(57)【要約】  本発明は、非免疫刺激性ポリヌクレオチド抗原結合体、及び非免疫刺激性ポリヌクレオチド抗原結合体を用いた個体における不要な免疫応答を処置する方法を抵抗する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原に連結した非免疫刺激性ポリヌクレオチドを含む非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）。
【請求項２】
前記抗原が、自己抗原、同種抗原（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ）又はアレルゲンである、請求項１に記載の結合体。
【請求項３】
前記非免疫刺激性ポリヌクレオチドが、免疫制御性配列（ＩＲＳ）を含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項４】
前記ＩＲＳが、ＴＬＲ９クラスＩＲＳ、ＴＬＲ７／８クラスＩＲＳ又はＴＬＲ７／８／９クラスＩＲＳである、請求項３に記載の結合体。
【請求項５】
前記非免疫刺激性ポリヌクレオチドが、アンチセンス分子又はアプタマーを含む、請求項１に記載の結合体。
【請求項６】
請求項１に記載の結合体及び医薬として許容される賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項７】
患者における抗原に対する末梢寛容を誘導する方法であって、非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）を含む組成物を患者に投与することを含み、ここで、前記ＮＩＳＣが抗原に連結した非免疫刺激性ポリヌクレオチドを含み、そして、前記組成物が前記抗原に対する末梢寛容を誘導するのに有効な量で投与される、前記方法。
【請求項８】
患者における不要な免疫活性化の症候を改善するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）を投与することを含み、ここで、前記ＮＩＳＣが抗原に連結した非免疫原性ポリヌクレオチドを含み、そして、前記不要の免疫活性化が前記抗原に指向される、前記方法。
【請求項９】
前記不要の免疫活性化が、自己免疫応答、アレルギー、喘息、移植片対宿主反応又は移植拒絶反応である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
患者における自己免疫応答を抑制するための方法であって、それを必要とする患者に、自己免疫応答を抑制するのに有効な量で非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）を投与することを含み、ここで、前記ＮＩＳＣが抗原に連結した非免疫刺激性ポリヌクレオチドを含み、そして、前記自己免疫応答が前記抗原に指向される、前記方法。
【請求項１１】
患者における自己免疫疾患の症候を抑制するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）を投与することを含み、ここで、前記ＮＩＳＣが抗原に連結した非免疫刺激性ポリヌクレオチドを含み、そして、前記自己免疫疾患が前記抗原に対する免疫応答に関与する、前記方法。
【請求項１２】
自己免疫疾患の症候を妨げる方法であって、自己免疫疾患を発症する危険性のある患者に非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）を投与することを含み、ここで、前記ＮＩＳＣが抗原に連結した非免疫刺激性結合体を含み、前記自己免疫疾患が前記抗原に対する免疫応答に関与し、そして、前記ＮＩＳＣが前記自己免疫疾患の症候を妨げるのに有効な量で投与される、前記方法。
【請求項１３】
患者におけるアレルギー応答を抑制するための方法であって、それを必要とする患者にアレルギー応答を抑制するのに有効な量で非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）を投与することを含み、ここで、前記ＮＩＳＣが抗原に連結した非免疫刺激性ポリヌクレオチドを含み、そして、前記アレルギー応答が前記抗原に指向される、前記方法。
【請求項１４】
患者におけるアレルギー症候を抑制するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）を投与することを含み、ここで、前記ＮＩＳＣが抗原に連結した非免疫刺激性ポリヌクレオチドを含み、そして、前記アレルギーが前記抗原に対する免疫応答に関与する、前記方法。
【請求項１５】
アレルギー応答を妨げるための方法であって、アレルギー応答を発症する危険性のある患者に非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）を投与することを含み、ここで、前記ＮＩＳＣが抗原に連結した非免疫刺激性ポリヌクレオチドを含み、前記アレルギー応答が前記抗原に対する免疫応答に関与し、そして、前記ＮＩＳＣが前記アレルギー応答を妨げるのに有効な量で投与される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
［０００１］本出願は、２００４年１２月１７日に出願された米国特許仮出願シリアル第６０／６３７，３５９号の利益を主張し、それは本明細書中に参照により全体として援用される。
【０００２】
技術分野
［０００２］本発明は、非免疫刺激性ポリヌクレオチド−抗原結合体に関する。それはまた、個体における不要な免疫応答を治療するための非免疫刺激性ポリヌクレオチド−抗原の投与に関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
［０００３］免疫系は、潜在的な病原性微生物に対して非常に特異的であり、しばしば非常に保護応答を提供する。しかしながら、いくつかの場合において、不適切な及び／又は不要な免疫活性化が、自分自身の組織の損傷又は崩壊へと導く有害な過程を引き起こし得る。寛容は、免疫応答が正常に生じるであろう抗原に対して特異的な免疫応答性の獲得した欠如である。典型的には、寛容を誘導することは、寛容化抗原に晒さなければならず、その結果、ある種のリンパ球の死又は機能的不活化となる。この過程は、一般的に、自己抗原に対する寛容又は自己寛容についての説明となる。完全な寛容は、抗原チャレンジに対する検出可能な免疫応答の欠如によって特徴付けられる。部分的な寛容は、免疫応答の定量的低減によって典型となる。一般的に定常状態及び一生ではあるが、特定抗原に対する寛容が崩壊し、不適切な免疫活性化の原因となる。
【０００４】
［０００４］不適切であり不要な免疫活性化は、例えば、抗体及び／又はＴリンパ球が生体組織の損害に対する自己抗原と反応する場合に自己免疫疾患において発生する。これはまた、アレルギー性反応における場合であって、ある種の環境事項に対する誇大化した免疫応答によって特徴付けられ、そして、組織崩壊へと導く免疫刺激反応の原因となるかもしれない。これはまた、提供者の同種抗原（ａｌｌｏａｎｔｉｇｅｎ）又は異種抗原（ｘｅｎｏａｎｔｉｇｅｎ）を認識する宿主に存在する同種反応性Ｔ細胞によって有意に仲介される移植された臓器の拒絶の場合である。
【０００５】
［０００５］いくつかの場合において、強力な免疫抑制剤は、自己免疫疾患又は同種異系の移植片を用いて患者を治療するために、不適切な又は不要な免疫応答を妨げ又は低減するために使用される。Ｔ細胞の免疫応答を妨げ又は抑制する薬物を用いて個体に投入することは、不要な免疫活性化を阻害するが、しかし、一般的な免疫抑制、毒性、及び日和見感染による死でさえその原因ともなる。
【０００６】
［０００６］同種移植片拒絶、自己免疫疾患、及び感染性微生物又は環境的抗原に対する組織崩壊的なアレルギー応答のような不要又は組織損傷性免疫学的反応によって引き起こされる疾患に対する効果的な治療薬の開発における主要な目的の１つは、免疫系の残余に影響を与えずに、有害な免疫過程の強度の許容されるレベルを特異的に抑制又は減少させることである。
【０００７】
［０００７］不適切であり不要な免疫活性化を制御するための戦略を確立する必要性が残されている。例えば、自己免疫疾患及びアレルギーにおける不適切な免疫活性化及び反応の阻害及び／又は低減の必要性がある。移植片対宿主疾患として知られる、移植に対する宿主による、及び受容者の組織に対する提供者の組織による不要な免疫応答の阻害及び／又は低減の必要性もある。
［０００８］本明細書中に引用されたあらゆる特許、特許出願及び刊行物は、本明細書中に参照により全体として援用される。
【発明の開示】
【０００８】
発明の開示
［０００９］本発明は、非免疫刺激性ポリヌクレオチド−抗原結合体（非免疫刺激性結合体又はＮＩＳＣ）に関し、そして、これらの結合体を用いて、患者、特にヒトにおける不要な又は不適切な免疫応答を制御する方法に関する。
【０００９】
［００１０］一側面において、本発明は、抗原に連結した非免疫刺激性ポリヌクレオチドを含む非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）を提供する。ある種の態様において、本発明は、本明細書中に記載したＮＩＳＣのいずれかを含む組成物を含む。この組成物はまた、例えば、医薬として許容される賦形剤又は多数の他の成分を含んでもよい。
【００１０】
［００１１］別の側面において、本発明は、有効量の非免疫刺激性結合体を患者に投与することを含む、抗原に対する末梢寛容を誘導又は促進する方法を提供する。本発明に従えば、ＮＩＳＣの投与は、ＮＩＳＣにおける抗原に対する末梢寛容を誘導又は促進する。
【００１１】
［００１２］別の側面において、本発明は、不要な免疫活性化の症候を改善する方法であって、それを必要とする患者に有効量の非免疫刺激性結合体を投与することを含む前記方法を提供する。本発明に従えば、ＮＩＳＣの投与は、ＮＩＳＣにおける抗原に指向した不要な免疫活性化の症候を改善する。いくつかの態様において、不要な免疫活性化は、自己免疫応答、アレルギー、喘息、移植片対宿主反応又は移植拒絶反応である。
【００１２】
［００１３］別の側面において、本発明は、自己免疫応答を抑制する方法であって、それを必要する患者に有効量の非免疫刺激性結合体を投与することを含む前記方法を提供する。本発明に従えば、ＮＩＳＣにおける抗原に指向した自己免疫応答を抑制する。
【００１３】
［００１４］別の側面において、本発明は、自己免疫疾患の症候を抑制するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の非免疫刺激性結合体を投与することを含む前記方法を提供する。本発明に従えば、ＮＩＳＣの投与は、ＮＩＳＣにおける抗原に対する免疫応答に関与する自己免疫疾患の症候を抑制する。
【００１４】
［００１５］別の側面において、本発明は、自己免疫疾患を発症する危険性のある患者に非免疫刺激性結合体を投与することを含む自己免疫疾患を妨げる方法を提供する。本発明に従えば、ＮＩＳＣの投与は、ＮＩＳＣにおける抗原に対する免疫応答に関与する自己免疫疾患の症候を妨げる。
【００１５】
［００１６］別の側面において、本発明は、アレルギー応答を抑制するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の非免疫刺激性結合体を投与することを含む前記方法を提供する。本発明に従えば、ＮＩＳＣの投与は、ＮＩＳＣにおける抗原に指向したアレルギー応答を抑制する。
【００１６】
［００１７］別の側面において、本発明は、アレルギーの症候を抑制するための方法であって、それを必要とする患者に有効量の非免疫刺激性結合体を投与することを含む前記方法を提供する。本発明に従えば、ＮＩＳＣの投与は、ＮＩＳＣにおける抗原の免疫応答に関与するアレルギーの症候を抑制する。
【００１７】
［００１８］別の側面において、本発明は、アレルギー応答を発症する危険性のある患者に非免疫刺激性結合体を投与することを含むアレルギー応答を妨げる方法を提供する。本発明に従えば、ＮＩＳＣの投与は、ＮＩＳＣにおける抗原に対する免疫応答に関与するアレルギー応答を妨げる。
【００１８】
［００１９］いくつかの態様において、本発明のＮＩＳＣは、自己抗原、同種抗原又はアレルゲンを含む。いくつかの態様において、本発明のＮＩＳＣの非免疫原性ポリヌクレオチドは、免疫制御性配列（ＩＲＳ）を含む。いくつかの態様において、ＩＲＳは、ＴＬＲ９クラスＩＲＳ、ＴＬＲ７／８クラスＩＲＳ又はＴＬＲ７／８／９ＩＲＳである。いくつかの態様において、本発明のＮＩＳＣの非免疫原性ポリヌクレオチドは、アンチセンス分子又はアプタマーを含む。
【００１９】
本発明を実施するための形態
［００２２］本発明に従えば、非免疫刺激性ポリヌクレオチドと抗原を連結することによって、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び／又は樹枝状細胞（ＤＣ）による抗原の取り込みは、ＡＰＣ若しくはＤＣの活性化又は成熟がほとんどないか又は全くない状態で増強及び／又は促進される。また、非免疫刺激性ポリヌクレオチドと抗原を接触することによって、ＡＰＣ及び／又はＤＣによる抗原の取り込みは、ＡＰＣ若しくはＤＣの活性化又は成熟がほとんどないか又は全くない状態で抗原提示を増加する。
【００２０】
［００２３］つまり、本発明は、非免疫刺激性ポリヌクレオチド抗原結合体（ＮＩＳＣ）が、個体、特にヒトにおける不要又は不適切な免疫応答を制御するために使用される方法を提供する。本発明の組成物は、抗原が不要な免疫応答に関与する場合、抗原に結合した非免疫刺激性ポリヌクレオチドを含む。本発明のＮＩＳＣは、特に抗原に対する不要な免疫応答を抑制及び／又は阻害する。本発明のＮＩＳＣはまた、末梢自己寛容の誘導又は促進に有用である。
【００２１】
［００２４］したがって、本発明は、限定されないが、自己免疫応答、同種免疫応答、アレルギー応答、及び同時異常免疫応答、例えば、セリアック病を含む抗原に対する不要な免疫応答を抑制及び／又は阻害するための方法及び組成物を提供する。本発明はまた、抗原特異性Ｔ制御性細胞を発生するための方法、及びＴｈ１及び／Ｔｈ２細胞の分化を阻害する方法を提供する。
【００２２】
［００２５］本発明はまた、限定されないが、自己免疫性に関連した症候、同種免疫性に関連した症候、アレルギーに関連した症候、及び同時異常免疫応答、例えばセリアック病に関連した症候を含む不要な免疫活性化と関連した症候を改善するための方法及び組成物を提供する。したがって、本発明はまた、移植拒絶及び／又は移植片対宿主（ＧＶＨ）疾患を低減するような移植に役立つ方法を提供する。
【００２３】
［００２６］本発明はまた、末梢自己寛容を誘導又は促進する方法及び組成物を提供する。
［００２７］さらに、本発明のＮＩＳＣを含むキットが提供される。キットは、さらに、患者における免疫制御のための本発明のＮＩＳＣを投与する使用説明書を含んでもよい。
【００２４】
一般技術
［００２８］本発明の実施は、他に指示がない限り、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学及び免疫学の慣用的な技術を使用されるであろうし、これらは当該技術分野の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．１９９１）；Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ（Ｄ．Ｗｉｌｄ，ｅｄ．，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ  ＮＹ，１９９４）；Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｕｅｓ（Ｇｒｅｇ  Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９９６）；及び、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｒ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．Ｈ．Ａｌｂｅｒｔ，ａｎｄ  Ｎ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ，ｅｄｓ．，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，１９９３）に十分に説明される。
【００２５】
定義
［００２９］用語「免疫刺激性」又は「免疫応答を刺激すること」は、本明細書中で使用するとき、特定の抗原性物質に対する免疫応答の免疫応答及び増強に参加する細胞タイプの刺激を含む。免疫刺激性核酸によって刺激される免疫応答は、一般的に、「Ｔｈ２タイプ」の免疫応答の対語として、「Ｔｈ１タイプ」の免疫応答である。Ｔｈ１タイプの免疫は、通常、抗原及び活性化したマクロファージ機能に対する「遅延型過感受性」反応によって特徴付けられ、そして、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、及びＴＮＦ−βのようなＴＨ１関連サイトカインのレベルの増加によって、生化学レベルで検出することができる。Ｔｈ２タイプの免疫応答は、一般的に、高レベルな抗体産生、特に、ＩｇＥ抗体産生、及び増大した好酸球数及び活性化、並びにＩＬ−４、ＩＬ−５及びＩＬ−１３のようなＴｈ２関連サイトカインの発現と関連付けられる。
【００２６】
［００３０］用語「免疫刺激性核酸」又は「免疫刺激性ポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用するとき、インビトロ、インビボ及び／又はエクスビボで測定される測定可能な免疫応答への影響及び／又は貢献する核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）を意味する。測定可能な免疫応答の例は、限定されないが、抗原特異的な抗体産生、サイトカイン分泌、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｂリンパ球等のようなリンパ球集団の活性化又は拡大を含む。免疫刺激性核酸配列は、固有の免疫応答を刺激することが知られ、特に、それら反応は、細胞におけるＴＬＲ−９シグナリングを通じて生じる。一般的に、免疫刺激性核酸配列は、少なくとも１つのＣＧジヌクレオチドを含み、このジヌクレオチドのＣは、メチル化されていない。
【００２７】
［００３１］用語「結合体」は、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原が結合した複合体を意味する。このような結合体の連結は、共有及び／又は非共有リンケージを含む。
［００３２］用語「非免疫刺激性ポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用するとき、インビトロ、インビボ及び／又はエクスビボで測定される測定可能な免疫応答に影響及び／又は貢献しない核酸分子（例えば、ポリヌクレオチド）を意味する。特に、非免疫刺激性ポリヌクレオチドは、たとえあったとしても、少ししかないＡＰＣ又はＤＣ活性化又は成熟を刺激する。ＡＰＣ及びＤＣの活性化及び成熟化のインジケータ、及びインジケータに関するアッセイは、当該技術分野において既知である。
【００２８】
［００３３］用語「免疫制御性配列」又は「ＩＲＳ」は、本明細書中で使用するとき、インビトロ、インビボ及び／又はエクスビボで測定される測定可能な固有の免疫応答を阻害及び／又は抑制する核酸配列を意味する。用語「免疫制御性ポリヌクレオチド」又は「ＩＲＰ」は、本明細書中で使用するとき、インビトロ、インビボ及び／エクスビボで測定される測定可能な固有の免疫応答を阻害及び／又は抑制する少なくとも１つのＩＲＳを含むポリヌクレオチドを意味する。ＴＬＲ、例えば、ＴＬＲ−７，８又は９の阻害は、限定されないが、例えば、リガンド−受容体結合による受容体部位での阻害、及び、リガンド−受容体結合後の下流のシグナル経路の阻害を含む。測定可能な固有の免疫応答の例は、限定されないが、サイトカインの分泌、ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球、Ｂリンパ球のようなリンパ球集団の活性化又は拡大、骨髄腫の樹枝状細胞のような細胞群の成熟等を含む。
【００２９】
［００３４］用語「免疫制御性化合物」又は「ＩＲＣ」は、本明細書中で使用するとき、免疫制御活性を有し、ＩＲＳを含む核酸部分を含む分子を意味する。ＩＲＣは、１より多くのＩＲＳを含む核酸部分からなっていてもよく、１つのＩＲＳでなっていてもよく、あるいは、それ自体で免疫刺激活性を有しない。ＩＲＣは、ポリヌクレオチド（「ポリヌクレオチドＩＲＣ」）からなっていてもよく、あるいは、追加部分を含んでいてもよい。したがって、用語ＩＲＣは、１以上の核酸部分を取り込む化合物を含み、少なくともその１つは、ＩＲＣを含み、非ヌクレオチドのスペーサー部分に共有的に連結する。
【００３０】
［００３５］本明細書中で相互交換可能に使用するとき、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、１本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二重鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、１本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及び二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、修飾したオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド又はそれらの組み合わせを含む。オリゴヌクレオチドは、線状又は環状に構成され得て、あるいはオリゴヌクレオチドは、線状及び環状セグメントの両方を含有することができる。オリゴヌクレオチドは、一般的に、リン酸ジエステル連結を通じて繋がれるヌクレオシドの高分子であるが、代替のリンケージ、例えば、ポスホロチオエートエステルはまた、オリゴヌクレオチドにおいて使用してもよい。ヌクレオシドは、糖に結合したプリン（アデニン（Ａ）若しくはグアニン（Ｇ）又はその誘導体）又はピリミジン（チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）若しくはウラシル（Ｕ）又はその誘導体）塩基からなる。ＤＮＡにおける４つのヌクレオシド単位（又は塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、及びデオキシシチジンと呼ばれる。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００３１】
［００３６］用語「３’」は、一般的に、同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける別の領域又は位置から、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド３’（下流）における領域又は位置を意味する。用語「３’端」は、ポリヌクレオチドの３’末端を意味する。
【００３２】
［００３７］用語「５’」は、一般的に、同じポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドにおける別の領域又は位置から、ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド５’（上流）における領域又は位置を意味する。
【００３３】
［００３８］用語「ペプチド」は、一般的に、ペプチドがハプテンであろうとなかろうと、生物学的反応、例えば、抗体産生又はサイトカイン活性化に影響する十分な長さ及び組成物であるポリペプチドを意味する。典型的には、これらペプチドは、長さにして少なくとも６個のアミノ酸残基である。用語「ペプチド」は、さらに、修飾したアミノ酸（天然に又は非天然に発生しようと発生しまいとかかわらず）、例えば、限定されないが、リン酸化、グリコシル化、ｐｅｇ化、脂質化（ｌｉｐｉｄｉｚａｔｉｏｎ）及びメチル化を含む修飾を含む。
【００３４】
［００３９］「輸送分子」又は「輸送ベヒクル」は、特定部位及び／又は特定の時期に関してＮＩＳＣの輸送を促進、許可、及び／又は増加する化学分子である。
［００４０］「個体」又は「患者」は、脊椎動物、例えば鳥類であり、そして、好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。哺乳類は、限定されないが、ヒト、霊長類、家畜、格闘（ｓｐｏｒｔ）動物、げっ歯類及びペットを含む。
【００３５】
［００４１］物質の「有効量」又は「十分量」は、臨床結果を含む有益又は所望の結果に影響するのに十分な量であり、例えば、「有効量」は適用される文脈に依存する。有効量は、１以上の投与において投与することができる。
【００３６】
［００４２］反応又はパラメータの「抑制」又は「阻害」は、目的とする状態又はパラメータを除く別の同じ状態と比較した場合、あるいは、代替的に別の状態と比較した場合、その応答又はパラメータを減少することを含む。
【００３７】
［００４３］本明細書中で使用するとき、当該技術分野において十分に理解されるように、「治療」は、臨床結果を含む有益又は所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的に対して、有益又は所望の臨床結果は、検出できようが又は検出できまいが、限定されないが、１以上の症候の緩和又は改善、疾患の程度の縮小、疾患の安定化した（即ち、悪化しない）状態、疾患の広がりの阻害、疾患の進行の遅延若しくは遅滞、疾患状態の改善若しくは軽減、及び鎮静（部分的であるか全体であるかを問わない）を含む。「治療」はまた、治療を受けないとした場合の期待される生存と比較して、生存の延長を意味することができる。
【００３８】
［００４４］疾患又は障害を「軽減すること（ｐａｌｌｉａｔｉｎｇ）」は、障害を治療しない場合と比較して、障害又は疾患の程度及び／又は所望の臨床症候が減少し、及び／又は進行の時間経過がゆっくりとなり又は長くなることを意味する。特に、自己免疫疾患の状況において、当業者に十分に理解されるように、軽減は、不要の免疫応答の制御又は低減に応じて発生してもよい。さらに、軽減は、１回の服用の投与によって必ずしも生じなくもよいが、しばしば、一連の服用の投与に応じて生じる。つまり、反応又は障害を軽減するのに十分な量は、１以上の投与で投与してもよい。
【００３９】
［００４５］本明細書中で使用するとき、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」及びその同語は、それらの包括的な意味で使用され；つまり、用途「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及びそれに対応する同語に均等である。
【００４０】
［００４６］本明細書中で使用するとき、単数形「１の（ａ）」、「１の（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、他に指示がない限り、複数の指示を含む。例えば、「１の（ａｎ）」抗原は、１以上の抗原を含む。
【００４１】
本発明の組成物
［００４７］本発明は、ポリヌクレオチド−抗原結合体を提供し、ここで、ポリヌクレオチドは、樹枝状細胞（ＤＣ）及び／又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の取り込みを促進又は増大するが、ＤＣ又はＡＰＣの活性化又は成熟がほとんどないか又は全くない。その代わりに、本発明は、ポリヌクレオチド−抗原結合体を提供し、ここで、ポリヌクレオチドは、ＤＣ及び／又はＡＰＣによって抗原提示を増加するが、ＤＣ又はＡＰＣの活性化又は成熟化がほとんどないか又は全くない。このような結合体中のポリヌクレオチドは、非免疫刺激性ポリヌクレオチドである。したがって、このような結合体は、本明細書中「非免疫刺激性結合体」（ＮＩＳＣ）を意味する。投与に応じて、本発明の結合体は、ＡＰＣ及び／又はＤＣ細胞の活性化又は成熟化を促進しないので、投与した抗原に対する寛容へと導くことができる。
【００４２】
［００４８］この結合体は、ＤＣ又はＡＰＣの成熟化をほとんど刺激しないか又は全く刺激しないポリヌクレオチドを含有する。非免疫刺激性ポリヌクレオチドは、限定されないが、（ａ）免疫制御性配列（ＩＲＳ）を含有するポリヌクレオチド、（ｂ）特定の活性を有するポリヌクレオチド（例えば、アプタマー又はアンチセンスポリヌクレオチド）（しかし、非免疫刺激性である）、及び（ｃ）特定の既知の活性を有しないポリヌクレオチドであって、非免疫刺激性であるポリヌクレオチド（即ち、（ａ）及び（ｂ）のいずれでもない）を含む。
【００４３】
［００４９］本発明の組成物は、ＮＩＳＣ単独（又は２以上のＮＩＳＣの組成物）を含む。本発明の組成物はまた、二次的未結合の抗原、抑制性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ）又は他の免疫抑制性試薬のような別の試薬と結合したＮＩＳＣを含んでもよい。本発明の組成物は、ＮＩＳＣ及び医薬として許容される賦形剤を含んでもよい。医薬として許容される賦形剤は、緩衝剤を含み、本明細書中に記載され、そして当該技術分野において周知である。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００）。
【００４４】
非免疫刺激性ポリヌクレオチド
［００５０］本明細書中に記載されるように、ＮＩＳＣの非免疫刺激性ポリヌクレオチドは、細胞、特に樹枝状細胞（ＤＣ）及び／又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）による抗原の取り込みを促進又は増大する。これらのポリヌクレオチドは、抗原取り込みを促進又は増大させるが、細胞の活性化又は成熟化をほとんど刺激しないか又は全く刺激しない。この促進又は増大した抗原取り込みは、ＡＰＣ及び／又はＤＣによる抗原提示の増加の原因となる。いくつかの例において、非免疫刺激性ポリヌクレオチドは、細胞の活性化を刺激し、及び細胞の成熟化を誘発するするポリヌクレオチドなしに抗原提示を促進又は増加する。
【００４５】
［００５１］本発明に従えば、ＮＩＳＣの非刺激性ポリヌクレオチドは、免疫刺激性ポリヌクレオチド（ＩＲＰ）又は免疫刺激性複合体（ＩＲＣ）であってもよく、これらは、同時係属の米国出願シリアル第６０／６０６，８３３号及び米国出願シリアル第１１／２１２，２９７号（これらは、参照により明細書中に全体として援用される）に記載される少なくとも１つの免疫制御性配列（ＩＲＳ）を含有する。いくつかの場合において、ＩＲＳは、５’−Ｇ，Ｃ−３’配列を含む。いくつかの場合において、ＩＲＳは、ポリヌクレオチドの５’端の又は近傍の少なくとも１つのＴＧＣトリヌクレオチド配列（即ち、５’−ＴＧＣ）を含む。いくつかの場合において、ＩＲＳは、５’−ＧＧＧＧ−３’配列を含む。いくつかの場合において、ＩＲＳは、５’−ＧＧＧＧ−３’配列を含まない。したがって、いくつかの場合において、ＩＲＰ又はＩＲＣは、５’−ＧＧＧＧ−３’配列を含まない。いくつかの場合において、５’−ＧＧＧＧ−３’配列を含むＩＲＰ又はＩＲＣは、１本鎖形体で使用される場合、特に効果的である。いくつかの場合において、５’−ＧＧＧＧ−３’配列を含むＩＲＰ又はＩＲＣは、ホスホロチオエート骨格を用いて作製される場合、特に効果的である。
【００４６】
［００５２］同時係属の米国出願シリアル第１１／２１２，２９７号及び米国出願第６０／６０６，８３３号に示されるように、特定のＩＲＳ及びＩＲＣは、ＴＬＲ−７及び／又はＴＬＲ−８依存の細胞応答を阻害する。また、特定のＩＲＰ及びＩＲＣは、ＴＬＲ−９依存の細胞応答を阻害し、そして、特定のＩＲＰ及びＩＲＣは、ＴＬＲ−７／８依存の細胞応答及びＴＬＲ−９依存の細胞応答を阻害する。本明細書中で使用するとき、「ＴＬＲ−７／８」は、「ＴＬＲ−７及び／又はＴＬＲ−８」を意味する。したがって、本明細書中で使用するとき、「ＴＬＲ−７／８／９」は、「（ＴＬＲ−７及び／又はＴＬＲ−８）及びＴＬＲ−９」を意味する。ある種のＩＲＰは、ＴＬＲ４依存の細胞応答を阻害しない。
【００４７】
［００５３］非免疫刺激性ポリヌクレオチドは、固有の免疫応答の刺激活性の不在によって定義される。それらは、当該技術分野において記載され、そして、刺激活性の不在は、サイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性、Ｂ細胞増殖、Ｔ細胞増殖、及び樹枝状細胞成熟化のような種々の側面の固有の免疫応答を指示する標準的なアッセイを用いて容易に測定してもよい。ＤＣの成熟化は、限定されないが、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような同時刺激性分子を含む細胞表面での種々のマーカーの上方制御によって評価することができる。
【００４８】
［００５４］免疫刺激性核酸及び固有の免疫応答の他の刺激因子は、当該技術分野において記載され、そして、それらの活性は、サイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性化、Ｂ細胞増殖、Ｔ細胞増殖、樹枝状細胞の成熟化のような種々の側面の固有の免疫応答を指示する標準的なアッセイを用いて容易に測定され得る。例えば、Ｋｒｉｅｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９；Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：４０７２−４０７６；Ｋｌｉｎｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：３６３５−３６３９；Ｐｉｓｅｔｓｋｙ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４２１−４２３；Ｒｏｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．３：８４９−８５４；ＷＯ９８／１６２４７；ＷＯ９８／５５４９５；ＷＯ００／６１１５１及び米国特許第６，２２５，２９２号を参照されたい。したがって、これらの方法及び他の方法は、例えば、ＡＰＣ及びＤＣを活性化せず、そして、成熟するためにＡＰＣを刺激しない、効果的な免疫刺激活性を欠如する配列、ポリヌクレオチド及び／又は化合物を同定、試験及び／又は確かめるために使用することができる。例えば、ＮＩＳＣの効果は、どの自己活性な免疫応答における細胞又は個体がいつ刺激されたかを決定することができる。
【００４９】
［００５５］本明細書中において明確に伝達されるように、本明細書中に記載した式に関して、いずれか及び全てのパラメータは、独立して選択される。例えば、ｘ＝０−２である場合、ｙは、ｘの値（式中の任意の他の選択可能なパラメータ）にかかわらずに独立して選択されてもよい。好ましくは、ＩＲＳを含むＩＲＰ又はＩＲＣは、少なくとも１つのホスホロチオエート骨格連結を有するポリヌクレオチドである。
【００５０】
［００５６］ＴＬＲ９に依存した細胞刺激を阻害するのに特に有効なＩＲＳは、「ＴＬＲ９クラス」ＩＲＳと称される。
［００５７］いくつかの態様において、ＩＲＳは、式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3（配列番号１）（ここで、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドであるが、ただし、Ｘ1がＣ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡでない）の配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ＩＲＳは、式配列番号１の配列（ここで、Ｘ1は、Ｃ又はＡである）を含んでもよい。いくつかの態様において、ＩＲＳは、式：Ｘ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3（配列番号２）（ここで、Ｘ1、Ｘ2、Ｘ3はヌクレオチドであるが、ただし、Ｘ1がＣ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではなく、そして、Ｘ1はＣ又はＡである）の配列を含んでもよい。
【００５１】
［００５８］いくつかの態様において、ＩＲＳは、式：ＧＧＮnＸ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3（配列番号３）（ここで、ｎは、１〜約１００（好ましく１〜約２０）の整数であり、各Ｎはヌクレオチドであり、そして、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドであるが、ただし、Ｘ1がＣ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡではない）の配列を含んでもよい。ある態様において、ＩＲＳは、式配列番号３（ここで、Ｘ1はＣ又はＡである）の配列を含んでもよい。
【００５２】
［００５９］いくつかの態様において、ＩＲＳは、式：ＮiＴＣＣＮj（ＧＧ）kＮmＸ1ＧＧＧＧＸ2Ｘ3（配列番号４）（ここで、各Ｎはヌクレオチドであり、ｉは、１〜約５０の整数であり、ｊは、１〜約５０までの整数であり、ｋは、０又は１であり、ｍは、１〜約２０までの整数であり、そして、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドであるが、ただし、Ｘ1＝Ｃ又はＡである場合、Ｘ2Ｘ3はＡＡでない）の配列を含んでもよい。いくつかの態様において、ＩＲＳは、式配列番号４（ここで、Ｘ1はＣ又はＡである）の配列を含んでもよい。
【００５３】
［００６０］いくつかの態様において、ＩＲＳは、式：Ｘ1Ｘ2Ｘ3ＧＧＧＧＡＡ（配列番号５）（ここで、Ｘ1、Ｘ2、及びＸ3はヌクレオチドであるが、ただし、Ｘ3がＣ又はＡである場合、Ｘ1Ｘ2はＧＧでない）の配列を含んでもよい。
【００５４】
［００６１］配列番号１、２、３、４又は５を含むオリゴヌクレオチドの例は、下記の配列：
５’−ＴＣＣＴＡＡＣＧＧＧＧＡＡＧＴ−３’（配列番号１０（Ｃ８２７））；
５’−ＴＣＣＴＡＡＧＧＧＧＧＡＡＧＴ−３’（配列番号１１（Ｃ８２８））；
５’−ＴＣＣＴＡＡＣＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１２（Ｃ８４１））；
５’−ＴＣＣＴＡＡＣＧＧＧＧＣＴＧＴ−３’（配列番号１３（Ｃ８４２））；
５’−ＴＣＣＴＣＡＡＧＧＧＧＣＴＧＴ−３’（配列番号１４（Ｃ８４３））；
５’−ＴＣＣＴＣＡＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１５（Ｃ８４４））；
５’−ＴＣＣＴＣＡＴＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１６（Ｃ８４５））；
５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号１７（Ｃ８６９））；
５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＣＴＧＴ−３’（配列番号１８（Ｃ８７０））；
５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＣＣＡＴ−３’（配列番号１９（Ｃ８７１））；
５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＣＡＴ−３’（配列番号２０（Ｃ８７２））；
５’−ＴＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＴ−３’（配列番号２１（Ｃ８７３））；
５’−ＴＣＣＧＧＡＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号２２（Ｃ８７４））；
５’−ＴＧＣ  ＨＥＧ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ−３’（配列番号７４（Ｃ９８３））；
５’−ＴＧＣ  ＴＥＧ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ−３’（配列番号７５（Ｃ９８４））；
５’−ＴＧＣ  ｄｄｄ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ−３’（配列番号７６（Ｃ９８５））；
５’−ＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ−３’（配列番号７７（Ｃ９８６））；
５’−Ｃ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ−３’（配列番号７８（Ｃ９８７））；
５’−ＡＡＡ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ−３’（配列番号７９（Ｃ９８８））；
５’−ＴＣＣ  ＴＧＧ  ｄＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ−３’（配列番号８０：（Ｃ９８９））；
５’−ＴＣＣ  ＴＧＧ  ｄｄＧ  ＧＧＧ  ＴＴＧ  Ｔ−３’（配列番号８１（Ｃ９９０）；及び
５’−ＴＧＣ  ＴＣＣ  ＴＧＧ  ＡＧＧ  ＧＧＴ  ＴＧＴ  ＨＥＧ  ＨＥＧ−３’（配列番号８２（Ｃ９９１））
を含み、ここで、「ｄ」は、脱塩基（ａｂａｓｉｃ）ヌクレオチドを意味する（即ち、ヌクレオチド塩基を欠損しているが、糖及びリン酸部分を有する）。
【００５５】
［００６２］いくつかの態様において、ＩＲＳは、任意の配列番号１、２、３、４又は５の配列（ここで、少なくとも１つのＧは、７−デアザ−ｄＧによって置換される）を含んでもよい。例えば、いくつかの態様において、ＩＲＳは、配列５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＺ’ＧＧＴＴＧＴ−３’（Ｚ’＝７−デアザ−ｄＧ；配列番号２３（Ｃ９２０））を含んでもよい。
【００５６】
［００６３］配列番号１、２、３、４若しくは５を含むＩＲＰ又は配列番号１、２、３、４又は５を含むＩＲＰ（ここで、少なくとも１つのＧは、特に、７−デアザ−ｄＧによって置換される）、ＴＬＲ９に依存した細胞刺激を阻害するのに効果的である。ＴＬＲ９に依存した細胞シグナリングを阻害するのに効果的でもある他のＩＲＳ配列は、下記：
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＡＧＧＣＧＧＧＧＡＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号２４（Ｃ５３３））；
５’−ＧＡＧＣＡＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＴＣＣＡＴ−３’（配列番号２５（Ｃ７０７）；及び
５’−ＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＺ’ＧＧ−３’（Ｚ’＝７−デアザ−ｄＧ；配列番号２６（Ｃ８９１））
を含む。
【００５７】
［００６４］本明細書中で示されるように、いくつかのＩＲＳは、ＴＬＲ７／８に依存した細胞刺激の阻害に特に効果的である。したがって、この活性を有するＩＲＳは、「ＴＬＲ７／８クラス」ＩＲＳと称する。例えば、配列５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号２７（Ｃ６６１））を含むオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ７／８に依存した細胞刺激を阻害する。
【００５８】
［００６５］いくつかの態様において、ＩＲＳは、配列番号２７（Ｃ６６１）の断片を含み、少なくとも１０個の塩基の回文部分を含む。例えば、このような配列は、下記の配列：
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧ−３’（配列番号２８（Ｃ９２１））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡ−３’（配列番号２９（Ｃ９２２））；
５’−ＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３０（Ｃ９３５））；
５’−ＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３１（Ｃ９３６））；及び
５’−ＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３２（Ｃ９３７））
を含む。
【００５９】
［００６６］いくつかの態様において、ＩＲＰは、配列番号２７（Ｃ６６１）、又はその断片からなる。いくつかの態様において、ＩＲＰは、配列番号２７（Ｃ６６１）の断片からなり、その少なくとも１０個の塩基の回文部分を含む。
【００６０】
［００６７］いくつかの態様において、ＴＬＲ７／８に依存した細胞刺激の阻害に有効なＩＲＰは、配列５’−ＴＧＣＮm−３’からなり、Ｎはヌクレオチドであり、ｍは５〜約５０の整数であり、そして、配列Ｎ1−Ｎmは少なくとも１つのＧＣジヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、このようなＩＲＰは、配列５’−ＴＧＣＮmＡ−３’、配列５’−ＴＧＣＮmＣＡ−３’又は配列５’−ＴＧＣＮmＧＣＡ−３’からなる。例えば、いくつかの態様において、ＩＲＰは、下記の配列：
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＡＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３３（Ｃ９１７））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＣＡ−３’（配列番号３４（Ｃ９１８））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡ−３’（配列番号３５（Ｃ９３２））；
５’−ＴＧＣＴＴＡＧＣＡＧＣＴＡＴＧＣＡＧＣＡ−３’（配列番号３６（Ｃ９３３））；又は
５’−ＴＧＣＡＡＧＣＡＡＧＣＴＡＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号３７（Ｃ９３４））
からなってもよい。
【００６１】
［００６８］ＴＬＲ７／８に依存した細胞シグナリングの阻害にも効果的である他のＩＲＳは、下記：
５’−ＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧ  ＣＡＡ  ＧＣＴ  Ｔ−３’（配列番号３８（Ｃ７９３））；
５’−ＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＧＡＴ  ＧＡＴ−３’（配列番号３９（Ｃ７９４））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣ−３’（配列番号４０（Ｃ９１９））；
５’−ＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＴ−３’（配列番号４１（Ｃ９２３））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧ−３’（配列番号４２（Ｃ９３０））；
５’−ＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号４３（Ｃ９３８））；
５’−ＴＡＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号４４（Ｃ９３９））；
５’−ＴＧＡＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号４５（Ｃ９４０））；
５’−ＡＡＡＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号４６（Ｃ９４１））；
５’−ＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号４７（Ｃ９４５））；
５’−ＡＡＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡ−３’（配列番号４８（Ｃ９５１））；
５’−ＴＧＡＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡ−３’（配列番号４９（Ｃ９５９））；
５’−ＴＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴＧＡＣＡＧＣＡ−３’（配列番号５０（Ｃ９６０））；及び
５’−ＴＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＴＴＧＡＣＡＧＡＣ−３’（配列番号５１（Ｃ９６１））を含む。
【００６２】
［００６９］ＩＲＳの別のクラスは、ＴＬＲ７／８及びＴＬＲ９に依存した細胞刺激の両方の阻害に特に効果的であるものを含む。したがって、この活性を有するＩＲＳは、「ＴＬＲ７／８／９クラス」ＩＲＳと称する。いくつかの場合において、ＴＬＲ７／８クラスＩＲＳとＴＬＲ９クラスＩＲＳの組み合わせは、ＴＬＲ７／８／９クラスのＩＲＳに帰着する。
【００６３】
［００７０］ＴＬＲ７／８／９クラスのＩＲＳは、配列ＴＧＣＮmＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号６）（ここで、各Ｎはヌクレオチドであり、ｍは０〜約１００の整数であり、いくつかの場合において、０〜約５０であり、好ましくは０〜約２０である）を含む。
【００６４】
［００７１］いくつかの態様において、ＩＲＳは、配列番号６を含み、ここで、配列Ｎ1−Ｎmは、配列５’−ＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡ−３’（配列番号７）の断片を含む。配列番号７の断片は、その配列の任意の部分、例えば、ＴＴＧＡＣ又はＧＣＴＴＧＡである。いくつかの態様において、配列番号７の断片は、配列番号７の５’末端からであり、例えば、ＴＴＧＡＣ又はＴＴＧを含む。
【００６５】
［００７２］いくつかの態様において、ＩＲＳは、配列５’−ＴＧＣＲＲＺＮＹＹ−３’（配列番号８）（ここで、Ｚは、Ｃを除く任意のヌクレオチドであり、Ｎは、任意のヌクレオチドであり、そして、ＺがＧ又はイノシンでない場合、Ｎは、グアノシン又はイノシンである）を含む。他の態様において、ＩＲＳは、配列５’−ＴＧＣＲＲＺＮポリ（ピリジミン）−３’（配列番号９）（ここで、Ｚは、Ｃを除く任意のヌクレオチドであり、Ｎは任意のヌクレオチドであり、そして、ＺがＧ又はイノシンでない場合、Ｎは、グアノシン又はイノシンである）を含む。
【００６６】
［００７３］ＴＬＲ７／８／９に依存した細胞シグナリングの阻害にも効果的であるＩＲＳ配列の例は、下記：
５’−ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号５２（Ｃ９５４））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号５３（Ｃ９５６））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号５４（Ｃ９５７））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号５５（Ｃ９６２））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号５６（Ｃ９６３））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号５７（Ｃ９６４））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号５８（Ｃ９６５））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＣＴＴＧＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号５９（Ｃ９６６））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号６０（Ｃ９６７））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号６１（Ｃ９６８））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴ−３’（配列番号６２（Ｃ９６９））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＴＴＧＡＣＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧ−３’（配列番号６３（Ｃ９７０））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号６４（Ｃ９７１））；
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号６５（Ｃ９７２））；及び
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号６６（Ｃ９０８））
を含む。
【００６７】
［００７４］本明細書中で記載されるように、いくつかのＩＲＰは、ＴＬＲ９に依存した細胞応答の抑制に特に効果的である。このようなＩＲＰは、限定されないが、配列番号２４（Ｃ５３３）；配列番号２５（Ｃ７０７）；配列番号８６（１０１９）；配列番号９１（Ｃ８９１）；配列番号１０（Ｃ８２７）；配列番号１１（Ｃ８２８）；配列番号１２（Ｃ８４１）；配列番号１３（Ｃ８４２）；配列番号１４（Ｃ８４３）；配列番号１５（Ｃ８４４）；配列番号１６（Ｃ８４５）；配列番号１７（Ｃ８６９）；配列番号１８（Ｃ８７０）；配列番号１９（８７１）；配列番号２０（Ｃ８７２）；配列番号２１（Ｃ８７３）；配列番号２２（Ｃ８７４）；配列番号２３（Ｃ９２０）、及び配列番号６６（Ｃ９０８）を含む。本明細書中に記載されるように、いくつかのＩＲＰは、ＴＬＲ７／８に依存した細胞応答の抑制に特に効果的である。このようなＩＲＰは、限定されないが、配列番号１７（Ｃ８６９）；配列番号２３（Ｃ９２０）；配列番号２７（Ｃ６６１）；配列番号３８（Ｃ７９３）；配列番号２９（Ｃ７９４）；配列番号３３（Ｃ９１７）；配列番号３４（Ｃ９１８）；配列番号４０（Ｃ９１９）；配列番号２８（Ｃ９２１）；配列番号２９（Ｃ９２２）；配列番号４１（Ｃ９２３）、及び配列番号６６（Ｃ９０８）を含む。
【００６８】
［００７５］非免疫刺激性ポリヌクレオチドは、特定の活性を有するポリヌクレオチドを含むが、非免疫刺激性であり、例えば、アプタマー又はアンチセンス分子である。アプタマーは、特定の細胞又は組織に対するイメージング及び／又は治療薬の輸送のための標的リガンドとして有用である。アプタマーは、高アフィニティー、高特異性ＲＮＡ、又はインビトロでの選択実験によって産生したＤＮＡを基礎としたリガンド（ＳＥＬＥＸ：指数関数的濃縮によるリガンドの系統的発生（ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ））である。アプタマーは、２０〜３０個のヌクレオチドのランダム配列から生じ、分子抗原又は細胞に対する吸着によって選択的にスクリーニングされそして、特異的な高アフィニティー結合リガンドを精製するために濃縮される。
【００６９】
［００７６］ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、１本鎖若しくは２本鎖ＤＮＡ、並びに１本酸若しくは２本鎖ＲＮＡ又は他の修飾したポリヌクレオチドであってよい。ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、直線状であってもよく、環状であったもよく、あるいは、環状の部分を含んでもよく、及び／又はヘアピンループを含んでもよい。ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、天然に発生する又は修飾した、非天然に発生する塩基を含有してもよく、修飾した糖、リン酸、及び／又は末端を含有してもよい。種々のこのような修飾は、本明細書中に記載される。
【００７０】
［００７７］複素環塩基又は核酸塩基は、ＮＩＳＣポリヌクレオチドにおいて取り込まれ、天然に発生する主要なプリン及びピリミジン塩基（即ち、ウラシル、チミン、シトシン、アデニン及びグアニン、上述）、並びに前期主要な塩基の天然に発生する及び合成の修飾体であり得る。つまり、ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、２’−デオキシウリジン及び／又は２−アミノ−２’−デオキシアデノシンを含んでもよい。
【００７１】
［００７８］ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾した塩基を含む。本明細書中で使用するとき、用語「修飾された塩基」は、「塩基類似体」と同義であり、例えば、「修飾されたシトシン」は、「シトシン類似体」と同義である。同様に、「修飾された」ヌクレオシド又はヌクレオチドは、本明細書において、ヌクレオシド又はヌクレオチド「類似体」と同義であるように定義される。塩基修飾の例は、限定されないが、ＮＩＳＣポリヌクレオチドのシトシンのＣ−５及び／Ｃ−６に対する電子求引性部分の付加を含む。好ましくは、電子求引性部分は、ハロゲン、例えば、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ヨードシトシンである。塩基修飾の他の例は、限定されないが、ＮＩＳＣポリヌクレオチドのウラシルのＣ−５及び／又はＣ−６に対する求引性部分の付加を含む。好ましくは、電子求引性部分はハロゲンである。このような修飾したウラシルは、限定されないが、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−フルオロウラシル、５−ヨードウラシルを含むことができる。
【００７２】
［００７９］塩基修飾の他の例は、限定されないが、６−チオ−グアニン、４−チオ−チミン、及び４−チオ−ウラシルを含む塩基に対する１以上のチオール基の付加を含む。塩基修飾の他の例は、限定されないが、Ｎ４−エチルシトシン、７−デアザグアニン、及び５−ヒドロキシシトシンを含む。例えば、Ｋａｎｄｉｍａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．９：８０７−８１３を参照されたい。
【００７３】
［００８０］ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、リン酸を修飾したポリヌクレオチドを含有することができ、そのいくつかは、ポリヌクレオチドを安定化させることが知られる。したがって、いくつかの態様は、安定化したＮＩＳＣポリヌクレオチドを含む。例えば、リン酸ジエステル連結に加えて、リン酸塩修飾は、限定されないが、メチルホスホネート、ホスホロチオエート、ホスホラミデート（架橋又は架橋なし）、ホスホトリエステル及びホスホロチオエートを含み、任意の組み合わせで使用してもよい。他の非リン酸連結はまた使用されてもよい。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格のみを含む。いくつかの態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格のみを含む。いくつかの態様において、ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、ホスホジエステル及びホスホロチオエート連結の組み合わせのようなリン酸塩骨格におけるリン酸塩連結の組み合わせを含んでもよい。
【００７４】
［００８１］本発明に使用されるＮＩＳＣは、１以上のリボヌクレオチド（糖成分のみ又は主としてリボースを含有する）、デオキシリボヌクレオチド（主要な糖成分としてデオキシリボースを含有する）を含むことができ、あるいは、当該技術分野に知られ、修飾した糖又は糖類似体は、ＮＩＳＣポリヌクレオチドに取り込まれ得る。つまり、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、及び糖「類似体」シクロペンチル基であり得る。糖は、ピラノシル又はフラノシル形体であり得る。ポリヌクレオチドにおいて、糖部分は、好ましくは、リボース、デオキシリボース、アラビノース又は２’−Ｏ−アルキルリボースのフラノシドであり、そして、糖は、α又はβアノマー立体配置のいずれかのそれぞれの複素環塩基に結合することができる。糖修飾は、限定されないが、２’−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２’−アミノ−ＲＮＡ類似体、２’−フルオロ−ＤＮＡ、及び２’−アルコキシ−又はアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラを含む。例えば、ポリヌクレオチドにおける糖修飾は、限定されないが、２’−Ｏ−メチル−ウリジン及び２’−Ｏ−メチル−シチジンを含む。これらの糖又は糖類似体の製造、及びそれぞれのヌクレオチド（このような糖又は糖類似体は複素環塩基（核酸塩基）それ自体に結合する）は知られ、そして、このような調製が任意の特異的な例に関連し得る範囲を除いて、本明細書中に記載する必要はない。糖修飾はまた、ＮＩＳＣポリヌクレオチドの製造における任意のホスフェート修飾を用いて作製及び組み合わせてもよい。
【００７５】
［００８２］ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、当該技術分野において周知である技術及び核酸合成装置を用いて合成することができ、限定されないが、酵素的方法、化学的方法、及び巨大なオリゴヌクレオチド配列の分解を含む。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）；及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）を参照されたい。酵素的に集められる場合、個々のユニットは、例えば、Ｔ４  ＤＮＡ又はＲＡＮリガーゼのようなリガーゼを用いて連絡することができる。米国特許第５，１２４，２４６号。ポリヌクレオチド分解は、米国特許第４，６５０，６７５号に例示されるように、ヌクレアーゼにオリゴヌクレオチドを晒すことによって達成することができる。
【００７６】
［００８３］ＮＩＳＣポリヌクレオチドはまた、慣用的なポリヌクレオチド単離手法を用いて単離することができる。このような手法は、限定されないが、共通したヌクレオチド配列を検出するためにゲノムライブラリー又はｃＤＮＡライブラリーに対するプローブのハイブリダイゼーション、共通の構造的特徴を検出するために発現ライブラリーの抗体スクリーニング、及びポリメラーゼ連鎖反応による特定の天然内冽の合成を含む。
【００７７】
［００８４］環状ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、単離され、組換え法を用いて合成され、又は化学的に合成される。感情ＮＩＳＣポリヌクレオチドが単離又は組換え法を用いて単離する場合、ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、好ましくはプラスミドであろう。小さな環状オリゴヌクレオチドの化学合成は、文献に記載された任意の方法を用いて実行し得る。例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２０２５−２０２９；及び、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３２６−２３３３を参照されたい。
【００７８】
［００８５］ポリヌクレオチド及び修飾したポリヌクレオチドを作製するための技術は、当該技術分野において既知である。天然に発生するＤＮＡ又はＲＮＡは、リン酸ジエステル連結を含有し、一般的に、３’末端で固相に付着した成長しているオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基に適切なヌクレオシドホスホアミダイトを逐次カップリングして合成し、その後、中間体の亜リン酸トリエステルを参加して、リン酸トリエステルを得る。所望のポリヌクレオチド配列が合成されると、ポリヌクレオチドは支持体から取り除かれ、リン酸トリエステル基は、リン酸ジエステルに脱保護され、そして、ヌクレオシド塩基は、アンモニア水又は他の塩基を用いて脱保護される。例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９９３）“Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＤＮＡ  ３：４０１及び米国特許第４，４５８，０６６号を参照されたい。
【００７９】
［００８６］修飾したリン酸リンケージ又は非リン酸リンケージを含有するポリヌクレオチドヌクレオチドの合成は、当該技術分野において既知である。概説については、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ（１９９７）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ：ａｎ  Ｏｖｅｒｖｅ”ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｃｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，（Ｄ．Ｊ．Ｃｈａｄｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｇ．Ｃａｒｄｅｗ，ｅｄ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい。リン誘導体（又は修飾したリン酸塩基）は、本発明のポリヌクレオチドのおける糖又は糖類似体部分に付着することができ、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、アルキルリン酸塩、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミデート等であり得る。上記に記載したリン酸塩類似体の調製、それらのヌクレオチドへの導入、修飾したヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドそれ自体はまた知られ、本明細書中で詳細に記載する必要はない。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１８４１−１８４８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２３１８−２３２３；及び、Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２９６６−２９７３。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は、酸化工程が硫酸化工程に置換されることを除いて、天然に発生しているオリゴヌクレオチドに関して上述したものに類似する（Ｚｏｎ（１９９３）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ”ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１６５−１９０）。同様に、他のリン酸塩類似体、例えば、ホスホトリエステル（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７１）ＪＡＣＳ  ９３：６６５７−６６６５）、非架橋ホスホルアミデート（Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：７２４７−７２４６）、Ｎ３’〜Ｐ５’ホスホルアミジエート（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）ＪＯＣ  ６２：７２７８−７２８７）及びホスホロジチオエート（米国特許第５，４５３，４９６号）の合成はまた記載されている。他の非リンを基礎とした修飾オリゴヌクレオチドはまた使用することができる（Ｓｔｉｒｃｈａｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：６１２９−６１４１）。
【００８０】
［００８７］当業者は、種々の複素環塩基及び種々の糖部分（及び糖類似体）を含む大多数の「合成」非天然ヌクレオシドは、当該技術分野に利用可能であること、そして、本発明の他の基準が満足される限りは、ＮＩＳＣポリヌクレオチドが天然に発生する核酸の主要な５個の塩基成分以外の１又は数個の複素環塩基を含むことができることを認識するであろう。しかしながら、好ましくは、ＮＩＳＣポリヌクレオチドにおける複素環塩基は、限定されないが、ウラシル−５−イル、シトシン−５−イル、アデニン−７−イル、アデニン−８−イル、グアニン−７−イル、グアニン−８−イル、４−アミノピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリジミン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−３−イル基を含み、プリンは９位を通じてＮＩＳＣポリヌクレオチドの糖部分に付着し、ピリミジンは１位を介して、ピロロピリミジンは７位を介し、そして、ピラゾロピリミジンは１位を介する。
【００８１】
［００８８］塩基修飾したヌクレオシドの調製、及び前駆体として前記塩基修飾ヌクレオシドを用いた修飾ポリヌクレオシドの合成は、例えば、米国特許第４，９１０，３００号、第４，９４８，８８２号、及び第５，０９３，２３２号に記載されている。これらの塩基修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの末端又は内部位置のいずれかに化学合成によって取り込むことができるように設計されている。このような塩基修飾ヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの末端又は内部のいずれかに存在し、ペプチドの付着のための部位として使用することができる。それらの糖部分に修飾したヌクレオシドはまた記載され（限定されないが、米国特許第４，８４９，５１３号、５，０１５，７３３号、第５，１１８，８００号、第５，１１８，８０２号を含む）、そして、同様にしようすることができる。
【００８２】
［００８９］いくつかの態様において、ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、およそ下記のいずれかの（塩基又は塩基対の）長さ：１０，０００；５，０００；２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；６０；５０；４０；３０；２５；２０；１５；１４；１３；１２；１１；１０；９；８；７；６；５；４未満である。いくつかの態様において、ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、およそ下記のいいずれかの（塩基又は塩基対の）長さ：４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０００；５０００；７５００；１００００；２００００；５００００を超える。その代わりに、ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、１０，０００；５，０００；２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；６０；５０；４０；３０；２５；２０；１５；１４；１３；１２；１１；１０；９；８；７；６；５；４の上限、及び独立して選択される４；５；６；７；８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０００；５０００；７５００の下限を有するサイズ幅のいずれかであり得て、ここで、下限は、上限未満である。いくつかの態様において、ＮＩＳＣポリヌクレオチドは、長さにして、好ましくは約２００又はそれ未満の塩基である。
【００８３】
［００９０］本発明はまた本明細書中に記載されるＮＩＳＣポリヌクレオチドを作製する方法を提供する。この方法は、本明細書中に記載したいずれかのものであってよい。例えば、本方法は、ＮＩＳＣポリヌクレオチドを（例えば、固相合成を用いて）合成することができ、そして、さらに、任意の精製工程（又は複数）を含んでもよい。
【００８４】
［００９１］ある種の態様において、本発明は、ポリヌクレオチド成分として、免疫制御性化合物（ＩＲＣ）を含む非刺激性結合体に指向される。このようなＩＲＣは、免疫制御活性を有し、ＩＲＳを含む核酸部分を含む。ＩＲＣは、１以上の核酸部分及び１以上の非核酸スペーサー部分を含有する。種々の構造式に適合する化合物は、ＮＩＳＣにおけるＩＲＣとしての使用のために意図され、下記の式Ｉ−ＶＩＩに記載したコア構造を含む。式Ｉ−ＩＩＩは、「直鎖状ＩＲＣ」に関するコア配列を示す。式ＩＶ−ＶＩは、「分岐ＩＲＣ」に関するコア配列を示す。式ＶＩＩは、「１つのスペーサーＩＲＣ」に関するコア構造を示す。
【００８５】
［００９２］本明細書中に提供された各式において、「Ｎ」は、核酸部分（５’→３’又は３’→５’配向のいずれかで配置される）を明示し、そして、「Ｓ」は、非核酸スペーサー部分を明示する。ダッシュ（「−」）は、核酸部分と非核酸スペーサー部分との間の共有結合を明示する。二重ダッシュ（「−−」）は、非核酸スペーサー部分と少なくとも２個の核酸部分との間の共有結合を明示する。三重ダッシュ（「−−−」）は、非核酸スペーサー部分と三重（即ち、少なくとも３個）核酸部分との間の共有結合を明示する。下付き文字は、異なって位置した核酸又は非核酸スペーサー部分を明示するために使用される。しかしながら、異なった核酸部分を区別するための下付き文字の使用は、該部分が異なった構造又は配列を必然的に有することを示すことを意図しない。同様に、異なったスペーサー部分を区別するための下付き文字の使用は、該部分が異なった構造を必然的に有することを示すことを意図しない。例えば、式ＩＩ（下記）において、Ｎ1及びＮ2と称される核酸部分は、同じ又は異なった配列を有することができ、Ｓ1及びＳ2と称されるスペーサー部分は、同じ又は異なった構造を有することができる。さらに、付加的な化学的部分（例えば、リン酸塩、モノヌクレオチド、付加的な核酸部分、アルキル、アミノ、チオ又はジスルフィド基あるいは連結基、及び／又はスペーサー部分）は、コア構造の末端で共有結合されてもよいことが意図される。
【００８６】
［００９３］直鎖状ＩＲＣは、コア構造の非核酸スペーサー部分が２以上の核酸部分に共有結合される構造を有する。典型的な直鎖状ＩＲＣは、下記の式：
Ｎ1−Ｓ1−Ｎ2                        （Ｉ）
Ｎ1−Ｓ1−Ｎ2−Ｓ2−Ｎ3              （ＩＩ）
Ｎ1−Ｓ1−Ｎ2−Ｓ2−［Ｎv−Ｓv］A    （ＩＩＩ）
（ここで、Ａは、１〜約１００の整数であり、そして、［Ｎv−Ｓv］は、非核酸スペーサー部分に結合した核酸部分のＡ個の付加的な繰り返し示す）
に適合する。下付き「ｖ」は、Ｎ及びＳは「［Ｎv−Ｓv］」の各繰り返しにおいて独立に選択されることを示す。「Ａ」は、時折１〜約１０、時折１〜３、時折正確には１、２、３、４又は５である。いくつかの態様において、Ａは、１、２、３、４又は５の下限、及び、独立して選択される１０、２０、５０又は１００（例えば、３〜１０）の上限によって定義される範囲の整数である。
【００８７】
［００９４］典型的な直鎖状ＩＲＣは、下記：
Ｎ1−ＨＥＧ−Ｎ2−ＯＨ                       （Ｉａ）
Ｎ1−ＨＥＧ−Ｎ1−ＰＯ4                      （Ｉｂ）
Ｎ1−ＨＥＧ−Ｎ2−ＨＥＧ                     （Ｉｃ）
ＨＥＧ−Ｎ1−ＨＥＧ−Ｎ1−ＨＥＧ             （Ｉｄ）
Ｎ1−ＨＥＧ−Ｎ2−ＨＥＧ−Ｎ1                （Ｉｅ）
Ｎ1−ＨＥＧ−Ｎ2−（ＨＥＧ）4−Ｎ3           （Ｉｆ）
（Ｎ1）2−グリセロール−Ｎ1−ＨＥＧ−Ｎ1     （Ｉｇ）
ＰＯ4−Ｎ1−ＨＥＧ−Ｎ2                      （Ｉｈ）
Ｎ1−（ＨＥＧ）15−Ｔ                        （Ｉｉ）
（Ｎ1−ＨＥＧ）2−グリセロール−ＨＥＧ−Ｎ2  （Ｉｊ）
Ｎ1−ＨＥＧ−Ｔ−ＨＥＧ−Ｔ                  （Ｉｋ）
を含む。
【００８８】
［００９５］ここで、ＨＥＧはヘキサ−（エチレングリコール）を意味する。ＴＥＧは、テトラ−（エチレングリコール）を意味する。
［００９６］好ましい直鎖状ＩＲＣは下記：
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−ＨＥＧ−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号６７（Ｃ９０７、Ｃ６６１−ＨＥＧ−Ｃ８６９）；
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＡＧＣＡＡＧＣＡ−ＨＥＧ−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号６８（Ｃ９１３、Ｃ９１７−ＨＥＧ−Ｃ８６９）；
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＣＡ−ＨＥＧ−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号６９（Ｃ９１４、Ｃ９１８−ＨＥＧ−Ｃ８６９）；
５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＣＡ−ＨＥＧ−ＴＣＣＴＧＧＡＧＺＧＧＴＴＧＴ−３’（配列番号７０（Ｃ９１６、Ｃ６６１−ＨＥＧ−Ｃ９２０）；及び
５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−ＨＥＧ−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’（配列番号７１（Ｃ９２８、Ｃ８６９−ＨＥＧ−Ｃ６６１）
を含む。
【００８９】
［００９７］分岐ＩＲＣは、少なくとも３つの（３）核酸部分に共有結合した多価スペーサー部分（Ｓp）を含む。典型的な分岐ＩＲＣは、下記の式：
［Ｎv］A−−Ｓp                 （ＩＶ）
［Ｓv−Ｎv］A−−−Ｓp          （Ｖ）
（Ｓ1−Ｎ1）−Ｓp−−（Ｎv）A   （ＶＩ）
に従って記載され、ここで、Ｓpは、個数「Ａ」に独立して選択される核酸分子Ｎv、Ｓv−Ｎv（核酸分子に共有結合したスペーサー部分を含む）に共有結合した多価スペーサーである。式ＩＶ及びＶに関して、Ａは少なくとも３である。式ＩＶ及びＶの種々の態様において、Ａは、３〜１００（包括的）の整数であり、Ａは、約３、５、１０、５０又は１００の下限、及び独立して選択される約５、７、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０又は５００の上限によって定義される範囲の整数であってよく、その代わりに、Ａは、５００を超えてもよい。式ＶＩについて、Ａは、少なくとも２であり、２、５、１０、５０又は１００の下限、及び独立して選択される５、１０、５０、１００、１５０、２００、２５０又は５００の上限によって定義される範囲の整数であり、又は５００を超える。
【００９０】
［００９８］典型的な分岐ＩＲＣは、下記：
（Ｎ1）2−グリセロール−Ｎ1                           （ＩＶａ）
（Ｎ2−ＨＥＧ）2−グリセロール−Ｎ1                   （ＩＶｂ）
（Ｎ1−ＨＥＧ−Ｎ2）2−グリセロール−Ｎ1              （ＩＶｃ）
［（Ｎ1）2−グリセロール−Ｎ1］2−グリセロール−Ｎ1   （ＩＶｄ）
を含む。
【００９１】
［００９９］好ましい分岐ＩＲＣは、（５’−Ｎ1−３’−ＨＥＧ）2−グリセロール−ＨＥＧ−５’−Ｎ1−３’及び（５’−Ｎ1−３’−ＨＥＧ）2−グリセロール−ＨＥＧ−５’−Ｎ1’を含む。
【００９２】
［０１００］１つのスペーサーＩＲＣは、１つのスペーサー部分、即ち、下記：
Ｎ1−Ｓ1  （ＶＩＩ）
に共有結合した１つの核酸部分が存在する構造を含む。
【００９３】
［０１０１］好ましい態様において、Ｓ1は、より小さなユニット（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、１’２’−ジデオキシリボース、Ｃ2アルキル−Ｃ12アルキルサブユニット等）、典型的にはエステルリンケージ（例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエートエステル）によって結合され、例えば、上述のものを含む多量体の構造を有する。例えば、上述の式ＶＩＩａを参照されたい。多量体は、異種量体又は同種量体であり得る。一態様において、スペーサーは、エステルリンケージ（例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエートエステル）によって接続された一量体（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、１’２’−ジデオキシリボース、Ｃ２アルキル〜Ｃ１２アルキルリンカー等）の異種量体である。例えば、上述の式ＶＩＩｂを参照されたい。
【００９４】
［０１０２］典型的な１つのスペーサーＩＲＣは、下記：
Ｎ1−（ＨＥＧ）15                                （ＶＩＩａ）
Ｎ1−ＨＥＧ−プロピル−ＨＥＧ−プロピル−ＨＥＧ  （ＶＩＩｂ）
を含む。
【００９５】
［０１０３］ある種の態様において、ＩＲＣの末端構造は、環状な立体構造に帰着する共有的に接続される（例えば、核酸部分に対する核酸部分；スペーサー部分に対するスペーサー部分、又はスペーサー部分に対する核酸部分）。
【００９６】
［０１０４］本発明のＮＩＳＣにおける使用のためのＩＲＣは、少なくとも１つの核酸部分を含む。用語「核酸部分」は、本明細書中で使用するとき、ヌクレオチド単量体（即ち、モノヌクレオチド）又は高分子（即ち、少なくとも２つの隣接するヌクレオチドを含む）を意味する。本明細書中で使用するとき、ヌクレオチドは、（１）リン酸基に対してエステル連結にある糖に連結したプリン又はピリミジン、あるいは（２）塩基及び／又は糖、並びにリン酸エステルが類似体によって置換される類似体（例えば、後述）を含む。１より多くの核酸分子を含むＩＲＣにおいて、核酸分子は、同じであるか又異なっている。
【００９７】
［０１０５］ＮＩＳＣに取り込まれるＩＲＣに使用される核酸部分は、本明細書中に開示した任意のＩＲＳ配列を含んでもよく、そして、付加的に、６個の塩基対又はそれ未満の配列であってもよい。複数の核酸部分を含むＩＲＣにおいて、核酸部分は同じか又は異なった長さであり得ることが意図される。ある種の態様において、ＩＲＣは、１以上の核酸部分を含む場合、ただ１つの部分はＩＲＳを含む必要がある。
【００９８】
［０１０６］複数の核酸部分を含むＩＲＣにおいて、核酸部分は同じであるか又は異なっていてもよいことが意図される。したがって、種々の態様において、ＮＩＳＣに取り込まれるＩＲＣは、（ａ）同じ配列を有する核酸部分、（ｂ）１以上反復した核酸部分、又は（ｃ）２若しくはそれより多くの異なった核酸部分を含む。さらに、１つの核酸部分は、１以上のＩＲＳを含んでもよく、それは、核酸部分内の付加的なヌクレオチド塩基に隣接するか、重なり合うか、あるいは分離してもよい。
【００９９】
［０１０７］本明細書中に記載されるように、いくつかのＩＲＰは、ＴＬＲ９に依存した細胞応答の抑制に特に効果的であり、そして、いくつかのＩＲＰは、ＴＬＲ７／８に依存した細胞応答の抑制に特に効果的である。ＩＲＣは、１以上のＩＲＰを含んでもよいので、種々の活性を有するＩＲＰは、特定の使用に対して特定の活性を有するＩＲＣを作製するために組み合わせることが可能である。
【０１００】
［０１０８］いくつかの場合において、ＩＲＣにおける２つのＩＲＰの組み合わせは、いずれかのＩＲＰ単独とは異なったＩＲＣの免疫制御活性に導く。どんな組み合わせであっても、ＮＩＳＣのオリゴヌクレオチドは、ＡＰＣ／ＤＣ活性化又は成熟化をほとんど刺激しないか又は全く刺激しない。例えば、ＩＲＣ配列番号６８（Ｃ９１３）は、ＨＥＧ部分を介して、ＩＲＰ配列番号１７（Ｃ８６９）に連結したＩＲＰ配列番号２２（Ｃ９１７）を含有する。ＩＲＰ配列番号３３（Ｃ９１７）は、ＴＬＲ−７／８に依存した細胞応答を阻害するが、ＴＬＲ−９に依存した細胞応答を阻害しない。ＩＲＰ配列番号１７（Ｃ８６９）は、ＴＬＲ−７／８に依存した細胞応答よりもＴＬＲ−９に依存した細胞応答に対する大きな阻害活性を有する。しかしながら、ＩＲＣ配列番号６８（Ｃ９１３）は、ＴＬＲ−７／８に依存した細胞応答及びＴＬＲ−９に依存した細胞応答の両方の阻害に非常に活性である。同じことがまた、ＩＲＣ配列番号６９（Ｃ９１４）及びその成分ＩＲＰ配列番号３４（Ｃ９１８）及び配列番号１７（Ｃ８６９）についても当てはまる。
【０１０１】
［０１０９］ＩＲＣは、核酸部分に共有結合した１以上の非核酸スペーサー部分を含む。便宜上、非核酸スペーサー部分は、時折、本明細書中、単に「スペーサー」又は「スペーサー部分」と呼ばれる。スペーサーは、一般的に、約５０〜約５０，０００、典型的には約７５〜約５０００、ほとんどの場合約７５〜約５００の分子量であり、種々の態様において、１、２、３又は３より多くの核酸部分に共有結合される。種々の試薬は、核酸部分の連結に適切である。例えば、学術論文において、「非核酸リンカー」、「非ヌクレオチドリンカー」又は「原子価プラットフォーム（ｖａｌｅｎｃｙ  ｐｌａｔｆｏｒｍ）分子」と称される種々の化合物は、ＩＲＣにおいてスペーサーとして使用されてもよい。ある種の態様において、スペーサーは、複数の共有的に連結したサブユニットを含み、そして、同種高分子構造又は異種高分子構造を有していてもよい。核酸部分と隣接する非核酸スペーサー部分との間に相違がないであろうという排除なしに、モノヌクレオチド及びポリヌクレオチドは、非核酸スペーサーの定義に含まれないことは理解されるであろう。
【０１０２】
［０１１０］ある種の態様において、スペーサーは、本明細書中で「ｄ」と称される１以上の脱塩基ヌクレオチド（即ち、ヌクレオチド塩基を欠如するが、糖及びリン酸部分を有する）を含んでもよい。典型的な脱塩基ヌクレオチドは、１’２’−ジデオキシリボース、１’−デオキシリボース、１’−デオキシアラビノース及びその高分子を含む。
【０１０３】
［０１１１］他の適したスペーサーは、場合により置換したアルキル、場合により置換したポリグリコール、場合により置換したポリアミン、場合により置換したポリアルコール、場合により置換したポリアミド、場合により置換したポリエーテル、場合により置換したポリイミン、場合により置換したポリホスホジエステル（例えば、ポリ（１−ホスホ−３−プロパノール））等を含む。任意の置換基は、アルコール、アルコキシ（例えば、メトキシ、エトキシ、及びプロポキシ）、直鎖若しくは分岐鎖アルキル（例えば、Ｃ１−Ｃ１２アルキル）、アミン、アミノアルキル（例えば、アミノＣ１−Ｃ１２アルキル）、ホスホルアミダイト、リン酸塩、チオホスフェート、ヒドラジド、ヒドラジン、ハロゲン（例えば、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ又はＩ）、アミド、アルキルアミド（例えば、アミドＣ１−Ｃ１２アルキル）、カルボン酸、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カルボン酸ハロゲン化物、スルホニルハロゲン化物、イミデートエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、ハロフォルメート、カルボジイミド付加物、アルデヒド、ケトン、スルフヒドリル、アルキルハライド、アルキルスルホネート、ＮＲ１Ｒ２（ここで、Ｒ１Ｒ２は、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ＝ＣＨＣ（＝Ｏ）（マレイミド）である）、チオエーテル、シアノ、糖（例えば、マンノース、ガラクトース、及び糖）、α，β−不飽和カルボニル、アルキルメルクリアル、α，β−不飽和スルホンを含む。
【０１０４】
［０１１２］適したスペーサーは、多環状分子を含んでもよく、例えば、フェニル又はシクロヘキシル環を含有するものである。スペーサーは、ポリエーテルであってもよく、例えば、ポリホスホプロパンジオール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、二官能性多環状分子、例えば、二官能性ペンタレン、インデン、ナフタレン、アズレン、ヘプタレン、ビフェニレン、アシムインダセン（ａｓｙｍｉｎｄａｃｅｎｅ）、シムインダセン（ｓｙｍ−ｉｎｄａｃｅｎｅ）、アセナフチレン、フルオレン、フェナレン、フェナントレン、アントラセン、フルオランテン、アセフェナトリレン、アセアントリレン、トリフェニレン、ピレン、クリセン、ナフタセン、チアントレン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサチインであってもよく、これらは、置換又は修飾されてもよく、あるいは、ポリエーテル及び多環状分子の組み合わせであってよい。多環状分子は、Ｃ１−Ｃ５アルキル、Ｃ６アルキル、アルケニル、ヒドロキシアルキル、ハロゲン又はハロアルキル基で置換又は多置換されてもよい。窒素含有ポリへテロ環状分子（例えば、インドリジン）は、典型的には、適したスペーサーでなはい。スペーサーはまた、ポリアルコール、例えば、グリセロール又はペンタエリトリトールであってもよい。別の態様において、スペーサーは、１−ホスホプロパン）3−ホスフェート又は１−ホスホプロパン）4−ホスフェート（テトラホスホプロパンジオール及びペンタホスホプロパンジオールとも呼ばれる）を含む。一態様において、スペーサーは、誘導化した２，２’−エチレンジオキシジエチルアミン（ＥＤＤＡ）を含む。
【０１０５】
［０１１３］ＩＲＣに有用な非核酸スペーサーの具体的な例は、Ｃｌｏａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６３２４；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：５１０９；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：２５８５；Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２：１７５１；ＭｃＣｕｒｄｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ＆  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １０：２８７；Ｊａｓｃｈｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３４：３０１；Ｏｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：９９１４；及び、国際公開ＷＯ８９／０２４３９に記載される「リンカー」を含む。
【０１０６】
［０１１４］他の適したスペーサーは、Ｓａｌｕｎｋｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４：８７６８；Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：５３３９−５３４４；Ｂａｒｔｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３６：１４５０２−５１１；Ｄａｇｎｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：４５０６−１２；Ｄｕｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６３５３−５９；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：７６０−６５；Ｈｅｎｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １２１９：４０５−１２；Ａｌｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：４８２７−３５に記載されるリンカーを含む。さらに他の適したスペーサーは、欧州特許ＥＰ０３１３２１９Ｂ１及び米国特許第６，１１７，６５７号に記載される。
【０１０７】
［０１１５］典型的な非核酸スペーサーは、オリゴ−エチレングリコール（例えば、トリエチレングリコール、テトラエチレングリコール、ヘキサエチレングリコールスペーサー、及び約１０、約２０、約４０、約５０、約１００又は約２００エチレングリコールユニットまでを含む他のポリマー）、アルキルスペーサー（例えば、プロピル、ブチル、ヘキシル、及び他のＣ２−Ｃ１２アルキルスペーサー、例えば、通常、Ｃ２−Ｃ１０アルキル、ほとんどの場合Ｃ２−Ｃ６アルキル）、脱塩基ヌクレオチドスペーサー、グリセロール由来の対称若しくは非対称のスペーサー、ペンタエチルトリトール又は１，３，５−トリヒドロキシシクロヘキサン（例えば、本明細書中に記載される対称の二重及び三重スペーサーを含む。スペーサーはまた、前述の化合物（例えば、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ホスホジエステル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート又は他のリンケージによって連結される）の異種量体又は同種量体のオリゴマー及びポリマーを含むことができる。
【０１０８】
［０１１６］適したスペーサー部分は、電荷及び／又は疎水性をＩＲＣに提供することができ、有利な薬物動態特性（例えば、改善した安定性、血中の長期な滞留時間）をＩＲＣに提供することができ、及び／又は特定の細胞若しくは臓器に対するＩＲＣの標的に帰着し得る。スペーサー部分は、所望の投与方式（例えば、経口投与）のために所望の薬物動態特性又は安定性にＩＲＣを調整するように選択又は修飾することができる。便宜上、スペーサー（又はスペーサー成分）は、時折、スペーサー成分が誘導される化合物の化学名（例えば、ヘキサエチレングリコール）によって言及されることが、ＩＲＣが実際に化合物と隣接した核酸部分又は他のスペーサー部分成分との結合体を含むという理解を伴って承認されるであろう。
【０１０９】
［０１１７］１を超えるスペーサー部分を含むＩＲＣにおいて、スペーサーは同じであるか又は異なっていてもよい。つまり、一態様において、非核酸スペーサー部分の全ては同じ構造を有する。一態様において、ＩＲＣは、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、若しくは少なくとも６又はそれより多くの異なった構造を有する非核酸スペーサー部分を含む。
【０１１０】
［０１１８］本発明のいくつかの意図される態様において、ＩＲＣのスペーサー部分は、ある種の構造を排除するように定義される。つまり、本発明のいくつかの態様において、スペーサーは、脱塩基ヌクレオチド又は脱塩基のポリマー以外である。本発明のいくつかの態様において、スペーサーは、オリゴ（エチレングリコール）（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ等）又はポリ（エチレングリコール）以外である。いくつかの態様において、スペーサーは、Ｃ３アルキルスペーサー以外である。いくつかの態様において、スペーサーは、ポリペプチド以外である。つまり、いくつかの態様において、免疫原性分子、例えば、タンパク質又はポリペプチドは、スペーサー部分の成分として適切ではない。しかしながら、上述したように、ある種の態様において、ＩＲＣは、「タンパク性ＩＲＣ」、即ち、ポリペプチドを含むスペーサー部分を含む。しかしながら、いくつかの態様において、スペーサー部分は、タンパク性及び／又は抗原ではない（即ち、ＩＲＣから単離される場合、スペーサー部分は抗原ではない）。
【０１１１】
［０１１９］一般的に、適したスペーサー部分は、それらが水溶液（例えば、ＰＢＳ、ｐＨ７．０）に不要な成分であるところのＩＲＣを提供しない。つまり、スペーサーの定義は、マイクロキャリア又はナノキャリアを除外する。さらに、低溶解度を有するスペーサー部分、例えば、ドデシルスペーサー（ジアルコール前駆体１，１２−ジヒドロキシドデカンとして測定される場合、溶解度＜５ｍｇ／ｍｌ）は好ましくない。これは、ＩＲＣの親水性及び活性を低減し得るためである。好ましくは、スペーサー部分は、ジアルコール前駆体として測定される場合、５ｍｇ／ｍｌ（例えば、≧２０ｍｇ／ｍｌ、≧５０ｍｇ／ｍｌ又は≧１００ｍｇ／ｍｌ）より非常に大きな溶解度を有するためである。
【０１１２】
［０１２０］ＩＲＣの電荷は、リン酸塩、チオリン酸塩又は核酸部分中の他の基、並びに非核酸スペーサー部分中の基によって提供される。本発明のいくつかの態様において、非核酸スペーサー部分は、正味電荷（例えば、ｐＨ７で測定される場合、正味の正電荷又は正味の負電荷）を担持する。１つの有用な態様において、ＩＲＣは、正味の負電荷を有する。いくつかの態様において、ＩＲＣのスペーサー部分の負電荷は、その電荷を増加するように本明細書中に記載したスペーサーサブユニットを誘導体化することによって増加される。例えば、グリセロールは、２つの核酸部分に共有結合することができ、そして、残りのアルコールは、活性化したホスホルアミダイトと反応させることができ、その後、リン酸塩又はチオリン酸塩を形成するために、それぞれ酸化又は硫化される。ある種の態様において、ＩＲＣの非核酸スペーサー部分によって提供される負電荷（即ち、１より多くのスペーサーがある場合の総電荷量）は、ＩＲＣの核酸部分によって提供される負電荷より大きい。電荷は、分子式に基づいて計算され、又は実験的に、例えば、キャピラリー電気泳動（Ｌｉ，ｅｄ．，１９９２，Ｃａｐｉｌｌａｒｙ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ，ｐｐ２０２−２０６）によって測定することができる。
【０１１３】
［０１２１］上述したように、適したスペーサーは、より小さな非核酸（例えば、非ヌクレオチド）化合物のポリマー、例えば、本明細書中に記載されるものであり得て、それらは、それ自体、スペーサーとして有用であり、非ヌクレオチド「リンカー」と共通に称される化合物を含む。このようなポリマー（即ち、「複合単位のスペーサー」）は、異種量体又は同種量体であってもよく、そして、しばしば、エステル結合（例えば、ホスホジエステル又はホスホロチオエートエステル）によって連結した単量体ユニット（例えば、ＨＥＧ、ＴＥＧ、グリセロール、１’２’−ジデオキシリボース等）を含む。つまり、一態様において、スペーサーは、非ヌクレオチド単位の重合体（例えば、異種重合体）構造を含む（例えば、２〜約１００単位、その代わりに２〜約５０、例えば２〜約５、その代わりに例えば約５〜約５０、例えば約５〜約２０）。
【０１１４】
［０１２２］例として、配列番号１７（Ｃ８６９）及び複合単位スペーサーを含有するＩＲＣは、下記：
５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−（Ｃ３）15−Ｔ
５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−（グリセロール）15−Ｔ
５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−（ＴＥＧ）8−Ｔ
５’−ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ−（ＨＥＧ）4−Ｔ
を含み、ここで、（Ｃ３）15は、ホスホロチオエートエステルを介して連結した１５個のプロピルリンカーを意味し；（グリセロール）15は、ホスホロチオエートエステルを介して連結した１５個のグリセロールリンカーを意味し；（ＴＥＧ）8は、ホスホロチオエートエステルを介して連結した８個のトリエチレングリコールリンカーを意味し；そして、（ＨＥＧ）4は、ホスホロチオエートエステルを介して連結した４個のヘキサエチレングリコールリンカーを意味する。ある種の複数単位のスペーサーが正味の負の電荷を有すること、そして、負の電荷が、例えば、エステル連結したモノマー単位の数を増加することによって増加し得ることは承認されるであろう。
【０１１５】
［０１２３］ある種の態様において、スペーサー部分は、多価の非核酸スペーサー部分（即ち、「多価スペーサー」）である。この文脈において使用されるとき、多価スペーサーを含有するＩＲＣは、３又はそれより多い拡散部分に共有結合したスペーサーを含有する。多価スペーサーは、時折、当該技術分野において「プラットフォーム分子」と称される。多価スペーサーは、重合性又は非重合性であり得る。適した分子の例は、グリセロール又は置換したグリセロール（例えば、２−ヒドロキシメチルグリセロール、レブリニル−グリセロール）；テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノベータシクロデキストリン、１，３，５−トリヒドロキシシクロヘキサン、ペンタエリトリトール及びペンタエリトリトールの誘導体、テトラアミノペンタエリトリトール、１，４，８，１１−テトラアザシクロ・テトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｃｌｅｎ）、ポリエチレンイミン、１，３−ジアミノ−２−プロパノール及び置換した誘導体、プロピルオキシメチル］エチル化合物（例えば、「三重体」）、いわゆる「ＳｔａｒＰＥＧ」及び「ｂＰＥＧ」のようなポリエチレングリコール誘導体（例えば、Ｇｎａｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８９：２８８５；Ｒｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｃｔａ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  ４４：２２５；米国特許第５，１７１，２６４号を参照されたい）、及びデンドリマーを含む。
【０１１６】
［０１２４］デンドリマーは、当該技術分野において知られ、そして、化学的に定義される球形分子であり、一般的に、分岐構造を得るための多機能モノマーの段階的又は反復的反応によって調製される（例えば、Ｔｏｍａｌｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．２９：１３８−７５）。種々のデンドリマー、例えば、アミン末端化ポリアミノアミン、ポリエチレンイミン及びポリプロピレンイミンデンドリマーが知られる。本発明に有用な典型的なデンドリマーは、「高密度スター（ｄｅｎｓｅ  ｓｔａｒ）」又は「星型（ｓｔａｒｂｕｒｓｔ）」ポリマー、例えば、米国特許第４，５８７，３２９号；第５，３３８，５３２号；及び第６，１７７，４１４号に記載されるものを含み、いわゆる「ポリ（アミドアミン）（「ＰＡＭＡＭ」）デンドリマー」を含む。本発明での使用に適した更なる他の多量体のスペーサー分子は、化学的に定義された非重合性原子価プラットフォーム分子、例えば、米国特許第５，５５２，３９１号、及びＰＣＴ出願公開ＷＯ００／７５１０５、ＷＯ９６／４０１９７、ＷＯ９７／４６２５１、ＷＯ９５／０７０７３、及びＷＯ００／３４２３１に記載されるものを含む。多くの他の適した多価スペーサーを使用することができ、当業者に知られるであろう。
【０１１７】
［０１２５］核酸部分とプラットフォーム分子との結合は、多数の方法で達成することができ、典型的には、１以上の架橋剤、及び核酸部分とプラットフォーム分子上の官能基に関与する。結合基は、標準的な合成化学技術を用いてプラットフォームに付加される。結合基は、標準的な技術を用いて核酸部分に添加することができる。
【０１１８】
［０１２６］種々の原子価を有する多価スペーサーは、本発明の実施に有用であり、種々の態様において、ＩＲＣの多価スペーサーは、約３〜約４００個の核酸部分に結合し、しばしば３〜１００個、時折３〜５０個、頻繁に３〜１０個、及び時折４００個を超える核酸部分である。種々の態様において、多価スペーサーは、１０を超える、２５を超える、５０を超える、又は５００を超える核酸部分（同じであっても又は異なっていてもよい）に結合される。ＩＲＣが多価スペーサーを含むある種の態様において、本発明は、僅かに異なっている分子構造を有するＩＲＣ集団を提供する。例えば、ＩＲＣが抗原子価としてデンドリマーを用いて調製される場合、多少の異種な分子混合物が製造され、即ち、各デンドリマー分子に接続した異なる数の（測定可能な範囲内で又は主に測定可能な範囲内で）核酸部分を含む。
【０１１９】
［０１２７］核酸部分への連結を可能にするために誘導化された多糖は、ＩＲＣのスペーサーとして使用することができる。適した多糖は、天然に発生する多糖（例えば、デキストラン）及び合成多糖（例えば、フィコール）を含む。例えば、アミノエチルカルボキシメチル−フィコール（ＡＥＣＭ−フィコール）は、Ｉｎｍａｎ（１９７５）Ｊ．Ｉｍｍ．１１４：７０４−７０９の方法によって調製することがきる。次に、ＡＥＣＭ−フィコールは、異種二官能性架橋剤、例えば、６−マレイミドカプロンアシルＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させ、その後、チオール誘導の核酸部分に結合させることができる（Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｍｏｌ．Ｉｍｍ．１７：７４９−５６を参照されたい）。他の多糖は、同様に修飾してもよい。
【０１２０】
［０１２８］日常的な方法を用いてＩＲＣを調製することは、本明細書及び当該技術分野の知識によって導かれる技術の１つの能力内に十分にあるだろう。核酸部分（例えば、オリゴヌクレオチド及び修飾したオリゴヌクレオチド）を作製する技術は知られ、本明細書中に記載される。
【０１２１】
［０１２９］例えば、ホスホジエステルリンケージを含有するＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチド（核酸部分）は、一般的に、下記工程：ａ）３’−固相に結合したヌクレオシド又は核酸の５’−ヒドロキシル基からの保護基の除外、ｂ）活性化したヌクレオシドホスホルアミダイドの５’−ヒドロキシル基へのカップリング、及びｄ）未反応５’−ヒドロキシル基のキャッピングの代表的な反応によって合成される。ホスホロチオエートリンケージを含有するＤＮＡ又はＲＮＡは、酸化工程を硫化工程で置換することを除いて、上述するように調製される。所望のオリゴヌクレオチド配列が合成されるとオリゴヌクレオチドは固相から除去され、リン酸トリエステル基はリン酸ジエステルに脱保護され、そして、ヌクレオシド塩基はアンモニア水又は他の塩基を用いて脱保護される。例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９９３）“Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”ｉｎ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＦＯＲ  ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＳ，ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ  ＡＮＤ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ（Ａｇｒａｗａｌ，ｅｄ．）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）ＤＮＡ  ３：４０１；Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｏｒｇ．Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．４：１９４−１９８；Ｗｙｒｚｙｋｉｅｗｉｃａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｉｏｏｒｇ．＆  Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．４：１５１９−１５２２；Ｒａｄｈａｋｒｉｓｈｎａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５５：４６９３−４６９９及び米国特許第４，４５８，０６６号を参照されたい。特定の配列の核酸部分を自動的に合成するプログラム可能な機械は、幅広く利用可能である。実施例は、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９自動化ＤＮＡシンセサイザー（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｆｒａｍｉｎｇｔｏｎ  ＭＡ）；ＡＢＩ  ３９４（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；及び、ＯｌｉｇｏＰｉｌｏｔ  ＩＩ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を含む。
【０１２２】
［０１３０］ポリヌクレオチドは、例えば、酸に不安定な５’−保護基及び３’−ホスホルアミダイトを含有する塩基を保護したヌクレオシド（モノマー）を用いて、３’〜５’の方向で集合し得る。このようなモノマーの例は、５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）保護したヌクレオシド−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）２−シアノエチルホスホルアミダイトを含み、保護したヌクレオシドの例は、限定されないが、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４−ベンゾイルシチジン、Ｎ２−イソブチリルグアノシン、チミジン、及びウリジンを含む。この場合において、使用される固相支持体は、３’−連結した保護されたヌクレオシドを含有する。その代わりに、ポリヌクレオチドは、酸に不安定な３’−保護基及び５’−ホスホルアミダイトを含有する塩基を保護したヌクレオシドを用いて５’から３’の方向で集積し得る。このようなモノマーの例は、３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）保護したヌクレオシド−５’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）２−シアノエチルホスホルアミダイトを含み、保護したヌクレオシドの例は、限定されないが、Ｎ６−ベンゾイルアデノシン、Ｎ４−ベンゾイルシチジン、Ｎ２−イソブチリルグアノシン、チミジン、及びウリジン（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）を含む。この場合において、使用される固相支持体は、５’−連結した保護されたヌクレオシドを含有する。環状核酸成分は、単離され、組換え法を通じて合成され、又は化学的合成することができる。化学合成は、文献に記載される任意の方法を用いて実行することができる。例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２０２５−２０２９及びＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３２６−２３３３を参照されたい。
【０１２３】
［０１３１］非核酸スペーサー部分の付加は、日常的な方法を用いて達成することができる。特定のスペーサー部分を付加する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、上記で引用した参考文献に記載される。例えば、Ｄｕｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６３５３−６３５９を参照されたい。スペーサー部分と核酸部分との間の共有結合は、多くのタイプのいずれかであり得て、リン酸ジエステル、ホスホロチオエート、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、ジスルフィド、ホスホルアミダイト、ホスホトリエステル、ホスホロジチオエート、メチルホスホネート及び他の連結を含む。しばしば、核酸部分の合成に使用される同じホスホルアミダイト型の化学を用いてスペーサー部分（又は複数）及び核酸部分（又は複数）を併せることは便利である。例えば、本発明のＩＲＣは、ホスホルアミダイト化学（例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ，１９９３，上述；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，上述を参照されたい）を用いた自動化ＤＮＡシンセサイザー（例えば、Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９０９；Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）を用いて都合良く合成することができる。しかしながら、当業者は、自動化ＤＮＡシンセサイザーによって実行される同じ（又は均等な）合成工程はまた、必要であれば、マニュアル通りに実行できることは理解されよう。このような合成において、典型的には、スペーサー（又は多価スペーサーについてはスペーサーサブユニット）の一端は、４，４’−ジメチルオキシトリチル基で保護し、一方、他端は、ホスホルアミダイト基を含有する。
【０１２４】
［０１３２］必要な保護及び反応基を有する種々のスペーサーは、商業的に利用可能であり、例えば、下記：
トリエチレングリコールスペーサー又は「ＴＥＧスペーサー」
９−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）トリエチレングリコール−１−Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２８２５  Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）
ヘキサエチレングリコールスペーサー又は「ＨＥＧスペーサー」
１８−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ヘキサエチレングリコール−１−Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）
プロピルスペーサー
３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシ−１−Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）
ブチルスペーサー
４−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ブチルオキシ−１−Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｓｈｌａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，２００  Ｈｏｍｅｒ  Ａｖｅ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）
ヘキシルスペーサー
６−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ヘキシルオキシ−１−Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイド］
【０１２５】
２−（ヒドロキシメチル）エチルスペーサー又は「ＨＭＥスペーサー」
１−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）−３−（レブリニルオキシ）−プロピルオキシ−２−Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］；「非対称分岐」スペーサーとも呼ばれる
「脱塩基ヌクレオチドスペーサー」又は「脱塩基スペーサー」
５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−１，２−ジデオキシリボース−３−Ｏ−［２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）
「対称分岐スペーサー」又は「グリセロールスペーサー」
１，３−Ｏ，Ｏ−ビス（４，４’−ジメトキシトリチル）グリセロール−２−Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイド］（Ｃｈｅｍ  Ｇｅｎｅｓ，Ａｓｈｌａｎｄ，ＭＡ）
「三重スペーサー」
２，２，２−Ｏ，Ｏ，Ｏ−トリス［３−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］エチル−１−Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）
「対称二重スペーサー」
１，３−Ｏ，Ｏ−ビス［５−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］プロピル−２−Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）
「ドデシルスペーサー」
１２−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ドデシルオキシ−１−Ｏ−［（２−シアノエチル）Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミダイト］（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ，ＶＡ）
である。
【０１２６】
［０１３３］これらの及び多様な他の保護したスペーサー部分の前駆体（例えば、ＤＭＴ及びホスホルアミダイト基保護基）は購入することができ、又は本明細書中に開示したＩＲＣの調製に有用な日常的な方法を用いて合成することができる。所望の順番でヌクレオチド及びスペーサーを添加するために、製造業者の使用説明書に従って機器がプログラムされる。
【０１２７】
［０１３４］ホスホルアミダイト化学の使用は、ある種のＩＲＣの調製に好都合であるけれども、本発明のＩＲＣは合成又は調製の任意の特定の方法によって調製される化合物に限定されないことは承認されるであろう。
【０１２８】
［０１３５］一態様において、１より多くの型の核酸部分に結合した多価スペーサーを有するＩＲＣが調製される。例えば、２つのマレイミド基（チオール含有ポリヌクレオチドと反応し得る）及び２つの活性化したエステル基（アミノ含有核酸と反応し得る）を含有するプラットフォームが記載されている（例えば、ＰＣＴ出願公開ＷＯ９５／０７０７３）。これらの２つの活性化した基は、互いに独立して反応することが可能である。これは、４個の核酸部分（各配列２つ）の全部を含有するＩＲＣに帰着するであろう。
【０１２９】
［０１３６］２つの異なる核酸配列を含有する多価スペーサーを有するＩＲＣはまた、上述した対称分岐スペーサー、及び慣用的なホスホルアミダイト化学を用いて（例えば、マニュアル又は自動化した方法を用いて）調製することができる。対称分岐スペーサーは、ホスホルアミダイト基、及び同じであって、同時に除去される２つの保護基を含有する。１つのアプローチでは、例えば、第一の核酸が合成され、対称分岐スペーサーに結合し、保護基はスペーサーから除去される。その後、２つの追加の核酸（同じ配列）は、スペーサー上で（各工程の１個の核酸部分の合成のために使用される量の２倍を用いて）合成される。
【０１３０】
［０１３７］同様の方法は、３つの異なる核酸部分（核酸Ｉ、ＩＩ及びＩＩＩとして下記に言及される）と多価プラットフォーム（例えば、非対称分岐スペーサー）とを連結するために使用することができる。これは、自動化したＤＮＡシンセサイザーを用いて最も好都合に実行される。一態様において、非対称分岐スペーサーは、独立して除去することができるホスホルアミダイト基、及び２つの直交する保護基を含有する。第一に、核酸Ｉが合成され、その後、非対称分岐スペーサーは、核酸Ｉに結合し、次に、核酸ＩＩは、保護基の１つの選択的除去後に添加される。核酸ＩＩは保護され、そしてキャップされ、その後、スペーサー上の他の保護基が除去される。最後に、核酸ＩＩＩが合成される。
【０１３１】
［０１３８］いくつかの態様において、核酸部分（又は複数）が合成され、そして、反応性連結基（例えば、アミノ、カルボキシレート、チオ、ジスルフィド等）は標準的な合成化学治術を用いて付加される。反応性連結基（得られたスペーサー部分の一部を形成することが考えられる）は、スペーサー部分を形成するための付加的な非核酸成分に結合される。連結基は、核酸合成のための標準的な方法を用いて核酸に添加され、文献に記載され又は商業的に利用可能な種々の試薬を使用する。例は、保護されたアミノ基、カルボキシレート基、チオール基、又はジスルフィド基及びホスホルアミダイト基を含有する試薬を含む。これらの化合物が、活性化したホスホルアミダイト基を介して核酸に取り込まれ、脱保護されると、それらは、アミノ、カルボキシレート又はチオール反応性を有する核酸を提供する。
【０１３２】
［０１３９］可変長の親水性リンカーは、例えば、核酸部分とプラットフォーム分子を連結するために有用である。種々の適したリンカーが知られる。適したリンカーは、限定されないが、エチレングリコールの線状オリゴマー又はポリマーを含む。このようなリンカーは、式Ｒ1Ｓ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）mＣＯ2Ｒ2（ここで、ｎ＝０−２００、ｍ＝１又は２、Ｒ1＝Ｈ又はトリチルのような保護基、Ｒ2＝Ｈ又はアルキル若しくはアリール、例えば４−ニトロフェニルエステルである）を有する。これらのリンカーは、チオエーテルを介してハロアシル、マレイアミド等のようなチオール反応基を含有する分子と、アミド結合を介したアミノ基を含有する第二の分子に連結するのに有用である。付着の順番は変化させることができ、即ち、チオエーテル結合は、アミド結合が形成される前又は後に形成することができる。他の有用なリンカーは、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（スルホスクシニミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］−シクロヘキサン−１−カルボキシレート）Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．製造番号２２３２２；Ｓｕｌｆｏ−ＥＭＣＳ（Ｎ−［ε−マレイミドカプロイルオキシル・スルホスクシンイミドエステル）Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．製造番号２２３０７；Ｓｕｌｆｏ−ＧＭＢＳ（Ｎ−［γーマレイミドブチリルオキシ］スルホスクシンイミドエステル）Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．製造番号２２３２４（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）、及び一般式マレイミド−Ｒ−Ｃ（Ｏ）ＮＨＳエステル（ここで、Ｒ＝アルキル、環状アルキル、エチレングリコールのポリマー等である）を含む。
【０１３３】
［０１４０］核酸部分を多価スペーサーに共有結合するための特に有用な方法は、上記で引用した参考文献に記載される。
［０１４１］ある種の態様において、ポリペプチドは、「タンパク性ＩＲＣ」を形成するために、複数の核酸部分が直接又はリンカーを介して共有結合する多価スペーサー部分として使用される。ポリペプチドは、担体（例えば、アルブミン）であり得る。典型的には、タンパク性ＩＲＣは、少なくとも１つ、そして、通常は数個又は多くの核酸部分を含み、（ａ）長さにして２〜７個、よりしばしば４〜７個のヌクレオチドであり、あるいは長さにして２〜６個、２〜５個、４〜６個又は４〜５個のヌクレオチドであり、及び／又は（ｂ）劣った同定した免疫調節活性を有し、若しくは同定した免疫調節活性を有しない。タンパクＩＲＣを作製する方法は、本開示の概説に基づいて当業者に明確であろう。核酸は、例えば、核酸部分の３’端又は５’端（又は核酸部分の内部位置の適切に修飾した塩基で）と適した反応基（例えば、シトシン残基のＮ４アミノ基と直接反応可能なＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）との間の連結を含む技術的に既知の方法によってポリペプチドスペーサー部分に共有結合することができる。更なる例として、ポリペプチドは、核酸部分に取り込まれたアミン、チオール又はカルボキシル基の遊離した５’端に付着することができる。その代わりに、ポリペプチドは、本明細書中に記載されるように、スペーサー部分い結合することができる。さらに、一端で保護されたアミン、チオール又カルボキシルを含む連結基、及びホスホルアミダイトは、ポリヌクレオチドのヒドロキシル基に共有結合することができ、その後、脱保護し、その官能性は、ＩＲＣをペプチドに共有結合するために使用することができる。
【０１３４】
抗原
［０１４２］本発明のＮＩＳＣは、不要若しくは不適切な免疫反応又は応答に関与した任意の抗原を含んでもよい。また、ＮＩＳＣは、個体が不要若しくは不適切な反応又は応答を発症する危険性にあるかもしれない任意の抗原を含んでもよい。
【０１３５】
［０１４３］いくつかの態様において、抗原は自己抗原である。自己抗原は、多数の自己免疫疾患に関して知られる。例えば、グレーブス病は、甲状腺の甲状腺刺激ホルモン受容体に対する自己抗体の産生によって特徴付けられ、ハシモト甲状腺炎は、甲状腺抗原（例えば、甲状腺ペルオキシダーゼ）に対する自己抗体及びＴ細胞により、そして、Ｉ型糖尿病は、β細胞抗原（例えば、グルタミン酸デカルボキシラーゼ及びインスリン）に対するＴ細胞及び自己抗体による。
【０１３６】
［０１４４］自己免疫疾患に関与する自己抗原の他の例は、限定されないが、アジソン病におけるシトクロームＰ４５０抗原、ＭＳにおけるミエリンタンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質）、ブドウ膜炎におけるブドウ膜抗原、悪性貧血における胃壁細胞抗原（例えば、Ｈ+／ＡＴＰａｓｅ、内因子）、グルテン性腸炎におけるトランスグルタミナーゼ、心筋炎及びリウマチ性心疾患における心筋細胞タンパク質（例えば、ミオシン）、特発性血小板減少性紫班病における血小板抗原（例えば、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ）、自己免疫溶血性貧血における赤血球細胞膜タンパク質、自己免疫好中球減少症における好中球膜タンパク質、グッドパスチュア疾患における基底膜抗原（例えば、ＩＶ型コラーゲンα３鎖）、原発性胆汁性肝硬変に対する肝内胆管／ミトコンドリア抗原（例えば、２−オキソ酸デヒドロゲナーゼ複合体）、自己免疫性肝炎に対する肝細胞抗原（例えば、シトクロームＰ４５０、２０６）、重症筋無力症に対するアセチルコリン受容体、並びに天疱瘡及び他の水疱性疾患を含む。
【０１３７】
［０１４５］いくつかの態様において、抗原は同種抗原である。同種抗原は、一般的に、１種類の個体メンバーの中で構造において変化する細胞抗原である。一個体由来の同種抗原は、同種の他のメンバーによる外来抗原として認識され得て、そして、しばしば、移植拒絶反応の根本となる。同種抗原の例は、限定されないが、主要組織適合抗原（ＭＨＣ）クラスＩ及びクラスＩＩ抗原、副組織適合抗原、ある種の組織特異性抗原、血液型抗原のような内皮糖タンパク質、及び炭水化物決定因子を含む。
【０１３８】
［０１４６］いくつかの態様において、抗原はアレルゲンである。アレルゲンの例は、表１に提供される。多くのアレルゲンの調製は、当該技術分野において周知であり、限定されないが、ブタクサ花粉アレルゲン抗原Ｅ（Ａｍｂ  ａ  Ｉ）（Ｒａｆｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２２０−１２３６）、シバフアレルゲン（Ｌｏｌ  ｐ  １）（Ｔａｍｂｏｒｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４９：８８６−８９４）、大部分のほこり・ダニアレルゲンＤｅｒ  ｐＩ及びＤｅｒ  ＰＩＩ（Ｃｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１７５−１８２；Ｃｈｕａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１：１２４−１２９）、家ネコ・アレルゲンＦｅｌ  ｄ  Ｉ（Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：５５９−５６８）、白樺花粉Ｂｅｔ  ｖ１（Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）ＥＭＢＯ  Ｊ．８：１９３５−１９３８）、スギ・アレルゲンＣｒｙ  ｊ  １及びＣｒｙ  ｊ  ２（Ｋｉｎｇｅｔｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ９９：６２５−６２９）、及び他の樹花粉に対するタンパク質抗原（Ｅｌｓａｙｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．２０４：１７−３１）を含む。示したように、樹由来のアレルゲンが知られ、カバノキ、ジュニバ及び日本杉を含む。インビボ投与のための花粉由来のタンパク質抗原の調製が報告されている。
【０１３９】
［０１４７］いくつかの態様において、アレルゲンは食品アレルゲンであり、限定されないが、ピーナッツアレルゲン、例えば、Ａｒａ  ｈ  Ｉ（Ｓｔａｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４０９：２１３−２１６）又はＡｒａ  ｈ  ＩＩ；クルミアレルゲン、例えば、Ｊｕｇ  ｒ  Ｉ（Ｔｕｅｂｅｒ  ｅｔａ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０１：８０７−８１４；ブラジルナッツアレルゲン、例えば、アルブミン（Ｐａｓｔｏｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０２：１０２１−１０２７；エビアレルゲン、例えば、Ｐｅｎ  ａ  Ｉ（Ｒｅｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１３：２４０−２４２；卵アレルゲン、例えば、オボムコイド（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：２０２６−２０３２）；ミルクアレルゲン、例えば、ウシβラクトグロビン（Ｓｅｌｏｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ａｌｌｅｒｇｙ  ２９：１０５５−１０６３）；魚アレルゲン、例えば、パルブアルブミン（Ｖａｎ  Ｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５０：６１９−６２５；Ｇａｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐｌ．７０６−６３−７１）を含む。いくつかの態様において、アレルゲンは、ラテックスアレルゲンであり、限定されないが、Ｈｅｖ  ｂ  ７（Ｓｏｗｋａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５５：２１３−２１９）を含む。表１は、使用してもよいアレルゲンの例示的リストを示す。
【０１４０】
【表１】
2008524237.tif 000002
【０１４１】
【表２】
2008524237.tif 000003
【０１４２】
【表３】
2008524237.tif 000004
【０１４３】
【表４】
2008524237.tif 000005
【０１４４】
［０１４８］グリアジンは、セリアック病の供給源となる小麦グルテンにおける抗原である。つまり、いくつかの態様において、この抗原は、グリアジンのような小麦グルテン抗原である。
［０１４９］いくつかの態様において、抗原は、感染体由来であり得て、原生動物、細菌、真菌（単細胞及び多細胞を含む）、及びウイルス性感染体を含む。例えば、寄生生物由来の抗原は、住血吸虫種（例えば、Ｓ．ｍａｎｓｏｎｉ）由来の抗原（例えば、Ｓｍ−ｐ４０）及びトキソプラズマ種（例えば、Ｔ．ｇｏｎｄｉｉ）由来の抗原を含む。例えば、Ｓｔａｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２１７−２２１；Ｓｕｂａｕｓｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５３２−５２７を参照されたい。このような場合において、感染体抗原は、不要な免疫応答が発生している又は発生の危険性のあるものである。
【０１４５】
［０１５０］抗原は、当該技術分野に既知の精製技術を用いてそれらの供給源から単離することができ、より好都合には、組換え法を用いて生産されてもよい。
［０１５１］抗原ペプチドは、精製した天然ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗タンパク質抽出物、弱毒化又は不活化したウイルス、細胞、微生物、又はこのようなペプチドの断片を含むことができる。当該技術分野において既知の化学合成の任意の方法が適している。溶液相ペプチド合成は、中程度の大きさのペプチドを構築するために使用することができ、又は、ペプチドの化学的構築体に関しては、固相合成を採用することができる。Ａｔｈｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６２：８３３−８３９。タンパク質分解酵素はまた、ペプチドを生産するためにアミノ酸をカップルするために利用することができる。その代わりに、ペプチドは、細胞の生化学的機構を用いることによって、又は、生物学的供給源からの単離によって得ることができる。組換えＤＮＡ技術は、ペプチドの生産のために採用することができる。ペプチドはまた、アフィニティークロマトグラフィーのような標準的な技術を用いて単離することができる。
【０１４６】
［０１５２］一般的に、抗原は、ペプチド、脂質（例えば、コレステロール、脂肪酸、及びリン脂質を除くステロール）、多糖、ガングリオシド及び糖タンパク質である。これらは、当該技術分野に既知のいくつかの方法を通じて得ることができ、化学的及び酵素的方法を用いた単離及び合成を含む。ある種の態様において、ステロール、脂肪酸及びリン脂質のように、分子の抗原部分は、商業的に利用可能である。
【０１４７】
［０１５３］感染体由来の抗原は、当該技術分野において既知の方法を用いて、天然のウイルス若しくは細菌抽出物、感染体で感染した細胞、精製したポリペプチド、組換え的に生産したポリペプチドから及び／又は合成ペプチドとして得てもよい。
【０１４８】
ＮＩＳＣ形成
［０１５４］本発明のＮＩＳＣにおいて、非免疫刺激性ポリヌクレオチドは、多くの方法において抗原と連結してもよく、結合体（連結）、カプセル化、プラットフォームへの付加又は表面上への吸着を含む。ポリヌクレオチド部分は、共有及び／又は非共有的相互作用に関与する結合体の抗原部分と連結することができる。一般的に、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原は、ＤＣ及び／又はＡＰＣ活性化又は成熟化がほとんどないか又は全くない状態でＤＣ及び／又はＡＰＣによる抗原の増加又は促進した取り込みを可能にするやり方で連結される。その代わりに、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原は、ＤＣ及びＡＰＣの活性化又は成熟化がほとんどないか又は全くない状態でＤＣ及び／又はＡＰＣによる抗原提示を増加し得るやり方で連結される。
【０１４９】
［０１５５］これら部分の間の連結は、非免疫刺激性ポリヌクレオチドの３’端又は５’端で、あるいは、ポリヌクレオチドの内部での適切に修飾した塩基で作製することができる。抗原がペプチドであり、適した反応基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を含有する場合、それは、シトシン残基のＮ4アミノ基と直接反応し得る。ポリヌクレオチド中のシトシン残基の数及び場所に依存して、１又はそれより多くの残基での特異的なカップリングが達成することができる。
【０１５０】
［０１５６］その代わりに、修飾したオリゴヌクレオシドは、当該技術分野において知られるように、非免疫刺激性ポリヌクレオチドのいずれかの末端、又は内部位置で取り込むことができる。これらは、非ブロック化した場合、目的の抗原上に提示又それに結合され得る種々の官能基と反応するブロックした官能基を含有することができる。
【０１５１】
［０１５７］抗原がペプチド又はポリペプチドである場合、結合体のこの部分は、固相支持体化学を通じてポリヌクレオチドの３’端に結合することができる。例えば、ポリヌクレオチド部分は、支持体上で前合成したポリペプチド部分に付加することができる。その代わりに、非免疫刺激性ポリヌクレオチドは、３’端から伸長する開裂可能なリンカーを通じて固相支持体に連結するように合成することができる。支持体からのポリヌクレオチドの化学的開裂に応じて、末端チオール基は、オリゴヌクレオチドの３’端で離れ、そして、末端アミノ基は、オリゴヌクレオチドの３’端で離れる。アミノ修飾した非免疫刺激性ポリヌクレオチドのペプチドのアミノ基への結合は、Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ  ６：４３−７２に記載したように実行することができる。チオール修飾した非免疫刺激性ポリヌクレオチドによるペプチドのカルボキシル基への結合は、当該技術分野において知られるように実行することができる。付加したマレイミドを担持するポリヌクレオチドとペプチドのシステイン残基のチオール側鎖のカップリングはまた、当該技術分野において知られる。例えば、Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０ａ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４９３−４９９；Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０ｂ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：５０１−５０５；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５３０５−５３２１；Ｃｏｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１４０１−１４０３；Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１７８１−１７９４；Ｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２：４６４−４６５を参照されたい。
【０１５２】
［０１５８］結合体のペプチド又はポリペプチド部分は、その合成中にオリゴヌクレオチドに取り込まれていたアミン、チオール又はカルボキシル基を介してポリヌクレオチドの５’端に結合し得る。好ましくは、オリゴヌクレオチドが固相支持体に固定される一方で、一端では保護されたアミン、チオール又はカルボキシル、そして、他端ではホスホルアミダイトを含む連結基は、５’ヒドロキシルに共有結合される。Ａｇｒａｗａｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６２２７−６２４５；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４８５−４５０２；Ｋｒｅｍｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：２８９１−２９０９；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３１３１−３１３９；Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４：３３６−３４４；Ｂｌａｎｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０２８３−１０２９９；及び米国特許第４，８４９，５１３号、第５，０１５，７３３号、及び第５，１１８，８０２号。脱保護に続いて、アミン、チオール、及びカルボキシル官能基は、オリゴヌクレオチドをペプチドに共有結合するために使用することができるＢｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）。
【０１５３】
［０１５９］ＮＩＳＣはまた、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合及び／又はファン・デル・ワールス吸引力のような非共有的相互作用を通じて形成することができる。
［０１６０］非共有的に連結した結合体は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体のような非共有的相互作用を含むことができる。ビオチニル基は、例えばポリヌクレオチドの修飾した塩基に結合することができる。Ｒｏｇｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７６４３−７６５１。ペプチド部分中のストレプトアビジンの取り込みは、ストレプトアビジンを結合したペプチド及びビオチン化オリゴヌクレオチドの非共有的結合複合体の形成を可能にする。
【０１５４】
［０１６１］非共有的結合はまた、ポリヌクレオチド及び帯電したアミノ酸のような抗原内の残基に関与するイオン性相互作用を介して、あるいは、ポリヌクレオチドと抗原の両方に相互作用し得る帯電した残基を含む連結基部分の使用を介して生じることが可能である。例えば、非共有的結合は、一般的に負に帯電したポリヌクレオチドと、ペプチド、例えば、ポリリジン、ポリアルギニン及びポリヒスチジン残基の正に帯電したアミノ酸残基との間に生じ得る。
【０１５５】
［０１６２］非免疫刺激性ポリヌクレオチドと抗原との間の非共有結合は、それらの天然のリガンドとしてＤＮＡと相互作用する分子のＤＮＡ結合モチーフを介して生じ得る。例えば、このようなＤＮＡ結合モチーフは、転写因子及び抗ＤＮＡ抗体に見出すことができる。
【０１５６】
［０１６３］非免疫刺激性ポリヌクレオチドによる脂質への連結は、標準的な方法を用いて形成することができる。これらの方法は、限定されないが、オリゴヌクレオチド−リン脂質結合体の合成（Ｙａｎａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．１９：１８９−９２）、オリゴヌクレオチド−脂肪酸結合体（Ｇｒａｂａｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１３１−３４；及び、Ｓｔａｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５６：２２０−２）、及びオリゴヌクレオチド−ステロール結合体（Ｂｏｕｊｒａｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５７２８−３１）を含む。
【０１５７】
［０１６４］オリゴヌクレオチドによるオリゴ糖への連結は、標準的な既知の方法を用いて形成することができる。これらの方法は、限定されないが、オリゴヌクレオチド−オリゴ糖結合体の合成を含み、ここで、オリゴ糖は、免疫グロブリンの部分である。Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７：３４７−５５。
【０１５８】
［０１６５］環状の非免疫刺激性ポリヌクレオチドによる抗原への連結は、いくつかの方法で形成することができる。環状のポリヌクレオチドが組換え又は化学的方法を用いて合成される場合、修飾したヌクレオシドが適している。次に、標準的な連結技術は、抗原に環状のポリヌクレオチドを連結するために使用することができる。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１：１６５。環状のポリヌクレオチドが単離され、又は組換え若しくは化学的方法を用いて合成される場合、連結は、抗原に取り込まれている化学的に活性な又は光活性な反応基（例えば、カルベン、ラジカル）によって形成され得る。
【０１５９】
［０１６６］ペプチド及び他の分子によるオリゴヌクレオチドへの結合のための追加の方法は、米国特許第５，３９１，７２３号；Ｋｅｓｓｌｅｒ（１９９２）“Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”ｉｎ  Ｋｒｉｃｋａ（ｅｄ．）Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及び、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６に見出すことができる。
【０１６０】
［０１６７］いくつかの態様において、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原は、カプセル化によって連結される。他の態様において、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原は、プラットフォーム分子への連結によってカップルされる。「プラットフォーム分子」（「プラットフォーム」とも称する）は、ポリヌクレオチド及び抗原（又は複数）の結合のために可能とする部位を含有する分子である。他の態様において、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原は、表面、好ましくは担体粒子上への吸着によって連結される。
【０１６１】
［０１６８］いくつかの態様において、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原は、カプセル化によって連結される。いくつかの態様において、非免疫刺激性ポリヌクレオチド、抗原、及びカプセル試薬を含む組成物は、水中油型乳剤、微粒子及び／又はリポソームの形体である。好ましくは、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原をカプセルにする水中油型乳剤、微粒子及び／又はリポソームは、大きさ約０．０４μｍ〜約１００μｍ、好ましくは、下記の範囲：約０．１μｍ〜約２０μｍ；約０．１５μｍ〜約１０μｍ；約０．０５μｍ〜約１．００μｍ；約０．０５μｍ〜約０．５μｍのいずれかのの粒子形体である。
【０１６２】
［０１６９］コロイド状分散系、例えば、マイクロスフェア、ビーズ、高分子複合体、ナノカプセル及び脂質を基礎とした系、例えば、水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル及びリポソームは、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原組成物の効果的なカプセル化を提供することができる。
【０１６３】
［０１７０］カプセル化組成物は、さらに、広範な成分のいずれかを含んでもよい。これらは、限定されないが、ミョウバン、脂質、リン脂質、脂質膜構造（ＬＭＳ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及び他のポリマー、例えば、ポリペプチド、糖ペプチド、及び多糖を含む。
【０１６４】
［０１７１］カプセル化成分に適したポリペプチドは、当該技術分野において既知のいずれかを含み、限定されないが、脂肪酸結合タンパク質を含む。修飾したポリペプチドは、種々の修飾化のいずれかを含有し、限定されないが、グリコシル化、リン酸化、ミリスチル化、硫酸化及びヒドロキシル化を含む。本明細書中で使用するとき、適したポリペプチドは、ＤＣ及び／又はＡＰＣによって取り上げられるまで、その完全な状態を保存するためのＮＩＳＣ組成物を保護するだろうものである。結合タンパク質の例は、限定されないが、ウシ血清アルブミン及びエンドウマメアルブミンのようなアルブミンを含む。
【０１６５】
［０１７２］他の適した高分子は、製薬の技術分野において知られるいずれかのものであり得て、限定されないが、デキストラン、ヒドロキシエチルスターチ及び多糖のような天然に発生する高分子、並びに合成高分子を含む。天然に発生する高分子の例は、タンパク質、糖ペプチド、多糖、デキストラン及び脂質を含む。追加の高分子は、合成高分子であり得る。本発明の使用に適している合成高分子の例は、限定されないが、ポリアルキルグリコール（ＰＡＧ）、例えばＰＥＧ、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＰ）、例えばポリオキシエチル化グリセロール（ＰＯＧ）、ポリトリメチレングリコール（ＰＴＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ）、ポリヒドロキシエチルメタクリレート、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリアクリル酸、ポリエチルオキサゾリン、ポリアクリルアミド、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリアミノ酸、ポリウレタン及びポリホスファゼンを含む。合成高分子はまた、直鎖状若しくは分岐の、飽和若しくは不飽和の、ホモポリマー、２以上の異なる合成モノマーの共重合体又はブロック共重合体であり得る。
【０１６６】
［０１７３］本発明のカプセル化組成物の使用に適したＰＥＧは、化学的な供給者から購入するか又は当業者に既知の技術を用いて合成される。
［０１７４］用語「ＬＭＳ」は、本明細書中で使用するとき、ラメラ脂質粒子を意味し、極性脂質の極性頭部は膜構造を形成するために接触面の水相に直面するように配置される。ＬＭＳの例は、リポソーム、ミセル、渦巻き（即ち、一般的には、円筒状のリポソーム）、マイクロエマルジョン、単層小嚢、多層小嚢等を含む。本明細書中で使用するとき、「リポソーム」又は「脂質小嚢」は、少なくとも１つの及び可能であれば１より多い二重層脂質膜によって結合した小嚢である。リポソームは、リン脂質、糖脂質、脂質ステロイド、例えばコレステロール、関連分子、又は当該技術分野において既知の任意の技術によるその組み合わせから人工的に作製され、限定されないが、ソニケーション、押出、又は脂質−界面活性剤複合体から界面活性剤の除去を含む。リポソームはまた、場合により、組織標的成分のよな追加の成分を含むことが可能である。「脂質膜」又は「脂質二重層」は、排他的に脂質からなる必要はないが、任意の適した他の成分を追加的に含有することができ、限定されないが、コレステロール及び他のステロイド、脂質可溶性化学物質、任意の長さのタンパク質、及び他の両親媒性の分子を含み、膜の一般的構造を提供するのは、疎水性コアを挟む２つの疎水性表面のシートである。膜構造の一般的な検討については、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｊ．Ｋｅｎｄｒｅｗ（１９９４）を参照されたい。適した脂質については、例えば、Ｌａｓｉｃ（１９９３）“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ：ｆｒｏｍ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ｔｏ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍを参照されたい。
【０１６７】
［０１７５］非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原を含有するリポソームを調製する方法は、当該技術分野において既知である。脂質小嚢は、当該技術分野において既知の任意の適した技術によって調製することができ、限定されないが、マイクロカプセル化、マイクロ流動化、ＬＬＣ法、エタノール注入、フレオン注入、「バブル」法、界面活性剤透析、水和、ソニケーション、及び逆相蒸発を含む。Ｗａｔｗｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｓｃｉ．６８：７１５−７２４に概説される。技術は、最も所望される属性を有する小嚢を提供するために組み合わせてもよい。
【０１６８】
［０１７６］本発明のＬＭＳ組成物は、界面活性剤を追加的に含むことができる。界面活性剤は、カチオン性、アニオン性、両親媒性、非イオン性であり得る。好ましい分類の界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であり；特に好ましいのは、水溶性のものである。
【０１６９】
［０１７７］本発明は、組織又は細胞の標的成分を含有するＬＭＳの使用を包含する。このような標的成分は、そのままの動物、臓器又は細胞培養に投与する場合、他の組織又は細胞部位に優先して、ある種の組織又は細胞部位でその蓄積を増加するＬＭＳの成分である。標的成分は、一般的に、リポソームの外部から接近可能であり、したがって、好ましくは、外部表面に結合されるか又は外部脂質二重層に挿入されるかのいずれかである。標的成分は、とりわけ、ペプチド、巨大ペプチドの領域、細胞表面分子若しくはマーカーに特異的な抗体、又はその抗体結合断片、核酸、炭水化物、複合糖質の領域、特定脂質、あるいは前述の分子のいずれかに結合した薬物、ホルモン若しくはハプテンにような小分子であり得る。細胞型の特異的細胞表面マーカーに対する特異性を有する抗体は、当該技術分野において既知であり、そして、当該技術分野に既知の方法によって容易に調製される。
【０１７０】
［０１７８］好ましくは、標的成分を有するＬＭＳを含むＮＩＳＣは、認知のＡＰＣ若しくはＤＣ、特にＡＰＣ又はＤＣを含有する任意の臓器に対して標的化される。このような標的細胞及び臓器は、限定されないが、ＡＰＣ、例えばマクロファージ、樹枝状細胞及びリンパ球、リンパ組織、例えばリンパ節及び脾臓、及び非リンパ系組織を含み、特に樹枝状細胞が見られるものである。
【０１７１】
［０１７９］非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原がプラットフォーム分子へのリンケージによって連結される態様において、プラットフォームは、タンパク性又は非タンパク性（即ち、臓器性）であってもよい。タンパク性プラットフォームの例は、限定されないが、アルブミン、ガンマグロブリン、イムノグロブリン（ＩｇＧ）及びオボアルブミンを含む。Ｂｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｓ  １２６：１５９−１６８；Ｄｕｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｒｃｈ．Ｄｅｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．２８７：１２３−１２８；Ｂｏｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７８：８０−８７。プラットフォームは、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原の両方への結合を適応するために、多価である（即ち、１より多くの結合又は連結部位を含有する）。したがって、プラットフォームは、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上の結合又は連結部位を含有してもよい。重合性プラットフォームの他の例は、デキストラン、ポリアクリルアミド、フィコール、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルアルコール、及びポリＤ−グルタミン酸／Ｄ−リジンである。
【０１７２】
［０１８０］プラットフォーム分子を用いる原理は、当該技術分野において十分に理解される。一般的に、プラットフォームは、ポリヌクレオチド及び抗原に適した結合部位を含有し又は含有するように誘導化される。さらに、あるいは、その代わりに、ポリヌクレオチド及び／又は抗原は、適切な連結基を提供するように誘導化される。例えば、単純なプラットフォームは、二官能性リンカー（即ち、２つの結合部位を有する）、例えばペプチドである。更なる例は、下記に検討される。
【０１７３】
［０１８１］プラットフォーム分子は、生物学的に安定化されてもよく、即ち、それらは、治療効果を与えるために、しばしば数時間〜数日〜数ヶ月のインビボでの排出半減期を提示し、好ましくは、所定の組成物の合成の１本鎖から構成される。それらは、一般的に、約２００〜約１，０００，０００の範囲、好ましくは、下記の範囲：約２００〜約５００，０００；約２００〜約２００，０００；約２００〜約５０，０００（未満、例えば３０，０００）のいずれか分子量を有する。原子価プラットフォーム分子の例は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ；好ましくは、約２００〜約８０００の分子量を有する）、ポリ−Ｄ−リジン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、Ｄ−グルタミン酸及びＤ−リジン（３：２の比）のようなポリマーである（又はポリマーから構成される）。使用してもよい他の分子は、アルブミン及びＩｇＧである。
【０１７４】
［０１８２］本発明の範囲内での使用に適した他のプラットフォーム分子は、米国特許第５，５５２，３９１号に開示された化学的に定義され、非重合性原子価プラットフォーム分子である。本発明の範囲内での使用に適した他の同種な化学的に定義された原子価プラットフォーム分子は、誘導体化した２，２’−エチレンジオキシジエチルアミン（ＥＤＤＡ）及びトリエチレングリコール（ＴＥＧ）である。
【０１７５】
［０１８３］追加の適した原子価プラットフォーム分子は、限定されないが、テトラアミノベンゼン、ヘプタアミノベータシクロデキストリン、テトラアミノペンタエリトリトール、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン（Ｃｙｃｌａｍ）及び１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン（Ｃｙｓｌｅｎ）を含む。
【０１７６】
［０１８４］一般的に、これらのプラットフォームは、標準的な化学的合成技術によって作製される。ＰＥＧは誘導化され、多価をなすに違いなく、それは標準的な技術を用いて達成することができる。結合体合成に適したいくつかの物質、例えば、ＰＥＧ、アルブミン、及びＩｇＧは商業的に利用可能である。
【０１７７】
［０１８５］非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原によるプラットフォーム分子への結合は、任意の多数の方法で達成してもよく、典型的には、１以上の架橋剤及び抗原及びポリヌクレオチド上の官能基、及びプラットフォームに関係する。プラットフォーム及び非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原は、適切な連結基を有しなくてはならない。連結基は、標準的な合成化学的技術を用いてプラットフォームに添加される。連結基は、標準的な固相合成技術又は組換え技術のいずれかを用いて、ポリペプチド抗原及びポリヌクレオチドに添加されてもよい。組換えアプローチは、リンカーを結合するために翻訳後の修飾を要求してもよく、そして、このような方法は当該技術分野において既知である。
【０１７８】
［０１８６］例として、ポリペプチドは、ポリペプチドとプラットフォームの結合に関する部位として使用される官能基、例えばアミノ、カルボキシル又はスルフヒドリル基を含有するアミノ酸側鎖部分を含有する。このような官能基を有する残基は、ポリペプチドがこれらの基を前々から含有していない場合、ポリペプチドに添加されてもよい。このような残基は、固相合成技術又は組換え技術によって取り込んでもよく、両者は、ペプチド合成の分野において周知である。ポリペプチドが糖質側鎖（又は複数）を有する場合（又は、抗原が糖質である場合）、官能性アミノ、スルフヒドリル及び／又はアルデヒド基は、慣用的な化学によってそれに取り込まれてもよい。例えば、一級アミノ基は、シアノホウ化水素ナトリウムの存在下で酸化した糖とエチレンジアミンの反応によって取り込んでもよく、スルフヒドリルは、システアミン・ジヒドロクロリドの反応、その後、標準的なジスルフィド還元剤を用いた還元によって導入してもよく、一方、アルデヒド基は、過ヨウ素酸塩酸化に従って発生させてもよい。同様のやり方で、プラットフォーム分子はまた、前々から適切な官能基を所有していない場合、官能基を含有するように誘導化してもよい。
【０１７９】
［０１８７］種々の長さの疎水性リンカーは、非免疫刺激性ポリヌクレオチドと抗原とをプラットフォーム分子に連結するために有用である。適したリンカーは、エチレングリコールの線状オリゴマー又はポリマーを含む。このようなリンカーは、式Ｒ1Ｓ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＣＨ2ＣＨ2Ｏ（ＣＨ2）mＣＯ2Ｒ2（ここで、ｎ＝０〜２００、ｍ＝１又は２、Ｒ1＝Ｈ若しくはトリチルのような保護基、Ｒ2＝Ｈ又はアルキル若しくはアリール、例えば４−ニトロフェニルエステルである）を有するリンカーを含む。これらのリンカーは、ハロアセチル、マレイミド等のようなチオール反応基を含有する分子を、アミド結合を介してアミノ基を含有する第二の分子にチオエーテルを介して連結するのに有用である。これらのリンカーは、結合の順番に関して柔軟であり、即ち、チオエーテルは最初に又は最後に形成しえる。
【０１８０】
［０１８８］非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原が表面上で吸着によって結合される態様において、この表面は、無機又は有機コアのいずれかで作製された担体粒子（例えば、ナノ粒子又はミクロ粒子）の形体であってもよい。このようなナノ粒子の例は、限定されないが、ナノ結晶性粒子、アルキルシアノアクリレートの重合化によって作製されるナノ粒子、及びマロン酸メチレデンの重合化によって作製されたナノ粒子を含む。非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原が吸着されてもよい追加の表面は、限定されないが、活性化した炭素粒子及びタンパク質−セラミックナノプレートを含む。担体粒子の他の例は、本明細書中に提供される。
【０１８１】
［０１８９］吸着した分子の細胞への輸送のために、表面へのポリヌクレオチド及びポリペプチドの吸着は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ．Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓ．３：２３３−２６１；Ｈａｇｉｗａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  １：２４１−２５２；Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１６：１４１−１４７；及び、Ｋｏｓｓｏｖｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，４６０，８３１号を参照されたい。好ましくは、吸着体表面を含む材料は、生体分解性である。表面への非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び／又は抗原の吸着は、イオン性及び／又は疎水性相互作用を含む非共有的相互作用を通じて発生してもよい。
【０１８２】
［０１９０］一般的に、ナノ粒子のような担体の特徴、例えば、表面電荷、粒子サイズ及び分子量は、重合条件、モノマー濃度、及び重合化過程での安定化剤の存在に依存する（Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。担体粒子の表面は、例えば、表面被覆で修飾されてもよく、ポリヌクレオチド及び／又は抗原の吸着を可能にさせ又は増加させる。吸着したポリヌクレオチド及び／又は抗原を伴う担体粒子は、他の基質でさらに被覆してもよい。このような他の基質の添加は、本明細書中に記載されるように、例えば、患者に投与した場合に粒子の半減期を延長することができ、及び／又は特異的細胞型又は組織に粒子を標的化することができる。
【０１８３】
［０１９１］非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原が吸着されてもよいナノ結晶性表面は記載されている（例えば、米国特許第５，４６０，８３１号）。ナノ結晶性コア粒子（１μｍ以下の直径を有する）は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド及び／又は他の医薬品の吸着を促進する表面エネルギー修飾層で被覆される。米国特許第５，４６０，８３１号に記載されるように、コア粒子は、オリゴヌクレオチドの吸着を促進する表面で被覆され、その後、例えば、脂質−抗原混合物の形体で抗原調製物を用いて被覆される。
【０１８４】
［０１９２］別の吸着体表面は、アルキルシアノアクリレートの重合化によって作製されるナノ粒子である。アルキルシアノアクリレートは、アニオン性重合化の過程によって酸性にした水性媒体中で重合することができる。重合条件に依存して、小粒子は、２０〜３０００ｎｍの範囲のサイズを有する傾向にあり、そして、特異的表面電荷を有し、ナノ粒子特異的表面的特徴を形成する可能性がある（Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７）。例えば、オリゴヌクレオチドは、テトラフェニルホスホニウムクロリドのようなカチオン、又はセチルトリメチルアンモニウムブロミドのような四級アンモニウム塩の存在下で、ポリイソブチル−及びポリイソヘキシルシアノアクリレート・ナノ粒子に吸着させてもよい。これらのナノ粒子上のオリゴヌクレオチド吸着は、核酸鎖の負に帯電したリン酸基と疎水性カチオンとの間のイオン対の形成によって仲介されるように見える。例えば、Ｌａｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ  ８０：９６９−９７６，Ｃｈａｖａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１１：１３７０−１３７８；Ｃｈａｖａｎｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．９：４４１−４４９を参照されたい。ポリペプチドはまた、ポリアルキルシアノアクリレート・ナノ粒子に吸着させてもよい。例えば、Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７；Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  １９：７７７−７８０を参照されたい。
【０１８５】
［０１９３］別の吸着表面は、マロン酸メチリデンの重合によって作製されるナノ粒子である。例えば、Ｂｏｕｓｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９に記載されるように、ポリ（マロン酸メチリデン２．１．２．）ナノ粒子に吸着したポリペプチドは、初期には、静電気力を介してそのようにされ、その後、疎水性力を通じて安定化されるように見える。
【０１８６】
［０１９４］本発明に有用なマイクロキャリアは、約１５０、１２０又は１００μｍ未満の大きさ、より一般的には約５０〜６０μｍ未満の大きさ、好ましくは約１０μｍ未満の大きさであり、純粋に不溶である。本発明に有用なマイクロキャリアは、好ましくは、生体分解性であるが、非生体分解性マイクロキャリアは許容される。マイクロキャリアは、一般的には、固相、例えば、「ビーズ」又は他の粒子であるが、液相マイクロキャリア、例えば、生体分解性ポリマー又はオイルを含む水中油型乳剤もまた意図される。マイクロキャリアとしての使用に許容される広範な生体分解性及び非生体分解性材料は、当該技術分野において既知である。
【０１８７】
［０１９５］本発明のＮＩＳＣ組成物又は方法における使用のためのマイクロキャリアは、一般的には、約１０μｍ未満の大きさ（例えば、約１０μｍ未満の平均径を有し、又は粒子の少なくとも約９７％の粒子が１０μｍのフィルターを通過する）、そして、ナノキャリア（即ち、約１μｍ未満の大きさの担体）を含む。好ましくは、約９、７、５、２若しくは１μｍ又は９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００若しくは１００ｎｍの上限の範囲内のサイズを有するマイクロキャリアが選択され、そして、独立して、約４、２若しくは１μｍ又は約８００、６００、５００、４００、３００、２５０、２００、１５０、１００、５０、２５若しくは１０ｎｍの下限が選択され、ここで、下限は上限未満である。いくつかの態様において、マイクロキャリアは、約１．０〜１．５μｍ、約１．０〜２．０μｍ又は約０．９〜１．６μｍの大きさを有する。ある種の好ましい態様において、マイクロキャリアは、約１０ｎｍ〜約５μｍ、又は約２５ｎｍ〜約４．５μｍ、約１μｍ、約１．２μｍ、約１．４μｍ、約１．５μｍ、約１．６μｍ、約１．８μｍ、約２．０μｍ、約２．５μｍ若しくは約４．５μｍの大きさを有する。マイクロキャリアがナノキャリアである場合、好ましい態様は、約２５〜約３００ｎｍ、５０〜約２００ｎｍ、約５０ｎｍ又は約２００ｎｍのナノキャリアを含む。
【０１８８】
［０１９６］固相生体分解性マイクロキャリアは、生体分解性ポリマーから製造してもよく、限定されないが、生体分解性ポリエステル、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、及びその共重合体（ブロック共重合体を含む）、並びにポリ（乳酸）及びポリ（エチレングリコール）のブロック共重合体；ポリオルトエステル、例えば、３，９−ジエチリデン−２，４，８，１０−テトラオキサスピロ［５．５］ウンデカン（ＤＥＴＯＳＵ）に基づくポリマー；ポリ無水物、例えば、セバシン酸のような相対的に疎水性モノマーに基づくポリ（無水物）ポリマー；ポリ無水物イミド、例えば、アミノ酸を導入しているセバシン酸誘導モノマーに基づくポリ無水物ポリマー（即ち、アミノ末端窒素を介したイミド結合によってセバシン酸に連結される）、例えばグリシン又はアラニン；ポリ無水物エステル；ポリホスファゼン、特に、カルボン酸基の発生を介したポリマー骨格の分解を触媒し得る加水分解感受性エステル基を含有するポリ（ホスファゼン）（Ｓｃｈａｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．１９９６：１０２）；そして、ポリアミド、例えば、ポリ（乳酸−ｃｏ−リジン）を含む。
【０１８９】
［０１９７］マイクロキャリアの製造に適した広範な非生体分解性材料はまた既知であり、限定されないが、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、シリカ、セラミック、ポリアクリルアミド、デキストラン、ヒドロキシアパタイト、ラテックス、金、及び強磁性又は常磁性材料を含む。ある種の態様は、金、ラテックス、及び／又は磁気ビーズを排除する。ある種の態様において、マイクロキャリアは、第二材料（例えば、ポリスチレン）でカプセル化された第一材料（例えば、磁性材料）で作製されてもよい。
【０１９０】
［０１９８］固相マイクロスフェアは、当該技術分野において既知の技術を用いて調製される。例えば、それらは、乳化−溶媒抽出／蒸発技術によって調製することができる。一般的に、この技術において、生体分解性ポリマー、例えば、ポリ無水物、ポリ（アルキル−α−シアノアクリレート）及びポリ（α−ヒドロキシエステル）、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）及びポリ（カプロラクトン）は、メチレンクロリドのような適した有機溶媒に溶解され、乳剤の分散相（ＤＰ）を構築する。ＤＰは、溶解した界面活性剤、例えば、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）又はポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）を含有する水性連続相（ＣＰ）の過剰容積に高速度のホモジネーションによって乳化される。ＣＰにおける界面活性剤は、不連続であり適切な大きさのエマルジョン滴の形成を確実にするためである。その後、有機溶媒は、ＣＰ中に抽出され、次に、システム温度を上昇することによって蒸発される。固相微粒子は、次いで、遠心又はろ過によって分別され、例えば、凍結乾燥若しくは真空の適用によって乾燥させ、４℃で保存される。
【０１９１】
［０１９９］乾燥したマイクロスフェアの平均径、サイズ分布及び表面電荷のような物理化学的特徴が決定されもよい。サイズ特徴は、例えば、動的光散乱技術によって決定され、そして、表面電荷はゼータ電位を測定することによって決定した。
【０１９２】
［０２００］マイクロキャリアに共有結合した非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び抗原は、本明細書中に記載され又は当該技術分野において既知の任意の共有結合架橋技術を用いて連結されてもよい。広範な架橋技術は、当該技術分野において知られ、アミノ、カルボキシル及びスルフヒドリル基と反応性の架橋剤を含む。当業者に明確となるであろうように、架橋剤及び架橋プロトコールの選択は、非免疫刺激性ポリヌクレオチド、抗原、及びマイクロキャリアの立体構造、並びにＮＩＳＣの所望の最終的な立体構造に依存するであろう。架橋剤は、同種二官能性又は異種二官能性のいずれかであり得る。同種二官能性架橋剤が使用される場合、架橋剤は、非免疫刺激性ポリヌクレオチド（又は抗原）及びマイクロキャリア上に同じ部分を使用する（例えば、アルデヒド架橋剤は、ポリヌクレオチド（又は抗原）及びマイクロキャリアが１以上のアミンを含む場合、ポリヌクレオチド（又は抗原）及びマイクロキャリアを共有結合的に連結するために使用されてもよい）。異種二官能性架橋剤は、非免疫刺激性ポリヌクレオチド（又は抗原）及びマイクロキャリア上の異なる部分を利用し（例えば、マレイミド−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルは、ポリヌクレオチド上の遊離スルフヒドリル、及びマイクロキャリア上の遊離アミンを共有結合的に連結するために使用されてもよい）、そして、マイクロキャリア間の結合の形成を最小にするために好ましい。架橋剤は、反応部分間の「スペーサー」アームを取り込んでもよく、あるいは、架橋剤の２つの反応部分が直接的に連結されてもよい。
【０１９３】
［０２０１］一態様において、ポリヌクレオチド部分は、マイクロキャリアに架橋するために少なくとも１つの遊離のスルフヒドリル（例えば、５’−チオール修飾した塩基又はリンカーによって提供される）を含み、一方、マイクロキャリアは遊離アミン基を含む。これらの２つの基と反応性の異種二官能性架橋剤（例えば、マレイミド基及びＮＨＳ−エステルを含む架橋剤）、例えば、スクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレートは、マイクロキャリアを活性化し、その後、ポリヌクレオチド／マイクロキャリア複合体を形成するためにポリヌクレオチドを共有的に架橋するために使用される。
【０１９４】
［０２０２］マイクロキャリアを含むＮＩＳＣは、イオン（静電）結合、疎水性相互作用、水素結合、ファン・デル・ワールス吸引力、又は２以上の異なる相互作用の組み合わせを含む任意の非共有結合又は相互作用によって連結に関与してもよい。
【０１９５】
［０２０３］好ましい非共有結合ＮＩＳＣマイクロキャリア複合体は、典型的には、疎水性若しくは静電気力（イオン）相互作用、又はその組み合わせによって（例えば、結合対として、非免疫刺激性ポリヌクレオチドとマイクロキャリアに結合したポリヌクレオチドとの間の塩基対を通じて）複合化される。ポリヌクレオチド骨格の疎水的性質により、複合体を形成するための疎水性相互作用に依存するＮＩＳＣ複合体は、非常に疎水的な部分を取り込むための複合体のポリヌクレオチド部分の修飾を一般的には必要とする。好ましくは、疎水性部分は、生体適合的な非免疫刺激性であり、組成物が意図される個体（例えば、哺乳動物、特にヒトに見出される）に天然に発生する。好ましい疎水的部分の例は、脂質、ステロイド、ステロール、例えば、コレステロール、及びテルペンを含む。疎水性部分をポリヌクレオチド又は抗原に連結する方法は、当然に、ポリヌクレオチド又は抗原の立体構造、及び疎水性部分の同一性に依存するであろう。疎水性部分は、ポリヌクレオチドの任意の都合良い部位、好ましくは、５’又は３’端のいずれかで添加されもよく；ポリヌクレオチドへのコレステロール部分の添加の場合、コレステロール部分は、好ましくは、慣用的な化学反応を用いてポリヌクレオチドの５’端に添加される（例えば、Ｇｏｄａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｌｃｈｅｍ．２３２：４０４−４１０を参照されたい）。好ましくは、疎水性結合によって連結したＮＩＳＣ複合体における使用のためのマイクロキャリアは、疎水性材料、例えば、油滴又は疎水性ポリマーから作製されるが、疎水性部分を取り込むために修飾した親水性材料は、同様に利用してもよい。
【０１９６】
［０２０４］静電的結合によって結合した非共有結合的ＮＩＳＣ複合体は、典型的には、ポリヌクレオチド骨格の非常に負の電荷を引き出す。したがって、非共有結合的に結合したＮＩＳＣ複合体において使用するためのマイクロキャリアは、一般的に、生理的なｐＨ（例えば、約ｐＨ６．８〜７．４）で正に帯電（カチオン性）される。マイクロキャリアは、本質的に、正の電荷を有してもよいが、正電荷を正常に所有しない化合物から作製したマイクロキャリアは、正電荷（カチオン性）となるように誘導化され又はそうでなければ修飾されてもよい。例えば、マイクロキャリアを作製するために使用されるポリマーは、１級アミンのように榮に対談した基を天下するために誘導化されてもよい。その代わりに、正に帯電した化合物は、製造中、マイクロキャリアの製剤に取り込んでもよい（例えば、正に帯電した表面は、得られたマイクロキャリア粒子上に正の電荷を授与するためにポリ（乳酸）／ポリ（グリコール酸）共重合体の製造中に使用してもよい）。
【０１９７】
［０２０５］例えば、カチオン性マイクロスフェアを調製するために、カチオン性脂質又はポリマー、例えば、１，２−ジオレオイル−１，２，３−トリメチルアンモニオプロパン（ＤＯＴＡＰ）、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイド（ＣＴＡＢ）又はポリリジンが、これらの相においてそれらの安定性により、ＤＰ又はＣＰのいずれかに添加さえる。
【０１９８】
［０２０６］ＮＩＳＣは、ポリヌクレオチド、抗原及び粒子のインキュベーションによって、好ましくは水性混合物中で、カチオン性マイクロスフェア上に吸着させることによって実行することができる。このようなインキュベーションは、任意の所望の条件下で実行してもよく、周囲（室内）温度（例えば、およそ２０℃）又は冷蔵下（例えば、４℃）を含む。カチオン性マイクロスフェア及びポリヌクレオチドは相対的に早く結合するために、インキュベーションは、任意の都合良い時間、例えば、５、１０、１５分以上であってもよく、一晩及び長期のインキュベーションを含む。例えば、ポリヌクレオチドは、４℃でのポリヌクレオチドと粒子の一晩の水性インキュベーションによるカチオン性マイクロスフェア上へ吸着され得る。しかしながら、カチオン性マイクロスフェア及びポリヌクレオチドは自然に結合するため、ＮＩＳＣは、ポリヌクレオチド、抗原及びマイクロキャリアの１回の同時投与によって形成され得る。マイクロスフェアは、ポリヌクレオチド結合の前後で大きさと表面電荷に関して特徴付けられてもよい。選択されたバッチは、その後、例えば、ＡＰＣ中で適した対照に対する活性について評価されてもよい。製剤はまた、適した動物モデルで評価されてもよい。
【０１９９】
［０２０７］ヌクレオチド塩基対によって連結した非共有的ＮＩＳＣは、慣用的な方法論を用いて生産されてもよい。一般的に、塩基対をなしたＮＩＳＣ複合体は、結合した、好ましくは共有結合した、非免疫刺激性ポリヌクレオチドに少なくとも部分的に相補的であるポリヌクレオチド（「捕捉ポリヌクレオチド」）を含むマイクロキャリアを用いて生産される。非免疫刺激性ポリヌクレオチドと捕捉ヌクレオチドとの間の相補性のセグメントは、好ましくは、少なくとも６、８、１０又は１５の隣接塩基対、より好ましくは少なくとも２０の隣接塩基対である。捕捉ヌクレオチドは、当該技術分野において既知の任意の方法によってマイクロキャリアに結合されもよく、そして、５’又は３’端で非免疫刺激性ポリヌクレオチドに共有結合されてもよい。いくつかの態様において、５’−ＧＧＧＧ−３’配列を含む非免疫刺激性ポリヌクレオチドは、１本鎖として配列のこの部分を保持するであろう。
【０２００】
［０２０８］他の態様において、結合対は、ＮＩＳＣにおいて非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び／又は抗原とマイクロキャリアとを連結させるために使用されてもよい。結合対は、受容体とリガンド、抗体と抗原（若しくはエピトープ）、又は高アフィニティー（例えば、約１０-8未満のＫｄ）で結合する任意の他の結合対であってもよい。好ましい結合対の１タイプは、ビオチンとストレプトアビジン又はビオチンとアビジンであり、それらは非常に密接な複合体を形成する。ＮＩＳＣ結合を仲介するために結合対を使用する場合、非免疫刺激性ポリヌクレオチド及び／又は抗原は、典型的には、共有結合によって、結合対の一メンバーを用いて誘導化され、そして、マイクロキャリアは、結合対の他のメンバーで誘導化される。誘導化された化合物の混合物は、ＮＩＳＣ形成に帰着する。
【０２０１】
本発明の方法
［０２０９］本発明は、個体、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトにおける免疫応答を制御する方法を提供し、本明細書中に開示されるように個体に非免疫刺激性結合体（ＮＩＳＣ）を投与することを含む。本発明によって提供される免疫制御の方法は、抗原に対する不要な免疫応答を抑制及び／又は阻害するものを含み、限定されないが、自己免疫応答、アレルギー応答、及び同様に異常な免疫応答、例えば、セリアック病で見られるものを含む。本発明はまた、抗原特異的Ｔ制御細胞の発生のための方法、そして、Ｔｈ１及び／又はＴｈ２細胞分化を阻害するための方法を提供する。
【０２０２】
［０２１０］本発明はまた、不溶な免疫活性化と関連した症候を改善するための方法を提供し、限定されないが、自己免疫に関連した症候、アレルギーに関連した症候、同様に異常な免疫応答と関連した症候、例えば、セリアック病、そして、同種免疫に関連した症候を含む。したががって、本発明はまた、移植における補助、例えば、組織不適合性及び／又は移植片対宿主（ＧＶＨ）病を軽減するための方法を提供する。
【０２０３】
［０２１１］本明細書中に示されるように、抗原に対する非免疫刺激性オリゴヌクレオチドの連結（ＮＩＳＣ）は、抗原及びオリゴヌクレオチドの混合物の投与と比較して、抗原の取り込みの増加へと導く。抗原取り込みにもかかわらず、ほとんどないか又は全くないＤＣ成熟化は、ＮＩＳＣ組成物によって刺激された。それに反して、免疫刺激性オリゴヌクレオチド−抗原結合体とのインキュベーションは、ＤＣによる抗原取り込み及びＤＣ成熟化の刺激の両方に帰着した。
【０２０４】
［０２１２］ＮＩＳＣは、抗原に対する免疫応答を制御するのに十分な量で投与される。本明細書中に記載されるように、免疫応答の制御は、体液性及び／又は細胞性であってもよく、そして、当該技術分野における標準的な技術を用いて、及び本明細書中に記載されるように測定される。
【０２０５】
［０２１３］ある種の態様において、個体は、不要な免疫活性化と関連した障害、例えば、アレルギー疾患又は状態、アレルギー及び喘息を被っている。アレルギー疾患又は喘息を有する個体は、既存のアレルギー疾患又は喘息の認識可能な症候を有する個体である。
【０２０６】
［０２１４］ある種の態様において、個体は、不要な免疫活性化と関連した障害、例えば、自己免疫疾患を被っている。自己免疫疾患を有する個体は、既存の自己免疫疾患の認識し得る症候を有する患者である。
【０２０７】
［０２１５］自己免疫疾患は、２つの広範なカテゴリー：臓器特異的及び全身性に分割し得る。自己免疫疾患は、限定されないが、関節リウマチ（ＲＡ）、全身性紅斑性狼瘡（ＳＬＥ）、Ｉ型真性糖尿病、ＩＩ型真性糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、免疫介在不妊症、例えば、早期閉経、強皮症、シェーグレン病、白斑、脱毛症（はが頭症）、多内分泌腺機能低下、グレーブス病、甲状腺機能低下症、多発性筋炎、尋常性天疱瘡、落葉状天疱瘡、クローン病及び潰瘍性大腸炎を含む炎症性腸疾患、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）及びＣ型肝炎（ＨＣＶ）と関したものを含む自己免疫肝炎、下垂体機能低下症、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）、心筋炎、アジソン病、自己免疫皮膚疾患、ブドウ膜炎、悪性貧血、及び副甲状腺機能低下症を含む。
【０２０８】
［０２１６］自己免疫疾患はまた、限定されないが、ハシモト甲状腺、Ｉ型及びＩＩ型自己免疫多腺性症候群、腫瘍随伴性天疱瘡、水疱性類天疱瘡、疱疹状皮膚炎、線状ＩｇＡ疾患、後天性表皮水疱症、結節性紅斑、類天疱瘡妊娠、瘢痕性類天疱瘡、混合本態性クリオグロブリン血症、小児の慢性水疱性疾患、溶血性貧血、血小板減少性紫斑病、グッドパスチャー症候群、自己免疫性好中球減少症、重症筋無力症、イートン・ランバート筋無力症候群、スティフマン症候群、急性播種性脳脊髄炎、ギラン・バレー症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経根障害、伝導ブロックを伴う多焦点運動ニューロパシー、単クローン性免疫グロブリン血症を伴う慢性ニューロパシー、オプソノクロヌス・ミオクロヌス症候群、小脳変性症、脳脊髄炎、網膜症、原発性硬化性胆管炎、硬化性胆管炎、グルテン過敏性腸疾患、強直性脊椎炎、反応性関節炎、多発性筋炎／皮膚筋炎、混合性結合組織疾患、ベチェット症候群、乾癬、結節性多発性動脈炎、アレルギー性血管炎及び肉芽腫症（チャーグ・ストラウス病）、多発性血管炎重複症候群、過敏性血管炎、ヴェーゲナー肉芽腫症、側頭動脈炎、タカヤス動脈炎、カワサキ病、中枢神経系の分離脈管炎、閉塞性血栓血管炎、サルコイドーシス、糸球体腎炎、及び寒冷症を含んでもよい。これらの状態は、医学の技術分野において周知であり、例えば、Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４ｔｈ  ｅｄ．，Ｆａｕｃｉ  Ａ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：ＭｃＧｒａ−Ｈｉｌｌ，１９９８に記載される。
【０２０９】
［０２１７］全身性疾患ＳＬＥは、抗クロマチン抗体、抗スプライセオソーム抗体、抗リボソーム抗体、及び抗ＤＮＡ抗体のようなほぼどの細胞にも豊富にある抗原に対する抗体の存在によって特徴付けられる。結果的に、ＳＬＥの効果、種々の組織、例えば、皮膚及び腎臓に見られる。自己反応性Ｔ細胞はまた、ＳＬＥにおける役割を演じる。例えば、マウスの狼瘡モデルの研究では、非ＤＮＡヌクレオソーム抗原、例えば、ヒストンが、抗ＤＮＡ産生Ｂ細胞を誘発し得る自己反応性Ｔ細胞を刺激することが知られている。ＩＦＮ−αの血清レベルの増加はＳＬＥ患者において観察され、発熱及び皮膚発疹を含む疾患活性及び重篤性の両方、並びに疾患過程と関連した本質的なマーカーお相関することが示されている（例えば、抗ｄｓＤＮＡ抗体タイター）。
【０２１０】
［０２１８］ある種の態様において、個体は、自己免疫疾患を発症する危険にあり、そして、ＮＩＳＣは、自己免疫疾患を遅延させ又は妨げるのに有効な量で投与される。自己免疫疾患を発症する危険性のある個体は、例えば、自己免疫疾患の発症に対する遺伝的又は他の素因を有するものである。ヒトにおいては、具体的な自己免疫疾患に対する感受性は、ＨＬＡ型と関連し、いくつかは、特定のＭＨＣクラスＩＩ対立遺伝子と非常に強く結び付き、そして、他は、特定のＭＨＣクラスＩ対立遺伝子と結び付く。例えば、強直性脊椎炎、急性前部ブドウ膜炎、及び若年性関節リウマチは、ＨＬＡ−Ｂ２７と関連し、グッドパスチャー症候群及びＭＳは、ＨＬＡ−ＤＲ２と関連し、グレーブス病、重症筋無力症及びＳＬＥは、ＨＬＡ−ＤＲ３と関連し、関節リウマチ及び尋常性天疱瘡は、ＨＬＡ−ＤＲ４と関連し、そして、ハシモト甲状腺炎は、ＨＬＡ−ＤＲ５と関連する。自己免疫疾患に対する他の遺伝的素因は、当該技術分野において知られ、そして、個体は、当該技術分野において周知なアッセイ及び方法によってこのような素因の存在に関して調べることができる。したがって、いくつかの場合において、自己免疫を発症する危険性にある個体を同定することができる。
【０２１１】
［０２１９］本明細書中に記載されるように、本発明のＮＩＳＣは、ＤＣ又はＡＰＣの活性化又は成熟を誘導又は促進するＮＩＳＣのオリゴヌクレオチド部分なしに、形質細胞性樹枝状細胞（ＤＣ）及び／又は抗原提示細胞（ＡＰＣ）によって採取される。このような活性又は成熟を妨げることによって、ＮＩＳＣはまた、限定されないが、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、及び／又はＩＦＮ−αを含むサイトカインの産生を妨げてもよく、そして、Ｂ細胞増殖を妨げてもよい。
【０２１２】
［０２２０］自己免疫疾患のための研究用の動物モデルは、当該技術分野において知られる。例えば、ヒトの自己免疫疾患に最も類似するように思われる動物モデルは、特定の疾患を高い発症率で自然に発症する動物系統を含む。このようなモデルの例は、限定されないが、１型糖尿病に類似した疾患を発症する非肥満糖尿病（ＮＯＤ）マウス、及び狼瘡様疾患状態動物、例えば、ニュージーランドハイブリッド、ＭＲＬ−Ｆａｓｌｐｒ及びＢＸＳＢマウスを含む。自己免疫疾患が含まれる動物モデルは、限定されないが、多発性硬化症のモデルである実験的自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）、関節リウマチのモデルであるコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）、及びブドウ膜炎のモデルである実験的自己免疫ブドウ膜炎（ＥＡＵ）を含む。自己免疫疾患の動物モデルはまた、遺伝子操作によって創作され、例えば、炎症性腸疾患用のＩＬ−２／ＩＬ−１０ノックアウトマウス、ＳＬＥ用のＦａｓ又はＦａｓリガンドノックアウト、そして、関節リウマチ用のＩＬ−１受容体アンタゴニストノックアウトを含む。
【０２１３】
［０２２１］したがって、当該技術分野における動物モデル標準は、自己免疫障害の治療のために、本発明の方法及び組成物の活性及び／又は有効性についてのスクリーニング及び／又は評価に利用できる。
【０２１４】
［０２２２］本発明の方法は、抗拒絶剤及び免疫抑制剤の投与のような障害又は状態の治療の標準を作製する他の治療薬と併用して実施してもよい。例えば、抗炎症剤、抗マラリア、ステロイド（例えば、コルチゾン）、及び細胞毒性化学療法はＳＬＥの治療に使用される。
【０２１５】
［０２２３］自己抗原及び自己免疫疾患に対する寛容は、広範に亘る、胸腺における自己反応性Ｔ細胞のネガティブ選択を含むメカニズム、及び胸腺除去を逃れ、末梢に見られる自己反応性Ｔ細胞に対する末梢寛容のメカニズムによって達成される。末梢Ｔ細胞寛容を提供するメカニズムの例は、自己抗原の「無教育」、自己抗原に対するアネルギー若しくは不反応性、サイトカイン免疫逸脱、そして、自己反応性Ｔ細胞の活性誘導の細胞死を含む。さらに、制御性Ｔ細胞は、末梢寛容の介在に関与することが知られている。例えば、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：１１−１９；Ｓｈｅｖａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１８２：５８−６７を参照されたい。いくつかの状況において、自己抗原に対する末梢寛容が失われ（又は崩壊し）、そして、自己免疫応答が続いて起こる。例えば、ＥＡＥの動物モデルにおいて、ＴＬＲ固有の免疫受容体を介した抗原提示細胞（ＡＰＣ）の活性化は、自己寛容を崩壊し、ＥＡＥの誘導の原因となることが知られた（Ｗａｌｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１３：９９０−９９７）。
【０２１６】
［００２４］したがって、いくつかの態様において、本発明は、ＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、及び／又はＴＬＲ７／８／９依存の細胞刺激を抑制又は低減しながら、抗原提示を増加する方法を提供する。本明細書中に記載されるように、特定のＮＩＳＣの投与は、免疫刺激性ポリヌクレオチドと関連したＴＬＲ７／８、ＴＬＲ９、及び／又はＴＬＲ７／８／９に依存した細胞応答を抑制しながら、ＤＣ又はＡＰＣによる抗原提示に帰着する。このような抑制は、１以上のＴＬＲに関したサイトカインのレベルを減少することを含んでも良い。ＴＬＲ９に依存した細胞刺激の抑制の使用に適したＩＲＰは、ＴＬＲ９と関連した細胞応答を阻害又は抑制するＩＲＰである。
【０２１７】
投与及び評価
［０２２５］ＮＩＳＣは、本明細書中に記載されるように、他の医薬品と併用して投与することができ、生理学的に許容されるその担体（及び、本発明がこれらの組成物を含むようなものである）と組み合わせることができる。ＮＩＳＣは、本明細書中に記載したもののいずれかである。
【０２１８】
［０２２６］免疫応答の調節に関する全ての組成物と同様に、特定のＮＩＳＣ製剤の有効量及び投与方法は、個体、どんな状態が治療されるべきか、当業者に明白な他の因子に基づいて変化し得る。考慮すべき因子は、ＮＩＳＣが輸送分子と共に又はそれに共有結合させて投与されるであろうかどうか、投与経路、及び投与されるべき服用回数を含む。このような因子は、当該技術分野において知られ、過度の実験なしにこのような測定をなすことは当業者の技術的範囲に十分にある。適した服用範囲は、免疫応答（例えば、抗原特異的制御性Ｔ細胞の増加）の所望の制御を提供するもである。末梢自己寛容の誘導又は促進が所望される場合、適した服用範囲は、末梢自己寛容の所望の誘導又は促進を提供するものである。一般的に、服用は、投与されたＮＩＳＣを含有する組成物の全量というよりは、患者に投与されるＮＩＳＣ中のオリゴヌクレオチドの量によって決定される。ＮＩＳＣのオリゴヌクレオチドの有用な服用範囲は、輸送されたオリゴヌクレオチドの量で与えられ、例えば、下記：０．５〜１０ｍｇ／ｋｇ、１〜９ｍｇ／ｋｇ、２〜８ｍｇ／ｋｇ、３〜７ｍｇ／ｋｇ、４〜６ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１〜１０ｍｇ／ｋｇ、５〜１０ｍｇ／ｋｇのいずれかであってもよい。各患者に与えられる絶対量は、生物学的利用能、浄化速度及び投与経路のような薬理学的特性に依存する。
【０２１９】
［０２２７］特定のＮＩＳＣ製剤の有効量及び投与方法は、個々の患者、所望の結果及び／又は障害のタイプ、疾患の段階、そして当業者に明確な他の因子に基づいて変化し得る。特定の応用に有用な投与経路（又は複数）は、当業者に明らかである。投与経路は、限定されないが、局所、皮膚、経皮、経粘膜、表皮、非経口、胃腸、及び鼻−咽頭、経気管支及び肺胞を含む肺を含む。適した服用範囲は、血液レベルによって測定されるように約１〜５０μＭの組織濃度に到達するのに十分なＮＩＳＣ含有組成物を提供するものである。各患者に与えられる絶対量は、生物学的利用能、浄化速度及び経口投与のような薬理学的な特性に依存する。
【０２２０】
［０２２８］本明細書中に記載されるように、不要な免疫活性化が発生しているか又は発生しそうである組織は、ＮＩＳＣに対する好ましい標的である。つまり、皮膚、リンパ節、脾臓、骨髄、及び血液は、ＮＩＳＣ投与の好ましい部位である。
【０２２１】
［０２２９］本発明は、局所投与に適したＮＩＳＣ製剤を提供し、限定されないが、生理学的に許容されるインプラント、軟骨、クリーム、リンス及びゲルを含む。皮膚投与の例示的経路は、経皮透過、表皮透過及び皮下注射のような最小の侵襲的であるものである。
【０２２２】
［０２３０］経皮投与は、ＮＩＳＣが皮膚を浸透し及び血流に入るようにできるクリーム、リンス、ゲル等の応用によって達成される。経皮投与に適した組成物は、限定されないが、皮膚に直接的に適用され又は経皮装置（いわゆる「パッチ」）のような保護担体に導入される医薬として許容される懸濁液、オイル、クリーム及び軟膏を含む。適したクリーム、軟膏等の例は、例えば、医師用卓上参考書に見出すことができる。経皮投与はまた、イオントフォレシス（ｉｏｎｔｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって、例えば、数日又はそれより長い期間、無傷の皮膚を通して連続的にそれらの産物を輸送する商業的に利用可能なパッチを用いて達成してもよい。この方法の使用は、相対的に大きな濃度で医薬組成物の制御した透過を可能にし、併用剤の投入を可能にし、そして、吸収促進剤の同時使用を可能にする。
【０２２３】
［０２３１］投与の非経口経路は、限定されないが、電気的（イオントフォレシス）又は直接的注入、例えば、中心静脈ラインへの直接注射、静脈内、筋内、腹腔内、皮内又は皮下注射を含む。非経口投与に適したＮＩＳＣの製剤は、一般的に、ＵＳＰ水又は注射用水に調合され、そして、さらに、ｐＨ緩衝液、塩充填剤、防腐剤、及びその他の医薬として許容される賦形剤を含んでもよい。非経口的注射用のＮＩＳＣは、注射用の塩溶液及びリン酸緩衝生理食塩水のような医薬として許容される無菌等張溶液に調合してもよい。
【０２２４】
［０２３２］投与の胃腸経路は、限定されないが、摂取及び直腸を含み、そして、例えば、注射用の医薬として許容される粉末剤、ピル又は液剤、及び直腸内投与用の坐剤を含むことができる。
【０２２５】
［０２３３］鼻−咽頭及び肺内投与は、吸入によって達成され、鼻腔内、経気管支及び肺胞内経路のような輸送経路を含む。本発明は、限定されないが、エアロゾルを形成するための液体懸濁剤、並びに乾燥粉末吸入輸送系用の粉末形体を含む吸入による投与に適したＮＩＳＣの製剤を含む。ＮＩＣＳ製剤の吸入による投与に適した装置は、限定されないが、噴霧器、吸入器、ネブライザー、及び乾燥粉末吸入輸送装置を含む。
【０２２６】
［０２３４］当該技術分野において周知であるように、本明細書中に記載した投与の経路に使用される溶液又は懸濁液は、いずれかの１以上の下記の成分：無菌希釈剤、例えば、注射用水、塩類溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒；抗菌剤、例えば、ベンジルアルコール又はメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム；キレート剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸；緩衝剤、例えば、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩、及び等張の調整用の試薬、例えば、塩化ナトリウム又はデキストロースを含むことができる。ｐＨは、酸又は塩基、例えば、塩酸又は水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。非経口調製剤は、アンプル、ディスポーザブルシリンジ又はガラス若しくはプラスチックで作られた複数回投与のバイアル中に封入することができる。
【０２２７】
［０２３５］当該技術分野において周知であるように、注射可能な使用に適した医薬組成物は、無菌水溶性液剤（水溶性である場合）、又は無菌の注射可能な液剤若しくは分散剤の即時調整剤用の分散剤及び無菌粉末剤を含む。静脈内投与に関して、適した担体は、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎ，ＮＪ）又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。全ての場合において、組成物は無菌でなけらばならず、そして、容易な注入可能性が存在する程度に流動的であるべきである。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌のような微生物の汚染活性に対して保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びそれらの適切な混合物を含有する溶媒又は分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのような被覆の使用によって、分散剤の場合においては要求される粒子サイズの維持によって、そして、界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の阻害は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザール等によって達成することができる。組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含むことが好ましいかもしれない。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅延させる試薬、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを組成物中に含めることによってもたらすことができる。
【０２２８】
［０２３６］当該技術分野において周知であるように、無菌の注射可能な溶液は、上記で列挙される成分の１つ又は組み合わせを含む適切な溶媒中に必要とされる量の活性化合物（又は複数）を導入することによって、必要であれば、その後にろ過滅菌によって調製することができる。一般的に、分散剤は、塩基性分散媒及び上記で列挙したものから必要とされる他の成分を含有する無菌のベヒクル中に活性化合物を導入することによって調製することができる。無菌の注射可能な液剤の調製用の無菌粉末剤の場合において、好ましい調製方法は、有効成分プラス予め無菌ろ過した溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥である。
【０２２９】
［０２３７］上述の組成物及び投与方法は、本発明のＮＩＳＣの製剤を投与する方法を記載するが、それに限定されないことを意味する。種々の組成物及び装置を製造する方法は、当業者の能力の範囲内であり、本明細書中には詳細に記載されない。
【０２３０】
［０２３８］不要な免疫応答の抑制におけるＮＩＳＣの活性の分析（定性及び定量の両方）は、本明細書中に記載され又は当該技術分野において既知の任意の方法によってなすことができ、限定されないが、抗原特異性制御Ｔ細胞の発生の測定、抗原寛容における導入又は促進の測定、Ｂ細胞のような特定の細胞群の増殖の抑制若しくは減少の測定、Ｔｈ１細胞及び／又はＴｈ２細胞分化の抑制又は減少の測定、樹枝状細胞（形質細胞性樹枝細胞を含む）及びＴ細胞（Ｔｈ１及び／又はＴｈ２細胞分化）のような特定の細胞群の成熟の抑制の測定、並びにサイトカイン、例えば、限定されないが、ＩＦＮ−α、ＩＬ−６、及び／又はＩＬ−１２の産生における抑制の測定を含む。特定の細胞型の数の測定は、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を用いて達成することができる。細胞の特定群の成熟化の測定は、細胞の成熟化の特定の段階に特異的なマーカー、例えば、細胞表面マーカーの発現を測定することによって達成することができる。細胞マーカー発現は、例えば、ＲＮＡ発現を測定し、あるいは、例えば、ＦＡＣＳ分析による特定のマーカーの細胞表面発現を測定することによって測定することができる。樹枝状細胞の成熟化の測定は、例えば、Ｈａｒｔｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：９３０５−９３１０に記載されるように実行することができる。サイトカイン濃度は、例えば、ＥＬＩＳＡによって測定することができる。固有の免疫応答を含む免疫応答の抑制を評価するこれらのアッセイ及び他のアッセイは、当該技術分野において周知である。
【０２３１】
本発明のキット
［０２３９］本発明は、キットを提供する。ある種の態様において、本発明のキットは、一般的に、本明細書中に記載される任意のＮＩＳＣを含む１以上の容器を含む。キットは、さらに、本明細書中に記載される任意の方法に関するＮＩＳＣの使用に関連した、適した組の指示、一般的に描写された指示を含んでもよい（例えば、不要免疫応答に対する反応の抑制、自己免疫応答の抑制、末梢寛容の誘導又は促進、自己免疫疾患の１以上の症候の改善、抗原特異的制御性Ｔ細胞の発生の刺激）。
【０２３２】
［０２４０］キットは、いずれかの便利な適したパッケージに包装されたＮＩＳＣを含んでもよい。例えば、ＮＩＳＣが乾燥製剤（例えば、凍結乾燥又は乾燥粉末）である場合、弾性ストッパーを含むバイアルが一般的に使用され、それは、ＮＩＳＣが、弾性ストッパーを通して流体物を注入することによって用意に再懸濁されてもよいためである。非弾性の取り外し可能な封入剤（例えば、シールされたガラス）又は弾性ストッパーを有するアンプルは、ＮＩＳＣの液剤に最も都合良く使用される。また、特定の装置、例えば、吸入器、鼻投与装置（例えば、噴霧器）、シリンジ又は注入装置、例えばポンプと併用した使用のパッケージが意図される。
【０２３３】
［０２４１］ＮＩＳＣの使用に関連する指示書は、一般的に、服用、服用スケジュール、及び意図された使用法のための投与経路に関する情報を含む。ＮＩＳＣの容器は、単位服用、バルクパッケージ（例えば、複数の服用パッケージ）又は副次的単位服用であってもよい。本発明のキットに供給される指示書は、典型的には、ラベル又はパッケージ挿入（例えば、キットに含まれるペーパーシート）に関する記載された指示書であり、機械による読み取り可能な指示書（例えば、磁気又は光学保存ディスク上に担持した指示書）もまた許容される。
【０２３４】
［０２４２］いくつかの態様において、本発明のキットは、投与用の複合体としてのＮＩＳＣ産物に関する材料、例えば、カプセル化材料、マイクロキャリア複合体材料等を含む。一般的に、キットは、ＮＩＳＣの別々の容器、及び複合体材料（又は複数）を含む。ＮＩＳＣ及び複合体は、好ましくは、供給されるＮＩＳＣ及び複合材料の混合に応じて、ＮＩＳＣ−複合体の形成を可能にする形体で供給される。この形体は、ＮＩＳＣ−複合体が非共有結合によって連結される場合に好ましい。この形体はまた、ＮＩＳＣ−複合体が異種二官能性架橋剤を介して架橋されるべき場合に好ましく；ＮＩＳＣ又複合体のいずれかが「活性化された」形体で供給される（例えば、ＮＩＳＣと反応性の部分が利用可能であるような異種二官能性架橋剤に連結される）。
［０２４３］下記の実施例は、限定されないが、本発明を例証するために提供される。
【実施例】
【０２３５】
実施例
実施例１：抗原の取り込み及び樹枝状細胞の成熟化
［０２４４］樹枝状細胞による抗原の取り込み及び提示におけるオリゴヌクレオチドの抗原への結合の効果を調べた。蛍光標識したオボアルブミン（Ａｌｅｘａ  ６４７に連結したＯＶＡ）は、ａ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド（５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（１０１８）配列番号７２）との混合物において、ｂ）免疫刺激性オリゴヌクレオチド（１０１８）に結合させて、又はｃ）非免疫刺激性オリゴヌクレオチド（（５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ−３’（１０４０）配列番号７３に結合させて、マウスの樹枝状細胞の培養物に添加した。その後、樹枝状細胞（ＤＣ）へ取り込まれたＡｌｅｘａ  ６４７蛍光は、標準的な方法を用いてフローサイトメトリーによって評価した。
【０２３６】
［０２４５］図１Ａ〜１Ｃに示されるように、ＩＳＳ結合体（１０１８−ＯＶＡ、中央のグラフ）及びＮＩＳＣ（１０４０−ＯＶＡ、右のグラフ）で処理したＤＣは、１０１８（混合物、左のグラフ）を混合した（結合していない）ＯＶＡと比較して蛍光が増加した。つまり、免疫刺激性オリゴヌクレオチド又は非免疫刺激性オリゴヌクレオチドへの結合は、樹枝状細胞による抗原の取り込みを促進する。
【０２３７】
［０２４６］オリゴヌクレオチド／抗原組成物とのインキュベーション後のマウスの樹枝状細胞の成熟化は、ＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６のような同時刺激性分子の上方制御によって評価した。図２−２Ｈに示されるように、ＮＩＳＣ（ＯＶＡ−Ｃ６６１（５’−ＴＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＴＧＣＡＡＧＣＡ−３’）配列番号２７及びＯＶＡ−１０４０（５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ−３’）配列番号７３）とのインキュベーション後、細胞成熟マーカーは、細胞培地単独でインキュベートした細胞上に見られるものと類似した。つまり、ＮＩＳＣは、樹枝状細胞の成熟化をほとんど誘導しないか又は全く誘導しない。対照的に、免疫刺激性オリゴヌクレオチド結合体ＯＶＡ−１０１８（５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’配列番号７２）は、細胞上の成熟マーカーのレベルを大いに誘導した。
【０２３８】
［０２４７］ヒト形質細胞性樹枝状細胞（ＰＤＣ）は、Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ．７３：７８１−９２に記載した方法を用いて単離した。ＰＤＣを分配して、２４時間、結合体又はオリゴヌクレオチドとインキュベートした。その後、成熟マーカーは細胞上で測定し、結果を表２に示す。
【０２３９】
【表５】
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【０２４０】
［０２４８］表２及び図２Ａ〜２Ｈに示すように、同様の結果は、ヒト血液から単離したＰＤＣ及びマウス由来のＤＣを用いて得られた。つまり、非常に高いレベルの取り込みを引き起こすにもかかわらず、ＮＩＳＣは、低いレベルの樹枝状細胞の成熟化のみを誘導する。
【０２４１】
実施例２：ＮＩＳＣ及びＮＩＳＣ活性化ＤＣへのインビボ応答
［０２４９］ＮＩＳＣ活性化ＤＣのインビボの寛容原性特性は、Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：２９３７−２９４６）に記載されるように、標的区画として肺が使用されるモデルにおいて評価される。この強力なシステムは、ＮＩＳＣ活性化ＤＣに対する応答の特徴付けを可能にする。オボアルブミン（ＯＶＡ）は、これらのアッセイにおいて抗原として使用される。
【０２４２】
［０２５０］１０6個のＮＩＳＣ活性化ＤＣは、２５ゲージの金属カテーテルを用いて麻酔されたＢＡＬＢ／ｃマウスの気管に注射される。マウスの他の群は、免疫刺激性オリゴヌクレオチド−ＯＶＡ結合体又はＯＶＡ単独でパルスされたＤＣを受けた。ＤＣ注射前の４８時間、２５×１０6個の精製したカルボキシフルオレセイン二酢酸スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）標識した未使用のＯＶＡ特異性ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、マウスに養子的に移入される。Ｔ細胞をＤＣに接触後、Ｔ細胞は、動物の肺から回収し、増殖について分析し、あるいはＫＪ１−２６に対して同時染色し、サイトカイン内容物に関して細胞に染色によってそれらのサイトカイン応答を分析するために脾臓細胞及びＯＶＡを用いてインビトロで再度刺激される。
【０２４３】
［０２５１］ＮＩＳＣ活性化ＤＣのインビボにおける寛容原性特性はまた、活性化したＤＣが動物のフットパッドに注射され、排液リンパ節におけるＴ細胞応答が評価されるモデルにおいて評価される。
【０２４４】
［０２５２］ＮＩＳＣ注射に対する直接的応答及びＯＶＡ又は無関係な抗原（例えば、ニワトリ卵白リゾチーム、ＨＥＬ）を用いたその後のインキュベーションの制御における効果の両方をマウスにおいて分析する。ＮＩＳＣ（ＯＶＡ）に対する直接的応答を評価するために、マウスは、２週間で週に１度（Ｄ０及びＤ７）、ＮＩＳＣ（ＯＶＡ）、免疫刺激性オリゴヌクレオチド−ＯＶＡ結合体、ＯＶＡ−Ａｌｕｍ又はＰＢＳで腹腔内（ｉ．ｐ．）に注射される。１４日で、抗体反応（ＯＶＡ特異的ＩｇＧ１、ＩｇＥ及びＩｇＧ２ａ）を測定するために採血し、フットパッドにＯＶＡをチャレンジされる。
【０２４５】
［０２５３］その後のＴｈ１又はＴｈ２応答におけるＮＩＳＣの効果を評価するために、マウスは、２週間で週に１度（Ｄ０及びＤ７）、ＮＩＳＣ（ＯＶＡ）、ＯＶＡ単独又はＰＶＳでｉ．ｐ．注射される。１４日で、マウスは、抗体反応を測定するために採血され、ＯＶＡ−Ａｌｕｍ（ｉ．ｐ．）又はＯＶＡ−ＣＦＡ（完全フロイントアジュバント）（皮下（ｓ．ｃ．））のいずれを受ける。１週間後、２１日で、マウスは、抗体反応を測定するために採血され、ＯＶＡでチャレンジされる。２５日で、抗体及び再応答を測定する。その代わりに、その後の免疫化は、抗原特異性の結果を扱うために、ＨＥＬのような無関係な抗原で実行される。その後の免疫化の障害、及びＮＩＳＣの前処理に応答したＴｈ１／Ｔｈ２反応の弱体化は、末梢寛容の誘導の指示である。
【０２４６】
［０２５４］インビボにおいてＣＤのＮＩＳＣ活性化によって誘導した抗原特異的寛容が治療的設置に効果的であろうかどうかを決定するために、既に確立したＴｈ１又はＴｈ２におけるＮＩＳＣ処置の効果を評価する。
【０２４７】
［０２５５］マウスは、はじめに、ＯＶＡ−Ａｌｕｍ（ｉ．ｐ．）（Ｔｈ２極性条件）又はＯＶＡ−ＣＦＡ（ｓ．ｃ．）（Ｔｈ１駆動状況）で注射される。開始から２週間後、マウスは、ＮＩＳＣ（ＯＶＡ）、ＯＶＡ単独又はＰＢＳ（ｉ．ｐ．）で２度（Ｄ１４及びＤ２１）免疫化を受ける。３５日に、最終免疫後から２週間、マウスは、動物のフットパッドにＯＶＡ注射でチャレンジされる。４日後（Ｄ３９）、マウスを屠殺し、そして、排液リンパ節から単離した細胞の抗体反応、並びに再度のＯＶＡ刺激に対するサイトカイン反応を測定する。抗原としてＨＥＬを用いた類似の実験は、ＮＩＳＣ（ＯＶＡ）誘導の末梢寛容がＯＶＡ抗原に特異的であるかどうかを測定するために実行される。
【０２４８】
［０２５６］前述の発明は明確性及び理解のために説明及び例の方法で幾分詳細に記載されているが、ある種の変化及び修飾が実行されてもよいことを当業者に明確であろう。したがって、記載及び例は、本発明の範囲を制限するものとして構築されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２４９】
【図１】［００２０］図１Ａ−１Ｃは、指定した組成物：ＯＶＡ及び免疫刺激性オリゴヌクレオチド１０１８（左）図１Ａ、免疫刺激性オリゴヌクレオチド（１０１８）−ＯＶＡ結合体（中央）図１Ｂ、非免疫刺激性オリゴヌクレオチド（１０４０）−ＯＶＡ結合体（右）図１Ｃを用いてインキュベートした後のマウスの樹枝状細胞によって取り込まれた抗原を示すグラフを記述する。
【図２】［００２１］図２Ａ−２Ｈは、培地のみ（図２Ａ−２Ｂ）又は指定した結合体：ＯＶＡ−Ｃ６６１（非免疫原性オリゴヌクレオチド）（図２Ｃ−２Ｄ）、ＯＶＡ０１０４０（非免疫刺激性オリゴヌクレオチド）（図２Ｅ−２Ｆ）、及びＯＶＡ−１０１８（免疫原刺激性オリゴヌクレオチド）（図２Ｇ−２Ｈ）でインキュベートした後のマウスの樹枝状細胞上の成熟マーカー（ＣＤ４０及びＣＤ８６）の発現を示すグラフを記述する。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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