(57)【要約】  Ｗｎｔシグナル伝達経路は、胚発生ならびにＭ腫瘍形成に関与する。ディシブルド（Ｄｖｌ）は、カノニカルおよび非カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路で、受容体フリズルド（Ｆｚ）からのＷｎｔシグナルを下流構成要素に伝達し、ＤｖｌのＰＤＺドメインは双方の経路において必須の役割を果たし、ＤｖｌのＰＤＺドメインはＦｚ受容体に直接に結合する。本発明ではＮＭＲ支援仮想リガンドスクリーニングを使用していくつかの化合物が同定され、ＤｖｌのＰＤＺドメインに結合することが分かった。分子動力学シミュレーションを使用して、ＰＤＺドメインとこれらの化合物との間の結合を詳細に分析した。これらの化合物は、Ｆｚ−Ｄｖｌ相互作用を妨げることでＷｎｔシグナル伝達をブロックできる、ＰＤＺドメインの高親和性阻害物質の合理的デザインの基礎を提供する。
2008537744.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜結合受容体と、Ｗｎｔシグナル伝達経路構成要素との結合を防止する、少なくとも１つの非天然化合物、非天然化合物の少なくとも１つの断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法。
【請求項２】
骨形成または骨再構築に関与する膜結合受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との結合を防止する、少なくとも１つの非天然化合物、非天然化合物の少なくとも１つの断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法。
【請求項３】
骨形成または骨再構築に関与する受容体、膜結合受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との結合を防止する、少なくとも１つの非天然化合物、非天然化合物の少なくとも１つの断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法。
【請求項４】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との結合を防止する、少なくとも１つの非天然化合物、非天然化合物の少なくとも１つの断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法。
【請求項５】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との結合を防止する、少なくとも１つの非天然化合物、非天然化合物の少なくとも１つの断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法。
【請求項６】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４〜１３１２、３２８９〜８６２５、３２８９〜５０６６、３２３７〜０７１９、３２３７〜０５６５、３２３７〜０７１３、３２３７〜０４３０、８００６〜２５６０、００９０〜００３１、２３７２〜２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９〜５０６６、３２８９〜８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７〜０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４〜１３１２、３２８９〜８６２５、３２８９〜５０６６、３２３７〜０７１９、３２３７〜０５６５、３２３７〜０７１３、３２３７〜０４３０、８００６〜２５６０、００９０〜００３１、２３７２〜２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９〜５０６６、３２８９〜８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７〜０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３若しくは６６８０３６、またはそのあらゆる誘導体若しくは類似体を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記２つ以上の化合物、または前記化合物断片が、架橋によって直接に結合し、またはリンカーアームによって間接的に結合している、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、同一のドメイン、キャビティ、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、異なるドメイン、キャビティ、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記化合物、または前記化合物断片が、リンカーアームまたは架橋によって結合している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記リンカーアームが、試薬の結合強度がいずれの個別のリガンドの結合強度よりも大きくなるような可撓性およびサイズを有する、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
二価のまたは多価の試薬の結合が、前記試薬の１つの添加によって抑制または逆転されてもよい、請求項８〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記化合物または前記化合物断片が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環式分子、複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学物質を含む化合物断片を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与するステップが、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜、舌下、局所、直腸、または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせによって投与するステップを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記化合物または前記化合物断片が、少なくとも１つのアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記化合物が、
ａ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うソフトウェアを使用して、前記ドメイン、キャビティまたは結合部位に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｂ）化合物を結合部位内にドッキングさせるソフトウェアを使用して、前記化合物を前記ドメイン、キャビティまたは結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｃ）結合親和性のスコアリングを提供するソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を得るステップと、
を含む方法を使用して同定される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
膜結合受容体または共受容体と、Ｗｎｔシグナル伝達経路構成要素との相互作用を妨げる、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類線維腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法。
【請求項１９】
骨形成または骨再構築に関与する膜結合受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨げる、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類線維腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法。
【請求項２０】
骨形成または骨再構築に関与する膜結合受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨げる、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法。
【請求項２１】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨げる、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌．類線維腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法。
【請求項２２】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨げる、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類線維腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法。
【請求項２３】
前記化合物が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６を含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６を含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記２つ以上の化合物または前記化合物断片が、架橋によって直接に結合し、またはリンカーアームによって間接的に結合している、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、同一のドメイン、キャビティ、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、異なるドメイン、キャビティ、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記化合物、または前記化合物断片が、リンカーアームまたは架橋によって結合している、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記リンカーアームが、試薬の結合強度がいずれの個別のリガンドの結合強度よりも大きくなるような可撓性およびサイズを有する、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
二価のまたは多価の試薬結合が、前記試薬の１つの添加によって抑制または逆転されてもよい、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記化合物または前記化合物断片が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環式分子、複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学物質を含む化合物断片を含む、請求項１８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記投与するステップが、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜癌、舌下、局所、直腸、または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせによって投与するステップを含む、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記化合物または前記化合物断片が、少なくとも１つのアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、請求項１８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記化合物が、
ａ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うソフトウェアを使用して、前記ドメイン、キャビティまたは結合部位内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｂ）化合物を結合部位内にドッキングさせるソフトウェアを使用して、前記化合物を前記ドメイン、キャビティまたは結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｃ）結合親和性のスコアリングを提供するソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を得るステップと、
を含む方法を使用して同定される、請求項１８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
膜結合受容体または共受容体と、Ｗｎｔシグナル伝達経路構成要素との結合を防止する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の処置のための治療用組成物。
【請求項３６】
骨形成または骨再構築に関与する膜結合受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との結合を防止する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、結腸直腸癌、類線維腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の処置のための治療用組成物。
【請求項３７】
骨形成または骨再構築に関与する受容体、膜結合受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との結合を防止する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の処置のための治療用組成物。
【請求項３８】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との結合を防止する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の処置のための治療用組成物。
【請求項３９】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との結合を防止する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の処置のための治療用組成物。
【請求項４０】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６を含む、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６を含む、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
前記２つ以上の化合物または化合物断片が架橋によって直接に結合し、またはリンカーアームによって間接的に結合している、請求項４０または４１に記載の組成物。
【請求項４３】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、同一のドメイン、キャビティ、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、異なるドメイン、キャビティ、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記化合物、または前記化合物断片がリンカーアームまたは架橋によって結合している、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記リンカーアームが、試薬の結合強度がいずれの個別のリガンドの結合強度よりも大きくなるような可撓性およびサイズである、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
二価または多価の試薬の結合が、前記試薬の１つの添加によって抑制または逆転されてもよい、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記化合物または前記化合物断片が、低分子化合物と、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環式分子、複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学物質を含む化合物断片を含む、請求項３５〜４７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
前記投与するステップが、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜癌、舌下、局所、直腸、または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせによって投与するステップを含む、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記化合物または前記化合物断片が、少なくとも１つのアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、請求項３５〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
前記非天然化合物が、
ａ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うソフトウェアを使用して、前記ドメイン、キャビティまたは結合部位内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｂ）化合物を結合部位内にドッキングさせるソフトウェアを使用して、前記化合物を前記キャビティ内にドッキングさせるステップと、
ｃ）結合親和性のスコアリングを提供するソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を得るステップと、
を含む方法を使用して同定される、請求項３５〜５０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記組成物が薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項３５〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記組成物が錠剤、丸薬、糖衣錠、液体、ゲル、カプセル、シロップ、スラリーまたは懸濁液として調合される、請求項３５〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
膜結合受容体または共受容体と、Ｗｎｔシグナル伝達経路構成要素との相互作用を妨げる、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の処置のための治療用組成物。
【請求項５５】
骨形成または骨再構築に関与する膜結合受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨げる、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の処置のための治療用組成物。
【請求項５６】
骨形成または骨再構築に関与する膜結合受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨げる、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、結腸直腸癌、類線維腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の処置のための治療用組成物。
【請求項５７】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨げる、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の処置のための治療用組成物。
【請求項５８】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨げる、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の処置のための治療用組成物。
【請求項５９】
前記化合物が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６を含む請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記化合物が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６またはそのあらゆる誘導体または類似体を含む、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記２つ以上の化合物または前記化合物断片が架橋によって直接に結合し、またはリンカーアームによって間接的に結合する、請求項５９または６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、同一のドメイン、キャビティ、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、異なるドメイン、キャビティ、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記化合物、または前記化合物断片が、リンカーアームまたは架橋によって結合している、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記リンカーアームが、試薬の結合強度がいずれの個別のリガンドの結合強度よりも大きくなるような可撓性およびサイズである、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
二価のまたは多価の試薬の結合が、前記試薬の１つの添加によって抑制または逆転されてもよい、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記化合物または前記化合物断片が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環式分子、複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学物質を含む化合物断片を含む、請求項５４〜６６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６８】
前記投与するステップが、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜癌、舌下、局所、直腸、または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせによって投与するステップを含む、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
前記非天然化合物が、
ａ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うソフトウェアを使用して、前記ドメイン、キャビティまたは結合部位内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｂ）化合物結合部位内に化合物をドッキングさせるソフトウェア使用して、前記化合物を前記ドメイン、キャビティまたは結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｃ）結合親和性のスコアリングを提供するソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を得るステップと、
を含む方法を使用して同定される、請求項５４〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７０】
薬学的に許容可能なキャリアをさらに含む、請求項５４〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７１】
前記組成物が、錠剤、丸薬、糖衣錠、液体、ゲル、カプセル、シロップ、スラリーまたは懸濁液として調合される、請求項５４〜６９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７２】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を促進しまたは阻害する、薬剤候補または化合物を同定する方法であって、
ａ）前記ＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位の仮想構造を決定するステップと、
ｂ）前記ドメイン、キャビティまたは結合部位上の特定の結合キャビティを同定するステップと、
ｃ）前記結合キャビティ内の特異的部位を同定するステップと、
ｄ）前記特異的部位内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
を含む、方法。
【請求項７３】
Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を同定するステップをさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記特定の結合キャビティを同定するステップが、化合物の生物学的機能に基づいて実験を行うステップを含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記実験が突然変異分析を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記ディシブルドタンパク質が非可溶性または膜結合性である、請求項７２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を促進しまたは阻害する、薬剤候補または化合物を同定する方法であって、
ａ）前記ＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位の仮想構造を決定するステップと、
ｂ）前記ドメイン、キャビティまたは結合部位上の特定の結合キャビティを同定するステップと、
ｃ）前記結合キャビティ内の特異的部位を同定するステップと、
ｄ）ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを使用して、前記特異的部位内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｅ）Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを使用して、前記化合物を前記特異的部位内にドッキングさせるステップと、
ｆ）Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を得るステップと、
を含む、方法。
【請求項７８】
前記特定の結合キャビティを同定するステップが、化合物の生物学的機能に基づいて実験を行うステップを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記実験が突然変異分析を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記ディシブルドタンパク質が非可溶性または膜結合性である、請求項７６〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位に結合する薬剤候補化合物を同定する方法であって、
ａ）アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ、ＰＤＺドメイン、キャビティ、または結合部位の類似体または誘導体またはあらゆるそれらの組み合わせの使用を含む、前記ドメイン、キャビティまたは結合部位の仮想または計算的構造を決定するステップと、
ｂ）突然変異分析、アミノ酸の化学修飾、共結晶構造解析、ＮＭＲ、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む生物学的機能に基づいた実験の使用を通じて、前記ドメイン、キャビティまたは結合部位上の特定の結合キャビティを同定するステップと、
ｃ）突然変異または化学修飾に基づいて前記結合キャビティ内の特異的結合部位を同定するステップと、
ｄ）ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを使用して、前記特異的部位内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｅ）Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを使用して、最高の結合親和性または最低エネルギーを有する化合物を同定し、最も良く適合する化合物を見出すステップと、
を含む、方法。
【請求項８２】
ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位に結合する薬剤候補化合物を同定する方法であって、
ａ）アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ、ＰＤＺドメイン、キャビティ、または結合部位の類似体または誘導体またはあらゆるそれらの組み合わせの使用を含む、前記ドメイン、キャビティまたは結合部位の仮想または計算的構造を決定するステップと、
ｂ）突然変異分析、化学修飾、共結晶構造解析、ＮＭＲ、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む生物学的機能に基づいた実験の使用を通じて、前記ドメイン、キャビティまたは結合部位上の特定の結合キャビティを同定するステップと、
ｃ）前記実験から得られた結果に基づいて前記結合キャビティ内の特異的結合部位を同定するステップと、
ｄ）ＵＮＩＴＹ（商標）プログラムを使用して、前記結合キャビティ内または前記結合キャビティ中の前記特異的部位内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｅ）Ｆｌｅｘｘ（商標）プログラムを使用して、前記化合物を前記結合キャビティ内または前記結合キャビティ中の前記特異的部位内にドッキングさせるステップと、
ｆ）Ｃｓｃｏｒｅ（商標）プログラムを使用して、最高の結合親和性または最低エネルギーがある化合物を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項８３】
ディシブルドタンパク質に結合する薬剤候補または化合物を同定する方法であって、
ａ）アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ、ディシブルドタンパク質の類似体または誘導体、またはあらゆるそれらの組み合わせの使用を含む、前記タンパク質の仮想または計算的構造を提供しまたは判定するステップと、
ｂ）突然変異分析、アミノ酸の化学修飾、共結晶構造解析、ＮＭＲ、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む様々な実験を使用して、前記タンパク質上の特定の結合キャビティ、部位またはドメインを同定するステップと、
ｃ）前記実験の結果に基づいて、前記結合キャビティ、部位またはドメイン内の特異的結合部位を同定するステップと、
ｄ）薬剤候補化合物のライブラリーをスクリーニングして、前記特異的結合部位または前記結合キャビティ、部位またはドメインに最良のフィットを有する薬剤候補または化合物を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項８４】
ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位に結合する薬剤候補または化合物を同定する方法であって、
ａ）アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ、ＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位の類似体または誘導体、またはあらゆるそれらの組み合わせの使用を含む、前記ドメイン、キャビティまたは結合部位の仮想または計算的構造を提供しまたは判定するステップと、
ｂ）突然変異分析、アミノ酸の化学修飾、共結晶構造解析、ＮＭＲ、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む様々な実験を使用して、前記ドメイン、キャビティまたは結合部位上の特定の結合部位を同定するステップと、
ｃ）前記実験の結果に基づいて、前記特定の結合部位内の特異的結合キャビティを同定するステップと、
ｄ）薬剤候補化合物のライブラリーをスクリーニングして、前記特異的結合キャビティまたは前記結合ドメイン、キャビティまたは部位に最良のフィットを有する薬剤候補または化合物を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項８５】
Ｗｎｔシグナル伝達経路に関与するタンパク質に結合する薬剤候補または化合物を同定する方法であって、
ａ）アミノ酸配列決定、Ｘ線結晶構造解析、ＮＭＲ、Ｗｎｔシグナル伝達経路に関与するタンパク質の類似体または誘導体、またはあらゆるそれらの組み合わせの使用を含む、前記受容体タンパク質の仮想または計算的構造を提供しまたは判定するステップと、
ｂ）突然変異分析、アミノ酸の化学修飾、共結晶構造解析、ＮＭＲ、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む様々な実験を使用して、前記タンパク質上の特定の結合キャビティ、部位またはドメインを同定するステップと、
ｃ）前記実験の結果に基づいて、前記結合キャビティ、部位またはドメイン内の特異的結合部位を同定するステップと、
ｄ）薬剤候補化合物のライブラリーをスクリーニングして、前記特異的結合部位または前記結合キャビティ、部位またはドメインに最良のフィットを有する薬剤候補または化合物を同定するステップと、
を含む、方法。
【請求項８６】
フリズルド受容体に対するディシブルドタンパク質の親和性を低減または除去する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、Ｗｎｔシグナル伝達を制御する方法。
【請求項８７】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６を含む、請求項８１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６、またはそのあらゆる誘導体または類似体を含む、請求項８１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記２つ以上の化合物、または前記化合物断片が架橋によって直接に結合し、またはリンカーアームによって間接的に結合している、請求項８７または８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、同一のドメイン、キャビティ、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、異なるドメイン、キャビティ、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記化合物、または前記化合物断片がリンカーアームまたは架橋によって結合している、請求項８１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記リンカーアームが、試薬の結合強度がいずれの個別のリガンドの結合強度よりも大きくなるような可撓性およびサイズである、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
二価のまたは多価の試薬の結合が、前記試薬の１つの添加によって抑制または逆転されてもよい、請求項８９〜９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記化合物または前記化合物断片が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環式分子、複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、若しくは化学物質を含む化合物断片を含む、請求項８１〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記投与するステップが、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜癌、舌下、局所、直腸、または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせによって投与するステップを含む、請求項８１〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記化合物または前記化合物断片が、少なくとも１つのアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、請求項８１〜９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
骨形成、骨再構築またはＷｎｔシグナル伝達に関与する膜貫通受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）コンピューターソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を前記第１の化合物セットから除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）結合親和性を提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、それらの予測結合能力に基づいて、前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記結合の第１のサブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項９９】
骨形成、骨再構築またはＷｎｔシグナル伝達に関与する膜貫通受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）コンピューターソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を前記第１の化合物セットから除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）結合親和性を提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、それらの予測結合能力に基づいて、前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記結合の第１のサブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１００】
フリズルド受容体とディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）コンピューターソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を前記第１の化合物セットから除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）結合親和性を提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、それらの予測結合能力に基づいて、前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記結合の第１のサブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１０１】
フリズルド受容体とディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）コンピューターソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を前記第１の化合物セットから除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）結合親和性を提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、それらの予測結合能力に基づいて、前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記結合の第１のサブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１０２】
骨形成または骨再構築またはＷｎｔシグナル伝達に関与する膜貫通受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷を含む様々な疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）コンピューターソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を前記第１の化合物セットから除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）結合親和性を提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、それらの予測結合能力に基づいて前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記結合の第１のサブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１０３】
骨形成または骨再構築またはＷｎｔシグナル伝達に関与する膜貫通受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷を含む様々な疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）コンピューターソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を前記第１の化合物セットから除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）結合親和性を提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、それらの予測結合能力に基づいて、前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記結合の第１のサブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１０４】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷を含む様々な疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）コンピューターソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を前記第１の化合物セットから除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）結合親和性を提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、それらの予測結合能力に基づいて、前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記結合の第１のサブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１０５】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷を含む様々な疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）コンピューターソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を前記第１の化合物セットから除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）結合親和性を提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、それらの予測結合能力に基づいて前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたコンピューターソフトウェアを使用して、前記結合の第１のサブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１０６】
前記理想的化合物の結合親和性を、蛍光分光法を使用して判定するステップをさらに含む、請求項９８〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記クエリーが２つの水素結合供与体および２つの水素結合受容体を含む、請求項９８〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記スコアリングシステムがＦスコアを割り当てるステップを含む、請求項９８〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記スコアリングシステムが最高の合意結合スコアを割り当てるステップを含む、請求項９８〜１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記理想的化合物と前記ドメインとの間の相互作用を分子動力学シミュレーション研究の使用を通じて調査するステップをさらに含む、請求項９８〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記相互作用の結合自由エネルギーをＭＭ−ＰＢＳＡアルゴリズムの使用を通じて計算するステップをさらに含む、請求項９８〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６を含む、請求項９８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６、またはそのあらゆる誘導体または類似体を含む、請求項９８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記２つ以上の化合物または前記化合物断片が架橋によって直接に結合し、またはリンカーアームによって間接的に結合している、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、同一のドメイン、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、異なる結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記２つ以上の化合物または前記化合物断片が、リンカーアームまたは架橋によって結合している、請求項９８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記リンカーアームが、試薬の結合強度がいずれの個別のリガンドの結合強度よりも大きくなるような可撓性およびサイズである、請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
二価のまたは多価の試薬の結合が前記試薬の１つの添加によって抑制または逆転されてもよい、請求項１１４〜１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記化合物または前記化合物断片が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環式分子、複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質糖脂質、リポタンパク質若しくは化学物質を含む化合物断片を含む、請求項９８〜１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記投与するステップが、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜癌、舌下、局所、直腸、または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせによって投与するステップを含む、請求項９８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記化合物または前記化合物断片が、少なくとも１つのアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、請求項９８〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
骨形成、骨再構築またはＷｎｔシグナル伝達に関与する膜貫通受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記ドメイン内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｃ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記化合物を前記ドメイン内にドッキングさせるステップと、
ｄ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を同定するステップと、
ｅ）前記化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１２４】
骨形成、骨再構築またはＷｎｔシグナル伝達に関与する膜貫通受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記ドメイン内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｃ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記化合物を前記ドメイン内にドッキングさせるステップと、
ｄ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を同定するステップと、
ｅ）前記化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１２５】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記ドメイン内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｃ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記化合物を前記ドメイン内にドッキングさせるステップと、
ｄ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を同定するステップと、
ｅ）前記化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１２６】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記ドメイン内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｃ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記化合物を前記ドメイン内にドッキングさせるステップと、
ｄ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を同定するステップと、
ｅ）前記化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１２７】
骨形成または骨再構築またはＷｎｔシグナル伝達に関与する膜結合受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記ドメイン内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｃ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記化合物を前記ドメイン内にドッキングさせるステップと、
ｄ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を同定するステップと、
ｅ）前記化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１２８】
骨形成または骨再構築またはＷｎｔシグナル伝達に関与する膜結合受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記ドメイン内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｃ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記化合物を前記ドメイン内にドッキングさせるステップと、
ｄ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を同定するステップと、
ｅ）前記化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１２９】
フリズルド受容体とディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記ドメイン内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｃ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記化合物を前記ドメイン内にドッキングさせるステップと、
ｄ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を同定するステップと、
ｅ）前記化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１３０】
フリズルド受容体とディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する、少なくとも１つの非天然化合物、少なくとも１つの非天然化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせを投与するステップを含む、結腸直腸癌、類腱腫、子宮内膜癌、胃癌、肝細胞癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、子宮癌、乳癌、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、神経芽細胞腫、肝芽細胞腫を含む様々な癌性疾患、糖尿病、脱毛、骨折、骨疾患、骨損傷、骨量損失、汗腺疾患、乳腺疾患を含むその他の疾患、またはＷｎｔシグナル伝達経路が重要な役割を果たす哺乳類対象におけるあらゆるその他の疾患の治療方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）受容体部位に適合する分子の立体配座検索を行うようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記ドメイン内に適合する化合物をスクリーニングするステップと、
ｃ）分子を結合部位内にドッキングさせるようにデザインされたソフトウェアを使用して、前記化合物を前記ドメイン内にドッキングさせるステップと、
ｄ）結合親和性のスコアリングシステムを提供するようにデザインされたソフトウェアを使用して、最高の結合親和性を有する化合物を同定するステップと、
ｅ）前記化合物を哺乳類対象に投与するステップ
を含む、方法。
【請求項１３１】
核磁気共鳴分光法を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記化合物の結合能力を試験するステップをさらに含む、請求項１２３〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
蛍光分光法を使用して前記化合物の結合親和性を判定するステップをさらに含む、請求項１２３〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３３】
分子動力学シミュレーション研究の使用を通じて、前記化合物と前記ドメインとの間の相互作用を調査するステップをさらに含む、請求項１２３〜１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
ＭＭ−ＰＢＳＡアルゴリズムの使用を通じて、前記相互作用の結合自由エネルギーを計算するステップをさらに含む、請求項１２３〜１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６を含む、請求項１２３〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記化合物または前記化合物断片が、ＮＣＩ６６８０３６、ＮＣＩ２２１１２０、ＮＣＩ１０７１４６、ＮＣＩ１４５８８２、ＮＣＩ１６１６１３、８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９、３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、２３７２−２３９３、１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５２１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３または６６８０３６、またはそのあらゆる誘導体または類似体を含む、請求項１２３〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記２つ以上の化合物または前記化合物断片が架橋によって直接に結合し、またはリンカーアームによって間接的に結合している、請求項１３５または１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが同一のドメイン、結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記化合物、前記化合物断片、またはあらゆるそれらの組み合わせが、異なる結合部位、受容体またはタンパク質上の第１の位置および第２の位置にドッキングする、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記２つ以上の化合物または前記化合物断片が、リンカーアームまたは架橋によって結合している、請求項１２３〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記リンカーアームが、試薬の結合強度がいずれの個別のリガンドの結合強度よりも大きくなるような可撓性およびサイズである、請求項１３７〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
二価のまたは多価の試薬結合が前記試薬の１つの添加によって抑制または逆転されてもよい、請求項１３７〜１４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記化合物または前記化合物断片が、低分子化合物、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、環式分子、複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質、糖脂質、リポタンパク質、化学物質、または複素環式有機分子、核酸、脂質、荷電脂質、極性脂質、非極性脂質、糖、糖タンパク質糖脂質、リポタンパク質若しくは化学物質を含む化合物断片を含む、請求項１２３〜１４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４４】
前記投与するステップが、吸入、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、非経口、経皮、膣内、鼻腔内、粘膜癌、舌下、局所、直腸、または皮下投与、またはあらゆるそれらの組み合わせによって投与するステップを含む、請求項１２３〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記化合物または前記化合物断片が、少なくとも１つのアゴニスト、アンタゴニスト、部分的アゴニスト、またはあらゆるそれらの組み合わせを含む、請求項１２３〜１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
骨形成、骨再構築またはＷｈｔシグナル伝達に関与する膜貫通受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメインとの結合を防止する方法であって、
ｉ．複数の試験化合物を提供するステップと、
ｉｉ．ＵＮＩＴＹソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｉｉｉ．ＵｎｉｔｙのＦｌｅｘｘ検索モデルを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｉｖ．ＳＹＢＹＬのＦｌｅｘｘプログラムを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｖ．前記第１の化合物セットから前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｖｉ．ＳＹＢＹＬのＣｓｃｏｒｅプログラムを使用して、それらの予測結合能力に基づいて、前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｖｉｉ．Ｃｓｃｏｒｅの採点機能を使用して、前記第１の結合サブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｖｉｉｉ．核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉｘ．前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｘ．所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｘｉ．前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１４７】
骨形成、骨再構築またはＷｈｔシグナル伝達に関与する膜貫通受容体または共受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメインとの相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）ＵＮＩＴＹソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）ＵｎｉｔｙのＦｌｅｘｘ検索モデルを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）ＳＹＢＹＬのＦｌｅｘｘプログラムを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記第１の化合物セットから前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）ＳＹＢＹＬのＣｓｃｏｒｅプログラムを使用して、それらの予測結合能力に基づいて、前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）Ｃｓｃｏｒｅの採点機能を使用して、前記第１の結合サブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１４８】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質の少なくとも１つのドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）ＵＮＩＴＹソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）ＵｎｉｔｙのＦｌｅｘｘ検索モデルを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）ＳＹＢＹＬのＦｌｅｘｘプログラムを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記第１の化合物セットから前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）ＳＹＢＹＬのＣｓｃｏｒｅプログラムを使用して、それらの予測結合能力に基づいて、前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）Ｃｓｃｏｒｅの採点機能を使用して、前記第１の結合サブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【請求項１４９】
フリズルド受容体と、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメイン、キャビティまたは結合部位との相互作用を妨害する方法であって、
ａ）複数の試験化合物を提供するステップと、
ｂ）ＵＮＩＴＹソフトウェアの使用を含む、クエリーをデザインするステップと、
ｃ）ＵｎｉｔｙのＦｌｅｘｘ検索モデルを使用して、前記複数の化合物内で前記クエリーの要件を満たす第１の化合物セットをスクリーニングするステップと、
ｄ）ＳＹＢＹＬのＦｌｅｘｘプログラムを使用して、前記第１の化合物セットを前記ドメインの結合部位内にドッキングさせるステップと、
ｅ）前記第１の化合物セットから前記ドメインの結合ポケット内にドッキングしなかった化合物を除去して、第１の結合化合物サブセットを得るステップと、
ｆ）ＳＹＢＹＬのＣｓｃｏｒｅプログラムを使用して、それらの予測結合能力に基づいて、前記第１の結合化合物サブセットを格付けするステップと、
ｇ）Ｃｓｃｏｒｅの採点機能を使用して、前記第１の結合サブセット内で最良の結合能力を有する第２の結合化合物サブセットを同定するステップと、
ｈ）核磁気共鳴分光計を提供するステップと、
ｉ）前記核磁気共鳴分光計を使用して得られた化学シフト摂動に従って、前記第２の結合化合物サブセットの結合能力を試験するステップと、
ｊ）所望の化学シフト摂動がある少なくとも１つの理想的化合物を同定するステップと、
ｋ）前記理想的化合物を哺乳類対象に投与するステップと、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連特許出願の参照
本出願は、２００５年３月１８日に出願された「スクレロスチン、およびＷｎｔシグナル伝達と骨形成に対する阻害（Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｎ  Ｗｎｔ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」（ダンウ（Ｄａｎ  Ｗｕ）ら）と題された特許出願の一部継続出願である。本出願は、参照によってその内容全体を本明細書に援用する２００４年５月１９日に出願された「骨形成および細胞自己再生の刺激または改良のための組成物および方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｅｌｆ−Ｒｅｎｅｗａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｓ）」と題された米国特許出願第１０／８４９，６４３号に関する。本出願はまた、参照によってその内容全体を本明細書に援用する２００４年５月１９日に出願された「骨形成および再構築のための組成物および方法（Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｂｏｎｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ）」と題された米国特許出願第１０／８４９／０６７号に関する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、カノニカルおよび非カノニカルＷｎｔシグナル伝達経路において、膜貫通受容体フリズルド（ｆｒｉｚｚｌｅｄ）からのＷｎｔシグナルを下流構成要素に並進させる、ディシブルドタンパク質（Ｄｉｓｈｅｖｅｌｌｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ）に関する。本発明は、発病に関与するＷｎｔシグナル伝達によって引き起こされる様々な疾患の処置における、治療法、組成物、およびその使用の分野に関する。より詳しくは組成物および方法は、フリズルドとディシブルドとの相互作用を妨げる化合物に向けたものである。化合物はスクリーニング法を使用して、化合物ライブラリーから同定される。これらの化合物をまた変性して、ライブラリー中または天然に存在しない、効果的に機能する誘導体または類似体を作り出してもよい。
【０００３】
本出願で引用または特定される全ての特許、特許出願、特許公報、科学論文などは、本発明が関係する現状技術についてより詳細に述べるために、その全体を参照によって本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
Ｗｎｔシグナル伝達経路は胚および後胚の発達に重要な役割を果たし、腫瘍形成に関係していると見なされている。カノニカルＷｎｔ−β−カテニン経路では、分泌されたＷｎｔ糖タンパク質が７つの膜貫通ドメインフリズルド（Ｆｚ）受容体に結合して、細胞内ディシブルド（Ｄｖｌ）タンパク質を活性化する。次に活性化されたＤｖｌタンパク質は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）を阻害する。この阻害はＧＳＫ−３β、大腸腺腫様ポリポーシス（ＡＰＣ）、アキシン、およびβ−カテニンによって形成された分子複合体の不安定化を引き起こし、ＧＳＫ−３βがβ−カテニンをリン酸化する能力を低下させる。非リン酸化β−カテニンタンパク質は、ユビキチン化および分解から逃れて細胞質中に蓄積する。この蓄積はβ−カテニンの核内への転位置をもたらし、それはそこでＴ細胞因子／リンパ系増強因子（Ｔｃｆ／Ｌｅｆ）をコードする遺伝子などのＷｎｔ標的遺伝子の転写を刺激する。多数のレポートが、新生物形成の発生に関与するＷｎｔ−β−カテニンシグナル伝達経路構成要素の突然変異を扱っている。
【０００５】
Ｗｎｔ経路と癌の間のつながりは、Ｗｎｔシグナル伝達の最初の発見にまでさかのぼる。第１の脊椎動物Ｗｎｔ生育因子は、マウスの乳癌においてプロウイルスの挿入によって活性化される細胞性癌遺伝子（Ｗｎｔ−１）の生成物として同定された。おそらく発癌におけるＷｎｔシグナル伝達の役割を支持する最も抗しがたい証拠は、およそ８５％の結腸直腸癌が、Ｗｎｔ経路の重要な構成要素の１つであるＡＰＣの突然変異によって特徴づけられるという知見である。Ｗｎｔシグナル伝達経路のメンバーはまた、バーキットリンパ腫、髄芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、および神経芽細胞腫などの様々な小児科癌の発病にも結びつけられている。さらに異常なＷｎｔシグナル伝達は、骨粗鬆症および糖尿病などのその他の疾患にも関与する。
【０００６】
Ｄｖｌは膜結合受容体からのＷｎｔシグナルを下流構成要素に伝達し、それによってＷｎｔシグナル伝達経路において必須の役割を果たす。Ｄｖｌタンパク質は動物界全体にわたり高度に保存されている。３つのＤｖｌホモログ、Ｄｖｌ−１、−２、および−３が、哺乳類系において同定されている。全ての３つのヒトＤｖｌ遺伝子は、脳、肺、腎臓、骨格筋、および心臓をはじめとする胎児および成人組織で広範に発現される。Ｄｖｌタンパク質は、Ｎ末端ＤＩＸドメイン、中央ＰＤＺモチーフ、およびＣ末端ＤＥＰドメインから構成される。これらの３つの内で、ＰＤＺドメインは、カノニカルおよび非カノニカルＷｎｔ経路の双方で重要な役割を果たすようである。確かにＤｖｌのＰＤＺドメインは、２つの経路間の顕著な役割だけでなく核局在化にも関与しているかもしれない。最近、マウスＤｖｌ−１（ｍＤｖｌ１）のＰＤＺドメイン（残基２４７〜３４１）とその結合パートナー間の相互作用が、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法を使用して調査された。ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメインのペプチド相互作用部位は、その配列が明白な相同性を持たない様々な分子と相互作用する。典型的なＰＤＺ結合モチーフではないが、ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメインに結合する１つのペプチドは、Ｆｚの保存されたモチーフ（ＫＴＸＸＸＷ）であり、それは７番目の膜貫通ドメイン後の２個のアミノ酸で始まる。この知見はＦｚとＤｖｌの間に直接の相互作用があることを示し、膜結合受容体とＷｎｔシグナル伝達経路の下流構成要素間の以前は未知であった関係を明らかにした。したがってＤｖｌ  ＰＤＺドメインの阻害物質は、ＤｖｌレベルでＷｎｔシグナル伝達経路を効果的にブロックする可能性がある。
【０００７】
Ｗｎｔ−β−カテニン経路におけるＤｖｌ  ＰＤＺドメインの特別な役割は、それを理想的な薬学的標的にする。Ｄｖｌ中のＰＤＺドメインの小型有機阻害物質は、分子機序を精査して、腫瘍またはその中でＷｎｔシグナル伝達が発病に関与するその他の疾患を標的とする医薬品を配合するのに有用かもしれない。Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインの構造に照らして仮想リガンドスクリーニングを使用し、Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインに結合する非ペプチド化合物ＮＣＩ６６８０３６を同定した。さらにＮＭＲ実験によって、化合物がＰＤＺドメイン表面のペプチド結合部位に結合することを確認した。化合物の結合親和性（解離定数、ＫＤ）は、蛍光分光法によって測定された。さらに本発明者らは、この化合物とＰＤＺドメイン間、ならびに既知のＰＤＺドメイン阻害物質（Ｄａｐｐｅｒ）のＣ末端領域とＰＤＺドメインとの間の相互作用の分子動力学（ＭＤ）シミュレーションを実施し、本発明者らは、分子力学ポアソン・ボルツマン表面積（ＭＭ−ＰＢＳＡ）法によって計算される、これらの相互作用の結合自由エネルギーを比較した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の要約
本発明は、Ｗｎｔシグナル伝達経路に関与する細胞内ディシブルド（Ｄｖｌ）タンパク質、または前記タンパク質のホモログの活性化または不活性化に基づく。
【０００９】
一態様では、本発明は、仮想スクリーニングを使用して化合物を同定する方法を提供する。
【００１０】
好ましい実施態様では、本発明は、ＮＭＲ支援仮想スクリーニングを行う方法を提供する。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ディシブルドタンパク質または前記ディシブルドタンパク質のホモログに結合する化合物を提供して、これらのタンパク質とフリズルド受容体、またはフリズルド受容体のホモログとの相互作用を妨げる。
【００１２】
なおも別の態様では、本発明は、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメインに結合する化合物を提供して、フリズルド受容体などの膜貫通受容体との相互作用を妨げる。
【００１３】
本発明の他の態様は、本発明に関連した以下の詳細な説明から当業者には明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の詳細な説明
構造ベースのリガンドスクリーニング
構造ベースの仮想スクリーニングの使用によって、ＤｖｌのＰＤＺドメインの可能な阻害物質の検索を行った。ＰＤＺは、２つのαらせんおよび６つのβシートを有するモジュラータンパク質相互作用ドメインである。αＢらせんおよびβＢシートは、βＢがそれに続く先行するループと共にペプチド結合裂溝を形成する。それらの結晶複合体構造において、Ｄａｐｐｅｒペプチド（Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインの結合パートナーの１つに由来する）は、ＰＤＺドメインのβＢシート中のＬｅｕ２６５、Ｇｌｙ２６６、Ｉｌｅ２６７、およびＩｌｅ２６９残基と共に水素結合を形成する。
【００１５】
この溝に結合して、ＰＤＺドメインとその結合パートナー間の相互作用を妨げることができる小型有機化合物を同定するために、トライポス・インコーポレーテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）からのソフトウェアパッケージＳＹＢＹＬ（商標）中のモジュールであるプログラムＵＮＩＴＹ（商標）を使用して、クエリーをデザインした。クエリーは、ＰＤＺドメイン上の２つの水素結合供与体（Ｇｌｙ２６６およびＩｌｅ２６９の主鎖アミド窒素）および２つの水素結合受容体（Ｉｌｅ２６７およびＩｌｅ２６９のカルボニル酸素）からなり、空間制約耐性は０．３Åであった。次にＵＮＩＴＹ（商標）のＦｌｅｘ（商標）検索モジュールを使用して、米国国立癌研究所（ＮＣＩ）の三次元（３Ｄ）低分子化合物データベースを探索し、クエリーの要件を満たす化合物を同定した。３ＤデータベースはＮＣＩから無料で利用でき、それは２５０，０００個を超える薬らしい化合物の座標を含む。ＵＮＩＴＹ（商標）のＦｌｅｘ（商標）検索オプションは化合物の可撓性を考慮し、それは定方向微調整（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔｗｅａｋ）アルゴリズムを使用して、迅速で立体配座的に可撓性の３Ｄ検索を行う。検索から最初のヒットとして１０８個の有機化合物を得た。
【００１６】
次にＳＹＢＹＬ（商標）のＦｌｅｘＸ（商標）プログラムを使用して、これらの１０８個のヒットをＰＤＺドメインの結合部位内に「ドッキング」させた。ＦｌｅｘＸ（商標）は、リガンドの立体配座を変化させて、それをタンパク質結合部位内にフィットさせるエネルギー最小化モデル化ソフトウェアである。対照として、本発明者らはＤａｐｐｅｒペプチドもまたＰＤＺドメイン内にドッキングさせた。残基Ｇｌｙ２６６、Ｉｌｅ２６９、およびＡｒｇ３２５によって選択半径５．９Åで受容体の結合部位を確定し、Ｇｌｙ２６６によって選択半径５．９Åでコアサブポケットを確定した。この条件下で、ドッキングしたＤａｐｐｅｒペプチドは、主鎖根平均二乗変位（ＲＭＳＤ）が２．０４Åの複合体の結晶構造中に見られるのと同様の立体配座を有した。特に６つのＣ末端アミノ酸の主鎖ＲＭＳＤは１．２２Åであり、ドッキング手順が、フルオロフォア標識ＰＤＺドメイン（ＴＭＲ−ＰＤＺ）を使用して、リガンド分光実験でドッキングできたことが示唆された。本発明者らはＮＣＩ６６８０３６をＴＭＲ−ＰＤＺ溶液中に滴定しながら、５７９ｎｍにおけるＴＭＲ−ＰＤＺの蛍光放射（５５２ｎｍでの励起がある）の消光を追跡した。ＴＭＲの蛍光放射は、ＮＣＩ６６８０３６とＰＤＺドメインとの結合のために抑制された。ＮＣＩ６６８０３６濃度に対する蛍光変化の二重逆数プロットから線形相関を得た。マイクロカル・ソフトウェア・インコーポレーテッドからの（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）オリジン（Ｏｒｉｇｉｎ）を使用した一次関数近似から２３７±３１μＭ（図３）のＫＤ（平均±標準偏差）計算した。
【００１７】
Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインとＮＣＩ６６８０３６間の複合体の分子動力学シミュレーション
ＰＤＺドメインとＮＣＩ６６８０３６間の相互作用をさらに詳しく調査するために、アンバー（ＡＭＢＥＲ）（商標）ソフトウェアスイートを使用して、ＮＣＩ６６８０３６−ＰＤＺドメイン複合体の分子動力学（ＭＤ）シミュレーション研究を行った。粒子メッシュエヴァルト（ＰＭＥ）法による平衡後に、明示的水（ｅｘｐｌｉｃｉｔ  ｗａｔｅｒ）の中でＭＤシミュレーションを５ｎｓ実施した。次にＭＭ−ＰＢＳＡアルゴリズムを使用して、ＰＤＺドメインとＮＣＩ６６８０３６間の相互作用の結合自由エネルギーを計算した。
【００１８】
ＭＤシミュレーション中に、十分な可能な結合モードをサンプリングするために、本発明者らは最初のＦｌｅｘＸ（商標）ドッキング結果の全出力部を再検査した。ＦｌｅｘＸ（商標）ドッキングアルゴリズムのデフォルト設定からは、３０個の可能なドッキング立体配座（図４）が得られ、最良のドッキングスコアを有した配座異性体を選択した。ドッキングした３０個のＮＣＩ６６８０３６の立体配座は全体的に非常によく似ていたが、明確なバリエーションがあった。これらの３０個の結合した配座異性体は、３つの主要なグループにまとめられる。グループＩは５個の配座異性体（赤色）を含み、ＮＣＩ６６８０３６中の全原子のＲＭＳＤはこの配座異性体群では０．４６〜０．７７Åの間であり、グループＩＩは１３個の配座異性体（黄色）を有し、ＲＭＳＤは１．４４〜１．７Åの間であり、グループＩＩＩは１２個の配座異性体（青色）を有し、ＲＭＳＤは２．３１〜２．８６Åの間である（図３Ａ）。これらのドッキング配座異性体の手動検査から、ＭＤシミュレーションの出発点として１０個の配座異性体の選択が導かれた（ＭＤシミュレーションで使用されるパラメーターの一覧については表１を参照されたい）。これらの１０個の配座異性体の内、１個はグループＩ（配座異性体６）から、５個はグループＩＩ（配座異性体４、７、１０、１４、および１５）から、４個はグループＩＩＩ（配座異性体１２、２２、２６、および２７）から得られた。１０回のＭＤシミュレーションラン中に、配座異性体２２（グループＩＩＩ）で始めたシミュレーションが最低で最安定の結合自由エネルギーを有し、この配座異性体が溶液中でＮＣＩ６６８０３６の真のＰＤＺドメイン結合立体配座に相当することが示唆された。
【００１９】
ＮＣＩ６６８０３６結合Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインの構造
配座異性体２２で始めたＭＤシミュレーションを詳細に分析した。５ｎｓのＭＤ生成ラン中に、ＭＤシステム（ウォーターボックスを含む）の総エネルギーは−４４５５２．６ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１〜−４４３４４．２ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１（平均、−４４４５０．８ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１）の間で変動し、根平均二乗（ｒｍｓ）は３２．６ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１であった（図５Ａおよび５Ｃ）。最低エネルギーは４．９０５ｎｓで起き、この時点でのＮＣＩ６６８０３６結合ｍＤｖｌ１の構造を図６Ａに示す。複合体中でＮＣＩ６６８０３６は、Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインのＬｅｕ２５８、Ｇｌｙ２５９、Ｉｌｅ２６０、Ｉｌｅ２６２、およびＡｒｇ３１８残基と水素結合を形成し（図６Ｂ）、リガンドとＰＤＺドメイン中の残基の間の密接な疎水性接触もまた観察された。例えば炭素Ｃ１に結合するバリル基は、残基Ｌｅｕ２５８、ｌｌｅ２６０、Ｉｌｅ２６２、Ｌｅｕ３１７、およびＶａｌ３１４の疎水性側鎖、ならびにＡｒｇ３１８のＣβ側鎖の３．５Å内である。さらにＣ１７メチル基はＰｈｅ２５７の３．５Å内であり、「Ｃ」末端ｔ−ブチル基は、（２つの残基の疎水性側鎖の３．５Å内で）Ｖａｌ２６３およびＶａｌ３ｌ４との疎水性接触を有した。
【００２０】
結合ＮＣＩ６６８０３６は結合Ｄａｐｐｅｒペプチドと類似の立体配座を取る
Ｄａｐｐｅｒペプチドに結合したＰＤＺドメインの結晶構造と、模擬ＮＣＩ６６８０３６−ＰＤＺドメイン複合体との比較からは、双方のリガンドが、ＰＤＺドメインに結合した際に同様の立体配座を取ることが明らかにされた（図５Ｃおよび５Ｄ）。ＰＤＺドメイン−ＮＣＩ６６８０３６およびＰＤＺドメイン−Ｄａｐｐｅｒペプチドの双方の質量加重主鎖ＲＭＳＤ（４個のＣ末端アミノ酸ＭＴＴＶのみがＲＭＳＤ計算に含まれた）は、１．４９Åであった。ＮＣＩ６６８０３６の主鎖は、主鎖中のカルボキシレート基（Ｃ）のカルボニル炭素とＮＣＩ６６８０３６の別の末端のカルボニル炭素（Ｃ８）とそれらの間の原子として画定された（全部で１３個の原子、図１）。
【００２１】
ＰＤＺドメイン−ＮＣＩ６６８０３６複合体で行ったＭＤシミュレーションと類似したさらに詳細な比較を行うために、本発明者らは最初に、ＰＤＺドメインおよびＤａｐｐｅｒペプチドからなる複合体の５ｎｓ  ＭＤシミュレーションを実施した。各ＭＤシミュレーションで１０００枚の「スナップショット」を保存し、詳細に分析した（図５）。ＭＤシミュレーションは２つの複合体内の水素結合の徹底的な比較を可能にし、それらの水素結合を１０００枚のスナップショット内のそれらの占有百分率と共に表５に列挙する。２つの複合体間の最も著しい違いは、Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ（ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメイン中のＰｈｅ２５７−Ｌｅｕ２５８−Ｇｌｙ２５９−Ｉｌｅ２６０）の保存モチーフと結合ペプチドのＣ末端残基によって形成された「カルボキシレート結合ループ」間の水素結合網目状組織内であった。この水素結合網目状組織は、ＰＤＺドメインのＣ末端ペプチド複合体構造の顕著な特徴であり、ＤａｐｐｅｒＰＤＺドメイン複合体の構造中で、Ｌｅｕ２５８、Ｇｌｙ２５９、およびＩｌｅ２６０のアミド基は、Ｄａｐｐｅｒペプチドのカルボキシレート基に水素結合を供与する。ＮＣＩ６６８０３６−ＰＤＺドメイン複合体では、エーテル結合の可撓性のために、Ｃ末端カルボキシレート基および酸素Ｏ３はシス立体配座にあった。この立体配座は、酸素Ｏ３およびＣ末端カルボキシレート基の双方が「水素網目状組織」に関与することを可能にした。Ｇｌｙ２５９およびＩｌｅ２６０のアミド基は酸素Ｏ３と水素結合を形成し、ＮＣＩ６６８０３６のＣ末端カルボキシレート基はＬｅｕ２５８のアミド基と水素結合を形成する。「カルボキシレート結合網目状組織」の外では、２つの結合リガンドが、非常によく似た宿主ＰＤＺドメインとの水素結合および疎水性接触を有した。したがってＤａｐｐｅｒペプチドの増大する結合親和性は、おそらくペプチドの余分の長さに起因し、結合Ｄａｐｐｅｒペプチドの残基Ｌｙｓ５、Ｌｅｕ６、およびＳｅｒ７は宿主ＰＤＺドメインと複数の水素結合および疎水性接触を形成する。
【００２２】
ＤａｐｐｅｒペプチドおよびＮＣＩ６６８０３６とＰＤＺドメインとの結合事象をさらに詳しく比較するために、複合体の結合自由エネルギーを調べた。正規モード分析と組み合わせたＭＭ−ＰＢＳＡアプローチを使用して、双方のシステムの絶対的結合自由エネルギーを計算した。結合自由エネルギーはＰＤＺ−ＮＣＩ６６８０３６複合体で−１．８８ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１であり、ＰＤＺ−Ｄａｐｐｅｒペプチド複合体で−７．４８ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１であった（ＭＭ−ＰＢＳＡ遊離結合エネルギー計算から得られた全エネルギー要素については表２、３、および４を参照されたい）。結合自由エネルギーの相対的格付けは、実験データと一致した。確かに、ＮＣＩ６６８０３６およびＤａｐｐｅｒペプチドの解離定数は２５℃でそれぞれ２３７μＭおよび１０μＭであったので、結合自由エネルギー（Ｇ＝−ＲＴｌｎＫＤ）はＮＣＩ６６８０３６で−４．９４ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１、Ｄａｐｐｅｒペプチドで−６．８２ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１であった。
【００２３】
ＮＣＩ６６８０３６によるＷｎｔシグナル伝達経路阻害
以前の研究において、ＤｖｌのＰＤＺドメインと、Ｗｎｔ受容体Ｆｚの第７の膜貫通らせんのＣ末端である保存された配列とが、直接に相互作用することが実証された。この相互作用は、ＦｚからのＷｎｔシグナルのＤｖｌ下流構成要素への伝達において必須である。したがってＤｖｌ  ＰＤＺドメインの阻害物質は、アンタゴニストとして作用することでＷｎｔシグナル伝達を調節するはずである。ＮＣＩ６６８０３６が確かにＷｎｔシグナル伝達経路を阻害できるかどうかを試験するために、カノニカルＷｎｔ経路の様々な活性化剤と共に、ＮＣＩ６６８０３６を二細胞期のアフリカツメガエル胚の動物極領域内に同時に注射した。次にＲＴ−ＰＣＲを実施して、胞胚から切り取られそれらの発達が初期原腸胚期に達するまで培養された外胚葉外植片におけるＷｎｔ標的遺伝子Ｓｉａｍｏｉｓの発現を分析した。ＲＴ−ＰＣＲ実験では、オルニチン脱炭酸酵素（ＯＤＣ）の発現を負荷対照として使用した。ＮＣＩ６６８０３６はＤｖｌ下流にあるＷｎｔシグナル伝達の構成要素β−カテニンによって誘発されるＳｉａｍｏｉｓ発現に対してわずかな効果しか有さなさなかったが、ＮＣＩ６６８０３６はＷｎｔ３Ａによって誘発されるＳｉａｍｏｉｓを阻害した（図７Ａ）。これらの結果は、ＮＣＩ６６８０３６とＤｖｌブロックのＰＤＺドメインとの結合が、カノニカルＷｎｔ経路中のシグナル伝達をＤｖｌレベルでブロックするという概念に一致する。
【００２４】
次にＮＣＩ６６８０３６が、二次体軸形成を誘発するＷｎｔのよく知られている能力に影響するかどうかを試験した。アフリカツメガエル外胚葉外植片の腹−植物性領域内に注射されたＷｎｔ３Ａは、完全な二次体軸形の形成を誘発した（図７Ｂおよび７Ｃ）。しかしＷｎｔ３Ａと同時に注射すると、ＮＣＩ６６８０３６は、実質的にＷｎｔ３Ａによって誘発された二次体軸形の形成を低下させた（図７Ｄ）。この低下は、部分的二次体軸または単体軸のみがある胚をもたらした（表６参照）。したがってＮＣＩ６６８０３６は、カノニカルＷｎｔ経路においてシグナル伝達を特異的にブロックすると結論づけられる。
【００２５】
ＰＤＺドメインに結合する可能性がある化合物のＵＮＩＴＹ（商標）検索、結合部位内への候補のＦｌｅｘＸ（商標）ドッキング、結合モードのＣｓｃｏｒｅ（商標）格付け、および化学シフト摂動ＮＭＲ実験を使用して、本発明者らは、ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメインに結合できる非ペプチド性小型有機分子（ＮＣＩ６６８０３６）を同定した。これはＮＭＲ支援仮想リガンドスクリーニングが、標的に結合することが予測される低分子化合物をそれらの構造的な徴群に基づいて同定する、実行可能なアプローチであることを示す。
【００２６】
仮想スクリーニング段階の検索クエリーを構築するために、マウスＤｖｌのａｐｏ−ＰＤＺドメインのＮＭＲ溶液構造の代わりに、Ｄａｐｐｅｒペプチドに結合したアフリカツメガエルＤｖｌのＰＤＺドメインの結晶構造を使用した。２つのＰＤＺドメインは、特にペプチド−結合部位周辺で高い相同性を共有した。結合部位近くでは、２つのＰＤＺドメインの間で単一アミノ酸のみの違いがあり（ｍＤｖｌ１のＰＤＺドメイン中のＧｌｕ３１９に対してアフリカツメガエルＤｖｌのＰＤＺドメイン中のＡｓｐ３２６）、この残基の側鎖はペプチド−結合裂溝から遠ざかる方向を向く。ドメインのペプチド結合キャビティは、アフリカツメガエルＤｖｌのＤａｐｐｅｒ結合ＰＤＺドメインの結晶構造中よりも溶液構造のａｐｏ形態中でより小さい。この違いは、ペプチドまたは小型有機分子の結合時に、ＰＤＺドメイン中の結合部位が立体配座変化を被って、結合リガンドを収容する古典的な「誘発適合」機序と一致する。しかしこの可撓性は、ＵＮＩＴＹ（商標）検索およびＦｌｅｘＸ（商標）ドッキングプロトコルを通じては、完全に探索できない。したがって実験的研究においてはマウスＤｖｌのＰＤＺドメインが使用されたが、アフリカツメガエルＤｖｌのＰＤＺドメインの結晶構造は、仮想スクリーニングステップのためのより良いテンプレートを提供する。確かにＰＤＺドメイン−ＮＣＩ６６８０３６のＭＤシミュレーションおよびＰＤＺドメイン−Ｄａｐｐｅｒペプチド複合体から計算される結合自由エネルギーは、実験的結合データに良好に適合する。
【００２７】
ＮＣＩ６６８０３６は、その中で２つのペプチド結合が２つのエーテル結合によって置換されているペプチド模倣剤である。したがってＮＣＩ６６８０３６は、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）で対応するペプチドよりも安定であることが予測される。それはＰＤＺドメインと比較的弱く結合するが、ＮＣＩ６６８０３６は、さらなる修正のためのテンプレートとして使用できる。確かにＮＣＩ６６８０３６は非常に単純な構造を有し、それは非常に安定しており高度に可溶性である。さらにＭＤシミュレーションは、より高い結合親和性（Ｋｄ＝１０μＭ）を有するＰＤＺドメインとＤａｐｐｅｒペプチドの複合体と比べて、ＰＤＺドメインとＮＣＩ６６８０３６によって形成された複合体は、全ての可能な相互作用を完全に利用して結合親和性を最大化しないことを示した。例えば結合親和性は、ＮＣＩ６６８０３６主鎖からの疎水性基の分枝がＰＤＺドメイン中のＰｈｅ２５７の側鎖に接触する場合に、増大することが予期される。
【００２８】
ＮＣＩ６６８０３６は、Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインと特異的に相互作用する。本発明者らは、クラスＩ  ＰＤＺドメインに属するＰＳＤ−９５、ＰＳＤ９５ａの第１のＰＤＺドメイン（ＰＤＢコード：１ＩＵＯ、１ＩＵ２）、およびクラスＩＩ  ＰＤＺドメインメンバーであるグルタミン酸受容体相互作用タンパク質（ＰＤＢコード：１Ｍ５Ｚ）のＰＤＺ７ドメインの２つの別のＰＤＺドメインを試験した（図１２は異なるＰＤＺドメインの構造ベースの配列比較を示す）。ＮＣＩ６６８０３６はこれらのＰＤＺドメインの双方に、極めて弱く結合する。Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインに対するＮＣＩ６６８０３６の特異性は、おそらくドメインのユニークな特徴であろう。Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインは、クラスＩまたはクラスＩＩ  ＰＤＺドメインのどちらにも属さない（図１２）。特にＤｖｌ  ＰＤＺドメインは２つのループを有する。１つは第１および第２βストランドの間（βＡ−βＢループ）であり、もう１つは第２αらせんおよび最後のβ−ストランドの間（βＢ−βＦループ）である。Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインのこれらの２つのループは、典型的なＰＤＺドメインのものよりも長い。Ｃ末端ペプチドに結合した典型的なＰＤＺドメインの構造中で、結合ペプチドのカルボキシレート基はまた、結合水分子を通じてβＡ−βＢループ中のアルギニンのグアニジウム基にも結合する。同一アルギニンの側鎖はまた、βＢ−βＦループ中のグリシンのアミド基とも水素結合を形成する。しかしＤｖｌ  ＰＤＺドメインはアルギニンおよびグリシンの双方を欠いており、典型的なＰＤＺドメイン中で結合水分子を保持するキャビティは、Ｄｖｌ  ＰＤＺ中ではるかに小さい。確かにＤａｐｐｅｒペプチドとの複合体中のＤｖｌ  ＰＤＺドメインの結晶構造中に結合水分子はない。しかしＮＣＩ６６８０３６がＤｖｌ  ＰＤＺドメインに結合すると、酸素Ｏ３はＰＤＺドメインの「カルボキシレート結合ループ」の２つの水素結合関係に参加して、結合ＮＣＩ６６８０３６のカルボキシレート基は空間内に押し出されて狭いキャビティ内に留まった。本発明者らは、このＮＣＩ６６８０３６の結合特性が、Ｄｖｌ  ＰＤＺドメインのための分子の特異性を説明するかもしれないと推測する。換言すると、ＮＣＩ６６８０３６はそのユニークな結合モードを使用してその特異性を達成する。この概念は、本発明者らのＭＤシミュレーション研究の１つからの結果によって支持される。ＭＤシミュレーションランでは、化合物のカルボキシレート基が宿主ＰＤＺドメインとの全ての３つの水素結合を形成するように、ＮＣＩ６６８０３６を結合Ｄａｐｐｅｒペプチド上に重ね合わせて、ＰＤＺドメイン−ＮＣＩ６６８０３６複合体の開始立体配座を作り出した。２００ｐｓの生成ラン後、システムはもはや安定でなかった。
【００２９】
既述のスクリーニング法を使用して、ディシブルドタンパク質のドメインに結合することが分かった追加的化合物を同定した。図８は全てディシブルドタンパク質に結合できることが分かった分子化合物の構造を示す。図９および図１０はディシブルドに結合する化合物の構造を示し、これらはまた非結合であることが分かった化合物も示す。図１１の全化合物構造は、ディシブルドタンパク質のＰＤＺドメインに結合することが分かった。これらの化合物はＮＣＩ化合物、シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）化合物、およびケムディブ（Ｃｈｅｍ  Ｄｉｖ）化合物であった。
【００３０】
ＤｖｌがＷｎｔシグナル伝達経路の岐路に立っており、その中で分子が関与する典型的な結合事象が比較的弱いが微細調整されて良好な平衡状態にあることを考慮すれば、効果的なＤｖｌアンタゴニストは、Ｗｎｔシグナル伝達の分析および様々な経路の精査において非常に有用かもしれない。ＮＣＩ６６８０３６の機能性研究は、この理論を強力に支持する。Ｄｖｌの強力な阻害物質は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の生物学的研究の強力なツールであるのに加えて、さらにその中でＷｎｔシグナル伝達経路が発病において重要な役割を果たす癌およびその他のヒトの疾患の処置で有用な医薬品の開発のための先導化合物として役立つ。
【実施例】
【００３１】
材料および方法
１５Ｎ標識ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメインの精製
１５Ｎ標識マウスＤｖｌ１  ＰＤＺドメイン（ｍＤｖｌ１の残基２４７〜残基３４１）を以前述べられたようにして調製した。タンパク質の溶解性を増大させるために、ＰＤＺドメインコンストラクト中で、リガンド結合部位外に位置するＣｙｓ３３４をアラニンに変異させた。
【００３２】
２−（（５（６）−テトラメチルローダミン）カルボキシルアミノ）エチルメタンチオスルホネート（ＴＭＲ）−結合ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメインの調製
標準手順を使用して野生型ＰＤＺドメインタンパク質（Ｃｙｓ３３４Ａｌａ突然変異なし）を生成した。Ｃｙｓ３３４はタンパク質中の唯一のシステインである。精製されたＰＤＺ（４０μＭ）を１００ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して４℃で一晩透析し、ジスルフィド結合の形成を防止するためにタンパク質精製ステップで添加したＤＴＴを除去した。次に本発明者らは、撹拌しながらＰＤＺドメイン溶液に、ＤＭＳＯに溶解した１０倍モル過剰量のＴＭＲを滴下して添加した。室温で２時間の反応後、４℃での１００ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対する高度の透析によって、過剰なＴＭＲおよびその他の反応物質を除去した。
【００３３】
ＰＤＺドメインに結合する小型化合物の構造ベースのリガンドスクリーニング
トライポス・インコーポレーテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）からのＳＹＢＹＬ（商標）ソフトウェアパッケージのＵＮＩＴＹ（商標）モジュールを使用して、Ｄｖｌ  ＰＤＺドメイン（ＰＤＢコード：１Ｌ６Ｏ）のペプチド結合溝内にフィットできる化学物質化合物についてＮＣＩ低分子化合物３Ｄデータベースをスクリーニングした。次にトライポス・インコーポレーテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）からのＳＹＢＹＬ（商標）のＦｌｅｘＸ（商標）モジュールを使用して、候補化合物を結合溝内にドッキングした。さらに詳しい試験のために、米国立癌研究所、癌処置および診断部門、開発途上治療プログラム、薬剤合成および化学科（Ｄｒｕｇ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｂｒａｎｃｈ，  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｐｒｏｇｒａｍ，  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）（ｈｔｔｐ：／／１２９．４３．２７．１４０／ｎｃｉｄｂ２／）から最高の合意結合スコアを示す化合物を得た。
【００３４】
ＮＭＲ分光法
バリアン・イノバ（Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ）６００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計を２５℃で使用して、ＮＭＲ  １５Ｎ−ＨＳＱＣ実験を実施した。サンプルは１００ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中のＤｖｌ  ＰＤＺドメイン（濃度約０．３ｍＭ）、１０％のＤ２Ｏ、および０．５ｍＭ  ＥＤＴＡからなった。ＮＭＲスペクトルをＮＭＲｐｉｐｅソフトウェアで処理し、プログラムＳｐａｒｋｙ（商標）を使用して分析した。
【００３５】
蛍光分光法
本発明者らはジョバンイボン・インコーポレーテッド（Ｊｏｂｉｎ−Ｙｖｏｎ，Ｉｎｃ．）からのフルオログ（Ｆｌｕｏｒｏｌｏｇ）−３分光蛍光計を使用して、ＴＭＰ結合ＰＤＺドメインとＮＣＩ６６８０３６化合物間の相互作用の蛍光測定を得た。滴定実験を１００ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中において２５℃で実施した。２ｍＬの１００ｍＭカリウムリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）中の３０μＭ  ＴＭＲ標識ＰＤＺドメインを含有する蛍光サンプルセル内に、ＮＣＩ６６８０３６（濃度１ｍＭ）の溶液を逐次注入した。蛍光測定中に励起波長は５５２ｎｍであり、放射波長は５７９ｎｍであった。マイクロカル・ソフトウェア・インコーポレーテッド（Ｍｉｃｒｏｃａｌ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）からのオリジン（ＯＲＩＧＩＮ）（商標）プログラムを使用して、蛍光データを分析した。増大する化合物濃度に対する蛍光変化の二重逆数プロットを使用して、ＫＤ値を判定した。
【００３６】
分子動力学シミュレーション
ｐａｒｍ９９力場でソフトウェアパッケージアンバー（ＡＭＢＥＲ）８（商標）中のサンダー（ｓａｎｄｅｒ）プログラムを使用して、ＭＤシミュレーションを実施した。アンバー（ＡＭＢＥＲ）８（商標）中のアンティチェンバー（Ａｎｔｅｃｈａｍｂｅｒ）モジュール４７を使用して、ＡＭ１−ＢＣＣ電荷をＮＣＩ６６８０３６に印加した。ＦｌｅｘＸ（商標）ドッキング研究からの結果を使用して、リガンド−タンパク質複合体の開始構造を調製した。中和後、各端がシステムの縁から１０Å離れた周期的長方形ＴＩＰ３Ｐウォーターボックス中に複合体を溶解した。これらのＭＤシステムの構成要素を表１にまとめる。システムは、１０００−ステップ最急降下最小化とそれに続く９０００−ステップ共役勾配最小化によって最小化された。２ｐｓの時間ステップと９．０Åに設定された非結合カットオフで、ＭＤシミュレーションを実施した。一定容積（ＮＴＶ）および一定圧力（ＮＴＰ）双方の周期的境界条を適用して、徐々にシステムをリラックスさせた。詳しくは、その中で温度が１００Ｋから３００Ｋに増大される５０  ｐｓ  ＮＶＴアンサンブル、その中で溶剤濃度が調製される５０  ｐｓ  ＮＰＴアンサンブル、およびその中で高調波抑制が５．０ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１Å−２から０に徐々に低下される別の１００  ｐｓ  ＮＰＴアンサンブル後に、ＭＤプロダクションランをＮＰＴ条件下で５ｎｓ実施した。プロダクションラン中にスナップショットを５ｐｓ毎に保存した。その他のシミュレーションパラメーターは、ゴールケ（Ｇｏｈｌｋｅ）らの研究で述べられるように設定した。
【００３７】
結合自由エネルギー計算
アンバー（ＡＭＢＥＲ）８（商標）のｍｍ＿ｐｂｓａ．ｐｌモジュールを使用して、ＭＭ−ＰＢＳＡアプローチが実行される（１）によって結合自由エネルギーを計算した。
Ｇｔｏｔａｌ＝Ｇｃｏｍｐｌｅｘ−Ｇｐｒｏｔｅｉｎ−Ｇｌｉｇａｎｄ    （１）
式中、
Ｇ＝Ｈｇａｓ＋Ｈｔｒａｎｓ／ｒｏｔ＋Ｇｓｏｌｖａｔｉｏｎ−ＴＳ    （２）
Ｇｓｏｌｖａｔｉｏｎ＝Ｇｐｏｌａｒ  ｓｏｌｖａｔｉｏｎ＋Ｇｎｏｎｐｏｌａｒ  ｓｏｌｖａｔｉｏｎ    （３）
Ｇｎｏｎｐｏｌａｒ  ｓｏｌｖａｔｉｏｎ＝ｙＡ＋ｂ    （４）
である。
上式中、気相エネルギーＨｇａｓは、分子力学によって計算されるように、カットオフなしの分子機械力場中の内部（結合、角度、およびねじれ）、ファンデルワールス、および静電エネルギーの合計である。６つの並進および回転自由度のために、Ｈｔｒａｎｓ／ｒｏｔは３ＲＴ（Ｒは気体定数）である。溶媒和自由エネルギーＧｓｏｌｖａｔｉｏｎは、ＰＢモデルを使用して計算される。ＰＢ計算では、パース半径、ｐａｒｍ９４電荷（ＰＤＺドメインおよびＤａｐｐｅｒペプチドで）、およびＡＭ１−ＢＣＣ電荷（化合物で）を使用して、デルフィ（Ｄｅｌｐｈｉ）ソフトウェアによってＰＤ式を解決して、極性溶媒和エネルギーＧｐｏｌａｒ  ｓｏｌｖａｔｉｏｎを得た。（４）によって非極性寄与率を計算した。式中、Ａはアンバー（ＡＭＢＥＲ）８（商標）中のモルサーフ（Ｍｏｌｓｕｒｆ）モジュールによって計算される溶剤アクセス可能領域であり、ｙ（表面張力）およびｂ（定数）は、それぞれ０．００５４２ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１Å−２および０．９２ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１である。上の全てのエネルギー項は２０ｐｓ毎に得た１５０のスナップショットから平均化され、エントロピーＴＳは、最後の３ｎｓのプロダクションラン中に２００ｐｓ毎に得た１５のスナップショットを使用して正規モード分析によって推定された。
【００３８】
表１．シミュレーションシステムの原子情報およびウォーターボックスサイズ
【００３９】
表２．５ｎｓの明示的シミュレーションの最後の３ｎｓにわたり平均化した化合物ＮＣＩ６６８０３６およびＰＤＺの結合自由エネルギー構成要素ａ
【００４０】
表３．５ｎｓの明示的シミュレーションの最後の３ｎｓにわたり平均化したＰＤＺドメインおよびＤａｐｐｅｒペプチドの結合自由エネルギー構成要素
【００４１】
表４．５ｎｓの明示的シミュレーションの最後の３ｎｓにわたり平均化したＰＤＺドメインおよびＮＣＩ６６８０３６、ＰＤＺドメインおよびＤａｐｐｅｒペプチドの結合自由エネルギー構成要素ａ
【００４２】
表５．５ｎｓの明示的シミュレーション中に化合物ＮＣＩ６６８０３６およびＰＤＺドメイン、ＤａｐｐｅｒペプチドおよびＰＤＺドメイン間で観察された水素結合ａ
【００４３】
表６．Ｗｎｔ３Ａおよびβ−カテニンによって誘発される二次体軸形成に対する化合物ＮＣＩ６６８０３６の効果ａ
ａ二細胞期におけるＷｎｔ３Ａ  ｍＲＮＡおよびβ−カテニン、ならびにＷｎｔ３Ａ  ｍＲＮＡおよびＮＣＩ６６８０３６の腹−植物性注射。実験の詳細は図７Ｂ〜７Ｄに示す。
ｂ初期神経胚の腹側の第２神経プレートおよび異所性眼球およびセメント腺の外観として定義される。百分率は定義を満たす胚の比率を示す。
ｃ２の独立した実験で注射を受けた胚の総数。
【００４４】
【表１】
2008537744.tif 000003
【００４５】
【表２】
2008537744.tif 000004
【００４６】
【表３】
2008537744.tif 000005
【００４７】
【表４】
2008537744.tif 000006
【００４８】
【表５】
2008537744.tif 000007
【００４９】
【表６】
2008537744.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【００５０】
図面の詳細な説明
【図１】化合物ＮＣＩ６６８０３６の構造  ＭＤＬインフォメーション・システムズ・インコーポレーテッド（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）からのＩＳＩＳ／Ｄｒａｗを使用して、ＮＣＩ６６８０３６の化学構造図を作った。（既述された）いくつかの原子は、アンバー（ＡＭＢＥＲ）８（商標）のアンティチェンバー（Ａｎｔｅｃｈａｍｂｅｒ）モジュールによって割り振られた原子名で標識される。
【図２】ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメインおよびＮＣＩ６６８０３６間の相互作用  遊離ＮＣＩ６６８０３６（赤輪郭線）、およびｍＤｖｌ１のＰＤＺドメインに結合したＮＣＩ６６８０３６（青輪郭線）の１５Ｎ−ＨＳＱＣスペクトルを示す。ＰＤＺドメインの濃度は０．３ｍＭであった。ＮＣＩ６６８０３６の濃度は７．８ｍＭ（結合形態）であった。上部差し込み図では、拡大したスペクトルの同一領域からのシグナルをより小さなボックスに入れた。差し込み図はまた、異なる濃度のＮＣＩ６６８０３６（２．４ｍＭ）からの追加的スペクトル（緑線）も含有する。ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメインの主鎖構造のコイル状の描写（下部差し込み図）では、コイルの厚さはＮＣＩ６６８０３６の結合時の１Ｈおよび１５Ｎシフトの加重和（単位Ｈｚ）に比例し、増大する化学シフト摂動が示される（青：低い、赤：高い）。図は、アクセルリス・インコーポレーテッド（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｉｎｃ．）からのソフトウェア、インサイト（Ｉｎｓｉｇｈｔ）ＩＩ（商標）を使用して作成した。
【図３】ＮＣＩ６６８０３６濃度に対する蛍光強度消光（Ｆ）の二重逆数プロットから判定されたｍＤｖｌ１  ＰＤＺとＮＣＩ６６８０３６間の結合親和性  ＴＭＲ−ＰＤＺドメインの溶液内にＮＣＩ６６８０３６を滴定して蛍光測定を得た。一次関数近似後に抽出された、ＮＣＩ６６８０３６およびｍＤｖｌ１のＰＤＺドメインによって形成された複合体のＫＤ値は、２３７±３１μＭであった。
【図４】ＦｌｅｘＸ（商標）プログラムを使用して発生させた化合物ＮＣＩ６６８０３６の３０個のドッキング立体配座は３つのグループにまとめられた  グループＩはＲＭＳＤが０．４６〜０．７７Åの５個の立体配座（赤色）を含み、グループＩＩはＲＭＳＤが１．４４〜１．７３Åの１３個の立体配座（黄色）を有し、グループＩＩＩはＲＭＳＤが２．３１〜２．８６Åの１２個の立体配座（青色）を有した。
【図５】ＮＣＩ６６８０３６結合ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメイン、Ｄａｐｐｅｒペプチド結合ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメイン、および開始構造の主鎖根平均二乗偏差（ＲＭＳＤ、Å）および５ｎｓの明示的シミュレーションにおけるＭＤシステムの全位置エネルギー  ２００ｐｓ平衡相は含まれていない。  Ａ．５ｎｓシミュレーションにおけるｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメイン（紫）およびＮＣＩ６６８０３６（緑）の主鎖ＲＭＳＤ  Ｂ．５ｎｓシミュレーションにおけるＤｖｌ１  ＰＤＺドメイン（紫）およびＤａｐｐｅｒペプチド（緑）の主鎖ＲＭＳＤ  Ｃ．−４４５５２．６ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１と−４４３４４．２ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１の間で変動する５ｎｓシミュレーション中のｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメインおよびＮＣＩ６６８０３６（水分子を含む）の全位置エネルギー（ＥＴＯＴ）。全位置エネルギー（平均±標準偏差）は−４４４５０．８±３２．６ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１であった。  Ｄ．−４４３４９．８ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１と−４４１２２．３ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１の間で変動する５ｎｓシミュレーション中のＤｖｌ１  ＰＤＺドメイン（水分子を含む）およびＤａｐｐｅｒペプチドの全位置エネルギー。全位置エネルギー（平均±標準偏差）は−４４２３３．８±３１．３ｋｃａｌ  ｍｏｌ−１であった。
【図６】ＰＤＺドメイン内にドッキングしたＮＣＩ６６８０３６およびＮＣＩ６６８０３６−ｍＤｖｌ１  ＰＤＺドメイン複合体の立体配座  Ａ．ＮＣＩ６６８０３６およびＤａｐｐｅｒペプチドは、同様の立体配座でＰＤＺドメインに結合する。トライポス・インコーポレーテッド（Ｔｒｉｐｏｓ，Ｉｎｃ．）からのＦｌｅｘＸ（商標）を使用して、ＮＣＩ６６８０３６（青）をＤｖｌ  ＰＤＺドメイン（灰色のリボンおよびチューブ）内にドッキングした。Ｄａｐｐｅｒペプチド（オレンジ）は、Ｘ線結晶構造解析によって判定されたその立体配座にあり、ＰＤＺドメインと複合体形成している。化合物ＮＣＩ６６８０３６とＤａｐｐｅｒペプチド（４Ｃ末端アミノ酸［ＭＴＴＶ］主鎖原子のみを使用した）の主鎖根平均二乗偏差の差は１．４９Åであった。  Ｂ．５ｎｓシミュレーション中の４．９０５ｎｓにおけるＮＣＩ６６８０３６の結合立体配座。ＰＤＺドメインを灰色のリボンおよびチューブとして示す。ＮＣＩ６６８０３６は、結合原子（緑：炭素、赤：酸素、青：窒素）に従って表される。化合物と水素結合を形成する残基は球と棒様式（黒：炭素、赤：酸素、青：窒素）で示され、水素結合は黄色破線で表される。化合物のイソプロピル、メチル（窒素原子の隣のもの）、およびｔ−ブチル基の３．５Å内の残基は、ＣＰＫ様式（灰色：炭素、赤：酸素、青：窒素）で示す。さらにＬｅｕ２５８、Ｉｌｅ２６０、およびＩｌｅ２６２は、カルボキシレート基に隣接するイソプロピル基の３．５Å内である。それらは明確さのために球と棒様式で示す。
【図７】アフリカツメガエル胚におけるカノニカルＷｎｔシグナル伝達に対するＮＣＩ６６８０３６の効果  Ａ．ＮＣＩ６６８０３６はＷｎｔ３Ａによって誘発されたカノニカルＷｎｔ経路を阻害したが、β−カテニンによって誘発されたものは阻害しなかった。ＲＴ−ＰＣＲを行って、外胚葉外植片におけるアフリカツメガエルＷｎｔ標的遺伝子Ｓｉａｍｏｉｓの発現を分析した。二細胞期で、Ｗｎｔ３Ａ（１ｐｇ）およびβカテニン（５００ｎｇ）に対応する合成ｍＲＮＡを単独でまたはＮＣＩ６６８０３６（１８０ｎｇ）と共に動物極領域内に注射し、それらが初期原腸胚期に達するまで外胚葉外植片を培養して、その時点でそれらにＲＴ−ＰＣＲ分析を施した。  Ｂ．注射しなかった対照胚。  Ｃ．Ｗｎｔ３Ａ  ｍＲＮＡを注射した胚は、完全な二次体軸を発達させた。  Ｄ．Ｗｎｔ３Ａ  ｍＲＮＡおよびＮＣＩ６６８０３６を同時注射した胚は、分的な二次体軸を発達させた。
【図８】ディシブルドタンパク質に結合するそれらの能力について試験したＮＣＩおよびシグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）化合物の分子構造  化合物２２１１２０、１０７１４６、１４５８８２、および１６１６１３がＤｖｌに弱く結合する一方、化合物１０８１２３、３３９９３８、ｖ８８７８、および５７９２７０は全く結合しないことが分かった。
【図９】ディシブルドタンパク質に結合するそれらの能力について試験したケムディブ（Ｃｈｅｍ  Ｄｉｖ）化合物の分子構造  化合物３２３７−０５６５、３２３７−０７１３、３２３７−０４３０、８００６−２５６０、００９０−００３１、および２３７２−２３９３はＤｖｌに結合する一方、０１３６−０１８１は結合しないことが分かった。
【図１０】ディシブルドタンパク質に結合するそれらの能力について試験したケムディブ（Ｃｈｅｍ  Ｄｉｖ）化合物の分子構造  化合物８００４−１３１２、３２８９−８６２５、３２８９−５０６６、３２３７−０７１９はＤｖｌ化合物に結合し、化合物８００３−２１７８、Ｃ６９１−００３０、１７４８−０２５３、１１０８−０４２４、２９２２−０１０２、３３７９−２２７４、および８００３−４７２６はＤｖｌに結合しなかった。
【図１１】ディシブルドタンパク質に結合するそれらの能力について試験された化合物の分子構造  化合物１０３６７３、１４５８８２、３２８９−５０６６、３２８９−８６２５、３３７８３７、７１２９、３２３７−０７１９、１２５１７、ｐ１、１４２２７７、８２５６９、３９８６９、ｐ３、４６８９３、６６１０７５、６６１０８０、６６１０８６、６６１０９２、６６１０９１、８４１２３および６６８０３６は全てＤｖｌに結合することが分かった
【図１２】Ｄｖｌホモログおよびその他のタンパク質のＰＤＺドメインのアミノ酸配列の構造ベースの配列比較  二次構造要素は配列上に示される。ｇｌｙ−ｈｉｓ（ＧＨ）位置の残基は太字で示す。星印はリガンドのＣ末端の結合ポケットを示す。ＰＤＺドメイン中の配列の違いは下線で示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年7月3日(2008.7.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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