(57)【要約】本発明は、癌の治療における薬剤としての改変単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）の組成物および使用に関する。本改変ＨＳＶ−２は、融合性活性を有する。本改変ＨＳＶ−２は、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を有するがプロテインキナーゼ活性を欠くポリペプチドをコードする改変／変異ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを含む。特定の態様では、このウイルスは、悪性細胞の治療に有用である。特定の実施態様では、このウイルスは、腫瘍細胞中で選択的に複製する。さらに別の特定の実施態様では、このウイルスは、細胞膜融合を起させて少なくともいくつかの望ましくない細胞の培養物、組織または生物を駆逐する。
2008546801.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを内部に有する単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）を含む化合物の、宿主内の癌細胞を選択的に殺傷するための薬物の製造における使用であって、該改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を有するがプロテインキナーゼ活性を欠くＩＣＰ１０ポリペプチドをコードする、使用。
【請求項２】
前記ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、該ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドのプロテインキナーゼドメインの一部を削除することによって改変されている、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、緑色蛍光蛋白質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）からなる群より選択されるレポーター蛋白質をコードするポリヌクレオチドの挿入によって改変されている、請求項１に記載の使用。
【請求項４】
前記ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、腫瘍壊死因子、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン−２、インターロイキン１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆ４２Ｋ、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１βおよびＭＣＰ−１からなる群より選択される免疫調節遺伝子をコードするポリヌクレオチドの挿入によって改変されている、請求項１に記載の使用。
【請求項５】
前記改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、構成的プロモーターに作動可能に結合している、請求項１から４の任意の１項に記載の使用。
【請求項６】
前記ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、前記内因性プロテインキナーゼ活性ドメインの少なくとも一部を融合性膜糖蛋白質をコードするポリヌクレオチドで置換することによってさらに改変されている、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記融合性膜糖蛋白質は、テナガザル白血病ウイルスエンベロープ融合性膜糖蛋白質、マウス白血病ウイルスエンベロープ蛋白質、細胞質ドメインを欠くレトロウイルスエンベロープ蛋白質、はしかウイルス融合蛋白質、ＨＩＶ  ｇｐ１６０蛋白質、ＳＩＶ  ｇｐ１６０、レトロウイルスＥｎｖ蛋白質、エボラウイルスＧｐおよびインフルエンザウイルスヘムアグルチニンからなる群より選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記薬物は、癌細胞を、該癌細胞膜の融合（合胞体形成）によって選択的に殺傷する、請求項１に記載の使用。
【請求項９】
前記薬物は、感染腫瘍細胞および周囲の腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することによって、癌細胞を選択的に殺傷する、請求項１に記載の使用。
【請求項１０】
前記薬物を腫瘍内投与する、請求項１に記載の使用。
【請求項１１】
前記薬物を全身投与する、請求項１に記載の使用。
【請求項１２】
前記薬物を腹腔内投与する、請求項１に記載の使用。
【請求項１３】
腫瘍崩壊特性と融合特性とを有するＨＳＶ−２ウイルスを生成する方法であって、
ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを改変する工程であって、該改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を有するがプロテインキナーゼ活性を欠くＩＣＰ１０ポリペプチドをコードする、工程、および
該改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを構成的に活性なプロモーターと作動可能に結合させる工程、
を含む方法。
【請求項１４】
腫瘍崩壊特性および融合特性を有する単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）を含む組成物であって、該ＨＳＶ−２は、改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを含み、該改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を有するがプロテインキナーゼ活性を欠くＩＣＰ１０ポリペプチドをコードし、該改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、構成的プロモーターに作動可能に結合された、組成物。
【請求項１５】
前記ＨＳＶ−２は、前記ＩＣＰ１０遺伝子のプロテインキナーゼ活性ドメインに挿入された、融合性膜糖蛋白質をコードするポリヌクレオチドをさらに含み、該融合性膜糖蛋白質は、テナガザル白血病ウイルスエンベロープ融合性膜糖蛋白質、該テナガザル白血病ウイルスエンベロープ糖蛋白質のＣ末端切除形（ＧＡＬＶ．ｆｕｓ）、マウス白血病ウイルスエンベロープ蛋白質、細胞質ドメインを欠くレトロウイルスエンベロープ蛋白質、はしかウイルス融合蛋白質、ＨＩＶ  ｇｐ１６０蛋白質、ＳＩＶ  ｇｐ１６０、レトロウイルスＥｎｖ蛋白質、エボラウイルスＧｐおよびインフルエンザウイルスヘムアグルチニンからなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＨＳＶ−２は、前記ＩＣＰ１０遺伝子のプロテインキナーゼ活性ドメインに挿入されたポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドは、緑色蛍光蛋白質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）からなる群より選択されるレポーター蛋白質をコードする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＨＳＶ−２は、前記ＩＣＰ１０遺伝子のプロテインキナーゼ活性ドメインに挿入されたポリヌクレオチドを含み、該ポリヌクレオチドは、腫瘍壊死因子、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターロイキン−２、インターロイキン１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｆ４２Ｋ、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１βおよびＭＣＰ−１からなる群より選択される免疫調節遺伝子をコードする、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１８】
前記ＨＳＶ−２は、前記ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドのプロテインキナーゼ活性ドメインに挿入された治療用ポリヌクレオチドをさらに含み、該治療用ポリヌクレオチドは、ＨＳＶｔｋ、シトシンデアミナーゼおよびカスパーゼ−３からなる群より選択される、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１９】
前記構成的に活性なプロモーターは、即時早期サイトメガロウイルスプロモーターである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２０】
リボヌクレオチドレダクターゼ活性を有するがプロテインキナーゼ活性を欠くポリペプチドをコードする改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを含むＨＳＶ−２ウイルスベクターを含む組成物であって、該改変ポリヌクレオチドは、構成的プロモーターに作動可能に結合した、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
この出願は、２００５年６月２３日に出願された仮出願第６０／６９３，１５７号（この全体が、参考として本明細書に援用される）への優先権を主張する。
【０００２】
（連邦の援助を受けた研究または開発においてなされた発明の権利に関する声明）
本発明は、少なくとも部分的に、ＮＩＨ補助金第ＲＯ１  ＣＡ１０６６７１−０１に従って米国政府が提供した資金を用いて開発された。米国政府は、本発明において特定の権利を有することがある。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、ウイルス学、癌生物学、細胞生物学、分子生物学、および癌治療薬を含む薬剤の分野を目的とする。詳しくは、本発明は、ＩＣＰ１０遺伝子の改変形を含む変異体単純ヘルペスウイルス２（ＨＳＶ−２）と、この変異体ＨＳＶ−２の悪性疾患の治療への使用を提供する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
複製選択的殺腫瘍ウイルスは、固形腫瘍に対する抗腫瘍因子として大きな将来性を示した。これらのウイルスは、腫瘍細胞中では優先的に複製することができるが、正常細胞中では複製する能力が制限される。殺腫瘍ウイルスの基本的な抗腫瘍機序は、ウイルスが、最初に感染した腫瘍細胞から周囲の腫瘍細胞へ伝播し、広がるときの直接細胞変性効果によるものであり、大きな体積の分布と抗癌効果とを実現する。殺腫瘍を目的として、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、最も普通には、正常細胞（非分裂型）中での効率的な複製に必要なウイルス遺伝子は削除するが、腫瘍細胞に関しては削除しないことによって改変されてきた。改変は、ウイルスγ３４．５遺伝子またはＩＣＰ６遺伝子の削除を含む。ウイルスγ３４．５遺伝子は、ＨＳＶ感染時に神経毒性因子として機能する（非特許文献１）。この遺伝子を除くと、非分裂細胞中でのウイルス複製が妨げられる（ＭｃＫｉｅら、（１９９６）  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ７４（５）：  ７４５−５２）。ウイルスＩＣＰ６遺伝子は、リボヌクレオチド１レダクターゼの大型サブユニットをコードする。この大型サブユニットは、ウイルスＤＮＡが効率的に複製するのに十分なｄＮＴＰプールを作り出し、腫瘍細胞中では大量に発現するが、非分裂細胞中では発現しない。従って、この遺伝子を変異させたウイルスは、腫瘍細胞中で選択的に複製し、腫瘍細胞を殺傷することができる。動物研究段階で広範に試験され、現在は臨床試験段階にある殺腫瘍ＨＳＶ  Ｇ２０７は、γ３４．５遺伝子座とＩＣＰ６遺伝子中の挿入変異との両方の複製体において、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子による削除を受ける（Ｗａｌｋｅｒら、（１９９９）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０（１３）：  ２２３７−２２４３）。あるいは、腫瘍特異性プロモーターを用いてＨＳＶ複製に必須のγ３４．５または他の遺伝子を駆動することによって、殺腫瘍１型ＨＳＶを構築することができる（Ｃｈｕｎｇら、（１９９９）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３（９）：  ７５５６−６４）。
【０００５】
殺腫瘍単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、当初、脳腫瘍の治療を目的として設計され、構築された（Ａｎｄｒｅａｎｓｋｙら、（１９９６）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．９３（２１）：  １１３１３−１１３１８）。その後、それらは、乳腺（Ｔｏｄａ，  ｅｔ  ａｔ，  （１９９８）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９（１５）：  ２１７７−２１８５）、前立腺（Ｗａｌｋｅｒら、（１９９９）  Ｈａｒｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０（１３）：  ２２３７−２２４３）、肺（Ｔｏｙｏｉｚｕｍｉら、（１９９９）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １０（１８）：  ３０１３−３０２９）、卵巣（Ｃｏｕｋｏｓら、（１９９９）  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５（６）：  １５２３−１５２７）、結腸および肝臓（Ｐａｗｌｉｋら、（２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６１（１１）：  ２７９０−２７９５）を含むさまざまなその他のヒト固形腫瘍において有効であることが見いだされた。殺腫瘍ＨＳＶの安全性も、マウス（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎら、（２０００）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７４（８）：  ３８３２−３８４１）および霊長類（ヨザル属）において検証された。後者は、ＨＳＶ感染症に極めて敏感である（Ｔｏｄｏら、（２０００）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７（６）：  ９３９−９４６）。これらの研究によって、殺腫瘍ＨＳＶはインビボ投与に極めて安全であることが確認された。
【０００６】
殺腫瘍ＨＳＶは、もっぱらＨＳＶ−１から構築されてきた。ＨＳＶ−２は、殺腫瘍ウイルスを構築する目的で検討されたことがない。しかし、ＨＳＶ−２は、腫瘍溶解剤としての可能性を高める独特の特徴をいくつか有する。例えば、ＨＳＶ−２は、ＨＳＶ−１と異なり、好中球、単核細胞およびＮＫ細胞の機能に影響を及ぼす糖蛋白質Ｇ（ｇＧ）の分泌形をコードすることが報告された（非特許文献２）。そのような性質は、ＨＳＶ−２から誘導された殺腫瘍ウイルスに、体の先天性免疫の阻害効果に抵抗する能力を提供することがある。先天性免疫は、侵入する微生物に対する宿主の高速応答であり、インビボのＨＳＶ複製を制限する主要な因子であることが見いだされた（Ｄａｌｌｏｕｌら、（２００４）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ  ３０（４）：  ３２９−３６；  Ｗａｋｉｍｏｔｏら、（２００３）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０（１１）：  ９８３−９０）。従って、ＨＳＶ−２から誘導された殺腫瘍ウイルスは、患者の体が抗ＨＳＶ先天性免疫を発展させても、自己複製し、広がるはずである。
【０００７】
前臨床研究は有望であったが、初期臨床試験の結果によると、現状の殺腫瘍ウイルスは、安全ではあるものの単独では限られた抗腫瘍活性しか有しないことが示唆された（Ｎｅｍｕｎａｉｔｉｓら、（２００１）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．  １９（２）：  ２８９−２９８）。本発明者らの研究によると、殺腫瘍ＨＳＶに細胞膜融合活性を組み込むと、ウイルスの抗腫瘍力を劇的に高めることができることが実証された（Ｆｕら、（２００２）  Ｍｏｔ  Ｔｈｅｒ．  ７（６）：  ７４８−７５４；  Ｆｕら、（２００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２：  ２３０６−２３１２。そのような融合殺腫瘍ウイルスは、腫瘍中の合胞体形成をもたらし、ウイルスの破壊力を直接高め、その腫瘍内の広がりを促進する（Ｆｕら、（２００３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ６２：  ２３０６−２３１２）。合胞体形成の腫瘍崩壊機序と融合殺腫瘍ＨＳＶによる直接細胞溶解とを独自に組み合わせると、インサイチュ腫瘍抗原提示が促進され、強力な抗腫瘍免疫応答が得られる（Ｎａｋａｍｏｒｉら、（２００４）  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ９（５）：  ６５８−６６５）。さらに、合胞体形成による融合殺腫瘍ＨＳＶの広がりによって、ホストの中の中和抗ウイルス抗体の存在下でも、抗腫瘍活性を維持することが可能になる。ウイルスは、生細胞の中でしか複製することができず、ウイルスの複製には、通常、特定の細胞信号伝達経路の活性化が必要である。多くのウイルスは、これらの信号伝達経路を活性化して複製に役立てるさまざまな戦略を進化の間に取得した。単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）リボヌクレオチドレダクターゼ（ＩＣＰ１０またはＲＲＩ）の大型サブユニットは、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（ＰＫ）活性を有する固有のアミノ末端ドメインを含む。このＰＫ活性は、細胞Ｒａｓ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路を活性化することが見いだされた（Ｓｍｉｔｈら、（２０００）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４（２２）：  １０４１７−２９）。
【０００８】
ＬｕｏとＡｕｒｅｌｉａｎとは、ＨＳＶ−２の中のＩＣＰ１０遺伝子のさまざまな削除を含むさまざまなベクターを記載して、特定のモチーフと特定の活性との間の関係を実証している  （Ｌｕｏ  ａｎｄ  Ａｕｒｅｌｉａｎ，  （１９９２）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７（１４）：  ９６４５−５３）。ＨＳＶ−２、ＩＣＰ１０遺伝子の改変構築体および削除構築体を用いて、リボヌクレオチドレダクターゼドメインの特定の特性が実証された（Ｐｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２１６（１）：  １８４−９６）。
【０００９】
リボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子からＰＫドメイン（ＩＣＰ１０  ＰＫ）を削除すると、活性化Ｒａｓ信号伝達経路を予め存在させていない細胞中では、複製するウイルスの能力がひどく低下する（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ  （１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２（１１）：  ９１３１−９１４１）。
【００１０】
特許文献１は、ＨＳＶ−２による攻撃からの保護を提供するワクチンを目的とする。ＩＣＰ１０のプロテインキナーゼドメインを削除したところ、細胞に感染し、細胞を変換させるＨＳＶ−２の能力に対して有害な効果が表れる。
【００１１】
本発明は、改変されたＨＳＶ−２を利用して癌の治療のための新規な治療薬を提供することによって、当分野における必要を満たす。
【特許文献１】米国特許第６，０１３，２６５号明細書
【非特許文献１】Ｃｈｏｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０）２５０：１２６２−１２６６
【非特許文献２】Ｂｅｌｌｎｅｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（２００５）１７４（４）：  ２２３５−４１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
本発明は、腫瘍崩壊特性を有する強力な改変単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）を提供することによって、当分野の長年の求めに対する答を示す。本発明の特定の実施態様では、ウイルスは、改変されたＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを有する。ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を有するが、プロテインキナーゼ活性の欠失するＩＣＰ１０ポリペプチドをコードする。特定の態様では、ウイルスは、悪性細胞の治療に有用である。特定の実施態様では、ウイルスは、腫瘍細胞中で選択的に複製する。さらに別の特定の実施態様では、ウイルスは、細胞膜融合を起させて少なくともいくつかの望ましくない細胞の培養物、組織または生物を駆逐する。さらに別の特定の実施態様では、ウイルスは、少なくともいくつかの望ましくない細胞の増殖を阻害し、および／または少なくともいくつかの望ましい細胞のアポトーシスを誘導し、および／または強力な抗腫瘍免疫応答を誘導し、および／またはそれらを組み合わせる。
【００１３】
野生型ＨＳＶ−２ウイルスは、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ活性などのプロテインキナーゼ（ＰＫ）活性を有するアミノ末端ドメインと、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を有するｃ−末端ドメインとを有するポリペプチドをコードするＩＣＰ１０ポリヌクレオチド（ＲＲ１ポリヌクレオチドとも呼ばれることがある）を含む。本発明の特定の態様では、ウイルスが、腫瘍細胞中で選択的複製活性（従って、腫瘍細胞を崩壊させる活性）および／またはウイルスを融合型にする活性を含み、あるいは膜融合（合胞体形成）活性を含むという意味で融合型活性を高めるように、内因性ＰＫドメインを改変する。いくつかの実施態様では、プロテインキナーゼドメインをコードする内因性配列の少なくとも一部を削除することによって、コード化されるポリペプチドのプロテインキナーゼ活性が欠失するように、ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを改変する。
【００１４】
本発明の別の実施態様では、プロテインキナーゼドメインの少なくとも一部をコードする内因性ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドの少なくとも一部を第２のポリヌクレオチドが置換する。さらにその他の実施態様では、置換されなかったＩＣＰ１０配列は、ＲＲドメイン全体を含む。内因性ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドの少なくとも一部の置換は、例えば、相同組み換え、またはＰＣＲおよび当業者に公知のその他の方法論の使用を含むその他の適当な遺伝子工学的方法によるなど、任意の適当な方法によって行ってよい。
【００１５】
本発明の追加の態様では、ＩＣＰ１０の内因性ＰＫドメインの少なくとも一部を置換するポリヌクレオチドは、任意の適当な配列であってよい。例えば、ＰＫドメインを置換するポリヌクレオチドは、レポーター遺伝子産物または治療遺伝子産物をコードしてよい。第２のポリヌクレオチド（ＰＫドメインの少なくとも一部を置換した）を含む改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、置換ポリヌクレオチドと、残るＩＣＰ１０遺伝子の非置換部分とで構成される融合蛋白質をコードする。本発明で用いるのに適するレポーター遺伝子の非限定的な例は、緑色蛍光蛋白質（ＳＥＱ  ＩＤ．ＮＯ：１６、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  Ｕ５５７６１）、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよび単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）を含む。治療ポリヌクレオチドの非限定例は、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトシンデアミナーゼ、カスパーゼ−３および野生型ｐ５３を含んでよい。
【００１６】
本発明のさらにその他の実施態様では、ＩＣＰ１０の内因性ＰＫドメインの少なくとも一部を置換するポリヌクレオチドは、免疫調節遺伝子、または融合膜糖蛋白質（ＦＭＧ）をコードするポリヌクレオチドであってよい。本発明で用いるのに適する免疫調節遺伝子の非限定的な例は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２またはＧＭ−ＣＳＦ、およびその他のサイトカイン類、Ｆ４２Ｋおよびその他のサイトカイン類縁体、あるいはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよびその他のケモカインを含む。本発明で用いるのに適する融合膜糖蛋白質をコードするポリヌクレオチドの非限定的な例は、パラミクソウイルスＦ蛋白質、ＨＩＶ  ｇｐ１６０蛋白質、ＳＩＶ  ｇｐ１６０蛋白質、レトロウイルスＥｎｖ蛋白質、エボラウイルスＧｐまたはインフルエンザウイルスヘムアグルチニン、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）由来の膜糖蛋白質またはテナガザル白血病ウイルスエンベロープ糖蛋白質Ｃ−末端切除形（ＧＡＬＶ．ｆｕｓ）を含む。
【００１７】
本発明のその他の実施態様では、改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、構成的プロモーターに作動可能結合される。本発明で用いるのに適する構成的プロモーターの非限定的な例は、即時早期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ベータチキンアクチンプロモーターおよびＨＳＶ０−ＴＫプロモーターを含む。本発明のその他の実施態様では、内因性ＰＫドメイン（またはＴＭドメイン）の少なくとも一部を置換するポリヌクレオチドは、それに作動可能結合した調節配列を含む。特定の実施態様では、調節配列は、真核細胞中で作動可能であり、さらに別の態様では、癌細胞中で作動可能である。本明細書に記載されている方法および組成物を実際に使用するために有用なプロモーターの非限定的な例は、腫瘍特異性プロモーターおよび／または組織特異性プロモーター、例えば前立腺特異性抗原（ＰＳＡ）プロモーター、カリクレイン２プロモーターおよびプロベイシンプロモーター（前立腺癌の場合）、Ｌ−プラスチンプロモーター（乳腺、卵巣および結腸の癌の場合）、サイログロブリンコアプロモーター（甲状腺癌の場合）、ミッドカインおよびシクロオキシゲナーゼ−２プロモーター（すい臓癌の場合）および大多数の腫瘍の場合のヒトテロメラーゼプロモーター（ｈＴＥＲＴ）を含んでよい。
【００１８】
さらに別の実施態様では、第１の細胞と第２の細胞との間の融合を生成する方法であって、本発明の組成物を第１の細胞に導入することによって第２の細胞膜を第１の細胞膜と融合させる工程を含む方法が提供される。特定の実施態様では、第１の細胞、第２の細胞、または第１の細胞と第２の細胞との両方は、固形腫瘍における悪性細胞などの悪性細胞である。本明細書に記載されている方法および組成物を実際に使用する際に用いるのに適する悪性細胞の非限定的な例は、乳癌細胞、肺癌細胞、皮膚癌細胞、前立腺癌細胞、すい臓癌細胞、結腸癌細胞、脳癌細胞、肝臓癌細胞、甲状腺癌細胞、卵巣癌細胞、腎臓癌細胞、脾臓癌細胞、白血病細胞または骨癌細胞を含んでよい。
【００１９】
特定の実施態様では、導入する工程は、さらに、ウイルスをヒトに全身供給することによるなど、ウイルスをヒトに供給する工程と定義される。投与の非限定的な経路は、本明細書に記載されている組成物を、静脈内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与またはそれらの任意の組み合わせによって投与することを含んでよい。特定の実施態様では、本組成物を複数の細胞に導入する。
【００２０】
追加の実施態様では、ヒトの悪性細胞などの悪性細胞を崩壊させる方法が提供される。この方法は、本発明の組成物を細胞に導入する工程を含み、この導入の後、悪性細胞の膜は別の細胞膜と融合する。
【００２１】
別の実施態様では、本発明の組成物を含む哺乳類細胞がある。この哺乳類細胞は、正常リンパ球、マクロファージ、天然キラー細胞または本発明の組成物を腫瘍細胞に送るキャリアとして機能する任意のその他の種類の細胞であってよい。
【００２２】
本発明のさらに別の実施態様では、本明細書に記載されている改変ＨＳＶ−２ウイルスまたはウイルスベクターは、ウイルスに感染した癌細胞中にアポトーシスを誘導する。さらに別の実施態様では、ウイルスに感染していないが、本明細書に記載されている改変ＨＳＶ−２ウイルスに感染した細胞の周囲の傍観者細胞中にアポトーシスが誘導される。
【００２３】
本発明のさらに別の実施態様では、本明細書に記載されているウイルスまたはウイルスベクターは、細胞を溶解させるためのウイルスの効力およびまたは合胞体形成を評価するためのシステムの部分を含む。このシステムは、本明細書に記載されているウイルスまたはベクターと接触した細胞を含む。いくつかの実施態様では、細胞は、原発癌細胞または癌細胞系統由来の細胞などの真核細胞であってよい。その他の実施態様では、細胞は、本明細書に記載されているウイルスまたはベクターにとってホストとして働く原核細胞であってよい。本発明のさらにその他の実施態様では、ウイルスまたはウイルスベクターをさらに含む細胞をインビトロに保持してよい。本発明のさらにその他の実施態様では、ウイルスまたはベクターをさらに含む細胞をマウスなどの動物の中に配置する。本発明のさらにその他の実施態様では、癌細胞をウイルスまたはベクターと接触させて配置する前に、動物中に移植してよい。
【００２４】
以上は、以下の本発明の詳細な説明をより良く理解することができるように、本発明の特徴および技術的利点の概要を広く示した。本発明の同じ目的を実行するために他の構造体を改変し、または設計するための基礎として、開示する概念および特定の実施態様を容易に利用し得ることは、当業者には自明である。そのような均等物な構築体は、添付の請求項に示される本発明の技術思想および範囲から逸脱しないことも、当業者には自明である。構成と、動作方法との両方に関して、本発明の特徴であると考えられる新規な特徴、その他の目的および利点とともに、添付の実施例および図と関連させて考慮すれば、以下の説明からよりよく理解されよう。しかし、実施例および図は、それぞれ、例を示し説明するために提供されるにすぎず、本発明の限定の定義としてではないことは明白に理解するべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
実施例１に記載するＨＳＶ−２ウイルス組成物を２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡに寄託した。ＡＴＣＣは、ブダペスト条約にもとづいて設立された国際的な寄託機関（ＩＤＡ）である。寄託証明書番号は  である。
【００２６】
Ｉ．定義
本明細書で用いられる用語「単純ヘルペスウイルス」または「ＨＳＶ」は、ヒトを含む哺乳類に感染する被膜、二十面体、二本鎖ＤＮＡウイルスを指す。野生型ＨＳＶは、最終分化非分裂細胞と分裂細胞との両方に感染し、内部で複製する。「ＨＳＶ−２」は、ＩＣＰ１０遺伝子を含むＨＳＶ系のメンバーを指す。本明細書で用いられる用語「ＦｕｓＯｎ−Ｈ２」は、本明細書で記載される、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を有するがプロテインキナーゼ活性の欠失したポリペプチドをコードする改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを有するＨＳＶ−２変異体を指す。
【００２７】
本明細書で用いられる用語「細胞膜融合」は、例えば２つの隣接する細胞など、少なくとも２つの細胞の外部膜の融合を指す。
【００２８】
本明細書で用いられる用語「融合活性の増強」は、細胞膜融合の増強、増加、強化、増加、拡大またはそれらの組み合わせを指す。
【００２９】
本明細書で用いられる用語「殺腫瘍」は、直接的または間接的に、結果として悪性細胞を崩壊させることができる剤の性質を指す。特定の実施態様では、この性質は、悪性細胞膜の別の膜と融合を引き起こすことを含む。
【００３０】
本明細書で用いられる用語「選択複製」または「条件付き複製」は、特定の組織（例えば腫瘍）の中で選択的に成長する殺腫瘍ウイルスの能力を指す。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「合胞体」は、著しく大きな数の融合細胞を含む複数核巨大細胞形成を指す。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、細胞の中に導入して自己複製させることができるようにするために、核酸配列を挿入することができるキャリア核酸分子を指す。挿入された核酸配列は、ベクターを導入した細胞に対して異物であるか、または細胞中の配列と相同であるが配列が本来見いだされない宿主細胞核酸中の位置にあるか、どちらの場合にも、「外因性」と呼ばれる。ベクターは、非ウイルスＤＮＡベクターまたはウイルスベクターのどちらであってもよい。ウイルスベクターは、ウイルス蛋白質中にカプセル化され、細胞を感染させることができる。ベクターの非限定的な例は、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、裸のＤＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミド、人工染色体（例えばＹＡＣ）、ファージベクター、陽イオン縮合剤と会合したＤＮＡ発現ベクター、リポソーム中にカプセル化されたＤＮＡ発現ベクターまたは特定の真核細胞、例えばプロデューサー細胞を含む。特に断らない限り、本明細書で用いられる「ベクター」は、ＤＮＡベクターおよびウイルスベクターを指す。当業者は、標準的な組み換え技法によってベクターを構築することが十分にできる。一般的に、これらは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  （１９８９）およびその中の引用文献を含む。ウイルス学的考察は、Ｃｏｅｎ  Ｄ．  Ｍ，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２”ｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｂ．  Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ  （ｅｄｉｔｏｒ），  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９０）およびその中の引用文献にも概説されている。
【００３３】
用語「発現ベクター」は、転写することができるＲＮＡをコードする核酸を含む任意の種類の遺伝子の構築体を指す。ある場合には、ＲＮＡ分子は、次に、蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳される。他の場合には、例えば、アンチセンス分子またはリボザイムの産生では、これらの配列は翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主細胞中に作動可能結合した暗号配列の転写およびおそらく翻訳に必要な核酸配列を参照するさまざまな「制御配列」を含んでよい。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、他の機能を果し、ならびに下記に記載されている核酸配列を含んでよい。
【００３４】
「プロモーター」は、転写の開始および転写の速度が制御される核酸配列の領域となる制御配列である。それは、核酸配列の時間的および空間的転写を開始するかまたは調節するＲＮＡポリメラーゼおよびその他の転写因子などの調節蛋白質および分子が結合する遺伝要素を含んでよい。句「動作有効配置される」、「作動可能結合される」、「制御される」および「転写調節される」は、核酸配列に対してプロモーターがその配列の転写開始および／または発現を制御する正しい機能位置にありおよび／または方向を有することを意味する。非限定的なプロモーターの例は、構成的プロモーター、組織特異性プロモーター、腫瘍特異性プロモーターまたは外因性誘導要素に制御される内因性プロモーターを含む。
【００３５】
本明細書で用いられる用語「構成的プロモーター」は、細胞周期全体を通じて時間的に連続して遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を推進するプロモーターを指す。構成的プロモーターは、細胞周期全体を通して連続して動作してそれが関連する遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を推進する限り、細胞型特異性または組織型特異性であってよい。非限定的な構成的プロモーターの例は、即時早期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＳＶ４０早期プロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ベータチキンアクチンプロモーターおよびＨＳＶ  ＴＫプロモーターを含む。
【００３６】
用語「エンハンサー」は、核酸配列の転写活性化の制御に関与するシス活性調節配列を指す。
【００３７】
本明細書では、用語「接触する」および「曝露される」は、細胞に適用されると、ウイルス、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、ＤＮＡベクターまたは任意のその他の治療剤が、単独または組み合わされて、標的細胞に投与されるかまたは標的細胞と直接共存して配置されるプロセスを記述するために用いられる。
【００３８】
句「改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドレダクターゼ（ＲＲ）活性を有するがプロテインキナーゼ活性の欠失したＩＣＰ１０ポリペプチドをコードするＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを指す。
【００３９】
句「リボヌクレオチドレダクターゼ活性」は、ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドのＣ末端のドメインの、ウイルス複製に必要なデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）を十分に発生させる能力を指す。
【００４０】
句「プロテインキナーゼ活性」は、ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドのアミノ末端ドメインの、Ｒａｓ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路を活性化することができるセリンおよびスレオニン残基をリン酸化する能力を指す。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「傍観者腫瘍細胞」は、本明細書に記載されている改変ＨＳＶ−２ウイルスに感染していないが、本明細書に記載されているウイルスまたはベクターに感染した腫瘍細胞に隣接するかまたは近傍にある腫瘍細胞を指す。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「抗癌剤」は、例えば、癌細胞を殺し、癌細胞中にアポトーシスを誘導し、癌細胞の成長速度を低下させ、転移の発生率または数を減らし、腫瘍サイズを小さくし、腫瘍成長を阻害し、腫瘍または癌細胞への血液の供給を減らし、癌細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進し、癌の進行を妨げるかまたは阻害し、あるいは癌を有する被験者の寿命を伸ばすことによって、被験者の体内の癌に負の影響を及ぼすことができる剤を指す。
【００４３】
本明細書で用いられる句「医薬品として」または「薬理学的に許容される」は、動物またはヒトに適切に投与されると、拒否反応、アレルギー反応またはその他の有害な反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。句「医薬品として許容されるキャリア」は、任意のおよびすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤ならびに類似物を含む。
【００４４】
用語「単位用量」は、被験者に用いるのに適する物理的に離散した単位を指す。各単位は、その投与に伴って所望の応答を生み出すと計算された、予め定められた量の治療組成物、すなわち適切な経路および治療計画を指す。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「有効な」または「治療として有効な」は、症状の悪化を阻むこと、疾患の発症を防ぐこと、疾患の広がりを防ぐこと、疾患の少なくとも１つの症状の回復、あるいはそれらの組み合わせを指す。
【００４６】
ＩＩ．導入
ウイルスは、生細胞の中でしか複製することができず、ウイルスの複製は、通常、特定の細胞信号伝達経路の活性化を必要とする。多くのウイルスは、これらの信号伝達経路を活性化して複製に利用するさまざまな戦略を進化の間に取得した。単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２）リボヌクレオチドレダクターゼ（ＩＣＰ１０またはＲＲ１）の大型サブユニットは、セリン／スレオニンプロテインキナーゼ（ＰＫ）活性を有する固有アミノ末端ドメインを含む。このＰＫ活性は、細胞Ｒａｓ／ＭＥＫ／ＭＡＰＫ経路を活性化することが見いだされた（Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｔ，  （２０００）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４（２２）：  １０４１７−２９）。その結果、このＰＫドメイン（ＩＣＰ１０  ＰＫ）をリボヌクレオチドレダクターゼ遺伝子から削除すると、予め存在する活性化Ｒａｓ信号伝達経路がない細胞などの、細胞中で自己複製するウイルスの能力がひどく低下する報告された（Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｔ，  （１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２（１１）：  ９１３１−９１４１）。
【００４７】
ここで、本発明者らは、ＨＳＶ−２のＰＫドメインを置換および／または改変し、その結果、改変ＩＣＰ１０遺伝子がコードする蛋白質にリボヌクレオチドレダクターゼ活性を持たせるがプロテインキナーゼ活性を欠失させると、ウイルスは、腫瘍細胞（少なくともＲａｓ信号伝達経路が腫瘍形成によって構成的に活性化された腫瘍細胞）の中で選択的に複製し、腫瘍細胞を崩壊させることを示す。さらに、本明細書に記載されているＩＣＰ１０ポリヌクレオチドの改変によって、ウイルスは固有融合型になる。すなわち、腫瘍細胞をこのウイルスに感染させると、広範な細胞膜融合（合胞体形成）が誘導される。この性質は、腫瘍細胞に対するウイルスの崩壊力を増大させる。さらに、インビボ研究によると、このウイルスは、局所投与にも全身投与にも極めて安全である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施態様では、ＰＫドメインの改変は、緑色蛍光遺伝子を発現する遺伝子などのレポーター遺伝子の挿入、および／または即時早期サイトメガロウイルスプロモーターなどの構成的プロモーターによる野生型プロモーター遺伝子の置換を含む。
【００４９】
いくつかの実施態様では、ＩＣＰ１０遺伝子のプロテインキナーゼ活性ドメインをコードするポリヌクレオチドに第２のポリヌクレオチドを挿入するか、またはプロテインキナーゼドメインの一部を第２のポリヌクレオチドで置換するかのどちらかによって、ＨＳＶ−２を遺伝子操作し、これによって、改変ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を持たせるがプロテインキナーゼ活性を欠失させる。例えば、第２のポリヌクレオチドは、融合膜糖蛋白質などの糖蛋白質をコードしてよい。本発明の範囲内で用いられる好ましい糖蛋白質は、テナガザル白血病ウイルスエンベロープ融合膜糖蛋白質（ＧＡＬＶ．ｆｕｓ）の切断型である。本発明の特定の態様では、本発明の殺腫瘍ウイルスとしてＧＡＬＶ．ｆｕｓを発現させると、ウイルスの抗癌効果は顕著に増強される。
【００５０】
いくつかの実施態様では、本発明の改変ＨＳＶ−２は、削除などの、ＩＣＰ１０の中の変異を含む。変異によって、ウイルスは細胞融合特性を得る。そのような変異は、ウイルススクリーニング時にランダムに発生させても自然から得てもよく、次に、本明細書に記載され、および／または当分野で既知の手段によって、細胞融合特性を有する潜在的な候補のプールの機能を評価する。融合性表現型をもたらす変異は、点変異、フレームシフト、反転、削除、スプライシング誤変異、転写後処理変異、特定のウイルス糖蛋白質の過剰発現、それらの組み合わせ等であってよい。変異は、特定のＨＳＶ−２の配列を解析し、それを既知の野生型配列と比較することによって特定してよい。
【００５１】
本発明の改変ＨＳＶ−２は、例えば、悪性細胞の広がりを阻み、分裂を減少させまたは阻害し、根絶し、発生または増殖を妨げ、またはそれらを組み合わせるなど、悪性細胞の治療に有用である。悪性細胞は、固形腫瘍などの任意の形の癌由来であってよいが、その他の形も治療可能である。本発明の改変ＨＳＶ−２は、肺、肝臓、前立腺、卵巣、胸、脳、すい臓、睾丸、結腸、頭および頸、黒色腫およびその他の種類の悪性腫瘍の治療に有用である。本発明は、転移段階を含む、癌疾患の任意の段階で悪性細胞を治療するのに有用である。本発明は、単独治療法として、または化学療法、手術、放射線治療および類似法を含む別の治療手段とともに利用してよい。
【００５２】
ＩＩＩ．改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチド
本発明は、改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを有するＨＳＶ−２変異体を記載する。改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を有するがプロテインキナーゼ（ＰＫ）活性の欠失したポリペプチドをコードする。ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、機能ＰＫドメインをコードするために必要な配列の少なくとも１部を削除するか、またはＰＫドメインをコードする配列の少なくとも１部を第２のポリヌクレオチドで置換するかのどちらかによって改変してよい。突然変異生成、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、相同組み換え、または当業者に既知の任意のその他の遺伝子操作技法を含む任意の適当な方法を用いて改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを生成させることができることは、当業者には自明である。
【００５３】
Ａ．突然変異生成
本発明の特定の実施態様では、例えば、さまざまな標準的な突然変異誘発手順のうち任意のものを用いる削除によって、ＨＳＶ−２ウイルスのＩＣＰ１０配列を変異させる。変異は、ヌクレオチド配列、単一遺伝子または遺伝子のブロックの改変を含んでよい。変異は、単一ヌクレオチドを含んでよく（ＤＮＡ配列内の単一ヌクレオチド塩基の除去、追加または置換を含む点変異など）、あるいは、多数のヌクレオチドの挿入または削除を含んでよい。変異は、ＤＮＡ複製の忠実さの誤差などの出来事の結果として自発的に起きてよく、あるいは、化学的または物理的突然変異原への曝露に続いて誘起されてよい。当業者に公知の特定の標的設定法を用いて、変異に部位指向性も付与してよい。
【００５４】
Ｂ．遺伝子組み換え
本発明の他の実施態様では、遺伝子組換え技法を用いてＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを改変し、ＰＫドメインをコードする配列の少なくとも一部を削除または置換する。削除／置換されるＰＫドメインの領域は、改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドがコードするポリペプチドに、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を維持させるがプロテインキナーゼ活性を欠失させる限り、任意の適当な領域であってよい。ただし、特定の実施態様では、ＰＫドメインを改変すると、８つのＰＫ触媒モチーフ（アミノ酸残基１０６〜４４５であるが、ＰＫ活性は、アミノ酸残基１〜４４５と考えられている）の１つ以上、および／または膜貫通（ＴＭ）領域、および／または不変のＬｙｓ（Ｌｙｓ１７６）に影響を及ぼす。野生型ＩＣＰ１０ポリペプチド配列の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１５（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ’ｓ  ＧｅｎＢａｎｋ  ｄａｔａｂａｓｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．１８１３２６２Ａ）に提供される。ＩＣＰ１０ポリペプチドをコードする野生型ポリヌクレオチドの例は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１７に提供される。
【００５５】
特定の実施態様では、ＰＫ活性に必要なＰＫドメインをコードする配列の一部を単に削除することによって、ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを改変する。ＰＫドメインをコードする配列の少なくともいくつかが欠失したＩＣＰ１０ポリヌクレオチドの例は、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１８に提供される。別の実施態様の例では、ＳＥＱ  ＩＤ：１９に提供されるように、ＰＫドメイン全体が削除されるように、ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを改変する。ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１８とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１９との両方が、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を有するがプロテインキナーゼ活性を欠くポリペプチドをコードするので、両方が、本明細書に記載されているＨＳＶ−２変異体を発生させるため用いるのに適する。特定の本発明の実施態様では、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１８またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１９に開示されている改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドは、内因性ＨＳＶ−２プロモーターに制御されてよく、あるいは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：２０に記載されている即時早期サイトメガロウイルスプロモーターなどの構成的プロモーターに作動可能結合されてよい。
【００５６】
本発明のさらに別の実施態様では、ＰＫドメインをコードする配列の少なくとも一部を、緑色蛍光蛋白質など、ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドのＲＲドメインをコードする配列のフレーム内に配置された、第２のポリヌクレオチドで置換することによって、ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを改変する。この構築体は、内因性ＨＳＶ−２プロモーターに制御されてもよく、ＣＭＶプロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）などの構成的プロモーターに制御されてもよい。実施例１に、この後者の構築体（ＧＦＰ置換ポリヌクレオチドおよびＣＭＶプロモーターを含む）をさらに詳しく記載する。
【００５７】
本発明の別の態様では、ＨＳＶ−２の内因性ＩＣＰ１０のプロテインキナーゼ活性ドメインの少なくとも一部を置換するポリヌクレオチドは、ウイルス融合膜糖蛋白質（ＦＭＧ）などの細胞膜融合誘導性ポリペプチドの少なくとも融合性部分をコードすることができる。このポリペプチドは、好ましくは、例えば、実質的に中性ｐＨ（ｐＨ約６〜８など）で細胞膜融合を誘導することができる。
【００５８】
特定の実施態様では、ＦＭＧは、ＭＬＶ（例としてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）またはＧＡＬＶ（例としてはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）などの、Ｃ−型レトロウイルスエンベロープ蛋白質由来の少なくとも融合性ドメインを含む。細胞質ドメインの一部、ほとんど、またはすべてを削除したレトロウイルスエンベロープ蛋白質は、ヒト細胞の場合、そのような操作が超融合活性を生む結果となるので有用である。いくつかの実施態様では、特定の改変をウイルス膜糖蛋白質中に導入して細胞膜融合を誘導する機能を増強する。例えば、複数のレトロウイルスおよびヘルペスウイルス糖蛋白質の細胞質ドメインを切断すると、融合活性が増加し、ときには、同時にウイルス粒子に組み込まれる効率が低下することが示された（Ｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６８（３）：  １７７３−８１）。
【００５９】
細胞膜融合ポリペプチドのいくつかの例は、はしかウイルス融合蛋白質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）、ＨＩＶ  ｇｐ１６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）およびＳＩＶ  ｇｐ１６０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）蛋白質、レトロウイルスＥｎｖ蛋白質（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、エボラウイルスＧｐ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびインフルエンザウイルスヘムアグルチニン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含む。
【００６０】
その他の実施態様では、第２の機能ポリヌクレオチドをＰＫドメインの中に挿入するか、または用いてＰＫドメインの一部または全体を置換してよい。この第２の機能ポリヌクレオチドは、免疫調節剤または他の治療剤をコードしてよい。これらの追加の剤は、細胞表面受容体およびＧＡＰ接合の上方調節、細胞増殖抑制剤および分化剤に影響を及ぼし、細胞接着を阻害し、または、悪性細胞のアポトーシス感受性を増加させると考えられる。免疫調節性または他の治療薬剤をコードするポリヌクレオチドの非限定的な例は、腫瘍壊死因子；インターフェロン、アルファ、ベータ、ガンマ；インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−１２、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、Ｆ４２Ｋ、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１β、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳ、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）、シトシンデアミナーゼおよびカスパーゼ−３を含む。
【００６１】
本発明のさらに別の実施態様では、レポーター蛋白質をコードするポリヌクレオチドの挿入によってＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを改変する。非限定的なレポーター蛋白質をコードするポリヌクレオチドの例は、緑色蛍光蛋白質、強化緑色蛍光蛋白質、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよびＨＳＶ−ｔｋを含む。
【００６２】
Ｃ．リボヌクレオチドレダクターゼ活性アッセイ
ＲＲの生物学的活性は、既に説明した方法（Ａｖｅｒｅｔｔら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５８：９８３１−９８３８  （１９８３）およびＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：９１３１−９１４１  （１９９８））に以下の変更を施して検出することができる。ＢＨＫ細胞を、最初、完全ＧＭＥＭ（１０％ＦＢＳを含む）中で密生させて成長させた後、０．５％ＦＢＳ  ＥＭＥＭ中で３日間培養し、続いて、２０ｐｆｕの野生型ＨＳＶ、ＨＳＶ−２変異体に感染させ、または偽感染させた。感染の２０時間後に細胞を集め、５００μｌのＨＤ緩衝液［１００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．６）、２ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）］に再び懸濁させ、氷の上で１５分間培養した後、３０秒間超音波処理した。遠心分離（１６，０００ｇ、２０分間、４℃）によって細胞破片を除去し、上清を４５％飽和の結晶硫酸アンモニウム（０．２５８ｇ／ｍｌ）で沈殿させる。２回目の遠心分離（１６，０００ｇ、３０分間）の後、ペレットを１００μｌのＨＦ緩衝液に溶解させ、５０μｌを取って等しい体積の２×反応緩衝液（４００ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ８．０）、２０ｍＭのＤＴＴおよび０．０２ｍＭ［３Ｈ］−ＣＤＰ（２４Ｃｉ／ｍｍｏｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  Ｉｌ）と混合する。１００ｍＭのヒドロキシ尿素と１０ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）とを加え、３分間沸騰させて反応を停止させる。次に１ｍｌのＣｒｏｔａｌｕｘ  ａｔｒｏｘ毒（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）を加え、３７℃で３０分間培養した後、さらに３間沸騰させる。次に、この溶液を０．５ｍｌのダウエックス−１ホウ酸塩カラムに通し、２ｍｌの水で試料を溶出させ、４つの溶出画分に集めてバイオフルオール（Ｂｉｏｆｌｕｏｒ）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｎｕｃｌｅａｒ，  Ｂｏｓｔｏｎ，  ＭＡ）と混合した後、シンチレーション計測する。リボヌクレオチドレダクターゼ活性を単位／ｍｇ蛋白質で表す。１単位は、１ｎｍｏｌ［３Ｈ］ＣＤＰのｄＣＤＰ／ｈｒ／ｍｇ蛋白質への変換を表す。
【００６３】
Ｄ．プロテインキナーゼ活性アッセイ
改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドがプロテインキナーゼ活性の欠失したポリペプチドをコードするか測定するために、改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドまたは野生型ＨＳＶ−２を有するＨＳＶ−２（ｍｏｉ＝２００、感染後１６時間）に感染させた細胞の抽出分を抗ＬＡ−１抗体で免疫沈降させ、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：３３８９−３３９８，  １９９８および米国特許第６，０１３，２６５号に記載されているＰＫアッセイに付す。通常、ＢＣＡ蛋白質アッセイキット（ＰＩＥＲＣＥ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ  ＩＬ．）を用いて細胞抽出物の免疫沈降物の蛋白質濃度を規格化し、２０ｍＭのＴｒｉｄ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、０．１５ＭのＮａＣｌを含むＴＳ緩衝液で洗浄し、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、２ｍＭのＭｎＣｌ２、１０μＣｉの［３２Ｐ］ＡＴＰ（３０００Ｃｉ／ミリモル、ＤｕＰｏｎｔ，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄ．）からなる５０μｌのキナーゼ反応緩衝液に懸濁させ、３０℃で１５分間培養する。ビーズを１ｍｌのＴＳ緩衝液で１回洗浄し、１００μｌの変性溶液に再懸濁させ、５分間沸騰させる。次に、７％ポリアクリルアミドゲルの上のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって蛋白質を分割する。次に、既に記載した（Ａｕｒｅｌｉａｎ  ｅｔ．  ａｌ．，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ７：１８７−１９１  １９８９）ように、蛋白質をニトロセルロース膜上に電気移動させ、特異抗体を用いるンキュベーションによって免疫ブロットした後、室温で１時間蛋白質Ａ−ペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）処理した。Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌ．  ２００：５９８−６１２（１９９４）に記載されているＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｃｈｉｃａｇｏ，  ＩＬ）によって検出を行ってよい。
【００６４】
ＩＶ．ベクター構築。
【００６５】
本発明は、ＩＣＰ１０配列の少なくとも一部を置換または削除し、これによって、改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドによってコード化される蛋白質に、リボヌクレオチドレダクターゼ活性を持たせるがプロテインキナーゼ活性を欠失させ、特定の実施態様では、構成的プロモーターなどの調節配列をさらに含む、ＨＳＶ−２ベクターを目的とする。いくつかの実施態様では、組成物は、改変ＩＣＰ１０遺伝子を含む裸のＤＮＡベクター（非ウイルス）であり、他の実施態様では、組成物は、改変ＩＣＰ１０遺伝子を有する組み換えＨＳＶ−２である。裸のＤＮＡベクターと組み換えウイルスとの両方は、以下の成分のいくつかまたはすべてをさらに含んでよい。
【００６６】
Ａ．ベクター
上記で定義したように、ベクターは、プラスミド、コスミド、ウイルス（バクテリオファージ、動物ウイルスおよび植物ウイルス）ならびに人工染色体（例えばＹＡＣｓ）を含むがそれらに限定されない。当分野では、設計されたウイルスおよびＤＮＡベクターを構築するための方法が知られている。通常、これらは、Ｓａｍｂｒｏｏｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｎｄ  Ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）およびその引用文献である。ウイルス学的考察は、Ｃｏｅｎ  Ｄ．  Ｍ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ａｎｉｍａｌ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ｉｎ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ２．ｓｕｐ．ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｂ．  Ｎ．  Ｆｉｅｌｄｓ  （Ｅｄｉｔｏｒ），  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎ．Ｙ．  （１９９０）およびその引用文献でも概説されている。
【００６７】
発現ベクターは、さまざまな「制御配列」を含んでよい。制御配列は、特定の宿主細胞中に作動可能結合した暗号配列の転写およびおそらく翻訳に必要な核酸配列を参照する。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、ＤＮＡベクター、発現ベクターおよびウイルスは、他の機能を果し、ならびに下記に記載されている核酸配列を含んでよい。
【００６８】
１．プロモーターおよびエンハンサー
一般に、プロモーターは、ＲＮＡ合成の開始部位の位置を決めるために機能する配列を含む。これの最もよく知られた例は、ＴＡＴＡボックスであるが、ＴＡＴＡボックスが欠失したいくつかのプロモーター（例えば哺乳類の末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のプロモーターおよびＳＢ４０後期遺伝子のプロモーター）では、開始部位自体の上にある離散的な要素が、開始の位置を決めるのを助ける。追加のプロモーター要素が転写開始の頻度を調節する。一般に、これらは、開始部位の上流の領域３０から１１０に配置されるが、複数のプロモーターが開始部位の下流にも機能要素を含んでいることが示された。コード化配列をプロモーターに「制御される」ようにするために、転写解読フレームの転写開始部位の５’−末端を、選ばれたプロモーターの「下流」（すなわち３’−側）に配置する。「上流」のプロモーターは、ＤＮＡの転写を刺激し、コード化されたＲＮＡの発現を促進する。
【００６９】
プロモーター要素の間の間隔は、頻繁に柔軟であり、その結果、要素が反転しても、互いに移動してもプロモーター機能は保たれる。ｔｋプロモーターにおいて、プロモーター要素の間の間隔は、５０ｂｐの間隔まで増加させないと活性は低下し始めない。プロモーターによって、個々の要素は、協力してまたは独立に機能して、転写を活性化することができるようである。プロモーターは、エンハンサーとともに用いてもよくてまたは用いなくてよい。
【００７０】
プロモーターは、コード化セグメントおよび／またはエキソンの上流に位置する５’非コード化配列を単離することによって得られるように、核酸配列と自然に会合するものであってよい。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のどちらかに位置する核酸配列と自然に会合するものであってよい。あるいは、コード化核酸セグメントを組み換えプロモーターまたは非相同プロモーターに制御される位置に配置することによって、特定の利点が得られる。非相同プロモーターは、その自然環境では、通常、核酸配列と会合していないプロモーターを指す。組み換えエンハンサーまたは非相同エンハンサーは、その自然環境では正常な核酸配列と会合していないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他のウイルス、原核生物細胞または真核生物細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然」でない、すなわち、さまざまな転写調節領域のさまざまな要素および／または発現を変える変異を含むプロモーターまたはエンハンサーを含む。例えば、組み換えＤＮＡ構築に最も普通に用いられるプロモーターは、βラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトースおよびトリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系を含む。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成によって作り出すことに加えて、ＰＣＲを含む組み換えクローン形成および／または核酸増幅技術を本明細書に開示されている組成物とともに用いて配列を作り出してよい（米国特許第４，６８３，２０２号および第５，９２８，９０６号を参照のこと）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストおよび類似物などの非核オルガネラ中の配列の転写および／または発現を指令す制御配列も使用することができると考えられる。
【００７１】
もちろん、発現のために選ばれたオルガネラ、細胞型、組織、器官または生物中のＤＮＡセグメントの発現を効果的に導くプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用することは重要になる。使用されるプロモーターは、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を導く適切な条件下で、組み換え蛋白質および／またはペプチドの大量産生に有利であるように、構成的、組織特異的、誘導可能、および／または有用であってよい。プロモーターは、非相同性であってよく、または内因性であってよい。
【００７２】
さらに、任意のプロモーター／エンハンサーの組み合わせを用いて発現を推進してよい。Ｔ３、Ｔ７またはＳＰ６細胞質発現系を用いることは、別の可能な実施態様である。真核細胞は、適切な細菌ポリメラーゼが、投与複合体の一部または追加の遺伝子発現構築体として提供されるなら、特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。
【００７３】
組織特異性プロモーターまたは要素の同定、ならびに活性の特性を把握するアッセイは、当業者に公知である。そのような領域の非限定的な例は、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子（Ｎｏｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｇｅｎｅ  ２３６（２）：  ２５９−２７１）、ソマトスタチン受容体−２遺伝子（Ｋｒａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．  ４２８（３）：  １６５−１７０）、マウス精巣上体レチノイン酸結合遺伝子（Ｌａｒｅｙｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９９）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７４（１２）：  ８２８２−８２９０）、ヒトＣＤ４  （Ｚｈａｏ−Ｅｍｏｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｅｔａ，１４４２（２−３）：  １０９−１１９）、マウスα−２（ＸＩ）コラーゲン（Ｔｓｕｍａｋｉ，  ｅｔ  ａｔ，  （１９９８），  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２７３（３６）：  ２２８６１−４）、ＤＩＡドーパミン受容体遺伝子（Ｌｅｅ，  ｅｔ  ａｔ，  （１９９７），  ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．  １６（１１）：  １２６７−１２７５）、インスリン様増殖因子ＩＩ  （Ｗｕ  ｅｔ  ａｔ，  （１９９７）  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍ．  ２３３（１）：  ２２１−２２６）およびヒト小板内皮細胞接着分子−１（Ａｌｍｅｎｄｒｏ  ｅｔ  ａｔ，  （１９９６）  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １５７（１２）：  ５４１１−５４２１）を含む。
【００７４】
２．開始信号および内部リボソーム結合部位
コード化配列の効率的な翻訳には、特定の開始信号も必要になることがある。これらの信号は、ＡＴＧ開始コドンまたは隣接配列を含む。ＡＴＧ開始コドンを含む外因性翻訳制御信号を提供する必要がある。当業者ならこれを測定し、必要な信号を提供することは容易にできる。開始コドンは、挿入部分全体の翻訳を確実にするために、所望の暗号配列の解読フレームの「フレーム内」になければならないことは周知である。外因性翻訳制御信号および開始コドンは、天然であっても合成であってもよい。適切な転写エンハンサー要素をふくむことによって、発現の効率が増強されることがある。
【００７５】
本発明の特定の実施態様では、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を用いて、多重遺伝子メッセージ、または多シストロン性メッセージを作り出す。ＩＲＥＳ要素は、５’メチル化キャップ依存性翻訳のリボソーム走査モデルを省略し、内部部位で翻訳を開始することができる。ＩＲＥＳ要素は、非相同性開放読み取りフレームに結合することができる。ＩＲＥＳによってそれぞれ分離された複数の開放読み取りフレームを一緒に転写して、多シストロン性メッセージを作り出すことができる。ＩＲＥＳ要素のおかげで、各開放読み取りフレームは、効率的な翻訳のためにリボソームにアクセスすることができる。単一のメッセージを転写する単一のプロモーター／エンハンサーを用いて、複数の遺伝子を効率的に発現することができる（米国特許第５，９２５，５６５号および第５，９３５，８１９号を参照すること）。
【００７６】
３．終止シグナル
本発明のベクターまたは構築体は、通常、少なくとも１つの終止シグナルを含む。「終止シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写物の特定の終了に関与するＤＮＡ配列で構成される。従って、特定の実施態様では、ＲＮＡ転写体の産生を終了する終止シグナルを包含する。望ましいメッセージレベルを実現するために、ｉｎ  ｖｉｖｏでターミネーターが必要になることがある。
【００７７】
真核生物系では、ターミネーター領域は、ポリアデニル化部位を露出させるように新しい転写産物を部位特異的に開裂させることができる特定のＤＮＡ配列も含んでよい。これによって、専用の内因性ポリメラーゼに、転写体の３’末端に約２００Ａ残基の並び（ポリＡ）を加えるように信号を伝達する。このポリＡ尾部で改変されたＲＮＡ分子は、安定性が増し、より効率的に変換されるようである。従って、真核生物が関与する他の実施態様では、ターミネーターは、ＲＮＡの開裂のための信号を含み、ターミネーター信号は、メッセージのポリアデニル化を促進すると考えられる。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位要素は、メッセージレベルを改良し、カセットから他の配列への読み通しを最小限にするように働くことができる。
【００７８】
本発明において用いられるターミネーターは、本明細書に記載されている任意の既知の転写ターミネーター、または当業者に既知の転写ターミネーターを含み、例えばウシ成長ホルモンターミネーターまたは例えばＳＶ４０ターミネーターなどのウイルス終止配列などの遺伝子の終結配列を例えば含むが、それらに限定されない。特定の実施態様では、終止シグナルは、配列の切断によるなどの転写可能配列または翻訳可能配列の欠失であってよい。
【００７９】
４．ポリアデニル化シグナル
発現、特に真核生物の発現では、一般に、転写体の適切なポリアデニル化を実現するために、ポリアデニル化シグナルを含む。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施を成功させる上で不可欠とは考えられず、任意のそのような配列を使用してよい。好ましい実施態様は、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルまたはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。これらはともに簡便であり、さまざまな標的細胞中で良好に機能することが知られている。ポリアデニル化は、転写体の安定性を増し、または細胞質輸送を促進することがある。
【００８０】
５．選択可能および検索可能マーカー
本発明の特定の実施態様では、本発明の核酸構築体を含む細胞は、発現ベクターにマーカーを含ませることによってインビボまたはインビトロで特定してよい。そのようなマーカーによって、特定することができる変化を細胞に付与し、発現ベクターを含む細胞を容易に特定することが可能になる。通常、選択可能なマーカーは、選抜を可能にする属性を付与するものである。正の選択可能マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、負の選択可能マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。正の選択可能マーカーの１例は、薬剤耐性マーカーである。
【００８１】
通常、薬物選択マーカーを含むと、クローン形成および変換体の特定が容易になる。例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、ＤＨＦＲ、ＧＰＴ、ゼオシンおよびヒスチジノールへの抵抗性を付与する遺伝子は、有用な選択可能マーカーである。諸条件の実体化によって変換体の差別化を可能にする表現型を付与するマーカーに加えて、比色分析を土台とするＧＦＰなどの選抜可能マーカーを含むその他の種類のマーカーも包含される。あるいは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｔｋ）またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）などの選抜可能酵素を利用してよい。当業者には、どのように免疫学的マーカーを、おそらく蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析とともに、使用するかも既知と考えられる。遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現することができる限り、用いられるマーカーは重要ではないと考えられる。選択可能マーカーおよび選抜可能マーカーのさらに別の例が当業者に公知である。
【００８２】
ベクターは、適当な方法によって、初期感染細胞に導入される。本発明において用いられる、オルガネラ、細胞、組織または生物を変換するために核酸を供給するためのそのような方法は、事実上、本明細書に記載されているかまたは当業者に既知の、核酸（例えばＨＳＶベクター）をオルガネラ、細胞、組織または生物中に導入することができる任意の方法を含むと考えられる。非限定的な方法の例は、エクスビボの形質移入によるＤＮＡの直接投与、注射（米国特許第５，９９４，６２４号、第５，９８１，２７４号、第５，９４５，１００号、第５，７８０，４４８号、第５，７３６，５２４号、第５，７０２，９３２号、第５，６５６，６１０号、第５，５８９，４６６号および第５，５８０，８５９号）、マイクロインジェクション（米国特許第５，７８９，２１５号）、エレクトロポレーション（米国特許第５，３８４，２５３号）、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥデキストランおよびその後のポリエチレングリコール、直接超音波投与、リポソーム媒介形質移入、受容体媒介形質移入、微粒子銃（国際特許出願第９４／０９６９９号および第９５／０６１２８号、米国特許第５，６１０，０４２号、第５，３２２，７８３号、第５，５６３，０５５号、第５，５５０，３１８号、第５，５３８，８７７号および第５，５３８，８８０号）、炭化ケイ素繊維による撹拌（米国特許第５，３０２，５２３号および第５，４６４，７６５号）、アグロバクテリウム媒介変換（米国特許番号５，５９１，６１６号および第５，５６３，０５５号）、プロトプラストのＰＥＧ媒介変換（米国特許第４，６８４，６１１号および第４，９５２，５００号）、除湿／阻害媒介ＤＮＡ取り込み、およびこれらの方法の任意の組み合わせ、または当業者に既知のその他の方法を含む。組成物は、医薬品として許容される賦形剤中で、静注などの全身投与法によって、哺乳類の細胞に供給してもよい。
【００８３】
Ｂ．細胞へのＤＮＡベクター供給の方法
１．エクスビボ変換
生物から取り出した細胞および組織にエクスビボ環境で形質移入するための方法が当業者に知られている。従って、本発明において、細胞または組織を取り出し、本明細書に記載されている核酸および組成物を用いてエクスビボで形質移入してよいとみなされる。特定の態様では、形質移入された細胞または組織を生物中に配置してよい。いくつかの実施態様では、形質移入された細胞または組織の中で核酸を発現させる。
【００８４】
２．注射
特定の実施態様では、核酸は、例えば、皮下、皮膚内、筋肉内、静脈内、腹腔内等などの１回以上の注射（すなわち針注射）によって、オルガネラ、細胞、組織または生物に投与してよい。注射の方法は、当業者に公知である（例えば食塩水を含む組成物の注射）。本発明のさらに別の実施態様は、直接マイクロインジェクションによる核酸の導入を含む。用いられる本発明の組成物の量は、影響を受ける細胞、組織または生物の性質によって変化させてよい。
【００８５】
３．エレクトロポレーション
本発明の特定の実施態様では、エレクトロポレーションによってオルガネラ、細胞、組織または生物の中に核酸を導入する。エレクトロポレーションは、細胞およびＤＮＡの懸濁液の高電圧放電への曝露を含む。この方法のいくつかの変化形では、ペクチン分解酵素などの特定の細胞壁分解酵素を使用して受け入れ標的細胞を非処理細胞よりエレクトロポレーションによる変換に対して敏感にする（米国特許第５，３８４，２５３号）。あるいは、受け入れ細胞を機械的損傷による変換に対してより敏感にしてよい。
【００８６】
４．リポソーム媒介トランスフェクション
本発明のさらに別の実施態様では、改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを有するベクターなどの本明細書に記載されている組成物を、例えばリポソームなどの脂質複合体の中に捕捉してよい。リポソームは、リン脂質２分子膜と内部の水性媒質とを特徴とするベシクル構造体である。多重ラメラリポソームは、水性媒質で分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水溶液の中に懸濁させると自発的に形成される。脂質成分は、自己再配置を行ってから閉鎖構造体を形成し、水および溶解した溶質を脂質２重層の間に捕捉する。リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）またはスーパーフェクト（Ｑｉａｇｅｎ）と複合体を形成した核酸も包含される。
【００８７】
本発明の特定の実施態様では、リポソームは、ヘマグルチナチンウイルス（ＨＶＪ）と複合体を形成させてよい。こうすると、細胞膜との融合が促進され、リポソームカプセル化ＤＮＡの細胞への進入が促進されることが示された（Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０；２４３（４８８９）：  ３７５−８）。その他の実施態様では、リポソームを核非ヒストン染色体蛋白質（ＨＭＧ１）と複合体形成させるかまたはともに使用してよい（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９１）  ＪＢｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．  （１９９１）  Ｆｅｂ  ２５；２６６（６）：  ３３６１−４）。さらにまた別の実施態様では、リポソームをＨＶＪとＨＭＧ１との両方と複合体形成させてよく、またはＨＶＪとＨＭＧ１との両方とともに使用してよい。その他の実施態様では、投与用ベヒクルは、リガンドおよびリポソームを含んでよい。
【００８８】
５．受容体媒介形質移入
核酸は、受容体媒介投与ベヒクルによって標的細胞に投与してよい。この手法は、受容体媒介エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。さまざまな受容体の細胞型特異的分布からみると、この投与方法は、別の度合いの特異性を本発明に加える。
【００８９】
特定の実施態様では、受容体媒介遺伝子標的化ベヒクルは、受容体特異性リガンドおよび核酸結合剤を含む。他の実施態様は、投与される核酸を動作有効結合した受容体特異性リガンドを含む。欧州特許ＥＰＯ  ０２７３  ０８５に記載されている、遺伝子をへん平上皮がん細胞に供給するために用いられた上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を含むいくつかのリガンドが、受容体媒介遺伝子移入のために、用いられてきた。
【００９０】
その他の実施態様では、細胞特異性核酸標的化ベヒクルの核酸投与ベヒクル成分は、リポソームと組み合わされた特異的結合リガンドを含んでよい。投与される核酸（単数または複数）をリポソームの中に収容し、特異的結合リガンドをリポソーム膜の中に官能基によって組み込む。従って、リポソームは、標的細胞の受容体（単数または複数）に特異的に結合し、内容物を細胞に供給する。
【００９１】
さらに別の実施態様では、標的化投与ベヒクルの核酸供給ベヒクル成分は、リポソーム自体であってよく、好ましくは、細胞特異的結合を導く１つ以上の脂質または糖蛋白質を含む。例えば、ガラクトース末端アシアルガングリオシドであるラクトシルセラミドをリポソームの中に組み込み、肝細胞によるインシュリン遺伝子の取り込みの増加が観測された（Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  １４９：１５７−７６）。本発明の組織特異的変換構築体は、同様な方法で標的細胞の中に特異的に投与することができると考えられる。
【００９２】
６．微粒子銃
微粒子銃技法を用いて、核酸を少なくとも１つのオルガネラ、細胞、組織または生物中に導入することができる（米国特許第５，５５０，３１８号、米国特許第５，５３８，８８０号、米国特許第５，６１０，０４２号、および国際特許出願第９４／０９６９９号）。この方法は、ＤＮＡで被覆されるかまたはＤＮＡを含むマイクロ発射体を、細胞を死滅させないで細胞膜を突き通し、細胞に入ることができる高速度に加速する能力に依拠する。マイクロ発射体は、タングステン、白金または金など、任意の生物学的に不活性な物質で構成してよい。爆撃のために、懸濁液の中の細胞は、フィルタまたは固体培地上で濃縮される。あるいは、未成熟胚またはその他の標的細胞を、固体培地上に配置してよい。爆撃される細胞は、固定プレート上の微粒子銃デバイスの下の適切な距離に配置する。本発明の実施に有用な非常に広範な微粒子銃技法が当業者に既知である。
【００９３】
Ｃ．宿主細胞
本明細書で用いられる用語「細胞」、「細胞系統」および「細胞培養物」は、区別なく用いてよい。これらの用語はすべて、それらの子孫を含む。子孫は、任意のおよびすべての後継世代である。すべての子孫は、故意または不慮の変異によって、同一でないことがあると理解される。非相同核酸配列を発現する場合、「宿主細胞」は、原核生物または真核生物の細胞を指し、ベクターを自己複製し、および／またはベクターによってコード化される非相同遺伝子を発現することができる任意の変換可能な生物を含む。宿主細胞は、ベクターの受け入れ体として用いることができ、用いられてきた。宿主細胞は「形質移入され」または「変換され」てよい。これは、外因性核酸が宿主細胞の中に移入または導入されるプロセスを指す。変換細胞は、被験者一次細胞およびその子孫を含む。本明細書で用いられる用語「設計された」および「組み換え」細胞または宿主細胞は、例えばベクターなどの外因性核酸配列が導入された細胞を指すものとする。従って、組み換え細胞は、組み替えによって導入された核酸を含まない天然細胞と区別することができる。
【００９４】
組織は、細胞膜融合発生ＨＳＶ−２変異体によって変換される単数または複数の宿主細胞を含んでよい。組織は、生物の一部分であってよく、または生物から分離されてよい。特定の実施態様では、組織は、脂肪細胞、歯槽、エナメル芽細胞、神経、基底細胞、血液（例えばリンパ球）、血管、骨、骨髄、グリア細胞、胸、軟骨、頸部、結腸、角膜、胎生期、子宮内膜、内皮、上皮、食道、色帯、繊維芽細胞、小胞、神経節細胞、グリア細胞、杯状細胞、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、ニューロン、卵巣、すい臓、末しょう血液、前立腺、皮膚、小腸、脾臓、幹細胞、胃、睾丸、およびそれらのすべての癌を含んでよいが、それらに限定されない。
【００９５】
特定の実施態様では、宿主細胞または組織は、少なくとも１つの生物の一部であってよい。特定の実施態様では、生物は、当業者には自明のように、原核生物（例えば真正細菌、古細菌）または真核生物であってよいが、それらに限定されない。
【００９６】
多数の細胞系統および培養物が宿主細胞として用いるために利用可能であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの組織によって市販されている。当業者は、ベクター主鎖および所望の結果によって適切なホストを決定することができる。ベクター複製および／または発現に利用できる細胞型の非限定的な例は、大腸菌（例えば大腸菌株ＲＲ１、ＬＥ３９２、Ｂ、Ｘ１７７６（ＡＴＣＣ第３１５３７号）、Ｗ３１１０、Ｆ、ラムダ、ＤＨ５α、ＪＭ１０９およびＫＣ８）、桿菌、例えば枯草菌などの細菌、その他の腸内細菌科、例えばサルモネラチフィムリウム、セラチアマルセッセンス、ならびに複数の市販の細菌宿主およびＳＵＲＥ（登録商標）コンピテント細胞およびソロパック（登録商標）（ＳＯＬＯＰＡＣＫＴ）ゴールド細胞（Ｇｏｌｄ  Ｃｅｌｌ）（ストラタジーン（登録商標）（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，  ＣＡ）などのコンピテント細胞を含む。ベクターの複製および／または発現のための真核生物宿主細胞の非限定的な例は、ＨｅＬａ、ＮＩＨ３Ｔ３、Ｊｕｒｋａｔ、２９３、Ｃｏｓ、ＣＨＯ、ＳａｏｓおよびＰＣ１２を含む。
【００９７】
いくつかのベクターは、原核生物細胞と真核生物細胞との両方の中で複製および／または発現することを可能にする制御配列を使用してよい。さらに、上記に記載した宿主細胞をすべて培養して維持し、ベクターの複製を可能にする条件は、当業者には自明と考えられる。ベクターの大量産生、ならびにベクターによってコード化される核酸および同種ポリペプチド、蛋白質またはペプチドの産生を可能にする技法および条件も自明であり、既知である。
【００９８】
Ｄ．ウイルスベクターパッケージングおよび増殖。
【００９９】
１．ウイルスパッケージング
本発明の特定の実施態様では、ＩＣＰ１０遺伝子を改変した後、相同組み換えによってウイルスに挿入する。通常、改変ＩＣＰ１０遺伝子を含むプラスミドＤＮＡと精製ＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡとをリポフェクタミンを用いてベロ細胞に共移入することによってこれを実行する。次に、組み換えウイルスを特定し（通常、ウイルスプラークを検索して選択可能マーカーの有無を調べて）、改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドを含むプラークを選択する。次に、組み換えウイルス選択したら、インビトロでキャラクタリゼーションして改変ＩＣＰ１０遺伝子がＨＳＶ−２ゲノム中に正しく挿入され、元のＩＣＰ１０遺伝子を置換したことを確認する。実施例１および２に、ウイルスパッケージングおよびインビトロのキャラクタリゼーションをさらに詳細に記載する。
【０１００】
２．ウイルス原料の調製
組み換えＨＳＶ−２変異体ウイルスを選択したら、以下のようにウイルス原料を調製する。１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）中でベロ細胞を成長させ、細胞あたり０．０１プラーク形成単位（ｐｆｕ）に感染させる。次に、２日後、凍結、解凍および超音波処理を繰り返して、細胞からウイルスを集める。ウイルスを集めたら、記載された（Ｎａｋａｍｏｒｉら、（２００３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９（７）：  ２７２７−２７３３）ように精製する。ウイルスを精製したら、滴定（実施例１０に記載されている）し、等分し、使用するまで−８０℃で保管する。
【０１０１】
Ｅ．蛋白質発現系
例えば、本発明のＤＮＡベクター組成物の発生において蛋白質発現系を利用して、改変ＩＣＰ１０ポリヌクレオチドによってコード化されたポリペプチドを機能研究のために発現させてよい。上記で考察した組成物の少なくとも一部または全体を含む多数の発現系が存在する。原核生物および／または真核生物による系を本発明とともに使用して核酸配列または同種ポリペプチド、蛋白質およびペプチドを産生させてよい。多くのそのような系が市販され、広く利用可能である。
【０１０２】
米国特許第５，８７１，９８６号および第４，８７９，２３６号に記載され、市販されている（例えば、ＣＬＯＮＴＥＣＨ，  Ｉｎｃ．  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）ものなどの昆虫細胞／バキュロウイルス系は、高水準の非相同核酸セグメントの蛋白質発現を行うことができる。
【０１０３】
市販発現系のその他の例は、合成エクジソン誘導性受容体を含む誘導性哺乳類発現系、ｐＥＴ発現系または大腸菌発現系（ＳＴＲＡＴＡＧＥＮＥ，  ＬａＪｏｌｌａ，  ＣＡ）；テトラサイクリン調節発現系、全長ＣＭＶプロモーターまたはメチロトローフ酵母ピキアメタノーリカ（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ，  Ｃａｒｌｓｂａｄ，  ＣＡ）中の高レベルの組み換え蛋白質の産生用に設計された酵母発現系を用いる誘導性哺乳類発現系を含む。
【０１０４】
本発明の方法によって産生される蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドは、「過剰発現」、すなわち、細胞中での天然の発現と比較すると増加したレベルで発現されてよいと考えられる。そのような過剰発現は、放射能標識および／または蛋白質精製を含むさまざまな方法によって評価してよい。しかし、簡単で直接的な方法、例えばＳＤＳ／ＰＡＧＥおよび蛋白質染色またはウェスタンブロッティングとそれに続く、結果として得られたゲルまたはブロットの密度測定掃引などの定量分析法を含むものが好ましい。特定の蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドが宿主細胞によって産生される他の蛋白質と比べると相対的に多くなるように、天然細胞中のレベルと比較した組み換え蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドのレベルの特定の増加は過剰発現を示し、例えば、ゲル上で目に見える。
【０１０５】
Ｖ．ＨＳＶ−２変異体の機能役割
本明細書に記載されているＨＳＶ−２変異体は、殺腫瘍剤としての複数の機能役割を示す。例えば、本ウイルスは、感染細胞ならびに傍観者細胞の両方において、溶菌ならびに合胞体形成およびアポトーシス誘導によって、腫瘍細胞を崩壊させることができる。さらに、ＨＳＶ−２変異体によって腫瘍を崩壊させると、強力な抗腫瘍免疫応答を誘導し、抗腫瘍免疫応答が、悪性疾患治療用の殺腫瘍剤としての本変異体ウイルスの治療効力にさらに貢献する。
【０１０６】
本ＨＳＶ−２変異体ウイルスは、周期活動中の細胞中で選択複製を示すが、非サイクリング細胞中では示さない。実施例４にさらに詳細に記載するように、本変異体ＨＳＶ−２は、プロテインキナーゼ活性が欠失しているので、周期活動中の細胞中での成長と比較して周期活動中でない細胞中での成長は少なくとも４０分の１に低下する。これとは対照的に、野生型ＨＳＶ−２の周期活動中の細胞と周期活動中でない細胞との間の増殖特性はわずかに影響を受けるだけである。従って、本明細書に記載の本ＨＳＶ−２変異体は、腫瘍細胞など、活性化Ｒａｓ経路を有するサイクリング細胞における殺腫瘍剤として用いるのに優れて適する。
【０１０７】
本明細書に記載の本改変ＨＳＶ−２は、他の殺腫瘍ウイルスおよび野生型ＨＳＶ−２と比較すると、優れた殺腫瘍細胞能力を有する。実施例５に記載するインビトロアッセイを用いて、さまざまな組織起源のヒト腫瘍細胞に対するＦｕｓＯｎ−Ｈ２の殺細胞能力が、米国特許出願第１０／３９７，６３５号に記載され、および／または従来検証された殺腫瘍ＨＳＶ−１の殺細胞能力より有意に強く、親の野生型ＨＳＶ−２の殺細胞能力を超えることを示す。さらに、実施例６に記載するように、本発明のウイルスの穏やかな投与量（１×１０６プラーク形成単位）を１回注射したところ、局所塗布によってヌードマウスに確立した胸腺腫瘍が、この動物の１００％（ｎ＝８）で完全に消失した。一方、殺腫瘍ＨＳＶ−１を同じ投与量で投与したが、３０％より少ないマウスで腫瘍が縮小しただけであった。
【０１０８】
溶解活性および融合活性に加えて、本ＨＳＶ−２変異体は、強力なアポトーシス誘導活性も有し、強力な抗腫瘍免疫応答も誘導することができる。本ＨＳＶ−２変異体は、インビトロ環境で、ウイルスに感染した細胞ならびに感染細胞の周りの非感染傍観者細胞中にアポトーシスを誘導することができる。さらに、本ＨＳＶ−２変異体は、インビボで、腫瘍細胞のアポトーシスを誘導する効果を有する。実施例８にこれをさらに詳しく記載する。本明細書に記載の組成物は、他の殺腫瘍ウイルスより腫瘍細胞を殺傷する上で有効であるだけでなく、本ＨＳＶ−２変異体は、強い抗腫瘍免疫応答の誘導によって、原発腫瘍および転移腫瘍に対してインビボで強い治療効果を示す。実施例９に記載するように、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２処理マウス由来の養子伝達ＣＴＬは、元の腫瘍の成長を阻害し、転移の発達を効果的に防ぐことができる。
【０１０９】
アポトーシスまたはプログラム化細胞死は、正常な胚発育の必須過程であり、成体組織中の恒常状態を維持し、発癌を抑制する。本発明のいくつかの実施態様では、本改変ＨＳＶ−２は、本ウイルスに感染した腫瘍細胞と、非感染傍観者腫瘍細胞とのアポトーシスの強力な誘導因子である。例えば、特定の実施態様では、腫瘍細胞を、ＩＣＰ１０遺伝子のプロテインキナーゼドメインの一部を緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）コード化遺伝子で置換したＨＳＶ−２構築体に感染させた。蛍光顕微鏡下でＧＦＰを可視化することによって感染細胞を識別することができ、クロマチン凝集によって明らかにして、アポトーシスを行う細胞を識別した。ＧＦＰ発現に対してクロマチン凝集を示す細胞の比は、２．６：１であり、本改変ＨＳＶ−２に感染しなかった腫瘍細胞のうちのかなりの数がアポトーシスを行うことを示唆した。実施例８に、本発明の殺腫瘍ウイルスのアポトーシスを誘導する能力をさらに詳細に記載する。
【０１１０】
悪性疾患と戦う際には、強い抗腫瘍免疫応答が有用である。本明細書に記載の本ＨＳＶ−２変異体は、原発腫瘍および転移腫瘍に対してインビボで強力な抗腫瘍免疫応答を誘導することができる。特定の実施態様では、本変異体ＨＳＶ−２（ＦｕｓＯｎ−Ｈ２）は、４Ｔ１マウス乳腺腫瘍細胞系統を用いるマウス乳腺腫瘍モデル中で選択複製し、腫瘍細胞を溶解させ、強い抗腫瘍免疫応答の誘導によって、インビボで原発腫瘍および転移腫瘍に対する強い治療効果を示した。詳しくは、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２で治療したマウス由来の養子伝達細胞毒性リンパ球（ＣＴＬ）は、元の腫瘍の成長を阻害し、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２による治療を受けていないマウスの転移を効果的に防ぐことができる。実施例９に、これをさらに詳細に記載する。
【０１１１】
ＶＩ．医薬品組成物および投与経路
Ａ．総合的考察
本発明の組成物は、改変ＩＣＰ１０遺伝子を有する組み換えＨＳＶ−２変異体か、本明細書に記載の改変ＩＣＰ１０遺伝子を有する裸の（非ウイルス）ＤＮＡベクターのどちらかを含む医薬品組成物として投与することができる。本発明の組成物は、通常の医薬品調製物を含む。通常、本発明の組成物は、本組成物を医薬品として許容されるキャリアまたは水性媒質に溶解または分散させて、薬学的剤として投与することができる。医薬活性物質のためのそのような媒質および剤の使用は、当分野で公知である。任意の通常の媒質または剤が本発明の組成物と適合する限り、治療組成物中のその使用は考慮範囲内である。他の抗疾患剤などの補助活性成分も、医薬品組成物中に組み込んでよい。本組成物の投与は、その経路によって標的細胞を利用できる限り、任意の普通の経路によってよい。投与経路の例は、口、鼻、舌下、直腸、膣または皮膚を含む。あるいは、同所注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈注射、または、直接腫瘍内注射によって投与してよい。本発明の組成物のための医薬組成物、用量および投与経路を下に記載する。
【０１１２】
Ｂ．ＨＳＶ−２変異体の医薬品製剤
本発明の変異体ウイルス組成物は、薬理学的に許容される製剤として調製することができる。通常、変異体ウイルスを、医薬品として許容され、ウイルスと適合する賦形剤と混合する。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールまたは類似物およびそれらの組み合わせである。さらに、望むなら、調製物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、アジュバントまたは免疫強化物質など、少量の補助物質を含んでよい。これらの補助物質は、本ウイルス変異体の有効性を高める（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ａ．  Ｒ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  ｐｕｂ．，  １８ｔｈ  ｅｄ．，  １９９０を参照すること）。例えば、注射用に医薬品として許容される一般的なキャリアは、リン酸緩衝生理食塩水のミリリットルあたり５０ｍｇから最大約１００ｍｇのヒト血清アルブミンを含んでよい。薬理学的に許容される組成物の製剤に用いるのに適する非水溶溶媒の別の非限定的な例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゴマ油、落花生油およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルを含む。水系キャリアの非限定的な例は、水、水溶液、食塩水、塩化ナトリウムなどの非経口ベヒクル、リンゲルのデキストロース等を含む。静脈内ベヒクルは、流体および栄養補液を含む。医薬品組成物のさまざまな成分のｐＨおよび正確な濃度を測定することは、定型的であり、当業者の知識の範囲内にある（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｇｉｌｍａｎ，  Ａ．  Ｇ．  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ｐｕｂ．，  ８ｔｈ  ｅｄ．，  １９９０を参照すること）。
【０１１３】
必要な、上記に記載したさまざまなその他の無菌成分とともに適切な溶媒の中に必要な量の活性化合物を組み込んで、無菌の注射可能溶液を調製する。通常、上記に記載した基本的な分散媒質と必要なその他の成分とを含む無菌ベヒクルにさまざまな殺菌された活性成分を組み込むことによって、分散液を調製する。
【０１１４】
Ｃ．ＨＳＶ−２変異体の投与経路および用量
本変異体ウイルス組成物は、標的組織へのアクセスを提供する任意の経路によって投与してよい。投与経路の非限定的な例は、口、鼻、舌下、直腸、膣、塗布を含んでよく、あるいは注射（同所注射、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、静脈内注射または直接腫瘍内注入を含む）によってであってよい。通常、本ウイルス変異体は、液体溶液または懸濁液としての注射可能薬物として調製してよく、注入前に、液体への溶解または液体への懸濁に適する固体も調製してよい。調製物は、乳化もさせてよい。
【０１１５】
例えば、水溶液で非経口投与する場合、必要なら溶液を適当に緩衝性とするひつようがある。まず、十分な食塩水またはグルコースで液体希釈剤を等張性にする。これらの特定の水溶液は静脈投与、筋肉内投与、皮下投与および腹腔内投与に、特に適する。これに関連して、使用することができる無菌水性媒質は、本開示によって、当業者に既知である。例えば、１用量を１ｍｌの等張性ＮａＣｌ溶液に溶解させ、１０００ｍｌの皮下注入流体に加えるか、または提案された注入部位に注入するかのどちらかを行う（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  １５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｐａｇｅｓ  １０３５−１０３８  ａｎｄ  １５７０−１５８０を参照すること）。治療を受ける被験者の状態によって、若干の用量の変化が必然的に起こる。いずれにしても、投与の責任者は、個々の被験者に適切な用量を決定する。
【０１１６】
本発明の組成物を用いて治療を提供するための最善の治療計画は、簡明直截的に決定することができることは、当業者には自明であろう。これは、実験の問題ではなく、最適化の問題であり、医術では定型的に行われている。例えば、マウスでインビボに調べ、用量および投与計画を最適化し始める出発点を得る。注射の頻度は、最初、週に一度であってよい。しかし、この頻度は、初期臨床試験から得られる結果および特定の患者の必要性によって、１日から２週間ごと、１月ごとまで、最適に調節する可能性がある。最初、マウスで用いた組成物の量から外挿してヒト投与量を決定してよい。
【０１１７】
１．用量
投与するウイルスベクターの量は、治療の回数、治療を受ける被験者、抗ウイルス抗体を合成する被験者免疫系の容量、崩壊させる標的組織、および所望の保護の程度を含むいくつかの因子に依存する。投与されるウイルス組成物の正確な量は、担当医の判断によって決まり、各個人独自である。しかし、適当な用量は、１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）から１０１０ｐｆｕの範囲にある。特定の実施態様では、ウイルスＤＮＡの用量は、約１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、最大１０１０ｐｆｕ以内であってよい。
【０１１８】
Ｄ．非ウイルスＤＮＡベクター製剤
上記に記載したウイルス医薬品調合物のための調合物に加えて、非ウイルスＤＮＡベクターも薬理学的に許容される無菌溶液の調製のための無菌粉体として調製することができる。無菌粉体の調製のための一般的な方法は、活性成分と、無菌ろ過済み溶液からの任意の別の所望の成分との粉体を生じる真空乾燥および凍結乾燥技法を含む。
【０１１９】
Ｅ．非ウイルスＤＮＡベクターの投与経路および用量
本発明のポリヌクレオチドを哺乳類細胞に移入するための非ウイルスベクターを供給するためのいくつかの方法が考慮範囲内にある。これらは、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、直接マイクロインジェクション、ＤＮＡ保持リポソームおよびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理、高速マイクロ発射体を用いる遺伝子衝撃、既に考察した受容体媒介形質移入を含む。これらの技法のいくつかを、インビボまたはエクスビボ使用のために適応させることができる。
【０１２０】
本発明のいくつかの実施態様では、発現ベクターは、単に、ポリヌクレオチドを含む裸の組み換えＤＮＡまたはプラスミドからなっていてよい。構築体の移入は、物理的または化学的に細胞膜を透過する本明細書に言及の任意の方法によって実行してよい。これは、特にインビトロ移入に適用可能であるが、インビボ使用にも適用してよい。
【０１２１】
その他の実施態様では、投与用ベヒクルは、リガンドおよびリポソームを含んでよい。例えば、Ｎｉｃｏｌａｕらは、リポソームに組み込まれたガラクトース末端アシアルガングリオシドであるラクトシルセラミドを使用し、肝細胞によるインシュリン遺伝子の取り込みの増加を観測した（Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｔ，  （１９８７）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｒｎｏｌ．  １４９：１５７−７６）。従って、リポソームの有無にかかわらず、任意の数の受容体−配位子システムによって、特定の遺伝子をコードする核酸を細胞型に特異的に供給することも実行できる。例えば、ＥＧＦ受容体の上方調節（欧州特許第０  ２７３  ０８５号に記載されている）を示す細胞へ核酸を媒介投与するための受容体として上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を用いてよく、マンノースを用いて肝臓細胞上のマンノース受容体を標的化してよい。
【０１２２】
特定の実施態様では、エクスビボ条件下での方が、ＤＮＡ移入を容易に実行することができる。エクスビボ遺伝子治療は、動物からの細胞を取り出し、核酸をインビトロで細胞に投与した後、改変細胞を動物へ戻すことを指す。これは、動物由来の組織／器官の外科的取り出し、または細胞および組織の初代培養を含んでよい。
【０１２３】
１．用量
特定の実施態様では、用量を約１０３ｐｆｕ／ｋｇ体重から約１０８ｐｆｕ／ｋｇ体重の間で変化させることは想定の範囲内である。特定の実施態様では、用量は、約１０３、１０４、１０５、１０６、１０７から１０８ｐｆｕ／ｋｇ体重以内であってよい。もちろん、通常そのような治療プロトコルで実行するように、初期臨床試験の結果および特定の患者の必要性に依存して、この用量を、上下に調節してよい。
【０１２４】
ＶＩＩ．併用療法
本発明の方法および組成物の有効性を増加させるために、本明細書に開示される方法および組成物を他の抗癌剤と組み合わせることが望ましいことがある。このプロセスは、癌細胞を少なくとも１つの他の抗癌剤と組み合わせた本発明の組成物と接触させることを含んでよい。これは、細胞を、両方の剤を含む単一の組成物または薬理学的製剤と接触させることによって、または細胞を２つの別個の組成物または製剤と接触させることによって、実現してよい。２つの別個の製剤を用いる場合、癌細胞を両方の製剤と同時に接触してもよく、他の製剤より先に１つの製剤と接触させてもよく、それらの任意の組み合わせまたは繰り返しサイクルであってもよい（例えば、本発明の組成物を、別の抗癌剤の投与の前または後に投与する）。本発明の組成物と他の剤とを別個に投与する実施態様では、通常、本発明の組成物と他の剤とが、依然として癌細胞に併用効果を有利に及ぼすことができるよう、各供与時間の間にあまり時間を置かないように注意する。２つの製剤の投与の間のこの時間間隔は、分から週の範囲にあってよい。
【０１２５】
本発明の組成物または方法とともに用いてよい抗癌剤の非限定的な例は、化学療法薬（例えばシスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、ピコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ジェムシタビエン、ナベルビン、ファルネシル−蛋白質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサン、またはそれらの任意の類縁体または誘導体変化形）、放射線治療薬剤（例えば腫瘍細胞へのγ線、Ｘ線、マイクロ波およびＵＶ照射および／またはラジオアイソトープの指向投与）、免疫療法剤および免疫調節剤、遺伝子治療薬剤、アポトーシス促進剤および当業者に公知のその他の細胞周期調節剤を含んでよい。
【０１２６】
免疫療法を本明細書に記載の組成物および方法とともに用いて、悪性疾患の治療のための併用療法としてもよい。通常、免疫療法は、癌細胞を標的とし、崩壊させる免疫エフェクター細胞と分子との使用に依拠する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のマーカーに特異的な抗体であってよい。この抗体は、単独で治療のエフェクターとして働いてよく、あるいは、他の細胞（例えば細胞毒性Ｔ細胞またはＮＫ細胞）を募って殺細胞を実際に実行してよい。この抗体は、薬物またはトキシン（例えば化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラトキシン、百日咳毒素等）と結合し、単に標的化剤として働いてよい。いくつかの実施態様では、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を有するリンパ球であってよい。その他の実施態様では、腫瘍細胞は、標的化の対象となるなんらかのマーカーを持っていなければならない。標的化に適する腫瘍マーカーの非限定的な例は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異性抗原、尿腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容器、ｅｒｂＢおよびｐ１５５を含んでよい。
【０１２７】
悪性疾患の治療のための複合治療法として本明細書に記載の組成物および方法とともに、遺伝子治療を併用してよい。併用療法としての遺伝子治療は、本明細書に記載の変異体ＨＳＶ−２とは別の治療遺伝子の投与および発現に依拠する。この遺伝子治療は、本明細書に記載のＨＳＶ−２変異体の前、後、または同時に起用してよい。遺伝子治療の非限定的な標的の例は、免疫調節剤、細胞表面受容体およびＧＡＰ接合の上方調節に影響を及ぼす剤、細胞静止剤および分化剤、細胞接着の阻害剤、または標的細胞のアポトーシス感受性を誘導し、または増加させる剤を含む。本発明と組み合わせて遺伝子治療の一部として用いることができる免疫調節遺伝子の非限定的な例は、腫瘍壊死因子；インターフェロンアルファ、ベータおよびガンマ；ＩＬ−２およびその他のサイトカイン；Ｆ４２Ｋおよびその他のサイトカイン類縁体；またはＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１ベータ、ＭＣＰ−１、ＲＡＮＴＥＳおよびその他のケモカインを含む。
【０１２８】
細胞増殖の阻害剤の例は、ｐ１６である。サイクリン依存性キナーゼ、すなわちＣＤＫによって真核生物の細胞周期の主要遷移を引き起こす。１つのＣＤＫ、すなわちサイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）は、Ｇ１期を通して進行を調節する。この酵素の活性は、Ｇ１後期にＲｂをリン酸化することであってよい。ＣＤＫ４の活性は、活性化サブユニット、すなわちＤ−型サイクリンによって、および阻害サブユニット、すなわちＣＤＫ４に特異的に結合し、阻害し、従って、Ｒｂリン酸化を調節してよいｐ１６ＩＮＫ４によって制御される。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子は、新しく記載されたＣＤＫ阻害性蛋白質の種類に属し、この種類は、ｐ１６Ｂ、ｐ１９、ｐ２１ＷＡＦ１およびｐ２７ＫＩ１も含む。ｐ１６ＩＮＫ４遺伝子の同型接合削除および変異は、ヒト腫瘍細胞系統では頻繁である。ｐ１６ＩＮＫ４蛋白質はＣＤＫ４阻害剤なので、この遺伝子を削除すると、ＣＤＫ４の活性が増加し、その結果、Ｒｂ蛋白質が高リン酸化される。遺伝子治療に使用して細胞増殖を阻害してよい他の遺伝子は、Ｒｂ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１、ｐ７３、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１／ＰＴＥＮ、ＤＢＣＣＲ−１、ＦＣＣ、ｒｓｋ−３、ｐ２７、ｐ２７／ｐ１６融合体、ｐ２１／ｐ２７融合体、抗血栓遺伝子（例えばＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ）、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、血管新生に関与する遺伝子（例えばＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦまたはそれらの受容体）およびＭＣＣを含む。
【０１２９】
細胞表面受容体またはＦａｓ／Ｆａｓリガンド、ＤＲ４またはＤＲ５／ＴＲＡＩＬなどのリガンドの上方調節は、過剰増殖性細胞に対する自己分泌効果または傍分泌効果を確立し、本発明のアポトーシス誘導能力を強化することも考慮の範囲内である。ＧＡＰ接合の数を上げて細胞間の信号伝達を増加させると、隣接する過剰増殖性細胞ポピュレーションに対する抗過剰増殖性効果が増加する。他の実施態様では、細胞増殖抑制剤または分化剤を本発明で用いて、治療法の抗過剰増殖性抗力を高めることができる。細胞接着の阻害剤は、本発明の効力を高めるとみなされる。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤およびロバスタチンである。さらに、抗体ｃ２２５などの過剰増殖性細胞のアポトーシス感受性を増加させる他の剤を本発明と組み合わせて用いて治療効果を高めることは、考慮の範囲内である。
【０１３０】
本発明とともにホルモン療法も用いてよい。乳癌、前立腺癌、卵巣癌または子宮頸部癌などの特定の癌の治療においてホルモンを使用してテストステロンまたはエストロゲンなどの特定のホルモンの効果のレベルを下げ、あるいは遮断してよい。この治療は、治療オプションとして、または転移の危険性を小さくするために、多くの場合に少なくとも１つの他の癌療法と組み合わせて用いられる。
【０１３１】
本願において引用するすべての特許、特許出願およびその他の刊行物は、公開されたアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を含めて、参照によって全体としてあらゆる目的について組み込まれる。
【実施例】
【０１３２】
以下の実施例を掲載して本発明の好ましい実施態様を示す。当業者は、以下の実施例に開示する技法は、本発明の実施において良好に機能することを本発明者が発見した技法を表し、従って本発明の実施にとって好ましいモードを構成するとみなしてよいと理解するべきである。しかし、当業者は、本開示を参照し、開示された特定の実施態様において多くの変化を施してもなお本発明の技術思想および範囲から逸脱せずに同様な類似の結果を得ることができることを理解するべきである。
【０１３３】
（実施例１）
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２の構築
図１に、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２の例の構築の例を示す。最初に、以下のプライマー対の例、すなわち５’−ＴＴＧＧＴＣＴＴＣＡＣＣＴＡＣＣＧＡＣＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）と３’−ＧＡＣＧＣＧＡＴＧＡＡＣＧＧＡＡＡＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）とを用いて、ＩＣＰ１０左側（ｌｅｆｔ−ｆｌａｎｋｉｎｇ）領域を含むＨＳＶゲノム領域（ＨＳＶ−２ゲノムのヌクレオチド番号８５９９４〜８６９９９と等価）を増幅させた。以下のプライマー対の例、すなわち、５’−ＡＣＡＣＧＣＣＣＴＡＴＣＡＴＣＴＧＡＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）と５’−ＡＡＣＡＴＧＡＴＧＡＡＧＧＧＧＣＴＴＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）とを用いて、ＲＲドメインおよび右側（ｒｉｇｈｔ−ｆｌａｎｋ）領域（ＨＳＶ−２ゲノムのヌクレオチド配列番号８８２２８〜８９３４７と等価）を増幅させた。これらの２つのＰＣＲ産物を、ＥｃｏＲＩ−ＮｏｔＩ−ＸｂａＩライゲーションによってｐＮｅｂ１９３の中にクローン化し、ｐＮｅｂ−ＩＣＰ１０−デルタＰＫを発生させた。次に、以下のプライマー対の例、すなわち、５’−ＡＴＧＧＴＧＡＧＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）と３’−ＣＴＴＧＴＡＣＡＧＣＴＣＧＴＣＣＡＴＧＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）とを用いて、ＣＭＶプロモーター−ＥＧＦＰ遺伝子を含むＤＮＡ配列を、ｐＳＺ−ＥＧＦＰからＰＣＲ増幅させた。次に、ＢｇＩＩＩおよびＮｏｔＩライゲーションによって、ＰＣＲ増幅ＤＮＡをｐＮｅｂ−ＩＣＰ１０−デルタＰＫの削除ＰＫ遺伝子座にクローン化してｐＮｅｂ−ＰＫＦ−２を発生させた。ＰＣＲ増幅戦略を設計する際には、ＥＧＦＰ遺伝子がＩＣＰ１０遺伝子の残るＲＲドメインのフレーム内に融合し、その結果、この融合遺伝子の新しい蛋白質産物は、以下の実験段階において組み換えウイルスの選択を容易にする無傷の機能ＥＧＦＰを含むように、プライマーを設計した。
【０１３４】
ｐＮｅｂ−ＰＫＦ−２プラスミドＤＮＡと、精製したＨＳＶ−２ゲノムＤＮＡ（１８６株）とをリポフェクタミンによってベロ細胞に共形質移入する相同組み換えによって、改変ＩＣＰ１０遺伝子をウイルス中に挿入した。ＧＦＰ陽性ウイルスプラークを検索して組み換えウイルスを選抜し、特定した。検索プロセスの間に、ＧＦＰ陽性プラークがすべて、明らかな感染細胞の合胞体形成を示すことに気がついた。これは、本発明の特定の実施態様では、この改変ウイルスが広範囲な細胞膜融合を誘導することを示している。合計６つのプラークを選抜した。さらにキャラクタリゼーションするため、およびその後のすべての実験のためにそれらの１つを選択した。これをＦｕｓＯｎ−Ｈ２と呼ぶ。
【０１３５】
実施例２
インビトロキャラクタリゼーション
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２ベクターの例を、当分野の標準的な分析法によってキャラクタリゼーションした。
【０１３６】
サザンブロット分析。
【０１３７】
改変ＩＣＰ１０遺伝子がＨＳＶ−２ゲノムに正しく挿入され、元のＩＣＰ１０遺伝子を置換したことを確認するために、精製したＦｕｓＯｎ−Ｈ２ウイルス原料からウイルスＤＮＡを抽出した。対照として、同じ手順によって、親の野生型ＨＳＶ−２からウイルスＤＮＡを抽出した。ＢａｍＨＩを用いてウイルスＤＮＡを消化し、０．８％アガロースゲル中で電気泳動した。ＢａｍＨＩによって消化すると、野生型ＨＳＶ−２ゲノムから、ＩＣＰ１０遺伝子全体およびその左側領域および右側領域を含む７３９０ｂｐのＤＮＡ断片が生じる。しかし、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２ゲノムを同じ酵素で消化すると、ＩＣＰ１０遺伝子座から２つのＤＮＡ断片、すなわち、１）左側領域とＣＭＶプロモーター配列とを含む４８３０ｂｐ断片、および２）ＧＦＰ、ＲＲおよび右側領域を含む３０３４ｂｐ配列、が生じる。ＤＮＡをナイロン膜に移し、１）ＤＮＡ配列の左側領域、２）ＰＫ領域全体、３）ＰＫの右側領域、および４）ＧＦＰ遺伝子、から調製した４つのプローブとハイブリッド化させる。結果（図２）によると、ＧＦＰ遺伝子から作った１つを除くすべてのプローブが７３９０ｂｐＤＮＡバンドにハイブリッド化した。左側領域プローブは、ＧＦＰおよび右側領域ＤＮＡ配列から調製したプローブによって認識されるＤＮＡバンドにハイブリッド化した。ＰＫドメイン配列から作ったプローブは、ＤＮＡ断片のどれにもハイブリッド化することができず、ＰＫドメインがＦｕｓＯｎ−Ｈ２のゲノムから完全に除去されたことを示した。
【０１３８】
ウェスタンブロットハイブリダイゼーション。
【０１３９】
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２のゲノムの中の改変ＩＣＰ１０遺伝子の正しさをさらに確認するために、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２または親の野生型ＨＳＶ−２のどちらかに感染させたベロ細胞から、またはｐＳＺ−ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡで形質移入された細胞から蛋白質を抽出した。１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で蛋白質を分離し、ハイボンド−Ｃ膜に移した。次に、抗ＧＦＰモノクローナル抗体（抗ＧＦＰ＃Ａｂ２９０、ＡＢＣＡＭ  Ｉｎｃ．，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ）で膜をブロットした。この抗ＧＦＰ抗体は、ｐＳＺ−ＥＧＰ形質移入細胞から発現された小型のＧＦＰ蛋白質（約２８ｋＤ）を選択した。同じ抗体は、著しく大きな蛋白質バンド（融合蛋白質のサイズは、約１２０ｋＤと予想される）も認識した。しかし、この抗体は、野生型ＨＳＶ−２に感染した細胞由来のどの蛋白質産物とも反応することができず、この抗体の特異性が確認された。これらの結果は、ＧＦＰ遺伝子がＦｕｓＯｎ−Ｈ２ゲノム中のＩＣＰ１０遺伝子の残っているＲＲドメインと正しく融合したことをさらに確認する。
【０１４０】
（実施例３）
インビトロＦｕｓＯｎ−Ｈ２表現型キャラクタリゼーション
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２の表現型を決定するために、本発明者らは、ベロ細胞を野生型ＨＳＶ−２またはＦｕｓＯｎ−Ｈ２のどちらかに感染させ、あるいは、細胞を感染させずにおいた。感染の２４時間後、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２に感染させた細胞単一層中に明らかな合胞体形成が見えた。非感染細胞にも、野生型ＨＳＶ−２に感染させた細胞にも、合胞体は見られなかった。さまざまな組織起源のヒト腫瘍細胞中でも同様な合胞体形成が観測された。いくつかの腫瘍細胞では、野生型ＨＳＶ−２に感染させても、ある程度の合胞体形成が誘導された。しかし、これらの細胞上でＦｕｓＯｎ−Ｈ２によって誘導される合胞体形成は、通常、有意に大規模であった。従って、この場合、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２は、親の野生型ＨＳＶ−２と比較すると、融合活性の増強を示す。これらの結果は、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２は、その感染が広範な合胞体形成を誘導するか、または腫瘍細胞中の合胞体形成の強度を強める点で、表現型として親のウイルスと異なることを示している。ＰＫドメインも、ＩＣＰ１０遺伝子全体も、これまで細胞膜融合といかなる機能関連を有すると報告されたことがない（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．  ７２（１１）：  ９１３１−９１４１；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９４）  Ｖｉｒｏｌ．  ２００（２）：  ５９８−６１２；  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９２）  Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７３（ｐｔ６）：  １４１７−１４２８）。いくつかの実施態様では、ＧＦＰ遺伝子を加え、および／またはＩＣＰ１０の天然プロモーターを強力なＣＭＶプロモーターで置換すると、このウイルスのこの表現型変化に効果があった。１型殺腫瘍ＨＳＶによって合胞体形成が誘導されると、例えば、ヒト腫瘍細胞に対するウイルスの殺細胞能力が著しく増加することが示されている（２００３年３月２６日出願の米国特許出願第１０／３９７，６３５号）ので、殺腫瘍を目的とする用途では、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２の融合性表現型は重要である。
【０１４１】
（実施例４）
増殖活動中の細胞および休止状態の細胞中のＦｕｓＯｎ−Ｈ２の成長曲線
分裂（腫瘍）細胞中のＦｕｓＯｎ−Ｈ２の選択複製の性質を求めるために、本発明者らは、ベロ細胞を感染させ、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（十分に増殖状態にある細胞）中、またはＦＢＳを含まない媒地（休止状態の細胞）中のどちらかで、野生型ＨＳＶ−２またはＦｕｓＯｎ−Ｈ２のどちらかとともに培養した。感染後、異なる時点でウイルスを集め、ベロ細胞で滴定した。細胞を休止状態にしても、野生型ウイルスの成長は、わずかな影響しか受けなかった（２分の１まで減少しない）。これとは対照的に、休止状態にある細胞中のＦｕｓＯｎ−Ｈ２の成長は、増殖状態にある細胞からのウイルス収量と比較すると、劇的に減少した（４０分の１より小さくなる）。これらの結果（図５）は、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２は、腫瘍細胞中で十分複製能力があるが、体の中の正常な体細胞を表す休止状態の細胞中では、通常、最小限の複製能力しかなく、従って、腫瘍細胞中でのＦｕｓＯｎ−Ｈ２の選択複製能力が得られることを示した。
【０１４２】
（実施例５）
ヒト腫瘍細胞に対するＦｕｓＯｎ−Ｈ２のインビトロ殺細胞アッセイ
次に、本発明者らは、直接、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２とその親の野生型ＨＳＶ−２とのインビトロ殺腫瘍効果、あるいは１型ＨＳＶ（ＨＳＶ−１）から構築した殺腫瘍ウイルスを比較した。ヒト卵巣がん細胞系統Ｓｋｏｖ−３またはヒト乳癌細胞系統ＭＤＡ−ＭＢ−４３５の例となる細胞を０．０１または０．１ｐｆｕ／細胞のどちらかで本ウイルスに感染させ、ウイルス感染の２４時間後または４８時間後のどちらかの時点で、例えば比色法乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）アッセイによって細胞生存率を測定した。結果（図６）によると、試験した殺腫瘍ＨＳＶの中で、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２が両方のヒト腫瘍細胞系統に対して最も高い殺細胞能力を有する。その殺細胞能力は、腫瘍細胞中に合胞体形成を誘導するその能力によって、その親の野生株ウイルスと比較しても有意に高かった。
【０１４３】
（実施例６）
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２のインビボ治療評価
インビボ条件下で、例となるＦｕｓＯｎ−Ｈ２ウイルスをキャラクタリゼーションした。
【０１４４】
ヒト乳癌異種移植部に対して
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２のインビボ抗腫瘍効果を評価するために、本発明者らは、非常におだやかな用量（１×１０６ｐｆｕ）のウイルスを、ヒト乳癌（乳腺脂肪層中のＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞の注入から）の確立された異種移植部（直径約５〜８ｍｍ）に直接注入した。比較のため、本発明者らは、ＨＳＶ−１由来の殺腫瘍ＨＳＶ（Ｂａｃｏ−１）をＦｕｓＯｎ−Ｈ２と同じ用量で同時に評価した。Ｂａｃｏ−１は、２００３年３月２６日出願の米国特許出願第１０／３９７，６３５号に記載されている。４週間にわたり、毎週腫瘍サイズを測定した。ＰＢＳ対照と比較すると、どちらのウイルスの単回注射も腫瘍成長（図７）に対して即時効果を示した。ウイルス注入後１週間以内に、殺腫瘍ウイルスのどちらで治療したマウスの腫瘍も、ＰＢＳを注射した腫瘍より著しく小さかった（Ｐ＜０．００１）。しかし、第２週から第４週では、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２は、Ｂａｃｏ−１より有意に大きな抗癌効果（Ｐ＜０．０１）を生じた。ＦｕｓＯｎ−Ｈ２投与後、第２週には、すべての動物（８匹中８匹）の腫瘍が消えた。これに対して、Ｂａｃｏ−１を注入した群では、２匹のマウスの腫瘍しか消えなかった。他の６匹のマウスでは、腫瘍は最初に縮んだが、ウイルス注入後第３週には再び成長し始めた。これらの結果は、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２がヒト乳癌に対する強力な抗腫瘍剤であり、ＨＳＶ−１から構築した融合性殺腫瘍ＨＳＶより有意に効果が大きいことを示している。
【０１４５】
ヒト卵巣がん異種移植部に対して
卵巣がんの腹腔内侵入は、よくある重大な臨床問題である。後期卵巣がん患者の約７０％が腹腔空洞内に転移性疾患を有すると報告された。従って、本発明者らは、例えば、ヒト卵巣がんに対するＦｕｓＯｎ−Ｈ２の有効性を試験する手段として、腹腔内転移モデル（異物移植Ｓｋｏｖ−３細胞）を選んだ。集めたばかりのＳｋｏｖ−３細胞を３Ｘ１０６細胞／マウスの用量でヌードマウスの腹腔内に接種した。２週間後、マウスの腫瘍細胞注射部位から遠く離れた部位に、３×１０６ｐｆｕのＢａｃｏ−１、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２またはＰＢＳ（対照）のどれかを単回腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。１週間後、この治療注射を繰り返した。最初の治療注射の４週間後、マウスを安楽死させ、腹腔空洞内の腫瘍成長を評価した。これらの治療群の各動物の複数の空洞内腫瘍小結節を観察すると明らかであったが、ＰＢＳ−またはＢａｃｏ−１治療群のどちらにも明らかな腫瘍のｉ．ｐ．転移があった（図８および表１）。
【０１４６】
表１  ヒト卵巣癌異種移植部の殺腫瘍治療後の腹腔内腫瘍小結節の数および重量
【０１４７】
【表１】
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ＰＢＳと比較すると、Ｂａｃｏ−１治療は、確立された卵巣がんに対して一定の治療効果を示した。１匹のマウスの腫瘍は完全に消え、１匹の腫瘍小結節は著しく小さくなった（１つの腫瘍小結節しか見られなかった）。しかし、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２の治療効果は明らかに大規模であった。実験の終りまでに、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２治療を受けた群の８匹のマウスのうち７匹の腫瘍が消えた（表１および図８）。腫瘍がなくならなかった唯一のマウスの腫瘍小結節は１つしかなかったが、小結節は、Ｂａｃｏ−１またはＰＢＳの治療を受けたマウスの小結節よりはるかに小さかった。これらの結果は、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２が、比較的大きな空洞の中に確立したヒト固形腫瘍を治療する上で、ウイルスを非常におだやかな用量で投与したときでも、極めて有効であることを明らかに実証している。
【０１４８】
（実施例７）
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２のインビボ毒性評価
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２の毒性を評価するための第一段階として、本発明者らは、５×１０６ｐｆｕの野生型ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２またはＦｕｓＯｎ−Ｈ２のどれかをＣ５７／ブラックマウス（Ｎ＝５）に皮下注射した。ウイルス投与の５日後に、野生型ＨＳＶ−ｌを受けた群の５匹のマウスのうち４匹が死んだ。野生型ＨＳＶ−２を受けた群では１匹のマウスが死んだ。しかし、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２を注射した群ではマウスは１匹も死ななかった。これらの結果は、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２が腫瘍細胞を殺傷することには極めて強力であるが、受け入れ宿主に対する毒性は親の野生型ＨＳＶより著しく低く、特定の実施態様では、臨床応用で安全なことを示している。
【０１４９】
（実施例８）
アポトーシスを誘導するＦｕｓＯｎ−Ｈ２の能力
本実施例によって、本発明に記載の改変ＨＳＶ−２ウイルス（ＦｕｓＯｎ−Ｈ２）は、感染腫瘍細胞および周囲の腫瘍細胞においてアポトーシスを効率的に誘導することができ、別の腫瘍破壊機序を提供することを示す。
【０１５０】
アフリカミドリザル腎臓（ベロ）細胞、ＳＷ４０３およびＳＷ４８０細胞（ヒト結腸癌細胞系統）、およびＡ５４９細胞（ヒト肺癌細胞系統）は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤ）から入手した。ヒト食道癌細胞系統のＥＣ９７０６は、Ｍｉｎｇｒｏｎｇ  Ｗａｎｇ博士（Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）の提供である。ヒト卵巣がん細胞系統のＳＫＯＶ３細胞は、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｂａｓｔ博士（ｔｈｅ  Ｍ．  Ｄ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）の提供である。ヒト骨肉腫系統のＵ２０Ｓ細胞は、Ｄｒ．  Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｄｏｎｅｈｏｗｅｒの提供である。細胞はすべて、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中で培養した。
【０１５１】
野生型ＨＳＶ−２株１８６（ｗｔ１８６）からＦｕｓＯｎ−Ｈ２を誘導した。その構築は実施例１に記載した。ＨＳＶ−１系殺腫瘍ウイルスＢａｃｏ−１の構築は、米国特許出願第１０／３９７，６３５号に記載されている。ウイルス原料は、細胞あたり０．０１プラーク形成単位（ｐｆｕ）のベロ細胞を感染させて調製した。２日後、ウイルスを集め、記載されている（Ｎａｋａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００３）  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ９（７）：  ２７２７−２７３３）ように精製した。純化ウイルスを滴定し、等分し、使用するまで−８０℃で保管した。
【０１５２】
ウイルス成長キャラクタリゼーション
２４ウェルプレートに３つ１組で、５０％密度で細胞を接種した。次の日、細胞を１ｐｆｕ／細胞のウイルスに１時間感染させた。細胞をＰＢＳで１度洗浄し、吸収されなかったウイルスと取り込まれなかったウイルスとを除去した後、新鮮な培地を加えた。感染後２４時間で細胞を集めた。凍結および解凍ならびに超音波処理を繰り返して、ウイルスを放出させた。プラークアッセイによってベロ細胞基準のウイルス力価を測定した。
【０１５３】
感染細胞のヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）染料染色およびクロマチン凝集の定量
次の日、２４ウェルプレートに接種した細胞を、１０ｐｆｕ／細胞のＦｕｓＯｎ−Ｈ２、ｗｔ１８６またはＢａｃｏ−１に感染させ、あるいは偽感染させた。感染の２４時間後、細胞を３７℃で１μｇ／ｍｌの最終濃度のヘキスト染料３３３５８（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  ＭＯ）で３０分間染色してから、蛍光顕微鏡下で顕微写真を撮影した。
【０１５４】
ＤＮＡラダーリングアッセイ
細胞を、６ウェルプレートに７０％密度で接種した。次の日、細胞を１０ｐｆｕ／細胞のウイルスに感染させた。ウイルス感染の２４時間後に、細胞を集め、ＤＮＡｚｏ１試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，  ＣＡ）を用いてＤＮＡを細胞から抽出した。抽出したＤＮＡをＲＮアーゼ（１００μｇ／ｍｌ）で処理した後、フェノール：クロロホルム抽出およびエタノール沈殿に付した。次に、ＤＮＡを、１％アガロースゲルに載せ、電気泳動を行い、臭化エチジウムで染色した後、ＵＶ照明下で視覚化した。
【０１５５】
ＥＧＦＰの発現は、クロマチン凝集に対応する
次の日、１２ウェルプレートに接種した細胞を、１ｐｆｕ／細胞のＦｕｓＯｎ−Ｈ２に感染させた。クロマチン凝集のためのヘキスト染料染色を、上記で説明したように実行した。Ｓｐｏｔ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，  Ｉｎｃ，  ＩＬ）を用いて、別々の蛍光灯による同じ画像域からの顕微鏡写真の重ね合せを実行した。同じ区域の中のＧＦＰ陽性アポトーシス細胞とＧＦＰ陰性アポトーシス細胞とを別々に計数した。各区域で約１００のアポトーシス細胞を数えた。全部で３つの区域を計算して、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２感染細胞によって誘導された傍観者効果を証明した。
【０１５６】
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ニック端標識化（Ｔｕｎｅｌ）アッセイ
雌のＨｓｄ無胸腺（ｎｕ／ｎｕ）マウス（Ｈａｒｌａｎ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄｉａｎａから入手した）を特定の病原体感染防止条件下に保ち、５から６週齢に達したとき実験に用いた。０．２５％のトリプシンおよび０．０５％のＥＤＴＡに短時間曝露した亜集密培養からＥＣ９７０６細胞を集めした。１０％ＦＢＳを含む培地でトリプシン処理を停止させた後、無血清培地中で細胞を１回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁した。第０日に、ヌードマウスの右横腹に５×１０６のＥＣ９７０６細胞を接種した。腫瘍細胞注入の２週間後、腫瘍の直径が約５ｍｍに到達したとき、体積１００μｌ中３×１０６ｐｆｕのＦｕｓＯｎ−Ｈ２またはＢａｃｏ−１、あるいは同じ体積のＰＢＳをマウスに単回腫瘍内注射した。腫瘍を毎週測定し、式：腫瘍体積［ｍｍ３］＝（長さ［ｍｍ］）×（幅［ｍｍ］）２×０．５２によって腫瘍の体積を求めた。Ｔｕｎｅｌアッセイでは、１×１０７ｐｆｕのＦｕｓＯｎ−Ｈ２またはＢａｃｏ−１ウイルスを腫瘍内注入して３日後、ＣＯ２に曝露してマウスを安楽死させた。腫瘍組織を外植し、Ｔｕｎｅｌ染色に備えて区分けした。
【０１５７】
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２は、さまざまな組織起源のヒト腫瘍細胞中にアポトーシスを誘導する
シクロヘキシミドなどの翻訳阻害剤によってウイルス蛋白質合成を遮断しなければ、特定のＨＳＶ−２遺伝子産物の抗アポトーシス活性によって、ＨＳＶ−２に感染させても、通常、アポトーシスを誘導しない（Ａｕｂｅｒｔ  ｅｔ  ａＧ，  （１９９９）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３（１２）：  １０３５９−７０）。ＨＳＶ−２由来のＩＣＰ１０遺伝子のＰＫドメインは、抗アポトーシス機能を有するウイルス遺伝子産物の１つとして認識され、ウイルスゲノムから削除すると、ある種の体細胞のアポトーシス死を誘導する能力をウイルスに与えることが記載された（Ｐｅｒｋｉｎｓら、（２００２）  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ７６（３）：  １４３５−４９）。
【０１５８】
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２が腫瘍細胞のアポトーシス死を誘導するか定めるために、さまざまな組織起源のヒト腫瘍細胞のパネルを１０ｍ．ｏ．ｉ．のウイルスに感染させた。ＨＳＶ−１、Ｂａｃｏ−１から誘導した殺腫瘍ウイルスを対照として評価に含めた。腫瘍細胞の中で、ＥＣ９７０６はヒト食道癌細胞系統であり、ＳＫＯＶ３はヒト卵巣がん細胞系統であり、ＳＷ４０３およびＳＷ４８０はヒト大腸癌細胞系統である。細胞を６ウェルプレートに接種し、翌日、ウイルスに感染させた。感染の２４時間後、細胞をヘキスト染料３３３５８で染色した。ＦｕｓＯｎ−Ｈ２による腫瘍細胞の感染は、大量のクロマチン凝集を誘導し、アポトーシスを示した。これは、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２感染細胞中に強い小さな青色の核染色が出現したことによって明白だった。全体として、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２に感染した腫瘍細胞の８０％超がクロマチン凝集を示した。非感染腫瘍細胞は、そのようなアポトーシスの特徴を非常にわずかに、またはまったく示さなかった。これらの腫瘍細胞を親の野生型ＨＳＶ−２（ｗｔ１８６）またはＢａｃｏ−１に感染させても、クロマチン凝集の青色蛍光染色の背景レベルはあまり増加しなかった。
【０１５９】
腫瘍細胞中にアポトーシスを誘導するＦｕｓＯｎ−Ｈ２の能力をさらに検証するために、ＤＮＡ断片化を解析した。前の実験に用いた３つの腫瘍細胞を１０ｐｆｕ／細胞のウイルスに感染させるかまたは偽感染させた。感染の２４時間後、細胞を集めた。ＤＮＡを細胞から抽出し、１％アガロースゲル中で分離した。ＦｕｓＯｎ−Ｈ２感染物質が載っているウェルには明らかなラダーリングがあった。このラダーリングは、ｗｔ１８６またはＢａｃｏ−１感染細胞のどちらか由来のＤＮＡ試料が載っているウェルの中で検出され、従って、上記で提示したクロマチン凝集の結果を再確認した。これらの結果を一緒にすると、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２に感染させるとこれらのヒト腫瘍細胞中にアポトーシスが効率的に誘導されるが、親の野生型ＨＳＶ−２にもＨＳＶ−１系殺腫瘍ウイルスにもそのような特性はない。
【０１６０】
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２に感染すると、傍観者細胞のアポトーシス死も誘導される
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２には強化された緑色蛍光蛋白質をコードする遺伝子があるので、その感染力は、蛍光顕微鏡下で容易に測定することができた。クロマチン凝集の蛍光性検出と感染力とを相互検証しているとき、青色の蛍光性クロマチン凝集を示す細胞と、ＧＦＰ染色を示す細胞との百分率の間の明らかな不一致を認めた。クロマチン凝集を示す腫瘍細胞とＧＦＰ発現を示す腫瘍細胞との絶対数を数えると、比は、約２．６：１であった。この結果によると、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２感染には、周囲の腫瘍細胞に対するかなりの傍観者アポトーシス効果があった。
【０１６１】
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２誘導アポトーシス死は、腫瘍細胞死を加速し、腫瘍細胞内のウイルス複製を弱める
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２に感染した腫瘍細胞と、殺腫瘍ウイルス誘導ＨＳＶ−１に感染した腫瘍細胞との間で、細胞が細胞変性効果（ＣＰＥ）を示した時間にも明らかな差異を認めた。１ｐｆｕ／細胞の用量のＦｕｓＯｎ−Ｈ２に感染した腫瘍細胞は、通常、２４時間以内に十分なＣＰＥを示したが、同じ用量のＢａｃｏ−１に感染した腫瘍細胞は、形態学的にほとんど正常に見えた。それらは、通常、感染後７２時間を超えるまで明らかなＣＰＥの徴候を示さなかった。ＦｕｓＯｎ−Ｈ２に感染させたウェルの中では、感染後２４時間で細胞の集団化と相互離脱を含む一般的なＣＰＥを容易に見ることができたが、Ｂａｃｏ−１に感染させた細胞は、感染後４８時間でも基本的に偽感染細胞と同じに見えた。これらの結果によると、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２によって誘導されるアポトーシス細胞死は、ウイルス感染後すぐに起こったが、ウイルス複製の殺腫瘍効果が起こるにはもっと長い時間を要した。
【０１６２】
アポトーシス腫瘍細胞死は重要なウイルスのインビボ抗腫瘍機序である
既に記載した実験で用いた腫瘍細胞の１つから確立した腫瘍異種移植物に対するＦｕｓＯｎ−Ｈ２のインビボ抗腫瘍活性を評価した。Ｂａｃｏ−１をこの実験に含め、これらの２つのウイルスの治療効果を直接比較することができるようにした。新たに調製した５×１０６のＥＣ９７０６細胞の皮下注射によって、腫瘍異種移植物を右横腹に確立した。腫瘍サイズが直径約５ｍｍに達したとき、マウスにどちらかのウイルス（ＦｕｓＯｎ−Ｈ２またはＢａｃｏ−１）、あるいは対照としてのＰＢＳを、３×１０６ｐｆｕの用量で単回腫瘍内注射した。６週にわたって腫瘍を定期的に測定し、治療前の腫瘍体積を治療後の異なる時点の腫瘍体積で除することによって、腫瘍成長比を求めた。ＦｕｓＯｎ−Ｈ２を治療投与すると、基本的に、腫瘍成長は１週間以内に停止した。その後、腫瘍は縮み始め、実験終了までに平均腫瘍サイズはビボ治療前のサイズの約２分の１でしかなくなり、半数を超えるマウスの腫瘍は完全に消えた。対照のＰＢＳと比べると、Ｂａｃｏ−１を投与しても、３週までいかなる治療効果も示さなかった。しかし、腫瘍は第３５日には再び成長し始めたので、腫瘍収縮は一時的なようであった。この腫瘍細胞中ではアポトーシスの誘導によって複製能力が制約されるという事実にもかかわらず、全体として、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２の治療効果は、評価を行ったすべての時点でＢａｃｏ−１の治療効果より有意に強かった（ｐ＜０．０５）。これらの結果によると、このインビボ研究では、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２によって誘導されたアポトーシス死と、同時に起こる傍観者効果とが主要抗腫瘍機序であった可能性が高い。
【０１６３】
（実施例９）
ＦｕｓＯｎ−Ｈ２による腫瘍破壊は強力な抗腫瘍免疫を誘導する
２つの純系腫瘍モデル、すなわちマウス乳腺腫瘍（４Ｔ１細胞）とマウス神経芽細胞腫（ニューロ２Ａ細胞）におけるＦｕｓＯｎ−Ｈ２の抗腫瘍活性を評価した。どちらの場合にも、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２は、統計的に有意な抗腫瘍効果を示し、同時に堅固な腫瘍特異性免疫応答も示した。下記に提示するのは、乳腺腫瘍モデルにおける研究からの一般的なデータである。
【０１６４】
この評価には、４Ｔ１細胞を利用した。これは、非免疫原性であり、非常に悪性であり、純系ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて高度に転移性である（Ａｓｌａｋｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ  （１９９２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５２（６）：  １３９９−４０５；  Ｐｕｌａｓｋｉ  ａｎｄ  Ｏｓｔｒａｎｄ−Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  （１９９８）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５８（７）：  １４８６−９３）。４Ｔ１細胞（１×１０５）を免疫能力のあるＢＡＬＢ／ｃマウスの乳腺脂肪層に同所投与注射して同所性腫瘍を確立した。マウスを１０日間飼育したところ、群の９０％を超える個体で肺転位を検知することができた。次に、腫瘍を持つマウスを３つの群（それぞれｎ＝１０）に分け、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２か、あるいは、このモデルにおいて有効な抗腫瘍免疫を誘導することが既に示されている二重融合型Ｓｙｎｃｏ−２Ｄ（Ｎａｋａｍｏｒｉ，  Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ９（５）：  ６５８−６６５）を含むＨＳＶ−１から誘導した他の殺腫瘍ＨＳＶか、のどちらかの１×１０７ｐｆｕを腫瘍内注射した。２週間にわたって、正所性部位の腫瘍質量を毎週測定した後、マウスを死なせ、免疫学的アッセイおよび肺転位の評価を行った（墨汁灌流後、解剖顕微鏡下で計測）。免疫学的アッセイでは、外植された脾臓から脾細胞を調製し、照射４Ｔ１細胞で５日間インビトロ刺激してから、以下のアッセイ、すなわち、１）５１Ｃｒ放出アッセイによる腫瘍特異性ＣＴＬ活性（４Ｔ１細胞または純系肉腫細胞系統Ｍｅｔｈ−Ａのどちらかを標的細胞とする）、２）ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社から購入した検出キットを用いるマウスＩＦＮ−γ分泌細胞のＥｌｉｓｐｏｔ分析、３）サイトカイン分泌の定量（インターフェロン−γとＩＬ−１０との両方について）を用いた。結果によると、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２を局所腫瘍内投与すると、正所性腫瘍だけででなく遠隔肺転位に対しても他のウイルスより有意に良好な治療効果が認められた。Ｓｙｎｃｏ−２Ｄは、Ｂａｃｏ−１と比較すると、正所性腫瘍および転移性腫瘍の成長を阻害することができた。この結果は、本発明者らの既報の観察結果（Ｎａｋａｍｏｒｉ，  Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，  （２００４）  Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．  ９（５）：  ６５８−６６５）と類似していた。しかし、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２は、この腫瘍を治療する上でＳｙｎｃｏ−２Ｄより有効でさえあるように見えた。ＦｕｓＯｎ−Ｈ２によって誘導される同時発生抗腫瘍免疫応答も、腫瘍特異性ＣＴＬ活性および頻度ならびにサイトカイン放出を含め、Ｓｙｎｃｏ−２Ｄの腫瘍免疫応答より明らかであり、局所腫瘍および転移性腫瘍の除去に対するそれらの寄与を示した。
【０１６５】
（実施例１０）
ウイルス力価を測定するためのプラーク形成アッセイ
ウイルス原料を調製した後、既に記載したプラーク形成アッセイ（Ｌａｎｃｚ  ＧＪ．  （１９７４）．  Ａｒｃｈ  Ｖｉｒｏｌ．，  ４６，  ３６−４３を参照すること）を用いてウイルス力価を測定した。ベロ細胞をトリプシン処理し、計数し、ウェルあたり４×１０５細胞で６ウェルプレートに塗布し、３７℃、５％ＣＯ２および９０％湿度で温置し、２４時間培養する。次の日、ウイルスを、１×最小必須培地（ＭＥＭ）の中で次々に１：１０に希釈して１０−３〜１０−８の６つの濃度にする。次に、培地をウェルから吸い取り、０．５ｍｌのウイルス希釈物を３つ１組で各ウェルに加える。次に、１５分ごとに振盪してプレートを１時間培養する。培養期間の後、ウイルス溶液を吸い取り、１％アガロースを含む２ｍｌのＭＥＭを各ウェルに加え、プレートを３日間培養した後、０．１％クリスタルバイオレットと２０％エタノールとを含む溶液で細胞を染色する。３０分間の培養期間の終わりに、染色物を吸い取り、１０倍の倍率の立体顕微鏡を用いてプラークを計数する。次に、ウイルス力価をｍｌあたりプラーク形成単位として表す。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】図１Ａ〜１Ｃは、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２構築のための戦略を示す。図１Ａ。ＨＳＶ−２ゲノムの概略図。ゲノムは灰色の横棒によって表され、末端繰り返し単位（ＴＲ）および内部繰り返し単位（ＩＲ）は灰色の箱として示される。ＩＣＰ１０遺伝子の位置も示されている。図１Ｂ。ＩＣＰ１０遺伝子の拡大図であり、ＰＫドメインおよびＲＲ１ドメイン、ならびに天然プロモーターの位置を示す。図１Ｃ。続いてウイルスゲノムに挿入されてＦｕｓＯｎ−Ｈ２を構築した改変ＩＣＰ１０遺伝子。図に示したように、ＰＫドメインは、ＥＧＦＰ遺伝子（ＲＲ遺伝子との枠組の中）で置換され、遺伝子の元のプロモーターは、最も強い哺乳類遺伝子プロモーターの１つであるサイトメガロウイルスの即時早期プロモーターで置換された。非改変ＩＣＰ１０遺伝子座および改変ＩＣＰ１０遺伝子座のＢａｍＨＩ制限部位を標識化する。ＰＫＬ、ＰＫ、ＧＦＰおよびＰＫＲと印を付けたボックスは、図２のサザンハイブリダイゼーションにおいて用いられる４つのプローブがハイブリッド形成する位置を示す。
【図２】図２は、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２のサザンブロット分析を示す。サザンブロットハイブリダイゼーションは、親の野生型ＨＳＶ−２（ｗ）またはＦｕｓＯｎ−Ｈ２（ｍ）のどちらか由来のＢａｍＨＩ溶解ウイルスＤＮＡを示す。サザンハイブリダイゼーションに用いられる４つのプローブは、左側（ｌｅｆｔ−ｆｌａｎｋ）領域から作られたＰＫＬ、ＰＫドメイン領域から作られたＰＫ、右側（ｒｉｇｈｔ−ｆｌａｎｋ）領域から作られたＰＫＲ、ＥＧＦＰ遺伝子から調製されたＧＦＰであった。
【図３】図３は、抗ＧＦＰｍＡｂを用いるＦｕｓＯｎ−Ｈ２のウェスタンブロット分析を示す。ＦｕｓＯｎ−Ｈ２（ｍ）またはその親の野生型ＨＳＶ−２（ｗ）のどちらかに感染したベロ細胞から、あるいはｐＳＺ−ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡ（ｐ）で形質移入したベロ細胞から、細胞溶解物を調製した。
【図４】図４は、培養細胞中のＦｕｓＯｎ−Ｈ２の表現型キャラクタリゼーションを示す。細胞は、０．０１ｐｆｕ／細胞の図に示したウイルスに感染させるか、または感染させなかった。感染の２４時間後に顕微鏡写真を撮影した。白色の矢印によって合胞体を示す。被検細胞の中で、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５はヒト乳癌系統であり、ＭＰａｎｓ−９６はヒトすい臓癌系統であり、ＳＫＯＶ３はヒト卵巣がん系統である。元の倍率は２００倍である。
【図５】図５Ａ〜Ｃは、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２の選択的複製を示す。図５Ａ。ベロ細胞を完全循環状態（１０％ＦＢＳ）に保持するか、または２４時間血清飢餓状態に保持してから、１ｐｆｕ／細胞のウイルスに感染させた。図に示した時点で細胞を集め、ベロ細胞単一層上のプラークアッセイによってウイルス収量を定量した。図５Ｂ。ウイルス感染の間、単独または５０μＭのＰＤ９８０５９共存下、低い百分率の血清（２％）を含む培地中でベロ細胞を培養した。感染の２４時間および４８時間後に細胞を集め、ＰＤ９８０５９非存在下でのウェル中の全ウイルス収量を、薬物を含むウェルからの収量で除することによって、ウイルス複製における倍数減少を計算した。図５Ｃ。インビトロ培養した一次肝細胞を１ｐｆｕ／細胞の図に示したウイルスに感染させた。図に示した感染後の時点でウイルスを集め、ベロ細胞単一層上のプラークアッセイによって定量した。＊ｐ＜０．０１、ｗｔ１８６と比較したＦｕｓＯｎ−Ｈ２（スチューデントｔ検定）。
【図６】図６ＡおよびＢ。殺腫瘍ＨＳＶによるヒト癌細胞のインビトロ殺細胞能力。０．０１ｐｆｕ／細胞（Ａ）または０．１ｐｆｕ／細胞（Ｂ）のどちらかで細胞をウイルスに感染させた。図に示した時点のＬＤＨアッセイによって細胞生存率を求めた。ウイルス感染細胞から放出されたＬＤＨを非感染細胞からのそれで除することによって殺細胞百分率を計算した。ｐ＜０．０１、ｗｔ１８６またはＢａｃｏ−１と比較したＦｕｓＯｎ−Ｈ２、Ψｐ＜０．０１、ｗｔ１８６と比較したＦｕｓＯｎ−Ｈ２（スチューデントｔ検定）。
【図７】図７ＡおよびＢ。異種移植型ヒト乳癌に対するＦｕｓＯｎ−Ｈ２のインビボ抗腫瘍活性。図７Ａ。腫瘍内投与後の治療効果。ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞を第２乳腺の脂肪部分に注入することによってヒト乳腺腫瘍異種移植を実施した。腫瘍が直径約５ｍｍに到達したとき、１×１０６ｐｆｕの投与量のウイルスを腫瘍内注射した。治療群は、ＦｕｓＯｎ−Ｈ２、Ｂａｃｏ−１またはＰＢＳを含む。ウイルス注入してから図に示した週後に測定した腫瘍体積を治療前の腫瘍体積で除することによって腫瘍成長比を求めた（群あたりｎ＝８のマウス）。図７Ｂ。大型乳腺腫瘍異種移植に対する治療効果。腫瘍内注射群および静脈内注射群（それぞれｎ＝５）について、腫瘍はそれぞれ直径１０および１０〜１５ｍｍであった。腫瘍内注射および静脈内注射のそれぞれで、３×１０６ｐｆｕおよび１．５×１０７ｐｆｕの投与量のウイルスを投与した。図６Ａの場合と同じ方法で腫瘍成長比を計算した。Ψｐ＜０．０５、Ｂａｃｏ−１と比較したＦｕｓＯｎ−Ｈ２、＊ｐ＜０．０１、Ｓｙｎｃｏ−２Ｄと比較したＦｕｓＯｎ−Ｈ２（スチューデントｔ検定）。
【図８】図８。ヌードマウスの腹腔内に確立した転移性ヒト卵巣癌異種移植に対するＦｕｓＯｎ−Ｈ２の治療効果。腹腔への２×１０６のＳＫＯＶ３細胞の腹腔内接種によってヒト卵巣がん異種移植を確立した（治療群あたりｎ＝８のマウス）。腫瘍細胞接種の８日後および１５日後、腫瘍着床部位から遠く離れた部位への３×１０６ｐｆｕの投与量の殺腫瘍ＨＳＶの腹腔内投与をマウスに施した。最初のウイルス注入の４週間後（すなわち腫瘍細胞注射の５週間後）に、マウスを安楽死させた。この図に腫瘍小結節の概観を示し、表１に各動物からの腫瘍小結節の数および腫瘍重量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年2月26日(2008.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２５】
（発明の詳細な説明）
実施例１に記載するＨＳＶ−２ウイルス組成物を２００６年６月８日にＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．  Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ  ２０１１０−２２０９  ＵＳＡに寄託した。ＡＴＣＣは、ブダペスト条約にもとづいて設立された国際的な寄託機関（ＩＤＡ）である。寄託証明書番号はＰＴＡ−７６５３である。
【手続補正書】
【提出日】平成20年10月30日(2008.10.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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