(57)【要約】本装置は、集積化インピーダンス測定電極を有するマルチウェルサンプルモジュール、及び各ウェルにおけるインピーダンス変化の同時測定を可能にする電気接続方法を提供する。マルチウェルサンプルモジュールの集積化インピーダンス測定電極は、電界を各ウェル内に生成し、ウェル内容物の各々のインピーダンスの変化を測定可能とする。
2008534965.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
マルチウェルインピーダンス測定装置であって、
Ａ．分離された複数のサンプルを平板型アレイ構造にて収容する複数のチャンバであって、前記複数のチャンバは下面を有し、かつ該複数のチャンバは複数の貫通孔を含む上部プレートと下部プレートとから形成されており、前記下部プレートは上面及び下面を有し、前記上部プレートは上面及び下面を有し、前記下部プレートの上面は前記上部プレートの下面に密閉固着されている、複数のチャンバと、
Ｂ．前記複数のチャンバの下面及び前記下部プレートの上面に平坦に設けられる複数の機能的等価インピーダンス測定電極であって、該複数の電極は前記複数のサンプルに対して露出されており、かつ前記複数の電極の各々は該マルチウェルインピーダンス測定装置内の複数の他の電極の各々から電気的に絶縁されており、かつ前記複数の電極は上面及び下面を有している、複数の機能的等価インピーダンス測定電極と、
Ｃ．前記下部プレートの下面から前記複数の電極の各々と電気コンタクトを取るための接続手段と、
を備える、マルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項２】
前記サンプルは液体である、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３】
前記サンプルは固体である、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４】
前記サンプルは生物学的化合物である、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項５】
前記サンプルは分子である、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項６】
前記貫通孔は円筒形である、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７】
前記貫通孔は方形である、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８】
前記貫通孔は円錐形である、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項９】
前記上部及び下部プレートは、プラスチック、エラストマー、セラミックス、複合材料、ガラス、カーボン材料、またはこれらの材料の組み合わせのいずれかにより作製されている、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１０】
前記プラスチックは、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、シクロオレフィンポリマー、またはポリエステルである、請求項９記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１１】
前記プラスチックは射出成形可能なプラスチックである、請求項９記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１２】
前記下部プレートは透明である、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１３】
前記平板型アレイは２４個のウェルから成る、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１４】
前記平板型アレイは９６個のウェルから成る、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１５】
前記平板型アレイは３８４個のウェルから成る、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１６】
前記平板型アレイは８６４個のウェルから成る、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１７】
前記平板型アレイは１５３６個のウェルから成る、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１８】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は２つの同一電極から成る、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１９】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、電気メッキ、スパッタリング、蒸着、スクリーン印刷、またはパッド印刷によって前記下部プレートの表面に堆積された導電材料により形成されている、請求項１記載の機能的等価電極。
【請求項２０】
前記導電材料は、金、銀、インジウム錫酸化物、銅、または炭素繊維である、請求項１記載の機能的等価電極。
【請求項２１】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、単一層の導電材料により形成されている、請求項１記載の機能的等価電極。
【請求項２２】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、複数層の導電材料により形成されている、請求項１記載の機能的等価電極。
【請求項２３】
前記上部プレートは、接着層、熱ボンディング、または超音波ボンディングを使用して前記下部プレートに密閉固着されている、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項２４】
前記下部プレートの下面から前記複数の電極の各々と電気コンタクトを取るための接続手段は、前記下部プレートの下面に形成された複数の電気接触パッドと、前記下部プレートの上面に設けられた前記複数の電極に前記複数の電気接触パッドを接続する複数の導電ビアとを含む、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項２５】
前記複数の電気接触パッドは、電気メッキ、スパッタリング、蒸着、スクリーン印刷、またはパッド印刷によって前記下部プレートの下面に堆積された導電材料により形成されている、請求項２４記載の電気接触パッド。
【請求項２６】
前記導電材料は、金、銀、インジウム錫酸化物、銅、または炭素繊維である、請求項２５記載の電気接触パッド。
【請求項２７】
前記複数の電気接触パッドは、導電性インクとして塗布された導電粒子により形成されている、請求項２４記載の電気接触パッド。
【請求項２８】
前記導電粒子は、金、銀、白金、または炭素により作製されている、請求項２７記載の電気接触パッド。
【請求項２９】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、導電性インクとして塗布された導電粒子により形成されている、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３０】
前記導電粒子は、金、銀、白金、または炭素により作製されている、請求項２９記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３１】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、金属層及び導電性インクにより形成されている、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３２】
前記複数の導電ビアは、金属層及び導電性インクにより形成されている、請求項２４記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３３】
前記複数の電気接触パッドは、金属層及び導電性インクにより形成されている、請求項２４記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３４】
計測器によりプレート識別情報を読み取り可能な手段をさらに備える、請求項１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３５】
前記計測器によりプレート識別情報を読み取り可能な手段は、光学的に読み取り可能なパターン、電気的に読み取り可能なパターン、機械的パターン、ＲＦＩＤタグ、またはメモリチップを含む、請求項３４記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３６】
マルチウェルインピーダンス測定装置であって、
Ａ．分離された複数のサンプルを平板型アレイ構造にて収容する複数のチャンバであって、前記複数のチャンバは下面を有し、かつ該複数のチャンバは複数の孔を含むプレートから形成されており、前記複数の孔は前記プレートの一部分を貫通して延びている、複数のチャンバと、
Ｂ．前記複数のチャンバの下面に平坦に設けられる複数の機能的等価インピーダンス測定電極であって、該複数の電極は前記複数のサンプルに対して露出されており、かつ前記複数の電極の各々は該マルチウェルインピーダンス測定装置内の複数の他の電極の各々から電気的に絶縁されており、かつ前記複数の電極は上面及び下面を有し、前記プレートは前記複数の電極の周りに形成されている、複数の機能的等価インピーダンス測定電極と、
Ｃ．前記プレートの下面から前記複数の電極と電気コンタクトを取るための接続手段と、
を備える、マルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３７】
前記サンプルは液体である、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３８】
前記サンプルは固体である、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項３９】
前記サンプルは生物学的化合物である、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４０】
前記サンプルは分子である、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４１】
前記孔は円筒形である、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４２】
前記孔は方形である、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４３】
前記孔は円錐形である、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４４】
前記プレートは、プラスチック、エラストマー、セラミックス、複合材料、ガラス、カーボン材料、またはこれらの材料の組み合わせのいずれかにより作製されている、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４５】
前記プラスチックは、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、シクロオレフィンポリマー、またはポリエステルである、請求項４４記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４６】
前記プラスチックは射出成形可能なプラスチックである、請求項４４記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４７】
前記プレートは透明である、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４８】
前記平板型アレイは２４個のウェルから成る、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項４９】
前記平板型アレイは９６個のウェルから成る、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項５０】
前記平板型アレイは３８４個のウェルから成る、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項５１】
前記平板型アレイは８６４個のウェルから成る、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項５２】
前記平板型アレイは１５３６個のウェルから成る、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項５３】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は２つの同一電極から成る、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項５４】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、スパッタリング、蒸着、スクリーン印刷、またはパッド印刷によって前記フレームに堆積された導電材料により形成されている、請求項３６記載の機能的等価電極。
【請求項５５】
前記プレートは前記フレーム上に成形されている、請求項５４記載の機能的等価電極。
【請求項５６】
前記導電材料は、金、銀、インジウム錫酸化物、または炭素繊維を含む、請求項３６記載の機能的に等価な電極。
【請求項５７】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、単一層の導電材料により形成されている、請求項３６記載の機能的等価電極。
【請求項５８】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、複数層の導電材料により形成されている、請求項３６記載の機能的等価電極。
【請求項５９】
前記プレートの下面から前記複数の電極の各々と電気コンタクトを取るための接続手段は、前記プレートの下面に位置する複数の電気接触パッドと、前記プレートの上面に設けられた前記複数の電極に前記複数の電気接触パッドを接続する複数の導電ビアとを含む、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項６０】
前記複数の電気接触パッドは、電気メッキ、スパッタリング、蒸着、スクリーン印刷、またはパッド印刷によって前記プレートの下面に堆積された導電材料により形成されている、請求項５９記載の電気接触パッド。
【請求項６１】
前記導電材料は、金、銀、インジウム錫酸化物、銅、または炭素繊維である、請求項６０記載の電気接触パッド。
【請求項６２】
前記複数の電気接触パッドは、導電性インクとして塗布された導電粒子により形成されている、請求項５９記載の電気接触パッド。
【請求項６３】
前記導電粒子は、金、銀、白金、または炭素により作製されている、請求項６２記載の電気接触パッド。
【請求項６４】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、導電性インクとして塗布された導電粒子により形成されている、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項６５】
前記導電性インクは、金、銀、白金、インジウム錫酸化物、ポリマー、または炭素により作製されている、請求項６４記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項６６】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、金属層及び導電性インクにより形成されている、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項６７】
前記複数の導電ビアは、金属層及び導電性インクにより形成されている、請求項５９記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項６８】
前記複数の電気接触パッドは、金属層及び導電性インクにより形成されている、請求項５９記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項６９】
計測器によりプレート識別情報を読み取り可能な手段をさらに備える、請求項３６記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７０】
前記計測器によりプレート識別情報を読み取り可能な手段は、光学的に読み取り可能なパターン、電気的に読み取り可能なパターン、機械的パターン、ＲＦＩＤタグ、またはメモリチップを含む、請求項６９記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７１】
マルチウェルインピーダンス測定装置であって、
Ａ．分離された複数のサンプルを平板型アレイ構造にて収容する複数のチャンバであって、前記複数のチャンバは下面を有し、かつ該複数のチャンバは複数の貫通孔を含む上部プレートと下部プレートとから形成されており、前記下部プレートは上面及び下面を有し、前記上部プレートは上面及び下面を有し、前記下部プレートの上面は前記上部プレートの下面に密閉固着されている、複数のチャンバと、
Ｂ．前記複数のチャンバの下面及び前記下部プレートの上面に平坦に設けられる複数の機能的等価インピーダンス測定電極であって、該複数の電極は前記複数のサンプルに対して露出されており、かつ前記複数の電極の各々は該マルチウェルインピーダンス測定装置内の複数の他の電極の各々から電気的に絶縁されており、かつ前記複数の電極は上面及び下面を有している、複数の機能的等価インピーダンス測定電極と、
Ｃ．前記下部プレートの下面から前記複数の電極の各々と電気コンタクトを取るための接続手段と、
Ｄ．計測器によりプレート識別情報を読み取り可能な手段と、
を備える、マルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７２】
前記サンプルは液体である、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７３】
前記サンプルは固体である、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７４】
前記サンプルは生物学的化合物である、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７５】
前記サンプルは分子である、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７６】
前記貫通孔は円筒形である、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７７】
前記貫通孔は方形である、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７８】
前記貫通孔は円錐形である、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項７９】
前記上部及び下部プレートは、プラスチック、エラストマー、セラミックス、複合材料、ガラス、カーボン材料、またはこれらの材料の組み合わせのいずれかにより作製されている、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８０】
前記プラスチックは、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリイミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエチレンテレフタレート、シクロオレフィンポリマー、またはポリエステルである、請求項７９記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８１】
前記プラスチックは射出成形可能なプラスチックである、請求項７９記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８２】
前記下部プレートは透明である、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８３】
前記平板型アレイは２４個のウェルから成る、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８４】
前記平板型アレイは９６個のウェルから成る、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８５】
前記平板型アレイは３８４個のウェルから成る、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８６】
前記平板型アレイは８６４個のウェルから成る、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８７】
前記平板型アレイは１５３６個のウェルから成る、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８８】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、２つの同一電極から成る、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項８９】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、スパッタリング、蒸着、スクリーン印刷、またはパッド印刷によって前記下部プレートの表面に堆積された導電材料により形成されている、請求項７１記載の機能的等価電極。
【請求項９０】
前記導電材料は、金、銀、インジウム錫酸化物、または炭素繊維である、請求項７１記載の機能的等価電極。
【請求項９１】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、単一層の導電材料により形成されている、請求項７１記載の機能的等価電極。
【請求項９２】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、複数層の導電材料により形成されている、請求項７１記載の機能的等価電極。
【請求項９３】
前記上部プレートは、接着層、熱ボンディング、または超音波ボンディングを使用して前記下部プレートに密閉固着されている、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項９４】
前記下部プレートの下面から前記複数の電極の各々と電気コンタクトを取るための接続手段は、前記下部プレートの下面に位置する複数の電気接触パッドと、前記下部プレートの上面に設けられた前記複数の電極に前記複数の電気接触パッドを接続する複数の導電ビアとを含む、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項９５】
前記複数の電気接触パッドは、電気メッキ、スパッタリング、スクリーン印刷、またはパッド印刷によって前記下部プレートの下面に堆積された導電材料により形成されている、請求項９４記載の電気接触パッド。
【請求項９６】
前記導電材料は、金、銀、インジウム錫酸化物、銅、または炭素繊維である、請求項９５記載の電気接触パッド。
【請求項９７】
前記複数の電気接触パッドは、導電性インクとして塗布された導電粒子により形成されている、請求項９４記載の電気接触パッド。
【請求項９８】
前記導電粒子は、金、銀、白金、または炭素により作製されている、請求項９７記載の電気接触パッド。
【請求項９９】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、導電性インクとして塗布された導電粒子により形成されている、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１００】
前記導電性インクは、金、銀、白金、インジウム錫酸化物、ポリマー、または炭素により作製されている、請求項９９記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１０１】
前記複数の機能的等価インピーダンス測定電極は、金属層及び導電性インクにより形成されている、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１０２】
前記複数の導電ビアは、金属層及び導電性インクにより形成されている、請求項９４記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１０３】
前記複数の電気接触パッドは、金属層及び導電性インクにより形成されている、請求項９４記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【請求項１０４】
前記プレート識別情報を読み取り可能な手段は、光学的に読み取り可能なパターン、電気的に読み取り可能なパターン、機械的パターン、ＲＦＩＤタグ、またはメモリチップを含む、請求項７１記載のマルチウェルインピーダンス測定装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本装置は、細胞の活性化を非標識（label-free）でリアルタイムに検出するスクリーニング装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
化合物の大規模ライブラリを生成する組み合わせライブラリ（combinatorial library ）法の確立、及び化学実験及び生物学実験の小規模化及び自動化の改善に伴い、生物学的（細胞）環境が存在するか存在しないかによらず、このようなライブラリをスクリーニングして分子ターゲットに結合させる方法に関心が高まっている。
【０００３】
［ＨＴＳ法］
最も広く使用されるスクリーニング方法は、標識化作動薬を利用する抗体や受容体のような選択ターゲットタンパク質に対するライブラリ化合物の競合結合または非競合結合である。この方法は多くの場合、ハイスループットスクリーニング装置で行なわれ、当該スクリーニング装置は、複数の分離マイクロウェルを基板表面に画定し、かつ各ウェル内の構造を測定するマルチウェル装置から成る。分析をハイスループット化するために種々の技術が開発されている。マルチウェル分析プレートを使用することにより並列処理が可能になり、一つのプレートの複数のウェルに分散する複数のサンプルの分析が可能になる。通常、サンプル及び試薬は、マルチウェル分析プレート（マイクロプレートまたはマイクロタイター（microtiter）プレートとしても知られる）に保存され、当該プレートで処理され、および／または分析される。分析では通常、各ウェルのサンプルの光学測定または放射能測定を行なう。マイクロタイタープレートは通常、分析内容を収容する容器として機能する。多くの場合、プレートの表面は、当該表面が複数の分析成分のうちの一つ以上の成分との結合の影響を多かれ少なかれ受け易くなるように処理される。別の構成として（非常に稀であるが）、マイクロタイタープレートは、異なる測定の実施を可能にする各ウェルの電極群のような構造と組み合わせることができる。
【０００４】
［種々の電極構造］
複数の電極構造がマイクロウェルプレートに使用されている。米国特許出願公開第２００２／００２５５７５号明細書は、ウェルへの挿入に適合させた一対の電極と、低電圧のＡＣ信号を複数の電極に印加する回路とを開示している。この回路は、当該複数の電極をテストサンプルに沈めたときに、それら複数の電極に低電圧のＡＣ信号を印加する。これらの電極に流れる電流を同時測定することにより、テスト化合物における成長または代謝活性のレベルをモニタリングすることができる。電極構造を各プレートウェルに挿入することにより、ハイスループットプロセスが煩雑になり、スループット（処理速度）が下がるので、電極を集積化することが必要であった。基板は複数の分離マイクロウェルを画定し、この場合、マルチ電極カバープレートに取り付けられる電極ピンは、カバーが基板を覆うように載置されると液体に浸漬される。
【０００５】
キャディ（Cady）らは米国特許第４，０７２，５７８号明細書において、バクテリアの測定を行なう検出器を備えたマイクロタイタープレート型チャンバアレイを開示している。この装置は、プレートの下面から垂直に突出する電極群を有する。突出電極によってマイクロウェルの流体のバルクを測定するが、電極上の細胞層の堆積を測定することはできない。ジャイバー（Giaver）らは米国特許第５，１８７，０９６号明細書において、作用電極及び基準電極の構造だけでなく、複数の電極層及び絶縁層を利用する細胞インピーダンス測定システムを示唆している。この装置は、電極プレートのエッジの上面に接触するプローブによって、インピーダンス測定システムに接続される。
【０００６】
ファン  デル  ワイド（Van der Weide ）らは米国特許第６，６４９，４０２号明細書において、電極群を備えるマイクロプレートに特許性があると主張し、これらの電極群をウェルを通して互いに接続して、各ウェルにおける電極群の間の容量または抵抗、或いは両方の測定を可能にし、各ウェルにおける容量または抵抗の経時変化は、成長培地におけるバクテリアの成長速度に関連付けられる。プレートの上部から導入されるプローブ群、及びプレートの下部に配置される電極群が検出装置を構成する。
【０００７】
幾つかのマイクロプレートは、能動電極、基準電極及び対向電極を該マイクロプレート構造に組み込んでおり、ｐＨ（酸性化）、イオン強度、または還元／酸化（酸化還元）電位の変化を検出する。ツクダ（Tsukuda ）らの欧州特許出願第１１３６８１９号明細書は、複数のセルを有するマイクロプレートにおいて、各セルが、各ウェルの下面に形成される２つの電極を有する構成を説明しているが、ツクダ（Tsukuda ）の酸素検出電極構造には、能動電極、対向電極、及び基準電極の構造を使用する必要がある。パービス（Purvis）は英国特許出願第２３８６９４９号明細書において、マルチウェルプレートに特許性があると主張する。このマルチウェルプレートでは、電解液のｐＨ、イオン強度、または化学組成の変化に対する全細胞の反応が電気化学的に分析される。プレートは複数のウェルを含み、これらのウェルの少なくとも一つは検出電極及び当該検出電極に接続される基準電極、及び任意に別の対向電極を有する。酸化還元反応は、従前から直流電圧を利用して行なわれ、かつ酸化還元反応に関連する電流は全ての細胞系の電気化学的平衡を崩すので、集積化酸化還元電極構造は、細胞の活性化をリアルタイムでモニタリングしようとするシステムに使用することができない。
【０００８】
電気化学発光（electrochemiluminescence:ECL）を利用する分析測定装置も能動電極、基準電極、及び対向電極を組み込むだけでなく、作用電極上で通常、不動態化されるＥＣＬ試薬、及びＥＣＬ試薬が活性化されると生じる反応により放出される発光強度を測定するシステムを利用する。これについては、譲受人：メソ  スケール  テクノロジー（Meso Scale Technologies ）の米国特許出願公開第２００４／００２２６７７号明細書に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
［新規技術の必要性］
電気的試験をマルチウェルプレートで行なうことによる利点が得られる一方で、ウェル数の増加に伴ない、多くの電気コンタクトが必要になるということが課題の一つとして挙げられる。ウェル当り２つの電気コンタクトが必要になる場合、９６個のウェルプレートを設けると１９２個の電気コンタクトが必要になり、３８４個のウェルプレートを設けると７６８個の電気コンタクトが必要になり、１５３６個のウェルプレートを設けると３０７２個の電気コンタクトが必要になる。幾つかの適用例では、必要な電気コンタクトの数は、一つ以上の導体を互いに接続することにより減らすことができるが（例えば、電極群が一つの共通接地線を共有する）、この構成は、接続導体を共有するウェル群の間で干渉が発生する可能性があり、かつ複数のウェルを同時に測定する機能が低下することにより望ましくない場合がある。必要な電気接続の数が少ない場合、ウェル群の電極群は、エッジタイプコネクタを用いることができるマイクロタイタープレートのエッジに達する電気接続線に接続することができる。必要な電気接続の数が多くなる場合、エッジ接続は不便になる。この場合、マイクロタイタープレートの下部の全表面積を使用することが望ましい。
【００１０】
必要なのは、安価で、使い捨てであり、量産可能な、かつ多くの情報を測定可能な装置、及び交流電圧が電極群に印加されるときに細胞インピーダンスとして現われる細胞群の反応を測定できる、アドレス指定可能な集積化電極である。この装置は、信号増幅を生じることなく、または細胞の電気化学的平衡を崩すことなく動作する必要がある。この装置は、容易に作成することができ、かつ共通マイクロプレート自動分析システムに適用することができるマイクロタイターフォーマットで動作する必要がある。必要とされる装置によって、利用可能な表面が極めて広くなって、複数の電気接続を行なって更に多くのウェルを正確に、かつ同時に測定することができるようにする必要がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本装置は、サンプル測定を行なうサンプルモジュール（サンプルプレートであることが好ましく、マルチウェルサンプルプレートであることが更に好ましい）及び装置に関する。装置のサンプルモジュールは、一つ以上のサンプル測定を行なう一つ以上の、好適には複数のウェル、チャンバ、及び／又はサンプル領域を含むことができ、この場合、サンプルは、液体、固体、細胞、または生物学的化合物を含むことができる。ウェル（well）、チャンバ（chamber ）、及びサンプル領域（sample region ）という用語は、本装置においては同じ意味を有するものとして定義される。好適には、これらのウェル、チャンバ、及び／又はサンプル領域は、導体と接触するサンプルのインピーダンスを測定する一つ以上の電気導体を含む。
【００１２】
マルチウェルサンプルプレートは種々の要素、例えば複数の貫通孔を有する上部プレート、下部プレート、ウェルまたはチャンバ、機能的に等価な導体、誘電体材料、電気接続線、プレート識別手段、及びサンプル試薬を含むことができる。プレート群のウェル群は上部プレートの貫通孔または開口によって画定することができる。下部プレートは上部プレートに（直接、または他の部品と組み合わせて）密閉固定することができ、かつウェルの底部として機能することができる。マルチウェルサンプルプレートは、いかなる個数、また、いかなるサイズまたは形状のウェルまたはチャンバも有することができ、これらのウェルまたはチャンバは、いかなるパターンまたは構成にも配置することができ、更にマルチウェルサンプルプレートは種々の異なる材料により作製することができる。便利なことに、幾つかの標準が、ハイスループット分析のサンプルを処理するために使用される計測のために提示されている。本装置の好適な実施形態では、産業標準フォーマットをプレート及びウェルの個数、サイズ、形状、及び構成に関して使用する。
【００１３】
マルチウェルサンプルプレートは通常、標準のサイズ及び形状に作製され、かつ標準のウェル構成を有する。ウェルの幾つかの高性能の構成は、９６ウェルプレート、３８４ウェルプレート、１５３６ウェルプレート、及び９６００ウェルプレートに設けられる複数のウェルを含み、これらのウェルは２次元アレイ状に構成される。他のフォーマットはシングルウェルプレート（複数の分析領域を有することが好ましい）、２ウェルプレート、６ウェルプレート、２４ウェルプレート、及び６１４４ウェルプレートを含むことができる。生物分子スクリーニング学会（The Society for Biomolecular Screening: SBS ）は、種々のプレートフォーマットに関する推奨の標準マイクロプレート仕様（http://www.sbs-online.org）を発行しており、ここで参照されることにより、この推奨の仕様が本明細書に組み込まれる。標準化プレートフォーマットで行なわれる分析では、分析プレートを格納および移動させるための機器を容易に利用可能となるだけでなく、液体をプレートに分注し、液体をプレートから取り出すための機器を容易に利用可能となる。
【００１４】
本装置によれば、複数の機能的に等価な導体がインピーダンス測定電極の形態でウェルに組み込まれる。本装置は、種々の新規の構成、及びマルチウェル分析プレート内の導体の材料、及び接続先のインピーダンス測定システムとのこれらの導体による接続を示す。本装置のマルチウェル分析プレートは１回のみ使用することができるように設計され、プレートが廃棄される適用に特に適合させている。或る実施形態では、マルチウェルプレートの一つのウェルは複数の領域を含むことができる。
【００１５】
本装置は、インピーダンス測定電極の形態の機能的に等価な導体を使用し、電流を測定するプロセスに関するものであり、このようなプロセスに使用される分析プレート装置及び方法を含む。本装置は更に、電流を、例えば機能的に等価な導体において生じさせ、および／または測定するために使用することができる装置に関する。本装置の別の態様は、分析を行なう方法に関するものであり、当該分析では、分析プレートから得られるインピーダンスを測定する。本装置の更に別の態様は、分析プレート及びプレート構成要素（例えば、プレート底部、プレート上部、及びマルチウェルプレート）に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本装置は、種々の異なるタイプの測定を行なう計測手段及び方法を含む。本装置は分析プレート、プレート部品、及びインピーダンスを利用する細胞分析を行なう方法を含む。本装置は、種々の新規の構成、及び／又は分析プレート内の特にマルチウェル分析プレート内の機能的に等価な導体の材料について記載する。
【００１７】
図１に示すように、本装置は、一つ以上の分析を行なうシングルウェルプレートまたはマルチウェルプレート１１０に関連し、プレートは上部プレート及び下部プレートにより形成され、かつ分析プレートは複数のウェル１３０（及び／又はチャンバ）、及び機能的に等価な導体ペア１５０を各ウェルまたはチャンバ内に有する。装置２１０（図２に示す）の一つの実施形態によれば、上部プレート２２０は、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、または射出成形して、射出加工して、または組み立てて所望の構造にすることができる他のプラスチックのような高硬度の熱可塑性材料により作製される単体の成形構造である。下部プレート２６０は、ポリエチレンテレフタレート（マイラー（mylar ）またはＰＥＴとして広く知られている）、ポリイミド、ポリカーボネート、ポリスチレン、またはシクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）により作製される。別の実施形態では、上部プレート２２０及び下部プレート２６０の材料は、複数のプラスチックの組み合わせを含むことができ、また、高衝撃ポリスチレンと混合して材料の輝度を下げるプラスチックを含むことができる。別の構成として、上部プレート２２０及び下部プレート２６０は、適切な形状に成形することができる材料であれば任意の材料によって作製することができる。プラスチック類、エラストマー類、セラミックス類、複合材料、ガラス、カーボン材料などのような材料を使用することができる。上部プレート２２０及び下部プレート２６０は、生物学的分析に通常使用される試薬をほとんど浸透させず、生体分子を吸収し難く、水を浸透させず、かつ化学ライブラリを溶解するために通常使用される有機溶剤を浸透させない材料により作製され、中程度の熱に耐えることができることが好ましい。上部プレート２２０及び下部プレート２６０は更に、十分に安価であることによって装置を１回使用した後に廃棄することができ、経済的に大きな負担となることがない、または地球環境に大きな影響を及ぼすことがない材料により作製される。
【００１８】
下部プレート２６０はプラズマ発生チャンバ内でエッチングして汚染箇所の表面をクリーニングし、通常は疎水性の基板材料を改質することができる。この処理は、所定の細胞タイプの付着及び生存を向上させることが知られており、かつ細胞成長が望ましい形で行なわれる使い捨ての実験用プラスチックに広く使用される。
【００１９】
上部プレート２２０は、プレート２１０が分析システムに導入されたときに、当該プレート２１０を効率的に温度制御することができるように平坦である必要がある。分析を行なっている期間中、マイクロプレート２１０を温度制御表面に押し付けて、ウェルの内容物の温度を一定に維持する。温度制御表面は、複数の孔を有するアルミニウムから成る平坦ブロックとすることができ、これらの孔を通して、接続先のインピーダンス測定システムの電気接続ピンが突出する。別の構成として、マイクロプレート２１０と温度制御表面との間のコンタクトを強くするために、弾性熱伝導層を温度制御表面と装置との間に設けることができる。
【００２０】
通常、室温と３７℃（または、昆虫細胞の場合は４２℃）との間で行なわれる分析の温度制御は２つの理由により重要である。第１に、装置の中で行なわれる細胞活性化分析は、化合物を細胞に添加する前と添加した後のインピーダンス差を使用して定量化されるということである。分析中の緩衝液または細胞の温度の変化によるインピーダンスの不特定変化は、望ましい高精度測定に悪影響を与える。第２に、単純な分子相互作用から複雑な細胞シグナル経路に渡る全てのタイプの生物学的活動は、温度の変化の影響を受け易いということである。これらの理由により、分析中の装置に対する温度制御は重要であり、設定温度の１度以内か、または０．５度以内、さらには０．１度以内に制御することが望ましい。
【００２１】
プレートはどのような厚さとすることもできるが、下部プレート２６０の厚さを最適化して透明度を最大にし、熱伝導率を最大にするのが好ましい（ウェルの内容物の温度は、下部プレートを温度制御表面に接触するように配置することにより制御されるからである）。上部プレート及び下部プレートの厚さは０．００１インチ〜０．０４３インチの範囲であり、更に好適な厚さは約０．００５インチである。下部プレート２６０の厚さ、及び材料を選択することによって、ウェル２３０の底部で成長する細胞の目視評価を可能にするために十分な大きさの透明度が確保されることが好ましい。下部プレート２６０は、プラスチック膜のような性質を持つために十分に薄いことが好ましく、このように構成された下部プレート２６０は上部プレート２２０の底部に固着させる。
【００２２】
上部プレート２２０及び下部プレート２６０を互いに密閉固定することにより分析プレート２１０を構成する。結果として得られるマイクロプレートでは、いずれのウェルからの流体のリークも防止されるので、プレートからのリーク、及びウェル間のリークの両方が防止される。密閉方法によって、投与実験に通常使用される培地、緩衝液、及び溶剤に曝されても安定している構造が形成される必要もある。プレート群は、これらの流体と数日間に渡って接触したままであると予測されるが、接着体系がこの期間の間は変わらないことが必要である。逆に、ウェルの内容物は決して密閉方法によって変化してはならない。例えば、接着プロセスに使用される接着剤は、細心の注意を払って選択して、分析中の細胞成長または細胞反応に対する悪影響を回避する必要がある。
【００２３】
一つの実施形態によれば、接着層２４０を用いて、上部プレート２２０を下部プレート２６０に接着させるとともにウェル間の密閉も行なう。接着層２４０は、ダイカットされた接着剤転写テープ（接着剤のみから、または接着面を持つフィルムから成る）、及び／又は薄膜層として接着表面全体に渡って、及び／又は各ウェルの周りに塗布される硬化性接着剤（例えば、常温硬化型のシアノアクリレート材料またはＵＶ硬化材料）を含むことが好ましい。接着剤の化学特性は、分析中に細胞の成長または反応に悪影響を全く及ぼすことがないように選択する必要がある。下部プレート２６０を可撓性材料とすることにより、下部プレート２６０を上部プレート２２０に接着剤により容易に接着させることができる。
【００２４】
別の実施形態では、上部プレート２２０及び下部プレート２６０はインサート成形（または熱ボンディング）または超音波ボンディングを使用して密閉接着される。インサート成形の場合、下部プレート２６０が射出成形機の内部に配置され、上部プレート２２０が下部プレート２６０の上に直接成形される。溶融プラスチックが下部プレートに接着され、冷却される。超音波ボンディングの場合、上部プレート２２０及び下部プレート２６０は加圧接着され、同時に、高周波数振動によって、上部プレート２２０のプラスチックと下部プレート２６０のプラスチックとの間に局所溶融及び局所的な接着が生じる。
【００２５】
上部プレート２２０に形成される貫通孔２１５は、上部プレート２２０が下部プレート２６０に密閉接着されると分析プレート２１０のウェル２３０を構成する。貫通孔２１５は、上部プレート２２０に射出成形または射出加工により形成されることが好ましく、通常、直径が約１ｍｍ〜２８ｍｍの円筒形、矩形、または円錐形である。９６ウェルプレートにおける貫通孔２１５の直径は１ｍｍ〜７ｍｍであることが一層好ましい。通常、射出成形を使用する場合、孔２１５にわずかな勾配が生じ、上部の直径は下部の直径よりもわずかに大きい。直径は、分析を完成させ、かつウェルの下面の面積を最小にするために必要な材料の量を少なくして、分析を行なうために必要な細胞の数を最小にするように最適に選択される。装置の一つの好適な実施形態によれば、分析プレート２１０は一つ以上の分析ウェル２３０即ちチャンバ（例えば、分析反応が生じる、および／または分析シグナルが放出される分析プレート表面の上の離散位置）を含む。別の実施形態は２個以上の、６個以上の、２４個以上の、９６個以上の、３８４個以上の、１５３６個以上の、または９６００個以上のウェルを含む。一つの特定の実施形態によれば、分析プレートはマルチウェル分析プレートであり、マルチウェル分析プレートは６ウェル、２４ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルといった標準のウェル構成を有する。
【００２６】
本装置によれば、インピーダンス測定電極の形態の複数の機能的に等価な導体２５０はウェル群の各々に組み込まれる。本装置では、マルチウェルサンプルプレートに収容される電極に関する種々の新規の構成及び材料について説明する。インピーダンス測定電極２５０は、下部プレート２６０の上面にアレイ状に形成されて、ウェル壁を構成する貫通孔２１５を含む上部プレート２２０が下部プレート２６０に密閉接着された後に、機能的に等価な電極群２５０が、形成ウェル２３０の底部に設けられるようになる。図３に示す複数のインピーダンス測定電極３５０によって回路３１０が各マイクロ分析プレートウェル３３０の底部に完成し、この回路によって細胞活性化中のインピーダンス変化をモニタリングすることができる。酸化還元反応に使用され、酸化がアノードで生じ、還元がカソードで生じる電気化学センサとは異なり、この装置のインピーダンス測定電極は消費されることがなく、かつ酸化または還元が電極表面で生じることがない。これらの電極は化学的に不活性である。インピーダンス測定手段がこの装置に接続される場合、これらの導体３５０の各々は機能的に等価であり、電極群の各電極上の細胞は細胞活性化時に生じるインピーダンス変化の原因となる。
【００２７】
インピーダンス測定電極３５０は導電材料から成る単一層または複数層により形成される。導電材料は細胞成長の影響を受け易い表面を有する金属材料または非金属材料であることが好ましい。好適な金属導電材料として、金、銀、及び白金を挙げることができる。好適な非金属導電材料として、ＩＴＯ、導電ポリマー、及び炭素繊維を挙げることができる。好適な導電材料は、生物学的分析に通常使用される有機化合物及び無機化合物に対して不活性であり、かつインピーダンス測定に使用される低電圧（１００ｍＶ）での電気化学反応に利用されることがない。
【００２８】
インピーダンス測定電極３５０は金属を均一層から基板材料全体に渡って除去する負のプロセスによって作製することができる。均一金属は、従来のスパッタリングまたは蒸着手段を使用して下部プレートの表面にスパッタリングまたは蒸着によって形成することができ、これによって数ナノメートルから数ミクロンの膜厚の薄膜が形成される。好適な膜厚は５０ｎｍである。５０ｎｍの膜厚の金層は半透明であり、かつこの金層によって電極群上の細胞群を共通の実験顕微鏡を使用して分析することができる。別の構成として、金属層は下部プレートの表面に電気メッキまたは積層法により形成することができる。堆積した後、均一金属層をパターニングしてインピーダンス測定電極をフォトリソグラフィ露光及び化学エッチングを使用して形成することができる、または金属はレーザアブレーションプロセスにより除去することができる。そして、除去されない金属が電極として構成される。
【００２９】
別の構成として、インピーダンス測定電極３５０は、導電性インクのスクリーン印刷やパッド印刷のような印刷プロセスのアディティブ法（additive method ）によって作製することができる。銀、金、白金、及び／又は炭素粒子を含有する導電性インクをこの目的に使用することができる。デュポン（Dupont）社及びアシュソン（Acheson ）社のような会社が製造する導電性インクが、これらの材料として使用される代表的な例である。金は、粒子の導電率が高く、かつ不活性度が高く、電極の表面が周囲雰囲気による、かつ分析ウェル３３０に使用することができる流体による劣化に対する耐性が高くなるという点で好ましい導電材料である。また、その不活性特性により、金は細胞に対して毒性を有することがない。０．２５〜１０ミクロンの範囲の金粒子をインクに使用することができ、インクを薄膜層に塗布して電極を形成する。更に、電極は金属層及び導電性インクを組み合わせることにより形成することができる。
【００３０】
電極３５０のパターンの寸法は５ミクロン〜３ミリメートルの範囲であり、１０ミクロン〜２５０ミクロンが好ましい範囲である。同様に、電極群３５０の間隔は５ミクロン〜３ミリメートルとすることができ、好適な範囲は、１０ミクロン〜２５０ミクロンである。パターンの間隔は狭いことが好ましい。この理由は、このような間隔のパターンにより形成される電気回路は分析に使用される緩衝液に対する温度変化及び蒸発変化の影響を受け難いからである。均一電界領域をマイクロプレートの底部の検出表面積全体に渡って形成することができる電極構造が好ましい。一つの実施形態では、電極構造は相互に噛み合う櫛歯状フィンガ構造であり、フィンガ幅及びギャップ幅はほぼ同じ寸法である。別の構造は、図４に示すように直線形または円形の２つの対向電極を有する簡易構造である。
【００３１】
ウェル内部の電極群と、プレートが動作するときの接続先となるインピーダンス測定システムとの間の接続を可能にするために、装置には、下部プレートの下面に配置されるアレイ状の複数の導電接触パッド（または電気接触パッド）と、これらの接触パッドを下部プレートの上面の電極群に接続するアレイ状の複数の導電ビアとが設けられる。図５（ウェルの側部断面の拡大図）に示すように、インピーダンス測定システムとの電気コンタクトは電気接触ピン５６５を通して行なわれ、電気接触ピンは、装置が接続先のインピーダンス測定システムに収容されるときに装置に接触する。下部プレート５６０の下面に配置される電気接触パッド５２５は、スパッタ成膜された金または銀インクのような導電材料から成る円形ターゲットまたは長円形ターゲットである。パッドのサイズは、ピン５６５の位置の公差内で、かつシステム内部へのプレートの配置の公差内で、必ず接触が保証されるように選択される。パッドは下部プレート５６０上で、電極５５０を下部プレート５６０の上面でパターニングするために使用される同じ処理工程を使用することにより、すなわち、金をスパッタリングして除去するか、または銀インクのような導電性インクをスクリーン印刷することによりパターニングすることができる。
【００３２】
下部プレート５６０の反対表面に位置する電気接触パッド５２５と電極５５０との間の電気コンタクトを取るために、導電ビア５４５を下部プレート５６０内部に形成する。これらのビア５４５は、まず下部プレート５６０にアレイ状の孔を開口することにより形成される。孔の開口は従来の加工法、レーザ加工法、または超音波ドリル法により行なうことができる。レーザドリル及び超音波ドリルを使用して、ガラスのような壊れ易い材料により作製される下部プレートに孔をドリル開口することができる。下部プレート５６０が薄いプラスチックフィルムにより作製される場合、レーザドリルは、直径が約１５０ミクロンの孔をドリル開口する高速の簡便法である。複数の孔を形成した後、これらの孔に導電材料を、導電材料が下部プレート５６０の反対表面に位置する電極５５０及び電気接触パッド５２５に接触するようにコーティングして埋める、または充填することにより、孔に導電ビア５４５を形成することができる。更に、導電接触パッド及び導電ビアは金属層及び導電性インクを組み合わせることにより形成することができる。
【００３３】
スパッタ成膜された金を使用して電極５５０及びパッド５２５の両方を形成する一つの実施形態では、孔はスパッタリングプロセスの前にドリル開口する。このようにして、スパッタ成膜された金によって開口孔の内側表面をコーティングして、導電ビアを形成することもできる。電極５５０及びパッド５２５が導電性インクを使用してスクリーン印刷により形成される別の実施形態では、既にドリル開口されている孔にインクをこれらの他のパターンを印刷している間にコーティングすることができる。
【００３４】
図６に示す別の実施形態では、電極６５０は、スパッタ成膜された５０ｎｍの膜厚の金により作製され、パッド６２５は導電性銀インクを印刷することにより作製される。更に別の電気パッド６２５を下部プレート６６０の上面に追加してビア６４５と電極６５０との間の電気的な連続性を確保する。この実施形態では、上部導電性インクパッド６２５は、下部プレート６６０の上面にスクリーン印刷により形成され、ドリル開口孔及び電極６５０の両方を横切る。この印刷工程の間に、導電性インクはビアホール６４５にも充填される。従って、下部プレート６６０の下面に印刷により形成された電気接触パッド６２５を形成するために印刷されたインクは上部電気パッド６２５を形成するために印刷されたインクと接触する。
【００３５】
更に別の実施形態では、電気接続は図７に示すように、測定システムピン７６５と電極７５０の下面との間で直接行なわれる。下部プレート７６０のドリル開口孔７５５によって、測定システムピン７６５による電極７５０との接続が可能になる。この場合、電極材料は孔７５５の開口の上部全体に延びることができるように、かつ装置製造の種々の段階の間に原型を保つために十分に強固である必要がある。孔７５５は、電極材料が孔７５５の上部を覆う強固な蓋となることができるように十分小さいサイズに形成する必要がある。逆に、孔７５５は測定システムピン７６５から成るアレイ全体との位置整合が可能になり、かつアレイ全体と接触することが可能になるように十分大きいサイズに形成して、計測器内のプレート位置の公差、及び計測器内のピン７６５の位置の公差を満たすようにする必要がある。電極が１０ミクロンの厚さの導電金属により作製される場合、孔を０．０１０インチ〜０．０８０インチの直径に開口することが提案される。これよりも厚い、または更に強固な他の電極材料は更に大きい孔を覆う蓋となることができる。逆に、これよりも薄い、または強固性に欠ける材料は小さい孔を覆う蓋となるためにのみ使用されることになる。
【００３６】
ウェルの上部を通して、またはマイクロプレートのエッジに沿って接続を行なうのではなく、マイクロプレートの下面とのコンタクトを取ることにより、顕著な利点が得られる。この構成によって、プレートの上部近傍の領域に自由に手を伸ばして、化合物を測定が行なわれている間にウェルに注入することができる。注入は、９６個以上のピペット先端をアレイ状に配置した大型ピペット方式分注ヘッドを使用して行なうことができる。更に、装置の下で利用することができる表面領域が広いので、ずっと多い数の電気接続を行なうことができる。この構成は２つの理由により重要である。第１に、この構成によって、より多い数の電極の接続が可能になり、これらの電極が、３８４個、８６４個、１５３６個、またはそれ以上の個数のウェルを持つ更に高密度のマイクロプレートに組み込まれるからである。第２に、各個々の電極をこのようにしてタッチパッドに接続することにより、各ウェルがプレートにおいて一つおきのウェルと電気的に同じ構成となる均一プレート構造（homogeneous plate architecture ）が可能になるからである。このアーキテクチャによって、任意の数のウェルを同時に測定することが可能になり、インピーダンス測定電子機器が複雑になるという制約を受けるだけである。この技術分野において明らかになっている他の装置は電気コンタクトの数を減らすために、複数の電極を備える共通電気コンタクトを実現している。例えば、電気バスは装置の各行のウェル群の全てとの接続を行なうことができる。しかしながら、この方式には２つの不具合がある。第１に、ウェル間の交差汚染または干渉を生じることなく１回に行当たり一つのウェルしか測定することができないことである。第２に、或る行との電気コンタクトを取ると問題が生じて行全体が無効になることである。
【００３７】
更に、底部コンタクト構成によって、多くの接続を有する装置においても、配線がマイクロタイタープレートの中で交差する必要が全くないことが保証される。従って、単一導電層を下部プレートに形成して、当該導電層の形成の簡易性及び低コスト性を維持する。この方式を用いると、複雑かつ高価な多層構造電気装置がインピーダンス計測器自体にだけ必要になる。
【００３８】
絶縁層を電極の上部に設けて、露出電極構造を更に画定して電極の所定領域による電気的影響を無くし、かつ接続先のインピーダンス測定システムとの電気接続を容易にすることができる。一つの例では、測定をマイクロタイタープレートウェルの中心においてのみ集中して行なって、分析を行なうために必要な導電材料の量を少なくし、かつ製造コスト全体を下げることが望ましい。例えば、金をウェル中心に使用することが好ましいが、金のコストは、金を導電要素全体に使用すると途方もない金額に達する。銀のような、より安価な導電材料を使用することが望ましいが、銀の毒性がウェル中心領域での銀の使用を妨げている。ウェル中心に対する集中的な測定を容易にするために、誘電体インクを印刷してウェル中心の外の電極領域を覆い隠す。このような例では、電極は２つの導電材料により形成することができ、第１材料は電極のうち、ウェルの中心に位置し、かつ分析内容と接触することになる部分を構成し、第２材料は第１材料と導電ビアとの間の電気経路の一部分を構成する。
【００３９】
上部プレート及び下部プレートにより形成される装置に替わって、装置を一体型装置として形成することができる。マイクロタイタープレートは、射出成形機に収容される導電リードフレームに成形材料を射出成形することによりリードフレームに直接形成することができる。インサート成形プロセスにより、アレイ状のインピーダンス測定電極が得られ、これらのインピーダンス測定電極は、流し込んだプラスチックによって密閉封止され、電極の露出された上面は作製ウェルの底部に位置し、電極の下面はマイクロタイタープレートの底部上の電気コンタクトの位置で露出する。リードフレームのうち、アレイ状の電極を作製プロセスの間に互いに機械的に接続するが電気的な観点から必要ではない部分は後処理ステップにおいて破断分離される。
【００４０】
図８に示すように、電極８３０によって生成される電界８２５は、ウェル８８０の底部の電極表面８３５から、電極８３０間のギャップにほぼ等しい深さだけ伸びる。ウェル８８０の底部及び電極８３０に成長している細胞８４５は、この電界８２５を受ける。回路における細胞内電流（Ｉｔｃ）及び細胞間電流（Ｉｅｃ）から成る合計電流を測定することにより、インピーダンス測定システムによる細胞層のインピーダンスの計算が可能になる。更に、ウェルの底部に沈殿し、かつ電界内に位置する非固着性の細胞はこの技術を使用して更に分析することができる。
【００４１】
インピーダンス測定を交流電圧を使用して行なう場合、検出器は印加交流電圧により生じる電流を測定する。結果として流れる電流の絶対値、及び位相（印加電圧に対する）は両方ともに、実数部分及び虚数部分から成る複素数であるインピーダンスの一部分である。接続先の測定システムは両方の部分またはいずれかの部分を測定することができる。通常、１００ｍＶ（ｒｍｓ）信号が印加され、０．１〜１ｍＡ（ｒｍｓ）の範囲の電流が測定される。システム（マイクロタイタープレート及び接続先のインピーダンス測定システム）は、３００〜４００ｍＶのような大きい電圧で動作するように構成する必要がある。基本的に、印加電圧の下限は、許容できる雑音のレベルによって規定される。電圧は通常、１０〜２０ｍＶのような小さい値である場合が非常に多い。
【００４２】
通常、特定のマイクロタイター分析プレートを分析システムの中で識別する必要がある場合、バーコードラベルをマイクロプレートの上部またはエッジに貼付する。現在の装置では、マイクロプレート自体の作製に、プレートタイプの識別を分析システムにおいて可能にするパターンを取り入れることが望ましい。これにより、個別のバーコードラベルを設け、かつ個別のバーコードリーダを計測器内部に設ける必要を無くすことができる。一つの実施形態では、プレート識別は多数の機構によって実施することができる。電気接触パッドと同時にプレート下部に作製される光学的に読み取り可能なパターンは、プレートが分析システム計測器の内部に移動するときに、固定の反射光学センサで読み取ることができる。電気接触パッドと同時にプレート底部に作製される光学的に読み取り可能なパターンは、インピーダンス測定システムの同じ電気接触ピン及び電子機器を使用して読み取ることができる。上部プレート上の、孔、ギザギザ、または段のような機械的パターンは、光学スイッチまたは機械スイッチを使用して読み取ることができる。ＲＦＩＤタグをプレート底部または上部に組み込み、このタグを接続先のインピーダンス測定システムの内部の近傍ユニットによって読み取ることができる。大量の情報の保存、及び読み出しを可能にするプレートＩＤを有効にする選択可能な別の手法では、ＰＲＯＭ（プログラマブルリードオンリメモリチップ）またはＥＥＰＲＯＭ（電気消去可能なプログラマブルリードオンリメモリチップ）のようなマイクロチップを組み込む。各機構は更に、エラー検出コードを実装することができ、エラー検出コードによってシステムエラーをプレートに対する読み取りの前に検出する。
【００４３】
本装置のマルチウェル分析プレートは付着性の細胞種、及び非付着性の細胞種、分子種、ウイルス粒子、及びバクテリアに利用することができ、当該分析プレートは１回だけ使用することができる、または複数回に渡って使用することができる。分析プレートは、プレートがウェル内容物の生物学的性質によって変わる形で廃棄することができるアプリケーションに適する。
【００４４】
［アプリケーション］
インピーダンス計測
以下の実施例において説明される装置は専用インピーダンス測定システムとのインターフェース接続を３つの方法により行なう。１）組立装置の底部に設けられる電気接触パッドは計測器の電気接触ピンと接触する。各ウェルの電気接続線をインピーダンス測定電子機器にまで配線する。２）装置の下面は熱制御表面に支えられて、装置のウェルの内容物の温度制御を可能にする。３）上部プレートのウェルを計測器の自動ピペット装置に位置合わせして、異なる化合物をウェルの各々に、インピーダンス測定の間に添加することができるようにする。
【００４５】
インピーダンス測定値は、インピーダンス絶対値及びインピーダンス位相から成る。これらの量の両方を使用して複素インピーダンスの実部を計算することができる。化合物を添加した後の異なるウェルのインピーダンス変化を比較することにより、化合物が細胞に影響をあたえるかどうかについて、かつ化合物が細胞にどの程度影響するかについて判断することができる。
【００４６】
［実施例１］
下部プレートは、１ｍｍの厚さで、１２２ｍｍ×７９ｍｍの寸法のＢｏｒｏｆｌｏａｔ（商標）ガラス基板により作製した。孔をガラス（０．０３０インチ厚）に超音波プロセスを使用してドリル開口した。１．６ミクロンの厚さの金をガラスの上面及び下面の両方にスパッタリングにより堆積させた。同時に、スパッタ成膜された金で、ドリル開口孔の内側表面を被覆して、ガラスの上面と下面との間に電気ビアを形成した。次に、フォトリソグラフィ露光及び化学エッチング法を使用して下部プレートの上面に設けられるインピーダンス測定電極をパターニングし、電気接触パッドを下部プレートの下面に形成した。電極は、相互に噛み合う櫛歯状フィンガペア（pair of interdigitated finger combs）であり、幅３０ミクロン及び長さ２．５ｍｍのフィンガサイズを有する。対向する櫛歯状フィンガの間のギャップは３０ミクロンであった。
【００４７】
下部プレートをＵＶ硬化エポキシを使用して、８×１２アレイの９６個の貫通孔を含むマシン加工ポリスチレン上部プレートに接着させた。各孔が直径６ｍｍ、深さ１２ｍｍの寸法を持つ構成の９６個の孔を接着下部プレート上の電極パターンの上部に位置合わせして９６個のウェルを形成した。
【００４８】
９６個のウェルを備える装置の各ウェルの中には、ｍ１−ムスカリン性受容体をトランスフェクションした４０，０００個のＣＨＯ細胞を、１５０μリットルの成長培地と共にピペットで添加した。装置を細胞培養装置に３７℃、５％ＣＯ２の環境で１８時間に渡って収容して、細胞をウェルの底部に沈殿させ、かつ細胞をウェル底部及びウェル電極の表面全体に付着させ、成長させることができた。細胞反応評価を行なう前に、成長培地を除去し、成長培地の代わりに、０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１３６ｍＭのＨａｎｋｓ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液を導入した。左から右に向かって濃度が薄くなるように、６種類の拮抗剤の滴定を行Ａから行Ｆ（行Ｆを含む）まで行ない、１５分間の培養を行なうことができた。行Ｇ及びＨには化学物質を添加しなかった（対照緩衝液）。装置をインピーダンス測定システムに収容し、２８℃で熱的にシステムと平衡させることができた。１５分間の培養を行なった後、単一濃度の拮抗剤（カルバコール）を行Ａ−Ｇに添加し、同時に行Ｈには化学物質を添加しなかった（対照緩衝液）。各装置のインピーダンスを、拮抗剤を添加する前の５分間、及び拮抗剤を添加した後の１０分間に渡って２０秒間隔で測定した。
【００４９】
図９には、９６個のウェルに対してインピーダンス測定を行なった結果が時間の関数として示される。拮抗剤濃度が低くなることによって細胞インピーダンスの変化が大きくなる様子が分かる。図１０には、反応を拮抗剤濃度の関数としてグラフ化して、各拮抗剤のＩＣ５０（５０％拮抗濃度）を求める様子が示され、異なる拮抗剤の相対的な効能を示している。
【００５０】
［実施例２］
下部プレートは、１ｍｍの厚さで、１２２ｍｍ×７９ｍｍの寸法のポリスチレンシート基板により作製した。孔をポリスチレン（０．０３０インチ厚）にドリル開口した。０．５ミクロンの厚さの金をポリスチレンの上面に、金属薄膜マスクまたはステンシルを通してスパッタリングにより堆積させて電極パターンを形成した。電極は、相互に噛み合う櫛歯状フィンガペアであり、幅２００ミクロン、及び長さ１．５ｍｍのフィンガサイズを有する。対向する櫛歯状フィンガの間のギャップは２００ミクロンであった。電極を形成すると同時に、スパッタ成膜された金で、ドリル開口孔の内側表面を被覆した。次に、０．５ミクロンの厚さの金をポリスチレンの上面に、金属薄膜マスクまたはステンシルを通してスパッタリングにより堆積させて電気接触パッドパターンを形成した。同時に、スパッタ成膜された金で、この場合も同じように、ドリル開口孔の内側表面を被覆して、電気ビアをポリスチレンの上面と下面との間に形成した。金パターンをポリスチレンの上に形成した後、下部プレートをプラズマエッチングして表面への細胞の接着性を高めた。
【００５１】
下部プレートをＵＶ硬化エポキシを使用して、８×１２アレイの９６個の貫通孔を含むマシン加工ポリスチレン上部プレートに接着させた。各孔が直径６ｍｍ、深さ１２ｍｍの寸法を持つ構成の９６個の孔を接着下部プレート上の電極パターンの上部に位置合わせして９６個のウェルを形成した。
【００５２】
ウェル当たり５０，０００個のＨｅＬａ（ヒーラ）細胞を、１５０マイクロリットルのＭＥＭ成長培地の装置の各ウェルの中にピペットで添加した。装置の細胞を夜間の間に細胞培養装置の中で３７℃、５％ＣＯ２の環境で培養した。翌日、培地を除去し、細胞を１３６ｍＭのＨａｎｋｓ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液で軽くゆすって３回洗浄した。最後の液交換では、０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１３６ｍＭのＨａｎｋｓ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液を１３５マイクロリットルだけ導入した。装置をインピーダンス測定装置に収容し、当該測定装置の中で、装置を２８℃に暖めた。培地を緩衝液に交換してから３０分経過したときに、インピーダンス測定を開始した。前駆体（ｐｒｅ−ｄｒｕｇ）を添加した状態のインピーダンス測定を５分間行なった後、パネル化した化合物を装置の細胞に添加した。パネルのソースは９２個の異なる化合物を含む９６ウェルプレートであった。残りの４個のウェルは緩衝液のみを含んでいた。
【００５３】
図１１には、９６個のウェルに対してインピーダンス測定を行なった結果が示される。異なる化合物に対する細胞の反応は、インピーダンス変化の絶対値だけでなく、インピーダンス応答の速度及び方向の両方によって特徴付けることができる。
【００５４】
図１２では、これらの化合物の各々による応答の絶対値をヒストグラム形式で比較している。
［実施例３］
下部プレートは、０．００５インチの厚さのポリエステルシート基板により作製した。孔をポリスチレン（０．１５ｍｍ厚）にレーザドリルにより開口して、後の工程で下部プレートに形成されることになる電気ビアと一致するパターンに形成した。導電性銀インクをスクリーン印刷プロセスに使用して、電気接触パッドを下部プレート材料の下面に形成し、当該インクをドリル開口ビアホールに充填した。次に、第２印刷パスを銀インクを用いて行なってパターンを下部プレートの上面に印刷して、パターンがドリル開口ビアから、マイクロプレートウェルの中心部が下部プレート及び上部プレートを接着させるときに形成される場所の近くの位置に向かって延びるようにする。次に、金インクから成るフィンガを印刷により形成して、相互に噛み合う櫛歯状フィンガパターンを２つの銀リードの間に形成した。各金フィンガはこれらの銀リードのうちの一方と一端で重なった。最後の印刷工程では、誘電体インクを印刷して、金フィンガの長さ部分を露出したままにする矩形を除く下部プレートの上面全体を被覆した。金フィンガの先端を絶縁誘電体で被覆することにより、露出金フィンガの合計長が誘電体窓の寸法及びフィンガ幅で決まるようにした。印刷が施された下部プレート材料を酸素雰囲気中で４分間に渡ってプラズマエッチングして細胞接着性を向上させた。エッチングの後、個々の下部プレートをシートから切り出した。
【００５５】
各下部プレートは、０．００２インチの厚さの接着剤転写テープを使用して、８×１２アレイの９６個の貫通孔を含む射出成形ポリスチレン上部プレートに接着させた。各孔が６．５５ｍｍの直径を有する構成の９６個の孔を接着下部プレート上の電極パターンの上部に位置合わせして９６個のウェルを形成した。
【００５６】
９６個のウェルを含む装置の各ウェルの中に、５０，０００個のＨｅＬａ細胞を、１５０μリットルの成長培地と共にピペットで添加した。装置を細胞培養装置に３７℃及び５％ＣＯ２の環境で１８時間に渡って収容して、細胞をウェルの底部に沈殿させ、かつ細胞をウェル底部及びウェル電極の表面全体に付着させ、成長させることができた。細胞反応実験を行なう前に、成長培地を除去し、成長培地の代わりに、０．１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を含む１３６ｍＭのＨａｎｋｓ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液を導入した。装置をインピーダンス測定システムに収容し、２８℃で熱的にシステムと平衡させることができた。６個のレプリカを含むパネル化した１４個のリガンドをそれぞれ、装置の７行（Ｂ〜Ｈ）に、行当たり２個のリガンドの割合で添加した。行Ａには化学物質を添加しなかった（緩衝液）。各装置のインピーダンスを、リガンドを添加する前の５分間、及びリガンドを添加した後の１０分間に渡って２０秒間隔で測定した。図１３には、インピーダンスの経時変化を各ウェルに関してプロットした。同様の応答速度及び特性をグループにまとめて（例えば、Ｄ０１−Ｄ０６，Ｄ０６−１２，及びＥ０１−０６が同様の挙動を示す）、これらのリガンドに対する細胞の反応が関連することを示している。２つの電気的にオープン状態になったウェルは、インピーダンス測定システムが示すように、有用なデータを提供しなかった（ウェルＤ０１及びＡ０７）。
【００５７】
［要約］
以上、装置の利用可能な実施形態について説明してきたが、種々の代替物、変形物及び等価物を使用することができる。例えば、この技術分野の当業者であれば、インピーダンス測定電極構造は相互に噛み合う櫛歯状フィンガ構造に制限されないことを理解し得る。他の導体構造を別の構成として使用することができる。更に、本出願において列挙した全ての刊行物及び特許文献は本明細書において参照することにより、個々の刊行物及び特許文献が個々に提示された状況と同じ程度に、刊行物及び特許文献の内容の全てが本明細書に、あらゆる目的のために組み込まれる。上記説明は装置の例示としての実施形態としてのみ捉えられるべきであり、これらの実施形態の違いは添付の請求項の差異及び範囲によって適切に規定される。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】９６個のウェル、及び各ウェル内のインピーダンス測定電極の形態の機能的に等価な導体ペアを有するマルチウェル分析プレートの一つの実施形態を示す。
【図２】下部プレートに密閉固定される前の貫通孔付き上部プレートを示す。
【図３】本装置の好適な実施形態による下部プレートのインピーダンス測定電極領域の上面図を示す。
【図４】種々の導体構造を示す。
【図５】一つの実施形態における一つのマイクロウェルの側部断面の拡大図を示す。
【図６】電極−電気接触パッド接続構造の一つの実施形態を示す。
【図７】本装置の別の実施形態に見られる、インピーダンス測定電極の下面と、接続先の測定システムとの間で行なわれる直接電気接続を示す。
【図８】本装置のマルチウェル分析プレートの好適な実施形態による、検出器が受信する電流信号、及びそれに関連し、かつウェルによって生成されるインピーダンスを示す。
【図９】本装置の特定の実施形態（特に、実施例１のプレート）の９６個のウェルから得られる９６個の動的インピーダンスプロットが細胞の活性化の実験中に同時に生成される様子を示す。
【図１０】本装置の特定の実施形態（特に、実施例１のプレート）による図９の各ウェルの最大インピーダンスを拮抗剤濃度の関数としてグラフにして各拮抗剤のＩＣ５０を求める様子を示し、グラフは、異なる拮抗剤の相対的な効能を求めるためのプレート構造の性能を示している。
【図１１】本装置の特定の実施形態（特に、実施例２のプレート）の９６個のウェルから得られるインピーダンス測定値の９６個の動的グラフを示す。
【図１２】本装置の特定の実施形態（特に、実施例２のプレート）のウェル群の中の化合物の各々から得られるインピーダンス応答の絶対値を比較するヒストグラムを示す。
【図１３】本装置の特定の実施形態（特に、実施例３のプレート）の９６個のウェルから得られるインピーダンス測定値の９６個の動的グラフを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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