(57)【要約】【課題】ＴＲＡＭ（Ｔｒｉｆ関連アダプター分子）のリン酸化の測定及び定量化に用いるアッセイ方法の提供。【解決手段】ＴＲＡＭは、プロテインキナーゼＣイプシロン（ＰＫＣε）によってＬＰＳ刺激により急速にリン酸化され、このリン酸化はＴＲＡＭの通常機能にとり不可欠である。ＴＲＡＭのリン酸化状態の検出に適するアッセイは、ＴＲＡＭを調節する活性を有する化合物を同定する際に有用性を発揮する。更に、ＴＲＡＭのリン酸化を調節してＴｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）により媒介されるシグナリングを調節するのに有用性を発揮する化合物もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＲＡＭの活性化状態を測定するアッセイ方法であって、前記方法が、細胞サンプルを含むＴＲＡＭを準備するステップと、ＴＲＡＭのリン酸化をモニタリングするステップを含んでなり、ＴＲＡＭがリン酸化されないことを、そのＴＲＡＭが不活性であることの指標とする方法。
【請求項２】
ＴＲＡＭをリン酸化に適した条件下でキナーゼと接触させる、請求項１記載のアッセイ方法。
【請求項３】
キナーゼがプロテインキナーゼＣイプシロンである、請求項２記載のアッセイ方法。
【請求項４】
ＴＲＡＭの１つ以上の調節物質質を同定するための方法であって、前記方法が、
（ｉ）ＴＲＡＭを含有する第１細胞サンプル及び第２細胞サンプルを準備するステップと、
（ｉｉ）ＴＲＡＭの候補調節物質と前記第１のサンプルを接触させるステップと、
（ｉｉｉ）リン酸化に適した条件下で、キナーゼを、前記第１細胞サンプル及び前記第２細胞サンプルと接触させるステップと、
（ｉｖ）ＴＲＡＭのリン酸化状態をモニターし、前記第１細胞サンプルと前記第２細胞サンプルとの間でのＴＲＡＭのリン酸化を比較するステップを含んでなり、
前記第１細胞サンプルと前記第２細胞サンプルとの間のＴＲＡＭリン酸化の違いに基づき、前記候補調節物質をＴＲＡＭ活性の調節物質として同定する方法。
【請求項５】
リガンドによるＴＬＲ４活性化を検出するためのアッセイ方法であって、前記アッセイ方法が、
ＴＬＲ４を発現している細胞を含む細胞サンプルを準備するステップと、
前記細胞をリガンドと接触させるステップと、
ＴＲＡＭのリン酸化を検出するステップを含んでなり、
ＴＲＡＭのリン酸化を、ＴＬＲ４へのリガンドの結合の指標とする方法。
【請求項６】
前記リン酸化のレベルを、リガンドに曝露しない同じタイプの細胞に由来するコントロールと比較する、請求項５に記載のアッセイ方法。
【請求項７】
ＴＬＲ４受容体のアゴニストを同定するためのアッセイ方法であって、前記アッセイ方法が、
ＴＬＲ４発現細胞を含む細胞サンプルを準備するステップと、
細胞を試験化合物に曝露するステップと、
ＴＲＡＭのリン酸化を検出するステップを含んでなり、
ＴＲＡＭのリン酸化レベルの上昇を、ＴＬＲ４受容体への試験化合物の結合に続く活性化の指標とする方法。
【請求項８】
ＴＬＲ４受容体のアンタゴニストを同定するためのアッセイ方法であって、前記アッセイ方法が、
ＴＬＲ４発現細胞を含む細胞サンプルを準備するステップと、
細胞を試験化合物に曝露するステップと、
ＴＲＡＭのリン酸化を検出するステップを含んでなり、
試験化合物の存在により、試験化合物が存在しない場合よりもＴＲＡＭのリン酸化が減少することを、その試験化合物がアンタゴニストであることの指標とする方法。
【請求項９】
前記アッセイ方法が、試験化合物に曝露する前に細胞をアゴニストに曝露するステップを更に含んでなる、請求項８に記載のアッセイ方法。
【請求項１０】
プロテインキナーゼＣイプシロンの機能の阻害剤として作用する化合物を決定するアッセイ方法であって、前記方法が、
候補化合物を準備するステップと、
前記候補化合物をプロテインキナーゼＣイプシロンと接触させるステップと、
プロテインキナーゼＣイプシロンのＴＲＡＭをリン酸化する能力の有無を測定するステップを含んでなり、
ＴＲＡＭがリン酸化されないことを、候補化合物によってプロテインキナーゼＣイプシロンの機能がブロッキングされることの指標とする方法。
【請求項１１】
プロテインキナーゼＣイプシロンによるＴＲＡＭのリン酸化を防止する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、前記アッセイ方法が、
候補化合物を準備するステップと、
前記候補化合物をＴＲＡＭと接触させるステップと、
リン酸化の開始に適する条件下でＴＲＡＭをプロテインキナーゼＣイプシロンに曝露するステップと、
ＴＲＡＭのリン酸化の有無を測定するステップを含んでなり、
リン酸化が行われないことを、プロテインキナーゼＣイプシロンとＴＲＡＭとの間の相互作用がブロッキングされることの指標とする方法。
【請求項１２】
ＴＲＡＭに存在するセリン１６の残基に対応するドメイン中の部位又は領域で、化合物をＴＲＡＭと結合させ、そのセリン残基がプロテインキナーゼＣイプシロンによりリン酸化されるのを防止する能力を測定するステップを更に含んでなる、請求項１１記載のアッセイ方法。
【請求項１３】
内毒素により媒介される症状の治療に適する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、前記アッセイ方法が、
候補化合物を準備するステップと、
前記候補化合物をＴＲＡＭと接触させるステップと、
前記候補化合物によるＴＲＡＭのリン酸化の有無を測定するステップを含んでなり、
ＴＲＡＭ活性の調節を、その化合物の有用性の指標とする方法。
【請求項１４】
前記内毒素により媒介される症状が敗血症又は敗血症性ショックである、請求項１３記載のアッセイ方法。
【請求項１５】
ＬＰＳにより媒介される症状の治療方法であって、前記方法がＴＲＡＭのリン酸化を阻害する処理を含んでなる方法。
【請求項１６】
ＴＲＡＭのリン酸化の抑制が、ＴＲＡＭへのプロテインキナーゼＣイプシロンの結合を防ぐことによってなされる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
ＴＲＡＭのリン酸化の抑制が、セリン１６の領域へのプロテインキナーゼＣイプシロンの結合を阻害する阻害剤によって促進される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載のＬＰＳにより媒介される症状に罹患する患者の治療方法であって、前記患者にＴＲＡＭのリン酸化を阻害する分子を、治療上有効量で投与することを含んでなる方法。
【請求項１９】
内毒素により媒介される症状の治療用薬剤の調製のための、プロテインキナーゼＣイプシロンの阻害剤の使用。
【請求項２０】
敗血症の治療用薬剤の調製のための、プロテインキナーゼＣイプシロンの阻害剤の使用。
【請求項２１】
内毒素により媒介される疾患（例えば敗血症）の治療用薬剤の調製のための、ＴＲＡＭのリン酸化を防止する化合物の使用。
【請求項２２】
ＬＰＳによるＴＬＲ４受容体への結合に続くシグナリングに関連する症状の治療を必要とする患者の治療方法であって、前記方法が本発明のアッセイのいずれか１つに従って同定される化合物の投与を含んでなる方法。
【請求項２３】
炎症性障害若しくは免疫媒介性障害の治療又は予防の使用に適する化合物を同定するためのアッセイ方法であって、前記アッセイ方法が、
候補化合物を準備するステップと、
前記候補化合物をＴＲＡＭと接触させるステップと、
前記候補化合物によるＴＲＡＭのリン酸化の有無を測定するステップを含んでなり、
ＴＲＡＭリン酸化の調節を、その化合物の有用性の指標とする方法。
【請求項２４】
前記免疫媒介性障害が関節炎又はアテローム性動脈硬化である、請求項２３記載のアッセイ方法。
【請求項２５】
炎症性障害若しくは免疫媒介性障害の治療用薬剤若しくは予防用薬剤の調製のための、プロテインキナーゼＣイプシロンの阻害剤の使用。
【請求項２６】
炎症性障害若しくは免疫媒介性障害の治療用薬剤若しくは予防用薬剤の調製のための、ＴＲＡＭのリン酸化を防止する化合物の使用。
【請求項２７】
化合物が請求項４記載のアッセイによって同定される化合物である、ＴＲＡＭのリン酸化を防止する化合物の使用。
【請求項２８】
抗原結合ドメインを含む特異的な結合メンバーであって、前記抗原結合ドメインがＴＲＡＭのセリン１６残基に対する特異性を有する結合メンバー。
【請求項２９】
特異的にＴＲＡＭのセリン１６残基と結合する免疫グロブリン。
【請求項３０】
プロテインキナーゼＣイプシロンによるＴＲＡＭのセリン１６残基のリン酸化を防止するイムノグロブリン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴＲＡＭ（Ｔｒｉｆ関連アダプター分子）のリン酸化の測定及び定量化のための新規なアッセイに関する。アッセイは特に、Ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の活性化のモニタリングに用いてもよく、かかるアッセイはその活性の調節物の同定に有用性を発揮する。本発明の更なる態様は、プロテインキナーゼＣイプシロンによってＴＲＡＭのリン酸化をブロック、阻害又は競争的に阻害する分子を測定するためのアッセイ方法の提供に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）スーパーファミリーは、病原微生物の侵入の認識、及び免疫応答の開始において中心的な役割を果たす。ヒトＴＬＲｓは現在までに１０種類同定されている。各々はシグナリングカスケードの活性化につながる異なる病原関連分子パターン（ＰＡＭＰ）を認識し、更に次々に転写制御因子ＮＦ−κＢ、更には分裂促進因子活性プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫｓ）、ｐ３８、ｃ−ｊｕｎ、Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）及びｐ４２／４４（非特許文献１及び２に開示される）を活性化させる。ＴＬＲ３及びＴＬＲ４も転写制御因子（ＩＦＮ制御された因子３（ＩＲＦ３））の活性化を介して他の経路を活性化させ、それはインターフェロン感受性反応要素（ＩＳＲＥ）と結合し、ＩＦＮ−β（非特許文献３）を含む遺伝子サブセットを誘導する。ＴＬＲｓはより大きいスーパーファミリーのメンバーであり、インターロイキン１受容体（ＩＬ−１Ｒ）／ＴＬＲスーパーファミリーとも呼ばれ、ＩＬ−１Ｒ１サブグループ及びＴＩＲ領域含有アダプターサブグループを包含する。３つの全サブグループは細胞質のＴｏｌｌ／ＩＬ−１受容体（ＴＩＲ）領域を有し、それはシグナリングにとって重要である。ＴＬＲｓは細胞外のロイシンリッチリピートを有し、ＩＬ−１Ｒ１サブグループは細胞外の免疫グロビン領域を有する。アダプター分子は細胞質に存在し、細胞外領域を含まない。
【０００３】
上記のように、各ＴＬＲはそれぞれ異なるＰＡＭＰを認識する。最初に同定されたＴＬＲはＴＬＲ４であり、それはグラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）の認識にとり重要である（非特許文献４、５）。ＴＬＲ１及び６と結合したＴＬＲ２は、それぞれジアシル−及びトリアシルリポペプチドを認識する（非特許文献６）。ＴＬＲ３はｄｓＲＮＡに認識し（非特許文献７）、ＴＬＲ５は細菌フラジェリンを認識し（非特許文献８）、ＴＬＲ９は非メチル化ＣｐＧのモティーフを認識する（非特許文献９）。一度ＴＬＲがＰＡＭＰを認識すると、次のシグナリング経路を活性化させるために、ＴＩＲドメイン含有アダプターを補充する必要がある。これらのアダプターで最初に同定されたものはＭｙＤ８８である。それはＴＬＲとＩＬ−１Ｒのシグナリングにおいて重要な役割を果たし（１０、１１、１２）、それにより生じるシグナリングカスケードが詳細に研究されている（非特許文献１３）。実験結果から、ＴＬＲ３を除く全てのＴＬＲｓからのシグナリングに関係していることが示唆されている。ＭｙＤ８８欠損マウスでは、ＩＬ−１刺激への応答、又はＴＬＲ２、ＴＬＲ５及びＴＬＲ９の刺激が行われない（非特許文献１１）。ＴＬＲ４の場合、遅い反応ではあるが、ＮＦ−κＢ及びＭＡＰＫの活性化が観察されている。更に、樹状細胞成熟の誘導及び転写制御因子ＩＲＦ３の活性化は、ＭｙＤ８８欠損マウスにおいても影響を受けなかった。これは、ＴＬＲ４が完全にその反応を活性化させるにはＭｙＤ８８以外の因子を必要とし、この反応が２つのカテゴリー（ＭｙＤ８８依存性の反応と、ＭｙＤ８８非依存性の反応）に分類できることを示唆する。ＮＦ−κＢ及びＴＮＦ産生はＴＬＲ３に応答して損なわれず、それはＭｙＤ８８がＴＬＲ３シグナリングとは無関係であることを示唆する。
【０００４】
次に同定されたアダプターはＭａｌ（ＭｙＤ８８  ａｄａｐｔｏｒ−ｌｉｋｅ）であり、それはＴＩＲＡＰ（ＴＩＲドメイン含有アダプタータンパク質）とも呼ばれている（非特許文献１４、１５）。最初は、これがＴＬＲ４へのＭｙＤ８８非依存性の反応を媒介するアダプターであると考えられていたが、Ｍａｌ欠損マウスによる研究の結果、これは正しくなく、またＭａｌとＭｙＤ８８は協働して作用し、ＭｙＤ８８依存性の経路を活性化させることが明らかとなった。ＭｙＤ８８欠損マウスと同様に、Ｍａｌ欠損マウスではＬＰＳに応答するＮＦ−κＢ及びＭＡＰＫの遅い活性化を示し、一方樹状細胞成熟及び転写制御因子ＩＲＦ３の活性化への影響は見られなかった（非特許文献１５、１６）。Ｍａｌ欠損マウスは通常、ＴＬＲ５、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９、ＩＬ−１及びＩＬ−１８のリガンドに反応し、それはＭｙＤ８８がこれらの受容体に必要とされる唯一のアダプターであることを裏付けるものである。ＴＬＲ３シグナリングはＭａｌ欠損マウスにおいて通常観察され、それはＭａｌもＭｙＤ８８もこの経路に関係しないことを示唆するものである。興味深いことに、ＴＬＲ２によって活性化するシグナリング経路はＭａｌ欠損マウスにおいて完全に喪失され、それはＭａｌ及びＭｙＤ８８の両方がこの経路（１６）の活性化に必要とされることを示唆するものである。
【０００５】
Ｔｒｉｆ（ＴＩＲドメイン含有アダプター誘導インターフェロン−β）は第３に同定されたアダプターである（非特許文献１７、１８）。それはＴＩＲ含有アダプター分子−１（ＴＩＣＡＭ−１）とも呼ばれている。ＴｒｉｆによるＮＦ−κＢ活性化（過剰発現の場合）はＭａｌ又はＭｙＤ８８による場合よりもかなり小さい程度であるが、ＩＦＮ−βに関しては非常に強い活性化因子として機能する（非特許文献１７）。すなわち、それがＭｙＤ８８非依存性の経路に関係しうることを示唆し、またＴｒｉｆ欠損マウスによりこの点が証明されている（非特許文献１９）。ＬＰＳに応答するＮＦ−κＢ活性化はこれらのマウスにおいてはほぼ正常であったが、これらの細胞でＴｒｉｆ及びＭｙＤ８８が欠損するとき、ＬＰＳへのＮＦ−κＢの反応は完全に喪失された。Ｔｒｉｆ欠損マウスにおいてＬＰＳに応答するＩＲＦ３の活性化が完全に喪失され、これもＴｒｉｆがＴＬＲ４によって活性化するＭｙＤ８８非依存性の経路に関係することを示唆するものである。ＴＬＲ３によるＩＲＦ３の活性化はＴｒｉｆ欠損細胞においても喪失され、またＮＦ−κＢの活性化も顕著に損なわれ、それらはＴｒｉｆがＴＬＲ３により用いられる唯一のアダプターであることを示唆するものである。
【０００６】
またＴｒｉｆが直接ＴＬＲ４と結合できないことが発見され（非特許文献１８）、架橋アダプターがＴＬＲ４への結合に必要であることを示唆するものである。その架橋アダプターは、現在幾つかの研究グループによって発見されており、ＴＲＡＭ（Ｔｒｉｆ関連アダプター分子）（非特許文献２０）、ＴＩＣＡＭ−２（ＴＩＲ含有アダプター分子−２）（非特許文献２１）又はＴＩＲＰ（ＴＩＲドメイン含有タンパク質）（非特許文献２２）と呼ばれている。
【０００７】
ＴＲＡＭは直接ＴＬＲ４と結合し、他のＴＬＲｓとは結合しない（２１）。ＴＲＡＭの過剰発現により、ＭｙＤ８８非依存的に、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７及びＮＦ−κＢが穏やかに誘導された。ＴＲＡＭのドミナントネガティブは、ＬＰＳによるＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３の活性化を阻害したが、ＴＬＲ３リガンド、ポリ（Ｉ：Ｃ）によるこれらの転写制御因子の活性化にも影響を及ぼさなかった。ＴＲＡＭの過剰発現（Ｔｒｉｆと共に）により、ＩＲＦ３の核への転座が誘導された（非特許文献２０）。ドミナントネガティブ形のＴｒｉｆは顕著にＴＲＡＭの活性を抑制してＮＦ−κＢ及びＩＦＮ−βを活性化させ、一方ではＭｙＤ８８及びＭａｌドミナントネガティブ変異体では効果を有しなかった。
【０００８】
ＴＲＡＭはＴｒｉｆノックダウンＲＡＷ細胞において機能することができず、すなわちＴＲＡＭがＴＬＲ４経路のＴｒｉｆの上流で機能することを示唆するものである。ＴＲＡＭ欠損マウスの作製によりこの理論の重要性がますます増加した（非特許文献２３）。これらのマウスを用いた研究により、ＴＲＡＭはＴＬＲ４に応答するＭｙＤ８８非依存性の経路の活性化にとって不可欠であり、他のＴＬＲ経路には関係しないことが示された。
【０００９】
本発明者による鋭意研究の結果、驚くべきことに、ＬＰＳのＴＬＲ４受容体（Ｔｏｌｌ様受容体４）への結合に続き、アダプター分子ＴＲＡＭがプロテインキナーゼＣイプシロンによって急速にリン酸化されることを見出した。すなわちＴＲＡＭがセリン１６残基の部位でプロテインキナーゼＣイプシロンによってリン酸化されることを確認した。ＴＬＲ４の活性化を測定する際、具体的にはＴＬＲ４受容体を介するＬＰＳシグナリングが異なる環境において適切に機能するどうかを測定する際、ＴＲＡＭのリン酸化をモニターするアッセイ方法は有用なツールとなりうる。
【００１０】
【非特許文献１】Ｊａｎｅｗａｙ，Ｃ．Ａ．，Ｊｒ．，Ｍｅｄｚｈｉｔｏｖ，Ｒ．，２００２．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０，１９７−２１６．
【非特許文献２】Ｄｕｎｎｅ  Ａ．，Ｏ’Ｎｅｉｌｌ，Ｌ．Ａ．，２００３ａ．Ｓｃｉ  ＳＴＫＥ  ２００３，ｒｅ３．
【非特許文献３】Ｄｏｙｌｅ，Ｓ．ら，（２００２）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １７，２５１−６３．
【非特許文献４】Ｐｏｌｔｏｒａｋ  Ａ．ら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２，２０８５−８．
【非特許文献５】Ｑｕｒｅｓｈｉ  Ｓ．Ｔ．ら、（１９９９）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８９，６１５−２５．
【非特許文献６】Ｔａｋｅｄａ  Ｋ．，Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ．及びＡｋｉｒａ  Ｓ．（２００２）Ｊ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｓ  ８，４５９−６３．
【非特許文献７】Ａｌｅｘｏｐｏｕｌｏｕ  Ｌ．ら、（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，  ７３２−８．
【非特許文献８】Ｈａｙａｓｈｉ  Ｆ．ら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０，１０９９−１０３．
【非特許文献９】Ｈｅｍｍｉ  Ｈ．ら、（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０８，７４０−５．
【非特許文献１０】Ｈｅｍｍｉ  Ｈ．ら、（２００２）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３，１９６−２００．
【非特許文献１１】Ａｄａｃｈｉ  Ｏ．ら、（１９９８）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ９，１４３−５０．
【非特許文献１２】Ｔａｋｅｕｃｈｉ  Ｏ．ら、（２０００）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４，５５４−７．
【非特許文献１３】ＭｃＧｅｔｔｒｉｃｋ  Ａ．Ｆ．及びＯ’Ｎｅｉｌｌ  Ｌ．Ａ．（２００４）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４１，５７７−８２．
【非特許文献１４】Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．Ａ．ら、（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１３，７８−８３．
【非特許文献１５】Ｈｏｒｎｇ，Ｔ．ら、（２００１）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２，８３５−４１．
【非特許文献１６】Ｈｏｒｎｇ，Ｔ．ら、（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４２０，３２９−３３．
【非特許文献１７】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ら、（２００２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６９，６６６８−７２．
【非特許文献１８】Ｏｓｈｉｕｍｉ，Ｈ．ら、（２００３）Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，１６１−７．
【非特許文献１９】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ら、（２００３）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１，６４０−３．
【非特許文献２０】Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｋ．Ａ．ら、（２００３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８，１０４３−５５．
【非特許文献２１】Ｏｓｈｉｕｍｉ，Ｈ．ら、（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，４９７５１−４９７６２．
【非特許文献２２】Ｂｉｎ，Ｌ．Ｈ．ら、（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，２４５２６−３２．
【非特許文献２３】Ｙａｍａｍｏｔｏ，Ｍ．ら、（２００３）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４，１１４４−５０．
【非特許文献２４】Ｔｈｅｌｅｎ  Ｍ．ら、（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５１，３２０−２．
【非特許文献２５】Ａｄｅｒｅｍ  Ａ．Ａ．ら、（１９８８）  Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３６２−４．
【非特許文献２６】Ｗｕ  Ｗ．Ｃ．ら、（１９８２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９，５２４９−５３．
【非特許文献２７】Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ  Ｅ．ら、（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０，７２４４−８．
【非特許文献２８】Ｒｏｚｅｎｇｕｒｔ  Ｅ．及びＳｉｎｎｅｔｔ−Ｓｍｉｔｈ  Ｊ．（１９８３）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０，２９３６−４０．
【非特許文献２９】Ｇｒａｆｆ  Ｊ．Ｍ．ら、（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６，５０３−６．
【非特許文献３０】Ｒｏｓｅｎ  Ａ．ら、（１９９０）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７２，１２１１−５．
【非特許文献３１】Ｍａｔｓｕｂａｒａ  Ｍ．ら、（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，４８８９８−９０２．
【非特許文献３２】Ｔａｋａｓａｋｉ  Ａ．ら、（１９９９）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，１１８４８−５３．
【非特許文献３３】Ｈａｙａｓｈｉ  Ｎ．，ら、（２０００）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ９，１９０５−１３．
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の第１の態様は、ＴＲＡＭ（Ｔｒｉｆ関連アダプター分子）の活性化状態を測定する方法の提供に関し、当該方法は、ＴＲＡＭを含有する細胞サンプルを提供するステップと、ＴＲＡＭのリン酸化をモニターするステップを含んでなる方法であり、ＴＲＡＭのリン酸化が行われない場合は、そのＴＲＡＭが活性を有しないことの指標となる。
【００１２】
本願明細書における「活性化状態」の用語は、ＴＲＡＭが細胞シグナリング経路に関係しているか否かを指す時に用いる。すなわち、活性ＴＲＡＭはＴＲＡＭのセリン１６残基のリン酸化により生じ、ＴＲＡＭ（活性化状態）はＴＬＲ４受容体により媒介されるシグナリングに関与する。
【００１３】
アッセイの好ましい実施態様では、ＴＲＡＭはリン酸化に適した条件下でキナーゼと接触する。一実施例において、当該キナーゼはプロテインキナーゼＣイプシロンであってもよい。
【００１４】
アッセイの更なる実施態様では、ＴＲＡＭリン酸化をコントロールとの比較によりモニターし、それによりリン酸化を測定する。
【００１５】
更なる態様では、ＴＲＡＭリン酸化を、細胞膜領域内におけるＴＲＡＭの存在との比較により測定する。ＴＲＡＭのリン酸化によって、細胞膜からのＴＲＡＭの移動が生じる。
【００１６】
したがって、本発明のこの態様の更なる実施態様は、細胞膜に存在するＴＲＡＭの存在又はレベルを測定することによってＴＲＡＭのリン酸化状態を測定する方法であって、膜領域内に存在するＴＲＡＭの、膜からの移動による喪失又は減少が、リン酸化状態のＴＲＡＭの指標となる方法の提供に関する。
【００１７】
一実施態様では、ＴＲＡＭのリン酸化の測定方法は、細胞膜中のＴＲＡＭの存在及び／又はレベルを測定及び／又定量化する膜減少アッセイを含んでなる。
【００１８】
理論に束縛されずないが、発明者は、リン酸化に続く細胞膜からのＴＲＡＭの移動が、ＴＲＡＭのセリン１６残基のリン酸化によって陰電荷を帯電し、膜からＴＲＡＭを移動させることとなる斥力が生じるものと予想している。
【００１９】
本願明細書では、ＴＲＡＭ（Ｔｒｉｆ関連アダプター分子）と称する分子は、ＴＩＣＡＭ−２（ＴＩＲ含有アダプター分子−２）（非特許文献２１）又はＴＩＲＰ（ＴＩＲドメイン含有タンパク質）（非特許文献２２）と称してもよい。
【００２０】
ＴＲＡＭのリン酸化状態を測定するための上記のアッセイは、ＴＲＡＭ活性化を調節できる候補薬剤の同定のために更に変更してもよい。
【００２１】
したがって、本発明の本態様の更なる実施態様は、ＴＲＡＭ活性の調節物質の同定方法の提供に関し、前記方法は、（ｉ）ＴＲＡＭを含有する第１及び第２の細胞サンプルを準備するステップと、（ｉｉ）ＴＲＡＭの候補調節物を有する前記第１のサンプルを接触させるステップと、（ｉｉｉ）リン酸化に適した条件下でキナーゼと前記第１及び第２のサンプルを接触させるステップと、（ｉｖ）ＴＲＡＭのリン酸化状態をモニターして、前記第１のサンプルと前記第２のサンプルとでＴＲＡＭのリン酸化を比較するステップを含んでなり、前記第１のサンプルと前記第２のサンプルとの間のＴＲＡＭリン酸化の差異を基に、ＴＲＡＭ活性の調節物として候補調節物質を同定することを特徴とする。
【００２２】
一実施態様では、ＴＲＡＭをリン酸化するキナーゼは、プロテインキナーゼＣイプシロンである。
【００２３】
本発明の本態様の上記のアッセイに従って同定される１つ以上の調節物質は、ペプチド分子又は非ペプチド分子（例えば化学物質又は医薬用物質）であってもよい。調節物質がペプチドである場合、抗体、抗体フラグメント又は同様の結合活性を有する分子であってもよい。更に、調節物質が抗体である場合、好ましくは単クローン抗体である。
【００２４】
本発明の更なる態様は、ＴＬＲ４受容体で媒介されるシグナリングを調節する薬物の調製に関する前述の態様に従って同定された調節物の使用に関する。ＴＬＲ４で媒介されるシグナリングの一実施態様では、受容体は上方制御される。更なる、好ましい実施態様では、ＴＬＲ４受容体で媒介されるシグナリングは下方制御される。
【００２５】
更に他の本発明の態様は、ＴＲＡＭのリン酸化を測定するキットの提供に関し、当該キットは参照サンプル、ＴＲＡＭのリン酸化を測定するための手段、及び本発明の第１の態様の方法を使用したいずれかの本発明のアッセイを実施するための使用説明書を含んでなる。
【００２６】
ＴＲＡＭのリン酸化状態を評価し、それを調節するのに有用な組成物の同定のためのアッセイ方法を記載した上記の本発明の態様に加えて、本発明は更に、リガンド、特にＬＰＳによるＴＬＲ４受容体の活性化を評価するアッセイにおいて有用性を発揮する。かかるアッセイは、ＴＬＲ４受容体を介して選択的にシグナリングを上方制御又は下方制御することができる化合物の同定及び開発において有用性を発揮しうる。かかる化合物は、ＴＬＲ４結合及び最も具体的にはＬＰＳ（リポ多糖）によるＴＬＲ４結合から生じるシグナリング経路の調節物質として有用性を発揮する。
【００２７】
第４の本発明の態様は、リガンドによるＴＬＲ４活性化を検出するアッセイ方法の提供に関するものであり、当該アッセイは、ＴＬＲ４発現細胞を含む細胞サンプルを準備するステップと、前記細胞をリガンドと接触させるステップと、ＴＲＡＭのリン酸化を検出するステップを含んでなり、ＴＲＡＭのリン酸化をＴＬＲ４へのリガンドの結合の指標とすることを特徴とする。
【００２８】
好ましくは、リン酸化のレベルを、コントロール試料（例えばリガンドに曝露されない同種の細胞）のそれと比較してもよい。あるいは、試験サンプルを、周知の、予め定められた基準値をコントロールとして比較してもよい。
【００２９】
リン酸化を測定することによって、ＴＬＲ４受容体との相互作用を介したＴＲＡＭのリン酸化を調整する候補薬剤を同定することが可能となる。
【００３０】
本発明の更なる態様は、ＴＬＲ４受容体で媒介されるシグナリングを調節する薬物の調製に係る、前述の本発明の態様に従って同定されるリガンドの使用に関する。一実施態様では、ＴＬＲ４受容体を介するシグナリングは上方制御される。
【００３１】
本発明の第４の態様の更なる実施態様は、ＴＬＲ４受容体のアゴニストを同定するためのアッセイに関し、当該アッセイは、ＴＬＲ４発現細胞を含む細胞サンプルを準備するステップと、細胞を試験化合物に曝露するステップと、ＴＲＡＭのリン酸化を検出するステップを含んでなり、ＴＲＡＭのリン酸化レベルの上昇を、試験化合物のＴＬＲ４受容体への結合に続く活性化の指標とすることを特徴とする。
【００３２】
一実施態様では、ＴＬＲ４受容体のアゴニストは、ＴＬＲ４受容体が媒介するシグナリングを誘導又は上方制御する。
【００３３】
本発明の更なる態様は、ＴＬＲ４受容体で媒介されるシグナリングを調節する薬剤の調製に係る、前述の本発明の態様に従って同定された化合物の使用に関する。一実施態様では、ＴＬＲ４受容体が媒介するシグナリングは上方制御される。
【００３４】
本発明のこの態様の、更に別の実施態様は、ＴＬＲ４受容体のアンタゴニストを同定するアッセイ方法に関し、当該アッセイ方法は、ＴＬＲ４発現細胞を含む細胞サンプルを準備するステップと、細胞を試験化合物に曝露するステップと、ＴＲＡＭのリン酸化を検出するステップを含んでなり、当該方法は、試験化合物が存在する場合における、試験化合物が存在しない場合と比較したＴＲＡＭのリン酸化の減少が、当該試験化合物がアンタゴニストであることの指標となることを特徴とする。
【００３５】
一実施態様では、ＴＬＲ４受容体のアンタゴニストはＴＬＲ４受容体によって媒介されるシグナリングを妨害又は下方制御する。
【００３６】
一実施態様では、上記アッセイ方法は更に、細胞を試験化合物に曝露する前にアゴニストに曝露する処理を含んでなる。
【００３７】
本発明の更なる態様は、ＴＬＲ４受容体で媒介されるシグナリングを調節する薬剤の調製に係る、前述の本発明の態様に従って同定される化合物の使用に関する。一実施態様では、ＴＬＲ４受容体で媒介されるシグナリングは上方制御される。
【００３８】
更に他の本発明の態様は、ＴＬＲ４受容体の活性を測定するキットの提供に関し、当該キットはサンプル、及び本発明の第４の態様の方法を実施するための使用説明書を含んでなる。
【００３９】
発明者は鋭意研究の結果、プロテインキナーゼＣイプシロン（ＰＫＣε）が、ＴＲＡＭをリン酸化するキナーゼであることを見出した。プロテインキナーゼＣイプシロンによるリン酸化の阻害は、ＮＫ−κＢ及びＩＦＮ−βを活性化させるＴＲＡＭの能力を弱める。
【００４０】
したがって、第６の本発明の態様は、プロテインキナーゼＣイプシロンのインヒビターとして作用する化合物を同定するためのアッセイ方法を提供し、当該方法は、候補化合物を準備するステップと、候補化合物をプロテインキナーゼＣイプシロンと接触させるステップと、プロテインキナーゼＣイプシロンのＴＲＡＭをリン酸化する能力の有無を測定するステップを含んでなり、ＴＲＡＭのリン酸化が行われない場合、それを候補化合物によってなされたプロテインキナーゼＣイプシロンの活性のブロッキングの指標とすることを特徴とする。
【００４１】
直接プロテインキナーゼＣイプシロン分子を阻害することにより、ＴＲＡＭのリン酸化が妨げられるだけでなく、プロテインキナーゼＣイプシロンの他の細胞内における活性も阻害される。しかしながら、発明者は、プロテインキナーゼＣイプシロンが結合するＴＲＡＭの特異的なドメインを同定し、これがプロテインキナーゼＣイプシロンの他の細胞内での活性の阻害を引き起こすことのない、ＴＲＡＭのリン酸化の選択的阻害の可能性を開拓することを見出した。
【００４２】
本発明の本態様の別の実施例は、プロテインキナーゼＣイプシロンによるＴＲＡＭのリン酸化を防止する化合物を同定するためのアッセイであって、当該アッセイは、候補化合物を準備するステップと、候補化合物をＴＲＡＭと接触させるステップと、ＴＲＡＭを、リン酸化の開始に適する条件下でプロテインキナーゼＣイプシロンに曝露するステップと、ＴＲＡＭのリン酸化の有無を測定するステップを含んでなり、リン酸化が行われないことを、プロテインキナーゼＣイプシロンとＴＲＡＭの間での相互作用のブロッキングの指標とすることを特徴とする。
【００４３】
好ましい実施態様では、当該化合物はプロテインキナーゼＣイプシロンによって選択的にＴＲＡＭのリン酸化を阻害する。
【００４４】
一実施態様では、当該方法は、ＴＲＡＭに存在するセリン１６の残基に対応するドメイン中の部位又は領域で、化合物がＴＲＡＭと結合して、そのセリン残基がプロテインキナーゼＣイプシロンによりリン酸化されるのを防止する能力を測定するステップを含んでなる。
【００４５】
更なる様々な態様では、本発明はスクリーニング及びアッセイ方法、並びにそれにより同定された物質に関する。
【００４６】
本発明のアッセイを用いて同定される新規な化合物は、更に別の本発明の態様を構成する。かかる化合物又は調節物質は、医薬組成物中に添加してもよい。
【００４７】
調節物質、又は本発明のアッセイで同定された化合物は、ペプチド又は非ペプチド分子（例えば化学物質又は医薬物質）であってもよい。調節物質質がペプチドである場合、抗体、抗体フラグメント又は同様に結合するフラグメントであってもよい。更に、調節物質が抗体である場合、好ましくは単クローン抗体である。
【００４８】
ＴＲＡＭに対して特異性を有する単クローン抗体、抗体フラグメント又は同様の結合分子（プロテインキナーゼＣイプシロンがＴＲＡＭのリン酸化を促進するために結合する領域におけるセリン−１６残基に特に結合する、又は完全若しくは部分的にブロッキングする）は、ＴＲＡＭのリン酸化の阻害に有用性を発揮し、それによりＴＬＲ４受容体へのＬＰＳの結合に続く、その下流側への活性シグナリング伝達の促進を防止する能力を有する。
【００４９】
したがって、本発明の更なる態様は、抗原結合ドメインを含む特異的な結合メンバーの提供に関し、当該抗原結合ドメインはＴＲＡＭのセリン−１６残基に対する特異性を有する。
【００５０】
一実施態様は、本発明はＴＲＡＭのセリン−１６残基に特異的に結合するか又は結合を防ぐイムノグロブリンの提供に関する。
【００５１】
更に他の実施態様は、プロテインキナーゼＣイプシロンによるＴＲＡＭのセリン−１６残基のリン酸化を防止するイムノグロブリンの提供に関する。
【００５２】
また、本発明の本態様には、ＴＲＡＭと特異的に結合してプロテインキナーゼＣイプシロンによるリン酸化を防止する結合メンバーが包含される。
【００５３】
内毒素は、リピドＡと多糖からなるリポ多糖（ＬＰＳ）複合体を含んでなる。ＬＰＳはＴＬＲ４受容体と結合し、これが適当な免疫応答を誘発する下流のシグナリングカスケードを生じさせる
【００５４】
敗血症及び敗血症性ショックなどのＬＰＳの媒介又は内毒素の媒介による症状によりしばしば死に至る。したがって、ＴＬＲ４の媒介による免疫応答経路を下方制御又は阻害する方法は、ＬＰＳの媒介による症状（例えば敗血症）の処理方法として望ましい。
【００５５】
ＴＬＲ４へのＬＰＳ結合に続いてＴＲＡＭがプロテインキナーゼＣイプシロンによってリン酸化されるという観察から、本発明は、ＬＰＳと細胞内キナーゼとの間の相互作用を制御するためのポテンシャルルートを提供する。これにより、ＬＰＳシグナリングを無力化するための強力なメカニズムが提供される。
【００５６】
したがって、本発明はＬＰＳの媒介による症状の治療に使用できる。
【００５７】
本発明のアッセイ、及び当該アッセイの使用によって解明されるＴＬＲ４シグナリング経路に対して生物学的重要性を有する化合物は、多くの医学的症状、最も具体的には内毒素及びＬＰＳにより媒介される症状（例えば敗血症）の治療に対して特に有用性を発揮する。
【００５８】
したがって、本発明の第７の態様は、内毒素により媒介される症状の治療用に適する化合物を同定するためのアッセイ方法に関し、当該アッセイは、候補化合物を準備するステップと、前記候補化合物をＴＲＡＭと接触させるステップと、候補化合物によるＴＲＡＭのリン酸化の有無を測定するステップを含んでなり、ＴＲＡＭリン酸化の調節を、その化合物の有用性の指標とすることを特徴とする。
【００５９】
一実施態様では、内毒素により媒介される症状は敗血症又は敗血症性ショックである。
【００６０】
更に他の本発明の態様は、ＬＰＳにより媒介される症状の治療方法の提供に関し、当該方法はＴＲＡＭのリン酸化を阻害する処理を含んでなる。
【００６１】
本発明の上記態様の好ましい一実施態様では、ＴＲＡＭのリン酸化の阻害は、ＴＲＡＭにプロテインキナーゼＣイプシロンの結合を防ぐことによってなされる。
【００６２】
一実施態様では、ＴＲＡＭへのプロテインキナーゼＣイプシロンの結合のブロッキングは、セリン１６ドメインへのプロテインキナーゼＣイプシロンの結合によるリン酸化を阻害する化合物によって促進される。
【００６３】
更に他の実施態様では、当該化合物は、プロテインキナーゼＣイプシロンがリン酸化するＴＲＡＭのセリン−１６部位と直接結合する。あるいは、阻害剤はＴＲＡＭ上の部位と結合し、セリン−１６残基のリン酸化に必要となる、ＴＲＡＭ上の結合部位へのプロテインキナーゼＣイプシロンのアクセスを防止する。
【００６４】
ＴＲＡＭの配列は、配列番号１：ＭＧＩＧＫＳＫＩＮＳＣＰＬＳＬＳＷＧとして定義される。セリン１６は、配列中の最後のセリンである。
【００６５】
あるいは、セリン−１６残基のリン酸化に適切な部位において、ＴＲＡＭへの結合に関してプロテインキナーゼＣイプシロンと競合する分子の提供に関する。
【００６６】
更に別の本発明の態様は、ＬＰＳにより媒介される症状（敗血症）に罹患する患者を治療する方法の提供に関し、前記患者にＴＲＡＭのリン酸化を阻害する分子を、治療上有効量で投与することを含んでなる。
【００６７】
本発明の本態様の好ましい一実施態様では、当該分子はプロテインキナーゼＣイプシロンによるＴＲＡＭのリン酸化を防止する。
【００６８】
内毒素により媒介される症状は、特にＬＰＳによって生じるものであり、しばしば発熱、白血球数の変化、播種性血管内凝固、低血圧、ショック及び死に至る。
【００６９】
好ましい一実施態様では、内毒素により媒介される上記症状は敗血症である。
【００７０】
本発明の更なる態様は、内毒素により媒介される症状の治療用薬剤の調製における、プロテインキナーゼＣイプシロンの阻害剤の使用の提供に関する。
【００７１】
したがって、本発明の更なる態様は抗原結合ドメインを含む特異的な結合メンバーの提供に関し、当該抗原結合ドメインはプロテインキナーゼＣイプシロンに対する特異性を有する。
【００７２】
一実施態様では、本発明は、プロテインキナーゼＣイプシロンに特異的に結合するか又は結合をブロックするイムノグロブリンの提供に関する。
【００７３】
更に他の本発明の態様は、敗血症の治療用薬剤の調製のための、プロテインキナーゼＣイプシロンの阻害剤の使用に関する。
【００７４】
更に別の本発明の態様は、内毒素により媒介される疾患（例えば敗血症）の治療用薬剤の調製のための、ＴＲＡＭのリン酸化を防止する化合物の使用に関する。
【００７５】
更に別の本発明の態様は、前述の本発明の態様のいずれか１つに従うアッセイ方法のいずれか１つによって同定される化合物を使用することを特徴とする、医学的症状の治療方法の提供に関する。
【００７６】
ＴＬＲ４受容体で媒介されるシグナリングは、内毒素によって媒介されるそれら以外の免疫応答と関連していてもよい。例えば、ＴＬＲ４受容体を介したシグナル伝達は炎症性疾患に関係している場合もあり、それゆえ、ＴＬＲ４受容体によるリガンド結合能力及びＴＬＲ４受容体の下流におけるシグナル伝達の調節は、炎症性疾患（例えば関節炎及びアテローム性動脈硬化）に影響を与えうる。若干の自己免疫性の症状では、ＴＬＲ４受容体の候補リガンド又は調節物質は未だ同定されていない。しかしながら、このような場合では、炎症又は傷害を伴う組織によって産生される内因性の因子がＴＬＲ４受容体又はその関連するシグナリング経路に影響を及ぼすことが示唆される。
【００７７】
したがって、更に他の本発明の態様は、炎症性又は免疫媒介性障害の治療又は予防に適する化合物を同定するためのアッセイ方法の提供に関し、当該アッセイは、候補化合物を準備するステップと、候補化合物をＴＲＡＭと接触させるステップと、候補化合物によるＴＲＡＭのリン酸化の有無を測定するステップを含んでなり、ＴＲＡＭリン酸化の調節を、その化合物の有用性の指標とすることを特徴とする。
【００７８】
好ましい実施態様では、当該免疫媒介性障害は関節炎又はアテローム性動脈硬化であってもよい。
【００７９】
更に他の本発明の態様は、炎症性症状又は免疫媒介性障害の治療又は予防用の薬剤の調製における、プロテインキナーゼＣイプシロンの阻害剤の使用に関する。
【００８０】
更に別の本発明の態様は、炎症性又は免疫媒介性障害の治療又は予防用薬剤の調製における、ＴＲＡＭのリン酸化を防止する化合物の使用に関する。
【００８１】
更なる本発明の態様では、ＬＰＳによるＴＬＲ４受容体への結合に続くシグナリングに関連する症状の治療を必要とする患者を治療する方法であって、当該方法は本発明のアッセイのいずれか１つに従って同定される化合物の投与を含んでなる。
【００８２】
他に必要としない限り、各本発明の態様の好ましい特徴は必要な変更を加えて他の態様の各々に適用してもよい。
【００８３】
アッセイ
本発明は、ＴＲＡＭリン酸化の測定、更にはＴＲＡＭリン酸化の発生によるＴＬＲ４活性化のモニタリングに用いるアッセイシステム及びスクリーニング法を提供する。本発明の「アッセイシステム」の用語には、ある特定の１つ以上の現象を検出及び／又は測定するアッセイを実行して、その結果を分析するために必要な全ての構成要素が包含される。
【００８４】
様々なアッセイを利用して、標的分子又はタンパク質のリン酸化状態を検出してもよい。
【００８５】
一実施態様では、当該アッセイはリン酸化を受けるＴＲＡＭのドメインを認識するリン酸化特異的な抗体を使用する。最も好ましくは、この抗体は、ＴＲＡＭにおけるセリン１６の位置又はその近傍領域と結合する。
【００８６】
ＴＲＡＭのアミノ酸配列は、配列番号１：ＭＧＩＧＫＳＫＩＮＳＣＰＬＳＬＳＷＧとして定義される。
【００８７】
好ましい実施態様では、本発明のアッセイではウエスタンブロッティングなどの公知の技術を使用する。当業者に公知の標準的な方法を使用して、ＴＬＲ受容体に対するリガンド（例えばＬＰＳ）によって刺激した細胞から調製した抗体が、ウエスタンブロットのサンプルとして用いられる。
【００８８】
更なる態様では、当該抗体を、他のアッセイのフォーマットにおいて使用してもよい。例えば、インビトロキナーゼアッセイにおいては、総タンパクの代わりにＴＲＡＭ由来するペプチドフラグメントを用いてアッセイを実施できる。
【００８９】
必須ではないが、好ましくは、本発明で使用するスクリーニングアッセイはハイスループット又はウルトラハイスループットアッセイであり、それによりオートメーション化された費用効果的なスクリーニング手段の提供につながる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９０】
治療
本明細書で使用される「治療」という用語は、ヒト又は人間以外の動物に適用できるいかなる療法も意味する。治療とは、既存の症状に関するものであってもよく、又は予防的なもの（予防的処置）であってもよい。治療には、治癒的、緩和的又は予防的効果が包含される。
【００９１】
医薬組成物
本発明は更に、リン酸化状態の変調又はリン酸化の防止による、ＴＲＡＭのリン酸化調節用の医薬及び医薬組成物に関する。
【００９２】
したがって、本発明の更なる態様は、免疫応答の調節用の医薬組成物の提供に関し、当該組成物は、主成分として、リン酸化を促進又はブロッキングすることによりＴＲＡＭのリン酸化を調節する化合物を含んでなる。
【００９３】
本発明の医薬組成物、並びにその本発明での使用においては、主成分に加えて、当業者に公知の薬学的に許容できる添加剤、担体、緩衝安定剤又は他の材料を含有させてもよい。
【００９４】
かかる材料は毒性を有してはならず、また主成分の有効性を妨げてはならない。担体又は他の材料の具体的な特性は投与ルートに依存する。
【００９５】
投与量
組成物は好ましくは「臨床的に有効な量」（個人に利益をもたらすのに十分な量）で患者に投与される。実際の投与量、並びに投与速度及び時間は、個人の状態及び処置を受ける症状に依存する。
【００９６】
至適投与量は、多くのパラメータ（例えば個人の年齢、阻害又は誘導される免疫応答の大きさ、投与される組成物の具体的な形態及び投与ルートなど）に基づいて決定できる。
【００９７】
当該組成物は、血液などの特定の組織に投入されるミクロスフェア、リポソーム、他の微粒子状の輸送システム又は徐放性製剤を経て投与できる。好適な徐放性担体の例としては、例えば坐薬又はマイクロカプセルなどの一般的な剤形の半透性ポリマーマトリックスが挙げられる。
【００９８】
上記の技術及びプロトコル、並びに本発明で使用できる他の技術及びプロトコルの例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．Ｒ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ；第２０版（Ｄｅｃｅｍｂｅｒ  １５，２０００）ＩＳＢＮ  ０−９１２７３４−０４−３、及び「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」；Ａｎｓｅｌ，Ｈ．Ｃ．ら、第７版  ＩＳＢＮ  ０−６８３３０５−７２−７に記載され、その開示内容は本願明細書に援用される。
【００９９】
抗体
本発明における「抗体」の用語は、イムノグロブリン若しくはその一部、又は抗体の結合ドメイン若しくはそのホモログであるポリペプチドを含む結合ドメインを指すものとする。
【０１００】
「抗体」はイムノグロブリンであり、天然であってもよく、又は部分的又は完全に合成されたものであってもよい。当該用語はまた、抗体結合ドメイン若しくはそのホモログである結合ドメインを有するあらゆるポリペプチド、タンパク質若しくはペプチドが包含される。これらは天然給源に由来してもよく、又は部分的又は完全に合成されたものであってもよい。
【０１０１】
当該抗体は完全な抗体であってもよく、又はそのフラグメントであってもよい。完全な抗体に由来するフラグメントは、抗原の結合能を発揮できる。かかる結合フラグメントの例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、Ｃｌ及びＣＨ１ドメインからなるＦａｂフラグメント、（ｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント、（ｉｉｉ）単一の抗体のＶＨ及びＶＬドメインからなるＦｖフラグメント、（ｉｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント、（ｖ）単離されたＣＤＲ領域、（ｖｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（２つのＦａｂフラグメントが連結した二価のフラグメント）（ｖｉｉ）単鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）（ＶＨドメイン及びＶＬドメインがペプチドリンカーで連結され、それにより２つのドメインが結合して抗原結合部位を形成する）、（ｖｉｉｉ）二重特異的な単鎖Ｆｖ二量体、及び（ｉｘ）遺伝子融合によって調製される多価性又は多重特異的フラグメント。
【０１０２】
抗体は多くの方法で修飾できるため、「抗体」の用語は、必要な特異性を有する結合ドメインを有するいかなる結合メンバー又は基質も包含されるものとして解釈すべきである。
【０１０３】
本発明の抗体は、単クローン抗体、又はそのフラグメント、誘導体、機能的均等物又はそのホモログであってもよい。抗体の定常部は、いかなる適切なイムノグロブリンサブタイプであってもよい。
【０１０４】
「抗体」という用語には、「ヒト化」された抗体、又はＣＤＲグラフティングなどの技術により調製された抗体が包含される。かかる技術は、当業者にとって周知である。
【０１０５】
抗体作成
本発明に係る、及び本発明に用いられる特異的な結合メンバーは、いかなる適切な方法で調製してもよく、天然由来であっても人工的に合成したものであってもよい。かかる方法としては、例えば抗体ライブラリを使用した従来のハイブリドーマ技術、組換えＤＮＡ技術又はファージディスプレイ技術などが挙げられる。かかる産生技術は当業者に公知であり、またその他の抗体産生技術は、「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８．に記載されている。
【０１０６】
特に定めのない限り、本願明細書において用いられる全ての技術的及び科学的な用語は、本発明の技術分野の当業者に一般に理解されている意味を有する。
【０１０７】
明細書全体を通じて、特に断りのない限り、用語「含んでなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」又は「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」又はそれらのあらゆる活用形は、特定の整数又は整数の群の包含を意味する一方で、他のいかなる整数又は整数の群を除外することを意味するものではない。
【０１０８】
本発明を、以下の実施例（それらは例示を目的として開示され、本発明を限定するものと解釈すべきでない）、更には図面を参照することにより例示する。
【実施例】
【０１０９】
材料及び方法細胞：
ＨＥＫ２９３細胞及びＴＬＲ４（ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４）で安定にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞を、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び２ｍＭのグルタミンを添加したＤｕｌｂｅｃｃｏ社の修飾Ｅａｇｌｅｓ培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ＴＨＰ１細胞を、１０％のＦＣＳ、１００単位／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン及び２ｍＭのグルタミンを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。
【０１１０】
逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：
鋳型として脾臓メッセンジャーＲＮＡ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）を使用してｃＤＮＡを調製した。１〜５μｇＲＮＡを、０．１μｇのランダムプライマーとインキュベートし、ＤＥＰＣ処理水で５μＬの最終液量とした。７０℃で１０分間、更に４℃で２分間インキュベートした。ｍｏｌｏｎｅｙマウス白血病ウイルス逆転写酵素（ＭＭＬＶ−ＲＴ）を使用して逆転写反応させた。４μＬの５×バッファ（２５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．３）、３７５ｍＭ  ＫＣｌ及び１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２）、２μＬの１００ｍＭ  ＤＴＴ、１μＬのＲＮａｓｉｎ（４０単位／ｍｌ）、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、１μＬのＭＭＬＶ−ＲＴ（２００単位／μＬ）及び６μＬのＤＥＰＣ処理水を添加した。この反応液を３７℃で１時間インキュベートし、酵素を不活性化するために９５℃で２分間処理した。この反応液の５μＬをＰＣＲ反応の鋳型として使用し、またＴＲＡＭの５’及び３’末端に特異的なプライマーを使用した。１×ＤＮＡポリメラーゼバッファ（１ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）、５ｍＭのＫＣｌ及び０．０１％のＴｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００）、各ｄＮＴＰ  ０．２ｍＭ、２．５ｕのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、特異的なオリゴヌクレオチドプライマを各０．５μＭ、及び０．５〜３ｍＭのＭｇＣｌ２を鋳型ＤＮＡ溶液に添加し、反応混合物をＰＣＲグレードの水を使用して５０μＬの最終的な液量とした。サーマルサイクラーを使用し、１分間９４℃、１分間５５℃及び２分間７２℃の３０サイクルで反応させた。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動で分析した。
【０１１１】
ＧＳＴ発現ベクター及び哺乳類の発現ベクターへのＴＲＡＭのクローニング：
ＴＲＡＭのＰＣＲ生成物を、ｐＧＥＸ−ｋｇベクター（ファルマシア社製）、ｐｃＤＮＡ３．１ベクター（インビトロゲン社）にライゲーションした。第１に、ＰＣＲ生成物及びベクターを、別々の反応において切断した。５〜１０単位の制限エンドヌクレアーゼ（ＮＥＢ社製）、１×制限酵素バッファ、±１×ＢＳＡ及び１〜１０μｇのＤＮＡを混合し、滅菌水で１０μＬにし、２時間３７℃でインキュベートした。次いで消化した生成物をＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ社製）を使用して精製した。１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（１単位／μＬ）（プロメガ社製）、２μＬのＴ４  １０×反応バッファ、１００〜１５０ｎｇの切断したベクターＤＮＡ、及び２００〜４００ｎｇの切断したＰＣＲ生成物を混合し、滅菌水で２０μＬにし、ライゲーション反応液を調製した。このライゲーション混合物を４℃で一晩静置し、更にＢＬ２１（ＤＥ３）細胞（ストラタジーン社）を形質転換した。
【０１１２】
ＴＲＡＭの部位特異的変異導入：
Ｑｕｉｃｋｃｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的変異導入キット（ストラタジーン社）を用い、ＴＲＡＭ遺伝子の特定の塩基を変異させた。製造業者の指示に従い、所望の突然変異を有するプライマーを使用して反応させた。
【０１１３】
ＧＳＴ−ＴＲＡＭの発現及び精製：
ＴＲＡＭ−ｐＧＥＸベクターを有するＢＬ２１（ＤＥ３）を、振盪培養器を用い、１０ｍＬのＬＢ培地で３７℃で一晩培養した。翌日、１０ｍＬを５００ｍＬのＬＢ培地に植え継ぎ、０．６〜０．８のＯＤとなるまで培養した。０．２ｍＭの最終濃度でＩＰＴＧを培養液に添加し、更にこの培養液を更に３０℃で４時間インキュベートした。更に培養液を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ５Ｃ遠心機（ＧＳＡローター使用）により、８，０００回転／分で１５分間遠心分離した。ペレットを２５ｍＬのＮＥＴＮバッファ（２０ｍＭのトリスＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％のＮＰ４０、１０μｇ／ｍＬのロイペプチン、１０μｇ／ｍＬのペプスタチン、１ｍＭのＰＭＳＦ、ｐＨ８．０）に再懸濁し、ソニケータ（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｅｒ  ２５０）を使用して５分間超音波破壊し、４５分間、１８，０００回転／分で遠心分離した。上澄みを６００μＬグルタチオンセファロースビーズ（アマシャム社製）に添加し、４℃で２時間インキュベートした。更にビーズを１５ｍＬのＮＥＴＮバッファで５回洗浄し、６００μＬのＮＥＴＮバッファに再懸濁した。
【０１１４】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子アッセイ：
ＨＥＫ２９３又はＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４細胞を、１×１０５細胞／ｍＬの密度で９６穴プレートに播種した。翌日、上記細胞を、Ｇｅｎｅｊｕｉｃｅ（Ｎｏｖａｇｅｎ）を用い、製造業者の指示に従い、選択したルシフェラーゼリポータプラスミド、及び選択した発現ベクターによってトランスフェクションした。ＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３活性化の検出に関する実験のために、８０ｎｇのＮＦ−κＢ又はＩＲＳＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子（ストラタジーン社）を、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部コントロールプラスミド（ストラタジーン社）４０ｎｇと共に細胞にトランスフェクションした。２４時間後に、細胞をｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（プロメガ社製）に溶解し、レポーター遺伝子活性を照度計を使用して測定した。データを、コントロールのレベルに対する刺激（倍数表示）の平均値として表した。
【０１１５】
キナーゼアッセイ：
ＴＨＰ１細胞を、Ｔ１７５フラスコ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社）中に２×１０５細胞／ｍＬで播種し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、３０ｍＬの細胞懸濁液を、１時間、５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社）中でＬＰＳの有無により処理した。細胞を遠心分離によって回収し、一度ＰＢＳで洗浄し、１０分間、１ｍＬのバッファ（１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、５０ｍＭのＮａＦ、２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭのＥＤＴＡ、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１％のＮＰ−４０、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０μｇ／ｍＬロイペプチン、１ｍＭのＮａ３ＶＯ４）中で溶解させた。細胞残渣を１３，０００回転／分で１０分間遠心分離し、上澄みをキナーゼアッセイ用に新規な試験管へ移した。グルタチオンビーズ上の精製されたＧＳＴ−ＴＲＡＭ  ５０μＬをエッペンドルフチューブに添加し、適当量のライゼートをチューブに添加し、４℃で２時間インキュベートした。ビーズを２，０００回転数／分で５分間のスピンダウンし、更にキナーゼバッファ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＡｃ、０．０３％のＴｒｉｔｏｎ、１００μｇ／ｍＬのホスファチジルセリン、２０ｍＭのβ−グリセロールリン酸、０．０１％（ｗ／ｖ）のロイペプチン及び１００μＭのＮａ３ＶＯ４）で３回洗浄した。これらのビーズを更に３０μＬのキナーゼバッファ（２０μＭの冷却したＡＴＰ及び５μＣｉ［γ３２Ｐ］ＡＴＰを含有する）中に再懸濁し、３７℃で３０分間インキュベートした。２０μＬのサンプルバッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、２％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）、０．１％のブロムフェノールブルー（ｗ／ｖ）及び５％のβ−メルカプトエタノール）をチューブに添加し、サンプルを５分間ボイルした。サンプルを更に１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜へ転写した。ニトロセルロース膜はａｕｔｏｒａｄカセット（コダック社製）に設置し、Ｘ線フィルムを上部に設置した。−８０℃で一晩静置し、更にフィルムを感光させた。
【０１１６】
膜分画：
ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４細胞を１×１０５細胞／ｍＬで播種し一晩インキュベートし、更に適当なプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を「結果」のセクションの方法に従い処理し、更に３００μＬの膜バッファ（２０ｍＭのトリス（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＥＤＴＡ、２５０μＭのスクロース、２００μＭのＰＭＳＦ）中にスクラップした。細胞をｄｏｕｎｃｅホモジェナイザを用いて３０ストロークで溶解させ、４℃で１時間、１００，０００回転／分でｈａｒｄｗａｌｌ  Ｂｅｃｋｍａｎチューブで遠心分離した。上澄（すなわちサイトソル画分）を新規なチューブへ移し、ペレット（すなわち膜画分）を５０μＬのサンプルバッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、２％のＳＤＳ（ｗ／ｖ）、０．１％のブロムフェノールブルー（ｗ／ｖ）及び５％のβ−メルカプトエタノール）中に再懸濁した。サイトソル画分を、ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  ＹＭ−１０（ミリポア社製）を使用して５０μＬまで濃縮した。サンプルを１２％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した。
【０１１７】
リン酸化特異的なＴＲＡＭ抗体の産生：
Ｆａｂｇｅｎｎｉｘ（テキサス、米国）社に、アミノ酸１６でセリンをホスホセリンで置換した、ＴＲＡＭ（ＫＩＮＳＣＰＬＳＬＳＷＧＫＲＨ）のアミノ酸７〜２１に対応する合成ペプチドを使用して、セリン１６でリン酸化されたＴＲＡＭを認識するリン酸化特異的な抗体の作製、精製を委託した。抗体の有効性は、リン酸化ＴＲＡＭの予測されるバンドがＴＲＡＭ欠損ＭＥＦｓ（データ示さない）から調製したサンプルでは存在しないことをもって確認した。
【０１１８】
ＲＡＮＴＥＳ  ＥＬＩＳＡ
示された細胞を２４穴プレート中に１×１０５細胞／ｍＬで前夜に播種し、更に適当なプラスミドによってトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を２４時間、適当な刺激で処理した。５倍希釈した上澄みをサンプルとして使用し、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社のマウスＲＡＮＴＥＳキットを用い、製造業者の指示に従いＲＡＮＴＥＳ  ＥＬＩＳＡを実施した。
【０１１９】
ＩＲＦ３二量体化アッセイ
適当な細胞を、２×１０５細胞／ｍＬで播種し、一晩インキュベートし、更に適当な刺激で処理した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μＬ非還元サンプルバッファ（５０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）、０．１％のブロムフェノールブルー（ｗ／ｖ）及び５％のβ−メルカプトエタノール）中にスクラップした。このうち２０μＬを非還元ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜に転写し、ＩＲＦ３に関してブロッティングした。
【０１２０】
結果ＴＲＡＭ遺伝子のクローン化及び変異体の生成：
ＴＲＡＭのｃＤＮＡ配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ（Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０２１６４９）から検索した。ＴＲＡＭの５’及び３’末端に対する特異的なプライマー（図１ａ）を用い、脾臓由来のｍＲＮＡを使用して、ＴＲＡＭのｃＤＮＡを増幅した（図１ｂ）。このｃＤＮＡをｐＧＥＸ−ｋｇベクターにクローニングし、細菌内でＧＳＴ−ＴＲＡＭ融合タンパク質を発現させた。哺乳類の発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１にもクローニングした。ＴＲＡＭの変異体を生成するため、部位特異的変異導入を行った。位置６、１０、１４及び１６（４Ｓｅｒ変異体と呼ばれる）でセリンが変異するようにプライマーを設計した（図１ｃ）。セリン１６のみを変異（Ｓｅｒ１６変異体と呼ばれる）させるプライマーも設計した。
【０１２１】
ＬＰＳ刺激によるＴＲＡＭのリン酸化：
ＴＲＡＭをミリストイル化し、細胞を静置し、膜に移動させた（未発表データ）。幾つかのミリストイル化タンパク質を静電的なスイッチに供し、それをリン酸化することにより膜から反発される。すなわち、ＴＲＡＭがリン酸化されたか否かが判定できるようにアッセイが設定されている。グルタチオンビーズ上の精製されたＧＳＴ−ＴＲＡＭを、ＴＨＰ１細胞（ＬＰＳの有無により処理）から調製したライゼートと２時間インキュベートした。更にサンプルを遠心分離し、相互作用した全てのタンパク質と共に、グルタチオンビーズ上のＧＳＴ−ＴＲＡＭをプルダウンした。更に［γ３２Ｐ］ＡＴＰで３０分間ビーズをインキュベートしてキナーゼアッセイを実施した。更にサンプルを１０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ニトロセルロース膜上に転写し、Ｘ線フィルムを使用して取り込まれた放射能を測定した。その結果、実際にＴＲＡＭがリン酸化され、すなわちこのリン酸化がＬＰＳ依存的であることを示した（図２ａ）。細胞が他の刺激（例えばＰｏｌｙＩ：Ｃ）で処理されたときは、このリン酸化は起こらなかった（図２ｂ）。
【０１２２】
Ｎ末端に最も近い４つのセリンを同定した。その後これらの４つのセリンを変異させた。この変異により、ＬＰＳ依存性のリン酸化が見られなくなった（図２ｃ）。
【０１２３】
ＴＲＡＭのリン酸化
プロテインキナーゼＣはミリストイル化されたタンパク質（ＭＡＲＣＫＳ）をリン酸化することを示したので、ＴＲＡＭがＰＫＣによってリン酸化されるか否かの試験のため、ｐａｎＰＫＣ阻害剤のビスインドリルマレイミド（ビス）を使用した。上記のように、ＧＳＴ−ＴＲＡＭをＬＰＳによって処置したＴＨＰ１細胞から調製したライゼートとインキュベートし、グルタチオンビーズを使用してプルダウンした。ビスの量を増加させてビーズに添加し、１時間インキュベートし、更に上記のようにキナーゼアッセイを実施した。ビスによりＴＲＡＭのＬＰＳ依存性のリン酸化が阻害された（図２ｃ）。これは、ＰＫＣキナーゼファミリーのメンバーがＬＰＳに応答するＴＲＡＭのリン酸化の原因となることを強く示唆するものである。
【０１２４】
ＴＨＰ１ライゼートの免疫減少を、プロテインＧビーズ（シグマ社）に結合させたＰＫＣε特異抗体（サンタクルス社）とライゼートとをインキュベートすることによって実施した。特異性をチェックするコントロールとしてＰＫＣζ抗体を用いた。抗体を遠心分離して除去し、ライゼートからＰＫＣε又はＰＫＣζを除去した。コントロールＩｇＧ抗体も使用した。これらのライゼートを更に上記と同様にＧＳＴ−ＴＲＡＭでインキュベートし、キナーゼアッセイを実施した。図２ｅは、ライゼートからのＰＫＣεの除去によりＴＲＡＭのリン酸化が行われなくなることを示す。これは、ＰＫＣεがＬＰＳに応答してＴＲＡＭをリン酸化することを示唆する。ＰＫＣζの除去はＴＲＡＭのリン酸化に影響を及ぼさず、ＰＫＣζがＴＲＡＭをリン酸化しないことを示唆する。この理論は、組換えＰＫＣε（ｒｅＰＫＣε）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社）がＧＳＴ−ＴＲＡＭをリン酸化したという事実（図２ｇ）、並びにＰＫＣε欠損ＭＥＦｓから調製したライゼートではＧＳＴ−ＴＲＡＭをリン酸化できないという事実（図２ｆ）によって更に裏付けられた。組換えＰＫＣζはＴＲＡＭをリン酸化せず、重ねて特異性を示唆するものであった（図２ｇ）。セリン１６はＰＫＣεリン酸化の候補であるため、アラニンにセリン１６を変異させたところ、ＴＲＡＭのＬＰＳ依存性のリン酸化が幾分損なわれることが明らかとなった（図３ａ）。
【０１２５】
位置１６のセリンがマウスにおいて保存されている４つのセリンのうち唯一のものであるため、このセリンを変異させた。その結果、ＴＲＡＭのＬＰＳ依存性のリン酸化が幾分損なわれた（図３ａ）。
【０１２６】
ＴＲＡＭのこのリン酸化が適切な機能にとり必須か否かを試験するため、位置１６のセリンをアラニンに変異させ、この変異体におけるＮＦ−κＢ及びＩＲＦ３経路を機能させる能力を解析した。ＷＴ−ＴＲＡＭ又はＳｅｒ１６−ＴＲＡＭを、ＮＦ−κＢ又はＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子と共にＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。前述のように、ＴＲＡＭはＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥルシフェラーゼを機能させることができる。しかしながら、セリン１６が変異した場合、ＴＲＡＭはいずれの経路も活性化できなくなった（図３ｂ）。
【０１２７】
セリン１６の変異はまた、ＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥ経路を刺激するＬＰＳの能力を低下させた（図３ｃ）。この変異体は、これらの経路上でドミナントネガティブとして作用することが明らかとなった。ＰＫＣによるＴＲＡＭのリン酸化が適正な機能にとり重要であるという更なる証拠として、ＰＫＣ阻害剤（ビスインドリルマレイミド）がＮＦ−κＢ経路を活性化させるＴＲＡＭの能力を阻害するが、ＭｙＤ８８に影響を及ぼさないという事実（図３ｄ）が挙げられる。この証拠は、セリン１６が適切に機能するためには、ＰＫＣεによってＴＲＡＭがリン酸化されることが必要であることを示唆する。
【０１２８】
セリン１６残基のリン酸化がＴＲＡＭの膜からの移動にとり十分であることを確認するため、セリン１６残基をグルタミン酸に変異させた。得られる変異体（ｓｅｒ１６Ｇｌｕ）は明確なグリコシル化コントロールとして機能し、すなわちグルタミン酸残基がグリコシル化された状態であるとき、セリン残基を模倣した。この変異により膜に存在するＴＲＡＭの量の重要な減少を引き起こし、セリン１６上のＴＲＡＭのリン酸化が膜からのＴＲＡＭの減少を引き起こすことを示唆している（図８ａ、レーン３と１を比較）。
【０１２９】
ＬＰＳで処理したＴＨＰ１細胞の内因性のＴＲＡＭの減少も検出した（図８ｂ）。最後に、ＰＫＣε−／−ＭＥＦｓＦＬＡＧ−ＴＲＡＭは、ＬＰＳ刺激によっても膜から消失しなかった（図８ｃ）。この試験結果は、ＰＫＣεによるセリン１６上のＴＲＡＭのリン酸化が、ＴＲＡＭの膜からの消失に必要であることを示唆する。
【０１３０】
内因性のＴＲＡＭは、セリン１６にリン酸化される
ホスホセリン抗体を使用して、過剰発現するＴＲＡＭのリン酸化の試験を行った。ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４細胞をＦＬＡＧ−ＴＲＡＭでトランスフェクションし、ＬＰＳによって刺激した。ＦＬＡＧ−ＴＲＡＭを細胞から免疫沈降させ、ライゼートを抗ホスホセリン抗体でブロッティングした。図４ａから解るように、３０分間のＬＰＳで処理した細胞において、ＴＲＡＭのセリンリン酸化の増加が示された。
【０１３１】
内因性のＴＲＡＭがＰＫＣεによってセリン１６にリン酸化されるかどうかを立証するために、アミノ酸１６でセリンをホスホセリンに置換したＴＲＡＭのアミノ酸７〜２１の配列を有する合成ペプチドを用い、抗体を作製した。
【０１３２】
ＬＰＳで処理したＴＨＰ１細胞から調製したライゼートをイムノブロットした結果、１５分後にセリン１６上のＴＲＡＭリン酸化が観察され、４５分でピークに達することが示された（図４ｂ、レーン１〜６）。ＬＰＳによる刺激の１時間前に、ＰＫＣ阻害剤のビスでこれらの細胞をインキュベーションした結果、ＴＲＡＭのリン酸化が妨げられた（図４ｂ、レーン７〜１２）。１５分間及び３０分間ＬＰＳで処理した、ＰＫＣεによって再構成されたＰＫＣε−／−ＭＥＦｓ細胞からのライゼートのイムノブロットの結果、ＴＲＡＭの正しい分子量のバンドが確認された（図４ｃ、上部パネル、レーン９及び１０）。効果が４５分（レーン１１）で減衰し、６０分（レーン１２）に不明確となったことから、リン酸化はこの細胞タイプの場合ＴＨＰ１細胞よりも初期に生じることが解った。ライゼート中の全ＴＲＡＭのレベルは、実験期間中一定であった（図４ｃ、第二パネル）。重要なことに、バンドはＰＫＣε−／−ＭＥＦｓから調製したライゼートにおいて検出されず（図４ｃ、上部パネル、レーン１〜６）、ＴＲＡＭ欠損細胞ではバンドは検出されなかった（示されないデータ）ことから、抗体の特異性が証明された。最後に、ＴＬＲ２リガンドであるＭＡＬＰ２又はＴＬＲ３リガンドであるポリＩ：ＣによるＰＫＣεを発現するＭＥＦｓ細胞の３０分間の処理では効果が表れなかった（図４ｄ）。
【０１３３】
ＴＲＡＭ及びＰＫＣε両方は、ＬＰＳシグナル伝達の遂行にとって不可欠である
更にＰＫＣε−／−ＭＥＦｓのＴＲＡＭ依存性のシグナル伝達を試験した。ＴＲＡＭ−／−ＭＥＦｓ及びＰＫＣε−／−ＭＥＦｓにおける、ＬＰＳで処理した細胞のｐ３８のリン酸化は、それらの対応する野生型ＭＥＦｓと比較して著しく減少していた（図５ａ上部パネル、レーン９〜１１とレーン３〜５を比較）。重要なことに、ＰＫＣε−／−ＭＥＦｓ又はＴＲＡＭ−／−ＭＥＦｓでは、ポリＩ：Ｃに応答したｐ３８のリン酸化の減少が見られなかった（図５ａ、パネル３、右側と左側を比較）。ＬＰＳによるＩＲＦ３の活性化を、その二量体化を指標として試験した。ＬＰＳによって誘導されるＩＲＦ３の二量体化は、ＰＫＣεを発現しているＭＥＦｓと比較し、ＰＫＣε−／−ＭＥＦ細胞では減少していた（図５ｂ、レーン２及び３をレーン４及び５と比較）。ポリＩ：Ｃに応答したＰＫＣε−／−ＭＥＦのＩＲＦ３二量体化の減少が見られなかった（図５ｃ、レーン２及び３をレーン４及び５と比較）。Ｙａｍａｍｏｔｏらが示すように、ＴＲＡＭ欠損ＭＥＦｓにおいて、この反応はＬＰＳ（ポリＩ：Ｃでない）への応答に関して損なわれていた。ＩＲＦ３と連結されたレポーター遺伝子の活性化を試験した結果、ＬＰＳ処理されたＰＫＣε−／−ＭＥＦｓでは損なわれたが、ポリＩ：Ｃを処置されたＰＫＣε−／−ＭＥＦｓでは正常だった（図５ｃ、右パネル）。同様の結果がＴＲＡＭ欠損ＭＥＦｓにおいても得られた。更にＴＲＡＭ経路の開始としてのＲＡＮＴＥＳの誘導を評価した。ＴＲＡＭ−／−ＭＥＦｓにおいては、ＬＰＳ刺激に応答して生じたＲＡＮＴＥＳのレベルが、対応する野生型ＭＥＦｓと比較して激減した（図５ｄ、左パネル）。ポリＩ：Ｃに応答するＲＡＮＴＥＳ産生のレベルは、影響を受けなかった（図５ｄ、右パネル）。重要なことに、この反応はＰＫＣε−／−細胞においても損なわれた。図５ｅ（左パネル）に示すように、ＬＰＳによるＲＡＮＴＥＳの誘導は、ＰＫＣε発現細胞と比較して損なわれた。両方の細胞タイプを比較したが、ポリＩ：Ｃへの反応の違いは見られなかった（図５ｅ、右パネル）。
【０１３４】
ＲＡＮＴＥＳの産生がＴＲＡＭのシグナリング経路と関連するマーカーであるため、ＰＫＣε−／−細胞及びＴＲＡＭ−／−ＭＥＦｓ細胞におけるその産生の喪失は更に、ＴＲＡＭがプロテインキナーゼＣイプシロンによってリン酸化されなければならず、このリン酸化がその機能にとって重要であるという考察を更に支持するものである。
【０１３５】
ＴＲＡＭＳ１６Ａは、ＴＲＡＭ欠損細胞のシグナル伝達を完全に再構成できない
ＰＫＣε−／−細胞のＬＰＳ処理に続くＴＲＡＭ依存性の反応の顕著な喪失、及びポリＩ：Ｃで処理された細胞においては同じ反応が損なわれなかったことは、ＴＲＡＭＳ１６Ａによる損なわれたシグナル伝達と組み合わせて考察すると、ＰＫＣεによるＴＲＡＭのリン酸化が、ＴＲＡＭの機能において不可欠であることを強く示唆した。更なる証拠を提供するために、ＴＲＡＭ欠損ＭＥＦｓ細胞のシグナル伝達を再構成するＴＲＡＭＳ１６Ａの能力を検討した。ＬＰＳを有する野生型ＭＥＦｓの処理によりＲＡＮＴＥＳ産生が誘導されたが、一方ではＬＰＳによるＴＲＡＭ−／−ＭＥＦｓの処理によってはＲＡＮＴＥＳ産生がほとんど誘導されなかった（図６ａ）。ＴＲＡＭ欠損細胞での反応は、野生型ＴＲＡＭで再構成することができた。重要なことに、ＴＲＡＭＳ１６Ａはシグナリングを再構成する能力が低かったが、同様に、ＬＰＳ刺激によるＴＲＡＭ欠損細胞でのｐ３８のリン酸化が、ＷＴ−ＴＲＡＭの過剰発現によって再構成された。ＴＲＡＭＳ１６Ａは、このシグナルを再構成することができなかった（図６ｂ）。したがって、プロテインキナーゼＣイプシロンによるセリン１６のリン酸化が、ＬＰＳ刺激によるＴＲＡＭの通常の機能にとり必要であると結論付けることができる。
【０１３６】
ＬＰＳ刺激により、膜のＴＲＡＭのレベルは減少する
ＴＲＡＭのミリストイル化により膜局在が促進される。特定のミリストイル化されたタンパク質がリン酸化により膜から解離することが知られている。ＰＫＣεによるＴＲＡＭのリン酸化によってＴＲＡＭの再分布が生じるか否かを更に試験した。
【０１３７】
ＦＬＡＧ−ＴＲＡＭ／ｐｃＤＮＡ３．１をＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４細胞にトランスフェクションし、これらの細胞を更に３０分間、ＬＰＳの有無により刺激した。細胞を膜画分及びサイトソル画分に分離した。膜画分に存在するＴＲＡＭの量はＬＰＳ刺激により減少し、すなわちＴＲＡＭが膜から消失することを示唆する（図７ａ、上部パネル、レーン１とレーン３を比較）。ＴＲＡＭはサイトソル画分では検出できなかった。これは分解によるものではない。なぜなら、細胞可溶化物中のＴＲＡＭのレベルは一定だからである（図７ａ、第三パネル）。膜からのＴＲＡＭの減少はＰＫＣε依存性であった。その理由は、ＬＰＳ刺激の１時間前にＰＫＣ阻害剤のビスを添加することにより、ＬＰＳ刺激の後でも膜へのＦＬＡＧ−ＴＲＡＭへの残留が見られたからである（図７ａ、レーン７）。ＴＲＡＭＳ１６Ａの減少を観察した場合、膜からの消失は観察されなかった（図７ａ、第二パネル）。ＬＰＳで処理したＴＨＰ１細胞の内因性のＴＲＡＭの減少も検出した（図７ｂ）。最後に、ＰＫＣε−／−ＭＥＦｓでは、ＦＬＡＧ−ＴＲＡＭはＬＰＳ刺激によっても膜から消失しなかった（図７ｃ）。この実験結果は、ＰＫＣεによるセリン１６上のＴＲＡＭのリン酸化が、ＴＲＡＭの膜からの消失に必要であることを示唆するものである。
【０１３８】
（本発明の要約）
ＴＲＡＭは、ＴＬＲ４及びＴｒｉｆ間の架橋アダプタとして作用し、ＬＰＳによって活性化するシグナリングカスケードにおいて不可欠な役割を果たす。ＴＲＡＭはミリストイル化され、それにより形質膜と相互作用する。ＴＲＡＭはまたリン酸化される。
【０１３９】
ＬＰＳに応答してＴＲＡＭはリン酸化され、それはここで記載したキナーゼアッセイを使用してインヴィトロで測定されうる。このリン酸化はＴＲＡＭの通常の機能に不可欠で、静電的なスイッチングに関与し、ＴＲＡＭを膜から移動させる。
【０１４０】
本明細書において言及される全ての文書は、参照によって本願明細書に援用される。本明細書に記載されている実施態様に対する本発明の範囲内における様々な修正や変更は、当業者にとって自明である。本発明を具体的な好ましい実施態様に関して記載したが、本発明の特許請求の範囲は、かかる具体的な実施例にのみ限定されるべきではない。本発明の実施に係る、実際に記載されている様式に対する様々な改良は当業者にとって自明であり、本発明に包含されている。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１ａ】ＴＲＡＭのクローニングに使用した、ＴＲＡＭの５’及び３’末端を標的とするプライマー。
【図１ｂ】得られるＰＣＲ生成物を幾つかのベクターにクローニングした。
【図１ｃ】特異的なプライマーを使用して、ＴＲＡＭの最初の４つのセリンをアラニンに変異させ、並びに１６番目のセリンのみをアラニンに変異させるため、部位特異的突然変異導入を実施した。
【図２ａ】ＧＳＴ−ＴＲＡＭは、ＬＰＳで処置されたＴＨＰ１のライゼートとの所定時間のインキュベーションによりリン酸化される。
【図２ｂ】細胞をポリＩ：Ｃで処理した場合、かかるＴＲＡＭのリン酸化は行われない。
【図２ｃ】ＴＲＡＭの最初の４つのセリンをアラニンに変異させた場合、このＬＰＳ依存性のリン酸化は行われない。
【図２ｄ】ＬＰＳで３０分間処理したＴＨＰ１細胞から調製したライゼートとのＧＳＴ−ＴＲＡＭプルダウンに続いて、サンプルを１時間ｐａｎＰＫＣ阻害剤（ビスインドールマレイミド（ビス））の量を増加させつつインキュベートした。その結果、ＴＲＡＭのリン酸化の減少が見られた。
【図２ｅ】ＧＳＴ−ＴＲＡＭとのインキュベーションの前にＰＫＣε抗体、ＰＫＣζ抗体又は免疫グロブリンＧコントロール抗体を使用して、ＴＨＰ１ライゼートの免疫減少を実施した。ライゼートからＰＫＣεの除去により、ＴＲＡＭのＬＰＳ依存性のリン酸化が妨げられた。
【図２ｆ】ＰＫＣεを欠損するＭＥＦｓから調製したライゼートはＧＳＴ−ＴＲＡＭをリン酸化が行われず、一方、ＰＫＣεで再構成したＭＥＦｓではリン酸化が行われた。
【図２ｇ】組換えＰＫＣε（ｒｅＰＫＣε）又はＰＫＣζ（ｒｅＰＫＣζ）をＧＳＴ−ＴＲＡＭと１５分間直接インキュベートし、その後キナーゼアッセイを実施した。ｒｅＰＫＣεはＷＴ−ＴＲＡＭでリン酸化されたが、Ｍａｌではされなかった。
【図３ａ】セリン１６の位置をアラニンに変異させたとき、ＧＳＴ−ＴＲＡＭはＴＨＰ１ライゼートとのインキュベーションによりもはやリン酸化され得ない。
【図３ｂ】ｐｃＤＮＡ３．１のみ（ｅＶ）、ＷＴ−ＴＲＡＭ／ｐｃＤＮＡ３．１及びＳｅｒ１６−ＴＲＡＭ／ｐｃＤＮＡ３．１の全てを、９６穴プレートに播種したＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。ＮＦ−κＢ又はＩＳＲＥ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子、並びにＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部コントロールプラスミドを同様にトランスフェクションした。２４時間後、リポータ遺伝子活性を測定し、データはコントロールのレベルに対する刺激（倍数表示）の平均値として表す。グラフは、ＷＴ−ＴＲＡＭはＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥ経路を活性化できず、一方Ｓｅｒ１６−ＴＲＡＭ変異体がどちらの経路も活性化できることを示す。
【図３ｃ】同様の実験をＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４細胞において実施し、トランスフェクション後２４時間において、細胞を６時間、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）の有無においてインキュベートした。試験の結果、ＷＴ−ＴＲＡＭがＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥを活性化させるＬＰＳの能力を増加させ、一方Ｓｅｒ１６−ＴＲＡＭ変異体がドミナントネガティブとして作用してＮＦ−κＢ及びＩＳＲＥを刺激するＬＰＳの能力を減少させることを示す。
【図３ｄ】ＨＥＫ２９３細胞を、ｐｃＤＮＡ３．１、ＭｙＤ８８／ｐｃＤＮＡ３．１又はＷＴ−ＴＲＡＭ／ｐｃＤＮＡ３．１、並びにＮＦ−κＢ−ルシフェラーゼレポーター遺伝子及びＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ内部コントロールプラスミドでトランスフェクションする前に、１時間ＰＫＣ阻害剤（ビスインドリルマレイミド（ビス））の有無によりインキュベートした。上記阻害剤はＮＦ−κＢ経路を活性化させるＭｙＤ８８の能力に影響を及ぼさなかったが、この経路を活性化させるＴＲＡＭの能力を阻害した。
【図４ａ】ＴＲＡＭがセリン１６残基にリン酸化されることを示す。ＦＬＡＧタグ付きＴＲＡＭを過剰発現するＨＥＫ２９３−ＴＬＲ４細胞を、３０分間、１μｇ／ｍｌのＬＰＳによって刺激した。ＦＬＡＧタグ付きＴＲＡＭは、抗ＦＬＡＧ抗体を使用して免疫沈降し、ホスホセリン抗体によりブロッティングした。
【図４ｂ】ＴＨＰ１細胞を、ＬＰＳによる刺激前に１時間、ＰＫＣ阻害剤ビスの有無によりインキュベートした。
【図４ｃ】一定時間の１μｇ／ｍｌのＬＰＳによる刺激に続いて、ＰＫＣε−／−ＭＥＦｓ、並びにＰＫＣεによって再構成されたＰＫＣε−／−ＭＥＦｓの結果を示す。
【図４ｄ】３０分間のＬＰＳ、ポリＩ：Ｃ若しくはＭＡＬＰ２による刺激に続いて、ＰＫＣε−／−ＭＥＦｓ、並びにＰＫＣεによって再構成されたＰＫＣε−／−ＭＥＦｓの結果を示す。
【図５ａ】ＴＲＡＭとＰＫＣεの両方は、ＬＰＳシグナル伝達の遂行にとって重要であることを示す。ＰＫＣε−／−ＭＥＦｓ及びＰＫＣεによって再構成されたＰＫＣε−／−ＭＥＦｓ細胞（上部の４枚のパネル）、又はＴＲＡＭ−／−ＭＥＦｓ及びＷＴ  ＭＥＦｓ細胞（下部の４枚のパネル）を、一定時間１μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は５μｇ／ｍｌのＰｏｌｙＩ：Ｃで刺激し、更にライゼートをリン酸化（チロシン１８０／１８２）及び全ｐ３８に関してイムノブロットした。
【図５ｂ】−ＰＫＣε−／−ＭＥＦｓ及びＰＫＣεによって再構成されたＰＫＣε−／−ＭＥＦｓを、１μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は５μｇ／ｍｌのｐｏｌｙＩ：Ｃで一定時間処理し、非還元ＰＡＧＥゲル電気泳動し、ＩＲＦ３に関してイムノブロットした。
【図５ｃ】ＩＳＲＥルシフェラーゼレポーター遺伝子及びコントロールのＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼレポーター遺伝子を、上記のタイプの細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、細胞を１μｇ／ｍｌのＬＰＳ又は５μｇ／ｍｌのＰｏｌｙＩ：Ｃによって６時間刺激した。データはコントロールのレベルに対するルシフェラーゼ活性の刺激（倍数表示）の平均値として表す。
【図５ｄ】上記の細胞タイプを、ＬＰＳ又はＰｏｌｙＩ：Ｃの所定の濃度によって２４時間刺激し、更にＲＡＮＴＥＳ  ＥＬＩＳＡを実施した。示す結果は、少なくとも３つの実験の代表的なものである。
【図５ｅ】同上。
【図６ａ】ＴＲＡＭＳ１６Ａは、ＴＲＡＭ欠損ＭＥＦｓの再構成がＷＴＴＲＡＭよりも弱かった。ＷＴＴＲＡＭ、ＴＲＡＭＳ１６Ａ及び空のベクターを、ＴＲＡＭ欠損ＭＥＦｓにトランスフェクションした。トランスフェクション後２４時間インキュベートした。細胞を更に２４時間、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）によって刺激し、培養液上清をＲＡＮＴＥＳに関してＥＬＩＳＡ解析した。
【図６ｂ】細胞を３０分間、ＬＰＳ（１μｇ／ｍｌ）によって刺激し、ライゼートをｐ３８に関してウエスタンブロッティング解析した。示す結果は、少なくとも３つの実験の代表的なものである。
【図７】膜に存在するＴＲＡＭの量がＬＰＳ刺激により減少することを示し、ＴＲＡＭが膜から消失したことを示唆するものである。
【図８ａ】セリン１６残基がグルタミン酸に変異した場合の、膜上に存在するＴＲＡＭの量の減少を示し、この突然変異がセリン１６上のＴＲＡＭのリン酸化が膜からのＴＲＡＭの消失を生じさせることを示唆するものである（レーン３と１を比較）。
【図８ｂ】更にＬＰＳで処理されたＴＨＰ１細胞における内因性のＴＲＡＭの減少が検出されることを示唆する。
【図８ｃ】更にＰＫＣε−／−ＭＥＦｓＦＬＡＧ−ＴＲＡＭは、ＬＰＳ刺激によって膜から消失しないことを示唆する。これらの結果は、ＰＫＣεによるセリン１６上のＴＲＡＭのリン酸化が、膜上のＴＲＡＭの減少にとり必要であることを示唆するものである。
【図１】
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【図２】
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【図２】
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【図３】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図３ｄ】
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【図５（ｄ）】
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【図５（ｅ）】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｃ】
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【図２ｄ】
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【図２ｅ】
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【図２ｆ】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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