(57)【要約】  局所親水性製剤が、親水性組成物中にカテキンおよび親水性抗酸化剤を２.３から１.７の間の比率（重量比）で含有する組成物および方法であり、前記カテキンおよび前記抗酸化剤が、前記組成物を皮膚に塗布するとカテキンが０．７mg／cm２および１.３mg／cm２の間の塗布量で沈着するような量で存在する、前記組成物および前記方法を提供する。特に好ましいカテキンは、緑茶カテキン、および特にＥＧＣＧを含むのに対して、好ましい抗酸化剤はアスコルビン酸およびこの誘導体を含む。
2008540643.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光老化を軽減するための局所親水性組成物であり、カテキンおよび親水性抗酸化剤を２．３から１．７（重量比）の間の比率で含みおよび前記組成物の投与によりカテキンを０．７ｍｇ／ｃｍ２から１．３ｍｇ／ｃｍ２の間の薬物量にて沈着させるような量で存在する前記組成物。
【請求項２】
カテキンがエピガロカテキンガレートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
カテキンが複数の更なるカテキンと共に提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
カテキンおよび複数の更なるカテキンがポリフェノンＥである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
親水性抗酸化剤がアスコルビン酸または置換されているアスコルビン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
２９０ｎｍから３９０ｎｍの間の波長において、少なくとも１０００ｃｍ−１のモル吸光係数を有する、ＵＶを吸収する化合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
カテキンと抗酸化剤との間の比率が２．１から１．９の間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
光老化の軽減が、ＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減、皮膚における過酸化水素ラジカル生成の低減、皮膚におけるタンパク質酸化の低減およびマトリックスメタロプロテアーゼの発現の低減の少なくとも１つにより特徴付けられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減が無処置と比較して少なくとも７５％である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
過酸化水素ラジカル生成の低減が無処置と比較して少なくとも５０％である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
カテキンおよび親水性抗酸化剤を親水性組成物中２.３から１.７の間の比率（重量比）で提供すること；
前記組成物を、カテキンが皮膚上に０．７ｍｇ／ｃｍ２から１．３ｍｇ／ｃｍ２の間の薬物量で存在するような量で、皮膚上に沈着させること；および
皮膚にＵＶ−Ｂ線を照射すること
を含む、光老化を軽減する方法。
【請求項１２】
カテキンがエピガロカテキンガレートである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
カテキンが複数の更なるカテキンと共に提供される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
カテキンおよび複数の更なるカテキンがポリフェノンＥである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
親水性抗酸化剤がアスコルビン酸または置換されているアスコルビン酸である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
２９０ｎｍから３９０ｎｍの間の波長で少なくとも１０００ｃｍ−１のモル吸光係数を有するＵＶを吸収する化合物をさらに含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
カテキンと抗酸化剤との間の比率が２．１から１．９の間である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
光老化の軽減が、ＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減、皮膚における過酸化水素ラジカル生成の低減、皮膚におけるタンパク質酸化の低減およびマトリックスメタロプロテアーゼの発現の低減の少なくとも１つにより特徴付けられる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
ＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減が無処置と比較して少なくとも７５％である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
過酸化水素ラジカル生成の低減が無処置と比較して少なくとも５０％である、請求項１８に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、光老化、特に皮膚の光老化の治療および防止のための組成物および方法である。
【背景技術】
【０００２】
皮膚の老化は、数多くのストレス状態に対する皮膚の機能および弾力性の進行性の損失として特徴付けることができ、しばしば傷害および病気の罹患性の増大により顕在化する。他の因子のなかで、老化した皮膚に伴う状態は、主として、遺伝的に決定された変性過程および繰り返される外的傷害および特に太陽紫外光への曝露（光老化）に起因し得る。
【０００３】
光老化は、多くの場合、皮膚の、皺、斑点状の色素沈着過剰および／または色素脱失、粗雑化、荒れ、弾性反発力不足ならびに易傷性の原因となる。長い期間をかけて傷害が悪化し、最終的には上皮性皮膚がん（例えば、日光角化症）または浸潤性の皮膚がんをもたらし得る。光老化は、紫外（ＵＶ）光への曝露の回避によりおよび／またはＵＶスペクトルの選択された部分を吸収する日焼け止めの使用により遅くすることができる。例えば、数多くの日焼け止め剤が、「Ｓｕｎｓｃｒｅｅｎｓ：Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｓ  Ａｎｄ  Ｃｏｍｍｅｒｉｃａｌ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ」Ｎａｄｉｍ  Ｓｈａａｔｈ著（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；第３版；ＩＳＢＮ：０８２４７５７９４７）に記載されている。また、数多くの天然のおよび合成の化合物が、日焼け止めの中に含まれている。例えば、緑茶ポリフェノールまたは抽出物（例えば、ＥＧＣＧ［エピガロカテキンガレート］を含むもの）は、炎症を軽減するためのおよび／または抗酸化作用を提供するための薬剤として日焼け止めに添加されてきた。しかしながら、著しい効果を得るために、このようなポリフェノールまたは抽出物の濃度は、比較的高くなければならない。さらに、および特に親水性調合物において、このようなポリフェノールおよび抽出物は、比較的不安定であり、急速に分解または重合する。光老化を軽減するための他の天然のおよび合成の化合物は、ビタミンＥ、コラーゲン、水和剤などを含み、これらは少なくともいくつかの報告されている有益な効果を有している。しかしながら、光老化を軽減するための現在公知の添加剤の全てでなければ大部分は、一時的な保護のみ提供し、または殆どもしくは全く再現性のある効果を有しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
このように、光老化を軽減するための数多くの組成物および方法が、当分野で公知である一方、それらのうちの全部またはほとんど全部が１つまたはそれ以上の不都合な点を抱えている。従って、光老化を軽減するための改良された組成物および方法に対する必要が今だに存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の概要）
本発明は、抗酸化剤の相乗的な量との組み合わせにて緑茶ポリフェノールを含む組成物および方法に関する。このような組成物は、皮膚に局所的に投与すると（好ましくは日光への曝露の前に）皮膚における光老化を軽減する。最も好ましくは、緑茶ポリフェノールは、ポリフェノンＥまたはそれの１つもしくはそれ以上の成分を含み、抗酸化剤は、アスコルビン酸またはその誘導体であり、局所調合物は、親水性局所調合物である。
【０００６】
本発明の主題の一つの態様において、光老化を軽減するための局所親水性組成物は、カテキン（最も好ましくはエピガロカテキンガレート）および親水性抗酸化剤（最も好ましくはアスコルビン酸）を２．３から１．７（重量比）の間の比率で含み、前記組成物の投与によりカテキンが０．７mg／cm２から１．３mg／cm２の間の薬物量にて沈着するような量で存在する。本発明の主題のさらに好ましい態様において、このカテキンは、複数の追加のカテキン（例えば、ポリフェノンＥの形態で）と共に提供され、アスコルビン酸は、場合により置換されていてよい。所望する場合、意図する局所調合物はまた、ＵＶ吸収化合物を含んでよく、特に意図するＵＶ吸収化合物は、２９０nmから３９０nmの間の波長で少なくとも１０００cm−１のモル吸光係数を有する。
【０００７】
特に好ましい局所組成物において、カテキンと抗酸化剤との間の比率は、２．１から１．９の間である。最も代表的には、意図する組成物を用いる皮膚の光老化の軽減は、ＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減、皮膚における過酸化水素ラジカル生成の低減、皮膚におけるタンパク質酸化の低減および／またはマトリックスメタロプロテアーゼの発現の低減により特徴付けられる。例えば、代表的な組成物は、無処置と比較して７５％またはそれ以上のＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減および／または無処置と比較して少なくとも５０％の過酸化水素ラジカル生成の低減を提供することができる。
【０００８】
したがって、本発明の主題のもう１つの態様において、光老化を軽減する方法は、親水性組成物中のカテキンおよび親水性抗酸化剤を２．３から１．７（重量比）の間の比率で提供する段階を含む。もう１つの段階において、この組成物は、カテキンが０．７mg／cm２から１．３mg／cm２の間の投与量で皮膚上に存在するような量で皮膚に投与される。さらにもう１つの段階において、このように処置した皮膚は、次に、光照射される。
【０００９】
本発明の種々の目的、特徴、態様および利点は、以下の本発明の好ましい実施形態の詳細な説明および添付図面から、より明らかになるであろう。
【００１０】
（図面の簡単な説明）
図１Ａは、種々の処置に応じた２倍化皮膚肥厚における変化を示すグラフである（測定値として）。
図１Ｂは、種々の処置に応じた２倍化皮膚肥厚における変化を示すグラフである（パーセントで）。
図１Ｃは、ＥＧＣＧの種々の濃度に応じた２倍化皮膚肥厚における変化を示すグラフである。
図１Ｄは、アスコルビン酸との組み合わせにおけるＥＧＣＧの種々の濃度に応じた２倍化皮膚肥厚における変化を示すグラフである。
図２は、種々の処置への応答としての過酸化水素の細胞内濃度を示すグラフである。
図３Ａは、種々の処置への応答としての細胞内タンパク質酸化を示すグラフである。
図３Ｂは、種々の処置への応答としての細胞内タンパク質酸化を示すウエスタンブロットの写真である。
図４は、種々の処置への応答としての細胞内マトリックスメタロプロテナーゼ発現を示すウエスタンブロットの写真である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
（詳細な記載）
太陽紫外（ＵＶ）線は、ヒトにおける加齢に関連する皮膚疾患の大部分について、第一原因として報告されてきた。他の病因性作用因子のなかで、特に反応性酸素種（ＲＯＳ）の酸化力が細胞の抗酸化力を上回る場合に、ＲＯＳが重要細胞高分子物質（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、脂質）の損傷に関与し得ることを、種々の研究が示唆した。
【００１２】
これらのおよび他の観察にもとづき、本発明者らは、酸化的ストレスが、皮膚の光老化に関連している可能性があると考えている。特に、本発明者らは、酸化ストレスが、選択された細胞信号伝達経路を活性化し、これが、直接的または間接的に皮膚マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のリン酸化および誘発につながる可能性があると考えている。他の原因のなかで、ＭＭＰの活性化が細胞外マトリックスタンパク質を分解し、これが、皺、光老化および／またはその他の皮膚障害につながる可能性がある。本発明者らは、皮膚へのＵＶ線の曝露が、酸化ストレスおよびマトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）のリン酸化をさらに悪化させることを発見し、このことが皮膚の光老化に重大な役割を果たすと考えている。
【００１３】
ここで、発明者らは意外にも、紫外（ＵＶ）光により誘発される酸化ストレスおよびＭＭＰのリン酸化が、カテキン（および特にカテキンの混合物［例えば、ポリフェノンＥおよび／または他の緑茶カテキン］）と抗酸化剤（特にアスコルビン酸）との相乗的組み合せにより、相乗的組み合せの比較的狭い範囲において防止され得ることができることを発見した。異なる視点から見ると、穏やかな保護効果が、いずれかの化合物について（即ち、カテキンまたは抗酸化剤単独）比較的幅広い濃度の範囲にわたり観察され得る。しかしながら、特定の組み合わせになるように組み合わせると（下のデータを参照のこと）、光老化に対して実質的および相乗的な保護効果が達成される。
【００１４】
１つの典型的な局所調合物において、１ヵ月の期間、ＵＶ（９０mJ／cm２）に、単一および多重曝露する前に、ポリフェノンＥまたはＥＧＣＧとアスコルビン酸との組み合わせを親水性クリームの状態で皮膚に投与し、各々２．０mg／cm２および１．０mg／cm２の量のポリフェノンＥ／ＥＧＣＧおよびアスコルビン酸を皮膚に沈着させた。意外にも、このような処置は、過酸化水素（５６−７３％）および酸化窒素（３０−６８％）の発生の減少により、測定された酸化ストレスを著しく減少させた。同様にして、このような処置はまた、表皮の脂質過酸化（４１−６４％）およびタンパク質酸化（５６−９０％）を著しく減少させた。さらにその上、観察された分子変化は、ＵＶ照射した皮膚における活性酸素種の存在に実質的に寄与していると考えられるＣＤ１１ｂ＋細胞のＵＶ誘発による浸潤の著しい抑制も伴った。更に、局所的処置もまた、老化に関連するＭＭＰ−２、−７および−９（４１から６６％）のＵＶＢ誘発によるリン酸化の抑制をもたらした。
【００１５】
もう１つの典型的な処置において、マウスを、飲料水中にポリフェノンＥを入れた状態（０．２％ｗ／ｖ）と入れない状態でＵＶＢ（９０mJ／cm２）に１日おきに１ヵ月間曝露させた。意外にも、このプロトコルは酸化ストレスのＵＶ誘発によるマーカーを抑制したが、局所的処置よりも少なかった。ＥＧＣＧの化学予防の有効性はポリフェノンＥよりも優れていた。さらに、ポリフェノンＥまたはＥＧＣＧで処置し、ＵＶ曝露したマウスにおける皮膚の外観は、ＵＶ曝露だけ行った皮膚の部位と比較して比較的より良好であった。
【００１６】
発明者の観察に基づき、皮膚の光老化は、カテキンと抗酸化剤との、および特に緑茶カテキン（例えば、ＥＧＣＧまたはポリフェノンＥ）とアスコルビン酸との相乗的組み合わせの投与により、軽減するまたは防止することさえもできると考えられる。このような処置の結果としてさらに、酸化ストレスおよびＭＭＰのリン酸化の防止は、創傷治癒の容易さの増大、機械的傷害に対する皮膚の回復力の増大、および皮膚の感染症に対する抵抗の増大を有利に提供できると考えられる。
【００１７】
適したカテキンに関して、植物から単離したカテキンが特に好ましく、特に適したカテキンには、緑茶から単離したカテキンが含まれることを理解されたい。従って、意図するカテキンは、特に、（−）−エピガロカテキンガレート、（−）−エピガロカテキン、（−）−ガロカテキンガレート、（−）−ガロカテキン、（−）−エピカテキンガレート、（−）−エピカテキン、（−）−カテキンガレートおよび（＋）−カテキンを含む。カテキンの別の由来は、紅茶、烏龍茶、リンゴ、梨およびワイン（ならびにこの他に、発酵および非発酵ブドウ抽出物）などを含む。さらに、カテキンは、意図する調合物中に単一化合物としてまたは複数の化学的に異なるカテキンの１つとして含まれていてよい。通常、１種類を超えるカテキンが局所調合物中に用いられる場合、カテキンは、植物抽出物の形態で、最も一般的には緑茶抽出物として供給される。他の適した抽出物のなかで、特に意図するカテキン製剤は、市販のポリフェノンＥおよびポリフェノンＢを含む。
【００１８】
所望する場合、カテキンを化学的に修飾して、少なくとも１つの化学的安定性（および特に酸化）を改良し、カテキンをより親油性にし、および／または１つまたはそれ以上の生理学的に望ましい特性を追加することができる。カテキンの化学修飾のための数多くの方法が当分野で公知であり、これらのすべてが本明細書中で用いるために適していると考えられる。典型的な修飾例が米国特許出願第ＵＳ２００５００１４９５８号、米国特許第６，５６２，８６４号または日本国特許出願の公開番号ＪＰ５７１２０５８４号に記載されている。その上さらに、本明細書中に提示される発明の主題と組み合わせて用いられるカテキンは、好ましくは天然源から単離される一方、合成カテキンもまた適していると考えられる。
【００１９】
抗酸化剤に関して、全ての公知の抗酸化剤がここで考慮されることを理解されたい。しかしながら、特に好ましい抗酸化剤は、薬学的に許容できる抗酸化剤である。さらにおよび特に、局所調合物が親水性製剤である場合、抗酸化剤は、親水性（例えば、１mlあたり少なくとも１０mg）抗酸化剤であることが好ましい。例えば、適した親水性抗酸化剤は、アスコルビン酸、カルノシン、ジメチルチオ尿素およびこれらの化学的誘導体（種々のエステルおよびアミド）を含む。あるいは、親水性抗酸化剤は、抗酸化性の抽出物または溶液の形態で提供されてよく、および特に好ましい溶液および抽出物は、アスコルビン酸塩に富む果実抽出物を含む。
【００２０】
一方、本発明の主題のそれほど好ましくない態様において、全抗酸化剤の少なくとも一部が疎水性抗酸化剤として提供され得るとも考えられる。したがって、適した疎水性抗酸化剤はまた、種々の、場合により置換されているトコフェロール、リコピンおよびカロテンを含む。本明細書中に提示される本発明の概念に限定することなく、抗酸化剤は、意図する局所組成物の少なくとも２倍効果を有すると考えられる。例えば、抗酸化剤は、カテキンの酸化を防止することならびに皮膚における酸化ストレス全般を軽減することに役立つことができる。同様に、カテキンは、１つを超える方法で望ましい生理学的効果を発揮することができる。例えば、カテキンは、抗酸化剤としておよび炎症またはストレス応答経路の調節剤として作用することができる。従って、相乗作用は、適した濃度で互いに高めあう望ましい効果の組み合わせにより達成することができる。
【００２１】
最も好ましい態様において、カテキンは、抗酸化剤に対して約２倍過剰（重量／重量基準で）で存在する。もう１つの観点から見ると、カテキンは、約５倍モル過剰（ＥＧＣＧに基づいて）で存在することが一般に好ましい。従って、特に意図する局所調合物には、カテキンおよび親水性抗酸化剤が２．７から１．２（重量比）の間の、より好ましくは２．５から１．５（重量比）の間の、さらにより好ましくは２．３から１．７（重量比）の間の、および最も好ましくは約２．１から１．９（重量比）の間の比率で含まれる。同様に、意図する調合物中のカテキンは、３倍から８倍の間の、より好ましくは４倍から７倍の間の、および最も好ましくは５倍から６倍の間のモル過剰の状態で存在する。
【００２２】
さらに、カテキンおよび（一般に親水性の）抗酸化剤は、調合物中に、光老化を軽減するために必要な相乗的な濃度で存在することが好ましい。例えば、およびとりわけ、そのような軽減に適したマーカーは、ＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減、皮膚における過酸化水素ラジカル生成の低減、皮膚におけるタンパク質酸化の低減およびＭＭＰ（すなわち、マトリックスメタロプロテアーゼ）の発現の低減を含む。最も好ましい態様において、カテキンおよび（一般に親水性の）抗酸化剤は、この組成物を投与するとカテキンが０．３５mg／cm２から１．７mg／cm２の間の、より好ましくは０．５mg／cm２から１．５mg／cm２の間の、さらにより好ましくは０．７mg／cm２から１．３mg／cm２の間の、および最も好ましくは０．８５mg／cm２から１．１５mg／cm２の間の量で沈着するような量で調合物中に存在する。
【００２３】
異なる観点から考察すると、カテキンおよび抗酸化剤は、ＵＶ誘発による皮膚肥厚を無処置と比較して少なくとも６０％の、およびより好ましくは少なくとも７５％の量で軽減するのに効果的な量で存在する。更にまたは別に、カテキンおよび抗酸化剤は、無処置と比較して少なくとも４０％の、より一般に少なくとも４５％の、および最も一般に少なくとも５０％の量で、過酸化水素ラジカルの生成を低減するのに効果的な量で存在する。同様に、カテキンおよび抗酸化剤が、皮膚中のタンパク質酸化を少なくとも６０％の、およびより一般に少なくとも７０％の量で減少させるのに、および／またはマトリックスメタロプロテアーゼの発現を少なくとも２０％の、およびより一般に少なくとも３０％の量で減少させるのに効果的な量で存在するように意図される。
【００２４】
加えて、意図される局所調合物はまた、ＵＶ吸収化合物、保湿化合物、アルファヒドロキシ酸およびコラーゲン合成を促進させる化合物を含む他の有効成分でよいことを理解されたい。ＵＶを吸収する特に好ましい化合物は、２９０nmから３９０nmの間の波長で少なくとも１０００cm−１のモル吸光係数を有する化合物である。例えば、適した化合物は、３−イミダゾール−４−イルアクリラート、サリシラート、ｐ−メトキシシンナマート、２−エチル−ヘキシル−２−シアノ−３，３−ジフェニルアクリラート、３，３，５−トリメチルシクロヘキシル−２−アセトアミノベンゾアート、ｐ−アミノベンゾアート、シンナマート、３，４−ジメトキシフェニルグリオキシラート、α−（２−オキソボルン−３−イリデン）−ｐ−キシレン−２−スルホナート、α−（２−オキソボルン−３−イリデン）トルエン−４−スルホナート、α−シアノ−４−メトキシシンナマート、２−フェニル−ベンズイミダゾール−５−スルホナート、２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン−５−スルホナート、２，２’−ジヒドロキシ−４，４’−ジメトキシ−ベンゾフェノン−３，３’−ジスルホナートを含み、適した保湿化合物は、セラミド、種々のポリオール（例えば、プロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、ヒアルロン酸）、コラーゲンなどを含み、適したアルファヒドロキシ酸は、乳酸、グリコール酸、リンゴ酸、クエン酸などを含み、適したコラーゲン合成促進剤は、ＧＨＫ−Ｃｕ２+錯体を含む。
【００２５】
カテキンおよび抗酸化剤は、数多くの局所調合物中に配合し得、特に好ましい調合物は、当分野で公知の親水性局所調合物（例えば、クリーム、泡沫、ローションまたはスプレー）が含まれることを理解されたい。例えば、適した局所調合物は、「Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  ａｎｄ  Ｔｏｉｌｅｔｒｙ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ」、第８版、Ｅｒｎｅｓｔ  Ｆｌｉｃｋ著（Ｎｏｙｅｓ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ；第２版（２０００年１月１５日）;ＩＳＢＮ：０８１５５１４５４９）中に記載されており、これは参照により本明細書に組み込まれる。
【００２６】
さらに、意図される局所調合物は、好ましくは、溶液、コロイド溶液、乳化ローション、Ｏ／Ｗクリーム（親水性クリーム）および水性ゲルなどの親水性、水性混合物が含まれ、ここで、水相は連続相である。あるいは、油溶液、軟膏、疎水性ゲル（例えば、ポリエチレンでゲル化した鉱物油）などの、乳化剤が油に添加される（ここで、油相は連続相である。）意図される疎水性油性混合物も適していると考えられる。
【００２７】
親水性成分は、一般に水溶液を含み、この水溶液はさらに親水性成分（例えば、グリセロール、炭水化物など）を含むことができる一方、疎水性成分は、炭化水素（例えば、流動パラフィン、ワセリン、固形パラフィン、マイクロクリスタリンワックスなど）を含む。乳化剤および分散剤が含まれていてよく、その例としての化合物は、アニオン性、カチオン性および非イオン性の界面活性剤である。非イオン性界面活性剤は、皮膚刺激性のレベルが低いので好ましい。非イオン性界面活性剤の例は、脂肪酸モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、ポリオキシエチレン脂肪酸エステルおよびポリオキシエチレン高級アルコールエーテルである。なおさらに、所望であればゲル化剤が使用され得、特に、カルボキシメチルセルロース、セルロースゲル、カルボポール、ポリビニルアルコール、ポリエチレングリコールおよび種々のガムを含んでよい。
【００２８】
局所製剤の安定性をさらに増大させるために、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、チオグリコール酸、チオ乳酸、チオグリセリン）、防腐剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のメチル、エチル、プロピルおよびブチルエステル、ｏ−フェニルフェノール、デヒドロ酢酸）または他の保存剤が添加されてよい。ｐＨを健康な皮膚のｐＨに一致させるかまたは近づけるように中性またはわずかに酸性のｐＨに調整することがなおさらに好ましい。適した酸性化剤は、特にクエン酸、乳酸、酒石酸などを含む。
【実施例】
【００２９】
実験
動物試験
６から８週齢のＳＫＨ−１無毛マウスを用いた。マウスを、ここにおける光老化モデル用に、１日おきに２ヵ月間ＵＶＢ曝露した（９０mJ／cm２）。実験の最後に、最終ＵＶ曝露から２４時間後にマウスを犠牲にし、種々のパラメータを分析するために、皮膚生検を収集した。
【００３０】
アスコルビン酸およびＥＧＣＧ（またはポリフェノンＥ）を、親水性クリーム中に種々の濃度で溶解し、これを、各部分をＵＶＢ曝露する２５から３０分前に、マウスの皮膚に局所的に投与した。予備試験において、発明者らは、皮膚中のＵＶＢ誘発による悪影響に対する、用量に依存するＡＡおよびＥＧＣＧの有効性を試験した。発明者らは、１mgＥＧＣＧ／cm２皮膚面積の投与が、ＵＶＢ照射に対して著しい化学予防効果をもたらすことを見出した。従って、抗光老化効果を評価するために、発明者らは、実施した全実験においてこの用量を用いた。
【００３１】
アスコルビン酸およびＥＧＣＧの抗光老化効果を評価するための生物マーカー
１．アスコルビン酸（ＡＡ）およびＥＧＣＧの処理を行った場合と行わない場合の、皮膚のＵＶ曝露部位の２倍化皮膚肥厚。
２．酸化ストレスのマーカーとしての過酸化水素生成。
３．タンパク質酸化。
４．皮膚の細胞外マトリックスの分解に主要な役割を果たし、皮膚の老化または皺の形成をもたらす、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９のようなマトリックスメタロプロテアーゼ。
５．マトリックスメタロプロテアーゼの組織抑制剤（ＴＩＭＰ）。ＡＡまたはＥＧＣＧ処置によるＴＩＭＰの誘発は、ＭＭＰ発現の抑制に関与し得る。
【００３２】
実験結果
ＡＡ、ＥＧＣＧおよびＡＡとＥＧＣＧとの組み合わせによる局所処置は、ＵＶＢ誘発による皮膚の損傷に対する保護の種々の程度をもたらした。対照実験を実施して、上記投与計画におけるＵＶＢ曝露による皮膚の損傷を検証した。一般に、ＵＶＢ損傷した皮膚は、粗い皮膚外観を呈し、皮膚厚は、２倍化皮膚肥厚で測定されるように増大した。以下の実験において、マウスにＵＶＢ（９０mJ／cm２）照射を１日おきに２ヵ月間行い、皮膚の光老化を生じさせた。ＡＡ、ＥＧＣＧまたはＡＡ（別に規定していない限り、０.５mgＥＧＣＧ／cm２皮膚面積）とＥＧＣＧ（別に規定していない限り、１mgＥＧＣＧ／cm２皮膚面積）との組み合わせのいずれかにより、各々のＵＶＢ曝露の前にマウスを局所的に処置し、これらの薬剤の光保護効果を測定した。親水性クリームを賦形剤として用いた。ＵＶＢを単独照射したマウス（対照）を、ＵＶＢ曝露の直前に賦形剤で局所的に処置した。
【００３３】
種々の実験に基づいて（データは示さない）、アスコルビン酸の最適投与量を約０.５mg／cm２皮膚面積と決定した。ほとんどの場合、０.５mg／cm２未満の投与量では、保護が低下する結果となった（２倍化皮膚肥厚で測定したところ）のに対して、０.５mg／cm２皮膚面積を実質的に超える用量では、炎症反応を誘発する傾向にあった。従って、およびこれらの知見に基づいて、選択された実験のためのアスコルビン酸の投与量を約０.５mg／cm２またはそれ未満に維持した。
【００３４】
図１Ａは、ＥＧＣＧの局所投与量が、２倍化肥厚試験により測定した光保護効果と相関性があったグラフを示す。ここで、光保護は、約１.０mg／cm２皮膚面積の投与量までは増大したが、それ以上投与量を増加しても更なる有益な効果はほとんどまたは全く得られなかった。図１Ｂは、ＥＧＣＧ（１mg／cm２）の固定投与量との組み合わせにおいて、アスコルビン酸の変化した投与量（０.１から０.５mg／cm２の間）を評価したグラフを示す。意外なことに、ほぼ完全な光保護が、ＥＧＣＧが約１mg／cm２の投与量で存在し、アスコルビン酸が約０.５mg／cm２の投与量で存在した処置により達成された（無処置の対照と相乗的組み合わせとの間に観察された効果は、いくつかの場合に誤差範囲内であった。）。
【００３５】
効果が相加的なものであるかまたは相乗的なものであるかを決定するため、アスコルビン酸およびＥＧＣＧを上記で決定した最適の投与量で局所的に用いた。図１Ｃおよび１Ｄに示すように、ＡＡとＥＧＣＧとの組み合わせを用いる局所処置は、２倍化肥厚試験で測定してＵＶＢ誘発による皮膚損傷の著しい防止をもたらしたのに対して、個々の処置は、実質的により少ない保護しか提供しなかった。対象の皮膚の外観が、ＡＡ処理をせずおよびＥＧＣＧ処理をしなかった皮膚の部位に比べてはるかにより良好であったことも観察された。興味深いことに、ＡＡとＥＧＣＧとの組み合わせの効果は、ＡＡまたはＥＧＣＧの個々の効果よりも、より大きかった。図１Ｄの括弧中のデータは、２倍化皮膚肥厚におけるＵＶＢ誘発による増加に対する保護パーセントを示している。
【００３６】
アスコルビン酸とＥＧＣＧとの相乗的組み合わせ（約１mg／cm２のＥＧＣＧ投与量および約０.５mg／cm２のアスコルビン酸投与量）の有益な効果をさらに確認するため、Ｈ２Ｏ２の細胞内放出を、酸化ストレスのマーカーとして測定した。ＵＶＢ曝露後、表皮および真皮からの単一細胞懸濁液を当分野で公知の手順に従って調製した。Ｈ２Ｏ２は、ジヒドロローダミン１２３を蛍光色素プローブとして用いて測定した。対照実験により証明され、図２に示されるように、アスコルビン酸およびＥＧＣＧを個別に用いた局所処置は皮膚細胞中のＨ２Ｏ２生成を誘発しなかったのに対して、皮膚のＵＶＢ照射は、Ｈ２Ｏ２の顕著な生成をもたらした。アスコルビン酸およびＥＧＣＧを用いる処置は、細胞中のＵＶＢ誘発によるＨ２Ｏ２生成を抑制した。また、観察されたアスコルビン酸とＥＧＣＧとの組み合わせの効果は、アスコルビン酸およびＥＧＣＧの個々の抑制効果よりも大きかった。
【００３７】
さらなる一連の実験において、タンパク質の酸化が皮膚の光損傷と関連づけられている為、皮膚におけるＵＶＢ誘発によるタンパク質の酸化を測定し、アスコルビン酸、ＥＧＣＧ、およびアスコルビン酸とＥＧＣＧとの相乗的組み合わせ（約１mg／cm２のＥＧＣＧ投与量および約０.５mg／cm２のアスコルビン酸投与量）を用いる局所処置の関数としてプロットした。図３に示すように、タンパク質の酸化を、タンパク質カルボニルの生成量として、慣用の分析方法により測定した。図４は、カルボニルを含むタンパク質に対する抗体を用いるウエスタンブロット解析を示す。タンパク質酸化を、ウエスタンブロット解析のあとにＯｘｙＢｌｏｔタンパク質酸化検出キット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ社、Ｐｕｒｃｈａｓｅ、ニューヨーク）を用いて測定した。アスコルビン酸およびＥＧＣＧは双方とも、ある程度はＵＶＢ誘発によるタンパク質酸化を個別に抑制した。しかしながら、アスコルビン酸およびＥＧＣＧを相乗的組み合わせにおいて組み合わせた場合、アスコルビン酸とＥＧＣＧとの効果は、個々の効果よりも大きかった。
【００３８】
マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の活性化または発現が細胞外マトリックスタンパク質の分解に関連するものであることがあらかじめ示されたので、アスコルビン酸、ＥＧＣＧ、およびアスコルビン酸とＥＧＣＧ（約１mg／cm２のＥＧＣＧ投与量および約０.５mg／cm２のアスコルビン酸投与量）との相乗的組み合わせを用いる局所処置の効果をまた、選択されたＭＭＰのＵＶＢ誘発による発現に関して確認した。大部分のマトリックスタンパク質が皮膚に抗張力を与えることから、これらは、皮膚の光老化および／または皺に関連するものと考えられている。本発明者らは、ＵＶＢへの皮膚の長期間曝露が、いくつかのＭＭＰ、特に、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７およびＭＭＰ−９の発現増加を誘発することを、先に報告した。図５に示すように、アスコルビン酸およびＥＧＣＧを個別に用いる局所処置は、ウエスタンブロットで測定されるように、少なくともある程度までは選択されたＭＭＰのＵＶＢ誘発による発現を抑制した。ブロットを剥離しβ−アクチン抗体用に再プローブして、タンパク質負荷が同等であることおよびゲルから膜へのタンパク質の移動が同等であることを検証した。明らかに、アスコルビン酸とＥＧＣＧとの組み合わせの効果は、再び個々の効果よりも実質的により高かった。さらに、アスコルビン酸およびＥＧＣＧはまた、ＵＶＢ曝露した皮膚におけるＭＭＰの活性化を抑制する原因であると思われるＴＩＭＰの発現を、上昇するように制御した。
【００３９】
経口ポリフェノンＥによる局所ＥＧＣＧの代替
光老化に対して意図された薬剤中の成分のうちの少なくとも１つの投与の別の経路を検討するために、発明者らは、ＥＧＣＧの局所投与をＥＧＣＧの経口投与に置き換えた。マウスを１８０mＪ／cm２の単一ＵＶ曝露に曝露し、ＵＶ曝露から２４時間後に動物を犠牲にした。皮膚生検を、各群のマウスから収集した。単一細胞懸濁液を調製し、ジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）を蛍光色素プローブとして用いてＨ２Ｏ２生成の測定に供した。多重ＵＶ曝露において、マウスを１日おきに１ヵ月間９０mJ／cm２に曝露し、マウスを最後のＵＶ曝露から２４時間後に犠牲にした。脂質過酸化を皮膚サンプルのミクロソーム分画中で測定した（ＭＤＡはマロンジアルデヒドである）。下記表中の括弧内データは、飲料水中のポリフェノンＥ処置による抑制パーセントを示している。
【００４０】
【表１】
2008540643.tif 000003
【００４１】
意外なことに、発明者は、ＵＶＢ光保護のための局所ＥＧＣＧ投与を、ＥＧＣＧが単独で（データは示さず）または他のカテキン（ここで、ポリフェノンＥ）との組み合わせで投与される経口投与に置き換えることができることを発見した。
【００４２】
【表２】
2008540643.tif 000004
【００４３】
グリセリルココエート、グリセリルトリラウラートおよびグリセリンを一緒に混合し、６０℃に加熱する。分離容器中で、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸塩およびリン酸緩衝溶液（０.３Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７.０）を混合し、６０℃に加熱する。次に、緩衝溶液を、グリセリルを含む溶液に添加し、混合しながら４０℃に冷却する。次に、ポリフェノンＥをゆっくりと混合しながら添加し、室温に放冷する。
【００４４】
かくして、光老化の軽減に対する特定の実施形態および応用例が開示された。しかしながら、当業者には、既に記述されたもの以外の多くのさらなる変更例が本明細書中の発明の概念から逸脱することなく可能であることは明らかであろう。従って、発明の主題は、添付の特許請求の範囲の精神における以外では制限されるべきではない。さらに、明細書および特許請求の範囲の両者の解釈において、用語はすべて文脈に矛盾することなくできる限り広範な様式で解釈されるものとする。特に、用語「含む」および「含んでいる」は、要素、成分または段階を参照するように非限定的解釈されるものとし、参照された要素、成分または段階が存在し、または利用され、またははっきりとは参照されていない他の要素、成分または段階と組み合わせることができることを示す。なおさらに、参照により本明細書中に組み込まれている引用文献中の用語の定義または使用が、本明細書中で規定される用語の定義に矛盾しているかまたは反している場合、本明細書中で規定された用語の定義を適用し、引用文献中の用語の定義は適用しない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１Ａ】図１Ａは、種々の処置に応じた２倍化皮膚肥厚における変化を示すグラフである（測定値として）。
【図１Ｂ】図１Ｂは、種々の処置に応じた２倍化皮膚肥厚における変化を示すグラフである（パーセントで）。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＥＧＣＧの種々の濃度に応じた２倍化皮膚肥厚における変化を示すグラフである。
【図１Ｄ】図１Ｄは、アスコルビン酸との組み合わせにおけるＥＧＣＧの種々の濃度に応じた２倍化皮膚肥厚における変化を示すグラフである。
【図２】図２は、種々の処置への応答としての過酸化水素の細胞内濃度を示すグラフである。
【図３】図３は、種々の処置への応答としての細胞内タンパク質酸化を示すグラフである。
【図４】図４は、種々の処置への応答としての細胞内タンパク質酸化を図示するウエスタンブロットの写真である。
【図５】図５は、種々の処置への応答としての細胞内マトリックスメタロプロテナーゼ発現を図示するウエスタンブロットの写真である。
【図１Ａ】
2008540643.tif 000005
【図１Ｂ】
2008540643.tif 000006
【図１Ｃ】
2008540643.tif 000007
【図１Ｄ】
2008540643.tif 000008
【図２】
2008540643.tif 000009
【図３】
2008540643.tif 000010
【図４】
2008540643.tif 000011
【図５】
2008540643.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月11日(2008.3.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
光老化を軽減するための局所親水性組成物であって、カテキンおよび親水性抗酸化剤を２．３〜１．７（重量比）の間の比率で含み、および前記組成物の投与によりカテキンを０．７ｍｇ／ｃｍ２〜１．３ｍｇ／ｃｍ２の間の薬物量にて沈着させるような量で存在する前記組成物。
【請求項２】
カテキンがエピガロカテキンガレートである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
カテキンが複数の更なるカテキンと共に提供される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
カテキンおよび複数の更なるカテキンがポリフェノンＥである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
親水性抗酸化剤がアスコルビン酸または置換されているアスコルビン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
２９０ｎｍ〜３９０ｎｍの間の波長において、少なくとも１０００ｃｍ−１のモル吸光係数を有する、ＵＶを吸収する化合物をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
カテキンと抗酸化剤との間の比率が２．１〜１．９の間である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
光老化の軽減が、ＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減、皮膚における過酸化水素ラジカル生成の低減、皮膚におけるタンパク質酸化の低減およびマトリックスメタロプロテアーゼの発現の低減の少なくとも１つにより特徴付けられる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
ＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減が無処置と比較して少なくとも７５％である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
過酸化水素ラジカル生成の低減が無処置と比較して少なくとも５０％である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１１】
カテキンおよび親水性抗酸化剤を親水性組成物中２.３〜１.７の間の比率（重量比）で提供すること；
前記組成物を、カテキンが皮膚上に０．７ｍｇ／ｃｍ２〜１．３ｍｇ／ｃｍ２の間の薬物量で存在するような量で、皮膚上に沈着させること；および
皮膚にＵＶ−Ｂ線を照射すること
を含む、光老化を軽減する方法。
【請求項１２】
カテキンがエピガロカテキンガレートである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
カテキンが複数の更なるカテキンと共に提供される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
カテキンおよび複数の更なるカテキンがポリフェノンＥである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
親水性抗酸化剤がアスコルビン酸または置換されているアスコルビン酸である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
２９０ｎｍ〜３９０ｎｍの間の波長で少なくとも１０００ｃｍ−１のモル吸光係数を有するＵＶを吸収する化合物をさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
カテキンと抗酸化剤との間の比率が２．１〜１．９の間である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
光老化の軽減が、ＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減、皮膚における過酸化水素ラジカル生成の低減、皮膚におけるタンパク質酸化の低減およびマトリックスメタロプロテアーゼの発現の低減の少なくとも１つにより特徴付けられる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
ＵＶ誘発による皮膚肥厚の軽減が無処置と比較して少なくとも７５％である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
過酸化水素ラジカル生成の低減が無処置と比較して少なくとも５０％である、請求項１８に記載の方法。
【国際調査報告】
2008540643.tif 000013