(57)【要約】【課題】試験試料に存在する検体の存在又は量を検出するための分析装置を提供する。【解決手段】抱合体パッドと吸上げパッドとに連通した多孔性膜を有する、試験試料に存在する検体の存在又は量を検出するための横流型分析装置。多孔性膜は、検体及び検体−抱合体錯体の少なくとも一部分に結合して検出信号を発生するように構成された不動化した第１の捕捉試薬を有する検出区画を有する。対照区画が、多孔性膜の検出区画の下流に位置することができ、対照区画内に不動化した第２の捕捉試薬を有する。抱合体パッドは、検出区画の上流に位置し、検体に対して特異的な結合員を備えた検出プローブを有する。試料は、対照区画と検出区画の間に堆積される。緩衝液放出区画が、抱合体パッドの上流に位置し、検出プローブを検出区画及び対照区画に移動させる働きをする緩衝液の付加を装置に提供する。【選択図】図１
2008524582.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験試料に存在する検体の存在又は量を検出するための横流型分析装置であって、
抱合体パッドと吸上げパッドとに連通した多孔性膜、
を含み、
前記多孔性膜は、
前記検体及び検体−抱合体錯体の少なくとも一部分に結合して強度を有する検出信号を発生するように構成された第１の捕捉試薬が不動化される検出区画を形成しており、
前記抱合体パッドは、前記検出区画の上流に位置し、かつ前記検体に対して特異的な結合員を備えた検出粒子を有し、
緩衝液放出区画が前記抱合体パッドの上流に配置されて、前記検出プローブを前記検出区画に移動させる働きをする緩衝液を横流型分析装置に付加し、
前記試料が、前記抱合体パッドと前記検出区画の間に配置される、
ことを特徴とする装置。
【請求項２】
前記抱合検出粒子は、色素原、触媒、発光化合物、放射性化合物、可視ラベル、リポゾーム、及びそれらの組合せから成る群から選択された物質を含むことを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項３】
前記抱合検出粒子は、発光化合物を含むことを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項４】
前記抱合検出粒子は、可視ラベルを含むことを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項５】
前記特異的結合員は、抗原、ハプテン、アプタマー、１次又は２次抗体、ビオチン、及びそれらの組合せから成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項６】
前記第１の捕捉試薬は、抗原、ハプテン、タンパク質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、１次又は２次抗体、及びそれらの錯体から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項７】
前記第２の捕捉試薬は、抗原、ハプテン、タンパク質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、１次又は２次抗体、及びそれらの錯体から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項８】
前記検体は、サルモネラ種、髄膜炎菌群、肺炎連鎖球菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、アスペルギルア、ヘモフィルスインフルエンザ、ＨＩＶ、トリコモナス、及びプラスモディウムから成る群から選択された大きな病原体であることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項９】
前記検体は、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、薬物中間体又は副産物、細菌、ウイルス粒子、及び以上の物質のいずれかの代謝産物又はいずれかに対する抗体から成る群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項１０】
前記多孔性膜、抱合体パッド、及び吸上げパッドは、単一の材料から作られることを特徴とする請求項１に記載の横流型分析装置。
【請求項１１】
試験試料に存在する検体の存在又は量を検出する方法であって、
ｉ）抱合体パッドと吸上げパッドとに液体連通した多孔性膜を含む横流型分析装置を準備する段階、
を含み、
前記抱合体パッドは、検体に対して特異的な結合員で抱合された検出粒子を有し、前記多孔性膜は、第１の捕捉試薬が不動化される検出区画と、第２の捕捉試薬が内部に不動化される対照区画とを形成し、
前記対照区画は、前記検出区画の下流に位置し、前記抱合体パッドは、前記多孔性膜の上流に位置し、かつ緩衝液放出区画が、該抱合体パッドの上流にあり、
ｉｉ）前記検体を含有する試験試料を前記抱合体パッドと前記検出区画の間に接触させる段階と、
ｉｉｉ）緩衝液を、該緩衝液が前記検出粒子を前記検出区画及び対照区画に運ぶことになるように、前記緩衝液放出区画で放出する段階と、
ｉｖ）検出信号を検出する段階と、
を更に含むことを特徴とする方法。
【請求項１２】
前記抱合検出粒子は、色素原、触媒、発光化合物、放射性化合物、可視ラベル、リポゾーム、及びそれらの組合せから成る群から選択された物質を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抱合検出粒子は、可視ラベルを含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記特異的結合員は、抗原、ハプテン、アプタマー、１次又は２次抗体、ビオチン、及びそれらの組合せから成る群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の捕捉試薬は、抗原、ハプテン、タンパク質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、１次又は２次抗体、及びそれらの錯体から成る群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２の捕捉試薬は、抗原、ハプテン、タンパク質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、１次又は２次抗体、及びそれらの錯体から成る群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２の捕捉試薬は、多価電解質を含むことを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記検体は、サルモネラ種、髄膜炎菌群、肺炎連鎖球菌、カンジダアルビカンス、カンジダトロピカリス、アスペルギルア、ヘモフィルスインフルエンザ、ＨＩＶ、トリコモナス、及びプラスモディウムから成る群から選択された大きな病原体であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記検体は、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物、薬物中間体又は副産物、細菌、ウイルス粒子、及び以上の物質のいずれかの代謝産物又はいずれかに対する抗体から成る群から選択されることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項２０】
試験試料に存在する検体の存在を検出するための横流型分析装置であって、
最初に抱合体パッド上に存在した検出粒子が、捕捉試薬を有する検出区画に位置する病原体まで移動される、
ことを特徴とする装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、試験試料に存在する検体の存在又は量を検出するための分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
検体を分析的に検出することができるように、検出可能な成分でラベル付けした免疫反応物質を用いるいくつかの公知の免疫学的検定法が存在する。例えば、「サンドイッチ型」分析は、一般的に、検体に対する特定の結合員で抱合された染色ラテックス又は放射性同位元素のような検出可能プローブと試験試料を混合することを伴っている。抱合されたプローブは、検体との錯体を形成する。これらの錯体は、次に、抗体と検体の間に結合が起こって三元「サンドイッチ錯体」を形成する、不動化された抗体の区画に到達する。サンドイッチ錯体は、検体を検出するための区画に局限される。この技術を用いて、定量的又は半定量的な結果を得ることができる。代替的な技術は、「競合型」分析である。「競合型」分析では、ラベルは、典型的には、試料に存在するラベル付けされていないあらゆる検体に抗体を結合するように競合するラベル付けされた検体又は検体類似物である。競合分析は、一般的に、各々が一価であって１つの抗体分子のみと結合することができるハプテンのような検体の検出に用いられる。
【０００３】
別の種類の分析は、検体が第１の線上に筋状に配置され、抱合粒子（例えば、ヤギ抗マウス又は「ＧＡＭ」）上の抗体に特異的な抗体が隣に筋状に配置される阻害／オーバーフロー分析である。この分析では、存在するあらゆる検体は、その検体に特異的な抗体（又は他の結合剤）を有する抱合粒子に結合することになる。検体のある一定の閾値量未満のレベルでは、粒子は、検体によって完全に覆われることにはならず、すなわち、完全に阻害されることにはならず、従って、検体を用いて筋状に配置した第１の線において依然として錯体を形成することができることになる。この阻害線は、検体が閾値レベル未満の時には、本質的に抱合体を除去／結合するように作用する。隣の線は、抱合粒子上の抗体を認識する抗体から成っており、「オーバーフロー」線として作用すると考えられる。これは、検体レベルが閾値レベルよりも高い場合に「のみ」粒子を結合する（それによって、色つきの線を形成する）。更に、異なる母集団の抱合粒子（例えば、それらの上にラビット抗体を有するようなもの）を捕捉するように筋状に配置されたヤギ抗ラビット（ＧＡＲ）線のような陽性の対照線を用いることができる。この線は、試験が実行可能で適正に実行されている限り、常に形成すべきである。
【０００４】
多くの検体に対して、流入又は横流型分析が一般的になってきているが、その多くは、横流型分析に特徴的な試料及びラベル又は抱合粒子の流れを可能にするために比較的大量の試料が必要である。より詳細には、現在利用可能な横流型分析は、試料堆積点の下流かつ検出区画の上流に位置する抱合体を用いる。試料自体は、抱合体を再懸濁してそれらを検出区画に運ぶ役割をしている。代替的に、付加的な希釈剤に試料を加えて試料を抱合体パッドに運び、抱合粒子を再懸濁するのを助け、次に検出区画に到達することができる。いずれの場合でも、粒子を再懸濁するのを助けるために、試料の付加は、典型的に抱合粒子の上流で行われる。「上流」及び「下流」とは、分析装置上の試料の流れの方向に対する品目の位置を意味することに注意されたい。
【０００５】
これらの装置で達成される恩典にも関わらず、これらは、常に望ましい信号（線）強度を生成するとは限らない。これは、検体のレベルが低い時に信号が可視でない場合があるので、これを用いることができる状況を限定する。従来の分析はまた、（血液）試料の赤色が強いために又は試料の流れに問題を引き起こすことがある試料の粘性のために信頼性を低くする場合がある。従って、より強い信号（線）強度を与え、並びに大量の試料を必要とすることなく信頼性のある結果を与えることができる分析の改善された技術に対する必要性が存在する。
【０００６】
【特許文献１】米国特許第６、４３６、６５１号
【特許文献２】米国特許第４、２７５、１４９号
【特許文献３】米国特許第５、６７０、３８１号
【特許文献４】米国特許第５、２５２、４５９号
【発明の開示】
【０００７】
本発明の一実施形態により、試験試料に存在する検体の存在又は量を検出するための分析装置を開示する。分析装置は、多孔性膜と液体連通した抱合体パッドを含み、この多孔性膜は、吸上げパッドとも連通している。抱合体パッド、多孔性膜、及び吸上げパッドは、全ての３つの区域の機能を有する単一の材料とすることができることも可能であることに注意すべきである。
多孔性膜は、例えばニトロセルロースのような検出プローブが通過することができる様々な材料のいずれから形成することができる。多孔性膜は、第１の捕捉試薬が不動化される検出区画を有する。第１の捕捉試薬は、検体及び検体抱合錯体の少なくとも一部分に結合して検出信号を発生するように構成される。第１の捕捉試薬は、抗原、ハプテン、タンパク質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、１次又は２次抗体、及びそれらの錯体から成る群から選択することができる。第１の捕捉試薬は、例えば、検体と抱合検出プローブの間に形成された錯体に結合することができる。
【０００８】
対照区画は、検出区画の下流の多孔性膜上に位置する。第２の捕捉試薬は、抱合体、抱合体−検体錯体、又は純粋なプローブに結合するように構成された対照区画内に不動化されて、分析が適正に行われていることを示す。一実施形態では、第２の捕捉試薬は、抗原、ハプテン、多価電解質、タンパク質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、１次又は２次抗体、及びそれらの錯体から成る群から選択される。
【０００９】
抱合体パッドは、検体の存在を信号で伝える検出プローブを収容する。抱合体パッドはまた、対照区画を示すためのプローブを含む他の異なるプローブ母集団を含むこともできる。必要に応じて、検出プローブは、色素原、触媒、発光化合物（例えば、蛍光、燐光等）、放射性化合物、可視ラベル、粒子（例えば、染色、金色、銀色、他の光学的に密な材料）、リポゾーム、及びそれらの組合せから成る群から選択された物質を含むことができる。特異的結合員は、抗原、ハプテン、アプタマー、１次又は２次抗体、ビオチン、及びそれらの組合せから成る群から選択することができる。
【００１０】
膜から離れた抱合体パッドの端部と液体連通して、緩衝液放出区画が存在する。試料が抱合体と検出区画の間の装置上に堆積した後に、緩衝液は、緩衝液放出区画の上流から放出される。緩衝液は、抱合体パッドから検出区画に向ってプローブを洗い、検出区画では、プローブは、検体が存在する時には検体によって検出区画上で捕捉されることになり、陽性の結果をもたらす。試料が検体を含有しない場合には、検出線は、陰性であることになる。一部のプローブ（検出プローブと異なるプローブを含むこともある）を依然として含有する緩衝液混合物は、試薬が抱合体、抱合体−検体錯体、又は純プローブを捕捉して分析が適正に機能していることを示す対照区画まで連続している。
吸上げパッドは、膜と液体連通しており、液体移動の推進力を提供する。
【００１１】
本発明の方法は、粒子の上流である従来の位置ではなく、粒子の下流に試料を加える段階を伴っている。試料を堆積した後に、粒子の上流の試験ストリップ上の点で希釈剤が放出される。希釈剤は、次に、粒子が試験ストリップを下って流れることができるように、粒子を再懸濁するのに要する流体を提供する。粒子に接触した後に、希釈剤−粒子混合物は、分析の残りのために試料（例えば、血液）に接触する点まで下って流れる。本方法により、線信号強度が増大する場合もあることが見出されている。
【００１２】
本発明の別の実施形態により、試験試料に存在する検体の存在又は量を検出する方法を開示する。本方法は、ｉ）抱合体パッドと吸上げパッドに液体連通した多孔性膜を有する横流型分析装置を準備する段階を含み、抱合体パッドは、検体に対して特異的な結合員で抱合された検出プローブを有し、多孔性膜は、第１の捕捉試薬が不動化された検出区画と、第２の捕捉試薬が内部に不動化される対照区画とを形成し、対照区画は、検出区画の下流に位置し、抱合体パッドは、多孔性膜の上流に位置し、緩衝液放出区画が、抱合体パッドの上流にあり、ｉｉ）検体を含有する試験試料を抱合体パッドの下流の装置に接触させる段階と、ｉｉｉ）緩衝液が検出プローブを試料付加区域まで、次に検出区画及び対照区画まで運ぶことになるように、緩衝液放出区画で緩衝液を放出する段階と、ｉｖ）検出信号を検出する段階とを更に含む。
本発明の他の特徴及び態様は、以下でより詳細に説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本明細書で用いる場合、「検体」という用語は、一般的に、検出される物質を意味する。例えば、検体には、抗原性物質、ハプテン、抗体、及びその組合せを含むことができる。検体には、以下に限定されるものではないが、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物（治療的な目的で投与されるもの、並びに違法に投与されるものを含む）、薬物中間体又は副産物、細菌、ウイルス粒子、イースト、真菌、プロトゾア、及び以上の物質のあらゆる代謝産物又は抗体が含まれる。一部の検体の特定の例には、フェリチン；クレアチニンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）；ジゴキシン；フェニトイン；フェノバルビタール；カルバマゼピン；バンコマイシン；ゲンタマイシン；テオフィリン；バルプロ酸；キニジン；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；エストラジオール、プロゲステロン；Ｃ反応性タンパク質；リポカリン；ＩｇＥ抗体；サイトカイン；ビタミンＢ２ミクログロブリン；糖化ヘモグロビン（ＧＩｙ．Ｈｂ）；コルチゾール；ジギトキシン；Ｎ−アセチルプロカインアミド（ＮＡＰＡ）；プロカインアミド；風疹ＩｇＧ及び風疹ＩｇＭのような風疹抗体；トキソプラズマ症ＩｇＧ（Ｔｏｘｏ−ｌｇＧ）及びトキソプラズマ症ＩｇＭ（Ｔｏｘｏ−ｌｇＭ）のようなトキソプラズマ症抗体；テストステロン；サリチル酸；アセトアミノフェン；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；抗Ｂ型肝炎コア抗原ＩｇＧ及びＩｇＭ（抗ＨＢＣ）のようなＢ型肝炎コア抗原抗体；ヒト免疫不全ウイルス１型及び２型（ＨＩＶ１型及び２型）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型及び２型（ＨＴＬＶ）；Ｂ型肝炎抗原（ＨＢｅＡｇ）；Ｂ型肝炎抗原抗体（抗ＨＢｅ）；インフルエンザウイルス；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；チロキシン（Ｔ４）；総トリヨードチロニン（総Ｔ３）；遊離トリヨードチロニン（遊離Ｔ３）；ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）；リポタンパク質、コレステロール、及びトリグリセリド；及びαフェトタンパク質（ＡＦＰ）が含まれる。乱用薬物及び規制物質には、以下に限定されるものではないが、アンフェタミン；メタンフェタミン；アモバルビタール、セコバルビタール、ペントバルビタール、フェノバルビタール、及びバルビタールのようなバルビツレート；リブリウム及びバリウムのようなベンゾジアゼピン；ハシシュ及びマリファナのようなカンナビノイド；コカイン；フェンタニール；ＬＳＤ；メタカロン；ヘロイン、モルヒネ、コデイン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、メサドン、オキシコドン、オキシモルフォン及びアヘンのようなアヘン剤；フェンシクリジン；及びプロポキシフェンが含まれる。他の可能な検体は、米国特許第６、４３６、６５１号に説明されていると考えられる。
【００１４】
本明細書で用いる場合、「試験試料」という用語は、一般的に、検体を含有することが疑われる材料を意味する。試験試料は、例えば、供給源から直接得られる材料、並びに、以下に限定されるものではないが、濾過、沈殿、希釈、蒸留、混合、濃縮、妨害化合物の不活性化、試薬の付加、及び溶解などのような技術を用いて前処理した材料を含むことができる。試験試料は、血液、間質液、唾液、眼水晶体液、脳脊髄液、汗、尿、乳汁、腹水、粘液、滑液、腹腔液、膣液、又は羊水などを含む生理液のような生物学的供給源から由来する場合がある。生理液以外に、水及び食品などのような他の液体試料を用いることもできる。更に、検体を含有する固形材料懸濁液も試験試料として用いることができる。
【００１５】
一般的に、本発明は、試験試料に存在する検体の存在又は量を検出するための横流型分析装置に関する。
従来の横流型法では、試料が粒子を再懸濁して試験を進行させるのを助けることができるように、試料は、一般的に、不動化された抱合粒子の位置の上流に付加される。しかし、これと対照的に、本発明は、例えば、血液に基づく分析のような少量の試料に伴う問題を減少又は消失させるために、新しい方法及び／又は試料を付加する位置を開示する。試料容量が更に限定される可能性がある特定の付加（例えば、血液に基づく付加及び綿球に基づく付加）の場合には、希釈剤を用いて試料と混合し、それによって必要な体液の量を低減することができる。これらの場合には、希釈剤自体により、不動化粒子を再懸濁させることができる。
【００１６】
公知の分析では、試料中の目標とする検体が、堆積点からそれを検出することができる点まで移動することが必要である。公知の分析では、抱合粒子を収容する区域を通して、次に検出区画まで試料を移動させる。これらの公知の分析の一部は、液体希釈剤又は「緩衝液」を用いて、試料を抱合粒子まで及び検出区画上に移動する。
公知の分析と対照的に、本発明の装置では、試料が抱合粒子の下流の堆積部位に移動することができる。その後、希釈剤（例えば、緩衝液）が放出され、最初に抱合体パッドに配置されていた粒子を粒子と検出区画の間に配置された試料まで移動する。
【００１７】
本発明者は、検出粒子を粒子の下流に加えられた試料まで希釈剤と共に移動させると、非常に少量の試料の使用を可能にすることを発見した。希釈剤は、非常に効率的に検出プローブを再懸濁させる働きをして、検出プローブが抱合体パッドの更に下流に膜に沿って移動して試験結果を与えることを可能にする。従来の横流型装置に入れた液体試料は、抱合粒子を再懸濁するのに用いられるために、本方法は、経験に反するものである。更に、免疫測定のために試料及び粒子が接触して結合が起こることは、従来的には望ましいものである。しかし、驚くべきことに、試料が粒子の下流に付加され、次に希釈剤中の再懸濁抱合粒子により「追跡」される本方法では、実際に信号強度を増大させることができる場合がある。
【００１８】
装置は、抱合体パッドと、試料付加区画と、検出区画とを有する多孔性膜を利用する。検出区画は、不動化捕捉試薬を有する。試料付加区画は、不動化粒子の下流である抱合体パッド材料上の位置とすることができ、又は膜の前方位置（検出区画の上流）とすることができ、又は抱合体パッドと検出区画を備えた膜の間に位置する別の材料とすることができる。装置は、試料付加区画と、希釈剤放出区画と試料の間に位置する抱合体パッドとの前の装置の上流側端部に希釈剤放出区画を更に用いる。吸上げパッドは、装置の下流側端部の多孔性膜の反対端と液体連通している。使用時には、試料は、試料付加区画に付加され、ある一定期間後に希釈剤が放出される。希釈剤は、抱合粒子を再懸濁して試料まで及び更に下流の検出区画まで運搬され、検体の存在を示すものになる。
【００１９】
本発明を用いて検出することができる適切な検体の例には、以下に限定されるものではないが、毒素、有機化合物、タンパク質、ペプチド、微生物、アミノ酸、核酸、ホルモン、ステロイド、ビタミン、薬物（治療の目的のために投与されるもの、並びに違法な目的のために投与されるものを含む）、薬物中間体又は副産物、細菌、ウイルス粒子、イースト、真菌、プロトゾア、及び以上の物質のあらゆる代謝産物又は抗体が含まれる。一部の検体の特定の例には、フェリチン；クレアチニンキナーゼＭＢ（ＣＫ−ＭＢ）；ジゴキシン；フェニトイン；フェノバルビタール；カルバマゼピン；バンコマイシン；ゲンタマイシン；テオフィリン；バルプロ酸；キニジン；黄体形成ホルモン（ＬＨ）；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）；エストラジオール、プロゲステロン；Ｃ反応性タンパク質；リポカリン；ＩｇＥ抗体；サイトカイン；ビタミンＢ２ミクログロブリン；糖化ヘモグロビン（ＧＩｙ．Ｈｂ）；コルチゾール；ジギトキシン；Ｎ−アセチルプロカインアミド（ＮＡＰＡ）；プロカインアミド；風疹ｌｇＧ及び風疹ＩｇＭのような風疹抗体；トキソプラズマ症ＩｇＧ（Ｔｏｘｏ−ｌｇＧ）及びトキソプラズマ症ＩｇＭ（Ｔｏｘｏ−ｌｇＭ）のようなトキソプラズマ症抗体；テストステロン；サリチル酸；アセトアミノフェン；Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）；抗Ｂ型肝炎コア抗原ＩｇＧ及びＩｇＭ（抗ＨＢＣ）のようなＢ型肝炎コア抗原抗体；ヒト免疫不全ウイルス１型及び２型（ＨＩＶ１型及び２型）；ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型及び２型（ＨＴＬＶ）；Ｂ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）；Ｂ型肝炎ｅ抗原抗体（抗ＨＢｅ）；インフルエンザウイルス；甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）；チロキシン（Ｔ４）；総トリヨードチロニン（総Ｔ３）；遊離トリヨードチロニン（遊離Ｔ３）；ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）；リポタンパク質、コレステロール、及びトリグリセリド；及びαフェトタンパク質（ＡＦＰ）が含まれる。乱用薬物及び規制物質には、以下に限定されるものではないが、アンフェタミン；メタンフェタミン；アモバルビタール、セコバルビタール、ペントバルビタール、フェノバルビタール、及びバルビタールのようなバルビツレート；リブリウム及びバリウムのようなベンゾジアゼピン；ハシシュ及びマリファナのようなカンナビノイド；コカイン；フェンタニール；ＬＳＤ；メタカロン；ヘロイン、モルヒネ、コデイン、ヒドロモルフォン、ヒドロコドン、メサドン、オキシコドン、オキシモルフォン及びアヘンのようなアヘン剤；フェンシクリジン；及びプロポキシフェンが含まれる。他の可能な検体は、米国特許第６、４３６、６５１号に説明されていると考えられる。
【００２０】
図１を参照して、形成することができる横流型分析装置２０の一実施形態をより詳細に以下に説明する。「横流型」という用語は、同じ作用を有するように他の方法でこの装置を構成することができるので説明的なものであり、制限的な意味ではないことに注意すべきである。半径方向又は垂直方向流れ装置は、例えば、本発明の精神から逸脱することなく本発明と同じ原理を用いて容易に考えることができる。図示のように、装置２０は、任意的に硬質材料２４によって支持された多孔性膜２２を含む。多孔性膜２２は、検出区画（又は線）３０を有する。更に、多孔性膜２２は、対照区画（又は線）３２を有することができる。
【００２１】
一般的に、多孔性膜２２は、検出プローブが通過することができる様々な材料のいずれかで形成することができる。例えば、多孔性膜２２を形成するのに用いられる材料には、以下に限定されるものではないが、多糖類（例えば、紙のようなセルロース材料及び酢酸セルロース及びニトロセルロースのようなセルロース誘導体）のような天然、合成、又は合成的に修飾された天然由来の材料；ポリエーテルスルホン；ポリエチレン；ナイロン；ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）；ポリエステル；ポリプロピレン；シリカ；塩化ビニル、塩化ビニル−プロピレンコポリマー、及び塩化ビニル−ビニルアセテートコポリマーのようなポリマーを備える不活性化アルミナ、珪藻土、ＭｇＳＯ4、又は多孔性ポリマーマトリックス内に均一に分散された他の無機微粉化材料のような無機材料；天然由来（例えば、綿）及び合成（例えば、ナイロン又はレーヨン）の両方の布；シリカゲル、アガロース、デキストラン、及びゼラチンのような多孔性ゲル；及びポリアクリルアミドのようなポリマーフィルムなどを含むことができる。１つの特定的な実施形態では、多孔性膜２２は、ニトロセルロース及び／又はポリエーテルスルホン材料で形成される。「ニトロセルロース」という用語は、セルロースの硝酸エステルを意味し、これは、ニトロセルロース単独とすることができ、又は硝酸並びに１〜７炭素原子を有する脂肪族カルボン酸のような他の酸の混合エステルとすることもできることを理解すべきである。適切な膜には、米国マサチューセッツ州ビルリカ所在の「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ」から入手されるニトロセルロース膜「ＨＦ０７５」及び「ＨＦ１２０」が含まれる。
【００２２】
装置２０はまた、吸上げパッド２６を収容することができる。吸上げパッド２６は、一般的に、多孔性膜２２全体を通って移動した流体を受け取る。当業技術で公知のように、吸上げパッド２６は、毛管作用及び膜２２を通る流体の流れを促進するのに役立たせることができる。
装置２０は、希釈剤放出区画３４を有する。一実施形態では、希釈剤放出区画３４は、希釈剤リザーバ３６を有し、その中に希釈剤３８を保存することができる。代替的に、希釈剤３８は、別のリザーバにより供給することができる。希釈剤２８は、本発明で用いられる検出プローブを運び出すことになるあらゆる液体とすることができる。適切な希釈剤の例には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液（ｐＨ７．２）、トリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）溶液（ｐＨ８．２）、又は２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．３）が含まれる。これらは、界面活性剤、水溶性ポリマー、タンパク質、非特異的な結合を防ぐ遮断剤、及び保存料のような他の添加物を含んで分析の性能を助けることができる。
【００２３】
抱合体パッド４０は、希釈剤放出区画３４と液体連通し、希釈剤３８が希釈剤放出区画３４から移動すると、抱合体パッド４０を横断して、抱合粒子を多孔性膜２２の検出区画３０及び対照区画３２まで運ぶことになるように、希釈剤放出区画３４と多孔性膜２２の間に位置する。抱合体パッド４０は、希釈剤が通過することができる材料で形成される。抱合体パッド４０は、例えば、ガラス繊維で形成することができる。１つの抱合体パッド４０しか示していないが、本発明には、他の抱合体パッドを用いることができることを理解すべきである。
【００２４】
試験試料中の検体の検出を開始するために、使用者は、試験試料を抱合体パッド４０と多孔性膜２２の検出区画３０部分との間の付加区画４２に直接付加、接触、又は堆積させることができる。試料が付加区画４２に接触した状態で、希釈剤放出区画３４に希釈剤３８が放出される。希釈剤３８は、一体型リザーバにより付加することができ、又はピペット又は当業者に公知の何らかの他の有効な手段のような別の供給源により付加することができる。希釈剤３８は、多孔性膜２２と液体連通した抱合体パッド４０を通って付加区画４２、検出区画３０、及び対照区画３２に進む。
【００２５】
試験試料内の検体の存在又は不在を正確に検出することを容易にするために、所定の量の少なくとも１つの種類の抱合粒子が抱合体パッドに付加される。一般的に、視覚的に又は計測装置により検出可能な信号を生成することができるあらゆる物質を検出プローブとして用いることができる。様々な適切な物質には、色素原；触媒；発光化合物（例えば、蛍光、燐光等）；放射性化合物；コロイド金属（例えば、金）及び非金属粒子、染色粒子、酵素又は基質、又は有機ポリマーラテックス粒子を含む可視ラベル；リポゾーム又は信号生成物質を含む他の小胞などを含むことができる。検出プローブとして用いるのに適切な一部の酵素は、米国特許第４、２７５、１４９号に開示されている。酵素／基質システムの一例は、酵素であるアルカリフォスファターゼ及び基質であるニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート、又はその誘導体又は類似物、又は基質である４−メチルウンベリフェリル−ホスフェートである。他の適切な抱合粒子は、米国特許第５、６７０、３８１号及び第５、２５２、４５９号に説明されていると考えられる。一部の実施形態では、抱合粒子は、検出可能信号を生成する蛍光化合物を含むことができる。蛍光化合物は、蛍光分子、ポリマー、デンドリマー、粒子等とすることができる。例えば、適切な蛍光分子の一部の例は、以下に限定されるものではないが、蛍光色素、ユーロピウムキレート、フィコビリタンパク質、ローダミン、及びその誘導体及び類似物を含む。
【００２６】
上述のような抱合粒子は、単独で用いることができ、又は微粒子（時に「ビーズ」又は「マイクロビーズ」と呼ばれる）と共に用いることもできる。例えば、核、マイコプラズマ、プラスミド、プラスチド、哺乳類の細胞（例えば、赤血球ゴースト）、単細胞微生物（例えば、細菌）、及び多糖類（例えば、アガロース）などのような天然由来の微粒子を用いることができる。更に、合成微粒子を用いることができる。例えば、一実施形態では、蛍光又は着色染料でラベル付けされたラテックス微粒子が用いられる。本発明ではあらゆるラテックス微粒子を用いることができるが、ラテックス微粒子は、一般的に、ポリスチレン、ブタジエンスチレン、スチレンアクリル−ビニルターポリマー、ポリメチルメタクリレート、ポリエチルメタクリレート、スチレン−無水マレイン酸コポリマー、ポリビニルアセテート、ポリビニルピリジン、ポリジビニルベンゼン、ポリブチレンテレフタレート、アクリロニトリル、塩化ビニル−アクリレートなど、又はそのアルデヒド、カルボキシル、アミノ、ヒドロキシル、又はヒドラジド誘導体で形成される。他の適切な微粒子は、米国特許第５、６７０、３８１号及び第５、２５２、４５９号に説明されていると考えられる。適切な蛍光粒子の市販の例には、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．」により商品名「ＦｌｕｏＳｐｈｅｒｅ」（レッド５８０／６０５）及び「ＴｒａｎｓｆｌｕｏＳｐｈｅｒｅ」（５４３／６２０）の下で販売されている蛍光カルボキシル化ミクロスフィア、並びにこれも「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｉｎｃ．」から販売されている「Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ」及び５−及び６−カルボキシテトラメチルローダミンが含まれる。更に、適切な着色ラテックス微粒子の市販の例には、「Ｂａｎｇ’ｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｉｎｃ．」により販売されているカルボキシル化ラテックスビーズが含まれる。
【００２７】
利用する時には、粒子の形状は、一般的に様々とすることができる。例えば、１つの特定的な実施形態では、粒子の形状は球状である。しかし、本発明では、平面、ロッド、円板、バー、管、不規則な形状などのような他の形状も考えられていることを理解すべきである。更に、粒子の大きさも様々とすることができる。例えば、粒子の平均の大きさ（例えば、直径）は、約０．１ナノメートル〜約１、０００ミクロンの範囲とすることができ、一部の実施形態では、約１ナノメートル〜約１００ミクロン、一部の実施形態では、約１０ナノメートル〜約１０ミクロンとすることができる。例えば、「ミクロン規模」の粒子が望ましいことが多い。利用する時には、このような「ミクロン規模」の粒子の平均の大きさは、約１ミクロン〜約１、０００ミクロンとすることができ、一部の実施形態では、約１ミクロン〜約１００ミクロン、一部の実施形態では、約１ミクロン〜約１０ミクロンとすることができる。同様に、「ナノ規模」の粒子を用いることができる。このような「ナノ規模」の粒子の平均の大きさは、約０．１〜約８０ナノメートルとすることができ、一部の実施形態では、約０．１〜約５ナノメートル、一部の実施形態では、約１〜約２０ナノメートルとすることができる。
【００２８】
一部の事例においては、検体に更に容易に結合することができるように、何らかの方法で粒子を修飾することが望ましい。このような事例では、粒子は、粒子に付着して抱合体粒子を形成するある一定の特異的結合員で修飾することができる。特異的結合員とは、一般的に、分子の一方が化学的及び／又は物理的に第２の分子に結合する特定の結合対の員、すなわち、２つの異なる分子を意味する。例えば、免疫反応性特異的結合員には、抗原、ハプテン、アプタマー、抗体（１次又は２次）、及び組換えＤＮＡ法又はペプチド合成によって形成されたものを含むその錯体を含むことができる。抗体は、モノクローナル又はポリクローナル抗体、組換えタンパク質又はその混合物又は断片、並びに抗体及び他の特異的結合員の混合物とすることができる。このような抗体の調製の詳細及びそれを特異的結合員として用いることに対する適合性は、当業者には公知である。他のよく用いられる特異的結合対には、以下に限定されるものではないが、ビオチン及びアビジン（又はその誘導体）、ビオチン及びストレプトアビジン、炭水化物及びレクチン、相補的ヌクレオチド配列（ターゲット核酸配列を検出するためのＤＮＡハイブリッド形成分析に用いられるプローブ及び捕捉核酸配列を含む）、組換え法によって形成されるものを含む相補的ペプチド配列、エフェクター及びレセプター分子、ホルモン及びホルモン結合タンパク質、酵素補因子及び酵素、酵素阻害剤及び酵素等が含まれる。更に、特異的結合対には、元の特異的結合員の類似物である員を含むことができる。例えば、検体に共通の少なくとも１つのエピトープを有する限り、検体の誘導体又は断片、すなわち、検体類似物を用いることができる。
【００２９】
特異的結合員は、一般的に、様々な公知の技術のいずれかを用いて粒子に付着させることができる。例えば、特異的結合員を検出プローブ（例えば、粒子）に共有的に付着させることは、タンパク質カプリング反応を達成することができるカルボキシル、アミノ、アルデヒド、ブロモアセチル、ヨードアセチル、チオール、エポキシ、及び他の反応又は連結官能基、並びに残留フリーラジカル及びラジカルカチオンを用いて達成することができる。更に、表面官能基は、粒子の表面に比較的高濃度の極性基を含むことができるために、官能化コモノマーとして組み込むことができる。更に、抱合粒子は、合成後に官能化されることが多いが、ポリ（チオフェノール）のようなある一定の場合には、微粒子は、更に修飾することを必要とせずにタンパク質と直接共有結合することができる。
【００３０】
再び図１を参照すると、分析装置２０は、検体又は抱合粒子−検体錯体に結合することができる第１の捕捉試薬が不動化される検出区画３０を収容する。検体の結合は、検体が存在することを検出可能にする指示をもたらし、このような指示は、以下に説明するように、可視であるか又は様々な検出器又は読取器（例えば、蛍光読取器）のような他の手段を通して見ることができる。読取器はまた、検出区画での信号強度に基づいて検出部位での検体の相対量を判断するように設計することができる。
【００３１】
一部の実施形態では、第１の捕捉試薬は、生物学的捕捉試薬とすることができる。このような生物学的捕捉試薬は、当業技術で公知であり、以下に限定されるものではないが、抗原、ハプテン、タンパク質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、キャプトアビジン、１次又は２次抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル等）、及びその錯体を含むことができる。多くの場合、これらの生物学的捕捉試薬は、抱合粒子上に存在する特異的結合員（例えば、抗体）に結合することができることが望ましい。
【００３２】
また、捕捉試薬には、様々な非生物学的材料を用いることが望ましい場合もある。例えば、一部の実施形態では、試薬には、多価電解質を含むことができる。多価電解質は、正味の正の電荷又は負の電荷を有することができ、又はほぼ中性の正味の電荷を含むこともできる。正味の正の電荷を有する多価電解質の一部の例には、以下に限定されるものではないが、ポリリジン（ミズーリ州セントルイス所在の「Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｉｎｃ．」から市販されている）、ポリエチレンイミド；ポリ（ジメチルアミン−コ−エピクロロヒドリン）のようなエピクロロヒドリン官能化ポリアミン及び／又はポリアミドアミン；ポリジアリルジエチル−塩化アンモニウム；及び四級アンモニウム水溶性モノマーでグラフト化したセルロースコポリマー又はセルロース誘導体のようなカチオン性セルロース誘導体等が含まれる。１つの特定的な実施形態では、四級アンモニウム水溶性モノマーを含有するセルロース誘導体である「ＣｅｌＱｕａｔ（登録商標）ＳＣ−２３０Ｍ」又は「Ｈ−１００」（「Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔａｒｃｈ  ＆  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｉｎｃ．」から入手可能）を用いることができる。正味の負の電荷を有する多価電解質の適切な一部の例には、以下に限定されるものではないが、ポリ（エチレン−コ−メタクリル酸ナトリウム塩）のようなポリアクリル酸が含まれる。更に、他の多価電解質を用いることができることを理解すべきである。両親媒性多価電解質（すなわち、極性部分及び非極性部分を有する）のようなこれらの一部は、ほぼ中性の正味の電荷を有することができる。例えば、適切な両親媒性多価電解質の一部の例には、以下に限定されるものではないが、ポリ（スチリル−ｂ−Ｎ−メチル２−ビニルピリジニウムヨージド）及びポリ（スチリル−ｂ−アクリル酸）が含まれ、その両方は、カナダのドーバル所在の「Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ、Ｉｎｃ．」から入手可能である。
【００３３】
第１の捕捉試薬は、検体と抱合粒子の間に形成される錯体のための静止結合部位として働く。より詳細には、抗体、抗原などのような検体は、一般的に、２つ又はそれよりも多くの結合部位（例えば、エピトープ）を有する。検出区画３０に到達すると、これらの結合部位の１つは、プローブの特異的結合員によって占有される。しかし、検体の遊離結合部位は、不動化捕捉試薬に結合することができる。不動化捕捉試薬に結合すると、合成されたプローブは、新しい三元サンドイッチ錯体を形成する。
【００３４】
検出区画３０は、一般的に、使用者が、試験試料内の特定の検体の濃度を更に良好に判断することができるように、あらゆる数の異なる検出領域を提供することができる。各領域は、同じ捕捉試薬を収容することができ、又は複数の検体を捕捉するために異なる捕捉試薬を収容することもできる。例えば、検出区画３０は、２つ又はそれよりも多くの異なる検出領域（例えば、線、ドット等）を含むことができる。検出領域は、分析装置２０を通る試験試料の流れに実質的に垂直な方向の線の形態に配置することができる。同様に、一部の実施形態では、検出領域は、分析装置２０を通る試験試料の流れに実質的に平行な方向の線の形態に配置することができる。
【００３５】
従来の横流型サンドイッチ装置では、非錯体化検体は、検出区画に位置する捕捉試薬に対して錯体化検体と競合し、検体の存在の指示を減少させると考えられる。時間に対する信号強度のグラフ表示では、この減少は、フックに似ており、従って、この現象は、「フック効果」として公知である。試験試料を抱合粒子の下流に配置すると、一部の検体は、抱合粒子と接触する前に捕捉試薬と錯体化することになる。それにより、一般的に、試薬の捕捉部位の全て又は実質的に全ては、検体に占有されることになる。抱合粒子は、検出区画に到達すると、実質的に新しい三元サンドイッチ錯体を形成する。この配列は、検体が事実上全ての捕捉試薬に結合し、（十分な検体が存在する場合）、かつ過剰な検出プローブが、事実上全ての捕捉試薬部位が錯体化検体を含有することを保証するので、以前の分析に見られた「フック効果」を消失させるのに役立つものである。
【００３６】
再び図１を参照すると、多孔性膜２２は、検出区画３０の下流に位置決めされた対照区画３２を収容することができる。対照区画３２は、一般的に、単一の異なる領域（例えば、線、ドット等）であるが、本発明では複数の領域も勿論考えられている。例えば、図示の実施形態では、単一の線が用いられている。対照区画３２は、装置２０を通る緩衝液及び検出プローブの流れに実質的に垂直な方向に配置することができる。同様に、一部の実施形態では、区画３２は、装置２０を通る流れに実質的に平行な方向に配置することができる。
【００３７】
その構成に関わらず、第２の捕捉試薬は、対照区画３２内の多孔性膜２２上に不動化することができる。第２の捕捉試薬は、検出区画３０で第１の捕捉試薬に結合しないあらゆる抱合粒子、及び／又は検体／抱合化粒子錯体のための静止結合部位として働く。第２の捕捉試薬は、錯体化及び非錯体化抱合粒子の両方に結合することが望ましいので、第２の捕捉試薬は、通常は第１の捕捉試薬と異なっている。一実施形態では、第２の捕捉試薬は、第１の捕捉試薬と異なる生物学的捕捉試薬（例えば、抗原、ハプテン、タンパク質Ａ又はＧ、ニュートラアビジン、アビジン、ストレプトアビジン、１次又は２次抗体（例えば、ポリクローナル、モノクローナル等）、及びその錯体）である。例えば、第１の捕捉試薬は、モノクローナル抗体（例えば、「ＣＲＰ  Ｍａｂ１」）とすることができ、第２の捕捉試薬は、アビジン（高カチオン性６６、０００ダルトン糖タンパク質）、ストレプトアビジン（非グリコシル化５２、８００ダルトンタンパク質）、ニュートラアビジン（脱グリコシル化アビジン誘導体）、及び／又はキャプトアビジン（ニトロ化アビジン誘導体）とすることができる。この実施形態では、第２の捕捉試薬は、ビオチンに結合することができ、これは、第１の捕捉試薬のモノクローナル抗体（例えば、「ＣＲＰ  Ｍａｂ２」）と異なるモノクローナル抗体で抱合された検出プローブにビオチン化されるか又は収容される。
【００３８】
更に、対照区画３２の第２の捕捉試薬に様々な非生物学的材料を用いることも望ましい場合がある。多くの事例において、このような非生物学的捕捉試薬は、残りの抱合化検出プローブ、及び／又は検体／抱合化プローブの全てを錯体化することをより良く保証するのに特に望ましいであろう。例として多価電解質材料がある。蛍光検出を用いて、検出及び対照区画の検体の存在を検出することができ、これはまた、一般的に、励起光子からの放出光子を単離する波長のフィルタ処理と、放出光子を示し、かつ記録可能な出力を通常電気信号又は写真画像として生成する検出器とを利用する。この種類の検出器の例には、分光蛍光光度計及びマイクロプレート読取器；蛍光顕微鏡；蛍光スキャナ；及びフローサイトメーターが含まれる。本発明に用いるのに適切な１つの蛍光検出器は、ニュージャージー州エジソン所在の「ＳＰＥＸ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．」から販売されている「ＦｌｕｏｒｏＬｏｇ  ＩＩＩ  分光蛍光光度計」である。
【００３９】
必要に応じて、本発明には、「時間分解蛍光検出」として公知の技術を利用することもできる。時間分解蛍光検出は、ユーロピウム（Ｅｕ（ＩＩＩ））及びテルビウム（Ｔｂ（ＩＩＩ））のランタニドキレートのようなある一定の蛍光材料の蛍光特性を利用することによって放出源から又は散乱過程（励起放射の散乱からもたらされる）からの背景信号を低減するように設計されている。このようなキレートは、十分に短い波長でキレートを励起した後に強い赤方シフトした狭帯域の長寿命発光を示すことができる。典型的に、キレートは、発色団が分子内でランタニドの近くに位置するために、強力な紫外線吸収帯を有する。発色団による光吸収に続いて、励起エネルギは、励起発色団からランタニドに移行することができる。これは、次に、ランタニドの蛍光発光特性に従うことになる。パルス励起及び時間ゲート検出の狭帯域発光フィルタと組み合わせた使用は、ランタニドキレートのみからの蛍光の特異的な検出を考慮し、試料に存在する典型的に短寿命又は短波長発光の他の化学種からの発光を拒絶するものである。
【実施例１】
【００４０】
この考えを以下の実験設定で試験した。すなわち、ヤギ抗マウス抗体（ＧＡＭ）をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．２）で０．１ｍｇ／ｍｌまで希釈し、「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ  １６００」コーティング機械を用いて分取率１ｕｌ／ｃｍ、ベッド速度５センチメートル／秒で「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ」ニトロセルロース「ＨＦ１２０」膜上に筋状に配置した。「Ｓｃｉｐａｃ」Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）（英国ケント所在の「Ｓｉｔｔｉｎｇｂｏｕｍｅ」）を水で希釈して最終濃度２．６ｍｇ／ｍｌにし、分取率１ｕｌ／ｃｍでＧＡＭ試験線の下に筋状に配置した。このカードは、３７℃で１時間放置して乾燥させた。
【００４１】
「ＶＦ２」（ニュージャージー州クリフトン所在の「Ｗｈａｔｍａｎ  Ｃｏｒｐ．」から）及び「ＧＦ３３」（ガラス繊維）抱合体パッド材料（マサチューセッツ州ビルリカ所在の「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐ．」から）を手動のギロチンカッターを用いて３０ｍｍ×３４ｍｍのバンドに切断した。抱合体のためのモノクローナル抗体は、「Ｍａｂ１」（カタログ番号１０−Ｃ０７、米国マサチューセッツ州０１７４２−３０４９、コンコード所在の「Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｉｎｃ．」から）であった、このＣＲＰ抗体は、２０ｎｍ直径の金粒子に抱合された。得られる抱合体は、１：１でヤギ抗ラビット（ＧＡＲ）抱合体金粒子（４０ｎｍ直径）と混合した。抗ＣＲＰ原液抱合体は、光学密度（ＯＤ）３２であり、従って、それがＧＡＲと１：１比で混合されると、ＯＤ１６まで減少する。これを２ｍＭの「Ｂｏｒａｘ」（ｐＨ７．２）及び５０％ショ糖（最終的に１０％ショ糖）で更に希釈し、最終的なＯＤを１０にした。「Ｂｏｒａｘ」は、有効な数少ない種類の緩衝液の１つであり、スクロース又は他の親水性材料は、その水中の高溶解度によって乾燥粒子の再懸濁を助けるものである。
【００４２】
抱合体は、「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ  １６００」コーティング機械を用いて「ＶＦ２」バンド上にこのバンドの縁から１０ｍｍ離し、かつ対照バンドとして反対側の縁から３ｍｍ離して、５ｕｌ／ｃｍ、５センチメートル／秒でスプレーした。これらは、相対湿度２０パーセント未満及び室温で一晩放置して乾燥させた。抱合体バンド及び吸上げ材料（Ｗｈａｔｍａｎからの「ＣＦ６」）を２０ｍｍ幅のバンドに切断し、筋状の「ＨＦ１２０」膜上に積層した。積層体バンドは、次に、計深棒を作るために「Ｋｉｎｅｍａｔｉｃ  ２３６０」を用いて４ｍｍ幅のストリップに切断された。
【００４３】
この実験には、ＥＤＴＡ処理全血又は較正生理食塩水（ワシントン州シアトル所在の「Ｋａｍａｙａ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ」）のいずれかを用いた。「Ｓｃｉｐａｃ  ＣＲＰ」を全血に加えて、最終濃度を２．５、１０、２０、４０、８０、及び１６０ｕｇ／ｍｌとした。「ＧＦ３３」実験には、「Ｋａｍａｙａ」標準生理食塩水を用いた。対照の試験ストリップに対しては、容積式ピペットを用いて１μｌの量の全血を線の「ＶＦ２」パッドの底部からほぼ１３ｍｍに加え、一方、本発明の分析に対しては、１ｕｌの血液をスプレーした抱合体バンドの直後（バンドの端部から〜１３ｍｍ）に加えた。次に、「ＰＢＳ」を２％「ＴＷＥＥＮ（登録商標）２０」界面活性剤（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）と共に緩衝液リザーバの吸上げストリップの反対端に加え、ハウジングの蓋を所定位置にクランプで留めた。試験ストリップは、３０分にわたって実施したままにし、その後視覚的に結果を読み取った。
【００４４】
本発明の分析により、試験線に遥かに強い信号が生じた。「阻害／オーバーフロー分析」のこの特別な場合の実施例に対しては、信号線として作用するＧＡＭ線は、検体（この場合、ＣＲＰ）のレベルが増大するとその強度が増大するので、本方法を用いた時に遥かに強い信号を有していた。
上述のように、血液試料を試験ストリップの基線から１３ｍｍに付加することに加えて、血液試料に対する別の位置を評価した。これらは、試験ストリップの基線から測定すると５ｍｍ〜２９ｍｍの範囲であった。これらの位置の全ては、試験信号の結果（例えば、線強度又は品質）に影響を及ぼす可能性がある。より詳細には、基線の近くに試料（例えば、血液）を付加するほど、背景が明瞭になり、従って、試験線での信号が改善することが見出された。このような信号の改善は、より強くより集中した線、優れた線品質、又は試験ストリップの他の区域上のより低い背景信号のいずれかの形をとった。
本発明をその特定的な実施形態に関して詳細に説明したが、当業者は、以上の理解が得られれば、これらの実施形態に対する代替、その変形、及びそれに対する均等物を容易に考えることができることは認められるであろう。従って、本発明の範囲は、特許請求の範囲及びそれに対するあらゆる均等物の範囲として理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】本発明の横流型分析装置の一実施形態の斜視図である。
【符号の説明】
【００４６】
２０  横流型分析装置
２２  多孔性膜
３０  検出区画
３２  対照区画
【図１】
2008524582.tif 000003
【国際調査報告】
2008524582.tif 000004
2008524582.tif 000005