(57)【要約】  第一級アリルアミンを含む酸性溶液が適当な中性ｐＨで亜硝酸を含む試料溶液と直接混合され、該試料溶液中にジアゾ化合物をｉｎ  ｓｉｔｕ形成させる、全ビリルビンジアゾアッセイが開示される。前記ジアゾ化合物は前記試料溶液中のビリルビンと反応して、測定可能な着色反応産物を形成する。
2008501121.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の被検体を検出するために用いるジアゾ試薬を生成する方法であって、
（ａ）該試料と亜硝酸イオンとを含み、約５を超えるｐＨを有する試料溶液を得るステップと、
（ｂ）該試料溶液を、第一級アリルアミンを含む酸性溶液と混合して、ジアゾ試薬を形成するステップとを含む、ジアゾ試薬を生成する方法。
【請求項２】
前記ステップ（ａ）は、前記試料を前記亜硝酸イオンを含む溶液と混合することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
分析装置が自動的に前記試料を前記亜硝酸イオンを含む溶液と混合する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ステップ（ｂ）は分析装置によって自動的に実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記亜硝酸イオンを含む溶液は前記分析装置の第１コンパートメントに存在する、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
前記亜硝酸イオンを含む溶液を前記分析装置の第１コンパートメントに添加してから少なくとも４日後に、該亜硝酸イオンを含む溶液を用いて前記分析装置がステップ（ａ）を実行する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記亜硝酸イオンを含む溶液を前記分析装置の第１コンパートメントに添加してから少なくとも２週間後に、該亜硝酸イオンを含む溶液を用いて前記分析装置がステップ（ａ）を実行する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記酸性溶液は前記分析装置の第２コンパートメントに存在する、請求項３ないし７のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記酸性溶液を前記分析装置の第２コンパートメントに添加してから少なくとも４日後に、該酸性溶液を用いて前記分析装置がステップ（ｂ）を実行する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記酸性溶液を前記分析装置の第２コンパートメントに添加してから少なくとも２週間後に、該酸性溶液を用いて前記分析装置がステップ（ｂ）を実行する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記酸性溶液は約４未満のｐＨを有する、請求項１ないし１０のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項１２】
前記酸性溶液は約１ないし約２のｐＨを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ステップ（ｂ）の後に、前記試料溶液中のアゾビリルビンの存在についてテストするステップを含む、請求項１ないし１２のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項１４】
アゾビリルビンの存在についてテストするステップは前記試料溶液の分光学的測定値を得ることを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記分光学的測定値は分析装置によって自動的に得られる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ステップ（ｂ）は前記試料溶液を該試料溶液の体積の約１０％以下の体積の前記酸性溶液と混合することを含む、請求項１ないし１５のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項１７】
前記酸性溶液は強酸を含む、請求項１ないし１６のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項１８】
前記強酸は、リン酸、硝酸、硫酸及び塩酸からなるグループから選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記強酸は０．０１Ｍないし０．６０Ｍの濃度で前記酸性溶液中に存在する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記第一級アリルアミンは、スルファニル酸とアントラニル酸とからなるグループから選択される、請求項１ないし１９のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項２１】
前記亜硝酸イオンを含む溶液は、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸リチウム、亜硝酸カルシウム及び亜硝酸マグネシウムからなるグループから選択される亜硝酸化合物を含む、請求項２ないし２０のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項２２】
前記亜硝酸イオンを含む溶液は、促進剤を含む、請求項２ないし２１のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項２３】
前記促進剤は、ジィフィリン、カフェイン、酢酸、安息香酸、ＤＭＳＯ、ＴＭＳ、メタノール及びアラビアゴムからなるグループから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記試料は、血液、血漿、血清及び尿からなるグループから選択される、請求項１ないし２３のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項２５】
試料中のビリルビンを検出するためのキットであって、
（ａ）約５を超えるｐＨを有する亜硝酸イオンを含む溶液と、
（ｂ）第一級アリルアミンを含む酸性溶液と、
（ｃ）前記（ａ）及び（ｂ）に記載の試薬を使用するための指示書とを含み、
該指示書は、前記亜硝酸を含む溶液をテストされる試料と混合した後、該亜硝酸を含む溶液及び試料の混合液に前記酸性溶液を添加することを指示する、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アッセイ用ジアゾ試薬の形成方法に関する。ジアゾ試薬はヘモグロビンの分解産物であるビリルビンを検出する臨床用途で頻繁に利用される。血清ビリルビンレベルの上昇が、溶血性疾患、胆管閉塞、胆汁鬱滞、肝炎及び肝硬変を含む、さまざまな疾患病状で観察される。患者の試料中のビリルビン量の定量化は、これらの病状の診断と、その治療の監視を行ううえで有用である。
【背景技術】
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は２００４年６月１日付けで出願された「ジアゾ試薬のｉｎ  ｓｉｔｕ形成を用いるアッセイシステム」という名称の米国特許出願第１０／８５８，６７３号に基づく優先権を主張する。したがって当該出願の開示内容の全体はあらゆる目的のために本明細書に取り込まれる。
【０００３】
（血清又は血漿のような）試料中のビリルビンを検出するためには、該試料がジアゾニウム塩を含む試薬組成物と接触される場合がある。前記ジアゾニウム塩は、ビリルビンと反応して、分光学的に検出可能なアゾビリルビン断片を形成する。前記アゾビリルビンは、ビリルビン自体の吸光係数より大きな吸光係数を有するので、検出可能である。
【０００４】
多くのジアゾニウム塩がビリルビンを測定するためのジアゾ法用に示唆されてきた。例えば、ある種の２，４−及び２，５−フェニルジアゾニウム塩及びジアゾ化スルファニルアミドは血清及び尿中のビリルビンの検出に用いられてきた。しかし、これらのジアゾニウム塩の一部は、乾燥すると、爆発を伴う不安定性がある、すなわち、衝撃誘発性の分解を起こす。したがって、ビリルビンアッセイの実施に関してかかる化合物を取り扱うことは危険であり、これらの化合物は臨床用途には商業的に使用されない。
【０００５】
ジアゾニウム塩化合物を直接使用することは不都合であるため、ビリルビン検出用のジアゾニウム（あるいは、たんに「ジアゾ」）試薬は前駆体試薬を混合することによって検出アッセイに使用する直前に調製されるのが一般的である。しかし、一般的にかかるジアゾ試薬は不安定で、数日以内に使用しなければならず、その後は廃棄しなければならない。短時間経過後はジアゾ試薬が濃い黄色になり、このジアゾ試薬の崩壊（ｄｅｃａｙ）はビリルビンアッセイの精度に影響を与える場合がある。場合によっては、ジアゾ試薬はたった８時間だけ安定なことがあり、より長い貯蔵寿命を有する溶液でさえ数日後には濃い黄色の発色を示す。
【０００６】
さまざまな溶液がビリルビンのジアゾアッセイを改良するために提案されてきた。例えばＳｈｅｒｍａｎに付与された特許文献１は、ジアゾアッセイ前駆体である、乾燥粉末形状の亜硝酸ナトリウムおよびスルファニル酸ナトリウムを混合してタブレットにする。該タブレットは使用直前にジアゾ試薬を形成するために溶液中に溶解される。
【特許文献１】米国特許第２，７３７，５０１号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
Ｍｅｉａｔｔｉｎｉに付与された特許文献２には異なるアプローチが説明され、試料はまず酸と混合され、その後、ジアゾ試薬を形成するために亜硝酸溶液が酸性になった試料溶液に添加される。試料溶液は緩衝液によってｐＨ３．１−３．６に調節される。しかし、アゾビリルビンは低いｐＨでは安定ではなく、前記試料溶液中のタンパク質はかかる低いｐＨでは沈殿する場合がある。
【特許文献２】米国特許第５，１８３，７６２号明細書
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、試料中の被検体を検出するために使用するジアゾ試薬の改良された作成方法を提供する。本方法では、例えば、亜硝酸イオンを含む溶液を前記試料に添加することによって、亜硝酸イオンを含み、約５より高いｐＨの試料溶液がまず得られる。つぎに、この試料溶液は第一級アリルアミンを含む賛成溶液と混合されて、前記試料溶液中でのジアゾ試薬形成につながる。前記酸性溶液は約３．５未満のｐＨを有することが好ましく、好ましい実施態様は約１ないし約２のｐＨを有する。前記酸性溶液の液体体積は前記試料溶液の体積の約１０％以下であることが好ましい。前記試料溶液中にジアゾ試薬が形成した後で、前記試料溶液の分光学的測定値を得る場合がある。
【０００９】
別の局面では本発明は、試料中のビリルビンを検出する方法を提供する。この方法は、試料溶液を調製するために約５を超えるｐＨを有する亜硝酸含有溶液と前記試料と混合することを含む。その後、第一級アリルアミンを含む酸性溶液が前記試料溶液に添加されて、該試料溶液中にジアゾ試薬を形成させ、その後該試料溶液中のアゾビリルビンの存在がテストされる場合がある。前記酸性溶液は約３．５未満のｐＨを有することが好ましく、約１ないし約２のｐＨを有することがより好ましい。前記試料中のアゾビリルビンの存在をテストするステップは、前記試料溶液の分光学的測定値を得ることを含む場合がある。
【００１０】
さらに別の局面では、本発明は、試料中のビリルビンを検出するためのキットを含む。かかるキットは、約５を超えるｐＨを有する亜硝酸含有溶液と、第一級アリルアミンを含む酸性溶液と、前記亜硝酸含有溶液と前記試料とを混合し、その後、この混合液に前記酸性溶液を添加することを指示する指示書（ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｓ）とを含む。前記酸性溶液は、リン酸、硝酸、硫酸又は塩酸のような強酸を含むことが好ましく、該強酸は前記酸性溶液中に０．０１Ｍないし０．６０Ｍの濃度で存在する場合がある。前記酸性溶液も約３．５未満のｐＨを有することが好ましく、約１ないし約２のｐＨを有することがより好ましい。前記酸性溶液の第一級アリルアミンは、スルファニル酸、アントラニル酸その他の第一級アリルアミンの場合がある。例えば、前記亜硝酸含有溶液中の亜硝酸化合物は、亜硝酸ナトリウム、亜硝酸カリウム、亜硝酸リチウム、亜硝酸カルシウム又は亜硝酸マグネシウムの場合がある。前記亜硝酸含有溶液は、ジィフィリン、カフェイン、酢酸、安息香酸、ＤＭＳＯ、ＴＭＳ、メタノール又はアラビアゴムのような促進剤（ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）をさらに含むことが好ましい。前記キットに含まれる前記指示書は、例えば自動分析装置を使用して、前記キットに提供される試薬で血液、血漿、血清又は尿をテストすることを指示することが好ましい。
【００１１】
本発明のさらなる局面は、自動分析装置を用いて試料中のビリルビンを検出する方法である。この方法では、前記亜硝酸試薬は前記自動分析装置のキュベットに自動的に送達され、その後、前記試料が自動的に亜硝酸を含有する前記キュベットに添加されて、試料溶液を形成する。それから、前記装置は第一級アリルアミンを含まれる酸性試薬を前記試料溶液に自動的に添加して、該試料溶液中にジアゾ試薬を形成させる。つぎに、好ましい実施態様では前記試料溶液の分光学的測定値が得られるが、自動的に得られることが好ましい。本発明は、このアッセイを実施する自動装置が、試薬が安定であるために、追加の亜硝酸試薬又は酸性試薬を受け入れることなく２週間以上の期間運転することを可能にする。
【００１２】
本明細書の開示内容で特定される全ての寸法は例示を目的とするものであって、限定することを意図するものではない。さらに、添付する図面に示される比例関係は必ずしも一定の縮尺に従うものではない。本明細書の開示内容を参照する当業者に理解されるとおり、本明細書に開示される装置又は装置の部分のいずれかの実寸はその意図された用途によって決定されるであろう。
【００１３】
発明の説明
本発明は、亜硝酸イオンを含む試料溶液を酸性第一級アリルアミン試薬と混合して、該試料溶液中にジアゾ試薬をｉｎ  ｓｉｔｕで形成させることによって、ジアゾ試薬を形成する従来技術の方法の欠点を克服する。このようなやり方で製造されるジアゾ試薬は、形成されて数分以内に前記試料中に存在するいずれかのビリルビンと接触して、ジアゾ試薬の貯蔵寿命の短さに関する問題を取り除く。前記試料溶液は本発明の間実質的に非酸性ｐＨに維持されるので、望ましくないタンパク質の沈殿を回避する。発明者は、本発明にしたがって実行されたビリルビンアッセイの直線性、精度（ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）及び的確性（ａｃｃｕｒａｃｙ）が良好で、動力学的応答（ｋｉｎｅｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）が速いことを示す。
【００１４】
本明細書で用いられるところの用語「ジアゾ試薬」とは、第一級アリルアミンと亜硝酸化合物との反応から形成される芳香族ジアゾニウム塩を意味する。用語「亜硝酸化合物」とは（亜硝酸の塩又はエステルのような）−ＮＯ２基を含む化合物をいい、「亜硝酸イオン」とはＮＯ２−をいう。「亜硝酸含有溶液」とは亜硝酸イオンを含む水溶液をいう。「亜硝酸試薬」とはジアゾ試薬を生成するための亜硝酸含有溶液をいう。「試料溶液」とは亜硝酸含有溶液と混合された試料をいう。
【００１５】
本明細書で用いられるところの用語「第一級アリルアミン」とは、アミノ基（アンモニアの誘導体）を含む化合物であって、該アミノ基のうちの１個の水素原子だけが１個または２個以上のベンゼン環を含む芳香族化合物によって置換された、アミノ基を含む化合物をいう。前記第一級アリルアミンはジアゾ化合物を形成するために亜硝酸と反応できなければならない。用語「酸性第一級アリルアミン試薬」は、約５以下のｐＨで第一級アリルアミンを含むジアゾ試薬を生成するための試薬をいうものとして用いられる。
【００１６】
本明細書で用いられるところの用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）と、「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」及び「ｃｏｎｐｒｉｓｅｓ」のような該用語の変形は、他の添加物、構成要素、整数又はステップを排除することを意図するものではない。
【００１７】
本発明は亜硝酸試薬と酸性第一級アリルアミン試薬という２種類だけの試薬を使用することを伴うことが好ましい。前記亜硝酸試薬は溶液中に亜硝酸イオンを含む。亜硝酸イオンは一般的には化学式Ｙ（ＮＯ２）ｍを有する化合物の誘導体であるが、該化学式において、Ｙは、ナトリウム（Ｎａ＋）、カリウム（Ｋ＋）、リチウム（Ｌｉ＋）、カルシウム（Ｃａ＋＋）又はマグネシウム（Ｍｇ＋＋）のようなアルカリ土類又はアルカリ金属であることが好ましく、ｍはＹの原子価の絶対値である。好ましくは、亜硝酸イオンは約７ｍＭないし７５ｍＭの濃度で水溶液中に存在する。より高濃度の使用も可能で、ジアゾ試薬の形成に不利な影響を与えないであろう。好ましい亜硝酸化合物は亜硝酸ナトリウム（ＮａＮＯ２）で、約０．０５−０．５％ｗ／ｖ亜硝酸ナトリウムの濃度で存在する場合がある。
【００１８】
亜硝酸試薬は約５を超えるｐＨを有し、約６を超えるｐＨを有することが好ましく、約７ないし約８のｐＨを有することがより好ましい。本発明にしたがうジアゾ試薬の形成は前記亜硝酸試薬及び／又は試料溶液が８を超えるｐＨを有するときに起こるが、ｐＨがより高い溶液の使用は好ましくない。ジアゾ試薬の形成は、前記酸性第一級アリルアミン試薬が添加されるとき、前記亜硝酸試薬及び／又は試料溶液内の局所的で、及び／又は一過性の、より酸性の環境で起こると信じられているため、より高いｐＨでの亜硝酸試薬及び／又は試料溶液の使用は、例えば前記亜硝酸試薬及び／又は試料溶液が約７ないし８のｐＨを有するときと比べて、より多くの体積の酸性試薬か、より低いｐＨの酸性試薬かが必要とされるであろう。
【００１９】
緩衝液が、所望のｐＨを確立及び／又は維持するために、前記亜硝酸試薬に含まれる場合がある。例えば、約５ないし１００ｇ／Ｌの濃度を有する酢酸ナトリウムが用いられる場合がある。より高濃度はジアゾ試薬を形成させる反応に悪影響を与えることはないが、約５０ｇ／Ｌの酢酸ナトリウムを含むことが好ましい。酢酸ナトリウムが用いられるとき、酢酸ナトリウムは、前記亜硝酸試薬を緩衝し、ジアゾ試薬のビリルビンとの反応を以下に説明するとおり促進するという２重の役割を果たす。リン酸緩衝液のような他の緩衝液も適当なｐＨを確立するのに十分な濃度で使用される場合がある。亜硝酸試薬に使用される緩衝剤化合物は試料溶液を緩衝する役割も果たす。
【００２０】
酸性試薬
酸性第一級アリルアミン試薬は、２，４−ジクロロアニリン、ｐ−アミノベンゼンスルホン酸、アントラニル酸、ｐ−クロロアニリン、２−メトキシ−５−ニトロアニリン及びｐ−トルイジンのような第一級アリルアミンを何個含んでもよい。アントラニル酸及びｐ−アミノベンゼンスルホン酸（スルファニル酸ともいう）のようなアミノベンゼン誘導体が好ましく、スルファニル酸が特に好ましい。
【００２１】
第一級アリルアミンは、試料溶液中に存在すると予想されるビリルビンを実質的に完全にアゾビリルビンに変換させるのに適切であるように十分な量の酸性試薬から形成されるジアゾ試薬が該酸性試薬中に含まれる。したがって、特に血漿、血清又は血液が関与するアッセイでは、前記酸性第一級アリルアミン試薬は約５ないし５０ｍＭの濃度の第一級アリルアミンを有することが推奨される。好ましいシステムでは、酸性第一級アリルアミン試薬は２５ないし３０ｍＭ、あるいは、約０．５％（ｗ／ｖ）のスルファニル酸を含む。
【００２２】
酸性第一級アリルアミン試薬は、約４未満のｐＨに保たれることが好ましく、約３．５未満に保たれることがより好ましく、約１ないし２のｐＨに保たれることがさらにより好ましい。酸性第一級アリルアミン試薬の低いｐＨでの使用は、より小さな体積の酸性第一級アリルアミン試薬をジアゾ試薬を形成させるために用いることを可能にする。したがって強酸、すなわち、塩酸のように水に完全に溶解するか、あるいは、実質的に完全に溶解する酸は、所望のｐＨを提供するために酸性第一級アリルアミン試薬に含まれることが好ましい。前記酸性第一級アリルアミン試薬に用いるのに適当な酸は、リン酸、硝酸、硫酸及び塩酸を含むが、他の酸も可能である。好ましい酸は塩酸で、約０．０１から０．６０Ｍまで（あるいはより高濃度）の濃度で使用できるが、約０．１Ｍが好ましい。
【００２３】
反応促進剤
亜硝酸試薬及び／又は酸性第一級アリルアミン試薬は、「ジアゾビリルビン・プロモーター」、「促進試薬（ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）」又は単に「促進剤（ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ）」として知られる成分を含むことが好ましい。かかる促進剤なしではジアゾ試薬とビリルビンとの間の反応、ひいては、検出可能な着色化合物の生成はより遅くなる。本発明で有用な促進剤は、ジィフィリン、カフェイン、酢酸（例えば、酢酸ナトリウム）、安息香酸（例えば、安息香酸ナトリウム）及びアラビアゴムを含む。これらの化合物の塩、エステルその他の誘導体も使用可能である。かかる化合物は当業者に知られた濃度で使用される。かかる促進剤は酸性試薬よりもむしろ亜硝酸試薬に存在するのが一般的である。
【００２４】
Ｗａｌｔｅｒｓ及びＧｅｒａｒｄｅによるＭｉｃｒｏｃｈｅｍ．Ｊ．、１５：２３１（１９７０）に開示されるとおり、低いｐＨでは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）も促進剤として使用可能である。しかし、ＤＭＳＯは少し粘稠であるため、自動化システムでの使用に容易に適合可能でないかもしれない。メタノールも使用可能だが、テストされる試料が血漿又は血清を含むときには血清タンパク質の沈殿を起こす場合があるため、あまりよくない。さらに、テトラメチレンスルホン（ＴＭＳ）も促進剤として使用可能で、メタノールが共存するときには全ビリルビンアッセイにおける血清タンパク質の沈殿を防止する場合がある。
【００２５】
複数の促進剤が本発明の試薬中で一緒に使用される場合がある。例えば、Ｊｅｎｄｒａｓｓｉｋ及びＧｒｏｆによってＢｉｏｃｈｅｍ．Ｚ．、２９７：８１（１９３８）で提唱されたタイプの促進剤のコレクションであって、０．３９Ｍ安息香酸ナトリウム、０．１９Ｍカフェイン及び０．６９Ｍ酢酸ナトリウムを含む場合がある。
【００２６】
その他の試薬
塩化ナトリウムのような塩も亜硝酸試薬及び／又は酸性第一級アリルアミン試薬に含まれる場合がある。塩が１Ｍないし飽和濃度の濃度で存在するとき、塩はジアゾ試薬を安定化するのを助けるが、最適濃度は約２Ｍである。しかし、本発明のジアゾ試薬はアッセイされる試料を含む溶液中で生成するため、本発明のたいていの実施態様ではジアゾ試薬を安定化する手段を提供することは重要ではない。
【００２７】
その他の成分も本発明に用いる試薬に含まれる場合がある。ＥＤＴＡのような保存剤や当業者に知られた他の保存剤も、例えば亜硝酸試薬中で使用される場合がある。
【００２８】
安定であるためには、亜硝酸試薬及び酸性第一級アリルアミン試薬は、１５−３０°Ｃ（すなわち室温）で２年間保存した後で全ビリルビンアッセイを行うために使用するとき、十分な量のジアゾ試薬を生成できなければならない。オン・インストルメント状態（ｏｎ−ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、すなわち、分析装置に付属するチャンバー又は容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）内に搭載された状態）で保存された試薬は、２ないし４０°Ｃの温度に曝されるのが典型的で、商業的に使用中の装置内に約２ヶ月間放置されることがよくある。オン・インストルメント状態での試薬の安定性は商業的に重要であるので、安定な試薬は４０°Ｃ以下で約２ヶ月間保存されるときに安定性を保持するものでなければならない。試薬は、該試薬の蒸発又は汚染の可能性を最小限にするために、２ヶ月より長い期間オン・インストルメント状態の後では使用されないのが一般的である。
【００２９】
本発明にしたがって試料中のビリルビンの存在を検出するために、まず分注量の亜硝酸試薬が試料溶液を形成するために生物学的試料と混合される。前記亜硝酸試薬は、手作業、例えばピペッターを用いて、容器又は反応容器（ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｖｅｓｓｅｌ）に添加されるか、あるいは、分析装置によって自動的に注入又は添加されるかした後、試料が添加される場合がある。代替的には、試料が亜硝酸試薬に添加される場合がある。前記試料溶液は約５を超えるｐＨでなければならない。亜硝酸試薬の添加前に試料のｐＨがこれより低い場合には、亜硝酸試薬は試料溶液のｐＨを上げるために十分な量の緩衝用化合物を含むべきである。
【００３０】
例えば試料は、ビリルビンを含む可能性が疑われる、いずれかの材料を含む場合がある。試料は、血液、血漿、血清又は尿を含むことが最も多い。試料は、（凍結乾燥された試料のように）乾燥状態の場合があり、その場合には、亜硝酸試薬に可溶化又は懸濁されるか、それとも、該亜硝酸試薬と混合される前に別の水溶液に可溶化又は懸濁されるべきである。
【００３１】
いったん試料溶液が形成されると、酸性第一級アリルアミン試薬がジアゾ反応混合液を形成するためにこの溶液に添加される。この反応混合液中の第一級アリルアミンは亜硝酸イオンと反応してジアゾ試薬を形成する。試料中の全ての可能なビリルビンを検出するために、存在する（か、あるいは、存在することが疑われる）ビリルビンの量と比較してモル過剰のジアゾ試薬が生成されるべきである。ジアゾ試薬を形成するためには１モルの第一級アリルアミンが１モルの亜硝酸イオンと反応するので、試料中の予想される量のビリルビンと反応するのに十分なジアゾ試薬を生成するために十分なモル量の各化学種がなければならない。臨床的な用途で遭遇するビリルビン濃度の範囲をカバーするためには、少なくとも０．５ｍＭのジアゾ試薬を生成することが好ましい。第一級アリルアミン又は亜硝酸イオンのいずれかのモル過剰が可能である。１つの実施態様では、酸性試薬は、試料溶液中に存在する約２モルの亜硝酸イオンに対して１モルの第一級アリルアミンを含む。
【００３２】
ジアゾを形成する反応は、臨床分析を行う通常の動作温度、一般的には２ないし４０°Ｃで起こることが好ましい。酸性第一級アリルアミン試薬を試料溶液に最初に添加すると、このジアゾ反応混合液のｐＨは局所的に（すなわち、前記試料溶液のポケット状の部域（ｐｏｃｋｅｔｓ）で）、及び/又は、一過性でジアゾ試薬が形成されることを可能にするのに十分低いｐＨになると信じられる。しかし、前記ジアゾ試薬の形成後は、ジアゾ含有試料溶液は約５より高いが一般的にはｐＨ６より低いｐＨになる。
【００３３】
ジアゾ化合物が形成されたほぼ直後に、前記ジアゾ試薬は前記試料溶液中に存在するいずれかのビリルビンと反応し、試料中の全てのビリルビンの完全な反応が５分間未満で起こるのが一般的である。前記反応によって生成したアゾビリルビン溶液の最終的な色は、特に直射日光を避ける場合には、室温で少なくとも１時間安定である。
【００３４】
その後、ジアゾ化試料溶液は分光光度計を使ってアゾビリルビンの存在についてテストされる。試料溶液中のアゾビリルビンを測定するために５２０ｎｍ付近の波長の光を使うことが好ましく、他の波長を使うよりも高いアッセイ感度が得られるのが一般的であるが、（６００ｎｍのような）他の波長も使うことができる。前記試料が少なくとも１つの透明な壁又は表面を含む容器に既に収容されていない場合には、アゾビリルビンの分光学的検出を容易にするために、かかる容器に移されるべきである。ジアゾ化ビリルビンの分光学的分析を実行するために装置は、ＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＣＸ及びＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＬＸ臨床分析器（４３００  Ｎ．Ｈａｒｂｏｒ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ  ９２８３４のベックマン・コールター社、製）を含むが、他の分光光度計又は分光光度計を含む装置を使用することができる。分光光度計によって測定された吸光度は既知の方法によってビリルビン濃度の情報に変換される。
【００３５】
分光光度計の測定値は、被検体が試料中に低濃度で存在するときには、ときどきあまり正確ではないことが知られている。そこで、既に溶液中にある試料に添加される亜硝酸試薬及び酸性第一級アリルアミン試薬の体積は、該溶液を有意に希釈してビリルビン濃度を分光光度計の測定器があまり正確でないレベルまで低下しないように、最小限に止められることが好ましい。１つの実施態様では、試料溶液中に添加される酸性第一級アリルアミン試薬の体積は、該試料溶液の液体の体積の約１０％以下で、５％以下がより好ましい。例えば、分析装置内の２００μＬの試料溶液に約１０μＬの酸性第一級アリルアミン試薬が添加できることが好ましい。
【００３６】
分析装置の使用
本アッセイは、従来のアッセイと比較してより少ないユーザ入力で自動分析装置を用いて実行できる点で有利である。用語「自動」及び「自動的に」は本明細書では、人間のオペレータによるよりもむしろ装置によって直接実行される動作を指すものとして用いられるが、オペレータは通常少なくとも前記装置への指示を提供し、あるいは、前記装置がアッセイを実行することと関連するかかる自動的な動作を実行する引き金となる（前記装置に試料を戴置することのような）動作を実行する。特に好ましい実施態様では、ジアゾ試薬の形成が自動化されるだけでなく、試料の分光学的分析も自動化される。例えば、前記装置のオペレータからのさらなる入力又は注意を要することなく、試料と、亜硝酸試薬と、酸性第一級アリルアミン試薬とが、全て臨床分析器のキュベット内で混合されて、分光学的分析に供される場合がある。
【００３７】
本発明は、必要な試薬が少なくとも２ヶ月のオン・インストルメント状態での貯蔵寿命を持つことができるので、臨床分析器を使ってビリルビンの測定の実行を容易にする。例えば、以下の実施例１に説明される試薬はオン・インストルメント状態で２ヶ月を超える期間、そして、（密封容器に入れて室温の）保管状態で（ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｈｅｌｆ）２年を超える期間安定である。
【００３８】
本発明にしたがって自動装置を用いてアッセイを実行するために、亜硝酸試薬及び酸性第一級アリルアミン試薬は試薬カートリッジの２つのコンパートメントに配置され、その後該カートリッジが前記装置に搭載される場合がある。アッセイされる試料は前記装置内のカップ又は容器内に搭載されるが、該試料はラック上に配置される場合がある。その後、前記分析器からのプローブが自動的に前記亜硝酸試薬及び試料を得て測定キュベットに送達し、その後、適当な量の酸性第一級アリルアミン試薬も自動的に添加される。その後、ジアゾ化された試料を保持する前記キュベットが自動的に分光光学的な分析に供されることが好ましい。このシステムを用いると、（自動的な分光測定を含むか含まないかに関わらず）上述のアッセイのステップは、これらの試薬が安定であるために、前記亜硝酸試薬又は酸性第一級アリルアミン試薬を廃棄又は交換する必要なく、典型的なジアゾ試薬の１ないし３日の寿命よりも長い期間のどの時点でも実行することができる。したがってかかるアッセイは、前記装置に新たな試薬を添加することなく、アッセイ試薬をどのくらい速く使い切るかだけに依存して、４日間、１週間、２週間、さらに２ヶ月間までの期間中実行することができる。
【００３９】
多数の商業的に入手可能な臨床分析器が本アッセイを実行するために使用できる。例えば、ベックマン・コールター社によって製造されるＳＹＢＣＨＲＯＮ  ＣＸ及びＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＬＸ臨床分析器は、試料と、亜硝酸試薬と、本方法に使用される酸性試薬とを混合し、分光学的分析を実行するように設定することができる。
【００４０】
キット
亜硝酸試薬及び/又は酸性第一級アリルアミン試薬は、試料中のビリルビンの存在を決定するために使用するキットとして販売される場合がある。かかるキットは、上記の亜硝酸試薬及び酸性第一級アリルアミン試薬を含み、これらの試薬を使うための指示書も含むことが好ましい。前記指示書は、例えばピペッター又は自動分析装置を用いて、前記亜硝酸試薬をテストされるべき試料と混合し、その後、前記酸性試薬を前記試料溶液に添加することを指示する。その後、かかる指示書は、分光光度計がジアゾ化された前記試料を測定し、アッセイを実行する人間か、自動分析装置かのいずれかによって吸光度データが記録されるように指示することが好ましい。
【００４１】
臨床分析器のような自動分析装置で使用するためのキットでは、指示書は、本発明にしたがうアッセイを実行するために、
（１）（血液、血漿、血清及び／又は尿のような）試料を前記自動装置とともに使用するように適合された容器か、前記装置のコンパートメントかに配置するステップと、
（２）前記容器又は前記装置のコンパートメント内で、順次、前記亜硝酸試薬を前記試料と混合し、その後、前記酸性第一級アリルアミン試薬と混合することを前記装置に指示するように前記装置を作動させるステップと、
（３）前記亜硝酸試薬及び酸性第一級アリルアミン試薬を添加した後で前記試料溶液の分光学的測定を実行することを前記装置に指示するように前記装置を作動させるステップとを指示することが好ましい。
【００４２】
試薬は、前記自動装置とともに使用されるように適合されるステップ（１）に記載の試料を含む容器又はコンパートメントに直接添加される場合があるが、代替的には、プローブが、所定量の試料を得て、ジアゾ試薬が形成されることになる前記装置の別の容器又はコンパートメントに該試料を分配する場合がある。ステップ（２）及び（３）も、（押しボタンその他の機構のような）単一の指示を通じて実行され、（キットの指示書に実行することが指示される）場合がある。任意的には、装置が、試料を含む容器を受け取るか、試料を該装置のチャンバー内に添加すると自動的にステップ（２）及び（３）を実行するように設定される場合があるが、その場合には、キットの指示書はそのように指示する。上述のステップの後、前記キットの指示書は、（自動的にか、あるいは、装置のオペレータによって手作業かで）分光光度計で吸光度データを得ること、該吸光度データをビリルビン濃度データに変換すること、及び、試料のビリルビン濃度を記録することを指示することが好ましい。
【実施例１】
【００４３】
試薬
以下の表１−１及び表１−２は、それぞれ本発明の亜硝酸試薬及び酸性第一級アリルアミン試薬を開示する。
【００４４】
【表１−１】
2008501121.tif 000003
【００４５】
【表１−２】
2008501121.tif 000004
【実施例２】
【００４６】
試薬の安定性
実施例１に説明された試薬溶液が７日間２つの異なる温度で保存され、その後、試料の全ビリルビン吸光度についてテストされた。前記試薬溶液の一方は対照として２−８°Ｃで保存されたが、他方は４５°Ｃで保存された。４５°Ｃ、１週間後の安定性についてのデータは、２−８°Ｃ、２年間の安定性を予測する。
【００４７】
以下の表２に示すとおり、４５°Ｃで保存された試薬溶液は、２−８°Ｃで保存された対照の試薬とほとんど同じ吸光度の測定値が得られ、これらの試薬が安定であることを示す。示された測定値は、ベックマン・コールター社製のＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＬＸ臨床化学システムで得られた吸光度データである。
【００４８】
【表２】
2008501121.tif 000005
（１ｍＡ＝１吸光度単位の１０００分の１）
【実施例３】
【００４９】
動力学的応答
本発明の全ビリルビンアッセイの動力学的応答は図１に示される。患者由来の試料１０μＬが、ＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＬＸ臨床化学システム内のキュベット中で表１に示された亜硝酸試薬２００μＬと混合された。その後表１に示された酸性試薬１０μＬが前記キュベットに注入された。前記装置は前記酸性試薬を注入してから７２秒後に５２０ｎｍでの分光光度計の読み取り値を得た。図１は、前記分光光度計による吸光度は酸性第一級アリルアミン試薬を注入してから約３０秒以内に定常状態に達する。
【実施例４】
【００５０】
アッセイの直線性
本ビリルビンアッセイの直線性、すなわち、異なる希釈度で決定されたビリルビン濃度が測定された吸光度に対してどのくらい直線性があるかは、実施例３に説明されたのと同じ実験条件下でテストされた。３０ｍｇ／ｄＬまでのビリルビン濃度がＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＬＸ臨床化学システムを使って測定され、結果が図２にプロットされた。図２に示す直線の等式（ｙ＝０．０２４７ｘ−０．０００１）はＲ２が０．９９９９であり、これは本方法が良好な直線性を有することを示す。この実験で測定された濃度範囲は臨床試料にみられる典型的な範囲である。
【実施例５】
【００５１】
アッセイ精度
分光光度計の測定精度（すなわち、測定値の変異係数％ＣＶがどのくらい大きいか）は、低い被検体濃度で最もばらつきが大きい。したがって、本発明の方法を使う装置の測定値における同時再現性（ｗｉｔｈｉｎ−ｒｕｎ  ｉｍｐｒｅｃｉｓｉｏｎ）を測定するために、比較的低濃度のビリルビンを有する試料の測定値が測定された。以下の表３に示される結果は、本方法を使うと再現性が良好であることを証明する。
【００５２】
【表３】
2008501121.tif 000006
ＳＤ＝標準偏差
【実施例６】
【００５３】
比較テスト
１セットのビリルビンを含む試料が、本方法と従来の分析方法との両方にしたがってテストされた。従来の方法では、（Ａ）生理的緩衝液、（Ｂ）（０．１Ｍ  ＨＣｌ、４．８１ｇ／Ｌ  スルファニル酸及び１０７．３１ｇ／Ｌ  塩化ナトリウムを含む）スルファニル酸を含む試薬及び（Ｃ）（７２．３５ｇ／Ｌ  亜硝酸ナトリウム及び０．８９６ｇ／Ｌ  ＥＤＴＡナトリウム塩を含む）亜硝酸イオンを含む試薬という、３種類の試薬が必要である。このジアゾ試薬は不安定であるので、ジアゾ試薬を分析装置に戴置する直前にジアゾ試薬を形成するために、試薬Ｂ及びＣ（１０．８ｍＬ  試薬Ｂ＋０．１ｍＬ  試薬Ｃ）が装置のオペレータによって混合される。その後ＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＬＸシステムによって、２５μＬの前記ジアゾ試薬（試薬Ｂ及びＣの混合物）が反応液を形成するために２５５μＬの生理学的緩衝液と混合され、反応キュベットに８μＬの試料が添加された。５２０ｎｍでの吸光度データは試料注入から１２８秒後に得られた。
【００５４】
その後、同じ試料が本方法にしたがってテストされた。この場合試料溶液を形成するために、ＳＹＮＣＨＲＯＮ  ＬＸシステムによって、１０μＬの各同一試料が実施例１の亜硝酸を含む溶液２００μＬに添加された。その後、１０μＬの実施例１の酸性試薬が反応キュベットに添加され、酸性試薬の注入から７２秒後に５２０ｎｍでの吸光度データが得られた。
【００５５】
両方の方法でアッセイされた試料についての吸光度データが記録され、対応するビリルビン濃度のデータが図３にプロットされた。図３に示される直線の等式（ｙ＝０．９５１５ｘ−０．２８５８）はＲ２が０．９９９４なので、直線性が良好であることを示す。傾き及び切片も、本方法と従来のビリルビン検出法との両方を使って得られた結果について良好な一致を示す。
【００５６】
本発明は一部の好ましい実施態様を参照してかなり詳細に説明されたが、他の実施態様も可能である。したがって、添付される特許請求の範囲は本明細書の開示内容に含まれる好ましい実施態様の記載に限定されるべきではない。本明細書に引用されたすべての文献は引用によりその全体が本明細書に取り込まれる。
【００５７】
本発明のこれら及びその他の特徴、局面及び利点は、本明細書の説明と、添付された特許請求の範囲及び図面とを参照してよりよく理解される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】本方法にしたがって実行された全ビリルビンアッセイの動力学的応答を示すグラフ。
【図２】本方法にしたがって実行された全ビリルビンアッセイにおける分析装置の測定値（ブランクで較正された吸光度）の直線性を示すグラフ。
【図３】従来の方法及び本方法を使って決定された複数の試料のビリルビン濃度（ｍｇ／ｄＬ）を比較するグラフ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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