(57)【要約】  ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログを用いたてんかん疾患の診断または治療のための組成物および方法が提供される。ＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログを用いたてんかん疾患の診断または治療のための組成物および方法が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞をＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、またはＥＦＨＣ１アナログと接触させるステップを含む、神経細胞の生長を阻害する方法。
【請求項２】
前記細胞を抗てんかん薬と接触させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗てんかん薬が、カルバマゼピン、エトスクシミド、ＣＢＺエポキシド、ラモトリジン、オクスカルバゼピン、バルプロ酸ナトリウム、アセタゾラミド、クロバザム、クロナゼパム、ガバペンチン、レベチラセタム、フェノバルビトン、フェニトイン、ピラセタム、プリミドン、チアガビン、トピラメート、ゾニサミド、またはビガバトリンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
以下のステップ：
（ａ）  患者に対してＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、またはＥＦＨＣ１アナログを投与するステップ；および
（ｂ）  該患者に対して抗てんかん薬を投与するステップ
を含む、患者におけるてんかん治療を強化する方法。
【請求項５】
前記抗てんかん薬が、カルバマゼピン、エトスクシミド、ＣＢＺエポキシド、ラモトリジン、オクスカルバゼピン、バルプロ酸ナトリウム、アセタゾラミド、クロバザム、クロナゼパム、ガバペンチン、レベチラセタム、フェノバルビトン、フェニトイン、ピラセタム、プリミドン、チアガビン、トピラメート、ゾニサミド、またはビガバトリンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、またはＥＦＨＣ１アナログが、Ｒ型電位依存性Ｃａ２＋チャネル（Ｃａｖ２．３）のアゴニストである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記てんかん治療が若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＣ）に対する治療である、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
以下のステップ：
（ａ）  ＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａを過剰発現するように操作された哺乳動物細胞または哺乳動物細胞培養物を用意するステップ；
（ｂ）  前記細胞を試験物質と接触させるステップ；および
（ｃ）  細胞の死滅に対する試験物質の効果についてアッセイするステップ
を含む、哺乳動物細胞の細胞死を促進する作用物質を特定する方法。
【請求項９】
前記細胞を抗てんかん薬と接触させるステップをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗てんかん薬がアポトーシスを促進するものである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗てんかん薬が、カルバマゼピン、エトスクシミド、ＣＢＺエポキシド、ラモトリジン、オクスカルバゼピン、バルプロ酸ナトリウム、アセタゾラミド、クロバザム、クロナゼパム、ガバペンチン、レベチラセタム、フェノバルビトン、フェニトイン、ピラセタム、プリミドン、チアガビン、トピラメート、ゾニサミド、またはビガバトリンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
細胞死に対する試験物質の効果を、アポトーシスの発生率を測定することによりアッセイする、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
細胞死に対する試験物質の効果を、ｐ５３の活性を測定することによりアッセイする、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞を、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａをコードする核酸構築物を用いてトランスフェクトする、請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞がｉｎ ｖｉｔｒｏにある、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞がｉｎ ｖｉｖｏにある、請求項８に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞がマウス体内にある、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
以下のステップ：
（ａ）  ＥＦＨＣ１ポリペプチドを化合物に接触させるステップ、ここで、該ＥＦＨＣ１ポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を含むものである；
（ｂ）  該化合物のＥＦＨＣ１ポリペプチドに対する機能的効果を測定し、それによりＥＦＨＣ１ポリペプチドの活性をモジュレートする化合物を特定するステップ
を含む、ＥＦＨＣ１ポリペプチドの活性をモジュレートする作用物質を特定する方法。
【請求項１９】
前記化合物がＥＦＨＣ１ポリペプチドの活性を増大させるものである、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが固相に連結している、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが固相に共有結合している、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが細胞内で発現されている、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが正常と比較して細胞内で増幅されている、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが配列番号４に示すアミノ酸配列を有する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
以下のステップ：
（ａ）  ＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａを過剰発現するように操作された哺乳動物細胞または哺乳動物細胞培養物を用意するステップ；
（ｂ）  前記細胞を試験物質およびアポトーシス薬と接触させるステップ；および
（ｃ）  アポトーシス薬の活性に対する該試験物質の効果についてアッセイするステップ
を含む、アポトーシス薬の活性をモジュレートする作用物質を特定する方法。
【請求項２６】
前記試験物質が前記アポトーシス薬の活性を強化するものである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記アポトーシス薬がアポトーシス経路を誘導する化学治療薬である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
以下のステップ：
（ａ）  治療が行われている哺乳動物由来の生物学的サンプルを用意するステップ；および
（ｂ）  てんかん治療が行われている患者由来の生物学的サンプル中の、配列番号４に対して少なくとも７０％のアミノ酸同一性を含むＥＦＨＣ１ポリペプチドもしくは配列番号３に対して少なくとも７０％のヌクレオチド同一性を含むＥＦＨＣ１ポリヌクレオチドのレベルを検出するか、またはＥＦＨＣ１ポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を検出するステップ、ここで、該生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１ポリペプチドもしくはＥＦＨＣ１ポリヌクレオチドのレベルまたは遺伝子コピー数の、該治療前かまたは該治療のより早い段階での該患者由来の生物学的サンプル中のレベルまたはコピー数と比較しての増大が、有効な治療を示すこと
を含む、てんかん治療の有効性をモニタリングする方法。
【請求項２９】
前記ＥＨＣ１ポリペプチドが配列番号４に示すアミノ酸配列を有するか、または前記ＥＨＣ１ポリヌクレオチドが配列番号３に示すヌクレオチド配列を有する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記てんかんが、若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＣ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記患者がヒトである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
以下のステップ：
（ａ）  哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；
（ｂ）  配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を含むＥＦＨＣ１ポリペプチドの発現を検出するステップ；および
（ｃ）  ＥＦＨＣ１ポリペプチドの発現と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップ
を含む、哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法。
【請求項３３】
ＥＦＨＣ１ポリペプチドの過少発現が前記被験体でのてんかんの存在と相関している、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
以下のステップ：
（ａ）  哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；
（ｂ）  配列番号３に示す核酸配列に対して少なくとも８５％の核酸配列同一性を含むＥＦＨＣ１ポリヌクレオチド配列のコピー数を検出するステップ；および
（ｃ）  ＥＦＨＣ１ポリヌクレオチド配列のコピー数と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップ
を含む、哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法。
【請求項３５】
ＥＦＨＣ１ポリヌクレオチド配列のコピー数の低下が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
以下のステップ：
（ａ）  哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；
（ｂ）  配列番号３に示す核酸配列に対して少なくとも８５％の核酸配列同一性を含むＥＦＨＣ１遺伝子中の突然変異を検出するステップ；および
（ｃ）  ＥＦＨＣ１遺伝子中の突然変異の有無と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップ
を含む、哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法。
【請求項３７】
ＥＦＨＣ１遺伝子中の突然変異の存在が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記突然変異が、ＥＦＨＣ１遺伝子中のミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を含むＥＦＨＣ１ポリペプチドをコードする、単離核酸。
【請求項４０】
配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＥＦＨＣ１ポリペプチドをコードする、請求項３９に記載の核酸。
【請求項４１】
配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む、請求項３９に記載の核酸。
【請求項４２】
請求項３９に記載の核酸を含んでなる発現ベクター。
【請求項４３】
請求項４２に記載の発現ベクターを含んでなる単離宿主細胞。
【請求項４４】
以下のステップ：
ａ）  ＥＦＨＣ１タンパク質の発現に適した条件下で請求項４３に記載の宿主細胞を培養するステップ；および
ｂ）  該宿主細胞培養物から該ポリペプチドを回収するステップ
を含む、ＥＦＨＣ１タンパク質を生成する方法。
【請求項４５】
前記宿主細胞が真核細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記宿主細胞が原核細胞である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を含む、単離ＥＦＨＣ１ポリペプチド。
【請求項４８】
配列番号４に示すアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して作製された抗体に特異的に結合する、請求項４７に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
請求項４７に記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項５１】
（ａ）  請求項５０に記載の１種以上の抗体；および
（ｂ）  レポーター基を含んでなる検出試薬
を含む診断キット。
【請求項５２】
前記抗体が固体支持体に固定化されている、請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
前記固体支持体がニトロセルロース、ラテックス、またはプラスチック材料を含む、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
前記検出試薬が、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンを含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５５】
前記レポーター基が、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵素、ビオチンおよび色素粒子からなる群より選択される、請求項５１に記載のキット。
【請求項５６】
ＥＨＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、１０〜４０ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドであって、ＥＨＣ１タンパク質が配列番号３に示すポリヌクレオチド配列または前記ポリヌクレオチドのいずれかの相補体によりコードされるアミノ酸配列を含むものである、上記オリゴヌクレオチド。
【請求項５７】
配列番号３に示す１０〜４０ヌクレオチドを含む、請求項５６に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５８】
（ａ）  請求項５６に記載のオリゴヌクレオチド；および
（ｂ）  ポリメラーゼ連鎖反応またはハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のための診断試薬
を含む診断キット。
【請求項５９】
以下のステップ：
（ａ）  治療が行われている哺乳動物患者由来の生物学的サンプルを用意するステップ；および
（ｂ）  てんかんの治療が行われている患者由来の生物学的サンプル中の、ＥＦＨＣ１ａポリペプチドもしくはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドのレベルを検出するか、またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を検出するステップ、ここで、前記生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１ａポリペプチドもしくはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドのレベルまたは遺伝子コピー数の、該治療前かまたは該治療のより早い段階での該患者由来の生物学的サンプル中のレベルまたはコピー数と比較しての増大が、有効な治療を示すこと
を含む、てんかん治療の有効性をモニタリングする方法。
【請求項６０】
前記てんかんが若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＣ）である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記患者がヒトである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
以下のステップ：
（ａ）  哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；
（ｂ）  ＥＦＨＣ１ａポリペプチドの発現を検出するステップ；および
（ｃ）  ＥＦＨＣ１ａポリペプチドの発現と該被験体におけるてんかんの有無との相関を調べるステップ
を含む、哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法。
【請求項６３】
ＥＦＨＣ１ａポリペプチドの過少発現が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
以下のステップ：
（ａ）  哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；
（ｂ）  ＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチド配列のコピー数を検出するステップ；および
（ｃ）  ＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチド配列のコピー数と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップ
を含む、哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法。
【請求項６５】
ＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチド配列のコピー数の低下が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
以下のステップ：
（ａ）  哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；
（ｂ）  ＥＦＨＣ１ａ遺伝子中の突然変異の有無を検出するステップ；および
（ｃ）  ＥＦＨＣ１ａ遺伝子中の突然変異の有無と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップ
を含む、哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法。
【請求項６７】
ＥＦＨＣ１ａ遺伝子中の突然変異の存在が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記突然変異が、ＥＦＨＣ１ａ遺伝子中のミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異である、請求項６６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は２００４年７月１６日提出の米国仮特許出願第６０／５８８，７６９号の利益を主張する。上記仮特許出願の全開示内容は参照により本明細書中に組み入れられる。
【０００２】
政府支援の表明
本研究はＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈの助成金１ＲＯ１−ＮＳ４２３７６−０１によって支援されたものである。政府は本発明に関する一定の権利を有することができる。
【０００３】
分野
本発明は、一般的には、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、またはＥＦＨＣ１アナログを用いたてんかん疾患の診断および治療のための組成物および方法に関する。本発明は、ＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、またはＥＦＨＣ１ａアナログを用いたてんかん疾患の診断および治療のための組成物および方法にさらに関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）は遺伝性大発作てんかん発作の原因になることが最も多い。ＪＭＥ領域は以前にマッピングされていて、最近では、染色体６ｐ１２−ｐ１１（ＥＪＭ１）に限定されている。Janz, J. Neurol., 176: 344-386, 1957; Delgado-Escueta, et al., Adv. Neurol., 79: 351-374, 1999; Liu, et al., Am. J. Hum. Genet., 57: 368-381, 1995; Liu, et al., Am. J. Med. Genet., 63: 438-446, 1996; , et al., Am. J. Med. Genet., 133: 268-274, 2002。
【０００５】
第６染色体の短腕上の２つの別個の遺伝子座、６ｐ２１．３および６ｐ１２−ｐ１１がＪＭＥ領域として提案されている。６ｐ２１．３−ＨＬＡ領域では、ＢＲＤ２中の２つのＳＮＰ変異体がＪＭＥと連鎖不平衡であったが、原因のコード突然変異は発見されなかった。対照的に、ベリーズ、ロス・アンジェルス、およびメキシコ出身のＪＭＥ家系は６ｐ１２−ｐ１１遺伝子座で有意に高いロッド値を示したが、６ｐ２１．３では除外される（exclusionary）ロッド値であった。最近、オランダのＪＭＥ家系について独立に行われた研究で６ｐ１２−ｐ１１がＪＭＥに関する感受性遺伝子座として確認された。Sander, et al., Neurology, 49: 842-847, 1997; Greenberg, et al., Am. J. Hum. Genet., 66: 508-516, 2000; Pal, et al., Am. J. Hum. Genet., 73: 261-270, 2003; Liu, et al., Am. J. Hum. Genet., 57: 368-381, 1995; Liu, et al., Am. J. Med. Genet., 63: 438-446, 1996; Bai, et al., Am. J. Med. Genet., 133: 268-274, 2002; Pinto, et al., Epilepsia, 45: 211-217, 2004。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
概要
本発明は、一般的には、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログ、またはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログを用いたてんかん疾患の診断および治療のための組成物および方法、または、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドもしくはポリペプチドの発現または活性を調節する組成物および方法に関する。本発明の利点は、染色体６ｐ１２−ｐ１１上のＥＪＭ１領域中の新規遺伝子ＥＦＨＣ１および染色体Ｘｐ１１．４上に位置するＥＦＨＣ１ａを含む組成物および方法の発見から得ることができるものである。ＥＦＨＣ１ａ遺伝子はミオクロニン（myoclonin）２をコードする。ＥＦＨＣ１遺伝子は、ＥＦハンドモチーフを有するタンパク質であるミオクロニン１をコードする。突然変異解析では、ＥＦＨＣ１において、３８２名の対照個体では出現しなかった、血縁関係のない若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）６家系のてんかんまたはＥＥＧ多棘波（polyspike wave）有病者と同時分離する５種のミスセンス突然変異が示された。マウス海馬の初代培養ニューロンでのＥＦＨＣ１過剰発現はアポトーシスを誘発し、それはＪＭＥ遺伝子座の突然変異によって顕著に低下した。マウス海馬の初代培養ニューロンにおけるアポトーシスは、Ｒ型電位依存性Ｃａ２＋チャネル（Ｃａｖ２．３）のアンタゴニストであるＳＮＸ−４８２によって特異的に抑制された。ＥＦＨＣ１およびＣａｖ２．３免疫反応物質（immunomaterial）はマウス脳においてオーバーラップし、ＥＦＨＣ１はＣａｖ２．３のＣ末端と免疫共沈降された。パッチクランプ解析では、ＥＦＨＣ１はＲ型カルシウム電流を明らかに増加させ、それはＪＭＥ変異によって逆転された。これらの知見は、ＥＦＨＣ１がＥＪＭ１遺伝子であることを強く裏付ける。
【０００７】
ＥＦＨＣ１／ミオクロニン１の突然変異は完全な疾患表現型を生じさせ得る。その突然変異はＪＭＥを有するスペイン系アメリカ先住民の２０パーセントにおいて認められる。ＥＦＨＣ１／ミオクロニン１の変異体はＪＭＥ患者の３８パーセントにおける感受性因子である。ミオクロニン１のホモログである、ＥＦＨＣ１ａ／ミオクロニン２は染色体Ｘｐ１１．４に位置し、突然変異および機能に関して分析中である。ＥＦＨＣ１／ミオクロニン１およびＥＦＨＣ１ａ／ミオクロニン２はＪＭＥの診断マーカーとして有用であり得る。６種以上、または８種以上の遺伝子が、てんかん、例えば、ベリース、ロス・アンジェルス、メキシコ、ブラジル、オランダ、および日本の家系において見出される若年性ミオクローヌスてんかんの発症に関連していることが予測される。ＪＭＥ家系のてんかんまたは多棘波有病者におけるＥＦＨＣ１突然変異の分離は、ＪＭＥ突然変異によるＥＦＨＣ１誘発型神経細胞死およびＥＦＨＣ１依存性のＲ型Ｃａ２＋電流の増加の逆転と併せて、ＥＦＨＣ１が染色体６ｐ１２上のＪＭＥ遺伝子であることを強く支持し、ＥＦＨＣ１ａが染色体Ｘｐ１１．４上のＪＭＥ遺伝子であることを支持する。特発性全般性てんかんの原因とされたほとんどの遺伝子はイオンチャネルをコードする。ＥＦハンドモチーフを含有し、Ｒ型ＶＤＣＣをモジュレートし、それと相互作用し、アポトーシス活性を示す非イオンチャネルタンパク質をコードする遺伝子の特定は、特発性てんかんの分子病理に対する新規アプローチを提供する。
【０００８】
本発明の一実施形態では、神経細胞の生長を阻害する方法は、該細胞を、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、またはＥＦＨＣ１アナログと接触させるステップを含む。別の実施形態では、前記方法は前記細胞を抗てんかん薬と接触させるステップを含む。別の実施形態では、前記抗てんかん薬には、カルバマゼピン、エトスクシミド、ＣＢＺエポキシド、ラモトリジン、オクスカルバゼピン、バルプロ酸ナトリウム、アセタゾラミド、クロバザム、クロナゼパム、ガバペンチン、レベチラセタム、フェノバルビトン、フェニトイン、ピラセタム、プリミドン、チアガビン、トピラメート、ゾニサミド、またはビガバトリンが含まれる。
【０００９】
本発明のさらに別の実施形態では、患者におけるてんかん治療を強化する方法であって、（ａ）患者に対してＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、またはＥＦＨＣ１アナログを投与するステップ；および（ｂ）該患者に対して抗てんかん薬を投与するステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、前記抗てんかん薬には、カルバマゼピン、エトスクシミド、ＣＢＺエポキシド、ラモトリジン、オクスカルバゼピン、バルプロ酸ナトリウム、アセタゾラミド、クロバザム、クロナゼパム、ガバペンチン、レベチラセタム、フェノバルビトン、フェニトイン、ピラセタム、プリミドン、チアガビン、トピラメート、ゾニサミド、またはビガバトリンが含まれる。別の実施形態では、前記ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、またはＥＦＨＣ１アナログは、Ｒ型電位依存性Ｃａ２＋チャネル（Ｃａｖ２．３）のアゴニストである。前記てんかん治療は、好ましくは、若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＣ）に対する治療である。
【００１０】
本発明にしたがって哺乳動物細胞の細胞死を促進する（作用）物質を特定する方法は、（ａ）ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを過剰発現するように操作された哺乳動物細胞を用意するステップ；（ｂ）前記細胞を試験物質と接触させるステップ；および（ｃ）細胞の死滅に対する試験物質の効果についてアッセイするステップを含む。前記方法は、好ましくは、前記細胞を抗てんかん薬と接触させるステップを含む。一実施形態では、前記抗てんかん薬はアポトーシスを促進する。別の実施形態では、前記抗てんかん薬には、カルバマゼピン、エトスクシミド、ＣＢＺエポキシド、ラモトリジン、オクスカルバゼピン、バルプロ酸ナトリウム、アセタゾラミド、クロバザム、クロナゼパム、ガバペンチン、レベチラセタム、フェノバルビトン、フェニトイン、ピラセタム、プリミドン、チアガビン、トピラメート、ゾニサミド、またはビガバトリンが含まれる。
【００１１】
一実施形態では、細胞死に対する試験物質の効果を、アポトーシスの発生率を測定することによりアッセイする。別の実施形態では、細胞死に対する試験物質の効果を、ｐ５３の活性を測定することによりアッセイする。好ましくは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａをコードする核酸構築物を用いて前記細胞をトランスフェクトする。前記細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏであってよく、げっ歯類動物、特にマウス体内にあってよい。
【００１２】
ＥＦＨＣ１ポリペプチドの活性をモジュレートする物質を特定する方法であって、（ａ）ＥＦＨＣ１ポリペプチドを化合物と接触させるステップ、ここで、該ＥＦＨＣ１ポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を含むものである；および（ｂ）ＥＦＨＣ１ポリペプチドに対する該化合物の機能的効果を測定するステップを含む方法を提供する。一実施形態では、前記化合物はＥＦＨＣ１ポリペプチドの活性を増大させる。別の実施形態では、前記ポリペプチドは固相に結合しているか、あるいはさらに、固相に共有結合していてよい。別の態様では、前記ポリペプチドを細胞内で発現させる。前記ポリペプチドを正常状態と比較して細胞内で増幅させることができる。別の実施形態では、前記ポリペプチドは配列番号４に示すアミノ酸配列を有する。
【００１３】
アポトーシス薬の活性をモジュレートする物質を特定する方法であって、（ａ）ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを過剰発現するように操作された哺乳動物細胞を用意するステップ；（ｂ）前記細胞を試験物質およびアポトーシス薬と接触させるステップ；および（ｃ）アポトーシス薬の活性に対する該試験物質の効果についてアッセイするステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、前記試験物質は前記アポトーシス薬の活性を強化する。別の実施形態では、前記アポトーシス薬は、アポトーシス経路を誘発する化学治療薬である。
【００１４】
てんかん治療の有効性をモニタリングする方法であって、（ａ）治療処置を受けている哺乳動物由来の生物学的サンプルを用意するステップ；および（ｂ）てんかんの治療を受けている患者由来の生物学的サンプル中の、配列番号４に対して少なくとも７０％のアミノ酸同一性を含むＥＦＨＣ１ポリペプチドまたは配列番号３に対して少なくとも７０％のヌクレオチド同一性を含むＥＦＨＣ１ポリヌクレオチドのレベルを検出するか、あるいはＥＦＨＣ１ポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を検出するステップを含み、ここで、該生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１ポリペプチドまたはＥＦＨＣ１ポリヌクレオチドのレベルまたは遺伝子コピー数が、該治療前または該治療のより早い段階での該患者由来の生物学的サンプル中のレベルまたはコピー数と比較して増大すれば、治療が有効であることが示される方法を提供する。一実施形態では、前記ＥＦＨＣ１ポリペプチドは配列番号４に示すアミノ酸配列を有するか、あるいは前記ＥＦＨＣ１ポリヌクレオチドは配列番号３に示すヌクレオチド配列を有する。一態様では、前記てんかんは若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＣ）である。別の態様では、前記患者はヒトである。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態では、哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法であって、（ａ）哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；（ｂ）配列番号４に示すアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を含むＥＦＨＣ１ポリペプチドの発現を検出するステップ；および（ｃ）ＥＦＨＣ１ポリペプチドの発現と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、ＥＦＨＣ１ポリペプチドの発現低下（過少発現）が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している。
【００１６】
本発明にしたがって哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法は、（ａ）哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；（ｂ）配列番号３に示す核酸配列に対して少なくとも８５％の核酸配列同一性を含むＥＦＨＣ１ポリヌクレオチド配列のコピー数を検出するステップ；および（ｃ）ＥＦＨＣ１ポリヌクレオチド配列のコピー数と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップを含む。別の実施形態では、ＥＦＨＣ１ポリヌクレオチド配列のコピー数の低下が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している。
【００１７】
哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法であって、（ａ）哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；（ｂ）配列番号３に示す核酸配列に対して少なくとも８５％の核酸配列同一性を含むＥＦＨＣ１遺伝子中の突然変異を検出するステップ；および（ｃ）ＥＦＨＣ１遺伝子中の突然変異の有無と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、ＥＦＨＣ１遺伝子中の突然変異の存在が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している。前記突然変異には、ＥＦＨＣ１遺伝子中のミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異が含まれ得る。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態では、単離核酸は、配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を含むＥＦＨＣ１ポリペプチドをコードする。別の態様では、前記核酸は、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＥＦＨＣ１ポリペプチドをコードする。別の態様では、前記核酸は、配列番号３に示すヌクレオチド配列を含む。別の実施形態では、発現ベクターは、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むＥＦＨＣ１ポリペプチドをコードする核酸を含む。単離宿主細胞は前記発現ベクターを含んでよい。
【００１９】
ＥＦＨＣ１タンパク質を生成する方法であって、ａ）前記ポリペプチドの発現に適した条件下で前記発現ベクターを含む単離宿主細胞を培養するステップ；およびｂ）前記宿主細胞培養物から前記ポリペプチドを回収するステップを含む方法を提供する。一態様では、前記宿主細胞は真核細胞である。前記宿主細胞は原核細胞であり得る。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態では、単離ＥＦＨＣ１ポリペプチドは、配列番号４に対して少なくとも９５％のアミノ酸同一性を含む。一態様では、前記ポリペプチドは配列番号４に示すアミノ酸配列を含む。別の態様では、前記ポリペプチドは、配列番号４に示すアミノ酸配列を含むポリペプチドに対して作製された抗体に特異的に結合する。別の態様では、抗体は前記ＥＦＨＣ１ポリペプチドに特異的に結合する。
【００２１】
本発明に基づく診断キットは、（ａ）前記ＥＦＨＣ１ポリペプチドに特異的に結合する１種以上の抗体；および（ｂ）レポーター基を含んでなる検出試薬を含む。一実施形態では、前記抗体は固体支持体に固定されている。前記固体支持体には、ニトロセルロース、ラテックスまたはプラスチック材料が含まれてよい。一態様では、前記検出試薬には、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡまたはレクチンが含まれる。別の態様では、前記レポーター基は、放射性同位体、蛍光基、発光基、酵素、ビオチンおよび色素粒子からなる群より選択される。
【００２２】
本発明のさらに別の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、ＥＦＨＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする、１０〜４０ヌクレオチドを含み、その場合、ＥＦＨＣ１タンパク質は配列番号３に示すポリヌクレオチド配列または前記ポリヌクレオチドのいずれかの相補体によりコードされるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、前記オリゴヌクレオチドは配列番号３に示す１０〜４０ヌクレオチドを含む。本発明に基づく診断キットは、（ａ）ＥＦＨＣ１タンパク質をコードするポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズする１０〜４０ヌクレオチドを含む前記オリゴヌクレオチド；および（ｂ）ポリメラーゼ連鎖反応またはハイブリダイゼーションアッセイにおける使用のための診断試薬を含む。
【００２３】
てんかん治療の有効性をモニタリングする方法であって、（ａ）治療処置を受けている哺乳動物由来の生物学的サンプルを用意するステップ；および（ｂ）てんかんの治療を受けている患者由来の生物学的サンプル中の、ＥＦＨＣ１ａポリペプチドまたはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドのレベルを検出するか、あるいはＥＦＨＣ１ａポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を検出するステップを含み、ここで、該生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１ａポリペプチドまたはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドのレベルまたは遺伝子コピー数が、該治療前または該治療のより早い段階での該患者由来の生物学的サンプル中のレベルまたはコピー数と比較して増大すれば、治療が有効であることが示される方法を提供する。前記てんかん治療は、好ましくは、若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＣ）に対する処置である。別の態様では、前記患者はヒトである。
【００２４】
本発明にしたがって哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法は、（ａ）哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；（ｂ）ＥＦＨＣ１ａポリペプチドの発現を検出するステップ；および（ｃ）ＥＦＨＣ１ａポリペプチドの発現と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップを含む。別の実施形態では、ＥＦＨＣ１ａポリペプチドの発現低下が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している。
【００２５】
哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法であって、（ａ）哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；（ｂ）ＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチド配列のコピー数を検出するステップ；および（ｃ）ＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチド配列のコピー数と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップを含む方法を提供する。別の実施形態では、ＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチド配列のコピー数の低下が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している。
【００２６】
本発明にしたがって哺乳動物被験体におけるてんかんを診断する方法は、（ａ）哺乳動物被験体由来の生物学的サンプルを用意するステップ；（ｂ）ＥＦＨＣ１ａ遺伝子中の突然変異の有無を検出するステップ；および（ｃ）ＥＦＨＣ１ａ遺伝子中の突然変異の有無と該被験体におけるてんかんの有無との相関関係を調べるステップを含む。一態様では、ＥＦＨＣ１ａ遺伝子中の突然変異の存在が前記被験体におけるてんかんの存在と相関している。前記突然変異には、ＥＦＨＣ１ａ遺伝子中のミスセンス突然変異またはナンセンス突然変異が含まれ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
詳細な説明
本発明は、ＥＦＨＣ１／ミオクロニン１またはＥＦＨＣ１ａ／ミオクロニン２のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを生成する方法を提供する。その配列を使用して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの活性に関連し、ならびに／あるいはそれをモジュレートする分子を特定するか、あるいはてんかんまたは、ＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａの増幅またはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａの活性もしくは発現に関連する他の疾患または症状を診断することができる。一態様では、本発明は、神経細胞、特に海馬細胞でＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子が突然変異し、ならびに／あるいは発現低下していることの知見に基づくものである。したがって、本方法を使用して、てんかん治療、例えば、若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）の治療の有効性をモニタリングし、例えば、神経細胞におけるＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの発現および／または活性を阻害することによって、てんかんを治療することができる。
【００２８】
また本発明は、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの核酸およびタンパク質のモジュレーター、例えばアクチベーター、インヒビター、刺激因子、エンハンサー、などに関してスクリーニングする方法を提供する。そのようなモジュレーターは、例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの転写、翻訳、ｍＲＮＡまたはタンパク質安定性をモジュレートすることによって；ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａと他の分子（例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ調節型遺伝子）との相互作用を変化させることによって；あるいはＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質活性に影響を及ぼすことによって、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性に影響し得る。一実施形態では、例えば、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を使用して、化合物をスクリーニングし、単離ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたはその断片に結合し、ならびに／あるいはその活性をモジュレートすることができる化合物を特定する。別の実施形態では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質を細胞で組換え発現させ、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ機能の任意の測定を使用してＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのモジュレーションをアッセイする。
【００２９】
多数の実施形態で、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏまたはｅｘ ｖｉｖｏで細胞に導入し、それにより細胞中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性をモジュレートする。例えば、全長ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを細胞集団に導入することができる。
【００３０】
特定の実施形態では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ、またはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａのサブフラグメントもしくはドメインに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体を患者に投与して、細胞中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの活性を阻害する。そのような実施形態は、例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性に関連する疾患または障害の治療において有用である。
【００３１】
また本発明は、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの核酸およびタンパク質発現を検出する方法を提供する。また、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドを使用して、ＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａ発現細胞の検出またはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａ活性の強化に有用なモノクローナルおよびポリクローナル抗体を作製することができる。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを発現する細胞は、ｍＲＮＡの逆転写および増幅、総ＲＮＡまたはポリＡ＋ＲＮＡの単離、ノーザンブロッティング、ドットブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、Ｓ１消化、ＤＮＡマイクロチップアレイのプローブ結合、ウエスタンブロット、などの技術を使用して特定することもできる。
【００３２】
また、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａに関するヌクレオチドおよびアミノ酸配列情報を使用して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質のモデルを構築する。その後、これらのモデルを使用して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質を活性化または阻害できる化合物を特定する。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの遺伝子またはタンパク質の活性をモジュレートするそのような化合物を使用して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子の生理学的役割を調査することができる。
【００３３】
また本発明は、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａと相互作用し、ならびに／あるいはそれらをモジュレートする化合物または他の分子を特定するためのアッセイ、好ましくはハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイを提供する。特定のアッセイでは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの特定のドメイン、例えば保存ドメインを使用する。
【００３４】
また本発明は、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性に関連する疾患または症状を治療する方法を提供する。例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ関連疾患を有する患者の細胞において、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの活性および／または発現を変化させることができる。特に、本発明はてんかんを治療する方法を提供する。
【００３５】
てんかんを治療するための本発明の方法は、典型的には、患者から採取された生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの存在を検出するステップを含む。特定の実施形態では、生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルを、てんかんを有しない患者から採取された対照サンプルと比較するか、あるいは、好ましくは、てんかんを有しない患者から採取されたサンプルに関して予測される値と比較する。対照サンプルは、てんかんを有すると疑われる同一患者の正常な組織から入手することもできる。
【００３６】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルの増大に基づく神経細胞の検出能は、任意の多数の適用に有用である。例えば、患者の細胞におけるＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルの増大を、単独で、あるいは他の診断方法と組み合わせて使用して、患者のてんかんを診断するか、あるいは患者が経時的にてんかんを発症する傾向を決定することができる。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの検出を使用して、てんかん治療の有効性をモニタリングすることもできる。例えば、抗てんかん治療後のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルを該治療前の患者におけるレベルと比較する。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが治療後に増大すれば、治療が有効であることが示される。
【００３７】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルの低下または診断上のそれらの存在を使用して、例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルの低下が抗てんかん治療の侵襲性と直接相関している場合、患者における抗てんかん治療の選択に影響をおよぼすこともできる。例えば、腫瘍細胞においてＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルが増大すれば、増殖を増加させる物質の使用がてんかんの治療に有効であろうことが示され得る。
【００３８】
さらに、神経細胞におけるてんかんの検出能を使用して、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで、患者の神経細胞の数または位置をモニタリングすることができ、例えば、経時的にてんかんの進行をモニタリングすることができる。さらに、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルまたは有無を特定の抗てんかん治療の有効性または観察される予後の転帰と統計学的に相関させることができ、それにより統計学ベースの予後に基づくデータベースの開発が可能になるか、あるいは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの特定のレベルまたは診断上のそれらの存在を考慮して、最も有効な治療の選択を行うことができる。
【００３９】
また本発明は、てんかんを治療する方法を提供する。特定の実施形態では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはポリペプチド活性のレベルが低下している細胞の増殖を阻害する。他の実施形態では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ発現は正常状態と比較して低下しないが、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性、例えば、細胞表面膜での機能を刺激して、神経細胞の生長または移動を妨げることができる。例えば、細胞を、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの転写または翻訳のアクチベーター、またはＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの活性のアクチベーターと接触させることによって、細胞生長および／または移動を低下させる。そのようなアクチベーターには、非限定的に、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性を刺激できる抗体、またはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａポリペプチドのアゴニスト、またはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａ活性の小分子アクチベーターが含まれる。
【００４０】
本方法を使用して、多数の種類のてんかん疾患のいずれか、例えば若年性ミオクローヌスてんかん（juvenile myoclonal epilepsy）（ＪＭＥ）を診断し、その予後を決定するか、あるいはそれを治療することができる。
【００４１】
本発明の方法は、例えば、霊長類、イヌ、ネコ、マウス、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ウサギ目などを含めた動物、ならびにヒトにおいて使用することができる。好ましい実施形態では、前記哺乳動物はヒトである。
【００４２】
また、本明細書中で開示される治療方法を実行するためのキットを提供する。
【００４３】
本明細書中で使用されるように、以下の用語は、特に指定しない限り、それらに認められる意味を有する。
【００４４】
「強化する」とは、有効もしくは活性すること、またはより有効もしくはより活性にすること；または薬物の活性を増大させ、相乗的に疾患の治療、例えばてんかん治療、または若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）治療を改善することを表す。
【００４５】
「患者」または「被験体」は交換可能に使用され、哺乳動物、例えばヒト患者および非ヒト霊長類、ならびに実験動物、例えばウサギ、ラット、およびマウス、および他の動物を表す。
【００４６】
「生物学的サンプル」とは、ＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａまたはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａタンパク質をコードする核酸を含有する生物学的組織、体液、または細胞のサンプルを表す。そのようなサンプルには、非限定的に、ヒトから単離された組織が含まれる。生物学的サンプルには、組織学的目的に供される組織切片、例えば凍結切片も含まれ得る。生物学的サンプルは、典型的に、真核の生物、好ましくは真核生物、例えば真菌、植物、昆虫、原生動物、鳥類、魚類、は虫類、および好ましくは哺乳動物、例えばラット、マウス、ウシ（cow）、イヌ、モルモット、またはウサギ、および最も好ましくは霊長類、例えばチンパンジーまたはヒトから入手される。
【００４７】
「治療」には、本発明の化合物または物質を投与して、疾患の症状、合併症、または生化学的徴候の発症を予防するか、あるいは遅延させ、症状を軽減するか、あるいは疾患、症状、または障害（例えば、てんかんまたは若年性ミオクローヌスてんかん）の追加の発生を抑止または阻害することが含まれる。治療は、疾患が明らかになった後の、予防的な（疾患の発症を予防するか、あるいは遅延させるか、あるいは臨床的またはその潜在性症状の出現を予防するための）または治療的な、症状の抑制または軽減であり得る。
【００４８】
「てんかん」とは、人をてんかん発作に感受性にする神経学的症状を特徴とする多数の疾患のいずれかを表す。てんかん発作は、脳における短時間の電気的障害によってもたらされる感覚、認識、または行動の変化である。てんかん発作は、瞬間的な感覚の崩壊から、短期間の意識消失または凝視（staring）小発作から、痙攣まで変動する。一部の人々は１種類のてんかん発作しか起こさない。他の人々は２種類以上を起こす。
【００４９】
「若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）」（Janz症候群、衝動小発作（impulsive petit mal）、青年期のミオクローヌスてんかんおよび痙攣てんかん（jerk epilepsy）とも称される）は、１９５６年にDr. Dieter Janzによって最初に報告された。この症候群の顕著な部分である突然の痙攣性（jerking）（ミオクロニー）てんかん発作を理由に、Dr. Dieter Janzはそれを衝動小発作と称した。この症候群は、特に覚醒時の、ミオクロニー発作（腕および脚の突然の痙攣）を特徴とする。若年性ミオクローヌスてんかんは一般に思春期に出現するが、その時期以前に存在することがあり、通常、それは進行しない；それは全般性強直間代性てんかん発作にも関連している。てんかん発作は、断眠；早朝の覚醒；アルコールおよび薬物使用；ストレス；強い感情、閃光刺激、および月経によって誘発されることがある。
【００５０】
「アポトーシス」および「プログラムされた細胞死（ＰＣＤ）」は同義の用語として使用され、制御された細胞の自己破壊を誘発する分子的および形態学的過程を説明する。アポトーシス細胞死は、種々の刺激、例えば細胞表面受容体の連結、飢餓、成長因子／生存因子欠乏、熱ショック、低酸素、ＤＮＡ損傷、ウイルス感染、および細胞傷害性／化学治療薬によって誘発され得る。アポトーシス過程は、胚形成、分化、増殖／恒常性（homoeostasis）、欠陥を有し、それゆえに有害な細胞の除去に関与し、ならびに特に免疫系の調節および機能に関与する。ゆえに、アポトーシスプログラムの機能障害または調節不全は、種々の病理学的症状、例えば免疫不全、自己免疫疾患、神経変性疾患、てんかんおよび癌に関係する。アポトーシス細胞は定型の形態学的変化：細胞萎縮によって認識することができる。細胞は萎縮し、変形を示し、隣接細胞への接触をゆるめる。そのクロマチンは凝縮し、最終的に細胞は断片化して、「アポトーシス小体」と称されるコンパクトな膜に囲まれた構造になる。それはサイトゾル、凝縮したクロマチン、および細胞小器官を含有する。アポトーシス小体はマクロファージによって飲み込まれ、ゆえに、炎症反応を引き起こすことなく、組織から除去される。これは壊死様式の細胞死と対照的である。壊死様式の細胞死の場合、細胞は大きな損傷を被り、その結果、膜完全性の喪失、細胞の膨潤および破裂が起こる。壊死時には、細胞内容物は無制御に細胞環境に放出され、その結果、対応する組織において周囲の細胞の損傷および強い炎症反応が生じる。例えば、Tomei L.D. and Cope F.O.（編）, 1991, APOPTOSIS: THE MOLECULAR BASIS OF CELL DEATH, Plainville, NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press; Isaacs J.T., 1993, Environ Health Perspect. 101(suppl 5):27-33を参照のこと；上記各文献は、すべての目的に関して、参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。種々のアポトーシスアッセイが当業者に周知である（例えば、ＤＮＡ断片化アッセイ、放射性増殖アッセイ（radioactive proliferation assays）、処置細胞に関するＤＮＡラダーアッセイ、４’−６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）染色細胞の蛍光顕微鏡観察アッセイ、など）。Kerr, et al., Br. J. Cancer, 26: 239-257, 1972。
【００５１】
「ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ」とは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの核酸およびポリペプチド多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、および種間ホモログであって、（１）例えば配列番号２に提供される、天然に存在するＥＦＨＣ１遺伝子の配列に対応する、好ましくは少なくとも約５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたる領域にわたって、約６０％を超えるアミノ酸配列同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、好ましくは８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれ以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有するもの；（２）天然に存在するＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子、および保存的に改変されたその変異体の配列に対応するアミノ酸配列を含む免疫原に対して生成された抗体、例えばポリクローナル抗体に結合するもの；（３）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、天然に存在するＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子および保存的に改変されたその変異体の配列に特異的にハイブリダイズするもの；（４）例えば配列番号１に提供される天然に存在するＥＦＨＣ１遺伝子の配列に対応する、好ましくは少なくとも約５０、１００、２００、５００、１０００、またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたる領域にわたって、約８０％を超えるヌクレオチド配列同一性、好ましくは約８５％または９０％、好ましくは約９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上を超えるヌクレオチド配列同一性を有する核酸配列を有するものを表す。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列は、典型的に、哺乳動物由来であり、その哺乳動物には、非限定的に、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、または任意の哺乳動物が含まれる。「ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチド」および「ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチド」はともに天然に存在するか、あるいは組換え型である。「ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質」または「ポリペプチド」は、天然に存在するアミノ酸または合成アミノ酸、例えば標識されているか、あるいは別の様式で修飾されたアミノ酸またはアミノ酸アナログを含むことができる。「ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質」は、典型的に、１種以上の特徴的なタンパク質モチーフを含有し、そのうちのいずれかを全長ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質中に通常存在する他のエレメントとは独立に使用することができ、ならびに、例えば１種以上の特徴的な活性または特性を有する。「ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質」は、任意の、天然に存在するか、あるいは合成の上記ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドを表し得る。ＬＯＣＵＳＩＤ７７６４としてＬＯＣＵＳＬＩＮＫ中にＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）においてリストされているヒトゲノム解析計画のドラフトの配列データによれば、天然に存在するヒトＥＦＨＣ１は染色体２０ｑ１３．２に位置する。ヒトゲノム解析計画のドラフト��配列データによれば、天然に存在するＥＦＨＣ１ａ遺伝子は染色体Ｘｐ１１．４に位置する。ＥＦＨＣ１遺伝子はポリペプチド、ミオクロニン１をコードする。ＥＦＨＣ１ａ遺伝子はポリペプチド、ミオクロニン２をコードする。
【００５２】
「全長」のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのタンパク質または核酸とは、１種以上の天然に存在する、野生型ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列中に通常含有されるすべてのエレメントを含有する、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列、またはその変異体を表す。
【００５３】
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを表す。特に限定されない限り、この用語は、参照核酸（例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ）と類似の結合特性を有し、かつ、天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの公知のアナログを含有する核酸を包含する。特に指定されない限り、特定の核酸配列は、明示される配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列をも暗黙のうちに包含する。特に、縮重コドン置換は、１種以上の選択（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成することができる。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされるｍＲＮＡと交換可能に使用される。Batzer, et al., Nucleic Acid Res., 19: 5081, 1991; Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem., 260: 2605-2608, 1985; Cassol, et al., 1992; Rossolini, et al., Mol. Cell. Probes, 8: 91-98, 1994。
【００５４】
「核酸プローブ」とは、１以上の種類の化学結合、通常は相補的塩基対形成、通常は水素結合の形成によって、相補的配列の標的核酸（例えば、てんかんに関連する核酸）に結合可能な核酸として定義される。本明細書中で使用されるように、プローブには、天然の塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシン、など）が含まれ得る。さらに、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨害しない限り、リン酸ジエステル結合以外の結合によって連結され得る。ゆえに、例えば、プローブは、リン酸ジエステル結合ではなく、ペプチド結合によって構成塩基が連結されているペプチド核酸であり得る。プローブは完全な相補性を欠いている標的配列に結合でき、その場合、プローブ配列はハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存することが当業者には理解される。
【００５５】
核酸プローブはＤＮＡまたはＲＮＡ断片であり得る。ＤＮＡ断片は、例えば、プラスミドＤＮＡの消化、またはＰＣＲの使用によって調製するか、あるいはBeaucage and Carruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1862に記載のホスホルアミダイト法またはMatteucci, et al., 1981, J. Am. Chem. Soc., 103:3185に記載のトリエステル法によって合成することができる。上記両文献は参照により本明細書中に組み入れられる。そして、所望であれば、化学合成された一本鎖を適切な条件下でともにアニーリングするか、あるいは適切なプライマー配列とともにＤＮＡポリメラーゼを使用し、相補鎖を合成することによって、二本鎖断片を得ることができる。核酸プローブに関する具体的な配列が与えられれば、その相補鎖もまた特定され、かつ包含されることが理解される。標的が二本鎖核酸である状況では、前記相補鎖は等しく良好に機能する。
【００５６】
「標識核酸プローブ」は、共有結合によって、リンカーを介して、あるいはイオン結合、ファンデルワールス結合または水素結合によって標識に結合されていて、プローブに結合している標識の存在を検出することによってプローブの存在が検出できるようにされている核酸プローブである。
【００５７】
「〜をコードする核酸配列」とは、構造ＲＮＡ、例えばｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、または特定のタンパク質またはペプチドの一次アミノ酸配列、またはトランス作動性調節物質の結合部位に関する配列情報を含有する核酸を表す。この言い回しは、特定の宿主細胞でのコドン優先度にしたがうように導入できる、ネイティブの配列または配列群の縮重コドン（すなわち、単一アミノ酸をコードする種々のコドン）を明確に包含する。
【００５８】
例えば、細胞、または核酸、タンパク質、またはベクターに関して使用される場合の「組換え（型）」とは、その細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸またはタンパク質の導入またはネイティブの核酸またはタンパク質の変化によって改変されていることを示し、あるいは、細胞の場合には、そのように改変された細胞の子孫を指す。ゆえに、例えば、組換え細胞はネイティブ（非組換え）型のその細胞内では見出されない遺伝子を発現するか、あるいは、さもなければ異常発現されるか、発現が低下するか、あるいは全く発現されないネイティブの遺伝子を発現する。
【００５９】
核酸の部分に関して使用される場合の「異種（性）」とは、その核酸が、天然には互いに同一の類縁内に見出されない２種以上の部分配列を含むことを示す。例えば、新規の機能的核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子由来の２種以上の配列、例えばある供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域を有する核酸は、典型的に、組換えによって生成される。同様に、異種タンパク質とは、そのタンパク質が、天然には互いに同一の類縁内に見出されない２種以上の部分配列を含むこと（例えば、融合タンパク質）を示す。
【００６０】
「保存的に改変された変異体」はアミノ酸および核酸配列の両者にあてはまる。特定の核酸配列に関して、保存的に改変された変異体とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸を表すか、あるいは核酸がアミノ酸配列をコードしない場合には、本質的に同一の配列を表す。遺伝暗号の縮重のために、多数の機能的に同一の核酸が任意の一定のポリペプチドをコードする。例えば、コドンＣＧＵ、ＣＧＣ、ＣＧＡ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧはすべてアミノ酸アルギニンをコードする。ゆえに、コドンによってアルギニンが指定されるすべての位置で、そのコドンを、対応する上記コドンのいずれかに変更することができ、その場合、コード対象のポリペプチドは変更されない。そのような核酸の変異（バリエーション）は「サイレント置換」または「サイレント変異」であり、「保存的に改変された変異」の一種である。また、ポリペプチドをコードする本明細書中に記載のすべてのポリヌクレオチド配列は、特筆された場合を除き、すべての考えられるサイレント変異を表す。ゆえに、サイレント置換は、アミノ酸をコードするすべての核酸配列に包含される特徴である。当業者は、標準的技術によって核酸中の各コドン（通常メチオニンに関する唯一のコドンであるＡＵＧを除く）を改変して、機能的に同一の分子を得ることができることを認識する。いくつかの実施形態では、酵素をコードするヌクレオチド配列は、好ましくは、その酵素の生成に使用される特定の宿主細胞（例えば、酵母、哺乳動物、植物、真菌、など）での発現に関して最適化される。
【００６１】
アミノ酸配列に関して、コード配列中の単一アミノ酸または小さい割合のアミノ酸を変更、付加、または欠失する、核酸、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質配列に対する個別の置換、欠失または付加は、その変化によってアミノ酸が化学的に類似のアミノ酸で置換される場合に、「保存的に改変された変異体」であることを当業者は認識する。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は当技術分野において周知である。そのような保存的に改変された変異体は、本発明の多型変異体、種間ホモログ、および対立遺伝子に追加されるものであり、それらを除外しない。
【００６２】
以下の８群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；および８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Creighton, 1984, PROTEINSを参照のこと）。
【００６３】
巨大分子の構造、例えばポリペプチド構造は、種々のレベルの構成の観点から説明することができる。この構成の一般的考察に関しては、例えば、Alberts et al., 1994, MOLECULAR BIOLOGY OF THE CELL, 第３版、およびCantor and Schimmel, 1980, BIOPHYSICAL CHEMISTRY Part I: THE CONFORMATION OF BIOLOGICAL MACROMOLECULESを参照のこと。「一次構造」とは、特定のペプチドのアミノ酸配列を表す。「二次構造」とは、ポリペプチド内の位置を特定して並べられた三次元構造を表す。これらの構造は一般にドメインとして知られている。ドメインはポリペプチドのコンパクトな単位を形成するポリペプチドの部分であり、典型的に５０〜３５０アミノ酸長である。典型的なドメインは下位の構造からなる部分、例えばβ−シートおよびα−ヘリックスのストレッチから構成される。「三次構造」とは、ポリペプチドモノマーの完全な三次元構造を表す。「四次構造」とは、独立した三次単位の非共有結合性の会合によって形成された三次元構造を表す。異方性項はエネルギー項としても知られている。
【００６４】
また特定の核酸配列は「スプライシング変異体」を暗黙のうちに包含する。同様に、核酸によってコードされる特定のタンパク質は、その核酸のスプライシング変異体によってコードされる任意のタンパク質を暗黙のうちに包含する。「スプライシング変異体」とは、その名称が示唆するように、遺伝子の選択的スプライシングの産物である。転写後、初期核酸転写産物は、種々の（選択的）核酸スプライス産物が種々のポリペプチドをコードするようにスプライスされ得る。スプライシング変異体の生産に関する機構はさまざまであるが、エクソンの選択的スプライシングが含まれる。リードスルー転写よって同一核酸から誘導される選択的ポリペプチドもこの定義に包含される。組換え型のスプライス産物を含めたスプライシング反応の任意の産物がこの定義に含まれる。
【００６５】
「生物学的サンプル」とは、１種以上のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質をコードする１種以上のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ核酸を含有する、細胞、生物学的組織または体液のサンプルを表す。ほとんどの場合、そのサンプルは患者または被験体から取り出されたものであるが、用語「生物学的サンプル」とは、ｉｎ ｖｉｖｏで分析された細胞または組織、すなわち患者または被験体から取り出すことを伴わないサンプルを表してもよい。典型的に、「生物学的サンプル」は、患者または被験体由来の細胞を含有するが、この用語はＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａレベルの測定に使用できる非細胞性生物学的材料、例えば血液の非細胞性フラクション、唾液、または尿を表してもよい。本発明では、多数の種類の生物学的サンプルを使用することができ、それには、非限定的に、組織生検、血液サンプル、頬腔擦取物（buccal scrape）、唾液サンプル、または乳頭分泌物が含まれる。そのようなサンプルには、非限定的に、ヒト、マウス、およびラットから単離された組織、特に、乳房および肺組織ならびに血液、リンパ組織、肝臓、脳、心臓、脾臓、精巣、卵巣、胸腺、腎臓、および胚組織が含まれる。生物学的サンプルには、組織学的目的に供される組織切片、例えば凍結切片も含まれ得る。生物学的サンプルは、典型的に、哺乳動物、例えばラット、マウス、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、またはウサギ、および最も好ましくは霊長類、例えばチンパンジーまたはヒトから入手される。
【００６６】
「生物学的サンプルを用意する」とは、本発明の上記方法で使用するための生物学的サンプルを入手することを意味する。ほとんどの場合、これは、患者または被験体から細胞のサンプルを取り出すことによって行われるが、以前に単離された細胞（例えば、別の人によって、別の時点で、ならびに／あるいは別の目的で単離された細胞）を使用することによるか、あるいは本発明の方法をｉｎ ｖｉｖｏで実施することによって達成することもできる。
【００６７】
「組織生検」とは、診断解析のために患者または被験体から取り出された一定量の組織を表す。てんかんを有する患者では、腫瘍から組織を取り出すことができ、したがって腫瘍内の細胞を分析することが可能になる。「組織生検」とは、任意の種類の生検、例えば針生検、細針生検、外科生検、などを表し得る。
【００６８】
「対照サンプル」とは、健康な、てんかんを有しない患者に代表的な生物学的材料のサンプルを表す。対照サンプル中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルは、望ましくは、正常な、てんかんを有しない患者の一般集団に典型的である。このサンプルは、特に本発明の上記方法において使用するために患者から取り出すことができ、あるいは、正常な、てんかんを有しない患者に代表的な任意の生物学的材料であり得る。対照サンプルは、てんかんを有するか、あるいはてんかんを有すると疑われる患者の正常な組織から入手することもできる。対照サンプルとは、正常な、てんかんを有しない患者の測定値に基づいて以前に確立されている、てんかんを有しない集団に代表的な、確立されたレベルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを表してもよい。正常な、てんかんを有しない患者に典型的なレベルより高いレベルが存在する場合に、ＥＥＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを単に検出する検出方法（すなわち、単純な陽性または陰性の結果をもたらす免疫組織化学アッセイ）が使用される場合、これは、対照レベルと比較したＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａレベルの評価であるとみなされ、その対照レベルはそのアッセイに固有なものである。
【００６９】
生物学的サンプル中の「ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのｍＲＮＡのレベル」とは、細胞または生物学的サンプル中に存在するＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子から転写されたｍＲＮＡの量を表す。前記ｍＲＮＡは、一般に、機能的ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質をコードするが、コード対象のタンパク質の機能を変化させるか、あるいは除去する変異または微小欠失が存在し得る。「ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのｍＲＮＡのレベル」を定量する必要はないが、例えば、ヒトによる主観的、視覚的検出によって、対照サンプル由来のレベルまたは対照サンプルの予測されるレベルと比較するか、あるいは比較せずに、単に検出することができる。
【００７０】
生物学的サンプル中の「ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのタンパク質またはポリペプチドのレベル」とは、細胞または生物学的サンプル中に存在するＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドの量を表す。前記ポリペプチドはＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質活性を有しても、有さなくてもよい。「ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質のレベル」を定量する必要はないが、例えば、ヒトによる主観的、視覚的検出によって、対照サンプル由来のレベルまたは対照サンプルの予測されるレベルと比較するか、あるいは比較せずに、単に検出することができる。
【００７１】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルの「増大」または「上昇」とは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの対照レベルと比較して、検出可能な程度に高い、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチド、例えば、ゲノムＤＮＡ、もしくはｍＲＮＡ、またはポリペプチドのレベルを表す。前記比較方法は、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルに関して定量された値を使用する統計学的方法であってよく、あるいは非統計学的な手段を使用して、例えばヒトによる視覚的、主観的評価によって比較することができる。
【００７２】
てんかんにおける診断および予後的適用に関して、対照サンプル中で「予測される」ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルとは、典型的な、てんかんを有しないサンプルを代表するレベルであって、そのレベルから、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの上昇した存在または診断上の存在を識別できるレベルを表す。好ましくは、「予測される」レベルは、患者または被験体の年齢、性別、および病歴などの要因、ならびに試験対象の具体的な生物学的サンプルに関して調整される。
【００７３】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性をモジュレートする試験化合物に関するアッセイの関連での「機能的効果」には、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの間接的または直接的影響下にある任意のパラメータの決定、例えば機能的、物理的、または化学的効果が含まれる。これらの効果には、遺伝子増幅、または神経細胞での発現が含まれる。「機能的効果」には、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、およびｅｘ ｖｉｖｏ活性が含まれる。
【００７４】
「機能的効果の決定」とは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの間接的または直接的影響下にあるパラメータ、例えば、機能的、物理的および化学的効果を増大または低下させる化合物に関してアッセイすることを表す。そのような機能的効果は、当業者に公知の任意の手段、例えば、タンパク質に関する分光学的特性（例えば、蛍光、吸光度、屈折率）、水力学的特性（例えば、形状）、クロマトグラフ特性、または溶解度特性の変化、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの誘導マーカーまたは転写活性化の測定；または結合アッセイ、例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａと他のタンパク質の会合の測定によって測定することができる。
【００７５】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの「インヒビター」および「モジュレーター」とは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏアッセイ、例えば、細胞膜でのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ発現を使用して特定される阻害性または調節性（modulating）の分子を表す。インヒビターは、例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａに結合し、それらの活性を部分的または完全にブロックし、それらの活性を低下させ、妨げ、活性化を遅延させ、不活性化し、脱感作するか、あるいはダウンレギュレートする化合物、例えば、アンタゴニストである。アクチベーターは、例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性を増大させるか、あるいはＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの発現または安定性を増大させる化合物である。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性のアクチベーターはＥＦＨＣ１アゴニストまたはＥＦＨＣ１ａアゴニストであり得る。またＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのモジュレーターには、遺伝子改変型のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ、例えば、改変された活性を有する型、ならびに天然に存在するリガンドおよび合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、化学小分子などが含まれる。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのインヒビターおよびアクチベーターに関するアッセイは、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、細胞、または細胞膜でＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを発現させ、推定されるモジュレーター化合物を作用させ、そして上記のようにＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性に対する機能的効果を決定するステップを含む。
【００７６】
「細胞生長（増殖）の阻害」とは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの不存在下での細胞生長と比較して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの存在下で細胞生長が低下することを表す。あるいは、細胞が基底レベルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチド発現を有する場合、それは、基底レベルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの存在下での細胞生長と比較して、増大したレベルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの存在下で細胞生長が低下することを表す。細胞生長（増殖）は、慣用のアッセイ、例えばコロニー形成アッセイを使用して測定することができる。
【００７７】
「モジュレート」とは、機能または症状の抑制、増強または誘発を表す。例えば、本発明のＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたは本発明のＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログは、カルシウム（Ｃａ２＋）チャネル活性の活性化または阻害によっててんかんをモジュレートすることができる。例えば、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、またはＥＥＨＣ１アナログは、神経細胞においてカルシウム（Ｃａ２＋）チャネル活性を活性化または阻害し、それにより神経細胞の生長を阻害または低下させることによっててんかんを軽減することができる。
【００７８】
「神経細胞」とは、中枢神経系の細胞を表し、それには、ニューロン、星状膠細胞、稀突起膠細胞などが含まれる。一実施形態では、本発明の神経細胞は、海馬ＣＡ１領域の錐体ニューロン、大脳皮質の錐体ニューロン、または小脳のプルキンエ細胞の細胞体および樹状突起由来の細胞である。
【００７９】
「接触させる」とは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ培養物に化合物を添加するか、あるいはｉｎ ｖｉｖｏで被験体に投与し、その化合物が細胞、例えば神経細胞によって取り込まれるようにすることを表す。
【００８０】
潜在的アクチベーター、インヒビター、またはモジュレーターで処理されたＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドを含むサンプルまたはアッセイを、そのインヒビター、アクチベーター、またはモジュレーターを含まない対照サンプルと比較して、該候補化合物の効果を調べる。対照サンプル（化合物で無処理）は相対的なＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ活性値１００％に割り当てられる。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの阻害は、対照と比較して、その活性値が約８０％、場合により約５０％または２５〜０％である場合に達成される。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの活性化は、対照と比較して、その活性値が約１１０％、場合により約１５０％、場合により約２００〜５００％、または約１０００〜３０００％以上である場合に達成される。
【００８１】
「単離（された）」、「精製（された）」、または「生物学的に純粋な」とは、そのネイティブの状態で見出されるように、それに通常付随する成分を実質的または本質的に含まない材料を表す。純度および均質性は、典型的に、分析化学技術、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動または高速液体クロマトグラフィーを使用して決定される。調製物中に存在する主要な分子種であるタンパク質が実質的に精製される。特に、単離ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ核酸を、そのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子に隣接し、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから分離する。用語「精製された」とは、核酸またはタンパク質が電気泳動ゲルで本質的に１つのバンドを生じさせることを意味する。特に、それは、核酸またはタンパク質が少なくとも８５％純粋、場合により、少なくとも９５％純粋、および場合により、少なくとも９９％純粋であることを意味する。
【００８２】
「核酸」とは、一本鎖または二本鎖型のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそのポリマーを表す。その用語は、合成の、天然に存在する、ならびに非天然に存在する、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された主鎖残基または結合を含有する核酸であって、参照核酸と類似の結合特性を有し、かつ、参照ヌクレオチドと類似の様式で代謝される核酸を包含する。そのようなアナログの例には、非限定的に、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、２−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。
【００８３】
特に指定されない限り、特定の核酸配列は、明示される配列だけでなく、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）および相補的配列をも暗黙のうちに包含する。特に、縮重コドン置換は、１種以上の選択（またはすべての）コドンの第３の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成することができる。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと交換可能に使用される。Batzer, et al., Nucleic Acid Res., 19: 5081, 1991; Ohtsuka, et al., J. Biol. Chem., 260: 2605-2608, 1985; Rossolini, et al., Mol. Cell. Probes, 8: 91-98, 1994。
【００８４】
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は本明細書中で交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーを表す。この用語は、１個以上のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的化学模倣物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマーおよび非天然に存在するアミノ酸ポリマーにあてはまる。
【００８５】
「アミノ酸」とは、天然に存在するアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸アナログおよびアミノ酸模倣物を表す。天然に存在するアミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびに後に改変されているアミノ酸、例えば、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、およびＯ−ホスホセリンである。アミノ酸アナログとは、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造、すなわち水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合しているα炭素を有する化合物を表し、例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムである。そのようなアナログは修飾されたＲ基（例えば、ノルロイシン）または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然に存在するアミノ酸と同一の基本化学構造を保持する。アミノ酸模倣物とは、アミノ酸の一般的化学構造と異なる構造を有するが、天然に存在するアミノ酸と類似の様式で機能する化学物質を表す。
【００８６】
本明細書中では、アミノ酸は、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionが推奨する、その一般に公知の３文字表記または１文字表記によって示される。同様に、ヌクレオチドは、その一般に許容される１文字コードによって示される。
【００８７】
「標識」または「検出可能部分」は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般に使用される酵素）、ビオチン、ジゴキシゲニン、またはハプテンおよび、例えば、そのペプチドに放射性標識を組み込むことによって検出可能にすることができるタンパク質、またはそのペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために使用することができるタンパク質が含まれる。
【００８８】
「標識核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」は、共有結合によって、リンカーまたは化学結合を介して、あるいは非共有結合によって、イオン結合、ファンデルワールス結合、静電結合、または水素結合によって標識に結合されていて、プローブに結合している標識の存在を検出することによってプローブの存在が検出できるようにされているものである。
【００８９】
「核酸プローブまたはオリゴヌクレオチド」とは、１以上の種類の化学結合、通常は相補的塩基対形成、通常は水素結合の形成によって、相補的配列の標的核酸に結合可能な核酸を表す。本明細書中で使用される場合、プローブには、天然塩基（すなわち、Ａ、Ｇ、Ｃ、またはＴ）または修飾塩基（７−デアザグアノシン、イノシン、など）が含まれ得る。さらに、プローブ中の塩基は、ハイブリダイゼーションを妨害しない限り、リン酸ジエステル結合以外の結合によって連結され得る。ゆえに、例えば、プローブは、リン酸ジエステル結合ではなく、ペプチド結合によって構成塩基が連結されているペプチド核酸であり得る。プローブは完全な相補性を欠いている標的配列に結合でき、その場合、プローブ配列はハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存することが当業者には理解される。前記プローブは、場合により、同位体、発色団、発光団（lumiphores）、色素原などで直接的に標識されるか、あるいはストレプトアビジン複合体が後に結合できるビオチンなどで間接的に標識される。プローブの有無をアッセイすることによって、選択配列または部分配列の有無を検出することができる。
【００９０】
「プロモーター」とは、核酸の転写を支配する一連の核酸制御配列を表す。本明細書中で使用される場合、プロモーターには、転写の開始部位付近の必要な核酸配列、例えば、ＩＩ型ポリメラーゼプロモーターの場合はＴＡＴＡエレメントが含まれる。またプロモーターには、場合により、転写の開始部位から数千の塩基対ほども離れた部位に位置し得る遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントが含まれる。「構成的」プロモーターはほとんどの環境条件および発生条件下で活性なプロモーターである。「誘導性」プロモーターは環境または発生上の調節下で活性なプロモーターである。用語「作動可能に連結されている」とは、核酸発現制御配列（例えばプロモーター、または一連の転写因子結合部位）と第二の核酸配列の間の機能的連結を表し、その場合、該発現制御配列は、第二の配列に対応する核酸の転写を支配する。
【００９１】
「発現ベクター」とは、宿主細胞における特定の核酸の転写を許容する一連の特定された核酸エレメントを有する、組換えまたは合成によって作製された核酸構築物を表す。発現ベクターはプラスミド、ウイルス、または核酸断片の一部分であり得る。典型的に、発現ベクターには、プロモーターに作動可能に連結された、転写対象の核酸が含まれる。
【００９２】
２種以上の核酸またはポリペプチド配列との関連での「同一」または％「同一性」とは、同一であるか、あるいは指定のパーセンテージの同一のアミノ酸残基またはヌクレオチド（すなわち、比較ウインドウまたは指定領域にわたって比較され、最大一致に関してアライメントされた場合の、指定の領域（例えば、天然に存在するＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子の配列）にわたる約７０％同一性、好ましくは７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の同一性）を有する２種以上の配列または部分配列を表す。それは、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを下記のデフォルトパラメータで使用して、あるいはマニュアルアライメントおよび視覚的点検によって測定される。以後、そのような配列を「実質的に同一」であると述べる。またこの定義は試験配列の相補体（compliment）を表す。またこの定義には、欠失および／または付加を有する配列、ならびに置換を有する配列が含まれる。下記のように、好ましいアルゴリズムではギャップなどを考慮することができる。好ましくは、同一性は、少なくとも約２５アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって存在し、あるいはより好ましくは、５０〜１００アミノ酸またはヌクレオチド長の領域にわたって存在する。
【００９３】
配列比較では、典型的には１つの配列が参照配列としての役割を果たし、それと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを使用する場合、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であれば部分配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを指定する。デフォルトのプログラムパラメータを使用してもよいし、代替のパラメータを指定してもよい。そして配列比較アルゴリズムでは、プログラムパラメータに基づいて、参照配列と比較された試験配列に関する配列同一性パーセントが算出される。
【００９４】
「比較ウインドウ」とは、２０〜６００、通常は約５０〜約２００、より通常は約１００〜約１５０からなる群より選択される多数の連続位置のいずれか１つのセグメントであって、配列を同数の連続位置の参照配列と、その２配列を最適にアライメントした後に比較することができるセグメントを表す。比較用の配列をアライメントする方法は当技術分野において周知である。比較用配列の最適なアライメントは、例えば、Smith, et al., Adv. Appl. Math., 2: 482, 1991の局所ホモロジーアルゴリズム、Needleman, et al., J. Mol. Biol., 48: 443, 1970のホモロジーアライメントアルゴリズム、Pearson, et al., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 85: 2444, 1988の類似度検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ手段（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、またはマニュアルアライメントおよび視覚的点検（例えば、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY. Ausubel, et al.（編）, supplement, 1995を参照のこと）によって行うことができる。
【００９５】
配列同一性パーセントおよび配列類似性の決定に適したアルゴリズムの別の例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムである。そのアルゴリズムは、それぞれ、Altschul, et al., Nuc. Acids Res., 25: 3389-3402, 1977; Altschul, et al., J. Mol. Biol., 215: 403-410, 1990に記載されている。ＢＬＡＳＴ解析を実施するソフトウェアはNational Center for Biotechnology Information（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）を通じて公に利用可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同一の長さのワードとアライメントされた場合に、いくらかの正の値の閾値スコアＴにマッチするか、あるいはそれを満たす、問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって高いスコアの配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは隣接（neighborhood）ワードスコア閾値と称される。これらの初期隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを発見する検索を開始するためのシードとして役割を果たす。そのワードヒットは各配列に沿って累積アライメントスコアが増加し得る範囲まで両方向に延長される。ヌクレオチド配列に関する、パラメータＭ（マッチする残基のペアに関して与えられるスコア（reward score）；常に＞０）およびＮ（残基のミスマッチに関するペナルティースコア；常に＜０）を使用して、累積スコアが算出される。アミノ酸配列では、スコア行列を使用して累積スコアが算出される。ワードヒットの各方向の伸長は、累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下した場合；１以上の負のスコアの残基アライメントの蓄積のために累積スコアがゼロ以下になった場合；またはいずれかの配列の末端に達した場合に停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ、およびＸはアライメントの感度および速度を左右する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）では、デフォルトとしてワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列に関するＢＬＡＳＴＰプログラムでは、デフォルトとしてワード長３、および期待値（Ｅ）
１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915, 1989を参照のこと）アライメント（Ｂ）５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。Altschul, et al., 上掲。
【００９６】
またＢＬＡＳＴアルゴリズムでは、２配列間の類似性の統計解析を実施する（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-5787, 1993を参照のこと）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似性の１つの尺度は最小確率和（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、それは２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のマッチが偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸を参照核酸と比較した場合に最小確率和が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満であれば、核酸は参照配列に類似しているとみなされる。
【００９７】
２核酸配列またはポリペプチドが実質的に同一である指標は、下記のように、第一の核酸によってコードされるポリペプチドが、第二の核酸によってコードされるポリペプチドに対して産生された抗体と免疫学的に交差反応性であることである。ゆえに、例えば２つのペプチドが保存的置換によってのみ異なる場合、典型的に、ポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一である別の指標は、下記のように、ストリンジェントな条件下で２つの分子またはその相補体が互いにハイブリダイズすることである。２つの核酸配列が実質的に同一であるさらに別の指標は、同一プライマーを使用してその配列が増幅できることである。
【００９８】
「〜に選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」とは、その配列が複合混合物（例えば、細胞総ＤＮＡもしくはＲＮＡまたはライブラリーＤＮＡもしくはＲＮＡ）中に存在する場合に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特定のヌクレオチド配列に対してのみ、分子が結合、二重鎖形成、またはハイブリダイズすることを表す。
【００９９】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、典型的には核酸の複合混合物中で、プローブがその標的部分配列にハイブリダイズするが、他の配列にはハイブリダイズしない条件を表す。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、環境に応じて異なる。長い配列ほどより高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての詳細な手引きは、Tijssen, 1993, "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays" in TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY -- HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC PROBESに見出せる。一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨで、特定の配列の熱融点（ＴＭ）より約５〜１０℃低いように選択される。ＴＭは、平衡状態で、標的に相補的なプローブの５０％が標的配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度条件下での）温度である（標的配列が過剰に存在する場合、ＴＭでは、平衡状態で５０％のプローブが占有される）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満であり、典型的には約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）であり、ｐＨ７．０〜８．３であり、温度が、短いプローブ（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）では少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、５０を超えるヌクレオチド）では少なくとも約６０℃である条件である。ストリンジェントな条件は不安定化物質、例えばホルムアミドを加えることによって達成することもできる。選択的または特異的なハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルはバックグラウンドの少なくとも２倍であり、場合によりバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。典型的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は以下のような条件であり得る：５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または、５×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳ中で６５℃で洗浄する。その洗浄は５、１５、３０、６０、１２０
分間、またはそれ以上実施することができる。ＰＣＲに関して、低ストリンジェンシーでの増幅は約３６℃の温度が典型的であり、アニーリング温度は、プライマー長に応じて約３２℃〜４８℃の範囲で変動し得る。高ストリンジェンシーでのＰＣＲ増幅は、約６２℃の温度が典型的であり、高ストリンジェンシーでのアニーリング温度は、プライマー長および特異性に応じて約５０℃〜約６５℃の範囲であり得る。高および低ストリンジェンシーの増幅に関する典型的なサイクル条件はともに、９０℃〜９５℃で３０秒〜２分間の変性相、３０秒〜２分間のアニーリング相、および約７２℃で１〜２分間の伸長相を含む。
【０１００】
ストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズしない核酸でも、それらがコードするポリペプチドが実質的に同一であれば、依然として実質的に同一である。これは、例えば、遺伝暗号によって許容される最大コドン縮重度を使用して核酸のコピーが創出された場合に生じる。そのような場合、前記核酸は、典型的に、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする。典型的な「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、４０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ＳＤＳのバッファー中で３７℃でのハイブリダイゼーション、および１×ＳＳＣ中で４５℃での洗浄を含む。その洗浄は５、１５、３０、６０、１２０分間、またはそれ以上実施することができる。陽性ハイブリダイゼーションはバックグラウンドの少なくとも２倍である。通常の当業者は、代替のハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を利用して、同様のストリンジェンシーの条件を提供できることを容易に認識する。
【０１０１】
「抗体」とは、抗原に特異的に結合し、それを認識する、免疫グロブリン遺伝子由来のフレームワーク領域またはその断片を含むポリペプチドを表す。認識されている免疫グロブリン遺伝子には、κ、λ、α、γ、δ、ε、およびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。軽鎖はκまたはλとして分類される。重鎖はγ、μ、α、δ、またはεとして分類され、そしてそれらは免疫グロブリンクラス、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥを規定する。
【０１０２】
典型的な免疫グロブリン（抗体）の構造単位は四量体を含む。各四量体は２組の同一のポリペプチド鎖ペアから構成され、各ペアは１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）および１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識を主に担う約１００〜１１０またはそれ以上のアミノ酸の可変領域を規定する。可変軽鎖（ＶＬ）および可変重鎖（ＶＨ）という用語は、それぞれ、これらの軽鎖および重鎖を表す。
【０１０３】
抗体は、例えば、無傷の免疫グロブリンとして、あるいはいくつかの十分に特徴付けされている、種々のペプチダーゼ消化産物であるフラグメントとして存在する。ゆえに、例えば、ペプシンは、抗体をヒンジ領域のジスルフィド結合の下で消化して、Ｆａｂの二量体であるＦ（ａｂ）’２を生産する。Ｆａｂ自体はジスルフィド結合によってＹＨ−ＣＨ１に連結された軽鎖である。そのＦ（ａｂ）’２を穏やかな条件下で還元して、ヒンジ領域のジスルフィド結合を切断し、それによってＦ（ａｂ）’２二量体をＦａｂ’モノマー（単量体）に変換することができる。Ｆａｂ’モノマーは本質的にヒンジ領域の部分を有するＦａｂである（FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY (Paul（編）, 第３版 1993) を参照のこと）。無傷の抗体の消化から種々の抗体フラグメントが規定されるが、当業者は、そのようなフラグメントを、化学的に、あるいは組換えＤＮＡ方法論を使用して、新規に合成できることを認識する。ゆえに、本明細書中で使用される抗体という用語は、完全抗体の改変によって生成される抗体フラグメント、または組換えＤＮＡ方法論を使用して新規に合成されるもの（例えば、単鎖Ｆｖ）またはファージディスプレイライブラリーを使用して特定されるもの（例えば、McCafferty, et al., Nature, 348: 552-554, 1990を参照のこと）をも含む。
【０１０４】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体の調製では、当技術分野において公知の任意の技術を使用することができる（例えば、Kohler & Milstein, Nature, 256: 495-497, 1975; Kozbor, et al., Immunology Today, 4: 72, 1983; Cole, et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, 1985を参照のこと）。単鎖抗体を生成する技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を改変して、本発明のポリペプチドに対する抗体を生産することができる。また、トランスジェニックマウス、または他の生物、例えば他の哺乳動物を使用して、ヒト化抗体を発現させることができる。あるいは、ファージディスプレイテクノロジーを使用して、選択抗原に特異的に結合する抗体およびヘテロマーＦａｂフラグメントを特定することができる（例えば、McCafferty, et al., Nature, 348: 552-554, 1990; Marks, et al., Biotechnology, 10: 779-783, 1992を参照のこと）。
【０１０５】
「キメラ抗体」とは、（ａ）定常領域、またはその一部分が改変、置換または交換されて、抗原結合部位（可変領域）が別のまたは改変されたクラス、エフェクター機能および／または生物種の定常領域、または、キメラ抗体に新規特性を付与する完全に別の分子、例えば、酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物、などに連結されている抗体分子；または（ｂ）可変領域、またはその部分が改変されているか、別のまたは改変された抗原特異性を有する可変領域で置換または交換されている抗体分子を表す。
【０１０６】
「抗ＥＦＨＣ１または抗ＥＦＨＣ１ａ」抗体とは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの遺伝子、ｃＤＮＡ、またはその部分配列によってコードされるポリペプチド、例えば、そのＣ末端ドメインに特異的に結合する抗体または抗体フラグメントを表す。
【０１０７】
「免疫アッセイ」とは、抗原に特異的に結合する抗体を使用するアッセイを表す。免疫アッセイは、特定の抗体の特異的結合特性を使用して、その抗原を単離し、標的にし、ならびに／あるいは定量することを特徴とする。
【０１０８】
抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」または「特異的に（または選択的に）免疫反応性である」とは、タンパク質またはペプチドに関する場合、タンパク質および他の生物学的物質（biologics）の混成集団中の該タンパク質の存在を決定する結合反応を表す。ゆえに、特定の免疫アッセイ条件下では、特定の抗体は特定のタンパク質に対してバックグラウンドの少なくとも２倍結合し、サンプル中に存在する他のタンパク質に対して顕著な程度に結合することは実質的にない。そのような条件下で抗体に特異的に結合するためには、特定のタンパク質に関するその特異性に関して選択された抗体が必要である場合がある。例えば、特定の生物種、例えばラット、マウス、またはヒト由来のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドに対して産生されたポリクローナル抗体を選択して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質と特異的に免疫反応性であり、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質の多型変異体および対立遺伝子を除く他のタンパク質には免疫っ反応性でないポリクローナル抗体のみを得ることができる。この選択は、他の生物種由来のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ分子と交差反応する抗体を取り除くことによって達成することができる。種々の免疫アッセイ形式を使用して、特定のタンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択することができる。例えば、固相ＥＬＩＳＡ免疫アッセイが、タンパク質と特異的に免疫反応性である抗体を選択するために通常使用される（例えば、特異的免疫反応性の決定に使用できる免疫アッセイ形式および条件の説明に関しては、Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, 1998を参照のこと）。典型的に、特異的または選択的反応はバックグラウンドシグナルまたはノイズの少なくとも２倍であり、より典型的にはバックグラウンドの１０〜１００倍以上である。
【０１０９】
「〜と選択的に会合する」とは、上記に規定の、核酸が別の核酸と「選択的にハイブリダイズする」能力、または、上記に規定の、抗体がタンパク質に「選択的に（または特異的に）結合する」能力を表す。
【０１１０】
「宿主細胞」とは、発現ベクターを含有し、その発現ベクターの複製または発現を支援する細胞を表す。宿主細胞は、原核細胞、例えば大腸菌（E. coli）、または真核細胞、例えば酵母、昆虫、両生類、または哺乳動物細胞、例えばＣＨＯ、ＨｅＬａなど、例えば、培養細胞、移植片、およびｉｎ ｖｉｖｏの細胞であり得る。
【０１１１】
「てんかんを検出する」または「てんかんを診断する」とは、患者におけるてんかんの有無を突き止めることを表す。また「てんかんを検出する」または「てんかんを診断する」とは、患者中にてんかんを引き起こし得る細胞が存在する見込みに関する間接的証拠を得ることを表し得る。てんかんの検出は、本発明の方法を単独で、他の方法と組み合わせて、あるいは患者または被験体の健康状態に関する他の情報を考慮して使用して達成することができる。
【０１１２】
「治療上有効な用量」とは、その投与の目的である効果を生じさせる用量を表す。的確な用量は治療の目的に依存し、その量は当業者が公知の技術を使用して確認することができる（例えば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms, Vols. 1-3, 1992; Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding, 1999; Pickar, Dosage Calculations, 1999を参照のこと）。
【０１１３】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１Ａ核酸の検出
本発明の多数の実施形態では、全長ＥＦＨＣ１タンパク質、ミオクロニン１、またはＥＦＨＣ１ａタンパク質、ミオクロニン２、またはその任意の誘導体、変異体、ホモログ、または断片を含めたＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドをコードする核酸を使用する。そのような核酸は多数の適用のいずれかに関して有用であり、その適用には、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質の生成、診断アッセイ、治療的適用、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ特異的プローブ、他の生物種またはマウス由来のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａホモログを同定および／または単離するためのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ結合性および／またはモジュレート化合物に関するアッセイ、その他の適用が含まれる。
【０１１４】
一般的組換えＤＮＡ法
本発明の多数の適用には、組換え遺伝学分野の通常の技術を使用して実施できる、核酸配列のクローニング、合成、維持、突然変異誘発、および他の操作が含まれる。本発明において有用な一般的方法を開示している基礎的な教科書には、Sambrook et al., MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL (第２版 1989); Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION: A LABORATORY MANUAL; およびCURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, 1995, (Ausubel et al. (編))が含まれる。
【０１１５】
核酸に関するサイズはキロベース（ｋｂ）または塩基対（ｂｐ）で記載される。これらは、アガロースまたはアクリルアミドゲル電気泳動、シーケンシング（配列決定）された核酸、または公開されているＤＮＡ配列から導き出される推定値である。タンパク質に関するサイズはキロダルトン（ｋＤａ）またはアミノ酸残基数で記載される。タンパク質のサイズは、ゲル電気泳動、シーケンシングされたタンパク質、推定アミノ酸配列、または公開されているタンパク質配列から見積もられる。
【０１１６】
市販されていないオリゴヌクレオチドは、Beaucage, et al., Tetrahedron Letts., 22: 1859-1862, 1981によって最初に報告された固相ホスホルアミダイトトリエステル法にしたがって化学的に合成することができる。その合成では、Van Devanter, et al., Nucleic Acids Res., 12: 6159-6168, 1984に記載されるように自動合成機を使用する。オリゴヌクレオチドの精製は、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはPearson, et al., J. Chrom., 255: 137-149, 1983に記載のアニオン交換ＨＰＬＣに基づく。
【０１１７】
クローニングされた遺伝子および合成オリゴヌクレオチドの配列は、クローニング後に、例えば、Wallace, et al., Gene, 16: 21-26, 1981の二本鎖鋳型のシーケンシングに関する鎖終結法を使用して検証することができる。
【０１１８】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａヌクレオチド配列の単離および検出
本発明の多数の実施形態では、組換えによる方法を使用してＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ核酸を単離し、クローニングする。そのような実施形態を使用して、例えば、タンパク質発現のため、または変異体、誘導体、発現カセット、またはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａ由来の他の配列の作製時にＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドを単離し、さまざまな生物種におけるＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ配列の決定のため、患者における診断目的のため、すなわちＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ中の変異を検出するため、または遺伝子型決定および／または法医学的適用のためにＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子の発現をモニタリングする。
【０１１９】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの核酸プローブ、およびオリゴヌクレオチドを使用し、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でライブラリーをスクリーニングすることによって、多型変異体、対立遺伝子、および種間ホモログならびにＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子と実質的に同一である核酸を単離することができる。あるいは、発現ライブラリーを使用し、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドに対して作製された抗血清または精製抗体を用いて、発現されたホモログを免疫学的に検出することによって、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質、多型変異体、対立遺伝子、および種間ホモログをクローニングすることができる。前記抗血清または抗体はＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａホモログを認識し、それに選択的に結合するものでもある。
【０１２０】
ｃＤＮＡライブラリーを作製するために、ＺＦＮ２１７ ＲＮＡが豊富な供給源を選択すべきであろう。次いで、逆転写酵素を使用してそのｍＲＮＡをｃＤＮＡにし、組換えベクターに連結し、増殖、スクリーニングおよびクローニングのための組換え宿主にトランスフェクトする。ｃＤＮＡライブラリーを作製およびスクリーニングする方法は周知である（例えば、Gubler, et al., Gene, 25: 263-269, 1983; Sambrook, et al., 上掲, 1983; Ausubel, et al., 上掲, 1983を参照のこと）。
【０１２１】
ゲノムライブラリーでは、組織からＤＮＡを抽出し、機械的に剪断するか、あるいは酵素によって消化して、約１２〜２０ｋｂの断片を得る。次いで勾配遠心分離によって望ましくないサイズからその断片を分離し、バクテリオファージλベクター中に構築する。これらのベクターおよびファージをｉｎ ｖｉｔｒｏでパッケージングする。Benton, et al., Science, 196: 180-182, 1977に記載のようにプラークハイブリダイゼーションによって組換えファージを分析する。コロニーハイブリダイゼーションは、Grunstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 72: 3961-3965, 1975におおまかに記載されるように実行する。
【０１２２】
より遠縁のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａホモログは、多数の周知の技術のいずれかを使用して同定することができ、その技術には、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａプローブをゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーとハイブリダイズさせることに基づく技術が含まれ、その場合、中程度にストリンジェントな条件を使用するか、あるいは低ストリンジェンシーの条件下で、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａに選択的な領域由来のプローブ、例えば、そのＣ末端ドメインに対して作製された特異的プローブを使用する。また、遠縁のホモログは、縮重プライマーセット、すなわち特に高度に保存されているアミノ酸伸長部に基づいて、一定のアミノ酸配列をコードするすべてのコドン候補を含むプライマーを使用して核酸ライブラリーから増幅することができる。そのようなプライマーは当業者に周知であり、例えば、インターネット上で、縮重プライマー設計用の多数のプログラムが利用可能である。
【０１２３】
特定の実施形態では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドを、例えば診断目的で、例えばＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのＲＮＡレベルを決定するか、あるいは特定のＤＮＡ配列を検出するためのハイブリダイゼーションベースの方法を使用して検出する。例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの遺伝子発現は、当技術分野において公知の技術、例えば、ノーザンブロッティング、リアルタイムＰＣＲ手順を用いたｍＲＮＡレベルの定量的ＰＣＲ解析（例えば、逆転写酵素−TAQMANTM増幅）を含めたｍＲＮＡの逆転写およびＰＣＲ増幅、ドットブロッティング、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＲＮａｓｅ保護、ＤＮＡマイクロチップアレイのプローブ結合、などによって分析することができる。
【０１２４】
一実施形態では、高密度オリゴヌクレオチド解析技術（例えば、GeneChipTM）を使用して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのオーソログ、対立遺伝子、保存的に改変された変異体、および多型変異体を特定するか、あるいはＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのｍＲＮＡのレベルをモニタリングする。ホモログが公知の疾患に関連付けられている場合には、診断ツールとしてGeneChipTMとともにそれらを使用して、生物学的サンプル中の疾患を検出することができる。例えば、Gunthand, et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses, 14: 869-876, 1998; Kozal, et al., Nat. Med., 2: 753-759, 1996; Matson, et al., Anal. Biochem., 224: 110-106, 1995; Lockhart, et al., Nat. Biotechnol., 14: 1675-1680, 1996; Gingeras, et al., Genome Res., 8: 435-448, 1998; Hacia, et al., Nucleic Acids Res., 26: 3865-3866, 1998を参照のこと。
【０１２５】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドおよびポリペプチドの検出は、そのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの定量的または定性的検出を含んでよく、対照値と実際に比較することを含んでよく、あるいは別法では、その検出自体が、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルの増大を本質的に示すように実施してよい。ＺＦＮ２１７核酸、多型変異体、オーソログ、および対立遺伝子は、天然に存在するＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子あるいはタンパク質のレベルの増大を示す女性が以下で考察されるてんかん（例えば若年性ミオクローヌスてんかん）のリスクの増大を示すような他のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａファミリーメンバーの発現、安定性または活性をモジュレートし得る。
【０１２６】
特定の実施形態、例えば、てんかんの診断では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチド、ポリペプチド、またはタンパク質活性のレベルを定量する。そのような実施形態では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの上昇したレベルと正常対照レベルとの差異が好ましくは統計学的に有意である。典型的に、診断上の存在、すなわちＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたは核酸の過剰発現または増大は、非てんかんサンプル中で予測されるレベルと比較して、生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたはポリヌクレオチドのレベルが少なくとも約１．５、２、３、５、１０倍、またはそれ以上増大することを示す。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの検出は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで、すなわち患者から採取された生物学的サンプル内の細胞中、またはｉｎ ｖｉｖｏで実施することができる。一実施形態では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルの増大をＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの診断マーカーとして使用する。本明細書中で使用される「診断上の存在」とは、非てんかんサンプル中で予測されるレベルを超えるＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの任意のレベルを示す。一実施形態では、生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関するアッセイを、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの正常レベル、すなわち非てんかんサンプルに典型的な、すなわちてんかんを有しない場合のレベルが検出されない条件下で行う。したがって、そのようなアッセイでは、生物学的サンプル中で任意のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリペプチドまたは核酸が検出されれば、診断上の存在、またはレベルの増大を示す。
【０１２７】
下記のように、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを検出する多数の方法のいずれかを使用することができる。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドレベルは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、およびｃＤＮＡを含めた任意のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのＤＮＡまたはＲＮＡを検出することによって検出することができる。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチド自体を検出するか、あるいはＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質活性を検出することによって検出することができる。検出は、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベル（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質レベル、またはタンパク質活性）の定量を含んでよく、あるいは別法では、特に対照レベルと比較した、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベル、またはその有無の定性的評価であってよい。上記のいずれかを検出する多数の方法のいずれかを下記のように使用することができる。そのような方法には、例えば、ハイブリダイゼーション、増幅、および他のアッセイが含まれる。
【０１２８】
特定の実施形態では、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで検出される、細胞中のレベルの増大、または診断上の存在についての検出能を、てんかん患者の神経細胞に関するマーカーとして、すなわち患者における神経細胞の数または局在性をモニタリングするために使用する。
【０１２９】
典型的に、本明細書中で検出されるＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、天然に存在するＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子に対して、少なくとも約５０、１００、２００、またはそれ以上のヌクレオチド、または２０、５０、１００、またはそれ以上のアミノ酸の領域にわたって、少なくとも約７０％同一、および好ましくは７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上同一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドである。そのようなポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、機能的または非機能的フォームのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ、またはその任意の変異体、誘導体、または断片であり得る。
【０１３０】
コピー数の検出
例えば、てんかんの診断または存在に関する一実施形態では、コピー数、すなわち細胞中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子の数を評価する。一般に、所与の常染色体遺伝子に関して、動物は２コピーの各遺伝子を有する。しかし、コピー数は、例えば神経細胞中の遺伝子の増幅または複製によって増加するか、あるいは欠失によって減少し得る。特定の遺伝子のコピー数を評価する方法は当業者に周知であり、それには、とりわけ、ハイブリダイゼーションベースのアッセイおよび増幅ベースのアッセイが含まれる。
【０１３１】
ハイブリダイゼーションベースのアッセイ：多数のハイブリダイゼーションベースのアッセイのいずれかを使用して、生物学的サンプルの細胞中のＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａ遺伝子またはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａ遺伝子のコピー数を検出することができる。そのような方法の１つはサザンブロットに基づく方法である。サザンブロットでは、典型的にゲノムＤＮＡを断片化し、電気泳動によって分離し、メンブレンにトランスファーし、次いでＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ特異的プローブにハイブリダイズさせる。コピー数の決定では、標的領域に関するプローブ由来のハイブリダイゼーションシグナルの強度を正常なゲノムＤＮＡの領域（例えば、同一または関連細胞、組織、器官、などの増幅されない部分）に関する対照プローブ由来のシグナルと比較することによって、相対的なＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのコピー数の見積りが得られる。サザンブロット方法論は当技術分野において周知であり、例えば、Ausubel et al., またはSambrook et al., 上掲に記載されている。
【０１３２】
サンプル中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子のコピー数を決定する代替の手段は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、例えば蛍光ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、すなわちＦＩＳＨに基づく方法である。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションアッセイは周知である（例えば、Angerer, Meth. Enzymol, 152: 649, 1987）。一般に、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションは以下の主要ステップを含む：（１）分析対象の組織または生物学的構造の固定；（２）標的ＤＮＡの到達性を高め、かつ非特異的結合を減少させるための生物学的構造のプレハイブリダイゼーション処理；（３）核酸の混合物と生物学的構造または組織中の核酸のハイブリダイゼーション；（４）ハイブリダイゼーションにおいて未結合の核酸断片を除去するためのハイブリダイゼーション後の洗浄；および（５）ハイブリダイズした核酸断片の検出。
【０１３３】
そのような用途で使用されるプローブは、典型的に、例えば放射性同位体または蛍光レポーターで標識されている。好ましいプローブは、ストリンジェントな条件下で標的核酸（群）と特異的にハイブリダイズするために十分な長さを有し、例えば、約５０、１００、または２００ヌクレオチド〜約１０００以上のヌクレオチド長である。
【０１３４】
多数の実施形態では、「比較プローブ」法、例えば比較ゲノムハイブリダイゼーション（ＣＧＨ）を使用してＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子の増幅を検出する。比較ゲノムハイブリダイゼーション法では、核酸の「試験」コレクションを第一の標識で標識し、第二のコレクション（例えば、健常細胞または組織由来）を第二の標識で標識する。核酸のハイブリダイゼーションの比はアレイの各ファイバーに結合している第一および第二の標識の比によって決定される。例えば試験コレクション中の遺伝子増幅に起因する２種類の標識由来のシグナルの比の差異を検出する。その比はＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子のコピー数の尺度を提供する。
【０１３５】
本発明の方法との併用に適したハイブリダイゼーションプロトコルは、例えば、Albertson, EMBO J., 3: 1227-1234, 1984; Pinkel, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85: 9138-9142, 1988; ＥＰＯ公報第４３０，４０２号; METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, VOL. 33: In Situ Hybridization Protocols, Choo（編）, 1994, Humana Press, Totowa, NJ, などに記載されている。
【０１３６】
増幅ベースのアッセイ：別の実施形態では、増幅ベースのアッセイを使用して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを検出するか、あるいはＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子のコピー数を測定する。そのようなアッセイでは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの核酸配列は増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、すなわちＰＣＲ）の鋳型として機能する。定量的増幅では、増幅産物の量は元のサンプル中の鋳型の量に比例する。適切な対照と比較すると、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子のコピー数の尺度が得られる。定量的増幅の方法は当業者に周知である。定量的ＰＣＲの詳細なプロトコルは、例えば、Innis, et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press, Inc. N.Y., 1990に提供されている。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの核酸配列は、当業者がその遺伝子の任意の部分を増幅するプライマーを通常通りに選択することを可能にするのに十分である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ＴａｑＭａｎに基づくアッセイを使用してＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドを定量する。ＴａｑＭａｎに基づくアッセイでは、５’蛍光色素および３’消光剤を含有する蛍光発生オリゴヌクレオチドプローブを使用する。前記プローブはＰＣＲ産物にハイブリダイズするが、３’末端の遮断剤のせいでそれ自体の伸長は不可能である。前記ＰＣＲ産物が以後のサイクルで増幅されると、ポリメラーゼ、例えばＡｍｐｌｉＴａｑの５’ヌクレアーゼ活性によってＴａｑＭａｎプローブの切断が生じる。この切断によって５’蛍光色素と３’消光剤が分離し、それによって増幅に応じた蛍光の増加が生じる（例えば、Perkin-Elmerによって提供される文献、例えばwww.perkin-elmer.comを参照のこと）。
【０１３８】
他の適切な増幅方法には、非限定的に、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、転写増幅、自律配列複製、ドットＰＣＲ、およびリンカーアダプターＰＣＲ、などが含まれる。Wu, et al., Genomics, 4: 560, 1989; Landegren, et al., Science, 241: 1077, 1988; Barringer, et al., Gene, 89: 117, 1990; Kwoh, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86: 1173, 1989; Guatelli, et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 87: 1874, 1990。
【０１３９】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ発現の検出
ダイレクトハイブリダイゼーションベースのアッセイ：核酸ハイブリダイゼーション技術を使用して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡまたはそれから作製されたｃＤＮＡ）のレベルを検出および／または定量する方法は当業者に公知である。Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, VOLS 1-3, Cold Spring Harbor Press, New York, 1989。
【０１４０】
例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのｃＤＮＡの有無または量を評価する方法の１つにはノーザンブロットが含まれる。簡単には、典型的な実施形態において、所定の生物学的サンプルからｍＲＮＡを単離し、そのｍＲＮＡ種を電気泳動によって分離し、そのゲルからニトロセルロースメンブレンにトランスファーする。次いで標識ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａプローブをそのメンブレンにハイブリダイズさせて前記ｍＲＮＡを特定および／または定量する。
【０１４１】
増幅ベースのアッセイ：別の実施形態では、増幅ベースの方法（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの転写産物（例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのｍＲＮＡ）を検出する。ＲＴ−ＰＣＲ法は当業者に周知である（例えば、Ausubel, et al., 上掲を参照のこと）。好ましくは、定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用し、それによってサンプル中のｍＲＮＡのレベルを対照サンプルまたは値と比較することを可能にする。
【０１４２】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチド発現の検出：核酸ハイブリダイゼーション技術を使用するＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの遺伝子および遺伝子発現の検出に加えて、そのポリペプチドを検出または定量することによってＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａレベルを検出および／または定量することもできる。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドは、当業者に周知の多数の手段のいずれかによって検出および定量する。これらの手段には、分析生化学的方法、例えば電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、高拡散（hyperdiffusion）クロマトグラフィー、など、または種々の免疫学的方法、例えば液体またはゲル沈降反応、免疫拡散（単純または二重）、免疫電気泳動法、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ、ウエスタンブロッティング、などが含まれる。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの検出は下記セクションＶＩで考察される。
【０１４３】
原核生物および真核生物における発現
いくつかの実施形態では、組換えテクノロジーを使用してＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドを生成することが望ましい。クローニングされた遺伝子または核酸、例えばＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドをコードするｃＤＮＡの高レベルの発現を達成するために、典型的には、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ配列を、転写を支配する強力なプロモーター、転写／翻訳ターミネーター、および、タンパク質をコードする核酸の場合には、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターにサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは当技術分野において周知であり、例えば、Sambrook et al.およびAusubel et al.に記載されている。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質を発現するための細菌発現系は、例えば大腸菌（E. coli）、バチルス種（Bacillus sp.）、およびサルモネラ（Salmonella）において利用可能である。そのような発現系に関するキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母、および昆虫細胞に関する真核生物の発現系は当技術分野において周知であり、同様に市販されている。一実施形態では、真核生物の発現ベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ベクター、またはレトロウイルスベクターである。Palva, et al., Gene, 22: 229-235, 1983; Mosbach, et al., Nature, 302: 543-545, 1983。
【０１４４】
治療的適用では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ核酸を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、またはｅｘ ｖｉｖｏで細胞に導入する。その場合、非限定的に、ウイルスベクターを用いた感染、リポソームベースの方法、微粒子銃による粒子加速（遺伝子銃）、および裸のＤＮＡの注射を含めた多数の方法のいずれかを使用する。そのような治療的に有用な核酸には、非限定的に、全長ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのコード配列、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ断片、ドメイン、誘導体、または変異体のコード配列、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａアンチセンス配列、およびＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａリボザイムが含まれる。典型的に、そのような配列はプロモーターに作動可能に連結されるが、多数の適用では、それ自体が治療的に直接有効である核酸、例えば特定のアンチセンスまたはリボザイム分子を細胞に投与する。
【０１４５】
異種核酸の発現を支配するために使用されるプロモーターは具体的適用に依存する。プロモーターは、場合により、その天然環境における転写開始部位からの距離とおよそ同一の、異種転写開始部位からの距離に位置する。しかし、当技術分野において公知のように、プロモーター機能を失うことなく、この距離をいくらか変化させることが許容され得る。
【０１４６】
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的に、宿主細胞でのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａコード核酸の発現に必要なすべての追加エレメントを含有する転写単位または発現カセットを含有する。ゆえに、典型的な発現カセットは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター、および転写産物の効率的なポリアデニル化に必要なシグナル、リボソーム結合部位、および翻訳終結部位を含有する。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドをコードする核酸配列は、コード対象のタンパク質のトランスフェクト細胞による分泌を促進するために切断シグナルペプチド配列に連結することができる。そのようなシグナルペプチドには、とりわけ、組織プラスミノゲンアクチベーター、インスリン、およびニューロン成長因子、およびHeliothis virescensの幼若ホルモンエステラーゼ由来のシグナルペプチドが含まれるであろう。前記カセットの追加エレメントには、エンハンサーおよび、構造遺伝子としてゲノムＤＮＡが使用される場合には、機能的スプライスドナーおよびアクセプター部位を有するイントロンが含まれ得る。
【０１４７】
プロモーター配列に加えて、前記発現カセットは、効率的な終結をもたらす、構造遺伝子の下流の転写終結領域をさらに含有すべきであろう。その終結領域はプロモーター配列と同一の遺伝子から取得してよく、あるいは別の遺伝子から取得してもよい。
【０１４８】
細胞内への遺伝情報の輸送に使用される具体的な発現ベクターは特に重要ではない。真核細胞または原核細胞での発現に使用される慣用のベクターのいずれかを使用することができる。標準的な細菌発現ベクターには、プラスミド、例えばｐＢＲ３２２ベースのプラスミド、ｐＳＫＦ、ｐＥＴ２３Ｄ、および融合発現系、例えばＧＳＴおよびＬａｃＺが含まれる。エピトープタグ、例えばｃ−ｍｙｃ、ＨＡ−タグ、６−Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質、ＶＳＶ−Ｇタグ、抗ＤＹＫＤＤＤＤＫタグ、または任意のそのようなタグを組換えタンパク質に付加して、好都合な単離方法を提供することもできる。多数のタグが当業者に周知である。
【０１４９】
真核生物の発現ベクターでは、真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクター、およびエプスタイン・バーウイルス由来のベクターが典型的に使用される。他の典型的な真核生物のベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳癌ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞での発現に有効であることが示されている他のプロモーターの支配下でタンパク質の発現を許容する任意の他のベクターが含まれる。
【０１５０】
いくつかの発現系は、遺伝子増幅を提供するマーカー、例えばネオマイシン、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ、およびジヒドロ葉酸レダクターゼを有する。あるいは、遺伝子増幅を含まない高収量発現系、例えば、昆虫細胞において、ポリヘドリンプロモーターまたは他の強力なバキュロウイルスプロモーターの支配下にＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドをコードする配列を有するバキュロウイルスベクターを使用する発現系も適切である。
【０１５１】
発現ベクターに典型的に含まれるエレメントには、大腸菌で機能するレプリコン、組換えプラスミドを有する細菌の選択を可能にする抗生物質耐性をコードする遺伝子、および真核生物の配列の挿入を許容するプラスミドの非必須領域中の唯一の制限部位も含まれる。選択される具体的な抗生物質耐性遺伝子は重要ではなく、当技術分野において公知の多数の耐性遺伝子のうち任意のものが適切である。場合により、原核生物の配列を選択して、必要であれば、それらが真核細胞中のＤＮＡの複製を妨害しないようにする。
【０１５２】
標準的なトランスフェクション方法を使用して、大量のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質を発現する、細菌、哺乳動物、酵母または昆虫細胞株を作製し、次いで標準的技術を使用してそれを純化する。真核細胞および原核細胞の形質転換は標準的技術にしたがって実施する。Colley, et al., J. Biol. Chem., 264: 17619-17622, 1989; Deutscher（編）, "Guide to Protein Purification," in METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 182, 1990; Morrison, J. Bact., 132: 349-351, 1977; Clark-Curtiss, et al., Methods in Enzymology, 101: 347-362, 1983; Wu, et al.（編）。
【０１５３】
外来性ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための任意の周知の手順を使用することができる。これらの手順には、Superfect（Qiagen）などの試薬、リポソーム、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃による粒子加速（遺伝子銃）、または、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来性遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかを使用することが含まれる。必要なことは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子を発現可能な宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を首尾良く導入可能な特定の遺伝子工学的手順を使用することだけである。Sambrook, et al., 上掲。
【０１５４】
発現ベクターを細胞に導入した後に、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの発現に好都合な条件下でトランスフェクト細胞を培養し、以下で特定される標準的技術を使用してそれを培養物から回収する。原核細胞または真核細胞を培養する方法は周知であり、例えば、Ausubel, et al., Sambrook, et al., およびFreshney, 1993, CULTURE OF ANIMAL CELLS, 第３版, A Wiley-Liss Publicationに教示されている。
【０１５５】
外来性ヌクレオチド配列を宿主細胞に導入するための任意の周知の手順を使用して、ベクター、例えばターゲティングベクターを細胞に導入することができる。これらの手順には、Superfect（Qiagen）などの試薬、リポソーム、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、プラスミドベクター、ウイルスベクター、微粒子銃による粒子加速（遺伝子銃）、または、クローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡまたは他の外来性遺伝物質を宿主細胞に導入するための他の周知の方法のいずれかを使用することが含まれる（例えば、Sambrook, et al., 上掲を参照のこと）。トランスジェニック細胞の作製で必要なことは、少なくとも１つの導入遺伝子を少なくとも１つの宿主細胞に首尾良く導入可能で、次いで標準的方法を使用してそれを選択できる特定の遺伝子工学的手順を使用することだけである。原核細胞または真核細胞を培養する方法は周知であり、例えば、Ausubel, et al., Sambrook, et al., 1993, およびFreshney, CULTURE OF ANIMAL CELLS, 第３版, A Wiley-Liss Publicationに教示されている。
【０１５６】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａトランスジェニック動物
本発明は、１種以上の機能的および構造的に破壊されたＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ対立遺伝子を含むトランスジェニックおよびキメラ非ヒト哺乳動物を提供する。あるいは、トランスジェニック動物中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの追加の遺伝子コピーは、トランスジェニック動物中のＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドまたはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａポリペプチドのレベルを増大させることができる。「キメラ動物」には、目的の機能的ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子を欠いているいくつかの細胞およびその不活性化された遺伝子を有しない他の細胞が含まれる。対照的に「トランスジェニック動物」は、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子を不活性にするか、あるいは別の様式で変化させる特定の改変をそのすべてが有している細胞から構成される。
【０１５７】
典型的にトランスジェニック動物は突然変異ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子をその子孫に常に遺伝可能であり、一方、キメラ動物がその変異を遺伝させる能力は、不活性化された遺伝子がその動物の生殖細胞中に存在するかどうかに依存する。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子を不活性化するか、あるいは別の様式で変化させる改変には、例えば、１個以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換が含まれ得る。その改変は、その遺伝子自体の転写、生じたｍＲＮＡの翻訳および／または安定性を妨害してよく、あるいは不活性であるかまたは別の様式で変化したＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチド、例えば改変された結合特性を有するＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドをコードする遺伝子を生じさせてよい。特に、このトランスジェニック動物およびキメラ動物は、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの１種以上の成分、例えば１種以上のジンクフィンガー結合ドメイン、異種タンパク質結合ドメインに関するコード配列を欠いていてよい。ゆえに、そのような導入遺伝子は、内因性ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ対立遺伝子内の任意の１つ以上のコドンを排除し得る。好ましい実施形態では、トランスジェニック動物は、全長タンパク質の少なくとも１０、２０、３０、またはそれ以上のコドンを欠いている対立遺伝子を有する。さらに、トランスジェニック動物は、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの発現または機能に必要な非コード配列、例えば５’または３’調節配列を欠いていてよい。
【０１５８】
トランスジェニック動物およびこれらの動物由来の細胞を使用して、下記のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質をスクリーニングおよび試験するアッセイのモジュレーターである化合物を試験することができる。この関連で、野生型または変異ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを発現可能なトランスジェニック動物および細胞株を試験物質に曝露することができる。これらの試験物質は、野生型ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの過剰発現を減少させるか、あるいは変異ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの発現または機能を損なわせる能力に関してスクリーニングすることができる。
【０１５９】
トランスジェニック動物を取得する方法は、例えば、ＰＣＴ公報ＷＯ ０１／３０７９８, Puhler, A.（編）, 1993, GENETIC ENGINEERING OF ANIMALS, VCH Publ.; Murphy and Carter, eds., 1993, TRANSGENESIS TECHNIQUES: PRINCIPLES AND PROTOCOLS (Methods in Molecular Biology, Vol. 18); およびPinkert, CA（編）, TRANSGENIC ANIMAL TECHNOLOGY: A LABORATORY HANDBOOK, 1994, Academic Pressに記載されている。
【０１６０】
典型的には、改変されたＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子を、例えば相同組換えによって、胚性幹細胞（ＥＳ）に導入する。胚性幹細胞は着床前の胚から取得し、ｉｎ ｖｉｔｒｏで培養する。例えば、Hooper, ML, 1993, EMBRYONAL STEM CELLS: INTRODUCING PLANNED CHANGES INTO THE ANIMAL GERMLINE (Modern Genetics, Vol. 1), Int'l. Pub. Distrib., Inc.; Bradley, et al., Nature, 309: 255-258, 1984を参照のこと。その後、形質転換ＥＳ細胞を非ヒト動物、例えばマウス由来の胚盤胞と混合する。ＥＳ細胞はその胚にコロニーを形成し、いくつかの胚では、結果として生じるキメラ動物の生殖系列を形成する。あるいは、ＥＳ細胞または、生物を再構成できる体細胞（「somatic repopulating cells」）を、トランスジェニック哺乳動物を生じさせる、除核された受精卵母細胞への移植用の核の供給源として使用することができる。Jaenisch, Science, 240: 1468-1474, 1988; Wilmut, et al., Nature, 385: 810-813, 1997。
【０１６１】
変異ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子をそのゲノム中に有するトランスジェニックまたはキメラ動物を取得する他の方法は、改変された、例えば不活性のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクターと受精卵母細胞を接触させることである。マウスなどのいくつかの動物では、典型的にｉｎ ｖｉｖｏで受精を実施し、受精卵を外科的に取り出す。他の動物、特にウシでは、生存または屠殺動物から卵を取り出し、その卵をｉｎ ｖｉｔｒｏで受精させることが好ましい。DeBoer, et al., ＷＯ ９１／０８２１６を参照のこと。ｉｎ ｖｉｔｒｏでの受精により、実質的に同期した細胞に導入するための変法が可能になる。
【０１６２】
典型的には、受精卵母細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏで培養し、約１６〜１５０細胞を含有する着床前の胚を取得する。１６〜３２細胞期の胚は桑実胚と称され、３２を超える細胞を含有する着床前の胚は胚盤胞と称される。これらの胚は胞胚腔の発生を示し、典型的にその時期は６４細胞期である。胚の細胞中の所望のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ突然変異の存在は、当業者に公知の方法、例えば、サザンブロッティング、ＰＣＲ、ＤＮＡシーケンシング、または他の標準的方法によって検出することができる。受精卵母細胞を着床前段階まで培養する方法は、例えば、Gordon, et al., Methods Enzymol., 101: 414, 1984; Hogan, et al., MANIPULATION OF THE MOUSE EMBRYO: A LABORATORY MANUAL, C.S.H.L. N.Y. (マウス胚), 1986; Hammer, et al., Nature, 315: 680, 1985 (ウサギおよびブタ胚); Gandolfi, et al., J. Reprod. Fert., 81: 23-28, 1987; Rexroad, et al., J. Anim. Sci., 66: 947-953 (ヒツジ胚), 1988; Eyestone, et al., J. Reprod. Fert., 85: 715-720, 1989; Camous, et al., J. Reprod. Fert., 72: 779-785, 1984; Heyman, et al., Theriogenology, 27: 5968 (ウシ胚), 1987に記載されている。着床前の胚を、後の着床までの期間凍結して保存することもできる。
【０１６３】
着床前の胚を適切な雌に導入すると、導入遺伝子が組み込まれた時点の発生の段階に応じて、トランスジェニックまたはキメラ動物が出産される。キメラ哺乳動物を繁殖させて、真の生殖系列トランスジェニック動物を形成させることができる。キメラマウスおよび生殖系列トランスジェニックマウスを市販の供給元（例えば、Deltagen, San Carlos, CA）に発注することもできる。
【０１６４】
哺乳動物の細胞または動物に突然変異を導入する他の方法にはリコンビナーゼ系が含まれる。リコンビナーゼ系の使用により、目的の遺伝子座の全体または部分を欠失させることができる。リコンビナーゼ系の例には、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘ系（例えば、Gu, et al., Science, 265: 103-106, 1994; Terry, et al., Transgenic Res., 6: 349-356, 1997を参照のこと）およびＦＬＰ／ＦＲＴ部位特異的組込み系（例えば、Dymecki, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 6191-6196, 1996を参照のこと）が含まれる。これらの系では、典型的に、特定のリコンビナーゼによって認識される部位を、欠失対象の遺伝子の部分に隣接する位置でゲノムに導入する。次いでリコンビナーゼを細胞に導入すると、前記組換え部位が隣接するポリヌクレオチド配列をゲノムから欠失させる組換えが触媒される。所望であれば、例えば、リコンビナーゼの発現を駆動する組織特異的プロモーターを使用することによって、特定の細胞タイプのみが目的のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子を欠いている動物を取得することができる。Tsien, et al., Cell, 87: 1317-26, 1996; Brocard, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 10887-10890, 1996; Wang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 93: 3932-6, 1996; Meyers, et al., Nat. Genet., 18: 136-41, 1998。
【０１６５】
細胞または動物におけるＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ遺伝子中の任意の突然変異の存在は、本明細書中に記載の任意の方法、例えば、サザンブロット、ＰＣＲ、ＤＮＡシーケンシングを使用するか、あるいは任意のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ依存性細胞または生体特性または行動に基づくアッセイを使用して検出することができる。例えば、Ausubel et al., 上掲を参照のこと。
【０１６６】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドの精製
天然に存在するか、または組換え型のＥＦＨＣ１ポリペプチド、ミオクロニン１、またはＥＦＨＣ１ａポリペプチド、ミオクロニン２を、機能的アッセイ、結合アッセイ、診断アッセイ、および他の適用で使用するために精製することができる。天然に存在するＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドは、例えば哺乳動物の組織、例えば血液、リンパ組織、またはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａホモログの任意の他の供給源から精製する。組換えＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドは、任意の適切な細菌または真核生物の発現系、例えばＣＨＯ細胞または昆虫細胞から精製する。
【０１６７】
標準的技術によってＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質を実質的に純粋にまで精製することができ、その技術には、非限定的に、硫酸アンモニウムなどの物質を用いた選択的沈殿；カラムクロマトグラフィー、免疫精製法、および他の技術が含まれる（例えば、Scopes, 1993, PROTEIN PURIFICATION: PRINCIPLES AND PRACTICE; 米国特許第４，６７３，６４１号; Ausubel et al., 上掲; およびSambrook et al., 上掲を参照のこと）。
【０１６８】
組換えＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドが精製対象である場合、多数の手順を使用することができる。例えば、確立された分子接着特性を有するタンパク質をＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドに可逆的に融合することができる。適切なリガンドを用いて、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドを精製カラムに選択的に吸着させ、次いで相対的に純粋な形態でカラムから遊離させることができる。次いで酵素活性によって前記融合タンパク質を除去する。イムノアフィニティーカラムを使用してＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質を精製することもできる。
【０１６９】
組換えＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質の精製：形質転換された細菌または真核細胞、例えばＣＨＯ細胞または昆虫細胞によって組換えタンパク質を大量発現させる。典型的にはプロモーターの誘導後に発現させるが、発現は構成的であってもよい。ＩＰＴＧを用いたプロモーターの誘導は誘導プロモーター系の一例である。当技術分野の標準的手順にしたがって細胞を培養する。タンパク質の単離には新鮮な細胞または凍結細胞を使用する。
【０１７０】
細菌で発現されたタンパク質は不溶性凝集体（「封入体」）を形成し得る。ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ封入体の精製に適した複数のプロトコルが存在する。例えば、封入体の精製は、典型的に、細菌細胞の破壊による封入体の抽出、分離および／または精製を含む。上記精製は、例えば、５０ｍＭ ＴＲＩＳ／ＨＣＬ ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１ｍＭ ＡＴＰ、および１ｍＭ ＰＭＳＦのバッファー中でインキュベートすることによって行う。その細胞懸濁物をFrench Pressに２〜３回通して溶解し、Polytron（Brinkman Instruments）を使用してホモジナイズするか、あるいは氷上で超音波処理することができる。細菌を溶解する代替の方法は当業者に自明である（例えば、Sambrook et al., 上掲; Ausubel et al., 上掲を参照のこと）。
【０１７１】
必要であれば、封入体を可溶化し、典型的に、溶解細胞の懸濁物を遠心分離して、望ましくない不溶物を除去する。封入体を形成したタンパク質を適合性バッファーを用いた希釈または透析によって再生させることができる。適切な溶媒には、非限定的に、尿素（約４Ｍ〜約８Ｍ）、ホルムアミド（容量／容量ベースで少なくとも約８０％）、および塩酸グアニジン（約４Ｍ〜約８Ｍ）が含まれる。凝集体形成タンパク質を可溶化可能ないくつかの溶媒、例えばＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）および７０％ギ酸は、この手順での使用には不適切である。その理由は、タンパク質が不可逆的に変性し、免疫原性および／または活性の欠如を伴う可能性があるからである。塩酸グアニジンおよび類似物質は変性剤であるが、この変性は不可逆的ではなく、その変性剤を除去（例えば透析による除去）または希釈して再生させることができ、免疫学的および／または生物学的に活性なタンパク質の再形成が許容される。他の適切なバッファーは当業者に公知である。標準的分離技術によって、例えばＮｉ−ＮＴＡアガロース樹脂を用いて、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドを他の細菌タンパク質から分離する。
【０１７２】
あるいは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドを細菌ペリプラズムから精製することが可能である。細菌を溶解した後、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質が細菌のペリプラズムに輸送される場合、当業者に公知の他の方法に加えて低温浸透圧ショックによって細菌のペリプラズム画分を単離することができる。組換えタンパク質をペリプラズムから単離するために、細菌細胞を遠心分離してペレットを形成させる。そのペレットを、２０％スクロースを含有するバッファーに再懸濁する。細胞を溶解するために、細菌を遠心分離し、そのペレットを氷冷５ｍＭ ＭｇＳＯ４に再懸濁し、氷浴中で約１０分間維持する。その細胞懸濁物を遠心分離し、上清をデカントして保存する。当業者に周知の標準的分離技術によって、上清中に存在する組換えタンパク質を宿主タンパク質から分離することができる。
【０１７３】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａポリペプチドを精製するための標準的なタンパク質分離技術：最初のステップとしてよくあるように、特にタンパク質混合物が複雑である場合には、最初の塩による分画によって多数の望ましくない宿主細胞タンパク質（または細胞培養培地由来のタンパク質）を目的の組換えタンパク質から分離することができる。好ましい塩は硫酸アンモニウムである。硫酸アンモニウムは、タンパク質混合物中の水の量を効果的に減少させることによってタンパク質を沈殿させる。そしてタンパク質はその溶解度に基づいて沈殿する。タンパク質がより疎水性であるほど、より低い硫酸アンモニウム濃度で沈殿する可能性が高くなる。典型的なプロトコルには、飽和硫酸アンモニウムをタンパク質溶液に加えて、結果として生じる硫酸アンモニウム濃度が２０〜３０％の範囲になるようにすることが含まれる。この濃度は最も疎水性のタンパク質を沈殿させる。次いで（目的のタンパク質が疎水性でない限り）沈殿を捨て、上清に硫酸アンモニウムを加えて、目的のタンパク質を沈殿させることが知られている濃度にする。次いで沈殿をバッファーに溶解し、必要であれば透析またはダイアフィルトレーションによって過剰の塩を除去する。タンパク質の溶解度に依存する他の方法、例えば低温エタノール沈殿は当業者に周知であり、その使用によって複雑なタンパク質混合物を分画することができる。
【０１７４】
ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質の分子量を利用し、種々の孔サイズの膜（例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅメンブレン）を介する限外ろ過を使用して、それより大きいサイズおよび小さいサイズのタンパク質からそれを単離することができる。第一ステップとして、目的のタンパク質の分子量より小さい分子量カットオフを有する孔サイズの膜を通してタンパク質混合物を限外ろ過する。次いでその限外ろ過の残留物（retentate）を、目的のタンパク質の分子量より大きい分子カットオフを有する膜に対して限外ろ過する。組換えタンパク質は膜を通過してろ液に入る。次いでそのろ液を下記のようにクロマトグラフィーに付することができる。
【０１７５】
また、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａタンパク質を、そのサイズ、正味の表面電荷、疎水性、および異種分子に対する親和性に基づいて他のタンパク質から分離することもできる。さらに、タンパク質に対して産生された抗体をカラム基質にコンジュゲートして、そのタンパク質を免疫精製することができる。すべてのこれらの方法は当技術分野において周知である。多数の諸製造元（例えば、Pharmacia Biotech）の装置を使用して、任意の規模で、クロマトグラフ技術を実施できることが当業者には自明である。
【０１７６】
てんかんの診断
本発明は、多数の種類のてんかんのいずれかを診断する多数の方法、例えば患者がてんかんを有するか否か、生物学的サンプルがてんかんを起こしやすい神経細胞を含有するか否かを判定する方法、患者がてんかんを発症する可能性を見積もる方法、およびてんかんを有する患者において抗てんかん治療の有効性をモニタリングする方法を提供する。そのような方法は、てんかんを起こしやすい神経細胞がＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドのレベル（すなわち遺伝子コピー数および／またはｍＲＮＡ）およびポリペプチドレベルの低下を示すという発見に基づくものである。したがって、細胞が、低下したレベルのＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａポリヌクレオチドまたはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａポリペプチド、例えばミオクロニン１またはミオクロニン２を含有するか否かを判定することによって、患者がてんかんを起こしやすいか否かを判定することが可能である。さらに、そのような細胞の存在を間接的に決定することができ、すなわち特定の実施形態では、それ自体はてんかんを起こしやすい細胞を含有しないが、身体の他の場所で細胞を有する動物から採取された生物学的サンプルは、低下したレベルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを含有し得る。それはてんかんを起こしやすい細胞の存在を反映する。
【０１７７】
てんかんの検出
本発明の多数の実施形態では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチド（またはその対立遺伝子変異体）のレベルおよび／または存在を生物学的サンプル中で検出し、それによって、その生物学的サンプル中の、あるいは特定の実施形態ではその生物学的サンプルの採取元の患者における、てんかんを起こしやすい神経細胞の有無を検出する。好ましい実施形態では、生物学的サンプルは、てんかんを起こしやすい神経細胞を含有することが疑われる組織由来の組織サンプルを含む。例えば、てんかんを有することが疑われる患者の神経組織を取り出す。そのような方法は、追加の診断法、例えば、他のてんかんマーカーの検出、乳房Ｘ線撮影、などと併用されることが多い。他の実施形態では、てんかん、例えば若年性ミオクローヌスてんかんを起こしやすいｃ神経細胞を含有することが知られている組織サンプルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａレベルを検出して、そのてんかんについての情報、例えば、特定の治療の有効性、その動物の生存予測、などを決定する。
【０１７８】
てんかんの存在を示すＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量は、多数の因子に依存し、その因子には、てんかんの種類、患者の年齢、性別、病歴、など、細胞タイプ、アッセイ形式、などが含まれる。好ましい実施形態では、生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルを定量するか、あるいは対照サンプルと直接比較したりせずに、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの「診断上の存在」と比較してそれを検出する。その場合、「診断上の存在」とは、サンプルの採取元の患者において、てんかんの存在を示すか、あるいはてんかんの可能性を示すＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの量を表す。好ましくは、「診断上の存在」は、陽性または陰性の結果をもたらすシンプルなアッセイで検出可能である。そのアッセイでは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの「診断上の存在」についての陽性の「検出」は、その患者におけるてんかんの存在を示す。
【０１７９】
検出対象の「診断上の存在」に関してＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａレベルを定量する必要はなく、単に、正常な、てんかんを有しない細胞、サンプル、または哺乳動物でのレベルより高いレベルでＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａが存在するかどうかを判定する任意の方法でよい。さらに、「診断上の存在」とは、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの何らかの絶対量を表すものではなく、生物学的サンプル、細胞タイプ、アッセイ条件、患者の医学的症状、などに応じて、てんかん、またはてんかん前のサンプルにおけるレベルを、正常な、てんかんを有しないサンプル中のレベルと区別するために十分な量に関する。
【０１８０】
前記方法は、任意のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチドが特定の対照サンプル中に通常存在するかどうか、あるいは存在することが「予測される」かどうかに関わらずに実施することができる。例えば、特定の細胞タイプではＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａが発現されず、その結果、そのような細胞タイプからなる対照生物学的サンプル中にはＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａがまったく存在しなくてよい。そのような生物学的サンプルでは、「診断上の存在」とは、任意のアッセイを使用して任意の量のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａが検出可能であることを表す。しかし、他の組織では、正常な、てんかんを有しない細胞中に検出可能なレベルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａが存在するかもしれず、「診断上の存在」はその正常レベルより高いレベルを表し、好ましくはその正常レベルを超える「統計学的に有意な」増大を表す。上で考察されるように、生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチド、ポリペプチド、および／またはタンパク質活性の「診断上の存在」は、正常な、てんかんを有しない患者から採取されたサンプル中で予測されるレベルより少なくとも約１．５、２、５、１０倍、またはそれ以上のレベルであることが多い。
【０１８１】
さらに、本方法を使用して、治療過程の有効性を評価することができる。例えば、低下した量のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含有することが見出されている生物学的サンプルの採取元であるてんかんを有する患者において、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａレベルを経時的にモニタリングすることによって、抗てんかん治療の有効性を評価することができる。例えば、治療後の患者から採取された生物学的サンプル中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチドレベルが、その治療前、またはその治療のより早い段階で該患者から採取されたサンプル中のレベルと比較して低下すれば、治療が有効であることが示される。
【０１８２】
一実施形態では、細胞傷害性アッセイによって、ヒト血清中のＥＦＨＣ１およびＥＦＨＣ１ａ抗原に対するＩｇＧ抗体を検出するための、あらかじめ較正されたＥＬＩＳＡ試薬を提供する。所定量のアフィニティー精製済みＥＦＨＣ１およびＥＦＨＣ１ａ抗原をTerasakiトレイの個別のウェルに入れる。試験サンプル由来の抗体と前記抗原のいずれかの特異的結合は、その後、ヒトＩｇＧのみを認識する、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗体とインキュベートすることによって検出する。反応の程度についての定量的測定は、適切な酵素基質を加えた後の発色に関する分光光度測定によって達成する。抗体特異性の定性的評価は、適切な標準および対照を使用して細胞傷害性アッセイの反応性パターンを分析することによって実施する。
【０１８３】
予後の決定
ＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａまたはその対立遺伝子変異体のレベルを利用して、てんかんを有する患者の予後を決定することができる。例えば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの検出以外の技術、例えば組織生検を使用しててんかんを検出するのであれば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの有無を利用して、患者の予後を決定することができる。すなわち、てんかんを有するが、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルが正常である患者と比較して、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルが低下すれば、患者の生存予測の低下が示される。本明細書中で使用される「生存予測」とは、疾患、症状、またはその任意の徴候の重症度、持続時間、または進行に関する予測を表す。好ましい実施形態では、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの、レベルの増大、診断上の存在、または定量レベルは、多数の患者において観察された疾患、症状、または徴候の進行と統計学的に相関し、それによってデータベースが提供され、そのデータベースから、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの任意の検出レベルまたは存在を考慮して統計学に基づく予後を決定できる。例えば、特定の種類の患者、すなわち特定の年齢、性別、医学的症状、病歴、などのヒトで、対照レベルの例えば２倍のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルが検出されれば、正常レベルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａを有する同様のヒトと比較して、該ヒトの生存予測が例えば１０％低下することを示され、その予測は、疾患進行が観察および記録された多数の同様の患者におけるＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのレベルについての以前の研究に基づくものである。
【０１８４】
好ましい治療過程の決定
本方法を使用して、てんかんを有する患者において最適な治療過程を決定することができる。例えば、低下したレベルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの存在は、てんかんを有する患者の生存予測の低下を示し得る。
【０１８５】
好ましい治療過程の決定
本方法を使用して、てんかんを有する患者において最適な治療過程を決定することができる。例えば、低下したレベルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａの存在は、てんかんを有する患者の生存予測の低下を示し、それによって、その患者には、より侵襲的な治療が必要であることが示され得る。さらに、ＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａのレベル、またはＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａの診断上の存在の有無と、１種または別の抗てんかん剤の相対的有効性の間では、容易に相関を確立することができる。そのような分析は、例えば遡及的に、すなわち、１以上の種類の抗てんかん治療を後に受けることになる患者からあらかじめ採取されたサンプル中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａレベルを検出し、そのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａレベルと前記治療について知られている有効性の相関関係を調べることによって実施することができる。
【０１８６】
多数の実施形態では、例えば抗ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ抗体を使用する免疫アッセイによって検出される、患者の神経細胞中のＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのレベルを利用して、ＥＦＨＣ１もしくはＥＦＨＣ１ａまたはその活性に対する治療の効果に基づいた抗てんかん治療の選択を導く。好ましい実施形態では、低下したレベルまたは診断レベルのＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａが検出されれば、ＥＦＨＣ１またはＥＦＨＣ１ａ、その対立遺伝子変異体の活性を阻害する治療の使用が有益であることが示される。
【０１８７】
治療計画
本発明は、製薬的に許容される担体とともに製剤化された、抗てんかん活性を有するＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの１種または組み合わせを含む医薬組成物を提供する。いくつかの組成物は、複数（例えば、２種以上）の本発明のＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの組み合わせを含む。
【０１８８】
予防的適用では、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの医薬組成物または医薬品を、疾患または症状（例えば、てんかん疾患）に罹患しやすいか、あるいは別の様式でそのリスクがある患者に、該疾患の生化学的、組織学的および／または行動的徴候、その合併症および該疾患の発生中に現れる中間の病理学的表現型を含めた該疾患のリスクを排除するか、あるいは減少させ、その重症度を低下させるか、あるいはその発生を遅延させるために十分な量で投与する。治療的適用では、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの組成物または医薬品（medicants）を、前記疾患に罹患していることが疑われるか、あるいはすでに罹患している患者に、その合併症および該疾患の発生中の中間の病理学的表現型を含めた該疾患の徴候（生化学的、組織学的および／または行動的徴候）を治癒するか、あるいは少なくとも部分的に停止させるために十分な量で投与する。治療的または予防的な処置を達成するために適切な量は治療または予防上有効な用量として定義される。予防および治療方式のいずれの場合も、通常、十分な予防または治療応答が達成されるまで、複数回の用量で薬剤を投与する。典型的に、予防または治療応答をモニタリングし、その応答が衰え始めたら反復用量を与える。
【０１８９】
本組成物および方法において有用なＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログを、それ自体で、そのプロドラッグ、製薬的に許容される塩、水和物、溶媒和物、酸性塩水和物、Ｎ−オキシドまたは等軸晶の形状（isomorphic crystalline form）の形式で、または治療有効量の化合物が適切な担体または賦形剤（群）と混合されている医薬組成物の形式でヒト患者に投与することができる。
【０１９０】
製薬上許容される担体は、投与対象の具体的な組成物によって、ならびに該組成物の投与に使用される具体的な方法によって部分的に限定されるだけである。したがって、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの組成物を投与するための医薬組成物の適切な製剤が多種多様に存在する（例えば、参照により本明細書中に組み入れられる、Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 第１８版, 1990を参照のこと）。前記医薬組成物は、概して、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、またはＥＦＨＣ１アナログを患者への投与に適した形式で含む。前記医薬組成物は、概して、滅菌されていて、実質的に等張で、かつU.S. Food and Drug AdministrationのすべてのGood Manufacturing Practice（ＧＭＰ）規則に完全にのっとった組成物として製剤化される。
【０１９１】
有効量
本明細書中に記載の、抗てんかん活性を有するＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの有効量は多数の諸因子に応じて変動し、その因子には、投与の手段、標的部位、患者の生理学的状態、該患者がヒトであるか、あるいは動物であるか、投与されている他の医薬品、および治療が予防的であるか、あるいは治癒的であるかが含まれる。通常、患者はヒトであるが、トランスジェニック哺乳動物を含めた非ヒト哺乳動物を治療することもできる。治療用量を力価測定して、安全性および有効性を最適化する必要がある。
【０１９２】
ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログを含む医薬組成物を用いた投与では、その用量は、約０．０００１〜１００ｍｇ／宿主体重ｋｇ、通常は約０．０１〜４０ｍｇ／宿主体重ｋｇ、より通常は約０．１〜約２０ｍｇ／宿主体重ｋｇの範囲である。例えば、用量は１ｍｇ／体重ｋｇまたは１０ｍｇ／体重ｋｇまたは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であり得る。いくつかの方法では、異なる結合特異性を有する２種以上のＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログを同時に投与し、その場合、投与されるその各ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの用量は指定の範囲内に入る。ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの組成物を、通常、複数の機会で投与する。患者におけるそのＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの血中レベルを測定することによって示されるように、間隔は不規則であり得る。いくつかの方法では、用量を調節して、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの血漿濃度１〜１００μｇ／ｍＬを達成する。あるいは、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログを徐放製剤として投与することができ、その場合、低頻度の投与しか必要とされない。用量および頻度は、患者中のＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの半減期に応じて変動する。投与の用量および頻度はその治療が予防的であるか、あるいは治癒的であるかに応じて変動し得る。予防的適用では、比較的低い用量を比較的頻度の低い間隔で長期間にわたって投与する。患者は、その人生の残りの期間、治療を受け続けることもある。治療的適用では、疾患の進行が減少または終結するまで、および好ましくは患者が疾患の徴候の部分的または完全な改善を示すまで、比較的短い間隔で比較的高い用量を必要とすることがある。その後、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログを含む医薬組成物の、予防方式の有効量を該患者に投与することができる。
【０１９３】
投与の経路
製薬上許容される担体とともに製剤化された、抗てんかん活性を有するＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログを、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、頭蓋内、腹腔内、鼻腔内、筋肉内手段によって、あるいは吸入剤として投与することができる。ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの最も典型的な投与経路は皮下または静脈内経路であるが、他の経路も同等に有効であり得る。２番目に一般的な経路は非経口経路である。いくつかの方法では、腫瘍が発生している特定の組織に薬剤を直接注射する。いくつかの方法では、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログを、徐放性の組成物または装置、例えばＭｅｄｉｐａｄＴＭ装置を用いて投与する。
【０１９４】
本発明の薬剤は、場合により、種々の疾患の治療に少なくとも部分的に有効な他の薬剤と組み合わせて投与することができる。例えば、てんかんの場合、本発明の薬剤を、血液脳関門（ＢＢＢ）を横切る本発明の薬剤の通過を増大させる他の薬剤と併せて投与することもできる。別の例を挙げれば、本発明の薬剤とともに公知の抗てんかん剤を用いて患者を治療すること（併用療法）が含まれるであろう。
【０１９５】
製剤化
抗てんかん活性を有するＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログは、有効な治療薬、および種々の他の製薬上許容される成分を含む医薬組成物として投与されることが多い。Remington's Pharmaceutical Science, 1990 上掲を参照のこと。好ましい形式は目的の投与および治療的適用の様式に依存する。その組成物には、所望の製剤に応じて、製薬上許容される無毒の担体または希釈剤を含ませてもよい。それらは、動物またはヒトに投与するための医薬組成物を製剤化するために一般に使用されるビヒクルとして規定される。前記希釈剤は、組み合わせの生物学的活性に影響しないように選択される。そのような希釈剤の例は、蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、およびハンクス溶液である。さらに、前記医薬組成物または製剤には、他の担体、補助剤（アジュバント）、または無毒の、非治療的、非免疫原性安定化剤などを含ませることもできる。
【０１９６】
医薬組成物には、大型の、緩徐に代謝される巨大分子、例えばタンパク質、多糖、例えばキトサン、ポリ乳酸、ポリグリコール酸およびコポリマー（例えばラテックス官能化SepharoseTM、アガロース、セルロース、など）、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、および脂質凝集体（例えば油滴またはリポソーム）を含ませることもできる。さらに、これらの担体は免疫賦活剤（すなわち、アジュバント）としても機能し得る。
【０１９７】
非経口投与では、生理学的に許容される希釈剤中の前記物質の溶液または懸濁液の注射用製剤として、滅菌溶液、例えば水、油、生理食塩水、グリセリン、またはエタノールであってよい医薬用担体とともに本発明の組成物を投与することができる。さらに、補助物質、例えば湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、ｐＨ緩衝物質などが組成物中に存在し得る。医薬組成物の他の成分は、石油、動物、植物、または合成起源の成分、例えば、ピーナッツ油、ダイズ油、および鉱油である。一般に、グリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは、特に注射用溶液に関して、好ましい液状担体である。
【０１９８】
有効成分の徐放またはパルス放出を可能にする様式で製剤化できる蓄積注射または移植調製物の形式で、本発明の薬剤を投与することができる。
【０１９９】
典型的には、注射用製剤として、液状の溶液剤または懸濁液剤として組成物を調製する；注射前に液状ビヒクル中で溶解または懸濁するために適した固形物を調製することもできる。上記考察のアジュバント効果を増強するために、リポソームまたは微粒子、例えばポリラクチド、ポリグリコリド（polyglycolide）、またはコポリマー中で前記調製物を乳化またはカプセル化することもできる。Langer, Science 249: 1527, 1990; およびHanes, Advanced Drug Delivery Reviews 28: 97-119, 1997。
【０２００】
他の投与様式に適した追加の製剤には、経口、鼻腔内、および肺製剤、坐剤、および経皮投与の製剤が含まれる。
【０２０１】
坐剤に関して、結合剤および担体には、例えば、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる；０．５％〜１０％、好ましくは１％〜２％の範囲の有効成分を含有する混合物からそのような坐剤を形成させることができる。経口製剤には、賦形剤、例えば医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、および炭酸マグネシウムが含まれる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放製剤または粉末剤の剤形をとり、１０％〜９５％、好ましくは２５％〜７０％の有効成分を含有する。
【０２０２】
局所適用は経皮または皮内送達に帰結し得る。局所投与は、薬剤をコレラ毒素またはその解毒された誘導体もしくはサブユニット、または他の同様の細菌毒素と同時投与することによって促進することができる。Glenn et al., Nature 391: 851, 1998。同時投与は前記成分を混合物として使用することによって達成することができる。
【０２０３】
あるいは、皮膚パッチを使用するか、あるいはトランスフェロソーム（transferosomes）を使用して、経皮送達を達成することができる。Paul et al., Eur. J. Immunol. 25: 3521-24, 1995; Cevc et al., Biochem. Biophys. Acta 1368: 201-15, 1998。
【０２０４】
前記医薬組成物は、概して、滅菌されていて、実質的に等張で、かつU.S. Food and Drug AdministrationのすべてのGood Manufacturing Practice（ＧＭＰ）規則に完全にのっとった組成物として製剤化される。
【０２０５】
毒性
本明細書中に記載の治療上有効な用量のＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログは、実質的に毒性を生じさせることなく治療上の利益を提供する。
【０２０６】
本明細書中に記載のタンパク質の毒性は、細胞培養物または実験動物での標準的な製薬的手順によって、例えばＬＤ５０（集団の５０％に対して致死の用量）またはＬＤ１００（集団の１００％に対して致死の用量）を決定することによって決定することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療係数である。これらの細胞培養アッセイおよび動物試験から取得されたデータを、ヒトにおける使用に無毒の用量範囲の製剤化に利用することができる。本明細書中に記載のＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログまたはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログの用量は、好ましくは、その有効量を含む循環濃度の範囲内であり、毒性はほとんどないか、まったくない。その用量は、採用される剤形および利用される投与の経路に応じて、この範囲内で変動し得る。的確な製剤、投与の経路および用量は、個別の医師が患者の症状を考慮して選択することができる。（例えば、Fingl et al., 1975, In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1,を参照のこと）。
【０２０７】
キット
本発明の組成物（例えば、ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログ、またはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログ）および使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。前記キットは、少なくとも１種の追加の試薬、または１種以上の追加の本発明のＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１アゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１アナログ、またはＥＦＨＣ１ａ、ＥＦＨＣ１ａアゴニスト、もしくはＥＦＨＣ１ａアナログをさらに含有することができる。キットは、典型的に、そのキットの内容物の目的の用途を示すラベルを含む。ラベルという用語には、キット上またはキットとともに供給されるか、あるいは別の様式でキットに付随する、任意の筆記物または記録物が含まれる。
【０２０８】
典型的な実施形態
【実施例１】
【０２０９】
ＥＦＨＣ１の構造および発現
６ｐ１２−ｐ１１の限定された３．５ｃＭ領域で１８遺伝子が特定され、突然変異解析によってＥＦＨＣ１を除くすべての遺伝子がＪＭＥ遺伝子としては除外された（ｒｅｆ．１０およびT.S. et al., 非公開データ）。ＥＦＨＣ１はマーカーＤ６Ｓ１９６０とＤ６Ｓ１０２４の間に位置し、約７２ｋｂにわたり、６４０アミノ酸のタンパク質をコードする。ドメイン検索では、３つのＤＭ１０ドメイン、未知の機能のモチーフ、およびＥＦハンド、Ｃａ２＋結合モチーフが示された（図１ａ）。ＥＦＨＣ１転写産物はエクソン４において選択的スプライシングを受け、その結果、Ｃ末端切断タンパク質が生じる。ノーザン解析では、脳を含めた種々のヒト組織で両転写産物が発現し、検出されることが確認されたが（図１ｃ）、リンパ球では発現されないことがＲＴ−ＰＣＲによって確認された。また、ノーザンブロットで観察された７ｋｂおよび９ｋｂ転写産物に対応する部分的ｃＤＮＡクローンを特定した。これらの長い転写産物は、延長された３’−ＵＴＲを有する転写産物Ｂの構造を含有する可能性があり、その理由はそれらがプローブ２および４によって検出されたからである（図１ｂ，ｃ）。Ｅｆｈｃ１と称されるＥＦＨＣ１のマウスオーソログを単離し、ＲＴ−ＰＣＲおよびノーザンブロット解析によって発現を調査した。２．３ｋｂのＥｆｈｃ１転写産物はノーザンブロットで観察されたが、その解析ではヒトで観察された大きい転写産物はいずれもほとんど検出されなかった。ヒトおよびマウスの両ＥＦＨＣ１タンパク質のアミノ酸残基５２２〜５３３を認識するポリクローナル抗ＥＦＨＣ１抗体を生成し、それらの発現を調査した（図１ｄ〜ｉ）。マウス初代培養ニューロンを抗ＥＦＨＣ１抗体および抗ＭＡＰ２（樹状突起マーカー）または抗リン酸化ニューロフィラメント（軸索マーカー）抗体で二重染色すると、Ｅｆｈｃ１はニューロンの細胞体および樹状突起に局在することが示されたが（図１ｄ〜ｆ）、Ｅｆｈｃ１シグナルは軸索では観察されなかった。マウス脳切片の免疫組織化学では、海馬ＣＡ１領域の錐体ニューロン（図１ｇ）、大脳皮質の錐体ニューロン（図１ｈ）および小脳のプルキンエ細胞（図１ｉ）の細胞体および樹状突起でＥｆｈｃ１シグナルが示された。Bai, et al., Am. J. Med. Genet., 133: 268-274, 2002; Braunewell, et al., Cell Tissue Res., 295: 1-12, 1999。
【０２１０】
図１ａは、（転写産物Ａによってコードされる）ＥＦＨＣ１タンパク質の模式図を示す。図１ｂは、ＥＦＨＣ１アイソフォーム、コンセンサス転写産物Ａ（ＡＫ００１３２８）、転写産物Ｂ（ＡＬ１２２０８４）およびＥＳＴクローン（ＡＹ６０８６８９）の模式図を示す。コード領域は白抜きのボックスで示され、推定上の非翻訳領域は黒色である。転写産物Ａ中の垂直線はＥＦハンドドメインを示す。ノーザンブロット解析に関して使用されるプローブの相対位置を上部に示す。留意すべきは、プローブ２が転写産物Ｂに特異的であることである。図１ｃは、プローブ１、２、３、および４を使用した、ヒト成体組織に関するＥＦＨＣ１のノーザンブロット解析を示す。対照であるβ−アクチン（プローブ１、２、４パネル）またはＧ３ＰＤＨ（プローブ３パネル）プローブに関して取得されたシグナルを下部パネルに示す。図１ｄ〜ｆは、抗ＥＦＨＣ１（ｄ）および抗ＭＡＰ２（ｅ）抗体で二重染色されたＥ１６マウス由来の海馬初代培養ニューロン（ｉｎ ｖｉｔｒｏで６日間）を示す。Ｅｆｈｃ１およびＭＡＰ２のシグナルはほとんどオーバーラップする（ｆ）。図１ｇ〜ｉは、抗ＥＦＨＣ１抗体で染色された成体マウス脳切片を示す。（ｇ）海馬ＣＡ１領域。錐体ニューロンの細胞体および樹状突起はシグナルが示す。Ｏ：上昇層，Ｐ：錐体細胞層，Ｒ：放線状層。図１ｈは大脳皮質の第ＩＩＩ層を示す。ニューロンの細胞体および樹状突起はシグナルを示す（矢印）。図１ｉは小脳を示す。プルキンエ細胞の樹状突起は強いシグナルを示す（矢頭）。ｓｇ：神経細胞層，ｓｇｒ：顆粒層，ｓｍ：分子層。免疫前ウサギ血清またはＥＦＨＣ１ペプチドであらかじめ吸収させた血清を用いた対照染色の結果である。
【実施例２】
【０２１１】
ＪＭＥ家系においててんかん形質とともに分離するＥＦＨＣ１突然変異
ＪＭＥ４４家系（メキシコ系３１家系、ベリーズ出身１家系、およびロス・アンジェルス出身白人１２家系）においてＥＦＨＣ１の突然変異解析を実施した（図２ａ，ｂ）。その解析では、血縁関係のない６家系のすべての２１名の有病者で、３種のヘテロ接合性（Ｆ２２９Ｌ、Ｄ２１０Ｎ、Ｄ２５３Ｙ）および１種の二重ヘテロ接合性（Ｐ７７ＴおよびＲ２２１Ｈ）突然変異が示された（図２ａ）。これらの突然変異（ＪＭＥ突然変異と称される）は、血縁関係のない３８２名の健常対照では観察されなかった。このことはそれらが無意味な多型ではないことを暗示する。ハプロタイプ解析では、二重ヘテロ接合性突然変異の周囲の６４０ｋｂ領域に関するファウンダー効果が示唆された（図２ｃ）。これらの突然変異の４種はＥＦＨＣ１オーソログ間で保存されている残基で生じていた。３種のコード多型（Ｒ１５９Ｗ、Ｒ１８２Ｈ、およびＩ６１９Ｌ）およびいくつかの非コード多型が有病集団および対照集団の両方で検出された。メキシコ系のＪＭＥ３３家系の発端者におけるこれらのコード多型の頻度は、それぞれ１６％（５／３１）、１９％（６／３１）、１０％（３／３１）であり、一般集団では、それぞれ１４％（２９／２０９）、１１％（２３／２１３）、および５％（１０／２０８）であった。その頻度は患者において高かったが、統計学的に有意ではなかった（それぞれｐ＝０．７８，０．２２，０．３８）。ベリーズ出身の大きな３世代家系では、１１名の有病者と同時分離する変異Ｒ１８２Ｈが示された（図２ｂ）。変異Ｉ６１９Ｌは他の３家系の有病者とともに分離した。前記家系を、ＥＦＨＣ１突然変異を有する家系およびそれを有しない家系に再編成し、個別にロッド値を再計算した。２群のスコア間に有意差は認められなかった。Bai, et al., Am. J. Med. Genet., 133: 268-274, 2002; Liu, et al., Am. J. Hum. Genet., 57: 368-381, 1995; Liu, et al., Am. J. Med. Genet., 63: 438-446, 1996。
【０２１２】
図２ａは、メキシコ系ＪＭＥ６家系の１３名のてんかん有病者および８名のＥＥＧ多棘波有病者と同時分離された１種の二重ヘテロ接合性突然変異（Ｐ７７Ｔ＆Ｒ２２１Ｈ）および３種のヘテロ接合性ミスセンス突然変異（Ｆ２２９Ｌ、Ｄ２１０Ｎ、Ｄ２５３Ｙ）を示す。１３名のてんかん有病者のうち、１０名がＪＭＥを有し、３名は大発作のみを有した。ＪＭＥを有する１０名のうち、３名は大欠神発作（rare absence）をさらに有し、１名は群発する大欠神発作を有した。唯一の表現型として現れるピクノレプシー欠神発作（Pyknoleptic absence）はいずれの有病者においても観察されなかった。突然変異を有する複数の家系メンバー（家系＃１のＩ−１；家系＃２のＩＩ−１；家系＃４のＩＩ−２，ＩＩ−３，ＩＩ−６；および家系＃５のＩＩ−３）は症候性てんかんまたはＥＥＧ多棘波を示さなかった。これは７８％（２１／２７）の浸透度を示す。＋：野生型対立遺伝子，ｍ：突然変異対立遺伝子、黒色の記号：ＪＭＥ罹患（Ｍ：ミオクローヌス性、ＧＭ：大発作強直間代性、Ａｂｓ：欠神発作、ＰＳ：ＥＥＧ多棘波複合の光感受性）、半分黒色の記号：ＥＥＧ３．５〜６Ｈｚ多棘徐波複合を有する臨床的に無症候の家系者。（ｂ）Ｒ１８２Ｈアミノ酸変化はベリーズ出身の大きなＪＭＥ家系（家系７）の有病家系者とともに分離し、浸透度は６５％（１１／１７）である。４分の１黒色の記号は熱性痙攣（ＦＣ）を示す。（ｃ）ＥＦＨＣ１遺伝子座の周囲のＪＭＥ家系のハプロタイプ。ハプロタイプ解析では、明らかに血縁関係のない家系＃１および＃２において、二重ヘテロ接合性突然変異の周囲の同一の６４０ｋｂの一連の対立遺伝子が示された。これはファウンダー効果を示唆する。家系＃３、＃４、＃５および＃６では、その突然変異の周囲に共通の対立遺伝子は発見されなかった。このことは家系＃３および＃４で発見された同一の突然変異が反復突然変異イベントによって生じたことを示唆する。ｍ：突然変異対立遺伝子、＋：野生型対立遺伝子、Ｎ：実施されていない。Liu, et al., Am. J. Hum. Genet., 57: 368-381, 1995; Liu, et al., Am. J. Med. Genet., 63: 438-446, 1996。
【実施例３】
【０２１３】
Ｒ型ＶＤＣＣ（Ｃａｖ２．３）の活性化
ニューロンにおけるＥＦＨＣ１およびその突然変異体の機能的重要性を調査するために、マウス海馬初代培養ニューロンをＥＧＦＰ−ＥＦＨＣ１発現構築物でトランスフェクトした（図３ａ〜ｉ）。トランスフェクションの１６時間後、ＥＦＨＣ１陽性ニューロンは短い神経突起および少ない分枝を示した（図３ｂ）。トランスフェクションの４８時間後、すべてのＥＦＨＣ１陽性ニューロンは神経変性および細胞死の徴候を示した。その徴候には、細胞体の収縮および突起の断片化が含まれる（図３ｄ）。一方、対照培養は健康であることが観察された（図３ｃ）。ＥＦＨＣ１トランスフェクト細胞はＴＵＮＥＬ陽性であり、アポトーシスが示唆された（図３ｅ〜ｇ）。次いで、細胞の形態とは無関係に、種々の時点で培養ディッシュに接着したＧＦＰ陽性生存細胞をカウントすることによって、細胞生存性に対するＥＦＨＣ１突然変異の効果を調査した。その結果、５種類のＪＭＥ変異または二重変異Ｐ７７Ｔ／Ｒ２２１Ｈのいずれによっても、ＥＦＨＣ１の細胞死効果が顕著に低減することが示された。対照的に、対照集団でも見られる３種のコード多型は、細胞死効果に顕著に影響を及ぼすことはなかった（図３ｈ）。ＪＭＥ突然変異に関する生存細胞の数はベクターでトランスフェクトされた細胞の数に近いようであるが、ＪＭＥ突然変異でトランスフェクトされた細胞はトランスフェクションの４８時間後に病的な形態を示した。このことは、ＪＭＥ突然変異が、完全には、ＥＦＨＣ１の機能を破壊しなかったことを暗示する。細胞生存に対するＥＦＨＣ１アイソフォームの効果を分析した。転写産物Ｂ発現構築物（Ｉｓｏと称される）は中程度の細胞死効果を生じさせ、ＷＴ（野生型）／Ｉｓｏを共発現させると中間的な効果が示された（図３ｉ）。転写産物Ｂによってコードされるアイソフォームタンパク質の細胞内機能は現在未知であるが、このアイソフォームがそのＯＲＦに突然変異Ｄ２５３Ｙを含まない事実は、このアイソフォームがＪＭＥの病因に主要な役割を果たさないであろうことを示唆する。
【０２１４】
ＥＦＨＣ１はＣａ２＋感受性ＥＦハンドモチーフを含有し、かつ電位依存性Ｃａ２＋チャネル（ＶＤＣＣ）の異常がヒトおよびマウスてんかん患者で報告されているため、観察された細胞死がいずれのＶＤＣＣのモジュレーションに起因するのかを調査した。ＲＴ−ＰＣＲでは、レベルは変動するが、ほとんどのＶＤＣＣサブタイプがマウス初代培養ニューロンで発現されることが示された（図３ｊ）。ＥＦＨＣ１でトランスフェクトされた初代培養ニューロンをＶＤＣＣサブタイプのいくつかのアンタゴニストで処理すると、Ｃａｖ２．３のアンタゴニストであるＳＮＸ−４８２（ｒｅｆ．１７）がＥＦＨＣ１陽性ニューロンの生存率を特異的に増大させることが示された（図３ｋおよび図１５）。Escayg, et al., Am. J. Hum. Genet., 66: 1531-1539, 2000; Jouvenceau, et al., Lancet, 358: 801-807, 2001; Fletcher, et al., Cell, 87: 607-617, 1996; Burgess, et al., Cell, 88: 385-392, 1997; Letts, et al., Nat. Genet., 19: 340-347, 1998。
【０２１５】
図３は、ＧＦＰ−ＥＦＨＣ１（ＥＦＨＣ１のＮ末端にＧＦＰが付加されている）融合タンパク質をコードする発現構築物ｐＥＧＦＰＣ２−ＥＦＨＣ１（ｂ，ｄ）またはＧＦＰのみをコードするｐＥＧＦＰＣ２対照ベクター（ａ，ｃ）で一過的にトランスフェクトされた海馬初代培養ニューロンを示す。その海馬ニューロンを抗ＭＡＰ２抗体で染色した（ａ〜ｄ）。トランスフェクションの１６時間後、ＥＦＨＣ１でトランスフェクトされた細胞は短い神経突起および少ない分枝を示した（ｂ）。トランスフェクションの４８時間後、ＥＦＨＣ１でトランスフェクトされた細胞は、神経変性の形態、例えば細胞体の収縮および突起の断片化を示した（ｄ）。（ｅ〜ｇ）ＥＦＨＣ１でトランスフェクトされた海馬初代培養のＴＵＮＥＬアッセイ。神経細胞を発現構築物ｐｃＤＮＡ３−Ｍｙｃ−ＥＦＨＣ１で一過的にトランスフェクトした。（ｅ）抗ｍｙｃ抗体での染色。（ｆ）ＴＵＮＥＬ陽性細胞。（ｇ）イメージｅ、ｆ、および核クロマチンのＨｏｅｃｈｓｔ染色のオーバーラップ。ほとんどのＥＦＨＣ１トランスフェクト細胞はＴＵＮＥＬ陽性細胞とオーバーラップする（矢印）。（ｈ，ｉ）ＥＦＨＣ１発現構築物によるトランスフェクションの２４、３６、および４８時間後のＧＦＰ蛍光陽性生存細胞数のグラフ。生存細胞数はパーセンテージで表記する；トランスフェクションの２４時間後の時点で１００％とする。各データポイントは７培養ウェル由来の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（野生型ＥＦＨＣ１と比較された場合のｔ検定）を示す。（ｈ）患者においてのみ観察されたＪＭＥ突然変異（Ｐ７７Ｔ／Ｒ２２１Ｈ、Ｐ７７Ｔ、Ｄ２１０Ｎ、Ｒ２２１Ｈ、Ｆ２２９Ｌ、Ｄ２５３Ｙ）はトランスフェクションの３６および４８時間後にＥＦＨＣ１の細胞死効果を顕著に逆転させた。一方、患者および対照の両方で観察された多型（Ｒ１５９Ｗ、Ｒ１８２Ｈ、Ｉ６１９Ｌ）を有する構築物はおおむね細胞死効果を維持した。（ｉ）転写産物Ａ（ＷＴ）および／または転写産物Ｂ（ｉｓｏ）のＧＦＰ融合構築物またはＧＦＰベクターを神経細胞にトランスフェクトした。ｉｓｏの単独トランスフェクションでは中程度の細胞死効果が示され、ＷＴおよびｉｓｏの共トランスフェクション（各々に関して半量のＤＮＡ）では中間的な効果が示された。（ｊ）ＲＴ−ＰＣＲによって調査されたマウス初代海馬ニューロン中のカルシウムチャネルα−サブユニットの発現レベル。対照としてニューロン特異的エノラーゼを同時増幅した（矢頭）。（ｋ）ＥＦＨＣ１でトランスフェクトされた海馬初代培養ニューロンに対するＶＤＣＣアンタゴニストの効果。トランスフェクションの４８時間後の生存細胞数をパーセンテージで表記する；アンタゴニストなしの場合を１００％とし、有意性に関してはｔ検定統計解析を用いた。値は平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４；対照，ｎ＝８）である。＊ｐ＜０．０５、対照（アンタゴニストなし）に対して。ＥＧＦＰベクターを用いた対照実験の結果は図１５に示される通りである。図１５ａは、ＥＧＦＰベクター対照でトランスフェクトされた海馬初代培養ニューロンに対するＶＤＣＣアンタゴニストの効果を示す。生存ＧＦＰ陽性ニューロンをカウントし、有意性に関しては試験統計解析を用いた。値は平均＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．（ｎ＝４；対照，ｎ＝６）である。図１５ｂは、ＥＦＨＣ１突然変異タンパク質およびＣａｖ２．３Ｃ末端断片タンパク質の免疫沈降アッセイを示す。Ｆｌａｇタグ付きＣａｖ２．３ Ｃ末端またはＦｌａｇタグ付きエンドフィリン、およびＭｙｃタグ付きＥＦＨＣ１野生型（ＷＴ）またはＥＦＨＣ１突然変異体をＨＥＫ細胞で共発現させ、細胞ライセートを抗Ｆｌａｇ抗体によって免疫沈降させた。細胞ライセートまたは免疫沈降物を電気泳動し、メンブレンにブロットし、抗Ｆｌａｇまたは抗Ｍｙｃ抗体でプローブした。ＥＦＨＣ１のＷＴおよびすべての突然変異体はＣａｖ２．３Ｃ末端と免疫共沈降した。Ｆｌａｇタグ付きエンドフィリンはＭｙｃタグ付きＥＦＨＣ１−ＷＴと共沈降しなかった。Ａｂ：抗体，ＩＰ：免疫沈降（immunoprecipitateion），ＩＢ：イムノブロッティング。
【実施例４】
【０２１６】
ＥＦＨＣ１およびＣａｖ２．３タンパク質の共局在
免疫組織化学的解析（図４ａ〜ｋ）では、Ｅｆｈｃ１タンパク質が、海馬（図４ａ，ｃ）、小脳（図４ｆ）、大脳皮質（図４ｉ）、視床、視床下部、扁桃体および脳幹上部を含めた成体マウス脳において広く発現され、おおむねＣａｖ２．３に関するシグナルとオーバーラップすることが示された（図４ｂ，ｄ，ｇ，ｊ；重ね合わせ画像ｅ，ｈ，ｋ）。Yokoyama, et al., J. Neurosci. 15: 6419-6432, 1995。海馬初代培養ニューロンを抗ＥＦＨＣ１抗体および抗Ｃａｖ２．３抗体で二重染色すると、細胞体および樹状突起でシグナルが示された（図４ｌ〜ｎ）。
【０２１７】
図４は以下のものを示す：（ａ〜ｋ）抗ＥＦＨＣ１抗血清（Ａｌｅｘａ−４８８で可視化）（ａ，ｃ，ｆ，ｉ）および抗Ｃａｖ２．３抗体（Ａｌｅｘａ−５９４で可視化）（ｂ，ｄ，ｇ，ｊ）でマウス成体脳切片を二重染色した。（ｅ，ｈ，ｋ）重ね合わせ画像。（ａ，ｂ）海馬。（ｃ〜ｅ）海馬ＣＡ１領域。（ｆ〜ｈ）小脳。（ｉ〜ｋ）大脳皮質。（ｌ〜ｎ）Ｅ１６マウス由来の海馬初代培養ニューロン（ｉｎ ｖｉｔｒｏで６日間）を抗Ｅｆｈｃ１（緑色；ｌ）および抗Ｃａｖ２．３抗体（赤色；ｍ）で二重染色した。図４ｎではシグナルが重ね合わせられている。
【実施例５】
【０２１８】
ＥＦＨＣ１およびＥＦＨＣ１の突然変異体による電位依存性Ｒ型Ｃａ２＋チャネル（Ｃａｖ２．３）活性の増強
Ｃａｖ２．３を安定に発現し、ＥＦＨＣ１発現構築物で一過的にトランスフェクトされた仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞のパッチクランプ解析では、ＥＥＨＣ１がＣａｖ２．３によって生成されるＲ型Ｃａ２＋電流を顕著に増大させることが示された（図５ａ〜ｃ）。Ｐ／Ｑ型ＶＤＣＣ（Ｃａｖ２．１）およびＥＦＨＣ１発現構築物で共トランスフェクトされた細胞はそのようなカルシウム電流の増大を示さなかった。Ｃａ２＋チャネルの補助サブユニットの効果と比較された場合でさえ、Ｃａｖ２．３に対するＥＦＨＣ１の効果は大きくかつユニークであった。これらの結果は、ＥＦＨＣ１がＣａｖ２．３を介したＣａ２＋流入を増強し、プログラム細胞死を刺激することを示唆する。ＪＭＥ突然変異は、ＥＦＨＣ１によるＲ型Ｃａ２＋電流の増大を部分的に逆転させる（図５ｂ，ｃ）。ＥＦＨＣ１誘発型の、Ｃａｖ２．３を介したカルシウム流入についての不完全な逆転は、ＪＭＥ患者における断眠、疲労、およびアルコールの誘発効果に感受性のカルシウム恒常性の不安定な状態に関与する可能性がある。３種のコード多型は弱い逆転効果しか示さないか、あるいはその効果を示さなかった（図５ｂ，ｃ）。このことは、これらの多型が機能的に良性であるか、あまり悪性ではない可能性があることを暗示する。転写産物Ｂアイソフォーム（ｉｓｏ）は中程度のレベルの電流増大を示した（図５ｂ，ｃ）。これらの結果は細胞死解析の結果と整合する（図３ｈ，ｉ）。Letts, et al., Nat. Genet., 19: 340-347, 1998; Wakamori, et al., J. Biol. Chem., 273: 34857-34867, 1998。
【０２１９】
図５は以下のものを示す：（ａ）対照ＧＦＰベクターまたは野生型（ＷＴ）ＥＦＨＣ１ ｃＤＮＡで一過的にトランスフェクトされたＢＨＫ細胞において誘発された組換えＣａｖ２．３のＣａ２＋電流。試験脱分極パルスは３０ｍｓで−４０〜８０ｍＶとした。保持電位は−１１０ｍＶとした。（ｂ）ＧＦＰベクター（白抜き丸）、ＷＴ ＥＦＨＣ１（黒丸）、転写産物Ｂ（ｉｓｏ）（白抜き下向き矢頭）、およびＥＦＨＣ１突然変異体Ｐ７７Ｔ（黒三角）、Ｄ２１０Ｎ（白抜き四角）、Ｒ２２１Ｈ（黒四角）、Ｐ７７Ｔ／Ｒ２２１Ｈ（黒菱形）、Ｆ２２９Ｌ（白抜き三角）、Ｄ２５３Ｙ（白抜き菱形）、Ｒ１５９Ｗ（白抜き左向き矢頭）、Ｒ１８２Ｈ（黒右向き矢頭）、Ｉ１６９Ｌ（星形）でトランスフェクトされたＢＨＫ細胞での組換えＣａｖ２．３の電流電位曲線。ＷＴ ＥＦＨＣ１および突然変異体はＲ型（Ｃａｖ２．３）Ｃａ２＋電流を顕著にアップレギュレートする。（ｃ）ＥＦＨＣ１構築物と組み合わせてＣａｖ２．３を共発現するＢＨＫ細胞中で２０ｍＶで誘発されたＣａ２＋電流密度。ＪＭＥ突然変異は、Ｒ型電流を増大させるＥＦＨＣ１の効果を部分的に逆転させた。突然変異Ｆ２２９ＬはＥＦＨＣ１の増強効果を有意に抑制した（＊ｐ＜０．０５）。ＥＦＨＣ１突然変異体によるＣａｖ２．３の活性化および不活性化特性のモジュレーションは図２４に記載される通りである。
【実施例６】
【０２２０】
ＥＦＨＣ１および電位依存性Ｃａ２＋チャネル（ＶＤＣＣ）の免疫沈降アッセイ
電位依存性Ｃａ２＋チャネル（ＶＤＣＣ）は、ＶＤＣＣの細胞内Ｃ末端と相互作用するタンパク質によって調節されることが多い。Ｐ／Ｑ型（Ｃａｖ２．１）、Ｎ型（Ｃａｖ２．２）およびＲ型（Ｃａｖ２．３）ＶＤＣＣのＣ末端断片を用いて免疫共沈降アッセイを実施したところ、Ｍｙｃタグ付きＥＦＨＣ１はＦｌａｇタグ付きＣａｖ２．３ Ｃ末端と共沈降するが、Ｃａｖ２．１またはＣａｖ２．２とは共沈降しないことが見出された（図６ａ，ｂ）。Ｆｌａｇタグ付きＥＦＨＣ１およびＭｙｃタグ付きＣａｖ２．３ Ｃ末端の逆方向の免疫共沈降でも同様に陽性の結果が得られた（図６ｃ，ｄ）。ＥＦＨＣ１の欠失解析では、Ｃａｖ２．３がＥＦＨＣ１のＮ末端（ａ．ａ．１〜３５９）に結合することが示された。そのＥＦＨＣ１のＮ末端は、ＤＭ１０（１）およびＤＭ１０（２）から構成され、前記ＪＭＥ突然変異のすべてを有する部分であった（図６ｃ，ｄ）。すべてのＥＦＨＣ１突然変異タンパク質はＣａｖ２．３のＣ末端に対する結合能力を示した。図１５を参照のこと。Catterall, et al., Annu. Rev. Cell Dev. Biol., 16: 521-555, 2000。
【０２２１】
図６は以下のものを示す：（ａ）Ｆｌａｇタグ付きＶＤＣＣ Ｃ末端、またはＦｌａｇタグ付きエンドフィリン、およびＭｙｃタグ付きＥＦＨＣ１またはＨＡタグ付きエンドフィリンをＨＥＫ細胞で共発現させ、細胞ライセートを抗Ｆｌａｇ抗体によって免疫沈降した。細胞ライセートまたは免疫沈降物を電気泳動し、メンブレンにブロットし、抗Ｆｌａｇ、抗Ｍｙｃ、または抗ＨＡ抗体でプローブした。Ｃａｖ２．３のＣ末端はＥＦＨＣ１と免疫共沈降したが、Ｃａｖ２．１およびＣａｖ２．２のＣ末端は共沈降しなかった。ＨＡタグ付きエンドフィリンは、以前に報告されている２９ようにＣａｖ２．１のＣ末端に結合したが、Ｆｌａｇタグ付きエンドフィリンはＭｙｃタグ付きＥＦＨＣ１と共沈降しなかった。ＥＦＨＣ１、Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２およびＣａｖ２．３のＣ末端のおよその分子量は、それぞれ７４ｋＤａ、５２ｋＤａ、６９ｋＤａおよび６２ｋＤａである。（ｂ，ｄ）免疫沈降アッセイに使用されるタグ付きタンパク質の構造。Ｃａｖ２．１、Ｃａｖ２．２、Ｃａｖ２．３のＣ末端をＰＣＲ増幅し、そのＮ末端にＦｌａｇまたはＭｙｃタグを付けた。全長および切断ＥＦＨＣ１をＰＣＲ増幅し、Ｎ末端にＭｙｃまたはＦｌａｇタグを付けた。（ｃ）ＥＦＨＣ１切断タンパク質およびＣａｖ２．３のＣ末端についてのアッセイ。その結果は、Ｃａｖ２．３がＥＦＨＣ１のＮ末端（ａ．ａ．１〜３５９）に結合することを示唆する。Ａｂ：抗体，ＩＰ：免疫沈降。
【実施例７】
【０２２２】
ＥＦＨＣ１中の変異はＪＭＥを引き起こし得る
ＥＦＨＣ１中の変異がどのようにＪＭＥを引き起こし得るかを説明する複数の可能性が存在する。可能性の１つは、ＪＭＥ突然変異が、Ｃａｖ２．３を介してＥＦＨＣ１のアポトーシス活性を損なうことによって、ＣＮＳ発達中の望ましくないニューロンの排除を妨げ、その結果、不安定なカルシウム恒常性を伴うニューロンの密度増加を招き、過剰興奮性回路が生じることである。実際に、ＪＭＥ患者の脳ではニューロンの密度の増加および異所性が観察されている。Ｃａｖ２．３を欠損するマウスにおいててんかん発作表現型は報告されていないが（ｒｅｆ．２３）、未検出の小発作感受性または脳の微小発育不全（microdysgeneses）がこのマウスに依然として存在する可能性がある。種差も一要因であるかもしれない。さらにまた、ＥＦＨＣ１タンパク質はＣａｖ２．３と結合するだけでなく、ＪＭＥ表現型を修飾する可能性があるさらにいくつかのタンパク質とも相互作用する。Woermann, et al., Brain, 121: 1661-1667, 1998; Meencke, et al., Jasper's Basic Mechanisms of the Epilepsies, 第３版, Advances in Neurology, 79: 123-131, 1999。
【０２２３】
この研究では、ＪＭＥ４４家系のうち６家系のみでＥＦＨＣ１の突然変異が明らかになった。ＥＦＨＣ１のイントロンまたは調節領域中には、未特定の突然変異が存在する可能性がある。それはウンフェルリヒト・ルントボルグ進行性ミオクローヌスてんかんで観察されたのと同様である。すべての前記ＪＭＥ家系に対して、ＥＦＨＣ１の各エクソン・イントロン境界の約１００ｂｐおよび５’−ＵＴＲの約６５０ｂｐ中の変異に関する詳細な検索を行った。複数の患者がＳＮＰを示したが、いずれも疾患表現型との顕著な関連を示さなかった。また、その５’ＵＴＲ中のＳＮＰはＥＦＨＣ１のプロモーター活性に影響しなかった。拡大された領域中でのさらなる突然変異の検索を行うのが妥当である。もう１つの可能性は、残りの３８家系のうちのいくつかにおいて、染色体６ｐ領域中またはその外側の他の遺伝子がＪＭＥに関与することである。小規模ＪＭＥ家系の有病者における６ｐ１２に位置する共通のハプロタイプは偶然に生じた可能性があり、全例におけるＥＦＨＣ１突然変異と必ずしも関連していないかもしれない。Pennacchio, et al., Science, 271: 1731-1734, 1996; Virtaneva, et al., Nat. Genet., 15: 393-396, 1997。
【０２２４】
要約すると、ＪＭＥ家系のてんかんまたは多棘波有病者におけるＥＦＨＣ１突然変異の分離は、ＥＦＨＣ１誘発性神経細胞死およびＲ型Ｃａ２＋電流のＥＦＨＣ１依存的増大のＪＭＥ変異による逆転と併せて、ＥＦＨＣ１が６ｐ１２上のＪＭＥ遺伝子であることを強く支持する。特発性全般性てんかんの原因とされたほとんどの遺伝子はイオンチャネルをコードする。ＥＦハンドモチーフを含有し、Ｒ型ＶＤＣＣをモジュレートし、それと相互作用し、アポトーシス活性を示す非イオンチャネルタンパク質をコードする遺伝子の特定は、特発性てんかんの分子病理に対する新規見地をもたらす。
【実施例８】
【０２２５】
方法
家系および患者
本研究では、ＪＭＥの４４家系（メキシコ系３１家系、ベリーズ出身１家系、およびロス・アンジェルス出身白人１２家系）を解析した。各参加者または保護者は、ＵＣＬＡ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅのヒト被験体保護委員会（the Human Subject Protection Committee）または参加機関により承認されたのと同様のインフォームド・コンセント書類に署名した。発端者に含めることについての基準は、以下の条件からなる：１）ミオクローヌス発作が１０〜２０歳の間に始まったこと（通常は覚醒時に、肩、腕、および四肢の他の部位に関して）。ミオクローヌス発作は意識喪失とは関連しなかったこと。２）強直間代性または間代強直間代性痙攣が、ミオクローヌス発作の開始後、１〜２年頻繁に発生し、また５〜１０年は稀にしか起らなかったこと。３）精神状態および知能をはじめとする神経学的検査においては正常でなければならない。および４）すべての発端者において、広汎性の同期した対称的な３．５〜６Ｈｚ多棘波複合が発作間欠時ＥＥＧにおいて見られること。ＥＥＧにおいて異常な棘波／多棘波複合を示す個体は、発作を起こさないとしても罹患しているものと扱った。３８２名の非血縁健常対照は、２５２名のメキシコ人、９６名の日本人、および３４名のロス・アンジェルス出身白人から構成される。ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｂｌｏｏｄ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔ（Qiagen）を用いて末梢静脈血からゲノムＤＮＡを抽出した。Bai, et al.,Am. J. Med. Genet., 133: 268-274, 2002; Liu, et al., Am. J. Hum. Genet, 57: 368-381, 1995; Liu, et al., Am. J. Med. Genet, 63: 438-446, 199。
【０２２６】
物理的・転写マップの構築
物理的マップの構築は、以前に報告されたように行った。ＢＡＣおよびＰＡＣ配列を、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴデータベース（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）に登録されている遺伝子の検索に用いた。Sugimoto, et al., Genomics, 68: 264-272, 2000。
【０２２７】
ドメイン検索
ＥＦＨＣ１アミノ酸配列内のドメイン検索は、ＩｎｔｅｒＰｒｏ、ＰｆａｍおよびＳＭＡＲＴデータベース（http://www.ebi.ac.uk/interpro/scan.html、http://pfam.wustl.edu/hmmsearch.shtml、http://smart.embl-heidelberg.de/）により行った。
【０２２８】
ノーザンブロット解析
ブロットは、購入するか、以下のように準備した。ＴＲＩＺＯＬＴＭ試薬（Invitrogen）を用いて、成体および胎生１７日目のＩＣＲマウス全脳から総ＲＮＡを抽出し、μＭＡＸ ｍＲＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Miltenyi Biotec GmbH）を用いてポリＡ＋ＲＮＡを取得した。１レーン当たり４μｇのポリＡ＋ＲＮＡを変性ホルムアルデヒド１％アガロースゲルにて泳動し、ナイロンメンブレンにブロットし、ＵＶ照射により固定した。ＥＦＨＣ１もしくはＥｆｈｃ１ ｃＤＮＡを、ヒトまたはマウス成体脳ｃＤＮＡを鋳型として用いてＰＣＲにより増幅した。ＰＣＲ産物をＨｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ Ｋｉｔ（Roche）により３２Ｐ放射標識し、ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ Ｇ−５０カラム（Amersham Biosciences）を用いて精製した。標識ＤＮＡを、以下のブロットについてのノーザンハイブリダイゼーションのためのプローブとして用いた：ヒト（またはマウス）成体複数組織ノーザンブロット、ヒト成体脳複数組織ノーザンブロット、マウス胎児組織ノーザンブロット（Clontech）または胎生１７日目および成体マウス脳ノーザンブロット。これらのブロットを、ＥｘｐｒｅｓｓＨｙｂハイブリダイゼーション溶液（Clontech）を用いて一晩ハイブリダイズさせ、最後に０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中、５０℃にて４０分間洗浄した。フィルターを−８０℃にて一晩、Ｘ線フィルムに曝露した。対照として、同じブロットをＧ３ＰＤＨまたはβ−アクチンプローブにハイブリダイズさせた。すべてのハイブリダイゼーションで新しいブロットを用い、繰り返し用いることはしなかった。
【０２２９】
ｃＤＮＡライブラリースクリーニング
λＺＡＰ ＩＩベクター（Stratagene）中に構築されたヒト成体脳、膵臓、および胎児脳ｃＤＮＡライブラリーを、製造業者の推奨する通りに、ＰＣＲ産物をプローブとして用いてスクリーニングした（プローブ３；図１ｂを参照）。
【０２３０】
抗ＥＦＨＣ１抗体の生成
ヒトＥＦＨＣ１のアミノ酸残基５２２−５３３（ＱＹＳＰＥＡＬＡＳＩＱＮ）に対応する合成ペプチド（マウスＥｆｈｃ１の配列と同一）を免疫に用いた。Ｎ末端に１個のシステイン残基を付加したペプチドをキーホルリンペット・ヘモシアニンとカップリングさせ、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でフロイント完全アジュバントと混合し、タンパク質１ｍｇ／注射の用量で２羽のウサギに注射した。最初の注射の３週後および６週後に、ＰＢＳ中の不完全アジュバントと混合したペプチド配列でウサギを追加免疫し、８週間飼育した。
【０２３１】
マウス海馬ニューロン初代培養
胎生１６日目のマウスから海馬ニューロンを単離し、ポリＬ−リジンでコーティングしたカバーガラスの入った２４穴プレートに１〜２×１０５細胞／ウェルで蒔き、Ｂ２７、０．５ｎＭ Ｌ−グルタミン（Invitrogen）を添加した無血清ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬＴＭ培地中で生長させた。
【０２３２】
免疫細胞化学
Ｅ１６マウス由来の海馬初代培養ニューロン（ｉｎ ｖｉｔｒｏで６日目）を４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で１５分間固定し、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（ＰＢＳ中）で５分間、細胞膜を透過性にした。細胞をブロッキング溶液（３％正常ヤギ血清、ＰＢＳ中）とともに３０分間インキュベートし、次にブロッキング溶液中の一次抗体とともに室温で１時間インキュベートした（抗ＥＦＨＣ１抗体（１：１０００希釈）および抗ＭＡＰ−２抗体（１：５００）（Sigma）；または抗リン酸化ニューロフィラメント抗体ＳＭＩ３１０（１：２００希釈）（Sternberger Monoclonals Incorporaed））。ＰＢＳでよく洗浄した後、細胞を１：１０００希釈した二次抗体とともに室温で１時間インキュベートし（Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートニワトリ抗ウサギＩｇＧおよびＡｌｅｘａ５９４コンジュゲートロバ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes））、ＰＢＳ中で３回洗浄し、ＴＣＳ ＳＰ２顕微鏡（Leica）を用いて蛍光を観察した。
【０２３３】
発色免疫組織化学
クライオスタット（Ｌｅｉｃａ １９００）を用いて４０μｍ切片を作製し、０．１Ｍ ＰＢＳ中で洗浄し、０．３％Ｔｒｉｔｏｎを加えたＰＢＳ（ＰＢＳＴ）中の１０％正常ヤギ血清に１０分間漬けた。同数の切片を一次抗体溶液中で４℃にて一晩インキュベートした（抗ＥＦＨＣ１ Ｃ１（１：２０００希釈）、免疫前血清（１：２０００希釈）、または５０μｇ／ｍＬのＥＦＨＣ１ペプチド（ＱＹＳＰＥＡＬＡＳＩＱＮ）を加えた抗ＥＦＨＣ１ Ｃ１（１：２０００希釈）；ＰＢＳＴ中１０％正常ヤギ血清で希釈）。ＰＢＳＴでの連続した洗浄の後、切片を二次抗体とともに４０℃で３時間インキュベートした（ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ）。次に切片を室温にて１時間、ＡＢＣ試薬で反応させた（ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ ＡＢＣ ＫＩＴ、Vector Lab. Inc.）。切片をＴｒｉｓバッファー（ｐＨ７．２）で洗浄し、０．０１％Ｈ２Ｏ２を加えた０．０２％ＤＡＢ（Doujindo）で室温にて２０分間反応させた。ＴｒｉｓバッファーおよびＰＢＳでの洗浄後、切片をスライドガラスに載せ、脱水し、キシレン中で透明化し、そしてカバーガラスをかけた。
【０２３４】
ＲＴ−ＰＣＲ
ＴＲＩＡＺＯＬＴＭ試薬（Invitrogen）を用いて、成体ＩＣＲマウス全脳および海馬初代培養神経細胞から総ＲＮＡを抽出し、ＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔＴＭＲＮＡ Ｈ−リバーストランスクリプターゼ（Invitrogen）を用いて２μｇの総ＲＮＡから一本鎖ｃＤＮＡを取得した。マウスｃＤＮＡを増幅するために、Ｅｆｈｃ１のエクソン１およびエクソン１１中（ｂｐ１３−２０３７）および対応する以下のＣａ２＋チャネルについて同様の位置にプライマーを設計した：ＣＡＣＮＡ１Ｓ（Ｃａｖ１．１）、ＣＡＣＮＡ１Ｃ（Ｃａｖ１．２）、ＣＡＣＮＡ１Ｄ（Ｃａｖ１．３）、ＣＡＣＮＡ１Ｆ（Ｃａｖ１．４）、ＣＡＣＮＡ１Ｇ（Ｃａｖ３．１）、ＣＡＣＮＡ１Ｈ（Ｃａｖ３．２）、ＣＡＣＮＡ１Ａ（Ｃａｖ２．１）、ＣＡＣＮＡ１Ｂ（Ｃａｖ２．２）およびＣＡＣＮＡ１Ｅ（Ｃａｖ２．３）。ニューロン特異的エノラーゼｃＤＮＡプライマーを対照として用いた。プライマー配列は必要ならば利用可能である。
【０２３５】
突然変異解析
突然変異スクリーニングは以前に報告されたように行った。簡潔に言えば、ＥＦＨＣ１の１１エクソンすべてを増幅するようにプライマーを設計し、Ｐｗｏ ＤＮＡポリメラーゼ（Roche）を用いてＰＣＲによりゲノムＤＮＡを増幅し、ＷＡＶＥ（Transgenomic）を用いたヘテロ二重鎖解析およびＡＢＩ自動シーケンサー３７００型（PE Applied Biosystems）を用いた直接シーケンシングにより解析した。プライマー配列は必要ならば利用可能である。Morita, et al., Epilepsy Res., 37: 151-158, 1999。
【０２３６】
発現構築物および突然変異誘発
ＥＦＨＣ１の完全なオープンリーディングフレーム（転写産物Ａ）をＰｙｒｏｂｅｓｔＴＭ（TaKaRa）を用いてＰＣＲによりヒト成体脳ｃＤＮＡ（Clontech）より増幅し、ｐＥＧＦＰＣ２（Clontech）、ｐｃＤＮＡ３−ＭｙｃＮ（Invitrogen）またはｐｃＤＮＡ３−ＦｌａｇＮ（Invitrogen）ベクターにクローニングした。転写産物Ｂ配列も同様にＰＣＲによりヒト成体脳ｃＤＮＡより増幅し、ｐＥＧＦＰＣ２にクローニングした。ＧＦＰ、ＭｙｃまたはＦｌａｇタグ配列をＥＦＨＣ１タンパク質のＮ末端に融合させた。５種類のＪＭＥ突然変異をＱｕｉｃｋ Ｃｈａｎｇｅ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Stratagene）を用いて導入し、ヌクレオチド変更および全体の配列の完全性をＤＮＡシーケンシングにより確認した。
【０２３７】
マウス海馬ニューロンのトランスフェクションおよび免疫染色
培養４日目に、野生型および突然変異型ＥＦＨＣ１タンパク質をコードする発現ＤＮＡ構築物で神経細胞をＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ２０００（Invitrogen）を用いてトランスフェクトした。培養細胞を、トランスフェクション後１６時間および４８時間で４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）を用いて固定し、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて細胞膜を透過性にし、３％正常ヤギ血清（ＰＢＳ中）にてブロッキングし、マウスモノクローナル抗ＭＡＰ−２抗体（１：５００；Sigma）およびＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０００；Molecular Probes）を用いて処理した。
【０２３８】
ＴＵＮＥＬアッセイ
培養４日目に、発現ＤＮＡ構築物（ｐｃＤＮＡ−ＭｙｃＮ−ＥＦＨＣ１−ＷＴ）でＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ２０００を用いてニューロンをトランスフェクトした。トランスフェクション４８時間後、神経細胞のアポトーシスをＤｅａｄＥｎｄＴＭ発色ＴＵＮＥＬシステム（Promega）を用いて検出した。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Molecular Probes）を用いて核を可視化した。これらの細胞を抗Ｍｙｃ抗体（１：２００；Cell Signaling）およびＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ５９４ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：１０００）でも染色した。すべての実験を２ウェルずつ行い、少なくとも３回繰り返した。神経細胞を、トランスフェクション４８時間後に共焦点顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＦＬＵＯＶＩＥＷ）で観察した。
【０２３９】
ＥＦＨＣ１突然変異体を用いた細胞死解析
海馬初代培養ニューロンをＧＦＰ−ＥＦＨＣ１融合タンパク質発現構築物（ＪＭＥ突然変異を有するもの、ＥＦＨＣ１アイソフォームのもの）またはＧＦＰベクターで培養４日目にＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ２０００を用いてトランスフェクトした。培養ディッシュに接着しているＧＦＰ蛍光陽性細胞数を計数することで、生存細胞数を評価した。各計数において、剥がれた細胞（死滅細胞）は培養培地を交換することにより注意深く取り除いた。細胞の形態（細胞形状、神経突起の長さおよび数、収縮等）は計数においては考慮しなかった。生存細胞数はトランスフェクション後２４時間、３６時間および４８時間で評価した。２つの独立に調製した発現構築物ＤＮＡを用いることにより解析を２回繰り返した。合計で、各トランスフェクションおよび各時点について２４穴プレートの７ウェルのニューロンを計数した。実験は盲検として行った。
【０２４０】
ＶＤＣＣインヒビターを用いた細胞死解析
胎生１６日マウス由来の海馬初代分散培養ニューロンを、ポリＬ−リジンコーティングカバーガラスの入った２４穴プレートに蒔いた（５×１０４細胞／ウェル）。アンタゴニストとともにｉｎ ｖｉｔｒｏで培養した６日目に、ニューロンをｐＥＧＦＰ−ＥＦＨＣ１でトランスフェクトし、トランスフェクション４８時間後に固定した。以下のカルシウムチャネルインヒビター：Ｐ型ＶＤＣＣ（Ｃａｖ２．１）についてω−アガトキシンＩＶＡ（PEPTIDE INSTITUTE, INC.）、Ｎ型ＶＤＣＣ（Ｃａｖ２．２）についてω−コノトキシンＧＶＩＡ（PEPTIDE INSTITUTE, INC.）、Ｒ型ＶＤＣＣ（Ｃａｖ２．３）についてＳＮＸ−４８２（PEPTIDE INSTITUTE, INC.）、Ｔ型ＶＤＣＣについてフルナリジン（Nacalai Tesque）およびＬ型ＶＤＣＣについてニフェジピン（SIGMA）をトランスフェクション３時間後に神経培養に直接加えた。
【０２４１】
蛍光免疫組織化学
ＩＣＲ成体マウスを深く麻酔し、リン酸バッファー（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で心臓から灌流した。脳を剖出し、４℃にてさらに３時間、後固定し、バッファー（ｐＨ７．４）中の３０％スクロースで凍結保護処理した。脳サンプルをＴｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴメディウムの入った型に移し、ＣＯ２ガスにより凍結させた。クライオスタットにより浮遊凍結切片（２０μｍ）を作製した。切片をＰＢＳ中でリンスし、５％ＦＢＳ（０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を加えたＰＢＳ中）で室温（ＲＴ）にて１時間ブロッキングし、次に抗ＥＦＨＣ１ウサギポリクローナル抗体（１：３０００希釈）とともに４℃にて７２時間インキュベートし、続いてヤギポリクローナル抗体抗α１Ｅ（Ｃａｖ２．３、Ｃ−２０；Santa Cruz Biotechnology）（１：１０希釈）とともにインキュベートした。切片を二次抗体とともにＲＴにて１時間インキュベートした（Ａｌｅｘａ４８８コンジュゲートニワトリ抗ウサギＩｇＧおよびＡｌｅｘａ５６４コンジュゲートロバ抗ヤギＩｇＧ；Molecular Probes）（１：３００希釈）。ＴＣＳ ＳＰ２顕微鏡（Leica）を用いて画像を取得した。
【０２４２】
電気生理学的解析
仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞株ＢＨＫ（ＢＩＩ−１０４−２）（α１Ｅ（ＢＩＩ）、α２／δおよびβ１ａサブユニットで安定にトランスフェクトされている）を、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、３０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび３０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地中で培養した。野生型または突然変異型ＥＦＨＣ１を一過的に発現させるために、ＢＨＫ（ＢＩＩ−１０４−２）細胞を、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（QIAGEN）を用いてＥＦＨＣ１またはその突然変異体のｃＤＮＡと融合させたＥＧＦＰを保持するｐＥＧＦＰ−Ｃ２プラスミド（Clontech）でトランスフェクトした。対照実験として、ＢＨＫ（ＢＩＩ−１０４−２）をＥＦＨＣ１インサートを有しない同量のｐＥＧＦＰでトランスフェクトすることにより、ＥＧＦＰを一過的に発現させた。細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ培地で希釈し、トランスフェクション１８時間後にカバーガラス上に蒔いた。トランスフェクション２４〜４８時間後にＧＦＰ陽性細胞からＣａ２＋電流を記録した。ＢＨＫ（ＢＩＩ−１０４−２）細胞からの電流は、ＥＰＣ−９増幅器（HEKA, Germany）を用いてホールセルモードでパッチクランプ技術により室温（２２〜２５℃）にて測定した。パッチピペットは、ホウケイ酸ガラス毛細管（外径１．５ｍｍ、内径０．８７ｍｍ、Hilgenberg）から、Ｐ−９７型Ｆｌａｍｉｎｇ−Ｂｒｏｗｎマイクロピペットピラー（Sutter Instrument CO., CA）を用いて作製した。ピペット抵抗は、下記のピペット溶液を満たした状態で２〜３ＭΩの範囲であった。直列抵抗は電気的に７０％より多く相殺し、漏れ電流と残余のキャパシタンスは−Ｐ／６法により差し引いた。電流は活性化カイネティクスでは１００ｋＨｚでサンプリングし、それ以外では５０ｋＨｚでサンプリングして１０ｋＨｚでフィルターをかけた。カルシウム電流は、以下の組成の細胞外溶液中で記録した（単位はｍＭ）：３ ＣａＣｌ２、１４８ 塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡ−Ｃｌ）、１０ グルコース、および１０ ＨＥＰＥＳ（Ｔｒｉｓ−ＯＨを用いてｐＨ７．４に調整）。ピペット溶液は以下の組成とした（単位はｍＭ）：８５ Ｃｓ−アスパラギン酸、４０ ＣｓＣｌ、４ ＭｇＣｌ２、５ ＥＤＴＡ、２ ＡＴＰ２Ｎａ、５ ＨＥＰＥＳ、および８ クレアチンリン酸（ＣｓＯＨを用いてｐＨ７．４に調整）。電位依存的活性化を調べるために、５ｍｓ試験パルス（−４０〜９０ｍＶ）後の−５０ｍＶでのテール電流の大きさを最大のテール電流の大きさで標準化した。電位依存的不活性化を調べるために、２ｓの保持電位の除去（−１１０ｍＶから２０ｍＶへ）に続く１０ｍｓの−１１０ｍＶまでの再分極後の３０ｍＶでの２０ｍｓの試験パルスにより引き起こされる電流の大きさを、２ｓの−１１０ｍＶまでの保持電位の除去後の試験パルスにより引き起こされる電流の大きさで標準化した。すべての値は平均±ＳＥとして表してある。統計学的比較は、スチューデントのｔ検定を用いて行った（＊、ｐ＜０．０５；＊＊、ｐ＜０．０１）。実験は盲検的に行った。Niidome, et al., FEBS Lett., 308: 7-13, 1992; Chen, et al., Cell, 115: 37-48, 2003。
【０２４３】
免疫沈降
発現構築物で共トランクフェクトしたＨＥＫ細胞をトランスフェクション２０時間後に回収した。細胞をＰＢＳで洗浄し、掻き取って、プロテアーゼインヒビター（完全；Roche）を添加した溶解バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＥＤＴＡ）中でホモジナイズした。４℃にて１２，０００×ｇで１０分間遠心分離することにより細胞残渣を取り除いた。上清をプロテインＧセファロース（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて４℃にて２時間、予備清浄化し、次にモノクローナル抗Ｆｌａｇ Ｍ２−アガロースビーズ（Sigma）または抗Ｍｙｃ抗体（Santa Cruz）とともに４℃にて１２時間インキュベートした。抗Ｍｙｃ抗体での沈降のためにプロテインＧセファロースを用いた。ビーズを溶解バッファーで５回洗浄し、次にＦｌａｇペプチドまたはＳＤＳサンプルバッファー（免疫ブロット解析用）のいずれかにより溶出した。
【０２４４】
ウエスタンブロット解析
発現構築物を用いて一過的にトランスフェクトしたコンフルエントのＨＥＫ細胞を氷上に置き、氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を培養ディッシュから掻き取り、プロテアーゼインヒビター混合物（完全；Roche）を添加した低張バッファー（０．２５Ｍスクロース、１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）中でホモジナイズした。ライセートを３，３００ｇで５分間遠心して核を取り除き、上清を全サイトゾルタンパク質として用いた。サンプルを４−２０％勾配ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて泳動し、トランスファーバッファー（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１９２ｍＭグリシン、０．１％ＳＤＳ、２０％（ｖ／ｖ）メタノール）中で電気ブロット装置（BioRad）を用いて１００Ｖで１時間、ニトロセルロースフィルター（０．４５μｍ、Schleicher & Schuell）にトランスファーした。フィルターを、３．５〜１０％の脱脂粉乳を添加したブロッキング溶液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ２、ｐＨ７．４）中で３７℃にて１時間インキュベートした。メンブレンを以下の連続的なインキュベーションに供した：一次抗体（抗ＥＦＨＣ１（１：１０００希釈）、マウス抗ＧＦＰモノクローナル抗体（Roche）（１：１０００希釈）、ウサギ抗Ｍｙｃポリクローナル抗体（Cell Signaling）（１：１０００希釈）、ヤギ抗ＨＡ抗体（Roche）（１：１０００希釈）、またはＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）コンジュゲート抗Ｆｌａｇ抗体（Roche）（１：０００希釈））、１時間、続いて０．４μｇ／ｍＬ ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Santa Cruz Biotechnology）。フィルター上の免疫反応性のタンパク質を、Ｗｅｓｔｅｒｎ ＬｉｇｈｔｉｎｇＴＭ Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｌｕｓ（Perkin Elmer Life Sciences）を用いて可視化した。
【実施例９】
【０２４５】
登録番号
ヒトＥＦＨＣ１の転写産物Ａ：ＡＫ００１３２８、ＥＦＨＣ１の転写産物Ｂ：ＡＬ１２２０８４、ヒトＥＦＨＣ１のＥＳＴクローン：ＡＹ６０８６８９、マウスＥＦＨＣ１オーソログ：ＡＫ００６４８９。ブタＥＳＴクローン：ＡＷ３４４７８０、ウシＥＳＴクローン：ＢＥ６６６１１７およびＡＶ５９５４５６。
【０２４６】
ｃ．４７５Ｃ＞Ｔ（Ａｒｇｌ５９Ｔｒｐ）：ｒｓ３８０４５０６、
ｃ．５４５Ｇ＞Ａ（Ａｒｇｌ８２Ｈｉｓ）：ｒｓ３８０４５０５。
【０２４７】
2008506707.tif 000003
【実施例１０】
【０２４８】
若年性ミオクローヌスてんかん：痙攣および欠神の基礎的メカニズム
てんかんの一般的な形態である若年性ミオクローヌスてんかんは、すべてのてんかんのうち、少なくとも６〜１２％にあたる。その完全な表現型は、ＥＥＧでの広汎な多棘徐波を伴うミオクロニー、大発作（間代強直間代性）痙攣および欠神の青年期での発症からなる。純粋な「大発作」痙攣とは「強直間代強直性発作」であり、これらの用語は相互に変換可能に用いられる。１つの内包される表現型（endophenotype）は、無症候者であり、彼らは単にＥＥＧ多棘波形質を有するのみである。神経病理学的研究により、ＪＭＥ脳の分子層および皮質下白質において異所性細胞（dystopic cell）の数が増大し、かつびまん性に分布していることが明らかになっている。定量的高分解能ＭＲＩでは、かかるＪＭＥ神経病理を「顕著に大きく肥厚した大脳皮質灰白質容量」として検出している。Genton, et al., Epilepsia, 32: S3,45, 1991; Genton, et al., Arch. Neurol, 58: 1487-1490, 2001; Manford, et al., Arch. Neurol, 49: 801-808, 1992; Goosses, Frei Berlin University, West Berlin, 1984; Meencke et al., Adv. Neurol, 79: 123-131, 1999; Woermann, et al., Brain, 122: 2101-2108, 1999。
【０２４９】
１つの目的は、痙攣および欠神の基礎的メカニズムを理解するために、若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）において突然変異した遺伝子であるＥＪＭ１Ａについて調べることである。ＪＭＥ表現型の分子的基盤を理解するために、推定上の遺伝子であるＥＪＭ１Ａを染色体６ｑ１２に同定した。計画では、ＥＪＭ１Ａを研究し、これは新規な遺伝子であって、ＥＦハンドモチーフを有し、Ｒ型高電位依存性カルシウムチャネルまたはＣａｖ２．３およびアポトーシスを調節する。ＥＪＭ１Ａは６４０アミノ酸からなるタンパク質であるミオクロニン１／ＥＦＨＣ１をコードする。ＥＪＭ１Ａは７２ｋｂにわたり、１１のエクソンを有し、３つのＤＭ１０ドメインと、機能不明なモチーフを有する。ＪＭＥのメキシコ系３１家系でのＥＪＭ１Ａの突然変異解析は、血縁関係のない６家系中の２５名のてんかん有病者またはＥＥＧ多棘波有病者で６種類のミスセンス突然変異を明らかにし、これは３８２名の血縁関係のない健常対照には存在しなかった。マウス海馬初代培養ニューロンでのミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の過剰発現はアポトーシスを引き起こしたが、この現象はＪＭＥ突然変異により著しく減少した。該アポトーシスは、Ｒ型電位依存性Ｃａ２＋チャネル（Ｃａｖ２．３）のアンタゴニストであるＳＮＸ−４８２により特異的に抑制された。ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１とＣａｖ２．３の免疫反応物質はマウス脳ではオーバーラップし、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１はＣａｖ２．３のＣ末端と免疫共沈降された。パッチクランプ解析では、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１はＲ型カルシウム電流を特異的に増大させたが、この現象はＪＭＥ突然変異により逆転した。これらの知見は、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１がＥＪＭ１Ａ遺伝子であることを強く示唆するものである。
【０２５０】
アポトーシス活性を有する遺伝子であるミオクロニン１／ＥＦＨＣ１中の突然変異は、ＪＭＥでのミオクロニー、大発作および欠神発作を引き起こすのであろうか。１つの仮説は、Ｃａｖ２．３を介したＥＦＨＣ１のアポトーシス活性を失わせることにより、ＪＭＥ突然変異がＣＮＳ発達の間の不要なニューロンの除去を妨げ、カルシウム恒常性が脱調節された異所性ニューロンの密度を増大させ、ミオクロニーおよび強直間代性痙攣に罹患しやすくする、というものである。図７を参照されたい。別の仮説は、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１中の突然変異がＳＮＡＰ２５へのその結合性を変化させ、Ｃａｖ２．３のモジュレーションを障害し、視床において、より低電位で活性化されるＴ型カルシウム電流へとバランスを崩させ、皮質棘波および欠神を引き起こす、というものである。
【０２５１】
ＪＭＥにおける痙攣および欠神発作の基礎的メカニズムを理解するために、以下の２種類のアプローチが採られるであろう：
（１）カルシウムモジュレーションの研究により、新規に特定された突然変異および変異体のＣａｖ２．３調節での役割を調べ、それらをヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株のパッチクランプ解析によりＲ型（Ｃａｖ２．３）およびＰ／Ｑ型（Ｃａｖ２．１）カルシウムチャネルに対するミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の作用と比較する。複数種類の転写産物（２．３ｋｂ、４．４ｋｂ、７．５ｋｂおよび９．５ｋｂ）およびＪＭＥ発作を抑制する抗てんかん薬について、Ｃａｖ２．３およびＣａｖ２．１の調節に対するそれらの効果を調べる。
【０２５２】
（２）ミオクロニン１−ＳＮＡＰ２５相互作用の研究を継続し、野生型ミオクロニン１−ＳＮＡＰ２５相互作用について、ｉｎ ｖｉｔｒｏＧＳＴプルダウン実験を用いて、およびトランスフェクトされて両タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞からの免疫共沈降によりｉｎ ｖｉｖｏにて調べる。続いて、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏでの、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１ミスセンス突然変異のＳＮＡＰ２５タンパク質に対する結合を評価する。発達中および成体野生型マウスの大脳、小脳、視床、海馬ならびに脳幹において、特異的ポリクローナル抗体を用いた二重染色技術を利用して、共焦点顕微鏡観察によりミオクロニン１／ＥＦＨＣ１／ＳＮＡＰ２５複合体の発現プロフィールを調べる。大発作痙攣および欠神発作の分子メカミズムを理解することは、若年性ミオクローヌスてんかんにおける治療的処置につながるであろう。
【０２５３】
てんかんの一般的形態である若年性ミオクローヌスてんかんは、遺伝的には不均一である。特発性全般性てんかん（ＩＧＥ）の中で、様々な著者が若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）、小児欠神てんかん（ＣＡＥ）および覚醒時純粋大発作をてんかんの一般的な種類と考えている。ＩＧＥのうち最も頻発する形態ではないが、ＪＭＥは原発性大発作の最も一般的な原因である。多くの病院での／臨床的報告はＪＭＥがすべてのてんかん患者のうち少なくとも１２％を占めると報告しているが、地域住民を対象とした有病率研究はＪＭＥをすべてのてんかん患者の６％に当たると位置づけた。図７を参照されたい。Delgado- Escueta, et al., Neurology, 34: 285-295, 1984; Nicoletti, et al., 1999; Delgado-Escueta, et al., Adv. Neurol., 89: 161-184, 2002; Delgado-Escueta, et al., Epilepsy and Movement Disorders, Cambridge University Press, pp. 421-450, 2002; Thomas, In: Roger, et al., (編) Epileptic syndromes in infancy, childhood and adolescence 第３版, Eastleigh: John Libbey & Co. Ltd., Chapter 24, pp. 335-355; Goosses, Frei Berlin University, West Berlin, 1984; Thomas, In: Roger, et al., (編) Epileptic syndromes in infancy, childhood and adolescence 第３版, Eastleigh: John Libbey & Co. Ltd., Chapter 24, pp. 335-355; Manford, et al., Arch. Neurol, 49: 801-808, 1992; Genton, et al., Li: Delgado-Escueta, et al., Myoclonic Epilepsies, Adv. Neurol, 2004, 出版準備中。
【０２５４】
若年性ミオクローヌスてんかんはケベック出身の大きな１家系での染色体５ｑ３４−ｑ３５上のＧＡＢＲＡ１遺伝子の突然変異、１人の女性での染色体２ｑ２２−ｑ２３上のＣＡＣＮＢ４遺伝子の突然変異、ドイツ出身の１家系での染色体３ｑ２６上のＣＬＣＮ２遺伝子の突然変異、ならびにニューヨーク市出身のＪＭＥヨーロッパ系アメリカ人家系での染色体６ｐ２１上のＢＲＤ２およびそのプロモーター領域のＳＮＰＳと関連付けられてきた。しかしながら、１つの報告を除いて、これらのメンデル遺伝てんかん遺伝子はＪＭＥの複雑な遺伝学的性質、その中間的な臨床表現型および内包されるＥＥＧ表現型である「多棘波のみを伴う無症候」を説明することができない。Cossette, et al., Nat. Genet., 31: 184-189, 2002; Escayg et al., Am, J. Hum. Genet., 66. 1531-1539, 2000; Haug, et al., Am. J. Hum. Genet, 69(S4): 226, 2001; Heils, et al., Epilepsia, 42(S7): 22, 2001; Pal, et al., Am. J. Hum. Genet., 71: 442, 2002。
【０２５５】
ＥＦハンドを有するタンパク質（ミオクロニン／ＥＦＨＣ１）をコードする遺伝子であるＥＪＭ１Ａは、ＪＭＥを有するスペイン系アメリカ先住民家系において突然変異している。１９８８年、１９９５〜１９９６年、２００１〜２００２年に、「古典的ＪＭＥ」の遺伝子座は、７０％の減少した浸透度を有する常染色体優性遺伝モデルと推定して、ロス・アンジェルス、メキシコおよびベリーズ出身の家系を用いて、Ｄ６Ｓ１７１４／Ｄ６Ｓ１９６０およびＤ６１５７３により占められる染色体６ｐ１２−１１（ＥＪＭ１Ａ）の７ｃＭ〜１ＭＢにわたる領域にマッピングされ、精密化された。メキシコ系３１家系が組換えマッピングおよび突然変異解析に用いられた。すべての領域をカバーし、１８遺伝子が特定されている物理的マップが作製された。ミオクロニン／ＥＦＨＣ１遺伝子を除いて１８遺伝子すべてが突然変異スクリーニングにより排除された。ＥＪＭ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＫ００１３２８）はＤ６Ｓ１９６０と１８０ｅ２２の間に位置し、メキシコ出身のＪＭＥ３１家系のうち６家系の症候性有病者およびＥＥＧ有病者の両者とともに分離する突然変異を有する。ＥＪＭ１Ａ遺伝子は約６３ｋｂにわたり、少なくとも１１のエクソンを有し、６４０アミノ酸のタンパク質をコードする。図７を参照されたい。ＩｎｔｅｒＰｒｏおよびＰｆａｍデータベースについてのドメイン検索により、アミノ酸残基５７８〜６０６のＥＦハンドモチーフが明らかになっている（ｐｆａｍ０００３６；Ｅ値＝０．０００６６）。ＥＪＭ１Ａはミオクロニン／ＥＦＨＣ１（EF-hand containing 1）遺伝子と名付けられた。一般的なＥＦハンドモチーフは２つの協調的に相互作用するドメインを有し、それらのそれぞれは、カルシウム結合ループにより連結されたＥおよびＦと呼ばれる垂直に位置する２つのαヘリックスから構成される。Ｃ末端ＥＦハンドは神経のカルシウムセンサーであるカルモジュリンファミリー、Ｃａ２＋ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ２＋活性化型Ｋ＋およびＣａ２＋チャネル、ならびに種々の新規なカルシウム結合タンパク質（カルセニリン、ＤＲＥＡＭおよびＫｃｈＩＰ３など）において見出される（Braunewell and Gundelfinger 1999）。Greenberg, et al., Am. J. Hum. Genet., 66. 508-516, 2000; Liu, et al., Amer. J. Hum. Genet., 57: 368-381, 1995; Liu, et al., Amer. J. Med. Genet., 63(3): 438-446, 1996; Serratosa, et al., Ann. Neurol, 39: 187-195, 1996; Bai, et al., Am. J. Med. Genet., 113: 268-274, 2002; Morita, et al., Am. J. Hum. Genet., 69: 534, 2001; Braunewell, et al., Cell Tissue Res., 295: 1-12, 1999。
【０２５６】
ミオクロニン／ＥＦＨＣ１遺伝子の全１１エクソンおよびイントロン−エクソン境界領域についてのＪＭＥ３１家系での突然変異解析により、メキシコおよびロス・アンジェルス出身の血縁関係のないＪＭＥ７家系のうち、２４名のてんかん有病者またはＥＥＧ多棘波有病者での４種類のヘテロ接合性ミスセンス突然変異および１つの二重ヘテロ接合性ミスセンス突然変異が明らかになった（付録２の記述を参照のこと）。これらの突然変異は、３８２名の健常対照（メキシコ系２５２名、日本人９６名、白人３４名）には見られず、このことは、これらが無関係な多型ではないことを暗示する。二重ヘテロ接合性突然変異（Ｐｒｏ７７ＴｈｒおよびＡｒｇ２２１Ｈｉｓ）は、家系＃１と＃２の有病者で見つかった。家系＃３および＃４では、ｃ．６８５Ｔ＞Ｃが２２９番目のコドンでのフェニルアラニンからロイシンへのアミノ酸変化（Ｐｈｅ２２９Ｌｅｕ）をもたらしていた。家系＃５では、ヌクレオチド変化ｃ．６２８Ｇ＞Ａがアミノ酸置換Ａｓｐ２１０Ａｓｎをもたらしていた。家系＃６の有病者は、突然変異Ａｓｐ２５３Ｔｙｒ（ｃ．７５７Ｇ＞Ｔ）についてヘテロ接合であった。
【０２５７】
ＥＦハンドモチーフを有する該新規遺伝子でのＡｒｇ１８２Ｈｉｓ変異体もまた、ＪＭＥスペイン系アメリカ先住民５家系の２３名の有病者に見つかっており、ＪＭＥの発端患者１２４名と顕著に関連している。コード多型であるｒｓ３８０４５０５（Ｇ／Ａ、Ａｒｇ１８２Ｈｉｓ）が、６ｐ１２が連鎖するベリーズ出身の大きなスペイン系アメリカ先住民家系のうち９９名（有病者１０名、非有病家系者６８名および２１名の配偶者を含む）において、ｄＨＰＬＣ、ＴａｑＭａｎ対立遺伝子鑑別および直接シーケンシングにより遺伝子型決定された（原稿を参照のこと）。３２２名の非有病・非血縁スペイン系アメリカ先住民も遺伝子型決定された。１０名すべての有病者はヘテロ接合（Ｇ／Ａ）であった。６８名の非有病者のうち、１１名が対立遺伝子Ｇ／Ａを有していた（１６．２％）。２１名の配偶者のうち、３名が対立遺伝子Ｇ／Ａを有していた（１４．７％）。３２２名の地域住民対照のうち、２５名がＧ／Ａを示す（１６．６％）。有病家系者と非有病家系者（ｘ２＝２０．４４、ｐ＜０．００）、配偶者（ｘ２＝２０．４４、ｐ＜０．００１）、および地域住民対照（ｘ２＝３８．１０、ｐ＜０．００１）の間で、差異は統計学的に有意であった。このことは、変異体ｒｓ３８０４５０５（Ｇ／Ａ、Ａｒｇ１８２Ｈｉｓ）はＪＭＥを有するこの大きな家系のうちの有病者に統計的に見て関連し、ＪＭＥのリスクに寄与していることを示唆する。この変異体は野生型ミオクロニンンの作用を部分的にしか逆転させず、ＰＱ型ＶＤＣＣの不活性化の遅延、Ｒ型ＶＤＣＣ電流の増大およびアポトーシスの誘導において野生型ミオクロニン／ＥＦＨＣ１と同様に有効に作用するので、上記の知見は大きな意味を持つ。
【０２５８】
ＳＮＰ ｒｓ３８０４５０５はまた、３２２名の症例対照と比較して、１２４名の非血縁発端者に有意に関連していることが認められた。
【０２５９】
予備的研究は、Ａｒｇ１８２Ｈｉｓ変異体が日本出身のＪＭＥ患者でもよく見出されることを示している。Ｙ染色体についての研究から、日本人の起源はシベリア地域に近く、ここはアメリカ先住民の起源でもあるので（Bianchi et al., 1998）、日本出身のＪＭＥ患者に同じＡｒｇ１８２Ｈｉｓ変異が存在するかどうかについて予備的なスクリーニングを行った。日本人ＪＭＥ患者でのＡｒｇ１８２Ｈｉｓ変異の有病率は３８％であり、それに比べて日本およびメキシコ出身の健常対照では８％であった（日本人患者についてΧ２＝１２．７、Ｐ＜０．０１）。
【０２６０】
ＪＭＥの複雑な遺伝学的性質は、稀な頻度の低い突然変異と頻発する変異体から構成され、このことが罹患性に広い幅を与えている可能性がある。低い対立遺伝子発生頻度と高い置換性（displacement）を有する遺伝子（メンデル遺伝または近メンデル遺伝（Risch, 2001））は、通常は連鎖およびポジショナル・クローニングにより特定されるものであることは一般的に知られている。これらの遺伝子を有する個体はリスク分布の末端部に位置し、大きな表現型効果、高い浸透性および家系内での古典的メンデル遺伝的挙動を有する対立遺伝子の確認に寄与する（Weiss and Terwilliger, 2000）。実際に、十分に大きな置換性（displacement）を有する共通対立遺伝子は連鎖によっては稀にしか検出されていない。それならば、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１での、Ａｒｇ１８２Ｈｉｓのようなエクソン内の変異体またはイントロン調節部位内の変異体が、スペイン系アメリカ先住民での様々な程度のリスク（低〜中程度）に寄与しているのではないか、Ａｒｇ１８２Ｈｉｓのような変異体がヨーロッパ系アメリカ人でのリスクに何らかの（およらくは小さい）効果を有しているのではないかと問うことは理にかなっている。これらの問いに答えるために、あるプロジェクトでは、メキシコ、カリフォルニアおよび中央アメリカ出身の６００名のＪＭＥ患者においてミオクロニン／ＥＦＨＣ１での突然変異および変異体をスクリーニングする。結果はスペイン系アメリカ先住民とヨーロッパ系アメリカ人とで対照的である。ミオクロニン変異体は連鎖不均衡に基づく相関研究によりマッピングされている（Smith et al., 2001; McKeigur et al., 1997, 1998）。一般的な疾患に関連する稀な遺伝子変異体の最近の２つの例は、クローン病でのＮＯＤ２ロイシンリッチリピート変異体（Hugot et al., 2001; Ogura et al., 2001）と、全身性エリテマトーデスでのＰＤＣＤ１（programmed cell death 1）中のイントロンＳＮＰ（Prokunina et al., 2002）である。Risch, Nature, 405: 847-856, 2000; Weiss, et al., Nature Genetics,
26: 151-157, 2000; Smith, et al., Amer. J. Hum. Genet, 69(5): 1080- 1094, 2001; McKeigue, Amer. J. Hum. Genet., 60: 188-196, 1997; McKeigue, Am. J. Hum. Genet., 63: 241-251, 1998; Hugot, et al., Nature, 411: 599-603, 2001; Ogura, et al., Nature, 411: 603-606, 2001; Prokunina, et al., Nature Genetics, 32(4): 666-669, 2002。
【０２６１】
表現型と遺伝子型はミオクロニン／ＥＦＨＣ１の機能と相関している。ミオクロニン／ＥＦＨＣ１の唯一の既知の機能的ドメインはＥＦハンドモチーフであり、神経でのカルシウム感受、結合およびモジュレーションでの役割を示唆する。ｓｔａｒｇａｚｅｒ、ｔｏｔｔｅｒｉｎｇおよびｌｅｔｈａｒｇｉｃてんかんマウスでのカルシウムチャネルサブユニットにおける突然変異はてんかんの病因におけるカルシウム恒常性の重要な役割を強調している。ＥＦハンドカルシウム感受モチーフがあるために、またてんかん患者で報告される異常のために、最初の機能性研究ではミオクロニン／ＥＦＨＣ１の電位依存性Ｃａ２＋チャネル（ＶＤＣＣ）に対する効果について研究された。Burgess, et al., Cell, 88: 385-92, 1997; Cox, et al., 1997; Letts, et al., Nat. Genet., 19: 340-7, 1998; Kawasaki, et al., Protein Profile, 1: 343-517, 1994; Heizmann, et al., Trends Neurosci., 15: 259-264, 1992; Kullman, 2002; Fletcher, et al., 1996; Burgess, et al., Cell, 88: 385-92, 1997; Letts, et al., Nat. Genet., 19: 340-7, 1998。
【０２６２】
ω−アガトキシンＩＶＡ感受性ＰＱ型ＶＤＣＣ（Ｃａｖ２．１）、ならびにＰＱ型ＶＤＣＣおよび野生型ＥＦＨＣ１または突然変異体構築物でトランスフェクトされたヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株について調べた。図８を参照されたい。パッチクランプ解析により、ＥＦＨＣ１は顕著に不活性化速度を遅らせ、また不活性化の電位依存性を正電位に向かってシフトさせることが示された。ＥＦＨＣ１は活性化の電位依存性（表１を参照のこと）またはＣａ２＋電流密度のような他のパラメータにはそれほど影響しなかった。
【表１】
2008506707.tif 000004
【０２６３】
ＪＭＥ突然変異Ｐ７７Ｔ、Ｒ２２１およびＦ２２９Ｌはカルシウム不活性化に対するＥＦＨＣ１の遅延効果を消失させた。Ｄ２１０Ｎはカルシウム不活性化には顕著な影響を及ぼさなかった（表１を参照のこと）。Ｄ２５３Ｙ突然変異体は、ベクターをトランスフェクトした対照のＰ／Ｑ型発現細胞と比較して、カルシウム電流の持続成分を減少させた。しかしながら、突然変異体Ｄ２５３Ｙは電流密度を顕著に増大させ、一方でＰ７７ＴはＣａ２＋密度を中程度に増大させる。他の突然変異体はＣａ２＋電流密度に影響しなかった。総合すると、Ｃａ２＋チャネルの補助サブユニットの効果と比較した場合であってさえ、カルシウム不活性化に対するＥＦＨＣ１の効果は、著しくかつユニークである。 Wakamori, et al., J. Biol. Chem., 273: 34857-34867, 1998; Letts, et al., Nat. Genet., 19: 340-7, 1998。
【０２６４】
ＳＮＸ−４８２感受性Ｒ型ＶＤＣＣに対するＥＦＨＣ１の効果を調べた。Ｒ型ＶＤＣＣおよびＥＦＨＣ１発現構築物を共トランスフェクトした仔ハムスター腎（ＢＨＫ）細胞のパッチクランプ解析により、ＥＦＨＣ１がＲ型ＶＤＣＣ電流を顕著に増大させることが明らかになった。ＪＭＥ突然変異はここでも、増大したＲ型Ｃａ２＋電流を部分的に逆転させた（付録２の記述を参照のこと）。
【０２６５】
ＥＦＨＣ１により引き起こされる不活性化の阻止はＰ／Ｑ型チャネルを介したカルシウム流入を助長し得ること、およびＥＦＨＣ１が直接的にＲ型カルシウム電流を増大させることから、下流の細胞内応答がもたらされる可能性がある。細胞培養のマウス海馬ニューロンを野生型ＥＦＨＣ１でトランスフェクトし、神経分化および神経突起伸長について特性決定した。トランスフェクション１６時間後、ＧＦＰ−ＥＦＨＣ１陽性ニューロンはｐＥＧＦＰベクターのみでトランスフェクトしたニューロンと比較して短い突起と少ない分枝を示した。トランスフェクション４８時間後（付録２の記述を参照のこと）、ＧＦＰ−ＥＦＨＣ１陽性ニューロンはすべて、細胞体の縮小および突起の断片化をはじめとする神経変性ならびに細胞死の徴候を示した。ｐＥＧＦＰベクターのみでトランスフェクトした対照培養は、変性の特徴を何ら示さなかった（付録２の記述を参照のこと）。ＥＦＨＣ１トランスフェクト細胞はＴＵＮＥＬ陽性であり、アポトーシスが示唆された。細胞の生存性に対するＥＦＨＣ１突然変異の効果を、細胞の形態とは関係なく、種々の時点で培養ディッシュに接着しているＧＦＰ陽性生存細胞の計数により調べた。ＥＦＨＣ１の細胞死効果は、５種類のＪＭＥ突然変異または二重突然変異Ｐ７７Ｔ／Ｒ２２１Ｈのいずれによっても顕著に低減された。対照集団で見出された３種類のコード多型はＥＦＨＣ１の細胞死効果に影響しなかった。細胞生存に対するＥＦＨＣ１アイソフォームの効果を評価した。転写産物Ｂ発現構築物（ｉｓｏと称される）は中程度の細胞死効果をもたらし、野生型の共発現は中間的な効果を示した。転写産物Ｂによりコードされるアイソフォームタンパク質による細胞内機能およびＶＤＣＣに対する効果はいまのところ不明である。
【０２６６】
１つの仮説は、Ｃａｖ２．３脱調節／不完全アポトーシスがミオクロニーおよび痙攣につながっているというものである。例えば、これまでの研究は、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１がＰＱ型カルシウム不活性化を遅延させ、Ｒ型ＶＤＣＣ電流を増大させることで、カルシウム流入を効果的に増大させていることを提案することを可能にするものである。次に、増大したカルシウム流入は海馬細胞でプログラムされた細胞死を引き起こす。ＪＭＥ突然変異は、Ｃａｖ２．３を介したＥＦＨＣ１のアポトーシス活性を弱めることにより、ＣＮＳ発達中の不要なニューロンの除去を妨げ、不安定なカルシウム恒常性を有するニューロンの密度の増大を引き起こし、過剰興奮性回路によるミオクロニーおよび大発作をもたらす。実験結果は、ボクセルに基づく定量的ＭＲＩおよび２ＦＤＧ ＰＥＴスキャンにより検出されたＪＭＥでの微小発育不全ならびに構造的に肥厚した大脳皮質の神経病理学的知見を説明する。図７を参照されたい。Woermann, et al., Brain, 122: 2101-2108, 1999。
【０２６７】
別の仮説は、ＪＭＥ突然変異がミオクロニン／ＥＦＨＣ１とＳＮＡＰ２５の異常な相互作用を引き起こし、ＨＶＡＣＣ電流を変化させ、よりＬＶＤＣＣ側へ、また皮質棘波生成の方向へとバランスを崩させる、というものである。
【０２６８】
ミオクロニン／ＥＦＨＣ１の「カルシウムミリスチン酸化」（calcium myristolation）機能と合致するのは、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１が相互作用する主要な組換えタンパク質として、酵母ツーハイブリッド系によりＳＮＡＰ２５、すなわち可溶性ＮＳＦ（Ｎ−エチルマレイミド感受性因子）付着タンパク質２５が特定されたことである。高電位依存性カルシウムチャネル、すなわちＨＶＤＣＣと相互作用するシナプス性ＳＮＡＰ２５の１コピーのマウスでの遺伝的欠失は、棘波および欠神てんかんをもたらす。Ｃａｖ２．３脱調節は痙攣性大発作およびミオクロニーを説明することが可能であり、一方で突然変異型ミオクロニン／ＥＦＨＣ１によるＳＮＡＰ２５の結合はＨＶＤＣＣを傷害し、視床で低電位活性化型Ｔ型ＶＤＣＣへとバランスを崩させ、ＪＭＥにおける皮質棘波および欠神発作を引き起こし得る。ＳＮＡＰ２５はパルミチン酸化された表在膜タンパク質であり、ボツリヌス毒素ＡおよびＥにより切断され、また、シンタキシン（syntaxin）と結合する。ＳＮＡＰ２５は形質膜とシナプス小胞の両方で見出されており、シナプス小胞輸送およびエキソサイトーシスに関与する。シナプトブレビン（synaptobrevin）と呼ばれるシナプス小胞タンパク質はボツリヌス毒素Ｂ、Ｄ、Ｆ、ＧおよびＨならびに破傷風毒素により切断される。ボツリヌス毒素Ｃ１は２種類の基質を切断する。ＳＮＡＰ２５とシンタキシンである。シンタキシンはＳＮＡＰ２５と共局在している。ボツリヌス毒素と破傷風毒素の基質としてこれら３種類のタンパク質、すなわちシナプトブレビン、ＳＮＡＰ２５およびシンタキシンが特定されたことにより、これらのタンパク質がプライミング反応において作用することが明らかとなった。図７を参照されたい。プライミング反応は部分融合反応を含むため、これら３種類のタンパク質はシナプス小胞の融合に直接的に関与しているはずである。この見解を支持するべく、これら３種類のタンパク質は互いに相互作用して安定な三量体複合体を形成する。Ames, et al., Nature, 389: 198-202, 1997; Zhang, et al., J. Neurosci., 24(22): 5239-5248, 2004。
【０２６９】
融合後、この三量体複合体は分解して、その構成タンパク質は次の融合反応のために活性型コンホメーションに戻るはずである。Ｎ−エチルマレイミド感受性因子（ＮＳＦ）と呼ばれるＡＴＰａｓｅがこの機能を果たすが、これは可溶性ＮＳＦ付着タンパク質（ＳＮＡＰ）と呼ばれる付着タンパク質とともにシャペロンとして働くことによる。ＮＳＦは当初は融合反応に直接的に参加していると考えられていたが、現在は、この酵素はおそらく膜融合装置の構成要素を活性型コンホメーションに再利用するために必要であることが明らかになっている。神経伝達物質のカルシウム誘発性放出は、続いて、比較的低親和性のセンサーであるシナプトタグミン（synaptotagmin）に複数のカルシウムイオンが結合することによりもたらされるものと思われる。
【０２７０】
ミオクロニン／ＥＦＨＣ１の正確な生化学的機能および生存ニューロンでの生理的な役割は未だ明らかになっておらず、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１はＰＱ型カルシウム不活性化を遅延させ、かつＲ型カルシウム電流を増大させ、また、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１がＳＮＡＰ２５（その欠失は欠神を引き起こすことが知られている）と結合するので、このタンパク質についての研究は、カルシウムモジュレーションでの役割とＳＮＡＰ２５との相互作用に集中している。そのタンパク質、ミオクロニン１は、１つのＥＦハンドドメインと、ミリスチン酸化ドメインの配列を含み、後者は細胞内カルシウムシグナル伝達およびエキソサイトーシスならびにおそらくてんかん発生に関与していることが知られている。従って、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１タンパク質は、治癒的抗てんかん薬設計および開発の重要な標的である。
【０２７１】
ＧＥＮｅｔｉｃ Ｅｐｉｌｅｐｓｙ ＳｔｕｄｉｅｓすなわちＧＥＮＥＳＳの一部である国際ＪＭＥ協会は、大きな複合的な家系の補充と共通てんかん遺伝子のさらなる発見に力を注いできた。この協会は、成人まで続く欠神てんかんの染色体遺伝子座を８ｑ２４に特定し、持続して若年性ミオクローヌスてんかんに発展する欠神てんかんの遺伝子座を１ｐに特定した。進展としては以下のことが挙げられる：まず６ｐ１２染色体座を特定したこと、マップ上の位置をさらに精密にしたこと、物理的マップを構築したこと、遺伝子を単離したこと、およびミオクロニン１／ＥＦＨＣ１においてＪＭＥ突然変異を明らかにしたこと。ラフォーラ型進行性ミオクローヌスてんかんにおけるさらなる進展としては以下が挙げられる：６ｑ２４染色体座を特定したこと、マップ上の位置をさらに精密にしたこと、６ｑ２４の物理的マップを構築したこと、遺伝子を単離したこと、およびラフォーリン（Laforin）／二重特異的ホスファターゼにおいてＥＰＭ２Ａ突然変異を明らかにしたこと。第２のラフォーラ病遺伝子であるＥＰＭ２Ｂ／マーリン（malin）が明らかにされている。ラフォーリンすなわちＥＰＭ２ａの全長マウスｃＤＮＡクローンおよびマウスゲノムクローンが単離され、マウス１０番染色体（ヒト染色体６ｑ２４のシンテニック（syntenic）領域）にマッピングされており、ＥＰＭ２ａエクソン４ＫＯマウスが作製されている。ＪＭＥについてのノックアウトマウスモデルを作製するために、同様の方法が採られている。
【０２７２】
ＧＥＮＥＳＳの国際ＪＭＥ協会の遺伝学コアユニットは、ＪＭＥ患者および家系者の症候性表現型ならびにＥＥＧ表現型を認定し（包含および排除の基準については付録２の記述を参照のこと）、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１における突然変異を特定している。メキシコとホンジュラスで集められ登録された、複合的で複数世代のＪＭＥ３０家系からなる３つの別個の新規なコホートがスクリーニングされている。遺伝学コアユニットはまた、プログラムされた細胞死のミオクロニン１／ＥＦＨＣ１誘導に対する効果について、ＪＭＥ突然変異をスクリーニングしている。野生型ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１のアポトーシス活性を逆転させるＪＭＥ突然変異は、仮説上は、不完全なアポトーシスによってＭＲＩにより示された肥厚した大脳皮質を有するはずである。従って、これらのＪＭＥ患者については、高解像能定量的ＭＲＩも行われている。ミオクロニン／ＥＦＨＣ１のドメインに対するポリクローナル抗体は、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（遺伝子転写産物の分布）と併せて、以下の対象での発達およびミオクロニン／ＥＦＨＣ１の機能の研究のために用いられている：（ａ）正常野生型マウス、（ｂ）てんかんの既往のない小児、青年期および成人ヒト解剖体の脳、および（ｃ）ＪＭＥのヒト解剖体の脳。Minassian, et al., Nature Genet., 20(2): 171-174, 1998; Minassian., et al., Neurology 8, 55(3): 341-346, 2000; Minassian, et al., Neurology, 54(2): 488-90, 2000; Ganesh, et al., Hum. MoI Genet., 12: 2359-2368, 2003。
【０２７３】
ミオクロニーと痙攣について説明する助けとするために、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の種々のドメイン、ＪＭＥ突然変異ならびにＣａｖ２．３およびＣａｖ２．１の機能に対する抗てんかん薬の役割が研究されている。ＪＭＥでの欠神発作について説明する助けとするために、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１とＳＮＡＰ２５との間の正確な分子間相互作用が研究されている。
【０２７４】
カルシウムモジュレーションの役割についての研究では、Ｃａｖ２．３調節において新規に特定された突然変異および変異体の役割が調べられ、ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株のパッチクランプ解析によりＲ型カルシウムチャネル（Ｃａｖ２．３）およびＰ／Ｑ型カルシウムチャネル（Ｃａｖ２．１）に対するミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の作用についてそれらが比較されるであろう。複数の転写産物（２．３ｋｂ、４．４ｋｂ、７．５ｋｂおよび９．５ｋｂ）およびＪＭＥ発作を抑制する抗てんかん薬が、Ｃａｖ２．３およびＣａｖ２．１に対する効果について研究されるであろう。
【０２７５】
電気生理学的研究では以下のことを調べる：（ａ）２．３ｋｂ、４．４ｋｂ、７．５ｋｂおよび９．５ｋｂ転写産物の細胞内作用、（ｂ）抗てんかん薬（レベチラセタム、ゾニサミド、ラモトリジン、トピラメート、エトスクシミド、フェニトイン、カルバマゼピン）の効果、ならびに（ｃ）コアユニットの活動により明らかになった新規なＪＭＥ突然変異および変異体の作用。
【０２７６】
抗てんかん薬（ＡＥＤ）の作用のメカニズムはてんかん遺伝子によりもたらされるてんかん発生についての知見を提供し得る。ＪＭＥで発作抑制性のＡＥＤ（バルプロエート、レベトリセタム、トピラメート、ゾミザミドおよびラモトリジン等）の作用機序は未だ明らかになっていない。同様に、エトスクシミドが効果を有しないこと、ならびにフェニトインおよびカルバマゼピンはＪＭＥで発作を悪化させる場合があることの理由も明らかになっていない。バルプロエートはラットの節上ニューロンでは低閾値Ｔ型ＶＤＣＣを選択的に減少させるが、視床ニューロンではその作用がない。一方、エトスクシミドは視床ニューロンでＴ型ＶＤＣＣを減少させる。レベチラセタムは高電位活性化型カルシウム電流を抑制したが、高電位活性化型カルシウム電流の具体的な型は明らかにされていない。レベチラセタムはＴ型ＶＤＣＣに対して効果がなかった。トピラメート（１０μｍｏｌ／Ｌ）はＬ型ＨＶＤＣＣのピークを低下させる。ゾニザミド（５００μｍｏｌ／Ｌ）はＨＶＤＣＣを変化させないが、培養胎児ラット皮質ニューロンでのＴ型ＬＶＤＣＣを減少させる。ラモトリジンはＬ型に作用しないが、Ｎ型とＰ型のＨＶＤＣＣを阻害する。ＬＶＤＣＣとＨＶＤＣＣ両者に対する野生型ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の効果およびＪＭＥ突然変異の効果についての、同等な「治療的」および「毒性」濃度でのこれら薬物の作用を明らかにすることによって、ＪＭＥ突然変異がいかにして発作を引き起こすのかについての知見が得られる。ＪＭＥ発作を抑制するＡＥＤはＰ／Ｑ型ＶＤＣＣおよびＲ型ＶＤＣＣに対するＪＭＥ突然変異の効果を逆転させる可能性がある（研究対象のＡＥＤの濃度については付録３の表を参照のこと）。Kelly, et al., Neurosci. Lett., 116:1-2, 1990; Coulter, et al., Ann. Neurol, 25: 582-593, 1989; Niespodziany, et al., Epilepsia, 31: 347, 2000; Suzuki, et al., Epilepsy Research, 12: 21-27, 1992。
【０２７７】
Ｐ／Ｑ型カルシウムチャネルの生物物理は主にα１Ａサブユニットにより決定され、より小さな補助ポリペプチド（Ｂ、α２ｄおよびγサブユニット）により多少決定されている。α１Ａサブユニットはポアを形成し、電位感受およびイオン透過に必須である。α１Ａの細胞質Ｃ末端は、βサブユニットとの相互作用、カルシウムカルモジュリン媒介不活性化およびＧタンパク質媒介性調節に関与する。以下のものをはじめとする種々の薬物について試験する：Ｐ型ＶＧＣＣアンタゴニストω−アガトキシンＩＶＡ（０．１μＭ；Calbiochem, La Jolla, CA）；Ｎ型ＶＧＣＣアンタゴニストω−コノトキシンＧＶ１Ａ（１μＭ；Calbiochem）およびＬ型ＶＧＣＣアンタゴニストニモドピン（nimodopine）またはニフェジピン（１μＭ；Research Biochemicals International, Natick, MA）、Ｒ型ＶＤＣＣアンタゴニストＳＮＸ−４８２（Peptide Institute Inc）、Ｔ型ＶＤＣＣアンタゴニストフルナリジン（Nacalai Tesque）。ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株であるＨＥＫ（ＢＩ−２）をα１Ｅ（ＢＩＩ）、α１Ａ（ＢＩ−２）、α２／ｄおよびβ１ａサブユニットで安定にトランスフェクトし、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）、３０μｇ／ｍＬペニシリンおよび３０μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で培養する。Liljelund, et al., J. Neurosci., 20(19): 7394-7403, 2000; Mori et al., Nature, 350: 398-402, 1991; Niidome T, Kim MS, Friedrich T, Mori Y, 1992, FEBS Lett., 308, 7-13; Niidome T, Teramoto T, Murata Y, Tanaka I, Seto T, Sawada K, Mori Y, Katayama K (1994). Stable expression of the neuronal BI (class A) calcium channel in baby hamster kidney cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 203:1821-1827。
【０２７８】
野生型または突然変異型ＥＦＨＣ１を一過的に発現させるために、ＨＥＫ（ＢＩ−２）細胞を、ＥＦＨＣ１もしくはその突然変異体のｃＤＮＡを融合させたＥＧＦＰを有するｐＥＧＦＰ−Ｃ２プラスミド（Clontech）で、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬（QIAGEN）を用いてトランスフェクトする。対照実験として、ＥＦＨＣ１インサートを有しない同量のｐＥＧＦＰでＨＥＫ（ＢＩ−２）をトランスフェクトすることにより、ＥＧＦＰを一過的に発現させた。トランスフェクション２４時間後に、細胞をトリプシン処理し、ＤＭＥＭ培地で希釈し、カバーガラス上に蒔く。ＧＦＰ陽性細胞からトランスフェクション３６〜４８時間後にＣａ２＋電流を記録する。ＨＥＫ（ＢＩ−２）細胞からの電流は、ＥＰＣ−９増幅器（HEKA, Germany）を用いて、ホールセルモードのパッチクランプ技術により、室温（２２〜２５℃）にて記録する。パッチピペットの作製、電流サンプリング、カルシウム電流記録、活性化および不活性化の電位依存性の測定はSuzuki et al. (2004)に記載されているのと同様に行う。すべての値は平均±ＳＥとして表す。
【０２７９】
ミオクロニン１−ＳＮＡＰ２５相互作用の役割についての研究は、ｉｎ ｖｉｔｒｏＧＳＴプルダウン実験を用いて、またトランスフェクトされて両タンパク質を発現するＨｅＬａ細胞からの免疫共沈降によりｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて継続する。次に、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１ミスセンス突然変異のＳＮＡＰ２５タンパク質へのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ結合を評価する。発達中および成体野生型マウス大脳、小脳、視床、海馬ならびに脳幹において特異的ポリクローナル抗体での二重標識技術を用いて、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１／ＳＮＡＰ２５複合体の発現プロフィールを共焦点顕微鏡観察により調べる。
【０２８０】
ミオクロニン１−ＳＮＡＰ２５相互作用の役割についての研究は、酵母ツーハイブリッド技術、直列的アフィニティー精製および質量分析を用いた特異的タンパク質−タンパク質相互作用の検証へと続く。ラフォーラ病のＥＭＰ２Ａ遺伝子転写産物であるラフォーリンと相互作用するタンパク質の、ツーハイブリッド系を用いた特定において、共焦点顕微鏡観察を使用する。Ganesh, et al., Hum. MoI. Genet., 12: 2359-2368, 2003。
【０２８１】
Ｄｕｐｌｅｘ−Ａ酵母ツーハイブリッドシステム（OriGene Technolgies Inc., Rockville, MD）を用いて、ミオクロニンとかみ合う一群のタンパク質を特定することができる。すべての実験は酵母株ＥＧＹ４８にて行った。ベイトベクターｐＥＧ２０２−ミオクロニンで、推奨されている通りに酢酸リチウム法を用いてＥＧＹ４８細胞を形質転換し、続いて形質転換体をｌａｃＺレポーター遺伝子の自己活性化の欠如について調べる。ライブラリースクリーニングのために、ｐＥＧ２０２−ミオクロニンで形質転換したＥＧＹ４８細胞の単一コロニーを一晩増殖させ、ベクターｐＪＧ４−５（OriGene）中に構築したヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリーで形質転換した。約２×１０６形質転換体をＹＮＢ（ｇａｌ）−ｈｉｓ−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｌｅｕ選択平板培地上に蒔いた。３０℃にて３〜５日間インキュベートした後、陽性クローンをガラクトース増殖依存性およびｌａｃＺ発現についてさらに試験した。ＹＮＢ（ｇａｌ）−ｈｉｓ−ｕｒａ−ｔｒｐ−ｌｅｕ平板培地での増殖によりβ−ｇａｌ陽性クローンからプラスミドＤＮＡを単離し、大腸菌ＫＣ８を形質転換した。酵母ツーハイブリッドスクリーニング陽性クローンをプローブとして、ヒト胎児脳ｃＤＮＡライブラリー（ＵＮＩ Ｚａｐベクター、Stratagene）および成体マウス脳ｃＤＮＡライブラリー（λＺＡＰベクター、Stratagene）をスクリーニングした。約２×１０６個のプラークを一晩ハイブリダイズさせ、陽性クローンファージでｉｎ ｖｉｖｏ切除（in vivo excision）によりプラスミドを形質転換し、インサートについてシーケンシングした。
【０２８２】
該スクリーニングにより、ミオクロニンとは相互作用することができたが、スクリーニングで用いた陰性対照とは相互作用しなかったタンパク質をコードする１０種類の異なるｃＤＮＡが明らかになった。４００〜１０００ｂｐの長さを有する１０種類のインサートを自動シーケンシングした。７種類のインサートは公知の配列とマッチし、３種類はＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースの配列とはマッチしないか、ヌクレオチドレベルで相同性を有していなかった。７つの配列のうち、４つは公知のｃＤＮＡ配列とマッチした：脳クレアチンキナーゼ（ＣＫＢ）、ヌクレオポリン（nucleoporin）ｐ５４タンパク質（ＮＵＰ５４）、シンタキシンおよびＳＮＡＰ２５である。３つの配列は公知の非コード配列とマッチした。
【０２８３】
これらの知見から、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１−ＳＮＡＰ２５複合体を直列的アフィニティー精製（ＴＡＰ）および質量分析により特性決定する。対象となるタンパク質（ミオクロニン／ＥＦＨＣ１）をコードするｃＤＮＡを、３’末端またはアミノ／カルボキシ末端にてＴＡＰカセットでタグ付けする。ＴＡＰカセットは２段階の高アフィニティー精製を可能にする２つのタグを含み、非常に軽い部位特異的プロテアーゼ処理により純粋でインタクトなタンパク質が遊離する。構築物を、ＣＭＶプロモーターの制御下にある好適な真核生物発現ベクターに挿入する。ＴＡＰタグ付けしたミオクロニン／ＥＦＨＣ１のｃＤＮＡを、対象となるタンパク質を有する細胞株にトランスフェクトし、そこで過剰発現させる。細胞を溶解させた後、直列的アフィニティー精製を２段階で行う。複合体のタンパク質構成成分をゲル電気泳動により分離し、単一バンドを溶出して、次にシーケンシングする。３ｎｇ程度のタンパク質で質量分析によりシーケンシングすることができる。この技術により、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１−ＳＮＡＰ２５複合体の分子量論を決定することが可能になり、またミオクロニン／ＥＦＨＣ１と相互作用する他のすべてのＳＮＡＰタンパク質を単離および規定することができる。
【０２８４】
ｉｎ ｖｉｔｒｏプルダウン実験によりＳＮＡＰ２５とミオクロニン／ＥＦＨＣ１との相互作用を確認した後、ミオクロニン突然変異とＳＮＡＰ２５との関係について、ミオクロニンミスセンス突然変異体とＳＮＡＰ２５とのｉｎ ｖｉｔｒｏでの結合を検証することにより調べる。（１）二重ヘテロ接合性突然変異（Ｐｒｏ７７ＴｈｒおよびＡｒｇ２２Ｈｉｓ）をコードする突然変異体、および（２）ｃ．６８５Ｔ＞Ｃをコードする突然変異体ミオクロニン／ＥＦＨＣ１ ｃＤＮＡを、ｐＧＥＸ−３Ｘ原核生物発現ベクター（Pharmacia）中でＧＳＴと融合させ、対応するＧＳＴ融合タンパク質を発現させて、グルタチオン・セファロース４Ｂビーズ（Sigma）を用いて細菌ライセートから精製する。ｐＮＭｙｃ−ＳＮＡＰ２５構築物を、３５Ｓ標識メチオニン存在下での「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」転写・翻訳系によるＳＮＡＰ２５の生成のために用いる。精製組換えＧＳＴタグ付けミオクロニン全長タンパク質またはミオクロニン突然変異体およびＧＳＴを３５Ｓ標識「ｉｎ ｖｉｔｒｏ」翻訳ＳＮＡＰ２５とともにインキュベートする。ＳＮＡＰ２５のポリペプチドがＧＳＴ−ミオクロニンビーズにより保持されるかどうかを決定する。
【０２８５】
ＳＮＡＰ２５とミオクロニン／ＥＦＨＣ１タンパク質とのｉｎ ｖｉｖｏ相互作用についてさらに明らかにするために、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１突然変異とＳＮＡＰ２５とのｉｎ ｖｉｖｏ結合性を調べる目的で、ｐＥＧＦＰ−ミオクロニンベクター（ＧＦＰミオクロニン融合タンパク質を発現）およびｐＮＭｙｃ−ＳＮＡＰ２５構築物（Ｍｙｃタグ付けＳＮＡＰ２５タンパク質を発現）をＨｅＬａ細胞にトランスフェクトする。抗ＧＦＰ抗体によってＧＦＰ−ミオクロニンが細胞ライセートから免疫沈降されるかどうか、および共トランスフェクトしたＳＮＡＰタンパク質がＧＦＰ−ミオクロニンと免疫共沈降されるかどうかを決定する。ミオクロニンとＳＮＡＰ２５が実際に相互作用しているかどうかを決定するために、ＧＦＰとＳＮＡＰ２５をそれぞれ発現するベクターで共トランスフェクトしたＨｅＬａ細胞において、抗ＧＦＰ抗体によりＳＮＡＰ２５が免疫共沈降されるか調べる。逆に、抗Ｍｙｃ抗体も共トランスフェクトした細胞からＧＦＰ−ミオクロニンタンパク質を免疫共沈降するはずであるし、また抗Ｍｙｃ抗体はＧＦＰタンパク質を免疫共沈降しないはずである。
【０２８６】
ミオクロニン突然変異体について、同様の実験を、強力なプロモーターの制御下にある真核生物発現ベクターにそれらを組み込み、次にＨｅＬａ細胞をトランスフェクトすることにより、ｉｎ ｖｉｖｏで行う。タンパク質が発現されているか、またそれがどの程度安定かについて、ウエスタンブロット解析により確認するべきである。免疫沈降実験により、大脳、小脳および脳幹神経細胞株もミオクロニン／ＥＦＨＣ１−ＳＮＡＰ複合体を有しているかどうかについて、さらに明らかになる。ＳＮＡＰファミリーのタンパク質に対する抗体がまだ市販されていない場合には、タンパク質へのＦＬＡＧタグ付けを用いる。各トランスフェクション実験に対して１種類ずつのＦＬＡＧタグ付けタンパク質を用いることができる。これらの一連の実験により、突然変異体ミオクロニンがｉｎ ｖｉｖｏにおいてＳＮＡＰ２５その他のＳＮＡＰタンパク質に結合するかどうか、過剰発現させた突然変異体がミオクロニン／ＥＦＨＣ１−ＳＮＡＰ複合体と相互作用し、ドミナントネガティブとして作用するかどうかが明らかになるはずである。
【０２８７】
発達中および成体野生型マウス大脳、小脳、視床、海馬ならびに脳幹でのミオクロニン／ＥＦＨＣ１の発現パターンは、ＡＢ６１およびＡＢ６２に対して生起されたポリクローナル抗体と、特異的ポリクローナル抗体での二重標識技術を用いたミオクロニン／ＥＦＨＣ１−ＳＮＡＰ２５複合体の共焦点顕微鏡観察とを用いて調べられている。図９は、ニューロン（９ａ）、グリア（９ｂ）および樹状突起（９ｃ：Ｃｏｎｆｏｃ １００×、エチジウム ｈｏｍｏ１：青 Ｅｐ０２１０６１：緑 ＭＡＰ−９ａｂ：樹状突起）でのミオクロニン／ＥＦＨＣ１抗体の免疫細胞化学物質を示し、軸索にはこれは見られない（９ｄ：海馬１８日目 Ｃｏｎｆｏｃ １００× エチジウム ｈｏｍｏ１：赤 Ｅｐ０２１０６１：緑 ＳＭＩ３１ 軸索：青）。発現ベクターのタンパク質産物および「対照」組織（正常マウス脳および正常ヒト脳）ならびにＪＭＥが疑われる特発性全般性てんかん患者解剖体の脳について調べる。かかる２種類の凍結脳はＵＣＬＡ／ＶＡ Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋから入手可能である。種々の年齢の正常・非ＪＭＥ脳標本（ヒトおよび動物）も入手可能である。Ｂｒａｉｎ Ｂａｎｋは事故により死亡した非ＪＭＥ成人、青年および小児解剖体の脳標本ならびに手術により摘出された脳標本から凍結脳領域を提供している。
【０２８８】
ＳＮＡＰ２５に対するポリクローナル抗体は入手可能であるので、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１および関連するＳＮＡＰ２５タンパク質の発達中ならびに成年マウスでの発現パターンを調べる。大脳、小脳、視床、海馬および脳幹について調べる。他のＳＮＡＰについては、それらもミオクロニンと相互作用するかどうか調べるために、それらに対する特異的ポリクローナル抗体を作製する。ＳＮＡＰタンパク質は、誘導可能ベクターであるｐＧＥＸ（Pharmacia）を正しいフレームで用いて、大腸菌異種系において合成する。ペプチドのコード配列をＧＳＴタグと融合させる形でプラスミドに挿入することにより、アフィニティークロマトグラフィーによって大量のタンパク質の簡便で迅速な単離が可能になる。精製したタンパク質に対して抗体を作製する。別個の遺伝子産物であるラフォーリンの二重標識研究が行われている。Ganesh, et al., Hum. Mol. Genet., 11: 1251-62, 2002; Ganesh, et al., Hum. Mol Genet., 11: 1263-1271, 2002。
【０２８９】
統計解析を行う。ＪＭＥ突然変異ならびに転写産物２．３ｋｂ、４．４ｋｂ、７．５ｋｂおよび９．５ｋｂによる活性化および不活性化の電位依存性を、野生型ＥＦＨＣ１と比較する。ＰＱ型およびＲ型ＶＤＣＣに対する抗てんかん薬の効果も調べる。比較に際してはスチューデントｔ検定を行い、０．０５未満の確率を有する統計データを有意とみなす。
【実施例１１】
【０２９０】
アポトーシス活性を有する遺伝子であるミオクロニン１／ＥＦＨＣ１での突然変異がいかにしてＪＭＥでの大発作および大欠神（rare absence）発作を引き起こすのか決定するための研究
ＪＭＥ突然変異の発現はＣａｖ２．３を介したＥＦＨＣ１のアポトーシス活性を阻止し、従ってＣＮＳ発達中の不要なニューロンの除去を妨害し、カルシウム恒常性が脱調節された異所性ニューロンの密度の増大およびミオクロニーと強直間代性痙攣の素因をもたらす。図７を参照されたい。
【０２９１】
ＪＭＥ発作を抑制するかまたは悪化させる抗てんかん薬（ＡＥＤ）を用いて、ＪＭＥ突然変異がいかにして発作を惹起するかを調べる。これらＡＥＤを調べることにより、パッチクランプにより解析されるヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株でのＣａｖ２．３およびＣａｖ２．１（Ｐ−Ｑ型ＶＤＣＣ）に対するミオクロニン／ＥＦＨＣ１およびＪＭＥ突然変異の効果に該薬物がどのようにして影響を与えるか決定する。ＪＭＥ突然変異がＣａｖ２．３電流の増大を逆転させることにより発作を引き起こす場合、ＪＭＥ発作を抑制するＡＥＤはＣａｖ２．３電流を増大させ、視床でＴ型ＶＤＣＣを消失させ、かつ皮質棘波を防止するはずである。ＪＭＥ発作を悪化させ、欠神の発生を早め、これを延長するＡＥＤは、Ｃａｖ２．３電流を阻害し、視床のＴ型ＶＤＣＣ機能および視床皮質棘波を増大させるはずである。
【０２９２】
一過的にトランスフェクトされた初代マウス海馬神経細胞培養でのアポトーシスカスケードにおけるミオクロニン／ＥＦＨＣ１およびＪＭＥ突然変異の作用部位を正確に示す。ミオクロニン／ＥＦＨＣ１ドメインに対する３種類のポリクローナル抗体および発達の間の時期および領域特異的なミオクロニン１／ｅｆｈｃ１発現の研究のためのｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、（ａ）野生型マウス、（ｂ）てんかんの既往のないヒト乳児、小児、青年および成人解剖体の脳、および（ｃ）ＪＭＥのヒト解剖体の脳で用いる。ミオクロニンおよびＪＭＥ突然変異がいかにしてアポトーシスを調節するかを理解することは、ＪＭＥの治療および予防に重要な示唆をもたらす可能性がある。
【０２９３】
定量的／容量測定ＭＲＩでは、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１突然変異を有する症候性有病者、ＥＥＧ有病者および非有病家系者の大脳皮質ならびに皮質下部分を測定する。ＪＭＥ突然変異がアポトーシスを妨害することによりてんかんを引き起こすならば、ＭＲＩではミオクロニン１／ＥＦＨＣ１突然変異を有するＪＭＥ患者で大脳皮質の肥厚が示されるはずである。Ｃａｖ２．３およびＣａｖ２．１調節およびアポトーシスでのミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の分子的作用の検証は、若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）に対する新規で治療的な薬物設計をもたらすことができる。
【０２９４】
今世紀、てんかんは世界中で最も一般的で深刻な神経学的問題であり、約４０００万〜１億人の人々を苦しめている。てんかんには米国で年間約１１１億〜１２５億ドルの費用がかけられている（Begley et al., 2000）。米国でのてんかんの生涯有病率は約２〜５％であり、３００万人のアメリカ人が罹患している計算になる（Begley et al., 2000）。すべてのてんかん患者のうち、特発性全般性てんかんはアメリカでは少なくとも３０％、メキシコでは２０％、ホンジュラス、パナマおよびグァテマラでは８％を占める（Jallon, 1998; Garcia Pedroza et al., 1983; Gracia et al., 1986; Medina et al., 1997; Mendizabal & Salguero, 1996; Rubio Donnadieu et al., 1991）。特発性てんかんは米国ではてんかん患者のかなりの割合を占めるが、これは、損傷性てんかんを引き起こす、寄生虫感染（嚢尾虫症など）、不十分な産科的ケアおよび幼少期の外傷が減ってきているためである。
【０２９５】
特発性全般性てんかん（ＩＧＥ）の中で、様々な著者が若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）、小児欠神てんかん（ＣＡＥ）および覚醒時純粋大発作をてんかんの一般的な種類と考えている。ＩＧＥのうち最も頻発する形態ではないが、ＪＭＥは原発性大発作の最も一般的な原因である。多くの病院での／臨床的報告はＪＭＥがすべてのてんかん患者のうち少なくとも１２％を占めると報告しているが、地域住民を対象とした有病率研究はＪＭＥをすべてのてんかん患者の６％に当たると位置づけた。しかしながら、データによれば、ＪＭＥは西洋ではすべてのてんかん患者の２０〜３０％ほどにも高い割合を占めることが示唆され、それは以下の理由による。ドイツのＪａｎｚの学派により覚醒時の純粋大発作が報告され（Janz, 1957, 1969, 1985, 1998; Goosses, 1984; Tsuboi and Christian, 1973-6）、すべてのてんかん患者のうち２２〜３７％にのぼる。一方で、アメリカ、ヨーロッパ、および中央アメリカでの疫学研究ならびにオーストラリアでの遺伝学的双生児研究では、覚醒時大発作てんかんはもっと低い頻度で観察された（Berkovic et al., 1994）。さらに、ＣＣＴＶ−ＥＥＧテレメータまたはポリグラフ計測では、覚醒時大発作にはほとんどの場合ミオクロニー発作もしくは欠神が先行することが示されている。Delgado-Escueta, et al., Neurology, 34: 285-295, 1984; Delgado-Escueta, et al., Epilepsy and Movement Disorders, Cambridge University Press, pp. 421-450, 2002; Delgado-Escueta, et al., Adv. Neurol, 89: 161-184, 2002; Thomas, In: Roger, et al., (編) Epileptic syndromes in infancy, childhood and adolescence 第３版, Eastleigh: John Libbey & Co. Ltd., Chapter 24, pp. 335-355; Goosses, Frei Berlin University, West Berlin, 1984; Nicoletti, et al., 1999; Manford, et al., Arch. Neurol, 49: 801-808, 1992; Genton, et al., In: Delgado-Escueta, et al., Myoclonic Epilepsies, Adv. Neurol, 2004, in press; Medina, et al., 1997; Loiseau, et al., 1964, 1991; Genton, et al., Epilepsia, 32: S3,45, 1991; Hauser, et al., 1990; Berkovic, et al., 1994; Delgado-Escueta, et al., Adv. Neurol, 79: 351-374, 1994; Janz, 1969; Roger, et al., 1992。
【０２９６】
長年の間、ＪＭＥ個体は正常な神経解剖学的構造および知能を有していると考えられていた。安静時ＪＭＥ被験体の運動前野および尾状核でのグルコース取り込みの低下、ワーキング記憶タスク中の背側前頭前皮質でのグルコース取り込み活性化の消失、および１８ＦＤＧ−ＰＥＴニューロイメージング中の同じタスクの成績の不良が報告されたときから、この認識には疑問が持たれるようになった。これらの被験体は、運動の敏捷性、時間制限試験および言語の流暢さでも障害を示し、これらは前頭葉機能不全をさらに支持するものであった。これらの知見は、ＪＭＥ患者の解剖体脳標本での灰白質分子層および皮質下白質における「異所性ニューロン」（dystopic neuron）の数の増加を示す神経病理とも相関した（Swartz, et al., 1995; Meencke, et al., 1984; Meencke, et al., 1996）。
【０２９７】
定量的ＭＲＩでは、そのような神経病理および構造的変化は２０名中８名のＪＭＥ患者での「対照被験体と比較して顕著に大きな皮質灰白質容量」として検出され、これは前頭葉中心領域で最大である。領域容量と年齢、発症年齢、てんかんの持続期間、全般性強直間代性痙攣、または無発作期間との相関は見られなかった。陽性の家族歴を有するＪＭＥ患者は、そうでない者よりも構造的異常を有する場合が多かった。ＪＭＥ被験体についてのさらなる検証からは、特に近心前頭葉での、大脳皮質の顕著な肥厚が示された。Woermann, et al., 1998による上記の結果、ならびにＪＭＥ患者の２ＦＤＧ ＰＥＴスキャンでの以前の研究およびＪＭＥでのＣａｖ２．３脱調節および不完全なアポトーシスという仮説に鑑みて、ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１に突然変異を有するＪＭＥ被験体のｉｎ ｖｉｖｏ神経解剖学が研究されるであろう。Woermann, et al., 1998。
【０２９８】
カルシウムモジュレーション研究ではＪＭＥ発作を抑制するかまたは悪化させる抗てんかん薬（ＡＥＤ）を用いて、ＪＭＥ突然変異がいかにして発作をもたらすかを調べる。これらＡＥＤを調べることにより、パッチクランプにより解析されるヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株でのＣａｖ２．３およびＣａｖ２．１（Ｐ−Ｑ型ＶＤＣＣ）に対するミオクロニン／ＥＦＨＣ１およびＪＭＥ突然変異の効果に該薬物がどのようにして影響を与えるか決定する。ＪＭＥ突然変異がＣａｖ２．３電流の増大を逆転させることにより発作を引き起こすならば、ＪＭＥ発作を抑制するＡＥＤはＣａｖ２．３電流を増大させ、視床でＴ型ＶＤＣＣを消失させ、かつ皮質棘波を防止するはずである。
【０２９９】
検証は以下のことを含む：（ａ）ヒト胎児腎（ＨＥＫ）細胞株のパッチクランプ解析により、Ｃａｖ２．３およびＣａｖ２．１に対する転写産物（２．３ｋｂ、４．４ｋｂ、７．５ｋｂおよび９．５ｋｂ）の細胞内作用、（ｂ）前記遺伝学コアユニットにより特定された新規なＪＭＥ突然変異および変異体によるＣａｖ２．３およびＣａｖ２．１に対する作用、ならびに（ｃ）ＪＭＥ発作を抑制するＡＥＤ（バルプロエート、レベチラセタム、ゾニサミド、ラモトリジン、トピラメート）の作用と、ＪＭＥ発作に対して効果を有しないかこれを悪化させるＡＥＤ（エトスクシミド、フェニトイン、カルバマゼピン）の作用との比較。
【０３００】
抗てんかん薬（ＡＥＤ）について研究するのは、ＡＥＤの作用機序がてんかん遺伝子により生起されるてんかん発生のメカニズムについての知見を提供し得るからである。さらに、ＡＥＤの作用機序を理解することは、実際的な臨床的用途を有し得る。ＪＭＥでの発作抑制性ＡＥＤ（バルプロエート、レバチラセタム、トピラメート、ゾニザミドおよびラモトリジン等）の作用機序は明らかになっていない。同様に、なぜエトスクシミドは効果がないのか、なぜフェニトインおよびカルバマゼピンはＪＭＥの発作を悪化させるのかも明らかになっていない。フェニトインおよびカルバマゼピンがなぜＪＭＥで最初に欠神を引き起こし、または２〜１０秒の重篤な欠神を３０〜６０分の欠神に変えるのかは謎のままである。ＶＰＡはラットの節上ニューロンで低閾値Ｔ型ＶＤＣＣを低減するが、視床ニューロンではその作用を有さず、ＪＭＥでは今もって最も効果的である。対照的に、トリメタジオンおよびエトスクシミドは視床ニューロンではＴ型ＶＤＣＣを低減するが、ＪＭＥには効果を有しない。レベチラセタムは高電位活性化型カルシウム電流を抑制するが、高電位活性化型カルシウム電流の具体的な型は明らかになっていない。レベチラセタムはＴ型ＶＤＣＣに対して効果を有しない。トピラメート（１０μｍｏｌ／Ｌ）はＬ型ＨＶＤＣＣのピークを低下させる。ゾニザミド（５００μｍｏｌ／Ｌ）は培養胎児ラット皮質ニューロンでＴ型ＬＶＤＣを低減するが、Ｎ型Ｃａ２＋チャネル活性を増大させ、おそらくＰ型カルシウムチャネル活性を低下させる。ラモトリジンはＬ型に影響を与えないが、Ｎ型およびＰ型ＨＶＤＣＣを阻害する。ＬＶＤＣＣとＨＶＤＣＣの両者についての野生型ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の効果およびＪＭＥ突然変異の効果に対する、同等の「治療的」および「毒性」濃度でのこれら薬物の作用を明らかにすることにより、ＪＭＥ突然変異がいかにして発作を引き起こすのかについてのさらなる知見が得られるものと思われる。Kelly, et al., Neurosci. Lett., 116:1-2, 1990; Coulter, et al., Ann. Neurol, 25: 582-593, 1989; Niespodziany, et al., Epilepsia, 31: 347, 2000 ; Kawata, et al., 1999; Suzuki, et al., Epilepsy Research, 12: 21-27, 1992; Okaka, et al., 2002。
【０３０１】
高電位活性化型サブユニット遺伝子であるＣａｖ２．１／α１Ａの突然変異対立遺伝子（ｔｏｔｔｅｒｉｎｇ／ｔｇ：ｌｅａｎｅｒ／ｔｇｌａ；ｒｏｃｋｅｒ／ｔｇｒｋｒ）、β４（ｌｅｔｈａｒｇｉｃ／ｌｈ）、γ２（ｓｔａｒｇａｚｅｒ／ｓｔｇ）、およびα２δ２（ｄｕｃｋｙ／ｄｕ）は、ヒト特発性欠神てんかんにおけるのと似通ったマウスでの電気的皮質棘波発生に関連付けられてきた。高電位活性化型カルシウムチャネルでの突然変異がいかにして皮質棘波を発生させるのかは現在も明らかになっていない。ｔｇ、ｌｈおよびｓｔｒ突然変異体の視床ニューロンについての最近の解析では、ＨＶＡ電流密度の減少およびカイネティクスの変化のみならず、ＬＶＡピーク電流およびチャネル利用能の顕著な増大が明らかになった。視床ＬＶＡ電流の増大が共通する下流の興奮性の欠如をもたらし、これが視床皮質棘波発生および欠神てんかんにつながることが研究から示唆される。ＳＮＡＰ２５欠損マウス突然変異体Ｃｏｌｏｂｏｍａにおいて、視床低電位活性化型電流が欠神てんかんの発生に先行することが研究により示されたことにより、この仮説の直接的な証明が得られた。Noebels, 1990; Zwingman, et al., 2001; Zhang, et al., 2002; Zhang, et al., J. Neurosci., 24(22): 5239-5248, 2004。
【０３０２】
ＪＭＥ突然変異はＣａｖ２．３およびＣａｖ２．１に対して効果を有し、発作を生起する。この効果は以下のように説明することができる。仮説的なモデルでは、バランスのとれたＨＶＤＣＣとＬＶＤＣＣが、視床Ｔ型ＬＢＤＣＣが視床皮質オシレーションおよび皮質棘波を発生させることを防ぐ。図１０を参照されたい。ＪＭＥ突然変異はＣａｖ２．３およびＣａｖ２．１に対する野生型ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の作用を逆転させ、ＨＶＡＣＣ機能を低下させる。ＪＭＥにおけるＨＶＡＣＣ機能の低下が、視床ＬＶＡＣＣ機能を増大させる方向にバランスを崩させ、視床皮質オシレーション、皮質棘波発生および発作を引き起こすことが提案されている。ＪＭＥ発作を抑制する抗てんかん薬と、ＪＭＥ発作を悪化させる抗てんかん薬の作用を研究することにより、このアイデアを検証する（表２を参照のこと）。Zhang, et al., J. Neurosci., 24(22): 5239-5248, 2004。
【表２】
2008506707.tif 000005
【０３０３】
この仮説的モデルでは、ＨＶＤＣＣとＬＶＤＣＣのバランスをとることが、視床Ｔ型ＬＶＤＣＣが皮質棘波を発生させるのを防ぐ。従って、提案された考えでは、ＪＭＥ突然変異が、ミオクロニンにより増大したＲ型ＶＤＣＣ電流を低減させることにより発作を引き起こすならば、ＪＭＥ発作を抑制するＡＥＤはＶＤＣＣ電流を増大させるはずである。同様に、ＪＭＥ発作を悪化させ、欠神発作を発生させるか長引かせるＡＥＤは、ＨＶＤＣＣ電流を阻害し、ＬＶＤＣＣに向かってバランスを崩させて視床Ｔ型ＶＤＣＣを増大させ、皮質棘波を発生させるはずである。ＪＭＥで皮質棘波を発生させる視床Ｔ型ＶＤＣＣを証明する完全な証拠には、ＪＭＥのトランスジェニックマウスモデルが必要であろう。
【０３０４】
発達におけるアポトーシスの役割をさらに調べるために、培養海馬細胞でのアポトーシスカスケードにおけるＥＦＨＣ１の作用部位を精密に特定するための研究を行う。ミオクロニン／ＥＦＨＣ１はカルシウム流入を刺激することによりアポトーシスを引き起こし、カルシウムが負荷されたミトコンドリアからのシトクロムｃ放出をもたらし、これがＡｐａｆ−１に結合し、そしてカスパーゼ３を切断し、細胞生存に必須のタンパク質を分解させるのであろうか。または、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１はカスパーゼ３の上流で作用し、前初期遺伝子および細胞死シグナル伝達タンパク質を活性化して、これがカスパーゼを活性化するのであろうか。
【０３０５】
アポトーシスでは、３つの連続する段階が生じる−−活性化段階、エフェクター段階および分解段階である。活性化段階では、生化学的なイベントがプログラムされた細胞死の機構を開始させ、細胞内小器官、特にミトコンドリアを関与させる。Ｂｃｌ−２ファミリータンパク質は細胞を保護し、Ａｐａｆ−１およびカスパーゼ３の上流でアポトーシスを阻害する。Ｂｃｌ−２はミトコンドリアからのシトクロムｃの放出をブロックする。Ｂｃｌ−２ファミリーのいくつかのメンバー（ｂａｘ、ｂａｋ、ｂｉｄ、ｂａｄ）はＢｃｌ−２に結合してその機能を阻害し、従って細胞死を促進する。Ａｐａｆ−１はＡＴＰ依存性加水分解活性を有し、カスパーゼ３の切断および活性化を促進する。エフェクター段階では、小胞体などの他の小器官がアポトーシスのエフェクターとして機能する。一般的なエフェクターカスパーゼ８、７および１２ならびにｂａｘはＥＲ内に存在する。ＪＮＫおよびｐ３８ＭＡＰキナーゼなどのＭＡＰキナーゼはカスパーゼ３を介して細胞死を仲介する。図１１を参照されたい。Rosse, et al., 1998; Sakahira, et al., 1998; Kluck, et al., 1997; Li, et al., 1997; Yang, et al., 1997; Zamzami, et al., 1996; Zhivotokovsky, et al., 1998; Zhu, et al., 1998; Liu, et al., 1999; Cheng, 2001; Cohen, et al., 1992; Cohen, et al., 1997; Deckwerth, et al., 1996; Enari, et al., 1998。
【０３０６】
活性化段階およびエフェクター段階は可逆的である。分解段階では核イベント、膜の泡状突起出現（blebbing）、カルシウムカルモジュリン系およびセリンプロテアーゼの活性化後のヌクレオチダーゼによるクロマチンのヌクレオソーム間切断、貪食による細胞除去をもたらす。この段階では細胞死からの回復は不可能である。Henderson, 1996; Raff, 1998; Hamburger, 1975; Zou, et al., 1997。
【０３０７】
ミオクロニン／ＥＦＨＣ１が機能するアポトーシスの正確な段階、およびどの段階までＪＭＥ突然変異がアポトーシスを逆転させるのかを正確に特定することが、治療的処置の開発に必要である。Ｂｃｌ−２ファミリーが仲介するチェックポイントを介するアポトーシス刺激は、通常は、ミトコンドリアからサイトゾルへのシトクロムｃの再分布を引き起こす。サイトゾルのシトクロムｃはｄＡＴＰまたはＡＴＰの存在中でＡＰＡＦ−１に結合し、カスパーゼ９の動員と活性化を、および続くカスパーゼ３の切断をもたらす。カスパーゼ３は最終的には著しいＤＮＡ断片化を引き起こす。ＤｓＲｅｄ−Ｂｉｄベクター（カスパーゼ活性化のマーカー）を有する胎児マウス初代海馬ニューロンで共発現させると、多数のＥＦＨＣ１発現ニューロンでのＢｉｄ活性化が起こることが研究により示されている。これらの結果は、脳の発達の間の神経のモデリングにニューロンが関与する際に、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１がニューロンでのカスパーゼ依存的アポトーシスを引き起こすことを示唆する。Ｂｉｄ活性化が成立した後、次のステップは、Ｂｉｄを介して作用するミオクロニンがミトコンドリアからのシトクロムｃの放出を引き起こし、続いてカスパーゼ３活性化を引き起こさせることである。このステップが成立した後は、ミオクロニンがＡＩＦを介してカスパーゼ３非依存的細胞死メカニズムでも機能するかどうかに向けて研究がなされるであろう。ｐ３８ＭＡＰキナーゼおよびＪＮＫがミオクロニン誘導性アポトーシスで働いているかどうかに向けた研究がなされるであろう。
【０３０８】
ＥＧＦＰタグ付きミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の作用に他のＢｃｌ−２細胞死促進因子が関与するかを明らかにするために、ｂａｘおよびカスパーゼ３の発現を調べる。ｂａｘ（Ｂｃｌ−２ファミリーのアポトーシス促進メンバー）は活性化によりコンホメーション変化が起こり、そのＣ末端疎水性ドメインが露出してサイトゾルからミトコンドリアその他の膜へ移動し、ミトコンドリア膜電位を消失させてシトクロムｃの放出を引き起こす。上記の通り、シトクロムｃはカスパーゼ３発現の活性化をもたらす。細胞培養中のマウス海馬ニューロンを野生型ＥＦＨＣ１でトランスフェクトし、トランスフェクション１６時間後および４８時間後に神経分化と神経突起伸長について調べる。Rosse, et al., 1998; Maarzo, et al., 1998; Chen, et al., 1998。
【０３０９】
細胞生存性に対するＥＦＨＣ１の効果を、培養ディッシュに接着しているＧＦＰ陽性生存細胞を、細胞の形態に関係なく計数することにより調べる。図１２ａおよび１２ｂを参照されたい。固定およびＰＢ−Ｇでの１時間の飽和後、海馬の培養を０．１％Ｔｒｉｔｏｎ含有ＰＢ−Ｇとともにさらに１０分間インキュベートし、続いてカスパーゼ３抗体（カスパーゼ３のｐ２０画分またはカスパーゼ３ａに対するウサギポリクローナル抗体）およびシトクロムｃ抗体（シトクロムｃに対するマウスモノクローナル抗体）とともにインキュベートする。ＦＩＴＣコンジュゲート抗マウスｍＡＢ（１：１００、Jackson Immuno Research）およびＣｙ３コンジュゲート抗ウサギポリクローナル抗体（１：１００、Jackson Immuno Research）を用いて二重染色を可視化する。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２での対比染色後、三重染色を走査式広視野顕微鏡で観察し、イメージデコンボリューションを行う。
【０３１０】
ウサギ抗ｂａｘ抗血清（Oncogene）またはウサギ抗カスパーゼ３抗血清（Santa Cruz Biotechnology）のみでのインキュベーションについて、同様の方法を用いる。抗血清は、ＡＢＣ（Vector Labs）および３，３ジアミノベンジジン（Sigma）をニッケル増幅とともに用いて検出する。抗血清の特異性は一次抗血清を用いない実験により確認する。免疫反応性を定量化する立体的アプローチを用いる。脳領域の切片４枚ごとでの免疫反応性物質含有細胞の総数を、脳切片のビデオ画像から計数する。海馬ニューロンおよび細胞内小器官でのｂａｘならびにカスパーゼ３免疫反応性物質の分布の電子顕微鏡観察は、細胞死のメカニズムについての知見を提供し得る。West, 1993; Wolter, et al., 1997; Rosse, et al., 1998; Marzo, et al., 1998。
【０３１１】
カスパーゼインヒビターを用いた実験のために、培養物をカスパーゼインヒビター（Enzyme systems products, Livermore, CA）で４５分間プレインキュベートし、続いてミオクロニン１／ＥＦＨＣ１に曝露する。カスパーゼ３インヒビター（ＤＥＶＤ−ｆｍｋ）、カスパーゼ９インヒビター（ＬＥＨＤ−ｆｍｋ）、カスパーゼ共通インヒビター（ＺＶＡＤ−ｆｍｋ）およびカスパーゼ１インヒビター（ＹＶＡＤ−ｆｍｋ）について評価する。ニューロン生存率は実験群当たり４ウェルでのトリパンブルーアッセイにより測定する。
【０３１２】
ミトコンドリア完全性とシトクロムｃ放出との関係を調べるために、ミトコンドリア膜電位を測定する。海馬細胞培養由来のミトコンドリアをBrustevetsky, et al., 2000に従い単離し、ミトコンドリア膜電位をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒオレンジ色素を用いて評価する。ＥＦＨＣ１がミトコンドリアにカルシウムを負荷することによりアポトーシスを誘導するならば、カスパーゼ３活性化に先行するシトクロムｃ放出を伴うミトコンドリア膜電位の消失が予想される。Niquet, et al., 2003。
【０３１３】
ＡＩＦがミオクロニン／ＥＦＨＣ１存在下で「カスパーゼ３非依存性」アポトーシスに関与するかどうかを調べる。ＡＩＦ抗体（QED BioscienceおよびSigma）、ＰＡＲＰ（カスパーゼ３基質）抗体での免疫染色とＴＵＮＥＬ染色を用いてアポトーシスニューロンが活性型カスパーゼ３と共局在するかどうか調べる。
【０３１４】
カスパーゼ８およびカスパーゼ２アポトーシス経路が関与しているかどうかを研究により調べる。カスパーゼ８の研究のためには、市販の酵素アッセイ基質（ＡｃＩＥＴＤ−ｐＮＡ、BD Biosciences）およびインヒビター（Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、１０μＭ、R&D Systems）を用いる。カスパーゼ２の研究のためには、酵素活性アッセイ基質（ＡｃＩＥＴＤ−ｐＮＡ、BD Biosciences）およびインヒビター（Ｚ−ＶＤＶＡＤ−ＦＭＫ、R&D Systems）を用いる。
【０３１５】
結果がミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の作用はＢｃｌ−２ファミリータンパク質の上流であることを示唆するものならば、さらに研究を行いミオクロニン１／ＥＦＨＣ１がカスパーゼ３を調節する上流シグナルとしてのＭＡＰキナーゼに作用するかどうかを調べる。海馬細胞をＪＮＫ１およびｐ３８ＭＡＰキナーゼの過剰発現ベクターでトランスフェクトし、測定により、それらがミオクロニン誘導性アポトーシスを促進するかどうか、およびＪＭＥ突然変異がそれらの効果を阻害するかどうか調べる。ＪＮＫ１およびｐ３８ＭＡＰキナーゼが活性化されるかどうか、およびｐ３８インヒビター（ＭＫＫ３／６）がそのような活性化を逆転するかどうかを、実験により調べることができる。ＪＮＫまたはｐ３８がミオクロニン１／ＥＦＨＣ１アポトーシスの特異的標的であるかを確かめるために、ＪＮＫ１／２／３ ＫＯマウス（Jackson laboratory）およびｐ３８ ＫＯマウスを用いることもできる。
【０３１６】
ヒト脳ｃＤＮＡ（Clontech）からＰｙｒｏｂｅｓｔＴＭを用いたＰＣＲによりＥＦＨＣ１の完全なオープンリーディングフレームを増幅するために、プライマーを設計する。ＰＣＲ産物を、ｐＥＧＦＰ−Ｃ２（Clontech）またはｐｃＤＮＡ３．１ ＭｙｃＨｉｓ（Invitrogen）ベクターにクローニングする。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的突然変異誘発（Stratagene）を用いて、ＥＦＨＣ１クローン中に５種類の突然変異を導入する。
【０３１７】
胎生１６日目のマウスから海馬ニューロンを単離し、ポリＬ−リジンコーティングカバーガラスの入った２４穴プレートに２×１０５細胞／ウェルで蒔き、Ｂ２７、０．５ｍＭ Ｌ−グルタミンを添加した無血清ＮＥＵＲＯＢＡＳＡＬＴＭ培地（Invitrogen）中で生育させ、マウス海馬初代培養を作製する。４日目に、野生型および突然変異型ＥＦＨＣ１タンパク質をコードするｃＤＮＡを、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥＴＭ２０００（Invitrogen）を用いて細胞にトランスフェクトする。トランスフェクション１６時間後および４８時間後に培養物を４％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中）で固定し、０．３％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を用いて細胞膜を透過性にし、３％正常ヤギ血清（ＰＢＳ中）でブロッキングして、モノクローナル抗ＭＡＰ−２抗体（１：５００、Sigma）、抗ｃ−ｍｙｃ抗体（１：２００、Santa Cruz Biotechnology）およびＡｌｅｘａ ｆｌｕｏｒ ５９４ヤギ抗マウスＩｇＧ抗体（１：１０００、Molecular Probes）で処理する。偶発性についてのカイ二乗検定を用いて、突然変異体でトランスフェクトした細胞のうちのアポトーシス細胞数を、野生型アポトーシス細胞と比較する。
【０３１８】
末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ媒介ｄＵＴＰ−ビオチン・ニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）はアポトーシスについて最も広く用いられている組織化学マーカーであるが、これはアポトーシス、ネクローシスおよび自己融解を区別することができず、アポトーシス細胞を検出するための完全な証明法を提供しない。それゆえ、ＴＵＮＥＬとＤＮＡ断片化アッセイが、光学顕微鏡および電子顕微鏡観察による細胞の検査と併せて用いられている。アポトーシスの間の形態変化、すなわち形質膜の泡状突起形成とクロマチン濃縮のＥＭでの知見は非常に特異的である。ＴＵＮＥＬアッセイではＤｅａｄＥｎｄＴＭ発色ＴＵＮＥＬシステム（Promega）を用いる。Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２（Molecular Probes）を用いて核を可視化する。すべての実験は２ウェルずつ行い、少なくとも３回繰り返す。ＧＦＰ陽性ニューロンについて共焦点顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ ＦＬＵＯＶＩＥＷ）でランダムに画像を取得する。細胞のサブセットを代表例を示す目的でＣａｎｖａｓ７ソフトウェアを用いて再構築する。１０×視野での生存細胞数を計数し、１つの条件当たり３枚のカバーガラスからの合計１５視野を、トランスフェクション４８時間後について統計解析する。ＤＮＡ断片化アッセイは、カルシウム／マグネシウム依存性エンドヌクレアーゼ（細胞内のＤＮＡを規則的に並んだヌクレオソーム単位の間で特異的に切断する）活性の活性化に基づいて行う。細胞質ヌクレオソームの存在を定量化するために、細胞死検出用ＥＬＩＳＡキット（Roche Molecular Biochemicals）を用いる。Dong, et al., 1997; Grasl-Kraaupp, et al., 1995; Portera-Cailliau, et al., J. Comp. Neurol., 378:70-87, 1997; Kerr, et al., 1991; Wyllie, et al., 1984; Chun, 1998。
【０３１９】
どの脳領域においてミオクロニン１／ＥＦＨＣ１がアポトーシス活性を発揮するのかを調べるために、正常な分布部位を明らかにする。異なる発達時期では、ある一部の領域および細胞集団がミオクロニン誘導性アポトーシスをより多く受ける可能性がある。ミオクロニンはアポトーシスの時期により多く発現する可能性がある。ＪＭＥ患者の脳ＭＲＩは、ＭＲＩにより検出されないミオクロニンアポトーシスの主要部位が前頭葉にあることを示唆する。よって、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１ドメインに対する３種類のポリクローナル抗体をｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（遺伝子転写産物の分布）と併せて用いて、以下のものにおいて発達中のミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の領域および部位特異的発現について調べる：（ａ）正常野生型マウス（胎生７、１１、１５、１７日、出生時、７、１４、２１日、１、２、６、１２および２４月）（図１３を参照のこと）、（ｂ）てんかんの既往のないヒト小児、青年および成人解剖体の脳、および（ｃ）ＪＭＥのヒト解剖体の脳。図１３は、以下のものを示す：（ａ）マウス全脳組織および海馬初代培養ニューロン由来ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析。上段パネル：マウスＥｆｈｃ１、下段パネル：ｇ３ｐｄｈ（対照）。（−）：鋳型なし。（ｂ）マウス全身（胎生７、１１、１５、１７日）、胎生１７日マウスおよび成体マウス由来の脳、ならびに成体マウス複数組織についてのマウスＥｆｈｃ１のノーザンブロット解析。Ｅｆｈｃ１ｃＤＮＡの一部分（ｎｔ．１６７０−１９９０）をＰＣＲにより増幅し、プローブとして用いた。下段パネルではβ−アクチンについての対照シグナルを示す。（ｃ）抗ＥＦＨＣ１抗体を用いたウエスタンブロット解析。示されている発現構築物で一過的にトランスフェクトしたＨＥＫ細胞からのライセートの免疫ブロットを解析した。ＥＧＦＰタグ付きＥＦＨＣ１（約１００ｋＤａ）およびＭｙｃタグ付きＥＦＨＣ１（約７４ｋＤａ）は、抗ＥＦＨＣ１抗血清により予想されるサイズで検出された。抗ＧＦＰ抗体により、ｐＥＧＦＰ−ＥＦＨＣ１トランスフェクト細胞では約１００ｋＤａのバンドが検出され、ｐＥＧＦＰベクタートランスフェクト細胞では約３０ｋＤａのバンドが検出された。抗Ｍｙｃ抗体により、ｐｃＤＮＡ３−ＭｙｃＮ−ＥＦＨＣ１トランスフェクト細胞で約７４ｋＤａのバンドが検出された。非トランスフェクト細胞のレーンではバンドは検出されなかった。組織化学および電子顕微鏡観察により、異なる時期では、これら種々の脳で組織、細胞および細胞部分レベルで、ミオクロニン発現が異なるかどうか調べることができる。
【０３２０】
組織ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションのために、Ｌｙｏｎｓら、１９９４；１９９５；１９９０のプロトコルを用いて生後マウス脳を種々の月齢（出生時、１、２、３、４、６、９、１２、１８および２４月）で固定し、包埋する。ラフォーラ病についての以前のマウスでの研究に基づいて、各ステージについて５匹のマウスを調べる。電子顕微鏡研究のためには、Ｇａｎｅｓｈら、２００２に発表されたのと同様に、心灌流、超薄切および免疫染色の手順に従う。
【０３２１】
正常マウス脳、正常ヒト脳およびＪＭＥヒト解剖体の脳での血液脳関門研究ならびにミオクロニン免疫反応性についての電子顕微鏡免疫金解析、またアポトーシスおよび非アポトーシス経路（糖化および脂質酸化最終産物を含む）についての研究を行う。ヒトＥＦＨＣ１のアミノ酸残基５２２−５３３（ＱＹＳＰＥＡＬＡＳＩＱＮ）に相当する合成ペプチドを免疫のために用いて、抗ミオクロニン／ＥＦＨＣ１抗体を作製した。この配列はマウスｅｆｈｃ１でも同一である。抗血清の特異性および感受性を、ＧＦＰタグ付きＥＦＨＣ１またはｍｙｃタグ付きＥＦＨＣ１発現構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ細胞のタンパク質抽出物をプローブすることにより確認した。該抗体は、ＧＦＰ−ＥＦＨＣ１およびｍｙｃ−ＥＦＨＣ１についてそれぞれ約１００ｋＤａおよび７４ｋＤａの予測されるバンドを検出し、ペプチドによる吸収によって、効果的にシグナルが失われた。ベクタートランスフェクト細胞および非トランスフェクト細胞からのタンパク質抽出物ではシグナルは見られなかった。抗体は免疫組織学的解析においてミオクロニン／ＥＦＨＣ１を成功裏に検出した。
【０３２２】
ミオクロニン／ＥＦＨＣ１は、海馬、小脳、大脳皮質、視床、視床下部、扁桃体および脳幹上部をはじめとするＣＮＳにおいて広範に分布している。図１４は、マウス海馬ＣＡ１領域（パネル１〜３）、大脳皮質第ＩＩＩ層（パネル４〜６）、および小脳（パネル７〜９）についての免疫組織化学的研究を示す。（１）抗ＥＦＨＣ１抗体はニューロンの細胞体および樹状突起でシグナルを示す。Ｍ：分子層、Ｏ：上昇層、Ｐ：錐体細胞層、Ｒ：放射状層。（４）ニューロンの樹状突起がシグナルを示している（矢印）。（７）プルキンエ細胞（矢頭）の樹状突起および細胞体がシグナルを示している。ｓｇ：神経細胞層、ｓｇｒ：顆粒層、ｓｍ：分子層。（パネル２、５および８）免疫に用いたＥＦＨＣ１ペプチドを加えた抗ＥＦＨＣ１抗体による染色。（パネル３、６および９）免疫前血清。ペプチドを加えた抗ＥＦＨＣ１および免疫前血清では、すべての領域で免疫反応が見られない（パネル２、３、５、６、８および９）。Ｅ１６マウス胎児由来のマウス海馬初代培養ニューロン（ｉｎ ｖｉｔｒｏで６日目）を、ＥＦＨＣ１およびＭＡＰ２に対する抗体で二重染色した。ＥＦＨＣ１とＭＡＰ２からのシグナルはほとんどオーバーラップしている。ミオクロニンは抗Ｒ型ＶＤＣＣ抗体とオーバーラップする。図４を参照されたい。ＥＦＨＣ１に対する抗体（図４Ａ、Ｃ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｏ）、Ｒ型ＶＤＣＣに対する抗体（図４Ｂ、Ｄ、Ｇ、Ｊ、Ｍ、Ｐ）および重ね合わせ画像（図４Ｅ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ）、抗ＭＡＰ２抗体（樹状突起マーカー）、抗シナプトフィジン抗体（前シナプス小胞マーカー）の共局在を参照されたい。抗ニューロフィラメント抗体（軸索マーカー）とは共局在していない。ミオクロニン／ＥＦＨＣ１シグナルは、主に樹状突起の棘状突起に見られる。ＡＧＥＰ（糖化最終産物）およびＡＬＥＰ（脂質酸化最終産物）に対する抗体を用いた免疫染色を行う。そのような研究はラフォーリン欠損マウスについての研究で行われており、ミオクロニン／ＥＦＨＣ１により誘発される細胞死での酸化ストレスの役割についての研究につながる。
【０３２３】
実施例１１
ＥＦＨＣ１ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
図１６は、推定上のヒトｃＤＮＡ配列（ＦＬＪ２２８４３；配列番号１）；ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿０２５１８４を示す。
【０３２４】
図１７は、推定上のヒトポリペプチド配列（ＦＬＪ２２８４３；配列番号２）；ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿０７９４６０を示す。
【０３２５】
図１８は、ＥＦＨＣ１ポリペプチド配列（ＮＣＢＩ登録番号ＡＫ００１３２８；ＮＭ＿０１８１００；配列番号４）と、マウスポリペプチド（ＮＣＢＩ登録番号ＡＫ００６４８９；配列番号５）、およびヒトポリペプチド（ＦＬＪ２２８４３；配列番号２）との比較を示す。
【０３２６】
図１９は、ヒトポリペプチド（ＦＬＪ２２８４３；配列番号２）と、ショウジョウバエポリペプチド（ＮＣＢＩ登録番号ＣＧ８９５９；配列番号６）、およびショウジョウバエポリペプチド（ＮＣＢＩ登録番号ＣＧ１１０４８；配列番号７）との比較を示す。
【０３２７】
図２０は、推定上のヒトＥＦＨＣ１ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＫ００１３２８；ＮＭ＿０１８１００；配列番号３）を示す。
【０３２８】
図２１は、推定上のヒトＥＦＨＣ１ポリペプチド配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＫ００１３２８；ＮＭ＿０１８１００；配列番号４）を示す。
【０３２９】
図２２は、推定上のヒトＥＦＨＣ１ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＬ１２２０８４；配列番号８）を示すが、これは選択的スプライシング変異体である。
【０３３０】
図２３は、推定上のヒトＥＦＨＣ１ポリペプチド、転写産物Ｂの２４３−２７８位、Ｃ末端（配列番号９）を示すが、これは選択的スプライシング変異体である。
【０３３１】
図２５（ａ）は、ヒトＥＦＨＣ１遺伝子転写産物Ａによりコードされるタンパク質の予測されるアミノ酸配列を示す（配列番号４）。太字で示された残基はＥＦハンドモチーフを表す（ｐｆａｍ０００３６；Ｅ値＝０．０００６６）。転写産物Ｂの推定上のＣ末端（下段；配列番号９）はイントロン４の残留により生じる。両方のタンパク質で共通のＮ末端領域には下線を付してある。図２１および２３を参照されたい。図２５（ｂ）は、マウス、ブタ、およびウシ由来の推定上のＥＦＨＣ１オーソログのアミノ酸配列アライメントを示す。５つのミスセンス突然変異のうち４つ（Ｄ２１０Ｎ、Ｒ２２１Ｈ、Ｆ２２９Ｌ、Ｄ２５３Ｙ）が、オーソログ間で保存された残基を標的としていることに留意されたい。３つの多型のうち２つ（Ｒ１８２Ｈ、Ｉ６１９Ｌ）もまたオーソログ間で保存された残基を標的としている。
【実施例１２】
【０３３２】
若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）におけるミクロニー、大発作および大欠神発作を予測するための診断アッセイ
てんかんの診断のための対立遺伝子および感受性遺伝子座を特定するアッセイは、本発明で有用である。若年性ミオクローヌスてんかん（ＪＭＥ）はすべてのてんかん患者の少なくとも６〜１２％を占める。ＪＭＥの完全な表現型は、ＥＥＧ広汎性多棘徐波を伴うミオクロニー、大発作（間代強直間代性）痙攣、および欠神の青年期での発生からなる。診断アッセイは、種々の表現型を含むこれらてんかん症候群への罹り易さ（感受性）を測定するのに有用である。
【０３３３】
ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の突然変異は、完全な疾患表現型をもたらすことができ、スペイン系アメリカ先住民のＪＭＥ患者の２０％に見られる。ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１の変異体は、ＪＭＥ患者の３８％で感受性因子である。ミオクロニン２／ＥＦＣＨ１ａ（ミオクロニン１のホモログ）は染色体Ｘｐ１１．４に位置し、突然変異および機能について解析されている。ミオクロニン１／ＥＦＨＣ１およびミオクロニン２／ＥＦＨＣ１ａはＪＭＥの診断マーカーとして機能することができる。ベリーズ、ロス・アンジェルス、メキシコ、ブラジル、オランダおよび日本の家系に見出された、若年性ミオクローヌスてんかんなどのてんかんの発症は、６以上、または８以上の遺伝子に関連していることが予想される。ＪＭＥ家系でのてんかんもしくは多棘波有病者のＥＦＨＣ１突然変異の分離、ならびにＪＭＥ突然変異によるＥＦＨＣ１誘導神経細胞死およびＲ型Ｃａ２＋電流のＥＦＨＣ１依存的増大の逆転は、ＥＦＨＣ１が染色体６ｐ１２上のＪＭＥ遺伝子であり、ＥＦＨＣ１ａがＸｐ１１．４上のＪＭＥ遺伝子であることを強く支持する。Suzuki et al., Epilepsy Res. 50: 265-275, 2000。特発性全般性てんかんの原因と言われる多くの遺伝子はイオンチャネルをコードする。ＥＦハンドを有し、Ｒ型ＶＤＣＣをモジュレートし、これと相互作用し、またアポトーシス活性を有する非イオンチャネルタンパク質をコードする１以上または複数の遺伝子の特定は、特発性てんかんの分子的病因への新たなアプローチをもたらす。
【０３３４】
ＥＦＨＣ１、ＥＦＨＣ１ａその他のＪＭＥに関連する遺伝子での多型を検出するために様々な診断試験が用いられる。診断アッセイとしては、微小細胞傷害性（Ｔｅｒａｓａｋｉトレイ）アッセイ、フローサイトメトリー評価、可溶性ミオクロニン１もしくはミオクロニン２タンパク質についてＥＩＡまたはＥＬＩＳＡアッセイ、等電点フォーカス化ならびにＥＦＨＣ１およびＥＦＨＣ１ａ遺伝子のヌクレオチド配列についてのポリメラーゼ連鎖反応が挙げられる。
【０３３５】
本明細書中で引用したすべての刊行物および特許出願は、各刊行物または特許出願が具体的かつ個別にすべての目的のために参照により組み入れられることが示されているのと同様に、すべての目的のために参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる。
【０３３６】
上記の発明について、理解の明確化のために図解および実施例によりいくぶんか詳細に記載してきたが、本発明の教示する内容に照らして、添付の特許請求の範囲の精神および範囲を逸脱することなく、該発明にある種の変更ならびに改変を行い得ることは、当業者には自明であろう。
【図面の簡単な説明】
【０３３７】
【図１】ＥＦＨＣ１の構造および発現を示す。
【図２】ＪＭＥ家系におけるてんかん形質とともに分離するＥＦＨＣ１変異を示す。
【図３】ＥＦＨＣ１によるＲ型ＶＤＣＣ（Ｃａｖ２．３）依存性アポトーシスの活性化およびＪＭＥ変異によるその逆転を示す。
【図４】Ｅｆｈｃ１およびＣａｖ２．３タンパク質が共局在することを示す。
【図５】ＥＦＨＣ１およびその突然変異体による電位依存性Ｒ型Ｃａ２＋チャネル（Ｃａｖ２．３）活性の増強を示す。
【図６】ＥＦＨＣ１および電位依存性Ｃａ２＋チャネル（ＶＤＣＣ）の免疫沈降アッセイを示す。
【図７】ＪＭＥにおけるてんかん発作の病因：Ｃａｖ２．３の脱調節および不完全アポトーシスを示す。
【図８】ＥＦＨＣ１がＰＱ型ＶＤＣＣ不活性化を遅延させることを示す。
【図９】ＡＢ６１およびＡＢ６２に対して作製されたポリクローナル抗体を使用した、発達中および成体野生型マウス脳組織におけるミオクロニン／ＥＦＨＣ１タンパク質の発現パターンを示す。
【図１０】視床皮質棘波発生のＮｏｅｂｅｌ仮説を現在の仮説と比較して示す。
【図１１】ＥＦＨＣ１／ミオクロニン１がアポトーシスカスケードにおいてＢｉｄおよびカスパーゼ３を活性化することを示す。
【図１２】アポトーシスに対するＪＭＥ突然変異の効果または転写産物ｂ（ｉｓｏ）の効果を示す。
【図１３】（ａ）マウス全脳組織および海馬初代培養ニューロン由来のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ解析、（ｂ）マウス組織についてのマウスＥｆｈｃ１のノーザンブロット解析、（ｃ）抗ＥＦＨＣ１抗体を用いたウエスタンブロット解析を示す。
【図１４】マウス海馬ＣＡ１領域、大脳皮質第ＩＩＩ層、および小脳の免疫組織化学研究を示す。
【図１５】ＥＧＦＰベクター対照でトランスフェクトされた海馬初代培養ニューロンに対するＶＤＣＣアンタゴニストの効果を示す。
【図１６】推定上のヒトｃＤＮＡ配列（ＦＬＪ２２８４３；配列番号１）；ＮＣＢＩ登録番号ＮＭ＿０２５１８４を示す。
【図１７】推定上のヒトポリペプチド配列（ＦＬＪ２２８４３；配列番号２）；ＮＣＢＩ登録番号ＮＰ＿０７９４６０を示す。
【図１８Ａ】ＥＦＨＣ１ポリペプチド配列（ＮＣＢＩ登録番号ＡＫ００１３２８；ＮＭ＿０１８１００；配列番号４）とマウスポリペプチド（ＮＣＢＩ登録番号ＡＫ００６４８９；配列番号５）、およびヒトポリペプチド（ＦＬＪ２２８４３；配列番号２）の比較を示す。
【図１８Ｂ】ＥＦＨＣ１ポリペプチド配列（ＮＣＢＩ登録番号ＡＫ００１３２８；ＮＭ＿０１８１００；配列番号４）とマウスポリペプチド（ＮＣＢＩ登録番号ＡＫ００６４８９；配列番号５）、およびヒトポリペプチド（ＦＬＪ２２８４３；配列番号２）の比較を示す。
【図１９Ａ】ヒトポリペプチド（ＦＬＪ２２８４３；配列番号２）とショウジョウバエポリペプチド（ＮＣＢＩ登録番号ＣＧ８９５９；配列番号６）、およびショウジョウバエポリペプチド（ＮＣＢＩ登録番号ＣＧ１１０４８；配列番号７）の比較を示す。
【図１９Ｂ】ヒトポリペプチド（ＦＬＪ２２８４３；配列番号２）とショウジョウバエポリペプチド（ＮＣＢＩ登録番号ＣＧ８９５９；配列番号６）、およびショウジョウバエポリペプチド（ＮＣＢＩ登録番号ＣＧ１１０４８；配列番号７）の比較を示す。
【図２０】推定上のヒトＥＦＨＣ１ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＫ００１３２８；ＮＭ＿０１８１００；配列番号３）を示す。
【図２１】推定上のヒトＥＦＨＣ１ポリペプチド配列、転写産物Ａ（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＫ００１３２８；ＮＭ＿０１８１００；配列番号４）を示す。
【図２２】推定上のヒトＥＦＨＣ１ ｃＤＮＡ配列（ＮＣＢＩ登録番号：ＡＬ１２２０８４；配列番号８）を示す。これは選択的スプライシング変異体である。
【図２３】推定上のヒトＥＦＨＣ１ポリペプチド、転写産物Ｂの２４３−２７８位、Ｃ末端（配列番号９）を示す。これは選択的スプライシング変異体である。
【図２４】ＥＦＨＣ１タンパク質によるＣａｖ２．３のモジュレーションおよび不活性化特性を示す。
【図２５】ヒトＥＦＨＣ１遺伝子の転写産物Ａによってコードされるタンパク質の予測アミノ酸配列、およびマウス、ブタ、およびウシ由来の推定されるＥＦＨＣ１オーソログのアミノ酸配列アライメントを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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