(57)【要約】  本発明は、金属イオン結合性の所望のレベルを保持する一方、少なくとも１の不所望の微生物の増殖を抑制するために、金属イオンラクトフェリンを含む組成物を処理する方法、及び特に、金属イオンラクトフェリンを含む組成物を圧力処理する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
保存性を維持又は増加させるために組成物を処理する方法であって、以下の：
(ａ)  金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片を含む組成物を準備し、そして
(ｂ)  上記組成物中に存在しうる不所望な微生物の増殖を抑制する処理圧力で上記組成物を圧力処理にかける
を含む、前記方法。
【請求項２】
保存性を維持又は増加させるために組成物を処理する方法であって、以下の：
(ａ)  金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片を含む組成物を準備し、
(ｂ)  上記組成物中に存在しうる不所望な微生物の増殖を抑制する処理圧力を選択し、そして
(ｃ)  上記組成物を上記処理圧力で圧力処理にかける
を含む、前記方法。
【請求項３】
保存性を維持又は増加させるために組成物を処理する方法であって、以下の：
(ａ)  金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片を含み、そして約３.０〜８.０のｐＨを有する組成物を準備し、そして
(ｂ)  上記組成物を約３５０ＭＰａ〜約１０００ＭＰａの処理圧力で圧力処理にかける
を含む、前記方法。
【請求項４】
保存性を維持又は増加させるために組成物を処理する方法であって、以下の：
(ａ)  金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片、及び１以上の不所望の微生物を含み、そして約３.０〜約８.０のｐＨを有する組成物を準備し、そして
(ｂ)  約３５０ＭＰａ〜１０００ＭＰａの処理圧力であって、不所望な微生物の増殖を抑制し、そしてラクトフェリン又は機能バリアント或いはそれらの断片に結合された金属イオンの少なくとも所望されるレベルを保持する処理圧力を選択し、
(ｃ)  上記処理圧力で上記組成物を圧力処理にかける
を含む前記方法。
【請求項５】
前記組成物が、金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片から本質的になるか又はそれらからなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記組成物は、約０.１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記組成物は、約１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記金属イオンが、アルミニウムイオン、カルシウムイオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、金イオン、鉄イオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、白金イオン、ルテニウムイオン、セレンイオン、又は亜鉛イオン、或いはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記金属イオンが鉄である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ラクトフェリンが、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ、又はヒトのラクトフェリン、或いはそれらの混合物である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ラクトフェリンが組換え、合成、又は天然ラクトフェリン、或いはそれらの混合物である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約５％金属イオン飽和である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約１０％金属イオン飽和である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約２０％金属イオン飽和である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約５０％金属イオン飽和である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約１００％金属イオン飽和である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物が、金属イオンラクトフェリンと、金属イオン機能バリアント又はそれらの断片のうちの少なくとも１つとの混合物を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記圧力が約３５０〜８５０ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記圧力が約３５０〜８００ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記圧力が約３５０〜７５０ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記圧力が約３５０〜７００ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記圧力が約３５０〜６５０ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記圧力が約４００〜８００ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記圧力が約４００〜７００ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記圧力が約４００〜６００ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記圧力が約５００〜８００ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記圧力が約５００〜７００ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記圧力が約５００〜６００ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記圧力が約５５０〜６５０ＭＰａである、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記組成物のｐＨが約３.３〜８.０である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物のｐＨが約４.０〜８.０である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物のｐＨが約４.５〜８.０である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記組成物のｐＨが約５.０〜８.０である、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物をパッケージング前に処理圧力にかける、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物をパッケージング後に処理圧力にかける、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、還元又は新鮮な全乳、還元又は新鮮な脱脂乳、還元全乳又は脱脂乳粉末、濃縮脱脂乳、脱脂乳単離体、全乳又は脱脂乳粉末、脱脂乳濃縮物、濃縮乳、バターミルク、限外濾過濃縮乳、乳タンパク質濃縮物(ＭＰＣ)、乳タンパク質単離体(ＭＰＩ)、カルシウム除外乳タンパク質濃縮物、カルシウム除外乳タンパク質単離体、低脂肪乳、低脂肪乳タンパク質濃縮体、低脂肪乳タンパク質単離体、初乳、初乳画分、初乳タンパク質濃縮物(ＣＰＣ)、初乳乳タンパク質濃縮物、初乳乳タンパク質単離体、初乳乳清、初乳乳清タンパク質濃縮物、初乳乳清タンパク質単離体、初乳由来の免疫グロブリン画分、乳清、乳清タンパク質濃縮物(ＷＰＣ)、乳清タンパク質単離体(ＷＰＩ)、加糖乳清、乳酸乳清、鉱酸乳清、還元乳清粉末、過免疫乳、過免疫乳タンパク質濃縮物、過免疫乳タンパク質単離体、過免疫乳清、過免疫乳清タンパク質濃縮物、過免疫乳清タンパク質単離体、過免疫初乳、過免疫初乳タンパク質濃縮物、過免疫初乳タンパク質単離体、過免疫初乳乳清、過免疫初乳乳清タンパク質濃縮物、過免疫初乳乳清タンパク質単離体、全ての乳又は初乳処理流から得られる組成物、全ての乳又は初乳加工流の限外ろ過又は精密ろ過により得られる濃縮物又は浸透物から得られる組成物、又は任意の乳又は初乳処理流のクロマトグラフィー分離により得られる浸透又は吸着画分から得られる組成物、又はこれらの組成物のいずれかの全部又は部分的加水分解物、又はそれらの混合物を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が飲料、酸性飲料、中性飲料、炭酸付加飲料、ヨーグルト又はゼリーである、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法に従って処理される組成物。
【請求項３９】
飲料である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
酸性飲料である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
中性飲料である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４２】
炭酸付加飲料である、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４３】
ヨーグルトである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４４】
ゼリーである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４５】
約０.１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片並びに約５００００ｃｆｕ／ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理された組成物。
【請求項４６】
約０.１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片並びに約５００００ｃｆｕ／ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理されたゼリー。
【請求項４７】
約０.１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片並びに約５００００ｃｆｕ／ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理されたヨーグルト。
【請求項４８】
約０.１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片並びに約５００００ｃｆｕ／ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理された飲料。
【請求項４９】
約１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片並びに約５００００ｃｆｕ／ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理された組成物。
【請求項５０】
約１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片並びに約５００００ｃｆｕ／ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理されたゼリー。
【請求項５１】
約１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片並びに約５００００ｃｆｕ／ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理されたヨーグルト。
【請求項５２】
約１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片並びに約５００００ｃｆｕ／ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理された飲料。
【請求項５３】
前記金属イオンが鉄である、請求項４５〜５２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約２０％金属イオン飽和である、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５５】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約４０％金属イオン飽和である、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約６０％金属イオン飽和である、請求項４５〜５３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
食品、飲物、食品添加物、飲料添加物、食品サプリメント、栄養製品、病院食、栄養補助食品、薬剤又は医薬品の製造における、請求項３８に記載の組成物の使用。
【請求項５８】
骨の成長を刺激し、骨の吸収を阻害し、軟骨細胞増殖を刺激し、骨芽細胞増殖を刺激し、破骨細胞の発達を阻害し、又は骨格、関節又は軟骨障害を治療又は予防するための、請求項３９に記載の使用。
【請求項５９】
対象において腫瘍形成を阻害し、対象おいてアポトーシスを誘導し、対象において腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、対象において血管新生を阻害し、対象において腫瘍血管新生を阻害し、対象において白血球細胞数及び赤血球細胞数のうちの１つ又は両方を維持又は改善し、対象において免疫系を刺激し、対象における腫瘍内のＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの産生を増加させ、対象の腸内でＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの産生を増加させ、対象の全身の血液循環においてＴｈ１及びＴｈ２サイトカインのレベルを増加させ、対象における抗腫瘍免疫応答を増加させ、癌治療への対象の応答性を増加させ、又は対象において癌治療への腫瘍の応答性を増加させるための、請求項３９に記載の使用。
【請求項６０】
鉄欠損性貧血又は妊娠に伴う鉄欠損の治療又は予防のための、貧血患者においてヘモグロビンを増加させるための、又は吸収不良のための腸再生治療のための、請求項３９に記載の使用。
【請求項６１】
骨の成長を刺激し、骨の吸収を阻害し、軟骨細胞の増殖を刺激し、骨芽細胞増殖を刺激し、破骨細胞の発達を阻害し、又は骨格、関節、又は軟骨の障害を治療又は予防する方法であって、それらを必要とする対象に請求項３８に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項６２】
対象において腫瘍形成を阻害し、対象おいてアポトーシスを誘導し、対象において腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、対象において血管新生を阻害し、対象において腫瘍血管新生を阻害し、対象において白血球細胞数及び赤血球細胞数のうちの１つ又は両方を維持又は改善し、対象において免疫系を刺激し、対象における腫瘍内のＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの産生を増加させ、対象の腸内でＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの産生を増加させ、対象の全身の血液循環においてＴｈ１及びＴｈ２サイトカインのレベルを増加させ、対象における抗腫瘍免疫応答を増加させ、癌治療への対象の応答性を増加させ、又は対象において癌治療への腫瘍の応答性を増加させる方法であって、治療を必要とする対象に請求項３８に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項６３】
鉄欠損性貧血又は妊娠に伴う鉄欠損の治療又は予防のための、貧血患者においてヘモグロビンを増加させるための、又は吸収不良のための腸再生治療のための方法であって、それらを必要とする対象に請求項３８に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、金属イオンラクトフェリン組成物の高圧処理に関し、特に金属イオンラクトフェリンを含む組成物を圧力処理して、金属イオン結合の所望のレベルを維持する一方、保存性(keeping quality)を維持又は増大する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物活性成分(例えば、タンパク質、脂質、又はそれらの加水分解物)を食品又は他の摂取可能な製品にデリバリーすることは、生物活性を維持する一方、安全な製品に有用な保存寿命(shelf life)を提供する必要性により制限される。有用な保存寿命を有する製品は、良好な保存性を有すると言われ、そして腐敗する傾向が低い。
【０００３】
生物活性成分のデリバリーは、少なくともその様な成分が摂取されたときに生理的に活性であり、そしてプラスの健康効果、例えば非限定的に骨健康、免疫効果、抗炎症活性、心臓健康、及び癌治療における有効性、を有しうるので、望ましい。
【０００４】
有用な保存性を保証する伝統的な方法は、食品などの生物活性にマイナスの影響を有する。特に、熱処理は、市販の滅菌生物活性製品の製造に一般的に適していない。例えば、市販の乳製品における免疫グロブリンタンパク質の分析は、免疫グロブリンの６０〜７５％が滅菌を通じて保持されるが、ＵＨＴ又は缶詰(蒸発させた)乳汁におけるレベルは無視できるものとなってしまうことを明らかにした(Li-Chanら、1995)。酸食品中の市販の滅菌性は、缶詰に使用されるよりは低い温度での加熱を用いることにより達成されてもよいが、加熱下における免疫グロブリンの感受性は、酸性化により増幅される(Dominguezら、2001)。
【０００５】
生物活性製品、成分、及び食品の製造には、生物活性の部分的又は完全な消失をもたらしうる多くの方法が存在する。乳製品に基づく成分及び食品の場合、生物活性に影響しうる加熱ステップに関与する方法は、熱滅菌、ホモジェナイズ、加熱、蒸発、及び乾燥を含む。食品加工の場合、生物活性に影響しうる加熱ステップの例は、発酵に先立つ熱処理、ＵＨＴ-処理、レトルト処理、熱充填、及びホットパッキングを含む。生物活性成分は典型的に、食品の製造の間に１以上の加熱ステップにかけられよう。処理が常に初期滅菌化ステップを含む場合、そして典型的にパッケージング及び販売の前にさらに加熱ステップを含む場合、乳製品について特に当てはまる。Korhonenら(1998)は、６０℃〜９０℃の範囲の温度に熱することは、タンパク質を変性させ、その結果生物活性タンパク質の活性を低下させることを報告した。
【０００６】
滅菌乳汁を用いて生産された生成物の乾燥は、４０％以下の免疫グロブリンの喪失を伴って、保存性を改善するために使用されてもよい (Li-Chan, 1995)。しかしながら、商業上の適用は、乾燥生物活性成分が実質的に再度加熱されることはない直接消費物(例えば、錠剤)又は生鮮製品(例えば、ヨーグルト)に限られる。乾燥及び加熱のため生じる消失は、中間生成物又は最終生成物に目的の生物活性成分を添加することによって補われても良いが、これは末端消費者に対する価格を増加させうる。
【０００７】
約３５０ＭＰａを超える圧力を用いた圧力処理は、食肉、野菜、及び果実に基づく製品の保存性(例えば、調理ハム、アボカド製品、及びジュース)の改良において商業的有用な改善を達成するために利用された。しかしながら、Huppertzら(2002)は、高圧力が、乳汁中の乳清タンパク質を変性させるということを報告する。さらに、Korhonenら(1998)は、約５００ＭＰａ以上の圧力での圧力処理が、多くの場合タンパク質を可逆的に変性させるということを報告した。Felipeら(1997)は、相当なレベルの免疫グロブリンの変性が、５００ＭＰａの圧力においてヤギの乳汁中でおこるということを報告した。
【０００８】
Masudaら(2001)は、４００ＭＰａ以上の圧力が、ウシの初乳の保存性を改善するために使用できないということを報告した。なぜならこうした圧力が免疫グロブリンタンパク質を変性させるからである。
【０００９】
Tonelloら(1992)は、２時間適用された２００ＭＰａの圧力が、少なくとも８５％の免疫グロブリン活性を保持するために使用されてもよいが、初乳の微生物負荷量(microbial load)は、２ log cycle未満しか低下させないことを報告した。６３℃での同一の処理は、検出限界未満に微生物負荷量を低減させることができる(７log cycle超)が、少なくとも５０％の免疫グロブリン活性が失われてしまう。
【００１０】
熱処理は、特定のｐＨにおける特定適用のための(Tomitaら、1994)、そして特定の目的のための(例えば飲料又は飲物として、Tanakaら、1994を参照のこと)、ラクトフェリン溶液の現在認識されている商業的滅菌法である。ラクトフェリンは、通常、鉄に対する親和性の低下のため、低ｐＨ(酸性)において幾つかの鉄を失うが(Bakerら、2002)、この喪失は、ｐＨ４.０未満になるまで目立つことはない(Groves, 1960; Bluard-Deconinckら、1978；Tweedieら、1994；Parry ＆ Brown, 1974)。しかしながら、飲料及びヨーグルトなどの様々な重要な適用についての推奨される加熱処理(飲料では、ｐＨ３.８〜４.０、８５℃で１０分、ヨーグルトではｐＨ４.５〜５.０、９０℃で１０分)は、ｐＨの低下のみにより引き起こされる喪失を超えて鉄(又は配位鉄の結合)の喪失をもたらす。さらに、鉄に再結合するラクトフェリンの能力は、かなり低減されてもよい。化学量論の鉄結合を好む高ｐＨ値では、ラクトフェリンは熱安定性が低く(Steijns & van Hooijdonk, 2000)、そしてこれらの数値では鉄は加熱処理の際に失われて、鉄結合能力の喪失を伴う。こうして、熱処理は、様々な適用において、低ｐＨの製品(例えば、ヨーグルト、ゼリー、酸性飲料)ばかりでなく、広いｐＨ範囲に渡る製品(例えば、スムージー及び通常ｐＨでの他の適用)において、鉄ラクトフェリンの使用を制限しうる。
【００１１】
少なくとも１の生物活性構成要素の生物活性を保持する一方、生物活性製品、例えば食品又は他の摂取可能な製品についての商業上有用な保存性を提供できる処理についての必要性が存在する。
【発明の開示】
【００１２】
その結果、所望のレベルの金属イオンの結合を保持する一方、金属イオンラクトフェリンを含む組成物中で不所望の微生物の増殖を抑制する改善された方法又は代わりの方法を提供すること、或いは少なくとも公衆に有用な選択を提供することが本発明の目的である。
【００１３】
従って、本発明の１の態様では、その保存性を維持又は増加させるために組成物を処理する方法であって、以下の：
(ａ)金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片を含む組成物を準備し、そして
(ｂ)少なくとも１の不所望の微生物の増殖を抑制する処理圧力で当該組成物を圧力処理にかける
を含む方法に関する。
【００１４】
別の態様は、本発明は、その保存性を維持又は増加させるために組成物を処理する方法であって、以下の：
(ａ)金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片を含む組成物を準備し、
(ｂ)少なくとも１の不所望の微生物を増殖することを妨げる処理圧力を選択し、そして
(ｃ)当該処理圧力で当該組成物を圧力処理にかける
を含む、方法に関する。
【００１５】
別の態様では、本発明は、保存性を維持又は増加させるために組成物を処理する方法であって、以下の：
(ａ)金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片を含み、そして約３.０〜約８.０又はそれより高いｐＨを有する組成物を準備し、そして
(ｂ)約３５０ＭＰａ〜約１０００ＭＰａの処理圧力で当該組成物を圧力処理にかける
を含む、方法に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、その保存性を維持又は増加させるために組成物を処理する方法であって、以下の：
(ａ)金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片を含みそして約３.０〜約８.０またはそれより高いｐＨを有する組成物を準備し、そして
(ｂ)少なくとも１の不所望の微生物の増殖を妨げ、そしてラクトフェリン又はその機能バリアント又は断片に結合する少なくとも所望のレベルの金属イオンを保持する約３５０ＭＰａ〜約１０００ＭＰａの処理圧力を選択し、そして
(ｃ)当該処理圧力で当該組成物を圧力処理にかける
を含む、方法に関する。
【００１７】
以下の実施態様は、上で記載された態様のいずれかに関してもよい。
【００１８】
１の実施態様では、組成物は、少なくとも約０.１ｍｇ/ｍｌ、好ましくは約０.１、０.５、１、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、２００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片を含み、そして有用な範囲は、これらの値のいずれかの間で選択されてもよい(例えば、０.１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、約１〜１０００ｍｇ／ｍｌ、約２〜１０００ｍｇ／ｍｌ、約３〜１０００ｍｇ／ｍｌ、約４〜１０００ｍｇ／ｍｌ、約５〜１０００ｍｇ／ｍｌ、約１０〜１０００ｍｇ／ｍｌ、約０.１〜１００ｍｇ／ｍｌ、約１〜１００ｍｇ／ｍｌ、約２〜１００ｍｇ／ｍｌ、約３〜１００ｍｇ／ｍｌ、約４〜１００ｍｇ／ｍｌ、約５〜１００ｍｇ／ｍｌ、及び約１０〜１００ｍｇ／ｍｌ)。
【００１９】
別の実施態様では、組成物又は製品は、金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片から本質的になるか、又はそれらからなる。
【００２０】
さらなる実施態様では、組成物又は製品は、約０.０１、０.０５、０.１、０.５、１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、９９.５、又は１００重量％の金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片から本質的になるか、又はそれらからなる。そして有用な範囲は、これらの値のいずれかの間で選択されうる(例えば、約０.０１〜約１００％、約０.０５〜約１００％、約０.１〜約１００％、約０.５〜約１００％、約１〜約１００％、約５〜約１００％、約１０〜約１００％、約１５〜約１００％、約２０〜約１００％、約２５〜約１００％、約３０〜約１００％、約３５〜約１００％、約４０〜約１００％、約４５〜約１００％、約５０〜約１００％、約５５〜約１００％、約６０〜約１００％、約６５〜約１００％、約７０〜約１００％、約７５〜約１００％、約８０〜約１００％、約８５〜約１００％、約９０〜約１００％、約９５〜約１００％、約９９〜約１００％、約０.０１〜約０.０５％、約０.０１〜約０.１％、約０.０１〜約０.５％、約０.０１〜約１％、約０.０１〜約５％、約０.０１〜約１０％、約０.０１〜約１５％、約０.０１〜約２０％、約０.０１〜約２５％、約０.０１〜約３０％、約０.０１〜約３５％、約０.０１〜約４０％、約０.０１〜約４５％、約０.０１〜約５０％、約０.０１〜約５５％、約０.０１〜約６０％、約０.０１〜約６５％、約０.０１〜約７０％、約０.０１〜約７５％、約０.０１〜約８０％、約０.０１〜約８５％、約０.０１〜約９０％、約０.０１〜約９５％、約０.０１〜約９９％、及び約０.０１〜約９９.９％)。
【００２１】
１の実施態様では、組成物又は製品は、金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片又はそれらの混合物から本質的になるか又はそれらからなる組成物で濃縮された。つまり、金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片又はそれらの混合物から本質的になるか又はそれらからなる組成物を、金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片又はそれらの混合物を増加させるために、当該組成物又は製品に加えられる。
【００２２】
１の実施態様では、組成物は１以上の不所望の微生物、例えば１以上の細菌(１以上のプロバイオティック細菌を含む)、１以上の菌類、１以上のカビ、１以上の酵母、又は１以上の藻類、又はそれらの混合物を含む。１の実施態様では、本明細書に有用である方法は、好ましくは、少なくとも１の不所望の微生物の増殖を妨げることを意図する。しかしながら、当該方法は、しばしば予防的に行われ、そして任意の不所望の生物が実際に存在しなくともよい。このような場合、当該方法は、保存性を維持又は改善するために行われるか、又は食品安全性要件、現在の適正製造基準又は規制基準に適合するために行われる。不所望の微生物の有無に関わらず、本明細書における有用な圧力処理法は、少なくとも１の生物活性成分の活性の少なくとも所望のレベルを保持し、そして保存性を維持又は増加させるために有用である。
【００２３】
１の実施態様では、当該方法は、金属イオン飽和の少なくとも所望のレベルを維持する一方、少なくとも１の不所望な微生物の増殖を妨げる。つまり、当該方法は、存在する任意のラクトフェリン・ポリペプチド又は機能バリアント又はそれらの断片の金属イオン飽和の程度に実質的に影響することなく、不所望の微生物の増殖を抑制する。
【００２４】
１の実施態様では、金属イオンは、アルミニウム、カルシウム、銅、クロム、コバルト、金、鉄、マンガン、マグネシウム、白金、ルテニウム、セレン及び亜鉛イオンを含む群から選ばれるイオンである。好ましくは金属イオンは鉄イオンである。
【００２５】
１の実施態様では、ラクトフェリンは、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ、及びヒトのラクトフェリン、並びにそれらの混合物を含む群から選ばれる。好ましくは、ラクトフェリンはウシ・ラクトフェリンである。
【００２６】
１の実施態様では、ラクトフェリンは、組換え合成又は天然ラクトフェリン或いはそれらの混合物である。
【００２７】
１の実施態様では、金属イオンラクトフェリン又は金属イオン飽和機能バリアント又はそれらの断片は、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９.５又は１００％の金属イオンで飽和され、そして有用な範囲は、前述の値のいずれかの間で選ばれてもよい(例えば、約５〜約１００％、約１０〜約１００％、約１５〜約１００％、約２０〜約１００％、約２５〜約１００％、約３０〜約１００％、約３５〜約１００％、約４０〜約１００％、約４５〜約１００％、約５０〜約１００％、約５５〜約１００％、約６０〜約１００％、約６５〜約１００％、約７０〜約１００％、約７５〜約１００％、約８０〜約１００％、約８５〜約１００％、約９０〜約１００％、約９５〜約１００％及び約９９〜約１００％)。
【００２８】
１の実施態様では、金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片は、少なくとも約１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００％の金属イオンで飽和されており、そして有用な範囲は、前述の値のいずれかの間から選ばれてもよい(例えば、約１０５〜約１５０％)。
【００２９】
１の実施態様では、組成物又は製品は、ラクトフェリン・ポリペプチド又は機能バリアント又はそれらの断片の集合であって、集合内の利用可能な金属イオン結合ポケットの少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９.５又は１００％が、金属イオン、好ましくは鉄イオンに結合しており、そして有用な範囲は、前述の値のいずれかの間から選ばれうる(例えば、約５〜約１００％、約１０〜約１００％、約１５〜約１００％、約２０〜約１００％、約２５〜約１００％、約３０〜約１００％、約３５〜約１００％、約４０〜約１００％、約４５〜約１００％、約５０〜約１００％、約５５〜約１００％、約６０〜約１００％、約６５〜約１００％、約７０〜約１００％、約７５〜約１００％、約８０〜約１００％、約８５〜約１００％、約９０〜約１００％、約９５〜約１００％、及び約９９〜約１００％)、上記集合を提供する。
【００３０】
１の実施態様では、集合内の約１００％の利用可能な金属イオン結合ポケットが金属イオン、好ましくは鉄イオンに結合し、そして更なるイオンが非特異的結合部位のラクトフェリン分子に結合し、その結果ラクトフェリンが、化学量論ベースで１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００％の金属イオンである、組成物又は製品は、ラクトフェリン・ポリペプチド又は機能バリアント又はそれらの断片を提供する。
【００３１】
有用な金属イオン飽和範囲は、約２５〜約２００％、約３０〜約２００％、約３５〜約２００％、約４０〜約２００％、約４５〜約２００％、約５０〜約２００％、約５５〜約２００％、約６０〜約２００％、約６５〜約２００％、約７０〜約２００％、約７５〜約２００％、約８０〜約２００％、約８５〜約２００％、約９０〜約２００％、約９５〜約２００％及び約１００〜約２００％の金属イオン飽和を含む。
【００３２】
１の実施態様では、処理後における金属イオン飽和値は、上に記載される値又は範囲から選ばれる。
【００３３】
１の実施態様では、金属イオンラクトフェリン又はそれらのバリアントの金属イオン機能断片は、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９又は１００％の結合された金属イオンを保持する。
【００３４】
１の実施態様では、当該方法は、金属イオンラクトフェリンと少なくとも１の金属イオン機能バリアント又はそれらの断片の混合物の投与を含む。
【００３５】
１の実施態様では、処理圧力は、少なくとも約３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０及び１０００ＭＰａ又はそれを超える圧力から選ばれ、そして有用な範囲は、これらのいずれかの値の間から選ばれうる(例えば、約３５０〜約４００ＭＰａ、約３５０〜約４５０ＭＰａ、約３５０〜約５００ＭＰａ、約３５０〜約５５０ＭＰａ、約３５０〜約６００ＭＰａ、約３５０〜約６５０ＭＰａ、約３５０〜約７００ＭＰａ、約３５０〜約７５０ＭＰａ、約３５０〜約８００ＭＰａ、約３５０〜約８５０ＭＰａ、約３５０〜約９００ＭＰａ、約３５０〜約９５０ＭＰａ及び約３５０〜約１０００ＭＰａ、約４００〜約１０００ＭＰａ、約４５０〜約１０００ＭＰａ、約５００〜約１０００ＭＰａ、約５５０〜約１０００ＭＰａ、約６００〜約１０００ＭＰａ、約６５０〜約１０００ＭＰａ、約７００〜約１０００ＭＰａ、約７５０〜約１０００ＭＰａ、約８００〜約１０００ＭＰａ、約８５０〜約１０００ＭＰａ、約９００〜約１０００ＭＰａ、約９５０〜約１０００ＭＰａ、約５００〜約５５０ＭＰａ、約５００〜約６００ＭＰａ、約５００〜約６５０ＭＰａ、約５００〜約７００ＭＰａ、約５００〜約７５０ＭＰａ、約５００〜約８００ＭＰａ、約５５０〜約８００ＭＰａ、約６００〜約８００ＭＰａ、約６５０〜約８００ＭＰａ、約７００〜約８００ＭＰａ、約７５０〜約８００ＭＰａ、約４００〜約８００ＭＰａ、約４００〜約７５０ＭＰａ、約４００〜約７００ＭＰａ、約４００〜約６５０ＭＰａ、約４００〜約６００ＭＰａ、約４５０〜約８００ＭＰａ、約４５０〜約７５０ＭＰａ、約４５０〜約７００ＭＰａ、約４５０〜約６５０ＭＰａ、約４５０〜約６００ＭＰａ、約５００〜約８００ＭＰａ、約５００〜約７５０ＭＰａ、約５００〜約７００ＭＰａ、約５００〜約６５０ＭＰａ、約５００〜約６００ＭＰａ、約５２５〜約６７５ＭＰａ、約５５０〜約６５０ＭＰａ及び約５７５〜約６２５ＭＰａ)。好ましくは、処理圧力は少なくとも約３５０、４００、４５０、５００又は６００ＭＰａである。
【００３６】
別の実施態様では、組成物が処理圧力にかけられる場合、組成物のｐＨは、少なくとも約３.０、３.１、３.２、３.３、３.４、３.５、３.６、３.７、３.８、３.９、４.０、４.１、４.２、４.３、４.４、４.５、４.６、４.７、４.８、４.９、５.０、５.１、５.２、５.３、５.４、５.５、５.６、５.７、５.８、５.９、６.０、６.１、６.２、６.３、６.４、６.５、６.６、６.７、６.８、６.９、７.０、７.１、７.２、７.３、７.４、７.５、７.６、７.７、７.８、７.９又は８.０であるか、或いはそれを超える圧力である。そして有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選ばれてもよい(例えば、約ｐＨ３.０〜約４.５、約ｐＨ３.０〜約５.０、約ｐＨ３.０〜約５.５、約ｐＨ３.０〜約６.０、約ｐＨ３.０〜約６.５、約ｐＨ３.０〜約７.０５約ｐＨ３.０〜約７.５、約ｐＨ３.０〜約８.０、約ｐＨ３.１〜約４.９、約ｐＨ３.２〜約４.８、約ｐＨ３.３〜約４.７、約ｐＨ３.４〜約４.６、約ｐＨ３.５〜約４.５、約ｐＨ３.６〜約４.４、約ｐＨ３.７〜約４.３、約ｐＨ３.８〜約４.２、約ｐＨ３.９〜約４.１、約ｐＨ３.１〜約８.０、約ｐＨ３.２〜約８.０、約ｐＨ３.３〜約８.０、約ｐＨ３.４〜約８.０、約ｐＨ３.５〜約８.０、約ｐＨ３.６〜約８.０、約ｐＨ３.７〜約８.０、約ｐＨ３.８〜約８.０、約ｐＨ３.９〜約８.０、約ｐＨ４.０〜約８.０、約ｐＨ４.５〜約８.０、約ｐＨ５.０〜約８.０、約ｐＨ５.５〜約８.０、約ｐＨ６.０〜約８.０、約ｐＨ６.５〜約８.０、及び約ｐＨ７.０〜約８.０)。或いは、さらに別の実施態様では、組成物のｐＨは、圧力処理前に上記ｐＨ又はｐＨ範囲に調節される。
【００３７】
１の実施態様では、本方法は、室温で行われる。好ましくは、圧力処理は、少なくとも摂氏約０、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０度の温度で行われ、そして有用な範囲は、これらの前述の値のいずれかの間から選ばれてもよい(例えば、約５〜約４０℃)。
【００３８】
１の実施態様では、処理圧力は、約１秒〜約３０分の処理時間のあいだ適用されてもよい。好ましくは処理時間は、約１、５、１０、２０、３０、６０、９０、１２０、１５０、１８０、２１０、２４０、２７０又は３００秒又は約０.５、１、１.５、２、２.５、３、３.５、４、４.５、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５又は６０分から選ばれ、そして有用な範囲は、これらの値のいずれかの間から選ばれてもよい(例えば、約１〜約１０分、約１〜約５分、又は約２〜約４分)。
【００３９】
別の実施態様では、処理圧力は、処理時間のあいだ実質的に一定に保たれる。別の実施態様では、圧力は周囲圧力(通常大気圧)から処理圧力に増大し、そして次に処理時間内に周囲圧力に戻される。周囲圧力は通常大気圧であろう。
【００４０】
１の実施態様では、上に記載される処理時間は、大気圧から処理圧力へと圧力を増加させ、そして次に圧力を大気圧に戻すためにかかる時間である。従って、１の実施態様では、１分の処理時間は、圧力が大気圧から処理圧力に増加し、そして次に大気圧に１分のうちに戻ることを意味する。
【００４１】
別の実施態様では、上で記載される処理時間は、圧力が処理圧力に保たれる時間である(保持時間)。従って、１の実施態様では、１分の処理時間は、圧力が処理圧力で１分間保持されることを意味する。その結果、０分の処理時間(つまり、保持無し)は、圧力が処理圧力にまで上げられるが、保たれることなく、そして圧力が次に大気圧に戻されるということを意味する。この実施態様では、好ましい処理時間は、０(保持無し)、０.５、１、１.５、２、２.５、３、３.５、４、４.５、５、５.５、６、６.５、７、７.５、８、８.５、９、９.５及び１０分を含む。好ましくは圧力は約０.５、１、１.５、２、２.５、３、３.５、４、４.５又は５分、又は約０、０.５、１、１.５、２、２.５又は３分、又は約０分間保持される。
【００４２】
１の代わりの実施態様では、全処理時間は、約０.５、１、１.５、２、２.５、３、３.５、４、４.５、５、５.５、６、６.５、７、７.５、８、８.５、９、９.５又は１０分未満である。つまり、圧力が周囲圧力(通常、大気圧)から上昇し、そして周囲圧力に戻るためにかかる時間は、約０.５、１、１.５、２、２.５、３、３.５、４、４.５、５、５.５、６、６.５、７、７.５、８、８.５、９、９.５又は１０分未満である。好ましくは、約８分未満、好ましくは約７分未満、好ましくは約６分未満、又は好ましくは約５分未満である。
【００４３】
別の実施態様では、組成物は、更なる圧力処理にかけられてもよい。処理圧力は、大気圧へと戻すことなく１の処理圧力から別の処理圧力にへと変化されてもよい。各圧力処理は、別の処理時間の間行われてもよい。従って、１の実施態様では、圧力は第一処理時間で周囲圧力から第一処理圧力へと増加し、そして次に圧力は第二処理時間で処理圧力に変えられる。好ましくは、第一処理時間は、第二処理時間よりも長い。好ましくは、第一処理時間は、第二処理時間よりも短い。さらに別の実施態様では、圧力は第１処理圧力に増加され、次に処理時間内に第二処理圧力に変化される。
【００４４】
１の実施態様では、組成物は、製品に取り込む前に処理圧力にかけられる。別の実施態様では、組成物は、製品に取り込まれた後に処理圧力にかけられる。従って、方法はさらに、組成物を製品に取り込む前又は後に処理圧力に掛けることを含む。
【００４５】
別の実施態様では、組成物は、パッケージング前に処理圧力にかけられる。別の実施態様では、組成物は、パッケージングの後に処理圧力にかけられる。従って、本方法はさらにパッケージング前又は後に処理圧力に組成物をかけることを含む。
【００４６】
１の実施態様では、処理圧力は約６００ＭＰａであり、そして保持時間は約０、１、２、又は３分である。別の好ましい実施態様では、処理圧力は約４００ＭＰａであり、そして保持時間は約３０分未満である。
【００４７】
１の好ましい実施態様では、処理圧力は約３５０〜約６５０ＭＰａであり、そして保持時間は約０分〜約５分である。好ましくは組成物はヨーグルトである。
【００４８】
１の好ましい実施態様では、処理圧力は約３５０〜約６５０ＭＰａであり、そして保持時間は約０分〜約５分である。好ましくは組成物は飲料である。
【００４９】
１の好ましい実施態様では、処理圧力は約３５０〜約６５０ＭＰａであり、そして保持時間は約０分〜約５分である。好ましくは組成物は発酵飲料である。
【００５０】
１の好ましい実施態様では、処理圧力は約３５０〜約６５０ＭＰａであり、そして保持時間は約０分〜約５分である。好ましくは組成物は、酸性飲料、液体濃縮物(ゲルを含む)、又はヨーグルトである。
【００５１】
１の好ましい実施態様では、処理圧力は約３５０〜約７００ＭＰａであり、保持時間は約０分〜約３０分であり、組成物のｐＨは約ｐＨ３.０〜約ｐＨ８.０であり、そして組成物は飲料(酸性化飲料、中性飲料、又は炭酸付加飲料を含む)、ヨーグルト又はゼリーである。
【００５２】
１の実施態様では、組成物は、乳製品タンパク質又は乳製品成分を含む。好ましくは、乳製品タンパク質組成物又は乳製品成分は、還元又は新鮮な全乳、還元又は新鮮な脱脂乳、還元全乳又は脱脂乳粉末、濃縮脱脂乳、脱脂乳単離体、全乳又は脱脂乳粉末、脱脂乳濃縮物、濃縮乳、バターミルク、限外濾過濃縮乳、乳タンパク質濃縮物(ＭＰＣ)、乳タンパク質単離体(ＭＰＩ)、カルシウム除外乳タンパク質濃縮物、カルシウム除外乳タンパク質単離体、低脂肪乳、低脂肪乳タンパク質濃縮体、低脂肪乳タンパク質単離体、初乳、初乳画分、初乳タンパク質濃縮物(ＣＰＣ)、初乳乳タンパク質濃縮物、初乳牛乳タンパク質単離体、初乳乳清、初乳乳清タンパク質濃縮物、初乳乳清タンパク質単離体、初乳由来の免疫グロブリン画分、乳清、乳清タンパク質濃縮物(ＷＰＣ)、乳清タンパク質単離体(ＷＰＩ)、加糖乳清、乳酸乳清、鉱酸乳清、還元乳清粉末、過免疫乳、過免疫乳タンパク質濃縮物、過免疫乳タンパク質単離体、過免疫乳清、過免疫乳清タンパク質濃縮物、過免疫乳清タンパク質単離体、過免疫初乳、過免疫初乳タンパク質濃縮物、過免疫初乳タンパク質単離体、過免疫初乳乳清、過免疫初乳乳清タンパク質濃縮物、過免疫初乳乳清タンパク質単離体、全ての乳又は初乳処理流から得られる組成物、全ての乳又は初乳加工流の限外ろ過又は精密ろ過により得られる濃縮物又は浸透物から得られる組成物、又は任意の乳又は初乳処理流のクロマトグラフィー分離により得られる浸透又は吸着画分から得られる組成物、又はこれらの組成物のいずれかの全部又は部分的加水分解物、又はそれらの混合物である。
【００５３】
好ましくは、乳製品成分は、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、又はヒト起源であるか、又はそれらの混合物である。
【００５４】
別の実施態様では、組成物又は製品は、ライソザイム、免疫グロブリン、グリコマクロペプチド、少なくとも約１％ｗ/ｗ免疫グロブリンを含む組成物、抗体レベルを増加させるために動物に予防接種することにより作製される製品、免疫乳、及びそれらの混合物を含む。
【００５５】
別の実施態様では、組成物又は製品は、非極性脂質及び極性脂質、例えばリン脂質、スフィンゴ脂質、ガングリオシド及びセラミド、並びにそれらの混合物から選ばれる成分をさらに含む。
【００５６】
別の実施態様では、組成物又は製品は、１以上のＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭを含む、少なくとも約１％ｗ/ｗ免疫グロブリンをさらに含む。
【００５７】
１の実施態様では、組成物又は製品は、食品である。好ましくは食品は、酸性飲料又は炭酸付加飲料である。好ましくは、当該食品は、固形ヨーグルト、攪拌ヨーグルト、香味付けヨーグルト、フルーツヨーグルト、及びプロバイオティックヨーグルト、フロマージュ・フレ、プティ・スイス、クワルク、発酵食品又は飲料、酸性化飲料又は乳製品である。好ましくは、食品はゼリーである。
【００５８】
１の実施態様では、組成物は、ラクトバチルス(Lactobacillus)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、ラクトコッカス(Lactococcus)、リューコノストック(Leuconostoc)、ペディオコッカス(Pediococcus)、ビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)、プロピオニバクテリウム(Propionibacterium)、エンテロコッカス(Enterococcus)、又はバチルス(Bacillus)、又はその混合物からなる群から選ばれるプロバイオティック微生物をさらに含む。
【００５９】
１の実施態様では、組成物は、ラクトバチルス アシドフィラス(Lactobacillus acidophilus)、ラクトバチルス デルブルッキー サブスピーシーズ ブルガリカス(Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus)、ラクトバチルス カゼイ(Lactobacillus casei)、ラクトバチルス クリスパタス(Lactobacillus crispatus)、ラクトバチルス ジョンソニー(Lactobacillus johnsonii)、ラクトバチルス プランタルム(Lactobacillus plantarum)、ラクトバチルス ロイテリ(Lactobacillus reuteri)、ラクトバチルス ラムノサス(Lactobacillus rhamnosus)、ラクトバチルス サリバリウス(Lactobacillus salivarius)、ビフィドバクテリウム ビフィダム(Bifidobacterium bifidum)、ビフィドバクテリウム ブレーベ(Bifidobacterium breve)、ビフィドバクテリウム インファンティス(Bifidobacterium infantis)、ビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシーズ ラクチス(Bifidobacterium animalis subsp. lactis)、ビフィドバクテリウム ロンガム(Bifidobacterium longum)、又は ストレプトコッカス サーモフィラス(Streptococcus thermophilus)からなる群から選ばれるプロバイオティック微生物又はそれらの混合物をさらに含む。
【００６０】
１の実施態様では、組成物は、ラクトバチルス ラムノサスＨＮ００１(ＡＧＡＬ ＮＭ ９７／０９５１４)、ビフィドバクテリウム  アニマリス サブスピーシーズ ラクチスＨＮ０１９(ＡＧＡＬ ＮＭ ９７／０９５１３)、ラクトバチルス アシドフィルスＨＮ０１７(ＡＧＡＬ ＮＭ ９７／０９５１５)、ラクトバチルス ラムノサスＨＮ０６７(ＡＧＡＬ ＮＭ ９７／０１９２５)(これら全てはUS 6,379,663に記載されている)、ラクトバチルス  ジョンソニー ＮＣＣ５３３ (Ｌａ１)(ＣＮＣＭ  Ｉ-１２２５)、ラクトバチルス ラムノサスＧＧ(ＡＴＣＣ ５３１０３)、ラクトバチルス カゼイ シロタ(ＦＥＲＭ-Ｐ４７５１)、ラクトバチルス アシドフィラス ＮＣＦＭ(ＡＴＣＣ ７００３９６)、ラクトバチルス プランタルム ２９９ｖ(ＤＳＭＺ ９８４３)、ラクトバチルス カゼイＤＮ１１４００１(ＣＮＣＭ Ｉ-１５１８)、ラクトバチルス サリバリウス ＵＣＣ４３３１(ＮＣＩＭＢ  ４０８２９)、ビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシーズ ラクチスＢＢ１２(ＡＴＣＣ  ２７５３６及びＤＳＭＺ１０１４０)、又はビフィドバクテリウム インファンティス３５６２４(ＮＣＩＭＢ  ４１００３)からなる群から選ばれるプロバイオティック微生物、又はそれらの混合物をさらに含む。好ましい不所望の生物又はプロバイオティック微生物は、ラクトバチルス ラムノサスＨＮ００１、ビフィドバクテリウム アニマリス サブスピーシーズ ラクチス ＨＮ０１９、ラクトバチルス アシドフィラスＨＮ０１７、又はラクトバチルス ラムノサス ＨＮ０６７、又はそれらの混合物を含む。
【００６１】
１の実施態様では、プロバイオティック微生物は、不活性プロバイオティック微生物である。不活性プロバイオティク微生物は、生存していなくてもよいが、生存していないが代謝的に活性であるか、又は死滅していてもよい。
【００６２】
別の態様では、本発明は、本発明の方法に従って処理されるか又は産生される組成物又は製品に関する。
【００６３】
別の態様では、本発明は、食品、飲料、食品添加物、飲料添加物、食品サプリメント、栄養製品、病院食、栄養補助食品、薬剤又は医薬品の製造において、本発明の方法に従って製造又は処理された組成物又は製品の使用に関する。
【００６４】
１の実施態様では、前記使用は、骨の成長を刺激し、骨の吸収を阻害し、軟骨細胞の増殖を刺激し、骨芽細胞増殖を刺激し、破骨細胞の発達を阻害し、又は骨、関節、又は軟骨の障害を治療又は予防することを目的とする。
【００６５】
１の実施態様では、前記使用は、対象において腫瘍形成を阻害し、対象においてアポトーシスを誘導し、対象において腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、対照において血管新生を阻害し、対照において腫瘍血管新生を阻害し、対象において白血球細胞数及び赤血球細胞数のうちの１つ又は両方を維持又は改善し、対象において免疫系を刺激し、対象の腫瘍においてＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの産生を増加させ、対象の腸内でＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの産生を増加させ、対象の全身の血液循環においてＴｈ１及びＴｈ２サイトカインのレベルを増加させ、対象における抗腫瘍免疫応答を増加させ、癌治療への対象の応答性を増加させ、又は対象において癌治療への腫瘍の応答性を増加させることを目的とする。
【００６６】
１の実施態様では、当該使用は、鉄欠乏貧血症又は妊娠に伴う鉄欠乏を治療又は予防すること、又は貧血症の患者においてヘモグロビン数を増加させること、又は吸収不良に対し腸再生治療をすることを目的とする。
【００６７】
別の態様では、本発明は、骨の成長を刺激し、骨の吸収を阻害し、軟骨細胞増殖を刺激し、骨芽細胞増殖を刺激し、破骨細胞の発達を防止し、又は骨格、関節又は軟骨障害を治療又は予防する方法であって、本発明の組成物又は製品をそれらを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００６８】
別の態様では、本発明は、対象において腫瘍形成を阻害し、対象においてアポトーシスを誘導し、対象において腫瘍細胞のアポトーシスを誘導し、対象において血管新生を阻害し、対象において腫瘍の血管新生を阻害し、対象において白血球細胞数及び赤血球細胞数のうちの１つ又は両方を維持又は改善し、対象において免疫系を刺激し、対象において腫瘍内のＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの産生を増大させ、対象の腸内のＴｈ１及びＴｈ２サイトカインの産生を増加させ、対象の全身血液循環おいてＴｈ１及びＴｈ２のレベルを増加させ、対象において抗腫瘍免疫応答を増加させ、対象の癌治療への応答性を増加させ、又は癌治療への対象の腫瘍の応答性を増加させる方法であって、本発明の組成物又は製品をそれを必要とする対象に投与することを含む方法に関する。
【００６９】
別の態様では、本発明は、鉄欠乏貧血症又は妊娠に付随する鉄欠乏症を治療又は予防する方法、貧血患者においてヘモグロビン数を増加させる方法、又は吸収不良の腸再生治療のための方法であって、それらを必要とする対象に本発明の組成物又は製品を投与することを含む、方法に関する。
【００７０】
別の態様は、約０.１ｍｇ/ｍｌ〜１０００ｍｇ/ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片、及び約５００００ｃｆｕ/ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理された組成物；約０.１ｍｇ/ｍｌ〜１０００ｍｇ/ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片及び約５００００ｃｆｕ/ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理されたゼリー；約０.１ｍｇ/ｍｌ〜１０００ｍｇ/ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片及び約５００００ｃｆｕ/ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理されたヨーグルト；約０.１ｍｇ/ｍｌ〜１０００ｍｇ/ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片及び約５００００ｃｆｕ/ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理された飲料；約１ｍｇ/ｍｌ〜１０００ｍｇ/ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片及び約５００００ｃｆｕ/ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理された組成物；約１ｍｇ/ｍｌ〜１０００ｍｇ/ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片及び約５００００ｃｆｕ/ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理されたゼリー；約１ｍｇ/ｍｌ〜１０００ｍｇ/ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片及び約５００００ｃｆｕ/ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理されたヨーグルト；或いは、約１ｍｇ/ｍｌ〜１０００ｍｇ/ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント又はそれらの断片及び約５００００ｃｆｕ/ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理された飲料に関する。
【００７１】
上及び下で引用される全ての出願、特許、及び公開の開示の全ては本明細書に援用される。
【００７２】
本明細書に開示される数字範囲への言及(例えば、１〜１０)が、その範囲内の全ての有利数を指すということを包含し(例えば、1、１.１、２、３、３.９、４、５、６、６.５、７、８、９及び１０)、そして当該範囲内の有利数の任意の範囲(例えば、２〜８、１.５〜５.５、及び３.１〜４.７)そしてその結果、明らかに本明細書に開示される全ての範囲の全てのサブ範囲は、本明細書に明らかに開示されている。これらは、具体的に意図された例に過ぎず、そして列挙される最も低い値と最も高い値との間の数値の全ての可能な組み合わせは、同様に本出願に明らかに述べられると考えられる。
【００７３】
本発明は、本出願の明細書に個別に又はまとめて記載され又は示される部分、要素、及び特徴にあると広く言われてもよく、当該部分、要素、又は特徴の２以上の任意又は全ての組合わせにあると広く言われてもよく、そして、本発明の属する技術分野における既知の同等物を有する具体的な整数が本明細書に挙げられている場合、その様な既知の同等物は、個別に記載されたのと同じ様に、本明細書に包含されると見なされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７４】
１.定義
本明細書及び特許請求の範囲で使用される「〜を含む」という用語は、「少なくとも部分的に〜なる」を意味する。本明細書及び特許請求の範囲において当該用語を含む記載を解釈する場合、各記載において当該用語の前に記載される特徴が全て存在することを必要とするが、他の特徴も存在することができる。関連する用語、例えば「含む」及び「含まれる」は、これと同じ様式で解釈されるべきである。
【００７５】
「免疫系を高める」及び「免疫系を刺激する」という用語(及びこれら用語の異なる時制)は、抗原特異的細胞溶解活性 (免疫細胞の活性、好ましくは細胞障害清Ｔ-リンパ球)及び/又はＮＫ細胞活性の生成を刺激し、(少なくとも細胞傷害性Ｔリンパ球の活性を通して)抗原に応答する細胞性免疫を改善し、（少なくとも、細胞傷害性Ｔ−リンパ球及び/又はＮＫ細胞の活性を少なくとも回復すること及びサイトカイン産生を高めることにより）免疫保護を改善し、(細胞傷害性Ｔ-リンパ球及び/又はＮＫ細胞の活性を少なくとも回復させ、そしてサイトカイン産生を高めることにより)免疫保護を回復し、又は炎症促進性及び免疫調節メディエーター(Ｔｈ１及びＴｈ２サイトカイン)を生成する金属イオンラクトフェリンの能力を指す。
【００７６】
「機能断片」という用語は、１又は２個の金属イオン結合ポケットを有し、そして少なくとも１のポケットで金属イオンと結合できるラクトフェリン・ポリペプチドの天然又は非天然部分を意味するように意図される。通常のラクトフェリン断片は、切り詰め型のラクトフェリン・ポリペプチド、金属イオン結合性のラクトフェリンの加水分解物、Ｎ-ローブ結合ポケットを含む断片(非限定的にＮ-ローブ配列を含む)、Ｃ-ローブ結合ポケットを含む断片(非限定的にＣ-ローブ配列を含む)、及び(人工又は天然方法により)作製される金属イオン結合性断片及び以下に記載される既知の技術により同定される。
【００７７】
「機能バリアント」という用語は、ラクトフェリン分子あたり２個の金属イオンに結合できるラクトフェリン・ポリペプチドのバリアントを意味するように意図される。
【００７８】
ラクトフェリン・ポリペプチドに関して使用される場合、「グリコシル化」という用語は、当該ラクトフェリンが完全に又は部分的に、天然又は非天然ヒト又はウシのグリコシル基でグリコシル化されるということを意味するように意図される。グリコシル化及びグリコシル化されていないラクトフェリンの形態が知られている(Pierceら、(1991)；Metz-Boutigueら、(1984)；van Veenら(2004)を参照のこと)。
【００７９】
「対象の応答性を増加させる」という用語は、本発明の方法にかけられない対象に比べて、腫瘍増殖の割合、腫瘍の大きさ、又は疾患の臨床症状において、対象が優れた低下を示すことを意味するように意図される。
【００８０】
「腫瘍の感受性を増加させる」という用語は、腫瘍が腫瘍増殖の割合、腫瘍の大きさのかなりの低下を示すか、又は根絶されると言うこと、一方本発明の方法にかけられない腫瘍がこれらの効果を示さないと言うことを意味するように意図される。
【００８１】
「腫瘍形成を阻害する」という用語は、腫瘍が形成しないこと、又は腫瘍が形成するが定着又は増殖しないこと、或いは腫瘍が形成するが小さく、良性であり、そして癌性にならないか又は転移しないこと、或いは腫瘍がかなりゆっくりしか増殖しないことを意味するように意図される。腫瘍形成は、現在利用できるＣＴスキャン及び腫瘍マーカーを通してモニターされうる。
【００８２】
「腫瘍増殖を阻害する」という用語は、本発明に従って処理された対象において腫瘍が形成しないこと、又は本発明に従って処理された対象において存在しうる１以上の腫瘍が、大きさの点で増殖せず、又は癌性にならず又は転写しないということ、或いは本発明に従って処理される対象に存在する１以上の腫瘍がサイズを低減すること(好ましくは、少なくとも体積で２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、又は１００％分)、又は本発明に従って処理される対象において存在する１以上の腫瘍が根絶されることを意味すると意図される。腫瘍サイズは、現在利用できるＣＴスキャン及び腫瘍マーカーを通してモニターされうる。
【００８３】
本明細書に使用される「鉄-ラクトフェリン」及び「鉄飽和ラクトフェリン」という用語(又は、「ＦｅＬＦ」と呼ばれる)は、部分的又は完全に鉄飽和されたラクトフェリン・ポリペプチド又は機能バリアント又はそれらの断片であって、集合に存在する金属イオン結合性ポケットのうちの、少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９.５、９９.９又は１００％が、結合された鉄イオンを有する、鉄結合ポケットの集合を提供するものを指すと意図される。
【００８４】
「保持時間」という用語は、圧力が処理圧力で保持される時間である、好ましい実施態様を指す。例えば、１分の保持時間は、圧力が処理圧力に１分間保持されることを意味する。０分の保持時間は(つまり保持無し)は、圧力が処理圧力に上げられるが、保持されることはなく、そして次に周囲圧力(通常大気圧)に戻されることを意味する。この実施態様では、好ましい処理時間は、０(保持無し)、０.５、１、１.５、２、２.５、３、３.５、４、４.５、５、５.５、６、６.５、７、７.５、８、８.５、９、９.５及び１０分を含む。意図的に圧力が処理圧力で保持されないが、使用される装備の性質のため、かなり短い保持時間(おそらく数ミリ秒)が存在しうるということが理解されるべきである。当該かなり短い保持時間は、当該方法の実施に実質的に影響することはないであろう。
【００８５】
本明細書に使用される「保存性」という用語は、長い期間不所望の微生物の増殖に抵抗する組成物の能力を意味することを意図する。熱又は本明細書に提供される許容される代替方法で処理されていない組成物は、商業的に許容される保存性を有さないようである。保存性の維持についての言及は、本発明の方法が少なくとも、圧力処理された組成物の保存寿命を延長する点で、熱処理された対照と少なくとも同じくらい有効であることを意味することを目的とする。保存性の増大又は改善についての言及は、長期間にわたる不所望の微生物の増殖に抵抗する組成物の能力が、未処理組成物に比べて高められることを意味することを目的とする。高められた保存性は、好ましくは、例えば、温度変化に耐える高められた能力及び延長された保存期間などの性質を導く。温度変化(例えば、冷蔵貯蔵の停止)は、任意の残存細菌の増殖を誘導することができる。
【００８６】
好ましくは、保存性は好気性生菌数(ＡＰＣ)に準拠して評価される。ＡＰＣは、サンプル中の細菌密度を評価するために使用される細菌計数法であり、そして他に総生菌数(Total Plate Count)、標準生菌数(Standard Plate Count)、又は総生菌数(Total Viable Count)として知られている。サンプルを回収し、混合し、希釈し、そして試験される細菌(例えば、エシェリキア コリ(Escherichia Coli)、スタフィロコッカス アウレウス(Staphylococcus aureus)、サルモネラ(Salmonellae)、シゲラ(Shigellae)、大腸菌、酵母、及びカビ、中温性胞子、好熱性胞子などの食品又は乳製品汚染菌)を検出するために適した寒天培地に蒔いた。ＡＰＣ結果は、プレートに蒔かれ、そして３２℃で７２時間インキュベートされたサンプル１ｍｌあたりのコロニー形成ユニット数(ｃｆｕ/ｍｌ)である。５００００ｃｆｕ/ｍｌ以下のＡＰＣは、生菌培養物を含むように意図されない新鮮な乳製品にかなり好ましい。５００００ｃｆｕ/ｍｌ以上のＡＰＣを有する製品は、許容される保存性を有さないようであり、存在する生物が製品にとって特に適している生物でない限り(この製品の例として生菌培養物が所望されるヨーグルト又は製品が挙げられる)、５００００ｃｆｕ/ｍｌ以上のＡＰＣを有する製品は、許容される保存性を有さないようである。
【００８７】
従って、１の実施態様では、好ましい方法は、処理後の好気性生菌数(ＡＰＣ)が、１ｍｌあたり約１００,０００、７５,０００、５０,０００、２５,０００、１０,０００、５,０００、１,０００、１００、又は１０コロニー形成ユニット(ｃｆｕ/ｍｌ)以下である方法である。好ましくはＡＰＣは約５００００ｃｆｕ/ｍｌ未満である。
【００８８】
「ラクトフェリン」という用語は、任意の非グリコシル化又はグリコシル化野生型ラクトフェリンアミノ酸配列、例えば以下に記載される配列などの相同ラクトフェリン配列を指す。ラクトフェリン・ポリペプチドは、２個の金属イオン結合ポケットを有し、そしてラクトフェリン分子あたり２個の金属イオンの化学量論比で金属イオンに結合できる。１の金属イオン結合ポケットは、ラクトフェリンのＮ末端ローブ(ｌｏｂｅ)(Ｎ-ローブ)に存在し、そしてもう一方のポケットはＣ末端ローブ(Ｃ-ローブ)に存在する(Mooreら、1997)。ウシ及びヒトラクトランスフェリン(ラクトフェリン前駆体)、その中のラクトフェリン及びペプチドの検証済み配列は、Ｓｗｉｓｓ-Ｐｒｏｔにおいて見つけることができる(http://au.expasy.org/cgi-bin/sprot-search-ful)。指標となるラクトフェリン・ポリペプチドは、ウシ・ラクトトランスフェリン前駆体寄託番号Ｐ24627、ウシラクトフェリン、ヒトラクトトランスフェリン前駆体寄託番号Ｐ02788、及びヒトラクトフェリンを含む。
【００８９】
「金属イオン飽和」及び「金属イオン結合」という用語は、ラクトフェリン・ポリペプチド又は機能バリアント又はそれらの断片の鉄結合ポケットに金属イオンを結合することを意図する。
【００９０】
「金属イオンラクトフェリン」及び「金属イオン飽和ラクトフェリン」という用語は、金属イオン結合ポケットの集合を提供する部分的又は完全に金属イオン飽和されたラクトフェリン・ポリペプチドの集合であって、当該集合内に存在する少なくとも約５％、好ましくは少なくとも約２５％の金属イオン結合ポケットが、結合された金属イオンを有する前記集合を指すことを意図する。当該集合が、異なる種のポリペプチドを含みうるということが理解されるべきである；例えば、イオンを結合していない分子もあれば、１又は２個のイオンを結合する分子もある。異なる金属イオンが使用される場合、鉄イオンに結合する分子もあれば、異なるイオンに結合する分子があってもよい。
【００９１】
同様に、「金属イオンラクトフェリン断片」及び「金属イオン飽和ラクトフェリン断片」という用語は、金属イオン結合ポケットの集合を提供する部分的又は完全に金属イオンで飽和されたラクトフェリン・ポリペプチド断片であって、集合内に存在する少なくとも５％、好ましくは少なくとも２５％の金属イオン結合ポケットが、結合された金属イオンを有する断片を指すと意図される。
【００９２】
本発明は、部分的又は完全に金属イオンで飽和されたラクトフェリン・ポリペプチド及びラクトフェリン断片の混合物を使用してもよい。かかる実施態様では、金属イオン結合ポケットの集合が、全てのラクトフェリン・ポリペプチドの２個のポケット、並びに断片の性質に依存して全てのラクトフェリン断片について１又は２個のポケットから作成される。
【００９３】
飽和度は、分光光度分析により行われうる(Brock & Arzabe, 1976; Batesら、1967; Batesら、1973)。ラクトフェリン・ポリペプチド間における金属イオンの交換があることが理解されるべきである。金属イオン飽和ラクトフェリンは、任意の有用な方法により作成されてもよい。１の実施態様では、鉄飽和ラクトフェリンは、Lawら、(1997)の方法により行われてもよい。別の実施態様では、鉄飽和ラクトフェリンは、Kawakamiら(1993)の方法により調製されても良い。金属イオン飽和ラクトフェリンは、ラクトフェリン分子又はラクトフェリン断片上のＦｅ結合ポケット及び他の非特異的結合部位などの金属イオン結合ポケットを含むラクトフェリンの金属イオン結合部位に金属イオンを結合させる事により調製されてもよい。好ましい実施態様では、結合ポケットの間の金属イオン交換の間でない限り、金属イオンは金属イオン結合ポケットによってのみ結合され、そして非特異的結合はほとんど起こらないか全く生じない。
【００９４】
１の実施態様では、ラクトフェリン分子の集合に存在する少なくとも約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９.５、９９.９又は１００％の金属イオン結合ポケットが、結合された金属イオンを有し、そして有用な範囲は、上記値のいずれかの間から選ばれる(例えば、約５〜約１００％、約１０〜約１００％、約１５〜約１００％、約２０〜約１００％、約２５〜約１００％、約３０〜約１００％、約３５〜約１００％、約４０〜約１００％、約４５〜約１００％、約５０〜約１００％、約５５〜約１００％、約６０〜約１００％、約６５〜約１００％、約７０〜約１００％、約７５〜約１００％、約８０〜約１００％、約８５〜約１００％、約９０〜約１００％、約９５〜約１００％、及び約９９〜約１００％)。１の実施態様では、金属イオン飽和ラクトフェリンは過飽和されたラクトフェリンである。
【００９５】
「経口投与」という用語は、経口、経頬側、腸内、及び胃内投与を含む。
【００９６】
「配位金属イオン結合(oriented metal ion binding)」及び「配位鉄結合」は、金属イオン(例えば鉄)が鉄結合ポケットに正確に配位され、ポケット内に部分的に結合されることはなく、又は非特異的に表面に結合されることがない場合、ラクトフェリン又は機能断片による金属イオン結合の立体特異的な性質を指す。完全な配位を伴うことなく金属イオンが鉄結合ポケットに結合される条件が存在し、そしてこれはスペクトル性質において示されてもよい。配位された鉄結合は、４６５ｎｍで単一の鉄ラクトフェリン最大値を有するＵＶ-ＶＩＳスペクトルにより示される。１の実施態様では、配位された金属イオン結合が好ましい。別の実施態様では配位されていない金属イオン結合が許容される。
【００９７】
「非経口投与」という用語は、非限定的に局所(例えば、任意の皮膚、上皮、又は粘膜表面への投与)、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、及び腫瘍内(例えば、腫瘍への直接投与)投与を含む。
【００９８】
「医薬として許容される担体」という用語は、非限定的に本発明の組成物の成分として対象に投与できる賦形剤、希釈剤、又は補助剤を含む担体を指すように意図される。好ましい担体は、組成物の活性を低減することなく、そしてラクトフェリン・ポリペプチド又は機能バリアント又はそれらの断片の有効量をデリバリーするために十分な容量で投与される場合、毒性ではない。製剤は、経口、鼻腔内、又は非経口で投与することができる。
【００９９】
「圧力処理」と言う用語は、超高圧(ＵＨＰ)処理を指す。このような処理は、少なくとも１００ＭＰａの圧力を用いると一般的に認められる。これは、「高圧」処理、「高静水圧(ＨＨＰ)」又は「高圧処理(ＨＰＰ)」として知られている。「圧力処理」された製品は、ＵＨＰ処理、つまり少なくとも１００ＭＰａの圧力での圧力処理、少なくとも約３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、又は８００ＭＰａ(又は、その他には上記範囲内)にかけられた製品である。
【０１００】
金属イオン飽和又は金属イオン結合の「所望のレベル」の保持についての言及は、組成物が本明細書に記載される方法に従って処理される場合に、ラクトフェリン・ポリペプチド又は機能バリアント又はそれらの断片の金属イオン飽和レベルが、実質的に低減されないことを意味することを意図する。好ましくは、処理の後の金属イオン飽和のレベルは、処理前の少なくとも約４０％の金属イオン飽和レベルである。これは、好ましくはラクトフェリン・ポリペプチド又はバリアント又はそれらの断片により結合される金属イオンの少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、又は１００％が保持される。例えば、１００％の金属イオン飽和ラクトフェリンを含む組成物では、好ましくは金属イオン飽和のレベルは、処理後に少なくとも４０％であり、好ましくは少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９９、又は１００％であり、そして好ましい範囲は、これらの値のいずれかの間から選ばれる(例えば、約４０〜１００％、約４５〜１００％、約５０〜１００％、約５５〜１００％、約６０〜１００％、約６５〜１００％、約７０〜１００％、約７５〜１００％、約８０〜１００％、約８５〜１００％、約９０〜１００％、約９５〜１００％、及び約９９〜１００％)。
【０１０１】
「対象」という用語は、動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくは哺乳動物コンパニオン動物又はヒトを指すように意図される。好ましいコンパニオン動物は、ネコ、イヌ、及びウマを含む。
【０１０２】
「過飽和ラクトフェリン」という用語は、十分な金属イオンが１００％の結合ポケットを満たし、そして更なる金属イオンが存在し、そしてラクトフェリン・ポリペプチド又はラクトフェリン断片の非特異結合部位により結合されている金属イオン結合ポケットの集合を提供するラクトフェリン・ポリペプチド又は機能断片の集合を指す。言い換えると、化学量論的に過剰量の金属イオンが提供される。好ましくは、結合ポケット間、非特異的結合部位間、そして結合ポケットと比特異的結合部位との間での金属イオンの交換が生じうるが、遊離金属イオンは、過飽和ラクトフェリンを含む本発明の組成物に存在しない。好ましくは、過飽和ラクトフェリンは、不溶性の凝集体を形成しない。１の実施態様では、過飽和ラクトフェリンは、少なくとも約１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５又は２００％の金属イオン飽和であり、好ましくは鉄飽和される。
【０１０３】
「治療」という用語及びその変化形は、最も広い起こりうる文脈で解釈すべきである。当該用語は、対象が完全に回復するまで治療されるということを暗示するように解釈されるべきではない。従って、「治療」は、症状の開始又は特定の病気の重篤度を軽減及び/又は予防することを広く含む。「治療」という用語は、感受性の個人について良好な健康状態の維持、及び疾患予防のための体力を作ることも広く含む。
【０１０４】
「不所望の微生物」という用語は、圧力処理前に組成物中で増殖しうる全ての微生物を指す。そのような増殖が不所望である一方、増殖しない状態の微生物、例えば非生存、弱毒化、又は死滅微生物、は重要でないこともあるし、又は所望されることもある。
【０１０５】
不所望の微生物の増殖抑制についての言及は、細菌(プロバイオティック細菌)、真菌、カビ、酵母、及び藻類などの微生物の増殖が実質的に低減、遅延、又は除去されるということを意味することを意図する。当該微生物は、必ずしも腐敗の原因であるか、又は病原性である必要はない。不所望の微生物の増殖は、視覚検査により、又は当該技術分野に知られている標準技術、例えば非限定的に顕微鏡、染色、ＰＣＲ、セルソーティングなど(Lundら、2000を参照のこと)、を用いることにより評価することができる。好ましくは、圧力処理後の組成物のＡＰＣは、約１００,０００、７５,０００、５０,０００、２５,０００、１０,０００、５,０００、１,０００、１００、又は１０ｃｆｕ／ｍｌに等しいか又はそれ未満であり、好ましくは約５０,０００ｃｆｕ／ｍｌ未満である。
【０１０６】
上に記載される様に、熱処理又は圧力処理されない組成物は、市販の許容される保存性を有さないようである。つまり、未処理組成物の保存性は、不所望の微生物の増殖を抑制するために行われるステップがないので、通常許容されるものではない。このようなステップが行われる場合、保存性が改良されよう。約１００,０００、７５,０００、５０,０００、２５,０００、１０,０００、５,０００、１,０００、１００、又は１０コロニー形成ユニット/ｍｌ（ｃｆｕ／ｍｌ）に等しいか又はそれ未満であり、好ましくは約５０,０００ｃｆｕ／ｍｌ未満である処理後の好気性プレートカウント(ＡＰＣ)が、任意の生物の保存性に影響を示す能力を低減、遅延、又は除去するであろう。低ｐＨ又は冷却(約１０℃未満、好ましくは約４℃未満の温度での貯蔵)又はその両方と組み合わせると、保存性に影響する生物の能力は、さらに低減、遅延、又は除去されよう。
【０１０７】
プロバイオティック微生物を用いる実施態様では、プロバイオティック微生物の増殖は所望されないが、プロバイオティック微生物の存在は所望される。従って、その様な実施態様において不所望な微生物の増殖を抑制することについての言及は、プロバイオティック微生物の増殖が実質的に低減、遅延、又は除外されるということを意味するように意図される。好ましくは、圧力処理は、少なくとも所望のレベルのプロバイオティック活性を保持する一方、プロバイオティック微生物を弱毒化するか、より好ましくはプロバイオティック微生物を殺菌する。
【０１０８】
１の実施態様では、プロバイオティック微生物は、不活性プロバイオティック微生物であり、少なくとも所望のレベルのプロバイオティック活性を保持する。不活性プロバイオティック微生物は、非生存性であるか、非生存であるが代謝的に活性であるか、又は死滅していてもよく、全ての場合で少なくとも所望レベルのプロバイオティック活性を保持する。
【０１０９】
別の実施態様では、プロバイオティック微生物は、圧力処理前に不活性なプロバイオティック微生物である。当該実施態様における圧力処理は、存在するプロバイオティック因子のプロバイオティック活性を維持する一方、他の不所望な微生物の増殖を抑制する。
【０１１０】
「バリアント」という用語は、天然(例えば、対立遺伝子バリアント)又は非天然(例えば、人工的に作製された突然変異体)ラクトフェリン ポリペプチド又はラクトフェリン断片であって、所定の種(例えば以下に記載される)のラクトフェリン・ポリペプチドの主な野生型アミノ酸配列から、１以上のアミノ酸の添加、欠失、又は置換により変化されたものを指す。
【０１１１】
一般的に、ポリペプチド配列バリアントは、以下の例に従ってアッセイされる場合、一般に定量的生物活性を所持する。さらに、これらのポリペプチド配列バリアントは、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を共有してもよい。ラクトフェリン・ポリペプチドのホモログも「バリアント」という用語の意味に含まれる。ホモログは、典型的に異なる種からのポリペプチドであるが、本明細書に開示される対応するポリペプチドと実質的に同じ生物学的機能又は活性を共有する。
【０１１２】
好ましいバリアント・ポリペプチドは、好ましくはウシ又はヒトラクトフェリンに対し少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５、又は９９％の同一性を有し、好ましくは少なくとも約９０、９５、又は９９％の同一性を有する。バリアント断片は、好ましくは本明細書に記載される断片に少なくとも約７０、７５、８０、８５、９０、９５又は９９％の同一性を有し、好ましくは少なくとも９０、９５、又は９９％の同一性を有し、非限定的にヒト又はウシラクトフェリンの断片を含む。同一性は、候補アミノ酸配列を、
ＢＬＡＳＴ Ｓｕｉｔｅのプラグラム(バージョン２.２.１２；2005年8月28日)(Tatusovaら、(1999)；McGinnisら、(2004))を用いて候補アミノ酸配列を本明細書に記載される配列、例えばラクトフェリン・ポリペプチド又はそれらの断片、と比較することにより、決定することができる。当該プログラムはＮＣＢＩから公的に利用できる(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/)。
【０１１３】
その生物学的活性を有意に変えることなくラクトフェリン・ポリペプチド配列の１又は幾つかのアミノ酸を保存的に置換することもまた有用である。当業者は、表現形としてサイレントなアミノ酸置換体を作製する方法を知っているであろう(例えば、Bowieら、(1990)を参照のこと)。
【０１１４】
２.ラクトフェリン・ポリペプチド
上で記載された有用なラクトフェリン・ポリペプチド及び断片に加えて、報告されそして本発明の方法において有用であるラクトフェリンアミノ酸及びｍＲＮＡ配列の例として、非限定的にヒトのラクトフェリンのアミノ酸配列(受託番号NP 002334)及びｍＲＮＡ配列(受託番号ＮＰ002343)；ウシのラクトフェリンのアミノ酸配列(受託番号NP 851341及びCAA38572)及びｍＲＮＡ配列(受託番号X54801及びNM 180998)；ヤギのラクトフェリンのアミノ酸配列(受託番号JC2323、CAA55517及びAAA97958)及びｍＲＮＡ配列(受託番号 U53857)；ウマのラクトフェリンのアミノ酸配列(受託番号 CAA09407)及びｍＲＮＡ配列(受託番号 AJ 010930)；ブタのラクトフェリンアミノ酸配列(受託番号 NP 999527、AAL40161、及びAAP70487)及びｍＲＮＡ配列(受託番号 NM 214362);マウスのラクトフェリンのアミノ酸配列(受託番号 NP 032548)及びｍＲＮＡ配列(受託番号 NM 008522)；水牛のラクトフェリンのアミノ酸配列(受託番号 CAA06441)及びｍＲＮＡ配列(受託番号 AJ005203)；ラクダのラクトフェリンのアミノ酸配列(受託番号 CAB53387)及びｍＲＮＡ配列(受託番号 AJ131674)が挙げられる。これらの配列は、本発明に従って、野生型又はバリアントフォームにおいて使用されてもよい。これらの配列によりコードされるポリペプチドは、既知の技術を用いて、天然ソースから単離されてもよいし、組み換えタンパク質として産生されてもよいし、又は有機合成により産生されてもよい。
【０１１５】
有用なポリペプチド及びバリアントを作成する方法は、当該技術分野において知られており、そして以下に記載されている。有用な組換えラクトフェリン・ポリペプチド及び断片、並びにそれらを産生する方法は、米国特許明細書US 5,571,691号、US 5,571,697号、US 5,571,896号、US 5,766,939号、US 5,849,881号、US 5,849,885号、US 5,861,491号、US 5,919,913号、US 5,955,316号、US 6,066,469号、US 6,080,599号、US 6,100,054号、US 6,111,081号、US 6,228,614号、US 6,277,817号、US 6,333,311号、US 6,455,687号、US 6,569,831号、US 6,635,447号、US 2005-0064546号及びUS 2005-0114911号において報告される。
【０１１６】
有用なバリアントは、ウシラクトフェリンバリアントｂＬｆ-ａ及びｂＬｆ-ｂを含む(Tsujiら、(1989); Yoshidaら、(1991))。さらに有用なバリアントは、ラクトフェリンのグリコシル化及び非グリコシル化形態を含み(Pierceら、(1991); Metz-Boutigueら、(1984); van Veenら、(2004))、そしてグリコシル化突然変異体を含む(グリコシル化の異なる点又は異なるグリコシル側鎖を有する)。
【０１１７】
有用な断片は、Ｎ-ローブ及びＣ-ローブ断片(Bakerら、2002)及びラクトフェリン結合ポケットを保持する他のラクトフェリン・ポリペプチド、例えば切り詰め型ラクトフェリン・ポリペプチドを含む。
【０１１８】
有用な切り詰め型ラクトフェリン・ポリペプチドは、約１〜約３００アミノ酸、好ましくは約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５又は３００アミノ酸又はそれより多くだけ切り詰められたポリペプチドを含み、そしてＮ末端、Ｃ末端、又はＮ末端及びＣ末端の両方で切り詰められたポリペプチドを含む。但し、切り詰め型ポリペプチドは、Ｎローブ又はＣローブの金属イオン結合ポケットのうちの少なくとも１を保持する。ウシラクトフェリンのＡｓｐ６０、Ｔｙｒ９２、Ｔｙｒ１９２、Ｈｉｓ２５３残基は、Ｎ-ローブ内のアミノ酸金属イオンリガンドである。ウシラクトフェリンのＡｓｐ３９５、Ｔｙｒ４３３、Ｔｙｒ５２６、Ｈｉｓ５９５残基は、Ｃローブにおけるアミノ酸金属イオンリガンドである(Karthikeyanら、1999)。これらの残基を含む任意の断片は、金属イオン結合ポケットを形成することができることもある。
【０１１９】
本発明に従って使用するための候補バリアント又はラクトフェリン断片は、野生型タンパク質を突然変異させる技術(Sambrookら、(1998)、及びこのような技術についての記載を参照のこと)、例えば非限定的に野生型ラクトフェリンの部位特異的突然変異誘導、及び得られたポリヌクレオチドの発現を含む技術；ランダム又は選択されたプライマーのプールを用いてＰＣＲなどの発現可能なポリヌクレオチド断片を作成する技術；野生型又はバリアントのラクトフェリンポリペプチドの完全又は部分的なタンパク質分解又は加水分解の技術；及びポリペプチドの化学合成の技術により作成されてもよい。ラクトフェリンのバリアント又は断片は、ラクトフェリンＤＮＡ又はＲＮＡ、又はそのバリアント若しくは断片からの組換え分子としての発現により調製されてもよい。ラクトフェリンのバリアント又は断片をコードする核酸配列は、細胞内に適切な発現ベクターを挿入してもよく、真核細胞、例えば非限定的にアスペルギルス、或いは細菌細胞、例えば非限定的に大腸菌、を含む。ラクトフェリン・バリアント又は断片は、既知のＰＣＲ技術、例えば非限定的に、誤りを引き起こしやすいＰＣＲ(error-prone PCR)及びＤＮＡシャッフリングを用いて調製してもよい。誤りを引き起こしやすいＰＣＲは、ＤＮＡポリメラーゼの複製フィデリティが低い条件下でＰＣＲを行う方法であり、その結果高率の点突然変異がＰＣＲ産物の全長に渡り得られる(Leungら、(1989)；Cadwellら(1992))。ＤＮＡシャッフリングは、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて異なるが高度に相関しているＤＮＡ配列のＤＮＡ分子間で強制相同組換えをすることを指す(Stemmer(1994))。強制相同組換えは、配列ホモロジーに基づいてＤＮＡ分子のランダム断片化に続いて、ＰＣＲ反応におけるプライマー伸張によりクロスオーバーを固定することにより行われる。このような方法において使用するための適切なラクトフェリン核酸配列は、上で記載される方法を含み、又は例えば、組織ＲＮＡの単離体の逆転写ＰＣＲ(ＲＴ-ＰＣＲ)を含む既知の方法により作成されても良い。ＲＴ-ＰＣＲに対する適切なプライマーは、上で記載されるｍＲＮＡに関して設計されてもよい。市販のキットは、ＲＴ-ＰＣＲに利用できる(例えば、AmbionからのCell-to-cDNA(商標)キット、USA)。
【０１２０】
ラクトフェリンのバリアント又は断片は、既知の合成方法により作成されても良い(例えば、Kimmerlinら、2005を参照のこと)。或いは、ラクトフェリン・ポリペプチド又は機能バリアント、又はそれらの断片は、Viejo-Diazら(2003)によりヒトカリオシン-１及びラクトフェリン由来ペプチドについて、及びNguyenら(2005)により記載されるウシのラクトフェリシン・ペプチドについて；及び van der Kraanら、(2004)により記載されるラクトフェランピン及び短い断片について記載された確立済みの合成Ｆｍｏｃ化学反応により製造することができる。
【０１２１】
ラクトフェリンの金属イオン結合性バリアント又は断片は、金属結合性ポリペプチドを単離するための既知の技術、例えば非限定的に金属アフィニティークロマトグラフィー、により得られてもよい。ラクトフェリンの候補バリアント又は断片は、遊離又は固定された金属イオン、例えばＦｅ3+で接触されてもよいし、そして適切な様式で生成されても良い。例えば、候補バリアント又は断片は、イミノ二酢酸又はトリス(カルボキシメチル)エチレンジアミン・リガンドを含むクロマトグラフィーマトリックスへのキレート化により固定される金属イオンと中性ｐＨで接触されてもよい。結合されたバリアント又は断片は、支持マトリックスから溶出されても良く、そして使用される緩衝液のｐＨ及びイオン強度を低減することにより回収されうる。金属結合性バリアント又は断片は、本明細書に記載される方法に従って製造されてもよい。
【０１２２】
ラクトフェリンの機能バリアント、断片、及び加水分解物は、ラクトフェリンのバリアント、断片、及び加水分解物を選択することにより、そして所望される効果を試験するために選ばれる効力アッセイを評価することにより得られてもよい。
【０１２３】
１の実施態様では、ラクトフェリンは、非限定的にヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ、又はヒトのラクトフェリンを含む任意の哺乳動物ラクトフェリンである。好ましくはラクトフェリンはウシラクトフェリンである。
【０１２４】
別の実施態様では、ラクトフェリンは、非限定的にヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ、又はヒトの組換えラクトフェリンを含む、任意の哺乳動物組換えラクトフェリンである。好ましくは、ラクトフェリンは、組換えウシラクトフェリンである。組換えラクトフェリンは、無細胞発現系において、又はトランスジェニック動物、植物、真菌、又は細菌、或いは他の有用な種において発現させることにより産生されてもよい。或いは、ラクトフェリンは、既知の有機合成法を用いて製造されても良い。
【０１２５】
さらに別の実施態様では、ラクトフェリンは乳汁、好ましくはヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ、又はヒトの乳汁から単離される。好ましくは、カチオン交換クロマトグラフィーの次に限外ろ過及び膜分離法を行うことにより乳汁から単離される。
【０１２６】
３.乳汁からのラクトフェリンの単離
以下の記載は牛乳からラクトフェリンを単離する代表的な方法である。
【０１２７】
新鮮な脱脂乳(７Ｌ、ｐＨ６.５)を、ミリＱ水で平衡化したＳ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗの３００ｍｌカラムに５ｍｌ/分の流速で４℃で通す。未結合のタンパク質を２.５ベッド体積の水で洗浄しそして結合したタンパク質を、各々約２.５ベッド体積の０.１Ｍ、０.３５Ｍ、及び１.０Ｍ塩化ナトリウムで段階的に溶出する。１Ｍ塩化ナトリウム中にかすかなピンク色のバンドとして溶出するラクトフェリンを１画分として回収し、そしてミリＱ水に対して透析し、次に凍結乾燥した。凍結乾燥された粉末を２５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.５中に溶解し、そして３ｍｌ/分の流速で上記緩衝液中に１Ｍの塩化ナトリウム勾配で、Ｓ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ上のクロマトグラフィーにかけた。ゲル電気泳動及び逆層ＨＰＬＣにより測定された際に、十分な純度のラクトフェリンを含有する画分が混合され、透析され、そして凍結乾燥される。ラクトフェリンの最終的な純度は、０.１５Ｍ塩化カリウムを含有する８０ｍＭリン酸二カリウム、ｐＨ８.６中のＳｅｐｈａｃｒｙｌ３００上でゲルろ過により達成される。選択された画分を混合し、ミリＱ水に対して透析し、そして凍結乾燥する。調製品の純度は、ＨＰＬＣにより示される場合９５％超であり、そしてラクトフェリンの鉄飽和形態について〜１９又はそれ未満のスペクトル比(２８０ｎｍ／４６５ｎｍ)である。
【０１２８】
４.ラクトフェリンの金属イオン飽和又は欠乏
鉄飽和は、２：１モル過剰量の５ｍＭ鉄ニトリロ三酢酸(Foley及びBates(1987))を、１０ｍＭ炭酸水素ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス、ｐＨ７.８中に溶解された１％の精製ラクトフェリン溶液に加えることにより達成される。過剰量の鉄ニトリロ三酢酸を１００体積のミリＱ水に対して、全体で２０時間、４℃で透析することにより取り除く(２回交換する)。鉄充填(ハロ-)ラクトフェリンは凍結乾燥されてもよい。鉄飽和の様々な程度は、少ない金属イオンドナーを提供することにより得られてもよい。
【０１２９】
鉄除去(アポ-)ラクトフェリンは、高度に精製されたラクトフェリンサンプルの１％水溶液を、３０体積の５００ｍｇ/ＬのＥＤＴＡ二ナトリウムを含む０.１Ｍクエン酸、ｐＨ２.３に対して透析することにより調製される(Masson 及びHeremans(1966)。クエン酸及びＥＤＴＡを次に、３０体積のミリＱ水に対して透析することにより取り除き(１回交換する)、そして得られた無色の溶液を凍結乾燥してもよい。
【０１３０】
ラクトフェリン・ポリペプチドは、(天然ラクトフェリン・ポリペプチドと同様に)鉄イオンを含むことができ、又は非鉄金属イオン(例えば、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、マンガンイオン、亜鉛イオン、又はマグネシウムイオン)を含むことができる。例えば、牛乳から単離されるラクトフェリンは、鉄を除去することができ、次に別のタイプの金属イオンを充填できる。例えば、銅充填は、上で記載された鉄充填と同じ方法に従って達成することができる。他の金属イオンを有する充填ラクトフェリンについて、Ainscoughら(1979)の方法を使用することができる。
【０１３１】
１の実施態様では、金属イオンは、アルミニウム、カルシウム、銅、クロム、コバルト、金、鉄、マンガン、マグネシウム、白金、ルテニウム、セレン、又は亜鉛イオンから選ばれるイオンであるか、又はそれらの混合物である。好ましくは金属イオンは鉄イオンである。
【０１３２】
本発明に従って使用するための組成物の調製品では、ラクトフェリン・ポリペプチド又は金属イオン結合ラクトフェリン断片は、１種又は異なる種から構成されうる。例えば、ポリペプチド又は断片は、各々異なる数の金属イオン又は異なる種の金属イオンを含むことができ；或いはポリペプチドの長さは様々であり、例えば全長ポリペプチドのものもあれば、断片のものもあり、そして断片は、各々全長ポリペプチドの特定の部分を示すこともある。このような調製品は、天然ソースから得ることもできるし、又は異なるラクトフェリン・ポリペプチド種を混合することにより得ることもできる。例えば、異なる長さのラクトフェリン・ポリペプチドの混合物は、全長ラクトフェリン・ポリペプチドの(完全又は部分的な)プロテイナーゼ切断により調製することができる。切断の程度は、当該技術分野に知られた方法に従って、例えば、プロテイナーゼの量又はインキュベート時間を操作することにより制御することができ、そして以下に記載される。全長切断は、全長ラクトフェリン・ポリペプチドの様々な断片の混合物を産生し；部分的な切断は、全長ラクトフェリン・ポリペプチド及び様々な断片の混合物を産生する。
【０１３３】
５.ラクトフェリン断片又はラクトフェリン加水分解物の調製
候補機能断片を含有する加水分解物は、既知の切断特異性を有する適切な酵素、例えばトリプシン又はキモトリプシン、を選択することにより、そしてｐＨ、温度、インキュベート時間及び酵素対基質比によりタンパク質分解を調節/制御することにより製造することができる。そのような単離されたポリペプチドの精練は、特異的エンドペプチダーゼを用いて行うことができる。一例として、ウシのラクトフェリシンは、ウシラクトフェリンをｐＨ２.０で４５分間３７℃でペプシンを用いて(Facon & Sura, 1996)、又はｐＨ２.５にて３７℃で４時間、３％(基質のｗ/ｗ)の酵素を用いて(Tomitaら、1994)、ウシのラクトフェリンを切断することにより産生することができる。ペプチドは、逆層ＨＰＬＣ(Tomitaら、1994)又は疎水性相互作用クロマトグラフィー(Tomitaら、2002)により単離することができる。
【０１３４】
或いは、ラクトフェリンペプチドは、Viejo-Diazら(2003)によりヒトカリオシン-１及びラクトフェリシン由来ペプチドについて記載され、Ngyuyenら(2005)により記載されるようにウシのラクトフェリシンについて記載され、そしてvan der Kraanら(2004)によりラクトフェランピン及び短い断片について記載されるように、確立された合成Ｆｍｏｃ化学反応により産生することができる。
【０１３５】
一般的に、ＳＤＳ-ＰＡＧＥは、加水分解産物を標準分子量に比較することにより、加水分解の程度を見積もるために使用されてもよい。サイズ排除クロマトグラフィーは、加水分解産物内で様々な種を分離するために使用されてもよく、そして分子量分布プロファイルを見積もるために使用されてもよい。
【０１３６】
好ましい加水分解法では、ウシのラクトフェリンを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８.０、５ｍＭ ＣａＣｌ2中に２０ｍｇ/ｍｌに溶解した。トリプシン(Sigma T8642,TPCK処理、XII型ウシ膵臓由来、１１７００Ｕ/ｍｇタンパク質)を１：５０ｗ/ｗの酵素基質比で加え、そして混合物を２５℃で３時間インキュベートした。反応をＰＭＳＦを添加することにより止めて、１ｍＭの終濃度にし、切断の程度をＳＤＳ-ＰＡＧＥによりモニターした。トリプシン切断物(４ｍｌ)を、５０ｍM Ｔｒｉｓ、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８.０を含むＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００(Amersham GE)(９０ｃｍ×２.６ｃｍカラム)上でゲルろ過にかけた。ウシラクトフェリンの主要な断片を含む適切な画分(Legrandら、1984)を次に、リン酸ナトリウム緩衝液ｐＨ６.５及び１Ｍ ＮａＣｌへの塩勾配を用いてＳ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ｆａｓｔ Ｆｌｏｗ(Ａｍｅｒｓｈａｍ ＧＥ)(１５ｃｍ×１.６ｃｍカラム)上のカチオン交換クロマトグラフィーにかけられた。Ｃローブ及びＮ+Ｃローブの最終的な分離を、１０％ｖ/ｖ酢酸を溶出剤として用いることを除いて上の記載と同様にＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ３００上でさらにゲルろ過することにより達成した(Mataら、1994)。(ミリQ水に対して)透析され、そして凍結乾燥された断片の同一性は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ及びエドマンＮ末端配列決定により確認した。
【０１３７】
別の方法では、上で記載されるトリプシン切断物は、Supertiら、(2001)と同様にＶｙｄａｃ Ｃ１８カラム上でのＲＰ-ＨＰＬＣにより分離され、そしてＣ-ローブ及びＮ-ローブに対応する高質量断片を回収した。ＭＡＬＤＩ ＭＳにより同一性を確認した。
【０１３８】
１の実施態様では、本明細書に有用な加水分解産物は、１以上の金属イオン結合性断片を含む。
【０１３９】
６.金属イオン飽和ラクトフェリンの圧力処理
本発明者は、少なくとも所望されるレベルの金属イオン結合を維持する一方、商業的に有用な保存性を達成する条件下で金属イオンラクトフェリンを含む組成物又は製品を圧力処理することが可能であるということを示した。
【０１４０】
本発明者は、商業的に鉄充填ラクトフェリン溶液を滅菌し又は保存性を延長するために高圧を使用することは、処理ｐＨでタンパク質に特異的に結合する鉄の保持を可能にするといことを発見した。圧力処理は、タンパク質構造に一般的にほとんど損傷を与えることはなく、そうしてラクトフェリンの鉄結合能力(及びその鉄に再結合できる能力)は、相対的に損なわれることはない。
【０１４１】
以下に記載される実施例は、圧力処理が、約１５％及び約１００％の鉄飽和されるラクトフェリンの鉄結合について、熱処理よりもずっと少ない影響しか与えないことを示す。評価された条件は、商業的に有用な圧力及び熱処理について許容された条件であり；つまり、滅菌又は保存性の改善について認められそして許容される条件である。
【０１４２】
完全又は部分的に鉄飽和されたラクトフェリンは、鉄欠損貧血症(Bethell＆Huang,2004；Huangら2004)、妊娠に付随する鉄欠損症(Valentiら、2005)を治療するように提案され、そして貧血患者においてヘモグロビン数を増大させる薬剤として提案された。食事としての鉄の摂取量の低下と、閉経女性における骨ミネラル密度の低下との間に関連があるようであるので(Medeirosら、2002)、そしてラクトフェリンは骨同化剤であるとしめされたので(Cornishら、2004)、鉄充填形態は、骨粗鬆症などの骨障害の治療に有用でありうる。さらに、ヒト及びウシラクトフェリンの鉄充填形態が、細胞培養において腸細胞株を増殖させるので、鉄ラクトフェリンは、吸収不良に対する腸の再生治療において適用を有しうる(Oguchiら、1995)。
【０１４３】
幾つかの特許明細書は、飲料、食品、及び食料の鉄添加のために、 (例えば、Sakuraiら、2000；Dugasら、2001；Dousakoら、1991；Tomitaら、1992；及びTanakaら、1991を参照のこと)、そして医薬として使用するために(Nitsche、1991を参照のこと)、鉄飽和ラクトフェリンを用いることを報告した。
【０１４４】
鉄-ラクトフェリンと同様に、他の金属イオンの使用も有利なものであっても良い。例えば、クロム-ラクトフェリンが報告され(Ainscoughら、1979)、クロム-ラクトフェリンを糖尿病に付随する症状を軽減する治療薬として使用することが報告される(Chiang & Mao, 2002)。
【０１４５】
１の実施態様では、本発明に記載される処理は、(不所望の微生物の増殖を除去することにより)金属イオンラクトフェリン組成物であって、組成物又は製品のｐＨが約３.０〜８.０、好ましくはｐＨ４.６と同等又はそれ未満である組成物を商業的に滅菌するために高圧を使用することを許容する。
【０１４６】
別の実施態様では、本発明に記載される処理は、(実質的に不所望の微生物の増殖を低減又は遅延することにより)金属イオンラクトフェリン組成物であって、当該組成物又は製品のｐＨが約ｐＨ３.０〜８.０であり、好ましくはｐＨ４.６と同等又はそれより高く、或いは中性ｐＨである組成物の保存性を延長するために、高圧力を使用することを許容する。
【０１４７】
さらに別の実施態様では、適切なｐＨと二酸化炭素の組み合わせを用いて、ｐＨ３.０〜８.０の範囲に選択されたｐＨで金属イオンラクトフェリンを含有する組成物又は製品の保存性を改善すること、又は市販の滅菌性を達成することは可能であろう。ｐＨと組み合わせた二酸化炭素は、低ｐＨでの影響に等しい影響(つまり、有効な増殖抑制及び所望レベルの金属イオン結合の維持)を与えうる。商業的な滅菌性又は改善された保存性は、二酸化炭素及びｐＨ調節の使用(例えば炭酸付加飲料)を通して得られても良い。
【０１４８】
一例として、本発明に従って処理された組成物又は製品は、圧力処理製品又は成分中でデリバリーされてもよく、実質的に熱処理されていない製品又は成分に加えられてもよく、又は実質的に圧力処理される製品又は成分に加えられてもよい。
【０１４９】
従って、本発明は、上に記載されるラクトフェリン含有組成物及び製品を処理又は産生する方法に関する。
【０１５０】
制限することを意図せず、本発明に記載される方法において有用な圧力処理は以下のステップ：
(ｉ)  圧力容器のチャンバー内に圧力処理される組成物又は製品を配置し、そしてチャンバーを密封し；
(ｉｉ)  当該チャンバー内の圧力を予め設定された圧力(つまり処理圧力)へと上昇させ；
(ｉｉｉ)  当該チャンバーを予め決められた時間であって、１分未満である時間(保持時間)の間当該圧力に保持し、
(ｉｖ)  当該チャンバーから圧力を解放し；そして
(ｖ)  圧力処理された組成物又は製品を取り出す
を含む。
【０１５１】
バッチ又は連続処理装置を用いて、そのようなプロトコルを続けてもよい。
【０１５２】
処理の間に当該組成物又は製品において圧力処理が、温度変動をもたらしうるということが理解されるべきである。その様なものとして、圧力処理の間の好ましい温度に対する記載が、圧力が上昇する前の組成物又は製品の温度を指す。
【０１５３】
本発明に記載される適切な処理圧力を同定する１の方法は、組成物又は製品を選択し、そして不所望の微生物を制御するために適切な処理圧力にそれらをかけることである。適切な処理圧力は、少なくとも約１００ＭＰａの圧力である。必要に応じて、組成物又は製品は、評価の目的のために不所望な生物を植菌されてもよい。
【０１５４】
本発明に記載される適切な処理圧力を同定する別の方法は、組成物又は製品を選択し、そしてそれらをラクトフェリン又は機能バリアント又はそれらの断片の金属イオン結合性に実質的に影響しない処理圧力にかけることである。
【０１５５】
不所望の微生物の増殖又はラクトフェリンの金属イオン結合性、又はその両方は、本明細書に記載されるように評価されても良い。例えば、微生物増殖の評価方法についてはLundら、(2000)を参照のこと。
【０１５６】
７.乳製品及び成分
本発明の組成物又は製品は、乳製品又は成分であってもよいし、又は乳製品又は成分を含んでもよい。
【０１５７】
乳汁は、新生児の完全な栄養源であるばかりでなく、生理学的に生物活性の成分の豊富なソースを提供し、そしてその様なものとして、「天然医薬品」とも呼ばれてきた。完全な栄養を提供することに加えて、乳汁は、乳児の発達、予防、及び回復において欠かせない役割を有する。健常な成人は、乳汁の栄養的な利得のみを通常必要とするが、慢性的な病気状態において、乳汁から得られる生物活性は、病気の予防及び治療の両方の点で多くを提供する。好ましくは、乳汁は、ヒツジ、ヤギ、ブタ、マウス、水牛、ラクダ、ヤク、ウマ、ロバ、ラマ、ウシ又はヒトの乳汁であり、そして最も好ましくはウシの乳汁である。乳製品は、免疫刺激性であると知られている。
【０１５８】
初乳は、標準の乳汁生産が始まるまえに産後即座に産生されるプレミルク(pre-milk)である。ウシの初期の初乳は分娩後最初の６時間で得られるが、初乳は分娩後最初の２日以内に回収されうる。初期の初乳は、典型的に２倍を越える乳固形分を含み、そして約４８時間後に得られる同じウシからの乳汁において見られるタンパク質の４倍を超えるタンパク質が見られる。消化酵素、免疫グロブリン(ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ)、サイトカイン、インターフェロン、成長因子、糖タンパク質、プロリンリッチペプチド、及びビタミンＡ、Ｄ、Ｅ、及びＫの濃度は全て、標準乳汁に比べて初期初乳において高い。初乳タンパク質濃縮物(ＭＰＣ)及び初乳乳清タンパク質濃縮物(ＷＰＣ)は、Elfstrandら、2002により記載されるように調製されてもよい。
【０１５９】
乳汁及び初乳誘導体及びそれらの製造法は、当該技術分野において知られている。このような誘導体は、一般的に、組合わせ遠心(combination centrifugation)(脂肪の除去のため)、カゼイン沈澱(酸又は酵素を用いる)、ろ過(ラクトース、ミネラル、及び水の除去又は場合によりタンパク質の除去のため)、クロマトグラフィー(タンパク質成分の生成のため)により一般的に得られ、そして還元又は新鮮な全乳、還元又は新鮮な脱脂乳、還元全乳又は脱脂乳粉末、濃縮脱脂乳、脱脂乳単離体、全乳又は脱脂乳粉末、脱脂乳濃縮物、濃縮乳、バターミルク、限外濾過濃縮乳、乳タンパク質濃縮物(ＭＰＣ)、乳タンパク質単離体(ＭＰＩ)、カルシウム除外乳タンパク質濃縮物、カルシウム除外乳タンパク質単離体、低脂肪乳、低脂肪乳タンパク質濃縮体、低脂肪乳タンパク質単離体、初乳、初乳画分、初乳タンパク質濃縮物(ＣＰＣ)、初乳乳タンパク質濃縮物、初乳乳タンパク質単離体、初乳乳清、初乳乳清タンパク質濃縮物、初乳乳清タンパク質単離体、初乳由来の免疫グロブリン画分、乳清、乳清タンパク質濃縮物(ＷＰＣ)、乳清タンパク質単離体(ＷＰＩ)、加糖乳清、乳酸乳清、鉱酸乳清、還元乳清粉末、任意の乳汁又は初乳処理流から得られる組成物、全ての乳又は初乳加工流の限外ろ過又は精密ろ過により得られる濃縮物又は浸透物から得られる組成物、又は任意の乳又は初乳処理流のクロマトグラフィー分離により得られる浸透又は吸着画分から得られる組成物、又はこれらの組成物のいずれかの全部又は部分的加水分解物、及び/又はそれらの混合物である。例えば、乳製品処理ハンドブック(tetra Pak Processing Systems, Lund, Sweden, 1995)を参照のこと。他のこのような誘導体は、上記乳製品組成物及び乳製品成分を含む。
【０１６０】
乳汁中に見られるタンパク質は、免疫グロブリン(例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む)、増殖因子、ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、αラクトアルブミン、β-ラクトアルブミン、及び多数のカゼインを含む。カゼインを除くこれらのタンパク質は、乳清中にも存在する。乳汁は、様々な細胞分裂タンパク質及び骨再形成に直接関与しうるタンパク質を含むことが知られている。成長因子(ＩＧＦ-インスリン様成長因子、ＴＧＦ-形質転換成長因子)、免疫グロブリン(ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む)、ＢＳＡ及び幾つかのβ-ラクトグリブリンは、カチオン交換クロマトグラフィーにより乳汁又は乳清から回収される。幾つかの増殖因子は、中性タンパク質として回収される。カゼイノグリコマクロペプチド(ＣＧＭＰ)は、アニオン交換により回収される酸性タンパク質画分である。オステノポンチン(ostenopontin)は、全ての体液(乳汁を含む)において見られる高度にリン酸化されそしてグリコシル化されているタンパク質である。
【０１６１】
ＣＧＭＰは、チーズ製造過程のレネンによるカゼイン凝集ステップ(キモシンの作用を通した)の間に、カッパ-カゼインから放出されるペプチドであり、そしてスィートホエイ(sweet whey)又はチーズホエイ(cheese whey)として知られている乳清画分中に見られる。ＣＧＭＰはしばしば、単にＧＭＰ(グリコマクロペプチド)として呼ばれることもある。チーズホエイタンパク質は、１５％〜２０％ＣＧＭＰからなる。ＣＧＭＰは、ＷＯ００/４９８８５において報告されるように、乳汁の骨健康促進性分のうちの１つとして提唱されてきた。
【０１６２】
乳酸ホエイは、乳酸菌を用いて発酵することにより、又はカゼイン塩又はカッテージ及びリコッタチーズの製造の間に乳酸菌を直接添加することにより産生される。鉱酸ホエイは、カゼイン塩製造の間に鉱酸を添加することにより産生される。乳酸ホエイ及び鉱酸ホエイは、ＣＧＭＰを含まない。これらの２個のプロセスの基礎は、キモシンの作用を用いて沈澱を引き起こすこととは対照的に、ｐＨを約４.６に低下させて沈澱させることにある。その結果、キモシンに晒されていない任意の乳汁製品は、ＣＧＭＰを含まない。
【０１６３】
乳清は、チーズ又はカゼイン製造の副産物であり、そして乳清から得られるタンパク質生成物は、そのタンパク質含量に基づいて分類されても良い。例えば、乳清タンパク質濃縮物(ＷＰＣ)は少なくとも３０％のタンパク質を含み、乳清タンパク質タンパク質単離体は少なくとも９０％のタンパク質を含む(Huffman、1996；IDF、1998)。膜限外ろ過及び透析は、典型的に、そのような生成物の製造において、乾燥前に乳清タンパク質を２５〜３５％の固体に濃縮するために使用され、そして膜ろ過ステップから得られるタンパク質濃縮物は、残渣として当該技術分野に知られている。乳清タンパク質は、幾つかの個別のタンパク質(非限定的に、α-ラクトアルブミン、β-ラクトグロブリン、プロテオース・ペプトン、免疫グロブリン(ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む)、グリコマクロペプチド、成長因子(例えば、ＴＧＦ β１及びＴＧＦ β２)、ウシ血清アルブミン、ラクトフェリン、及びラクトペルオキシダーゼを含む。)を包含する集合的な用語であり、そして本発明では、乳清タンパク質を集合的に又はそれらの断片を含んでもよい。乳清の商業的な製造に適した方法は、Zadow(1992)及びSienkiewiczら(1990)により記載される。ＷＰＣ及びＷＰＩの製造方法は、当該技術分野において知られおり、そしてU.S. Whey and Lactose Produxts, 第７章：Whey Products- Definition, Composition, Functions; Page, J., Meyer, D., Haines, B., Lagrange, V., and Kenney, A.(編), American Dairy Products Institute, Elmhurst, IL, USA, (2004年６月)( http://www.usdec.org/files/pdfs/US08D 04.pdfでも利用できる)において議論されている。Dairy Processing Handbook(Tetra Pak Processing Systems, Lund, Sweden, 1995)を参照のこと。乳清タンパク質は、免疫刺激性であるということが知られている。
【０１６４】
過免疫乳汁及び過免疫化初乳は、初乳及び乳汁中の特定の抗体を上昇させるために、病原体から抗原で妊娠中の乳汁産生哺乳動物を免疫化することにより製造される(このような方法の参照についてKorhonenら、2000を参照のこと)か免疫化生成物のタンパク質濃度は、上で記載される既知の方法に従って製造されてもよい。過免疫化乳汁及び過免疫化初乳は、免疫刺激性であると知られている(Korhonenら、２０００)。過免疫化乳汁及び過免疫化初乳は、過免疫化乳タンパク質濃縮物、過免疫化乳タンパク質単離体、過免疫化乳清、過免疫化乳清タンパク質濃縮物、過免疫化乳清タンパク質単離体、過免疫化初乳、過免疫化初乳タンパク質濃縮物、過免疫化初乳タンパク質単離体、過免疫化初乳乳清、過免疫化初乳乳清タンパク質濃縮物、又は過免疫化初乳乳清タンパク質単離体、又はそれらの混合物などの誘導体を産生するために加工された通常の乳汁及び初乳などであってもよい。
【０１６５】
一例として、本発明に従って産生される組成物又は製品は、圧力処理された製品又は成分でデリバリーされてもよく；実質的に加熱処理されていない製品又は成分に加えられてもよく；又は実質的に圧力処理されている製品又は成分に加えられてもよい。
【０１６６】
本発明に従って処理される組成物中に存在するタンパク質の不所望な効果を低減するため、例えば、組成物中に存在する任意のカゼインを安定化するために、幾つかの実施態様では、安定剤を加えるために組成物は液体であることが望ましいことがある。従って、１の実施態様では、組成物は、ローカストビーンガム、グアーガム、キサンタンガム、カッシアガム(cassia gum)、こんにゃく粉末(konjac flour)、β-グルカン、タラガム、アラビアゴム、ゲランガム、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、トラガカントガム、カラヤガム、アカシアガム、キトサン、アラビノグラクチン(arabinoglactins)、アルギネート、ペクチン、カラゲナン、又はサイリウム又はそれらの混合物をさらに含む。好ましくは、本発明の方法に従って処理される組成物は、約０.０１、０.０５、０.１、０.１５、０.２、０.２５、０.３、０.３５％ｗ／ｖ又はそれより多くの安定剤を必要に応じて含む。
【０１６７】
およそ中性ｐＨにおいて生物活性組成物を安定化するために、幾つかの実施態様において、１以上の疎水性リガンドを組成物中に含むことが所望されてもよい。疎水性リガンドの存在は、リガンドの不存在下において容易に得られうるよりも高いレベルの活性を維持する一方、約７.０、好ましくは約５.０〜８.０のｐＨで生物活性成分を圧力処理することを許容する。理論に束縛されることを望まないが、これらのリガンドが生物活性成分の疎水性ポケットに結合し、圧力処理の間における感受性を低減すると信じられている。従って、幾つかの実施態様において、組成物が、パルミチン酸、ミリスチン酸、リノール酸、共役リノール酸(ＣＬＡ)、1以上のリン脂質、１以上のホスファチジルコリン、１以上のスフィンゴミエリン、１以上のガングリオシド、酪酸、１以上のω-３脂肪酸(非限定的に、エイコサペンタエン酸(ＥＰＡ)及びドコサヘキサエン酸(ＤＨＡを含む)、１以上のフィトステロール、１以上のフィトステロールエステル、１以上のフィトステロール酢酸塩、１以上のω６脂肪酸(非限定的に魚油を含む)、脂肪可溶性疎水性ビタミン(ビタミンＡ［レチノール］及びビタミンＤを含む)、リコピン、又はドデシル硫酸ナトリウム、又はそれらの混合物を含む。好ましくは、この実施態様において、組成物のｐＨは、約５.０〜８.０である。
【０１６８】
本明細書に有用な製品の例として、飲料(酸性飲料及び炭酸付加飲料を含む)、ヨーグルト、及びゼリーを含む。このような製品は、以下に記載される様に処方されてもよいし、そして上の記載及び実施例において記載されるように評価されてもよい。
【０１６９】
本発明の様々な態様は、以下の実施例を参照することにより非限定的に記載されよう。
【実施例】
【０１７０】
１.ラクトフェリン溶液
ラクトフェリン(〜１５％鉄飽和、つまり元来の飽和レベルである)をFonterra Co-operative Group limitedから得た。
【０１７１】
鉄飽和ラクトフェリン(〜１００％)を、２：１のモル過剰量の５ｍＭ鉄ニトリロ三酢酸(Foley及びBates、1987)を、１０ｍＭ炭酸水素ナトリウムを含有する５０ｍＭのＴｒｉｓ-ＨＣｌ、ｐＨ７.８に溶解した１％ラクトフェリン溶液を加えることにより製造した。１００体積のミリＱ水(２回交換)を用いて全体で２０時間４℃で透析することにより過剰試薬を取り除いた。鉄充填(ハロ-)ラクトフェリンを凍結乾燥した。
【０１７２】
加熱及び圧力処理用のラクトフェリン溶液をミリＱ水中に６％(ｗ/ｖ)にし、そしてｐＨを３Ｍ・ＮａＯＨ又は３Ｍ・ＨＣｌで必要とされる値に調節した。最初のｐＨ調節後、溶液を一晩平衡化させ、そして溶液のｐＨを最終的に必要とされるｐＨに再調節した。
【０１７３】
２.圧力処理
溶液をＢｅｃｋｍａｎ  Ｐｏｌｙａｌｌｏｍｅｒ  Ｑｕｉｃｋ-Ｓｅａｌ(商標)遠心チューブ(１３ｍｍ内径、５１ｍｍ高さ；Beckman Instruments, Inc., Spinco division、Palo Alto, CA 94304)に移し、そしてチューブを熱密封した。サンプルチューブを次に、室温で５、１５、及び３０分間６００ＭＰａの高圧ユニット中で処理した。圧力を除いた後に、サンプルチューブを切り開き、そして圧力処理されたサンプル及び未処理(コントロール)を様々な技術を用いて分析した。
【０１７４】
３.熱処理
一定量(２ｍｌ)のラクトフェリン溶液を、８ｍｌＷｈｅａｔｏｎガラススクリューキャップバイアルに入れ、そしてキャップをきつく閉めて密封を保証した。各サンプルを含むバイアルを水浴中で３７℃で５分間プレインキュベートした。バイアルを素早く所定の温度に設定された油浴に移し、そして固定し、そしてこの時点から時間を計測した。サンプルバイアルを適切な時点でとり出し、そして即座に氷上に置き、急速冷却のためにバイアルを完全に浸した。サンプルを４℃で分析まで貯蔵した。
【０１７５】
４.分析
熱又は圧力処理から生じたサンプルにおける定性的及び定量的変化を、以下に記載される様々な技術により評価した。
【０１７６】
４.１  ＰＡＧＥ分析
１５％ゲルを用いて、Mandersonら(1998)に記載される様に、還元及び非還元ポリアクリルアミドゲル電気泳動(ＰＡＧＥ）を行った。
【０１７７】
４.２  ＨＰＬＣ
サンプルを適切にミリＱ水に希釈し、そしてPalmano ＆ Elgar(2002)に記載される様に逆相ＨＰＬＣにより分析した。高純度ウシラクトフェリンを用いて作成された標準曲線を参照することにより定量を行った。
【０１７８】
４.３  ＥＬＩＳＡ
Bethylキットを製品説明書に従って用いて、適切に希釈されたサンプルについてＥＬＩＳＡアッセイを行った。
【０１７９】
４.４  免疫親和性
サンプルを適切にＨＥＰＥＳ中に希釈し、そしてＢｉａＣｏｒｅ装置をIndyk＆Filonzi(2005)に記載される様に用いて分析した。高純度ウシラクトフェリンを用いて作成された標準曲線を参照することにより定量を行った。
【０１８０】
４.５  鉄結合性
サンプル中の鉄飽和レベルは、４６５ｎｍでの吸光度により評価した。サンプル中のラクトフェリンの鉄結合能力を評価するために、鉄ニトリロ三酢酸(ＦｅＮＴＡ)を用いて分光滴定を用いた(Batesら、1967；Brock＆Arzabe、1976)。
【０１８１】
実施例１
上で記載される様に調製された６％(ｗ／ｖ)の天然の(〜１５％鉄飽和)ラクトフェリン溶液は、半透明の濃オレンジ色であった。アポ-ラクトフェリン(〜０％鉄飽和)溶液は透明であった。３.８〜７.０のｐＨ範囲での天然のラクトフェリンの熱処理は、温和な条件(例えば、７５℃で５分間)が試験溶液においていくらかの色の変化を誘導し、特に低ｐＨにおいてラクトフェリンにおける鉄の喪失又は配位された鉄の結合の喪失を指し示す(表１)。高温(８５℃〜９０℃で５分)は、上記ｐＨ範囲において実質的に全ての溶液において完全に色がなくなることをもたらした。ｐＨ７.０では、形成された厚い沈澱は、ラクトフェリンの過度の変性を指し示す。
【０１８２】
【表１】
2008532513.tif 000002
【０１８３】
対照的に、６００ＭＰａで最大４５分の圧力処理は、ｐＨ３.８及び４.０での圧力処理を除いて、全てのサンプルにおいて色の変化又は濁度の変化をもたらさなかった。ここで、高ｐＨでは色は密接に足並みを揃えており(表２)、低ｐＨでは配位鉄結合においていくらかの再調整がなされたことを示唆する。特定ｐＨでの色の変化は、炭酸水素の一定の再平衡を必然的に伴う二酸化炭素の圧力により生じる「可溶化」のため生じうる。
【０１８４】
【表２】
2008532513.tif 000003
【０１８５】
実施例２
上で記載される様に調整された６％(ｗ/ｖ)１００％鉄飽和ラクトフェリン溶液は半透明の暗赤紫色であった。ｐＨ３.８、４.８、及び７.０において完全に鉄飽和されたラクトフェリン(〜１００％)を(８５℃で１０分間及び９０℃で１０分間)熱処理することは、(ｐＨ３.８及び４.８で)色の消失をもたらし、結合された鉄の消失が示され、そしてｐＨ７.０のサンプルの場合、可溶性ラクトフェリンの消失及び完全な凝集をもたらした(データー未掲載)。
【０１８６】
対照的に、６００ＭＰａで最大３０分の圧力処理は、いずれの溶液についても目に見える色の変化をもたらさなかった(表３)。
【０１８７】
【表３】
2008532513.tif 000004
【０１８８】
実施例３
完全にイオン飽和されたラクトフェリン溶液(〜１００％)を、ｐＨ７.０、４.８、又は３.８に調節し、そして６００ＭＰａで５分又は３０分間高圧にかけ、或いは８５℃で１０分又は９５℃で１０分間熱処理にかけた。ラクトフェリン、結合された鉄、及び鉄結合能力の統一性は、各サンプルについて測定された。各ｐＨでの未処理サンプルは、対照として役に立った。処理の結果として形成された沈澱又は不溶性凝集物が存在する場合、サンプルを８０００×ｇで３０分間１０℃で遠心し、そして上清を分析にかけた。
【０１８９】
表４は、ＨＰＬＣの結果を示す。定量は、ピークの積分によって、未処理対照に対する割合(％)として総可溶性ラクトフェリンを与えた。ピークの形を、変性の定量的指標として用いた。
【０１９０】
【表４】
2008532513.tif 000005
【０１９１】
圧力処理されたサンプルについて、試験されたｐＨ範囲にわたりラクトフェリンのピーク形状又は量において変化がなかった。一方、熱処理されたサンプルでは、各ｐＨでラクトースのピーク形状が目に見えて変化し、そしてラクトフェリンがかなり減少した。これは、ｐＨ７.０において最も顕著であり、ラクトフェリンが完全に変性した。
【０１９２】
表５はＢｉａＣｏｒｅ分析の結果を示す。
【０１９３】
【表５】
2008532513.tif 000006
【０１９４】
表４及び５は、熱処理が、全てのｐＨ、特に中性ｐＨ、において鉄結合ラクトフェリンの喪失をもたらす一方、圧力処理が、ｐＨ３.８、４.８、及び７.０において実質的に鉄飽和ラクトフェリンレベルを保持することを示した。
【０１９５】
サンプルを、非還元及び還元ＳＤＳ-ＰＡＧＥにより分析した(データー未掲載)。全ての場合で、圧力処理されたサンプル中のラクトフェリンは、未処理の対照と異なる変化を示さなかった。対照的に、熱処理されたサンプルは、全て、ラクトフェリンのある程度の変化を示した。例えば、低いｐＨ値(３.８及び４.８)では、非還元ゲルは、ゲル内に浸透しない凝集された物質を示す。当該物質が還元後に実質的に存在しないことは、凝集が熱誘導性重合のため生じると言うことを指し示す。ｐＨ７において、熱処理されたサンプル中では、計測可能なラクトフェリンがほとんど残らなかった。
【０１９６】
鉄飽和ラクトフェリンの対照溶液が、ｐＨに依存するスペクトルの差を示した(データー未掲載)。親鉄飽和ラクトフェリンのスペクトル(ｐＨ８.０、未調整)は、鉄結合トランスフェリンについて報告されたスペクトルに特有であり、鉄結合についての最大吸収は、４６５ｎｍであった(Bates Schlabach、１９７３)。とりわけ、各ｐＨで圧力処理されたサンプルは、未処理のｐＨ対照についてのスペクトルと実質的に同一であるスペクトルを与えた。このスペクトルから評価された結合鉄の量(炭酸水素塩及びＴｒｉｓ緩衝液ｐＨ８.０の存在下で４６５ｎｍでの吸光度)は、親溶液についての量と同じであった。その結果、圧力処理は、各ｐＨでの鉄結合又は配位鉄結合に変化をもたらさなかった。
【０１９７】
対照的に、熱処理されたサンプルから得られたスペクトルは、対照とは明確な違いを示した(データー未掲載)。ｐＨ３.８では、熱処理されたサンプルは、４６５ｎｍで低減された吸光度を示し、鉄結合ラクトフェリンが失われたことを示し、一方ｐＨ４.８では熱処理されたサンプルは、対照とはことなるスペクトル形状を与えた(ｐＨ７.０のサンプルでは、上記の様にサンプルの凝集のためスペクトルは記録されなかった)。これは、加熱処理のため、いくらかの不可逆的な変化が生じ、そして適切な鉄結合が保証されなかったということを示す。上記の全ての場合において、追加のイオンをＦｅＮＴＡとして加えることは、観察されるスペクトルの変化を生じさせなかった。
【０１９８】
実施例４
６％ｗ/ｖの完全に鉄飽和されたラクトフェリン溶液のサンプル(〜１００％)をｐＨ３.３、３.８、４.２、５.０、６.０、７.０、又は８.０に調節し、そして大腸菌及び酵母及びカビを植菌する。サンプルを６００ＭＰａで保持時間無し、３分、１５分間圧力処理し、又は８５℃/１０分又は９０℃/１０分で熱処理した。未処理対照の微生物分析は、７.０×１０5ｃｆｕ/ｍｌの酵母及びカビのカウントを示した。一方、各ｐＨにおいて圧力処理されたサンプルの全てにおいて酵母及びカビは検出されなかった。ｐＨ５.０〜８.０のサンプルについて、データーを表６に示す。全てのサンプルについてＨＰＬＣ分析(Palmano＆Elgar、2000)は、各ｐＨでの圧力処理が定量可能なラクトフェリンについて(未処理対照に対して)影響を与えず、そして４６５ｎｍでの吸光度計測は、ｐＨ５.０以上において、鉄飽和が実質的に１００％であることを示した。ＲＰ-ＨＰＬＣは、総ラクトフェリン含量の計測である。４６５ｎｍでの吸光度は、溶液内に存在する完全に鉄飽和されたラクトフェリン(ＦｅＬＦ)の量を計測するために使用することができる。ＲＰ-ＨＰＬＣ計測及び４６５ｎｍから得られる計測が、およそ同じである場合(ｍｇ／ｍｌ)、溶液内に存在するおよそ完全に飽和されたラクトフェリンの濃度が示される。
【０１９９】
【表６】
2008532513.tif 000007
【０２００】
実施例５
(上に記載される様に調整された)完全に鉄飽和されたラクトフェリン(〜１００％)は、(図１に概説される方法に従って調製される)ヨーグルト、(図２に概説される方法に従って調製される)飲料、又は(図３に概説される方法に従って調製される)ゼリー中に含められる。熱処理、圧力処理、及び対照サンプルを図に記載される様に調製した。ラクトフェリンを、完全性、結合鉄、及び鉄結合能力の分析用にこれらのサンプルから抽出した。
【０２０１】
簡潔に記載すると、ヨーグルトのサンプル(〜１００ｇ)を８０００×ｇ、１０℃で３０分間で遠心した。上清ホエイを取り出し、０.１Ｍリン酸二ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.５を用いて１：１に希釈し、そしてｐＨをＮａＯＨを用いてｐＨ６.５に調節した。形成された沈澱を、上記の様に遠心により取り除いた。得られた懸濁液(〜１００〜１１０ｍｌ)をＳ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｂｉｇ Ｂｅａｄｓ(ＳＰＢＢ)のカラム(１.６×２０ｃｍ)に２ｍｌ／分で充填した。
【０２０２】
ゼリーサンプルについて、均一になるように攪拌しながら〜５０ｇのゼリーをミリＱ水を用いて２００ｍｌに希釈した。希釈されたゼリー(〜１００ｍｌ)のサンプルを０.４５μｍＰＶＤＦ膜(Millipore)を通してろ過し、そしてろ液を２ｍｌ／分でSPBBのカラム(１.６×２０ｃｍ)に適用した。
【０２０３】
各サンプルについての別々のカラムを以下のように処理した。未結合の物質を０.１Ｍリン酸二ナトリウム緩衝液、ｐＨ６.５を通して洗浄した。結合されたタンパク質を最初に(２８０ｎｍ及び２１４ｎｍでの吸光度が基線に到達するまで)０.４５ＭのＮａＣｌで溶出し、そして次に１.５ＭのＮａＣｌで溶出した。逆相ＨＰＬＣ(Palmano＆Elgar,２０００)による画分の分析により、実質的に全てのラクトフェリンが、１.５ＭのＮａＣｌ溶出画分中に捕捉され、そしてヨーグルト又は飲料サンプルについて少なくとも９３％の純度、又はゼリーサンプルについて８２〜８８％純度であることが示された。各サンプルについての１.５ＭのＮａＣｌ溶出画分は、ミリＱ水に対して透析され、凍結乾燥され、そして分析まで-３０℃で貯蔵される。
【０２０４】
結果-鉄結合
ヨーグルト、飲料、及びゼリー中のラクトフェリンの量を、逆相ＨＰＬＣにより、そしてＢｉａＣｏｒｅ(Indyk ＆Filonzi、２００５)分析を用いた免疫アッセイにより製造後〜１４日目に評価した。抽出されたラクトフェリン中の鉄飽和度を、分光滴定により測定した。結果を表７に与える。
【０２０５】
【表７】
2008532513.tif 000008
【０２０６】
上記結果は、高圧処理適用サンプルが、鉄-ラクトフェリンの完全性を維持することを示し、一方、熱処理がタンパク質にとってかなり有害であるということを示す。計測された全ての場合、圧力処理されたサンプルにおける鉄飽和は、対応する対照における鉄飽和とほぼ等しいか、又は対照における鉄飽和より高く、圧力処理が鉄飽和状態を維持することができ、そしてさらに特定の適用において鉄結合状態をさらに改善することができるということを示唆する。熱処理サンプル中のラクトフェリン濃度及び完全性が残留性であるので、ラクトフェリンの抽出を保証することはできない。ヨーグルトにおいて観測される低飽和度は、低ｐＨで混合された微生物により鉄が取り除かれることが原因であるかもしれない。全ての場合において、抽出ラクトフェリンは完全な鉄結合生物活性を保持し、９０％超の飽和度で鉄に結合できる(データー未掲載)。
【０２０７】
結果-微生物学
飲料、ゼリー、及びヨーグルトの微生物分析は、１〜２週間行われ、そして表８〜１０に示される。この結果により、本処理が微生物含量を低下するのに有効であることが示された。
【０２０８】
【表８】
2008532513.tif 000009
【０２０９】
【表９】
2008532513.tif 000010
【０２１０】
【表１０】
2008532513.tif 000011
【０２１１】
実施例６
鉄飽和凍結乾燥ラクトフェリン粉末を４ｍｇ／ｍｌで含む炭酸付加飲料を図４に概説されるように調製した。圧力処理前に飲料を大腸菌及び酵母及びカビで植菌した。飲料を未処理のままにし、又は圧力処理した。飲料のラクトフェリン含量をＨＰＬＣ(Palmano & Elgar, 2000)及びＥＬＩＳＡにより分析した。結果は、圧力処理が定量ラクトフェリンについてほとんど影響を及ぼさないが、５ｌｏｇ超だけ大腸菌及び酵母及びＡＰＣ数を低減したということを示した。
【０２１２】
【表１１】
2008532513.tif 000012
【０２１３】
工業的適用
本発明の方法は、食品及び健康産業用の金属イオンラクトフェリン組成物の調製における有用性を有する。本発明に従って産生された組成物及び製品は、上で記載される様に多くの健康利得及び治療適用を有する。
【０２１４】
上の記載が、例示の方法により提供されており、そして本発明はそれらに限定されないということは当業者により理解されるであろう。
【０２１５】
【表１２】
2008532513.tif 000013
【０２１６】
【表１３】
2008532513.tif 000014
【０２１７】
【表１４】
2008532513.tif 000015
【０２１８】
【表１５】
2008532513.tif 000016
【０２１９】
【表１６】
2008532513.tif 000017
【０２２０】
【表１７】
2008532513.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【０２２１】
【図１】図１は、対照の鉄ラクトフェリン(ＦｅＬＦ)ヨーグルト、熱処理ＦｅＬＦヨーグルト及び圧力処理(ＨＰＰ)ＦｅＬＦヨーグルトの製造を要約するフローチャートである。
【図２】図２は、標準(加熱処理)酸性飲料、未処理(対照)酸性飲料及び圧力処理産生飲料の製造を要約するフローチャートである。
【図３】図３は、対照(未処理)ＦｅＬＦゼリー及び圧力処理されたＦｅＬＦゼリーの製造を要約するフローチャートである。
【図４】図４は、対照(未処理)ＦｅＬＦ炭酸付加飲料及び圧力処理ＬＦ炭酸付加飲料の製造を要約するフローチャートである。
【図１】
2008532513.tif 000019
【図２】
2008532513.tif 000020
【図３】
2008532513.tif 000021
【図４】
2008532513.tif 000022
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月13日(2007.11.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
保存性を維持又は増加させるために組成物を処理する方法であって、以下の：
(ａ)  金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片を含み、そして約３.０〜８.０のｐＨを有する組成物を準備し、そして
(ｂ)  上記組成物を約３５０ＭＰａ〜約１０００ＭＰａの処理圧力で圧力処理にかけて当該組成物中に存在しうる不所望の微生物の増殖を抑制し、そしてラクトフェリン又は機能バリアント或いはそれらの断片に結合する金属イオンの少なくとも所望のレベルを保持する
を含む、前記方法。
【請求項２】
保存性を維持又は増加させるために組成物を処理する方法であって、以下の：
(ａ)  金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片、及び１以上の不所望の微生物を含み、そして約３.０〜約８.０のｐＨを有する組成物を準備し、そして
(ｂ)  約３５０ＭＰａ〜１０００ＭＰａの処理圧力であって、不所望な微生物の増殖を抑制し、そして少なくとも所望レベルの金属イオンであって、ラクトフェリン又は機能バリアント或いはそれらの断片に結合された金属イオンの少なくとも所望されるレベルを保持する処理圧力を選択し、そして
(ｃ)  上記処理圧力で上記組成物を圧力処理にかける
を含む前記方法。
【請求項３】
前記組成物が、金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片から本質的になるか又はそれらからなる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記組成物は、約０.１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片、或いは金属イオンラクトフェリンと、金属イオン機能バリアント又はそれらの断片との混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記組成物は、約１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片、或いは金属イオンラクトフェリンと、金属イオン機能バリアント又はそれらの断片との混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記金属イオンが、アルミニウムイオン、カルシウムイオン、銅イオン、クロムイオン、コバルトイオン、金イオン、鉄イオン、マンガンイオン、マグネシウムイオン、白金イオン、ルテニウムイオン、セレンイオン、又は亜鉛イオン、或いはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記金属イオンが鉄である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約５％又は１０％の金属イオン飽和である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約２０％、５０％、又は１００％金属イオン飽和である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物が、還元又は新鮮な全乳、還元又は新鮮な脱脂乳、還元全乳又は脱脂乳粉末、濃縮脱脂乳、脱脂乳単離体、全乳又は脱脂乳粉末、脱脂乳濃縮物、濃縮乳、バターミルク、限外濾過濃縮乳、乳タンパク質濃縮物(ＭＰＣ)、乳タンパク質単離体(ＭＰＩ)、カルシウム除外乳タンパク質濃縮物、カルシウム除外乳タンパク質単離体、低脂肪乳、低脂肪乳タンパク質濃縮体、低脂肪乳タンパク質単離体、初乳、初乳画分、初乳タンパク質濃縮物(ＣＰＣ)、初乳乳タンパク質濃縮物、初乳乳タンパク質単離体、初乳乳清、初乳乳清タンパク質濃縮物、初乳乳清タンパク質単離体、初乳由来の免疫グロブリン画分、乳清、乳清タンパク質濃縮物(ＷＰＣ)、乳清タンパク質単離体(ＷＰＩ)、加糖乳清、乳酸乳清、鉱酸乳清、還元乳清粉末、過免疫乳、過免疫乳タンパク質濃縮物、過免疫乳タンパク質単離体、過免疫乳清、過免疫乳清タンパク質濃縮物、過免疫乳清タンパク質単離体、過免疫初乳、過免疫初乳タンパク質濃縮物、過免疫初乳タンパク質単離体、過免疫初乳乳清、過免疫初乳乳清タンパク質濃縮物、過免疫初乳乳清タンパク質単離体、全ての乳又は初乳処理流から得られる組成物、全ての乳又は初乳加工流の限外ろ過又は精密ろ過により得られる濃縮物又は浸透物から得られる組成物、又は任意の乳又は初乳処理流のクロマトグラフィー分離により得られる浸透又は吸着画分から得られる組成物、又はこれらの組成物のいずれかの全部又は部分的加水分解物、又はそれらの混合物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が飲料、酸性飲料、中性飲料、炭酸付加飲料、ヨーグルト又はゼリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法に従って処理される組成物。
【請求項１３】
飲料、酸性飲料、中性飲料、炭酸付加飲料、ヨーグルト、又はゼリーである、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
約０.１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片並びに約５００００ｃｆｕ／ｍｌ未満の微生物を含む圧力処理された組成物。
【請求項１５】
ゼリー、ヨーグルト又は飲料である、請求項１４に記載の圧力処理された組成物。
【請求項１６】
約１ｍｇ／ｍｌ〜１０００ｍｇ／ｍｌの金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片、並びに約５００００ｃｆｕ／ｍｌ未満の微生物を含む、請求項１４に記載の圧力処理された組成物。
【請求項１７】
前記金属イオンラクトフェリン又は金属イオン機能バリアント或いはそれらの断片が、少なくとも約２０％、４０％、又は６０％金属イオン飽和である、請求項１４に記載の組成物。
【国際調査報告】
2008532513.tif 000023
2008532513.tif 000024
2008532513.tif 000025
2008532513.tif 000026
2008532513.tif 000027