(57)【要約】  分析物を検出するための比色分析センサーが開示される。比色分析センサーの使用方法、および分析物を比色分析検出するためのキットも開示される。
2008524603.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物を検出するための比色分析システムであり：
比色分析センサーであって：
レセプター；
少なくとも１種のジアセチレン化合物を含む重合した組成物；
を含み、前記レセプターが前記重合した組成物の中に組み込まれてトランスデューサーを形成している、比色分析センサー；ならびに
前記分析物と前記トランスデューサーとの間の相互作用を媒介する緩衝剤組成物；
を含む比色分析システムであって、
前記トランスデューサーは、分析物と接触したときに色の変化を示し；
そしてさらに、前記ジアセチレン化合物が重合前に下記の式を有しており：
【化１】
2008524603.tif 000030
式中、Ｒ1は以下のものを含み、
Ｃ1〜Ｃ20アルキル、
【化２】
2008524603.tif 000031
Ｒ2は、以下のものを含み
【化３】
2008524603.tif 000032
Ｒ3、Ｒ8、Ｒ13、Ｒ21、Ｒ24、Ｒ31、およびＲ33は独立して、Ｃ1〜Ｃ20アルキルであり；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ14、Ｒ16、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ22、Ｒ25、およびＲ32は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンであり；
Ｒ6、Ｒ15、Ｒ18、およびＲ26は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレン、Ｃ2〜Ｃ8アルケニレン、またはＣ6〜Ｃ13アリーレンであり；
Ｒ9は、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは−ＮＲ34−であり；
Ｒ10、Ｒ12、Ｒ27、およびＲ29は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは（Ｃ1〜Ｃ14アルキレン）−（Ｃ2〜Ｃ8アリーレン）であり；
Ｒ11およびＲ28は独立して、Ｃ2〜Ｃ30アルキニルであり；
Ｒ17は、エステル活性化基であり；
Ｒ23は、Ｃ6〜Ｃ13アリーレンであり；
Ｒ30は、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは−ＮＲ36−であり；
Ｒ34およびＲ36は、Ｃ1〜Ｃ4アルキルであり；
ｐは、１〜５であり；そして
ｎは、１〜２０であるが；
ここで、Ｒ1とＲ2は同一ではない、
比色分析システム。
【請求項２】
前記緩衝剤組成物がＨＥＰＥＳ緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項３】
プローブをさらに含む、請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項４】
前記プローブがフィブリノーゲン、ストレプトアビジン、ＩｇＧ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項５】
界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項６】
前記トランスデューサーがリポソームである、請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項７】
前記トランスデューサーが、前記緩衝剤組成物と接触すると色の変化を示す、請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項８】
前記緩衝剤が、前記トランスデューサーとのイオン的な相互作用によって、前記分析物の相互作用を媒介する、請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項９】
前記緩衝剤組成物が、前記トランスデューサーとの疎水的な相互作用を増強させることにより、前記分析物の相互作用を媒介する、請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項１０】
Ｒ1が次式であり、
【化４】
2008524603.tif 000033
［式中、Ｒ7はエチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、またはノナメチレンであり、Ｒ6はエチレン、トリメチレン、エテニレン、またはフェニレンである］；
Ｒ2が次式であり、
【化５】
2008524603.tif 000034
［式中、Ｒ20はエチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、またはノナメチレンであり、Ｒ21は、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシルである］；
ｐが１である、
請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項１１】
Ｒ1が次式であり、
【化６】
2008524603.tif 000035
［式中、Ｒ7はエチレンである］；
Ｒ2が次式であり
【化７】
2008524603.tif 000036
［式中、Ｒ20はテトラメチレン、そしてＲ21はトリデシルである］；
ｐが１である、
請求項１０に記載の比色分析システム。
【請求項１２】
前記レセプターがリン脂質を含む、請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項１３】
前記リン脂質が、ホスホコリン、ホスホエタノールアミン、およびホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロール、ならびにそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１２に記載の比色分析システム。
【請求項１４】
前記緩衝剤組成物が２種以上の異なる緩衝剤を含む、請求項１に記載の比色分析システム。
【請求項１５】
分析物を検出するための方法であって：
レセプターおよびジアセチレンを含む重合した組成物を含む比色分析センサーを形成する工程であって、前記レセプターが前記重合した組成物の中に組み込まれて、色の変化を示すことが可能なトランスデューサーを形成する、工程；
前記センサーをプローブと接触させる工程；
前記センサーを、緩衝剤組成物の存在下に、標的分析物を含んでいる疑いのある試料とさらに接触させる工程；および
分析物が存在している場合には、色の変化を観察する工程
を含む方法であり；
ここで、前記ジアセチレン化合物が重合前に下記の式を有しており：
【化８】
2008524603.tif 000037
式中、Ｒ1は以下のものを含み、
Ｃ1〜Ｃ20アルキル、
【化９】
2008524603.tif 000038
Ｒ2は、以下のものを含み、
【化１０】
2008524603.tif 000039
Ｒ3、Ｒ8、Ｒ13、Ｒ21、Ｒ24、Ｒ31、およびＲ33は独立して、Ｃ1〜Ｃ20アルキルであり；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ14、Ｒ16、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ22、Ｒ25、およびＲ32は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンであり；
Ｒ6、Ｒ15、Ｒ18、およびＲ26は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレン、Ｃ2〜Ｃ8アルケニレン、またはＣ6〜Ｃ13アリーレンであり；
Ｒ9は、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは−ＮＲ34−であり；
Ｒ10、Ｒ12、Ｒ27、およびＲ29は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは（Ｃ1〜Ｃ14アルキレン）−（Ｃ2〜Ｃ8アリーレン）であり；
Ｒ11およびＲ28は独立して、Ｃ2〜Ｃ30アルキニルであり；
Ｒ17は、エステル活性化基であり；
Ｒ23は、Ｃ6〜Ｃ13アリーレンであり；
Ｒ30は、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは−ＮＲ36−であり；
Ｒ34およびＲ36は、Ｃ1〜Ｃ4アルキルであり；
ｐは、１〜５であり；そして
ｎは、１〜２０であるが；
ここで、Ｒ1とＲ2は同一ではない、
方法。
【請求項１６】
前記緩衝剤系が２種以上の異なる緩衝剤を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
分析物を検出するための方法であって：
レセプターおよびジアセチレンを含む重合した組成物を含む比色分析センサーを形成する工程であって、前記レセプターが前記重合した組成物の中に組み込まれて、プローブの存在下に色の変化を示すことが可能なトランスデューサーを形成する、工程；
緩衝剤組成物の存在下に、前記トランスデューサーを、標的分析物を含んでいる疑いのある試料、ならびに前記標的分析物および前記レセプターの両方に対して親和性を有するプローブと接触させる工程；および
分析物が存在している場合には、色の変化が本質的に観察されない工程を、含む方法であり；
ここで、前記ジアセチレン化合物が重合前に下記の式を有しており：
【化１１】
2008524603.tif 000040
式中、Ｒ1は以下のものを含み、
Ｃ1〜Ｃ20アルキル、
【化１２】
2008524603.tif 000041
Ｒ2は、以下のものを含み、
【化１３】
2008524603.tif 000042
Ｒ3、Ｒ8、Ｒ13、Ｒ21、Ｒ24、Ｒ31、およびＲ33は独立して、Ｃ1〜Ｃ20アルキルであり；
Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ14、Ｒ16、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ22、Ｒ25、およびＲ32は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンであり；
Ｒ6、Ｒ15、Ｒ18、およびＲ26は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレン、Ｃ2〜Ｃ8アルケニレン、またはＣ6〜Ｃ13アリーレンであり；
Ｒ9は、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは−ＮＲ34−であり；
Ｒ10、Ｒ12、Ｒ27、およびＲ29は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは（Ｃ1〜Ｃ14アルキレン）−（Ｃ2〜Ｃ8アリーレン）であり；
Ｒ11およびＲ28は独立して、Ｃ2〜Ｃ30アルキニルであり；
Ｒ17は、エステル活性化基であり；
Ｒ23は、Ｃ6〜Ｃ13アリーレンであり；
Ｒ30は、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは−ＮＲ36−であり；
Ｒ34およびＲ36は、Ｃ1〜Ｃ4アルキルであり；
ｐは、１〜５であり；そして
ｎは、１〜２０であるが；
ここで、Ｒ1とＲ2は同一ではない、
方法。
【請求項１８】
前記標的分析物が、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、プロテインＡ、ＰＢＰ２’、Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記トランスデューサーを標的分析物を含んでいる疑いのある試料と接触させてから６０分以内に、観察可能な色の変化が起きる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記緩衝剤組成物が２種以上の異なる緩衝剤を含む、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国仮特許出願第６０／６３６，９９３号明細書（出願日：２００４年１２月１７日）に対する優先権を主張するが、その出願のすべてを、参照により本明細書に援用する。
【背景技術】
【０００２】
微生物、特に抗生物質に耐性を有する細菌を検出するために現在使用されている方法は一般に時間がかかり、典型的には純粋な状態でその細菌を培養することが含まれる。高い関心を寄せられているそのような微生物の一つが、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（「Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）」）であって、それは広範囲の感染症を引き起こす病原体であるが、そのような感染症の例として次のものが挙げられる：表層の病変たとえば小皮膚膿瘍および創傷感染症；全身性および生命を脅かすような病状たとえば心内膜炎、肺炎および敗血症；さらには中毒症たとえば食中毒およびトキシックショック症候群。Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、２、３の選択された抗生物質を除いた、すべての抗生物質に対して耐性を有する。
【０００３】
広く各種の従来からの方法を用いて微生物の分析が試みられてきた。たとえば、それらの方法としては、蛍光分析免疫クロマトグラフィー（たとえば米国特許第５，７５３，５１７号明細書に記載されているような、迅速分析物測定手順）、ＥＬＩＳＡ（たとえば、比色分析ＥＬＩＳＡ）、およびその他の比色分析法の使用などが挙げられる。ポリジアセチレン（ＰＤＡ）物質を含む比色分析センサーは、米国特許第５，６２２，８７２号明細書および国際公開第０２／００９２０号パンフレット；米国特許第６，３９５，５６１Ｂ１号明細書；米国特許第６，３０６，５９８Ｂ１号明細書；米国特許第６，２７７，６５２号明細書；米国特許第６，１８３，７２２号明細書；および米国特許第６，０８０，４２３号明細書などに記載されている。
【０００４】
ジアセチレンは典型的には、溶液中のモノマーとしては無色であるが、加熱または化学線照射のいずれかで付加重合する。重合が進行するにつれて、それらの化合物はブルーまたはパープルに対照的な色変化をする。外部刺激たとえば、熱、物理的応力、または溶媒や対イオンの変更などに暴露されると、ポリジアセチレンは、その平面的な骨格のコンホメーションの歪みが原因で、さらなる色変化を示す。たとえば、ポリジアセチレン集合体（ａｓｓｅｍｂｌｉｅｓ）は、温度の上昇やｐＨにおける変化があると、共役された骨格におけるコンホメーションが変化するために、ブルーからレッドに変色することが知られている（下記の文献を参照：ミノ（Ｍｉｎｏ）ら、ラングミュア（Ｌａｎｇｍｕｉｒ）、第８巻、ｐ．５９４、１９９２；チャンス（Ｃｈａｎｃｅ）ら、ジャーナル・オブ・ケミストリー・アンド・フィジックス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ）、第７１巻、ｐ．２０６、１９７９；シブタグ（Ｓｈｉｂｕｔａｇ）、シン・ソリッド・フィルムズ（Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ）、第１７９巻、ｐ．４３３、１９８９；カネコ（Ｋａｎｅｋｏ）ら、シン・ソリッド・フィルムズ（Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ）、第２１０巻、ｐ．５４８、１９９２；ならびに米国特許第５，６７２，４６５号明細書）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、さらにはその他の微生物を検出するための方法については、当業者の間で報告があるものの、改良された検出方法があれば有利であろう。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ポリジアセチレン集合体にコンホメーション的な変化を起こさせるような相互作用を分析物が及ぼした結果として起きる、スペクトル的な変化（肉眼で、または比色計を用いて観察可能な色変化）により、分析物の存在を検出する比色分析センサーを提供する。そのポリジアセチレン集合体は、簡単ではあるが、高感度な方法で、分析物の存在を示す。
【０００７】
分析物を検出するための比色分析システムが提供されるが、それには以下のものを含む比色分析センサーが含まれる：レセプター；少なくとも１種のジアセチレン化合物を含む重合した組成物（これが意味するのは、その重合した組成物が、ジアセチレン化合物を重合させることにより形成されている、ということである）；（ここでそのレセプターは、重合した組成物の中に組み込まれてトランスデューサーを形成する）；ならびに、分析物とトランスデューサーとの間の相互作用を媒介する緩衝剤組成物であるが、ここで、その緩衝剤システムは、好ましくは２種以上の異なる緩衝剤を含み；ここで、そのトランスデューサーは分析物と接触すると色変化を示す。
【０００８】
一つの実施態様においては、その緩衝剤組成物は、より高いイオン強度の緩衝剤とより低いイオン強度の緩衝剤とを組み合わせたものである。好ましい実施態様においては、その緩衝剤組成物は、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、ＰＢＳ緩衝剤、およびそれらの組合せからなる群から選択される。一つの実施態様においては、その緩衝剤は、トランスデューサーとのイオン的な相互作用によって、分析物の相互作用を媒介する。また別の実施態様においては、その緩衝剤組成物は、トランスデューサーとの疎水的な相互作用を増強させることにより、分析物の相互作用を媒介する。そのトランスデューサーは、水性溶液中に分散させてもよいし、あるいは基材の上にコーティングしてもよい。
【０００９】
また別の実施態様においては、この比色分析システムには、プローブがさらに含まれる。好ましい実施態様においては、そのプローブは、フィブリノーゲン、ストレプタビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）、ＩｇＧ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００１０】
また別の実施態様においては、この比色分析システムには、界面活性剤がさらに含まれる。好ましい実施態様においては、その界面活性剤にはノニオン性界面活性剤が含まれる。
【００１１】
一つの例示的実施態様においては、この比色分析システムのトランスデューサーがリポソームであるか、および／または緩衝剤組成物との接触によって色変化を示す。
【００１２】
一つの例示的実施態様においては、そのジアセチレン化合物（すなわち、ポリジアセチレン物質のための出発物質）は次式のものである
【化１】
2008524603.tif 000003
式中、Ｒ1は以下のものを含み、
Ｃ1〜Ｃ20アルキル、
【化２】
2008524603.tif 000004
Ｒ2は、以下のものを含み、
【化３】
2008524603.tif 000005
ここで、Ｒ3、Ｒ8、Ｒ13、Ｒ21、Ｒ24、Ｒ31、およびＲ33は独立して、Ｃ1〜Ｃ20アルキルであり；Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ14、Ｒ16、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ22、Ｒ25、およびＲ32は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンであり；Ｒ6、Ｒ15、Ｒ18、およびＲ26は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレン、Ｃ2〜Ｃ8アルケニレン、またはＣ6〜Ｃ13アリーレンであり；Ｒ9は、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンであるかまたは−ＮＲ34−であり；Ｒ10、Ｒ12、Ｒ27、およびＲ29は独立して、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは（Ｃ1〜Ｃ14アルキレン）−（Ｃ2〜Ｃ8アリーレン）であり；Ｒ11およびＲ28は独立して、Ｃ2〜Ｃ30アルキニルであり；Ｒ17は、エステル活性化基であり；Ｒ23は、Ｃ6〜Ｃ13アリーレンであり；Ｒ30は、Ｃ1〜Ｃ14アルキレンまたは−ＮＲ36−であり；Ｒ34およびＲ36は、Ｃ1〜Ｃ4アルキルであり；ｐは、１〜５（本明細書においては、「ジアセチレン」という用語は、２〜１０個のＣ−Ｃ三重結合を含む化合物を包含して使用される）であり；そしてｎは１〜２０であるが；ここでＲ1とＲ2が同一ではない。
【００１３】
一つの実施態様においては、比色分析システムの中のレセプターには、ホスホコリン、ホスホエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、およびそれらの組合せからなる群から選択されるリン脂質が含まれる。
【００１４】
分析物を検出するための方法もまた提供される。その方法に含まれるのは、レセプターおよびジアセチレンを含む重合した組成物（すなわち、その重合組成物が、ジアセチレンを重合させることにより誘導される）を含む比色分析センサーを形成する工程（ここで、そのレセプターは重合した組成物の中に組み込まれて、色変化を示すことが可能なトランスデューサーを形成する）；前記センサーをプローブと接触させる工程；前記センサーを緩衝剤組成物（２種以上の異なる緩衝剤を含んでいるのが好ましい）の存在下に標的分析物を含むと疑われる試料と接触させる工程；および、その分析物が存在すれば、変化する色を観察する工程、である。
【００１５】
また別の実施態様においては、分析物を検出するための方法が提供されるが、それに含まれるのは、レセプターおよびジアセチレンを含む重合した組成物を含む比色分析センサーを形成する工程（ここで、そのレセプターは、重合した組成物の中に組み込まれて、プローブの存在で色の変化を示すことが可能なトランスデューサーを形成する）；そのトランスデューサーを、緩衝剤組成物（２種以上の異なる緩衝剤を含んでいるのが好ましい）の存在下に、標的分析物を含んでいる疑いのある試料、およびその標的分析物とレセプターとの両方に親和性を有するプローブと接触させる工程；ならびに、その分析物が存在する場合、色の変化が本質的に観察されない工程、である。プローブと標的分析物を含んでいる疑いのある試料とを組み合わせて、混合物を形成させてから、トランスデューサーと接触させるのが好ましい。
【００１６】
一つの例示的実施態様においては、その分析物は、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、プロテインＡ、ＰＢＰ２’、Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、およびシュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）からなる群から選択される。ほとんどの実施態様においては、その比色分析システムは、トランスデューサーを分析物を接触させてから６０分以内に、観察可能な色の変化を示す。
【００１７】
定義
以下に定義される用語については、その定義が、特に別な定義が与えられない限り、特許請求項および本明細書の他の部分においても適用されるものとする。
【００１８】
本明細書で使用するとき、「アルキル」という用語は、所定の数の炭素原子を有する、直鎖もしくは分岐鎖、または環状の１価の炭化水素基を指す。アルキル基には、１〜２０個の炭素原子を有するものが含まれる。本明細書で使用するとき、「アルキル」の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソブチル、イソプロピルなどが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。環状残基を目的とする場合には、前記アルキルの中には少なくとも３個の炭素が存在していなければならない、ということは理解されたい。そのような環状残基としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、およびシクロヘプチルなどが挙げられる。
【００１９】
本明細書で使用するとき、「アルキレン」という用語は、所定の数の炭素原子を有する、直鎖もしくは分岐鎖、または環状の２価の炭化水素基を指す。アルキレン基には、１〜１４個の炭素原子を有するものが含まれる。本明細書で使用するとき、「アルキレン」の例としては、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレンなどが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。環状残基を目的とする場合には、前記アルキレンの中には少なくとも３個の炭素が存在していなければならない、ということは理解されたい。そのような環状としては、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン、およびシクロヘプチレンなどが挙げられる。
【００２０】
本明細書で使用するとき、「アルケニレン」という用語は、所定の数の炭素原子と１個または複数の炭素−炭素二重結合を有する、直鎖もしくは分岐鎖、または環状の２価の炭化水素基を指す。アルケニレン基には、２〜８個の炭素原子を有するものが含まれる。本明細書で使用するとき、「アルケニレン」の例としては、エテン−１，２−ジイル、プロペン−１，３−ジイルなどが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。
【００２１】
本明細書で使用するとき、「アリーレン」という用語は、２価の不飽和芳香族カルボキシル基を有する単一環たとえばフェニレン、または多重縮合環たとえばナフチレンもしくはアントリレンを指す。アリーレン基には、６〜１３個の炭素原子を有するものが含まれる。本明細書で使用するとき、「アリーレン」の例としては、ベンゼン−１，２−ジイル、ベンゼン−１，３−ジイル、ベンゼン−１，４−ジイル、ナフタレン−１，８−ジイルなどが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。
【００２２】
本明細書で使用するとき、「アルキレンアリーレン」という用語は、上で定義されたアリーレン残基に結合された、上に定義されたアルキレン残基を指す。本明細書で使用するとき、「アルキレンアリーレン」の例としては、−ＣＨ2−フェニレン、−ＣＨ2ＣＨ2−フェニレン、および−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−フェニレンが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。
【００２３】
本明細書で使用するとき、「アルキニル」という用語は、２〜１３個の炭素原子と少なくとも１個の炭素−炭素三重結合を有する、直鎖もしくは分岐鎖、または環状の１価の炭化水素基を指す。本明細書で使用するとき、「アルキニル」の例としては、エチニル、プロピニルおよびブチニルが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。
【００２４】
本明細書で使用するとき、「分析物」という用語は、本発明のセンサーシステムによって検出可能な各種の物質を指す。そのような物質の例を挙げれば、低分子、病原性および非病原性微生物、トキシン、膜レセプターおよび膜断片、揮発性有機化合物、酵素および酵素基質、抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、核酸、ならびにペプチド核酸などが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。「標的分析物」という用語は、センサーシステムにおいて検出の標的とされる物質を指す。
【００２５】
本明細書で使用するとき、「細菌」という用語は、球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、プロトプラストなどを含め、細菌であるとみなされているすべての形態の微生物を指す。
【００２６】
本明細書で使用するとき、「レセプター」という用語は、標的分析物および／またはプローブに対する親和性を有する、各種の分子または分子の集合体を指す。レセプターとしては、天然由来または合成のレセプター、たとえば脂質、表面膜タンパク質、酵素、レクチン、抗体、組換え体タンパク質、合成タンパク質、核酸、ｃ−グリコシド、炭水化物、ガングリオシド、およびキレート化剤などが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。
【００２７】
本明細書で使用するとき、「集合」または「自己集合」という用語は、重合の前に、ジアセチレン分子およびリン脂質が自発的に配列することを指す。Ｊ．イスラエラシビリ（Ｊ．Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ）『インターモレキュラー・アンド・サーフェス・フォーシズ（Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｆｏｒｃｅｓ）（第２版）』（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９２）、ｐ．３２１〜４２７を参照されたい。
【００２８】
本明細書で使用するとき、「自己集合単一層」（ＳＡＭｓ）という用語は、自発的な自己集合によって、所定の基材の上に形成される、各種の配列された有機超薄膜を指す。Ａ．ウルマン（Ａ．Ｕｌｍａｎ）『アン・イントロダクション・トゥ・ウルトラシン・オーガニック・フィルムズ（Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｉｌｍｓ）』（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９１）、ｐ．２３７〜３０１を参照されたい。
【００２９】
本明細書で使用するとき、「トランスデューサー」という用語は、分子レベルにおける共有結合もしくは非共有結合性の相互作用（たとえば、静電相互作用、極性相互作用、ファン・デル・ワールス力）のような認識事象を、観察可能なシグナルに変換させることが可能な物質を指す。
【００３０】
「プローブ」という用語は、標的分析物および／またはレセプターと相互作用することが可能な、構成成分を指す。したがって、プローブは１種の「検出可能な結合薬剤」、すなわち、分析物（すなわち、標的分析物）および／またはレセプターを特異的に認識し、それらと相互作用または結合するような薬剤であり、ここでそのプローブは結合されたときに検出可能となるような性質を有している。「特異的に相互作用する」という用語は、検出可能な結合剤が、標的分析物またはレセプターとは物理的に相互作用するが、その試料の中に同時に存在する他の分析物は実質的に排除する、ということを意味している。本発明において有用な検出可能な結合薬剤が結合することで、安定性が得られ、その結合の測定が可能となる。
【００３１】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という用語およびその変化体は、本明細書および特許請求項においてそれらの用語が使用された場合、限定的な意味合いを有さない。
【００３２】
「好適な（ｐｒｅｆｅｒｒｅｄおよびｐｒｅｆｅｒａｂｌｙ）」という用語は、ある種の環境下において本発明の実施態様がある種のメリットを与えるということを指している。しかしながら、同一または異なった環境下において、別な実施態様が好ましいこともあり得る。さらに、１種または複数の好ましい実施態様を引用したからといって、他の実施態様が有用ではないということではなく、また、他の実施態様を本発明の範囲から除外しようとするものでもない。
【００３３】
本明細書で使用するとき、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１種の」、および「１種または複数の」という用語は、相互に置き換え可能として使用される。
【００３４】
本明細書中の数字はすべて、「約」という用語によって修飾されているとみなす。末端を明示して数字の範囲を引用した場合、その範囲の中に包含されるすべての数字が含まれている（たとえば、１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、および５が含まれる）。
【００３５】
上に本発明をまとめたが、これは、本発明のそれぞれの開示された実施態様またはすべての実施を記述しようとしたものではない。以下の記述において、例示的な実施態様についてさらに詳しく説明する。本明細書全体を通じて、いくつかの箇所で、例を列挙しながら方向を示しているが、それらの例は、種々組み合わせて使用することが可能である。それぞれの場合において、引用されたリストは代表的な群を示したに過ぎず、限定するためのリストと解釈してはならない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３６】
本発明は、分析物を検出するための比色分析センサーシステムを提供する。この比色分析システムに含まれるのは、比色分析センサーであって、それには、レセプターおよび重合されたジアセチレン物質（ポリジアセチレン集合体、これは、組織化されたポリジアセチレン構造（それには、（必ずという訳ではないが）他の成分が含まれていてもよい）を指す）が含まれるが、ここで、そのレセプターはポリジアセチレンの中に組み込まれて、プローブおよび／または分析物と結合したときに色の変化を与えることが可能なトランスデューサーを形成している。この比色分析センサーは、溶液中でも機能できるし、あるいは基材の上にコーティングしても機能できる。
【００３７】
ポリジアセチレン集合体
本発明のジアセチレン化合物は、溶液の中で自己集合をして、秩序のある集合体を形成し、それは、各種の化学線たとえば、ＵＶ中の電磁放射線、または電磁スペクトルの可視光範囲などを用いて重合させることができる。ジアセチレン化合物を重合させると、重合反応生成物が得られるが、それは、それらのコンホメーションおよび外部因子への曝露に応じて、５７０ナノメートル（ｎｍ）未満、５７０ｎｍ〜６００ｎｍ（両端の数字を含む）の間、あるいは６００ｎｍより大の可視光線スペクトル中に色を有している。典型的には、本明細書に開示されるジアセチレン化合物の重合では、ポリジアセチレン骨格を含む、準安定なブルー相ポリマーネットワークが得られる。それらの準安定なブルー相ポリマーネットワークは、外部因子たとえば熱、（可能であれば）溶媒もしくは対イオンの変更、物理的応力などに暴露させると、ブルーから赤みがかったオレンジ色へと、色変化を起こす。
【００３８】
本明細書に開示される、ジアセチレン化合物とそれらの重合反応生成物が、物理的応力に曝露されると目に見える色の変化を起こす性能を有するために、それらは、分析物を検出するためのセンサーデバイスを調製するための候補物質とすることができる。開示された、ジアセチレン化合物から形成されるポリジアセチレン集合体は、バイオセンサー用途においてトランスデューサーとして機能することができる。
【００３９】
所望のセンサー用途のための、ジアセチレン系分子の構造的な要件は、典型的には適用の特異性である。たとえば全体の鎖長、溶解度、極性、結晶性、さらなる分子修飾をするための官能基の存在などの特性がすべて働いて、ジアセチレン系分子が有用なセンサー物質として使用できる性能を有しているかどうかが決まる。たとえば、水媒体の中で分析物をバイオ検出するような場合、そのジアセチレン系化合物の構造は、水中で安定な分散体を形成し、効率的に重合して着色物質となり、分析物に結合させるための適切なレセプター化合物を取り込み、色の変化によってその結合相互作用をトランスデュースできなければならない。それらの性能は、それらのジアセチレン化合物の構造的な特徴に依存する。
【００４０】
本発明のジアセチレン化合物は、先に述べたような能力を有しており、容易かつ効率的に重合してポリジアセチレン集合体となり、所望の色変化をもたらすことができる。それに加えて、それらのジアセチレン化合物は、安定で、重合可能な溶液を形成しながらも、非重合性物質、たとえば以下に述べるレセプターを大過剰に組み込むことを可能とする。
【００４１】
本明細書に開示されたジアセチレン化合物（出発物質）は、ハイスループット合成を含め、高速高収率な方法で合成することができる。そのジアセチレン系化合物（出発物質）の骨格の中に、たとえばヘテロ原子のような官能基が存在すると、目的とするセンサー用途の要件を満たすために、容易に構造に手を加えることが可能となる。ジアセチレン系化合物は、ジアセチレンを適切な溶媒たとえば水に添加し、その混合物を超音波処理し、次いでその溶液に紫外光線、典型的には２５４ｎｍの波長を照射することによって重合させて、ネットワークを含む所望のポリジアセチレン骨格を得ることができる。その溶液を重合させると、色の変化が起きて、青色がかったパープルとなる。
【００４２】
本発明において有用なジアセチレン（出発物質）には典型的には、少なくとも８個の平均炭素鎖長を有し、少なくとも１個のたとえばカルボキシル基、一級または三級アミン基、カルボキシルのメチルエステルなどの官能基を含む。好適なジアセチレンとしては、米国特許第５，４９１，０９７号明細書（リビ（Ｒｉｂｉ）ら）、国際公開第０２／００９２０号パンフレット、米国特許第６，３０６，５９８号明細書、および国際公開第０１／７１３１７号パンフレットに記載されているようなものが挙げられる。
【００４３】
好ましい実施態様においては、ポリジアセチレン集合体には、次式のジアセチレンから得られる重合された化合物が含まれる：
【化４】
2008524603.tif 000006
式中、Ｒ1は以下のものであり、
アルキル、
【化５】
2008524603.tif 000007
Ｒ2は以下のものであり、
【化６】
2008524603.tif 000008
Ｒ3、Ｒ8、Ｒ13、Ｒ21、Ｒ24、Ｒ31、およびＲ33は独立して、アルキルであり；Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ14、Ｒ16、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ22、Ｒ25、およびＲ32は独立して、アルキレンであり；Ｒ6、Ｒ15、Ｒ18、およびＲ26は独立して、アルキレン、アルケニレン、またはアリーレンであり；Ｒ9は、アルキレンまたは−ＮＲ34−であり；Ｒ10、Ｒ12、Ｒ27、およびＲ29は独立して、アルキレンまたはアルキレンアリーレンであり；Ｒ11およびＲ28は独立して、アルキニルであり；Ｒ17はエステル活性化基であり；Ｒ23はアリーレンであり；Ｒ30はアルキレンまたは−ＮＲ36−であり；Ｒ34およびＲ36は独立して、ＨまたはＣ1〜Ｃ4アルキルであり；ｐは１〜５であり；そしてｎは１〜２０であるが；ここでＲ1とＲ2は同一ではない。
【００４４】
化合物のさらなる例は、米国特許出願公開第２００５／０１０１７９４−Ａ１号明細書、ならびに米国特許出願公開第２００４／０１２６８９７−Ａ１号明細書および米国特許出願公開第２００４／０１３２２１７−Ａ１号明細書に記載されている。
【００４５】
好ましい実施態様においては、Ｒ1が次式であり
【化７】
2008524603.tif 000009
［式中、Ｒ7は、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、またはノナメチレンであり、Ｒ6はエチレン、トリメチレン、エテニレン、またはフェニレンである］；そして、ここでＲ2は次式であり、
【化８】
2008524603.tif 000010
［式中、Ｒ20は、エチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン、またはノナメチレンであり、そしてここでＲ21は、ウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシルである］；そしてｐは１である。
【００４６】
本発明には、本明細書に記載された化合物を含め、異性体たとえば構造異性体および幾何異性体、塩、溶媒和化合物、多形などもまた含まれる。
【００４７】
式ＸＸＩＩＩのジアセチレンは、スキーム１に概略を示したようにして調製することができるが、ここでｎは典型的には１〜４であり、ｍは典型的には１０〜１４である。
【化９】
2008524603.tif 000011
【００４８】
式ＸＸＩＩＩの化合物は、式ＸＸＩＩから酸化により調製することができるが、それには、適切な溶媒たとえばＤＭＦ中で、適切な酸化剤と反応させる。好適な酸化剤としては、たとえばジョーンズ試薬や二クロム酸ピリジニウムなどが挙げられる。上述の反応は典型的には、０℃〜４０℃、通常は０℃〜２５℃の温度で、１時間〜４８時間、通常は８時間かけて行わせる。
【００４９】
式ＸＸＩＩの化合物は、式ＸＸＩの化合物から、適切な酸塩化物と反応させることにより、調製することができる。適切な酸塩化物としては、所望の反応生成物を与えるものであればいかなる酸塩化物であってもよいが、たとえば、塩化ラウロイル、塩化１−ドデカノイル、塩化１−テトラデカノイル、塩化１−ヘキサデカノイル、および塩化１−オクタデカノイルなどが挙げられる。好適な溶媒としては、たとえば、エーテル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン、およびクロロホルムなどが挙げられる。上述の反応は、典型的には、塩基たとえばトリアルキルアミンまたはピリジン塩基の存在下に、０℃〜４０℃、通常は０℃〜２５℃の温度で、１時間〜２４時間、通常は３時間かけて行わせる。
【００５０】
式ＸＸＩの化合物は、市販品（たとえば、ｎが１〜４の場合）を購入することもできるし、あるいは、スキーム１に示したように、化合物ＸＩＸおよびＸＸを経由して、式ＸＶＩＩＩの化合物から調製することも可能であるが、この反応については、たとえばアブラムズ、スザンヌ・Ｒ（Ａｂｒａｍｓ，Ｓｕｚａｎｎｅ  Ｒ．）：ショウ、アンジェラ・Ｃ（Ｓｈａｗ，Ａｎｇｅｌａ  Ｃ．）「トリプル−ボンド・アイソメリゼーションズ：２−・トゥ・９−デシン−１−オール（Ｔｒｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ  ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ：  ２−  ｔｏ  ９−ｄｅｃｙｎ−１−ｏｌ）」、オーガニック・シンセシス（Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．）、１９８８、６６、１２７〜３１、ならびにブランズマ・Ｌ．（Ｂｒａｎｄｓｍａ  Ｌ．）『プリパラティブ・アセチレニック・ケミストリー（Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｃｅｔｙｌｅｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）』（エルセビア・パブリッシング・コーポレーション（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９７１）にも開示がある。
【００５１】
本明細書に開示されているようなジアセチレン系化合物は、式ＸＸＩＩの化合物を、適切な溶媒たとえばトルエンの存在下に、酸無水物たとえば無水コハク酸、無水グルタル酸または無水フタル酸と反応させることにより、調製することも可能である。上述の反応は典型的には、５０℃〜１２５℃、通常は１００℃〜１２５℃の温度で、１時間〜２４時間、通常は１５時間かけて行わせる。
【００５２】
重合されたジアセチレンを含む比色分析センサーは、分子認識事象の比色分析検出の基礎として役立たせることができる。そのセンサーは、重合の前または後に、ジアセチレンモノマーにレセプターを添加することにより調製できる。レセプターは、各種の手段を通してポリジアセチレン集合体を官能化させることが可能で、そのような手段としては、物理的な混合、共有結合、非共有結合的相互作用（たとえば、静電相互作用、極性相互作用など）が挙げられる。
【００５３】
重合時または重合の後に、レセプターをポリマーネットワークに効果的に組み込んで、レセプターの分析物との相互作用によって、共役された「エン−イン（ｅｎｅ−ｙｎｅ）」ポリマー骨格の摂動のために、目に見える色変化をもたらすようにすることができる。
【００５４】
ポリジアセチレン集合体にレセプターを組み込むことによって、プローブおよび／または分析物との相互作用または結合に応答して変形することが可能な構造形状が得られる。特に有用なレセプターは典型的には、ロッド形状の分子構造を有する両親媒性分子の集合体であるが、そのものは、ｖ／（ａ0ｌc）で定義される充填パラメーター（イスラエラシビリ、Ｊ．Ｎ．（Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ、Ｊ．Ｎ．）ら、クオータリー・レビューズ・オブ・バイオフィジックス（Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．）、１３、１２１、１９８０参照）によって特性を表すことができるが、ここでｖは、その分子の炭化水素成分（たとえば、リン脂質または脂肪酸の炭化水素鎖）によって占められる容積であり、ａ0は、極性のヘッド基（たとえば、リン脂質のホスフェートヘッド基または脂肪酸のカルボン酸ヘッド基）によって占められる有効面積であり、そしてｌcは、いわゆる極限長さ（ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｌｅｎｇｔｈ）であって、一般的にはその環境温度における分子の長さと呼ばれているものである。レセプターにとって好適な両親媒性分子は、（１／３）から１の間の充填パラメーター値ｖ／（ａ0ｌc）を有するものである。
【００５５】
有用なレセプターの例としては、脂質、表面膜タンパク質、酵素、レクチン、抗体、組換え体タンパク質、合成タンパク質、核酸、ｃ−グリコシド、炭水化物、ガングリオシド、およびキレート化剤などが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。ほとんどの実施態様においては、そのレセプターはリン脂質である。好適なリン脂質としては、以下のものが挙げられる：ホスホコリン（たとえば、１，２−ジメリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ホスホエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、およびホスファチジルグリセロール、たとえば、シルバー、ブライアン・Ｌ．（Ｓｉｌｖｅｒ，Ｂｒｉａｎ  Ｌ．）『ザ・フィジカル・ケミストリー・オブ・メンブレンズ（Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）』第１章、ｐ．１〜２４（１９８５）に記載されているようなものである。
【００５６】
一つの実施態様においては、レセプターをポリジアセチレンの中に物理的に混合、分散させて構造を形成させるが、ここでその構造自体が、プローブおよび／または目的の分析物に対する結合親和性を有している。構造としては、リポソーム、ミセル、およびラメラなどが挙げられるが、これらに限定される訳ではない。好ましい実施態様においては、その構造がリポソームである。理論に拘束されることを望むものではないが、リン脂質が細胞膜が模倣すると、その際にポリジアセチレン集合体は、リポソームに生じた物理化学的変化を目に見える色の変化に変換させることができる、と考えられる。調製したままのリポソームは、明瞭なモルホロジー、サイズ分布、およびその他の物理的特性たとえば明瞭な表面電位を有している。
【００５７】
リポソーム内におけるレセプターのジアセチレン化合物（出発物質）に対する比率は、物質の選択および所望する比色分析応答に応じて変化させることができる。ほとんどの実施態様においては、リン脂質のジアセチレン化合物（出発物質）に対する比率は、少なくとも２５：７５、より好ましくは少なくとも４０：６０である。好ましい実施態様においては、そのリポソームは、ジアセチレン化合物：ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3［コハク酸モノ−（１２−テトラデカノイルオキシ−ドデカ−５，７−ジイニル）エステル］と双生イオン性リン脂質の１，２−ジメリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン［ＤＭＰＣ］との６：４の比率の混合物からなる。
【００５８】
本明細書においては、ＰＤＡ系の議論は、レセプター集合体中のリポソームの利用を対象としているが、この議論は、他のレセプター集合体、たとえば他の平面配位のものにも適用される。
【００５９】
リポソームは、緩衝剤溶液（調製緩衝剤と呼ぶ）の中に懸濁された物質の混合物をプローブ超音波処理することにより調製される。たとえば、調製緩衝剤は、低イオン強度（５ｍＭ）のＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］緩衝剤（ｐＨ＝７．２）であってもよい。別の有用な調製緩衝剤は、低イオン強度（２ｍＭ）のＴｒｉｓヒドロキシメチルアミノエタン［ＴＲＩＳ］緩衝剤（ｐＨ＝８．５）である。
【００６０】
本発明の比色分析システムは、プローブが、レセプターたとえばリン脂質と重合されたジアセチレンとの両方を含むリポソームに作用することが可能である方法を活用するよう設計されている。リポソームは、タンパク質のようなプローブと相互作用する、生体膜のモデルとして使用することが可能であるが、これについては、エラーリッヒ、Ｓ．（Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ，Ｓ．）ら、ジャーナル・オブ・フィジカル・ケミストリー・Ｂ（Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．Ｂ）、２００４、１０８、ｐ．３８７１〜３８７８；およびズッカーマン、Ｍ．Ｊ．（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ，Ｍ．Ｊ．）、ハイムブルク（Ｈｅｉｍｂｕｒｇ）、Ｔ．（Ｈｅｉｍｂｕｒｇ，Ｔ．）、バイオフィジカル・ジャーナル（Ｂｉｏｐｈｙｓｉ．Ｊ．）、２００１、８１、ｐ．２４５８〜２４７２に記載がある。一般的には、脂質対タンパク質の濃度比が高いと、主として静電相互作用によって、タンパク質がリポソームの表面に吸着する。
【００６１】
タンパク質濃度が高くなるにつれ、すなわち脂質対タンパク質の濃度比が低くなるにつれて、タンパク質がリポソームを完全に飽和させる、あるいは包み込むまで、タンパク質が静電的にリポソームの表面に吸着され続ける。このプロセスが進行するにつれて、リポソームとタンパク質のいずれもが、モルホロジー的およびコンホメーション的な変化を受け、ついにはリポソームの表面を覆うタンパク質の疎水性セグメントが、疎水性のリポソーム構造の内部と相互作用を開始することが可能となる。この時点において、そのタンパク質は、リポソーム構造に疎水的に結合され、浸透することが可能となり、その結果、リポソーム構造の中で実質的にモルホロジー的な変化が起こり、リポソームのサイズおよび膜透過性に劇的な変化が生じる。最終的には、タンパク質の層が懸濁安定性を失い、フロキュレートし、ついには沈殿することとなりうる。
【００６２】
これらの静電的相互作用が存在するかどうかは、存在しているタンパク質および脂質のタイプだけではなく、それらの環境の影響を多分に受ける。理論に拘束されることを望むものではないが、与えられた緩衝剤系のイオン強度がリポソームと荷電されたタンパク質の両方の表面電位を確立させ、そのために、それらのそれらが相互作用する性質が、顕著に静電的となるのに役立っている、と考えられる。
【００６３】
たとえば、中性のｐＨで低イオン強度（２〜５ｍＭ）の緩衝剤系（たとえば、ＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ）の中では、荷電されたプローブは、ポリジアセチレンリポソームに静電的に吸着することができる。初期の吸着は、それ自体では、リポソームのサイズとモルホロジーにおける実質的な変化の引き金にはなり得ず、そのため初期の小さなあるいは無視できるような比色分析応答しか与えないが、プローブが脂質に対して過剰に存在するならば、最終的にはプローブがリポソームに疎水的に結合され、その内部膜構造に浸透していくであろう。この時点で、プローブがリポソーム構造の内部に組み込まれることによって生じる大きな機械的な応力が、ポリジアセチレンのコンホメーションを顕著に変化させ、その結果、随伴する比色分析の応答が容易に観察できるようになる、ということが期待できるであろう。
【００６４】
それとは別な方法で、プローブが中性のｐＨで負に帯電されると、それがポリジアセチレンリポソームと静電的に相互作用する性能が著しく妨害され、プローブとレセプター含有ポリジアセチレンリポソームとの間の疎水的な相互作用のために、比色分析応答が生じる性能が損なわれる可能性がある。この事象においては、中性のｐＨで高イオン強度の緩衝剤（＞１００ｍＭ）（たとえば、リン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）、イミダゾール緩衝剤）を使用すると、（リポソームの表面電荷をスクリーニングすることによる）リポソームの表面電位を低下させるための手段が与えられ、荷電されていないプローブとリポソームとの直接的な疎水性相互作用が促進され、その結果、そのタンパク質がリポソームの構造の中に組み込まれる。したがってこの場合には、その緩衝剤系が（それ以外では起きないような）実質的な比色分析応答を可能とするのに役立つ。緩衝剤のイオン強度がより高いことによって、リポソームの表面電位に及ぼすその効果のために、プローブが存在しなくても顕著な比色分析応答を導くことが可能ではあるが、プローブが存在すると、タンパク質−リポソームの疎水的な相互作用のためにその比色分析応答が顕著に促進される、ということが見出された。この結果は、実務的には極めて有用な結果を与え、所定の検出限界における検出時間を顕著に短縮することが可能になり、あるいはそれとは逆に、アッセイ時間を固定した場合には、その検出限界を顕著に低下させることができる。
【００６５】
この現象に基づき、プローブは、所定の分析対象のターゲットおよびポリジアセチレンリポソームの両方と特異的に相互作用して、比色分析応答の引き金になる性能を基準にして選択することができる。ポリジアセチレン含有リポソームの比色分析応答は、プローブの濃度、あるいは直接分析のケースではプローブ−分析物錯体の濃度に正比例する。
【００６６】
特定の用途のためのプローブの選択は、プローブのサイズ、形状、電荷、疎水性、および分子に対する親和性にある程度依存するであろう。プローブは、環境ｐＨに応じて、正に荷電していても、負に荷電していても、あるいは双生イオン的であってもよい。プローブの等電点よりも低いｐＨでは、そのプローブは正に荷電され、東電点よりも高いｐＨでは、負に荷電される。本明細書で使用するとき、「等電点」という用語は、プローブの正味の電荷がゼロとなるｐＨを指している。
【００６７】
ポリジアセチレン／リン脂質系を用いた生化学的アッセイを設計するためには、レセプター（またはプローブ）の等電点の知識が、緩衝剤の組合せの選択に影響するであろう。より低い等電点のプローブでは、リポソームのモルホロジーにおける変化を得るためには、より高いイオン強度の緩衝剤を必要とする。より高い等電点のタンパク質を、ＨＥＰＥＳ緩衝剤のような低イオン強度緩衝剤の中で使用して、色の変化を起こさせることができる。
【００６８】
この一般的なメカニズムが存在するとすれば、ポリジアセチレンリポソームの組成（たとえば、使用するリン脂質の選択およびリン脂質対ジアセチレンの比率）および使用するプローブ（たとえば、ポリミキシン、フィブリノーゲン、抗体）だけではなく、緩衝剤系の選択により決まってくる水性環境もまた考慮に入れて、検出アッセイを定めることが重要である。
【００６９】
本発明の緩衝剤組成物は、他の成分の存在下でのｐＨの変化に抵抗することが可能で、その中のプロトン供与体とプロトン受容体の比率がほぼ１であるような共役酸−塩基対からなる系を与える。さらに、本発明の緩衝剤組成物は、分析物と比色分析センサーの成分との間の物理的または化学的相互作用を媒介する。たとえば、一つの実施態様においては、緩衝剤組成物が、分析物のレセプターに対する相互作用を阻害する。また別の実施態様においては、緩衝剤組成物が、分析物のレセプターに対する相互作用を促進する。特に有用な緩衝剤組成物としては、ＨＥＰＥＳ緩衝剤、イミダゾール緩衝剤、およびＰＢＳ緩衝剤などが挙げられる。
【００７０】
好ましい実施態様においては、緩衝剤（すなわち、異なる緩衝剤）の組合せを用いて、プローブおよび／または検出すべき標的分析物の選択に基づいて、所定の用途に適したイオン強度に調節する。
【００７１】
２種以上の異なる緩衝剤を組み合わせることは、緩衝剤系の物理的性質を意のままに調節して、リポソーム−タンパク質プローブの相互作用における静電性および疎水性成分の適切なバランスを得るための、好都合な手段である。
【００７２】
たとえば、ＨＥＰＥＳ緩衝剤（ｐＨ：７．２）だけを含む系においては、ポリミキシン（等電点：７．７）は正の電荷を有し、リン脂質の負に帯電した極性ヘッド基に容易に付着し、比色分析センサーにおいてブルーからレッドへの色の変化を誘導することができる。５．３の等電点を有するフィブリノーゲンは、同一のＨＥＰＥＳ緩衝剤組成物の中では負の電荷を有するために、吸着も、リン脂質の極性ヘッド基とのいかなる静電的相互作用も妨害される。
【００７３】
別な方法として、より高いイオン強度を有する緩衝剤たとえばイミダゾールまたはＰＢＳの存在下では、そのイオン強度がリポソーム（または他のトランスデューサー構造）のモルホロジーを変化させ、疎水性部分を露出させる。より高いイオン強度の緩衝剤組成物を含む比色分析システムにおいては、フィブリノーゲンはその構造の中に、リン脂質と相互作用して色の変化を起こす疎水性部分を含む。
【００７４】
リポソーム−タンパク質相互作用において、静電性成分と疎水性成分の最適なバランスを達成するための一つの好都合な方法は、２種以上の異なる緩衝剤の混合物を使用することである。たとえば、低イオン強度の有機緩衝剤（ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ）を無機緩衝剤（ＰＢＳ）と各種のイオン強度で混合することにより、単一の緩衝剤の場合には制限のある緩衝剤の性能の範囲を広げることが可能となる。したがって、混合緩衝剤系を設計することにより、最適化されたリポソーム−タンパク質の相互作用が得られるように、設計することが可能である。
【００７５】
混合緩衝剤系はさらに、緩衝剤系で、相互作用のある緩衝剤対相互作用のない緩衝剤の比率をどの程度にするかを任意に調節する方法も与える。たとえば、相互作用のある緩衝剤（ＰＢＳ、イミダゾール）を、相互作用のない緩衝剤（ＨＥＰＥＳ）を用いて「希釈」して、リポソームモルホロジーに対するその効果を調節することが可能となる。言うまでもないことであるが、混合緩衝剤系を使用することによって、逆の（相互作用のない緩衝剤をより相互作用性とする）効果を達成することもまた可能である。
【００７６】
最後に、同様の方法において、プローブと比色分析センサーとの疎水性相互作用に役立つ、界面活性剤成分を緩衝剤組成物の中に導入することも可能である。本発明において特に有用な界面活性剤としては、ノニオン性界面活性剤が挙げられる。ポリアルコキシル化、特にポリエトキシル化されたノニオン性界面活性剤は、溶液中の本発明の成分を特に好適に安定化させることができる。
【００７７】
有用な、ノニオン性のタイプの界面活性剤として以下のものが挙げられる：
１：ポリエチレンオキシド伸長させたソルビタンモノアルキレート（すなわち、ポリソルベート）特に、ニッコール（ＮＩＫＫＯＬ）ＴＬ−１０（バレット・プロダクツ（Ｂａｒｒｅｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）製）として市販されているポリソルベート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）２０が極めて有効である。
２：ポリアルコキシル化アルカノールデラウェア州ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）のＩＣＩ・スペシャルティ・ケミカルズ（ＩＣＩ  Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から商品名ブリッジ（ＢＲＩＪ）として入手可能なもので、少なくとも約１４のＨＬＢを有する界面活性剤が有用であることが判った。特に、ブリッジ（ＢＲＩＪ）７８およびブリッジ（ＢＲＩＪ）７００は、ポリエチレンオキシドをそれぞれ２０および１００モル含むステアリルアルコールエトキシレートであるが、極めて有用であることが判った。有用なものとしてはさらに、セテアレス５５も有用であるが、このものは、ニュージャージー州マウント・オリーブ（Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）のＢＡＳＦ・コーポレーション（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．）、パフォーマンス・ケミカルズ・ディビジョン（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｖ．）から、商品名プルラファック（ＰＬＵＲＡＦＡＣ）Ａ−３９として入手可能である。
３：ポリアルコキシル化アルキルフェノールこのタイプの有用な界面活性剤としては次のものが挙げられる：少なくとも約１４のＨＬＢ値を有するポリエトキシル化オクチルまたはノニルフェノールであって、それらはそれぞれ、ニュージャージー州マウント・オリーブ（Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）のＢＡＳＦ・コーポレーション（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．）、パフォーマンス・ケミカルズ・ディビジョン（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｖ．）から、商品名アイコノール（ＩＣＯＮＯＬ）およびトリトン（ＴＲＩＴＯＮ）、ならびにコネチカット州ダンベリー（Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）のユニオン・カーバイド・コーポレーション（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｏｒｐ．）からそれぞれ市販されている。例としては、トリトン（ＴＲＩＴＯＮ）Ｘ１００（１５モルのエチレンオキシドを有するオクチルフェノール、コネチカット州ダンベリー（Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）のユニオン・カーバイド・コーポレーション（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｏｒｐ．）から入手可能）、ならびにアイコノール（ＩＣＯＮＯＬ）ＮＰ７０およびＮＰ４０（それぞれ４０モルおよび７０モルのエチレンオキシド単位を有するノニルフェノール、ニュージャージー州マウント・オリーブ（Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）のＢＡＳＦ・コーポレーション（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．）、パフォーマンス・ケミカルズ・ディビジョン（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｖ．）から入手可能）などが挙げられる。それらの界面活性剤のスルフェート化およびホスフェート化誘導体もまた有用である。そのような誘導体の例としては、アンモニウムノノキシノール−４−スルフェートが挙げられるが、このものは、ニュージャージー州デイトン（Ｄａｙｔｏｎ，ＮＪ）のローディア（Ｒｈｏｄｉａ）から、商品名ローダペックス（ＲＨＯＤＡＰＥＸ）ＣＯ−４３６として入手可能である。
４：ポロキサマーエチレンオキシド（ＥＯ）およびプロピレンオキシド（ＰＯ）のブロックコポリマーをベースとする界面活性剤は、本発明の被膜形成性ポリマーを安定化させ、良好なぬれ性を与えるのに効果があることが判った。ＥＯ−ＰＯ−ＥＯブロック、ＰＯ−ＥＯ−ＰＯブロックのいずれもが、そのＨＬＢが少なくとも約１４、好ましくは少なくとも約１６であれば、良好に機能するであろうと考えられる。そのような界面活性剤は、ニュージャージー州マウント・オリーブ（Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）のＢＡＳＦ・コーポレーション（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．）、パフォーマンス・ケミカルズ・ディビジョン（Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｖ．）から、商品名プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）およびテトロニック（ＴＥＴＲＯＮＩＣ）として市販されている。ＢＡＳＦからのプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）界面活性剤は、上述の数値とは異なったＨＬＢ計算値が報告されていることに、注意されたい。このような場合には、ＢＡＳＦによって報告されているＨＬＢ値を使用するべきである。たとえば、好適なプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）界面活性剤はＬ−６４およびＦ−１２７であって、それらは、それぞれ１５および２２のＨＬＢを有している。プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）界面活性剤は、本発明の組成物を安定化させるのには極めて効果的であり、また活性剤としてのヨウ素にも極めて効果的ではあるが、活性剤としてポビドン−ヨウ素を使用している組成物の抗菌活性を低下させる可能性がある。
５：ポリアルコキシル化エステルポリアルコキシル化グリコールたとえば、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロールなどは、（Ｃ8〜Ｃ22）アルキルカルボン酸を用いて、部分的または全面的にエステル化させる、すなわち１個または複数のアルコールをエステル化させることができる。少なくとも約１４、好ましくは少なくとも約１６のＨＬＢを有するそのようなポリエトキシル化エステルは、本発明の組成物において使用するには適している。
【００７８】
アルキルポリグルコシドたとえば米国特許第５，９５１，９９３号明細書（ショルツ（Ｓｃｈｏｌｚ）ら）の第９カラム、第４４行以降に記載されているようなアルキルポリグルコシドは、本発明の塗膜形成性ポリマーとは相溶性があり、ポリマーを安定化させるのに役立つであろう。例としては、グルコポン（ｇｌｕｃｏｐｏｎ）４２５が挙げられるが、このものは、平均鎖長が１０．３炭素である（Ｃ8〜Ｃ16）アルキル鎖長と１〜４個のグルコース単位とを有している。
【００７９】
究極的には、本発明の比色分析物質をベースとする検出システムは、１種または複数の以下の因子に依存する：ジアセチレン化合物の分子構造；採用されるレセプター残基のタイプ；リポソームのモルホロジー（サイズおよび構造）またはジアセチレンおよびレセプター分子のその他取りうるアグリゲート構造；使用されるタンパク質プローブ；およびアッセイを実施するために使用される緩衝剤系。
【００８０】
検出方法
本発明は、分析物を分析するための方法を提供するが、それに含まれるのは、上述の比色分析センサーを分析物を含む溶液試料または表面と接触させる工程、および吸光測定を使用するか、または肉眼で観察してその比色分析センサーにおける色の変化を検出する工程である。
【００８１】
また別な実施態様においては、本発明は、ポリジアセチレン集合体の中に取り込まれたレセプターと分析物の両方と結合する親和性を有するプローブを選択することによって、分析物を間接的に検出する方法を提供する。その選択されたプローブは、分析物と競合するような親和性を示すであろう。目的とする分析物が存在すると、プローブが、ポリジアセチレン骨格の上のレセプターとよりも、分析物と結合して、分析物の濃度に逆比例する色の変化を与える。分析物が存在しない場合には、プローブがポリジアセチレン骨格の上に組み込まれたレセプターと結合して、ブルーからレッドへの色の変化を起こす。そのプローブは、分析物がセンサーと接触した後にセンサーと接触してもよいし、あるいは、分析物と混合した後で、その混合物をセンサーと接触させてもよい。
【００８２】
逆検出アッセイにおいては、プローブおよび標的分析物は、緩衝剤溶液の中で相互作用させておき、次いでセンサーとの接触状態に置く。緩衝剤において遊離しているプローブの濃度は、存在している標的分析物の量に依存し、分析物の濃度が高いほど、プローブの残存濃度が低くなる。センサーの比色分析応答は、利用できる遊離のプローブの量に比例するので、その比色分析応答は、分析物濃度に逆比例する。
【００８３】
いくつかのケースにおいては、プローブが、分析物と、センサーと直接的に相互作用することが可能な錯体を形成することが可能であって、その結果、比色分析応答が分析物の濃度に正比例する直接アッセイができる。
【００８４】
一つの実施態様においては、本発明の方法には、緩衝剤組成物の中に分析物を含む試験試料を備えること、緩衝剤組成物の中にプローブを備えること、その試験試料とプローブとを組み合わせること（ここで、そのプローブは、レセプターに対するよりも分析物に対する結合親和性の方が高い）、およびバイオセンサーを用いてその変化を検出すること、が含まれる。
【００８５】
いくつかのアッセイにおいては、標的分析物を断片化または溶解させることによって、プローブをインサイツで生成させることも可能である、ということを認識しておくことも重要である。そのプローブは、センサーを用いた直接的な相互作用が利用できる、微生物の細胞壁の外側に存在するタンパク質またはタンパク質の断片と考えてもよい。プローブと分析物との間の相互作用は、リポソームとの間の相互作用を排除して、行わせることが可能である。別な方法として、プローブを分析物と相互作用させて、錯体を形成させ、得られた錯体をリポソームと相互作用させることもできる。
【００８６】
プローブは、溶液中、または基材にコーティングさせたセンサーと接触させることができる。プローブは、標的分析物とレセプターの両方に親和性を有する分子であればいかなる分子であってもよい。本発明において使用することが可能なプローブとしては以下のものが挙げられる：細胞膜破壊性のペプチドたとえば、アラメチシン、マゲイニン、グラミシジン、硫酸ポリミキシンＢ、およびメリチン；フィブリノーゲン；ストレプトアビジン；抗体；レクチン；およびそれらの組合せ。
【００８７】
いくつかの実施態様においては、プローブとして抗体が採用される。「抗体」という用語は、その抗原結合性断片も含めて、所定の抗原と特異的に結合する能力を有している、免疫グロブリンを指す。「抗体」という用語には、各種のアイソタイプ（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）の正味の抗体、および脊椎動物（たとえば、哺乳動物の）タンパク質に特異的な反応性を有するそれらの断片が含まれるものとする。抗体は、慣用される方法を用いて断片化することが可能であり、それらの断片は、正味の抗体と同様にして有用性のスクリーニングをすることができる。したがって、その用語には、抗体分子の、タンパク質分解酵素的に切断されたり、組換え技術によって調製されたりした断片であって、ある種のタンパク質と選択的に反応することが可能なものが含まれる。そのようなタンパク質分解および／または組換え体断片の例を非限定的に挙げれば、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ、ならびに、ペプチドリンカーによって結合されたＶＬおよび／またはＶＨドメインを含む一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）などがある。ｓｃＦｖは、共有結合的または非共有結合的に結合されて、２個以上の結合サイトを有する抗体を形成することができる。抗体は、当業者公知の各種の検出可能な残基を用いて、ラベル化することが可能である。
【００８８】
当業者には種々の抗体が公知である。たとえば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体は、シグマ・アンド・アキュレート・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から市販されている。使用する抗体の濃度は、少なくとも２ナノグラム／ミリリットル（ｎｇ／ｍＬ）とするのが好ましい。典型的には、抗体の濃度は、少なくとも１００ナノグラム／ｍＬである。たとえば、１００マイクログラム／ｍＬの濃度を使用することができる。典型的には、約５００マイクログラム／ｍＬ以下の濃度を用いる。
【００８９】
別な実施態様においては、フィブリノーゲンをプローブとして採用する。理論に束縛されることなく言えば、分析物の上または中に発現または存在するフィブリノーゲン−結合タンパク質が、フィブリノーゲンと反応する、と考えられる。たとえば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）はフィブリノーゲン結合タンパク質を発現するが、このものは多くの場合、接触させたときにフィブリノーゲンと反応するクランピング因子とみなされている。
【００９０】
この反応を起こすためのフィブリノーゲンの濃度は、典型的には、少なくとも０．０００１重量％、一般には５重量％以下である。ヒトの血漿および動物（たとえば、ラビット）の血漿は、適切なフィブリノーゲン含有媒体である。市販されている血漿製剤には一般に、抗凝血剤たとえばＥＤＴＡ、サイトレート、ヘパリンなどが含まれている。ヒト由来のフィブリノーゲンは、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から市販されている。
【００９１】
間接的検出方法を使用すると、使用するプローブの濃度に基づいて、低レベルを検出できる高い感度が可能となる。検出戦略として、所望の検出濃度レベルに対応するように、プローブ濃度を選択することが可能である。プローブを使用する間接的検出方法によって、所定の用途において所望の感度を与えることができる、その系のプローブのタイプと濃度に関する設計が可能となる。このことにより、複数の目的とする分析物に対して、トランスデューサーを普遍的に使用することが可能となる。たとえば、単一のトランスデューサー（ポリジアセチレン／レセプターの組合せ）を、トランスデューサーと接触するプローブを変化させることによって、分析物に対するプローブの親和性に従って、複数の分析物を検出するのに使用できる。
【００９２】
特に注目される検出の分析物は、微生物（ｍｉｃｒｏｂｅｓまたはｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）たとえばグラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、酵母、ウイルス、さらには脂質−エンベロープドウイルスなどである。特に関連のある微生物としては、以下のものが挙げられる：エンテロバクテリアセアエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）科のもの、または属で、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ）属、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属、ビブリオ（Ｖｉｂｒｉｏ）属、さらにはヘルペスウイルス、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、およびカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属。具体的な病原性微生物としては、以下のものが挙げられる：スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（耐性菌株、たとえばメシチリン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）を含む）、Ｓ．エピデルミジス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、ストレプトコッカス・ニューモニエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、Ｓ．アガラクチアエ（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、バンコマイシン耐性エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）（ＶＲＥ）、バンコマイシン耐性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン中等度感受性スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（ＶＩＳＡ）、バチルス・アンスラシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、Ａ．フミガーツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、Ａ．クラバタス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、Ｆ．オキシスポルム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、Ｆ．クラミドスポルム（Ｆ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｕｍ）、リステリア・モノシトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、ビブリオ・コレラ（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、Ｖ．パラヘモリチカス（Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、サルモネラ・コレラスイス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、Ｓ．チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、Ｃ．グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、Ｃ．クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、および多剤耐性グラム陰性桿菌（ＭＤＲ）。
【００９３】
特に関心が持たれるのが、グラム陽性菌たとえばスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）である。典型的には、それらは、その細菌の細胞壁成分特有のもの、たとえば細胞壁タンパク質の存在を検出することにより、検出することが可能となる。特に関心が持たれるとしてはさらに、抗生物質耐性の微生物たとえば、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡ、ＶＩＳＡ、ＶＲＥおよびＭＤＲなどである。典型的にはそれらは、細胞の内部成分、たとえば膜タンパク質の存在をさらに検出することにより、検出することができる。
【００９４】
そのような微生物もしくは関心を持たれる他の生物種は、各所から採取された試験試料中のものを分析することが可能であるが、そのようなものとしては、生理学的流体、たとえば、血液、唾液、眼球レンズ流体、滑液、大脳脊髄液、排膿、汗、滲出物、尿、粘液、乳などが挙げられる。さらに、試験試料は、身体の各部たとえば、創傷、皮膚、鼻腔、頭皮、爪などから取り出してもよい。本明細書で使用するとき、「試験試料」という用語は、標的分析物を含む試料を指す。それらの試料は液体またはガスであるのが好ましいが、液体であればより好ましい。
【００９５】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を検出するための、患者からのサンプリングテクニックが各種、報告されている。そのようなサンプリングテクニックは、本発明の方法においても同様に好適である。患者の鼻腔をぬぐって試料を得るのが一般的である。特に好適なサンプリングテクニックとしては、滅菌したレイヨン製のスワブを用いて、被験者（たとえば患者）の前鼻腔をぬぐう方法が挙げられる。それぞれの被験者についてサンプリングするのに１本のスワブ、すなわち両方の鼻孔に対して１本のスワブを使用する。サンプリングは、レイヨン製のスワブ（英国イースト・グリンステッド（Ｅａｓｔ  Ｇｒｉｎｓｔｅａｄ，ＵＫ）のピューリタン（Ｐｕｒｉｔａｎ）から、商品名「ピュア・ラップス（Ｐｕｒｅ−Ｗｒａｐｓ）」とし市販されているもの）を、乾燥状態または適切な溶液で湿らせて、被験者の鼻孔の前端部分に挿入し、鼻腔の粘膜表面に沿ってスワブを完全に２回転させて、実施する。次いでそのスワブを直接培養するか、あるいは典型的には水を含み、場合によっては緩衝剤と少なくとも１種の界面活性剤を組み合わせた適切な溶液を用いて抽出する。
【００９６】
生理的流体に加えて、他の試験試料としては、他の液状物さらには液状媒体に溶解させた（１種または複数の）固形物が挙げられる。対象としうる試料としては、プロセス流体、水、土壌、植物またはその他の植生、空気、表面（たとえば、汚染表面）などが挙げられる。
【００９７】
試験試料（たとえば、液状物）は、たとえば粘稠な流体の希釈のような、前処理にかけてもよい。試験試料（たとえば、液状物）は、試料ポートに注入する前に、たとえば濃縮（濾過、蒸留、透析など）、希釈、濾過、天然成分の不活化、試薬の添加、化学的処理などの、他の処理方法にかけてもよい。
【００９８】
標的分析物のシグナルの検知を促進することが可能な処理の方法の一つは、細胞を溶解させて細胞壁断片を形成させ、その細胞壁断片を分析する方法であって、たとえば米国特許出願公開第２００５／０１５３３７０号明細書に記載がある。具体的には、その方法は、微生物特にスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に特徴的な細胞壁の１つまたは複数の成分を検出するのに、有用である。その方法には以下の工程が含まれる：無培養細胞を含む試験試料を備える工程；その無培養細胞を溶解させて細胞壁断片を含む溶解産物を形成させる工程；および、分析物に特有の細胞壁成分についてその細胞壁断片を分析する工程、であるが；ここで、その分析物に特有の細胞壁成分が、未溶解細胞における同一の成分に比較して、高いシグナルを示す。
【００９９】
細胞壁成分に含まれるのは、たとえば、細胞壁タンパク質たとえばプロテインＡおよび微生物表面成分認識接着性マトリックス分子（ＭＳＣＲＡＭＭ、ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）たとえば、フィブリノーゲン−結合タンパク質（たとえば、クランピング因子）、フィブロネクチン−結合タンパク質、コラーゲン−結合タンパク質、ヘパリン／ヘパリン関連多糖類結合タンパク質などである。プロテインＡおよびクランピング因子、たとえばフィブリノーゲン−結合因子およびクランピング因子Ａ、Ｂ、およびＥｆｂは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の存在を検出するには、特に有用でもある。他の細胞壁成分としては、莢膜多糖類および細胞壁炭水化物（たとえば、タイコ酸およびリポタイコ酸）などが挙げられる。
【０１００】
溶解には、細胞を溶解剤に接触させること、または物理的に細胞を溶解させることが含まれる。溶解は、通常の条件下、たとえば温度約５℃〜約３７℃、好ましくは温度約１５℃〜約２５℃で実施することができる。注目すべきは、溶解は、無培養細胞、すなわち直接の試験試料を用いても起こすことが可能であるが、培養細胞も同様に使用できる、ということである。
【０１０１】
細胞を溶解させて細胞壁断片を形成させ、その結果細胞壁成分のシグナルを増強させることにより、対象の種を比較的低濃度でしか有していない試料の評価が可能となる。たとえば、ある種の実施態様では、試験試料に比較的低濃度の微生物、特にスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含んでいてもよい。そのような比較的に低い濃度としては、たとえば、約５×１０4コロニー形成単位（「ｃｆｕ」）／ミリリットル（ｃｆｕ／ｍＬ）未満の微生物、約５×１０3ｃｆｕ／ｍＬ未満、約１０００ｃｆｕ／ｍＬ未満、さらには、約５００ｃｆｕ／ｍＬもの低濃度が挙げられる。微生物、たとえばＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は高いレベルでも同様に検出可能であって、その範囲はたとえば５×１０7ｃｆｕ／ｍＬにもなる。
【０１０２】
好適な溶解剤としては、たとえば、酵素たとえばリソスタフィン、リゾチーム、エンドペプチダーゼ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、およびＡＬＥ−１などが挙げられる。所望により、酵素を各種組み合わせて使用することもできる。スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）の存在を検出する方法においては、リソスタフィンが特に有用である。
【０１０３】
その他の溶解剤としては、塩（たとえば、カオトロピック塩）、可溶化剤（たとえば、洗剤）、還元剤（たとえば、ＤＴＴ、ＤＴＥ、システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、酸（たとえば、ＨＣｌ）、塩基（たとえば、ＮａＯＨ）などが挙げられる。所望により、そのような溶解剤を種々組み合わせて使用することができる。
【０１０４】
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が存在している場合が一つの例であり、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に特有のプロテインＡに関して、試験試料の中に溶解された細胞を分析することが可能であって、バイオセンサー表面に固定されたプロテインＡに特異的な抗体を利用して検出することができる。さらに、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のような細胞を溶解させると、（細胞の細胞壁部分とは反対側の）細胞の内側部分からタンパク質マーカーを放出する。そのようなタンパク質マーカーは、たとえば抗体のようなプローブによって検出することができる。
【０１０５】
試験試料とプローブは、各種の適切な方法で組み合わせればよい。一つの態様においては、分離して、プローブをセンサーに供し、試験試料を比色分析センサーに供するが、その順序は任意である。たとえば、フィブリノーゲン含有溶液を用いて表面をコーティングしてもよく、場合によっては乾燥させる。また別な態様においては、試験試料およびプローブを混合物として組み合わせ、その混合物を比色分析センサーに供する。好ましい実施態様においては、分析物を含む試験試料にプローブを相互作用させた後で、比色分析センサーと接触させる。
【０１０６】
好都合なことには、本発明の方法は改良された感度を有する。後の実施例でさらに詳しく説明するが、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、５×１０4コロニー形成単位（「ｃｆｕ」）／ミリリットル、５×１０3ｃｆｕ／ｍＬ、および５×１０2ｃｆｕ／ｍＬの濃度で検出することができる。したがって、当業者ならばよく理解するところであるが、本発明の方法を用いれば、５×１０2ｃｆｕ／ｍＬもの低濃度の標的分析物を（たとえば、１０ｃｆｕ／ｍＬ刻みにおける上述の濃度間での任意の特定濃度）検出することができる。さらに、最高５×１０7ｃｆｕ／ｍＬもの高レベルでも、同様にして、標的分析物を検出することも可能である。
【０１０７】
その方法とは別な方法、またはその方法に加えて、本発明の方法では、改良された検出速度が得られるのも有利である。本明細書において採用されたデバイスでは、比較的に短時間で分析物を検出することができる。たとえば、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、上述の濃度であればどの場合でも、１２０分未満（たとえば、９０分、６０分、３０分、１０分）で検出することができる。
【０１０８】
用途
開示されたジアセチレン化合物から形成される、本発明の比色分析センサーは、実験室環境外で、費用効率が高く、安定していて、精度が高く、ぶれが無く、迅速な診断をしたいという、各種の用途に適用できる。用途の例としては、介護の場における試験（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ  ｔｅｓｔ）、家庭における試験診断、軍および民間における空気媒介または飲料水媒介病原体およびＶＯＣの検出、食品加工などが挙げられる。
【０１０９】
一つの実施態様においては、比色分析センサーを使用して生物学的流体中のグラム陰性細菌を検出することにより、感染症の存在を診断することができる。たとえば、尿の中にグラム陰性細菌が存在するならば、尿路感染症を示している。本発明のポリジアセチレン集合体を含む比色分析センサーは、溶液中または基板の上のコーティングでの色の変化から、生物学的流体の中のグラム陰性細菌たとえばＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の存在を示すことができる。
【０１１０】
ある種の実施態様においては、本発明の比色分析センサーを他の公知の診断方法と組み合わせることによって、細菌またはその他の分析物の存在を多面的に調べることができる。
【０１１１】
一つの実施態様においては、本発明の比色分析センサーを創傷用包帯と組み合わせて使用することにより、感染症の存在を検出することができる。センサーを、創傷部分と直接的または間接的に接触する層として包帯に組み込むことができる。使用している包帯の中に、センサーを挿入することもできる。別な方法として、創傷の滲出物が創傷部分から、創傷とは接触していないセンサーを位置させた包帯の部分に、たとえば米国特許第６，４２０，６２２Ｂ１号明細書に記載されているような微少流体チャンネルを通して、向かうような包帯の構成も考えられる。創傷スワブから抽出した分析物を分析することによって、創傷感染症を評価する、スタンドアローン診断法として、センサーを使用することも可能である。
【０１１２】
ポリジアセチレン集合体を含むセンサーは、通常のＬＢ（ラングミュア・ブロジェット）プロセスによって膜を形成してから、それを適切な支持体の上に移行させる、という手順を必要とすることはなく、得ることができる。別な方法として、このポリジアセチレン集合体は、Ａ．ウルマン（Ａ．Ｕｌｍａｎ）『アン・イントロダクション・トゥ・ウルトラシン・オーガニック・フィルムズ（Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｉｌｍｓ）』（アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９９１、ｐ．１０１〜２１９に記載されているような、公知のＬＢプロセスを使用して基材の上に形成させることも可能である。
【０１１３】
本発明により、使い捨ての粘着性物品に、バイオセンサー性能を与えることが可能である。そのセンサーは、自己完結型であって、測定結果を得るための追加の装置を必要としない。それとは別な方法で、他の測定機器と共に使用することも可能であり、それによって、分析物を検出した後に発色する、蛍光性の「レッド」相を有する蛍光の場合のように、さらに感度が向上する。このセンサーは、臨界値に近い量で存在している特定の分析物を検出したい場合に、迅速すなわち３０分未満、好ましくは１５分未満でのスクリーニングデバイスを与える機能も有している。さらに、本発明のセンサーは、使い捨てが可能であり、比較的安価である。
【０１１４】
本発明の一つの実施態様においては、比色分析センサーには、溶液中でポリジアセチレン集合体の内部に組み込まれたレセプターから形成されたトランスデューサーが含まれる。その溶液は、簡単なバイアルシステムで得ることが可能であって、対象となる分析物に対して特異的なトランスデューサーを含む溶液を入れたバイアルに、分析物を直接添加する。別な方法として、比色分析センサーがキットになった複数のバイアルからなっていてもよく、それぞれのバイアルには、各種の分析物に対して特異的なレセプターを組み込んだ、ポリジアセチレン集合体を含むトランスデューサーが含まれる。分析物を直接ポリジアセチレントランスデューサーに添加することが不可能なような用途では、二液系のバイアルシステムを使用してもよい。バイアルの一つの区画には、分析物の試料を調製するための反応剤が含まれ、それとは物理的に隔離された第二の区画には、ポリジアセチレン集合体から形成させたトランスデューサーが含まれる。試料の調製が完了したら、それらの区画を隔離していた物理的なバリアーを除いて、その分析物をトランスデューサーと混合して、検出する。
【０１１５】
調製したままの比色分析センサーを次いで、固形の基材の上にコーティングすることができるが、それには、基材にスポッティングしてから、水を蒸発させる方法か、あるいは、適切なポアサイズの膜を通して懸濁液を押出し、ポリジアセチレン集合体を捕捉して、コーティングされた膜を得て、次いでそれを乾燥させる方法かの、いずれかを用いる。適切な膜とは一般に、ポアサイズが２００ｎｍ以下で、ポリカーボネート、ナイロン、ＰＴＦＥ、ポリエチレン（他の材料でもよい）などの物質を含むものである。それらの基材は、ジアセチレン集合体の重合された懸濁液を用いてコーティングするか、あるいは、懸濁液を未重合の形でコーティングしてからそのコーティングされた状態で重合させるか、のいずれかでコーティングすることができる。
【０１１６】
本発明のまた別な実施態様においては、比色分析センサーが、図１に示したような、テープまたはラベルの様式の迅速インジケーターである。図１には、テープまたはラベル１０であって、基材４０の上にコーティングされた、感圧粘着剤２０とトランスデューサー３０を用いてコーティングされている。本発明において使用するのに好適な基材は、米国特許出願公開第２００４−０１３２２１７Ａ１号明細書に記載されているように、ミリＱ（Ｍｉｌｌｌｉ−Ｑ）（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））水およびヨウ化メチレン（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いた接触角測定により特性を表すことができる。
【０１１７】
基材４０の例としては、以下のものが挙げられる：高度にフラットな基材、たとえば原子レベルでフラットなケイ素（１１１）ウェーファーの上に蒸着させた金、原子レベルでフラットなケイ素（１１１）ウェーファー、またはフロートガラス（これはむき出しであっても、その表面エネルギーを系統的に変化させるために自己集合単一層（ＳＡＭ）を用いて変性されていてもよい）；または高度に構造化されたトポグラフィーを有する基材、たとえば紙基材、ポリマーインキ受容コーティング、構造化ポリマーフィルム、微孔性フィルム、および膜物質。
【０１１８】
乾燥させたときにポリジアセチレン集合体が元の「ブルー」相を保持している、本発明の一つの実施態様においては、基材４０は、ヨウ化メチレンを用いて５０度未満の前進接触角を示す。この状態は、その表面エネルギーが４０ダイン／ｃｍよりも高い分散成分により特徴づけられる基材に相当する。それに代わる実施態様においては、水との前進接触角が９０度未満である性質を有する基材からは、ブルー相とレッド相を混合して含む乾燥コーティングが得られる。この状態は、その中では分散表面エネルギー成分が４０ダイン／ｃｍ未満であるが、極性表面エネルギー成分が少なくとも１０ダイン／ｃｍよりも高い表面に相当する。
【０１１９】
図１の参照に戻ると、感圧粘着剤２０はテープまたはラベル１０を表面に固定して、分析物を直接検出する。感圧粘着剤２０は、ポリジアセチレン集合体を含むトランスデューサー３０からは隔離されていて、悪影響を可能な限り最小とする。図１においては、感圧粘着剤２０が、テープまたはラベル１０の中央に位置するトランスデューサー３０を取り囲んでいる。別な実施態様（図示せず）においては、感圧粘着剤とトランスデューサーが組み合わさっている。
【０１２０】
場合によっては、テープまたはラベル１０の、テープまたはラベル１０の感圧粘着剤２０を含まない側に透明な窓を取り付ける。その窓は、トランスデューサー３０に中心を有していて、分析物を含む表面からテープまたはラベル１０を剥がさなくても、色の変化を観察することが可能である。
【０１２１】
図２においては、テープまたはラベル１１０が、複数のトランスデューサー１１２、１１３、１１４、１１５、および１１６からなるアレイ１１１として示されている。トランスデューサー１１２、１１３、１１４、１１５、および１１６のそれぞれは、同一または異なるポリジアセチレン集合体から形成されており、それぞれのポリジアセチレン集合体が同一または異なるレセプターを取り込んでいる。トランスデューサー１１２、１１３、１１４、１１５、および１１６を変化させることによって、アレイ１１１が、種々の濃度レベルで、複数の分析物を検出できるように設計することが可能である。別な方法として、トランスデューサー１１２、１１３、１１４、１１５のいずれか一つを、他の診断試験と置き換えることも可能である。本発明を考慮に入れた他の実施態様は、米国特許出願第１０／７３８，５７３号明細書において提供される。
【０１２２】
分析物の試料を調製することが必要な用途においては、キットには反応剤を貯蔵するためのバイアルを含み、分析物と混合してから、二次元基材の上にコーティングされた比色分析センサーと接触させる。一つの実施態様においては、そのキットには反応剤を貯蔵するためのバイアルと、分析物の調製物とを含み、基材の上にコーティングした本発明のトランスデューサーを含む、キャップシステムを有する。
【実施例】
【０１２３】
本発明が以下に記載される具体的な実施例に限定されると受け取ってはならず、むしろ、本発明は、添付された特許請求項に明白に記載された本発明のすべての態様を含んでいると受け取るべきである。本発明を適用することが可能な、各種の修正、等価プロセス、さらには多くの構造は、本発明が対象としている当業者ならば、本明細書を読むことにより、容易に理解されるであろう。実施例および本明細書の残りの部分においては、部、パーセント、比率は、特に断らない限り、モル基準である。特にメーカーを記載していない、溶媒および反応剤はすべて、ウィスコンシン州ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）のアルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から購入した。水は、Ｕ−Ｖ・ミリ−Ｑ（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ）・浄水器を使用して、精製して、抵抗値１８．２ＭΩ／ｃｍとした（マサチューセッツ州ベッドフォード（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）のミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）製）。
【０１２４】
比色分析応答（ＣＲ）は、デジタルカメラで撮影した写真から求めた。写真を、アドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア（商品名アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ））を使用してスキャンして、それぞれのポリジアセチレンセンサー試験についてのＲＧＢ（レッド、グリーン、ブルー）チャンネル値を得た。レッドおよびブルーのチャンネル値は、次式のＣＲ＝（（ＰＲinitial−ＰＲsample）／ＰＲinitial）により求めることができるが、ここでＰＲはその試料のレッド値パーセントであって、次式のＰＲ＝Ｒvalue／（Ｒvalue＋Ｂvalue）＊１００で求められるが、ここでＲvalueおよびＢvalueはそれぞれ、ポリジアセチレンセンサーのレッドおよびブルーのチャンネル値に相当する。
【０１２５】
【表１】
2008524603.tif 000012
【０１２６】
調製例１：ジアセチレンリポソームの懸濁液の調製
ジアセチレン、ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3を、米国特許出願公開第２００４／０１３２２１７号明細書の実施例６に従って調製した。基本的な手順は以下の通りである：５，７−ドデカジイン−１，１２−ジオールである（ＨＯ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4ＯＨ）を塩化ミリストルと反応させ、次いでその反応生成物を無水コハク酸と反応させると、ジアセチレンの、ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3が白色の固形物として得られた。
【０１２７】
ジアセチレン化合物の（６：４）混合物：
ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3（コハク酸モノ−（１２−テトラデカノイルオキシ−ドデカ−５，７−ジイニル）エステル）と、双生イオン性のリン脂質である１，２−ジメリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ、式量（Ｆ．Ｗ．）６７８、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手可能）をガラス製のバイアルに量り込み、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝剤（５ｍＭ、ｐＨ＝７．２）の中に懸濁させて、１ｍＭ溶液を調製した。次いでこの溶液を、ミソニックス（Ｍｉｓｏｎｉｘ）ＸＬ２０２プローブソニケーター（ニューヨーク州ファーミントン（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）のミソニックス・インコーポレーテッド（Ｍｉｓｏｎｉｘ  Ｉｎｃ．）から市販）を用いて２分間プローブ超音波処理をし、４℃の冷蔵庫に約２０時間保存した。この方法によって、安定なリポソーム懸濁液が生成した。
【０１２８】
調製例２：ジアセチレンリポソーム懸濁液の重合
１．２μｍシリンジフィルターを通して、調製例１で調製した懸濁液を濾過し、その試料を２５４ｎｍＵＶランプ（ペンシルバニア州ウェスト・チェスター（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）のＶＷＲ・サイエンティフィック・プロダクツ（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）から市販）の下３ｃｍの距離で１０分間照射させることにより重合させると、ブルーの色に発色するのが観察された。
【０１２９】
調製例３：ジアセチレンリポソーム懸濁液をコーティングした試料の調製
調製例１で調製した懸濁液を、直径２００（ｎｍ）の細孔を有する直径２５（ｍｍ）の多孔質ポリカーボネート膜（カナダ国オタワ（Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）のアベスチン・インコーポレーテッド（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．）製）の上にコーティングして、比色分析ディテクター試料を作成した。膜には、下記のような手動押出しプロセスを用いてコーティングした。コーティングするポリカーボネート膜を、手動押出しシステム（商品名リポファスト（ＬＩＰＯＦＡＳＴ）、カナダ国オタワ（Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）のアベスチン・インコーポレーテッド（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．）から入手可能）のステンレス鋼チャンバーの中に入れた。その膜で、テフロン（登録商標）（ＴＥＦＬＯＮ（登録商標））ベースの底部Ｏ−リングを覆った。膜が曲がったり、および／またはしわが入ったりしないように注意した。上部テフロン（登録商標）（ＴＥＦＬＯＮ（登録商標））Ｏ−リングを、ステンレス鋼ハウジングの中のその膜の上に置いた。次いで、ステンレス鋼のキャップを手で締めて、チャンバーを密閉した。ガス・タイト（Ｇａｓ  Ｔｉｇｈｔ）シリンジ（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、５００−マイクロリットル（μＬ））にジアセチレンリポソームの懸濁液を充填して、底部に取付け、第二のシリンジをもう一方のキャップに取り付けた。第一のシリンジのリポソームを、均圧を保ちながら徐々に注入して、チャンバーを通過させた。
【０１３０】
膜がその表面の上にリポソームを捕捉し、透明な緩衝剤は徐々に通過して、第二のシリンジへ移った。この作業は、１パスのコーティングとみなした。この実施例で、ディテクターとして使用される膜試料では、２パスのコーティングを用いた。２回目のパスでは、１回目と同様にして、第二の０．５ミリリットル（ｍＬ）の量のリポソームを、すでにコーティングされている膜に塗布した。濾過された緩衝剤を含む第二のシリンジを外し、その内容物を廃棄した。ステンレス鋼の末端キャップのねじをゆるめて、テフロン（登録商標）（ＴＥＦＬＯＮ（登録商標））のＯ−リングブロックを外した。濡れた膜を取り出し、コーティングされた側を上にしてガラススライドの上に置き、５℃の冷蔵庫に少なくとも３時間入れておいた。次いでその試料を、ＣａＳＯ4の入ったデシケーターの中で３０分間乾燥させ、２５４ナノメートル（ｎｍ）のＵＶ光に３０〜９０秒間露光させた。
【０１３１】
ＰＤＡコーティングした基材（２５ミリメートル（ｍｍ）円）を、４枚の四分円に切り分けた。それぞれの四分円の試料を、実験用の試料として使用した。
【０１３２】
調製例４：リン酸塩緩衝剤生理食塩液（ＰＢＳ緩衝剤溶液）の調製
リン酸塩緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）溶液、１０×ＰＢＳ液状濃縮物（カリフォルニア州サン・ジエゴ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＥＭＤ・バイオサイエンシズ（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）から市販）を１０倍に希釈して調製した。こうして得られたＰＢＳ緩衝剤溶液は下記の塩組成を有している：１０ｍＭリン酸ナトリウム、１３７ｍＭ塩化ナトリウム、２．７ｍＭ塩化カリウム。そのＰＢＳ緩衝剤溶液は、２５℃で７．５のｐＨを有している。
【０１３３】
調製例５：プルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）Ｌ６４（ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液）を加えたリン酸塩緩衝剤生理食塩液の調製
ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液は、調製例４で調製したＰＢＳ緩衝剤溶液に、０．２％（ｗ／ｖ）のプルロニック（ＰＬＵＲＯＮＩＣ）Ｌ６４界面活性剤（ニュージャージー州マウント・オリーブ（Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）のＢＡＳＦ・コーポレーション（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能）を添加することにより調製した。そのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液は、２５℃で７．５のｐＨを有している。
【０１３４】
調製例６：Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌懸濁液の調製
Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌は、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から、商品名「ＡＴＣＣ２５９２３」として入手した。その細菌を、５〜１０ミリリットルの調製した、滅菌トリプティック・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）（カリフォルニア州サンタ・マリア（Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，ＣＡ）のハーディ・ディアグノスティックス（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製）にその細菌を播種することにより調製した、ブロス培養中で一夜（１７〜２２時間、３７℃）増殖させた。培養物を、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）モデルＮｏ．５８０４Ｒ遠心機（ニューヨーク州ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）のブリンクマン・インストルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）中で遠心分離（８，０００〜１０，０００ｒｐｍ、１５分）により洗浄し、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤中に再懸濁させ、この溶液を用いて、さらに３回遠心分離により洗浄した。
【０１３５】
調製例７：Ｓ．エピデルミジス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）細菌懸濁液の調製
Ｓ．エピデルミジス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）細菌は、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から、商品名「ＡＴＣＣ１２２２８」として入手した。その細菌を、５〜１０ミリリットルの調製した、滅菌トリプティック・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）（カリフォルニア州サンタ・マリア（Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，ＣＡ）のハーディ・ディアグノスティックス（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製）にその細菌を播種することにより調製した、ブロス培養中で一夜（１７〜２２時間、３７℃）増殖させた。培養物を、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）モデルＮｏ．５８０４Ｒ遠心機（ニューヨーク州ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）のブリンクマン・インストルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）中で遠心分離（８，０００〜１０，０００ｒｐｍ、１５分）により洗浄し、ＰＢＳ  Ｌ緩衝剤中に再懸濁させ、この溶液を用いて、さらに３回遠心分離により洗浄した。
【０１３６】
調製例８：Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌懸濁液の調製
Ｅ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌は、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）のジ・アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から、商品名「ＡＴＣＣ２５９２２」として入手した。その細菌を、５〜１０ミリリットルの調製した、滅菌トリプティック・ソイ・ブロス（Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）（カリフォルニア州サンタ・マリア（Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，ＣＡ）のハーディ・ディアグノスティックス（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）製）にその細菌を播種することにより調製した、ブロス培養中で一夜（１７〜２２時間、３７℃）増殖させた。培養物を、エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）モデルＮｏ．５８０４Ｒ遠心機（ニューヨーク州ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）のブリンクマン・インストルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）製）中で遠心分離（８，０００〜１０，０００ｒｐｍ、１５分）により洗浄し、ＨＥＰＥＳ緩衝剤中に再懸濁させ、この溶液を用いて、さらに３回遠心分離により洗浄した。
【０１３７】
実施例１：フィブリノーゲンタンパク質プローブの溶液相検出
ヒト血漿からのフィブリノーゲン（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から入手可能、カタログＮｏ．ＦＲ４１２９）を、イミダゾール緩衝剤の中に、０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解させた。イミダゾール緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン（１００μＬ）を、１００μＬの、調製例２で調製したブルーのポリジアセチレンリポソーム溶液と混合した。さらに、１００μＬのフィブリノーゲンを含まないイミダゾール緩衝剤と、１００μＬの、調製例２で調製したブルーのポリジアセチレンリポソーム溶液とを含む対照試料もまた調製した。いずれの試料も、最初の２０分間でブルーからレッドへと変色したが、フィブリノーゲンを含む懸濁液試料は、フロキュレートを始め、次いで、合計３０分の内に沈殿した。対照試料の懸濁液は、観察期間の間ずっと安定なままであった。
【０１３８】
実施例２：ラビット抗スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＩｇＧ抗体タンパク質プローブの溶液相検出
ラビット抗スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＩｇＧ抗体（ニューヨーク州ウェストベリー（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ）のアキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手、カタログＮｏ．ＹＶＳ６８８１）を、イミダゾール緩衝剤溶液の中に１００μｇ／ｍＬの濃度で溶解させた。イミダゾール緩衝剤溶液中のその抗体（１００μＬ）を、１００μＬの、ブルーのポリジアセチレンリポソーム溶液（調製例２で調製）と混合した。さらに、１００μＬの抗体を含まないイミダゾール緩衝剤と、１００μＬの、ブルーのポリジアセチレンリポソーム溶液（調製例２で調製）とを含む対照試料もまた調製した。いずれの試料も、最初の３０分間でブルーからレッドへと変色したが、抗体を含む懸濁液試料は、フロキュレートを始め、次いで、２４時間後には沈殿した。対照試料の懸濁液は、観察期間の間ずっと安定なままであった。
【０１３９】
実施例３：Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液の存在下におけるフィブリノーゲンタンパク質プローブの溶液相検出
実施例１において調製したイミダゾール緩衝剤中フィブリノーゲン溶液（１００μＬ）を、１００μＬのブルーのポリジアセチレンリポソーム溶液（調製例２において調製）および１００μＬの、調製例６で調製した１０6ｃｆｕ／ｍＬのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含むＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液と混合した。対照試料もまた、１００μＬのイミダゾール緩衝剤中フィブリノーゲン溶液、１００μＬのブルーのポリジアセチレンリポソーム溶液、および１００μＬの、Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含まないＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液を混合することにより、調製した。いずれの試料も３０分の間にブルーからレッドへと変色したが、実施例１の場合とは対照的に、いずれの試料も２４時間の観察時間の間ではその懸濁液は安定なままであった。
【０１４０】
実施例４：Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液の存在下における、ラビット抗スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＩｇＧ抗体タンパク質プローブの溶液相検出
調製例２において調製したブルーのポリジアセチレンリポソーム溶液を、実施例２において調製したイミダゾール緩衝剤溶液中の抗体および調製例６において調製したＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含むＰＢＳ緩衝剤溶液と混合したが、３種類の組合せを用いた：
試料４Ａ：１００μＬのブルーポリジアセチレンリポソーム溶液＋１００μＬのイミダゾール緩衝剤溶液中抗体＋１００μＬの、１０7ｃｆｕ／ｍＬのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含むＰＢＳ緩衝剤溶液
試料４Ｂ：１００μＬのブルーポリジアセチレンリポソーム溶液＋１００μＬのイミダゾール緩衝剤溶液中抗体＋１００μＬの、細菌を含まないＰＢＳ緩衝剤溶液
試料４Ｃ：１００μＬのブルーポリジアセチレンリポソーム溶液＋１００μＬの抗体を含まないイミダゾール緩衝剤溶液＋１００μＬの、細菌を含まないＰＢＳ緩衝剤溶液
【０１４１】
４５分経過後のそれらの試料の色を以下の表１に示す。
【０１４２】
【表２】
2008524603.tif 000013
【０１４３】
実施例５：ポリジアセチレンのコーティング試料を使用したフィブリノーゲンタンパク質プローブの検出
調製例３において調製したポリジアセチレンコーティングした基材を３枚、２４ウェルのマイクロタイタープレート（ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）のコーニング・インコーポレーテッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）から市販、カタログＮｏ．３５２４、商品名「コスター（ＣＯＳＴＡＲ）」）のウェルの底に入れ、以下の溶液を添加した：
試料５Ａ：２５０μＬの実施例１において調製したイミダゾール緩衝剤中フィブリノーゲン溶液＋２５０μＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液
試料５Ｂ：２５０μＬの実施例１において調製したイミダゾール緩衝剤中フィブリノーゲン溶液＋２５０μＬの、調製例６において調製した１０7ｃｆｕ／ｍＬのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含むＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液
試料５Ｃ：２５０μＬの実施例１において調製したイミダゾール緩衝剤中フィブリノーゲン溶液＋２５０μＬの、調製例７において調製した１０7ｃｆｕ／ｍＬのＳ．エピデルミジス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含むＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液
【０１４４】
それぞれの試料がブルーからレッドへと変色するのに要した時間を以下の表２に示す。
【０１４５】
【表３】
2008524603.tif 000014
【０１４６】
実施例６：イミダゾール緩衝剤溶液中のフィブリノーゲンタンパク質プローブを使用した、各種濃度のＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
調製例３において調製したポリジアセチレンコーティングした基材を６枚、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別個のウェルの底に入れた。実施例１において調製したイミダゾール緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン（２５０μＬ）を、２５０μＬの、調製例６において調製したＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含むＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液と混合して、各種の濃度の細菌を含む一連の試料混合物を得た。それらの細菌の濃度は以下の表３に示す。各種の試料混合物をボルテックスし、５分間静置してから、ポリジアセチレンコーティングした基材を含むそれぞれのウェルに加えた。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。６分のところで、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、アドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェアを用いてスキャンした。先にのべたようにして、比色分析応答（ＣＲ）を求めた。下記の表３におけるデータでは、比色分析応答を細菌濃度の関数として示している。
【０１４７】
【表４】
2008524603.tif 000015
【０１４８】
実施例７：抗体−ストレプトアビジン複合タンパク質プローブおよびポリジアセチレンのコーティング試料を用いたＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
調製例３において調製したポリジアセチレンコーティングした基材を２枚、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別個のウェルの底に入れた。ストレプトアビジン複合ラビット抗スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＩｇＧ抗体タンパク質プローブは以下のようにして調製した。ストレプトアビジン複合抗体を、１００μｇ／ｍＬの濃度でイミダゾール緩衝剤溶液の中に溶解させた。
【０１４９】
次いで、以下の試料溶液を調製した：
試料７Ａ：２５０μＬのイミダゾール緩衝剤溶液中ストレプトアビジン複合抗体＋２５０μＬのＰＢＳ緩衝剤溶液（調製例４で調製したもの）
試料７Ｂ：２５０μＬのイミダゾール緩衝剤溶液中ストレプトアビジン複合抗体＋２５０μＬの、調製例６において調製したＰＢＳ緩衝剤溶液中に１０6ｃｆｕ／ｍＬのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含むＰＢＳ緩衝剤溶液
【０１５０】
それらの溶液をボルテックスし、混合後５分間静置してから、センサーを含むそれぞれのウェルに添加した。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。表４には、それぞれのセンサーがブルーからレッドへと変色するのに必要とした時間を示している。
【０１５１】
【表５】
2008524603.tif 000016
【０１５２】
実施例８：ポリジアセチレンのコーティング試料を使用し、抗体−ビオチン複合タンパク質プローブを使用した、ストレプトアビジンの検出
調製例３において調製したポリジアセチレンコーティングした基材を４枚、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別個のウェルの底に入れた。ビオチン複合マウス抗プロテインＡＩｇＧモノクローナル抗体（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）から市販、カタログＮｏ．１３−３１５０）タンパク質プローブを、１００μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ緩衝剤溶液に溶解させた。ストレプトアビジン（ペンシルバニア州ウェスト・グローブ（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）のジャクソン・イムノ・リサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）から市販、カタログＮｏ．０１６−０５０−０８４）を、１００μｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳ緩衝剤溶液に溶解させた。
【０１５３】
次いで、以下の試料溶液を調製した：
試料８Ａ：３００μＬのイミダゾール緩衝剤溶液
試料８Ｂ：１５０μＬのイミダゾール緩衝剤溶液＋１５０μＬのＰＢＳ緩衝剤溶液中ストレプトアビジン
試料８Ｃ：１００μＬのイミダゾール緩衝剤溶液＋１００μＬのＰＢＳ緩衝剤溶液中ストレプトアビジン＋１００μＬのＰＢＳ緩衝剤溶液中ビオチン複合抗体
試料８Ｄ：１５０μＬのイミダゾール緩衝剤溶液＋１５０μＬのＰＢＳ緩衝剤溶液中ビオチン複合抗体
【０１５４】
それらの溶液をボルテックスし、混合後５分間静置してから、センサーを含むそれぞれのウェルに添加した。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。表５には、それぞれのセンサーがブルーからレッドへと変色するのに必要とした時間を示している。
【０１５５】
【表６】
2008524603.tif 000017
【０１５６】
実施例９：ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲンタンパク質プローブを使用した、各種濃度のＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
調製例３において調製したポリジアセチレンコーティングした基材を６枚、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別個のウェルの底に入れた。フィブリノーゲンを、０．５％（ｗ／ｖ）の濃度でＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液に溶解させた。同様にして、フィブリノーゲンを、０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度でもＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液に溶解させた。
【０１５７】
以下の試料溶液を調製した：
試料９Ａ：２５０μＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中フィブリノーゲン（濃度０．５％）＋２５０μＬの、細菌を含まないＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液。
試料９Ｂ：２５０μＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中フィブリノーゲン（濃度０．５％）＋２５０μＬの、調製例６において調製した１０3ｃｆｕ／ｍＬのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含むＰＢＳＬ６４緩衝剤溶液
試料９Ｃ：２５０μＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中フィブリノーゲン（濃度０．５％）＋２５０μＬの、１０5ｃｆｕ／ｍＬのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含むＰＢＳＬ６４緩衝剤溶液
試料９Ｄ：２５０μＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中フィブリノーゲン（濃度０．０５％）＋２５０μＬの、細菌を含まないＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液。
試料９Ｅ：２５０μＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中フィブリノーゲン（濃度０．０５％）＋２５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含むＰＢＳＬ６４緩衝剤溶液
試料１５Ｆ：２５０μＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中フィブリノーゲン（濃度０．０５％）＋２５０μＬの、１０5ｃｆｕ／ｍＬのＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を含むＰＢＳＬ６４緩衝剤溶液
【０１５８】
比較する目的で、別に二つの試料も調製した：
試料９Ｇ：２５０μＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中フィブリノーゲン（濃度０．５％）＋２５０μＬの、調製例７において調製した１０5ｃｆｕ／ｍＬのＳ．エピデルミジス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）細菌を含むＰＢＳＬ６４緩衝剤溶液
試料９Ｈ：２５０μＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中フィブリノーゲン（濃度０．０５％）＋２５０μＬの、１０5ｃｆｕ／ｍＬのＳ．エピデルミジス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）細菌を含むＰＢＳＬ６４緩衝剤溶液
【０１５９】
各種の試料混合物をボルテックスし、５分間静置してから、ポリジアセチレンコーティングした基材を含むそれぞれのウェルに加えた。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。３０分のところで、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のアドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア（商品名、アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０）を用いて、スキャンした。以下の表６のデータに、それらの試料における比色分析応答（ＣＲ）を示す。
【０１６０】
【表７】
2008524603.tif 000018
【０１６１】
実施例１０：ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中フィブリノーゲンタンパク質プローブを使用した臨床試料中の全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
６名の患者から一人の患者あたり２本、合計１２本の鼻腔スワブ試料を採取した。それらの鼻腔スワブ試料は、滅菌したレイヨン製のスワブ棒（英国イースト・グリンステッド（Ｅａｓｔ  Ｇｒｉｎｓｔｅａｄ，ＵＫ）のピューリタン（Ｐｕｒｉｔａｎ）から、商品名「ピュア−ラップス（Ｐｕｒｅ−Ｗｒａｐｓ）」として市販）を使用して、患者の前鼻腔をぬぐうことにより得た。サンプリングは、レイヨン製のスワブを被験者の鼻孔の前端部分に挿入し、鼻腔の粘膜表面に沿ってスワブを完全に２回転させることにより、実施した。それぞれの、スワブ試料を、１ｍＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液を用いて溶出させた。６人の患者それぞれから１本ずつの試料は、調製例３において調製されたコーティングされたポリジアセチレンセンサーを用いて分析した。同じ患者からの第二の試料は、比較のために、１ｍＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液を用いて溶出し、培養して細菌を計数したが、その結果を以下の表７に示す。これらの実験における培養の手順は、以下の一般的な記述に従った：クロスレー、Ｋ．Ｂ．（Ｃｒｏｓｓｌｅｙ，Ｋ．Ｂ．）およびアーチャー、Ｇ．Ｌ．（Ａｒｃｈｅｒ  Ｇ．Ｌ．）編『ザ・スタフィロコッキ・イン・ヒューマン・ディジーズ（Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ）』（チャーチル・リビングストン（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ）、ニューヨーク（ＮＹ）、１９９７、ｐ．２３３〜２５２）。ポリジアセチレンセンサーを用いて分析する試料は、２５０μＬの、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中に溶解させたフィブリノーゲン（濃度、０．５％（ｗ／ｖ））と、２５０μＬの、それぞれの患者のスワブから溶出させた溶液とを混合することにより、調製した。その試料溶液をボルテックスし、５分間静置してから、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別途のウェルの中に置いてある、ポリジアセチレンコーティングしたセンサーの上に置いた。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。４５分のところで、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のアドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア（商品名、アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０）を用いて、スキャンした。下記の表７におけるデータでは、比色分析応答を細菌濃度の関数として示している。
【０１６２】
【表８】
2008524603.tif 000019
【０１６３】
実施例１１：ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中フィブリノーゲンタンパク質プローブを使用した臨床試料中の溶解させたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
５名の患者から一人の患者あたり２本、合計１０本の鼻腔スワブ試料を採取した。それらの試料は、実施例１０におけると同様にして採取した。５人の患者それぞれから１本ずつの試料は、調製例３において調製されたコーティングされたポリジアセチレンセンサーを用いて分析した。同じ患者からの第二の試料は、比較のために、１ｍＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液を用いて溶出し、実施例１０の記載に従って、培養して細菌を計数した。ポリジアセチレンセンサーを用いて分析する試料は、以下のようにして調製した。一番目に、１ｍＬの溶出スワブ試料中に存在するＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を、等容積の、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中に濃度３μｇ／ｍＬで含まれるリソスタフィン（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、カタログＮｏ．Ｌ−４４０２、）からなる溶解緩衝剤溶液と混合することにより、溶解させた。二番目に、２５０μＬのその溶解溶液を、２５０μＬの、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中に濃度０．５％（ｗ／ｖ）で溶解させたフィブリノーゲンと混合した。その試料溶液をボルテックスし、５分間静置してから、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別途のウェルの中に置いてある、ポリジアセチレンコーティングしたセンサーの上に置いた。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。４２分のところで、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のアドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア（商品名、アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０）を用いて、スキャンした。下記の表８におけるデータでは、比色分析応答を細菌濃度の関数として示している。
【０１６４】
【表９】
2008524603.tif 000020
【０１６５】
実施例１２：ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のラビット抗スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＩｇＧ抗体タンパク質プローブを使用した、臨床試料中の溶解されたＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
６名の患者から一人の患者あたり２本、合計１２本の鼻腔スワブ試料を採取した。サンプリングは、実施例１０の記載に従って実施した。６人の患者それぞれから１本ずつの試料は、調製例３において調製されたコーティングされたポリジアセチレンセンサーを用いて分析した。同じ患者からの第二の試料は、比較のために、１ｍＬのＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液を用いて溶出し、培養して細菌を計数したが、その結果を以下の表９に示す。その培養手順は、実施例１０の記載に従って実施した。ポリジアセチレンセンサーを用いて分析する試料は、以下のようにして調製した。一番目に、１ｍＬの溶出スワブ試料中に存在するＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌を、等容積の、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中に濃度３μｇ／ｍＬで含まれるリソスタフィン（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、カタログＮｏ．Ｌ−４４０２、）からなる溶解緩衝剤溶液と混合することにより、溶解させた。二番目に、２５０μＬのその溶解溶液を、２５０μＬの、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中に濃度１００μｇ／ｍＬで溶解させたラビット抗スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＩｇＧ抗体（アキュレート・ケミカルズ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手）と混合した。その試料溶液をボルテックスし、５分間静置してから、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別途のウェルの中に置いてある、ポリジアセチレンコーティングしたセンサーの上に置いた。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。２０分のところで、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のアドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア（商品名、アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０）を用いて、スキャンした。下記の表９におけるデータでは、比色分析応答を細菌濃度の関数として示している。
【０１６６】
【表１０】
2008524603.tif 000021
【０１６７】
実施例１３：ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のラビット抗スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＩｇＧ抗体タンパク質プローブを使用したときの、ポリジアセチレンコーティングしたセンサーの、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）対全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出効率の比較
調製例１において調製した、ジアセチレンのＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3と１，２−ジメリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）の（６０／４０）配合物を、直径２００ｎｍの細孔を有する直径２５ｍｍの多孔質ポリカーボネート膜（カナダ国オタワ（Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ）のアベスチン・インコーポレーテッド（Ａｖｅｓｔｉｎ，Ｉｎｃ．）製）の上にコーティングして、比色分析ディテクター試料を作成した。そのディテクター試料は、調製例３のようにして調製した。
【０１６８】
ポリジアセチレンコーティングした基材（２５ミリメートル（ｍｍ）円）を、４枚の四分円に切り分けた。それぞれの四分円の試料を、実験用の試料として使用した。それらの基材を、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別々のウェルに置いた。全細菌試料溶液は、２５０μＬの、全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌ＡＴＣＣ２５９２３を含むＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液と、２５０μＬの抗体溶液を混合することにより調製した。抗体溶液は、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中に、ラビット抗スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．）、カタログＮｏ．ＹＶＳ６８８１）を１００μｇ／ｍＬの濃度で含んでいた。ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中に溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のＡＴＣＣ２５９２３を含む試料は、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中にリソスタフィン（シグマ−アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から市販、カタログＮｏ．Ｌ−４４０２）を３マイクログラム／ミリリットルの濃度で含む溶解緩衝剤を使用して調製した。溶解細菌試料溶液は、２５０μＬの、先に記述したようにして調製した抗体溶液に混合した、２５０μＬの、ＰＢＳ  Ｌ６４中の溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌（ＡＴＣＣ２５９２３）からなっていた。試験試料の中で使用した細菌の濃度は、下記の表１０に示したように、０〜１０5ｃｆｕ／ｍＬの間で変化させた。細菌と抗体溶液の混合物を５分間静置してから、ポリジアセチレンコーティングした基材を含む、２４ウェルプレートに加えた。比較のために、対照試料も同様にして調製した。対照試料には細菌を含まず、２５０μＬのＰＢＳ−Ｌ６４緩衝剤を、２５０μＬの、前述のようにして調製した抗体溶液と単純に混合したものからなっていた。
【０１６９】
５分ごとに、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のアドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア、商品名、アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０を用いて、スキャンした。下記の表１０のデータは、１５分の時点で測定した、対照試料と、細菌含有試料（全細菌または溶解細菌のいずれか）との間における比色分析応答における違いを示している。
【０１７０】
【表１１】
2008524603.tif 000022
【０１７１】
実施例１４：ラビット抗スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）ＩｇＧ抗体タンパク質プローブおよびポリジアセチレンコーティングしたセンサーを使用したときの、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出におよぼす緩衝剤溶液組成の影響
調製例３において調製したポリジアセチレンコーティングした基材を３２枚、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別個のウェルの底に入れた。
【０１７２】
以下の試料溶液を調製した：
試料１４Ａ：５００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、実施例２において調製したＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中の抗体
試料１４Ｂ：４００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、実施例２において調製したＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中の抗体＋１００μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１４Ｃ：３５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、実施例２において調製したＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中の抗体＋１５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１４Ｄ：３００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、実施例２において調製したＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中の抗体＋２００μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１４Ｅ：２５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、実施例２において調製したＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中の抗体＋２５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１４Ｆ：２００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、実施例２において調製したＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中の抗体＋３００μＬの、ＨＥＰＥＳ溶液
試料１４Ｇ：１５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、実施例２において調製したＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中の抗体＋３５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１４Ｈ：５００μＬの、濃度１００μｇ／ｍＬの、ラビット抗スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（カタログＮｏ．ＹＶＳ６８８１、アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐ．））、および１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＨＥＰＥＳ溶液
【０１７３】
全細菌または溶解細菌を含んでいないことを除けば、試料１４Ａ〜１４Ｈと組成的に同一である、一連の対照試料溶液もまた調製した。
【０１７４】
各種の試料混合物をボルテックスし、５分間静置してから、ポリジアセチレンコーティングした基材を含むそれぞれのウェルに加えた。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。４０分のところで、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のアドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア（商品名、アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０）を用いて、スキャンした。下記の表１１のデータは、１５分の時点で測定した、対照試料と、細菌含有試料（全細菌または溶解細菌のいずれか）との間における比色分析応答における違いを示している。
【０１７５】
【表１２】
2008524603.tif 000023
【０１７６】
実施例１５：高濃度のフィブリノーゲンタンパク質プローブおよびポリジアセチレンコーティングしたセンサーを使用したときの、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出におよぼす緩衝剤溶液組成の影響
調製例３において調製したポリジアセチレンコーティングした基材を３２枚、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別個のウェルの底に入れた。
【０１７７】
以下の試料溶液を調製した：
試料１５Ａ：５００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン
試料１５Ｂ：４００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋１００μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１５Ｃ：３５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋１５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１５Ｄ：３００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋２００μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１５Ｅ：２５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋２５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１５Ｆ：２００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋３００μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１５Ｇ：１５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋３５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１５Ｈ：５００μＬの、０．５％（ｗ／ｖ）の濃度のフィブリノーゲン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手可能、カタログＮｏ．ＦＲ４１２９、ロットＮｏ．０８３Ｋ７６０４）、および１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
【０１７８】
試料溶液１５〜１５Ｈのすべてにおいて、フィブリノーゲンは緩衝剤溶液中に、０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で溶解させた。全細菌または溶解細菌を含んでいないことを除けば、試料１５Ａ〜１５Ｈと組成的に同一である、一連の対照試料溶液もまた調製した。
【０１７９】
各種の試料混合物をボルテックスし、５分間静置してから、ポリジアセチレンコーティングした基材を含むそれぞれのウェルに加えた。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。４０分のところで、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のアドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア（商品名、アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０）を用いて、スキャンした。比色分析応答（ＣＲ）を測定した。下記の表１２のデータは、１５分の時点で測定した、対照試料と、細菌含有試料（全細菌または溶解細菌のいずれか）との間における比色分析応答における違いを示している。
【０１８０】
【表１３】
2008524603.tif 000024
【０１８１】
実施例１６：低濃度のフィブリノーゲンタンパク質プローブおよびポリジアセチレンコーティングしたセンサーを使用したときの、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）および全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出におよぼす緩衝剤溶液組成の影響
調製例３において調製したポリジアセチレンコーティングした基材を３２枚、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別個のウェルの底に入れた。以下の試料溶液を調製した：
試料１６Ａ：５００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン
試料１６Ｂ：４００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋１００μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１６Ｃ：３５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋１５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１６Ｄ：３００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋２００μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１６Ｅ：２５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋２５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１６Ｆ：２００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋３００μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１６Ｇ：１５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの、実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のフィブリノーゲン＋３５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
試料１６Ｈ：５００μＬの、０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度のフィブリノーゲン（シグマ（Ｓｉｇｍａ）から入手可能、カタログＮｏ．ＦＲ４１２９、ロットＮｏ．０８３Ｋ７６０４）、および１０3ｃｆｕ／ｍＬの全Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌もしくは１０3ｃｆｕ／ｍＬの実施例１１に記載の手順により溶解させた、溶解Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細菌のいずれかを含む、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液
【０１８２】
試料溶液１６Ａ〜１６Ｈのすべてにおいて、フィブリノーゲンは、０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で緩衝剤溶液に溶解させた。全細菌または溶解細菌を含んでいないことを除けば、試料１６Ａ〜１６Ｈと組成的に同一である、一連の対照試料溶液もまた調製した。
【０１８３】
各種の試料混合物をボルテックスし、５分間静置してから、ポリジアセチレンコーティングした基材を含むそれぞれのウェルに加えた。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。４０分のところで、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のアドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア（商品名、アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０）を用いて、スキャンした。下記の表１３のデータは、１５分の時点で測定した、対照試料と、細菌含有試料（全細菌または溶解細菌のいずれか）との間における比色分析応答における違いを示している。
【０１８４】
【表１４】
2008524603.tif 000025
【０１８５】
実施例１７：プロテインＡを予備反応させたモノクローナル抗体およびポリジアセチレンコーティングしたセンサーを使用した、メタシリン耐性Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の検出
ＭＲＳＡにおけるＰＢＰ２’に対するモノクローナルＩｇＧ１κ抗体は、プロテインＡと交差反応をする。この抗体を、プロテインＡと予備反応させてから、溶解ＭＲＳＡ（３Ｍ・カルチャー・コレクション（３Ｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）Ｎｏ．３６０）に暴露させた。ＭＲＳＡを溶解させるための手順は、実施例１１の場合に従った。溶解ＭＲＳＡは、実施例１３の記載に従ってＰＢＳ  Ｌ６４の中で調製した。溶解され、この実施例で使用された細菌の濃度は、１０5ｃｆｕ／ｍＬおよび１０3ｃｆｕ／ｍＬであった。ＰＢＳ  Ｌ６４中に細菌は含まず、溶解剤のみを含む対照試料を使用した。ＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体は、ＨＥＰＥＳ緩衝剤中、濃度１００μｇ／ｍＬで調製した。プロテインＡ（カリフォルニア州サンフランシスコ（ＳａｎＦｒａｎｓｉｓｃｏ，ＣＡ）のザイムド（Ｚｙｍｅｄ）、カタログＮｏ．１０−１００６）もまた、ＨＥＰＥＳ緩衝剤中、濃度２００μｇ／ｍＬで調製した。以下に示すようにして、細菌溶液と、抗体およびプロテインＡを含むＨＥＰＥＳ緩衝剤の２種の異なる組合せを使用した。
【０１８６】
試料１７Ａ：１５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤中ＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体の溶液を、１００μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤中プロテインＡと混合した。そのバイアルをボルテックスし、５分間静置した。
【０１８７】
次いで、試料１７Ａを、２５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬもしくは１０5ｃｆｕ／ｍＬのいずれかを含むＰＢＳ  Ｌ６４溶液、または細菌を含まない対照試料と混合した。そのバイアルをボルテックスし、５分間静置した。調製例３の記述に従って、ポリカーボネート膜上にＰＤＡをコーティングした３種の試料を、２４ウェルプレートの底部に置いた。細菌のレベルを変化させた溶液を、それぞれのウェルの中にピペッティングした。ブルーからの色の変化が起きたので、それを以下の表１４に示す。
【０１８８】
【表１５】
2008524603.tif 000026
【０１８９】
試料１７Ｂ：１５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤中ＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体の溶液を、５０μＬの、ＨＥＰＥＳ緩衝剤中プロテインＡと混合した。そのバイアルをボルテックスし、５分間静置した。
【０１９０】
次いで、試料１７Ｂを、３００μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬもしくは１０5ｃｆｕ／ｍＬのいずれかを含むＰＢＳ  Ｌ６４溶液、または細菌を含まない対照試料と混合した。そのバイアルをボルテックスし、５分間静置した。調製例３の記述に従って、ポリカーボネート膜上にＰＤＡをコーティングした３種の試料を、２４ウェルプレートの底部に置いた。細菌のレベルを変化させた溶液を、それぞれのウェルの中にピペッティングした。ブルーからの色の変化が起きたので、それを以下の表１５に示す。
【０１９１】
【表１６】
2008524603.tif 000027
【０１９２】
実施例１８：タンパク質プローブとしてのモノクローナル抗体およびポリジアセチレンコーティングしたセンサーを使用した、メタシリン耐性Ｓ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の検出
ＭＲＳＡを溶解させるための手順は、実施例１１の場合に従った。溶解ＭＲＳＡは、実施例１３の記載に従ってＰＢＳ  Ｌ６４の中で調製した。溶解され、この実施例で使用された細菌の濃度は、１０5ｃｆｕ／ｍＬおよび１０3ｃｆｕ／ｍＬであった。ＰＢＳ  Ｌ６４中に細菌は含まず、溶解剤のみを含む対照試料もまた使用した。ＰＢＰ２’に対するモノクローナルＩｇＧ１κ抗体は、ＨＥＰＥＳ緩衝剤中、濃度１００μｇ／ｍＬで調製した。
【０１９３】
次いで、以下の試料溶液を調製した：
試料１８Ａ：２５０μＬの、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体の溶液を、２５０μＬの、細菌を含まないＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液と混合した。そのバイアルをボルテックスし、５分間静置した。
試料１８Ｂ：２５０μＬの、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体の溶液を、２５０μＬの、１０3ｃｆｕ／ｍＬの溶解ＭＲＳＡを含むＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液と混合した。そのバイアルをボルテックスし、５分間静置した。
試料１８Ｃ：２５０μＬの、ＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液中のＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体の溶液を、２５０μＬの、１０5ｃｆｕ／ｍＬの溶解ＭＲＳＡを含むＰＢＳ  Ｌ６４緩衝剤溶液と混合した。そのバイアルをボルテックスし、５分間静置した。
【０１９４】
調製例３の記述に従って、ポリカーボネート膜上にＰＤＡをコーティングした３種の試料を、２４ウェルプレートの底部に置いた。細菌のレベルを変化させた溶液を、それぞれのウェルの中にピペッティングし、そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（エバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）、ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））上で振盪させた。４５分のところで、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のアドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア（商品名、アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０）を用いて、スキャンした。それぞれの試料における比色分析応答を以下の表１６に示す。
【０１９５】
【表１７】
2008524603.tif 000028
【０１９６】
実施例１９：ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液中ポリミキシンタンパク質プローブを使用した、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液中各種の濃度のＥ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の検出
調製例３において調製したポリジアセチレンコーティングした基材を５枚、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別個のウェルの底に入れた。硫酸ポリミキシンＢ（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ）から市販）を、２６ナノモル／ｍＬの濃度でＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液中に溶解させた。
【０１９７】
以下の試料溶液を調製した：
試料１９Ａ：５００μＬの、細菌を含まないＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液中の硫酸ポリミキシンＢ
試料１９Ｂ：５００μＬの、調製例８において調製した１０3ｃｆｕ／ｍＬのＥ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を含む、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液中の硫酸ポリミキシンＢ
試料１９Ｃ：５００μＬの、調製例８において調製した１０5ｃｆｕ／ｍＬのＥ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を含む、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液中の硫酸ポリミキシンＢ
試料１９Ｄ：５００μＬの、調製例８において調製した１０7ｃｆｕ／ｍＬのＥ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を含む、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液中の硫酸ポリミキシンＢ
試料１９Ｅ：５００μＬの、調製例８において調製した１０9ｃｆｕ／ｍＬのＥ・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細菌を含む、ＨＥＰＥＳ緩衝剤溶液中の硫酸ポリミキシンＢ
【０１９８】
各種の試料混合物をボルテックスし、５分間静置してから、ポリジアセチレンコーティングした基材を含むそれぞれのウェルに加えた。そのマイクロタイタープレートを、エバーバッハ（Ｅｂｅｒｂａｃｈ）モデル６０００シェーカー（ミシガン州アン・アーバー（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）のエバーバッハ・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）製）上で振盪させた。３０分のところで、デジタルカメラを用いて写真を撮った。その写真を、カリフォルニア州サン・ノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のアドーブ・システムズ・インコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）からのソフトウェア（商品名、アドーブ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０）を用いて、スキャンした。比色分析応答（ＣＲ）を測定した。下記の表１７におけるデータでは、比色分析応答を細菌濃度の関数として示している。
【０１９９】
【表１８】
2008524603.tif 000029
【０２００】
本発明の範囲および精神から外れることなく、本発明に対して各種の修正および変更が可能であることは、当業者には自明であろう。本発明は、本明細書において言及された説明のための実施態様によって不当に限定されることは意図されていないこと、および、そのような実施態様は例を挙げるためだけに提示されていて、本発明が特許請求項のみによって限定されるように意図されていることは、理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０２０１】
【図１】本発明の比色分析センサーの模式図である。
【図２】本発明の比色分析センサーアレイの模式図である。
【図１】
2008524603.tif 000043
【図２】
2008524603.tif 000044
【国際調査報告】
2008524603.tif 000045
2008524603.tif 000046
2008524603.tif 000047