(57)【要約】ＮＫＴ細胞抗原受容体およびそれに対応する抗原提示分子と相互作用するが、ＮＫＴ細胞の免疫機能を抑制する分子が患者に投与される。特に対象となっている病態としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、癌、アテローム硬化症、およびアレルギー性疾患が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、この抑制剤はアネルギー性糖脂質、例えば、β−ガラクトシドセラミドである。このような糖脂質の製薬処方物が提供され、望ましくないＮＫＴ細胞活性化を含む疾患の処置に使用される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における望ましくないＮＫＴ細胞活性化に伴う疾患を処置する方法であって、該方法は、有効用量のＮＫＴ細胞抑制剤を患者に投与することを含み、前記薬剤が、抗原提示分子との相互作用を通してＮＫＴ細胞免疫機能を抑制することを特徴とする、方法。
【請求項２】
前記疾患が全身性エリテマトーデスまたはその動物モデルである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記疾患がアレルギー性疾患である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記疾患が喘息である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＮＫＴ細胞抑制剤が、一般構造：
Ｇ−Ｌ
を有する非活性化糖脂質であり、
式中Ｌは脂質であり、Ｇは糖である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記糖と前記脂質との間の結合が、Ｏ原子のいずれかにおけるものであり得、アルファ配置またはベータ配置にある、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
Ｇがガラクトースである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
Ｌが、Ｃ８からＣ３０の脂肪酸、長鎖第二級アルコール、長鎖アミノアルコール、および長鎖ジ−またはトリヒドロキシ塩基を有する脂肪酸アミド類よりなる群から選択され、それらのいずれかが場合によってはリン酸化または硫酸化されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
Ｌがセラミドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＮＫＴ細胞抑制剤がβ−ガラクトシルセラミドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
喘息の処置における治療剤をスクリーニングする方法であって：
候補薬剤をＮＫＴ細胞と接触させてＮＫＴ細胞活性化を抑制する際の前記薬剤の有効性を決定することを含む方法。
【請求項１４】
全身性エリテマトーデスの処置における治療剤をスクリーニングする方法であって、該方法は、候補薬剤をＮＫＴ細胞と接触させてＮＫＴ細胞活性化を抑制する際の前記薬剤の有効性を決定することを含む、方法。
【請求項１５】
前記候補薬剤が、一般構造：
Ｇ−Ｌ
を有する非活性化糖脂質であり、
式中Ｌは脂質であり、Ｇは糖である、請求項１３および１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記糖と前記脂質との間の結合が、Ｏ原子のいずれかにおけるものであり得、アルファ配置またはベータ配置にある、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｇがガラクトースである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
Ｌが、Ｃ８からＣ３０の脂肪酸、長鎖第二級アルコール、長鎖アミノアルコール、および長鎖ジ−またはトリヒドロキシ塩基を有する脂肪酸アミド類よりなる群から選択され、それらのいずれかが場合によってはリン酸化または硫酸化されている、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって与えられた助成金番号ＮＩＨ−ＡＩ−４００６３による政府支援の下で行われた。
【０００２】
ＮＫＴ細胞はＴリンパ球の独自の亜集団を構成しており、ヒト種とマウス種の双方において保存性が高い。ＮＫＴ細胞は、Ｃ型レクチンＮＫＲＰ−１ＡなどのいくつかのＮＫ特異的表面マーカーを発現し、このため古典的ＮＫ細胞といくつかの性質を共有している。ＮＫＴ細胞はまた、ヒトでは、可変Ｖβ１１鎖と優先的に対となる不変Ｖα２４ＪαＱ再配列からなる半不変Ｔ細胞受容体を発現する。マウスでは、ＮＫＴ細胞は、可変Ｖβ８、Ｖβ７、またはＶβ２と対になった不変Ｖα１４Ｊα２８１再配列を発現する。補助受容体発現の点で、不変ＮＫＴ細胞は、リンパ球の正の単独ＣＤ４＋ＣＤ４または負の二重ＣＤ４−ＣＤ８−ＴＣＲα／βサブセットに属する。
【０００３】
ＮＫＴ細胞の天然リガンドはまだ同定されていないが、これらの細胞は、それらのＴＣＲが、ＣＤ１ｄによって提示されたマウス海綿体由来のグリコシルセラミドを認識した時に活性化される。このクラスのα−グリコシル化セラミドは、哺乳動物では検出されないが、それらは、天然のＣＤ１ｄ−リガンドと重要な構造的特徴を共有し得、ＮＫＴ細胞が疎水性（脂質）および親水性部分を含有している抗原を認識することを示唆している。
【０００４】
ＮＫＴ細胞の生物学的役割は十分には明らかになっていない。ＮＫＴ細胞は、それらのＴ細胞受容体を介した活性化に応答して、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）とインターロイキン−４の双方を大量に分泌することが示されている（例えば、非特許文献１；および非特許文献２を参照）。活性化が反復された後、ＮＫＴ細胞は、主にＩＬ−４を産生する分極細胞になる。
【０００５】
ＮＫＴ細胞は、一定の自己免疫疾患への感受性の制御における免疫調節機能を受け持っていることが示唆されている。例えば、いくつかの疾患モデルにおいて、疾患に罹りやすいレシピエントへのＮＫＴ細胞の移植が、自己免疫疾患の発現を防いでおり、ＩＬ−４産生するよう従来のＴ細胞を分極化することによるＮＫＴ細胞の活性化が自己免疫疾患の免疫調節のための治療的介入を提供し得ることが示唆されている（非特許文献３）。また、ＮＫＴ細胞およびＩＬ−１３（恐らくＮＫＴ細胞により産生された）が、細胞障害性Ｔリンパ球による腫瘍免疫監視をダウンレギュレートできるとの報告がある（非特許文献４）。
【０００６】
しかし、ＮＫＴ細胞の活性化は、Ｔｈ１タイプの免疫応答、および成体ＮＺＢ／ＶＶマウスにおける狼蒼の発現に寄与する自己抗体の分泌を増強するとの報告もある（非特許文献５）。
【０００７】
ヒトの臨床的条件におけるＮＫＴ細胞の役割は非常に興味深い。ＮＫＴ細胞系に関しては、種間での保存レベルが高い。α−ガラクトシルセラミドは、マウスとヒト双方のＮＫＴ細胞を刺激することができ、マウスとヒト双方のＣＤ１ｄ分子は、いずれの種のＮＫＴ細胞に対しても、α−ＧａｌＣｅｒを提示でき、ヒトの臨床試験に対する動物試験との関連性を示している。本発明により、ＮＫＴ細胞応答の操作法が提供される。
【非特許文献１】Ｈｏｎｇら（１９９９）Ｉｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６９：１３１頁
【非特許文献２】Ｓｉｎｇｈら（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６３：２３７３頁
【非特許文献３】Ｓｈａｒｉｆら（２００２）Ｊ  Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８０：２９０−３００頁
【非特許文献４】Ｔｅｒａｂｅら（２０００）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１（６）：５１５−２０頁
【非特許文献５】Ｚｅｎｇら（２００３）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１２：１２１１頁
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
（発明の要旨）
ＮＫＴ細胞の機能を抑制する（「アネルギーする」）ための方法および組成物を提供し、それによって、合成または天然アゴニストによるＮＫＴ細胞活性化を抑制する。ＮＫＴ細胞の免疫機能が抑制されるような、ＮＫＴ細胞抗原受容体およびその提示分子、例えばＣＤ１と相互作用する分子が患者に投与され、ＮＫＴ細胞活性化を抑制するように作用する。特に対象となっている病態としては、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、および喘息などのアレルギー性疾患の処置が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、該抑制剤は、ＮＫＴ細胞抗原受容体をダウンレギュレートするアネルギー糖脂質である。このような糖脂質は、糖部分と脂質部分の間のβ結合、例えば、β−ガラクトシルセラミドを含んでなる。このような糖脂質の製薬処方物が提供され、望ましくないＮＫＴ細胞活性化を含む疾患の処置に使用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（発明の詳細な説明）
特にアレルギー性疾患またはＳＬＥの処置において、ＮＫＴ細胞の免疫機能を抑制するための方法および組成物が提供される。ＮＫＴ細胞抗原受容体およびその提示分子、例えばＣＤ１と特異的に相互作用し、ＮＫＴ細胞の免疫機能を抑制する分子が患者に投与され、アゴニストに対するＮＫＴ細胞活性化応答を抑制するように作用する。本発明のいくつかの実施形態において、該阻止剤は、ＮＫＴ細胞抗原受容体をダウンレギュレートするアネルギー糖脂質である。このような糖脂質は、糖部分と脂質部分の間のβ結合、例えば、β−ガラクトシルセラミドを含んでなる。
【００１０】
用語の「処置」または「処置すること」は、限定はしないが、ヒトおよび動物モデルにおけるアレルギー疾患、例えば、喘息など、哺乳動物における疾患の任意の処置を言う。治療としては、疾患の誘導前に予防用の組成物を投与することにより、疾患の臨床症状を発現させない疾患予防；誘導事象後だが疾患の臨床的発現または再発現の前に予防用組成物を投与することにより、疾患の臨床症状を発現させない疾患抑制；臨床症状の最初の発現後に予防用組成物を投与することにより、臨床症状の発現を制止する疾患阻止；および／または臨床症状の最初の発現後に予防用組成物を投与することにより、臨床症状の退行を生じさせる疾患軽減が挙げられる。
【００１１】
当然のことながら、ヒトの医療では、最終的な誘導事象または事象類が不明であったり、潜在的であったり、または事象または事象類が発生して相当後になるまで患者の確認がされなかったりすることがあり得るため、「予防」と「抑制」の間を必ずしも区別することができない。したがって、用語の「予防」を、「治療」と区別して用い、本明細書で定義された「防ぐこと」と「抑制すること」の双方を包含することが一般的である。本明細書に用いられる「処置」は、「予防」を含むことを意味する。
【００１２】
用語の「有効量」は、治療されている疾患状態に処置を提供する上で十分な投与量を意味する。これは、患者、疾患および施されている処置に依って変わる。ＮＫＴ細胞抑制剤は、疾患の処置に用いられ；また、例えば、プレドニゾンまたはヒドロコルチゾンのより低用量の使用を促進するために、ステロイド節約型薬剤として、同時処方に使用できる。
【００１３】
疾患処置のためのインビボ活性は、ヒトの状況を模して、対照および処置群において、動物モデル、例えば、動物の誘導喘息モデル；または遺伝性狼蒼様疾患に罹っている同系マウスの数種の株の１つにおいて、抑制剤を試験し、ＡＮＡ産生、病原性抗ｄｓ  ＤＮＡ抗体、免疫複合体糸球体腎炎、リンパ節炎およびＢ細胞およびＴ細胞の異常機能の発現を観察することによって実証することができる。ヒトの臨床有効性は、当業者に公知の方法論を用いて、臨床試験において実証することができる。
【００１４】
（定義）
当然のことながら、本発明は、特定の方法論、プロトコル、細胞系、動物種または動物属、構築体、および記載された試薬に限定されず、変わり得る。やはり当然のことではあるが、本明細書に用いられる用語は、特定の実施形態を記述するためだけのものであり、本発明の範囲を限定する意図はなく、それは、添付の請求項によってのみ限定される。
【００１５】
本明細書に用いられる単数形の「ある」、「ならびに」、および「該」は、文脈により明らかに示されない限りは、複数系指示物を含む。したがって、例えば、「ある構築体」は、このような構築体の複数を含み、「該細胞」という言及は、１つ以上の細胞および当業者に公知のその等価物の言及を含む。本明細書に用いられる全ての専門用語および科学用語は、別に明らかに示されない限り、本発明が属する通常の当業者に一般的に認識されているものと同じ意味を有する。
【００１６】
アレルギーは、ＩｇＥベースの感受性の増加傾向であり、例えば、昆虫毒液、粉塵ダニ、花粉、カビ、動物のふけ、食物抗原、またはラテックスなどの免疫原に対する特異的ＩｇＥ抗体産生が生じる。アレルギー応答は、抗原特異的であり、例えば、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３などのＴｈ２タイプのサイトカインの産生を特徴とする。特定のアレルゲンに対する感作は、抗原への曝露後に、遺伝的素因のある人に起こり、タバコの煙およびウィルス感染は感作過程を補助し得る。
【００１７】
この群には、軽い鼻炎から生命を脅かす喘息にわたる臨床疾患を発現させる喘息関連アレルギーに罹っているものが含まれる。感作後、アレルゲンに対する継続的曝露は、喘息罹患率の顕著な増加を導く。一旦感作が生じると、アレルゲンへの再曝露は、喘息悪化の危険因子である。アレルギー性喘息の有効な管理は、典型的に、薬理学的療法およびアレルゲン回避を必要とする。アレルギーに関連した喘息の具体的な生理学的作用としては、気道の炎症、好酸球増加症および粘液産生、ならびにＩＬ−４および抗原特異的ＩｇＥの産生が挙げられる。
【００１８】
造血前駆体細胞の誘導体である肥満細胞は、存在している末梢組織内で分化／成熟の最終段階を受け、それらが高親和性でＩｇＥのＦｃ部分に結合することを可能にする細胞表面受容体（ＦｃＲＩ）を発現する。このようなＩｇＥ感作肥満細胞は、それらのＦｃＲＩ結合ＩｇＥによって認識される特異的抗原に遭遇すると、細胞の細胞質顆粒に貯蔵される前形成伝達物質、例えば、ヒスタミン、ヘパリン、および中性プロテアーゼ、新たに合成された脂質生成物、例えば、プロスタグランジンＤ２およびロイコトリエンＣ４、および多様なサイトカイン類などの広範囲の一団の生物活性伝達物質を分泌する。肥満細胞に誘導される可能性のあるこれらの伝達物質の多くは、可逆的気道閉塞、気管支過敏、および／または気道炎症を促進し得る。
【００１９】
しかし、喘息に罹っている患者の気道における慢性炎症浸潤物中に双方とも十分に表されている好酸球とＴｈ２リンパ球などのさらなる細胞型もまた、サイトカイン類およびこの疾患の特徴の多くに寄与し得る他の伝達物質を産生することができる。かつては、組織の肥満細胞および好塩基球に限定されていると考えられていたＦｃＲＩもまた、単球、循環樹枝状細胞、ランゲルハンス細胞および好酸球の表面に発現し、したがって、これらの細胞もまた、種々のＩｇＥ依存炎症応答におけるさらなる伝達物質源としての可能性があることを示唆している（レビューとしては、Ｇａｌｌｉ（１９９７）Ｊ．Ｅ．Ｍ．  １８６：３４３−３４７頁を参照。その開示およびそこに引用された参考文献は、参照として本明細書に組み込まれている）。
【００２０】
アレルゲンは、罹病しやすい個体において、Ｔｈ２タイプのＴ細胞応答およびＩｇＥのＢ細胞応答を引き起こす免疫原性化合物である。具体的なアレルゲンは、例えば、多糖類、脂肪酸部分、タンパク質などの任意のタイプの化学的化合物であり得る。アレルゲンとしては、果実（メロン、イチゴ、パイナップルおよび他の熱帯果実）、落花生、落花生油、他のナッツ類、乳タンパク質、卵白、貝、トマトなどの食物に見られる抗原；草の花粉、動物のふけ、イエダニの糞などの空中抗原；ペニシリンおよび関連抗生物質、サルファ剤、バルビツレート、抗痙攣薬、インスリン処方物（特に動物源のインスリン）、局所麻酔薬（例えばノボカイン）、およびヨード（Ｘ線造影色素の多くに見られる）などの薬物抗原；昆虫毒液および蚊（ハマダラカ属種、ヤブカ属種、Ｃｕｌｉｓｅｔａ属種、イエカ属種）、ハエ（サンチョウバエ属種、サシバエ属種）特に、ブユ、アブおよび咬むミジ、ダニ（カクマダニ属種、カズキダニ属種、オトビウス属種）、ノミ（例えば、ネズミノミ属、ヒトノミ属およびイヌノミ属ネコノミ）を含む双翅目などの吸血節足動物によって引き起こされたアレルギー性皮膚炎の原因物質；およびラテックスが挙げられる。
【００２１】
アナフィラキシーアレルゲンは、過敏症の個体にアナフィラキシー反応の危険性を与える抗原である。アナフィラキシーは、個体が抗原に感作した後に生じる急性の全身性のアレルギー反応である。アナフィラキシーは、筋肉収縮、気道の狭窄、および血管の拡張を引き起こすＩｇＥ抗体の高レベルの産生およびヒスタミンの放出に関連している。アナフィラキシー反応の症状としては、蕁麻疹、全身の痒み、鼻腔鬱血、喘鳴、呼吸困難、咳、チアノーゼ、眩暈、めまい感、混乱、言語蹉跌、速脈、動悸、悪心および嘔吐、腹痛または痙攣、皮膚の発赤または炎症、鼻腔の腫れ、肋間収縮などが挙げられる。
【００２２】
本明細書に定義された喘息は、複数の遺伝的因子および環境因子間の相互作用の結果として生じ得る間欠的および可逆的な気道閉塞、気道過敏および気道炎症という３つの基本的な特徴により典型的に特性化される症候群である。喘息は、気道壁における好酸球、肥満細胞、好塩基球、およびＣＤ２５＋  Ｔリンパ球などの細胞の存在を特徴とする。種々の伝達性および生物学的エフェクター性を有するサイトカインの活性により、これらの細胞間には密接な相互作用が存在する。ケモカインは炎症部位に細胞を引き寄せ、サイトカインはそれらを活性化する結果、粘膜に炎症および損傷が生じる。この過程が慢性になると、基底膜の肥厚化、および線維増多などの二次的変化が生じる。この疾患は、種々の刺激に対する気道過敏性の増加、および気道炎症を特徴とする。喘息と診断された患者は一般に、喘鳴、喘息発作、およびメタコリン誘発に対する陽性応答、すなわち、約４ｍｇ／ｍｌ未満のメタコリン誘発でのＰＣ２０など、経時的に、複数の徴候を有する。診断の指針は、例えば、喘息の診断および管理に関する国家喘息教育プログラム専門家委員会指針、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、１９９１年、第９１−３０４２号に見ることができる。
【００２３】
ＳＬＥ。全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）は、ポリクローナルＢ細胞の活性化を特徴とする自己免疫疾患であり、種々の抗タンパク質抗体および非タンパク質抗体を生じる（この疾患のレビューに関しては、Ｋｏｔｚｉｎら（１９９６）Ｃｅｌｌ  ８５：３０３−３０６頁を参照）。複数の臓器系に蓄積する免疫複合体からのこれらの自己抗体が組織損傷を引き起こす。ＳＬＥは、増悪と寛解を特徴とする種々の疾病経過を有する研究上難しい疾患である。例えば、主に、実際上、皮膚発疹および関節痛を示し、自然な寛解を示してほとんど医療を必要としない患者もあり得る。範囲内の他方の極端には、高用量のステロイドおよびシクロホスファミドなどの細胞毒性薬物による療法を必要とする重篤で進行性の腎臓への関与（糸球体腎炎）を示す患者が含まれる。
【００２４】
ＳＬＥの発現には、複数の因子が寄与し得る。組織適合性抗原ＨＬＡ−ＤＲ２およびＨＬＡ−ＤＲ３などのいくつかの遺伝子座が罹病性に寄与し得る。一卵性双生児の一致率が、２５％から６０％の間と中程度であることから、この遺伝的素因の多遺伝子性ならびに環境因子の寄与が示唆される。
【００２５】
自己抗体産生の起源に関しては、多くの原因が示唆されている。抗ｄｓＤＮＡ抗体分泌に関するＴ細胞援助の提案された機構としては、ヒストンなどのＤＮＡ結合タンパク質抗原のＴ細胞認識、およびクラスＩＩ  ＭＨＣの文脈においては、抗ＤＮＡ抗体由来ペプチドの認識が挙げられる。抗体のクラスもまた因子としての役割を演じ得る。ＮＺＢ／ＮＺＷマウスの遺伝性狼蒼においては、カチオン性ＩｇＧ２ａ抗二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ抗体が病原である。これらの動物において、ＩｇＭからＩｇＧへの自己抗体分泌の移行は、約６ヵ月齢で生じ、Ｔ細胞は、ＩｇＧ産生の調節において重要な役割を演じ得る。
【００２６】
疾患の症状発現は、免疫複合体の蓄積、白血球血栓症、または血栓症による再発性血管損傷から生じる。また、細胞障害性抗体は自己免疫溶血性貧血および血小板減少症を媒介でき、一方、特定の細胞抗原に対する抗体は、細胞機能を攪乱させ得る。後者の一例は、抗ニューロン抗体と神経精神医学的ＳＬＥとの関連である。
【００２７】
ＮＫＴ細胞はリンパ球のサブ集団の１つを構成し、胸腺、脾臓、肝臓および骨髄に多く、肺にも存在する。それらは、胸腺中、ＣＤ４＋ＣＤ８＋始原細胞から発達し、血液中で循環し、特有な細胞質顆粒を有し、前もって免疫または活性化する必要なく、インビトロで一定のリンパ球腫瘍細胞系を死滅させる能力によって機能的に同定できる。ＮＫＴ細胞の死滅させる機構は、適応性免疫応答において作出された細胞Ｔ細胞によって用いられるものと同じである。すなわち、結合した標的細胞の表面に細胞障害性顆粒が放出され、それらが含有するエフェクタータンパク質が細胞膜を貫通し、プログラム化された細胞死を誘導する。
【００２８】
ＮＫＴ細胞は、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ１．１およびＣＤ１６１など）と通常のＴ細胞（ＴＣＲ類など）の双方に特徴的な表面マーカーを発現する。いくつかのＮＫＴ細胞は、マウスにおいて、非多型主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラス１様タンパク質ＣＤ１ｄを認識し、不変ＴＣＲを発現する。
【００２９】
ＮＫＴ細胞抗原受容体。抗原ＮＫＴ細胞に対する受容体は、２本のタンパク質鎖、Ｔ細胞受容体αおよびＴ細胞受容体βからなるα：βＴ細胞受容体である。通常のＴ細胞上の受容体のように、ＮＫＴ細胞受容体は抗原をそのネイティブな状態では認識しないと考えられる。通常のＴ細胞は、ＭＨＣ分子に結合したペプチド抗原の複合体リガンドを認識する。ＮＫＴ細胞抗原受容体に対する提示分子は、ＣＤ１ｄであると考えられるが、これはペプチド断片ではなく、糖脂質と結合していることが多い。他のＭＨＣクラス１分子と類似して、結合抗原は、ＣＤ１ｄの２つのαらせんセグメントの間に挟まれていると考えられる。Ｔ細胞受容体は、この複合体リガンドと相互作用し、ＣＤ１ｄと抗原の双方に接触する。
【００３０】
Ｔ細胞受容体のアミノ酸配列は、双方の鎖が免疫グロブリンＶドメインに相同なアミノ末端可変（Ｖ）領域、免疫グロブリンＣドメインに相同な不変（Ｃ）領域、および鎖内ジスルフィド結合を形成するシステイン残基を含有する短いヒンジ領域を有することを示している。各鎖は、疎水性の膜貫通ドメインによって脂質二重層にわたっており、短い細胞質尾部で終わっている。
【００３１】
ＴＣＲα座は、ＶおよびＪ遺伝子セグメント（ＶαおよびＪα）を含有する。ＴＣＲβ座は、ＶβおよびＪβ遺伝子セグメントに加えてＤ遺伝子セグメントを含有する。ＤおよびＪ遺伝子セグメントが寄与する、Ｔ細胞受容体α鎖およびβ鎖の第３の高頻度可変ループ（ＣＤＲ３ｓ）は、Ｔ細胞受容体の抗原結合部位の中心を形成し；その部位の周辺は、生殖細胞系ＶαおよびＶβ遺伝子セグメント内にコード化されているＣＤＲ１ループおよびＣＤＲ２ループの等価物からなっている。
【００３２】
ヒトでは、ＮＫＴ細胞のＴ細胞受容体は、可変Ｖβ１１鎖と優先的に対になった不変Ｖα２４ＪαＱ再配列からなる。マウスでは、ＮＫＴ細胞は可変Ｖβ８、Ｖβ７、またはＶβ２と対になった不変Ｖα１４Ｊα２８１再配列を発現する。
【００３３】
ＣＤ１：ＣＤ１は、β２ミクログロブリン（β２ｍ）と非共有結合していることを見出し得る、非多型、クラス１ＭＨＣ様、非ＭＨＣコード分子である。ヒトでは、ＣＤ１の５つのイソ体が同定されており（ＣＤ１ａ、ｂ、ｃ、ｄおよびｅ）、ヒトＢ細胞は、ＣＤ１ｃとＣＤ１ｄを発現することが知られている。マウスでは、ＣＤ１ｄイソ体のみが同定されている。ＣＤ１分子は、糖脂質および疎水性ペプチドに対する抗原提示分子であることが証明されている。本発明のいくつかの実施形態において、ＣＤ１イソ体はＮＫＴ細胞抗原受容体と相互作用するＣＤ１ｄである。
【００３４】
ヒトおよびマウスのＣＤ１イソ体は、クローン化され、それらの配列について特性化されている。ヒトＣＤ１ａの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、登録番号Ｍ２８８２５で見ることができる。ＣＤ１ｂの配列は、タンパク質配列データベース、公開６４．００、２０００年３月３１日のＰＩＲ１節、登録番号Ｂ３９９５７；Ｂ４５８０１；および１７９４７０に見ることができる（Ｍａｒｔｉｎら（１９８７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８４（２４）：９１８９−９３頁）。ＣＤ１ｃの配列は、ＰＩＲ１、登録番号Ｃ４５８０１；Ｃ３９９５７；および１７９４７２に見ることができる（ＡｒｕｆｆｏおよびＳｅｅｄ（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１７２３−１７３０頁）。ヒトＣＤ１ｄは、Ｇｅｎｂａｎｋ、登録番号Ｊ０４１４２に見ることができる（Ｂａｌｋら（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ８６（１）、２５２−２５６頁）。ヒトＣＤ１ｅ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ、登録番号Ｘ１４９７５、Ｘ１５１１０に見ることができる（Ｃａｌａｂｉら（１９８９）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９（２）、２８５−２９２頁）。
【００３５】
本発明において、アネルギー剤を治療中の患者の抗原提示細胞上に存在しているＣＤ１タンパク質に結合させる。すなわち、ヒトの療法では、アネルギー剤はヒトＣＤ１および類似物に結合する。ＣＤ１は多型性が高くないため、患者は一般に、蒸気の野生型タンパク質を発現するが、患者が該タンパク質の変異体を発現する例外もあり得る。
【００３６】
薬剤はヒトＣＤ１イソ体の一種または複数種、特に抗原提示細胞上に発現したイソ体、例えばＣＤ１ｄと特異的に結合できる。替わりの一実施形態において、患者に存在する全イソ体と一般に結合させるために、全てのＣＤ１イソ体上の共通エピトープを認識する交差反応性のアネルギー剤；またはイソ体特異的薬剤のカクテルが用いられる。
【００３７】
ＮＫＴ細胞抑制剤は、それらの抗原受容体を介して、例えば、ＣＤ１の細胞外ドメインに対する、またはＴ細胞抗原受容体に対する競合的または非競合的結合によってＮＫＴ細胞の活性化を妨げるか、または活性化抗原の提示を阻止する分子である。通常、抑制剤の結合親和性は、少なくとも約１００μＭである。抑制剤は、ペプチド、単独で、またはペプチドと組み合わせた脂質、例えば、糖脂質、リン脂質など；小型有機分子、ペプチド模倣物、可溶性Ｔ細胞受容体；などであり得る。糖脂質は好ましい阻止剤である。
【００３８】
本発明の一実施形態において、ＮＫＴ細胞抑制剤はアネルギー糖脂質である。対象となっている糖脂質は、以下の一般式を有する：
Ｇ−Ｌ
式中、Ｌは脂質であり、Ｇは糖であり、ヘキソースまたはペントースであり得、また、モノ−、ジ−、トリ−、オリゴ、もしくは多糖、またはそれらの誘導体であり得る。対象となっている糖としては、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロース、フルクトース、マルトース、ラクトース、およびスクロースが挙げられる。糖と脂質との間の結合は、通常は１位、２位、３位または４位のいずれかにおけるＯ原子、さらに通常は１位におけるＯ原子におけるものであり得る。該結合は、αまたはベータの立体配置であり得、いくつかの特定の実施形態において、該結合はベータの立体配置である。対象となっている脂質としては、アシル鎖およびスフィンゴシンを有するセラミドが挙げられる。
【００３９】
例えば、ＮＫＴ細胞抑制剤は、以下の構造を有し得る：
【００４０】
【化１】
2008518974.tif 000003
式中、Ｌは脂質であり、ＲはＨ、ペントース、糖、ヘキソース糖、オリゴ糖もしくは多糖；またはＣ１からＣ６の低級アルキルなどのアルキル基、アリール基またはアルケニル基よりなる群から選択され、該アルキルは、任意に置換されており、該置換基としては、限定はしないが、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アラルキル基、アラルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基またはシクロアルキルアルケニル基を挙げることができ；かつ１つまたは複数のＮ、ＳまたはＯのヘテロ原子を含有し得る。Ｏ原子の各々は、αまたはβの配位であり得、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノースなどであり得る。
【００４１】
本発明の一実施形態において、Ｇは以下の構造を有する：
【００４２】
【化２】
2008518974.tif 000004
式中、Ｇはガラクトースであり、Ｌに対する結合（示されている）はαまたはβ立体配置において１位である。
【００４３】
多数の脂質はＬとして、Ｃ８からＣ３０の脂肪酸、長鎖二級アルコール、長鎖アミノアルコール、長鎖ジまたはトリヒドロキシ塩基などを使用する。例えば、グリコシル部分（１つまたはいくつかのユニット）は、脂肪アルコールまたはヒドロキシ脂肪アルコールの１つのヒドロキシル基に、または脂肪酸のカルボニル基に結合できる。好適な脂質の例としては、セラミド、スフィンゴミエリン、セレブロシドなどが挙げられ、スフィンゴシン、ジヒドロスフィンゴシン、Ｃ２０−ジヒドロスフィンゴシン、スフィンガジエニンなどが含まれる。
【００４４】
分枝鎖スフィンゴイド塩基は、いくつかの海洋無脊椎動物で記載されている。このように、分枝状Ｃ１９アルキル鎖および３つの二重結合を有する塩基、２−アミノ−９−メチル−４，８，１０−オクタデカトリエン−１，２−ジオールは、ヒトデのグルコシルセラミドに（Ｉｒｉｅ  Ａら、Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９９０年、１０７，５７８頁）、またイカ神経のスフィンゴミエリンに（Ｏｈａｓｈｉら、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ２０００年、４１、１１１８頁）存在することが示されている。２つの二重結合を有する分枝状塩基がイソギンチャクのセレブロシドに（Ｋａｒｌｓｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １９７９年、５７４、７９頁）、また菌類の菌糸に（Ｋａｗａｉら、Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  １９８５年、２６、３３８頁）に見出されている。
【００４５】
セラミドは、長鎖ジまたはトリヒドロキシ塩基を有する脂肪酸のアミドであり、動物では、スフィンゴシン、植物ではフィトスフィンゴシンが最も一般的である。セラミドのアシル基は、一般に長鎖飽和またはモノ不飽和脂肪酸である。動物セラミドに最もよく見られる脂肪酸は、１８：０、２４：０および２４：１（ｎ−９）であり、長鎖ヒドロキシ脂肪酸もまた見られる。
【００４６】
一実施形態において、ＮＫＴ細胞抑制剤は、以下の構造を有する：
【００４７】
【化３】
2008518974.tif 000005
式中、Ｒ１とＲ２は同一であっても異なっていてもよく、約８から３０の炭素のアルキルまたはアルケニルから独立して選択され、線状でも分枝状でもよく、通常は線状で、通常は０、１つ、２つまたは３つ以下の不飽和結合であり、該鎖は、任意に、置換されているか、リン酸化されているかまたは硫酸化されており；またはエステルなどのそれらの誘導体であり；
各Ｒは、同一であっても異なっていてもよく、Ｈ、ＯＨ、低級アルキルアリールのエーテルまたはアルケニル基よりなる群から独立して選択され、該アルキルは任意に置換されており、該置換基としては、限定はしないが、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アラルキル基、アラルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基またはシクロアルキルアルケニル基を挙げることができ；かつ１つまたは複数のＮ、ＳまたはＯのヘテロ原子、Ｏ結合ペントース糖、Ｏ結合ヘキソース糖、Ｏ結合オリゴ糖もしくは多糖；またはＣ１からＣ６の低級アルキルなどのアルキル基、アリール基またはアルケニル基を含有していてもよく、該アルキルは、任意に置換されており、該置換基としては、限定はしないが、アルキル基、アリール基、アルケニル基、アラルキル基、アラルケニル基、シクロアルキル基、シクロアルキルアルキル基またはシクロアルキルアルケニル基を挙げることができ；かつ１つまたは複数のＮ、ＳまたはＯのヘテロ原子を含有し得る。Ｒ原子の各々は、αまたはβの配位であり得、例えば、グルコース、ガラクトース、マンノースなどであり得る。
【００４８】
一実施形態において、ＮＫＴ細胞抑制剤は、以下の構造を有する：
【００４９】
【化４】
2008518974.tif 000006
式中、Ｒ１は：（ｉ）水素；または（ｉｉ）−ＳＯ２Ｒ１０で、式中、Ｒ１０は：ハロ；ヒドロキシ；ＯＲ１１；ＯＲ１２；アミノ；ＮＨＲ１１；Ｎ（Ｒ１１）２；ＮＨＲ１２；Ｎ（Ｒ１２）２；アラルキルアミノ；または、ハロ、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、ＯＲ１１、ＯＲ１２、アシルオキシ、アミノ、ＮＨＲ１１、Ｎ（Ｒ１１）２、ＮＨＲ１２、Ｎ（Ｒ１２）２、アラルキルアミノ、メルカプト、チオアルコキシ、Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、Ｓ（Ｏ）Ｒ１２、ＳＯ２Ｒ１１、ＳＯ２Ｒ１２、ＮＨＳＯ２Ｒ１１、ＮＨＳＯ２Ｒ１２、サルフェート、ホスフェート、シアノ、カルボキシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１１、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１）２、０〜３のＲ１３を含有するＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、０〜３のＲ１３を含有するＣ３〜Ｃ１０ヘテロシクリル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアルケニル、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロシクロアルケニル、０〜３のＲ１４を含有するＣ６〜Ｃ２０アリール、または０〜３のＲ１４を含有するヘテロアリールによって任意に置換されているＣ１〜Ｃ１２アルキル；または
１つまたは複数のハロ、ヒドロキシ、オキソ、ＯＲ１１、ＯＲ１２、アシルオキシ、ニトロ、アミノ、ＮＨＲ１１、Ｎ（Ｒ１１）２、ＮＨＲ１２、Ｎ（Ｒ１２）２、アラルキルアミノ、メルカプト、チオアルコキシ、Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、Ｓ（Ｏ）Ｒ１２、ＳＯ２Ｒ１１、ＳＯ２Ｒ１２、ＮＨＳＯ２Ｒ１１、ＮＨＳＯ２Ｒ１２、サルフェート、ホスフェート、シアノ、カルボキシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１１、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１）２、アルキル、ハロアルキル、０〜３のＲ１３を含有するＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、０〜３のＲ１３を含有するＣ３〜Ｃ１０ヘテロシクリル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアルケニル、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロシクロアルケニル、０〜３のＲ１４を含有するＣ６〜Ｃ２０アリールヘテロアリール、または０〜３のＲ１４を含有するＣ６〜Ｃ２０ヘテロアリールによって任意に置換されているＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３〜Ｃ１０ヘテロシクリル、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアルケニル、またはＣ５〜Ｃ１０ヘテロシクロアルケニル；または
１つまたは複数のハロ、ヒドロキシ、ＯＲ１１、ＯＲ１２、アシルオキシ、ニトロ、アミノ、ＮＨＲ１１、Ｎ（Ｒ１１）２、ＮＨＲ１２、Ｎ（Ｒ１２）２、アラルキルアミノ、メルカプト、チオアルコキシ、Ｓ（Ｏ）Ｒ１１、Ｓ（Ｏ）Ｒ１２、ＳＯ２Ｒ１１、ＳＯ２Ｒ１２、ＮＨＳＯ２Ｒ１１、ＮＨＳＯ２Ｒ１２、サルフェート、ホスフェート、シアノ、カルボキシル、Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、Ｃ（Ｏ）Ｒ１２、Ｃ（Ｏ）ＯＲ１１、Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、Ｃ（Ｏ）ＮＨＲ１１、Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ１１）２、アルキル、ハロアルキル、０〜３のＲ１３を含有するＣ３〜Ｃ１０シクロアルキル、０〜３のＲ１３を含有するＣ３〜Ｃ１０ヘテロシクリル、Ｃ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、Ｃ５〜Ｃ１０シクロアルケニル、Ｃ５〜Ｃ１０ヘテロシクロアルケニル、０〜３のＲ１４を含有するＣ６〜Ｃ２０アリール、または０〜３のＲ１４を含有するＣ６〜Ｃ２０ヘテロアリールによって任意に置換されているＣ２〜Ｃ６アルケニル、Ｃ２〜Ｃ６アルキニル、アリール、またはヘテロアリール；または
（ｉｉｉ）Ｒ１０が上記に定義されている−Ｃ（Ｏ）Ｒ１０；または（ｉｖ）Ｒ１０が上記に定義されている−Ｃ（Ｒ１０）２（Ｒ１５）；Ｒ１５は水素、Ｒ１０であるか、またはＲ１５とＲ２は一緒になって、それらが結合している炭素原子と窒素原子との間に二重結合を形成している；または（ｖ）Ｒ１とＲ２は一緒になって、Ｒ１０によって任意に置換されている３〜１０の環原子のヘテロシクリルを形成し；Ｒ２は、水素であるか、またはＲ２とＲ１５は一緒になって、それらが結合している炭素原子と窒素原子との間に二重結合を形成しているか、またはＲ２とＲ１は一緒になって、Ｒ１０によって任意に置換されている３〜１０の環原子のヘテロシクリルを形成し；
Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、およびＲ７は、各々独立して、水素、Ｃ１〜Ｃ６アルキル、Ｃ６〜Ｃ１２アラルキル、またはＣ１〜Ｃ６アシルであり；Ｒ８は−（ＣＨ２）ＸＣＨ３であり；Ｒ９は線状または分枝状Ｃ３〜Ｃ１００アルキルであり；Ｒ１１は、ハロ、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルフェート、またはホスフェートによって任意に置換されているＣ１〜Ｃ２０アルキルであり；Ｒ１２は、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルフェート、またはホスフェートによって任意に置換されているアリールであり；各Ｒ１３は独立して、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、オキソ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルフェート、またはホスフェートであり；各Ｒ１４は独立して、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、アルコキシ、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、サルフェート、またはホスフェートであり；Ｘは１〜１００である。
【００５０】
上記の式について言うと、上記の化合物のサブセットは、Ｘが２４であり、Ｒ９がｎ−テトラデシルであるものである。
【００５１】
他の好適な置換基は、参照として本明細書に組み込まれている国際公開ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００８５３０号に記載されている。ＰＣＴ／ＵＳ２００３／００８５３０号は、該化合物のα体に関するものであるが、本明細書においては、β体でも同じ種類の置換がなし得ることが意図されている。
【００５２】
スクリーニングアッセイ：候補薬剤を、ＮＫＴ細胞活性化を抑制するそれらの能力に関してスクリーンできる。結合の親和性および特異性を決定するための、競合的および非競合的アッセイなどのアッセイは当業界に知られている。対象となっているアッセイとしては、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、フローサイトメトリーなどが挙げられる。結合アッセイでは、固体基質にＣＤ１を結合し、次いで結合したＣＤ１に候補リガンド（薬剤）を加える。結合の親和性は、プラズモン共鳴分光法（バイオコアアッセイ）によって測定できる。あるいは、競合物質、例えば糖脂質などの存在下、候補の阻止剤を結合したＣＤ１と組み合わせることができる。
【００５３】
結合アッセイはまた、候補薬剤がＣＤ１に対する分子の結合を妨害するかどうか；またはＮＫＴ細胞受容体とＣＤ１／糖脂質複合体との間の相互作用を妨害するかどうかを評価するために実施できる。候補薬剤がＮＫＴ細胞受容体（ＮＫＴＣＲ）に結合できるかどうかを決定するためのアッセイには、ＣＤ１二量体または四量体が利用できる（Ｋｒｏｎｅｎｂｅｒｇら（２００１）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９８：２９５０−２９５２頁を参照）。例えば、ＣＤ１四量体に候補薬剤を入れ；次いで生じた複合体をＮＫＴＣＲ、通常はＮＫＴ細胞に接触させ、結合レベルを、例えばフローサイトメトリーによって定量化できる。陽性対照として、ＣＤ１四量体／αガラクトシルセラミドの結合を定量化できるか；または競合的結合アッセイに用いることができる。いくつかの実施形態において、対象となっている薬剤をこれらの条件下で、ＮＫＴＣＲに結合させる。
【００５４】
他の実施形態において、対象となっている薬剤は、ＣＤ１およびＴＣＲに結合するアゴニストを妨害する。このような阻止は、先ず陽性対照（αガルサーなどのアゴニスト）をＣＤ１二量体または四量体に入れることによってアッセイでき、四量体は検出可能に標識できる。生じた試薬を用いてＮＫＴ細胞集団に結合させ、この結合を、例えばフローサイトメトリーにより定量化する。候補薬剤が結合を妨害することを示すために四量体を候補薬剤と共にプレインキュベートし、次いでアゴニストを入れ；生じた複合体を、ＮＫＴ細胞に結合するその能力に関してアゴニスト複合体と比較する。いくつかの実施形態において、対象となっている薬剤は、アゴニストとＣＤ１との結合間の相互作用を妨害する。
【００５５】
一般に、種々の濃度に対する種々の応答を得るために、種々の薬剤濃度と並行して複数のアッセイ混合物を操作する。典型的には、これらの濃度の１つは、陰性対照、すなわち、ゼロ濃度または検出レベル以下の濃度のものが用いられる。
【００５６】
対象となっているアッセイは、ＮＫＴ細胞の免疫機能を抑制する薬剤に指向的である。対象となっているアッセイは、ＮＫＴ細胞受容体および／またはＣＤ１に対する結合アッセイに指向的であり得るか；またはＮＫＴ細胞活性化の評価に指向的な機能的アッセイ、および／またはＮＫＴ細胞活性化に関する動物モデルを利用できる。
【００５７】
抑制化合物のスクリーニングに使用できるインビトロ機能アッセイは、ＮＫＴ細胞および抗原提示細胞を含むマウス脾臓細胞などの免疫細胞混合物においてＮＫＴ細胞を活性化するαガラクトシルセラミドの能力に基づいている。典型的には、αガラクトシルセラミドを細胞培養物に加えて２４時間置き、細胞増殖および培養上澄み液中へのＩＬ−４およびＩＦＮ−γの分泌によって活性化をアッセイする。
【００５８】
抑制化合物のスクリーニングは、該細胞混合物を候補抑制分子（アンタゴニスト）と共にプレインキュベートし、次いでαガラクトシルセラミド活性化分子（アゴニスト）を加え、細胞増殖をアッセイすることによって実施できる。サイトカイン分泌に関して、上澄み液を２４時間後にアッセイする。抑制効力は、増殖およびサイトカイン分泌の減少によって決定する。あるいは、細胞培養物は精製ＮＫＴ細胞および精製抗原提示細胞、特に樹状細胞を含み得る。
【００５９】
候補薬剤は、合成または天然化合物のライブラリーなどの多種多様な供給源から得られる。例えば、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向的合成のための多数の手段が入手できる。あるいは、細菌、真菌、植物および動物抽出物の形態における天然化合物のライブラリーが入手できるか、または容易に製造できる。また、天然または合成で製造されたライブラリーおよび化合物を、従来の化学的、物理的および生化学的手段によって容易に修飾できる。構造類縁体を製造するために、公知の薬理学的試剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向的またはランダムな化学的修飾に供することができる。
【００６０】
喘息の処置には、ＮＫＴ活性化を抑制、または阻止するための、ＣＤ１に特異的な抗体が興味深い。好適な抗体は、ＣＤ１タンパク質の全部または一部を含んでなるペプチドで宿主動物を免疫することによって得ることができる。好適な宿主動物としては、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ハムスター、ウサギなどが挙げられるタンパク質免疫原の出所は、マウス、ヒト、ラット、サルなどであり得る。宿主動物は一般に免疫原とは異なる種であり、例えば、ハムスターの免疫にはマウスＣＤ１が用いられ、マウスの免疫にはヒトＣＤ１が用いられるなど。このような高保存性領域から誘導されたペプチドは免疫原として、交差特異的抗体の作出に使用できる。該免疫原は、完全タンパク質、またはその断片および誘導体を含み得る。好ましい免疫原は、ヒトＣＤ１の細胞外ドメインの全部または一部を含み、これらの残基は、天然ＣＤ１に見られるグリコシル化などの翻訳後修飾を含み得る。細胞外ドメインを含んでなる免疫原は、例えば、従来の組換え法を用いたクローン化遺伝子の発現、Ｔ細胞からの単離、高レベルのＣＤ１を発現する選別細胞集団などの当業界に公知の種々の方法で作製される。モノクローナル抗体は従来の方法によって作製される。一般に、免疫した宿主動物の脾臓および／またはリンパ節はプラズマ細胞源を提供する。プラズマ細胞は骨髄腫細胞と融合してハイブリドーマ細胞を作製することによって不死化する。個々のハイブリドーマからの培養上澄み液を、標準的方法を用いてスクリーンし、所望の特異性を有する抗体を産生するものを同定する。ヒトタンパク質に対するモノクローナル抗体産生のための好適な動物としては、マウス、ラット、ハムスターなどが挙げられる。マウスタンパク質に対する抗体を増加させるための動物は、一般にハムスター、モルモット、ウサギなどである。該抗体は、不溶性支持体、タンパク質Ａセファロースなどに結合させたＣＤ１を用いて、従来の方法、例えば、アフィニティークロマトグラフィーにより、ハイブリドーマ細胞上澄み液または腹水から精製できる。インビボ使用、特にヒトへの注射では、阻止剤の抗原性を低下させることが望ましい。阻止剤に対するレシピアントの免疫応答は、療法が有効である時間を減少させる可能性がある。形質転換動物宿主におけるヒト抗体の産生、動物抗体の「ヒト化」への修飾、または抗体の「リサーフェース」、またはファージ表示スクリーニングにおけるヒト抗体断片の選択など、ヒト抗体またはヒト化抗体を提供するために探索できるいくつかの方法がある。ヒト抗体およびヒト化抗体のレビューは、Ｖａｕｇｈａｎら（１９９８）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１６：５３５頁に見ることができる。抗体をヒト化する方法は、当業界に知られている。対象となっている抗体は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、ヒンジドメイン、および／またはフレームワークドメインを、対応するヒト配列に置換するために、組換えＤＮＡ法により操作できる（国際公開第９２／０２１９０号；Ｒｏｇｕｓｋａら（１９９４）Ｐ．Ｎ．Ａ．Ｓ．９１：９６９−９７３頁；Ｊｏｎｅｓら（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５頁；Ｐａｄｌａｎ（１９９１）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２８：４８９−４９８頁を参照）。
【００６１】
スクリーニングアッセイには、他の種々の試薬を含めることができる。これらには、最適なタンパク質−ＤＮＡ結合を促進するための、および／または非特異的または背景相互作用を減少させるための、塩、中性タンパク質、例えばアルブミン、界面活性剤などの試薬が挙げられる。また、別に、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤など、該アッセイの有効性を改善する試薬も使用できる。
【００６２】
対象となる機能アッセイは、インビトロまたはインビボ設定におけるＮＫＴ細胞の機能的活性化の評価を含む。活性化は、ＮＫＴ細胞の増殖；サイトカイン、例えば、ＩＦＮ−γおよび／またはＩＬ−４の放出；標的細胞の死滅などにより測定できる。活性化に関する陽性対照としては、ＣＤ１発現抗原提示細胞により提供されたα−ガラクトシルセラミド；またはその無細胞類縁体、例えば、ＣＤ１四量体の使用をあげることができる。
【００６３】
ＮＫＴ細胞は、種々のアフィニティー法、例えば、フローサイトメトリー、免疫磁気ビーズなどを用いて患者の末梢血液から単離できる。活性化アッセイは、例えば、ヒト細胞、齧歯類細胞などを用いて、ＮＫＴ細胞クローンまたはＮＫＴ細胞ハイブリドーマにおいて実施できる。ＮＫＴ細胞活性化をモニタリングするためのアッセイは、当業界に知られており、増殖アッセイ、およびＥＬＩＳＡスポットアッセイを含めて、サイトカイン放出アッセイが挙げられる。
【００６４】
増殖アッセイでは、特定の抗原に応答したＮＫＴ細胞増殖のレベルが測定される。アッセイの一例では、マウス脾臓細胞、精製ＮＫＴ細胞の混合物および樹状細胞などを調製し、洗浄し、次いで活性化剤、例えばα−ガラクトシルセラミドの存在下、培養する。該細胞は通常２４時間から数日間培養する。糖脂質に誘導された増殖を、培養、例えば、培養の最後の１８時間の間、３Ｈ−チミジンの組み込みによるＤＮＡ合成のモニタリングによって評価する。
【００６５】
ＮＫＴ細胞の細胞障害アッセイでは、死滅活性を有する細胞ＮＫＴ細胞の数が測定される。ＮＫＴ細胞は、標的細胞を死滅させるそれらの能力に関して試験される。アッセイの一例では、標的細胞はＮａ５１ＣｒＯ４によって標識される。次いで標的細胞を、活性化された可能性のあるＮＫＴ細胞の懸濁液に加える。溶解細胞からのＮａ５１ＣｒＯ４の放出を定量化することによって、細胞障害性が測定される。自然放出および合計放出に関する対照が、典型的にアッセイに含まれる。自然放出のパーセンテージに基づいて、特定の５１Ｃｒ放出パーセントが算出できる。
【００６６】
活性化ＮＫＴ細胞のサイトカインプロフィルを決定するために、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）および他の免疫特異的アッセイが使用でき、ＩＬ−４、γ−ＩＦＮなどのサイトカインの発現をモニターするために使用できる。捕捉抗体は、対象となっているサイトカインに特異的な任意の抗体であり得、上記のＮＫＴ細胞培養物の上澄み液が抗原供給源として便利に用いられる。ブロッキングおよび洗浄の後、標識された検出抗体を加え、存在するタンパク質の濃度を、結合している標識の関数として測定する。
【００６７】
（処方物）
ＮＫＴ細胞抑制剤は、溶液において、または投与に好適な他の任意の薬理学的に好適な形態で提供できる。該薬剤は、このような物質の投与に慣例的な様式で、投与のために処方される。典型的な処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、イーストン、ペンシルベニア州に提供されたものである。投与経路は、投与される化合物、患者の状態および処置されている疾患に基づいて選択される。化合物は疾患の重症度に依って種々の経路によって投与でき、例えば、緊急状況では静脈内投与が必要となり得、急性だが命にかかわらない状況では経口で治療でき、一方、慢性治療ではエアロゾルにより投与できる。
【００６８】
療法での使用、特に気道疾患においては、局所送達が好ましい。エアロゾルの吸入または吹送による送達では、全身的に吸収される濃度に比べて高濃度の薬物が送達される。あるいは、筋肉内、静脈内（ＩＶ）、皮下または腹腔内注射などの注射により該薬剤を投与でき、ＩＶおよび局所注射が最も好ましい。しかし、該薬剤が全身循環に入ることを可能にする手段が利用できるならば、経口、経粘膜または経皮などの他の投与様式も使用でき、これらは、座剤、皮膚パッチ、または鼻腔内として適用できる。血流または局所的に肺への該薬剤の移行をもたらす任意の好適な処方物を適切に使用できる。
【００６９】
注射では、好適な処方物は、一般に、生理的食塩水、ハンクス液、または任意に安定化剤または他の微量成分を含む他の緩衝液を用いた水溶液または懸濁液を含んでなる。リポソーム処方物および他のミクロエマルジョンの形態も使用できる。また、該薬剤を凍結乾燥形態で供給し、投与のために再構成することもできる。経粘膜および軽皮投与は、一般に、粘膜バリアまたは皮膚バリアの通過を促進する胆汁、塩類、フシジン酸およびその類縁体、種々の界面活性剤などの薬剤を含む。また、経口投与も可能である（例えば、Ｍｉｙａｍｏｔｏら（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１３（６８５５）：５３１−４頁）。
【００７０】
この処方物の性質は、ある程度、選択された薬剤の性質に依存する。好適な処方物は公知の方法を用いて調製され、処方の原理は当業者に十分に知られている。具体的な製薬組成物に含有される薬剤のパーセンテージもまた、処方物の性質に依り；そのパーセンテージは、約１重量％から約８５重量％の広い範囲にわたって変わり得る。
【００７１】
薬剤は、吸入経路用の薬剤送達系によって患者に投与できる。吸入による投与に好適な形態で製化合物を剤化できる。該薬剤送達系は、その薬剤を気管支の粘膜内層へ局所投与することによる呼吸器療法に好適なものである。本発明は、容器から薬剤を放出する圧縮ガスの力に依るシステムを利用できる。この目的のために、エアロゾルまたは加圧パッケージが使用できる。
【００７２】
本明細書に用いられる用語の「エアロゾル」は、加圧下の噴射ガスによって治療適用部位へ運搬されるきわめて微細な液体または固体粒子を称する従来の意味で用いられる。本発明に製薬エアロゾルが用いられる場合、該エアロゾルは液体担体と噴射剤の混合物中に溶解、懸濁化、または乳濁化できる治療的に活性な化合物を含有する。該エアロゾルは、溶液、懸濁液、乳濁液、粉末、または半固体処方物の形態であり得る。本発明に用いられるエアロゾルは、患者の気道を介した微細な固体粒子または液体ミストとしての投与が意図されている。当業者に公知の種々のタイプの噴射剤を利用することができる。好適な噴射剤の例としては、限定はしないが、炭化水素または他の好適な気体が挙げられる。加圧エアロゾルの場合、用量単位は、計量された量を送達する値を提供することによって決定できる。
【００７３】
また、本発明は気体中、実質的に均一なサイズのきわめて微細な液体粒子を生成させる器具であるネブライザーによっても実施できる。該薬剤を含有する液体は小滴として分散されることが好ましい。微小滴は、ネブライザーの管出口を通って、空気の流れによって運搬できる。生じたミストは、患者の気道内へ進入する。
【００７４】
滑沢剤、担体、または噴射剤を有する、または有さない、該薬剤を含有する粉末組成物を、療法の必要な哺乳動物に投与できる。本発明のこの実施形態は、吸入によって粉末製薬組成物を投与するための従来の装置を用いて実施できる。例えば、該化合物および乳糖または澱粉などの好適な粉末基材の粉末混合物を、例えば、吸入器の助けで粉末が投与できるカプセルまたはカートリッジ、例えば、ゼラチンまたはブリスターパックにおける単位用量形態で提供できる。
【００７５】
該薬剤を含有する微粒子は、容器内に、すなわちドライパウダーとして維持できる。保存中、または処方の間、それらは任意の好適な製薬処方物、担体、増量剤などと混合でき、最終的な治療使用に意図された性質を有する製品を与えるために所望の任意の方法によって処理できる。特に、肺に送達できる処方物のための、例えば、計量用量またはドライパウダー吸入器を用いた粒子の処方は当業者に知られている。
【００７６】
「製薬的に許容できる賦形剤」が本明細書に使用でき、これは、一般に安全で、非毒性であり、生物学的にも他の面でも望ましくないということのない、製薬組成物の調製に有用な化合物を言い、製薬的使用に許容できる賦形剤が含まれる。本明細書および請求項に用いられる製薬的に許容できる賦形剤には、このような賦形剤の１つと１つ超の双方が含まれる。好適な賦形剤のいくつかの例としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉類、アラビアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、トラガカントゴム、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、ホスファチジルコリン、セルロース、滅菌水、シロップ、およびメチルセルロースが挙げられる。
【００７７】
この処方物はさらに、タルク、ステアリン酸マグネシウム、および鉱油；湿潤剤；乳化剤および懸濁液化剤；およびメチル−およびプロピルヒドロキシ−ベンゾエートおよびベンジルアルコールなどの保存剤を含むことができる。
【００７８】
本発明の該活性剤を含有する処方物は、種々の賦形剤を用いて処方できる。製薬的に許容できる賦形剤は、揮発性であっても不揮発性であってもよい。揮発性賦形剤は加熱されると、同時に揮発、エアロゾル化され、抗ヒスタミン剤と共に吸入される。このような賦形剤のクラスは、当業界に知られており、限定はしないが、気体状、超臨界液、液体、および固体溶媒が挙げられる。以下は、これらのクラス内の担体例の一覧である：水、メントールなどのテルペン類；エタノール、プロピレングリコール、グリセロールなどのアルコールおよび他の類似アルコール；ジメチルホルムアミド；ジメチルアセトアミド；ワックス；超臨界二酸化炭素；ドライアイス；およびそれらの混合物。単に賦形剤の例として挙げられる界面活性剤は、親油性部分と親水性部分の双方を有する両親媒性分子であり、これら２つの特徴の間のバランスは変化する。該分子が親油性である場合、この物質の水中での低溶解性により、その有用性が制限され得る。しかし、親水性部分が圧倒的に優勢な場合は、この分子の表面活性の性質が最少になり得る。したがって、界面活性剤が有効であるためには、十分な溶解性と十分な表面活性との適切なバランスを取らなければならない。胆汁塩および胆汁塩誘導体（ウルソデオキシコレート、タウロコレート、グリココレート、およびタウロジヒドロフシデートのナトリウム塩）は全て、肺における吸収を効果的に増強させる。
【００７９】
リン脂質、グリコシド、オクチルグルコピラノシド、チオグルコピラノシドおよびマルトピラノシドなどのアルキルグリコシド、シクロデキストリンならびにこれらの誘導体は、鼻腔吸収を効果的に増強させ、肺においての同様に機能し得る。有用な可能性のある他の界面活性剤は、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸ナトリウム、およびグリシルリジン酸、サポニングリコシドおよびアシルカルニチンなどの天然界面活性剤である。
【００８０】
単に例としてだが、リン脂質、トコフェロール、ステロール、脂肪酸、アルブミンなどの糖タンパク質、陰電荷脂質およびカチオン脂質を含む合成、半合成または天然の脂質などの脂質が本発明の処方物に使用できる。リン脂質に関しては、卵ホスファチジルイノシトール（ＥＰＩ）、卵ホスファチジルセリン（ＥＰＳ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＥＰＥ）、およびホスファチジン酸（ＥＰＡ）；大豆相当物、大豆ホスファチジルコリン（ＳＰＣ）；ＳＰＧ、ＳＰＳ、ＳＰＩ、ＳＰＥ、およびＳＰＡ；水素化卵および大豆相当物（例えば、ＨＥＰＣ、ＨＳＰＣ）などの脂質、グリセロールの２位および３位に、１２から２６の炭素原子の鎖を含有する脂肪酸のエステル結合、およびグリセロールの１位にコリン、グリセロール、イノシトール、セリン、エタノールアミンならびに対応するホスファチジン酸などの種々の頭部基からなる他のリン脂質が挙げられる。これらの脂肪酸の鎖は、飽和でも不飽和でもよく、該リン脂質は、種々の鎖長および種々の飽和度の脂肪酸からなり得る。特に、該処方物の組成物は、天然の肺表面活性物質の主な構成要素であるＤＰＰＣを含み得る。他の例としては、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）およびジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）およびジパルミトイルホスファチジルウリセロール（ＤＰＰＧ）ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）およびジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジオレイルホスファチジル−エタノールアミン（ＤＯＰＥ）およびパルミトイルステアロイルホスファチジル−コリン（ＰＳＰＣ）およびパルミトイルステアロイルホスファチジルグリセロール（ＰＳＰＧ）のような混合リン脂質、およびモノオレオイル−ホスファチジル−エタノールアミン（ＭＯＰＥ）のような単独のアシル化リン脂質が挙げられる。ステロールとしては、コレステロール、コレステロールヘミスクシネートなどのコレステロールのエステル、硫酸水素コレステロールおよび硫酸コレステロールなどのコレステロールの塩、エルゴステロールヘミスクシネートなどのエルゴステロールのエステル、硫酸水素エルゴステロールおよび硫酸エルゴステロールなどのエルゴステロールんも塩、ラノステロール、ラノステロールヘミスクシネートなどのラノステロールのエステル、硫酸水素ラノステロールおよび硫酸ラノステロールなどのラノステロールの塩を挙げることができる。トコフェロールとしては、トコフェロール、トコフェロールヘミスクシネートなどのトコフェロールのエステル、硫酸水素トコフェロール、硫酸トコフェロールなどのトコフェロールの塩を挙げることができる。用語の「ステロール化合物」としては、ステロール類、トコフェロール類などが挙げられる。
【００８１】
使用されるカチオン性脂質としては、脂肪酸、リン脂質およびグリセリドのアンモニウム塩を挙げることができる。脂肪酸としては、飽和または不飽和の１２から２６の炭素原子の鎖長の脂肪酸が挙げられる。いくつかの具体的な例としては：ミリスチルアミン、パルミチルアミン、ラウリルアミンおよびステアリルアミン、ジラウロイルエチルホスホコリン（ＤＬＥＰ）、ジミリストイルエチルホスホコリン（ＤＭＥＰ）、ジパルミトイルエチルホスホコリン（ＤＰＥＰ）およびジステアロイルエチルホスホコリン（ＤＳＥＰ）、Ｎ−（２，３−ジ−（９−（Ｚ）−オクタデセニルオキシ）−プロパ−１−イルＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）および１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）が挙げられる。使用できる陰電荷脂質としては、ホスファチジル−グリセロール類（ＰＧｓ）、ホスファチジン酸類（ＰＡｓ）、ホスファチジルイノシトール類（ＰＩｓ）およびホスファチジルセリン類（ＰＳｓ）が挙げられる。例としては、ＤＭＰＧ、ＤＰＰＧ、ＤＳＰＧ、ＤＭＰＡ、ＤＰＰＡ、ＤＳＰＡ、ＤＭＰＩ、ＤＰＰＩ、ＤＳＰＩ、ＤＭＰＳ、ＧＰＰＳおよびＤＳＰＳが挙げられる。
【００８２】
イオン性増強剤（例えば、上記のアニオン性界面活性剤）では、対イオンの性質が重要であり得る。選択された特定の対イオンは、粉末の性質、溶解度、安定性、吸湿性、および増強剤または増強剤を含有する任意の処方物の局所／全身毒性に影響を与え得る。それはまた、それと組み合わせる活性剤の安定性および／または溶解度に影響を与え得る。一般に、ナトリウム、カリウム、リチウム、ルビジウム、およびセシウム、アンモニアならびに有機アミン類などの一価金属イオン。このような有機アミン類の例としては、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、２−アミノ−２−メチルエチルアミン、ベタイン類、エチレンジアミン、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンテトラアミン、アルギニン、ヘキサメチレンテトラアミン、ヒスチジン、Ｎ−メチルピペリジン、リジン、ピペラジン、スペルミジン、スペルミンおよびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンが挙げられる。
【００８３】
ＮＫＴ細胞抑制剤の処方物において使用できる他の賦形剤は、単に例として、澱粉ミクロスフェア、ならびにエチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）のナトリウム塩などのキレート剤があり得る。
【００８４】
ＮＫＴ細胞抑制剤／賦形剤（またはＮＫＴ細胞抑制剤／賦形剤／希釈剤）組み合わせの好ましい比率は、最適用量の効率的で一貫した送達、副作用の最少化、および許容できる吸収率などの基準に基づいて、標準的方法により、通常の薬理学業界者によって容易に決定できる。
【００８５】
本発明に関連して使用できるいくつかの異なるタイプの吸入方法論がある。本発明のアンタゴニストは、吸入のための基本的に３つの異なるタイプの処方物において処方できる。第１に、本発明の抑制剤は、低沸点噴射剤と共に処方できる。このような処方物は、一般に、従来の用量計量吸入器（ＭＤＩ）によって投与される。しかし、従来のＭＤＩは、米国特許第５，４０４，８７１号および第５，５４２，４１０号で検討されたような患者の吸息量および吐き出し量を測定する方法を利用することにより、反復投与を得る能力を増加させるために、改変することができる。あるいは、本発明の抑制剤は、水溶液またはエタノール溶液中に処方でき、従来のネブライザーによって送達できる。しかし、このような溶液処方物は、米国特許第５，４９７，７６３号；第５，５４４，６４６号；第５，７１８，２２２号；および第５，６６０，１６６号に開示されているような装置およびシステムを用いてエアロゾル化することがより好ましい。最後に、本発明の抑制剤化合物は、ドライパウダー処方物に処方できる。このような処方物は、該パウダーのエアロゾルミストを生成させた後、該ドライパウダー処方物を単に吸入することによって投与できる。このような実施技法は、１９９８年７月７日発行の米国特許第５，７７５，３２０号および１９９８年４月２１日発行の米国特許第５，７４０，７９４号に記載されている。
【００８６】
経口処方物としては、該薬剤は、錠剤、散剤、顆粒剤またはカプセル剤を作製するために、単独で、または適切な添加剤、例えば、乳糖、マンニトール、トウモロコシ澱粉、またはジャガイモ澱粉などの従来の添加剤と；結晶セルロース、セルロース誘導体、アラビアゴム、トウモロコシ澱粉またはゼラチンなどの結合剤と；トウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどの崩壊剤と；タルクまたはステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤と；およびいくつかの実施形態では、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤および風味剤と組み合わせて使用される。
【００８７】
本発明の一実施形態において、経口処方物は、活性剤が腸管に送達されるように、腸溶コーティングを含んでなる。腸溶処方物は、胃の強酸内容物から活性成分を保護するためにしばしば用いられる。このような処方物は、酸性の環境では不溶性で、塩基性の環境では溶解性のポリマーの薄膜によって、固体投与形態をコーティングすることによって作製される。薄膜の例としては、酢酸フタル酸セルロース、酢酸フタル酸ポリビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび酢酸コハク酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、メタクリレートコポリマー、および酢酸フタル酸セルロースがある。
【００８８】
他の腸溶処方物は、胃腸粘膜および細胞内層との強い接着相互作用を示し、粘膜の吸収性上皮およびパイエル板のリンパ系組織を覆っている濾胞結合上皮の双方を移行できる生物学的侵食性ポリマーから作製された人工ポリマーミクロスフェアを含んでなる。該ポリマーは、腸上皮との接触を長時間維持し、細胞を通り、また細胞間で、実際にそれを貫通する。例えば、Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚら（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８６（６６２３）：４１０−４１４頁を参照されたい。薬物送達系はまた、Ｄｏｒｋｏｏｓｈら（２００１）Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７１（３）：３０７−１８頁に記載されている超多孔性ヒドロゲル（ＳＰＨ）のコアおよびＳＰＨ複合体（ＳＰＨＣ）を利用できる。
【００８９】
処方物は、典型的に、単位剤形において提供され、用語の「単位剤形」とは、ヒト対象に対する単位用量として好適な物理的に区別された単位を言い、各単位は、製薬的に許容できる希釈剤、担体または媒体と関連づけて、所望の効果を生じる上で十分な量において算出された予め決められた量を含有する。本発明の単位剤形に関する明細は、使用される具体的薬剤、および達成すべき効果、ならびに宿主における各複合体に関連する薬物動態に依存する。
【００９０】
（同時処方物：）
対象となっているＮＫＴ細胞抑制剤は、ＳＬＥ、喘息などの症状を軽減するように作用する他の薬剤と関連づけて処方または投与できる。これらの薬剤としては、非ステロイド抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、例えば、アセチルサリチル酸；イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン；ナブメトン；トルメチン；などが挙げられる。コルチコステロイドは、炎症を軽減し、免疫系の活性を抑えるために用いられる。このタイプで最も一般的に処方される薬物はプレドニゾンである。クロロキン（アラレン）またはヒドロキシクロロキン（プラケニル）もまた、狼蒼に罹っている個体の一部に非常に有用であり得る。これらは（狼蒼の皮膚および関節の症状に最もよく処方される。アザチオプリン（イムラン）およびシクロホスファミド（シトキサン）は炎症を抑制し、免疫を抑制する傾向がある。これらの薬剤の副作用としては、貧血、低白血球数、および感染の危険性増大が挙げられる。他の薬剤、例えば、メトトレキサートおよびシクロスポリンは、狼蒼の症状の制御に使用される。双方ともそれら自体の副作用を有する免疫調節剤である。抗凝集剤は、血液が急速に凝固することを防ぐために使用される。それらは、血小板がヘパリン／クーマジンに付着することを防ぐきわめて低用量でのアスピリンからの範囲にある。
【００９１】
本発明によるＮＫＴ細胞抑制剤と関連づけて投与できる薬剤としては、吸入によって有用に送達される任意の薬剤、例えば、鎮痛剤、例えば、コデイン、ジヒドロモルヒネ、エルゴタミン、フェンタニルまたはモルヒネ；狭心症処方物、例えば、ジルチアゼム；抗アレルギー剤、例えば、クロモグリク酸、ケトチフェンまたはネドクロミル；抗感染剤、例えば、セファロスポリン、ペニシリン、ストレプトマイシン、スルホンアミド類、テトラサイクリン類またはペンタミジン；抗ヒスタミン剤、例えば、メタピリレン；抗炎症剤、例えば、ベクロメタゾン、フルニソリド、ブデソニド、チプレダン、トリアムシノロンアセトニドまたはフルチカゾン；鎮咳剤、例えばノスカピン；気管支拡張剤、例えば、エフェドリン、アドレナリン、フェノテロール、ホルモテロール、イソプレナリン、メタプロテレノール、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、ピブテロール、レプロテロール、リミテロール、サルブタモール、サルメテロール、テルブタリン、イソエタリン、ツロブテロール、オルシプレナリンまたは（−）−４−アミノ−３，５−ジクロロ−α−〔〔〔６−〔２−（２−ピリジニル）エトキシ〕ヘキシル〕−アミノ〕メチル〕ベンゼンメタノール；利尿剤、例えば、アミロライド；抗コリン剤、例えば、イプラトロピウム、アトロピンまたはオキシトロピウム；ホルモン類、例えば、コルチゾン、ヒドロコルチゾンまたはプレドニゾロン；キサンチン類、例えば、アミノフィリン、コリンテオフィィネート、リジンテオフィィネートまたはテオフィリン；ならびに治療用タンパク質およびペプチド類、例えば、インスリンまたはグルカゴンが挙げられる。該薬剤の活性および／または安定性を最適化するために、適切な場合、該薬剤は、塩（例えば、アルカリ金属またはアミン塩として、または酸付加塩として）の形態で、またはエステル（例えば、低級アルキルエステル）として、または溶媒和物（例えば水和物）として使用できることは、当業者に明らかであろう。
【００９２】
ＮＫＴ細胞抑制剤は、ＮＫＴ細胞の望ましくない活性化を被っている患者に投与され、該患者としては、喘息などのアレルギー疾患、ＳＬＥなどに罹っている個体を挙げることができる。ＳＬＥ患者は、該疾患の皮膚、関節、腎臓、および／または中枢神経系の徴候を被り得る。他の実施形態において、癌患者は、免疫監視のダウンレギュレーションを軽減するために、ＮＫＴ細胞を抑制する方法から利益を得ることができる。アテローム硬化症患者もまた、本発明の方法から利益を得ることができる。
【００９３】
（用量）
種々の投与方法を用いることができる。外薬剤の処方物は、吸入、血管内注射、皮下注射、腹腔内注射などであり得る。該治療処方物の用量は、疾患の性質、投与回数、投与様式、投与の目的、宿主からの該薬剤のクリアランスなどに依って広く変化する。投与量は、具体的な薬剤の薬物動態的特徴、投与様式および投与経路、レシピエントの年齢、健康および体重、症状の性質および程度、併用治療、治療の頻度および所望される効果などの公知の因子に依って変化する。該用量は、週に１回、または２週間に１回と回数を少なくして投与してもよいし、より少ない容量に分割して投与してもよいし、有効な用量レベルを維持するために、毎日、１週間に２回などと投与してもよい。一般に、活性成分の毎日の用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。内部投与に好適な投与形態は、１単位当り、約０．１ｍｇから５００ｍｇの活性成分を一般に含有する。該活性成分は、該組成物の全重量に基づいて、０．５重量％から９５重量％と変化し得る。
【００９４】
活性成分は、組成物の全重量を基準にして０．５重量％から９５重量％まで変化し得る。
【００９５】
いくつかの実施形態において、活性成分の投与量は、組成物の全重量を基準にして２０重量％、１９重量％、１８重量％、１７重量％、１６重量％、１５重量％、１４重量％、１３重量％、１２重量％、１１重量％、１０重量％、９重量％、８重量％、７重量％、６重量％、５重量％、４重量％、３重量％、２重量％、１重量％、０．５重量％、０．４重量％、０．３重量％、０．２重量％、０．１重量％、０．０９重量％、０．０８重量％、０．０７重量％、０．０６重量％、０．０５重量％、０．０４重量％、０．０３重量％、０．０２重量％、０．０１重量％、０．００９重量％、０．００８重量％、０．００７重量％、０．００６重量％、０．００５重量％、０．００４重量％、０．００３重量％、０．００２重量％、０．００１重量％、０．０００９重量％、０．０００８重量％、０．０００７重量％、０．０００６重量％、０．０００５重量％、０．０００４重量％、０．０００３重量％、０．０００２重量％、または０．０００１重量％未満であり得る。
【００９６】
いくつかの実施形態において、活性成分の投与量は、組成物の全重量を基準にして２０重量％、１９．７５重量％、１９．５０重量％、１９．２５重量％、１９重量％、１８．７５重量％、１８．５０重量％、１８．２５重量％、１８重量％、１７．７５重量％、１７．２５重量％、１７重量％、１６．７５重量％、１６．５０重量％、１６．２５重量％、１６重量％、１５．７５重量％、１５．５０重量％、１５．２５重量％、１５重量％、１４．７５重量％、１４．５０重量％、１４．２５重量％、１４重量％、１３．７５重量％、１３．５０重量％、１３．２５重量％、１３重量％、１２．７５重量％、１２．５０重量％、１２．２５重量％、１２重量％、１１．７５重量％、１１．５０重量％、１１．２５重量％、１１重量％、１０．７５重量％、１０．５０重量％、１０．２５重量％、１０重量％、９．７５重量％、９．５０重量％、９．２５重量％、９重量％、８．７５重量％、８．５０重量％、８．２５重量％、８重量％、７．７５重量％、７．５０重量％、７．２５重量％、７重量％、６．７５重量％、６．５０重量％、６．２５重量％、６重量％、５．７５重量％、５．５０重量％、５．２５重量％、５重量％、４．７５重量％、４．５０重量％、４．２５重量％、４重量％、３．７５重量％、３．５０重量％、３．２５重量％、３重量％、２．７５重量％、２．５０重量％、２．２５重量％、２重量％、１．７５重量％、１．５０重量％、１．２５重量％、１重量％、０．５重量％、０．４重量％、０．３重量％、０．２重量％、０．１重量％、０．０９重量％、０．０８重量％、０．０７重量％、０．０６重量％、０．０５重量％、０．０４重量％、０．０３重量％、０．０２重量％、０．０１重量％、０．００９重量％、０．００８重量％、０．００７重量％、０．００６重量％、０．００５重量％、０．００４重量％、０．００３重量％、０．００２重量％、０．００１重量％、０．０００９重量％、０．０００８重量％、０．０００７重量％、０．０００６重量％、０．０００５重量％、０．０００４重量％、０．０００３重量％、０．０００２重量％、または０．０００１重量％超であり得る。
【００９７】
幾つかの実施形態において、活性成分の投与量は、組成物の全重量を基準にして約０．０００１重量％から約５０重量％、約０．００１重量％から約４０重量％、約０．０１重量％から約３０重量％、約０．０２重量％から約２９重量％、約０．０３重量％から約２８重量％、約０．０４重量％から約２７重量％、約０．０５重量％から約２６重量％、約０．０６重量％から約２５重量％、約０．０７重量％から約２４重量％、約０．０８重量％から約２３重量％、約０．０９重量％から約２２重量％、約０．１重量％から約２１重量％、約０．２重量％から約２０重量％、約０．３重量％から約１９重量％、約０．４重量％から約１８重量％、約０．５重量％から約１７重量％、約０．６重量％から約１６重量％、約０．７重量％から約１５重量％、約０．８重量％から約１４重量％、約０．９重量％から約１２重量％、約１重量％から約１０重量％の範囲内である。
【００９８】
いくつかの実施形態において、活性成分の投与量は、体重１ｋｇ当り１０ｇに等しいか、またはそれ未満、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ、または０．０００１ｇである。
【００９９】
いくつかの実施形態において、活性成分の投与量は、体重１ｋｇ当り０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５ｇ、３ｇ、３．５ｇ、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ、または１０ｇ超である。
【０１００】
幾つかの実施形態において、活性成分の投与量は、体重１ｋｇ当り０．０００１〜１０ｇ、０．０００５〜９ｇ、０．００１〜８ｇ、０．００５〜７ｇ、０．０１〜６ｇ、０．０５〜５ｇ、０．１〜４ｇ、０．５〜４ｇ、１〜３ｇである。
【０１０１】
一般に、活性成分の毎日の投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ体重から１００ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。体内投与に好適な剤形は、１単位当り約０．１ｍｇから５００ｍｇの活性成分を一般に含有する。本発明のいくつかの実施形態において、活性成分の投与量は、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、活性成分の投与量は、０．１〜５ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、活性成分の投与量は、０．１〜２ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、活性成分の投与量は、０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、活性成分の投与量は、０．５〜２ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。
【０１０２】
本発明のいくつかの態様において、ＮＫＴ細胞抑制剤投与のために患者に単位用量の処方物を提供する。このような単位用量は、例えば、全容量が５０ｍＬ未満、５０ｍＬ、４０ｍＬ、３０ｍＬ、２０ｍＬ、１０ｍＬ、９ｍＬ、８ｍＬ、７ｍＬ、６ｍＬ、５ｍＬ、４ｍＬ、３ｍＬ、２ｍＬ、１ｍＬ、０．９ｍＬ、０．８ｍＬ、０．７ｍＬ、０．６ｍＬ、０．５ｍＬ、０．４ｍＬ、０．３ｍＬ、０．２ｍＬ、０．１ｍＬ、０．０９ｍＬ、０．０８ｍＬ、０．０７ｍＬ、０．０６ｍＬ、０．０５ｍＬ、０．０４ｍＬ、０．０３ｍＬ、０．０２ｍＬ、０．０１ｍＬ、０．００９ｍＬ、０．００８ｍＬ、０．００７ｍＬ、０．００６ｍＬ、０．００５ｍＬ、０．００４ｍＬ、０．００３ｍＬ、０．００２ｍＬ、０．００１ｍＬ、０．０００９ｍＬ、０．０００８ｍＬ、０．０００７ｍＬ、０．０００６ｍＬ、０．０００５ｍＬ、０．０００４ｍＬ、０．０００３ｍＬ、０．０００２ｍＬ、または０．０００１ｍＬを有することができる。幾つかの実施形態において、このような単位用量は、全容量が０．２ｍＬ以上で５００ｍＬ未満を有することができる。幾つかの実施形態において、このような単位用量は、全容量が０．１ｍＬ未満を有することができる。幾つかの実施形態において、このような単位用量は、全容量が０．１ｍＬ未満を有することができる。幾つかの実施形態において、このような単位用量は、全容量が０．１〜０．２ｍＬ（０．１ｍＬと０．２ｍＬを含む）を有することができる。幾つかの実施形態において、このような単位用量は、全容量が０．１ｍＬ未満および０．２ｍＬ超を有することができる。
【０１０３】
幾つかの実施形態において、単位用量は、１標的部位当り０．０００１〜５００ｍＬ、０．０００５〜４００ｍＬ、０．００１〜３００ｍＬ、０．００５〜２００ｍＬ、０．０１〜１００ｍＬ、０．０５〜９０ｍＬ、０．０６〜８０ｍＬ、０．０７〜７０ｍＬ、０．０８〜６０ｍＬ、０．０９〜５０ｍＬ、０．１〜４０ｍＬ、０．２〜３０ｍＬ、０．３〜２９ｍＬ、０．４〜２８ｍＬ、０．５〜２７ｍＬ、０．６〜２６ｍＬ、０．７〜２５ｍＬ、０．８〜２４ｍＬ、０．９〜２３ｍＬ、１０〜２２ｍＬ、１１〜２１ｍＬ、１２〜２０ｍＬ、１３〜１９ｍＬ、１４〜１８ｍＬ、または１５〜１７ｍＬの範囲の全容量を有する。
【０１０４】
（装置）
比較的短い投与期間における吸入に関しては本発明の処方物の比較的小容量を送達するために、該処方物は、比較的高いエアロゾル排出速度を有する吸入装置の使用により投与できる。有用な装置はまた、高放出用量効率（すなわち、装置内の低残量）を示すことができる。システムの全体的効率を増加させるために、放出は、患者による実際の吸入時間（すなわち、吸息作動）にさらに限定される。したがって、従来のエアジェットネブライザーは、３μｌ／秒、約４μｌ／秒、約」５μｌ／秒のオーダーで、または約８μｌ／秒以上のオーダーのエアロゾル排出速度を示すことができる。本発明の実施に有用な吸入装置は、患者による吸入用のエアロゾルとしての負荷用量の少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約８５％を放出できる。幾つかの実施形態において、本発明に使用される吸入装置は、吸息作動でき、患者による実際の吸入時間にＮＫＴ細胞抑制剤を含有する処方物のエアロゾル化粒子送達に限定される。該吸入器は、手持型、自蔵式、および易運搬型吸入器であり得る。本発明の他の実施形態において、本発明の濃縮ＮＫＴ細胞抑制剤処方物の送達に有用な装置としては、従来のエアジェットネブライザーに従来の放出圧よりも高圧にできるコンプレッサーを連結させたものが挙げられる。
【０１０５】
以下の実施例は、例証目的で提供されており、限定目的ではない。
【実施例】
【０１０６】
（実施例１）
ガラクトシルセラミド（ユタ州Ｐｒｏｖｏ所在のＢｒｉｇｈａｍ  Ｙｏｕｎｇ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙから入手）をＣ５７ＢＬ／６マウスへ腹腔内注入することにより、ＮＫＴ細胞を選択的に活性化させることによってＩＬ−４およびＩＦＮ−γの血清レベルを増加させる。Ｃ１２βガラクトシルセラミド（Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ社）の腹腔内注入は、αガラクトシルセラミドの能力に拮抗してこれらマウスの血清中ＩＬ−４．インターフェロン−ガンマ、およびＩｇＥのレベルを上昇させる。
【０１０７】
約８週齢のオスのＣ５７ＢＬ／６マウスに、１００μｇのβガラクトシルセラミド（βＧａｌｃｅｒ）腹腔内、０．１μｇのαガラクトシルセラミド（α）腹腔内、０．１μｇのαＧａｌｃｅｒ腹腔内投与１時間前か、または同時に１００μｇβＧａｌｃｅｒの腹腔内投与するか、あるいは何も処置しなかった。β−Ｇａｌｃｅｒは、Ａｖａｎｔｉ  Ｌｉｐｉｄｓ社から入手した。糖脂質は、ＰＢＳとの水溶液であった。サイトカインレベルを、Ｚｅｎｇら（２００３）、上記文献により先に記載されたようにＥＬＩＳＡにより測定した。全てのマウスを、６時間後に殺し、図１Ａおよび１Ｂに示されたとおり、ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４の血清レベルを測定した。
【０１０８】
ＩＦＮ−γに関するアッセイにより、通常（未処理）マウスは、約５０ｐｇ／ｍｌのレベルを有することが示された。上記のβＧａｌｃｅｒの注入により、このレベルは増加しなかったが、αＧａｌｃｅｒ単独の注入により、２倍以上レベルが増加した。しかしながら、βＧａｌｃｅｒを、αＧａｌｃｅｒの投与１時間前、またはαＧａｌｃｅｒと同時に投与した場合、そのレベルは、４０ｐｇ／ｍｌ以下であった。これらの結果は、βガルサーが、αＧａｌｃｅｒによって誘導された増加を阻止することを示している。
【０１０９】
同様のパターンが、血清ＩＬ−４レベルを測定した際に見られた。未処置マウスは、約１００ｐｇ／ｍｌのＩＬ−４を有し、１００μｇのβＧａｌｃｅｒ単独によって、このレベルは増加しなかった。しかしながら、０．１μｇのαＧａｌｃｅｒは、１０００ｐｇ／ｍｌと約１０倍このレベルが増加した。１００μｇのβＧａｌｃｅｒを、０．１μｇのαＧａｌｃｅｒの投与１時間前に投与した場合、この増加は、完全に阻止され、両糖脂質を同時に投与した場合、ＩＬ−４レベルは約２５０ｐｇ／ｍｌであった。βＧａｌｃｅｒは、αＧａｌｃｅｒによって誘導された血清中のＩＦＮ−γレベルの増加を阻止できるのみならず、ＩＬ−４レベルの増加をも阻止できることを、これらの結果は示している。血清へのサイトカイン分泌により決定されたように、αＧａｌｃｅｒによって誘導されたＮＫＴ細胞のインビボ活性化をβＧａｌｃｅｒが阻止できると、我々は結論付けている。
【０１１０】
別の実験において、３匹のＣ５７ＢＬ／６マウス群の平均血清ＩｇＥレベルを、０．１μｇのαＧａｌｃｅｒ単独の腹腔内注入、１００μｇのβガルサー単独注入、または０．１μｇのαＧａｌｃｅｒ注入１時間前に１００μｇのβＧａｌｃｅｒを注入し、注入前または注入１０日後に測定した。図１Ｃおよび１Ｄに示された結果により、αＧａｌｃｅｒ単独は、約５０００ｎｇ／ｍｌと約３倍ＩｇＥレベルを上昇させ、βＧａｌｃｅｒは、約４００μｇ／ｍｌと少ない増加を誘導し、両糖脂質の組合せは、約２５０μｇ／ｍｌのレベルを誘導したことを示している。バーは、三重反復測定平均値を示し、括弧内は標準偏差を示している。独立手段のスチューデントｔ検定により決定された、前後間の血清中レベルの唯一の有意差は、αガルサー単独（ｐ＜０．０５）で見られた。βＧａｌｃｅｒが、αＧａｌｃｅｒにより誘導された血清中ＩｇＥレベルの増加を阻止すると、我々は結論付ける。対照のＩｇＧ２ｃ発現には有意な変化は見られなかった。
【０１１１】
（実施例２）
（喘息に対するβＧａｌｃｅｒの効果）
喘息のマウスモデルにおいて、βＧａｌｃｅｒを、ＯＶＡ免疫ＢＡＬＢ／ｃマウス、またはαＧａｌｃｅｒ誘導気道応答性亢進（ＡＨＲ）マウスに投与した。
【０１１２】
（材料および方法）
動物：ＢＡＬＢ／ｃＢｙＪマウスは、メイン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ所在のＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｗｅｌｆａｒｅは、本試験に用いた動物プロトコルを許可した。
【０１１３】
モノクローナル抗体：モノクローナル抗体は、腹水から硫酸アンモニウム沈殿およびイオン交換クロマトグラフィにより精製した。以下のハイブリドーマを用いた：ＡＴＣＣ（メリーランド州Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ所在のＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から入手したＲ４６Ａ２（抗ＩＦＮ−γ  ｍＡｂ）；ＸＭＧ１．２（抗ＩＦＮ−γ抗体）；ＢＶＤ４−１Ｄ１１、ＢＶＤ６−２４Ｇ２（抗ＩＬ−４  ｍＡｂ）。抗３８Ｃ１３イディオタイプｍＡｂ  ４Ｇ１０（ラットＩｇＧ２ａ）を、イソタイプ対照として用いた。
【０１１４】
免疫。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、２００μｇの明礬（Ａｌ［ＯＨ］３）に吸着させたＯＶＡ（１００μｇ／マウス）により足蹠に初回刺激した。７日、８日、および９日後にマウスを、５０μｌのＮａＣｌ  ０．９％中の５０μｇＯＶＡにより鼻腔内誘発した。ＯＶＡによる最後の鼻腔内誘発１日後に、全身プレチスモグラフにおいて、メタコリン増加濃度の吸入後、意識のあるマウスから気道反応性亢進を測定した。αＧａｌｃｅｒによる免疫を、記載されたとおり実施した。
【０１１５】
抗原の鼻腔内投与時の肺吸入を促進させるために、通常の生理食塩水中、０．２５ｍｌのケタミン（０．４４ｍｇ／ｍｌ）／キシラジン（６．３ｍｇ／ｍｌ）により、マウスに軽く腹腔内（ｉ．ｐ．）麻酔をかけた。鼻腔内に投与された抗原の７５％は、引続き肺内で検出できる（Ｔｓｕｙｕｋｉら（１９９７）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１６７１−９頁）。
【０１１６】
サイトカインＥＬＩＳＡ。以前にＭａｃａｕｌａｙら（１９９８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１６９４−１７００頁に記載されたとおりにＥＬＩＳＡＳを実施した。使用された抗体対は、以下のとおり捕捉／ビオチン化検出によりリストされている：ＩＬ−４、ＢＶＤ４−１Ｄ１１／ＢＶＤ６−２４Ｇ２；ＩＦＮ−γ、Ｒ４−５Ａ２／ＸＭＧ１．２。組換えサイトカインを標品として用いて、ＩＬ−４に関しては５００ｐｇ／ｍｌから３９ｐｇ／ｍｌ、ＩＦＮ−γに関しては２０〜２，１５６ｎｇ／ｍｌの１：２希釈で曲線を作成した。
【０１１７】
抗ＯＶＡ抗体イソタイプの測定。マウスを、屠殺時に放血させ、修飾抗原特異的ＥＬＩＳＡを用いてＯＶＡ特異的抗体を測定した。ＯＶＡ特異的ＩｇＧの測定のため、プレートを、５μｇ／ｍｌＯＶＡで一晩コーティングした。洗浄および阻止後、連続希釈血清をプレートに加えた。一晩インキュベーション後、ＨＲＰＯ複合化ヤギ抗ＩｇＧサブクラス特異的抗体（アラバマ州Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ所在のＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を用いてプレートを展開した。さらに洗浄後、ＯＰＤ基質を加え、プレートを展開し、ＯＤを４９２ｎｍで測定した。抗ＯＶＡ  ＩｇＧ１  ｍＡｂ６Ｃ１および抗ＯＶＡ  ＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ  ３Ａ１１を、各ＩｇＧサブクラスの定量化用標品として用いた。ＯＶＡ特異的ＩｇＥの測定は、プレートのコーティングに、ラット抗マウスＩｇＥ  ｍＡｂ  ＥＭ９５（５．０μｇ／ｍｌ）を用いてＥＬＩＳＡにより実施された。サンプルを塗布し、一晩インキュベート後、プレートを洗浄し、ビオチン化ＯＶＡ（１０μｇ／ｍｌ）を加えた。２時間後、プレートを洗浄し、ＨＲＰＯ複合化アウトレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を加えた。プレートをＯＰＤ基質で展開し、ＯＤを４９２ｎｍで測定した。明礬中のＯＶＡで高度免疫マウスからの血清をＩｇＥに関して定量化し、ＯＶＡ特異的ＩｇＥ  ＥＬＩＳＡ用の標品として用いた。
【０１１８】
気道応答性の測定。気道応答性は、全身プレチスモグラフ（モデルＰＬＹ３２１１、ニューヨーク州Ｔｒｏｙ所在Ｂｕｘｃｏ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ社）に置かれた意識のあるマウスからメタコリン誘導気流閉塞により評価した。肺気流閉塞は、以下の式を用いてＰｅｎｈにより測定された：
【０１１９】
【数１】
2008518974.tif 000007
式中、Ｐｅｎｈ＝休止増強（無次元）、Ｔｅ＝呼気時間、ＲＴ＝弛緩時間、ＰＥＦ＝ピーク呼気流量（ｍｌ／秒）、およびＰＩＦ＝ピーク吸気流量（ｍｌ／秒）である（Ｈａｍｅｌｍａｎｎら、（１９９７）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５６：７６６−７５頁）。休止増強（Ｐｅｎｈ）、分時呼吸量、一回呼吸量、および呼吸回数は、チャンバー圧から得られ、前置増幅器モジュール（モデルＭＡＸ２２７０）に接続されたトランスデューサー（モデルＴＲＤ５１００）により測定され、システムＸＡソフトウェア（モデルＳＩ−１  １８１０）により解析された。メタコリン応答性の測定は、ＮａＣｌ  ０．９％に２分間マウスを曝すことにより得られた。
【０１２０】
ＢＡＬ液および肺組織の採取。動物に、致死量のフェノバルビタール（４５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注入した。気管をカニューレし、次に肺を０．８ｍｌのＰＢＳで３回洗浄し、液体を集めた。洗浄液中の細胞を血球計数器を用いてカウントし、ＢＡＬ細胞差異を、Ｈａｎｓｅｌ  Ｓｔａｉｎ（ミズーリ州Ｆｌｏｒｉｓｓａｎｔ所在のＬｉｄｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で染色したスライド作製上で決定した。従来の形態学的評価基準に基づいた光学顕微鏡により少なくとも２００個の細胞が識別された。何匹かの動物では、ＢＡＬを実施しなかったが、肺を取り出し、ＰＢＳで洗浄し、１０％ホルマリンで固定し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。
【０１２１】
（結果）
Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒによる処置は、ＡＨＲを誘導した。図２に示されるように、１．５μｇのα−Ｇａｌｃｅｒの鼻腔内投与２時間前に投与された１００μｇのＣ１２−β−Ｇａｌｃｅｒの静脈内投与により、２４時間目のＡＨＲが大いに減少する。Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒ単独の静脈内投与は、それだけではＡＨＲを誘導しない。（ｂ）０．５μｇのα−Ｇａｌｃｅｒの鼻腔内投与２時間前に５０μｇのＣ１２−β−Ｇａｌｃｅｒの鼻腔内および静脈内投与により、２４時間でＡＨＲを大いに減じるが、鼻腔内投与されたＣ１２−β−Ｇａｌｃｅｒは、ＡＨＲを軽微に誘導する。１群当り最少４匹のマウスを用いた。
【０１２２】
Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒにより処置は、ＯＶＡ／明礬誘導ＡＨＲを減少させる。図３に示されるように、マウスを、２００μｌの水酸化アルミニウム（明礬）と共に１００μｇのＯＶＡの腹腔内注入により感作し、次いで７日、８日、９日後に５０μｇのＯＶＡにより鼻腔内誘発を行った。（ａ）ＡＨＲを１０日目に測定した。Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒ（１００μｇ）を、ＯＶＡ／明礬感作１日前、各鼻腔内誘発６時間前に静脈内（１００μｇ）に投与した。この処置は、ＡＨＲを減少することが示された。（ｂ）血清ＯＶＡ特異的ＩｇＥは、Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒ処置群で減少した。（ｃ）Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒ処置群由来のリンパ節細胞は、６２．５μｇ／ｍｌ  ＯＶＡ（１ウェル当り５．０＊１０６細胞）による培養４日後にＩＦＮ−γを僅かに多く産生し、またＩＬ−４の産生はより少なかった。１群当り４匹のマウスを試験した。
【０１２３】
抗ＣＤ１ｄ抗体（ＨＢ３２３）による処置は、ＯＶＡ／明礬誘導ＡＨＲを阻止する。図４に示されるように、（ａ）マウスを、２００μｌの水酸化アルミニウム（明礬）と共に１００μｇのＯＶＡの腹腔内注入により感作し、次いで７日、８日、９日後に５０μｇのＯＶＡにより鼻腔内誘発を行った。ＡＨＲを１０日目に測定した。抗ＣＤ１ｄ抗体を、ＯＶＡ／明礬感作（５００μｇ）１日前、腹腔内に投与し、再度鼻腔内誘発（５００μｇ）直前に投与した。この処置は、ＡＨＲを減少することが示された。（ｂ）抗ＣＤ１ｄ抗体（ＨＢ３２３）による処置は、リンパ節サイトカイン産生を減少させる。１ウェル当り５．０×１０５細胞のリンパ節培養は、ＯＶＡ／明礬感作および気道誘発１１日後に確立した。培養液を１２５μｇ／ｍｌから滴定されたＯＶＡで処理し、上清のサイトカインをＥＬＩＳＡにより測定した。１群当り最少４匹のマウスを用い、データは、２回の実験を表している。
【０１２４】
Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒにより、α−Ｇａｌｃｅｒ誘導ＡＨＲ後に血清ＩＦＮ−γがより多く産生される。組織学的所見は、Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒ処置により細気管支周囲好酸球性炎症の減少を示している。重要なことに、Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒの静脈内注入は、それだけでは肺炎を生じさせない。これらのマウスは、組織学的所見により可能性としてはＯＶＡ／明礬の陽性対照よりも好中球が増加して肺の好酸球浸潤を減少させるものの、存在はすることを示した。組織学してい的所見はまた、抗ＣＤ１ｄ処置マウスの肺において好酸球性炎症が減少する（依然として存在しているが）ことを示している。ＨＢ３２３阻止は、良好な結果を提供するが、１Ｂ１抗ＣＤ１ｄ抗体の使用によっても、ＡＨＲの減少が生じる。
【０１２５】
これらのデータは、ＡＨＲおよび喘息の発現におけるＮＫＴ細胞の関与を示しており、さらにこの疾患の処置において阻止剤βｌＧａｌｃｅｒ、および抗ＣＤ１の有効性を示している。
【０１２６】
（実施例３）
（阻止剤の経口投与）
１００〜８００μｇ／マウスの範囲でのβ−ガラクトシルセラミド用量を経口投与した。ＩＦＮ−γおよびＩＬ−４のサイトカインレベルは、Ｚｅｎｇら（２００３）、上記文献により先に説明されたＥＬＩＳＡにより血清レベルから測定された。
【０１２７】
ＩＦＮ−γのアッセイにより、投与２４時間後において、いずれの用量においても血清レベルの増加がないことが示された。血清ＩＬ−４レベルを測定した際にも同様のパターンが見られた。
【０１２８】
図５に示されるように、β−ガラクトシルセラミドの経口投与により、肝臓中のＮＫＴ細胞マーカーに対する染色の減少が生じた。
【０１２９】
１００〜８００μｇ／マウスの投与量は、４〜３２ｍｇ／ｋｇの用量と等価である。ヒトとの等価に関するＦＤＡガイドラインを用いると、ヒトの等価用量は、０．３２〜２．６ｍｇ／ｋｇである。
【０１３０】
（実施例４）
（狼蒼の処置）
全身性エリテマトーデスに関するマウスモデルであるＮＺＢ×ＮＺＷマウスにおいて、動物に、ＰＢＳ、５０μｇ／マウスのβ−ガラクトシルセラミド、または１００μｇ／マウスのβ−ガラクトシルセラミドのうちの一方を週２回注入した。狼蒼発生の指標であるタンパク尿に関して動物を分析した。１５匹のマウスの対照群において、３８週目にタンパク尿が無かったのは、凡そ３０％のマウスであり、一方、高用量のβ−ガラクトシルセラミドで処置したマウスでは凡そ８０％はタンパク尿が無かった。これらのデータは、β−ガラクトシルセラミドが本モデルにおいて狼蒼の進行を阻止できることを示している。
【０１３１】
個々の刊行物または特許出願が各々具体的かつ個別に参照として組み込まれていることが示されているように、本明細書に引用された全ての刊行物および特許出願は、参照として本明細書に組み込まれている。
【０１３２】
前述の本発明は、理解を明瞭にする目的で図および実施例を用いていくらか詳細に記載したが、一定の変更および修飾が、添付の請求項の精神または範囲から逸脱することなくそれに成すことができることは、本発明の教示を鑑みて通常の当業者にとって容易に明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１Ａ】図１Ａ。β−Ｇａｌｃｅｒによる処置は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４の発現、およびＩｇＥ合成などのインビボでのＮＫＴ細胞活性化の効果を低下させる。ＩｇＧ２ｃ合成は影響を受けない。
【図１Ｂ】図１Ｂ。β−Ｇａｌｃｅｒによる処置は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４の発現、およびＩｇＥ合成などのインビボでのＮＫＴ細胞活性化の効果を低下させる。ＩｇＧ２ｃ合成は影響を受けない。
【図１Ｃ】図１Ｃ。β−Ｇａｌｃｅｒによる処置は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４の発現、およびＩｇＥ合成などのインビボでのＮＫＴ細胞活性化の効果を低下させる。ＩｇＧ２ｃ合成は影響を受けない。
【図１Ｄ】図１Ｄ。β−Ｇａｌｃｅｒによる処置は、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４の発現、およびＩｇＥ合成などのインビボでのＮＫＴ細胞活性化の効果を低下させる。ＩｇＧ２ｃ合成は影響を受けない。
【図２】図２Ａ〜２Ｂ。Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒによる処置は、α−Ｇａｌｃｅｒに誘導されたＡＨＲを阻止する。
【図３】図３Ａ〜３Ｃ。Ｃ１２−β−Ｇａｌｃｅｒによる処置は、ＯＶＡ／ａｌｕｍに誘導されたＡＨＲを減少させる。
【図４】図４Ａ〜４Ｂ。抗ＣＤ１ｄ抗体（ＨＢ３２３）による処置は、ＯＶＡ／明礬に誘導された気道反応性亢進（ＡＨＲ）を阻止する。
【図５】図５。β−ガラクトシルセラミドの経口投与。
【図１Ａ】
2008518974.tif 000008
【図１Ｂ】
2008518974.tif 000009
【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
2008518974.tif 000014
【図５】
2008518974.tif 000015
【国際調査報告】
2008518974.tif 000016
2008518974.tif 000017