(57)【要約】  本発明は、試料中、好ましくは病原体感染個体からの試料中に存在する病原体の各種変異体（株）の核酸増幅のための方法に関する。好ましい態様において、病原体はＨＩＶのようなレトロウイルスである。増幅された病原体核酸は、試料中に存在する病原体変異体を同定するために、試料中に存在する病原体を定量するために、および核酸ワクチンとして、または抗原提示細胞ワクチンの製造に用いられる。本発明の方法により生産された核酸またはそれによりコードされるタンパク質は、抗原提示細胞をトランスフェクト／負荷するために用いられる。次いで、負荷された抗原提示細胞は、病原体感染の治療用ワクチンとして用いられる。他の態様において、本発明の方法により生産された核酸は、抗原提示細胞への事前の負荷なしに、核酸ワクチンとして直接用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個々の対象者に存在する病原体の各種株からの一またはそれ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでなり、かつ一またはそれ以上の病原体ポリペプチドがどの株からも提示されない、単離抗原提示細胞（ＡＰＣ）。
【請求項２】
前記核酸が病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅から導かれるものである、請求項１に記載のＡＰＣ。
【請求項３】
前記病原体ポリヌクレオチドが、前記病原体の各種株間の配列可変性を補償するように設計されたプライマーを用いて増幅されたものである、請求項２に記載のＡＰＣ。
【請求項４】
前記核酸がＲＮＡである、請求項２に記載のＡＰＣ。
【請求項５】
前記ＲＮＡがインビトロ転写ＲＮＡである、請求項３に記載のＡＰＣ。
【請求項６】
前記ＡＰＣが樹状細胞である、請求項１に記載のＡＰＣ。
【請求項７】
前記病原体がウイルスである、請求項１に記載のＡＰＣ。
【請求項８】
前記病原体がレトロウイルスである、請求項６に記載のＡＰＣ。
【請求項９】
前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、およびＨＣＶからなる群より選択されるものである、請求項７に記載のＡＰＣ。
【請求項１０】
前記病原体がＨＩＶであり、前記病原体ポリペプチドが、ｇａｇポリペプチド、ｒｅｖポリペプチド、ｖｐｒポリペプチド、ｅｎｖポリペプチド、ｎｅｆポリペプチド、ｖｐｕポリペプチド、ｖｉｆポリペプチド、ｐｏｌポリペプチドからなる群のうち二種以上を含んでなる、請求項９に記載のＡＰＣ。
【請求項１１】
前記ＡＰＣが前記対象者からのもの、またはそれから派生したものである、請求項１に記載のＡＰＣ。
【請求項１２】
さらにインビトロ転写ＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡを含んでなるものである、請求項１に記載のＡＰＣ。
【請求項１３】
個々の対象者に存在する病原体の各種株からの病原体ポリペプチドを含んでなり、かつ一またはそれ以上の病原体ポリペプチドがどの株からも提示されない、単離ＡＰＣ。
【請求項１４】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項１３に記載のＡＰＣ。
【請求項１５】
病原体がウイルスである、請求項１３に記載のＡＰＣ。
【請求項１６】
前記ウイルスがレトロウイルスである、請求項１５に記載のＡＰＣ。
【請求項１７】
前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、およびＨＣＶからなる群より選択されるものである、請求項１６に記載のＡＰＣ。
【請求項１８】
前記レトロウイルスがＨＩＶである、請求項１７に記載のＡＰＣ。
【請求項１９】
前記病原体ポリペプチドが、ｇａｇポリペプチド、ｒｅｖポリペプチド、ｖｐｒポリペプチド、ｅｎｖポリペプチド、ｎｅｆポリペプチド、ｖｐｕポリペプチド、ｖｉｆポリペプチド、ｐｏｌポリペプチドからなるＨＦＶポリペプチドの群のうち二種以上を含んでなる、請求項１８に記載のＡＰＣ。
【請求項２０】
請求項１に記載のＡＰＣおよび薬学上許容される担体を含んでなる、ワクチン。
【請求項２１】
請求項１３に記載のＡＰＣおよび薬学上許容される担体を含んでなる、ワクチン。
【請求項２２】
請求項２０に記載のワクチンを前記患者に投与することからなる、病原体感染患者の治療方法。
【請求項２３】
請求項２１に記載のワクチンを前記患者に投与することからなる、病原体感染患者の治療方法。
【請求項２４】
前記個体に存在する病原体の各種株からの一またはそれ以上の病原体ポリペプチドをコードする核酸で、病原体感染個体から得られるまたは導かれる抗原提示細胞をトランスフェクトすることからなり、かつ一またはそれ以上の病原体ポリペプチドがどの株からも提示されない、自己ワクチンの製造方法。
【請求項２５】
前記核酸が、前記病原体の各種株間の可変性を補償するように設計された複数種のプライマー対を用いた病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅により導かれるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プライマーが下記から選ばれるものである、請求項２５に記載の方法：
ａ．フォワードプライマーアニーリング用の第一領域およびリバースプライマーアニーリング用の第二領域を選択する（前記第一領域および第二領域は、病原体のオープンリーディングフレームおよび／またはエピトープに隣接している）、そして
ｂ．前記第一領域用および第二領域用のフォワードおよびリバースプライマー候補を選択する（前記プライマーのうち少なくとも一種は、病原体の各種変異体間の配列可変性を補償するように設計されている）。
【請求項２７】
前記抗原提示細胞が樹状細胞である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記樹状細胞が未成熟樹状細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
トランスフェクション後に前記未成熟樹状細胞を成熟させることをさらに含んでなる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記樹状細胞が成熟樹状細胞である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記核酸がＣＤ４０ＬをコードするｍＲＮＡをさらに含んでなるものである、請求項２４に記載の方法。
【請求項３２】
下記からなる群より選択される一またはそれ以上のプライマーを含んでなる組成物：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２、３、５〜１５、または１８のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｇａｇフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３〜２５、２８〜３１、３５、３９、４２、４３、１０２〜１０５、１０９〜１１２、または１１３のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｇａｇリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４５、４６、４７、５０〜５２、５４、または５５のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｖｐｒフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６２、６３、７１〜７３、１１４〜１２０、２０１〜２０３、２６４〜２７２、または２７３のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｖｐｒリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７５、７８、または８５からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｒｅｖフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９２、９３、９７、９９〜１０１、１２３〜１２５、１９３、１９４、または１９５のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｒｅｖリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２７４〜２７９、２９０〜２９２、または２９３のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｅｎｖフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５７〜１５９、２８０〜２８９、２９４〜２９８、または２９９のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｅｎｖリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６７〜３７０または３７１のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｎｅｆフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００〜３１０または３１１のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｖｉｆフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２〜３１９、３２９〜３３１、または３３２のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｖｐｕフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２０〜３２８、３３３〜３３５、または３３６のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｖｐｕリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３７〜３４４、３５６〜３５９、または３６０のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｐｏｌフォワードプライマー、および
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４５〜３５５、３６１〜３６５、または３６６のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｐｏｌリバースプライマー。
【請求項３３】
下記プライマーを含んでなる組成物：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２０、１６２、１６４、１６８、および１６９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｇａｇフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜４３、１０２〜１１３、１７２、および１７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｇａｇリバースプライマー。
【請求項３４】
下記プライマーを含んでなる組成物：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４〜５８、１７６、および１７７からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｖｐｒフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、１１４〜１２２、１９６〜２０３、および２６４〜２７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｖｐｒリバースプライマー。
【請求項３５】
下記プライマーを含んでなる組成物：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８〜１４３、１４７〜１４８、１６０〜１６１、２０４、および３６７〜３７１からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｎｅｆフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１４９〜１５３、１６３、および１６７からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｎｅｆリバースプライマー。
【請求項３６】
下記プライマーを含んでなる組成物：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０〜１３２、１３４〜１３６、２７４〜２７９、および２９０〜２９３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｅｎｖフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３、１５４〜１５９、２８０〜２８９、および２９４〜２９９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｅｎｖリバースプライマー。
【請求項３７】
下記プライマーを含んでなる組成物：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４〜８８、１８０、および１８３〜１８９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｒｅｖフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９〜１０１、１２３〜１２９、および１９０〜１９２からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｒｅｖリバースプライマー。
【請求項３８】
下記プライマーを含んでなる組成物：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４〜８８、１８０、および１８３〜１８９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｒｅｖフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１４９〜１５３、１６３、および１６７からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｎｅｆリバースプライマー。
【請求項３９】
下記プライマーを含んでなる組成物：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００〜３１１からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｖｉｆフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、１１４〜１２２、１９６〜２０３、および２６４〜２７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｖｐｒリバースプライマー。
【請求項４０】
下記プライマーを含んでなる組成物：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２〜３１９および３２９〜３３２からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｖｐｕフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２０〜３２８および３３３〜３３６からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｖｐｕリバースプライマー。
【請求項４１】
下記プライマーを含んでなる組成物：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３７〜３４４および３５６〜３６０からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｐｏｌフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４５〜３５５および３６１〜３６６からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるｐｏｌリバースプライマー。
【請求項４２】
５′部分がプロモーターおよびKozak配列を含んでなるものであり、３′部分がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６〜２１８、３７２〜３８６、および３８７からなる群より選択される配列から本質的になるものである、５′部分および３′部分を含んでなるプライマー。
【請求項４３】
前記プロモーターがＴ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターである、請求項４１に記載のプライマー。
【請求項４４】
５′部分が約３０〜１００Ｔヌクレオチドを有するポリＴオリゴヌクレオチドを含んでなり、３′部分がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０〜２６８からなる群より選択される配列を含んでなる、５′部分および３′部分を含んでなるプライマー。
【請求項４５】
下記を含んでなる、ＨＩＶの各種変異体の増幅用キット：
ａ．請求項３３〜４０または４１の組成物ならびに
ｂ．熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、デオキシヌクレオチド三リン酸、およびＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡからなる群より選択される一またはそれ以上の試薬。
【請求項４６】
請求項３３〜４０または４１に記載のプライマー組成物を用いてＨＩＶ ＤＮＡの各種変異体を増幅させることからなる、ＨＩＶアンプリコンを作製する株に依存しない方法。
【請求項４７】
前記ＨＩＶ ＤＮＡが、ＨＩＶゲノムＲＮＡまたはＨＩＶ ｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡを含んでなるものである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ＨＩＶ ＤＮＡの各種変異体が、単一ＨＩＶ感染ヒトから単離されたもの、またはそれから派生したものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
下記からなるＨＩＶ ＲＮＡを作製する株に依存しない方法：
ａ．下記からなる群より選択されるフォワードおよびリバースプライマー対組成物を用いてＨＦＶ ＤＮＡの各種変異体を増幅させることにより一次アンプリコンを生産する：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１８、１６２、１６４、１６８、および１６９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｇａｇフォワードプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜４３、１７２、および１７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｇａｇリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４〜５６、１７６、および１７７からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｖｐｒフォワードプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、１９６〜１９９、および２００からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｖｐｒリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８〜１４３、１６０〜１６１、２０４、３６７〜３７０、および３７１からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｎｅｆフォワードプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１６３、および１６７からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｎｅｆリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０〜１３２、２７４〜２７８、および２７９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｅｎｖフォワードプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３、１５４〜１５６、２８０〜２８８、および２８９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｅｎｖリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４〜８６、１８０、１８３〜１８８、および１８９からなる群  より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｒｅｖフォワードプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９〜１０１、１９０、１９１、および１９２からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｒｅｖリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４〜８６、１８０、１８３〜１８８、および１８９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｒｅｖフォワードプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１６３、および１６７からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｎｅｆリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３００〜３０６および３０７からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｖｉｆフォワードプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、１９６〜１９９、および２００からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｖｐｒリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１２〜３１８および３１９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｖｐｕフォワードプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２０〜３２７および３２８からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｖｐｕリバースプライマー、ならびに
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３７〜３４３および３４４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｐｏｌフォワードプライマーおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４５〜３５４および３５５からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のｐｏｌリバースプライマー、
ｂ．増幅発現カセットを生産するために、フォワードプロモータープライマーおよび５′ポリＡテールを含んでなるリバースプライマーを用いて、前記一次アンプリコンを増幅させる、そして
ｃ．ＨＩＶ ＲＮＡを生産するために、前記発現カセットを転写する。
【請求項５０】
前記ＨＩＶ ＤＮＡが、ＨＩＶゲノムＲＮＡまたはＨＩＶ ｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記プロモーターがＴ７プロモーターまたはＳＰ６プロモーターである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記フォワードプロモータープライマーが、前記プロモーターの３′側に最適化Kozak配列を含んでなる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記最適化Kozak配列が、ＣＣＡＣＣＡＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項４９に記載の方法により生産されたＲＮＡと抗原提示細胞を接触させることからなる、抗原提示細胞に負荷する方法。
【請求項５５】
対象者に存在する病原体の各種株からの一またはそれ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでなり、かつ一またはそれ以上の病原体ポリペプチドがどの株からも提示されない、核酸ワクチン。
【請求項５６】
前記核酸がＲＮＡである、請求項５５に記載の核酸ワクチン。
【請求項５７】
前記核酸がＤＮＡである、請求項５５に記載の核酸ワクチン。
【請求項５８】
ＣＤ４０Ｌをコードする核酸をさらに含んでなる、請求項５５に記載の核酸ワクチン。
【請求項５９】
前記核酸が請求項４９に記載の方法に従い作製されるものである、請求項５５に記載の核酸ワクチン。
【請求項６０】
前記核酸が、前記病原体の各種株間の可変性を補償するように設計された複数種のプライマー対を用いた病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅により導かれるものである、請求項５５に記載の核酸ワクチン。
【請求項６１】
病原体がウイルスである、請求項５５に記載の核酸ワクチン。
【請求項６２】
前記ウイルスがレトロウイルスである、請求項６１に記載の核酸ワクチン。
【請求項６３】
前記レトロウイルスが、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ、およびＨＣＶからなる群より選択されるものである、請求項６２に記載の核酸ワクチン。
【請求項６４】
前記レトロウイルスがＨＩＶである、請求項６３に記載の核酸ワクチン。
【請求項６５】
前記病原体ポリペプチドが、ｇａｇポリペプチド、ｒｅｖポリペプチド、ｖｐｒポリペプチド、ｅｎｖポリペプチド、ｎｅｆポリペプチド、ｖｐｕポリペプチド、ｖｉｆポリペプチド、ｐｏｌポリペプチドからなるＨＦＶポリペプチドの群のうち二種以上を含んでなるものである、請求項６４に記載の核酸ワクチン。
【請求項６６】
前記プライマーが下記から選ばれるものである、請求項６０に記載の核酸ワクチン：
ａ．フォワードプライマーアニーリング用の第一領域およびリバースプライマーアニーリング用の第二領域を選択する（前記第一領域および第二領域は病原体のオープンリーディングフレームおよび／またはエピトープに隣接している）ならびに
ｂ．前記第一領域用および第二領域用のフォワードおよびリバースプライマー候補を選択する（前記プライマーのうち少なくとも一種は、病原体の各種変異体間の配列可変性を補償するように設計されている）。
【請求項６７】
病原体感染哺乳動物に請求項５５に記載の核酸ワクチンを投与することからなる、感染症の治療方法。
【請求項６８】
前記病原体がＨＩＶである、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記病原体がＨＣＶである、請求項６６に記載の方法。
【請求項７０】
少なくとも二種の病原体株からの一またはそれ以上のポリペプチドを提示する病原体アンプリコンの生産方法であって、
ａ．病原体の第一株および第二株からのポリヌクレオチドを混ぜ合わせ、混合物を形成し、そして
ｂ．前記ポリヌクレオチドを増幅させ、第一アンプリコンおよび第二アンプリコンを生産する（ここで、前記第一アンプリコンは前記第一株からのポリペプチドをコードし、前記第二アンプリコンは前記第二株からの対応ポリペプチドをコードしている）ことを含んでなる、方法。
【請求項７１】
一またはそれ以上の病原体ポリペプチドがどの株からも提示されない、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記病原体がレトロウイルスである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記レトロウイルスがＨＩＶである、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記病原体がＨＩＶであり、前記ポリペプチドがｇａｇポリペプチドである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記病原体がＨＩＶであり、前記ポリペプチドがｖｐｒポリペプチドである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
請求項７０に記載の方法により生産される病原体アンプリコンを含んでなる組成物。
【請求項７７】
前記増幅が、前記病原体の各種株間の可変性を補償するように設計されたプライマーを用いて行われる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
前記プライマーが、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１６、１７、１９、２０、２１、２２、２６、２７、３２、３３、３４、３６、３７、３８、４０、４１、４４、４８、４９、５３、５６、５７、５８、６０、６１、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７４、７６、７７、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９４、９５、９６、９８、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２６〜１５６、１６０〜１６７、１７５、１７７、１７８、１８３〜１９２、１９６〜２００、および２０４のプライマーから選択される、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
下記からなる群より選択される一またはそれ以上のプライマーを含んでなる組成物：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１６、１７、１９、または２０のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｇａｇフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２、２６、２７、３２、３３、３４、３６、３７、３８、４０、４１、１０６、１０７、または１０８のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｇａｇリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、４８、４９、５３、５６、５７、または５８のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｖｐｒフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０、６１、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、１２１、１２２、１９６〜１９９、または２００のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｖｐｒリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４、７６、７７、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８６、８７、８８、１８３〜１８８、または１８９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｒｅｖフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９、９０、９１、９４、９５、９６、９８、１２６〜１２９、１９０、１９１、または１９２のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｒｅｖリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０〜１３２、１３４、１３５、または１３６のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｅｎｖフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１５４、１５５、または１５６のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｅｎｖリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３のオリゴヌクレオチドからなるＨＩＶ ｅｎｖリバースプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８〜１３９、１４７〜１４８、１６０〜１６１、または２０４のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｎｅｆフォワードプライマー、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０〜１４２または１４３のオリゴヌクレオチドからなるＨＩＶ ｎｅｆフォワードプライマー、ならびに
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１４９〜１５２、または１５３のオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｎｅｆリバースプライマー。
【請求項８０】
下記からなる群より選択される、ＨＦＶプライマー組成物：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６および１７のプライマーを含んでなるｇａｇフォワードプライマー組成物、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、３３、および３４のプライマーを含んでなるｇａｇリバースプライマー組成物、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６〜３８、４０、および４１のプライマーを含んでなるｇａｇリバースプライマー組成物、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、１３９、および２０４のプライマーを含んでなるｎｅｆフォワードプライマー組成物、
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０〜１４３のプライマーを含んでなるｎｅｆフォワードプライマー組成物、ならびに
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６のプライマーを含んでなるｎｅｆリバースプライマー組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
発明の分野
本発明は、病原体の株非依存的増幅法、患者特異的ワクチン、および関連組成物に関する。本発明の好ましい態様は、ＨＩＶおよびＨＣＶのようなレトロウイルスに対する患者特異的ワクチンに関する。
【０００２】
背景技術
多くの病原体は急速に変異および組換えを起こして、有効なワクチンを作り出すことを難しくしている。この問題は、ウイルス病原体、特にＨＩＶのようなＲＮＡウイルスで最も多い。ＨＩＶ感染個体は各種のＨＩＶ株を宿し、典型的には各種のＨＩＶ擬似種を宿すことがある。ＨＩＶ‐Ｉのような病原体に感染した個体を治療するための戦略は、抗ウイルス剤に耐性であるウイルス株の出現からこれら薬物の多様な副作用まで多くの課題があるため、これら治療薬の継続投与は極めて困難で、高価なものになる。
【０００３】
数種の治療用のＨＩＶワクチンが開発されたが、これらワクチンは臨床試験においてほとんど効力を示さなかった。これらワクチンが成功しなかった一つの理由は、ＨＩＶウイルスゲノムの共通配列を取り込んだ免疫原としてのウイルスベクターの使用にある。共通配列の存在は、異種ウイルスに対して免疫応答を導く前記配列の効力に関して、必ずしも争いとなっていない。共通配列と自己に感染しているＨＩＶ株との間でなお相違が大きいため、ＨＩＶ‐ＩサブタイプＢ共通配列に基づくワクチンまたは抗ウイルス試薬ではＨＩＶ感染を適切に治療することができない。さらに、それらのウイルスベクターに基づくワクチンは、抗原プロセッシングおよび提示に関して免疫系で最も有能な細胞、すなわち樹状細胞を標的としていない。
【０００４】
多くの文献が、ＨＩＶ用のワクチンとしてＨＩＶの核酸またはＨＩＶのペプチドを負荷した抗原提示細胞の使用を提案している。例えば、Huangら（J Infect.Dis. 2003 187:315-319）は、リポソーム複合化ＨＦＶタンパク質で負荷された樹状細胞、およびこのような負荷細胞のワクチンとしての使用の可能性を開示している。Weissmanら（J Immunol 2000 165:4710-4717）は、単一クローン化ＨＩＶのｇａｇ配列をコードするｍＲＮＡを樹状細胞へトランスフェクションすることにより、ＭＨＣクラスＩおよびII分子への抗原性ｇａｇペプチドの送達と、インビトロでＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導とをもたらすことを開示している。米国特許第５，８５３，７１９号および米国特許第６，６７０，１８６号（Nairら）には、自己抗原提示細胞をインビトロで負荷するための患者から単離された腫瘍または病原体から得られたＲＮＡの使用、およびワクチンとしてそれらの使用を開示している。しかしながら、全病原体ＲＮＡで負荷された抗原提示細胞を患者に予防接種した場合には、患者において病原体量を増加させてしまうこともあり得る。
【０００５】
所定病原体の全変異体、特にＨＩＶの全変異体からの核酸を増幅させうるプライマーを選択する難しさが、常に認識されてきた。ＨＩＶゲノムの特異的領域の増幅が、ウイルスの低忠実性の逆転写酵素により生じるＨＩＶゲノムの高い突然変異率、およびインビボにおける免疫選択により複雑になる。それにもかかわらず、各種ＨＦＶ変異体からのＨＩＶゲノムのある領域を増幅させうるプライマーが開発されてきた。例えば、Abravayaら（J Clinical Microbio 2000 38:716-723）は、血漿中でＨＩＶ‐１ Ｍ群のサブタイプＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ、Ｏ群、ならびにＨＩＶ‐２ ＲＮＡを検出するための多重ＰＣＲアッセイ用としてｐｏｌ遺伝子に存在する保存配列を標的としたＨＩＶ−Ｉ特異的およびＨＩＶ‐２特異的プライマーおよびプローブ、および血液供給の安全性を改善する上でのこのようなアッセイの使用について開示している。
【０００６】
Christophersonら（Nucleic Acids Res 1997 25:654-658）は、ｇａｇの１４２塩基対領域を増幅させる上で、ＲＴ‐ＰＣＲでの内部プライマーとＨＩＶ−１鋳型との不一致の影響について論じている。ＨＩＶ‐Ｉ鋳型とプライマー２８〜３０塩基長さとの間で、２〜４の不一致ではなく、５〜６の不一致は、ＲＴ‐ＰＣＲによる収率を有意に減少させた。不一致を受容するために、典型的に用いられるものより長いプライマーが設計された。アニーリング温度を５０℃に下げ、温度を徐々に高めていく逆転写工程を行なうことにより、分岐の多いＨＩＶ−ＩサブタイプＡおよびＥの増幅効率の減少は、４倍〜１０倍改善された。しかも、可変性塩基の位置でシトシンまたはイノシンから５‐メチルシトシンへの置換は、相同性および最分岐ＨＩＶ−Ｉ鋳型間で産物収率に４倍未満の違いを生じた。Ｔで終わるプライマーは、Ｃ、Ｇ、またはＴと一致または不一致となる場合に増幅した。
【０００７】
Michaelら（J Clin Microbiol 1999 37:2557-2563）は、ＨＩＶ−Ｉ ｇａｇ遺伝子の１５５ヌクレオチド配列を増幅するためのプライマーについて開示している。前記プライマーは、サブタイプＡ〜Ｇの３０種ＨＩＶ−Ｉ単離物との相同性を最大化して、プライマーの３′末端近くでＨＩＶ−Ｉ対プライマーとの不一致を最少化するように選択された。増幅に際して、不一致許容度を高めるためにアニーリング温度を下げた。最適化されたプライマーと増幅条件は、以前に利用された試験と比較して検出されるＨＩＶ−Ｉ ＲＮＡの量を増加させたが、サブタイプＡ、Ｄ、Ｆ、およびＧでは不十分であり、サブタイプＨおよびＪの要素は含まれなかった。
【０００８】
あるいは、米国特許第６，００１，５５８号には、ＬＴＲの短い断片（＜２００塩基対）、各種ＨＩＶ−Ｉ単離物からのｐｏｌ領域と、各種ＨＩＶ‐２単離物からのＬＴＲ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ領域を増幅させる上で、各種プライマーの使用について開示している。その際、増幅産物を検出するために各種のプローブが用いられた。プライマー／プローブ組合せは、Ｍ群およびＯ群からの五種類のＨＩＶ−Ｉ単離物、および二種類のＨＩＶ‐２単離物を検出することができた。ＨＩＶ−Ｉの高度保存配列に対応するプライマーが下記基準により選択された：１）増幅ＰＣＲ産物の長さが２００塩基対を超えることはない、なぜなら小さな産物ほど大きな産物より効率的に増幅され、他の反応条件に過敏でないからである、２）プライマーセットは増幅産物の検出用に機能性プローブ領域を増幅させねばならない、３）プライマーの３′末端近くの不一致は、５′末端近くの不一致よりはるかに好ましくない、そして４）３′末端安定性に関する他の基準、長さ（約２３〜３１ヌクレオチド）、ＧＣ含有率、および他のプライマーおよびプローブとの相互作用。
【０００９】
米国特許第６，１９４，１４２号には、ＨＩＶ−Ｉ Ｂｒｕ、ＨＩＶ−Ｉ ＭａｌおよびＨＩＶ−Ｉ Ｅｌｉ、ＨＩＶ‐２ ＲＯＤ、およびＳＩＶ ＭＡＣ株のｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子間、ならびにＨＩＶ‐２ ＲＯＤおよびＳＩＶ ＭＡＣのｎｅｆ２、ｖｉｆ２、およびｖｐｘ遺伝子、またはＨＩＶ−Ｉ Ｂｒｕ、ＨＩＶ−Ｉ ＭａｌおよびＨＩＶ−Ｉ Ｅｌｉのｅｎｖ、ｎｅｆｌ、ｖｉｆｌ、およびｖｐｒ遺伝子間で保存されている配列に対応するプライマー対を用いた、ＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ‐２、およびＳＩＶ感染のインビトロ診断法について開示している。ＨＩＶ変異体およびＳＩＶに対応する変異ヌクレオチドとプライマーとの混合物が、ＰＣＲ反応で同時に用いられた。
【００１０】
米国特許第６，２３２，４５５号は、３１種類のＨＩＶ−Ｉ Ｍ群（サブタイプＡ、Ｂ、およびＤ）およびＯ群の単離物とＨＩＶ‐２ ＡおよびＢサブタイプの１４種類の単離物の共通配列から派生したプライマー／プローブセットについて開示している。ＨＩＶ−Ｉ共通プライマー／プローブセットはＨＩＶ−Ｉの検出に特異的であり、一方ＨＩＶ‐２共通プライマー／プローブセットはＨＩＶ‐２の検出に特異的である。
【００１１】
米国特許第６，５３１，５８８号には、患者で各種ＨＩＶ擬似種からのｐｏｌの０．７ｋＢ、１．５７ｋｂ、または２．１ｋｂ領域の増幅用のプライマーと、適切な療法を探して薬物耐性を測定する際に使用の患者特異的ＨＩＶ遺伝子型情報を求めるための配列決定について開示している。
【００１２】
米国特許第２００３／０１４８２８０号には、循環組換え型（ＣＲＦ：サブタイプ間の組換え体を表す）を含めた一応全てのＨＩＶ−Ｉ Ｍ、Ｎ、およびＯ群株の検出用のプライマーセットおよびプローブについて開示している。前記プライマーは、ＨＩＶ−Ｉ ｇａｇ ｐ２４（３９９ｂｐアンプリコン）、ｐｏｌインテグラーゼ（８６４ｂｐアンプリコン）、およびｅｎｖ ｇｐ４１免疫優性領域（ＩＤＲ：３６９ｂｐアンプリコン）を標的としている。
【００１３】
これら文献はいずれも、抗原提示細胞ワクチンまたは核酸ワクチンの製造用に、個体に存在する病原体の多数種からの特定ポリペプチドについてコードする増幅自己病原体核酸を用いる可能性を示唆していない。本発明は、患者特異的ワクチンを開発して自己感染病原体を治療するという、常に望まれてきた要求に取組んでおり、追加の利点も発揮する。
【発明の概要】
【００１４】
本発明者らは、試料中、好ましくは病原体感染個体の試料中に存在する病原体の各種変異体（株）の核酸増幅に関する方法を見出した。好ましい態様において、病原体はＨＩＶのようなレトロウイルスである。増幅された病原体核酸は、試料中に存在する病原体変異体を同定するために、試料中に存在する病原体を定量するために、および核酸ワクチンとして、または抗原提示細胞ワクチンの製造に用いられる。本発明による方法により生産された核酸は、抗原提示細胞をトランスフェクト（負荷）するために用いられる。次いで、負荷された抗原提示細胞は病原体感染の治療用ワクチンとして用いられる。他の態様において、本発明による方法により生産された核酸は、抗原提示細胞への事前の負荷なしに、核酸ワクチンとして直接用いてもよい。
【００１５】
本発明は、さらに下記からなる病原体の各種変異体の増幅に適したプライマーを選択する方法を提供する：
ａ．フォワードプライマーアニーリング用の第一領域およびリバースプライマーアニーリング用の第二領域を選択する（前記第一領域および第二領域は病原体のオープンリーディングフレームおよび／またはエピトープに隣接している）、そして
ｂ．前記第一および第二領域用のフォワードおよびリバースプライマー候補を選択する（前記プライマーのうち少なくとも一種は病原体の各種変異体間の配列可変性を補償するように設計されている）。
【００１６】
好ましくは、フォワードおよびリバースプライマー候補は、長さが２００ヌクレオチド以上、さらに好ましくは長さが少なくとも２２５、２５０、３００ヌクレオチド、またはそれ以上の増幅産物を生産するように選択される。
【００１７】
好ましい態様において、増幅された核酸は、インビトロまたはインビボで翻訳されるｍＲＮＡを生産する上で、効率的なインビボまたはインビトロ転写用の転写シグナルおよび翻訳シグナルを含有している。本発明者らは、核酸、好ましくは本発明による方法により生産されたｍＲＮＡを用いて、抗原提示細胞、好ましくは樹状細胞に負荷する方法をさらに提供する。負荷された抗原提示細胞は、病原体感染の治療用ワクチンとして有用である。
【００１８】
このように、他の態様において、本発明は、哺乳動物に存在する病原体の各種株（変異体）からの一種以上の抗原をコードする複数種の核酸をトランスフェクトした抗原提示細胞を含んでなる組成物を提供する。前記核酸は病原体の前記変異体間の可変性を補償するように設計された複数種のプライマー対を用いる病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅から派生する。前記抗原提示細胞および前記病原体核酸は前記哺乳動物からのものであるか、またはそれから派生したものである。本発明は、個体に感染した病原体の各種変異体の代表的な核酸で負荷された抗原提示細胞を作製する方法、ならびに本発明よるワクチンを用いて病原体に感染した個体を治療する方法をさらに提供する。好ましい抗原提示細胞は、樹状細胞である。
【００１９】
一つの態様において、本発明は、哺乳動物に存在する病原体の各種変異体からの一種以上の抗原をコードする複数種の核酸、および薬学上許容される担体を含んでなる核酸ワクチンを提供する。ここで、前記核酸は病原体の前記変異体間のヌクレオチド配列可変性を補償する複数種のプライマー対を用いた病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅から派生する。
【００２０】
他の態様において、本発明は、下記からなる病原体の少なくとも二種の株からの一またはそれ以上のポリペプチドを提示する病原体アンプリコンを生産する方法を提供する：（ａ）混合物を形成するために病原体の第一株および第二株からのポリヌクレオチドを混ぜ合わせる、そして（ｂ）第一アンプリコンおよび第二アンプリコンを生産するために前記ポリヌクレオチドを増幅させる、ここで前記第一アンプリコンは前記第一株からのポリペプチドをコードし、前記第二アンプリコンは前記第二株からの対応ポリペプチドをコードしている。このようなアンプリコンは核酸ワクチンとして、抗原提示細胞のトランスフェクションに、およびインビトロ翻訳病原体ポリペプチドの生産に用いられる。
【００２１】
病原体の各種株からの標的病原体遺伝子およびその断片を増幅させる能力があれば、全病原体核酸、例えば病原体ＤＮＡまたはＲＮＡゲノム、ＲＮＡウイルスの全長ｃＤＮＡ複製などを精製または増幅する必要がない。例えば、核酸ワクチンとしてまたはＡＰＣへの負荷用に全ＨＩＶゲノムを用意すると、前記遺伝子が核酸断片の形でまたは隣接病原体ゲノムとして存在するかどうかにかかわらず、再構成感染ウイルスを得られる。加えて、ある病原体核酸またはある病原体ポリペプチド（例えば、ＨＩＶ ｎｅｆまたはｖｐｒ）は、特に抗原提示細胞に対して、有害作用を有することがある。有害作用を有するポリペプチドまたは前記ポリペプチドをコードする核酸を除いても、または他の病原体ポリペプチドをコードする核酸に対して低いモル比で存在させてもよい。したがって、各種病原体株の病原体ポリペプチドを提示するが、全部に満たない病原体ゲノムを提示するか、または全部に満たない病原体タンパク質をコードする、核酸を含んでなるワクチンを提供することにより、持続感染、ウイルス遺伝子、またはタンパク質の構成的発現のような病原体感染のネガティブな作用が避けられる。有害な病原体ポリヌクレオチドおよびタンパク質も避けられる。このように、本発明は、存在する病原体の各種株からの一またはそれ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでなる組成物を提供するが、ここで一またはそれ以上の病原体ポリペプチドはどの株からも提示されない。前記核酸は一以上の個体に存在する各種病原体株からのポリペプチドを提示しうる。増幅病原体核酸は、一以上の病原体感染個体からの生物学的試料中に存在する病原体核酸から直接生産しても、または病原体のクローン化単離物から生産してもよい。このように、一つの態様において、本発明は、個々の対象者に存在する病原体の各種株からの一またはそれ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでなる単離抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供するが、ここで一またはそれ以上の病原体ポリペプチドはどの株からも提示されない。
【００２２】
本発明の他の態様において、増幅病原体核酸はインビトロで翻訳されて、患者に直接予防接種するかまたはＡＰＣに負荷するために用いられる。病原体ポリペプチドまたはこのようなペプチドで負荷されたＡＰＣは、薬学上許容される担体と一緒に、ワクチンとして投与される。したがって、本発明は、病原体の各種株からの病原体ポリペプチドを含んでなる組成物を提供する。ここで、一またはそれ以上の病原体ポリペプチドはどの株からも提示されない。本発明は、個々の対象者に存在する病原体の各種株からの病原体ポリペプチドを含んでなる単離ＡＰＣも提供する。ここで、一またはそれ以上の病原体ポリペプチドはどの株からも提示されない。
【００２３】
一つの態様において、本発明は、下記からなる自己ワクチンの製造方法を提供する：個体または一以上の他の個体に存在する病原体の各種株からの一またはそれ以上の病原体ポリペプチドをコードする核酸で、病原体感染個体から得られた、または派生した抗原提示細胞をトランスフェクトする。ここで、一またはそれ以上の病原体ポリペプチドはどの株からも提示されない。
【００２４】
他の態様において、本発明は、下記からなる自己ワクチンの製造方法を提供する：前記哺乳動物に存在する病原体の各種変異体からの一種以上の抗原をコードする核酸で、病原体感染哺乳動物から得られた、または派生した抗原提示細胞をトランスフェクトする。ここで、前記核酸は、病原体の前記変異体間の可変性を補償しうる複数種のプライマー対を用いた病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅から派生する。
【００２５】
さらにもう一つの態様において、本発明は、下記からなる病原体感染哺乳動物を治療する方法を提供する：
ａ．増幅病原体ＤＮＡを生産するために、病原体の各種変異体を増幅させうる複数種のプライマー対を用いて、哺乳動物に存在する病原体の各種変異体の核酸を増幅させる、
ｂ．場合により、病原体ＲＮＡを生産するために、前記増幅病原体ＤＮＡを転写する、そして
ｃ．前記病原体ＤＮＡまたは前記病原体ＲＮＡを前記哺乳動物に投与する。
【００２６】
本発明による方法は、あらゆる病原体の核酸を増幅させるために用いられる。加えて、増幅産物は病原体量（例えば、ウイルス量）を調べるために定量でき、個体内での病原体進化を調べるために配列決定できる。好ましい態様において、病原体はＨＩＶまたはＨＣＶである。本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜５８、６０〜１６１、および１７２〜３７１から本質的になるＨＩＶの各種変異体の増幅用プライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜５８、６０〜１６１、および１７２〜３７１からなる群より選択される核酸と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるプライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜５８および６０〜３７１からなる群より選択されるプライマー、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜５８および６０〜３７１と少なくとも７５％の配列の同一性を有する核酸との組合せを含んでなるプライマー対、およびこのようなプライマー対を含有しているキットを提供する。前記キットは、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、デオキシリボヌクレオチド三リン酸、およびＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡに限定されないが、それらを含めた一種以上の試薬をさらに含有してもよい。
【００２７】
一つの態様において、本発明は、本発明によるフォワードプライマーおよびリバースプライマーでＨＩＶ ＤＮＡの各種変異体を増幅させることからなる、ＨＩＶ配列を増幅させる株に依存しない方法を提供する。
【００２８】
他の態様において、本発明は、感染患者に特有のウイルス種により発現される各種規定ＨＩＶタンパク質変異体に向けた治療免疫応答を引き出す、ＨＩＶに対する自己ワクチンを提供する。好ましい態様において、本発明は、自己ウイルス由来の各種ＨＩＶ抗原をコードするＲＮＡでトランスフェクトされた生体外の形成成熟樹状細胞から構成される患者特異的ワクチンを提供する。
【発明の具体的説明】
【００２９】
本発明は、試料中に存在している病原体の変異体のほとんどまたはすべてからの核酸を増幅させる方法に関する。プライマー組成物、増幅産物、およびその誘導体は、個体に存在している病原体変異体の同定および定量において使用され、そして病原体感染の治療または予防用の核酸ワクチン、および細胞に基づいたワクチンとしての用途を有している。
【００３０】
この開示を通して、様々な文献、特許、および公開特許明細書が引用の明記により引用文献とされる。これら文献、特許、および公開特許明細書の開示は、本発明が関係する技術状況についてさらに詳しく記載するために、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。しかしながら、相反する対立があれば、本明細書では調整される。
【００３１】
本発明の実施には、別記されない限り、当分野の技術に属する分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の慣用技術を用いる。このような技術は文献で詳細に説明されている。これらの方法は下記文献で記載されている。例えば、Sambrook et al. MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,2nd edition(1989)、CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY（F.M.Ausubel et al.eds.(1987)）、シリーズMETHODS IN ENZYMOLOGY（Academic Press,Inc.）、PCR:A PRACTICAL APPROARCH（M.MacPherson et al. IRL Press at Oxford University Press(1991)）、PCR 2:A PRACTICAL APPROARCH（MJ.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995)）、ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL（Harlow and Lane eds.(1988)）、USING ANTIBODIES,A LABORATORY MANUAL（Harlow and Lane eds.(1999)）、およびANIMAL CELL CULTURE（R.I.Freshney ed.(1987)）参照。
【００３２】
定義
ここで用いられているように、ある用語は以下の定義された意味を有している。明細書および請求項で用いられている単数形“ａ”、“ａｎ”、および“ｔｈｅ”は、内容が明らかにそれ以外のことを述べていないかぎり、複数の言及を含んでいる。例えば、“細胞”という用語は、その混合物を含めて、複数の細胞を含んでいる。
【００３３】
すべての数値表示、例えばｐＨ、温度、時間、濃度、および分子量は、範囲を含めて、０．１の増分で（＋）または（−）変動する概算値である。常に断言できるわけではないが、すべての数値表示は“約”という語句で前置されている、と理解されるであろう。常に断言できるわけではないが、ここで記載されている試薬は例示にすぎず、そのような相当物が当業界で知られている、ことも理解されるであろう。
【００３４】
“増幅”とは、標的核酸配列の多数の複製を生み出す、プライマーおよび核酸ポリメラーゼを用いた核酸増幅操作に関する。このような増幅反応は当業者に公知であり、それにはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：米国特許第４，６８２，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号、および米国特許第４，９６５，１８８号参照）、ＲＴ‐ＰＣＲ（米国特許第５，３２２，７７０号および米国特許第５，３１０，６５２号参照）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ：ＥＰ０ ３２０ ３０８号参照）、ＮＡＳＢＡまたは類似反応、例えば米国特許第５，３９９，４９１号で記載されているＴＭＡ、およびｇａｐ ＬＣＲ（ＧＬＣＲ：米国特許第５，４２７，２０２号参照）があるが、それらに限定されない。核酸標的がＲＮＡであれば、ＲＮＡは逆転写酵素を用いて最初に相補的ＤＮＡ鎖に複製してもよい（米国特許第５，３２２，７７０号および米国特許第５，３１０，６５２号参照）。“アンプリコン”とは、増幅操作を用いて合成された核酸に関する。
【００３５】
“抗原”という用語は当該技術分野においてよく理解されており、免疫原性である物質、すなわち免疫原を含み、免疫原または抗原の様々な異なるフォーミュレーションを含んでいる。
【００３６】
“抗原提示細胞（ＡＰＣ）”という用語は、免疫系の特異的エフェクターＴ細胞により認識されうる抗原‐ＭＨＣ複合体の形で一種以上の抗原を提示しうる細胞の種類を表す。ＡＰＣとしてはマクロファージ、Ｂ細胞、および樹状細胞（例えば、未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞、形質細胞様樹状細胞、およびランゲルハンス細胞）があるが、それらに限定されない。
【００３７】
ここで用いられている“から本質的になる”という用語は、組合せに必須の重要な他の要素を除外した意味である。そのため、ここで定義されているような要素から本質的になる組成物では、単離および精製法からの微量汚染物、生物学的緩衝液、および薬学上許容される担体（例えば、リン酸緩衝塩水、保存剤）などを除外しない。プライマーと対照オリゴヌクレオチドとの関係で用いられている場合、“から本質的になる”という用語は、プライマーが対照ヌクレオチドの５′末端で１１以上の追加ヌクレオチド残基も、対照オリゴヌクレオチドの３′末端で１１以上の追加ヌクレオチド残基も有していないことを意味している。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘのオリゴヌクレオチドから本質的になるプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘの５′末端で０〜１０の追加ヌクレオチドおよびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘの３′末端で０〜１０の追加ヌクレオチドを有してもよい。好ましくは、対照オリゴヌクレオチドから本質的になるプライマーは、対照オリゴヌクレオチドの５′および３′末端の各々で、５、６、７、８、または９以下の追加ヌクレオチドを有している。最も好ましくは、対照オリゴヌクレオチドから本質的になるプライマーは、対照オリゴヌクレオチドの５′および３′末端の各々で、１、２、３、または４以下の追加ヌクレオチドを有している。
【００３８】
ここで用いられているような、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｚからなる群より選択されるオリゴヌクレオチドから本質的になるプライマーを含んでなる組成物は、各オリゴヌクレオチドの５′末端および／または３′末端で０〜１０の追加ヌクレオチドを有した、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘ、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｙ、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｚのオリゴヌクレオチドの一種またはそれらの組合せを含有してもよい。組成物自体はこのようなプライマーを含んでなり、そのため追加の要素も含有してよい。
【００３９】
ここで用いられている“対応ポリペプチド”とは、病原体遺伝子またはその断片の異なる対立遺伝子によりコードされているポリペプチドである。仮定の例として、ウイルスの株Ｘは、ポリペプチドＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤを各々コードする四種遺伝子ａ、ｂ、ｃ、およびｄを有している。ウイルスの株Ｙは、ポリペプチドＡ′、Ｂ′、Ｃ′、およびＤ′を各々コードする、ａ′、ｂ′、ｃ′、およびｄ′と表示される、同様の四種遺伝子の異なる対立遺伝子をコードしている。この場合、ＡおよびＡ′は対応ポリペプチドであり、ＢおよびＢ′は対応ポリペプチドであるなどである。ポリペプチドという用語は、全長タンパク質およびその断片の双方に関する。
【００４０】
ここで用いられている“発現”とは、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されて、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質に翻訳される工程を表す。ポリヌクレオチドが真核細胞のゲノムＤＮＡから派生したものであれば、発現にはｍＲＮＡのスプライシングを含むこともある。発現に必要な調節要素には、ＲＮＡポリメラーゼと結合するプロモーター配列およびリボソーム結合用の翻訳開始配列がある。例えば、細菌発現ベクターは、プロモーター、例えば転写開始用のｌａｃプロモーター、リボソーム結合用のShine-Dalgarno配列、および翻訳開始用の開始コドンＡＵＧを含む（Sambrook et al.(1989)前掲）。同様に、真核細胞発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼII用の異種または同種プロモーター、下流ポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧおよびリボソーム解離用の終止コドンを含む。このようなベクターは商業的に得られるか、または当業界で知られている方法、例えば一般的にベクターを構築する以下の方法で記載された順序で組み立てられている。
【００４１】
“遺伝的に修飾された”という用語は、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を修飾する外来遺伝子または核酸配列を含有および／または発現させることを意味している。換言すると、それは細胞の内在性ヌクレオチドに対する何らかの付加、欠失または分断に関する。
【００４２】
“ＨＩＶ ＲＮＡ”とは、ゲノムＨＩＶ ＲＮＡおよびＨＩＶ ｍＲＮＡ、ならびに本発明による方法により得られるＨＩＶアンプリコンの転写により生産されたＲＮＡを意味している。
【００４３】
“ＨＩＶ変異体”、“ＨＩＶの変異体”、または“ＨＩＶ株”とはＨＩＶの現存または新規変異体を表し、ＨＩＶ−ＩおよびＨＩＶ‐２、ＨＩＶ−ＩＭ、Ｎ、およびＯ群、全ＨＩＶサブタイプ（分岐群(clade)）、例えばＨＩＶ−Ｉ サブタイプＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｃ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、Ｊ、およびＫ、分岐群(clade)の変異体、その全擬似種および循環組換え体形があるが、それらに限定されない。用語“株”がここで用いられている場合は、単一のヌクレオチドで異なる二種のＨＩＶ単離物はＨＩＶの二種の異なる“株”と考えられる。用語群は、ＨＩＶ−Ｉ 系統Ｍ、Ｎ、およびＯに言及するために常用されている。用語サブタイプは、群に属する主分岐群(clade)に言及するために用いられている。サブタイプ内にもさらに配列可変性がある。循環組換え体形（ＣＲＦ）とは、ＨＩＶ汎流行で重要な役割を果たす組換え体系統を表わしている。ＣＲＦ構成員は類似または同一の寄せ集め構造を共有しており、即ちそれらは同様の組換え現象から派生している。ＨＩＶの循環組換え体形には以下があるが、それらに限定されない：
名称                  対照株                  サブタイプ
ＣＲＦ０１  ＡＥ ＣＭ２４０                Ａ，Ｅ
ＣＲＦ０２  ＡＧ ＩｂＮＧ                  Ａ，Ｇ
ＣＲＦ０３  ＡＢ ＫａＩ１５３              Ａ，Ｂ
ＣＲＦ０４  ｃｐｘ    ９４ＣＹ０３２            Ａ，Ｇ，Ｈ，Ｋ，Ｕ
ＣＲＦ０５  ＤＦ ＶＩ１３１０              Ｄ，Ｆ
ＣＲＦ０６  ｃｏｘ ＢＦＰ９０                Ａ，Ｇ，Ｊ，Ｋ
ＣＲＦ０７  ＢＣ ＣＮ５４                  Ｂ１，Ｃ
ＣＲＦ０８  ＢＣ ＧＸ‐６Ｆ                Ｂ＼Ｃ
ＣＲＦ０９  ｃｐｘ    ９６ＧＨ２９１１          未公表
ＣＲＦ１０  ＣＤ ＴＺＢＦ０６１            Ｃ，Ｄ
ＣＲＦ１１  ｃｐｘ    ＧＲＩ７                  Ａ，ＣＲＦ０１ ＡＥ，Ｇ，Ｊ
ＣＲＦ１２  ＢＦ ＡＲＭＡＩ５９            Ｂ，Ｆ
ＣＲＦ１３  ｃｐｘ    ９６ＣＭ‐１８４９        Ａ，ＣＲＦ０１ ＡＥ，Ｇ，Ｊ，Ｕ
ＣＲＦ１４  ＢＧ Ｘ３９７                  Ｂ，Ｇ
ＣＲＦ１５  ０１Ｂ ９９ＴＨ．ＭＵ２０７９    ＣＲＦ０１ ＡＥ，Ｂ
ＣＲＦ１６  Ａ２Ｄ ＫＩＳII５００９          Ａ２，Ｄ
前記ＣＲＦの記載およびマップとＨＩＶ配列へのリンクはWv.lanl.gov/content/Hv-db/CRFs/CRF.htmlで参照できる。
【００４４】
同様に、“病原体変異体”、“病原体の変異体”、“病原体株”、または“病原体の株”とは病原体の全変異体を表し、患者に存在する病原体の変異体、変種、および組換え体を含んでいる。ここで用いられている、単一のヌクレオチドで異なる病原体の二種変異体は、病原体の二種の異なる株と考えられる。
【００４５】
ここで用いられている“インビボ”遺伝子送達、遺伝子トランスファー、遺伝子療法などは、生物、例えばヒトまたは非ヒト哺乳動物の体内への直接的な外在性ポリヌクレオチドを含んでなるベクターの導入に関する用語であり、それにより外在性ポリヌクレオチドがインビボで生物に導入される。
【００４６】
“単離された”という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片が自然状態で通常結合している諸成分、細胞およびその他から分離されることを意味する。例えば、ポリヌクレオチドに関しては、単離されたポリヌクレオチドとは、それが染色体で通常結合している５′配列および３′配列から分離されたものである。当業者に明らかなように、非天然ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片は、それをその天然相当物から区別する上で“単離”を必要としない。加えて、“濃縮された”、“分離された”、または“希釈された”ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、または、その断片は、分子の濃度または容積当たり分子の数がその天然相当物の場合より“濃縮されている”または“減少している”という点で、その天然対応物から区別しうる。一次配列で、または例えばそのグリコシル化形態で天然対応物とは異なるポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはその断片はその単離形で存在する必要がなく、なぜならそれはその一次配列でまたは他の特性、例えばそのグリコシル化形態でその天然対応物から区別しうるからである。ここで開示されている発明の各々については断言していないが、以下でおよび適切な条件下で開示されている組成物の各々に関する前記態様のすべてが本発明により提供されると理解されるべきである。そのため、非天然ポリヌクレオチドは単離天然ポリヌクレオチドとは別の態様として提供される。細菌細胞で生産されるタンパク質は、自然に生産されている真核細胞から単離された天然タンパク質とは別の態様として提供される。抗原提示細胞のような単離哺乳動物細胞は、哺乳動物でその通常箇所から分離または除去される。
【００４７】
“抗原提示細胞（ＡＰＣ）の負荷”とは、抗原、そのエピトープ、ペプチド、タンパク質、またはそれらをコードする核酸のＡＰＣによる取込みを表す。ＡＰＣは、インビトロまたはインサイチュー（in situ）で負荷される。
【００４８】
“ｍＲＮＡ”とは翻訳可能ＲＮＡを意味する。ｍＲＮＡはリボソーム結合部位および開始コドンを含有する。好ましくは、ｍＲＮＡは５′キャップ、終止コドン、およびポリＡテールも含有している。
【００４９】
“多重ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）”とは、二種以上の標的配列が複数のプライマー対を用いて単一増幅反応で同時に増幅される、ＰＣＲの変法である。非限定的例として、多重増幅には、異なる遺伝子、単一遺伝子の異なる対立遺伝子、および単一遺伝子の異なる断片の増幅反応を含む。多重ＰＣＲ条件を最適化するための方法は、Abravaya et al. J Clinical Microbiol 2000 38:716-723、Kremer et al. J Clin Microbiol 2004 42:3017-3022、Garcia-Canas et al. Electrophoresis 2004 25:2219-2226、およびMarkoulatos et al. J Clin Lab Anal 2003 17:108-12で開示されており、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００５０】
ここで用いられている“病原体”とは、何らかの病気を引き起こす生物またはウイルス、さらにはその弱毒化誘導体を表す。
【００５１】
“医薬組成物”とは、インビトロ、インビボまたは生体外で診断または治療に適した組成物にさせる不活性担体または活性担体と活性剤との組合せを含めた意味である。
【００５２】
ここで用いられている“薬学上許容される担体”という用語は、あらゆる標準的な薬学上の担体、例えばリン酸緩衝塩水溶液、水、および乳剤（例えば、油／水または水／油乳剤）、および様々な種類の湿潤剤を包含している。前記組成物は安定剤および保存剤も含有しうる。担体、安定剤、およびアジュバントの例に関しては、Martin REMINGTON’S PHARM.SCL, 18th Ed.（Mack Publ.Co.,Easton(1990)）参照。
【００５３】
“有効量”とは、有益なまたは望ましい結果をもたらすための十分量である。有効量が一回以上の投与、適用、または服用で投与される。
【００５４】
“ポリヌクレオチド”および“核酸分子”という用語は、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマー形を表すために、互換的に用いられている。ポリヌクレオチドにはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および／またはそれらの類縁体を含む。ヌクレオチドは何らかの三次元構造を有してもよく、既知または未知の何らかの機能を発揮しうる。“ポリヌクレオチド”という用語には、例えば、一本鎖、二本鎖、および三重らせん分子、遺伝子または遺伝子断片、エキソン、イントロン、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分枝ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、あらゆる配列の単離ＤＮＡ、あらゆる配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、およびプライマーを含んでいる。自然核酸分子に加えて、本発明の核酸分子には修飾核酸分子も含む。
【００５５】
“プライマー”とは、増幅反応で用いうる長さ９〜１５０ヌクレオチドのオリゴヌクレオチドを意味する。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘから本質的になるプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘの５′末端で１１以上の追加ヌクレオチドも、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：Ｘの３′末端で１１以上の追加ヌクレオチドも有しない。“フォワードプライマー”とは、センス鎖または翻訳ｍＲＮＡの配列に対応する核酸へＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼにより伸張されうるプライマーを意味する。“リバースプライマー”とは、センス鎖または翻訳ｍＲＮＡに相補的な核酸へＲＮＡポリメラーゼまたはＤＮＡポリメラーゼにより伸張されうるプライマーを意味する。“プライマー対”とは、アンプリコンを生産するために増幅反応で用いられるフォワードおよびリバースプライマーを表す。
【００５６】
“ＲＮＡ”という用語は、リボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド類縁体がリン酸ジエステル結合で一緒に結合されている、あらゆる長さのリボヌクレオチドのポリマー形を表す。“ＲＮＡ”という用語には、例えば、一本鎖、二本鎖および三重らせん分子、一次転写物、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、インビトロ転写物、インビトロ合成ＲＮＡ、分枝ポリリボヌクレオチド、あらゆる配列の単離ＲＮＡなどを含んでいる。
【００５７】
配列間の相同性または配列の同一性（前記用語はここでは互換的に用いられている）の計算は次のように行なわれる。二種アミノ酸配列または二種核酸配列の同一率を求めるために、前記配列が最適な比較目的で整列される（例えば、ギャップも最適な整列のために第一および第二アミノ酸または核酸配列の一方または双方に導入してよく、非相同配列は比較目的のため無視してもよい）。異なる長さの二種プライマーまたは候補プライマーを整列させる際、短いプライマーの長さは長い配列の長さの少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％にすべきである。プロモータープライマー（例えば、Ｔ７プロモータープライマー）とポリｄＴプライマーとの同一率を比較する目的の場合は、非コード領域が比較から除かれる。非コードとはオープンリーディングフレーム外の領域を意味している。次いで、対応アミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが比較される。第一配列における位置が第二配列における対応位置と同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、分子は前記位置で同一である（ここで用いられているアミノ酸または核酸の“同一性”はアミノ酸または核酸“相同性”と同意義である）。二配列間の同一率は前記配列により共有される同一位置の数の関数であり、その際には二配列の最適な整列のために導入を要するギャップの数と各ギャップの長さを考慮する。
【００５８】
配列の比較と二配列間の同一率の決定は数学アルゴリズム用いて行なわれ、好ましい態様では、二アミノ酸配列間の同一率は、（gcg.comのワールドワイドウェブで入手しうる）ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたNeedleman and Wunsch（J.Mol.Biol.(1970)48:444-453）アルゴリズムを用い、Blossum６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスと１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５、または６の長さウェイトを用いて求められる。さらに他の好ましい態様において、二ヌクレオチド配列間の同一率は、（gcg.comのワールドワイドウェブで入手しうる）ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用い、ＮＷＳgapdna.ＣＭＰマトリックスと４０、５０、６０、７０、または８０のギャップウェイトおよび１、２、３、４、５または６の長さウェイトを用いて求められる。パラメーター（と、分子が本発明に属するかどうかを調べるためにどのようなパラメーターが適用されるべきかについて実施者がわからないのであれば、用いられるべきものと）の特に好ましいセットでは、１２のギャップオープンペナルティ、４のギャップエキステンドペナルティ（gap extend penalty）および５のフレームシフトギャップペナルティで、Blossum６２スコアリングマトリックスを用いている。
【００５９】
二アミノ酸またはヌクレオチド配列間の同一率は、ＰＡＭ１２０ウェイト残基表、１２のギャップ長さペナルティ、および４のギャップペナルティで、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE.Meyersおよび W.Miller（CABIOS,4:11-17(1989)）のアルゴリズムを用いて求められる。
【００６０】
ここで記載されている核酸およびタンパク質配列は、公共データベースをサーチして、例えば他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定するために、“クイリ配列（query sequence）”として用いられる。このようなサーチはAltschul, et al.(1990) J.Mol.Biol.,215:403-10のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行なわれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチは、本発明の病原体核酸分子およびプライマーと相同的なヌクレオチド配列を得るために、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長（wordlength）＝１２で行なわれる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチは、本発明のＥＰＬＩＮタンパク質分子と相同的なアミノ酸配列を得るために、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で行なわれる。比較目的でギャップ付整列を得るためには、ギャップ化ＢＬＡＳＴがAltschul et al.(1997),Nucleic Acids Res.,25(17):3389-3402で記載されているように利用される。ＢＬＡＳＴおよびギャップ化ＢＬＡＳＴプログラムを利用するときは、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターが用いられる。Ncbi.nlm.nih.gov参照
【００６１】
ＨＩＶのような急速変異病原体は、予防接種にとって扱いにくい標的である。病原体に対する以前の予防接種戦略は、共通株または共通配列に向けられてきた。しかしながら、病原体標的が高度に可変性であるため、これらの戦略は急速変異または組換え病原体から保護または治療効果を得ることに失敗している。自己病原体ワクチン、自己ＨＩＶワクチン、特に患者に感染する全変異体を同時に標的化しうるものの開発には、治療に新たな理論的枠組みを要する。前記個体に存在する特異的病原体抗原に対して免疫応答を発揮するワクチンで病原体感染個体を治療しうる能力があれば、ウイルス排除を実現するかまたはウイルス負荷を抑制する上で、これまでほとんどまたは全く能力を示さなかった従来のＨＩＶワクチンのような、共通抗原に対するワクチンよりも有効であることがわかるはずである。
【００６２】
本発明の目的は、個体内に存在する病原体可変性を補償する個々の細胞または核酸ワクチンを用いた病原体の治療のための患者特異的予防接種戦略を提供することである。この戦略は、感染対象者からの病原体核酸の増幅および患者特異的ワクチンにおけるこのような増幅病原体物質、またはその誘導体の使用に依存している。増幅病原体核酸またはその誘導体（例えば、インビトロ転写産物、インビトロ転写／翻訳産物、またはこのような増幅核酸を含有したベクター）が、自己または同種異系核酸ワクチンとして用いられるか、または自己抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えば樹状細胞（ＤＣ）中に負荷されてから、患者に投与される。加えて、増幅産物は、感染個体に存在する病原体変異体を同定するため、および治療介入の効果を測定するために用いられる。
【００６３】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および他の核酸増幅技術は、対象の特異的病原体抗原をコードするＤＮＡを得るために便利で効率的な手段を提供する。しかしながら、一部病原体、特にレトロウイルス病原体、例えばＨＩＶの高変異頻度により、本発明の以前には、個々の患者に存在しうる病原体変異体の標的領域を信頼性高く増幅させうるＰＣＲプライマーを設計することが大きな難題であった。例えば、コード領域に隣接するＨＩＶ配列では異種性が著しく少ないとしても、対象とする各遺伝子用の単一ユニバーサルプライマー対の設計を行なえる絶対保存領域は存在していない。したがって、本発明による方法では、対象とする病原体遺伝子またはその一部分の核酸増幅用にフォワードおよびリバース抗原特異的プライマーのプールを用いている。そのため、多様な標的配列の増幅を行なえるように、感染個体に存在する病原体のほとんどまたは全部の株が少なくとも一種のフォワードおよび一種のリバースプライマーと反応する。
【００６４】
本発明は、プライマーアニーリング部位で病原体核酸間の可変性を補償する各種プライマー対および増幅条件を用いた、病原体核酸の株に依存しない核酸増幅のための方法を提供する。これらの方法を用いることにより、感染個体に存在する病原体の変異体の本質的に全てから、全部または標的部分を増幅させることが可能である。個体に存在する病原体変異体の全部またはほとんどの増幅は、感染個体に存在する変異体を同定および定量するために用いられるアンプリコンを生産する。このようなアンプリコンまたはその誘導体は、病原体感染を治療するためおよび／または感染個体に存在する病原体変異体を同定するために、細胞に基づいたワクチンまたは核酸ワクチンで使用される。これらの増幅産物（アンプリコン）は直接使用しても、あるいはインサイチュー（in situ）またはインビトロのいずれかでＡＰＣ、好ましくは自己ＡＰＣへ負荷するために翻訳可能ＲＮＡへ変換してもよい。前記転写物から作製されたアンプリコンおよびインビトロ転写物も、核酸ワクチンとして使用される。このようなインビトロ転写物から作製されたインビトロ翻訳ポリペプチドは、ポリペプチドワクチンとしておよびＡＰＣ負荷のために使用される。
【００６５】
病原体核酸の株に依存しない増幅において重要な面は、プライマーの選択および増幅条件である。本発明者らは、病原体核酸の分岐領域を増幅させうるプライマー対を選択するための方法を見出した。ＨＩＶのような可変性病原体からの選択標的抗原を増幅させるために、株に依存しない方法では、目的とする標的の信頼しうる増幅と現存変異体の同時共増幅を確実に行えるＰＣＲプライマーのプールが戦略的に選択される。
【００６６】
増幅の標的となる自己抗原の数および選択は、次の二つの主要因に基づくことができる：（１）標的遺伝子の重要領域が、扱いやすい複雑度をもつプライマープールを用いた核酸の増幅に対して影響を受けやすいこと、ならびに（２）好ましくは、標的抗原の発現がＤＣのような標的ＡＰＣの生態に悪影響を及ぼさないこと。全病原体核酸よりもむしろ病原体核酸の特定領域を増幅させることにより、最も免疫原性な断片をコードする領域を選択して、免疫系でのネガティブな作用を有しうる領域を避けることが可能である。例えば、樹状細胞の阻害に関与するＨＩＶ ｎｅｆ遺伝子の部分は、阻害に関与するｎｅｆの領域を増幅させないプライマーを選択することにより避けられる。
【００６７】
病原体の既知の変異体に対応した各種プライマーが、標的遺伝子座でハイブリッド形成のために設計される。しかしながら、プライマーの複雑度を管理するためには、既知の病原体変異体間の保存ヌクレオチド配列をまず調べることが有用である。病原体核酸の保存領域とハイブリッド形成するプライマーの選択により、個体に存在する病原体の全部またはほとんどの変異体の増幅を確実に行う上で必要なプライマーの数を減らせる。プライマー選択でのもう一つの重要な考慮すべき事項は、既知変異体アニーリング部位に対するプライマー配列の３′半分における不一致が回避または最小化されながら、３′末端の不一致のＴが典型的には増幅に悪影響を及ぼさないことである。残りの３′の不一致はアニーリング温度を低下させることで補償される。プライマー配列の５′半分における不一致は許容され、アニーリング温度を低下させることで補償される。増幅反応条件は、非特異的増幅を避けながら、感染個体に存在する全病原体変異体の増幅を行なえるように最適化される。したがって、本発明のプライマーおよび／または方法を用いた増幅によれば、個体に存在する病原体の全変異体の同定および定量を行なえる。対照的に、従来の方法は存在する病原体の量を典型的には過少評価し、なぜなら単一の病原体変異体のみが同定されるからである。
【００６８】
ＨＩＶの各種変異体を増幅させうるプライマー対の選択に関して前記記載した方法および下記例で記載された方法は、病原体の各種変異体を増幅させうるプライマー対の選択に適用しうる。ここで記載されたプライマー選択工程は、フォワードプライマーアニーリング用の第一領域およびリバースプライマーアニーリング用の第二領域を選択する（前記第一および第二領域は病原体のオープンリーディングフレームおよび／またはエピトープに隣接している）、前記第一および第二領域用のフォワードおよびリバースプライマー候補を選択する（前記プライマーのうち少なくとも一種は、病原体の各種変異体間の配列可変性を補償するように設計される）工程を含んでなる。
【００６９】
本発明の一態様において、感染哺乳動物に存在する病原体の各種変異体からの核酸を増幅させるために、プライマーが前記方法により設計される。次いで、増幅された核酸は同病原体感染哺乳動物を治療するために自己核酸ワクチンで用いられる。一方、増幅された核酸は病原体に感染した異なる哺乳動物を治療するために同種異系核酸ワクチンとして、または感染を予防するために予防ワクチンとして用いられる。予防用の場合、一以上の個体から単離または得られた病原体核酸から作製されたアンプリコンを用いて核酸ワクチンまたは核酸負荷ＡＰＣが製造される。
【００７０】
このように、一態様において、本発明は、下記からなる、病原体の少なくとも二種の株から一またはそれ以上のポリペプチドを提示する病原体アンプリコンを生産する方法を提供する：（ａ）混合物を形成するために病原体の第一および第二株からのポリヌクレオチドを混ぜ合わせる、そして（ｂ）第一アンプリコンおよび第二アンプリコンを生産するために前記ポリヌクレオチドを増幅させる、前記第一アンプリコンは前記第一株からのポリペプチドをコードし、前記第二アンプリコンは前記第二株からの対応ポリペプチドをコードしている。例えば、第一株および第二株からのポリヌクレオチドは、一以上の病原体感染個体の生物学的試料から、一以上の病原体培養物から、クローン化病原体またはクローン化病原体核酸から得られる。アンプリコンおよびこのようなアンプリコンのインビトロ転写により生産されたＲＮＡは、核酸ワクチンとして、および抗原提示細胞に負荷する上で有用である。
【００７１】
別の態様において、本発明は、哺乳動物に存在する病原体の各種変異体からの一種以上の抗原をコードする複数種の核酸と薬学上許容される担体を含んでなる核酸ワクチンを提供し、ここで前記核酸は病原体の前記変異体間の可変性を補償しうる複数種のプライマー対を用いた病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅から派生する。
【００７２】
他の態様において、本発明は、前記の病原体感染哺乳動物に前記の核酸ワクチンを投与することからなる感染症の治療方法を提供する。
【００７３】
同様に、本発明は、下記からなる核酸ワクチンの製造方法を提供する：哺乳動物に存在する病原体の各種変異体からの一種以上の抗原をコードする複数種の核酸と薬学上許容される担体を混合する、ここで前記核酸は病原体の前記変異体間の可変性を補償しうる複数種のプライマー対を用いた病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅から派生する
【００７４】
さらに他の態様において、本発明は、個々の対象者に存在する病原体の各種株からの一またはそれ以上のポリペプチドをコードする核酸を含んでなる単離抗原提示細胞（ＡＰＣ）を提供するが、ここで一またはそれ以上の病原体ポリペプチドはどの株からも提示されない。仮定例として、ウイルスがポリペプチドＡ、Ｂ、およびＣをコードする全部で三種の遺伝子ａ、ｂ、およびｃを有していると仮定する。このウイルスは急速に変異し、ウイルスの二種株、株ＸおよびＹが感染患者から単離される。株Ｘは、ポリペプチドＡ′、Ｂ′、およびＣ′をコードする対立遺伝子ａ′、ｂ′、およびｃ′を有している。株Ｙは、ａ*、ｂ*、およびｃ*と表示され、変異ポリペプチドＡ*、Ｂ*、およびＣ*をコードする、同遺伝子の異なる対立遺伝子を有している。前記のように、前記の抗原提示細胞は病原体の各種株（例えば、ウイルスの株ＸおよびＹ）からの一種以上の病原体ポリペプチドをコードする核酸を含んでなるが、少なくとも一種の病原体ポリペプチドはどの株からも提示されない。これは、ＡＰＣが三種遺伝子のうち一または二種の各対立遺伝子を提示するポリヌクレオチドを含有していることを意味する。例えば、ＡＰＣはＡ′、Ａ*、Ｂ′、およびＢ*をコードするポリヌクレオチドを含有するが、ＣまたはＣ*は含有していない。ここでどの株からも提示されない病原体ポリペプチドはポリペプチドＣであり、ＣもＣ*も提示されない。ここで用いられているポリペプチドという用語は、全長タンパク質またはその断片の双方を表す。このように、ＡＰＣはＡ′、Ａ*、Ｂ′、またはＢ*をコードする核酸ならびにＣおよびＣ*の対応断片を含有しうるが、ＣおよびＣ*の全部ではない。病原体ポリペプチドの全部をコードする核酸を用いたこのアプローチの利点は、それが感染性病原体の再構築を避けられることである。追加の利点は、患者または抗原提示細胞に有害なポリペプチドをコードする核酸が特に避けられることである。
【００７５】
本発明による核酸ワクチンは、哺乳動物への投与に適している。好ましい態様において、哺乳動物は霊長類、最も好ましくはヒトである。最も好ましくは、本発明による核酸ワクチンは、病原体ポリヌクレオチドが得られた特定の哺乳動物に投与される。例えば、好ましい態様において、病原体ポリヌクレオチドは感染患者から単離され、核酸ワクチンがその患者に投与される。
【００７６】
本発明によるワクチンは、病原体の各種変異体からの一種以上の抗原をコードする複数種の核酸を含んでなる。前記核酸は一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡである。好ましい態様において、核酸はＲＮＡであり、最も好ましい核酸はｍＲＮＡである。本発明による核酸ワクチンは、それらが投与された哺乳動物において、一種以上の細胞の種類で発現されうるはずである。発現とは、核酸（例えば、翻訳可能ＲＮＡでは）が直接翻訳されるか、または（例えば、プロモーターおよび開始コドンと、その後のオープンリーディングフレームを含んでなるＤＮＡでは）転写されて翻訳可能ｍＲＮＡを生産する、および／または（例えば、線状ＤＮＡ、ＤＮＡベクター、ＲＮＡウイルスベクター、およびＤＮＡウイルスベクターでは）それが導入された哺乳動物細胞のゲノムに組み込まれると転写されることを意味する。翻訳可能ｍＲＮＡは（一次または工程転写物として）インビボ転写によりまたはインビトロ転写により生産される。好ましい態様において、本発明によるワクチンで用いられる核酸はＲＮＡ、最も好ましくはｍＲＮＡである。
【００７７】
病原体という用語は、病因に関与するウイルスまたは生物、さらにはその弱毒化誘導体に関する。このような病原体には細菌、原生動物、真菌、およびウイルス病原体、例えばHelicobacter、例えばHelicobacter pylori、Salmonella、Shigella、Enterobacter、Campylobacter、様々なマイコバクテリア、例えばMycobacterium leprae、Bacillus anthracis、Yersiniapestis、Francisella tularensis、Brucella種、Leptospira interrogans、Staphylococcus、例えばS.aureus、Streptococcus、Clostridum、Candida albicans、Plasmodium、Leishmania、Trypanosoma、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ＨＣＶ、ＨＰＶ、ＣＭＶ、ＨＴＬＶ、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス１型、単純ヘルペスウイルス２型、コロナウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、およびエプスタイン‐バールウイルス）、パピローマウイルス、インフルエンザウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、および風疹ウイルスがあるが、それらに限定されない。本発明による方法は高可変性病原体、例えばウイルス病原体、好ましくはレトロウイルス病原体、最も好ましくはＨＩＶおよびＨＣＶの核酸の増幅に特に有用である。
【００７８】
病原体の変異体または株とは、病原体のあらゆる誘導体を表す。このような誘導体は病原体の変異、組換え、または組換え操作により出現する（または出現していた）。例えば、ＨＦＶの変異体には既知および未同定ＨＩＶ変異体を包含し、ＨＩＶ−Ｉ Ｍ、Ｎ、およびＯ群、全ＨＩＶサブタイプまたは分岐群(clade)、例えばＨＩＶ−ＩＡ１、Ａ２、Ｂ、Ｃ、Ｃ、Ｆ１、Ｆ２、Ｇ、Ｈ、Ｊ、およびＫ分岐群(clade)、分岐群(clade)の変異体、ＨＩＶ‐２の全変異体、およびその全組換え体および擬似種があるが、それらに限定されない。
【００７９】
“病原体の各種変異体”または“病原体の各種株”とは、感染個体に存在する病原体の変異体を含めた意味である。病原体の各種変異体は、同時にまたは別々に、個体へ入り込んできたかもしれない。一方、各種病原体変異体は変異および／または組換えにより個体内で出現しうる。例えば、好ましい態様において、病原体はレトロウイルス、好ましくはＨＩＶである。ある感染個体に存在する病原体（ＨＩＶ）の各種変異体には前記個体に存在しうるあらゆるＨＩＶを含み、このような場合、ＨＩＶの各種変異体にはＨＩＶ−Ｉ、例えばあらゆるまたは全部のＨＩＶ−Ｉ Ｍ、Ｎ、およびＯ群、およびそのサブタイプ、分岐群(clade)および擬変異体、さらにはＨＩＶ‐２およびその変異体、およびまだ同定されていないＨＩＶの種類を含む。
【００８０】
抗原とは、一種以上の免疫原性エピトープを含んでなるポリペプチドを意味する。例えば、本発明による増幅核酸は一以上のオープンリーディングフレーム、または一以上のオープンリーディングフレームの一部分をコードしうる。例えば、好ましい態様において、病原体はＨＩＶであり、増幅核酸は感染個体に存在するＨＩＶの各々または少なくともほとんどの変異体からの一種以上のＨＩＶポリペプチドの一以上のオープンリーディングフレームまたはその一部分をコードしている。好ましいＨＩＶポリペプチドはｇａｇ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、ｖｐｒ、およびｅｎｖとその断片またはエピトープである。ｖｐｒの好ましい断片（対照配列としてＮＣ_００１８０２を用いる）は、ヌクレオチド５１０５‐５３２０（ｖｐｒアミノ酸残基１‐７２をコードする）、５１３８‐５３２０（ｖｐｒアミノ酸残基１２‐７２をコードする）、５１０５‐５１６５（ｖｐｒアミノ酸残基１‐２０をコードする）、および５１３８‐５１６５（ｖｐｒアミノ酸残基１２‐２０をコードする）ならびに他のＨＩＶ変異体の対応断片でコードされている。追加の好ましいｖｐｒ断片は、残基２５‐４０、２９‐３７、３０‐３８、３１‐３９、３１‐５０、３４‐４２、４１‐４９、５２‐６２、５３‐６３、５５‐７０、５９‐６７、および６２‐７０である。追加の断片およびエピトープは、インターネットhttpサイト：（//hiv.lanl.gov/content/immunology/）でアクセスされるＨＩＶ Molecular Immunology Databaseでみられ、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００８１】
病原体ポリヌクレオチドは鋳型であるか、または一種以上の病原体抗原若しくはエピトープをコードする核酸の増幅用鋳型の原型である。病原体ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡである。非限定的例として、病原体ポリヌクレオチドはＤＮＡ、例えば病原体ゲノム、ＤＮＡベクター若しくは断片、または病原体宿主のゲノムに組み込まれた病原体ＤＮＡである。病原体ポリヌクレオチドがＤＮＡである場合、それは本発明による方法に従い増幅用の鋳型として直接用いられる。
【００８２】
病原体ポリヌクレオチドは、スプライスされたまたはスプライスされていない、病原体ゲノム（例えば、レトロウイルスゲノム）の形をしたＲＮＡまたは病原体ｍＲＮＡでもよい。例えば、ＨＩＶの場合に、核酸は宿主ゲノムの組込みウイルスＤＮＡに対応した、または宿主ゲノムへのウイルス組込み前に細胞中に存在するＨＩＶ ｃＤＮＡに対応したＤＮＡでもよい。ＨＩＶ ＲＮＡはウイルス複製に際してウイルス粒子または宿主細胞から単離されたウイルスＲＮＡゲノムの形でも、スプライスされたまたはスプライスされていないＨＩＶ ｍＲＮＡの形でもよい。好ましい態様において、病原体ＲＮＡはＨＩＶビリオン(virion)から単離されたＨＩＶゲノムＲＮＡである。病原体ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合、それはｃＤＮＡを生産するために逆転写され、次いで核酸増幅用の鋳型として使用される。
【００８３】
好ましくは、病原体ポリヌクレオチドは、感染個体に存在する各種病原体変異体からのものであるか、またはそれから派生したものである。この関係において、“から派生した”とは、核酸が病原体核酸を含有する病原体または細胞から少なくとも部分的に精製されたこと、または核酸が病原体核酸から増幅されたことを意味している。個体に存在する各種病原体変異体からの核酸を導くことにより、得られたワクチンは個体に存在する病原体の変異体のおそらく全部に対して免疫応答を引き出せる。
【００８４】
本発明による方法に従い選択されたプライマーを用いて核酸増幅により生産された一次アンプリコンは、病原体抗原またはそのエピトープをコードするＤＮＡを含んでなる。一次アンプリコンはさらなる修飾なしに核酸ワクチンで用いられる。一方、一次アンプリコンは核酸ワクチン、ウイルスワクチンに使用のために、またはＡＰＣへの負荷のために、発現カセットまたは発現ベクター中へ挿入してもよい。好ましい態様において、一次ＤＮＡアンプリコンは、インビトロ転写用の鋳型として機能するように修飾される。
【００８５】
鋳型ＤＮＡ配列（例えば、ＰＣＲ産物）を転写するために、鋳型はＲＮＡポリメラーゼ結合部位またはプロモーターを含有するべきである。さらに、真核細胞での効率的な翻訳のために、転写ＲＮＡは好ましくは５′キャップ、ＡＴＧ翻訳開始コドンを含むKozak配列、およびその３′末端でポリアデニル化配列を含有する。好ましくは、転写ＲＮＡは翻訳終止コドン（ＵＡＡ、ＵＡＧ、またはＵＧＡ）も含有する。これら転写および翻訳シグナルの一部、例えばプロモーター、Kozak配列、開始および終止コドンは、標的病原体核酸の鋳型に存在してもよく、ＰＣＲまたは他の増幅反応に際して増幅される。一方、これらの配列はいずれかの増幅過程で用いられるフォワードおよびリバースプライマーに含有させてもよい。
【００８６】
目的のワクチンがインサイチュー（in situ）投与用のまたはＡＰＣへの負荷用のｍＲＮＡワクチンであれば、５′ネステッド（nested）プライマーに含有されるプロモーター配列はインビトロ転写に適したものにすべきである。インビトロ転写に適したプロモーターとインビトロ転写の方法は当業者に知られている。非限定的例として、好ましいプロモーターは市販のＲＮＡポリメラーゼに相当するもの、例えばＴ７プロモーターおよびＳＰ６プロモーターである。他の有用なプロモーターも当業者に知られている。目的のワクチンが標的細胞内で転写のための核酸を含有していれば、５′プライマー配列に含有されるプロモーターは、目的の標的細胞で活性なものにすべきである。しかも、ワクチンが標的細胞内で転写のための核酸を含有している場合、プロモーターおよび翻訳開始シグナルは、フォワードプライマーへ組み込むか、またはアンプリコンを発現カセットへ挿入することにより、鋳型から増幅される。好ましいことに、プロモーターは市販インビトロ転写キットを用いて効率的転写を行なえる。インビトロ転写および翻訳の方法は当業者に知られている（例えば、米国特許第２００３／０１９４７５９号参照）。典型的なインビトロ転写反応では、ＤＮＡ鋳型は全四種リボヌクレオシド三リン酸およびキャップジヌクレオチド、例えばｍ７Ｇ（５′）ｐｐｐ（５′）Ｇまたはキャップ類縁体、例えばＡＲＣＡの存在下でバクテリオファージＲＮＡポリメラーゼを用いて転写される。
【００８７】
プロモーターおよび翻訳開始シグナルは、一次増幅に際して用いられるプライマーまたは後のラウンドで用いられるネステッド（nested）プライマーに含有させる。増幅の任意二次ラウンドで用いられるプライマーのアニーリング標的は一次増幅反応で用いられるものと同一でも、またはそれは一次アンプリコンに内在する（“ネステッド（nested）”）部位でもよい。好ましい態様において、増幅の一次または二次（好ましくは二次）ラウンドで用いられるフォワードプライマーは、プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）をコードする５′非ハイブリッド形成領域（“オーバーハング”）、および一次アンプリコンのアンチセンス鎖に相補的な３′領域を含んでなる。典型的には、フォワードプライマーはKozak配列、好ましくは最適化Kozak配列、例えば塩基５′ＣＣＡＣＣＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５９）も含有し、ここで下線ＡＴＧは翻訳開始コドンである。ＡＴＧ開始コドンを含有するKozak配列はフォワードプライマーの５′オーバーハング領域またはプライマーの３′アニーリング領域に存在するが、それはこのような配列が一次アンプリコンに存在するかどうかによる。加えて、一次アンプリコンが最適に達しない程度のKozak配列を含有していれば、完全に相補的ではないが最適なKozak配列を有するフォワードプライマーを用いることによりそれは最適化される。好ましくは、フォワードプライマーの３′部分は、イニシエーターＡＴＧコドンのすぐ下流の配列、または一次アンプリコンに際して増幅される最も５′側のコード配列と本質的に相補的である。リバースプライマーは好ましくは、インビトロ転写に際してポリアデニル化用の鋳型として働く５′ポリＴオーバーハングをその５′末端に含有している。リバースプライマーの３′半分は一次増幅反応で単離されるセンス配列と相補的である。適切な翻訳終止コドンが一次アンプリコンに存在していなければ、それはリバースプライマーの５′オーバーハング部分に含有させる。前記プライマーを用いて増幅により得られた二次アンプリコンは、ｍ７Ｇキャップまたはその類縁体、例えばＡＲＣＡの存在下でインビトロ転写反応時に鋳型として働く（例えば、米国特許第２００３／０１９４７５９号参照）。
【００８８】
このように、他の態様において、本発明は、下記からなる病原体感染哺乳動物の治療方法を提供する：
ａ．増幅病原体ＤＮＡを生産するために、病原体の各種変異体を増幅させうる複数種のプライマー対を用いて、哺乳動物に存在する病原体の各種変異体の核酸を増幅させる、
ｂ．場合により、病原体ＲＮＡを生産するために前記増幅病原体ＤＮＡを転写する、そして
ｃ．前記病原体ＤＮＡまたは前記病原体ＲＮＡを前記哺乳動物に投与する。
【００８９】
核酸ワクチンを処方して対象者に送達するための方法は当業者に知られている。例えば、Scheel et al. Eur J Immunol (2204)34:537-547、Hoerr et al.(2000) Eur J Immunol 30:1-7、Liu et al (2002) Vaccine 20:42-48、Riedl et al.(2002) J Immunol 168:4951、Riedel et al.(2004) J MoI Med 82:144、米国特許第５，７８３，５６７号、米国特許第６，６０３，９９８号、ＥＰ０８８０３６０号、ＥＰ１０８３２３２号参照、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。投与の経路としては局所送達、皮膚のエレクトロポレーション、ならびに皮膚、皮下、皮内、粘膜および筋肉内投与などがあるが、それらに限定されない。
【００９０】
核酸ワクチンとして一次若しくは二次アンプリコン、またはインビトロ転写ＲＮＡを用いる代わりに、このような核酸はインビトロで抗原提示細胞中へ負荷してもよい。負荷された抗原提示細胞もワクチンとして使用に適している。
【００９１】
このように、他の態様において、本発明は、下記組成物を提供する：哺乳動物に存在する病原体の各種変異体からの一種以上の抗原をコードする複数種の核酸でトランスフェクトされた抗原提示細胞を含んでなる、ここで前記核酸は病原体の前記変異体間の可変性を補償しうる複数種のプライマー対を用いた病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅から派生したものであり、前記抗原提示細胞および前記病原体核酸は前記哺乳動物からのものであるか、またはそれから派生したものである。
【００９２】
抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてはマクロファージ、Ｂ細胞、および樹状細胞（例えば未成熟樹状細胞、成熟樹状細胞、およびランゲルハンス細胞）があるが、それらに限定されない。プロフェショナル抗原提示細胞、特に樹状細胞（ＤＣ）は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞双方に及ぼす効果を介して、細胞性免疫の刺激のための強力な手段を提供する（Banchereau 1998，Banchereau 2000）。それらの機能に固有なものとして、それらはＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞へＭＨＣクラスＩおよびII産物双方で提示のために抗原を効率的にプロセッシングする。表面抗原濃縮技術で末梢血または骨髄から単離された、またはＰＢＭＣの培養物から収集された樹状細胞は、特異的候補抗原で負荷することができ、こうしてナイーブまたは休止Ｔ細胞に関連抗原を提示しうる（Heiser 2000，Mitchell 2000）。好ましくは、抗原提示細胞は予防接種される個体由来の自家であり、病原体核酸も患者から単離されたまたは派生したものである。
【００９３】
抗原提示細胞は哺乳動物対象者によりおよびそこで得られるか、または哺乳動物対象者から単離された細胞から導かれ、好ましい態様において、抗原提示細胞は樹状細胞である。“樹状細胞（ＤＣ）”という用語は、様々なリンパ系および非リンパ系組織でみられる（Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol. 9:271-296）、またはインビトロで樹状細胞前駆体から導かれる、形態学的に類似した細胞種の多様な群を表す。樹状細胞はＡＰＣで最も有力なものであり、Ｔ細胞活性化および増殖に必要なシグナルを供給する。樹状細胞は骨髄始原細胞から導かれ、末梢血で少数が循環し、未成熟ランゲルハンス細胞または末梢分化成熟細胞として出現する。好ましい態様において、樹状細胞は単球から分化する。抗原提示細胞（ＡＰＣ）の単離および樹状細胞前駆体および成熟樹状細胞の生産のための方法は、当業者に知られている。例えばBerger et al. J Immunol Methods 2002 268:131-40、米国特許出願２００３０１９９６７３号、２００２０１６４３４６号および６０／５２２，５１２号、およびＷＯ９３／２０１８５号参照、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。好ましい態様において、樹状細胞はRomani et al.(J Exp Med 1994 180:83-93)またはSallusto et al.(J Exp Med 1994 179:1109-1118)で記載された方法によりＣＤ１４＋末梢血単球（ＰＢＭＣ）から作製される、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。。一方、樹状細胞はCaux et al.(J Exp Med 1996 184:695-706)の方法によりＣＤ３４＋細胞からも作製できる。
【００９４】
抗原提示細胞に負荷するための方法は当業者に知られており、エレクトロポレーション、受動的取込み、リポフェクション、カチオン性試薬、ウイルストランスダクション、ＣａＰＯ４などがあるが、それらに限定されない。例えばＰＣＴ／ＵＳ０５／２２７０５号および米国出願番号６０／５８３，５７９号、米国公開番号２００３／０１４３７４３号、米国公開番号２００５０００８６２２号、米国公開番号２００４０２３５１７５号、および米国公開番号２００４０２１４３３３号参照、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。好ましい態様において、抗原提示細胞は病原体の各種株からのポリペプチドをコードするＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡおよびＲＮＡの双方で負荷される。抗原提示細胞のトランスフェクションに有用なヒトＣＤ４０Ｌ ｃＤＮＡ、ＣＤ４０Ｌタンパク質、および好ましいＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡは、各々ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４０７および４０８で示されている。好ましい態様において、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４１０のヌクレオチド３８‐８７７に相当するｍＲＮＡ。好ましくは、ｍＲＮＡは５′キャップ化およびポリアデニル化される。好ましい態様において、キャップはＡＲＣＡである。好ましいポリＡテール長さは５０〜１０００ヌクレオチド、さらに好ましくは６４〜９００ヌクレオチド、最も好ましくは１０１〜６００ヌクレオチドの範囲である。別の態様において、抗原提示細胞は病原体の各種株からの病原体ポリペプチドをコードするＲＮＡのインビトロ翻訳により得られるポリペプチドで負荷される。病原体ポリペプチドはＣＤ４０Ｌ ｍＲＮＡで抗原提示細胞中に負荷してもよい。樹状細胞は、成熟または未成熟時にインビトロで負荷される。負荷された未成熟樹状細胞は予防接種前にインビトロでまたは予防接種後に（外部成熟刺激でまたはそれ無しで）インビボで成熟させる。一方、核酸はインサイチュー（in situ）で抗原提示細胞に送達してもよい。例えば、Liu et al.(Vaccine 2002 20:42-48)、Lisziewics et al.(Vaccine 2003 21:620-623)、およびO’Hagen（Curr Drug Targets Infect Disord 2001 1:273-286）参照、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【００９５】
好ましくは、前記組成物中の抗原提示細胞は樹状細胞である。負荷された樹状細胞は患者で病原体感染を治療するためにワクチンとして用いられる。好ましくは、病原体および抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）は治療患者由来の自家である。
【００９６】
他の態様において、本発明は、下記なる自己ワクチンの製造方法を提供する：哺乳動物に存在する病原体の各種変異体からの一種以上の抗原をコードする核酸で、病原体感染哺乳動物から得られるまたは導かれる抗原提示細胞をトランスフェクトする、ここで前記核酸は病原体の前記変異体間の可変性を補償するように設計された複数種のプライマー対を用いた病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅から派生する
【００９７】
本発明は、前記の負荷抗原提示細胞を含んでなるワクチンをさらに提供する。このようなワクチンにおいて、負荷抗原提示細胞は患者への治療投与に適した緩衝液中に存在する。ワクチンは抗原提示細胞またはＴ細胞の刺激のための要因としてアジュバントをさらに含んでもよい。医薬組成物を処方する方法は当業者に知られている。例えば、Remington’s Pharmaceutical Scienceの最新版参照。
【００９８】
樹状細胞ワクチンの最適な免疫処置の間隔は当業者により定められる。好ましい態様において、患者は一回当たり１×１０６〜１×１０７の生存能力のあるＲＮＡ負荷ＤＣで五回予防接種される。予防接種用に選択される用量レベルは安全で十分許容されるようにする。
【００９９】
抗原提示細胞を単離、製造、トランスフェクト、処方、および投与する方法は当業界で知られている。例えば、Fay et al. Blood 2000 96:3487、Fong et al. J Immunol 2001b 166:4254-4259、Ribas et al. Proc Am Soc Clin One 2001 20:1069、Schuler-Thurner et al. J Exp Med. 2002 195:1279-88、Erratum in:J Exp Med. 2003 197:395、およびStift et al. J Cli Oncol 2003 21:135-142参照、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。
【０１００】
臨床で用いられるＡＰＣ投与の経路としては静脈内（ＩＶ）、皮下（ＳＣ）、皮内（ＩＤ）、およびリンパ内があるが、それらに限定されない。客観的臨床応答が他のＡＰＣワクチンのＩＶ、ＳＣ、およびＩＤ投与後に報告されていた。現在、ＩＤ投与が主流となりつつある、なぜなら真皮が樹状細胞の常在箇所であり、そこからそれらが排リンパ節へ移動することが知られているからである。ネズミモデルでは、ＳＣ注入樹状細胞が排リンパ節のＴ細胞領域でその後みられ、ＦＶ免疫処置後の場合より優れた防御抗腫瘍免疫を引き出す。防御抗腫瘍免疫または細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を生じる上で、リンパ節への直接的な樹状細胞注入が他の送達経路より優れているという、ネズミでの証拠がある（Lambert et al. Cancer Res 2001 61:641-646、引用することにより本明細書の開示の一部とされる。）。これは、（用量を多部位に分けてできるだけ多くの節を用いるよりも）単一の排リンパ節または貯留域で影響を与えるように全樹状細胞用量が送達されるべきであることを示している。
【０１０１】
ワクチンの免疫原性を評価するために、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞の成熟プロファイルを追跡することにより、予防接種個体の免疫応答が測定される。例えば、ＨＩＶ特異的エフェクター細胞機能の回復が、エフェクターＴ細胞の表現型、ＣＤ４５ ＲＡ＋ ＣＣＲ７−を発現して高レベルのＩＦＮ‐γおよびグランザイム Ｂを分泌する細胞の存在により調べられる。ＨＩＶ特異的増殖応答の回復は、ＨＦＶ‐ＲＮＡ回復ＨＩＶ特異的記憶Ｔ細胞画分でトランスフェクトされた樹状細胞で刺激後に、ＩＬ‐２を生産して低ＣＦＳＥにしうる細胞の能力により調べられる。
【０１０２】
ワクチンにより誘導される特異的Ｔ細胞の成熟は、フローサイトメトリーアッセイで表面および細胞内マーカーを用いて測定される。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、αβＴＣＲ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、およびＣＤ１０７を含めた表面マーカーまたはグランザイム Ｂもしくはγ‐ＩＦＮのような細胞内分子について染色することにより測定される。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＣＲ７、およびＩＬ‐２がＣＤ４＋Ｔ細胞を測定するために用いられる。このようなアッセイは、患者からの自己ＨＩＶ配列を含むペプチドとのインキュベート後に、免疫応答を測定するために用いられる。ベースラインと毎月の各新予防接種前との細胞性免疫応答の比較から、細胞性免疫応答の幅に及ぼすワクチンの影響を調べられる。免疫応答の幅はＣＦＳＥ増殖アッセイを用いて測定してもよい。
【０１０３】
ＨＩＶ抗原によりコードされる数百のＣＴＬエピトープが記載されてきたが、自己ＨＩＶワクチンに関する前記要因の考慮が、ワクチン用の主標的としてｇａｇ（ｐ５５）、ｒｅｖ、ｎｅｆ、およびｖｐｒの選択に本発明者らは至った。しかしながら、他のＨＩＶ抗原も本発明による方法を用いて標的とできた。前記の方法は、ＨＦＶ感染個体からのＨＦＶの各種株を増幅させうるプライマーを選択するために用いられた。特に、本発明者らは各種ＨＦＶ株からのｇａｇ、ｎｅｆ、ｒｅｖ、およびｖｐｒ遺伝子を増幅させうるプライマーを見出した。前記プライマー配列、プライマー番号および名称、Ｔｍおよび長さが図１に示されている。対照ＨＩＶゲノム（受理番号ＮＣ００１８０２）に対するこれらプライマーの位置が図２に示されている。
【０１０４】
このように、一つの態様において、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２０、２０６、および２０７からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２０、２０６、および２０７と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｇａｇフォワードプライマーを含んでなる組成物を提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１０５】
好ましいｇａｇフォワードプライマーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、４、１６、１７、１９、および２０であり、これらは唯一のフォワードプライマーとしてまたはいずれかの組合せにより用いられる。ｇａｇフォワードプライマーの好ましい組合せはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６および１７、１９および２０である。
【０１０６】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜４３、１０２〜１１３、および２２０〜２３２からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜４３、１０２〜１１３、および２２０〜２３２と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｇａｇリバースプライマーを含んでなる組成物をさらに提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１０７】
好ましいｇａｇリバースプライマーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２２、２６、２７、３２〜３４、３６〜３８、４０〜４１、および１０６〜１０８である。ｇａｇリバースプライマーの好ましい組合せはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３および４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、３６、３７、および４０、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２６、および３８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２および２７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、３３、および３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３６、３７、３８、４０、および４１、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６、１０７、および１０８である。
【０１０８】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４〜５８、２０８、および２０９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４〜５８、２０８、および２０９と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｖｐｒフォワードプライマーを含んでなる組成物も提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１０９】
好ましいｖｐｒフォワードプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４〜５２である。ｖｐｒフォワードプライマーの好ましい組合せは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４および４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５７および５８である。
【０１１０】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、１１４〜１２２、１９６〜２０３、２３３〜２４１、および２６１〜２７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、１１４〜１２２、１９６〜２０３、２３３〜２４１、および２６１〜２７３と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｖｐｒリバースプライマーを含んでなる組成物をさらに提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１１１】
好ましいｖｐｒリバースプライマーはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６〜２０３および２６９〜２７３である。ｖｐｒリバースプライマーの好ましい組合せはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９６および１９７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９８、１９９、および２００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０１〜２０３、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６９〜２７３である。
【０１１２】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４〜８８、１８３〜１８９、２１０、および２１１からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４〜８８、１８３〜１８９、２１０、および２１１と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｒｅｖフォワードプライマーを含んでなる組成物も提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１１３】
ｒｅｖフォワードプライマーの好ましい組合せはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８７および８８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３および１８４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５、１８６、および１８７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８および１８９である。
【０１１４】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９〜１０１、１２３〜１２９、１９０〜１９５、２４２〜２４８、および２５８〜２６０からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９〜１０１、１２３〜１２９、１９０〜１９５、２４２〜２４８、および２５８〜２６０と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＦＶ ｒｅｖリバースプライマーを含んでなる組成物をさらに提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１１５】
ｒｅｖリバースプライマーの好ましい組合せは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９０、１９１、および１９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９３、１９４、および１９５である。
【０１１６】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０〜１３２、１３４〜１３６、および２１２〜２１４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０〜１３２、１３４〜１３６、および２１２〜２１４と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｅｎｖフォワードプライマーを含んでなる組成物も提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１１７】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３、１５４〜１５９、２４９、および２５５〜２５８からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３、１５４〜１５９、２４９、および２５５〜２５８と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＦＶ ｅｎｖリバースプライマーを含んでなる組成物をさらに提供する。
【０１１８】
加えて、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３のオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドからなるＨＩＶ ｅｎｖリバースプライマーを含んでなる組成物を提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１１９】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８〜１３９、１４７、１４８、２０４、および２１５〜２１８からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８〜１３９、１４７、１４８、２０４、および２１５〜２１８と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｎｅｆフォワードプライマーを含んでなる組成物も提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１２０】
加えて、本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０〜１４３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０〜１４３と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドからなるＨＩＶ ｎｅｆフォワードプライマーを含んでなる組成物を提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１２１】
ｎｅｆフォワードプライマーの好ましい組合せはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、１３９、および２０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０〜１４３、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４７〜１４８、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８および１３９である。
【０１２２】
本発明は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１４９〜１５３、および２５０〜２５４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１４９〜１５３、および２５０〜２５４と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドから本質的になるＨＩＶ ｎｅｆリバースプライマーを含んでなる組成物をさらに提供する。好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１２３】
ｎｅｆリバースプライマーの好ましい組合せは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４９〜１５１である。
【０１２４】
ＨＩＶ配列を増幅させるために、一またはそれ以上のフォワードプライマーが一またはそれ以上のリバースプライマーと組み合わされる。このように、本発明は、ＨＩＶの各種変異体の増幅に有用なプライマー対組合せを提供する。これらのプライマー対組合せは一種のフォワードプライマーと一種のリバースプライマーを含有しうる（各プライマーは典型的には二以上の複製として存在する）。しかしながら、ＨＩＶの各種変異体の増幅を確実に行うために、最も有用なプライマー対の組合せは複数種のフォワードプライマーと複数種のリバースプライマーを含有する。
【０１２５】
このように、本発明は、下記プライマーを含んでなる組成物を提供する：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２０、１６２、１６４、１６８、１６９、２０６、および２０７からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２０、１６２、１６４、１６８、１６９、２０６、および２０７と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｇａｇフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜４３、１０２〜１１３、１７２、１７３、および２２０〜２３２からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜４３、１０２〜１１３、１７２、１７３、および２２０〜２３２と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｇａｇリバースプライマー。
好ましくは、配列の同一性は、少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１２６】
ｇａｇフォワードプライマーとｇａｇリバースプライマーとの好ましい組合せはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３２、３３、および３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、３２、３３、および３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、３２、３３、および３４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、３６、３７、３８、４０、および４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４、３６、３７、３８、４０、および４１、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６、１７、３６、３７、３８、４０、および４１である。
【０１２７】
他の態様において、本発明は、下記プライマーを含んでなる組成物を提供する：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４〜５８、１７６、１７７、２０８、および２０９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４〜５８、１７６、１７７、２０８、および２０９と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｖｐｒフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、１１４〜１２２、１９６〜２００、２３３〜２４１、２６１〜２７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、１１４〜１２２、１９６〜２００、２３３〜２４１、２６１〜２７３と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｖｐｒリバースプライマー。
好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１２８】
フォワードおよびリバースｖｐｒプライマーの好ましい組合せはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、４８、１９６、および１９７、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４４、４８、１９８、１９９、および２００、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、１９６、および１９７、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４９、１９８、１９９、および２００である。
【０１２９】
さらに他の態様において、本発明は、下記プライマーを含んでなる組成物を提供する：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８〜１４３、１４７、１４８、２０４、および２１５〜２１８からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８〜１４３、１４７、１４８、２０４、および２１５〜２１８と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｎｅｆフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１４９〜１５３、および２５０〜２５４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１４９〜１５３、および２５０〜２５４と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｎｅｆリバースプライマー。
好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１３０】
ｎｅｆフォワードおよびリバースプライマーの好ましい組合せは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、１３９、１４４、１４５、１４６、および２０４、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４０〜１４６、またはＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３８、１３９、１４４、１４５、および１４６である。
【０１３１】
さらに他の態様において、本発明は、下記プライマーを含んでなる組成物を提供する：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０〜１３２、１３４〜１３６、および２１２〜２１４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３０〜１３２、１３４〜１３６、および２１２〜２１４と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｅｎｖフォワードプライマー、ならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３、１５４〜１５９、２４９、および２５５〜２５８からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３３、１５４〜１５９、２４９、および２５５〜２５８と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｅｎｖリバースプライマー。
好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１３２】
本発明による方法を実施する際に、一次核酸増幅で鋳型として使用のために下記のいずれかを単離することが可能である：組込みＨＩＶプロウイルス、ゲノムＨＩＶ ＲＮＡ（ビリオン(virion)またはＨＩＶビリオン(virion)を複製する細胞から）、ＨＩＶ一次転写物、およびＨＩＶプロセスｍＲＮＡ。しかしながら、本発明の好ましい態様において、ＨＩＶ ＲＮＡゲノムは、血中に存在するビリオン(virion)から単離される。ｅｎｖおよびｒｅｖのオープンリーディングフレームは、ＨＩＶゲノムで一部重複しており、ＨＩＶ発現の標準過程で、ｒｅｖ一次ＲＮＡ転写物の第一および第二ｒｅｖエキソンは継ぎ合わされて、プロセスｒｅｖ ｍＲＮＡを生じる。好ましいＨＩＶの鋳型は、ＨＩＶゲノムＲＮＡであるため、スプライシング後に枠内のみで、全ｒｅｖ遺伝子よりも第一または第二ｒｅｖエキソンを増幅させることが最も実用的である。したがって、好ましい態様において、本発明は、第二ｒｅｖエキソンの増幅に適したｒｅｖフォワードおよびリバースプライマーの組合せを提供する。
【０１３３】
このように、さらに他の態様において、本発明は、下記プライマーを含んでなる組成物を提供する：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４〜８８、１８３〜１８９、２１０、および２１１からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４〜８８、１８３〜１８９、２１０、および２１１と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｒｅｖフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９〜１０１、１２３〜１２９、１９０〜１９５、２４２〜２４８、および２５８〜２６０からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８９〜１０１、１２３〜１２９、１９０〜１９５、２４２〜２４８、および２５８〜２６０と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｒｅｖリバースプライマー。
好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１３４】
ｒｅｖフォワードおよびリバースプライマーの好ましい組合せは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８３、１８４、１９０、１９１、および１９２、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８５、１８６、１８７、１９０、１９１、および１９２、およびＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１８８〜１９２である。
【０１３５】
本発明の一つの態様において、ｎｅｆとｒｅｖの第二エキソンをコードする単一アンプリコンを生産するために、ｒｅｖフォワードプライマーがｎｅｆリバースプライマーと組み合わされる。ネステッド（nested）ＰＣＲが別の二次ｎｅｆおよびｒｅｖアンプリコンを生産するために用いられる。
【０１３６】
したがって、本発明は、下記プライマーを含んでなる組成物を提供する：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４〜８８、１８３〜１８９、２１０、および２１１からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７４〜８８、１８３〜１８９、２１０、および２１１と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｒｅｖフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１４９〜１５３、および２５０〜２５４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４４〜１４６、１４９〜１５３、および２５０〜２５４と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるｎｅｆリバースプライマー。
好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１３７】
同様に、対象のＨＩＶ遺伝子の一種以上の連続組合せの他の一次アンプリコンを生産することが可能である。例えば、ｇａｇフォワードプライマーは、ＨＩＶゲノムのほとんどを増幅させるためにｎｅｆリバースプライマーと組み合わされる。他の非限定的例は、ｖｐｒフォワードプライマーおよびｎｅｆリバースプライマー、ｖｐｒフォワードプライマーおよびｒｅｖリバースプライマー、ならびにｅｎｖフォワードプライマーおよびｎｅｆリバースプライマーとの組合せである。
【０１３８】
このように、本発明は、下記プライマーを含んでなる組成物を提供する：
ａ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２０、４４〜５８、７４〜８８、１３０〜１３２、１３４〜１３６、１６２〜１８８、および１８９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２０、４４〜５８、７４〜８８、１３０〜１３２、１３４〜１３６、１６２〜１８８、および１８９と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるフォワードプライマーならびに
ｂ．ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、８９〜１０１、１１４〜１２２、１３３、１４４〜１４６、１９０〜１９２、１９６〜２０３、および２６９〜２７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチならびにＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、８９〜１０１、１１４〜１２２、１３３、１４４〜１４６、１９０〜１９２、１９６〜２０３、および２６９〜２７３と少なくとも７５％の配列の同一性を有するオリゴヌクレオチドを含んでなるリバースプライマー。
好ましくは、配列の同一性は少なくとも８０％、８５％、９０％、または少なくとも９５％である。
【０１３９】
前記のプライマーおよびプライマー対は、標的抗原をコードする一次ＤＮＡアンプリコンを生産する上で、ＨＩＶ核酸の増幅に有用である。
【０１４０】
これらの指針に基づき、ＨＦＶの各種変異体からのｇａｇ、ｖｐｒ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、およびｎｅｆ抗原の増幅に適したフォワードおよびリバースネステッド（nested）プライマーが提供される。これらのプライマーは一次増幅反応で、好ましくは一次増幅後に核酸増幅の第二ラウンドで用いられる。好ましい態様において、一次増幅が前記のＨＩＶフォワードおよびリバースｇａｇ、ｖｐｒ、ｒｅｖ、ｅｎｖ、および／またはｎｅｆプライマーで、次いで二次増幅が下記のネステッド（nested）プライマー対を用いて行なわれる。
【０１４１】
このように、本発明は、５′部分および３′部分を含んでなるフォワードプライマーを提供し、ここで５′部分はプロモーターおよび最適化Kozak配列を含んでなり、３′部分はＧＴＧＣＧＡＧＡＧＣＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０６、ｇａｇ増幅用）、ＧＴＧＣＧＡＧＡＣＣＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０７、ｇａｇ増幅用）、ＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣ４Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０８、ｖｐｒ増幅用）、ＡＡＣＡＡＧＣＣＣＣＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２０９、ｖｐｒ増幅用）、ＡＣＣＣ＾ＣＣＴＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１０、ｒｅｖ増幅用）、ＡＣＣＣＧＣＣＴＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１１、ｒｅｖ増幅用）、ＧＡＧＴＧＡ７Ｘ３Ｇ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１２、ｅｎｖ増幅用）、ＧＡＧＴＧＡ/.ＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１３、ｅｎｖ増幅用）、ＧＡＧＴＧＡＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１４、ｅｎｖ増幅用）、ＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡ/IＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１５、ｎｅｆ増幅用）、ＧＴＧＧＣＡＡＧＴＧＧＴＣＡＡＡＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１６、ｎｅｆ増幅用）、ＴＧＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＣＴＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１７、ｎｅｆ増幅用）、ＡＧＧＣＡＣＡＡＧＡＧＧＡＡＧＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１８、ｎｅｆ増幅用）、ＡＧＡＧＴＧＡＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７２、ｅｎｖ増幅用）、ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７３、ｅｎｖ増幅用）、ＡＧＡＧＴＧＡＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７４、ｅｎｖ増幅用）、ＡＧＡＧＴＧＡＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７５、ｅｎｖ増幅用）、ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７６、ｖｉｆ増幅用）、ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＴＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７７、ｖｉｆ増幅用）、ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＣＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７８、ｖｉｆ増幅用）、ＡＡＡＣＡＧＡＴＧＧＣＡＧＧＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３７９、ｖｉｆ増幅用）、ＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８０、ｖｐｕ増幅用）、ＴＣＴＡＴＣＡＡＡＧＣＡＧＴＧＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８１、ｖｐｕ増幅用）、ＴＣＴＡＴＣＡＧＡＧＣＡＧＴＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８２、ｖｐｕ増幅用）、ＴＣＴＡＣＣＡＡＡＧＣＡＧＴＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８３、ｖｐｕ増幅用）、ＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８４、ｐｏｌ増幅用）、ＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８５、ｐｏｌ増幅用）、ＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８６、ｐｏｌ増幅用）、およびＧＧＡＡＧＧＣＣＡＧＧＡＡＡＴＴＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８７、ｐｏｌ増幅用）からなる群より選択される配列を含んでなる。好ましくは、プロモーターはＴ７プロモーターである。前記プライマーの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドの５′部分は一緒にＴ７プロモーターおよび最適化Kozak配列を含んでなり、配列ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡＣＣＡＣＣＡrＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１９）を有し、ここでＴ７プロモーター配列は標準体で示され、最適化Kozak配列はイタリック体で示されている。好ましいＴ７プロモーター／プライマー態様において、混合５′部分および３′部���は一緒にＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９、２０、５７、５８、８７、８８、１３４、１３５、１３６、１４７、１４８、１６０、１６１、２９０〜２９３、３０８〜３１１、３２９〜３３２、および３５６〜３６０からなる群より選択される配列を含んでなる。
【０１４２】
本発明は、５′部分および３′部分を含んでなるリバースプライマーも提供し、ここで５′部分は、約３０〜１００Ｔヌクレオチドを有するポリＴオリゴヌクレオチドを含んでなり、３′部分は、５′ＧＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２０）、５′ＧＴＧＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＣＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２１）、５′ＧＴＡＡＣＧＡＧＧＧＧＴＣＧＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２２）、５′ＧＴＧＴＣＧＡＧＧＧＧＧＣＧＴＴＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２３）、５′ＧＣＴＣＣＴＧＴＡＴＣＴＡＡＴＡＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２４）、５′ＧＣＴＣＣＴＧＴＡＴＣＴＡＡＴＡＡＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２５）、５′ＧＣＴＣＣＴＧＴＡＴＣＴＡＡＣＡＧＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２６）、５′ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２７）、５′ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２８）、５′ＧＧＣＴＴＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２９）、５′ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＴＴＣＣＣＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３０）、５′ＧＧＴＴＴＣＣＡＴＴＴＴＣＣＴＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３２）、５′ＧＧＡＴＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３３）、５′ＧＡＡＴＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３４）、５′ＧＡＡＴＡＡＡＣＡＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３５）、５′ＡＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＧＡＣＡＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３６）、５′ＡＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＧＧＣＧＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３７）、５′ＡＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＣＧＧＣＡＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３８）、５′ＡＴＴＣＴＧＣＴＡＴＧＴＴＧＡＣＡＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２３９）、５′ＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣＴＣＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４０）、５′ＣＴＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４１）、５′ＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＡＴＡＣＴＧＴＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４２）、５′ＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＡＴＡＣＴＧＣＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４３）、５′ＣＣＴＧＡＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＴＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４４）、５′ＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＡＡＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４５）、５′ＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＣＴＡＡＣＴＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４６）、５′ＧＣＡＴＴＧＡＧＣＡＡＧＴＴＡＡＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４７）、５′ＧＣＡＴＴＡＡＧＣＡＡＡＣＴＡＡＣＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４８）、５′ＡＴＡＧＣＡＡＡＧＣＣＣＴＴＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２４９）、５′ＣＣＡＧＴＡＣＡＧＧＣＡＡＡＡＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５０）、５′ＣＡＧＴＡＣＡＧＧＣＧＡＡＡＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５１）、５′ＣＣＡＧＴＡＣＡＧＧＣＡＡＧＡＡＧＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５２）、５′ＧＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＴＴ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５３）、５′ＧＴＣＡＧＣＡＧＴＣＴＣＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５４）、５′ＧＡＣＣＡＣＴＴＧＣＣＡＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５５）、５′ＧＡＣＣＡＣＴＴＧＣＣＡＣＴＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５６）、５′ＧＡＣＣＡＣＴＴＧＣＣＣＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５７）、５′ＣＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＴＣＴＴＣＴＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５８）、５′ＣＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＴＣＴＴＡＣＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２５９）、５′ＣＣＣＴＧＴＣＴＴＡＴＴＣＴＴＧＴＡＧＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６０）、５′ＧＣＡＧＴＴＧＴＡＧＧＣＴＧＡＣＴＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６１）、５′ＧＣＡＧＴＴＧＴＡＧＧＣＴＧＡＣＴＣＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６２）、５′ＧＣＡＧＴＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＣ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６３）、５′ＡＧＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６４）、５′ＡＧＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＣＡＡ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６５）、５′ＡＧＣＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＣＡＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６６）、ＡＧＣＧＡＡＣＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＡＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６７）、ＡＧＣＧＡＴＣＡＡＡＣＡＧＴＡＧＴＴＧＴＴＧＣＡＧ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６８）からなる群より選択される配列を含んでなる。
【０１４３】
好ましくは、５′ポリＴ部分は、長さ６４Ｔヌクレオチドである。好ましい態様において、リバースネステッド（nested）プライマー組成物は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０２〜１２９、１３７、１４９〜１５３、１５７〜１５９、１９３〜１９５、２０１〜２０３、および２６９〜２７３からなる群より選択される一またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【０１４４】
さらに他の態様において、本発明は、下記プライマーを含んでなる、ＨＩＶの各種変異体の増幅用キットを提供する：
ａ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜２０、４４〜５８、７４〜８８、１３０〜１３２、１３４〜１３６、１３８〜１４３、１４７〜１４８、１６０〜１６２、１６４、１６８、１６９、１７６、１７７、１８０、１８３〜１８９、および２０４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるフォワードプライマーならびに
ｂ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜４３、６０〜７３、８９〜１２９、１３３、１３７、１４４〜１４６、１４９〜１５９、１６３、１６７、１７２、１７３、１７８、１７９、１８１、１８２、１９０〜２０３、および２２０〜２７３からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなるリバースプライマー。
【０１４５】
好ましくは、前記キットは加えて熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、および増幅反応に適した緩衝液（１×または濃縮）を含有している。加えて、キットは、逆転写酵素および／または増幅用の非感染性ＨＦＶコントロール鋳型も含有している。しかも、キットは好ましくは一次アンプリコンの二次増幅用に少なくとも一対のフォワードおよびリバースネステッド（nested）プライマーを含有する。フォワードネステッド（nested）プライマーは５′プロモーターと、場合により翻訳開始コドンを含むKozak配列、および対象の一次アンプリコンを標的とする３′配列を含有する。リバースネステッド（nested）プライマーは、５′ポリＴ配列および対象の一次アンプリコンと相補的な３′配列と、場合により翻訳終止コドンを含有する。前記キットは病原体変異体の同定および定量とワクチンの製造に有用である。
【０１４６】
他の態様において、本発明は、下記からなるＨＩＶ配列を増幅させる株に依存しない方法を提供する：
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１８、４４〜５６、７４〜８６、１３０〜１３６、１３８〜１４３、および２０４からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のフォワードプライマー、そして
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１〜４３、６０〜７３、８９〜１０１、１３３、１４４〜１４６、１５４〜１５６、１９０〜１０２、１９６〜１９９、および２００からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる一またはそれ以上のリバースプライマー
でＨＩＶ ＤＮＡの各種変異体を増幅させる。
【０１４７】
ＨＩＶ ＤＮＡには、宿主細胞ゲノムへ組み込まれたＨＩＶ ＤＮＡも含む。しかしながら、好ましい態様において、ＨＩＶ ＤＮＡは、ＨＩＶゲノムＲＮＡまたはＨＩＶ ｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡである。感染個体から組込みＨＦＶ ＤＮＡ、ＨＩＶゲノムＲＮＡ、およびＨＩＶ ｍＲＮＡを単離するための方法は当業者に知られている。同様の方法が、対象の他の病原体の核酸を単離するために用いられる。
【０１４８】
好ましくは、ＨＩＶ核酸は、本発明によるワクチンで治療される、ＨＩＶに感染した個体からの生物学的試料から単離または派生する。ここで用いられている“生物学的試料”とは、病原体、病原体感染細胞、または病原体核酸を含有している可能性があるあらゆる生物学的試料を表し、血液、血漿、血清、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、精液、膣分泌物、水晶体液、脳脊髄液、唾液、乳、腹水、滑液、腹膜液、羊水、組織、組織培養物などがあるが、それらに限定されない。
【０１４９】
最も好ましくは、ＨＩＶゲノムＲＮＡを含有したウイルス粒子(virion)は、血液または血清から単離される。ウイルス粒子(virion)から得られたゲノムＲＮＡは、ＨＩＶ ｃＤＮＡを生産するため逆転写に付される。感染患者からＨＩＶウイルス粒子(virion)を単離する方法およびｃＤＮＡを作製する方法は、当業者に知られている。ＨＩＶ ＲＮＡの逆転写は、ランダムヘキサマーまたは特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いて開始される。次いでＨＩＶ ｃＤＮＡがＨＩＶ配列の株に依存しない増幅の前記方法において鋳型として用いられる。これらと同様の方法も他の病原体のｍＲＮＡまたはゲノムＲＮＡからｃＤＮＡを作製するために用いられる。
【０１５０】
本発明による方法により増幅されたＤＮＡは、核酸ワクチンとして用いられるか、または抗原提示細胞中へ負荷されてからワクチンとして用いられる。加えて、前記ＤＮＡは、試料に存在するまたは患者に感染しているＨＩＶの変異体を同定するために配列が決定される。病原体鋳型またはそのｃＤＮＡの複製から増幅されたＤＮＡは“一次アンプリコン”と称される。一次アンプリコンはそれを発現カセット、発現ベクター、および／または送達ベクター中へ挿入することにより修飾され、次いでそれらが核酸ワクチン、ウイルスベクターワクチンなどとして用いられ、またはこのようなベクターが抗原提示細胞中へ負荷されてからワクチンとして用いられる。
【０１５１】
好ましい態様において、一次アンプリコンは、インビトロ発現および／またはインビボ発現に適した転写および翻訳シグナルを含むネステッド（nested）プライマーを用いて、第二ラウンドの増幅に付される。好ましくは、ＤＮＡは、翻訳終止コドンおよびポリＴテールの相補体を含むリバースネステッド（nested）プライマーと組み合わせて、１）インビトロ転写に適したプロモーター、例えばＴ７またはＳＰ６プロモーター、２）ＡＴＧコドンを含む最適化Kozak配列を含有したフォワードネステッド（nested）プライマーを用いて、第二ラウンドの増幅に付される。増幅のネステッド（nested）ラウンドから得られた二次アンプリコンは、インビトロ転写および５′キャッピング用の鋳型として用いられる。次いで、得られたｍＲＮＡは核酸ワクチンに、またはワクチンとして用いられる抗原提示細胞へ負荷するために用いられる。
【０１５２】
非限定的例として、病原体ＲＮＡは逆転写酵素、適切な反応緩衝液、およびランダムヘキサマーを用いて一本鎖ｃＤＮＡへ逆転写される。次いで、一本鎖ｃＤＮＡは多重プライマーを用いて一次ＰＣＲ反応で二本鎖ＤＮＡへＰＣＲ増幅される。一次ＰＣＲ反応の産物は、第二ラウンドまたはネステッド（nested）ＰＣＲ増幅に用いられる。この増幅ラウンドにおいて、５′プライマーは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ結合配列とのオーバーハングを含有し、３′プライマーは、ポリＴストレッチとのオーバーハングを含有している。ＰＣＲのネステッド（nested）ラウンドでオーバーハング領域により導入される修飾は、インビトロでＰＣＲ産物の転写と、ＤＣ中への送達に際して翻訳の成功をなしうる。前記工程はＰＣＲ増幅の工程後に中断して、ＰＣＲ産物をさらなるプロセッシング用に凍結保存してもよい。ｃＤＮＡ物質の精製はＱＩＡquick（登録商標）ＰＣＲ精製キット構成品（ＱＩＡquick（登録商標）Column、ＰＢ緩衝液、ＰＥ緩衝液、およびＥＢ緩衝液）を用いて行なわれる。二本鎖ＤＮＡが標準転写反応で鋳型として用いられる。インビトロ転写ＲＮＡのクリーンアップはＲＮeasy（登録商標）Kit（ＲＮeasy（登録商標）Column、ＲＬＴ緩衝液およびＲＰＥ緩衝液）の構成品を用いて行なわれる。ＲＮＡは無ヌクレアーゼ水で溶出される。必要ならば、エタノール沈降がＲＮＡを濃縮するために行なわれる。ＲＮＡは無ヌクレアーゼ水に懸濁され、０．８／０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）フィルターに通され、次いで０．５ｍＬ安全ロックポリプロピレンチューブ中に分配され、長期貯蔵用に≦１５０℃で凍結保存される。
【０１５３】
したがって、本発明は、下記工程からなる、ＨＩＶ ＲＮＡを作製する株に依存しない方法を提供する：
ａ）フォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いて、ＨＩＶ ＤＮＡの各種変異体を増幅させることにより一次アンプリコンを生産する（前記フォワードプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１〜１８、４４〜５６、７４〜８６、１３０〜１３２、１６２〜１８８、および１８９からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなり、前記リバースプライマーは、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６０〜７３、８９〜１０１、１３３、１４４〜１４６、１９０〜１９２、および１９６〜２００からなる群より選択されるオリゴヌクレオチドを含んでなる）、
ｂ）増幅発現カセットを生産するために、フォワードプロモータープライマーおよび５′ポリＴテールを含んでなるリバースプライマーを用いて、前記一次アンプリコンを増幅させる、そして
ｃ）ＨＩＶ ＲＮＡを生産するために、前記発現カセットを転写する。
【０１５４】
好ましくは、ＨＩＶ ＤＮＡは、ＨＩＶゲノムＲＮＡまたはＨＩＶ ｍＲＮＡの逆転写により得られるｃＤＮＡである。好ましい態様において、フォワードプロモータープライマーはＴ７またはＳＰ６プロモーターを含んでなる。好ましくは、フォワードプライマーは、プロモーターの３′側に最適化Kozak配列をさらに含んでなる。
【０１５５】
キャップ化ＲＮＡおよびポリアデニル化ＲＮＡは、インビトロ翻訳反応で、および／または樹状細胞若しくは他の抗原提示細胞中へのトランスフェクションで試験される。翻訳タンパク質の同一性は、特異的抗体を用いてウェスタンブロット分析で試験される。ＡＰＣの成熟に及ぼす発現個別抗原およびそれら組合せの負の影響の欠如は、細胞外マーカーの分析により試験される。例えば、成熟しうるＤＣの能力は、フローサイトメトリーマーカー（例えば、ＨＬＡ ＤＲ、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ１４）を用いて表現型分析により確かめられる。新たに発現されたタンパク質が、ＤＣの機能に影響を及ぼす可能性を排除するために、抗原またはそれらの組合せをコードする個々のＲＮＡがＦｌｕ ＲＮＡと組み合わせてコトランスフェクトされ、次いでＣＴＬアッセイでコトランスフェクトＤＣについて試験される。このような方法は当業者に知られている。
【０１５６】
本発明による方法に従い作製されたキャップ化およびポリアデニル化ＲＮＡは、インビトロまたはインサイチュー（in situ）で、樹状細胞または他の抗原提示細胞中へトランスフェクトされる。このようなインビトロトランスフェクト抗原提示細胞はワクチンとして用いられる。一方、キャップ化ＲＮＡおよびポリアデニル化ＲＮＡはインビトロで翻訳され、次いでインビトロで抗原提示細胞中へ負荷されるか、または直接ワクチンで用いられる。このように、他の態様において、本発明は、本発明による方法により生産されたＲＮＡと抗原提示細胞を接触させることからなる抗原提示細胞の負荷方法を提供する。
【０１５７】
下記実施例は、本発明の非限定的な態様を表す。
【実施例】
【０１５８】
実施例１
ＨＩＶの各種変異体の増幅用プライマーの選択
Los Alamos National Databaseに寄託された４９種全長ＨＩＶ単離物の分析から、ＨＩＶゲノムにおける高可変性領域と、低可変性の選択抗原のコード配列外の領域とを明らかにした。主としてｇａｇ、ｖｐｒ、およびｒｅｖのオープンリーディングフレーム外に存在する、それらの比較的保存された領域は、ＰＣＲ増幅に用いられるオリゴヌクレオチドの設計用の鋳型として働いた。Los Alamos Databaseに掲載された同定配列に存在するものに加えて変異が個々の患者で生じうることから、プライマーアニーリング用の各種領域が調べられた。これらの単離物と相補的なプライマーを分析した。単離物間で比較的配列保存されているヌクレオチド領域がプライマー選択に好まれた。下記パラメーターがプライマー設計に適用された：プライマーは５５℃〜６２℃のＴｍ、約１７〜２０ｂｐの長さを有し、ホモダイマーの形成を予測できず、ＢＬＡＳＴ分析で二次構造とＨＩＶ以外の配列との相同性を欠いていることであった。用いられるプライマーの数を最少にするため、プライマー配列の５′半分における不一致は許容されたが、一方、３′半分の不一致は許容されなかった。選択抗原の失敗の無い増幅を保証するために、対象のオープンリーディングフレーム外でもいくつかの領域を選択した。図１は、プライマー設計用に選択された領域の概略図を示している。プライマー名にある番号は、対照として選択された受理番号ＮＣ_００１８０２の配列内の位置に相当する。この対照配列はＶＰＲの端部を切り欠く変異を含んでいるが、これはほとんどのＨＩＶ配列に存在していない。
【０１５９】
（ＮＣ_００１８０２  ２２５‐１８３８以外で）ｇａｇの上流および下流における選択領域とアニーリングするプライマーは、ｇａｇの全オープンリーディングフレームの増幅を行なえる。プライマー用の領域を特定した後、各既知ＨＩＶ配列と相補的な各選択箇所のためのプライマーを決定した。４９種分析単離物との全相補配列をコードするリバースプライマー群ｇａｇ１８８３のための例が表１で示されている。
【表１】
2008513009.tif 000002
表１．ｇａｇを増幅させるために選択されるＮＣ_００１８０２の１８３３位のためのリバースプライマー群。これはプライマーのリバース群であるため、逆相補配列をここで示す。全分析ＨＩＶ配列と相補的な可変性塩基はイタリック体で表され、非共通変異体は太字イタリック体で表す。
【０１６０】
用いられるプライマーの数を最少にするため、我々はさらなる選択基準を適用した：プライマー配列の３′半分における不一致はできるだけ避けるが、プライマー配列の５′半分の不一致は許容される。このような不一致はＰＣＲ増幅ストリンジェンシーを下げることで補償した。それらの選択基準が適用された場合、その群に関するプライマーのリストは表２で示されているように著しく短縮され、そこではそれらの３′半分で分岐するプライマーを表す。
【表２】
2008513009.tif 000003
表２．領域ｇａｇ１８３３のために選択されたリバースプライマーの配列。対照配列ＮＣ_００１８０２に相補的な配列は最上列に示す。個々のＨＩＶ単離物でみられる領域での変異は大文字の太字イタリック体で表されている。対照配列とは逆の(reverse)相補配列をここで示す。
【０１６１】
下記表３は、Ｒｅｖのためのフォワードプライマー群に関するプライマーデザインを列挙している。最も一般的なＨＩＶ分岐群(clade)からの各種ＨＩＶ単離物およびさほど一般的でない単離物の配列の並びから、７８４７位および７８４８位の可変性残基で比較的保存された領域を明らかにした。したがって、共通Ｂ配列（Ｒｅｖ Ｆ７８３０）と完全に相補的で、この頻出(frequent)配列の変化も受容しうるプライマーを設計するために、追加の代替プライマーが設計された。これらの代替プライマーは、７８４７位および７８４８位で繁出する変異に対する補償変異を含有している（Ｒｅｖ Ｆ ７８３０．１およびＲｅｖ Ｆ ７８３０．２）。プライマーの３′半分のみは、補償変異を有するように設計し、一方、残基７８３０‐７８４０の５′半分における不一致は許容した。様々な株の“失敗しない”増幅を保証するために、対象のオープンリーディングフレーム外で二以上の領域を分析した。例えば、単離物０１Ａ１．ＣＭ．ＣＭ５３１２２は、標的領域の欠失により、領域Ｒｅｖ Ｆ７８３０に関して設計されたプライマーを用いて増幅させることに失敗するであろう。したがって、これを補償するために、７５５０位および７９１１位の配列もフォワードＲｅｖプライマーを設計するために用いた。
【表３】
2008513009.tif 000004
【０１６２】
インビトロでＰＣＲ断片の転写を可能にするため、５′末端にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を挿入して、断片を修飾した。さらに、翻訳の開始成功には、その３′末端で、Kozak配列を含有するように最適化された翻訳イニシエーターＡＴＧコドンとポリ（Ｔ）６４テール双方の付加を必要とした。修飾フォワードおよび修飾リバースプライマーを用いるＰＣＲの追加ネステッド（nested）ラウンドに、一次ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ断片を付すことにより、一次ＰＣＲ配列の修飾を行なった。フォワードプライマーは、Ｔ７ＲＮＡプロモーターの配列をコードするオーバーハングおよび、抗原用イニシエーターＡＴＧコドンの−３、−２、および−１位で塩基ＡＣＣを含有していた。加えて、ＡＴＧコドンがＰＣＲ増幅の第一ラウンドで増幅されなかった、ＲｅｖのようなＨＩＶ遺伝子において、ＡＴＧコドンもネステッド（nested）ＰＣＲ反応で加えられた。ネステッド（nested）フォワードプライマーの３′半分は、イニシエーターＡＴＧコドンのすぐ下流の配列、または一次ＰＣＲ増幅に際して増幅される最５′側コード配列と相補的であった。リバースプライマーは、その５′末端で、転写に際してＲＮＡ分子の３′末端でポリアデニル化（ポリＡ）配列用の鋳型として働くポリ（Ｔ）６４オーバーハングも含有していた。リバースプライマーの３′半分は一次ＰＣＲ反応で単離された配列と相補的であった。
【０１６３】
実施例２
ｇａｇプライマー用増幅条件の決定
各抗原用のＰＣＲプライマーを多重化することにより、ＰＣＲ反応数のさらなる減少が達成された。ＰＣＲプライマーをそれらのＴｍに基づいて分類した。次いで、フォワードプライマーの各群とリバースプライマーの各群とを含む順列をＰＣＲ反応において異なる温度で試験した。プライマーの初期選択に際して、感染性物質を用いて作業する危険性を減少させるために、ＮＩＨ ＡＩＤＳ Research and Reference Reagent Programから得られた分岐した非感染性でほぼ全長のＨＩＶクローンを用いて、プライマー設計を試験し、反応条件を最適化させた。
【０１６４】
１×Ｐｆｕ緩衝液、０．２ｍＭ最終濃度の各ｄＮＴＰ、０．４μＭ最終濃度の各プライマー、および一単位のＰＦＵ Hot start（Stratagene）ポリメラーゼを含有した２５μＬ ＰＣＲ反応液中で、非感染性ＨＩＶクローンｐＢＫＢＨＩＯＳプラスミド鋳型（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Research & Reference Reagent Program Ｃａｔ＃１９４）１０ｎｇを用いた。反応液を９５℃で４５秒間加熱し、次いで２５ラウンドの増幅に際して９５℃で４５秒間、図３で表されたアニーリング温度で４５秒間および７２℃で三分間付した。最終伸張は７２℃で十分間であった。プライマー群は次の通りであった：フォワード １群（ＦＧ１）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１および４を有するプライマー、フォワード ２群（ＦＧ２）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１６および１７を有するプライマー、リバース １群（ＲＧ１）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３３および４１を有するプライマー、リバース ２群（ＲＧ２）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３２、３６、３７、および４０を有するプライマー、リバース ３群（ＲＧ３）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３４を有するプライマー、リバース ４群（ＲＧ４）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２１、２６、３８を有するプライマー、リバース ５群（ＲＧ５）：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２２および２７を有するプライマー。結果が図３に示されている。各アニーリング温度のレーン１〜１０は、図中に記号で表されているプライマーの群で行なわれたＰＣＲ反応を含んでいた。これらプライマー群のすべてを用いた増幅は、許容温度５４℃および６０℃で成功したが、一部のプライマー組合せはそれより高い温度６５℃および７０℃でアンプリコンを生産することに失敗した。
【０１６５】
実施例３
反応毎にＨＩＶの各種変異体の多重ＰＣＲ増幅
ＨＩＶがいくつかの形態または擬似種で単一個体に存在し、これらがこの個体（ＣＴＬまたは小分子）に存在するあらゆる圧力からの変異回避の作用により生じている、という証拠が存在している。患者が重複感染して、様々なＨＩＶ株を同時に宿しているかもしれない、という証拠も存在している。特定の産物を増幅させるほどストリンジェントな条件であるにもかかわらず、プライマーと標的配列との単一塩基対ヌクレオチドの不一致を生じるほど乱雑な条件を用いて、患者に存在する全ＨＩＶ変異体を増幅させることは、現在の技術力の範囲内である。
【０１６６】
同一反応で各種ＨＩＶ変異体を増幅させうる我々の能力を実験するために、異なるＨＩＶ鋳型を単一ＰＣＲ反応で混ぜ合わせた。この実験で用いられる様々なＨＩＶ単離物のコード配列をコードする分子クローンが以下に示されている。
【表４】
2008513009.tif 000005
【０１６７】
このように、ＰＣＲ増幅用の反応条件が実施例２のように決定されたら、四種の異なる単離物のＨＩＶゲノムをコードする鋳型を一回のＰＣＲ反応へ供することによりＰＣＲ反応の複雑度を増加させた。特に、（ＨＩＶ ＡＩＤＳ research and reference reagent program Ｃａｔ＃１９４、３２８４、４００９、および３２８３から各々得られる）異なるＨＩＶ鋳型と各々対応する、２．５ｎｇの各プラスミド鋳型ｐＢＫＢＨＩＯＳ、ｐ９０ＣＦ２０４．１、ｐ９３ＢＲ０２９．４、およびｐ９３ＴＨ２５３．３をＰＣＲ反応液２５μＬ中で混合した。反応条件およびプライマー混合物は、実施例２および図３に記載されたものと同様であった。この実験において、アニーリング温度は示されたように６０℃、６２℃、および６５℃であった。結果は図４Ａに示されている。６２℃および６５℃で失敗したＰＣＲ反応（レーンＡおよびレーンＢ）は、リバースプライマー ３群で唯一のプライマーであるリバースプライマー３４を共通要素として有している。プライマー鋳型の不一致はＴｍを６０℃まで下げることで補償される。
【０１６８】
図４Ｂは、リバースプライマー ２、１、および３群で各々用いられているリバースプライマー３２、３３、および３４の逆相補体の５′→３′配列と、各プライマーで計算されたＴｍを表している。図４Ｃは、これらのプライマーに対応した標的領域における四種プラスミド鋳型配列の並びを表している。配列分析から、反応で用いられている全分子クローンにおいて標的プライマー配列の５′末端から６位がアデニン（ａ）を含有していることを明らかにした。しかしながら、プライマー３４はこの位置でグアニン（ｇ）を含有しており、プライマー３４と標的配列との相補性の欠如が、ストリンジェントな温度で増幅の成功を妨げていた。プライマー３４のＢＬＡＳＴ分析では、４９種全長ＨＩＶ単離物の我々の初期分析に含まれていた受理番号ＡＢ０７８００５と、日本から単離されたＨＩＶとの相補性を明らかにしている。プライマーと標的との不一致は、ストリンジェントな条件において増幅しなかったが、ＰＣＲ増幅アニーリング温度のストリンジェンシーを６０℃に下げると増幅現象の成功をもたらすことは、着目する上で重要である。プライマー：標的配列の不一致が乱雑ＰＣＲ条件により補償されたという証明は、ＨＩＶ増幅に選択された戦略が成功するであろうという最初の指摘として役立つ。プライマー３３も標的配列に対して４位で不一致を包含している、しかしながらこのプライマーは、他の三つの要素を含み、そのうち一以上の要素が標的配列とうまくアニーリングしてＰＣＲ産物を生じた、ＲＧ２群の要素である。
【０１６９】
要約すると、コード配列外の異なる領域に対応して同領域を標的にするならば、配列に各種の配列バリエーションを含む多重ＰＣＲプライマーと、Ｔｍを変えることによるＰＣＲ反応のストリンジェンシーの変更との組合せは、一次ＰＣＲでコード配列に失敗のない増幅を保証することになる。
【０１７０】
実施例４
多重ＰＣＲを用いた非感染性ＨＩＶ ＲＮＡ鋳型からのＧＡＧ領域の増幅
非感染性でほぼ全長のＨＩＶゲノム（ＮＩＨ ＡＩＤＳ Research & Reference Reagent Program Ｃａｔ＃１９４）を含有したｐＢＫＢＨＩＯＳプラスミドＤＮＡをＸｂａＩで切断し、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写した。簡単に言うと、プラスミドＤＮＡ鋳型１μｇを２０μＬの最終反応液容量中で三〜四時間転写し、次いでＤＮアーゼTurboに三十分間かけて切断し、ＤＮＡ鋳型を除去した。ＲＮＡをＲＮeasy（商標）Column（QIAGEN）で精製し、ＲＮアーゼの無い水中で溶出させ、分別し、液体窒素の冷凍庫で貯蔵した。
【０１７１】
１×Sensiscript（商標）緩衝液（QIAGEN（登録商標））、０．５ｍＭ最終濃度の各ｄＮＴＰ、１０μＭ最終濃度のランダムヘキサマー、十単位のＲＮアーゼインヒビター（Ambion（登録商標））、およびSensiscript（商標）ＲＴ（QIAGEN（登録商標））を含有した第一鎖ｃＤＮＡ合成反応用の鋳型として、得られた９．２ｋｂインビトロ転写ＲＮＡの１００，０００の複製を用いた。反応液２０μＬを３７℃で一時間インキュベートした。１×ＰＦＵ超反応緩衝液（Stratagene（商標））、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ（Stratagene（商標））、２．５単位のHot Start PfuUltra（商標）ポリメラーゼ（Stratagene（商標））、実施例２で記載されているようなプライマー ＦＧ１、ＦＧ２、ＲＧ１、ＲＧ２、ＲＧ３、およびＲＧ４群ならびに図５で示されているフォワードおよびリバースプライマー群における０．４μＭの各フォワードおよびリバースプライマーを含有した各一次ＰＣＲ反応液中へ１０，０００複製のｃＤＮＡを入れた。反応の最終容量は２５μＬであった。反応を９５℃で二分間変性させ、そして次のように４０サイクル行なった：９５℃で三十秒間、５４℃で三十秒間、７２℃で三分間。ネステッド（nested）ＧａｇフォワードＴ７プライマー群（ＧＡＧ Ｆ Ｔ７：プライマー１９および２０）およびＧａｇリバース６４Ｔプライマー群（ＧＡＧ Ｒ ６４Ｔ：プライマー１０６、１０７、および１０８）での一次増幅からの鋳型を用いて二次ＰＣＲ増幅を行なった。最終サイクル後に、反応を７２℃で十分間かけて完了させ、次いで４℃に冷却した。各試料４μＬを非変性１％アガロースゲル上に載せた。図５で示された結果は、プライマー群の組合せＦＧ１：ＲＧ１、ＦＧ１：ＲＧ２、ＦＧ１：ＲＧ３、ＦＧ２：ＲＧ１、ＦＧ２：ＲＧ２、およびＦＧ２：ＲＧ３を用いた多重ＰＣＲがｐＢＫＢＨＩＯＳに含有されたＨＩＶ配列からのｇａｇコード配列の増幅を行なえたことを表している。
【０１７２】
実施例５
各種ＨＩＶ擬似種が本発明のプライマーを用いて増幅される
１×Ｐｆｕ緩衝液、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、各最終濃度０．４μＭのプライマー ＦＧ２およびＲＧ２群、ならびに一単位のＰｆｕ Hot Startポリメラーゼ（Stratagene）を含有した一次ＰＣＲ反応液中で、四種ＨＩＣ擬似種を提示する２．５ｎｇの各ｐＢＫＢＨＩＯＳ、ｐ９０ＣＦ４０２．１、ｐ９３ＢＲ０２９．４、およびｐ９３ＴＨ２５３．３を混合した。ＰＣＲ反応を実施例２で記載されたように始めた。完了時に、Ｉ×Ｐｆｕ緩衝液、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、０．４μＭ最終濃度のプライマー１９、０．４μＭ最終濃度のプライマー３６、および一単位のＰｆｕ Hot Startポリメラーゼ（Stratagene（商標））を含有した二次２５μＬ反応液中へ一次ＰＣＲ反応液１μＬを入れた。Zero Blunt（登録商標） TOPO（登録商標） ＰＣＲクローニングキット（Invitrogen（商標））を用いて二次ＰＣＲ産物２μＬをサブクローニングした。個々のコロニーを用いて細菌培養物に接種した。ＱＩＡquick mini column（QIAGEN（登録商標））を用いてそれら培養物からプラスミドＤＮＡを単離し、インサートに隣接するクローニングベクターの領域に存在するＥｃｏＲＩ部位を用いて制限切断により分析した。約１．６５ｋｂのインサートを含有したクローンをさらなる配列決定のために選択した。Lasergene software（ＤＮＡＳtar）を用いて、この分析から得られた部分配列を並べた。その並びの結果は図６に示されている。配列分析は最終混合物が四種の別クローン（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）から構成されていることを示し、患者に存在しうる各種ＨＩＶ変異体または擬似種の単離を本発明が行なえることを表している。
【０１７３】
実施例６
非感染性ＨＩＶ ＲＮＡからのＶＰＲ、ＲＥＶ、およびＮＥＦコード領域の増幅
ほぼ全長の非感染性ＨＩＶ ＲＮＡの第一鎖ｃＤＮＡを、実施例４で記載されているようなｐＢＫＢＨＩＯＳからのインビトロ転写ＲＮＡのＲＴ‐ＰＣＲにより合成した。１０，０００複製のＨＩＶ ＲＮＡから合成されたｃＤＮＡ物質を、ｎｅｆ、ｖｐｒ、またはｒｅｖ用の多重プライマーを含有した各一次ＰＣＲ反応に入れた。下記のネステッド（nested）Ｔ７および６４Ｔプライマー群を用いた二次ＰＣＲ反応を、鋳型として一次ＰＣＲ反応の産物を用いて行なった。（ＶＰＲ６４Ｔプライマー２３１〜２３５は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２６９〜２７３に相当する。）反応条件は前記と同一であった、ただし最終プライマー濃度はｎｅｆで０．４μＭ、ｒｅｖで０．２μＭ、およびｖｐｒで０．６μＭであった。プライマー群は下記プライマーからなっていた：
【表５】
2008513009.tif 000006
【０１７４】
フォワードおよびリバースプライマー組合せが図７ａに示されている。各組合せが増幅を生じた。
【０１７５】
図７ｂは、ｖｐｒリバースプライマー６０、６１、６４、６５、６６、６７、６８、６９、および７０と様々なストリンジェンシー（アニーリング温度）で別々な増幅反応で組み合わされたフォワードｖｐｒプライマー４４を用いた、インビトロ転写ｐＢＫＢＨＩＯＳ ＲＮＡからのｖｐｒコード領域の増幅を証明している。予想されたように、産物収率はアニーリング温度の上昇に従い減少し、一部のプライマーはより高い温度の場合に増幅に失敗した。このように、ＰＣＲストリンジェンシー条件の低下は鋳型とプライマーの不一致を補償する。
【０１７６】
図７ｃは、インビトロ転写ｐＢＫＢＨＩＯＳ ＲＮＡからｎｅｆの増幅について証明している。オリゴｄＴ（２０）プライマー、十単位のSuperscript（商標）III（Invitrogen（商標））、二単位のＲＮＡseout（商標）（Invitrogen（商標））、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ（Clontech（商標））、５ｍＭ ＤＴＴ、およびSuperscript（商標）第一鎖緩衝液を含有した反応液中でインビトロ転写ＲＮＡを第一鎖ｃＤＮＡ合成用の鋳型として用いた。反応液を５５℃で一時間、インキュベートした。
【０１７７】
次いで、５０μＬの最終反応液容量で五単位のＰＦＵUultra（商標）ＨＳ、ＰＦＵ緩衝液（Stratagene（商標））、０．８ｍＭの各ｄＮＴＰ（Clontech（商標））、０．４ｍＭのＮｅｆプライマー ＮＥＦ Ｆ ８２３５およびＮＥＦ Ｒ ９０６９群（レーン１）、またはＮｅｆプライマー ＮＥＦ Ｆ ８３４３およびＮＥＦ Ｒ ９０６９群（レーン２）を含有した、一次ＰＣＲ反応液中へ全容量２．５μＬの第一鎖ｃＤＮＡ反応液を入れた。ＰＣＲ反応を９５℃で二分間変性させ、そして次のように４０サイクル行なった：９５℃で三十秒間、５４℃で三十秒間、および７２℃で三分間。最終サイクル後、伸張を７２℃で十分間行い、反応を４℃に冷却することで停止させた。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析した（図７ｃ）。ＰＣＲ反応用ｎｅｆプライマー群の組成は次の通りであった：
【表６】
2008513009.tif 000007
【０１７８】
実施例７
ＧＡＧコード領域は感染患者血漿から単離されたＨＩＶ ＲＮＡから増幅される
ＨＩＶ ＲＮＡを単離するためにＨＩＶ感染患者血漿を用いた。血漿物質を清澄化する低速遠心後に、それを溶解緩衝液で希釈し、製造業者の指示（Macherey-Nagel）に従いNucleospin（登録商標）精製カラムで精製した。ＲＮＡをヌクレアーゼの無い水で溶出させ、次回の使用まで−８６℃で貯蔵した。１×Superscript（商標）第一鎖合成緩衝液（Invitrogen（商標））、５ｍＭ ＤＴＴ、４０単位のＲＮＡseインヒビター、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、最終１μＭのプライマーＧＡＧ Ｒ１９１３群および４００単位のSuperscript III（商標）（Invitrogen）を含有した２０μＬ第一鎖ｃＤＮＡ合成反応液中へＲＮＡを入れた。反応液を５５℃で一時間、次いで７０℃で十五分間インキュベートして、酵素を不活性化させた。前記と同様の条件を用いて各ＰＣＲ反応液中へ２．５μＬのＲＴ反応液を入れた、ただしプライマーは０．４μＭ最終濃度で用い、ＰＣＲサイクルに際する伸張時間は二分間であった。各ＰＣＲ反応用プライマー群の組成は次の通りであった：
【表７】
2008513009.tif 000008
【０１７９】
１×Ｐｆｕ緩衝液、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＰｆｕ Hot Start Polymerase（Stratagene（商標））、ならびに０．２μＭの各ネステッド（nested）フォワードＴ７プロモータープライマーＧＡＧ Ｆ ３３４（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１９）およびリバース６４ＴプライマーＧＡＧ Ｒ １８８１（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０６）を含有した、二次ＰＣＲ反応液中へ１μＬの一次ＰＣＲアンプリコンを入れた。結果は図８に示されている。プライマーの組合せＦ１２４：Ｒ１８８１、Ｆ３０４：Ｒ１８８１、Ｆ３３４：Ｒ１８８１、Ｆ３０４：Ｒ１９１３、およびＦ３３４：Ｒ１９１３の各々は、慢性感染ＨＩＶ患者の血漿から単離された鋳型ＨＩＶ ＲＮＡを用いて、ｇａｇコード領域を増幅させた。
【０１８０】
実施例８
ＶＰＲおよびＲＥＶコード領域は、感染ＨＩＶ患者の血漿から単離されたＨＩＶ ＲＮＡから増幅される
ＨＩＶ ＲＮＡを前記実施例で記載されたように血漿から単離した。１×第一鎖合成緩衝液（Invitrogen（商標））、５ｍＭ ＤＴＴ、４０単位のＲＮＡseインヒビター、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μＭのプライマーＶＰＲ Ｒ５５０７またはＲｅｖ Ｒ８３００群（下記の通り）、および４００単位のSuperscript（商標）IIIを含有した２０μＬ第一鎖ｃＤＮＡ合成反応液中へＲＮＡを入れた。反応液を５５℃で一時間、次いで７０℃で十五分間インキュベートして、酵素を不活性化させた。前記と同様の条件を用いて、各ＰＣＲ反応液中へ２．５μＬのＲＴ反応液を入れた、ただしプライマーがＶＰＲの場合には最終濃度０．６μＭ、およびＲＥＶの場合には０．２μＭで用い、ＰＣＲサイクルの際の伸張時間は二分間であった。各ＰＣＲ反応用プライマー群の組成は次の通りであった：
【表８】
2008513009.tif 000009
【０１８１】
１×Ｐｆｕ緩衝液、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＰｆｕ Hot Start Polymerase（Stratagene（商標））、ならびに次のような６４ＴおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含むプライマー：０．４μＭ ＶＰＲプライマーＶＰＲ Ｆ５０９０およびＶＰＲ Ｒ５４１９ならびに０．６μＭ ＲｅｖプライマーＲＥＶ Ｆ７９１２およびＲＥＶ Ｒ８３００を含有した二次ＰＣＲ中へ一次ＰＣＲから取り出した１μＬを入れた。図９で示された結果は、下記フォワードおよびリバースプライマー ＶＰＲ Ｆ４９９５群：ＶＰＲ Ｒ５５０７、ＶＰＲ Ｆ５０５８：ＶＰＲ Ｒ５５０７、ＶＰＲ Ｆ４９９５：ＶＰＲ Ｒ５４１９、およびＶＰＲ Ｆ５０５８：ＶＰＲ Ｒ５４１９の各々が慢性感染患者から得られたＨＩＶ ＲＮＡからｖｐｒを増幅させうることを証明している。同様に、下記フォワードおよびリバースプライマー ＲＥＶ Ｆ７７５０群：ＲＥＶ Ｒ８３００、ＲＥＶ Ｆ７８３０：ＲＥＶ Ｒ８３００、およびＲＥＶ Ｆ７９１１：ＲＥＶ Ｒ８３００の各々も慢性感染患者から得られたＨＩＶ ＲＮＡからｒｅｖを増幅させうる。
【０１８２】
実施例９
慢性感染ＨＩＶ患者の血漿からのＨＩＶ ＲＮＡのＮＥＦコード領域の増幅
ＨＩＶ ＲＮＡを前記のように血漿物質から単離する。１×第一鎖合成緩衝液（Invitrogen（商標））、５ｍＭ ＤＴＴ、４０単位のＲＮＡseインヒビター、０．５ｍＭの各ｄＮＴＰ、１μＭのプライマーＮＥＦ Ｒ９０９６、および４００単位のSuperscript（商標）IIIを含有した２０μＬ第一鎖ｃＤＮＡ合成反応液中へＲＮＡを入れる。反応液を５５℃で一時間、次いで７０℃で十五分間インキュベートして、酵素を不活性化させる。前記と同様の条件を用いて各ＰＣＲ反応液中へ２．５μＬのＲＴ反応液を入れる、ただしプライマーは０．４μＭ最終濃度で用い、ＰＣＲサイクルに際する伸張時間は二分間である。各ＰＣＲ反応用ｎｅｆプライマー群の組成は次の通りである：
【表９】
2008513009.tif 000010
【０１８３】
１×Ｐｆｕ緩衝液、０．２ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５単位のＰｆｕ Hot Start Polymerase（Stratagene（商標））、ならびに６４ＴおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ結合部位を含む０．２μＭの各プライマー：プライマーＮＥＦ Ｆ ８３４３およびＮＥＦ Ｒ ９０６９を含有した二次ＰＣＲ中へ一次ＰＣＲから取り出した１μＬを入れる。
【０１８４】
実施例１０
各種ＨＩＶ擬似種が、慢性感染ＨＩＶ患者から増幅されたｇａｇ、ｒｅｖ、およびｖｐｒコード配列の分析により検出される
ｇａｇコード領域を前記のように患者物質から増幅させた。各種プライマー組合せ（レーンＧＡＧ Ｆ１２４：ＧＡＧ Ｒ１８８１、ＧＡＧ Ｆ３０４：ＧＡＧ Ｒ１８８１、ＧＡＧ Ｆ３３４：ＧＡＧ Ｒ１８８１、ＧＡＧ Ｆ３０４：ＧＡＧ Ｒ１９１３、図８）を用いて二次ネステッド（nested）ＰＣＲで得られたＰＣＲ断片をサブクローニングし、前記のように配列決定した。部分配列の並びが図１０Ｃで示されている。分析では、少なくとも七種の別々なＧＡＧクローンがこの患者血漿から回収されたことを示している。
【０１８５】
各々ＲｅｖおよびＶＰＲに関するコード配列の並び。ＲｅｖおよびＶＰＲの二次ネステッド（nested）ＰＣＲ反応からのＰＣＲ産物をサブクローニングし、ＧＡＧに関して記載されたように分析した。ｒｅｖクローン（図１０Ｂ）およびｖｐｒクローン（図１０Ｃ）の配列分析が各種ＨＩＶ擬似種の増幅を証明している。
【０１８６】
実施例１１
ＶＰＲの単離擬似種は、ＨＬＡエピトープのタンパク質配列領域でアミノ酸変化を含んでいる
ＶＰＲコード配列に関する予想ＨＬＡエピトープマップ（Los Alamos National Laboratory ＨＩＶ Sequence Database）を、同一慢性感染ＨＩＶ患者からのＨＩＶ ＲＮＡの増幅により得られた単離ＶＰＲクローンの推定タンパク質配列と比較した。同定されたアミノ酸置換のうち二つは、ＣＴＬエピトープでタンパク質組成に影響を与えている（図１１）。
【０１８７】
実施例１２
樹状細胞におけるＲＮＡコードＧＡＧ発現
ヒト樹状細胞の単離
Lifeblood（Memphis,ＴＮ）により記載されたAutoＰＢＳＣ操作を用いて、健常人ボランティアからの白血球搬出試料をＣＯＢＥ Spectra（Gambro ＢＣＴ）に集めた。Ficoll（商標）密度勾配（Histopaque（登録商標）-1007 Hybri-Max（登録商標）,Sigma）を用いて末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を白血球搬出試料で単離し、プラスチックフラスコ中で一〜二時間培養して粘着単球（ＣＤ１４＋）を得た。非粘着細胞は捨て、残りの単球を顆粒球マクロファージ‐コロニー刺激因子（ＧＭ‐ＣＳＦ）およびインターロイキン‐４（ＩＬ‐４）の存在下、Ｘ‐ＶＩＶＯ‐１５（商標）培地（Cambrex）で六日間培養した。単球由来細胞はＣＤ１４の発現を次第に失われ、未成熟状態で樹状細胞の表現型と一致するＣＤ８０発現を獲得した。
【０１８８】
七日目に、通常ｍ７Ｇ Ｃａｐ類縁体および（Ａ）６４テールまたはＡＲＣＡおよび（Ａ）６４テールで修飾されたｇａｇ ＲＮＡ  ５μｇ ＲＮＡ／１０６細胞でエレクトロポレーションにより未成熟ＤＣをトランスフェクトした。詳しくは、未成熟樹状細胞をリン酸緩衝塩水（ＰＢＳ）で洗浄して緩衝条件と交換し、緩衝液に再懸濁する。樹状細胞へエレクトロポレーションにより増幅病原体ＲＮＡをトランスフェクトする。エレクトロポレーションは４×１０７細胞／ｍＬ含有の細胞懸濁液５００μＬを含有した４ｍｍギャップキュベット中において３００Ｖ、１００Ω、および１５０μＦのパルスで行う。次いで、成熟サイトカインであるＩＬ‐１β、ＩＬ‐６、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ‐α）、およびジノプロストン（プロスタグランジンＥ２）ならびにＧＭ‐ＣＳＦおよびインターロイキン‐４（ＩＬ‐４）を含有した培地で四時間または二十六時間にわたり細胞を培養する。タンパク質発現を行わせるインキュベーション後、細胞を収集し、固定し、透過性を上げ、１：２０希釈で抗ＧＡＧマウスモノクローナル抗体（ＮＩＨ＃４１２１）で染色した。抗体結合をロバ抗マウスＩｇＧ‐ＰＥ二次抗体（Research Diagnostics,Inc.,Flanders,ＮＪ）で検出した。Cellquest（商標）分析プログラムを用いて、Becton Dickinson FACSCalibur（商標）フローサイトメーターで細胞を分析した。図１２で示された結果は、本発明による方法に従い得られたｇａｇ ｍＲＮＡがトランスフェクション後四時間および二十六時間でトランスフェクトＤＣで発現されることを示している。
【０１８９】
実施例１３
ＨｅＬａ細胞におけるＧＡＧタンパク質発現の時間経過
プラスミドｐＢＫＢＨＩＯＳから増幅されたＧＡＧ用のＡＲＣＡおよび（Ａ）６４テール修飾ＲＮＡ２μｇで、Transmessenger（商標）（QIAGEN（登録商標））試薬を用いて、５×１０８ＨｅＬａ細胞をトランスフェクトした。陰性コントロール細胞も同様に処理した、但しトランスフェクションに際してＲＮＡは加えなかった。トランスフェクション後に細胞を表記時間にわたり培地中へ戻し、ウェスタンブロット分析用に収集した。細胞を等張タンパク質抽出緩衝液（０．０１％トリトンＸ‐１００、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１００ｍＭ Tris ｐＨ７．６、５ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶解させた。ＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルを用いて各条件からのタンパク質溶解物（lysate）２５μｇを分離させ、ＰＶＤＦ膜へ移し、次いで１：４０希釈でマウスモノクローナル抗ＧＡＧ抗体（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ Research & Reference Reagent Program Ｃａｔ＃４１２１）とインキュベートした。抗体の結合を製造業者の勧めに従い、二次ヤギ抗マウス抗体（Santa Cruz Ｃａｔ＃ｓｃ‐２０５５）およびＥＣＬ（商標）plus試薬（Amersham）とのインキュベートにより視覚化させた。２００ｎｇ組換え精製ＧＡＧ ｐ２４（Immunodiagnostic）を陽性コントロールとして用いた。図１３で示された結果は、ＨｅＬａ細胞での最大タンパク質発現がトランスフェクション後６〜１５時間で観察されたことを示している。
【０１９０】
実施例１４
樹状細胞におけるＲＥＶ発現
樹状細胞を六日目に収集し、ＭＡＲＴまたはＡＲＣＡ（Ａ）６４テールＲＥＶ ＲＮＡ  ５μｇ ＲＮＡ／１０６細胞でトランスフェクトし、新鮮サイトカインおよび成熟カクテルとの培養に戻した。四時間目にトランスフェクト細胞を固定し、透過性を上げ、１：１０００希釈で抗ＲＥＶヒツジポリクローナル抗体（Novus Biologicals,Ｃａｔ＃ａｂ９５１３）で染色した。抗体結合をロバ抗ヒツジＩｇＧ‐ＰＥ二次抗体（United States Biologicals,Swampscott,ＭＡ）で検出した。Cellquest（商標）分析プログラムを用いてBecton-Dickinson FACSCalibur（商標）フローサイトメーターで細胞を分析した。図１４はトランスフェクション後、四時間でＤＣにおけるｒｅｖ ｍＲＮＡの発現を示している。
【０１９１】
実施例１５
ＨｅＬａ細胞におけるＲＥＶタンパク質発現時間経過
ＨｅＬａ細胞をウェスタンブロット分析用に前記のようにＡＲＣＡおよび（Ａ）６４テール修飾ＲＮＡでトランスフェクトした。タンパク質溶解物（lysate）４０μｇをＳＤＳゲル電気泳動で分離させ、ＰＶＤＦ膜へ移した。タンパク質を１：１５００希釈でポリクローナルヒツジ抗ＲＥＶ抗体（Novus Biologicals Ｃａｔ＃ａｂ９５１３）とのインキュベートにより検出した。抗体の結合は、二次抗ヒツジ抗体（Santa Cruz Ｃａｔ＃ｓｃ‐２７０１）とインキュベートし、次いでＥＣＬ plusキット（Amersham）で展開することにより視覚化させた。図１５と他の独立実験で示された結果は、ＲＥＶタンパク質の最大発現レベルがトランスフェクション後６〜２０時間であることを示している。
【０１９２】
実施例１６
樹状細胞におけるＮｅｆ発現
樹状細胞を六日目に収集し、ＧＦＰまたはＡＲＣＡ（Ａ）６４テールＮＥＦ ＲＮＡ  ４μｇ ＲＮＡ／１０６細胞でエレクトロポレートし、新鮮サイトカインおよび成熟カクテルとの培養に戻した。４時間目または２４時間目にトランスフェクト細胞を固定し、透過性を上げ、１／１０００（４時間目）または１／４０００（２４時間目）に希釈して、抗Ｎｅｆウサギポリクローナル抗体（Dr.R.Sekalyの好意）で染色した。抗体結合をヤギ抗ウサギ二次抗体（Southern Biotechnology Associates,Birmingham,ＡＬ）で検出した。Cellquest（商標）分析プログラムを用いてBecton-Dickinson FACSCalibur（商標）フローサイトメーターで細胞を分析した。図１６で示された結果は、ｎｅｆがトランスフェクション後、４時間目および２４時間目で発現されることを示している。
【０１９３】
実施例１７
ＨＩＶ感染患者からの各種ＨＩＶ ＲＮＡ抗原擬似種の増幅成功と樹状細胞での発現
我々の新規多重ＲＴ‐ＰＣＲ操作を実証するために、我々はＨＩＶ感染患者の血漿からの四種の抗原を増幅させた。各々ＨＩＶ力価２５０，０００、１４６，１４８、および３，２２１，８３５複製／ｍＬの患者三例の保管された(archived)凍結血漿から抽出されたＲＮＡを各抗原についてＲＴ‐ＰＣＲで使用した。下記Ｔ７プロモーターおよび６４ｄＴプライマー群をネステッド（nested）ＰＣＲで使用した。
【表１０】
2008513009.tif 000011
図１７Ａは、ＨＩＶ感染患者三例全てにおいて、全四種抗原の増幅が成功したことを証明している。
【０１９４】
ＰＣＲのネステッド（nested）ラウンドからの産物をインビトロで転写してＲＮＡを作製し、全四種の抗原を無事に転写した（図１７ｂ）。これは、全ＰＣＲ断片がＰＣＲのネステッド（nested）ラウンドに際して、Ｔ７プロモーターでうまく修飾されたことを示していた。ポリＴ６４伸張(stretch)と一緒に、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ結合部位による修飾成功の独立した確認と、配列の同一性の確認が、サブクローン化二次ＰＣＲ断片から得られた配列データの分析により行われた。
【０１９５】
フォワードおよびリバースプライマーの群を用いる我々の戦略は、ＨＩＶ感染の各患者に特有の各種ＨＩＶ擬似種を増幅させるように設計した。個々の患者間のＨＩＶ抗原擬似種の態様により、異なるプライマー群は異なる擬似種配列とアニーリングすると予想され、そのため増幅は各患者に特有の傾向で生じるであろう。これはＨＩＶ感染患者三例でのＧａｇの増幅に関して図１７ａで証明されている：レーン３のプライマー群は患者１でＰＣＲ産物を何も生産しなかったが、患者２ではクリーンな産物をもたらし、一方、レーン６のプライマー群は患者２からの物質を増幅させなかったが、患者１および患者３のＲＮＡはうまく増幅させた。
【０１９６】
別のプライマー群は、別のＨＩＶ擬似種を捕捉することを確認するために、我々は高血中ウイルス濃度（３，２２１，８３５複製／ｍＬのＨＩＶ力価）の患者３から得られた全長ＰＣＲ Ｇａｇクローンを配列決定および分析した。この実験では、Ｇａｇに関する予想される大きさの別々のバンドがレーン１、２、４、５、および６で得られた（図１７ａ）。二次ＰＣＲ断片をクローニングし、インサートの存在についてスクリーニングし、配列決定した。別々なプライマー群の組合せにより増幅されたＰＣＲ産物をプライマー群当たり合計１０の陽性クローンで別々にクローニングした。Lasergene software（ＤＮＡＳtar）、Los Alamos ＨＩＶ Sequence Database、およびＢＬＡＳＴ分析を用いてヌクレオチド配列分析を行った。新たに増幅されたヌクレオチド配列の系統関係が、以前に報告されていた対応配列との比較により調べられた。共通ＨＩＶ分岐群(clade)の共通配列をLos Alamos ＨＩＶ Sequence Databaseから得て、対照として用いた。Clustal Ｖ ソフトウェアを用いてヌクレオチド配列を並べた。LasergeneソフトウェアのMegAlignモジュールを用いて系統樹を確立させた。患者３からの別々のＧａｇクローンの系統関係の分析では、捕捉された擬似種の広い多様性を明らかにした（図１８Ａ）。さらに重要で、予想されたように、プライマーのある群を用いた増幅により一部の擬似種は捕捉されたが、一部は捕捉されなかった。
【０１９７】
我々のワクチンテクノロジー抗原で潜在的に極めて重要な利点は、宿主ＣＴＬ下で進化して初期免疫応答への抵抗性を導くＨＩＶ回避変異を提示する擬似種抗原の増幅および抗原提示であろう。患者１において、我々はＧａｇ ｐｉ７タンパク質にアミノ酸置換をもたらしうる配列変異をＧａｇ擬似種で特定し、次いでLos Alamos Molecular Immunology Databaseを用いてこれらの変異アミノ酸配列を予想ＨＬＡエピトープと比較した。これらのデータは、図１８ｂでまとめられており、一部の捕捉変異が抗原提示を伴うＨＬＡエピトープの関連位置でアミノ酸トランジションを生じたこと示している。これはＣＴＬ圧力に対抗性であるＨＩＶ擬似種の進化を反映している。対照的に、ＨＩＶ変異の結果として生じる新規および関連免疫原性エピトープも我々の新規開発増幅プロトコールを用いて捕捉されるであろう。ＨＩＶ感染患者１の血漿から増幅された全長ｇａｇ、ｒｅｖ、およびｖｐｒクローンの系統関係が図１８Ｃ、１８Ｄ、および１８Ｅで示されている。
【０１９８】
我々は、少なくとも三例のＨＩＶ感染患者から単離および増幅されたＲＮＡを用いて、トランスフェクトされた真核細胞でＨＩＶ Ｇａｇ、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＮｅｆ抗原タンパク質のＲＮＡの翻訳および発現を確認した。Ｇａｇに関してＨＩＶ感染患者から増幅されたキャップ化およびポリアデニル化ＲＮＡを３５Ｓメチオニンの存在下、インビトロで翻訳した。変性ゲルを用いた電気泳動によりタンパク質を分離させ、ＰＶＤＦへ移し、暴露した。Ｖｐｒに関する増幅ＲＮＡはＨｅＬａ細胞中へトランスフェクトし、ＲｅｖおよびＮｅｆに関する増幅ＲＮＡは樹状細胞中へトランスフェクトした。トランスフェクション後１２〜１５時間で、細胞を収集して溶解させた。全細胞溶解物（lysate）をＳＤＳ‐ＰＡＧＥゲルで分離させ、ＰＶＤＦ上へ移し、各抗原の特異的抗体を用いてプローブした。ポリクローナルヒツジ抗Ｒｅｖ抗体（Novus Biologicals）を用いて、Ｒｅｖタンパク質を検出し、抗ＨＩＶ‐１ＮＬ４‐３Ｖｐｒ抗血清（１‐４６）（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ Research & Reference Reagent program）を用いてＶｐｒタンパク質を検出し、抗Ｎｅｆウサギポリクローナル抗体（Dr.R.Sekalyの好意）を用いて、Ｎｅｆタンパク質を検出した。これらの結果は図１９でまとめられており、そこでは適切な分子量（５６ｋＤａ）のタンパク質が鋳型としてＧａｇ ＲＮＡを用いたインビトロ翻訳反応で検出されたことを示している。コントロールレーンは、非感染性ＨＩＶクローンから増幅された対応抗原ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞から得られた溶解物（lysate）を含有している。ＮＴＣレーンは、いかなるＲＮＡも存在せずに、トランスフェクト細胞またはインビトロ翻訳混合から得られる溶解物（lysate）を含有していた。分子マーカーの分子量が左に示されている。発現Ｇａｇタンパク質の同一性は、コントロールプラスミドｐＢＫＢＨＩＯＳから増幅されたＧａｇ ＲＮＡを用いて、ウェスタンブロットにより確認した。患者１および患者３からのＧａｇ ＲＮＡはＨｅＬａ細胞抽出物で翻訳された。他の抗原は、Ｖｐｒ（１０．５ｋＤａ）、Ｒｅｖ（１１．４ｋＤａ）、およびＮｅｆ（２３．６ｋＤａ）をコードするＲＮＡでトランスフェクトされた樹状またはＨｅＬａ細胞からの細胞溶解物（lysate）で検出した。患者１では、抗Ｎｅｆ抗体で認識された特定バンドが拡散しており、一部の物質は高い分子量の方へ移動していた。一つの可能な説明は、Ｎｅｆの二種以上の擬似種または翻訳後修飾によるＮｅｆの変異が存在し、そのことが分子量の違いに従い移動する異なるタンパク質を生じさせたことである。類似の観察が患者３からのＲｅｖ ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣから得られた溶解物（lysate）で行われた。発現Ｇａｇタンパク質の同一性は、抗Ｇａｇモノクローナル抗体（Beckman Coulter）を用いて、患者１からのＧａｇ ＲＮＡでトランスフェクトされたＤＣのＦＡＣＳ分析により確認された。エレクトロポレーション後、四時間で収集されたＤＣの細胞内ＦＡＣＳ染色は細胞を陽性に染色した。ＡＲＣＡ類縁体で修飾されたＲＮＡでトランスフェクトされた細胞における抗体の結合性は、通常ｍ７Ｇキャップ類縁体で修飾されたＲＮＡでトランスフェクトされたものより高かった。ｍ７Ｇキャップ化ＲＮＡまたはＡＲ��Ａ修飾ＲＮＡを等量で用いたところ、ＡＲＣＡキャップ化ｍＲＮＡがｍ７Ｇキャップ化ｇａｇ ｍＲＮＡの場合と比較して、高いタンパク質発現を呈することを示した。患者から単離されたＨＩＶ株から増幅されたＶｐｒは、樹状細胞（データ示さず）およびＨｅＬａ細胞で発現された。
【０１９９】
前記例の結果は以下のことを証明している：（１）限定的な複雑度のプライマープールが、異なる分岐群(clade)に及ぶ鋳型の多様な群から目的産物を信頼下で増幅しうるように、戦略的に設計される、（２）ネステッド（nested）ＰＣＲが、Ｔ７プロモーターを５′末端およびオリゴｄＴテールを３′末端へ加えるために行える、（３）患者血清に存在する各種ＨＩＶ擬似種が、この方法により増幅される、（４）ネステッド（nested）ＰＣＲ産物がキャップ化ＲＮＡ、ポリアデニル化ＲＮＡに転写される、（５）樹状細胞が抗原特異的ＲＮＡでトランスフェクトされて、ＦＡＣＳ分析で示されているように予想タンパク質を発現する、および（６）生産されたタンパク質がトランスフェクト細胞のウェスタンブロット分析で示されているように正確な分子量である。一緒に、これらの観察は、我々のワクチン設計戦略により樹状細胞による抗原提示のための各種ＨＦＶ擬似種の増幅を行える、という実質的証拠を与えている。さらに、プライマーの群を組み合わせることにより、ＨＩＶ感染の個々の患者に特有のＨＩＶ擬似種およびＣＴＬレパートリーの全幅にわたる提示を行うことが可能であり、このことはエイズワクチン技術の大きな発展を表わしている。
【０２００】
実施例１８
患者血清から増幅されたＨＩＶ ｍＲＮＡでトランスフェクトされた樹状細胞は自己末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を刺激する
ＨＦＶ ＤＮＡを生産するために本発明によるプライマーを用いて、患者血清中のＨＩＶ株を増幅させることにより自己ＨＩＶ ＲＮＡを作製し、次いでこれをインビトロで転写してｖｐｒ、ｒｅｖ、ｎｅｆ、およびｇａｇポリペプチドをコードするＨＩＶ ｍＲＮＡを生産した。ＣＤ４０ＬをコードするＲＮＡと一緒に四種の自己ＨＦＶ遺伝子（Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびＧａｇ）で未成熟ＤＣをコトランスフェクトし、次いで完全ＤＣ成熟を行わせるためにＩＦＮ‐γの存在下で培養した。自己ＨＩＶ患者ＰＢＭＣを刺激するために抗原負荷成熟ＤＣを用いた。培養六日間後、ＰＢＭＣを回収し、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇａｇ（２プール）の共通配列に対応する四種の個々の重複ペプチドライブラリーで再刺激した。ＩＦＮ‐ガンマ陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度を、各個別ＨＩＶ遺伝子の認識に応じてＩＣＳにより調べた。ＤＣ調製物を四種ＨＩＶ遺伝子の各々により１μｇのＲＮＡ／百万ＤＣで負荷し（図２０、左欄）、並行実験では、Ｎｅｆ ＲＮＡペイロードを０．２５μｇ／百万ＤＣに減少させ、一方、他の三種遺伝子は１μｇのＲＮＡ／百万ＤＣで各々トランスフェクトした（図２０、右欄）。結果は、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、およびＧａｇ ｍＲＮＡと比較してＮｅｆ ｍＲＮＡペイロードを減少させると、Ｎｅｆ抗原に対する免疫応答を含むことなく免疫全体を高めていることを示している。
【０２０１】
実施例１９
自己ＨＩＶ ＲＮＣでトランスフェクトされた成熟樹状細胞は、共通ペプチドでパルスされた成熟ＤＣより強いリコール応答を誘導する
未成熟ＤＣを５μｇのｅＧＦＰ ＲＮＡ／百万ＤＣのみでトランスフェクトし（陰性コントロール）、次いでｅＧＦＰトランスフェクトＤＣを２プールとしてｇａｇ共通ペプチドでパルスした。一方、ＤＣを自己Ｇａｇ ＲＮＡ（５μｇ ＲＮＡ／百万ＤＣ）でトランスフェクトした。すべての場合に、ＤＣをＣＤ４０Ｌ ＲＮＡでコトランスフェクトし、次いで完全成熟を行わせるためにＩＦＮ‐ガンマ中で培養した。抗原負荷ＤＣをＣＦＳＥで予めラベルされたＰＢＭＣと同時培養した。六日後、ＰＢＭＣを回収し、抗原反応（ＣＦＳＥ低）細胞の頻度を調べた。加えて、ＣＦＳＥ低細胞をＣＴＬエフェクター機能のマーカーとしてグランザイムＢについてＩＣＳにより染色した。図２１で示された結果は、ｇａｇ共通ペプチドでパルスされたＤＣと比較して、自己ＨＩＶ ｇａｇ ＲＮＡで負荷されたＤＣにより誘導された免疫応答の方が優れていることを証明している。
【０２０２】
実施例１９
患者でＨＩＶの各種株からのポリペプチドをコードするＲＮＡで負荷された自己樹状細胞ワクチンの臨床試験
この試験の目的は、ＨＡＡＲＴ療法を受けているＨＩＶ感染患者へ樹状細胞ワクチンを投与して、安全性と免疫応答を調べるためである。この研究の主目的は以下のとおりである：
・ＨＡＡＲＴ療法を受けているＨＩＶ感染患者で、ＲＮＡ負荷ＤＣの複数回投与の安全性を調べること。
・研究の過程で通院１（スクリーニング）、通院２（予防接種前のベースライン）、４、８、２０、３２、および３６週目の予防接種五回の各々の前、および／または研究の最後／通院終了時に八回集められた血液試料で、細胞内サイトカイン染色（ＩＣＳ）およびＣＳＦＥ Ｔ細胞増殖アッセイを用いることにより、ＲＮＡ負荷ＤＣ予防接種に対するＴ細胞応答を評価すること。
【０２０３】
試験設計
前治療期は治療期の開始前に外来患者に基づいて行われる。患者適格はスクリーニング評価で調べ、ベースライン評価で確認する。この期は以下からなる：
・スクリーニング通院。
・採血。
・白血球搬出通院〔患者が白血球搬出に適することを管理医が調べた後で行う〕。
・免疫モニタリング（試料は通院２（スクリーニング）および通院３（予防接種前のベースライン）で集める）。
・ベースライン評価（投薬の初日に、ただしワクチンの初回投与前に行う）。
【０２０４】
治療期に、患者は研究０、４、８、２０、および３２週目に皮内予防接種を受ける。研究のアーム１に無作為化された患者は０．６ｍＬの容量で１．２×１０７トランスフェクトＤＣを受け、研究のアーム２に無作為化された患者は０．６ｍＬの容量で１．２×１０６トランスフェクトＤＣを受ける。安全性評価は各通院時に行われる。免疫モニタリングが通院２（スクリーニング）、通院３（予防接種前のベースライン）、研究−４、０、４、８、２０、および３２週目の各投与後、および／または研究の最後／通院終了時（最終ワクチンの投与後最短で二週間）に行われる。
【０２０５】
安全性
・各予防接種前に得られたベースライン値からの生命兆候（血圧、心拍数、呼吸数、および体温）の治療出現変化。
・治療出現ＡＥの発生率。
・各予防接種後における局所ワクチン注射部位反応の治療出現変化。
・各予防接種前および後に評価された治療出現アデノパシー、圧痛、または炎症（鼠蹊および腋窩）。
・各予防接種前に得られた臨床ラボラトリー試験でベースライン値（ＣＴＣによるグレーディングを含む）からの治療出現変化。
・治療期で周期的間隔時における身体検査および心電図（ＥＣＧ）の治療出現変化。
・治療期で周期的間隔時における臨床兆候および症状（例えば、発疹、血球減少、関節痛）とラボラトリー評価（ＡＮＡ、ＲＦ、抗ｄｓＤＮＡ抗体、ＣＨ５０、抗甲状腺抗体、Indirect Coombs試験）により測定されるような自己免疫評価の治療出現変化。
【０２０６】
対象者の選択および加入
適格を調べるスクリーニングおよび評価は、研究エントリー前二週間以内に終了しなければならない。
【０２０７】
加入基準
研究エントリー以前のいずれかの時期に、認可ＥＬＩＳＡ試験キットで証明されて、ウェスタンブロットにより確認されているようなＨＩＶ‐Ｉ感染。ＥＬＩＳＡ以外の方法による陽性ＨＩＶ‐Ｉ培養物、ＨＩＶ‐Ｉ抗原、血漿ＨＩＶ‐Ｉ ＲＮＡ、または第二抗体試験が、代替確認試験として容認される。
【０２０８】
研究エントリー前≧六ヶ月間にわたり、三種以上の抗レトロウイルス剤の組合せとして規定される、第一有効ＡＲＴ法を現在受けている対象者。対象者が第一有効ＡＲＴ法以外の有効ＡＲＴ法を現在受けていれば、対象者はスクリーニングＨＩＶ‐Ｉ ＲＮＡレベルが得られた日以前に少なくとも四週間にわたり現有効ＡＲＴ法を受けていなければならず、ウイルス学的な失敗以外の理由から現有効ＡＲＴ法に変えねばならなかった。
注記：リトナビルも、他のプロテアーゼインヒビターと組み合わせて、一種の抗レトロウイルス剤として数えられる。
【０２０９】
一ヶ月間を三十日として、少なくとも一ヶ月間で互いに離された少なくとも三回の測定で実証され、一回目の測定が研究エントリーの少なくとも六月前に行われ、他の測定が研究エントリーの六ヶ月以内に行われた、研究エントリー以前に少なくとも六ヶ月間にわたる現持続ＨＩＶ‐Ｉ ＲＮＡレベル≦４００複製／ｍＬのドキュメンテーション。
【０２１０】
一ヶ月間を三十日として、少なくとも二回の測定で実証され、一回目の測定が研究エントリーの少なくとも三ヶ月前に行われ、二回目の測定が研究エントリーの一ヶ月以内に行われた、研究エントリー以前に少なくとも三ヶ月間にわたる現持続ＣＤ４＋Ｔ細胞計測≧３５０細胞／ｍｍ３のドキュメンテーション。
【０２１１】
ＡＡＣＴＧ認可フローラボラトリーのスクリーニングで得られたＣＤ４＋Ｔ細胞数≧３５０細胞／ｍｍ３。
【０２１２】
研究スクリーニングにおいて、Roche Amplicor ＨＩＶ‐Ｉ Monitor（商標） UltrasensitiveアッセイでＨＩＶ‐Ｉ ＲＮＡレベル≦２００複製／ｍＬ、
男性および女性年齢≧１８歳。
【０２１３】
研究エントリー前三十日以内に得られた実験室での値：
・クレアチニン≦３×ＵＬＮ、
・ＡＳＴ（ＳＧＯＴ）、ＡＬＴ（ＳＧＰＴ）、およびアルカリホスファターゼ≦５×ＵＬＮ。
【０２１４】
研究エントリー前三十日以内と研究エントリーの７２時間以内に得られた実験値。これらの値は別々な二時点で得られねばならない：
・絶対好中球計測（ＡＮＣ）≧７５０／ｍｍ３、
・ヘモグロビン＞８ｇ／ｄＬ、
・血小板計測≧７５，０００／ｍｍ３、
・生殖能力のある全女性対象者で陰性妊娠試験。
【０２１５】
除外基準
研究エントリー前十四日以内に何らかの急性感染症または重病。研究エントリー以前に少なくとも十四日間にわたり、研究者の見解で、対象者が治療を終えるかまたは治療で臨床的に安定化するまで、対象者は（全身治療および／または入院を要する）重病のため、この研究から除外される。
研究エントリーの六ヶ月以内に得られたＨＩＶ‐Ｉ ＲＮＡ値＞４００複製／ｍＬ。
研究エントリーの三ヶ月以内に得られたＣＤ４ Ｔ細胞計測＜３５０細胞／ｍｍ３。
リンパ節放射線照射の履歴。
何らかのＨＩＶワクチンの事前使用。
研究エントリー前４５日以内にヒドロキシ尿素の使用。
妊娠および授乳。
全身コルチコステロイド、インターフェロン、インターロイキン、サリドマイド、サルグラモスチム（顆粒球‐マクロファージコロニー刺激因子〔ＧＭ‐ＣＳＦ〕）、ジニトロクロロベンゼン（ＤＮＣＢ）、チモシンアルファ、チモペンチン、イノシプレックス、ポリリボヌクレオシド、ジトカーブナトリウムに限定されないが、そのような薬物を含めた、研究エントリー前三十日以内における何らかの免疫調節剤または抑制剤の受領。
研究薬物またはそれらの処方剤へのアレルギー／過敏性。
研究者の見解で、研究要件の厳守を妨げる激しい薬物またはアルコール使用または依存症。
研究エントリー前、一年以内に既知ＨＩＶ‐Ｉセロコンバージョン。
広範なアクセスでも得られない治験用抗レトロウイルス剤。
【０２１６】
患者の治療
研究投薬療法および用量
ワクチンは、選択自己ＨＩＶ ＲＮＡでエレクトロポレートされた無菌処理成熟自己樹状細胞からなる。熱不活性化自己血漿中１０％ＤＭＳＯおよび５％グルコースに懸濁された自己増幅ＨＩＶ ＲＮＡ負荷成熟ＤＣを用意するために、１．２×１０７細胞／ｍＬ（アーム１）または１．２×１０６（アーム２）の濃度で懸濁された０．６ｃｃ凍結保存細胞を含有したクライオバイアルに、各用量が用意される。
【０２１７】
用量根拠
上限用量レベルの選択は、一回の白血球搬出から得られ、少なくとも六つのワクチン（投与用に五つおよび品質コントロール用に一つ）を用意できる、予想最大数のＲＮＡ導入樹状細胞により行われた。免疫処置間隔は、妥当な時間枠内で、免疫応答を呈するために多くの場合に必要とされる、複数回の免疫処置を行えるように選択した。
【０２１８】
用量および投薬
投与用ワクチンの製造
ワクチンは患者への投与直前に凍結保管庫から取り出し、開いた手のひらの間でバイアルを転がすかまたは手で握ってバイアルを握ることにより解凍した。製品は三〜五分内で完全に解凍される。この操作には注意を払うべきである、なぜならバイアルは断熱容器（dry-shipper）から初めて取り出すときに極めて冷たいからである。
【０２１９】
ＤＭＳＯへの解凍細胞暴露を最少にするために、ワクチンは解凍直後に投与されるべきである。
【０２２０】
使用前に、解凍細胞はバイアルを軽く叩いて、穏やかに混ぜるべきである。バイアルの倒置は避けねばならない。混ぜた後、ワクチンをインテグラル２６ゲージ針（製造業者により供給）付の１ｍＬアレルギーシリンジ三本に吸引する（０．２ｍＬが各シリンジに吸引される）。
【０２２１】
ワクチン投与
シリンジ中で沈殿する細胞により生じる不均等な用量送達を防ぐために、シリンジが満たされた直後にワクチンは投与されるべきである。
ワクチンは皮内投与される。投与は研究０、４、８、２０、および３２週目に行う。
各ワクチン注射日に、右腋窩から出発して四箇所の解剖学的部位（右腋窩、左腋窩、左鼠蹊、および右鼠蹊）間で時計回りに回すことにより、単一のリンパ節貯留域に全用量が向けられる。できるだけ関節に近い四肢の前正中面で注射が行われるべきである。腕では、肘から遠い上腕の前表面が用いられる。
【０２２２】
ワクチンの投与は、全用量０．６ｍＬで０．２ｍＬのワクチンを送達する、三回の皮内注射により送達されねばならない。各注射部位は互いに約５ｃｍ離さねばならない。漏出を最少に抑えられるように、針をゆっくり引き抜く注意が払われねばならない。漏出率は注射三回で平均化され、２５％を最小単位として概数で表し、患者ＣＲＦに記録されねばならない。研究投薬療法の用量変更は研究中に行われない。
【０２２３】
研究治療割当て
患者がインフォームドコンセントの書面に署名した後、現場職員が患者をスポンサーとして登録する。現場職員は、スクリーン通院時に、各患者に固有な現場の特定スクリーン番号を割り当てる。
【０２２４】
すべての前治療評価が容認しうることを確認した後、患者はＩＤ番号を取得して、登録される。最大で２０名の評価可能な患者が登録される。白血球搬出後に、少なくとも六回分のワクチン（投与用に五つおよび品質コントロール用に一つ）を用意するには不十分な細胞を有する患者は、研究から除外される。これらの患者は製造の失敗につながるため、研究では入れ替えない。少なくとも五回の予防接種を終了する前に、病気の進行またはワクチン治療と無関係な理由（例えば、事故死、行方不明）で研究から除外され、または自ら離脱した患者は評価不可であるため、入れ替えられる。研究者の見解で、初回ワクチン注射が行える前に病気の進行で他の療法を要するならば、患者は病気の進行のため研究から除外され、入れ替えられない。
【０２２５】
併用投薬療法／容認治療
患者は併用ＡＲＴ、他の免疫抑制剤、または他の形態の免疫療法以外で何らかの併用投薬療法を受けてもよい。研究中に受けたすべての併用処方薬および禁止併用市販薬（ＯＴＣ）投薬療法（例えば、局所ステロイドなど）はＣＲＦに記録される。非禁止併用ＯＴＣ投薬療法はＣＲＦに記録されない。
【０２２６】
研究投薬療法取扱い
ワクチン成分の収集および輸送
血液／血漿試料収集
白血球搬出
・患者は、ＣＯＢＥ Spectra Leukapheresis Systemを用いて、臨床現場の白血球搬出ドナーセンターで白血球搬出を受ける。末梢静脈アクセスが不適当であれば、硬質二重管腔カテーテルが頸静脈または鎖骨下静脈に入れられる。血漿交換看護師がスクリーニング通院の際に静脈アクセスを目で評価することが勧められる。
・白血球搬出産物約１８０ｍＬが、白血球搬出通院時に集められる。
・別の自己血漿約１５０ｍＬが、白血球搬出収集時に集められる。
・患者の血圧を記録し、白血球搬出の前およびその直後に、時差別の全血球計測（ＣＢＣ）のために採血する。時差別のＣＢＣが白血球搬出産物でも行われる。
・ＰＢＭＣがStudy Reference Mannualに記された標準臨床実務および記載に従って、無菌使捨て一回用血球血漿交換バッグに集められる。
・白血球搬出試料および自己血漿試料は、製造業者により用意された特製輸送容器で、さらに処理することなく、製造ラボラトリー施設へ輸送される。これらの産物は制御、測定、断熱された容器で維持され、夜間の商業運送業者により輸送される。
・白血球搬出産物はStudy Reference Mannualの記載に従って、操作当日に製造業者へ輸送されねばならない。
製造施設で、白血球搬出産物はそれがワクチン製造に許容しうるかどうかを調べるために検査される。少なくとも六つのワクチンを生産する上で産物が適さなければ、前記患者は研究から除外される。
【０２２７】
ワクチンの貯蔵条件
ワクチンの各用量は、０．６ｍＬの全容量中、約１．２×１０７細胞（アーム１）または０．６ｍＬの全容量中、１．２×１０６細胞（アーム２）である。熱不活性化自己血漿中で、１０％ＤＭＳＯおよび５％グルコースに懸濁された自己増幅腫瘍全ＲＮＡ負荷成熟ＤＣを用意するために、１．２×１０７細胞／ｍＬの濃度で懸濁された凍結保存細胞を含有したクライオバイアルで、ワクチンの各用量が用意される。各治療日にワクチンが個々に輸送される。研究投薬療法の在庫品は臨床現場で保存されない。クライオバイアルは−１５０℃以下の温度で制御条件下、液体窒素用断熱容器(dry shipper)で輸送される。クライオバイアルは使用時まで現場でこの断熱容器(dry shipper)中に貯蔵される。この容器は次回用量分を運ぶために製造業者へ直ちに戻されねばならない。
【０２２８】
時間およびイベントスケジュール
前治療期が治療期の開始前に外来患者に基づいて行われる。スケジュールが図２２で示されている。前治療期の全期間は六週間である。前治療期は下記通院からなる：
スクリーン通院（通院１）、
白血球搬出通院（通院２）、
ベースライン評価通院（通院３）。
【０２２９】
治療期
下記研究評価が、治療期に行われるべきである：
【０２３０】
免疫測定
臨床安全性終点に加えて、免疫応答が評価される。免疫測定が通院１（スクリーニング通院）、通院３（予防接種前のベースライン）、研究４、８、２０、３２、および３６週目（通院８）の各ワクチンの投与前、または研究の最後／通院終了時（最終ワクチンの投与後最短で二週間）に行われる。
【０２３１】
血液試料が七回の時点で集められ、下記方法に従い（ＩＦＮ‐γおよびＩＬ‐２を測定する）ＩＣＳおよびＣＦＳＥ Ｔ細胞増殖により、予防接種に応答するＴ細胞の存在についてアッセイされる：
免疫測定分析用ＰＢＭＣの調製：
器具／備品
１．無菌５０ｍＬポリプロピレンチューブ
２．３７℃水浴
３．個別に包装された１０および２５ｍＬピペット
４．２ｍＬクライオバイアル
５．−８０℃の冷凍庫
６．凍結容器（Nalgene）
７．液体窒素の冷凍庫
８．血球計
【０２３２】
試薬
１．ヒトＡＢ血清（Gemini BioProducts）
２．ＤＭＳＯ（Ｃａｔ＃Ｄ２６５０，試験エンドトキシン，Sigma），ＤＭＳＯは開封後六ヶ月間で期限が切れる。
３．ＲＰＭＩ１６４０（Life Technologies）
４．ヒト血清アルブミン（５ｇ，ｃａｔ＃Ａ５８４３，低エンドトキシン，SigmaまたはSerologicals Corp.）
１２．５％ＨＳＡ溶液を調製するために、５ｇボトルにＲＰＭＩ１６４０ ４０ｍｉｓを入れる。反転により穏やかに混ぜる。ＨＳＡが泡立つことからボルテックスを行わない。フィルター滅菌し、４℃で六ヶ月間まで貯蔵する。
５．アッセイ培地：ＭＡＴＩＳ＋１０％ヒトＡＢ血清
無菌５００ｍＬボトルへピペットで入れる：
ＲＰＭＩ１６４０  ２５０ｍＩｓ
ＥＨＡＡ  ２５０ｍｉｓ
Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ溶液  １０ｍＬ
２００ｍＭ  Ｌ‐グルタミン  ２５ｍｉｓ
０．５Ｍ  ２‐メルカプトエタノール溶液  ５０μＬ
熱不活性化ヒトＡＢ血清  ５０ｍｉｓ
ボトルに日付および頭文字で標識する。４℃で貯蔵する。
６．トリパンブルー（ＰＢＳ中０．４％、ｃａｔ＃Ｔ８１５４、Sigma）
【０２３３】
操作
ＰＢＭＣ凍結
１．Nalgene凍結容器を４℃で置く。
２．クライオバイアルを以下のように標識する：
患者ＩＤ
１０×１０６ＰＢＭＣ
採血日および技術用語の頭文字
３．標識を付したクライオバイアルを−２０℃の冷凍庫へ入れる。
４．各クライオバイアルに、１ｍＬの全容量を１０×１０６ＰＭＢＣ当たりで加える。
５．２×凍結培地を調製する：２０クライオバイアルで
１２．５％ＨＳＡ溶液１０ｍｉｓ
ＤＭＳＯ ２．５ｍｉｓ
混ぜて、最少で３０分間氷上に置く。
６．冷却１２．５％ＨＳＡ溶液に２×１０７生存リンパ球／ｍＬでフィコール処理ＰＢＭＣを再懸濁する。
７．チューブを穏やかに回しながら、冷却２×凍結培地を細胞懸濁液に滴下する。
８．冷却クライオバイアルを−２０℃から取り出し、クライオバイアル毎に１ｍＬずつ分ける。
９．ＰＢＭＣが分割されたら、クライオバイアルを氷上に置く。
１０．クライオバイアルをNalgene凍結容器へ移し、−８０℃の冷凍庫へ入れる。
１１．長期貯蔵用に、−８０℃で２４時間の凍結後、液体窒素の冷凍庫へクライオバイアルを移す。一時的でも、細胞を−２０℃で貯蔵しない。
１２．試料データベースおよびフリーザーバインダーの双方にバイアル位置（ボックス番号およびスロット番号）を記録する。
【０２３４】
ＰＢＭＣ解凍
１．細胞培地を３７℃水浴に約三十分間置く。
２．試料毎に５０ｍＬ遠心管を標識し、温（２２℃〜３７℃）アッセイ培地８ｍｉｓを加える。
３．液体窒素の冷凍庫からクライオバイアルを取出し、ドライアイス上に直接置く。
４．一回で二本以下のクライオバイアルを解凍する。細胞懸濁液がほぼ完全に溶融するかまたは少量の氷が残留するだけになるまで、クライオバイアルを３７℃水浴に置く。
５．クライオバイアルの外側を乾かし、７０％エタノールでふき取る。
６．温（２２℃〜３７℃）細胞培地１ｍＬを解凍細胞へゆっくり加える。
７．培地８ｍｉｓを含有した５０ｍＬポリプロピレンチューブへ細胞懸濁液を移す。
８．チューブの釣り合いをとり、１２００ｒｐｍで十分間遠心する。
９．上澄を吸引し、細胞を２ｍＬアッセイ培地へ再懸濁する。
１０．ＰＢＭＣ生存数を調べるために、トリパンブルーを用いて手作業で細胞計測を行う。
【０２３５】
ＩＣＳ手順
器具／備品
無菌５０ｍＬポリプロピレンチューブ
無菌１５ｍＬポリプロピレンチューブ
１ｍＬ  ９６ウェル丸底プレート
【０２３６】
試薬
ヒトＡＢ血清（Gemini BioProducts）
ＲＰＭＩ１６４０（Life Technologies）
ＰＢＳ
ＰＢＳ ２％ＦＣＳ
１５マーＨＩＶおよびコントロールペプチド
ブレフェルジンＡ
抗体：ＣＤ４ ＡＰＣ‐Ｃｙ７、ＣＤ２７‐ＰＥ、ＩＬ‐２ ＦＩＴＣ、ＩＦＮ‐γ ＡＰＣ、ＣＣＲ７‐ＰＥ Ｃｙ７、ＣＤ２８ CyChrome（ＢＤ）、およびＣＤ４５ ＲＡ ＥＣＤ（Coulter）
ＨＩＶ感染個体からのＰＢＭＣ
【０２３７】
操作
１．ＰＢＭＣ解凍（関連プロトコール参照）
２．ＩＣＳ
‐２．１０６細胞／１ｍＬ／ウェル（９６ウェル深丸底プレート）で分配する。我々は六回の染色で各ペプチド毎に５ウェルを用意する。
‐抗ＣＤ２８抗体およびＣＤ４９ｄ（Becton Dickinson,San Jose,ＣＡ）を各試料（１μｇ／ｍＬ）へ共刺激剤として加えた。
‐細胞を以下で活性化させる
ＳＥＡ（２００ｎｇ／ｍＬ）
またはＮＳ（陰性コントロール）
またはペプチド（５μｇ／ｍＬ）
‐全試料を３７℃でインキュベートする。全インキュベートは約十二時間である。
‐３７℃で１〜１．５時間のインキュベート後、１０μｇ／ｍＬの最終濃度までブレフェルジンＡを加える。
‐全部で十二時間のインキュベートが行われた後、９６ウェル丸底プレートに細胞を移す。
‐ＰＢＳ ２％ＦＣＳで二回洗浄する。
‐ＰＢＳ ２％ＦＣＳ１００μＬ中で細胞表面マーカー（ＣＤ４ ＡＰＣ‐Ｃｙ７（５μＬ）、ＣＤ２７ ＰＥ（１０μＬ）、ＣＤ２８ CyChrome（２０μＬ）、ＣＣＲ７‐ＰＥ Ｃｙ７（１０μＬ）、ＣＤ４５ ＲＡ CyChrome（１０μＬ））について染色する。
‐４℃で三十分間インキュベートする。
‐ＰＢＳ ２％ＦＣＳで二回洗浄する。
‐ＰＢＳ１００μＬおよび４％パラホルムアルデヒド１００μＬを加える。
‐ＲＴで三十分間インキュベートする。
‐透過性緩衝液（ＰＢＳ中０．５％サポニン：毎回新たに調製する）で二回洗浄する。
‐透過性緩衝液５０μＬを加える。
‐ＲＴで三十分間インキュベートする。
‐透過性緩衝液５０μＬ中で細胞内サイトカインＩＬ‐２ ＦＩＴＣ（１μＬ）、ＩＦＮ‐γ ＡＰＣ（１０μＬ）について染色する。
‐室温で三十分間インキュベートする。
‐ＰＢＳ ２％ＦＣＳで二回洗浄する。
‐ＰＢＳ１００μＬおよび４％パラホルムアルデヒド１００μＬを加える。
‐翌日、細胞をＦＡＣＳで分析する。
【０２３８】
コントロール：
‐陰性コントロールとして未染色細胞
‐表面染色のイソタイプコントロール
‐細胞内染色のイソタイプコントロール
‐陽性コントロール
‐透過性コントロール（Perm-a-sure＝構成的発現ヒト細胞タンパク質を認識する）：一試料は透過性が上がるが、一つは上がらない。
‐活性化コントロール：一試料は無活性化バックグラウンドコントロールとして未刺激のままである。
【０２３９】
ＣＳＦＥ Ｔ細胞増殖アッセイ
試薬：
・ＳＥＢまたはＳＥＡストック１ｍｇ／ｍＬ
・５，６‐カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）（Molecular Probes、ｃａｔ＃Ｃ-１１５７）
・細胞表面マーカー：ＦＬ２（ＰＥ）、ＦＬ３（PerＣＰまたはCychrome）、およびＦＬ４（ＡＰＣ）複合化抗体
‐ＰＢＳ
・染色洗浄緩衝液：ＰＢＳ２％ＦＣＳ
・ＲＰＭＩ‐１０ヒトＡＢ血清（Sigma）
【０２４０】
操作：
滴定
ＣＦＳＥを無水試薬等級ＤＭＳＯに溶解し、−８０℃で貯蔵する。最適な染色結果を得るためにＣＦＳＥの新調製液が滴定されねばならない。滴定のため、等容量の濃度０．５〜５μＭ ＣＦＳＥをＰＢＭＣ（１×１０７／ｍＬ）へ加え、室温で八分間穏やかに混ぜながら暗所下でインキュベートする。反応を一分間行い、等容量のＨＳの添加により停止させる。細胞をＰＢＳで洗浄し、１０％ＨＳ含有ＲＰＭＩ中、１×１０６／ｍＬで５％ＣＯ２下３７℃で一晩培養し、様々な濃度で処理された細胞の蛍光強度をＦＡＣＳ分析により調べる。最適ＣＦＳＥ濃度は、全細胞がフローサイトメトリー（ＦＬ１チャンネル）で１０３〜１０４ｌｏｇ単位の蛍光強度で染色されるもの、と規定される。蛍光強度が染色時と翌日との間で有意に減少し、そのため全滴定結果および実験データが前記条件で二十四時間のインキュベート後にようやく集められることを、我々は観察した。ＦＬ２（ＰＥ）およびＦＬ３（PerＣＰまたはCychrome）複合化表面マーカーが、試験される全ＣＦＳＥ濃度で、電圧および補償を定めるために加えられるべきである（ＣＦＳＥ蛍光が高すぎれば、ＦＬ２およびＦＬ３を補償することはほぼ不可能である）。我々の実験で、通常用いられる最終ＣＦＳＥ濃度は０．５〜１．２５μＭである。
【０２４１】
染色
１）ＰＢＳにＰＢＭＣを一千万／ｍＬで再懸濁する。
２）２×ＣＦＳＥ溶液を調製する（最終作業溶液が１．５μＭであれば、３μＭ溶液を調製する）。
３）一倍容量の２×ＣＦＳＥ溶液をＰＢＭＣへ加える。
４）フード下無光で、穏やかに混ぜながら８〜１０分間インキュベートする。
５）チューブ容量をＲＰＭＩ １０％ＨＳで満たすことにより反応停止させる。
６）細胞を集め（七分間、１４００ＲＰＭ）、完全培地に百万／ｍＬで再懸濁する。
７）９６穴の深底ウェルプレートに細胞（一〜二百万／ウェル）を分配し、増殖の陽性コントロールとしてＳＥＢ（１μｇ／ｍＬまたはＳＥＡ５０〜１００ｎｇ／ｍＬ）、１０μｇ／ｍＬの単一ペプチド、ペプチドプールを用いる場合は２μｇ／ｍＬ／ペプチド、２μｇ／ｍＬの組換えタンパク質で刺激する。
８）３７℃で４〜７日間インキュベートする。
９）上澄８００μＬを取出し、細胞を底部に残す。多チャンネルピペットマンを用いて、９６Ｖボトムプレートへ細胞を移す。
１０）ＰＢＳ ２％ＦＣＳ（１００μＬ）で洗浄する。
１１）ＰＢＳ ２％ＦＣＳ  ５０μＬ中で表面マーカーについて染色する。
１２）暗所下ＲＴで二十分間インキュベートする。
１３）ＰＢＳ ２％ＦＣＳ（１５０μＬ）で洗浄する。
１４）ＰＢＳ ２％ＦＣＳ中２％ホルムアルデヒド４００μＬに再懸濁する。
１５）フローサイトメトリーでデータを得る。
【０２４２】
安全性評価
患者の安全性が、病歴、臨床ラボラトリー試験、ＥＣＧ、生命徴候測定、およびＡＥ評価を含めた身体検査により評価される。安全性の変動要素には、血液学および血液化学パラメーターを含めた樹状細胞の投与に伴う副作用の頻度および程度の格付けを含む。これらの変動要素には、自己免疫評価、アデノパシー評価、および局所ワクチン注射部位反応の評価も含む。全安全性操作および評価の結果は研究中終始測定される。
【０２４３】
身体検査および病歴
スクリーニング通院時に、１）身体系の検査および２）ＡＲＴを含めた処方箋投薬療法の使用へ特に注意を払いながら、病歴が調べられる。スクリーニング通院時に、血漿交換看護師が患者の静脈アクセスを目で評価することが勧められる。
【０２４４】
身体検査はスクリーニング通院時、ベースライン評価通院時、およびその後の治療期の各通院時に行われる。身体検査は研究終了時も行われる。下記カテゴリーに属する身体所見が評価される：神経系、心血管系、呼吸系、リンパ系、皮膚、腹、頭、耳、目、鼻、喉、およびアレルギー。
【０２４５】
臨床ラボラトリー評価
臨床化学、血液学、および尿検査パラメーターの測定および評価用の血液および尿試料が、研究中の様々な時点で集められる。下記パラメーターの値が得られる：
臨床化学評価
ナトリウム
カリウム
塩化物
クレアチニン
カルシウム
ＳＧＯＴ（ＡＳＴ）（血清グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ）
ＳＧＰＴ（ＡＬＴ）（血清グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ）
アルカリホスファターゼ
ビリルビン（全体）
ＬＤＨ（スクリーン時のみ）（乳酸デヒドロゲナーゼ）
血清アルブミン
【０２４６】
血液学評価
時差別の全血球計測
血小板計測
ヘモグロビン（Ｈｇｂ）
ヘマトクリット
プロトロンビン時間（ＰＴ）（スクリーン時のみ）
部分トロンボプラスチン時間（ＰＴＴ）（スクリーン時のみ）
【０２４７】
尿検査
ディップスティックのみ（タンパク質、グルコース、ヘモグロビン、ｐＲ、およびケトンを含む）、および臨床的に示されるならば顕微鏡を用いて。研究時に行われた臨床ラボラトリー試験の結果は、研究参加への各患者継続適格を調べる上で、研究者により評価されねばならない。値が正常基準範囲外であれば、研究者はＣＴＣ毎に毒性度を調べて、値が研究関連内で臨床的に有意であるかどうかを評価しなければならない。研究者により臨床的に有意と思われた全ての異常実験値は、ＣＲＦのＡＥ頁に記さねばならない。ラボラトリー異常が医学的な診断または症候群と明らかに関連していれば、個々の実験値ではなく、その診断または症候群がＡＥ頁に記録される。異常値が診断または症候群と関連していなければ、実験値はＡＥ頁に記録されない。
【０２４８】
生命徴候および体重
生命徴候には、収縮期および拡張期血圧、心拍数、呼吸数、および体温を含む。これらの測定は、患者の体重と一緒に、スクリーニング通院時、白血球搬出通院時（白血球搬出前および白血球搬出後の血圧のみ）、ベースライン評価通院時、全投薬通院時（生命徴候について、予防接種前、予防接種後最初の一時間は十五分毎、および予防接種後次の一時間は三十分毎）および研究終了時に行われる。生命徴候測定は座位で五分後に行われる。他の測定または操作はこの五分間で行われない。
【０２４９】
自己免疫評価
自己免疫評価は、臨床徴候および症状（例えば、発疹、血球減少、関節痛）とＡＮＡ、ＲＦ、抗ｄｓＤＮＡ抗体、ＣＨｓｏ、抗甲状腺抗体、およびIndirect Coombs試験のラボラトリー評価により測定される。評価はスクリーン通院時とその後の各通院時に行う。これらの測定は研究終了時にも繰り返される。
【０２５０】
アデノパシー評価
排リンパ節（腋窩および鼠蹊）が大きさの変化、圧痛、または炎症について評価される。評価はベースライン評価通院時とその後の各通院時に行われる。加えて、患者は各通院時の間に家庭で節不快感について記録する。
【０２５１】
ワクチン注射部位反応評価
ワクチン注射部位反応評価は、予防接種後最初の一時間は十五分毎に、予防接種後次の一時間は三十分毎に、および予防接種後四十八時間は患者により家庭で行われる。患者にはその四十八時間観察を記録するカードが与えられる。現場職員は各予防接種後２〜６日内でこの情報を回収するために患者に電話する。グレード２部位注射反応ＡＥを報告した患者については、熟練者による部位注射反応の評価のために患者が病院へ戻るよう、主任研究者または被指名者は要請する。前記反応はＣＴＣに従って格付けされ、それらがＣＲＦにＡＥと記録される。
【図面の簡単な説明】
【０２５２】
【図１】プライマー番号、５′→３′配列、長さ、およびＴｍのリスト。プライマー名にある番号は、Los Alamos National Laboratoryにより示され、下記httpアドレスのワールドワイドウェブで得られるＨＩＶ Sequence Databaseにおいて、受理番号ＮＣ_００１８０２を有するＨＩＶゲノムにおけるそれらの位置に対応する：//hiv-web.lanl.gov/content/index
【図２】受理番号ＮＣ_００１８０２を有するＨＩＶゲノムの配列、ｇａｇ、ｅｎｖ、ｒｅｖ、ｖｐｒ、およびｎｅｆのオープンリーディングフレームおよびタンパク質配列と、プライマーの位置および配向。センス鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８８）および相補鎖（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３８９）を表す。
【図３】設計されたプライマーの群を用いたｐＢＫＢＨＩＯＳプラスミド鋳型からのｇａｇ領域の増幅。下記プライマー群が用いられた：レーン１：ＦＧ１：ＲＧ１、レーン２：ＦＧ１：ＲＧ２、レーン３：ＦＧ１：ＲＧ３、レーン４：ＦＧ１：ＲＧ４、レーン５：ＦＧ１：ＲＧ５、レーン６：ＦＧ２：ＲＧ１、レーン７：ＦＧ２：ＲＧ２、レーン８：ＦＧ２：ＲＧ３、レーン９：ＦＧ２：ＲＧ４、レーン１０：ＦＧ２：ＲＧ５。
【図４】反応毎に四種ＨＩＶサブタイプの多重ＰＣＲ増幅。Ａ：６０℃、６２℃、および６５℃で行なわれたＰＣＲ反応のアガロースゲル分離。各レーンのプライマー群は図３で記載されたものと同一である。Ｂ：プライマー３２、３３、および３４の逆相補体、リバースプライマー群番号およびＴｍ。Ｃ：プライマー３２〜３４に対応した領域におけるｐＢＫＢＨＩＯＳ、ｐ９３ＴＨ２５３．３、ｐ９０ＣＦ４０２．１、およびｐ９３ＢＲ０２９．４ＨＩＶプラスミド鋳型の配列。下線“Ａ”はＢで示されたプライマーの逆相補体において６位に相当する。
【図５】多重ＲＴ‐ＰＣＲを用いた非感染性ＨＩＶ ＲＮＡ鋳型からのＧＡＧ領域の増幅。一次ＰＣＲ産物は、二次ＰＣＲ反応でネステッド（nested）プライマーを用いて増幅された。増幅に用いられたプライマー群を各レーンの上に示す。
【図６】各種ＨＦＶ擬似種増幅ｐＢＫＢＨＩＯＳ、ｐ９３ＴＨ２５３．３、ｐ９０ＣＦ４０２．１、およびｐ９３ＢＲ０２９．４ＨＩＶプラスミド鋳型の整列配列。四種の特有変異体Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤが実施例４で記載されたＰＣＲ反応で増幅された。
【図７】（ａ）非感染性ＨＩＶ ＲＮＡからのＨＩＶ ＶＰＲ、ＲＥＶ、およびＮＥＦコード領域のＲＴ‐ＰＣＲ増幅のアガロースゲル分離。一次ＰＣＲ産物は、ネステッド（nested）プライマーを用いて二次ＰＣＲ反応で増幅された。増幅に用いられたプライマー群を各レーンの上に示す、（ｂ）各レーンの上にＳＥＱ ＩＤ ＮＯで示された個々のプライマー対を用いた増幅ｇａｇ領域のアガロースゲル分離、（ｃ）増幅ｎｅｆ領域のアガロースゲル分離。
【図８】感染ＨＩＶ患者の血漿から単離されたＨＩＶ ＲＮＡからＲＴ‐ＰＣＲにより増幅されたＧＡＧコード領域のアガロースゲル分離。一次ＰＣＲ産物は、ネステッド（nested）プライマーを用いて二次ＰＣＲ反応で増幅された。増幅に用いられたプライマー群を各レーンの上に示す。
【図９】感染ＨＩＶ患者の血漿から単離されたＲＮＡからＲＴ‐ＰＣＲにより増幅されたＶＰＲおよびＲＥＶコード領域のアガロースゲル分離。一次ＰＣＲ産物は、ネステッド（nested）プライマーを用いて二次ＰＣＲ反応で増幅された。増幅に用いられたプライマー群を各レーンの上に示す。
【図１０】感染ＨＩＶ患者の血漿から単離され、ＲＮＡから増幅されたＧＡＧ（１０Ａ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９８）、ＲＥＶ（１０Ｂ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３９９）、およびＶＰＲ（１０Ｃ：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４００）領域で検出された擬似種の配列。点は配列同一を示す。
【図１１】ＶＰＲコード領域の単発的変異が、ＨＬＡエピトープでタンパク質配列に影響を及ぼす。
【図１２】成熟ＲＮＡトランスフェクト樹状細胞におけるｇａｇ発現の検出。コントロール（ＭＡＲＴ）の細胞（点線）、ｇａｇトランスフェクト体（実線）、またはＡＲＣＡ‐ｇａｇトランスフェクト体（斜線）に対する抗ｇａｇモノクローナル抗体の結合のＦＡＣＳ分析。
【図１３】ＨｅＬａ細胞におけるＧＡＧタンパク質発現の時間経過。ＨｅＬａ細胞におけるＧＡＧタンパク質発現のウェスタンブロット分析。非トランスフェクト体（陰性コントロールレーン）またはＡＲＣＡ（Ａ）６４テールＲＮＡでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞からの溶解物（lysate）が、表記時間の際、分析のために収集された。Ｐ２４陽性コントロールレーンはｐ２４組換え精製ｇａｇタンパク質２５μｇを含有する。
【図１４】成熟ＲＮＡトランスフェクト樹状細胞におけるＲＥＶ発現の検出。コントロール（ＭＡＲＴ）細胞（斜線）、ｒｅｖトランスフェクト（点線）樹状細胞に対する抗ｒｅｖポリクローナル抗体の結合のＦＡＣＳ分析。
【図１５】ＨｅＬａ細胞におけるＲＥＶタンパク質発現時間経過。トランスフェクトされていないまたはＡＲＣＡ Ａ６４テールＲＥＶでトランスフェクトされたトランスフェクトＨｅＬａ細胞からの溶解物（lysate）のウェスタンブロット分析。収集の時間を各レーンの上に示す。
【図１６】成熟ＲＮＡトランスフェクト樹状細胞におけるＮＥＦ発現のＦＡＣＳ分析。
【図１７】（ａ）ＨＩＶ患者三例からのｇａｇ、ｖｐｒ、ｒｅｖ、およびｎｅｆ領域のアガロースゲル分離。各レーンで用いられたプライマー群は次の通りである：Ｇａｇ：レーン１ Ｆ１２４：Ｒ１８８１、レーン２ Ｆ３０４：Ｒ１８８１、レーン３ Ｆ３３４：Ｒ１８８１、レーン４ Ｆ１２４：Ｒ１９１３、レーン５ Ｆ３０４：Ｒ１９１３、レーン６ Ｆ３３４：Ｒ１９１３、Ｖｐｒ：レーン１ Ｆ４９９５：Ｒ５５０７、レーン２ Ｆ５０５８：Ｒ５５０７、レーン３ Ｆ４９９５：Ｒ５４１９、レーン４ Ｆ５０５８：Ｒ５４１９、Ｒｅｖ：レーン１ Ｆ７７５０：Ｒ８３００、レーン２ Ｆ７８３０：Ｒ８３００、レーン３ Ｆ７９１１：Ｒ８３００、Ｎｅｆ：レーン１ Ｆ８２３５：Ｒ９０６９、レーン２ Ｆ８３４３：Ｒ９０６９。  各プライマー群の組成に関しては実施例６、７、および８参照。（ｂ）増幅ＨＩＶ ＲＮＡから得られたｇａｇ、ｖｐｒ、ｒｅｖ、およびｎｅｆインビトロ転写物のアガロースゲル分離。
【図１８】（Ａ）患者３から増幅されたＨＩＶ ｇａｇ擬似種の系統樹、  （Ｂ）患者１から単離されたＨＩＶ擬似種から増幅されたｇａｇ ｐｉ７におけるアミノ酸置換、  （Ｃ）患者１から増幅されたＨＩＶ ｇａｇ擬似種の系統樹、  （Ａ）患者１から増幅されたＨＩＶ ｒｅｖ擬似種の系統樹、  （Ａ）患者１から増幅されたＨＩＶ ｖｐｒ擬似種の系統樹。
【図１９】患者三例から増幅されたＨＩＶ ＲＮＡのインビトロ翻訳により得られたｇａｇ、ｖｐｒ、ｒｅｖ、およびｎｅｆタンパク質のポリアクリルアミドゲル分離。コントロールレーンは、コントロールプラスミドｐＢＫＢＨＩＯＳから増幅されたＧａｇ ＲＮＡのインビトロ翻訳により得られたｇａｇタンパク質を示す。
【図２０】ＣＤ４０ＬをコードするＲＮＡと一緒に四種自己ＨＩＶ遺伝子（Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびＧａｇ）で未成熟ＤＣがコトランスフェクトされ、次いで完全にＤＣを成熟されるためにＩＦＮ‐ガンマの存在下で培養された。自己ＨＩＶ患者ＰＢＭＣを刺激するために抗原負荷成熟ＤＣを用いた。培養六日後、ＰＢＭＣが回収され、Ｖｐｒ、Ｒｅｖ、Ｎｅｆ、およびｇａｇ（２プール）の共通配列に対応する四種の個々の重複ペプチドライブラリーで再刺激された。ＩＦＮ‐γ陽性細胞の出現頻度が、各個別のＨＩＶ遺伝子の認識に応答してＩＣＳにより調べられた。ＤＣ調製物が四種ＨＩＶ遺伝子の各々により１μｇ ＲＮＡ／百万ＤＣで負荷され、並行実験では、ＮＥＦ ＲＮＡペイロード（payload）が０．２５μｇ／百万ＤＣに減少したが、一方、他の三種遺伝子は１μｇ ＲＮＡ／百万ＤＣで各々トランスフェクトされた。
【図２１】未成熟ＤＣが５μｇ ｅＧＦＰ ＲＮＡ／百万ＤＣ（陰性コントロール）のみでトランスフェクトされ、またはｅＧＦＰトランスフェクトＤＣが次いで２プールとしてｇａｇ共通ペプチドでパルスされた。一方、ＤＣが自己Ｇａｇ ＲＮＡ（５μｇ ＲＮＡ／百万ＤＣ）でトランスフェクトされた。すべてのケースで、ＤＣがＣＤ４０Ｌ ＲＮＡでコトランスフェクトされ、次いで完全に成熟されるためにＩＦＮ‐ガンマを含んでなる培地で培養された。抗原負荷ＤＣがＣＦＳＥで予め標識されたＰＢＭＣと同時培養された。六日後、ＰＢＭＣが回収され、抗原反応（ＣＦＳＥ低）細胞の出現頻度が調べられた。加えて、ＣＦＳＥ低細胞がＣＴＬエフェクター機能のマーカーとしてグランザイムＢでＩＣＳにより染色された。
【図２２】臨床試験手順に関する時間およびイベントスケジュール。
【図１Ａ】
2008513009.tif 000012
【図１−Ｂ】
2008513009.tif 000013
【図１−Ｃ】
2008513009.tif 000014
【図１−Ｄ】
2008513009.tif 000015
【図１−Ｅ】
2008513009.tif 000016
【図１−Ｆ】
2008513009.tif 000017
【図１−Ｇ】
2008513009.tif 000018
【図１Ｈ】
2008513009.tif 000019
【図１Ｉ】
2008513009.tif 000020
【図１−Ｊ】
2008513009.tif 000021
【図１−Ｋ】
2008513009.tif 000022
【図２−Ａ】
2008513009.tif 000023
【図２−Ｂ】
2008513009.tif 000024
【図２−Ｃ】
2008513009.tif 000025
【図２−Ｄ】
2008513009.tif 000026
【図２Ｅ】
2008513009.tif 000027
【図２Ｆ】
2008513009.tif 000028
【図２Ｇ】
2008513009.tif 000029
【図２Ｈ】
2008513009.tif 000030
【図２Ｉ】
2008513009.tif 000031
【図２Ｊ】
2008513009.tif 000032
【図２Ｋ】
2008513009.tif 000033
【図２Ｌ】
2008513009.tif 000034
【図２Ｍ】
2008513009.tif 000035
【図２−Ｎ】
2008513009.tif 000036
【図２Ｏ】
2008513009.tif 000037
【図２Ｐ】
2008513009.tif 000038
【図２Ｑ】
2008513009.tif 000039
【図２Ｒ】
2008513009.tif 000040
【図２Ｓ】
2008513009.tif 000041
【図２Ｔ】
2008513009.tif 000042
【図２Ｕ】
2008513009.tif 000043
【図２Ｖ】
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【図２Ｗ】
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【図２Ｘ】
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【図２Ｙ】
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【図２Ｚ】
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【図２−ＡＡ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【配列表】
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