(57)【要約】本発明は、AQdecay発光タンパク質、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、ならびにAQdecay発光タンパク質の活性および使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）配列番号：２に開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子；
ｂ）配列番号：１に示された配列を含有する核酸分子;
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）由来の核酸分子とハイブリダイズし、発現産物が発光タンパク質の生物学的機能を示す核酸分子；
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子;
からなる群から選択される核酸分子またはその機能フラグメント。
【請求項２】
請求項１記載の核酸配列によってコードされており、発光タンパク質の特性を有する、ポリペプチドまたはその機能フラグメント。
【請求項３】
配列番号７を基にした位置１２９−１４９において１以上の変異を有し、時間的に変化した生物発光を提示する、発光タンパク質またはその機能的フラグメント。
【請求項４】
配列番号７を基にした位置１３９に変異を有し、変化した時間的生物発光を提示する、発光タンパク質またはその機能的フラグメント。
【請求項５】
請求項３または４に記載のタンパク質をコードする配列を含有する核酸分子。
【請求項６】
コード配列に対して５'側に機能プロモーターを含有する、請求項１または５に記載の核酸。
【請求項７】
請求項６に記載の核酸を含有する組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクター。
【請求項８】
請求項７に記載のベクターを担持する生物。
【請求項９】
請求項１または５のいずれかに記載の核酸分子の構成配列と、同一または相補的である１０をこえる連続するヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
細菌、真核細胞またはイン・ビトロ発現系において、請求項２、３または４のいずれかに記載のポリペプチドを発現するための方法。
【請求項１１】
請求項１０記載の、発現した発光タンパク質ポリペプチドを精製/単離するための方法。
【請求項１２】
マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子としての請求項１または５に記載の核酸の使用。
【請求項１３】
マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子としての請求項１または５に記載の核酸とその他のレポーター遺伝子との組み合わせにおける使用。
【請求項１４】
１以上の変異が、配列番号７を基にした位置１３７−１４１によって規定される領域において発光タンパク質中へ導入され、これにより時間的生物発光における変化を導くことを特徴とする、発光タンパク質を調製するための方法。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法によって調製される、発光タンパク質。
【請求項１６】
標識またはリポーターとして請求項２、３、４または１５に記載の発光タンパク質の使用。
【請求項１７】
標識またはリポーターとして請求項２、３、４または１５に記載の発光タンパク質と、その他のリポーター遺伝子との組合せにおける使用。
【請求項１８】
時間的に変化した生物発光を示す、発光タンパク質イクオリンの変異体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発光タンパク質AQdecay、そのヌクレオチドおよびアミノ酸配列、および該活性、ならびに発光タンパク質AQdecayの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発光タンパク質
生物による光生成の現象は生物発光と呼ばれる。それは細胞内の生化学反応の結果であり、この反応中に化学エネルギーが光量子の形で放出される（化学発光手段による冷陰極放出と呼ばれるものである)。この方法で生成される光は、離散電子移動に関連して放出されるのでその光は単色であるが、それはより長波長のスペクトル領域へと二次蛍光染色体[例えば、エクオリア（Aequoria）属の蛍光クラゲの場合には蛍光タンパク質]により変化され得る。
【０００３】
生物発光は、生物学的機能の違いを有する：２００〜１０００m(中深海)の深海では、全生物の約９０％が発光する。この場合では、蛍光シグナルはパートナーの誘引、偽装および擬似餌として用いられる。ツチボタルおよびホタルは、パートナーを探すために光のシグナルを用いる。一方、細菌、菌類および単細胞藻類の発光に関する重要性は明らかでない。大規模な集団において多数の個体調整のために使用されるか、あるいは生物時計の一つのタイプを示すと考えられている。
【０００４】
多数の腔腸動物は生物発光している（Morin et al., 1974)。これらの生物は、青色または緑色を放出する。単離タンパク質としてオワンクラゲ(Shimomura et al., 1969)から得られ、１９６２年に同定された最初の発光タンパク質であるイクオリン（aequorin）は、オワンクラゲの場合、表現型として見られるように緑色光ではなく、青色光を放出した。イクオリンによって活性化された結果として、オワンクラゲを表現型的に緑色に見せる緑色蛍光発光タンパク質(ＧＦＰ)がこのクラゲ（medusa）から単離された(Johnson et al., 1962; Hastings et al., 1969;Inouye et al., 1994)。同定され、記述されているその他の発光タンパク質はクリシン（clytin）(Inouye et al., 1993)、ミトロコミン（mitrocomin）(Fagan et al., 1993)およびオベリン（obelin）(Illarionov et al., 1995)である。
【０００５】
表１：幾つかの発光タンパク質の概略
表には、名前、単離タンパク質の由来生物、データベース登録の識別番号(Acc. No.)を示す。
【表１】
2008539741.tif 000002
【０００６】
表２：幾つかの発光タンパク質の概略
表は、単離タンパク質の由来生物発光タンパク質の名前および特許および出願の選択を示す。
【表２】
2008539741.tif 000003
【０００７】
生物発光は、現在、広範で多様な方法における技術、例えば環境汚染のバイオインジケーターの形態で、あるいは生化学的にタンパク質を感度よく検出するためかまたは特定化合物を定量するため、あるいは細胞内での遺伝子調節の研究に関するレポーターと呼ばれるものとして使用される。
【０００８】
発光タンパク質は、それらのヌクレオチドおよびアミノ酸配列においてだけではなく、それらの生物化学的および物理的特性においても異なる。
【０００９】
発光タンパク質の物理的および生物化学的特性は、これらのタンパク質のアミノ酸配列を変えることによって変化し得ることが示されてきた。突然変異した発光タンパク質の例示は、文献(US 6,495,355; US 5,541,309; US 5,093,240; Shimomura et al., 1986)に記載されている。
【００１０】
上記発光タンパク質は、コエレンテラジン（coelenterazine）を酸化することによって発光する(Haddock et al., 2001; Jones et al., 1999)。
【００１１】
レポーターシステム
一般的に、簡単な生物化学的方法または組織化学的方法を用いて、遺伝子産物を容易に検知し得る遺伝子は、レポーター遺伝子またはインジケーター遺伝子と呼ばれる。少なくとも２つの型のレポーター遺伝子が分類される。
【００１２】
１．耐性遺伝子。これは、その発現により、耐性遺伝子がなければ細胞死へと導く成長培地中に存在する抗生物質またはその他の物質に対して耐性を細胞に与える遺伝子に使用される用語である。
２．レポーター遺伝子。レポーター遺伝子の製品は、融合されたまたは融合されていないインジケーターとして、遺伝子操作において使用される。最も一般的なレポーター遺伝子には、β−ガラクトシダーゼ(Alam et al., 1990)、アルカリフォスファタ−ゼ(Yang et al., 1997; Cullen et al., 1992)およびルシフェラーゼおよび他の発光タンパク質(Shinomura, 1985; Phillips GN, 1997; Snowdowne et al., 1984)が包含される。
【００１３】
可視スペクトルの範囲における光量子の放出は、励起した放出分子によって作用される放出によるもので、発光と呼ばれる。蛍光とは対照的に、この場合、該エネルギーは短波長の発光の形で外部から供給されるものではない。
【００１４】
化学発光と生物発光とは区別される。励起電子が基底状態へと戻る場合にそれ自体が発光する励起分子によりもたらされる化学反応は、化学発光と呼ばれる。該反応が酵素によって触媒される場合に、この現象は生物発光であると言われ、この反応に関与する酵素は、一般的にルシフェラーゼと呼ばれる。
【発明の開示】
【００１５】
変異体の調製
変異体を調製するために、分子生物学的方法を用いて位置89[Y89F] (GenBank #AAA27716；配列番号５の位置89)および位置139 [Y139F] (GenBank #AAA27716;配列番号５の位置139)で変異を挿入した。ストラタジーン（Stratagene）の”クイック・チェンジ（Quick change）”方法(カタログ番号#200521;改訂#063001b;2003編)をこの目的に使用した。配列番号３および配列番号４をプライマーとして使用した。該ベクターをpET22b-AQdecayと呼ぶ。
【００１６】
AQdecay
置換を示している個々のアミノ酸の結果として変化したスペクトルまたは生物化学的特性を示す発光タンパク質はすでに文献に記載されている。これらの発光タンパク質には、オベリンW92F(Vysotski et al., 2003)およびイクオリン(Shrestha et al., 2002; Ohmiya et al., 1993)が包含される。
【００１７】
イクオリン変異体AQdecayは、発光タンパク質イクオリンまたは他の発光タンパク質と比較して、時間的に（chronologically）変化された光の放出を示す。
【００１８】
光放出における時間的変化に関与し得る位置139での変異を、位置89の変異と組み合わせた。位置89での変化はすでに記述されており、発光タンパク質のスペクトル特性における変化をもたらす。光放出における時間的変化の提示に加えて、選択された組合せはまた、変化したスペクトル特性も示す。位置139での変化と他のアミノ酸の置換とを組合せることが出来る。また、位置139での変化と残存するイクオリン発光タンパク質の野生型の配列とを組み合わせることも出来る。
【００１９】
驚くべきことに、発光タンパク質AQdecayは、これまでに記載されていなかった遅延型光放出または発光反応速度を示す。慣習的な潜在的用途に加え、この特性により該発光タンパク質を、真核細胞または他の系における急速なカルシウム放出に関する反応または機構を探索するために特に使用することが可能となる。前記した発光タンパク質変異体または野生型発光タンパク質からの光の放出の反応速度は、"フラッシュ"反応速度として説明され、活性化(例えば、カルシウムを用いて)後に、この光は短い時間にわたり放出され、その後この反応は停止するか、少なくとも著しく弱くなる。この急速な反応速度を測定するためには、特殊な測定機器が必要である。記載された発光タンパク質変異体AQdecayまたはその等価物は、他の測定機器または測定方法の使用が可能となるだけでなく、特に非常に急速な反応速度を調査することができる。この反応速度は、例えばP2Xファミリーに属するイオンチャンネルと関連して生じ得る。
【００２０】
470 nmで極大を持つイクオリンのスペクトルは記述されている(Shimomuro et al., 1966)。コエレンテラジン（coelenterazine）のスペクトル特性は、Shinomuroによって調査されている(Shimomura et al., 2000)。
【００２１】
発光タンパク質AQdecayは、オワンクラゲ由来のイクオリンとアミノ酸レベルで最も高い相同性を示す９９％の同一性を有する(実施例８に示される）。ＢＬＡＳＴ法（Altschul et al., 1997)を配列の比較に使用した。
【００２２】
本発明は、配列番号：２に示されるアミノ酸配列を有する発光タンパク質AQdecayに関する。本発明は、配列番号：１に示す核酸分子にも関する。
【００２３】
本発明は、AQdecayの機能的等価物にも関する。機能的等価物とは、同等の物理化学特性を持つタンパク質である。
【００２４】
本発明は、アミノ酸位置129-149、124-134、好ましくは137-141、特に138-140(GenBank #AAA27716を基にした)の領域において、変化されている生物発光特性を導く１以上のアミノ酸変異を示すイクオリン発光タンパク質に関する。さらに、本発明は、位置139で(GenBank #AAA27716を基にした) 生物発光特性における変化を導くアミノ酸変異を示すイクオリン発光タンパク質に関する。この関連において、イクオリン発光タンパク質は、アミノ酸134-145領域において切除されたイクオリン(GenBank #AAA27716)のものと同様のモチーフを示す発光タンパク質でもあり得る。この関連において、類似モチーフを有する領域は、この領域において80%、好ましくは90%の同一性を示す配列であると見なされる。
【００２５】
本発明は、アミノ酸位置79-99、84-94、好ましくは87-91、特に88-90(GenBank #AAA27716を基にした)の領域中で、蛍光スペクトルまたは生物発光スペクトルにおける変化をもたらす１以上のアミノ酸変異を示すイクオリン発光タンパク質のアミノ酸位置139領域における変異との組合せ物に関する。さらに、本発明は、蛍光スペクトルまたは生物発光スペクトルにおける変化をもたらす位置89(GenBank #AAA27716を基にした)におけるアミノ酸変異を示すイクオリン発光タンパク質のアミノ酸位置139領域における変異との組合せ物に関する。この関連において、480-520nm、好ましくは485-515nm、特に好ましくは490-510nm、495-505nmの範囲、あるいは特に500nmで、蛍光スペクトルまたは生物発光スペクトルにおいて極大を示すこれら発光タンパク質が好まれる。この関連において、イクオリン発光タンパク質は、アミノ酸84-94の領域において、切除されたイクオリン(GenBank #AAA27716)のものと類似したモチーフを示すそれら発光タンパク質でもあり得る。この関連において、類似のモチーフを有する領域は、この領域において80%、好ましくは90%の同一性を示すような配列と見なされる。
【００２６】
同様に、AQdecayタンパク質の機能的フラグメントまたはかかるフラグメントをコードしている核酸もまた本発明に関する。
【００２７】
本発明の他のタンパク質の切除された機能的フラグメントまたはこれらフラグメントをコードしている核酸は、発明の一部を形成する。
【００２８】
発光タンパク質AQdecayは、レポーター遺伝子として、細胞系、特に受容体、イオンチャンネル、トランスポーター、転写ファクターまたは誘導系に使用されるのが適当である。
【００２９】
また、発光タンパク質AQdecayは、細胞オルガネラ、特にミトコンドリアを、標識、同定および特性分析するための、レポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００３０】
発光タンパク質AQdecayは、細胞オルガネラ、特にミトコンドリアの内外のパラメーター、特にカルシウム濃度を決定するための、レポーター遺伝子として使用されることもまた適当である。
【００３１】
発光タンパク質AQdecayは、細菌および真核生物系、特に哺乳動物細胞、細菌、酵母、バキュロウイルスおよび植物におけるレポーター遺伝子として使用されるのが適当である。
【００３２】
発光タンパク質AQdecayは、レポーター遺伝子として、生物発光または化学発光系、特にルシフェラーゼ、オキシゲナーゼまたはホスファターゼを用いる系とを組合せた細胞系に使用されるのが適当である。
【００３３】
発光タンパク質AQdecayは、特に受容体、イオンチャンネル、トランスポーター、転写ファクター、プロテイナーゼ、キナーゼ、ホスホジエステラーゼ、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、トランスフェラーゼ、膜タンパク質および糖タンパク質について、融合タンパク質として使用されるのが適当である。
【００３４】
発光タンパク質AQdecayは、特に抗体、ビオチンまたは磁性または磁化し得る支持体によって固定化に使用されるのに適当である。
【００３５】
発光タンパク質AQdecayは、エネルギー転位系、特にＦＲＥＴ(蛍光共鳴エネルギー移動)、ＢＲＥＴ(生物発光共鳴エネルギー転位：bioluminescence resonance energy transfer)、ＦＥＴ(フィールド効果トランジスター）、ＦＰ(蛍光分極化)およびＨＴＲＦ(均一時間分解蛍光)系のためのタンパク質としての使用に適当である。
【００３６】
発光タンパク質AQdecayは、基質またはリガンド、特にプロテアーゼ、キナーゼまたはトランスフェラーゼを標識するのに適当である。
【００３７】
発光タンパク質AQdecayは、細菌系で発現されるために、特に力価決定のために、生物化学系の基質、特にプロテイナーゼとキナーゼのための基質として適当である。
【００３８】
発光タンパク質AQdecayは、標識として、特に抗体と結合した、酵素と結合した、受容体と結合した、またはイオンチャンネルおよび他のタンパク質と結合した標識として使用されるのに適当である。
【００３９】
発光タンパク質AQdecayは、医薬活性化合物の探索、特にＨＴＳ(ハイスループットスクリーニング)において、レポーター遺伝子として使用されるのに適当である。
【００４０】
発光タンパク質AQdecayは、イオンチャンネル、特にｐ２Ｘ、ＴＲＰ、ＳＣＮ、ＫＣＮ、ＣＮＧまたはＡＣＣＮ型のイオンチャンネルを特徴付けること、同定すること、調査することの関連において、レポーター遺伝子として使用するために適当である。
【００４１】
発光タンパク質AQdecayは、検出系の成分として、特にＥＬＩＳＡ(酵素結合免疫吸着アッセイ)、免疫組織化学、ウェスタンブロッティングまたは共焦点顕微鏡検査法に使用されるのが適当である。
【００４２】
発光タンパク質AQdecayは、相互作用、特にタンパク質-タンパク質相互作用、ＤＮＡ-タンパク質相互作用、ＤＮＡ-ＲＮＡ相互作用、ＲＮＡ−ＲＮＡ相互作用またはＲＮＡ-タンパク質相互作用(ＤＮＡ:デオキシリボ核酸；ＲＮＡ：リボ核酸)を分析するための標識として使用されるのに適当である。
【００４３】
発光タンパク質AQdecayは、遺伝子導入生物、特にマウス、ラット、ハムスターおよび他の哺乳動物、霊長類、魚、虫または植物における発現のための標識または融合タンパク質として使用されるのに適当である。
【００４４】
発光タンパク質AQdecayは、胚発生を分析するのに標識または融合タンパク質として使用されるのに適当である。
【００４５】
発光タンパク質AQdecayは、カップリングメディエーター、特にビオチン、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）またはＣＮ−Ｂｒにより標識として使用されるのが適当である。
【００４６】
発光タンパク質AQdecayは、核酸、特にＤＮＡまたはＲＮＡに結合されるレポーターとして使用されるのに適当である。
【００４７】
発光タンパク質AQdecayは、タンパク質またはペプチドと結合されるレポーターとして使用されるのに適当である。
【００４８】
発光タンパク質AQdecayは、細胞内外のカルシウム濃度を測定するためのレポーターとして使用されるのに適当である。
【００４９】
発光タンパク質AQdecayは、細胞系におけるシグナルカスケードを特徴分析するために適当である。
【００５０】
核酸またはペプチドと結合された発光タンパク質AQdecayは、特にノーザンブロット、サザンブロット、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、核酸配列決定、タンパク質分析またはチップ分析のためのプローブとして使用されるのに適当である。
【００５１】
発光タンパク質AQdecayは、医薬製剤、特に感染物質、抗体または「小分子」を標識するのに適当である。
【００５２】
発光タンパク質AQdecayは、地質調査、特に海、地下水および河川に使用されるのが適当である。
【００５３】
発光タンパク質AQdecayは、発現系、特にイン・ビトロ翻訳系、細菌系、酵母系、バキュロ系、ウイルス系および真核生物系において発現されるのに適切である。
【００５４】
発光タンパク質AQdecayは、外科的介入、特に侵襲性、非侵襲性および最小の侵襲性介入との関連において、組織または細胞を可視化するために適当である。
【００５５】
発光タンパク質AQdecayは、特に組織学的調査および外科的介入との関連において、腫瘍組織およびその他の表現型的に変化した組織を標識するためにも適当である。
【００５６】
本発明は、特に野生型タンパク質、融合タンパク質および突然変異タンパク質として発光タンパク質AQdecayの精製にも関する。
【００５７】
発光タンパク質AQdecayは、発現系において様々なレポーター遺伝子を同時に測定するために適当である（多重化）。
【００５８】
本発明は、化粧品の分野、特に入浴剤、ローション、ソープ、身体用染料、歯磨き粉および身体用パウダーにおける、発光タンパク質AQdecayの使用にも関する。
【００５９】
本発明は、染色のため、特に食材、入浴剤、インク、服飾物およびプラスチックを染色するための、発光タンパク質AQdecayの使用にも関する。
【００６０】
本発明は、紙、特にグリーティングカード、紙類製品、壁紙および手工芸物品を染色するための、発光タンパク質AQdecayの使用にも関する。
【００６１】
本発明は、液体、特に水鉄砲、噴水、飲料および氷を染色するための、発光タンパク質AQdecayの使用にも関する。
【００６２】
本発明は、装身物を製造するための、特にマニキュアおよび化粧品製造のための、発光タンパク質AQdecayの使用にも関する。
【００６３】
本発明は、配列番号：２に開示されたポリペプチドをコードする核酸分子、またはその機能的等価物または機能的フラグメントに関する。
【００６４】
本発明は、さらに、
ａ）配列番号：２に開示されたアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸分子;
ｂ）配列番号：１に示された配列を含有する核酸分子;
ｃ）ストリンジェントな条件下で、相補鎖がａ）またはｂ）の核酸分子とハイブリダイズし、発現産物が発光タンパク質の生物学的機能を示す核酸分子；
核酸分子のストリンジェントなハイブリダイゼーションを、６８℃で、０.２×ＳＳＣ（1
×標準的なクエン酸生理食塩水＝１５０ｍＭ ＮａＣｌ, １５ｍＭクエン酸三ナトリウム）（Sambrook et al., 1989）を含有する水溶液中で行う、
ｄ）遺伝子コードの縮重のために、ｃ）に記載した核酸分子とは異なる核酸分子；
からなる群から選択される核酸分子、またはその機能的等価物または機能的フラグメントに関する。
【００６５】
本発明は、配列が、発光タンパク質をコードしている配列またはリーダーまたはシグナル配列をコードしている配列に対して５'側の機能プロモーターを含有する上記核酸分子に関する。
【００６６】
本発明は、先に記載した組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクターの一部を形成する核酸分子にも関する。
【００６７】
本発明は、かかるベクターを担持する生物に関する。
【００６８】
本発明は、先に記載したヌクレオチド配列によってコードされた発光タンパク質に関する。
【００６９】
本発明は、細菌、真核細胞またはイン・ビトロ発現系において本発明の発光タンパク質ポリペプチドを発現するための方法に関する。
【００７０】
本発明は、本発明の発光タンパク質ポリペプチドを精製／単離するための方法にも関する。
【００７１】
本発明は、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、特に医薬活性化合物および診断薬を探索するための、発光タンパク質をコードしている本発明の核酸の使用に関する。
【００７２】
本発明は、標識またはレポーターとして、また各々マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、本発明の発光タンパク質または発光タンパク質をコードしている本発明の核酸の使用に関する。
【００７３】
本発明は、特に医薬活性化合物および診断薬を探索するための、標識もしくはレポーターとして、また各々マーカーまたはレポーター遺伝子としての、発光タンパク質AQdecay(配列番号：２)、その機能フラグメントまたは等価物の使用あるいは発光タンパク質AQdecayをコードする核酸またはその機能フラグメントまたは等価物の使用に関する。
【００７４】
本発明は、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子として、特に医薬活性化合物および診断薬を探索するための配列番号：１を示す核酸の使用に関する。
【００７５】
本発明は、本発明のポリペプチドを認識するポリクローナルまたはモノクローナル抗体にも関する。
【００７６】
本発明は、発光タンパク質AQdecay (配列番号：２)を認識するモノクローナルまたはポリクローナル抗体にも関する。
【００７７】
本発明は、コード配列に対して５'側に機能プロモーターを含有する前記した段落に記載した核酸に関する。
【００７８】
本発明は、先に記載した核酸を含有する組換えＤＮＡまたはＲＮＡベクターを含む。
【００７９】
同様に、本発明は、先に記載したベクターを担持する生物に関する。
【００８０】
同様に、上記した核酸配列によってコードされるポリペプチドは、本発明の一部を形成する。
【００８１】
本発明は、細菌、真核細胞またはイン・ビトロ発現系において、上記ポリペプチドを発現するための方法にも関する。
【００８２】
本発明のポリペプチドを精製/単離するための方法は、本発明の一部を形成する。
【００８３】
本発明は、マーカー遺伝子またはレポーター遺伝子としての、本発明の核酸の使用に関する。
【００８４】
本発明は、標識またはレポーターとしての本発明の発光タンパク質の使用に関する。
【００８５】
本発明のポリペプチドと１以上のルシフェラーゼおよび／または１以上の発光タンパク質との組合せにおける使用も、本発明の一部を形成する。
【００８６】
１２９−１４９、１２４−１３４、好ましくは１３７−１４１、特に１３８−１４０の領域（GenBank#AAA27716を基にした）において１以上の変異を持ち、そして変化された生物発光シグナル、特に遅延型生物発光シグナルを示す発光タンパク質またはその機能フラグメントは、本発明に関する。
【００８７】
同様に、２つ前の段落に関するタンパク質をコードする配列を含む核酸分子も本発明に関する。
【００８８】
本発明は、さらに、GenBank #AAA27716に基づいて１以上の変異を、位置１２９−１４９、１２４−１３４、好ましくは１３７−１４１、特に１３８−１４０によって規定される領域において発光タンパク質中に導入され、これにより生物発光における変化を導くことを特徴とする発光タンパク質を調製するための方法に関する。
【００８９】
同様に、前段に記載した通りの方法によって調製される発光タンパク質も本発明に関する。
【００９０】
本発明は、アミノ酸配列における１以上の変化の結果として、変化した光放出反応速度を示す他の発光タンパク質にも関する。
【００９１】
本発明は、発光タンパク質AQdecayの記述した用途についての、他の変化した発光タンパク質の使用にも関する。
【００９２】
変化した光放出反応速度、特に遅延型光放出または長時間型光放出を示す発光タンパク質は、細胞を基にした方法、特に薬理学的に活性な化合物の探索および特徴付け、特に診断において、レポータータンパク質として使用されるのに適切である。
【００９３】
変化した光放出反応速度、特に遅延型光放出または長期間型光放出を示す発光タンパク質は、イオンチャンネルを探索するのに適切である。
【００９４】
本発明は、生物学的または物理化学的特性を変化させるための、特に改善された発現、特に変化した安定性のための、本発明のタンパク質のコドン至適化変異体にも関する。
【００９５】
本発明は、細胞オルガネラまたは細胞区画中へ／内に輸送または局在化する目的のための、認識ペプチドと本発明のタンパク質との融合物に関する。
【００９６】
本発明は、スペクトル特性、蛍光強度、基質特異性、補酵素の使用、カルシウム親和性またはその他の物理化学特性または生物学的特性において変化をもたらす本発明のタンパク質の変異体に関する。
【００９７】
本発明の発光タンパク質の発現
遺伝子が適当な宿主細胞中に導入された後、発現ベクター中にクローニングされた外来遺伝子を転写および翻訳し得る分子の産生が発現と呼ばれる。発現ベクターは、原核生物または真核細胞において遺伝子を発現するために必要とされるコントロールシグナルを含有する。
【００９８】
基本的には、発現ベクターは２つの異なる方法で構築され得る。転写融合と呼ばれる場合には、クローニングされた外来遺伝子によってコードされたタンパク質は、オーセンティックな生物学的に活性なタンパク質として合成される。この目的のために、発現ベクターは、発現に必要とされる全ての５'および３'側にコントロールシグナルを担持する。
【００９９】
翻訳融合と呼ばれるものの場合には、クローニングされた外来遺伝子によってコードされたタンパク質は、ハイブリッドタンパク質として、簡単に検出され得る別のタンパク質と共に発現される。発現に必要とされる５'および３'側のコントロールシグナルは、開始コドンとおそらく、形成されるべきハイブリッドタンパク質のＮ末端領域をコードする配列の一部を包含するもので、ベクターに由来する。付加的に挿入されたタンパク質部分は、多くの場合に、クローニングされた外来遺伝子によってコードされたタンパク質を細胞性プロテアーによる分解に対して安定化させるだけでなく、形成されるハイブリッドタンパク質を検出および単離するために使用され得る。発現は、一過的または安定的に起こる。適当な宿主生物は、細菌、酵母、ウイルスまたは真核生物系である。
【０１００】
本発明の発光タンパク質の精製
タンパク質の単離(それらがさらに過剰発現した後)は、しばしばタンパク質精製と呼ばれる。多くの確立された方法は、タンパク質を精製するために利用し得る。
【０１０１】
固体/液体分離は、タンパク質を単離することに関連した基本操作である。この手順のステップは、細胞を培養培地から分離する時、細胞を破砕させ、細胞破砕物を除去した後に粗製抽出物を清澄する時、そして沈殿後に沈殿物を分離する時に必要とされる。それは、遠心分離および濾過によって行う。
【０１０２】
細胞内タンパク質を得るために、細胞壁は、破壊されるかまたは透過し得るようにされるべきである。高圧ホモゲナイザーまたは攪拌ボールミルまたはガラスビーズボールは、規模や生物によって、この目的のために使用される。機械的な細胞破砕機および超音波処置が、特に研究室スケールに対して使用される。
【０１０３】
細胞外タンパク質および細胞内タンパク質(細胞破砕後)の両方の場合、塩類(特に、硫酸アンモニウム)または有機溶媒(アルコールまたはアセトン)を用いる様々な沈殿方法は、タンパク質を濃縮するための迅速かつ有効な方法を示す。細胞内タンパク質が精製される場合、可溶性核酸を除去すること（例えば、硫酸ストレプトマイシンまたは硫酸プロタミンによる沈殿）が望ましい。細胞外性タンパク質が単離される場合、担体（例えば、スターチまたは珪藻土）は、取扱いが容易な沈殿物を得るために沈殿剤を添加する前に添加されることが多い。
【０１０４】
多くのクロマトグラフィー法および分配方法(吸着クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィーおよび電気泳動)は、高度な精製のために利用し得る。カラムクロマトグラフィーは、工業的規模で使用される。ステップあたりの精製係数を数１００まで上げることが可能であるアフィニティークロマトグラフィーは、研究室スケールでは特に重要である。
【０１０５】
細胞外タンパク質は、相対的に希薄な溶液中に存在する。細胞外タンパク質と同様に、それらは、さらなる使用に供する前に濃縮されるべきである。すでに記載された方法に加えて、限外濾過は工業的規模としても同様に価値のあるものと証明されてきた。
【０１０６】
タンパク質を伴う無機塩は、特定の用途には好ましくないことが多い。それらは、特にゲル濾過、透析および膜分離精製によって除去され得る。
【０１０７】
多くのタンパク質は乾燥調製物として使用される。重要な乾燥方法は、真空乾燥、凍結乾燥および噴霧乾燥である。
【０１０８】
ヌクレオチドおよびアミノ酸配列
発光タンパク質AQdecayは、次のヌクレオチド配列(配列番号：１）によってコードされている:
【表３】
2008539741.tif 000004
【０１０９】
該配列により、次のアミノ酸配列(配列番号：２)を生じる:
【表４】
2008539741.tif 000005
【０１１０】
プライマー：
（配列番号：３）
5'-GAATGGCCTGAATTTATCGAAGGATGGAA-3'
（配列番号：４）
5'-TTCCATCCTTCGATAAATTCAGGCCATTC-3'
（配列番号：５）
5'-GAATGGAAAGCATTCACCAAATCTGCTG-3'
（配列番号：６）
5'-CAGCAGATTTGGTGAATGCTTTCCATTC-3'
【０１１１】
発光タンパク質イクオリン（Genbank:AAA27716）は次の配列(配列番号：７)を有する。位置８９および１３９を太字および下線で記載した。
【表５】
2008539741.tif 000006
これらの配列は配列表に再現される。
【実施例】
【０１１２】
実施例
実施例１
変異体を調製するために、分子生物学的方法を用いて変異を位置１３２（切除されたイクオリンの；Gen Bank #27716）に挿入した。Stratagene(U.S.A.)によって提供された「クイック・チェンジ」方法をこの目的に使用した。用いたプライマーは、配列番号：３および配列番号：４であった。該ｃＤＮＡを、ベクターpET22b(Novagen)のNdeI/XhoI解裂部位に挿入した。このベクターをpET22b−AQdecayと称す。
図１は、ベクター pET22b-AQdecayのプラスミドマップを示す。
【０１１３】
実施例２
Clontechにより提供されたプラスミドpcＤＮＡ3.1(＋)を、下記に述べる構築体を調製するためのベクターとして使用した。ベクターの誘導体をpcＤＮＡ3-AQdecayと称する。ベクターpcＤＮＡ3-AQdecayを、真核生物系でAQdecay を発現するために使用した。
図２は、ベクターpcＤＮＡ３-AQdecayのプラスミドマップを示す。
【０１１４】
実施例３
細菌発現
細菌的発現は、発現プラスミドpET22b-AQdecayを用いて細菌を形質転換することによってＥ．coli 株 BL21(DE3)で行った。形質転換細菌を、ＬＢ培地中で３７℃で３時間インキュベートし、発現を製造者指示書（Novagen）に従って誘導した。誘導された細菌を、遠心分離により集菌し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ(ｐＨ ９．０)＋５ ｍＭ ＥＤＴＡに再懸濁し、超音波処理により破砕した。溶菌物を、１３.０００ rpm (１６０００ rcf)で１５分間遠心分離し、上清を取出した。上清(Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ９.０による１：５、１：１０、１：２０および１：５０希釈)を、コエレンテラジン(Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ ｐＨ ９.０中１０Ｅ−０７Ｍコエレンテラジン)と共に３時間暗所でインキュベートした。生物発光を、５ｍＭ塩化カルシウムを添加した後、ルミノメーターで直接測定した。測定積分時間は４０秒であった。
図４は、細菌中のAQdecay生物発光測定の反応速度を示す。
【０１１５】
実施例４
真核生物系の発現
構成的真核生物系発現は、一時的実験において発現プラスミドpcＤＮＡ３-AQdecayおよびpcＤＮＡ3.1(＋)を用いて細胞をトランスフェクトの結果としてＣＨＯ細胞でおこった。このために、ウェルあたり１００００個の細胞を、９６ウェルマイクロタイタープレート上のＤＭＥＭ−Ｆ１２培地中に播種し、プレートを終夜３７℃でインキュベートした。トランスフェクションを、製造者指示書に従ってＦugene ６ キット(Roche)を用いて行った。トランスフェクト細胞を、終夜ＤＭＥＭ−Ｆ１２培地において３７℃でインキュベートした。次いで、該培地を除去し、コエレンテラジン(ＰＢＳ中１０Ｅ ０７Ｍ コエレンテラジン)（５０ μl）で置換した。細胞を２８℃２４時間でインキュベートし、ＡＴＰ(アデノシン３リン酸)を終濃度１μＭまで添加した。ルミノメーターでの測定を添加後に直接開始した。積算時間は１秒であり、総測定維持時間は６０秒であった。
図３は、ＣＨＯ細胞中のAQdecayの生物発光の測定結果を示す。
図５は、ＣＨＯ細胞中のAQdecayの生物蛍光の測定値の反応速度を示す。
【０１１６】
実施例５
ＢＬＡＳＴ
アミノ酸レベルでのAQdecayＢＬＡＳＴ分析の結果：
＞emb|CAC93774.1|未詳タンパク質産物[Aequorea victoria]
長さ＝196、スコア＝410 bits (1054)、期待数＝e-113、同一性＝194/196(98%)、陽性＝196/196 (100%)
＞pir||A26623 イクオリン１前駆体-ヒドロクラゲ(Aequorea victoria)sp|P07164|AEQ1_AEQVI イクオリン１前駆体gb|AAA27716.1|イクオリン１前駆体
長さ＝196、スコア＝410 bits (1054)、期待数＝e-113、同一性＝194/196(98%)、陽性＝196/196(100%)
＞gb|AAB14842.1|米国特許US 5541309からの配列１gb|AAA55424.1| EP特許0187519からの配列２ 
長さ＝196、スコア＝407bits (1046)、期待数＝e-113、同一性＝193/196(98%)、陽性＝195/196 (99%)
＞gb|AAB14845.1|US特許5541309からの配列４
長さ＝196、スコア＝405 bits (1041)、期待数＝e-112、同一性＝192/196 (97%)、陽性＝194/196 (98%)
＞gb|AAB14846.1| US特許5541309からの配列５
長さ＝196、スコア＝405 bits (1040)、期待数＝e-112、同一性＝192/196(97%)、陽性＝194/196(98%)
＞gb|AAB14844.1| US特許5541309からの配列３
長さ＝196、スコア＝405 bits (1040)、期待数＝e-112、同一性＝192/196 (97%)、陽性＝194/196 (98%)
＞emb|CAC93778.1| 未詳タンパク質産物 [Aequorea victoria]
長さ＝196、スコア＝402 bits (1034)、期待数＝e-111、同一性＝191/196 (97%)、陽性＝ 193/196 (98%)
＞dbj|BAC81730.1| アポイクオリン [Aequorea victoria]
長さ＝196、スコア＝401 bits (1031)、期待数＝e-111、同一性＝189/196 (96%)、陽性＝195/196 (99%)
【０１１７】
＞emb|CAC93779.1| 未詳タンパク質産物 [Aequorea victoria]
長さ＝196、スコア＝400 bits (1029)、期待数＝e-111、同一性＝190/196 (96%)、陽性＝ 192/196 (97%)
＞emb|CAC93780.1| 未詳タンパク質産物 [Aequorea victoria]
長さ＝196、スコア＝400 bits (1028)、期待数＝e-110、同一性＝190/196 (96%)、陽性＝ 192/196 (97%)
＞pdb|1SL8|鎖A、Aequorea Victoriaからのカルシウム担持アポイクオリン
長さ＝191、スコア＝395 bits (1015)、期待数＝e-109、同一性＝187/190(98%)、陽性＝189/190 (99%)
＞gb|AAB14843.1| US特許5541309からの配列２
長さ＝189、スコア＝394 bits (1011)、期待数＝e-108、同一性＝186/189(98%)、陽性＝188/189(99%)
＞emb|CAC93777.1|未詳タンパク質産物 [Aequorea victoria]
長さ＝189、スコア＝391 bits (1005)、期待数＝e-108、同一性＝185/189(97%)、陽性＝187/189 (98%)
＞emb|CAC93781.1| 未詳タンパク質産物 [Aequorea victoria]
長さ＝189、スコア＝391 bits (1004)、期待数＝e-108、同一性＝184/189(97%)、陽性＝187/189 (98%)
＞emb|CAC93775.1| 未詳タンパク質産物 [Aequorea victoria]
長さ＝196、スコア＝384 bits (985)、期待数＝e-105、同一性＝176/196 (89%)、陽性＝192/196 (97%)
＞dbj|BAC81731.1| アポイクオリン [Aequorea victoria]
長さ＝196、スコア＝384 bits (985)、期待数＝e-105、同一性＝176/196 (89%)、陽性＝192/196 (97%)
【０１１８】
実施例６
BLAST 
核酸レベルでのAQdecayのBLAST分析の結果:
＞gb|M16103.1|AEVAEQA A.victoria (クラゲ) イクオリン１mRNA、完全なcds
長さ＝672、スコア＝1104 bits (557)、期待数＝0.0、同一性＝569/573 (99%)
＞dbj|AB103337.1|アポイクオリンに対するAequorea victoria mRNA、クローン:UTAEQ04
長さ＝591、スコア＝961 bits (485)、期待数＝0.0、同一性＝551/573 (96%)
＞dbj|AB103338.1|アポイクオリンに対するAequorea victoria mRNA、クローン:UTAEQ09
長さ＝591、スコア＝739 bits (373)、期待数＝0.0、同一性＝523/573 (91%)
＞gb|L29571.1|AEVAQ440X Aequorea victoria イクオリン (AQ440) mRNA、完全なcds
長さ＝925、スコア＝731 bits (369)、期待数＝0.0、同一性＝522/573 (91%)
＞gb|M11394.1|AEVAEQD Aequorea victoria (クラゲ) イクオリンmRNA、完全なcds
長さ＝861、スコア＝731 bits (369)、期待数＝0.0、同一性＝522/573(91%)
＞dbj|AB103336.1|アポイクオリンに対するAequorea victoria mRNA、クローン:UTAEQ01
長さ＝591、スコア＝724 bits (365)、期待数＝0.0、同一性＝521/573 (90%)
【０１１９】
＞dbj|AB103339.1|アポイクオリンに対するAequorea victoria mRNA、クローン:UTAEQ11
長さ＝591、スコア＝716 bits (361)、期待数＝0.0、同一性＝520/573 (90%)
＞gb|AY601106.1| Aequorea victoria イクオリン mRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝716 bits (361)、期待数＝0.0、同一性＝517/569 (90%)
＞gb|AY604002.1|Aequorea victoria クローン AEQ_V44A 修飾イクオリンmRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝708 bits (357)、期待数＝0.0、同一性＝516/569 (90%)
＞gb|AY604001.1| Aequorea victoria クローン AEQ_Q168R修飾イクオリンmRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝708 bits (357)、期待数＝0.0、同一性＝516/569 (90%)
＞gb|AY604000.1|Aequorea victoria クローン AEQN26D 修飾イクオリンmRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝708 bits (357)、期待数＝0.0、同一性＝516/569 (90%)
＞gb|AY603999.1| Aequorea victoria クローン AEQ_L170I 修飾イクオリンmRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝708 bits (357)、期待数＝0.0、同一性＝516/569 (90%)
＞gb|AY603998.1| Aequorea victoria クローン AEQ_F149S 修飾イクオリンmRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝708 bits (357)、期待数＝0.0、同一性＝516/569 (90%)
＞gb|AY603997.1|Aequorea victoriaクローン AEQ_E35G 修飾イクオリン mRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝708 bits (357)、期待数＝0.0、同一性＝516/569 (90%)
＞gb|AY603996.1| Aequorea victoria クローン AEQ_E128G 修飾イクオリンmRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝708 bits (357)、期待数＝0.0、同一性＝516/569 (90%)
【０１２０】
＞gb|AY603995.1| Aequorea victoria クローン AEQ_D153G 修飾イクオリンmRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝708 bits (357)、期待数＝0.0、同一性＝516/569 (90%)
＞gb|AY603994.1| Aequorea victoria クローン AEQ_D117G修飾イクオリンmRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝708 bits (357)、期待数＝0.0、同一性＝516/569 (90%)
＞gb|AY603993.1|Aequorea victoria クローン: AEQ-Q168A-L170V 修飾イクオリンmRNA、完全なcds
長さ＝600、スコア＝676 bits (341)、期待数＝0.0、同一性＝512/569 (89%)
【０１２１】
実施例７
図７は、アミノ酸レベルでのAQdecayとイクオリン(野生型; wt)のアラインメントを示す。
wt                MTSEQYSVKLTPDFDNPKWIGRHKHMFNFLDVNHNGRISLDEMVYKASDIVINNL
DECAY             MTSEQYSVKLTPDFDNPKWIGRHKHMFNFLDVNHNGRISLDEMVYKASDIVINNL
wt                GATPEQAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPEFIEGWKRLASEELKRYSKNQIT
DECAY             GATPEQAKRHKDAVEAFFGGAGMKYGVETEWPEYIEGWKRLASEELKRYSKNQIT
wt                LIRLWGDALFDIIDKDQNGAISLDEWKAFTKSDGIIQSSEDCEETFRVCDIDESG
DECAY             LIRLWGDALFDIIDKDQNGAISLDEWKAYTKSDGIIQSSEDCEETFRVCDIDESG
wt                QLDVDEMTRQHLGFWYTMDPACEKLYGGAVP
DECAY             QLDVDEMTRQHLGFWYTMDPACEKLYGGAVP
【０１２２】
実施例８
細菌で発現したAQdecayの反応速度分析
AQdecayの生物発光の反応速度的分析のために、E. coli BL 21(DE3)をpET22b-AQdecay またはpET22b (いずれの合成cＤＮＡも含まない)により形質転換した。この細菌を、実施例３に記載のとおりに増殖および分裂させた。測定データを１秒間の積算時間を用いて６０秒間収集した。
図４は、細菌におけるAQdecayの反応速度分析の結果を示す。
【０１２３】
実施例９
ＣＨＯ細胞中で発現したAQdecayの反応速度分析
AQdecayの生物発光を反応速度論的に分析するために、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞を、pcDNA3-AQdecay またはpcDNA3(いずれの合成cＤＮＡも含まない)で一過的に形質転換した。トランスフェクションおよび測定を実施例４に記載したとおりに行った。測定データを１秒間の積算時間を用いて６０秒間収集した。
図５は、ＣＨＯ細胞でのAQdecayの反応速度分析の結果を示す。
【０１２４】
実施例１０
多重化実験におけるAQdecayの使用
発光タンパク質AQdecayは、多重化読み出し方法における成分として使用するのに適当であって、成分中に幾つかのレポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼまたは光タンパク質）を実験混合物中で使用した。このために、AQdecayを発現するＣＨＯ細胞を、野生型イクオリンを発現したＣＨＯ細胞と１：１（または１：２、１：３・・）の比率で混合した。野生型イクオリンを発現した細胞は、Ｇタンパク質共役受容体（例えば、ニューロメジンＵ受容体２）をさらに発現していた。この細胞混合物を、９６ウェル、３８４ウェルまたは１５３６ウェルマイクロタイタープレート上に播種し、その後３７℃で２４時間インキュベートした。
【０１２５】
その後、該細胞にコエレンテラジンを担持（実施例４に記載したとおりに）させた。Ｇタンパク質受容体アゴニストを添加することによって、細胞内でのカルシウム放出をもたらす。この放出を、野生型イクオリン（野生型イクオリンによる光放出）を用いて読むことが出来る。第二の細胞型のAQdecayを、内部のＣＨＯ受容体を活性化するアゴニスト（例えば、ＡＴＰ）を連続的に添加することによって活性化され得る。
【０１２６】
実施例１１
細胞オルガネラまたは区画内のAQdecayの位置決定
発光タンパク質AQdecayまたはその等価物は、特定の細胞区画またはオルガネラへの輸送または局在化目的のために、ペプチド、リーダー配列、輸送シグナル、タンパク質またはタンパク質フラグメントと融合するために適当である。輸送およびその後の位置決定をする目的のために、本発明の発光タンパク質である発光タンパク質AQdecayを、ペプチドMSVLTPLLLRGLTGSARRLPVPRAKIHSLPPEGKLと融合させた。AQdecayのアミノ酸配列上流のペプチドの融合により、真核生物宿主細胞のミトコンドリア中に輸送される融合タンパク質となる。ミトコンドリアにある発光タンパク質AQdecayを、ミトコンドリア内のカルシウム濃度を測定するために使用し得る。発光タンパク質AQdecayのアミノ酸配列の記載したペプチド上流の融合を、標準的分子生物学的方法を用いて核酸レベルで行った。
【０１２７】
文献/特許
US 6,495,355
US 5,541,309
US 5,093,240
US-0908909
US 6,152,358
JP-0176125
GB-0024357
WO03006497
WO200168824
【０１２８】
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【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、ベクター pET22b-AQdecayのプラスミドマップを示す。
【図２】図２は、ベクター pcＤＮＡ3-AQdecayのプラスミドマップを示す。
【図３】図３は、CHO細胞内でAQdecayの真核生物的発現の結果を示す。この実験は、実施例４に記載したとおりに行った。(Ｙ＝相対的光ユニット、ＲＬＵ；Ｘ＝ＡＴＰ/mol/lのlog濃度）。
【図４】図４は、AQdecayの細菌系発現の結果を示す。この実験は、実施例３に記載したとおりに行った。(Ｙ＝相対的光ユニット、ＲＬＵ；Ｘ＝時間［秒］；黒色の曲線：AQdecay；灰色の曲線：野生型イクオリン）
【図５】図５は、AQdecayの生物発光反応速度を示す（CHO細胞内で発現）。この実験は、実施例４に記載したとおりに行った。(Ｙ＝相対的光ユニット、ＲＬＵ；Ｘ＝時間［秒］；黒色の曲線：AQdecay；灰色の曲線：野生型イクオリン）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月11日(2008.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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