(57)【要約】  本発明は、マスクなしアレイ合成（ＭＡＳ）技術により合成されたオリグヌクレオチドアレイを設計するのに用いたれるプローブを合理的に選択する可変長のプローブ選択アルゴリズムを用いることによる、ハイスループット変異マッピングとゲノム再配列決定の効果と精度を向上させる新規な方法を提供する。また、オリグヌクレオチドアレイ等の設計に用いる可変長のプローブ選択アルゴリズムに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の可変長のオリゴヌクレオチドプローブを有する一連のフィーチャーを持つマイクロアレイを製造する方法であって、
複数の可変長のオリゴヌクレオチドアレイプローブを選択する工程、ここで前記可変長のプローブは、複数のオリゴヌクレオチドアレイプローブに対するターゲット融解温度、最小プローブ長さ、及び最大プローブ長さをプローブ選択アルゴリズムにインプットすることにより誘導され；前記アルゴリズムにより可変オリゴヌクレオチドプローブ長さを計算することができ、全ての前記プローブは下記性質を示す：（ｉ）同様の融解温度、及び（ｉｉ）各プローブの近似の熱力学中心に位置する各プローブ中のミスマッチ位置；及び
選択工程により幾つかのフィーチャー中のプローブ長さが他のフィーチャー中のプローブ長さとは異なるように選択することにより決定されるプローブ長さを有するオリゴヌクレオチドプローブのマイクロアレイを合成する工程、
を含む上記方法。
【請求項２】
ターゲット融解温度（Ｔｍ）が、プローブの平均Ｔｍに対して、低いＴｍを有するプローブ長さを伸ばし、かつ高いＴｍを有するプローブの長さを短くすることにより達成される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
複数のアレイプローブの各々のターゲットＴｍが半分に分割され、ミスマッチ位置の両側のプローブの各半分はそれぞれ独立に長さが異なり、最小及び最大プローブ長さパラメーター内にあり、ターゲットＴｍの半分を達成する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
プローブＴｍが次の式を用いて計算される：
Ｔｍ＝５＊（Ｇｎ＋Ｃｎ）＋１＊（Ａｎ＋Ｔｎ）  （式中、ｎは、プローブ上に存在する特定の各塩基の数である。）、請求項１記載の方法。
【請求項５】
複数の可変長のオリゴヌクレオチドアレイプローブを、アレイ−ベースのゲノム再配列決定に用いる、請求項１記載の方法。
【請求項６】
マイクロアレイの合成を、マスクなしアレイ合成手段上で行う、請求項１記載の方法。
【請求項７】
支持体；
前記支持体上の複数の一本鎖ヌクレオチドプローブであって、所定の場所で合成され、一端が前記支持体に連結されているプローブ；及び
マイクロアレイ中のフィーチャー中にグループ分けされたプローブであって、一つのフィーチャー中のプローブ長さが、前記マイクロアレイ中の他のフィーチャー中のプローブ長さと異なる長さである、プローブ；
を含むマイクロアレイ。
【請求項８】
マイクロアレイ中のフィーチャーの長さが、プローブとプローブに結合される核酸間で形成された複合体の、設計された融解温度を達成するように変更された、請求項７記載のマイクロアレイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願のクロスレファレンス
本件出願は、米国仮出願番号第６０／５８１，１２１（２００４年６月１８日）を優先権主張している。
【背景技術】
【０００２】
ＤＮＡマイクロアレイ技術の出現により、顕微鏡スライドの大きさのような、非常に小さな面積で非常に多数のアレイを作成することが可能となった。たとえば米国特許第６，３７５，９０３及び米国特許第５，１４３，８５４を参照されたい（本明細書にこれらの内容を全て組み入れるものとする）。米国特許第６，３７５，９０３（本明細書にこの内容を全て組み入れるものとする）は、いわゆるマスクなしアレイ合成（ＭＡＳ）機器の構築を可能とした。この機器では、光を用いてＤＮＡ配列の合成を指示し、デジタルマイクロミラー装置（ＤＭＤ）を用いて光による指示を行う。ＭＡＳ機器を用いて、マイクロアレイ中で構築されるＤＮＡ配列の選択を、ソフトウェア制御の下で行い、それぞれカスタマイズされたアレイを製造することができる。一般に、ＭＡＳベースのＤＮＡマイクロアレイ合成技術により、標準顕微鏡スライド上の非常に小さな面積内で、８００，０００を超える独自のオリグヌクレオチドを平行合成を行うことができる。一般に、マイクロアレイは、アレイ上の特定の位置（これらの位置をフィーチャーと呼ぶ）で合成されるように光により指示されて、合成される。ＭＡＳマイクロアレイ合成機器の他の利点は、プローブの指定がコンピューターソフトウェアの制御下で行われることである。各アレイについて異なるプローブを作成することができるので、同じ遺伝子要素をアッセイすることを目的とする異なるアレイであっても、このことにより、カスタム設計マイクロアレイを設計することができ、アレイプローブの設計に関して最大の柔軟性をもって実行することが可能となる。
【０００３】
公共のデータベースに参照配列が一般に寄託されているため、多数の微生物の全体のゲノムを入手することが可能であることから、マイクロアレイはそのような微生物から単離されたＤＮＡの配列分析を行うために使用されている。遺伝子変異体を同定するために使用することができる一つの技術は、個体のゲノムＤＮＡの配列決定を行い、その配列と、その微生物の参照配列とを比較する方法である。ＤＮＡ配列における多くの差異が、ＤＮＡ配列における単一変異として示され、しばしば単一ヌクレオチドポリモルフィズムまたはＳＮＰと呼ばれる。一つの種の試験ゲノムと参照ゲノム間の配列比較は、特定の個体に対するＳＮＰを同定するための、毛管配列決定の総当り手法と言われてきた。
【０００４】
病気に伴う遺伝子的な変異を同定するための重要なステップと最近のアプローチは、候補遺伝子または患者における目的の他のゲノム領域の再配列決定であり、特定の表現型を伴うそれらのＳＮＰを同定するために制御することである。（Ｓａｋａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）ＰＮＡＳ  ８６：６２３０−６２３４参照）。重要な結果を示してきた再配列決定アプローチは、オリゴヌクレオチドマイクロアレイ技術を使用するものである（Ｈａｃｉａ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，２１（１  Ｓｕｐｐｌ）：４２−７．）。
【０００５】
特に、この型のアレイ−ベースの再配列決定（ＡＢＲ）アプローチは、ゲノムフラグメントの完全マッチ（ＰＭ）及びミスマッチ（ＭＭ）の短いオリゴヌクレオチドに対する示差ハイブリダイゼーションに依存する。検索される各ヌクレオチドが、オリゴヌクレオチドの中心位置に配置される。各ＰＭオリゴヌクレオチドに対し、３つの可能なミスマッチヌクレオチドを表すプローブ、同じ中心位置でそれぞれ可能なＳＮＰを表すプローブがアレイ上で合成される。ＰＭオリゴヌクレオチドに強力に結合する配列と、相当するＭＭオリゴヌクレオチドに弱く結合する配列間の、ハイブリダイゼーションシグナル強度の差異により、所定の配列位置における正しい塩基を識別することができる。このように、理論的には、ＳＮＰが存在するときはいつも、このＳＮＰを表すミスマッチプローブは、参照配列にマッチする相当するプローブよりも高い強度のシグナルを有するであろう。
【０００６】
しかし、シグナル強度における非予測性、ハイブリダイゼーション有効性の変動、及び様々な他の雑音源のため、この方法は、典型的には、多数の塩基位置の同定の予測が不正確となる結果をもたらす。例えば、全てのアレイプローブは、同じ温度及び同じハイブリダイゼーションストリンジェンシー条件でハイブリダイズしなければならないため、アレイがハイブリダイズする温度から大きく異なる融解温度（Ｔｍ）を有するプローブには問題がある。低いＴｍを有するプローブについては、ハイブリダイズしたターゲットを、アレイ表面から有効に洗い落として、ほとんどまたは全くシグナルを示さないようにしてもよい。高いＴｍを有するプローブについては、一塩基ミスマッチは著しく不安定にはならず、適切な識別を与えて、強固な（ロバスト）塩基コールを行う。
【０００７】
一塩基識別に伴う他の問題は、ミスマッチの位置がプローブの能力を著しく変えることができ、有効な識別を与えて、強固な塩基コールを行うことである。例えば、もしミスマッチの両側のプローブの部分のＴｍが非常に高い場合には、そのプローブの部分は、ミスマッチに依存しない強固なハイブリダイゼーションを示しうる。そして、塩基コールに対して十分なミスマッチ識別を提供しない。その場合、微生物のゲノム中の変異を同定するＤＮＡ再配列決定のような、アレイ−ベースのアッセイの有効性及び正確さを向上させるための他のアプローチは、当業技術分野に対して望ましい寄与を与える。
【発明の開示】
【０００８】
発明の簡単な要約
本発明は、要約すると、可変長プローブ選択アルゴリズムを用いて、オリゴヌクレオチドアレイの設計に用いるプローブを理論的に選択することにより、ハイスループット変異マッピングとゲノム再配列決定の有効性と精度を向上させる新規な方法に関する。本発明は従って、大スケールの再配列決定プロジェクトにおける正確な一塩基ミスマッチ識別を可能にする、オリゴヌクレオチドプローブ長さを合理的に変化させるための方法とアルゴリズムを提供する。
【０００９】
一つの実施態様において、本発明は複数の可変長のオリゴヌクレオチドプローブを含む一連のフィーチャーを持つマイクロアレイを製造する方法を提供する。前記方法は、複数の可変長のオリゴヌクレオチドアレイプローブを選択する工程：前記可変長のプローブは、複数のオリゴヌクレオチドアレイプローブに対するターゲット融解温度、最小プローブ長さ、及び最大プローブ長さを、プローブ選択アルゴリズムにインプットすることにより誘導される（ここでアルゴリズムは様々なオリゴヌクレオチドプローブ長さを計算することができ、全てのプローブは下記特徴を示す；（ｉ）同様の融解温度及び（ｉｉ）各プローブにおけるミスマッチ位置（各プローブ合成の近似の熱力学中心に位置する））；マスクなしアレイ合成（ＭＡＳ）を用いて、マイクロアレイのフィーチャー上に変動した長さを有するオリゴヌクレオチドプローブのアレイを合成する工程；及び複数の可変長のオリゴヌクレオチドプローブを持つ一連のフィーチャーを有するマイクロアレイを製造する工程；を含む。
本方法の一態様は、上記特徴を有さないプローブと比較して、塩基コールに対する向上したミスマッチ識別を提供する。
【００１０】
他の態様において、本発明は、低いＴｍを有するプローブの長さを長くし、かつ高いＴｍを有するプローブの長さを短くすることにより、ターゲットＴｍを得ることを提供する。
他の態様として、本発明は、同様の融解温度および各オリゴヌクレオチドの近似の熱力学中心において保持される各プローブのミスマッチ位置を有する可変長のオリゴヌクレオチドアレイプローブを提供する。
本発明のこの態様において、低いＴｍを有するオリゴヌクレオチドプローブはより長く、また高いＴｍを有するプローブはより短く作成される。
本発明の他の態様において、アレイ上の全てのプローブに対するターゲットＴｍと共に最小及び最大プローブ長さデータを許容することができる、プローブ選択アルゴリズムを提供する。
【００１１】
本発明の態様において、ターゲットＴｍの目的のプローブを半分にわけ、ミスマッチの両側のプローブの各部分の長さを、特定の長さパラメーター内に入るようにし、特定のターゲットＴｍの半分に達成するように、変動させることができる。
本発明のこの態様において、プローブＴｍを下記式を用いて計算する。
Ｔｍ＝５＊（Ｇｎ＋Ｃｎ）＋１＊（Ａｎ＋Ｔｎ）  （式中、ｎは、プローブ中に存在する特定の塩基の数である）。
本発明の他の目的、利点及び特徴は、下記明細書から明らかになるであろう。
【００１２】
発明の詳細な説明
本発明は、可変長のプローブ選択アルゴリズムを用いて、オリゴヌクレオチドアレイの設計に用いるプローブを理論的に選択することにより、ハイスループット変異マッピングとゲノム再配列決定の有効性と精度を向上させる新規な方法を広く提供する。特に、本発明は、オリゴヌクレオチドプローブの長さを理論的に変化させることにより、大スケールアレイ−ベースの再配列決定における塩基コールに対する不十分なミスマッチ識別という課題を解決する。これを行うために、発明者らは、低いＴｍを有するプローブをより長くすることができ、かつ高いＴｍを有するプローブをより短くすることができて、更に同時にオリゴヌクレオチドの熱力学中心における各プローブのミスマッチ位置を維持する機能を有する可変長のプローブ選択アルゴリズムを開発した。このアプローチは、全て同じ長さのプローブを用いて、典型的にはプローブの配列をさせる従来のアプローチとは異なるものである。
【００１３】
本発明によれば、一つの実施態様は、複数の可変長のオリゴヌクレオチドプローブを含む一連のフィーチャーを有するマイクロアレイを製造する方法を提供し、前記方法は、複数の可変長のオリゴヌクレオチドアレイプローブを選択する（ここで可変長のプローブは、複数のオリゴヌクレオチドアレイプローブに対するターゲット融解温度、最小プローブ長さ及び最大プローブ長さを、プローブ選択アルゴリズムにインプットすることにより誘導される）ことを含む。前記アルゴリズムは、可変のオリゴヌクレオチドプローブ長さを計算することができ（全てのプローブは下記の特徴を有する：（ｉ）同様の融解温度、及び（ｉｉ）近似の熱力学中心に位置する各プローブのミスマッチ位置）、異なる長さを有するオリゴヌクレオチドプローブアレイを合成することができる。そのようなアレイは、可変長のオリゴヌクレオチドプローブを持つ一連のフィーチャーを有するマイクロアレイを製造することができるマスクなしアレイ合成（ＭＡＳ）機器を用いて、最適に作成できる。
【００１４】
通常の用語を使用するために、本明細書では、“プローブ”を、マイクロアレイの一部として合成された通常の一本鎖核酸分子であり、典型的には支持体に連結されたものを意味するものとして用いる。プローブは、定義された配列であり、定義された領域の全てのプローブは共通の配列を有し、同じ共通配列のプローブの領域を、マイクロアレイのフィーチャーと呼ぶ。本発明に従えば、プローブは異なる長さを有するが、通常全ての１つのフィーチャー中のプローブは同じ長さであることが明らかである。ＭＡＳ機器を用いて、使用可能な品質の７５〜１００ヌクレオチドの長さのプローブを有するマイクロアレイを構築するのが実用的である。
【００１５】
他の実施態様では、本発明は、塩基コールに対する不十分なミスマッチ識別を解決する方法を提供する。前記方法は、同様のＴｍを有し、同時にオリゴヌクレオチドの熱力学中心にあるプローブミスマッチ位置を有するプローブを選択する、可変長のプローブ選択アルゴリズムを使用して、オリゴヌクレオチドプローブの長さを合理的に変化させることにより行う。これらの二つの機能を同時に行うために、本発明の方法は、使用者からの入力データを受け入れて、アレイ上の全てのプローブに対するターゲットＴｍ、及び最小及び最大プローブ長さを特定することができるアルゴリズムを使用する。プローブのターゲットＴｍを次に半分に分け、ミスマッチの両側のプローブの各部分の長さを変化させて、両方が特定の長さパラメータ内に入るようにし、特定のターゲットＴｍの半分に到達するようにする。
【００１６】
下記の式を用いて、プローブＴｍを計算した。
プローブ  Ｔｍ＝５＊（Ｇn＋Ｃn）＋１＊（Ａn＋Ｔn），
式中、ｎは、プローブ中に存在する各特定のオリゴヌクレオチド塩基（Ｇ，Ｃ，ＡまたはＴ）の数である。しかし、プローブ温度を決定するためのいずれかの式も、プローブ長さを変化させるための新規なストラテジーと共に用いて、塩基コールに対するミスマッチ識別を改良することができる。
【００１７】
従って、本発明の他の実施態様は、ゲノム再配列決定プロジェクトのためのオリゴヌクレオチドアレイの設計に用いる可変長のプローブ選択アルゴリズムである。可変長のプローブ選択アルゴリズムの使用により、理論的には最も不安定な場所である各オリゴヌクレオチドの近似の熱力学中心において保持されるミスマッチ位置と、同様のＴｍとを有するアレイプローブを製造する。
下記実施例は、本発明の特定の実施態様を非制限的に示すために提供されている。
【実施例】
【００１８】
ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの１００００塩基の配列決定（シークエンシング）及び再配列決定（リシークエンシング）
ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの〜１００００塩基を再配列決定するために、下記に述べるようにＳＡＲＳ由来のゲノムＤＮＡを増幅し、消化し、ラベル化した。例えば、１μｇのＳ  ＳＡＲＳを多重化ＰＣＲを用いていくつかの反応で増幅し、１μｇの増幅したＤＮＡを得た。各アレイハイブリダイゼーションのために、１００ｎｇの増幅したゲノムＤＮＡを、全２０μＬ容量中の、０．１Ｕ  ＤＮａｓｅ  Ｉ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）と１倍濃度のワン−ホル−オール（１ｘＯｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ）バッファー（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて消化した。ＤＮａｓｅ  Ｉを９７℃で１５分間インキュベートすることにより不活化した。試料を１μＬビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）−Ｎ６  ｄｄＡＴＰ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ，ＭＡ）及び２５Ｕ末端デオキシヌクオチジルトランスフェラーゼ（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  Ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて、３７°Ｃで９０分間処理して、末端ラベル化し、末端トランスフェラーゼを９７℃で１５分間インキュベートすることにより不活化した。
【００１９】
ラベル化した試料をアレイに適用する前に、再配列決定アレイを１倍濃度のニンブルゲン（１×ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ）再配列決定バッファー（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）と前ハイブリダイズした。試料を９５℃に５分間加熱し、４５℃に加熱し、５分間＞１２０００ｇで遠心した。次に各ラベル化ＤＮＡ試料をアレイに適用した。アレイは、カスタム化ハイブリダイゼーションチャンバー内に置かれて、４５℃で１４〜１６時間、ロティセリーオーブン中でインキュベートされた。アレイを次に非ストリンジェント洗浄バッファー（６ＸＳＳＰＥ，０．０１％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ−２０）で洗浄し、次にストリンジェント洗浄バッファー（１００ｍＭ  ＭＥＳ，０．１Ｍ  ＮａＣｌ，０．０１％［ｖ／ｖ］Ｔｗｅｅｎ−２０）で４７°Ｃで洗浄した。アレイをＣｙ３−ストレプトアビジンコンジュゲート（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む溶液で１０分間染色し、非ストリンジェント洗浄バッファーで再度洗浄した。Ｃｙ３シグナルを、ビオチニル化ヤギ抗ストレプトアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）により二次的にラベル化したＤＮＡにより増幅した。二次抗体を、非ストリンジェント洗浄バッファーで洗い流し、アレイを、Ｃｙ３−ストレプトアビジン溶液で再染色した。最後に、染色液を除去し、アレイを非ストリンジェント洗浄バッファー中で洗浄し、続いて０．５ＸＳＳＣで３０秒間、７０％エタノール中で１５秒間洗浄した。アレイを一般的な遠心機で脱水し、スキャンするまえに保存した。
【００２０】
マイクロアレイを次に、Ｇｅｎｅｐｉｘ（登録商標）４０００ｂスキャナー（Ａｘｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｕｎｉｏｎ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、５μｍ分解能でスキャンした。ＮＩＨイメージソフト（ｈｔｔｐ：／／ｒｓｂ．ｉｎｆｏ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｎｉｈ−ｉｍａｇｅ／）を用いて、画像を補間し、２．５倍のサイズに拡大した。ピクセル強度をＮｉｍｂｌｅＳｃａｎTMＳｏｆｔｗａｒｅ（ＮｉｍｂｌｅＧｅｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いて抽出した。
Ｋ−最近傍と呼ばれる分類技術を用いる、好ましい新規な機械学習アルゴリズムを用いて、両ストランドからのデータを組み合わせて、ハイブリダイゼーション強度の静的分析に基づいて配列コールを行った。アレイを次にスキャンし、画像を上述したように抽出した。
【００２１】
単一対可変プローブ長さの比較
ＳＡＲＳコロナウイルスゲノムの〜１００００塩基を再配列決定するためのプローブを設計して、変動したターゲットプローブＴｍにおける可変長のプローブ選択アルゴリズムと単一プローブ長さとを比較することにより、可変長のプローブ選択アルゴリズムを試験した。
ＳＡＲＳ由来のゲノムＤＮＡを増幅し、消化し、ラベル化し、かつ上述したように再配列決定した。試料を次にアレイにハイブリダイズさせた。各実験におけるアレイセットの数は、分析されるゲノムのサイズに依存して変化させることができる。
【００２２】
最も良好なプローブ選択技術を決定するために、非適合塩基の数を、各プローブ選択基準に対して計算した。本明細書では、“適合塩基”は、参照ウイルス配列中の塩基と同じであるとアレイによりコールされあるいは帰属された塩基である。また、本明細書において、“非適合塩基”は、参照配列中の相当する塩基とは異なるとコールされあるいは帰属された塩基である。従って、もしシステムが完全に機能するとすれば、全ての塩基は参照と一致するであろう。最も少ない数の非適合塩基を与えるプローブ選択アルゴリズムは、最も良好な実験結果を出す。
下記表は、いくつかのプローブ選択基準を用いた、実際の再配列決定結果を挙げたものである。
【００２３】
表１
2008503222.tif 000002
【００２４】
表１は、可変長のプローブ選択アルゴリズムが、均一長プローブより優れていることを明らかに示している。更に、ターゲットＴｍを７２℃にセットすることにより、非適合塩基コールの最も少ない数が観察され、試験した基準の塩基コールに対して、最も良好でかつ最も正確なミスマッチ識別が得られた。
更に、出願人は、オリゴヌクレオチドアレイを設計するための可変長のプローブ選択アルゴリズムを、いずれの再配列決定プロジェクトにおいても用いることができることを想定している。そのようなプロジェクトは、例えば、二倍体ゲノムの半数体（ハプロイド）種あるいはハプロイド体における変異を同定するために使用される比較ゲノム再配列決定である。本発明はまた、ＢＡＣ（バクテリア人工染色体、平均サイズ１００ｋｂ）、プラスミド、ホスミド、ＹＡＣ（酵母人工染色体）または他のゲノムのハプロイド部分を単離させるライブラリーまたは調製物を用いる、再配列決定の大プロジェクトに有用であってもよい。
本明細書に記載された発明の特定の適用は、当業者によるルーチン的な最適化であり、本発明の観点及び精神から離れることなく、提供できることが理解されえるであろう。
【国際調査報告】
2008503222.tif 000003
2008503222.tif 000004
2008503222.tif 000005