(57)【要約】本発明は、ST6GalNAcIの切り詰め型突然変異体に関する組成物および方法を特徴とする。特に、本発明は、切り詰め型のヒト、マウスおよびニワトリST6GalNAcIポリペプチドを特徴とする。本発明はまた、そのような切り詰め型ポリペプチドをコードする核酸、加えて、ベクター、宿主細胞、発現系、ならびにそのようなポリペプチドを発現させる、および用いる方法を特徴とする。2008501344.tif 000092
2008501344.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ST6GalNAcIシグナルドメインの全部または一部を欠損し、かつアミノ酸残基1位〜232位を欠損するニワトリST6GalNAcIポリペプチド切り詰め突然変異体ではないという条件付きで、ST6GalNAcIポリペプチドがヒトST6GalNAcIポリペプチドおよびニワトリST6GalNAcIポリペプチドからなる群より選択される、単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項２】
ST6GalNAcI膜貫通ドメインの全部または一部をさらに欠損している、請求項1記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項３】
ST6GalNAcIステムドメインの全部または一部をさらに欠損している、請求項2記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項４】
SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、および図31に示されたニワトリ配列のΔ225からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有する、請求項1記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、および図31に示されたニワトリ配列のΔ225からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項６】
SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、および図31に示されたニワトリ配列のΔ225からなる群より選択されるアミノ酸配列からなる、請求項1記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項７】
請求項1記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドに共有結合したタグポリペプチドを含む単離されたキメラポリペプチド。
【請求項８】
タグポリペプチドが、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、FLAGタグ、およびデンプン結合ドメインタグからなる群より選択される、請求項7記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項９】
請求項1または請求項4記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸。
【請求項１０】
核酸がそれに作動可能に連結したプロモーター/制御配列をさらに含む、請求項9記載の単離された核酸。
【請求項１１】
請求項9記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１２】
請求項11記載の単離された核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項１３】
真核細胞または原核細胞である、請求項12記載の組換え細胞。
【請求項１４】
真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞および真菌細胞からなる群より選択される、請求項13記載の組換え細胞。
【請求項１５】
昆虫細胞が、SF9細胞、SF9+細胞、Sf21細胞、HIGH FIVE細胞またはショウジョウバエ(Drosophila)Schneider S2細胞からなる群より選択される、請求項14記載の組換え細胞。
【請求項１６】
原核細胞が、大腸菌(E. coli)細胞および枯草菌(B. subtilis)細胞からなる群より選択される、請求項13記載の組換え細胞。
【請求項１７】
切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項13記載の組換え細胞を増殖させる段階を含む切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを産生する方法。
【請求項１８】
請求項1記載のポリペプチドをシアル酸部分および受容体部分とインキュベートする段階を含む、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、該ポリペプチドが該シアル酸部分の該受容体部分への共有結合を媒介し、それにより、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する、方法。
【請求項１９】
請求項1記載のポリペプチドをシチジン一リン酸-シアル酸(CMP-NAN)シアル酸供与体およびアシアロウシ顎下腺ムチン受容体部分とインキュベートする段階を含む、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、該ポリペプチドが、該CMP-NANシアル酸供与体から該アシアロウシ顎下腺ムチン受容体への該シアル酸部分の転移を媒介し、それによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する、方法。
【請求項２０】
請求項1記載のポリペプチドをシチジン一リン酸-シアル酸(CMP-NAN)シアル酸供与体およびポリペプチド受容体とインキュベートする段階を含む、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、該ポリペプチド受容体が、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンα、-β、および-γ、第IX因子、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン-2、エリスロポエチン、抗TNF-α、ならびにリソソーム加水分解酵素からなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
ポリペプチド受容体が糖ペプチドである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
さらに、シアル酸部分がポリエチレングリコール部分を含む、請求項19または請求項20記載の方法。
【請求項２３】
方法が商業的規模で行われる、請求項19または請求項20記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ST6GalNAcIポリペプチドの切り詰め型突然変異体に関連した組成物および方法を特徴とする。特に、本発明は切り詰め型ヒト、マウスおよびニワトリST6GalNAcIポリペプチドを特徴とする。本発明はまた、そのような切り詰め型ポリペプチドをコードする核酸、加えて、ベクター、宿主細胞、発現系、ならびにそのようなポリペプチドを発現させて、用いる方法を特徴とする。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2004年6月3日に出願された、米国仮出願第60/576,433号、および2005年2月4日に出願された米国仮出願第60/650,011号の恩典を主張する；それらの両方ともすべての目的について参照により本明細書に組み入れられている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
オリゴ糖構造の大きな多様性および糖ペプチドの多くの型が天然で見出され、これらは、部分的には、多数のグリコシルトランスフェラーゼにより、合成される。グリコシルトランスフェラーゼは、糖鎖の開始または伸長のために活性化モノまたはオリゴ糖残基を存在する受容体分子へ転移させることにより、糖脂質、糖ペプチドおよび多糖の合成を触媒する。触媒反応は、酵素の触媒部位に加えて、適切なドメインによる供与体および受容体の両方の認識を含むと考えられている。
【０００４】
多くのペプチド治療用物質および多くの可能性のあるペプチド治療用物質は、グリコシル化ペプチドである。組換え糖ペプチドの作製は、組換え非グリコシル化ペプチドと対照的に、組換えで産生されたペプチドが、細胞内かまたはペプチドが細胞により産生された後かのいずれかで、追加の処理段階にかけられ、その処理段階がインビトロで行われることを必要とする。ペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼを用いて、1つまたは複数のグリコシル基をペプチド上へ導入するために酵素的に処理されうる。具体的には、グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシル基をペプチドへ共有結合性に付着させる。
【０００５】
糖ペプチドを作製するためのペプチド処理の余分のインビトロ段階は、時間がかかり、かつ高くつきうる。これは、部分的には、ペプチドのインビトログリコシル化のための組換えグリコシルトランスフェラーゼおよび糖ペプチド治療用物質を作製するための糖ペプチドを作製する負担および費用のせいである。組換え糖治療用物質の需要および有用性が増加するにつれて、より効率的に糖ペプチドを調製するために新しい方法が必要とされる。その上、ますます糖ペプチドが、様々な疾患の処置に有用であることが発見されるにつれて、それらの生産の費用を低くする方法の必要性がある。さらに、糖ペプチド治療用物質を開発および改良するのに用いられる組換え糖ペプチドをより効率的に作製する方法を開発する当技術分野における必要性もある。
【０００６】
グリコシルトランスフェラーゼは、全体として参照により本明細書に組み入れられている、国際(PCT)特許出願第WO 03/031464(PCT/US02/32263)号（特許文献1）に一般的に概説されている。治療用糖ペプチドの開発および作製において有用性をもつ、1つのそのような特定のグリコシルトランスフェラーゼは、ST6GalNAcIである。ST6GalNAcI、すなわち、GalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ、はシアル酸供与体からシアル酸受容体へのシアル酸の転移を触媒する。例えば、全長のニワトリST6GalNAcI酵素は、Kurosawa et al.(1994, J. Biol. Chem. 269:1402-1409)（非特許文献1）により開示されている。しかしながら、増強された触媒活性または増強された安定性のような増強された生物活性を有する、この酵素の有用な突然変異体の同定は、今まで報告されていない。
【０００７】
以前は、糖ペプチドのインビトロ作製のために組換えグリコシルトランスフェラーゼの有効性を増加させる努力がなされてきた。今まで、オリゴ糖または糖ペプチドの小規模生産にも時々、適しうる組換えグリコシルトランスフェラーゼに関しては、限られた研究しかなされていない。例えば、Kurosawa et al.(1994, J. Biol. Chem. 269:1402-1409)（非特許文献1）は、全長酵素のアミノ酸残基1位〜232位を欠損するニワトリST6GalNAcIの切り詰め突然変異体を記載している。マウスST6GalNAcIの切り詰めもまた、Kurosawa et al.(2000, J. BioChem., 127:845-854)（非特許文献2）により報告された。しかしながら、例えば、Kurosawa et al.により記載された切り詰め型ニワトリ酵素は、他のST6GalNAcI酵素の基質特異性を欠き、かつ糖ペプチド治療用物質の生産を含む、「薬学的規模」処理および反応に必要とされる活性を欠く。それゆえに、糖ペプチド治療用物質の生産を含む「薬学的規模」処理および反応に適している活性を有する組換えグリコシルトランスフェラーゼについての必要性がなお存在している。特に、有利な機能的および構造的特徴をもつ組換えグリコシルトランスフェラーゼの必要性がある。さらに、組換えグリコシルトランスフェラーゼの同定および特徴付けの効率的な方法、加えてそのようなグリコシルトランスフェラーゼの産生の必要性が存在する。本発明は、これらの必要性に取り組みかつ満足させる。
【０００８】
【特許文献１】国際(PCT)特許出願第WO 03/031464(PCT/US02/32263)号
【非特許文献１】Kurosawa et al.(1994, J. Biol. Chem. 269:1402-1409)
【非特許文献２】Kurosawa et al.(2000, J. BioChem., 127:845-854)
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、例えば、ST6GalNAcIシグナルドメインの全部もしくは一部、ST6GalNAcI膜貫通ドメインの全部もしくは一部、またはST6GalNAcIステムドメインの全部もしくは一部を欠損する単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド；ただし、そのポリペプチドはアミノ酸残基1位〜232位を欠損するニワトリST6GalNAcIポリペプチド切り詰め突然変異体ではないという条件でのポリペプチドを提供する。切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、例えば、切り詰め型ヒトST6GalNAcI切り詰め型ニワトリST6GalNAcI、または切り詰め型マウスST6GalNAcIでありうる。
【００１０】
一つの態様において、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200から選択されるポリペプチドと、少なくとも90%または95%の同一性を有する。もう一つの態様において、単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、融合タンパク質で、例えば、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、FLAGタグ、およびデンプン結合ドメインタグのようなタグポリペプチドを含みうる。
【００１２】
もう一つの局面において、本発明は、上記の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。核酸は、プロモーター/制御配列へ作動可能に連結されうる、または発現ベクターの一部でありうる。本発明はまた、上記の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を含む。そのような宿主細胞は、真核生物または原核生物の宿主細胞でありうる。真核細胞は、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および真菌細胞を含む。昆虫細胞は、例えば、SF9細胞、SF9+細胞、Sf21細胞、HIGH FIVE細胞、またはショウジョウバエ(Drosophila)Schneider S2細胞を含みうる。好ましい原核細胞は、例えば、大腸菌(E.coli)細胞および枯草菌(B. subtilis)細胞を含む。本発明はまた、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドの発現に適した条件下で組換え宿主細胞を増殖させることによる、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを産生するためにその宿主細胞を用いる方法を含む。
【００１３】
もう一つの局面において、本発明は、シアル酸部分の受容体部分への共有結合を媒介し、それによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒するために上記の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを用いる、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法を含む。
【００１４】
さらなる局面において、本発明は、上記の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをシチジン一リン酸-シアル酸(CMP-NAN)シアル酸供与体およびアシアロウシ顎下腺ムチン受容体部分とインキュベートすることによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、該ポリペプチドが、該CMP-NANシアル酸供与体から該アシアロウシ顎下腺ムチン受容体への該シアル酸部分の転移を媒介し、それによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する、方法を提供する。好ましい態様において、受容体は、例えば、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンα、-β、および-γ、第IX因子、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン-2、エリスロポエチン、抗TNF-α、ならびにリソソーム加水分解酵素のようなポリペプチド受容体である。他の態様において、ポリペプチド受容体は糖ペプチドである。さらなる好ましい態様において、シアル酸部分は、ポリエチレングリコール部分を含む。なおさらなる態様において、方法は、シアル酸付加された産物、例えば、シアル酸付加された糖タンパク質または糖ペプチド、の商業的規模の量を製造するために商業的規模で行われる。
【００１５】
もう一つの局面において、本発明は、ST6GalNAcIシグナルドメインの全部または一部を欠損する単離された切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドであって、そのポリペプチドがアミノ酸残基1位〜232位を欠損するニワトリST6GalNAcIポリペプチド切り詰め突然変異体ではないという条件でのポリペプチドを提供する。他の態様において、切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドは、追加として、ST6GalNAcI膜貫通ドメインの全部もしくは一部を欠損しうる、またはST6GalNAcIステムドメインの全部もしくは一部を欠損しうる。
【００１６】
いくつかの態様において、切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドは、以下と少なくとも90%または95%同一性を有するアミノ酸配列を含む：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、および図31に示されたニワトリ配列のΔ225。さらなる態様において、切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドは、融合タンパク質で、例えば、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、FLAGタグ、およびデンプン結合ドメインタグのようなタグポリペプチドを含みうる。
【００１８】
もう一つの局面において、本発明は、上記の切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。核酸は、プロモーター/制御配列へ作動可能に連結されうる、または発現ベクターの一部でありうる。本発明はまた、上記の切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を含む。そのような宿主細胞は、真核生物または原核生物の宿主細胞でありうる。真核細胞は、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および真菌細胞を含む。昆虫細胞は、例えば、SF9細胞、SF9+細胞、Sf21細胞、HIGH FIVE細胞、またはショウジョウバエSchneider S2細胞を含みうる。好ましい原核細胞は、例えば、大腸菌細胞および枯草菌細胞を含む。本発明はまた、切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドの発現に適した条件下で組換え宿主細胞を増殖させることによる、切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドを産生するためにその宿主細胞を用いる方法を含む。
【００１９】
もう一つの局面において、本発明は、シアル酸部分の受容体部分への共有結合を媒介し、それによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒するために上記の切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドを用いる、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法を含む。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、上記の切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドをシチジン一リン酸-シアル酸(CMP-NAN)シアル酸供与体およびアシアロウシ顎下腺ムチン受容体部分とインキュベートすることによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、該ポリペプチドが、該CMP-NANシアル酸供与体から該アシアロウシ顎下腺ムチン受容体への該シアル酸部分の転移を媒介し、それによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する、方法を提供する。好ましい態様において、受容体は、例えば、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンα、-β、および-γ、第IX因子、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン-2、エリスロポエチン、抗TNF-α、ならびにリソソーム加水分解酵素のようなポリペプチド受容体である。他の態様において、ポリペプチド受容体は糖ペプチドである。さらなる好ましい態様において、シアル酸部分は、ポリエチレングリコール部分を含む。なおさらなる態様において、方法は、シアル酸付加された産物、例えば、シアル酸付加された糖タンパク質または糖ペプチド、の商業的規模の量を製造するために商業的規模で行われる。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の組成物および方法は、ヒトST6GalNAcI、マウスST6GalNAcI、およびニワトリST6GalNAcIの切り詰め突然変異体、これらのタンパク質をコードする単離された核酸、ならびにそれらの使用の方法を含む。ST6GalNAcIポリペプチドは、シアル酸供与体からシアル酸受容体へのシアル酸の転移を触媒する。
【００２２】
グリコシルトランスフェラーゼST6GalNAcIは、治療用糖ペプチドのグリコシル化にとって必須の試薬である。加えて、ST6GalNAcIは、治療的に重要な糖ペプチドおよびオリゴ糖治療用物質の研究および開発にとって重要な試薬である。ST6GalNAcIは、典型的には、天然源から、または労力および費用のかかるインビトロおよび組換えの供給源から、単離および精製される。本発明は、ST6GalNAcI酵素の生産の簡単化され、かつより費用効果の高い方法に関する、組成物および方法を提供する。特に、本発明は、全長酵素対応物と比較して改善されかつ有用な性質をもつ切り詰め型ST6GalNAcI酵素に関する組成物および方法を提供する。
【００２３】
本発明の切り詰め型グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、グリコシル化ペプチドのインビボおよびインビトロでの調製に、加えて本発明の切り詰め型グリコシルトランスフェラーゼ酵素により転移されうる特定のグリコシル残基を含むオリゴ糖の作製に有用である。これは、ST6GalNAcIポリペプチドの切り詰め型が、それらの全長ポリペプチド対応物と匹敵する、および場合によっては、それを超える、生物活性を有することは初めて本明細書で示されているからである。本出願ではまた、そのような切り詰め突然変異体が生物活性を有することだけでなく、切り詰め突然変異体が、溶解性、安定性およびタンパク分解性分解に対する抵抗性の増強された性質を有しうることもまた開示されている。
【００２４】
定義
他に定義されていない限り、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似したまたは等価の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験に用いられうるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載されている。
【００２５】
以下のような、当技術分野において一般的であるような特定の略語が本明細書で用いられる：アセチルとして「Ac」；グルコースとして「Glc」；グルコサミンとして「Glc」；グルクロン酸として「GlcA」；イズロン酸として「IdoA」；N-アセチルグルコサミンとして「GlcNAc」；N-アセチルノイラミン酸として「NAN」または「シアル酸」または「SA」；ウリジン二リン酸として「UDP」；シチジン一リン酸として「CMP」。
【００２６】
本明細書に用いられる場合、以下の用語のそれぞれは、本セクションにおけるそれに関連した意味をもつ。
【００２７】
冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、その冠詞の文法的対象の1つを、または1つより多くを(すなわち、少なくとも1つを)指すために本明細書で用いられる。例として、「1つの要素(an element)」は、1つの要素または1つより多い要素を意味する。
【００２８】
「コードする」とは、ヌクレオチドの限定された配列(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)かまたはアミノ酸の限定された配列のいずれかおよびそれらから生じる生物学的性質を有する生物学的過程における他のポリマーならびに高分子の合成のための鋳型としての役割を果たしうる、遺伝子、cDNAまたはmRNAのような核酸におけるヌクレオチドの特定の配列の固有の性質を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を生じる場合には、そのタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であるコード鎖、および遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖の両方は、その遺伝子もしくはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると称されうる。
【００２９】
遺伝子の「コード領域」は、その遺伝子の転写により生じるmRNA分子のコード領域と、それぞれ、相同であるまたは相補的である、その遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基およびその遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドを含む。
【００３０】
mRNA分子の「コード領域」はまた、そのmRNA分子の翻訳中のトランスファーRNA分子のアンチコドン領域とマッチしている、または終止コドンをコードするmRNA分子のヌクレオチド残基を含む。コード領域は、従って、mRNA分子によりコードされる成熟タンパク質に存在しないアミノ酸残基(例えば、タンパク質搬出シグナル配列におけるアミノ酸残基)に対応するヌクレオチド残基を含みうる。
【００３１】
「アフィニティータグ」は、第二のポリペプチドの精製、単離、ターゲティング、輸送または同定を目的として、第二のポリペプチドへ遺伝的にもしくは化学的に融合されうるペプチドまたはポリペプチドである。アフィニティータグの第二のタンパク質への「遺伝的」付着は、核酸ベクターにおける第二のタンパク質をコードする核酸に隣接したアフィニティータグをコードする核酸をクローニングすることによりもたらされうる。
【００３２】
本明細書に用いられる場合、用語「グリコシルトランスフェラーゼ」は、供与体糖を受容体部分へ転移させる能力を有する任意の酵素/タンパク質を指す。
【００３３】
「糖ヌクレオチド生成酵素」は、糖ヌクレオチドを生じる能力を有する酵素である。糖ヌクレオチドは当技術分野において公知であり、限定されるわけではないが、UDP-Gal、UDP-GalNAcおよびCMP-NANのような部分を含む。
【００３４】
「単離された核酸」は、天然に存在する状態においてそれに隣接する配列から分離された核酸セグメントまたは断片、例えば、通常ではその断片に隣接している配列、例えば、それが天然に存在するゲノムにおいてその断片に隣接した配列、から取り出されたDNA断片、を指す。その用語はまた、その核酸、例えばRNAもしくはDNA、に天然で付随する他の成分、または細胞においてそれに天然で付随するタンパク質、から実質的に精製されている核酸に適用される。その用語は、それゆえに、例えば、ベクターへ、自律複製プラスミドもしくはウイルスへ、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAへ組み入れられている、または他の配列から独立した別個の分子として(例えば、cDNA、または、PCRもしくは制限酵素消化により産生されたゲノムもしくはcDNA断片として)存在する、組換えDNAを含む。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【００３５】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基についての以下の略語が用いられる。「A」はアデノシンを指し、「C」はシチジンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」は、核酸の一本鎖または平行および逆平行鎖を意味する。従って、ポリヌクレオチドは一本鎖かまたは二本鎖のいずれかの核酸でありうる。
【００３７】
用語「核酸」は典型的には、大きなポリヌクレオチドを指す。しかしながら、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書で交換可能に用いられる。
【００３８】
用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的には、短いポリヌクレオチド、一般的には約50ヌクレオチドより長くないもの、を指す。ヌクレオチド配列は、DNA配列(すなわち、A、T、G、C)により表される場合、これはまた、「U」が「T」と置き換わるRNA配列(すなわち、A、U、G、C)を含むことは理解されているものと思われる。
【００３９】
慣習的な表示法が核酸配列を記載するために本明細書で用いられる：一本鎖核酸配列の左手末端は5'末端である；二本鎖核酸配列の左手方向は、5'方向と呼ばれる。
【００４０】
例えば、第一の核酸配列の最後のヌクレオチドが、第二の核酸配列の最初のヌクレオチドへリン酸ジエステル結合を通して化学的に結合している場合、第一の限定された核酸配列は、第二の限定された核酸配列に「直接隣接」していると言われる。逆に、例えば、第一の核酸配列の最初のヌクレオチドが、第二の核酸配列の最後のヌクレオチドへリン酸ジエステル結合を通して化学的に結合している場合、第一の限定された核酸配列は、第二の限定された核酸配列に「直接隣接」していると言われる。
【００４１】
例えば、第一のポリペプチド配列の最後のアミノ酸が、第二のポリペプチド配列の最初のアミノ酸へペプチド結合を通して化学的に結合している場合、第一の限定されたポリペプチド配列は、第二の限定されたポリペプチド配列に「直接隣接」していると言われる。逆に、例えば、第一のポリペプチド配列の最初のアミノ酸が、第二のポリペプチド配列の最後のアミノ酸へペプチド結合を通して化学的に結合している場合、第一の限定されたポリペプチド配列は、第二の限定されたポリペプチド配列に「直接隣接」していると言われる。
【００４２】
新生RNA転写産物へのヌクレオチドの5'から3'への付加の方向は、転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」と呼ばれる；DNA上の参照点の5'側に位置しているDNA鎖上の配列は、「上流配列」と呼ばれる；DNA上の参照点の3'側に位置しているDNA鎖上の配列は、「下流配列」と呼ばれる。
【００４３】
他に特定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、お互いの縮重バージョンであり、かつ同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列およびRNAは、イントロンを含みうる。
【００４４】
本明細書に用いられる場合、「相同的な」とは、同じ核酸鎖の2つの領域間、または2つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両方の領域におけるヌクレオチド残基の位置が、同じヌクレオチド残基により占有される場合、その領域は、その位置において相同である。各領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基位置が同じ残基により占有される場合には、第一領域は、第二領域と相同である。2つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基により占有されている2つの領域のヌクレオチド残基位置の比率によって表される。例として、ヌクレオチド配列5'-ATTGCC-3'を有する領域およびヌクレオチド配列5'-TATGGC-3'を有する領域は、50%相同性を共有する。好ましくは、第一領域は、第一部分を含み、第二領域は第二部分を含み、各部分のヌクレオチド残基位置の少なくとも約50%、および好ましくは少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%が同じヌクレオチド残基により占有されている。より好ましくは、各部分のすべてのヌクレオチド残基位置は、同じヌクレオチド残基により占有されている。
【００４５】
本明細書に用いられる場合、用語「パーセント同一性」は、「相同性」と同意語として用いられる。2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成されうる。例えば、2つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、KarlinおよびAltschul(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)のアルゴリズムであり、KarlinおよびAltschul(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)におけるように改変される。このアルゴリズムは、Altschul et al.(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)のNBLASTおよびXBLASTプログラムへ組み込まれており、例えば、National Institutes of Health(NIH)におけるNational Library of Medicine(NLM)のNational Center for Biotechnology Information(NCBI)ワールドワイドウェブサイトのBLASTサイトでアクセスされうる。BLASTヌクレオチド検索は、本明細書に記載された核酸と相同的なヌクレオチド配列を得るために、以下のパラメーターを用いて、NBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と名付けられている)で行われうる：ギャップペナルティー＝5；ギャップ伸長ペナルティー＝2；不一致ペナルティー＝3；一致報酬＝1；期待値10.0：およびワードサイズ＝11。BLASTタンパク質検索は、本明細書に記載されたタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得るために、以下のパラメーターを用いて、XBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と名付けられている)またはNCBI「blastp」プログラムで行われうる：期待値10.0、BLOSUM62スコア行列。
【００４６】
比較を目的としてギャップドアラインメントを得るために、ギャップド(Gapped)BLASTが、Altschyl et al.(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されているように利用されうる。または、PSI-BlastまたはPHI-Blastは、分子間(同上)の遠い関係および共通のパターンを有する分子間の関係を検出する反復検索を行うために用いられうる。BLAST、ギャップドBLAST、PSI-BlastおよびPHI-Blastプログラムを利用する場合、National Institutes of HealthのNational Library of MedicineのNational Center for Biotechnology Informationのウェブサイト上で利用可能である、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが用いられうる。
【００４７】
2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許すまたは許さないに関わらず、上で記載されたものと類似した技術を用いて決定されうる。パーセント同一性を計算することにおいて、典型的には、正確な一致が数えられる。
【００４８】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結した、アミノ酸残基、それらの、関連した天然に存在する構造的変異体および合成の天然に存在しない類似体から構成されるポリマー、それらの、関連した天然に存在する構造的変異体ならびに合成の天然に存在しない類似体を指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成機を用いて、合成されうる。「ポリペプチド」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、それゆえに、そのポリマーが少なくとも2つのアミノ酸残基を含むとの条件で、アミノ酸残基の任意のサイズのポリマーを指す。
【００４９】
用語「タンパク質」は、典型的には、大きなペプチドを指し、本明細書では「ポリペプチド」とも呼ばれる。用語「ペプチド」は、典型的には、短いポリペプチドを指す。しかしながら、用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書で交換可能に用いられる。例えば、用語「ペプチド」は、3個のアミノ酸のアミノ酸ポリマー、および数百個のアミノ酸のアミノ酸ポリマーを指しうる。
【００５０】
本明細書に用いられる場合、アミノ酸は、以下の表に示されているように、それらの完全な名前により、それらに対応する三文字コードにより、またはそれらに対応する一文字コードにより、表される：
完全な名前 三文字コード 一文字コード
アスパラギン酸           Asp                D
グルタミン酸             Glu                E
リジン                   Lys                K
アルギニン               Arg                R
ヒスチジン               His                H
チロシン                 Tyr                Y
システイン               Cys                C
アスパラギン             Asn                N
グルタミン               Gln                Q
セリン                   Ser                S
トレオニン               Thr                T
グリシン                 Gly                G
アラニン                 Ala                A
バリン                   Val                V
ロイシン                 Leu                L
イソロイシン             Ile                I
メチオニン               Met                M
プロリン                 Pro                P
フェニルアラニン         Phe                F
トリプトファン           Trp                W
【００５１】
用語「タンパク質」は、典型的には、大きなポリペプチドを指す。
【００５２】
用語「ペプチド」は、典型的には、短いポリペプチドを指す。
【００５３】
慣習的な表示法が、ポリペプチド配列を描くために本明細書で用いられる：ポリペプチド配列の左手末端は、アミノ末端である；ポリペプチド配列の右手末端は、カルボキシル末端である。
【００５４】
「治療用ペプチド」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、疾患状態を処置するために、または生きている生物体の健康全般を向上させるために有用である任意のペプチドを指す。治療用ペプチドは、単独で投与される場合、またはもう一つの物質の治療的能力を向上させるために用いられる場合、生きている生物体においてそのような変化をもたらしうる。用語「治療用ペプチド」は、本明細書で、用語「治療用ポリペプチド」および「治療用タンパク質」と交換可能に用いられる。
【００５５】
「試薬ペプチド」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、食物生化学、バイオレメディエーション、低分子治療用物質の製造において、および治療用ペプチドの製造においてでも、有用である任意のペプチドを指す。典型的には、試薬ペプチドは、前述の領域のいずれかにおいて有用な生産物を製造する反応を触媒する能力がある酵素である。用語「試薬ペプチド」は、本明細書で、用語「試薬ポリペプチド」および「試薬タンパク質」と交換可能に用いられる。
【００５６】
「糖ペプチド」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、ペプチドに共有結合性に連結した少なくとも1つの糖質部分を有するペプチドを指す。糖ペプチドが上記のように「治療用糖ペプチド」でありうることは理解されていると思われる。用語「糖ペプチド」は、本明細書で、用語「糖ポリペプチド」および「糖タンパク質」と交換可能に用いられる。
【００５７】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部へ送達するために用いられうる組成物である。多数のベクターが当技術分野において公知であり、限定されるわけではないが、線状核酸、イオン性または両親媒性化合物と付随した核酸、プラスミドおよびウイルスを含む。従って、用語「ベクター」は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。その用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞への核酸の移動を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、限定されるわけではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含む。
【００５８】
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列へ作動可能に連結した発現制御配列を含む組換え核酸を含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞により、またはインビトロ発現系において、供給されうる。発現ベクターは、組換え核酸を組み入れるコスミド、プラスミド(例えば、裸の、またはリポソームに含まれる)およびウイルスのような、当技術分野において公知のすべてのものを含む。
【００５９】
「多重クローニング部位（multiple cloning site）」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、少なくとも1つの制限酵素により認識されるヌクレオチドの1つより多い配列を含む核酸ベクターの領域である。
【００６０】
「抗生物質耐性マーカー」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、生きている細胞に発現される時、抗生物質の存在下において生きかつ増殖する能力をその細胞へ与えるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を指す。
【００６１】
本明細書に用いられる場合、用語「ST6GalNAcI」は、N-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼIを指す。
【００６２】
ペプチドの「切り詰め」型とは、その用語が本明細書で用いられる場合、ペプチドの全長アミノ酸配列と比較して1つ以上のアミノ酸残基を欠損しているペプチドを指す。例えば、ペプチド「NH2-Ala-Glu-Lys-Leu-COOH」は、全長ペプチド「NH2-Gly-Ala-Glu-Lys-Leu-COOH」のN末端切り詰め型である。用語「切り詰め型」および「切り詰め突然変異体」は、本明細書で交換可能に用いられる。非限定的例として、切り詰め型ペプチドは、活性ドメイン、ステム(stem)ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルドメインを含むST6GalNAcIであって、シグナルドメインが、全長ST6GalNAcIと比較して1つのN末端アミノ酸残基を欠損している。
【００６３】
用語「糖」は、一般的に、任意の糖質、(CH2O)nの最も基本的な構造をもつ化学的実体、を指す。糖は複雑性において異なり、核酸、アミノ酸、または実質的には生体系に存在する任意の他の化学的部分も含みうる。
【００６４】
「単糖」は、定義済みのアイデンティティの糖質の単一の単位を指す。
【００６５】
「オリゴ糖」は、定義済みのアイデンティティの糖質の数個の単位からなる分子を指す。典型的には、2〜20単位の糖配列は、オリゴ糖と呼ばれうる。
【００６６】
「多糖」は、定義済みのアイデンティティの糖質の多数の単位からなる分子を指す。しかしながら、2個以上の単位の任意の糖は、正確には、多糖とみなされうる。
【００６７】
本明細書に用いられる場合、糖「供与体(donor)」は、グリコシルトランスフェラーゼが糖を糖受容体へ転移させるように、糖をグリコシルトランスフェラーゼへ供給することができる部分である。非限定的例として、GalNAc供与体は、UDP-GalNAcでありうる。
【００６８】
本明細書に用いられる場合、糖「受容体(acceptor)」は、糖供与体から糖を受けることができる部分である。グリコシルトランスフェラーゼは、糖を糖受容体へ共有結合性に連結することができる。非限定的例として、G-CSFは、GalNAc受容体であり得、GalNAc部分は、GalNAc-トランスフェラーゼを経由してGalNAc受容体へ共有結合性に連結されうる。
【００６９】
「限定されたサイズ」をもつオリゴ糖は、同定可能な数の単糖単位からなるものである。例えば、10個の単糖単位からなるオリゴ糖は、10個の同一の単糖単位、または第一のアイデンティティの5個の単糖単位および第二のアイデンティティの5個の単糖単位からなりうるものである。さらに、不均一なアイデンティティの単糖単位からなる限定されたサイズのオリゴ糖は、オリゴ糖の始めから終わりまで任意の順序で単糖単位を有しうる。
【００７０】
「ランダムなサイズ」のオリゴ糖は、限定されたサイズのオリゴ糖生成物を供給しない方法を用いて合成されうるものである。例えば、オリゴ糖合成の方法は、間にあるいくつかまたはすべての長さを含む、2個の単糖ユニットから22個の糖ユニットまでの範囲であるオリゴ糖を供給しうる。
【００７１】
「商業的規模」は、単一の反応における生成物糖、または糖タンパク質、または糖ペプチドのグラム規模の製造を指す。好ましい態様において、商業的規模は、約50、75、80、90、または100、125、150、175、または200グラムより多い製造を指す。
【００７２】
用語「シアル酸」は、9炭素のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、N-アセチル-ノイラミン酸(2-ケト-5-アセタミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノース-1-オン酸(しばしば、Neu5Ac、NeuAcまたはNANAと略記される))である。ファミリーの第二メンバーは、N-グリコリル-ノイラミン酸(Neu5GcまたはNeuGc)であり、NeuAcのN-アセチル基がヒドロキシル化されている。第三のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソン酸(KDN)(Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265:21811-21819 (1990))である。9-置換型シアル酸、例えば、9-O-ラクチル-Neu5Acまたは9-O-アセチル-Neu5Ac、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Acおよび9-アジド-9-デオキシ-Neu5Acのような9-O-C1〜C6アシル-Neu5Ac、も含まれる。シアル酸ファミリーの概説として、例えば、Varki, Glycobiology 2:25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed.(Springer-Verlag, New York (1992))を参照。シアル酸付加手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、1992年10月1日に公開された国際出願第WO 92/16640号に開示されている。
【００７３】
本明細書に用いられる場合、「タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、または糖ペプチドを再構築する方法」は、グリコシルトランスフェラーゼを用いて糖残基のタンパク質、ペプチド、糖タンパク質または糖ペプチドへの付加を指す。好ましい態様において、糖残基は、PEG分子へ共有結合性に付着させられる。
【００７４】
本明細書に用いられる場合、「不対システイン残基」は、正しく折り畳まれたタンパク質(すなわち、生物活性をもつタンパク質)において、もう一つのシステイン残基とジスルフィド結合を形成していないシステイン残基を指す。
【００７５】
「不溶性グリコシルトランスフェラーゼ」は、細菌の封入体において発現されているグリコシルトランスフェラーゼを指す。不溶性グリコシルトランスフェラーゼは、典型的には、例えば、界面活性剤もしくはカオトロピック剤またはいくつかの組み合わせを用いて可溶化または変性される。「再構築」は、生物活性のあるグリコシルトランスフェラーゼの構造を、可溶化または変性されているグリコシルトランスフェラーゼへ再建する過程を指す。従って、再構築緩衝液は、グリコシルトランスフェラーゼの再構築を増強または促進する緩衝液を指す。
【００７６】
「レドックス対」は、還元型および酸化型チオール試薬の混合物を指し、還元型および酸化型グルタチオン(GSH/GSSG)、システイン/シスチン、システアミン/シスタミン、DTT/GSSGおよびDTE/GSSGを含む。(例えば、Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)参照)。
【００７７】
用語「接触すること」は、本明細書で、以下と交換可能に用いられる：「と組み合わされた」、「に加えられた」、「と混合された」、「を通過させられた」、「とインキュベートされた」、「の上を流された」など。
【００７８】
用語「PEG」は、ポリ(エチレングリコール)を指す。PEGは、ペプチドに結合させられている例示的なポリマーである。ペプチド治療用物質を誘導体化するためのPEGの使用は、ペプチドの免疫原性を低下させ、かつ循環からのクリアランス時間を延ばすことが実証されている。例えば、米国特許第4,179,337号(Davis et al.)は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコールと連結した酵素およびペプチドホルモンのような非免疫原性ペプチドに関する。10モルと100モルとの間のポリマーが1モルのペプチド当たり用いられ、生理学的活性の少なくとも15%が維持される。
【００７９】
本明細書に用いられる場合、用語「比活性」は、酵素、例えば、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、の触媒活性を指し、活性ユニットで表されうる。本明細書に用いられる場合、1活性ユニットは、所定の温度(例えば、37℃)およびpH値(例えば、pH 7.5)において1分あたり1 μmolの形成を触媒する。従って、10ユニットの酵素は、10 μmolの基質が、例えば37℃の温度および例えば7.5のpH値において1分間に10 μmolの生成物へ変換する、その酵素の触媒的量である。
【００８０】
「N結合型」オリゴ糖は、アスパラギン-N-アセチルグルコサミン結合としてアスパラギンを通してペプチドバックボーンに結合しているオリゴ糖である。N結合型オリゴ糖はまた、「N-グリカン」とも呼ばれる。すべてのN結合型オリゴ糖は、Man3GlcNAc2の共通の五糖のコアを有する。それらは、N-アセチルグルコサミン、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、フコースおよびシアル酸のような末梢糖の分枝(アンテナとも呼ばれる)の存在において、および、その数において異なる。任意で、この構造はまた、コアのフコース分子および/またはキシロース分子を含みうる。
【００８１】
「O結合型」オリゴ糖は、トレオニン、セリン、ヒドロキシプロリン、チロシン、または他のヒドロキシ含有アミノ酸を通してペプチドバックボーンに結合しているオリゴ糖である。
【００８２】
「実質的に均一な」の上の定義における用語「実質的に」とは、一般的に、特定のグリコシルトランスフェラーゼについての受容体基質の、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、またはより好ましくは、少なくとも約90%、およびなおより好ましくは、少なくとも約95%がグリコシル化されていることを意味する。
【００８３】
「融合タンパク質」は、本来のまたは天然の全長タンパク質をコードするアミノ酸配列またはそれらの部分配列、に付加されている、の代わりである、よりも短い、および/または、異なる、アミノ酸配列を含むタンパク質を指す。
【００８４】
グリコシルトランスフェラーゼに関しての「ステム領域」は、天然のグリコシルトランスフェラーゼにおいて、膜貫通ドメインの近傍に位置するタンパク質ドメインまたはその部分配列を指し、ゴルジ体においてグリコシルトランスフェラーゼを維持しうる保持シグナルとして、およびタンパク分解性切断の部位として機能すると報告されている。ステム領域は、一般的に、疎水性膜貫通ドメイン後の最初の親水性アミノ酸から始まり、触媒性ドメインで、または場合によっては、膜貫通ドメイン後の最初のシステイン残基で終わる。例示的なステム領域は、限定されるわけではないが、真核生物のST6GalNAcIのステム領域、約30位から約207位までのアミノ酸残基(例えば、マウス酵素)、ヒト酵素についてアミノ酸35位〜278位、またはニワトリ酵素についてアミノ酸37位〜253位；哺乳動物GalNAcT2のステム領域、約71位から約129位までのアミノ酸残基(例えば、ラット酵素)を含む。
【００８５】
「触媒性ドメイン」は、その酵素により行われる酵素反応を触媒するタンパク質ドメインまたはその部分配列を指す。例えば、シアリルトランスフェラーゼの触媒性ドメインは、シアル酸残基を供与体から受容体糖へ転移させるのに十分なシアリルトランスフェラーゼの部分配列を含む。触媒性ドメインは、酵素全体、その部分配列を含みうる、または、天然で見出されるようにその酵素もしくはその部分配列に付着していない、追加のアミノ酸配列を含みうる。
【００８６】
用語「単離された」とは、酵素の活性に干渉する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。本発明の糖、タンパク質または核酸について、用語「単離された」とは、それの天然の状態において見出されるように通常、その材料に付随している成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。典型的には、本発明の単離された糖、タンパク質または核酸は、銀染色されたゲル上のバンド強度、または純度を決定するための他の方法により測定される場合、少なくとも約80%純粋(pure)、通常には少なくとも約90%純粋、および好ましくは少なくとも約95%純粋である。純度または均一性は、当技術分野において周知のいくつかの手段により示されうる。例えば、試料におけるタンパク質または核酸は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分解され得、その後、タンパク質または核酸は、染色により可視化されうる。特定の目的のために、タンパク質または核酸の高分解能が望ましい場合があり、例えば、精製のためのHPLCまたは類似した手段が利用されうる。
【００８７】
説明
I. 単離された核酸
A. 一般的に
哺乳動物ST6GalNAcIおよびニワトリST6GalNAcIの様々な切り詰め突然変異体が本明細書に例示されている。しかしながら、本発明は、アミノ酸残基1位〜232位を欠損するニワトリST6GalNAcI切り詰め突然変異体ポリペプチドを網羅すると解釈されるべきではない。
【００８８】
全長ST6GalNAcI核酸は、N末端シグナルドメイン、膜貫通ドメイン、ステムドメインおよび活性ドメインを含み、活性ドメインがそのようなポリペプチドのアミノ酸配列の大部分を含みうる、他のグリコシルトランスフェラーゼと類似したドメイン構造を有するポリペプチドをコードする。当業者により理解されているように、組換えST6GalNAcIポリペプチドの活性ドメインに無関係のドメイン構造の存在は、水性またはインビトロ環境においてポリペプチドの溶解性、安定性および活性に負の影響を及ぼしうる。例えば、任意の特定の理論に制約されることを望まないが、インビトロ反応混合物に用いられる組換えST6GalNAcIポリペプチド上の疎水性膜貫通ドメインの存在は、ポリペプチドを、疎水性膜貫通ドメインを含まない組換えST6GalNAcIポリペプチドより溶解度を小さくさせ得、さらに、折り畳まれた構造に影響を及ぼすかまたは不安定化することにより、ポリペプチドの酵素活性を減少させさえしうる。
【００８９】
それゆえに、ST6GalNAcIポリペプチドの活性、安定性および/または有用性を増強することを目的として、全長ST6GalNAcIより短いST6GalNAcIをコードする組換えST6GalNAcI核酸を作製することが望ましい。本発明は、ST6GalNAcIのそのような改変型を提供する。より具体的には、本発明は、そのような切り詰め型ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
【００９０】
本発明の核酸は、本明細書の他の場所でより詳細に記載されているように、ST6GalNAcIポリペプチドの切り詰め型をコードする。本発明の核酸によりコードされる切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、本明細書で「切り詰め突然変異体」とも呼ばれているのだが、当業者に理解されているように、様々な方法で切り詰められうる。本発明の核酸によりコードされる切り詰め型ポリペプチドの例は、限定されるわけではないが、単一のN末端残基を欠損するポリペプチド、単一のC末端残基を欠損するポリペプチド、単一のN末端残基および単一のC末端残基の両方を欠損するポリペプチド、N末端から残基の連続した配列を欠損するポリペプチド、C末端から残基の連続した配列を欠損するポリペプチド、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。
【００９１】
それゆえに、ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸の切り詰めが、多数の理由のためになされうることは、本明細書に示された開示に基づいて、理解されるものと思われる。本発明の一つの態様において、切り詰めは、ST6GalNAcIのシグナルペプチドドメインをコードする核酸配列の一部または全部を除去するためになされうる。
【００９２】
本発明のもう一つの態様において、切り詰めは、ST6GalNAcIの膜貫通ドメインをコードする核酸配列の一部または全部を除去するためになされうる。非限定的例として、膜貫通ドメインをコードする核酸配列の一部または全部の除去は、コードされたST6GalNAcIポリペプチドの溶解性もしくは安定性を増加しうる、および/またはコードされたポリペプチドの発現のレベルを増加しうる。
【００９３】
本発明のさらにもう一つの態様において、切り詰めは、ST6GalNAcIのステムドメインをコードする核酸配列の一部または全部を除去するためになされうる。非限定的例として、ステムドメインをコードする核酸配列の一部または全部の除去は、コードされたST6GalNAcIポリペプチドの溶解性もしくは安定性を増加しうる、および/またはコードされたポリペプチドの発現のレベルを増加しうる。
【００９４】
当業者は、本明細書に示された開示を携えている場合、本明細書の他の場所で詳細に示されているようにST6GalNAcIの切り詰め突然変異体を設計および創造する方法を理解するものと思われる。本発明の一つの局面において、切り詰めがなされている核酸残基は、高度に保存された残基でありうる。本発明のもう一つの局面において、切り詰めがなされている核酸残基は、コードされたポリペプチドが、発現されたポリペプチドの精製において助けとなるであろう新しいN末端アミノ酸残基を有するように選択されうる。
【００９５】
B. ST6GalNAcI単離核酸
本発明は、全長より小さいST6GalNAcIをコードする核酸を特徴とする。すなわち、本発明は、核酸により発現されたポリペプチドが全長タンパク質の生物活性を保持するとの条件で、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸を特徴とする。発明の一つの局面において、切り詰め型ポリペプチドは、哺乳動物の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドである。本発明のもう一つの局面において、切り詰め型ポリペプチドは、ヒトの切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドである。本発明のさらにもう一つの局面において、切り詰め型ポリペプチドは、マウスの切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドである。本発明のなおもう一つの局面において、切り詰め型ポリペプチドは、ニワトリの切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドである。
【００９６】
当業者により理解されているように、全長ST6GalNAcIをコードする核酸は、ST6GalNAcIの「活性ドメイン」、触媒活性に主として関与するドメイン、に加えて、1つまたは複数の同定可能なポリペプチドドメインをコードする核酸配列を含みうる。これは、全長ST6GalNAcIポリペプチドが、活性ドメインに加えて、シグナルドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインを含むことはその分野において公知であるからである。従って、全長ST6GalNAcIをコードする核酸は、ポリペプチドのアミノ末端においてシグナルドメイン、続いて、シグナルドメインに直接隣接した膜貫通ドメイン、続いて、膜貫通ドメインに直接隣接しているステムドメイン、続いて、ポリペプチドのカルボキシ末端まで伸び、ステムドメインに直接隣接している活性ドメインを有するポリペプチドをコードしうる。
【００９７】
それゆえに、一つの態様において、本発明の単離された核酸は、切り詰め型哺乳動物のST6GalNAcIポリペプチドをコードし得、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドが、ST6GalNAcIシグナルドメインの全部または一部を欠損している。もう一つの態様において、本発明の単離された核酸は、切り詰め型哺乳動物のST6GalNAcIポリペプチドをコードし得、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドが、ST6GalNAcIシグナルドメインおよびST6GalNAcI膜貫通ドメインの全部または一部を欠損している。さらにもう一つの態様において、本発明の核酸は、切り詰め型哺乳動物のST6GalNAcIポリペプチドをコードし得、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドが、ST6GalNAcIシグナルドメイン、ST6GalNAcI膜貫通ドメイン、およびST6GalNAcIステムドメインの全部または一部を欠損している。
【００９８】
本発明の開示を携えている場合、当業者は、ST6GalNAcIのこれらを始めとするそのような切り詰め突然変異体を作成および使用する方法を認識するものと思われる。特に、本発明の開示を携えている場合、当業者は、ヒトST6GalNAcI、マウスST6GalNAcIおよびニワトリST6GalNAcIの切り詰め突然変異体をコードする単離された核酸を作製ならびに使用する方法を認識するものと思われる。
【００９９】
「ST6GalNAcIの生物活性」は、シアル酸部分をシアル酸供与体から受容体分子へ転移させる能力である。全長ヒトST6GalNAcIは、例えば、その配列がSEQ ID NO:1に示されているが、そのような活性を有する。「ST6GalNAcIの切り詰め型ポリペプチドの生物活性」は、同様に、シアル酸部分をシアル酸供与体から受容体分子へ転移させる能力である。すなわち、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、全長ST6GalNAcIと同じ糖転移反応を触媒することができる。非限定的例として、本発明のST6GalNAcI核酸によりコードされる切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチドは、シアル酸部分をCMP-シアル酸供与体からウシ顎下腺ムチン受容体へ転移させる能力をもち、そのような転移は、結果として、ウシ顎下腺ムチン受容体上のGalNAc残基へのシアル酸部分の共有結合性連結を生じる。
【０１００】
それゆえに、全長より小さいまたは「切り詰め型」ST6GalNAcIをコードする核酸は、切り詰め型ST6GalNAcIがST6GalNAcI生物活性をもつとの条件で、本発明に含まれる。
【０１０１】
本発明の方法および組成物は、本明細書に開示されているようなST6GalNAcI切り詰め突然変異体を含む核酸にもっぱら限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、シアル酸のシアル酸受容体への転移を触媒する能力がある、既知かまたは未知かを問わず、本明細書での開示に従って調製される、ST6GalNAcIの切り詰め型突然変異体をコードするいずれの核酸も含むと解釈されるべきである。改変された核酸配列、すなわち、天然に存在するタンパク質をコードする核酸配列と異なる配列を有する核酸配列もまた、改変された核酸が、例えば、シアル酸のシアル酸受容体への転移を触媒する生物活性をもつ切り詰め型タンパク質をなおコードする限り、本発明の方法および組成物により含まれる。これらの改変された核酸配列は、点突然変異により引き起こされた改変、遺伝暗号の縮重または天然に存在する対立遺伝子変異体による改変、および遺伝子操作により、すなわち、人の手により、導入されているさらなる改変を含む。従って、核酸という用語はまた、具体的には、5つの生物学的に存在する塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基から構成される核酸を含む。
【０１０２】
本発明は、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、Δ51、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、Δ200、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31およびSEQ ID NO:33のいずれか1つに示された核酸配列と少なくとも約90%、95%、97%、98%または99%同一である核酸配列を含む単離された核酸を特徴とする。本発明はまた、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、Δ51、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、Δ200、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31またはSEQ ID NO:33に示された配列のいずれか1つを含む単離された核酸配列であって、単離された核酸が切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする、単離された核酸配列を特徴とする。本発明はさらに、表20に列挙された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０１０３】
本発明はまた、活性にとって必須ではないアミノ酸残基に変化を含む切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。本発明の単離された核酸によりコードされるそのようなポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200に示された配列のいずれか1つとはアミノ酸配列において異なる；しかしそれでも、ST6GalNAcIの生物活性を保持する。非限定的例として、本発明の単離された核酸は、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列と少なくとも約90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含みうる。さらに、もう一つの非限定的例として、本発明の単離された核酸は、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200のいずれか1つに示されたアミノ酸配列と少なくとも約90%、95%、97%、98%または99%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成されうる。例えば、2つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、KarlinおよびAltschul(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)のアルゴリズムであり、KarlinおよびAltschul(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)においてのように改変される。このアルゴリズムは、Altschul et al.(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)のNBLASTおよびXBLASTプログラムへ組み込まれており、例えば、National Center for Biotechnology Information(NCBI)ワールドワイドウェブサイトにおいてアクセスされうる。BLASTヌクレオチド検索は、本明細書に記載された核酸と相同的なヌクレオチド配列を得るために、以下のパラメーターを用いて、NBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と名付けられている)で行われうる：ギャップペナルティー＝5；ギャップ伸長ペナルティー＝2；不一致ペナルティー＝3；一致報酬＝1；期待値10.0：およびワードサイズ＝11。BLASTタンパク質検索は、本明細書に記載されたタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得るために、以下のパラメーターを用いて、XBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と名付けられている)またはNCBI「blastp」プログラムで行われうる：期待値10.0、BLOSUM62スコア行列。比較を目的としてギャップドアラインメントを得るために、ギャップド(Gapped)BLASTが、Altschul et al.(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されているように利用されうる。または、PSI-BlastまたはPHI-Blastは、分子間(同上)の遠い関係および共通のパターンを有する分子間の関係を検出する反復検索を行うために用いられうる。BLAST、ギャップドBLAST、PSI-BlastおよびPHI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが用いられうる。一般的に、National Library of MedicineおよびNational Instituites of Healthにより維持されている、National Center for Biotechnology Informationについてのインターネットウェブサイトを参照されたい。
【０１０５】
もう一つの局面において、本発明の方法および組成物に有用で、かつ切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸は、そのような切り詰め型突然変異体の核酸配列へ挿入された少なくとも1個のヌクレオチドを有しうる。または、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする追加の核酸は、核酸配列から除去された少なくとも1個のヌクレオチドを有しうる。さらに、切り詰め型突然変異体をコードし、かつ本発明に有用なST6GalNAcI核酸は、切り詰め型ポリペプチドをコードする単一の核酸配列に存在するヌクレオチド挿入およびヌクレオチド欠失の両方を有しうる。
【０１０６】
コードされたタンパク質またはポリペプチドの機能的性質を変化させるように設計されるヌクレオチド配列に変化を導入するための技術は当技術分野において周知である。そのような改変は、塩基の欠失、挿入または置換、およびそれに従って、アミノ酸配列における変化を含む。当業者に公知であるように、核酸挿入および/または欠失は、限定されるわけではないが、核酸安定性の改変、核酸発現レベルの改変、発現されたポリペプチドの安定性または半減期の改変、発現されたポリペプチドの活性の改変、発現されたポリペプチドの性質および特徴の改変、ならびにグリコシル化パターンにおける変化を含む、多数の理由のために遺伝子へ設計されうる。そのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列へのすべてのそのような改変は本発明に含まれる。
【０１０７】
本発明の方法および組成物が、用いられる核酸の性質により限定されることは意図されない。本発明の方法および組成物により含まれる標的核酸は、天然または合成された核酸でありうる。核酸は、DNAまたはRNAであり得、二本鎖、一本鎖、または部分的二本鎖形で存在しうる。さらに、核酸は、ウイルスまたは他の高分子の一部として見出されうる。例えば、Fasbender et al., 1996, J. Biol. Chem. 272:6479-89を参照。
【０１０８】
II. ベクターおよび発現系
他の関連した局面において、本発明は、核酸が、好ましくは、核酸によりコードされたポリペプチドの発現を指揮する能力があるようにプロモーター/制御配列を含む核酸に作動可能に連結した切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸を含む。従って、本発明は、例えば、Sambrook et al.(第3版, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)に、およびAusubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載されているように、細胞へ外因性DNAを導入し、それらの細胞において外因性DNAを同時発現させるための発現ベクターおよび方法を含む。
【０１０９】
細胞における切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドの発現は、適切な核酸をコードする核酸を含むプラスミド、ウイルスまたは他の型のベクターを作製する段階であって、核酸が、ベクターが導入される細胞においてタグ有りまたは無しでコードされたポリペプチドの発現を作動させる役割を果たすプロモーター/制御配列と作動可能に連結されている、段階により達成されうる。さらに、金属、グルココルチコイドなどのような誘発剤に応答して誘導される当技術分野において周知であるプロモーターもまた、本発明において企図される。従って、本発明は、既知かまたは未知のいずれでもあり、かつ作動可能に連結した切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドの発現を作動させる能力がある、任意のプロモーター/制御配列の使用を含むことは、認識されているものと思われる。
【０１１０】
本発明に有用な発現系において、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸は、機能性ポリペプチドをコードする1つまたは複数の追加の核酸に融合されうる。非限定的例として、アフィニティータグのコード配列が、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドのコード配列に隣接して、そこから上流に、またはそこから下流に、核酸ベクターへと挿入されうる。当業者により理解されているように、アフィニティータグは、典型的には、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドとインフレームで多重クローニング部位へ挿入される。当業者はまた、アフィニティータグのコード配列が、アフィニティータグおよび切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを付随させて発現することにより組換え融合タンパク質を産生するように用いられうることを理解しているものと思われる。発現された融合タンパク質は、その後、アフィニティータグを用いて、単離、精製または同定されうる。
【０１１１】
本発明に有用なアフィニティータグは、限定されるわけではないが、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、FLAGタグ、およびデンプン結合ドメインタグを含む。他のタグは、当技術分野において周知であり、本発明におけるそのようなタグの使用は、当業者により容易に理解されるものと思われる。
【０１１２】
当業者により理解されているように、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含むベクターは、非融合タンパク質として、または融合タンパク質としてのいずれかで切り詰め型ポリペプチドを発現させるために用いられうる。任意の特定のプラスミドベクターまたは他のDNAベクターの選択は、本発明において限定因子ではなく、幅広く大量のベクターが当技術分野において周知である。さらに、特定のプロモーター/制御配列を選択し、いずれかの切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードするDNA配列へ、それらのプロモーター/制御配列を作動可能に連結することは、十分、当業者の技術範囲内である。そのようなテクノロジーは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al.(第3版, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)に、およびAusubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載されている。非限定的例として、本発明の一つの態様において有用なベクターは、pcWori+ベクター(Muchmore et al., 1987, Meth. Enzymol. 177:44-73)に基づいている。
【０１１３】
従って、本発明は、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸を含むベクターを含む。核酸のベクターへの組み入れおよびベクターの選択は、例えば、Sambrook et al.(第3版, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)に、およびAusubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載されているように、当技術分野において周知である。
【０１１４】
本発明の局面において、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸は、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸と連結して、宿主細胞のゲノムへ組み込まれる。本発明のもう一つの局面において、細胞は、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸を一過性にトランスフェクションされる。本発明のもう一つの局面において、細胞は、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸を安定にトランスフェクションされる。
【０１１５】
単離された核酸を細胞へ挿入することを目的として、当業者はまた、本発明の単離された核酸を宿主細胞へ導入するために有効な方法および必要とされる方法が、様々であり、宿主細胞の選択に依存することを理解しているものと思われる。単離された核酸を宿主細胞へ導入する適切な方法は、当技術分野において周知である。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための他の適した方法は、限定されるわけではないが、Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)および他のそのような実験マニュアルに見出されるものを含みうる。
【０１１６】
切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において周知であるように、任意の適した手段により精製されうる。例えば、核酸は、逆相またはイオン交換HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー、またはゲル電気泳動により精製されうる。もちろん、当業者は、精製の方法が、精製されるべきDNAのサイズに一部依存するものであることを認識していると思われる。
【０１１７】
本発明はまた、本明細書の他の場所で記載されているように、とりわけ、核酸ベクターを含む組換え細菌宿主細胞を特徴とする。一つの局面において、組換え細胞は、本発明のベクターで形質転換される。形質転換されるベクターは、細胞ゲノムへ組み込まれる必要がなく、また細胞において発現される必要もない。しかしながら、形質転換されるベクターは、細胞において発現される能力をもつ。本発明の一つの局面において、枯草菌が、本発明のベクターの形質転換およびそれからのタンパク質の発現に用いられる。本発明のもう一つの局面において、大腸菌が、本発明のベクターの形質転換およびそれからのタンパク質の発現に用いられる。本発明のもう一つの局面において、大腸菌のK-12株が、本発明のベクターからのタンパク質の発現に有用である。本発明に有用な大腸菌の菌株は、限定されるわけではないが、JM83、JM101、JM103、JM109、W3110、chi1776およびJA221を含む。
【０１１８】
本発明に有用な宿主細胞は、小規模、中規模、または大規模での増殖および培養の能力があると理解される。例えば、本発明の宿主細胞は、それが、試薬または治療用タンパク質産物の大規模製造に有用であるのと同様に、本発明のベクターからのタンパク質の発現を試験するために有用である。宿主細胞を培養し、それらに含まれるベクターからタンパク質を発現させるのに有用な技術は、当技術分野において周知であり、それゆえに、本明細書に列挙されていない。
【０１１９】
上記のように、本発明の方法に有用な宿主細胞は、本明細書に示された開示を携えている場合、当業者により理解されるように、様々な方法に従って調製されうる。一つの局面において、本発明の宿主細胞は、本発明の形質転換された宿主細胞を作製するために本発明のベクターで形質転換されうる。形質転換は、当業者に公知であるように、核酸ベクターを含む宿主細胞が生存可能なままであるように、核酸ベクターを宿主細胞へ挿入する過程を含む。核酸の細菌細胞へのそのような形質転換は、限定されるわけではないが、安定に形質転換された宿主細胞の作製、生物学的蓄積物（deposit）を生成すること、ベクター含有宿主細胞を増殖させること、追加のベクターの産生および単離のためにベクター含有宿主細胞を増殖させること、ベクターによりコードされる標的タンパク質の発現などを含む目的に有用である。
【０１２０】
細胞をベクターで形質転換する方法は多数あって、当技術分野において周知であり、それゆえに、本明細書に列挙されていない。非限定的例として、本発明のコンピテント細菌細胞は、電気穿孔法を用いて本発明のベクターにより形質転換されうる。細菌細胞を「コンピテント」にさせる方法は、当技術分野において周知であり、典型的には、細胞が外因性DNAを取り込むように細菌細胞の調製することを含む。同様に、電気穿孔法の方法は、当技術分野において公知であり、そのような方法の詳細な説明は、例えば、Sambrook et al.(1989, 前記)に見出されうる。コンピテント細胞のベクターDNAでの形質転換はまた、化学物質に基づいた方法を用いて達成されうる。細菌形質転換の周知の化学物質に基づいた方法の1つの例は、Inoue, et al.(1990, Gene 96:23-28)により記載されている。形質転換の他の方法は、当業者に公知であると思われる。
【０１２１】
本発明の形質転換される宿主細胞は、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを発現させるために用いられうる。本発明の態様において、形質転換された宿主細胞は、本発明の切り詰め型ポリペプチドをコードする核酸配列を含む本発明のベクターを含む。切り詰め型ポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の発現方法を用いて発現される(例えば、IPTG)。発現された、切り詰め型ポリペプチドは、宿主細胞内に含まれうるか、またはそれは宿主細胞から増殖培地へ分泌されうる。
【０１２２】
発現されたポリペプチドを単離するための方法は、当技術分野において周知であり、当業者は、任意の与えられた宿主細胞発現系の特徴に基づいて、発現されたポリペプチドの単離のための最善の方法を決定する手法を認識するであろう。非限定的例として、宿主細胞から分泌される発現されたポリペプチドは、増殖培地から単離されうる。増殖培地からのポリペプチドの単離は、細菌細胞および細胞片の除去を含みうる。もう一つの非限定的例として、宿主細胞内に含まれる発現されたポリペプチドは、宿主細胞から単離されうる。そのような「細胞内の」発現されたポリペプチドの単離は、宿主細胞の破壊およびその結果として生じた混合物からの細胞片の除去を含みうる。これらの方法は、本発明の排他的代表であることを意図されず、むしろ、単に、本発明の様々な適用の例証を目的としているにすぎない。
【０１２３】
本発明に従って発現された切り詰め型ポリペプチドの精製は、当技術分野において公知の任意の手段によりもたらされうる。当業者は、本発明に従って発現されたポリペプチドの精製のための最善の方法を決定する手法を認識するであろう。精製方法は、限定されるわけではないが、発現宿主、ポリペプチドの粗抽出物の内容、ポリペプチドのサイズ、ポリペプチドの性質、ポリペプチド精製過程の所望の最終産物、およびポリペプチド精製過程の最終産物のその後の使用のような因子に基づいて当業者により選択される。
【０１２４】
本発明の態様において、本発明に従って発現された、切り詰め型ポリペプチドの単離または精製が望まれない場合がある。本発明の局面において、発現されたポリペプチドは、ポリペプチドが発現された細菌宿主細胞の内部に蓄積または輸送されうる。本発明のもう一つの局面において、発現されたポリペプチドは、ポリペプチドが発現された宿主細胞の溶解により生成される粗可溶化液の形で用いられうる。本発明のさらにもう一つの態様において、発現されたポリペプチドは、本明細書に示された、または記載された方法のいずれかに従って、部分的に単離または部分的に精製されうる。当業者は、本発明のポリペプチドを単離または精製することが所望されない場合を認識し、そのようなポリペプチドの使用および調製に有効な技術を熟知しているであろう。
【０１２５】
本明細書に示された開示を携えている場合、当業者はまた、本発明の真核生物の宿主細胞を調製する方法を認識するものと思われる。本明細書の他の場所で示されているように、および本明細書に提供された開示に基づいて当業者に知られているように、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸は、例えば、レンチウイルスに基づいたゲノム組み込みまたはプラスミドに基づいたトランスフェクションを用いて、真核生物宿主細胞へ導入されうる(Sambrook et al., 第3版, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))。本発明の一つの態様において、真核生物宿主細胞は真菌細胞である。本発明の真核生物宿主細胞として有用な真菌細胞は、限定されるわけではないが、A. ニゲル(A. niger)およびP. ルクノウェンサ(P. lucknowensa)のような菌株を含む。
【０１２６】
もう一つの態様において、本発明の切り詰め型ポリペプチドをコードする核酸は、切り詰め型ポリペプチドの発現のための特定のプロモーター配列を含むレンチウイルスベクターへクローニングされる。切り詰め型ポリペプチド含有レンチウイルスベクターは、その後、切り詰め型ポリペプチドの発現のために宿主細胞をトランスフェクションするために用いられる。本発明に有用なもののようなレンチウイルスベクターを作製しかつ用いる方法は、当技術分野において周知であり、本明細書ではさらには記載されていない。
【０１２７】
さらにもう一つの態様において、本発明の切り詰め型ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルス発現系を用いて宿主細胞へ導入される。ウイルス発現系は、当技術分野において周知であり、本明細書では詳細に記載されていない。本発明の一つの局面において、ウイルス発現系は、哺乳動物のウイルス発現系である。本発明のもう一つの局面において、ウイルス発現系は、バキュロウイルス発現系である。そのようなウイルス発現系は、典型的には、多数の売主から市販されている。
【０１２８】
当業者は、本発明の切り詰め型ポリペプチドの発現のために宿主細胞-ベクター発現系を用いる方法を認識するであろう。真核生物の宿主と用いる適切なクローニングおよび発現ベクターは、開示が全体として参照により本明細書に組み入れられている、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)において記載されている。
【０１２９】
昆虫細胞もまた、本発明の切り詰め型ポリペプチドの発現に用いられうる。本発明の局面において、Sf9、Sf9+、Sf21、High Five(商標)、またはショウジョウバエSchneider S2細胞が用いられる。本発明のさらにもう一つの局面において、バキュロウイルス、すなわち、バキュロウイルス/昆虫細胞発現系は、pAcGP67、pFastBac、pMelBacまたはpIZベクター、およびポリヘドリン、p10またはOpIE3アクチンプロモーターを用いて、本発明の切り詰め型ポリペプチドを発現させるために用いられうる。本発明のもう一つの局面において、ショウジョウバエ発現系は、pMTまたはpAC5ベクターおよびMTまたはAc5プロモーターと用いられうる。
【０１３０】
本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドはまた、哺乳動物細胞において発現されうる。本発明の局面において、294、HeLa、HEK、NSO、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、Jurkat、またはCOS細胞が、本発明の切り詰め型ポリペプチドを発現させるために用いられうる。切り詰め型ポリペプチドの哺乳動物細胞発現の場合、pT-Rex、pSecTag2、pBudCE4.1またはpCDNA/His Maxベクターのような適したベクターが、例えば、CMVプロモーターと共に用いられうる。当業者により理解されているように、プロモーターの選択、加えて1つまたは複数のプロモーターを本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを発現させるために用いられる宿主細胞へ導入するための方法およびストラテジーは、当技術分野において周知であり、用いられる宿主細胞および発現系に依存して変わるであろう。
【０１３１】
様々な哺乳動物細胞培養系が、組換えタンパク質を発現させるために用いられうる。哺乳動物発現系の非限定的例は、Gluzman, Cell 23:175 (1981)により記載されたサル腎臓線維芽細胞のCOS-7系、およびコンパチブルベクターを発現させる能力がある他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞系を含む。哺乳動物発現系は、複製起点、適したプロモーター、ならびに、いずれの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体および受容体部位、転写終結配列、および5'隣接非転写配列をも含みうる。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えば、SV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位は、必要とされる非転写遺伝要素を供給するために用いられうる。
【０１３２】
当業者により理解されているように、本発明の任意の単離された核酸を宿主細胞へ導入するのに有効な方法および必要とされる方法は、様々であり、宿主細胞の選択に依存する。単離された核酸を宿主細胞へ導入する適した方法は、当技術分野において周知である。非限定的例として、ベクターDNAは、通常のトランスフェクション技術を用いて真核細胞へ導入されうる。本明細書に用いられる場合、用語「トランスフェクション」は、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法を含む、外来性核酸(例えば、DNA)を宿主細胞へ導入するための様々な、技術分野で認識されている技術を指す。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適した方法は、Sambrook, et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)および他のそのような実験マニュアルに見出されうる。
【０１３３】
例えば、哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のわずか一部分のみが、外来性DNAをそれらのゲノムへ組み込みうることは知られている。これらの形質転換体を同定および選択するために、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性)をコードする遺伝子が、一般的に、対象となる遺伝子と共に宿主細胞へ導入される。様々な選択マーカーは、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を与えるものを含む。選択マーカーをコードする核酸は、本発明の切り詰め型ポリペプチドをコードするものと同じベクター上に宿主細胞へと導入されうるか、または別々のベクター上に導入されうる。導入された核酸を安定的にトランスフェクションされた細胞は、薬物選択により同定されうる(例えば、選択マーカー遺伝子を組み入れている細胞は生存するが、他の細胞は死ぬ)。
【０１３４】
III. ポリペプチド
本発明の切り詰め型ポリペプチドは、本明細書に示された開示を携えている場合、公知でかつ当業者により理解されているように、様々な方法で切り詰められうる。本発明の切り詰め型ポリペプチドの例は、限定されるわけではないが、単一のN末端残基を欠損するポリペプチド、単一のC末端残基を欠損するポリペプチド、単一のN末端残基および単一のC末端残基の両方を欠損するポリペプチド、N末端から残基の連続した配列を欠損するポリペプチド、C末端から残基の連続した配列を欠損するポリペプチド、ならびにそのような、それらの任意の組み合わせを含む。
【０１３５】
当業者により理解されているように、全長ヒトST6GalNAcIポリペプチドは、ST6GalNAcIの「活性ドメイン」、即ち主として触媒活性に関与するドメインに加えて、1つまたは複数の同定可能なポリペプチドドメインを含みうる。これは、全長ST6GalNAcIポリペプチドが、活性ドメインに加えて、シグナルドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインを含むことが、当該技術分野において公知であるからである。従って、全長ST6GalNAcIは、ポリペプチドのアミノ末端にシグナルドメイン、続いて、シグナルドメインに直接隣接した膜貫通ドメイン、続いて、膜貫通ドメインに直接隣接しているステムドメイン、続いて、ポリペプチドのカルボキシ末端まで伸び、ステムドメインに直接隣接している活性ドメインを有しうる。
【０１３６】
それゆえに、一つの態様において、本発明のST6GalNAcIポリペプチドは、ST6GalNAcIシグナルドメインの全部または一部を欠損する切り詰め型哺乳動物ST6GalNAcIポリペプチドである。もう一つの態様において、本発明のST6GalNAcIポリペプチドは、ST6GalNAcIシグナルドメインおよびST6GalNAcI膜貫通ドメインの全部または一部を欠損する切り詰め型哺乳動物ST6GalNAcIポリペプチドである。さらにもう一つの態様において、本発明のST6GalNAcIポリペプチドは、ST6GalNAcIシグナルドメイン、ST6GalNAcI膜貫通ドメイン、およびST6GalNAcIステムドメインの全部または一部を欠損する切り詰め型哺乳動物ST6GalNAcIポリペプチドである。本発明の開示を携えている場合、当業者は、これらを始めとするヒトST6GalNAcIのそのような切り詰め突然変異体を作製かつ使用する方法を認識するであろう。
【０１３７】
本発明の切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体のサイズおよび同定は、全長ポリペプチドが切り詰められている点に基づいている。非限定的例として、本発明の「Δ35ヒト切り詰め型ST6GalNAcI」突然変異体は、全長ポリペプチドのN末端から数えてアミノ酸1位〜35位がポリペプチドから欠失している、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを指す。それゆえに、Δ35ヒト切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体のN末端は、全長ポリペプチドの「アミノ酸36位」と呼ばれるアミノ酸残基から始まる。この命名法は、限定されるわけではないが、哺乳動物ST6GalNAcI、ヒトST6GalNAcI、マウスST6GalNAcIおよびニワトリST6GalNAcI由来のものを含む、本発明のすべての切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドに適用される。特定の欠失が示されている場合、欠失は、図31に示されたニワトリ、マウスまたはヒト由来の全長ST6GalNAcI配列を用いて決定される。そのような欠失の好ましい態様は、例えば、表20に示されている。いくつかの態様において、切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体は、以下から選択される。ヒトの切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体について(単一の突然変異体に対して2つの可能な名前を用いる)：Δ35またはK36、Δ124またはK125、Δ257またはS258、Δ72またはT73、Δ109またはE110、Δ133またはM134、Δ170またはT171、Δ232またはA233、およびΔ272またはG273。ニワトリの切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体について(単一の突然変異体に対して2つの可能な名前を用いる)：Δ48またはQ49、Δ152またはV153、Δ225またはL226、Δ226またはR227、Δ231またはK233、およびΔ232またはT233。マウスの切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体について(単一の突然変異体に対して2つの可能な名前を用いる)：Δ30またはK31、Δ31またはD32、Δ51またはE52、Δ126またはS127、Δ185またはS186、およびΔ200またはS201。
【０１３８】
それゆえに、本発明はまた、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200に示された配列のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも約90%の同一性を有する。より好ましくは、単離されたポリペプチドは、約95%同一、ならびによりいっそう好ましくは約98%同一、なおより好ましくは約99%同一であり、ならびに最も好ましくは、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含む単離されたポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200のうちの1つに示されたポリペプチドと同一である。
【０１３９】
本発明はまた、本明細書に開示されているように、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含むポリペプチドの類似体を提供する。類似体は、保存的アミノ酸配列の違いで、または配列に影響を及ぼさない修飾で、または両方で、天然に存在するタンパク質またはペプチドと異なりうる。
【０１４０】
例えば、保存的アミノ酸変化がなされ得、それらがタンパク質またはペプチドの一次配列を変化させるが、通常にはそれの機能を変化させない。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リジン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
【０１４１】
修飾(通常には、一次配列を変化させない)は、インビボまたはインビトロのポリペプチドの化学的誘導体化、例えば、アセチル化、またはカルボキシル化を含む。グリコシル化の修飾も含まれ、例えば、合成および処理中に、またはさらなる処理段階において；例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル酵素にポリペプチドを曝すことにより、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより作製されたものである。リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンを有する配列もまた含まれる。
【０１４２】
タンパク分解性分解に対する抵抗性を向上させるために、または溶解性性質を最適化するために、または治療剤としてより適切にするために、通常の分子生物学的技術を用いて修飾されているポリペプチドもまた含まれる。そのようなポリペプチドの類似体は、天然に存在するL-アミノ酸以外の残基、例えば、D-アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含むものを含む。本発明のペプチドは、本明細書に列挙された特定の例示的な過程のいずれかの生成物に限定されない。
【０１４３】
本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドの断片は、断片が全長ポリペプチドの生物活性を有するとの条件で、本発明に含まれる。すなわち、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、全長ST6GalNAcIと同じ糖転移反応を触媒することができる。非限定的例として、本発明の切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチドは、シアル酸部分をCMP-シアル酸供与体からウシ顎下腺ムチン受容体へ転移させる能力を有し、そのような転移は、結果として、ウシ顎下腺ムチン受容体上のGalNAc残基へのシアル酸部分の共有結合性連結を生じる。それゆえに、全長より短い、すなわち「切り詰め型」ST6GalNAcIは、切り詰め型ST6GalNAcIがST6GalNAcI生物活性を有するとの条件で、本発明に含まれる。
【０１４４】
本発明のもう一つの局面において、本明細書に記載されているような単離された、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含む組成物は、高度に精製された、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含みうる。または、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含む組成物は、特定の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを発現させるために用いられる細胞から調製される細胞可溶化物を含みうる。さらに、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、ポリペプチドの発現に適したかなり多数の細胞の1つにおいて発現され得、そのような細胞は、本明細書の他の場所で詳細に記載されているように、当業者に周知である。
【０１４５】
切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドのすべての上の記載は、限定されるわけではないが、哺乳動物ST6GalNAcI、ヒトST6GalNAcI、マウスST6GalNAcIおよびニワトリST6GalNAcIを含む、任意の源由来の本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドへ等しく適用されることは認識されているものと思われる。
【０１４６】
本明細書に記載されているように単離および得られた実質的に純粋なタンパク質は、タンパク質精製のための以下の公知の手順により精製され得、免疫学的、酵素的または他のアッセイ法が、手順における各段階で精製をモニターするために用いられる。タンパク質精製方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Deutscher et al.(ed., 1990, Guide to Protein Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego)に記載されている。好ましい態様において、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、精製タグ、例えば、マルトース結合ドメイン(MBD)タグまたはデンプン結合ドメイン(SBD)タグと融合される。そのような切り詰め型ST6GalNAcI融合タンパク質は、精製タグへ特異的に結合するカラムの通過により精製されることができ、例えば、MBDまたはSBDタンパク質は、シクロデキストリンカラム上で精製されうる。さらなる態様において、例えば、MBDまたはSBDタグのような精製タグを含む切り詰め型ST6GalNAcI融合タンパク質は、精製タグへ特異的に結合するカラム上に固定化され、基質、例えばシアル酸供与体またはPEG化シアル酸供与体、およびO結合型グリコシル化部位を含む糖タンパク質または糖ペプチドは、供与体、例えば、CMP-シアル酸またはCMP-PEG化シアル酸から糖タンパク質または糖ペプチド受容体へのシアル酸の転移、およびそれによるシアル酸付加糖タンパク質またはシアル酸付加糖ペプチドの生成を促進する条件下で、カラムを通過させられる。
【０１４７】
III. 方法
本発明は、切り詰め型ポリペプチドを発現させる方法を特徴とする。本発明の方法に従って発現されうるポリペプチドは、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含む。より好ましくは、本発明の方法に従って発現されうるポリペプチドは、限定されるわけではないが、切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチド、切り詰め型マウスST6GalNAcIポリペプチド、および切り詰め型ニワトリST6GalNAcIポリペプチドを含む。好ましい態様において、本発明の方法に従って発現されうるポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200に示されたポリペプチド配列のいずれか1つを含むポリペプチドである。
【０１４８】
一つの態様において、本発明は、本明細書の他の場所で記載されているように、本発明の単離された核酸によりコードされる切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを発現させる方法であって、発現される切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドが、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する性質を有する、方法を特徴とする。本発明の一つの局面において、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを発現させる方法は、本発明の単離された核酸を発現ベクターへクローニングする段階、発現ベクター構築物を宿主細胞へ挿入する段階、および切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをそこから発現させる段階を含む。
【０１４９】
ポリペプチドの発現、加えて、ポリペプチドの発現のための発現系および組換え宿主細胞の構築の方法は、本明細書の他の場所で幅広く詳細に考察されている。本発明の切り詰め型ポリペプチドの発現の方法は、限定されるわけではないが、本明細書に記載されているようなすべてのそのような方法を含むと理解されていると思われる。いくつかの発現系において、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、不溶性タンパク質として、例えば、細菌宿主細胞における封入体タンパク質内に、発現される。ST6GalNAcIポリペプチドを含む不溶性グリコシルトランスフェラーゼを再び折り畳む方法は、2004年2月4日に出願された米国仮特許出願第60/542,210号；2004年8月6日に出願された米国仮特許出願第60/599,406号；2004年11月12日に出願された米国仮特許出願第60/627,406号；および2005年2月4日に出願された国際特許出願第PCT/US05/03856号に開示されており、それぞれは、すべての目的のために参照により本明細書に組み入れられている。
【０１５０】
本発明はまた、グリコシル供与体とグリコシル受容体の間のグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒する方法を特徴とする。一つの態様において、本発明は、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、シアル酸転移反応が、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをシアル酸供与体および受容体部分とインキュベートすることにより行われる、方法を特徴とする。一つの局面において、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、シアル酸部分の受容体部分への共有結合を媒介し、それにより、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する。
【０１５１】
本発明の態様において、糖転移反応に有用な切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチドである。もう一つの態様において、糖転移反応に有用な切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、切り詰め型ニワトリST6GalNAcIポリペプチドである。好ましい態様において、糖転移反応に有用な切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32に示されたポリペプチド配列のいずれか1つ、または表20に列挙されたヒトの切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドのいずれかを含むポリペプチドである。
【０１５２】
非限定的例として、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法は、切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチドをシチジン一リン酸-シアル酸(CMP-NAN)シアル酸供与体およびアシアロウシ顎下腺ムチン受容体部分とインキュベートする段階であって、切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチドが、CMP-NANからウシ顎下腺ムチン受容体へのシアル酸部分の転移を媒介する、段階を含む。
【０１５３】
それゆえに、一つの態様において、本発明はまた、ポリペプチド受容体部分を特徴とする。本発明の一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、ヒト成長ホルモンである。もう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、エリスロポエチンである。さらにもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、インターフェロン-αである。もう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、インターフェロン-βである。本発明のもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、インターフェロン-γである。本発明のなおもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、リソソーム加水分解酵素である。もう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、血液因子ポリペプチドである。なおもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、抗腫瘍壊死因子-αである。本発明のもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、卵胞刺激ホルモンである。本発明のさらにもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、グルカゴン様ペプチドである。
【０１５４】
一つの態様において、本発明はまた、シアル酸-ポリエチレングリコール結合体(SA-PEG)を受容体分子へ転移させる方法を特徴とする。一つの局面において、受容体分子は、ポリペプチドである。もう一つの局面において、受容体分子は、糖ペプチドである。SA-PEG結合体を設計する、作製するおよび受容体分子へ転移させるのに有用な組成物ならびに方法は、国際(PCT)特許出願第WO 03/031464(PCT/US02/32263)号および米国特許出願第2004/0063911号で詳細に考察されており、それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０１５５】
グリコシルトランスフェラーゼ活性をアッセイする方法は、当技術分野において周知である。本発明に従って用いられうるグリコシルトランスフェラーゼを検出するための様々なアッセイ法は刊行されている。以下は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を検出するのに有用なアッセイ法の例証となるが、限定としてみなされるべきではない。Furukawa et al. (1985, Biochem. J., 227:573-582)は、ホウ酸含浸ペーパー電気泳動アッセイ法および蛍光アッセイ法を記載する。Roth et al. (1983, Exp'l Cell Research 143:217-225)は、以前は熱量測定的にアッセイされていた、グルクロニルトランスフェラーゼへのホウ酸アッセイ法の適用を記載する。Benau et al. (1990, J. Histochem. Cytochem., 38:23-30)は、ジアゾニウム塩のNADHによる還元に基づいた組織化学的アッセイ法を記載する。参照により本明細書に組み入れられた、Rothの米国特許第6,284,493号も参照されたい。
【０１５６】
実験例
本発明は、ここで、以下の実施例に関して記載されている。これらの実施例は、例証を目的として提供され、本発明は、決して、これらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供された教示の結果として明らかになる、任意の、かつ全てのバリエーションを含むと解釈されるべきである。
【０１５７】
実施例1：マウスGalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)のMBP-pCWin2ベクターへの分子クローニング
5つのN末端アミノ酸を切り詰め型GalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)遺伝子のpCWin2 MBP融合タグ発現ベクターへのクローニングおよび発現は、本明細書に記載されているように行われた。pCWin2-MBPベクターにおけるマルトース結合タンパク質(MBP)に融合したST6GalNAcI遺伝子の5つの異なるアミノ末端切り詰めの作製もまた、本明細書に記載されている。これらの構築物で形質転換されたJM109細胞の作製およびその後の、これらの形質転換体におけるタンパク質発現の誘発が示されている。すべての5つの融合タンパク質は、IPTGでの誘発で様々なレベルで発現される。
【０１５８】
鋳型DNA(pTS103)が、マウスST6GalNAcIの増幅のために用いられた。プライマーは、Δ31、Δ51、Δ126、Δ185およびΔ200を含む、5つのマウスST6GalNAcIのN末端切り詰め型について以下の配列を用いてマウスST6GalNAcI遺伝子をクローニングするように設計された。用いられたプライマーは以下の通りであった：
2008501344.tif 000003
PCR反応は、様々なST6GalNAcI遺伝子の増幅のために加圧滅菌された500 μlの反応チューブにおいて行われた。
【０１５９】
（表１）マウスST6GalNAcI切り詰め突然変異体についてのPCR反応パラメーター
2008501344.tif 000004
【０１６０】
PCR反応の結果は、0.8%アガロース/TAEゲルを用いて可視化された。ST6GalNAcI遺伝子は、約1.5 Kbで同定された。DNAは、製造会社の使用説明書(Millipore, Bellerica, MA)に従って、Amicon Ultra free DAフィルターを用いてゲルから抽出され、Microcon YM-100フィルターを用いて精製された。
【０１６１】
0.8%アガロースゲルにおける1.5 kbあたりのDNAバンドがUVライトボックスを用いて同定された。DNAを含むゲル切片がゲルから切除された。Amicon Ultra free DAフィルター(Millipore, Bellerica, MA)を用いて、ゲル切片は、ゲル噴霧器に置かれ、装置は、バイアルに付着したキャップで密封された。組み立て装置は、5000 x gで10分間、遠心分離された。押し出されたDNAは、試料フィルターカップにおける微多孔膜を通過し、濾液バイアスに収集された。バイアルにおける精製されたDNAは、Microcon YM-100ユニット(Millipore, Bellerica, MA)の試料貯蔵所へ移され、2000 rpmで12分間、遠心分離された。移されたDNAは収集された。
【０１６２】
PCR反応から濃縮されたDNAの制限酵素消化は、1.5 mlのチューブにおいて、6.0 μlの精製されたPCR産物、2.5 μlの10X BamHI緩衝液、2.5 μlの10X BSA、1.5 μlのBamHI酵素、1.5 μl XhoI酵素、および11.0 μlのヌクレアーゼを含まない水を加えることにより行われた。反応は、37℃で1.5時間、インキュベートされ、5分間、氷上に置かれた。MBP-pCWin2ベクターDNAは、1.5 mlのチューブにおいて、6.0 μl ベクターDNA(MBP-pCWin2)、2.5 μl 10X BamHI緩衝液、2.5 μl 10X BSA、1.5 μl BamHI酵素、1.5 μl XhoI酵素および11.0 μl ヌクレアーゼを含まない水を加えることにより、消化された。消化反応は、0.8%アガロース/TAEゲル上の電気泳動により分析された。ゲルは、2 μlのローディング色素および10 μlの消化されたDNAを含む消化混合物を添加された。製造会社の使用説明書(Millipore, Bellerica, MA)に従って、1.5 KbあたりのDNAが、Amicon Ultra free DAプロトコールを用いてゲルから抽出され、Microcon YM-100を用いて精製された。
【０１６３】
加圧滅菌された0.5 ml チューブにおいて、以下のBamHI/XhoI消化されたDNAが、その挿入断片をベクターへライゲーションするために加えられた：
【０１６４】
（表２）マウスST6GalNAcI切り詰め突然変異体についてのライゲーション反応
2008501344.tif 000005
【０１６５】
反応混合物は4℃で一晩、インキュベートされた。
【０１６６】
1、2、3、4および5と番号を付された5つのあらかじめ冷却された2 mm ギャップのキュベットのそれぞれへ、表2に列挙された2.0 μlのライゲーション反応物が加えられた。混合物は、50 μlの解凍された(氷上)DH5αエレクトロコンピテント細胞を含む対応するキュベットに加えられた。混合物は、2.5 KV、R5抵抗および129 OHMSにおける電気穿孔法にかけられた。SOC培地(1 ml)が、各反応混合物へ添加され、その後、225 RPMで振盪しながら、37℃で1時間、インキュベートされた。100 μlの各形質転換反応物は、LB(50 μg/ml) Kanrプレート上へ置かれ、37℃で一晩、インキュベートされた。
【０１６７】
陽性クローンのスクリーニングについて、4つの形質転換体コロニーが各構築物から選択され、10 μg/mlのカナマイシンを含むLBブロスの5.0 mlへ接種され、振盪(225 rpm)しながら、37℃で5時間、増殖させられた。DNAは、製造会社の使用説明書(Qiagen, Valencia, CA)に従って、QIA prep Spin Miniprep Kitを用いて単離された。プラスミドDNAは、前に記載されているように、両方のBamHI/XhoIで調製された。消化反応物は、その後、0.8%アガロース/TAEゲル上で分析された。
【０１６８】
コロニー#1〜#4、構築物DH5α/MBP-pCWin2-ST6GalNAcI(それぞれ、Δ31、Δ51、Δ126、Δ185およびΔ200に対応するD32、E52、S127、S186、S201)からのDNAは、MBP-ST6GalNAcI断片を単離するために表3に示されているような制限酵素NdeIおよびHindIIIを用いて二重消化された。
【０１６９】
（表３）ST6GalNAcI切り詰め突然変異体DNA単離物のための診断的条件
2008501344.tif 000006
【０１７０】
反応は、37℃で1.5時間、インキュベートされた。消化反応物は、その後、0.8%アガロース/TAEゲル上で分析された。
【０１７１】
それぞれの切り詰め型ST6GalNAcIからの5つの陽性クローン(コロニー#1)が、発現のために大腸菌JM109細胞へ挿入された。D32、E52、S127、S186およびS201とラベルを付された5つの1.5 ml 加圧滅菌されたエッペンドルフチューブへ、50 μlのJM109化学的コンピテント細胞、構築物DH5α/MBP-pCWin2-ST6GalNAcIからの2.0 μlのミニプレップ(mini-prep)DNAコロニー#1(チューブD32、E52、S127、S186およびS201に対応する)が加えられた。混合物は、振盪なしで、氷上で30分間、インキュベートされ、その後、42℃で30秒間、熱ショックを与えられた。熱ショック後すぐに、チューブを氷へ移された。室温SOC培地(250 μl)が添加され、チューブは、37℃で1時間、225 rpmで水平に振盪された。各培養物の150 μlの容量がLB(50 mg/ml)Kanr寒天プレート上に塗布され、37℃で一晩、インキュベートされた。
【０１７２】
コロニー#1およびコロニー#2構築物JM109/MBP-pCWin2-ST6GalNAcI(D32、E52、S127、S186およびS201)からのDNAはその後、単離されたMBP-ST6GalNAcI断片を得るために以下の通りに制限酵素NdeIおよびXhoIを用いて二重消化された。消化条件は表4に示されている。
【０１７３】
（表４）MBP-pCWin2-ST6GalNAcI構築物のための消化条件
2008501344.tif 000007
【０１７４】
バイアルは、37℃で1.5時間、インキュベートされた。消化反応物は、その後、0.8%アガロース/TAEゲル上で分析された。
【０１７５】
マウスGalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)は、MBP-pCWin2-ST6GalNAcIを有するJM109細胞から発現された。10 μg/mlのカナマイシンを含む150 ml Martone L-ブロスが、JM109/pCWin2-MBP-ST6GalNAcIのそれぞれのN末端アミノ酸を切り詰め型構築物(D32、E52、S127、S186およびS201)のコロニー#1を接種された。光学濃度は、培養物が0.7のODに達するまで620 nmでモニターされた。タンパク質発現は、IPTGの添加(最終濃度＝500 mM)により35℃で一晩、誘発された。次の日、培養物は、40℃、5000 rpmで30分間の遠心分離により採集された。ペレットは蒸留水に再懸濁された。ペレットの1グラムあたり、3.3 mlの水が添加された。細胞はフレンチプレス(French press)を用いて破砕され、溶解された細胞は、10000 rpmで20分間、遠心分離された。細胞ペレットは、細胞上清から分離され、SDS pageゲルは、試料を可視化するために用いられた。
【０１７６】
SDS-PAGEは、Novex XCELL Electrophoresis SystemにおいてNovexプレキャスト4〜20%Tris-グリシンゲルを用いて(Invitrogen, Carlsbad, CA)行われた。試料は、50 μlのタンパク質溶液を50 μlの2X添加液および10 μlの1 M DTTと混合し、続いて98℃で4分間、加熱することにより、調製された。各試料の10 μlの容量は、ゲル上へ添加され、100 Vの定電圧にかけられた。マーカー色素がゲルの下端に達した時、ゲルは、毎回5分間、3回、水で洗浄された。ゲルは、穏やかに振盪しながら、室温で1時間、染色された。ゲルは、クリアなバックグラウンドを得るために水で脱染された。
【０１７７】
（表５）大腸菌DH5αの電気穿孔法のための100 μlの種菌から生じるコロニーの数
すべての形質転換体の表
2008501344.tif 000008
【０１７８】
（表６）大腸菌JM109宿主細胞の電気穿孔法のための150 μlの種菌から生じるコロニーの数
すべての形質転換体の表
2008501344.tif 000009
【０１７９】
図2は、両方のエンドヌクレアーゼを用いる制限消化後、PCRから得られたDNAを示している。1488 bp、1428 bp、1203 bp、1026 bp、および981 bpの予想されるDNA断片は、それぞれ、N末端アミノ酸を切り詰め型ST6GalNAcIのD32、E52、S127、S186およびS201に対応する。図3は、組換えコロニーDH5α/pCWin2-MBP-ST6GalNAcIのスクリーニングを示し、そのDNAは、D32産物についてHindIII/XhoI制限酵素、ならびに構築物E52、S127、S186およびS201産物についてBamHI/XhoIを用いて消化された。
【０１８０】
要約すれば、5つのマウスN末端アミノ酸を切り詰め型GalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)構築物が、示されているように、成功裡に、クローニングされ、大腸菌DH5αおよびJM109宿主細胞へ形質転換された。ST6GalNAcIΔ200を表す構築物S201は、配列分析によりさらに確認された。融合タンパク質は、大腸菌JM109宿主細胞から発現された。大腸菌JM109形質転換体は、SDS pageゲル上で正しいサイズのST6GalNAcI-MBP融合タンパク質を発現させることが示された。
【０１８１】
実施例2：大腸菌発現されたMBP-マウスST6GalNAcIについてのタンパク質再折り畳み条件の開発
マルトース結合タンパク質(MBP)および切り詰め型GalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の大腸菌発現された融合タンパク質は、調べられ、活性酵素を生じるように再び折り畳まれた。この研究について、酵素活性は、CMP-NAN供与体を用いる、ST6GalNAcIによる受容体タンパク質顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)-O-GalNac上へのシアル酸の転移として定義される。
【０１８２】
MBP-ST6GalNAcIに関する再折り畳み実験は、5つの異なるMBP-ST6GalNAcI DNA構築物および16個の異なる可能性のある再折り畳み条件で、1 mlの規模で行われた。再折り畳みは、Hampton Research Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)を用いて行われ、アッセイは、シアル酸のG-CSF-O-GalNAcへの付加を利用するマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(MALDI)分析を用いて、アシアロウシ顎下腺ムチン(A-BSM)またはアシアロフェツイン(AF)へのCMP[14C]シアル酸付加の放射性検出により行われた。データは、大腸菌発現されたMBP-ST6GalNAcIが活性酵素へ再び折り畳まれうることを示している。Hampton Research's Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)に見出される再折り畳み条件8の下で、本明細書に記載されているように、MBP-ST6GalNAcI構築物S201(セリン201)の活性高次構造が得られた。これは、CMP[14C]-シアル酸ST6GalNAcIアッセイ法により確証され、後で、GalNAc-O-G-CSFアッセイ法により確認された。
【０１８３】
JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcI構築物のグリセロールストックが調製された。これらの構築物の組み立ては、本明細書の他の場所で記載されている。本来のマウスST6GalNAcIタンパク質からの異なるアミノ末端アミノ酸切り詰めから構成される；構築物1  −  pCWin2 MBP-ST6GalNAcI-D32アスパラギン酸(496アミノ酸、57115.13分子量)；構築物2  −  pCWin2 MBP-ST6GalNAcI-E52グルタミン酸(476アミノ酸、54814.77分子量)；構築物3  −  pCWin2 MBP-ST6GalNAcI-S127セリン(401アミノ酸、46562.77分子量)；構築物4  −  pCWin2 MBP-ST6GalNAcI-S186セリン(342アミノ酸、40160.65分子量)；および構築物5  −  pCWin2 MBP-ST6GalNAcI-S201セリン(327アミノ酸、38245.82分子量)を含む。
【０１８４】
構築物は、10 μg/ml 硫酸カナマイシンを含む150 ml マルトン(Martone)L-ブロスで増殖された。各培養物は、構築物#1〜#5に対応する1つの単離されたコロニーを接種された。150 ml 培養物は、250 rpmで振盪しながら、37℃で一晩、インキュベートされた。10 μg/ml 硫酸カナマイシンを含む5 ml マルトンL-ブロスのスターター培養物が、構築物S186およびS201の1つの単離されたコロニーを接種された。この手順は、合計4つのスターター培養物について行われた。スターター培養物は、250 rpmで振盪しながら、37℃で一晩、インキュベートされた。
【０１８５】
最後に、10 μg/ml 硫酸カナマイシンを含む2つの1 L マルトン(Martone)L-ブロス培養物が調製された。これらの培養物のそれぞれは、構築物S186またはS201の一晩スターター培養物の5 mlを接種された。これらの1 L 培養物は、OD620が0.6〜1.0の範囲に測定されるまで、250 rpmで振盪しながら37℃でインキュベートされた。この点に達すると同時に、IPTGが、0.5 mMの最終濃度まで2つの1 L 培養物のそれぞれへ添加された。培養物を、250 rpmで振盪しながら、37℃で一晩、インキュベートし続けるようにさせておいた。さらに、10 μg/ml カナマイシンを含む1 1/2リットルのマルトン(Martone)L-ブロスを含む2つの発酵槽容器が、以下のユニット仕様での5.0 mlのスターター培養物を接種された：温度＝37.0、pH＝7.0。
【０１８６】
JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcI構築物1〜5の培養物(150 ml)は、250 mlの遠心分離ボトルへ移された。培養物は、その後、4℃で30分間、5000 rpmで遠心分離された。上清は除去され、ペレットは重量を計られた。各試料からのペレットは、その後、封入体(IBs)を単離するために洗浄された。各構築物のペレットは、最初、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、pH=9の6.0 mlに再懸濁され、その後、20 mg/ml リソザイムの25 μlおよび1 mg/ml DNアーゼIの10 μlを添加することにより溶解された。反応チューブは、その後、37℃で1時間、インキュベートされた。
【０１８７】
各構築物についての可溶化液は、その後、4℃で15分間、10,000 rpmで遠心分離された。上清は除去され、ペレットは、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、pH=6.5の6.0 mlに再懸濁された。上清はその後、除去され、ペレットは、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、pH=6.5の6.0 mlに2度目の再懸濁された。懸濁液は、その後、5000 rpm、25℃で5分間、遠心分離された。上清は除去され、3度目の洗浄が、20 mM Tris-HCl、pH=6.5、5 mM EDTAの6.0 mlにペレットを再懸濁することにより行われた。懸濁液は、その後、5000 rpm、25℃で5分間、遠心分離された。各試料からの上清は除去され、ペレットは重量を計られ、-20℃で保存された。SDS-PAGEは、可溶化液およびペレットの両方を用いて、試料の50 μlおよび2X添加液の50 μlおよび1.0 M DTTの10 μlを加え、98℃で6分間、加熱することにより、行われた。タンパク質の発現は、ゲルにおいて観察された。ペレットは、その後、重量を計られ、20 mM Tris-HCl pH=6.5、5 mM EDTAの1.0 mlで再懸濁された。1 ml アリコートが、5つの構築物のそれぞれについて作製され、分析のために用いられた。これらのアリコートは、3度洗浄された封入体(TWIsB)を表す。
【０１８８】
振盪器フラスコおよび発酵槽におけるJM109/pCWin2-MBP-ST6GalNAcI構築物S186およびS201からの培養物は、1 L 遠心分離ボトルへ移された。培養物は、その後、4℃で30分間、5000 rpmで遠心分離された。上清は除去され、ペレットは重量を計られた。各試料からのペレットは、その後、封入体(IBs)を単離するために洗浄された。S186およびS201のペレットは、最初、20 mM Tris-HCl、pH=8.0、5mM EDTAの35 mlに再懸濁され、その後、12,000 psiでのフレンチプレスの2回の通過により溶解された。
【０１８９】
各構築物についての可溶化液は、その後、50 ml 使い捨てチューブにおいて5000 rpm、25℃で5分間、遠心分離された。上清は除去され、ペレットは、20 mM Tris-HCl、pH=6.5、5 mM EDTAの35 mlに再懸濁された。懸濁液はその後、遠心分離され、試料は、20 mM Tris-HCl、pH=6.5、1%トリトンX-100の35 mlに2度目の再懸濁された。懸濁液は、再び、5000、25℃で5分間、遠心分離された。上清は除去され、3度目の洗浄が、20 mM Tris-HCl、pH=6.5、5 mM EDTAの35 mlにペレットを再懸濁することにより行われた。懸濁液は、その後、5000 rpm、25℃で5分間、遠心分離された。各試料からの上清は除去され、ペレットは重量を計られ、-20℃で保存された。
【０１９０】
可溶化緩衝液は、材料の以下の濃度で調製された：6 M グアニジンHCl、5 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH=6.5および10 mM DTT。この溶液の1 mlが、20 mg TWIBsに添加され、20 mg/ml 溶液を生じた。溶液は、IBsを可溶化するためにベンチトップ上で一晩、インキュベートされた。この手順は、再折り畳み実験のためのタンパク質を供給するために各MBP-ST6GalNAcI構築物のTWIBアリコートに関して行われた。各構築物からのタンパク質試料は、IB可溶化緩衝液の950 μlをタンパク質試料の50 μlを混合することにより希釈された。試料は、その後、UV分光光度計により分析され、タンパク質濃度およびパーセントタンパク質可溶化変換は、それらの値およびモル吸光係数から計算された：構築物D32  −  1 A280ユニットあたり1.24 mg/ml、構築物E52  −  1 A280ユニットあたり1.29 mg/ml、構築物S127  −  1 A280ユニットあたり1.52 mg/ml、構築物S186  −  1 A280ユニットあたり1.77 mg/ml、構築物S201  −  1 A280ユニットあたり1.38 mg/ml。
【０１９１】
タンパク質再折り畳み試料は、Harvard Bioscience G-50 Macro Spin Columns(Holliston, MA)を用いて精製された。G-50カラムからキャップが外され、これらは、2 ml 微量遠心管へ置かれた。500 μlの水が各カラムへ添加され、それらを、その後、水和するように15分間、インキュベートさせておいた。カラムはその後、〜2000 x gで4分間、遠心分離され、その後、それらは、新しい2 ml 遠心管へ移された。各再折り畳み溶液の150 μlが、カラムの1つへ添加された。カラムはその後、2000 x gで〜2分間、遠心分離された。結果として生じた透過物は、精製された再折り畳み試料を表した。SDSゲルが、精製されたタンパク質を可視化するために用いられた。
【０１９２】
大腸菌発現されたMBP-ST6GalNAcIの活性型を結果として生じうる再折り畳み条件をスクリーニングするために、Hampton Foldit Screeningキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)が利用された。各再折り畳み緩衝液の組成物は、本明細書の他の場所で示されている。与えられた再折り畳み条件について、950 μlの再折り畳み緩衝液が、50 μlの可溶化タンパク質と混合された(高タンパク質濃度条件について)、または950 μlの再折り畳み緩衝液が、可溶化タンパク質の高タンパク質濃度の1:10希釈の50 μlと混合された(低タンパク質濃度条件について)。再折り畳み反応物は、低温室(4℃)で回転装置上に置かれ、一晩回転した。
【０１９３】
放射標識された[14C]CMP-シアル酸アッセイ法は、アシアロフェツイン(AF)またはA-BSM(アシアロウシ顎下腺ムチン)受容体への放射標識の付加をモニターすることにより、大腸菌発現された、再折り畳みMBP-ST6GalNAcIの活性を測定するために行われた。50 mgのAFが、50 mg/mlの初期濃度をもつように1.0 mlの水に溶解された。A-BSMは、BSM(ムチン、1-S型)からの加水分解を用いてシアル酸の遊離により調製された。最初のスクリーニングは、150 ml 培養物において得られた、再折り畳みタンパク質試料に関して行われた。その後の再折り畳み試料もまた、再び折り畳まれ、構築物S201およびS186についての1リットルの培養物から精製された。アッセイは、タンパク質試料、陽性対照としてバキュロウイルス由来のST6GalNAcI、受容体を除くすべての成分を含む陰性対照試料、および酵素を除くすべての成分を含む最大入力試料を含んだ。合計20個の試料が試験された。14C ST6GalNAcIアッセイ反応混合物は、50 mM MES pH 6.0、100 mM NaCl、40 nCi [14C]-CMP-シアル酸、0.2 mM 非放射性CMPシアル酸において、50 mg/ml A-BSMまたは0.25 mgでのAFを10 μl 酵素溶液と共に含んだ。
【０１９４】
各再折り畳み試料について、40 μlの反応混合物が、10 μlの再折り畳み試料と混合された。陰性対照として、10 μl H2Oが、40 μlの反応混合物と混ぜ合わされた。陽性対照は、10 μlのST6GalNAcIバキュロウイルス酵素の添加である試料と同じように処理され、上清は40 μl 反応混合物に加えられた。最大入力試料について、40 μlの反応混合物が、10 μlのdH2Oと混ぜ合わされた。反応は、37℃で60分間、インキュベートされた。反応は、5%リンタングステン酸/15%TCAの混合物の100 μlの添加により停止された。反応混合物は、10000 rpmで2分間、微量遠心分離された。上清は、ピペッティングにより除去され、沈降物は、500 μlの5%TCAで洗浄され、ボルテックスされた。混合物は、10,000 rpmで2分間、遠心分離され、上清は、ピペッティングにより除去された。ペレットは、100 μlの10 N NaOHに再懸濁された。1 mlのH2Oが各反応へ加えられた；試料は、短時間、ボルテックスされ、その後、シンチレーションバイアルへ添加された。5 mlのシンチレーションカクテルが、試料および対照のそれぞれに加えられた。試料は、短時間、振盪され、シンチレーションカウンター上に添加され、放射能が測定された。
【０１９５】
G-CSFアッセイが、大腸菌発現された、再折り畳みMBP-ST6GalNAcIが、CMP-NANの存在下で、シアル酸をGalNAc-O-G-CSF受容体へ転移させることができるかどうかを決定するために行われた。ST6GalNAcI構築物S186(再折り畳み緩衝液#8および#11)および構築物S201(再折り畳み緩衝液#8)が、トランスフェラーゼ活性についてアッセイされた。さらに、陽性対照として、バキュロウイルス由来のST6GalNAcIがアッセイされた。アッセイは、GalNAc-O-GCSF(100 μg)、CMP-NAN(0.750 mg)、MES緩衝液、pH 6.0、およびMnCl2(100 mM)を含んだ。表7は、再折り畳み条件#8により得られた酵素により触媒された場合のシアリルトランスフェラーゼ反応を示している。
【０１９６】
（表７）再折り畳み条件#8下で得られた酵素のシアリルトランスフェラーゼ活性
細菌ST6GalNAcI再折り畳み#8によるシアル酸のGalNac-G-CSFへの転移
2008501344.tif 000010
異なる時間間隔(2、24、48および120時間)において、試料のアリコートは、MALDI-飛行時間型（TOF）分析にかけられた。結果は、明らかに、シアル酸のGalNac-O-G-CSFへの転移を示している。
【０１９７】
ペレット重量および封入体重量が、培養物1〜5を表す、5つの150 ml JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcIのそれぞれについて測定された：
【０１９８】
（表８）150 ml JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcI培養物からのペレットおよび封入体重量
2008501344.tif 000011
【０１９９】
ペレット重量および封入体重量は、JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcI構築物S186およびS201培養物を含む1 L 振盪器フラスコおよび1.5 L 発酵槽における培養物について測定された。タンパク質試料は、希釈され、濃度はOD280で測定された。タンパク質濃度および可溶化タンパク質変換のパーセントは、表9に示されているように、すべての5つの切り詰め型ST6GalNAcIクローンについて計算された。
【０２００】
（表９）1 L 振盪器フラスコおよび1 1/2 L 発酵槽JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcI培養物からのペレットおよび封入体重量
2008501344.tif 000012
【０２０１】
表10は、Hampton Research Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)を用いる再折り畳み条件を示す：
【０２０２】
（表１０）Hampton Research Folditキットと共に用いるタンパク質再折り畳み条件
2008501344.tif 000013
【０２０３】
（表１１）最初の再折り畳み緩衝液スクリーニングからの結果
このアッセイにおいて、すべての5つの構築物が、Hampton Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)からのすべての16個の再折り畳み条件下で試験された。これらの再折り畳みは、G-50ゲル濾過により精製され、その後、上記のように、放射性アッセイにより活性について試験された。
2008501344.tif 000014
【０２０４】
この放射性アッセイからの結果は、再折り畳み条件8および9が構築物S201について最良に働くことを示した。構築物S186について2つの条件  −  8および11、構築物S127について条件12、ならびに構築物E52について条件6が、最高CPM数を提供した。
【０２０５】
（表１２）S201構築物再折り畳み#8および#9からの結果
このアッセイにおいて、構築物S201は、Hampton Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)からのDTT有りおよび無しで、1.0 mg/mlおよび0.1 mg/mlの濃度での再折り畳み条件8および9の下で再試験された。再折り畳みタンパク質は、G-50ゲル濾過により精製され、その後、放射性アッセイにより活性について試験された。結果は、再折り畳み#8が再折り畳み#9より高いCPM数を保持することを示している。
2008501344.tif 000015
【０２０６】
（表１３）S186の再折り畳み#11およびS201の再折り畳み#8の反復の結果
これらのタンパク質は、シアル酸のG-csf-O-GalNac(AM644-pg150-156)への転移を分析するために用いられた。
2008501344.tif 000016
【０２０７】
スクリーニング過程において得られた結果から、S201について再折り畳み条件8および9ならびにS186について条件8および11が最も有望な結果を生じることが決定された。再現性を達成するために、追加の再折り畳み反応が、S201について再折り畳み8および9ならびにS186について8および11に関してG-50ゲル濾過を用いて同じ条件下で行われた。これらの実験から、再折り畳み8は、より高い計数を生じ、再現可能であることが見出されたが、条件9および11は生じなかった。
【０２０８】
顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)アッセイが、再折り畳み緩衝液8において構築物S186およびS201の再折り畳みタンパク質について行われた。G-CSF反応物を、32℃で5日間、インキュベートさせておいた。反応物は、1時間目、2時間目および16時間目において、ならびに1日目、2日目および5日目の時点において、分析された。GalNAc-O-G-CSFについての親ピークは、分子量〜19006にあると予想される。成功した反応は、そのピークへの〜309および509分子量の追加により示される。再折り畳みS201についての5日目のデータから、発生ピークが〜19313(GalNAc＋SA)および19515(2GalNAc＋SA)、約307および509の差、に見られた。このデータは再び、シアル酸が、再折り畳み切り詰め型マウスST6GalNAcIタンパク質によりGalNAc-O-G-CSFへ付加され、放射性アッセイにより報告されたことを確認したことを示した。
【０２０９】
これらのデータは、再び折り畳まれた、大腸菌発現されたMBP-ST6GalNAcIが活性のあるシアリルトランスフェラーゼ酵素であること、およびHampton Research's Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)における再折り畳み条件8の下で、MBP-ST6GalNAcI構築物S201(Δ200)の活性のある高次構造が達成可能であることの結論を支持する。機能的に再折り畳みタンパク質の作製は、[14C]放射性およびGalNAC-O-G-CSFアッセイにおいて実証された。
【０２１０】
実施例3：バキュロウイルス発現系におけるヒトおよびマウスGalNAc α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)のクローニングならびに発現
ヒトおよびマウスのGAlNAc α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の両方の発現は、Sf9(昆虫)細胞において実証された。SF9(昆虫)細胞におけるヒトGalNAc α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(hST6GalNAcI)の発現を調べるために、全長ヒトcDNAの長い型が、2つのESTクローンのpCDNA3.1(+)へのPCRクローニングにより構築された(GenBankアクセッション番号はY11339である；NCBIデータベースにおいてcDNAのより短い型がある)。hST6GalNAcIの3つの切り詰め型、K36、K125およびS258(Δ35、Δ124およびΔ257に対応する)は、このhST6GalNAcIクローンに基づいたバキュロウイルスベクターpAcgp67Bへクローニングされた。すべての3つの切り詰めは、Sf9細胞において発現されうり、K36は最高の活性を示した。pTS103と呼ばれる、pAcgp67Aでのバキュロウイルス発現ベクターにおけるマウスST6GalNAcI(Δ30に対応するK31切り詰め)もまた得られた。2つの追加の切り詰め、S127およびS186(Δ126およびΔ185に対応する)が作製され、バキュロウイルスベクターpFastBac-1-gp(Invitrogen, Carlsbad, CA)に発現された。これらの3つの切り詰めに関する発現研究は、S127が最高発現レベルをもつことを示した。
【０２１１】
cDNAの供給源、最終発現プラスミドの組み立てにおける段階の詳細な説明、分泌されたタンパク質の発現および酵素活性を含む、Sf9(昆虫)細胞におけるヒトおよびマウスのGalNAc α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の両方のクローニングならびに発現の過程が本明細書に記載されている。
【０２１２】
ヒトST6GalNAcIの2つの断片を含む2つのヒトESTクローン(クローンIDは4816713/カタログ番号97002RGおよび6300955/カタログ番号97002RG)がInvitrogenから入手された。これらのクローンは、ドライアイス上のチューブにおける細菌グリセロールストックとして得られた。細菌ストックは、クローン#4816713についてアンピシリンを含むLB寒天プレート上に、クローン#6300955についてクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上に、画線された。プレートは、37℃で一晩、インキュベートされた。3つの個々のコロニーが採取され、5 ml LB培地へ接種された。DNAプラスミドは、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いて単離された。酵素消化は、クローン#4816713が、EcoRIにより遊離される約2.2 Kbの挿入断片を有し、クローン#6300955が、EcoRIおよびXhoIにより遊離される約1.5 Kbの挿入断片を有することを示した(図1)。両方のクローンは、予想されたサイズの挿入断片を遊離した。
【０２１３】
配列を公開されたヒトST6GalNAcI(長い型、アクセッション番号Y11339)と比較することにより、クローン#4816713が、ヌクレオチド1375位から1480位までの断片を除く全配列を網羅することが明らかである。クローン#6300955は、ヌクレオチド1070位からC末端までの配列を網羅する。それゆえに、PCRプライマーの2セットは、全長ヒトST6GalNAcI cDNAをクローニングするために設計された。プライマーの第1セットは以下である：
2008501344.tif 000017
。プライマーの第2セットは以下である：
2008501344.tif 000018
(大文字は、pcDNA3.1へのクローニングのための制限部位BamHIおよびEcoRIを表し、下線を引いた残基は、2つの小片をいっしょに置くためのcDNAにおけるXmaI部位を示す)。
【０２１４】
hST6GalNAcIのN末端断片は、鋳型としてクローン#4816713DNA、上で考察されたプライマーの第1セット、およびPfu DNAポリメラーゼを用いて増幅された。hST6GalNAcIのC末端断片は、鋳型としてクローン#6300955、プライマーの第2セット、およびPfu DNAポリメラーゼを用いて増幅された。PCR断片は、QIAEX IIゲル精製キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲル精製された。両方のDNA断片は、pCR-Bluntベクター(Invitrogen, Zero Blunt PCR Cloning Kit, Carlsbad, CA)へクローニングされた。EcoRI消化は、pCR-hST6-N#1〜6およびpCR-hST6-C#1〜6の両方が正しい挿入サイズをもつことを示した。
【０２１５】
pCR-hST6GalNAcI-N#1およびpCR-hST6GalNAcI-C#1が、それぞれ、BamHIおよびXmaI、ならびにXmaIおよびEcoRIで消化された。遊離された断片は、EcoRIおよびBamHIで切断されたpcDNA3.1(+)とライゲーションされた。最終産物pcDNa3.1(+)-hST6GalNAcI-N1C1#1は、酵素消化およびDNAシーケンシング分析の両方により確認された。得られたhST6GalNAcI cDNAは、3つのヌクレオチド変化をもち、それらのうちの2つは、アミノ酸配列を変化させる(Q65KおよびM379I)。これらの違いはすべて、ESTクローンから生じた。
【０２１６】
3つの追加のプライマーが、Sf9細胞における発現のためのhST6GalNAcIの3つの切り詰めを生成するために設計された。プライマーは以下である：
2008501344.tif 000019
(大文字は、pAcgp67Bへのクローニングのための制限部位BamHIを表す)。K36クローンは、ヒトST6GalNAcIの膜貫通ドメイン直後で切り詰められており、S258クローンは、アミノ酸配列比較により、ニワトリST6GalNAcI T233と同じ相対的位置で切り詰められている。後者は、Sf9におけるニワトリST6GalNAcI発現に用いられる同じ発表された切り詰めである(Kurosawa, N., et al. (1994)J. Biol. Chem. 269, 1402-1409)。
【０２１７】
3つのPCR産物が、hST6GN1-R1と対形成される3つのプライマー、鋳型としてpcDNA3.1(+)-hST6GalNAcI-N1C1#1、およびpfu DNAポリメラーゼを用いて得られた。すべてはpCR-bluntへクローニングされた。K36#6、K125#4およびS258#6配列分析は、ベクターが正しいcDNAを含むことを確認した。pCR-bluntベクター由来の挿入断片は、gp67シグナル配列とインフレームでpAcgp67BのBamHIおよびEcoRI部位へクローニングされた。3つの切り詰め、pAcgp67B-K36#4、K125#4およびS258#2、の配列はDNA分析により確認され、全長ヒトST6GalNAcI配列と同じと同定された。
【０２１８】
pAcgp67Bにおける上の3つの切り詰め型hST6GalNAcI、K36、K125およびS258、のDNAは、BD BaculoGold Transfection Kit(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)を用いてBaculoGold DNAと同時トランスフェクションされた。バキュロウイルスを増幅するために、0.1 mlのトランスフェクション上清が、10 cm皿において2x106細胞/mlにおける10 mlのSf9細胞に感染させるために用いられた。P1上清は、感染から3日後、採集された。P2ウイルスストックは、2x106細胞/mlおよびMOI=0.2において50 ml Sf9細胞に感染させることにより得られた。バキュロウイルス上清は、高力価を得るために2回、増幅された。ウイルス力価は、BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)により測定された。50 ml規模生産は、MOI=2、2x106細胞/mlに設定された。培養上清は、2〜4日目に得られた。ST6GalNAcIアッセイは、50 ml規模において、K36およびK125の両方が0.25〜0.35 U/リットルで、およびS258が0.1〜0.2 U/リットルで発現したことを示した。12個のプラーク精製されたK36クローンがさらに試験され、増幅された。クローン#10は、最高活性(1 U/リットル)を示した。クローン#10の1リットル規模生産は、3 U/リットルでの発現レベルをもった。
【０２１９】
pTS103 DNA(10 μg)は、TOP10細胞へ形質転換され、DNAは、その後、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いて単一コロニーから調製された。pTS103は、DNAシーケンシング分析により分析され、データは、このクローンが公開された配列と数個のヌクレオチドの違いをもつことを実証した。pTS103は、K31切り詰め、およびBamHIとBglII制限部位の間のC末端の終わりにmycタグを有するマウスST6GalNAcI(mST6GalNAcI)を含むpAcgp67Aである。
【０２２０】
プライマーは、切り詰め型mST6GalNAcI:S127およびS186を作製するために設計された。プライマーは以下である：
2008501344.tif 000020
(大文字はEcoRIおよびXhoIについての制限部位を表す)。用いられるクローニングベクターはInvitrogen(Carlsbad, CA)からのpFastBac-1-gpであり、gp67シグナル配列が、BamHIとEcoRI部位の間に挿入された。
【０２２１】
2つのPCR産物が、3つの上で言及されたプライマーを用いて得られた。pfu DNAポリメラーゼおよびpTS103は、鋳型として用いられ、pCR-bluntへクローニングされた。配列分析は、pCR-S127#2およびS186#2が正しいcDNAを含むことを確認した。pCR-bluntベクター由来の挿入断片は、gp67シグナル配列とインフレームでpFastBac-1-gpのEcoRIおよびXhoI部位へクローニングされた。pFastBac-1-gp-S127#3およびS186#2は、EcoRIおよびXhoI二重消化ならびにDNA配列分析により確認された。
【０２２２】
pFastBac-1-gp-S127#3およびS186#2 DNAは、Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(Invitrogen, Carlsbad, CA)からのDH10Bacコンピテント細胞へ形質転換された。各形質転換からの12個の白色コロニーが、プレート上を再び画線され、12個のうち8個が実際に色が白であった。「バクミド(bacmid)」DNAは、マニュアル(Qiagen, Valencia, CA)からのプロトコールに従って、QIAprep Spin Miniprep KitでP1、P2およびN3を用いて単離された。PCRスクリーニングは、プライマーとしてM13FおよびmST6-XhoI-3'およびTaq DNAポリメラーゼ(Qiagen, Valencia, CA)を用いてバクミドDNAにおいてmST6GalNAcIの挿入断片を検出するために行われた。各構築物からのすべての8つのクローンは、正しい挿入断片を有し、それらはpTS103配列と同じであった。
【０２２３】
S127、クローン#5および#6、S186、クローン#3および#4、の追加のバクミドDNAが、S.N.A.P. MidiPrep Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて細菌から単離された。バクミドDNAは、Cellfectin(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてSf9細胞へトランスフェクションされた。バキュロウイルス上清は、高力価を得るために1回、増幅された。ウイルス力価は、BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)により測定された。50 ml規模生産は、MOI=2、2x106細胞/mlに設定された。培養上清は、2〜4日目に得られた。ST6GalNAcIアッセイは、両方のS127ウイルスストックが、いずれのS186ウイルスストックより、50 ml規模において0.15〜0.25 u/リットルでのより高い活性を生じたことを示した。12個のプラーク精製されたS127クローンがさらに試験され、増幅された。すべてのクローンは同じ活性を示したが、クローン#4は、わずかにより高い活性(0.46 u/リットル)をもった。クローン#4の1リットル規模生産は、1.7 u/リットルの発現レベルを示した。
【０２２４】
上の研究は、ヒトおよびマウスのGalNAc α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の両方がSf9(昆虫)細胞において発現されうること、ならびに酵素が、約2〜3 u/リットルの発現レベルで培地へ分泌されたことを実証した。
【０２２５】
実施例4：組換えバキュロウイルスを用いる、Sf9細胞におけるニワトリN-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の発現
ニワトリN-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)は、バキュロウイルス発現ベクター系を用いてツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞において発現された。N-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)は、シアル酸をCMP-シアル酸からα2,6結合により、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基のC-6ヒドロキシル基上へ転移させる。
【０２２６】
この酵素は、組換えバキュロウイルスをSf9細胞の培養物に感染させることにより産生された。ニワトリST6GalNAcIの代替の非プラーク精製バキュロウイルスストックもまた、発表された文献における代替クローンの使用に基づいて、用いられた。この代替クローンは、以前には、アミノ酸T233で切り詰められていると考えられていたが、N末端配列分析は、T233の前の余分なアミノ酸がクローニング中に導入され、それゆえに、代替クローンにより産生されたポリペプチドが、全長ST6GalNAcI配列由来のアミノ酸K(リジン)232を含むことを示した。それゆえに、代替クローンは、実際には、K232で切り詰められている。この系統は、プラーク精製され、増幅され、その後、本明細書での実験に用いられた。
【０２２７】
酵素の配列分析のためにニワトリST6GalNAcIのプラーク精製されたウイルスストックからバキュロウイルスDNAを得るために行われる実験、およびこれらのウイルスDNA系統から酵素を産生するために用いられる条件が、本明細書に記載されている。この研究において、産生された酵素は、以下の条件を用いて1リットル規模で産生される場合、11.8ユニット/Lの平均発現レベルをもった：MOI=5〜10、130 rpm、27℃、3.5e9細胞〜7e9細胞の総細胞数、および72時間のインキュベーション。
【０２２８】
バキュロウイルスDNAは、以下のプロトコールに従って単離された。濃縮されたウイルスストックへ、6 μl 0.5 M EDTAおよび4.5 μl 1 M Tris-HCl、pH 8.0が加えられた。その後、0.3 ml 溶解緩衝液(0.2 M NaOH、1% SDS)が加えられ、混合物は、室温で5分間、インキュベートされた。溶解後、0.3 mlの中和緩衝液(3 M NaOAc、pH 5.2)が加えられ、混合物は、4℃で10分間、インキュベートされた。混合物は、微量遠心管において、4℃で、14,000 rpmで10分間の遠心分離により透明にされた。その結果生じた0.84 mlの上清におけるバキュロウイルスDNAは、0.8 ml イソプロパノールを用いて沈澱させられ、氷上で10分間、インキュベートされた。沈澱したウイルスDNAは、室温において、14,000 rpmで10分間の遠心分離により収集された。結果として生じたDNAペレットは、0.5 ml 70% エタノールで洗浄され、空気乾燥された。DNAペレットは、その後、20 μl 1xTE緩衝液(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0)に溶解された。DNA濃度は、OD260を用いて測定された。OD260=0.012、およびそれゆえに、DNA濃度=600 μg/ml。
【０２２９】
ニワトリST6GalNAcIの単離は、PCRを用いて行われた。用いられたプライマーは、
2008501344.tif 000021
を含んだ。50 μl PCR反応は、以下の成分で設定された：5 μl 10xPCR緩衝液、2 μl 10 mM dNTP、1 μl 5'プライマー(10 pmol/μl)、1 μl 3'プライマー(10 pmol/μl)、2 μl DMSO、1 μl DNA鋳型、0.5 μl Herculase酵素(Stratagene, Carlsbad, CA)、および37.5 μl PCRグレードH2O。PCRプログラム条件は、95℃、3分間；95℃、45秒間；5サイクルとして、42℃、1分間、72℃、1分間；95℃、45秒間；35サイクルとして、57℃、1分間、72℃、1分間；72℃、10分間；4℃休止のサイクルを含んだ。
【０２３０】
PCR産物は、MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いて単離された。DNAは、20 μl 1xTE(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0)に溶出された。pCRBluntライゲーションおよび形質転換は、4 μlのPCR反応産物、1 μl 食塩水、および1 μl TOPO pCR4 Bluntベクター(ZeroBlunt TOPO, Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて行われた。ライゲーション混合物の6 μlの容量が、その後、50 μlのTop10細胞へ加えられた。以下のライゲーションインキュベーションが行われた：まず、氷上で30分間、37℃で1分間、その後、氷上で2分間。反応は、0.5 ml SOC培地を加え、その後、混合物を37℃で1時間、インキュベートすることにより行われた。インキュベーション後、200 μlの混合物がカナマイシン含有プレート上に蒔かれた。約100個のコロニーが生成された。
【０２３１】
PCR産物の直接的クローニングもまた、以下の条件下で行われた。反応混合物は、16 μl PCR産物、1 μl BamHI、1 μl XhoI、4 μl BamHI緩衝液、20 μl H2Oを含んだ。反応混合物は、37℃で2時間、インキュベートされた。もう一つの反応混合物は、1 μl pCWIN2-MBPベクター(0.35 mg/ml)、0.5 μl BamHI、0.5 μl XhoI、2 μl BamHI緩衝液、および16 μl H2Oを含んだ。反応混合物は、37℃で2時間、インキュベートされた。直接的クローニング産物のゲル電気泳動、ゲル抽出、ライゲーションおよび形質転換後、10個のコロニーが選択され、プラスミドDNAミニプレップ(miniprep)のために増殖された。これらの10個のミニプレップのうち、6個が、pCWIN2-MBPベクター内に正しい挿入断片を含んでいた。
【０２３２】
アミノ酸232位で切り詰め型ニワトリST6GalNAcIは、発現され、Sf9細胞において、1リットル規模で、組換えバキュロウイルスを用いて、1リットル規模、MOI=5〜10、130 rpm、27℃、3.5e9細胞〜7e9細胞の総細胞数、および72時間のインキュベーション時間を含む条件を用いて、生産された。これらの生産実行における酵素の平均発現レベルは、11.8ユニット/Lである。
【０２３３】
細胞は血球計方法を用いて数えられ、トリパンブルーの作業溶液が調製された。トリパンブルーは、最初は、0.4%溶液であり、0.04%の作業濃度までPBSで希釈される(1:10希釈)。細胞懸濁液の試料は、計数されるために無菌で回収され、希釈溶液(1:2、1:4、1:5、1:10および1:20)が、必要に応じてトリパンブルー作業溶液において、調製された。細胞は、トリパンブルーで染色された後3分以内に数えられた。染色された細胞懸濁液の約10 μlが回収され、ピペットのチップが、カバースリップと共に清潔な血球計のスロット上へ置かれた。細胞懸濁液は、毛管現象によりカバースリップの下を通過した。血球計は、倒立顕微鏡の載物台上へ置かれ、読み取られた。生細胞数は、以下の式を用いることにより決定された：生細胞(細胞/ml)＝(数えられた生細胞の数)/(数えられた正方形の数)x104x希釈係数。すなわち、最初の懸濁液における生細胞総数は、生細胞/mlに最初の懸濁液における総mlを掛けることにより見出された。
【０２３４】
プラーク精製アッセイが、その後、用いられた。方法は、上記のように、Sf9細胞を数える段階および生存度を測定する段階を含んだ。細胞は、少なくとも90%生存可能で、かつ対数増殖期でなければならない。細胞は、20 mlと30 mlの間の最終容量をもって、5e5細胞/mlの密度まで新鮮な培地で希釈された。細胞懸濁液の2.0 mlの容量が、2つの6ウェルプレートにおける各ウェルへ加えられ、細胞は、細胞を平らに分配されるように揺り動かされた。各ウェルは、約1e6細胞を含んだ。プレートは、湿気を供給するために約50〜100 mlの水で湿らされた2枚のペーパータオルを含む密封された容器内に置かれた。プレートは、その後、湿ったタオルとの直接的接触を防ぐためにタオルの上のラック上に置かれ、細胞がウェルの底へ接着するまで、27℃で1〜4時間、容器内でインキュベートされた。ウイルスストックの1:10の段階希釈が、1.0e-1から1.0e-9まで、作製された。容量0.5 ml ウイルスストックが、その系統の希釈のために4.5 ml SFM Sf-900 II培地へ置かれた。
【０２３５】
細胞が、約70〜80%密集度の平らな単層を形成した場合、培地は、滅菌ピペットを用いて細胞から吸引された。陰性対照は、1 mlの新鮮な培地を2つのウェルのそれぞれへ穏やかに加えることにより調製された。1.0e-2から1.0e-9まで、各希釈について2つのウェルが、各ウェルへ1 mlのウイルス希釈溶液を穏やかに加えることにより、感染させられた。プレートは、ウイルスが細胞に感染するのを可能にするように、水平面上において、室温で1時間、インキュベートされた。プラーク形成培地が、その後、10 mlの4%アガロース中の30 mlのSf-900 II 1.3Xを含み、滅菌100 mlボトルにおいて調製された。ボトルは、使用(1時間のウイルスインキュベーション後)直前まで37℃水浴においてインキュベートされた。1時間のインキュベーション後、ウイルス種菌は、滅菌ピペットを用いて、プレートを傾け、縁から吸引することにより、細胞から吸引された。2.0 mlのプラーク形成培地が各ウェルへ加えられた。アガロースを室温で10〜15分間、凝固するようにさせておき、その後、調製物は、プラークが現れるまで、5〜7日間、湿ったペーパータオルと共に密封された容器内で27℃でインキュベートされた。
【０２３６】
プラーク精製は、遠く離れて間隔をあけているプラークをもつプレートを選び取ることにより行われた。滅菌パスツールピペットおよびバルブを用いて、透明なプラークが採取され、アガロースプラグ(ウイルスを含む)を媒介として、500 μl SFM Sf-900 II培地を含む滅菌1.5 ml 微量遠心管へ移された。アガロースプラグは、4℃で一晩、培地でインキュベートされた。ウイルスは、継代1(P=1)増幅へ増幅された。
【０２３７】
6ウェルのプレートに、3 mlにおいて7e5細胞/ml(〜2.0e6細胞総数/ウェル)で対数期Sf9細胞を播種し、室温で5〜15分間、定着するようにさせておいた。プレートに、100 μl プラーク「ピックアップ」を感染させ、穏やかに振盪させた。感染のない1つのウェルは陰性対照として用いられた。プレートは、感染の徴候(粒状に見え、しなびた、死にかけている細胞)の観察まで、27℃で3〜4日間、インキュベートされた。上清は採取され、タンパク質についてアッセイされた。さらなる増幅のための最高活性を含むウェルがP=1ウイルスストックであった。
【０２３８】
アシアロウシ顎下腺ムチン(アシアロBSM)またはアシアロヒツジ顎下腺ムチン(アシアロOSM)基質が、ST6GalNAcI酵素アッセイのために調製された。シアル酸は、500 μl BSMまたはOSM(20 mg/ml)、500 μl dH2O、および130 μl 2 M 氷酢酸を含む反応物において海水分解により遊離された。成分は混合され、80℃で5時間〜18時間、インキュベートされた。反応混合物は、5 ml PBSで希釈された。試料は、Amicon Ultra-15カラム上へ添加され、3,000xg、4℃で20分間、遠心分離された(Millipore, Bedford, MA)。5 mlのPBSが加えられ、カラムは再び、遠心分離された。過程は、3回、または混合物が約pH 7.0であるまで、繰り返された。未処理のBSMまたはOSMは、線形回帰によりAOSMまたはABSMの濃度を推定しうる標準曲線を調製するために用いられた。
【０２３９】
放射性アッセイ法は、ST6GalNAcIをアッセイするために用いられた。反応混合物は、合計40 μl 反応容量において、100,000 CPMの濃度でのCMP14Cシアル酸(窒素により乾燥させられた)、0.2 mM(反応において合計10 nモル)での非放射性CMPシアル酸、A-BSM(受容体基質、0.25 mg)、50 mMでのMES pH 6.0、および100 mMでのNaClを10 μlの酵素試料と共に含んだ。酵素を含まないおよび/または受容体を含まない陰性対照が含まれた。反応混合物は、37℃で1時間、インキュベートされ、その時点において、100 μl(反応あたり)の5%リンタングステン酸/15%TCAが加えられ、十分、混合された。試料は、微量遠心管において最大速度で2分間の遠心分離により調製され、上清は捨てられた。TCA(5%)が反応あたり500 μlで加えられ、試料はボルテックスされた。試料は、再び、微量遠心管において最大速度で2分間、遠心分離され、上清は、ピペッティングにより捨てられた。ペレットは、100 μl 10 N NaOHに再懸濁され、1 ml 水が加えられ、5 ml シンチレーション液が、その結果生じた混合物に加えられ、混合物は、1分間、カウントされた。
【０２４０】
（表１４）ユニット/リットルにおけるST6GalNAcI活性の計算
2008501344.tif 000022
【０２４１】
継代2ウイルス増幅は、30 ml〜50 mlのSFM Sf-900 II培地を含む、250 ml使い捨てエールレンマイアー(ehrlenmeyer)フラスコにおいて2.0e6細胞/mlの濃度までSf9細胞の懸濁液を増殖させることにより行われた。力価測定されたウイルスストックは、0.2のMOIで加えられ、新鮮なSFM Sf900 II培地が50 ml〜100 mlの総容量まで加えられた。培養物は、27℃、130 rpmで48時間、振盪インキュベーターにおいてインキュベートされた。細胞は、滅菌250 ml円錐遠心管を用いる遠心分離により収集された。ウイルスストックは、終点希釈アッセイ法により力価測定された。
【０２４２】
大規模ウイルスストックはSf9細胞において調製された。Sf9細胞の懸濁液は、500 mlのSFM Sf-900 II培地を含む2 L バッフルなしのフェルンバッハ(fernbach)フラスコにおいて7.0e6細胞/ml〜1.4e7細胞/ml(合計3.5e9〜7e9細胞)の濃度まで増殖させられた。力価測定されたウイルスストックは、0.2のMOIで加えられ、新鮮なSFM Sf900 II培地が1リットルの総容量まで加えられた。培養物は、27℃、130 rpmで48時間、振盪インキュベーターにおいてインキュベートされ、細胞は、滅菌1 L円錐遠心ボトルを用いる遠心分離により収集された。ウイルスストックは、終点希釈アッセイ法により力価測定され、4℃で保存された。
【０２４３】
ウイルスストックはまた、以下のように終点希釈アッセイ法を用いて力価測定された。細胞は数えられ、生存度は上記のように測定された。細胞は、少なくとも90%生存可能、かつ対数増殖期にあった。細胞は、新鮮な培地で、10 mlにおいて2.5e5細胞/mlの密度まで希釈され、細胞は、その後、72ウェルのマイクロタイタープレートにおいて10 μl/ウェルで蒔かれた。培地は、各行の最後の2個のウェルにおいてのみ蒔かれた。1.0e-1から1.0e-9までのウイルスストックの段階(1:10)希釈。ウイルスストック(100 μl)は、希釈のために900 μl SFM Sf-900培地へ置かれ(1.0 mlの総容量希釈溶液)、10 μlの1.0e-1希釈された系統が最初のプレートの10個のウェルのそれぞれへ置かれた。プレートは、湿り気のある容器内で27℃で7日間、インキュベートされた。プレートは、10X対物レンズをもつ顕微鏡を用いて観察された。ウェルは、「感染した」または「感染していない」として評価された。Reed-Muench式(Reed, L.J. and Muench, H. (1938) Amer. Jour. Hygiene, 27, 493-497)が、ウイルス力価を決定するために用いられるウイルスの50%感染用量(TCID50)を決定するために用いられた。図25は、上記のように用いられる力価測定ワークシートを示す。
【０２４４】
Sf9細胞における大規模タンパク質ST6GalNAcI生産は、500 mlのSFM Sf900II培地を含む2 Lバッフルなしのフェルンバッハフラスコにおいて7.0e6細胞/ml〜1.4e7細胞/ml(合計3.5e9〜7e9細胞)の濃度までSf9細胞の懸濁液を増殖させることを含む。力価測定されたウイルスストックは、5〜10のMOIで培養物に加えられた。新鮮なSFM Sf900II培地が、その後、1リットルの総容量まで加えられ、培養物は、27℃、130 rpmで72時間、振盪インキュベーターにおいてインキュベートされた。細胞は、滅菌1 L遠心ボトルを用いる遠心分離により収集された。その結果生じた上清は、0.2 μm フィルターユニットを通して濾過され、最終産物は4℃で保存された。
【０２４５】
（表１５）プラーク精製されたP=1ウイルスストックをスクリーニングするST6GalNAcI活性
2008501344.tif 000023
【０２４６】
プラーク精製されたP=1ウイルスストックをスクリーニングする目的は、酵素活性を含む単一のクローン単離物を同定することである。クローン4(0.354 U/L)、クローン6(0.318 U/L)、およびクローン10(0.330 U/L)は最高活性をもち、さらなる増幅のための良い候補である。クローン4は、それがその3つの中の最も高い活性をもつため、選択された。
【０２４７】
（表１６）ニワトリST6GalNAcIの大規模生産
2008501344.tif 000024
【０２４８】
ニワトリST6GalNAcIの配列は以下のように確認された。N末端シーケンシングは、精製されたニワトリST6GalNAcIの20 ugを用いて行われ、結果として、配列：
2008501344.tif 000025
を生じ、本明細書に記載された実験に用いられたニワトリST6GalNAcIが、発表されたアミノ酸K232で切り詰め型X74946ニワトリST6GalNAcIと同じアミノ酸配列(下線を引いた)を有することを検証した。ニワトリST6GalNAcIのDNAシーケンシングは、50 mlのニワトリST6GalNAcIバキュロウイルスストックを用いて行われた。ウイルスDNAはこの系統から抽出され、PCR増幅され、ベクターpCWIN2-MBPへ挿入され、シーケンシングされた。DNAは、K232切り詰めではなく、T233切り詰めの点からシーケンシングされた。その結果生じたDNAは、Sac2/Kpn2制限部位を有し、49.36%GC含有量をもつ1029塩基を有した(図26)。図27に示された、得られた配列の翻訳により、発表されたニワトリST6GalNAcI GenBank X74946と比較した場合、1残基の違いが明らかにされた、すなわちV251A(GTA対GCA、バリン対アラニン)。実験のDNA配列は、pCWIN2-MBP-chST6GalNAcにおいて1つの他の突然変異、沈黙突然変異T233(ACT対ACG、同じアミノ酸、トレオニン)を有し、それは、クローニング中にPCRプライマーにより導入された。
【０２４９】
K232は、ウイルスDNAがPCR増幅された場合、含まれなかった。DNA配列の残りの部分は、発表された配列と同じであることが検証された。
【０２５０】
要約すれば、ニワトリST6GalNAcIウイルスストックは、プラーク精製され、増幅され、酵素がその系統から産生された。8つの生産実行が1リットル規模でなされた。96時間感染させられた実行のうちの2つは、有るか無しかの活性をもった。この報告の期間に行われた生産実行について見られた最良の条件は、MOI=5〜10、130 rpm、27℃、3.5e9細胞〜7e9細胞の総細胞数、72時間のインキュベーションである。これらの条件下で、産生されたST6GalNAcIの平均活性は、11.8ユニット/リットルであった。ニワトリST6GalNAcI配列もまた検証された。N末端シーケンシングは、精製されたニワトリST6GalNAcIタンパク質に関して行われ、配列分析は、それがK232で切り詰められ、N末端部分において発表された配列と同じアミノ酸を有することを確認した。DNAシーケンシングもまた、配列の検証のために行われた。組換えウイルスDNAは、ニワトリST6GalNAcIバキュロウイルスストックから抽出され、PCR増幅された。DNAは、K232ではなく、T233切り詰めからPCR増幅された。DNAはベクターpCWIN2-MBPへ挿入され、シーケンシングされた。結果より、発表された配列GenBank X74946と比較した場合、シーケンシングされたニワトリST6GalNAcIにおける1塩基の違い(GTA対GCA)が明らかにされた。この違いは、結果として、ポリペプチドにおいてV251A(バリン対アラニン)の1アミノ酸の違いを生じる。DNA配列によりまた、PCRプライマーにより導入された1つの他の沈黙突然変異T233(ACT対ACG)が明らかにされた。DNA配列の残りの部分は、発表された配列と同じであることが確認された。
【０２５１】
実施例5：組換えバキュロウイルスを用いるSf9細胞におけるニワトリN-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)のN末端欠失のシアリルトランスフェラーゼ活性
この実施例は、pAcGP67バキュロウイルス発現ベクター系を用いる、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞におけるニワトリN-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の4つのN末端欠失の発現を記載する。N-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)は、シアル酸をCMP-シアル酸から、α2,6-結合により、糖タンパク質のトレオニンまたはセリンへO結合したN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基上へ転移させる。
2008501344.tif 000026
【０２５２】
ニワトリST6GalNAcIのN末端欠失を発現させるウイルスストックが得られた。このウイルスストックは、pVL1392バキュロウイルス発現系を用いて作製された(Blixt et al., 2002, J. Am. Chem. Soc., 124:5739-5746)。このウイルスストックを用いる複数の10x 1 L 酵素生産実行の酵素活性は平均して12 U/Lであった。
【０２５３】
ニワトリST6GalNAcIの4つのN末端欠失  −  Δ48、全長ニワトリST6GalNAcIのアミノ酸49位から始まる切り詰め突然変異体；Δ152、全長ニワトリST6GalNAcIの残基153位から始まる切り詰め突然変異体；Δ225、全長ニワトリST6GalNAcIの残基226位から始まる切り詰め突然変異体；およびΔ232、全長ニワトリST6GalNAcIの残基233位から始まる切り詰め突然変異体  −  がPCRを用いて作製された。結果として生じた4つのPCR断片は、それぞれ、アミノ酸Q49、V153、L226およびT233で始まるST6GalNAcIコード配列を含んだ。ニワトリST6GalNAcIのN末端欠失の部位は、ヒト、マウスおよびニワトリST6GalNAcIコード配列間の配列類似性に基づいて選択された(図28)。
【０２５４】
Δ48N末端欠失突然変異体は、予想された膜貫通ドメイン直後に開始するコード配列を作製するように設計された。ニワトリST6GalNAcIの膜貫通領域は、以前には、アミノ酸17位〜37位の間であると予想されていたが(Kurosawa et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:1402-1409)、ヒドロパシープロット分析は、アミノ酸26位と48位の間の膜貫通領域を示唆した。Δ152N末端欠失突然変異体は、ヒトおよびマウス酵素との配列類似性の予想された領域を含むニワトリST6GalNAcI酵素のステム領域の部分を含む切り詰め突然変異体を作製するように選択された(図31)。第3のN末端欠失突然変異体、Δ232は、Blixt et al.(2002, J. Am. Chem. Soc., 124:5739-5746)により発表されたようなST6GalNAcIコード配列に似ているように作製された。
【０２５５】
最初の活性アッセイは、Δ232ウイルスストックが不活性であることを示した(下記参照)。最初のウイルスストックに含まれたST6GalNAcI配列は、それゆえに分析された。野生型酵素に存在するものと同一の追加のN末端アミノ酸が、ベクターの多重クローニング部位からのこの切り詰め突然変異体配列へうっかりと供与され、Δ232のN末端直接にアミノ酸DPKの挿入を含むことが決定された。ST6GalNAcIファミリーにおいて、すべての3つの配列におけるΔ232のすぐ上流のアミノ酸は、(NED)FKである(添付書類2参照)。それゆえに、第4のN末端欠失、Δ225は、Blixt et al.(2002, J. Am. Chem. Soc., 124:5739-5746)により記載されたクローンを代表するように作製された。
【０２５６】
ニワトリST6GalNAcIウイルスストックは、イヌのインスリン分泌シグナルペプチドを含むベクター、pVL1392、を用いて作製された。この研究のために調製された他の欠失は、糖タンパク質67(gp67)分泌シグナルペプチドを含むpAcGP67Bベクター(Pharmingen, San Diego, CA)へクローニングされた。gp67シグナルペプチドは、イヌのインスリン分泌ペプチドより強い分泌シグナルとして用いられた。PCR反応は、表17に示されているように、設定された。
【０２５７】
（表１７）切り詰め突然変異体の作製のためのPCR反応
2008501344.tif 000027
PCRプログラムは、以下のサイクル下で行われた：a)95℃、3分間；b)5サイクルとして、95℃、45秒間；42℃、1分間、72℃、1.5分間；c)30サイクルとして、95℃、45秒間；57℃、1分間、72℃、1.5分間；d)72℃、10分間；e)4℃休止。
【０２５８】
Δ232突然変異体を作製するために用いられたPCRプライマー対は、
2008501344.tif 000028
であった。単離かつ濃縮されたバキュロウイルスDNA鋳型がPCRに用いられた。1マイクロリットルの鋳型(600 ng/μl)がPCRに用いられた。1002 bp PCR産物が産生された。
【０２５９】
Δ48を作製するために用いられたPCRプライマー対は、
2008501344.tif 000029
であった。Δ152突然変異体を作製するために用いられたPCRプライマー対は、
2008501344.tif 000030
であった。両方のPCR断片についてのDNA鋳型は、プラスミドDNA pBluescript-chST6GalNAcIであった。chST6GalNAcI-Δ48について、1554 bp PCR産物が産生された。chST6GalNAcI-Δ152について、1242 bp PCR産物が産生された。
【０２６０】
Δ225突然変異体を作製するために用いられたPCRプライマー対は、
2008501344.tif 000031
であった。DNA鋳型は、プラスミドDNA pBluescript-chST6GalNAcIであった。最初の5サイクルについてのアニーリング温度は、40℃であり、最後の30サイクルについては53℃であった。chST6GalNAcI-Δ225について、1023 bp PCR産物が産生された。
【０２６１】
PCRバンドは、電気泳動され、ゲル抽出により単離された。DNAは、20 μl 1xTE(10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH 7.5)に溶出された。単離されたPCR産物をベクターへライゲーションするために、ライゲーション反応は、各単離されたDNAに関して行われた。chST6GalNAc 1-Δ232PCR産物について、ライゲーション反応は、4 μl PCR産物、1 μl 食塩水、および1 μl TOPO pCR4(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含んだ。反応は、室温で15分間、インキュベートされた。すべての他のPCR産物について、ライゲーション反応は、4〜7 μl PCR産物、1 μl pCR4 Bluntベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)、1 μl T4 DNAリガーゼ緩衝液、1 μl T4 DNAリガーゼを含み、残りの容量はH2Oを含む10 μlまでであった。ライゲーション反応は16℃で1時間、インキュベートされた。
【０２６２】
その後、各ライゲーション混合物の6 μlが、50 μlのTop10細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含むチューブを区別するように加えられた。それぞれのインキュベーションは、氷上で30分間、37℃で1分間、氷上で2分間、0.5 ml SOCを加えて、その後、37℃で1時間、行われた。インキュベーション後、各インキュベーション混合物の200 μlが、カナマイシン含有プレート上に塗布された。約100個のコロニーが各形質転換反応について生成された。
【０２６３】
単一のコロニーが選択され、50 μg/ml カナマイシンを含む3 ml 培地において37℃で一晩、増殖された。挿入断片は、PCRプライマーへ設計された制限部位に対応する対での制限酵素を用いることにより正しいと検証された。
【０２６４】
pAcGP67BベクターおよびpCRBluntベクターにおける各挿入断片は、制限部位に適切な、対での制限酵素で消化された。消化されたDNAは、0.8%アガロースゲル上で分離された。対応するバンドは、外科手術用ナイフで切除され、DNAがMiniElute Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲルから抽出された。挿入断片およびベクターが、T4 DNAリガーゼを用いていっしょにライゲーションされた(1:1から6:1までの範囲の比で)。ライゲーション混合物は、Top10細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)へ形質転換され、カルベニシリン含有プレート上に塗布された。37℃での一晩のインキュベーション後、数個のコロニーが採取され、各プラスミドについての正しい挿入断片およびベクターに関してスクリーニングされた。サブクローニング手順は、pAcGP67B-Δ232 BamHI/EcoRI、pAcGP67B-Δ152およびpAcGP67B-Δ48 BamHI/EcoRIおよびpAcGP67B-Δ225 BamHI/EcoRIを含んだ。
【０２６５】
25 cm2 ファルコン(Falcon)フラスコ(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)において、1x106 Sf9細胞が播種された(50〜70%集密)。直線化されたBaculoGold DNA(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)(0.5 μg)は、微量遠心管において2 μg 組換えプラスミドDNAおよび100 μlのSF900 II SFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)と混合された。もう一つのチューブにおいて、6 μlのセルフェクチン(cellfectin)が、100 μl SF900 II SFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)と混合された。2つの混合物は、混ぜ合わせられ、室温で15〜45分間、インキュベートされた。フラスコにおける培地は、除去され、Sf9細胞は、DNA混合物で覆われた。SF900 II SFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)の追加の0.8 mlがフラスコへ加えられ、27℃で5時間、インキュベートされた。インキュベーション後、DNA混合物およびセルフェクチンは除去され、3 mlの新鮮なSF900 II SFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)がフラスコへ加えられた。フラスコにおけるSf9細胞は、27℃で5日間、振盪なしでインキュベートされた。可視の感染は、72時間後に観察された。
【０２６６】
5日間のインキュベーション後、培養上清は、1,000 x gで10分間の遠心分離により透明化された。この上清は、継代1(P1)ウイルス増幅系統と名付けられた。1 mlのP1ウイルスストックは、Sf9細胞の50 ml 懸濁培養物(2x106細胞/ml)とインキュベートされた。インキュベーションは、100 rpmで5日間、撹拌しながら、27℃で行われた。培養物は、4℃でのCorning滅菌円錐遠心管(Corning, Corning, NY)における5000 rpm(7,000 x g)で30分間の遠心分離により収集され、その結果生じた上清は、継代2(P2)ウイルス増幅系統と名付けられた。
【０２６７】
12 mlのP2ウイルスストックは、Sf9細胞の150 ml 懸濁培養物(2x106細胞/ml)とインキュベートされた。インキュベーションは、27℃で撹拌しながら、100 rpmで5日間、行われた。P2ウイルスストックについて記載されているように単離された上清は、継代3(P3)ウイルス増幅系統と名付けられた。P1およびP2は、-80℃で保存された。P3は、暗闇中4℃で保存された。組換えバキュロウイルスの力価は、プラークアッセイ法により測定された。
【０２６８】
組換えタンパク質は、2x106細胞/ml Sf9細胞の200 mlにP3ウイルスストックの25 mlを感染させることにより産生された。培養物は、27℃で撹拌しながら、100 rpmで72時間、インキュベートされた。上清は、P2およびP3ウイルスストックについて記載されているように単離された。
【０２６９】
その結果生じた上清は、アシアロウシ顎下腺ムチンのシアル酸付加を触媒する、およびシアル酸-ポリエチレングリコール結合体のG-CSFへの転移(G-CSFの「シアリルPEG化」)を触媒する能力についてアッセイされた。より一般的には、グリカン-ポリエチレングリコール結合体、すなわち「グリコPEG」結合体、のもう一つの分子への設計および転移は、全体として参照により本明細書に組み入れられている、国際(PCT)特許出願第WO 03/031464(PCT/US02/32263)号において詳細に示されている。
【０２７０】
放射性アッセイ法は、本明細書の他の場所に記載されているように、14C-シアル酸の14C-CMP-シアル酸からアシアロ-ウシ顎下腺ムチへの転移を測定するために用いられた。
【０２７１】
（表１８）シアリルPEG化アッセイ
2008501344.tif 000032
【０２７２】
シアリルPEG化反応混合物は、33℃で穏やかに振盪させながら、18〜72時間、インキュベートされた(下記のように)。インキュベーション後、2.5 μlの5x SDS試料緩衝液が各反応混合物へ加えられ、全反応混合物は、4〜20%SDS-PAGE勾配ゲルにおける電気泳動にかけられた。PEG化G-CSFは、ゲルのヨード染色により検出された。
【０２７３】
DNAミニプレップ分析を用いて、pCRBlunt構築物が挿入断片について調べられた。分析は、pCRBlunt-chST6GalNAcI-Δ232 BamHI/XhoIコロニー#2〜#6が正しい挿入断片を含むと同定され、pCRBlunt-chST6GalNAcI-Δ152 BamHI/EcoRIコロニー#1、#3〜#6が正しい挿入断片を含むと同定され、pCRBlunt-chST6GalNAcI-Δ48 BamHI/EcoRIコロニー#1、#2、#3、#5および#6が正しい挿入断片を含むと同定され、pCRBlunt-chST6GalNAcI-Δ225 EcoRIコロニー#2が正しい挿入断片を含むと同定されることを実証した。
【０２７４】
DNAミニプレップ分析を用いて、サブクローニング構築物が挿入断片について調べられた。分析は、pAcGP67B-chST6GalNAcI-Δ232 BamHI/EcoRIコロニー#1〜#4が正しい挿入断片を含むと同定され、pAcGP67B-chST6GalNAcI-Δ152 BamHI/EcoRIコロニー#1〜#4が正しい挿入断片を含むと同定され、pAcGP67B-chST6GalNAcI-Δ48 BamHI/EcoRIコロニー#1〜#4が正しい挿入断片を含むと同定され、pAcGP67B-chST6GalNAcI-Δ225 BamHI/EcoRIコロニー#1〜#8が正しい挿入断片を含むと同定されることを実証した。
【０２７５】
ニワトリST6GalNAcI突然変異体を含む組換えバキュロウイルスの力価もまた測定された。Δ232突然変異体は8.50x106の力価をもち、Δ152突然変異体は2.28x107の力価をもち、Δ48突然変異体は1.28x107の力価をもった。
【０２７６】
（表１９）放射性アッセイ法におけるシアル酸付加活性の概要
2008501344.tif 000033
【０２７７】
K232 VS4-001を用いる精製された酵素は陽性対照として用いられた。タンパク質産生に用いられたMOIは以下の通りであった：Δ48 #1、0.800；Δ152 #1、1.430；Δ232 #1、0.531；Δ48 #2、0.200；Δ152 #2、0.356；Δ232 #2、0.133。RSDは2.5%未満。
【０２７８】
注記：Δ232ウイルスストックについて、活性は4/8/04においてゼロであったため、それらは4/26/04において再アッセイされなかった。ダブルアスタリスク(**)でマークされた結果をもつ突然変異体は、シアリルPEG化活性について陽性と判定された。
【０２７９】
実施例6：MBP-ST6GalNAcIタンパク質の再折り畳み
真核生物のST6GalNAcIはMPBに融合された。簡単には、5つのマウスST6GalNAcI構築物が作製された：D32、E52、S127、S186およびS201。各構築物は、ベクターpcWin2-MBP由来のMBPタグの後に発現され、構築物に含まれる「ステム」領域の範囲が異なる。D32が最も長い型で、予想されるアミノ末端膜貫通ドメインのすぐ下流から始まる。S201は最も短く、保存された触媒性ドメインの予想される出発点のすぐ前から始まる。
【０２８０】
マウス構築物に加えて、ヒトST6GalNAcI K36もまた、MBPとの融合体として発現された。ヒト構築物は、膜貫通ドメイン直後から始まる。ヒトST6GalNAcIのK36からそれのc末端までをコードするDNAは、鋳型として既存のバキュロウイルス発現ベクターを用いるPCRにより単離され、pcWin2-MBP内のBamHI-XhoI部位へクローニングされた。
【０２８１】
参照として、MBP-mST6GalNAcI S127およびMBP-hST6GalNAcI K36についての配列は図26に含まれる。さらに、図38は、ヒトST6GalNAcIについて、およびニワトリST6GalNAcIについての全長アミノ酸配列、ならびに天然のマウスタンパク質の残基32位から始まるマウスST6GalNAcIタンパク質の配列を提供した。
【０２８２】
上記のものに加えての欠失突然変異体が作製されており、本発明に用いる好ましいST6GalNAcIの完全リストは表20に見出される。図35は、いくつかの好ましいヒトST6GalNAcI切り詰め突然変異体の概略図を提供する。図36は、ヒトST6GalNAcI切り詰め突然変異体を含むMBP融合タンパク質の概略図を示す。
【０２８３】
（表２０）ST6GalNAcI突然変異体
2008501344.tif 000034
【０２８４】
図37は、ヒトST6GalNAcIタンパク質における対および不対のシステイン残基の位置を示す。単一および二重システイン置換もまた示されている、例えば、C280S、C362S、C362T、(C280S＋C362S)、および(C280S＋C362T)。
【０２８５】
最初の発現研究は、ST6GalNAcI融合タンパク質が不溶性タンパク質として発現されたことを示した。活性組換え酵素を回復させるために、不活性の不溶性タンパク質は単離され、以下に記載されているように、再び折り畳まれた：
【０２８６】
pcWin2-MBP-mST6GalNAcI D32、E52、S127、S186、またはpcWin2-MBP-hST6GalNAcI K36のいずれかを有するJM109細胞の対数的増殖中の0.5 L 培養物は、1 mM IPTGで、37℃で一晩、誘発された。細胞は遠心分離により収集され、20 mM Tris pH 8、5 mM EDTAの100 mLにおいて微量流動化装置での機械的破壊により溶解された。不溶性物質は7000 x gで20分間の遠心分離により収集された。上清は捨てられ、ペレットは、高塩緩衝液(20 mM Tris pH 7.4、1 M NaCl、5 mM EDTA)、界面活性剤緩衝液(25 mM Tris pH 8、1%Na-デオキシコール酸、1%トリトンX100、100 mM NaCl、5 mM EDTA)、およびTE(10 mM Tris pH 8、1 mM EDTA)で洗浄された。各洗浄は100 mLにおいてであり、ペレットは上記のように遠心分離により収集された。洗浄後、封入体ペレットは等分され、-80℃で保存された。
【０２８７】
適切な再折り畳みおよびそれに従ってのST6GalNAcI活性の回復を可能にする条件をスクリーニングするために、マウスおよびヒトST6GalNAcI融合タンパク質封入体のアリコートは、6 M グアニジン、10 mM DTT、1x TBSに可溶化された。タンパク質濃度は、ブラッドフォード(Bradford)アッセイ法により標準化され、可溶化されたタンパク質は、一連の市販されているタンパク質再折り畳み緩衝液へ移された。再折り畳みは、振盪させながら、96ウェルのプレートにおいて4℃で一晩、0.2 mg/mLでの0.25 mL中で行われた。再折り畳み物は、96ウェルの透析プレート(25000 NWCO)へ移され、1x TBS、0.05%ツイーン-80に対して4℃で4時間、透析され、続いて、10 mM BisTris pH 7.1、100 mM NaCl、0.05%ツイーン-80に対して4℃で一晩、透析された。
【０２８８】
再折り畳み組換えST6GalNAcI融合タンパク質は、384ウェルの固相活性アッセイ法において活性について試験された。簡単には、活性アッセイ法は、ビオチン化シアル酸の、ビオチン化CMP-NANから、384ウェルのプレートにおけるアシアロ-ウシ顎下腺ムチンコーティング化ウェルへのST6GalNAcI媒介性転移を検出する。各反応(13.5 μL 再折り畳み物＋1.5 μL 10x反応緩衝液)は、4連で行われた。10x反応緩衝液は、0.2 M BisTris pH 6.7、25 mM MgCl2、25 mM MnCl2、0.5%ツイーン-80、および1 mM 供与体であった。37℃での一晩のインキュベーション後、プレートは、過剰1xTBS、0.05%ツイーン-20、および製造会社の使用説明書(Perkin Elmer)の通りユーロピウム標識されたストレプトアビジンで検出されるビオチンで洗浄された。ST6GalNAcI活性を示す、プレート上に保持されたユーロピウム蛍光レベルは、Perkin Elmer Victor3Vプレートリーダーで記録され、発現および活性結果は、表21に要約されている。再折り畳みST6GalNAcI融合タンパク質のうちの3つは、検出可能な活性をもった。
【０２８９】
（表２１）固相アッセイ法による活性について試験された、再折り畳みST6GalNAcI融合タンパク質の概要
2008501344.tif 000035
【０２９０】
要約すれば、ニワトリST6GalNAcIの4つのN末端欠失は、分泌される活性酵素として、Sf9細胞において成功裡に発現された。4つの活性クローンについての最大活性レベルは様々であり、K232 VS4-001は19 U/Lにおいて、Δ48は47 U/Lにおいて、Δ152は44.1 U/Lにおいて、およびΔ225は27.9 U/Lにおいてであった。さらに、Δ48、Δ152およびΔ225ウイルスストックにおいて産生される突然変異体ニワトリST6GalNAcIは、等しく、GalNAc-O-G-CSFをシアリルPEG化することができた(図32および33)。
【０２９１】
実施例7：追加のヒトST6GalNAcIタンパク質の作製
hST6GalNAcI切り詰め型のクローニング：以下のオリゴ：hST6T73-hST6-G273およびhST6CooHは、様々なヒトST6GalNAcI切り詰め型を増幅するために用いられた。
【０２９２】
（表Ｉ）hST6GalNAcIについての切り詰め型オリゴ
オリゴ、hST6-T73-G273についてのBamHI制限部位、およびhST6-CooHオリゴについてのXbaI制限部位は下線を引かれた。
2008501344.tif 000036
【０２９３】
鋳型DNA：phST6GalNAcI K36(hST6GalNAcI遺伝子のΔ35切り詰めをもつプラスミド)
【０２９４】
PCR反応：50 μl 反応物は、以下のPCR条件下で、Herculase(登録商標)Enhanced DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて行われた：30サイクル：92℃、45秒間；61℃、1分間；72℃、3分間；および4サイクル：92℃、45秒間；61℃、1分間；72℃、10分間。
【０２９５】
アガロースゲル分析：PCR反応物からの3 μl アリコートが、EtBrで染色されたTAE緩衝液における1%アガロースゲルにおいて分析された。
【０２９６】
hST6GalNAcI切り詰め型のクローニング：PCR増幅されたDNA断片は、アガロースゲルからMillipore Ultrafree DAカートリッジを用いて精製され、Amicon microcon YM-100フィルターを用いて濃縮された。精製されたDNA断片からの1〜2 ul アリコートが、Zero blunt(登録商標)TOPO(登録商標)PCRクローニングキット(Invitrogen)に用いられた。反応物は、コンピテントTOP10大腸菌細胞(Invitrogen)へ形質転換された。50 μl 形質転換体がMartone Agar Kan50プレート(Teknova)上へ導入された後、以下のコロニーが得られた。
2008501344.tif 000037
【０２９７】
プラスミドDNAは、50 μg/ml カナマイシンを追加されたMartone L-Broth液体培地(Teknova)の5 mlにおいて選択されたコロニー(各切り詰め型から4〜5個)を増殖させた後、培養物から得られた。
【０２９８】
hST6GalNAcIクローンのスクリーニング：プラスミドDNAは、Wizard(登録商標)Plus SV Minipreps DNA精製システムを用いて4 mlの一晩の培養物から精製された。精製されたプラスミド(10 μl)は、BamHIおよびXbaI制限酵素で消化され、続いて、正しい挿入断片(切り詰め)を確認するためにアガロースゲル分析[1.2%E-gel(Invitrogen)]が行われた。
【０２９９】
上のhST6GalNAcI切り詰め型は、バキュロウイルス発現ベクター、pAcGP67Bへクローニングされ、SF9昆虫細胞培養において発現された。ST6GalNAcI活性は、感染した培養物から得られた試料において測定され、結果は図38に示されている。切り詰め型ヒトST6GalNAcIタンパク質のそれぞれは、バキュロウイルス系における発現後、検出可能な活性をもった。hST6-E110タンパク質が最高活性をもった。
【０３００】
hST6GalNAcI切り詰め型は図39に示されている。図はまた、マウスおよびニワトリタンパク質とのヒト配列のアラインメントを示し、タンパク質間の同一および保存されたアミノ酸残基を同定している。
【０３０１】
実施例8：SBD配列を含む切り詰め型ST6GalNAcIタンパク質
N-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)は、シアル酸をCMP-シアル酸から、α2,6結合により、糖タンパク質のトレオニンまたはセリンへO結合したN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基上へ転移させる。
【０３０２】
この報告は、pAcGP67バキュロウイルス発現系を用いて、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞におけるヒト(SBD-K36、K36-SBD)およびマウス(SBD-S127、S127-SBD)ST6GalNAcIのN末端ならびにC末端でのSBDタグのクローニングおよび発現を記載する。
【０３０３】
すべての4つのウイルスストックは、SF9細胞(150 mL規模)を96時間、感染させるために用いられ、その結果生じた上清は、β-シクロデキストリンカラム上で単離され、濃縮され、アシアロウシ顎下腺ムチンのシアル酸付加およびG-CSFのシアリルPEG化の両方についてアッセイされた。
【０３０４】
方法
1. 構築物設計
gp67分泌ペプチド、ST6GalNAcIコード配列、およびSBDコード配列の間の三者融合が構築された。ST6GalNAcIおよびSBDの制限地図(添付書類4)ならびにpAcGP67Bベクターにおける多重クローニング部位に基づいて、NcoI/NotI/BglIIが、SBD-ST6GalNAcI構築物をクローニングするために選択され、およびBamHI/NotI/BglIIが、ST6GalNAcI-SBD構築物をクローニングするために選択された。NotI部位は、SBDとST6GalNAcIコード配列の間に4アミノ酸(WRPPまたはRRPP)を導入した。この伸長は、これらの2つのタンパク質ドメインを分離するのに役立つことができた。大腸菌について最適化されたSBD遺伝子コドンは、この研究に用いられなかった。SF9細胞のコドン偏りが、原核生物の大腸菌とは対照的に、真核生物のA. ニゲル(A. niger)のそれにより近いであろうことが決定されたため、本来のA. ニゲルSBDコード配列が選択された。
【０３０５】
2. PCR反応
5 μl  10x PCR緩衝液
2 μl  10 mM dNTP
1 μl  5'プライマー(10 pモル/μl)
1 μl  3'プライマー(10 pモル/μl)
2 μl  DMSO
1 μl  DNA鋳型(10 ng/μl)
0.5 μl  Herculase(Stratagene、カタログ番号600260-51)
37.5 μl  PCRグレードH2O
【０３０６】
K36およびS127について用いられたPCRプログラムは、a)95℃、3分間；b)5サイクルとして、95℃、45秒間；42℃、45秒間、72℃、1.5分間；c)30サイクルとして、95℃、45秒間；54℃、45秒間、72℃、1.5分間；d)72℃、10分間；e)4℃休止であった。(LL774、pg 51)。PCRはT3サーモサイクラーを用いて行われた。
【０３０７】
SBDについて用いられたPCRプログラムは、a)95℃、3分間；b)5サイクルとして、95℃、45秒間；40℃、45秒間、72℃、1分間；c)30サイクルとして、95℃、45秒間；55℃、45秒間、72℃、1分間；d)72℃、10分間；e)4℃休止であった。(LL774、pg 51)。PCRはT3サーモサイクラーを用いて行われた。
【０３０８】
3. ゲル抽出
MinElute Gel Extraction KitがすべてのPCRバンドを単離するために用いられた。DNAは、20 μl 1x TE(10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH 7.5)に溶出された。
【０３０９】
4. pCRBluntライゲーションおよび形質転換
4.5 μl  PCR産物
1.0 μl  食塩水
0.5 μl  TOPO pCR4
【０３１０】
反応物は、室温で9分間、インキュベートされた。
【０３１１】
各ライゲーション混合物の2マイクロリットルが、Top10細胞の25 μlを含むエッペンドルフチューブを区別するように加えられた。それぞれの以下のインキュベーションが行われた：氷上で5分間、42℃45秒間、氷上で2分間、0.1 mL SOCを加え、その後、37℃1時間。インキュベーション後、120 μlの混合物がカナマイシンプレート上に塗布された。約7個〜70個のコロニーが各形質転換について生成された(LL774、pg 51)。
【０３１２】
プラスミドDNAミニプレップ
【０３１３】
単一のコロニーが採取され、50 μg/mL カナマイシンを含む2 mL テリフィックブロス(terrific broth)培地において37℃で一晩、増殖された。正しい挿入断片は、部位がPCRプライマー中へ設計された対での制限酵素で調べられた。
【０３１４】
5. サブクローニング
pAcGP67BベクターおよびpCRBluntベクターにおける各挿入断片は、適切な対での制限酵素で消化された。消化されたDNAは、0.8%アガロースゲル上で分離された。対応するバンドは、外科手術用ナイフで切り出され、DNAは、MiniElute Kitを用いてゲルから抽出された。挿入断片およびベクターは、T4 DNAリガーゼを用いていっしょにライゲーションされた。ライゲーション混合物は、Top10細胞へ形質転換され、アンピシリン(カルベニシリン)プレート上に塗布された。37℃での一晩のインキュベーション後、数個のコロニーが採取され、各プラスミドについての正しい挿入断片およびベクターについてスクリーニングされた。
【０３１５】
6. 同時トランスフェクション
25 cm2 ファルコンフラスコにおいて、1x106個のSf9細胞が播種された(50〜70%集密)。直線化されたBaculoGold DNA(0.5 μg)は、エッペンドルフにおいて2 μg 組換えプラスミドDNAおよび100 μLのSF900 II SFMと混合された。もう一つのチューブにおいて、6 μlのセルフェクチンが、100 μl SF900 II SFMと混合された。2つの混合物は、混ぜ合わせられ、室温で15〜45分間、インキュベートされた。フラスコにおける培地は、除去され、Sf9細胞は、DNA混合物で覆われた。SF900 II SFMの追加の0.8 mlがフラスコへ加えられ、27℃で4時間、インキュベートされた。インキュベーション後、DNA混合物およびセルフェクチンは除去され、3 mlの新鮮なSF900 II SFMがフラスコへ加えられた。フラスコにおけるSf9細胞は、27℃で3日間、振盪なしでインキュベートされた。可視の感染は、72時間後に観察されることができた(LL774、pg 89)。
【０３１６】
7. 組換えバキュロウイルス増幅
3日間のインキュベーション後、培養上清は、1,000 x gで10分間の遠心分離により透明化された。この上清は、継代ゼロ(P0)ウイルス増幅系統と名付けられた。
【０３１７】
P0ウイルスストック(0.5 mL)は、Sf9細胞の50 mL 懸濁培養物(1x106細胞/mL)とインキュベートされた。インキュベーションは、27℃で、撹拌しながら(100 rpm)、3日間、行われた。培養物は、4℃で、5000 rpm(7,000 x g)で30分間のCorning滅菌円錐遠心管における遠心分離により収集され、その結果生じた上清は、継代1(P1)ウイルス増幅系統(LL774、pg 96)と名付けられた。
【０３１８】
3 mLのP2ウイルスストックは、Sf9細胞の150 mL 懸濁培養物(1x106細胞/mL)とインキュベートされた。インキュベーションは、27℃で、撹拌(100 rpm)しながら、66時間、行われた。P1ウイルスストックについて記載されているように単離された上清は、継代2(P2)ウイルス増幅系統と名付けられた(LL774、pg 96、103)。
【０３１９】
P0は-80℃で保存された。P1およびP2は暗闇の中で4℃で保存された。P2における組換えバキュロウイルスの力価は、プラークアッセイ法により測定された。
【０３２０】
8. 低MOIプロトコール
LL774、pg 120
材料：
250 mL 振盪フラスコにおける30 mLのSf9細胞。総フラスコ：10。
目標とする細胞濃度：1.5E6細胞/mL。
目標とするMOI：5E-4〜5E-8。
バキュロウイルス：
SBD-K36  2.55x107 pfu/mL
K36-SBD  2.55x107 pfu/mL
計算：
総細胞：1.5e6 x 30=45e6
最高MOIについての総ウイルス：
SBD-K36(5E-4x45e6)/2.55E7=22500/2.55E7=0.88 μl
K36/SBD(5E-4x45e6)/2.25E7=22500/2.25E7=1.00 μl
希釈手順：
以下によりウイルスを希釈：
MOI 5e-3について8.8 μl SBD-K36ウイルス＋1 mL Sf900II SFM
MOI 5e-3について10.0 μl K36-SBDウイルス＋1 mL Sf900II SFM
MOI 5E-4について0.2 mL 5E-3＋1.8 mL Sf900II SFM
MOI 5E-5について0.2 mL 5E-4＋1.8 mL Sf900II SFM
MOI 5E-6について0.2 mL 5E-5＋1.8 mL Sf900II SFM
MOI 5E-7について0.2 mL 5E-6＋1.8 mL Sf900II SFM
MOI 5E-8について0.2 mL 5E-7＋1.8 mL Sf900II SFM
実験：
1 mLの各希釈溶液を30 mLのSf9細胞へ加えることにより実験を開始。
細胞濃度をチェックし、4日目、5日目、6日目および7日目において放射性アッセイ法のために1 mL 試料を採取。
要約結果
注記：
実際の開始細胞濃度は1.47E6である。
細胞はPSG16においてであった。
【０３２１】
9. タンパク質産生
組換えタンパク質は、1.5x106細胞/mL Sf9細胞の150 mLにP2ウイルスストックの75 μlを感染させることにより産生された。培養物は、27℃で撹拌(100 rpm)しながら96時間、インキュベートされた。上清は、P1およびP2ウイルスストックについて記載されているように、単離された。感染のために用いられたMOIは以下であった：SBD-K36、0.0085；K36-SBD、0.0075；SBD-S127、0.013；S127-SBD、0.013(LL774、pg 103、120)。
【０３２２】
10. β-シクロデキストリンカラムにおけるSBDタグを用いるST6GalNAcI酵素の精製
SBDタグと融合したヒトおよびマウスST6GalNAcIは、β-シクロデキストリンカラムの通過によりSf9細胞上清から単離された。SBD-ヒトまたはマウスST6GalNAcI、それぞれの22.5 mUまたは182.4 mUのいずれかは、4℃で約0.4 mL/分で別々のβ-シクロデキストリンカラム(ベッド容量7.5 mL)上へ添加された。カラムは、80〜100 mLの洗浄緩衝液(1xPBS pH 7.4 Fisherカタログ番号BP-399-500)で洗浄された。結合した酵素は、溶出緩衝液(洗浄緩衝液における3 mM β-シクロデキストリン Sigmaカタログ番号C-4767)によりカラムから溶出された。1〜2 mLの12個の画分が収集された。溶出プロファイルは、OD280として記録された。ピーク画分は、プールされ、Joann遠心分離機におけるVIVASPIN 6 mLまたは20 mL 濃縮器を用いて、4℃で、7500 rpm(〜6000 g)で約30分間、濃縮された。1 mLの洗浄緩衝液は、この時点で濃縮器へ加えられ、100〜200 μLの最終容量まで濃縮し続けられた。濃縮された産物は、シアル酸付加およびシアリルPEG化について試験された。
【０３２３】
β-シクロデキストリンカラムは、洗浄緩衝液における1 M NaClを用いて再生され、その後、洗浄緩衝液と平衡化された、または0.5 M NaOHに一晩、浸漬された。カラムは、次に、pHが7.0に達するまでH2Oで洗浄され、その後、洗浄緩衝液と平衡化された。
【０３２４】
11. シアル酸付加放射性アッセイ法
放射性アッセイ法は、14C-CMP-シアル酸からアシアロ-ウシ顎下腺ムチンへの14C-シアル酸の転移を測定した(詳細についてはDR-518-04参照)。
【０３２５】
12. シアリルPEG化アッセイ法
LL774、pg 163
G-CSF-O-GalNAc(0.4 mg/mL)    10.0 μL
125 mM MnCl2                  0.5 μL
CMP-SA-PEG-20K                0.5 μL
ST6GalNAcI                    2.0 μL
100 mM Bis-Tris pH6.5        10.0 μL
総容量                       23.0 μL
【０３２６】
反応混合物は、33℃で振盪なしで66時間、インキュベートされた。
【０３２７】
インキュベーション後、2.5 μLの5x SDS試料緩衝液(DTTなし)が、5 μlの水と共に5 μlの反応物へ加えられ、試料を加熱することなしに、4〜20%SDS-PAGE勾配ゲル上へ添加された。
【０３２８】
PEG化されたG-CSFは、ゲルのヨウ素染色により検出された。
【０３２９】
残りの反応混合物へ、42 μlの水が加えられ、試料はHPLCにより分析された。
GalNAc付加反応：
G-CSF(40 mM Bis-Tris pH 6.5における〜1 mg/mL)  140 μl
100 mM MnCl2                                     3 μl
30 mM UDP-GalNAc                                 9 μl
100 mM Bis-Tris pH 6.5                         113 μl
GalNAcT2                                         5 μl
【０３３０】
33℃、振盪なし、2日間。
【０３３１】
結果
1. PCR結果
K36 BamHI/NotI、S127 BamHI/NotI、K36 NotI/BglII、S127 NotI/BglLLおよびSBD NotI/BglIIの正しい長さのPCRバンドが生じた。
【０３３２】
2. クローニング結果
正しい長さのクローンが生成された。
【０３３３】
3. ST6GalNAcIクローンの組換え(P2)バキュロウイルスストックの力価
SBD-K36   2.55x107
K36-SBD   2.25x107
SBD-S127  3.85x107
S127-SBD  3.95x107
【０３３４】
4. 放射性アッセイ法におけるシアル酸付加活性の概要
2008501344.tif 000038
【０３３５】
5. 超低MOI研究結果
2008501344.tif 000039
【０３３６】
開始細胞濃度は1.47E6細胞/mL、LL-774 pg 120であった。
【０３３７】
6. β-シクロデキストリンカラムにおけるヒトおよびマウスST6GalNAcI SBD融合タンパク質の精製の概要
2008501344.tif 000040
【０３３８】
2つのヒトST6GalNAcI融合構築物(SBD-K36およびK36-SBD)および2つのマウスST6GalNAcI融合構築物(SBD-127および127-SBD)は、分泌された活性酵素としてSf9細胞において成功裡に発現され、それらのSBDタグを用いてβ-シクロデキストリンカラム上で精製された。
【０３３９】
4つの活性クローンの精製され、濃縮された試料の活性レベルは以下であった：
SBD-K36    122.9 U/L
K36-SBD     22.9 U/L
SBD-S127     5.5 U/L
S127-SBD    15.9 U/L
【０３４０】
すべての4つの酵素は、G-CSFをシアリルPEG化することができた。
【０３４１】
超低MOIを用いる、ヒトST6GalNAcI-SBDタンパク質の活性発現は増加し、6日目および7日目におけるSBD-K36に関する5e-7のMOIが、それぞれ、3.09 U/Lおよび3.25 U/Lの活性を与え、6日目におけるK36-SBDに関する5e-7のMOIが2.26 U/Lの活性を与えた。
【０３４２】
本明細書に引用されたありとあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０３４３】
本発明は、特定の態様に関して開示されているが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の真意および範囲から逸脱することなく、当業者により考案されうることは明らかである。添付された特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および等価なバリエーションを含むと解釈されることを意図される。
【０３４４】
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【図面の簡単な説明】
【０３４５】
本発明の例示の目的のために、本発明のある種の態様が図面に記述される。しかし、本発明は、図面に記述された態様の正確な配列および手段に限定されない。
【図１】マウスST6GalNAcI切り詰め突然変異体Δ31、Δ51、Δ126、Δ185およびΔ200(それぞれ、説明図においてD32、E52、S127、S186およびS201として参照されている)内の制限酵素切断部位の位置を示す概略図である。図はまた、各構築物の塩基数（bp）におけるそれぞれのサイズを示す。
【図２】N末端アミノ酸を切り詰め型ST6GalNAcI核酸のD32、E52、S127、S186およびS201にそれぞれ対応する、1488 bp、1428 bp、1203 bp、1026 bpおよび981 bpの電気泳動ゲルDNA断片の画像である。レーン1、bpラダー；レーン2、D32；レーン3、E52；レーン4、S127；レーン5、S186；レーン6、S201。
【図３】E52、S127、S186およびS201マウスST6GalNAcI構築物についてエンドヌクレアーゼBamHI/XhoI、およびD32マウスST6GalNAcI構築物についてHindIII/XhoIを用いる制限酵素消化からのDNAを含む電気泳動ゲルの画像である。約1.5〜1.0 KbのDNA断片は、ST6GalNAcIの異なる切り詰め突然変異体に対応する。6.0 Kb近くに見える大きい方の断片は、pCWin2-MBPである。レーン1、bpラダー；上部レーン2〜4、E52；上部レーン5〜7、S127；上部レーン8〜10、S186；上部レーン11〜12、S201；下部レーン2〜5、D32；下部レーン7〜9、MBP-pCWin2。
【図４】D32構築物を消化するためにHindIII/XhoI制限酵素、ならびに構築物E52、S127、S186およびS201を消化するためにBamHI/XhoIを用いる、組換えコロニーDH5α/pCWin2-MBP-ST6GalNAcIのスクリーニングの結果を示す電気泳動ゲルの画像である。各切り詰めからのすべての4つのコロニー(1〜4の番号を付された)は、ST6GalNAcIのD32、E52、S127、S186、およびS201にそれぞれ対応する約1.5〜1.0 Kbの断片を放出し、6.0 Kbあたりのより大きい断片はMBP-pCWin2ベクターを表す。レーン1、bpラダー。上部レーン1、3、5、7および9、非切断D32/ベクター；上部レーン11、13、15、非切断E52/ベクター；上部レーン17および19、非切断S127/ベクター；上部レーン2、4、6および8、切断D32；上部レーン10、12および14、切断E52；上部レーン16および18、切断S127；下部レーン1、3および5、非切断S127；下部レーン7、9および11、非切断S186；下部レーン13、15、17および19、非切断S201；下部レーン2および4、切断S127；下部レーン6、8、10および12、切断S186；下部レーン14、16および18、切断S201。
【図５】各構築物DH5α/pCWin2-MBP-ST6GalNAcIのコロニー#1〜#2から単離されたプラスミドDNAに関する制限消化分析を示す電気泳動ゲルの画像である。プラスミドDNAは、NdeI/HindIII酵素で二重消化された。D32含有コロニーを除くすべてのコロニーは、MBP-ST6GalNAcI挿入断片を示す2.5 Kbあたりの単一のバンドを放出したが(D32は2つの断片を放出した)、5.0 Kbあたりのより大きい予想されたバンドは、pCWin2ベクターに対応する。M＝bpラダー。レーン1、3＝D32；5、7＝E52；11、22＝S127；12、14＝S186、および16、18＝S201、かつすべては、非切断DNAを含む。レーン2、4＝D32；6、8＝E52；10、21＝S127；13、15＝S186、および17、19＝S201、かつすべては消化されたDNAを含む。
【図６】NdeI/XhoI制限酵素を用いる、構築物JM109/pCWin2-MBP-ST6GalNAcIの診断的制限酵素消化を示す電気泳動ゲルの画像である。D32を例外として、すべてのコロニーは、切り詰め型MBP-ST6GalNAcI融合タンパク質に対応する2.5 Kbあたりの断片を放出した(D32は2つの断片を放出した)。5.0 Kbにおける断片は、pCWin2ベクターに対応する。MW＝bpラダー。レーン1、3＝D32；レーン5、7＝E52；レーン9、11＝S127；レーン13、15＝S186；レーン17および19＝S201、かつすべては、非切断DNAを含む。レーン2、4＝D32；レーン6、8＝E52；レーン10、12＝S127；レーン14、16＝S186；レーン18および20＝S201、かつすべては消化されたDNAを含む。
【図７】それぞれのDNA構築物を含む細胞について、細胞可溶化物および封入体に存在するそれぞれのマウスST6GalNAcI切り詰め突然変異体の予想されたサイズに対応するポリペプチドの存在を示す電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーンMWは、MWマーカーを含む。各「レーン1」はD32を含む、各「レーン2」はE52を含む、各「レーン3」はS127を含む、各「レーン4」はS186を含む、および各「レーン5」はS201を含む。
【図８】JM109細胞から得られた可溶化液および封入体におけるMBP融合タンパク質としてのマウスST6GalNAcIの切り詰め型の発現を示す電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーンMWは、MWマーカーを含む。各「レーン1」はD32を含む、各「レーン2」はE52を含む、各「レーン3」はS127を含む、各「レーン4」はS186を含む、および各「レーン5」はS201を含む。
【図９】JM109およびW3110/pCWin2 MBP-ST6GalNAcI構築物S186およびS201におけるMBP-ST6GalNAcIの発現を示す電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーンMWは、MWマーカーを含む。レーン1は、w3110#11、1.0 mg/ml由来のS186を含む；レーン2は、w3110#11、0.1 mg/ml由来のS186を含む；レーン3は、JM109#11、1.0 mg/ml由来のS186を含む；レーン4は、JM109#11、0.1 mg/ml由来のS186を含む；レーン5は、w3110#8、1.0 mg/ml由来のS201を含む；レーン6は、w3110#8、0.1 mg/ml由来のS201を含む；レーン7は、JM109#8、1.0 mg/ml由来のS201を含む；レーン8は、JM109#8、0.1 mg/ml由来のS201を含む。
【図１０】細菌から単離された、再折り畳みST6GalNAcI構築物S201によるシアル酸のGalNAc-O-G-CSF受容体への転移の質量分光学的描写の画像である。パネルAは、24時間目において採取された試料を示し、パネルBは、48時間目に採取された試料を示し、パネルCは、2日目に採取された試料を示し、パネルDは5日目に採取された試料を示す。
【図１１】制限酵素消化によりESTクローンのヒトST6GalNAcI挿入断片を確認する電気泳動ゲルの画像である。レーン1〜3、EcoRIにより消化されたESTクローン#4816713のクローン#1〜3；レーン4、1Kbラダー；レーン5〜6、EcoRIおよびXhoIにより消化されたESTクローン#6300955のクローン#1〜3。
【図１２】#4816713およびクローン#6300955ヒトST6GalNAcI ESTクローンのcDNA配列のアラインメントを示す概略図である。
【図１３】正しいサイズのcDNA挿入断片を含むすべての6つのヒトST6GalNAcIクローンのpCR-hST6-NおよびpCR-hST6-CのEcoRI制限消化を示す電気泳動ゲルの画像である。レーン1〜6は、6つのpCR-hST6-Nクローンの制限消化物を含む；レーン7〜12は、6つのpCR-hST6-Cクローンの制限消化物を含む。
【図１４】pcDNA3.1-hST6GalNAcIの制限酵素消化を示す電気泳動ゲルの画像である。パネルA：レーン1、1Kbラダー；レーン2〜7、pcDNA3.1-hST6GalNAcIクローン#1〜6。パネルB：pcDNA3.1-hST6GalNAcIの制限酵素地図の図解。
【図１５】pcDNA3.1(+)-hST6GalNAcI-N1C1#1のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図１６】ヒトST6GalNAcIのドメイン構造および様々な切り詰め突然変異体を描く漫画である。
【図１７Ａ】pAcGP67-Bバキュロウイルス転移ベクターのプラスミド地図である。
【図１７Ｂ】pAcGP67-Bバキュロウイルス転移ベクターのクローニング部位を示す地図である。
【図１８】K36、K125およびS258ヒトST6GalNAcI構築物について、およびpTS103について、Sf9細胞培地におけるST6GalNAcI活性を描くグラフである。
【図１９Ａ】pTS103由来のマウスST6GalNAcIのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す。
【図１９Ｂ】マウスST6GalNAcIのドメイン構造および様々な切り詰め突然変異体を描く漫画である。
【図２０Ａ】pFastBac1ベクターのプラスミド地図である。
【図２０Ｂ】pFastBa-1-gpベクターのポリクローニング部位の地図である。
【図２１】pFastBac-1-gp-mST6GalNAcIからマウスST6GalNAcI DNA挿入断片を放出するためにEcoRIおよびXhoI制限消化にかけられたプラスミドDNAを示す電気泳動ゲルの画像である。レーン1〜4、S127切り詰め突然変異体のクローン#1〜4；レーン5〜8、S186切り詰め突然変異体のクローン#1〜4；レーン9、1 Kbラダー。
【図２２Ａ】pFastBac-1バクミド上のプライマー対の概略図である。
【図２２Ｂ】バクミドDNAにおけるマウスST6GalNAcI cDNAのPCRスクリーニングを示す電気泳動ゲルの画像である。PCR産物の電気泳動は、1%アガロースゲル上で行われた。レーン1、1kbラダー；レーン2〜9、組換えバクミドDNAのクローン1〜8。
【図２３】1%アガロースゲル上におけるマウスST6GalNAcIバクミドDNAの分析を示す電気泳動ゲルの画像である。レーン1、1kbラダー；レーン2、S186#3；レーン3、S186#4；レーン4、S127#5；レーン5、S127#6。
【図２４】マウスST6GalNAcI構築物S127#5、S127#6、S186#3、S186#4について、およびpTS103プラスミドについて、Sf9細胞培地におけるST6GalNAcI活性を描くグラフである。
【図２５】ニワトリST6GalNAcI切り詰め型突然変異体構築物のスクリーニングに用いるウイルスストックの力価計算を描く表である。
【図２６】ニワトリST6GalNAcIの全長核酸配列を示す。
【図２７】図26のDNA配列に基づいて翻訳された場合のアミノ酸配列を示す。
【図２８】GenBankアクセッション番号X74946に示されているような全長ニワトリST6GalNAcIの核酸配列を示す。
【図２９】K232切り詰め型ニワトリST6GalNAcIの核酸配列を示す。
【図３０】K232切り詰め型ニワトリST6GalNAcIのアミノ酸配列を示す。
【図３１】ヒト、マウスおよびニワトリST6GalNAcIアミノ酸配列の配列比較である。Δ48、Δ152、Δ225、およびΔ232突然変異体についての開始残基  −  それぞれ、アミノ酸Q49、V153、L226およびT233  −  は四角で囲まれている。
【図３２】Δ48、Δ152、Δ225突然変異体ST6GalNAcI酵素によるG-CSFのシアリルPEG化を示す電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーン1、MWマーカー；レーン2、Δ48(MOI=0.8、35.6 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン3、Δ152(MOI=1.43、39.5 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン4、Δ232(MOI=0.531、0 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン5、K232 VS4-001 ST6GalNAcI(上清)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン6、K232 VS4-001 ST6GalNAcI(精製)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン7、Δ48(MOI=0.2、35.4 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン8、Δ152(MOI=0.356、39.9 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン9、Δ232(MOI=0.133、0 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン10、Δ232(MOI=0.133、0 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン11、K232 VS4-001 ST6GalNAcI(精製)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン12、MWマーカー。
【図３３】Δ48、Δ152、Δ225突然変異体ST6GalNAcI酵素によるG-CSFのシアリルPEG化を示す電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーン1、MWマーカー；レーン2、Δ48(MOI=0.8、35.6 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン3、Δ48(MOI=0.2、35.4 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン4、Δ152(MOI=1.43、39.5 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン5、Δ152(MOI=0.356、39.9 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン6、Δ225(27.9 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン7、K232 VS4-001 ST6GalNAcI(精製)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン8、MWマーカー。
【図３４】A)ヒトST6GalNAcIについておよびB)ニワトリST6GalNAcIについての全長アミノ酸配列、ならびにC)天然のマウスタンパク質の残基32位から始まるマウスST6GalNAcIタンパク質の配列を提供する。
【図３５】いくつかの好ましいヒトST6GalNAcI切り詰め突然変異体の概略図を提供する。
【図３６】ヒトST6GalNAcI切り詰め突然変異体を含むMBP融合タンパク質の概略図を示す。
【図３７】ヒトST6GalNAcIタンパク質における対および不対のシステイン残基の位置を示す。単一および二重システイン置換もまた示されている、例えば、C280S、C362S、C362T、(C280S＋C362S)、および(C280S＋C362T)。
【図３８】ヒト切り詰め型タンパク質のST6GalNAcI活性を示す。活性は、バキュロウイルス系から得られた試料において測定された。
【図３９】3つのST6GalNAcI酵素：ヒト、ニワトリおよびマウスのアミノ酸配列アラインメントを示す。最初のヒト酵素切り詰めは、膜貫通領域の直後のΔ35(K36)位置においてであった。以前のヒトST6GalNAcI切り詰めに加えて、ここに、さらに6つのヒト酵素切り詰めが設計され、かつ作製された。最初の1つΔ72(T73)は、プロテアーゼ切断に基づいており、残りは、3つまたは2つの酵素間の相同性領域に基づいて設計された。最後の切り詰めΔ272(G273)は、初期のニワトリST6GalNAcI切り詰めと類似していた。矢印は、ヒトタンパク質における切り詰めを示す。図はまた、ヒト配列のマウスおよびニワトリタンパク質とのアラインメントを示し、タンパク質間の同一および保存されたアミノ酸残基を同定している。
【図４０】gp67分泌ペプチド、ST6GalNAcIコード配列、およびSBDコード配列の間の三者融合の概略図を示す。融合タンパク質は、バキュロウイルスにおいて発現され、シクロデキストリンカラム上で精製され、酵素活性についてアッセイされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ−１】
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【図２０Ｂ−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月5日(2007.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸残基1位〜232位を欠損するニワトリST6GalNAcIポリペプチド切り詰め突然変異体ではないという条件付きの、ST6GalNAcIシグナルドメインの全部または一部を欠損している、単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項２】
ST6GalNAcI膜貫通ドメインの全部または一部をさらに欠損している、請求項1記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項３】
ST6GalNAcIステムドメインの全部または一部をさらに欠損している、請求項2記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項４】
切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドが、切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチド、切り詰め型ニワトリST6GalNAcIポリペプチド、および切り詰め型マウスST6GalNAcIポリペプチドからなる群より選択される、請求項1記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200からなる群より選択されるポリペプチドと少なくとも90%の同一性を有する、請求項1記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項６】
SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項1記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項７】
SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200からなる、請求項1記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド。
【請求項８】
請求項1記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドに共有結合したタグポリペプチドを含む単離されたキメラポリペプチド。
【請求項９】
タグポリペプチドが、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、FLAGタグ、およびデンプン結合ドメインタグからなる群より選択される、請求項8記載の単離されたキメラポリペプチド。
【請求項１０】
請求項1または請求項5記載の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸配列を含む単離された核酸。
【請求項１１】
核酸がそれに作動可能に連結したプロモーター/制御配列をさらに含む、請求項10記載の単離された核酸。
【請求項１２】
請求項10記載の単離された核酸を含む発現ベクター。
【請求項１３】
請求項12記載の単離された核酸を含む組換え宿主細胞。
【請求項１４】
真核細胞または原核細胞である、請求項13記載の組換え細胞。
【請求項１５】
真核細胞が、哺乳動物細胞、昆虫細胞および真菌細胞からなる群より選択される、請求項14記載の組換え細胞。
【請求項１６】
昆虫細胞が、SF9細胞、SF9+細胞、Sf21細胞、HIGH FIVE細胞またはショウジョウバエ(Drosophila)Schneider S2細胞からなる群より選択される、請求項15記載の組換え細胞。
【請求項１７】
原核細胞が、大腸菌(E. coli)細胞および枯草菌(B. subtilis)細胞からなる群より選択される、請求項14記載の組換え細胞。
【請求項１８】
切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドの発現に適した条件下で、請求項14記載の組換え細胞を増殖させる段階を含む切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを産生する方法。
【請求項１９】
請求項1記載のポリペプチドをシアル酸部分および受容体部分とインキュベートする段階を含む、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、該ポリペプチドが該シアル酸部分の該受容体部分への共有結合を媒介し、それにより、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する、方法。
【請求項２０】
請求項1記載のポリペプチドをシチジン一リン酸-シアル酸(CMP-NAN)シアル酸供与体およびアシアロウシ顎下腺ムチン受容体部分とインキュベートする段階を含む、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、該ポリペプチドが、該CMP-NANシアル酸供与体から該アシアロウシ顎下腺ムチン受容体への該シアル酸部分の転移を媒介し、それによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する、方法。
【請求項２１】
請求項1記載のポリペプチドをシチジン一リン酸-シアル酸(CMP-NAN)シアル酸供与体およびポリペプチド受容体とインキュベートする段階を含む、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、該ポリペプチド受容体が、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンα、-β、および-γ、第IX因子、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン-2、エリスロポエチン、抗TNF-α、ならびにリソソーム加水分解酵素からなる群より選択される、方法。
【請求項２２】
ポリペプチド受容体が糖ペプチドである、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
さらに、シアル酸部分がポリエチレングリコール部分を含む、請求項20または請求項21記載の方法。
【請求項２４】
方法が商業的規模で行われる、請求項20または請求項21記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ST6GalNAcIポリペプチドの切り詰め型突然変異体に関連した組成物および方法を特徴とする。特に、本発明は切り詰め型ヒト、マウスおよびニワトリST6GalNAcIポリペプチドを特徴とする。本発明はまた、そのような切り詰め型ポリペプチドをコードする核酸、加えて、ベクター、宿主細胞、発現系、ならびにそのようなポリペプチドを発現させて、用いる方法を特徴とする。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2004年6月3日に出願された、米国仮出願第60/576,433号、および2005年2月4日に出願された米国仮出願第60/650,011号の恩典を主張する；それらの両方ともすべての目的について参照により本明細書に組み入れられている。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
オリゴ糖構造の大きな多様性および糖ペプチドの多くの型が天然で見出され、これらは、部分的には、多数のグリコシルトランスフェラーゼにより、合成される。グリコシルトランスフェラーゼは、糖鎖の開始または伸長のために活性化モノまたはオリゴ糖残基を存在する受容体分子へ転移させることにより、糖脂質、糖ペプチドおよび多糖の合成を触媒する。触媒反応は、酵素の触媒部位に加えて、適切なドメインによる供与体および受容体の両方の認識を含むと考えられている。
【０００４】
多くのペプチド治療用物質および多くの可能性のあるペプチド治療用物質は、グリコシル化ペプチドである。組換え糖ペプチドの作製は、組換え非グリコシル化ペプチドと対照的に、組換えで産生されたペプチドが、細胞内かまたはペプチドが細胞により産生された後かのいずれかで、追加の処理段階にかけられ、その処理段階がインビトロで行われることを必要とする。ペプチドは、グリコシルトランスフェラーゼを用いて、1つまたは複数のグリコシル基をペプチド上へ導入するために酵素的に処理されうる。具体的には、グリコシルトランスフェラーゼは、グリコシル基をペプチドへ共有結合性に付着させる。
【０００５】
糖ペプチドを作製するためのペプチド処理の余分のインビトロ段階は、時間がかかり、かつ高くつきうる。これは、部分的には、ペプチドのインビトログリコシル化のための組換えグリコシルトランスフェラーゼおよび糖ペプチド治療用物質を作製するための糖ペプチドを作製する負担および費用のせいである。組換え糖治療用物質の需要および有用性が増加するにつれて、より効率的に糖ペプチドを調製するために新しい方法が必要とされる。その上、ますます糖ペプチドが、様々な疾患の処置に有用であることが発見されるにつれて、それらの生産の費用を低くする方法の必要性がある。さらに、糖ペプチド治療用物質を開発および改良するのに用いられる組換え糖ペプチドをより効率的に作製する方法を開発する当技術分野における必要性もある。
【０００６】
グリコシルトランスフェラーゼは、全体として参照により本明細書に組み入れられている、国際(PCT)特許出願第WO 03/031464(PCT/US02/32263)号（特許文献1）に一般的に概説されている。治療用糖ペプチドの開発および作製において有用性をもつ、1つのそのような特定のグリコシルトランスフェラーゼは、ST6GalNAcIである。ST6GalNAcI、すなわち、GalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ、はシアル酸供与体からシアル酸受容体へのシアル酸の転移を触媒する。例えば、全長のニワトリST6GalNAcI酵素は、Kurosawa et al.(1994, J. Biol. Chem. 269:1402-1409)（非特許文献1）により開示されている。しかしながら、増強された触媒活性または増強された安定性のような増強された生物活性を有する、この酵素の有用な突然変異体の同定は、今まで報告されていない。
【０００７】
以前は、糖ペプチドのインビトロ作製のために組換えグリコシルトランスフェラーゼの有効性を増加させる努力がなされてきた。今まで、オリゴ糖または糖ペプチドの小規模生産にも時々、適しうる組換えグリコシルトランスフェラーゼに関しては、限られた研究しかなされていない。例えば、Kurosawa et al.(1994, J. Biol. Chem. 269:1402-1409)（非特許文献1）は、全長酵素のアミノ酸残基1位〜232位を欠損するニワトリST6GalNAcIの切り詰め突然変異体を記載している。マウスST6GalNAcIの切り詰めもまた、Kurosawa et al.(2000, J. BioChem., 127:845-854)（非特許文献2）により報告された。しかしながら、例えば、Kurosawa et al.により記載された切り詰め型ニワトリ酵素は、他のST6GalNAcI酵素の基質特異性を欠き、かつ糖ペプチド治療用物質の生産を含む、「薬学的規模」処理および反応に必要とされる活性を欠く。それゆえに、糖ペプチド治療用物質の生産を含む「薬学的規模」処理および反応に適している活性を有する組換えグリコシルトランスフェラーゼについての必要性がなお存在している。特に、有利な機能的および構造的特徴をもつ組換えグリコシルトランスフェラーゼの必要性がある。さらに、組換えグリコシルトランスフェラーゼの同定および特徴付けの効率的な方法、加えてそのようなグリコシルトランスフェラーゼの産生の必要性が存在する。本発明は、これらの必要性に取り組みかつ満足させる。
【０００８】
【特許文献１】国際(PCT)特許出願第WO 03/031464(PCT/US02/32263)号
【非特許文献１】Kurosawa et al.(1994, J. Biol. Chem. 269:1402-1409)
【非特許文献２】Kurosawa et al.(2000, J. BioChem., 127:845-854)
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、例えば、ST6GalNAcIシグナルドメインの全部もしくは一部、ST6GalNAcI膜貫通ドメインの全部もしくは一部、またはST6GalNAcIステムドメインの全部もしくは一部を欠損する単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチド；ただし、そのポリペプチドはアミノ酸残基1位〜232位を欠損するニワトリST6GalNAcIポリペプチド切り詰め突然変異体ではないという条件でのポリペプチドを提供する。切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、例えば、切り詰め型ヒトST6GalNAcI切り詰め型ニワトリST6GalNAcI、または切り詰め型マウスST6GalNAcIでありうる。
【００１０】
一つの態様において、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200から選択されるポリペプチドと、少なくとも90%または95%の同一性を有する。もう一つの態様において、単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、融合タンパク質で、例えば、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、FLAGタグ、およびデンプン結合ドメインタグのようなタグポリペプチドを含みうる。
【００１２】
もう一つの局面において、本発明は、上記の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。核酸は、プロモーター/制御配列へ作動可能に連結されうる、または発現ベクターの一部でありうる。本発明はまた、上記の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を含む。そのような宿主細胞は、真核生物または原核生物の宿主細胞でありうる。真核細胞は、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および真菌細胞を含む。昆虫細胞は、例えば、SF9細胞、SF9+細胞、Sf21細胞、HIGH FIVE細胞、またはショウジョウバエ(Drosophila)Schneider S2細胞を含みうる。好ましい原核細胞は、例えば、大腸菌(E.coli)細胞および枯草菌(B. subtilis)細胞を含む。本発明はまた、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドの発現に適した条件下で組換え宿主細胞を増殖させることによる、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを産生するためにその宿主細胞を用いる方法を含む。
【００１３】
もう一つの局面において、本発明は、シアル酸部分の受容体部分への共有結合を媒介し、それによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒するために上記の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを用いる、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法を含む。
【００１４】
さらなる局面において、本発明は、上記の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをシチジン一リン酸-シアル酸(CMP-NAN)シアル酸供与体およびアシアロウシ顎下腺ムチン受容体部分とインキュベートすることによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、該ポリペプチドが、該CMP-NANシアル酸供与体から該アシアロウシ顎下腺ムチン受容体への該シアル酸部分の転移を媒介し、それによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する、方法を提供する。好ましい態様において、受容体は、例えば、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンα、-β、および-γ、第IX因子、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン-2、エリスロポエチン、抗TNF-α、ならびにリソソーム加水分解酵素のようなポリペプチド受容体である。他の態様において、ポリペプチド受容体は糖ペプチドである。さらなる好ましい態様において、シアル酸部分は、ポリエチレングリコール部分を含む。なおさらなる態様において、方法は、シアル酸付加された産物、例えば、シアル酸付加された糖タンパク質または糖ペプチド、の商業的規模の量を製造するために商業的規模で行われる。
【００１５】
もう一つの局面において、本発明は、ST6GalNAcIシグナルドメインの全部または一部を欠損する単離された切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドであって、そのポリペプチドがアミノ酸残基1位〜232位を欠損するニワトリST6GalNAcIポリペプチド切り詰め突然変異体ではないという条件でのポリペプチドを提供する。他の態様において、切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドは、追加として、ST6GalNAcI膜貫通ドメインの全部もしくは一部を欠損しうる、またはST6GalNAcIステムドメインの全部もしくは一部を欠損しうる。
【００１６】
いくつかの態様において、切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドは、以下と少なくとも90%または95%同一性を有するアミノ酸配列を含む：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、および図31に示されたニワトリ配列のΔ225。さらなる態様において、切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドは、融合タンパク質で、例えば、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、FLAGタグ、およびデンプン結合ドメインタグのようなタグポリペプチドを含みうる。
【００１８】
もう一つの局面において、本発明は、上記の切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。核酸は、プロモーター/制御配列へ作動可能に連結されうる、または発現ベクターの一部でありうる。本発明はまた、上記の切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドをコードする発現ベクターを含む宿主細胞を含む。そのような宿主細胞は、真核生物または原核生物の宿主細胞でありうる。真核細胞は、例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、および真菌細胞を含む。昆虫細胞は、例えば、SF9細胞、SF9+細胞、Sf21細胞、HIGH FIVE細胞、またはショウジョウバエSchneider S2細胞を含みうる。好ましい原核細胞は、例えば、大腸菌細胞および枯草菌細胞を含む。本発明はまた、切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドの発現に適した条件下で組換え宿主細胞を増殖させることによる、切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドを産生するためにその宿主細胞を用いる方法を含む。
【００１９】
もう一つの局面において、本発明は、シアル酸部分の受容体部分への共有結合を媒介し、それによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒するために上記の切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドを用いる、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法を含む。
【００２０】
さらなる局面において、本発明は、上記の切り詰め型ヒトまたはニワトリST6GalNAcIポリペプチドをシチジン一リン酸-シアル酸(CMP-NAN)シアル酸供与体およびアシアロウシ顎下腺ムチン受容体部分とインキュベートすることによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、該ポリペプチドが、該CMP-NANシアル酸供与体から該アシアロウシ顎下腺ムチン受容体への該シアル酸部分の転移を媒介し、それによりシアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する、方法を提供する。好ましい態様において、受容体は、例えば、エリスロポエチン、ヒト成長ホルモン、顆粒球コロニー刺激因子、インターフェロンα、-β、および-γ、第IX因子、卵胞刺激ホルモン、インターロイキン-2、エリスロポエチン、抗TNF-α、ならびにリソソーム加水分解酵素のようなポリペプチド受容体である。他の態様において、ポリペプチド受容体は糖ペプチドである。さらなる好ましい態様において、シアル酸部分は、ポリエチレングリコール部分を含む。なおさらなる態様において、方法は、シアル酸付加された産物、例えば、シアル酸付加された糖タンパク質または糖ペプチド、の商業的規模の量を製造するために商業的規模で行われる。
【００２１】
発明の詳細な説明
本発明の組成物および方法は、ヒトST6GalNAcI、マウスST6GalNAcI、およびニワトリST6GalNAcIの切り詰め突然変異体、これらのタンパク質をコードする単離された核酸、ならびにそれらの使用の方法を含む。ST6GalNAcIポリペプチドは、シアル酸供与体からシアル酸受容体へのシアル酸の転移を触媒する。
【００２２】
グリコシルトランスフェラーゼST6GalNAcIは、治療用糖ペプチドのグリコシル化にとって必須の試薬である。加えて、ST6GalNAcIは、治療的に重要な糖ペプチドおよびオリゴ糖治療用物質の研究および開発にとって重要な試薬である。ST6GalNAcIは、典型的には、天然源から、または労力および費用のかかるインビトロおよび組換えの供給源から、単離および精製される。本発明は、ST6GalNAcI酵素の生産の簡単化され、かつより費用効果の高い方法に関する、組成物および方法を提供する。特に、本発明は、全長酵素対応物と比較して改善されかつ有用な性質をもつ切り詰め型ST6GalNAcI酵素に関する組成物および方法を提供する。
【００２３】
本発明の切り詰め型グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、グリコシル化ペプチドのインビボおよびインビトロでの調製に、加えて本発明の切り詰め型グリコシルトランスフェラーゼ酵素により転移されうる特定のグリコシル残基を含むオリゴ糖の作製に有用である。これは、ST6GalNAcIポリペプチドの切り詰め型が、それらの全長ポリペプチド対応物と匹敵する、および場合によっては、それを超える、生物活性を有することは初めて本明細書で示されているからである。本出願ではまた、そのような切り詰め突然変異体が生物活性を有することだけでなく、切り詰め突然変異体が、溶解性、安定性およびタンパク分解性分解に対する抵抗性の増強された性質を有しうることもまた開示されている。
【００２４】
定義
他に定義されていない限り、本明細書に用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野における当業者により一般的に理解されているのと同じ意味をもつ。本明細書に記載されたものと類似したまたは等価の任意の方法および材料は、本発明の実施または試験に用いられうるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載されている。
【００２５】
以下のような、当技術分野において一般的であるような特定の略語が本明細書で用いられる：アセチルとして「Ac」；グルコースとして「Glc」；グルコサミンとして「Glc」；グルクロン酸として「GlcA」；イズロン酸として「IdoA」；N-アセチルグルコサミンとして「GlcNAc」；N-アセチルノイラミン酸として「NAN」または「シアル酸」または「SA」；ウリジン二リン酸として「UDP」；シチジン一リン酸として「CMP」。
【００２６】
本明細書に用いられる場合、以下の用語のそれぞれは、本セクションにおけるそれに関連した意味をもつ。
【００２７】
冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、その冠詞の文法的対象の1つを、または1つより多くを(すなわち、少なくとも1つを)指すために本明細書で用いられる。例として、「1つの要素(an element)」は、1つの要素または1つより多い要素を意味する。
【００２８】
「コードする」とは、ヌクレオチドの限定された配列(すなわち、rRNA、tRNAおよびmRNA)かまたはアミノ酸の限定された配列のいずれかおよびそれらから生じる生物学的性質を有する生物学的過程における他のポリマーならびに高分子の合成のための鋳型としての役割を果たしうる、遺伝子、cDNAまたはmRNAのような核酸におけるヌクレオチドの特定の配列の固有の性質を指す。従って、遺伝子は、その遺伝子に対応するmRNAの転写および翻訳が細胞または他の生物学的系においてタンパク質を生じる場合には、そのタンパク質をコードする。ヌクレオチド配列がmRNA配列と同一であるコード鎖、および遺伝子またはcDNAの転写のための鋳型として用いられる非コード鎖の両方は、その遺伝子もしくはcDNAのタンパク質または他の産物をコードすると称されうる。
【００２９】
遺伝子の「コード領域」は、その遺伝子の転写により生じるmRNA分子のコード領域と、それぞれ、相同であるまたは相補的である、その遺伝子のコード鎖のヌクレオチド残基およびその遺伝子の非コード鎖のヌクレオチドを含む。
【００３０】
mRNA分子の「コード領域」はまた、そのmRNA分子の翻訳中のトランスファーRNA分子のアンチコドン領域とマッチしている、または終止コドンをコードするmRNA分子のヌクレオチド残基を含む。コード領域は、従って、mRNA分子によりコードされる成熟タンパク質に存在しないアミノ酸残基(例えば、タンパク質搬出シグナル配列におけるアミノ酸残基)に対応するヌクレオチド残基を含みうる。
【００３１】
「アフィニティータグ」は、第二のポリペプチドの精製、単離、ターゲティング、輸送または同定を目的として、第二のポリペプチドへ遺伝的にもしくは化学的に融合されうるペプチドまたはポリペプチドである。アフィニティータグの第二のタンパク質への「遺伝的」付着は、核酸ベクターにおける第二のタンパク質をコードする核酸に隣接したアフィニティータグをコードする核酸をクローニングすることによりもたらされうる。
【００３２】
本明細書に用いられる場合、用語「グリコシルトランスフェラーゼ」は、供与体糖を受容体部分へ転移させる能力を有する任意の酵素/タンパク質を指す。
【００３３】
「糖ヌクレオチド生成酵素」は、糖ヌクレオチドを生じる能力を有する酵素である。糖ヌクレオチドは当技術分野において公知であり、限定されるわけではないが、UDP-Gal、UDP-GalNAcおよびCMP-NANのような部分を含む。
【００３４】
「単離された核酸」は、天然に存在する状態においてそれに隣接する配列から分離された核酸セグメントまたは断片、例えば、通常ではその断片に隣接している配列、例えば、それが天然に存在するゲノムにおいてその断片に隣接した配列、から取り出されたDNA断片、を指す。その用語はまた、その核酸、例えばRNAもしくはDNA、に天然で付随する他の成分、または細胞においてそれに天然で付随するタンパク質、から実質的に精製されている核酸に適用される。その用語は、それゆえに、例えば、ベクターへ、自律複製プラスミドもしくはウイルスへ、または原核生物もしくは真核生物のゲノムDNAへ組み入れられている、または他の配列から独立した別個の分子として(例えば、cDNA、または、PCRもしくは制限酵素消化により産生されたゲノムもしくはcDNA断片として)存在する、組換えDNAを含む。それはまた、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換えDNAを含む。
【００３５】
本発明の文脈において、一般的に存在する核酸塩基についての以下の略語が用いられる。「A」はアデノシンを指し、「C」はシチジンを指し、「G」はグアノシンを指し、「T」はチミジンを指し、「U」はウリジンを指す。
【００３６】
「ポリヌクレオチド」は、核酸の一本鎖または平行および逆平行鎖を意味する。従って、ポリヌクレオチドは一本鎖かまたは二本鎖のいずれかの核酸でありうる。
【００３７】
用語「核酸」は典型的には、大きなポリヌクレオチドを指す。しかしながら、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、本明細書で交換可能に用いられる。
【００３８】
用語「オリゴヌクレオチド」は、典型的には、短いポリヌクレオチド、一般的には約50ヌクレオチドより長くないもの、を指す。ヌクレオチド配列は、DNA配列(すなわち、A、T、G、C)により表される場合、これはまた、「U」が「T」と置き換わるRNA配列(すなわち、A、U、G、C)を含むことは理解されているものと思われる。
【００３９】
慣習的な表示法が核酸配列を記載するために本明細書で用いられる：一本鎖核酸配列の左手末端は5'末端である；二本鎖核酸配列の左手方向は、5'方向と呼ばれる。
【００４０】
例えば、第一の核酸配列の最後のヌクレオチドが、第二の核酸配列の最初のヌクレオチドへリン酸ジエステル結合を通して化学的に結合している場合、第一の限定された核酸配列は、第二の限定された核酸配列に「直接隣接」していると言われる。逆に、例えば、第一の核酸配列の最初のヌクレオチドが、第二の核酸配列の最後のヌクレオチドへリン酸ジエステル結合を通して化学的に結合している場合、第一の限定された核酸配列は、第二の限定された核酸配列に「直接隣接」していると言われる。
【００４１】
例えば、第一のポリペプチド配列の最後のアミノ酸が、第二のポリペプチド配列の最初のアミノ酸へペプチド結合を通して化学的に結合している場合、第一の限定されたポリペプチド配列は、第二の限定されたポリペプチド配列に「直接隣接」していると言われる。逆に、例えば、第一のポリペプチド配列の最初のアミノ酸が、第二のポリペプチド配列の最後のアミノ酸へペプチド結合を通して化学的に結合している場合、第一の限定されたポリペプチド配列は、第二の限定されたポリペプチド配列に「直接隣接」していると言われる。
【００４２】
新生RNA転写産物へのヌクレオチドの5'から3'への付加の方向は、転写方向と呼ばれる。mRNAと同じ配列を有するDNA鎖は、「コード鎖」と呼ばれる；DNA上の参照点の5'側に位置しているDNA鎖上の配列は、「上流配列」と呼ばれる；DNA上の参照点の3'側に位置しているDNA鎖上の配列は、「下流配列」と呼ばれる。
【００４３】
他に特定されない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」は、お互いの縮重バージョンであり、かつ同じアミノ酸配列をコードする、すべてのヌクレオチド配列を含む。タンパク質をコードするヌクレオチド配列およびRNAは、イントロンを含みうる。
【００４４】
本明細書に用いられる場合、「相同的な」とは、同じ核酸鎖の2つの領域間、または2つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列類似性を指す。両方の領域におけるヌクレオチド残基の位置が、同じヌクレオチド残基により占有される場合、その領域は、その位置において相同である。各領域の少なくとも1つのヌクレオチド残基位置が同じ残基により占有される場合には、第一領域は、第二領域と相同である。2つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基により占有されている2つの領域のヌクレオチド残基位置の比率によって表される。例として、ヌクレオチド配列5'-ATTGCC-3'を有する領域およびヌクレオチド配列5'-TATGGC-3'を有する領域は、50%相同性を共有する。好ましくは、第一領域は、第一部分を含み、第二領域は第二部分を含み、各部分のヌクレオチド残基位置の少なくとも約50%、および好ましくは少なくとも約75%、少なくとも約90%、または少なくとも約95%が同じヌクレオチド残基により占有されている。より好ましくは、各部分のすべてのヌクレオチド残基位置は、同じヌクレオチド残基により占有されている。
【００４５】
本明細書に用いられる場合、用語「パーセント同一性」は、「相同性」と同意語として用いられる。2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成されうる。例えば、2つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、KarlinおよびAltschul(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)のアルゴリズムであり、KarlinおよびAltschul(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)におけるように改変される。このアルゴリズムは、Altschul et al.(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)のNBLASTおよびXBLASTプログラムへ組み込まれており、例えば、National Institutes of Health(NIH)におけるNational Library of Medicine(NLM)のNational Center for Biotechnology Information(NCBI)ワールドワイドウェブサイトのBLASTサイトでアクセスされうる。BLASTヌクレオチド検索は、本明細書に記載された核酸と相同的なヌクレオチド配列を得るために、以下のパラメーターを用いて、NBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と名付けられている)で行われうる：ギャップペナルティー＝5；ギャップ伸長ペナルティー＝2；不一致ペナルティー＝3；一致報酬＝1；期待値10.0：およびワードサイズ＝11。BLASTタンパク質検索は、本明細書に記載されたタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得るために、以下のパラメーターを用いて、XBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と名付けられている)またはNCBI「blastp」プログラムで行われうる：期待値10.0、BLOSUM62スコア行列。
【００４６】
比較を目的としてギャップドアラインメントを得るために、ギャップド(Gapped)BLASTが、Altschyl et al.(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されているように利用されうる。または、PSI-BlastまたはPHI-Blastは、分子間(同上)の遠い関係および共通のパターンを有する分子間の関係を検出する反復検索を行うために用いられうる。BLAST、ギャップドBLAST、PSI-BlastおよびPHI-Blastプログラムを利用する場合、National Institutes of HealthのNational Library of MedicineのNational Center for Biotechnology Informationのウェブサイト上で利用可能である、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが用いられうる。
【００４７】
2つの配列間のパーセント同一性は、ギャップを許すまたは許さないに関わらず、上で記載されたものと類似した技術を用いて決定されうる。パーセント同一性を計算することにおいて、典型的には、正確な一致が数えられる。
【００４８】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合を介して連結した、アミノ酸残基、それらの、関連した天然に存在する構造的変異体および合成の天然に存在しない類似体から構成されるポリマー、それらの、関連した天然に存在する構造的変異体ならびに合成の天然に存在しない類似体を指す。合成ポリペプチドは、例えば、自動化ポリペプチド合成機を用いて、合成されうる。「ポリペプチド」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、それゆえに、そのポリマーが少なくとも2つのアミノ酸残基を含むとの条件で、アミノ酸残基の任意のサイズのポリマーを指す。
【００４９】
用語「タンパク質」は、典型的には、大きなペプチドを指し、本明細書では「ポリペプチド」とも呼ばれる。用語「ペプチド」は、典型的には、短いポリペプチドを指す。しかしながら、用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書で交換可能に用いられる。例えば、用語「ペプチド」は、3個のアミノ酸のアミノ酸ポリマー、および数百個のアミノ酸のアミノ酸ポリマーを指しうる。
【００５０】
本明細書に用いられる場合、アミノ酸は、以下の表に示されているように、それらの完全な名前により、それらに対応する三文字コードにより、またはそれらに対応する一文字コードにより、表される：
完全な名前 三文字コード 一文字コード
アスパラギン酸           Asp                D
グルタミン酸             Glu                E
リジン                   Lys                K
アルギニン               Arg                R
ヒスチジン               His                H
チロシン                 Tyr                Y
システイン               Cys                C
アスパラギン             Asn                N
グルタミン               Gln                Q
セリン                   Ser                S
トレオニン               Thr                T
グリシン                 Gly                G
アラニン                 Ala                A
バリン                   Val                V
ロイシン                 Leu                L
イソロイシン             Ile                I
メチオニン               Met                M
プロリン                 Pro                P
フェニルアラニン         Phe                F
トリプトファン           Trp                W
【００５１】
用語「タンパク質」は、典型的には、大きなポリペプチドを指す。
【００５２】
用語「ペプチド」は、典型的には、短いポリペプチドを指す。
【００５３】
慣習的な表示法が、ポリペプチド配列を描くために本明細書で用いられる：ポリペプチド配列の左手末端は、アミノ末端である；ポリペプチド配列の右手末端は、カルボキシル末端である。
【００５４】
「治療用ペプチド」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、疾患状態を処置するために、または生きている生物体の健康全般を向上させるために有用である任意のペプチドを指す。治療用ペプチドは、単独で投与される場合、またはもう一つの物質の治療的能力を向上させるために用いられる場合、生きている生物体においてそのような変化をもたらしうる。用語「治療用ペプチド」は、本明細書で、用語「治療用ポリペプチド」および「治療用タンパク質」と交換可能に用いられる。
【００５５】
「試薬ペプチド」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、食物生化学、バイオレメディエーション、低分子治療用物質の製造において、および治療用ペプチドの製造においてでも、有用である任意のペプチドを指す。典型的には、試薬ペプチドは、前述の領域のいずれかにおいて有用な生産物を製造する反応を触媒する能力がある酵素である。用語「試薬ペプチド」は、本明細書で、用語「試薬ポリペプチド」および「試薬タンパク質」と交換可能に用いられる。
【００５６】
「糖ペプチド」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、ペプチドに共有結合性に連結した少なくとも1つの糖質部分を有するペプチドを指す。糖ペプチドが上記のように「治療用糖ペプチド」でありうることは理解されていると思われる。用語「糖ペプチド」は、本明細書で、用語「糖ポリペプチド」および「糖タンパク質」と交換可能に用いられる。
【００５７】
「ベクター」は、単離された核酸を含み、かつ単離された核酸を細胞の内部へ送達するために用いられうる組成物である。多数のベクターが当技術分野において公知であり、限定されるわけではないが、線状核酸、イオン性または両親媒性化合物と付随した核酸、プラスミドおよびウイルスを含む。従って、用語「ベクター」は、自律複製プラスミドまたはウイルスを含む。その用語はまた、例えば、ポリリジン化合物、リポソームなどのような、細胞への核酸の移動を促進する非プラスミドおよび非ウイルス化合物を含むと解釈されるべきである。ウイルスベクターの例は、限定されるわけではないが、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどを含む。
【００５８】
「発現ベクター」は、発現されるべきヌクレオチド配列へ作動可能に連結した発現制御配列を含む組換え核酸を含むベクターを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシス作用性エレメントを含む；発現のための他のエレメントは、宿主細胞により、またはインビトロ発現系において、供給されうる。発現ベクターは、組換え核酸を組み入れるコスミド、プラスミド(例えば、裸の、またはリポソームに含まれる)およびウイルスのような、当技術分野において公知のすべてのものを含む。
【００５９】
「多重クローニング部位（multiple cloning site）」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、少なくとも1つの制限酵素により認識されるヌクレオチドの1つより多い配列を含む核酸ベクターの領域である。
【００６０】
「抗生物質耐性マーカー」とは、その用語が本明細書に用いられる場合、生きている細胞に発現される時、抗生物質の存在下において生きかつ増殖する能力をその細胞へ与えるタンパク質をコードするヌクレオチドの配列を指す。
【００６１】
本明細書に用いられる場合、用語「ST6GalNAcI」は、N-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼIを指す。
【００６２】
ペプチドの「切り詰め」型とは、その用語が本明細書で用いられる場合、ペプチドの全長アミノ酸配列と比較して1つ以上のアミノ酸残基を欠損しているペプチドを指す。例えば、ペプチド「NH2-Ala-Glu-Lys-Leu-COOH」（SEQ ID NO: 109）は、全長ペプチド「NH2-Gly-Ala-Glu-Lys-Leu-COOH」（SEQ ID NO: 110）のN末端切り詰め型である。用語「切り詰め型」および「切り詰め突然変異体」は、本明細書で交換可能に用いられる。非限定的例として、切り詰め型ペプチドは、活性ドメイン、ステム(stem)ドメイン、膜貫通ドメインおよびシグナルドメインを含むST6GalNAcIであって、シグナルドメインが、全長ST6GalNAcIと比較して1つのN末端アミノ酸残基を欠損している。
【００６３】
用語「糖」は、一般的に、任意の糖質、(CH2O)nの最も基本的な構造をもつ化学的実体、を指す。糖は複雑性において異なり、核酸、アミノ酸、または実質的には生体系に存在する任意の他の化学的部分も含みうる。
【００６４】
「単糖」は、定義済みのアイデンティティの糖質の単一の単位を指す。
【００６５】
「オリゴ糖」は、定義済みのアイデンティティの糖質の数個の単位からなる分子を指す。典型的には、2〜20単位の糖配列は、オリゴ糖と呼ばれうる。
【００６６】
「多糖」は、定義済みのアイデンティティの糖質の多数の単位からなる分子を指す。しかしながら、2個以上の単位の任意の糖は、正確には、多糖とみなされうる。
【００６７】
本明細書に用いられる場合、糖「供与体(donor)」は、グリコシルトランスフェラーゼが糖を糖受容体へ転移させるように、糖をグリコシルトランスフェラーゼへ供給することができる部分である。非限定的例として、GalNAc供与体は、UDP-GalNAcでありうる。
【００６８】
本明細書に用いられる場合、糖「受容体(acceptor)」は、糖供与体から糖を受けることができる部分である。グリコシルトランスフェラーゼは、糖を糖受容体へ共有結合性に連結することができる。非限定的例として、G-CSFは、GalNAc受容体であり得、GalNAc部分は、GalNAc-トランスフェラーゼを経由してGalNAc受容体へ共有結合性に連結されうる。
【００６９】
「限定されたサイズ」をもつオリゴ糖は、同定可能な数の単糖単位からなるものである。例えば、10個の単糖単位からなるオリゴ糖は、10個の同一の単糖単位、または第一のアイデンティティの5個の単糖単位および第二のアイデンティティの5個の単糖単位からなりうるものである。さらに、不均一なアイデンティティの単糖単位からなる限定されたサイズのオリゴ糖は、オリゴ糖の始めから終わりまで任意の順序で単糖単位を有しうる。
【００７０】
「ランダムなサイズ」のオリゴ糖は、限定されたサイズのオリゴ糖生成物を供給しない方法を用いて合成されうるものである。例えば、オリゴ糖合成の方法は、間にあるいくつかまたはすべての長さを含む、2個の単糖ユニットから22個の糖ユニットまでの範囲であるオリゴ糖を供給しうる。
【００７１】
「商業的規模」は、単一の反応における生成物糖、または糖タンパク質、または糖ペプチドのグラム規模の製造を指す。好ましい態様において、商業的規模は、約50、75、80、90、または100、125、150、175、または200グラムより多い製造を指す。
【００７２】
用語「シアル酸」は、9炭素のカルボキシル化糖のファミリーの任意のメンバーを指す。シアル酸ファミリーの最も一般的なメンバーは、N-アセチル-ノイラミン酸(2-ケト-5-アセタミド-3,5-ジデオキシ-D-グリセロ-D-ガラクトノヌロピラノース-1-オン酸(しばしば、Neu5Ac、NeuAcまたはNANAと略記される))である。ファミリーの第二メンバーは、N-グリコリル-ノイラミン酸(Neu5GcまたはNeuGc)であり、NeuAcのN-アセチル基がヒドロキシル化されている。第三のシアル酸ファミリーメンバーは、2-ケト-3-デオキシ-ノヌロソン酸(KDN)(Nadano et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:11550-11557; Kanamori et al., J. Biol. Chem. 265:21811-21819 (1990))である。9-置換型シアル酸、例えば、9-O-ラクチル-Neu5Acまたは9-O-アセチル-Neu5Ac、9-デオキシ-9-フルオロ-Neu5Acおよび9-アジド-9-デオキシ-Neu5Acのような9-O-C1〜C6アシル-Neu5Ac、も含まれる。シアル酸ファミリーの概説として、例えば、Varki, Glycobiology 2:25-40 (1992); Sialic Acids: Chemistry, Metabolism and Function, R. Schauer, Ed.(Springer-Verlag, New York (1992))を参照。シアル酸付加手順におけるシアル酸化合物の合成および使用は、1992年10月1日に公開された国際出願第WO 92/16640号に開示されている。
【００７３】
本明細書に用いられる場合、「タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、または糖ペプチドを再構築する方法」は、グリコシルトランスフェラーゼを用いて糖残基のタンパク質、ペプチド、糖タンパク質または糖ペプチドへの付加を指す。好ましい態様において、糖残基は、PEG分子へ共有結合性に付着させられる。
【００７４】
本明細書に用いられる場合、「不対システイン残基」は、正しく折り畳まれたタンパク質(すなわち、生物活性をもつタンパク質)において、もう一つのシステイン残基とジスルフィド結合を形成していないシステイン残基を指す。
【００７５】
「不溶性グリコシルトランスフェラーゼ」は、細菌の封入体において発現されているグリコシルトランスフェラーゼを指す。不溶性グリコシルトランスフェラーゼは、典型的には、例えば、界面活性剤もしくはカオトロピック剤またはいくつかの組み合わせを用いて可溶化または変性される。「再構築」は、生物活性のあるグリコシルトランスフェラーゼの構造を、可溶化または変性されているグリコシルトランスフェラーゼへ再建する過程を指す。従って、再構築緩衝液は、グリコシルトランスフェラーゼの再構築を増強または促進する緩衝液を指す。
【００７６】
「レドックス対」は、還元型および酸化型チオール試薬の混合物を指し、還元型および酸化型グルタチオン(GSH/GSSG)、システイン/シスチン、システアミン/シスタミン、DTT/GSSGおよびDTE/GSSGを含む。(例えば、Clark, Cur. Op. Biotech. 12:202-207 (2001)参照)。
【００７７】
用語「接触すること」は、本明細書で、以下と交換可能に用いられる：「と組み合わされた」、「に加えられた」、「と混合された」、「を通過させられた」、「とインキュベートされた」、「の上を流された」など。
【００７８】
用語「PEG」は、ポリ(エチレングリコール)を指す。PEGは、ペプチドに結合させられている例示的なポリマーである。ペプチド治療用物質を誘導体化するためのPEGの使用は、ペプチドの免疫原性を低下させ、かつ循環からのクリアランス時間を延ばすことが実証されている。例えば、米国特許第4,179,337号(Davis et al.)は、ポリエチレングリコール(PEG)またはポリプロピレングリコールと連結した酵素およびペプチドホルモンのような非免疫原性ペプチドに関する。10モルと100モルとの間のポリマーが1モルのペプチド当たり用いられ、生理学的活性の少なくとも15%が維持される。
【００７９】
本明細書に用いられる場合、用語「比活性」は、酵素、例えば、本発明の組換えグリコシルトランスフェラーゼ融合タンパク質、の触媒活性を指し、活性ユニットで表されうる。本明細書に用いられる場合、1活性ユニットは、所定の温度(例えば、37℃)およびpH値(例えば、pH 7.5)において1分あたり1 μmolの形成を触媒する。従って、10ユニットの酵素は、10 μmolの基質が、例えば37℃の温度および例えば7.5のpH値において1分間に10 μmolの生成物へ変換する、その酵素の触媒的量である。
【００８０】
「N結合型」オリゴ糖は、アスパラギン-N-アセチルグルコサミン結合としてアスパラギンを通してペプチドバックボーンに結合しているオリゴ糖である。N結合型オリゴ糖はまた、「N-グリカン」とも呼ばれる。すべてのN結合型オリゴ糖は、Man3GlcNAc2の共通の五糖のコアを有する。それらは、N-アセチルグルコサミン、ガラクトース、N-アセチルガラクトサミン、フコースおよびシアル酸のような末梢糖の分枝(アンテナとも呼ばれる)の存在において、および、その数において異なる。任意で、この構造はまた、コアのフコース分子および/またはキシロース分子を含みうる。
【００８１】
「O結合型」オリゴ糖は、トレオニン、セリン、ヒドロキシプロリン、チロシン、または他のヒドロキシ含有アミノ酸を通してペプチドバックボーンに結合しているオリゴ糖である。
【００８２】
「実質的に均一な」の上の定義における用語「実質的に」とは、一般的に、特定のグリコシルトランスフェラーゼについての受容体基質の、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、またはより好ましくは、少なくとも約90%、およびなおより好ましくは、少なくとも約95%がグリコシル化されていることを意味する。
【００８３】
「融合タンパク質」は、本来のまたは天然の全長タンパク質をコードするアミノ酸配列またはそれらの部分配列、に付加されている、の代わりである、よりも短い、および/または、異なる、アミノ酸配列を含むタンパク質を指す。
【００８４】
グリコシルトランスフェラーゼに関しての「ステム領域」は、天然のグリコシルトランスフェラーゼにおいて、膜貫通ドメインの近傍に位置するタンパク質ドメインまたはその部分配列を指し、ゴルジ体においてグリコシルトランスフェラーゼを維持しうる保持シグナルとして、およびタンパク分解性切断の部位として機能すると報告されている。ステム領域は、一般的に、疎水性膜貫通ドメイン後の最初の親水性アミノ酸から始まり、触媒性ドメインで、または場合によっては、膜貫通ドメイン後の最初のシステイン残基で終わる。例示的なステム領域は、限定されるわけではないが、真核生物のST6GalNAcIのステム領域、約30位から約207位までのアミノ酸残基(例えば、マウス酵素)、ヒト酵素についてアミノ酸35位〜278位、またはニワトリ酵素についてアミノ酸37位〜253位；哺乳動物GalNAcT2のステム領域、約71位から約129位までのアミノ酸残基(例えば、ラット酵素)を含む。
【００８５】
「触媒性ドメイン」は、その酵素により行われる酵素反応を触媒するタンパク質ドメインまたはその部分配列を指す。例えば、シアリルトランスフェラーゼの触媒性ドメインは、シアル酸残基を供与体から受容体糖へ転移させるのに十分なシアリルトランスフェラーゼの部分配列を含む。触媒性ドメインは、酵素全体、その部分配列を含みうる、または、天然で見出されるようにその酵素もしくはその部分配列に付着していない、追加のアミノ酸配列を含みうる。
【００８６】
用語「単離された」とは、酵素の活性に干渉する成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。本発明の糖、タンパク質または核酸について、用語「単離された」とは、それの天然の状態において見出されるように通常、その材料に付随している成分を実質的にまたは本質的に含まない材料を指す。典型的には、本発明の単離された糖、タンパク質または核酸は、銀染色されたゲル上のバンド強度、または純度を決定するための他の方法により測定される場合、少なくとも約80%純粋(pure)、通常には少なくとも約90%純粋、および好ましくは少なくとも約95%純粋である。純度または均一性は、当技術分野において周知のいくつかの手段により示されうる。例えば、試料におけるタンパク質または核酸は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分解され得、その後、タンパク質または核酸は、染色により可視化されうる。特定の目的のために、タンパク質または核酸の高分解能が望ましい場合があり、例えば、精製のためのHPLCまたは類似した手段が利用されうる。
【００８７】
説明
I. 単離された核酸
A. 一般的に
哺乳動物ST6GalNAcIおよびニワトリST6GalNAcIの様々な切り詰め突然変異体が本明細書に例示されている。しかしながら、本発明は、アミノ酸残基1位〜232位を欠損するニワトリST6GalNAcI切り詰め突然変異体ポリペプチドを網羅すると解釈されるべきではない。
【００８８】
全長ST6GalNAcI核酸は、N末端シグナルドメイン、膜貫通ドメイン、ステムドメインおよび活性ドメインを含み、活性ドメインがそのようなポリペプチドのアミノ酸配列の大部分を含みうる、他のグリコシルトランスフェラーゼと類似したドメイン構造を有するポリペプチドをコードする。当業者により理解されているように、組換えST6GalNAcIポリペプチドの活性ドメインに無関係のドメイン構造の存在は、水性またはインビトロ環境においてポリペプチドの溶解性、安定性および活性に負の影響を及ぼしうる。例えば、任意の特定の理論に制約されることを望まないが、インビトロ反応混合物に用いられる組換えST6GalNAcIポリペプチド上の疎水性膜貫通ドメインの存在は、ポリペプチドを、疎水性膜貫通ドメインを含まない組換えST6GalNAcIポリペプチドより溶解度を小さくさせ得、さらに、折り畳まれた構造に影響を及ぼすかまたは不安定化することにより、ポリペプチドの酵素活性を減少させさえしうる。
【００８９】
それゆえに、ST6GalNAcIポリペプチドの活性、安定性および/または有用性を増強することを目的として、全長ST6GalNAcIより短いST6GalNAcIをコードする組換えST6GalNAcI核酸を作製することが望ましい。本発明は、ST6GalNAcIのそのような改変型を提供する。より具体的には、本発明は、そのような切り詰め型ポリペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
【００９０】
本発明の核酸は、本明細書の他の場所でより詳細に記載されているように、ST6GalNAcIポリペプチドの切り詰め型をコードする。本発明の核酸によりコードされる切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、本明細書で「切り詰め突然変異体」とも呼ばれているのだが、当業者に理解されているように、様々な方法で切り詰められうる。本発明の核酸によりコードされる切り詰め型ポリペプチドの例は、限定されるわけではないが、単一のN末端残基を欠損するポリペプチド、単一のC末端残基を欠損するポリペプチド、単一のN末端残基および単一のC末端残基の両方を欠損するポリペプチド、N末端から残基の連続した配列を欠損するポリペプチド、C末端から残基の連続した配列を欠損するポリペプチド、ならびにそれらの任意の組み合わせを含む。
【００９１】
それゆえに、ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸の切り詰めが、多数の理由のためになされうることは、本明細書に示された開示に基づいて、理解されるものと思われる。本発明の一つの態様において、切り詰めは、ST6GalNAcIのシグナルペプチドドメインをコードする核酸配列の一部または全部を除去するためになされうる。
【００９２】
本発明のもう一つの態様において、切り詰めは、ST6GalNAcIの膜貫通ドメインをコードする核酸配列の一部または全部を除去するためになされうる。非限定的例として、膜貫通ドメインをコードする核酸配列の一部または全部の除去は、コードされたST6GalNAcIポリペプチドの溶解性もしくは安定性を増加しうる、および/またはコードされたポリペプチドの発現のレベルを増加しうる。
【００９３】
本発明のさらにもう一つの態様において、切り詰めは、ST6GalNAcIのステムドメインをコードする核酸配列の一部または全部を除去するためになされうる。非限定的例として、ステムドメインをコードする核酸配列の一部または全部の除去は、コードされたST6GalNAcIポリペプチドの溶解性もしくは安定性を増加しうる、および/またはコードされたポリペプチドの発現のレベルを増加しうる。
【００９４】
当業者は、本明細書に示された開示を携えている場合、本明細書の他の場所で詳細に示されているようにST6GalNAcIの切り詰め突然変異体を設計および創造する方法を理解するものと思われる。本発明の一つの局面において、切り詰めがなされている核酸残基は、高度に保存された残基でありうる。本発明のもう一つの局面において、切り詰めがなされている核酸残基は、コードされたポリペプチドが、発現されたポリペプチドの精製において助けとなるであろう新しいN末端アミノ酸残基を有するように選択されうる。
【００９５】
B. ST6GalNAcI単離核酸
本発明は、全長より小さいST6GalNAcIをコードする核酸を特徴とする。すなわち、本発明は、核酸により発現されたポリペプチドが全長タンパク質の生物活性を保持するとの条件で、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸を特徴とする。発明の一つの局面において、切り詰め型ポリペプチドは、哺乳動物の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドである。本発明のもう一つの局面において、切り詰め型ポリペプチドは、ヒトの切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドである。本発明のさらにもう一つの局面において、切り詰め型ポリペプチドは、マウスの切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドである。本発明のなおもう一つの局面において、切り詰め型ポリペプチドは、ニワトリの切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドである。
【００９６】
当業者により理解されているように、全長ST6GalNAcIをコードする核酸は、ST6GalNAcIの「活性ドメイン」、触媒活性に主として関与するドメイン、に加えて、1つまたは複数の同定可能なポリペプチドドメインをコードする核酸配列を含みうる。これは、全長ST6GalNAcIポリペプチドが、活性ドメインに加えて、シグナルドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインを含むことはその分野において公知であるからである。従って、全長ST6GalNAcIをコードする核酸は、ポリペプチドのアミノ末端においてシグナルドメイン、続いて、シグナルドメインに直接隣接した膜貫通ドメイン、続いて、膜貫通ドメインに直接隣接しているステムドメイン、続いて、ポリペプチドのカルボキシ末端まで伸び、ステムドメインに直接隣接している活性ドメインを有するポリペプチドをコードしうる。
【００９７】
それゆえに、一つの態様において、本発明の単離された核酸は、切り詰め型哺乳動物のST6GalNAcIポリペプチドをコードし得、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドが、ST6GalNAcIシグナルドメインの全部または一部を欠損している。もう一つの態様において、本発明の単離された核酸は、切り詰め型哺乳動物のST6GalNAcIポリペプチドをコードし得、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドが、ST6GalNAcIシグナルドメインおよびST6GalNAcI膜貫通ドメインの全部または一部を欠損している。さらにもう一つの態様において、本発明の核酸は、切り詰め型哺乳動物のST6GalNAcIポリペプチドをコードし得、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドが、ST6GalNAcIシグナルドメイン、ST6GalNAcI膜貫通ドメイン、およびST6GalNAcIステムドメインの全部または一部を欠損している。
【００９８】
本発明の開示を携えている場合、当業者は、ST6GalNAcIのこれらを始めとするそのような切り詰め突然変異体を作成および使用する方法を認識するものと思われる。特に、本発明の開示を携えている場合、当業者は、ヒトST6GalNAcI、マウスST6GalNAcIおよびニワトリST6GalNAcIの切り詰め突然変異体をコードする単離された核酸を作製ならびに使用する方法を認識するものと思われる。
【００９９】
「ST6GalNAcIの生物活性」は、シアル酸部分をシアル酸供与体から受容体分子へ転移させる能力である。全長ヒトST6GalNAcIは、例えば、その配列がSEQ ID NO:1に示されているが、そのような活性を有する。「ST6GalNAcIの切り詰め型ポリペプチドの生物活性」は、同様に、シアル酸部分をシアル酸供与体から受容体分子へ転移させる能力である。すなわち、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、全長ST6GalNAcIと同じ糖転移反応を触媒することができる。非限定的例として、本発明のST6GalNAcI核酸によりコードされる切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチドは、シアル酸部分をCMP-シアル酸供与体からウシ顎下腺ムチン受容体へ転移させる能力をもち、そのような転移は、結果として、ウシ顎下腺ムチン受容体上のGalNAc残基へのシアル酸部分の共有結合性連結を生じる。
【０１００】
それゆえに、全長より小さいまたは「切り詰め型」ST6GalNAcIをコードする核酸は、切り詰め型ST6GalNAcIがST6GalNAcI生物活性をもつとの条件で、本発明に含まれる。
【０１０１】
本発明の方法および組成物は、本明細書に開示されているようなST6GalNAcI切り詰め突然変異体を含む核酸にもっぱら限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、シアル酸のシアル酸受容体への転移を触媒する能力がある、既知かまたは未知かを問わず、本明細書での開示に従って調製される、ST6GalNAcIの切り詰め型突然変異体をコードするいずれの核酸も含むと解釈されるべきである。改変された核酸配列、すなわち、天然に存在するタンパク質をコードする核酸配列と異なる配列を有する核酸配列もまた、改変された核酸が、例えば、シアル酸のシアル酸受容体への転移を触媒する生物活性をもつ切り詰め型タンパク質をなおコードする限り、本発明の方法および組成物により含まれる。これらの改変された核酸配列は、点突然変異により引き起こされた改変、遺伝暗号の縮重または天然に存在する対立遺伝子変異体による改変、および遺伝子操作により、すなわち、人の手により、導入されているさらなる改変を含む。従って、核酸という用語はまた、具体的には、5つの生物学的に存在する塩基(アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル)以外の塩基から構成される核酸を含む。
【０１０２】
本発明は、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、Δ51、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、Δ200、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31およびSEQ ID NO:33のいずれか1つに示された核酸配列と少なくとも約90%、95%、97%、98%または99%同一である核酸配列を含む単離された核酸を特徴とする。本発明はまた、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:17、Δ51、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:23、Δ200、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31またはSEQ ID NO:33に示された配列のいずれか1つを含む単離された核酸配列であって、単離された核酸が切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする、単離された核酸配列を特徴とする。本発明はさらに、表20に列挙された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０１０３】
本発明はまた、活性にとって必須ではないアミノ酸残基に変化を含む切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸分子を含む。本発明の単離された核酸によりコードされるそのようなポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200に示された配列のいずれか1つとはアミノ酸配列において異なる；しかしそれでも、ST6GalNAcIの生物活性を保持する。非限定的例として、本発明の単離された核酸は、SEQ ID NO:10のアミノ酸配列と少なくとも約90%、95%、97%、98%または99%同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含みうる。さらに、もう一つの非限定的例として、本発明の単離された核酸は、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200のいずれか1つに示されたアミノ酸配列と少なくとも約90%、95%、97%、98%または99%同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１０４】
2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成されうる。例えば、2つの配列を比較するのに有用な数学的アルゴリズムは、KarlinおよびAltschul(1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268)のアルゴリズムであり、KarlinおよびAltschul(1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877)においてのように改変される。このアルゴリズムは、Altschul et al.(1990, J. Mol. Biol. 215:403-410)のNBLASTおよびXBLASTプログラムへ組み込まれており、例えば、National Center for Biotechnology Information(NCBI)ワールドワイドウェブサイトにおいてアクセスされうる。BLASTヌクレオチド検索は、本明細書に記載された核酸と相同的なヌクレオチド配列を得るために、以下のパラメーターを用いて、NBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と名付けられている)で行われうる：ギャップペナルティー＝5；ギャップ伸長ペナルティー＝2；不一致ペナルティー＝3；一致報酬＝1；期待値10.0：およびワードサイズ＝11。BLASTタンパク質検索は、本明細書に記載されたタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得るために、以下のパラメーターを用いて、XBLASTプログラム(NCBIウェブサイトでは「blastn」と名付けられている)またはNCBI「blastp」プログラムで行われうる：期待値10.0、BLOSUM62スコア行列。比較を目的としてギャップドアラインメントを得るために、ギャップド(Gapped)BLASTが、Altschul et al.(1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402)に記載されているように利用されうる。または、PSI-BlastまたはPHI-Blastは、分子間(同上)の遠い関係および共通のパターンを有する分子間の関係を検出する反復検索を行うために用いられうる。BLAST、ギャップドBLAST、PSI-BlastおよびPHI-Blastプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが用いられうる。一般的に、National Library of MedicineおよびNational Instituites of Healthにより維持されている、National Center for Biotechnology Informationについてのインターネットウェブサイトを参照されたい。
【０１０５】
もう一つの局面において、本発明の方法および組成物に有用で、かつ切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸は、そのような切り詰め型突然変異体の核酸配列へ挿入された少なくとも1個のヌクレオチドを有しうる。または、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする追加の核酸は、核酸配列から除去された少なくとも1個のヌクレオチドを有しうる。さらに、切り詰め型突然変異体をコードし、かつ本発明に有用なST6GalNAcI核酸は、切り詰め型ポリペプチドをコードする単一の核酸配列に存在するヌクレオチド挿入およびヌクレオチド欠失の両方を有しうる。
【０１０６】
コードされたタンパク質またはポリペプチドの機能的性質を変化させるように設計されるヌクレオチド配列に変化を導入するための技術は当技術分野において周知である。そのような改変は、塩基の欠失、挿入または置換、およびそれに従って、アミノ酸配列における変化を含む。当業者に公知であるように、核酸挿入および/または欠失は、限定されるわけではないが、核酸安定性の改変、核酸発現レベルの改変、発現されたポリペプチドの安定性または半減期の改変、発現されたポリペプチドの活性の改変、発現されたポリペプチドの性質および特徴の改変、ならびにグリコシル化パターンにおける変化を含む、多数の理由のために遺伝子へ設計されうる。そのようなタンパク質をコードするヌクレオチド配列へのすべてのそのような改変は本発明に含まれる。
【０１０７】
本発明の方法および組成物が、用いられる核酸の性質により限定されることは意図されない。本発明の方法および組成物により含まれる標的核酸は、天然または合成された核酸でありうる。核酸は、DNAまたはRNAであり得、二本鎖、一本鎖、または部分的二本鎖形で存在しうる。さらに、核酸は、ウイルスまたは他の高分子の一部として見出されうる。例えば、Fasbender et al., 1996, J. Biol. Chem. 272:6479-89を参照。
【０１０８】
II. ベクターおよび発現系
他の関連した局面において、本発明は、核酸が、好ましくは、核酸によりコードされたポリペプチドの発現を指揮する能力があるようにプロモーター/制御配列を含む核酸に作動可能に連結した切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸を含む。従って、本発明は、例えば、Sambrook et al.(第3版, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)に、およびAusubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載されているように、細胞へ外因性DNAを導入し、それらの細胞において外因性DNAを同時発現させるための発現ベクターおよび方法を含む。
【０１０９】
細胞における切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドの発現は、適切な核酸をコードする核酸を含むプラスミド、ウイルスまたは他の型のベクターを作製する段階であって、核酸が、ベクターが導入される細胞においてタグ有りまたは無しでコードされたポリペプチドの発現を作動させる役割を果たすプロモーター/制御配列と作動可能に連結されている、段階により達成されうる。さらに、金属、グルココルチコイドなどのような誘発剤に応答して誘導される当技術分野において周知であるプロモーターもまた、本発明において企図される。従って、本発明は、既知かまたは未知のいずれでもあり、かつ作動可能に連結した切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドの発現を作動させる能力がある、任意のプロモーター/制御配列の使用を含むことは、認識されているものと思われる。
【０１１０】
本発明に有用な発現系において、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸は、機能性ポリペプチドをコードする1つまたは複数の追加の核酸に融合されうる。非限定的例として、アフィニティータグのコード配列が、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドのコード配列に隣接して、そこから上流に、またはそこから下流に、核酸ベクターへと挿入されうる。当業者により理解されているように、アフィニティータグは、典型的には、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドとインフレームで多重クローニング部位へ挿入される。当業者はまた、アフィニティータグのコード配列が、アフィニティータグおよび切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを付随させて発現することにより組換え融合タンパク質を産生するように用いられうることを理解しているものと思われる。発現された融合タンパク質は、その後、アフィニティータグを用いて、単離、精製または同定されうる。
【０１１１】
本発明に有用なアフィニティータグは、限定されるわけではないが、マルトース結合タンパク質、ヒスチジンタグ、第IX因子タグ、グルタチオン-S-トランスフェラーゼタグ、FLAGタグ、およびデンプン結合ドメインタグを含む。他のタグは、当技術分野において周知であり、本発明におけるそのようなタグの使用は、当業者により容易に理解されるものと思われる。
【０１１２】
当業者により理解されているように、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含むベクターは、非融合タンパク質として、または融合タンパク質としてのいずれかで切り詰め型ポリペプチドを発現させるために用いられうる。任意の特定のプラスミドベクターまたは他のDNAベクターの選択は、本発明において限定因子ではなく、幅広く大量のベクターが当技術分野において周知である。さらに、特定のプロモーター/制御配列を選択し、いずれかの切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードするDNA配列へ、それらのプロモーター/制御配列を作動可能に連結することは、十分、当業者の技術範囲内である。そのようなテクノロジーは、当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al.(第3版, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)に、およびAusubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載されている。非限定的例として、本発明の一つの態様において有用なベクターは、pcWori+ベクター(Muchmore et al., 1987, Meth. Enzymol. 177:44-73)に基づいている。
【０１１３】
従って、本発明は、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸を含むベクターを含む。核酸のベクターへの組み入れおよびベクターの選択は、例えば、Sambrook et al.(第3版, 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York)に、およびAusubel et al.(1997, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York)に記載されているように、当技術分野において周知である。
【０１１４】
本発明の局面において、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸は、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸と連結して、宿主細胞のゲノムへ組み込まれる。本発明のもう一つの局面において、細胞は、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸を一過性にトランスフェクションされる。本発明のもう一つの局面において、細胞は、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸を安定にトランスフェクションされる。
【０１１５】
単離された核酸を細胞へ挿入することを目的として、当業者はまた、本発明の単離された核酸を宿主細胞へ導入するために有効な方法および必要とされる方法が、様々であり、宿主細胞の選択に依存することを理解しているものと思われる。単離された核酸を宿主細胞へ導入する適切な方法は、当技術分野において周知である。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための他の適した方法は、限定されるわけではないが、Sambrook et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)および他のそのような実験マニュアルに見出されるものを含みうる。
【０１１６】
切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする核酸は、当技術分野において周知であるように、任意の適した手段により精製されうる。例えば、核酸は、逆相またはイオン交換HPLC、サイズ排除クロマトグラフィー、またはゲル電気泳動により精製されうる。もちろん、当業者は、精製の方法が、精製されるべきDNAのサイズに一部依存するものであることを認識していると思われる。
【０１１７】
本発明はまた、本明細書の他の場所で記載されているように、とりわけ、核酸ベクターを含む組換え細菌宿主細胞を特徴とする。一つの局面において、組換え細胞は、本発明のベクターで形質転換される。形質転換されるベクターは、細胞ゲノムへ組み込まれる必要がなく、また細胞において発現される必要もない。しかしながら、形質転換されるベクターは、細胞において発現される能力をもつ。本発明の一つの局面において、枯草菌が、本発明のベクターの形質転換およびそれからのタンパク質の発現に用いられる。本発明のもう一つの局面において、大腸菌が、本発明のベクターの形質転換およびそれからのタンパク質の発現に用いられる。本発明のもう一つの局面において、大腸菌のK-12株が、本発明のベクターからのタンパク質の発現に有用である。本発明に有用な大腸菌の菌株は、限定されるわけではないが、JM83、JM101、JM103、JM109、W3110、chi1776およびJA221を含む。
【０１１８】
本発明に有用な宿主細胞は、小規模、中規模、または大規模での増殖および培養の能力があると理解される。例えば、本発明の宿主細胞は、それが、試薬または治療用タンパク質産物の大規模製造に有用であるのと同様に、本発明のベクターからのタンパク質の発現を試験するために有用である。宿主細胞を培養し、それらに含まれるベクターからタンパク質を発現させるのに有用な技術は、当技術分野において周知であり、それゆえに、本明細書に列挙されていない。
【０１１９】
上記のように、本発明の方法に有用な宿主細胞は、本明細書に示された開示を携えている場合、当業者により理解されるように、様々な方法に従って調製されうる。一つの局面において、本発明の宿主細胞は、本発明の形質転換された宿主細胞を作製するために本発明のベクターで形質転換されうる。形質転換は、当業者に公知であるように、核酸ベクターを含む宿主細胞が生存可能なままであるように、核酸ベクターを宿主細胞へ挿入する過程を含む。核酸の細菌細胞へのそのような形質転換は、限定されるわけではないが、安定に形質転換された宿主細胞の作製、生物学的蓄積物（deposit）を生成すること、ベクター含有宿主細胞を増殖させること、追加のベクターの産生および単離のためにベクター含有宿主細胞を増殖させること、ベクターによりコードされる標的タンパク質の発現などを含む目的に有用である。
【０１２０】
細胞をベクターで形質転換する方法は多数あって、当技術分野において周知であり、それゆえに、本明細書に列挙されていない。非限定的例として、本発明のコンピテント細菌細胞は、電気穿孔法を用いて本発明のベクターにより形質転換されうる。細菌細胞を「コンピテント」にさせる方法は、当技術分野において周知であり、典型的には、細胞が外因性DNAを取り込むように細菌細胞の調製することを含む。同様に、電気穿孔法の方法は、当技術分野において公知であり、そのような方法の詳細な説明は、例えば、Sambrook et al.(1989, 前記)に見出されうる。コンピテント細胞のベクターDNAでの形質転換はまた、化学物質に基づいた方法を用いて達成されうる。細菌形質転換の周知の化学物質に基づいた方法の1つの例は、Inoue, et al.(1990, Gene 96:23-28)により記載されている。形質転換の他の方法は、当業者に公知であると思われる。
【０１２１】
本発明の形質転換される宿主細胞は、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを発現させるために用いられうる。本発明の態様において、形質転換された宿主細胞は、本発明の切り詰め型ポリペプチドをコードする核酸配列を含む本発明のベクターを含む。切り詰め型ポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の発現方法を用いて発現される(例えば、IPTG)。発現された、切り詰め型ポリペプチドは、宿主細胞内に含まれうるか、またはそれは宿主細胞から増殖培地へ分泌されうる。
【０１２２】
発現されたポリペプチドを単離するための方法は、当技術分野において周知であり、当業者は、任意の与えられた宿主細胞発現系の特徴に基づいて、発現されたポリペプチドの単離のための最善の方法を決定する手法を認識するであろう。非限定的例として、宿主細胞から分泌される発現されたポリペプチドは、増殖培地から単離されうる。増殖培地からのポリペプチドの単離は、細菌細胞および細胞片の除去を含みうる。もう一つの非限定的例として、宿主細胞内に含まれる発現されたポリペプチドは、宿主細胞から単離されうる。そのような「細胞内の」発現されたポリペプチドの単離は、宿主細胞の破壊およびその結果として生じた混合物からの細胞片の除去を含みうる。これらの方法は、本発明の排他的代表であることを意図されず、むしろ、単に、本発明の様々な適用の例証を目的としているにすぎない。
【０１２３】
本発明に従って発現された切り詰め型ポリペプチドの精製は、当技術分野において公知の任意の手段によりもたらされうる。当業者は、本発明に従って発現されたポリペプチドの精製のための最善の方法を決定する手法を認識するであろう。精製方法は、限定されるわけではないが、発現宿主、ポリペプチドの粗抽出物の内容、ポリペプチドのサイズ、ポリペプチドの性質、ポリペプチド精製過程の所望の最終産物、およびポリペプチド精製過程の最終産物のその後の使用のような因子に基づいて当業者により選択される。
【０１２４】
本発明の態様において、本発明に従って発現された、切り詰め型ポリペプチドの単離または精製が望まれない場合がある。本発明の局面において、発現されたポリペプチドは、ポリペプチドが発現された細菌宿主細胞の内部に蓄積または輸送されうる。本発明のもう一つの局面において、発現されたポリペプチドは、ポリペプチドが発現された宿主細胞の溶解により生成される粗可溶化液の形で用いられうる。本発明のさらにもう一つの態様において、発現されたポリペプチドは、本明細書に示された、または記載された方法のいずれかに従って、部分的に単離または部分的に精製されうる。当業者は、本発明のポリペプチドを単離または精製することが所望されない場合を認識し、そのようなポリペプチドの使用および調製に有効な技術を熟知しているであろう。
【０１２５】
本明細書に示された開示を携えている場合、当業者はまた、本発明の真核生物の宿主細胞を調製する方法を認識するものと思われる。本明細書の他の場所で示されているように、および本明細書に提供された開示に基づいて当業者に知られているように、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをコードする単離された核酸は、例えば、レンチウイルスに基づいたゲノム組み込みまたはプラスミドに基づいたトランスフェクションを用いて、真核生物宿主細胞へ導入されうる(Sambrook et al., 第3版, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))。本発明の一つの態様において、真核生物宿主細胞は真菌細胞である。本発明の真核生物宿主細胞として有用な真菌細胞は、限定されるわけではないが、A. ニゲル(A. niger)およびP. ルクノウェンサ(P. lucknowensa)のような菌株を含む。
【０１２６】
もう一つの態様において、本発明の切り詰め型ポリペプチドをコードする核酸は、切り詰め型ポリペプチドの発現のための特定のプロモーター配列を含むレンチウイルスベクターへクローニングされる。切り詰め型ポリペプチド含有レンチウイルスベクターは、その後、切り詰め型ポリペプチドの発現のために宿主細胞をトランスフェクションするために用いられる。本発明に有用なもののようなレンチウイルスベクターを作製しかつ用いる方法は、当技術分野において周知であり、本明細書ではさらには記載されていない。
【０１２７】
さらにもう一つの態様において、本発明の切り詰め型ポリペプチドをコードする核酸は、ウイルス発現系を用いて宿主細胞へ導入される。ウイルス発現系は、当技術分野において周知であり、本明細書では詳細に記載されていない。本発明の一つの局面において、ウイルス発現系は、哺乳動物のウイルス発現系である。本発明のもう一つの局面において、ウイルス発現系は、バキュロウイルス発現系である。そのようなウイルス発現系は、典型的には、多数の売主から市販されている。
【０１２８】
当業者は、本発明の切り詰め型ポリペプチドの発現のために宿主細胞-ベクター発現系を用いる方法を認識するであろう。真核生物の宿主と用いる適切なクローニングおよび発現ベクターは、開示が全体として参照により本明細書に組み入れられている、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)において記載されている。
【０１２９】
昆虫細胞もまた、本発明の切り詰め型ポリペプチドの発現に用いられうる。本発明の局面において、Sf9、Sf9+、Sf21、High Five(商標)、またはショウジョウバエSchneider S2細胞が用いられる。本発明のさらにもう一つの局面において、バキュロウイルス、すなわち、バキュロウイルス/昆虫細胞発現系は、pAcGP67、pFastBac、pMelBacまたはpIZベクター、およびポリヘドリン、p10またはOpIE3アクチンプロモーターを用いて、本発明の切り詰め型ポリペプチドを発現させるために用いられうる。本発明のもう一つの局面において、ショウジョウバエ発現系は、pMTまたはpAC5ベクターおよびMTまたはAc5プロモーターと用いられうる。
【０１３０】
本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドはまた、哺乳動物細胞において発現されうる。本発明の局面において、294、HeLa、HEK、NSO、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、Jurkat、またはCOS細胞が、本発明の切り詰め型ポリペプチドを発現させるために用いられうる。切り詰め型ポリペプチドの哺乳動物細胞発現の場合、pT-Rex、pSecTag2、pBudCE4.1またはpCDNA/His Maxベクターのような適したベクターが、例えば、CMVプロモーターと共に用いられうる。当業者により理解されているように、プロモーターの選択、加えて1つまたは複数のプロモーターを本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを発現させるために用いられる宿主細胞へ導入するための方法およびストラテジーは、当技術分野において周知であり、用いられる宿主細胞および発現系に依存して変わるであろう。
【０１３１】
様々な哺乳動物細胞培養系が、組換えタンパク質を発現させるために用いられうる。哺乳動物発現系の非限定的例は、Gluzman, Cell 23:175 (1981)により記載されたサル腎臓線維芽細胞のCOS-7系、およびコンパチブルベクターを発現させる能力がある他の細胞系、例えば、C127、3T3、CHO、HeLaおよびBHK細胞系を含む。哺乳動物発現系は、複製起点、適したプロモーター、ならびに、いずれの必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与体および受容体部位、転写終結配列、および5'隣接非転写配列をも含みうる。SV40ウイルスゲノム由来のDNA配列、例えば、SV40起点、初期プロモーター、エンハンサー、スプライスおよびポリアデニル化部位は、必要とされる非転写遺伝要素を供給するために用いられうる。
【０１３２】
当業者により理解されているように、本発明の任意の単離された核酸を宿主細胞へ導入するのに有効な方法および必要とされる方法は、様々であり、宿主細胞の選択に依存する。単離された核酸を宿主細胞へ導入する適した方法は、当技術分野において周知である。非限定的例として、ベクターDNAは、通常のトランスフェクション技術を用いて真核細胞へ導入されうる。本明細書に用いられる場合、用語「トランスフェクション」は、DEAE-デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、または電気穿孔法を含む、外来性核酸(例えば、DNA)を宿主細胞へ導入するための様々な、技術分野で認識されている技術を指す。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適した方法は、Sambrook, et al.(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第3版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)および他のそのような実験マニュアルに見出されうる。
【０１３３】
例えば、哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションについて、用いられる発現ベクターおよびトランスフェクション技術に依存して、細胞のわずか一部分のみが、外来性DNAをそれらのゲノムへ組み込みうることは知られている。これらの形質転換体を同定および選択するために、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性)をコードする遺伝子が、一般的に、対象となる遺伝子と共に宿主細胞へ導入される。様々な選択マーカーは、G418、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を与えるものを含む。選択マーカーをコードする核酸は、本発明の切り詰め型ポリペプチドをコードするものと同じベクター上に宿主細胞へと導入されうるか、または別々のベクター上に導入されうる。導入された核酸を安定的にトランスフェクションされた細胞は、薬物選択により同定されうる(例えば、選択マーカー遺伝子を組み入れている細胞は生存するが、他の細胞は死ぬ)。
【０１３４】
III. ポリペプチド
本発明の切り詰め型ポリペプチドは、本明細書に示された開示を携えている場合、公知でかつ当業者により理解されているように、様々な方法で切り詰められうる。本発明の切り詰め型ポリペプチドの例は、限定されるわけではないが、単一のN末端残基を欠損するポリペプチド、単一のC末端残基を欠損するポリペプチド、単一のN末端残基および単一のC末端残基の両方を欠損するポリペプチド、N末端から残基の連続した配列を欠損するポリペプチド、C末端から残基の連続した配列を欠損するポリペプチド、ならびにそのような、それらの任意の組み合わせを含む。
【０１３５】
当業者により理解されているように、全長ヒトST6GalNAcIポリペプチドは、ST6GalNAcIの「活性ドメイン」、即ち主として触媒活性に関与するドメインに加えて、1つまたは複数の同定可能なポリペプチドドメインを含みうる。これは、全長ST6GalNAcIポリペプチドが、活性ドメインに加えて、シグナルドメイン、膜貫通ドメイン、およびステムドメインを含むことが、当該技術分野において公知であるからである。従って、全長ST6GalNAcIは、ポリペプチドのアミノ末端にシグナルドメイン、続いて、シグナルドメインに直接隣接した膜貫通ドメイン、続いて、膜貫通ドメインに直接隣接しているステムドメイン、続いて、ポリペプチドのカルボキシ末端まで伸び、ステムドメインに直接隣接している活性ドメインを有しうる。
【０１３６】
それゆえに、一つの態様において、本発明のST6GalNAcIポリペプチドは、ST6GalNAcIシグナルドメインの全部または一部を欠損する切り詰め型哺乳動物ST6GalNAcIポリペプチドである。もう一つの態様において、本発明のST6GalNAcIポリペプチドは、ST6GalNAcIシグナルドメインおよびST6GalNAcI膜貫通ドメインの全部または一部を欠損する切り詰め型哺乳動物ST6GalNAcIポリペプチドである。さらにもう一つの態様において、本発明のST6GalNAcIポリペプチドは、ST6GalNAcIシグナルドメイン、ST6GalNAcI膜貫通ドメイン、およびST6GalNAcIステムドメインの全部または一部を欠損する切り詰め型哺乳動物ST6GalNAcIポリペプチドである。本発明の開示を携えている場合、当業者は、これらを始めとするヒトST6GalNAcIのそのような切り詰め突然変異体を作製かつ使用する方法を認識するであろう。
【０１３７】
本発明の切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体のサイズおよび同定は、全長ポリペプチドが切り詰められている点に基づいている。非限定的例として、本発明の「Δ35ヒト切り詰め型ST6GalNAcI」突然変異体は、全長ポリペプチドのN末端から数えてアミノ酸1位〜35位がポリペプチドから欠失している、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを指す。それゆえに、Δ35ヒト切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体のN末端は、全長ポリペプチドの「アミノ酸36位」と呼ばれるアミノ酸残基から始まる。この命名法は、限定されるわけではないが、哺乳動物ST6GalNAcI、ヒトST6GalNAcI、マウスST6GalNAcIおよびニワトリST6GalNAcI由来のものを含む、本発明のすべての切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドに適用される。特定の欠失が示されている場合、欠失は、図31に示されたニワトリ、マウスまたはヒト由来の全長ST6GalNAcI配列を用いて決定される。そのような欠失の好ましい態様は、例えば、表20に示されている。いくつかの態様において、切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体は、以下から選択される。ヒトの切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体について(単一の突然変異体に対して2つの可能な名前を用いる)：Δ35またはK36、Δ124またはK125、Δ257またはS258、Δ72またはT73、Δ109またはE110、Δ133またはM134、Δ170またはT171、Δ232またはA233、およびΔ272またはG273。ニワトリの切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体について(単一の突然変異体に対して2つの可能な名前を用いる)：Δ48またはQ49、Δ152またはV153、Δ225またはL226、Δ226またはR227、Δ231またはK233、およびΔ232またはT233。マウスの切り詰め型ST6GalNAcI突然変異体について(単一の突然変異体に対して2つの可能な名前を用いる)：Δ30またはK31、Δ31またはD32、Δ51またはE52、Δ126またはS127、Δ185またはS186、およびΔ200またはS201。
【０１３８】
それゆえに、本発明はまた、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含む単離されたポリペプチドを含む。好ましくは、本発明の単離された切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200に示された配列のいずれか1つのアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも約90%の同一性を有する。より好ましくは、単離されたポリペプチドは、約95%同一、ならびによりいっそう好ましくは約98%同一、なおより好ましくは約99%同一であり、ならびに最も好ましくは、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含む単離されたポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200のうちの1つに示されたポリペプチドと同一である。
【０１３９】
本発明はまた、本明細書に開示されているように、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含むポリペプチドの類似体を提供する。類似体は、保存的アミノ酸配列の違いで、または配列に影響を及ぼさない修飾で、または両方で、天然に存在するタンパク質またはペプチドと異なりうる。
【０１４０】
例えば、保存的アミノ酸変化がなされ得、それらがタンパク質またはペプチドの一次配列を変化させるが、通常にはそれの機能を変化させない。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む：
グリシン、アラニン；
バリン、イソロイシン、ロイシン；
アスパラギン酸、グルタミン酸；
アスパラギン、グルタミン；
セリン、トレオニン；
リジン、アルギニン；
フェニルアラニン、チロシン。
【０１４１】
修飾(通常には、一次配列を変化させない)は、インビボまたはインビトロのポリペプチドの化学的誘導体化、例えば、アセチル化、またはカルボキシル化を含む。グリコシル化の修飾も含まれ、例えば、合成および処理中に、またはさらなる処理段階において；例えば、グリコシル化に影響を及ぼす酵素、例えば、哺乳動物のグリコシル化または脱グリコシル酵素にポリペプチドを曝すことにより、ポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することにより作製されたものである。リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリンまたはホスホトレオニンを有する配列もまた含まれる。
【０１４２】
タンパク分解性分解に対する抵抗性を向上させるために、または溶解性性質を最適化するために、または治療剤としてより適切にするために、通常の分子生物学的技術を用いて修飾されているポリペプチドもまた含まれる。そのようなポリペプチドの類似体は、天然に存在するL-アミノ酸以外の残基、例えば、D-アミノ酸または天然に存在しない合成アミノ酸を含むものを含む。本発明のペプチドは、本明細書に列挙された特定の例示的な過程のいずれかの生成物に限定されない。
【０１４３】
本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドの断片は、断片が全長ポリペプチドの生物活性を有するとの条件で、本発明に含まれる。すなわち、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、全長ST6GalNAcIと同じ糖転移反応を触媒することができる。非限定的例として、本発明の切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチドは、シアル酸部分をCMP-シアル酸供与体からウシ顎下腺ムチン受容体へ転移させる能力を有し、そのような転移は、結果として、ウシ顎下腺ムチン受容体上のGalNAc残基へのシアル酸部分の共有結合性連結を生じる。それゆえに、全長より短い、すなわち「切り詰め型」ST6GalNAcIは、切り詰め型ST6GalNAcIがST6GalNAcI生物活性を有するとの条件で、本発明に含まれる。
【０１４４】
本発明のもう一つの局面において、本明細書に記載されているような単離された、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含む組成物は、高度に精製された、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含みうる。または、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含む組成物は、特定の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを発現させるために用いられる細胞から調製される細胞可溶化物を含みうる。さらに、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、ポリペプチドの発現に適したかなり多数の細胞の1つにおいて発現され得、そのような細胞は、本明細書の他の場所で詳細に記載されているように、当業者に周知である。
【０１４５】
切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドのすべての上の記載は、限定されるわけではないが、哺乳動物ST6GalNAcI、ヒトST6GalNAcI、マウスST6GalNAcIおよびニワトリST6GalNAcIを含む、任意の源由来の本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドへ等しく適用されることは認識されているものと思われる。
【０１４６】
本明細書に記載されているように単離および得られた実質的に純粋なタンパク質は、タンパク質精製のための以下の公知の手順により精製され得、免疫学的、酵素的または他のアッセイ法が、手順における各段階で精製をモニターするために用いられる。タンパク質精製方法は、当技術分野において周知であり、例えば、Deutscher et al.(ed., 1990, Guide to Protein Purification, Harcourt Brace Jovanovich, San Diego)に記載されている。好ましい態様において、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、精製タグ、例えば、マルトース結合ドメイン(MBD)タグまたはデンプン結合ドメイン(SBD)タグと融合される。そのような切り詰め型ST6GalNAcI融合タンパク質は、精製タグへ特異的に結合するカラムの通過により精製されることができ、例えば、MBDまたはSBDタンパク質は、シクロデキストリンカラム上で精製されうる。さらなる態様において、例えば、MBDまたはSBDタグのような精製タグを含む切り詰め型ST6GalNAcI融合タンパク質は、精製タグへ特異的に結合するカラム上に固定化され、基質、例えばシアル酸供与体またはPEG化シアル酸供与体、およびO結合型グリコシル化部位を含む糖タンパク質または糖ペプチドは、供与体、例えば、CMP-シアル酸またはCMP-PEG化シアル酸から糖タンパク質または糖ペプチド受容体へのシアル酸の転移、およびそれによるシアル酸付加糖タンパク質またはシアル酸付加糖ペプチドの生成を促進する条件下で、カラムを通過させられる。
【０１４７】
III. 方法
本発明は、切り詰め型ポリペプチドを発現させる方法を特徴とする。本発明の方法に従って発現されうるポリペプチドは、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを含む。より好ましくは、本発明の方法に従って発現されうるポリペプチドは、限定されるわけではないが、切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチド、切り詰め型マウスST6GalNAcIポリペプチド、および切り詰め型ニワトリST6GalNAcIポリペプチドを含む。好ましい態様において、本発明の方法に従って発現されうるポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、図31に示されたヒト配列のΔ35、図31に示されたヒト配列のΔ72、図31に示されたヒト配列のΔ109、図31に示されたヒト配列のΔ133、図31に示されたヒト配列のΔ170、図31に示されたヒト配列のΔ232、図31に示されたヒト配列のΔ272、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32、図31に示されたニワトリ配列のΔ225、SEQ ID NO:18、図31に示されたマウス配列のΔ30、図31に示されたマウス配列のΔ51、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:24、および図31に示されたマウス配列のΔ200に示されたポリペプチド配列のいずれか1つを含むポリペプチドである。
【０１４８】
一つの態様において、本発明は、本明細書の他の場所で記載されているように、本発明の単離された核酸によりコードされる切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを発現させる方法であって、発現される切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドが、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する性質を有する、方法を特徴とする。本発明の一つの局面において、切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドを発現させる方法は、本発明の単離された核酸を発現ベクターへクローニングする段階、発現ベクター構築物を宿主細胞へ挿入する段階、および切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをそこから発現させる段階を含む。
【０１４９】
ポリペプチドの発現、加えて、ポリペプチドの発現のための発現系および組換え宿主細胞の構築の方法は、本明細書の他の場所で幅広く詳細に考察されている。本発明の切り詰め型ポリペプチドの発現の方法は、限定されるわけではないが、本明細書に記載されているようなすべてのそのような方法を含むと理解されていると思われる。いくつかの発現系において、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、不溶性タンパク質として、例えば、細菌宿主細胞における封入体タンパク質内に、発現される。ST6GalNAcIポリペプチドを含む不溶性グリコシルトランスフェラーゼを再び折り畳む方法は、2004年2月4日に出願された米国仮特許出願第60/542,210号；2004年8月6日に出願された米国仮特許出願第60/599,406号；2004年11月12日に出願された米国仮特許出願第60/627,406号；および2005年2月4日に出願された国際特許出願第PCT/US05/03856号に開示されており、それぞれは、すべての目的のために参照により本明細書に組み入れられている。
【０１５０】
本発明はまた、グリコシル供与体とグリコシル受容体の間のグリコシルトランスフェラーゼ反応を触媒する方法を特徴とする。一つの態様において、本発明は、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法であって、シアル酸転移反応が、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドをシアル酸供与体および受容体部分とインキュベートすることにより行われる、方法を特徴とする。一つの局面において、本発明の切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、シアル酸部分の受容体部分への共有結合を媒介し、それにより、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する。
【０１５１】
本発明の態様において、糖転移反応に有用な切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチドである。もう一つの態様において、糖転移反応に有用な切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、切り詰め型ニワトリST6GalNAcIポリペプチドである。好ましい態様において、糖転移反応に有用な切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドは、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32に示されたポリペプチド配列のいずれか1つ、または表20に列挙されたヒトの切り詰め型ST6GalNAcIポリペプチドのいずれかを含むポリペプチドである。
【０１５２】
非限定的例として、シアル酸部分の受容体部分への転移を触媒する方法は、切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチドをシチジン一リン酸-シアル酸(CMP-NAN)シアル酸供与体およびアシアロウシ顎下腺ムチン受容体部分とインキュベートする段階であって、切り詰め型ヒトST6GalNAcIポリペプチドが、CMP-NANからウシ顎下腺ムチン受容体へのシアル酸部分の転移を媒介する、段階を含む。
【０１５３】
それゆえに、一つの態様において、本発明はまた、ポリペプチド受容体部分を特徴とする。本発明の一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、ヒト成長ホルモンである。もう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、エリスロポエチンである。さらにもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、インターフェロン-αである。もう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、インターフェロン-βである。本発明のもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、インターフェロン-γである。本発明のなおもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、リソソーム加水分解酵素である。もう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、血液因子ポリペプチドである。なおもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、抗腫瘍壊死因子-αである。本発明のもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、卵胞刺激ホルモンである。本発明のさらにもう一つの態様において、ポリペプチド受容体部分は、グルカゴン様ペプチドである。
【０１５４】
一つの態様において、本発明はまた、シアル酸-ポリエチレングリコール結合体(SA-PEG)を受容体分子へ転移させる方法を特徴とする。一つの局面において、受容体分子は、ポリペプチドである。もう一つの局面において、受容体分子は、糖ペプチドである。SA-PEG結合体を設計する、作製するおよび受容体分子へ転移させるのに有用な組成物ならびに方法は、国際(PCT)特許出願第WO 03/031464(PCT/US02/32263)号および米国特許出願第2004/0063911号で詳細に考察されており、それぞれが全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０１５５】
グリコシルトランスフェラーゼ活性をアッセイする方法は、当技術分野において周知である。本発明に従って用いられうるグリコシルトランスフェラーゼを検出するための様々なアッセイ法は刊行されている。以下は、グリコシルトランスフェラーゼ活性を検出するのに有用なアッセイ法の例証となるが、限定としてみなされるべきではない。Furukawa et al. (1985, Biochem. J., 227:573-582)は、ホウ酸含浸ペーパー電気泳動アッセイ法および蛍光アッセイ法を記載する。Roth et al. (1983, Exp'l Cell Research 143:217-225)は、以前は熱量測定的にアッセイされていた、グルクロニルトランスフェラーゼへのホウ酸アッセイ法の適用を記載する。Benau et al. (1990, J. Histochem. Cytochem., 38:23-30)は、ジアゾニウム塩のNADHによる還元に基づいた組織化学的アッセイ法を記載する。参照により本明細書に組み入れられた、Rothの米国特許第6,284,493号も参照されたい。
【０１５６】
実験例
本発明は、ここで、以下の実施例に関して記載されている。これらの実施例は、例証を目的として提供され、本発明は、決して、これらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本明細書に提供された教示の結果として明らかになる、任意の、かつ全てのバリエーションを含むと解釈されるべきである。
【０１５７】
実施例1：マウスGalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)のMBP-pCWin2ベクターへの分子クローニング
5つのN末端アミノ酸を切り詰め型GalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)遺伝子のpCWin2 MBP融合タグ発現ベクターへのクローニングおよび発現は、本明細書に記載されているように行われた。pCWin2-MBPベクターにおけるマルトース結合タンパク質(MBP)に融合したST6GalNAcI遺伝子の5つの異なるアミノ末端切り詰めの作製もまた、本明細書に記載されている。これらの構築物で形質転換されたJM109細胞の作製およびその後の、これらの形質転換体におけるタンパク質発現の誘発が示されている。すべての5つの融合タンパク質は、IPTGでの誘発で様々なレベルで発現される。
【０１５８】
鋳型DNA(pTS103)が、マウスST6GalNAcIの増幅のために用いられた。プライマーは、Δ31、Δ51、Δ126、Δ185およびΔ200を含む、5つのマウスST6GalNAcIのN末端切り詰め型について以下の配列を用いてマウスST6GalNAcI遺伝子をクローニングするように設計された。用いられたプライマーは以下の通りであった：
2008501344.tif 000189
PCR反応は、様々なST6GalNAcI遺伝子の増幅のために加圧滅菌された500 μlの反応チューブにおいて行われた。
【０１５９】
（表１）マウスST6GalNAcI切り詰め突然変異体についてのPCR反応パラメーター
2008501344.tif 000190
【０１６０】
PCR反応の結果は、0.8%アガロース/TAEゲルを用いて可視化された。ST6GalNAcI遺伝子は、約1.5 Kbで同定された。DNAは、製造会社の使用説明書(Millipore, Bellerica, MA)に従って、Amicon Ultra free DAフィルターを用いてゲルから抽出され、Microcon YM-100フィルターを用いて精製された。
【０１６１】
0.8%アガロースゲルにおける1.5 kbあたりのDNAバンドがUVライトボックスを用いて同定された。DNAを含むゲル切片がゲルから切除された。Amicon Ultra free DAフィルター(Millipore, Bellerica, MA)を用いて、ゲル切片は、ゲル噴霧器に置かれ、装置は、バイアルに付着したキャップで密封された。組み立て装置は、5000 x gで10分間、遠心分離された。押し出されたDNAは、試料フィルターカップにおける微多孔膜を通過し、濾液バイアスに収集された。バイアルにおける精製されたDNAは、Microcon YM-100ユニット(Millipore, Bellerica, MA)の試料貯蔵所へ移され、2000 rpmで12分間、遠心分離された。移されたDNAは収集された。
【０１６２】
PCR反応から濃縮されたDNAの制限酵素消化は、1.5 mlのチューブにおいて、6.0 μlの精製されたPCR産物、2.5 μlの10X BamHI緩衝液、2.5 μlの10X BSA、1.5 μlのBamHI酵素、1.5 μl XhoI酵素、および11.0 μlのヌクレアーゼを含まない水を加えることにより行われた。反応は、37℃で1.5時間、インキュベートされ、5分間、氷上に置かれた。MBP-pCWin2ベクターDNAは、1.5 mlのチューブにおいて、6.0 μl ベクターDNA(MBP-pCWin2)、2.5 μl 10X BamHI緩衝液、2.5 μl 10X BSA、1.5 μl BamHI酵素、1.5 μl XhoI酵素および11.0 μl ヌクレアーゼを含まない水を加えることにより、消化された。消化反応は、0.8%アガロース/TAEゲル上の電気泳動により分析された。ゲルは、2 μlのローディング色素および10 μlの消化されたDNAを含む消化混合物を添加された。製造会社の使用説明書(Millipore, Bellerica, MA)に従って、1.5 KbあたりのDNAが、Amicon Ultra free DAプロトコールを用いてゲルから抽出され、Microcon YM-100を用いて精製された。
【０１６３】
加圧滅菌された0.5 ml チューブにおいて、以下のBamHI/XhoI消化されたDNAが、その挿入断片をベクターへライゲーションするために加えられた：
【０１６４】
（表２）マウスST6GalNAcI切り詰め突然変異体についてのライゲーション反応
2008501344.tif 000191
【０１６５】
反応混合物は4℃で一晩、インキュベートされた。
【０１６６】
1、2、3、4および5と番号を付された5つのあらかじめ冷却された2 mm ギャップのキュベットのそれぞれへ、表2に列挙された2.0 μlのライゲーション反応物が加えられた。混合物は、50 μlの解凍された(氷上)DH5αエレクトロコンピテント細胞を含む対応するキュベットに加えられた。混合物は、2.5 KV、R5抵抗および129 OHMSにおける電気穿孔法にかけられた。SOC培地(1 ml)が、各反応混合物へ添加され、その後、225 RPMで振盪しながら、37℃で1時間、インキュベートされた。100 μlの各形質転換反応物は、LB(50 μg/ml) Kanrプレート上へ置かれ、37℃で一晩、インキュベートされた。
【０１６７】
陽性クローンのスクリーニングについて、4つの形質転換体コロニーが各構築物から選択され、10 μg/mlのカナマイシンを含むLBブロスの5.0 mlへ接種され、振盪(225 rpm)しながら、37℃で5時間、増殖させられた。DNAは、製造会社の使用説明書(Qiagen, Valencia, CA)に従って、QIA prep Spin Miniprep Kitを用いて単離された。プラスミドDNAは、前に記載されているように、両方のBamHI/XhoIで調製された。消化反応物は、その後、0.8%アガロース/TAEゲル上で分析された。
【０１６８】
コロニー#1〜#4、構築物DH5α/MBP-pCWin2-ST6GalNAcI(それぞれ、Δ31、Δ51、Δ126、Δ185およびΔ200に対応するD32、E52、S127、S186、S201)からのDNAは、MBP-ST6GalNAcI断片を単離するために表3に示されているような制限酵素NdeIおよびHindIIIを用いて二重消化された。
【０１６９】
（表３）ST6GalNAcI切り詰め突然変異体DNA単離物のための診断的条件
2008501344.tif 000192
【０１７０】
反応は、37℃で1.5時間、インキュベートされた。消化反応物は、その後、0.8%アガロース/TAEゲル上で分析された。
【０１７１】
それぞれの切り詰め型ST6GalNAcIからの5つの陽性クローン(コロニー#1)が、発現のために大腸菌JM109細胞へ挿入された。D32、E52、S127、S186およびS201とラベルを付された5つの1.5 ml 加圧滅菌されたエッペンドルフチューブへ、50 μlのJM109化学的コンピテント細胞、構築物DH5α/MBP-pCWin2-ST6GalNAcIからの2.0 μlのミニプレップ(mini-prep)DNAコロニー#1(チューブD32、E52、S127、S186およびS201に対応する)が加えられた。混合物は、振盪なしで、氷上で30分間、インキュベートされ、その後、42℃で30秒間、熱ショックを与えられた。熱ショック後すぐに、チューブを氷へ移された。室温SOC培地(250 μl)が添加され、チューブは、37℃で1時間、225 rpmで水平に振盪された。各培養物の150 μlの容量がLB(50 mg/ml)Kanr寒天プレート上に塗布され、37℃で一晩、インキュベートされた。
【０１７２】
コロニー#1およびコロニー#2構築物JM109/MBP-pCWin2-ST6GalNAcI(D32、E52、S127、S186およびS201)からのDNAはその後、単離されたMBP-ST6GalNAcI断片を得るために以下の通りに制限酵素NdeIおよびXhoIを用いて二重消化された。消化条件は表4に示されている。
【０１７３】
（表４）MBP-pCWin2-ST6GalNAcI構築物のための消化条件
2008501344.tif 000193
【０１７４】
バイアルは、37℃で1.5時間、インキュベートされた。消化反応物は、その後、0.8%アガロース/TAEゲル上で分析された。
【０１７５】
マウスGalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)は、MBP-pCWin2-ST6GalNAcIを有するJM109細胞から発現された。10 μg/mlのカナマイシンを含む150 ml Martone L-ブロスが、JM109/pCWin2-MBP-ST6GalNAcIのそれぞれのN末端アミノ酸を切り詰め型構築物(D32、E52、S127、S186およびS201)のコロニー#1を接種された。光学濃度は、培養物が0.7のODに達するまで620 nmでモニターされた。タンパク質発現は、IPTGの添加(最終濃度＝500 mM)により35℃で一晩、誘発された。次の日、培養物は、40℃、5000 rpmで30分間の遠心分離により採集された。ペレットは蒸留水に再懸濁された。ペレットの1グラムあたり、3.3 mlの水が添加された。細胞はフレンチプレス(French press)を用いて破砕され、溶解された細胞は、10000 rpmで20分間、遠心分離された。細胞ペレットは、細胞上清から分離され、SDS pageゲルは、試料を可視化するために用いられた。
【０１７６】
SDS-PAGEは、Novex XCELL Electrophoresis SystemにおいてNovexプレキャスト4〜20%Tris-グリシンゲルを用いて(Invitrogen, Carlsbad, CA)行われた。試料は、50 μlのタンパク質溶液を50 μlの2X添加液および10 μlの1 M DTTと混合し、続いて98℃で4分間、加熱することにより、調製された。各試料の10 μlの容量は、ゲル上へ添加され、100 Vの定電圧にかけられた。マーカー色素がゲルの下端に達した時、ゲルは、毎回5分間、3回、水で洗浄された。ゲルは、穏やかに振盪しながら、室温で1時間、染色された。ゲルは、クリアなバックグラウンドを得るために水で脱染された。
【０１７７】
（表５）大腸菌DH5αの電気穿孔法のための100 μlの種菌から生じるコロニーの数
すべての形質転換体の表
2008501344.tif 000194
【０１７８】
（表６）大腸菌JM109宿主細胞の電気穿孔法のための150 μlの種菌から生じるコロニーの数
すべての形質転換体の表
2008501344.tif 000195
【０１７９】
図2は、両方のエンドヌクレアーゼを用いる制限消化後、PCRから得られたDNAを示している。1488 bp、1428 bp、1203 bp、1026 bp、および981 bpの予想されるDNA断片は、それぞれ、N末端アミノ酸を切り詰め型ST6GalNAcIのD32、E52、S127、S186およびS201に対応する。図3は、組換えコロニーDH5α/pCWin2-MBP-ST6GalNAcIのスクリーニングを示し、そのDNAは、D32産物についてHindIII/XhoI制限酵素、ならびに構築物E52、S127、S186およびS201産物についてBamHI/XhoIを用いて消化された。
【０１８０】
要約すれば、5つのマウスN末端アミノ酸を切り詰め型GalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)構築物が、示されているように、成功裡に、クローニングされ、大腸菌DH5αおよびJM109宿主細胞へ形質転換された。ST6GalNAcIΔ200を表す構築物S201は、配列分析によりさらに確認された。融合タンパク質は、大腸菌JM109宿主細胞から発現された。大腸菌JM109形質転換体は、SDS pageゲル上で正しいサイズのST6GalNAcI-MBP融合タンパク質を発現させることが示された。
【０１８１】
実施例2：大腸菌発現されたMBP-マウスST6GalNAcIについてのタンパク質再折り畳み条件の開発
マルトース結合タンパク質(MBP)および切り詰め型GalNAcα2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の大腸菌発現された融合タンパク質は、調べられ、活性酵素を生じるように再び折り畳まれた。この研究について、酵素活性は、CMP-NAN供与体を用いる、ST6GalNAcIによる受容体タンパク質顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)-O-GalNac上へのシアル酸の転移として定義される。
【０１８２】
MBP-ST6GalNAcIに関する再折り畳み実験は、5つの異なるMBP-ST6GalNAcI DNA構築物および16個の異なる可能性のある再折り畳み条件で、1 mlの規模で行われた。再折り畳みは、Hampton Research Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)を用いて行われ、アッセイは、シアル酸のG-CSF-O-GalNAcへの付加を利用するマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法(MALDI)分析を用いて、アシアロウシ顎下腺ムチン(A-BSM)またはアシアロフェツイン(AF)へのCMP[14C]シアル酸付加の放射性検出により行われた。データは、大腸菌発現されたMBP-ST6GalNAcIが活性酵素へ再び折り畳まれうることを示している。Hampton Research's Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)に見出される再折り畳み条件8の下で、本明細書に記載されているように、MBP-ST6GalNAcI構築物S201(セリン201)の活性高次構造が得られた。これは、CMP[14C]-シアル酸ST6GalNAcIアッセイ法により確証され、後で、GalNAc-O-G-CSFアッセイ法により確認された。
【０１８３】
JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcI構築物のグリセロールストックが調製された。これらの構築物の組み立ては、本明細書の他の場所で記載されている。本来のマウスST6GalNAcIタンパク質からの異なるアミノ末端アミノ酸切り詰めから構成される；構築物1  −  pCWin2 MBP-ST6GalNAcI-D32アスパラギン酸(496アミノ酸、57115.13分子量)；構築物2  −  pCWin2 MBP-ST6GalNAcI-E52グルタミン酸(476アミノ酸、54814.77分子量)；構築物3  −  pCWin2 MBP-ST6GalNAcI-S127セリン(401アミノ酸、46562.77分子量)；構築物4  −  pCWin2 MBP-ST6GalNAcI-S186セリン(342アミノ酸、40160.65分子量)；および構築物5  −  pCWin2 MBP-ST6GalNAcI-S201セリン(327アミノ酸、38245.82分子量)を含む。
【０１８４】
構築物は、10 μg/ml 硫酸カナマイシンを含む150 ml マルトン(Martone)L-ブロスで増殖された。各培養物は、構築物#1〜#5に対応する1つの単離されたコロニーを接種された。150 ml 培養物は、250 rpmで振盪しながら、37℃で一晩、インキュベートされた。10 μg/ml 硫酸カナマイシンを含む5 ml マルトンL-ブロスのスターター培養物が、構築物S186およびS201の1つの単離されたコロニーを接種された。この手順は、合計4つのスターター培養物について行われた。スターター培養物は、250 rpmで振盪しながら、37℃で一晩、インキュベートされた。
【０１８５】
最後に、10 μg/ml 硫酸カナマイシンを含む2つの1 L マルトン(Martone)L-ブロス培養物が調製された。これらの培養物のそれぞれは、構築物S186またはS201の一晩スターター培養物の5 mlを接種された。これらの1 L 培養物は、OD620が0.6〜1.0の範囲に測定されるまで、250 rpmで振盪しながら37℃でインキュベートされた。この点に達すると同時に、IPTGが、0.5 mMの最終濃度まで2つの1 L 培養物のそれぞれへ添加された。培養物を、250 rpmで振盪しながら、37℃で一晩、インキュベートし続けるようにさせておいた。さらに、10 μg/ml カナマイシンを含む1 1/2リットルのマルトン(Martone)L-ブロスを含む2つの発酵槽容器が、以下のユニット仕様での5.0 mlのスターター培養物を接種された：温度＝37.0、pH＝7.0。
【０１８６】
JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcI構築物1〜5の培養物(150 ml)は、250 mlの遠心分離ボトルへ移された。培養物は、その後、4℃で30分間、5000 rpmで遠心分離された。上清は除去され、ペレットは重量を計られた。各試料からのペレットは、その後、封入体(IBs)を単離するために洗浄された。各構築物のペレットは、最初、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、pH=9の6.0 mlに再懸濁され、その後、20 mg/ml リソザイムの25 μlおよび1 mg/ml DNアーゼIの10 μlを添加することにより溶解された。反応チューブは、その後、37℃で1時間、インキュベートされた。
【０１８７】
各構築物についての可溶化液は、その後、4℃で15分間、10,000 rpmで遠心分離された。上清は除去され、ペレットは、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、pH=6.5の6.0 mlに再懸濁された。上清はその後、除去され、ペレットは、20 mM Tris-HCl、5 mM EDTA、pH=6.5の6.0 mlに2度目の再懸濁された。懸濁液は、その後、5000 rpm、25℃で5分間、遠心分離された。上清は除去され、3度目の洗浄が、20 mM Tris-HCl、pH=6.5、5 mM EDTAの6.0 mlにペレットを再懸濁することにより行われた。懸濁液は、その後、5000 rpm、25℃で5分間、遠心分離された。各試料からの上清は除去され、ペレットは重量を計られ、-20℃で保存された。SDS-PAGEは、可溶化液およびペレットの両方を用いて、試料の50 μlおよび2X添加液の50 μlおよび1.0 M DTTの10 μlを加え、98℃で6分間、加熱することにより、行われた。タンパク質の発現は、ゲルにおいて観察された。ペレットは、その後、重量を計られ、20 mM Tris-HCl pH=6.5、5 mM EDTAの1.0 mlで再懸濁された。1 ml アリコートが、5つの構築物のそれぞれについて作製され、分析のために用いられた。これらのアリコートは、3度洗浄された封入体(TWIsB)を表す。
【０１８８】
振盪器フラスコおよび発酵槽におけるJM109/pCWin2-MBP-ST6GalNAcI構築物S186およびS201からの培養物は、1 L 遠心分離ボトルへ移された。培養物は、その後、4℃で30分間、5000 rpmで遠心分離された。上清は除去され、ペレットは重量を計られた。各試料からのペレットは、その後、封入体(IBs)を単離するために洗浄された。S186およびS201のペレットは、最初、20 mM Tris-HCl、pH=8.0、5mM EDTAの35 mlに再懸濁され、その後、12,000 psiでのフレンチプレスの2回の通過により溶解された。
【０１８９】
各構築物についての可溶化液は、その後、50 ml 使い捨てチューブにおいて5000 rpm、25℃で5分間、遠心分離された。上清は除去され、ペレットは、20 mM Tris-HCl、pH=6.5、5 mM EDTAの35 mlに再懸濁された。懸濁液はその後、遠心分離され、試料は、20 mM Tris-HCl、pH=6.5、1%トリトンX-100の35 mlに2度目の再懸濁された。懸濁液は、再び、5000、25℃で5分間、遠心分離された。上清は除去され、3度目の洗浄が、20 mM Tris-HCl、pH=6.5、5 mM EDTAの35 mlにペレットを再懸濁することにより行われた。懸濁液は、その後、5000 rpm、25℃で5分間、遠心分離された。各試料からの上清は除去され、ペレットは重量を計られ、-20℃で保存された。
【０１９０】
可溶化緩衝液は、材料の以下の濃度で調製された：6 M グアニジンHCl、5 mM EDTA、50 mM Tris-HCl、pH=6.5および10 mM DTT。この溶液の1 mlが、20 mg TWIBsに添加され、20 mg/ml 溶液を生じた。溶液は、IBsを可溶化するためにベンチトップ上で一晩、インキュベートされた。この手順は、再折り畳み実験のためのタンパク質を供給するために各MBP-ST6GalNAcI構築物のTWIBアリコートに関して行われた。各構築物からのタンパク質試料は、IB可溶化緩衝液の950 μlをタンパク質試料の50 μlを混合することにより希釈された。試料は、その後、UV分光光度計により分析され、タンパク質濃度およびパーセントタンパク質可溶化変換は、それらの値およびモル吸光係数から計算された：構築物D32  −  1 A280ユニットあたり1.24 mg/ml、構築物E52  −  1 A280ユニットあたり1.29 mg/ml、構築物S127  −  1 A280ユニットあたり1.52 mg/ml、構築物S186  −  1 A280ユニットあたり1.77 mg/ml、構築物S201  −  1 A280ユニットあたり1.38 mg/ml。
【０１９１】
タンパク質再折り畳み試料は、Harvard Bioscience G-50 Macro Spin Columns(Holliston, MA)を用いて精製された。G-50カラムからキャップが外され、これらは、2 ml 微量遠心管へ置かれた。500 μlの水が各カラムへ添加され、それらを、その後、水和するように15分間、インキュベートさせておいた。カラムはその後、〜2000 x gで4分間、遠心分離され、その後、それらは、新しい2 ml 遠心管へ移された。各再折り畳み溶液の150 μlが、カラムの1つへ添加された。カラムはその後、2000 x gで〜2分間、遠心分離された。結果として生じた透過物は、精製された再折り畳み試料を表した。SDSゲルが、精製されたタンパク質を可視化するために用いられた。
【０１９２】
大腸菌発現されたMBP-ST6GalNAcIの活性型を結果として生じうる再折り畳み条件をスクリーニングするために、Hampton Foldit Screeningキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)が利用された。各再折り畳み緩衝液の組成物は、本明細書の他の場所で示されている。与えられた再折り畳み条件について、950 μlの再折り畳み緩衝液が、50 μlの可溶化タンパク質と混合された(高タンパク質濃度条件について)、または950 μlの再折り畳み緩衝液が、可溶化タンパク質の高タンパク質濃度の1:10希釈の50 μlと混合された(低タンパク質濃度条件について)。再折り畳み反応物は、低温室(4℃)で回転装置上に置かれ、一晩回転した。
【０１９３】
放射標識された[14C]CMP-シアル酸アッセイ法は、アシアロフェツイン(AF)またはA-BSM(アシアロウシ顎下腺ムチン)受容体への放射標識の付加をモニターすることにより、大腸菌発現された、再折り畳みMBP-ST6GalNAcIの活性を測定するために行われた。50 mgのAFが、50 mg/mlの初期濃度をもつように1.0 mlの水に溶解された。A-BSMは、BSM(ムチン、1-S型)からの加水分解を用いてシアル酸の遊離により調製された。最初のスクリーニングは、150 ml 培養物において得られた、再折り畳みタンパク質試料に関して行われた。その後の再折り畳み試料もまた、再び折り畳まれ、構築物S201およびS186についての1リットルの培養物から精製された。アッセイは、タンパク質試料、陽性対照としてバキュロウイルス由来のST6GalNAcI、受容体を除くすべての成分を含む陰性対照試料、および酵素を除くすべての成分を含む最大入力試料を含んだ。合計20個の試料が試験された。14C ST6GalNAcIアッセイ反応混合物は、50 mM MES pH 6.0、100 mM NaCl、40 nCi [14C]-CMP-シアル酸、0.2 mM 非放射性CMPシアル酸において、50 mg/ml A-BSMまたは0.25 mgでのAFを10 μl 酵素溶液と共に含んだ。
【０１９４】
各再折り畳み試料について、40 μlの反応混合物が、10 μlの再折り畳み試料と混合された。陰性対照として、10 μl H2Oが、40 μlの反応混合物と混ぜ合わされた。陽性対照は、10 μlのST6GalNAcIバキュロウイルス酵素の添加である試料と同じように処理され、上清は40 μl 反応混合物に加えられた。最大入力試料について、40 μlの反応混合物が、10 μlのdH2Oと混ぜ合わされた。反応は、37℃で60分間、インキュベートされた。反応は、5%リンタングステン酸/15%TCAの混合物の100 μlの添加により停止された。反応混合物は、10000 rpmで2分間、微量遠心分離された。上清は、ピペッティングにより除去され、沈降物は、500 μlの5%TCAで洗浄され、ボルテックスされた。混合物は、10,000 rpmで2分間、遠心分離され、上清は、ピペッティングにより除去された。ペレットは、100 μlの10 N NaOHに再懸濁された。1 mlのH2Oが各反応へ加えられた；試料は、短時間、ボルテックスされ、その後、シンチレーションバイアルへ添加された。5 mlのシンチレーションカクテルが、試料および対照のそれぞれに加えられた。試料は、短時間、振盪され、シンチレーションカウンター上に添加され、放射能が測定された。
【０１９５】
G-CSFアッセイが、大腸菌発現された、再折り畳みMBP-ST6GalNAcIが、CMP-NANの存在下で、シアル酸をGalNAc-O-G-CSF受容体へ転移させることができるかどうかを決定するために行われた。ST6GalNAcI構築物S186(再折り畳み緩衝液#8および#11)および構築物S201(再折り畳み緩衝液#8)が、トランスフェラーゼ活性についてアッセイされた。さらに、陽性対照として、バキュロウイルス由来のST6GalNAcIがアッセイされた。アッセイは、GalNAc-O-GCSF(100 μg)、CMP-NAN(0.750 mg)、MES緩衝液、pH 6.0、およびMnCl2(100 mM)を含んだ。表7は、再折り畳み条件#8により得られた酵素により触媒された場合のシアリルトランスフェラーゼ反応を示している。
【０１９６】
（表７）再折り畳み条件#8下で得られた酵素のシアリルトランスフェラーゼ活性
細菌ST6GalNAcI再折り畳み#8によるシアル酸のGalNac-G-CSFへの転移
2008501344.tif 000196
異なる時間間隔(2、24、48および120時間)において、試料のアリコートは、MALDI-飛行時間型（TOF）分析にかけられた。結果は、明らかに、シアル酸のGalNac-O-G-CSFへの転移を示している。
【０１９７】
ペレット重量および封入体重量が、培養物1〜5を表す、5つの150 ml JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcIのそれぞれについて測定された：
【０１９８】
（表８）150 ml JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcI培養物からのペレットおよび封入体重量
2008501344.tif 000197
【０１９９】
ペレット重量および封入体重量は、JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcI構築物S186およびS201培養物を含む1 L 振盪器フラスコおよび1.5 L 発酵槽における培養物について測定された。タンパク質試料は、希釈され、濃度はOD280で測定された。タンパク質濃度および可溶化タンパク質変換のパーセントは、表9に示されているように、すべての5つの切り詰め型ST6GalNAcIクローンについて計算された。
【０２００】
（表９）1 L 振盪器フラスコおよび1 1/2 L 発酵槽JM109 pCWin2 MBP-ST6GalNAcI培養物からのペレットおよび封入体重量
2008501344.tif 000198
【０２０１】
表10は、Hampton Research Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)を用いる再折り畳み条件を示す：
【０２０２】
（表１０）Hampton Research Folditキットと共に用いるタンパク質再折り畳み条件
2008501344.tif 000199
【０２０３】
（表１１）最初の再折り畳み緩衝液スクリーニングからの結果
このアッセイにおいて、すべての5つの構築物が、Hampton Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)からのすべての16個の再折り畳み条件下で試験された。これらの再折り畳みは、G-50ゲル濾過により精製され、その後、上記のように、放射性アッセイにより活性について試験された。
2008501344.tif 000200
【０２０４】
この放射性アッセイからの結果は、再折り畳み条件8および9が構築物S201について最良に働くことを示した。構築物S186について2つの条件  −  8および11、構築物S127について条件12、ならびに構築物E52について条件6が、最高CPM数を提供した。
【０２０５】
（表１２）S201構築物再折り畳み#8および#9からの結果
このアッセイにおいて、構築物S201は、Hampton Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)からのDTT有りおよび無しで、1.0 mg/mlおよび0.1 mg/mlの濃度での再折り畳み条件8および9の下で再試験された。再折り畳みタンパク質は、G-50ゲル濾過により精製され、その後、放射性アッセイにより活性について試験された。結果は、再折り畳み#8が再折り畳み#9より高いCPM数を保持することを示している。
2008501344.tif 000201
【０２０６】
（表１３）S186の再折り畳み#11およびS201の再折り畳み#8の反復の結果
これらのタンパク質は、シアル酸のG-csf-O-GalNac(AM644-pg150-156)への転移を分析するために用いられた。
2008501344.tif 000202
【０２０７】
スクリーニング過程において得られた結果から、S201について再折り畳み条件8および9ならびにS186について条件8および11が最も有望な結果を生じることが決定された。再現性を達成するために、追加の再折り畳み反応が、S201について再折り畳み8および9ならびにS186について8および11に関してG-50ゲル濾過を用いて同じ条件下で行われた。これらの実験から、再折り畳み8は、より高い計数を生じ、再現可能であることが見出されたが、条件9および11は生じなかった。
【０２０８】
顆粒球コロニー刺激因子(G-CSF)アッセイが、再折り畳み緩衝液8において構築物S186およびS201の再折り畳みタンパク質について行われた。G-CSF反応物を、32℃で5日間、インキュベートさせておいた。反応物は、1時間目、2時間目および16時間目において、ならびに1日目、2日目および5日目の時点において、分析された。GalNAc-O-G-CSFについての親ピークは、分子量〜19006にあると予想される。成功した反応は、そのピークへの〜309および509分子量の追加により示される。再折り畳みS201についての5日目のデータから、発生ピークが〜19313(GalNAc＋SA)および19515(2GalNAc＋SA)、約307および509の差、に見られた。このデータは再び、シアル酸が、再折り畳み切り詰め型マウスST6GalNAcIタンパク質によりGalNAc-O-G-CSFへ付加され、放射性アッセイにより報告されたことを確認したことを示した。
【０２０９】
これらのデータは、再び折り畳まれた、大腸菌発現されたMBP-ST6GalNAcIが活性のあるシアリルトランスフェラーゼ酵素であること、およびHampton Research's Folditキット(Hampton Research, Aliso Viejo, CA)における再折り畳み条件8の下で、MBP-ST6GalNAcI構築物S201(Δ200)の活性のある高次構造が達成可能であることの結論を支持する。機能的に再折り畳みタンパク質の作製は、[14C]放射性およびGalNAC-O-G-CSFアッセイにおいて実証された。
【０２１０】
実施例3：バキュロウイルス発現系におけるヒトおよびマウスGalNAc α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)のクローニングならびに発現
ヒトおよびマウスのGAlNAc α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の両方の発現は、Sf9(昆虫)細胞において実証された。SF9(昆虫)細胞におけるヒトGalNAc α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(hST6GalNAcI)の発現を調べるために、全長ヒトcDNAの長い型が、2つのESTクローンのpCDNA3.1(+)へのPCRクローニングにより構築された(GenBankアクセッション番号はY11339である；NCBIデータベースにおいてcDNAのより短い型がある)。hST6GalNAcIの3つの切り詰め型、K36、K125およびS258(Δ35、Δ124およびΔ257に対応する)は、このhST6GalNAcIクローンに基づいたバキュロウイルスベクターpAcgp67Bへクローニングされた。すべての3つの切り詰めは、Sf9細胞において発現されうり、K36は最高の活性を示した。pTS103と呼ばれる、pAcgp67Aでのバキュロウイルス発現ベクターにおけるマウスST6GalNAcI(Δ30に対応するK31切り詰め)もまた得られた。2つの追加の切り詰め、S127およびS186(Δ126およびΔ185に対応する)が作製され、バキュロウイルスベクターpFastBac-1-gp(Invitrogen, Carlsbad, CA)に発現された。これらの3つの切り詰めに関する発現研究は、S127が最高発現レベルをもつことを示した。
【０２１１】
cDNAの供給源、最終発現プラスミドの組み立てにおける段階の詳細な説明、分泌されたタンパク質の発現および酵素活性を含む、Sf9(昆虫)細胞におけるヒトおよびマウスのGalNAc α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の両方のクローニングならびに発現の過程が本明細書に記載されている。
【０２１２】
ヒトST6GalNAcIの2つの断片を含む2つのヒトESTクローン(クローンIDは4816713/カタログ番号97002RGおよび6300955/カタログ番号97002RG)がInvitrogenから入手された。これらのクローンは、ドライアイス上のチューブにおける細菌グリセロールストックとして得られた。細菌ストックは、クローン#4816713についてアンピシリンを含むLB寒天プレート上に、クローン#6300955についてクロラムフェニコールを含むLB寒天プレート上に、画線された。プレートは、37℃で一晩、インキュベートされた。3つの個々のコロニーが採取され、5 ml LB培地へ接種された。DNAプラスミドは、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いて単離された。酵素消化は、クローン#4816713が、EcoRIにより遊離される約2.2 Kbの挿入断片を有し、クローン#6300955が、EcoRIおよびXhoIにより遊離される約1.5 Kbの挿入断片を有することを示した(図1)。両方のクローンは、予想されたサイズの挿入断片を遊離した。
【０２１３】
配列を公開されたヒトST6GalNAcI(長い型、アクセッション番号Y11339)と比較することにより、クローン#4816713が、ヌクレオチド1375位から1480位までの断片を除く全配列を網羅することが明らかである。クローン#6300955は、ヌクレオチド1070位からC末端までの配列を網羅する。それゆえに、PCRプライマーの2セットは、全長ヒトST6GalNAcI cDNAをクローニングするために設計された。プライマーの第1セットは以下である：
2008501344.tif 000203
。プライマーの第2セットは以下である：
2008501344.tif 000204
(大文字は、pcDNA3.1へのクローニングのための制限部位BamHIおよびEcoRIを表し、下線を引いた残基は、2つの小片をいっしょに置くためのcDNAにおけるXmaI部位を示す)。
【０２１４】
hST6GalNAcIのN末端断片は、鋳型としてクローン#4816713DNA、上で考察されたプライマーの第1セット、およびPfu DNAポリメラーゼを用いて増幅された。hST6GalNAcIのC末端断片は、鋳型としてクローン#6300955、プライマーの第2セット、およびPfu DNAポリメラーゼを用いて増幅された。PCR断片は、QIAEX IIゲル精製キット(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲル精製された。両方のDNA断片は、pCR-Bluntベクター(Invitrogen, Zero Blunt PCR Cloning Kit, Carlsbad, CA)へクローニングされた。EcoRI消化は、pCR-hST6-N#1〜6およびpCR-hST6-C#1〜6の両方が正しい挿入サイズをもつことを示した。
【０２１５】
pCR-hST6GalNAcI-N#1およびpCR-hST6GalNAcI-C#1が、それぞれ、BamHIおよびXmaI、ならびにXmaIおよびEcoRIで消化された。遊離された断片は、EcoRIおよびBamHIで切断されたpcDNA3.1(+)とライゲーションされた。最終産物pcDNa3.1(+)-hST6GalNAcI-N1C1#1は、酵素消化およびDNAシーケンシング分析の両方により確認された。得られたhST6GalNAcI cDNAは、3つのヌクレオチド変化をもち、それらのうちの2つは、アミノ酸配列を変化させる(Q65KおよびM379I)。これらの違いはすべて、ESTクローンから生じた。
【０２１６】
3つの追加のプライマーが、Sf9細胞における発現のためのhST6GalNAcIの3つの切り詰めを生成するために設計された。プライマーは以下である：
2008501344.tif 000205
(大文字は、pAcgp67Bへのクローニングのための制限部位BamHIを表す)。K36クローンは、ヒトST6GalNAcIの膜貫通ドメイン直後で切り詰められており、S258クローンは、アミノ酸配列比較により、ニワトリST6GalNAcI T233と同じ相対的位置で切り詰められている。後者は、Sf9におけるニワトリST6GalNAcI発現に用いられる同じ発表された切り詰めである(Kurosawa, N., et al. (1994)J. Biol. Chem. 269, 1402-1409)。
【０２１７】
3つのPCR産物が、hST6GN1-R1と対形成される3つのプライマー、鋳型としてpcDNA3.1(+)-hST6GalNAcI-N1C1#1、およびpfu DNAポリメラーゼを用いて得られた。すべてはpCR-bluntへクローニングされた。K36#6、K125#4およびS258#6配列分析は、ベクターが正しいcDNAを含むことを確認した。pCR-bluntベクター由来の挿入断片は、gp67シグナル配列とインフレームでpAcgp67BのBamHIおよびEcoRI部位へクローニングされた。3つの切り詰め、pAcgp67B-K36#4、K125#4およびS258#2、の配列はDNA分析により確認され、全長ヒトST6GalNAcI配列と同じと同定された。
【０２１８】
pAcgp67Bにおける上の3つの切り詰め型hST6GalNAcI、K36、K125およびS258、のDNAは、BD BaculoGold Transfection Kit(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)を用いてBaculoGold DNAと同時トランスフェクションされた。バキュロウイルスを増幅するために、0.1 mlのトランスフェクション上清が、10 cm皿において2x106細胞/mlにおける10 mlのSf9細胞に感染させるために用いられた。P1上清は、感染から3日後、採集された。P2ウイルスストックは、2x106細胞/mlおよびMOI=0.2において50 ml Sf9細胞に感染させることにより得られた。バキュロウイルス上清は、高力価を得るために2回、増幅された。ウイルス力価は、BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)により測定された。50 ml規模生産は、MOI=2、2x106細胞/mlに設定された。培養上清は、2〜4日目に得られた。ST6GalNAcIアッセイは、50 ml規模において、K36およびK125の両方が0.25〜0.35 U/リットルで、およびS258が0.1〜0.2 U/リットルで発現したことを示した。12個のプラーク精製されたK36クローンがさらに試験され、増幅された。クローン#10は、最高活性(1 U/リットル)を示した。クローン#10の1リットル規模生産は、3 U/リットルでの発現レベルをもった。
【０２１９】
pTS103 DNA(10 μg)は、TOP10細胞へ形質転換され、DNAは、その後、QIAprep Spin Miniprep Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いて単一コロニーから調製された。pTS103は、DNAシーケンシング分析により分析され、データは、このクローンが公開された配列と数個のヌクレオチドの違いをもつことを実証した。pTS103は、K31切り詰め、およびBamHIとBglII制限部位の間のC末端の終わりにmycタグを有するマウスST6GalNAcI(mST6GalNAcI)を含むpAcgp67Aである。
【０２２０】
プライマーは、切り詰め型mST6GalNAcI:S127およびS186を作製するために設計された。プライマーは以下である：
2008501344.tif 000206
(大文字はEcoRIおよびXhoIについての制限部位を表す)。用いられるクローニングベクターはInvitrogen(Carlsbad, CA)からのpFastBac-1-gpであり、gp67シグナル配列が、BamHIとEcoRI部位の間に挿入された。
【０２２１】
2つのPCR産物が、3つの上で言及されたプライマーを用いて得られた。pfu DNAポリメラーゼおよびpTS103は、鋳型として用いられ、pCR-bluntへクローニングされた。配列分析は、pCR-S127#2およびS186#2が正しいcDNAを含むことを確認した。pCR-bluntベクター由来の挿入断片は、gp67シグナル配列とインフレームでpFastBac-1-gpのEcoRIおよびXhoI部位へクローニングされた。pFastBac-1-gp-S127#3およびS186#2は、EcoRIおよびXhoI二重消化ならびにDNA配列分析により確認された。
【０２２２】
pFastBac-1-gp-S127#3およびS186#2 DNAは、Bac-to-Bac Baculovirus Expression System(Invitrogen, Carlsbad, CA)からのDH10Bacコンピテント細胞へ形質転換された。各形質転換からの12個の白色コロニーが、プレート上を再び画線され、12個のうち8個が実際に色が白であった。「バクミド(bacmid)」DNAは、マニュアル(Qiagen, Valencia, CA)からのプロトコールに従って、QIAprep Spin Miniprep KitでP1、P2およびN3を用いて単離された。PCRスクリーニングは、プライマーとしてM13FおよびmST6-XhoI-3'およびTaq DNAポリメラーゼ(Qiagen, Valencia, CA)を用いてバクミドDNAにおいてmST6GalNAcIの挿入断片を検出するために行われた。各構築物からのすべての8つのクローンは、正しい挿入断片を有し、それらはpTS103配列と同じであった。
【０２２３】
S127、クローン#5および#6、S186、クローン#3および#4、の追加のバクミドDNAが、S.N.A.P. MidiPrep Kit(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて細菌から単離された。バクミドDNAは、Cellfectin(Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いてSf9細胞へトランスフェクションされた。バキュロウイルス上清は、高力価を得るために1回、増幅された。ウイルス力価は、BacPAK Baculovirus Rapid Titer Kit(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)により測定された。50 ml規模生産は、MOI=2、2x106細胞/mlに設定された。培養上清は、2〜4日目に得られた。ST6GalNAcIアッセイは、両方のS127ウイルスストックが、いずれのS186ウイルスストックより、50 ml規模において0.15〜0.25 u/リットルでのより高い活性を生じたことを示した。12個のプラーク精製されたS127クローンがさらに試験され、増幅された。すべてのクローンは同じ活性を示したが、クローン#4は、わずかにより高い活性(0.46 u/リットル)をもった。クローン#4の1リットル規模生産は、1.7 u/リットルの発現レベルを示した。
【０２２４】
上の研究は、ヒトおよびマウスのGalNAc α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の両方がSf9(昆虫)細胞において発現されうること、ならびに酵素が、約2〜3 u/リットルの発現レベルで培地へ分泌されたことを実証した。
【０２２５】
実施例4：組換えバキュロウイルスを用いる、Sf9細胞におけるニワトリN-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の発現
ニワトリN-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)は、バキュロウイルス発現ベクター系を用いてツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞において発現された。N-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)は、シアル酸をCMP-シアル酸からα2,6結合により、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基のC-6ヒドロキシル基上へ転移させる。
【０２２６】
この酵素は、組換えバキュロウイルスをSf9細胞の培養物に感染させることにより産生された。ニワトリST6GalNAcIの代替の非プラーク精製バキュロウイルスストックもまた、発表された文献における代替クローンの使用に基づいて、用いられた。この代替クローンは、以前には、アミノ酸T233で切り詰められていると考えられていたが、N末端配列分析は、T233の前の余分なアミノ酸がクローニング中に導入され、それゆえに、代替クローンにより産生されたポリペプチドが、全長ST6GalNAcI配列由来のアミノ酸K(リジン)232を含むことを示した。それゆえに、代替クローンは、実際には、K232で切り詰められている。この系統は、プラーク精製され、増幅され、その後、本明細書での実験に用いられた。
【０２２７】
酵素の配列分析のためにニワトリST6GalNAcIのプラーク精製されたウイルスストックからバキュロウイルスDNAを得るために行われる実験、およびこれらのウイルスDNA系統から酵素を産生するために用いられる条件が、本明細書に記載されている。この研究において、産生された酵素は、以下の条件を用いて1リットル規模で産生される場合、11.8ユニット/Lの平均発現レベルをもった：MOI=5〜10、130 rpm、27℃、3.5e9細胞〜7e9細胞の総細胞数、および72時間のインキュベーション。
【０２２８】
バキュロウイルスDNAは、以下のプロトコールに従って単離された。濃縮されたウイルスストックへ、6 μl 0.5 M EDTAおよび4.5 μl 1 M Tris-HCl、pH 8.0が加えられた。その後、0.3 ml 溶解緩衝液(0.2 M NaOH、1% SDS)が加えられ、混合物は、室温で5分間、インキュベートされた。溶解後、0.3 mlの中和緩衝液(3 M NaOAc、pH 5.2)が加えられ、混合物は、4℃で10分間、インキュベートされた。混合物は、微量遠心管において、4℃で、14,000 rpmで10分間の遠心分離により透明にされた。その結果生じた0.84 mlの上清におけるバキュロウイルスDNAは、0.8 ml イソプロパノールを用いて沈澱させられ、氷上で10分間、インキュベートされた。沈澱したウイルスDNAは、室温において、14,000 rpmで10分間の遠心分離により収集された。結果として生じたDNAペレットは、0.5 ml 70% エタノールで洗浄され、空気乾燥された。DNAペレットは、その後、20 μl 1xTE緩衝液(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0)に溶解された。DNA濃度は、OD260を用いて測定された。OD260=0.012、およびそれゆえに、DNA濃度=600 μg/ml。
【０２２９】
ニワトリST6GalNAcIの単離は、PCRを用いて行われた。用いられたプライマーは、
2008501344.tif 000207
を含んだ。50 μl PCR反応は、以下の成分で設定された：5 μl 10xPCR緩衝液、2 μl 10 mM dNTP、1 μl 5'プライマー(10 pmol/μl)、1 μl 3'プライマー(10 pmol/μl)、2 μl DMSO、1 μl DNA鋳型、0.5 μl Herculase酵素(Stratagene, Carlsbad, CA)、および37.5 μl PCRグレードH2O。PCRプログラム条件は、95℃、3分間；95℃、45秒間；5サイクルとして、42℃、1分間、72℃、1分間；95℃、45秒間；35サイクルとして、57℃、1分間、72℃、1分間；72℃、10分間；4℃休止のサイクルを含んだ。
【０２３０】
PCR産物は、MinElute Gel Extraction Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いて単離された。DNAは、20 μl 1xTE(10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、pH 8.0)に溶出された。pCRBluntライゲーションおよび形質転換は、4 μlのPCR反応産物、1 μl 食塩水、および1 μl TOPO pCR4 Bluntベクター(ZeroBlunt TOPO, Invitrogen, Carlsbad, CA)を用いて行われた。ライゲーション混合物の6 μlの容量が、その後、50 μlのTop10細胞へ加えられた。以下のライゲーションインキュベーションが行われた：まず、氷上で30分間、37℃で1分間、その後、氷上で2分間。反応は、0.5 ml SOC培地を加え、その後、混合物を37℃で1時間、インキュベートすることにより行われた。インキュベーション後、200 μlの混合物がカナマイシン含有プレート上に蒔かれた。約100個のコロニーが生成された。
【０２３１】
PCR産物の直接的クローニングもまた、以下の条件下で行われた。反応混合物は、16 μl PCR産物、1 μl BamHI、1 μl XhoI、4 μl BamHI緩衝液、20 μl H2Oを含んだ。反応混合物は、37℃で2時間、インキュベートされた。もう一つの反応混合物は、1 μl pCWIN2-MBPベクター(0.35 mg/ml)、0.5 μl BamHI、0.5 μl XhoI、2 μl BamHI緩衝液、および16 μl H2Oを含んだ。反応混合物は、37℃で2時間、インキュベートされた。直接的クローニング産物のゲル電気泳動、ゲル抽出、ライゲーションおよび形質転換後、10個のコロニーが選択され、プラスミドDNAミニプレップ(miniprep)のために増殖された。これらの10個のミニプレップのうち、6個が、pCWIN2-MBPベクター内に正しい挿入断片を含んでいた。
【０２３２】
アミノ酸232位で切り詰め型ニワトリST6GalNAcIは、発現され、Sf9細胞において、1リットル規模で、組換えバキュロウイルスを用いて、1リットル規模、MOI=5〜10、130 rpm、27℃、3.5e9細胞〜7e9細胞の総細胞数、および72時間のインキュベーション時間を含む条件を用いて、生産された。これらの生産実行における酵素の平均発現レベルは、11.8ユニット/Lである。
【０２３３】
細胞は血球計方法を用いて数えられ、トリパンブルーの作業溶液が調製された。トリパンブルーは、最初は、0.4%溶液であり、0.04%の作業濃度までPBSで希釈される(1:10希釈)。細胞懸濁液の試料は、計数されるために無菌で回収され、希釈溶液(1:2、1:4、1:5、1:10および1:20)が、必要に応じてトリパンブルー作業溶液において、調製された。細胞は、トリパンブルーで染色された後3分以内に数えられた。染色された細胞懸濁液の約10 μlが回収され、ピペットのチップが、カバースリップと共に清潔な血球計のスロット上へ置かれた。細胞懸濁液は、毛管現象によりカバースリップの下を通過した。血球計は、倒立顕微鏡の載物台上へ置かれ、読み取られた。生細胞数は、以下の式を用いることにより決定された：生細胞(細胞/ml)＝(数えられた生細胞の数)/(数えられた正方形の数)x104x希釈係数。すなわち、最初の懸濁液における生細胞総数は、生細胞/mlに最初の懸濁液における総mlを掛けることにより見出された。
【０２３４】
プラーク精製アッセイが、その後、用いられた。方法は、上記のように、Sf9細胞を数える段階および生存度を測定する段階を含んだ。細胞は、少なくとも90%生存可能で、かつ対数増殖期でなければならない。細胞は、20 mlと30 mlの間の最終容量をもって、5e5細胞/mlの密度まで新鮮な培地で希釈された。細胞懸濁液の2.0 mlの容量が、2つの6ウェルプレートにおける各ウェルへ加えられ、細胞は、細胞を平らに分配されるように揺り動かされた。各ウェルは、約1e6細胞を含んだ。プレートは、湿気を供給するために約50〜100 mlの水で湿らされた2枚のペーパータオルを含む密封された容器内に置かれた。プレートは、その後、湿ったタオルとの直接的接触を防ぐためにタオルの上のラック上に置かれ、細胞がウェルの底へ接着するまで、27℃で1〜4時間、容器内でインキュベートされた。ウイルスストックの1:10の段階希釈が、1.0e-1から1.0e-9まで、作製された。容量0.5 ml ウイルスストックが、その系統の希釈のために4.5 ml SFM Sf-900 II培地へ置かれた。
【０２３５】
細胞が、約70〜80%密集度の平らな単層を形成した場合、培地は、滅菌ピペットを用いて細胞から吸引された。陰性対照は、1 mlの新鮮な培地を2つのウェルのそれぞれへ穏やかに加えることにより調製された。1.0e-2から1.0e-9まで、各希釈について2つのウェルが、各ウェルへ1 mlのウイルス希釈溶液を穏やかに加えることにより、感染させられた。プレートは、ウイルスが細胞に感染するのを可能にするように、水平面上において、室温で1時間、インキュベートされた。プラーク形成培地が、その後、10 mlの4%アガロース中の30 mlのSf-900 II 1.3Xを含み、滅菌100 mlボトルにおいて調製された。ボトルは、使用(1時間のウイルスインキュベーション後)直前まで37℃水浴においてインキュベートされた。1時間のインキュベーション後、ウイルス種菌は、滅菌ピペットを用いて、プレートを傾け、縁から吸引することにより、細胞から吸引された。2.0 mlのプラーク形成培地が各ウェルへ加えられた。アガロースを室温で10〜15分間、凝固するようにさせておき、その後、調製物は、プラークが現れるまで、5〜7日間、湿ったペーパータオルと共に密封された容器内で27℃でインキュベートされた。
【０２３６】
プラーク精製は、遠く離れて間隔をあけているプラークをもつプレートを選び取ることにより行われた。滅菌パスツールピペットおよびバルブを用いて、透明なプラークが採取され、アガロースプラグ(ウイルスを含む)を媒介として、500 μl SFM Sf-900 II培地を含む滅菌1.5 ml 微量遠心管へ移された。アガロースプラグは、4℃で一晩、培地でインキュベートされた。ウイルスは、継代1(P=1)増幅へ増幅された。
【０２３７】
6ウェルのプレートに、3 mlにおいて7e5細胞/ml(〜2.0e6細胞総数/ウェル)で対数期Sf9細胞を播種し、室温で5〜15分間、定着するようにさせておいた。プレートに、100 μl プラーク「ピックアップ」を感染させ、穏やかに振盪させた。感染のない1つのウェルは陰性対照として用いられた。プレートは、感染の徴候(粒状に見え、しなびた、死にかけている細胞)の観察まで、27℃で3〜4日間、インキュベートされた。上清は採取され、タンパク質についてアッセイされた。さらなる増幅のための最高活性を含むウェルがP=1ウイルスストックであった。
【０２３８】
アシアロウシ顎下腺ムチン(アシアロBSM)またはアシアロヒツジ顎下腺ムチン(アシアロOSM)基質が、ST6GalNAcI酵素アッセイのために調製された。シアル酸は、500 μl BSMまたはOSM(20 mg/ml)、500 μl dH2O、および130 μl 2 M 氷酢酸を含む反応物において海水分解により遊離された。成分は混合され、80℃で5時間〜18時間、インキュベートされた。反応混合物は、5 ml PBSで希釈された。試料は、Amicon Ultra-15カラム上へ添加され、3,000xg、4℃で20分間、遠心分離された(Millipore, Bedford, MA)。5 mlのPBSが加えられ、カラムは再び、遠心分離された。過程は、3回、または混合物が約pH 7.0であるまで、繰り返された。未処理のBSMまたはOSMは、線形回帰によりAOSMまたはABSMの濃度を推定しうる標準曲線を調製するために用いられた。
【０２３９】
放射性アッセイ法は、ST6GalNAcIをアッセイするために用いられた。反応混合物は、合計40 μl 反応容量において、100,000 CPMの濃度でのCMP14Cシアル酸(窒素により乾燥させられた)、0.2 mM(反応において合計10 nモル)での非放射性CMPシアル酸、A-BSM(受容体基質、0.25 mg)、50 mMでのMES pH 6.0、および100 mMでのNaClを10 μlの酵素試料と共に含んだ。酵素を含まないおよび/または受容体を含まない陰性対照が含まれた。反応混合物は、37℃で1時間、インキュベートされ、その時点において、100 μl(反応あたり)の5%リンタングステン酸/15%TCAが加えられ、十分、混合された。試料は、微量遠心管において最大速度で2分間の遠心分離により調製され、上清は捨てられた。TCA(5%)が反応あたり500 μlで加えられ、試料はボルテックスされた。試料は、再び、微量遠心管において最大速度で2分間、遠心分離され、上清は、ピペッティングにより捨てられた。ペレットは、100 μl 10 N NaOHに再懸濁され、1 ml 水が加えられ、5 ml シンチレーション液が、その結果生じた混合物に加えられ、混合物は、1分間、カウントされた。
【０２４０】
（表１４）ユニット/リットルにおけるST6GalNAcI活性の計算
2008501344.tif 000208
【０２４１】
継代2ウイルス増幅は、30 ml〜50 mlのSFM Sf-900 II培地を含む、250 ml使い捨てエールレンマイアー(ehrlenmeyer)フラスコにおいて2.0e6細胞/mlの濃度までSf9細胞の懸濁液を増殖させることにより行われた。力価測定されたウイルスストックは、0.2のMOIで加えられ、新鮮なSFM Sf900 II培地が50 ml〜100 mlの総容量まで加えられた。培養物は、27℃、130 rpmで48時間、振盪インキュベーターにおいてインキュベートされた。細胞は、滅菌250 ml円錐遠心管を用いる遠心分離により収集された。ウイルスストックは、終点希釈アッセイ法により力価測定された。
【０２４２】
大規模ウイルスストックはSf9細胞において調製された。Sf9細胞の懸濁液は、500 mlのSFM Sf-900 II培地を含む2 L バッフルなしのフェルンバッハ(fernbach)フラスコにおいて7.0e6細胞/ml〜1.4e7細胞/ml(合計3.5e9〜7e9細胞)の濃度まで増殖させられた。力価測定されたウイルスストックは、0.2のMOIで加えられ、新鮮なSFM Sf900 II培地が1リットルの総容量まで加えられた。培養物は、27℃、130 rpmで48時間、振盪インキュベーターにおいてインキュベートされ、細胞は、滅菌1 L円錐遠心ボトルを用いる遠心分離により収集された。ウイルスストックは、終点希釈アッセイ法により力価測定され、4℃で保存された。
【０２４３】
ウイルスストックはまた、以下のように終点希釈アッセイ法を用いて力価測定された。細胞は数えられ、生存度は上記のように測定された。細胞は、少なくとも90%生存可能、かつ対数増殖期にあった。細胞は、新鮮な培地で、10 mlにおいて2.5e5細胞/mlの密度まで希釈され、細胞は、その後、72ウェルのマイクロタイタープレートにおいて10 μl/ウェルで蒔かれた。培地は、各行の最後の2個のウェルにおいてのみ蒔かれた。1.0e-1から1.0e-9までのウイルスストックの段階(1:10)希釈。ウイルスストック(100 μl)は、希釈のために900 μl SFM Sf-900培地へ置かれ(1.0 mlの総容量希釈溶液)、10 μlの1.0e-1希釈された系統が最初のプレートの10個のウェルのそれぞれへ置かれた。プレートは、湿り気のある容器内で27℃で7日間、インキュベートされた。プレートは、10X対物レンズをもつ顕微鏡を用いて観察された。ウェルは、「感染した」または「感染していない」として評価された。Reed-Muench式(Reed, L.J. and Muench, H. (1938) Amer. Jour. Hygiene, 27, 493-497)が、ウイルス力価を決定するために用いられるウイルスの50%感染用量(TCID50)を決定するために用いられた。図25は、上記のように用いられる力価測定ワークシートを示す。
【０２４４】
Sf9細胞における大規模タンパク質ST6GalNAcI生産は、500 mlのSFM Sf900II培地を含む2 Lバッフルなしのフェルンバッハフラスコにおいて7.0e6細胞/ml〜1.4e7細胞/ml(合計3.5e9〜7e9細胞)の濃度までSf9細胞の懸濁液を増殖させることを含む。力価測定されたウイルスストックは、5〜10のMOIで培養物に加えられた。新鮮なSFM Sf900II培地が、その後、1リットルの総容量まで加えられ、培養物は、27℃、130 rpmで72時間、振盪インキュベーターにおいてインキュベートされた。細胞は、滅菌1 L遠心ボトルを用いる遠心分離により収集された。その結果生じた上清は、0.2 μm フィルターユニットを通して濾過され、最終産物は4℃で保存された。
【０２４５】
（表１５）プラーク精製されたP=1ウイルスストックをスクリーニングするST6GalNAcI活性
2008501344.tif 000209
【０２４６】
プラーク精製されたP=1ウイルスストックをスクリーニングする目的は、酵素活性を含む単一のクローン単離物を同定することである。クローン4(0.354 U/L)、クローン6(0.318 U/L)、およびクローン10(0.330 U/L)は最高活性をもち、さらなる増幅のための良い候補である。クローン4は、それがその3つの中の最も高い活性をもつため、選択された。
【０２４７】
（表１６）ニワトリST6GalNAcIの大規模生産
2008501344.tif 000210
【０２４８】
ニワトリST6GalNAcIの配列は以下のように確認された。N末端シーケンシングは、精製されたニワトリST6GalNAcIの20 ugを用いて行われ、結果として、配列：
2008501344.tif 000211
を生じ、本明細書に記載された実験に用いられたニワトリST6GalNAcIが、発表されたアミノ酸K232で切り詰め型X74946ニワトリST6GalNAcIと同じアミノ酸配列(下線を引いた)を有することを検証した。ニワトリST6GalNAcIのDNAシーケンシングは、50 mlのニワトリST6GalNAcIバキュロウイルスストックを用いて行われた。ウイルスDNAはこの系統から抽出され、PCR増幅され、ベクターpCWIN2-MBPへ挿入され、シーケンシングされた。DNAは、K232切り詰めではなく、T233切り詰めの点からシーケンシングされた。その結果生じたDNAは、Sac2/Kpn2制限部位を有し、49.36%GC含有量をもつ1029塩基を有した(図26)。図27に示された、得られた配列の翻訳により、発表されたニワトリST6GalNAcI GenBank X74946と比較した場合、1残基の違いが明らかにされた、すなわちV251A(GTA対GCA、バリン対アラニン)。実験のDNA配列は、pCWIN2-MBP-chST6GalNAcにおいて1つの他の突然変異、沈黙突然変異T233(ACT対ACG、同じアミノ酸、トレオニン)を有し、それは、クローニング中にPCRプライマーにより導入された。
【０２４９】
K232は、ウイルスDNAがPCR増幅された場合、含まれなかった。DNA配列の残りの部分は、発表された配列と同じであることが検証された。
【０２５０】
要約すれば、ニワトリST6GalNAcIウイルスストックは、プラーク精製され、増幅され、酵素がその系統から産生された。8つの生産実行が1リットル規模でなされた。96時間感染させられた実行のうちの2つは、有るか無しかの活性をもった。この報告の期間に行われた生産実行について見られた最良の条件は、MOI=5〜10、130 rpm、27℃、3.5e9細胞〜7e9細胞の総細胞数、72時間のインキュベーションである。これらの条件下で、産生されたST6GalNAcIの平均活性は、11.8ユニット/リットルであった。ニワトリST6GalNAcI配列もまた検証された。N末端シーケンシングは、精製されたニワトリST6GalNAcIタンパク質に関して行われ、配列分析は、それがK232で切り詰められ、N末端部分において発表された配列と同じアミノ酸を有することを確認した。DNAシーケンシングもまた、配列の検証のために行われた。組換えウイルスDNAは、ニワトリST6GalNAcIバキュロウイルスストックから抽出され、PCR増幅された。DNAは、K232ではなく、T233切り詰めからPCR増幅された。DNAはベクターpCWIN2-MBPへ挿入され、シーケンシングされた。結果より、発表された配列GenBank X74946と比較した場合、シーケンシングされたニワトリST6GalNAcIにおける1塩基の違い(GTA対GCA)が明らかにされた。この違いは、結果として、ポリペプチドにおいてV251A(バリン対アラニン)の1アミノ酸の違いを生じる。DNA配列によりまた、PCRプライマーにより導入された1つの他の沈黙突然変異T233(ACT対ACG)が明らかにされた。DNA配列の残りの部分は、発表された配列と同じであることが確認された。
【０２５１】
実施例5：組換えバキュロウイルスを用いるSf9細胞におけるニワトリN-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)のN末端欠失のシアリルトランスフェラーゼ活性
この実施例は、pAcGP67バキュロウイルス発現ベクター系を用いる、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞におけるニワトリN-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)の4つのN末端欠失の発現を記載する。N-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)は、シアル酸をCMP-シアル酸から、α2,6-結合により、糖タンパク質のトレオニンまたはセリンへO結合したN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基上へ転移させる。
2008501344.tif 000212
【０２５２】
ニワトリST6GalNAcIのN末端欠失を発現させるウイルスストックが得られた。このウイルスストックは、pVL1392バキュロウイルス発現系を用いて作製された(Blixt et al., 2002, J. Am. Chem. Soc., 124:5739-5746)。このウイルスストックを用いる複数の10x 1 L 酵素生産実行の酵素活性は平均して12 U/Lであった。
【０２５３】
ニワトリST6GalNAcIの4つのN末端欠失  −  Δ48、全長ニワトリST6GalNAcIのアミノ酸49位から始まる切り詰め突然変異体；Δ152、全長ニワトリST6GalNAcIの残基153位から始まる切り詰め突然変異体；Δ225、全長ニワトリST6GalNAcIの残基226位から始まる切り詰め突然変異体；およびΔ232、全長ニワトリST6GalNAcIの残基233位から始まる切り詰め突然変異体  −  がPCRを用いて作製された。結果として生じた4つのPCR断片は、それぞれ、アミノ酸Q49、V153、L226およびT233で始まるST6GalNAcIコード配列を含んだ。ニワトリST6GalNAcIのN末端欠失の部位は、ヒト、マウスおよびニワトリST6GalNAcIコード配列間の配列類似性に基づいて選択された(図28)。
【０２５４】
Δ48N末端欠失突然変異体は、予想された膜貫通ドメイン直後に開始するコード配列を作製するように設計された。ニワトリST6GalNAcIの膜貫通領域は、以前には、アミノ酸17位〜37位の間であると予想されていたが(Kurosawa et al., 1994, J. Biol. Chem., 269:1402-1409)、ヒドロパシープロット分析は、アミノ酸26位と48位の間の膜貫通領域を示唆した。Δ152N末端欠失突然変異体は、ヒトおよびマウス酵素との配列類似性の予想された領域を含むニワトリST6GalNAcI酵素のステム領域の部分を含む切り詰め突然変異体を作製するように選択された(図31)。第3のN末端欠失突然変異体、Δ232は、Blixt et al.(2002, J. Am. Chem. Soc., 124:5739-5746)により発表されたようなST6GalNAcIコード配列に似ているように作製された。
【０２５５】
最初の活性アッセイは、Δ232ウイルスストックが不活性であることを示した(下記参照)。最初のウイルスストックに含まれたST6GalNAcI配列は、それゆえに分析された。野生型酵素に存在するものと同一の追加のN末端アミノ酸が、ベクターの多重クローニング部位からのこの切り詰め突然変異体配列へうっかりと供与され、Δ232のN末端直接にアミノ酸DPKの挿入を含むことが決定された。ST6GalNAcIファミリーにおいて、すべての3つの配列におけるΔ232のすぐ上流のアミノ酸は、(NED)FKである(添付書類2参照)。それゆえに、第4のN末端欠失、Δ225は、Blixt et al.(2002, J. Am. Chem. Soc., 124:5739-5746)により記載されたクローンを代表するように作製された。
【０２５６】
ニワトリST6GalNAcIウイルスストックは、イヌのインスリン分泌シグナルペプチドを含むベクター、pVL1392、を用いて作製された。この研究のために調製された他の欠失は、糖タンパク質67(gp67)分泌シグナルペプチドを含むpAcGP67Bベクター(Pharmingen, San Diego, CA)へクローニングされた。gp67シグナルペプチドは、イヌのインスリン分泌ペプチドより強い分泌シグナルとして用いられた。PCR反応は、表17に示されているように、設定された。
【０２５７】
（表１７）切り詰め突然変異体の作製のためのPCR反応
2008501344.tif 000213
PCRプログラムは、以下のサイクル下で行われた：a)95℃、3分間；b)5サイクルとして、95℃、45秒間；42℃、1分間、72℃、1.5分間；c)30サイクルとして、95℃、45秒間；57℃、1分間、72℃、1.5分間；d)72℃、10分間；e)4℃休止。
【０２５８】
Δ232突然変異体を作製するために用いられたPCRプライマー対は、
2008501344.tif 000214
であった。単離かつ濃縮されたバキュロウイルスDNA鋳型がPCRに用いられた。1マイクロリットルの鋳型(600 ng/μl)がPCRに用いられた。1002 bp PCR産物が産生された。
【０２５９】
Δ48を作製するために用いられたPCRプライマー対は、
2008501344.tif 000215
であった。Δ152突然変異体を作製するために用いられたPCRプライマー対は、
2008501344.tif 000216
であった。両方のPCR断片についてのDNA鋳型は、プラスミドDNA pBluescript-chST6GalNAcIであった。chST6GalNAcI-Δ48について、1554 bp PCR産物が産生された。chST6GalNAcI-Δ152について、1242 bp PCR産物が産生された。
【０２６０】
Δ225突然変異体を作製するために用いられたPCRプライマー対は、
2008501344.tif 000217
であった。DNA鋳型は、プラスミドDNA pBluescript-chST6GalNAcIであった。最初の5サイクルについてのアニーリング温度は、40℃であり、最後の30サイクルについては53℃であった。chST6GalNAcI-Δ225について、1023 bp PCR産物が産生された。
【０２６１】
PCRバンドは、電気泳動され、ゲル抽出により単離された。DNAは、20 μl 1xTE(10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH 7.5)に溶出された。単離されたPCR産物をベクターへライゲーションするために、ライゲーション反応は、各単離されたDNAに関して行われた。chST6GalNAc 1-Δ232PCR産物について、ライゲーション反応は、4 μl PCR産物、1 μl 食塩水、および1 μl TOPO pCR4(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含んだ。反応は、室温で15分間、インキュベートされた。すべての他のPCR産物について、ライゲーション反応は、4〜7 μl PCR産物、1 μl pCR4 Bluntベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)、1 μl T4 DNAリガーゼ緩衝液、1 μl T4 DNAリガーゼを含み、残りの容量はH2Oを含む10 μlまでであった。ライゲーション反応は16℃で1時間、インキュベートされた。
【０２６２】
その後、各ライゲーション混合物の6 μlが、50 μlのTop10細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)を含むチューブを区別するように加えられた。それぞれのインキュベーションは、氷上で30分間、37℃で1分間、氷上で2分間、0.5 ml SOCを加えて、その後、37℃で1時間、行われた。インキュベーション後、各インキュベーション混合物の200 μlが、カナマイシン含有プレート上に塗布された。約100個のコロニーが各形質転換反応について生成された。
【０２６３】
単一のコロニーが選択され、50 μg/ml カナマイシンを含む3 ml 培地において37℃で一晩、増殖された。挿入断片は、PCRプライマーへ設計された制限部位に対応する対での制限酵素を用いることにより正しいと検証された。
【０２６４】
pAcGP67BベクターおよびpCRBluntベクターにおける各挿入断片は、制限部位に適切な、対での制限酵素で消化された。消化されたDNAは、0.8%アガロースゲル上で分離された。対応するバンドは、外科手術用ナイフで切除され、DNAがMiniElute Kit(Qiagen, Valencia, CA)を用いてゲルから抽出された。挿入断片およびベクターが、T4 DNAリガーゼを用いていっしょにライゲーションされた(1:1から6:1までの範囲の比で)。ライゲーション混合物は、Top10細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)へ形質転換され、カルベニシリン含有プレート上に塗布された。37℃での一晩のインキュベーション後、数個のコロニーが採取され、各プラスミドについての正しい挿入断片およびベクターに関してスクリーニングされた。サブクローニング手順は、pAcGP67B-Δ232 BamHI/EcoRI、pAcGP67B-Δ152およびpAcGP67B-Δ48 BamHI/EcoRIおよびpAcGP67B-Δ225 BamHI/EcoRIを含んだ。
【０２６５】
25 cm2 ファルコン(Falcon)フラスコ(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)において、1x106 Sf9細胞が播種された(50〜70%集密)。直線化されたBaculoGold DNA(BD Bioscience, Franklin Lakes, NJ)(0.5 μg)は、微量遠心管において2 μg 組換えプラスミドDNAおよび100 μlのSF900 II SFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)と混合された。もう一つのチューブにおいて、6 μlのセルフェクチン(cellfectin)が、100 μl SF900 II SFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)と混合された。2つの混合物は、混ぜ合わせられ、室温で15〜45分間、インキュベートされた。フラスコにおける培地は、除去され、Sf9細胞は、DNA混合物で覆われた。SF900 II SFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)の追加の0.8 mlがフラスコへ加えられ、27℃で5時間、インキュベートされた。インキュベーション後、DNA混合物およびセルフェクチンは除去され、3 mlの新鮮なSF900 II SFM(Invitrogen, Carlsbad, CA)がフラスコへ加えられた。フラスコにおけるSf9細胞は、27℃で5日間、振盪なしでインキュベートされた。可視の感染は、72時間後に観察された。
【０２６６】
5日間のインキュベーション後、培養上清は、1,000 x gで10分間の遠心分離により透明化された。この上清は、継代1(P1)ウイルス増幅系統と名付けられた。1 mlのP1ウイルスストックは、Sf9細胞の50 ml 懸濁培養物(2x106細胞/ml)とインキュベートされた。インキュベーションは、100 rpmで5日間、撹拌しながら、27℃で行われた。培養物は、4℃でのCorning滅菌円錐遠心管(Corning, Corning, NY)における5000 rpm(7,000 x g)で30分間の遠心分離により収集され、その結果生じた上清は、継代2(P2)ウイルス増幅系統と名付けられた。
【０２６７】
12 mlのP2ウイルスストックは、Sf9細胞の150 ml 懸濁培養物(2x106細胞/ml)とインキュベートされた。インキュベーションは、27℃で撹拌しながら、100 rpmで5日間、行われた。P2ウイルスストックについて記載されているように単離された上清は、継代3(P3)ウイルス増幅系統と名付けられた。P1およびP2は、-80℃で保存された。P3は、暗闇中4℃で保存された。組換えバキュロウイルスの力価は、プラークアッセイ法により測定された。
【０２６８】
組換えタンパク質は、2x106細胞/ml Sf9細胞の200 mlにP3ウイルスストックの25 mlを感染させることにより産生された。培養物は、27℃で撹拌しながら、100 rpmで72時間、インキュベートされた。上清は、P2およびP3ウイルスストックについて記載されているように単離された。
【０２６９】
その結果生じた上清は、アシアロウシ顎下腺ムチンのシアル酸付加を触媒する、およびシアル酸-ポリエチレングリコール結合体のG-CSFへの転移(G-CSFの「シアリルPEG化」)を触媒する能力についてアッセイされた。より一般的には、グリカン-ポリエチレングリコール結合体、すなわち「グリコPEG」結合体、のもう一つの分子への設計および転移は、全体として参照により本明細書に組み入れられている、国際(PCT)特許出願第WO 03/031464(PCT/US02/32263)号において詳細に示されている。
【０２７０】
放射性アッセイ法は、本明細書の他の場所に記載されているように、14C-シアル酸の14C-CMP-シアル酸からアシアロ-ウシ顎下腺ムチへの転移を測定するために用いられた。
【０２７１】
（表１８）シアリルPEG化アッセイ
2008501344.tif 000218
【０２７２】
シアリルPEG化反応混合物は、33℃で穏やかに振盪させながら、18〜72時間、インキュベートされた(下記のように)。インキュベーション後、2.5 μlの5x SDS試料緩衝液が各反応混合物へ加えられ、全反応混合物は、4〜20%SDS-PAGE勾配ゲルにおける電気泳動にかけられた。PEG化G-CSFは、ゲルのヨード染色により検出された。
【０２７３】
DNAミニプレップ分析を用いて、pCRBlunt構築物が挿入断片について調べられた。分析は、pCRBlunt-chST6GalNAcI-Δ232 BamHI/XhoIコロニー#2〜#6が正しい挿入断片を含むと同定され、pCRBlunt-chST6GalNAcI-Δ152 BamHI/EcoRIコロニー#1、#3〜#6が正しい挿入断片を含むと同定され、pCRBlunt-chST6GalNAcI-Δ48 BamHI/EcoRIコロニー#1、#2、#3、#5および#6が正しい挿入断片を含むと同定され、pCRBlunt-chST6GalNAcI-Δ225 EcoRIコロニー#2が正しい挿入断片を含むと同定されることを実証した。
【０２７４】
DNAミニプレップ分析を用いて、サブクローニング構築物が挿入断片について調べられた。分析は、pAcGP67B-chST6GalNAcI-Δ232 BamHI/EcoRIコロニー#1〜#4が正しい挿入断片を含むと同定され、pAcGP67B-chST6GalNAcI-Δ152 BamHI/EcoRIコロニー#1〜#4が正しい挿入断片を含むと同定され、pAcGP67B-chST6GalNAcI-Δ48 BamHI/EcoRIコロニー#1〜#4が正しい挿入断片を含むと同定され、pAcGP67B-chST6GalNAcI-Δ225 BamHI/EcoRIコロニー#1〜#8が正しい挿入断片を含むと同定されることを実証した。
【０２７５】
ニワトリST6GalNAcI突然変異体を含む組換えバキュロウイルスの力価もまた測定された。Δ232突然変異体は8.50x106の力価をもち、Δ152突然変異体は2.28x107の力価をもち、Δ48突然変異体は1.28x107の力価をもった。
【０２７６】
（表１９）放射性アッセイ法におけるシアル酸付加活性の概要
2008501344.tif 000219
【０２７７】
K232 VS4-001を用いる精製された酵素は陽性対照として用いられた。タンパク質産生に用いられたMOIは以下の通りであった：Δ48 #1、0.800；Δ152 #1、1.430；Δ232 #1、0.531；Δ48 #2、0.200；Δ152 #2、0.356；Δ232 #2、0.133。RSDは2.5%未満。
【０２７８】
注記：Δ232ウイルスストックについて、活性は4/8/04においてゼロであったため、それらは4/26/04において再アッセイされなかった。ダブルアスタリスク(**)でマークされた結果をもつ突然変異体は、シアリルPEG化活性について陽性と判定された。
【０２７９】
実施例6：MBP-ST6GalNAcIタンパク質の再折り畳み
真核生物のST6GalNAcIはMPBに融合された。簡単には、5つのマウスST6GalNAcI構築物が作製された：D32、E52、S127、S186およびS201。各構築物は、ベクターpcWin2-MBP由来のMBPタグの後に発現され、構築物に含まれる「ステム」領域の範囲が異なる。D32が最も長い型で、予想されるアミノ末端膜貫通ドメインのすぐ下流から始まる。S201は最も短く、保存された触媒性ドメインの予想される出発点のすぐ前から始まる。
【０２８０】
マウス構築物に加えて、ヒトST6GalNAcI K36もまた、MBPとの融合体として発現された。ヒト構築物は、膜貫通ドメイン直後から始まる。ヒトST6GalNAcIのK36からそれのc末端までをコードするDNAは、鋳型として既存のバキュロウイルス発現ベクターを用いるPCRにより単離され、pcWin2-MBP内のBamHI-XhoI部位へクローニングされた。
【０２８１】
参照として、MBP-mST6GalNAcI S127およびMBP-hST6GalNAcI K36についての配列は図26に含まれる。さらに、図38は、ヒトST6GalNAcIについて、およびニワトリST6GalNAcIについての全長アミノ酸配列、ならびに天然のマウスタンパク質の残基32位から始まるマウスST6GalNAcIタンパク質の配列を提供した。
【０２８２】
上記のものに加えての欠失突然変異体が作製されており、本発明に用いる好ましいST6GalNAcIの完全リストは表20に見出される。図35は、いくつかの好ましいヒトST6GalNAcI切り詰め突然変異体の概略図を提供する。図36は、ヒトST6GalNAcI切り詰め突然変異体を含むMBP融合タンパク質の概略図を示す。
【０２８３】
（表２０）ST6GalNAcI突然変異体
2008501344.tif 000220
【０２８４】
図37は、ヒトST6GalNAcIタンパク質における対および不対のシステイン残基の位置を示す。単一および二重システイン置換もまた示されている、例えば、C280S、C362S、C362T、(C280S＋C362S)、および(C280S＋C362T)。
【０２８５】
最初の発現研究は、ST6GalNAcI融合タンパク質が不溶性タンパク質として発現されたことを示した。活性組換え酵素を回復させるために、不活性の不溶性タンパク質は単離され、以下に記載されているように、再び折り畳まれた：
【０２８６】
pcWin2-MBP-mST6GalNAcI D32、E52、S127、S186、またはpcWin2-MBP-hST6GalNAcI K36のいずれかを有するJM109細胞の対数的増殖中の0.5 L 培養物は、1 mM IPTGで、37℃で一晩、誘発された。細胞は遠心分離により収集され、20 mM Tris pH 8、5 mM EDTAの100 mLにおいて微量流動化装置での機械的破壊により溶解された。不溶性物質は7000 x gで20分間の遠心分離により収集された。上清は捨てられ、ペレットは、高塩緩衝液(20 mM Tris pH 7.4、1 M NaCl、5 mM EDTA)、界面活性剤緩衝液(25 mM Tris pH 8、1%Na-デオキシコール酸、1%トリトンX100、100 mM NaCl、5 mM EDTA)、およびTE(10 mM Tris pH 8、1 mM EDTA)で洗浄された。各洗浄は100 mLにおいてであり、ペレットは上記のように遠心分離により収集された。洗浄後、封入体ペレットは等分され、-80℃で保存された。
【０２８７】
適切な再折り畳みおよびそれに従ってのST6GalNAcI活性の回復を可能にする条件をスクリーニングするために、マウスおよびヒトST6GalNAcI融合タンパク質封入体のアリコートは、6 M グアニジン、10 mM DTT、1x TBSに可溶化された。タンパク質濃度は、ブラッドフォード(Bradford)アッセイ法により標準化され、可溶化されたタンパク質は、一連の市販されているタンパク質再折り畳み緩衝液へ移された。再折り畳みは、振盪させながら、96ウェルのプレートにおいて4℃で一晩、0.2 mg/mLでの0.25 mL中で行われた。再折り畳み物は、96ウェルの透析プレート(25000 NWCO)へ移され、1x TBS、0.05%ツイーン-80に対して4℃で4時間、透析され、続いて、10 mM BisTris pH 7.1、100 mM NaCl、0.05%ツイーン-80に対して4℃で一晩、透析された。
【０２８８】
再折り畳み組換えST6GalNAcI融合タンパク質は、384ウェルの固相活性アッセイ法において活性について試験された。簡単には、活性アッセイ法は、ビオチン化シアル酸の、ビオチン化CMP-NANから、384ウェルのプレートにおけるアシアロ-ウシ顎下腺ムチンコーティング化ウェルへのST6GalNAcI媒介性転移を検出する。各反応(13.5 μL 再折り畳み物＋1.5 μL 10x反応緩衝液)は、4連で行われた。10x反応緩衝液は、0.2 M BisTris pH 6.7、25 mM MgCl2、25 mM MnCl2、0.5%ツイーン-80、および1 mM 供与体であった。37℃での一晩のインキュベーション後、プレートは、過剰1xTBS、0.05%ツイーン-20、および製造会社の使用説明書(Perkin Elmer)の通りユーロピウム標識されたストレプトアビジンで検出されるビオチンで洗浄された。ST6GalNAcI活性を示す、プレート上に保持されたユーロピウム蛍光レベルは、Perkin Elmer Victor3Vプレートリーダーで記録され、発現および活性結果は、表21に要約されている。再折り畳みST6GalNAcI融合タンパク質のうちの3つは、検出可能な活性をもった。
【０２８９】
（表２１）固相アッセイ法による活性について試験された、再折り畳みST6GalNAcI融合タンパク質の概要
2008501344.tif 000221
【０２９０】
要約すれば、ニワトリST6GalNAcIの4つのN末端欠失は、分泌される活性酵素として、Sf9細胞において成功裡に発現された。4つの活性クローンについての最大活性レベルは様々であり、K232 VS4-001は19 U/Lにおいて、Δ48は47 U/Lにおいて、Δ152は44.1 U/Lにおいて、およびΔ225は27.9 U/Lにおいてであった。さらに、Δ48、Δ152およびΔ225ウイルスストックにおいて産生される突然変異体ニワトリST6GalNAcIは、等しく、GalNAc-O-G-CSFをシアリルPEG化することができた(図32および33)。
【０２９１】
実施例7：追加のヒトST6GalNAcIタンパク質の作製
hST6GalNAcI切り詰め型のクローニング：以下のオリゴ：hST6T73-hST6-G273およびhST6CooHは、様々なヒトST6GalNAcI切り詰め型を増幅するために用いられた。
【０２９２】
（表２２）hST6GalNAcIについての切り詰め型オリゴ
オリゴ、hST6-T73-G273についてのBamHI制限部位、およびhST6-CooHオリゴについてのXbaI制限部位は下線を引かれた。
hST6-T73   5' tattggatccacaaccatctatgcagagccag（SEQ ID NO: 111）
hST6-E110  5' tattggatccgaggagcaggacaaggtgccc（SEQ ID NO: 112）
hST6-M134  5' tattggatccatggtgaacacactgtcaccca（SEQ ID NO: 113）
hST6-T171  5' tattggatccaccaggaagctgacggcctcca（SEQ ID NO: 114）
hST6-A233  5' tattggatccgccaccccaccccctgcccctt（SEQ ID NO: 115）
hST6-G273  5' tattggatccggaggccttcagacgacttgcc（SEQ ID NO: 116）
hST6-CooH  5' gcgctctagatcagttcttggctttggcagttcc（SEQ ID NO: 117）
【０２９３】
鋳型DNA：phST6GalNAcI K36(hST6GalNAcI遺伝子のΔ35切り詰めをもつプラスミド)
【０２９４】
PCR反応：50 μl 反応物は、以下のPCR条件下で、Herculase(登録商標)Enhanced DNAポリメラーゼ(Stratagene)を用いて行われた：30サイクル：92℃、45秒間；61℃、1分間；72℃、3分間；および4サイクル：92℃、45秒間；61℃、1分間；72℃、10分間。
【０２９５】
アガロースゲル分析：PCR反応物からの3 μl アリコートが、EtBrで染色されたTAE緩衝液における1%アガロースゲルにおいて分析された。
【０２９６】
hST6GalNAcI切り詰め型のクローニング：PCR増幅されたDNA断片は、アガロースゲルからMillipore Ultrafree DAカートリッジを用いて精製され、Amicon microcon YM-100フィルターを用いて濃縮された。精製されたDNA断片からの1〜2 ul アリコートが、Zero blunt(登録商標)TOPO(登録商標)PCRクローニングキット(Invitrogen)に用いられた。反応物は、コンピテントTOP10大腸菌細胞(Invitrogen)へ形質転換された。50 μl 形質転換体がMartone Agar Kan50プレート(Teknova)上へ導入された後、以下のコロニーが得られた。
2008501344.tif 000222
【０２９７】
プラスミドDNAは、50 μg/ml カナマイシンを追加されたMartone L-Broth液体培地(Teknova)の5 mlにおいて選択されたコロニー(各切り詰め型から4〜5個)を増殖させた後、培養物から得られた。
【０２９８】
hST6GalNAcIクローンのスクリーニング：プラスミドDNAは、Wizard(登録商標)Plus SV Minipreps DNA精製システムを用いて4 mlの一晩の培養物から精製された。精製されたプラスミド(10 μl)は、BamHIおよびXbaI制限酵素で消化され、続いて、正しい挿入断片(切り詰め)を確認するためにアガロースゲル分析[1.2%E-gel(Invitrogen)]が行われた。
【０２９９】
上のhST6GalNAcI切り詰め型は、バキュロウイルス発現ベクター、pAcGP67Bへクローニングされ、SF9昆虫細胞培養において発現された。ST6GalNAcI活性は、感染した培養物から得られた試料において測定され、結果は図38に示されている。切り詰め型ヒトST6GalNAcIタンパク質のそれぞれは、バキュロウイルス系における発現後、検出可能な活性をもった。hST6-E110タンパク質が最高活性をもった。
【０３００】
hST6GalNAcI切り詰め型は図39に示されている。図はまた、マウスおよびニワトリタンパク質とのヒト配列のアラインメントを示し、タンパク質間の同一および保存されたアミノ酸残基を同定している。
【０３０１】
実施例8：SBD配列を含む切り詰め型ST6GalNAcIタンパク質
N-アセチルガラクトサミン-α2,6-シアリルトランスフェラーゼ(ST6GalNAcI)は、シアル酸をCMP-シアル酸から、α2,6結合により、糖タンパク質のトレオニンまたはセリンへO結合したN-アセチルガラクトサミン(GalNAc)残基上へ転移させる。
【０３０２】
この報告は、pAcGP67バキュロウイルス発現系を用いて、ツマジロクサヨトウ(Spodoptera frugiperda)(Sf9)細胞におけるヒト(SBD-K36、K36-SBD)およびマウス(SBD-S127、S127-SBD)ST6GalNAcIのN末端ならびにC末端でのSBDタグのクローニングおよび発現を記載する。
【０３０３】
すべての4つのウイルスストックは、SF9細胞(150 mL規模)を96時間、感染させるために用いられ、その結果生じた上清は、β-シクロデキストリンカラム上で単離され、濃縮され、アシアロウシ顎下腺ムチンのシアル酸付加およびG-CSFのシアリルPEG化の両方についてアッセイされた。
【０３０４】
方法
1. 構築物設計
gp67分泌ペプチド、ST6GalNAcIコード配列、およびSBDコード配列の間の三者融合が構築された。ST6GalNAcIおよびSBDの制限地図(添付書類4)ならびにpAcGP67Bベクターにおける多重クローニング部位に基づいて、NcoI/NotI/BglIIが、SBD-ST6GalNAcI構築物をクローニングするために選択され、およびBamHI/NotI/BglIIが、ST6GalNAcI-SBD構築物をクローニングするために選択された。NotI部位は、SBDとST6GalNAcIコード配列の間に4アミノ酸(WRPP（SEQ ID NO: 118）またはRRPP（SEQ ID NO: 119）)を導入した。この伸長は、これらの2つのタンパク質ドメインを分離するのに役立つことができた。大腸菌について最適化されたSBD遺伝子コドンは、この研究に用いられなかった。SF9細胞のコドン偏りが、原核生物の大腸菌とは対照的に、真核生物のA. ニゲル(A. niger)のそれにより近いであろうことが決定されたため、本来のA. ニゲルSBDコード配列が選択された。
【０３０５】
2. PCR反応
5 μl  10x PCR緩衝液
2 μl  10 mM dNTP
1 μl  5'プライマー(10 pモル/μl)
1 μl  3'プライマー(10 pモル/μl)
2 μl  DMSO
1 μl  DNA鋳型(10 ng/μl)
0.5 μl  Herculase(Stratagene、カタログ番号600260-51)
37.5 μl  PCRグレードH2O
【０３０６】
K36およびS127について用いられたPCRプログラムは、a)95℃、3分間；b)5サイクルとして、95℃、45秒間；42℃、45秒間、72℃、1.5分間；c)30サイクルとして、95℃、45秒間；54℃、45秒間、72℃、1.5分間；d)72℃、10分間；e)4℃休止であった。(LL774、pg 51)。PCRはT3サーモサイクラーを用いて行われた。
【０３０７】
SBDについて用いられたPCRプログラムは、a)95℃、3分間；b)5サイクルとして、95℃、45秒間；40℃、45秒間、72℃、1分間；c)30サイクルとして、95℃、45秒間；55℃、45秒間、72℃、1分間；d)72℃、10分間；e)4℃休止であった。(LL774、pg 51)。PCRはT3サーモサイクラーを用いて行われた。
【０３０８】
3. ゲル抽出
MinElute Gel Extraction KitがすべてのPCRバンドを単離するために用いられた。DNAは、20 μl 1x TE(10 mM Tris-HCl、0.1 mM EDTA、pH 7.5)に溶出された。
【０３０９】
4. pCRBluntライゲーションおよび形質転換
4.5 μl  PCR産物
1.0 μl  食塩水
0.5 μl  TOPO pCR4
【０３１０】
反応物は、室温で9分間、インキュベートされた。
【０３１１】
各ライゲーション混合物の2マイクロリットルが、Top10細胞の25 μlを含むエッペンドルフチューブを区別するように加えられた。それぞれの以下のインキュベーションが行われた：氷上で5分間、42℃45秒間、氷上で2分間、0.1 mL SOCを加え、その後、37℃1時間。インキュベーション後、120 μlの混合物がカナマイシンプレート上に塗布された。約7個〜70個のコロニーが各形質転換について生成された(LL774、pg 51)。
【０３１２】
プラスミドDNAミニプレップ
【０３１３】
単一のコロニーが採取され、50 μg/mL カナマイシンを含む2 mL テリフィックブロス(terrific broth)培地において37℃で一晩、増殖された。正しい挿入断片は、部位がPCRプライマー中へ設計された対での制限酵素で調べられた。
【０３１４】
5. サブクローニング
pAcGP67BベクターおよびpCRBluntベクターにおける各挿入断片は、適切な対での制限酵素で消化された。消化されたDNAは、0.8%アガロースゲル上で分離された。対応するバンドは、外科手術用ナイフで切り出され、DNAは、MiniElute Kitを用いてゲルから抽出された。挿入断片およびベクターは、T4 DNAリガーゼを用いていっしょにライゲーションされた。ライゲーション混合物は、Top10細胞へ形質転換され、アンピシリン(カルベニシリン)プレート上に塗布された。37℃での一晩のインキュベーション後、数個のコロニーが採取され、各プラスミドについての正しい挿入断片およびベクターについてスクリーニングされた。
【０３１５】
6. 同時トランスフェクション
25 cm2 ファルコンフラスコにおいて、1x106個のSf9細胞が播種された(50〜70%集密)。直線化されたBaculoGold DNA(0.5 μg)は、エッペンドルフにおいて2 μg 組換えプラスミドDNAおよび100 μLのSF900 II SFMと混合された。もう一つのチューブにおいて、6 μlのセルフェクチンが、100 μl SF900 II SFMと混合された。2つの混合物は、混ぜ合わせられ、室温で15〜45分間、インキュベートされた。フラスコにおける培地は、除去され、Sf9細胞は、DNA混合物で覆われた。SF900 II SFMの追加の0.8 mlがフラスコへ加えられ、27℃で4時間、インキュベートされた。インキュベーション後、DNA混合物およびセルフェクチンは除去され、3 mlの新鮮なSF900 II SFMがフラスコへ加えられた。フラスコにおけるSf9細胞は、27℃で3日間、振盪なしでインキュベートされた。可視の感染は、72時間後に観察されることができた(LL774、pg 89)。
【０３１６】
7. 組換えバキュロウイルス増幅
3日間のインキュベーション後、培養上清は、1,000 x gで10分間の遠心分離により透明化された。この上清は、継代ゼロ(P0)ウイルス増幅系統と名付けられた。
【０３１７】
P0ウイルスストック(0.5 mL)は、Sf9細胞の50 mL 懸濁培養物(1x106細胞/mL)とインキュベートされた。インキュベーションは、27℃で、撹拌しながら(100 rpm)、3日間、行われた。培養物は、4℃で、5000 rpm(7,000 x g)で30分間のCorning滅菌円錐遠心管における遠心分離により収集され、その結果生じた上清は、継代1(P1)ウイルス増幅系統(LL774、pg 96)と名付けられた。
【０３１８】
3 mLのP2ウイルスストックは、Sf9細胞の150 mL 懸濁培養物(1x106細胞/mL)とインキュベートされた。インキュベーションは、27℃で、撹拌(100 rpm)しながら、66時間、行われた。P1ウイルスストックについて記載されているように単離された上清は、継代2(P2)ウイルス増幅系統と名付けられた(LL774、pg 96、103)。
【０３１９】
P0は-80℃で保存された。P1およびP2は暗闇の中で4℃で保存された。P2における組換えバキュロウイルスの力価は、プラークアッセイ法により測定された。
【０３２０】
8. 低MOIプロトコール
LL774、pg 120
材料：
250 mL 振盪フラスコにおける30 mLのSf9細胞。総フラスコ：10。
目標とする細胞濃度：1.5E6細胞/mL。
目標とするMOI：5E-4〜5E-8。
バキュロウイルス：
SBD-K36  2.55x107 pfu/mL
K36-SBD  2.55x107 pfu/mL
計算：
総細胞：1.5e6 x 30=45e6
最高MOIについての総ウイルス：
SBD-K36(5E-4x45e6)/2.55E7=22500/2.55E7=0.88 μl
K36/SBD(5E-4x45e6)/2.25E7=22500/2.25E7=1.00 μl
希釈手順：
以下によりウイルスを希釈：
MOI 5e-3について8.8 μl SBD-K36ウイルス＋1 mL Sf900II SFM
MOI 5e-3について10.0 μl K36-SBDウイルス＋1 mL Sf900II SFM
MOI 5E-4について0.2 mL 5E-3＋1.8 mL Sf900II SFM
MOI 5E-5について0.2 mL 5E-4＋1.8 mL Sf900II SFM
MOI 5E-6について0.2 mL 5E-5＋1.8 mL Sf900II SFM
MOI 5E-7について0.2 mL 5E-6＋1.8 mL Sf900II SFM
MOI 5E-8について0.2 mL 5E-7＋1.8 mL Sf900II SFM
実験：
1 mLの各希釈溶液を30 mLのSf9細胞へ加えることにより実験を開始。
細胞濃度をチェックし、4日目、5日目、6日目および7日目において放射性アッセイ法のために1 mL 試料を採取。
要約結果
注記：
実際の開始細胞濃度は1.47E6である。
細胞はPSG16においてであった。
【０３２１】
9. タンパク質産生
組換えタンパク質は、1.5x106細胞/mL Sf9細胞の150 mLにP2ウイルスストックの75 μlを感染させることにより産生された。培養物は、27℃で撹拌(100 rpm)しながら96時間、インキュベートされた。上清は、P1およびP2ウイルスストックについて記載されているように、単離された。感染のために用いられたMOIは以下であった：SBD-K36、0.0085；K36-SBD、0.0075；SBD-S127、0.013；S127-SBD、0.013(LL774、pg 103、120)。
【０３２２】
10. β-シクロデキストリンカラムにおけるSBDタグを用いるST6GalNAcI酵素の精製
SBDタグと融合したヒトおよびマウスST6GalNAcIは、β-シクロデキストリンカラムの通過によりSf9細胞上清から単離された。SBD-ヒトまたはマウスST6GalNAcI、それぞれの22.5 mUまたは182.4 mUのいずれかは、4℃で約0.4 mL/分で別々のβ-シクロデキストリンカラム(ベッド容量7.5 mL)上へ添加された。カラムは、80〜100 mLの洗浄緩衝液(1xPBS pH 7.4 Fisherカタログ番号BP-399-500)で洗浄された。結合した酵素は、溶出緩衝液(洗浄緩衝液における3 mM β-シクロデキストリン Sigmaカタログ番号C-4767)によりカラムから溶出された。1〜2 mLの12個の画分が収集された。溶出プロファイルは、OD280として記録された。ピーク画分は、プールされ、Joann遠心分離機におけるVIVASPIN 6 mLまたは20 mL 濃縮器を用いて、4℃で、7500 rpm(〜6000 g)で約30分間、濃縮された。1 mLの洗浄緩衝液は、この時点で濃縮器へ加えられ、100〜200 μLの最終容量まで濃縮し続けられた。濃縮された産物は、シアル酸付加およびシアリルPEG化について試験された。
【０３２３】
β-シクロデキストリンカラムは、洗浄緩衝液における1 M NaClを用いて再生され、その後、洗浄緩衝液と平衡化された、または0.5 M NaOHに一晩、浸漬された。カラムは、次に、pHが7.0に達するまでH2Oで洗浄され、その後、洗浄緩衝液と平衡化された。
【０３２４】
11. シアル酸付加放射性アッセイ法
放射性アッセイ法は、14C-CMP-シアル酸からアシアロ-ウシ顎下腺ムチンへの14C-シアル酸の転移を測定した(詳細についてはDR-518-04参照)。
【０３２５】
12. シアリルPEG化アッセイ法
LL774、pg 163
G-CSF-O-GalNAc(0.4 mg/mL)    10.0 μL
125 mM MnCl2                  0.5 μL
CMP-SA-PEG-20K                0.5 μL
ST6GalNAcI                    2.0 μL
100 mM Bis-Tris pH6.5        10.0 μL
総容量                       23.0 μL
【０３２６】
反応混合物は、33℃で振盪なしで66時間、インキュベートされた。
【０３２７】
インキュベーション後、2.5 μLの5x SDS試料緩衝液(DTTなし)が、5 μlの水と共に5 μlの反応物へ加えられ、試料を加熱することなしに、4〜20%SDS-PAGE勾配ゲル上へ添加された。
【０３２８】
PEG化されたG-CSFは、ゲルのヨウ素染色により検出された。
【０３２９】
残りの反応混合物へ、42 μlの水が加えられ、試料はHPLCにより分析された。
GalNAc付加反応：
G-CSF(40 mM Bis-Tris pH 6.5における〜1 mg/mL)  140 μl
100 mM MnCl2                                     3 μl
30 mM UDP-GalNAc                                 9 μl
100 mM Bis-Tris pH 6.5                         113 μl
GalNAcT2                                         5 μl
【０３３０】
33℃、振盪なし、2日間。
【０３３１】
結果
1. PCR結果
K36 BamHI/NotI、S127 BamHI/NotI、K36 NotI/BglII、S127 NotI/BglLLおよびSBD NotI/BglIIの正しい長さのPCRバンドが生じた。
【０３３２】
2. クローニング結果
正しい長さのクローンが生成された。
【０３３３】
3. ST6GalNAcIクローンの組換え(P2)バキュロウイルスストックの力価
SBD-K36   2.55x107
K36-SBD   2.25x107
SBD-S127  3.85x107
S127-SBD  3.95x107
【０３３４】
4. 放射性アッセイ法におけるシアル酸付加活性の概要
2008501344.tif 000223
【０３３５】
5. 超低MOI研究結果
2008501344.tif 000224
【０３３６】
開始細胞濃度は1.47E6細胞/mL、LL-774 pg 120であった。
【０３３７】
6. β-シクロデキストリンカラムにおけるヒトおよびマウスST6GalNAcI SBD融合タンパク質の精製の概要
2008501344.tif 000225
【０３３８】
2つのヒトST6GalNAcI融合構築物(SBD-K36およびK36-SBD)および2つのマウスST6GalNAcI融合構築物(SBD-127および127-SBD)は、分泌された活性酵素としてSf9細胞において成功裡に発現され、それらのSBDタグを用いてβ-シクロデキストリンカラム上で精製された。
【０３３９】
4つの活性クローンの精製され、濃縮された試料の活性レベルは以下であった：
SBD-K36    122.9 U/L
K36-SBD     22.9 U/L
SBD-S127     5.5 U/L
S127-SBD    15.9 U/L
【０３４０】
すべての4つの酵素は、G-CSFをシアリルPEG化することができた。
【０３４１】
超低MOIを用いる、ヒトST6GalNAcI-SBDタンパク質の活性発現は増加し、6日目および7日目におけるSBD-K36に関する5e-7のMOIが、それぞれ、3.09 U/Lおよび3.25 U/Lの活性を与え、6日目におけるK36-SBDに関する5e-7のMOIが2.26 U/Lの活性を与えた。
【０３４２】
本明細書に引用されたありとあらゆる特許、特許出願および刊行物の開示は、全体として参照により本明細書に組み入れられている。
【０３４３】
本発明は、特定の態様に関して開示されているが、本発明の他の態様およびバリエーションが、本発明の真意および範囲から逸脱することなく、当業者により考案されうることは明らかである。添付された特許請求の範囲は、すべてのそのような態様および等価なバリエーションを含むと解釈されることを意図される。
【０３４４】
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2008501344.tif 000275
2008501344.tif 000276
【図面の簡単な説明】
【０３４５】
本発明の例示の目的のために、本発明のある種の態様が図面に記述される。しかし、本発明は、図面に記述された態様の正確な配列および手段に限定されない。
【図１】マウスST6GalNAcI切り詰め突然変異体Δ31、Δ51、Δ126、Δ185およびΔ200(それぞれ、説明図においてD32、E52、S127、S186およびS201として参照されている)内の制限酵素切断部位の位置を示す概略図である。図はまた、各構築物の塩基数（bp）におけるそれぞれのサイズを示す。
【図２】N末端アミノ酸を切り詰め型ST6GalNAcI核酸のD32、E52、S127、S186およびS201にそれぞれ対応する、1488 bp、1428 bp、1203 bp、1026 bpおよび981 bpの電気泳動ゲルDNA断片の画像である。レーン1、bpラダー；レーン2、D32；レーン3、E52；レーン4、S127；レーン5、S186；レーン6、S201。
【図３】E52、S127、S186およびS201マウスST6GalNAcI構築物についてエンドヌクレアーゼBamHI/XhoI、およびD32マウスST6GalNAcI構築物についてHindIII/XhoIを用いる制限酵素消化からのDNAを含む電気泳動ゲルの画像である。約1.5〜1.0 KbのDNA断片は、ST6GalNAcIの異なる切り詰め突然変異体に対応する。6.0 Kb近くに見える大きい方の断片は、pCWin2-MBPである。レーン1、bpラダー；上部レーン2〜4、E52；上部レーン5〜7、S127；上部レーン8〜10、S186；上部レーン11〜12、S201；下部レーン2〜5、D32；下部レーン7〜9、MBP-pCWin2。
【図４】D32構築物を消化するためにHindIII/XhoI制限酵素、ならびに構築物E52、S127、S186およびS201を消化するためにBamHI/XhoIを用いる、組換えコロニーDH5α/pCWin2-MBP-ST6GalNAcIのスクリーニングの結果を示す電気泳動ゲルの画像である。各切り詰めからのすべての4つのコロニー(1〜4の番号を付された)は、ST6GalNAcIのD32、E52、S127、S186、およびS201にそれぞれ対応する約1.5〜1.0 Kbの断片を放出し、6.0 Kbあたりのより大きい断片はMBP-pCWin2ベクターを表す。レーン1、bpラダー。上部レーン1、3、5、7および9、非切断D32/ベクター；上部レーン11、13、15、非切断E52/ベクター；上部レーン17および19、非切断S127/ベクター；上部レーン2、4、6および8、切断D32；上部レーン10、12および14、切断E52；上部レーン16および18、切断S127；下部レーン1、3および5、非切断S127；下部レーン7、9および11、非切断S186；下部レーン13、15、17および19、非切断S201；下部レーン2および4、切断S127；下部レーン6、8、10および12、切断S186；下部レーン14、16および18、切断S201。
【図５】各構築物DH5α/pCWin2-MBP-ST6GalNAcIのコロニー#1〜#2から単離されたプラスミドDNAに関する制限消化分析を示す電気泳動ゲルの画像である。プラスミドDNAは、NdeI/HindIII酵素で二重消化された。D32含有コロニーを除くすべてのコロニーは、MBP-ST6GalNAcI挿入断片を示す2.5 Kbあたりの単一のバンドを放出したが(D32は2つの断片を放出した)、5.0 Kbあたりのより大きい予想されたバンドは、pCWin2ベクターに対応する。M＝bpラダー。レーン1、3＝D32；5、7＝E52；11、22＝S127；12、14＝S186、および16、18＝S201、かつすべては、非切断DNAを含む。レーン2、4＝D32；6、8＝E52；10、21＝S127；13、15＝S186、および17、19＝S201、かつすべては消化されたDNAを含む。
【図６】NdeI/XhoI制限酵素を用いる、構築物JM109/pCWin2-MBP-ST6GalNAcIの診断的制限酵素消化を示す電気泳動ゲルの画像である。D32を例外として、すべてのコロニーは、切り詰め型MBP-ST6GalNAcI融合タンパク質に対応する2.5 Kbあたりの断片を放出した(D32は2つの断片を放出した)。5.0 Kbにおける断片は、pCWin2ベクターに対応する。MW＝bpラダー。レーン1、3＝D32；レーン5、7＝E52；レーン9、11＝S127；レーン13、15＝S186；レーン17および19＝S201、かつすべては、非切断DNAを含む。レーン2、4＝D32；レーン6、8＝E52；レーン10、12＝S127；レーン14、16＝S186；レーン18および20＝S201、かつすべては消化されたDNAを含む。
【図７】それぞれのDNA構築物を含む細胞について、細胞可溶化物および封入体に存在するそれぞれのマウスST6GalNAcI切り詰め突然変異体の予想されたサイズに対応するポリペプチドの存在を示す電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーンMWは、MWマーカーを含む。各「レーン1」はD32を含む、各「レーン2」はE52を含む、各「レーン3」はS127を含む、各「レーン4」はS186を含む、および各「レーン5」はS201を含む。
【図８】JM109細胞から得られた可溶化液および封入体におけるMBP融合タンパク質としてのマウスST6GalNAcIの切り詰め型の発現を示す電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーンMWは、MWマーカーを含む。各「レーン1」はD32を含む、各「レーン2」はE52を含む、各「レーン3」はS127を含む、各「レーン4」はS186を含む、および各「レーン5」はS201を含む。
【図９】JM109およびW3110/pCWin2 MBP-ST6GalNAcI構築物S186およびS201におけるMBP-ST6GalNAcIの発現を示す電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーンMWは、MWマーカーを含む。レーン1は、w3110#11、1.0 mg/ml由来のS186を含む；レーン2は、w3110#11、0.1 mg/ml由来のS186を含む；レーン3は、JM109#11、1.0 mg/ml由来のS186を含む；レーン4は、JM109#11、0.1 mg/ml由来のS186を含む；レーン5は、w3110#8、1.0 mg/ml由来のS201を含む；レーン6は、w3110#8、0.1 mg/ml由来のS201を含む；レーン7は、JM109#8、1.0 mg/ml由来のS201を含む；レーン8は、JM109#8、0.1 mg/ml由来のS201を含む。
【図１０】細菌から単離された、再折り畳みST6GalNAcI構築物S201によるシアル酸のGalNAc-O-G-CSF受容体への転移の質量分光学的描写の画像である。パネルAは、24時間目において採取された試料を示し、パネルBは、48時間目に採取された試料を示し、パネルCは、2日目に採取された試料を示し、パネルDは5日目に採取された試料を示す。
【図１１】制限酵素消化によりESTクローンのヒトST6GalNAcI挿入断片を確認する電気泳動ゲルの画像である。レーン1〜3、EcoRIにより消化されたESTクローン#4816713のクローン#1〜3；レーン4、1Kbラダー；レーン5〜6、EcoRIおよびXhoIにより消化されたESTクローン#6300955のクローン#1〜3。
【図１２】#4816713およびクローン#6300955ヒトST6GalNAcI ESTクローンのcDNA配列のアラインメントを示す概略図である。
【図１３】正しいサイズのcDNA挿入断片を含むすべての6つのヒトST6GalNAcIクローンのpCR-hST6-NおよびpCR-hST6-CのEcoRI制限消化を示す電気泳動ゲルの画像である。レーン1〜6は、6つのpCR-hST6-Nクローンの制限消化物を含む；レーン7〜12は、6つのpCR-hST6-Cクローンの制限消化物を含む。
【図１４】pcDNA3.1-hST6GalNAcIの制限酵素消化を示す電気泳動ゲルの画像である。パネルA：レーン1、1Kbラダー；レーン2〜7、pcDNA3.1-hST6GalNAcIクローン#1〜6。パネルB：pcDNA3.1-hST6GalNAcIの制限酵素地図の図解。
【図１５】pcDNA3.1(+)-hST6GalNAcI-N1C1#1のヌクレオチド（SEQ ID NO: 15）およびアミノ酸（SEQ ID NO: 2）配列を示す。
【図１６】ヒトST6GalNAcIのドメイン構造および様々な切り詰め突然変異体を描く漫画である。
【図１７Ａ】pAcGP67-Bバキュロウイルス転移ベクターのプラスミド地図である。
【図１７Ｂ】pAcGP67-Bバキュロウイルス転移ベクターのクローニング部位（SEQ ID NO: 19およびSEQ ID NO: 20）を示す地図である。
【図１８】K36、K125およびS258ヒトST6GalNAcI構築物について、およびpTS103について、Sf9細胞培地におけるST6GalNAcI活性を描くグラフである。
【図１９Ａ】pTS103由来のマウスST6GalNAcIのヌクレオチド（SEQ ID NO: 25）およびアミノ酸（SEQ ID NO: 4）配列を示す。
【図１９Ｂ】マウスST6GalNAcIのドメイン構造および様々な切り詰め突然変異体を描く漫画である。
【図２０Ａ】pFastBac1ベクターのプラスミド地図である。
【図２０Ｂ】pFastBa-1-gpベクター（SEQ ID NO: 35〜37）のポリクローニング部位の地図である。
【図２１】pFastBac-1-gp-mST6GalNAcIからマウスST6GalNAcI DNA挿入断片を放出するためにEcoRIおよびXhoI制限消化にかけられたプラスミドDNAを示す電気泳動ゲルの画像である。レーン1〜4、S127切り詰め突然変異体のクローン#1〜4；レーン5〜8、S186切り詰め突然変異体のクローン#1〜4；レーン9、1 Kbラダー。
【図２２Ａ】pFastBac-1バクミド上のプライマー対の概略図である。
【図２２Ｂ】バクミドDNAにおけるマウスST6GalNAcI cDNAのPCRスクリーニングを示す電気泳動ゲルの画像である。PCR産物の電気泳動は、1%アガロースゲル上で行われた。レーン1、1kbラダー；レーン2〜9、組換えバクミドDNAのクローン1〜8。
【図２３】1%アガロースゲル上におけるマウスST6GalNAcIバクミドDNAの分析を示す電気泳動ゲルの画像である。レーン1、1kbラダー；レーン2、S186#3；レーン3、S186#4；レーン4、S127#5；レーン5、S127#6。
【図２４】マウスST6GalNAcI構築物S127#5、S127#6、S186#3、S186#4について、およびpTS103プラスミドについて、Sf9細胞培地におけるST6GalNAcI活性を描くグラフである。
【図２５】ニワトリST6GalNAcI切り詰め型突然変異体構築物のスクリーニングに用いるウイルスストックの力価計算を描く表である。
【図２６】ニワトリΔ232 ST6GalNAcIの全長核酸配列（SEQ ID NO: 38）を示す。
【図２７】図26のDNA配列に基づいて翻訳された場合のアミノ酸配列（SEQ ID NO: 39）を示す。
【図２８】GenBankアクセッション番号X74946に示されているような全長ニワトリST6GalNAcIの核酸配列（SEQ ID NO: 40）を示す。
【図２９】K232切り詰め型ニワトリST6GalNAcIの核酸配列（SEQ ID NO: 41）を示す。
【図３０】K232切り詰め型ニワトリST6GalNAcIのアミノ酸配列（SEQ ID NO: 42）を示す。
【図３１】ヒト（SEQ ID NO: 67）、マウス（SEQ ID NO: 68）およびニワトリ（SEQ ID NO: 6）ST6GalNAcIアミノ酸配列の配列比較である。Δ48、Δ152、Δ225、およびΔ232突然変異体についての開始残基  −  それぞれ、アミノ酸Q49、V153、L226およびT233  −  は四角で囲まれている。コンセンサスペプチド＝SEQ ID NO: 69〜106。
【図３２】Δ48、Δ152、Δ225突然変異体ST6GalNAcI酵素によるG-CSFのシアリルPEG化を示す電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーン1、MWマーカー；レーン2、Δ48(MOI=0.8、35.6 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン3、Δ152(MOI=1.43、39.5 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン4、Δ232(MOI=0.531、0 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン5、K232 VS4-001 ST6GalNAcI(上清)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン6、K232 VS4-001 ST6GalNAcI(精製)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン7、Δ48(MOI=0.2、35.4 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン8、Δ152(MOI=0.356、39.9 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン9、Δ232(MOI=0.133、0 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン10、Δ232(MOI=0.133、0 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン11、K232 VS4-001 ST6GalNAcI(精製)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン12、MWマーカー。
【図３３】Δ48、Δ152、Δ225突然変異体ST6GalNAcI酵素によるG-CSFのシアリルPEG化を示す電気泳動タンパク質ゲルの画像である。レーン1、MWマーカー；レーン2、Δ48(MOI=0.8、35.6 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン3、Δ48(MOI=0.2、35.4 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン4、Δ152(MOI=1.43、39.5 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン5、Δ152(MOI=0.356、39.9 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン6、Δ225(27.9 U/L)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン7、K232 VS4-001 ST6GalNAcI(精製)でシアリルPEG化されたG-CSF；レーン8、MWマーカー。
【図３４】A)ヒトST6GalNAcI（SEQ ID NO: 107）についておよびB)ニワトリST6GalNAcI（SEQ ID NO: 6）についての全長アミノ酸配列、ならびにC)天然のマウスタンパク質（SEQ ID NO: 108）の残基32位から始まるマウスST6GalNAcIタンパク質の配列を提供する。
【図３５】いくつかの好ましいヒトST6GalNAcI切り詰め突然変異体の概略図を提供する。
【図３６】ヒトST6GalNAcI切り詰め突然変異体を含むMBP融合タンパク質の概略図を示す。
【図３７】ヒトST6GalNAcIタンパク質における対および不対のシステイン残基の位置を示す。単一および二重システイン置換もまた示されている、例えば、C280S、C362S、C362T、(C280S＋C362S)、および(C280S＋C362T)。
【図３８】ヒト切り詰め型タンパク質のST6GalNAcI活性を示す。活性は、バキュロウイルス系から得られた試料において測定された。
【図３９】3つのST6GalNAcI酵素：ヒト（SEQ ID NO: 67）、ニワトリ（SEQ ID NO: 6）およびマウス（SEQ ID NO: 68）のアミノ酸配列アラインメントを示す。最初のヒト酵素切り詰めは、膜貫通領域の直後のΔ35(K36)位置においてであった。以前のヒトST6GalNAcI切り詰めに加えて、ここに、さらに6つのヒト酵素切り詰めが設計され、かつ作製された。最初の1つΔ72(T73)は、プロテアーゼ切断に基づいており、残りは、3つまたは2つの酵素間の相同性領域に基づいて設計された。最後の切り詰めΔ272(G273)は、初期のニワトリST6GalNAcI切り詰めと類似していた。矢印は、ヒトタンパク質における切り詰めを示す。図はまた、ヒト配列のマウスおよびニワトリタンパク質とのアラインメントを示し、タンパク質間の同一および保存されたアミノ酸残基を同定している。
【図４０】gp67分泌ペプチド、ST6GalNAcIコード配列、およびSBDコード配列の間の三者融合の概略図を示す。融合タンパク質は、バキュロウイルスにおいて発現され、シクロデキストリンカラム上で精製され、酵素活性についてアッセイされた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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