(57)【要約】本発明は、細胞性心筋形成術を用いた、「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」としての、心疾患を治療するためのシステムを提供する。システムは、冠動脈疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、および虚血による障害心筋を有する患者を選定し、治療するのに特に有用である。患者は、さまざまな臨床的基準に基づいて選定され、患者の心機能を改善するために、細胞性心筋形成術を用いて任意で治療される。心筋形成術は、薬物治療または左心室補助装置などの他の治療と併用されてもよい。望ましくは、細胞性心筋形成術は、バイパス移植術または心移植などの侵襲的手術の必要性を解消する。本発明は、本発明の方法を用いた患者の選定および治療に用いられるキットも提供する。
2008540536.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
心疾患を有する患者を治療する方法であって、
左心室補助装置を用いて、心疾患に罹患している患者を治療するステップと、
細胞性心筋形成術を用いて、前記患者を治療するステップと、
を含む、心疾患を有する患者を治療する方法。
【請求項２】
前記左心室補助装置を取り外すステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞性心筋形成術を用いて前記患者を治療する前記ステップは、該患者の心臓への細胞の投与を含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記細胞は、骨格筋芽細胞、胎児心筋細胞、胚幹細胞、および骨髄肝細胞から成る群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記細胞は、自己骨格筋芽細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
細胞性心筋形成術を用いて前記患者を治療する前記ステップは、左心室補助装置を用いて該患者が治療される前または最中に実施される、請求項１記載の方法。
【請求項７】
前記患者は、急性心疾患に罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記患者は、慢性心疾患に罹患している、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記心疾患は、冠動脈疾患、心臓弁疾患、心筋炎、心不全、拡張型虚血性心不全、うっ血性心不全、心筋症、拡張型心筋症、心筋梗塞から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記投与される細胞の数は、細胞数１×１０６から１０×１０９の範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記投与される細胞の数は、細胞数１×１０７から１０×１０９の範囲である、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞は、９０％を超えて生存している、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞は、９０％を超えて純粋な骨格筋芽細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞は、８０％を超えて純粋な骨格筋芽細胞である、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
左心室補助装置により前記患者を治療する前記ステップは、細胞性心筋形成術により該患者を治療する前記ステップが実施される少なくとも１週間後に終了される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
左心室補助装置により前記患者を治療する前記ステップは、細胞性心筋形成術により該患者を治療する前記ステップが実施される少なくとも４週間後に終了される、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
左心室補助装置により前記患者を治療する前記ステップは、細胞性心筋形成術により該患者を治療する前記ステップが実施される少なくとも８週間後に終了される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
左心室補助装置により前記患者を治療する前記ステップは、細胞性心筋形成術により該患者を治療する前記ステップが実施された少なくとも６ヶ月後に終了される、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
左心室補助装置により前記患者を治療する前記ステップは、細胞性心筋形成術により該患者を治療する前記ステップが実施される少なくとも１２ヶ月後に終了される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
左心室補助装置により前記患者を治療する前記ステップは、細胞性心筋形成術により該患者を治療する前記ステップが実施される少なくとも１８ヶ月後に終了される、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
左心室補助装置により前記患者を治療する前記ステップは、細胞性心筋形成術により該患者を治療する前記ステップが実施される少なくとも２４ヶ月後に終了される、請求項１の方法。
【請求項２２】
細胞性心筋形成術による治療の対象となる患者を選定する方法であって、
年齢、駆出率、冠動脈狭窄の数と割合、既往歴、心筋酵素値、血圧、コレステロール値、ＥＫＧ、心拍出量、運動負荷試験の結果、ホルター心電図、慢性または急性心疾患、および尿検査から成る群から選択される任意の基準に基づいて、心疾患に罹患している患者を選定するステップを含む方法。
【請求項２３】
前記患者の心臓への細胞の投与をさらに含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記患者は、急性心疾患に罹患している、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記患者は、慢性心疾患に罹患している、請求項２２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）の下で、２００５年５月９日に出願された米国仮特許出願第６０／６７８，９７６号に対する優先権を主張する。米国仮特許出願第６０／６７８，９７６号は、本明細書中に参考として援用される。
【背景技術】
【０００２】
過去３０年にわたる心疾患治療の飛躍的な進歩にかかわらず、西欧諸国において、冠動脈疾患（ＣＡＤ）は依然として主な死亡原因としてとどまっている（「Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｈｅａｒｔ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ  ＆  Ｍｏｒｔａｌｉｔｙ  Ｗｅｅｋｌｙ  Ｒｅｐｏｒｔ、５０：９０−９３、２００１年。参照により、本開示に含まれる）。さらに具体的には、予防措置および「機械的」血行再建術（血管形成術およびバイパス手術）は、かかる療法の候補である個人に、８０％を超える５年生存率をもたらしたが、冠疾患がびまん性、閉塞性疾患、および／または梗塞に進行してしまうと、治療の選択肢は依然として限られている（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｕｐｄａｔｅ、２００３年。参照により本開示に含まれる）。このような進行した冠動脈疾患を有する個人の２年生存率は、２０％という低いものである（Ａｎｙａｎｗｕら、「Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ｈｅａｒｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｓ  ａｌｏｎｅ  ｃａｎｎｏｔ  ｂｅ  ｔｈｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｅｎｄ  ｓｔａｇｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、ＢＭＪ  ３２６：５０９−５１０、２００３年。参照により本開示に含まれる）。
【０００３】
毎年、ほぼ１１０万人の米国人が急性心筋梗塞に罹患している（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｕｐｄａｔｅ、２００３年。参照により本開示に含まれる）。早期介入は、梗塞面積を制限し、初期生存を向上させる（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、「Ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ａｆｔｅｒ  ｆｉｒｓｔ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈｓ  ａｎｄ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｓｈａｐｅ」、Ｊ  Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ  １９：１１３６−４４、１９９２年；Ｍｉｇｒｉｎｏら、「Ｅｎｄ−ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ  ｉｎｄｅｘ  ａｔ  ９０  ａｎｄ  １８０  ｍｉｎｕｔｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｓｔｒｏｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：１１６−１２１、１９９７年；Ｂｏｙｌｅら、「Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｆａｒｃｔ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｂｙ  ｌａｔｅ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ．Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｉｍｅ  ｃｏｕｒｓｅ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８８：２８７２−８３、１９９３年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。しかし、急性心筋梗塞を克服する患者の２０％は、６０ｍＬ／ｍ２を下回る左室収縮末期容積指数（ＬＶＥＳＶＩ）を伴う、著しい左室拡張を発現する。ＧＵＳＴＯ  Ｉ試験（Ｍｉｇｒｉｎｏら、「Ｅｎｄ−ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ  ｉｎｄｅｘ  ａｔ  ９０  ａｎｄ  １８０  ｍｉｎｕｔｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｓｔｒｏｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｅａｒｌｙ  ａｎｄ  ｌａｔｅ  ｍｏｒｔａｌｉｔｙ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６：１１６−１２１、１９９７。参照により本開示に含まれる）は、心筋梗塞後の左室拡張は、死亡の重大かつ独立した予測因子であること実証した。したがって、心筋梗塞後の初期生存は、適切な再灌流療法の適時性および妥当性により予測できる可能性があるが、長期予後は左室の形態と機能の変化に大きく左右される。これらはうっ血性心不全の決定因子である（Ｍｉｔｃｈｅｌｌら、「Ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ａｆｔｅｒ  ｆｉｒｓｔ  ａｎｔｅｒｉｏｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ：ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｌｅｎｇｔｈｓ  ａｎｄ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｓｈａｐｅ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ．１９：１１３６−４４、１９９２年；Ｇｈｅｏｒｇｈｉａｄｅら、「Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ，ａ  ｍａｎｉｆｅｓｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．９７：２８２−８９、１９９８年；Ｗｈｉｔｅら、「Ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄ−ｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｖｏｌｕｍｅ  ａｓ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ  ｏｆ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｆｔｅｒ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｆｒｏｍ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ７６（１）：４４−５１、１９８７年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。
【０００４】
急性心筋梗塞に起因することがあるうっ血性心不全（ＣＨＦ）には、現在５００万人を超える米国人が冒されている（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  ａｎｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｄａｔａ  Ｆａｃｔ  Ｓｈｅｅｔ：ｃｏｎｇｅｓｔｉｖｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：Ａ  ｎｅｗ  ｅｐｉｄｅｍｉｃ、ＮＨＬＢＩウェブサイト。
ｗｗｗ／ｎｈｌｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｈｅａｌｔｈ／ｐｕｂｌｉｃ／ｈｅａｒｔ／ｏｔｈｅｒ／ｃｈｆ．ｈｔｍ；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌら、「Ｅｃｏｎｏｍｉｃ  ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ：ｔｉｍｅ  ｆｏｒ  ａ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ａｐｐｒｏａｃｈ」、Ｊ．Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１３：Ｓ１Ｏ７−Ｓ１１２、１９９４年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。医学療法は、進歩はあったものの、もっとも重度の末期ＣＨＦの患者に、未だ＜５０％の１年生存しかもたらさない（Ｒｏｓｅら、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ａｓｓｉｓｔ  ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｅｎｄ−ｓｔａｇｅ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、ＮＥＪＭ  ３４５（２０）：１４３５−４３、２００１年。参照により本開示に含まれる）。その臨床効果にもかかわらず、心臓移植は心不全と闘う上で免疫学的意義がほとんどない療法である（Ｔａｙｌｏｒら、「Ｔｈｅ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｌｕｎｇ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：２０ｔｈ  ｏｆｆｉｃｉａｌ  ａｄｕｌｔ  ｈｅａｒｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｒｅｐｏｒｔ−２００３」、Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２２（６）：６１６−６２４、２００３年。参照により本開示に含まれる）。その結果、梗塞を起こした心筋の修復および再生のための細胞ベースの療法は、慢性心不全に罹患した患者を治療するために提案されてきた（Ｃｈｉｕら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐｌａｓｔｙ：ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒ．Ｓｕｒｇ．６０：１２−８、１９９５年；Ｐａｇａｎｉら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｄａｍａｇｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ」、Ｊ  Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１：８７９−８８８、２００３年；Ｇｈｏｓｔｉｎｅら「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ１３１−６、２００２年；Ｄｏｒｆｍａｎら、「Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｔｈｏｒ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１６：７４４−５１、１９８８年；Ｔａｙｌｏｒら、「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ４（８）：９２９−３３、１９９８年；Ｒｅｔｕｅｒｔｏら、「Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐｌａｓｔｙ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｅｔａｌ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｔｈｏｒａｃ．  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１２７：１−１１、２００４年；Ｊａｉｎら、「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−２７、２００１年；Ｒｅｉｎｅｃｋｅら、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｆｕｓｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ」、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９４（６）：ｅ５６−６０、２００４年；ＭｃＣｏｎｎｅｌｌら、「Ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．、２００４年（印刷中）；Ｋｅｓｓｌｅｒら、「Ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｉｎｔｏ  ｈｅａｒｔ  ｍｕｓｃｌｅ：ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．６１：２１９−４２、１９９９年；Ｙｏｏら、「Ｈｅａｒｔ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｈｅａｒｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｉｃ  ｈａｍｓｔｅｒｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．１０２（１９  Ｓｕｐｐｌ  ３）：ＩＩＩ２０４−９、２０００年；Ｋｏｈら、「Ｓｔａｂｌｅ  ｆｅｔａｌ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｅａｒｔｓ  ｏｆ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｍｉｃｅ  ａｎｄ  ｄｏｇｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９６（４）：２０３４−４２、１９９５年；Ｋｌｕｇら、「Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｅｍｂｒｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒｍ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ  ｇｒａｆｔｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８（ｌ）：２１６−２４、１９９６年；Ｊａｃｋｓｏｎら、「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ  ｂｙ  ａｄｕｌｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０７（１１）：１３９５−４０２、２００１年；Ｋｏｃｈｅｒら、「Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，ｒｅｄｕｃｅｓ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａ���ｄｉａｃ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：４３０−４３６、２００１年；Ｋａｍｉｈａｔａら、「Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｓｉｄｅ  ｓｕｐｐｌｙ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ，ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ，ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：１０４６−１０５２、２００１年；Ｏｒｌｉｃら、「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ａｄｕｌｔ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｐａｉｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ」、Ａｎｎ．ＮＹ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３８：２２１−９、ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ  ２２９−３０、２００１年；Ｏｒｌｉｃら、「Ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｐａｉｒ  ｔｈｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｈｅａｒｔ，ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．（９８）：１０３４４−９、２００１年；Ｂａｌｓａｍら、「Ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ａｄｏｐｔ  ｍａｔｕｒｅ  ｈａｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｆａｔｅｓ  ｉｎ  ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４２８（６９８３）：６６８−７３、２００４年；Ｒｅｉｎｅｃｋｅら、「Ｔａｋｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｏｌｌ  ａｆｔｅｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｒａｆｔｉｎｇ：ａ  ｒｅｍｉｎｄｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊ．ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄ．３４：２５１−２５３、２００２年；Ｐｅｒｉｎら、「Ｔｒａｎｓｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ，ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ，ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０７：２２９４−２３０２、２００３年；Ｔｓｅら、「Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ｉｓｃｈａｅｍｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：４７−４９、２００３年；Ｋａｍｉｈａｔａら、「Ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｃｏｌｌａｔｅｒａｌ  ｐｅｒｆｕｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ｓｉｄｅ  ｓｕｐｐｌｙ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｂｌａｓｔｓ，ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｌｉｇａｎｄｓ，ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０４：１０４６−１０５２、２００１年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。機能および形態の回復を促進するための血管形成、脈管形成、および／または筋形成を目的に、未熟細胞が���筋機能障害の主要部に移植される。残念ながら、現在のヒトの臨床試験の結果は、移植細胞の生存数が、通常＜１％の自己筋芽細胞生着と、非常に少ないことを示している（Ｐａｇａｎｉら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｄａｍａｇｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ」、ＪＡｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１：８７９−８８８、２００３年。参照により本開示に含まれる）。このように細胞の生存および生着率が低い理由はわかっていない。
【０００５】
細胞移入は、（１）瘢痕化した心筋を収縮筋細胞によって「再増殖」させ、（２）菲薄化した損傷心室のさらなるリモデリングを抑えるために「足場」を提供し、および／または（３）虚血心筋の血管形成刺激の媒体としての機能を果たすことにより、心筋梗塞の状態において心機能の再生を提供するための考えである（Ｓｃｏｒｓｉｎら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１９：１１６９−７５、２０００年；Ｊａｉｎら、「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−１９２７、２００１年；Ｓｕｚｕｋｉら、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｙ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０２［ｓｕｐｐｌ  ＩＩＩ］：ＩＩＩ−３５９−ＩＩＩ−３６４、２０００年；Ｏｒｌｉｃら、「Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：７０１−７０４、２００１年；Ｗａｎｇら、「Ｍａｒｒｏｗ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐｌａｓｔｙ：ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ」、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１２０：９９９−１００６、２０００年；Ｔｏｍｉｔａら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｄａｍａｇｅｄ  ｈｅａｒｔ  ｈｅａｒｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−２４７−ＩＩ−２５６、１９９９年；Ｒｅｉｎｅｃｋｅら、「Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｒａｆｔｓ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：１９３−２０２、１９９９年；Ｓａｋａｉら、「Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｆｅｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ」、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５−２５、１９９９年；Ｃｈｅｄｒａｗｙら、「Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｐｌａｎｔｅｄ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ａｎｄ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｎａｔｉｖｅ  ｍｙｕｏｃａｒｄｉａｌ  ｆｉｂｅｒｓ：ａｎａｔｏｍｉｃ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔｓ」、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１２４：５８４−９０、２００２年；Ｋｌｕｇら、「Ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｓｅｌｅｃｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒｍ  ｓｔａｂｌｅ  ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ  ｇｒａｆｔｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２１６−２２４、１９９６年；Ａｔｋｉｎｓら、「Ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｙｉｅｌｄｓ  ｔｗｏ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｔｒｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６７：１２４−９、１９９９年；Ｌｅｏｒら、「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｏｆ  ｒａｔ．Ａ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ？」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９４［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−３３２−ＩＩ−３３６、１９９６年；Ｚｈａｎｇら、「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｐａｉｒ：ｇｒａｆｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｄｅａｔｈ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｊ．ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．３３：９０７−９２１、２００１年；Ｌｉら、「Ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｒａｔ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｉｎｔｏ  ａｄｕｌｔ  ｒａｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｓｃａｒ  ｔｉｓｓｕｅ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９６［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−１７９−ＩＩ−１８７、１９９７年；Ｔａｙｌｏｒら、「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：９２９−９３３、１９９８年；Ｍｅｎａｓｃｈｅ、「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｃ  Ｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  ３２５：７３１−７３８、２００２年、Ｏｈら、「Ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｈｏｍｉｎｇ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１２３１３−１８、２００３年；Ｔｅｒａｄａら、「Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ａｄｏｐｔ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：５４２−５、２００２年；Ｙｉｎｇら、「Ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｂｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：５４５−８、２００２年４月４日。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。細胞性心筋形成術（ＣＣＭ）の推定的有効性に関連があるとすれば、これらのうちどの機序が関連するのかは未知である。これに関し、通常は極度に効率の悪い（＜１０％）、観察された細胞の心筋瘢痕部への生着は、動物実験後に指摘された、比較的限定された心室機能の改善を説明する可能性があるものとして挙げられており（Ｐａｇａｎｉら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｄａｍａｇｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ：Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ」、Ｊ  Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１：８７９−８８、２００３年；Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａら、「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｊｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｒａｆｔｅｄ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ  ａｔ  ｔｈｅ  ｂｏｒｄｅｒ  ｚｏｎｅ  ｏｆ  ｒａｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−２６２−ＩＩ−２６８、１９９９年；Ｋｅｈａｔら、「Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｉｎｔｏ  ｍｙｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０８：４０７−４１４、２００１年；Ｂｏｈｅｌｅｒら、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ」、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．９１：１８９−２０１、２００２年；Ｔｏｍａら、「Ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｔｏ  ａ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｍｕｒｉｎｅ  ｈｅａｒｔ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０５：９３−９８、２００２年；Ｔａｍｂａｒａら、「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｃａｎ  ｆｕｌｌｙ  ｒｅｐｌａｃｅ  ｔｈｅ  ｉｎｆｒａｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｗｈｅｎ  ｔｈｅｙ  ｓｕｒｖｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−２５９−ＩＩ−２６３、２００３年；Ｍｉｎａｍｉら、「Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｍｅｅｔｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｍｕｓｃｌｅ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１：１０８４−６、２００３年；Ｇｈｏｓｔｉｎｅら、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ−１３１−Ｉ−１３６、２００２年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）、また移植細胞の、血管形成の一時的なメディエータとしての潜在的役割ではない、心筋瘢痕における持続的な物理的存在について疑念を呼び起こしてきた（Ｓｃｏｒｓｉｎら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１９：１１６９−７５、２０００年；Ｒｅｉｎｅｃｋｅら、「Ｓｕｒｖｉｖａｌ，Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｒａｆｔｓ：ａ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｉｎｊｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｈｅａｒｔｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １００：１９３−２０２、１９９９年；Ｚｈａｎｇら、「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｐａｉｒ：ｇｒａｆｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｄｅａｔｈ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｊ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ  ３３：９０７−９２１、２００１年；Ｍｅｎａｓｃｈｅ、「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｃ．Ｒ．Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  ３２５：７３１−７３８、２００２年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。また、ＣＣＭの有効性は、幹細胞の分化を機能的な心筋細胞に関連させるために理想化されてきたが、そのような分化の証拠は、潜在的に発生する移植された幹細胞と宿主筋細胞との細胞融合により交絡されてきた可能性がある（Ｏｈら、「Ｃａｒｄｉａｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｈｏｍｉｎｇ，ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｓｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１２３１３−１８、２００３年；Ｔｅｒａｄａら、「Ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ  ａｄｏｐｔ  ｔｈｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｏｆ  ｏｔｈｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｆｕｓｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４
１６：５４２−５、２００２年；Ｙｉｎｇら、「Ｃｈａｎｇｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｂｙ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｆｕｓｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  ４１６：５４５−４８、２００２年４月４日。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。しかし骨格筋芽細胞移植は、心筋形成術の研究において、線維芽細胞移植に優る機能的利点を提供することが実証されてきている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。
【非特許文献１】Ｓｃｏｒｓｉｎら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１９：１１６９−７５、２０００年
【非特許文献２】Ｊａｉｎら、「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｓ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−１９２７、２００１年
【非特許文献３】Ｓａｋａｉら、「Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．Ｆｅｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ：ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅｓ」、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１８：７１５−２５、１９９９年
【非特許文献４】Ｔａｙｌｏｒら、「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：９２９−９３３、１９９８年
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
心疾患を治療するための細胞性心筋形成術の使用と、この分野でなされた進歩とを考慮すると、細胞性心筋形成術用いての心臓組織の損傷を治療する必要性が残されている。また、最近この治療が出現したことを考慮すると、さまざまなタイプおよび重症度の心疾患に罹患した患者の治療において、どうすればこの治療方法を最善の形で用いることができるのか、という問題が残されている。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、細胞移植が、損傷した心臓を回復させ、心移植またはその他のさらなる療法が遅延あるいは回避するのに役立つという認識に端を発する。特定の実施例では、本発明は、細胞性心筋形成術の候補としての心疾患患者の選定を伴い、および／または選定された患者の疾患の管理に、細胞性心筋形成術がどのように用いられるべきかを判断する。本発明は、さまざまな原因論、重症度、予後など（虚血性心疾患、うっ血性心不全、急性または慢性心疾患、心原性ショックなど）を有するものを含む広範な心疾患に罹患している患者の治療において、細胞性心筋形成術を提供する。本発明は、細胞性心筋形成術は、患者によっては「ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ（最終治療）」あるいは「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」であってよいという認識を含む。
【０００８】
１つの側面では、細胞性心筋形成術は、「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」として用いられてよい。心機能を改善するために、患者の心臓には骨格筋芽細胞などの細胞が移植される。細胞性心筋形成術は、単独で、あるいは左心室補助装置、心臓外科手術、移植、または薬物治療など、他の治療様式と併用して用いられてよい。特定の実施例では、細胞性心筋形成術は、心臓手術または同所性心移植などの侵襲的処置の必要性を解消してよい。細胞性心筋形成術は、たとえば心臓のリモデリングを逆行、予防、または軽減させるなど、心機能を改善する。特定の実施例では、細胞性心筋形成術は、患者が心移植まで生存できるよう、ＬＶ拡張を予防、および／またはＬＶサイズを減少させる｛左室収縮末期指数（ＬＶＥＳＩ）を約６０ｍＬ／ｍ２に維持するなど｝。特定の実施例では、細胞性心筋形成術は、心機能の改善を提供し、それにより患者の入院の必要性がなくなったり、入院期間が短縮されたり、または再入院の必要性が低減されたりする。特定の実施例では、細胞性心筋形成術は、細胞性心筋形成術を受けていない患者のものと比較して、より質の高い生活を提供する。特定の実施例では、細胞性心筋形成術により治療された患者の死亡率は低下する。
【０００９】
本発明は、特定の臨床的基準に基づき、細胞性心筋形成術の候補となる患者を選定する方法も提供する。この方法は、細胞性心筋形成術による、「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」としての治療の対象となる患者を選定する方法も提供する。患者がかかる治療の候補であるかどうかを判断するために用いられる基準には、駆出率（左室駆出率など）、左室収縮末期容積指数、左室拡張末期容量指数、心拍出量、血圧、負荷テスト、心エコー検査またはその他の心臓画像法、ＥＫＧなどが含まれてよい。特定の実施例では、細胞性心筋形成術に選定される患者は、びまん性虚血性心疾患に罹患している。別の特定の実施例では、患者は例えば心筋梗塞の後などの、心原性ショックに陥っていてよい。特定の実施例では、患者は心術後ショックに陥っている、またはその危険性がある。別の実施例では、患者は心筋炎に罹患している。さらに別の実施例では、患者は心筋症に罹患している。特定の実施例では、患者は心臓移植に失敗している、または失敗しつつある。別の実施例では、細胞性心筋形成術の対象に選定される患者は、心臓移植の候補ではない。さらに別の実施例では、患者は冠動脈バイパス移植術などの心臓手術の候補ではない。特定の実施例では、選択された患者は軽度の心疾患に罹患しており、細胞性心筋形成術および薬物治療により管理することができる。特定の実施例では、選択された患者は急性心疾患に罹患している。別の実施例では、選択された患者は慢性心疾患に罹患している。
【００１０】
細胞性心筋形成術の候補としての患者が選定されると、細胞は、患者の心臓に任意で移植される。細胞性心筋形成術を実施するためのあらゆる手法が用いられてよい。特定の実施例では、細胞性心筋形成術は、米国特許出願第ＵＳＳＮ６０／６６６，９３２号（２００５年３月３１日申請）の、名称「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ」（参照により本開示に含まれる）に記載されるように、血管形成促進療法と併用される。本発明の方法に用いられる細胞は、骨格筋芽細胞、間葉系幹細胞、心筋細胞、胎児心筋細胞、胚幹細胞、線維芽細胞、胚幹細胞、および成人骨髄由来幹細胞を含んでよい。特定の実施例では、骨格筋芽細胞が用いられる。別の特定の実施例では、間葉系幹細胞が患者の心臓に移植される。使用される細胞は、人工的に改変されていてよい。細胞は、例えば直接心外膜注射によるもの、またはカテーテルでの心外膜供給によるものなど（２００５年３月４日申請の米国特許出願第ＵＳＳＮ６０／６５８，８８７号に記載されるが、これは参照により本開示に含まれる）を含むいかなる手段で供給されてもよい。細胞は、外科的処置の最中に供給されてよい。細胞は、複数回投与されてよい。例えば細胞は、ＬＶＡＤ設置またはその他の侵襲的処置時に心外膜注射により投与され、その後カテーテルを用いて投与されてよい。特定の実施例では、サイドポート針を用いて細胞を移植する（２００３年８月６日出願の米国特許出願第ＵＳＳＮ１０／６３５，２１２号に記載されるが、これは参照により本開示に含まれる）。
【００１１】
本発明は、「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」としての心筋形成術の候補である患者を選定および治療する方法をともに提供する。治療の対象となる患者が選ばれると、患者の心疾患を治療するために、心臓、特に心臓の障害のある部分に細胞を供給するあらゆる手法を用いてよい。本発明は、「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」として患者を選定、治療する際に有用であってよいキット（診断キット、治療キットなど）、試薬、ソフトウェア、細胞組成物、医療装置なども含む。
【００１２】
定義
血管形成とは、新生血管（毛細血管など）の形成を指す。特に本発明で使用される血管形成は、細胞が移植された、または移植される予定の心臓組織における新生血管の形成を指す。特定の実施例では、細胞が虚血領域に移植され、血管形成が増進される。血管形成は、例えば細胞移植の実施の結果として、虚血の結果として、および／またはＶＥＧＦなどの血管新生促進因子の投与の結果として発生する。
【００１３】
心機能不全に特徴付けられる心臓障害または疾患は、慢性、急性に関わらず、正常な心機能の傷害または不在、あるいは異常な心機能の存在を含む。異常な心機能は、病気、損傷、および／または加齢によるものの場合がある。ここで使用される異常な心機能には、心筋細胞、心筋細胞の数、心臓組織、心筋、心内膜、心外膜、心臓の部分（左心室、右心室、左心房、右心房、中隔、伝導系など）、または心臓自体の形態学的および／または機能的異常が含まれる。形態学的および／または機能的異常の例としては、心筋細胞の物理的劣化および／または死、心筋細胞の異常な成長パターン、心筋細胞間の物理的接続の異常、心筋細胞による１つあるいは複数の物質の産生不足または過剰、心筋細胞が健康な心筋細胞により産生される１つあるいは複数の物質を産生しない、また異常なパターンでまたは異常な時期に電気的刺激を伝達する、運動異常、駆出率の減少、心エコー検査で観察される変化（拡張など）、EKGの変化、運動耐容の変化、毛細血管血流の低下、および血管造影で観察される変化などが挙げられるが、これらに限定されない。異常な心機能は、例えば狭心症、心筋梗塞、慢性虚血性心疾患などの虚血性心疾患、高血圧性心疾患、肺性心疾患（肺性心）、リウマチ熱、僧帽弁逸脱、僧帽弁輪石灰化などの心臓弁疾患、カルチノイド心疾患、感染性心内膜炎、先天性心疾患、心筋炎、拡張型心筋症、高血圧性心筋症などの心筋症、うっ血性心不全を引き起こす心傷害、および原発性肉腫や二次性腫瘍などの心臓腫瘍などの多くの傷害を伴って現れる。
【００１４】
〜に由来するとは、試料または対象から得られた細胞、あるいは試料または対象から得られた細胞の後代または子孫の細胞を指す。１つの細胞株に由来する細胞は、その細胞株のメンバー、あるいはその細胞株のメンバーである細胞の後代または子孫である。臓器、組織、個人、細胞株などに由来する細胞は、採取したあとにインビトロで修正してよい。例えば細胞は、関心のある遺伝子を発現するよう作り変えてよい。そのような細胞でも、その由来源から由来するとみなされる。
【００１５】
生着するとは、移植された筋細胞または筋細胞組成物が、移植された筋細胞の被移植者心臓への直接の付着の有無に関わらず（形成デスモソームまたはギャップ結合などによって）、心臓組織に組み込まれることである。特定の実施例では、細胞は、例えば心拍出量を増加させたり、あるいは心機能の低下を予防または減速したりすることによって、新機能を向上させる。別の実施例では、生着は、損傷した心臓のリモデリングを防止するための足場を提供してよい。別の実施例では、生着は、血管形成を刺激してよい。特定の実施例では、生着は、移植された細胞の心臓における生存を指す。
【００１６】
心臓内での細胞生存、筋芽細胞生存、または線維芽細胞生存とは、（１）細胞、筋芽細胞、または線維芽細胞自体の生存、（２）細胞、筋芽細胞、または線維芽細胞が分化される細胞の生存、（３）細胞、筋芽細胞、または線維芽細胞の後代の生存、（４）融合産物（細胞、筋芽細胞、または線維芽細胞が融合する細胞）の生存のいずれか、またはこれらの組み合わせを指す。
【００１７】
心筋虚血とは、心筋虚血性障害を引き起こす、心臓またはその一部への酸素流量の不足を指す。ここで使用される心筋虚血性障害というフレーズは、心筋への血流の低下に起因する傷害を含む。心筋虚血および心筋虚血性障害の原因の例としては、大動脈拡張期血圧の低下、心室内圧および心筋収縮の上昇、冠動脈狭窄（冠動脈結紮、固定冠動脈狭窄、急性プラーク変化（崩壊、出血など）、冠動脈血栓症、血管収縮など）、大動脈弁狭窄および逆流、右心房圧の上昇が含まれるが、これらに限定されない。心筋虚血および心筋虚血性障害の有害作用の例としては、筋細胞損傷（筋細胞消失、筋細胞肥大、筋細胞過敏性）、狭心症（安定狭心症、異型狭心症、不安定狭心症、突然心臓死）、心筋梗塞、およびうっ血性心不全が含まれるが、これらに限定されない。心筋虚血による障害は、急性または慢性であってよく、結果には瘢痕形成、心臓リモデリング、心臓肥大、壁菲壁菲薄化、拡張、および関連する機能変化が含まれてよい。急性または慢性心筋障害および／または心筋虚血の存在と原因論は、当業者に周知のさまざまな方法および手法を用いて診断されてよいが、これには例えば、非侵襲性画像診断（MRI,、心エコー検査など）、血管造影法、ストレス試験、心筋トロポニンなどの心筋特異的なタンパク質のアッセイ、臨床症状の評価などが含まれる。これらの方法および手法、また他の適切な手法は、どの対象がここに記載される治療方法に適した候補であるかを判断するために用いられてよい。
【００１８】
ペプチドまたはタンパク質は、ペプチド（アミド）結合によって互いに結合する少なくとも３本のアミノ酸の鎖を備える。「ペプチド」という用語は、個々のペプチドまたはペプチドの集合を指してよい。発明のペプチドは、多くの場合天然アミノ酸のみを含有するが、非天然アミノ酸（自然に発生したのではないが、ポリペプチド鎖に組み込まれることが可能な化合物）、および／または当業者には既知のアミノ酸類似体を代替的に採用してよい。また、発明のペプチドにおける１つ以上のアミノ酸は、例えば炭水化物基、リン酸基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、接合のためのリンカーなどの化学物質の添加、官能基化、またはその他の修飾などにより、変更されてよい。
【００１９】
ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つのヌクレオチドのポリマーを指す。ポリマーは、天然ヌクレオチド（アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、およびデオキシシチジン）、ヌクレオチド類似体（２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロピリミジン、３−メチルアデノシン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−メチルシチジン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、Ｏ（６）−メチルグアニン、および２−チオシチジンなど）、化学的に修飾された塩基、生物的に修飾された塩基（メチル化塩基など）、挿入塩基、修飾糖（２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラビノース、およびヘキソースなど）、または修飾リン酸基（ホスホロチオエートおよび５’−Ｎ−ホスホラミダイト連鎖など）を含んでよい。
【００２０】
小分子とは、非ペプチド性、非オリゴマー性有機化合物を指す。特定の実施例では、小分子は、実験室における全合成、部分合成、または半合成によって合成される。別の実施例では、小分子は自然界に見られるものである。ここで使用される小分子は、「天然物様」化合物を指すことができるが、「小分子」という用語は「天然物様」化合物に限定されない。さらに正確には、小分子は通常、いくつかの炭素−炭素結合を含み、また１５００を下回る分子量を有することに特徴付けられるが、この特徴付けは本発明の目的を制限することを意図しない。
【００２１】
骨格筋芽細胞および骨格筋芽細胞は、筋管および骨格筋繊維の前駆体を指す。骨格筋芽細胞という用語は、骨格筋中の筋繊維と密接に関わる衛星細胞、単核細胞も含む。衛星細胞は、骨格筋筋原線維の基底膜付近に位置し、筋原線維に分化できる。前述のように、骨格筋芽細胞を備える発明の組成物のいくつかは、検出可能な筋管および筋繊維が欠如している。心筋細胞という用語は、心筋に由来する筋肉細胞を含む。このような細胞は、１つの細胞核を有し、心臓に存在する場合は、介在板構造により結合される。
【００２２】
幹細胞は、正しい条件下で、さらに分化した細胞を生じさせるあらゆる多能性細胞を指す。幹細胞は、複数の型の分化した細胞に分化することができてよい。本発明に従って使用されてよい幹細胞には、間葉、筋肉、心筋、骨格筋、胎児幹細胞、および胚幹細胞が含まれる。本発明で有用な幹細胞は、心筋細胞、または心臓で通常見られるその他の細胞を生じさせる。幹細胞は、（１）自己更新する（２）さらに分化した細胞を生じさせる、というその能力により特徴付けることもできる。これは、運動的定義と言われている。
【００２３】
ここで使用される治療するとは、心筋障害または機能障害の少なくとも１つの有害作用または症状を低減する、あるいは緩和することを指す。この用語は特に、心筋虚血、心筋虚血性障害、心臓障害、または心機能不全に特徴付けられる疾患の治療に適用される。心疾患の有害作用または症状は、多数あり、よく特徴付けられている。心疾患の有害作用または症状の例としては、呼吸困難、胸痛、動悸、眩暈、失神、浮腫、チアノーゼ、蒼白、倦怠、および死亡が含まれるが、これらに限定されない。多種の心疾患の有害作用または症状のさらなる例としては、Ｒｏｂｂｉｎｓら（１９８４年）、Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、フィラデルフィア州）、５４７−６０９；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら編集（１９９２年）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ＆  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ（Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、コネチカット州）、２５７−３５６を参照されたい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、細胞性心筋形成術を用いて、心疾患に罹患した患者を選定し、任意に治療するためのシステムを提供する。１つの実施例では、本発明は、「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」として、あるいは「ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ（最終治療）」として、心疾患に罹患した患者を選定および治療する方法を提供する。心室補助装置が移植または回復への橋渡しであると考えられてきたのとほぼ同様に（Ｋｈｅｒａｎｉら、「Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ａｓ  ａ  Ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  ｏｒ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ」、Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  １０１：９３−１０３、２００４年；Ｈｏｎら、「Ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌｅｆｔ  Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ａｓｓｉｓｔ  Ｄｅｖｉｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｅｎｂｕｔｅｒｏｌ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７５：Ｓ３６−４１、２００３年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）、心疾患の治療での高い成功を収めてきた細胞性心筋形成術の発達は、心疾患の管理において、これをｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）となるよう導いてきた。心疾患に罹患した患者に対する細胞性心筋形成術を用いての治療は、入院を減らし、再入院の必要性を減少させ、生活の質を向上させ、および／または死亡率と疾病率を低下させることができる。
【００２５】
本発明のシステムは、心疾患に罹患したいかなる患者の介護を管理するのにも有用である。心疾患の例としては、心筋症、肥大型心筋症、拡張型心筋症、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、虚血性心疾患、心筋炎、ウイルス感染、寄生虫感染、細菌感染、創傷、高血圧性心筋症、心臓弁膜症、先天性心疾患、心筋梗塞、うっ血性心不全、不整脈、心原性ショック、心術後ショック、心臓移植失敗、末期心不全などが含まれるが、これらに限定されない。本発明のシステムは、収縮性の欠如（駆出率の低下により示される可能性があるものなど）など、心臓組織への傷害を伴う心臓疾患に罹患した患者を選定し、治療するのに有用である。本発明のシステムは、虚血に起因する心臓の損傷を伴う心臓疾患に罹患した患者を選定し、治療するのに有用である。発明のシステムは、心原性ショック、心筋炎、または心筋症に罹患した患者を選定し、治療するのに有用である。発明のシステムは、心臓移植に失敗した、あるいは失敗しつつある患者の治療に用いられてもよい。本発明のシステムは、心臓移植のリストに載っている患者の治療に用いられてもよい。患者は、慢性心疾患または急性心疾患に罹患していてよい。心疾患を有するあらゆる患者は、細胞性心筋形成術を用いた診断および／または治療のための本発明のシステムの使用を検討されてよい。
【００２６】
本発明のシステムは、ヒトの治療に限定されず、家畜またはペットを含むあらゆる動物の治療に使用することができる。本発明のシステムは、マウス、ラット、イヌ、ブタ、ヒツジ、および霊長類（類人猿、チンパンジー、サルなど）にも使用してよい。本発明のシステムは、心疾患、特に心臓の収縮性の欠如を伴う疾患、虚血性心疾患、または心臓のリモデリングを引き起こす疾患に罹患した動物の治療を提供する。
【００２７】
患者は通常、治療する医師、看護士、医師助手、またはその他の医療専門家により、評価される。患者を細胞性心筋形成術を用いて治療するかどうかの決定は、治療する医師には明らかであろう任意の数の基準に基づいてよい。医療専門家に使用される基準は、患者の年齢、患者の状態、疾患の程度、疾患の種類、予後、患者のライフスタイル、身体検査、病歴、他の疾患（糖尿病、高コレステロール血症、不整脈など）、臨床的兆候（血圧、心拍数、脈拍など）、臨床症状（胸痛、息切れ、眩暈など）、医学的検査（心筋酵素、心エコー検査または他の画像検査、ＥＫＧ、負荷テスト、血管造影など）、患者の他の疾患、心臓パラメータ（駆出率、心拍出量、左室収縮末期指数（ＬＶＥＳＩ）、心拍出量など）、心エコー検査、ホルター心電図、ＭＲＩ、ＰＥＴ、尿検査などを含んでよい。例１は、細胞性心筋形成術を用いた「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」治療の対象となる患者を選定する際に使用してよいいくつかの基準を詳述している。治療する臨床医学者は、これらの基準を評価し、患者が本発明のシステムを使用した治療に適しているかどうかを判断する。特定の実施例では、患者がｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）療法としての細胞性心筋形成術の候補であるかどうか決定する際に、患者の心拍出量が判断される。
【００２８】
特定の実施例では、患者は虚血性心疾患を有する。特定の実施例では、患者はびまん性冠動脈疾患に罹患している。別の実施例では、患者は心筋梗塞に罹患したことがある。さらに別の実施例では、患者は血管形成術または冠動脈バイパス移植術などの侵襲的処置を受けたことがある。患者は、心筋梗塞またはその他の虚血性疾患のあとの心臓リモデリングを予防または減少させるための治療に選定される。特定の学説にとらわれることを望まないが、細胞移植は、死んだまたは損傷した心筋の修復または交換を促進してよい。患者は、心拍出量を増加させるための治療に選定されてよい。
【００２９】
特定の実施例では、細胞性心筋形成術は、他の治療と併用される。例えば、細胞性心筋形成術は、薬物療法と併用されてよい。特定の実施例では、細胞性心筋形成術は、選択的β-２アゴニストであるクレンブテロールの投与と併用される。別の実施例では、細胞性心筋形成術は、心移植と併用される。ただし、特定の実施例では、細胞性心筋形成術は、心移植以外の他の治療と併用される。細胞性心筋形成術は、左心室補助装置、バルーンポンプ、またはペースメーカーなどの心臓装置の使用と併せて用いられてよい。特定の実施例では、細胞性心筋形成術は、左心室補助装置と併用され、任意によりさらにクレンブテロールなどの薬物治療と併用される。患者が慢性心不全を再発せずに、安定した状態を保つのに十分なだけ正常な心機能が回復するまで、左心室補助装置の使用が継続される。回復およびさらなるサポートを伴うLVADの除去が予定される患者は、生活の質の改善、罹患率の低下、死亡率の低下、入院の減少、および／または再入院の必要性の低下につながる細胞性心筋形成術の利益を受けてよい。
【００３０】
特定の実施例では、ＬＶＡＤのサポートからの脱却を保障するのに十分なほど回復していない患者でも、細胞性心筋形成術の利益を受けることができる。ＬＶＡＤを除去せずにでも、細胞性心筋形成術により治療される患者は、入院、再入院、罹患率、および／または死亡率が減少し、心機能および生活の質の改善が見られる。そのため、これらの患者も細胞性心筋形成術の候補である。
【００３１】
特定の実施例では、細胞性心筋形成術による治療は、細胞の移植と、血管新生促進因子（血管新生促進因子をコードするベクター）の投与との双方が伴う。この治療は、米国特許出願第Ｕ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／６６６，９３２号、２００５年３月３１日申請、名称「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ」にさらに詳しく記載されているが、これは参照により本開示に含まれる。特定の学説にとらわれることを望まないが、細胞性心筋形成術を血管新生促進因子の投与と組み合わせることにより、移植される細胞は、細胞性心筋形成術単独での治療と比較して、より高い生存率を有することが仮定される。血管新生促進因子（１つまたは複数）による治療は、移植細胞を受け入れる心臓の虚血、障害、または損傷部分における新生血管の発現につながる。細胞性心筋形成術と組み合わされた結果は、移植された細胞のより生存および生着率につながってよい。
【００３２】
細胞性心筋形成術
患者が「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」としての細胞性心筋形成術を用いた治療に選定された場合は、その患者の心臓に細胞が移植される。細胞は、心機能を改善するために、心臓の疾患または損傷部分に移植される。本発明のシステムに有用な細胞には、患者の既存の心筋中で自ら増殖、生着することができる細胞が含まれる。本発明のシステムにおいて特に有用であると考えられる細胞には、筋芽細胞（骨格筋芽細胞など）、間葉系幹細胞、胎児心筋細胞、胚幹細胞、および骨髄肝細胞が含まれる。特定の実施例では、骨格筋芽細胞が本発明のシステムにおいて用いられる。本発明のシステムにおいて有用な骨格筋芽細胞についてのより詳しい説明は、米国特許出願第ＵＳＳＮ６０／１４５，８９４号、１９９９年７月２３日申請；ＵＳＳＮ０９／６２４，８８５号、２０００年７月２４日申請；およびＵＳＳＮ１０／１０５，０３５号、２００２年３月２１日申請（これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）を参照されたい。特定の実施例では、心筋細胞が本発明のシステムで用いられる（例として、米国特許第６，６７３，６０４号；６，４９１，９１２号；５，９１９，４４９号；公開米国特許出願第２００３／０２３２４３１号；２００３／００２２３６７；２００１／００５３３５４号参照。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。特定の実施例では、投与される細胞は、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％純粋な細胞集団である。別の実施例では、純粋な細胞集団が調製され、心臓への投与前に任意で別の細胞型と混合される。上述の出願に記載されるように、骨格筋芽細胞またはその他の細胞集団の純度は、筋生検材料から、一定の条件下で、５〜２０倍加、望ましくは１０〜１５倍加、あるいはさらに望ましくは１１〜１２倍加により細胞を培養することにより得られてよい（Ｊａｉｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−１９２７、２０００年を参照。参照により本開示に含まれる）。特定の実施例では、細胞は培養されない。別の実施例では、細胞は最小限に培養される。例えば細胞は、数分、数時間、または数日間、細胞培養皿に放置されたあと、非接着性細胞が除去される。特定の実施例では、細胞の全てまたはかなりの部分は、投与される前に細胞分裂していない。別の実施例では、細胞は１〜２倍加、３〜４倍加、４〜５倍加、または５〜１０倍加がおこなわれている。骨格筋芽細胞の純度は、細胞上のＣＤ５６マーカーまたはその他のマーカーの存在によりテストされてよい。別の実施例では、細胞は幹細胞（幹細胞胚幹細胞、胎児幹細胞、成人由来幹細胞など）である。投与される細胞は、望ましくは少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％生存であり、さらに望ましくは９０％または９５％生存である。
【００３３】
特定の実施例では、細胞は間葉系幹細胞、または間葉系幹細胞由来の細胞である。特定の実施例では、細胞は、幹細胞特性を獲得させるような方法で処理される。通常、細胞は未熟または未分化であり、移植後に筋細胞に分化させる。特定の実施例では、間葉系幹細胞は、患者の骨髄から得られる。間葉系幹細胞は、胎児心筋細胞などの心筋細胞と共培養されてよい。胎児心筋細胞との培養は、あらかじめ心筋細胞表現型へと分化した細胞を得るのに役立つ。特定の実施例では、幹細胞は心筋細胞と融合する。別の実施例では、この融合は回避される。特定の実施例では、細胞は全く培養されない、または上述のように最小限に培養される。
【００３４】
本発明のシステムで使用される細胞は、あらゆる供給源から得ることができる。しかしながら、細胞は通常、拒絶問題が起きないよう、患者から採取される（自己移植）。細胞は、例えば患者の筋肉から、骨髄から、血液から、患者の胎児臍帯血からなど、採取されてよい。自己移植以外に、細胞は血縁者、ＭＨＣ適合ドナー、同血液型のドナー、または同種のあらゆるドナーから得られてもよい。特定の実施例では、細胞の異種間提供が用いられる（異種間移植）。治療する医師には明らかであろうように、ドナー細胞が患者または血縁ドナーからのものでない場合、免疫抑制が要求されてよい。細胞は、免疫原性を低下させるために処理または修正されてもよい。例えば、細胞のＭＨＣクラスＩ分子は、その免疫原性を制限するためにマスクされても、または修正されてもよい。
【００３５】
一般的に、集団が本発明により有用となるために、集団の中の細胞の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％は生存であるべきである（トリパンブルー排除などの方法により判断される）。通常、投与直前の細胞生存率は、９０％、９５％、または９８％を超える。投与される細胞数の範囲は、１×１０４〜１×１０１０細胞、または１×１０５〜１×１０９細胞、または１×１０６〜１×１０８細胞、または１×１０６〜１×１０１０細胞、または１×１０７〜１×１０８細胞、または１×１０８〜１×１０９細胞であってよい。細胞は１つの部位にあるいは複数の部位に注射されてよい（３〜３０部位など）。通常、１回の注射で１千万の細胞が投与される。投与される細胞の合計数は、損傷心臓組織の範囲による。細胞は通常、心筋の心内膜と心外膜の間の１〜５ｃｍの距離にわたって注射される。
【００３６】
本発明に使用される細胞は、遺伝子操作されていてもよい。細胞は、当技術分野で知られるいかなる方法を用いて操作されてもよい。例えば、細胞のゲノムは永久的に改変されてよく、あるいは細胞は一時的にのみ遺伝子を発現するように改変されてもよい。特定の実施例では、細胞は、米国出願第ＵＳＳＮ６０／６６６，９３２号、２００５年３月３１日申請、名称「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｆｏｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ」に記載されているように、血管新生促進ペプチドまたはタンパク質を産生するよう遺伝子操作されている。特定の実施例では、少なくとも１つの血管新生促進因子を発現するよう操作された細胞の移植は、血管新生促進剤の投与および細胞の移植の双方を構成する。血管新生ペプチド／タンパク質は、移植された細胞で構成的に発現されてよく、あるいは特定の刺激により発現されてもよい。遺伝子発現を制御してよい特定の刺激には、低酸素症、栄養不良，成長因子の存在、ｐＨの変化、老廃物の蓄積、細胞ストレスなどが含まれる。特定の実施例では、移植された本発明の細胞は、抗アポトーシス遺伝子を発現してよい。別の実施例では、細胞は、成長因子（塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）など）などの増殖を高めるための遺伝子を発現する、または発現するよう誘発されることが可能である。別の実施例では、心臓細胞表現型は、細胞中の心臓細胞遺伝子産物の発現により、細胞中で促進される。例えばＧＡＴＡ転写（ＧＡＴＡ４、ＧＡＴＡ６など）は、心臓細胞表現型を促進するために、発現されてよい。
【００３７】
細胞は、当技術分野で知られる任意の方法で、損傷組織に供給される。細胞は、心臓手術中に供給されてよい。代替として、あるいは追加で、細胞はカテーテルを介して供給されてよい。細胞は通常、注射器と針を用いて損傷細胞に注射される。特定の実施例では、サイドポート針を用いて、細胞を組織に注射する（米国特許出願第ＵＳＳＮ６０／４０１，４４９号、２００２年８月６日申請、およびＵＳＳＮ１０／６３５，２１２号、米国第２００４／０１９１２２５号として公開、２００３年８月６日申請、を参照。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。
【００３８】
心臓の収縮する力のため、心筋の注射部位から流出する細胞数を制限する措置を講じることが望ましくてよい。例えば、注射部位に、針が除去されたあと数秒から数分間、圧力を付加することができる。代替として、または追加で、基質など粘度増強剤を、例えば注射前に細胞に混合された状態で使用してよい。基質は生体適合性ポリマー（セルロース、タンパク質、ポリエチレングリコール、ソルビトール、ポリ（乳酸−グリコール酸）など）、あるいはグリセロール、炭水化物など、その他の賦形剤であってよい。特定の実施例では、ポリマーは生分解性でもある。いくつかの実施例では、ポリマーは生物基質（タンパク質、ＥＣＭタンパク質など）である。いくつかの実施例では、ポリマーはバイオゲルである。特定の実施例では、基質はＣｙｍｅｔｒａである。別の特定の実施例では、基質は無細胞化真皮基質であり、望ましくは無細胞化真皮基質である。基質は、基底膜基質であってもよい。特定の実施例では、基質に血管新生促進因子が添加されてよい。基質は、血管形成促進因子の遅延放出（例えば、経時的におよび／または信号または環境刺激に反応して）を可能にするために選択することができる。別の実施例では、注射された細胞の流出を防ぐために、注射部位上にプラグ（ポリマープラグなど）または帯具（縫合糸など）を適用してよい。
【００３９】
本発明の方法は、治療する医師による判断で繰り返されてよい。方法の一定のステップは繰り返されてよい。例えば、血管新生促進因子は繰り返し投与されてよく、あるいは細胞は繰り返し移植されてよく、またはその両方でもよい。患者の疾患および状態は、反復療法が必要とされる程度を判断する際に利用してよい。上述のように、本発明の方法は、血管形成術、冠動脈バイパス移植、左心室補助装置、薬物療法、ステント留置、心臓移植など、さらに従来の治療と併用してよい。
【００４０】
本発明のシステムは、患者の心機能を改善し、心機能を安定させ、および／または心機能の低下を制限するよう意図されている。特定の実施例では、本発明のシステムは、心機能を駆出率、心拍出量、心拍出量、血圧などを含む任意の数のパラメータによる測定で、１％、２％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、または５００％改善させてよい。これらのパラメータは、心エコー検査、ＭＲＩ、カテーテル検査、ＥＫＧ、血液測定用カフ、パルス酸素濃度計などにより測定されてよい。特定の実施例では、心機能の改善は、運動負荷試験により測定されてよい。特定の実施例では、本発明のシステムは、特に心臓の虚血性損傷後の、心臓の拡張および／または衰弱を予防する。特定の実施例では、本発明のシステムは、左室収縮末期指数を５０ｍＬ／ｍ２を超えて、６０ｍＬ／ｍ２を超えて、または７０ｍＬ／ｍ２を超えて維持する。特定の実施例では、左室拡張は低下または安定化される。特定の実施例では、中隔乳頭短軸の長さが短縮される。特定の実施例では、本発明のシステムは、心臓移植などの他の治療が実施される前に、患者を安定させるために用いられる。望ましくは、患者の「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」治療は、患者がＭＩなどの心イベントの前に従っていたライフスタイルで生活することを可能とする結果をもたらす。例えば、患者は、心イベントの前と同じ距離を歩くことができ、同じ量の運動をおこなうことができる。特定の実施例では、患者は、入院、バイパス手術、血管形成術、ステント留置、または心移植をもはや必要としない。特定の実施例では、患者の死亡率は低下する。
【００４１】
本発明のシステムは、他の治療様式と併用される。これらの他の治療には、薬物治療（例えば、血圧薬物治療、カルシウムチャンネル遮断剤、ジキタリス、不整脈治療剤、ＡＣＥ阻害剤、抗凝血剤、免疫抑制剤、鎮痛剤、血管拡張剤など）、血管形成術、ステント留置、冠動脈バイパス移植、心臓補助装置（左心室補助装置、バルーンポンプなど）、ペースメーカー設置、心臓移植などが含まれる。特定の実施例では、本発明のシステムは、心臓移植を受けるのを待っている患者に、回復への橋渡しを提供する。
【００４２】
キット
本発明は、本発明のシステムの実践に有用なキットも提供する。キットは通常、発明の実践に有用な機器、器材、医薬品、生物製剤、試薬、医療装置、細胞などの任意の組み合わせを含む。キットの内容は、治療する医師、看護士、またはその他の医療関係者が使用するのに便利なように包装されている。キットの中の材料も、滅菌状態で包装されている。特定の実施例では、キットは、細胞、注射器、カテーテル、針（サイドポート針など）、媒体、緩衝剤、血管新生因子、血管新生因子発現のためのベクター（ＶＥＧＦ、またはその他の上述のあらゆる因子など）、アデノウイルスベクター、保存容器、バイアル、麻酔剤、消毒剤、使用説明書、ポリヌクレオチド、帯具、細胞を供給するための医薬的に許容される賦形剤、組織培養皿、酵素、抗体などのうちいくつか、または全てを含んでよい。
【００４３】
特定の実施例では、キットは、「ｂｒｉｄｇｅ  ｔｏ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ（回復への橋渡し）」としての、細胞性心筋形成術による治療の対象となる患者を選定するために提供される。キットは、血液検査、尿検査などを含むさまざまなテストを実施するための試薬および用具を含んでよい。キットは、患者を選定するためのソフトウェアまたは説明書を含んでよい。キットは、患者が治療に選定された場合、患者を治療するための素材も含んでよい。
【００４４】
特定の実施例では、キットは、患者から骨格筋芽細胞を採取し、細胞を精製し、細胞を増殖させるために提供される。かかるキットは、針、注射器、緩衝剤、細胞培養培地、血清、保存媒体、グリセロール、細胞培養皿、取扱説明書、およびその組み合わせのいずれかを含んでもよい。キットは、細胞を精製するための素材も含んでよい。キットは、得られた集団の純度を検出するための素材（細胞マーカーに対する抗体など）も含んでよい。
【００４５】
別の実施例では、キットは治療方法を実践するために提供される。キットは、針、カテーテル、注射器、血管新生因子、血管新生因子発現のためのベクター、細胞を注射するための医薬的に許容される賦形剤、取扱説明書、およびその組み合わせのいずれかを含んでよい。特定の実施例では、キットは、ＶＥＧＦなどの精製された血管新生因子を含む。因子は、凍結乾燥粉末として提供されてよい。
【００４６】
本発明は、上述とおりキットに含まれてよい他の素材および試薬も提供する。例えば発明は、本発明で有用なベクターおよびポリヌクレオチドを提供する。特定の実施例では、ベクターは遺伝子操作されたアデノウイルスである。一部の特定の実施例では、ベクターは、感染した細胞におけるＶＥＧＦの発現をもたらす遺伝子操作されたアデノウイルスである。ベクターは、血管新生因子の発現を制御するための制御配列を含んでもよい。例えば、血管新生因子の発現は、酸素欠乏、ｐＨの変化、老廃物の蓄積などを誘発されてよい。ベクターはベクターを複製および選択するための配列を含んでもよい。
【００４７】
本発明は、本発明のシステムのための細胞も提供する。通常これらの細胞は、筋芽細胞（骨格筋芽細胞など）、胎児心筋細胞、胚幹細胞、および骨髄肝細胞である。特定の望ましい実施例では、細胞は骨格筋芽細胞である。細胞は、遺伝子操作されていてよい。特に細胞は、血管新生因子を発現するよう遺伝子操作されていてよい。別の場合、細胞は抗アポトーシス遺伝子を発現し、細胞がアポトーシスを起こすのを防いでよい。特定の実施例では、細胞は他の細胞から離して、または通常細胞とともに見られる他の成分から離して精製されてよい。
【００４８】
本発明のこれらおよびその他の側面は、以下の例を検討することによりさらに理解されるであろう。これらの例は、本発明の一部の特定の実施例を例示することを目的とし、請求項に定義される要旨を制限することを意図しない。
【実施例】
【００４９】
実施例１−自己骨格筋芽細胞生存と拡張型虚血性心不全における左室リモデリングの変化との相関
序論
自己骨格筋芽細胞（ＡＳＭ）移植または心筋形成術は、複数の実験的研究において、心筋梗塞（ＭＩ）後の心機能を改善することが示されてきた（Ｃｈｉｕら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐｌａｓｔｙ：ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓａｔｅｌｌｉｔｅ  ｃｅｌｌ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒ．Ｓｕｒｇ．６０：１２−１８、１９９５年；Ｌｉら、「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｈｅａｒｔ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒ．Ｓｕｒｇ．６２：６５４−６１、１９９６年；Ｍｕｒｒｙら、「Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ」、Ｊ  Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８：２５１２−２３、１９９６年；Ｓｃｏｒｓｉｎら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｃａｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｔｈｏｒ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１９：１１６９−７５、２０００年；Ｔａｍｂａｒａら、「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｃａｎ  ｆｕｌｌｙ  ｒｅｐｌａｃｅ  ｔｈｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｗｈｅｎ  ｔｈｅｙ  ｓｕｒｖｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−２５９−６３、２００３年；Ｔａｙｌｏｒら、「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４（８）：９２９−３３、１９９８年；Ｊａｉｎら、「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−１９２７、２０００年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。研究の大部分は、ＭＩの小動物モデルにおいて実施されてきたが、大型動物モデルにおいても（Ｇｈｏｓｔｉｎｅら、「Ｌｏｎｇ−  ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ１３１−６、２００２年。参照により本開示に含まれる）、また最初の患者試験においても、（Ｍｅｎａｓｃｈｅら、「Ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：２７９−８０、２００１年；Ｍｅｎａｓｃｈｅら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１：１０７８−８３、２００３年；Ｐａｇａｎｉら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｄａｍａｇｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１：８７９−８８８、２００３年；Ｐｏｕｚｅｔら、「Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７１：８４４−８５１、２００１年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）同様の改善が示されている。かかる機能の前向きの変化の背後にある機序は、成長する生着した骨格筋芽細が、その宿主心筋から電気機械的に分離されている（コネキシン４３および／またはギャップ結合がみられないことから証明される）ことを考えると、依然としてあまり理解されていない（Ｓｃｏｒｓｉｎら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｃａｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｔｈｏｒ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１１９：１１６９−７５、２０００年；Ｇｈｏｓｔｉｎｅら、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ１３１−６、２００２年；Ｍｅｎａｓｃｈｅら、「Ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：２７９−８０、２００１年；Ｍｅｎａｓｃｈｅら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１：１０７８−８３、２００３年；Ｐｏｕｚｅｔら、「Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７１：８４４−８５１、２００１年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。さらに、臨床的ＡＳＭ心筋形成術は、重度の虚血性心筋症にのみ適用されてきており、またさらに重要なことに、これは常に冠血行再建術および／または左心室補助装置（ＬＶＡＤ）の補助として実施されてきた（Ｐａｇａｎｉら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｔｒａｎｓｐ��ａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｄａｍａｇｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ」、Ｊ  Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．４１：８７９−８８８、２００３年。参照により本開示に含まれる）。これらの併用療法により、心筋灌流、生存、および機能指数の改善は、ＡＳＭ注射のみによるものとすることは難しい。
【００５０】
さらに、増加する実験的証拠は、移植されたＡＳＭ細胞の数と機能的／形態的影響が直接関連していることを示唆している（Ｔａｍｂａｒａら、「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｃａｎ  ｆｏｌｌｙ  ｒｅｐｌａｃｅ  ｔｈｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｗｈｅｎ  ｔｈｅｙ  ｓｕｒｖｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−２５９−６３，２００３；Ｐｏｕｚｅｔら、「Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７１：８４４−８５１、２００１年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。例えば、Ｔａｍｂａｒａら（「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｃａｎ  ｆｏｌｌｙ  ｒｅｐｌａｃｅ  ｔｈｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｗｈｅｎ  ｔｈｅｙ  ｓｕｒｖｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−２５９−６３、２００３年。参照により本開示に含まれる）は、ラットに胎児由来ＡＳＭを使用し、心機能とリモデリングがともに用量依存的な形で影響されたことを実証している。しかしこれらの利益は、上昇した壁応力と変更された心筋の機械的エネルギー特性がＡＳＭ生存、分化、そして最終的には機能的有効性に障害を生じさせる虚血性拡張型ＨＦでは実証されていない。そのため、本研究の目的は、末期虚血性ＨＦの動物モデル（ＬＶＥＦ＜３５％およびＬＶ収縮末期容量＞８０ｍｌ／ｍ２）へのＡＳＭ移植後のＬＶリモデリングおよび機能を評価することであった。さらに研究は、これら同動物に注射されたＡＳＭの生存、分化、および整列を評価することも意図した。
【００５１】
素材と方法
虚血性心不全モデル
実験的虚血性心不全は、Ｓａｂｂａｈら（「Ａ  ｃａｎｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｍｉｃｒｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６０：Ｈ１３７９−８４、１９９１年。参照により本開示に含まれる）がイヌについて記載しているように、微細な変更を加えてヒツジにおいて作成された。端的に説明すると、連続および選択的な左冠動脈回旋枝（ＬＣｘＡ）微少塞栓術（１動物当り２．９±０．４注射）が、ポリスチレンビーズ（７０−１１０μｍ）を週ごとに、左室駆出率（ＬＶＥＦ）が２週連続して３５％以下に維持されるまで注射することにより実施された。
【００５２】
実験群
ヒツジのＨＦ対照群（ベースライン）は、ＬＣｘＡ微少塞栓術およびＨＦ誘発の２週間前に準備された（ＨＦ対照、Ｎ＝６）。ヒツジの移植群は、準備およびＡＳＭの注射の前にＬＣｘＡ微少塞栓術およびＨＦ誘発がおこなわれた（ＨＦ＋ＡＳＭ、Ｎ＝５）。研究は、覚醒した鎮静剤を与えられていない動物に対し、週ごとに６週間実施された。
【００５３】
長期準備
全てのヒツジは、左開胸により準備された。左室（ＬＶ）ソリッドステート電子圧力トランスデューサ（４．０または４．５ｍｍ、Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇ、カリフォルニア州）がＬＶの心尖に設置され、大動脈、ＬＶ、および右室（ＲＶ）圧を監視するために、長期、ヘパリン化（ｌ０００Ｕ／ｍＬ）液充填カテーテル（Ｔｙｇｏｎ）が挿入された。６つの圧電性結晶（Ｓｏｎｏｍｅｔｒｉｃｓ  Ｉｎｃ．、カナダ、オンタリオ州ニューロンドン）が、ＬＶ心内膜の中隔乳頭レベル（短軸、ＳＡ）、ＬＶ基部、および心尖（長軸、ＬＡ）、またＬＶ後外側の心筋中央（セグメント長、ＳＬｐｏｓｔ）に外科的に設置された。１６ｍｍオクルーダ（Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｍｅｔｒｉｃｓ．、カリフォルニア州ヒールズバーグ）は、下大静脈（ＩＶＣ）周囲に位置づけられた。全てのカテーテルおよびケーブルは動物の肩甲骨の間に位置するよう通された。
【００５４】
血行動態計測および圧容積解析
大動脈、ＲＶ、およびＬＶ液体充填カテーテルは、較正されたＳｔａｔｈａｍ圧力トランスデューサ（型：Ｐ２３ＸＬ；Ｂｉｇｇｏ−Ｓｐｅｃｔｒａｍｅｄ、カリフォルニア州オックナード）に取り付けられ、増幅された（Ｇｏｕｌｄ、オハイオ州バレー）。電子ＬＶ圧力計は、ＬＶ液体充填カテーテルを使用して較正された。圧力波形を収集し（１ｋＨｚで）、１６チャンネルのデータ収集およびソフトウェアシステム（ＩＯＸ；ＥＭＫＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、バージニア州フォールズチャーチ）で解析された。
【００５５】
ソノメトリック信号は、波形の心周期依存（拡張末期および収縮末期）および独立（最低、最高、平均など）パラメータについて解析された。左室容積（ｍｌ）は、ＳＡおよびＬＡ径、および方程式：ＳＡ２＊ＬＡ＊π／６）／１０００、を用いてリアルタイムで計算された。左室容積指数も計算された：ＬＶ容積＊体表面積（ｍｌ／ｍ２）。下大静脈閉塞は、解析ソフトウェア（ＩＯＸ、ＥＭＫＡ）によりオフラインで解析されるＰＶ関係を発生させるために実施された。
【００５６】
左室仕事量は、圧容積面積（ＰＶＡ）を計算することにより、推定された（Ｔｏｄａｋａら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｍｉｃｒｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７２：Ｈ１８６−９４、１９９７年；Ｓｕｇａ、「Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ」、Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．７０：２４７−７７、１９９０年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。
ＰＶＡは、オフラインのＥＳＰＶＲ由来データから、ＬＶの位置エネルギー（ＰＥＬＶ）および一回仕事量（ＳＷＬＶ）として計算された。
ＰＥＬＶ＝（１／２［Ｖ０−ＬＶＥＳＶ］×ＬＶＥＳＰ）
ＰＶＡ＝ＳＷＬＶ＋ＰＥＬＶ
Ｖ０：圧力ゼロでのＬＶの容積（Ｅｅｓのｘ切片）、ＬＶＥＳＶ：ＬＶ収縮末期容量（ｍＬ）、およびＬＶＥＳＰ：ＬＶ収縮末期圧
骨格筋生検材料および自己骨格筋芽細胞培養
骨格筋生検材料（１〜３グラム）は、ＨＦ＋ＡＳＭヒツジへの最初微少塞栓術時にヒツジの左前肢から採取された。前肢筋肉が露出され、生検材料が、電気メスを避けて鋭的切開で取り出され、生検材料輸送培地を含む管に入れられ、Ｊａｉｎらにより記載されるもの（Ｊａｉｎら、「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−１９２７、２０００年。参照により本開示に含まれる）と同様のＡＳＭの調製と培養のため、ＧｅｎＶｅｃ，Ｉｎｃ（マサチューセッツ州チャールズタウン）に輸送された。
【００５７】
全細胞は、移植前に１１〜１２倍加のあいだ拡張され、低温保存される。筋芽細胞は解凍され、移植媒体に調製され、直接心筋に注射するために輸送された。筋芽細胞の純度は、抗ＮＣＡＭｍＡｂ（ＣＤ５６−ＰＥ、Ｃｌｏｎｅ  ＭＹ−３１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州、サンディエゴ）に対する反応性により、また多核筋管への融合力により測定された。細胞生存率は、トリパンブルー排除により判断された。筋芽細胞は、ツベルクリン注射器（〜１．０×１０８細胞／ｍＬ）に装填され、４°Ｃで輸送された。移植時、細胞は徐々に室温にあたためられ、緩やかな攪拌により再懸濁され、それ以上操作せずに注射された。自己骨格筋芽細胞は、分節性のソノマイクロメトリ結晶近接の、梗塞を起こした心筋の複数の部位に注射された。不慮の血管内または心室内への細胞の注入を回避するために、注射針は心外膜および心内膜表面から等距離の心筋中央へと３〜４ｃｍの距離にわたり通過させ、注射器に陰圧が付加され、血液が戻ってこなければ、針をゆっくりと引きながら細胞が注入された。注射後、針出口部の上に、数秒間わずかな圧力を付加し、細胞が針跡から流出するのを制限した。
【００５８】
組織学的検査
研究の６週間後、各動物を安楽死させ、心臓を摘出して１０％緩衝ホルマリンで灌流した。ＡＳＭ注射を受ける塞栓心筋から組織片が作られた。標準方法を用いて、ヘマトキシリン、エオシン、およびトリクロム染色が実施された。
【００５９】
免疫組織化学的検査
成熟した移植片の表現型を確認するために、脱パラフィンされた切片が、心筋と反応しない抗ミオシン重鎖抗体、アルカリフォスファターゼ結合ＭＹ−３２ｍＡｂ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）により免疫組織化学的に染色された。切片は、ＢＣＩＰ−ＮＢＴ（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンフランシスコ）で発色させ、核の赤と対比染色された。さらに、コネキシン−４３Ａｂ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）および心筋特異的なトロポニンＩ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）の染色もおこなわれた。
【００６０】
筋芽細胞生存の推定
心臓は、寸法約２．５ｃｍ×２．５ｃｍ×３ｍｍの断片に切り取られ、パラフィンで処理された。いくつかの例では断片全体が切断され（５μｍ厚）、別の例では組織の一部のみが切断された。定量的に細胞を数えるために、続いて組織切片に、骨特異的なミオシン重鎖（ＭＹ−３２）の免疫染色をおこなった。６週間での細胞生存率は、ミオシン重鎖発現の開始（Ｈａｖｅｎｉｔｈら、「Ｍｕｓｃｌｅ  ｆｉｂｅｒ  ｔｙｐｉｎｇ  ｉｎ  ｒｏｕｔｉｎｅｌｙ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ  ｗｉｔｈ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．  ９３：４９７、１９９０年。参照により本開示に含まれる）、骨格筋細胞と一致する細胞構築構成、および末梢に位置する正常な外見の核の存在に基づいて推測された。典型的な組織切片とコンピュータによる画像解析を用いて、生着範囲が計算され、トリクロムに染色された切片で別個に計算した核密度により、生着した核の数に換算された。各組織片における生存筋芽細胞核の合計数は、以下の方程式を使って推定された。
【００６１】
切片移植面積合計×移植面積当り核密度×断片当り切片数＊×Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ補正
（Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ、「Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎｔ．  Ｒｅｃ．  ９４：２３９−４７、１９４６年。参照により本開示に含まれる）
＊断片厚およそ３ｍｍ、切片厚およそ５μｍに基づいた、断片当りの切片の推定数。
【００６２】
統計的分析
データは、平均±標準誤差（ＳＥＭ）として提示された。６週間のＨＦ研究期間におけるＬＶの血行動態、形態的、および機能的データの、経時的および群間の差は、反復測定による多因子（二元配置）分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて検討された（因子：群および時間）。ＨＦ対照では、ベースラインとＨＦとの時点の差は、反復測定による一元配置ＡＮＯＶＡ試験を用いて規定された。Ｆ比が臨界値（アルファ＜０．０５）を超える場合、ポストホックＳｔｕｄｅｎｔ−Ｎｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ法を用いて、一対比較が実施された。ＨＦ第１週におけるＨＦ＋ＡＳＭデータは、ｔ検定を用いてベースラインと比較された。
【００６３】
ＰＶ関係の独立した回帰分析は、解析ソフトウェア（ＩＯＸ、ＥＭＫＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により計算された。ＨＦ＋ＡＳＭとＨＦ対照のＰＶ関係の同一性は、定性的（群）および相互作用的条件の両方を考慮して、重回帰により検討された。つまり回帰関数の勾配と交差の差を同時にテストした。線形回帰分析も実施され、ＬＶリモデリングと機能の指数の関係を、ＨＦ対照（Ｎ＝１１）を含む生存しているＡＳＭ由来筋細胞の数と対比して検討した。
【００６４】
ＨＦをＥＳＶＩ上昇とＬＶＥＦ低下の両方、２つの変数から成る帰無仮説として規定する際、複数の比較のためのボンフェローニ法が、適切な信頼度で使用された：アルファ＜０．０２５。Ｐ値を判断および考慮し、比較の有意性と重要性を指定した。
【００６５】
結果
ＨＦの確立後、１１頭のヒツジは、ＡＳＭ注射有り（ＨＦ＋ＡＳＭ、Ｎ＝５）、また無し（ＨＦ対照、Ｎ＝６）で、６週間検討された。ＨＦ＋ＡＳＭ群用の８頭のうち３頭のヒツジは、準備処置中のＡＳＭ注射前（Ｎ＝２）あるいは注射後７２時間以内に死亡し、研究には含まれなかった。ＨＦ対照のヒツジはいずれも初期に死亡しなかった。動物は、研究期間の６週間にわたり食欲と体重を維持した。ヒツジは、ＨＦ誘発後活性が低下し、軽度の労作で呼吸困難となったが、毎日の観察では、群間で違いは認められなかった。
【００６６】
組織学的検査
注射された筋芽細胞の平均数は、３．４４±０．４９×１０８細胞であり、１．５３から４．３×１０８細胞の範囲であった。筋芽細胞の純度９２±１．４％、および細胞生存率９３±１．２％は、輸送時に評価され、筋芽細胞生存率は、輸送（４°Ｃ）後に＞９０％であることが確認された（トリパンブルー排除を使用）。ＡＳＭ由来骨格筋筋線維は、注射された心臓全てに見られたが、第６週に生存していた注射された筋芽細胞の相対生存率（考察参照）は、１４０，０００細胞（０．０５％生存）〜３，３００万細胞（１０．７％生存）であった。
【００６７】
典型的な組織学切片は、詳しい説明とともに図１および２に示されている。一般的に、骨格筋細胞は他の骨格筋繊維と整列して、また残存心筋細胞とも整列している（図１Ｃ−Ｆ；図２Ａ、Ｂ）。生着した骨格筋繊維は、重鎖速筋イソフォームを染色することに特徴付けられた（紫に染色、図１Ｂ、Ｄ、Ｆ、および２Ｂ）。しかしながら、生存している心筋細胞との緊密な並列にもかかわらず、どの切片にも、トロポニンＩまたはコネキシン−４３に染色されたＡＳＭ由来筋原線維は見られなかった（それぞれ図２ＣおよびＤ）。
【００６８】
心血行動態
血行動態データは、表１にまとめられている。研究は、ＬＶＥＦの５０％変化を検出するよう、適度に強化された（β≦０．２０）が、ＡＳＭ注射後、どの動物にもｄＰ／ｄＴｍａｘおよびＬＶＥＦの改善はなかった。生存細胞の数とＬＶＥＦ（Ｒ２＝０．０００１７、ｐ＝０．９９）、またはｄＰ／ｄＴｍａｘ（Ｒ２＝０．０４８、ｐ＝０．５４３）との間に直線関係は見られなかった。
【００６９】
【表１−１】
2008540536.tif 000003
【００７０】
【表１−２】
2008540536.tif 000004
ｄＰ／ｄＴ：圧力の導関数、ＨＲ：心拍数、ＬＶＳＰ：ＬＶ収縮期圧、ＬＶＥＤＰ：ＬＶ拡張末期圧、ＥＳＶＩおよびＥＤＶＩ：ＬＶ収縮末期および拡張期容積指数、Ｔａｕ：弛緩時定数（Ｗｅｉｓｓ法）。Ｍｗ：前負荷動員一回仕事量；Ｅｅｓ：収縮末期圧容積関係；Ｖｏ：Ｅｅｓのｘ−切片；Ｖｗ：Ｍｗのｘ−切片；ＰＥ：ＬＶ位置エネルギー；ＳＷ：ＬＶ一回仕事量
圧容積解析  （ＰＶ解析）
ＨＦ対照およびＨＦ＋ＡＳＭヒツジからのＥＳＰＶＲ、ＰＲＳＷ、および仕事量のデータ（ＰＶＡ）は、表１にまとめられ、図３に例示されている。ＰＶ解析は、両群のＨＦヒツジで、ベースラインからのＰＲＳＷ勾配（Ｍｗ）および心収縮性の負荷非依存指数（Ｅｅｓ）の低下を示した。群間の共分散を明らかにするさらなる複数の線形回帰分析も、容積修正ＰＶ関係の勾配（ＷＫｌ：ｐ＝０．６１４、ＷＫ６：ｐ＝０．５１９、ｐｏｗｅｒ＝１）または切片（ＷＫｌ：ｐ＝０．９４５、ＷＫ６：ｐ＝０．９２８、ｐｏｗｅｒ＝１）の群間での有意差は、どの時点でも見られなかったことを示した。生存細胞の数とＥｅｓ（Ｒ２＝０．０８８、ｐ＝０．４３６）またはＭｗ（Ｒ２＝０．０１８、ｐ＝０．７３１）との間に直線関係は見られなかった。
【００７１】
ＨＦ対照に関して、第１週から第６週までのＥｅｓのＶ０（ｘ切片）に増加（右方向の移行、ｐ＝０．０２６）があった（図３）。反対にＨＦ＋ＡＳＭヒツジに関しては、Ｖ０は、ＨＦ＋ＡＳＭ動物では６週間にわたり減少傾向（ｐ＝０．２０）（左方移行）にあり、第６週にＨＦ対照とＨＦ＋ＡＳＭとの間に差が指摘され（ｐ＝０．０１４）、ＡＳＭ注射がＬＶリモデリングを減衰したことを立証した。結果として、またＨＦ対照において心筋効率の多大な喪失を示唆するように、ＰＥは、ＨＦ対照において第１週から第６週までに増加したが（ｐ＝０．０２８）、総仕事量（ＰＶＡ）は６週間の研究にわたり、群間で差が認められなかった。Ｖ０と同様に、ＰＲＳＷ（Ｖｗ）のｘ切片は、第１週から第６週までに、ＨＦ対照群（ｐ＝０．０３）で増加し、第６週ではＨＦ＋ＡＳＭ群と比較して異なったままであった（ｐ＝０．００９）（表１および図３）。
【００７２】
ソノマイクロメトリおよび左室の分節性機能
左室の局所性および分節性データは、表２に提示されている。ＳＬｐｏｓｔは、第１週から各群で差はなかったが、ＨＦ対照群のベースラインからは増加した（ＨＦ第１週において、ｐ＜０．０５）。左室の分節性運動異常は微少塞栓術後に現れ、そのため収縮期隆起（ＳＢ）と収縮後短縮（ＰＳＳ）は、ともに６週間の研究を通して明白であった。
【００７３】
【表２】
2008540536.tif 000005
ＥＳ：収縮末期、ＳＡ：ＬＶ短軸、ＬＡ：ＬＶ長軸、ＳＬｐｏｓｔ：後部ＬＶ切片（微小塞栓術）、％ｓｈｒｔ：％収縮期短縮、ＳＢ：収縮期隆起、ＰＳＳ：収縮後短縮。＊＊注：ＳＬｐｏｓｔ長さは、準備後の局所性の梗塞拡大によりベースラインとＨＦ対照とで異なるが、ＨＦ＋ＡＳＭでは、ＨＦ＋ＡＳＭ動物の準備が心不全後（梗塞拡大後）であったため、ベースラインと異ならない。そのため群間の相対比較は、第１週から第６週までである。
【００７４】
ソノマイクロメトリおよび左室径
左室収縮末期および拡張末期容積指数（ＥＳＶＩおよびＥＤＶＩそれぞれ）は、ＨＦ第１週において両群でベースラインから増加したが（ｐ＜０．０５）、第１週では群間で差はなかった（表１）。ＨＦ＋ＡＳＭでは、ＬＶ拡張は、ＨＦ対照（ｐ＝０．０１６）と比較して、第３週までに減衰され（ＥＳＶＩの％変化：それぞれ５．３±１．２％および１７．８±３．３％）、第６週までに向上した（ｐ＝０．００６）（図４）。有意な（ｐ＝０．００５）減衰により、ＬＶ容積の差が、ＳＡ拡張にのみ、また第３週までにはＨＦ＋ＡＳＭに生じた。ＬＡ拡張では、群間で差はなかった（Ｐ＞０．５）。ＥＳＶＩ、ＳＡ、およびＬＡのＡＳＭ生存との相関は、図４に示されている。
【００７５】
考察
過去の研究は、骨格筋芽細胞が、実験的心筋梗塞後の心機能とリモデリングの改善に貢献したと推定される生存骨格筋移植片を形成することを示唆している。既存の臨床的に有意で重度の虚血性機能障害およびリモデリングを有する心臓（ＬＶＥＦ＜３５％、ＬＶＥＳＶＩ＞８０ｍｌ／ｍ２）での、ＡＳＭの影響を調査した研究は、もしあったとしてもほとんどない。本研究は、冠血行再建術または他の支持療法に付随する交絡因子を伴わない、虚血性拡張型心不全の臨床的に適用されるモデルにおいて、ＡＳＭ心筋形成術の治療的有用性を確立する。
【００７６】
ＡＳＭ由来骨格筋は、６週間で、注射を受けた全てのヒツジに観察された。動物間での相対生存率の比較を可能とする、推定生存率をここに報告する。細胞生存率を計算するために使用される方法には、著しい限界があるため（Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅ、「Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎｔ．  Ｒｅｃ，  ９４：２３９−４７、１９４６年。参照により本開示に含まれる）、細胞生存率の数値は絶対的細胞生存であると解釈されるべきではない。本研究で認められた筋芽細胞の長期生存率（最高１０．７％生存）は、ＬＶＡＤ設置時に同様の数のＡＳＭ細胞を移植された患者について報告されているよりも高いものであった（＜１％生存）（Ｐａｇａｎｉら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｄａｍａｇｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１：８７９−８８８、２００３年。参照により本開示に含まれる）。他でも報告されているように（Ｓｃｏｒｓｉｎら、「Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆｅｔａｌ  ｃａｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ａｎｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｔｈｏｒ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．  ２０００；１１９：１１６９−７５；Ｊａｉｎら、「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−１９２７、２０００年；Ｇｈｏｓｔｉｎｅら、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ１３１−６、２００２年；Ｍｅｎａｓｃｈｅら、「Ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：２７９−８０、２００１年；Ｍｅｎａｓｃｈｅら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１：１０７８−８３、２００３年；Ｐａｇａｎｉら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｄａｍａｇｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１：８７９−８８８、２００３年；Ｐｏｕｚｅｔら、「Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．  ７１：８４４−８５１、２００１年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）、ＡＳＭ由来骨格筋においてコネキシン−４３染色は見られなかった。移植されたＡＳＭ由来骨格筋筋線維は、全ての切片において、互いに、また残存心筋原線維と整列した（図１および２）。このようなＡＳＭ由来繊維の編成された整列は、これらの繊維が、心筋内に見られる応力−ひずみ関係に影響を受けやすいことを示唆している（Ｋａｄａら、「Ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ  ｃｈａｎｇｅ  ｏｆ  ｃａｒｄｉｏｃｙｔｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｃｙｃｌｉｃ  ｓｔｒｅｔｃｈ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ：ｔｉｍｅ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｉｎｖｏｌｖｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ」、Ｊ  ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３１  ：２４７−５９、１９９９年；Ｐｆｅｆｆｅｒら、「Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８１：１１６１−７２、１９９０年；Ａｔｋｉｎｓら、「Ｉｎｔｒａｃａｒｄｉａｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｙｉｅｌｄｓ  ｔｗｏ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｔｒｉａｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｓｉｔｕ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．  ６７：１２４−９、１９９９年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。ＡＳＭ注射後の瘢痕の置換についての有意義な推定は、微少塞栓術後に存在した異質な梗塞パターンと、研究された動物が比較的少数であったことを考慮すると、不可能であった。しかしながら、高密度の心筋梗塞において、互いに整列して生存する細胞が一貫して観察され（図１）、頻度は高くないが生存心筋細胞の隣接に細胞が認められた（図２）。
【００７７】
比較的低い筋芽細胞の細胞生存率であっても（図１、１．１％細胞生存率の動物）、瘢痕心筋のかなりの範囲は、筋原線維の細胞融合と、それに続く増殖（未発表の観察結果では、筋芽細胞に対し、細胞核当りの筋原線維の断面積が約１０倍増加）の結果として、生存筋原線維で補うことができる。従って、低い細胞生存率であっても、心筋の損傷範囲を完全に補うことができる可能性がある。一般的に、注射された細胞の最大９５％は、注射後直ちに喪失する（Ｍｅｎａｓｃｈｅ、「Ｍｙｏｂｌａｓｔ−ｂａｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ８：２２１−２７、２００３年；Ｇｒｏｓｓｍａｎら、「Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」、Ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ  ５５：３９２−３９７、２００２年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。この早期喪失は、直接心筋内注射後のリンパおよび／または静脈の細胞排出により説明される（Ｇｒｏｓｓｍａｎら、「Ｉｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ」、Ｃａｔｈｅｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎｓ  ５５：３９２−３９７、２００２年。参照により本開示に含まれる）。他の因子も、心筋／瘢痕内に保持される細胞のさらなる喪失の原因となる可能性がある。最近の研究では、ＡＳＭのＶＥＧＦによる前処理（Ｒｅｔｕｅｒｔｏら、「Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐｒｅ−ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐｌａｓｔｙ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ｗｉｔｈ  ｆｅｔａｌ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．  １２７：１−１１、２００４年。参照により本開示に含まれる）、およびトランスフェクション（Ａｓｋａｒｉら、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ，ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｄｉｒｅｃｔ，ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ」、ＪＡＣＣ  ４３：１９０８−１４、２００４年。参照により本開示に含まれる）が、おそらく灌流と栄養供給を促進したことにより、心機能を改善したことを示している。さらに、炎症および／またはアポトーシスをともに制限する戦略も、細胞性心筋形成術後の効果を向上させるのに有益であると証明されている（Ｚｈａｎｇら、「Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｆｏｒ  ｃａｒｄｉａｃ  ｒｅｐａｉｒ：ｇｒａｆｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ａｎｄ  ａｎｔｉ−ｄｅａｔｈ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ」、Ｊ  ＭｏＩ．Ｃｅｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ３３：９０７−２１、２００１年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。注射から６週間後の移植部位における極度の炎症の形跡は観察されなかった（図１および２）。
【００７８】
左室機能
表１および２の、ＡＳＭ注射後の心機能を評価するデータは、このモデルの末期拡張型虚血性ＨＦを有するヒツジにおいて、いかなる血行動態パラメータまたは心収縮性指標の改善も示唆しなかった。過去に発表されたヒツジにおける結果とのこの不一致は（Ｇｈｏｓｔｉｎｅら、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ１３１−６、２００２年。参照により本開示に含まれる）、本研究のヒツジのＬＶ構造および機能がより劣るためと思われる。Ｇｈｏｓｔｉｎｅらの局所的心機能の改善は、病態がより軽度であり、そのため、もし存在するとすればＡＳＭ収縮への妨害がより少なかった結果と思われる。
【００７９】
ＬＶ機能（ＬＶＥＦ）により層別化したラットにおいて、注射された細胞の数とＬＶ指標との有意な相関（最も重度に障害のあるものが、最も大きな利益を受けた）を示したＰｏｕｚｅｔら（Ｐｏｕｚｅｔら、「Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．  ７１  ：８４４−８５１、２００１年。参照により本開示に含まれる）とは違い、本研究では、生存しているＡＳＭ由来筋細胞の数と比較し、かかる関係を示すことができなかった。注射された細胞の数と生存している割合を比較することの明らかな違いを除いて、この違いは、筋芽細胞の培養、増殖の違い、または単に細胞の投与量の不足により説明できるであろうか。ＰｏｕｚｅｔらおよびＧｈｏｓｔｉｎｅらは、注射時の筋芽細胞純度を５０％未満と提示しているが、我々はより純粋な筋芽細胞集団を増殖した（＞９０％ＣＤ５６陽性）。筋芽細胞注射懸濁液の純度は、結果に影響し得るであろうか。もしそれが可能だとしても、より高い純度の筋芽細胞が、機能的利益を低下させるとは考えにくい。さらに、本研究とその他の公開されている動物実験（Ｇｈｏｓｔｉｎｅら、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ１３１−６、２００２年；Ｍｅｎａｓｃｈｅら、「Ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ」、Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：２７９−８０、２００１年；Ｍｅｎａｓｃｈｅら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｓｅｖｅｒｅ  ｐｏｓｔｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１：１０７８−８３、２００３年；Ｐａｇａｎｉら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−  ｄａｍａｇｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ」、Ｊ  Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１：８７９−８８８、２００３年；Ｐｏｕｚｅｔら、「Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．  ７１：８４４−８５１、２００１年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）とにおけるＬＶ病態の多様性を考慮すると、細胞培養および増殖手法の影響を理解することは難しい。
【００８０】
本研究で実証できる直接の機能的利益が認められなかったことは、単回の虚血性発作（クライオインファークション（ｃｒｙｏｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ）（Ｔａｙｌｏｒら、「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ４（８）：９２９−３３、１９９８年。参照により本開示に含まれる）、結紮（Ｊａｉｎら、「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−１９２７、２０００年。参照により本開示に含まれる）、コイル塞栓術（Ｇｈｏｓｔｉｎｅら、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ１３１−６、２００２年。参照により本開示に含まれる））を用いた動物モデルと比較して、本研究のＨＦモデル（数週間にわたる複数の微小梗塞）が、ＬＶ機能障害の慢性的性質と重症性を有したことに関連する可能性がある。微少塞栓術モデルは、ＡＳＭ注射後に陳旧性心筋が関与することを避け、意図的に、陳旧性心筋の代償機序をより効果的に研究していると思われる（Ｓａｂｂａｈら、「Ａ  ｃａｎｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｍｉｃｒｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６０：Ｈ１３７９−８４、１９９１。参照により本開示に含まれる）。我々は、ラットの体外標本における、ＡＳＭ注射後に観察された適度の機能改善は、非機能性特性への効果の結果（直接的にＬＶ収縮ではなく、ＬＶ拡張の減衰）であると思われるというＪａｉｎらによる解釈（「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−１９２７、２０００年。参照により本開示に含まれる）に同意する。要するに、ＡＳＭ由来骨格筋によって、陳旧性心筋の細胞への壁応力が小さくなって、さらなるＬＶの室拡張が防がれたことが、陳旧性心筋機能の改善を生み出したのであろう。おそらく、治療が早いほど、ＬＶリモデリングに対し、ＡＳＭ由来骨格筋の効果がより早く実現され、そのため陳旧性心筋細胞が十分に全体的なＬＶ機能を代償し、またそれに貢献する可能性が高まるのであろうか。同様に、本研究に基づき、拡張が重度であるほど、機能的変化が観察されるまでに、より長い期間を要すると考えられる。
【００８１】
左室リモデリング
本研究の重要な発見は、細胞生存率に依存する形での、ＡＳＭ移植後のＬＶ拡張の減衰であった（図４）。小型および大型の両動物における研究は、ＡＳＭ注射後のＬＶ拡張への好ましい効果も示してきた（Ｔａｍｂａｒａら、「Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｃａｎ  ｆｕｌｌｙ  ｒｅｐｌａｃｅ  ｔｈｅ  ｉｎｆａｒｃｔｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｗｈｅｎ  ｔｈｅｙ  ｓｕｒｖｉｖｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｉｎ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８［ｓｕｐｐｌ  ＩＩ］：ＩＩ−  ２５９−６３、２００３年；Ｔａｙｌｏｒら、「Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ：ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．  ４（８）：９２９−３３、１９９８年；Ｊａｉｎら、「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−１９２７、２０００年；Ｇｈｏｓｔｉｎｅら、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ１３１−６、２００２年；Ｐｏｕｚｅｔら、「Ｆａｃｔｏｒｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ａｆｔｅｒ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．  ７１：８４４−８５１、２００１年。参照により本開示に含まれる）。最近の研究のその他の興味深い発見は、ＬＶ拡張への効果は、ＳＡ寸法に対してのみであったことである。このＳＡリモデリングへの優先的効果を定義する機序は、完全に明確ではない。細胞性心筋形成術が、瘢痕の弾性に直接影響し、そのため瘢痕の拡張を制限するという考えは、局所的拡張の減衰の説明となり得る（Ｔｏｒｒｅｎｔ−Ｇｕａｓｐら、「Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｂｕｔｔｒｅｓｓ  ｗｒａｐｐｉｎｇ．  Ａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｉ−  ＶＩＩ」、Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｏｒ．  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．  １３：２９８−４１６、２００１年。参照により本開示に含まれる）。慢性的な虚血心筋における、収縮後短縮と収縮期隆起との相互作用は、あまり特性が明らかになっていないが（Ｓｋｕｌｓｔａｄら、「Ｐｏｓｔｓｙｓｔｏｌｉｃ  ｓｈｏｒｔｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｉｓｃｈｅｍｉｃ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ，  ａｃｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ  ｏｒ  ｐａｓｓｉｖｅ  ｒｅｃｏｉｌ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６：７１８−２４、２００２年。参照により本開示に含まれる）、ＡＳＭ注射後に、ＰＳＳあるいはＳＢに���視できない改善が見られるという事実は依然存在する。
【００８２】
ＡＳＭ由来骨格筋筋線維が、体外で実証されたように（Ｍｕｒｒｙら、「Ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ」、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．  ９８：２５１２−２３、１９９６年。参照により本開示に含まれる）、その繊維で列になって積極的に力（伸縮）に抵抗し、それによりＬＶ拡張を制限することができれば、選択的にＬＶ短軸に対するＬＶ拡張の減衰が観察されたことの説明となるかもしれない。例えば、虚血性障害のあと、心室が次第に球状になるに従い、優位な心筋繊維の軸（例：６０°）は、漸進的に水平軸または短軸（例：３０°）に向かって方向を変える（Ｔｏｒｒｅｎｔ−Ｇｕａｓｐら、「Ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅｌｉｃａｌ  ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｂｕｔｔｒｅｓｓ  ｗｒａｐｐｉｎｇ．  Ａｒｔｉｃｌｅｓ  Ｉ−ＶＩＩ」、Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｏｒ．  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．  １３：２９８−４１６、２００１年。参照により本開示に含まれる）。我々は、ＡＳＭ由来骨格筋筋線維が互いに、また残存心筋細胞と整列して認められ、そのため理論的には、生着したＡＳＭ由来筋原線維の志向性は、ＬＶ短軸とより整列することの証拠が提供される。示唆されるように、ＡＳＭ由来筋原線維は、その繊維長上への、またはそれに沿った拡張力に対する先天的な抵抗力を示し、それにより、ＬＶ短軸に沿ったＡＳＭ生着細胞と整列する拡張を選択的に防いでよい（図４）。
【００８３】
Ｊａｉｎら（「Ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｄｅｌｅｔｅｒｉｏｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｃａｒｄｉａｃ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０−１９２７、２０００年。参照により本開示に含まれる）と同様に、摘出心臓標本において、本研究でもＡＳＭ心筋形成術が、Ｅｅｓ切片（Ｖ０）およびＰＲＳＷの切片の右方向の移行を防いだことが認められた（表１および図４）。ＡＳＭ移植のＬＶリモデリングとＬＶ機能とへの明らかに不調和な効果を有意義に定量化する観点で、またその目的で、得られた圧容積データからＰＶＡを計算した（Ｔｏｄａｋａら、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｉｎｇ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ａｎｄ  ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｒｅｐｅａｔｅｄ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｍｉｃｒｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２７２：Ｈ１８６−９４、１９９７年；Ｒｅｃｃｈｉａら、「Ｒｅｄｕｃｅｄ  ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｌｔｅｒｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｅｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｃｉｎｇ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ  ｄｏｇ」、Ｃｉｒ．Ｒｅｓ．  ８３（１０）：９６９−７９、１９９８年；Ｔａｋａｏｋａら、「Ｄｅｐｒｅｓｓｅｄ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｌｅ  ｓｔａｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｎｏｎ−ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｗｏｒｋ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｏｌｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．  ２８：１２５１−７、１９９４年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。非機械的心仕事量またはＰＥの増加（表１）が、ＡＳＭ移植に減衰したという事実は、心臓の機械的エネルギー特性への利益を示唆している。かかる利益は、長期にわたるより高い心機能を可能としてよく、これはＡＳＭ動物が、６週間にわたりそのＥｅｓにそれ以上の悪化を示さず、より時間が与えられれば、これは群間において有意であることが証明されたかもしれないという事実に裏付けられる。研究は、心機能の改善が、より先の時点において、またはより多数のＡＳＭ細胞の移植後に実証されるかどうかを評価するために、現在進行中である。
【００８４】
研究の限界
本研究で使用された動物モデルは、原因論、病態の程度、冠動脈構造において臨床的虚血性ＨＦに近似している（Ｓａｂｂａｈら、「Ａ  ｃａｎｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅａｒｔ  ｆａｉｌｕｒｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｍｉｃｒｏｅｍｂｏｌｉｚａｔｉｏｎｓ」、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ２６０：Ｈ１３７９−８４、１９９１年；Ｐｆｅｆｆｅｒら、「Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８１：１１６１−７２、１９９０年；Ｍｅｎａｓｃｈｅ、「Ｍｙｏｂｌａｓｔ−ｂａｓｅｄ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ８：２２１−２７、２００３年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。微少塞栓術は、全ての患者、特に単一の広範囲な梗塞に罹患した患者の虚血性ＨＦにつながる心筋梗塞の事象を完全に模倣しない。さらにこのモデルは、慢性虚血性ＨＦに典型的な疾患進行を大きく加速する（Ｐｆｅｆｆｅｒら、「Ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ８１：１１６１−７２、１９９０年；Ｐｆｅｆｆｅｒ、「Ｌｅｆｔ  ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ  ａｆｔｅｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｍｅｄ．  ４６：４５５−６６、１９９５年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）。
【００８５】
各動物は、同じ数と種類の処置を受け、またＨＦの確定のための同様の血行動態基準に従った。本研究に認められた差異は、群間での準備（およびＡＳＭ注射）のタイミングに基づいて生じた可能性がある。ＨＦ＋ＡＳＭにおいて、ＳＡ寸法でのみ拡張の減衰が観察され、相互に関連付けられたが、ＬＡ拡張はＨＦ対照とＡＳＭとの群間でほぼ同一であったという事実は、群間で見られた差異が、処置の順序よりも筋芽細胞注射に依存していることをさらに裏付ける。
【００８６】
ソノマイクロメトリにより計測される局所性および／または分節性機能は、ＡＳＭ生存率の可変性により、ＡＳＭ生着の正確な範囲における機能を十分に明らかにしていないかもしれないが、筋芽細胞注射は、明確にソノマイクロメトリ結晶に向けられ、また第６週にはその直近で発見された。局所性の準備がＡＳＭ注射後の機能的利益を明らかにすることができなかったのであれば、ＥＳＰＶＲ（Ｅｅｓ）およびＰＲＳＷ（Ｍｗ）などの指標は、室圧に関わるＬＶ容積の変化に対して引き続き敏感であり、ＡＳＭ注射の影響を明らかにすべきであった。過去に認識されているように、Ａｂｅｒｃｒｏｍｂｉｅにより記載される方法は（「Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｍｉｃｒｏｔｏｍｅ  ｓｅｃｔｉｏｎｓ」、Ａｎｔ．Ｒｅｃ．  ９４：２３９−４７、１９４６年。参照により本開示に含まれる）、細胞数を計るための標準化されたアプローチである。これは生存する細胞の数を推定する最良の方法であるが、サンプリング誤差が大きな限界となっている。最後に、ＡＳＭ注射後にＬＶ機能への利益が観察されていないことは、研究期間が限られていたことに関連している可能性がある（Ｇｈｏｓｔｉｎｅら、「Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｒｅｇｉｏｎａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ」、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ１３１−６、２００２年。参照により本開示に含まれる）。
【００８７】
結論
本研究は、付随する介入を伴わない、臨床的に適用される慢性虚血性ＨＦの大型動物モデルにおけるＡＳＭ移植について記載している。心機能への直接の機能的影響はないようであるが、我々は、ＡＳＭ移植後のＬＶ拡張の有意な減衰を実証することができた。ＬＶ拡張の減衰は、短軸のみに対してであり、細胞生存率依存性の形で観察された。これらの観察は、ＡＳＭが、細胞間コミュニケーションと無関係の機序、および／または直接の機能改善によりＬＶリモデリングに影響するが、ＡＳＭの生着と整列はかかる機序で役割を果たしてよいことを示唆している。
【００８８】
実施例２−コイル塞栓術により梗塞を起こしたブタの心筋における経皮的自己骨格筋芽細胞移植の安全性と可能性
全ての実験は、「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＤＨＨＳ  出版番号ＮＩＨ８５−２３、１９８５年改訂）に公開されているガイドライン、およびＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅによるＦｅｄｅｒａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅ  ＡｃｔのＡ節に従って、またＦＤＡ  Ｇｏｏｄ  Ｌａｂ  Ｐｒａｃｔｉｃｅの精神で実施された。研究プロトコルは、研究開始前に、アリゾナ州フェニックス、Ａｒｉｚｏｎａ  Ｈｅａｒｔ  ＨｏｓｐｉｔａｌのＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認された。
【００８９】
素材と方法
動物の準備：生後３〜６ヶ月で、体重９１±２５ｌｂｓ．の１０頭の雌ヨークシャーブタは、心筋梗塞を誘発された。３頭が、心筋梗塞の誘発中、または直後に死亡した。１頭は注射された筋芽細胞の短期滞留と生体内分布を判定するために用いられ、６頭はＡＳＭまたは輸送培地のみのいずれかの受容動物としての役割を果たした。
【００９０】
梗塞を誘発する直前、心電図記録、心エコー検査、心拍出量および指数、および血液値が評価され、筋肉生検材料が採取され、ループ記録装置が埋め込まれた（これらの処置の更なる詳細は以下を参照）。各動物は、筋肉内（塩酸チレタミンと塩酸ゾラゼパム、５００ｍｇ）により麻酔され、挿管され、人工的に２％イソフルレンおよび酸素を吸入された。８−Ｆ動脈シースが、経皮的にまたは静脈切開法により右大腿動脈に挿入され、選択的左右冠動脈造影、左心室造影およびＮＯＧＡＴＭマッピングが実施された。
【００９１】
大腿静脈切開と同時に、生検材料が６頭の研究用ブタそれぞれから採取された。滅菌状態下で、右後肢に沿って縦方向に６ｃｍ切開し、５〜１０グラムの大腿筋の生検材料が、鋭的切開法により摘出された。その後切開部は、層状に吻合された。筋生検材料は、速やかに氷上の生検材料移植媒体に置かれ、筋芽細胞増殖のために細胞培養施設に送られた。
【００９２】
筋生検のあと、埋め込み型ループ記録器（ＩＬＲ）が、各ブタに挿入された。無菌操作を用い、脊椎の左側に沿って、心臓のすぐ上に単一の２ｃｍ切開がなされた。切創は筋膜まで切開され、約４×２ｃｍの皮下ポケットが筋肉上に形成された。事象観察装置は、皮下に設置され、心電図（ＥＣＧ）信号の特性と振幅が検証された。創縫合は、従来の方法で実施された。
【００９３】
梗塞モデル：ＩＬＲ埋め込みと左心カテーテルの直後に、２×１０ｍｍの複合螺旋または３×２３ｍｍのダイヤモンド型のＶｏｒｔｘコイル（Ｂｏｓｔｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／Ｔａｒｇｅｔ、マサチューセッツ州ナティック）を用いた、左冠動脈前下行枝（ＬＡＤ）遠位部に対するコイル塞栓術により、各ブタに前壁梗塞が誘発された。冠動脈閉塞は、冠動脈造影と左冠動脈前下行枝の閉塞の数分後にＶ１−Ｖ３においてＳＴ上昇を示したＥＣＧに実証されるように、コイル配置の平均１６分後に発生した。大腿動脈は、Ａｎｇｉｏ−Ｓｅａｌ血管吻合装置または縫合糸を使用して吻合され、動物は標準作業手順により回復させた。重大な心室性不整脈は、２％リドカインの静脈ボーラス投与、および電気的除細動により治療された。処置後の不快感は、筋肉内酒石酸ブトルファノール（Ｄｏｌｏｒｅｘ、１．０ｍＬ）投与により治療された。
【００９４】
筋芽細胞の増殖：自己骨格筋芽細胞は、筋肉組織を細かく刻み、続いて０．５ｍｇ／ｍＬトリプシンおよび０．５ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼを含む３ステップの酵素消化をおこなうことにより分離される。各ステップで遊離された細胞は、洗浄され、ゼラチンコートディッシュで培養された。細胞は、ＳｋＢＭ(R)（骨格筋基本培地、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ニュージャージー州イーストラザフォード）から成り、１５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ウシ胎児血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、１０ｎｇ／ｍＬのｒｈＥＧＦ（Ｃａｍｂｒｅｘ）、３．９μｇ／ｍＬのデキサメタゾン（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｌａｂ、ニューヨーク州シャーリー）、および５０μｇ／ｍＬのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州カールズバッド）を補填した成長培地（ＧＭ）において、２代の継代にわたって増殖された。細胞は、自然発生的細胞融合を防ぐため、密度＜７０％に維持され、トリプシン／ＥＤＴＡ消化により採取され、低温保存された。培養物の約１０％は、ＢｒｄＵ特異的な免疫組織化学的検査により、生着した細胞の識別を容易にするために、培養の最終２４時間の間にブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）で標識された。
【００９５】
細胞注射に備えて、凍結された筋芽細胞は解凍され、ＧＭで２回、移植媒体で２回洗浄された。最後に、細胞は適切な細胞密度にされて１ｍＬ注射器に入れられ、氷またはコールドパック上で、動物実験施設に輸送された。
【００９６】
細胞をイリジウムで標識するため、動物からの４千万の細胞は、１３．４×１０１０イリジウム粒子（０．３μｍ径、提供：ＢｉｏＰｈｙｓｉｃｓ  Ａｓｓａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、マサチューセッツ州ウースター）と混合され、筋芽細胞によるイリジウムの吸収を助長するために、３７°Ｃで２．５時間インキュベートされた。吸収されなかった粒子は、細胞を成長培地で６回洗浄することにより除去された。残った標識された細胞は、標識されていない筋芽細胞と混合されて、移植媒体で最終細胞産物が調製され、１ｃｃ注射器に装填された。最終細胞産物の一定分量は、検量線が作成できるように保持された（下記参照）。
【００９７】
細胞集団の特徴付け：細胞は、生存、無菌性、純度、能力を分析された。生存は、トリパンブルーを用いて評価され、無菌性は膜ろ過法とＬＡＬ（カブトガニアメーバ様細胞溶解物）ゲルクロットアッセイを用いて、エンドトキシンを検出するために測定された。細胞純度は、筋芽細胞に特異的なインテグリンα７（イリノイ大学Ｋａｕｆｍａｎ博士提供、Ｈ３６）に対する一次抗体を用いて、ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分類）により判定された。筋芽細胞の能力は、コンフルエントな筋芽細胞培養物を融合培地に交換することにより実施される融合アッセイを用いて評価された。これらの条件の下で、筋芽細胞は融合し、多核筋管を形成した。汚染線維芽細胞は、この能力を有さず、単一細胞のままとなる。
【００９８】
筋芽細胞移植媒体での最終調製時に、細胞の生存率は６０％〜９６％であった（表４参照）。動物実験現場での筋芽細胞の受け取り時には、生存率は低下していた。細胞調製物の純度は、３０％から６２％の範囲であり、線維芽細胞の状態である可能性がある汚染細胞を含んでいた。全ての移植細胞は、ＵＳＰの濾過滅菌およびエンドトキシンＬＡＬ試験に合格した。
【００９９】
自己筋芽細胞移植：梗塞の３０日後、自己骨格筋芽細胞は、４頭の治療用ブタそれぞれに移植された。各動物は、上記と同様に麻酔された。８−Ｆ動脈シースが、静脈切開法を用いて左大腿動脈に挿入され、心筋評価が繰り返された。
【０１００】
経皮的自己骨格筋芽細胞移植は、８−Ｆ動脈シースを用いて、左右いずれかの大腿動脈を通して、血管内注射カテーテル（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ心筋内注射装置）を前進させることにより実施された。３次元ユニポーラ電圧マップ（ＮＯＧＡＴＭ）を使用して、梗塞範囲を判定し、針注射カテーテルを誘導した。１３７地点の平均を用いて左室をマッピングし、ユニポーラ電圧の中間値７．８±１．５ｍＶ（バイポーラ：２．３±０．４ｍＶ）を用いて梗塞範囲を検出した。使用されたカテーテルは、ＢまたはＣのいずれかであった。注射針は直線および曲線部（９０度）で計測され、心エコー検査で測定された壁厚に応じて、心内膜の梗塞部位内に３〜５．５ｍｍ伸びるように調整された。貫通は、蛍光透視、ＳＴ上昇、または針の前進中の心室性期外収縮のいずれかにより検証された。
【０１０１】
注射の直前、各注射器は室温に戻され、確実に細胞懸濁液を均一にするため、数回反転させた。温度は接触により評価され、均一性は視覚的に評価された。懸濁細胞は、心筋の梗塞部位の中心および周辺端部に注射された。第２群の動物は、１回１００μＬの１９回の注射で〜３００×１０６細胞を投与された。第３群の動物は、１００〜１５０μＬの３１〜３９回の注射で〜６００×１０６細胞を投与された。第１群の動物（対照）は、同様の回数の注射および注入量で筋芽細胞移植媒体を注射された。表４には、用量特性を詳細に記載している。注射が完了したあと、大腿動脈はＡｎｇｉｏ−Ｓｅａｌ血管吻合装置または縫合糸により吻合され、動物を回復させた。
【０１０２】
インジウムで標識したＡＳＭ分布の定量化
最後の注射の２時間後、イリジウムで標識したＡＳＭを注射された動物を致死させ、心臓、脳、腎臓、肝臓、肺、および脾臓が計量された。左心室の前部、側部、下部、および中隔部は、８つの等しい切片に切断され（各部につき２つの垂直方向切片）、また５〜９グラムの各臓器が、分析のために切除された。全ての組織試料と標識された細胞の標準物質は、バイアルに入れ、７０°Ｃで１晩乾燥させた。
【０１０３】
得られた乾燥試料は、活性化および検出の２つのステップを含む解析のため、ＢｉｏＰｈｙｓｉｃｓ  Ａｓｓａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに送られた。活性化中、細胞内のイリジウム原子に入射中性子を捕獲させる高エネルギー中性子に、試料を曝露した。中性子束の不安定な放射性生成物は、自然放射能の介入を軽減するために、続いて２日間崩壊させた。検出期には、試料は高解像度ガンマ線検出モニタに設置され、エネルギー準位と放出されたガンマ粒子の数を計測した。既知の数のイリジウム標識された細胞を含む試料から作成された検量線を使用して、各組織試料のガンマ粒子放出は、保持されたイリジウム標識された細胞の数に換算された。それぞれの臓器（心臓以外）全体で、標識された細胞の合計を計算するために、各試料の数値に、試料組織の重量で除された臓器の重量を乗じた。
【０１０４】
安全性評価：安全性は、動物の生存、健康、心拍リズム、血液検査、および有害事象により判断された。健康と生存は、９０日の研究期間中、連続的に監視、記録された。心拍リズムは、安静時仰臥位で選択された時点に取得した、埋め込み型ループ記録器（ＩＬＲ）による、標準１２誘導心電図を使用して監視された。使用されたＩＬＲは、Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ  Ｒｅｖｅａｌ(R)Ｐｌｕｓ  ９５２６（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ、ミネソタ州ミネアポリス）であるが、これは不整脈イベント中に、皮下心電図を連続的に（ルーピング）記録するために作られた、使い捨ての、プログラム可能な装置である。ＩＬＲは、心筋梗塞および移植の最中およびその後２４時間、起動していた。さらなる照会が、各処置から２週間は週３回、移植と摘出との間には週１回おこなわれた。各装置は以下のようにプログラムされた。格納モード−連続１６回の拍動間に、徐脈＜３０ｂｐｍ、頻脈＞２３０ｂｐｍ、心停止＞３秒を検出する、４２分間の１３の自己活性イベント。全てのＩＬＲ装置は、最大ゲイン８（±０．２）ｍＶに設定され、最適感度を得るために、感度は１０〜１３に調整された。
【０１０５】
血液学および化学：（表３参照）標本は、各処理で動物を１晩断食させたあと採取した。血液は、麻酔下で大腿部経由で採取された。ＥＤＴＡナトリウムが血液テストのための抗凝血剤として使用された。臨床化学試験のための試料は、抗凝血剤を使用せずに採取された。
【０１０６】
【表３−１】
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【０１０７】
【表３−２】
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心筋機能評価：心臓の機能評価は、細胞移植の効果を治療群と対照群とで検出、比較するために、選択された時点で実施された。
【０１０８】
駆出率および心室壁厚は、標準安静時心エコー（エコー）を用いて評価された。エコーは２次元で、傍胸骨長軸および短軸像、心尖部四腔、二腔、および長軸、肋骨下四腔および短軸像で実施された。エコー結果は、熟練した心臓病専門医により、盲検的に解釈された。さらなる駆出率評価は、心室造影（ＬＶグラム）により成された。冠動脈は、右および左前斜投影を使用した左心カテーテル中に、冠動脈造影により開存性を可視化され、研究者により解釈された。心指標は、Ｂｉｏ−Ｚ装置（Ｃａｒｄｉｏ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、非侵襲的インピーダンスカルジオグラフィ（ＩＣＧ）により評価された。４つのＩＣＧセンサーが、各動物に取り付けられ（首と胴の両側に各１つずつ）、ブタの胸部構造の値を調整するために、補正率１．４８が使用された（Ｂｒｏｏｍｈｅａｄら、Ｂｒ．Ｊ．Ａｎｅｓｔｈ．  ７８：３２３−３２５、１９９７年。参照により本開示に含まれる）。
【０１０９】
３次元電気機械的マッピングは、８−Ｆシースを通して左心室に前進させた７−Ｆ  ＮＡＶＩＳＴＡＲＴＭカテーテルを介して、ＮＯＧＡ  Ｂｉｏｓｅｎｓｅナビゲーションシステム（Ｂｉｏｓｅｎｓｅ  Ｗｅｂｓｔｅｒ、カリフォルニア州ダイヤモンドバー）を用いて実施された。このナビゲーションシステムは、弱い磁場エネルギーと、先端にセンサーが付いたカテーテルを使用し、３次元空間におけるカテーテルの位置を特定する。これは電気機械的マッピングと相まって、心室の健康／正常、虚血、および梗塞の範囲を識別する、左心室（ＬＶ）の３Ｄ画像の構築を可能とする（Ｋｏｒｎｏｗｓｋｉら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８：１１１６−１１２４、１９９８年。参照により本開示に含まれる）。これらのマップには、ユニポーラ（ＵＰ）およびバイポーラ（ＢＰ）電圧マップが含まれる。心筋の各部分における電圧を表示するための数および色の基準は、コンピュータにより指定された。
【０１１０】
Ｂｉｏｓｅｎｓｅ注射カテーテルは、物質を心筋内に注射するために作られた、偏向可能なチップと注射針を有する多電極の経皮的カテーテルである。注射カテーテルのチップには、Ｂｉｏｓｅｎｓｅ位置センサーと、液体供給のための伸縮自在の中空２７ゲージ針が備えられている。注射部位は、リアルタイムで左心室マップに表示され、注射の正確な配置を可能とする。局所的電気信号が取得され、カテーテルチップによる外傷を最小限に抑える。
【０１１１】
組織学的検査：組織学的分析は、治療および対照群の動物の心臓が研究の９０日目に摘出されたあと、その全てに対し実施された。心臓は計量され、１０％中性緩衝ホルマリン中に保存され、組織学的分析のため、室温でＧｅｎＶｅｃに輸送された。各心臓の梗塞を起こした部分は、パラフィンに包埋され、切断され、スライド上に設置された。これは移植細胞の生着と、処置に対する炎症反応の可能性を識別するために、染色された。組織染色には、ヘマトキリン＆エオシン、およびトリクロムが含まれた。免疫組織化学的染色には、骨格筋特異的なミオシン重鎖（ＭＹ３２）、およびブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）に対する免疫反応性が含まれた。
【０１１２】
統計的分析：群間の連続型変数は、スチューデントｔ検定を用い、Ｐ値＜０．０５を有意とみなして比較された。相対変化率は、ベースライン値で除された前後の値の差として計算された。
【０１１３】
予備実験
経皮的注射の可能性：損傷心筋および正常心筋の双方への経皮的カテーテル注射の可能性は、まず２頭のブタにおいて判定された。正常なブタおよび梗塞を起こしたブタの心筋に、メチレンブルーまたは造影剤を別々の機会に注射するために、２つの異なるカテーテルが使用された。染料の注射前に、血管造影がおこなわれ、カテーテルが心臓の心尖の心筋梗塞部位に正確に位置づけられた。この予備実験は、心臓の特定の部位を標的として、筋芽細胞を供給することが可能であることを示した。
【０１１４】
注射カテーテルの生体適合性：ＭｙｏＳｔａｒＴＭ心筋内注射装置（ＢｉｏＳｅｎｓｅ−Ｗｅｂｓｔｅｒ、カリフォルニア州ダイヤモンドバー）を使用して移植研究を開始する前に、予備生体適合性研究が実施された。この実験は、細胞通過中にカテーテル自体から排出されたかもしれない残渣の存在または不在を微視的に検証することも目的とした。筋芽細胞は、１０、３０、５０、７０、および１００×１０６細胞／ｍＬの濃度で、あらかじめ標識された注射器で、実験当日にＧｅｎＶｅｃから提供された。細胞濃縮物の容量は、それぞれ０．４４、０．４４、０．２８、０．４５、および０．４０ｍＬであった。細胞生存率は、細胞通過の前後に、トリパンブルー染色（０．４％、Ｇｉｂｃｏ）を用いて判断された。残渣に対する微視的視覚評価は、カテーテル前検査、カテーテルのフラッシュ、およびカテーテル後検査の時点に、光学顕微鏡を使用して２Ｏ×拡大で実施された。実験中に蓄積した可能性があるあらゆる残渣を証明するために、デジタル写真が撮影された。
【０１１５】
筋原性細胞株（Ｏｒｏｎら、「Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｎ  ｅｎｄｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｃａｔｈｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｉｍｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｒｉｏｖａｓｃ．Ｉｎｔｅｒｖｅｎｔ．  ３：２２７−２３０、２０００年。参照により本開示に含まれる）と同じように、本データは、細胞濃度１０×１０６〜１００×１０６細胞／ｍｌにおいて、カテーテル通過後の細胞生存率の有意な変化を示さず、Ｂｉｏｓｅｎｓｅカテーテルの使用時に細胞生存率に対する有害作用が起こらなかったことを示唆した。さらに、全ての用量の濃縮物で、カテーテル前、フラッシュ、またはカテーテル後において、微視的差が認められなかった。
【０１１６】
【表４】
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Ｂｉｏｓｅｎｓｅカテーテルによる、梗塞を起こしたブタの心筋への筋芽細胞供給：前述のカテーテル供給法は、筋芽細胞を心臓に注射するために使用された。３頭のブタの大腿筋から、生検材料（約５グラム）が採取され、筋芽細胞培養のために輸送された。生検後約３〜４週間で、注射のための細胞を受け取った。２件の筋芽細胞移植が、Ｂｉｏｓｅｎｓｅ  ＮＯＧＡマッピングおよび注射を用いて実施された。自己移植は、１頭のブタで完了し、２頭目は、免疫抑制を伴わず、同種異系筋芽細胞移植を受けた。
【０１１７】
瘢痕範囲への貫通は、ＳＴ上昇により、また針の前進中の心室性期外収縮により検証された。５．６×１０４細胞／ｍＬでの９回の０．１ｍＬ注射（自己注射）、および２００×１０６細胞／ｍＬでの２５回の０．１ｍＬ注射（同種異系）が、２頭のブタにそれぞれ実施された。注射部位は、電気機械的マップに描写された。移植の成功は、１０日目（同種異系）および３ヶ月目（自己）の心筋摘出の実施時に認められた（図６参照）（Ｎｉｂら、Ｊ．Ｅｎｖａｓｃ．Ｔｈｅｒ．  ９：３１３−３１９、２００２年。参照により本開示に含まれる）。
【０１１８】
結果
ブタモデルにおける筋芽細胞の生体内滞留および分布：梗塞範囲は、健康な心筋壁より薄い。染料の供給には成功したが、心臓損傷部位への細胞のカテーテル供給は、正常な厚い壁と比較し、また別の課題を呈示するかもしれない。心筋梗塞は、冠動脈前下行枝に白金コイルを設置することにより、ブタに誘発された。移植の直前、筋芽細胞はイリジウム粒子の吸収により標識された。心筋梗塞の１ヵ月後、イリジウムで標識した筋芽細胞は、３Ｄ  ＮＯＧＡＴＭマッピングに誘導され、Ｂｉｏｓｅｎｓｅカテーテルを用いて移植された（図５参照）。移植２時間後、ブタを致死させ、心臓、脳、脾臓、肝臓、両腎臓、および肺を摘出した。臓器は、組織を高エネルギー中性子源に曝露することにより、筋芽細胞の滞留について評価された。励起したイリジウムから放出されたガンマ粒子は、筋芽細胞の局在性の、間接的な定量的測定として数えられた。筋芽細胞の約４．１％は、注射を受けた梗塞範囲で観察された。筋芽細胞の約５％は、肺で観察された。０．１％未満が脾臓で観察され、脳、肝臓、または腎臓では筋芽細胞は検出されなかった。
【０１１９】
これらのデータは、Ｂｉｏｓｅｎｓｅ心筋内注射装置を使用して、細胞が心筋の特定の部位（薄壁の梗塞範囲）を正確に標的とできることを示している。注射部位での滞留全体は、この供給方式を用いて約４％である。心臓壁に留まらなかった細胞は、おそらく針跡を通して漏出し心室内に戻ったか、または心臓静脈系に注射され、肺に到達したと思われる。注射された細胞の大多数が把握されてはないが、脳、腎臓、肝臓、または脾臓では大量に検出されていないため、検出するには低すぎるレベルの細胞が、動物の体内に分散したと思われる。
【０１２０】
Ｂｉｏｓｅｎｓｅ注射カテーテルシステムを使用した自己骨格筋芽細胞移植の安全性と可能性：表４は、自己骨格筋芽細胞の特徴付けの結果をまとめている。筋芽細胞移植媒体での最終調製時に、細胞の生存率は６０％〜９６％であり、動物実験現場での筋芽細胞の受け取り時には、生存率は低下していた。全ての移植細胞は、ＵＳＰの濾過滅菌およびエンドトキシンＬＡＬ試験に合格した。
【０１２１】
【表５】
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＊ＦＡＣＳによるα７インテグリン免疫染色率
Ｎ／Ａ−該当なし  ＮＤ−実施せず
対照動物（第１群）は、第２および３群における対応する治療動物と同様の注射回数および注射容量で、筋芽細胞移植媒体を注射された。第２群の動物は、１回１００μＬの１９回の注射で、約３００×１０６細胞を注射された。第３群の動物は、１回１００〜１５０μＬの３１から３９の注射で、約６００×１０６細胞を注射された。表４には、用量特性を詳細に記載している。
【０１２２】
全ての群において、カテーテルによる自己骨格筋芽細胞の供給に関連しての合併症または死亡はなかった。心拍リズムは、安静時仰臥位で選択された時点に取得した、埋め込み型ループ記録器（ＩＬＲ）による、標準１２誘導ＥＣＧを使用して監視された。ＩＬＲは、ＭＩおよび移植の最中およびその後２４時間、起動していた。さらなる照会が、各処置から２週間は週３回、移植と摘出との間には週１回おこなわれた。ＩＬＲは、非持続性心室頻脈の発現を１件、洞性頻脈の発現を２件記録したが、これらは全て移植前であった。どの群においても、ＡＳＭＴ後６０日間、ＩＬＲにより不整脈は記録されなかった（表５参照）。
【０１２３】
【表６】
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ＮＳＶＴ＝非持続性心室頻脈、ＳＴ＝洞性頻脈
心筋機能：心臓の機能的評価は、対照と比較して治療群で発生したかもしれない、可能性と機能の変化を検出および比較するために実施された。移植時（ベースライン）、エコーによるＥＦ、ＬＶグラムによるＥＦ、Ｂｉｏ−Ｚによる心指数、ＮＯＧＡによる左室ユニポーラ電圧（ＬＶＵＰＶ）、およびＮＯＧＡによる心尖ユニポーラ電圧（ＡＰＵＰＶ）において、治療および対象群間で優位な差は認められなかった。
【０１２４】
致死時、対照と比べ、治療群では心機能改善への一貫した傾向が見られた（表６）。３億と６億のＡＳＭを注射された動物間で、心機能の改善に明らかな違いがなかったことを考慮し、両治療群からのデータを解析のために蓄積した。盲検的心エコー評価により、治療された動物は、エコーによるＥＦでは、対照動物の−１０％悪化に対し１５％改善を、またＬＶグラムによるＥＦでは、対照動物の１２％悪化に対し２％減少を示した。最後に、ＡＰＵＰＶ中間値は、治療動物では２３％改善したが、対照動物では４％低下した。
【０１２５】
【表７】
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試験化学データ：ベースライン、移植（心筋梗塞１ヵ月後）、および摘出（移植２ヶ月後）において、完全血球算定、血小板、白血球分類、血中尿素窒素、電解質、重炭酸塩、アニオンギャップ、クレアチニン、ＬＦＴ、アルカリホスファターゼ、クレアチン、Ｂ型ナトリウム利尿ペプチド、カルシウムとリン酸塩、尿酸、コレステロール、およびトリグルセリド値の有意な変化は測定されなかった。さらに、選択されたどの時点においても、治療の２群と対照との間に有意な差は認められなかった。
【０１２６】
組織学的検査：各治療ブタの左室前壁を通して採取された切片の組織学的分析は、移植６０日後に細胞が生存していないことを示した。注射された筋芽細胞、あるいはより成熟した多核筋管は、Ｈ＆Ｅおよびトリクロム染色、または筋芽細胞特異的なミオシン重鎖免疫染色（ＭＹ−３２）により検出されなかった。Ｈ＆Ｅおよびトリクロム染色による形態評価は、形態評価の存在の有無を確定的に判断するには、十分な感度を有さない。また、全動物において細胞核ＢｒｄＵの免疫染色は陰性であった。被移植ブタの病変は、対照動物のものより重度ではなく、または量的に異ならなかった
これらのデータを合わせると、経皮的なカテーテルによる自己骨格筋芽細胞の移植は、受容動物の全般的健康、または梗塞を起こしたブタの心筋に有害効果を及ぼさないことが示される。さらに、対照と比べ、２つの治療群で確認された心筋機能の改善への傾向は、安全性の結果を裏付けるだけでなく、カテーテルによる供給は可能であり、より優れた全体的心機能につながることを示している。
【０１２７】
考察
実験的に、筋芽細胞は、数々の方法を用いて、損傷心臓に供給されてきたが、これには冠循環への血管内注入（Ｔａｙｌｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  １０９：２４５−２５３、１９９７年。参照により本開示に含まれる）、筋芽細胞の損傷心筋への直接注射（Ｔａｙｌｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ａｓｓｏｃ．Ａｍ．Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  １０９：２４５−２５３、１９９７年；Ｄｉｂら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０８（ｓｕｐ［ｒｈｏ］ｌ１７）：ＩＶ−６２３、２００３年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）、また最も近年ではカテーテルによる心室内供給（Ｄｉｂら、Ｊ．Ｅｎｄｏｖａｓｃ．Ｔｈｅｒ．  ９：３１３−３１９、２０００年。参照により本開示に含まれる）が含まれる。カテーテルによる供給は、心筋壁が回復する組織よりも薄いことから、直接注射よりも難しい。そのため、細胞を薄壁に供給するための針注射カテーテルの使用が検討され、穿孔と細胞漏出のリスクが評価された。
【０１２８】
治療されたブタのうち１頭を検査することにより、梗塞を起こした心筋におけるイリジウム標識された自己骨格筋芽細胞の４．１％の生体内滞留率が得られた。人体試験により、心外膜供給で移植された筋芽細胞が生存し、筋管および筋原繊維を形成することは知られている（Ｍｅｎａｓｈｅら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１：１０７８−１０８３、２００３年。参照により本開示に含まれる）。さらに、移植５ヵ月後のＬＶＡＤ患者から外植された心臓の組織学的分析は、骨格筋遅筋ミオシンの発現を示し、移植物が異環境で生存できることを示唆した（Ｐａｇａｎｉら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１  ８７９−８８８、２００３年。参照により本開示に含まれる）。
【０１２９】
ここに提示される安全性と可能性の研究では、経皮的カテーテルによる供給方法での移植処置に関連する合併症は見られなかった。外科的に埋め込まれたループ記録器への照会では、総容量５．８５ｍＬの最高６億の細胞が注射されたときの不整脈が示されなかった。２ヵ月後、炎症または腫瘍形成過程の徴候である可能性がある心筋酵素の上昇はなかった。心筋酵素後、細胞移植処置前までに発症した合併症は観察されなかったが、ブタの１頭は心筋梗塞を生き延びず、１頭は持続性ＶＴを有し、２頭は洞性頻脈を有した。
【０１３０】
ＭＹ−３２による組織化学的染色での陰性に関わらず、心エコー検査、左心室造影、および導電性の出力により、心機能改善への傾向が認められた。この矛盾した結果は、治療群における改善が、心筋梗塞範囲の他の細胞型の動因、新生血管形成、またはさらなるアポトーシスの防止によるものである可能性を示唆している。これはまた、移植された筋芽細胞の寿命は、心筋機能の長期改善に不可欠でなくてよいという概念も生み出す。
【０１３１】
本研究の限界の１つは、心エコー検査結果は盲検的に判定されたが、左心室造影の結果は判定されなかったことである。この評価の盲検判定は、結果の精度を向上させていた可能性がある。
【０１３２】
ブタ以外の種における、多数の動物および臨床試験から（ラット（Ｊａｉｎら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０３：１９２０、２００１年。参照により本開示に含まれる）、ウサギ（Ｔａｙｌｏｒ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ４：９２９、１９９８年）、ヒツジ（Ｇｈｏｓｔｉｎｅ、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６［ｓｕｐｐｌ  Ｉ］：Ｉ−１３１−Ｉ−１３６、２００２年）、ヒト（Ｈａｇｅｇｅ、Ｌａｎｃｅｔ  ３６１：４９２、２００３年；Ｐａｇａｎｉら、「Ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｅｄ  ｔｏ  ｉｓｃｈｅｍｉａ−ｄａｍａｇｅｄ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１：８７９−８８８、２００３年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）、心外膜供給により移植された筋芽細胞が生存し、筋管および筋原繊維を形成することが知られているが、これは移植された筋芽細胞が異環境でも生存できることを示唆している。現在我々は、ブタの筋芽細胞が、正常なまたは梗塞を起こした心筋で、筋芽細胞を長期間生存させられない特異的性質を有すると推測している。この結論は、心外膜に注射されたブタ筋芽細胞を用い、移植後数日以上のＡＳＭ生存を示さなかった他の研究（データは示さない）における、未公開の発見に基づいている。文献では、ブタの心臓における筋芽細胞移植の短期研究（Ｂｒａｓｓｅｌｅｔら、「Ｔｈｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｉｎｕｓ：Ａ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｒｏｕｔｅ  ｆｏｒ  ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｍｙｏｂｌａｓｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．  ４１：６７Ａ−６８Ａ、２００３年；Ｃｈａｚａｕｄ、Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｒｅｓ．  ５８：４４４−４５０、２００３年。これらはそれぞれ参照により本開示に含まれる）についての参考資料はあるが、ＡＳＭ生存を説明する長期研究についてのものはない。
【０１３３】
要約すると、得られたデータは、自己骨格筋芽細胞の、経皮的な心室内手法による、コイル梗塞を起こしたブタ心筋への供給は、処置あるいは細胞への毒性に関連する有害事象を伴わず、安全におこなわれるであろうことを示している。さらに、本結果は、自己骨格筋芽細胞のカテーテルによる供給が実現可能で、その処置が心機能の改善につながるという過去の研究を裏付ける。
【０１３４】
（その他の実施形態）
上述は、本発明の限定されない望ましい実施例の一部についての記載である。当業者には、以下の請求項に定められる本発明の精神または要旨から逸脱することなく、この記載に対するさまざまな変更および修正が加えられてよいことは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】図１は、虚血性心不全（ＨＦ）のヒツジへの自己骨格筋芽細胞（ＡＳＭ）注射の６週間後の、染色部分を示しているが、複合トリクロム（Ａ）および骨格筋特異的ミオシン重鎖（Ｂ、ＭＹ−３２、紫色染色）染色は、心筋瘢痕の部位に生着したＡＳＭ由来骨格筋繊維の広範な斑紋を示している。パネルＣおよびＤでは、パネルＡよりも高い拡大率で（矢印）、骨格繊維がお互いに整列し、さらに筋原繊維束を編成しているのが見られた（パネルＣおよびＤ）。ＡＳＭ由来骨格筋は、残存心筋細胞（パネルＥ、「ｃ」）と整列し、ＭＹ−３２の染色により確認される近接の骨格筋筋線維と整列した（Ｆ）。パネルＢ、ＤおよびＦのスケールバーは、それぞれ２ｍｍ、０．５ｍｍ、および０．２ｍｍである。
【図２】図２は、トリクロム染色（Ａ）により見られる、心筋線維症予および瘢痕の範囲内にある生筋を示している。ＭＹ−３２による染色（Ｂ）は、残存心筋細胞（「ｃ」）の隣接に整列して生着したＡＳＭ由来骨格筋が、トロポニン−Ｉ（Ｃ）に選択的に染色されないことを確認した。同じ部位からの（Ｃ、矢印）高い拡大率では、ＡＳＭ由来骨格筋細胞は、残存心筋細胞（「ｃ」）と非常に緊密な並列であるが、コネキシン４３（Ｄ）に染まっていない。パネルＡおよびＤのスケールバーは、それぞれ０．２ｍｍおよび０．１ｍｍである。
【図３】図３は、単一のヒツジの、微少塞栓術の前後（上および中央のパネル）の左室容積（ＬＶＶ）および左室圧（ＬＶＰ）の出力記録を表しているが、ハイライトは、ＥＳＰＶＲ（中央）、および微少塞栓術後のＡＳＭ移植（下パネル、丸）を伴う、または伴わないＰＲＳＷ（下、四角）で変化している。ＡＳＭ移植は、第１週目のあと（○および□）に心機能（傾斜）を改善しなかったが、移植は第６週目（●および■）に、ＨＦ対照動物に見られるＰＲＳＷにおける右方向の移行を防止した。
【図３Ａ】図３は、単一のヒツジの、微少塞栓術の前後（上および中央のパネル）の左室容積（ＬＶＶ）および左室圧（ＬＶＰ）の出力記録を表しているが、ハイライトは、ＥＳＰＶＲ（中央）、および微少塞栓術後のＡＳＭ移植（下パネル、丸）を伴う、または伴わないＰＲＳＷ（下、四角）で変化している。ＡＳＭ移植は、第１週目のあと（○および□）に心機能（傾斜）を改善しなかったが、移植は第６週目（●および■）に、ＨＦ対照動物に見られるＰＲＳＷにおける右方向の移行を防止した。
【図３Ｂ】図３は、単一のヒツジの、微少塞栓術の前後（上および中央のパネル）の左室容積（ＬＶＶ）および左室圧（ＬＶＰ）の出力記録を表しているが、ハイライトは、ＥＳＰＶＲ（中央）、および微少塞栓術後のＡＳＭ移植（下パネル、丸）を伴う、または伴わないＰＲＳＷ（下、四角）で変化している。ＡＳＭ移植は、第１週目のあと（○および□）に心機能（傾斜）を改善しなかったが、移植は第６週目（●および■）に、ＨＦ対照動物に見られるＰＲＳＷにおける右方向の移行を防止した。
【図３Ｃ】図３は、単一のヒツジの、微少塞栓術の前後（上および中央のパネル）の左室容積（ＬＶＶ）および左室圧（ＬＶＰ）の出力記録を表しているが、ハイライトは、ＥＳＰＶＲ（中央）、および微少塞栓術後のＡＳＭ移植（下パネル、丸）を伴う、または伴わないＰＲＳＷ（下、四角）で変化している。ＡＳＭ移植は、第１週目のあと（○および□）に心機能（傾斜）を改善しなかったが、移植は第６週目（●および■）に、ＨＦ対照動物に見られるＰＲＳＷにおける右方向の移行を防止した。
【図４】図４は、左室拡張（ＥＳＶＩ、上パネル）および中隔乳頭の短軸の長さ（ＳＡ、中央パネル）の増加が、心不全対照（Ｎ＝６、斜線棒グラフ）と比較して、ＡＳＭ注射後（Ｎ＝５、無地棒グラフ）に減衰したことを表している。左室の長軸の長さ（ＬＡ、下パネル）は、群間で違いがなかった。ＨＦ対照（「なし」）を含む全動物は、ＡＳＭ由来筋細胞生存（ログ）のＬＶリモデリング（各パネルに挿入、Ｎ＝１１）との関係を評価するために使用された。ＡＳＭ由来筋細胞生存が最高であった動物は、特にＬＶの短軸拡張において、最大の減衰を示した。それぞれの関係に、相関統計が提示されている。
【図４Ａ】図４は、左室拡張（ＥＳＶＩ、上パネル）および中隔乳頭の短軸の長さ（ＳＡ、中央パネル）の増加が、心不全対照（Ｎ＝６、斜線棒グラフ）と比較して、ＡＳＭ注射後（Ｎ＝５、無地棒グラフ）に減衰したことを表している。左室の長軸の長さ（ＬＡ、下パネル）は、群間で違いがなかった。ＨＦ対照（「なし」）を含む全動物は、ＡＳＭ由来筋細胞生存（ログ）のＬＶリモデリング（各パネルに挿入、Ｎ＝１１）との関係を評価するために使用された。ＡＳＭ由来筋細胞生存が最高であった動物は、特にＬＶの短軸拡張において、最大の減衰を示した。それぞれの関係に、相関統計が提示されている。
【図４Ｂ】図４は、左室拡張（ＥＳＶＩ、上パネル）および中隔乳頭の短軸の長さ（ＳＡ、中央パネル）の増加が、心不全対照（Ｎ＝６、斜線棒グラフ）と比較して、ＡＳＭ注射後（Ｎ＝５、無地棒グラフ）に減衰したことを表している。左室の長軸の長さ（ＬＡ、下パネル）は、群間で違いがなかった。ＨＦ対照（「なし」）を含む全動物は、ＡＳＭ由来筋細胞生存（ログ）のＬＶリモデリング（各パネルに挿入、Ｎ＝１１）との関係を評価するために使用された。ＡＳＭ由来筋細胞生存が最高であった動物は、特にＬＶの短軸拡張において、最大の減衰を示した。それぞれの関係に、相関統計が提示されている。
【図４Ｃ】図４は、左室拡張（ＥＳＶＩ、上パネル）および中隔乳頭の短軸の長さ（ＳＡ、中央パネル）の増加が、心不全対照（Ｎ＝６、斜線棒グラフ）と比較して、ＡＳＭ注射後（Ｎ＝５、無地棒グラフ）に減衰したことを表している。左室の長軸の長さ（ＬＡ、下パネル）は、群間で違いがなかった。ＨＦ対照（「なし」）を含む全動物は、ＡＳＭ由来筋細胞生存（ログ）のＬＶリモデリング（各パネルに挿入、Ｎ＝１１）との関係を評価するために使用された。ＡＳＭ由来筋細胞生存が最高であった動物は、特にＬＶの短軸拡張において、最大の減衰を示した。それぞれの関係に、相関統計が提示されている。
【図５】図５は、ＮＯＧＡ  Ｂｉｏｓｅｎｓｅナビゲーションシステムからの画像である。前壁中隔および前壁心尖部の壁の短縮前後の３次元電気機械的（電圧）マッピング。ＮＯＧＡマップのカラーコーディングは、電圧の高いものから低いものへと、紫（＞１５．００ｍＶ）から赤（＜＝５．００ｍＶ）の虹形式で表される。
【図６Ａ】図６は、生着した筋芽細胞のマッソン・トリクローム組織像を示している。Ａ）筋芽細胞注射後の梗塞を起こした心筋の低倍率（１０Ｘ）画像（右）。右下隅の部分は、赤に染色される正常心筋である。青に染色された部分は、瘢痕化した梗塞部分に見られる繊維性細胞を示している。心内膜表面の赤い斑点状の部分（矢印）は、増殖筋芽細胞を含んでいるが、これは高倍率画像（左上；Ｈ＆Ｅ、原型拡大２００Ｘ）でより認識しやすい。Ｂ）筋芽細胞は、多核筋管を形成している。
【図６Ｂ】図６は、生着した筋芽細胞のマッソン・トリクローム組織像を示している。Ａ）筋芽細胞注射後の梗塞を起こした心筋の低倍率（１０Ｘ）画像（右）。右下隅の部分は、赤に染色される正常心筋である。青に染色された部分は、瘢痕化した梗塞部分に見られる繊維性細胞を示している。心内膜表面の赤い斑点状の部分（矢印）は、増殖筋芽細胞を含んでいるが、これは高倍率画像（左上；Ｈ＆Ｅ、原型拡大２００Ｘ）でより認識しやすい。Ｂ）筋芽細胞は、多核筋管を形成している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【国際調査報告】
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