(57)【要約】繊維状リグノセルロース系原材料からエタノールを製造するための方法。原材料を前処理した後、まず、繊維状の一部を高濃度で加水分解し、つぎに、セルラーゼによる加水分解を継続させると同時に、変性した原材料を発酵混合物中でエタノール発酵させた。利用可能なセルロースの主要な部分がエタノールへ変換されるまで発酵を継続させ、つぎに、可溶化されたヘミセルロースを含む液体を少し発酵混合物中へ添加し、発酵を継続させた。本発明の方法によれば、高い発酵率、高いエタノール濃度、低いエタノール製造コストが達成可能である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
繊維質のリグノセルロース原材料からのエタノールの製造方法であって、
ａ）濃度が高められたセルロースを含む固体のリグノセルロース画分と、可溶化したヘミセルロースを主に含む液体画分とへ、原材料を変換すること、
ｂ）繊維質のリグノセルロース材料を高濃度でセルロース酵素を用いて加水分解し、増加した流動性を有する変性リグノセルロース材料を与えること、
ｃ）変性リグノセルロース材料を同時に、セルラーゼを用いて引き続いて加水分解するとともに、発酵混合物中でエタノール発酵させること、
ｄ）発酵を継続して利用可能な炭水化物の本質的な部分をエタノールへ変換すること、
ｅ）可溶化したヘミセルロースを含む液体画分を発酵混合物へ添加して発酵を継続すること、
ｆ）発酵混合物からエタノールを回収すること
を備えたことを特徴とするエタノールの製造方法。
【請求項２】
段階ａで原材料が蒸気爆発を受けることを特徴とする請求項１記載のエタノールの製造方法。
【請求項３】
段階ｂの加水分解は、４０−９０℃の温度で０．５から２４時間行われることを特徴とする請求項１又は２記載のエタノールの製造方法。
【請求項４】
段階ｂの加水分解は、１０−２５％乾燥質量の濃度で行われることを特徴とする請求項３記載のエタノールの製造方法。
【請求項５】
段階ｂの加水分解は、ｐＨが２から６の範囲内で行われることを特徴とする請求項３又は４記載のエタノールの製造方法。
【請求項６】
段階ｂの加水分解は、第一のセルラーゼ調製とともに行われ、段階ｃの加水分解は、第二のセルロース調製とともに行われ、前記第一と第二のセルラーゼは異なっていることを特徴とする請求項３から５のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項７】
段階ｂで用いられる酵素は、広域型のセルラーゼを有し、３０から９０℃の範囲の温度で活性であることを特徴とする請求項１から６のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項８】
酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータ−グルコシダーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも２つの活性を有していることを特徴とする請求項７記載のエタノールの製造方法。
【請求項９】
段階ｂの加水分解は、段階ｃの加水分解と発酵よりも高い温度で行われることを特徴とする請求項１から８のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項１０】
段階ｃは、３０から７０℃の範囲の温度で行われることを特徴とする請求項１から９のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項１１】
段階ｃで用いられる酵素は、広域型のセルラーゼを有し、３０から９０℃の温度で活性であることを特徴とする請求項１から１０のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項１２】
酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータ−グルコシダーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも２つの活性を有していることを特徴とする請求項１１記載のエタノールの製造方法。
【請求項１３】
段階ｃで用いられる酵素は、段階ｃからｅにおいて存在するリグノセルロース材料を加水分解する能力を有することを特徴とする請求項１１又は１２項記載のエタノールの製造方法。
【請求項１４】
発酵段階は、主要なリグノセルロース由来の糖であるヘキソースとペントースを発酵する能力を有する発酵菌の存在下で行われることを特徴とする請求項１から１３のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項１５】
発酵菌は、３０−７０℃の温度で主要なリグノセルロース由来の糖からエタノールを生成する能力を有することを特徴とする請求項１４記載のエタノールの製造方法。
【請求項１６】
発酵菌は、主要なリグノセルロース由来の糖からエタノールを生成する能力のある酵母であることを特徴とする請求項１４又は１５記載のエタノールの製造方法。
【請求項１７】
発酵は、３０から７０℃の温度で行われ、加水分解は、６から９６時間の反応時間で、この温度で活性な第二の酵素を用いて継続されることを特徴とする請求項１から１６のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項１８】
可溶化したヘミセルロースを含む液体画分は、少なくとも５０質量％の利用可能なヘキソースとペントースが発酵してエタノールになったときに、発酵混合物へ添加されることを特徴とする請求項１から１７のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項１９】
液体画分の濃度は、段階ａの後と段階ｄの前に高められることを特徴とする請求項１８記載のエタノールの製造方法。
【請求項２０】
ヘミセルロース画分は、５−６０％の乾燥質量濃度で添加されることを特徴とする請求項１９記載のエタノールの製造方法。
【請求項２１】
液体画分は、発酵を阻害する可能性のある基質からヘミセルロース画分を解放するための無害化操作が施されることを特徴とする請求項１から２０のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項２２】
阻害物は、揮散、蒸発、イオン排除、樹脂又は活性炭処理法によって除去されることを特徴とする請求項２１記載のエタノールの製造方法。
【請求項２３】
濃縮されたヘミセルロース画分は、１０分から４８時間の期間中に添加され、その期間の後、発酵は、さらに６から７２時間、温度３０−７０℃、ｐＨ４から６において継続されることを特徴とする請求項１８から２２のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項２４】
第一及び第二の酵素は、同じ系統であり、段階ｂからｅに含まれる全体の工程でリグノセルロース材料の効率的な加水分解のために設計されたものであることを特徴とする請求項１から２３のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項２５】
リグノセルロース原材料は、針葉樹材、広葉樹材、専用の作物、農業廃棄物、古紙、林業からの副産物が起源であることを特徴とする請求項１から２４のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項２６】
−繊維質のリグノセルロース材料を１０から４０％乾燥重量の濃度でセルラーゼ酵素を用いて加水分解し、約２０から８０％の炭水化物を加水分解し、ヘキソースとペントースを含む変性リグノセルロース材料を与え、前記材料は増加した流動性を有すること、
−変性リグノセルロース材料を同時に、セルラーゼを用いて引き続いて加水分解するとともに、発酵混合物中でヘキソースとペントースについてエタノール発酵させること、
−少なくとも５０質量％の利用可能なヘキソースとペントースが発酵してエタノールになったときに、可溶化したヘミセルロースを含む液体画分を発酵混合物へ添加し、発酵を継続すること、
−発酵混合物からエタノールを回収すること
を備えたことを特徴とする請求項１から２５のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【請求項２７】
繊維質のリグノセルロース材料は、炭水化物を含むことを特徴とする請求項１から２６のいずれか１項記載のエタノールの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、エタノールの製造方法に関する。特に、本発明は、発酵によって繊維状リグノセルロース系材料をエタノールへ変換する新規な製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
バイオマスの燃料エネルギーへの変換は、化石燃料から得られるエネルギーに取って代わる手段として、大きな注目を浴びている。液体化石燃料（エタノール、メタノール、脂肪酸メチルエステル）のなかで、エタノールは、長い間に証明された歴史と環境上の利点とを有している。それは、種々の原材料から製造可能である。従来、エタノールは、農業生産物に基づくデンプンや糖から生産されてきたが、今日では、関心の的は、別の農業生産物と林業の残留物又は林業からの副産物とに置かれている。エタノール製造の非常に顕著な環境上の利点は、原材料が再生可能な廃棄残留物又は木材から得られるという条件から、二酸化炭素の発生が少ないことである。今日、原材料を含んでいるリグノセルロースから生産されるエタノールのコストは、いくつかの理由で依然として高すぎる。その障壁のなかには、リグノセルロースの変換技術の高コスト、エタノールの低濃度及び収率、低生産速度などがあるが、これらはすべて、デンプン又は糖に基づく原材料から生産されるエタノールと比較して、リグノセルロースからのエタノール生産のコストを増加させる。
【０００３】
木材又は農産物由来のリグノセルロース材料から糖さらにエタノールへの変換は、いくつかの段階（前処理、固体の電気的分離、セルロースの加水分解、セルロースとヘミセルロースからのエタノールの製造とエタノールの蒸留）を含む複雑な処理である。原材料に応じて、異なった種類の前処理技術が必要とされる。前処理段階は、一般に、セルロース部分の加水分解性を向上させるために必要とされる。前処理の目的は、セルロースとヘミセルロースから糖を効率的に製造するために、バイオマス材料を、化学的又は酵素的な加水分解のいずれかについて、より接触可能にすることである。前処理の目標は、ヘミセルロースをセルロースから除去し分離すること、リグニンデンプンを遮断し分離すること、セルロースの結晶化度を低下させること、セルロースの接触可能表面積を増大させること、加水分解剤の浸透を容易にするためにセルロースの孔径を増大させることである（チャンとホルツップル、２０００）。
【０００４】
様々な前処理技術の詳細な説明が入手可能である（例えば、スウら、１９９６によって検討されている）。様々な前処理の選択肢の中で、蒸気爆発（硫酸含浸と二酸化硫黄を用いた）が、最も広範囲に研究されている方法の一つである（チャンドラカントとビサリア、１９９８）。
【０００５】
セルロースの最大消化率は、通常、ヘミセルロースを完全に除去したときと一致する。したがって、効率的な前処理方法において、ほとんどのヘミセルロースは可溶性にされ、主にヘミセルロース由来の糖を含む可溶画分（「ヘミセルロース濾液」と称される）を形成する。前処理に由来する未処理のヘミセルロース濾液は、通常、リグノセルロースの様々な分解産物を含む。これらは、リグニン及び糖の分解生成物である可能性があり、フルフラール、ヒドロキシメチルフルフラール、蟻酸、酢酸を含む。これらの成分のほとんどは、酵素と微生物に対して有害であり、つぎの加水分解と発酵の進行を遅らせる。多くの異なった無害化法が研究されている（ゴングら、１９９９）。石灰を用いた中和、活性炭処理、種々の吸着樹脂が研究されている方法の中にある。ヘミセルロース濾液中の阻害物質は、加水分解と発酵の両方の速度を大幅に減少させることが証明されている。
【０００６】
セルロース部分の加水分解工程は、酸又は酵素のどちらに基づいてもよい。酵素加水分解の主な欠点は、進行が非常に遅く、酵素の費用がいまだに高すぎることである（ケイレンら、２０００）。一般に、加水分解収率は、基質の種類と前処理、酵素の種類と添加量、加水分解時間に依存する。前処理段階に由来する基質中の阻害性化合物の量に起因して、ほとんどの実験は、低い原材料濃度で行われてきた。
【０００７】
セルロース（及びヘミセルロース）をエタノールに変換するために使用可能な本質的に異なる２種類の方法が存在する。それは、加水分解と発酵を個別に行う方法（ＳＨＦ）と、同時糖化発酵（ＳＳＦ）である。後者の方法はまた、同時糖化ヘミセルロース発酵（ＳＳＨＦ）も含むように拡張されており、同時糖化共発酵（ＳＳＣＦ）とも称される。種々のセルロース生物変換スキームの中で、ＳＳＦは、セルロースを生化学的にエタノールへ変換するための最も期待できる方法である。工業的なエタノールの生産は伝統的に酵母によって行われているが、これは周知の活気のある生命体である。新規の菌株（酵母又は細菌のいずれか）は、リグノセルロース原料由来のすべての糖を効果的に活用するために設計されてきた。ヘミセルロース由来のペントースとすべてのヘキソースを含む、すべての糖の活用は、エタノールの経済的な生産のためには不可欠である。
【０００８】
個別の加水分解法（ＳＨＦ）に用いられる加水分解条件は、酵素（５０℃及び４から５の範囲のｐＨにおいて最大の活性を有する、主に真菌のセルラーゼ）の最適条件に従って検討されている。個別の加水分解段階の主な利点は、加水分解が酵素の最適温度で実施され、個別の発酵が酵母の最適温度である約３０℃で実施されることである。主な欠点は、加水分解で放出される糖が、加水分解中のセルラーゼの活性を大幅に阻害することである。これは、用いられる調製物中のベータ−グルコシダーゼの活性を増加させることによって（個別の酵素を添加することによって、又は過剰生産する菌株を用いることによって）、少なくとも部分的に克服可能である。セルラーゼの添加量は、通常、基質（又はセルロース）について１０から２０ＦＰＵ／ｇの範囲であり、ベータ−グルコシダーゼが補充される。通常、生産される糖の濃度は、加水分解における低い乾燥体量に起因して、非常に低い。通常、最終生成物阻害が最小限に抑えられるより希薄な系において、収率（糖からの）はより高くなる。長い反応時間によっても、より高いエタノールの収率と濃度の可能性がもたらされる。
【０００９】
同時糖化発酵法（ＳＳＦ）において、セルラーゼを用いたセルロースのグルコースへの糖化と、その後のグルコース（及びペントース）のエタノールへの発酵は、同じ反応槽中で実施される。現在の工程スキームによると、すべての反応物質（セルロース、酵素、発酵有機体）は、同時に加えられていた。ＳＳＦ法の最も重要な必要条件の一つは、温度（３７℃未満）、ｐＨ、基質濃度を考慮した糖化と発酵の系の両立性である。ＳＳＦによって提供される主な利点は、セルラーゼの活性を阻害する糖が（酵母によって）摂取されることによってセルロース加水分解の速度が上昇することと、無菌状態の必要性が減少することである。欠点は、加水分解と発酵の最適条件が異なることである。すべての材料を使用して、単に濾過するのではなく、発酵のために同時に固体のセルロースとヘミセルロースの両方を濾過することによって、例えば、乳酸の形成が減少するといった利点が示されている（ステンバーグら、２０００）。
【発明の開示】
【００１０】
本発明の目的は、既知の技術の経済性と効率（原材料の活用の点に関して）を改善することと、リグノセルロース材料をエタノールへ変換する新規の方法を提供することである。特に、本発明の目的は、発酵工程の最終エタノール濃度を増加させることと、生成速度と収率を改善することである。
【００１１】
本発明は、高基質濃度において加水分解と発酵を行い、ヘミセルロース濾液の阻害作用を回避することによって、必要とされる酵素の量を減少させ、最終的には、全体のエタノール製造費用を削減するという発想に基づいている。少数の公開された方法の構成（ＮＲＥＬ法など）は、その目標には到達していない。
【００１２】
本発明は、３つの主要な処理段階の組合せに基づいており、すなわち、第一の段階では、前処理されたリグノセルロース材料は、セルロース材料又はリグノセルロース材料がエタノールへ発酵可能な濃度へ高められているが、準備段階の高濃度での加水分解段階の対象とされる。つぎに、本発明の第二の段階の間、発酵と同時に、加水分解が続けられる。そして最後に、原材料の前処理中に分離された、可溶化したヘミセルロースは、−発酵阻害物質の除去後であってもよいが−発酵混合物へ添加され、すべてを含めた基質の発酵が継続され、増加した製品収率を与える。
【００１３】
より詳細には、本発明は主に、請求項１の特徴部分に記述された事項によって特徴づけられる。
【００１４】
改善された加水分解と発酵の技術の本質的特徴からなる本発明は、以下の優位性を備えている。
【００１５】
高い加水分解速度と高い濃度は、前加水分解酵素の最適条件において、高い原材料濃度で加水分解を開始することによって得られる。酵母は、酵素の最終生成物阻害を引き起こす可能性のある糖を消費し、酵母による加水分解された糖からのエタノール生成と同時に、主要な加水分解段階を継続することによって、最終生成物阻害は回避される。
【００１６】
最終生成物阻害の減少とベータ−グルコシダーゼの必要性が低いことに起因して、必要とされる酵素の量は減少する。ヘミセルロース画分の濃縮と任意の無害化は、エタノール生成速度を上昇させ、高い最終的なエタノール濃度をもたらす。後の段階におけるヘミセルロース画分の添加は、酵素と有機生命体のどのような阻害物質による阻害をも減少させる。阻害作用の最小化と原材料（炭水化物）の濃度の増加は、より高い発酵速度、より高い最終エタノール濃度、より低いエタノール生産費用をもたらす。
【００１７】
以下、添付した図面を参照しながら本発明についてより詳細に説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】リグノセルロースをエタノールへ変換するための本発明による新規の三段階製造法の配置を図式的に示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
炭水化物を含む、繊維質のリグノセルロース原材料から、エタノールを製造するための全体的な方法は、通常、以下の段階を含む。
−酵素の最適温度における高濃度、通常は１０％乾燥質量以上での酵素前加水分解。酵素の組成は特に前加水分解のために設計されてもよく、又は、前加水分解の間において主要な加水分解段階の場合と同じであってもよい。
−第二の同時の発酵菌に適した温度における酵素の主要な加水分解とヘキソース糖の発酵。
−ヘキソース糖の大部分を発酵させた後の、濃縮され任意に無害化されたヘミセルロース画分の添加。この手順はまた、無害化されていないヘミセルロース濾液の使用を許容する。
【００２０】
特に、その方法は、
ａ）濃度が高められたセルロースを含む固体のリグノセルロース画分と、可溶化したヘミセルロースを主に含む液体画分とへ、原材料を変換すること、
ｂ）繊維質のリグノセルロース材料を高濃度でセルロース酵素を用いて加水分解し、増加した流動性を有する変性リグノセルロース材料を与えること（このことは、例えば、混和性やポンプ送液性を改善する）、
ｃ）変性リグノセルロース材料を同時に、セルラーゼを用いて引き続いて加水分解するとともに、発酵混合物中でエタノール発酵させること、
ｄ）発酵を継続して利用可能な炭水化物の本質的な部分をエタノールへ変換すること、
ｅ）可溶化したヘミセルロースを含む液体画分を発酵混合物へ添加して発酵を継続すること、
ｆ）発酵混合物からエタノールを回収すること
を備えている。
【００２１】
この方法において、原材料として、任意のリグノセルロース材料、通常は、かなりの量のセルロースとヘミセルロースを含む、繊維質のリグノセルロース材料を、単糖、ヘキソース、ペントースへの炭水化物材料の加水分解を前提とするエタノール発酵に用いることができる。
【００２２】
通常は、原材料は針葉樹材と広葉樹材の残留物、専用の作物、農業廃棄物、古紙、林業からの副産物から選択される。
【００２３】
ここで図面を参照すると、以下の参照数字は種々の製造段階を示すために用いられていることが分かる。
１  前処理
２  濾過及び洗浄
３  前加水分解
４  加水分解及びヘキソース発酵
５  濃縮
６  無害化
７  加水分解及びヘミセルロース発酵
８  蒸留
これらの段階を以下に説明する。
【００２４】
１  原材料の前処理
ヘミセルロースをリグノセルロースの繊維質の基質から解放する目的で、蒸気爆発などの前処理方法を用いて、原材料を前処理する。一つの技術として、蒸気爆発は、例えばサッドラーら（１９９３）によりさらに詳細に説明されており、前処理のための装置と方法は、パームクビストら（１９９６）によって説明されている。（Saddler, J, Ramos, L and Breuil, C (1993) Steam pre-treatment of lignocellulosic residues. In: Bioconversion of Forest and Agricultural plant Residues. Saddler, J.N. (ed.) CAB International, Wallingford, UK, Chapter 3, 73-92; Palmqvist, E, Hahn-Hagerdal, B, Galbe, M, Larsson, M, Stenberg, K, Szengyel, Z, Tengborg, C and Zacchi, G. 1996 Design and operation of a bench-scale process development unit for the production of ethanol from lignocellulosics. BioresourceTechnology 58:171-179）
原材料は、木材（針葉樹材、広葉樹材、又はこれらの混合物）などのリグノセルロース材料、多年生植物又は一年生植物などの農産物由来のリグノセルロース材料からなる。
【００２５】
２  濾過及び洗浄
つぎの段階において、スラリーは濾過、洗浄にかけられる。ヘミセルロースのかなりの部分（全原料の約３質量％から３０質量％）は液相（水相）に溶解しているので、上に述べたようにして得られた繊維質の材料は、原材料と比較して、セルロースの濃度が増加している。その目的は、原材料中に存在するヘミセルロースのかなりの部分、少なくとも４０質量％、特に少なくとも５０質量％を分離することと、それらを主として単量体又はオリゴマーの形で液相へ取り入れることである。通常、液体分画中のヘミセルロース／糖類の量は、繊維質の材料よりも、少なくとも２倍多く、好ましくは２．５から１５倍多い（質量換算）。
【００２６】
主にセルロースを含む固体画分の分離と洗浄のために、例えば、圧搾濾過又はその他の従来の分離法を用いて、濾過が行われる。分離は、高い固体含有量の濾過ケーキ（高温で）と、可溶化したヘミセルロースだけでなく阻害化合物をも含む液体画分をもたらす。
【００２７】
３  前加水分解（上記の段階ｂ）
加水分解の段階ｂは、３０−９０℃、又は４０−９０℃の温度で、０．５−２４時間、通常は約１から１２時間行われる。濃度は高く、一般に５から４０％乾燥質量、好ましくは１０−２５％乾燥質量、又は１０−４０％乾燥質量である。加水分解は、弱酸性、好ましくはｐＨが２から６の範囲内で行われる。
【００２８】
以下でより詳細に説明するように、段階ｂの加水分解は、第一のセルラーゼ調製とともに行われ、段階ｃの加水分解（図１の参照数字５）は、第二のセルロース調製とともに行われ、セルラーゼはどちらも同じ又は、好ましくは、異なっている。異なるセルラーゼを用いることによって、様々な働きのために最適化された酵素を用いることが可能になる。したがって、第一の酵素は、高濃度における処理性（混合やポンプ送液など、一般に「流動性」）を改善し、粘性を減少させ、発酵性の糖を生成し、段階ｂにおいて３０−９０℃の温度で活性であるように、特別に最適化可能である。前加水分解の間、少なくともいくらかのセルロースとその他の炭水化物は、糖（ヘキソースやペントースなどの単糖）へ加水分解される。一般に少なくとも５％、好ましくは約１０％−９０％、特に約２０−８０％の炭水化物は、この段階で加水分解されて発酵性の単糖を生成する。以下の実施例は、加水分解度が約２０−７０％であった。
【００２９】
好ましくは、段階ｂで用いられる酵素は、広域型のセルラーゼを有している。特に、酵素は、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータ−グルコシダーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも２つの活性を有している（以下の酵素のより詳細な説明を参照）。
【００３０】
４  加水分解及びヘキソース発酵
同時加水分解発酵の段階（段階ｃ）は、好ましくは、３０から７０℃の範囲の温度で行われる（段階ｂの加水分解は、好ましくは段階ｃの加水分解と発酵よりも高い温度で行われる）。加水分解は、６から９６時間の反応時間で、この温度で活性な第二の酵素を用いて行われる。
【００３１】
段階ｃで用いられる酵素は、広域型のセルラーゼを有し、３０から９０℃の温度で活性である。酵素は、好ましくは、セロビオヒドロラーゼ活性、エンドグルカナーゼ活性、ベータ−グルコシダーゼ活性、ヘミセルラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも２つの活性を有している。これは、段階ｃからｅにおける残留したリグノセルロース材料の加水分解を行うために特別に最適化されている。
【００３２】
２つの酵素は、好ましくは同じ系統であり、段階ｂからｅに含まれる全体の工程でリグノセルロース材料の効率的な加水分解のために設計されたものである。
【００３３】
酵素のさらに完全な説明は以下のとおりである。
【００３４】
加水分解の間、セルロース材料とリグノセルロース材料の残留したセルロース部分とその他の炭水化物部分は、糖へ変換される。
【００３５】
発酵段階は、主要なリグノセルロース由来の炭水化物（糖）、すなわち、ヘキソース、ペントースなどの単糖を発酵する能力を有する発酵菌の存在下で行われる。発酵菌は、３０−７０℃の温度で主要なリグノセルロース由来の糖からエタノールを生成する能力を有する。
【００３６】
適切な菌の例は以下のとおりである。
【００３７】
酵母
サッカロミセスセレビシェ（Saccharomyces cerevisiae）、ＶＴＴ株Ｂ−０３３３９などの遺伝子組み換え生物（ＧＭＯ）を含む
ピキア・スチピチス（Pichia stipitus）
キャンディダ・シェハーテ（Candida shehatae）
ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）
パキソレン・タンノフィラス（Pachysolen tannophilus）
ブレッタノミセス・ナールデネンシス（Brettanomyces naardenensis）
ピキア・セゴビエンシス（Pichia segobiensis）
ピキア・グイレルモンディ（P. guillermondii）
ピキア・ナガニシ（P. naganishii）
キャンディダ・テナス（Candida tenuis）
キャンディダ・アルビカンス（C. albicans）
キャンディダ・トロピカリス（C. tropicalis）
キャンディダ・マルトサ（C. maltosa）
キャンディダ・トレシ（C. torresii）
メツキニコウィア・ビクスピダタ（Metschnikowia bicuspidata）
メツキニコウィア・ゾベリ（Metschnikowia zobellii）
スポロパキデルミア・クエルクーム（Sporopachydermia quercuum）
ウィンゲア・ロベルトシ（Wingea robertsii）
細菌
ザイモモナス・モビリス（Zymomonas mobilis）
エスケリキア・コリ（E. coli）(ＧＭＯ−カンタ／カントジャ（kanta/kantoja）)
クレブシエラ・オキシトカ（Klebsiella oxytoca）（ＧＭＯ−カンタ（kanta））
菌類
フザリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）
キャンディダ・グイレルモンディ（Candida guillermondii）
キャンディダ・ミレリ（C. millerii）
キャンディダ・トロピカリス（C. tropicalis）
キャンディダ・パラプシロシス（C. parapsilosis）
ペトロミセス・アルベルテンシス（Petromyces albertensis）
デバロミセス・ハンセニ（Debaromyces hansenii）
セルロモナス・セルランス（Cellulomonas cellulans）
コリネバクテリウム属（Corynebacteriumusp.）
セラチア・マルセッセンス（Serratia marcescens）
特に、発酵菌は、主要なリグノセルロース由来の糖からエタノールを生成する能力のある酵母である。
【００３８】
５  濃縮
濾過段階から得られた液体画分の濃度は、その液体を発酵混合物へ添加する前に高められる。したがって、ヘミセルロース画分の濃度を５−６０％の乾燥質量濃度まで増加させるのが好ましい。
【００３９】
濃縮は、蒸発や様々な膜技術によって行うことができる。蒸発による濃縮の間、発酵菌に対するいくつかの阻害化合物もまた、ヘミセルロース濾液から除去される可能性がある。
【００４０】
６  無害化
前処理の条件に依存するが、液体画分は、発酵を阻害する可能性のある基質からヘミセルロース画分を解放するための無害化操作が施されてもよい。阻害物は、例えば、揮散、蒸発、イオン排除、樹脂又は活性炭処理法によって除去可能である。
【００４１】
７  加水分解及びヘミセルロース発酵
段階ｃの間に発酵に利用可能な炭水化物の基質の本質的な部分がエタノールへ発酵してしまったときに、液体画分が添加される。加水分解中に生成した、好ましくは、少なくとも５０質量％、特に少なくとも５５質量％又は少なくとも６０質量％の利用可能な単糖、特にヘキソースとペントースは、液体画分が添加される前に発酵してエタノールになる。濃縮されたヘミセルロース画分は、つぎに、１０分から４８時間、好ましくは約１５分から２４時間の期間中に添加され、その期間の後、発酵は、さらに６から７２時間、好ましくは８から４８時間、温度３０−７０℃、ｐＨ４から６において継続される。
【００４２】
上記工程の結果として、通常、質量で約０．５から１０％、特に約１．５から８％のエタノールを含む発酵混合物が得られる（利用可能な炭水化物から計算された収率は、８０質量％又はそれ以上、特に８５％又はそれ以上である）。
【００４３】
８  エタノール蒸留
エタノール蒸留と脱水は、従来又は新規の技術で行われる。
【００４４】
セルロース加水分解酵素
上記の酵素加水分解段階は、セルラーゼ酵素の混合物を用いて実施可能である。混合物は、特に、主要な３つの種類の酵素、すなわち、セロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ）、エンドグルカナーゼ（ＥＧ）、ベータ−グルコシダーゼからなる。さらに、混合物は、ヘミセルラーゼなど、ほかの加水分解酵素を含んでいてもよい。酵素の混合物の組成は、炭水化物、特にセルロースを効率よく単糖へ加水分解するために最適化さている。このために、セロビオヒドロラーゼはセルロースの結晶質部分に作用し、エンドグルカナーゼは主にセルロースの非晶質部分に作用することが必要とされ、ベータ−グルコシダーゼは、セロビオースが最終生成物阻害によってＣＢＨ酵素の作用を阻害するため、加水分解混合物からセロビオースを除去することが必要とされる。加水分解の機構は良く知られており、さらに詳細は、例えばティーリ（１９９７）によって説明されている。現在の市販用のセルラーゼ酵素の調製品は、主に菌類（例えば、トリコデルマ（Trichoderma）、アスペルギルス（Aspergillus））に由来している。混合物の特性は、生物技術的方法を用いて特定の条件に適合するように改善又は構成が可能である。混合物は、遺伝子工学の方法を用いて、ほかの生命体に由来する新規のセルラーゼ蛋白質を含むように変更されてもよく、又は現在のセルラーゼ蛋白質の特性は蛋白質工学によって改善されてもよい。
【００４５】
（Teeri, T. (1997) Crystalline cellulose degradation: new insight into the function of cellobiohydrolases. TIBTECH 15(May 1997), p.161-167.）
以下の限定されない実施例は、本発明をさらに説明するものである。
【実施例１】
【００４６】
［前処理された針葉樹材の前加水分解］
針葉樹材を蒸気で前処理し、２つの画分、主にセルロースを含む固体画分と、主にヘミセルロース糖と阻害化合物を含む可溶画分に分けた。固体画分を濾過、洗浄し、懸濁させて乾燥体１４．４％を有する繊維懸濁液を形成させた。市販の酵素調製品（セルクラスト（Celluclast）１、５Ｌ  ＦＧ、２０ＦＰＵ／ｇ乾燥質量、及びノボザイム（Novozym）１８８、ベータ−グルコシダーゼ用量２００ｎｋａｔ／ｇ乾燥質量）を用いて、５０℃で２から２０時間、繊維を前加水分解した。
【００４７】
加水分解の間に７４％のセルロースの繊維がグルコースに加水分解され、グルコースは液体画分中に４６ｇ／ｌの濃度で存在していた。さらに、液体部分はほかにも少量の発酵可能な糖、０．１ｇ／ｌのマンノース、０．０３ｇ／ｌのガラクトース、０．０４ｇ／ｌのキシロースを含んでいた。固体画分の粘度は加水分解の間に急速に低下し、混合特性は、加水分解の最初の２時間以内ですでに明らかに改善され、繊維懸濁液のより有利な処理特性が付与された。はじめに説明したのと同様に、ただしヘミセルロース糖画分の分離と洗浄を行わずに、蒸気前処理された針葉樹材を酵素でも直接的に処理をした。この場合において、加水分解率は洗浄された繊維によって得られたそれの１１％にすぎず（８％のセルロースの繊維が加水分解された）、前加水分解に先立ってヘミセルロース画分を繊維から分離した場合において、明らかに前加水分解段階がより効率的になることが示された。
【００４８】
類似の加水分解の実験をより少ない繊維含有量（２％の乾燥体）で実施したときに、洗浄されていない繊維を用いた加水分解率は向上し、洗浄された繊維の加水分解率の６６％であった。これは、繊維の含有量が増加するとヘミセルロースによる酵素の阻害が明らかにより深刻になることを示している。したがって、高濃度処理での前加水分解段階における効率的な加水分解のために、繊維からヘミセルロース濾液を分離することは非常に重要である。
【実施例２】
【００４９】
［前加水分解された針葉樹材からのエタノールの製造］
針葉樹材を蒸気で前処理し、２つの画分、主にセルロースを含む固体画分と、主にヘミセルロース糖を含む可溶画分に分けた。固体画分を濾過、洗浄し、懸濁させて乾燥体１４．５％を有する繊維懸濁液を形成させた。市販の酵素調製品を用いて、５０℃で繊維を前加水分解した。加水分解の条件は、１３．３％固体乾燥質量、酢酸緩衝液中、ｐＨ５であり、使用した酵素調製品は、セルクラスト（Celluclast）１、５Ｌ  ＦＧ、２０ＦＰＵ／ｇ乾燥質量、及びベータ−グルコシダーゼ用量２００ｎｋａｔ／ｇ乾燥質量のノボザイム（Novozym）１８８であった。２０時間後、前加水分解されたものを３０℃に下げ、接種前に栄養素に懸濁させた酵母（ＶＴＴ−Ｂ−０３３３９株）を、水に対して１０体積％（前加水分解されたものの）で接種した。対照となる処理を、酵素の添加後すぐに処理の初期において酵母を接種したことを除いて、同様の条件で行った。
【００５０】
前加水分解と対照となる処理の実験はともに、エタノール濃度が２５ｇ／ｌとなる結果となり、理論上のエタノール収率の８１％に相当した。したがって、前加水分解は、工程中のエタノール生成の期間の個別の加水分解と同じくらい良好であり、しかも結果として、エネルギー要求量がより低くより良好な混合特性となった。
【実施例３】
【００５１】
［ヘミセルロース画分の有無と前加水分解した針葉樹材からのエタノールの製造］
針葉樹材を蒸気で前処理し、２つの画分、主にセルロースを含む固体画分と、主にヘミセルロース糖を含む可溶画分に分けた。固体画分を濾過、洗浄し、懸濁させて乾燥体１８％を有する繊維懸濁液を形成させた。市販の酵素調製品を用いて、５０℃で繊維を前加水分解した。加水分解の条件は、１６．２％固体乾燥質量、酢酸緩衝液中、ｐＨ５であり、使用した酵素調製品は、セルクラスト（Celluclast）１、５Ｌ  ＦＧ、２０ＦＰＵ／ｇ乾燥質量、及びベータ−グルコシダーゼ用量２００ｎｋａｔ／ｇ乾燥質量のノボザイム（Novozym）１８８であった。前加水分解後、繊維画分中の約２０％のセルロースがグルコースへ加水分解されていた。
【００５２】
２０時間後、前加水分解されたものを３０℃に下げ、接種前に栄養素に懸濁させた酵母（ＶＴＴ−Ｂ−０３３３９株）を、水に対して約１０体積％（前加水分解されたものの）で接種した。
【００５３】
酵母にとっての阻害物及び毒性化合物を含むヘミセルロース濾液を
ａ）加水分解の開始時に（加水分解において結果として１３．３％固体乾燥重量となった）
ｂ）酵母と同時に発酵の開始時に
ｃ）発酵が開始した後の結果として２回の添加によって
のいずれかにおいて添加した。
【００５４】
ヘミセルロース画分を含み、洗浄していない、蒸気で前処理を行った材料、すなわち、ヘミセルロース画分の分離を行わず洗浄を行っていない材料を用いて、対照となる処理を実施した。
【００５５】
酵母発酵において生成したエタノールの濃度は、それぞれの場合において、ａ）０．２％、ｂ）２．６％、ｃ）３．２％であった。対照となる処理では、０．１５％のエタノールしか生成しなかった。添加した濾液由来の糖は、ｂ）の場合では部分的にしか利用されなかったのに対し、ｃ）の場合はその主要な部分が消費された。この結果は、発酵の後の方の段階で毒性を有する濾液を段階的に添加することによって、収率と生成速度が改善されることを示している。濾液の毒性によって、加水分解と発酵の両方の速度が低下した。
【実施例４】
【００５６】
［蒸発によるヘミセルロース濾液からの阻害物の除去］
ヘミセルロース濾液を蒸気で前処理されたトウヒの繊維から分離し、６０−６５℃で真空蒸発によって４．８倍に濃縮した。濃縮の前後において、ＨＰＬＣによって濾液の単糖といくつかの阻害化合物である酢酸、フルフラール、５−ヒドロキシメチルフルフラール（５−ＨＭＦ）を分析した。
【００５７】
蒸発の間に、フルフラールは濾液から除去された（その量は濃縮物中でＨＰＬＣの検出限界以下であった）。蒸発による濃縮物中、酢酸の量は６７％減少し、５−ＨＭＦの量は１２％減少した。したがって、発酵工程へ添加する前にヘミセルロース濾液を濃縮する目的で実施される蒸発によって、いくつかの阻害化合物の量を減少させることができ、又はそれらをヘミセルロース濾液から除去することができる。
【実施例５】
【００５８】
［三段階工程における前処理された針葉樹材からのエタノールの製造］
工程の全体について、高い固体乾燥質量濃度（前加水分解段階において１３質量％）条件で、終わりの方のＳＳＦ段階の間に濃縮されたヘミセルロース画分（２７％糖濃度）を添加して、試験を行った。実験用発酵槽中でｐＨと温度を制御しスラリーを効率的に混合しながら、実験を行った。１３％の濃度で前加水分解段階と同時に５０℃において実験を開始し（実施例２で説明したように酵素を添加）、２４時間継続した。前加水分解後、繊維画分中の６０％のセルロースがグルコースに加水分解した。
【００５９】
つぎに発酵槽の温度を３０℃に下げ、適切な栄養素を添加し、発酵槽にペントース発酵酵母（ＶＴＴ−Ｂ−０３３３９株）を接種した。加水分解で生成した糖は急速に消費され、同時加水分解発酵が継続した。酵母接種から２４時間後、蒸発によって無害化され（当初の体積の約２０％に）濃縮された、濃縮ヘミセルロース画分の添加を開始し、約２５時間の間継続した。発酵が完了したときに、エタノール濃度は、原材料の炭水化物に対する理論上の収率の約９０％に相当する、４．５％であった。濾液中の糖の主要な部分も利用され、例えば、マンノースとグルコースの全体としての利用は、原材料中に存在するすべてのマンノースとグルコースに対して、それぞれ９２％と９５％であった。この方法はこのように、高い濃度と収率のエタノールを製造し、ヘミセルロース画分の糖の利用を容易にした。
【図１】
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【国際調査報告】
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