(57)【要約】  プラスミノーゲン又はプラスミノーゲンのアナログであるタンパク質の分離、除去、単離、精製、特徴付け、同定又は定量のために、式（II）｛式中、１のＸがＮであり、そして他のＸがＮ，Ｃ−Ｃｌ又はＣ−ＣＮであり；  Ａは、スペーサーによりトリアジン環に場合により連結された支持マトリックスであり；  ＺはＯ，Ｓ又はＮ−Ｒであり、ここでＲは、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ヒドロキシアルキル、ベンジル又はβ−フェニルエチルであり；  Ｂは、１〜１０個の炭素原子を含む場合により置換された炭化水素連結であり；  ＤはＨ，ＯＨ又は第一アミノ、第二アミノ、第三アミノ、第四アンモニウム、イミダゾール、グアニジノ又はアミジノ基であり；又は  Ｂ−Ｄは、−ＣＨＣＯＯＨ−（ＣＨ2）3-4−ＮＨ2であり；そして  ｑは２〜６である。｝で表される化合物であるアフィニティー吸着剤を使用する。
2008540497.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プラスミノーゲン又はプラスミノーゲンのアナログであるタンパク質の分離、除去、単離、精製、特徴付け、同定又は定量のためのアフィニティー吸着剤の使用であって、当該アフィニティー吸着剤が、以下の式（II）：
【化１】
2008540497.tif 000009
｛式中、１のＸがＮであり、そして他のＸがＮ，Ｃ−Ｃｌ又はＣ−ＣＮであり；
Ａは、スペーサーによりトリアジン環に場合により連結された支持マトリックスであり；
ＺはＯ，Ｓ又はＮ−Ｒであり、ここでＲは、Ｈ、Ｃ1-6アルキル、Ｃ1-6ヒドロキシアルキル、ベンジル又はβ−フェニルエチルであり；
Ｂは、１〜１０個の炭素原子を含む場合により置換された炭化水素連結であり；
ＤはＨ，ＯＨ又は第一アミノ、第二アミノ、第三アミノ、第四アンモニウム、イミダゾール、グアニジノ又はアミジノ基であり；又は
Ｂ−Ｄは、−ＣＨＣＯＯＨ−（ＣＨ2）3-4−ＮＨ2であり；そして
ｑは２〜６である。｝で表される化合物である前記使用。
【請求項２】
前記吸着剤が式（III）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記吸着剤が式（IV）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記吸着剤が式（Ｖ）を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記プラスミノーゲンが血漿のサンプル中に存在する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載される式（II）を有する新規化合物。
【請求項７】
Ａが、トリアジン環に直接又は間接的に連結された官能基により置換される、請求項６に記載の化合物の前駆体である化合物であって、それにより固体支持体上での当該前駆体の固定化が可能にされている前記前駆体である化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野
本発明は、化合物、及びアフィニティー・リガンドとしてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
プラスミノーゲン（マイクロプラスミン、ＰＬＧ又はアンジオスタチンとしても知られる）は、１本鎖の９１kDa糖タンパク質チモーゲンであり、そしてフィブリン溶解酵素プラスミンの前駆体である。プラスミノーゲンの天然形は、７９１個のアミノ酸から成り、グルタミン酸は、そのＮ末端部分に位置する（Ｇｌｕ−プラスミノーゲン）、プラスミノーゲンは、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅｓ）として知られる５つの相同領域をもつ。これらの領域は、ｔＰＡ，ｕＰＡ、及びプロトロンビン上に位置する相補的クリングルに特異的である。これらのクリングルは、１つの高アフィニティーの、そして４つの低アフィニティーのリジン結合部位をもち、これらの部位は、プラスミノーゲンとフィブリン及びアルファ−２−抗プラスミンとの相互作用を仲介する。
【０００３】
プラスミノーゲンは、さまざまな反応のカスケードを介してプラスミンに変換され、これらの反応は、プラスミノーゲンのＡｒｇ５６０−Ｖａｌ５６１ペプチドの加水分解をもたらし、最終的に、ジスルフィド結合により共有結合により会合された２つの鎖となる。トリプシン様プロテアーゼ・プラスミンの主な役割は、血塊の破壊である。
【０００４】
コーディングＤＮＡ内のホモ−又はヘテロ接合突然変異により生じるプラスミノーゲンの欠陥は、木質結膜炎及び血栓症を含む多数の病因において現れる。
【０００５】
プラスミノーゲンは、約１００μｇ／mLの濃度でヒト血漿中に存在する。十分に特徴付けられたアフィニティー・クロマトグラフィー・プロセスにおいて、固体支持体上に固定化されたリジンを用いて血漿からプラスミノーゲンを精製することができる。固定化されたリジン・クロマトグラフィーは、一般に、血塊破壊薬として使用される組織プラスミノーゲン活性物質（ｔＰＡ）の如きタンパク質の細胞培養収獲物からの一次捕獲のためにも使用される。プラスミノーゲンに対する商業的に入手しうる樹脂の結合能力は、典型的には、吸着剤１mL当り０．６〜１．０mgタンパク質の範囲内にある。これらの材料から溶出されたプラスミノーゲンの純度は高く、一次捕獲から一般に＞９５％の純度である。優れた溶出純度をもつ上記特性を保持しながら、現在入手しうるものを超える結合能力を示す材料を提供することは有用であろう。
【０００６】
ＷＯ９７／１０８８７は、アフィニティー吸着剤として有用な、以下の式（Ｉ）：
【化１】
2008540497.tif 000003
｛式中、Ｒ1は、Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、シクロアルキル、ＮＨ2、フェニル、ナフチル、１−フェニルピラゾール、インダゾール、ベンズチアゾール、ベンズオキサゾール又はベンズイミダゾールであり、その芳香族基の内のいずれかは、アルキル、アルコキシ、アシルオキシ、アシルアミノ、アミノ、ＮＨ2，ＯＨ，ＣＯ2Ｈ、スルホニル、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルフォニル、及びハロゲンの内の１以上で置換されていてもよく；
１のＸはＮであり、そして他のＸはＮ，Ｃ−Ｃｌ又はＣ−ＣＮであり；
ＹはＯ，Ｓ又はＮＲ2であり；
ＺはＯ，Ｓ又はＮＲ3であり；
Ｒ2とＲ3は各々Ｈ、アルキル、ヒドロキシアルキル、ベンジル又はβ−フェニルエチルであり；
Ｑは、ベンゼン、ナフタレン、ベンズチアゾール、ベンズオキサゾール、１−フェニルピラゾール、インダゾール又はベンズイミダゾールであり；
Ｒ4，Ｒ5とＲ6は各々、Ｈ，ＯＨ、アルキル、アルコキシ、アミノ、ＮＨ2、アシルオキシ、アシルアミノ、ＣＯ2Ｈ、スルホン酸、カルバモイル、スルファモイル、アルキルスルフォニル又はハロゲンであり；
ｎは０〜６であり；
ｐは０〜２０であり；そして
Ａは、スペーサーによりトリアジン環に場合により連結された支持マトリックスである。｝で表されるトリアジン−ベースの化合物を開示する。
【０００７】
式（Ｉ）の化合物は、免疫グロブリン、インスリン、第VII因子又はヒト成長ホルモンの如きタンパク質に対してアフィニティーをもつものとして開示されている。
【０００８】
関連構造をもつ化合物は、ＷＯ００／６７９００及びＷＯ０３／０９７１１２中に開示される。それらは内毒素に対するアフィニティーをもつ。
【発明の開示】
【０００９】
本発明の概要
驚ろくべきことに、その内の多くが新規である特定の化合物がプラスミノーゲンのアフィニティー−ベースの単離のために有用であることが発見された。これらの化合物は以下の式（II）：
【化２】
2008540497.tif 000004
｛式中、Ａ，Ｘ、及びＺは先に式（Ｉ）のために定義したものと同じであり；
Ｂは、１〜１０個の炭素原子を含む場合により置換された炭化水素連結であり；
Ｄは、Ｈ，ＯＨ、又は第一アミノ、第二アミノ、第三アミノ、第四アンモニウム、イミダゾール、グアニジノ又はアミジノ基であり；
Ｂ−Ｄは、−ＣＨＣＯＯＨ−（ＣＨ2）3-4−ＮＨ2であり；そして
ｑは２〜６である。｝を有する。
【００１０】
さらに、本発明の化合物は、式中Ａがトリアジン環に直接又は間接的に連結された官能基により置換され、支持マトリックス上に固定化されうる、対応のリガンドを含む。用語「リガンド」と「吸着剤」は、以下、互換使用されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明の説明
ＷＯ９７／１０８８７，ＷＯ００／６７９００、及びＷＯ０３／０９７１１２は、リガンドのコンビナトリアル・ライブラリーが固体支持体上でどのようにして構築されうるかということを開示する。本発明に共通する態様及び手順の例を含むそれらの開示を、本明細書中に援用する。供給原料としてプールされたヒト血漿を用いてこれらのコンビナトリアル・ライブラリーのセットをスクリーニングする間、ヒトプラスミノーゲンに選択的に結合し、かつ、これを溶出することができるものとして多数のリガンドが同定された。
【００１２】
本発明において使用される式（II）の化合物は、当業者に知られた手順により調製されうる。これらの手順は、前記した３つのＰＣＴ公開公報中に記載され；それらは、新規化合物の調製のために容易に改作されうる。
【００１３】
本発明の化合物においては、ｑは好ましくは４である。上記分子の「腕」はリジンに由来することが理解されるであろう。Ｂは、好ましくは芳香族、例えばベンゼン環を含む。
【００１４】
ＷＯ９７／１０８８７は、それを介してトリアジン環が固体支持体Ｍに連結されうるところのスペーサー又はリンカーＬを含むＡの実施例を与える。ＷＯ９７／１０８８７中に記載されるように、このような支持体は、アガロース、セファロース、シリカ、セルロース、デキストラン、デンプン、アルギン酸塩、カラギーナン、合成ポリマー、ガラス、及び金属酸化物を含む。このような材料は、反応前に活性化されて、本発明の吸着剤が形成される。
【００１５】
Ｌは、例えば、−Ｔ−（−Ｖ1−Ｖ2）m−であることができ、ここで
ＴはＯ，Ｓ又は−ＮＲ7−であり；
ｍは０又は１であり；
Ｖ1は２〜２０個のＣ原子の場合により置換された炭化水素基であり；そして
Ｖ2はＯ，Ｓ，−ＣＯＯ−，−ＣＯＮＨ−，−ＮＨＣＯ−，−ＰＯ3Ｈ−，−ＮＨ−アリーレン−ＳＯ2−ＣＨ2−ＣＨ2−又は−ＮＲ8−であり；そして
Ｒ7とＲ8は各々独立にＨ又はＣ1-6アルキルである。
【００１６】
本発明の好ましい態様においては、プラスミノーゲン結合性吸着剤は、以下の構造III：
【化３】
2008540497.tif 000005
により表される。
【００１７】
本発明のさらに好ましい態様においては、プラスミノーゲン結合性吸着剤は、以下の構造IV：
【化４】
2008540497.tif 000006
により表される。
【００１８】
本発明の最も好ましい態様においては、プラスミノーゲン結合性吸着剤は、以下の構造Ｖ：
【化５】
2008540497.tif 000007
により表される。
【００１９】
本明細書中に記載するプラスミノーゲン結合性リガンド及び吸着剤は、非制限的に、ヒト血漿１以上の他のタンパク質を減じたヒト血漿、及び組換え発酵上清を含む各種液体及び複雑な混合物からのプラスミノーゲンのアフィニティー単離及び精製に有用である。この有用性は、ヒトのプールされた血漿を用いたクロマトグラフィー実験により、実施例４において以下に証明される。
【００２０】
用語「プラスミノーゲン」は、プラスミノーゲン自体、及び例えば、本明細書中に記載される所定の化合物に対するアフィニティーの点で、プラスミノーゲンの機能特性をもつアナログを記載するために使用される。したがって、アナライトは、プラスミノーゲンの機能的断片であるタンパク質、又は同一結合部位の全ての内の１以上をもつ構造アナログ、又は融合タンパク質でありうる。
以下の実施例は本発明を説明する。
【実施例】
【００２１】
実施例１−吸着剤IIIの合成
６％架橋Ｐｕｒａｂｅａｄアガロースゲル（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｏｓｍｏｓｉｓ（ＲＯ）水中沈殿１０００ｇ）をＲＯ水（６７０mL）、１０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（９０mL）、及びエピクロロヒドリン（１２７mL）を用いてスラリー化した。このスラリーを２時間にわたり撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、次いでＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。エポキシ基の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り１７．３μmolのエポキシ基で誘導体化されたことを示した。
【００２２】
ゲルを排水し、その後、ＲＯ水（８００mL）と０．８８比重水性アンモニア溶液（２００mL）を添加した。混合物を撹拌し、そして４０℃に加熱し、次いで１６時間にわたりこの温度で撹拌した。サンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、次いでＲＯ水（１２×１０００mL）で洗浄した。アミン基のＴＮＢＳ分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り２５．６μmolのアミン基で誘導体化されたことを示した。
【００２３】
沈殿し、アミノ化されたゲル（１０００ｇ）を１Ｍリン酸カリウムpH７．０（１Ｌ）中に懸濁し、その後排水した。次いで、このゲルに、１Ｍリン酸カリウムpH７．０（２５０ml）及びＲＯ水（２５０ml）を添加した。このスラリーを激しく撹拌し、同時にアセトン（５００mL）を添加した。氷／塩浴内で３０分間にわたり冷却した後、冷アセトン（２５mL）中の塩化シアヌール酸（２５ｇ）を一部で添加した。混合物を１時間にわたり０℃で撹拌し、その後、５０％水性アセトン（５×１Ｌ）、ＲＯ水（５×１Ｌ）、５０％水性アセトン（５×１Ｌ）、及びＲＯ水（１０×１Ｌ）で洗浄した。ゲルを重力下で放置して沈殿させ、その後サンプルを分析のために採取した。塩化物放出の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り１６．８μmolの置換ジクロロトリアジンで誘導体化されたことを示した。
【００２４】
先のステージからの沈殿ゲル（１０００ｇ）を、１６時間にわたり室温で塩酸リジン（４５ｇ）を含有する１Ｍリン酸カリウム・バッファー（１Ｌ）を用いてスラリー化した。このスラリーを濾過し、次いでＲＯ水（１５×１Ｌ）で洗浄した。ＲＯ水（９５０mL）中にスラリー化されたゲル９５０ｇ（沈殿）に、エタノールアミン（１４．８２ｇ）を添加した。混合物を一夜６０℃で撹拌した。上清のサンプルを分析のために採取した後、スラリーを濾過し、その後、ＲＯ水（１２×１Ｌ）で洗浄した。塩化物放出の分析は、ゲルが、沈殿ゲル１ｇ当り２２．７μmolのエタノールアミンで誘導体化されていたことを示した。
【００２５】
ゲル４０℃で一夜０．５Ｍ  ＮａＯＨの最終濃度でインキュベートし、その後０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×１Ｌ）で洗浄した。最終洗浄液を重力下で放置して沈殿させた後、０．５Ｍ  ＮａＯＨ（１Ｌ）を添加し、そして混合物を４０℃で一夜インキュベートした。次いで、ゲルを０．５Ｍ  ＮａＯＨ（５×１Ｌ）で、その後ＲＯ水（１０×１Ｌ）で洗浄した。０．１Ｍ  ＰＢＳ  pH７．０（３×１Ｌ）で洗浄した後、ゲルをさらにＲＯ水（１０×１Ｌ）で洗浄し、その後、２０％ｖ／ｖ水性エタノール中４℃で冷却室内で保存した。
【００２６】
実施例２−吸着剤IVの合成
ジクロロトリアジン活性化アガロースを、実施例１に記載した方法に従って調製した。沈殿ゲル（４１．５ｇ、２２μmol  ＤＣＴ／沈殿１ｇ）を一夜６０℃で、水（４０mL）中塩酸リジン（１．６７ｇ、１０モル当量）の水溶液と反応させ、同時に、そのpHを１０Ｍ  ＮａＯＨで９．０に維持した。この時点で、ゲルを、５０％水性ジメチルホルムアミド（５×８０mL）、ＲＯ水（５×８０mL）、０．１Ｍ  ＨＣｌ（５×８０mL）、３０％イソプロパノール／０．２Ｍ  ＮａＯＨ（５×８０mL）、及びＲＯ水（５×８０mL）で洗浄し、その後、２０％ｖ／ｖ水性エタノール中４℃で冷却室内で保存した。
【００２７】
実施例３−吸着剤Ｖの合成
ジクロロトリアジン活性化アガロースを実施例１に記載した方法に従って調製した。沈殿ゲル（４３ｇ、２１．１μmol  ＤＣＴ／沈殿１ｇ）を３０分間にわたり５℃で、５０％  ＤＭＦ／水（４０mL）中２−（ヒドロキシメチル）アニリン（０．５６ｇ、５モル当量）の溶液と反応させた。この時点で、ゲルを、５０％水性ジメチルホルムアミド（５×８０mL）及びＲＯ水（５×８０mL）で洗浄した。ゲルを、次いで、６０℃で一夜、水（４０mL）中塩酸リジン（１．７１ｇ、１０モル当量）の水性溶液と反応させ、同時にそのpHを１０Ｍ  ＮａＯＨで９．０に維持した。この時点でゲルを５０％水性ジメチルホルムアミド（５×８０mL）、ＲＯ水（５×８０mL）、０．１Ｍ  ＨＣｌ（５×８０mL）、３０％イソプロパノール／０．２Ｍ  ＮａＯＨ（５×８０mL）、及びＲＯ水（５×８０mL）で洗浄し、その後、２０％ｖ／ｖ水性エタノール中４℃で冷却室内で保存した。
【００２８】
実施例４−ヒト血漿を用いた吸着剤III，IV、及びＶを用いたクロマトグラフィー
Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒクロマトグラフィー・システムを用いた１．６cm内直径の１０cm床高カラム・クロマトグラフィー・カラムを用いて、クロマトグラフィー実験を実施した。カラムを、１００cm／時間で１４０mM塩化ナトリウム／２０mMクエン酸ナトリウム／２０mM  Ｔｒｉｓ  pH７．５で平衡化した。ヒト血漿（３，０．８，０．４５、及び０．２μｍフィルターを通して濾過され、２０mM  Ｔｒｉｓ／pH７．５に調整された、１．３Ｌ）を次いで、５０cm／時間でロードした。ロード後洗浄を、５０cm／時で１４０mM塩化ナトリウム／２０mMクエン酸ナトリウム／２０mM  Ｔｒｉｓ  pH７．５を用いて行い、ベースライン吸光度までもっていった。その後、このカラムを１００cm／時で１４０mM塩化ナトリウム／２０mMクエン酸ナトリウム／２０mM  Ｔｒｉｓ／５００mM  ε−アミノカプロン酸pH７．５で溶出し、そして０．５Ｍ水酸化ナトリウムで再生した。ロード、非結合、及び溶出フラクションを、比濁計により分析して結合能力を測定した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥを実施して純度を測定した。
【００２９】
上記吸着剤の全てからの溶出フラクションの純度は＞８５％であった。（１０％ブレークスルーにおける）動的結合能力を以下の表１に示す。
【００３０】
【表１】
2008540497.tif 000008
【国際調査報告】
2008540497.tif 000010
2008540497.tif 000011