(57)【要約】  光学装置（200）は特に血液自動分析機における白血球の計数および弁別に適しており、光学タンク内を流通する血液検体（311）を照明するためのエレクトロルミネッセンス・ダイオード型の光源（201）を備えている。【選択図】      図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
血液自動分析機（21）における白血球の計数および弁別のための光学装置（200）であって、射出軸線（X300）に沿って光学タンク（300）内を流通する血液検体を照明するためのエレクトロルミネッセンス・ダイオード型の光源（201）を備えていることを特徴とする装置。
【請求項２】
前記ダイオード（201）は600ナノメータより小さな波長の光を放出することを特徴とする請求項１に基づく装置。
【請求項３】
前記ダイオードは500ナノメータより小さな波長の光を放出することを特徴とする請求項２に基づく装置。
【請求項４】
この装置は射出軸線の近傍で5〜200ミクロンの幅の光源光束（211）を放出することを特徴とする請求項１から３のいづれかに基づく装置。
【請求項５】
この装置は射出軸線の近傍で90〜120ミクロンの幅の光束を放出することを特徴とする請求項４に基づく装置。
【請求項６】
前記光束は、実質的に検体の流れの方向に対して横断方向に、実質的にタンクの方向へ放出されることを特徴とする請求項１から５のいづれかに基づく装置。
【請求項７】
この装置は、対向する２つの面の間を光源光束（211）が横切るようにダイオードとタンクとの間に配置された、回転可能に装着された透明なガラス板（220）を備えていることを特徴とする請求項４から６のいづれかに基づく装置。
【請求項８】
前記透明なガラス板はタンク内の血液検体の移動に対して実質的に平行な軸線（X220）を中心として回転可能に装着されていることを特徴とする請求項７に基づく装置。
【請求項９】
この装置は、光学タンクの向こうにおいて、光源光束に由来する派生光束（212）のためのフレネル損失による分離手段（205）を備え、前記分離手段は前記光束を、軸方向派生光束（213）と、分離手段（205）通過時のフレネル損失により構成される少なくとも１つのフレネル損失派生光束（214）、とに分離することを特徴とする請求項１から８のいづれかに基づく装置。
【請求項１０】
前記分離手段は透明な分離材料の表面である少なくとも１つの分離表面を有し、透明材料を横切った軸方向派生光束と前記分離表面によって反射されたフレネル損失派生光束とを分離し、前記表面はタンクの向こうで派生光束に対して傾斜していることを特徴とする請求項９に基づく装置。
【請求項１１】
この装置は、更に、軸方向派生光束の光を測定する機器（222）と、少なくとも１つの損失光束の光を測定する少なくとも１つの他の機器（223）を備えていることを特徴とする請求項９又は１０に基づく装置。
【請求項１２】
前記測定機器（222、223）は蛍光測定のうちの測定手段を備えていることを特徴とする請求項１１に基づく装置。
【請求項１３】
前記測定機器（222、223）は軸線における光損失を測定する手段を備えていることを特徴とする請求項１１又は１２に基づく装置。
【請求項１４】
前記測定機器（222、223）は軸線近傍の回折を測定する手段を備えていることを特徴とする請求項１１から１３のいづれかに基づく装置。
【請求項１５】
この装置は更にタンク内の検体による大角度の光束回折を測定する手段を備えていることを特徴とする請求項１から１４のいづれかに基づく装置。
【請求項１６】
この装置は、タンクの前で光束の進路上に設けた少なくとも１つのノイズ光阻止絞り（202）を有することを特徴とする請求項１から１５のいづれかに基づく装置。
【請求項１７】
請求項１から１４のいづれかに基づく装置（200）を備えていることを特徴とする血液学装置（21）、特に血液自動分析機。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液自動分析機において白血球を計数しかつ弁別（鑑別。differentiation）するための光学装置、および斯る装置を備えた分析装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
血液検体の分析は、一般に：
−白血球の総数；
−特に、サブ（部分）母集団（sub population）（好塩基性球、好酸球、好中球、単核白血球、およびリンパ球）による白血球の数；
−赤血球および血小板の数；および、
−ヘモグロビンの割合；
を決定することを目的としている。
【０００３】
幾つかの分析手法が知られており、特に以下のものがある：
−ヘモグロビンの定量は、赤血球の細胞溶解（lysis）（即ち、赤血球の細胞膜の破壊）の後に行われると共に、媒質中に釈放されたヘモグロビンの分光測光による測定によって行われる；ヘモグロビンの定量は、更に、適当な波長における単一の化合物の吸収を測定するべく錯体化された形のヘモグロビン（オキシヘモグロビン又はシアンメトヘモグロビン）の安定化を必要とする。
−白血球全体の計数は、赤血球の特殊な細胞溶解を行いながら、かつ、白血球の保護を行いながら、血液検体に対して抵抗率により行われる。
−サブ母集団による白血球の弁別（differentiation）と白血球の計数は：
−赤血球の特殊な細胞溶解と、白血球の保護と、ｐＨ調節の後に、抵抗率の容積測定によって行われるか（しかし、これは只一回の分析で全てのサブ母集団を弁別することを可能にするものではない）；
−或いは、赤血球の特殊な細胞溶解と白血球の保護の後に、小さな、中位の、および大きな角度の軸線内で白血球の流れに対して異なるパラメータ（特に、回折、蛍光、吸収）を測定しながら、および、場合によりマーキング剤（例えば、クロラゾールブラック、又はDNA又はRNAをマーキングする染料、又は蛍光染料）を加えた後に、異なる波長で測定することにより、光学的方法によって、特に、フロー・サイトメトリ（flow cytometry）によって、行われる（この方法は、白血球のサブ母集団を弁別するのを可能にする）。
−赤血球と血小板の計数は特殊な試薬を加えることなく希釈された検体に対して抵抗率の測定により行われる。
【０００４】
血液検体の出来るだけ完全な分析を行うべくこれらの方法を使用する多数の血液自動分析機が存在する。
【０００５】
これらの自動分析機においては、従来、異なる２つの分析回路が共存している：
−ヘモグロビンの測定及び／又は白血球全体の計数のために設計された第１の回路、と、
−血液検体に対して弁別、及び／又は、フロー・サイトメトリによる白血球計数を行うべく設計された第２の回路。
【０００６】
夫々の回路は、用いる分析手段と、一若しくは複数の試薬の添加と、適当な実施・測定手段とに適合した、血液検体希釈率によって特徴づけられる。
【０００７】
即ち、ヘモグロビン測定と白血球計数のためには、この回路は典型的にはいわゆる計数用のタンク（この中で血液検体が希釈される）を備え、そこには特に赤血球の細胞溶解用化合物とヘモグロビンで形成された錯体の安定化化合物とロイコプロテクター化合物とからなる試薬が添加され、そしてこのタンク内で直接に分光測光によりヘモグロビンが測定されると共に抵抗率により白血球の数が測定される。希釈率は、分析溶液が完全に均質になり、かつ、検出装置が飽和しないように選ばれる。この希釈率は1／100〜1／500、一般に1／160〜1／180である。
【０００８】
フロー・サイトメトリによる白血球弁別のため、この回路は血液検体の希釈タンクを使用し、このタンクに赤血球細胞溶解剤、場合により弁別剤（例えば、白血球のDNA又はRNAの蛍光染料）、を含有する一若しくは複数の試薬を加え、次いでこの溶液の一部を採取してフロー・サイトメータ（flow cytometer）の流通型光学タンク内に射出する。ここで、使用する希釈率は1／100より小さく、今日市販されている公知の（ハイドロフォーカス型の）サイトメータを用いて最適な分析時間を得るのを可能にする。
【０００９】
従って、従来、２つの分析回路のために少なくとも２つの異なる試薬を使用しなければならず、血液検体の別々の二度の希釈がこれら２つの分析回路内で行われている。
【００１０】
製造業者が目標とする主な目的は、構成要素と試薬の数を低減することにより既存の自動分析機を簡素化することであり、これは、血液検体の完全な分析の時間を低減することなく、自動分析機の製造コスト、維持コスト、およびサイズを低減することを可能にする。
【００１１】
本発明は、特に、これらの目的を達成しようとするものである。
【００１２】
文献WO 2004/003517は、この意味で、２つの分析回路が共通の手段を有するような方法および装置を提案している。原理は、血液検体の最初の希釈を唯一の希釈タンク内で行い、この希釈液の所定容積の一部を測定／計数アッセンブリの方へ逐次移送して、その都度、血液検体内に含まれた異なる要素を測定し又は計測することにある。完全な分析（即ち、赤血球および血小板の計数と、白血球の計数と、ヘモグロビンの測定と、白血球の弁別）を行うため、この文献は次のような解決方法を記載している：赤血球と血小板を計数するため第１の移送を行い、希釈タンクに細胞溶解剤を加え、次に白血球の計数をするために第２の移送を行い、ヘモグロビンの割合を測定するために細胞溶解された希釈溶液の第３の移送を行い、白血球弁別試薬を加え、そして測定アッセンブリ内で白血球弁別を行うべく第４の移送を行う。
【００１３】
この原理は確かに唯一のタンク（いわゆる希釈タンク）を使用することを可能にするが、分析時間を節約することを可能にするものではない。何故ならば、測定又は計数は希釈液の一部をその都度移送した後に逐次行われるからである。更に、相継ぐ試薬と分配済み希釈液の容量、並びに、測定アッセンブリに向けて移送された希釈液の容量の完全な制御を必要とする。その上更に、複数のシリンジと細胞溶解試薬の使用を必要とする。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は更に斯る不都合を解消することを目的とするものである。
【００１５】
本発明の第１の目的によれば、本発明は血液検体の自動分析方法、並びにモノ試薬、およびこの方法を実施するための装置を提供することにある。
【００１６】
本発明の方法は以下のことを特徴とする：
−単一の希釈・分析タンク内で、前記血液検体、希釈液、および：
−赤血球を細胞溶解するための少なくとも１つの化合物；
−白血球を保護するための少なくとも１つの化合物；および、
−色素形成錯体の形のヘモグロビンを安定化するための少なくとも１つの化合物；
を含有する分析溶液を形成し、
−この分析溶液について前記タンク内で赤血球の細胞溶解の後に分光測光によりヘモグロビンの割合を測定し；そして、
−前記タンク内のこの分析溶液の適量を採取して、それに対して光学手段による白血球弁別を行う。
【００１７】
白血球の計数は同時に分析タンク内で及び／又は光学手段によって行うことができる。
【００１８】
赤血球および場合により血小板の計数は例えば単一の希釈・分析タンク内で採取したサンプルについてこの方法の予備段階で行うことができる。
【００１９】
従って、本発明は、従来は２つの別々の回路内で行われていた２種の分析（即ち、一方においてヘモグロビンの測定と場合により白血球の計数、他方において光学手段による白血球の弁別）のために単一の分析溶液をそのまゝ使用するという思想に立脚しており、前記分析溶液は少なくともこれらの分析を行うことの可能な“試薬”化合物を、その性質と量において、結合する。導入される試薬化合物は化学的に互いに両立するように選ばれると共に、目的とする分析に適合する量だけ選ばれる。それらは従来技術において典型的に使用されている化合物の中から選ぶことができる。また、白血球弁別を行うために従来使用されている商業的な処方組成物（即ち、赤血球細胞溶解用の化合物およびロイコプロテクター化合物を含有するもの）を使用し、それに色素形成錯体の形のヘモグロビンを安定化するための第３の試薬化合物を添加してもよい。
【００２０】
この単一の分析溶液のため、本発明は特に以下の利点を呈する：
−自動分析機は分析溶液調製用の単一のタンクを有することができる、
−ヘモグロビンの測定、並びに分析溶液の抵抗率の測定による白血球の全体的計数、は直接にこのタンクに対して行うことができる；
−ヘモグロビン測定と光学手段による白血球弁別のために必要なあらゆる“試薬”化合物を結合するモノ試薬を使用することができ、これは後述するように特に水力学回路を簡素化するのを可能にする；
−血液検体のモノ−希釈は、用いる測定・検出手段に応じて定めた希釈率で、直接に単一の希釈・分析タンク内で行うことができる。モノ試薬はこのモノ−希釈を実施するための希釈液として作用することができる。好ましくは、希釈率は、ヘモグロビンの割合の測定に必要な希釈率に対応して、1／100〜1／500、より好ましくは約1／175（後述する実施例では、1／173）、に固定されるであろう。
【００２１】
従って、モノ希釈およびモノ試薬を使用できる可能性により、本発明のこの第１の観点によれば、血液検体の完全な分析を行う可能性を常に提供しながらも、分析装置を大幅に簡素化することができる。
【００２２】
本発明は、また、1／100より大きな希釈率における白血球分析（計数とサブ母集団による弁別）を行うのを可能にする光学的測定手段を提案するもので、これについては後に定義しかつ記載する。
【００２３】
本発明は、また、本発明の方法を実施するための細胞溶解用モノ試薬を提供するもので、これは次のものを包含することを特徴としている：
−赤血球を細胞溶解するための少なくとも１つの化合物；
−白血球を保護するための少なくとも１つの化合物；および、
−色素形成錯体の形のヘモグロビンを安定化するための少なくとも１つの化合物。
【００２４】
斯るモノ試薬は、分光測光による血液検体のヘモグロビン濃度の測定と光学手段による白血球弁別を可能にする。それは、更に、白血球の抵抗式の及び／又は光学的な計数を可能にする。好ましくは、それは少なくとも５つのサブ母集団の弁別を可能にするように選ばれる。好ましくは、それはシアン化物を含まないように選ばれる。
【００２５】
本発明によれば、赤血球を細胞溶解するための化合物は好ましくは少なくとも１つの陽イオン表面活性剤で構成される。更に好ましくは、かつ、それ自体公知のように、オキシヘモグロビン錯体を形成するべく選定する（何故ならば、シアンイオンを含むシアンメトヘモグロビン錯体に較べて無毒性）。従って、陽イオン表面活性剤は、オキシヘモグロビン錯体しか形成しないようにするため、釈放されたヘモグロビンを更に酸化するように選ばれる。従って、陽イオン表面活性剤の量は、赤血球を効果的に溶血（hemolysis）すると共に、釈放されたヘモグロビンを酸化するように選ばれる。それは好ましくは次のものの中から選ばれる：
−第四アンモニウム塩、好ましくは、アルキルトリメチルアンモニウム塩、より詳しくは、セチル−、ドデシル−、トリデシル−臭化物および塩化物、およびヘキサデシルトリメチルアンモニウム；
−ピリジニウム塩；
−エトキシル化長鎖アミン；および、
−アルキルスルフェート（SDS）。
【００２６】
本発明のロイコプロテクター化合物は白血球の破壊を遅延又は予防する化合物である。好ましくは、それは出来れば次の中から選ばれた非イオン性又は両性の表面活性剤である：
−エトキシル化アルコール、特に、市販品IPEGAL990（登録商標）、TERGITOL NP9（登録商標）、TRITON（登録商標）X100又はX114、plurafac（登録商標）A38、又はBrij35（登録商標）のような、２−フェノキシエタノール、ポリオキシエチレンアルキルフェニルエーテル；
−第四アンモニウムのベタイン又はスルフォベタイン、特に、ラウラミドプロピルベタイン（LAB）、およびドデシルジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート（DDAPS）又はテトラデシルジメチル−３−アンモニオ−１−プロパンスルフォネート（TDAPS）；
−N,N−ジメチルラウリルアミン−N−オキサイド（LDAO）又は３−［（３コラミドプロピル）−ジメチルアミノ−］−１−プロパン（CHAPS又はCHAPSO）のような第三アミンオキサイド；
−グリコシド型の化合物、より詳しくはトリテルペンサポニン；
−炭水化物型の化合物（マニトール、D−グルコース、トレハロース、デクストランスルフェート）。
【００２７】
色素形成錯体の形のヘモグロビンの安定化化合物は好ましくは次の中から選ばれる：
−配位子原子（非結合対：O、N、S、およびCOO−・・・カルボキシ原子団）を有するモノ又はポリデンデート・キレート、特に：
・エチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）又はエチレングリコール−ビス−（３−アミノエチルエーテル）N−N−テトラ酢酸（EGTA）の塩および特にそれらの二ナトリウム又は二カリウム塩；
・蓚酸カリウムK2OX OX=C2O42-；
・ヒドロキシルアミンの塩（好ましくは、塩酸塩）；および、
・有機酸（特に蟻酸又は酢酸）。
−配位子原子（非結合対：O、N、S・・・を有する）を有する芳香族化合物（モノ又はポリデンデート・キレート）、特に：
・Tiron（登録商標）；
・８−オキシキノリンおよびその誘導体；
・ピリジン又はビピリジンおよびそれらの誘導体；
・１，１０−フェナントロリンおよびその誘導体；
・フェノール化合物（モノ又はビスおよびそれらの誘導体）；
・ピラゾール及び／又はピラゾロンおよびそれらの誘導体；
・イミダゾールおよびその誘導体；
・スルホサリチル酸；および、
−サポニン、第三アミン酸化物、第四アンモニウムのベタイン又はスルフォベタイン（DDAPS、TDAPS、LAB等）。
【００２８】
本発明によって特定された３つの化合物の外に、次のものを（モノ）試薬に加えることができる：
−ある種の白血球、より詳しくは好酸球（又は塩基性球）、を特にマーキングする少なくとも１つの染料（又は混合物）であって、少なくとも５つの主要な白血球サブ母集団を分別するのを可能にするためのもので、次の中から選ばれたもの：
・シアニン；
・オクサジン750
・ライト＆ロマノウスキー試薬；
・DAPI；
・クロザゾールブラックE；
・トルイジンブルー；
・アストラブルー；
・チアゾールオレンジG又はブルー；
・他の蛍光試薬。
−白血球の膜を強化するのを可能にする少なくとも１つの定着剤（これは好ましくはアルデヒド、より詳しくはグルタールアルデヒド又はフォルムアルデヒドであろう）；
−流動性を最適化すると共に泡の発生を回避するための、更に細片の溶解剤として作用する、少なくとも１つの湿潤剤であって、次の中から選ばれたもの：
・アルコール（メタノール、エタノール、又は２−プロパノール）；
・グライコル（エチレン又はプロピレングライコル）；
・エトキシル化アルコール（特に、Triton X100（登録商標）又はBrij35（登録商標）；
・グリコシド化合物TWEEN80（登録商標）又はTWEEN20（登録商標）；
定着剤と溶解剤の濃度は厳密に限定されている（何故ならば、過剰は赤血球の細胞溶解を阻害すると共に白血球の光学特性を変える可能性があるからである）；および、
−ｐＨを5.0〜10.0、好ましくは6.0〜8.0に、かつ中性（7.0±0.4）に近い最適値に、固定するための緩衝系。このようなｐＨの選定は、細胞の自然条件を遵守することを意図するものである。更に、このｐＨは本発明で使用する諸成分の最良の溶解を可能にするものである。
【００２９】
前記緩衝液は塩酸又はソーダ（４−６Ｎ）によって
前記ｐＨにした一対の塩（無機又は有機）からなり、次の中から選ばれる：
・ジヒドロゲンリン酸／ヒドロゲンリン酸H2PO4-／HP O4-2ナトリウム又はカリウム；
・炭酸水素／炭酸NaHCO3／NaCO3ナトリウム
・クエン酸／クエン酸ナトリウム（III）緩衝液
・TRIS-HCl
・トリエタノールアミン（TEA）
・イミダゾール
【００３０】
−次の中から選ばれた酸：
・有機酸：ヘモグロビンの色素形成錯体の形成と安定化にも寄与するフタール酸、スルホサリチル酸、又は蟻酸；および
・無機酸：Hcl、H3PO4・・・
−抵抗率の測定に必要な10〜50ms／cmのオーダーの導電性と、120〜500mOsmのオーダーの浸透性を保障する、好ましくは等張性（290±5mOsm）に近い、バックグラウンド塩であって、次の中から選ばれたもの：
・塩化ナトリウムNaCl；
・塩化カリウムKCl；
・塩化マグネシウムMgCl2；
・塩化カルシウムCaCl2；
・無水硫酸ナトリウムNa2SO4；
（このバックグラウンド塩は緩衝系の中に入れることができる）
−次の中から選ばれた、抗酸化特性及び／又は抗生特性を有する少なくとも１つの保存剤：
・２−フェノキシエタノール；
・パラベン；
・BHT；
・イソチアゾロン（Proclin（登録商標）150又は300）；
・イミダゾール又は尿素の誘導体；
・抗生物質；
−次の中から選ばれた、更に染料の透過を容易にする天然の抗生性の細胞透過化合物（イオノフォア）：
・NH4+型イオノフォアI（ノナティン）；
・Ca2+型イオノフォアIII（カルシミシン）；
・Cl-型イオノフォア；
・K+型イオノフォアI（ヴァリノミシン）；
【００３１】
本発明に基づく諸成分と適切な濃度範囲を次表に要約する。
【００３２】
【表１】
2008534945.tif 000003
【００３３】
本発明は、また、本発明の方法を実施するための装置を提案するもので、この装置は：
−前記分析溶液を容れるための分析タンクと；
−前記分析溶液中に存在するヘモグロビンの割合を前記タンク内で分光測光により測定する手段と；
−前記分析溶液を採取する手段と；
−白血球分析を行うための前記サンプルに対する光学的測定手段；
を特徴とする。
【００３４】
本発明の第２の目的によれば、本発明は、本発明の前記第１の目的に係る方法を実施するために更に特に有用な、血液検体の自動分析機のための光学装置を提供しようというものである。
【００３５】
前述したように、ある種の白血球のサブ母集団は光学的手段（例えば、一若しくは複数の角度における細胞による回折の測定、又は、細胞の吸収の測定）によってしか弁別することができない。血液細胞を特徴づけるための光学装置は１つの共通のベースを有し、このベースの中には、光束を放出する光源と、血液細胞がこの光束を横切るようになった光学タンクと、細胞の流れに対して光束を調節する装置と、細胞によって遮られた後に光学タンクから出る光を測定する手段とが配置してある。特に白血球を特徴づける場合には、白血球はタンク内で流れになって移動する。白血球はタンク内で流れ（これは検体流と呼ばれる）に対して収束された光束によって照明される。
【００３６】
斯る装置は高価である；特に、光源として使用するレーザは高価であり、これはまた嵩ばると共に放熱装置を必要とする；レーザとしてのレーザ・ダイオードは高価なアラインメント（整線）装置を必要とする。これらの光源によって放出された光束は、ほぼガウス形の横断方向光分布を有する。従って、強度は半径のうちの狭い中央の部分内でしかほぼ一定でなくかつ最大でない。アラインメント装置はこの中央部分を検体流に整列させるのを可能にする。更に、検体流の幅はこの中央部の幅を超えてはならず、これら２種の幅が近ければ近いほどこのアラインメント装置の精度は大きくなければならない。その結果、検体流の幅を出来るだけ減少させる必要がある。
【００３７】
計数すべき及び／又は弁別すべき血液細胞を含有する検体流は、光が収束されるのと同じくらい狭くしなければならない。従って、断面の幅が50μｍより小さな流れを使用するのであり、この流れは光束（それ自体は検体流の断面より大きな断面を有する光束として収束される）を横断しなければならない。これは光学タンク内に流れを射出するために特に精密な、従って高価な、射出装置を必要とする。従来技術においては、ハイドロフォーカス（hydrodynamic focusingの略）型の装置を使用することによりこのような結果を得ている。検体流はスリービング（sleeving。筒状被覆）流によって囲繞される。検体流のインジェクタはスリービング流の中央に浸漬される。このように生成された検体流は、インジェクタから光束によって照明された領域まで進む間に延伸又は収束され、この区域では直径約5〜50μｍの所望の幅を有する。この目的を達成するためには、単一の又は二重のスリービングがしばしば必要である。
【００３８】
更に、前述したように、要求される精度レベルを考慮すれば、細胞流を光束に一致させるためには調節装置は不可欠である。２つのアプローチが可能である：細胞流又は光束を変位させることができる。血液細胞流を変位させることを選んだ場合には、光学タンク全体を変位させる必要がある。このオプションを採用した場合には、タンクは並進テーブルに装着され、このテーブルはそのボールベアリングのお陰で２軸に沿って精密で一様な変位を保障する。このような精密機械アッセンブリはかなり高価である。また、光束を変位させて光束を血液細胞流に一致させることも可能である。これは一般に方位決め可能な複数のプリズムを用いて行われる。光学要素を精密機械に組み込むこのやり方は、また、コスト高を意味する。
【００３９】
更に、血液細胞が光束を横切る時には、血液細胞は光線の進路を偏向させる。偏向された光線の強度と角度は細胞のタイプに関する情報を得るのを可能にする。２つの角度範囲が一般に使用される：即ち、光軸に対して10度未満の小さな角度と、光軸にほぼ垂直な大きな角度。小さな角度範囲においては、２つの情報が有用である：即ち、軸における損失と回折における損失。光軸に垂直に、一般に散乱と蛍光を測定する。これら２つの角度範囲について、光は従って２つの異なるチャンネルに分配されねばならない。これは一般に二色ミラー又は更に干渉フィルターによって行われる。これらの光学的構成要素は、２つ共、ガラス基材上に薄膜を被着することにより形成される。それらの有効性は良好であるが、一方のフィルターから他方のフィルターへと大きな不釣合が存在すると共に、それらの寿命は限られている。従って、それらは定期的に交換しなければならない。
【００４０】
総じて嵩高なこれら全ての装置は、更に脆弱であると共に保守を必要とし、これはまた非常に高コストである。従って、この種の装置は斯る自動分析機に投資できるような充分に大きな分析試験所に保持されている。
【００４１】
本発明は、充分な測定品質を確保しながらも、より簡単で製造並びに保守がより経済的で、小規模の試験所で自動分析機を使用しかつ装備することの可能な、白血球弁別及び／又は白血球計数装置を提供することを目的とするものである。
【００４２】
本発明の第２の目的によれば、本発明は、血液自動分析機において白血球計数及び／又は弁別を行うための光学装置を提供するもので、この装置は、射出軸線に沿って光学タンク内を流通する血液検体を光源光束を用いて照明するためのエレクトロ・ルミネッセンス・ダイオード型の光源を備えていることを特徴としている。斯るダイオードは光束の断面の幅方向に（従って、より幅広かつ均質な読み取り領域にわたって）より均質な光束を得るのを可能にする。
【００４３】
好ましくは、ダイオードは600ナノメータ（更に好ましくは500ナノメータ）より小さな波長の光を放出する。斯る波長は最良の回折効率を可能にし、従って、回折を利用する測定の最良の精度を可能にする。
【００４４】
更に、光学装置（即ち、検体流を照明する光源）によって放出された光束の幅は有利なことに射出軸線の近傍で50〜200ミクロン（μｍ）であり、これは、実施する測定に充分な精度を可能にしながらも、より幅広の検体流を照明するのを可能にする。更に、より有利なことに、この幅は90〜120ミクロンである。流れのこのような幅はエレクトロルミネッセンス・ダイオードの使用によって特に可能になる。
【００４５】
好ましくは、光源光束は、検体の流れの方向に対してほぼ横断方向に、ほぼタンクの方向へ放出される。対向する２つの面の間を光源光束が横切るように設けた透明なガラス板（回転可能に装着してあると共に、ダイオードとタンクとの間に配置してある）は、ガラス板を横切る時の光束の二重屈折のお陰で、光束を横断方向に変位させることができる。ガラス板の回転は、ガラス板に対する光束の入射角を修正するのを可能にし、従って、横断方向オフセット値を調節するのを可能にする。好ましくは、透明ガラス板は、タンク内の血液検体の変位に対してほぼ平行な軸線を中心として回転可能に装着されている。
【００４６】
光学タンクの向こうでは、光源光束に由来する入射派生（resultant）光束のための、フレネル損失による分離手段が有利に使用してあり、この分離手段は斯くして前記光束を、軸方向派生光束と、分離手段通過時のフレネル損失により構成される少なくとも１つの損失派生光束、とに分離する。この分離手段は透明な分離材料の表面である少なくとも１つの分離表面を有し、透明材料を横切った軸方向派生光束と前記分離表面によって反射されたフレネル損失派生光束とを分離し、前記表面はタンクの向こうで光束に対して傾斜している。単なるガラス板は、安価であり、分離手段として作用することができる。さらに、それは、二色ミラー又は干渉フィルターとは異なり、保守しなくてもほぼ無制限の寿命を有する。
【００４７】
この装置は、更に、軸方向派生光束の光を測定するための装置と、フレネル損失に由来する少なくとも１つの光束の光を測定するための装置を有することができる。これらの測定装置は、特に、蛍光測定、軸線近傍の光損失の測定、および軸線近傍の回折の測定、のいづれかのための測定手段を有することができる。この装置は、更に、タンク内における検体による大角度の光束回折を測定する手段を有することができる。例として、これらの大きな角度は60°〜150°であり得る。
【００４８】
この装置は、また、タンクの前で光束の進路上に設けた、少なくとも１つのノイズ光阻止絞りを有することができる。
【００４９】
本発明は、また、血液学装置（特に斯る装置を備えた血液自動分析機）に関する。
【００５０】
本発明の第３の目的によれば、本発明は、また、白血球の計数および弁別に適した光学装置のための流通型（flow through）光学タンク（例えば、フロー・サイトメータ）、並びに、斯るタンクを備えた分析装置を提供しようというものである。本発明の目的は、充分な測定品質を確保しながらも、より簡単で製造並びに保守がより経済的で、タンクを備えた自動分析機をより小規模の試験所が使用するのを可能にするような、タンクを提供することである。
【００５１】
本発明によれば、血液自動分析機における白血球の計数および弁別のための光学装置のための流通型タンクは、タンク（304）の分析領域において、タンクの断面は１〜５ミリメータの少なくとも１つの横断方向寸法を有することを特徴としている。この断面はほぼ矩形であり、横断方向寸法は矩形の側辺の一方及び／又は他方で測定される。
【００５２】
このようなタンクは、少なくとも部分的に、射出プラスチック材料で形成することができる。このようなタンクは、一般に接合により組み合わされた石英の側壁で形成された従来技術のタンクに較べて、製造するのが特に有利である。
【００５３】
このタンクは、更に、タンクと一体部品としてモールド成形された少なくとも１つのレンズを有することができる。この少なくとも１つのレンズは、光軸に対して側方に配置するべく設けたレンズを有することができる。このレンズは半球形レンズを有することができる。
【００５４】
このタンクは、光軸に沿って、光束の入口用の窓と光束の出口用の窓を有することができる。少なくとも１つの窓はタンクと一体部品としてモールド成形することができ、及び／又は、石英やガラスのような透明材料のインサートであることができる。
【００５５】
このタンクは、好ましくは、検体流のためのインジェクタと、射出流の周りにスリービング流を形成するための手段とを有することができる。このインジェクタは、従来技術の流れよりもほぼ幅広の検体流を得るのを可能にする、直径20〜150ミクロンの出口オリフィスを有することができる。従来技術の装置とは異なり、検体流を引き伸ばすことにより検体流の幅を決めるのは、スリービング流ではなくて、インジェクタの出口の形状と断面である。従って、被覆流（スリービング流）は最早積極的な役割は有さず、特に例えば検体流を幅広のタンクの中に芯合わせするためのような受動的な役割しか有しない。
【００５６】
第１実施例によれば、このインジェクタはほぼ剛性の材料で単一部品として形成することができる。この材料は例えばステンレス鋼、セラミック、合成ルビー、若しくはプラスチック材料又はこれらの材料の複数であり得る。
【００５７】
第２実施例によれば、このインジェクタは、例えば金属製の、例えばステンレス鋼製の、剛性の構造管と、この構造管の内側のプラスチック材料製の被覆管とを備え、この被覆管はそれと一体部品に形成されたノズルによって延長されている。イジェクタのプラスチック材料はポリテトラフルオロエチレンであることができ、これは管内における検体の流通をより容易にすると共に管が詰まる危険を低減する。
【００５８】
本発明は、更に、本発明のタンクのためのインジェクタに関するもので、インジェクタはこれらの実施例のいづれかに基づいて形成されている。
【００５９】
本発明は、また、本発明のタンクを備えた血液学装置、特に血液の自動分析機、に関する。
【００６０】
本発明の第４の目的によれば、本発明は、また、血液分析装置のための水力学装置であって、簡素化され、製造並びに保守がより経済的で、充分な測定品質を確保しながらも、斯る装置を備えた自動分析機を小規模の試験所が使用するのを可能にするような装置を提供しようというものである。本発明は、また、斯る装置に適した分析方法を提供しようというものである。
【００６１】
即ち、本発明は、血液分析装置（特に自動分析機）のための水力学装置を提案するもので、この装置は、検体流を圧力下で流通型光学タンク内に射出すると共にスリービング液を用いて検体流の周りにスリービング液流を生成する手段を備え、この装置の特徴は、検体流の流量をスリービング液の流量に対して調節する手段を備えていることからなる。このような調節は均質でほぼ乱流のない流れをタンク内に維持するのを可能にする。
【００６２】
射出手段はシリンジと水力回路と電磁弁とを有することができる。この手段は圧力下の検体をスリービング流に対して射出する手段を有することができる。
【００６３】
この装置は、好ましくは、射出される検体のためのピストンを押出し（pistoning）液を用いて形成する手段を有することができる。斯る押出し液体は分析に充分な僅かな検体しか使用しないことを可能にするもので、射出に必要な液体の残部は分析装置内で入手可能な液体であって、検体ほど貴重でない。
【００６４】
スリービングは、検体流のための断面を減少したまゝにしながらも大きな断面のタンクを使用するために特に有利である。スリービング流に対して検体流を調節する手段の中で、この装置は、好ましくは、スリービング液の流量に対して押出し液の流量を調節するための手段を有することができる。この調節手段は、押出し液の分岐回路内の水頭損失手段、及び／又は、スリービング液の分岐回路内の水頭損失手段を有することができる。例えば、水頭損失手段は、口径設定された管の既知の長さ、固定水力抵抗、および可変抵抗の中から選ぶことができる。
【００６５】
この水力学装置は、検体流とスリービング流とを同時に生成するための唯一の動力（例えば、唯一の電動モータ）だけを有することができる。更に、この装置は、検体流とスリービング流とを発生させるための少なくとも２つのシリンジを有することができ、これらのシリンジのピストンは互いに強固に連結されている。従って、それらは１つの共通の運動を行い、検体流とスリービング流とは全く同時的である。
【００６６】
特に、従来技術のハイドロフォーカス型タンクは本発明の前記したような回路と共に使用することができ、このタンク内への検体の射出はスリービング流に対して圧力をかけることなく行うことができる。
【００６７】
本発明によれば、また、流通型サイトメータにおける血液検体の分析方法が提案されるもので、この方法は、サイトメータの流通型タンク内に血液検体を（場合により圧力下で）射出し（検体はそこで検体流を形成する）、かつ、スリービング液を用いて検体流の周りにスリービング液流を生成し、検体流の流量をスリービング液の流量に対して調節することを特徴とする。
【００６８】
特に、水力学回路の射出分岐管内に検体を導入すると共に、射出分岐管内の検体の上流に押出し液を導入することができ、押出し液はそれをタンク内に射出する時に検体を押し出す作用をする。この押出し液は試薬および希釈液の中から選ぶことができ、好ましくは希釈液である。従って、検体の分析の見地から検体の調製にどうしても必要なこれらのもの以外の他の液体を用意するのは有意義ではない。
【００６９】
また、タンク内の検体流の周りにスリービング液を用いてスリービング流を生成することができる。このスリービング液も試薬および希釈液の中から選ぶことができ、好ましくは希釈液である。ここでも、検体の分析の見地から検体の調製にどうしても必要なこれらのもの以外の他の液体を用意するのは有意義ではない。
【００７０】
ハイドロフォーカス法、又は本発明の第３の目的に係るタンク、を使用する場合には、例えば、押出し液用の分岐回路内に水頭損失を導入することにより、及び／又は、スリービング液用の分岐回路内に水頭損失手段を導入することにより、押出し液の流量をスリービング液の流量に対して調節するのが有利である。
【００７１】
本発明の方法においては、特に本発明の第３の目的に係るタンクについては、血液検体が少なくとも1／100の希釈率を呈するように容易にすることができる。即ち、この方法においては、従来技術の方法の速度より大きな速度で、かつ、タンク内の検体流のためのより大きな断面幅で、圧力下の検体をスリービング液に対してタンク内に導入することができる。従って、分析時間を増加させることなく、白血球の弁別と計数のために、ヘモグロビンの測定のために従来行われている希釈率と同一の希釈率（特にほぼ1／100〜1／500、わけても1／160〜1／180、の希釈率）を使用することができる。
【００７２】
本発明はまた、本発明の水力学装置を備えていることを特徴とする血液学装置、特に血液自動分析機、に関する。
【００７３】
本発明および他の利点は以下の実施例の記載からより明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
図１には単一の希釈・分析タンク１が模式的に示してあり、これには分析すべき血液検体２と希釈液３と試薬４（これらは共に分析溶液を形成する）とを供給することができる。このタンク１は、測光により前記分析溶液中のヘモグロビンの割合を測定する手段５と、白血球の総数を計数するべく前記分析溶液の抵抗率を測定する手段６とを備えている。また、分析タンク１内の分析溶液の一部を採取するための手段、および、それを白血球分析用の光学測定手段８（例えばフロー・サイトメータ）を備えた光学タンク７内に射出する手段が設けてある。この実施例では、更に、血液検体と希釈液とからなる前溶液の一部を採取して、それを計数・希釈タンク９（これは赤血球と血小板を計数するために前記前溶液の一部の抵抗率を測定する手段１０を備えている）内に導入するための手段が設けてある。従来のように、この装置は、ほぼ３５℃にサーモスタット制御された温度を得るための加熱手段を備えている。この温度は細胞溶解の反応時間と赤血球細胞溶解の最良の品質を可能にする。
【００７５】
この装置は次のように作動する：
−血液の整除部分（15.6μｌ）を分析タンク１内に射出し、２ｍｌの希釈液で希釈して、分析用前溶液を形成する；希釈率は1／130；
−この分析用前溶液の非常に微量な一部（約20μｌ）を採取し、赤血球および血小板計数タンク９に入れる；
−次に0.7ｍｌの試薬を分析タンク１内の残りの前溶液に加える：細胞溶解は約10秒続き（赤血球を破壊し、オキシヘモグロビン錯体を形成しかつ安定化させるため）、こうして形成された分析溶液は約1／173の最終希釈率を有する；この分析溶液の一部を採取して光学タンク７内に射出する（このタンクでは白血球の分析（サブ母集団による白血球の計数及び／又は弁別）が行われる）；同時に分析タンク１内では、抵抗率の測定により白血球が計数されると共に、形成されたオキシヘモグロビン錯体の波長における吸収による測定によりヘモグロビンが計数される。
【００７６】
本発明の光学装置（1／100より小さい希釈率を有する分析溶液に対する白血球分析に特に適している）は後述する（より詳しくは1／160〜1／180の希釈に適している）。慣例により、希釈率1／160は率1／100より小さいと考えられる。
【００７７】
勿論、前述した方法および装置の変化形は可能である：
−装置について：細胞溶解化合物と、ロイコプロテクター化合物と、分析タンク１内でヘモグロビンを用いて形成された（従って、よりモノ試薬の形の）錯体の安定化化合物とを別々に導入する手段を設けることができる；分析溶液の抵抗率を測定する手段６はオプションであり、白血球の総数は分析溶液の光学分析により得ることができる。同様に、計数タンク９およびこのタンク内の抵抗率測定手段１０は血液検体の完全な分析を希望する場合にのみ設けることができる；
−同じく方法について：反応化合物の導入はモノ試薬の代わりに独立に若しくはグループで行うことができ、導入は同時に若しくは逐次行うことができる；赤血球および血小板の計数の予備段階および白血球の総数計数段階は省略することができる；更に、血液検体の相継ぐ二回の希釈を行うことができる；即ち、ハイドロフォーカス型の公知の従来のサイトメーター内で行えるような、白血球弁別に特に適した最初の希釈（約1／80）（この白血球弁別に必要な一部はこれから採取される）と、次いで、第２の時期における、公知の分光計を用いて行えるようなヘモグロビン測定に適した第２の希釈（1／100〜1／500）。
【００７８】
更に他の変化形によれば、タンク１は、シリンジのニードル内で待機しているサンプルを用いてタンクを満たすことにより、清掃後の赤血球および血小板の計数を行うべく第２の時期に使用することができる。
【００７９】
次に、本発明の（モノ）試薬の特定の実施例を用いて得られた結果を記載する。
【００８０】
フロー・サイトメトリーによる白血球決定のために市販されているABX社の組成物Eosinofix（登録商標）（このため赤血球を細胞溶解するための化合物とロイコプロテクター化合物（ABXの特許EP 0430750参照）とを含有している）からモノ試薬を調製した。本発明によれば、この組成物にヘモグロビン錯体の安定化化合物を加えた。
【００８１】
分光測光によるヘモグロビンの測定
分光光度計を用いて542ｎｍで線形性（リニアリティー）のテストを行った。グラフを図２ａ〜２ｅに示す。グラフは予期した濃度に対する測定されたヘモグロビン濃度を示す。より詳しくは：
−図２ａは分光測光（ORPHEE社から販売されているLMG（登録商標））によるヘモグロビン測定のための基準細胞溶解に対応する；
−図２ｂ、２ｃ、２ｄは、ヘモグロビン錯体安定化剤として、夫々、Tiron、DDAPS、およびイミダゾールを用いた実施例No．４のモノ試薬に対応する；そして、
−図２ｅはモノ試薬としてEosinofix（登録商標）のみ（即ち、本発明に基づくヘモグロビン錯体安定化剤を含有しない）を使用しながら実施した本発明の方法に対応する。
【００８２】
本発明に基づいて行った３つの試験について、１±１０−４の相関係数Ｒ２（図面に示す）を夫々有する正の線形性テストを良好に得た。この結果は、図２ａの基準細胞溶解により得た結果に一致している。これは、本発明の方法は血液検体中の真のヘモグロビンの割合を測定することを全く可能にすることを意味している。
【００８３】
これに対して、図２ｅから分かるように、ヘモグロビン安定化剤を用いることなく試薬（Eosinofix）を用いた場合には、線形の関係は得られない。これは、ヘモグロビンの割合を測定するためにこの試薬のみを使用することはできないことを意味している。
【００８４】
フロー・サイトメトリによる白血球の弁別
図２ｆ〜２ｉは、Eosinofix単独、DDAPSを添加したEosinofix、Tiron、およびイミダゾールに夫々対応する、フロー・サイトメータBD FACScan（登録商標）を用いて得たサイトグラフである。これらの図から、白血球のサブ母集団の弁別が良好に、かつ、従来の白血球弁別用試薬（図２ｆにおけるEosinofixを用いて得たマトリックス）に匹敵するように、行われていることが分かる。
【００８５】
また、特に本発明のサイトメータを用いて得た図１１ｂ（後述）のサイトグラフを参照することができる。
【００８６】
次に、本発明の第４の目的に係る水力学装置を説明する。
【００８７】
図３は、本発明の水力学装置の理解を可能にするための、水力回路100および血液自動分析機20の幾つかの機器の概要を部分的に示す。
【００８８】
図３に示した自動分析機は、特に血液の貯蔵および自動分析機までの搬送に使用されるパイプ内の分析すべき血液を採取するためのニードル101を有する。採取された血液は検体の形でニードルによってタンク102内へ注がれる。タンク102は特に血液検体の赤血球の希釈及び／又は細胞溶解のために設けてある。検体の全部又は一部は、希釈の前又は後で、自動分析機の他の部分（例えば後述する装置120）内で分析する目的で採取することができる。ヘモグロビン分析装置110（例えば分光光度計）はタンク102の近傍に配置されている。希釈剤用の貯槽103と試薬（特に細胞溶解）用の貯槽104は水力学回路100を介してタンク102に接続してある。
【００８９】
他の分析装置120は、例えばタンク102内で採取された検体の全部又は一部について、特に白血球の計数と弁別に使用される。以下ではこの全部又は一部も検体と言う。白血球分析装置120は特に光学装置200と光学タンク300を備えている。この光学タンクは水力学回路100を介してタンク102に接続されている。
【００９０】
一組のシリンジは水力学回路内での液体の移動を可能にする。これらのシリンジの中で、希釈用シリンジ105と試薬用シリンジ106は本発明が良く分かるように図示してある。本発明の理解のために必要ないので図示してない他のシリンジは、この装置を補完することができる。
【００９１】
液体循環用導管の他に、この水力学回路は、分析の所与の瞬間になされる用途に応じて水力学回路100内の異なる回路を切換えるための電磁弁を有する。図３には水力学回路100の電磁弁のなかの８つの電磁弁111〜119が示してある。各電磁弁は２つの位置を有し、夫々文字Ａ又はＢで示してある。
【００９２】
以下に述べるような水力学回路の構成は、図示した複数のシリンジのために唯一の動力Ｍしか使用しないことを可能にする。同じ動力を更に他のシリンジのために使用することができる。斯くして、シリンジ105、106のピストンは互いに強固に連結されている。従って、それらは同時運動を行う（即ち、各シリンジの夫々のシリンダ内でピストンが押し込まれる時の押し運動Ｐか、ピストンが引き抜かれる時の牽引運動Ｔ）。
【００９３】
次に、この自動分析機の配置と水力学的作動を説明する。
【００９４】
タンク300は外部本体301とインジェクタ302とを有し、本体301の内側では、本体とインジェクタとの間にスリービング容量303が形成されている。
【００９５】
水力学回路100は以下のものを備えている：
−インジェクタと弁111との間で、インジェクタの上流に延長する射出分岐管131；
−射出分岐管上の検体分岐点142に接続され、タンク102まで延長する検体分岐管132；
−検体分岐点142の上流において、弁113を介して射出分岐管上の吸引分岐点143に接続され、真空源107（例えば、シリンジ又は蠕動ポンプ）まで延長する吸引分岐管133；
−吸引分岐点143の上流において、射出分岐管上の排出分岐点144に接続され、試薬貯槽104まで延長する排出分岐管134；
−本体301の上流で延長し、スリービング容量と弁115とを接続するスリービング分岐管135；
−弁115を介して弁116と希釈液の用途108との間で延長する希釈分岐管136；
−希釈液貯槽103と弁116との間で延長する希釈分岐管137；
−試薬貯槽104と弁117との間で延長する試薬分岐管140；
−弁111を介して弁117と試薬の用途119との間で延長する反応分岐管141；
−弁118を介してタンク102と真空源107との間で延長するタンク102用ドレーン分岐管138（検体分岐管132はタンク102と弁118との間でこのドレーン分岐管に接続されており、吸引分岐管はタンクに関して弁118の向こうでドレーン分岐管132に接続されている）；および、
−タンク300の下流を弁119を介して例えば大気圧下の廃棄物槽に、又は、吸引源を介してシリンジ若しくは蠕動ポンプに接続する出口分岐管139。
【００９６】
弁116の第１位置116Aにおいては、希釈用シリンジ105は希釈液貯槽に連通しているので、牽引力Ｔはシリンジ105を希釈液で満たすのを可能にする。
【００９７】
希釈用シリンジには希釈液が入っており、第１の場合には、弁116はシリンジ105を希釈分岐管136に接続する第２位置116Bにあり、弁115は希釈分岐管を希釈液の用途108に接続する第１位置115Aにあるので、推力Ｐは例えば検体全体の希釈のために希釈液を例えばタンク102内のこの用途108まで移動させるのを可能にする。
【００９８】
第２の場合には、弁116はその第２位置116Bにあり、弁115は希釈分岐管をスリービング分岐管135に接続する第２位置115Bにあるので、推力Ｐはスリービング流を形成するべく希釈液を光学タンク300内まで移動させるのを可能にする。本発明におけるこのスリービング流の有用性は、後のタンク300の説明の際に解説する。
【００９９】
弁117は試薬シリンジを試薬貯槽104に接続する第１位置117Aにあり、弁114は排出分岐管134を切断する第１位置114Aにあるので、牽引力Ｔは試薬シリンジ106を試薬で満たすのを可能にする。
【０１００】
試薬シリンジには試薬が入っており、第１の場合には、弁117は試薬シリンジ104を試薬分岐管141に接続する第２位置117Bにあり、弁111は反応分岐管を試薬の用途109に接続する第１位置111Aにあるので、推力Ｐは例えば検体全体の細胞溶解のために試薬を例えばタンク102内のこの用途109まで移動させるのを可能にする。
【０１０１】
第２の場合には、弁117はその第２位置117Bにあり、弁111は反応分岐管141を射出分岐管131に接続する第２位置111Bにあるので、試薬シリンジ106は直接にインジェクタ302に接続される。
【０１０２】
弁118はドレーン分岐管を通って検体分岐管132から吸引分岐管133を分離する第１位置118Aにあり、弁112は検体分岐管132の上流を下流に接続する第１位置112Aにあり、弁113は吸引分岐管133の下流を上流（従って、真空源107）に接続する第１位置113Aにあるので、分析すべき検体は、検体分岐管142と吸引分岐管143との間で、射出分岐管131内まで吸引される。
【０１０３】
排出分岐管134は可変又は所定口径の流体抵抗150を有する。
【０１０４】
希釈シリンジ105に希釈液が入っており、試薬シリンジ106に試薬が入っており、かつ、分析すべき血液検体が射出分岐管131内に存在する場合には；更に、弁112、113がそれらの夫々の分岐管の上流と下流を分離する第２位置112B、113Bにある場合には；更に、弁115、116が希釈液シリンジ105をスリービング容量303に接続する第２位置115B、116Bにある場合には；最後に、弁111、117が試薬シリンジ106をインジェクタ302に接続する第２位置111B、117Bにあり、弁114が第２位置114Bにある場合には；唯一の動力Ｍによって発生せられた唯一の押し運動Ｐは希釈液と試薬と血液検体とをタンク300の方向へかつ当該タンクを横切って駆動するのを可能にし、他方、試薬の一部は流体抵抗150に応じて試薬貯槽104へ戻る。
【０１０５】
抵抗150は特にスリービング液と押出し液の相対流量を調節するのを可能にする。これはこれらの流量をこれらの液の異なる機能に適合させるのを可能にする。特に、これは、従来のハイドロフォーカス型タンクを使用する時に、分析領域304内のスリービングと検体のために同じような流速を得るのを可能にする。
【０１０６】
特に、排出分岐管134および前述した配置は、単一の動力を使用することを可能にし、従って、自動分析機のコストおよび嵩を大幅に低減することを可能にする。
【０１０７】
希釈液はタンク300の分析領域304内で検体のためのスリービング流を形成する（特に図４および図５参照）。射出分岐管131内で検体の上流に位置する試薬は、押出し液として作用する（即ち、それは試薬シリンジのピストンの運動を検体に伝達するのを可能にする）。従って、検体の分析をすることができるように試薬シリンジを検体で満たすことは意味がない。従って、僅かな容積の検体であっても分析することができ、かつ、射出分岐管131又はシリンジ106内に一部分を残すことなくこの検体の全部を射出し分析することができる。
【０１０８】
勿論、自動分析機20の良好で完全な作動のために、図３に示してない他のシリンジ、弁および分岐管で水力学回路100を補完することができる。
【０１０９】
次に、特に図４および図５を参照しながら、本発明の光学装置200を説明する。
【０１１０】
光学装置はほぼ単色の光源201を有する。この光源はエレクトロルミネッセンス・ダイオードである。光は主として光軸X200に沿って放出される。光軸X200は光学タンク300内における検体の移動の射出軸線X300に対してほぼ垂直に配置されている。これら２つの軸X200およびX300は共に１つの光学平面を画定している。
【０１１１】
光源201から出た光源光束311がノイズ光によって汚染されるのを回避するため、一組の３つの絞りが夫々光束の進路に対して垂直に配置してある。絞り202にはオリフィスが穿孔してあり、オリフィスの直径は光束にほぼ等しいと共に、各絞りにおいて、この直径が光源201から遠ざかりながら増大するにつれて光束の直径に適合するべく漸増している。次いで光束は一若しくは複数のレンズからなる収束装置203を通過する。
【０１１２】
収束装置の向こうでは、光束は射出軸線X300に垂直な平面内で（即ち、タンク内の検体の移動に対して横断方向に）光軸を変位させるための調節装置に出会う。光束を側方にオフセット（ずれ）させれば、検体の部分的な（又はゼロの）照明をもたらすことができ、これは分析結果に直接に影響する。
【０１１３】
記載した実施例の枠組においては、この調節装置は軸線X220を中心として回転可能に装着された透明なガラス板220からなる。軸線X221は射出軸線X300にほぼ平行である。もしガラス板を光軸X200に垂直に配置したならば、光束は偏向されることなくそれを横切る。反対に、もしガラス板が光軸と角度を成すならば、ガラス板の入口と出口における二重屈折は調節軸線X220に垂直な平面内で光束をオフセットさせる。調節軸線X220は射出軸線X300にほぼ平行であるから、ガラス板内における屈折により横断方向オフセットのみが生じる。ガラス板の厚さ及び／又は屈折率が大きければ大きいほど、かつ、ガラス板が光軸に対して傾斜すればするほど、このオフセットは大きい。従って、特定の厚さおよび屈折率のガラス板については、光学タンク300の分析領域304内を移動する検体に対する光束の位置を調節するには、ガラス板220をその軸線X220を中心として回転させれば充分である。高精度の機構の使用すれば、精密回転運動は一般に精密並進運動よりも実施が容易であることから、このような調節装置は従来技術の装置に較べて特に経済的である。
【０１１４】
タンク内に進入しかつ検体を横切った後は、光源光束211は少なくとも部分的に軸方向派生光束212となり、これはほぼ光軸に沿ってタンクから出る。軸方向派生光束212はそれが横切って来た検体に関する情報を担持している。
【０１１５】
これらの情報の幾つかを同時に測定するのを可能にするため、複数の測定装置222、223を用いて光束を分析できなければならない。特に、光学分析は２つの角度範囲（即ち、小さな角度と大きな角度）に沿って回折した光の検出に依存している。夫々の角度範囲において、異なる２つの情報を使用する。従って、夫々の範囲について異なる２つのチャンネルに光を分配する必要がある。従って、派生光束212を２つの派生光束213、214に分離する手段205を使用する。この分離手段は主として分離用ガラス板（ビームスプリッタ）205で構成される。この分離用ガラス板はガラスの透明板である。それは光軸から45度に配置してある。その結果、分離用ガラス板を通過した光によって形成される二次的な軸方向派生光束213と、フレネル損失によって形成された（即ち、分離用ガラス板によって反射された光によって形成された）損失派生光束214が生じる。
【０１１６】
このような分離用ガラス板は、従来技術においてこの種の光学式分析装置で使用されている分離手段に較べて非常に低コストのものである。特に、それは追加的な反射被膜を全く備えていないので、経時的に殆ど変質せず、ほぼ何等の保守も必要としない。ガラス板の内部における多重反射を考慮すれば、かつ、軸方向派生光束の入射光線の偏光を考慮すれば、5〜15％のエネルギが反射され、残りは二次的な軸方向派生光束の形で透過する。
【０１１７】
タンクと分離用ガラス板との間では、軸方向派生光束212は適当な手段206によって平行にされる。分離用ガラス板を越えたところでは、派生光束213、214は夫々の測定装置222、223による分析を目的として夫々適当な手段207、208によって再び収束される。
【０１１８】
前述した実施例では、二次的な軸方向派生光束213を分析する測定装置222は、血液細胞による光軸近傍の回折の測定装置である（いわゆるFSC測定）。記載した実施例では、フレネル損失に由来する光束214を分析する測定装置223は、光軸上の光損失（即ち、検体中の細胞による光の掩蔽）を測定する装置である（いわゆるALL測定）。
【０１１９】
図５は射出軸線X300に垂直で光軸X200を含む平面におけるタンクの断面を模式的に示す。この図に特に示したように、側方派生光束315として検体によって側方に再放出された光（測定装置224内のタンクの向こうで収束される）も分析される。
【０１２０】
次に、特に図６を参照しながら、特に前述したような水力学回路と共に使用するようになった、本発明の光学タンクを説明する。このタンクの作動は図１０に極めて模式的に示した従来技術のハイドロフォーカス型の作動に匹敵する。
【０１２１】
図１０のタンク350は本体351とインジェクタ302と分析領域354を有する。タンクの横断方向内側寸法D354は約250ミクロンである。この寸法は、タンクが円形断面の場合には直径であり、タンクが正方形又は長方形断面の場合には側辺であることができる。破線で示したように、検体流361の直径を著しく減少させるためにスリービング流362が使用されるので、分析領域354においては検体流は、従来技術においては、50ミクロンより小さな直径D361を有する。
【０１２２】
図４〜６に示した本発明のタンク300は、射出軸線X300に沿ってほぼ同軸的に配置された、本体301とインジェクタ302を有する。分析領域304はインジェクタの下流に配置されている。
【０１２３】
本体は射出成形材料、好ましくはプラスチック材料、で形成されている。このような製造方法は複雑な形状を得るのを可能にする。特に、レンズ305は本体内にインサート成形されている。このレンズは、血液細胞によって掩蔽され、回折され、又は散乱された光を収集するのを可能にする。
【０１２４】
このレンズは、射出された材料中に場合によっては存在する局部的不均質性を寸法に較べて無視できるに充分な寸法（特に直径）を有していなければならない。図示した実施例では、レンズ305は３mm前後の直径を有する。射出成形されたこのレンズは側方派生光束315が通過する側方レンズ305である。更に、この側方レンズは、出来るだけ多くの方向に沿って（即ち、出来るだけ大きな方向範囲（directional field）で）光を回収することができなければならない。従って、レンズが検体に近いほど、方向範囲が大きい。図示した実施例ではレンズは90°型と呼ばれる半球形レンズである。更に、レンズはタンクの壁の一部であるから、検体とレンズとの間には、タンク内の液体との直接接触がある（即ち、屈折率の小さな空気層がない）。これにより測定がそれだけ向上する。
【０１２５】
均質性欠陥を克服するため、光が特に収束される場合にはガラス（例えば、BK7タイプ）が使用される。これは、特に、光源光束211がタンク内に入りかつ軸方向派生光束212がタンクから出るところの軸方向窓306の場合である。
【０１２６】
このような寸法の射出成形レンズを形成し得るためには、従って、分析領域においてタンク300が少なくとも匹敵し得る寸法を有する必要がある。更に、これらの大きな寸法はガラス製の窓をプラスチック製の壁と一体化するのを可能にするのであるが、これに対して従来技術の小さな寸法のタンクにおいてはそれらは完全にガラス又は石英の壁で作られている。特に図５および図６に示した実施例においては、タンクの内側断面は光軸に沿って４.５mmで垂直方向に３mmである。分析すべき血液細胞を搬送する検体の僅かな容量に関連するこの大きな寸法の矩形断面は、検体の流体力学的スリービングを使用することを必要とする。対比するに、従来技術のタンクは250ミクロンに近い分析領域横断方向内側寸法D354を有する。
【０１２７】
分析領域304の上流では、タンクの本体301はインジェクタ302を囲繞していると共に、インジェクタの周りにスリービング容量303を形成している。インジェクタの壁は、インジェクタの内側で検体によって形成された流れ311を、スリービング容量内のスリービング流312から分離する。検体流は水力学回路100の射出分岐管131から出る。スリービング流は水力学回路100のスリービング分岐管135から出る。分析領域においては、これら２つの流れは接触し、同心的なまゝに留まり、タンク内で同時に流れる。
【０１２８】
自動分析機のコストを低減するため、構成部品の製造精度を減らすのが好ましい。前述したように、斯る目的はより大きな断面の検体流を創成することにより達成することができる。
【０１２９】
しかしながら、スリービング流によって検体流を引っ張るような従来技術のやり方を使用する場合には、大きな断面の検体流は乱流となるであろう。これは測定精度に著しく悪影響を与えるであろう。更に、検体流の断面は次第に減少するであろう。これは大きな断面の検体流を得るべきであるという所望の効果に反している。斯る目的は図１を参照しながら前述した本発明の水力学回路100を使用することにより達成される。斯る回路は、検体流に殆ど乱流が現れないようにするために、かつ、これらの乱流が分析結果に著しく影響しないようにするために、スリービング流の流速と検体流の流速とを独立に選定するのを可能にする。これら２つの流れは夫々ほぼ一様であることができ、場合によっては適当な或る速度範囲においては層流である。
【０１３０】
更に、図７又は図８に示したようなインジェクタ302は、また、検体流内の乱流を制限するのを可能にする。それは、更に、ほぼ一様な流れを保持しながら検体を光学タンク内に大きな速度で射出するのを可能にする。
【０１３１】
図７に示したようなインジェクタ302は、例えばインジェクタの剛性を保障するステンレス鋼で形成された構造管320を有する。この構造管は例えばポリテトラフルオロエチレン（PTFE）のようなプラスチック材料からなる管321によって内側が被覆されている。図示した実施例では、構造管と被覆管は円筒形である。この被覆管は、構造管の下流において、同じプラスチック材料からなるノズルによって延長してある。プラスチック材料の使用に伴い、構造管の構造的機能をノズルの射出機能から区別したので、充分に精密な形状を最低のコストで容易に得ることが可能になる。
【０１３２】
ノズルは被覆管の内径D321からノズル322の下流端324のところの出口オリフィス323の内径D323に至るまで漸減する断面を有する。実施例では、下流端324は長さL324の円筒である。ノズルの壁は、最初は内側に向かって凹状であるが、次いで内側に凸状になるように曲がっており、従って、ノズルの断面は、直径D321から直径D324に至るまで、上流から下流に向けて漸減している。凹面は円筒形の被覆管の内側面に対して接線方向である。凸面は円筒形端部324の内側面に対して接線方向である。実施例では、オリフィス323の直径D323は約60ミクロンであり、被覆管の内径D321は約１ミリメータであり、ノズルの長さL322は約２.５ミリメータであり、構造管の長さL320は約６ミリメータであり、円筒形端部の長さL324は約200ミクロンである。
【０１３３】
図８および図９に示したようなインジェクタは、唯一の部品からなり、かつ、ほぼ剛性の唯一の材料からなる。この材料は、例えば、ステンレス鋼、セラミック、剛性ルビー、或いはプラスチック材料であり得る。プラスチック材料は好ましくはポリテトラフルオロエチレンである。このインジェクタは下流においてノズル332によって延長されたほぼ円筒形の管331を有する。
【０１３４】
ノズルの内側は管331の内径D331からノズル332の下流端334のところの検体用出口オリフィス333の内径D333に至るまで漸減している。図示した実施例では、縮径は好ましくは9〜10度の角度で開いた円錐截頭に沿って行われる。円錐截頭の向こうで、出口オリフィス333までは、長さL335で直径D333の円筒形部分335内で直径は一定に留まる。
【０１３５】
ノズルの外部では、その外径は約8〜9度の角度で開いた円錐截頭に沿って僅かに漸減しており、次いで、端部において約35〜45度の角度A334で開いた円錐截頭に沿って出口オリフィス333の周りの外径D334まで大きく漸減している。D334はD333よりも約３〜４倍大きい。
例として、D333＝60μｍ、D334＝200μｍ、A334＝40°である。
【０１３６】
前述した種々の装置のお陰で、高い射出速度を得ることができる。即ち、前述した実施例においては、200マイクロリッター以上の検体を10秒以内に射出することができる。特に、斯る射出速度は、従来技術の自動分析機に較べて分析時間を増加しなくても、大きな血液検体希釈率を使用するのを可能にする。特に、装置110（図３参照）によるヘモグロビン分析のためと、光学装置120による白血球分析のために、白血球分析のために一般的に使用されている1／80に代えて、同じ希釈率（例えば、1／160）を使用することができる。
【０１３７】
図１１ａ〜ｃは本発明の第１目的に係る方法および装置を使用して得られた結果を示すもので、当該装置は本発明の第３目的に係る光学タンク７と本発明の第２目的に係る光学装置８を使用している。図１１ａはヘモグロビン測定の正の線形性テストを示し、従って、本発明による血液検体のヘモグロビンの割合の測定の可能性と信頼性を立証するものである。図１１ｂは本発明の組成物を添加した好酸球30％の血液テスト検体について得られた光学マトリックスを示す。このマトリックスでは、５つのサブ母集団が有効に存在し、かつ、弁別される（このサイトグラフ上に画定された集合は：好酸球のＥ、好中球のＮ、単核白血球のＭ、塩基性球のＢ、およびリンパ球のＬ）。図１１ｃは抵抗率による白血球の割合の測定に関する正の線形性テストを示す。
【０１３８】
これらの図は、本発明のお陰で、本発明の（特に、モノ試薬の形の）組成物を使用することにより、少なくともヘモグロビンの割合と、白血球の割合の分析と、白血球の弁別とを行うことができることを示している。
【０１３９】
勿論、本発明は前述した実施例に限定されるものではなく、本発明の範囲を逸脱することなく上記実施例に種々の修正を施すことができる。
【０１４０】
例えば、スリービング流およびピストン液を夫々形成するために希釈液や試薬以外の化合物を使用することができる（特に他の用途のための自動分析機においてそれらが利用可能な場合）。
【０１４１】
また、流体抵抗は、射出回路だけに配置する代わりに、スリービング回路に又は同時に２つの回路に配置することができる。
これは押出し用又はスリービング用液体の移動手段によって与えられる最大流量に応じて行うことができる。
【０１４２】
光学タンク及び／又は光学装置の複数の又は全部のレンズも、また、前述したような唯一のものの代わりに、タンク本体と一体に射出成形することができる。特に、ガラスの窓は射出成形することができる。特に、測定のための所望の精度に対して、射出した材料中の不均質性がほぼ無視できる場合。
【０１４３】
前述した調節装置及び／又は分離手段は互いに独立に使用することができ、場合によってはエレクトロルミネッセンス・ダイオード以外の他の光源と共に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】図１は本発明の第１の目的に係る装置の実施例を模式的に示す。
【図２】図２ａ〜２ｅは本発明の方法に基づく分光測光によるヘモグロビン測定の線形性テストのグラフであり；図２ｆ〜２ｉは対応するサイトグラフである。
【図３】図３は本発明の第４の目的に係る水力学装置を使用した血液検体自動分析機の模式図である。
【図４】図４は本発明の第２の目的に係る光学装置の全体の長手方向模式図である。
【図５】図５は、図４の平面に垂直な平面における、図４の光学装置のより詳細な長手方向模式図である。
【図６】図６は本発明の第３の目的に係る光学タンクの斜視図である。
【図７】図７は本発明の光学タンクのためのインジェクタの第１実施例の長手方向断面図である。
【図８】図８は本発明の光学タンクのためのインジェクタの第２実施例の長手方向断面図である。
【図９】図９は図８のインジェクタの端部の長手方向断面図である。
【図１０】図１０はタンクの長手方向断面図で、タンク内へ血液検体を射出するための従来技術の方法を示す。
【図１１】図１１ａ〜１１ｃは、本発明の装置および光学タンクを備えたサイトグラフを使用しながら、本発明の方法を実施する自動分析機を用いて得られた結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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