(57)【要約】インターロイキン-9（IL-9）ムテインに連結されたインターロイキン-4（IL-4）ムテインを含むキメラポリペプチドアンタゴニストが、IL-4およびIL9キメラムテインアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドとともに、提供される。また、IL-4、IL-9、および／またはインターロイキン-13のようなサイトカインへの細胞の応答性を減少させる、または阻害するために、キメラムテインアンタゴニストおよびコードするポリペプチドを使用する方法が提供される。肺障害（例えば喘息）のような障害を処置するために組成物を使用する方法も、また提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
インターロイキン-9（IL-9）ムテイン受容体アンタゴニストに作動的に連結されたインターロイキン-4（IL-4）ムテイン受容体アンタゴニストを含み、インターロイキンの、IL-4受容体、IL-9受容体、インターロイキン-13（IL-13）受容体、またはそれらの組み合わせとの会合を減少させ得る、または阻害し得る、キメラポリペプチド。
【請求項２】
IL-4ムテイン受容体アンタゴニストが、IL-9ムテイン受容体アンタゴニストのN末端に位置する、請求項1記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
SEQ ID NO:2に示されるアミノ酸配列を有する、請求項1記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
IL-9ムテイン受容体アンタゴニストが、IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのN末端に位置する、請求項1記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を有する、請求項4記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
部分を更に含む、請求項1記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
部分が、ペプチドを含む、請求項6記載のキメラポリペプチド。
【請求項８】
ペプチドが、タグを含む、請求項7記載のキメラポリペプチド。
【請求項９】
タグが、ポリヒスチジンタグ、mycタグ、FLAGエピトープ、V5タグ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項8記載のキメラポリペプチド。
【請求項１０】
部分が、検出可能な標識を含む、請求項6記載のキメラポリペプチド。
【請求項１１】
検出可能な標識が、放射性核種、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、常磁性部分、酵素、基質、受容体、またはリガンドを含む、請求項10記載のキメラポリペプチド。
【請求項１２】
IL-4受容体αポリペプチド、IL-9受容体αポリペプチド、またはそれらの組み合わせに特異的に結合し、それによって機能的なインターロイキン受容体の集合を減少させる、または阻害する、請求項1記載のキメラポリペプチド。
【請求項１３】
IL-4受容体、IL-9受容体、またはそれらの組み合わせに特異的に結合し、それによってインターロイキンの、IL-4受容体、IL-9受容体、またはそれらの組み合わせへの特異的な結合を減少させる、または阻害する、請求項1記載のキメラポリペプチド。
【請求項１４】
請求項1記載のキメラペプチドおよび担体を含む、組成物。
【請求項１５】
担体が、生理学的に許容される担体、薬学的に許容される担体、またはそれらの組み合わせを含む、請求項14記載の組成物。
【請求項１６】
請求項1記載のキメラペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項１７】
SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:7に示されるキメラポリペプチドをコードする、請求項16記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、またはSEQ ID NO:6に示されるヌクレオチド配列を含む、請求項16記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
異種核酸分子に作動的に連結された、請求項16記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
異種核酸分子が、転写調節要素、翻訳調節要素、またはそれらの組み合わせを含む、請求項19記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
異種核酸分子が、ペプチドをコードする、請求項19記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
ペプチドが、タグ、細胞局在化領域、またはそれらの組み合わせを含む、請求項21記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項16記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２４】
発現ベクターである、請求項23記載のベクター。
【請求項２５】
発現ベクターが、原核生物発現ベクター、真核生物発現ベクター、またはシャトルベクターである、請求項24記載のベクター。
【請求項２６】
ウイルスベクターを含む、請求項23記載のベクター。
【請求項２７】
請求項16記載のポリヌクレオチドを含む、宿主細胞。
【請求項２８】
請求項23記載のベクターを含む、請求項27記載の宿主細胞。
【請求項２９】
ベクターが発現ベクターである、請求項28記載の宿主細胞。
【請求項３０】
細胞を請求項1記載のキメラポリペプチドと接触させる段階を含む、細胞のサイトカイン応答性を減少させる、または阻害する方法。
【請求項３１】
細胞のサイトカイン応答性が、細胞の増殖、細胞によるタンパク質発現、またはそれらの組み合わせを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
サイトカイン応答性が、IL-4応答性、IL-9応答性、IL-13応答性、またはそれらの組み合わせを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
細胞が、リンパ球、多形核白血球、単球、またはそれらの組み合わせを含む、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
細胞が、Bリンパ球、Tリンパ球、好酸球、またはそれらの組み合わせを含む、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
細胞が、白血病細胞を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３６】
白血病細胞が、赤白血病細胞、または巨核芽球性白血病細胞を含む、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
被験者に請求項1記載のキメラポリペプチドを、IL-4、IL-9、IL-13、またはそれらの組み合わせの受容体への特異的な結合を減少させる、または阻害するのに十分な量投与し、それによって被験者における病理学的状態を改善する段階を含む、被験者においてIL-4受容体、IL-9受容体、またはIL-13受容体より選択される少なくとも一つの受容体を発現する細胞と関連づけられる病理学的状態を改善する方法。
【請求項３８】
被験者が哺乳動物である、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
被験者がヒトである、請求項37記載の方法。
【請求項４０】
病理学的状態が、喘息、慢性閉塞性肺疾患、アレルギー性炎症性応答、またはそれらの組み合わせを含む、請求項37記載の方法。
【請求項４１】
慢性閉塞性肺疾患が、気腫、または慢性気管支炎を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
請求項14記載のポリヌクレオチドを発現し、それによってキメラポリペプチドを作製する段階を含む、IL-9ムテイン受容体アンタゴニストに作動的に連結されたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストを含むキメラポリペプチドを作製する方法。
【請求項４３】
ポリヌクレオチドが発現される条件の下で、請求項27記載の宿主細胞を培養する段階を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４４】
ポリヌクレオチドの発現に適する条件の下で、請求項29記載の宿主細胞を培養する段階を含む、請求項42記載の方法。
【請求項４５】
請求項42記載の方法によって生産された、IL-9ムテイン受容体アンタゴニストに作動的に連結されたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストを含む、キメラポリペプチド。
【請求項４６】
キメラポリペプチドを精製する段階を更に含む、請求項42記載の方法。
【請求項４７】
請求項46記載の方法によって生産された、IL-9ムテイン受容体アンタゴニストに作動的に連結されたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストを含む、精製されたキメラポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2004年9月22日に提出された米国特許出願第60/612,275号、および2004年12月29日に提出された米国特許出願第11/026,396号の、米国特許法119条(e)項の下の優先権の恩典を主張し、その全内容が、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
発明の分野
本発明は、一般に、免疫応答を調節することを扱うのに有用な組成物に関し、かつ、より具体的には、インターロイキン-4、インターロイキン-9、およびインターロイキン-13活性のアンタゴニストとして作用するインターロイキン-4（IL-4）およびインターロイキン-9（IL-9）キメラムテイン（mutein）、ならびに、細胞のサイトカイン媒介応答を調節し、かつサイトカイン媒介応答性と関連づけられる障害を改善するために、そのようなIL-4およびIL-9キメラアンタゴニストムテインを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン-4（IL-4）、およびインターロイキン-13（IL-13）は、抗原刺激時に活性化T細胞より産生されるサイトカインである。喘息は、活性化Tリンパ球(T細胞)および好酸球を伴う気管支粘膜浸潤と関連づけられる、可逆性気流閉塞および気道過敏症（AHR）によって特徴づけられる。これらの細胞は、気道に内在する肥満細胞とともに、疾患の病因において根本的な役割を果たす様々なサイトカインおよび媒介物質を分泌する（1,2）。
【０００４】
IL-9が、Th2依存性免疫応答の媒介物質として、喘息において役割を有していることを、多くの研究が示唆する。ヒトの連鎖解析は、IL-9遺伝子、およびIgE産生の高い血清レベル、および気道過敏症の間の関連を示した（3,4）。IL-9トランスジェニックマウスは、ヒト喘息の多くの特徴を示し、かつ、アレルゲン曝露の後に著しく強い気管支周囲および脈管周囲の好酸球増加を有する。好酸球増加は、好酸球の走化性物質であるエオタキシン、MIP-1およびMCP-1、MCP-3、ならびにMCP-5の肺上皮細胞における上方制御と一致していた（5）。喘息におけるIL-9の役割についての他の証拠は、気道上皮細胞によるムチンの分泌を刺激するIL-9の能力の研究を含む（6）。まとめると、これらの研究は、喘息およびアレルギー性炎症の多くの臨床的特徴を調節することにおけるIL-9の役割を例証し、かつ裏付ける。
【０００５】
IL-4およびIL-13は、アレルギー性炎症および喘息の発生の中枢であると考えられている。いずれかのサイトカインを欠失した動物で行った研究、または、IL-4もしくはIL-13いずれかの機能を中和する試薬を用いた研究は、これらのサイトカインが、気道炎症および気道過敏症を導く一次的および二次的な免疫応答を調節することにおいて果たす重要な役割を解明してきている（7,8）。漸増的に、これらのデータは、IL-4およびIL-13が、アレルギー性気道応答において独立した役割に加えて重複した役割を有することを示唆する。
【０００６】
減少したIL-9、IL-4、およびIL-13活性は、T細胞応答のTh2極性化を減少させ、好酸球の生存および好中球活性を減少させ、かつ気道上皮細胞による粘液の産生を減衰させ得る。次いで、これらの効果は、ガス交換およびクリアランスを増加すると同時に、気道過反応性およびリモデリングを減少させ得、かつ、そのために、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患(気腫および慢性気管支炎)、および関連した肺状態を含むいくつかの肺疾患のための有効な治療的様相を提供し得る。そのように、IL-9、IL-4、およびIL-13を標的とすることは、これらのサイトカインのいずれかを単独で標的とすることと比較して、重要な治療的恩恵を提供し得る。従って、細胞上のIL-9、IL-4、およびIL-13の効果を調節し得る組成物に対する要求が存在する。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、インターロイキン-9（IL-9）ムテイン受容体アンタゴニストに作動的に連結されたインターロイキン-4（IL-4）ムテイン受容体アンタゴニストを含む、キメラポリペプチドに関する。キメラポリペプチドは、例えばIL-4またはIL-9αポリペプチドに結合すること、および、機能的なIL-4、IL-9および／またはインターロイキン-13（IL-13）受容体を形成するためのIL-2受容体γポリペプチドとのαポリペプチドの会合を減少させる、または妨げることによって、IL-4受容体、IL-9受容体、IL-13受容体の形成を特異的に妨害し得ることにおいて、一部特徴づけられる。そのように、本発明のキメラポリペプチド、またはキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、例えば、IL-4、IL-9、および／またはIL-13の、細胞上のIL-4、IL-9、および／またはIL-13受容体への特異的な結合を減少させる、または阻害するために有用である。そのようなインターロイキンの特異的受容体への結合は、喘息および他の肺障害のような病理学的状態、ならびに白血病のような特定の癌と関連づけられ得るため、本発明の組成物は、そのような病理学的状態を改善するために有用であり得る。
【０００８】
本発明のキメラポリペプチドは、IL-9ムテイン受容体アンタゴニストのN末端に位置するIL-4ムテイン受容体アンタゴニスト成分を含み得、また、IL-4ムテイン受容体アンタゴニストのN末端に位置するIL-9ムテイン受容体アンタゴニスト成分を含み得る。そのようなキメラポリペプチドは、それぞれSEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4に示されるポリペプチドによって例示され、IL-4ムテイン（IL-4RA）およびIL-9ムテイン（IL-9RA）成分を含み、かつ、IL-4およびIL-9成分のN末端に位置するシグナルペプチド配列、ポリヒスチジンタグ、およびタバコエッチウイルス（TEV）プロテアーゼ認識部位を更に含む。キメラポリペプチドのIL-4およびIL-9成分は、直接連結され得（すなわち、一つの成分のC末端が第二の成分のN末端に直接連結され得る）、または、各成分がそれぞれのIL-4、IL-9および／またはIL-13アンタゴニスト活性を維持するように、二つの成分を作動的に連結するスペーサー分子を経て連結され得る。一つの態様において、スペーサー分子はペプチドであり、スペーサーペプチドを含むキメラポリペプチドは、ポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質を含む。もう一つの態様において、スペーサー分子は、化学反応を経たIL-4およびIL-9成分の作動的結合を可能にする。
【０００９】
本発明のキメラポリペプチドは、キメラポリペプチドのN末端および／もしくはC末端に位置し得、IL-4成分およびIL-9成分の間に位置し得、ならびに／またはIL-4およびIL-9成分の一つもしくは双方のアミノ酸側鎖に結合され得る、一つまたは複数の追加的な、作動的に連結される部分を含み得る。部分は、例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、有機もしくは無機低分子、炭水化物、脂質、またはそのような分子の組み合わせを含む、ポリペプチドに連結され得る任意のタイプの分子であり得る。例えば、部分はペプチドタグ（例えば、ポリヒスチジンタグ、mycタグ、FLAGタグ、またはV5タグ）、またはビオチン（または、アビジンもしくはストレプトアビジン）のような他のタグであり得る。そのようなタグは、キメラポリペプチドの存在を検出するため、および／またはキメラポリペプチドを含む組成物よりキメラポリペプチドを精製するための手段を提供し得る。ペプチド部分はまた、プロテアーゼのための認識部位（例えば、TEVプロテアーゼ認識部位）を提供し得る。部分はまた、キメラポリペプチドの便利な検出を可能にし得る、検出可能な標識であり得る。例えば、試料においては、そのような場合、試料におけるキメラポリペプチドの量を決定するための手段を更に提供し得る；または細胞においては、そのような場合、細胞によって発現されるIL-4、IL-9、および／もしくはIL-13受容体、または、IL-4および／もしくはIL-9受容体αポリペプチドへのキメラポリペプチドの結合を検出するための手段を提供し得る；またはインビボにおいては、そのような場合、キメラポリペプチドが投与された被験者における分布および／または局在化をモニターするための手段を提供し得る。検出可能な標識は、放射性核種、蛍光部分、発光部分、化学発光部分、常磁性部分、酵素(または同族の基質)、受容体（または同族のリガンド）、または、キメラポリペプチドと結合された際に便利に検出され得る任意の他の分子を含み得る。
【００１０】
本発明のキメラポリペプチドは、実質的に精製された（単離された）形態で存在し得、または、一つまたは複数の担体を含む組成物として製剤され得る。担体は、例えば水性または非水性の担体（例えば、緩衝液、生理食塩水、またはエタノール）を含む、キメラポリペプチドを混合することが望ましい任意の物質であり得、または、キメラポリペプチドが乾燥（例えば凍結乾燥された）状態で維持され得る安定化材料（例えば炭水化物）であり得る。一つの態様において、組成物は、生理学的に許容される担体、薬学的に許容される担体、またはそれらの組み合わせを含み、キメラポリペプチドを細胞と接触させる、および／またはキメラポリペプチドを被験者（例えばヒト被験者）へ投与することが望ましいときに、組成物が使用され得る。
【００１１】
本発明はまた、IL-9ムテインに作動的に連結されたIL-4ムテインを含むキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに関する。ポリヌクレオチドは、DNA、RNA、またはDNA/RNAハイブリッドであり得、かつ、一本鎖または二本鎖であり得る。また、提供されるのは、本発明のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定するために有用なオリゴヌクレオチドであり、そのようなオリゴヌクレオチドは、IL-4をコードする配列およびIL-9をコードする配列を含むポリヌクレオチドの領域、またはそれらに相補的なヌクレオチド配列にハイブリダイズし得ることで、一部特徴付けられる。本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、またはSEQ ID NO:7に示されるアミノ酸配列を有するキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびに、SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、およびSEQ ID NO:6に示されるヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、例示される。
【００１２】
一つの態様において、本発明のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、機能的な核酸分子であり得、または、ポリヌクレオチドの存在を同定するためのタグとして作用し得る異種核酸分子に、作動的に連結される。そのように、異種核酸分子は、転写調節要素(例えば、プロモーター、エンハンサー、またはサイレンサー)、翻訳調節要素（例えば、コザック共通配列、開始コドン、リボソーム結合配列、終止コドン、またはポリアデニル化シグナル）、または、転写および／もしくは翻訳調節要素の組み合わせを含み得、またはコードし得る。異種核酸分子はまた、タグおよび／もしくは検出可能な標識として機能し得る、または、特定の細胞区画の中へもしくは外への、発現されたキメラポリペプチドの輸送を促進する、細胞局在化領域として機能し得るペプチドをコードし得る。
【００１３】
本明細書において開示されるように、本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子治療型の手順に有用であり得、本発明のキメラポリペプチドが発現されるような条件の下でポリヌクレオチドが細胞と接触され、キメラペプチドがそのアンタゴニスト活性をもたらし得る。従って、ポリヌクレオチドはベクターに含まれ得、ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターであり得、かつ、原核生物ベクター、真核生物ベクター、またはシャトルベクター（すなわち、原核生物および真核生物細胞双方において、または異なるタイプの真核細胞において継代され得るベクター）であり得る。一つの態様において、ベクターは、細胞または関心対象の細胞型においてポリヌクレオチドの発現を促進する、一つまたは複数の調節要素を含む、発現ベクターである。発現ベクターは、ウイルスベクターもしくはプラスミドベクターであり得、または双方の要素を含み得る。また、提供されるのは、本発明のキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、そのポリヌクレオチドがベクター（例えば発現ベクター）に含まれ得るが、含まれる必要は無い。一つの局面において、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム中に安定に組み込まれる。
【００１４】
本発明はまた、細胞のサイトカイン応答性を減少させる、または阻害する方法を提供する。そのような方法は、培養における細胞（例えば、確立された細胞株もしくは細胞培養の細胞、または被験者のエクスビボの細胞）を用いて行われ得、または、細胞はインビボで（例えば、実験動物系、またはサイトカインへの細胞応答性と関連づけられる障害を患う被験者において）接触され得る。方法は、例えば、細胞をIL-9ムテインに作動的に連結されたIL-4ムテインをコードするキメラポリペプチドと接触させることによって、または、コードされたキメラポリペプチドの発現に適する条件の下で、細胞をキメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと接触させることによって、実践され得る。細胞のサイトカイン（特にIL-4、IL-9、および／またはIL-13）応答性は、例えば、サイトカインによって媒介される細胞増殖における増加または減少、例えばIL-4、IL-9、および／またはIL-13との接触のために増加した細胞によるサイトカインの発現を含む、サイトカインに曝露された細胞によるタンパク質発現における増加または減少を含む。
【００１５】
様々な局面において、細胞のサイトカイン応答性は、IL-4応答性、IL-9応答性、もしくはIL-13応答性であり得、または、細胞はサイトカインの組み合わせ（例えば、IL-4およびIL-9、IL-4およびIL-13、または、IL-9およびもう一つもしくはそれ以上のサイトカイン）に応答し得る。接触される細胞は、サイトカインへの応答、特に、細胞により発現される受容体へのサイトカインの結合により媒介される応答を示す任意の細胞であり得る。そのように、細胞は、例えば、リンパ球（例えば、Tリンパ球またはBリンパ球）、多形核白血球(例えば、好酸球)、単球（例えば、組織球）、または肥満細胞であり得る。細胞は、そのサイトカイン応答性のために障害(例えば、喘息のような肺障害)に貢献する正常細胞(例えば、肥満細胞)であり得、または、サイトカイン応答性が異常な増殖によって明白である癌細胞（例えば、赤白血病細胞または巨核芽球性白血病細胞のような白血病細胞）であり得る。
【００１６】
従って、本発明はまた、被験者において、IL-4受容体、IL-9受容体、またはIL-13受容体より選択される少なくとも一つの受容体を発現する細胞と関連づけられる病理学的状態を改善する方法に関する。被験者は、IL-4、IL-9、および／またはIL-13受容体を発現する細胞を有し、サイトカインへの細胞の応答性が病理学的状態と関連づけられる任意の被験者であり得る。そのように、被験者は、例えば、哺乳動物被験者、特に病理学的状態（例えば、喘息のような肺障害、または白血病のような癌）を患うヒト被験者を含む、脊椎動物被験者であり得る。病理学的状態を改善する方法は、例えば、IL-4ムテインおよびIL-9ムテインを含むキメラポリペプチドアンタゴニスト、またはキメラポリペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオチドを、IL-4、IL-9、IL-13、またはそれらの組み合わせの受容体への特異的な結合を減少させ、または阻害し、それによって被験者における病理学的状態を改善するのに十分な量、被験者に投与することによって実践され得る。本方法による改善の影響を受けやすい病理学的状態は、例えば、喘息および慢性閉塞性肺疾患（例えば、気腫および慢性気管支炎）のような肺障害、およびアレルギー性炎症性応答を含む。本方法による処置の影響を受けやすい追加的な病理学的状態は、白血病およびリンパ腫（例えば、非ホジキンリンパ腫）のような癌を含む。
【００１７】
本発明はまた、IL-9ムテイン受容体アンタゴニストに作動的に連結されたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストを含む、キメラポリペプチドを作製する方法に関する。そのような方法は、キメラポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することによって、便利に行われ得る。例えば、ベクターに含まれ得るが、含まれる必要は無いポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが発現され、かつキメラポリペプチドが生産される条件の下で培養され得る宿主細胞に、含まれ得る。従って、本発明は、そのような方法によって生産される、IL-9ムテイン受容体アンタゴニストに作動的に連結されたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストを提供する。更に、方法はキメラポリペプチドを精製する段階を含み得る。そのように、本発明はまた、そのような方法により生産される、IL-9ムテイン受容体アンタゴニストに作動的に連結された、精製されたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストを提供する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、インターロイキン-4（IL-4）ムテイン（IL-4RA）およびインターロイキン-9（IL-9）ムテイン（IL-9RA）を含むキメラポリペプチドが、免疫および炎症性応答に関与する細胞のIL-4、IL-9、およびIL-13媒介応答性に対するアンタゴニストとして作用するとの発見に基づく。従って、一つの態様において、本発明は、IL-4受容体、IL-9受容体、インターロイキン-13（IL-13）受容体の形成を特異的に妨害し得る、IL-9ムテイン受容体アンタゴニストに作動的に連結されたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストを含むキメラポリペプチドを提供する。もう一つの態様において、キメラポリペプチドは、それぞれ、IL-9またはIL-4成分に作動的に連結されたIL-4RAまたはIL-9RAを含む。また提供されるのは、そのようなキメラムテインアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドに加えて、IL-4、IL-9、および／またはIL-13の、細胞上のIL-4、IL-9、および／またはIL-13受容体への特異的結合を減少させるため、または阻害するために、キメラポリペプチド、またはコードするポリヌクレオチドを使用する方法である。
【００１９】
キメラ組み換えムテインは、IL-9誘導細胞増殖を阻害するヒトIL-9ムテイン（IL-9RA）、および、アミノ酸配列の2箇所において変異しているヒトIL-4ムテイン（IL-4RA）より開発されてきた。IL-9RAおよびIL-4RAは、それぞれIL-9およびIL-4受容体α鎖に結合するように設計され、それによって、野生型サイトカインの受容体への結合を拮抗的に阻害する、ならびに／または、IL-4および／もしくはIL-9αポリペプチドのIL-2受容体γポリペプチドとの会合を減少させるか、もしくは阻害する（こうして機能的なIL-4、IL-9、および／またはIL-13受容体の集合を妨げる）。野生型IL-9は、IL-9Rα、ならびに、IL-2、IL-4、IL-7、IL-13、IL-15、および恐らく他の受容体複合体の共有成分である共通γ鎖からなる、二つのサブユニットの受容体を通してシグナルを伝達する。比較して、IL-4は、IL-4Rαおよび共通γ鎖を通してシグナルを伝達する。IL-4Rα鎖はまた、IL-13受容体複合体の機能的なシグナル伝達成分である。
【００２０】
例えば喘息のような肺障害を含む様々な障害は、サイトカインへの細胞応答性と関連づけられる。本明細書において開示されるように、例えばサイトカイン誘導細胞増殖を含むIL-9、IL-4、およびIL-13媒介細胞活性は、IL-9RAおよびIL-4RAキメラポリペプチドアンタゴニストの作動的に連結された形態を用いて、それぞれの同族の細胞表面受容体を通したサイトカインシグナル伝達を阻害することによって、減衰され得る（実施例1参照）。IL-9RAおよびIL-4RAキメラムテインアンタゴニストは、サイトカインのそれぞれの受容体への結合を妨げることによって、野生型IL-9、IL-4、およびIL-13のシグナルを伝達する能力を拮抗的に阻害する。従って、本発明は、例えば、IL-9ムテインおよびIL-4ムテインを含む融合タンパク質を含むキメラポリペプチド、そのようなIL-9およびIL-4キメラアンタゴニストムテインをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを含む組成物、ならびに、例えば、細胞のサイトカイン媒介応答性を調節するために、かつサイトカイン媒介応答性と関連づけられる病理学的状態を改善するために、組成物を使用する方法を提供する。
【００２１】
本発明は、IL-4、IL-9、およびIL-13によって媒介される免疫応答を阻害する試薬および方法を提供する。例えば、IL-9ムテイン受容体アンタゴニストに作動的に連結された、修飾されたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストを含む、キメラ（融合）タンパク質を含む精製されたタンパク質調製物が提供される。融合タンパク質のIL-4RA成分は、IL-9RA成分のN末端に位置し得（「IL-4RA/IL-9RA」；例えばSEQ ID NO:2参照）、または、融合タンパク質のIL-9RA成分は、IL-4RAのN末端に位置し得る（「IL-9RA/IL-4RA」；例えばSEQ ID NO:4参照；また、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:7も参照されたい）。本明細書において使用されるとき、キメラポリペプチドの名称は、IL-4およびIL-9成分のN末端からC末端への方向を示し（例えば「IL-4RA/IL-9RA」はIL-4ムテインがIL-9ムテインのN末端にあることを示す）；「RA」という名称は、成分（例えばIL-4）がサイトカイン受容体アンタゴニストとして作用し得るムテイン（すなわちIL-4RA）であることを示す。本明細書において開示されるように、受容体アンタゴニストのIL-4およびIL-9成分の一つ、または好ましくは双方がムテインである。本明細書において使用されるとき、「IL-4RAおよびIL-9RAキメラポリペプチド」または「IL-9RAおよびIL-4RAキメラアンタゴニスト」または「IL-4およびIL-9ムテイン融合タンパク質」などの言及は、キメラムテインアンタゴニストにおいて、IL-4成分がIL-9成分のN末端またはC末端に存在し得ることを意味する。
【００２２】
「作動的に連結された」という用語は、共有結合性または非共有結合性の相互作用を共有する二つまたはそれ以上の分子であって、各分子が、分子単独で示す機能のいくつかまたはすべてを維持している分子について言及するために、本明細書において使用される。ペプチド（ポリペプチド）、ポリヌクレオチド、または他の分子であり得る二つまたはそれ以上の分子は、お互いに直接的に連結され得、または、リンカー（スペーサー）分子を経て作動的に連結され得る。例えば、第一のペプチド、例えばIL-4RAをコードするポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列がインフレームであるように、異種ペプチド、例えばIL-9RAをコードするポリヌクレオチドに作動的に連結され得る。そのような組み換えポリヌクレオチドの発現の際には、ペプチドは融合タンパク質として発現され、ここで、IL-4およびIL-9成分が作動的に連結され、かつ、融合タンパク質のIL-4RA成分が少なくともIL-4受容体、特にIL-4受容体αポリペプチドに特異的に結合し得、およびIL-9RA成分が少なくともIL-9受容体、特にIL-9受容体αポリペプチドに特異的に結合し得る。
【００２３】
「融合タンパク質」または「キメラポリペプチド」などの用語は、作動的に連結された二つ以上のペプチドを意味するために、本明細書において使用される。融合タンパク質は、例えば、融合タンパク質をコードする組み換えポリヌクレオチドの発現によって取得され得、または、キメラタンパク質は、第一のペプチド（例えばIL-4またはIL-4RA）を第二の（または他の）ペプチド（例えばIL-9またはIL-9ムテイン）に化学的に連結することによって、または、ペプチド成分を含むタンパク質全体を化学的に合成することによって、取得され得る。本発明のキメラタンパク質はまた、例えば、IL-9RAに作動的に連結されたIL-4RAを含む融合ポリペプチドを発現し、それから融合タンパク質にペプチドタグ（例えばポリヒスチジンタグ）を更に化学的に連結することを含む、そのような方法の組み合わせを用いて取得され得る。
【００２４】
「作動的に連結された」という用語はまた、二つまたはそれ以上の連結されたポリヌクレオチドを含み、それぞれがポリヌクレオチドに特徴的な機能を維持している組み換えポリヌクレオチドについて言及するために使用される。例えば、組み換えポリヌクレオチドは、コード配列がインフレームであり、かつIL-4RA活性およびIL-9RA活性を有する融合タンパク質として発現され得る、IL-9RAコード配列に作動的に連結されたIL-4RAコード配列を含み得る。組み換えポリヌクレオチドはまた、例えば、コード配列に作動的に連結された転写プロモーター（または他の調節要素）を含み得、ここで転写プロモーターは、プロモーターからのポリヌクレオチドの発現に適切な条件下で、コード配列の発現を駆動する。そのように、第一のポリヌクレオチドコード配列は、キメラポリペプチドが作動的に連結されたコード配列から発現され得るように、第二の（またはそれ以上の）コード配列に作動的に連結され得る。
【００２５】
「ペプチド」または「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、ペプチド結合によって連結された2個またはそれ以上のアミノ酸を意味するために、本明細書において広く使用される。一般に、本発明のペプチドはキメラペプチドを含むが、二つのペプチドの連結された領域を含むペプチド断片が企図される。ペプチドは、一般に、少なくとも約6個のアミノ酸を含み、通常は約10個のアミノ酸を含み、かつ15個またはそれ以上のアミノ酸、特に20個またはそれ以上のアミノ酸を含み得る。「ペプチド」という用語は、本明細書において、分子を構成するアミノ酸の特定の大きさまたは数を示唆するように使用されず、かつ、本発明のペプチドはいくつかのアミノ酸残基またはそれ以上まで含み得ることが認識されるべきである。本明細書において使用されるとき、「実質的に精製された」または「実質的に純粋な」または「単離された」という用語は、言及された分子、例えばペプチドまたはポリヌクレオチドが、自然に会合している（すなわち自然界の）タンパク質、核酸、脂質、炭水化物、または他の材料を比較的含まない形態にあることを意味する。一般に、実質的に純粋なペプチド、ポリペプチド、または他の分子は、試料の少なくとも20パーセントを構成し、一般には試料の少なくとも約50パーセントを構成し、通常は試料の少なくとも約80パーセントを構成し、および特に試料の約90パーセントまたは95パーセントまたはそれ以上を構成する。
【００２６】
本明細書において開示されるように、IL-4RAおよびIL-9RAキメラポリペプチドに作動的に連結されたポリヒスチジンタグの包含は、発現されたキメラポリペプチドを実質的に精製するための手段を提供した。更に、タグとIL-4RAおよびIL-9RA成分との間のTEVプロテアーゼ切断部位の包含は、キメラポリペプチドアンタゴニストよりタグを切断するための手段を提供した（例えばSEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4参照）。本発明のペプチドまたはポリヌクレオチドが実質的に純粋であるという決定は、周知の方法を用いて、例えば、電気泳動を行い、かつ比較的分離したバンドとして特定の分子を同定することによって、なされ得る。実質的に純粋なポリヌクレオチドは、例えば、ポリヌクレオチドのクローニングによって、または化学的もしくは酵素的合成によって取得され得る。実質的に純粋なペプチドは、例えば、化学合成の方法によって、または、タンパク質分解、および、望まれる場合はクロマトグラフィーもしくは電気泳動的方法による更なる精製が続くタンパク質精製の方法を用いて、取得され得る。
【００２７】
本発明のキメラポリペプチドは、IL-4ムテインおよび／もしくはIL-9ムテインのアミノ酸配列に相当し得、または、例えば、対応するL-アミノ酸の代わりに1個もしくは複数のD-アミノ酸を含むことによって；または1個もしくは複数のアミノ酸類似体、例えば、誘導された、もしくは反応側鎖で別な方法で修飾されたアミノ酸を含むことによって、ムテイン配列より変化し得る。同様に、ペプチドにおいて一つまたは複数のペプチド結合が修飾され得る。加えて、アミノ末端またはカルボキシ末端または双方の反応基が、修飾され得る。そのように、キメラポリペプチドアンタゴニストは、例えば、プロテアーゼ、酸化剤、または生物学的環境においてペプチドが遭遇する可能性がある他の反応性材料に対して改善された安定性を有するように修飾され得、かつ、そのために、本発明の方法を行うのに特に有用であり得る。もちろん、ペプチドは、ペプチドが環境において活性を有する期間が短縮されるように、生物学的環境における減少された安定性を有するように修飾され得る。
【００２８】
本発明のキメラポリペプチドの配列はまた、ペプチド成分における1個または数個のアミノ酸に対して保存的アミノ酸置換を組み込むことによって、IL-4RAおよび／またはIL-9RA成分における対応する配列と比較して修飾され得る。保存的アミノ酸置換は、置換がキメラポリペプチドアンタゴニストのIL-4、IL-9、および／またはIL-13アンタゴニスト活性の消失を結果として生じない条件で、1個のアミノ酸残基を比較的同一の化学的特徴を有する別のアミノ酸残基に交替すること、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、もしくはメチオニンのような1個の疎水性残基の別の残基への置換、または1個の極性残基の別の残基への置換、例えばアルギニンのリジンへの置換；もしくはグルタミン酸のアスパラギン酸への置換；もしくはグルタミンのアスパラギンへの置換などを含む。
【００２９】
修飾されたIL-4ムテイン受容体アンタゴニストは、例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,723,118号および第6,130,318号において記述される。修飾されたIL-9ムテイン受容体アンタゴニストは、例えば、参照により本明細書に組み入れられる国際出願番号第PCT/US2004/015168号において記述される。開示されるように、変異は、二重ムテインIL9およびIL4キメラ受容体アンタゴニストを生じるように、例えばIL-9における126位のリジンのグルタミン酸への置換（K126E）および133位のグルタミンのリジンへの置換（Q133K）（または国際出願番号第PCT/US2004/015168号において開示される任意の他の変異）を含んで、Dへリックスに導入され得る。IL-4および／またはIL-9の一つまたは複数の部位での置換が、本発明のキメラポリペプチドアンタゴニストを調製するのに有用なムテインアンタゴニストを結果として生じることを決定するための方法は、本明細書において開示されており（実施例1参照）、かつ、別の方法で当技術分野において公知である（例えば、米国特許第5,723,118号および第6,130,318号、ならびに国際出願番号第PCT/US2004/015168号参照）。例えば、IL-4RAおよびIL-9RAムテイン融合タンパク質の、免疫細胞の増殖性応答を減少させる、または阻害する能力は、実施例1において概略が述べられる増殖アッセイを用いて評価され、かつ、「50％阻害濃度」（IC50）として表現される。一般に、本発明のキメラポリペプチドアンタゴニストは、例えば約1.0nM〜100nM、または約0.5nM〜1μMを含む、約0.1nM〜10μMの範囲の好ましいIC50で、ヒトIL-4およびIL-9受容体の集合を妨げ、かつその能力を中和し得、免疫細胞の増殖を妨げる。
【００３０】
また提供されるのは、例えば、IL-4RA/IL-9RA融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばSEQ ID NO:1を参照）、およびIL-9RA/IL-4RA融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（例えばSEQ ID NO:3およびSEQ ID NO:6を参照）を含む、IL-4RAおよびIL-9RAキメラアンタゴニストムテインをコードするポリヌクレオチドである。従って、本発明は更に、IL-4およびIL-9キメラアンタゴニストムテインをコードするポリヌクレオチドを含むベクター（例えば発現ベクター）を、そのようなポリヌクレオチドおよび／またはベクターを含む宿主細胞と同様に提供する。加えて、本発明は、アンタゴニストの発現に適する条件の下でそのような宿主細胞を培養することによって、IL-4およびIL-9ムテイン融合タンパク質を作製する方法を提供する。そのような方法は、宿主細胞の培養物よりアンタゴニストを精製する段階を更に含み得、従って実質的に精製されたアンタゴニストを取得する手段を提供する。
【００３１】
「ポリヌクレオチド」という用語は、リン酸ジエステル結合によってお互いに連結された2個またはそれ以上のデオキシリボヌクレオチド、またはリボヌクレオチドの配列を意味するために、本明細書において広く使用される。そのように、「ポリヌクレオチド」という用語は、遺伝子またはその一部であり得るRNAおよびDNA、cDNA、合成ポリデオキシリボ核酸配列、などを含み、DNA/RNAハイブリッドと同様に、一本鎖または二本鎖であり得る。更に、本明細書において使用される「ポリヌクレオチド」という用語は、例えば、化学合成の方法またはポリメラーゼ連鎖反応（PCR）のような酵素的方法によって調製され得る合成分子と同様に、細胞より単離され得る自然に見出される核酸分子を含む。様々な態様において、本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオシドまたはヌクレオチド類似体、またはリン酸ジエステル結合以外の骨格結合を含み得る（上記参照）。
【００３２】
一般に、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、自然に見出される、2'-デオキシリボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニン、もしくはチミンのようなデオキシリボヌクレオチド、または、リボースに連結されたアデニン、シトシン、グアニン、もしくはウラシルのようなリボヌクレオチドである。しかしながら、ポリヌクレオチドはまた、自然に見出されない合成ヌクレオチド、または修飾された自然に見出されるヌクレオチドを含む、ヌクレオチド類似体を含み得る。そのようなヌクレオチド類似体は、当技術分野において周知で、かつ商業的に入手可能であり、そのようなヌクレオチド類似体を含むポリヌクレオチドも同様である（Lin et al., Nucl. Acids Res. 22:5220-5234 (1994); Jellinek et al., Biochemistry 34:11363-11372 (1995); Pagratis et al., Nature Biotechnol. 15:68-73 (1997)、各文献は参照により本明細書に組み入れられる）。
【００３３】
ポリヌクレオチドのヌクレオチドを連結する共有結合は、一般にはリン酸ジエステル結合である。しかしながら、共有結合は、チオジエステル結合、ホスホロチオエート結合、ペプチド様結合、または合成ポリヌクレオチドを生産するためにヌクレオチドを連結するのに有用であるとして当業者に公知である任意の他の結合を含む、多数の他の結合のうちの任意のものであり得る（例えば、Tam et al., Nucl. Acids Res. 22:977-986 (1994); Ecker and Crooke, BioTechnology 13:351360 (1995)を参照されたく、各文献は参照により本明細書に組み入れられる）。自然に見出されないヌクレオチド類似体、またはヌクレオチドもしくは類似体を連結する結合の組み込みは、修飾されたポリヌクレオチドは分解への感受性がより低い可能性があるため、例えば、組織培養培地または生きている被験者への投与の際を含む、核酸分解（nucleolytic）活性を含み得る環境にポリヌクレオチドが曝露されることになる場所で、特に有用であり得る。
【００３４】
自然に見出されるヌクレオチドおよびリン酸ジエステル結合を含むポリヌクレオチドは、化学的に合成され得、または、適切なポリヌクレオチドを鋳型として使用して、組み換えDNA法を用いて生産され得る。比較して、ヌクレオチド類似体またはリン酸ジエステル結合以外の共有結合を含むポリヌクレオチドは、一般に化学的に合成されるであろうが、T7ポリメラーゼのような酵素は一定のタイプのヌクレオチド類似体をポリヌクレオチドへ組み込み得、そのために適切な鋳型よりそのようなポリヌクレオチドを組み換え的に生産するのに使用され得る（Jellinek et al., 上述, 1995）。
【００３５】
ポリヌクレオチドがペプチド、例えば、IL-4および／またはIL-9ムテインを含むキメラポリペプチドをコードする場合、コード配列はベクターに含まれ得、望ましい場合は組織特異的プロモーターまたはエンハンサーを含む、適切な調節要素に作動的に連結され得る。コードされたペプチドは、例えば、試料において（例えば標的細胞において）キメラポリペプチドの発現の同定を容易にし得る、ポリヒスチジン（例えばHis6）タグなどのようなペプチドタグに、更に作動的に連結され得る。ポリヒスチジンタグペプチドは、ニッケルイオン、コバルトイオンなどのような二価の陽イオンを用いて検出され得る。追加的なペプチドタグは、例えば、抗FLAG抗体を用いて検出され得るFLAGエピトープ（例えば、Hopp et al., BioTechnology 6:1204, 1998; 米国特許第5,011,912号を参照、各文献は参照により本明細書に組み入れられる）；エピトープに特異的な抗体を用いて検出され得るc-mycエピトープ；ストレプトアビジンまたはアビジンを用いて検出され得るビオチン；およびグルタチオンを用いて検出され得るグルタチオンS-トランスフェラーゼを含む。キメラのIL-4および／またはIL-9ムテインのN末端、C末端、または双方に作動的に連結され得るそのようなタグは、例えば、実質的に精製された形態においてキメラポリペプチドを取得することが望ましい場合、作動的に連結されたキメラポリペプチドの単離を容易にし得る付加的な利点を提供し得る。そのように、本発明のポリヌクレオチドは、所望の量のキメラポリペプチド（例えば治療的使用に十分な量）を取得するための便利な手段を提供し得る。
【００３６】
ベクター中にあり得る本発明のポリヌクレオチドは、宿主細胞に含まれ得、または、膜成分、タンパク質、および脂質のような他の細胞成分を含まず単離され得る。単離されたポリヌクレオチドは、例えば、標準的な核酸精製技術を用いてそのような宿主細胞より取得され得、または、増幅技術（例えばPCR）を用いて、もしくは自動合成機を用いて合成され得る。例えば、制限酵素およびプローブが、IL-4およびIL-9キメラムテインアンタゴニストポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを同定し、かつ単離するために使用され得る。
【００３７】
IL-4およびIL-9キメラムテインアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドは、標的細胞へのポリヌクレオチドの導入を含む、ポリヌクレオチドの操作を容易にし得るベクターに含まれ得る。ベクターは、ポリヌクレオチドを維持するのに有用であるクローニングベクターであり得、または、ポリヌクレオチドに加えて、コードされたキメラアンタゴニストポリペプチドを発現するのに有用な調節要素を含む発現ベクターであり得る。発現ベクターは、例えば、コードするポリヌクレオチドの継続された転写を達成するために必要な発現要素を含み得、または、調節要素は、ベクターにクローン化されるより前にポリヌクレオチドに作動的に連結され得る。
【００３８】
発現ベクター（またはポリヌクレオチド）は、一般に、コードするポリヌクレオチドの恒常的、または、望ましい場合は誘導性もしくは組織特異的もしくは発生段階特異的発現を提供し得るプロモーター配列、ポリA認識配列、およびリボソーム認識部位もしくは内部リボソーム進入部位、または、組織特異的であり得るエンハンサーのような他の調節要素を含み、またはコードする。ベクターはまた、望ましいように、原核生物（例えば細菌)もしくは真核生物(例えば昆虫、酵母(例えばピキア（Pichia））、および／または哺乳動物)の宿主系または双方における複製に必要とされる要素を含み得る。プラスミドベクターおよび、バクテリオファージ、バキュロウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、セムリキ森林ウイルス（semliki forest virus）およびアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスベクターを含むそのようなベクターは、周知であり、かつ、商業的供給源（Promega, Madison WI; Stratagene, La Jolla CA; GIBCO/BRL, Gaithersburg MD; Invitrogen Corp., Carlsbad CA）より購入され得、または当業者によって構築され得る（例えば、Meth. Enzymol., Vol. 185, Goeddel, ed.(Academic Press, Inc., 1990); Jolly, Canc. Gene Ther. 1:51-64, 1994; Flotte, J. Bioenerg. Biomemb. 25:37-42, 1993; Kirshenbaum et al., J. Clin. Invest. 92:381-387, 1993を参照、各文献は参照により本明細書に組み入れられる）。
【００３９】
テトラサイクリン（tet）プロモーターのような誘導性プロモーターは、IL-4およびIL-9ムテイン融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現を駆動するのに特に有用であり得る。テトラサイクリン、またはテトラサイクリン類似体の、tet誘導性プロモーターに作動的に連結されたポリヌクレオチドを含む被験者への投与の際に、コードされたキメラポリペプチドの発現が誘導され、それによってキメラポリペプチドがIL-4、IL-9、および／またはIL-13アンタゴニスト活性をもたらし得る。または、もしくは加えて、ポリヌクレオチドは、組織特異的調節要素、例えば、肺上皮細胞特異的調節要素に作動的に連結され得、これにより、コードされたペプチドの発現が、個体において肺細胞に限定され、または、培養において混合された細胞集団、例えば器官培養において肺細胞に限定される。そのような場合において、コードされたキメラポリペプチドは、キメラポリペプチドが細胞外へ搬出され、そこでサイトカイン応答性細胞に対しアンタゴニスト活性をもたらし得るように、シグナルペプチドを更に含み得る。
【００４０】
ウイルス発現ベクターは、細胞、特に被験者における細胞にポリヌクレオチドを導入するのに特に有用であり得る。ウイルスベクターは、比較的高効率で宿主細胞を感染させ得、かつ特異的な細胞のタイプを感染させ得る利点を提供する。例えば、本発明のキメラポリペプチドアンタゴニストをコードするポリヌクレオチドは、バキュロウイルスベクターにクローン化され得、その後昆虫宿主細胞を感染させるのに使用され得、それによって大量のコードされたキメラポリペプチドを生産する手段を提供する。ウイルスベクターはまた、関心対象の生物の細胞、例えば、哺乳動物、鳥類、または魚類宿主細胞のような脊椎動物宿主細胞に感染するウイルスに由来し得る。ウイルスベクターは、本発明の方法を実行するのに有用なポリヌクレオチドを、標的細胞に導入するために特に有用であり得る。ウイルスベクターは、特定の宿主系、特に哺乳動物系における使用のために開発されてきており、例えば、レトロウイルスベクター、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）に基づくもののような他のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクターなどを含む（Miller and Rosman, BioTechniques 7:980-990, 1992; Anderson et al., Nature 392:25-30 Suppl., 1998; Verma and Somia, Nature 389:239-242, 1997; Wilson, New Engl. J. Med. 334:1185-1187 (1996)参照、各文献は参照により本明細書に組み入れられる。）
【００４１】
ベクターに含まれ得るポリヌクレオチドは、当技術分野において公知の多様な方法のうち任意のものによって、細胞に導入され得る（Sambrook et al., "Molecular Cloning: A laboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press 1989); Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, MD (1987, and supplements through 1995)、各文献は参照により本明細書に組み入れられる）。そのような方法は、例えば、トランスフェクション、リポフェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、および、ウイルスベクターでの感染を含み；および、ポリヌクレオチドの細胞への導入を容易にし得、かつ細胞への導入に先立って分解からポリヌクレオチドを保護し得るリポソーム、マイクロエマルジョンなどの使用を含み得る。特定の方法の選択は、例えば、細胞が培養において単離されているか、または、培養において組織もしくは器官にあるか、またはインサイチューであるかと同様に、ポリヌクレオチドが導入されることになる細胞に依存するであろう。
【００４２】
ウイルスベクターでの感染による細胞へのポリヌクレオチドの導入は、核酸分子をエクスビボまたはインビボで細胞に効率的に導入し得る点で特に有利である（例えば、米国特許第5,399,346号参照、文献は参照により本明細書に組み入れられる。）更に、ウイルスは非常に専門化され、かつ、1種または数種の特異的な細胞のタイプに感染し、かつ増殖する能力に基づいて、ベクターとして選択され得る。このように、天然の特異性は、ベクターに含まれる核酸分子が特異的な細胞のタイプを標的とするのに使用され得る。そのように、HIVに基づくベクターはT細胞を感染させるのに使用され得、アデノウイルスに基づくベクターは、例えば気道上皮細胞を感染させるのに使用され得、ヘルペスウイルスに基づくベクターは、神経細胞を感染させるのに使用させ得る、などである。アデノ随伴ウイルスのような他のベクターは、より広い宿主細胞の範囲を有し得、そのために様々な細胞のタイプを感染させるのに使用され得るが、ウイルス、または非ウイルスベクターはまた、受容体媒介事象を通して標的特異性を変更するために、特異的な受容体またはリガンドで修飾され得る。
【００４３】
本発明のキメラタンパク質は、細胞の応答性に依存して、サイトカイン、特にIL-4、IL-9、および／またはIL-13への細胞の応答性を調節するために使用され得る。一つの態様において、キメラタンパク質は、約0.1nM〜約10μM（例えば、約0.5nM〜約1μM、または約1.0nM〜約100nM）の濃度のIC50（細胞の50％の増殖を阻害する濃度）で、IL-4、またはIL-13、またはIL-4およびIL-13双方への赤白血病細胞（例えばTF-1細胞）の増殖性応答を阻害し得る。もう一つの態様において、キメラタンパク質は、約0.1nM〜約10μM（例えば、約0.5nM〜約1μM、または約1.0nM〜約100nM）のIC50で、IL-4、またはIL-9、またはIL-4およびIL-9双方への巨核芽球性白血病細胞（例えばMo7e細胞）の増殖性応答を阻害し得る。更にもう一つの態様において、キメラタンパク質は、約0.1nM〜約10μM（例えば、約0.5nM〜約1μM、または約1.0nM〜約100nM）のIC50で、B細胞、またはT細胞、またはB細胞およびT細胞双方（例えばヒトB細胞および／またはT細胞）の、IL-4への増殖性応答を阻害し得る。
【００４４】
様々な局面において、サイトカインへの細胞の応答性を調節する方法は、そのような細胞応答性と関連づけられる病理学的状態を予防する方法、および病理学的状態を改善するための治療的方法を提供する。病理学的状態は、例えば、アレルギー性炎症性反応、喘息、および慢性閉塞性肺障害（例えば、気腫および気管支炎）を含む、異常な免疫応答、および／または異常な炎症性応答として明示され得る。従って、本発明は、IL-4および／またはIL-9受容体が障害と関連づけられる細胞において発現している障害、特に哺乳動物（例えばヒト）を含む脊椎動物の障害を処置する方法を提供する。一つの態様において、方法は、IL-4、IL-9および／またはIL-13媒介活性に拮抗するキメラタンパク質を、処置される被験者（例えばヒト）へ投与することによって実行され、そこにおいてキメラタンパク質がIL-4、IL-9および／またはIL-13媒介活性に拮抗するのに十分な量、投与され、それによって病理学的状態を改善する。もう一つの態様において、方法は、IL-4、IL-9および／またはIL-13媒介活性に拮抗するキメラタンパク質をコードする発現可能なポリヌクレオチドを、処置される被験者（例えばヒト）へ投与することによって実行され、そこにおいて、ベクターに含まれ得るポリヌクレオチドが、細胞に入り得るように投与され、そこでキメラポリペプチドがIL-4、IL-9および／またはIL-13媒介活性に拮抗するのに十分な量、発現され得、かつ細胞より放出され得、それによって病理的状態を改善する。
【００４５】
本発明はまた、サイトカイン発現、および／またはサイトカイン、特にIL-4、IL-9、および／またはIL-13への細胞応答性と関連づけられるそのような病理学的状態（例えば肺障害）を患う被験者に投与され得る、薬学的組成物を含む組成物を提供する。そのような本発明の組成物は、例えば、IL-4受容体αポリペプチドおよび／またはIL-9受容体αポリペプチドに特異的に結合し得る（それによってヒトIL-4、IL-9、および／またはIL-13受容体の集合を妨害する）、IL-9RAに作動的に連結されたIL-4RAを含むキメラタンパク質、または、キメラタンパク質をコードするポリヌクレオチド、および、意図された被験者への投与に適した薬学的に許容される担体を含む。本明細書において使用されるとき、「特異的に結合する」という用語は、二つの分子が生理学的条件の下で比較的安定した複合体を形成することを意味する。その用語は、本明細書において、インターロイキンムテイン（例えばIL-4RA）および同族のインターロイキン受容体またはその成分（例えばIL-4受容体αポリペプチド）を含む、インターロイキンおよびその受容体（例えばIL-4およびIL-4受容体）に言及して使用される。特異的結合は、少なくとも約1 x 10-6M、一般に少なくとも約1 x 10-7M、通常は少なくとも約1 x 10-8M、および特に少なくとも約1 x 10-9Mもしくは1 x 10-10Mまたはより大きい解離定数によって特徴づけられ得る。特異的結合は、一般に、例えば、哺乳動物細胞、または他の脊椎生物もしくは無脊椎生物由来の細胞を維持するために使用されるような細胞培養において生じる条件と同様に、ヒトもしくは他の脊椎動物、または無脊椎動物のような生きている個体において生じる条件を含む、生理学的条件の下で安定である。二つの分子が特異的に結合するかどうかを決定するための方法は周知であり、例えば、平衡透析、表面プラズモン共鳴法、ツーハイブリッドアッセイなどを含む。例えば、IL-9RAに作動的に連結されたIL-4RAキメラポリペプチドを含むキメラタンパク質の特異的結合は、インターロイキン（例えばIL-4）のその受容体との結合の妨害を検出すること、インターロイキンの同族の受容体との結合の減少もしくは阻害を検出すること、ならびに／または、機能的なインターロイキン受容体を形成するIL-4および／もしくはIL-9αポリペプチドのIL-2γポリペプチドとの集合の減少もしくは阻害を検出することによって同定され得る。
【００４６】
本明細書において開示されるように、本発明の組成物は、例えば、白血病およびリンパ腫のような癌と同様に、喘息および気管支炎のような肺障害を改善することを含む、細胞のサイトカイン応答性と関連づけられる障害を処置することにおいて使用され得る。そのように、キメラポリペプチドおよびコードするポリヌクレオチドは、サイトカイン（例えばIL-4、IL-9、および／またはIL-13）誘導細胞応答性と関連づけられる病理学的状態を患う被験者を処置することにおける使用のための薬剤として有用である。
【００４７】
薬学的に許容される担体は、当技術分野において周知であり、例えば、水もしくは生理学的に緩衝された生理食塩水のような水性溶液、または、グリコール、グリセロール、オリーブ油のような油、もしくは注射可能な有機エステルのような他の溶剤もしくは媒体を含む。薬学的に許容される担体は、例えば、安定化するように、または抱合体の吸収を増加させるように作用する、生理学的に許容される化合物を含み得る。そのような生理学的に許容される化合物は、例えば、グルコース、スクロース、もしくはデキストランのような炭水化物、アスコルビン酸もしくはグルタチオンのような抗酸化剤、キレート剤、低分子量タンパク質、または他の安定化剤もしくは賦形剤を含む。当業者は、生理学的に許容される化合物を含む、薬学的に許容される担体の選択が、例えば、治療薬の物理化学的特徴、ならびに、例えば、経口的、吸入経由、もしくは静脈内のような非経口的、および、注射、挿管、もしくは当技術分野において公知である他のそのような方法により得る、組成物の投与経路に依存することを承知していると考えられる。薬学的組成物はまた、IL-4およびIL-9キメラムテインポリペプチドに加えて、診断試薬、栄養物質、毒素、または、治療薬、例えば癌の化学療法薬のような、他の試薬も含み得る。
【００４８】
キメラポリペプチドは、水中油型エマルジョン、マイクロエマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソーム、マイクロスフェア、または他のポリマーマトリックスのような、カプセル化材料中に組み込まれ得る（例えば、Gregoriadis, "Liposome Technology", Vol.1 (CRC Press, Boca Raton, FL 1984); Fraley, et al., Trends Biochem. Sci., 6:77 (1981)を参照、各文献は参照により本明細書に組み入れられる）。例えば、リン脂質または他の脂質からなるリポソームは、作製し、かつ投与するのが比較的容易である、非毒性で、生理学的に許容され、かつ代謝可能な担体である。「ステルス（stealth）」リポソーム（例えば、米国特許第5,882,679号；第5,395,619号；および第5,225,212号を参照、各特許は参照により本明細書に組み入れられる）は、本発明の方法を実践するのに有用な薬学的組成物を調製するために特に有用な、そのようなカプセル化材料の例であり、かつ、治療薬が循環において存続する時間を延長するリポソームのような、他の「隠れた（masked）」リポソームが、同様に使用され得る。例えば、陽イオンリポソームはまた、特異的な受容体またはリガンドで修飾され得る（Morishita et al., J. Clin. Invest., 91:2580-2585 (1993)、文献は参照により本明細書に組み入れられる）。加えて、ポリヌクレオチド剤は、例えばアデノウイルス-ポリリジンDNA複合体を用いて細胞に導入され得る（例えば、Michael et al., J. Biol. Chem. 268:6866-6869 (1993)を参照、文献は参照により本明細書に組み入れられる)。
【００４９】
本発明のキメラポリペプチド（またはコードするポリヌクレオチド）を含む薬学的組成物の投与経路は、分子の化学構造に一部依存するであろう。例えば、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドは、消化管において分解され得るため、経口的に投与される際には特に有用でない。しかしながら、例えば、内因性プロテアーゼによる分解をより受けにくくし、または消化管を通してより吸収可能にする、ポリペプチドを化学的に修飾するための方法が、周知である（例えば、Blondelle et al., 前記, 1995; Ecker and Crook, 前記, 1995）。加えて、キメラポリペプチドは、D-アミノ酸を用いて調製され得、または、ペプチド領域の構造を模倣した有機分子であるペプチド模倣薬（peptidomimetics）に基づく；または、ビニロガスペプトイド（vinylogous peptoid）のようなペプトイドに基づく一つまたは複数の領域を含み得る。
【００５０】
本明細書において開示される薬学的組成物は、例えば、吸入経由、経口的、または、静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、包内、腹腔内、気管内、直腸内、槽内、または、例えば、それぞれ皮膚パッチもしくは経皮的イオン導入法を用いる、皮膚を通した受動的もしくは促進された吸収によるような、非経口的を含む、様々な経路によって個体に投与され得る。更に、薬学的組成物は、注射、挿管によって、経口的または局所的に投与され得、後者は、例えば、軟膏の直接適用による受動的であり得、または、例えば、鼻スプレーもしくは吸入剤を用いる（その場合組成物の一つの成分が適切な噴霧剤である）、能動的であり得る。薬学的組成物はまた、例えば、腫瘍に血液を供給する血管中へ静脈内もしくは動脈内に、または、肺障害の処置のために吸入経由で、病理学的状態の部位に投与され得る。
【００５１】
本発明の方法を実施することにおいて投与される薬剤の総量は、単一の投与量として、巨丸剤としてまたは比較的短期間に渡る点滴どちらかによって被験者に投与され得、または、多数の投与量が長期間に渡って投与される、分割処置プロトコールを用いて投与され得る。当業者は、被験者における病理学的状態を処置するための薬学的組成物の量が、投与経路および投与される処置の回数に加えて、被験者の年齢および一般的健康状態を含む多くの要因に依存することを承知していると考えられる。これらの要因を考慮して、当業者は、必要なように特定の投与量を調整すると考えられる。一般に、薬学的組成物の処方、ならびに、投与の経路および頻度は、最初に第一相および第二相臨床試験を用いて決定される。
【００５２】
薬学的組成物は、錠剤、または、溶液もしくは懸濁液形態のような、経口製剤のために製剤され得;または、経腸的もしくは非経口的適用に適する、有機もしくは無機担体、もしくは賦形剤との混合剤を含み得、および、例えば、錠剤、小丸剤、カプセル、坐薬、溶液、エマルジョン、懸濁液、または使用に適する他の形態のための、通常の非毒性で薬学的に許容される担体と共に調合され得る。担体は、上記で開示されたものに加えて、グルコース、ラクトース、マンノース、アカシアゴム、ゼラチン、マンニトール、デンプン糊、三ケイ酸マグネシウム、タルク、コーンスターチ、ケラチン、コロイド状シリカ、ポテトスターチ、尿素、鎖長が中間のトリグリセリド、デキストラン、および、固体、半固体、または液体形態において調製物を製造するための使用に適する他の担体を含み得る。加えて、補助剤、安定化剤、増粘剤、または着色剤および香料、例えばトリウロース（triulose）のような安定化乾燥剤が使用され得る（例えば、米国特許第5,314,695号参照）。
【００５３】
本明細書において開示されるように、本発明の融合タンパク質アンタゴニストは、薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物において提供され得る。薬学的に許容される担体は、好ましくは、非発熱性である。組成物は、単独、または少なくとも一つの他の薬剤（例えば、安定化化合物）との組み合わせで投与され得、かつ、例えば、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、および水を含む、任意の、無菌の生体適合性薬学的担体において、投与され得る。例えば、0.4％生理食塩水、0.3％グリシンなど、様々な水性担体が使用されてもよい。これらの溶液は、無菌であり、かつ、一般に粒子状物質を含まない。これらの溶液は、通常の、周知の滅菌技術（例えば濾過）によって滅菌され得る。組成物はまた、pHおよび緩衝能力のような生理学的条件に近づくように、薬学的に許容される補助物質を含む。薬学的製剤におけるキメラポリペプチドアンタゴニストの濃度は、例えば、約0.5重量％未満（例えば、0.05％、0.1％、または0.25％）〜約20重量％（例えば、1％、2％、3％、4％、5％、10％、または15％）を含んで、望ましいように変化し得、かつ、例えば、流体量、粘度、または、選択される投与の特定の様式に対して当技術分野において公知である他のパラメーターに基づいて選択され得る。望ましい場合、例えば、IL-4および／またはIL-9受容体結合に対して異なった解離定数（Kd）を有するキメラポリペプチドアンタゴニストを含む、二つまたはそれ以上の異なったサイトカインアンタゴニストが、製剤に含まれ得る。
【００５４】
組成物は、単独、または、他の薬剤、薬物、もしくはホルモンとの組み合わせで、患者に投与され得る。薬学的組成物は、活性成分に加えて、活性化合物の薬学的に使用され得る調製物への加工を容易にする賦形剤および補助剤を含む、適した薬学的に許容される担体を含み得る。本発明の薬学的組成物は、例えば、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、鞘内、心室内、経皮的、皮下、腹腔内、気管内、鼻腔内、非経口、局所、舌下、または直腸内を含む、任意の数の経路によって投与され得る。調製時には、薬学的組成物は、指示された条件の処置のために、適切な容器中に置かれ、かつラベルされ得る。そのようなラベルは、例えば、投与の量、頻度、および／または方法に関する情報を含み得る。
【００５５】
本発明はまた、IL-4およびIL-9キメラムテインポリペプチドアンタゴニスト、または、キメラポリペプチドをコードする発現可能なポリヌクレオチドを、IL-4、IL-9、IL-13、またはそれらの組み合わせの受容体への特異的結合を減少させ、または阻害し、それによって被験者における病理学的状態を改善するのに十分な量、被験者に投与することによって、被験者において、IL-4受容体、IL-9受容体、またはIL-13受容体より選択される少なくとも一つの受容体を発現する細胞と関連づけられる病理学的状態を改善する方法を提供する。本明細書において使用されるとき、「改善する」という用語は、病理学的状態に言及して使用される場合、状態と関連づけられる徴候または症状が減らされることを意味する。モニターされる徴候または症状は、特定の病理学的状態に特徴的であろうし、かつ、徴候および状態をモニターする方法と同様に、熟練した臨床医に周知であろう。例えば、病理学的状態が喘息の場合、熟練した臨床医は、気道過敏性のようなパラメーターにおける、および／または、例えば、肥満細胞、好酸球、および／もしくはリンパ球の漸増の検出によることを含む、気道炎症における改善を検出することによって、改善が同定され得ることを承知しているであろう。喘息、気管支炎などのような肺障害の改善は、例えば、キメラポリペプチドまたはコードするポリヌクレオチドの投与の後で呼吸がより楽であることを示す被験者によって、決定され得る。
【００５６】
本明細書において開示されるように、本発明の方法は、サイトカイン、特にIL-4、IL-9および／またはIL-13への細胞の応答性を減少させる、または阻害する手段を提供する。本明細書において使用されるとき、「サイトカインへの細胞の応答性」という用語は、言及される細胞が、IL-4、IL-9、および／またはIL-13に特異的に結合するIL-4、IL-9、および／またはIL-13受容体を発現し、かつ、細胞に対する、または細胞による効果を媒介することを意味する。効果は、例えば細胞増殖およびタンパク質発現を含む、サイトカイン結合と関連づけられる任意の細胞性の効果であり得る。「減少させる、または阻害する」という用語は、いくつかの例において、細胞応答性のレベルが、本発明のキメラポリペプチドアンタゴニストとの接触の際に、特定のアッセイによって検出され得るレベルより下に減少され得ることが認識されるため、本明細書において合わせて使用される。そのように、細胞によるタンパク質の発現が、アッセイの検出レベルより低く減少されるか、または完全に阻害されるかどうかは、そのようなアッセイを用いて決定可能ではない可能性がある。しかしながら、とにかく、キメラポリペプチドアンタゴニストの非存在下での細胞の応答性のレベルと比較して、変化が測定可能であろう。
【００５７】
本方法による改善の影響を受けやすい病理学的状態は、例えば、喘息および慢性閉塞性肺疾患（例えば、気腫および慢性気管支炎）のような肺障害、アレルギー性炎症性応答、および癌（例えば、白血病およびリンパ腫）を含む。例えば、喘息の特徴は、呼吸症状の繰り返される発現；自発的または処置いずれかによって時に可逆的である、変動する気流閉塞；気道過敏性の存在；ならびに、例えば、肥満細胞、好酸球、Tリンパ球、マクロファージ、好中球、および上皮細胞を含む、多くの細胞、および細胞要素が関与する慢性気道炎症、を含む（National Heart, Lung, and Blood Institute: National Asthma Education and Prevention Program. Expert Panel Report Guidelines for the diagnosis and management of asthma. J. Allergy Clin. Immunol. 88:425-534, 1991; National Heart, Lung, and Blood Institute National Asthma Education Program Expert Panel Report II: Guidelines for the diagnosis and management of asthma; 1997. NIH Publication No. 97-4051A参照）。これらの特徴のすべてが、任意の所定の喘息患者に存在する必要は無く、かつ、喘息の診断を確立するための絶対的な「最低標準」は、存在せず、または広く合意されていないが、気道過敏性の存在が、現在の症状および活動的な喘息を有する患者における共通の所見である。
【００５８】
喘息の重症度は、症状の頻度、ピークフロー、および吸入βアゴニストの必要性に基づいて4種類のカテゴリー：軽症間欠型、軽症持続型、中等症持続型、および重症持続型に分類される（Kavuru et al., "Asthma" (The Cleveland Clinic, January 2003)、ワールドワイドウェブ（www）上の"clevelandclinicmeded.com/diseasemanagement/pulmonary/asthma/asthma.htm"で入手可能）。胸部X線写真上の最も共通した所見である過膨張は、診断的または治療的価値を有さない。肺炎、気胸、または気管支内の病変の合併症が疑われない限りは、胸部X線写真は取得されるべきではない。急性喘息と動脈血ガスとの間の重症度の相関は、不十分である。軽症〜中等症の喘息は、呼吸／還流不適合を基礎とする呼吸性アルカローシスおよび軽症の低酸素血症と、典型的に関連づけられる。重症の低酸素血症は、喘息においてはかなり稀である。炭酸正常状態および高炭酸ガス症は、予測される値の通常25％未満のFEV1で、重症の気流閉塞を意味する。
【００５９】
気道過敏症は喘息に特有な特徴であり、吸入された収縮剤アゴニストへの気道の増加した感受性、用量‐反応曲線のより急な勾配、およびアゴニストへのより大きな最大応答からなる（Byrne and Inman, Chest, 2003）。気道応答性の測定は、特に、喘息と一致する症状を有し、かつ、気道閉塞の証拠を有さない患者において、喘息の診断を行うのに有用である。例えば、環境に存在するアレルゲンを含む、吸入されたある刺激物は、気道炎症を増加し、かつ、気道過敏症を増強する。健常な被験者における気道過敏性の変化は、持続型気道過敏症を有する喘息患者の際に見られるものより、非常に小さな規模である。喘息の病因、および、本方法に係る処置による改善は、気管支鏡、気管支肺胞洗浄、気道生検、気道ガスの測定、および熟練した臨床医に公知である他のそのような方法によって、追跡され得る。
【００６０】
治療的利益を達成するのに必要とされるキメラポリペプチドの量は、本明細書において開示される方法、または、当技術分野において公知である他の方法を用いて決定され得る。治療的有効投与量は、治療的有効投与量の非存在下で明白である効力と比較して、障害を有効に処置するのに使用されるアンタゴニスト量のことを意味する。治療的有効投与量は、最初に動物モデル（例えば、ラット、マウス、ウサギ、イヌ、ブタ、または非ヒト霊長類モデル）を用いて評価され得る。動物モデルはまた、適切な濃度範囲および投与経路を決定するために有用であり得、投与のために有用な投与量および経路が、その後、例えば臨床試験において、ヒトに対して同定され得る。
【００６１】
例えばED50（すなわち、特定の集団の50％において治療的に有効である投与量）、およびLD50（集団の50％が致死である投与量）を含む、IL-4およびIL-9キメラムテインアンタゴニストの、治療的有効性および毒性は、細胞培養または実験動物において、標準的な薬学的手順を用いて決定され得る。治療効果に対する毒性の量の割合（すなわち治療指数）は、LD50／ED50という比として表わされ得る。一般に、大きな治療指数を示す薬学的組成物が好ましい。動物研究より得られたデータは、ヒトの使用のために投薬量の範囲を定式化するのに使用される。そのような組成物に含まれる投薬量は、好ましくは、毒性がほとんど無い、または無い、ED50を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は、使用される剤形、患者の感受性、および投与経路に依存して、この範囲内で変化する。
【００６２】
ヒト被験者を処置するための正確な投薬量は、例えば、処置を必要とする患者に関する要因を考えて、従業者によって決定されるであろう。投薬量および投与は、アンタゴニストの十分なレベルを提供し、または所望の効果を維持するために調整される。考慮に入れられ得る要因は、疾患状態の重症度、被験者の一般的健康状態、被験者の年齢、体重、および性別、飲食物、投与の時間および頻度、薬物の組み合わせ、反応感受性、および治療への耐性／応答を含む。長期間作用する薬学的組成物は、特定の製剤の半減期およびクリアランス率に依存して、3〜4日毎、毎週、または2週間に１回、投与され得る。本発明のアンタゴニストの有効なインビボ投薬量は、例えば、患者の体重に対して、約1μg/kg〜約5mg/kg、または約10μg/kg〜約1mg/kg、または約100〜250μg/kgを含む、約0.1〜50mg/kgの範囲であり得る。
【００６３】
以下の実施例は、本発明を例証するが限定しないことを意図する。
【００６４】
実施例1
IL-4およびIL-9キメラムテインアンタゴニストはサイトカイン誘導細胞増殖を阻害する
本実施例は、IL-4およびIL-9キメラムテインアンタゴニストが、IL-4および／またはIL-9による細胞増殖を阻害し得ることを証明する。
【００６５】
配列
タグとIL-4およびIL-9成分の間にTEVプロテアーゼ切断部位を含む、ポリヒスチジンタグが付加されたIL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:1）およびIL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:3）キメラムテインアンタゴニストをコードする例示的なポリヌクレオチドが、コードされたポリペプチド（それぞれSEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4）と同様に提供される。また提供されるのは、シグナル配列を欠くIL-9RA/IL-4RAキメラポリペプチド（SEQ ID NO:5）；および、シグナル配列を含むIL-9RA/IL-4RAキメラムテインアンタゴニストをコードするポリヌクレオチド配列（SEQ ID NO:6）、および、シグナル配列を含むコードされたポリペプチド（SEQ ID NO:7）である。
【００６６】
タンパク質精製
ポリペプチドの精製は、IL-4RA精製によって例示される。抗IL-4抗体カラムは、20％エタノールにおいて4℃で保存された。抗IL-4抗体カラムは、室温で使用され、かつランニング緩衝液で平衡化された。直径1.5cmのカラムに対して、1分あたり約2mlの流速が使用された。緩衝液は以下であった：「ランニング緩衝液」はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）；「溶出緩衝液」は200mMグリシン、pH2.8；「中和緩衝液」はトリス塩基の飽和溶液；「クリーニング溶液」は24％エタノール、2％酢酸であった。
【００６７】
IL-4RAポリペプチドの精製は、カラムの3倍容量のクリーニング溶液をカラムを通して流し、続いてカラムの10倍容量のPBSを流すことによって行われた。濾過された試料がロードされ、その後カラムの10倍容量のPBSがカラムに通された。IL-4RAは、溶出緩衝液を用いて溶出され；溶液は採取後直ちに数滴のトリス塩基で中和された。これらの段階が、各精製作業について繰り返された。
【００６８】
HisTevタグが付加されたIL-9RAおよびIL-4RAキメラ受容体アンタゴニストの精製は、金属イオン（例えばニッケル）でチャージされたキレート樹脂（例えばPharmacia Chelating SEPHAROSE樹脂）を用いて行われた。キレート樹脂は、タグが付加されたタンパク質の非特異的結合を防ぐために、500mM NaClが追加されたPBS（pH7.0）で平衡化された。キメラ受容体アンタゴニストを発現する細胞培養の上清は、30,000ダルトン以上の分子量カットオフを有するスピンカラムを用いて濃縮され、その後PBS（pH7.2）で20倍希釈されて、2回目の濃縮をされた。2回目の希釈が行われ、約400倍の緩衝液交換を達成するために、上清は3回目の濃縮をされた。濃縮されて交換された上清は、固定化金属イオンクロマトグラフィー（IMAC）カラムに適用され、かつ、カラムの数倍容量の平衡緩衝液で洗浄された。カラムに結合したタグが付加されていないタンパク質不純物は、10〜20mMイミダゾール（pH7.5）に調整された平衡緩衝液で洗浄された。HisTevタグの付加されたIL-9RAおよびIL-4RAキメラ受容体アンタゴニストは、その後、250mM イミダゾール（pH7.5）に調整されたPBSを用いてカラムより溶出された。
【００６９】
IL-4およびIL-13拮抗についてのTF-1細胞増殖アッセイ
TF-1細胞は、増殖によっていくつかの炎症促進性サイトカインに応答し、そのためにサイトカイン生物活性を評価するのに使用され得る赤白血病細胞株である。TF-1細胞の、IL-4（0.5ng/ml、0.033nM）またはIL-13（5ng/ml、0.416nM）への増殖性応答が、His6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）およびHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）キメラポリペプチドの機能的アンタゴニスト活性を評価するのに使用された。キメラアンタゴニストポリペプチドが翻訳後にシグナルペプチドを除去する細胞において発現されたことに、注意されるべきである。そのように、本実施例においてはHis6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）およびHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）について言及されるが、本実験において使用されたキメラポリペプチドは、SEQ ID NO:2およびSEQ ID NO:4それぞれにおいてアミノ酸残基1〜18位に示されたシグナルペプチドを欠く。
【００７０】
TF-1細胞は、96ウェルプレート（1x104/ウェル、100μl容量）で3日間、IL-4またはIL-13、およびHis6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）またはHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）を含む、または含まないRPMI+10％血清で培養された。GM-CSF処理が、陽性対照として使用された。最終判断の24時間前に、10μlのAlamarBlue（商標）色素（10％容量）が各ウェルに添加された。WALLAC Victor 2分光蛍光光度計を用いて、530/590nmで蛍光が測定された。「50％阻害濃度」（IC50）は、候補アンタゴニスト分子の用量滴定に基づいて計算された。IL-4およびIL-13存在下でHis6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）およびHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）を用いて得られたIC50値が、表1に示される（下記）。
【００７１】
更なる実験において、タグの付加されていないIL-9RA/IL-4RA（例えば、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:7参照;それぞれシグナルペプチドを欠く、および含むムテインアンタゴニスト）のTF-1細胞のIL-4誘導増殖を阻害する能力。表1に示されるように、タグが付加されていないIL-9RA/IL-4RAキメラポリペプチドは、0.6237nMのIC50（n=3）を有していた。
【００７２】
これらの結果は、IL-4RAおよびIL-9RAキメラムテインポリペプチドが、赤白血病細胞のIL-4および／またはIL-13誘導細胞増殖のアンタゴニストとして作用することを証明する。
【００７３】
IL-4およびIL-9拮抗についてのMo7e細胞増殖アッセイ
Mo7e細胞は、TF-1細胞のように、増殖を介していくつかの炎症促進性サイトカインに応答する、巨核芽球性白血病細胞株である。Mo7e細胞はまた、IL-4に加えてIL-9にも増殖性応答を示す。Mo7e細胞の、IL-9（0.25ng/ml、17.8pM）およびIL-4（0.5ng/ml、0.033nM）への増殖性応答がまた、His6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）およびHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）キメラポリペプチドの機能的アンタゴニスト活性を評価するために検討された。Mo7e細胞株は、the Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（Braunschweig, Germany）より取得され、10ng/ml GM-CSF、およびペニシリンを含む10％胎児ウシ血清添加RPMI-1640（RPMI-10）で維持された。
【００７４】
実験に先立って、Mo7e細胞のGM-CSFを一晩欠乏させ、RPMI-10細胞培養培地で104細胞/ウェル、総容量100ul/ウェルになるようにプレーティングした。細胞は、His6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）またはHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）に加えて野生型ヒトIL-9またはIL-4で3日間処理された。GM-CSF処理が、陽性対照として使用された。最終判断の24時間前に、10μlのAlamarBlue（商標）色素（10％容量）が各ウェルに添加された。WALLAC Victor 2分光蛍光光度計を用いて、530/590nmで蛍光が測定された。IC50は、候補アンタゴニスト分子の用量滴定に基づいて計算された。野生型IL-9または野生型IL-4の存在下でHis6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）およびHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）キメラポリペプチドを用いて得られたIC50値が、表2に示される（下記）。
【００７５】
Mo7e細胞のIL-9誘導増殖を阻害する、タグが付加されていないIL-9RA/IL-4RA（例えば、SEQ ID NO:5およびSEQ ID NO:7）の能力もまた、検討された。表2に示されるように、タグが付加されていないIL-9RA/IL-4RAキメラポリペプチドは、29.625nMのIC50（n=2）を有していた。
【００７６】
これらの結果は、IL-4RAおよびIL-9RAキメラムテインポリペプチドが、巨核芽球性白血病細胞のIL-4および／またはIL-9誘導細胞増殖のアンタゴニストとして作用することを証明する。
【００７７】
プライマリー（primary）T細胞増殖アッセイ
T細胞は、いくつかの炎症性細胞経路の応答を演出する、アレルギー性免疫応答の重要な成分であり、ヒトにおいて喘息の病因に関与する。プライマリーT細胞のIL-4への増殖性応答が、細胞をHis6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）またはHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）キメラポリペプチドで前処理した後に評価された。T細胞は、末梢血より単離され、芽球の形成を誘導するためにPHA-Pで4日間処理された。細胞は洗浄されて、96ウェルプレート（ウェルあたり105細胞）に播種された。フィトヘマグルチニン（PHA）T細胞芽球は、様々な濃度のキメラムテインアンタゴニストポリペプチド存在下で、IL-4（10ng/ml、0.667nM）で3日間刺激された。インキュベーションの最後の20時間におけるトリチウム標識チミジンの取り込みが、増殖の指標として使用された。
【００７８】
野生型IL-4の存在下でHis6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）およびHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）を用いて得られたIC50値が、表3に示される（下記）。これらの結果は、IL-4RAおよびIL-9RAキメラムテインポリペプチドが、IL-4誘導T細胞増殖のアンタゴニストとして作用することを証明する。
【００７９】
プライマリーB細胞増殖アッセイ
T細胞はB細胞の増殖および分化をもたらす。B細胞は、抗体産生の原因であり（分化した形質細胞として）、かつ、喘息患者においてT細胞活性と非常に強く関連づけられる。プライマリーB細胞のIL-4への増殖性応答が、His6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）およびHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）の後に検討された。B細胞は、末梢血より単離され、抗CD40モノクローナル抗体で処理された。細胞は、96ウェルプレートに播種されて（ウェルあたり105細胞）、様々な濃度のムテインアンタゴニスト分子存在下で、IL-4（10ng/ml、0.667nM）で3日間刺激された。インキュベーションの最後の20時間におけるトリチウム標識チミジンの取り込みが、増殖の指標として使用された。
【００８０】
野生型IL-4の存在下でHis6TEV-IL-4RA/IL-9RA（SEQ ID NO:2）およびHis6TEV-IL-9RA/IL-4RA（SEQ ID NO:4）を用いて得られたIC50値が、表3に示される（下記）。これらの結果は、IL-4RAおよびIL-9RAキメラムテインポリペプチドが、IL-4誘導B細胞増殖のアンタゴニストとして作用することを証明する。
【００８１】
（表１）TF-1細胞増殖アッセイにおけるIL-9およびIL-4キメラアンタゴニストムテインの生物活性評価
2008513518.tif 000002
*括弧内の数字はSEQ ID NO:
【００８２】
（表２）Mo7e細胞増殖アッセイにおけるIL-9およびIL-4キメラアンタゴニストムテインの生物活性評価
2008513518.tif 000003
*括弧内の数字はSEQ ID NO:
【００８３】
（表３）プライマリーT細胞およびB細胞増殖アッセイにおけるIL-9およびIL-4キメラアンタゴニストムテインの生物活性評価
2008513518.tif 000004
*括弧内の数字はSEQ ID NO:
【００８４】
引用された参照文献
以下の各論文は、参照により本明細書に組み入れられる。
1. Ying et al., J.Immunol.158: 3539-3544, 1997.
2. Huang et al., J.Immunol.155: 2688-2694, 1995.
3. Ulbrecht et al., J Allergy Clin Immunol 199:828-836, 1997.
4. Postma et al., New Engl.J.Med.333:894-900, 1995.
5. Dong et al., Eur J Immunol 29:2130-2139, 1999.
6. Longphre et al., J Clin Invest 104: 1375-1382, 1999.
7. Zhu et al., J.Clin.Invest.103: 779-788, 1999.
8. Henderson et al., J.Immunol.164: 1086-1095, 2000.
【００８５】
本発明は上記の実施例に関して記述されてきたが、修飾および変化は本発明の精神および範囲内に包含されると理解されるであろう。従って、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【配列表】
2008513518000001.app