(57)【要約】  本発明は、感染性病原体感染症に対する暴露、反応及び回復に宿主反応を示す末梢血白血球由来の遺伝子発現マーカーの特異セットを提供する。本発明は、さらに、遺伝子発現マーカーの特異セットを確認する方法、感染性病原体感染症の病気進行及び治療を監視する方法、感染性病原体感染症の発症を予知する方法、並びに感染性病原体感染症を診断し、関係がある病原体を確認する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種又はそれ以上の感染性病原体にすでに暴露されている被験者について遺伝子発現プロファイルを調べる方法であって、
ａ）被験者から生体試料を採取し；
ｂ）前記試料からＲＮＡを単離し；
ｃ）前記試料からＤＮＡ混入物を除去し；
ｄ）前記試料に標準化対照を加え；
ｅ）前記試料に含まれるＲＮＡからｃＤＮＡを合成し；
ｆ）前記ｃＤＮＡからｃＲＮＡを生体外で転写し、前記ｃＲＮＡを標識し；
ｇ）前記ｃＲＮＡを遺伝子チップにハイブリダイズさせ、次いで洗浄し、染色し、走査し；
ｈ）前記遺伝子チップから遺伝子発現プロファイルを取得し、前記被験者が暴露された病気を基準として前記試料中のＲＮＡによって表される遺伝子発現プロファイルを解析する；
ことからなる１種又はそれ以上の感染性病原体に暴露された被験者について遺伝子発現プロファイルを調べる方法。
【請求項２】
前記生体試料が全血である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、（ｃ）と（ｄ）の間に、
−  前記ＲＮＡを濃縮し、精製する
ことからなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
さらに、（ｄ）と（ｅ）の間に、
−  前記試料中のグロビンｍＲＮＡを減少させる及び／又は除去する
ことからなる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記試料中の前記のグロビンｍＲＮＡの減少及び／又は除去が、ビオチン化グロビン捕捉オリゴ類を前記試料に加えてグロビンｍＲＮＡを結合し、得られた結合グロビンｍＲＮＡを、グロビン除去ＲＮＡを残すストレプトアビジン磁性ビーズで除去することからなる請求項４に記載の方法。
【請求項６】
さらに、前記グロビン除去ＲＮＡを磁性ＲＮＡビーズと接触させることによりグロビン除去ＲＮＡをさらに精製することからなる請求項５に記載の方法。
【請求項７】
さらに、（ｅ）と同時に、
−  前記のｃＤＮＡ合成中にＰＮＡを前記試料に加えることにより前記試料中のグロビンｍＲＮＡを減少させる及び／又は除去する
ことからなる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
さらに、（ｇ）と（ｈ）の間に、（ｇ）の前記遺伝子チップと異なる第二の遺伝子チップを用いて（ｇ）を反復することからなり、この場合に（ｈ）において、取得の後に前記の第一の遺伝子チップ及び第二の遺伝子チップから得られたデータを一つにまとめる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
１種又はそれ以上の感染性病原体にすでに暴露されている被験者において健康である、発熱がある又は回復期にあるかを識別するための遺伝子発現マーカーを確認する方法であって、
ａ）１種又はそれ以上の感染性病原体にすでに暴露されている被験者について請求項１に記載の方法で遺伝子発現プロファイルを取得し；
ｂ）前記の１種又はそれ以上の感染性病原体に対する暴露から回復している被験者について請求項１に記載の方法で遺伝子発現プロファイルを取得し；
ｃ）前記の１種又はそれ以上の感染性病原体に暴露されていない健康な被験者について請求項１に記載の方法で遺伝子発現プロファイルを取得し；
ｄ）（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からの被験者についての遺伝子発現プロファイルを対比較により比較し；
ｅ）患者の表現型を前記対比較に基づいたクラス予測アルゴリズムにより健康である、発熱がある又は回復期にあると分類する最小セットの遺伝子に対してネステッド（the nested）の同一性を調べ；
ｆ）（ｅ）で調べた最小セットの遺伝子の遺伝子発現プロファイルに基づいて健康である、発熱がある又は回復期にあるという分類を割り当てる；
ことからなる１種又はそれ以上の感染性病原体にすでに暴露されている被験者において健康である、発熱がある又は回復期にあるかを識別するための遺伝子発現マーカーを確認する方法。
【請求項１０】
分類を必要とする被験者を健康である、発熱がある又は回復期にあると分類する方法であって、
ａ）前記被験者から生体試料を採取し；
ｂ）前記試料からＲＮＡを単離し；
ｃ）前記試料からＤＮＡ混入物を除去し；
ｄ）前記試料に標準化対照を加え；
ｅ）前記試料に含まれるＲＮＡからｃＤＮＡを合成し；
ｆ）前記ｃＤＮＡからｃＲＮＡを生体外で転写し、前記ｃＲＮＡを標識し；
ｇ）前記ｃＲＮＡを遺伝子チップにハイブリダイズさせ、次いで洗浄し、染色し、走査し；
ｈ）前記遺伝子チップから遺伝子発現プロファイルを取得し、前記試料中のＲＮＡによって表される遺伝子発現プロファイルを解析し；
ｉ）患者表現型を、請求項９に記載の方法で調べられる健康である、発熱がある又は回復期にあると分類する最小セットの遺伝子の前記被験者の遺伝子発現プロファイルを調べ；
ｊ）（ｉ）で得られた遺伝子発現プロファイルを、請求項９に記載の方法で調べられる最小セットの遺伝子の遺伝子発現プロファイルに基づいて健康である、発熱がある又は回復期にあるという分類割り当ての遺伝子発現プロファイルと比較することによって、分類を必要とする被験者を健康である、発熱がある又は回復期にあると分類する；
ことからなる分類を必要とする被験者を健康である、発熱がある又は回復期にあると分類する方法。
【請求項１１】
前記生体試料が全血である請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
さらに、（ｃ）と（ｄ）の間に、
−  前記ＲＮＡを濃縮し、精製する
ことからなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
さらに、（ｄ）と（ｅ）の間に、
−  前記試料中のグロビンｍＲＮＡを減少させる及び／又は除去する
ことからなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記試料中の前記のグロビンｍＲＮＡの減少及び／又は除去が、ビオチン化グロビン捕捉オリゴ類を前記試料に加えてグロビンｍＲＮＡを結合し、得られた結合グロビンｍＲＮＡを、グロビン除去ＲＮＡを残すストレプトアビジン磁性ビーズで除去することからなる請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
さらに、前記グロビン除去ＲＮＡを磁性ＲＮＡビーズと接触させることによりグロビン除去ＲＮＡを精製することからなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、（ｅ）と同時に、
−  前記のｃＤＮＡ合成中にＰＮＡを前記試料に加えることにより前記試料中のグロビンｍＲＮＡを減少させる及び／又は除去する
ことからなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
さらに、（ｇ）と（ｈ）の間に、（ｇ）の前記遺伝子チップと異なる第二の遺伝子チップを用いて（ｇ）を反復することからなり、この場合に（ｈ）において、取得の後に前記の第一の遺伝子チップ及び第二の遺伝子チップから得られたデータを一つにまとめる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
発熱がない患者を発熱がある患者と識別するための遺伝子の最小セットが、PDCD1LG1、PLSCR1、FCGR1A、PLSCR1、FCGR1A、CEACAM1、SERPING1、TNFAIP6、ANKRD22、EPSTI1、FLJ39885、DNAPTP6、IFI35、OAS1、PRV1、STK3、GBP1、GBP1、CASP5、IFIT4、GPR105、MGC20410、cig5、LOC129607、IFI44、GBP5、C1QG、HSXIAPAF1、cig5、UPP1、PML、LAMP3、IFRG28、G1P2、C1orf29、IFI44、LIPA、OAS1、MX1、SN、HSXIAPAF1、IFIT1、OAS2及びIFI27からなるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項１９】
健康である患者と回復期にある患者を識別するための遺伝子の最小セットがRPL27、RPS7、DAB2、LAMA2、IGHM、EVA1及びKREMEN1からなるものである請求項１０に記載の方法。
【請求項２０】
アデノウイルスによる発熱がある患者と、アデノウイルスによらない発熱がある患者を識別するための遺伝子の最小セットが、IL1RAP、ZCCHC2、IFI44、ZCCHC2、ZSIG11、NOP5/NOP58、LGALS3BP、MS4A7、LY6E、BTN3A3及びIFI27からなるものである請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［連邦政府資金プロジェクトに関する陳述］
米国政府は、国防脅威削減局（DTRA；Interagency Cost Reimbursement Order（IACRO#02-4118）、MIPR番号01-2817、02-2292、02-2219、及び02-2887）、the Office of the U.S. Air Force Surgeon General (HQ USAF SGR；MIPR番号NMIPR035203650、NMIPRONMIPRO35203881、NMIPRONMIPRO35203881）、米国陸軍医学研究所買収活動（契約# DAMD17-03-2-0089）、防衛高等研究企画局（DARPA；MIPR番号M189/02）及び海軍研究事務所（NRL Work Unit 6456）からの資金に従って本発明の権利を所有する。
【０００２】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００４年１１月５日付けで出願された米国特許出願第６０／６２６，５００号の優先権を主張する。
【０００３】
本発明は、感染性病原体からの暴露、反応及び回復に対して宿主反応を示す全血及び／又は末梢血白血球（ＰＢＬ）由来の遺伝子発現マーカーの特定の特異的セットを提供する。本発明はまた、遺伝子発現マーカーの特定のセットを確認する方法、病気の進行及び感染性病原体感染症の治療を監視する方法、感染性病原体感染症の症状及び／又は徴候の発生を予測する方法、並びに感染性病原体感染症を診断し、関係のある病原体を分類する方法を提供する。
【０００４】
本発明はまた、下記の方法：すなわち、
（１）コホート〔例えば、基礎軍事訓練生（ＢＭＴ）母集団〕において差次的遺伝子発現（differential gene expression）マーカーを確認する(validate)方法。このような方法は、特異的疾患について代替法によって確認されるバイオマーカーのサブセットを確認する及び／又は拡張するのに使用できる、
（２）暴露母集団における発症前遺伝子発現変化を調べる方法を設計し、実施する方法、
（３）他の（例えば、メタデータ）情報を総合的診断又は評価に組み合わるための統計学的（例えばベイズ統計学的）推論方法、
及び
（４）Genechipマイクロアレイ以外の代替測定方法であって、最小量の血液（数ｍｌの血液を得る静脈内採血に代えて数滴の血液を得るランセット）中の遺伝子の小さな分別サブユニット（すなわち、本発明のマイクロアレイに基づく方法で確認される遺伝子のサブセット）の変化を数日に代えて数時間で測定するのに使用できるGenechipマイクロアレイ以外の代替測定法（しかし、Genechipマイクロアレイを必ずしも除外しない）
を提供する。
【０００５】
また、本発明は、総合的ビジネスモデルに関し、その要素として：
（１）発症前遺伝子発現マーカーを使用する、化学生物テロリズムの感染性病原体又は薬剤に暴露された個人の罹病可能性の評価、
（２）主要症状の発生前に感染性疾患に対して予防的介入するための、選りすぐりの個人（例えば、２４時間ミッションの開始前の航空機搭乗員パイロット）又は一般公衆使用のための罹病可能性の事前評価、及び
（３）生理学及び血液遺伝子発現に影響を及ぼすヒトの行動活動（すなわち、運動、摂食、絶食、喫煙、など）の評価、従ってある一定の信頼の確率で個人の確立された過去の活動に使用し得るこれらの行動に関連したバイオマーカーの発見を可能にする評価
を含む。
【０００６】
本発明は、さらにまた、
（１）他の病気診断（例えば、血液関連；自己免疫疾患、白血病）で使用される本明細書において開発された方法（例えば、PAXgeneプロセシング及びメタデータ）を外挿する方法；
（２）病気評価の推論モデルに取り入れることを可能にするフォーマットにおいてメタデータを組み立てる方法；及び
（３）包括的ヒト遺伝子発現基準(baseline)データベースであって、それと対比して摂動（perturbation）、このような病原体暴露、感染及びその他の疾患状態が比較される包括的ヒト遺伝子発現基準データベースを構築する方法
に関する。
【背景技術】
【０００７】
近年、種々の形態の組織及び培養細胞において遺伝子の発現を監視するためにＤＮＡマイクロアレイの使用を必要とする多数の用途において爆発的な成長を目にする（１〜５）。このような“発現プロファイリング”は、幾つかの形の摂動に応答して宿主細胞において転写されたメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の相対量の測定可能な変化を必要とする。前記測定は、通常は不安定なｍＲＮＡのより安定な相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）への逆転写（ＲＴ）によって間接的に行われ、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）は、次々にフルオロフォアで標識され（大部分の仕事について当てはまるが、Affymetrix法は、ｃＤＮＡの元のＲＮＡへの再転化を伴い、ＲＮＡは次々に標識され、ハイブリダイズされる）、関心の標的ｃＤＮＡを結合する複数のＤＮＡ“プローブ”分子を含有するマイクロアレイとハイブリダイズさせられる。
【０００８】
典型的には、相対転写物量を蛍光強度の比から推定することを可能にする有色フルオロフォアが、ｃＤＮＡの“対照”プール及び“実験”プールを標識するのに使用される。別法として、単色測定は、Affymetrix高密度マイクロアレイ（以下を参照）を用いる場合のように、Affymetrixアレイ同士の間からの変化が大部分のスポットアレイプラットフォームに比べてごく僅かであることから、種々のマイクロアレイの間の強度の基準化（scaling）によって可能になり得る。外部摂動に応答して調節される遺伝子の定義セット(defining set)は、重要であり(non-trivial)、且つ生物学的変動、マイクロアレイ製造バッチ、処理因子、及び試料処理中に現れる変動に起因する“ノイズ”によって複雑になる（６）。
【０００９】
マイクロアレイプローブ分子の種類
ＤＮＡプローブそれ自体が、極めて変化しやすい長さを有し得ることは意義深い。ｃＤＮＡ分子〔これは、“発現配列標識（Expressed Sequence Tag）”；すなわちＥＳＴとして知られている転写単離物のＲＴ／ＰＣＲ産物である〕からなるプローブは、種々の長さ（通常は数百塩基対）を有することができ、そして吸着され（非共有的に）、次いで正荷電ポリリシン又はアミノシラン被覆顕微鏡スライドに（化学的に又は紫外線を使用して）架橋される場合が多い。それに比べて、定義された“長い”（７０ ｍｅｒ）又は“短い”（２５ ｍｅｒ）オリゴヌクレオチドからなるプローブは、固定された長さを有し、ほとんど変わることなくＤＮＡ分子の一端を介して共有結合で結合される。さらに高度の転写物検出感度は、通常は、短いプローブ（例えば２０〜２５ ｍｅｒ）に比べて７０ ｍｅｒプローブを用いて達成することができる。しかし、７０ ｍｅｒ標的／プローブハイブリダイゼーションは少ない数（例えば２〜３個）の１塩基ミスマッチに一般的に感受性がないことから、特異性が低下し、これに対して短いプローブは１塩基ミスマッチに敏感であり、従ってより大きな特異性を提供する。それに比べて、ＥＳＴライブラリーから調製される相補的ｃＤＮＡプローブに結合する転写物特異的ｃＤＮＡについては、言えることはほとんどない。その理由は、プローブの長さ（数百塩基対）が、多数のより小さい転写特異的ｃＤＮＡ分子の結合をもたらし得るからである。これらの寄与の区別は、マイクロアレイスキャナーで測定される単一蛍光強度信号からは不可能であろう。
【００１０】
少なくとも２、３の研究グループが、種々のレベルの“配列分離度”を識別できるマイクロアレイを開発している。ヒトゲノムの中で、“エキソン”と呼ばれる全配列の僅かな割合の配列だけが、機能性ポリペプチドを実際にコードし、これらのセグメントには“イントロン”と呼ばれる非コードセグメントが散在する。Shoemakerら（７）は、予測されるエキソン領域を標的とする長さ（５０〜６０塩基）からなる“エキソンアレイ”を開発し、且つヒト染色体２２について関心のゲノム領域を完全に覆う（blanket）ために同様の長さの重複オリゴヌクレオチドのセットを使用した“タイリングアレイ”を開発した。これは、この染色体からの大部分のＲＮＡ転写物、例えば伝統的に遺伝子とみなされない転写物の測定を可能にする。さらに、これらのマイクロアレイは、染色体ＤＮＡそれ自体における突然変異の位置を確認することもできるであろう。また、これは、機能性タンパク質をコードする転写物の特異的なスプライス変異体の形成においてどのエキソンが表現されるかの決定を可能にする
本発明について、発明者らは、Affymetrix HG-U133A及びHG-U133Bヒトゲノム発現チップ（Part No.900444；詳細な情報に関しては、製造業者から入手できる製品文献を参照）、並びにHG-U133A、HG-U133B及び一つのカートリッジ上の追加10,000プローブセット由来のプローブを含有するHG-U133 plus 2.0 plus チップ（Part No.900467）を使用した。GeneChip（登録商標）プローブアレイは、複数の“セル”を含有し、そのそれぞれは、独特な２５ ｍｅｒプローブの多数のコピーを有し且つ完全マッチ（ＰＭ）と中間（番号１３）の位置が変化したミスマッチ（ＭＭ）とのみからなるプローブ対で配置される。標準的に、ＲＮＡは、試料から抽出され、ｃＤＮＡに逆転写され、次いで加えられたＴ７プロモーター領域を用いて二本鎖ｃＤＮＡに逆転写される。次いで、生体外転写が行われて、ＲＮＡが直線的に増幅され且つビオチン化ヌクレオチドが組み込まれてビオチン標識ｃＲＮＡが調製される。標識されたｃＲＮＡ標的は、マイクロアレイ上に通常は一夜にわたりハイブリダイズされ、次いで洗浄及び翌日にストレプトアビジン複合蛍光染料による検出が続く。標識された転写標的のマイクロアレイへのハイブリダイゼーション（詳細な情報については、“Eukaryotic Sample and Array Processing”という表題でAffymetrix社から入手できる製品文献を参照）の後に、Affymetrix ＧＣＯＳソフトウエア（Affymetrix社から入手できるマニュアル）(８）を使用して、未加工スキャンイメージ（.DAT）ファイルを、対応するプローブ位置のそれぞれに割り当てられた強度を有する簡易化ファイルフォーマット（.CELファイル）に縮小した。
【００１１】
プローブ対のレイアウト及び発現解析アルゴリズムのグラフによる記載は、Affymetrix ＧＣＯＳマニュアル第５０５〜５２３頁（８）に見出される。Ｕ１３３Ａ及びＢ ＧｅｎｅＣｈｉｐ（登録商標）について、ヒトゲノムから作成されたＵｎｉｇｅｎｅデータベースＵ１３３（詳細な情報については、製造業者から入手できる製品文献を参照）からそれぞれ（〜３９,０００）の公知及び推定の遺伝子は、遺伝子のある長さにわたって間隔をあけた１０個のプローブ対で表され、３´末端方向に向かってある偏りを有する（Affymetrixウエブサイトから利用できるNetAffxウエブサイトから入手できる地図及び解析）。ＧＣＯＳソフトウエアは、転写物の量を推測し且つ２又はそれ以上の実験の間の発現の倍率変化（fold change）を算出するのに使用される全体的強度を割り当てるアルゴリズムを実行する。それはまた、遺伝子が“存在する”（検出可能に発現される）か又は存在しないかを示すために測定基準を提供する。これらの計算の後に、個々のプローブ強度は明確には参照されないが、これら強度は、各実験について.CELファイルに永続的データの一部のままである。
【００１２】
従って、使用したマイクロアレイプローブの種類及び個数並びにプローブからの強度の空間的パターンを解析するのに使用したアルゴリズムに応じて、“遺伝子発現”測定値の解釈可能性においてかなりの相違がある。
【００１３】
転写マーカー
同様に重要なのは、後生動物系における転写物量の測定の“配列分離度”に関連して、“遺伝子”及び転写遺伝子産物の組成の変化である。ヒトゲノムの初期原稿（９、１０）は、ヒトゲノムが、有意限界を有する計算法によって大部分が識別される約３０,０００の遺伝子からなることを示している（１１）。しかし、桁違いに多い種々のタンパク質が、これらの遺伝子から非コード配列（イントロン）が散在する内部コード配列（エキソン）の組換えによって産生され得る。従って、転写ライブラリーから誘導されるｃＤＮＡクローンからなるプローブは、時間及び条件の特定のセットの下で得られる完全な遺伝子産物配列の検出に偏り、別のスプライス変異体が転写配列組成を変化させるであろうより一般的な条件で哺乳動物遺伝子発現の多形性を表すことができない。
【００１４】
病原体に対する免疫反応における遺伝子発現プロファイリングの従来技術
細胞培養モデル
幾つかのグループが、生体外で微生物又は微生物成分に暴露後の個々の免疫細胞種の遺伝子発現プロファイルを測定している。ホワイトヘッド研究所（Whitehead Institute）のグループ（１２）及びスタンフォードのグループ（１３）は、Affymetrix ｃＤＮＡマイクロアレイ型及びスポットｃＤＮＡマイクロアレイ型それぞれを使用して、種々の死滅細菌及び細菌細胞壁成分に暴露された場合の培養ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ；すなわち、循環マクロファージ前駆細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球）、好酸球及び好塩基球の比較的定型化された応答を観察した。応答の類似性は、固有の免疫系内の進化的に保存された炎症誘発反応を反映し、そして病原体特異反応が明白に検出できるであろうことを示唆しない。Chaussableら（１４）は、生体外で生じさせたマクロファージ及び樹状細胞を用いた研究を報告しており、この研究は、多様な病原体に対する固有の免疫反応に対する洞察を提供するが、監視(surveillance)には実用的でない。その理由は、これらの細胞型は、これらの自然な遺伝子発現を変化させるであろう実験手法で単離できるだけであるからである。
【００１５】
感染宿主から取り出された末梢血白血球（ＰＢＬ）
Craig Cummings、David Relman及びPatrick Brown（スタンフォード大学）は、特異的病原体によって発現される病原因子の独特な混合物が宿主において対応する独特な転写反応を生じるであろうという仮説を立てた（１５）。彼らは、体に近づく病原体がそれぞれ特異的遺伝子調節の組み合わせに特徴がある多様な免疫反応機構を誘発するであろうという理由から、魅力的な宿主組織源は末梢血白血球（ＰＢＬ）であろうと推論した。彼らはまた、この方法は培養できないか又は特定されていない病原体さえもその早期診断を可能にし得ること、宿主発現プロファイルの変動が暴露以後の時間の推定を可能にし得ること及び単一の方法を多数の種々の病気を診断するのに使用できることを指摘した。
【００１６】
Relmanらは、“Lymphochip”（１６、１７）（これは、ヒトリンパ組織の転写ライブラリーから調製されたｃＤＮＡクローンからなる約３,０００〜３,５００の“リンパ系”遺伝子についての複数のプローブからなる）の変形物(variations)を使用して、７５人の健康なヒトドナー由来のPAXgene Blood RNA tubeから単離されたＲＮＡから、培養ＰＢＭＣ（１３）及びＰＢＬ（ＰＢＬ寄与−全白血球細胞及びその差は典型的には４１〜７７％好中球、２０〜５１％リンパ球、１.７〜９％単球及び１％未満の好塩基球及び好酸球である）の発現変化を解析した（１８）。後者の研究（１８）は、ＰＢＬにおける相対遺伝子発現量は、特異的血液細胞種、性別、年齢及び時間の変化に関係付けられることを例証した。Relmanらはまた、大痘瘡（Variola major）、すなわちヒト天然痘に関与するウイルスを用いた実験的接種の後の非ヒト霊長類（ＮＨＰ）におけるＰＢＭＣ発現の変化も観察した。また、Relmanらは、ＮＨＰのエボラ感染症を比較した。しかし、本明細書の発明者らは、これらの変化を、その他の病原体を使用するＮＨＰ接種及びヒトの基準遺伝子発現と関連づける開示を知らない。マイクロアレイ（ｃＤＮＡ  ＥＳＴクローン）の型のために、それは、倍率変化（倍率変化）を特定の遺伝子に割り当てることの原因である特定の転写配列に帰することはできない。本発明者らは、これらのデータを記載するパブリックドメイン（public domain）における記載を知らない。
【００１７】
要するに、Relmanの論文は全て、ｃＤＮＡアレイ及びＰＢＭＣ（これらは、その場での単離用遠心分離機及び専門家を必要とする）を使用する。彼らがpaxgeneを使用した場合には、彼らはそれを２４時間以内に処理した。これは、監視には実用的ではない。これに対して、本発明において、本発明者らは、paxgene管が監視に修正可能な条件で取り扱った場合でさえも適切な遺伝子発現プロファイルを与えることができることを実証する。Relmanは、このことを知らなかった及び／又は試験しなかったので、彼らはＲＮＡが分解しなかったという注釈で安全であるべき２４時間以内に全てのことを行った。また、ｃＤＮＡアレイについて、Relmanは、全てのチップについて２色を比較するために関心の組織に類似する遺伝子発現プロファイルを用いる参照ＲＮＡを必要とし、これは何がこれらの参照ＲＮＡ内に含まれるかというよりもむしろ種々の遺伝子を発現する大きな母集団を研究することを実行不可能にする。これに対して、Ａｆｆｙチップは１色であるので、参照共通ＲＮＡを必要とせず、特に本発明者らが標準化（normarlization）対照ＲＮＡを加える場合に、本発明者らが多数のチップを、規定時間を越えて比較することを可能にする。
【００１８】
生物兵器に暴露後の差次的な遺伝子及びタンパク質の発現
少なくとも一つの米国特許第６,３１６,１９７Ｂ１号明細書（１９）は、生物兵器（バイオテロリズム物質）に対する暴露を診断するために、感染した宿主から特徴的遺伝子発現を調べる方法を特許請求している。この米国特許出願の発明者らは、生物毒素〔例えば、スタフィロコッカス・エンテロトキシン（Staphylococcus enterotxin）Ｂ；すなわちＳＥＢ、及びボツリヌス毒素〕又は微生物（例えば、炭疽菌）を用いて接種した後の培養細胞中で差次的に発現される遺伝子を発見するために、ディファレンシャル・ディスプレイＰＣＲ（ＤＤ−ＰＣＲ）から始まる一連の工程を記載した。手短に言えば、ＤＤ−ＰＣＲは、宿主ＲＮＡ転写物をｃＤＮＡに転化させるために逆転写酵素の使用を必要とし、ｃＤＮＡは次々にＰＣＲで増幅され、ゲル電気泳動で分離される。特異的配列が、対応する電気泳動バンドのそれぞれについて調べられ、差次的に発現される遺伝子、すなわち差次的発現遺伝子が確認される。米国特許第６,３１６,１９７号明細書の発明者らは、観察された変化を同じ生物兵器（バイオテロリズム物質）に暴露された動物において測定する方法と関連付ける測定方法（逆転写酵素ＰＣＲ及びＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーションの使用を含む）を開示し、培養物において認められた変化に対応する遺伝子発現変化を見出した。全体として、この研究は、差次的生物学的反応に関与する遺伝子を発見する一般的に使用される方法を使用し、幾つかの型の中毒性障害に対する暴露と相関関係がある幾つかの転写マーカーを暗示する。しかし、ヒトを使用する同じ実験を行う倫理的な方法はなく、従ってヒト母集団について臨床的に適切なデータを得る方法はない。この研究においては摂動を基準発現プロファイルと比較する試みもない。また、Relmanらによって開示された方法のいずれも監視セッティングに修正することはできない。
【００１９】
総合的バイオディフェンスシステムにおける差次的遺伝子発現測定
幅広いスペクトルの病原体識別に使用されるマイクロアレイの概念は、医療行為及び国防の両方に対して相当な且つ明白な興味を引く。これは、国防科学委員会（Defense Sciences Board) (DSB) Summer 2000 Panelの勧告において最もよく説明されており、米国国防省は、“Zebra Chip”；すなわち、遺伝子発現マーカーを含むことができ、一般的及び非一般的（例えばバイオテロリズム）病原体の両方について日常的な臨床診断として広く普及して使用されている（DoD TriCare System）であろう特定されていない技術の仮想マイクロアレイを開発することをＤＡＴＳＤ（ＡＴＬ）に勧告した。Zebra Chipはまた、一般的な病原体のプローブを有する他に、まれな（“zabra”）病原体の多数のプローブも含有するであろう。このようなデバイスがバイオテロリズム事件又は天然流行病（例えばＳＡＲＳ）の時に広く使用されていたならば、ごく僅かな（インフルエンザの様な）症状が現れた際に病原体の最も早い可能な検出によって、財政上及び人的被害の両方において経費節約は莫大であろう。
【００２０】
さらにまた、“基準(baseline)”発現プロファイルであって、それと対比して“摂動”状態プロファイルが比較される“基準”発現プロファイルを明確に定義する必要がある。なぜならば、“基準”発現プロファイルが、時間及び個人間で変化しやすいものであり得るからである。
【００２１】
病原体ゲノムマーカー（例えば、ＰＣＲ又はマイクロアレイを使用して）によって感染症の具体的な原因を識別することは必ずしも可能であるとは限らないことから、病因の性質を解明し且つ臨床医に感染症の適切な管理を教えるであろう宿主由来の別の代わるべき“バイオマーカー”を調べる緊急な要求が依然としてある。
【００２２】
従って、公表された従来の方法のいずれも、極めて長期にわたる分野の研究／監視に修正できない。公表された方法の全てが、迅速な１回限りの遺伝子発現研究のためだけのものである。従って、前記の点から見て、病状を診断し、治療計画を管理するのに役立ち、且つ治療／操作上の決定を行うのを手助けするために、感染宿主から生じる特有の遺伝子発現変化を調べる方法について重要な要求が依然としてある。また、独立して使用してもよいし又は別の検出及び診断方法並びに装置と組み合わせて使用してもよい現場実施に有用な迅速で、ほぼ即時応答する方法に対する緊急な要求が存在する。
【発明の開示】
【００２３】
本発明の目的は、健康な個人における基準遺伝子発現、及び病原体又は感染症に特有の遺伝子発現パターンの系統的変化を調べる方法を提供することにある。さらに詳しくは、この目的は、包括的ヒト遺伝子発現基準データベースであって、それと対比して摂動、このような病原体暴露、感染症及びその他の病状が比較される包括的ヒト遺伝子発現基準データベースを構築する方法に関する。
【００２４】
本発明の別の目的は、コホートで識別される差次的遺伝子発現マーカーを確認する方法を提供する。
【００２５】
本発明のさらに別の目的は、治療計画を設定／調整するために、暴露された母集団において発症前遺伝子発現変化を調べる方法を設計及び実施し、これにより治療計画を設計し／調整することにある。
【００２６】
前記の目的の中で、本発明はさらに、その他の（例えば、メタデータ）情報を全般的な診断又は評価に組み合わるための統計学的（例えばベイズ統計学的）推論方法を提供する。
【００２７】
本発明の目的は、その他の病気診断に使用される本明細書において開発された種々の方法（例えば、PAXgeneプロセシング及びメタデータ）を外挿すること(extrapolating)に拡張し得、本発明はこの外挿することを包含する。
【００２８】
また、本発明の目的は、病気評価の推論モデルに組み込むことを可能にするフォーマットにおいてメタデータを組み立てる方法を提供することにある。
【００２９】
本発明の目的は、全般的ビジネスモデルであって、
（１）発症前遺伝子発現マーカーを使用する、化学生物テロリズムの感染性病原体又は物質に暴露された個人の罹病可能性の評価、
（２）主要症状の発症に先立つ感染症に対する予防的介入のための選りすぐりの個人（例えば、２４時間ミッションの開始前の航空機搭乗員）又は一般公衆使用のための罹病可能性の事前評価、及び
（３）生理学及び血液遺伝子発現に影響を及ぼすヒトの行動活動（すなわち、運動、摂食、絶食、喫煙、など）の評価、従ってある一定の信頼の確率で個人の確立された過去の活動に使用し得るこれらの行動に関連したバイオマーカーの発見を可能にする評価、
（４）現在又は将来の関心の表現型についての臨床情報データベースと共に試料（すなわち、Paxgene）のバンキング(banking)
を含む全般的ビジネスモデルを進める（further）ことにある。
【００３０】
本発明のある目的において、（ｉ）健康な人及び／又は（ｉｉ）１種又はそれ以上の感染性病原体に暴露された被験者について遺伝子発現プロファイルを調べる方法であって、
ａ）被験者から生体試料（例えば、全血）を採取し；
ｂ）前記試料からＲＮＡを単離し；
ｃ）前記試料からＤＮＡ混入物を除去し；
ｄ）前記試料に標準化対照を加え；
ｅ）前記試料に含まれるＲＮＡからｃＤＮＡを合成し；
ｆ）前記ｃＤＮＡからｃＲＮＡを生体外で転写し、前記ｃＲＮＡを標識し；
ｇ）前記ｃＲＮＡを遺伝子チップにハイブリダイズさせ、次いで洗浄し、染色し、走査し；
ｈ）前記遺伝子チップから遺伝子発現プロファイルを取得し、交絡因子変数（confounder variables）について調節しながら、（ｉ）被験者の健康又は（ｉｉ）前記被験者がすでに暴露されている病気を基準として前記試料中のＲＮＡによって示される遺伝子発現プロファイルを解析する；
ことによって（ｉ）健康な人及び／又は（ｉｉ）１種又はそれ以上の感染性病原体にすでに暴露されている被験者について遺伝子発現プロファイルを調べる方法が提供される。
【００３１】
この目的の中で、前記方法の全体的感度を高めるために及びそれによって得られる結果の信頼性を高めるために、次の追加工程：すなわち、
−  （ｃ）と（ｄ）の間に前記のＲＮＡを濃縮し、精製し；
−  （ｄ）と（ｅ）の間に前記試料中のグロビンｍＲＮＡを減少させる及び／又は除去する、例えばビオチン化グロビン捕捉オリゴ類を前記試料に加えてグロビンｍＲＮＡを結合し、得られる結合グロビンｍＲＮＡを、グロビン除去ＲＮＡを残すストレプトアビジン磁性ビーズで除去し、場合により、前記グロビン除去ＲＮＡを磁性ＲＮＡ結合ビーズ又はＲＮＡ結合カラムと接触させることによってグロビン除去ＲＮＡをさらに精製し；
−  （ｅ）と同時に、前記のｃＤＮＡ合成中に前記試料にＰＮＡを加えることによって前記試料中のグロビンｍＲＮＡを減少する及び／又は排除し；及び／又は
−  （ｇ）と（ｈ）の間に、（ｇ）の前記遺伝子チップと異なる第二の遺伝子チップを用いて（ｇ）を反復し、この場合に（ｈ）において取得後に前記の第一の遺伝子チップ及び第二の遺伝子チップから得られたデータを結合する
工程を行ってもよい。
【００３２】
本発明の別の目的において、本発明は、１種又はそれ以上の感染性病原体にすでに暴露されている被験者において健康である、発熱がある又は回復期にあるかを識別するための遺伝子発現マーカーを確認する方法であって、
ａ）１種又はそれ以上の感染性病原体にすでに暴露されている被験者について前記の目的の方法で遺伝子発現プロファイルを取得し；
ｂ）前記の１種又はそれ以上の感染性病原体に対する暴露から回復している被験者について前記の目的の方法で遺伝子発現プロファイルを取得し；
ｃ）前記の１種又はそれ以上の感染性病原体に暴露されていない健康な被験者について前記の方法で遺伝子発現プロファイルを取得し；
ｄ）（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からの被験者についての遺伝子発現プロファイルを対比較により比較し；
ｅ）患者の表現型を前記の対比較に基づいた分類予測アルゴリズムにより健康である、熱がある又は回復期にあると分類する遺伝子の最小セットの同一性を調べ；
ｆ）（ｅ）で調べた遺伝子の最小セットの遺伝子発現プロファイルに基づいて健康である、発熱がある又は回復期にあるとの分類を割り当てる及び／又は前記コホートにおけるその他の熱性疾患のバックグラウンドケースからアデノウイルス熱性感染症を分類する
ことによって１種又はそれ以上の感染性病原体にすでに暴露されている被験者において健康である、発熱がある又は回復期にあるかを識別するための遺伝子発現マーカーを確認する方法が提供される。
【００３３】
本発明のさらに別の目的において、分類を必要とする被験者を健康である、発熱がある又は回復期にあると分類する方法であって、
ａ）前記被験者から生体試料（全血）を採取し；
ｂ）前記試料からＲＮＡを単離し；
ｃ）前記試料からＤＮＡ混入物を除去し；
ｄ）前記試料に標準化対照を加え；
ｅ）前記試料に含まれるＲＮＡからｃＤＮＡを合成し；
ｆ）前記ｃＤＮＡからｃＲＮＡを生体外で転写し、前記ｃＲＮＡを標識し；
ｇ）前記ｃＲＮＡを遺伝子チップにハイブリダイズさせ、次いで洗浄し、染色し、走査し；
ｈ）前記遺伝子チップから遺伝子発現プロファイルを取得し、前記試料中のＲＮＡによって示される遺伝子発現プロファイルを解析し；
ｉ）患者表現型を、前記の方法で調べられる健康である、発熱がある又は回復期にあると分類する最小セットの遺伝子の前記被験者の遺伝子発現プロファイルを調べ；
ｊ）（ｉ）で得られた遺伝子発現プロファイルを、前記の方法で調べられる最小セットの遺伝子の遺伝子発現プロファイルに基づいて健康である、発熱がある又は回復期にあるという分類割り当ての遺伝子発現プロファイルと比較することによって、分類を必要とする被験者を健康である、発熱がある又は回復期にあると分類する
ことによって分類を必要とする被験者を健康である、発熱がある又は回復期にあると分類する方法が提供される。
【００３４】
本発明者らによって得られた結果は、同じ割合の正確な分類結果を得ることができる種々のセットにおいて数個の遺伝子から多数の遺伝子までの一連の遺伝子セットを提供する。より大きなセットサイズは、母集団がより多くの表現型を含む場合には、よりしっかりした予測を提供し得る。一方、小さいセットサイズの利点及び／又は有用性は、迅速な独立した診断を行うことができることにあり得る。
【００３５】
前記の種々の目的は、本発明のある一定の局面を強調する。本発明の別の目的、要旨、及び具体的態様は、以下の本発明の詳細な説明に見出される。
【００３６】
発明のさらに完全な理解及びその多数の付随する利点は、以下の詳細な説明に関連して以下の図面を参照することによってよりよく理解されるようになるように、容易に得られるであろう。
【００３７】
〔図１〕  図１は、ＰＡＸ管に採取した血液を処理するのに使用した２つの条件に関するダイアグラムを表す。条件Ｅは、室温で２時間の最小インキュベーション時間後のＰＡＸ管採取血液からの全ＲＮＡの単離を記載し、これに対して条件Ｏは、ＲＮＡ単離の前に室温で９時間の延長されたインキュベーション時間、次いで−２０℃で６日間の凍結を考慮に入れる。
【００３８】
〔図２〕  図２は、ＤＮＡ混入及び除去を表す。（Ａ）オンカラムＤＮアーゼ処理後のＰＡＸ管から単離された全ＲＮＡのＤＮＡ混入物。ｇａｐｄｈ  ＤＮＡの検出のためのリアルタイムＰＣＲ反応物のゲル電気泳動。レーン１：分子量（ＭＷ）マーカー；レーン２〜７：オンカラムＤＮアーゼ処理によりＰＡＸ管から単離された全ＲＮＡから増幅したｇａｐｄｈ ２９０ ｂｐ生成物；レーン８：非鋳型陰性対照。（Ｂ）ＰＣＲで検出できないレベルまで混入ＤＮＡが除去された溶液中ＤＮアーゼ処理。種々の試料中のｇａｐｄｈ ＤＮＡを検出するリアルタイムＰＣＲ反応物のゲル電気泳動。レーン１：ＭＷマーカー；レーン２及び４：ＰＡＸ管から単離された溶液中ＤＮアーゼ処理ＲＮＡ；レーン３及び５：ＤＮアーゼなしでレーン２及び４のように処理したもの；レーン６：ｃＤＮＡ陽性対照；レーン７：陽性対照としてのオンカラムＤＮアーゼ処理試料；レーン８：鋳型なし陰性対照。（Ｃ）ＲＮＡの完全な状態は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定されるように溶液中ＤＮアーゼ処理後に維持された。レーン１：ＭＷマーカー；レーン２〜５：パネル（Ｂ）のレーン２〜５で使用したＲＮＡ試料からのｃＤＮＡ；レーン６：パネル（Ｂ）のレーン４に対応する試料の逆転写酵素なし陰性対照；レーン７：鋳型なし陰性対照
〔図３〕  図３は、全ＲＮＡがＤＮアーゼ処理前又は処理後及びこれらの条件同士の間で同様の品質であったことを表す。種々の全ＲＮＡ試料の移動時間に対するバイオアナライザーの痕跡。（Ａ）ＤＮアーゼ処理前のＰＡＸ管中の血液から単離した全ＲＮＡ。黒色の痕跡は、条件Ｅの試料からのものであり；灰色の痕跡は条件Ｏの試料からのものである。〜２３秒の最初のピークは、標識対照である。〜４１秒の第二のピークは、１８ＳリボソームＲＮＡである。〜４７秒の第三のピークは、２８ＳリボソームＲＮＡである。〜５０秒以後の大きなこぶ（hump）は、ＤＮＡ混入物を示した。（Ｂ）ＤＮアーゼ処理後の全ＲＮＡ。説明は（Ａ）に記載の通りである。（Ｃ）ＤＮアーゼ処理前及び処理後の痕跡の比較。それぞれの条件の黒色の痕跡は、ＤＮアーゼ処理前であり、これに対してそれぞれの条件の灰色の痕跡は、ＤＮアーゼ処理後である。
【００３９】
〔図４〕  図４は、二本鎖ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ及び断片化ｃＲＮＡの特性プロファイルを表す。種々の試料の移動時間に対する蛍光のバイオアナライザー痕跡。濃い灰色の痕跡は、条件Ｅからの試料である。薄い黒色の痕跡は、条件Ｏからの試料である。濃いライトグレーの痕跡は、非試料陰性対照の痕跡である。（Ａ）精製二本鎖ＤＮＡ。（Ｂ）精製ｃＲＮＡ。（Ｃ）断片化ｃＲＮＡ。
【００４０】
〔図５〕  図５は、HG-U133A及びHG-U133Bチップについての種々の試料の品質管理測定基準に関する個々の折れ線グラフを表す。ｘ軸のチップの次数は、CELファイルの生成の時間に基づく。ＵＣＬは上部管理限界を表し；ＬＣＬは下部管理限界を表す。前記の両方の限界は、±３の標準偏差で設定される。
【００４１】
〔図６〕  図６は、前記の２つの条件からの遺伝子−発現量が、関連試料に比べて、極めて相関関係があることを表す。HG-U133Aチップ（左側パネル）及びHG-U133Bチップ（右側パネル）に関するクラスターリングデンドログラム。文字“Ｅ”及び“Ｏ”を用いた試料名は、図１に記載の時間と同じ時間で処理した試料に対応し；また、上記と同じ文字を用いた試料名は、技術的複製を表す。試料全てに関する更なる説明を、試料名の下に示す。それぞれの記号は、試料記述的オントロジー（ontology）を記号化する。条件変数について、“Ｅ”は、条件Ｅと同様に処理した試料を表し、これに対して“Ｏ”は、条件Ｏと同様に処理した試料を表す。オペレーターについて、“Ｏ”は、一方のオペレーターを表し、これに対して“１”は他方のオペレーターを表す。ＲＮＡの種類について、“Ｔ”は、全ＲＮＡを表し；“Ｈ”はＩＰ ＲＰ ＨＰＬＣ精製ｍＲＮＡを表し；“ｐ”はポリＲＮＡを表す。ドナーＩＤについて、それぞれの番号は、種々のボランティアを表す。
【００４２】
〔図７〕  図７は、発熱がない 対 発熱がある（Ａ及びＢ）、健康である 対 回復期にある（Ｃ及びＤ）及びアデノウイルスによる発熱がある 対 アデノウイルス感染無しで発熱がある（Ｅ及びＦ）についての分類予測の最適化を表す。Ａ、Ｃ及びＥは、一変量の有意なα量(alpha level)の増加（Ａ、Ｃ及びＥのｘ軸）、種々のアルゴリズム（着色痕跡）について得られる％正分類率（correct classification）（左側ｙ軸）及び分類器(classifier）の遺伝子の数（右側ｙ軸、黒丸を有する黒色の痕跡）を表す；矢印は、最も高い％正分類率をもたらした最も大きいα量を示す。Ｂ、Ｄ及びＦにおいて、３つの分類のそれぞれについて最適α量で、分類器遺伝子は、得られる種々のアルゴリズム（着色の痕跡）についての％正分類率（左側ｙ軸）、及び分類器の遺伝子の数（右側ｙ軸、黒丸を用いた黒色の痕跡）を用いて倍率変化レベル（Ｂ、Ｄ及びＦのｘ軸）までさらにフィルターをかけた；矢印は、最も高い割合の正確な分類を生じた倍率変化量を示す。
【００４３】
〔図８〕  図８は、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊｕｒｋａｔ＋グロビン（ＪＧ）、及びpaxgene ＲＮＡから種々の技術条件で誘導されたｃＲＮＡプロファイルを表す。図８Ａ−ビオチン化グロビンオリゴ（ＪＧＡ）で処理、ＰＮＡ（ＪＧＰ）処理、未処理（ＪＧＣ）のＪＧ ＲＮＡから及び未処理Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡ（ＪＣ）から誘導されたcＲＮＡの電気泳動図。図８Ｂ−４種類のＲＮＡから誘導され且つＪＧＰ及びＪＧＣにおいてグロビン分子の大きさ（〜０.８ ｋｂを示した矢印）を示したｃＲＮＡのゲル図。図８Ｃ−ビオチン化グロビンオリゴ（ＢＡ）処理、ＰＮＡオリゴ（ＢＰ）処理及び未処理（ＢＣ）のpaxgene ＲＮＡから誘導されたｃＲＮＡの電気泳動図。図８Ｄ−グロビン（矢印）の大きさを示したＢＡ、ＢＰ及びＢＣのＲＮＡから誘導されたｃＲＮＡのゲル図。
【００４４】
〔図９〕  図９は、Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡに対するグロビン減少Ｊｕｒｋａｔ＋グロビンＲＮＡ試料の間のpresent call concordance及び３つの異なる技術条件でのpaxgene ＲＮＡの間の関係を説明するベンダイアグラムを表す。図９Ａ−ＪＡ、ＪＰ及びＪＣに一般に存在する制御遺伝子セット（ＪＣＡＰ）の識別。図９Ｂ−ＪＧＰ及びＪＣＡＰに存在する遺伝子に対してＪＧＡ及びＪＣＡＰに存在する追加の１３９４遺伝子がある。図９Ｃ−グロビン低下の末処理（ＢＣ）に対する追加の４１５９（２６０７＋１５５２）の遺伝子をもたらすビオチン化グロビンオリゴ処理の後のPaxgene ＲＮＡ。少なくとも６２.５％（２６０７／４１５９）が、グロビン除去によって存在すると考えらる可能性が高かった。
【００４５】
〔図１０〕  図１０は、各技術条件についての信号の変化を表す。図１０Ａ−ビオチン化グロビンオリゴ処理（ＪＡ、ＪＧＡ）、ＰＮＡ処理（ＪＰ及びＪＧＰ）及びグロビン減少未処理（ＪＣ、ＪＧＣ）のＪｕｒｋａｔ（Ｊ）及びＪｕｒｋａｔ＋グロビン（ＪＧ）ＲＮＡ試料から誘導された全てのプローブセットデータを使用する基準化信号強度に対する変動係数（ＣＶ）のグラフを示した。図１０Ｂ−ビオチン化グロビンオリゴ処理（ＢＡ）、ＰＮＡ処理（ＢＰ）及び未処理（ＢＣ）のpaxgene ＲＮＡから誘導された全てのプローブセットデータを使用する基準化信号強度に対するＣＶのグラフ。データは全て、自由度２に応じるLoess フィッティング(fitting)によって平滑化された。
【００４６】
〔図１１〕  図１１は、Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡ（Ｊ）及びグロビンに加えたＪｕｒｋａｔ ＲＮＡ（ＪＧ）並びにpaxgene ＲＮＡから得られた遺伝子発現について行った多次元基準化クラスター解析を表す。log raw信号強度を用いた全てのプローブセットを使用した。図１１Ａ−各三重反復試験について密なクラスターをもたらした各三重反復試験内の大きな相関関係。それぞれの技術条件を用いてＪｕｒｋａｔ ＲＮＡから誘導された三重反復クラスターは、ＪＧ ＲＮＡと比べてより接近して置かれた。しかし、グロビンの除去（ＪＧＡ、ＪＧＰ）は、三重反復クラスターをＪＧＣに比べてＪｕｒｋａｔ ＲＮＡにより近い状態にもって行った。図１１Ｂ−種々の技術条件を用いてそれぞれのpaxgene ＲＮＡについての三重反復は、より接近してクラスターを形成した。３つの技術変動は、３つの別々の三重反復クラスターをもたらした。
【００４７】
〔図１２〕  図１２は、Ｊｕｒｋａｔ及びJＧ ＲＮＡ及びpaxgene ＲＮＡ試料についての遺伝子発現プロファイルについて行った階層的クラスター解析を表す。基準化信号強度を有するGeneChip Human Genome U133 plus 2.0（約５６,０００）での全てのプローブセットが、遺伝子発現プロファイルの概要について示された。差次的遺伝子発現プロファイルは、０.００１の誤検出率を有する確率変動モデル（Random Variance Model）での一変量試験（Univariate test）から得られた。図１２Ａ−３種類の技術条件を用いたＪｕｒｋａｔ及びＪＧ ＲＮＡを代表する１８個の試料の間の遺伝子発現プロファイルの概要。ビオチン化グロビンオリゴによるＪＧ ＲＮＡからのグロビン除去は、Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡに対してより高い信号相関関係をもたらした、すなわちJGA三重反復及びＪｕｒｋａｔ ＲＮＡは同じ群にクラスター形成した。図１２Ｂ−これらの１８個の試料の間の差次的発現遺伝子プロファイルを使用することによって行ったクラスター解析。８６１４の差次的に発現された遺伝子及び遺伝子をもたらした解析は、ＪＧＡ発現パターンに基づいてＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及びＩＶに分けられた。図１２Ｃ−paxgene ＲＮＡから誘導された全体的遺伝子発現プロファイルについて行ったクラスター解析。ビオチン化グロビンオリゴ（ＢＡ）及びＰＮＡオリゴ（ＢＰ）によるpaxgene ＲＮＡからのグロビン除去は、非グロビン減少（ＢＣ）と比べてより類似した発現パターンを示した。図１２Ｄ−１９８８の差次的発現遺伝子をもたらした９種類のpaxgene ＲＮＡ試料の間の分類比較解析。
【００４８】
〔図１３〕  図１３は、ＢＭＴ母集団由来の試料のPAX systemから誘導されたＲＮＡ品質を表す。（ａ）種々の表現型及び取扱条件を用いたＢＭＴからの電気泳動図のオーバーレイ。１８Ｓ及び２８Ｓリボソームピークを示す。（ｂ）電気泳動図から算出した品質測定基準のボックスプロット。（ｃ）性能低下因数(degradation factor)(ｒ＝０.３、Ｐ＝０.００８、ＡＮＯＶＡ）に対するアレイＡのｇａｐｄｈ ３´／５´値の間の相関関係。（ｄ）血液採取から処理までの経過日数にわたるＲＮＡ分解がない。‘＋’、‘ｘ’又は‘ｚ’で印を付けた試料は、ＲＮＡ単離のために最終的解凍の前に追加の解凍−凍結サイクルを有していた。（ｅ）平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）とアレイＢでPresentと呼ばれるプローブセットの数の相関関係（ｒ＝−０.２７２；Ｐ＝０.００８、ＡＮＯＶＡ）。示した線は、式：Number Present＝８１０８−１１７ ＭＣＨからのものである。
【００４９】
〔図１４〕  図１４は、ＢＭＴの遺伝子発現プロファイルを表す。検出されなかった転写物を除去するために、試料全体に＞８０％ absent callを有する試料は、フィルターにかけられ、１５,７２１〜４４,９２８のプローブセットをもたらした。役に立たない転写物を除去するために、２０％未満がプローブセットの平均値から１.５倍又はそれ以上の変化を有するプローブを除去し、７６８２のプローブセットをもたらした。４種類の感染状態表現型の間の発現の相違を有する転写物に焦点を合わせるために、ＡＮＯＶＡでＰ＞０.０１を有するプローブセットを除外し、４４１４のプローブセットをもたらした。熱地図は、各血液試料（縦列）においてこれらの４４１４のプローブセット（横列）で検出された転写物量（緑色〜赤色の強度）を表す。前記の横列は、１−相関距離及び平均結合を用いて階層的にクラスター形成された。これに対して縦列は、感染状態表現型に分類された。上部の青色、茶色、黄色及びライトブルーのバー（棒）は、健康である、アデノウイルスを有せずに発熱がある及びアデノウイルスを有して発熱がある、並びに回復期にある患者それぞれからの試料を表す。下部の目盛りは、熱地図の緑色〜赤色の強度についての標準値を表す。側部の灰色、橙色及び紫色のバーは、表現型の間で異なる転写物のクラスターを表す。
【００５０】
〔図１５〕  図１５は、発熱がない 対 発熱がある（ａ）、健康である 対 回復期にある（ｂ）、及びアデノウイルスを有せずに発熱がある 対 アデノウイルス感染による発熱がある（ｃ）の表現型についての分類予測の最適化を表す。３つのパネルの下部左隅に、３つの分類のそれぞれについての推定最適Ｐ値カットオフ(cut-off)レベルを示す。分類器転写物は、種々のアルゴリズム（着色痕跡）について得られた％正分類率（左側ｙ軸）、及び分類器におけるプローブセットの数（右側ｙ軸、数珠状をなした黒色の痕跡）を用い、さらに倍率変化レベル（ｘ軸）でさらにフィルターにかけた；矢印は、最も高い％正分類率をもたらした倍率変化レベルを示す。
【００５１】
〔図１６〕  図１６は、分類予測解析から見出された分類器sにおける同一性及び遺伝子の発現を表す。各パネルにおいて、上部バーは、試料の分類表現型（縦列）を示す。パネルは、健康である、回復期にある、アデノウイルスを有せずに発熱がある及びアデノウイルスを有し発熱がある試料それぞれを青色、ライトブルー、褐色及び黄色それぞれとして示す第二のバーを有する。各パネルの着色バーの中央のセットは、種々のアルゴリズムで誤って分類された（黒色）試料をマークする。熱地図は、右側の遺伝子記号で特定される遺伝子の相対発現レベル（緑色〜赤色の強度）を示す；遺伝子記号無しのｃＤＮＡクローンについては、プローブセット識別子を代わりに表示する。デンドログラムは、１−相関距離及び平均結合を使用する標準化転写物レベル（横列）のクラスタリングからのものである。下部目盛りは、熱地図での緑色〜赤色の強度についての標準値を表す。パネルａ、ｂ及びｃの転写物セットは、図３ａ、ｂ及びｃそれぞれで矢印を付した結果を示した。
【００５２】
発明を実施するための態様
具体的に定義しない限りは、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、酵素学、生化学、細胞生物学、分子生物学及び医学の当業者によって一般に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００５３】
本明細書に記載の方法及び物質と同様の又は均等の全ての方法及び物質は、本発明の実施又は試験に使用することができ、適当な方法及び物質が本明細書に記載される。矛盾の場合には、本明細書、例えば定義は、調整するであろう。また、物質、方法及び実施例は、単なる例示であり、特に明記しない限りは、限定すること意図するものではない。
【００５４】
本発明は、呼吸器感染の病因物質を確認し、感染後の期間中の回復の尺度を提供するために血液中のヒト遺伝子転写物及びその発現パターンを確認する方法を提供する。ここで開発した方法は、暴露を示し且つ病気の実際の進行を予測するであろう遺伝子発現プロファイルの発見に拡大することができる。これらの能力は、これ迄にヒト母集団では実証されていない。
【００５５】
遺伝子発現：以下の記載は、本発明の重要性及びその遺伝子発現解析における有用性を詳述する：
１．培養できない微生物：すなわち、一般的に全ての年齢群で呼吸器疾患を引き起こす肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、百日咳菌（Bordetella pertussis）及びクラミジア肺炎病原体（Chlamydia pneumoniae）の確認。これらの微生物は、呼吸器分泌物の試料採取用の特殊な輸送媒体を必要とする。最適な輸送を用いたとしても、これらの一般的な微生物を培養することは極めて困難である；従って、医療従事者は、診断を行なうことができない場合が多く且つ抗菌療法をその期間を潜在的に短縮する及びこれらの微生物による病気の伝染を予防するように指示する機会がほとんどない。百日咳菌は、子供の百日咳の病原体であり、高い罹患率を有する。この微生物に感染した成人は、長期にわたって空咳を生じる場合が多く、感染性及び可能な伝染の期間中は診断が下されない状態にある。成人は、子供の健康に大きな影響を及ぼし得るこの微生物の病気の典型的な診断が下されてない病原体保有者に相当すると思われる。
【００５６】
２．試料を採取することができない微生物、例えば幼児からのＴＢの解析。幼児は、結核感染を広めている傾向があり、喀痰を伴う咳を有する傾向はないであろう；このことは、前記微生物を探すために痰を採取することが極めて困難であることを意味する。子供の結核感染及び病気について免疫学的サイン(signature)を検出する血液のアッセイを有することは、著しい医学的進歩であろう。世界中で、結核は、子供の、特に世界の貧しい地域の子供の発病及び死亡の大きな原因である。感染の早期発見は、病気を顕著に抑制する。従って、この領域は、本発明において特に重要である。
【００５７】
３．単一血液試料中の多数の微生物の解析及び確認。  
４．コロニー形成からの病原体の識別（以下でさらに論じる）。  
５．発症前暴露個人の測定。  
６．非感染／毒素暴露への拡大。  
７．全ての研究について比較するための正規基準(normal baseline)の確認。
【００５８】
上記及び本明細書に記載の具体的態様に基づいて、本発明は、治療選択肢を指示する機会を提供する。すなわち、遺伝子発現パターン（基準の健康及び病気の両方）を決定することによって、専門家は、診断法及び対応する処置を決定することができるであろう、すなわち個人が細菌感染症（抗生物質を与える）を有するか又はウイルス感染症（抗生物質がない）を有するか否かを決定することができるであろう。このようにして、医学専門家は、不適切な抗生物質の使用を減らし、抵抗性を減らし得る。
【００５９】
また、本発明は、治療に対する応答を測定するのに使用し得る−すなわち、宿主が感染から回復しつつあるという証拠があるか？ を判断するのに使用し得る。時には、個人は呼吸器感染のために入院し、治療を受けるであろう、彼らは快方に向かうと思われるが、この場合には再度発熱を生じる−発熱の原因は以下にあり得る：すなわち、新たな感染−静脈ラインが感染しているか又は患者はフォーリーカテーテルを内在することによる尿路感染症を発症している−典型的には、複合検査は、感染の新たな部位があるか否かを調べるために送られた血液、尿、痰でなければならない。また、入院している間に極めて重篤な患者で発症する膵炎又は胆嚢炎のような病気は、入院後に発症する発熱の感染源であり得ない。本明細書に記載の遺伝子発現は、単一試料、血液を採取し且つ発熱の非感染源からの感染を識別し及び解剖学的部位での新たな病原体が新たな発熱に関与するか否かを確認する手段を提供する−例えば、個人が肺炎連鎖球菌で入院し、これと一致した遺伝子発現パターンを有するが、病院で新たな発熱を生じ、黄色ブドウ球菌（皮膚病原体）感染症と一致した変動遺伝子発現パターンを有する場合には、新たな遺伝子発現パターンは、開業医に新たな感染源についてＩＶ部位及びその他の皮膚の部位、例えば褥瘡性潰瘍を検査するように向けるであろう。遺伝子発現パターンが感染因子に対する反応と一致すると思われなかった場合には、開業医は、膵炎又は胆嚢炎のような診断を考慮すべきである。入院中の熱の発生は、稀でなく、特に集中治療室の重症患者では健康管理開業医には当惑させる問題である場合が多い。従って、本明細書に記載の技術は、医療専門家に十分に受け入れられるであろう。
【００６０】
本発明は、本発明の前には多量のグロビンＲＮＡによる妨害のために全血発現プロファイリングについて有効であると実証されていなかった市販技術（Affymetrix Human Genome U133 チップセット）の首尾よい適合の後に達成された（２０）。本発明の実施可能性の実証は、部分的には、高められた試料調製法〔例えば、PAXgene（商標）〕を用いることによって促進された。また、厳密なスクリーニング及び制御機能を用いることによって、本発明は、それによって得られたデータがその他の遺伝子監視研究全体に広がる混同する環境の影響がないという大きな利点を提供する。さらにまた、様々な熱性呼吸器疾患を識別するのに使用される遺伝子産物は、全ゲノム転写監視又は付随する処理工程を必要としない様々な別のアッセイタイプを標的とすることができる。
【００６１】
本明細書において、本発明者らは、高密度ＤＮＡマイクロアレイ技術を、感染症の血液転写マーカー並びに健康的、職業的及び軍事的重要性について重要なその他の因子の発見のために促進された系に挿入するのに適合させることができることを実証する。
【００６２】
宿主遺伝子発現プロファイリングを考慮すると、何千ものアッセイを同時に実施することができる能力は、データ解析、保存及び管理に関して課題を有する。データ保存及び管理の問題、情報技術専門家にとって大きな技術的な関心事であるが、解析技術に関する明確な合意が宿主遺伝子発現プロファイルを利用するために明らかになっていない。バイオインフォマティクスが果たす主要な役割は、検出の手段を提供し得るだけではなく、病気の開始及び進行の基礎となる遺伝的ネットワークの解明も提供し得る病原体に対する反応に関連したパターンの識別である。遺伝子発現プロファイルの解析のための最も一般的に利用されているツールは、基本的仮説が遺伝子調節の相対振幅において、距離の測定によって計算される類似傾向が機能の類似性を暗示するということにある階層的クラスタリング（２１、２２）である。
【００６３】
大きなデータファイルの解釈に重要な必要性は、情報の視覚化であり、これはクラスター解析から誘導することができるデンドログラムによって容易に達成することができる。発現プロファイリングデータの解釈は、遺伝子機能について深い洞察を得るのに使用されている。統計学的アルゴリズムと併用される酵母において発現された遺伝子のクラスタリングは、調節性転写サブネットワークのモデルをもたらした（２３）。クラスタリングの有用性の有意な実証は、Hughesらによって提供されており（２４）、そこでは３００の多様な酵母突然変異の発現プロファイルの概要が、数種の細胞機能のタンパク質をコードした新規な読み取り枠を識別するのに使用された。病原体検出に関して、個々の発現プロファイルによって反映される種々の病理学的状態もまたクラスター形成し得る（遺伝子によるよりもむしろアレイによるクラスタリング）が、広範な遺伝子又はディメンションの間の変化が、病原体暴露状態を見分ける能力を低下させ得る。
【００６４】
癌研究に関連した機能的ゲノミクスにおける努力は、遺伝子発現サインの追跡において大きな成功をもたらした。発現に基づく基準又はクラス分類予測値(predictor)が、近隣解析（２５）、ベイズ回帰モデル（２６）、及び人工神経ネットワーク（２７〜２９）に基づいて定義された。これらの予測値が、臨床的評価に一致した方法で新規な試料を分類するのにうまく使用された。事実、遺伝子発現だけに基づくか又はクラス発見に基づく分類もまた実証されており、遺伝子発現プロファイリングがこれまでに定義されていなかったサブタイプを識別する能力を有することを示唆している（２５）。
【００６５】
見込みがあるが、癌系統遺伝子発現解析は、一次元であることを認めるべきであり；一方、病原体暴露によって誘発された宿主発現プロファイルは、一時的であり且つ“用量依存性”であることが予期されるであろう。病原体暴露についての時間的範囲及び用量範囲を調査する遺伝子発現プロファイルの包括的セットは、一連の遺伝子発現変化を地図化するために作成されなければならない。
【００６６】
本発明は、部分的に、種々の病気表現型をもつヒトの比較的大きな試料由来のＰＡＸ管からのＲＮＡ品質の厳密な評価に基づいて、下記：すなわち（ａ）健康である、（ｂ）回復した、（ｃ）アデノウイルス感染による発熱がある、及び（ｄ）アデノウイルス感染なしで発熱があるの４つの表現型を最適に分類できる遺伝子のネストされたセット（nested sets）；上記４つの表現型の間の種々の遺伝子のリスト；並びにアデノウイルス感染 対 非アデノウイルス感染による呼吸器疾患に関与する血液細胞の経路を調べるために開発された。これらの結果は、母集団レベルで全血からの遺伝子発現の測定に関与する可能性及び問題点を実証し；病原体分類を識別するために血液細胞における宿主遺伝子発現反応の使用可能性を示し；アデノウイルス性呼吸器疾患に関与する機能的経路を明らかにし；且つ他の関心の生物学的疑問に答えるために統計学的モデルを開発するためのデータセットを提供する。
【００６７】
本発明は、本発明者らが米国空軍のＢＭＴ母集団を利用できる結果として完成された。ＢＭＴ母集団は、監視研究について利点を提供した。主な利点は、ＢＭＴ母集団が、人種的に及び民族的に多様であり、米国で認められる人種的及び民族的多様性を代表していることである。ＢＭＴ母集団は、喫煙、運動、ストレス、学校教育（教育）、日常生活動作を含めるために他の母集団の環境要因に似た環境要因を経験し；日常生活動作は、前記母集団の対応一般市民よりもより厳格に管理されていると思われるが、これら母集団は、典型的なスケジュール（早い朝食、訓練、６時間の教育、規則正しい昼食及び夕食、寮の清掃又は夕方のＴＶ）を大きく反映している。これらの特徴は、多数の調査質問に都合がよいことである。ＢＭＴ母集団と一般市民母集団の間の一つの相違は、ＢＭＴ母集団では性別の優位性があり（男性９０％、女性１０％）且つ年齢範囲が典型的には１８〜２５歳であることである。このことを扱うために、本発明者らは、この研究を、上気道感染症の症状をもつ診療所及び病棟に居住する１８歳以上の全ての年齢の個人（男性及び女性）を含む一般市民母集団に広げつつある。比較的一様な母集団における差次的遺伝子発現プロファイルに帰することができることは、軍事用途に直接に応用することができ、より大きな母集団について予測するであろうマーカーのサブセットの発見に必要な方法の開発を可能にする。
【００６８】
試料調製
研究団体の中には、血液は広範なウイルス及び細菌感染症に対する免疫反応と関係がある最もよい範囲の遺伝子発現バイオマーカーを提供するであろうという少なからぬ推測があった。種々の血液細胞単離キット及び試薬が、例えば血液を採取し、遠心分離後にＰＢＭＣを分離することができるＣＰＴバキュテーナー管（Beckman Dickenson）；Paxgene Blood RNA System（これは、血液採取用のバキュテーナー管内にＲＮＡ安定剤試薬を有する）；及び安定剤を有するが市場では比較的新しいApplied Bioscience製のTempus血液採取管が、血液細胞を採取し、遺伝子発現解析用のＲＮＡを単離するのに有用であり得る。
【００６９】
Relman（１８）は、PAXgeneを使用して、ｃＤＮＡ及び長いオリゴヌクレオチド（７０ ｍｅｒ）マイクロアレイを使用して血液中の遺伝子発現変化をうまく測定した。しかし、多施設監視に実用的な取り扱い条件全体にわたるＰＡＸ管中のＲＮＡの安定性は、評価されなかった。Relman（１８）は、全てのＰＡＸ管を採取の２４時間以内に処理した。これは大規模多施設監視には実用的ではない。また、原則として、より高度な配列分離は、関心の全ゲノム領域を覆う高密度プローブタイリングを有する短い（２５ ｍｅｒ）オリゴヌクレオチドアレイ（例えば、Affymetrix GeneChip）を使用して得ることができる。しかし、従来の観察結果は、PAXgeneがAffymetrix GeneChip発現マイクロアレイで不十分な数の“％ present”call（すなわち、Affymetrix GCOS遺伝子発現ソフトウエアで測定されるような測定可能に発現されると決定された全遺伝子の割合）を生じたことであった。おそらくは、十分でないレベルの“％ present”callは、多量のグロビンＲＮＡのより少ない量の転写マーカーの結合に対する干渉によって生じたと考えられる。従って、本明細書に記載の報告の前には、PAXgene血液ＲＮＡキットとAffymetrix GeneChip（登録商標）プラットフォームの併用について従来報告はなかった。
【００７０】
ロジスティックな観点から、PAXgene技術の使用は、病原体の移動ヒト母集団との日和見的接触中の発現マーカーの検出に極めて好ましいであろう。これは、制御された暴露及びサンプリング時間を使用する制御された実験室環境よりもむしろ、軍隊の臨床設定における保存及び処理時間並びに条件を変化させることによって引き起こされる可変性ＲＮＡ分解及び遺伝子発現摂動の交絡効果を最小限に抑える、細胞中の遺伝子発現を迅速に終結し且つ採血時にＲＮＡを安定化させるPAXgene試薬の独特な能力の提案（proposition）による。伝統的に、血液細胞の研究は、細胞選別、ゲノタイピング、及び発現プロファイリングなどの解析用の生存単核細胞を採取するために、密度勾配に基づく方法を利用する。しかし、ＲＮＡ母集団は、転写物量は血液採取後に早期に変動し得るので、生存細胞の処理により変化又は分解してしまい得る（３０〜３２）。さらに、これらの方法は、好中球を単離しない。好中球は、典型的には密度勾配に通し且つ解析のために採取されない。これらの方法は、大きな労力を必要とし、機動性のある母集団には十分に翻訳しない。これに対して、ＰＡＸ管は、ＲＮＡ分解を抑える専有の溶液を含有し、遺伝子２.５ｍｌの血液として遺伝子導入がこの管に注がれる（３０〜３２）。しかし、血液細胞は、死滅し、保存できないし、ＤＮＡもまたＰＡＸキットハンドブックに記載の手法を使用して単離することができない（３３）。
【００７１】
本発明者らの目標は、診断又は疫学的監視のためにＲＮＡ転写物量を測定することにあるので、本発明者らは、ＰＡＸ管のＲＮＡ安定化能が特に採取直後に血液試料を処理できない状況について本発明者らの関心を補足すると判断した。別の試料調製方法を、これらの別の試料調製方法が試料内に含まれるＲＮＡ物質の完全性を損なわない限りは、本出願の方法に使用し得ることが理解されるべきである。
【００７２】
上記の点からみて、本発明者らは、Affymetrix GeneChip（登録商標）プラットフォームを用いて動作するPAXgene Blood RNA Systemを用いて採取され、処理されたヒト血液から単離されたＲＮＡの遺伝子発現解析用の改変プロトコールを開発した。前記プロトコールは、監視及び臨床研究に実用性を提供し得る２つの方法（条件Ｅ及びＯ）で処理されたＰＡＸ管に採取された血液のプロファイルを比較するのに使用された。これらの方法は、血液試料をＰＡＸ管に採取し、次いで、（ａ）試料を室温で最小限２時間インキュベートし（条件Ｅ）、次いでＰＡＸ管採取血液試料からＲＮＡを単離するか、又は（ｂ）試料を室温で９時間インキュベートし、次いで−２０℃で６日間保存し（条件Ｏ）、次いでいでＰＡＸ管採取血液試料からＲＮＡを単離することを必要とする。
【００７３】
本発明者らは、上記２つの処理方法（しかし、これらの条件のいずれも本発明との関連で使用し得る）の間に相違を見出した。条件Ｅの試料は、条件Ｏの試料よりも高いＤＮＡ混入物、低い全ＲＮＡ収量及び高い二本鎖ｃＤＮＡ収量を有していた。ＡＮＯＶＡにより、上記２つの条件は、遺伝子発現量の相違に寄与するが、その大きさは最小であり、全変動の０.０９％であることが示された。これらの結果は、発現プロファイリングプロトコール及び処理方法の臨床及び監視レベル手順(procedure)への組込みを促進するであろう。
【００７４】
臨床診断及び疫学的監視に関連してヒト血液試料のゲノム規模での発現研究は、多数の難題に直面している−主要な難題の一つは、転写物量の信頼できる検出を生じることができることである。多数の要因が、標的検出の変動、例えば：血液採取の方法、試料処理、ＲＮＡ安定化、ＲＮＡ単離及びその他の後処理プロセスに寄与する。
【００７５】
Affymetrix（登録商標）GeneChip（登録商標）プラットフォームは、トランスクリプトームの重要なサブセットを測定することができる。設計において、それは、ＲＮＡ母集団から増幅される標識されたcＲＮＡ標的を検出するためにフォトリソグラフィーによって製造されるＤＮＡオリゴヌクレオチドマイクロアレイを内蔵する。しかし、ある研究室では、血液採取又は処理方法にかかわらず、単核細胞由来のＲＮＡに比べて、全血由来のＲＮＡを使用して検出される低い割合の遺伝子を観察している。この現象は、網状赤血球由来のＲＮＡによる白血球ＲＮＡの希釈、単離操作中の白血球の活性化、及び／又はＰＡＸ管から単離されたＲＮＡの分解に起因し得る。
【００７６】
室温で、−２０℃で、−８０℃で保存されるか、又は凍結−融解サイクル後に保存されるＰＡＸ管中の血液から単離されたＲＮＡは、数個の遺伝子についてアガロースゲル上のリボソームＲＮＡバンド、バイオアナライザー（Agilent Technologies）上の蛍光プロファイル、又はＲＴ−ＰＣＲで調べられるように、安定であることが明らかにされている（３１、３４〜４５）。しかし、Affymetrixマイクロアレイで測定されるトランスクリプトーム量でのＲＮＡの完全性は、調べられていない。多施設疫学的研究に関連して、試料採取の時点で並びに試料保存及び輸送中にトランスクリプトームを安定化させる必要がある。従って、本発明者らは、２つの方法（上記の条件Ｏ及びＥ）で処理したＰＡＸ管に採取した並列血液試料の遺伝子発現プロファイルを比較した（図１）。第一の方法（図１．条件Ｅ、新鮮である）では、ＲＮＡは、静脈切開から２時間の最小インキュベーション時間後に抽出された；これに対して第二の方法（図１．条件Ｏ、凍結された）では、血液は、室温で９時間そのままにしておき、次いで−２０℃で６日間保存し、次いでＲＮＡ抽出した。遺伝子発現に関連したようにこれらの２つの方法の間に差がなかった場合には、これは、処理されるか、あるいは輸送又は後処理のために凍結しなければならない前に合理的な時間枠を考慮するであろう。さもなければ、相違を考慮に入れ、試料取扱い、保存及び処理の柔軟性、実用性及び可能性に対するトランスクリプトーム変動性に対するその寄与をよく考える必要がある。
【００７７】
本明細書において、本発明者らは、信頼できる遺伝子発現プロファイルを作成し、PAXgene（商標）Blood RNA Systemを使用して全血から単離されたＲＮＡ及びGeneChip（登録商標）システムを使用することができる品質保証及び管理プロトコールを述べる。本発明者らは、このプロトコールを使用して、図１に図で示した方法で処理したＰＡＸ管採取血液の品質管理（ＱＣ）測定基準と遺伝子発現プロファイルを比較した。これらの結果は、臨床研究のためのプロトコールを方向付け、診断及び監視においてトランスクリプトームを使用するという目標に向けて本発明者らを進ませる。
【００７８】
本発明者らの結果は、多施設研究のための試料取り扱いに関して幾つかの提言を暗示する。前記の２つの条件同士の間に相違があるが、これら２つの条件は両方共に良好な群内信頼性を示したことから、変動を抑えるために好ましくは一つの方法を選択すべきである。いずれの場合でも、試料を処理し、凍結しなければならない前に時間を充て且つ凍結中の輸送を考慮したことから、条件Ｏは、条件Ｅよりも都合がよいと思われた。前記２つのの条件の間の取り扱い方法の範囲について柔軟性が必要とされる場合には、以後の解析中に、統計学的厳密性が高められる限りは、これはさらに可能であろう。
【００７９】
従って、本発明の好ましい具体的態様において、血液試料は、マイクロアレイ解析のために以下の一般的プロトコールに従うことによって得られ、調製される：
（ａ）血液採取
−  ＲＮＡ安定化試薬を有するＰＡＸバキュテーナー管を使用することが好ましい；
−  あるいは、当業者は、数滴の血液を得るために毛細管を使用し、次いでＲＮＡを安定化させるためにＲＮＡｓｔａｔに配置してもよい；
−  別の代替法は、Applied Biosystems製のTempus管の使用であり、これもまたＲＮＡ安定化試薬を有する；
−  また、本発明の範囲内で、当業者は、数滴の血液からの単細胞を使用し、試料をマイクロ流体チャンネルに通して、トランスクリプトームを含む細胞について種々の物を測定する種々のステーションに送ってもよい。そのようにすることにおいて、この技術は、ＲＮＡを安定化させる必要がない十分な迅速測定法を提供し得る；
【００８０】
（ｂ）標的ＲＮＡ単離
−  ＰＡＸ管を使用することが好ましく、ＰＡＸキットシステムは、製造業者の取り扱い説明書に対する改良（本明細書の別の個所に記載した）を用いて標的ＲＮＡを単離するのに使用される；
−  市販されており且つ本発明で使用し得る別のキットとしては、安定化溶液においてではなく全血からＲＮＡを単離するために、Qiagenから市販されているキット（例えば、Qiamp）、又はZymogenから市販されているキット、あるいはGentraから市販されているキットが挙げられる；
−  また、使用に適したものは、高速処理法で血液からＲＮＡを生成するのに利用できるロボット装置である；
【００８１】
（ｃ）標的ＲＮＡの標識及び／又は増幅
−  好ましくは、標的ＲＮＡの増幅のために、精製ＲＮＡを、ｃＤＮＡに逆転写し、次いでその後の生体外転写のためにＴ７プロモーターを用いて二本鎖ｃＤＮＡに逆転写して、得られるcＲＮＡ標的を増幅し、標識する；
−  あるいは、十分な量のＲＮＡが血液から単離される場合には、ＲＮＡは、蛍光色素又は高感度検出のために、従って時間節約を提供するために高い光出力をもつその他の分子を用いて直接標識することができる；
−  その他のＲＮＡ増幅及び方法、例えば以下に限定されないが、必要とされるＲＮＡの初期量を減らし且つ処理時間を減らすために１サイクル及び２サイクルを使用するＯｖａｔｉｏｎ ＲＮＡ増幅技術（Affymetrix）も使用し得る；
【００８２】
（ｄ）マイクロアレイへのハイブリダイゼーション
−  標識した標的のGeneChipマイクロアレイへのハイブリダイゼーションについてAffymetrixハイブリダイゼーションオーブンを４５℃で１５〜１７時間使用することが好ましい。条件、例えばインキュベーション時間及び温度は、感度及び精度が維持される限りは、さらに部分変更してもよい。  
−  その他のプラットフォーム（他の個所に記載される）が、ハイブリダイゼーション時間を短くすることが可能であり得る本発明で使用するのに適当であり得る；
【００８３】
（ｅ）結合標的ＲＮＡの検出
−  ストレプトアビジンフィコエリトリンを使用してビオチンを標的ＲＮＡ表面に結合し、次いでビオチン化抗ストレプトアビジン抗体を用いてさらに１回増幅し、別にストレプトアビジンフィコエリトリンを用いて染色して感度を高めることが好ましい；
−  あるいは、この工程は、消光することなくさらに光を発することができる分子を用いることができる。このような分子の例としては、量子ドット、alexi色素、又はビオチン化ウイルスが挙げられる。それによって、検出及び／又はハイブリダイゼーション時間を短縮し得る；
【００８４】
（ｆ）データ統合及び解析
PaxGeneに基づいた方法は本発明において十分に機能するが、本発明はさらに最適化方法を熟慮し且つ含む。現存プロトコールに対する一つの調整は、ＲＮＡ単離中のプロテイナーゼＫの増加を省くことである。この目的のために、幾つかの報告書は、十分なペレット形成が遠心分離時間を単に長くすることによって可能であることを述べている。従って、プロテイナーゼＫ増加の省略に付随して遠心分離時間を長くすることも可能である。別法として、タンパク質Ｋ消化工程は、より濃縮されたプロテイナーゼＫ及びより短いインキュベーション時間を使用することによって短くし得る。また、ｍＲＮＡ溶出中の溶出液の容量は１００μｌであったが、２００μｌの全溶出液がよりよい収量を提供し得る。溶液中ＤＮアーゼ処理は、ＤＮＡの除去を確認するのに使用された。しかし、オンカラムカラムＤＮアーゼ処理後に残るＤＮＡの量は、以後の工程を妨害しないだろう。
【００８５】
さらに、PaxGene技術それ自体について調製時間を改善するために、細胞を回収するのに細胞のペレット化するために管を遠心分離するよりもむしろ真空濾過法を使用し得る。別の許容される部分変更は、砕片を所定時間（例えば、３０分）遠沈するよりもむしろプロテイナーゼＫ消化後に上清を回収するのに濾過法を使用することである。ロボットシステムも液体処理時間を相当に短くするのに使用し得る。
【００８６】
現存プロトコールの代替について、他の関連試料採取法及びトランスクリプトーム測定技術を使用し得る。これらとしては、以下が挙げられる：
１）Applied Biosystems製のTempus（商標）血液採取管；
２）Becton Dickenson製のＣＰＴ（商標）細胞調製管、これは生存細胞を回収することができ且つ遠沈後に末梢血単球を単離することができる；
３）ナノワイヤ上のオリゴマープローブのナノアレイ及び マイクロフルイディクスチャンネルを流れる単一細胞からのトランスクリプトーム測定；
４）数滴の血液を採取し、次いでおそらくは赤血球の溶解及びＲＮＡ安定化のためにＲＮＡLater中での保存のための毛細管。次いで、必要とされる場合には、ＲＮＡは、血液細胞から他のキット、例えばQiagen製のQiampキット又はZymogen製の血液ＲＮＡ単離キットを使用して抽出することができる。
【００８７】
さらなる代替及び／又は追加調製法もまた考慮され、これらは時間を短くし且つ初期入力ＲＮＡ量を減らし得る、例えば：
１）全ＲＮＡ又はポリＡ ＲＮＡを増幅せずに直接標識できる Affymetrixによって公表された新規な方法（４６）(Cole K、et al. “Direct labeling of RNA with multiple biotins allows sensitive expression profiling of acute leukemia class predictor genes.” Nucleic Acids Res. 2004 Jun 17；32（11）:e86.）；
２）例えば、MirusによるLabellT（登録商標）μArray（商標）ビオチン標識キットの方法によるＲＮＡの直接化学標識化；
３）NuGEN Technologies、Inc.から入手できるOvationキット、これは、ほんの１５ｎｇのＲＮＡを使用して４時間内で多量のＲＮＡを生じさせることができる。この技術は、ほんの数滴の血液を必要とするだけであるのでＰＡＸシステムの直接置換を可能にし得る；
４）Dynalbiotech製のDynabeads(登録商標) mRNA DIRECTTM Kit、これは磁性ビーズを使用して単一の管内で１５分内にｍＲＮＡを抽出する。全血を使用して行うことができる。  
５）Ambionから入手できるMessageAmp（商標）II RNA Amplification Kit。
【００８８】
また、試料調製の感度を高めるのに考慮される他の方法としては、以下の方法が挙げられる：
１）非標識グロビンＲＮＡ又はＤＮＡをハイブリダイゼーション工程に加えてバックグラウンドをブロックし、それによっておそらくは検出呼出し(detection call)を高める；
２）磁性ビーズ単離によるグロビンｍＲＮＡの除去；及び
３）チップ上により多くのcＲＮＡの添加及び／又はアイテム＃２のようにバックグラウンド低下。
【００８９】
上記のように、本発明は、多量のグロビンＲＮＡによる妨害のせいで、全血発現プロファイリングに有効であることがこれまでに実証されていなかった市販の技術（Affymetrix Human Genome U133 チップセット）の首尾よい適合の後に達成された（２０）。従って、全血ＲＮＡについてのグロビン減少は、全血試料からの遺伝子発現プロファイルを向上させる重要な工程である。なぜならば、全血試料中の７０％の全ＲＮＡがグロビンｍＲＮＡであり、これは低下した％ present call、低下したcall concordance及び高められた信号変化をもたらすであろうという理由からである。
【００９０】
実施例４において、本発明者らは、全血ＲＮＡ由来のグロビンｍＲＮＡを減らすために２つの最も効果的な方法であることを証明するビオチン化グロビンオリゴ（Ambion）及びＰＮＡオリゴ（Affymetrix）を評価した。しかし、これまでに、これらの２つの方法から誘導される遺伝子発現プロファイルに関して系統的な比較はなかった。Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡと、ＲＮＡと同時にＪｕｒｋａｔ ＲＮＡ（ＪＧ）に加えられたグロビンとを使用する本発明者らの研究は、遺伝子発現プロファイルにおけるcＲＮＡプロファイル、％ call、call concordance、信号変化、多次元尺度構成法及び階層的クラスター解析についてこれら２つの方法同士の比較の詳細な洞察を提供する。
【００９１】
２つのグロビン減少方法のいずれもＪｕｒｋａｔ ＲＮＡと同じ遺伝子発現プロファイル（ｇｘｐ）を与えなかったが、ビオチン化グロビンオリゴを使用するグロビン除去方法は、ＰＮＡ法よりも近いｇｘｐを与えた。実施例４に示したデータは、グロビン除去ＲＮＡが、Ｊｕｒｋａｔ及びＪＧ ＲＮＡにおける単一工程ＰＮＡ減少法と比べて、著しく高いpresent call数（％）、高いcall concordance ％、低い偽陰性率発見、及び非グロビン対照に近い遺伝子発現プロファイルをもたらすことを示す。しかし、それはまた、ＰＮＡ法と比べて、高い信号変化、低い三重（triplicate）相関係数及び非グロビン対照との相関関係において相違がないことをもたらした。おそらくは２時間の処理時間を必要とする多工程操作によると思われる。ＲＮＡ混入物のない高純度ＲＮＡがグロビン除去方法に必要とされ、Rneasy Mineluteカラム（Qiagen）を使用する清浄化及び濃縮に供されるべき溶液中DNアーゼ消化paxgene ＲＮＡを必要とすることは注目に値する。それに対して、単一工程ＰＮＡ法は、下流application tubeにオリゴ混合物を加えることによって簡単に行うことが容易である。しかし、本発明者らは、３´／５´GAPDH及び３´／５´アクチンの高い比がpaxgene ＲＮＡ試料中に現れ且つ小さいcＲＮＡサイズがＰＮＡ処理paxgene ＲＮＡ中に現れることを認めた。cＲＮＡサイズの低下は、２つの対照プローブセットの高い比を招き得、おそらくはpaxgene ＲＮＡを用いて認められる高いＣＶの原因である。
【００９２】
ＰＮＡオリゴは、グロビンｍＲＮＡの３´末端に特異的にハイブリダイズした。これに対してビオチン化捕捉グロビン特異的オリゴは、グロビンｍＲＮＡにハイブリダイズさせ、次いでストレプトアビジン磁性ビーズでグロビンｍＲＮＡを除去した。従って、グロビン除去法は、グロビンｍＲＮＡを試料から物理的に分離することから、非３´バイアス方法を下流で、例えば標的調製のためのグロビン除去ＲＮＡの直接標識化を可能にした。グロビン除去法は、２.０を越えて２６０／２８０の比で良好な品質のＲＮＡを生じる。しかし、Ｊ及びＪＧ  ＲＮＡからではなくpaxgene ＲＮＡから、cＲＮＡ収量は、未処理又はＰＮＡ処理試料の量の半分に低下し及び少なくとも５μgのpaxgene ＲＮＡがハイブリダイゼーションに十分な量のcＲＮＡを得るために必要である。これに対して、ＰＮＡオリゴで処理した１μgのpaxgene ＲＮＡは、ハイブリダイゼーションに十分な量のcＲＮＡ（約２０μｇ）を増幅することができる。
【００９３】
要するに、本発明者らは、グロビン除去法とＰＮＡ法について良い点と悪い点を比較した。この比較に基づいて、本発明者らは、これらの方法は両方共に全血ＲＮＡ中のグロビンの量を減少させるのに使用し得ることを見出した。方法の選択は、個々のプロジェクト設定及び目標に依存する。しかし、これらの方法の一つを用いることによっていずれのシナリオでも、著しく高い数のcpresent all（％）、高いcall concordance ％、低い偽陰性発見及び非グロビン対照に近い遺伝子発現プロファイルを得ることができる。
【００９４】
前記に基づいて、本発明者らは、１種又はそれ以上の種々の感染性病原体にすでに暴露されている被験者において健康である、発熱がある、又は回復期にあるという間を識別するための遺伝子発現マーカーを確認する方法を開発した。
【００９５】
一般的に、本発明の好ましい方法は、次の通りである：
ａ）試料採取；
ｂ）前記試料からのＲＮＡの単離；
ｃ）前記試料からのＤＮＡ混入物の除去；
ｄ）ＲＮＡの任意の濃度及び清浄化；
ｅ）標準化のための添加(spike-in)対照；
ｆ）任意のグロビンｍＲＮＡ減少／排除；
ｇ）ｃＤＮＡの合成；
ｈ）ＩＶＴ（生体外転写）標識化及びｃＲＮＡ合成；
ｉ）cＲＮＡ定量及び品質管理；
ｊ）遺伝子チップハイブリダイゼーション、洗浄、染色及び走査；
ｋ）任意の第二の遺伝子チップハイブリダイゼーション、洗浄、染色及び走査；
ｌ）データ取得及び管理；及び
ｍ）統計学的解析。
【００９６】
この好ましい態様を含む本発明の文脈の範囲内で、試料は全血であることが好ましい。しかし、本発明の文脈の範囲内で、ＲＮＡ源は、全血由来のものであろうと又は幾つかの他の供給源から抽出されたものであろうと、利用し得る。好ましい態様において、並びに前記のように及び実施例において、試料が全血である場合には、採取デバイスはPAXgene 血液ＲＮＡ管である。
【００９７】
この好ましい態様を含む本発明の文脈の範囲内で、ＲＮＡは公知のＲＮＡ単離法で単離し得る。前述のように、ＲＮＡ単離法は、市販のキット、例えばPAXキットシステム又はQiampの使用によって容易になり得る。好ましくは、ＲＮＡ単離は、オンカラムＤＮアーゼ処理無しで行い得る。また、本発明の態様において、ＲＮＡ単離は、Qiashredderカラム（Qiagen Corp.）を用いて行い得、これは病気の被験者から得られた試料から得られるＲＮＡの収量を増加させるのに役立つ。
【００９８】
この好ましい態様を含む本発明の文脈の範囲内で、ＤＮＡは公知の方法で除去し得る。好ましい態様においては、ＤＮＡは試料から溶液中(in-solution)ＤＮアーゼ処理によって除去される。ＤＮアーゼ処理は、不活性化試薬を用いるか又は用いずに行い得る。不活性化試薬の使用の場合には、不活性化試薬はＤＮアーゼ処理の開始後の所定期間後に加えることが好ましい。この場合には、所定期間は、試料中に残るＤＮＡの量で設置することが好ましい。ＤＮアーゼ不活性化試薬を使用しない場合には、その後にグロビン除去法のためにＲＮＡをきれいにし（従って、ＤＮアーゼ及び金属イオンが除去される）、濃縮するのにカラムを使用するからである。
【００９９】
この好ましい態様を含む本発明の文脈の範囲内で、ＤＮＡは必要ならば濃縮し、浄化してもよい。本発明の好ましいプロトコールにおいてその後の方法について、浄化し、濃縮するためにカラムに加える前には、初めに全体で少なくとも８ ＤｇのＲＮＡが存在することが好ましい。それ自体、幾つかの方法の一つ又はそれ以上を使用してＲＮＡを濃縮し、清浄化するのに使用し得る。例えば、Ｍｉｎｅｌｕｔｅカラムが使用し得、ＲＮＡがＢＲ５に溶出される。また、水に再懸濁させながらエタノール沈殿法を使用することができるが、この方法は十分なＲＮＡ（例えば、約１０ Ｄｌ）を浄化しないので、これは下流のグロビン除去と適合しない。また、さらなる濃縮及び／又は浄化が必要であるか否かを調べるために、ＲＮＡ及び／又はその品質は、バイオアナライザー又はナノドロップを用いて評価し得る。
【０１００】
この好ましい態様を含む本発明の文脈の範囲内で、その後の工程〔すなわち、工程（ｅ）〜（ｍ）〕は、全ＲＮＡの出発量は少なくとも５ Ｄｇであるが、１ Ｄｇの出発量がＰＮＡ及び非グロビン減少法と共に機能し得ることが好ましい。
【０１０１】
この好ましい態様を含む本発明の文脈の範囲内で、ｃＤＮＡ合成に先立って添加（spike-in)対照を、被験者ＲＮＡを含有する反応混液に加えることが重要である。この工程は、病気と患者の間の規格化に重要であり、現存技術に対する改良を有する。本発明で使用される添加対照は、ポリＡ対照又はＥＲＣＣ一般対照（http：//www.cstl.nist.gov /biotech/ workshops/ERCC2003/）であることが好ましい。
【０１０２】
前述のように、全血試料中のｍＲＮＡの７０％がグロビンｍＲＮＡであり、これは低下した％ present call、低下したcall concordance及び増加した信号変化をもたらすであろう。それ自体、特に好ましい態様においては、グロビンＲＮＡ内容物は減らされるか又は除去される。この目的のために、“減少される”という用語は、減少処理前の試料と比較して、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８０％、さらにより一層好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％の試料中グロビンＲＮＡの全量の減少があることを意味すると解釈される。本発明の文脈の範囲内で、グロビンＲＮＡの減少は、部分変更された製造業者の手順に従ってビオチン化グロビン捕捉オリゴ（Ambionグロビン除去キット）又はＰＮＡ（Affymetrix GeneChipグロビン除去キット）を使用して行ってもよい（本発明の実施例参照）。
【０１０３】
グロビンＲＮＡ減少方法がビオチン化グロビン捕捉オリゴ類を使用する場合には、ビオチン化グロビン捕捉オリゴ類を全ＲＮＡに加え、次いでＲＮＡ混合物をストレプトアビジンビーズ（例えば、Streptavidin磁性ビーズ）と接触させることによってグロビンｍＲＮＡを除去することが好ましい。グロビン除去ＲＮＡは、磁性ＲＮＡビーズを使用してさらに精製される。別法として、磁性ビーズに基づくＲＮＡ単離工程を、Qiagenカラムクロマトグラフィーに置き換えることができる。いずれの場合も、被験者ＲＮＡは、水又はＢＲ５を用いて溶出することが好ましい（濃縮後に、全塩分含有量が１×ＢＲ５であるか、水を溶出に使用する場合には、少容量にspeedvac濃縮し、次いでＢＲ５を使用して適当な容量まで増やすように希釈することが好ましい）。従って、グロビンＲＮＡ減少方法がビオチン化グロビン捕捉オリゴ類を使用する方法である場合には、前記方法の前及び／又は後に、ＲＮＡを濃縮し、清浄化することが、極めて好ましい態様である。グロビン除去キットに付属している溶出緩衝液(Elution buffer）は、下流speed vac濃縮及びaffymetrix target prepと共に働かないことを認めることが重要である。Ambion試験は、その溶出緩衝液（Elution buffer）をそのMessage Amp target prep方法と共に使用するが、これに対して本発明は、好ましくはaffymetrix target prepを使用する。
【０１０４】
ＰＮＡ法をＲＮＡ減少法として使用する場合には、この工程は、ｃＤＮＡ合成と同時に実施される。この方法において、ＰＮＡは、ｃＤＮＡ合成混液と共に添加される（spiked in）。ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴヌクレオチドは、グロビンｍＲＮＡの３´末端に特異的に結合して、ｃＤＮＡ合成中の逆転写を阻害する。しかし、この方法を用いる場合には、ＰＮＡの安定性を保持することに注意を払わなければならないし、またＰＮＡの凝集及び沈降を防止する処置を講じなければならない。Ｊｕｒｋａｔグロビンを効率的グロビン除去用対照として実施することが望ましいものであり得る。
【０１０５】
前記の方法をグロビンＲＮＡ減少プロトコールの不存在下で実施する場合には、低感度及び高変化が観察される。ＰＮＡ法に従う場合には、感度が高められ、低い変動(variance)が観察されるが、この方法は３´バイアス逆転写アレイのために働くだけである。ビオチン化グロビン捕捉オリゴ法に従う場合には、最もよい感度が得られ、低い変動が観察され、ＲＮＡは、非逆転写アッセイ、例えば非３´バイアスアッセイに使用し得る。ビオチン化グロビン捕捉オリゴ法に関しては、極めて高い品質のＲＮＡが必要とされ、これに対してＰＮＡ法は、高品質ＲＮＡでない場合でも有用である。ERCC対照が使用される場合には、データは極めて異なる遺伝子発現プロファイル全体にわたって標準化され得ることが重要である。
【０１０６】
この好ましい態様を含む本発明の文脈の範囲内で、精製された標的ＲＮＡは、逆転写によって、Ｔ７ポリＴプライマー（又はエキソンアレイの代替として非３´−バイアスアッセイのためのランダムプライマー）を利用してｃＤＮＡに増幅され、次いでその後の生体外転写ためににＴ７プロモーターを用いて二本鎖ｃＤＮＡに増幅sれることが好ましい。二本鎖ｃＤＮＡの生成の後の、二本鎖ｃＤＮＡは、適当ならば清浄化され、濃縮されるべきである。
【０１０７】
この好ましい態様を含む本発明の文脈の範囲内で、市販の生体外転写キットは、得られたcＲＮＡを増幅し、標識するのに使用されることが好ましい。このようなキットの例は、Enzo Biochemから又はAffymetrixから容易に入手できる。これらの方法は、適当ならばその後のcＲＮＡは、製造業者よって指示されたようにして実施し得、適当ならばその後に清浄化を実施し得る。
【０１０８】
この好ましい態様を含む本発明の文脈の範囲内で、cＲＮＡが定量され、cＲＮＡ収量及び試料の純度それぞれを調べるために試料の品質が評価される。追加の濃縮及び／又はさらなる清浄化が必要であるか否かを調べるために、ＲＮＡ及び／又はその品質を、バイオアナライザー、ナノドロップ、及び／又はＵＶ分光光度計（キュベット又はプレートリーダー）を用いて評価し得る。必要ならば、高められたcＲＮＡ収量が必要である場合には、Ambions Message Amp kitを製造業者の取扱説明書に従って使用し得る。この態様内の品質管理の中には、２６０／２８０の比、ｃＲＮＡの収量などがある。
【０１０９】
この好ましい態様を含む本発明の文脈の範囲内で、遺伝子チップ（第一のチップ第二のチップ、又はそれに続くチップ）のハイブリダイゼーション、洗浄、染色及び走査は、標準Affymetrixプロトコールによって指示されているようにして実施し得る。例えば、ハイブリダイゼーションは、約１０ Ｄｇのビオチン組込みｃＲＮＡを遺伝子チップと、Affymetrixハイブリダイゼーションオーブン中で、GeneChipマイクロアレイ上の標識標的のハイブリダイゼーションの４５℃で１５〜１７時間接触させることによって実施し得る。条件、例えばインキュベーション時間及び温度は、感度及び精度が維持される限りは、さらに変更してもよい。また、洗浄及び染色条件もまた、方法の感度及び精度が維持される限りは、さらに変更してもよい。本発明で使用される遺伝子チップの性質、身元及び組成は限定されない；しかし、好ましい態様においては、遺伝子チップは、Affymetrix U133A、U133B、及びU133 plus 2.0から選択される。好ましい態様において、U133 plus 2.0か又はU133A及びU133Bの両方のいずれかを遺伝子チップとして使用することが好ましい。
【０１１０】
以下で論じるように、データの取得及び処理は、当業者に公知の手段で実施し得る。例えば、データの取得及び処理は、手動で又は種々のプログラム、例えば遺伝子チップリーダーを伴う製造業者開発ソフトウエアに通すことによって実施し得る。
【０１１１】
データ管理及び統計学的／関数解析についてさらに完全な考察を、以下の記載及び以下の実施例に示す。
【０１１２】
しかし、手短に言えば、データ管理は、ExcelにエクスポートされるAffymetrix GCOS遺伝子発現ソフトウエアデータを使用することによって行われる。MAS5.0信号及びpresent callは、基準化された及び基準化されていない信号値であるように、標準化仮説及び方法を試験するためにエクスポートされ、タブ区切りテキストファイルとして保存される。テキストファイル（及びファイル名）は、その後にArraytools インハウス(in house) R-scriptに取り込むために再フォーマットされる。QC解析ソフトウエア、datamatrix及びJMP IN （SAS Institute）プログラムが、変動の解析及びさらなるデータ活用に使用される。適当ならば、U133A及びU133BについてのデータがArraytools内で一緒にされる。
【０１１３】
解析ソフトウエアについて、以下を挙げることができる：
統計解析ソフトウエア：ＳＡＳ及びＪＭＰ；
クラス予測解析ソフトウエア：ＢＲＢ−Ａｒｒａｙｔｏｏｌｓ；
クラスタリング解析ソフトウエア：ＢＲＢ−Ａｒｒａｙｔｏｏｌｓ及びｄＣｈｉｐ；並びに
機能解析ソフトウエア：ＥＡＳＥ、ＤＡＶＩＤ、Ｐａｔｈｗａｙ  Ａｓｓｉｓｔ、及びＩｏｂｉｏｎ  Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ。
【０１１４】
病原体暴露から得られる遺伝子発現プロファイルを識別するために及び本明細書に記載の一般技術を可能にするために、以下のプログラムが、アデノウイルスモデル系を用いて着手された。
【０１１５】
ＧＸＰプログラムの詳細
プログラムの説明：
テキサス州サンアントニオ（San Antonio）所在のラックランド空軍基地（Lackland Air Force Base)（ＬＡＦＢ）は、米国空軍の全ての新兵のための基礎軍事訓練の場所である。約４０,０００人の基礎軍事訓練生（ＢＭＴ）が任務の割り当てに先立って６週間の訓練コースを受ける。これらＢＭＴは、狭苦しい場所で食事し、眠り、訓練する５０〜６０人の飛行小隊に組織される。各飛行小隊は、計画行動について同時配置のために接触が多くなる兄弟又は姉妹飛行小隊と対にされ、多数の飛行小隊が同じ寄宿舎に居住する飛行中隊に分けられ、個々の飛行小隊ごとに寄宿舎に細分化される。米国軍隊で軍務に就いている若くて健康な成人は、彼らの一般人仲間と比べて、呼吸器感染症の著しく高められた危険がある。密集及び多数のストレス要因が呼吸器病原体の伝染を容易にする。６週間の基礎軍事訓練コース中に、ＢＭＴの約２０％が発熱及び呼吸器症状を発現するであろう。
【０１１６】
アデノウイルスは、今日、ＢＭＴ母集団に認められる最も一般的な呼吸器病原体である。アデノウイルスワクチンが利用できる以前には、アデノウイルスは、急性呼吸器疾患を有するＢＭＴの３０〜７０％において相次いで単離された。その発生は、命令をできなくする場合が多く、基礎軍事訓練を通して新規訓練生の流れを停止する。１９７１年に、血清型４及び７に対して向けられたアデノウイルスワクチンが、新規軍事訓練生に日常的に利用できるようになった。このワクチンは、訓練生の病気に劇的な効果を有し、全呼吸器疾患を５０〜６０％まで減少させ且つアデノウイルス特異疾患率を９５〜９９％まで減少させた。アデノウイルスワクチンの使用は、製造業者が生産を中止するまで２５年間、途切れることなく続いた。ワクチンの中止後に、症状を示す軍事訓練生からの３４１３個の咽頭培養物のうちの１８１４個が、１９９６年１０月から１９９８年６月までの期間中にアデノウイルスを生じた。当時、アデノウイルス４型、７型、３型及び２１型が単離物の５７％、２５％、９％及び７％それぞれの割合を占めた。現在では、アデノウイルス４型の優位が認められる。アデノウイルスワクチンの中止以降、ＢＭＴの約２０％が発熱及び呼吸器疾患の症状を発現し、これらの６０％がアデノウイルスによるものである。その他の病原体、例えばインフルエンザＡ、肺炎マイコプラズマ、クラミジア肺炎、百日咳菌及び化膿連鎖球菌が、この母集団の小数の呼吸器疾患を引き起こし続けている。混合感染が生じることが知られているが、混合感染に関与する病原体の頻度及び種類は、大部分は特定されていない。混合病原体の消散(resolution)は、本発明者らのグループによる関連特許出願の主題である（２００４年７月２日付けで出願された米国仮特許出願第６０／５９０,９３１号明細書）。本発明において、本発明者らは、多数の病原体を特定することを試みていないが、単一病原体（ヒトアデノウイルス４型；Ａｄ４）の優位を信頼して感染症のカテゴリーを作成し、非Ａｄ４ ＦＲＩ及び回復期Ａｄ４ ＦＲＩからなる別のカテゴリーの感染症の場合と比較する。
【０１１７】
技術の現状では、アデノウイルス及びインフルエンザの血清型及び株の識別は、多大な時間を必要とし、多大な労力を必要とする。アデノウイルスの培養物は、増殖させるのに１週間を要し、その後のアデノウイルス単離物の分類は、取り扱いにくく且つ血清型確認に２〜３週間もの長い時間を要する有意な相互交差反応に供する赤血球凝集阻害及び中和アッセイを使用して行わなければならない。ウイルスが確認される時までに、ＢＭＴは、感染症を多数のＢＭＴに既に伝染させている場合が多い。より迅速な診断アッセイに対する大きな要求があり且つ公衆衛生尺度が適切に指示され得るようにこれら呼吸器感染症発生の疫学を詳しく述べる必要がある。
【０１１８】
さらに重要なことには、特に本発明に関して、感染性病原体に対する個人の暴露を実際の感染に関係させる信頼できる生理学的マーカーを調べるために知られている方法はない。従って、咽頭スワブ又は鼻洗浄液などの試料は、呼吸器病原体の存在のための核酸マーカーを生成し得るが、個人が病気になるか又は病原体（１種又は複数）によって引き起こされる感染症からちょうど回復したか否かを調べるのに利用できる技術は存在しない。また、生物は、気道のサンプリングから回収し得る。一般に、この生物が気道に簡単にコロニー形成しているか又は病気の原因であるか否かは不明であり得る；この生物の免疫学的サインの存在についてアッセイすることは、疾患からコロニー形成の識別の助けとなることが期待される。さらにまた、発熱性呼吸器疾患を示す個人の群の中で、感染の重篤性、又は宿主免疫系との相互作用の程度及び種類を調べる方法は存在しない。本発明は、統計学的に有効な方法でこれらの評価を行う方法を説明する。
【０１１９】
開始基準及び試料採取
遺伝子発現プロファイリングが感染した個人及びアデノウイルス 対 他の感染性病原体を有する病気を識別することができるかを調べるために、本発明者らは、Institutional Review Board（ＩＲＢ）承認の研究を行った（以下を参照）。ＬＡＦＢに到着するＢＭＴは、この研究に参加するためにインフォームドコンセントを受けた。４〜５本のＰＡＸ管を満たす約１５ｍｌの血液が、各ボランティアから採取された。訓練の１〜３日目に、血液試料が標準プロトコール（本明細書の他の個所に記載）により健康なＢＭＴからＰＡＸ管に採取されたが、鼻洗浄液はこの群について採取されなかった。全血球計算値（ＣＢＣ）も得られた。これらの個人は、標準質問表を用いたスクリーニングによって健康であると決定された。基本訓練に着いている４週間内に急性内科的疾患を有する初期ＢＭＴを除外した。
【０１２０】
研究の第ＩＩ相において、１００.４°Ｆを超える温度及び呼吸器症状を有する訓練の後期のＢＭＴは、ＰＡＸ管及びＣＢＣのための鼻洗浄液、咽頭スワブ及び採血に同意した。これらの個人は、アデノウイルス感染症を有する発熱群又はアデノウイルス感染症を有していない発熱群に分類された。時には、アデノウイルスについて迅速抗原捕捉アッセイを使用して、アデノウイルス陰性であった個人を選別した；これは、この群の個人の登録者数を改善するために行った。迅速アッセイの全ての結果は、培養で確認された。
【０１２１】
研究の第ＩＩＩ相において、アデノウイルスを有する発熱ボランティアから試料採取後約３週間目に、彼らが回復し、回復群を形成している場合のこれらの個人から、さらに血液（ＰＡＸ管及びＣＢＣ）及び鼻洗浄液を採取した。
【０１２２】
全てのＰＡＸ管を室温で２時間保持し、次いで−２０℃で凍結し、処理のために７日以内にワシントン ＤＣのNavy Research Laboratory（ＮＲＬ）にドライアイスを用いて発送した。鼻洗浄は、標準プロトコールにより、５ｍｌの標準食塩水を使用して上咽頭を洗浄し、次いで滅菌容器に溶出液を採取することにより行った。鼻洗浄溶出液は、４℃で１〜２４時間保存し、その後に試料採取し、−２０℃で保存し、処理のために７日以内にＮＲＬに発送した。鼻洗浄液及び咽頭スワブは、アデノウイルス、インフルエンザ、パラインフルエンザ１型、２型及び３型並びにＲＳＶの標準ウイルス培養のために送った。鼻洗浄液及び咽頭スワブはまた、アデノウイルス４型について多重ＰＣＲで試験して、この病原体について培養結果をさらに確認した。上記は本研究で採用したプロトコールを記載したが、本発明が、試料の完全性が損なわれない限りは、別の保存及び出荷条件をさらに考慮することが理解される。
【０１２３】
全てのＢＭＴが、病気の発現中の初期発現時に及び追跡時に標準質問表を受けた。ＢＭＴに郵送された質問としては：ワクチン接種履歴、アレルギー、最近の食事、最近の運動、最近の負傷、受けた投薬、喫煙履歴、観察自覚症状及び最近の月経（適当ならば）が挙げられる。質問され、追跡される観察された自覚症状の中に、咽頭炎、鼻づまり、咳（喀痰性又は非喀痰性）、発熱、悪寒、吐き気、嘔吐、下痢、倦怠感、体の痛み、鼻水、頭痛、疼痛 w/深呼吸、及び発疹がある。全てのデータを、個人識別番号及び試料採取日を使用して電子フォーマットで保存した。
【０１２４】
試料採取期間中、化膿連鎖球菌の発生が生じた。咽頭スワブ及び血液試料を、急性疾患ＢＭＴについて及び疾患から回復し、未だ基本訓練中のＢＭＴについて、上記のようにして採取した。化膿連鎖球菌の診断は、細菌培養及びその後のＰＣＲにより確認された。
【０１２５】
本発明を支持する実験について、健康である（基礎訓練の開始前４週間に急性内科的疾患がない）と判定された女性ＢＭＴ全員が研究に適任であった。第ＩＩ相において、Ｔ＞１００.４及び呼吸器症状を有する女性ＢＭＴが、同意に適任であった。以下の実施例に記載の実験において、登録された患者母集団は、１７〜２５歳の女性ＢＭＴから構成された。７０％が白人であり、１２％がラテンアメリカ系であり、１２％が黒人であり、６％がアジア人であった。健康であると判定された３０人のＢＭＴが登録され、発熱及び呼吸器症状を有しており且つび迅速アッセイによってアデノウイルスを有すると判定された（ウイルス培養及びＰＣＲで確認された）３０人のＢＭＴが登録され、発熱、呼吸器症状及び非アデノウイルス感染症を有する１９人のＢＭＴが登録された。前記の発熱、呼吸器症状及びアデノウイルスを有する３０人のＢＭＴは、その疾患からの回復中に別の鼻洗浄及び採血が行われた。
【０１２６】
本発明を支持する実験についてのメタデータは、健康な新入ＢＭＴに標準質問表を提供することによって得られた。これらの個人は、もし彼らが基礎訓練前４週間以内に発熱、鼻づまり、吐き気／嘔吐、排尿による灼熱痛、咳、咽頭炎、下痢又は悪寒を有していた場合には、算入から除外される。基準遺伝子発現に影響を及ぼし得る条件を判定するために、これらの個人は、人種／民族性、ワクチン接種状況、最近の食事の時間、最後の運動の時間、受けたストレス量、アレルギー、最近の傷害、現在の投薬及び喫煙履歴について選別された。
【０１２７】
第ＩＩ相について、ＢＭＴが発熱及び呼吸器症状を示していた場合には、標準質問表を与えた。基準遺伝子発現に影響を及ぼし得る条件を判定するために、これらの個人は、人種／民族性、ワクチン接種状況、最近の食事の時間、最後の運動の時間、受けたストレス量、アレルギー、最近の傷害、現在の投薬及び喫煙履歴について選別された。咽頭炎、鼻づまり、咳、発熱、悪寒、吐き気、嘔吐、下痢、疲労、体の痛み、鼻水、頭痛、胸痛及び発疹を含む呼吸器症状の期間及び種類を、標準形式で記録した。健康診断は、ＢＭＴの病気の徴候を詳述するために標準形式で記録した。受けた投薬の種類及び期間を記録した。
【０１２８】
第ＩＩＩ相について、アデノウイルス性疾患を有するＢＭＴが回復した（発病後１４〜２８日）際に、つい最近の食事の時間、最後の運動の時間、受けたストレス量、アレルギー、最近の傷害、現在の投薬及び喫煙履歴についての質問を含む別の標準質問表を与えた。第II相の質問表からそれぞれの症状の全期間が書き留められ、それぞれの症状から全回復期間が判定された。第ＩＩ相と第ＩＩＩ相の間の投薬使用の詳細な履歴が取得された。
【０１２９】
長期にわたる研究において試料を採取できることは、感染性疾患の経過を通じて遺伝子発現を研究することを可能にする。上記で概説され且つ本出願の実施例によってさらに支持された研究において、本発明者らは、病気からの回復の時間を通じてアデノウイルスを有する疾患であったＢＭＴを特に追跡した。症状の種類及び期間に関する詳細なデータベースは、本発明者らがこれらの要因がアデノウイルス及び化膿連鎖球菌について遺伝子発現サインに影響を及ぼすか否かを調べることを可能にする。また、詳細なデータベースはまた、本発明者らが、最近の病気及び病気の重症度（例えば、病気／症状の予測される期間）に対して早期に識別することを可能にする。
【０１３０】
最近の食事、最近の運動、受けたストレス量、最近の傷害、現在の投薬及び喫煙履歴などの情報の詳細且つ標準化された収集は、交絡変数(confounding variable)のコントロールを可能にし、確認された遺伝子発現パターンが具体的病原体の特異的免疫学的痕跡であるという結論を増強する。この収集情報はまた、このような条件が母集団の遺伝子発現パターンに著しい影響を及ぼすか否かを調べるのに使用することができる。これらの因子が必要であるか否かの統計学的評価又は正確な分類についての交絡(confounding)は、これらについて将来の実験及び応用を監視する必要があるか否かを決定するであろう。
【０１３１】
将来は、病気の種々の段階での個々の病原体についての遺伝子発現パターン（免疫学的サイン）は、罹病率及び死亡率を予測するのに使用し得る。これは、医療専門家が適切なケアのレベル（使用すべき投薬の種類、病院に入院を必要とするケアのレベル又は外来患者環境においてケアを提供する必要があるケアのレベル）を決定する助けとなり得る。現在、呼吸器感染症（特に肺炎）を有する個人を病院に入院させるべきか（及びケアのどのレベルまで）を判定するアルゴリズムが存在し、これらのアルゴリズムは、発熱の程度、心拍数、呼吸数、血液ガス及び血液化学物質のような因子に依存する(４７、４８)(４９)。遺伝子発現による病人の免疫学的活性化の状態の詳細な理解は、病気の重症度を判定するのにさらに役立ち得る。
【０１３２】
また、特定の感染性疾患から回復する個人において、本明細書に記載の発明の技術に基づいた遺伝子発現パターンを理解することは、過去の発生の法医学解析を可能にするであろう。その後に、この情報は、ある種の病原体が特定の地理上の地域に生来特有であるか否か又は新たな感染症が地域に持ち込まれているか否か（例えば、どのくらい多くが既に西ナイルウイルスに感染しているか？）を判定するのに使用し得る。
【０１３３】
また、個人について、本発明は、これらの個人が過去に特定の感染性病原体に感染しているか否かの判定を可能にし、及びこの情報から同じ生物又は関連生物による将来の感染に対する免疫性／保護の可能性を判定する。このような情報は、ワクチン接種又は予防が特定の配置中である／配置された軍隊又は病院従事者に必要であるか否かを導くことができることから、役立つであろう。
【０１３４】
“実世界(real world)”シナリオにおけるＰＡＸ管の使用の評価
ＰＡＸ管を使用する期待される長期研究を確立するならば、これは、本発明者らに、上気道疾患の進行中の集団発生の実世界テストベッド(test bed)においてＰＡＸ管及びAffymetrix GeneChipプラットフォームを使用するＲＮＡの遺伝子発現解析用の部分変更プロトコールの質を評価する機会を与えた。
【０１３５】
多数の因子が、標的検出の変動性に寄与し、ＲＮＡの品質が最も重要な因子の一つである。血液採取したＰＡＸ管からのＲＮＡの品質は、ドナーの病状、試料処理及びその他の後処理によって影響され得る。これまでに、本発明者らは、実用的試料処理の代表的な２つの条件下で、ＰＡＸシステムが良好な品質測定基準及び比較的安定なトランスクリプトーム測定値を得るために血液ＲＮＡを保存できることを明らかにした（５０）。最近、ＲＮＡ分解を誘導するための細胞又は精製ＲＮＡの実験処理と、バイオアナライザーを用いたＲＮＡの電気泳動図から誘導される測定基準との間の関連性に基づいて新たなＲＮＡ品質測定基準が提案された。（５１）。一つの新しい測定基準は、分解因子(degradation factor)（％Ｄｇｒ／１８Ｓ）であり、これは、１００を乗じた１８Ｓバンド強度に対する分解したＲＮＡ（すなわち１８Ｓリボソームピークよりも小さい分子量のピーク）からのバンドの平均強度の比である。それは、‘Alert’と命名されるカテゴリー変数を誘導するのに使用される連続型変数である。Alertは５つの値を有する：
BLACK−リボソームピークが検出されなかったことを示す；
NULL−ＲＮＡ分解が無く、分解因子の値≦８に相当する；
YELLOW−ＲＮＡについて分解を検出できる及び＞８から１６までの値；
ORANGE−重度の分解及び１６＞から２４までの値について；
RED−最も高いalert、強い分解について、＞２４からの値について。
【０１３６】
別の新しい測定基準は、アポトーシス因子（２８Ｓ／１８Ｓ）であり、これは２８Ｓピークの高さと１８Ｓピークの高さの比であり、アポトーシスを受ける細胞の％を示す（５１）。本発明者らは、バイオアナライザーAgilent 2100からの電気泳動図のＲＮＡ ＱＣ方法、分解因子、Alert、及びアポトーシス因子を、どれがマイクロアレイ遺伝子発現解析に使用されるＲＮＡについて試料処理品質の最もよい指標であるかを調べるために比較した。
【０１３７】
従って、本発明者らの先の研究（５０）及び現在のＢＭＴコホートからＲＮＡを単離したＰＡＸシステムについて、他の研究室による比較及び計画立案に有用であろうＲＮＡ品質測定基準の寄与が報告され；マイクロアレイ標的検出結果の質を最もよく示す後処理品質測定基準が調べられ；且つ標的検出の感度に関する個人間ヘモグロビン変動性の影響が調べられた。
【０１３８】
本発明者らは、特に実際には進行中の研究中に電気泳動図全てを見ることはできないし且つさらなる評価のための試料に注意を与える(flag)ために指標を信頼することができなければならないことから、Alert測定基準がマイクロアレイ結果のしっかりした(robust)指標であり、高速処理ＲＮＡ品質管理に有用であることを実証する。
【０１３９】
アポトーシス因子の大きさは、高い割合の血液細胞がアポトーシス細胞死を行うことを示唆した。これは、血液細胞と接触することでアポトーシスによる細胞死を誘発するPAX ＲＮＡ安定化試薬によるか、又は単に全血と、アポトーシス因子が誘導される培養細胞との間の相違によるものであり得る。アポトーシス関連経路を研究することに興味をもったならば、この性質をさらにＰＡＸシステム技術を用いて研究しなければならないであろう。このように、アポトーシス経路に関係させるためにアポトーシス因子を遺伝子発現プロファイルと相関づけることが可能であり得る。
【０１４０】
種々の方法で処理されたＰＡＸ管血液からのＲＮＡの安定性は、将来の研究について、これらの処理条件の範囲全体を通じてＲＮＡの安定性に一層自信があり得ることを示唆する。
【０１４１】
本発明者らは、次に、臨床表現型の検出に適用した場合に遺伝子発現アレイの適切な基準化方法を開発することができた。国際的な基準化アプローチが、遺伝子発現アレイを必要とするその他の研究設計及び使用について主張されているが、本発明者らは、１００個のハウスキーピング遺伝子の使用は最も見方の偏った(biased)アプローチを提供すると結論付けたが、次の５つのアプローチが検討された：
１）二重基準化国際的正規化
２）全く正規化されていない
３）１００ ｈｋ 遺伝子基準化
４）１００ ｈｋ 遺伝子平均正規化
５）正規化遺伝子の実験セット
ＰＡＸ管ＲＮＡ及びマイクロアレイ基準化のＱＣ／ＱＡの後に、本発明者らは、クラス予測及びクラス比較モデリングを行った（概要は、表７、１０及び１１にある）。遺伝子発現を使用するクラス予測は、示唆的に、ＣＢＣ又は電気泳動図だけを使用する場合よりも良好に行った。これは、遺伝子発現が、実際に、試料についてより多くの情報を含んでいること又は遺伝子発現が単純により多くの変数を有し、従って良好な分類器をただ偶然だけで見出すより多くの機会を提供することであり得る。さらに詳しくは、分類率（classification rate）の有意検定のｐ値は、遺伝子発現が分類についてＣＢＣ又は電気泳動図よりもよいことを示唆し及びＣＢＣが実際に１０倍も多い遺伝子発現を有し、十分に行われなかったことから遺伝子発現が多数の変数の機能を得たとは思われないことを示唆する。
【０１４２】
回収された病原体の数を増やすための調査（病院調査）
別の患者母集団（広い年齢範囲、男性及び女性、一般市民）を調査し且つ回収された病原体の数を増やすために、ラックランドＡＦＢのWilford Hall Medical Centerの内科診療所及び病棟に居住する患者に焦点を合わせた別のプロトコールに着手した（以下、時には“病院調査”と呼ぶ）。
【０１４３】
病院調査について、患者選択（算入基準）は次の通りに行った。１８歳よりも年齢の多い成人（男性及び女性）を含めた。全員が病院又は病院診療所に居住し、＞１００.４°Ｆの体温及び呼吸器症状を示した。鼻洗浄液及び咽頭スワブは、最も一般的には調査看護婦によって又は調査看護婦に指示された医療従事者によって採取された。鼻洗浄液の一部を使用して迅速抗原捕捉アッセイ（５２）によってインフルエンザＡ型又はＢ型について選別し、この結果を培養及びＰＣＲで確認した。全ての鼻洗浄液標本を、パラインフルエンザ１型、２型、３型、ＲＳＶ及びアデノウイルスについてさらに培養した。従って、本発明の態様において、遺伝子発現解析は、一つ又はそれ以上のプレスクリーンニング法と組み合わせてもよい。例えば、プレスクリーンニング法としては、前記のインフルエンザＡ型又はＢ型迅速抗原捕捉アッセイ、培養アッセイ、ＰＣＲ型アッセイ、２００４年７月２日出願の付米国特許出願第６０／５９０,９３１号明細書に記載の方法が挙げられる。
【０１４４】
ＣＢＣは、相違を有する全ての登録者について得られるであろう。また、各登録者は、人種／民族性、ワクチン接種状態、最近の食事の時間、最近の運動の時間、受けたストレスレベル、アレルギー、最近の傷害、現在の投薬及び喫煙歴に関する質問を含む標準質問表を提示されるであろう。咽頭炎、鼻づまり、咳、発熱、悪寒、吐き気、嘔吐、下痢、疲労、体の痛み、鼻水、頭痛、胸痛及び発疹を含む呼吸器症状の期間及び種類が、標準様式で記録される。身体検査所見は、標準様式で記録される。
【０１４５】
これは、種々の重症度の病気を有する全ての年齢の成人を含む横断調査である（ある人は外来患者臨床設定中にあるであろうし、他の人は病院に入院した人であろう）。２以上のインフルエンザシーズンにわたり血液試料を採取することができることは、本発明者らがインフルエンザＡ型及びＢ型に対する遺伝子発現パターンを調べることを可能にし、本発明者らがインフルエンザＡ型の種々の株（H1N1 vs. H3N2）について特異的遺伝子発現パターンがあるか否かを調べることを可能にする。
【０１４６】
この調査について、本発明者らは、個人が注射剤のインフルエンザワクチンを受けたか否か及び病気に対するワクチンの時期を監視するであろう。本発明者らは、遺伝子発現パターンが、インフルエンザワクチン後２週間を越えて生じる“ブレークスルー(breakthrough）”インフルエンザ疾患を有する個人の間で、ワクチン未接種の病気を有する個人に認められる遺伝子発現パターンと比べて異なるか否かを識別するであろう。本発明者らは、インフルエンザの生きた弱毒化株を用いたFluMist（MedImmune Vaccines）鼻腔内ワクチン接種を受ける個人について上記と同じ比較を行うであろう。ワクチン接種後の遺伝子発現パターンの理解は、病気からの保護の可能性及びブレークスルー疾患の可能性を予測し得る；インフルエンザワクチンの効果は７０〜８０％であると考えられる。
【０１４７】
ラックランドＢＭＴ母集団は、２００４〜２００５年インフルエンザシーズンの間に予防の方法としてFluMistを受けつつあるでろうから、本発明者らは、FluMistを受け、インフルエンザ様症状及びワクチン接種後の７日目を越えるインフルエンザ様症状を発現する個人の遺伝子発現プロファイルを評価するであろう；FluMistを受ける個人は、弱毒化ウイルス〔以下のCID 2004：38（1 March), 760-762 全体を参照〕を与えたので、咳、咽頭炎及び筋肉痛をワクチン接種後２〜７日目に発現し得ることは周知であるが、ワクチン接種後の遺伝子発現パターンは調べられなかった。この調査は、どの個人がFluMistワクチン接種後に症状を示すが、防御免疫反応を発現するか及びどの個人が母集団において循環野生型インフルエンザの獲得による咳、咽頭炎、筋肉痛を実際に発現したかを本発明らが識別することを可能にする遺伝子発現パターンが存在するかを本発明者らが調べることを可能にするであろう。これは、閉鎖母集団、例えば寮のＢＭＴ又は大学生においてなすべき重要な区別である。その理由は、FluMistワクチンを受けることが最も適切であり、さらに閉鎖宿舎において野生型インフルエンザの伝染を有する可能性が最も高いのがこの年齢群であるからである。
【０１４８】
発症前研究
個人は、典型的には感染性病原体に感染してしまい、病気の発症前の潜伏期の間に発症前の状態にある。この潜伏期の間に、宿主は感染する病原体に対して免疫反応を開始し始める。典型的に、初期反応は、ナチュラルキラー細胞及び好中球によって開始される先天性免疫反応である。感染の後に、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球及び抗体反応からなる特異宿主免疫反応が有効になる。幾つかの感染症、例えば病原体フランシセラ・ツラレンシス（Francisella tularensis）を有する感染症において、１０種ほどの少ない生物が最終的に症候性疾患を引き起こすことができる；この小数の生物は直接に検出することは困難であり得るが、宿主免疫反応は、典型的には文字通り何百万の免疫細胞の増幅された反応を構成し、この免疫学的形跡は臨床症状の開始前に検出できると思われる。
【０１４９】
誰が特定の病原体に感染しているかだけではなく、直接暴露によるか又は感染発端者からの感染により誰がこの同じ病原体に暴露されているかを調べるために医療提供者、公衆衛生官及び指揮官／公務員にとって都合がよいであろう臨床シナリオが存在する。例えば、天然痘の病原体が放出され、発端者が発見された場合には、それぞれの発端者が、呼吸器液滴及び核による密接な接触（３フィート以内の対面接触）に著しく暴露するであろうということが予期される。典型的に、天然痘の各発端者について、１０人ほどの多くの別の感染しやすい個人が病気を発現し得る。天然痘ワクチンの限定された量及びワクチンに対する可能な有害反応からみて、暴露された人の中で誰が病気を発現するかを予測することは、手段(resources)を向け、ワクチンの副作用を限定するであろう。遺伝子発現研究は、病原体について発現しつつある特異的免疫学的サインを検出し、母集団において誰が顕著に暴露されており、感染しているか（生物を有する）及び暴露−感染した人の間で誰が最終的に病気を発現するかを調べるのに役立ち得る。従って、本発明の方法は、遺伝子発現サインの識別に特に有用であり、それによって得られる結果は、治療計画を直接に導く及び／又は調整するのに使用し得る。
【０１５０】
このために、以下の研究デザインは、病原体暴露及び発現の種々の段階での手がかり及び発現プロファイルの研究を可能にする。それぞれのホーム(home)共同体から基礎訓練に就いているＢＭＴの大部分はアデノウイルスによる感染症に感染しやすいことから、本発明者らは、ラックランドＡＦＢ診療所に発熱及び呼吸器症状を示すＢＭＴをアデノウイルスについて迅速アッセイを用いて選別することができる。ＢＭＴはアデノウイルスに感染していると確認されると、彼／彼女と対面接触をもったＢＭＴは、感染及びその後の病気の発現について追跡され得る。著しく暴露されたＢＭＴは、暴露／無症状期間中に並びに病気の発現後及び回復中の遺伝子発現のために採血し得る。次いで、これらの時点から得られた遺伝子発現パターンが解析され、病気の発現を最もよく予測する遺伝子発現パターンが調べられる。
【０１５１】
前記研究の予測において、基礎訓練中に発熱及び呼吸器症状を伴った病気にかかっているＢＭＴは、彼らがここ１週間以内に対面接触をもった他のＢＭＴを調べるために標準質問表を受け取っている；感染したＢＭＴを現在の“発端者”として標識し且つ彼／彼女が最近接触をもった全てのＢＭＴを“暴露された”として標識するデータベースが作成される。発端者に暴露されたＢＭＴ及び彼らの関係に関するデータが保持される；例えば、暴露されたＢＭＴは、発端者の訓練指導者又は寮長又は小隊長であり得る。暴露した発端者は次に発熱及び呼吸器疾患を有し診療所に居る場合には、その発端者は最初の発端者及び彼／彼女が現在暴露しているかもしれない他のＢＭＴと関係がある。感染性呼吸器疾患が感染している可能性が最も大きい状況があるか；すなわち、寮長又は小隊長がその寮又は小隊内で個人に最も一般的に伝染させるか？を調べるために疫学が行われる。これは、“有意な暴露”について最もよい症例定義を構成するかについて、従ってどのＢＭＴが “暴露”群における遺伝子発現研究のためにより集めるのにベストであるかについてＥＯＳ臨床チームを向けるであろう。この群は、その後の病気の発現について追跡されるであろう、またこれらの個人が発熱及び呼吸器症状を示す場合には血液が採取されるであろう。
【０１５２】
次に、本発明者らは、ＧＸＰプロトコール及びデータ処理について本発明を説明する。
【０１５３】
トランスクリプトーム／ｍＲＮＡ測定法の説明：
ｍＲＮＡを種々の処理量で定量的に測定するために幾つかの方法がある。これらの方法の幾つかは、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、ヌクレアーゼ保護アッセイ、Quantigene、ＳＡＧＥ、ディファレンシャル・ディスプレイ、in situハイブリダイゼーション、ナノアレイ及びマイクロアレイである。これらの幾つかは、高速処理に容易に適応しないか、又はトランスクリプトーム量で測定することができる。本発明者らの監視及びバイオマーカー発見のために、マイクロアレイに基づいた方法が、これらの目的に最もよく修正できる。バイオマーカーが発見されると、短い処理時間を有するが、低い並行処理能力を有する方法、例えばＲＴ−ＰＣＲ又はQuantigeneが、診断目的に最も有用であり得る。ｍＲＮＡを測定する方法は、一般に試料調製、ｍＲＮＡ増幅及び必要ならば標識、次いでハイブリダイゼーション、次いで洗浄、染色、及び／又は信号検出を伴う。これらの主要な工程全てに変化が存在する。試料調製は、例えばAffymetrix遺伝子チッププラットフォームについてのように広範囲にわたっていてもよいし又はGenospectraからのQuantigeneシステムについてのように最小限であってもよい。理想的には、本発明者らの目的について、本発明者らは、最も多い数の転写物を最も短い時間並びに最も高い感度及び特異性で測定することを欲する。本発明者らは、GeneChip技術を使用してバイオマーカー及び経路を発見したが、現在のAffymetrix技術又はこの分野で評価するのに考えることができるか又はすでに利用できるその他の技術に関して多数の可能な改良が存在する（これらの幾つかは、本明細書で論じ、本発明の一部を形成する）。
【０１５４】
標準マイクロアレイ技術に対する改良：
本発明者らが試験したプラットフォーム、すなわちAffymetrix遺伝子チッププラットフォームについて、最近の改良は、必要とされる最初のＲＮＡの量の減少、処理時間の短縮、又は高速処理を促進するためのロボット工学を含み且つオペレーターの変動を減らす。幾つかのオプション（付加仕様）が、GeneChipプラットフォームの試料処理工程に組み込むために市場で入手できる。１つは、従来の５ Ｄｇに対して１ Ｄｇ出発量の全ＲＮＡを使用できるAffymetrix製の新しいＩＶＴキットである。別のオプションは、１０μgの全ＲＮＡを用いて開始することができるAffymetrix製の二重サイクルIVTである。しかし、その処理時間及びアッセイの複雑さが増している、Ovationキットもまた増幅し、ＲＮＡ ５ｎｇほどの少ない量を用いて開始するＲＮＡを標識することができ、これらは４時間の時間を要する。しかし、それはGeneChipマイクロアレイを用いて広範囲にわたって試験されていない。最近の刊行物もまた処理時間を短くするために増幅せずに直接にｍＲＮＡ 標識することを試みたが、感度が低下した。
【０１５５】
本発明者らが本発明で意図する処理における種々の工程で改良について多くの領域がある。一つは、監視プロセスにおける種々の工程を組み合わせ、開発することである。試料採取について、Paxgeneの代わりに毛細管を、血液を採取するのに使用し、次いでRNAstatを用いて安定化させ、次いで小容量の血液からＲＮＡ単離のための幾つかの利用できるキット、例えば１つの管だけを使用して１５分でｍＲＮＡを単離することができるDynabeads（登録商標）mRNA DIRECTTM KitによってＲＮＡを単離し、次いでOvationキットを使用して増幅し、標識し、次いでGeneChipにハイブリダイゼーションし、翌日に洗浄し、染色することができる。また、ハイブリダイゼーション時間は、それをGeneChip上での現在の１６時間から８〜１４時間、好ましくは１０〜１２時間の範囲の時間、又はさらに短い時間まで短縮し得る。ハイブリダイゼーション時間をさらに短縮するために、本発明は、ハイブリダイゼーション中にチップに強い電場／磁場を印加することを意図する。また、ハイブリダイゼーション時間を短縮するために、ハイブリダイジング温度を高め、次いでハイブリダイゼーションのための現行温度を４５℃まで下降させ得る。
【０１５６】
感度を高めるために、当業者は、代替シグナルエミターを使用し得る。現在、シグナルエミターは、ストレプトアビジン−フィコエリトリンであり、次いでビオチン化抗ストレプトアビジンを用いるさらなる増幅である。しかし、本発明は、信号を増幅するためにGenospectra製のブランチＤＮＡ、量子ドット、次いで多重スキャンの使用を意図する。なぜならば、量子ドットは、alexi色素、又は減少させたクゥエンチング（quenching）、より高い量子収量及びウイルス、又はRLS粒子当たりにつき最大120個のビオチン分子のために信号を極めて増加させるビオチン標識ウイルスをクゥエンチしないからである。さらに、本発明は、導電性材料上で合成されるプローブを使用することを意図し、それによって二重鎖形成時の電気信号によって検出することができ、この場合に適切に信号を検出することができる。さらに別の態様において、別のｍＲＮＡ測定技術、特に単一細胞からのｍＲＮＡを測定するために開発されたナノアレイを用いてもよい。
【０１５７】
データ取得：
本発明において、データ取得は、スキャナー（遺伝子チップ）及びコンピューターを使用して行われる。
【０１５８】
データ処理及び解析：
データの取得及び処理は、当業者に公知の手段で行い得る。例えば、データの取得及び処理は、手動で及び種々のプログラムに通すことによって行い得る。本発明者らは、全ての必要なデータ解析を自動的に行い、結果を得るためにソフトウエアを開発する過程にある。
【０１５９】
メタデータ及びマイクロアレイ分析、分類などのためのアルゴリズム：
−  擬似コード：遺伝子は、識別するために尤度(likelihood）により順位付けされる
−  ２値分類器 対 多特性分類器。２値分類器(classifier)は、臨床表現型を複数の群に分類するためにバイナリーツリー（すなわち２分木）を形成する。バイナリーツリーのそれぞれのノード（すなわち節）は、最小％誤分類率によって決定される。その結果は、それぞれのツリーの先端では表現型のそれぞれの群であるべきであるということである；しかし、幾つかの表現型は、発見される分類器がないために、必ずしも分離されることができると限らないものであり得る。多特性分類器は、直ちにツリーによって分ける代わりに表現型を選り分ける。両方の方法は、現行の調査方法である。本発明者らの結果は、今までのところ、大きい及び小さい最適分類器を有する表現型の混合物について、２値法がより意味をなし得ることを示唆する。例えば、健康であると、病気であるとを識別するために、分類器において比較的多い数の遺伝子を得ることができ、これに対してアデノウイルスによる病気とアデノウイルスによらない病気とを識別するために、分類器において比較的少ない数の遺伝子のみが見出され得る。ｇｘｐクラス予測についての発明者らの事例解析は、基本的には、発熱がない 対 発熱がある、次いで健康である 対 回復期にある、次いでアデノウイルスによる発熱がある 対 アデノウイルスによらない発熱があるの間の比較を用いた２値解析である。これは、基本的には２値クラス予測の手動バージョンである。多特性分類器は、バイナリーノードを調べる(going through)ことなく、健康である、回復期にある、アデノウイルスによる発熱がある及びアデノウイルスによらない発熱があるを全て一度に分類するであろう。現在のArrayToolsソフトウエアは、最初のノードについて大きな分類器をもたらし且つ本発明者らのｇｘｐデータのための次の節については小さい分類器をもたらす全てのツリーのノードについて等しい一変量αパラメーターを用いてバイナリーツリー分類を実行することができるだけである。一つの可能な将来的方法は、それぞれのノードについて分類器の大きさを一様にするためにそれぞれのノードで種々の一変量αを考慮に入れるべきである。バイナリーツリー法はまた、特に誤分類率のｐ値を見出すために、極めて計算に強い。本発明者らの事例におけるように、特にクラスの間の差のダイナミックレンジが大きく変化する場合には、クラス予測に最もよいアルゴリズムを見出すためにさらにコンピューター（in silicon）実験を行う必要がある。２値分類について、それぞれのノードでどの分岐（ブランチ）が事例を分類するかを決定することを含めるために、外部非遺伝子発現アッセイから種々の情報を考慮することもできる。本明細書に記載の本発明者らの現在のｇｘｐ結果に基づいて、データは、それぞれのバイナリーノードで、一定の％精度で確実性のある一定の確率で、５０未満の遺伝子を有する４つの群に分類することができる。
【０１６０】
遺伝子発現データの完全解析：Ｎ＝３０の調査からのＧＸＰ結果の解析について、最初に、完全な細胞数計測データ、電気泳動図データ、及び遺伝子発現データの標準化を、種々の方法を検討した後に行った。次いで、データの質を、測定方法安定性を調べるために個々の管理チャート、異常値(outlier)、及びAffymetrixにより示唆される標準又は他の研究室からの標準との比較によって評価した。この品質管理は、解析について一組の信頼できる試料もたらす。次いで、ＰＡＸ管からのＲＮＡ品質を、電気泳動図のオーバーレイ・グラフ及びＲＮＡ品質測定基準によって評価する。そして、ＲＮＡ品質変動性とマイクロアレイ変動性の間の関係を調べる。品質及び信頼性が確立されると、フィルタリングパラメーターが変数の数を減らすために設定される。次いで、管理された方法を使用するクラス予測解析を行い、最適化して、並べ替え検定（permutation test）を使用するある一定の信頼性を有するある一定の％精度で臨床表現型を分類できる遺伝子のセットを調べた。臨床表現型について可能な交絡因子もまた、分類木器遺伝子が、多分、交絡因子よりもむしろ臨床表現型によるものであることを確認するために評価された。次いで、クラス比較解析を行い、臨床表現型同士の間で相違を示す遺伝子を調べた。最後に、機能解析を行って病気表現型に関与する経路を調べた。多数のよりよい解析、例えば遺伝子オントロジー比較、プロモーター解析、ゲノム分布、母集団における免疫反応の変化、細胞数算定不均一性をコントロールしながら差次的遺伝子発現のモデル化、及び公開マイクロアレイデータベースを用いた比較、及び交差プラットフォーム解析、未知機能を用いた遺伝子の機能の発見を行なうことができる。
【０１６１】
−  診断能力：これは、アッセイの感度、特異性、陽性予測値、陰性予測値を調べることによって評価される。ｇｘｐ調査のためのクラス予測の感度及び特異性の幾つかは、本明細書に記載のようにして算出される。全体として、目標は、クラス予測結果のＲＯＣ曲線を最適化することにあり、これは誤分類率の最小化に類似している。陰性及び陽性予測値は、病気の有病率が一旦知られると、算出することができる。アッセイ時間、感度、信頼性、並びにアッセイ及び解析の自動化を向上させると、診断能力をさらに促進するであろう。このために、倫理上の問題が解決されると、患者を病歴と結び付けるためにヒトに埋め込まれたチップは、病気の結果の自動化された解析及び予測に役立つであろう。多数の病気についての遺伝子発現データの実用性もまた、診断能力を大きく高める。ゲノム変化との関連もまた、多くの患者の病気の経過予想を提供するであろう。また、遺伝子発現技術のナノスケールマイクロアレイへの進歩は、診断可能性を大きく高めるであろう。本明細書に例示したｇｘｐ調査について、診断分類器は、より大きな予測セットを用いて確認されるであろう；しかし、本発明の実施例を支持するデータセットを用いた場合でさえも、これは評価されることができる。健康である 対 発熱があるについて最小分類器について、予測セットは、訓練セットとの処理の相違にかかわらず１００％正確であった。しかし、遺伝子発現の測定における処理の相違は、病気単独の間のように相違の小さい表現型を有するクラスにより大きい影響を及ぼす。予測のクラス予測結果に対する分類器における遺伝子の数の影響に関する別の分析研究が評価されるであろう。別の見込みのある研究は、本発明者らがｇｘｐ研究において見出し、確認し始めた分類器の診断能力をより確実に評価するであろう。
【０１６２】
予後能力のためにＧＸＰ
−  実験プロトコール
・  基準患者及び発病開始による追跡
病気の時期、重症度及び処理に対する反応の予測のための遺伝子発現の予後能力を調べるために、感染暴露による健康状態から病気／症状の発現まで追跡することができるコホートをもたなければならない。ラックランドＢＭＴ母集団は、この母集団が頻出する固有率(endemic rate)と共に進行中の上気道疾患の優位な固有率を有することにおいて独特である。これは、研究が発症前の個人において遺伝子発現マーカーを調べることを可能にする。特異的な発熱性呼吸器疾患を有する発端者が確認されるであろうし、著しく暴露されたこれらのＢＭＴは、後の病気の発現を予測する免疫学的サインを調べるために遺伝子発現について評価されるであろう。病気を有するＢＭＴは、病気の重症度及び遺伝子発現との関連を評価するために追跡されるであろう。
【０１６３】
・  生物学的に過酷な環境を用いた挑戦
生物剤、例えばアデノウイルスに自然に暴露され、感染したＢＭＴは、遺伝子発現についてアッセイされるであろう。この群は、その後に病気になるかもしれないし又はならないかもしれないし、また遺伝子発現プロファイルの比較が複数の群同士の間で行われるであろう。  
−  遺伝子を時間及び疾患の関数として追跡する機会
−  ａ）病気になる傾向、ｂ）疾患の発症に対する時系列、ｃ）治療計画の効果、ｄ）回復などに関する予後。
【０１６４】
診断及び予後方法並びに分類器を確証する能力
−  理論的根拠及び方法論
診断及び予測方法並びに分類器を有効にするために。最初に、本発明者らは、ある種の病気及び／又は表現型について分類器を発見するために実験を行った。次いで、％正分類率を、種々の方法及びパラメーターを変化させることによって最適化させる。これらの分類器は、この段階で交差(cross)確証方法から試料のサブセットを残すことによって確証される。また、発見された分類器を使用する最適％正分類率の信頼性を、並べ替え検定によって評価する。最適分類器及びアルゴリズムが見出され、訓練セットを用いて確証されると、追加の試料が採取され、測定して予測セットが形成される。予測セットは分類器遺伝子を発見し且つこれらを統計学的に確証するために使用された訓練セットから完全に独立していることから、最適分類器及びアルゴリズムを使用して、予測セットにおける種々の事例を分類して、分類器をさらに確証する。さらに、分類器は、種々のアッセイ方法、例えばＲＴ−ＰＣＲを使用してさらに確証され、分類器遺伝子セットが生物学的に有意であり、単にアッセイ方法特異的でないことをさらに確認する。ついで、分類器を、このアッセイを使用することが意図される母集団のより大きな試料においてさらに試験する。
【０１６５】
−  本発明の方法は、実質的に微生物について独立した遺伝子サインの検出を可能にする。注目すべき例としては、下記の例が挙げられる：
・  インフルエンザ：インフルエンザＡ型及びＢ型免疫マーカーが、自然発生疾患及びワクチン誘発免疫（筋肉内及び鼻腔内ワクチン接種）に対して調べられるであろう。  
・  化膿連鎖球菌：進行中の研究は、ＢＭＴ及び臨床母集団において化膿連鎖球菌について遺伝子発現バイオマーカーを評価しつつある。  
・  Ａｄ４：  現在、本発明者らは、発熱性アデノウイルス陽性患者とアデノウイルス陰性患者とを識別する遺伝子発現バイオマーカーを確認している。  
・  さらなる微生物感染症としては、アデノウイルス種、髄膜炎菌（N. meningitides）、インフルエンザＡ型及びＢ型、百日咳菌、パラインフルエンザＩ型、ＩＩ型、ＩＩＩI型、肺炎連鎖球菌（S. pneumoniae）、ライノウイルス、クラミジア肺炎菌（C. pneumoniae）、ＲＳＶ、化膿連鎖球菌（S. pyogenes）、西ナイルウイルス、炭疽菌（B. anthracis）、コロナウイルス、大痘瘡、エボラウイルス、ラッサウイルス、野兎病菌（F. tularensis）、ペスト菌（Y. pestis）によって引き起こされる感染症が挙げられる。
【０１６６】
−  疾患の組み合わせ
・  さらに、宿主の遺伝子発現は、体に挑む物質のセットの中で物質のサブセットの機能的生物活性を表す。従って、宿主遺伝子発現からの結果は、病原体ゲノムのみを測定するその他のアッセイ、例えばＰＣＲ、ＲＰＭ、又は化学生物剤抗原、例えばイムノアッセイからの結果と相乗作用を与えるであろう。これらのアッセイの現在の高並行使用のために、多数の結果、例えば無症候性感染症の存在下で多重感染の兆候(indication)を得る場合が多く、この場合、どの剤が病因物質であるかは明確でない。遺伝子発現プロファイルは、これを選り分けるために情報を提供し得る。また、同様の疾患を誘発する多数の病原体について、遺伝子発現プロファイルからの結果は、高結合性で一般的ノード経路について解析し得、次いでこれは治療剤、例えば薬物による治療介入として標的にし得る。これはまた、具体的な病気についての経路から同じ経路を活性化する他の病気までの経路を標的とすることが知られている治療剤の使用を示唆するであろう。
【０１６７】
本発明はまた、開業医及び臨床医に他のアッセイによって確認される発現プロファイルを監視及び／又は確証する能力を提供する。例えば、Griffithsら（７１）は、急性マラリア又は他の発熱性疾患に罹っている患者からの全血において宿主遺伝子発現を監視することによって調べられるマラリア用のバイオマーカーを報告している。Cobbらは（７２）は、血液白血球の遺伝子発現プロファイルに対する外傷の影響を報告している。Rubinsら（７３）は、天然痘に罹っている霊長類について調べた遺伝子発現プロファイルを報告している。本発明の方法は、これらの疾患及び同様の疾患において確認されたバイオマーカー精度及び信頼性を評価し、これらのバイオマーカーが病気の進行を追跡するのに利用できるか否かを調べるのに使用することができる。
【０１６８】
先に取得された知見〔ベイジアンプライアー(prior）〕の利用
サインの認識（宿主反応チップ）
この方法において、本発明は、診断の精度を高めるために他の診断方法（すなわち、ＲＰＭ、標準血液検査、免疫測定法など）と組み合わせてもよい。個人の健康状態の診断及びその病気の経過の予後は、通常は徴候及び症状の評価から検査室診断検査に及ぶ幾つかのアッセイを必要とする。各アッセイは、次のアッセイのための陽性及び陰性予測値の事前確率を提供する。ベイズ統計学理論は、その後の検査の予測値を調べるためにこの検査前確率（主観的に調べられるか又はアッセイによって調べられる）を考慮に入れ、これは作用の経過を識別することにおいて臨床医に役立つより正確な情報を提供するであろう。この例は、全血球算定（ＣＢＣ）、次いで電気泳動図データ、次いで遺伝子発現データに基づいたクラス予測の本発明者らの解析である。これらの種々のアッセイは、臨床医が病気のクラス予測に標準的に使用するものではないが、統計学的解析は、遺伝子発現プロファイルが感染状態の予測について最も高い精度を提供したことを例証する。２値クラス予測アルゴリズムを考慮するならば、バイナリーツリーのそれぞれのノードについてよりも、よりよい診断及び予後について最もよい情報を提供すると思われる遺伝子発現バイオマーカーアッセイの他に他の確立されたアッセイから診断確率及び予後確率を考慮し得る。
【０１６９】
本発明によって開発されたデータベースアプローチを用いて調査し得る質問及び仮説
病原体暴露に対応して遺伝子発現プロファイルを調べるほかに、本発明者らによって開発されたデータベースを用いて調査することができる多数の質問及び仮説がある。これらの質問の幾つかを以下に示す：
１）臨床サブタイプについて分類器を見つけ出すことができるか、例えば培養によるアデノウイルスについて発熱があるか及び陰性であるか、ＰＣＲにより陽性であるか？ アッセイの種類、例えば培養、ＰＣＲ、又は病原体マイクロアレイによって調べられる感染状態の間には幾つかの不一致がある。これらの不一致を分類するために遺伝子発現データを使用することができるか？
２）これらの培養、ＰＣＲ及び遺伝子発現の間の一致、感度及び特異性の関連は何であるか？
３）ＰＡＸ管採取の時間と、発現プロファイルにおけるある種の遺伝子との間に概日リズムの関係があるのか？  時刻と相互関係がある遺伝子発現プロファイルは、概日リズム機能に関係があるであろう。  
４）たくさんの数は何に影響を及ぼすのか？
５）転写物量を調べるために種々の統計学的モデルを現在の結果とどのように比較するのか？  各プローブについて各細胞から放出される光の量に基づいて転写物の量を調べるための多数のモデルがある。これらの幾つかは、Ｍａｓ４アルゴリズム、ＭＡＳ５アルゴリズム及びマルチチップモデル：ＲＭＡ、ｄチップ、Ｐｌｉｅｒ及びｍｉｘモデルである。本明細書におけるＧＸＰ結果は、これらのモデルが通常は実験群の間で遺伝子発現プロファイルの比較的小さい変化を前提とすることから、マルチチップモデルを使用できないことを示唆しており、これは断じて多重疾患の監視研究の事例ではない。
【０１７０】
６）どのように種々の標準化アルゴリズムを現在の結果と比較するのか？  多数の標準化方法：メジアン尺度、トリムミーン尺度、分位数、スプラインなどがある。一般に、本発明者らは、遺伝子発現プロファイルの分布が、一般的に健康である 対 病気であるような群について同じであることを想定する標準化方法を使用できない。従って、本発明者らは、現在の研究から、ポリＡ ＲＮＡにおけるスパイキング(spiking)が試料同士の間の定量的比較のための標準化について最も論理的であることを見出した。
【０１７１】
７）どのように本発明者らはデータの容量（dimension）を減らすのであろうか？  （主成分解析、特異値分解、強い特異値分解？）この解析は、どのように多数の独立した成分が遺伝子発現データの変化の大部分を説明するかというアイデアを与えるであろう。
【０１７２】
８）何がデータの変動構造であるか及びメタデータ変数のどれが変化に最も寄与するのか？  どれが最も少なく寄与するのか？
９）データの変動構造の成分のどれが、ある一定のメタデータ変数を最も正確に分類するのか？
１０）文献からの遺伝子発現解析において何が最も新しいか？  本発明者らはこれらの新しい方法及び／又はソフトウエアのどれを使用できるのか？
１１）アデノウイルス陰性病気母集団にサブグループはあるのか？  アデノウイルス陰性の病気母集団は、多剤に起因し得る。このための証拠は本発明の方法によって得られるデータセットに見出されるのか？
１２）ポリＡＲＮＡ試料と全ＲＮＡ試料の間の相違は何か？
１４）種々の表現型を分類するのに関与すると認められる遺伝子の機能は何か？
１５）特に正常群について、何がコホートにおける発現において生物学的に等しい遺伝子について遺伝子発現の変化であるのか？  何の遺伝子が個人の間のバックグラウンド変化よりも大きい変化を示すのか？
１６）コホートに免疫関連遺伝子において正常変化よりも大きい変化があるのか？ ウイルス感染症にはどのくらい多い免疫反応の種類があるのか？  Th1 対 Th2 応答があるのか？
１７）発現において高い変化を示す遺伝子がＤＮＡ配列における変化と相関関係があるのか？
１８）表現型同士の間で異なる遺伝子について染色体上に遺伝子配置のクラスタリングがあるのか？
１９）変化した遺伝子についてある種のプロモーター配列の高い出現があるか？
２０）アデノウイルス感染症及び発熱の経路にさらなる調査は？  これはヒトのアデノウイルス感染症及び発熱の生物学的メカニズムについて何を暗示するのか？
２１）本発明者らはＲＴ−ＰＣＲを用いてこれらの遺伝子の相違を確認することができるか？  何が一致の割合か？
２２）どのように、本発明者らが本発明者らの研究に関連して見出した遺伝子をアデノウイルス感染症の公表された生体外研究と比較するのか？  他のウイルス感染症は？  喫煙暴露のような他の表現型は？
２３）本発明者らの遺伝子リストがある種の細胞型の違いと関係があるか否か判読するのに特異的な細胞型である遺伝子を使用せよ。
【０１７３】
２４）本発明者らがプラットフォーム及び／又は研究室解析を交差させることができるか？
２５）どのように低レベル解析、非管理下及び管理下クラスタリングなどのついての種々の公表された方法を癌データと対照的に本発明者らのデータと比較するのか？
２６）本発明者らはよりよいモデルを見つけ出すことができるのか？
２７）異なるＣＢＣを用いる群について細胞当たりの量(at the per cell level)で差次的遺伝子発現を調べる統計学的モデルを見つけ出すことができるのか？
２８）記録される他の定量形質と関連がある遺伝子は何であるか？  例えば、最後の食事、運動など。これらの遺伝子は、いつか以前にある一定の確率レベルで人の活動を調べるのに使用可能であり得る。
【０１７４】
２９）発熱に関与する経路を調べると、他よりも母集団にわたってより小さい変動に関与する遺伝子を見つけ出すことが可能であり得る。これは、これらの遺伝子が母集団についてより有効である効果を有する薬物開発の標的であることを暗示する。これに対して、母集団全体にわたって高い変動を示す遺伝子を用いる経路は、これらの遺伝子が一般母集団的について意図される薬剤の良好な標的ではあり得ない。
【０１７５】
標準遺伝子発現測定に対する応用
本発明は、確かに“基準”（すなわち標準）遺伝子発現サイン測定値の測定に用途を見出すであろう。これは、定義された人口統計学的母集団全体にわたる基準遺伝子発現プロファイルの確立を適宜することにおいて大きな価値を有するであろう。この基準測定は、性別、人種、並びに発現及び老化プロセスの間の基本的な違いの発見における高い価値を有するであろう。このような母集団遺伝子発現プロファイリングの価値は、化学兵器及び種々の免疫疾患が特定の病因を確認することなく報告された（５３、５４）。環境有害物質に想定される暴露の後の湾岸戦争病のような現象において例証される。湾岸戦争病に応答して、国防総省は、普通の健康の“基準”指数を確立することを期待して何千もの現役軍人から集めた全般的健康質問表を有するミレニアム・コホート（Millennium Cohort）として知られている幅広い基礎研究を開始した。これに対して、１０５〜１０６の特異的２５ ｍｅｒ転写配列についての基準遺伝子発現は、外部摂動によって引き起こされる表現型又は無症候性疾患の可能なゲノム及び生理学的病因に関して桁違いに大きな情報を提供するであろう。
【０１７６】
その他の血液疾患及び病気を診断するための応用
本発明はまた、癌疾患、例えば：ＣＭＬ（ｂｃｒ／ａｂｌ０）(３０)、循環腫瘍細胞検出、結腸直腸癌再発、神経学（ＭＳ）、血栓（hemostatus）及び血栓症、炎症性疾患（Source Precision Medicine製の慢性関節リウマチ用の４８炎症遺伝子）、糖尿病、呼吸器疾患並びに細胞毒性及び毒物学の診断に使用し得る。（５５）。一般に、本発明は、血液由来のｍＲＮＡバイオマーカーを有する病気又は生理学的状態において有用性を見出し得る。本明細書に記載の類似の方法を使用することができる
疾病リスクの発症前予後及び評価
遺伝子発現プロファイルは発症前疾患の診断及び予後に診断に役立ち得ることが推測されているが、実施に対するこの概念の実質的削減が極めて専門的に証明している。少なくとも一つの従来の研究は、PAXgeneキットを使用して得られる末梢血白血球は、ｃＤＮＡマイクロアレイ基準（すなわち健康な）発現サインを得る有用性の証拠をもたらしたことを明らかにしている（Whitney et al 2003）（１８）。別の研究及び従来技術は、既知量の病原体の時間暴露が検出可能なサインをもたらし得ることを明らかにしている。
【０１７７】
しかし、それは、統計学的に有意な数の下記カテゴリー：すなわち（１）病原体に感染するであろう個人として同じ物理的環境にある健康な基準の個人、（２）病原体に対して獲得免疫を有していないが、その病原体に対する低レベルの病原体暴露に遭遇するか、又は高い先天性免疫を有し、そして病原体に対して区別できる“首尾よい”免疫反応を示し且つ病気について症状が現れない個人、（３）実際の病原体暴露の後に病気になり且つ発熱することなく症状を示す個人、（４）病原体に暴露し且つ“発熱性呼吸器疾患”（ＦＲＩ）についての基準を満たす症状と共に病気を発症するが入院を必要とするような病気にならない個人、（５）重篤な疾患を発症し且つ個人が入院についての医用基準を満たすこと以外は４と同じ個人、及び（６）カテゴリー３〜５からの回復の種々の段階の個人；を含む一様な、単離され且つ実験的に利用できるヒト母集団における遺伝子発現プロファイルの同時測定を可能にする実験コホートを得ることができない場合には、極めて困難であった。
【０１７８】
個人が病原体を潜伏させつつあり且つ症状の発現前にある間に、先天性免疫系は、基本的な応答、次いでより効果的な特異的免疫反応を開始し始める。これらの段階中に、免疫細胞は、種々のサイトカイン及びケモカインを生成して効果的な応答を開始する。免疫反応のこれらのバイオマーカーは、臨床症状を進め得る免疫学的サインを提供する。
【０１７９】
従って、上述のクラス内の種々の時点について独特な遺伝子発現パターンの発見方法を開発する緊急な必要性があり、本発明はこれらの方法を首尾よく実証する。
【０１８０】
遺伝子発現プロファイルに基づく発症前アッセイの好ましい使用
感染症の発症前診断及び予後のためのアッセイは、その情報が判定の質の情報(decision-quality information)を提供するのに十分な質である種々の用途で有用性を見出すであろう。例えば、起こりそうな又は今にも起こりそうな病気の結果として、自分自身の、他人の、又は重要な仕事完遂の危険を冒している個人は、今にも起こりそうな病気がうまく処理されるまでに一時的にもとに戻して置くことができる。例として、長距離飛行前のパイロット（職業パイロット又は軍パイロット）、外科医などが挙げられるであろう。
【０１８１】
他の使用は、数百人、数千人、又はさらに数百万人の個人が毒物又は病原体に様々な程度で暴露されるであろうバイオテロリズム又は産業災害の行為の緩和においてであろう。ワシントン、ＤＣ及びニューヨーク、ＮＹにおける２００１年炭疽菌攻撃の後に得られたデータは、炭疽菌が引き起こす病気及び死に対して十分な暴露を得た人１人当たりにつき、抗生物質の予防投与の候補者であった別の1,５００人の“病気を気にしている健康な”人がいたことを示した。この数は、その剤が炭疽菌の代わりに感染性であった（例えば天然痘ウイルス）場合には、もっと桁違いに大きいものであり得る。治療行為、例えば高用量のワクチン、抗生物質、又は薬物の投与が、関連した危険性（例えば、２５０人につき１人において高い副作用）をもつ場合には、治療行為は、暴露された母集団内の危険性の適切な評価なしには公衆衛生にとって初期の攻撃又は事故よりも大きな脅威であり得る。あるいは、ワクチン、抗生物質、又は薬物は供給が不足し得、暴露された個人の選別は、入手できる量を最大使用することが極めて望ましいものであろう。従って、一組の発症前インジケーターは、前述の状況における対応策の適切な適用において決定的に重要であり得る。
【０１８２】
転写マーカーの検出のための代替法及びプラットフォーム
前述の用途において、ＤＮＡマイクロアレイを使用する方法よりも迅速且つ費用効率的方法で転写マーカーの特定のセットを測定することが必要であろう。従って、高密度ＤＮＡマイクロアレイは、最も有意義な転写マーカーの蒸留を教えるハイコンテント（high-content）発見ツールである。しかし、最近の進歩、例えば少ない初期量のＲＮＡを用いての試料及び標的調製の時間短縮は、高密度ＤＮＡマイクロアレイが単にバイオマーカー発見プラットフォームである代わりに直接診断プラットフォームであることを可能にする。遺伝子発現の高度並行測定のための他のラットフォームとしては、ＳＡＧＥ及びＭＰＳＳが挙げられる（５６）が、これらの方法は技術的に興味深い。ＭＰＳＳは、極めて低いレベルでのものであっても、細胞当たりのＲＮＡ分子の正確の数を提供できる。従って、ＭＰＳＳは、マイクロアレイからの結果を確認するのに使用し得る。
【０１８３】
“遺伝子”内の部分配列の定義
代替プラットフォームに対する減少(reduction)における最初の段階は、エラーの許容し得る確率で高い割合の分類をさらに行うのに必要とされる特定の転写マーカーの数の統計学的減少を伴う。ｃＤＮＡ分子（数百塩基対の二本鎖ＤＮＡ）又はさらに長いオリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖の７０ ｍｅｒ）を使用して調製されるマイクロアレイを使用する“遺伝子発現”の発見と異なって、Affymetrix遺伝子発現マイクロアレイは、少なくとも１０個の２５ ｍｅｒプローブ対の組み合わせ〔この場合、その対のメンバーの一方が予測される遺伝子配列に対して完全配列マッチであり且つ他方がミスマッチであり、中間（番号１３の位置）ヌクレオチドを除いてそのパートナーと同じ配列からなる〕を用いて全ての公知の遺伝子を探査する。２５ ｍｅｒプローブとその標的転写標識との間の相補的結合は、まさに１個のミスマッチ（長いオリゴヌクレオチド及びｃＤＮＡプローブと異なって）によって大幅に弱められる。従って、ごく小さいオリゴヌクレオチドプローブだけが極めて不均質な(highly hetergenous)トランスクリプトームのプローブ様の質問(probe-wise interrogation)を提供し、その含有量は、正確な生理学的条件に応じて遺伝子活性化及び非活性化と共に変化するばかりではなく、別の代わりとなるエキソンスプライス変化と共にも変化することを認めることが重要である。
【０１８４】
ＧＣＯＳソフトウエアは、遺伝子配列の３´末端の全域でプローブ対強度プロファイルを考慮するアルゴリズムに基づいた公知の又は予測される全長遺伝子配列について“present”call又は“absent”callを作成するが、その結果は個々のプローブ対の強度にデコンボリュートされる(de-convoluted)ことができる。それぞれの公知の遺伝子配列内に置かれたそれぞれのプローブについて利用できる強度値は、その２５ ｍｅｒ転写配列が種々の得られるｍＲＮＡにスプライスされているか否かに依存しない比較的高い信頼性の配列識別(identification)である。全長遺伝子産物用のｃＤＮＡプローブは、このような識別を全く行なうことができないであろうし、７０ ｍｅｒプローブアレイは中間レベルの配列決定を示すが、より高いハイブリダイゼーション・ストリンジェンシー(stringency)を必要とするであろう。また、長いオリゴヌクレオチド７０ ｍｅｒから決定された転写配列におけるエラー率は、中程度〜高い誤差であろう。
【０１８５】
部分配列含有量の減少
分類を行うのに必要とされる完全配列遺伝子の数を減らすための本発明に記載の方法と同様の方法で、全長遺伝子配列内の部分配列の数も、Affymetrix GCOSソフトウエアが全長“遺伝子”を“存在する”又は“存在しない”と確認したか否かにかかわらず、分類に使用するために選択し得る。このようにして、分類の問題は、実際に存在するかもしれないし又は存在しないかもしれないし、あるいは量が変化するかもしれないし又は変化しないかもしれない部分配列からなるであろう全長遺伝子配列の代わりに実験的に確認された量変化を有する規定の２５ ｍｅｒ部分配列の一組に減らされるであろう。
【０１８６】
別のアッセイデザイン
Affymetrix GeneChip（登録商標）プラットフォームは、研究におけるゲノム幅発現変化の発見のための及びあるいは結果（例えば、腫瘍予後）について１日又はそれ以上の日数を見込む状況における臨床診断のための優れたフォーマットを提供する。しかし、多数の用途、例えば感染診断は、より決定的に時間に依存するであろう。理想的には、これらのアッセイは、数時間内に行われるであろう。
【０１８７】
幾つかの極めて好ましい態様において、全ゲノムGeneChip（登録商標）実験から集められた情報は、速さ及び簡単さの両方に最適化される代替フォーマットにおいて迅速に測定され得るマーカーの著しく減少したセットを製造するに使用されるであろう。一つの極めて好ましい態様において、減少したセットの遺伝子発現マーカーは、全ＲＮＡの単離を必要とすることなく逆転写ＰＣＲ（ＲＴ／ＰＣＲ）で解析される。この例は、Ambion（Austin、TX）“Cell-to-Signal（商標）” Kitを用いて見出し得、これは、試薬を用いて５分インキュベーションを行う細胞溶解物から直接にＲＴ／ＰＣＲ増幅を可能にし、ｍＲＮＡ単離の必要性を回避する。このような方法は、全血溶解物に適用しえるし又は全血から、多数の方法、例えば遠心分離、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）で、又はその他のフローサイトメトリー（流動細胞計測法）法で、例えばAgilent Bioanalyzer 2100などを使用して分離される特異的細胞種の溶解物に適用し得る。
【０１８８】
前記の調製物からのｃＤＮＡ産物は、リアルタイムＰＣＲ法〔例えば、ＴａｑＭａｎ、又は蛍光エネルギー移動（Fluorescence Energy Transfer（ＦＲＥＴ）法、分子標識、など〕を使用して僅かな量で直接に分析できるし又は速さ及び簡単さについて最適化されるシステムにおける全ゲノムAffymetrix GeneChipsよりもさらに少ないプローブ含有量を有するＤＮＡマイクロアレイを使用して多量で直接に分析できる（５７）。この目的に使用されるマイクロアレイは、先の概説に記載の多数のオプションから選択し得る（５８）。
【０１８９】
極めて好ましい態様において、前記の型のアッセイを行うのに必要な血液の容量は、本発明に記載の実験に必要とされた容量に比べて著しく減らされるであろう。
【０１９０】
現在市場で入手できる２つのスモール・アリコート法(small aliquot technique)がある。この２つの方法は共に、ナノグラム量のＲＮＡからマイクログラム量のＲＮＡまで増幅することができる。一つは、その２サイクル増幅プロトコールを支持するAffymetrixからのものである。このプロトコールは、基本的に、より多くのcＲＮＡ産物を得るために生体外転写工程を二重にする。勿論、これはまた、仕事量及び時間を相当に増やすであろう。ナノグラムのＲＮＡを比較的短い時間で増幅するための新しいプロトコールは、Ovation（商標）から入手できる。この方法はAffymetrixシステムで広範囲にわたって試験されていないが、大いに見込みがあり、本発明で考慮される。これらの方法により、ナノグラムのＲＮＡを単離するのに、数滴の血液が必要とされるだけである。さらなる方法が、数滴の血液の採取及びＲＮＡ安定化に開発され得る。一つのこのような可能性は、血液を安定化させるために並びに輸送及び保存、次いで必要とする場合のＲＮＡ単離のためにＲＮＡｓｔａｔを使用することである。
【０１９１】
あるいは、全ゲノムGeneChip（登録商標）実験から得られる情報は、GeneChip（登録商標）全ゲノムアッセイによって検出される転写 マーカーによってコードされるポリペプチドを探査するアッセイを得るのに使用できるであろう。これらのポリペプチドは、血液中で又は細胞溶解物から、ＤＮＡプローブの代わりに抗体からなるマイクロアレイを使用して（５９）又は相対タンパク質量を測定する質量分光分析法で検出できるであろう。
【０１９２】
全体的ビジネスモデルの部分として
しかし、臨床環境において並列病原体監視アッセイを現実的に幅広く用いる唯一の経済的方法は、一般的な病原体日常的臨床診断のためのそれ自体の権利において有効性を有するアッセイを用いて並行してそのようにするべきであるということが、集団発生監視（Epidemic Outbreak Surveillance)（ＥＯＳ）プログラム及び本発明の主要な仮説である。すなわち、一般的な病原体についてについてreimbursableな診断アッセイとは異なって、生物兵器監視のためのun-reimbursableなアッセイは、臨床オペレーションに過酷な負担を負わせるのみであろうし且つ広く採用されないであろう。病原体ゲノムマーカー（例えば、ＰＣＲ又はマイクロアレイを使用して）介して感染症の特異的原因を確認することが必ずしも可能ではあり得ないことから、病気の原因の性質を解明し且つ臨床医の感染症の適切な管理を指導する宿主由来の代替“バイオマーカー”を調べる重要な必要が依然としてある。遺伝子発現の監視は、何千とまではいかないが何百ものこのような“バイオマーカー”を提供できるもしかすると画期的な技術であると考えられる。しかし、遺伝子発現に基づいた生体防御アッセイが科学的好奇心を超えて及び臨床診断の領域に移るために、重要な研究を行ってその原理が日常の臨床診断に適用できることを実証しなければならない。従って、基準（標準）ヒト遺伝子発現量のデータベースを開発し且つ病原体感染の種々のレベル及び段階によって引き起こされる摂動の性質を理解する重要な必要がある。
【０１９３】
本発明の上記の記載は、当業者が本発明をなし、使用することができるように本発明をなし、使用する態様及び方法を提供し、この実施可能性は、特に付属の特許請求の範囲の主題について提供される。
【０１９４】
上記で使用されるように、“からなる群から選択される”、“から選択される”などの語句は、特定された物質の混合物を包含する。
【０１９５】
数値限定又は数値範囲が本明細書に記載される場合には、その終点が含まれる。また、数値限定又は数値範囲内の全ての値及び部分範囲が、明確に記載されるように具体的に含まれる。
【０１９６】
前記の記載は、当業者に本発明をさせ、使用することを可能にするために提示され及び特定の用途及びその要件に関連して提供される。好ましい態様に対する種々の改変は、当業者には容易に明らかであろうし、また本明細書で定義した一般的原理は、別の具体的態様及び用途に本発明の精神及び範囲から逸脱することなく適用し得る。従って、本発明は、示した具体的態様に限定されることを意図するものではなく、本明細書に開示される原理及び特徴と一致した最も広い範囲と一致されるべきである。
【０１９７】
本発明を一般的に説明すると、さらなる理解が、本明細書において単なる例示の目的に提供され且つ特に明記しない限りは限定することが意図されないある具体的な例を参照することによって得ることができる。
【実施例】
【０１９８】
総見（Overview）
告知同意を受けた基本の軍事訓練者（Basic Military Trainees）（BMTs）は血液及び／又は鼻の洗浄液を十分に寄付した。血液の採取及びRNAの単離はパックスジーン（Paxgene）血液RNA装置（PreAnalyti X）を用いて行ない、該装置は血液採取用の吸引管（PAX管）と全血から全RNAを単離するための処理キット（PAXキット）とよりなる（35）。単離したRNAを増殖し、標識し、且つアフィメトリックス（Aftymetrix）からのHG−U 133A(A)及びHG−U133B(B)遺伝子チップ（Gene chips）上で尋問した。アフィメトリックスの遺伝子チップ  プラットフォームは転写物（transciptome）の有意なサブセットを測定する。設計上、遺伝子チップは、RNA母集団から増殖した標識済みcRNA標的を検出するのに光リトグラフィーを介して製造したDNAオリゴヌクレオチド  マイクロアレー（microarray）を組入れてある。鼻の洗浄液はアリコートであり培養及び即時のPCRを介してアデノウィルス感染の測定用に送る。
【０１９９】
実施例１；試料の採取
テキサス州サンアントニオにあるラックランド空軍基地（LAFB）は、米国空軍への全ての新兵に対する基本軍事訓練の場所である。50,000人以上の基本軍事訓練者（BMTs）は任務の割当て前に6週間の訓練過程を受けた。これらのBMTsは狭い宿所で食べ、眠り且つ訓練する50〜60人の人数の小隊（flights）に編成される。各々の小隊は仲間の小隊と対になっており、これによって予定した活動のため共同局在により接触が増大され、多数の小隊が同じ兵舎建物で居住する中隊にグループ分けされ、個々の小隊のため兵舎毎に再区分される。
【０２００】
LAFBに到着するBMTsはこの研究に参画するのに告知同意を受けた。訓練の1〜3日目に、大体15mlの血液を、標準の実験様式当り各々のBMTsから全部で5本のパックスジーン管に抜出して基準（baseline）の遺伝子発現プロファイルを確立する。100.5又はそれ以上の温度及び呼吸症状で訓練中に呈したBMTsは鼻の洗浄及びパックスジーンでの血液抜出しに同意した。全てのパックスジーン管を室温で2時間維持し次いで−20℃に冷凍し、処理のため7日以内に海軍の研究所（Naval Research Laboratory）（NRL）にドライアイス上で運搬する。鼻の洗浄は標準の実験様式により5 ccの標準食塩水を用いて行ない鼻腔腔を洗浄して無菌容器中に流出液を採取する。鼻の洗浄流出液は区分される前に1〜24時間4℃で貯蔵し、−20℃で貯蔵し、処理のため7日以内にNRLに運搬する。
【０２０１】
全てのBMTsは最初の呈示で、病気を有する呈示中に及び再調査（follow-up）で標準化した尋問を受けた。BMTsに持ち出された質問には次のものがある；予防接種の履歴、アレルギー、最後の食事、最後の運動、最後の負傷、受けた投薬、喫煙履歴、観察した被検者の症状及び最後の月経（適当ならば）。観察した被検者の症状のうちでは、次のものを質問且つ監視した；咽喉痛、副鼻腔充血（sinus congestion）、咳（喀痰あり又は空咳）、発熱、悪寒、嘔気、嘔吐、下痢、倦怠、全身痛、鼻感冒、頭痛、疼痛を伴なう深呼吸及び皮疹。全てのデータは個人の識別番号を用いて電子フォーマットに記録した。
【０２０２】
本発明者は基礎軍事訓練者（BMT）母集団で発現する遺伝子発現パターンを調べることを求めた。何故ならばBMT母集団は呼吸性の病原体に自然に曝されるからであり、しかも次後の6週の訓練期間中に病気を発生するからである。BMTsの50％までが訓練中に上部気道の感染（URI）を経験し、BMTsの40％が発熱とURI症状とを有する。発熱呼吸疾患の大体60〜80％がアデノウイルス型式４に因る。有意な少数の病気を生起する別の病原体には、化膿連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎クラミジア（Chlamydia pneumoniae）、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）及び百日咳菌（Bordetella pertussis）がある。
【０２０３】
BMTsは6週の訓練番組に亘って設定スケジュールを維持し、密に接近して保持され；BMT母集団は、計画をくじくような外部からの要因／環境上の要因の不在下に病原体の暴露及び／又は感染から得られる遺伝子発現プロファイルを評価する独特な機会を提供する。
【０２０４】
EOS番組の最初の18ヵ月において、ラックランド及び空軍の軍医総監による施設検査部（Institutional Review Board）（IRB）で承認された実験様式（プロトコル）を実施する。この実験様式はラックランドの第37回訓練の空軍中佐（Wing Commander）及び基地司令官（Base Commander）によって支持されるように続行する。本発明者はBMTsの4つの範ちゅうからの全血発現プロファイルを比較するために実験モデルを実施した；
１．健康人（基準）
２．アデノウイルス４に感染した（Ad4＋）発熱呼吸病（FRI）の患者
３．アデノウイルスにかかっていない（Ad４−）FRI患者
４．FRI Ad4＋後の患者（アデノウイルス感染から回復した個人、即ち前記のNo.2）。
【０２０５】
それぞれの個人は彼等が基本訓練の0週にありしかも先の4週で呼吸症状を有しないならば、健康であると識別される。FRIを有する個人は、健康クリニック及び健康相談所に呈示されたBMTsとして、主要な供給者及び研究看護婦によって識別される。BMTsは全員遺伝子発現プロファイルを調べるための血液抜出しに同意し且つこれを受けた。全ての病気のBMTsは存在している症状の種類及び症状の開始及び期間を調べるのに標準化した尋問を受けた。肉体の検査及び完全な血球算定を記録した。迅速な免疫測定／PCR／培養によりアデノウイルス病を有すると調べられたBMTsはそれらの初期のFRI呈示から14〜21日後に次後の血液抜出し及び鼻の洗浄を受け；これらの患者の大部分は再調査の血液抜出しの時点で感染の更なる症状は有しない。アデノウイルスに対するPCR及び全ての呼吸性ウイルスに対する培養を鼻の洗浄液について行なう。100人のBMTsが30人の健康なBMTsを含めて該研究に参加した。アフィメトリックスU133A／Bチップ  セットを用いてPAXジーン血液RNA試料について33,000個の既知遺伝子及びオープンリーディングフレーム（ORFs）に対する全血遺伝子発現プロファイリングを行なった。76人のBMTsからのデータは次の分類を利用できる：健常者（n=38）、アデノウイルス感染を有しない発熱患者（n=14）、培養により測定するとアデノウイルス感染を伴なう発熱患者（n＝24）及びアデノウイルスを伴なう発熱病態から回復した患者（n=26）。グループ間でより低い90％の信頼間隔の＞=1.5倍率変化の発現レベル差を示す遺伝子についての最初の調査によって、913個の遺伝子が0.1％メジアンの偽の発見率（false discovery rate）（FDF）で健常者と発熱患者との間で異なり；203個の遺伝子が2.0％FDRで健常者と回復期の患者との間で異なることを示した。アデノウイルスに対する審査用の迅速な検定を追加した進行する補充によってFRI Ad4−BMTsの登録増大を可能とし且つFRI Ad4＋4群とAd4−群との間で統計的な解析を可能とする。
【０２０６】
実施例２；試料の調製
材料及び方法
PAX管での血液の採取。血液は生産者の指示により志願者からPAX管に収集した（60）。図1に記載した実験については、12本のPAX管を1人から採取する。次いで、PAX管を２つの条件について6本の2群に分ける。続いて、対のPAX管からのRNAは、更なる処理のため十分なRNAを得るようにプールしなければならない。これによって各々の条件において3回の反復再現が得られる。
【０２０７】
全RNAの単離。  試料の採取後に、PAX管を２時間又は９時間室温でインキュベートし、続いて直ちに全RNAの単離を行なうか又は更なる処理前に６日間−20℃で冷凍する。全RNAの単離について、本発明者はPAXキットの教本に従がう(33)が、プロテイナーゼＫ処理後に緻密なペレット形成を助力する改変を伴なう。弛いペレットは問題がある。緻密なペレットを形成するには、試料当りに添加したプロテイナーゼＫを40μlから80μl（＞600mAU／ml）に増大させ、55℃でのインキュベーション時間を10分から30分に増大させた。試料を回転した（spinning）後に、緻密なペレットが未だ形成されていないならば、その時は試料を再混合し、更に5分間55℃でインキュベートし、続いて遠心分離する。PAXキットの教本に記載される任意のオン−コラム（on-column）DNase消化（digestion）は実施しなかった。即ち、この時点でのOD測定はDNA混入に因り正確な定量を与えないが、260／280の比率は別の混入物を示し得る。80μlで溶離したRNAの大体4μlが0.1より大きい吸光度を得るのに必要とされる。全てのアリコートをOD読み取りのため10ｍMのTris-Cl  pH7.5中に希釈する。
【０２０８】
イン−ソルーション（In-solution）DNase消化。  続いて、DNA−除去（即ち無含有）（登録商標）キット（Ambion社）を用いて溶液中DNase処理を行なう。要約すると、80μlのBR5緩衝液に溶離した各々の試料について、7μlの10×DNase  1緩衝液と1μlのDNaseとを添加し、続いて混合し、37℃で20分間インキュベーションを行なう。しかる後に、7μlのDNase不活化試薬を添加し、室温で２分間インキュベートし、回転させて（spin down）不活化試薬中にあるビーズを造粒する。上澄み液中の処理したRNAをペレットの破裂なしにピペットで除去する。各々のRNA試料の一分量（アリコート）を定量化のため且つQC測定のため生体解析器上で操作する。
【０２０９】
ポリ−A  RNAの単離。  DNase処理後に、対の試料をプールし、オリゴテックス（Oligotex）（登録商標）mRNAキット（Qiagen社）を用いてmRNAを単離した。mRNAを全部で100μlのOEB緩衝液に溶離した。
【０２１０】
試料の濃縮。  次に、エタノールの沈降を介して試料を濃縮する。各々100μlの試料について、1μlのグリコーゲン（5mg／ml）（ambion社）と15μlの5M酢酸アンモニウムと−20℃に冷却した200μlの100％エタノールとを添加した。反応物を−20℃で一昼夜インキュベートした。次の日に、試料を13.791ｇで4℃で30分間回転させた。ペレットを−20℃に冷却した80％エタノールで2回洗浄し；風乾し；12μlのヌクレアーゼ除去水（Ambion社）に再懸濁させた。
【０２１１】
cRNAの生成。  全ての次後の工程はジーンチップ（Gene Chip）（登録商標）発現解析便覧（6）に記載の如く行なう。各々の試料の10μlを一本鎖cDNA合成反応に用いる。精製した二本鎖cDNAの10μlをビオチン標識したcRNAの合成に用いる。フラグメント化ハイブリダイゼーション及び検出は該便覧（6）に記載の如く行なう。
【０２１２】
生体解析器（bioanalyzer）での測定。  RNA  6000ナノ検定（Nano Assay）（Agilent Technologies社）（61）に記載した実験様式を用いて、DNase前及び後の全てのRNAから、精製した二本鎖cDNA、精製したcRNA  1：10に希釈及びフラグメント化したcRNAの1μlを生体解析器上で操作した。生体解析器の使用はゲル電気泳動と同様であるが、但しゲル基質及び試料はカートリッジの微量流動チャンネルを通って流動しかくして小さな試料の使用及び自動化定量を容易とするものである。
【０２１３】
gapdh遺伝子についての即時（real-time）PCR。  gapdh DNAについて各々の即時PCR反応は次の成分を含有する；12.5μlの2×SYBRグリーンPCRマスター混合物（Applied Biosystem社）と0.5μlの5’GTGAAGGTCGGAGTCAACGGフォワードプライマー（10μM）と0.5μlの5’GCCAGTGGACTCCACGACGTAリバースプライマー（10μM）と10.5μlの水と1μlの全RNA又はcDNA試料からのテンプレート。反応は40回の周期につき95℃で3分間；95℃で30秒間、58℃で30秒間及び72℃で30秒間の周期設定でアイサイクラー（iCycler）（Biorad社）中で行ない；続いて融解曲線の解析及び／又は4℃での保持を行なう。反応完了はまたゲル電気泳動により分析する。
【０２１４】
逆転写。  実験様式発現中のRNA特性評価について、cDNAの合成はRT−PCRキット（Invitrogen Life Technologies社）用のスーパースクリプト（SuperScript）（登録商標）一本鎖合成系を用いて行なった。
【０２１５】
統計的な解析。  260／280 OD比、260 nmでの吸光度を介しての濃度、蛍光分布の統合を介しての濃度、限界値サイクルを介しての混入しているDNAの相対量、リボソーム28S／18Sピーク比を介してのRNA特性、二本鎖cDNAの収量、精製したcRNAの収量及び精製したcRNAの260／280比の間で統計的に有意な差異を調べるのに、スタットビュー（Statview）（SAS Institute社）ソフトウェアを用いて非変数的なマン−ウィットニー（Mann-Whitney）U試験を行なう。0.05より低いか又はこれに等しいP−値は統計的に有意であると考えられる。
【０２１６】
ノイズ（Raw Q）、ピクセル強度の変動の尺度（indicator）；平均背景；スケール因子、チップ間の強度変化の尺度；プレゼントコールの％、検出した遺伝子の個数の尺度；及びgapdh 3'／5'信号及びactin3'／5'信号、RNA分解の尺度を含めてQC（品質管理）計量の生成にアフィメトリックス  マイクロアレー  スウィーツ（Affymetrix Microarray Suite）5.0（MAS 5.0）（62）を用いる。データプロット（63）を用いてQC計量の自動相関を評価する。スタットビューを用いて個々の線図を形成し且つ平均値から±標準偏差で品質管理の限界値を設定する。
【０２１７】
各々のプローブの強度値を含有するMAS 5.0 CELファイル及び遺伝子発現のプレゼントコールを更なる解析のためdチップ（64.65）に引き入れる。dチップにおいては、HG−U133A及びHG−U133Bチップを別個に分析する。dチップは多重アレーにおけるプローブの強度値を用いて発現指数を算定し、これは転写物存在量の尺度である。発現指数はMAS 5.0により信号の統計的な産出と同様である。dチップは階層的なクラスタリング及び倍率変化の測定に用い、発現指数は変数の解析のためJMP IN（SAS Institute社）に提供された。
【０２１８】
結果
ジーンチップ(Gene Chip)（登録商標）装置で用いるのにPAX管からのRNAの応用
PAXキットを備えた実験様式を用いたPAX管からRNAを単離する。分光法によって測定すると、収量は4.8μgであり；260／280比は2.01であり；濃度は0.06μg／μlである。これは0.5μg／μlで5μgの当初の全RNA量を指示したジーンチップ（登録商標）実験様式で用いるには十分でない(6)。即ち、2本のPAX管から単離したRNAをプールし、続いてエタノール沈降させ、15μlのBR5緩衝剤に再懸濁させる。これによって10.4μgの収量と、2.07の260／280比と0.7μg／μlの濃度とが得られ、これはジーンチップ（登録商標）プロトコールで推奨される量に適合する。
【０２１９】
任意のオンコラムDNase消化工程はPAXキットに記載の如く行なう。然しながら、特性の保証のためには、精製したRNA中のDNAの存在をgapdh遺伝子の即時（real time）PCRを介して評価する。PCRはgapdh DNAの存在を検出でき（図2A）オンコラムDNase消化がPCRによって検出できないレベルにまでDNAを除去するのに十分な程に有効ではないことを示唆している。即ち、RNAを溶液中のDNaseで処理する。その後に、gapdhDNAは即時PCRによっては検出されず（図2B）、大部分のDNAは消化されてしまったことを示唆している。然しながら、RNAの保全性は溶液中のDNase処理中に妥協でき；即ち逆転写続いてのgapdh用の即時PCRを溶液中のDNase処理済み試料について行なう。gapdhDNAは逆転写したPCRに続いて検出され（図2C）、RNAは未だ良好な特性を有することを示唆している。
【０２２０】
オリゴテックス（Oligotex）で精製したmRNAの使用は、全RNA体PAX管中の血液から単離したmRNAを用いる時に検出される遺伝子の個数を比較する予備実験に基づく。検出した遺伝子の個数を表わす得られるプレゼントコールは全RNAにつき33％であり、HG−U133Aチップ上のmRNAにつき41％である。オリゴテックスを介して単離したmRNAとイオン対逆相高性能液体クロマトグラフィー（IP RP PHLC）を介して単離したmRNAとの間で比較を行なう（66）。得られるプレゼントコールはIP RP HPLCのmRNAについては17％及び19％であり、オリゴテックスのmRNAについては35％及び40％である。35％及び40％である。オリゴテックスで単離したmRNAは最高％のプレゼントコールを示したので、該工程を実験様式に組入れる。
【０２２１】
PAXgene血液RNA装置及びジーンチップ（登録商標）プラットフォームを用いて人血試料の遺伝子発現プロファイルに用いた実験様式は、供給者当り少なくとも２本のPAX管、オンコラムDNase消化なしに但し溶液中のDNase消化を伴なう全RNAの単離、mRNAの単離、濃縮用の沈降続いてのジーンチップ（登録商標）便覧からの標準実験様式を包含する。
【０２２２】
条件E及びOに対するQC測定の比較
PAX管に収集した血液試料の品質管理測定を比較し、該血液試料のRNAは室温で2時間の最小インキュベーション時間後に単離され（図１、条件E）及び室温で9時間インキュベーションし、続いて−20℃で６日間貯蔵した後に単離された（図１、条件O）。
【０２２３】
２つの条件からの全RNAの純度及び収量を比較するのに、RNA試料に分光分析を行なう。２つの処理の間で260／280比に差異はなく（表１、列１）、RNA純度は試料について同等であることを示唆している。DNase処理前の収量は条件Oよりも条件Eについて1.0μg高い（表１、列２）。然しながら、この測定は試料中の差次的なDNA混入によって混同されてしまう。即ち、溶液中のDNase処理後には、生体分析器を用いてRNAを定量化した（図3B）。驚くべきことには、条件Eよりも条件Oにおいて収量は0.9μg高い。これはOと対比するとEにおいてより以上のDNA混入があったことを意味する。それ故、本発明者はgapdhに対する即時PCRを介して２つの処理におけるDNA混入の相対量を測定した。限界値交差サイクル（threshld crossing cycle）はOと対比するとEにおいてより低く（表1、列4）、Fにおいてはより以上のDNAがあることを示している。これらの所見は、より以上のDNA混入がOよりもEにおいて生起したが、RNAの収量はEよりもOにおいてより高いことを示している。
【０２２４】
表１−PAX管から単離した全RNAの純度、収量及び安定性に関する特性計量の条件E対O間の比較。各々の細胞で示した各々の平均±SEM値はn=6から算出する。
【０２２５】
2008518626.tif 000002
種々の試料からのRNAは生体分析器で種々のプロファイルを生じ、本発明者はQC用にかかるプロファイルを用いたものである。それ故、本発明者は試料からのRNAプロファイルを重ねて試料間の変数及びRNA特性を評価した（図3）。DNase処理前に、条件Eからの蛍光プロファイルは平均して、条件Oからの試料よりも高い（図3A）。溶液中のDNase処理後には、蛍光プロファイルは全般的に低減し、条件に関して逆転した（図3B）。興味あることには、DNase処理前及び処理後のプロファイルの比較ではDNAは２つのリボソームピークの間で目立つ傾向があり且つより後の時間ではこぶ（hump）として目立つ傾向があることを示唆した（図3A及びC）。これらの所見は分光法及び即時PCRによって測定した収量及びDNA混入結果を確証する。28Sと16SリボソームRNAピークの比率は、生体分析器の自動ピーク検出及び算出ソフトウェアに基づいて大体1.6平均であった（表1、列5）。然しながら、手動の調節では28S／16S比は大体2平均であることを示した。条件E及びOの間では28S／16S比の差異はない（表1、列5）。蛍光プロファイルの形状は両方の処理で同様である（図3B）。これらの結果は両方の条件からのRNA分布は同様な良好な特性を有することを示唆している。
【０２２６】
RNAは２つの条件について同様な特性を有するので、本発明者はフラグメント化した標識済みcRNAを形成する手法を続行した。本発明者は二本鎖cDNA合成（図4a）、精製したcRNA（図4B）及びフラグメント化cRNA（図4c）を監視する生体分析器を用いた。図4における特徴的なプロファイルは成功裡の反応を示している。二本鎖のcDNAの収量は条件Oよりも条件Eにおいて0.09μg高く（表2、列1）、然るに精製したcRNAの収量は約30μgであり、その際２つの条件間で検出し得る差異はない（表2、列2）。260／280比は２つのグループ間で同様である（表2、列3）。
【０２２７】
表2−PAX管から採取したmRNAから誘導した二本鎖cDNA及びcRNAの収量及び純度に関する特性計量の条件E対O間の比較。各々の細胞で示した各々の平均±SEM値はn=3から算出する。
【０２２８】
2008518626.tif 000003
QC計量（metrics）は試料の調製が成功したことを示唆したので、本発明者は試料をヒトのHG−U133Aチップにハイブリッド化し、続いて−80℃で貯蔵された同じハイブリッド形成カクテルを用いてHG−U133Bチップ上にハイブリッド形成した。ハイブリッド形成、洗浄、検出及び走査はジーンチップ（登録商標）便覧（6）に記載の如く行なう。
【０２２９】
その後に、本発明者は本発明者の設備で処理した別の試料と共にQC計量を評価した（図5）。計量が経時的に無作為に変動するかどうかを調べるには、図5に示した各々のQC計量を遅れのプロット及び自動相関プロットでグラフ化する（図示せず）（67）。該プロットに明白なパターンはなく、計量が一定の分布から無作為に抜出されることを示唆しており、かくして中央平均から±3の標準偏差で管理限界の設定を可能とする。全ての測定値は管理限界内にある。平均背景は70付近に中心を有し、これは20〜100の典型的範囲内である（68）。重要なことには、プレゼントの％はHG−U133Aチップについて39％で中心であり、HG−U133Bチップについて25％で中心である。最後に、gapdhとactinとの両方について3'／5'の信号比は〜1.2で中心となり、これはRNAが良好な特性を有し且つcDNA合成が有効であることを示している。条件E及びOからの試料についてこれらのQC計量の比較では有意な差異を示さなかった。これらのQC結果は本発明者のプロセスの信頼性に強固な自信を示唆した。
【０２３０】
遺伝子発現プロファイルの解析
転写物存在度（transcript abundance）の測定における変動に対して、取扱い条件、マイクロアレーチップ及び種々の遺伝子の寄与を調べるのに、本発明者はHG−U133Aチップからのd−チップ誘導遺伝子発現指数における変数の三方分析を行なった。6個のチップからの発現指数の変位値−標準プロットは発現指数が正常に分布されなかったことを示す。即ち、22,577個の遺伝子から100個の遺伝子を無作為に抽出し、それらの発現指数は零を除くのに全ての値に「1」を加えることにより変換し続いてボックス−コックス（Box−Cox）変換にかけて常態により近い分布とさせる。続いて変換したデータを次のモデルに適合させる；
Yijk＝M＋Ci＋Pj＋Gk＋Eijk
但しYは変換した発現指数を表わし、Mは総平均を表わし、Cは２つの条件（i＝1，2）を表わし、Gは100個の抽出した遺伝子（k＝1，2，3・・・100）を表わし、Eは残留誤差を表わす。Pは３つのレベル（j＝1，2，3）を有し、血液抜出しの順序、処理の順序及び／又はチップ間の順序に因る変動を包含する。例えば、Pのレベルj＝1は各々の条件の1個のチップからの発現指数を含有し、これらの2個のチップは、最初に抜出され（条件Eについては抜出し順序の番号1，3，及び条件Oについては抜出し順序の番号2，4，図1）且つ互いに処理されたPAX管試料からの標的を検出する。モデルへの適合後に、残留プロット対予測プロットは相関を示さず、残留値（residuals）は正常に分布された（シャピローウィルクW試験、P＝0.24）、測定係数（R2）は0.993である。これらの結果は該モデルがデータ中の変動の大部分を適正に説明することを示唆している。変動結果の分析を表３に示す。
【０２３１】
2008518626.tif 000004
「スクェアの合計」欄は「供給源（Source）」欄の下に挙げた諸因子により説明される変動の大きさを示し、然るに「全変動の％」欄はスクェアの合計を％に転化した。F比（１因子の平均スクェア／残留値の平均スクェア）を用いて１因子によって説明される変動が残留値の変動よりも統計的に大きいかどうかを試験し；0.05より小さいP−値は統計的な意義を示した。結果が示す処によれば、全ての３つの因子；C, P及びGは全変動の複数部分を有意な程に説明した。然しながら、遺伝子（G）因子は変動の大部分（99％）を説明したが、取扱い条件は遺伝子発現レベルの差異に最小限に（0．09％）寄与した。これらの結果はチップ上の全ての遺伝子に一般化し得る。何故ならば分析した100個の遺伝子は無作為に選出されたからである。
【０２３２】
本発明者の実験室で処理した別のPAX管誘導試料に関連して２つの条件の試料間の遺伝子レベルの相関を調べるのに、クラスター（cluster）分析を行なう。試料は平均結合を有する階層的クラスタリング（clustering）を介してクラスター化し、遺伝子の濾過、及び遺伝子又は試料の標準化は行わない。試料間の距離は1〜rであり、その際rはパールソン（Pearson）の直線相関係数である。この距離測定は全発現プロファイル間の不同性を定量化した。試料の記述的な存在論を有する得られる樹木図（デンドログラム）を図6に示す。条件F及びOからの試料は、操作員及び個々の供給者の如き別の因子によって異なる試料とは離して互いに集めておき、該試料はHG−U133Bチップでの遺伝子についてE及びO条件に分離した。この結果は相異なる条件が遺伝子プロファイルに多大の変化を誘発しなかった点で変数の分析を更に立証する。
【０２３３】
倍率変化により２つの条件間の差異を定量化するのに、本発明者は２つの条件間で全ての遺伝子の倍率変化を比較した。濾過されていない遺伝子のセット（HG−U133チップについては〜22,600個の遺伝子、HG−U133Aについては7，600個の遺伝子及びMAS5.0によりプレゼントコールされるHG−U133Bについては5,600個の遺伝子を有する）から、本発明者は倍率変化評価の90％信頼区間の下限を用いて条件間で1.3以上の倍率変化を示す遺伝子を濾過した。これによってHG−U133Aチップについて5個の遺伝子及びHG−U133Bチップについて22個の遺伝子が得られる（表4）。下限を1.5に設定する時は、1個のみの遺伝子がHG−U133Aチップに残留し、HG−U133Bチップには残留しなかった。これらの結果は、２つの条件間の差異が発現指数が90％下限のわずか1.5倍に過ぎないだけ異なる遺伝子に因るものであることを示している。
【０２３４】
2008518626.tif 000005
2008518626.tif 000006
1  条件Eの発現指数の平均値（n=3）
2  条件Oの発現指数の平均値（n=3）
２つの条件を比較するに、より多くの遺伝子がHG−U133Aチップにおいて検出されるとしても、HG−U133AチップにおいてよりもHG−U133Bチップにおいて変化を示した多数の遺伝子がある。また、HG−U133Bチップにおいて変化した遺伝子は大抵条件Oに入る。
【０２３５】
本発明者の結果は多中心（multi-centered）研究に対する試料取扱いについて幾つかの推奨を意味する。両方の条件は良好な群内（within-group）信頼性を示すが両条件間に差異があるので、変動を減らすのに１つの方法を選ぶのが好ましい。この場合には、条件Oが条件Eよりも有利であると思われる。何故ならば、条件Oは試料を処理又は冷凍しなければならない前に時間を与えるからであり、しかも冷凍している間に運搬を考慮するからである。両条件間の取扱い法の範囲の融通性を必要とするならば、次後の分析中に90％下限の1.5以上の倍率変化の遺伝子のみをパスする如く統計的な厳しさを増大する限りはこの融通性は尚可能であろう。
【０２３６】
実施例３：GXPプログラム“Quad 30”実験
材料及び方法
鼻洗液からアデノウイルスの培養。  全ての試料をアデノウイルス、パライソインフルエンザ１，２及び、３、インフルエンザＡ及びＢ及びRSVについて培養した。アカゲザル腎臓−PMK又はサイノモロガス（Cynomologous）サル腎臓−CYNを含めて標準細胞型式をA549細胞に加えて最も普通に用いる。標準培養及び直接の蛍光抗体を有するシェル小ビン（shell vial）を用いる。全ての呼吸性培養物を陰性と呼ばれるまで10〜14日間保持する。
【０２３７】
鼻洗液からアデノウイルス血清型４に対する蛍光性（fluorogenic）即時PCR。マスターピュア（登録商標）DNA精製キット（Epicentre Technologies社、Madison、W1）を用いて、DNAを100μlの鼻洗浄液から抽出し、10μlのヌクレアーゼ無含有水（Ambion社、Austin、TX）に再懸濁させた。２種の異なる蛍光性即時PCRを用いてアデノウイルス血清型４ヘキソン及び繊維遺伝子を検出する。ヘキソン遺伝子特異PCRについては、各々の反応物は20mMのTis−HCl（pH 8.4）と、50mMのKClと4mMのMgCl2と200μMのdNTPs（Invitrogen Life Technologies社、Carlsbad、CA）と200nMのプライマーと、100μMのTaq Manプローブ（Integrated DNA Technologies社、Coravile、IA）と0.6Uの白金Taq DNAポリメラーゼ（Invitrogen Life Technologies社、Carlsbad、CA）と0.6μlの鼻洗液からの精製DNAとを含有する15μlの全量である。アデノウイルス４特異性ヘキソンプライマーの塩基配列は次の通りである；5'−GTTGCTAACTACGATCCAGATATTG−3'（前進；SEQ ID NO: 1）及び5'−CCTGGTAAGTGTCTGTCAATCC−3'（リバース；SEQ ID NO; 2）アデノウィルス４ヘキソン特異性プローブの塩基配列は次の通りである；5'−FAM−CAGTATGTGGAATCAGGCGGTGGACAGC-TAMRA-3'（SEQ ID NO.3）、但しFAMは蛍光リポータであり、TAMRAは蛍光消光体である。反応条件は次の通りである：94℃で3分間の変性次いで95℃へのランピング（ramping）及び60℃で20秒間の２工程での35回周期。繊維遺伝子特異性PCRについて、各々の反応物は1.5μlのFastStart DNA MASTER SYBRグリーン１（Roche Applid Science社、インジアナポリス、IN）と3mMのMgClと200nMのプライマーと0.6μlの鼻洗液からの精製DNAとを含有する15μlの全量である。アデノウイルス４特異性ヘキソンプライマーの塩基配列は次の通りである；5'−TCCCTACGATGCAGACAACG−3'（前進；SEQ ID NO:4）及び5'−AGTGCCATCTATGCTATCTCG3，（リバース；SEQ ID NO:5）反応条件は94℃で10分の変性次いで95℃へのランピング及び60℃で20秒間の２工程での40回周期である。両反応ともRAPIDライトサイクラー（登録商標）（Idaho Technology社、ソルトレークシティ、ユタ州）中で行なう。
【０２３８】
血液から全RNAの単離。  凍結したPAX管を室温で２時間解凍し、続いてPAXキット教本（60）に前記の如く全RNAの単離を行なうが、１試料当りプロテイナーゼｋを40μlから80μl（7600mAU／ml）に増大させ、55℃のインキュベーション時間を10分から30分に延長し、遠心時間を30分又はそれ以上に延長することにより緻密なペレットの形成を助力するように改良する。任意のオンコラムDNase消化は行なわない。精製した全RNAを−80℃で貯蔵する。
【０２３９】
標的の調製。  精製したRNA試料からDNAをより完全に除去するためには、特定の収集日で同じ供血者からの血液の複数PAX管から単離したRNAを引き出し、続いてDNA−フリー（登録商標）キット（Ambion社）を用いて溶液中（in-solution）DNase処理を行なう。然しながら、DNase不活化ビーズの除去を促進するには、ビーズペレットを攪乱することなく上澄み液をピペットで採取するように試みるよりもむしろ完了した反応物をスピンカラム（Qiagen、Cat No.79523）に通して回転させる。続いて、各々のDNase後の全RNA試料から1μlを、RNA特性及びRNA量の定量化の評価のためRNA 6000ナノアッセー（Agilent Technologies社）を用いて生体解析器上に走行する。次に、大抵の試料については、エタノール沈降を介して5μgのRNAを濃縮する。各々100μlのRNA試料に対して、1μlのグリコーゲン（5mg／ml）（Ambion社）と、15μlの5M酢酸アンモニウムと−20℃に冷却した200μlの100％エタノールとを添加した。反応物を−20℃で一昼夜インキュベートした。次の日に試料を4℃で30分間13.791gで回転させた。ペレットを−20℃で冷却した80％エタノールで２回洗浄し；風乾し；10又は12μlのヌクレアーゼ無含有水（Ambion社）に再懸濁させた。全ての次後の工程はジーンチップ（登録商標）発現分析技術便覧（6）に記載される如くである。
【０２４０】
データベースの統合。  データベースは２つの主要な範ちゅうに分割できる；1）メタデータ、遺伝子発現測定でない試料処理に関する全ての情報；及び2）遺伝子発現データ。メタデータは幾つかの副範ちゅう；臨床データ、実験室の取扱いデータ及びマイクロアレー結果の特性計量データよりなる。
【０２４１】
臨床データは尋問から転写される如き患者についての情報、全血算（CBC）についての情報及び収集したPAX管血液試料の取扱いについての情報を捕捉する。
【０２４２】
実験室でのデータは血液試料の処理についての情報を含有する。PAX管中の血液から全RNA抽出への工程については、処理の日時、試薬のロット番号及び操作員の如き領域、分野が捕捉される。DNased処理したRNA試料の次後の生体解析器測定によって、蛍光強度対時間のデータが得られ、これはグラフで表わして電気泳動図を形成し、同様にメタデータとして処理される。電気泳動図をバイオサイジング（Agilent Technologies社）ソフトウェアにより解析して28S−対−18S強度比及びRNA収量を生産し且つデグラドメーター（Degradometer）1.1（51）ソフトウェアにより解析して分解因子及びアポトーシス因子の如き特性計量を合体化し、計数し且つ算出する。生体解析器での解析後からハイブリッド形成までの工程に対しては、cRNAの収量及び処理回分の如き変数を記録する。
【０２４３】
マイクロアレー結果データの特性計量は、走査したチップに関連する情報である。このデータには、チップのロット番号及びDATファイルに記録した走査済み画像の日付けの如き領域がある。また、ジーンチップ操作ソフトウェア1.1（GCOS 1.1）（Aftymetrix社）により生成したレポートファイルからの領域があり、これはチップについての標的検出の特性を要約する。
【０２４４】
マイクロソフト  アクセス及びエクセル  ワークシートを用いて臨床データ及び実験室取扱いデータを手作業で記入する。デグラドメーター1.1からの生産値はエクセルワークシート中にある。リポートツーマトリックス（ReportToMatrix）（スクリプトは以下に与える）と呼ばれるインハウス（in-house）スクリプトを用いてリポートファイルをエクセル中のデータマトリックスに再フォーマットし且つ合体化する。GCOS1.1からのメタデータはアクセスに提供された。
【０２４５】
リポートツーマトリックス スクリプト；
2008518626.tif 000007
【０２４６】
2008518626.tif 000008
【０２４７】
2008518626.tif 000009
【０２４８】
2008518626.tif 000010
【０２４９】
2008518626.tif 000011
【０２５０】
2008518626.tif 000012
【０２５１】
2008518626.tif 000013
【０２５２】
2008518626.tif 000014
【０２５３】
2008518626.tif 000015
【０２５４】
2008518626.tif 000016
【０２５５】
2008518626.tif 000017
【０２５６】
2008518626.tif 000018
【０２５７】
2008518626.tif 000019
【０２５８】
2008518626.tif 000020
【０２５９】
最後に、JMP IN（SAS社）ソフトウェアを用いてこれらの種々のデータの表を識別体、通常は志願者のID番号及び血液採取日を用いて互いに統合する。メタデータの表は1000以上のコラムを有する。
【０２６０】
遺伝子発現データに関して、チップの走査したイメージを捕捉し、マイクロアレー  スーツ5.0（MAS 5.0）（Aftymetrix社）に記録し、次後にGCOS1.1に運搬する。プローブの強度から遺伝子の存在度を定量する信号値及びプレゼント（P）コール、マージナル（M）コール又はアブセント（A）コールに遺伝子の検出を定性する検出コールは、MAS 5.0アルゴリズム（算法）を用いるGCOS1.1で算出する。HG−U133Aチップ及びBチップの両方については、計数因子（scaling factor）及び標準化値（normalization value）を１に設定して、信号値を生成した後には計数又は標準化は得られない。これによって種々の計数法及び標準化法の試験を可能とする。信号値及び検出コールはエクセル（Excel）に提供され、１つのホルダーにおけるAチップ及び別のホルダーにおけるBチップに対してタブ−デリミテッド(tab-delimited)テキストファイルとして貯える。
【０２６１】
統計的な解析。  統計的な品質管理及びメタデータ変数間の関係をJMP IN及びスタッドビュー（StatView）(SAS社)で解析する。CBC又は電気泳動図データを用いてANOVA、t−試験及び臨床表現型の等級予測はリチャード  サイモン博士及びアミー  ペングラム博士により開発されたBRB−アレーツール（Arraytools）3.2.0ベータ（アレーツール社）で行なう（アメリカ国立衛生研究所、国立ガン研究所、ガン研究及び診断の部門、生物統計調査支部に対するウェブ−サイトによって利用できる）。アレーツールは遺伝子発現データの解析用に書込むが、ここではアレーツールにより「遺伝子」として処理されるのにCBCの如き或る定量的なメタデータ領域を引入れてその等級予測アルゴリズムを利用する。
【０２６２】
メタデータ変数と遺伝子発現プロファイルとの間の関係をアレーツールで解析する。信号値及び検出コールでテキストファイルのインポート（import）を促進するのに、インハウス  スクリプトをRで書込んで当該ファイルを別のフォルダーに移動させ、アレーツールと相溶性であるファイルを再命名し且つ再フォーマットする；（スクリプトは以下に与えてある）。
【０２６３】
アレーツールと相溶性であるファイルを再フォーマットするためのスクリプト；
2008518626.tif 000021
【０２６４】
2008518626.tif 000022
【０２６５】
選択したメタデータ領域をアレーツールの実験説明者ワークシートに取り入れる。データの取入れ後に、アレーツールを用いて臨床表現型と共に及び／又は臨床表現間で差次的な遺伝子発現及び存在論、等級予測及び定量的な特性相関を調べる。
【０２６６】
CBCデータは２つのマシンから得られる。第１のマシンは白血球（WBC）を３つの群のみ；リンパ球、単球及び顆粒球に区分けし、然るに第２のマシンはWBCを５つの群；リンパ球、単球、好中球、好酸球及び好塩基球に区分けする。それ故、２つのマシン間でCBCを匹敵させるには、次のイン−シリコ変換を行なう。顆粒球は好中球、好酸球及び好塩基球よりなるので、好中球、好酸球及び好塩基球の計算を合計することにより５つの群を有する試料を３つの群に転化する。またこの研究にない25名の志願者からの血液試料を両方のマシン上で操作する。これらのCBCは２つのマシン間で直線相関を示した（データは示さず）。それ故、線形回帰方程式を２つのマシン間のCBC変数について算出する。これらの方程式を用いて現在のBMTコホートのCBCを標準化する。
【０２６７】
デグラドメーター1.1ソフトウェアはマーカーピーク（51）における添加物（spliced）を用いて電気泳動図を計数する。
【０２６８】
計数（scaling）は遺伝子−発現データに対して行なう。各々の血液試料に対して、同じハイブリッド形成反応混液がチップA上に次いでチップB上に進行するので、実質上のアレーを形成するのにイン−シリコで互いに２個のチップからのデータの連鎖形成（concatenation）は論理的であり、２個のチップ型式を別々に解析しながら問題点を回避し（bypass issues）；またAチップ及びBチップ間で共通の100個の対照プローブセットは遺伝子を検出して同様な信号分布が得られる。幾つかの方法がAチップ及びBチッププロファイルを連鎖するのに考えられる。
【０２６９】
先ず、各々のAチップ及びBチップを500の標的値にまで別個に大規模に（globally）計数（スケール）するならば、次いで得られるスケール因子（SF）はAチップについてよりもBチップについて有意な程に高く（データは示さず）（t−試験、p<0.0001）、一般にBチップからの信号はAチップからの信号よりも実際上低いことを示唆している。100個の対照遺伝子の信号が各々のチップを大規模に計数した後にAチップにおいてよりもBチップにおいて高いことはこの傾向を確認している。Bチップにおけるより低い全般の信号は、低い発現遺伝子を大抵検出するプローブセットを含有するBチップに恐らくは因るものである（69）。これらの所見が示唆する処によれば、各々のチップを大規模に計数する前記工程は２つのアレー型式からのデータを連鎖する前に行なうことは適当でない。
【０２７０】
即ち、別の方法を検定し、これは500の標的値まで100個の対照遺伝子のみを用いて全てのAチップ及びBチップを計数するものである。これによって終始安定なSFが得られ（データは示さず）しかも健康人、アデノウイルス感染の患者及び回復期の患者及びアデノウイルス感染を有しない患者の４つの表現型間でSFの有意な差異はないことが得られる（データは示さず）（ANOVA、p＝0.1047  Aチップ、p＝0.1782  Bチップ）。100個の対照遺伝子は種々の組織型式の多大の研究から発現の安定性に基づいて選択され（69）；それ故この計数法は対応するA及びBチップの連鎖を可能とし且つ遺伝子濃度とは別個に検定変動を除去すべきである。このスケーリング法はイン−ハウスRスクリプトを用いて行なう（スクリプトは以下に与えた）；
スケーリング用スクリプト；
2008518626.tif 000023
【０２７１】
2008518626.tif 000024
【０２７２】
100個の対照遺伝子を用いて計数後に、対応のAチップ及びBチップからの発現プロファイルを結合して実質上のアレーを形成する。更には本発明者は検定変動を更に除去するのにこれらの実質アレーを大規模に計数することを考えた。然しながら、この方法からのSFは４つの表現型の間で差異を示した；健康な群では最高のSF次いで回復期の群、続いて発熱群でのSF（データは示さず）（ANOVA、p<0.0001）。それ故、この工程は全体のデータセットには用いられないが、アデノウイルス感染を有する患者対アデノウイルス感染のない患者の間の如く、同等なSFを有する群間で差次的な発現を有する遺伝子の検出感度を増大するのに尚有用であるかもしれない。これらの結果がまた示唆する処によれば、トランスクリプトの比較的大きなサブセットは健康人、回復期の患者及び発熱患者の間で異なるが、トランスクリプトの比較的小さなサブセットはアデノウイルスを有する患者とアデノウイルスを有しない患者との間で異なる。これらの解析工程はまたイン−ハウスRスクリプトを用いて行なう（スクリプトは以下に与えた）；
「真実の」チップを計数するスクリプト；
2008518626.tif 000025
【０２７３】
2008518626.tif 000026
【０２７４】
結果
BMTs母集団から得られるPAX系から誘導したRNAの特性及び変動
多数の因子が目標検出の可変性に基因し、その際RNAの特性は、最も重要な因子の１つである。PAX管で採取した血液からのRNAの特性は、供血者の疾病状態、試料の取扱い及び他の下流方向の過程によって影響されてしまう。以前、本発明者が示した処によれば、実際の試料取扱いを表現する２つの条件下で、PAX系は良好な特性計量（metrics）と比較的安定な転写（transcriptome）測定とを生ずるのに血液のRNAを保存し得るものである（50）。最近、新規なRNA特性計量が、RNA分解を誘発する細胞又は精製RNAの実験処理と生体分析器でのRNAの電気泳動図から誘導される計量との間の組合せに基づいて提案されている（51）。１つの新規な計量は分解因子（degradation factor）(%Dgr/18S) であり、これは18Sリボソームピークよりも小さい分子量のピークである分解したRNAからのバンドの平均強度と、100を掛けた18Sバンド強度との比率である。該計量は「警戒警報」（Alert）と呼ばれる明白な変数を誘導するのに用いられる連続変数である。警戒警報（アラート）は次の５つの意義を有する；
黒色・・・リボソームピークが検出されないことを示している；
無色（NULL）・・・RNAの分解はなく、分解因子値≦８に対応する；
黄色・・・RNAの分解が検出でき、分解因子値＞８〜16に対応する；
橙色・・・RNAの分解は苛酷であり、分解因子値＞16〜24に対応する；
赤色・・・最高の警報についてであり、分解は強力で分解因子値＞24に対応する。
【０２７５】
分解因子は、伝統的な28S／18Sバンド強度の比率よりもRNA分解のより感受性の指標である。別の新規な計量はアポトーシス因子（28S／18S）であり、これは28S／18Sピークの高さの比率であり、アポトーシスを受ける細胞の百分率を表わしている（51）。1〜3のアポトーシス因子はアネキシン（annexin）Vに対して陽性の培養細胞の80％〜０％と逆に相関している。即ち、本発明者の従前の研究（50）及び最近のBMTコホートからのPAX系で単離したRNAについて、本発明者はRNA特性計量の分布を報告しており、これは他の実験室による実験様式の比較及び計画に有用であり；マイクロアレー（microarray）の目標検出結果の特性を最も表わしている上流方向の特性計量を測定し；且つ目標検出の感受性について個人間のヘモグロビン可変性の作用を測定した。
【０２７６】
Thach等（50）からの電気泳動図を、２つのPAX管取扱い条件について再分析し、その際新鮮な血液の如き条件Ｅでは、放血から２時間の最小インキュベーション時間後にRNAを抽出し、凍結血液の如き条件Oでは、血液を室温で９時間放置し続いて−20℃で６日間貯蔵し、続いてRNA抽出する。分解因子はＥについては5.34±0.53（平均±SE、n＝6）であり、Oについては6.53±0.40であり、２つの取扱い法の間に差異はなく（Wilcoxon, p＝0.13）；その等級（分類）は分解が検出されなかったことを示している（データは示さず）。分解因子とgapdh及びactin 3'/5'との間の直線相関は組織依存性（51）であり、ここでは検出しなかった（データは示さず）。アポトーシス因子はＥについて1.39±0.06であり、Ｏについては1.29±0.09であり、また条件間の差異（Wilcoxon, p＝0.38）はなかった（データは示さず）。これらの結果によって取扱い条件間に大きな差異がないことを確認した。
【０２７７】
前記の再解析は技術的変動を有するのみの試料からであり、然るに最近のBMTsコホートは個体間の変動及び疾病状態の変動を捕捉し、より多くの試料を有し；それ故BMTsからの電気泳動図が評価される。BMTs集団に対する分解因子は8.47±0.48（平均±SE、n＝120）であり、アポトーシス因子は1.17±0.02である。警報の分布は；77個の無色、36個の黄色、3個の橙色及び4個の赤色である。
【０２７８】
橙色及び赤色試料の電気泳動図をより詳細に観察すると、大抵同じ操業からのこれらの試料は真のRNA分解よりも生体解析器での増大した雑音により高い分解因子を有することが示唆された。前記の条件Ｅ及びＯの試料の再分析とは対照的に、直線相関は、恐らくは試料のより大きな変動とより大きな個数の故に分解因子とgapdh及びactin 3'／5'との間で検出される。然しながら、相関の大きさは中度である（Ａチップgapdh r＝0.526、actin r＝0.303；Ｂチップgapdh r＝0.325、actin r＝0.284）。28Sと18Sバンド強度比に対して分解因子、gapdh 3'／5'又はactin 3'／5'との間に有意な相関はない。また、生体解析器ソフトウェアから誘導した28Sと18Sバンド強度比値の約50％のみが1.8と2.1の範囲間に入り、然るに残りはこの標準範囲外にある。
【０２７９】
最後に、生体解析器によって測定した如き全RNAの収量の分布はPAX管当り1〜15μgの範囲にある。これらの結果が示唆する処によれば、生体分析器工程で得られたRNA特性に関する計量のうちでRNAの収量、28Sと18Sバンド強度の比率、分解因子及び警報、可変性の警報は処理を継続するため個々のRNA試料の評価に最も有用であろう。何故ならば許容できる特性計量を有するマイクロアレーはRNA試料尚得られるけれども、他の計量は伝統的範囲の外側で大きな変動を有するからである。
【０２８０】
条件Ｏにおいて、凍結時間は６日であり；然るに、最近のBMT研究においては、試料を20日までの間−20℃で凍結し、少数の試料を数回凍結し且つ解凍する。それ故、凍結時間及び凍結−解凍がPAX系から誘導したRNAの特性に影響するかどうかを測定するには、試料をRNA抽出前に凍結するのとRNA特性の計量との時間の間で直線相関を行なう。冷凍時間に対する分解因子、アポトーシス因子、PAX管当りの全RNA収量、28Sと18Sバンド強度比、gapdh及びactin 3'／5'の間で検出される有意な相関はない。これらの結果が示唆するところによれば、PAX系から誘導されるRNAはこれらの条件について安定である。
【０２８１】
多数の因子が、目標の検出感度を示しているプレゼントコール（calls）の多数に影響する。１つの明白な因子は平均背景（バックグラウンド）である。平均背景が増大するにつれてプレゼントコールの個数は減少する。これは最近のデータセットに見られるが、影響は小さい（Ａチップ、r＝−0.397、p＝0.00003；Ｂチップ、r＝−0.211、p＝0.032）。感度に影響する余り明白でない因子はmRNA母集団のグロブリン転写物の割合（％）である。グロビンmRNA転写物の増大量が細胞系統からの全RNAに加えられた時は、プレゼントコール％は直線的に減少する（20）。この効果が存在するかを測定するために且つ最近のデータセットにおけるその大きさを定量するために、プレゼントの個数（Number Present）と平均細胞ヘモグロビン（MCH）との間の直線相関を行ない、グロビンmRNA量に直接関連するらしい赤血球細胞当りのヘモグロビンのピコグラムの測定を行なう。有意な効果だが、小さな効果が検出される（r＝0.229、p＝0.020）が、Ｂチップのみについてであるに過ぎない。回帰直線の方程式が示唆する処によれば、ヘモグロビンのピコグラム増大毎に100個の遺伝子（genes）のプレゼント検出コールが減損するか又はＢチップで検出されるプレゼントコール遺伝子の平均個数の約２％が減損する。
【０２８２】
これらの結果が示唆するところによれば、種々の疾病表現型と取扱い条件とを有するBMT母集団のPAX管で収集した血液からのRNAの特性は、遺伝子発現分析について良好で再現性の特性を有するが、ヘモグロビン量の変化はジーンチップ（Gene chip）マイクロアレーにより目標の検出感度に小さな効果を基因させた。警戒計量は、満足なマイクロアレー結果を示している無色及び黄色の値を有しながら、目標調製工程を持続させる丈夫な尺度であると思われる。
【０２８３】
BMTs母集団からのPAX系で誘導したRNAのマイクロアレー（microarray）測定の特性
処理したアレーの個数及びそれらの配置を測定した。全部で145個のＡチップ及びＢチップセットをPAX系由来のRNAから得られるハイブリッド形成カクテル試料から成形した。これらの145個のうち、128個はBMTs母集団から得られ、残りの17個は一般人から得られた。
【０２８４】
17個のうち、6個は同じ供血者から得られ、条件Ｏ対Ｅの研究（50）で用いた試料であり；６個は全部対ポリＡ  RNAを用いて比較する別の供血者からの試料であり；２個は第３の供血者からの技術的反復であり；３個は女性の供血者からの技術的反復である。
【０２８５】
BMTs母集団からの128個のチップセットを10回分で操作した（変数名「RNA対hybカクテル回分番号」）。回分（バッチ）１は８個の血液試料を有し、ポリＡ  RNAをThach等（50）の如く用いる。回分２は回分１の如く成形した８個の血液試料で12個のチップセットを有するが、RNAはオーバーフラグメントされており；これらの試料のうちの４個は５μg以上のcRNAが残されており（left over）、こうしてこれらの試料はアレーにハイブリッド化されて回分２について12個のチップセットが得られる。回分３は全RNAを用いて成形された８個の血液試料で12個のチップセットを有し；８個の血液試料のうちの４個は代りにポリRNAを用いて複製を有するように十分な全RNAを生成した。全部で96個のチップセットとなる残りの回分は、回分３からの８個の全RNA血液試料として成形される。96個のチップセットのうちの１個は回復期にあるBMTからのものであり、その鼻洗液は未だ陽性のアデノウイルス培養を有し、それ故この単一症例は大部分の分析から除外する。得られる95個のチップセットを階級（分類）予測（class prediction）分析における訓練セットとして用いる。成形の差異に拘わらず別の50個のチップセットを試験セットに配置した。95個のチップセット及び回分３からの８個の血液試料は合計すると103個のチップセットとなり、これらを同様に成形し、これらの103個のチップセットを階級比較の如き大部分の別の分析に用いる。各々の回分は４つの表現型：健康、アデノウイルスを伴なう発熱、回復期およびアデノウイルスなしの発熱を大体等しく表現している。それ故、これらの４つの群のうちの比較は生物学的な差異を検知する。何故ならばこれらの４つの群は処理過程により同様な変動を有するからである。これらの結果を以下の表５に要約する。
【表５】
2008518626.tif 000027
【０２８６】
信号及び濃度の相関及びbioB、bioC、bioD及びcre cRNAスパイク−インズ（spike-ins）の感受性を評価する。スパイクインズ（spike-ins）は全てのチップに亘って既知の濃度で強力な直線状の関係を示し（データは示さず）、しかもbioBの濃度が検定感度のレベルにあるbioBのプレゼントコール％は全てのチップについて良好な感度を示唆する時間の100％であることを示した。100個の対照遺伝子を介してのスケーリング（scaling）後に、スパイクインズは尚既知の濃度で強力な直線状関係を示し、スケーリング法が有意な程の人工産物を生じないことを示唆している（データは示さず）。
【０２８７】
個々の対照チャート対マイクロアレーを精査した日を描いて特性計量の安定性を求め、域外値及び処理過程での誤差が知られている時の除外したアレーを測定し且つ本発明の結果を別の実験室からの値及びアフィメトリックス（affymetrix）により提案された値と対比する。インシリコ（in silico）パラメーターの設定は予期した通りに亘って均一であった。Ａチップについては、これらの計量がスキャナーの再較正後に正常に戻った時スキャナーの変動によりバックグラウンド及びノイズにおいて上方への変動（ドリフト）がある。Ｂチップの大部分は変動前にしかも再較正後に成形されたのでこの因子はＢチップに影響しない。プレゼント％はＡチップについて32±10（平均±3SD）であり、Ｂチップについて21±6である。回分２はオーバーフラグメントされており、高いgapdh及びactin 3'／5'が得られ、適当な場合には分析から除外される。全ての他のチップはアフィメトリックスによって提案された限界である３よりも十分に低いgapdh及びactin 3'／5'値を示した（68）。バックグラウンド及びノイズを含めて全ての特性計量は同一の実験様式からの103個のチップセットについて安定である。
【０２８８】
これらの品質管理（QC）結果は本発明の方法の信頼性を示唆しており且つ或る質問に答えるのに特定の統計的分析に適当なサブセットを形成するマイクロアレーの封入及び排除を簡易化した。
【０２８９】
感染状態の等級予測
遺伝子のセットが４つの表現型、健康、アデノウイルスを伴なう発熱、回復期及びアデノウイルスのない発熱に分類し得るかを調べるために、訓練セットでの等級予測を行なう。監督した等級予測については、等級表示は発熱及び回復期群の試料からのアデノウイルス培養のゴールド標準検定からの結果である。監督されていない群の試料は、遺伝子発現分布間の主たる変動が発熱患者対非発熱患者であることを示唆した（図示せず）。
【０２９０】
それ故、発熱患者対非発熱患者、アデノウイルスを伴なう発熱患者対アデノウイルスのない発熱患者、及び健康者対回復期の患者を最良に分類し得る遺伝子（ジーン）のセットを測定するのに、等級予測を行ない、これら３つの対比を最適化する（図７）。４つのパラメーターを変動させて、最適％の正確な分類を得る。１つのパラメーターは分類用の算法であり、これは試験した6種の方法よりなり；即ちコンパウンド共変動プレディクター（compound covariate predictor）、対角線状の判別分析、１−隣接（nearest-neighbor）、３−隣接、隣接セントロイド（centroid）及びサポート  ベクトル  マシン（support vector machine）よりなる。全てのこれら６種の方法について、「単変動の有意なp−値切取り」（univariate significant p-value cut off）又は「単変動の誤分類率」を変動する。また単変動試験についてランダム化した分散モデルを用いる効果を評価する。最後に、最適な単変動p−値又は分類率及びランダム化した分散モデルの有無と組合せて、２つの等級間の幾何学平均の倍率比（fold ratio）を最適化する。
【０２９１】
正確に分類した最適化％及び３つの比較についての最適条件を以下の表６に示す；
【表６】
2008518626.tif 000028
【０２９２】
表には、CBC又は電気泳動図のデータを用いた時の正確な最適％及び条件が示されている。結果が示す処によれば、各々のデータ型式について最適な条件下では、遺伝子発現データは４つのグループに最良に分類する情報を提供し、その際発熱患者対非発熱患者の間で正確な99％、健康者と回復期の患者との間で87％及びアデノウイルスを伴なう疾病患者とアデノウイルスを伴わない疾病患者との間で91％の値が見られる。４つのグループのうちで同等な最適分類に対して遺伝子の最適な個数は重ねた（nested）セットである傾向があり、その際最も異なる発現を有する遺伝子を含有する同じ最適な等級予測正確性を与えるセットを最小とする。これはそのとおりであるらしい。何故ならば、若干の遺伝子は互いに相関しており、かくして分類に同等な量の情報を提供したからである。表７、10及び11は予測の信頼性の尺度としてp−値を提供し、次の等級（クラス）に分類するのに用いた遺伝子の最小セットを挙げる；発熱患者対非発熱患者−99％の発熱状態、p＜5E−4、分類体（classifier）における遺伝子の個数＝47（表７）；健康者対回復期の患者−健常者と回復期の患者との間で87％の正確性、p＝0.001、分類欄における遺伝子の個数＝8（表10）；及びアデノウイルスを伴なう発熱患者対アデノウイルスを有しない発熱患者−91％のアデノウイルス感染した発熱患者対アデノウイルス感染のない発熱患者、p＜5E−4、分類欄での遺伝子の個数＝11（表１１）。
【０２９３】
2008518626.tif 000029
【０２９４】
2008518626.tif 000030
【０２９５】
2008518626.tif 000031
【０２９６】
2008518626.tif 000032
【０２９７】
前述した遺伝子から、前述した47個の遺伝子のリストにおいてGO等級及び親等級の「観察した対予測した」表の表を作成して、識別した遺伝子が関与する分子機能（表８）及び／又は生物学的プロセス（表９）を解明するのに役立ち得る。選択したサブセットで少なくとも５つの所見で且つ少なくとも２の「観察した対予測した」比率でGO等級及び親等級のみを示す。
【０２９８】
表８−分子機能
2008518626.tif 000033
【０２９９】
表９  生物学的プロセス
2008518626.tif 000034
【表１０】
2008518626.tif 000035
【表１１】
2008518626.tif 000036
前記の４つの表現型と共変動する断言的で連続的なメタデータ（metadata）変数を評価する。４つの表現型と相関する唯一の断言的な変数は用いた沢山のPAX系を包含する。これらの共変数は遺伝子発現の結果に影響しそうもない。何故ならば生産者は調和のため品質管理（QC）の生産物を有するからである。「知覚したストレス」は病気に対して増大する定性的な傾向を示すが、これは予期される。これによって遺伝子の本発明者の等級（クラス）予測セットが他の混同する変数よりもむしろ感染の健康状態に因るという本発明者の信頼が増大する。
【０３００】
表18、22及び26は、それぞれ発熱患者対非発熱患者、アデノウイルスを伴なう発熱患者対アデノウイルスのない発熱患者、及び健常者対回復期の患者の順序で高い割合（％）の正確な分類を尚与える遺伝子のより大きなリストを提供する。表18、22及び26において、分類体の組成を、0.001のレベルで有意な遺伝子について記載し、t−値によって区分する。t−値は−2.62〜＋2.62を除外して−22.99〜14.6の範囲にある。
【０３０１】
表16、20及び24は、表18、22及び26について用いた交差確認中の分類体の性能について詳細な要約を提供する。
【０３０２】
表17、21及び25は交差確認中の分類体の性能に関して、複合共変動予測対分類体（Compound Covariate Predictor Classifier）の性能、1−隣接分類体の性能、3−隣接分類体の性能、最接近セントロイド（Nearest Centroid）分類体の性能、サポートベクトルマシン（Support Vector Machine）分類体の性能及び直線対角識別分析分類体の性能に関して詳細を提供する。更に詳しく言えば、表17、21及び25は各々の分類法及び各々の等級に用いたパラメーターを発表する。
【０３０３】
表17、21及び25におけるデータの編集のため、次の式を用いる；
或る等級Ａについて、
n11＝Aと予測した等級A試料の個数
n12＝非Aと予測した等級A試料の個数
n21＝Aと予測した非−A試料の個数
n22＝非Aと予測した非−A試料の個数
次いで次のパラメーターは分類体の性能を特徴付け得る；
感受性＝n11／(n11＋n12)
特異性＝n22／(n21+n22)
正の予測値(PPV)＝n11／(n11＋n21)
負の予測値(NPV)＝n22／(n12＋n22)
表19、23及び27は、同定した遺伝子が関与する細胞成分、分子機能及び／又は生物学的プロセスを解明するのに役立つGO等級及び親等級の「観察した対予期した」表の表を提供し及び表18、22及び26で報告した遺伝子の頻度を挙げる。選定したサブセットにおいて少なくとも５回の観察で且つ少なくとも２の「観察した対予期した」比率でGO等級及び親等級のみを示す。
【０３０４】
等級の比較
４つの表現型のうちで種々に発現される遺伝子のリストを決定するために、等級の比較を行なう。表28、30及び32は、それぞれ発熱患者対非発熱患者、アデノウイルスを伴なう発熱患者対アデノウイルスなしの発熱患者及び健常者対回復期の患者の間で異なることが見出された遺伝子のリストを示す。表29、31及び33は同定した遺伝子が関与する細胞成分、分子機能及び／又は生物学的プロセスを解明するのに役立つGO等級及び親等級の「観察した対予期した」表の表を提供し且つ表28、30及び32で報告した遺伝子の頻度を挙げる。選定したサブセットにおいて少なくとも５回の観察で且つ少なくとも２の「観察した対予期した」比率でGO等級及び親等級のみを示す。
【０３０５】
表28について
問題の報告；
等級の個数；２
遺伝子の個数；44928
基準を濾過通過した遺伝子の個数；15720
用いた単変動試験の型式；T−試料T−セット（任意の変数モデルで）
等級を変動定義する実験報告シート（Experiment descriptors sheet）の欄；発熱状態
1000個の任意の順列に基づいて多変動順列試験を算出する。
【０３０６】
各々の単変動試験の公称有意水準；0.001
偽の発見率評価の信頼レベル；90％
偽の正遺伝子の最大許容個数；10
偽の負遺伝子の最大許容割合；0.1
結果の要約
単変動試験の0.001のレベルで有意な遺伝子の個数；5768
等級の間で真の差異がないならばチャンス（0.001のレベルで）により有意な少なくとも5768個の遺伝子を得る確率；0
等級間で識別する遺伝子
表28−単変動試験のp−値により区分
最初の5768個の遺伝子は単変動試験の公称0.001のレベルで有意である。
【０３０７】
90％の確率で最初の5142個の遺伝子は10個の偽の発現を含有するに過ぎない。90％の確率で最初の6430個の遺伝子は10％の偽の発見を含有するに過ぎない。リストの更なる拡大は中止する。何故ならば該リストは100以上の偽の発見を含むからである。
【０３０８】
表30について
問題の報告；
等級の個数；2
遺伝子の個数；44928
基準を濾過通過した遺伝子の個数；15720
用いた単変動試験の型式；２個の試料のT−試験（任意の変数モデルで）
変動し得る等級を定義する実験報告シートの欄；H_ND対F_NEのみ1000個の任意の順列に基づいて多変動順列試験を算出する。
【０３０９】
各々の単変動試験の公称有意水準；0.001
偽の発見率評価の信頼レベル；90％
偽の正遺伝子の最大許容個数；10
偽の負遺伝子の最大許容割合；0.1
結果の要約；
単変動試験の0.001の水準で有意な遺伝子の個数；2943
等級の間で真の差異がないならばチャンス（0.001の水準で）により有意な少なくとも2943個の遺伝子を得る確率；0
等級間で識別する遺伝子；
表30−単変動試験のp−値により区分した。
【０３１０】
最初の2943個の遺伝子は単変動試験の公称0.001の水準で有意である。90％の確率で最初の2151個の遺伝子は10個の偽の発見を含有するに過ぎない。
【０３１１】
90％の確率で最初の4562個の遺伝子は10％の偽の発見を含有するに過ぎない。
【０３１２】
表32について
問題の報告；
等級の個数；2
遺伝子の個数；44928
基準を濾過通過した遺伝子の個数；15720
用いた単変動試験の型式；T−試料T−試験（任意の変数モデルで）
可変の等級を定義する実験報告シートの欄；S_AD対S_NEのみ
1000個の任意の順列に基づいて多変動順列試験を算出する。
【０３１３】
各々の単変動試験の公称有意水準；0.001
偽の発見率評価の信頼レベル；90％
偽の正遺伝子の最大許容個数；10
偽の負遺伝子の最大許容割合；0.1
結果の要約；
単変動試験の0.001の水準で有意な遺伝子の個数;445
等級間に真の差異がないならばチャンス（0.001の水準で）により有意な少なくとも445個の遺伝子を得る確立；0.001
等級間で識別する遺伝子
表32  単変動試験のp−値により区分した。
【０３１４】
最初の445個の遺伝子は単変動試験の公称0.001の水準で有意である。90％の確立で最初の229個の遺伝子は10個の偽の発見を含有するに過ぎない。
【０３１５】
90％の確立で最初の758個の遺伝子は10％の偽の発見を含有するに過ぎない。
【０３１６】
然しながら、CBC（以下の表12）における差異の故に、RNAでのこれらの差異は細胞型式の不均質性及び／又は細胞レベル当りでの種々の発現に因り得る。
【０３１７】
然しながらCBC変数の差異はこれらの多大の差異を説明し得ないらしい故に細胞レベル当りでの種々の発現に因るものであるらしい。統計的なモデルはこれら２つの作用を区分するのに発現されねばならない。偶然にも、アデノウイルスを伴なう発熱患者対アデノウイルスを有しない発熱患者間の比較についてCBCにおける差異はない（以下の表12）。
【表１２】
2008518626.tif 000037
2008518626.tif 000038
それ故、種々に発現した遺伝子（ジーン）は細胞レベル当りであり、これらの遺伝子を伴なう生体分子経路はアデノウイルス感染と非アデノウイルス感染との間の差異に関連すると示唆すると推量される。これらの経路を測定するには、既知の経路でのこれらの遺伝子の機能を解明するのにEASE（70）を用いてKEGG経路及び遺伝子組合せデータベースに対して遺伝子リストを統合する。
【０３１８】
KEGG経路データベース調査の結果は次の通りである；
●hsa00071  脂肪酸代謝
2180  ACSL1; アシル-CoA  シンテターゼ長鎖ファミリーメンバー1 [EC:6.2.1.3] [SP; LCF1  ヒト (HUMAN)]
51703  ACSL5; アシル-CoA  シンテターゼ長鎖ファミリーメンバー5 [EC:6.2.1.3][SP;  LCF5 _HUMAN]
●hsa00190  酸化的ホスホリル化
1355  COX15; COX15同族体、シトクロムcオキシダーゼ集成タンパク質 (イースト) 
522  ATP5J; ATPシンターゼ、H+運搬、ミトコンドリアFO錯体、サブユニットF6 [EC; 3.6.3.14] [SP; ATPR_HUMAN] 
●hsa00193  ATP合成
522  ATP5J; ATPシンターゼ、H+運搬、ミトコンドリアFO錯体、サブユニットF6 [EC; 3.6.3.14] [SP; ATPR_HUMAN] 
●hsa00230  プリン代謝
3614  IMPDHI; IMP (イノシン−モノホスフェート) デヒドロゲナーゼ  1 [EC; 1.1.1.205] [SP; IMD_HUMAN] 
6241  RRM2; リボヌクエオチド  レダクターゼM2ポリペプチド [EC; 1.17.4.1] [SP: RI2_HUMAN]
953  ENTPD1; エクトヌクレオシド  トリホスフェート  ジホスホハイドロラーゼ1 [EC; 3.6.1.5] [SP; ENP1_HUMAN]
●hsa00240  ピリミジン代謝
6241  RRM2; リボヌクレオチド  レダクターゼM2ポリペプチド [EC; 1.17.4.1] [SP_RIR2_HUMAN]
7298  TYMS; チミジレート  シンテターゼ [EC; 2.1.1.45] [SP; TYSY_HUMAN] 
953  ENTPD1; エクトヌクレオシド  トリホスフェート  ジホスホハイドロラーゼ1 [EC; 3.6.1.5] [SP; ENPI_HUMAN] 
●hsa00252  アラニン及びアスパルテートの代謝
1615  DARS; アスパルチル−tRNAシンテターゼ [EC; 6.1.1.12] [SP; SYD_HUMAN] 
●hsa00361  ガンマ−ヘキサクロロシクロヘキサン分解
93650  ACPT; 酸性ホスファターゼ、精巣 [EC; 3.1.3.2] 
●hsa00510  N−グリカン生合成
6185  RPN2; リボホリンII [EC; 2.4.1.119] [SP; RIB2_HUMAN] 
●hsa00532  コンドロイチン／硫酸ヘパラン生合成
55501  CHST12; 炭水化物 (コンドロイチン4) スルホトランスフェラーゼ12
●hsa00561  グリセロリピド代謝
2710  GK; グリセロール  キナーゼ[EC; 2.71.30] [SP; GLPK_HUMAN]
●hsa00670  葉酸塩による１個の炭素プール
10588  MTHFS; 5,10−メテニルテトラハイドロホレート  シンテターゼ (5−ホルミルテトラハイドロホレート  シクロ−リガーゼ) [EC; 6.3.3.2] [SP; FTHC_HUMAN] 
7298  TYMS; チミジレート  シンテターゼ [EC; 2.1.1.45] [SP; TYSY_HUMAN] 
●hsa00740  リボフラビン代謝
93650  ACPT; 酸性ホスファターゼ、精巣 [EC; 3.1.3.2] 
●hsa00920  硫黄の代謝
55501  CHST12; 炭水化物 (コンドロイチン4) スルホトランスフェラーゼ12
●hsa00970  アミノアシル−tRNA生合成
1615  DARS; アスパルチル−tRNAシンテターゼ [EC; 6.1.1.12][SP; SYD_HUMAN] 
●hsa03022  基底転写因子
2965  GTF2H1; 一般的転写因子IIH、ポリペプチド1、62kDa [SP：TFH1_HUMAN] 
●hsa03050  プロテアソーム
10213  PSMD14; プロテアソーム、（プロソーム、マクロパイン) 26Sサブユニット、非ATPase、14
●hsa04010  MAPK信号化経路
6416  MAP2K4; ミトゲン−賦活化タンパク質キナーゼキナーゼ4 [EC: 2.7.1.-] 
[SP; MPK4_HUMAN]
7850  IL1R2; インターロイキン1レセプター、タイプII [SP;  IL1S_HUMAN]
●hsa04060  サイトカイン−サイトカイン  レセプター相互作用
1436 CSF1R; コロニー刺激因子1レセプター、以前はマクドナフ（McDonough）ネコの肉腫ウイルス（v-fms）オンコージン同族体[EC; 2.7.1.112] [SP; KFMS_HUMAN]
1524  CX3CR1; ケモカイン（C-X3-Cモチーフ）レセプター[SP; C3X1_HUMAN]
3556  IL1RAP；インターロイキン1レセプター付属タンパク質
7850  IL1R2; インターロイキン1レセプター、タイプII [SP; IL1S_HUMAN]
●hsa04110  細胞周期
1028  CDKNIC;  サイクリン依存性キナーゼインヒビターIC(p57, Kip2)[SP; CDNC_HUMAN]
4171  MCM2; MCM2ミニ染色体維持欠如2、ミトチン(S.酵母(cerevisiae))
4175  MCM6; MCM6ミニ染色体維持欠如6(MIS5同族体、S.ポンベ（pombe）(S. cerevisiae)[SP; MCM6_HUMAN]
5111  PCNA; 増殖性細胞核抗原 [SP; PCNA_HUMAN]
●hsa04120  ユビキチン仲介タンパク質分解
54926  UBE2R2; ユビキチン−共役酵素E2R2
●hsa04210  アポトーシス
3556  IL1RAP; インターロイキン1 レセプター付属タンパク質
5573  PRKAR1A; タンパク質キナーゼ、cAMP−依存性、調節型、タイプI、アルファ（組織特異性消滅体1）[SP; KAP0_HUMAN]
●hsa04310Wnt  信号化用経路
6934  TCF7L2; 転写因子7-様2 (T−細胞特異性、HMG-ボックス)
●hsa04350  TGF-ベータ信号化用経路
3398  ID2; DNA結合2のインヒビター、優性陰性のラセン−ループ−ラセンタンパク質[SP; ID2_HUMAN]
●hsa04610  補体及び凝固カスケード
712  CIQA;補体成分1、qサブコンポーネント、アルファポリペプチド[SP-C1QA_HUMAN]
966  CD59; CD59抗原p.18-20(モノクローナル抗体によって同定した抗原16.3A5, EJ16, EJ30, EL32及びG344)[SP; CD59_HUMAN]
●hsa04611
712 C1QA; 補体成分1、qサブコンポーネント、アルファポリペプチド[SP; C1QA_HUMAN]
966  CD59; CD59抗原p.18-20(モノクローナル抗体によって同定した抗原16.3A5, EJ16, EJ30, EL32及びG344) [SP; CD59_HUMAN]
●hsa04620トール様レセプター信号化経路
6416 MAP2K4; ミトゲンで賦活化したタンパク質キナーゼキナーゼ[EC; 2.7.1.-] [SP; MPK4_HUMAN]
6772  STAT1; 信号変換体及び転写の賦活剤1, 91kDa[SP; STA1_HUMAN]
●hsa04630 Jak-STAT信号化経路
6772  STAT1; 信号変換体及び転写の賦活剤1、91kDa[[SP; STA1_HUMAN]
868  CBLB; -Cas-Br-M(ネズミ)エコトロピック  レトロウイルス変換配列b
●hsa05110  コレラ-感染
377  ARF3; ADP-リボシル化因子3[SP; ARF3_HUMAN]
遺伝関連データベースの回分調査は次の遺伝子について行なった：
CX3CR1, TRIM14, ARF3, BRD7, PILRB, ENTPD1, CSF1R,RABGAP1, ICAM2, KLHL2, PUM1, MTHFS, LY6E, MRPL47, NPM1 , C12orfS, TNFAIP3, CHES1, SIP1 , MYOZ2, ATP5J, IFI44, SEC14L1, GIP2, GTF2H1, FBXO2, USP18, ACPT, SP100, AIP, ABHD5, SCO2, PWWP1, RAN, GRN, MX1, SLC1A4, GZMB, SNRPA1, IMPDH1, TARDBP, ZCCHC2, IER5, CBLB, STAT1, WBSCR20A, MEA, TNRC6, MAK, TCF7L2, T1NF2, HNRPH1, HNRPH2, GK, SART3, H1FX, PTP4A2, PSMD14, EIF3S4, BTN3A3, LETM1, TIMM23, HIVEP2, USP22, MT1L, C1QA, ILlRAP, MS4A7, NICAL, KBTBD7, Clorf29, PNUTL2, RPN2, ILF3, PCNA, HMGB1, BAG1, MCM2, TYMS, MT1X, CPD, COX15, MCM6, SN, C6orf133, BACE2, SYT6, OAS1, FACL2, OAS2, C6orf209, NUP98, PRKAR1A, OAS3, CHST12, PACL5, SLPI, CD59, IFIT1, IFI27, SORL1, RNPC4, IFIT4, HMGN4, CECR1, CDCA7, MTSS1, C6orf37, CDKN1C, RBPSUH,IL1R2, YWHAQ, RRM2, DARS, UBE2R2, SFRS7, FCGR2A, OASL, ID2, PLCL2, LGALS3BP, KPNA2,及びMAP2K4
これらの遺伝子のうち、次のヒットが報告される; 
CX3CR1
1)病気の等級＝感染、広い表現型(疾患)＝HIV/SIV感染
2)病気の等級＝未解明; 広い表現型(疾患)＝ヒトの腎移植
SCO2
1)病気の等級＝心臓血管、広い表現型(疾患)＝肥大型心筋症及びシトクロムcオキシダーゼ欠如
FCGR2A
1)病気の等級＝感染、広い表現型(疾患)＝重度のマラリア
2)病気の等級＝感染、広い表現型(疾患)＝子供の電撃性髄膜炎菌敗血症ショック
3)病気の等級＝免疫; 広い表現型(疾患)＝アトピー病; 
4)病気の等級＝免疫; 広い表現型(疾患)＝リウマチ様関節炎
5)病気の等級＝免疫; 広い表現型(疾患)＝全身性エリテマトーデス
実施例４：全血からの遺伝子発現プロフィールに対する、２種のグロビン
ｍRNA低減(reduction)法の影響
材料及び方法
試料の採集。  ラックランド(Lackland) AFB IRBの認可を得、かつ、十分な同意の後、10 個のPAX チューブを満たす約25mlの血液を各々の健常な提供者から採血した。血液を標準的なプロトコールによってPAX チューブに吸引した｛Prenalytix＃23 ＊｝。PAX チューブの全てを室温で２時間保持しついで−20℃で凍結し、−80℃で５日間貯蔵しついで加工するために、ワシントンDCのNavy Research Laboratoryにドライアイスに乗せて送付した。
【０３１９】
試料の処理。  血液の採集とRNAの単離はPAXシステムを使用して行った：このシステムは、血液採取用の排気管(PAX チューブ）と、全血から全RNAを単離するための処理キット(PAX kit)とからなる｛＊Jurgensen＃32；Jurgensen＃33｝。単離されたRNAをグロビン低減(globin reduction）にかけ、増幅し、標識しついでHG−U133プラス2.0ジェネチップ( Genechip 登録商標)マイクロアレイ(microarray)(Affimetrix)について審問した(interrogate)。
【０３２０】
血液からの全RNAの単離。  凍結PAXチューブを室温で２時間解凍しついで、プロテイナーゼKを試料当り40μlから80μl(＞600mAU/ml)に増加させ、55℃インキュベーション時間を10分から30分に延長しそしてQLAシュレツダースピンカラム(Quiagen)を通過させることにより緊密な(tight)ペレットの形成を助長するために修正した以外、PAXキットハンドブック
｛Prenalytix＃24｝に記載されるごとくして全RNAの単離を行った。随意に行うカラム上でのDNアーゼ(DNase）消化は行わなかった。精製された全RNAは−80℃で貯蔵した。
【０３２１】
全RNAの浄化(cleanup)及び濃縮。  精製RNAからDNAをより完全に除去するために、複製(duplicate) RNA試料をプールし、DNA−フリー(登録商標)キット(Ambion)を使用して、但し、DNアーゼ不活性化剤を添加することなしに、溶液内DNアーゼ処理(in―solution DNase treatment）を行った。DNアーゼ処理後、RNAをRNAeasy MinElute Cleanup(Qiagen cat＃74204)にかけついで製造業者の手順に従って濃縮した。ついで、各々の試料からの１マイクロリットルをバイオアナライザー2100 (Agilent)に通送してRNAの品質を評価し、一方、ナノドロップ(NanoDrop)を定量に使用した。バイオアナライザーの使用法は毛管ゲル電気泳動法に類似している。この結果、RNAの量対RNAの大きさに関連する、蛍光の強さ対時間を示すエレクトロフェログラムが得られた。
【０３２２】
グロビンの低減及び標的の調製。  mRNAを除去するために、修正された製造業者の手法に従って、ビオチニル化(biotinylated) グロビン捕獲オリゴ(globin capture oligos)(Ambion Globinclear kit)とPNA(Affymetrix GeneChip Globin Reduction kit) を使用した。簡単に言えば、グロビンクリアー(globinclear)工程については、ビオチニル化グロビン捕獲オリゴを５μgの全RNAに添加し、グロビン mRNAをストレパビジン(strepavidin)磁気ビーズにより除去した。ついで、残留しているグロビン低減全RNAを磁気ビーズを使用して精製し、30μlの水中で溶離した。１マイクロリットルのRNAをバイオアナライザー測定に使用し、残りのRNAはスピードバック濃縮(Speed Vac concentration)を使用して、室温で８μlに濃縮した。PNAグロビン低減工程については、RNAeasy MinElute Cleanup工程からの９μlのBR5中の５μgの全RNAを下流工程(downstream procedure)で使用した。グロビン低減キットに付帯のカラムは使用しなかった。全ての後続の工程はGeneChip Expression Analysis Technical Manual version 701021 Rev 3に記載されている。
【０３２３】
データーベースの集積。  実験室データーはPAXチューブ中の血液からの試料のcRNA標的製剤への加工並びにバイオアナライザー及びナノドロップ(nanodrop)の測定に関する情報を含んでいた。エレクトロフェログラムをバイオサイジング(biosizing)ソフトウェア(Aglient)により分析して、28S/18S強度比及びRIN QCメトリックスをアウトプットさせ、一方、ナノドロップは
RNAの量及び260/280比をアウトプットさせた。アレイ(array)についての標的検出(target detection）の品質を要約するレポートファイルはGeneChip (登録商標)オペレーティング ソフトウェア( Operating Software) 1.1 (Affiymetrix)により発生させた。これらの種々のデーターテーブルを結合してメタデーターテーブル(metadata table)とするのにJMP(SAS)を使用した。遺伝子発現データーについては、種々の下流側分析法に対する影響を試験するために、マイクロアレイ シュート5.0 アルゴリズム(Microarray Suite 5.0 algorithm)を使用して、スケーリングを伴うか又は伴うことなしに、信号値(signal value)を算定した。
【０３２４】
統計的分析。  統計的品質管理及びメタデーター変数(metadata variable)と遺伝子発現プロフィールとの関係をJMPにおいて分析した。ANOVAs、多次元スケーリング及び遺伝子発現データーの機能的分析は、Richard Simon 及び Amy Lamによって開発されたアレイツールス(Arraytools）3.2.0 ベーター(Arraytools 3.2.0 Beta)において行った(http//linus.nci.nih.gov/BRB−ArrayTools.html)。ヒートマップ(Heat map)及びデンドログラム(dendrogram)はdChip｛Li, 2001＃41；Li,2001＃42)を使用してグラフにした。スケールされた(scaled)発現データーは処理群の間でスケールファクター(scale factor)における差を示さなかった。
【０３２５】
結果
RNAの品質、グロビンの低減(globin reduction）及び標的製剤。  遺伝子発現プロフィールに対する2つのグロビン低減法の影響を検討するために、下記のRNA試料を使用した：
1) ジャーカット(Jurkat)細胞系から単離されたジャーカットRNA(J)
2) スパイクされた(spiked−in)グロビンmRNAを含有するジャーカットRNA(JG)
3) 全血からのパクスゲン(Paxgen) RNA(B)
【０３２６】
試験したグロビン低減法のプロトコールは下記の通りである：
1) ビオチニル化グロビン捕獲オリゴを使用するアンビオンのグロビ
ンクリアー法(A)
2) PNAオリゴを使用するアフィメトリックス法(P)
3) 技術的対照として、グロビン低減処理を行わない方法(C）
【０３２７】
同一のロットのJ及びJG RNAを使用した。アンビオングロビンクリアーで処理したRNAは、J及びJG RNAについて〜90％の回収率を有していた。アンビオン群についてのcRNAの収率は各々のRNA種についての３種の技術的条件の中で最も低かった；しかしながら、アンビオングロビンクリアー群について260/280の比によって判断されるさRNA純度は最高であった(表13)。
【０３２８】
2008518626.tif 000039
【０３２９】
バイオアナライザーを使用して比較したJ及びJG RNAについてのcRNAのプロフィール(図８A，B)は、アンビオンで処理したJG RNA(JG A)とPNAで処理したJG RNA(JGP)はJGCに対して著しく減少したグロビンピーク(図8A中の矢印)及びグロビンバンド(図8B)を有することを示した。JGAとJGPについてのエレクトロフェログラム及びゲルプロフィールは、処理しないジャーカットRNA(JC)に非常に類似していた。JCから誘導されたcRNAプロフィール又は、アンビオングロビンクリアーで処理したジャーカットRNA(JA) 又は、PNAグロビン低減工程で処理したジャーカットRNA(JP)には相違がなかった
(データーは示されていない)。
【０３３０】
パクスゲン(paxgene) RNAの間では生物学的変動は認められなかった；その理由は各々の技術的条件について使用されたパクスゲンRNAは一つの出血において同一の個体から捕集された、プールされたパクスゲンから誘導されたものであるからである。1.9−2.1の比260/280を有するパクスゲンRNAを原料RNAとして使用した；パクスゲンRNAについての〜75％回収(表13)。
【０３３１】
アンビオン グロビンクリアーで処理されたパクスゲンRNA試料(BA)から誘導されたcRNAプロフィール及びBC(非処理)と比較した、PNAグロビン低減においては、グロビンピークとバンドの減少も認められた(図8C及びD)。しかしながら、BAからのcRNAサイズはBPより大きかった。全体として、我々の結果はアンビオン グロビンクリアー及びPNA グロビン低減プロトコールがグロビン mRNA不純物を効果的に減少させることを示した。
【０３３２】
各々の技術的条件についてのマイクロアレイ測定の特質。  マイクロアレイデーター品質の評価については、スケーリングシグナル強度と非スケーリングデーターを使用して、各々のマイクロアレイについてのポリA 対照グラフをプロットした。線形性(linearity)は全ての試料についての４個の対照プローブセットの間で達成された(データーは示されていない)。RPTレポートから得られるスケールファクター(SF)、バックグラウンド及びノイズ(表13参照)のごとき常数及び主要な変動値は全てANOVA及びWilcoxon試験を使用して評価した。JA、JC、JP、JGA、JGP及びJGCの間でのSF及びノイズにおいて、BA、BP及びBCにおいても統計学的に重大な差異は無かった。従って、全てのプローブセットについてのスケーリングシグナル強度を遺伝子発現プロフィールの比較に使用した。ジャーカットRNAについては、バックグラウンドがJGCにおいて最高であり、おそらくは、スパイクされたグロビン mRNAのため、他から大きく相違していた。全てのパクスゲンRNAの間でバックグラウンドに差異は無かった。全てのマクロアレイについての3’/ 5’ GAPDHの比は全て５以下であり、RNAの分解(degradation) が無いことを示した。おそらくは、cRNAサイズの減少により、3’/ 5’ アクチン(Actin)及びGAPDHの若干高い比がPNA処理したパクスゲンRNAにおいて認められた(図８CのBP)。他の変数における大きな差異は検出されないので、更なる統計的分析と遺伝子発現プロフィールの比較を行った。
【０３３３】
グロビンの除去は、遺伝子発現にけるプレゼントコール(present call)の数(％)及びコールコンコーダンス(call concordance)を増大させる。
【０３３４】
２種の方法によるグロビンの除去により、JGA、JGB、BA、BPにおけるプレゼントコールの数(％)が、その対応する対照、JGC及びBCに比較して著しく増大した(ANOVA、Wilcoxon 試験)；しかしながら、ANOVA及びWilcoxon試験を使用するジャーケトRNAにおける３つの技術的条件の間には差異はなかった。スチューデント t−試験を使用するこれらの方法の更なる分析はJGPよりJGAにおいて統計的に有為な、より高いプレゼントコールを示したが(スチューデント t−試験、p＜0.05)、BAとBPの間で、パクスゲンRNAに重大な差異はなかった(表13)。３種の技術的条件についてのジャーカットRNAの間のプレゼセントコールの同向性(present call concordance)を比較し、技術的条件に影響されない、JCAPと呼ばれる、19731個の遺伝子を含有する遺伝子サブセット(図9A中のJCAP)を同定してJG RNAについての対照遺伝子セットとして役立たせた。ついで、JGA及びJGPについてのプレゼントコールをJCAPと比較した結果、18176(＝16349＋1827)個の遺伝子がJCAPとJGAの両者中に存在し、16782(＝16349＋433)個の遺伝子がJCAPとJGPの両者に存在していたが(図9B)、JCAPとJGPの両者には14069個の遺伝子だけが存在していた(データーは示されていない)。我々のデーターは、JGAはJGPに対して1394個の追加のコンコーダントコール(concordant call)を示し、JGCに対して4107個の追加のコンコーダントコールを示すことを示した。パクスゲンRNAについては、BA/BPはBA/BCに対して2104個の追加のコンコーダントコールを有しており、BC/BPに対しては2406個の追加のコンコーダントコールを有していた(図9C)。
【０３３５】
プレゼントコールコンコーダンスの評価の他に、ジャーカット及びJG RNAの間のマージンコール(margin call)を除く全コールコンコーダンスを表に示し、技術的条件の間の正と負のファルス(false)のパーセンテージを比較した(図14)。我々のデーターはJGA及びJGPは、JGCに対して、コンコーダントプレゼントコールを、それぞれ、８％及び５％増大させ、JGA及びJGPと比較して、ファルス陰性コール(false negative call)を７％及び４％増大させた。ファルス陽性プレゼントコール(false positive present call)は、JGCに比較して、それぞれ、１％及び0.22％のJGA及びJGP処理試料において生起した。ジャーカットRNAの“ゴールドスタンダード”と比較した、JGA、JGP及びJGCについての算定感受性(calculated sensitivity)は、それぞれ、86％、79.5％及び68.2％であった。特異性(specificity)は全ての処理法について保持されており、JGA、JGP及びJGCについての特定の値は、それぞれ、94.3％、96.2％及び96.2％であった。このデーターは、アンビオングロビンクリアー法はJGCに対する特異性を大きく失うことなしに、著しく高い感受性パーセントのプレゼントコールを有することを示していた。
【０３３６】
2008518626.tif 000040
【０３３７】
2008518626.tif 000041
【０３３８】
2つのグロビン低減法によって生じる変動。  三重反復(triplicate)の間におけるシグナルの変動(signal variation)を変動率(coefficience of variance）((VC)を比較することにより評価した(図10)。各々の技術的条件についてのスケーリング因子(scaling factor)に統計的差異はないので、全てのプローブセットについてのスケーリングシグナル強度を、CVグラフをプロットするのに使用し、２度の自由度(freedom)を有するロエスフィッティング(Loess fitting) を曲線に適合させるために導入した。JCと比較して、技術的条件によって導入されたより高いCVがJA又はJCで認められた(図10Aの一点鎖線)。しかしながら、ビオチニル化グロビンオリゴ及びPNAによって除去されたグロビンはJG RNAにおける各々の対応する技術的条件についての変化を著しく減少させた(図10Aの実線)。JAは、特に、10４より大きいシグナル強度を有する遺伝子セットにおいて最高のCVを有していた。この高いCVは多工程グロビンクリアー法によるものであり得る。これと対照的に、パクスゲンRNAにおいては、グロビンクリアー三重反復試験の間でのCVは非処理のごとく低かった。RNA種及び純度はグロビンクリアーにより生じる技術的変化に影響し得る。パクスゲンRNAにおいては、PNA三重反復試験についてのCVは、おそらくは、PNAオリゴ処理(図8C)からのcRNAサイズの減少のために、すべての技術的条件の間で最大であった(図10B)。
【０３３９】
CV(％)の比較の他に、ピアーソン相関係数(Pearson correlation coefficiency)(同様に、これらの観察のいずれかが有意であるか否かを決定することは困難であった)も算定し、各々の三重反復試験において、同一のRNA種内の技術的条件の間及びRNA種の間で比較した(表15)。技術的条件の間又はRNA種の間で認められるものと比較して、より高いシグナル相関関係が三重反復試験内で認められた。JG RNAにおいては、ビオチニル化グロビンオリゴ(ambion)によるグロビン除去は、非処理JGCとのより低いシグナル相関関係(0.966)を有しているが、JGPはJGCとのより高い相関関係(0.983)を有していた。このことは、グロビンクリアーJG RNAは、JGPよりJGCについて遺伝子発現プロフィールにおいてより大きな相違を有することを示している。パクスゲンRNAにおいては、PNA処理は非処理(BC)とのより低いシグナル相関関係(0.967)を有するが、JGAはBCとのより高い相関関係(0.978)を有している。このことは、BA及びBCよりBP及びBCにおいて、遺伝子発現において、より大きな相違が認められることを示唆している。パクスゲンRNA又はJG RNAからのグロビンmRNAの除去により、同一のRNA種において又はジャーカットとジャーカット＋グロビンRNAとの間(表15のRNA種の間)でより高いシグナル相関関係が得られる。
【０３４０】
遺伝子発現プロフィールの多次元スケーリングクラスター分析。  各々の技術的条件について、試料の群の間での関係を更に評価するために、多次元スケーリング(MSD)クラスター分析を行った。非スケーリングデーター及びスケーリングデーターが類似のクラスタリングパターンを示したので、我々は非スケーリングシグナル強度を有する全てのプローブセットを使用してMDSプロットだけを示した(図11）。我々のデーターは各々の三重反復 (triplicate)は緊密に(tightly)にクラスター化し(cluster)、異なる技術的条件を有するジャーカットRNAについての三重反復クラスター(triplicate cluster)は相互に近接していることを示した。異なる技術的条件を有するJG RNAについての三重反復クラスターは、ジャーカットRNAクラスターの最も近くに配置されたJGA三重反復クラスターを有するジャーカットRNAからのものより、より多く分離された(図11A)。パクスゲンRNAも各々の技術的条件に対応する３つの分離した三重反復クラスターを形成した(図11B)。
【０３４１】
遺伝子発現プロフィ−ルの階層(HIERARCALクラスター分析。  異なる技術的条件を有するジャーカット及びJG RNA試料の全体的発現プロフィ−ルを、中心関係(center correlation）及び平均結合(average linkage)パラメーターを使用して分析した(図12A)。MDSプロットと一致させて、ビオチニル化グロビンオリゴによるJR RNAからのグロビン mRNAの除去は、ジャーカットRNA群に類似した遺伝子発現プロフィ−ルを示し、ジャーカットRNA試料についてと同一の群において集合した(図12A)。これらの１８個のチップを、JA、JP、JC、JGA、JGP及びJGCからなる６個のクラスに分け、ランダムバリアンスモデル(Random Variance model)におけるユニバリエート試験を使用して、これらのクラスの間で、遺伝子発現プロフィ−ルを比較した。このクラスの比較により、8614個の別異的に発現した遺伝子が得られ、これらをdチップソフトウエアー分析を使用して更にクラスター化させた(cluster)。
【０３４２】
これらの別異的に発現した遺伝子をデンドログラムの右側に示すごとく4個の群に分割した(図12B)。グループIはJGA及び全てのジャーカットRNA試料におけるダウンレギュレートされた遺伝子の大部分を表し、グロビン遺伝子及びグロビンmRNAクロスハイブリッド形成によって影響される遺伝子を包含していた。グループIIはジャーカットRNA試料におけるアップレギュレートされた(upregulated)遺伝子を表すが、JG試料の全てにおいてはダウンレギュレートされた遺伝子を表す。このグループは表15に示される若干のファルス(false)陰性遺伝子を包含し得る。ファルス陰性遺伝子はグロビンRNAノイズによって生じる負の衝撃から生じ、低シグナル強度を生じる。グループIIIはビオチニル化グロビンオリゴプロトコーを用いるグロビンRNAの減少の後に出現し得るが、PNAプロトコール及び非処理についてダウンレグレートされたままである遺伝子を表す (図12B中のIII)。グループVIは、ビオチニル化オリゴプロトコールから生じる独特のアップレギュレート遺伝子を表す。このグループは表14における若干のファルス陽性遺伝子を包含し得る。
【０３４３】
同一の手段を使用して、遺伝子発現プロフィールと、BA、BP及びBCの間での別異的に発現した遺伝子プロフィールを、全部で９個のパクスゲン血液RNA試料を使用して分析し、中心相関及び平均リンケージを使用してクラスターさせた(clustered)。我々の結果はビチニル化グロビンオリゴ及びPNAオリゴを使用するグロビンmRNAの除去はより類似の遺伝子発現プロフィールを示し、おそらくは、グロビン低減のために、同一の群内でクラスターされることを示した(図12C)。更に、ランダムバリアンスモデル(Random Variance model)についてのユニバリエートテスト(univariate test)を使用して、パクスゲン血液RNA試料の間に、1988の別異的に発現した遺伝子があった(図12D)。クラスター分析の結果はBA及びBCについての別異的に発現した遺伝子プロフィールはBPに、より類似していることを示した。このことは、BA及びBCの間でのより高い相関関係と一致する。
【０３４４】
実施例５：  通常の熱性呼吸疾患を有する、基礎的軍事被訓練生(military
trainee）におけるトランスクリプトームの監視及び
回復期表現型(covalescent phenotype)
材料及び方法
エントリー基準及び試料採集。  LAFBは米国空軍への全て初年兵についての基礎的軍事訓練(Basic Military Training)の場所である。BMTは封鎖された兵舎で食事し、睡眠しそして訓練する50−60名の飛行隊員(flight)に組織される。週当り、40−50という多数のBMTがFRIと共に存在し、50−70％はアデノウイルスによるものである。LAFB IRBの承諾を取り、十分な同意の後、４ｘ５ PAXチューブを満たす約15mlの血液を各々の志願者から採取した。訓練の１−３日目に、血液を標準的プロトコール{Prenalytix #23}によって健常なBMTから採取し、PAXチューブに注入したが、鼻洗浄液(nasal wash)はこの群については採集しなかった。訓練中、38.1℃又はそれ以上の温度を示したBMT及びFRIは鼻洗浄液と血液のドロー(blood draw)を提供した。これらの個体はアデノウイルスのないFRIとアデノウイルス群を有するFRIに分類された。アデノウイルスを有するFRI志願者からの試料の採取の約３週間後に、回復型群を構成するために追加の血液と鼻洗浄液を採取した。全てのPAXチューブを室温で２時間保持しついで−20℃で凍結し、ついで、加工するために、ワシントンDCのNavy Research Laboratoryにドライアイスに乗せて送付した。鼻の洗浄は標準プロトコールを使用して、鼻咽喉の標準塩水洗浄液の５mlを用いて行いついで流出液を殺菌容器に捕集した。鼻洗浄流出液を４℃で１−24時間貯蔵し、その後、分割し、アデノウイルスの培養のために送付した。全てのBMTは各々の試料の採取の前に標準化された審問(standardized questionary）を受けた。健常な個体は基礎的訓練に到達する４週間以内に急性内科疾患についてスクリーンした。BMTは遺伝子発現についての混同する変動(confounding vaiable)を評価するために、人種/民族、アレルギー、最近の損傷、及び喫煙暦についてスクリーンした。咽喉炎、鼻の充血、咳、熱、悪寒、吐き気、嘔吐、下痢、疲労、体の痛み、鼻風邪、頭痛、胸痛及び皮膚痛を包含させるための呼吸症状の期間とタイプを記録した。身体検査を記録した。
【０３４５】
試料の加工。血液の採集とRNAの単離はPAXシステムを使用して行った：このシステムは、血液採取用の排気管(PAX チューブ）と、全血から全RNAを単離するための加工キット(PAX kit)とからなる｛Jurgensen＃32；Jurgensen＃33｝。単離されたRNAを増幅し、標識しついでHG−U133A及びHG−U133B Genechip（登録商標)マイクロアレイ(microarray)(Affimetrix)(それぞれ、A及びBアレイと称する)上で審問した。
【０３４６】
血液から全RNAの単離。  凍結PAXチューブを室温で２時間解凍しついで、プロテイナーゼKを試料当り40μlから80μl(＞600mAU/ml)に増加させ、55℃インキュベーション時間を10分から30分に延長しそして遠心分離時間を30分又はそれ以上に延長させることにより緊密なペレットの形成を助長するために修正した以外、PAXキットハンドブック｛Prenalytix＃24｝に記載されるごとくして全RNAの単離を行った。随意に行うカラム上でのDNアーゼ消化は行わなかった。精製された全RNAは−80℃で貯蔵した。
【０３４７】
ターゲットの調製。  精製RNAからDNAをより完全に除去するために、複製(duplicate) RNA試料をプールし、DNA−free(登録商標)キット
(Ambion)を使用して溶液内DNアーゼ処理を行った。しかしながら、DNアーゼ不活性化ビーズの除去を促進するために、ビーズペレットを阻害することなしに上澄み液をピペットで除去するのではなしに、完了した反応を回転カラムで回転させた(Quiagen、Cat＃79523)。ついで、ついで、各々の試料からの１マイクロリットルをバイオアナライザー(Agilent)に通送してRNAの品質と量を評価した。バイオアナライザーの使用法は毛管ゲル電気泳動法に類似している。この結果、RNAの量対RNAの大きさに関連する、蛍光の強さ対時間を示すエレクトロフェログラムが得られる(図13a)。ついで、５μgのRNAを前記したごとくエタノール沈殿により濃縮した｛Thach、2003＃18)。全ての後続の工程はGeneChip Expression Analysis Technical Manual version 701021 Rev ３に記載されている。
【０３４８】
データーベースの集積。  データーベースは標準化審問(questionary)、完全血液係数(complete blood count)(CBC)及び血液試料の取扱いから複写された情報のごとき診療データーから構成されていた。実験室データーは、PAXチューブ中の血液からRNA抽出への試料の処理並びにその後のバイオアナライザー測定に関する情報を含有していた。28S/18S強度比及びRNA収量をアウトプットさせるためのバイオサイジング(Biosizing)(Aglient)ソフトウェア及び分解及びアポトーシス因子を強化し、スケールしそして算定するためのデグラドメーター1.1｛Auer、2003 ＃26)ソフトウエアーによりエレクトロフェフォグラムを分析した。アレイについてのターゲット検出を要約するレポートファイルをGeneChip(登録商標)オペレーティングソフトウエアー1.1 (Affimetrix)によって発生させた。JMP(SAS)を使用して、これらの種々のデーター表を千以上の欄を有するメタデーターテーブルに結合させた。遺伝子発現については、シグナル値はスケーリング又は標準化(normalization) のないマイクロアレイシュート(Microarray Suit) 5.0 アルゴリズムを使用して計算した。これによりスケーリング及び標準化の後続の試験が可能になった。
【０３４９】
統計的分析。  統計的品質制御及びメタデーター変数の間の関係をJMPにおいて分析した。ANOVA及び遺伝子発現データーを使用する表現型の分類予言(class prediction)を、Richard Simon 及び Amy Lamによって開発されたアレイツールス 3.2.0 ベーター(Arraytools 3.2.0 Beta)を使用して行った(http//linus.nci.nih.gov/BRB−ArrayTools.html)。ヒートマップ及びデンドログラムdChip｛Li, 2001＃41；Li,2001＃42)を使用してグラフにした。遺伝子機能の分析はアレイツールス(Arraytools）及びEASE｛Hosack、2003 ＃30｝によって助成された。データー分析は、当初、D.T.によって行った。
【０３５０】
スケーリングを遺伝子発現データーについて行った。各々の血液試料について、同一のハイブルダイゼーションコックテイルをA及びBアレイ上で行い、2個のアレイからのデーターの連鎖(concatenation)により事実上のアレイを形成させた。2つのデーターを分析する、この迂回法(bypassed issu)は別個に設定された。A及びBアレイに共通の100個の対照プローブセットは、種々の組織タイプについての多大な研究からの、発現における安定性に基づいて選択された｛Affymetrix、2002＃27｝。 かくして、アレイデーターを、100個の対照プローブセットのトリムされた平均(trimmed mean)を使用して500の標的値にスケールした。この結果、時間に亘っての安定なスケール係数(SF)が得られ、感染状態の表現型の間でのSFにおける差異は無かった(ANOVA、P＝0.1047 A アレイ、P＝0.1782 B アレイ)。このスケーリング法は対応するアレイA及びBの濃度を許容しており、遺伝子特異的でない変化も除去すべきである。
【０３５１】
結果
診療的表現型。  30名の健常者、FRIを有するかつアデノウイルスについての培養によって陰性の19名、FRIを有するかつアデノウイルスについての培養によって陽性の30名及びアデノウイルス−陽性FRIからの回復者の30名をこの研究で記録した(enrolled)。これらの４つの感染状態表現型における記録者は年齢±３年及び人種/民族について調和させた。男性のBMTだけを記録した。遺伝子発現分析についての基準を満足させる試料の選択後、アデノウイルスを有していない17名のFRIは５±３日間罹病し(メジアン±SD)、アデノウイルスを有する26名のFRIは８±４日間罹病した(P＝0.006、Wilcoxon)。全ての群に亘っての病徴の率は下記の通りであった：咽喉炎(95.3％)、咳(93％)、鼻充血(90.7％)、頭痛(88％)、悪寒(84％)、鼻漏(81％)、体痛(65％)、倦怠(63％)、吐き気(94％)、下痢(14％)、胸膜性胸痛(14％)、嘔吐(14％)及び皮疹(０％)；FRI群の間に大きな差異はなかった。また、感染状態表現型の間でのアレルギー、最近の損傷及び喫煙歴にも大きな差異はなかった。
【０３５２】
BMT母集団からのPAX系から誘導されるRNAの品質及び変動。  母集団における表現型について診療的に関連する遺伝子発現プロフィールの差異を同定するためには、マイクロアレイに適用されるRNA試料が生体内での転写の量の典型であることが必要である。血液細胞の後の収集物の取り扱いを最小にしかつRNAを迅速に安定化しかつ転写を停止させるためにPAX系を使用した。本出願人はマイクロアレイ分析用の安定なRNAを提供する、このPAX系を使用する2つの方法を以前に示した｛Thach、2003＃18｝。
【０３５３】
この研究で分析される95個のマイクロアレイの各々についてRNAの品質を評価するために、RNAのエレクトロフェログラムから誘導される最近公表された計量法(metrics)を使用した｛Auer、2003＃26｝。18Sリボソームピークより低い分子量のバンド平均強度の、18Sバンド強度に対する比に100を掛けたものである分解係数(degradation factor)はRNAの最小の分解を示した(図13)。試料についてのこの分解係数は、Aアレイ上のgapdh3’/5’(図13C；r  0.3、P＝0.008、ANOVA）及びBアレイ上のアクチン(actin) 3’/5(r  0.2；P＜0.05、ANOVA)、マイクロアレイ上でのRNAの品質の評価についての内部測定に関連した。28S/18S対分解係数、gapdh3’/5及びアクチン3’/5にの間には有意な相関関係はなく、分解係数はマイクロアレイ分析についてのRNA品質の評価のための優れた方法であることを示唆している。表現型群の間では分解係数における大きな差異は見られなかった。
【０３５４】
28Sの高さと18Sピークの比であるアポトーシス係数｛Auer、2003＃26｝は、高いパーセンテージの血液細胞がアポトーシス細胞死を蒙ったことを示唆していた。分解係数の分布、アポトーシス係数、28S/18S及び全RNAの収量は図13bに示されている。表現型群の間ではアポトーシス係数における大きな差異は見られなかった。凍結の期間と分解係数の間に顕著な相関関係は無かった(図13d)；アポトーシス係数、RNA収率、28S/18又はgapdh3’/5及びアクチン3’/5についての相関関係は無かった。
【０３５５】
我々は血液細胞のタイプの不均一性が転写の検出の感度に影響するか否かを決定した。マイクロアレイ上のプレゼントコール(present call)の数に影響する完全血液計数(CBC）の変量(variable)の評価は、プレゼント(Present)と呼ばれるプローブセットの数と、ミーン コルプスクラー ヘモグロビン(Mean Corpuscular Hemoglobin)(MCH)との間で直線関係を示した。有意な効果(r＝0.272；P＝0.008、ANOVA)はBアレイにだけ検出された(図13e)。回帰線の方程式は、ヘモグロビンの各ピコグラムの増加について、100のプローブセットのプレゼント検出コール又はBアレイ上のプレゼントと呼ばれるプローブセットの平均数の２％の損失を示唆していた。感染状態表現型の間ではMCHに大きな差異は無かった。
【０３５６】
BMT母集団からのPAX系誘導RNAのマイクロアレイ測定の特質。  時間に亘っての特性計量(quality metrics)の安定性を予測し、概略を決定しそしてアレイ製造者によって提案されている値と比較するために、個個の対照チャート対マイクロアレイ走査のデーターをプロットした。転写のパーセントプレゼントはAアレイについては32±10(平均±3SD)であり、Bアレイについては21±６であった。Gapdh及びアクチン3’/5’ 値は３以下、Affimetrixによって提案されている上限値｛Affimetrix、2004＃29｝であった。ノイズは、Aアレイについては3.6±1.3であり、Bアレイについては2.9±0.8であった。平均バックグラウンドは、Aアレイについては100±48であり、Bアレイについては78±33であった。別異にそして誤って加工されたことが知られているアレイセットの排除の後、安定な特性計量を有する、全部で95のA及びBアレイセットが残留した。これらの95個のセットを、バッチ方式で、4つの感染状態の表現型の、ほぼ等しい手法(representation）で処理した。従って、これらの4つの群の比較は、これらの群は処理により類似の変化を有するので、生物学的差異を検出すべきである。
【０３５７】
遺伝子発現プロフィール。  我々のグループ(cohort)のプロフィールを特徴づけかつ可視化するために、転写物の階層クラスタリング(hierachical clustering)を有する熱−マップ上に遺伝子発現プロフィールを表示した(図14)。当初の試験は、非熱性で、健常なかつ回復期の患者と比較して、熱性群(febrile group)において、高い発現レベルを有する多数の転写物(図14、オレンジ色の棒)及び低い発現レベルを有する少数の転写物(図14、紫色の棒)を示した。健常なかつ回復期の患者の間で差異を示す転写物もあり(図14、灰色の棒)、一方、この視覚検査からのアデノウイルスを有していない熱(febrile)と、アデノウイルスを有する熱の間で差異を示す転写物の明白な群は無かった。各々の群において、この集団における別異の免疫応答を示唆する個体間変動(inter−individual variation)が観察された。
【０３５８】
感染状態表現型のクラス予想(class prediction)。  上記パターン認識(pattern recognition)は、健常で、熱性でかつ回復した(recovered)患者の間で発現レベルにおける差異を有する転写物があることを示唆していた。従って、4つの感染状態表現型を最もよく分類する転写物のセットを発見するためにクラス予想を行った。試料に亘って＞80％のアブセントコールを有するプローブセットをろ過し、更なる分析のための15,721個のプローブセットを得た。指示されたクラス予想については、熱性群についてのクラスラベルを、アデノウイルスの存在又は不存在を同定する呼吸ウイルス培養の結果から決定した。
【０３５９】
図14は、熱状態の個体が試料の間での遺伝子発現プロフィールの主要な源泉でありそしてこれを試料の非指示クラスタリングによって確認した。最初、非熱性患者対熱性患者を分類する転写物のセット(ノード１)、ついで非熱性患者のセット、更に、健常な又は回復期の患者のセット(ノード２)、そして、熱性患者の間で、アデノウイルスを有するか又は有していないものに分類する転写物のセット(ノード３）を見出すために、指示クラス予想分析を使用した。この棒状図面(nodal scheme）による試料の分離(segregatin)は２進樹クラス予測(binary tree class prediction)分析により確認した。
【０３６０】
癌研究のデーター｛Golub、2004＃34；Valk、2004＃９｝と異なり、感染症の分類に最適な転写物選択方法又はクラス予想アルゴリズムは報告されていない。従って、我々はリーブ−ワン−アウト−クロス−確認(leave−one−out−cross-validation)中に最高のパーセントでの正しい分類を行う転写物選択法及び分類アルゴリズムを決定した。各々のノードでの分類についての最適の転写物選択パラメーターを評価するために、ユニバリエート(univariate) P−値のカット−オッフレベルを変化させて、設定カット−オッフレベルに等しい又はそれより小さい P−値での2つの群の間で統計的に有意な差異を示すプローブセットを選択した。P−値のカット−オッフはより厳密になったので、選択されるプローブの数は減少した。ついで、各々のP−値カット−オッフレベルについて、クロス−確認(cross−validation)分析と共に種々のアルゴリズムを使用して試料を分類するために、選択されたプローブセットを使用した。ノード１，２及び３の分類について、それぞれ、10−２、10−３、10−５の最適P−値カット−オッフレベル(図15a−c、下方−左コーナー)を選択した。
【０３６１】
最適P−値カット−オッフレベルを評価しかつ一定に保持した後、各々のノードについて、フォールド−チェンジ カット−オッフ スレッショールド(fold−change cut−off threshold）の追加の基準を変動させた(図15a−c、ｘ−軸)。図15はフォールド−チェンジ カット−オッフ レベルの近接して通過する、試験した6個のアルゴリズムについてのパーセント−コレクト トレース(percent−correct trace)は増大するが、方法の間で、10−20％という大きさで相違し得ることを示している。図15中の黒色矢印は特定のP−値及びフォールド−チェンジ カット−オッフでの最適パーセント−コレクト分類を示している。非熱性対熱性については、10−２のP−値カット−オッフレベルでのサポートベクター機械アルゴリズム及び分類機中にあるべき47個のプローブセットについて選択された＞５のフォールド−チェンジスレッショールドを使用して、99％のパーセントコレクトが達成された(図15a)。健常患者対回復期患者の分類については、10−３のP−値カット−オッフレベルでの対角的線状判別分析アルゴリズム及び類機中にあるべき８個のプローブセットについて選択された＞1.9のフォールド−チェンジスレッショールドを使用して、87％の最適パーセントコレクトが得られた(図15b)。アデノウイルス感染を有していない患者対アデノウイルス感染を有している患者の分類については、10−5のP−値カット−オッフレベルでのサポートベクター機械アルゴリズム及び分類機中にあるべき11個のプローブセットについて選択された＞1.7のフォールド−チェンジスレッショールドを使用して、91％の最適パーセントコレクトが得られた(図15c)。
【０３６２】
種々のアルゴリズム及び選択された転写物セットについての関連する遺伝子発現プロフィールによる誤って分類された(misclassified)試料は図16に示されている。ノード１については、アデノウイルスを有する熱性患者(febrile)において誤って分類された個体はなく、誤って分類された試料はアデノウイルスを有していない熱性患者又は回復期群に属する傾向を示した。ノード２については、誤って分類された試料は健常な及び回復期の群の間に同等に分布しているように思われ、一方、ノード３については、誤って分類された試料はアデノウイルスを有していない熱性患者中にある傾向にあった。幾つかの試料はアルゴリズムに関係なしに誤って分類されていることが観察された。
【０３６３】
非熱性対熱性患者、健常者対回復期患者及びアデノウイルス感染を有する患者対アデノウイルス感染を有して異いない患者の、評価された最適パーセント−コレクト分類は、それぞれ、99％、87％及び91％であった。これらのパーセンテージの信頼性を決定するために、2000の順列を使用して順列試験を行った。これによって、それぞれ、＜0.0005、0.001及び＜0.0005のP−値が得られた。
【０３６４】
クラスファイアーセット中の遺伝子の機能。  クラス予想結果についての、発見された転写物セットの識別体(identifier)は図16に示されている。熱性状態(図16a及び表７)を分類するのに使用した47個のプローブセットは40個の転写物を提供する。これらは、IFI27、IFI44、IFI35、IFRG28、IFIT１、IFIT4、OAS1、OAS2、GBP1、CASP5、MX1及びGIP2を包含する、インターフェロンによって誘導される多くのものを含んでいた。更に、OAS1及びOAS2はアデノシンの2’,5’オリゴマーを触媒して、RNアーゼLを活性化しかつ細胞タンパク質合成を抑制し、一方、MX１はGTPアーゼ族の一員である。OAS1、OAS2及びMX1は抗菌作用を有することが示されており、興味のあることに、非人類霊長類が高い力価(titer)の天然痘に感染した直後、活性化されることが見出されている｛Rubins、2004＃35｝。補体カスケード(complement cascade)に包含される転写物、抗体/抗原複合体の下流にあるC1GQ及び補体の第１成分の活性化を抑制するSERPING１は熱（fever)を伴っている。TNF−アルファ及びIL−1誘導遺伝子、即ち、細胞外マトリックスの安定性及び細胞移動に関係する分泌タンパク質であるTNFAIP6及びMAPKシグナル通路(signaling pathway）に関係しかつTNF及びILIレセプターの下流にあるSTK3及びCASP5をクラス予想体として同定した。適応(adaptive)免疫応答において機能しかつIgGを連結させるFCGRIAはクラスファイアーの一部であった。FRIに不明確に関連する、係合する既知の機能を有するか又は未知の機能を有する他の転写物も同定された。幾つかの遺伝子の存在学的記載(gene ontology description)及び括弧内において、観察された発生の数と予測された発生の数の比は以下の通りである(表８−９参照)：GTP結合(6)、グアニルヌクレオチド結合(6)、ウイルスに対する応答(32)、免疫応答(8)、デフェンス応答(7)、ペスト/病原体/パラサイト(6)及びストレスに対する応答(3)。
【０３６５】
リポソーム構造に係合するRPP127及びRPS７を含めて、７の転写物に対して図示された(mapped)健常患者対回復期患者を区別するための８のプローブセットクラスファイアー(表10)；IGHM、免疫グロブリン 重いコンスタント mu 転写物；LAMA2、これは細胞接着、移動及び組織再モデル化に関係する；DAB2、KREMEN1及びEVA1のごとき他の機能に関連する転写物。
【０３６６】
アデノウイルス感染を有していない熱性患者とアデノウイルス感染を有している熱性患者を区別する10個の転写物クラスファイアー(表11)は、インターロイキン−１補助タンパク質、ILIPAP；熱状態についてのクラスファイアーである、2種のインターフェロン誘導遺伝子；IFI27及びIFI44；及び細胞−細胞間及び細胞−マトリックス間反応に関係するかつヒト免疫不全ウイルスに感染した個体において上昇することが認められているLGALS3BPを包含していた。アデノウイルスFRIとの関連がより明らかでない既知の機能又は未知の機能を有する他の転写物としてはZCCHC2、ZSIG11、NOP5/NOP58、MS4A7、LY6E及びBTN3A3が挙げられる。
【０３６７】
検討
異なる感染状態表現型を有するヒトの比較的大きい試料中でPAXチューブで処理した試料のRNAの量を厳密に評価した後、我々は、健常な個体、アデノウイルス感染を有するFRI及び有していないFRI及び回復期の個体の全血試料からのトランスクリプトームの特徴を調べかつ比較し、クラス予想法を評価し、感染状態表現型を最適に分類できる転写物のネステッドセット(nested set)を発見し、FRIに関係する通路(pathway)と遺伝子機能とを関係させることを開始した。
【０３６８】
我々は分解因子(degradation factor)と呼ばれる以前に報告されている品質管理メトリックス(quality control metrics)｛Auer、2003＃26｝を我々のRNA試料に適用し、この因子はマイクロアレイ上に存在する品質管理メトリックス(GAPDH3’/5’及びアクチン3’/5’)に関連することを決定した。この分解因子は、マイクロアレイを処理する前にバイオアナライザーから入手されるエレクトロフェログラムデーターを評価することにより、大きな母集団についてのマイクロアレイ研究に容易に適用することができそして不良な品質の試料を示すために設定し得る。28S/18S比のごとき典型的に使用される品質計量法(quality metrics)は1.8〜2.1の従来の標準範囲の外側で高い可変性を有しており、マイクロアレイ上に存在する品質管理メトリックスと余り関連しないことが認められた。
【０３６９】
ノイズ品質メトリックスに対するシグナルを評価する際に、おそらく、Aアレイに比較してBアレイ上での低い発現転写物の検出により、MCHはBアレイだけについてのプレゼントコールの数に大きく影響することを発見した
｛Affimetrix、2002＃27｝。プローブの設計のときに、Aチップ上のプローブをBチップ上のものより多くの注釈(annotation)を付けた。MCHは赤血球当りのヘモグロビンの尺度であり、おそらく、全血中のグロビンmRNAの量に直接関連する；以前の研究は、増大する量のグロビンmRNA転写物の、細胞系から全RNAへの移行(spiking)はパーセントプレゼントコールを直線的に減少させることを示している｛Affimetrix、2003＃28｝。この因子は将来のマイクロアレイ研究において制御されることを必要とするか又はグロビンmRNAは減少されることを必要とされるであろう。現在の研究においては、感染状態表現型の間でMCHの相違はない。
【０３７０】
指図された分析において、パーセント コレクト クラシフィケーションを最適化するために、P−値カット−オッフの他に、フォルド−チェンジ カット−オッフ スレッショールドを変化させた。これらの組合せた基準は、2つの群の間で統計的に相違するばかりでなしに、特定のフォルド−チェンジ スレッショールド上でも変動する転写物について選択し、ノイズを表し得る転写物を減少させる。遺伝子発現プロフィールが非熱性患者対熱性患者の間でのごとく、大きな、確実な(consistent)差異を示した場合、クラシフィケーションの精度は転写物選択パラメーター及びアルゴリズムに対して抵抗性であると思われる；厳密なP−値及びフォルド−チェンジ カット−オッフ レベルは、健常なかつ回復期の患者及び熱性患者を、それぞれ、87％及び91％の精度に分類する有益な転写物をを選択するのに必要であった。
【０３７１】
分類された試料は、おそらく不均一であると思われる群に属する傾向があり、ミスクラシフィケーションがクラスラベルの特異性の欠乏によりものであり得ることを示唆している。大きなサイズでの将来の研究においては、回復期群は回復の期間に基づいて更に副分類されるかも知れず、アデノウイルスを有していない熱性患者は同定された特定の病原体に基づいて副分類されるかも知れない。図16に示されるクラスファイアー中の転写物の大部分は、リーブ−ワン−アウト クロス バリデーション中、100％の時間、クラスファイアー中に残留した(100％CVサポート)。かくして、クラスファイアー中のこれらの転写物は、図16aに例示されるごとく、これらを研究のために存在させたとき、2個の診療的表現型の個体の間で、確実に相違する。アデノウイルス群を有するFRI中の個体は、アデノウイルス群を有していないものより病気の際に、遅くまで存在する傾向があり、おそらくは、2つの群の間での遺伝子発現の差異を説明している。感染状態にある、これらの遺伝子の発現における変化の関係は、これらの遺伝子はヒト宿主熱病及び生体内でのアデノウイルス感染に対する免疫応答に関係することも示唆している。これらの転写物は群の間での最大のフォルド変化(fold change)を確実に示しており、発現における変化は通路レベルであり、細胞濃度だけの差異によって説明され得ないようであることを示唆している。更に、アデノウイルス群を有していない熱性患者とアデノウイルス群を有する熱性患者の間では細胞−タイプ濃度に大きな差はない。熱及び免疫応答に対する転写物のこの関係は、ヒトの生体内での自然感染から誘導され、母集団レベルでの宿主応答におけるこれらの遺伝子の重要な規則を示唆している。おそらくは、各々の転写物の発現は関連する通路(pathway)中の他の転写物に非依存性ではないが、これに関係するという事実により、転写物のネストされた(nested)セットにより類似のパーセント−コレクトカラシフィケーションが得られる。免疫応答に関係しない機能又は未知の機能を有する転写物の発見は、感染表現型のモデル系を更に研究して機械的機能を明らかにすべきことを意味している。
【０３７２】
他の病因によるFRIのバックグランドケースからのアデノウイルス感染によるFRIを有する患者のクラスを予測できるという我々の例証は、生物学的監視及び病因学において遺伝子発現を使用する可能性を支持している。我々の知識において、このことは、宿主の転写的署名(transcriptional signature)を介しての感染症のクラシフィケーションの最初の、生体内での例証である。この技術を生物学的防御(biodefence)及び感染症の監視の適用することの可能性を更に決定するために、我々はこれらの発見をウイルス性及びバクテリア性病原体及び女性に拡大した。
【０３７３】
上記の教示に鑑み、本発明の多数の修正及び変更が可能である。従って、特許請求の範囲内で、上記で特に記載したもの以外で本発明を実施し得ることを理解すべきである。
【０３７４】
参考文献
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補足情報：電子型で提供される表のリスト及び簡単な説明
表16−発熱状態(即ち、発熱患者対非発熱患者)についてのクラス予想のためのクロス−バリデーション中のクラシファイアーの性能
表17−クロス−バリデーション中のクラシファイアーの性能、表16についてのパラメ−ターの表
表18−クラシファイアーの組成、発熱状態についてのクラス予想のための0.01レベル(t−値により検索)での有意な(significant)遺伝子のリスト
表19−表18に示される有意な遺伝子のリスト中の、GOクラス及びペアレントクラスの、‘観察された表対予測された表’
表20−アデノウイルスを有する発熱患者対アデノウイルスを有していない発熱患者についてのクラス予想のためのクロス−バリデーション中のクラシファイアーの性能
表21−クロス−バリデーション中のクラシファイアーの性能、表20についてのパラメーターの表
表22−クラシファイアーの組成、アデノウイルスを有するライル(rile)患者対アデノウイルスを有していないライル患者についてのクラス予想のための0.01レベル(t−値により検索)での有意な遺伝子のリスト
表23−表22に示される有意な遺伝子のリスト中の、GOクラス及びペアレントクラスの、‘観察された表対予測された表’
表24−健常な患者対回復期の患者についてのクラス予想のためのクロス−バリデーション中のクラシファイアーの性能
表25−クロス−バリデーション中のクラシファイアーの性能、表24についてのパラメーターの表
表26−クラシファイアーの組成、健常な患者対回復期の患者についてのクラス予想のための0.01レベル(t−値により検索)での有意な遺伝子のリスト
表27−表26に示される有意な遺伝子のリスト中の、GOクラス及びペアレントクラスの、‘観察された表対予測された表’
表28−発熱状態(即ち、発熱患者対非発熱患者) を区別する遺伝子のリスト
表29−表28に示される有意な遺伝子のリスト中の、GOクラス及びペアレントクラスの、‘観察された表対予測された表’
表30−アデノウイルスを有する患者対アデノウイルスを有していない患者を区別する遺伝子のリスト
表31−表30に示される有意な遺伝子のリスト中の、GOクラス及びペアレントクラスの、‘観察された表対予測された表’
表32−健常な患者対回復期の患者を区別する遺伝子のリスト
表33−表32に示される有意な遺伝子のリスト中の、GOクラス及びペアレントクラスの、‘観察された表対予測された表’
【０３７５】
【表１６】
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【０３７６】
【表１７】
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【０３７７】
【表１８】
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【０３７８】
【表１９】
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【０３７９】
【表２０】
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【０３８０】
【表２１】
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【０３８１】
【表２２】
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【０３８２】
【表２３】
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【０３８３】
【表２４】
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【０３８４】
【表２５】
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【０３８５】
【表２６】
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【０３８６】
【表２７】
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【０３８７】
【表２８】
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【０３８８】
【表２９】
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2008518626.tif 000093
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【０３８９】
【表３０】
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【０３９０】
【表３１】
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【０３９１】
【表３２】
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【０３９２】
【表３３】
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【図面の簡単な説明】
【０３９３】
【図１】図１は、ＰＡＸ管に採取した血液を処理するのに使用した２つの条件に関するダイアグラムを表す。
【図２】図２は、ＤＮＡ混入及び除去を表す。（Ａ）オンカラムＤＮアーゼ処理後のＰＡＸ管から単離された全ＲＮＡのＤＮＡ混入物。（Ｂ）ＰＣＲで検出できないレベルまで混入ＤＮＡが除去された溶液中ＤＮアーゼ処理。（Ｃ）ＲＮＡの完全な状態は、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで測定されるように溶液中ＤＮアーゼ処理後に維持された。
【図３】図３は、全ＲＮＡがＤＮアーゼ処理前又は処理後及びこれらの条件同士の間で同様の品質であったことを表す。（Ａ）ＤＮアーゼ処理前のＰＡＸ管中の血液から単離した全ＲＮＡ。（Ｂ）ＤＮアーゼ処理後の全ＲＮＡ。（Ｃ）ＤＮアーゼ処理前及び処理後の痕跡の比較。
【図４】図４は、二本鎖ｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ及び断片化ｃＲＮＡの特性プロファイルを表す。（Ａ）精製二本鎖ＤＮＡ。（Ｂ）精製ｃＲＮＡ。（Ｃ）断片化ｃＲＮＡ。
【図５】図５は、HG-U133A及びHG-U133Bチップについての種々の試料の品質管理測定基準に関する個々の折れ線グラフを表す。
【図６】図６は、前記の２つの条件からの遺伝子−発現量が、関連試料に比べて、極めて相関関係があることを表す。
【図７】図７は、発熱がない 対 発熱がある（Ａ及びＢ）、健康である 対 回復期にある（Ｃ及びＤ）及びアデノウイルスによる発熱がある 対 アデノウイルス感染無しで発熱がある（Ｅ及びＦ）についての分類予測の最適化を表す。
【図８】図８は、Ｊｕｒｋａｔ、Ｊｕｒｋａｔ＋グロビン（ＪＧ）、及びpaxgene ＲＮＡから種々の技術条件で誘導されたｃＲＮＡプロファイルを表す。図８Ａ−ビオチン化グロビンオリゴ（ＪＧＡ）で処理、ＰＮＡ（ＪＧＰ）処理、未処理（ＪＧＣ）のＪＧ ＲＮＡから及び未処理Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡ（ＪＣ）から誘導されたcＲＮＡの電気泳動図。図８Ｂ−４種類のＲＮＡから誘導され且つＪＧＰ及びＪＧＣにおいてグロビン分子の大きさ（〜０.８ ｋｂを示した矢印）を示したｃＲＮＡのゲル図。図８Ｃ−ビオチン化グロビンオリゴ（ＢＡ）処理、ＰＮＡオリゴ（ＢＰ）処理及び未処理（ＢＣ）のpaxgene ＲＮＡから誘導されたｃＲＮＡの電気泳動図。図８Ｄ−グロビン（矢印）の大きさを示したＢＡ、ＢＰ及びＢＣのＲＮＡから誘導されたｃＲＮＡのゲル図。
【図９】図９は、Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡに対するグロビン減少Ｊｕｒｋａｔ＋グロビンＲＮＡ試料の間のpresent call concordance及び３つの異なる技術条件でのpaxgene ＲＮＡの間の関係を説明するベンダイアグラムを表す。図９Ａ−ＪＡ、ＪＰ及びＪＣに一般に存在する制御遺伝子セット（ＪＣＡＰ）の識別。図９Ｂ−ＪＧＰ及びＪＣＡＰに存在する遺伝子に対してＪＧＡ及びＪＣＡＰに存在する追加の１３９４遺伝子がある。図９Ｃ−グロビン低下の末処理（ＢＣ）に対する追加の４１５９（２６０７＋１５５２）の遺伝子をもたらすビオチン化グロビンオリゴ処理の後のPaxgene ＲＮＡ。
【図１０】図１０は、各技術条件についての信号の変化を表す。図１０Ａ−ビオチン化グロビンオリゴ処理（ＪＡ、ＪＧＡ）、ＰＮＡ処理（ＪＰ及びＪＧＰ）及びグロビン減少未処理（ＪＣ、ＪＧＣ）のＪｕｒｋａｔ（Ｊ）及びＪｕｒｋａｔ＋グロビン（ＪＧ）ＲＮＡ試料から誘導された全てのプローブセットデータを使用する基準化信号強度に対する変動係数（ＣＶ）のグラフを示した。図１０Ｂ−ビオチン化グロビンオリゴ処理（ＢＡ）、ＰＮＡ処理（ＢＰ）及び未処理（ＢＣ）のpaxgene ＲＮＡから誘導された全てのプローブセットデータを使用する基準化信号強度に対するＣＶのグラフ。
【図１１】図１１は、Ｊｕｒｋａｔ ＲＮＡ（Ｊ）及びグロビンに加えたＪｕｒｋａｔ ＲＮＡ（ＪＧ）並びにpaxgene ＲＮＡから得られた遺伝子発現について行った多次元基準化クラスター解析を表す。図１１Ａ−各三重反復試験について密なクラスターをもたらした各三重反復試験内の大きな相関関係。図１１Ｂ−種々の技術条件を用いてそれぞれのpaxgene ＲＮＡについての三重反復は、より接近してクラスターを形成した。
【図１２】図１２は、Ｊｕｒｋａｔ及びJＧ ＲＮＡ及びpaxgene ＲＮＡ試料についての遺伝子発現プロファイルについて行った階層的クラスター解析を表す。図１２Ａ−３種類の技術条件を用いたＪｕｒｋａｔ及びＪＧ ＲＮＡを代表する１８個の試料の間の遺伝子発現プロファイルの概要。図１２Ｂ−これらの１８個の試料の間の差次的発現遺伝子プロファイルを使用することによって行ったクラスター解析。図１２Ｃ−paxgene ＲＮＡから誘導された全体的遺伝子発現プロファイルについて行ったクラスター解析。図１２Ｄ−１９８８の差次的発現遺伝子をもたらした９種類のpaxgene ＲＮＡ試料の間の分類比較解析。
【図１３】図１３は、ＢＭＴ母集団由来の試料のPAX systemから誘導されたＲＮＡ品質を表す。（ａ）種々の表現型及び取扱条件を用いたＢＭＴからの電気泳動図のオーバーレイ。１８Ｓ及び２８Ｓリボソームピークを示す。（ｂ）電気泳動図から算出した品質測定基準のボックスプロット。（ｃ）性能低下因数(degradation factor)(ｒ＝０.３、Ｐ＝０.００８、ＡＮＯＶＡ）に対するアレイＡのｇａｐｄｈ ３´／５´値の間の相関関係。（ｄ）血液採取から処理までの経過日数にわたるＲＮＡ分解がない。（ｅ）平均赤血球ヘモグロビン量（ＭＣＨ）とアレイＢでPresentと呼ばれるプローブセットの数の相関関係（ｒ＝−０.２７２；Ｐ＝０.００８、ＡＮＯＶＡ）。
【図１４】図１４は、ＢＭＴの遺伝子発現プロファイルを表す。
【図１５】図１５は、発熱がない 対 発熱がある（ａ）、健康である 対 回復期にある（ｂ）、及びアデノウイルスを有せずに発熱がある 対 アデノウイルス感染による発熱がある（ｃ）の表現型についての分類予測の最適化を表す。
【図１６】図１６は、分類予測解析から見出された分類器sにおける同一性及び遺伝子の発現を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2008518626.tif 000130
【図１６】
2008518626.tif 000131
【配列表】
2008518626000001.app
【国際調査報告】
2008518626.tif 000132