(57)【要約】本発明は、被験体に送達するための活性物質をカプセル化するために用いられ得る生分解性の粒子（例えば、三次元粒子）およびミセルを提供する。本発明はさらに、このような粒子およびミセルを生成および送達するための方法を提供する。さらに、本発明は、これらの新規の粒子およびミセルの使用を含むワクチン接種の戦略を提供する。本発明によって、ケタール基を含む生分解性疎水性ポリケタール重合体が提供され、ここで、該重合体の各ケタール基は、該重合体骨格内に、２つの酸素原子を有する。
2008540558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ケタール基を含む生分解性疎水性ポリケタール重合体であって、ここで、該重合体の各ケタール基は、該重合体骨格内に、２つの酸素原子を有する、重合体。
【請求項２】
請求項１に記載のポリケタール重合体を含む生分解性粒子。
【請求項３】
さらに１つ以上の活性物質を含む、請求項２に記載の粒子。
【請求項４】
請求項１に記載の重合体であって、ここで、あるケタール基は、２，２−ジオキシプロピル基である、重合体。
【請求項５】
請求項１に記載の重合体であって、ここで、あるケタール基は、アルキル基、アリール基およびシクロアルキル基からなる群から選択される基に結合している、重合体。
【請求項６】
請求項１に記載の重合体であって、ここで、あるケタール基は、１，４−ジメチルベンゼン基または１，４−ジメチルシクロヘキシル基に結合している、重合体。
【請求項７】
請求項１に記載の重合体であって、ここで、該重合体は、ポリ（１，４−フェニレン−アセトン  ジメチレン  ケタール）またはポリ（１，４−シクロヘキサン−アセトン  ジメチレン  ケタール）である、重合体。
【請求項８】
請求項２に記載の粒子であって、ここで、該粒子は、ナノ粒子またはマイクロ粒子である、粒子。
【請求項９】
請求項８に記載の粒子であって、ここで、該粒子は、約５０〜１０００ｎｍのサイズである、粒子。
【請求項１０】
請求項８に記載の粒子であって、ここで、該粒子は、約２００〜６００ｎｍのサイズである、粒子。
【請求項１１】
請求項３に記載の粒子であって、ここで、該活性物質は、治療剤、予防剤または診断用薬剤である、粒子。
【請求項１２】
請求項１１に記載の粒子であって、ここで、前記治療剤は、免疫調節剤である、粒子。
【請求項１３】
請求項１２に記載の粒子であって、ここで、前記免疫調節剤は、
ａ．ＴＬＲ２、３、４、５、７、８、９、１０および１１に対するリガンドのいずれかまたはその組み合わせ、
ならびに
ｂ．樹状細胞、マクロファージまたは抗原提示細胞内の調節経路のインヒビター
ｃ．ＲＩＧ−１、ｄｅｃｔｉｎ−１およびＤＣ−ＳＩＧＮを含む任意のＣ型レクチン、またはキャタピラタンパク質に対するリガンド
からなる群から選択される、粒子。
【請求項１４】
請求項１３に記載の粒子であって、ここで、前記インヒビターは、（ａ）ＥＲＫ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｆｏｘｐ３、ＰＩ３キナーゼ、ＪＮＫ、ｐ３８、ＮＦ−Ｋｂ、ＳＴＡＴ  １、ＳＴＡＴ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＦＮ−αのシグナリングのインヒビター；または（ｂ）ＳＯＣＳ  １、２、３、もしくは他のＳＯＣＳタンパク質のインヒビターからなる群から選択される、粒子。
【請求項１５】
請求項３に記載の粒子を生成およびカプセル化するための方法であって、
ａ．ケタールおよびジオールまたは不飽和アルコールの疎水性重合体を形成する工程；ならびに
ｂ．１つ以上の活性物質の存在下で、該（ａ）の重合体の粒子を形成し、それによって、請求項３に記載の該粒子を生成およびカプセル化する工程を包含する、方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記ケタールは、２，２−ジメトキシプロパンである、方法。
【請求項１７】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記ジオールは、アルキルジオール、アリールジオールおよびシクロアルキルジオールからなる群から選択される、方法。
【請求項１８】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記ジオールは、１，４−ベンゼンジメタノールまたは１，４−シクロヘキサンジメタノールである、方法。
【請求項１９】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記（ａ）の疎水性重合体は、ポリ（１，４−フェニレン−アセトン  ジメチレン  ケタール）またはポリ（ｌ，４−シクロヘキサン−アセトン  ジメチレン  ケタール）である、方法。
【請求項２０】
請求項１５に記載の方法であって、ここで、前記活性物質は、治療剤、予防剤または診断用薬剤である、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、ここで、前記治療剤は、免疫調節剤である、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、ここで、前記免疫調節剤は、
ａ．ＴＬＲ２、３、４、５、７、８、９、１０および１１に対するリガンドのいずれかまたはその組み合わせ、
ｂ．樹状細胞、マクロファージまたは抗原提示細胞内の調節経路のインヒビター、
ｃ．ＲＩＧ−１、ｄｅｃｔｉｎ−１およびＤＣ−ＳＩＧＮなどの任意のＣ型レクチン、または任意のキャタピラタンパク質に対するリガンドからなる群から選択される、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、ここで、前記インヒビターは、（ａ）ＥＲＫ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｆｏｘｐ３、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、ｐ３８、ＮＦ−Ｋｂ、ＳＴＡＴ  １、ＳＴＡＴ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＦＮ−αのシグナリングのインヒビターからなる群から選択されるか；あるいは（ｂ）ＳＯＣＳ  １、２、もしくは３または任意のＳＯＣＳタンパク質のインヒビターである、方法。
【請求項２４】
請求項１５に記載の方法により生成される生分解性粒子。
【請求項２５】
多数の重合体を含む生分解性架橋ミセルであって、ここで、該重合体は、外部架橋剤により架橋され、ここで、該外部架橋剤は、（ａ）少なくとも２つのチオール基または（ｂ）抗原を含む、ミセル。
【請求項２６】
さらに１つ以上の活性物質を含む、請求項２５に記載のミセル。
【請求項２７】
請求項２５に記載のミセルであって、ここで、前記重合体は、架橋可能なブロック共重合体またはグラフト共重合体である、ミセル。
【請求項２８】
請求項２６に記載のミセルであって、ここで、前記活性物質は、ポリヌクレオチドである、ミセル。
【請求項２９】
請求項２７に記載のミセルであって、ここで、前記ブロック共重合体は、ＰＥＧを含む重合体である、ミセル。
【請求項３０】
請求項２９に記載のミセルであって、ここで、前記ＰＥＧは、ＰＥＧ−ポリ（リジン−チオ−ピリジル）である、ミセル。
【請求項３１】
請求項２５に記載のミセルであって、ここで、前記抗原は、ＨＩＶ抗原である、ミセル。
【請求項３２】
請求項２６に記載のミセルであって、ここで、前記活性物質は、治療剤、予防剤または診断用薬剤である、ミセル。
【請求項３３】
請求項３２に記載のミセルであって、ここで、前記治療剤は、免疫調節剤である、ミセル。
【請求項３４】
請求項３３に記載のミセルであって、ここで、前記免疫調節剤は、
ａ．ＴＬＲ２、３、４、５、７、８、９、１０および１１に対するリガンドのいずれかまたはその組み合わせ、
ｂ．樹状細胞、マクロファージまたは抗原提示細胞内の調節経路のインヒビター、
ｃ．ＲＩＧ−１、ｄｅｃｔｉｎ−１およびＤＣ−ＳＩＧＮなどの任意のＣ型レクチン、または任意のキャタピラタンパク質に対するリガンドからなる群から選択される、ミセル。
【請求項３５】
請求項３４に記載のミセルであって、ここで、前記インヒビターは、（ａ）ＥＲＫ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｆｏｘｐ３、ＰＩ３キナーゼ、ＪＮＫ、ｐ３８、ＮＦ−Ｋｂ、ＳＴＡＴ  １、ＳＴＡＴ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＦＮ−αのシグナリングのインヒビターからなる群から選択されるか；あるいは（ｂ）ＳＯＣＳ  １、２、もしくは３、または任意のＳＯＣＳタンパク質のインヒビターである、ミセル。
【請求項３６】
請求項２５に記載のミセルを生成するための方法であって、以下の工程：
ａ．ミセルを形成するように、目的の重合体を反応させる工程；および
ｂ．該ミセルと外部架橋剤とを架橋させる工程を包含する、方法。
【請求項３７】
請求項３６に記載の方法であって、ここで、工程ａ）において、前記ミセルを形成するように、前記目的の重合体は、１つ以上の活性物質の存在下で反応させられる、方法。
【請求項３８】
請求項３６に記載の方法であって、ここで、前記目的の重合体は、架橋可能なブロック共重合体である、方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、前記活性物質は、ポリヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡである、方法。
【請求項４０】
請求項３８に記載の方法であって、ここで、前記ブロック共重合体は、ＰＥＧを含む重合体である、方法。
【請求項４１】
請求項４０に記載の方法であって、ここで、前記ＰＥＧは、ＰＥＧ−ポリ（リジン−チオ−ピリジル）である、方法。
【請求項４２】
請求項３７に記載の方法であって、ここで、前記活性物質は、治療剤、予防剤または診断用薬剤である、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、ここで、前記治療剤は、免疫調節剤である、方法。
【請求項４４】
請求項４３に記載の方法であって、ここで、前記免疫調節剤は、
ａ．ＴＬＲ２、３、４、５、７、８、９、１０および１１のいずれかまたはその組み合わせに対するリガンド、ならびに
ｂ．樹状細胞、マクロファージまたは他の抗原提示細胞内の調節経路のインヒビター、
ｃ．ＲＩＧ−１、任意のＣ型レクチン（例えば、ｄｅｃｔｉｎ−１およびＤＣ−ＳＩＧＮを含む）、または任意のキャタピラタンパク質に対するリガンドからなる群から選択される、方法。
【請求項４５】
請求項４４に記載の方法であって、ここで、前記インヒビターは、（ａ）ＥＲＫ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｆｏｘｐ３、ＰＩ３キナーゼ、ＪＮＫ、ｐ３８、ＮＦ−Ｋｂ、ＳＴＡＴ  １、ＳＴＡＴ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＦＮ−αのシグナリングのインヒビターからなる群から選択されるか；あるいは（ｂ）ＳＯＣＳ  １、２、もしくは３、任意のＳＯＣＳタンパク質のインヒビターである、方法。
【請求項４６】
請求項３６に記載の方法により生成される生分解性ミセル。
【請求項４７】
請求項３に記載の粒子を被験体内へ投与する工程を包含する、活性物質を該被験体に送達するための方法であって、該粒子は、その中の該活性物質が、放出され、そして該被験体に送達されるように、該被験体内で分解される、方法。
【請求項４８】
請求項２５に記載のミセルを被験体内へ投与する工程を包含する、活性物質を該被験体に送達するための方法であって、該ミセルは、その中の該活性物質が、放出され、そして該被験体に送達されるように、該被験体内で分解される、方法。
【請求項４９】
請求項４７または４８に記載の方法によって、疾患または障害に作用し得る活性物質を送達することにより、該疾患または障害を患う被験体を処置する方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、ここで、前記疾患または障害は、自己免疫疾患、アレルギー疾患、感染症、糖尿病および癌からなる群から選択される、方法。
【請求項５１】
請求項５０に記載の方法であって、ここで、前記感染症は、ＨＩＶ、マラリア、ＴＢ、ＳＡＲＳ、炭疽、エボラ、インフルエンザ、トリインフルエンザおよびＨＣＶからなる群から選択される、方法。
【請求項５２】
請求項５０に記載の方法であって、ここで、前記自己免疫疾患は、狼瘡、慢性関節リウマチ、乾癬、喘息およびＣＯＰＤからなる群から選択される、方法。
【請求項５３】
請求項３に記載の粒子を含む薬学的組成物。
【請求項５４】
請求項２５に記載のミセルを含む薬学的組成物。
【請求項５５】
ミセル中に容易にカプセル化され得る、可逆的に改変された活性物質。
【請求項５６】
ミセル中に容易にカプセル化されるようにタンパク質を可逆的に改変するための方法であって、該タンパク質のアミノ基を、該タンパク質における荷電部位の数を増加させる物質と反応させ、それによって、該タンパク質の電荷を変える工程を包含する、方法。
【請求項５７】
請求項５６に記載の方法であって、ここで、前記荷電物質は、シス−アコニチルである、方法。
【請求項５８】
請求項３に記載の粒子であって、ここで、前記活性物質は、タンパク質、ペプチド、核酸または低分子である、粒子。
【請求項５９】
請求項５８に記載の粒子であって、ここで、前記核酸は、ｓｉＲＮＡである、粒子。
【請求項６０】
請求項２５に記載のミセルであって、ここで、前記活性物質は、タンパク質、ペプチド、核酸または低分子である、ミセル。
【請求項６１】
請求項６０に記載のミセルであって、ここで、前記核酸は、ｓｉＲＮＡである、ミセル。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願を通じて、様々な刊行物が、参考文献として引用されている。これらの刊行物の開示の全体は、本発明が属する最新技術をより十分に説明するために、本明細書により参考として本出願に援用されている。
【０００２】
本発明は、ＮＩＨ／ＮＩＡＩＤの助成金ＡＩ０４８６３８、ＡＩ０５６４４９９、ＡＩ０５６９４７、ＡＩ０５７１５７、ＡＩ０５７２６６０１、およびＮＩＨ／ＮＩＤＤＫの助成金ＤＫ０５７６６５の下の政府支援によって、行われた。政府は、本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、活性物質（例えば、（ｉ）ワクチン；（ｉｉ）免疫調節剤（生得免疫細胞（例えば、樹状細胞）の機能を調節するＴＬＲリガンドもしくは合成分子、または細胞（例えば、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞）内のシグナリングネットワークを調節する合成分子もしくはｓｉＲＮＡを含む）および／あるいは；（ｉｉｉ）生得免疫および獲得免疫を調節するように、治療用環境または予防用環境において、抗原提示細胞を標的化する薬物）を送達するための戦略に基づいた粒子およびミセルに関する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
（ワクチン接種のために生得免疫を利用する）
免疫系の特徴は、質的に異なる型の免疫反応を惹起する能力である。従って、例えば、Ｔヘルパー１（すなわちＴｈ１）免疫反応は、ウイルス感染細胞または腫瘍を殺傷する細胞傷害性「キラー」Ｔ細胞を刺激する。反対に、Ｔヘルパー２（すなわち、Ｔｈ２）反応は、抗体産生（特に、細胞外の寄生虫もしくは細菌または毒素に対する保護を付与するＩｇＥ抗体の分泌）と関連している。さらに、Ｔ調節性反応は、強すぎる免疫反応を抑制し得、従って、アレルギー、自己免疫、移植片拒絶、またはセプシス様症状により引き起こされる免疫病理学症状を制限する。このような広範な型の免疫反応の存在、ならびにウイルス、腫瘍、細胞外の寄生虫および細菌に対する有効な保護を付与すること、ならびにアレルギー、自己免疫、移植およびセプシスにおける有害な免疫反応を調節することにおけるそれらの特異な役割を考慮に入れると、近代免疫学の「ロゼッタ石」は、様々な臨床上環境における有効な免疫反応を最適に誘導する方法を学ぶことである。
【０００５】
この意味において、免疫学における最近の進歩は、免疫反応の質と量との両者を制御することにおける生得免疫系の根本的な役割を明らかにした（非特許文献１）。このように、免疫系は、可溶性の分解された形態で注射されるほとんどの外来性のタンパク質に対して非反応性であるが、「アジュバント」と呼ばれる免疫刺激物質と一緒に注射される場合、これらの外来性のタンパク質は、強い免疫を誘導し得ることが、ずっと前から知られてきた。実際、アジュバントの本質は、その後の特定の型の免疫反応を決定するものであり、この特定の型の免疫反応は、細胞傷害性Ｔ細胞反応、抗体反応、または特定のクラスのＴヘルパー反応に対して偏し得ることが公知であった。（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献１）。アジュバントの重要性にも拘わらず、米国において臨床上の使用を許可されているアジュバントは、ミョウバン１つのみしか存在せず、そしてほとんどの他の実験的なアジュバントは、免疫細胞の強力な活性化を誘導するが、毒性をもまたもたらす、微生物または細菌の粗抽出物からなる。最近まで、このようなアジュバントの作用機構は、理解されていなかった。しかしながら、生得免疫における最近の進歩は、アジュバントがどのように作用するのかを理解することに関して概念的な枠組みを提供してきた。この問題の中核は、樹状細胞（ＤＣ）として公知の細胞の、希少であるが、広く分布したネットワークであり、これは、生得免疫系の必須構成成分を構成する。「天然のアジュバント」と呼ばれているＤＣは、微生物およびウイルスの構成成分を認識し得るレセプターを発現する。このようなレセプターとしては、微生物の刺激を「感知」し得、そしてＤＣおよび他の免疫細胞を活性化し得るＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）、Ｃ型レクチン、およびキャタピラタンパク質（ＣＡＴＴＥＲＰＩＬＬＡＲ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられる（非特許文献２；非特許文献３；非特許文献１）。ＤＣが、免疫反応の質および量を調整することに必須の役割を果たすことは、今や明らかである。
【０００６】
現在、哺乳類に関して記載されている約１３個のＴＬＲが、存在する。ＤＣ上の異なるＴＬＲを活性化することは、質的に異なる型の免疫反応を誘導する（前出のＰｕｌｅｎｄｒａｎら，２００１年；前出のＤｉｌｌｏｎら，２００４年；非特許文献４；非特許文献５）。従って、殆どのＴＬＲを活性化することは、Ｔｈ１反応を誘導し得；ＴＬＲ３、７または９を活性化することは、ウイルス感染細胞および腫瘍を殺傷する細胞傷害性Ｔ細胞を誘導し得；そして得られる証拠は、ＴＬＲ２を活性化することが、（ウイルスまたは細胞外の細菌もしくは寄生虫に対する保護を提供する抗体反応に関連している）Ｔｈ２反応、または（強すぎる免疫反応を抑制し、従って、アレルギー、自己免疫、セプシス、および移植における制御できない免疫に対する保護を提供する）Ｔ調節性反応もしくは免疫寛容を生じる反応までも誘導することを示唆する。このように、ＤＣならびにＴＬＲおよび他の認識レセプターは、ワクチン学者および薬物開発者にとって魅力的な免疫調節の標的を代表する。従って、生得免疫系（例えば、ＤＣおよびＴＬＲ）の基本的要素を開発する方法を学ぶことは、新規の薬物およびワクチンの開発において、最も重要である。
【０００７】
この概念から導出される重要な結論は、（最初に記録されたエドワード  ジェンナーのワクチン接種試験以来）過去２００年にわたり開発されてきたワクチンの大部分が、実験的に開発されてきたということである。従って、様々な災い（例えば、天然痘、ポリオ、ＴＢおよび黄熱病）を制御することにおけるワクチンの成功にも拘らず、我々は、これらのワクチンがどのようにこのような有効な免疫を刺激するのかに対する科学的な理由について、全く知識を有していない。例えば、黄熱病ワクチン１７Ｄ［ＹＦ−１７Ｄ］は、最も有効な公知のワクチンの１つである。６５年よりも前の黄熱病ワクチン１７Ｄの開発以来、このワクチンは、世界中の４億人を超える人々に投与されてきた。その成功にも拘らず、その作用機構は、知られていない。従って、上記のように、ここ６年ほどの間に起こった生得免疫における目を見張る進歩は、我々に、２１世紀の新興感染症および再興感染症に対する将来のワクチンを考案するために、このような知識を用いるという視点で、このような「黄金基準（ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）」ワクチンの作用方法（ｍｏｄｕｓ  ｏｐｅｒａｎｄｉ）を理解するために用いる新しい見解を提供する。この意味において、我々の最近の知見は、非常に有効な黄熱病ワクチン（ＹＦ−１７Ｄ）が、ＤＣ、および多数のＴＬＲ（ＴＬＲ２、７、８および９を含む）の強力な刺激因子であることを示唆する（非特許文献６）。異なるＴＬＲにより引き起こされる異なる型の免疫反応（前出のＰｕｌｅｎｄｒａｎら，２００１年；非特許文献４；前出のＤｉｌｌｏｎら，２００４年；非特許文献５）を考慮に入れた上で、多数のＴＬＲを活性化することにより、ＹＦ−１７Ｄが、広いスペクトルの免疫反応を誘導していることを推測することは、魅力的であった。実際、我々のデータは、ＹＦ−１７Ｄが、広いスペクトルの生得免疫反応および獲得免疫反応（Ｔｈ１細胞、Ｔｈ２細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、中和抗体）を引き起こし、異なるＴＬＲが、異なる型のこの多価免疫を制御することを示唆する（非特許文献６）。このような広いスペクトルの免疫反応を誘発することはまた、現在ワクチンが存在しない他の感染（例えば、ＨＩＶ、ＨＣＶ、マラリア、ＴＢ、インフルエンザ、炭壊およびエボラ）に対する、または腫瘍に対するワクチンを設計するのに有利である可能性がある。従って、新興感染または再興感染に対する将来のワクチンを設計するための戦略は、多岐にわたる免疫反応を誘導するために、多数のＴＬＲリガンドおよび抗原、ならびに免疫調節剤を組み込むことから利益を得うる。従って、重要な挑戦は、インビボでこのような免疫調節剤を送達する能力を有する送達システムの開発である。
【０００８】
（新規ワクチンのための送達システム）
ポリエステルおよびポリ無水物に基づいた薬物送達媒体は、それらの優れた生物適合性プロフィールおよび遅い加水分解速度に起因して、治療薬の持続型放出のために広く用いられてきた（非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。しかしながら、多数の医学的適用（例えば、リソソームおよび腫瘍の酸性環境を標的化すること）は、迅速なｐＨ感受性の分解を受ける薬物送達システムを必要とする（非特許文献１１；非特許文献１２）。薬物送達のために用いられる生分解性重合体の大部分は、生理的ｐＨ値で塩基により触媒される加水分解によって分解されるエステル結合から構成されているので、この必要条件を満たすことができない。エステルベースの物質（例えば、ポリ（乳酸グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリオルトエステル、およびポリ無水物）から作製される粒子は全て、分解する際に、多量の酸を生じる。このことは、タンパク質治療薬およびＤＮＡ治療薬の分解を引き起こし、この分解はまた、何週間から何ヶ月もかかる。成熟ＤＣの寿命は、約２日なので、これらの物質は、ワクチン開発にとって理想的ではない。最近、ポリ（オルトエステル）およびポリ（β−アミノエステル）に基づくｐＨ感受性疎水性マイクロ粒子が、細胞内薬物送達および腫瘍標的化のために首尾よく用いられてきており、従って、薬物送達のための酸感受性の生物物質の可能性を有することを示している（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）。結果として、ｐＨ感受性生分解性重合体の合成のための新しい戦略を開発することにおける多大な関心が、存在する。
【０００９】
組換えタンパク質、ペプチド抗原、またはこのようなワクチン抗原をコードするＤＮＡワクチンに基づいたワクチンは、その抗原エピトープが規定されている感染症および腫瘍に対し、大いに治療の可能性を有する。このようなワクチンは、動物モデル、および現在開発中のこのようなワクチンに関する多数の臨床試験において、感染症に対する防御免疫を生じる能力を有していた（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。しかしながら、それらの期待にも拘わらず、挑戦の多くは、有効な免疫反応を惹起するために、適切な型の抗原提示細胞を標的化するような、ペプチド、タンパク質、ＤＮＡワクチンおよびアジュバントの効率的な送達を懸念する。脂質結合体およびＰＬＧＡマイクロ粒子から構成されるペプチドワクチンに関して、期待できる結果が得られてきたが、依然として、新規のペプチドワクチン送達媒体開発について多大な需要が、存在する（非特許文献２１；非特許文献２２）。
【非特許文献１】Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ  ＆  Ａｈｍｅｄ，Ｃｅｌｌ，２００６年，１２４，ｐ．８４９−８６３
【非特許文献２】Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，２００４年，１９９，ｐ．２２７−２５０
【非特許文献３】Ｐｕｌｅｎｄｒａｎ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００５年，１７５，ｐ．２４５７−２４６５
【非特許文献４】Ａｇｒａｗａｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００３年，１７１，ｐ．４９８４−４９８９
【非特許文献５】Ｄｉｌｌｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００６年，１１６，ｐ．９１６−９２８
【非特許文献６】Ｑｕｅｒｅｃら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，２００６年，２０３，ｐ．４１３−４２１
【非特許文献７】Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｍ．ら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，１９９７年，２８，ｐ．５−２４
【非特許文献８】Ｊａｉｎ，Ｒ．Ａ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ，２０００年，２１，ｐ．２４７５−２４９０
【非特許文献９】Ｍａｔｈｉｏｗｉｔｚ，Ｅ．ら，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｐｏｌｙｍ．ＳｃＬ，１９８８，３５，ｐ．７５５−７７４
【非特許文献１０】Ｂｅｒｋｌａｎｄ，Ｃ．ら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００４年，９４，ｐ．１２９−１４１
【非特許文献１１】Ｓｔｕｂｂｓ，Ｍ．ら，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．Ｔｏｄａｙ，２０００年，６，ｐ．１５−１９
【非特許文献１２】Ｌｅｒｏｕｘ，Ｊ．−Ｃ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，２００４年，５６，ｐ．９２５−９２６
【非特許文献１３】Ｈｅｌｌｅｒ，Ｊ．ら，Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００４年，５，ｐ．１６２５−１６３２
【非特許文献１４】Ｈｅｌｌｅｒ，Ｊ．ら，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖ．，２００２年，５４，ｐ．１０１５−１０３９
【非特許文献１５】Ｂｅｒｒｙ，Ｄ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ，２００４年，１１，ｐ．４８７−４９８
【非特許文献１６】Ｐｏｔｉｎｅｎｉ，Ａ．ら，Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２００３年，８６，ｐ．２２３−２３４
【非特許文献１７】ｖａｎ  Ｅｎｄｅｒｔ，ＰＭ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，２００１年，２９，ｐ．２８５−８
【非特許文献１８】Ｐｕｒｃｅｌｌ，ＡＷら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３年，９，ｐ．２５５−８１
【非特許文献１９】Ｓｈｉｒａｉ，Ｍ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９４年，６８，ｐ．３３３４−４２
【非特許文献２０】Ｈｕｎｚｉｋｅｒ，ＩＰら，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２００２年，１４，ｐ．６１５−２６
【非特許文献２１】Ｅｒｔｌ，ＨＣＪら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９６年，１４，ｐ．８７９−８５
【非特許文献２２】Ｊａｃｋｓｏｎ，ＤＣら，Ｖａｃｃｉｎｅ，１９９７年，１５，ｐ．１６９７−７０５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、被験体に送達するための活性物質をカプセル化するために用いられ得る生分解性の粒子（例えば、三次元粒子）およびミセルを提供する。本発明はさらに、このような粒子およびミセルを生成および送達するための方法を提供する。さらに、本発明は、これらの新規の粒子およびミセルの使用を含むワクチン接種の戦略を提供する。
【００１１】
（疎水性ポリケタール粒子）
本発明は、重合体の骨格内にケタール基を含む新規の型の疎水性重合体に向けられている。ここで、上記ケタール基は、両方の酸素原子が上記重合体の骨格内に位置する様式で、配置されている。
【００１２】
さらに、このケタール重合体は、ケタールとジオールとの間のケタール交換反応により形成され得る。本発明に従って、１つ以上の型のケタールおよび／またはジオールは、ホモ重合体または共重合体の形成のために用いられ得る。
【００１３】
また、本発明により含まれるのは、他の重合体（例えば、ＰＥＧ、ポリエステル、ポリアミド、多糖、ポリエーテル、またはポリ無水物）により連結されるポリケタール重合体である。その結果生じる重合体は、交互共重合体、ランダム共重合体、ブロック共重合体、またはグラフト共重合体であり得る。ポリチオ−アミンケタール、ポリチオ−ヒドロキシルケタールおよびポリヒドロキシル−アミンケタールが混合したポリチオケタール重合体もまた、本発明の範囲内である。
【００１４】
本発明のポリケタール重合体は、水溶液中で加水分解して、低分子量、水溶性のアルコールおよびケトンになる。骨格内のケタール結合の利点は、このケタール結合が、ファゴソームの酸性条件下、１〜２日以内にｐＨ５．０で分解することである。従って、ポリケタールはまた、腫瘍、炎症およびファゴリソソームの酸性環境を標的化するために、用いられ得る。この分解は、酸性分解産物を生じない。従って、上記ケタール重合体は、生物学的使用に適する。
【００１５】
（ミセル）
本発明はさらに、多数の重合体を含む新規の生分解性の架橋されたミセルを提供する。ここで、上記重合体は例えば、外部（ｅｘｔｅｒｎａｌ）架橋剤（すなわち、重合体鎖内に導入されない薬剤）により架橋されている。外部薬剤を用いることの利点は、重合体内の架橋可能部分のみが用いられる反応と比較して、架橋反応がより速いことである。上記外部架橋剤はまた、カプセル化されたタンパク質が破壊される機会を減少させる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本出願において用いられている全ての科学用語および専門用語は、そうでないことが記載されない限り、当該分野において一般的に用いられている意味を有する。本出願において用いられている、以下の語または句は、記載されている意味を有する。
【００１７】
本明細書中に用いられている、用語「ミセル」は、液体培地中における異なる性質と関連づけられる少なくとも２つの異なる部分を有する重合体分子のコロイド状凝集物を指す。これらの性質の違いは、異なる疎水性／親水性、極性、荷電もしくは電荷の分布、または分子の溶解性に影響を与える他のパラメータに起因して、起こり得る。本発明のミセルは、二層から構成されるリポソームと区別され、これを除外する。
【００１８】
本明細書中に用いられている、用語「重合体」は、単量体分子の共有結合された配置を指す。この配置は、直鎖または分岐された形態で実現され得る。上記重合体は、１つの型の単量体分子からのみ構成されるホモ重合体であっても、２つ以上の異なる型の単量体が同じ重合体の鎖内で結合されている共重合体であってもよい。上記２つの異なる単量体が、交互の様式で配置される場合、その重合体は、交互共重合体と呼ばれる。ランダム共重合体において、上記２つの異なる単量体は、任意の順序で配置され得る。ブロック共重合体において、各型の単量体は、一緒にまとめられている。ブロック共重合体は、それらの末端で一緒に結合されている２つ以上のホモ重合体とみなされ得る。１つの単量体から作製される重合体鎖が、別の単量体の重合体鎖にグラフトされる場合、グラフト共重合体が、形成される。
【００１９】
本明細書中に用いられている、用語「粒子」または「三次元粒子」は、ナノ粒子および／またはマイクロ粒子を指す。標準的な定義によると、上記用語「ナノ粒子」は、寸法が１００ｎｍよりも小さい少なくとも１つの粒子のみを含む。この必要条件を満たさないより大きい粒子は、「マイクロ粒子」と呼ばれる。本発明は、ナノメートル（ｎｍ）およびミクロン（μｍ）のスケールのサイズである三次元粒子を提供する。
【００２０】
本明細書中に用いられている用語「ケタール」および「ジオール」は、アルキル基、シクロアルキル基およびアリール基を含むケタールおよびジオールを包含する。本明細書中に用いられている「アルキル基」または「脂肪族基」は、直鎖状または分岐鎖のアルキル基である。一実施形態において、直鎖アルキル基が、好ましい。上記アルキルの定義に含まれるのはまた、ヘテロ原子が窒素、酸素、リン、硫黄およびケイ素であり得るヘテロアルキル基である。
【００２１】
本明細書中に用いられている、用語「シクロアルキル基」または「脂環式基」は、環内に少なくとも３つの炭素原子を含む環構造のアルキルを表す。一実施形態において、５個または６個の炭素を有するシクロアルキル基が、好ましい。シクロアルキル基はまた、ヘテロ原子が窒素、酸素、リン、硫黄およびケイ素であり得る複素環式環を含む。
【００２２】
本明細書中に用いられている「アリール基」または「芳香族基」は、芳香族アリール環（例えば、フェニル）、複素環式芳香族環（例えば、ピリジン、フラン、チオフェン、ピロール、インドールおよびプリン）、および窒素、酸素、硫黄またはリンを含む複素環式環である。アルキル基、シクロアルキル基およびアリール基の定義に含まれるのは、置換されたアルキル基、シクロアルキル基およびアリール基である。これらの基は、１つ以上の置換を保有し得る。適切な置換基としては、ハロゲン類、アミン類、ヒドロキシル基、カルボン酸類、ニトロ基、カルボニル基および他のアルキル基、シクロアルキル基およびアリール基が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書中に記載されている本発明がより十分に理解され得るために、以下の説明が、示されている。
【００２４】
（本発明の組成物）
本発明のポリケタール重合体
本発明は、各ケタール基が重合体骨格内に２つの酸素原子を有する多数のケタール基を含む、生分解性疎水性ポリケタール重合体を提供する。
【００２５】
適切なケタール基の例としては、２，２−ジオキシプロピル基、２，２−ジオキシブチル基、１，１−ジオキシシクロヘキシル基またはジオキシアセトフェニル基が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の範囲内にはまた、１つ以上のヘテロ原子（例えば、窒素、硫黄、酸素およびハロゲン化物）を含む脂肪族ケタール、脂環式ケタールまたは芳香族ケタールを含むケタール重合体がある。
【００２６】
本発明の一実施形態において、上記重合体はさらに、アルキル基、アリール基、およびシクロアルキル基を含む化合物を含む。この実施形態において、上記化合物は、直接的に上記ケタール基に結合され得る。
【００２７】
適切なアルキル基の例としては、メチル基、エチル基およびブチル基が挙げられるが、これらに限定されない。適切なアリール基の例としては、置換されているかまたは非置換のベンジル基、フェニル基またはナフチル基（例えば、１，４−ジメチルベンゼン）が挙げられるが、これらに限定されない。適切なシクロアルキル基の例としては、置換されているかまたは非置換のシクロヘキシル基、シクロプロピル基、シクロペンチル基（例えば、１，４−ジメチルシクロヘキシル基）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
好ましい実施形態において、上記重合体は、ポリ（ｌ，４−フェニレン−アセトン  ジメチレンケタール）であり得る。この重合体は、２，２−ジメトキシプロパンおよび１，４−ベンゼン  ジメタノールで合成され得る。上記重合体はまた、２，２−ジメトキシプロパンおよび１，４−シクロヘキサン  ジメタノールで合成され得るポリ（ｌ，４−シクロヘキサン−アセトン  ジメチレンケタール）であり得る。
【００２９】
本発明はさらに、本発明のポリケタール重合体を含む生分解性粒子を提供する。上記粒子のサイズは、変化し得る。例えば、生分解性粒子は、ナノメートル（ｎｍ）またはミクロン（μｍ）のスケールで作製され得る。好ましい粒子サイズは、約５０ｎｍと１０００ｎｍとの間であり、より好ましくは、約２００ｎｍと６００ｎｍとの間である。
【００３０】
生分解性粒子を形成するための適切なポリケタール重合体の好ましいサイズは、約０．５ｋＤａと約２ＭＤａとの間であり、より好ましいのは、１ｋＤａと約１５０ｋＤａとの間であり、最も好ましいのは、約４ｋＤａと約６ｋＤａとの間である。本発明に従って、上記重合体における単量体の数は、約２から約２０，０００まで、好ましくは約１０から約１，０００まで、より好ましくは約１０から約５０までの範囲であり得る。
【００３１】
本発明のポリケタール重合体は、水溶液中で加水分解して、低分子量、水溶性のアルコールおよびケトンになる。例えば、ポリ（アルキル−アセトン  ジメチレンケタール）の分解は、酸感受性であり、ｐＨ  ７．４で１０２．０時間およびｐＨ  ５．０で３５．０時間の半減期を有する。骨格内のケタール結合の利点は、このケタール結合が、ファゴソームの酸性条件下、１〜２日以内にｐＨ５．０で分解することである。従って、ポリケタールはまた、腫瘍、炎症およびファゴリソソームの酸性環境を標的化するために、用いられ得る。この分解は、酸性分解産物を生じない。従って、上記ケタール重合体は、生物学的使用に適する。
【００３２】
本発明の実施に従って、上記ポリケタール重合体粒子はさらに、１つ以上の活性物質を含み得る。本明細書中に用いられている、用語「活性物質」は、タンパク質、ペプチド、核酸（ＤＮＡもしくはＲＮＡ）または有機分子、および他の合成核酸分子、ｓｉＲＮＡ分子、またはアンチセンス分子を指す。上記活性物質は、免疫調節剤（例えば、ＲＩＧ−１またはＴＬＲ、またはＣ型レクチン（例えば、ｄｅｃｔｉｎ−１およびＤＣ−ＳＩＧＮ）またはキャタピラタンパク質に対する特異的リガンド、あるいは特異的ＴＬＲリガンドの組み合わせ、あるいはＤＣおよびマクロファージによる調節性シグナリングネットワークを阻害する合成分子またはｓｉＲＮＡ）であり得る。上記活性物質はさらに、組換えタンパク質、ワクチン抗原、ＤＮＡワクチン、またはワクチン自体（例えば、インフルエンザワクチン）を含み得る。最終的に、活性物質は、ＤＣのサブセット（ランゲルハンス細胞、皮膚のＤＣ、骨髄のＤＣ、腸管のＤＣ、形質細胞様ＤＣを含む）、または単球およびマクロファージのサブセットを標的化するか、刺激するか、調節するかまたは阻害する抗体を含み得る。従って、これらの粒子の表面は、標的群（例えば、樹状細胞のサブセットに対する抗体、または樹状細胞もしくはマクロファージのサブセットを刺激するタンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＤＥＣ−２０５、ＣＤ１１ｃ、ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＭＡＲＣＯ、３３Ｄ１など））を含むように改変され得る。
【００３３】
適切な活性物質の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：（１）ＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ−２、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−４、ＴＬＲ−５、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＴＬＲ−９、ＴＬＲ−１０、およびＴＬＲ−１１）のアゴニストおよびアンタゴニスト、（２）住血吸虫の卵の抗原（ＳＥＡ）により活性化されるレセプターのアゴニストおよびアンタゴニスト、（３）これらの型のレセプターのいずれかの活性化により生じるシグナルを伝達する細胞内シグナリング経路の構成要素の発現または活性を刺激または阻害する分子、ならびに（４）１つ以上のこれらのシグナリング経路により誘導または安定化される転写因子を刺激または阻害する物質。
【００３４】
アゴニストの例としては、ペプチドグリカン（Ｏ．Ｔａｋｅｕｃｈｉら，１９９９  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：４４３−４５１）またはザイモサン（Ｄｉｌｌｏｎら，２００６  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１６（４）：９１６−２８  Ａ．Ｏｚｉｎｓｋｙら，２０００  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３７６６−１３７７１）が挙げられるが、これらに限定されない。アゴニストとしてはまた、細菌性リポペプチド（例えば、ジアシル化およびトリアシル化されたリポペプチド）、リポテイコ酸、リポアラビノマンナン、フェノール溶解性モジュリン（ｍｏｄｕｌｉｎ）、グリコイノシトールホスホリピッド、糖脂質、ポーリン、Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｉｎｔｅｒｒｏｇｎｓもしくはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ由来の不定型のＬＰＳ、またはＨＳＰ７０も挙げられる（概説については、Ｋ  Ｔａｋｅｄａら，２００３  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：３３５−３７６を参照のこと）。上記アゴニストは、単離および／または高度精製された分子であり得る。上記アゴニストは、分子全体またはそのフラグメント、あるいは天然に存在するアゴニストもしくは合成アゴニストを包含する。例としては、コレラ毒素の非毒性形態（Ｂｒａｕｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：５４１−５５２，１９９９）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの特定の形態（ｄ’Ｏｓｔｉａｎｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１６６１−１６７４，２０００），またはＰ．ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＬＰＳ（Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６７：５０６７−５０７６，２００１）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３５】
細菌性リポペプチドの例としては、Ｎ末端システインの脂肪酸鎖が異なる細菌細胞壁リポペプチド（例えば、ジアシル化およびトリアシル化されたリポペプチド）が挙げられる。例えば、ジアシル化されたリポペプチドとしては、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ由来のマクロファージ活性化リポペプチド  ２キロダルトンもしくはそのフラグメントまたは合成アナログ（例えば、ＭＡＬＰ２、Ｐａｍ２ＣＳＫ４、Ｐａｍ２ＣＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫ、およびＰａｍ２ＣＧＮＮＤＥＳＮＩＳＦＫＥＫ−ＳＫ４）が挙げられる。トリアシル化されたリポペプチドとしては、Ｐａｍ３ｃｙｓ｛Ｓ−［２，３−ビス（パルミトイルオキシ）−（２−ＲＳ）−プロピル］−Ｎ−パルミトイル−Ｒ−Ｃｙｓ−Ｓ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ４−ＯＨ）｝（Ｔａｋｅｕｃｈｉら，２００１  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １３：９３３−９４０）が挙げられる。
【００３６】
ある実施形態において、上記アゴニストは、特異的に、ＴＬＲ−２またはＳＥＡにより結合されるレセプター（ＳＥＡに関して、ＭａｃＤｏｎａｌｄら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：１９８２−１９８８，２００１を参照のこと）に作用する。ここでもまた、上記アゴニストは、天然のリガンド、その生物学的に活性なフラグメント、または低分子もしくは合成の分子であり得るが、これらに限定されない。他の有用なアゴニストとしては、コレラ毒素の非毒性形態（Ｂｒａｕｎら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９：５４１−５５２，１９９９）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓの特定の形態（ｄ’Ｏｓｔｉａｎｉら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：１６６１−１６７４，２０００）、またはＰｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｇｉｎｇｉｖａｌｉｓ  ＬＰＳ（Ｐｕｌｅｎｄｒａｎら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：５０６７−５０７６．２００１）が挙げられ得る。これらの物質は、ＩＬ−１２（ｐ７０）を誘導できず、Ｔｈ２−様反応を刺激できない。
【００３７】
上記アゴニストは、（Ｔｈ反応（例えば、ＴＨ１）に対して免疫反応を偏向させる）ＴＬＲ−４のアゴニストであり得、タキソール、ラウス肉腫ウイルス由来の融合タンパク質、ＭＭＴＶ由来のエンベロープタンパク質、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のＨｓｐ６０または宿主由来のＨｓｐ６０もしくはＨｓｐ７０が挙げられる。ＴＬＲ−３を作動する他の宿主因子は、フィブロネクチンのＩＩＩ型リピートエキストラドメイン（ｅｘｔｒａ  ｄｏｍａｉｎ）Ａ、ヒアルロン酸のオリゴ糖、硫酸ヘパリンの多糖フラグメント、およびフィブリノーゲンを含む。多数の合成化合物（例えば、イミダゾキノリン（イミキモドおよびＲ−８４８）、ロキソリビン、ブロピリミン、および核酸と構造的に関係する他の化合物）は、ＴＬＲ−７のアゴニストとして作用する。
【００３８】
適切な活性物質のさらなる例としては、ＥＲＫ、ｃ−Ｆｏｓ、Ｆｏｘｐ３、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ、ＪＮＫ、ｐ３８、ＮＦ−Ｋｂ、ＳＴＡＴ  １、ＳＴＡＴ２、ＩＲＦ３、ＩＲＦ７、ＩＦＮ−αのシグナリングのインヒビターまたはその組み合わせが挙げられる。適切な活性物質としてはさらに、ＳＯＣＳ  １〜７タンパク質のインヒビターが挙げられ得る。このようなインヒビターは、低分子、またはペプチド、タンパク質または核酸（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはアンチセンス）であり得る。
【００３９】
上記アゴニストは、内因性リガンドでも外因性リガンドでもよく、それらの多くは、当該分野において公知である。下記の新規のスクリーニング方法（特に、ＴＬＲの結合または活性化を検出することを特色にする方法）は、他のリガンド（天然に存在する分子、そのフラグメントもしくは誘導体、抗体、他のペプチドもしくはタンパク質を含む複合体、または合成のリガンドのいずれであってもよい）を同定するために用いられ得る。例えば、ＴＬＲ−２の外因性リガンドとしては、ＬＰＳ（リポ多糖；グラム陰性細菌の外膜の構成成分）、酵母の粒子であるザイモサン、細菌のペプチドグリカン、細菌およびマイコプラズマに由来するリポタンパク質、およびＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ由来のＧＰＩアンカーが挙げられ；内在性リガンドとしては、熱ショック（または「ストレス」）タンパク質（例として、例えば、細菌病原体またはマイコプラズマ病原体に由来するＨｓｐ６０）およびサーファクタントタンパク質Ａが挙げられる。ＴＬＲ−３の外因性リガンドとしては、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ウイルスｄｓＮＲＡ）が挙げられ；ＴＬＲ−４の外因性リガンドとしては、ＬＰＳ、およびＲＳウイルスが挙げられる（内因性リガンドとしては、ストレスタンパク質（例えば、Ｈｓｐ６０またはＨｓｐ７０）、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、ヒアルロン酸およびそのフラグメント、ならびにサーファクタントタンパク質Ａが挙げられる）。フラゲリンは、ＴＬＲ−５の外因性リガンドである。ＣｐＧ（シトシン−グアニン  リピート）ＤＮＡおよびｄｓＤＮＡは、各々、ＴＬＲ−９の外因性リガンドおよび内因性リガンドである。Ｚｕａｎｙ−Ａｍｏｒｉｍら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １：７９７−８０７，２００２，およびＴａｋｅｄａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：３５５−３７６，２００３を参照のこと。
【００４０】
適切な活性物質のさらなる例としては、（ａ）樹状細胞内のＡＰ−１転写因子の発現または活性を阻害する物質、（ｂ）ＡＰ−１転写因子の発現または活性を阻害する物質を含む培養物中で処理された樹状細胞、あるいは（ｃ）（ｂ）に記載されている通り処理された樹状細胞を含む培養物中で刺激された同系のＴ細胞が挙げられる。上記転写因子としては、ｃ−ｆｏｓ、ｆｏｓ−Ｂ、Ｆｏｘｐ３、またはｃ−ｊｕｎが挙げられ得、（上記転写因子または本明細書中に記載されている経路の任意の構成成分（これらの構成成分は当該分野において公知である）の）発現を阻害する物質は、ｃ−ｆｏｓ、ｆｏｓ−Ｂ、Ｆｏｘｐ３、もしくはｃ−ｊｕｎの発現（またはキナーゼ、ホスファターゼ、もしくは上記シグナリング経路の他の構成成分の発現）を特異的に阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドあるいはＲＮＡｉ分子であり得る。本発明の生分解性粒子に関連して議論されている阻害性活性物質はまた、抗体（またはその改変体（例えば、単鎖抗体もしくはヒト化抗体）であり得；好ましくは上記抗体は、モノクローナル抗体である）。
【００４１】
別の実施形態において、上記活性物質は、ＴＬＲ２のシグナリングまたは活性化を弱める細胞内経路のアンタゴニスト（例えば、インヒビターまたはサプレッサ）である。上記アンタゴニストとしては、グラム陰性ＬＰＳ、タキソール、ＲＳＶの融合タンパク質、ＭＭＴＶのエンベロープタンパク質、ＨＳＰ６０、ＨＳＰ７０、フィブロネクチンのＩＩＩ型リピートエキストラドメインＡ、ヒアルロン酸のオリゴ糖、硫酸ヘパリンのオリゴ糖フラグメント、フィブリノーゲンおよびフラゲリンが挙げられる（例えば、概説については、Ｋ  Ｔａｋｅｄａら，２００３  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：３３５−３７６を参照のこと）。
【００４２】
さらなる実施形態において、上記活性物質は、ＳＥＡのシグナリングまたは活性化を弱める細胞内経路のアンタゴニストである。１つの他の実施形態において、その分子は、ＪＮＫ  １／２経路のアンタゴニストである。別の実施形態において、上記分子は、ｐ３８およびＥＲＫを活性化するＣｐＧ  ＤＮＡである（Ａ−Ｋ  Ｙｉら，２００２  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １６８：４７１１−４７２０）。
【００４３】
別の実施形態において、上記活性物質は、樹状細胞の成熟を阻害し得、従って、ＩＬ１２およびＴｈ１反応を増大させ得るＥＲＫ  １／２のインヒビターである。上記分子の例としては、ＰＤ９８０５９およびＵ０１２６（Ａ．Ｐｕｉｇ−Ｋｒｏｇｅｒら，２００１  Ｂｌｏｏｄ  ９８：２１７５−２１８２）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４４】
別の実施形態において、上記活性物質は、ｃ−ｆｏｓのシグナリングを阻害し、従って、ＩＬ１２およびＴｈ１反応を増大させる。このようなとして分子は、ｃ−ｆｏｓのＤＥＦドメイン変異体またはＤＥＦドメイン変異を有する任意のポリペプチドが挙げられ（Ｌ．Ｏ．Ｍｕｒｐｈｙら，２００２  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４：５５６−５６４および補遺情報１〜３頁）、これらとしては、ラットのＦｒａ−１、およびＦｒａ−２；マウスのＦｏｓＢ、ＪｕｎＤ、ｃ−Ｊｕｎ、ｃ−Ｍｙｃ、およびＥｇｒ−１；ならびにヒトのＪｕｎＢ、Ｎ−Ｍｙｃ、およびｍＰｅｒｌが挙げられる。
【００４５】
活性物質は、治療用遺伝子を含み得る。治療用遺伝子の例としては、自殺遺伝子が挙げられる。これらは、遺伝子配列であり、その発現により、腫瘍細胞増殖または腫瘍細胞死を阻害するタンパク質または薬剤が生成される。自殺遺伝子としては、酵素をコードする遺伝子、癌遺伝子、腫瘍抑制遺伝子、毒素をコードする遺伝子、サイトカインをコードする遺伝子、またはオンコスタチンをコードする遺伝子が挙げられる。上記治療用遺伝子の目的は、癌細胞の増殖を阻害するか、または癌細胞を殺傷するか、あるいは直接的もしくは間接的に癌細胞の増殖を阻害するかまたは癌細胞を殺傷するサイトカインまたは他の細胞傷害性物質を産生することである。
【００４６】
適切な癌遺伝子および腫瘍抑制遺伝子としては、ｎｅｕ、ＥＧＦ、ｒａｓ（Ｈ、Ｋ、およびＮ  ｒａｓが挙げられる）、ｐ５３、網膜芽細胞腫腫瘍抑制遺伝子（Ｒｂ）、ウィルムス腫瘍遺伝子産物、ホスホチロシンホスファターゼ（ＰＴＰａｓｅ）、ならびにｎｍ２３が挙げられる。適切な毒素としては、シュードモナス属の外毒素Ａおよび外毒素Ｓ；ジフテリア毒素（ＤＴ）；Ｅ．ｃｏｌｉのＬＴ毒素、志賀毒素、志賀類似毒素（ＳＬＴ−１、−２）、リシン、アブリン、ｓｕｐｐｏｒｉｎ、およびゲロニン（ｇｅｌｏｎｉｎ）が挙げられる。
【００４７】
活性物質は、酵素を含み得る。適切な酵素としては、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のキサンチン−グアニン  ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）遺伝子もしくはＥ．ｃｏｌｉのシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）、またはヒポキサンチン  ホスホリボシル  トランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）が挙げられる。
【００４８】
活性物質は、サイトカインを含み得る。適切なサイトカインとしては、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）が挙げられる（Ｗｏｎｇ  Ｇら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８５；２２８：８１０）；ＷＯ９３２３０３４（１９９３）；Ｈｏｒｉｓｂｅｒｇｅｒ  Ｍ．Ａ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９０年５月，６４（３）：１１７１−８１；Ｌｉ  ＹＰら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２年２月１日，１４８（３）：７８８−９４；Ｐｉｚａｒｒｏ  Ｔ．Ｔ．ら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９３年８月，５６（２）：３９９−４０４）；（Ｂｒｅｖｉａｒｉｏ  Ｆ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９２年１１月５日，２６７（３１）：２２１９０−７；Ｅｓｐｉｎｏｚａ−Ｄｅｌｇａｄｏ  Ｉ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９２年１１月１日，１４９（９）：２９６１−８；Ａｌｇａｔｅ  Ｐ．Ａ．ら，Ｂｌｏｏｄ，１９９４年５月１日，８３（９）：２４５９−６８；Ｃｌｕｉｔｍａｎｓ  Ｆ．Ｈ．ら，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，１９９４年１月，６８（６）：２９３−８；Ｍａｒｔｉｎｅｚ  Ｏ．Ｍ．ら，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，１９９３年５月，５５（５）：１１５９−６６。
【００４９】
活性物質は、増殖因子を含み得る。増殖因子としては、トランスホーミング増殖因子α（ＴＧＦ−α）およびβ（ＴＧＦ−β）、サイトカインコロニー刺激因子が挙げられる（Ｓｈｉｍａｎｅ  Ｍ．ら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｆｅｂ．２８，１９９４，１９９（１）：２６−３２；Ｋａｙ  Ａ．Ｂ．ら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｍａｒ．１，１９９１，１７３（３）：７７５−８；ｄｅ  Ｗｉｔ  Ｈら，１９９４  Ｆｅｂ．，８６（２）：２５９−６４；Ｓｐｒｅｃｈｅｒ  Ｅ．ら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１９９２，１２６（ｌ−４）：２５３−６９）。
【００５０】
本発明の活性物質は、天然に存在しているか、合成であるか、または組換えにより生成され得、この活性物質としては、任意の微生物もしくはウイルスの構成成分またはその誘導体（微生物細胞またはウイルスの構造の一部分であるか、またはこれらにより生成される任意の構成成分（細胞壁、被膜タンパク質、細胞外タンパク質、細胞内タンパク質、任意の毒性化合物もしくは非毒性化合物、炭水化物、タンパク質−炭水化物複合体、または微生物細胞もしくはウイルスの任意の他の構成成分が挙げられるが、これらに限定されない））が挙げられるが、これらに限定されない。上記微生物細胞またはウイルスは、病原性であり得る。
【００５１】
本発明は、本発明の粒子を生成するための方法を提供する。一実施形態において、上記方法は、ａ）ケタールおよびジオールまたは不飽和アルコールの疎水性重合体を形成する工程；ｂ）１つ以上の活性物質の存在下で、ａ）の重合体の重合体粒子を形成し、それによって、上記物質をカプセル化する工程を包含する。ケタールおよびジオールまたは不飽和アルコールの疎水性重合体を形成するための適切な化学の例としては、単一エマルジョンまたは二重エマルジョンおよび非環式ジエン複分解を用いたアセタール交換反応（Ｈｅｆｆｅｒｎａｎ  ＭＪ  および  Ｍｕｒｔｈｙ  Ｎ．，２００５  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１６（６）：１３４０−２；Ｊａｉｎ  ＲＡ．，２０００  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ．２１（２３）：２４７５−９０：Ｗａｇｅｎｅｒ  Ｋ．Ｂ．  および  Ｇｏｍｅｚ  Ｆ．Ｊ．，「ＡＤＭＥＴ  Ｐｏｌｙｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ」，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ：Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＥＪ．Ｋｒａｍｅｒ  および  Ｃ．  Ｈａｗｋｅｒ編集，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｏｘｆｏｒｄ，５，４８（２００２））が挙げられる。
【００５２】
この方法のための適切なケタールの例としては、２，２−ジメトキシプロパン、２，２−ジメトキシブタン、１，１−ジメトキシシクロヘキサンまたはジメトキシアセトフェノールが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の範囲内にあるのはまた、１つ以上のヘテロ原子（例えば、窒素、硫黄、酸素およびハロゲン化物）を含む脂肪族ケタール、脂環式ケタールまたは芳香族ケタールを含むケタール重合体である。
【００５３】
本発明の実施に従って、上記ジオールは、アルキル  ジオール、アリール  ジオールおよびシクロアルキル  ジオールのいずれかであり得る。
【００５４】
ジオールの適切な例としては、１，４−ベンゼンジメタノール、１，４−シクロヘキサンジメタノール、１，５−ペンタン  ジオール、１，４−ブタン  ジオールまたは１，８−オクタン  ジオールが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
（本発明のミセル）
本発明はさらに、多数の重合体を含む生分解性の架橋されたミセルを提供する。上記重合体は、外部架橋剤により架橋され得る。本明細書中に用いられている外部架橋剤は、上記重合体鎖に導入されない薬剤である。外部薬剤を用いることの利点は、重合体内の架橋可能部分のみが用いられる反応と比較して、架橋反応がより速いことである。上記外部架橋剤はまた、カプセル化されたタンパク質が破壊される機会を減少させる。
【００５６】
本発明の一局面において、適切な架橋剤は、少なくとも２つのチオール基を含む化合物である。適切な架橋剤の例としては、エチレングリコールジチオール、脂肪族ジチオール類、ケタール結合により連結されるジチオール類、およびジアミン含有分子が挙げられるが、これらに限定されない。チオール基の利点は、還元条件に対する感受性であり、従って、上記ミセルの容易な分解を可能にすることである。他の架橋戦略としては、アミン、エステル、カーボネート、チオエステル、シッフ塩基、ビシナルジオール、アルケンおよびアルキン、ケタール、ケタール  オルトエステル、チオ−ケタール、チオ−オルトエステル、ｓｉｌｙ−ケタール、フェニル  ボロン酸−ジオール複合体、炭素−炭素結合、スルホン、ホスファートを含む官能基、アジド、酵素で切断可能な結合、およびウレタンにより架橋することが挙げられるが、これらに限定されない。シッフ塩基、チオールおよびケトンが、本出願の一実施形態において好ましい（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙら，２００５  Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ．，１７（２４）：５９７６−５９８８；Ｈａｎｋｅｒら，２００５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９（５７３８）：１２００−０５；Ｌｅ，Ｚ．ら，２００５  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ２１（２５）：１１９９９−１２００６；実施例１，図９）。
【００５７】
本発明の別の局面において、上記外部架橋剤は、抗原を含む。適切な抗原の例としては、タンパク質またはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。上記抗原は、天然に存在し得るか、化学的に合成され得るかまたは組換えにより作製され得る。適切なタンパク質抗原またはペプチド抗原の特定の例としては、ＨＩＶ抗原（例えば、ｇｐｌ２０タンパク質（またはそのフラグメント）、ＴＡＴタンパク質（またはそのフラグメント）、ＮＥＦタンパク質（またはそのフラグメント）、ＨＣＶタンパク質（またはそのフラグメント）、およびｅｎｖタンパク質（またはそのフラグメント）が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい抗原としては、そこにさらなるジスルフィド結合を作製するため、４つのさらなるシステイン残基を含むように化学的に合成および改変されたｇｐｌ２０ペプチド抗原が挙げられる。架橋可能な基を有する任意の抗原が、用いられ得る。架橋可能な基を有しないかまたはほとんど有しない抗原が、架橋可能なチオール基、アジド、アルキン、アミン、マレイミド、ビニルスルホン、ケトン、ヒドラジンおよびチオエステルを含むように改変され得る（例えば、化学的に改変され得る）。
【００５８】
ミセル形成のために用いられる重合体は、ホモ重合体または共重合体（例えば、ブロック共重合体またはグラフト共重合体）であり得る。適切な重合体の例としては、ＰＥＧが開始剤として作用する原子転移重合化により合成された、ＰＥＧブロック共重合体（例えば、ＰＥＧ−ポリアミノ酸（例えば、ＰＥＧ−ポリリジン、ＰＥＧ−ポリグルタミン酸、ＰＥＧ−ポリアスパラギン酸またはＰＥＧ−ポリアルギニン）；ＰＥＧ−ポリエステル、ＰＥＧ−ポリウレタン、ＰＥＧ−ＰＰＯ、改変されたまたは改変されていない、ＰＥＧ−ポリアクリラートまたはＰＥＧ−ポリメタクリラート）が挙げられるが、これらに限定されない。重合体の架橋を促進するために、上記重合体は、化学基（アミン、エステル、カーボネート、チオエステル、シッフ塩基、ビシナルジオール、アルケンおよびアルキン、ケタール、ケタールまたはオルトエステル、チオ−ケタール、チオ−オルトエステル、ｓｉｌｙ−ケタール、フェニル  ボロン酸−ジオール複合体、炭素−炭素結合、スルホン、ホスファート含有官能基、アジド、酵素で切断可能な結合、およびウレタンが挙げられるが、これらに限定されず、シッフ塩基、チオールおよびケトンが、本発明の一実施形態において好ましい）を含むように改変され得る。これらの基は、当該分野において公知の化学反応（例えば、とりわけ、Ｍｉｃｈａｅｌ付加またはアシル化）によって導入され得る（実施例１、図９）。１つの好ましい実施形態において、上記改変された重合体は、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダール（ｔｈｉｏｐｙｒｉｄａｌ）（図９）である。
【００５９】
上記ポリメタクリラートブロックまたはポリアクリラートブロックは、ワクチン構成成分および架橋を用いた組立てを可能にするための改変を含み得る。例えば、ポリアクリラートブロックは、ポリジメチルアミノ−アクリラート−ポリ−グリシジル  アクリラートからなるブロック共重合体であり得る。ワクチン構成成分を用いてミセルを形成する能力を有する様々なアクリラート単量体またはメタクリラート単量体から構成されるランダム共重合体のホモ重合体もまた、本発明の範囲内にある。
【００６０】
本発明の別の局面において、上記ミセルはさらに、１つ以上の活性物質を含み得る。適切な活性物質の例は、本明細書中に、上記される。
【００６１】
本発明の実施に従って、上記ミセルと上記活性物質との間の相互作用は、静電性または疎水性であり得るかあるいは重合体および物質の型に依存して、水素結合形成または分子認識に起因して生じ得る。このミセルの表面は、標的化群（例えば、樹状細胞に対する抗体、または樹状細胞もしくはマクロファージのサブセットを刺激するタンパク質（例えば、ＣＤ４０Ｌ、ＤＥＣ−２０５、ＣＤ１１ｃ、ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＭＡＲＣＯ、３３Ｄ１など））を含むように改変され得る。
【００６２】
上記ミセルは、２工程で生成され得る。最初に、目的の重合体は、適切な条件下で液体（用いられる重合体に依存して、極性の液体または非極性の液体）と接触されて、ミセルを形成し得る。ミセル形成後、上記ミセルは、本発明の生分解性ミセルを生成するために、外部架橋剤と架橋され得る。
【００６３】
一実施形態において、上記ミセルは、ペプチド抗原および免疫調節性分子を抗原提示細胞（ＡＰＣ）に送達するように設計される。この実施形態において、上記ミセルは、免疫調節性分子、ペプチド抗原および共重合体を含む。上記ペプチド抗原は、このペプチド抗原が効率的にカプセル化されてそのペプチド架橋されたミセル（ＰＣＭ）となることを可能にし、また血清構成成分による分解に対してこれらのＰＣＭを安定化する架橋剤として作用する。
【００６４】
別の実施形態において、上記ミセルは、免疫調節剤（多数のＴＬＲリガンド、または分子（例えば、細胞（例えば、樹状細胞もしくは他の抗原提示細胞）内のシグナリングネットワークを調節する合成の化合物またはｓｉＲＮＡ）が挙げられる）を用いて、ペプチドまたはタンパク質を一緒にカプセル化するために用いられ得る。樹状細胞およびマクロファージがファゴサイトーシスによりナノメートルのサイズの物質をしっかりと内在化するので、上記ミセルは、ナノメートルの寸法を有することによってこれらの細胞を標的化する。上記ミセルは、ジスルフィド結合を含む架橋剤により架橋され、この架橋剤は、これらのミセルを血清タンパク質により誘導される分解に対して安定化する。本発明のさらなる実施形態において、上記ミセルは、５〜５０ミクロンのサイズを有する。
【００６５】
ファゴサイトーシス後、本発明の生分解性粒子およびミセルは、分解され、上記カプセル化された物質（例えば、ペプチドまたは抗原、および免疫刺激剤［例えば：ＩＳＳ  ＤＮＡ、ＴＬＲ  ７／８、ＴＬＲ  ３リガンド（例えば、ｓｓ  ＲＮＡ）、ＴＬＲ  ２リガンド、および調節経路（例えば、ＥＲＫ、ｃ−ＦｏｓまたはＦｏｘｐ３の経路）のインヒビター］）は、樹状細胞またはマクロファージ内に放出され、上記免疫調節剤は、抗原提示細胞を誘導して、様々なサイトカインを分泌させる。このシグナルの組み合わせが、最適なＴ細胞の活性化、ならびに調節性Ｔ細胞および樹状細胞の阻害をもたらす。
【００６６】
本発明のミセルは、免疫調節剤［例えば：ＩＳＳ  ＤＮＡ、ＴＬＲ  ７／８リガンド（例えば、ｓｓ  ＲＮＡ）、ＴＬＲ  ２リガンド、および調節経路のインヒビター（例えば、ＥＲＫ、ｃ−ＦｏｓもしくはＦｏｘｐ３、ＰＩ３キナーゼ、Ａｋｔ、ＳＯＣＳ  １〜７タンパク質のインヒビター）、またはｓｉＲＮＡ分子もしくはこのような調節経路を阻害するアンチセンス分子］と共に、活性物質（例えば、関係する病原体に由来する抗原から構成されたワクチン）を含み得る。
【００６７】
本発明はまた、タンパク質が上記ミセル中にカプセル化されるために適切な電荷を有するように、可逆的にこれらのタンパク質を改変するための方法を提供する。この戦略は、上記タンパク質のアミン基と化合物を反応させて、全てのアミン基についてさらなる負電荷を生成し、このタンパク質を負にすることに基づく。次いで、上記改変されたタンパク質は、上記ミセル中にカプセル化され、架橋され、次いで、上記タンパク質からその挿入された化合物を除去するために、ｐＨが、低下される。本発明の一実施形態において、上記化合物は、アミン基は、シス−アコニチル（ｃｉｓ−ａｃｏｎｉｔｙｌ）である。この群は、各アミン基に負電荷を付加し、ｐｈ  ４．０で放出され得る。
【００６８】
標的化戦略のための例は、一端でのＤＮＡ結合ドメイン、およびタンパク質に結合され得るもう一端を有するヘテロ二官能性ＰＥＧを合成することを含む。次いで、このＰＥＧ鎖は、タンパク質に結合され、次いで、免疫刺激性ＤＮＡを含む予備形成されたミセルに組み立てられる。ＤＮＡ結合ドメインの例としては、アクリジンまたはポリアクリジンが挙げられる。標的化リガンドの例としては、ガラクトース、マンノースリン酸、マンノース、ペプチド、および抗体が挙げられる。
【００６９】
本発明の生分解性粒子およびミセルのさらなる改変
上記生分解性粒子またはミセルはさらに、（１）ＤＣもしくはマクロファージもしくは単球の特定のサブセット（ランゲルハンス細胞、皮膚のＤＣ、骨髄のＤＣ、形質細胞様ＤＣを含む）上の特異的なレセプター、または（２）抗原提示細胞上の特異的なレセプター（例えば、ＤＥＣ２０５、Ｌａｎｇｅｒｉｎ、ＤＣ−ＳＩＧＮ、ｄｅｃｔｉｎ−１、３３
Ｄ１、ＭＡＲＣＯ）を標的化する抗体または他の分子を組み込むように改変され得る。
【００７０】
（本発明の組成物を用いるための方法）
本発明はさらに、例えば、疾患を罹患している被験体を処置する（例えば、疾患に関連する症状を緩和する）ために活性物質を送達するために、本発明の粒子または本発明のミセルを介して、この被験体に、本発明の活性物質を送達するための方法を提供する。上記疾患は、ＨＩＶ、マラリア、ＴＢ、ＳＡＲＳ、炭疽、エボラ、インフルエンザ、トリインフルエンザおよびＨＣＶのいずれかであり得る。さらなる疾患または障害は、感染症、自己免疫疾患、アレルギー疾患、移植、糖尿病および癌に関連する障害または合併症のいずれかであり得る。自己免疫疾患の例としては、狼瘡、慢性関節リウマチ、乾癬、喘息およびＣＯＰＤが挙げられる。
【００７１】
上記活性物質は、本発明の粒子を介して、様々な投与手段（静脈内、皮下、筋肉内、経口および吸入の手段が挙げられるが、これらに限定されない）により送達される。本発明の組成物のための最も有効な投与様式および投薬レジメンは、処置される疾患または障害の正確な位置、この疾患または障害の重症度および経過、被験体の健康および処置に対する反応、ならびにその処置する医師の判断に依存する。従って、この分子の用量は、個々の被験体に合わせて調節されるべきである。
【００７２】
表面積のｍｇ／ｍ２に基づいた、様々なサイズおよび種の動物に対する用量とヒトに対する用量との相互関係は、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ，Ｅ．Ｊ．ら，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．，Ｒｅｐ．５０（４）：２１９−２４４（１９６６）に記載されている。上記投薬レジメンにおける調整は、腫瘍細胞の増殖阻害反応および殺傷反応を最適化するために行われ得る（例えば、用量が、分割され得、１日ベースで投与され得るか、またはこの用量が、その状況に比例して減少され得る（例えば、いくつかの分割された用量が、日ごとに投与され得るか、またはその特異的治療状況に依存して比例して減少され得る））。処置を達成するために必要とされる本発明の組成物の用量が、計画の最適化によってさらに減少され得ることは、明らかである。
【００７３】
本明細書中に用いられている、用語「被験体」は、ヒト、任意の動物（例えば、ウマ、ブタ、ウシ、マウス、イヌ、ネコ、および鳥類の被験体）、細胞または細胞組織を含み得る。本発明の実施に従って、上記活性物質は、上記被験体に（本発明の組成物を用いて）上記疾患もしくは障害の発症の前、後、またはその間に、送達または投与され得る。
【００７４】
本発明は、本発明の粒子またはミセルを介して活性物質を投与することによって免疫反応を調節するための方法を提供する。例えば、本発明の方法において、免疫反応は、被験体に、所望の活性物質を含む本発明の粒子もしくはミセルを送達または投与することにより、ＴＬＲ依存的様式でＴｈ免疫反応へと偏し得る。一実施形態において、ＴＬＲを発現する細胞は、Ｔｈ免疫反応（例えば、Ｔｈ０、Ｔｈ２またはＴ調節性細胞免疫反応）に対する偏りをもたらす（本発明の粒子またはミセルにより送達される）物質と接触される。例えば、ＴＬＲ−２、ＥＲＫ  １／２、またはｃ−ｆｏｓを活性化する物質（例えば、天然のリガンド、その生物学的に活性のフラグメント、または低分子もしくは合成の分子）。
【００７５】
上記のように、上記免疫反応は、レセプターの活性化からシグナリング経路の下流（例えば、ＴＬＲ結合から下流またはＴＬＲ活性化もしくは認識から下流）の時点において、調節（ｒｅｇｕｌａｔｅ）または調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）され得る（例えば、Ｔｈ免疫反応に対して偏向することを増大または縮小させる）。従って、患者はまた、下流のシグナリング経路の要素に対して細胞内で作用することにより免疫反応を偏向させる（本発明の組成物を用いて送達される）活性物質または活性物質の組み合わせを用いて、処置され得る。
【００７６】
本発明は、本発明の組成物を用いて送達される所望の活性物質を用いて、ＭＡＰキナーゼ経路のいずれか（ＥＲＫ  １／２経路が挙げられる）の細胞シグナリング（例えば、活性化）を誘導することにより、Ｔｈ２免疫反応に対して偏向させるための方法を提供する。誘導されるＭＡＰキナーゼ経路は、ＭＡＰキナーゼ経路（ＥＲＫ  １／２が挙げられる）のリン酸化される構成成分の量の増加および／または期間の延長により特徴付けられ得る。
【００７７】
本発明の方法の別の実施形態において、ＴＨ２免疫反応を調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）ようにＥＲＫ  １／２  ＭＡＰキナーゼ経路を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）する活性物質が、本発明の組成物を介して送達され得る。この実施形態において、例として、ＴＬＲ（例えば、ＴＬＲ−２）のアゴニストは、ＴＨ２免疫反応を増大させるようにＥＲＫ  １／２のリン酸化を誘導する。さらに本発明の方法の別の実施形態において、活性物質は、細胞内のｃ−ＦＯＳ経路を調節（ｍｏｄｕｌａｔｅ）して、それによってＴＨ２免疫反応を調節する（ｒｅｇｕｌａｔｅ）ように、本発明の組成物を介して送達され得る。この実施形態において、例として、ｃ−ｆｏｓ経路のアゴニストは、ＴＨ２免疫反応を増大させるように、ｃ−ｆｏｓの発現および／またはｃ−ｆｏｓのリン酸化を誘導する。さらに本発明の方法のさらなる実施形態において、活性物質は、ＴＬＲ２またはその下流のシグナリング経路の要素（例えば、ＥＲＫ  １／２  ＭＡＰキナーゼ経路およびｃ−ＦＯＳ経路）に作用することによりＴｈ２免疫反応を調節するように、本発明の組成物を介して送達され得る。例えば、本発明の組成物を介して送達される、上記活性物質は、ＩＬ−１０の産生または活性を調節する（例えば、ＩＬ−１０の産生を増加させるかまたはＩＬ−１０をアップレギュレーションする）ために用いられ得る。
【００７８】
一実施形態において、Ｔｈ２免疫反応に対して偏向させるための方法は、本発明の組成物を介して送達される活性物質を投与することにより、ＩＬ１２の産生を媒介する（例えば、阻害する）ｐ３８および／もしくはＪＮＫ経路のシグナリングを弱めるかまたは阻害し、それによって、Ｔｈ１反応に対して偏向させることを含む。別の実施形態において、Ｔｈ２免疫反応に対して偏向させるための方法は、所望の活性物質（もしくはその組み合わせ）を含む本発明のミセルまたは粒子を投与することにより、ＩＬ１２の産生を媒介し（例えば、阻害する）、それによってＴｈ１反応に対して偏向させる、ｐ３８および／またはＪＮＫのリン酸化された量を減少させるかまたは阻害すること、あるいは、ｐ３８および／またはＪＮＫのリン酸化の持続時間を短縮または阻害することを含む。
【００７９】
本発明はまた、本発明の組成物を介して送達される活性物質を投与することによって、ＭＡＰキナーゼ経路のいずれか（ｐ３８および／またはＪＮＫ経路が挙げられる）の細胞シグナリング（例えば、活性化）を誘導することにより、Ｔｈ１免疫反応に対して偏向させるための方法を提供する。誘導されるｐ３８および／またはＪＮＫ経路は、ＭＡＰキナーゼ経路（ｐ３８、および／またはＪＮＫが挙げられる）のリン酸化された構成成分の量の増加および／または持続時間の延長により特徴付けられ得る。
【００８０】
一実施形態において、Ｔｈ１免疫反応に対して偏向させるための方法は、本発明の組成物を介して送達される活性物質を投与することにより、ＥＲＫ  １／２および／またはｃ−ｆｏｓ経路のシグナリンを弱めるかまたは阻害することを含む。別の実施形態において、Ｔｈ１免疫反応に対して偏向させるための方法は、本発明の組成物を介して送達される活性物質を投与することにより、リン酸化されたＥＲＫ  １／２および／またはｃ−ｆｏｓの量を減少または阻害すること、あるいはＥＲＫ  １／２および／またはｃ−ｆｏｓのリン酸化の持続時間を短縮または阻害することを含む。
【００８１】
さらに、本発明は、ＴＨ２免疫反応を調節するための方法を提供し、この方法は、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）と、本発明の組成物を介して送達される、ＥＲＫ  １／２を活性化しならびに／またはｃ−ｆｏｓもしくはｃ−ｆｏｓ経路を活性化するＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ−２アゴニスト）を含む培養物中で処理されたＴＬＲ陽性細胞（例えば、ＤＣ）とを接触させる工程を包含する。
【００８２】
さらに、本発明は、ＴＨ１免疫反応を調節するための方法を提供し、この方法は、Ｔ細胞（例えば、ナイーブＴ細胞）と、本発明の組成物を介して送達される、ｐ３８経路および／またはＪＮＫ経路を活性化するＴＬＲアゴニスト（例えば、ＴＬＲ−４アゴニスト）を含む培養物中で処理されたＴＬＲ陽性細胞（例えば、ＤＣ）とを接触させる工程を包含する。
【００８３】
本発明は、免疫に関係する状態または疾患（例えば、アレルギー、自己免疫疾患、および他の免疫に関係する状態（癌が挙げられる））を有する被験体を処置するための方法を提供し、この方法は、Ｔｈ１、Ｔｈ２もしくはＴｈ０免疫反応に対してまたは反して偏向させるために、本発明の組成物を介して送達される、本発明の任意の物質を、この被験体に、有効量で投与する工程を包含する。上記被験体は、ウシ、ブタ、マウス、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ヒト、ヒツジ、魚類または鳥類であり得る。
【００８４】
一実施形態において、強いＴｈ２反応に関連する状態または疾患を有する被験体は、本発明の組成物を介して送達される、Ｔｈ１免疫反応に対して偏向させるようにこの被験体内の細胞シグナリングを活性化する、本発明の物質を用いて処置される。強いＴｈ２反応により特徴付けられる疾患としては、アレルギー、喘息、および慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ（例えば、気腫または慢性気管支炎））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８５】
別の実施形態において、強いＴｈ２反応と関連する状態または疾患を有する被験体は、本発明の組成物を介して送達される、Ｔｈ２免疫反応に対して偏向させることを阻害する分子を用いて処置される。
【００８６】
一実施形態において、強いＴｈ１反応と関連する状態または疾患を有する被験体は、本発明の組成物を介して送達される、Ｔｈ２免疫反応に対して偏向させるようにこの被験体内の細胞シグナリングを活性化する本発明の物質を用いて、処置される。強いＴｈ１反応により特徴付けられる疾患としては、糖尿病、慢性関節リウマチ、多発性硬化症、乾癬、および全身性エリテマトーデスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８７】
別の実施形態において、強いＴｈ１反応と関連する状態または疾患を有する被験体は、本発明の組成物を介して送達される、Ｔｈ１免疫反応に対して偏向させることを阻害する活性物質を用いて、処置される。
【００８８】
以下の実施例は、本発明を説明するために、ならびに当業者が同じものを作製および使用することを援助するために示されている。実施例は、他に本発明の範囲を限定するようには決して意図されない。
【実施例】
【００８９】
（実施例１）
抗原を含む架橋されたミセルの合成
タンパク質抗原のオボアルブミンおよび免疫刺激性ＤＮＡを含む架橋されたミセルを、２工程のプロセスで合成した。最初に、ミセルを、陽イオン性ブロック共重合体のＰＥＧ−ポリリジン−チオピリダールと負に荷電したＦＩＴＣ−オボアルブミン（ＦＩＴＣ−ＯＶＡ）および免疫刺激性ＤＮＡ（ＩＳＳ−ＤＮＡ）との間で形成した。これらのミセルは、濃度１０ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ポリリジン−チオピリダール、濃度０．５ｍｇ／ｍｌのＦＩＴＣ−ＯＶＡおよび濃度０．５ｍｇ／ｍｌのＩＳＳ−ＤＮＡを含んでいた。上記ミセルを１時間形成させ、次いで、このミセルを０．４ｍｇ／ｍｌのジチオ−エチレン  グリコールで架橋した。上記架橋反応をＵ．Ｖ．活性（３４２ｎｍ）によりモニタリングしたところ、チオピリダール基が１時間後に室温で量的に反応したことを示した。１００ｋＤ  ｓｐｉｎ−ｆｉｌｔｅｒ（ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）により上記ミセルを遠心分離し、回収した溶液をＦＩＴＣ蛍光（励起  ４９４ｎｍ、放射  ５１０ｎｍ）について解析することにより、上記ミセル中のＦＩＴＣ−ＯＶＡのカプセル化効率を決定した。このことは、ＦＩＴＣ−ＯＶＡの９５％より多くが、上記ミセル中にカプセル化されたことを示した。
【００９０】
（実施例２）
ポリケタール粒子の合成（疎水性薬物の送達のための単一エマルジョン方法）
水中油型エマルジョン方法を用いて、粒子を、ポリ（ｌ，４−フェニレン−アセトン  ジメチレン  ケタール）により合成した。簡単に言えば、１０ｍｇの２、１ｍｇのＥＲＫインヒビターＵＯ１２６および０．１ｇのクロロ−メチル  フルオレセイン  ジアセタート（ＣＭＦＤＡ）を、０．５ｍＬのＣＨＣｌ３（０．１％のトリエチルアミンを含む）中に溶解させた。次いで、この溶液を、２ｍｇ／ｍｌのポリビニル  アルコール（ＰＶＡ，３１〜５０  ｋＤａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む５ｍＬのｐＨ  ９緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）に添加した。この油−水混合物を、少しの間振とうし、次いで、２〜３分間４０ワットで超音波処理して（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０）、微細な油／水エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、Ｎ２流れ下で少なくとも３時間攪拌して、その溶媒を蒸発させ、そして粒子懸濁物を生成した。粒子サイズを、動的光散乱（ｄｙｎａｍｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）（ＤＬＳ）により解析したところ、その平均直径が２８２ｎｍであることを示した。
【００９１】
（実施例３）
ポリケタール粒子の合成（親水性薬物の合成のための二重エマルジョン方法）
ＦＩＴＣ−オボアルブミンを含むポリケタール粒子（ＰＫＮ）を、二重エマルジョン方法を用いて作製した。最初に、５００μＬのクロロホルム中に溶解させた２０ｍｇのポリ（１，４−フェニレン  アセトン  ジメチレン  ケタール）（ＰＰＡＤＫ）を、１００μＬのＦＩＴＣ−Ｏｖａ溶液（約０．７ｍｇ）に添加した。この混合物を、４０ワットで１分間超音波処理して、一次エマルジョンを形成した。次に、５ｍＬの１０ｍＭ  ｐＨ９  リン酸ナトリウム緩衝液中の０．２％  ｗ／ｖ  ポリビニル  アルコール（ＰＶＡ，  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加し、そしてこの混合物を、４０ワットで少なくとも１分間超音波処理して、二次エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、窒素通気下で４時間混合し、その後、その容量を、緩衝液を用いて５ｍＬにした。２バッチのＦＩＴＣ−Ｏｖａ含有ＰＫＮを、２バッチの無添加（ｐｌａｉｎ）ＰＫＮ（ＦＩＴＣ−Ｏｖａを含まない）と同様の様式で調製した。上記ＰＫＮ懸濁物を、４℃で保管した。粒子のサイジングを、動的光散乱（ＤＬＳ）により決定した。２バッチの、ＦＩＴＣ−オボアルブミンをロードしたＰＫＮは、４２６ｎｍおよび４６２ｎｍの有効な直径を有し、空のＰＫＮバッチは、３２１ｎｍおよび３４７ｎｍであった。
【００９２】
ＦＩＴＣ−Ｏｖａの標識
鶏卵アルブミン（オボアルブミン）を、次の通りに、フルオレセインを用いて標識した。オボアルブミンを、１０ｍｇ／ｍＬで２００ｍＭ  ｐＨ９  ＮａＨＣＯ３緩衝液中に溶解した。イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）を、１０ｍｇ／ｍＬでＤＭＳＯ中に溶解した。次に、２．５ｍＬのオボアルブミン溶液（２５ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）を、５０μＬのＦＩＴＣ／ＤＭＳＯ（０．５ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ）と共に少なくとも１時間３０℃で混合した。この生成物を、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＰＤ−１０カラム中で濾過し、遊離色素を除去した；このカラムに、２．５ｍＬの生成物をロードし、そして２．５ｍＬの水で溶出した。得られたオボアルブミンの濃度は、約７ｍｇ／ｍＬであった。４９７ｎｍでのＦＩＴＣの吸収を測定することにより、かつオボアルブミンの推定濃度を用いて、標識の程度を１．０９と算出した。
【００９３】
ＰＫＮ中のＦＩＴＣ−Ｏｖａのカプセル化の決定
２つのＦＩＴＣ−Ｏｖａ  ＰＫＮバッチを、５倍の水により希釈し、そして希釈した試料各々の一部分を、０．１μｍ  Ｓｕｐｏｒ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ  （Ｐａｌｌ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ）を通して濾過した。これらの濾過された試料および濾過されていない試料をさらに、１０倍のｐＨ９  リン酸ナトリウム緩衝液中に希釈し、そしてフルオレセインを、４９４ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの放射波長で測定した（図１）。
【００９４】
上記カプセル化の効率を、上記濾過された試料および濾過されていない試料の蛍光強度を用いて、次の通りに、算出した：
【００９５】
【化３２】
2008540558.tif 000003
。
【００９６】
（実施例４）
ケタール骨格の重合体（ポリケタール）の合成および分解
図２は、以下を示す：（Ａ）ケタール中間体  １を生成するための１，４−ベンゼンジメタノールと２，２−ジメトキシプロパンとの間のケタール交換反応。（Ｂ）ポリケタール  ２を生成するための１の段階的重合体化。副生成物のメタノールを蒸留することにより、反応工程ＡおよびＢを進める。（Ｃ）溶媒蒸発方法による薬物をロードした粒子の形成。粒子は、低分子量の排出可能な化合物へのｐＨ感受性の分解を表す。
【００９７】
合成
上記ポリケタールを、ケタール交換反応（１４）に基づいた新規の重合体化戦略により合成する。この反応は一般的に、低分子量のアルコールに保護基を導入するために用いられており、これまでは、重合体を合成するために用いられていなかった。しかしながら、本発明者らはここで、簡単に２，２−ジメトキシプロパン（ＤＭＰ）をジオールと反応させることにより、上記ケタール交換反応が、酸感受性の重合体を合成するために用いられ得ることを明らかにする。本発明者らは、上記重合体化が図２の反応機構により起こることを提唱する。上記ケタール交換反応は、ＤＭＰのプロトン化およびその後のアルコールによる求核攻撃を含む平衡反応である。副生成物のメタノールを蒸留して除くことにより、この平衡を、上記ケタール中間体  １の形成に対してシフトさせる。この反応が進むにつれて、１の分子は、段階的様式で結合して、２を形成する。
【００９８】
ＤＭＰと１，４−ベンゼンジメタノール（ＢＤＭ）との代表的な重合体化により、４８％の収率でポリケタール  ２を得た。上記重合体化を、短い経路の蒸留ヘッドに結合した２５ｍＬの二首フラスコ内で実行した。１０ｍＬの温かい酢酸エチル中に溶解したＢＤＭ（１．０ｇ、７．３ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、１００℃で保たれた１０ｍＬの蒸留されたベンゼンに添加した。次いで、５５０μＬの酢酸エチル中に溶解した再結晶化されたｐ−トルエン  スルホン酸（５．５ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を、添加した。酢酸エチルを蒸留して除いた後、上記反応を開始するために、蒸留されたＤＭＰ（９００μＬ、７．４ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加した。ＤＭＰのさらなる容量（各容量は２ｍＬのベンゼンおよび３００〜５００μＬのＤＭＰからなる）を、計量漏斗を介して添加した。各容量を、間に３０分の間期を含む３０〜４０分の期間にわたって添加した。上記反応の全持続時間は、７時間であった。上記反応を、１００μＬのトリエチルアミンの添加により停止し、そして冷ヘキサン中に沈殿させた。この粗生成物を、真空濾過し、エーテルおよびヘキサンでリンスし、そして真空乾燥させて、６００ｍｇの白色固体生成物（収率４８％）を得た。この回収した重合体を、ＧＰＣおよび１Ｈ  ＮＭＲにより解析した。
【００９９】
図３Ａは、１つのバッチ由来のＧＰＣトレースを示す。このバッチにおいて、繰り返し単位２２．５個の重合体化の程度に対して、Ｍｗ＝４０００および１．５４の多分散度指数を得た。１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（図３Ｂ）は、２の繰り返し単位がジメチルケタール基（「６ａ」）を含むことを確認する。共に、ＧＰＣおよび１Ｈ  ＮＭＲのデータは、成功したポリケタール  ２の合成についての証拠を提供する。
【０１００】
加水分解
２の加水分解の速度論を、リソソーム（ｐＨ  ５．０）および血流（ｐＨ  ７．４）に対するｐＨ値で測定した。ポリケタール  ２を細かい粉末にひき、そしてこの粉末を、ｐＨ  ７．４（ホスファート緩衝液）、ｐＨ  ５．０（アセタート緩衝液）、およびｐＨ  １．０（ＤＣｌ）の重水素を入れた溶液に添加することにより、上記加水分解の速度を測定した。この懸濁物を３７℃で攪拌し、データの点を３時間、２４時間、４８時間、および７２時間でとった。各懸濁物を４分間、１８００ｇで遠心分離し、そしてその上清を１Ｈ  ＮＭＲにより解析した。これらのスペクトルは、ＢＤＭについてのピーク（７．２４ｐｐｍおよび４．４７ｐｐｍ）ならびにアセトンについてのピーク（２．０５ｐｐｍ）を含んでいた。２つのＢＤＭピークの積分の平均を用いて、加水分解の相対的な程度を決定した。この加水分解のパーセントを、ｐＨ  ７．４または５．０の試料のＢＤＭピークの平均をｐＨ  １．０  対照バッチのＢＤＭピークの平均で除算することにより算出した。
【０１０１】
指数崩壊半減期を、ｐＨ  ７．４で１０２時間およびｐＨ  ５．０で３５時間と算出した。これは、ｐＨ  ７．４から５．０までの３倍の速度増加を表す（図４）。２のｐＨ感受性は、Ｋｗｏｎら，（９）により報告された水溶性ケタールに関するｐＨ感受性よりも有意に小さい。本発明者らは、２のより小さいｐＨ感受性がその水不溶性に起因すると仮定する。この水不溶性は、水の拡散を制限し、そしてｐＨに対して非感受性である別の速度制限工程をつくり出す。２から作製される物質内への水の拡散の速度論は、この粒子のサイズに依存し、そして本発明者らは、より小さい粒子が挽いた粒子よりも大きいｐＨ感受性を有することを予測する。
【０１０２】
（実施例５）
ミクロンサイズの粒子の合成
また、化合物２を、ミクロンサイズの粒子を合成するために用いた。水中油型エマルジョン方法（１５）を、上記粒子を形成するために用いた。簡単に言うと、１ｍＬのＣＨＣｌ３（０．１％  トリエチルアミンを含む）中に溶解させた５０ｍｇの２を、乳化剤として様々な量のポリビニル  アルコール（ＰＶＡ、３１〜５０ｋＤａ、Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む５ｍＬの１０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３  ｐＨ９緩衝液に添加した。この油−水混合物を、少しの間振とうし、次いで、２〜３分間４０ワットで超音波処理して（Ｂｒａｎｓｏｎ  Ｓｏｎｉｆｉｅｒ  ２５０）、微細な油／水エマルジョンを形成した。上記エマルジョンを、Ｎ２フロー下で少なくとも３時間攪拌して、その溶媒を蒸発させ、そして粒子懸濁物を生成した。
【０１０３】
粒子のサイズを、動的光散乱（ＤＬＳ）およびＳＥＭにより解析した。１０ｍＬのｐＨ  ９緩衝液中に上記粒子懸濁物を希釈し、そしてより大きい粒子を安定させることにより、ＤＬＳの試料を調製した。次いで、各バイアルの液体部分に由来するアリコートを、ＤＬＳの粒子のサイジング（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  ９０Ｐｌｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅｒ）のために希釈した。上記粒子懸濁物を１０分間（５０００ｇ、４℃）で遠心分離し、蒸留水で洗浄し、そしてその回収したペレットを凍結乾燥することにより、ＳＥＭの試料を、ＰＶＡ：ポリケタールの比率  ０．２：１で作製した。
【０１０４】
予測した通り、上記粒子サイズは、ＰＶＡ対ポリケタールの比率に対して感受性であった。上記ＤＬＳの粒子の直径は、ＰＶＡ：ポリケタールの比率  ０．２：１、０．８：１、および２：１の各々を含む試料について、５２０ｎｍ、２９０ｎｍ、および２８０ｎｍであった。上記０．２：１  バッチのＳＥＭ画像（図５Ａおよび５Ｂ）は、上記ポリケタールが、粒子サイズの分布が直径０．５〜３０μｍの範囲にわたるミクロンサイズの粒子を形成することを確認する。
【０１０５】
（実施例６）
ポリケタール粒子中のデキサメタゾンのカプセル化
抗炎症薬デキサメタゾン（Ｄｅｘ，Ｓｉｇｍａ）を、２を用いて作製された粒子中にカプセル化した。油相が５ｍｇ／ｍｌの濃度のＤｅｘを含んでいたこと、およびＰＶＡ：ポリケタールの比率  １：１を用いたことを除いて上記の手順と同じ手順を用いて、Ｄｅｘをロードした粒子を処方した。これらの粒子のＳＥＭ画像は、これらの粒子が直径２００〜６００ｎｍであることを明らかにする（図５Ｃ）。ＤＬＳによる粒子のサイジングは、Ｄｅｘをロードした粒子のバッチについての有効な直径  ２５０ｎｍを示した。上記Ｄｅｘのカプセル化効率は、４３〜５３％の間の範囲にわたった。対照バッチを、ポリケタール／ＰＶＡのみおよびＤｅｘのみを用いて調製した。Ｄｅｘのカプセル化を測定するために、各粒子バッチをｐＨ  ９緩衝液中に再懸濁し、次いで、アリコートをさらに希釈した。一部分を０．１μｍ  Ｓｕｐｏｒ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐ．）を通して濾過し、そしてその濾液の２４２ｎｍでの吸光度を、Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＵＶ−  １７００  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒにより記録した。上記カプセル化効率を、（ＡＤｅｘ−ＡＤｅｘＰｏｌｙ）／（ＡＤｅｘ−ＡＰｏｌｙ）として算出した。ここで、Ａは２４２ｎｍでの吸光度であり、下付き文字「Ｐｏｌｙ」、「Ｄｅｘ」、および「ＤｅｘＰｏｌｙ」は、「ポリケタールのみ」、「Ｄｅｘのみ」、および「Ｄｅｘ＋ポリケタール」の試料を各々指す。これらの算出により、様々な試料についてのＤｅｘカプセル化効率  ４３％〜５３％を得た。
【０１０６】
実施例４〜６についての参考文献：
（１）  Ａｈｓａｎ，Ｆ．；Ｒｉｖａｓ，Ｉ．Ｐ．；Ｋｈａｎ，Ｍ．Ａ．；Ｔｏｒｒｅｓ−Ｓｕａｒｅｚ，Ａ．Ｉ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００２，７９，２９−４０．
（２）  Ｐｒｉｏｒ，Ｓ．；Ｇａｎｄｅｒ，Ｂ．；Ｂｌａｒｅｒ，Ｎ．；Ｍｅｒｋｌｅ，Ｈ．Ｐ．；Ｓｕｂｉｒａ，Ｍ．Ｌ．；Ｉｒａｃｈｅ，Ｊ．Ｍ．；Ｇａｍａｚｏ，Ｃ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２００２，１５，１９７−２０７．
（３）  Ｈａｈｎ，Ｓ．Ｋ．；Ｊｅｌａｃｉｃ，Ｓ．；Ｍａｉｅｒ，Ｒ．Ｖ．；Ｓｔａｙｔｏｎ，Ｐ．Ｓ．；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．Ｊ．Ｂｉｏｍａｔｅｒ．Ｓｃｉ．Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｅｄｎ．２００４，１５，１１１１−１１１９．
（４）  Ｗａｌｔｅｒ，Ｅ．；Ｄｒｅｈｅｒ，Ｄ．；Ｋｏｋ，Ｍ．；Ｔｈｉｅｌｅ，Ｌ．；Ｋｉａｍａ，Ｓ．Ｇ．；Ｇｅｈｒ，Ｐ．；Ｍｅｒｋｌｅ，Ｈ．Ｐ．Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ２００１，７６，１４９−１６８．
（５）  ｖａｎ  Ａｐｅｌｄｏｏｒｎ，Ａ．Ａ．；ｖａｎ  Ｍａｎｅｎ，Ｈ．−Ｊ．；Ｂｅｚｅｍｅｒ，Ｊ．Ｍ．；ｄｅ  Ｂｒｕｉｊｎ，Ｊ．Ｄ．；ｖａｎ  Ｂｌｉｔｔｅｒｓｗｉｊｋ，Ｃ．Ａ．；Ｏｔｔｏ，Ｃ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００４，１２６，１３２２６−１３２２７．
（６）  Ｆｕ，Ｋ．；Ｐａｃｋ，Ｄ．Ｗ．；Ｋｌｉｂａｎｏｖ，Ａ．Ｍ．；Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２０００，１７，１００−１０６．
（７）  Ｓｈｅｎｄｅｒｏｖａ，Ａ．；Ｂｕｒｋｅ，Ｔ．Ｇ．；Ｓｃｈｗｅｎｄｅｍａｎ，Ｓ．Ｐ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９９，１６，２４１−２４８．
（８）  Ｆｉｆｅ，Ｔ．Ｈ．；Ｊａｏ，Ｌ．Ｋ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９６５，３０，１４９２−１４９５．
（９）  Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｊ．；Ｓｔａｎｄｌｅｙ，Ｓ．Ｍ．；Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ａ．Ｐ．；Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｅ．Ｒ．；Ｆｒｅｃｈｅｔ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２００５，２，８３−９１．
（１０）  Ｍｕｒｔｈｙ，Ｎ．；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．；Ｆａｕｓｔｏ，Ｎ．；Ｈｏｆｆｍａｎ，Ａ．Ｓ．；Ｓｔａｙｔｏｎ，Ｐ．Ｓ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００３，１４，４１２−４１９．
（１１）  Ｍｕｒｔｈｙ，Ｎ．；Ｘｕ，Ｍ．；Ｓｃｈｕｃｋ，Ｓ．；Ｋｕｎｉｓａｗａ，Ｊ．；Ｓｈａｓｔｒｉ，Ｎ．；Ｆｒｅｃｈｅｔ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．２００３，１００，４９９５−５０００．
（１２）  Ｓｔａｎｄｌｅｙ，Ｓ．Ｍ．；Ｋｗｏｎ，Ｙ．Ｊ．；Ｍｕｒｔｈｙ，Ｎ．；Ｋｕｎｉｓａｗａ，Ｊ．；Ｓｈａｓｔｒｉ，Ｎ．；Ｇｕｉｌｌａｕｄｅｕ，Ｓ．Ｊ．；Ｌａｕ，Ｌ．；Ｆｒｅｃｈｅｔ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００４，７５，１２８１−１２８８．
（１３）  Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｅ．Ｒ．；Ｇｏｏｄｗｉｎ，Ａ．Ｐ．；Ｆｒｅｃｈｅｔ，Ｊ．Ｍ．Ｊ．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．２００４，１５，１２５４−１２６３．
（１４）  Ｌｏｒｅｔｔｅ，Ｎ．Ｂ．；Ｈｏｗａｒｄ，Ｗ．Ｌ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９６０，２５，５２１−５２５．
（１５）  Ｐａｎｙａｍ，Ｊ．；Ｗｉｌｌｉａｍｓ，Ｄ．；Ｄａｓｈ，Ａ．；Ｌｅｓｌｉｅ−Ｐｅｌｅｃｋｙ，Ｄ．；Ｌａｂｈａｓｅｔｗａｒ，Ｖ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．２００４，９３，１８０４−１８１４．
（図１〜１５、１７〜１９および２２〜２４の実験の詳細）
図１は、濾過されたＦＩＴＣ−Ｏｖａ含有ＰＫＮおよび濾過されていないＦＩＴＣ−Ｏｖａ含有ＰＫＮの蛍光強度を示す棒グラフである（励起  ４９４ｎｍ、放射  ５２０ｎｍ）。示されているこれらのデータは、２つの試料の平均である。ＦＩＴＣ−Ｏｖａのカプセル化効率は、６０％である。
【０１０７】
図２は、ケタール骨格の重合体（ポリケタール）の合成および分解を示す模式図である。（Ａ）ケタール中間体  １を生成するための１，４−ベンゼンジメタノールと２，２−ジメトキシプロパンとの間のケタール交換反応。（Ｂ）ポリケタール  ２を生成するための１の段階的重合体化。副生成物のメタノールを蒸留して除くことにより、反応工程ＡおよびＢを進める。（Ｃ）溶媒蒸発方法による薬物をロードした粒子の形成。粒子は、低分子量の排出可能な化合物をもたらすｐＨ感受性の分解を示す。
【０１０８】
図３（Ａ）は、ＴＨＦ中のポリケタール  ２のＧＰＣトレース（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＳＣＬ−１０Ａ）を示す。ポリスチレン標準（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）に基づき、Ｍｗ＝４０００、Ｍｗ／Ｍｎ＝１．５４。Ｙ軸は、２６２ｎｍでの相対的吸光度を示す。（Ｂ）は、ＣＤＣｌ３中のポリケタール  ２の１Ｈ  ＮＭＲスペクトル（Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  Ｖｘ  ４００）；７．３ｐｐｍ（４ｂ）、４．５ｐｐｍ（４ｃ）、および１．５ｐｐｍ（６ａ）での繰り返し単位のピークを示す。２．５および１．０でのピークは、ケタールの加水分解を防ぐために添加したトリエチルアミンに起因する。
【０１０９】
図４は、ｐＨ１．０、５．０、および７．４でのポリケタール  ２（微細にひいた粉末）の加水分解の速度論を示す線グラフである。指数崩壊半減期は、１０２時間（ｐＨ  ７．４）および３５時間（ｐＨ  ５．０）である。ｐＨ  １．０の対照バッチは、最初の時点の前に完全に加水分解した。
【０１１０】
図５は、ポリケタール２で作製された粒子のＳＥＭ画像を示す。（Ａ、Ｂ）０．２：１のＰＶＡ：ポリケタール  ２の比率を用いた粒子（粒子のサイズ：０．５〜３０μｍ）。（Ｃ）１：１のＰＶＡ：ポリケタール  ２を用いて作製した、デキサメタゾンをロードした粒子（粒子のサイズ：２００〜５００ｎｍ）。スケールバーは、（Ａ）８０μｍ、（Ｂ）３μｍ、および（Ｃ）４μｍである。
【０１１１】
図６は、粒子形成を示す概略図である。Ａ．工程１：ポリケタールおよび薬物をクロロホルム中に溶解する；ポリビニル  アルコールを水中に溶解する。Ｂ．工程２：クロロホルム溶液を水に添加し、そして超音波処理し、ミクロンサイズの小滴を生成する。工程３：クロロホルムを蒸発させ、粒子を生成する。
【０１１２】
図７は、フルオレセインをロードしたポリケタール粒子が、肝臓に取り込まれることを示す。静脈内注射後の、ＰＫＮからのフルオレセインの放出を示すマウス肝臓組織切片。
【０１１３】
図８は、ペプチド架橋されたミセルの設計および合成を示す概略図である。工程１：ＩＳＳ  ＤＮＡとＩとを混合して、ミセル（架橋されていないミセル）を形成する。工程２：次いで、これらのミセルを抗原性ペプチド（ＩＩ）で架橋して、免疫刺激分子とペプチド抗原との両者をカプセル化し得る送達システムを生成する。ＡＰＣによるファゴサイトーシスの後、ペプチド架橋されたミセルは、それらの構成成分を放出する。
【０１１４】
ＨＩＶペプチドワクチンを、ペプチド  ＣＧＣＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫＣＧＣＧ（ＩＩ）を用いたＰＣＭ戦略を用いて合成した。上記ペプチドＩＩは、ＧＰ−１２０タンパク質に由来し、クラスＩ抗原とクラスＩＩ抗原の両者である配列  ＲＩＱＲＧＰＧＲＡＦＶＴＩＧＫを含む。最初に、０．５ｍｌの５０ｍＭ  ＰＢＳ中で、０．５ｍｇのＩを０．１ｍｇのＩＳＳ  ＤＮＡ（５−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ−３）（電荷比率は１５対１（−／＋）であった）と混合することにより、ＩとＩＳＳ−ＤＮＡとの間でミセルを形成した。Ｃｕｍｕｌａｎｔｓ方法を用いた、これらのミセルの動的光散乱は、これらのミセルが５７．０ｎｍの平均直径を有することを示した。次いで、０．１ｍｇのＩＩを上記ミセルに添加すること（等モル比のＩＩにおけるシステイン対Ｉにおけるチオピリダール基）により、これらのミセルを架橋した。ジスルフィド交換反応により、上記ペプチドＩＩを上記ミセルに組み込んだ。
【０１１５】
図９は、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成および性質決定を示す。Ａ．ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダール（Ｉ）の合成。４４マイクロモルのＰＥＧ−ポリ−ｌ−リジン（ＰＥＧ＝５ｋｄおよびポリ−ｌ−リジン＝５，０００を含む）を、攪拌棒の備わった５ｍｌの丸底フラスコ内で１ｍｌのＤＭＦ中に溶解した（完全に上記重合体を溶解させるために、室温での一晩中の攪拌を必要とした）。次いで、４１５マイクロモルのヒドロキシル−エチル  チオピリダール  アクリラートおよび５８μｌのトリエチルアミンを、上記ＰＥＧ−ポリ−ｌ−リジン溶液に添加し、そしてこの反応を室温で２４時間継続させた。上記反応溶液を１５ｍｌの氷冷したジエチルエーテル中に沈殿させることにより、この生成物を単離した。この収率は、８８．２％であった。Ｂ．Ｄ２Ｏ中のＰＥＧ−ＰＬＬ−チオピリダールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル。（Ａ）の生成物を、Ｄ２Ｏにおける１Ｈ  ＮＭＲにより解析した。ピリジンのプロトン（−ＮＣ５Ｈ４：δ＝７．１０１ｐｐｍ、７．６２９ｐｐｍ、８．１８７ｐｐｍ）対ポリ−ｌ−リジンのα、β、γ−メチレンのプロトン（−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２：δ＝１．１２２ｐｐｍ、１．２８５ｐｐｍ、１．５５３ｐｐｍ）のピーク強度の比率を比較することにより、アルキル化されたアミンのパーセンテージを決定した。これは、上記アミンの１００％が反応したことを示した。Ｃ．／Ｄ．架橋されていないＰＣＭ（Ｃ）およびペプチド架橋されたＰＣＭ（Ｄ）の動的光散乱解析。０．０６ｍｇ／ｍｌのＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールおよび２０μｇ／ｍｌのＩＳＳ  ＤＮＡを含むｐＨ  ７．４の５０ｍＭ  ＰＢＳ緩衝溶液を、調製し、そして２００ｎｍ  ｓｙｒｉｎｇｅ  ｆｉｌｔｅｒを通して濾過した。次いで、この溶液を、Ｃｕｍｕｌａｎｔ方法を用いて、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により解析した（Ｃ）。次いで、０．１２ｍｇのペプチド抗原（ＩＩ）を添加することにより、この溶液を架橋し、反応の３時間後、この溶液を、上記の通りのＤＬＳにより解析した（架橋されたミセルのサイズおよびサイズの分布はＤに示されている）。Ｅ．ペプチド抗原（ＩＩ）におけるシステインの架橋反応。Ｆ．ペプチド抗原（ＩＩ）とブロック共重合体ミセルとの間の架橋反応についてのＵＶ解析。エッペンドルフチューブ内で、０．５ｍｌの５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液（ｐＨ  ７．４）中、０．５ｍｇのＩを０．１ｍｇのＩＳＳ  ＤＮＡと混合することにより（アミン対ホスファートの比率１５／１を表す）、ブロック共重合体ミセルを、ＩとＩＳＳ  ＤＮＡとの間で形成した。室温で２時間のインキュベーションの後、０．ｌｍｇのＩＩ（１：１のシステイン：チオピリダールの比率を表す）を上記ミセルに添加した。ＩＩにおけるシステインと上記ミセル中のチオピリダール基との間の架橋反応を、３４２ｎｍでのＵＶ解析（放出されたチオピリドンを表す）により決定した。システイン基のパーセンテージを、以下の式により決定した：
【０１１６】
【化４０】
2008540558.tif 000004
ここで：ＡＢＳ１＝上記ペプチド架橋されたミセル反応についての３４２ｎｍでのＵＶ吸収（黒丸）；ＡＢＳ２＝ペプチドを含まない架橋されていないミセルについての３４２ｎｍでのＵＶ吸収（白四角）；ＡＢＳ０＝（ＤＴＴの添加により）全チオピリドン基が反応した場合の３４２ｎｍでのＵＶ吸収（白丸）。
【０１１７】
図１０は、ペプチドおよびＤＮＡの放出におけるＧＳＨの影響を示す。Ａ．ＧＳＨ感受性のペプチド放出。ファゴサイトーシス後にＰＣＭがペプチド抗原を放出するかどうかを決定するために、ＧＳＨの存在に起因するＰＣＭからのペプチドの刺激反応性放出を、調べた。ＰＣＭを、異なる濃度のＧＳＨと共に２４時間、５０ｍＭ  ｐＨ  ７．４  ＰＢＳ緩衝液中でインキュベートし、次いで、ペプチドの放出を決定するためにＨＰＬＣにより解析した。この図は、ペプチドの放出がＧＳＨの存在により引き起こされることを明らかにする。１０ｍＭ  ＧＳＨ（細胞内レベル）と共に行うＰＣＭのインキュベーションはペプチドの７１％の放出を誘導するが、緩衝液のみとのＰＣＭのインキュベーションはペプチドの１０％の放出のみしか引き起こさない。Ｂ．ＧＳＨ感受性のＤＮＡ放出。ＰＣＭが血清ヌクレアーゼによる分解からカプセル化されたＩＳＳ−ＤＮＡを保護する能力を、調べた。ＰＣＭを、（上記の通りに）合成し、そして１０％の血清と共に１２時間インキュベートし、次いで、カプセル化されたＩＳＳ−ＤＮＡの安定性を決定するために、これらのＰＣＭをゲル電気泳動により調べた。対照として、ＩＳＳ−ＤＮＡ自体を、血清と共にインキュベートした。この図は、ＩＳＳ−ＤＮＡ自体は、１０％の血清中で完全に加水分解され（レーン  ２）、対照的に、ＰＣＭ中にカプセル化されたＩＳＳ−ＤＮＡは、おそらく、ヌクレアーゼが上記ミセルに入るのを防ぐに違いない架橋の効果に起因して（レーン  ３）、血清ヌクレアーゼから保護されることを明らかにする。Ｃ．ＩＳＳ−ＤＮＡは、ＰＣＭ中の血清ヌクレアーゼから保護される。ＰＣＭ戦略の重要な利点は、架橋送達システムを生成することである。この架橋は、インビボでＰＣＭを安定化するに違いない。分解に対するＰＣＭの安定性を、負に荷電した重合体、ポリ（ビニル  スルファート）（ＰＶＳ）をＰＣＭと混合することにより調べ、次いで、ＰＶＳにより置換されたＩＳＳ−ＤＮＡの量を決定するために、この混合物を、ゲル電気泳動により解析した。対照として、ＰＶＳをまた、ＩＩおよびＩＳＳ−ＤＮＡからのみ構成された架橋されていないミセルと共にインキュベートした。図Ａ、レーン  ４は、ＰＶＳがＩＳＳ−ＤＮＡおよびＩＩからのみ構成される架橋されていないミセルを破壊し得ることを明らかにする。対照的に、Ａ、レーン  ５は、おそらく、ペプチド架橋が、ＰＶＳが上記ミセル中に分散しＩＳＳ−ＤＮＡを置き換えることを防ぐことに起因して、ＰＶＳが、ＰＣＭ由来のＩＳＳ−ＤＮＡを置換し得ないことを明らかにする。重要なことには、細胞内濃度のＧＳＨと共のＰＣＭのインキュベーションの後、ＰＣＭは、ＰＶＳの存在下で、カプセル化されたＩＳＳ−ＤＮＡを放出する。このことは、ファゴサイトーシス後に上記ミセルがそれらの中身を放出する筈であることを明らかにする（ｂのレーン  ２および３））。ＩＳＳ−ＤＮＡ対Ｉの電荷比率は、１対１５（−／＋）である；１μｇのＤＮＡを、各レーンにロードした；カプセル化されたＩＳＳ−ＤＮＡの放出を誘導するために、ＧＳＨ（１００μＭ）レーン  ３に添加した。全試料を、１０％の血清と共に、室温で１２時間インキュベートした。
【０１１８】
図１１は、ブロック共重合体ミセルを示す：Ａ．ＰＥＧ−ポリ（リジン−チオ−ピリジル）の化学構造。ＰＥＧ鎖は、上記ミセルに対する安定性を与え、そしてポリリジンセグメントを、タンパク質およびＤＮＡまたはＲＮＡとの静電相互作用のために用いる。チオピリダール基は、結果として生じるジスルフィド結合を介した架橋のためである。Ｂ．工程Ｉ：ＰＥＧ−ポリ（リジン−チオ−ピリダール）をＤＮＡおよびタンパク質と混合し、その外側のＰＥＧと共にミセルを形成する。Ｃ．工程ＩＩ：ミセルを分子含有ジチオール（例えば、ジ−チオエチレン  グリコール）と架橋する。Ｄ．架橋されたミセルを、血中よりも細胞内で一層高い濃度を有するグルタチオンにより還元する。
【０１１９】
図１２は、ミセルの免疫学を示す。Ａ．ＤＣ由来のヒト単球によるＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＣＦＳＥミセルの取り込み。ＤＣ由来のヒトＰＢＭＣ（培養６日目）を、４時間３７℃で、濃度１０μｇ／ｍｌ、５×１０＊５細胞／ウェル、９６−Ｕウェル、ＲＰＭＩ／１０％  ＦＣＳで、ＳＩＩＮＦＥＫＬ／ＣＦＳＥ  ミセルを用いてパルスした。細胞を、洗浄し、この形態に固定し、そして共焦点顕微鏡イメージング用に調製した。Ｂ．ＤＣ由来のヒト単球による、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをカプセル化されたミセルの効率的な取り込み。ＤＣ由来のヒトＰＢＭＣ（培養６日目）を、４時間３７℃で、濃度１０μｇ／ｍｌ、５×１０＊５細胞／ウェル、９６−Ｕウェル、ＲＰＭＩ／１０％  ＦＣＳで、無添加ＳＩＩＮＦＥＫＬ／ＣＦＳＥ（１）またはＳＩＩＮＦＥＫＬ／ＣＦＳＥを処方されたミセル（２、３）を用いてパルスした。細胞を、洗浄し、ＣＤ１１ｃおよびＨＬＡＤＲについて染色した。細胞を、ＣＤ１１ｃ＋細胞、ＨＬＡＤＲ＋細胞に対してゲートし、そしてＣＦＳＥの蛍光について解析した。Ｃ．マウスのＤＣおよびマクロファージによる、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをカプセル化されたミセルの効率的な取り込み。全マウスＣ５７Ｂ１／６Ｊ  ＦＬＴ３−Ｌ脾臓を、３７℃で、濃度１×１０＊６細胞／ウェル、９６−Ｕウェル、ＲＰＭＩ／１０％  ＦＣＳで、１もしくは１０μｇ／ｍｌのＣＦＳＥで標識された無添加のＳＩＩＮＦＥＫＬ（１）またはペプチド（２，３）を処方されたミセルを用いて４時間（青線）パルスするか、あるいは処理しないでおいた（赤線）。細胞を、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｂについて染色し、そしてＣＦＳＥ陽性蛍光について解析した。
【０１２０】
図１３は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを処方されたミセルが、インビトロで強いＴ細胞反応を誘導することを示す棒グラフである。同系のＣ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｈ−２ｂ  ＦＬＴ３−Ｌの処置されたマウスに由来する精製されたＣＤ１１ｃ＋を、４時間、示された濃度および組み合わせの無添加ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドまたはＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを処方されたミセルでパルスした。細胞を、洗浄し、そして、２０時間（左のパネル）または９６時間（右のパネル）、全ＯＴ−１脾臓細胞と共に培養した。細胞を、ＣＤ８および細胞内ＩＦＮγについて染色し、フローサイトメーターで解析した。グラフは、ミセル  ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ２１３．３（黒のバー）、ミセル  ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ２１３．２（灰色のバー）、無添加のＳＩＩＮＦＥＫＬ（白のバー）、培地（ドットのバー）がＣＤ１１ｃ＋ＤＣを刺激したことを表す。
【０１２１】
図１４は、ミセルの免疫学を示す。Ａ．マウスのＤＣおよびマクロファージによる、ＯＶＡタンパク質をカプセル化されたミセルの効率的な取り込み。全マウスＣ５７Ｂ１／６Ｊ  ＦＬＴ３−Ｌ脾臓細胞を、３７℃、濃度１×１０＊６細胞／ウェル、９６−Ｕ  ウェル、ＲＰＭＩ／１０％  ＦＣＳで、１もしくは１０μｇ／ｍｌのＦＩＴＣで標識された無添加のオボアルブミン（１）またはタンパク質を処方されたミセル（２）を用いて１時間（黒線）、５時間（点線）パルスするか、あるいは処理しないでおいた（影つき）。細胞を、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｂについて染色し、そしてＦＩＴＣ陽性蛍光について解析した。Ｂ．ＯＶＡ／ＣｐＧをカプセル化されたミセルは、インビトロでＤＣを活性化する。全マウスＣ５７Ｂ１／６Ｊ  ＦＬＴ３−Ｌ脾臓細胞を、１μｇ／ｍｌの無添加ＯＶＡ（１）、無添加ＯＶＡ＋ｌμｇのＣｐＧ（２）またはＯＶＡを処方されたミセル（３）またはミセル  ＯＶＡ＋ｌμｇのＣｐＧ（４）を用いて、２４時間パルスした。ＣＤ１１ｃ＋細胞を、ＣＤ８０マーカーまたはＣＤ８６マーカーについて解析した。データは、アイソタイプの対照（影つき）、処理されていない細胞（灰色の線）または刺激で処理された細胞（黒線）を表す。
【０１２２】
図１５は、ポリケタール粒子の免疫学を示すグラフである。インビトロでの、マウスのＤＣおよびマクロファージによる、Ｕ０１２６をカプセル化されたポリケタール粒子（ＰＫＮ）の取り込み。全マウスＣ５７Ｂ１／６Ｊ  ＦＬＴ３−Ｌ脾臓細胞を、５時間３７℃で、１×１０＊６細胞／ウェル、９６−Ｕ  ウェル、ＲＰＭＩ／１０％  ＦＣＳで、Ｕ０１２６  ＥＲＫインヒビターを保有する、１または１０μｇ／ｍｌのＣＭＦＤＡで標識されたポリケタール粒子を用いて、パルスした。細胞を、ＣＤ１１ｃおよびＣＤ１１ｂについて染色し、そしてＣＭＦＤＡ陽性蛍光について解析した。データは、細胞を処理された培地（影つき）または５時間の取り込み（黒線）を表す。
【０１２３】
図１７は、ミセルの免疫学を示す。Ａ．抗原を処方されたミセルは、インビトロで強いＴ細胞反応を誘導する。同系のＣ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｈ−２ｂマウス由来の精製されたＣＤ１１ｃ＋細胞を、４時間、示されている濃度およびオボアルブミンならびに無添加のＣｐＧまたは処方されたミセルの組み合わせを用いてパルスした。細胞を洗浄し、１×１０＊５のＣＤ１１ｃ＋を、１×１０＊６の全ＯＴ−１（ＳＩＩＮＦＥＫＬ  特異的）脾臓細胞と共に、５日間培養した。５日後、細胞を、ＢＦＡ（５μｇ／ｍｌ）と共にＳＩＩＮＦＥＫＬ  ペプチド（ｌμｇ／ｍｌ）で６時間再刺激し、そしてＣＤ８および細胞内ＩＦＮγについて染色した。左のパネルは、フローサイトメーター解析を表し；右のパネルは、これらのデータの概要を示す。Ｂ．抗原を処方されたミセルは、ＣＤ４＋依存性のＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導機構を克服する。同系のＣ５７Ｂ１／６Ｊ  Ｈ−２ｂマウス由来の精製されたＣＤ１１ｃ＋細胞を、示されている濃度およびオボアルブミンならびに無添加のＣｐＧまたは処方されたミセルの組み合わせを用いて、４時間パルスした。細胞を洗浄し、１×１０＊５のＣＤ１１ｃを、５×１０＊５のＣＤ８＋  ＭＡＣＳ精製されたＯＴ−１脾臓細胞（約９０％の精度）と共に、５日間培養した。５日後、細胞を、ＢＦＡ（５μｇ／ｍｌ）と共にＳＩＩＮＦＥＫＬ  ペプチド（ｌμｇ／ｍｌ）で６時間再刺激し、そしてＣＤ８および細胞内ＩＦＮγについて染色した。左のパネルは、フローサイトメーター解析を表し；右のパネルは、これらのデータの概要を示す。Ｃ．抗原を処方されたミセルは、インビボでＤＣを活性化する。Ｃ５７Ｂ１／６Ｊマウス（２／群）に、無添加で５μｇ／マウスのオボアルブミン／ＣｐＧまたは５００μｌ  ＰＢＳ中に処方されたミセルをｉ．ｖ．注射した。脾臓を、注射後４時間および２４時間後に摘出し、コラゲナーゼで処理し（３０分／３７℃）、ホモジナイズし、そして赤血球溶解緩衝液で処理した。ＣＤ１１ｃ＋細胞を、ＣＤ８０マーカーまたはＣＤ８６マーカーについて染色し、そしてフローサイトメーターを用いて解析した。データは、アイソタイプの対照（影つき）、処置されていないマウス（灰色の線）または抗原を注射されたマウス（黒線）を表す。
【０１２４】
図１８は、ミセルおよびポリケタール粒子の免疫学を示す。Ａ．ワクチンを処方されたミセルは、インビボでの強いＴ細胞反応−ＣＤ８＋ＩＦＮγ＋を誘導する。４匹のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスのコホートに、５μｇ／マウスのＯＶＡ（１）またはＯＶＡ＋ＣｐＧ（２）、ミセル  ＯＶＡ（３）、ミセル  ＯＶＡ／ＣｐＧ（４）をｓ．ｃ．でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、３６日目（ブースト  １）および８４日目（ブースト  ２）にブーストした。ブースト  ２後６日目に血液を採取し、ＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ方法を用いて単離し、ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ペプチド（ｌμｇ／ｍｌ）およびＢＦＡ（５μｇ／ｍｌ）を用いて６時間再刺激し、そしてＣＤ８および細胞内ＩＦＮγについて染色した。左のパネルは、フローサイトメトリー解析および選択されたマウスに対するゲート戦略を表し；右のパネルは、全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％として、これらのデータの概要を示す。Ｂ．ワクチンを処方されたミセルは、インビボで強いＴ細胞反応−ＣＤ８＋ＴＮＦα＋を誘導する。４匹のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスのコホートに、５μｇ／マウスのＯＶＡ（１）またはＯＶＡ＋ＣｐＧ（２）、ミセル  ＯＶＡ（３）、ミセル  ＯＶＡ／ＣｐＧ（４）を、ｓ．ｃ．でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、３６日目（ブースト  １）および８４日目（ブースト  ２）にブーストした。ブースト  ２後６日目に血液を採取し、ＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ方法を用いて単離した。４匹のマウス由来のＰＢＭＣをプールし、ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ペプチド（ｌμｇ／ｍｌ）およびＢＦＡ（５μｇ／ｍｌ）を用いて６時間再刺激し、そしてＣＤ８ならびに細胞内のＴＮＦαおよびＩＬ−１０について染色した。左のパネルは、フローサイトメトリー解析および選択されたマウスに対するゲート戦略を表し；右のパネルは、全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＣＤ８＋ＴＮＦα＋細胞の％として、これらのデータの概要を示す。Ｃ．ＯＶＡ／ＣｐＧワクチン接種後の特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論。４匹のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスのコホートに、５μｇ／マウスのＯＶＡ＋ＣｐＧ（灰色の線）およびミセル  ＯＶＡ／ＣｐＧ（青の線）をｓ．ｃ．でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、０日目に初回免疫し、３６日目（ブースト  １）および８４日目（ブースト  ２）にブーストした。初回免疫およびブーストの後の異なる日に血液を採取し、ＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ方法を用いて単離した。４匹のマウス由来のＰＢＭＣを、ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ペプチド（ｌμｇ／ｍｌ）およびＢＦＡ（５μｇ／ｍｌ）を用いて６時間再刺激し、そしてＣＤ８ならびに細胞内のＩＦＮγについて染色した。パネルは、全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％（ＳＥＭエラーバーを含む）として、これらのデータの概要を表す。Ｄ．ＯＶＡ＋ＵＯ１２６  ＰＫＮワクチン接種後の特異的ＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論。４匹のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスのコホートに、５μｇ／マウスのＯＶＡ＋ＣｐＧ（灰色の線）、ミセル  ＯＶＡ／ＣｐＧ（青の線）およびミセル  ＯＶＡ＋１０μｇ  ＵＯ１２６  ＰＫＮ（赤の線）をｓ．ｃ．でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、０日目に初回免疫し、３６日目（ブースト  １）および８４日目（ブースト  ２）にブーストした。初回免疫およびブーストの後の異なる日に血液を採取し、ＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ  ｇｒａｄｉｅｎｔ方法を用いて単離した。４匹のマウス由来のＰＢＭＣを、ＳＩＩＮＦＥＫＬ  ペプチド（ｌμｇ／ｍｌ）およびＢＦＡ（５μｇ／ｍｌ）を用いて６時間再刺激し、そしてＣＤ８ならびに細胞内のＩＦＮγについて染色した。パネルは、全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＣＤ８＋ＩＦＮγ＋細胞の％（ＳＥＭエラーバーを含む）として、これらのデータの概要を表す。Ｅ．ワクチンを処方されたミセルは、インビボで強い抗原特異的ＩｇＧ抗体反応を誘導する。４匹のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスのコホートに、５μｇ／マウスのＯＶＡ（１）またはＯＶＡ＋ＣｐＧ（２）、ミセル  ＯＶＡ（３）、ミセル  ＯＶＡ／ＣｐＧ（４）ミセル  ＯＶＡ＋１０μｇのＰＫＮ  Ｕ０１２６（５）またはミセル  ＯＶＡ／ＣｐＧ＋１０μｇのＰＫＮ  Ｕ０１２６（６）をｓ．ｃ．でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、３６日目および８４日目にブーストした。初回免疫（初回）後４週目、１回目のブースト（ブースト  １）後６週目および２回目のブースト後７週目（ブースト  ２）に、瀉血を行った。個々のマウス由来の血清を、プールし、そしてプレートＥＬＩＳＡを用いて、ＯＶＡ特異的な全ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２ａ抗体およびＩｇＧ２ｂ抗体の反応性について試験した。抗体反応性を、血清の連続的希釈物についての４５０ｎｍ  吸光度として測定した。データは、特異的抗ＯＶＡ抗体の逆数として表されている。Ｆ．ワクチンを処方されたミセルは、インビボで抗原特異的なＩｇＥ抗体反応およびＩｇＭ抗体反応を誘導する。４匹のＣ５７Ｂ１／６Ｊマウスのコホートに、５μｇ／マウスのＯＶＡ（１）またはＯＶＡ＋ＣｐＧ  （２）、ミセル  ＯＶＡ（３）、ミセル  ＯＶＡ／ＣｐＧ（４）ミセル  ＯＶＡ＋１０μｇのＰＫＮ  Ｕ０１２６（５）またはミセル  ＯＶＡ／ＣｐＧ＋１０μｇのＰＫＮ  Ｕ０１２６（６）をｓ．ｃ．でワクチン接種した。同じ抗原処方物を用いて、動物に、３６日目および８４日目にブーストした。２回目のブースト後７週目に、瀉血を行った。個々のマウス由来の血清を、プールし、そしてプレートＥＬＩＳＡを用いて、ＯＶＡ特異的なＩｇＥ抗体およびＩｇＭ抗体の反応性について試験した。抗体反応性を、血清の連続的希釈物についての４５０ｎｍ  吸光度として測定した。データは、特異的抗ＯＶＡ抗体の逆数として表されている。
【０１２５】
図１９は、シクロヘキサン  ジメタノール由来のポリケタールを示す。Ａ．シクロヘキサン  ジメタノール由来のポリケタール（ＰＣＡＤＫと呼ばれる）は、分解して、シクロヘキサン  ジメタノールおよびアセトンになり、どちらも、ヒトの使用のためのＦＤＡ承認を有する。Ｂ．ＰＣＡＤＫは酸感受性様式で分解する。ＰＣＡＤＫ内のケタール結合は、生理的ｐＨ条件下、週単位で加水分解する。ＰＣＡＤＫ内のケタール結合の加水分解を、４．５および７．４のｐＨでのＨ−ＮＭＲにより測定した。ファゴソームのｐＨ  ４．５で、ＰＣＡＤＫのケタール結合は、１０日後に約３０％が加水分解される。この結果に基づいて、本発明者らは、ＣＡＴ−ＰＫＮが、マクロファージによるファゴサイトーシス後４〜５週間以内に、完全に加水分解される筈であると予想する。
【０１２６】
図２２は、ほとんどのいかなる脂肪族ジオールをも含むポリケタールが、作製され得ることを示す化学的表記である。上記ポリケタールの疎水性は、その加水分解の速度論を決定する。
【０１２７】
図２３は、ＦＩＴＣ標識されたポリケタールが、肝臓のマクロファージによりファゴサイトーシスされることを示す写真である。インビボでのクップファー細胞によるＰＫＮのファゴサイトーシス。マウスに、ＦＩＴＣ−ＰＫＮまたは空のＰＫＮのいずれかを注射した。これらのマウスの肝臓を、組織学により解析した。左：点在する緑の蛍光により証明されるように、ＦＩＴＣ−ＰＫＮは、クップファー細胞内に豊富に存在する（倍率  １００×）。中央：空のＰＫＮは、バックグラウンドの緑の蛍光をほとんど生じない（倍率  １００×）。右：ＦＩＴＣ（赤）についての免疫組織化学（ＩＨＣ）は、クップファー細胞による取り込みを確認する（倍率  ４００×）。
【０１２８】
図２４．Ａ．ポリケタール粒子中にカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼをカプセル化するために用いられる二重エマルジョンの手順。ホモジナイザーを用いて、カタラーゼ（１ｍｇ／ｍｌ）の水溶液５０μＬを、１ｍＬのクロロメタン中に溶解した７５ｍｇのＰＣＡＤＫからなる有機相中に分散させ、油中水型（ｗ／ｏ）エマルジョンを生成した。次いで、このｗ／ｏエマルジョンを、２５ｍＬの４％  ＰＶＡ溶液中に滴下し、そしてこの溶液を、ホモジナイザーを用いて機械的に攪拌した。次いで、この結果生じたｗ／ｏ／ｗエマルジョンを、２２５ｍＬの４％  ＰＶＡ溶液に注ぎ、そして塩化メチレンが蒸発するまで数時間、機械的に攪拌した。この結果生じた粒子を、遠心分離により単離し、凍結乾燥し、そしてＳＥＭ（Ｂ）により調べた。このタンパク質のカプセル化効率は、３５％であった。これらのＣＡＴ−ＰＫＮは、約８ミクロンの平均直径を有する。Ｂ．カタラーゼ含有粒子のＳＥＭ画像、およびカタラーゼ含有粒子の蛍光顕微鏡画像。Ｃ．過酸化水素の２４０ｎｍでの吸光度を減少させる能力により証明されるように、カタラーゼ粒子は酵素活性を有する。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１】図１は、濾過されたＦＩＴＣ−Ｏｖａ含有ＰＫＮおよび濾過されていないＦＩＴＣ−Ｏｖａ含有ＰＫＮの蛍光強度を示す棒グラフである（励起  ４９４ｎｍ、放射  ５２０ｎｍ）。
【図２】図２は、ケタール骨格の重合体（ポリケタール）の合成および分解を示す模式図である。
【図３Ａ】図３（Ａ）は、ＴＨＦ中での（図２の）ポリケタール２のＧＰＣのトレースを示すグラフである。
【図３Ｂ】図３（Ｂ）は、ＣＤＣｌ３中での（図２の）ポリケタール２の１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。
【図４】図４は、（図２の）ポリケタール２の加水分解の速度論を示すグラフである。
【図５】図５は、（図２の）ポリケタール２で作製された粒子のＳＥＭ画像を示す。
【図６】図６は、粒子形成の概略図を示す。
【図７】図７は、フルオレセインをロードしたポリケタール粒子が、肝臓に取り込まれることを示す写真である。
【図８】図８は、ペプチド架橋されたミセルの設計および合成を示す概略図である。
【図９Ａ】図９は、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成および性質決定を示す。Ａは、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成を示す化学的図式である。Ｂは、Ｄ２Ｏ中でのＰＥＧ−ＰＬＬ−チオピリダールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。Ｃ／Ｄは、架橋されていないＰＣＭ（Ｃ）およびペプチド架橋された（Ｄ）の動的光散乱解析を示すグラフである。Ｅは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）におけるシステインの架橋反応を示すグラフである。Ｆは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）とブロック共重合体ミセルとの間の架橋反応のＵＶ解析を示すグラフである。
【図９Ｂ】図９は、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成および性質決定を示す。Ａは、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成を示す化学的図式である。Ｂは、Ｄ２Ｏ中でのＰＥＧ−ＰＬＬ−チオピリダールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。Ｃ／Ｄは、架橋されていないＰＣＭ（Ｃ）およびペプチド架橋された（Ｄ）の動的光散乱解析を示すグラフである。Ｅは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）におけるシステインの架橋反応を示すグラフである。Ｆは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）とブロック共重合体ミセルとの間の架橋反応のＵＶ解析を示すグラフである。
【図９Ｃ】図９は、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成および性質決定を示す。Ａは、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成を示す化学的図式である。Ｂは、Ｄ２Ｏ中でのＰＥＧ−ＰＬＬ−チオピリダールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。Ｃ／Ｄは、架橋されていないＰＣＭ（Ｃ）およびペプチド架橋された（Ｄ）の動的光散乱解析を示すグラフである。Ｅは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）におけるシステインの架橋反応を示すグラフである。Ｆは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）とブロック共重合体ミセルとの間の架橋反応のＵＶ解析を示すグラフである。
【図９Ｄ】図９は、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成および性質決定を示す。Ａは、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成を示す化学的図式である。Ｂは、Ｄ２Ｏ中でのＰＥＧ−ＰＬＬ−チオピリダールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。Ｃ／Ｄは、架橋されていないＰＣＭ（Ｃ）およびペプチド架橋された（Ｄ）の動的光散乱解析を示すグラフである。Ｅは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）におけるシステインの架橋反応を示すグラフである。Ｆは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）とブロック共重合体ミセルとの間の架橋反応のＵＶ解析を示すグラフである。
【図９Ｅ】図９は、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成および性質決定を示す。Ａは、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成を示す化学的図式である。Ｂは、Ｄ２Ｏ中でのＰＥＧ−ＰＬＬ−チオピリダールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。Ｃ／Ｄは、架橋されていないＰＣＭ（Ｃ）およびペプチド架橋された（Ｄ）の動的光散乱解析を示すグラフである。Ｅは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）におけるシステインの架橋反応を示すグラフである。Ｆは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）とブロック共重合体ミセルとの間の架橋反応のＵＶ解析を示すグラフである。
【図９Ｆ】図９は、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成および性質決定を示す。Ａは、ＰＥＧ−ポリリジン  チオピリダールの合成を示す化学的図式である。Ｂは、Ｄ２Ｏ中でのＰＥＧ−ＰＬＬ−チオピリダールの１Ｈ−ＮＭＲスペクトルである。Ｃ／Ｄは、架橋されていないＰＣＭ（Ｃ）およびペプチド架橋された（Ｄ）の動的光散乱解析を示すグラフである。Ｅは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）におけるシステインの架橋反応を示すグラフである。Ｆは、ペプチド抗原ＩＩ（図８）とブロック共重合体ミセルとの間の架橋反応のＵＶ解析を示すグラフである。
【図１０Ａ】図１０は、ペプチドおよびＤＮＡの放出におけるＧＳＨの影響を示す。Ａは、ＧＳＨ感受性のペプチド放出を示すグラフである。Ｂは、ＧＳＨ感受性のＤＮＡ放出を示すゲル電気泳動解析である。Ｃは、ＩＳＳ−ＤＮＡが、ＰＣＭ中の血清ヌクレアーゼから保護されることを示すゲル電気泳動解析である。
【図１０Ｂ】図１０は、ペプチドおよびＤＮＡの放出におけるＧＳＨの影響を示す。Ａは、ＧＳＨ感受性のペプチド放出を示すグラフである。Ｂは、ＧＳＨ感受性のＤＮＡ放出を示すゲル電気泳動解析である。Ｃは、ＩＳＳ−ＤＮＡが、ＰＣＭ中の血清ヌクレアーゼから保護されることを示すゲル電気泳動解析である。
【図１０Ｃ】図１０は、ペプチドおよびＤＮＡの放出におけるＧＳＨの影響を示す。Ａは、ＧＳＨ感受性のペプチド放出を示すグラフである。Ｂは、ＧＳＨ感受性のＤＮＡ放出を示すゲル電気泳動解析である。Ｃは、ＩＳＳ−ＤＮＡが、ＰＣＭ中の血清ヌクレアーゼから保護されることを示すゲル電気泳動解析である。
【図１１Ａ】図１１は、ブロック共重合体ミセルを表す。Ａは、ＰＥＧ−ポリ（リジン−チオ−ピリジル）の化学構造を示す。Ｂは、ミセル形成を示す概略図である。Ｃは、ミセルの架橋を示す概略図である。Ｄは、架橋されたミセルの還元を示す概略図である。
【図１１Ｂ】図１１は、ブロック共重合体ミセルを表す。Ａは、ＰＥＧ−ポリ（リジン−チオ−ピリジル）の化学構造を示す。Ｂは、ミセル形成を示す概略図である。Ｃは、ミセルの架橋を示す概略図である。Ｄは、架橋されたミセルの還元を示す概略図である。
【図１１Ｃ】図１１は、ブロック共重合体ミセルを表す。Ａは、ＰＥＧ−ポリ（リジン−チオ−ピリジル）の化学構造を示す。Ｂは、ミセル形成を示す概略図である。Ｃは、ミセルの架橋を示す概略図である。Ｄは、架橋されたミセルの還元を示す概略図である。
【図１１Ｄ】図１１は、ブロック共重合体ミセルを表す。Ａは、ＰＥＧ−ポリ（リジン−チオ−ピリジル）の化学構造を示す。Ｂは、ミセル形成を示す概略図である。Ｃは、ミセルの架橋を示す概略図である。Ｄは、架橋されたミセルの還元を示す概略図である。
【図１２Ａ】図１２は、ミセルの免疫学を示す。Ａ．ＤＣ由来のヒト単球によるＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＣＦＳＥミセルの取り込みについての共焦点顕微鏡解析。Ｂ．ＤＣ由来のヒト単球による、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをカプセル化されたミセルの取り込みについてのＦＡＣＳ解析。Ｃ．マウスのＤＣおよびマクロファージによる、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをカプセル化されたミセルの取り込みについてのＦＡＣＳ解析。
【図１２Ｂ】図１２は、ミセルの免疫学を示す。Ａ．ＤＣ由来のヒト単球によるＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＣＦＳＥミセルの取り込みについての共焦点顕微鏡解析。Ｂ．ＤＣ由来のヒト単球による、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをカプセル化されたミセルの取り込みについてのＦＡＣＳ解析。Ｃ．マウスのＤＣおよびマクロファージによる、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをカプセル化されたミセルの取り込みについてのＦＡＣＳ解析。
【図１２Ｃ】図１２は、ミセルの免疫学を示す。Ａ．ＤＣ由来のヒト単球によるＳＩＩＮＦＥＫＬ−ＣＦＳＥミセルの取り込みについての共焦点顕微鏡解析。Ｂ．ＤＣ由来のヒト単球による、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをカプセル化されたミセルの取り込みについてのＦＡＣＳ解析。Ｃ．マウスのＤＣおよびマクロファージによる、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドをカプセル化されたミセルの取り込みについてのＦＡＣＳ解析。
【図１３】図１３は、ＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを処方されたミセルが、インビトロで強いＴ細胞反応を誘導することを示す棒グラフである。
【図１４Ａ】図１４は、ミセルの免疫学を示す。Ａは、マウスのＤＣおよびマクロファージによる、ＯＶＡタンパク質をカプセル化されたミセルの効率的な取り込みについてのＦＡＣＳ解析を示す。Ｂは、ＯＶＡ／ＣｐＧをカプセル化されたミセルが、インビトロでＤＣを活性化することを示すグラフである。
【図１４Ｂ】図１４は、ミセルの免疫学を示す。Ａは、マウスのＤＣおよびマクロファージによる、ＯＶＡタンパク質をカプセル化されたミセルの効率的な取り込みについてのＦＡＣＳ解析を示す。Ｂは、ＯＶＡ／ＣｐＧをカプセル化されたミセルが、インビトロでＤＣを活性化することを示すグラフである。
【図１５】図１５は、ポリケタール粒子の免疫学を示すグラフである。インビトロでの、マウスのＤＣおよびマクロファージによる、Ｕ０１２６をカプセル化されたポリケタール粒子（ＰＫＮ）の取り込み。
【図１６】図１６は、ＯＶＡ−ＯＴ／１トランスジェニックモデルを用いた、インビトロでのＴ細胞の刺激についての実験の概略を示す概略図である。
【図１７Ａ】図１７は、ミセルの免疫学を示す。Ａ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、抗原を処方されたミセルでパルスされた脾臓細胞が、インビトロで強い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｂ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、抗原を処方されたミセルでパルスされたＤＣが、インビトロで強い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｃ．抗原を処方されたミセルが、インビボでＤＣを活性化することを示すフローサイトメトリー。
【図１７Ｂ】図１７は、ミセルの免疫学を示す。Ａ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、抗原を処方されたミセルでパルスされた脾臓細胞が、インビトロで強い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｂ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、抗原を処方されたミセルでパルスされたＤＣが、インビトロで強い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｃ．抗原を処方されたミセルが、インビボでＤＣを活性化することを示すフローサイトメトリー。
【図１７Ｃ】図１７は、ミセルの免疫学を示す。Ａ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、抗原を処方されたミセルでパルスされた脾臓細胞が、インビトロで強い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｂ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、抗原を処方されたミセルでパルスされたＤＣが、インビトロで強い抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｃ．抗原を処方されたミセルが、インビボでＤＣを活性化することを示すフローサイトメトリー。
【図１８Ａ】図１８は、ミセルおよびポリケタール粒子の免疫学を示す。Ａ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｂ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＴＮＦα＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｃ．ＯＶＡ／ＣｐＧワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｄ．ＯＶＡ＋ＵＯｌ２６  ＰＫＮワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｅ．ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＩｇＧ抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。Ｆ．ワクチンを処方されたミセルは、インビボで抗原特異的なＩｇＥおよびＩｇＭの抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。
【図１８Ｂ】図１８は、ミセルおよびポリケタール粒子の免疫学を示す。Ａ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｂ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＴＮＦα＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｃ．ＯＶＡ／ＣｐＧワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｄ．ＯＶＡ＋ＵＯｌ２６  ＰＫＮワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｅ．ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＩｇＧ抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。Ｆ．ワクチンを処方されたミセルは、インビボで抗原特異的なＩｇＥおよびＩｇＭの抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。
【図１８Ｃ】図１８は、ミセルおよびポリケタール粒子の免疫学を示す。Ａ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｂ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＴＮＦα＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｃ．ＯＶＡ／ＣｐＧワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｄ．ＯＶＡ＋ＵＯｌ２６  ＰＫＮワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｅ．ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＩｇＧ抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。Ｆ．ワクチンを処方されたミセルは、インビボで抗原特異的なＩｇＥおよびＩｇＭの抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。
【図１８Ｄ】図１８は、ミセルおよびポリケタール粒子の免疫学を示す。Ａ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｂ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＴＮＦα＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｃ．ＯＶＡ／ＣｐＧワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｄ．ＯＶＡ＋ＵＯｌ２６  ＰＫＮワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｅ．ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＩｇＧ抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。Ｆ．ワクチンを処方されたミセルは、インビボで抗原特異的なＩｇＥおよびＩｇＭの抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。
【図１８Ｅ】図１８は、ミセルおよびポリケタール粒子の免疫学を示す。Ａ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｂ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＴＮＦα＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｃ．ＯＶＡ／ＣｐＧワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｄ．ＯＶＡ＋ＵＯｌ２６  ＰＫＮワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｅ．ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＩｇＧ抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。Ｆ．ワクチンを処方されたミセルは、インビボで抗原特異的なＩｇＥおよびＩｇＭの抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。
【図１８Ｆ】図１８は、ミセルおよびポリケタール粒子の免疫学を示す。Ａ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｂ．左のパネルは、フローサイトメトリー解析であり、右のパネルは、ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＣＤ８＋ＴＮＦα＋Ｔ細胞反応を誘導することを示す概要である。Ｃ．ＯＶＡ／ＣｐＧワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｄ．ＯＶＡ＋ＵＯｌ２６  ＰＫＮワクチン接種後の特異的なＣＤ８＋／ＩＦＮγ＋Ｔ細胞の速度論を示す線グラフ。Ｅ．ワクチンを処方されたミセルが、インビボで強い抗原特異的ＩｇＧ抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。Ｆ．ワクチンを処方されたミセルは、インビボで抗原特異的なＩｇＥおよびＩｇＭの抗体反応を誘導することを示す棒グラフ。
【図１９】図１９は、シクロヘキサンジメタノール由来のポリケタール（ＰＣＡＤＫと呼ばれる）を示す。Ａ．シクロヘキサンジメタノール由来のポリケタールを示す化学的表記。Ｂ．酸感受性様式でＰＣＡＤＫが分解することを示す線グラフ。
【図２０】図２０は、ＰＣＡＤＫ由来の粒子が、疎水性の化合物および薬物（例えば、ローダミンレッド（ｒｈｏｄｈａｍｉｎｅ  ｒｅｄ）およびエブセレン（ｅｂｓｅｌｅｎ））をカプセル化し得ることを示すＳＥＭ画像を示す。
【図２１】図２１は、ＰＣＡＤＫ由来のローダミンレッドの放出が、ｐＨ感受性であることを示す線グラフを示す。
【図２２】図２２は、ほとんどのいかなる脂肪族ジオールをも含むポリケタールが、作製され得ることを示す化学的表記である。
【図２３】図２３は、ＦＩＴＣ標識されたポリケタールが、肝臓のマクロファージによりファゴサイトーシスされることを示す写真である。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ポリケタール粒子中にカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼをカプセル化するために用いられる二重エマルジョンの手順を示す概略図である。Ｂは、カタラーゼ含有粒子のＳＥＭ画像、およびカタラーゼ含有粒子の蛍光顕微鏡画像である。Ｃは、カタラーゼの粒子が酵素活性を有することを示すグラフである。
【図２４Ｂ】図２４Ａは、ポリケタール粒子中にカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼをカプセル化するために用いられる二重エマルジョンの手順を示す概略図である。Ｂは、カタラーゼ含有粒子のＳＥＭ画像、およびカタラーゼ含有粒子の蛍光顕微鏡画像である。Ｃは、カタラーゼの粒子が酵素活性を有することを示すグラフである。
【図２４Ｃ】図２４Ａは、ポリケタール粒子中にカタラーゼおよびスーパーオキシドジスムターゼをカプセル化するために用いられる二重エマルジョンの手順を示す概略図である。Ｂは、カタラーゼ含有粒子のＳＥＭ画像、およびカタラーゼ含有粒子の蛍光顕微鏡画像である。Ｃは、カタラーゼ粒子が酵素活性を有することを示すグラフである。
【図２５】図２５は、非環式ジエン複分解（ＡＤＭＥＴ）により作製されるポリケタールを示す化学的表記である。
【図２６】図２６は、薬剤をロードした粒子の合成および酸分解についての概略図である。
【図２７】図２７は、ローダミン含有ＰＣＡＤＫ粒子を異なるものにするために用いられる条件を示す表である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
2008540558.tif 000020
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
2008540558.tif 000022
【図１１Ａ】
2008540558.tif 000023
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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