(57)【要約】  本発明は、遺伝毒性化合物を同定するための急速なハイスループットスクリーニング法を提供する。これは、遺伝毒性または非遺伝毒性化合物について選択的にスクリーニングするバイオマーカー予測遺伝子のセットを使用して達成される。
2008518598.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
予測モデルを使用した化合物の遺伝毒性の予測法であって：
キャリブレーションセットからの遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物に曝したときに変化した発現プロファイルを示す複数のバイオマーカー遺伝子をサンプルから同定し；
バリデーションセットのサンプルからの遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物に曝したときに変化した発現プロファイルを示すバイオマーカー遺伝子のサブセットをキャリブレーションセットから同定し；
バリデーションセットのサンプルで同定されたバイオマーカー遺伝子を遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物に応答するものとして分類し；そして
この分類したバイオマーカー遺伝子を、試験化合物を細胞サンプルに曝し、そしてサンプル中のバイオマーカー遺伝子の発現プロファイルをバリデーションセットにおいて同定されたものと比較することにより、試験化合物の遺伝毒性の同定に使用する
工程を含む、方法。
【請求項２】
分類したバイオマーカー遺伝子がバイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝子、バイオマーカー−２(ＢＭ２)遺伝子およびバイオマーカー−３(ＢＭ３)遺伝子から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
バイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝子が色素性乾皮症、相補性群Ｃ、フェレドキシンレダクターゼ、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ、仮想タンパク質MGC5370、障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２、４８kDa、転写座位、パピリン、プロテオグリカン様硫酸化糖タンパク質、フコシダーゼ、アルファ−Ｌ−１、組織、カルボキシペプチダーゼＭ、腫瘍タンパク質ｐ５３誘導性タンパク質３、サイクリン依存性キナーゼインヒビター１Ａ(ｐ２１、Ｃｉｐ１)、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、仮想タンパク質FLJ10375、液胞タンパク質ソーティング５４(酵母)、hv89d09、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、ホスファチジルセリン受容体、アルファ−心臓性アクチン、仮想タンパク質FLJ11383、ｒａｓ同族体遺伝子ファミリー、メンバーＱ、チオレドキシン相互作用タンパク質、仮想タンパク質LOC339290、ＮＣＫ関連タンパク質１、ＴＢＣ１ドメインファミリー、メンバー１７、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、チオレドキシン相互作用タンパク質、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、および溶質担体ファミリー３３(アセチル−ＣｏＡトランスポーター)、メンバー１から成る群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
バイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝子が、色素性乾皮症、相補性群Ｃ、フェレドキシンレダクターゼ、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ、仮想タンパク質MGC5370、および障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２、４８kDaから成る群から選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
バイオマーカー−２(ＢＭ２)遺伝子が、EST370545、ホモ・サピエンスアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)、ホモ・サピエンス染色体１２オープン・リーディング・フレーム５  ｍＲＮＡ、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、カルボキシペプチダーゼＭ、プレキシンＢ２、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、仮想タンパク質FLJ12484、KIAA0907タンパク質、転写座位、ＡＲＰ９、wb67g03、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有、カリウム大コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＭベータメンバー３、KAT11914、ミトコンドリア担体３反復１、ｔａｘ１(Ｉ型ヒトＴ細胞白血病ウイルス)結合タンパク質３、セストリン１、ｒｅｔフィンガータンパク質、ＳＭＡＤ、ホモ・サピエンスマイトジェン誘導性遺伝子ｍｉｇ−２、FLJ10378タンパク質、仮想タンパク質MGC7036、ユビキチン結合酵素、KIAA0368、ホスファチジルセリン受容体、Ｏ連結Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)トランスフェラーゼ(ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ)、Ｍｄｍ２、仮想タンパク質LOC51061、ＮｕｄＥ核分散遺伝子Ｅ同族体様１(A. nidulans)、ＨＴＰＡＰタンパク質、およびシンデカン１から成る群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項６】
バイオマーカー−２(ＢＭ２)遺伝子がEST370545、ホモ・サピエンスアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)、ホモ・サピエンス染色体１２オープン・リーディング・フレーム５  ｍＲＮＡ、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、およびイソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)から成る群から選択される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
バイオマーカー−３(ＢＭ３)遺伝子がＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、プレクストリン相同様ドメイン、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、Ｆボックスタンパク質２２、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２  Ｂ(ＴＰ５３誘導性)、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、ホスホヒスチジンホスファターゼ１、仮想タンパク質FLJ20296、ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー１、転写座位、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、ヒト受容体チロシンキナーゼＤＤＲ遺伝子、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、601565341F1 NIH_MGC_21ホモ・サピエンスｃＤＮＡクローン、Ｆボックスタンパク質２２、サイトゾルシアル酸９−Ｏ−アセチルエステラーゼ同族体、ＢＴＧファミリーメンバー２、アストロタクチン２、ＩＫＫ相互作用タンパク質、サーフェイト４、中性スフィンゴミエリナーゼ(N-SMase)活性化関連因子、ＡＤＰリボシル化因子様１、ゴルジ再集合スタッキングタンパク質２、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有、混合系統白血病、仮想タンパク質LOC253981、胎盤特異的８、グルタチオンペルオキシダーゼ１、ＫＤＥＬ(Lys-Asp-Glu-Leu)小胞体タンパク質保持受容体２、シンタキシン７、リソソーム関連マルチスパンニング膜タンパク質−５、およびホスホイノシチド−３−キナーゼ触媒アルファポリペプチドから成る群から選択される、請求項２記載の方法。
【請求項８】
バイオマーカー−３(ＢＭ３)遺伝子がＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、およびアデノシンデアミナーゼから成る群から選択される、請求項７記載の方法。
【請求項９】
予測モデルを使用した化合物の遺伝毒性の予測法であって：
試験化合物をバイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝子、バイオマーカー−２(ＢＭ２)遺伝子およびバイオマーカー−３(ＢＭ３)遺伝子から成る群から選択される複数のバイオマーカー遺伝子の第一セットに曝し；
バイオマーカー遺伝子の分布を、既知参照化合物の遺伝子発現の分布と比較し；そして
試験化合物をバイオマーカー遺伝子の発現に基づき化合物のクラスに分け、ここで、化合物のクラスが遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物である
工程を含む、方法。
【請求項１０】
バイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝子が色素性乾皮症、相補性群Ｃ、フェレドキシンレダクターゼ、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ、仮想タンパク質MGC5370、障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２、４８kDa、転写座位、パピリン、プロテオグリカン様硫酸化糖タンパク質、フコシダーゼ、アルファ−Ｌ−１、組織、カルボキシペプチダーゼＭ、腫瘍タンパク質ｐ５３誘導性タンパク質３、サイクリン依存性キナーゼインヒビター１Ａ(ｐ２１、Ｃｉｐ１)、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、仮想タンパク質FLJ10375、液胞タンパク質ソーティング５４(酵母)、hv89d09、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、ホスファチジルセリン受容体、アルファ−心臓性アクチン、仮想タンパク質FLJ11383、ｒａｓ同族体遺伝子ファミリー、メンバーＱ、チオレドキシン相互作用タンパク質、仮想タンパク質LOC339290、ＮＣＫ関連タンパク質１、ＴＢＣ１ドメインファミリー、メンバー１７、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、チオレドキシン相互作用タンパク質、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、および溶質担体ファミリー３３(アセチル−ＣｏＡトランスポーター)、メンバー１から成る群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
バイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝子が色素性乾皮症、相補性群Ｃ、フェレドキシンレダクターゼ、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ、仮想タンパク質MGC5370、および障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２、４８kDaから成る群から選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
バイオマーカー−２(ＢＭ２)遺伝子がEST370545、ホモ・サピエンスアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)、ホモ・サピエンス染色体１２オープン・リーディング・フレーム５  ｍＲＮＡ、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、カルボキシペプチダーゼＭ、プレキシンＢ２、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、仮想タンパク質FLJ12484、KIAA0907タンパク質、転写座位、ＡＲＰ９、wb67g03、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有カリウム大コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＭベータメンバー３、KAT11914、ミトコンドリア担体３反復１、ｔａｘ１(Ｉ型ヒトＴ細胞白血病ウイルス)結合タンパク質３、セストリン１、ｒｅｔフィンガータンパク質、ＳＭＡＤ、ホモ・サピエンスマイトジェン誘導性遺伝子ｍｉｇ−２、FLJ10378タンパク質、仮想タンパク質MGC7036、ユビキチン結合酵素、KIAA0368、ホスファチジルセリン受容体、Ｏ連結Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)トランスフェラーゼ(ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ)、Ｍｄｍ２、仮想タンパク質LOC51061、ＮｕｄＥ核分散遺伝子Ｅ同族体様１(A. nidulans)、ＨＴＰＡＰタンパク質、およびシンデカン１から成る群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１３】
バイオマーカー−２(ＢＭ２)遺伝子がEST370545、ホモ・サピエンスアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)、ホモ・サピエンス染色体１２オープン・リーディング・フレーム５  ｍＲＮＡ、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、およびイソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)から成る群から選択される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
バイオマーカー−３(ＢＭ３)遺伝子がＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、プレクストリン相同様ドメイン、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、Ｆボックスタンパク質２２、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２  Ｂ(ＴＰ５３誘導性)、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、ホスホヒスチジンホスファターゼ１、仮想タンパク質FLJ20296、ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー１、転写座位、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、ヒト受容体チロシンキナーゼＤＤＲ遺伝子、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、601565341F1 NIH_MGC_21ホモ・サピエンスｃＤＮＡクローン、Ｆボックスタンパク質２２、サイトゾルシアル酸９−Ｏ−アセチルエステラーゼ同族体、ＢＴＧファミリーメンバー２、アストロタクチン２、ＩＫＫ相互作用タンパク質、サーフェイト４、中性スフィンゴミエリナーゼ(N-SMase)活性化関連因子、ＡＤＰリボシル化因子様１、ゴルジ再集合スタッキングタンパク質２、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有混合系統白血病、仮想タンパク質LOC253981、胎盤特異的８、グルタチオンペルオキシダーゼ１、ＫＤＥＬ(Lys-Asp-Glu-Leu)小胞体タンパク質保持受容体２、シンタキシン７、リソソーム関連マルチスパンニング膜タンパク質−５、およびホスホイノシチド−３−キナーゼ触媒アルファポリペプチドから成る群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１５】
バイオマーカー−３(ＢＭ３)遺伝子がＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、およびアデノシンデアミナーゼから成る群から選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
参照化合物が、遺伝毒性参照化合物および非遺伝毒性参照化合物から成る群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１７】
遺伝毒性参照化合物がアクチノマイシン−Ｄ、ブレオマイシン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ＥＮＵ／エチルニトロソウレア、メタンスルホン酸メチル、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、およびスチレンオキシドから成る群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１８】
非遺伝毒性参照化合物がジフルニサル、フルフェナム酸、塩化カリウム、Ｎ−アセチルシステイン、塩化ナトリウム、ラニチジン、リファンピシン、トランスプラチン、およびベラパミルから成る群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１９】
予測モデルを使用した化合物の遺伝毒性の予測法であって：
試験化合物を、色素性乾皮症、相補性群Ｃ、フェレドキシンレダクターゼ、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ、仮想タンパク質MGC5370、障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２、４８kDa、転写座位、パピリン、プロテオグリカン様硫酸化糖タンパク質、フコシダーゼ、アルファ−Ｌ−１、組織、カルボキシペプチダーゼＭ、腫瘍タンパク質ｐ５３誘導性タンパク質３、サイクリン依存性キナーゼインヒビター１Ａ(ｐ２１、Ｃｉｐ１)、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、仮想タンパク質FLJ10375、液胞タンパク質ソーティング５４(酵母)、hv89d09、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、ホスファチジルセリン受容体、アルファ−心臓性アクチン、仮想タンパク質FLJ11383、ｒａｓ同族体遺伝子ファミリー、メンバーＱ、チオレドキシン相互作用タンパク質、仮想タンパク質LOC339290、ＮＣＫ関連タンパク質１、ＴＢＣ１ドメインファミリー、メンバー１７、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、チオレドキシン相互作用タンパク質、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、および溶質担体ファミリー３３(アセチル−ＣｏＡトランスポーター)、メンバー１から成る群から選択される複数のバイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝子に曝し；
バイオマーカー遺伝子の分布を、既知参照化合物の遺伝子発現の分布と比較し；そして
試験化合物をバイオマーカー遺伝子の発現に基づき化合物のクラスに分け、ここで、化合物のクラスが遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物である、
工程を含む、方法。
【請求項２０】
予測モデルを使用した化合物の遺伝毒性の予測法であって：
試験化合物をEST370545、ホモ・サピエンスアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)、ホモ・サピエンス染色体１２オープン・リーディング・フレーム５  ｍＲＮＡ、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、カルボキシペプチダーゼＭ、プレキシンＢ２、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、仮想タンパク質FLJ12484、KIAA0907タンパク質、転写座位、ＡＲＰ９、wb67g03、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有カリウム大コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＭベータメンバー３、KAT11914、ミトコンドリア担体３反復１、ｔａｘ１(Ｉ型ヒトＴ細胞白血病ウイルス)結合タンパク質３、セストリン１、ｒｅｔフィンガータンパク質、ＳＭＡＤ、ホモ・サピエンスマイトジェン誘導性遺伝子ｍｉｇ−２、FLJ10378タンパク質、仮想タンパク質MGC7036、ユビキチン結合酵素、KIAA0368、ホスファチジルセリン受容体、Ｏ連結Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)トランスフェラーゼ(ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ)、Ｍｄｍ２、仮想タンパク質LOC51061、ＮｕｄＥ核分散遺伝子Ｅ同族体様１(A. nidulans)、ＨＴＰＡＰタンパク質、およびシンデカン１から成る群から選択される複数のバイオマーカー−２(ＢＭ２)遺伝子に曝し；
バイオマーカー遺伝子の分布を、既知参照化合物の遺伝子発現の分布と比較し；そして
試験化合物をバイオマーカー遺伝子の発現に基づき化合物のクラスに分け、ここで、化合物のクラスが遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物である
工程を含む、方法。
【請求項２１】
予測モデルを使用した化合物の遺伝毒性の予測法であって：
試験化合物をＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、プレクストリン相同様ドメイン、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、Ｆボックスタンパク質２２、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２  Ｂ(ＴＰ５３誘導性)、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、ホスホヒスチジンホスファターゼ１、仮想タンパク質FLJ20296、ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー１、転写座位、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、ヒト受容体チロシンキナーゼＤＤＲ遺伝子、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、601565341F1 NIH_MGC_21ホモ・サピエンスｃＤＮＡクローン、Ｆボックスタンパク質２２、サイトゾルシアル酸９−Ｏ−アセチルエステラーゼ同族体、ＢＴＧファミリーメンバー２、アストロタクチン２、ＩＫＫ相互作用タンパク質、サーフェイト４、中性スフィンゴミエリナーゼ(N-SMase)活性化関連因子、ＡＤＰリボシル化因子様１、ゴルジ再集合スタッキングタンパク質２、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有、混合系統白血病、仮想タンパク質LOC253981、胎盤特異的８、グルタチオンペルオキシダーゼ１、ＫＤＥＬ(Lys-Asp-Glu-Leu)小胞体タンパク質保持受容体２、シンタキシン７、リソソーム関連マルチスパンニング膜タンパク質−５、およびホスホイノシチド−３−キナーゼ触媒アルファポリペプチドから成る群から選択される複数のバイオマーカー−３(ＢＭ３)遺伝子に曝し；
バイオマーカー遺伝子の分布を、既知参照化合物の遺伝子発現の分布と比較し；そして
試験化合物をバイオマーカー遺伝子の発現に基づき化合物のクラスに分け、ここで、化合物のクラスが遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物である
工程を含む、方法。
【請求項２２】
差別的な細胞成分のセットの同定法であって、ここで、差別的なセットを候補薬剤を特徴付けするために使用し：
ａ)少なくとも１個のモデル毒性化合物を提供し；
ｂ)化合物が細胞上に予定された程度の毒性を発揮する濃度を評価し；
ｃ)細胞を予定された毒性濃度の化合物に曝し；
ｄ)細胞成分のクラスを細胞から単離し、そしてそのクラスの複数のメンバーの存在、非存在または濃度を別々に評価し；そして
ｅ)その化合物の特徴付けに関与するクラスのメンバーを同定し；それにより差別的なセットを提供する
工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
薬剤候補物について毒物学的試験を行うことは、しばしば時間がかかり、長い仕事である。発癌性のようなエンドポイントの予測は終了まで数ヶ月または数年かかる可能性があり、多数の実験動物を必要とする。インビトロ試験系(例えば、エイムズ試験、またはインビトロ小核アッセイ)は費用および時間を減らすことを可能にし、前臨床試験において日常的に使用されている。一つの細菌遺伝子に対する遺伝学的効果を利用するＡｍｅｓ試験は、しかしながら哺乳動物、とりわけヒトにおける遺伝子の相互作用ネットワークにおける毒物学的効果にわずかな関連しかない。故に、リード候補物のヒト安全性懸念の早期の検出を可能にする信頼できるインビトロ試験系が、開発化合物の後期の損失を防止するために改善される必要がある。
【０００２】
トキシコゲノミクス  −  毒物学における遺伝子発現の使用  −  は、新規に開発された候補薬剤の望まない副作用の決定において薬剤安全性グループを助ける新規ツールである。トキシコゲノミクスベースの試験は、遺伝子発現変化が数時間または数日間以内に見ることができるとの事実を利用する。予測的トキシコゲノミクスは、化合物の毒性効果の可能性を予測し、比較するために十分に定義されたマーカー遺伝子の小セットを使用するだけでよく、それによりリード物質最適化のための初期薬剤候補物の選択を助ける。予測的トキシコゲノミクスは、マーカー遺伝子セットの定義のために、最初だけマイクロアレイ実験を必要とする。予測的マーカー遺伝子選別を、次いでより安く、よりハイスループットの遺伝子発現分析法を使用して、実行できる。
【０００３】
予測的トキシコゲノミクスにおいて、好ましくはマーカー遺伝子のセットとしてまたは少数のマーカー遺伝子セットとして、適切なマーカー遺伝子を同定するために適用できる、確固たる方法の開発の強い要求がある。さらに、用いる試験系におよび試験する対象薬剤候補物の性質に非常に無関係なままであるマーカー遺伝子のセットの同定のための緊急の要求がある。本発明はこれらのおよび関連する要求に取り組む。
【発明の開示】
【０００４】
発明の要約
本発明は、ある種の予測遺伝子が、遺伝毒性または非遺伝毒性化合物の選別に使用できるとの発見に基づく。本発明は、故に、慣用の遺伝毒性化合物スクリーニング法に比べて時間を節約する、速いハイスループットスクリーニング法を提供する。
【０００５】
従って、一つの局面において、本発明は予測モデルを使用した化合物の遺伝毒性の予測法に関する。これは、キャリブレーションセットのサンプルからの遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物に曝したときに変化した発現プロファイルを示す複数のバイオマーカー遺伝子を同定することにより行う。バリデーションセットのサンプルからの遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物に曝したときに変化した発現プロファイルを示すバイオマーカー遺伝子のサブセットをキャリブレーションセットから同定する。バリデーションセットのサンプルで同定されたバイオマーカー遺伝子を、遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物に応答するものとして分類する。分類したバイオマーカー遺伝子を、次いで、試験化合物を細胞サンプルに曝し、サンプル中のバイオマーカー遺伝子の発現プロファイルを、バリデーションセットのサンプルにおいて同定されたものと比較することにより、試験化合物の遺伝毒性の同定に使用する。キャリブレーションサンプルに基づいて、予測モデルは、試験サンプルの毒性を予測するために構築された。
【０００６】
分類したバイオマーカー遺伝子は、バイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝子、バイオマーカー−２(ＢＭ２)遺伝子およびバイオマーカー−３(ＢＭ３)遺伝子から成る群から選択できる。バイオマーカー−１遺伝子は、色素性乾皮症、相補性群Ｃ、フェレドキシンレダクターゼ、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ、仮想タンパク質MGC5370、障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２、４８kDa、転写座位、パピリン、プロテオグリカン様硫酸化糖タンパク質、フコシダーゼ、アルファ−Ｌ−１、組織、カルボキシペプチダーゼＭ、腫瘍タンパク質ｐ５３誘導性タンパク質３、サイクリン依存性キナーゼインヒビター１Ａ(ｐ２１、Ｃｉｐ１)、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、仮想タンパク質FLJ10375、液胞タンパク質ソーティング５４(酵母)、hv89d09、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、ホスファチジルセリン受容体、アルファ−心臓性アクチン、仮想タンパク質FLJ11383、ｒａｓ同族体遺伝子ファミリー、メンバーＱ、チオレドキシン相互作用タンパク質、仮想タンパク質LOC339290、ＮＣＫ関連タンパク質１、ＴＢＣ１ドメインファミリー、メンバー１７、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、チオレドキシン相互作用タンパク質、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、および溶質担体ファミリー３３(アセチル−ＣｏＡトランスポーター)、メンバー１を含むが、これらに限定されない。一つの態様において、バイオマーカー−１遺伝子は、色素性乾皮症、相補性群Ｃ、フェレドキシンレダクターゼ、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ、仮想タンパク質MGC5370、および障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２、４８kDaから成る群から選択される。
【０００７】
バイオマーカー−２遺伝子は、EST370545、ホモ・サピエンスアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)、ホモ・サピエンス染色体１２オープン・リーディング・フレーム５  ｍＲＮＡ、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、カルボキシペプチダーゼＭ、プレキシンＢ２、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、仮想タンパク質FLJ12484、KIAA0907タンパク質、転写座位、ＡＲＰ９、wb67g03、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有カリウム大コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＭベータメンバー３、KAT11914、ミトコンドリア担体３反復１、ｔａｘ１(Ｉ型ヒトＴ細胞白血病ウイルス)結合タンパク質３、セストリン１、ｒｅｔフィンガータンパク質、ＳＭＡＤ、ホモ・サピエンスマイトジェン誘導性遺伝子ｍｉｇ−２、FLJ10378タンパク質、仮想タンパク質MGC7036、ユビキチン結合酵素、KIAA0368、ホスファチジルセリン受容体、Ｏ連結Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)トランスフェラーゼ(ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ)、Ｍｄｍ２、仮想タンパク質LOC51061、ＮｕｄＥ核分散遺伝子Ｅ同族体様１(A. nidulans)、ＨＴＰＡＰタンパク質、およびシンデカン１を含むが、これらに限定されない。一つの態様において、バイオマーカー−２遺伝子はEST370545、ホモ・サピエンスアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)、ホモ・サピエンス染色体１２オープン・リーディング・フレーム５  ｍＲＮＡ、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、およびイソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)から成る群から選択される。
【０００８】
バイオマーカー−３遺伝子は、ＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、プレクストリン相同様ドメイン、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、Ｆボックスタンパク質２２、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２  Ｂ(ＴＰ５３誘導性)、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、ホスホヒスチジンホスファターゼ１、仮想タンパク質FLJ20296、ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー１、転写座位、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、ヒト受容体チロシンキナーゼＤＤＲ遺伝子、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、601565341F1 NIH_MGC_21ホモ・サピエンスｃＤＮＡクローン、Ｆボックスタンパク質２２、サイトゾルシアル酸９−Ｏ−アセチルエステラーゼ同族体、ＢＴＧファミリーメンバー２、アストロタクチン２、ＩＫＫ相互作用タンパク質、サーフェイト４、中性スフィンゴミエリナーゼ(N-SMase)活性化関連因子、ＡＤＰリボシル化因子様１、ゴルジ再集合スタッキングタンパク質２、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有混合系統白血病、仮想タンパク質LOC253981、胎盤特異的８、グルタチオンペルオキシダーゼ１、ＫＤＥＬ(Lys-Asp-Glu-Leu)小胞体タンパク質保持受容体２、シンタキシン７、リソソーム関連マルチスパンニング膜タンパク質−５、およびホスホイノシチド−３−キナーゼ触媒アルファポリペプチドを含むが、これらに限定されない。一つの態様において、バイオマーカー−３遺伝子はＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、およびアデノシンデアミナーゼ、プレクストリン相同様ドメインから成る群から選択される。
【０００９】
他の局面において、本発明は、バイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝子、バイオマーカー−２(ＢＭ２)遺伝子およびバイオマーカー−３(ＢＭ３)遺伝子から成る群から選択される複数のバイオマーカー遺伝子の第一セットに試験化合物を曝すことによる、予測モデルを使用した化合物の遺伝毒性の予測法に関する。バイオマーカー遺伝子の分布を、既知参照化合物の遺伝子発現と比較し、試験化合物を、予測モデルのカスケードを使用して、バイオマーカー遺伝子の発現に基づいて化合物のクラスに分類し、ここで、化合物のクラスが遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物である。
【００１０】
さらに別の局面において、本発明は、試験化合物を、色素性乾皮症、相補性群Ｃ、フェレドキシンレダクターゼ、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ、仮想タンパク質MGC5370、障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２、４８kDa、転写座位、パピリン、プロテオグリカン様硫酸化糖タンパク質、フコシダーゼ、アルファ−Ｌ−１、組織、カルボキシペプチダーゼＭ、腫瘍タンパク質ｐ５３誘導性タンパク質３、サイクリン依存性キナーゼインヒビター１Ａ(ｐ２１、Ｃｉｐ１)、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、仮想タンパク質FLJ10375、液胞タンパク質ソーティング５４(酵母)、hv89d09、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、ホスファチジルセリン受容体、アルファ−心臓性アクチン、仮想タンパク質FLJ11383、ｒａｓ同族体遺伝子ファミリー、メンバーＱ、チオレドキシン相互作用タンパク質、仮想タンパク質LOC339290、ＮＣＫ関連タンパク質１、ＴＢＣ１ドメインファミリー、メンバー１７、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、チオレドキシン相互作用タンパク質、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、および溶質担体ファミリー３３(アセチル−ＣｏＡトランスポーター)、メンバー１から成る群から選択される複数のバイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝子に曝すことによる、予測モデルを使用した化合物の遺伝毒性の予測法に関する。バイオマーカー遺伝子の発現プロファイルを既知参照化合物の遺伝子発現の分布と比較し、次いで、試験化合物を、バイオマーカー遺伝子の発現に基づき化合物のクラスに分け、ここで、化合物のクラスが遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物である。
【００１１】
さらに別の局面において、本発明は、試験化合物を、EST370545、ホモ・サピエンスアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)、ホモ・サピエンス染色体１２オープン・リーディング・フレーム５  ｍＲＮＡ、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、カルボキシペプチダーゼＭ、プレキシンＢ２、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、仮想タンパク質FLJ12484、KIAA0907タンパク質、転写座位、ＡＲＰ９、wb67g03、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有カリウム大コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＭベータメンバー３、KAT11914、ミトコンドリア担体３反復１、ｔａｘ１(Ｉ型ヒトＴ細胞白血病ウイルス)結合タンパク質３、セストリン１、ｒｅｔフィンガータンパク質、ＳＭＡＤ、ホモ・サピエンスマイトジェン誘導性遺伝子ｍｉｇ−２、FLJ10378タンパク質、仮想タンパク質MGC7036、ユビキチン結合酵素、KIAA0368、ホスファチジルセリン受容体、Ｏ連結Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)トランスフェラーゼ(ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ)、Ｍｄｍ２、仮想タンパク質LOC51061、ＮｕｄＥ核分散遺伝子Ｅ同族体様１(A. nidulans)、ＨＴＰＡＰタンパク質、およびシンデカン１から成る群から選択される複数のバイオマーカー−２(ＢＭ２)遺伝子に曝すことによる、予測モデルを使用した化合物の遺伝毒性の予測法に関する。バイオマーカー遺伝子の分布を既知参照化合物と比較する。試験化合物をバイオマーカー遺伝子の発現に基づいて化合物のクラスに分類し、ここで、化合物のクラスが遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物である。
【００１２】
さらに別の局面において、本発明は、試験化合物を、ＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、プレクストリン相同様ドメイン、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、Ｆボックスタンパク質２２、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２  Ｂ(ＴＰ５３誘導性)、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、ホスホヒスチジンホスファターゼ１、仮想タンパク質FLJ20296、ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー１、転写座位、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、ヒト受容体チロシンキナーゼＤＤＲ遺伝子、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、601565341F1 NIH_MGC_21ホモ・サピエンスｃＤＮＡクローン、Ｆボックスタンパク質２２、サイトゾルシアル酸９−Ｏ−アセチルエステラーゼ同族体、ＢＴＧファミリーメンバー２、アストロタクチン２、ＩＫＫ相互作用タンパク質、サーフェイト４、中性スフィンゴミエリナーゼ(N-SMase)活性化関連因子、ＡＤＰリボシル化因子様１、ゴルジ再集合スタッキングタンパク質２、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有混合系統白血病、仮想タンパク質LOC253981、胎盤特異的８、グルタチオンペルオキシダーゼ１、ＫＤＥＬ(Lys-Asp-Glu-Leu)小胞体タンパク質保持受容体２、シンタキシン７、リソソーム関連マルチスパンニング膜タンパク質−５、およびホスホイノシチド−３−キナーゼ触媒アルファポリペプチドから成る群から選択される複数のバイオマーカー−３(ＢＭ３)遺伝子に曝すことによる、予測モデルを使用した化合物の遺伝毒性の予測法に関連する。バイオマーカー遺伝子の分布を既知参照化合物と比較する。試験化合物をバイオマーカー遺伝子の発現に基づいて化合物のクラスに分類し、ここで、化合物のクラスが遺伝毒性化合物または非遺伝毒性化合物である。
【００１３】
図面の簡単な説明
図１。記載の遺伝毒性および非遺伝毒性化合物(ポイント１−９)の希釈の関数としてのＧ２期の細胞の割合と、ポイント１０−１２のコントロールサンプルのグラフ表示。元のカラー画像をコンピュータでグレースケールに変換している。
【００１４】
図２。生細胞数により表示した、発現データから抽出した全２１５個の候補遺伝子の遺伝子発現と６個の参照化合物の主成分分析法のグラフ表示。ｔ[１](横座標)は変動の最高比率を説明する主成分＃１のスコアを示し、そしてｔ[２](縦座標)は主成分＃２のスコアを示す。上パネル：点が着色された元画像；下パネル：コンピュータでグレースケールに変換した画像。見られる通り、細胞数は無作為に散乱し、遺伝毒性または非遺伝毒性分離を説明しない。
【００１５】
図３。アラマーブルーで標識した全２１５個の候補遺伝子の遺伝子発現の主成分分析法のグラフ表示。ｔ[１](横座標)は変動の最高比率を説明する主成分＃１のスコアを示し、そしてｔ[２](縦座標)は主成分＃２のスコアを示す。上パネル：点が着色された元画像；下パネル：コンピュータでグレースケールに変換した画像。見られる通り、アラマーブルー細胞数は無作為に散乱し、遺伝毒性または非遺伝毒性分離を説明しない。
【００１６】
図４。全２１５個の遺伝子で行った部分的最小二乗法−判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)のＰＣ１(主成分１；ｔ[１])のスコア。カラーの元画像をコンピュータでグレースケールに変換している。
【００１７】
図５。６個の参照化合物に基づいて２３個の最良予測遺伝子で行ったＰＬＳ−ＤＡのＰＣ１(主成分１；ｔ[１])のスコア。カラーの元画像をコンピュータでグレースケールに変換している。
【００１８】
図６。６個の参照化合物後の細胞毒性および遺伝毒性化合物の２３個の予測遺伝子についてのクラスター解析。上パネルは点が着色された元画像を示し、そして下パネルはコンピュータでグレースケールに変換した画像を示す。
【００１９】
図７。細胞毒性および遺伝毒性化合物についての６個の予測遺伝子のクラスター解析。上パネルは点が着色された元画像を示し、そして下パネルはコンピュータでグレースケールに変換した画像を示す。
【００２０】
図８。全６個の予測遺伝子で行ったＰＬＳ−ＤＡのＰＣ１(主成分１；ｔ[１])のスコア。カラーの元画像をコンピュータでグレースケールに変換している。
【００２１】
図９。無作為応答順列による予測モデルのバリデーション。ｘ軸は、元の毒性クラスのセットと順列を入れ替えたものとのとの相関を示す；ｙ軸は、計算したＲ２(適合度)およびＱ２(予測度)値を示す。カラーの元画像をコンピュータでグレースケールに変換している。
【００２２】
図１０Ａは、左手側はバイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝毒性サンプルクラスターおよび右手側は非遺伝毒性のキャリブレーションおよびバリデーションサンプルの偏差値の散布図である；分離線はｘ＝０である。トランスプラチンサンプル以外の他の全てのバリデーションサンプルが正しく予測された。
【００２３】
図１０Ｂは、ＢＭ１の応答順列(ｎ＝１００回)によるバリデーションのグラフである。このタイプのバリデーションのために、サンプルのクラス構成員を無作為に混ぜ、予測モデルを構築した。ランダムデータでのこれらのモデルの性能を、Ｒ２およびＱ２切片の観点から評価し、(ｘ＝１)の正しいクラス構成員で得られたモデルの性能パラメータと比較する。
【００２４】
図１１Ａは、バイオマーカー−２(ＢＭ２)のキャリブレーションおよびバリデーションサンプルの偏差値の散布図である。左手側は遺伝毒性サンプルクラスターおよび右手側は非遺伝毒性；分離線はｘ＝０である。トランスプラチンサンプル以外、他の全てのバリデーションサンプルが正しく予測された。
【００２５】
図１１Ｂは、ＢＭ２の応答順列(ｎ＝１００回)によるバリデーションのグラフである。サンプルのクラス構成員を無作為に混ぜ、予測モデルを構築した。ランダムデータでのこれらのモデルの性能をＲ２およびＱ２の観点から評価し、正しいクラス構成員で得られたモデルの性能パラメータと比較する。
【００２６】
図１２Ａは、バイオマーカー−３(ＢＭ３)のキャリブレーションおよびバリデーションサンプルの偏差値の散布図である。左手側は遺伝毒性サンプルクラスターおよび右手側は非遺伝毒性；分離線はｘ＝０である。トランスプラチンサンプル以外、他の全てのバリデーションサンプルが正しく予測された。
【００２７】
図１２Ｂは、ＢＭ３の応答順列(ｎ＝１００回)によるバリデーションのグラフである。サンプルのクラス構成員を無作為に混ぜ、予測モデルを構築した。ランダムデータでのこれらのモデルの性能を、Ｒ２およびＱ２の観点から評価し、正しいクラス構成員で得られたモデルの性能パラメータと比較する。
【００２８】
発明の詳細な記載
薬剤について、開発プログラムの初期に行う毒性試験は、インビトロでしばしば行われ、しばしば、第三者検査機関により許容されないと見なされる試験の代表である。このような試験はそれにも係わらず、インビボ臓器毒性のような開発プログラム後期の毒性試験におけるエンドポイントの予測に役立ち得る。後期のエンドポイントの予測は複雑な問題であり、一般に一つの初期マーカーと相関しない。故に、数個の初期マーカー(例えば、転位置、微小核、または遺伝子発現のような細胞マーカー、タンパク質)を含むアプローチは、他の一エンドポイント系よりも優れているはずである。しかし、このような“多エンドポイントアプローチ”は、適切な試験要素を同定するためによりさらに洗練された“予測機能”を必要とする。これは、本発明において、システムのトレーニングにより達成される。
【００２９】
本発明において、毒性は、遺伝毒性のための予測モデルにおけるクラス予測またはクラス識別系を使用して確立される。ここで使用する用語“予測モデル”は、化合物を複数の遺伝子の遺伝子発現のレベルに基づいて遺伝毒性または非遺伝毒性化合物に評価および分類するために、遺伝子の発現プロファイルおよびコンピュータアルゴリズムを使用するシステムを意味する。バイオマーカー遺伝子は、遺伝子発現のレベルが加重値を与える加重投票制度により同定されている。遺伝子の予測的性能をクロス−バリデーションによりさらに評価する。これは、遺伝毒性の予測となるある種の遺伝子を同定する。得られる予測モデルを、次いで、分類した遺伝子の発現に基づいて、化合物が遺伝毒性または非遺伝毒性であるかを同定するのに使用できる。
【００３０】
実施例に詳述する本発明の態様において、化合物の２クラス、すなわち、遺伝毒性および非遺伝毒性を確立した。一般に、２クラスを超えて定義し得る。診断／予測目的のために開発されたツールは教師付きか、または知識ベースの方法(例えば、ベイジアンネットワーク、ｋ−最近接(ＫＮＮ)、部分的最小二乗法−判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)、またはサポートベクターマシン)である。実施例の態様において、ある種の教師付きツールをクラス予測に使用するために設計する。選択したクラスの最も有効な予測を可能にする遺伝子を同定する。これらの方法は、分類アルゴリズムの、モデルクラス化合物を使用して予測的遺伝子について得た発現プロファイルのような参照データでのトレーニングを含む。要約すると、一つの単独エンドポイント(例えば、コロニー数)を調査する代わりに、最適化された予測または識別機能の開発を、選択したマーカー遺伝子のセットの発現を使用して行う。
【００３１】
ここに記載の一般的分類法において、マーカー遺伝子のセットを同定するために、細胞を、培養中複数のクラスの化合物に曝さなければらなない。好ましくは、各化合物について、この暴露を含む同定法の前に、細胞が予定された程度の細胞毒性を示す化合物の濃度を決定する。一般に使用される方法において、予定された毒性レベルは５０％細胞毒性である。それにも係わらず、細胞について、毒性の何らかの意図するレベル、例えば、化合物の２０％、２５％、３０％、４０％、６０％、７０％、７５％、８０％毒性を予定できる；加えて、毒性の予定されたレベルは、本発明の分野の当業者の要求または意図に従い、ここに挙げた値以外であり得る。毒性レベルのこの決定の重要な局面は、同じ予定された毒性レベルを、同定法において用いる全化合物について選択することである。これは、同定法において用いる各化合物に対する細胞の応答が、方法中の全化合物で同等となることを確実にする。
【００３２】
予定されたレベルの毒性の評価において、細胞生存能または、逆に、細胞死(例えば、ＴＫ６ヒトリンパ芽球様細胞)を証明する全ての方法を、細胞に対する化合物の予定されたレベルの細胞毒性の評価に用いることができる。生きた細胞と死んだ細胞を分ける多くの色素が、本発明に関連する分野の当業者に既知である。とりわけトリパンブルー色素およびアラマーブルーであり、各々クロモフォアおよびフルオロフォアである。他の生死判別試薬は、Guava ViaCountTM(Guava Technologies, Hayward, CA)、およびバイオルミネッセンスに基づいたCellTiter-Glo(登録商標)発光細胞生存能アッセイ(Promega, Madison, WI)を含む。本発明の分野の当業者に既知の細胞生存能または死を証明する同等な方法は本発明の範囲内である。
【００３３】
全化合物の予定された毒性レベルに対応する濃度が決定されたら、細胞を、別々にその濃度の各化合物に曝す。有利な態様において、同じ細胞を予定された毒性レベルの確立および細胞に対するその化合物の効果のアッセイに使用する。しかしながら同じ細胞を２ステージの方法に使用する必要はない。記載の通り、様々な化合物を試験する。化合物は、複数のクラスを代表するように選択する。
【００３４】
故に、最小で、化合物を毒性と非毒性のような２クラスに分けるが、さらに多様な特定の特質により分類を作製するのが有利である。特定化の例は、非限定的例として、遺伝毒性、腎毒性、肝毒性、神経毒性、細胞毒性などを含み、全ての既知の臓器特異的、組織特異的毒性もしくは他のクラスの毒性または病理学をカバーする。いずれの場合も、非遺伝毒性、非腎毒性などのようなネガティブ分類、すなわち、第一のクラスと反対のクラスも使用できる。さらに、毒性特定化の各カテゴリーの中で、直接的または間接的遺伝毒性、および／またはある臓器毒性を担う異なる病理学を代表するクラスのようなサブクラスが存在する。本発明の分野の当業者に既知の化合物の全ての同等な分類を用いることができ、本発明の範囲内に入る。
【００３５】
本発明の方法において、細胞に対する種々の化合物の効果の評価のモダリティーは、細胞と試験する化合物のインキュベートの何らかの結果を含む。故に、例えば、細胞形態、細胞代謝または生理、何らかの細胞表現型、差次的遺伝子発現、差次的タンパク質発現、差次的代謝物発現、および類似の現象または特質が、問題の化合物と同じクラスに入らない化合物により証明されない化合物により誘発される特徴的効果の同定に役立つ。実施例において示す態様において、差次的遺伝子発現は実験のアウトプットを提供する；差次的に発現される遺伝子を、細胞サンプルから得たＲＮＡと、細胞が由来する種の全ゲノムの大部分を包含するプローブをハイブリダイズすることにより評価する。使用した複数のクラス中の種々の化合物に曝した全細胞からの実験のアウトプットを、上記に同定したような教師付き統計法により評価する。本発明に関連する分野の当業者に既知の、トレーニングできる評価法を提供する全ての同等な統計分析のセットを、ある細胞を他のものから分けに役立つ細胞特性の同定に使用できる。本発明の重要な態様において、細胞特性は、その差次的発現が、使用する化合物のクラスを最適に分ける遺伝子を含む。この方法で同定されたこれらの特性は、候補薬剤を分類するために本発明において使用すべき特性の予測セットとなる。
【００３６】
前段落に記載のような方法は、候補薬剤のような新規化合物の分類に使用される細胞特性のセットを提供する。本発明の重要な態様において、細胞特性の同定に使用されたクラスは、毒性対非毒性として分類されており、そしてある例の場合においては、クラスは遺伝毒性対非遺伝毒性、または遺伝毒性対純粋に細胞毒性である。実施例において詳述する他の重要な態様において、毒性対非毒性を識別するために用いる細胞特性は、差次的発現により同定される遺伝子のコード配列および教師付き統計解析法の適用を含む。
【００３７】
本発明は、試験化合物の毒性または非毒性、および特に、遺伝毒性または非遺伝毒性、または遺伝毒性または細胞毒性としての有効な分類を可能にする、ここｎ記載のもののような方法により同定された単離ポリヌクレオチドのセットを提供する。これらのポリヌクレオチドセットは、上記のようなある毒性分類のサブセットまたはサブクラスの間の分類をさらに可能にする。本セットは、試験化合物の分類法において使用すべき２個以上の単離ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド(下記に説明の通り、これらの用語は、本明細書においては交換可能に使用される)を含む。一般にポリヌクレオチドを差次的遺伝子発現アッセイのプローブとして使用し、すなわち、それらはオリゴヌクレオチドプローブとして役立つ。２個以上、または３個以上、または４個以上、さらに多数のオリゴヌクレオチドのセットは、ここに記載するアッセイ法において使用するために、本発明において初めて同定された。重要な事に、完全コード配列は、典型的に、その差次的発現が試験化合物の分類に使用できるものであるとして同定されており、そして、完全コード配列が特定のプローブポリヌクレオチドを構成できるが、有利なことにプローブオリゴヌクレオチドはこのようなコード配列のフラグメントである。より包括的に、プローブポリヌクレオチドはａ)NCBI(National Center for Biotechnology Information)受託番号(別名GenBankまたはRefseq受託番号)により同定される配列のような完全コード配列；ｂ)アイテムａ)のコード配列に相補的なヌクレオチド配列；ｃ)アイテムａ)において同定されているコード配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列；ｄ)アイテムｃ)において同定したヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；またはｅ)アイテムａ)からｄ)のヌクレオチド配列のいずれかのフラグメントであるヌクレオチド配列のいずれかである。
【００３８】
ここで使用する用語“試験”、および関連する用語および句は、本発明の分類法において有用であると同定されるであろう化合物もしくは組成物集団のメンバー、または、本方法において使用してこれらの化合物または組成物を評価した結果としてそのように同定された実際の化合物または組成物のいずれかである、化合物または組成物に関する。本発明の重要な態様において、試験化合物は試験ポリヌクレオチドまたは試験タンパク質またはポリペプチドである。故に、試験物質は、モデル化合物または候補化合物でサンプルを処置後に見ることができる。
【００３９】
ここで使用する用語“サンプル”および類似の用語は、全ての細胞またはその成分、あるいは、無傷の細胞中の核酸、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはタンパク質もしくはポリペプチド、または代謝物、または小器官または他の成分の形と同一の、または最小限変えられた、核酸、ポリヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、またはタンパク質もしくはポリペプチド、生化学的代謝物、細胞内小器官、脂質、ポリサッカライドのような細胞成分を含む全ての物質、組成物または物体、または全ての細胞成分に関する。ここで使用するサンプルはモデル化合物または候補薬剤で処置されている。広く、サンプルは、無傷の細胞から成る生物学的サンプルであり得る。この広い意味で、サンプル中のＤＮＡはゲノムＤＮＡであり、そしてサンプル中のＲＮＡはｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、および類似のまたは他のＲＮＡ、例えば、排他的でなく、ミクロＲＮＡを含む。サンプルはまた、細胞のサンプルからの核の単離、または細胞のサンプルに含まれる核の分裂のような工程の観点から、ゲノムＤＮＡから最低限変えられたＤＮＡを含み得る。別の意味で、サンプルは細胞内フラクション、または細胞内成分または小器官でありえ、または、無傷の細胞を見るとき、細胞自体または細胞の細胞内領域であり得る。
【００４０】
ここで使用する用語“参照”または“コントロール”および類似の用語は、“サンプル”について上記で定義した全ての物質、組成物または物体であるが、ただし、モデル化合物または候補化合物で処置されている代わりに、参照は処置されていないか、または他の化合物を含まない担体もしくは媒体のみで処置されている。より広く、参照は、確かにコントロールとして、または非実験状態の特徴として役立つ源由来である。
【００４１】
Ｉ. 検出および標識
試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドまたは何らかの試験細胞成分のような試験物質を多くの方法で検出できる。検出は、試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドの存在および量を観察できる結果をもたらす何らかの１個またはそれ以上の方法を含み得る。一つの態様において、サンプル核酸含有試験ポリヌクレオチドを伸展、または増幅前に検出できる。別の態様において、サンプル中の試験ポリヌクレオチドを伸展、または増幅して、伸展された試験ポリヌクレオチドを提供し、該伸展されたポリヌクレオチドを検出または定量する。物理学的、化学的または生物学的方法を使用して、試験ポリヌクレオチドを検出および定量できる。
【００４２】
物理学的方法は、非限定的例として、光学的可視化は、蛍光顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、インサイチュ・ハイブリダイゼーションの顕微鏡可視化、表面にプローブを結合させ、試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドの固定化プローブへの結合の検出のためのＳＰＲを使用するような表面プラズモン共鳴(ＳＰＲ)検出、またはクロマトグラフ媒体中にプローブを含ませ、クロマトグラフ媒体中の試験ポリヌクレオチドの結合を検出するような、種々の顕微鏡法を含む。物理学的方法は、さらに、試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドが他のポリヌクレオチドまたはポリペプチドから分解し、本分解した試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドを検出するゲル電気泳動またはキャピラリー電気泳動形態を含む。物理学的方法は、さらに、広く、非限定的に吸収分光学、蛍光またはリン光分光学、赤外線分光学、マイクロ波分光学、総内部反射率分光学、核磁気共鳴分光学および電子スピン共鳴分光学を含む、物質の検出または定量のための任意の分光法を含む。
【００４３】
化学的方法は、試験ポリヌクレオチドがプローブにハイブリダイズするハイブリダイゼーション法全般を含む。化学的方法はまた、代謝物のような細胞成分の検出のための全ての診断または酵素アッセイを含む。ポリペプチドおよびある種の他の細胞成分の検出のための化学的方法はまた免疫アッセイ法を含む。このような免疫アッセイ法は、ドットブロット法、ウェスタンブロット法、競合的および非競合的タンパク質結合アッセイ、酵素結合免疫吸着検定法(ＥＬＩＳＡ)、免疫組織化学、蛍光標識細胞分取(ＦＡＣＳ)、および本発明に関連する分野の当業者に一般に使用され、広く知られているその他を含むが、これらに限定されない。
【００４４】
生物学的方法は、試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドが細胞に生物学的作用を発揮させるようにし、その作用を検出することを含む。本発明は、生物学的アッセイとして使用できる生物学的効果の例を記載する。多くの態様において、ポリヌクレオチドを、検出および定量の助けとなるように下記の通り標識できる。例えば、サンプル核酸を標識ヌクレオチドまたは標識オリゴヌクレオチドリンカーのような標識部分の化学的または酵素添加により標識できる。試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドの検出の多くの同等な方法が本発明の分野に関連する分野の当業者に既知であり、本発明の範囲内であると意図される。
【００４５】
本発明の核酸は、広範なＰＣＲ増幅法のいずれかに従って適切なオリゴヌクレオチドプライマーと共に、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡまたは任意の他のタイプのＲＮＡ、あるいは、ゲノムＤＮＡを鋳型として使用して伸展できる。このように増幅された核酸を、適切なベクターにクローン化し、ＤＮＡ配列分析により特徴付けできる。さらに、試験ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドを、標準合成法により、例えば、自動ＤＮＡ合成装置を使用して製造できる。
【００４６】
伸展されたポリヌクレオチドを直接検出および／または定量できる。例えば、伸展されたポリヌクレオチドを、サイズにより分離するゲル電気泳動に付し、その存在および量を確認する色素で染色し得る。あるいは、伸展試験ポリヌクレオチドを、ハイブリダイズ条件(下記参照)下でプローブ核酸に曝し、ハイブリダイゼーションによる結合を検出および／または定量する。検出を、試験ポリヌクレオチドがプローブと結合していることを測定できる何らかの方法で達成する。これは、ハイブリダイズフラグメントによりもたらされたプローブの物理学的特性の変化の検出により達成できる。このような物理学的検出法の非限定的例は表面プラスマ共鳴(ＳＰＲ)である。
【００４７】
検出を達成するための別の方法は、標識された形の試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドを使用し、結合した標識を検出することである。ポリヌクレオチドは、核酸の伸展法中にさらなる特性として、または他の方法により標識する。標識は、フラグメント内に、フラグメント集団の伸展に使用した組成物に含まれる修飾ヌクレオチドを使用することにより取り込ませ得る。標識は、例えば、その放射活性により検出可能な125Ｉ、35Ｓ、32Ｐ、14Ｃ、または3Ｈのような放射性同位体標識であり得る。あるいは、標識を、それが、例えば分光法を使用して検出できるように選択し得る。一例として、標識は入射光線を吸収するクロモフォアであり得る。好ましい標識は、発光により検出できるものである。発光は、蛍光、リン光、および化学発光を含む。故に、蛍光を発する、またはリン光を発する、または化学発光反応を誘発する標識を用い得る。適当な蛍光標識、または蛍光色素の例は、152Ｅｕ標識、フルオレッセイン標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン標識、Ｃｙ−３、Ｃｙ−５、アロフィコシアニン標識、ｏ−フタルアルデヒド標識、およびフルオレサミン標識を含む。発光標識は、高感度の検出を可能にする。
【００４８】
標識は、さらに、電子常磁性共鳴により検出可能な安定な遊離ラジカル標識、または核磁気共鳴により検出可能な核標識のような磁気共鳴標識であり得る。標識は、なおさらに、特異的リガンド−受容体対中のリガンドであり得る；リガンドの存在を、次いで一般にそれ自体検出用に標識された特異的受容体の二次的結合により検出する。このようなリガンド−受容体対の非限定的例は、ビオチンおよびストレプトアビジンまたはアビジン、ハプテ、例えばジゴキシゲニンまたは抗原およびその特異的抗体などを含む。標識はまたさらに、試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドに追加された融合配列であり得る。このような融合は試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドの単離および／または検出および定量を可能にする。非限定的例として、融合配列はＦＬＡＧ配列、ポリヒスチジン配列、蛍光タンパク質配列、例えば緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、アルカリホスファターゼ、グルタチオントランスフェラーゼなどであり得る。要約すると、標識は、本明細書に関連する分野の当業者に既知の広範な方法により達成できる。試験ポリヌクレオチドまたは試験ポリペプチドの検出および／または定量を可能にする全ての同等な標識が、本発明の範囲内に入ると理解される。
【００４９】
標識を含む、検出、定量法は、非限定的例として、分光学、核酸化学、生化学、分子生物学および細胞生物学を含む、本発明に関連する分野の当業者に一般に既知である。定量は、プローブに結合している核酸またはポリヌクレオチド、またはそのフラグメントの量、質量、または濃度の測定を可能にする。定量は、このおよび前の段落に奇異債の通りの物理学的、化学的、または生物学的特性が変化した量の測定を含む。例えば、標識が発生するシグナルの強度を、プローブに結合した核酸の量の評価に使用できる。プローブ核酸にハイブリダイズしたポリヌクレオチドまたはそのフラグメントの存在および／または量、質量、または濃度を検出する全ての同等な方法は、本発明の範囲内にあるとみなす。
【００５０】
II. ポリヌクレオチド
ここで使用する用語“核酸”および“ポリヌクレオチド”および類似の用語および句は、互いに同義語であるとみなされ、生化学、分子生物学、ゲノミクス、および本発明の分野に関連する類似の分野の当業者により慣用的に理解されている通りに使用する。本発明で用いるポリヌクレオチドは一本鎖であってよく、またはそれは塩基対形成した二本鎖構造、またはさらに三本鎖の塩基対形成した構造であってよい。ポリヌクレオチドはＤＮＡ、ＲＮＡ、または、非限定的例として、ＤＮＡ−ＲＮＡ二本鎖構造のようなＤＮＡ鎖とＲＮＡ鎖の何らかの混合物または組合せであり得る。ここで使用するポリヌクレオチドおよび“オリゴヌクレオチド”は、鎖の長さ以外、ポリヌクレオチドについてここで定義された何らかのそして全ての特性に関して同一である。ここで使用するポリヌクレオチドは約５０ヌクレオチドまたは塩基対長またはそれより長くてよく、約６０、または約７０、または約８０、または約１００、または約１５０、または約２００、または約３００、または約４００、または約５００、または約７００、または約１０００、または約１５００、または約２０００または約２５００、または約３０００、ヌクレオチドまたは塩基対長またはそれより長い長さであってよい。オリゴヌクレオチドは、少なくとも３ヌクレオチドまたは塩基対長であってよく、約７０、または約６０、または約５０、または約４０、または約３０、または約２０、または約１５、または約１０ヌクレオチドまたは塩基対長より短くてよい。ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの両方とも化学的に合成できる。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドはプローブとして使用できる。
【００５１】
ここで使用する“フラグメント”および類似の用語は、参照の完全配列より短い核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの一部、またはタンパク質またはポリペプチドの一部に関する。フラグメント中の塩基の配列、またはアミノ酸残基の配列は、それがもたらされた分子の対応する部分から変えられていない；それがもたらされた分子の対応する部分と比較して、フラグメント中に挿入または欠失はない。ここで意図される、核酸またはポリヌクレオチド、例えばオリゴヌクレオチドのフラグメントは、１５以上の塩基長、または１６以上、１７以上、１８以上、２１以上、２４以上、２７以上、３０以上、５０以上、７５以上、１００以上の塩基長で、完全長配列よりも１塩基短いまでの長さである。ポリヌクレオチドの全てのフラグメントを化学的に合成でき、プローブとして使用できる。
【００５２】
ここでおよび特許請求の範囲中で使用する“ヌクレオチド配列”、“オリゴヌクレオチド配列”または“ポリヌクレオチド配列”、“ポリペプチド配列”、“アミノ酸配列”、“ペプチド配列”、“オリゴペプチド配列”、および類似の用語は、交換可能に、そのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、またはポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが有する塩基またはアミノ酸の配列、ならびに、その配列が所有オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、またはポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチド構造の両方に関連する。ヌクレオチド配列またはポリヌクレオチド配列、またはポリペプチド配列、ペプチド配列またはオリゴペプチド配列は、さらに全ての天然または合成ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、または塩基もしくはアミノ酸の配列が、当分野で慣用的に用いられる塩基またはアミノ酸を明示する特定の配列の記載または引用により定義されているポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドに関する。
【００５３】
ヌクレオチド残基は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中の連続した位置を占拠する。従ってヌクレオチドの修飾または誘導は、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド中の任意の連続した位置で起こり得る。全ての修飾または誘導体化されたオリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドは、本発明に包含され、特許請求の範囲の範囲内に入る。修飾または誘導体は、リン酸基、モノサッカライドまたは塩基で起こり得る。このような修飾は、非限定的例として、修飾塩基、およびその糖リン酸骨格修飾または誘導体化されている核酸を含む。これらの修飾は、それらが、例えば、対象において治療に適用するためのアンチセンス結合核酸として使用できるように、少なくとも一部、修飾した核酸の化学的安定性の安定性を高めるために行う。
【００５４】
ここでおよび特許請求の範囲で使用する“核酸”または“ポリヌクレオチド”、およびこれらに基づく類似の用語は、天然に存在するヌクレオチドから成るポリマーならびに合成または修飾ヌクレオチドから成るポリマーを意味する。故に、ここで使用するＲＮＡであるポリヌクレオチド、またはＤＮＡであるポリヌクレオチドは、天然に存在する塩基およびリボースまたはデオキシリボース環のような天然に存在する部分を含み得るか、またはそれらは下記に記載の通りの合成または修飾部分であり得る。ヌクレオチドの間の結合は、一般に天然ホスホジエステル結合、ホスホチオエステル結合であり得る３'−５'リン酸結合、およびさらに他の合成結合である。修飾骨格の例は、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよび３'−アルキレンホスホネート、５'−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含む他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３'−アミノホスホロアミデートおよびアミノアルキルホスホロアミデートを含むホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェートおよびボラノホスフェートを含む。さらなる結合は、ホスホトリエステル、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチルエステル、アセトアミデート、カルバメート、チオエーテル、架橋ホスホロアミデート、架橋メチレンホスホネート、架橋ホスホロチオエートおよびスルホンヌクレオチド間結合を含む。他の重合結合は、これらの２'−５'結合した類似体を含む。引用により本明細書に包含させる米国特許６,５０３,７５４および６,５０６,７３５およびそこに引用された引用文献を参照のこと。モノサッカライドは、例えば、リボースまたはデオキシリボース以外にペントースまたはヘキソースであることにより修飾され得る。モノサッカライドはまたヒドロキシル基をヒドロまたはアミノ基で置換することにより、さらなるヒドロキシル基をエステル化することなどによりまたさらに置換され得る。
【００５５】
オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの塩基は、プリン塩基アデニン(Ａ)およびグアニン(Ｇ)、およびピリミジン塩基チミン(Ｔ)、シトシン(Ｃ)およびウラシル(Ｕ)を含む、“非修飾”または“天然”塩基であり得る。加えて、それらは修飾または置換された塩基であり得る。ここで使用する修飾塩基は、５−メチルシトシン(５−ｍｅ−Ｃ)、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミンおよび２−チオシトシン、５−ハロウラシルおよびシトシン、５−プロピニルウラシルおよびシトシンおよびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、５−ウラシル(シュードウラシル)、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチルおよび他の５−置換ウラシルおよびシトシン、７−メチルグアニンおよび７−メチルアデニン、２−フルオロ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニンおよび８−アザアデニン、７−デアザグアニンおよび７−デアザアデニンおよび３−デアザグアニンおよび３−デアザアデニンのような他の合成および天然塩基を含む。さらなる修飾塩基は、フェノキサジンシチジン(１Ｈ−ピリミド[５,４−ｂ][１,４]ベンゾキサチン−２(３Ｈ)−オン)、フェノチアジンシチジン(１−ピリミド[５,４−ｂ][１,４]ベンゾチアジン−２(３Ｈ)−オン)のような三環式ピリミジン、置換フェノキサジンシチジン(例えば、９−(２−アミノエトキシ)−Ｈ−ピリミド[５,４−ｂ][１,４]ベンゾキサチン−２(３Ｈ)−オン)、カルバゾールシチジン(２Ｈ−ピリミド[４,５−ｂ]インドル−２−オン)、ピリドインドールシチジン(Ｈ−ピリド[３',２'：４,５]ピロロ[２,３−ｄ]ピリミジン−２−オン)のようなＧ−クランプを含む。修飾塩基はまた、プリンまたはピリミジン塩基が他のヘテロ環で置換されているもの、例えば７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドンも含み得る。
【００５６】
さらなる塩基は、米国特許３,６８７,８０８に記載のもの、The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering, pages 858-859, Kroschwitz, J. I., ed. John Wiley & Sons, 1990に記載のもの、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition(1991)30, 613に記載のもの、およびSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B., ed., CRC Press, 1993に記載のものを含む。ある種のこれらの塩基は、特に本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を高めるのに有用である。これらは、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含む、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジンおよびＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換は、０.６−１.２℃核酸二本鎖安定性を高めることが示されており(Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. and Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278)、現在好ましい塩基置換であり、特に２'−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わさったとき、さらにそうである。引用して本明細書に包含させる米国特許６,５０３,７５４および６,５０６,７３５およびその中の引用文献参照。
【００５７】
ヌクレオチドはまた標識を有するように修飾できる。例えば、蛍光標識またはビオチン標識を担持するヌクレオチドは、Sigma(St. Louis, MO)から入手可能である。
【００５８】
ここで使用する“単離”核酸分子は、核酸の天然源に存在する少なくとも１個の他の核酸分子から分離されたものである。単離核酸分子の例は、組み換えポリヌクレオチド分子、ベクターに含まれる組み換えポリヌクレオチド配列、異種宿主細胞中に維持される組み換えポリヌクレオチド分子、部分的にまたは実質的に精製された核酸分子、および合成ＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。好ましくは、“単離”核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡにおいて、その核酸に天然では隣接する配列(すなわち、核酸の５'および３'末端に位置する配列)がない。例えば、種々の態様において、単離試験核酸分子は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいて、その核酸分子と天然では隣接する約５０kb、２５kb、５kb、４kb、３kb、２kb、１kb、０.５kbまたは０.１kb未満のヌクレオチド配列の配列を含み得る。さらに、ｃＤＮＡ分子のような“単離”核酸分子は、組み換え技術により産生したときは他の細胞物質または培養培地が、または化学的に合成したときは、化学的前駆体または他の化学物質が実質的にないことが可能である。
【００５９】
本発明において使用する核酸分子、例えば、NCBI GenBankまたはRefseq受託番号によりここで同定したヌクレオチド配列を有する核酸分子、またはこれらのヌクレオチド配列のいずれかの相補鎖は、標準分子生物学法およびここに提供する配列情報を使用して、単離できる。ここで、NCBI受託番号により同定するいずれかの配列の核酸配列の全てまたは一部をハイブリダイゼーションプローブとして使用して、試験核酸配列を、単離ｕｓｉｎｇ標準ハイブリダイゼーションおよびクローニング法(例えば、Sambrook et al., eds., MOLECULAR CLONING: A Laboratory Manual 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001; およびBrent et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (2003)に記載の通り)を使用して単離できる。
【００６０】
ここで使用する用語“相補的”は、核酸分子のヌクレオチド単位間のWatson-CrickまたはHoogsteen塩基対形成を意味する。ここでおよび特許請求の範囲で使用する用語“相補的”および類似の用語は、核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの一つの鎖中の第一の核酸塩基が、核酸、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの第二の鎖中の特定の第二の核酸塩基とのみ特異的に相互作用する能力に関する。非限定的例として、天然に存在する塩基を考慮するとき、ＡとＴまたはＵは互いに相互作用し、そしてＧとＣは互いに相互作用する。本明細書および特許請求の範囲で用いる、“相補的”は、領域内で“完全に相補的”、すなわち、少なくともその領域中、２個のポリヌクレオチド鎖を互い配置したとき、一つの鎖中の連続塩基の配列における核塩基が、逆の鎖上の同じ長さの連続塩基の相互作用配列と相補的であることを表すことを意図する。
【００６１】
ここで使用する“ハイブリダイズ”、“ハイブリダイゼーション”および類似の用語は、鎖と相補的配列を互いに相互作用させることにより、核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチド二本鎖を形成させる方法に関する。本相互作用は、対を形成するために特異的に相互作用する鎖の各々の上の相補的塩基のために起こる。互いにハイブリダイズする鎖の能力は、下記に明示する通りの、様々な条件に依存する。各鎖の十分な数の対応する位置が、互いに相互作用できるヌクレオチドにより占有されているとき、核酸鎖は互いにハイブリダイズする。非限定的例として分子生物学者および細胞生物学者を含む本発明の分野の当業者により、二本鎖を形成する鎖の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、互いに１００％相補的である必要なない。
【００６２】
他の態様において、本発明の単離核酸分子は、ヌクレオチド配列ｉｎ  ここでNCBI GenBankまたはRefseq受託番号により同定したいずれかの配列、またはそのヌクレオチド配列の一部の相補鎖である核酸分子である。ここでNCBI GenBankまたはRefseq受託番号により同定したヌクレオチド配列に相補的な核酸分子は、ここでNCBI GenBankまたはRefseq受託番号により同定したヌクレオチド配列と十分相補的であり、すなわち、ここでNCBI GenBankまたはRefseq受託番号により同定したヌクレオチド配列とほとんどまたは全くミスマッチがなく水素結合でき、それにより安定な二本鎖を形成できるものである。
【００６３】
核酸、ポリヌクレオチド、またはオリゴヌクレオチドの顕著な使用は、プローブ核酸がハイブリダイズする標的配列の同定を目的としたアッセイにおいてである。標的に対するプローブの選択性は、ハイブリダイズ条件のストリンジェンシーにより影響される。ハイブリダイゼーション反応の“ストリンジェンシー”は、当業者により容易に決定でき、そして一般にプローブ長、温度、および緩衝液組成に依存した経験的評価である。ハイブリダイゼーションは、一般に変性したＤＮＡが、相補的鎖がそれらの融解温度より低い環境に存在するときに、再アニールする能力に依存する。相対的温度が高いほど、反応条件はストリンジェントになり、温度が低いほど、ストリンジェントは低くなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーおよび様々なストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件の同定のさらなる詳細および説明については、Brent et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, (2003), およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., New York: Cold Spring Harbor Press, 2001を参照のこと。加えて、高処理または多重アッセイ系において、プローブ特性およびストリンジェンシーの両方とも、単一セットのストリンジェンシー条件下で、多重アッセイの目的を達成できるように、最適化できる。
【００６４】
ここで定義する“ストリンジェント条件”または“高ストリンジェンシー条件”の非限定的例は：(１)洗浄のために低イオン強度および高温、例えば０.０１５Ｍ  塩化ナトリウム／０.００１５Ｍ  クエン酸ナトリウム／０.１％ドデシル硫酸ナトリウム、５０℃を用いるか；(２)ハイブリダイゼーション中、ホルムアミド、例えば、５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドのような変性剤と、０.１％ウシ血清アルブミン／０.１％Ficoll／０.１％ポリビニルピロリドン／５０mM  リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.５と７５０mM  塩化ナトリウム、７５mM  クエン酸ナトリウムを４２℃で用いるか；(３)５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０.７５Ｍ  ＮａＣｌ、０.０７５Ｍ  クエン酸ナトリウム)、５０mM  リン酸ナトリウム(ｐＨ６.８)、０.１％ピロリン酸ナトリウム、５×デンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μg／ml)、０.１％ＳＤＳ、および１０％硫酸デキストラン、４２℃を、４２℃で０.２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)および５０％ホルムアミドで５５℃で洗浄し、その後の０.１×ＳＳＣ含有ＥＤＴＡ、５５℃から成る高ストリンジェンシー洗浄を用い、または(４)５０℃で７％ドデシル硫酸ナトリウム(ＳＤＳ)、０.５Ｍ  ＮａＰＯ4、１mM  ＥＤＴＡを、２×ＳＳＣ、０.１％ＳＤＳ、５０℃の洗浄と共に用いるものを含む。
【００６５】
“中程度のストリンジェント条件”は、非限定的例として、上記のものより低いストリンジェントの洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度および％ＳＤＳ)の使用を含む。中程度のストリンジェント条件の例は、一晩、３７℃で：２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０mM  ＮａＣｌ、１５mM  トリクエン酸ナトリウム)、５０mM  リン酸ナトリウム(ｐＨ７.６)、５×デンハルト溶液、１０％硫酸デキストラン、および２０mg／ml  変性して剪断したサケ精子ＤＮＡ中のインキュベーション、続く１×ＳＳＣで約３７−５０℃でのフィルターの洗浄を含む。当業者は、プローブ長などのような因子に適応させるために必要な温度、イオン強度などをどのように調節するか認識する。
【００６６】
III. 変異体試験ポリヌクレオチド
本発明は、さらに、記載の試験ヌクレオチド配列と異なる核酸分子を含む。例えば、配列は、遺伝コードの縮重のために異なる。これらの核酸は、故に、NCBI GenBankまたはRefseq受託番号によりここで同定する配列に示すヌクレオチド配列によりコードされるのと同じ試験タンパク質をコードする。このような態様において、本発明の単離核酸分子は、NCBIまたは同等なGenBankまたはRefseq受託番号によりここで同定したアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。
【００６７】
NCBI GenBankまたはRefseq受託番号によりここで同定したヒト試験ヌクレオチド配列に加えて、試験タンパク質のアミノ酸配列に変化をもたらすＤＮＡ対立遺伝子配列多形が集団(例えば、ヒト集団)内に存在し得ることは当業者に認識される。このような天然対立遺伝子変異は、典型的に試験遺伝子のヌクレオチド配列中、１−５％分散をもたらし得る。天然対立遺伝子変異の結果であり、試験タンパク質の機能活性を変えないこのようなヌクレオチド変化および結果としての試験タンパク質におけるアミノ酸多形の何れかかよび全て、本発明の範囲内であると意図される。
【００６８】
さらに、他の種からの試験オルソログをコードする、および故に、ここでNCBI GenBankまたはRefseq受託番号により同定したいずれかの配列のヒト配列と異なるヌクレオチド配列を有する、核酸分子は、本発明の範囲内であると意図される。天然対立遺伝子多形に対応する核酸分子および本発明の試験ｃＤＮＡのオルソログは、ヒトｃＤＮＡまたはその一部をストリンジェントハイブリダイゼーション条件下の標準ハイブリダイゼーション法に従った、ハイブリダイゼーションプローブとして使用することにより、ここに記載のヒト試験核酸とのそれらの相同性に基づいて単離できる。
【００６９】
IV. ポリペプチド
ここで使用する用語“タンパク質”、“ポリペプチド”、または“オリゴペプチド”、およびそれらに基づく類似の用語は、ペプチド結合で結合しているアルファアミノ酸のポリマーに関する。アルファアミノ酸は、核酸、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドのトリプレットコドンによりコードされるものを含む。それらはまた、遺伝コードによりコードされるものと異なる側鎖を有するアミノ酸も含み得る。
【００７０】
ここで使用する本発明において開示するポリペプチドまたはタンパク質の“成熟”形態は、天然に存在するポリペプチドまたは前駆体形態またはプロタンパク質の産物である。天然に存在するポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質は、非限定的例として、対応する遺伝子によりコードされる、完全長遺伝子産物を含む。あるいは、それはここに記載のオープン・リーディング・フレームによりコードされるポリペプチド、前駆体またはプロタンパク質として定義できる。“成熟”形態の産物は、また非限定的例として、遺伝子産物が生する細胞、または宿主細胞内で起こり得る通りの１個以上の天然に存在する処理工程に起因する。ポリペプチドまたはタンパク質の“成熟”形態に至るこのような処理工程は、オープン・リーディング・フレームの開始コドンによりコードされるＮ末端メチオニン残基の切断、またはシグナルペプチドまたはリーダー配列のタンパク質分解的切断を含む。故に、残基１ないしＮ(ここで、残基１はＮ末端メチオニンである)を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生ずる成熟形態は、Ｎ末端メチオニンの除去後に残る残基２ないしＮを有するはずである。あるいは、残基１ないしＮ(ここで、残基１ないし残基ＭまでのＮ末端シグナル配列が切断されている)を有する前駆体ポリペプチドまたはタンパク質から生じる成熟形態は、残る残基Ｍ＋１ないし残基Ｎを有するはずである。さらなるここで使用するポリペプチドまたはタンパク質の“成熟”形態は、タンパク質分解的切断以外の翻訳後修飾の工程により生じ得る。このような付加的工程は、非限定的例として、グリコシル化、ミリストイル化またはリン酸化を含む。一般に、成熟ポリペプチドまたはタンパク質は、これらの工程のだた一つのみ、またはこれらのいずれかの組合せの作用に由来し得る。
【００７１】
本発明の方法により同定した試験タンパク質またはポリペプチドは、別のスプライシング過程の産物であり得る。故に、タンパク質同族体は、除去されたエキソンによりコードされる配列を欠く遺伝子産物を生じる、特定のｍＲＮＡから除去されたゲノムＤＮＡに見られるある種のエキソンを有し得ると見なされる。
【００７２】
ここで使用する“アミノ酸”は、タンパク質において見られる天然に存在するアルファ−アミノ酸のいずれか１個を意味する。加えて、用語“アミノ酸”は、タンパク質化学、生化学、および本発明に関連する他の分野の当業者に既知の天然に存在しない全てのアミノ酸を意味する。これらは、非限定的例として、サルコシン、ヒドロキシプロリン、ノルロイシン、アロイソロイシン、シクロヘキシルアラニン、フェニルグリシン、ホモシステイン、ジヒドロキシフェニルアラニン、オルニチン、シトルリン、天然に存在するＬ−アミノ酸のＤ−アミノ酸異性体、およびその他を含む。加えて、アミノ酸は、例えば側鎖と標識をカップリングすることにより、修飾または誘導体化し得る。当業者に既知の全てのアミノ酸を、ここに記載のポリペプチドに包含できる。
【００７３】
ここで使用するとき、用語“エピトープ標識した”は、“標識ポリペプチド”に融合した試験ポリペプチドを含む、キメラポリペプチドを意味する。標識ポリペプチドは、それに対して抗体を製造できるのにエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、それが誘導したポリペプチドの活性を妨害しないのに十分な程に小さい。標識ポリペプチドは、好ましくはまた抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように、相当独特である。適当な標識ポリペプチドは、一般に少なくとも６アミノ酸残基および通常約８〜５０アミノ酸残基(好ましくは、約１０〜２０アミノ酸残基)を有する。
【００７４】
ここで使用する用語“活性な”または“活性”および類似の用語は、天然のまたは天然に存在する試験物の生物学的および／または免疫学的活性を保持するポリペプチドの形態(複数もある)に関し、ここで、“生物学的”活性は、天然のまたは天然に存在する試験が持つ抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘発する能力以外の、天然のまたは天然に存在する試験物によりもたらされる生物学的機能(阻害性または刺激性いずれか)に関し、そして“免疫学的”活性は、天然のまたは天然に存在する試験物が持つ抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘発する能力に関する。
【００７５】
Ｖ. ２個以上の配列の間の類似性の決定
２個のアミノ酸配列または２個の核酸の類似性％を決定するために、配列を、最適比較目的のために配置する(例えば、配列の最適配置について比較する配列のいずれかに、ギャップを挿入できる)。ここで使用するアミノ酸またはヌクレオチド“同一性”はアミノ酸またはヌクレオチド“相同性”と同義である。
【００７６】
用語“配列同一性”は、２個のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が、比較する特定の領域にわたり、残基−対−残基ベースで同一である程度に関する。用語“配列同一性の％”は、比較する領域にわたり２個の最適に配置した配列の比較により計算し、マッチする位置の数を産するために同一核酸塩基(例えば、核酸の場合、Ａ、ＴまたはＵ、Ｃ、Ｇ、またはＩ)が両配列で生ずる位置の数を決定し、マッチする位置の数を比較する領域の位置の総数(すなわち、ウィンドー幅)で割り、そして結果を１００倍して、配列同一性の％を産する。ここで使用する用語“実質的同一性”は、ポリヌクレオチドが、参照配列と比較領域にわたり比較して、少なくとも８０％配列同一性、好ましくは少なくとも８５％同一性およびしばしば９０〜９５％配列同一性、より普通には少なくとも９９％配列同一性を有する配列を含む、ポリヌクレオチド配列の特徴を意味する。ポリペプチドにおいて、“ポジティブ残基の％”は、２個の最適に配置した配列を比較の領域にわたり比較することにより計算し、マッチする位置の数を産するために上記で定義の通りの同一および保存的アミノ酸置換が、両配列で生ずる位置の数を決定し、マッチする位置の数を比較領域の位置の総数(すなわち、ウィンドー幅)で割り、結果を１００倍して、ポジティブ残基の％を産する。
【００７７】
同分野で既知の通り“同一性”は、配列の比較により決定した、２個以上のポリペプチド配列または２個以上のポリヌクレオチド配列の間の関係である。当分野で“同一性”はまた、場合によっては、このような配列の間のマッチにより決定した、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列の間の配列関係性の程度も意味する。“同一性”および“類似性”は、Computational Molecular Biology, Lesk. A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I. Griffin, A.M., and Griffin, H.G., eds. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; and Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M Stockton Press. New York, 1991; およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math. (1988) 48: 1073に記載の方法を含むが、これらに限定されない既知方法により容易に計算できる。同一性を決定するための好ましい方法は、試験配列間の最大のマッチを与える。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータプログラム法は、ＧＣＧプログラムパッケージ(Devereux, J., et al. (1984)Nucleic Acids Research 12(1): 387)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、およびＦＡＳＴＡ(Atschul, S.F. et al. (1990)J. Molec. Biol. 215: 403-410)を含むが、これらに限定されない。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、NCBIおよび他の源から公的に入手可能である(BLAST Manual, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH Bethesda, MD. 20894; Altschul, S., et al. (1990)J. Mol. Biol. 215: 403-410)。既知のSmith Watermanアルゴリズムもまた同一性の決定に使用できる。
【００７８】
加えて、ＢＬＡＳＴアラインメントツールは、２配列間の類似性および同一性％の検出に有用である。ＢＬＡＳＴは、National Center for Biotechnology InformationのサイトからWorld Wide Web上で入手可能である。ＢＬＡＳＴ分析を記載する参考文献は、Madden, T.L., Tatusov, R.L. & Zhang, J. (1996)Meth. Enzymol. 266: 131-141; Altschul, S.F., Madden, T.L., Schaeffer, A.A., Zhang, J., Zhang, Z., Miller, W. & Lipman, D.J. (1997)Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402; そして Zhang, J. & Madden, T.L. (1997)Genome Res. 7: 649-656を含む。
【００７９】
VI. 試験タンパク質およびポリペプチド
本発明において用いるタンパク質は、その配列が、NCBIまたは同等なGenBankまたはRefseq受託番号によりここで同定される任意の配列に提供されている単離試験タンパク質である。本発明はまたその残基のいずれかがNCBIまたは同等なGenBankまたはRefseq受託番号によりここで同定される配列の対応する残基と異なるが、まだその試験タンパク質様活性および生理学的機能を維持するタンパク質をコードする突然変異体または変異体タンパク質、またはその機能的フラグメントを含む。例えば、本発明は、上記の変異体試験核酸によりコードされるポリペプチドを含む。突然変異体または変異体タンパク質において、残基の２０％までまたはそれ以上がこのように変化してよい。
【００８０】
一般に、試験タンパク質様機能を保存する試験タンパク質様変異体は、配列中の特定の位置の残基が他のアミノ酸により置換されており、さらに親タンパク質の２残基の間に１個またはそれ以上の残基が挿入する可能性ならびに親配列から１個以上の残基が欠失する可能性を含む、任意の変異体を含む。任意のアミノ酸置換、挿入、または欠失が本発明により包含される。有利な状況において、本置換は、上記で定義の本質的ではないまたは保存的置換である。さらに、本発明の範囲を限定しないが、NCBIまたは同等なGenBankまたはRefseq受託番号によりここで同定される任意の配列の位置を、突然変異体または変異体タンパク質が１個以上の置換を含み得るように置換してよい。
【００８１】
本発明はまた、単離試験タンパク質、およびその生物学的に活性な一部、またはその誘導体、フラグメント、類似体または同族体も含む。抗試験タンパク質抗体を産生するための免疫原として使用するのに適当なポリペプチドフラグメントも提供される。ペプチドまたはオリゴペプチドのようなタンパク質またはポリペプチドのフラグメントは、５アミノ酸以上の残基長、または６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１５以上、２０以上、２５以上、３０以上、５０以上、１００以上の残基長ないし、完全長配列より一つ短い長さまでであり得る。一つの態様において、天然の試験タンパク質を、標準タンパク質精製法を使用する適切な精製スキームにより、細胞または組織源から単離できる。他の態様において、試験タンパク質は、組み換えＤＮＡ法により産生する。組み換え発現に変えて、試験タンパク質またはポリペプチドを、標準ペプチド合成法を使用して化学的に合成できる。タンパク質およびポリペプチドの精製は、例えば、“Protein Purification, 3rd Ed.”, R.K. Scopes, Springer-Verlag, New York, 1994; “Protein Methods, 2nd Ed.,” D.M. Bollag, M.D. Rozycki, and S.J. Edelstein, Wiley-Liss, New York, 1996; および“Guide to Protein Purification”, M. Deutscher, Academic Press, New York, 2001のようなテキストに記載されている。
【００８２】
VII. 変異体試験タンパク質
集団中に存在し得る試験配列の天然に存在する対立遺伝子多形に加えて、当業者は、NCBI GenBankまたはRefseq受託番号によりここで同定するアミノ酸の変異体を、当業者が製造できることを当業者はさらに認識するであろう。変異体タンパク質は本方法で使用する細胞中に発生し得、または本方法におけるタンパク質発現の検出のための標準として働き得る。機能的タンパク質に至るまたは検出すべき能力を保持する全てのアミノ酸変化が、本発明の範囲内で意図される。従って、他の態様において、試験タンパク質は、NCBIまたは同等なGenBankまたはRefseq受託番号によりここで同定される任意の配列のアミノ酸配列と少なくとも約４５％類似、およびより好ましくは約５５％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、またはさらに９９％以上類似のアミノ酸配列を含むタンパク質である。
【００８３】
VIII. 抗試験タンパク質抗体
試験タンパク質の重要なクラスは、本発明の分類法において同定される試験タンパク質遺伝子産物と特異的に結合する抗体または抗体フラグメントである。同定した試験タンパク質もしくはフラグメントまたはその変異体と結合する抗体を、本試験タンパク質の検出に使用する。抗試験抗体は、抗原である試験タンパク質、フラグメントまたは変異体と結合するポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはその特異的結合部分であり得る。
【００８４】
IX. アレイ
本発明の重要な態様において単離ポリヌクレオチドのセットまたは単離ポリペプチドのセットを、固体支持体に付着して、アレイを形成させる。アレイに付着させるためのポリペプチドの有用なクラスは、抗試験抗体分子を含む。アレイ中の各位置またはスポットはアドレス可能であり、アレイ中の他の場所またはスポットと異なる。各場所を、そこに付着した組成物により同定できる。故に、原則として各場所は、その部位のアドレスにより同定する独特な組成物を担持する。非限定的例として、ポリヌクレオチドプローブから成るアレイにおいて、例えば、アレイの各場所は、ａ)NCBI(National Center for Biotechnology Information)GenBankまたはRefseq受託番号により配列同定したような完全コード配列；ｂ)アイテムａ)のコード配列に相補的なヌクレオチド配列；ｃ)アイテムａ)において同定したコード配列と少なくとも９０％同一のヌクレオチド配列；ｄ)アイテムｃ)において同定したヌクレオチド配列に相補的なヌクレオチド配列；またはｅ)アイテムａ)からｄ)のいずれかのｅヌクレオチド配列のフラグメントであるヌクレオチド配列のいずれかであるそこに付着されたプローブポリヌクレオチドを有し得る。タンパク質またはポリペプチド、または特定のタンパク質またはポリペプチドと特異的に結合する特異的結合剤のような他の組成物を、ポリヌクレオチドプローブの代わりにアレイの場所に付着し得る。
【００８５】
アレイを構築するための固体支持体の例は、膜、フィルター、スライド、紙、ナイロン、ウェハー、繊維、磁性または非磁性ビーズ、ゲル、管類、ポリマー、ポリビニルクロライド皿などを含むが、これらに限定されない。オリゴヌクレオチドが直接的または間接的に、共有結合または非共有結合的結合のいずれかにより結合できる全ての固体表面を使用できる。特に好ましい固体支持体は高密度マイクロアレイまたはGeneChip発現プローブアレイ(例えば、Affymetrix Inc., Santa Clara, Calif.のGeneChipTM)である。これらの高密度アレイは、アレイ上の予め選択した場所に特定のオリゴヌクレオチドプローブを含む。各々の予め選択した場所は、特定のプローブの１個以上の分子を含み得る。オリゴヌクレオチドが支持体上の特異的位置に存在するため、ハイブリダイゼーションパターンおよび強度(これらは一緒になって独特な発現プロファイルまたはパターンをもたらす)は、特定の遺伝子の発現レベルの観点で解釈される。
【００８６】
アレイは、当分野で既知の広範囲の方法のいずれかにより製造する。オリゴヌクレオチドおよび他の組成物のアレイの製造を記載する源の非限定的例は、Chetverin et al., “Oligonucleotide Arrays: New Concepts and Possibilities,” Biotechnology, 12: 1093-1099 (1994); Di Mauro et al., “DNA Technology in Chip Construction,” Adv. Mater., 5(5): 384-386 (1993); Dower et al., “The Search for Molecular Diversity (II): Recombinant and Synthetic Randomized Peptide Libraries,” Ann. Rep. Med. Chem., 26: 271-280 (1991); Diggelmann, “Investigating the VLSIPS synthesis process,” Sep. 9, 1994; 米国特許６,５０６,５５８；米国特許６,０５４,２７０；および米国特許５,８３０,６４５を含む。
【００８７】
Ｘ. 候補化合物の分類法
本発明は、どのクラスの毒性に、候補薬剤のような候補化合物が入るかの決定に関する。上記の通り、本発明における重要な意義あるクラス識別は、毒性と非毒性、または遺伝毒性と非遺伝毒性のような２要素識別、ならびにより複雑な分類スキームを含む。薬剤となり得る化合物の強いリード化合物の同定法を加速するために、この目的のためのインビトロアッセイのようなハイスループットアッセイの使用が遊離である。インビトロでの細胞ベースのアッセイがこのグループに含まれる。上記に詳述の通り、何らかの適当な細胞特性または細胞特性の群を、分類結果を提供するための識別力として同定し得る。これらは、非限定的例として、細胞形態、細胞代謝または生理学、何らかの細胞表現型、差次的遺伝子発現、差次的タンパク質発現、差次的代謝物発現、および類似の現象または特質を含む。
【００８８】
候補化合物を分類するために、化合物が有利な薬理学的または治療作用を発揮することが予測される濃度または濃度範囲を決定する。本方法のインビトロアッセイにおいて、インビボ試験で予測されるものを非常に反映する結果をアッセイにおいて提供すると見なされる適当な細胞を使用する。数複製されたサンプルにおいて、細胞を少なくとも１濃度の、および有利には数種の濃度の候補化合物に、毒性作用、または遺伝毒性作用のような作用が種々のクラスの細胞成分上に発揮されるのに十分と見なされる条件および期間、曝す。この方法の種々の態様において、分析し得る細胞成分のクラスの非限定的例は、ＤＮＡおよび種々のタイプの細胞ＲＮＡ種のような核酸、細胞のタンパク質およびポリペプチド成分、膜結合タンパク質およびポリペプチド、細胞の脂質成分、細胞、小器官およびその成分内で起こる生化学的に特異的な代謝物、および細胞のイオン成分を含む。十分な時間経過後、選択法において目的の細胞成分のメンバーを細胞から単離する。クラスの１以上のメンバーが分類を行うことを可能にする化合物の適用に応答することが既に決定されている。
【００８９】
ここで使用する用語“応答性”および類似の用語および句は、その存在、非存在または濃度が、細胞成分が由来する細胞を、モデル化合物または候補化合物とインキュベートしたとき、化合物なしのコントロールインキュベーションと比較して、測定可能に異なる細胞成分に関する。検出または他の有意に関する基準を超える測定可能な差異が、ここに記載の方法の実施に際して本発明の分野の当業者により課せられる。
【００９０】
この細胞成分のクラスの応答性メンバーを、次いでその存在、非存在または濃度を評価するための分析に付す。このクラスの応答性メンバーの全てについての結果の全体を、次いで実施例に記載の教師付き統計分析のような方法を使用して特徴付けし、その特徴が候補化合物を用いたのと同様に行う類似実験において毒性モデル化合物を使用したとき、または候補化合物での実験を行う前または行った後に得られた特徴と似ているか否か決定する。分析および特徴付けの結果は、候補化合物を、最初にモデル化合物で設定した分類系に依存して毒性もしくは非毒性、または遺伝毒性もしく非遺伝毒性などとして分類される結果を提供する。
【００９１】
XI. 差次的遺伝子発現を使用する候補化合物分類
候補化合物の分類法の重要な態様において、分析に付す細胞成分は、細胞と候補化合物との接触に応答する細胞に存在するＲＮＡ分子の集団である。候補化合物の特徴付けおよび分類前に、細胞は、差次的遺伝子発現を分析する方法を使用して、非毒性化合物とは逆に毒性化合物の適用により有意な形態で応答する、複数の遺伝子の同定のために使用されている。特に顕著な態様において特に顕著な態様において、本分類は、遺伝毒性またはその欠失に従い成されている。
【００９２】
この候補化合物の分類法において、最初に、化合物が予め決定された毒性(遺伝毒性または細胞毒性)作用を発揮する濃度または一連の濃度を同定する。次に、細胞を化合物の予定された毒性濃度または一連の濃度に曝す。候補化合物を細胞中のＲＮＡ発現に対して作用させた後、本細胞ＲＮＡ集団を単離する；記載の通り、少なくともある種のＲＮＡ種の存在、非存在または濃度が、考慮されている化合物のクラスに対して応答性であることが予め証明されている。応答性ＲＮＡ種の存在、非存在または濃度は、そのＲＮＡを、例えば少なくとも応答性遺伝子配列のフラグメントを含む複数のプローブヌクレオチド配列に対してハイブリダイゼーションすることにより決定する。最後に、ハイブリダイゼーション法を反映する発現パターンを使用して、特徴付けが、毒性モデル化合物を使用したとき、または非毒性モデル化合物を使用したときに得られる特徴付けと似ているか否かを決定する。この分析および決定の結果は、故に、候補化合物を分類する。遺伝毒性対非遺伝毒性、または遺伝毒性対細胞毒性のような他の分類を、モデル化合物のクラスの設立において使用できる。
【００９３】
実施例は、最初のトレーニングセットと見なされ得る遺伝毒性化合物の初期セット、ならびに、対象細胞培養中の差次的遺伝子発現における細胞毒性であるが遺伝毒性ではない化合物のセットの使用を記載する。実施例１−７において、転写プロファイルを、実験化合物を含まないコントロール、３個の既知の遺伝毒性化合物(シスプラチン、メタンスルホン酸メチル、およびマイトマイシンＣ)、または純粋に細胞毒性であることが既知の３個の化合物(ＮａＣｌ、リファンピシン、およびトランスプラチン)で処置したＴＫ６ヒトリンパ芽球様細胞から得た。
【００９４】
実施例１−７に報告する実験は、新規であると考えられる予測遺伝子の２セットの発現パターンを含む判別関数を提供した；２３遺伝子を含む第一のセットは、部分的最小二乗法−判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)を使用して同定し、２７予測遺伝子の第二のセットは、ＫＮＮ分析を使用して同定した。細胞毒性および遺伝毒性化合物で処置したサンプルを、何らかの誤分類なしに分類できるとして同定された６遺伝子が、両予測セットで共通して見られた。ＰＬＳ−ＤＡ由来の２３個の予測遺伝子のほとんどおよびＫＮＮの２７予測遺伝子のほとんどが、遺伝毒性に関連する分子事象との相関を直接的または間接的に示す。本遺伝子セットの選択したメンバーを、下記パラグラフに示す。
【００９５】
実施例８において、付加的参照化合物を、データセット中に包含した。これらは、５個の付加的な既知遺伝毒性化合物(エチルニトロソウレア、ドキソルビシンＨＣｌ、スチレンオキシド、硫酸ブレオマイシン、およびダウノルビシンＨＣｌ)、および純粋に細胞毒性が既知の５個の付加的化合物(ＫＣｌ、Ｎ−アセチルシステイン、ラニチジンＨＣｌ、フルフェナム酸、およびベラパミルＨＣｌ)を含む。
【００９６】
実施例８の結果は、最初の実験の結果をさらに確認し、ある種のバイオマーカー遺伝子を、本予測モデルにおける化合物の遺伝毒性の予測値として使用できるとの証拠を提供する。一つの態様において、化合物の遺伝毒性または非遺伝毒性を予測するために使用するバイオマーカー遺伝子のセットは、バイオマーカー−１(ＢＭ１)グループ中にある。これらは、色素性乾皮症、相補性群Ｃ、フェレドキシンレダクターゼ、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ、仮想タンパク質MGC5370、障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２、４８kDa、転写座位、パピリン、プロテオグリカン様硫酸化糖タンパク質、フコシダーゼ、アルファ−Ｌ−１、組織、カルボキシペプチダーゼＭ、腫瘍タンパク質ｐ５３誘導性タンパク質３、サイクリン依存性キナーゼインヒビター１Ａ(ｐ２１、Ｃｉｐ１)、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、仮想タンパク質FLJ10375、液胞タンパク質ソーティング５４(酵母)、hv89d09、インターロイキン６シグナルトランスデューサー(ｇｐ１３０、オンコスタチンＭ受容体)、ホスファチジルセリン受容体、アルファ−心臓性アクチン、仮想タンパク質FLJ11383、ｒａｓ同族体遺伝子ファミリー、メンバーＱ、チオレドキシン相互作用タンパク質、仮想タンパク質LOC339290、ＮＣＫ関連タンパク質１、ＴＢＣ１ドメインファミリー、メンバー１７、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、チオレドキシン相互作用タンパク質、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、ホスファチジルイノシトールグリカン、クラスＦ、および溶質担体ファミリー３３(アセチル−ＣｏＡトランスポーター)、メンバー１を含むが、これらに限定されない。一つの態様において、バイオマーカー−１遺伝子は色素性乾皮症、相補性群Ｃ、フェレドキシンレダクターゼ、アポリポタンパク質ＢｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ、仮想タンパク質MGC5370、および障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２、４８kDaから成る群から選択される。
【００９７】
一つの態様において、化合物の遺伝毒性または非遺伝毒性を予測するために使用するバイオマーカー遺伝子のセットは、バイオマーカー−２(ＢＭ２)グループ中にある。これらは、EST370545、ホモ・サピエンスアデノシンデアミナーゼ(ＡＤＡ)、ホモ・サピエンス染色体１２オープン・リーディング・フレーム５  ｍＲＮＡ、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、カルボキシペプチダーゼＭ、プレキシンＢ２、ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ、仮想タンパク質FLJ12484、KIAA0907タンパク質、転写座位、ＡＲＰ９、wb67g03、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有カリウム大コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＭベータメンバー３、KAT11914、ミトコンドリア担体３反復１、ｔａｘ１(Ｉ型ヒトＴ細胞白血病ウイルス)結合タンパク質３、セストリン１、ｒｅｔフィンガータンパク質、ＳＭＡＤ、ホモ・サピエンスマイトジェン誘導性遺伝子ｍｉｇ−２、FLJ10378タンパク質、仮想タンパク質MGC7036、ユビキチン結合酵素、KIAA0368、ホスファチジルセリン受容体、Ｏ連結Ｎ−アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)トランスフェラーゼ(ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン：ポリペプチド−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ)、Ｍｄｍ２、仮想タンパク質LOC51061、ＮｕｄＥ核分散遺伝子Ｅ同族体様１(A. nidulans)、ＨＴＰＡＰタンパク質、およびシンデカン１を含むが、これらに限定されない。一つの態様において、バイオマーカー−２遺伝子はＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、プレクストリン相同様ドメインから成る群から選択される。
【００９８】
一つの態様において、化合物の遺伝毒性または非遺伝毒性を予測するために使用するバイオマーカー遺伝子のセットは、バイオマーカー−３(ＢＭ３)グループ中にある。これらは、ＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、プレクストリン相同様ドメイン、外胚葉−神経皮質(ＢＴＢ様ドメインを伴う)、Ｆボックスタンパク質２２、リボヌクレオチドレダクターゼＭ２  Ｂ(ＴＰ５３誘導性)、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、イソクエン酸脱水素酵素１(ＮＡＤＰ＋)、ホスホヒスチジンホスファターゼ１、仮想タンパク質FLJ20296、ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー１、転写座位、グアニジノアセテートＮ−メチルトランスフェラーゼ、ヒト受容体チロシンキナーゼＤＤＲ遺伝子、トランスメンブラン７スーパーファミリーメンバー３、601565341F1 NIH_MGC_21ホモ・サピエンスｃＤＮＡクローン、Ｆボックスタンパク質２２、サイトゾルシアル酸９−Ｏ−アセチルエステラーゼ同族体、ＢＴＧファミリーメンバー２、アストロタクチン２、ＩＫＫ相互作用タンパク質、サーフェイト４、中性スフィンゴミエリナーゼ(N-SMase)活性化関連因子、ＡＤＰリボシル化因子様１、ゴルジ再集合スタッキングタンパク質２、ロイシンに富む反復配列および細胞死ドメイン含有混合系統白血病、仮想タンパク質LOC253981、胎盤特異的８、グルタチオンペルオキシダーゼ１、ＫＤＥＬ(Lys-Asp-Glu-Leu)小胞体タンパク質保持受容体２、シンタキシン７、リソソーム関連マルチスパンニング膜タンパク質−５、およびホスホイノシチド−３−キナーゼ触媒アルファポリペプチドを含むが、これらに限定されない。一つの態様において、バイオマーカー−３遺伝子はＬＡＧ１長寿確定同族体５(S. cerevisiae)、仮想タンパク質HSPC132、FKSG44遺伝子、およびアデノシンデアミナーゼ、プレクストリン相同様ドメインから成る群から選択される。
【００９９】
当業者は、バイオマーカー遺伝子の任意の１セット(すなわち、ＢＭ１、ＢＭ２またはＢＭ３)を単独で、または互いに組み合わせて使用できることを認識するであろう。例えば、化合物の遺伝毒性を予測するために、ＢＭ１グループからの遺伝子を、ＢＭ２グループからの遺伝子またはＢＭ３グループからの遺伝子と組み合わせて使用できる。
【０１００】
また本発明の範囲内であるのは、古典的遺伝毒性試験から同定された遺伝子を、化合物の遺伝毒性を予測するためのデータセットに包含できる、予測モデルの適合である。
【０１０１】
ここで行う実験から、多くの共通予測遺伝子が、細胞周期およびＤＮＡ修復過程において重要な役割を有することが同定された。数個の代表例は下記の通りである：
【０１０２】
色素性乾皮症グループＣ遺伝子(ＸＰＣ)：ヌクレオチド除去修復(ＮＥＲ)遺伝子ＸＰＣは、ＤＮＡ損傷誘発およびｐ５３制御遺伝子であり、ｐ５３依存性ＮＥＲ経路において役割を有する可能性がある。ＸＰＣ欠損は、シスプラチン処置介在ｐ５３応答を減少し、これは、ＸＰＣタンパク質がシスプラチン処置介在細胞応答において重要な役割を有することを示唆する。癌細胞薬剤耐性の可能性のある機構もまた示唆し得る(Wang G, Dombkowski A, Chuan L; Xu XX: Cell Res. 2004 Aug; 14(4): 303-14)。
【０１０３】
フェレドキシンレダクターゼ(ＦＤＸＲ)：フェレドキシンレダクターゼ遺伝子はｐ５３ファミリーにより制御され、細胞を酸化的ストレス誘発アポトーシスに感受性とする。それはＨ１２９９およびＨＣＴ１１６細胞の５−フルオロウラシル−、ドキソルビシン−およびＨ(２)Ｏ(２)介在アポトーシスに対する感受性を高める(Liu G, Chen X.: Oncogene. 2002 Oct 17; 21(47): 7195-204)。ＦＤＸＲは、ミトコンドリア中の酸化的ストレスの産生を介してｐ５３介在アポトーシスに関与する。
【０１０４】
アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒的ポリペプチド様３Ｃ(APOBEC3C)：APOBEC1は、ＲＮＡ編集成分の触媒成分であるが、その機能が免疫グロブリン遺伝子ＤＮＡの多様化を増強するタンパク質である、活性化誘発シチジンデアミナーゼ(ＡＩＤ)と相同性を示す。ここで、我々は、APOBEC1およびその同族体APOBEC3CおよびAPOBEC3Gが大腸菌アッセイにおいて強力なＤＮＡミューテーター活性を示すことを示す。実際、ＡＩＤと同様、これらのタンパク質は、ｄＣ脱アミノ化を介してＤＮＡ突然変異の引き金を引くように見える。しかしながら、各タンパク質は、異なる局所標的配列特異性を示す。結果は、活性なｄＣ／ｄＧミューテーターの可能性があるファミリーの存在を、癌への関与の可能性と共に確認する(Harris RS, Petersen-Mahrt SK, Neuberger MS.: Mol Cell. 2002 Nov; 10(5): 1247-53.)。
【０１０５】
リボソームタンパク質２７様(ＲＰＳ２７Ｌ)：ＤＮＡ損傷処置に対する感受性が増加したシロイヌナズナ劣性突然変異体が、Ｔ−ＤＮＡ挿入突然変異誘発により産生した８００ファミリーのうち１個で同定された。Ｔ−ＤＮＡは、その発現を防止するＳ２７リボソームタンパク質遺伝子(ＡＲＳ２７Ａ)の３個のうち１個のプロモーターにおける１２８７bpの染色体欠失を産生した。ａｒｓ２７Ａの実生は標準生育条件下で正常に発育し、翻訳の野生型習熟(proficiency)を示唆する。しかしながら、生育は、野生型に影響しない濃度でメチルメタンスルフェート(ＭＭＳ)を添加した培地で強く阻害された。この阻害は、補助的な根の代わりの腫瘍様構造の形成により達成された。致死量まで増加させた濃度のＭＭＳで処置した野生型実生は決してこのような性質を示さず、この表現型は、ＭＭＳなしまたは他のストレス条件下のａｒｓ２７Ａ植物でも見られなかった。故に、過敏症および腫瘍様増殖は、遺伝毒性ＭＭＳ処置に対する突然変異体特異的応答である。突然変異体の他の重要な特性は、それが、野生型植物で見られるような、ＵＶ処置後の急速な転写物の分解を行うことが不可能であることである。故に、我々は、ＡＲＳ２７Ａタンパク質が、標準条件下のタンパク質合成には重要ではないが、ＵＶ照射後の損傷した可能性のあるｍＲＮＡの除去のために必要であると提案する。(Revenkova E, Masson J, Koncz C, Afsar K, Jakovleva L, Paszkowski J.: Involvement of Arabidopsis thaliana ribosomal protein S27 in mRNA degradation triggered by genotoxic stress. EMBO J. 1999 Jan 15; 18(2): 490-9.)
【０１０６】
障害特異的ＤＮＡ結合タンパク質２(ＤＤＢ２)：ｃＤＮＡマイクロアレイ分析は、ヒ素(ＡｓIII)処置が、ＤＮＡ修復に関連する遺伝子(例えば、ｐ５３および障害特異的ＤＮＡ−結合タンパク質２)の発現を減少させ、酸化的ストレスに対する細胞応答の指標である遺伝子(例えば、スーパーオキシドディスムターゼ１、ＮＡＤ(Ｐ)Ｈキノンオキシドレダクターゼ、およびセリン／スレオニンキナーゼ２５)の発現を増加させることを示した。ＡｓIIIはまた、増加した細胞増殖と関連するある種の転写物(例えば、サイクリンＧ１、タンパク質キナーゼＣデルタ)、癌遺伝子、および細胞形質転換と関連する遺伝子(例えば、Ｇｒｏ−１およびＶ−ｙｅｓ)の発現も調節する。これらの観察は、ＡｓIII処置が細胞有糸分裂を２４時間に用量依存性に増加させ、細胞増殖を４８時間の暴露後に増加させるという、細胞増殖の測定値および有糸分裂測定値と相関する。(Hamadeh HK, Trouba KJ, Amin RP, Afshari CA, Germolec D.: Coordination of altered DNA repair and damage pathways in arsenite-exposed keratinocytes. Toxicol Sci. 2002 Oct; 69(2): 306-16.)
【０１０７】
臨床的色素性乾皮症表現型を有する新たに同定した患者は、ＤＤＢ２遺伝子中にナンセンス突然変異を有し、(６−４)光産物の修復が不完全である。(Itoh T, Mori T, Ohkubo H, Yamaizumi M. A newly identified patient with clinical xeroderma pigmentosum phenotype has a non-sense mutation in the DDB2 gene and incomplete repair in (6-4) photoproducts. J Invest Dermatol. 1999 Aug; 113(2): 251-7.)。
【０１０８】
ＴＰＡまたは血清飢餓ではなく、ＵＶ光、マイトマイシンＣ、またはアフィディコリンで前処置した細胞は、高いレベルのこの障害特異的ＤＮＡ結合(ＤＤＢ)タンパク質を有する。これらの結果は、ＤＤＢタンパク質の誘導のためのシグナルが、ＤＮＡに対して損傷性であるか、細胞ＤＮＡ複製を妨害するいずれかであり得ることを示唆する。ＤＤＢタンパク質の導入は、異なる表現型の霊長類細胞間で異なる：(１)ウイルス−形質転換修復−熟練細胞(proficient cell)は、構成的レベルを超えてＤＤＢタンパク質を誘発する能力を部分的にまたは完全に失う；(２)修復−欠損色素性乾皮症(ＸＰ)グループＣ、および形質転換ＸＰグループＡおよびＤからの初代細胞は構成的ＤＤＢタンパク質を示すが、ＵＶで４８時間後にこのタンパク質の誘導されたレベルを示さない；および(３)１名のＸＰ  Ｅ患者からの初代および形質転換修復−欠損細胞は、構成的および誘導されたＤＢ活性の両方を欠失する。ＤＤＢタンパク質と促進されたＵＶ−損傷発現ベクターの修復の間の相関は、この誘導性細胞応答におけるＤＤＢタンパク質の関与を暗示する。(Protic M, Hirschfeld S, Tsang AP, Wagner M, Dixon K, Levine AS.: Induction of a novel damage-specific DNA binding protein correlates with enhanced DNA repair in primate cells. Mol Toxicol. 1989 Oct-Dec; 2(4): 255-70.)
【０１０９】
ポリメラーゼ(ＤＮＡ指向性)、エータ(ＰＯＬＨ)：ＵＶ照射は、ＤＮＡにおいて主としてシクロブタンピリミジン二量体(ＣＰＤ)および(６−４)光産物を産生する。ＣＰＤは、ＵＶ誘発突然変異のほとんどに責任があると考えられている。チミン−チミンＣＰＤ、およびおそらくまたＣＰＤ含有シトシンが、ＤＮＡポリメラーゼエータ(Ｐｏｌエータ)依存性過程により、インビボで非常に蓄積されるような方法で複製される。Ｐｏｌエータは、ヒトにおいてＰＯＬＨ(ＸＰＶ)遺伝子によりコードされる。(Choi JH, Pfeifer GP.: The role of DNA polymerase eta in UV mutational spectra. DNA Repair (Amst). 2005 Feb 3; 4(2): 211-20.)。色素性乾皮症Ｖ(ＸＰＶ)は、染色体６ｐ２１.１−６ｐ１２に位置するＰＯＬＨ遺伝子の分子改変によりもたらされる。罹患した個体は、遺伝学的病変のスペクトルに関してホモ接合またはヘテロ接合であり、ナンセンス突然変異、欠失または挿入を含み、その状態の常染色体劣性性質が確認される。ＸＰＶ遺伝子としてのＰＯＬＨの同定は、ＸＰＶファミリーにおける改善された分子診断のための重要な装置を提供する。(Gratchev A, Strein P, Utikal J, Sergij G.: Molecular genetics of Xeroderma pigmentosum variant. Exp Dermatol. 2003 Oct; 12(5): 529-36.)
【０１１０】
ヌクレオチド除去修復突然変異体の系統的分析は、転写と結合したヌクレオチド除去修復の関与およびヒトＰＯＬＨ遺伝子によりコードされるＤＮＡポリメラーゼエータの病変を迂回することが一部必要であることを証明する。(Zheng H, Wang X, Warren AJ, Legerski RJ, Nairn RS, Hamilton JW, Li L.: Nucleotide excision repair- and polymerase eta-mediated error-prone removal of mitomycin C interstrand cross-links. Mol Cell Biol. 2003 Jan; 23(2): 754-61.)
【０１１１】
ロイシンに富むおよび細胞死ドメイン含有(ＬＲＤＤ)：この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ロイシンに富む反復および細胞死ドメインを含む。このタンパク質は、細胞死ドメインを介して関連しているＦａｓ(ＴＮＦＲＳＦ６)(ＦＡＤＤ)およびＭＡＰ−キナーゼ活性化細胞死ドメイン−含有タンパク質(ＭＡＤＤ)のような他の細胞死ドメインタンパク質と相互作用することが示されており、故に、細胞死関連シグナル伝達過程におけるアダプタータンパク質として機能し得る。この遺伝子のマウス対応物の発現は、腫瘍サプレッサーｐ５３により正に調節され、ＤＮＡ損傷に応答して細胞アポトーシスを誘発することが見られており、これは、この遺伝子のｐ５３依存性アポトーシスのエフェクターとしての役割を示唆する。異なるアイソフォームをコードする３個の別々にスプライスされた転写物変異体が報告されている。
【０１１２】
タンパク質ホスファターゼ１Ｄマグネシウム依存性、デルタアイソフォーム(ＰＰＭ１Ｄ)：この遺伝子によりコードされるタンパク質は、Ｓｅｒ／Ｔｈｒタンパク質ホスファターゼのＰＰ２Ｃファミリーのメンバーである。ＰＰ２Ｃファミリーメンバーは、細胞ストレス応答経路の負の調節因子であることが知られている。この遺伝子の発現は、種々の環境ストレスに応答してｐ５３依存性方法で誘発される。腫瘍サプレッサータンパク質ＴＰ５３／ｐ５３により誘導されるが、このホスファターゼは、ｐ３８  ＭＡＰキナーゼ、ＭＡＰＫ／ｐ３８の経路を、それがｐ５３のリン酸化を減少させ、続いてｐ５３介在転写およびアポトーシスを抑制することにより、負に調節する。このホスファターゼは、故に、増殖阻害およびストレス誘発アポトーシスの抑制に関与するｐ３８−ｐ５３シグナル伝達のフィードバック制御を介在する。この遺伝子は、乳癌において増幅することが既知の染色体領域に位置する。この遺伝子の増幅は、乳癌細胞系および原発性乳房腫瘍の両方で検出されており、これは、この遺伝子の癌発生における役割を示唆する。
【０１１３】
Ｔａｘ相互作用タンパク質１(ＴＩＰ−１)：ＴＩＰ−１は、Ｗｎｔ／ベータ−カテニンシグナル伝達経路における新規調節要素を示し得る。Ｗｎｔシグナル伝達は、発育中は必須であるが、この経路の脱制御は、結腸直腸癌腫を含む種々の腫瘍の形成に至る。本経路の重要な成分はベータ−カテニンであり、それは、ＴＣＦ−４と一緒になって、Ｗｎｔ−応答性遺伝子の発現を直接制御する。ＴＩＰ−１の過剰発現が結腸直腸癌細胞の増殖および足場非依存的増殖を減少させることが示されている。[KanamoriM et al., 2003]
【０１１４】
ＴＢＣ１ドメインファミリー、メンバー５(ＴＢＣ１Ｄ５)、仮想タンパク質ＦＬＪ２３３１１、および仮想タンパク質ＭＧＣ１３０２４は未知の機能を有する。
【０１１５】
腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー、メンバー１Ｂ(ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ)：この遺伝子によりコードされるタンパク質は、ＴＮＦ−受容体スーパーファミリーのメンバーである。このタンパク質およびＴＮＦ−受容体１は、Ｅ３ユビキチンリガーゼ活性を有する、２個の抗アポトーシス性タンパク質、ｃ−ＩＡＰ１およびｃ−ＩＡＰ２の集合を介在するヘテロ複合体を形成する。ＴＮＦ−受容体シグナル伝達におけるＩＡＰの機能は未知であるが、しかしながら、ｃ−ＩＡＰ１は、抗アポトーシス性シグナルを介在するＴＮＦ−受容体関連因子２のユビキチン化および分解によりＴＮＦ誘発アポトーシスを増強すると考えられる。マウスにおけるノックアウト試験はまた、抗酸化経路の刺激によりアポトーシスから神経細胞を保護することにおける、このタンパク質の役割も示唆する。
【０１１６】
ジスコイジンドメイン受容体ファミリー、メンバー１(ＤＤＲ１)：受容体チロシンキナーゼ(ＲＴＫ)は、細胞とそれらのミクロ環境の連絡において重要な役割を有する。これらの分子は細胞増殖、分化および代謝の制御に関与する。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、正常および形質転換上皮性細胞において広く発現され、種々のタイプのコラーゲンにより活性化されるＲＴＫである。このタンパク質は、それらの細胞外ドメインに細胞性粘菌タンパク質ジスコイジンＩに対する相同性領域を有するチロシンキナーゼ受容体のサブファミリーに属する。その自己リン酸化は、試験した全てのコラーゲン(タイプＩ〜タイプVI)で活性化される。インサイチュ試験およびノーザン・ブロット分析は、このコードされたタンパク質の発現が、特に腎臓、肺、胃腸管、および脳中の、上皮性細胞に限定されることを示す。加えて、このタンパク質は、乳房、卵巣、食道、および小児脳からの数種のヒト腫瘍で著しく過剰発現する。この遺伝子は染色体６ｐ２１.３上に、数個のＨＬＡクラスＩ遺伝子の近くに位置する。この遺伝子の３個のアイソフォームが、異なるスプライシングにより産生される。
【０１１７】
ケトヘキソキナーゼ(フルクトキナーゼ)(ＫＨＫ)：ＫＨＫは、フルクトースからフルクトース−１−ホスフェートへの変換を触媒し、遺伝子ケトヘキソキナーゼにコードされる。提示されるスプライス変異体は、肝臓、腎皮質、および小腸で見られる非常に活性な形態をコードするが、別の変異体は、他のほとんどの組織で見られる低い活性の形態をコードする。
【０１１８】
サーチュイン(沈黙接合型情報制御２、S. cerevisiae、同族体)３(ＳＩＲＴ３)：この遺伝子は、酵母Ｓｉｒ２タンパク質と同族の、タンパク質のサーチュインファミリーをコードする。サーチュインファミリーのメンバーは、サーチュイン・コア・ドメインにより特徴付けられ、４クラスに分類される。ヒトサーチュインの機能はまだ決定されていない；しかしながら、酵母サーチュインタンパク質は、後成的な遺伝子サイレンシングを調節し、ｒＤＮＡの組み替えを抑制することが知られている。試験は、ヒトサーチュインが、モノ−ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ活性を伴う細胞内調節タンパク質として機能し得ることを示唆する。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、サーチュインファミリーのクラスＩに含まれる。
【０１１９】
トランスフォーミング増殖因子、ベータ１(ＴＧＦＢ１)：トランスフォーミング増殖因子ＴＧＦベータ１は、細胞増殖および分化、血管形成、免疫機能および細胞外マトリックス形成を含む、様々な重要な細胞機能に関与する。ＴＧＦベータ(１)は、結腸直腸癌における血管形成を調整することにより腫瘍進行と関連し、ＴＧＦベータ(１)はバイオマーカーとして使用できる可能性がある。World J Gastroenterol. 2002 Jun; 8(3): 496-8。
【０１２０】
タンパク質チロシンホスファターゼ、非受容体タイプ２２(リンパ系)(ＰＴＰＮ２２)：この遺伝子は、主にリンパ系組織で発現されるタンパク質チロシンホスファターゼをコードする。この酵素は分子アダプタータンパク質ＣＢＬと会合し、Ｔ−細胞受容体シグナル伝達経路におけるＣＢＬ機能の調節に関与し得る。この遺伝子の異なるスプライシングは、異なるアイソフォームをコードする２個の転写物変異体をもたらす。
【０１２１】
アクチン、アルファ２、平滑筋、大動脈(ＡＣＴＡ２)：アクチンアルファ２、ヒト大動脈平滑筋アクチン遺伝子は、同定された６個の異なるアクチンアイソフォームの中の１個である。アクチンは、細胞運動性、構造および完全性に関与する非常に保存的なタンパク質である。アルファアクチンは、収縮装置の主要な構成要素である。
【０１２２】
シンデカン−１(Ｓｄｃ１)：間質性線維芽細胞におけるシンデカン−１発現の導入は、ヒト乳癌細胞の増殖を促進する。さらに、乳癌腫における高シンデカン−１発現は、攻撃的な表現型および悪い予後と相関する。甲状腺癌腫におけるシンデカン−１発現：間質性発現とその後の上皮性発現は、脱分化と顕著に関連する。
【実施例】
【０１２３】
材料および方法
(ｉ)化学物質、培地および血清
全ての化学物質は試薬等級であり(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO; Fluka sold through Sigma Aldrich; Lancaster Synthesis, Lancashire, UK)、可能であれば“細胞培養試験”用に購入した。“RPMI 1640 Glutamax-I”培地、ペニシリン／ストレプトマイシンおよびウマ胎児血清はGibcoから得た。RNeasy Mini KitはQiagenから購入した。
【０１２４】
(ii)細胞培養
ヒトリンパ芽球様細胞系ＴＫ６(ATCC, Manassas, VA)を、RPMI 1640培地(Glutamaxおよび１０％ＦＨＳ添加)中、０.２×１０5〜１０×１０5細胞／mlの細胞密度で培養した。細胞を、継代数に従って凍結アリコートから開始して、慣用的に継代した。実験のために、３〜１５の継代数を使用した。
【０１２５】
(iii)細胞毒性決定
細胞毒性濃度を、Sysmex細胞カウンター(Sysmex America, Inc., Mundelein, IL)上で細胞密度を測定することにより、またはアラマーブルー(Serotec Inc., Raleigh, NC)細胞毒性アッセイを使用した代謝物細胞活性の使用により、決定した。アラマーブルー指標色素は、ヒトおよび他の細胞の増殖を定量的に測定する。アラマーブルーは、増殖培地の酸化還元状態に感受性の感受性蛍光定量的および比色定量的試薬である。Sysmexによる細胞密度は、２４時間処置後に測定した。アラマーブルーによる細胞毒性は、処置期間終了の３時間前、すなわち、２１時間目に測定した。２００μlの細胞懸濁液を２０μlのアラマーブルー試薬と、９６ウェルプレート中で混合し、１時間に１回５４４nm励起および６１２nm放出フィルターを有する蛍光プレートリーダーを使用して測定した。細胞毒性希釈シリーズからの細胞懸濁液サンプルを、細胞数測定エンドポイントについて、レーザー走査細胞数測定により分析した。
【０１２６】
(iv)細胞培養の処置
ＴＫ６ヒトリンパ芽球様細胞を以下の処置に曝した(２４時間、０.１５×１０6細胞／ml)：
【表１】
2008518598.tif 000003
【０１２７】
表１において、トランスプラチンはトランス−ジアンミン白金(II)ジクロライドであり、シスプラチンはシス−ジアミン白金(II)ジクロライドである。表１の縦列の４番目に示す用量を提供するための用量−応答決定を、０.１５×１０6細胞／mlの最初の細胞密度で行った(実施例１参照)。
【０１２８】
(ｖ)ＲＮＡ単離
全ＲＮＡを、Qiagen(Hilden, Germany)のRNeasy Mini Kitを使用して、薬剤またはコントロールで２４時間処置後に単離した。サンプルは約０.３×１０6細胞／mlの細胞密度の１０ml  ＴＫ６細胞懸濁液から成った。カラム精製したＲＮＡを４０μl  水で溶出し、ＵＶ分光測定法およびAgilentの“ラボ・オン・チップ”法(ＲＮＡナノチップ、Bioanalyzer 2100, Agilent Technologies, Santa Clara, CA)により品質チェックした。ＲＮＡ抽出および精製は、GeneChip systemの製造業者により記載されている。
【０１２９】
(vi)マイクロアレイハイブリダイゼーション
Ｄ１実施例１−７、実施例１−７についてＤＮＡマイクロアレイ実験は、GeneChip system(Affymetrix, Inc. 2002)の製造業者により推奨の通り、および以前に記載(Lockhart et al. 1996)の通り行った。精製した全ヒトＴＫ６  ＲＮＡを、ヒト特異的ヒトゲノムU133A 2.０アレイ(Affymetrix)を使用して分析した。ヒトゲノムU133A 2.０アレイは、約１８,４００個の転写物および変異体をカバーし、２２,０００個を超えるプローブセットにより表される１４,５００個の十分特徴付けされたヒト遺伝子を含む。アレイの設計に使用した配列は、GenBank(登録商標)、ｄｂＥＳＴ、およびRefseqから選択した。本配列クラスターをUniGeneデータベース(Build 133, ２００１年４月２０日)から創成し、次いで分析ならびにワシントン大学ＥＳＴトレース・レポジトリーおよびカリフォルニア大学、Santa Cruz Golden-Pathヒトゲノムデータベース(２００１年４月公開)を含む多くの他の公的に利用可能なデータベースとの比較により、絞り込んだ。
【０１３０】
実施例８で行った実験のために、ヒトゲノムU133 Plus 2.0アレイを使用した。このアレイは、５４,０００個を超えるプローブセット中に４７,０００個を超える転写物をカバーする。これらのプローブセットが由来する配列は、GenBank(登録商標)、ｄｂＥＳＴ、およびRefseqから選択した。本配列クラスターは、UniGeneデータベース(Build 133, ２００１年４月２０日)から創成し、次いで分析ならびにワシントン大学ＥＳＴトレース・レポジトリーおよびカリフォルニア大学、Santa Cruz Golden-Pathヒトゲノムデータベース(２００１年４月公開)を含む多くの他の公的に利用可能なデータベースとの比較により、絞り込んだ。加えて、それは、GenBank、ｄｂＥＳＴ、およびRefseqから選択された配列に基づいて約６,５００個の遺伝子を表す９,９２１個のプローブセットを含む。配列クラスターを、UniGeneデータベース(Build 159、２００３年１月２５日)から創成し、次いで分析ならびにワシントン大学ＥＳＴトレース・レポジトリーおよびNCBIヒトゲノム・アッセンブリー(Build 31)を含む多くの他の公的に利用可能なデータベースとの比較により、絞り込んだ。
【０１３１】
画像ファイル(.datファイル)である得られる一次生データを、Microarray Analysis Suite 5(ＭＡＳ５)ソフトウェア(Affymetrix)を使用して処置した。シグナル強度(シグナル)および分類別の発現レベル測定に関するデータを含む、タブで区切ったファイルを得た(Absolute Call)。
【０１３２】
(vii)マイクロアレイデータ分析
ＭＡＳ５由来の生データを、Simca-P 10.5/GeneSpring 7.2を使用して分析した. 
【０１３３】
Simca-P 10.5/GeneSpring 7.2
“Simca-P 10.5/GeneSpring 7.2”アプローチは、SIMCA-P 10.5ソフトウェア(Umetrics AB, S-Umea)とGeneSpring 7.2の統計ツールを組み合わせた。GeneChipからＭＡＳ５により得られた生データを、分析のためにGeneSpring 7.2にインポートした。データをチップあたりおよび遺伝子あたり、各中央値に対して正規化した。遺伝子をLocusLink命名法(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/LocusLink/)に従い、注釈を付けた。
【０１３４】
２クラスの毒性を区別できるモデルを開発するために、細胞毒性および遺伝毒性化合物で処置したサンプルのみを分析に含めた：コントロールサンプルを分析から除いた。データの選別を各遺伝子について下記基準に従って行った：
変化倍率＞１.４または変化倍率＜０.７；および
シグナル平均(細胞毒性)＞５０またはシグナル平均(遺伝毒性)＞５０；および
シグナルＣＶ(細胞毒性)＜５０％およびシグナルＣＶ(遺伝毒性)＜５０％；ここで、ＣＶは変動係数である。
【０１３５】
変化倍率は、遺伝毒性対細胞毒性の比率に関する。これらの試験が確固たる予測遺伝子の探索であるため、一貫するがわずかな差異しか示さない遺伝子を除去するために、限界値(１.４および０.７)を選択した。さらに、２クラスのうち少なくとも１個の平均シグナルは、５０より大きい強度の信頼できるシグナルを示すべきであり、各クラス内の遺伝子発現シグナルの変動係数は、非常に変動する遺伝子を除くために５０％より小さくなければならない。選別は、Microsoft Excel 2002 SP 2で行った。２１５個の遺伝子が選別分析からもたらされた。
【０１３６】
データの選別後、２個の予測モデル化アプローチである部分最小二乗法−判別分析およびｋ−最近接分析を適用した。
【０１３７】
部分最小二乗法−判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)；全ての計算をソフトウェアパッケージSIMCA-P version 10(Umetrics AB, Umea, Sweden)により行った。
【０１３８】
２１５個の遺伝子の生遺伝子発現強度を対数変換し、中央に置き、そして単分散に対して評価(scaled)した。主成分分析法(ＰＣＡ)をデータに適用し、その低次元空間における相対的位置をチェックし、それらの相対的位置に対する細胞数およびアラマーブルーの影響を調査した。
【０１３９】
ＰＬＳ−ＤＡは、クラス変量としての細胞および遺伝毒性と共に遺伝子発現データに繰り返し適用した。いずれかのクラスの平均スコア間の差次的遺伝子パターンの評価が、この分離に顕著に関与する遺伝子を同定した。各繰り返しで、本予測モデルを１点除外(leave-one-out)アプローチ(ＬＯＯ)によりクロス確認した。最終モデルを応答順列により確認した；すなわち各サンプルのクラス構成員を、無作為に帰属させ、モデルにより評価し、モデルの解答を元のクラス構成員と対比させた。１００個の順列を行った。
【０１４０】
予測モデル化の第二のアプローチを、ｋ−最近接(ＫＮＮ)分析(GeneSpring 7.2)により行った。ＰＬＳ−ＤＡに使用した同じ２１５個の候補遺伝子をこのアプローチに使用した。制限のあるサンプルサイズのため、キャリブレーションサンプルセットおよび試験サンプルセットの組成物を数回入れ替えた。
【０１４１】
ＰＬＳ−ＤＡおよびｋ−最近接アプローチで得られた予測遺伝子の交差を、選択した遺伝子の予測力を調査するために、ＰＬＳ−ＤＡおよび条件クラスタリング(condition clustering)(GeneSpring 7.2)に付した。
【０１４２】
実施例８で使用した実験のために、下記方法を使用した：
正規化：チップあたり：サンプル中央値に対して正規化。遺伝子あたり：全サンプルの遺伝子中央値に対して正規化(GeneSpring 7.2)。
【０１４３】
遺伝子の前選別：フラッグでの選別：プローブセットは少なくとも５０％のサンプルで“存在”または“境界”フラッグを示す必要があり、強度で選別する：少なくとも５０％のサンプル中の強度＞５０を有するはずであるプローブセットは、１８'５１２個のプローブセットをもたらした(GeneSpring 7.2)。
【０１４４】
統計学的選別：ウェルチｔ検定(GeneSpring 7.2)：全(９８)サンプルデフォルト時解釈  −  ‘クラス(非遺伝毒性対ｇｔｘ)'；パラメトリック検定によりグループ分けしたとき、統計的に有意な差の５０％のサンプル中の“存在”およびシグナルＧＴ  ５０からの遺伝子は、変動は等しいとは想定されない(ウェルチｔ検定)。ｐ値カットオフ０.００１、多重検定補正：BenjaminiおよびHochberg偽発見率(ＦＤＲ)。これの規定で１８'５１２個の遺伝子を試験した。約０.１％の同定した遺伝子が、偶然この規定を通過すると予測された。４'９１１個のプローブセットがこの選別を通過した。０.１％の所定のＦＤＲで、４９１１個中５個が、偽陽性であると予測された。
【０１４５】
実施例１。細胞毒性およびＧ２期ブロックの決定
表１において同定した６個のモデル化合物を、希釈シリーズでＴＫ６細胞に適用した。６個の化合物各々について得られる希釈シリーズは、細胞密度およびアラマーブルーアッセイにより決定して、５０％細胞死(ＥＣ50)のための個々に最適化された細胞毒性濃度をもたらす。これらのデータは図１および表２。細胞密度およびアラマーブルーアッセイが同一の細胞毒性プロファイルをもたらし得ない可能性もある。故に、化合物の濃度は、両細胞毒性パラメーターが、４０−６０％生存能減少の範囲内となることを目的として最適化した。加えて、代表的希釈シリーズについて、数個の細胞数測定エンドポイントを分析したが(BrdU取り込み、KI-67染色(Histogenex, Edegem, Belgium)、ヨウ化プロピジウム染色)、これらのパラメーターは濃度選択には使用しなかった。
【表２】
2008518598.tif 000004
【０１４６】
３個の非遺伝毒性化合物ｔＰｔ、ＲｉｆおよびＮａＣｌは、相対的に別種の化合物クラスに属する。結果として、最も明白な効果および最終的に強い細胞毒性に至る重大な作用機序が完全に異なり得る。この状況は得られた細胞毒性プロファイルにより反映される。大凡のＥＣ50値は３３μM〜３.８mMであり、同様に、細胞密度および酸化還元エンドポイント(アラマーブルー)の感受性は化合物依存的である。確認されたＥＣ50値まで、細胞周期パラメータにおける顕著なシフトは検出されず(図１)、３個の化合物のいずれも、細胞周期の調節経路に対して特異的影響を有しないと結論付けられる。
【０１４７】
これと比較して、この３個の遺伝毒性化合物は、著しく低いＥＣ50値(０.１０μM〜６.３μMの範囲)を有し、細胞周期パラメータにおいて著しいシフトを導いた。最も顕著な作用は、ＥＣ50値付近が最大であると概算される明白なＧ2期ブロックであり、ＤＮＡ修復活性を示す(図１)。この観察は、この細胞モデル系内で外因性遺伝毒性ストレスに応答して適応応答が起こるという、基本的仮説と一致する。幸運なことに、これは細胞数測定レベルれ既に可視である。
【０１４８】
実施例２。候補予測遺伝子の同定
ＲＮＡのヒトゲノムプローブに対するハイブリダイゼーションに至る実験において、表１に特定した化合物の濃度を使用した(実施例１)。これらの濃度は、等細胞毒性(equicytotoxic)(例えば、ｃＰｔ：１.３μM、およびｔＰｔ：３３μM)である。各化合物を、２日間または３日間の違う日に６個の独立した反復を使用して試験した。全ＲＮＡを単離後、発現プロファイルをAffymetrix HGU133A PLUS 2マイクロアレイを使用して編集した。
【０１４９】
材料および方法に記載の通り、１個の媒体、３個の細胞毒性試薬および３個の遺伝毒性試薬を使用してＴＫ６細胞を処置した。反復サンプルの各々を、ハイブリダイゼーションおよび結果の検出のために、Affymetrix HGU133Aチップに適用した。これらのデータを材料および方法に記載の通り、変化倍率、シグナル平均およびシグナルＣＶに関して選別した。２１５個の遺伝子のみが、この厳しい選別法を通過した。これらの選別した遺伝子は表３に編集する。
【表３】
2008518598.tif 000005
【表４】
2008518598.tif 000006
【０１５０】
【表５】
2008518598.tif 000007
【表６】
2008518598.tif 000008
【０１５１】
【表７】
2008518598.tif 000009
【表８】
2008518598.tif 000010
【０１５２】
【表９】
2008518598.tif 000011
【表１０】
2008518598.tif 000012
【０１５３】
【表１１】
2008518598.tif 000013
【表１２】
2008518598.tif 000014
【０１５４】
【表１３】
2008518598.tif 000015
【表１４】
2008518598.tif 000016
【０１５５】
【表１５】
2008518598.tif 000017
【表１６】
2008518598.tif 000018
【０１５６】
【表１７】
2008518598.tif 000019
【表１８】
2008518598.tif 000020
【０１５７】
【表１９】
2008518598.tif 000021
【表２０】
2008518598.tif 000022
【０１５８】
【表２１】
2008518598.tif 000023
【表２２】
2008518598.tif 000024
【０１５９】
【表２３】
2008518598.tif 000025
【表２４】
2008518598.tif 000026
【０１６０】
【表２５】
2008518598.tif 000027
【表２６】
2008518598.tif 000028
【０１６１】
【表２７】
2008518598.tif 000029
【表２８】
2008518598.tif 000030
【０１６２】
【表２９】
2008518598.tif 000031
【表３０】
2008518598.tif 000032
【０１６３】
【表３１】
2008518598.tif 000033
【表３２】
2008518598.tif 000034
【０１６４】
選択した遺伝子を、例えばGeneOntologyツール(http: //www.geneontology.org)を、広範な生物学的機能：転写、細胞死、細胞増殖および増殖、細胞周期関連、酵素、ポリメラーゼおよびプロテアーゼ、免疫系関連タンパク質、シグナル伝達、トランスポーター、細胞付着、発育関連、および多くの未知のものの制御を提供するとして分類する(表４参照)。
【０１６５】
選択した遺伝子は、広範な生物学的機能：転写、細胞死、細胞増殖および増殖、細胞周期関連、酵素、ポリメラーゼおよびプロテアーゼ、免疫系関連タンパク質、シグナル伝達、トランスポーター、細胞付着、発育関連、および多くの未知のものの制御を提供するとして分類する(表４参照)。
【表３３】
2008518598.tif 000035
【０１６６】
これらの２１５個の遺伝子の主成分分析法(ＰＣＡ)の結果は、図２および３に示す。図２は、各点に隣接した細胞数についての数値を示す。図３、各点に隣接したアラマーブルーについての数値を示す。図２および３、ＮａＣｌからの点およびｔＰｔからの数点は四分割の左上にある；Ｒｉｆからの点は四分割の左下にある。ＭＭＳからのほとんどの点は四分割の右下にある；ＭＭＣからの点の半分は四分割の右上にあり、残り半分が四分割の右下にある。ｃＰｔの点の１／３が四分割の右上にあり、２／３が四分割の右下にある。ｔＰｔの残りの点はｔ[１]＝０に近い。これらの結果から、細胞毒性と遺伝毒性化合物の間の明らかな差異が判別できることが見られる；これは、しかしながら遺伝子の選択に使用した選択によると予測される。リファンピシンおよびＮａＣｌ処置サンプルは同種クラスターを形成し、それは残りのサンプルから明瞭に区別できる。
【０１６７】
実施例３。ＰＬＳ−ＤＡＩを使用した非常に予測的な遺伝子の同定
部分的最小二乗法−判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)を、実施例２で同定した２１５個の候補遺伝子のセットに適用した。この分析は、細胞毒性および遺伝毒性化合物を最良に分離する判別関数を提供する。これらの２１５個の遺伝子に基づいた第一成分ｔ[１]のスコアのプロットを図４に示し、これは２クラスの化合物間の良好な分離を示し、ＮａＣｌ、ＲｉｆおよびｔＰｔの各々についてはｔ[１]＝０のまたはそれ以上であり、ｃＰｔ、ＭＭＣ、およびＭＭＳの全サンプルについてはｔ[１]＝０より低かった。しかしながら、シスプラチングループの２個のサンプルはトランスプラチンサンプルの非常に近くに位置した。ＰＬＳ−ＤＡによる差次的遺伝子パターンの調査は、細胞毒性と遺伝毒性サンプル間の識別に最も強く関与する２３個の遺伝子を確認した。これらの遺伝子は表５Ａおよび５Ｂに、それらの平均、変動係数、変化倍率およびステューデントのｔ検定のｐ値と共に編集する。
【表３４】
2008518598.tif 000036
【表３５】
2008518598.tif 000037
【表３６】
2008518598.tif 000038
【表３７】
2008518598.tif 000039
【表３８】
2008518598.tif 000040
【０１６８】
これらの２３個の遺伝子を含むＰＬＳ−ＤＡモデルのスコアのプロットを図５に示す。２クラスの分離は、２１５個の遺伝子のモデルと同等である(図４)。図４と５の類似性は、同定した２３個の遺伝子が、細胞毒性と遺伝毒性の判別関数の最大の原因である遺伝子を含むことを強く示唆する。
【０１６９】
図６は、これらの２３個の遺伝子の結果を使用したクラスター図を示す。２個の主要なクラスターの上で、明白に線引きされていることが見られる；実際、これらのクラスターは、サンプルを予測される細胞毒性および遺伝毒性クラスに分ける(図６の最もしたの線の見だしを参照)。
【０１７０】
実施例４。ｋ−最近接分析を使用した非常に予測的な遺伝子の同定
選別スクリーニング(実施例２)により同定した２１５個の候補遺伝子を、ｋ−最近接分析(ＫＮＮ)に基づいたGeneSpring予測ツールで分析した。ＳＩＭＣＡ−ＰおよびGeneSpringの間のデータの異なる正規化のため、ＫＮＮにより同定した予測遺伝子が、ＰＬＳ−ＤＡで見られるものと異なる可能性が予期された。
【０１７１】
ＫＮＮで決定して最高の予測的強度を持つ２７個の遺伝子中２６個のリストを表６に記載する。GeneChip上の２７番目の遺伝子(プローブセット)は、それと関連する同定情報がなかった。これらの遺伝子は、それらの遺伝毒性または細胞毒性各々に従い、全サンプルを分類できた。
【表３９】
2008518598.tif 000041
【表４０】
2008518598.tif 000042
【表４１】
2008518598.tif 000043
【表４２】
2008518598.tif 000044
【０１７２】
実施例５。分析法に無関係な予測遺伝子
６遺伝子が、ＰＬＳ−ＤＡおよびＫＮＮの両方からの予測遺伝子セットで共通することが判明した；これらを表７に同定する。図６は、ＰＬＳ−ＤＡ分析由来のクラスター図における６遺伝子を同定する、６本の矢印を左に含む。この減らした遺伝子セットの効力を証明するために、ＰＬＳ−ＤＡおよびＫＮＮ分析を使用した予測モデルを、これらの６個のみを含んで構築した。この減らした遺伝子セットは、誤分類なしに２クラスの毒性の間を識別できた。図７は、サンプルが、正確に遺伝毒性および細胞毒性サンプル(図７、右)である２つの主要なクラス(左の系統樹参照)に分離されることを示す、条件クラスタリング(GeneSpring)の結果を示す。この結果は、２クラスの毒性が分離できることを明らかに示す。同じ結果が、図８に示すＰＬＳ−ＤＡで確認される。２クラスのサンプルの分離は、全２１５個の遺伝子(図４)でならびに表５Ａおよび５Ｂ(図５)における２３遺伝子で見られるものと同等である。
【表４３】
2008518598.tif 000045
【０１７３】
ＰＬＳ−ＤＡに基づく６個の遺伝子モデルの予測力を、真のクラス構成員で得た結果と、サンプルのクラス構成員を無作為に入れ替えた後に得た結果を比較する、無作為順列により確認できる；これは１００回行った。本バリデーション結果を図９に示す。元のデータはｘ＝１、ｙ＝０.８に位置する；毒性クラス構成員を無作為に入れ替えたデータは、ｘ＜０.４５でいくつかの値が示され、入れ替えたデータが元のものと非常に類似するものではないことを示唆する。Ｒ２は“適合度”の指標であり、Ｑ２は“予測度”の指標である。両方の値とも、無作為応答順列と比較して、元のデータで有意に高い。Ｒ２およびＱ２の負の切片値(−０.０６１２および−０.１６２)が顕著である。回帰線の切片はモデルの力の指標である。それは、Ｒ２について−０.０６１２およびＱ２について−０.１６２であり、これの点、無作為を遙かに超える高い予測値に向かう。
【０１７４】
実施例３−５に示す結果は、２個の独立した統計分析法が、各々２３個のおよび２７個の予測遺伝子をもたらすことを示す。重要なことに、両セットに共通する６遺伝子セットも、相対的に小さいクラスのサイズにもかかわらず、予測力を何ら落とすくとなく、それらの毒性に従い、２クラスのモデル化合物を一意的に分類できた。
【０１７５】
加えて、本方法は、ｔＰｔおよびｃＰｔのような不明瞭なトレーニングサンプル間を識別するのに十分感受性である。トランスプラチンは、シスプラチンと対象的に抗腫瘍活性を何等らさないため、非遺伝毒性であると長い間考えられてきた。しかしながら、いくつかの古い文献が、トランスプラチンは典型的遺伝毒ではないが、抗濃度である弱い正の効果に至り得ることを記している。故に、実施例で使用した非常に異なる濃度(トランスプラチン：３３μM、シスプラチン：１.３μM)にも係わらず、本方法は、あいまいさなく、そららのモデルクラスに分離することに成功した。あるいは、シスおよびトランスプラチンが、約９９％しか純粋でない異性体のため、トランスプラチン中のシスプラチンから成るわずかな不純物が、前者を高濃度で適応したとき、なぜトランスプラチンおよびシスプラチンの両方が分離線の近くに位置するかを説明する。
【０１７６】
実施例６。予測遺伝子セットを同定するための拡大した化合物セットの使用
材料および方法に記載のような実験を行う。実施例１−５において使用した３個の細胞毒性化合物および３個の遺伝毒性化合物の元のセットに加えて、またはこれらの化合物の代わりに、表８に示す遺伝毒性および非遺伝毒性化合物を使用する。遺伝毒性化合物は、一般に直接作用変異原物質または染色体切断物質の特性を有する。
【表４４】
2008518598.tif 000046
【０１７７】
各遺伝毒性および非遺伝毒性化合物について、毒性の５０％有効に対応する濃度を、文献から得るかまたは実験的に評価した。ＴＫ６細胞のようなヒト細胞を、各化合物の５０％毒性用量と共に、材料および方法に記載の通り培養する。ＲＮＡを、各サンプルから単離し、支持体上に配置した適切なヒト遺伝子プローブセットに対してハイブリダイズする。上記の通り、Affymetrix HG-U133A PLUS 2遺伝子チップを使用できる；あるいは、ヒトゲノムの相当な部分に由来するプローブを示す同等なすべてのアレイを使用でき、またはＰＣＲのような転写物の特異的定量を可能にするすべての他の方法を使用できる。ハイブリダイゼーション結果を、材料および方法、ならびに実施例１−３に記載の通り、走査し、評価する。種々のサイズおよび種々の構成要素遺伝子を含む予測(差別的な)遺伝子セットを同定する。
【０１７８】
実施例７。候補化合物の遺伝毒性の決定。
候補化合物を、適切な研究開発活動により同定する。５０％毒性の有効量を、数回、ＴＫ６細胞のようなヒト細胞系に適用した希釈実験(実施例１)により評価する。細胞を、材料および方法に記載の通り、適当な時間(例えば、２４時間)培養し、全ＲＮＡを各サンプルから抽出する。コントロール細胞をまた培養し、コントロールＲＮＡを単離する。ＲＮＡの各サンプルを、最小でもここで同定した予測遺伝子セットからのプローブを含む適当なヒト遺伝子アレイに対してハイブリダイズする(実施例２−６参照)；加えてベータアクチンまたはグリセルアルデヒドホスフェートデハイドロゲナーゼに対するような内部標準プローブも、この実施例で用いるアレイに包含し得る。より一般に、材料および方法に記載のアレイまたは実施例６に記載のような同等物を使用できる。本ハイブリダイゼーション結果を、材料および方法ならびに実施例２−４に記載の統計学的方法により評価する。候補化合物で処置した細胞から得たＲＮＡサンプルを、既知モデル化合物から判明したパー単との比較により分類する。候補化合物の結果が非遺伝毒性化合物のものと似ているならば、その候補化合物はおそらく遺伝毒性ではないと結論付けられる。候補物の結果が遺伝毒性化合物のものと似ているならば、その候補化合物はおそらく遺伝毒性であると結論付けられる。
【０１７９】
実施例８。遺伝毒性の予測モデルの開発
この実施例は、遺伝毒性のための予測モデルを確立する方法をさらに特徴付けする。実験プロトコールは、上記と同じであった。しかしながら、遺伝毒性または非遺伝毒性であることが既知の付加的化合物を参照化合物として使用した。既知の遺伝毒性または非遺伝毒性化合物の完全なセットを下記表９に示す。
【表４５】
2008518598.tif 000047
【０１８０】
ＭＡＳ５処理データを表題“材料および方法”の章に記載の通り統計学的に分析した。簡単に言うと、正規化はチップあたり：サンプル中央値に対して正規化および遺伝子あたり：全サンプルの遺伝子中央値に対して正規化を含む(GeneSpring 7.2)。
【０１８１】
遺伝子の前選別は、フラッグでの選別：プローブセットは少なくとも５０％のサンプルで“存在”または“境界”フラッグを示す必要があり、強度で選別する：少なくとも５０％のサンプル中の強度＞５０を有するはずであるプローブセットは、１８'５１２個のプローブセットをもたらした(GeneSpring 7.2)。統計的選別はウェルチｔ検定(GeneSpring 7.2)を使用して行った。
【０１８２】
結果
ＰＬＳ−ＤＡによる予測モデル化
一般に、上記の通り正規化した値をモデル化のために使用した。正規化値を、対数変換し(低１０)、パレート評価(scaled)した。
全９８サンプルでの前試験
【表４６】
2008518598.tif 000048
Ｒ2Ｘ：全成分により説明される全Ｘの平方和(ＳＳ)の画分
Ｒ2Ｙ：全成分により説明される全Ｙの平方和(ＳＳ)の画分
Ｑ2：クロス−バリデーションにより予測できるＹの全変数の画分
【０１８３】
表１０によると、最大の予測力(Ｑ２)は約２４個のプローブセットで達成される。モデルＭ１−Ｍ９の予測的遺伝子は、上記ウェルチｔ検定の上位の遺伝子と非常に相関する。
【０１８４】
キャリブレーションサンプルのみでのモデル化
９８個のサンプルのセットを、７４個のサンプルのキャリブレーションセットと、２４個のサンプルから成るバリデーションセットに無作為に分けた。トランスプラチンで処置したサンプルを、汚濁物の可能性のため、キャリブレーションサンプルに入れた；ほとんどのトランスプラチンサンプルの遺伝子発現パターンは、文献から期待されるような純粋な細胞毒性よりもむしろ遺伝毒性を示した。しかしながら、全トランスプラチンサンプルは、バリデーションサンプルのメンバーであった。ウェルチｔ検定による上位１００個のプローブセットを、予測モデル化のための特性の開始セットとして使用した。
【０１８５】
これらの１００個の候補遺伝子から合計で３個の、ほぼ同等な予測力のバイオマーカー(ＢＭ１−ＢＭ３)が作製された(表１１参照)。各バイオマーカーは、無関係な遺伝子のセットから成り、異なるバイオマーカー間に遺伝子(プローブセット)の重複はない。
【表４７】
2008518598.tif 000049
Ｒ2Ｘ：全成分により説明される全Ｘの平方和(ＳＳ)の画分
Ｒ2Ｙ：全成分により説明される全Ｙの平方和(ＳＳ)の画分
Ｑ2：クロス−バリデーションにより予測できるＹの全変数の画分
【０１８６】
Ｑ２に関して、ＢＭ１の性能はＢＭ２より良く、そしてＢＭ２の性能はＢＭ３より良く、これは予測通りである。しかしながら、差異は最低限であり、実際的な重要性はない。応答順列によるバリデーションはまた、３個のバイオマーカーの類似の性能を確認した(図１０Ａ−１２Ｂ参照)。
【０１８７】
全遺伝子を、それらが属するバイオマーカー、genbank受託番号、Affymetrixプローブセット番号、遺伝子記号および説明、ならびに非遺伝毒性および遺伝毒性サンプルの中央値遺伝子発現強度、変化倍率、およびウェルチｔ検定ｐ値を含む表１２に記載する。３個のバイオマーカーの性能パラメータを表１２に要約する：
【０１８８】
遺伝毒性または非遺伝毒性化合物に対するＢＭ１−ＢＭ３のバイオマーカー遺伝子の応答の分類を、図１０Ａ−１２Ｂおよび表１２に示す。
【表４８】
2008518598.tif 000050
【表４９】
2008518598.tif 000051
【０１８９】
【表５０】
2008518598.tif 000052
【表５１】
2008518598.tif 000053
【０１９０】
【表５２】
2008518598.tif 000054
【表５３】
2008518598.tif 000055
【０１９１】
【表５４】
2008518598.tif 000056
【表５５】
2008518598.tif 000057
【０１９２】
結論として、最初の試験(実施例１−７)および本試験(実施例８)のデータは、選択したバイオマーカー遺伝子の遺伝子発現の変化に基づく予測モデルを使用した、遺伝毒性および非遺伝毒性化合物の急速なスクリーニング法の確立を確認する。
【０１９３】
遺伝毒性の最初のバイオマーカーは、既知の毒性の６個の参照化合物に基づき、それらは：非遺伝毒性化合物としてリファンピシン、ＮａＣｌ、トランスプラチン、および既知遺伝毒性化合物としてメタンスルホン酸メチル、マイトマイシンＣ、およびシスプラチンであった。２１５個の候補遺伝子を同定し、部分最小二乗法−判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)およびＫ−最近接(ＫＮＮ)のような教師付き学習アルゴリズムに付し、２３個の遺伝子の予測的ＰＬＳ−ＤＡモデルおよび２７個の遺伝子の予測的ＫＮＮモデルと両モデルの共通する６個の遺伝子をもたらした。
【０１９４】
本分析の３個のバイオマーカーは、最初の分析のものを含む９個の非遺伝毒性および１０個の遺伝毒性化合物に基づく。遺伝毒性対非遺伝毒性サンプルの統計学的比較(ウェルチｔ検定)は、０.１％のＦＤＲで４９１１個の候補遺伝子を生じた。２１５個の候補遺伝子中１１８個がまた４９１１個の新規候補遺伝子の中にある。バイオマーカーＢＭ１−３の１００個の遺伝子と２７個のＫＮＮ予測遺伝子の重複は９個であり、２３個のＰＬＳ−ＤＡ予測遺伝子との重複は５個である。表１３は実験１−７および実験８のデータを要約する。
【０１９５】
結論として、最初のバイオマーカーの予測遺伝子が、データセットを多様な遺伝毒性および非遺伝毒性化合物を含む拡大したデータセットに適用したとき、良好な予測となると述べることができる。しかしながら、拡大したデータセットに基づく特性抽出は、遺伝毒性の予測遺伝子のより強力なセットである。
【０１９６】
【表５６】
2008518598.tif 000058
【表５７】
2008518598.tif 000059
【０１９７】
【表５８】
2008518598.tif 000060
【表５９】
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【０１９８】
【表６０】
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【表６１】
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【０１９９】
【表６２】
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【表６３】
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【０２００】
【表６４】
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【表６５】
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【０２０１】
【表６６】
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【表６７】
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【表６８】
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【０２０２】
【表６９】
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【表７０】
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【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】記載の遺伝毒性および非遺伝毒性化合物(ポイント１−９)の希釈の関数としてのＧ２期の細胞の割合と、ポイント１０−１２のコントロールサンプルのグラフ表示。元のカラー画像をコンピュータでグレースケールに変換している。
【図２】生細胞数により表示した、発現データから抽出した全２１５個の候補遺伝子の遺伝子発現と６個の参照化合物の主成分分析法のグラフ表示。ｔ[１](横座標)は変動の最高比率を説明する主成分＃１のスコアを示し、そしてｔ[２](縦座標)は主成分＃２のスコアを示す。上パネル：点が着色された元画像；下パネル：コンピュータでグレースケールに変換した画像。見られる通り、細胞数は無作為に散乱し、遺伝毒性または非遺伝毒性分離を説明しない。
【図３】アラマーブルーで標識した全２１５個の候補遺伝子の遺伝子発現の主成分分析法のグラフ表示。ｔ[１](横座標)は変動の最高比率を説明する主成分＃１のスコアを示し、そしてｔ[２](縦座標)は主成分＃２のスコアを示す。上パネル：点が着色された元画像；下パネル：コンピュータでグレースケールに変換した画像。見られる通り、アラマーブルー細胞数は無作為に散乱し、遺伝毒性または非遺伝毒性分離を説明しない。
【図４】全２１５個の遺伝子で行った部分的最小二乗法−判別分析(ＰＬＳ−ＤＡ)のＰＣ１(主成分１；ｔ[１])のスコア。カラーの元画像をコンピュータでグレースケールに変換している。
【図５】６個の参照化合物に基づいて２３個の最良予測遺伝子で行ったＰＬＳ−ＤＡのＰＣ１(主成分１；ｔ[１])のスコア。カラーの元画像をコンピュータでグレースケールに変換している。
【図６】６個の参照化合物後の細胞毒性および遺伝毒性化合物の２３個の予測遺伝子についてのクラスター解析。上パネルは点が着色された元画像を示し、そして下パネルはコンピュータでグレースケールに変換した画像を示す。
【図７】細胞毒性および遺伝毒性化合物についての６個の予測遺伝子のクラスター解析。上パネルは点が着色された元画像を示し、そして下パネルはコンピュータでグレースケールに変換した画像を示す。
【図８】全６個の予測遺伝子で行ったＰＬＳ−ＤＡのＰＣ１(主成分１；ｔ[１])のスコア。カラーの元画像をコンピュータでグレースケールに変換している。
【図９】無作為応答順列による予測モデルのバリデーション。ｘ軸は、元の毒性クラスのセットと順列を入れ替えたものとのとの相関を示す；ｙ軸は、計算したＲ２(適合度)およびＱ２(予測度)値を示す。カラーの元画像をコンピュータでグレースケールに変換している。
【図１０Ａ】左手側はバイオマーカー−１(ＢＭ１)遺伝毒性サンプルクラスターおよび右手側は非遺伝毒性のキャリブレーションおよびバリデーションサンプルの偏差値の散布図である；分離線はｘ＝０である。トランスプラチンサンプル以外の他の全てのバリデーションサンプルが正しく予測された。
【図１０Ｂ】ＢＭ１の応答順列(ｎ＝１００回)によるバリデーションのグラフである。このタイプのバリデーションのために、サンプルのクラス構成員を無作為に混ぜ、予測モデルを構築した。ランダムデータでのこれらのモデルの性能を、Ｒ２およびＱ２切片の観点から評価し、(ｘ＝１)の正しいクラス構成員で得られたモデルの性能パラメータと比較する。
【図１１Ａ】バイオマーカー−２(ＢＭ２)のキャリブレーションおよびバリデーションサンプルの偏差値の散布図である。左手側は遺伝毒性サンプルクラスターおよび右手側は非遺伝毒性；分離線はｘ＝０である。トランスプラチンサンプル以外、他の全てのバリデーションサンプルが正しく予測された。
【図１１Ｂ】ＢＭ２の応答順列(ｎ＝１００回)によるバリデーションのグラフである。サンプルのクラス構成員を無作為に混ぜ、予測モデルを構築した。ランダムデータでのこれらのモデルの性能をＲ２およびＱ２の観点から評価し、正しいクラス構成員で得られたモデルの性能パラメータと比較する。
【図１２Ａ】バイオマーカー−３(ＢＭ３)のキャリブレーションおよびバリデーションサンプルの偏差値の散布図である。左手側は遺伝毒性サンプルクラスターおよび右手側は非遺伝毒性；分離線はｘ＝０である。トランスプラチンサンプル以外、他の全てのバリデーションサンプルが正しく予測された。
【図１２Ｂ】ＢＭ３の応答順列(ｎ＝１００回)によるバリデーションのグラフである。サンプルのクラス構成員を無作為に混ぜ、予測モデルを構築した。ランダムデータでのこれらのモデルの性能を、Ｒ２およびＱ２の観点から評価し、正しいクラス構成員で得られたモデルの性能パラメータと比較する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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