(57)【要約】高い保存安定性を有している治療用ウイルス処方物が記載される。この処方物には、ウイルスベクター、さらに、水性共溶媒、ウイルスによってコードされる可逆性プロテアーゼ阻害剤、および穏やかな還元剤またはウイルス成分の特異的な分解を妨げる他の物質の１つ以上が含まれる。別の局面では、この処方物には、アデノウイルスベクター、ＡＲＣＡ緩衝液と、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ、スクロース、グリセロール、およびグリコフロールからなる群より選択される水性共溶媒が含まれる。この場合、処方物は、水性共溶媒が含まれていない処方物よりも、２℃から３０℃において高い安定性を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノウイルスベクター、グリシン、ＭｇＣｌ２、Ｔｒｉｓ緩衝液ならびに、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ、スクロース、グリセロール、およびグリコフロールからなる群より選択される水性共溶媒が含まれている処方物であり、該水性共溶媒が含まれていない処方物よりも、２℃から３０℃においてより高い安定性を示す、処方物。
【請求項２】
前記水性共溶媒がプロピレングリコールである、請求項１に記載の処方物。
【請求項３】
前記プロピレングリコールが約３から２０％の濃度で存在する、請求項２に記載の処方物。
【請求項４】
前記水性共溶媒がグリコフロールである、請求項１に記載の処方物。
【請求項５】
前記グリコフロールが約５から２０％の濃度で存在する、請求項４に記載の処方物。
【請求項６】
前記水性共溶媒がスクロースである、請求項１に記載の処方物。
【請求項７】
前記スクロースが少なくとも２０％の合計濃度で存在する、請求項６に記載の処方物。
【請求項８】
前記水性共溶媒がグリセロールである、請求項１に記載の処方物。
【請求項９】
前記グリセロールが約１０から５０％の濃度で存在する、請求項８に記載の処方物。
【請求項１０】
前記処方物が約５℃で保存される、請求項１に記載の処方物。
【請求項１１】
前記処方物がほぼ室温（１５〜３０℃）で保存される、請求項１に記載の処方物。
【請求項１２】
細胞への侵入のためのウイルスによってコードされるイントラキャプシドプロテアーゼに依存するウイルスベクターと可逆性のプロテアーゼ阻害剤が含まれている処方物であって、該可逆性のプロテアーゼ阻害剤が含まれていない処方物よりも、２℃から３０℃においてより高い安定性を示す、処方物。
【請求項１３】
前記ウイルスによってコードされるイントラキャプシドプロテアーゼがアデノウイルスプロテアーゼである、請求項１２に記載の処方物。
【請求項１４】
前記可逆性のプロテアーゼ阻害剤がＬ３／ｐ２３システインプロテアーゼの阻害剤である、請求項１３に記載の処方物。
【請求項１５】
前記可逆性のプロテアーゼ阻害剤が、チオグリセロール、ジメチルスルフィド、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、システイン、グルタチオン、およびメチオニンが含まれるチオ化合物からなる群より選択される、請求項１４に記載の処方物。
【請求項１６】
アデノウイルスベクター、グリシン、ＭｇＣｌ２、Ｔｒｉｓ緩衝液、およびチオ化合物を含む処方物であって、該チオ化合物が含まれていない処方物よりも、２℃から３０℃においてより高い安定性を示す、処方物。
【請求項１７】
前記チオ化合物がチオグリセロールである、請求項１６に記載の処方物。
【請求項１８】
前記チオグリセロールが、約０．５から２０％または約５０から２００ｍＭの濃度で存在する、請求項１７に記載の処方物。
【請求項１９】
前記チオ化合物がジメチルスルフィドである、請求項１６に記載の処方物。
【請求項２０】
前記ジメチルスルフィドが、約１０から１００ｍＭの濃度で存在する、請求項１９に記載の処方物。
【請求項２１】
前記チオ化合物がＤＴＴである、請求項１６に記載の処方物。
【請求項２２】
前記ＤＴＴが約２０〜１００ｍＭの濃度で存在する、請求項２１に記載の処方物。
【請求項２３】
前記ＤＴＴが５０ｍＭの濃度で存在する、請求項２２に記載の処方物。
【請求項２４】
前記チオ化合物がシステインである、請求項１６に記載の処方物。
【請求項２５】
前記システインが少なくとも１％または１５０ｍＭの濃度で存在する、請求項２４に記載の処方物。
【請求項２６】
前記処方物が５℃で保存される、請求項１２に記載の処方物。
【請求項２７】
前記処方物が５℃で保存される、請求項１６に記載の処方物。
【請求項２８】
前記処方物が室温（１５〜３０℃）で保存される、請求項１２に記載の処方物。
【請求項２９】
前記処方物が室温で保存される、請求項１６に記載の処方物。
【請求項３０】
前記処方物に、さらに、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ、スクロース、グリセロール、およびグリコフロールからなる群より選択される水性共溶媒が含まれる、請求項１２に記載の処方物。
【請求項３１】
前記処方物に、さらに、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ、スクロース、グリセロール、およびグリコフロールからなる群より選択される水性共溶媒が含まれる、請求項１６に記載の処方物。
【請求項３２】
前記水性共溶媒がプロピレングリコールである、請求項３１に記載の処方物。
【請求項３３】
前記プロピレングリコールが約３から２０％の濃度で存在する、請求項３２に記載の処方物。
【請求項３４】
前記水性共溶媒がグリコフロールである、請求項３１に記載の処方物。
【請求項３５】
前記グリコフロールが約５から２０％の濃度で存在する、請求項３４に記載の処方物。
【請求項３６】
前記水性共溶媒がスクロースである、請求項３１に記載の処方物。
【請求項３７】
前記スクロースが少なくとも３５％の合計濃度で存在する、請求項３６に記載の処方物。
【請求項３８】
前記水性共溶媒がグリセロールである、請求項３１に記載の処方物。
【請求項３９】
前記グリセロールが約１０から５０％の濃度で存在する、請求項３８に記載の処方物。
【請求項４０】
前記処方物が５℃で保存される、請求項３１に記載の処方物。
【請求項４１】
前記処方物が室温（１５〜３０℃）で保存される、請求項３１に記載の処方物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願への相互参照）
本出願は、２００５年３月１日に出願された米国特許出願第６０／６５６，８８３号（この内容は、その全体において参考として本明細書に援用される）の利益を主張する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的には、治療用ウイルスの処方物に関係し、具体的には、水性共溶媒、可逆性のイントラキャプシド（ｉｎｔｒａｃａｐｓｉｄ）プロテアーゼ阻害剤、および／または穏やかな還元剤を含む、１種類以上の安定化剤が含まれている治療用ウイルスの処方物に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ヒトへの治療用途が意図されるウイルス粒子は、生物学的活性を保持するためにはそれらの構造の完全性を維持しなければならない。しかし、長期間にわたるウイルスベクター処方物の保存によっては、生物学的活性の低下が生じ得る。現在のウイルス治療薬は、通常は、長期間にわたりそれらを保存がすることができる緩衝液の中に処方される。しかし、このような処方物は、それらの生物学的活性を維持するためには、比較的低い温度で維持され、輸送されなければならない、多くの場合には、保存の間に活性の損失が生じる。
【０００４】
比較的低い温度での保存および輸送は力価の損失を最少にするために使用されるが、しかし、これによって、適切な条件下でウイルスを保存するための設備がない臨床設定において使用されるウイルス治療のコストおよび能力という結果に至っている。
【０００５】
多くの既知のウイルス（治療用ウイルスベクターとして使用されているものが含まれる）としては、エクスターナルキャプシド（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃａｐｓｉｄ）（すなわち、アデノウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス）が挙げられる。細胞への侵入の間にエクスターナルキャプシドが脱殻（ｕｎｃｏａｔｉｎｇ）されるように、ほとんどのキャプシドタンパク質は隣接するキャプシドタンパク質と共有結合以外によって会合している。これらの共有結合以外による相互作用は、細胞外媒体の中で有限時間の間、キャプシドのアセンブリされた状態を維持するためには十分に強いが、特定の生物学的条件下（すなわち、低いｐＨ、受容体の結合が原因である特異的な立体構造の変化、酵素分解など）では十分に不安定である。これにより、感染の間の分解が可能となる。キャプシドタンパク質−タンパク質の会合を安定化させる物質は、治療用ウイルス産物処方物において有用性が見出される。
【０００６】
アデノウイルスは、イントラキャプシドウイルスによってコードされるプロテアーゼと共にアセンブリされることが知られている。アデノウイルスの脱殻は段階的なプロセスであり、これによって、核内へのウイルスＤＮＡの放出と、ウイルスキャプシドの解離が生じる。システインプロテアーゼの阻害剤であるＬ３／ｐ２３は、キャプシドの内側に存在しており、これは、プロテインＶＩの分解をブロックすることが示されている。このことは、Ｌ３／ｐ２３プロテアーゼは侵入前にウイルスをアセンブリするために必要であるが、入ってくるウイルスの解離にもまた必要であることを示している。他のウイルスもまた、それらの生活環の一部として、イントラキャプシドプロテアーゼに依存している可能性がある。
【０００７】
処方されたウイルスの中でプロテアーゼの活性化を誘発する事象によっては、処方されたウイルスの分解が引き起こされる場合があり、これによって、不安定化および不活化が生じる場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、商業的に合理的な条件下で最少の分解と保存安定性を示す、治療的な用途のためのウイルスベクター処方物が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の１つの態様は、培養された細胞に由来するウイルス（アデノウイルスが含まれるが、これに限定はされない）の生産および保存のための改良された方法に関する。この生産方法により、保存の間のウイルスの安定性が改善され、そして力価の損失の減少をもたらす新規の処方物が提供される。
【００１０】
本発明の第２の態様は、プロセシング後のウイルスを保存するための処方物に関する。この処方物により、凍結条件および非凍結条件のいずれの下でも、具体的には、室温で、ウイルスの活性が保存される。本発明の１つの態様においては、これはプロテインＶＩの分解を阻害することによって行われる。
【００１１】
１つの実施形態においては、処方物には、水性共溶媒、ウイルスによってコードされる可逆性プロテアーゼ阻害剤、および穏やかな還元剤、またはウイルス成分の特異的な分解を妨げる他の物質の１つ以上が含まれる。
【００１２】
別の実施形態においては、処方物には、アデノウイルスベクター、ＡＲＣＡ緩衝液と、プロピレングリコール、ＤＭＳＯ、ＰＥＧ、スクロース、グリセロール、およびグリコフロールからなる群より選択される水性共溶媒が含まれる。この場合、処方物は、水性共溶媒が含まれていない処方物よりも、２℃から３０℃において高い安定性を示す。
【００１３】
水性共溶媒は、約３から２０％の濃度のプロピレングリコール；約５から２０％までの濃度のグリコフロール；全濃度、すなわち、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、または６０％のスクロースであり得る。
【００１４】
なお別の実施形態においては、処方物には、細胞への侵入のためのウイルスによってコードされるイントラキャプシドプロテアーゼに依存するアデノウイルスベクターと可逆性のプロテアーゼ阻害剤が含まれる。この場合、処方物は、可逆性のプロテアーゼ阻害剤が含まれていない処方物よりも、２℃から３０℃において、より高い安定性を示す。
【００１５】
可逆性のプロテアーゼ阻害剤は、約０．５から２．０％、または５０から２００ｍＭの濃度のチオグリセロール、約１０から１００ｍＭの濃度のジメチルスルフィド、約２０〜１００ｍＭ、好ましくは、５０ｍＭの濃度のジチオスレイトール（ＤＴＴ）、少なくとも１％の濃度のシステイン、あるいは、１５０ｍＭのグルタチオン、およびメチオニンであり得る。
【００１６】
本発明により、さらに、水性共溶媒と可逆性のプロテアーゼ阻害剤（上記）の両方が含まれている、アデノウイルスベクターの保存のための処方物が提供される。
【００１７】
好ましくは、この処方物は、水性共溶媒および／または可逆性のプロテアーゼ阻害剤が添加されていない処方物よりも、５℃または３０℃で保存された場合に高い安定性を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（詳細な説明）
定義
本発明の実施の態様では、他の場所に明記されていない限りは、化学、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、遺伝学、免疫学、細胞生物学、および細胞培養の通常の技術が使用され、これらは、当業者の能力の範囲内である。
【００１９】
他の場所に明記されていない限りは、本明細書中で使用される全ての用語は、それらが当業者に知られているものと同じ意味を有し、本発明の実施には、化学、微生物学、および組み換えＤＮＡ技術の従来技術が使用されるであろう。
【００２０】
本発明が記載される際には、以下の用語が使用され、これらは、以下に示されるように定義されることが意図される。
【００２１】
用語「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「ポリヌクレオチドベクター構築物」、「核酸ベクター構築物」、および「ベクター構築物」は、当業者に理解されているように、遺伝子導入のための任意の核酸構築物を意味するように、本明細書中では同義的に使用される。
【００２２】
本明細書中で使用される場合は、用語「ウイルスベクター」は、その当該分野で認識されている意味にしたがって使用される。これは、ウイルス起点の少なくとも１つのエレメントを含み、ウイルスベクター粒子の中にパッケージされ得る核酸ベクター構築物を意味する。ウイルスベクター粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞の中にＤＮＡ、ＲＮＡ、または他の核酸を導入する目的のために利用することができる。
【００２３】
用語「ウイルス」、「ウイルス粒子」、「ベクター粒子」、「ウイルスベクター粒子」、および「ビリオン」は同義的に使用され、そして、例えば、本発明のウイルスベクターが感染性粒子の作成のために適切な細胞または細胞株の中に導入されると形成される、感染性ウイルス粒子を意味するとして広く理解される。本発明のウイルス粒子は、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞内に核酸を導入する目的のために利用することができる。本発明で利用されるベクターは、状況に応じて、選択マーカーをコードする場合がある。
【００２４】
本明細書中で使用される場合は、用語「アデノウイルス」および「アデノウイルス粒子」（同義的に使用される）は、アデノウイルスとカテゴリー分類することができる任意の、および全てのウイルスを意味し、これには、ヒトまたは動物に感染する任意のアデノウイルスが含まれ、全てのグループ、サブグループ、および血清型のものが含まれる。
【００２５】
したがって、本明細書中で使用される場合は、「アデノウイルス」および「アデノウイルス粒子」は、ウイルス自体またはその誘導体を意味し、これには、他の場所で明記される場合を除き、全ての血清型とサブタイプ、および自然界に存在している形態と組み換え形態の両方が含まれる。このようなアデノウイルスは野生型である場合も、また、当該分野で公知であるかまたは本明細書中に開示されるような様々な方法で修飾することができる場合もある。このような修飾には、感染性ウイルスを作成するための、粒子の中にパッケージされるアデノウイルスゲノムに対する修飾が含まれる。このような修飾としては、当該分野で公知の欠失、例えば、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ、Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、Ｅ３、またはＥ４コード領域の１つ以上の中での欠失が挙げられる。
【００２６】
「複製」および「増殖」は同義的に使用され、ウイルスベクターの複写または増幅する能力を意味する。これらの用語は当該分野で十分に理解されている。本発明の目的については、複製には、アデノウイルスタンパク質の生産が含まれ、一般的には、これは、アデノウイルスの複製を指す。複製は、当該分野で標準的であり、本明細書中に記載されるアッセイ、例えば、ウイルス量アッセイ（ｖｉｒｕｓ  ｙｉｅｌｄ  ａｓｓａｙ）、バーストアッセイ、またはプラークアッセイを使用して測定することができる。「複製」および「増殖」には、ウイルスの製造のプロセス（ウイルス遺伝子の発現；ウイルスタンパク質、核酸または他の成分の生産；ウイルス成分の完全なウイルスへのパッケージング；および細胞溶解が含まれるが、これらに限定はされない）に直接または間接的に関与している任意の活性が含まれる。
【００２７】
用語「組み換え」は、核酸分子に関して本明細書中で使用される場合は、子孫の核酸分子の中では組み換えＤＮＡ技術を使用して一緒につながれる核酸分子の組み合わせを意味する。ウイルス、細胞、および生物体に関して本明細書中で使用される場合は、用語「組み換え体」、「形質転換された」、および「トランスジェニック」は、その中に異種核酸分子が導入されているか、または自然界に存在している核酸配列が欠失させられているもしくは修飾されている、宿主ウイルス、細胞、または生物体を意味する。異種核酸分子の導入の場合には、核酸分子は、宿主のゲノムの中に安定に組み込まれることができ、また、核酸分子は、染色体外分子として存在することもできる。このような染色体外分子は、自律複製することができる。組み換え体ウイルス、細胞、および生物体には、形質転換プロセスの最終産物だけではなく、その組み換え体である子孫も含まれると理解される。「形質転換されていない」、「非トランスジェニック」、または「組み換え体ではない」宿主は、異種核酸分子を含まない野生型ウイルス、細胞、または生物体を意味する。
【００２８】
用語「複製可能な（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）」は、本明細書中で使用される場合は、特定のタイプの細胞または組織の中では優先的に複製するが、全ての他のタイプの中では、より少ない程度に複製するか、または全く複製しないベクターおよびウイルス粒子を意味する。本発明の１つの実施形態においては、ベクターは、腫瘍細胞および／または異常に増殖している組織（例えば、固形腫瘍および他の新生物）の中で選択的に複製する、複製可能なアデノウイルスベクターおよび／または粒子である。これには、米国特許第５，６７７，１７８号、同第５，６９８，４４３号、同第５，８７１，７２６号、同第５，８０１，０２９号、同第５，９９８，２０５号、および同第６，４３２，７００号、ならびに、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１９４３４、同ＷＯ９８／３９４６５、同ＷＯ９８／３９４６７、同ＷＯ９８／３９４６６、同ＷＯ９９／０６５７６、同ＷＯ９８／３９４６４、および同ＷＯ００／１５８２０に開示されているウイルスが含まれる。このようなウイルスは、「腫瘍溶解ウイルス（ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓｅ）」または「腫瘍溶解ベクター」と呼ばれる場合があり、これは、「細胞溶解性」または「細胞変性性」であり、そして標的細胞の「選択的細胞溶解」を行うと考えることができる。
【００２９】
用語「選択複製型ウイルス（ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  ｖｉｒｕｓ）」、「優先的に複製するウイルス」、「特異的に複製するウイルス」、および「選択的に複製するウイルス」は同義的に使用される用語であり、特定のタイプの細胞または組織の中では優先的に複製するが、全ての他のタイプの中では、より少ない程度に複製するか、または全く複製しない、複製可能なウイルスベクターおよびウイルス粒子である。
【００３０】
「宿主細胞」には、本発明の実施に使用されるウイルスベクターであり得るかまたはそのようなウイルスベクターのレシピエントである、個々の細胞あるいは細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、そしてこれらの子孫は、自然界での、偶発的な、または意図的な突然変異および／または変化が原因で、もとの親細胞と完全に同一（形態学または全体的なＤＮＡの相補性に関して）であることは必ずしも必要ではない場合がある。本明細書中で言及される場合は、宿主細胞には、インビボまたはインビトロでウイルスベクターでトランスフェクトされたかまたはウイルスベクターに感染させられた細胞が含まれる。
【００３１】
用語「ウイルス許容状態（ｖｉｒｕｓ  ｐｅｒｍｉｓｓｉｖｅ）」は、ウイルスまたはウイルスベクターが、宿主細胞株の細胞環境の中で細胞内生活環の全てを完了させることができることを意味する。
【００３２】
表現「薬学的または薬理学的に許容される」は、動物またはヒトに適切に投与された場合に、有害な、アレルギー性の、または他の望ましくない反応を生じない分子実体および組成物を意味する。
【００３３】
本明細書中で使用される場合は、「薬学的に許容される担体」には、任意のおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング剤、抗生物質、および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤などが含まれる。薬学的活性のある物質についてのこのような媒体および薬剤の使用は当該分野で周知である。任意の従来の媒体または物質が有効成分と不適合である場合を除き、治療用組成物の中でのその使用が意図される。補助活性成分もまた、組成物の中に組み込むことができる。
【００３４】
「安定化剤」は、本明細書中で使用される場合は、処方物の中のウイルスまたはウイルス粒子の安定性を高めるか、あるいはそれらの生物学的活性を維持するように作用する、ウイルス処方物の成分を意味する。高いウイルス安定性は、最初の完全なキャプシドビリオンの割合（％ＩＣＶ０）、最初のプロテインＶＩの割合（％ＶＩ０）、１ｍｌあたりのウイルス粒子に関する感染力価アッセイ（ＶＰ／ｍＬ）；ヘキソンＦＡＣＳ、ＧＭ−ＣＳＦ分泌レベルなどの安定性に基づいて決定することができる。
【００３５】
用語「水性共溶媒」は、水混和性の有機低分子（例えば、プロピレングリコール、グリセリルホルマール、ＤＭＳＯ、低分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、５ｗｔ．％を超える濃度のスクロース、グリセロールおよびグリコフロール）を意味するように本明細書中で使用される。
【００３６】
用語「可逆性のイントラキャプシドプロテアーゼ阻害剤」は、本明細書中で使用される場合は、キャプシド化されたウイルスによってコードされるＬ３／ｐ２３システインプロテアーゼの可逆性の阻害剤を意味する。「可逆性のイントラキャプシドプロテアーゼ阻害剤」として作用することができる化合物の例としては、チオグリセロール、システイン、グルタチオン、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メチオニン、およびジメチルスルフィドが挙げられる。
【００３７】
用語「穏やかな還元剤」は、本明細書中で使用される場合は、一般的に、チオ化合物またはチオール化合物（例えば、チオール類およびチオエーテル類）を意味する。
【００３８】
用語「ＡＲＣＡ」は、本明細書中で使用される場合は、約５％のスクロース、１％のグリシン、１ｍＭのＭｇＣｌ２、および１０ｍＭのＴｒｉｓと、０．０５％のポリソルベート８０（「Ｔｗｅｅｎ  ８０」としても知られている）が含まれているウイルス処方物用の緩衝液を意味する。
【００３９】
用語「個体」、「被験体」、「哺乳動物被験体」、またはそれらの文法上同等の表現によって、個々の哺乳動物が意味される。
【００４０】
本発明の処方物および方法
−２０℃から室温までの温度でのアデノウイルスベクターの処方物の保存のための様々な安定化ストラテジーが本明細書中に記載される。これらの安定化ストラテジーは、長期間にわたる物理化学的安定性と、長期にわたる高いウイルス感染性の維持を提供することが明らかにされている。
【００４１】
処方物には、液体の溶液としてまたは懸濁液としてのいずれかで、注射可能な組成物が含まれる；注射前に液体とする溶液または懸濁液に適している固体の形態もまた調製することができる。これらの調製物は乳化させることもできる。このような目的のための典型的な組成物には、薬学的に許容される担体が含まれる。例えば、組成物には、１ミリリットルのリン酸緩衝化生理食塩水あたり約１００ｍｇのヒト血清アルブミンが含まれ得る。他の薬学的に許容される担体には、水性溶液、非毒性の賦形剤（塩、保存剤、緩衝液などが含まれる）が含まれる。
【００４２】
保存剤（抗菌剤、抗酸化剤、キレート化剤、および不活性ガスが含まれる）もまた、処方物の中に含まれる場合がある。薬学的組成物中の様々な成分のｐＨと実際の濃度はウイルス濃度、保存温度などにしたがって調整され、そしてこのような調整は当業者に公知である。処方物はさらに、本発明に従う望ましい保存条件について最適化することができる。本発明の１つの実施形態、特に、臨床的用途のために処方されたウイルスを用いる実施形態においては、試料は、液体形態で、好ましくは、低温、通常は、約１０℃未満、より通常には、５℃もしくはそれよりも低い温度で保存される。
【００４３】
例えば、−２０℃または−８０℃で凍結保存される試料については、適切な緩衝液は上記に記載されたものである。アデノウイルス処方物は、通常は、約１０１１から約２×１０１３粒子／ｍｌのウイルス濃度で保存され、あまり濃縮されていない形態で保存された場合に通常明白である高い安定性を有する。
【００４４】
本発明の薬学的組成物は、その意図される投与経路と適合するように処方される。投与経路の例としては、非経口（例えば、静脈内、同所、皮内、皮下、腫瘍内、経皮（局所）、筋肉内、腹腔内、経粘膜、静脈内注射）、経口（例えば、吸入）および直腸投与が挙げられる。
【００４５】
このような組成物は、通常、薬学的に許容される組成物として投与され、これには、生理学的に許容される担体、緩衝液、または他の賦形剤が含まれる。腫瘍に対する適用については、直接的な腫瘍内注射、切除された腫瘍ベッドの注射、局所（すなわち、リンパ）、または全身投与（ｇｅｎｅｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）が意図される。数時間または数日間にわたり、疾患部位（例えば、腫瘍または腫瘍部位）へのカテーテルによる持続的な潅流を行うことが所望される場合もある。有効量は、臨床結果を含む有用なまたは所望される結果を得るために十分な量である。有効量は、１回以上の投与において投与することができる。本発明の目的については、アデノウイルスベクターの有効量は、疾患状態を軽くする、緩和する、安定化させる、覆す、その進行を遅くする、または遅らせるために十分な量である。投与される量は、個体の症状、疾患の程度、投与経路、投与される用量の回数、および所望される目的に応じて決定される。
【００４６】
本発明の１つの実施形態、特に、臨床用途のための処方されたウイルスを用いる実施形態においては、試料は、液体形態で、好ましくは、低温、通常は、約１０℃未満、より通常には、５℃未満の温度で保存される。このような条件について、アデノウイルスベクターの液体処方物を安定化させる様々なストラテジーが本明細書中に記載される。これらの安定化ストラテジーは、長期間にわたる物理化学的安定性と、長期にわたる高いウイルス感染性の維持を提供することが明らかにされている。これらのストラテジーには、以下の１つ以上を含む処方物の使用が含まれる：（１）キャプシドバーテックスタンパク質の優先的な水和を促進する物質としての、水性共溶媒（例えば、プロピレングリコールまたはグリセロール）；（２）キャプシド化されたウイルスによってコードされるＬ３／ｐ２３プロテアーゼシステインプロテアーゼの可逆性阻害剤（例えば、チオール類またはチオエーテル類）；ならびに（３）穏やかな還元剤またはウイルス成分の特異的な分解を妨げる他の物質。
【００４７】
理論に束縛されることは望ましくないが、可逆性Ｌ２／ｐ２３プロテアーゼ阻害剤の作用について提案されている機構は、プロテインＶＩの消化を妨げることである（Ｇｒｅｂｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）；ＥＭＢＯ  Ｊ．１５（８））。これは、バーテックスセメントタンパク質として作用し、したがって、キャプシドのバーテックスからのペントン複合体の解離を防ぐ。ウイルスキャプシドからのペントン複合体の解離は、ビリオンを生物学的に不活化させる。したがって、水性共溶媒、ウイルスによってコードされる可逆性プロテアーゼ阻害剤、または穏やかな還元剤をアデノウイルス処方物の中に含めることによってこの解離事象を防ぐことにより、長期にわたりウイルス感染性の安定化がもたらされる。
【００４８】
阻害剤の作用の形態は、プロテアーゼ活性部位を直接阻害することである得るか、あるいは、プロテアーゼおよび／またはｐＶＩｃプロテアーゼ補因子の遠位領域の阻害剤との相互作用により、活性部位への立体構造上の変化を誘導することによって間接的に活性部位を阻害することであり得る（Ｊｏｎｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）；Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７７，１８２１−１８２４）。プロテアーゼの阻害機構に関する証拠は、実施例と添付されるデータに提供される。Ｌ３／ｐ２３阻害剤の１つのクラスである穏やかな還元剤もまた、キャプシドタンパク質（特に、ヘキソン）の酸化を、酸化剤種をスカベンジャーすることによって阻害するように作用する。通常、抗酸化剤（例えば、ＢＨＴおよびＢＨＡ）は、キャプシドタンパク質の酸化を妨げ、そして本発明の成分として含まれるであろう。
【００４９】
共溶媒は、バーテックス複合体の表面の優先的な水和を促進させるように作用し得（Ｇｅｋｋｏ  ａｎｄ  Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ（１９８１），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０，４６６７−４６７６；Ａｒａｋａｗａ  ａｎｄ  Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ（１９８２），Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２１，６５３６−６５４４）、末梢ヘキソンからのペントン、およびファセットヘキソン（ｆａｃｅｔ  ｈｅｘｏｎｓ）からの末梢ヘキソンの解離のポテンシャルエネルギーを高くする。共溶媒は、リボソーム複合体に対して（Ｄｏｕｚｏｕ（１９８６），Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２５，３８−４７）、およびアセンブリされたチューブリンに対して（Ｐｉｔｔｚ  ａｎｄ  Ｔｉｍａｓｈｅｆｆ（１９７８）；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７，６１５−６２３）安定な構造を提供するようである。共溶媒（例えば、スクロース、グリセロール、グリセリルホルマール、プロピレングリコール、またはグリコフロール）の十分に高い濃度もまた、Ｌ３／ｐ２３プロテアーゼの活性部位を阻害する場合があり、これにより、先に記載された安定化剤の阻害剤クラスのメンバーとして作用する場合がある。共溶媒の優先的水和効果は、バーテックスの中の立体構造の変化の速度を低下させて、プロテアーゼがプロテインＶＩに接近するように、またはバーテックスタンパク質との間での他の会合を「解除する（ｕｎｌｏｃｋｉｎｇ）」ことを導くように作用し得る。ビリオンの濃度に依存するペントン解離事象についての誘発点の実証（本明細書中に提供されるデータによって示される）は、共溶媒の安定化の別の方法が、溶液の粘度を高くなることによってビリオンの衝突頻度が下がったためであり得ることを示唆している。
【００５０】
本発明の処方物は、ウイルスが含まれている粗精製または半精製プロセスの中間体の安定化において、および液体状態で行われ、最終的な処方された生成物が導かれるプロセシング工程の間のウイルスのインサイチュでの安定化において有用性が見出されている。例えば、Ｌ３／ｐ２３プロテアーゼ阻害剤は、下流のプロセシングの間のプロテインＶＩの消化を妨げるために、回収工程で添加することができ、そしてウイルス適合性の共溶媒の高い濃度を抑えることは、クロマトグラフィーによる溶出および接線流濾過の間に使用することができ、これにより、ウイルス力価を保存するための手段として、局所的な高いウイルス濃度が生じる。
【００５１】
実施例のセクションにおいて以下にさらに記載されるように、水性共溶媒、ウイルスによってコードされる可逆性プロテアーゼ阻害剤、および穏やかな還元剤の１つ以上が含まれている様々な処方物を試験するための多数の研究が行われている。
【００５２】
アデノウイルスベクター
本発明では、本発明の処方物の中でアデノウイルスベクターとウイルス粒子を構築するための任意のおよび全てのアデノウイルス血清型の使用が意図される。本発明にしたがって使用することができるアデノウイルスストックには、任意のアデノウイルス血清型が含まれる。アデノウイルス血清型１から５１は、現在、アメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から入手することができ、本発明には、任意の供給業者から入手することができる任意の他のアデノウイルス血清型が含まれる。本発明にしたがって使用することができるアデノウイルスは、ヒト起源のものである場合も、また、ヒト以外の起源（例えば、ウシ、ブタ、イヌ、サル、鳥類）のものである場合もある。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８、３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、５０）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５、６、）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２〜３０、３２、３３、３６、３９、４２、４７、４９、５１）、サブグループＥ（血清型４）、サブグループＦ（血清型４０、４１）、または任意の他のアデノウイルス血清型のものであり得る。ヒトアデノウイルスおよび動物アデノウイルスの多数の例は、アメリカンタイプカルチャーコレクションにおいて入手することができ、例えば、ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ＳｅａｒｃｈＣａｔａｌｏｇｓ／ＣｅｌｌＢｉｏｌｏｇｙ．ｃｆｍ．で見られる。
【００５３】
本発明のアデノウイルスベクターには、複製能力のない（欠損）ベクターと複製可能なベクターが含まれる。複製能力のないベクターは、標的細胞の中で複製することができないか、または非常に低いレベルでしか複製することができない。本明細書中では、Ａｄ／ＧＭ−ＣＳＦベクターによって例示される。１つの態様においては、複製することができないベクターは、Ｅ１ａ、Ｅ１ｂ，Ｅ２ａ、Ｅ２ｂ、またはＥ４の中に、通常は、コード領域の一部または全てが欠失または変異させられたことにより不活化させられた、少なくとも１つのコード領域を有する。これらのベクターを増幅させるための方法は当該分野で周知である。
【００５４】
別の態様においては、アデノウイルスベクターは複製可能である。複製可能なベクターは、標的細胞の中で複製することができ、本明細書中では、ＣＧ７０６０ベクターによって例示される。複製可能なウイルスとしては、野生型のウイルス、および標的細胞の中で複製するように操作されたウイルスが挙げられる。これらには、複製特異的ウイルスが含まれる。複製特異的ウイルスは、別のものと比較した場合に、１つのタイプの細胞の中で特異的または優先的に複製するように設計される。この用語にはまた、複製特異的アデノウイルスも含まれる。これは、特定のタイプの細胞または組織の中では優先的に複製するが、全ての他のタイプの中では、より少ない程度に複製するか、または全く複製しないウイルスである。このようなウイルスは、「細胞溶解性」または「細胞変性性」ウイルス（またはベクター）と呼ばれる場合もあり、これらが新生物細胞に対してそのような作用を有している場合には、「腫瘍溶解性」ウイルス（またはベクター）と呼ばれる。いくつかの実施形態においては、本発明のアデノウイルスベクターには、治療用の遺伝子配列（例えば、サイトカイン遺伝子の配列）が含まれる。
【００５５】
本発明の１つの実施形態においては、ウイルスベクターおよび／または粒子は、腫瘍細胞および／または異常に増殖している組織（例えば、固形腫瘍および他の新生物）の中で選択的に複製する。
【００５６】
標的細胞の中で選択的に複製するアデノウイルスベクターの例においては、特異的に弱毒化させられた複製可能なウイルスベクターが、ガン細胞の中でのその選択的な複製によってそれらの細胞を優先的に破壊するように開発されている。様々な細胞特異的複製可能なでのウイルス構築物（特定の細胞タイプの中で優先的に複製する（したがってそれを破壊する））は、例えば、ＷＯ９５／１９４３４、ＷＯ９６／１７０５３、ＷＯ９８／３９４６４、ＷＯ９８／３９４６５、ＷＯ９８／３９４６７、ＷＯ９８／３９４６６、ＷＯ９９／０６５７６、ＷＯ９９／２５８６０、ＷＯ００／１５８２０、ＷＯ００／４６３５５、ＷＯ０２／０６７８６１、ＷＯ０２／０６８６２、米国特許出願公開番号ＵＳ２００１００５３３５２、ならびに、米国特許第５，６９８，４４３号、同第５，８７１，７２６号、同第５，９９８，２０５号、および同第６，４３２，７００号に記載されている、複製可能なアデノウイルスベクターは、腫瘍細胞の中で選択的に複製するように設計されている。
【００５７】
本発明の例示的なアデノウイルスベクターとしては、ＤＮＡ、アデノウイルス外殻の中にカプセル化されたＤＮＡ、別のウイルスまたはウイルス様の形態（例えば、単純ヘルペス、およびＡＡＶ）の中にパッケージされたアデノウイルスＤＮＡ、リポソームの中にカプセル化されたアデノウイルスＤＮＡ、ポリリジンと複合体を形成したアデノウイルスＤＮＡ、合成のポリカチオン性分子と複合体を形成した、トランスフェリンと結合した、もしくはＰＥＧのような化合物と複合体を形成したアデノウイルスＤＮＡが挙げられるが、これらに限定はされない。これらは、抗原性を免疫学的に「マスクする」こと、および／またはウイルスの半減期を延ばすこと、あるいは、非ウイルスタンパク質への結合を含むがこれらに限定はされない様々な用途を有している。
【００５８】
アデノウイルスベクター粒子にはまた、繊維タンパク質へのさらなる修飾も含まれ得る。１つの実施形態においては、本発明のアデノウイルスベクターには、さらに、粒子のキャプシドタンパク質の中に含まれる標的化リガンドが含まれる。標的化されたアデノウイルスの例については、例えば、ＷＯ００／６７５７６、ＷＯ９９／３９７３４、ＵＳ６，６８３，１７０、ＵＳ６，５５５，３６８、ＵＳ５，９２２，３１５、ＵＳ５，５４３，３２８、ＵＳ５，７７０，４４２、およびＵＳ５，８４６，７８２を参照のこと。
【００５９】
加えて、本発明のアデノウイルスベクターにはまた、他のウイルスキャプシドタンパク質に対する修飾も含まれる場合がある。これらの変異の例としては、米国特許第５，７３１，１９０号、同第６，１２７，５２５号、および同第５，９２２，３１５号に記載されているものが挙げられるが、これらに限定はされない。他の修飾されたアデノウイルスは、米国特許第６，０５７，１５５号、同第５，５４３，３２８号、および同第５，７５６，０８６号に記載されている。
【００６０】
挿入された配列の発現のためのアデノウイルスベクターを作成するための標準的なシステムは当該分野で公知であり、商業的な供給業者から入手することができる。例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）（Ｃｌｏｎｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（２０００年１月）、ｐ．１０１２）によるＡｄｅｎｏ  Ｘ発現システム、Ａｄｅｎｏｖａｔｏｒ  Ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ、およびＡｄＥａｓｙ（いずれもＱｂｉｏｇｅｎｅ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）による）である。
【００６１】
ウイルスの生産および精製
本発明のウイルス調製物を作成することにおいて使用される宿主細胞は、候補のウイルスの複製をサポートすることができる。本明細書中で定義される場合は、「宿主細胞」には、ウイルスに感染させることができるか、もしくはウイルスに感染している、個々の細胞または細胞培養物が含まれる。宿主細胞には、単一の宿主細胞の子孫が含まれ、そしてこれらの子孫は、自然界での、偶発的な、または意図的な突然変異および／または変化が原因で、もとの親細胞と完全に同一（形態学または全体的なＤＮＡの相補性に関して）であることは必ずしも必要ではない場合がある。宿主細胞には、インビボまたはインビトロで本発明のウイルスベクターでトランスフェクトされたかまたはウイルスベクターに感染させられた細胞が含まれる。
【００６２】
本発明の宿主細胞は哺乳動物細胞に、好ましくは、霊長類の細胞に由来する。様々な霊長類の細胞が好ましく、ヒト細胞が最も好ましいが、ウイルスの複製をサポートすることができる任意のタイプの細胞が本発明の実施の条件を満たしている。本発明の実施において使用される細胞のタイプとしては、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、または生産されるウイルスのタイプに寛容である任意の真核生物細胞が挙げられるが、これらに限定はされない。候補の細胞株は、当該分野で公知の方法による、例えば、感染していない細胞、または１つ以上のヘルパーウイルスに感染させた細胞の層を、ウイルス粒子と接触させること、その後の細胞のインキュベーションとウイルスの複製の決定により、ウイルスの複製をサポートするその能力について試験することができる。
【００６３】
様々な宿主細胞はアデノウイルスの複製をサポートすることができる。様々な霊長類の細胞が好ましく、ヒト細胞が最も好ましいが、ウイルスの複製をサポートすることができる任意のタイプの細胞が本発明の実施の条件を満たしている。アデノウイルスの商業的規模での生産に好ましい細胞株は、ＨｅＬａ−Ｓ３細胞株であり、例えば、米国特許出願番号１０／８２４７９６に記載されている。
【００６４】
アデノウイルスの商業的規模での生産に好ましい別の細胞株は、Ａ５４９細胞、ＰＥＲＣ６細胞、およびヒト２９３胚腎臓細胞であり、これらは、アデノウイルスＥＩＡおよびＥＩＢ遺伝子産物などを発現する。適切に標的化させられたアデノウイルスを生産することができる細胞株としては、ヒトＬＮＣａＰ（前立腺ガン）、ＨＢＬ−１００（乳房上皮細胞）、ＯＶＣＡＲ−３（卵巣ガン）などが挙げられる。
【００６５】
細胞培養
宿主細胞は、通常、潅流システムにおいて増殖させられる。潅流システムは、細胞を増殖させながら、ｐＨ、ＣＯ２、およびＯ２について良好な培養環境を維持することができる。潅流によって、活性のある代謝物を取り出すことができ、一方では、栄養分が供給される。本発明のウイルスベクターの生産に有用な細胞株の培養に適している適切な培地および条件は当該分野で周知であり、任意の適切な培地（例えば、ＲＰＭＩ、ＤＭＥＭなど）を利用することができる。培地には、血清（例えば、ウシ胎児血清）が含まれる場合も、また無血清培地である場合もある。無血清懸濁培養物への足場依存性細胞の血清離脱の適用は、組み換え体タンパク質およびウイルスワクチンの生産に使用されており、ウイルスベクターの生産において用途を見出すことができる。
【００６６】
特定の実施形態においては、望ましくない細胞の増殖を防ぐ選択システムを使用することが有用である場合がある。これは、選択マーカーをコードするベクターで細胞株を永久的にトランスフェクトすることによって、または選択マーカーをコードするウイルスベクターを細胞株に導入するか細胞に感染させることによって行うことができる。いずれの状況においても、適切な薬剤または選択化合物を含む形質転換／形質導入された細胞の培養によって、マーカーを有しているそのような細胞の選択的な複製が得られるであろう。マーカーを有している細胞の選択的複製は、適切なタイプおよび濃度の薬剤または選択化合物の存在下での形質転換／形質導入された細胞の培養により、マーカーを有していない細胞と比較して、マーカーを有している細胞の優先的または排他的のいずれかの複製が生じることを意味する。マーカーの例としては、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＴＫ）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ）およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）遺伝子が、それぞれ、ＴＫ細胞、ＨＧＰＲＴ細胞、またはＡＰＲＴ細胞において挙げられるが、これらに限定はされない。また、代謝拮抗物質耐性を、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）（これによっては、メトトレキセートに対する耐性が付与される）；ｇｐｔ（これによっては、ミコフェノール酸に対する耐性が付与される）；ｎｅｏ（これによっては、アミノグリコシドＧ４１８に対する耐性が付与される）；およびｈｐｈ遺伝子（これによっては、ハイグロマイシンに対する耐性が付与される）の選択基準として使用することができる。
【００６７】
無血清懸濁培養物への足場依存性細胞の血清離脱の適用は、２９３細胞（Ｗｉｌｌｉａｍｓｂｕｒｇ  ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，１９９６年１１月．１８−２１；ＷＯ９８／２２５８８）およびＡ５４９細胞（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｗｉｌｌｉａｍｓｂｕｒｇ  ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ，１９９６年１１月．１８−２１）を使用する、組み換え体タンパク質の生産（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１４：９７２−９７８，１９９３）、およびウイルスワクチンの生産（Ｐｅｒｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ，１３：１２４４−１２５０，１９９５；Ｇｉｌｂｅｒｔ）に使用されている。
【００６８】
いくつかの足場依存性細胞は、懸濁培養物に適応させることができ、これによって、商業的規模での生産を容易にすることができる。本発明は、ウイルスの生産のためのバイオリアクター技術の使用に依存し得る。バイオリアクターの中で細胞を増殖させることにより、本発明の方法および処方物の中で使用されるウイルスベクターに感染させることができる細胞の商業的規模での生産が可能となる。潅流条件下でシステムを操作すること、および精製のための改良されたスキームを適用することにより、本発明は、十分な量の商業的に有用なウイルスベクターを生産するように容易に拡張することができるストラテジーを提供する。
【００６９】
バイオリアクターは、懸濁液および足場依存性の動物細胞培養物の両方からの生物学的産物の生産に広く使用されている。培養物の隅々までの新鮮な培地の潅流は、様々なデバイス（例えば、ファイバーディスク、ファインメッシュスピンフィルター、中空繊維、または平板膜フィルター、沈降管など）を用いて細胞を保持することによって行うことができる。簡単な潅流プロセスは、培地の流入と、細胞および生成物の流出を有している。培養培地は、予め決定された一定の速度でリアクターに供給され、これによって、細胞の最大特異的増殖速度よりも低い値で、培養物の稀釈速度が維持される。
【００７０】
ウイルスの生産においては、宿主細胞は、ウイルスを取り込ませることができる生理学的条件下で細胞がウイルスと接触させられることによってウイルスに感染させられる。細胞は最適な収量を得るために、高い感染多重度（ＭＯＩ）で感染させられる場合がある。宿主細胞はウイルスを複製させ、これは、感染の２〜５日後に回収することができる。
【００７１】
細胞溶解物
ウイルス生産のプロセスにおいて重要な工程は、細胞膜の溶解の際の宿主細胞からのウイルスの放出である。細胞を溶解させるための伝統的な方法（例えば、機械的攪拌（例えば、高圧押し出し、固体剪断、液体剪断、または超音波処理）、および凍結融解サイクル）によってはウイルスを傷つけてしまう場合があり、多くの場合には、生物学的活性のあるウイルス産物の収量が低くなってしまう。別の溶解方法は、界面活性剤による溶解であり、これは、通常は、感染させられた細胞に対する非イオン性界面活性剤（約０．５％〜２．５重量／容積％の最終濃度で）の添加に頼る。一般的に使用される、非陰イオン性界面活性剤としては、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）ファミリーの界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１５；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−３５；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−４５；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１０２；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１１４；Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１６５（これらの異種界面活性剤は全て芳香族環に結合させられた分岐した８炭素の鎖を有している））、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）界面活性剤（これは、脂肪酸の非変性非イオン性ポリオキシエチレンソルビタンエステルのファミリーである）、ならびに、両性イオン性界面活性剤ＣＨＡＰＳ（これは、コール酸のスルホベタイン誘導体である）が挙げられる。しかし、このような非イオン性界面活性剤にもまた、ウイルスを傷つけてしまう可能性がある。
【００７２】
ウイルスに感染した細胞は、回収し、そして細胞−膜タンパク質と会合し、それらの可溶化を助けることが公知である、１つ以上の非イオン性界面活性剤を含む溶解試薬を使用して溶解させることができる（例えば、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１６１２：６５−７５，２００３；Ｓａｎｔｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，３：２４９−２５３，２００３；およびＨａｚａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．４０７：１１７−１２４，２００２を参照のこと）。このような非イオン性界面活性剤は、精製の間にウイルスを傷つけることは少なく、そして保存の間の安定性を高めることができる。溶解試薬中の非イオン性界面活性剤は、好ましくは、親水性部分と親油性部分の両方を有する。非イオン性界面活性剤の例としては、アルキル置換された単糖、ニ糖、および多糖、環状のアルキル置換された単糖、ニ糖、および多糖アルキルアルコール、ポリオキシエチレンエーテル、ジアルキル−グリセロール、ならびに、それらの異性体が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７３】
親水性置換基を有している任意の単糖、ニ糖、または多糖を、本発明の溶解試薬中の非イオン性界面活性剤として使用することができる。例示的な二糖化合物としては、スクロース、ラクトース、マルトース、イソマルトール、トレハロース、およびセロビオースが挙げられる。親油性置換基には、好ましくは、アルキル基またはアルケニル基が含まれる。本発明の好ましい実施形態にしたがうと、親水性置換基は、アルカン酸残基である。
【００７４】
親水性置換基は、直鎖のもの（例えば、直鎖のｎ−アルカンまたはアルケン）であっても、また、直鎖ではないもの（例えば、環状または分岐鎖のアルカンもしくはアルケン）であってもよい。親水性置換基はまた、アルカン酸残基であってもよい。親水性置換基の長さは、所望される親水性−親油性バランスが得られるように変化させることができる。
【００７５】
好ましい非イオン性界面活性剤としては、米国特許出願番号１０／７４３８１３および同６０／６３１４３４にさらに記載されているように、アルキル置換された単糖、アルキル置換されたニ糖、アルキル置換された多糖、環状のアルキル置換された単糖、環状のアルキル置換されたニ糖、環状のアルキル置換された多糖、アルキルアルコール、ポリオキシエチレンエーテル、ジアルキル−グリセロール、およびそれらの異性体（例えば、ｎ−ドデシル−ｂ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−ｂ−Ｄ−マルトシド、ｎ−ドデシル−ｂ−Ｌ−マルトシド、ｎ−ドデシル−ｂ−Ｌ−マルトシド、６−シクロヘキシルヘキシル−ｂ−Ｄ−マルトシド、６−シクロヘキシル−ｂ−Ｄ−マルトシド、６−シクロヘキシルヘキシル−ｂ−Ｌ−マルトシド、６−シクロヘキシルヘキシル−ｂ−Ｌ−マルトシド、６−シクロヘキシルヘキシル−ｂ−Ｄ−マルトシド、スクロースモノラウレート、ｎ−トリデシル−ｂ−Ｌ−マルトシド、ｎ−トリデシル−ｂ−Ｌ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−ｂ−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−ｂ−Ｄ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−ｂ−Ｌ−マルトシド、ｎ−テトラデシル−ｂ−Ｌ−マルトシド、およびポリドカノールが挙げられる。
【００７６】
溶解試薬は、細胞を溶解させ、そしてシステムからさらなる付着細胞を除去するために十分な時間の間、細胞と接触させられる。このようなシステムにおいては、ウイルスの精製の前に、粗ウイルス溶解物は、通常、明澄化させられる。すなわち、膜断片が除去される。明澄化は、特定の空隙率の非吸着材料のパッケージされたカラムから構成されるデプス型フィルター（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ）の使用によって行うことができ、その結果、より大きな膜の破片は、ウイルス粒子の損失なく保持される。デプス型フィルターは、フィルターの粒子の保持機構（ｍｅｃｈａｎｉｃａｌ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ）、吸着特性、ｐＨ値、表面品質、厚み、および強度に基づいて選択される。市販されているカートリッジには、いくつかのタイプのフィルター（例えば、ポリプロピレン、ガラス繊維、ニトロセルロースなど）を組み合わせられている。
【００７７】
ウイルスの精製
細胞溶解物から感染性ウイルスを単離するために使用される技術は当該分野で周知である。例えば、ウイルスは、密度勾配遠心分離またはクロマトグラフィーのいずれかによって単離することができる（例えば、米国特許第６，１９４，１９１号および同第６，６８９，６００号を参照のこと）。遠心分離についての適切な密度条件が、分離されるウイルスベクターの種類、および当該分野で一般的に知られている情報に応じて利用される。
【００７８】
ウイルスの精製を行うためには、拡張することができるプロセス、これは、クロマトグラフィーのような手順を使用することが好ましく、これによって、遠心分離を行うことなく細胞溶解物から細胞の破片が取り除かれる。標準的なプロセスにおいては、ウイルス粒子は、フィルターカートリッジ上でのイオン交換クロマトグラフィーによって明澄化された細胞溶解物から分離され、この多数の例が当該分野で公知である。様々な市販されているクロマトグラフィー用物質を、ウイルスの精製に使用することができる。有用な支持マトリックスとしては、ポリマー物質（例えば、セルロースまたはシリカゲル型の樹脂または膜）、あるいは、架橋された多糖（例えば、アガロース）、あるいは他の樹脂が挙げられるが、これらに限定はされない。クロマトグラフィー用物質には、さらに、生物学的分子を分離することにおいて有用であるマトリックスに結合させられた様々な官能基または活性のある基が含まれていてもよい。
【００７９】
このように、ウイルスは、様々な共有結合以外の機構によってウイルスがそれと相互作用し、その後に除去される支持マトリックスに結合させられた親和性基の使用によって、精製することができる。好ましい分離方法としては、イオン交換（具体的には、陰イオン交換）が挙げられる。他の特異的な親和性基としては、支持マトリックスに結合させられたヘパリンおよびウイルス特異的抗体が挙げられる。ウイルスの精製における親和性基の選択において考慮されるものは、ウイルスが選択された親和性基と相互作用する親和力と、ウイルス粒子の生物学的機能／感染性を傷つけることなくそれから取り外すことの容易さである。例示的なポリマー材料としては、製品Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；マクロ多孔性ヒドロキシアパタイト（例えば、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ））；および硫酸セルロース（Ａｍｉｃｏｎ）が挙げられる。ウイルスを精製するために使用することができる親和性リガンドとしては、当業者に公知の他のものと同様に、適切な樹脂に結合させられた抗ウイルス抗体が挙げられる。
【００８０】
陰イオン交換クロマトグラフィーは、当該分野で公知の様々な機能性部分を利用して行うことができる。これには、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、ＱＡＥ（四級アミノエチル）、およびＱ（四級アンモニウム）が含まれるが、これらに限定はされない。これらの機能性部分は、セルロースおよびシリカ樹脂を含む任意の適切な樹脂に結合させることができる。例えば、ＤＥＡＥは、カラム（例えば、ＤＥＡＥ−ＭｅｍＳｅｐ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ））の中で様々な樹脂（セルロース樹脂を含む）に結合させることができる。Ｓａｒｔｏｂｉｎｄ（登録商標）吸収体膜（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ，Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，Ｎ．Ｊ．）およびシリカ樹脂（例えば、ＡＣＴＩ−ＭＯＤ（登録商標）（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ））。例示的な樹脂としてはまた、ジビニルベンゼンビーズとともに架橋されたポリスチレン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑにおいて見られる）および高度に架橋された球状のアガロースビーズに結合させられたデキストラン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬにおいて見られる）が挙げられる。例えば、ＷＯ００／４０７０２を参照のこと。
【００８１】
陽イオン交換クロマトグラフィーもまた、ウイルスの精製に使用することができ、これには、ＳＰ  ＭｅｍＳｅｐ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、ＣＭ  ＭｅｍＳｅｐ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＳＯ３（ＥＭ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、およびＭａｃｒｏｐｒｅｐ  Ｓ（登録商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）のようなカラム、ならびに、ヘパリンをベースとする樹脂の使用が含まれるが、これらに限定はされない。Ｈｅｐａｒｉｎ  ＡＣＴＩ−ＭＯＤ（登録商標）Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｎｃ．，Ｎａｔｉｃｋ，ＭＡ）およびＰＯＲＯＳ（登録商標）Ｐｅｒｆｕｓｉｏｎクロマトグラフィー媒体（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）はさらに別の例を示す。
【００８２】
ヌクレアーゼ処理
溶出されたウイルスは、ヌクレアーゼで処理される場合がある。クロマトグラフィー後のヌクレアーゼでの処理では、回収の直後と比較すると、必要なヌクレアーゼの量は最少となる。ヌクレアーゼ処理後の第２のクロマトグラフィー工程が、断片化したＤＮＡとヌクレアーゼを除去するために含まれる場合がある。
【００８３】
多くのヌクレアーゼが当該分野で公知であり、広範な特異性のエンドヌクレアーゼの１つまたは組み合わせ（例えば、酵素分類３．１．２７．５（膵臓リボヌクレアーゼ）と３．１．３１．１（ミクロコッカスヌクレアーゼ）などを含む、好ましいヌクレアーゼが存在している。ベンゾナーゼ（登録商標）（ＢｅｎｚｏｎａｓｅＴＭ）は、ＤＮａｓｅ活性とＲＮａｓｅ活性の両方を有している遺伝子操作された酵素であり、ウイルスの精製プロセスのこの工程に特に有用である。ベンゾナーゼＴＭの核酸を迅速に加水分解する能力により、酵素は、細胞溶解物の粘度を下げるために有用となり、そして精製の間の核酸のロードを減少させるために有用となり、したがって、緩衝を排除し、収量を改善することができる。完全に消化されると、溶液の中に存在している遊離の核酸は、２から４塩基の長さのオリゴヌクレオチドになるように還元される。ヌクレアーゼでの消化の後、ウイルスは、イオン交換フィルター上で２回目の実行が行われ得、この場合、フィルターは、１回目のフィルターと同じである場合も、また、異なる場合もある。
【００８４】
濾過／滅菌
溶出させられたウイルスは、状況に応じて、従来の方法（例えば、中空繊維濃縮装置を用いて）濃縮され、透析される。使用される最終的な調製物においては、精製されたウイルス試料は滅菌濾過される場合がある（例えば、臨床的用途について）。この目的に適している様々なフィルターは当該分野で公知であり、例えば、ニトロセルロース膜フィルター；酢酸セルロース膜フィルター；ＰＶＤＦ（改良型フッ化ポリビニリデン）膜フィルターなどである。ＰＶＤＦ膜フィルター（例えば、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｍｉｌｌｉｐａｋフィルター）が好ましい。収量は、緩衝液（例えば、薬学的に許容される賦形剤）を使用してフィルターを予め洗浄することによって改善することができる。収量は、フィルターへのウイルスの結合によって減少することが明らかになっている。この場合、結合は、特定のレベルの後、飽和する。したがって、収量は、損失の割合が最少となるように、より多数の粒子をロードすることによって改善することができる。濾過による滅菌のための特定の条件は、精製の程度、使用されるウイルスベクターの濃度などに応じて適切に設定される。
【００８５】
ウイルスの特性決定
富化されたまたは単離されたウイルスの効力および純度を決定するための方法は当該分野で周知である。例えば、ウイルスの感染性の定量的特性決定は、許容状態にある細胞の中でのウイルスによってコードされるタンパク質の発現を測定することによって決定することができる。通常、許容状態にある細胞は、段階稀釈されたウイルスに感染させられ、一定の時間の間（例えば、１〜２日間）インキュベートされ、その後、ウイルスによってコードされる遺伝子（これは、ウイルス遺伝子（例えば、アデノウイルスのＤＮＡ結合タンパク質）またはウイルスによって保有されるトランス遺伝子（例えば、β−ガラクトシダーゼ）であり得る）の発現についてスクリーニングされる。特定のウイルス（例えば、アデノウイルスおよびワクシニアウイルス）の感染性はまた、プラークアッセイによっても決定することができる。
【００８６】
ウイルスの純度は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって決定することができる。クロマトグラフィーの間に、完全なウイルスはその構造上の成分、すなわち、ヘキソン、ベントン塩基（Ｐｂ）、および繊維に解離し、これにより、様々な成分の完全性に基づいてシフトし得る特徴的なフィンガープリントが得られる。ウイルス濃度はまた、構造タンパク質の定量によって測定することもできる（例えば、Ｌｅｈｍｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．７３２：４１１−４２３，１９９９；およびＲｏｉｔｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ  Ｂ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｓｃｉ  Ａｐｐｌ．，７５２：２６３−２８０，２００１を参照のこと）。表１を参照のこと。
【００８７】
陰イオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）もまた、ウイルスの純度、濃度、および効力を決定するために使用される場合がある。この方法は、粗溶解物または非常に純粋な試料のいずれかにおいてアデノウイルス粒子を定量するために使用されている（Ｓｈａｂｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎ  Ｔｈｅｒ．，８：４５３−４６５，１９９７）。これは、稀釈物および濃縮された試料の両方において、ワイドダイナミックレンジ（ｗｉｄｅ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ）にわたり粒子を評価するために使用することができる。
【実施例】
【００８８】
様々なアデノウイルス処方物の安定性
培養したＨＥＫ２９３細胞を、選択した血清型のアデノウイルスに感染させ、遠心分離によって回収した。細胞ペレットを溶解緩衝液の中に再懸濁し、以下に記載するさまざまな緩衝液とともに処方した。ＡＲＣＡ緩衝液には、５％のスクロース、１％のグリシン、１ｍＭのＭｇＣｌ２、および１０ｍＭのＴｒｉｓと、０．０５％のポリソルベート８０（「Ｔｗｅｅｎ  ８０」としても知られている）が含まれている。それぞれの処方物を、０．２ミクロンのフィルターを通して濾過滅菌し、そしてＴｅｆｌｏｎでコーティングされており、シリコンゴムのストッパーを有している１ｍｌのガラス製バイアルに入れた。バイアルを、５℃、２５℃、または３０℃で保存した。２５℃、または３０℃での保存を室温での保存と考えた。選択した時点で、個々の処方物の試料を、陰イオン交換クロマトグラフィー、逆層クロマトグラフィーなどによって実験した。ＡＥ−ＨＰＬＣによって、ＡＲＣＡ緩衝液成分と水性共溶媒のみ、または穏やかな還元剤もしくは可逆性のプロテアーゼ阻害剤と組み合わせたＡＲＣＡ緩衝液成分と水性共溶媒の中よりも、ＡＲＣＡ緩衝液だけの中で維持した試料において、ピークのパターンにより大きな変化が起こったことを確認した。例えば、図２Ａ〜Ｃ、ならびに、図４ＡおよびＢを参照のこと。
【００８９】
ＡＥ−ＨＰＬＣを、経時的な、完全な成分、ヘキソン、ペントン塩基（Ｐｂ）、および繊維の割合を評価するために使用した。これは、完全なペントン塩基および繊維の割合は、保存時間が長くなれば長くなるほど、有意に少なくなるが、完全なヘキソンの割合は比較的安定していることを示している（例えば、表１）。
【００９０】
例えば、時間０で３７℃で保存したＧＴＳ／ＡＲＭＷＧ緩衝液中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦの溶液（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）についてのＡＥ−ＨＰＫＣクロマトグラムは、ＩＣＶだけについて、６．１１３分でピークを示した。中間の保存時間では、６．１０６分と６．６５０分に２つのピークが存在しており（ＩＶＣについてのものとＰＶＶについてのもの）、そしてより遅い保存時間では、６．７０１分にＰＶＶについてのピークが優位であった。
【００９１】
表１は、Ａｄ／ＧＭ−ＣＳＦの調製物（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）を３７℃で保存したＧＴＳ／ＡＲＭＷＧ緩衝液の中で保存した場合には、非感染性ウイルス（およそ６．７分でのピークによって示される）に対する生存しているウイルス（およそ６．１分でのピークによって示される）の間での移行を示している。表１もまた、生存しているウイルス（ヘキソン、ペントン塩基（Ｐｂ）、および完全な繊維含有量によって示される）の間での移行を示す、０分、０．４分、および０．７分の保持時間のシフトを有しているＨＰＬＣピークの組成を示している。保持時間のシフトのないピークは、生存しているウイルスの高い割合と、完全なキャプシドビリオンの割合（ＩＣＶ）（％）と関係しているが、０．７分の保持時間のシフトがあったピークは、非感染性ウイルス（ペントン−空ビリオンまたはＰＶＶとして示される）と関係している。
【００９２】
【表１】
2008531700.tif 000002
表１と一致して、図２Ａは、２５℃のＡＲＣＡ緩衝液の中で保存した１×１０１２ｖｐ／ｍｌのＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦの処方物が経時的に分解し、その結果、完全なキャプシドビリオン（ＩＣＶ）の割合（％）は、ペントン−空ビリオン（ｐｅｎｔｏｎ−ｖａｃａｎｔ  ｖｉｒｉｏｎ）（ＰＶＶ）とＧＭ−ＣＳＦの分泌の増加と一致して減少することを示している。
【００９３】
図２Ｃは、ＧＭ−ＣＳＦの分泌の減少が最初の完全なキャプシドビリオン（ＩＣＶ）の割合（％）の減少と相関関係にあることを示しており、このことは、ＩＣＶの割合が、ＧＭ−ＣＳＦの分泌を行うＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦウイルス調製物の能力の指標であることを示している。
【００９４】
水性共溶媒をアデノウイルス処方物の安定性に対するそれらの作用について評価した多数の実験を行った。図３に示すように、２０％のＰＥＧ、２０％のグリセロールが含まれている処方物によっては、保持時間にはわずかな変化しか導かれず、これは、高いウイルス安定性を示している。
【００９５】
ＡＲＭＷＧ処方物（１０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５％のグリセロール、ｐＨ８）中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１．２×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の溶液についての、３０℃での保持時間の関数としての完全なキャプシドビリオンの割合（％ＩＣＶ０）についてのさらなる実験を、ＡＲＣＡ対照と比較して、０．７５Ｍ（図５Ａ）または１２重量％（図５Ｂ）の濃度の様々な安定剤添加物の効果を評価するために行った。図５Ａおよび図５Ｂに示すことができたように、プロピレングリコールまたはグリコフロールが含まれている処方物は高い安定性を示し、ＡＲＣＡ対照処方物は、３０℃で少なくとも５０日の後、最も低い保存安定性を示した。
【００９６】
ウイルスの安定性に対する様々な濃度のスクロースの効果もまた、Ａｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１．２×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の溶液についての、３０℃での保存時間の関数としての完全なキャプシドビリオンの割合（％ＩＣＶ０）に基づいて評価した。５重量％のスクロース処方物が標準ＡＲＣＡ処方物である（ＡＲＣＡが５重量％のスクロースを含むという事実から）。図６に示すことができたように、スクロース濃度が高ければ高いほど、より高いアデノウイルスの安定性が生じる。
【００９７】
図５Ａ、５Ｂ、および６は、ウイルスがＡＲＣＡのみの中で保存された場合に見られる％ＩＣＶの低下は、プロピレングリコールおよびグリコフロールのような様々な水性共溶媒を含めることによって少なくすることができることを示している。
【００９８】
可逆性のプロテアーゼ阻害剤および／または穏やかな還元剤がアデノウイルス処方物の安定性に寄与している機構を理解するための試みにおいて、多数の実験を行った。可能性のある機構を明らかにするために、ウイルス粒子を、特定の処方物への添加の前に予め処理した。Ｌ３／ｐ２３プロテアーゼの構造の模式図を図７に提供する。これは、ジスルフィド結合と遊離のチオールの存在を示している。予備処理実験は、単に、特定のタイプの物質の可能性のある作用機構を説明する目的のためのものにすぎず、本発明の処方物の中に含まれるようには意図されない。例えば、ＮＥＭまたはＮ−エチルマレイミドは、不可逆性のプロテアーゼ阻害剤であり、ジアミドは酸化剤である。いずれも、概念研究の証明のために使用され、治療的用途のための組成物の成分であるとは意図されない。ＤＴＴは遊離のチオールを維持するためにジスルフィド結合を可逆的に阻害する還元剤であり、本発明の１つの態様を構成する。
【００９９】
図８Ａ、８Ｂ、および９Ａ〜９Ｃは、ＮＥＭ、ＤＴＴ、およびジアミドでの前処理により、ウイルスがＡＲＣＡ緩衝液中で３０℃で保存された場合に経時的に見られる％ＩＣＶの減少が最少となることを示している。このことは、ウイルス調製物がＡＲＣＡ緩衝液の中で保存される場合には、ウイルスプロテアーゼの阻害が高いウイルス安定性を得るための手段であり得ることを示唆している。前処理を行わないことの効果を、ＡＲＣＡ中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の処方物についての１５ｍＭおよび５０ｍＭのＤＴＴでのＤＴＴ前処理と比較した。３０℃での保存時間の関数としての完全なキャプシドビリオン（ＩＣＶ０）の割合は、５０ｍＭのＤＴＴを含む処方物が、ＤＴＴを含まない処方物および１５ｍＭのＤＴＴを含む処方物よりも高い安定性を示したことを示している（図９Ｂ）。
【０１００】
図１０および１１は、最初の完全なキャプシドビリオンの割合（％ＩＣＶ０）と最初のプロテインＶＩの割合（％ＶＩ０）を、それぞれ、様々なプロテアーゼ阻害剤を含むＡＲＣＡ処方物の中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の処方物について、３０℃での保存時間の関数として示す。結果は、５０ｍＭのＤＴＴ、１５０ｍＭのシステインと、１５ｍＭのジメチルスルフィドを含む処方物が安定性を示したことを、最初の完全なキャプシドビリオンの割合（％ＩＣＶ０）と最初のプロテインＶＩの割合（％ＶＩ）の両方についての分析結果に基づいて示す。
【０１０１】
表２は、５０ｍＭのＤＴＴ，１５０ｍＭのチオグリセロールと、１５ｍＭのジメチルスルフィドを含む処方物が安定性を示したことを、それぞれ、プロテアーゼ阻害剤を含まないＡＲＣＡ処方物と比較して、３０℃での保存時間の関数としてのＧＭ−ＣＳＦの分泌に基づいて示す。
【０１０２】
【表２】
2008531700.tif 000003
多数の様々な処方物（表３に列挙する）が、３０℃での保存時間の関数としての最初の完全なキャプシドビリオンの割合（％ＩＣＶ０）；３０℃での保存時間の関数としての最初のプロテインＶＩの割合（％ＶＩ０）；および最初のＧＭ−ＣＳＦ分泌速度の割合（ＧＳＲ）によって決定したように、Ａｄ／ＧＭ−ＣＳＦウイルスのストックの安定性を高めることが示された。表３に列挙したそれぞれの処方物についての安定性を表４に提供する。
【０１０３】
【表３】
2008531700.tif 000004
【０１０４】
【表４】
2008531700.tif 000005
表５は、長い保存期間（およそ３６．５ヶ月間）の後にもなお、Ａｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（ＣＧ６４４４）処方物（５０重量％のグリセロール、１０ｍＭのＴｒｉｓ、７．４のｐＨ）の、−２０℃での長期間の安定性を示す。
【０１０５】
【表５】
2008531700.tif 000006
水性共溶媒をアデノウイルス処方物の安定性に対するそれらの作用について評価した多数のさらなる実験を行った。
【０１０６】
多数の様々な共溶媒処方物（表６に列挙する）を、１Ｅ１２  ＶＰ／ｍＬを含むＣＧ００７０ウイルスストックを試験するために使用し、それぞれが、１６ヶ月までの−２０℃での保存時間の関数として、ＣＧ００７０ウイルスのストックの安定性を高めることが示された。表６に列挙したそれぞれの処方物についての力価分析および安定性試験の結果を表７に提供する。試験したそれぞれの処方物は、１６ヶ月まで良好な安定性を示した。
【０１０７】
【表６】
2008531700.tif 000007
【０１０８】
【表７】
2008531700.tif 000008
多数の様々な共溶媒処方物（表８に列挙する）を、２０ヶ月まで５℃で、１Ｅ１２および２Ｅ１２  ＶＰ／ｍＬを含むウイルスストックを試験するために使用した。それぞれの共溶媒処方物は、ＡＲＣＡ処方物と比較して、ウイルスストックの高い安定性を示した。表８に列挙したそれぞれの処方物についての力価分析および安定性試験の結果を表９に提供する。試験したそれぞれの処方物は、％ＩＣＶの分析＝完全なキャプシドビリオン；［ＩＣＶ］＝時間０での［ＶＰ］；ＲＴ、プラーク（ＶＰ／ＰＦＵ）、およびＧＳＲの変化＝参照標準物に対して正規化したＧＭ−ＣＳＦ分泌速度；（式中、＜＃＞は、ＩＣＶの存在を含まない現在のペントン−空ビリオンである％［ＶＰ］を示す）によって決定した場合に、２０ヶ月まで、良好な安定性を示した。
【０１０９】
【表８】
2008531700.tif 000009
ＡＲＣＡ＝５％のスクロース、１％のグリシン、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭの塩化マグネシウム、ＲＴ−ｐＨ７．８；ＤＭＳ＝ジメチルスルフィド；Ｐ８０＝ポリソルベート８０；Ｐ．Ｇｌｙｃｏｌ＝プロピレングリコール
【０１１０】
【表９Ａ】
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【０１１１】
【表９Ｂ】
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多数の様々なジメチルスルホキシドおよびプロピレングリコール共溶媒処方物（表１０に列挙する）を、４ヶ月までの５℃における、４Ｅ１２  ＶＰ／ｍＬを含むウイルスストックを試験するために使用した。それぞれの共溶媒処方物が、ＡＲＣＡ処方物と比較してウイルスストックの高い安定性を示したことが示された。表１０に列挙したそれぞれの処方物についての力価分析と安定性試験の結果を表１１に提供する。試験したそれぞれの処方物は、％ＩＣＶの分析＝完全なキャプシドビリオン；［ＩＣＶ］＝時間０での［ＶＰ］；ＲＴ、プラーク（ＶＰ／ＰＦＵ）、およびＧＳＲの変化＝参照標準物に対して正規化したＧＭ−ＣＳＦ分泌速度；（式中、＜＃＞は、ＩＣＶの存在を含まない現在のペントン−空ビリオンである％［ＶＰ］を示す）によって決定した場合に、４ヶ月まで、良好な安定性を示した
【０１１２】
【表１０】
2008531700.tif 000012
ＡＲＣＡ＝５％のスクロース、１％のグリシン、１０ｍＭのＴｒｉｓ、１ｍＭの塩化マグネシウム、ＲＴ−ｐＨ７．８；ＤＭＳ＝ジメチルスルフィド；Ｐ８０＝ポリソルベート−８０；ＰｒｏｐＧｏｌ＝プロピレングリコール
【０１１３】
【表１１】
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ＩＣＶ＝完全なキャプシドビリオン；［ＩＣＶ］＝時間０での［ＶＰ］；＜＃＞は、ＩＣＶの存在を含まない現在のペントン−空ビリオンである％［ＶＰ］を示す
ＧＳＲ＝参照標準物に対して正規化したＧＭ−ＣＳＦ分泌速度
ＮＤ＝行わなかった。
【０１１４】
ＡＲＣＡとＤＭＳを含む処方物の中でのヘキソンの高い安定性
チオ化合物がアデノウイルスプロテアーゼを可逆的に阻害する機構をさらに理解するための実験を行った。これらの実験においては、ウイルス調製物を、ＡＲＣＡ緩衝液とＤＭＳの中に処方した。強制的な酸化実験は、ヘキソンがプロテインＶＩよりも優先して酸化され、そして、ヘキソンとプロテインＶＩの酸化が、ＧＭ−ＣＳＦ分泌速度についてのアッセイによって決定したように、生物学的機能性に影響を与えることはなかったことを示していた。しかし、ヘキソンを上回るプロテインＶＩの優先的な分解が、ウイルスを３０℃の酵素活性温度で保存した場合には、時間の関数として示された。この実験においては、ＧＭ−ＣＳＦのアッセイによって決定したように、生物学的機能性と相関していた分解は、処方物へのＤＭＳの添加によって阻害された。
【０１１５】
関連する実験においては、漸増濃度のＤＭＳ（それぞれ、１５ｍＭおよび１５０ｍＭ）は、酸化によるヘキソンの修飾が少ないことと相関していることが示されており、そして１５ｍＭのＤＭＡをＡＲＣＡ処方物の中に含めることにより、２０ヶ月間の実験期間にわたりヘキソンの酸化が有意に阻害されることが示された。
【０１１６】
上記発明は、明確化および理解の目的のために、説明および例示の方法でいくらか詳細に記載されているが、特定の変化および修飾を行うことができることは、当業者に明らかであろう。本発明の様々な態様は一連の実験によって行われており、そのいくつかは、以下の限定ではない実施例によって記載される。したがって、記載および実施例は、添付の特許請求の範囲によって線引きされる本発明の範囲の限定とは解釈されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、５℃で保存したＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）、１０ｗｔ．％のＰＥＧ処方物についての（図１Ａ）、および２５℃で保存したＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）、ＡＲＣＡ処方物についての（図１Ｂ）、保存時間の関数としての陰イオン交換（ＡＥ）ＨＰＬＣ保持時間のシフトを示しているグラフである。
【図２】図２Ａは、２５℃で保存したＡＲＣＡ緩衝液の中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）処方物についての、完全なキャプシドビリオン（ＩＣＶ）とペントン−空ビリオン（ｐｅｎｔｏｎ−ｖａｃａｎｔ  ｖｉｒｉｏｎ）（ＰＶＶ）を示している、ＡＥ−ＨＰＬＣクロマトグラムのピークの保存時間の関数としての保持時間の変化（ΔＲＴ）を示しているグラフである。図２Ｂは、図２Ａに記載したアデノウイルス処方物について、保存時間の関数として最初の完全なキャプシドビリオン（ＩＣＶ）とペントン−空ビリオン（ＰＶＶ）の割合を示しているグラフである。図２Ｃは、図２Ａに記載したアデノウイルス処方物について、最初の完全なキャプシドビリオン（ＩＣＶ）の割合（％）、ビリオン粒子（ＶＰ）（ＩＣＶ＋ＰＶＶ）、および保存時間の関数としてのＧＭ−ＣＳＦの分泌を示しているグラフである。
【図３】図３は、５℃で保存した様々なＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（２×１０１２ｖｐ／ｍｌ）アデノウイルス処方物についての、保存時間の関数としてのＲＴ（分）での変化のグラフであり、これは、保持時間の処方物に応じたシフトを示している。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、逆相（ＲＰ）ＨＰＬＣプロットであり、これは、アデノウイルスタンパク質の分解を示している。ここでは、図４Ａは、時間ゼロでのＡＲＣＡ中の１×１０１２ｖｐ／ｍｌのＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦの溶液についてのプロットであり、図４Ｂは、１５℃で１２ヶ月間の保存後の同じアデノウイルス溶液についてのプロットである。
【図５Ａ】図５Ａは、ＡＲＭＷＧ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５％のグリセロール、ｐＨ８）の中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１．２×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の処方物についての、３０℃での保存時間の関数としての完全なキャプシドビリオンの割合（ＩＣＶ０）（％）を示しているグラフであり、これは、ＡＲＣＡ対照処方物とともに様々な共溶媒（０．７５Ｍ）の効果を示している。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＡＲＭＷＧ（１０ｍＭのＴｒｉｓ、２５ｍＭのＮａＣｌ、２．５％のグリセロール、ｐＨ８）の中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１．２×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の処方物についての、３０℃での保存時間の関数としての完全なキャプシドビリオンの割合（ＩＣＶ０）（％）を示しているグラフであり、これは、ＡＲＣＡ対照処方物とともに様々な添加物（１２重量％）の効果を示している。
【図６】図６は、ＡＲＣＡ中のＣＧ７０６０アデノウイルス（２×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の処方物についての、５℃での保存時間の関数としての完全なキャプシドビリオンの割合（ＩＣＶ０）（％）を示しているグラフであり、これは、様々な濃度のスクロース添加物の効果を示している。
【図７】図７は、Ｌ３／ｐ２３プロテアーゼの構造の模式図である。
【図８Ａ】図８Ａは、ＮＥＭ前処置を行った、およびＮＥＭ前処理を行っていない、ＡＲＣＡ緩衝液中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦの溶液についての、３０℃での保存時間の関数としての完全なキャプシドビリオンの割合（ＩＣＶ０）（％）とＧＭ−ＣＳＦの分泌速度（ＧＳＤ）を示しているグラフである。
【図８Ｂ】図８Ｂは、ＮＥＭ前処置を行った、およびＮＥＭ前処理を行っていない、ＡＲＣＡ緩衝液中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦの処方物についての、３０℃での保存時間の関数としての完全なプロテインＶＩの割合（ＶＩ０）（％）を示しているグラフである。
【図９Ａ】図９Ａは、ＡＲＣＡ緩衝液中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の処方物についての、３０℃での保存時間の関数としての完全なキャプシドビリオンの割合（ＩＣＶ０）（％）を示しているグラフであり、これは、ＤＴＴ前処理だけ、または続くＮＥＭ前処理の効果を示している。
【図９Ｂ】図９Ｂは、１５ｍＭまたは５０ｍＭのＤＴＴが含まれているＡＲＣＡ緩衝液中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の処方物についての、３０℃での保存時間の関数としての完全なキャプシドビリオンの割合（ＩＣＶ０）（％）を示しているグラフである。
【図９Ｃ】図９Ｃは、５ｍＭのジアミド（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルアゾジカルボキサミド）前処理を行った、または前処理を行っていない、ＡＲＣＡ緩衝液中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の処方物についての、２５℃での保存時間の関数としての完全なキャプシドビリオンの割合（ＩＣＶ０）（％）を示しているグラフである。
【図１０】図１０は、様々なＬ３／ｐ２３プロテアーゼ阻害剤または穏やかな還元剤が含まれているＡＲＣＡ緩衝液中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の処方物についての、３０℃での保存時間の関数としての完全なキャプシドビリオンの割合（ＩＣＶ０）（％）を示しているグラフである。
【図１１】図１１は、３０℃で長期間にわたり完全なキャプシドビリオンの割合（ＩＣＶ０）（％）の維持を生じることがこれまでに示されている、選択されたＬ３／ｐ２３プロテアーゼ阻害剤または穏やかな還元剤が含まれているＡＲＣＡ中のＡｄ／ＧＭ−ＣＳＦ（１×１０１２ｖｐ／ｍｌ）の処方物についての、３０℃での保存時間の関数としてのプロテインＶＩの割合（ＶＩ０）（％）を示しているグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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