(57)【要約】【課題】処置に対する応答の予後診断のための方法の提供。【解決手段】本発明は、生物試料から、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、上記疾患に罹患している患者の応答を決定するための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、シノビオリンをコードする遺伝子の発現が測定されることを特徴とする方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物試料から、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、前記疾患に罹患している患者の応答を決定するための、あるいは、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、前記疾患に罹患している患者の応答を経時的にモニタリングするための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、
シノビオリンをコードする遺伝子の発現が測定される
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
シノビオリンをコードする遺伝子の発現の測定は以下の方法で実施される：
ａ．生物材料を生物試料から抽出する；
ｂ．生物材料を、シノビオリンをコードする遺伝子に特異的な少なくとも１つの試薬と接触させる；
ｃ．シノビオリンをコードする遺伝子の発現を決定する：
ことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ａ）で抽出された生物材料は核酸を含む
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）の特異的な少なくとも１つの試薬は少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む
ことを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項５】
関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、前記疾患に罹患している患者の応答を決定するための、あるいは、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、前記疾患に罹患している患者の応答を経時的にモニタリングするための、シノビオリンをコードする遺伝子に特異的な少なくとも１つの試薬の使用。
【請求項６】
関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、前記疾患に罹患している患者の応答の予後診断用キットであって、
シノビオリンをコードする遺伝子に特異的な少なくとも１つの試薬を含む
ことを特徴とするキット。
【請求項７】
関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、前記疾患に罹患している患者の応答をモニタリングするためのキットであって、
前記シノビオリンをコードする遺伝子に特異的な少なくとも１つの試薬を含む
ことを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は関節リウマチに関し、具体的には、関節リウマチの炎症プロセスに関係しているサイトカインに対する処置に対しての、上記疾患に罹患している患者の応答を決定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関節リウマチ（ＲＡ）は、いくつかの関節の炎症及び変形を特徴とし、加えて、関節外での合併症のリスクもある、慢性的な症状である。細胞間相互作用におけるサイトカインの役割に関する知識を元にして、抗サイトカイン薬による処置の合理的な開発が導かれた。
【０００３】
症状の重篤度は一人ひとり異なるが、長期間になると罹患率及び死亡率が増大する。対症療法は、非ステロイド系抗炎症薬を用いるものであるが、状況によってはコルチコステロイドを用いる場合もある。現在のところ、メトトレキセートが参照の処置であるようである。炎症誘発性サイトカインを阻害する処置もまた、関節リウマチの根本的な処置のために提案されている。これについて、エタネルセプト（ｅｔａｎｅｒｃｅｐｔ）及びインフリキシマブ（登録商標）を挙げることができ、これら２つは、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインＴＮＦ（腫瘍壊死因子）に対する阻害剤である。このような分子は、抗ＴＮＦと記載される。より一般的には、因子ＴＮＦ−αは、モノクローナル抗体又は可溶性受容体などの生物学的阻害剤を用いた臨床試験に基づいて、主要な治療標的として浮上してきた。この点において、インフリキシマブ（登録商標）は、炎症を軽減するために処方されるが、他の医薬品では十分でない場合には、関節リウマチの進行を遅らせるためにも処方される。しかし、必ずしも全ての患者がインフリキシマブ（登録商標）での処置に対して同程度に応答するわけではない。関節リウマチに罹患している患者をインフリキシマブ（登録商標）で処置した１年後に撮影された、関節のＸ線写真によれば、多くの患者は改善されたが、少数の患者は関節が損傷していたことが明らかになった。同様に、必ずしも全ての患者がエタネルセプトでの処置に対して同程度に応答するわけではなかった。
【０００４】
したがって、臨床的な観点から、医師の提案する処置に患者が応答するか否かを、処方前に判断することが重要である。
【０００５】
現時点では、抗ＴＮＦでの処置の前に、患者の応答はそれぞれどのようなものになるかを判断する方法はない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明によれば、関節リウマチに対する患者の処置を改善するための新規の生物学的ツールを提供することによって、先行技術における欠点の解決が提案される。本発明によれば、実際に、インフリキシマブ（登録商標）などの処置に対する、関節リウマチに罹患している患者の応答を決定することが可能となる。本発明はまた、インフリキシマブ（登録商標）などの処置に対する被験患者の応答のモニタリングにも大きく関係している。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
驚くべきことに、本発明者らは、シノビオリン（ｓｙｎｏｖｉｏｌｉｎ）をコードする遺伝子の発現を（具体的には末梢血中において）分析することによって、上記処置に対する患者の応答を決定することができるということを明らかにした。本発明者らはまた、シノビオリンをコードする遺伝子の発現をモニタリングすることによって、インフリキシマブ（登録商標）などの処置に対する患者の応答をモニタリングできるということも明らかにした。
【０００８】
この効果について、本発明は、生物試料から、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、上記疾患に罹患している患者の応答を決定するための、あるいは、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、上記疾患に罹患している患者の応答を経時的にモニタリングするための、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける方法であって、シノビオリンをコードする遺伝子の発現が測定されることを特徴とする方法に関する。
【０００９】
好ましくは、上記処置は、ＴＮＦ−αサイトカインに対するものである。この点において、ＴＮＦ（例えば、具体的には、インフリキシマブ（登録商標）、エタネルセプト及びアダリムマブ）の作用を阻害する処置を挙げることができる。
【００１０】
本発明の好ましい実施形態によれば、シノビオリンをコードする遺伝子の発現の測定は以下の方法で実施される：
ａ）生物材料を生物試料から抽出する；
ｂ）生物材料を、シノビオリンをコードする遺伝子に特異的な少なくとも１つの試薬と接触させる；
ｃ）シノビオリンをコードする遺伝子の発現を決定する。
【００１１】
本発明の目的について、用語「生物試料」は、患者から採取される、本明細書において以下で定義されるような生物材料を含んでいてよい任意の試料を意味するものとする。この生物試料は、具体的には、血液試料、血清試料、組織試料、又は、患者に由来する滑膜細胞の試料であってよい。この生物試料は、当業者に公知の任意の試料採取手段によって得られる。本発明の好ましい実施形態によれば、患者から採取される生物試料は血液試料である。
【００１２】
本発明の方法の工程ａ）においては、当業者に公知の任意の核酸抽出及び精製プロトコルによって、生物材料を生物試料から抽出する。本発明の目的については、用語「生物材料」は、標的遺伝子の発現を検出することができる任意の材料を意味するものとする。生物材料には、具体的に、タンパク質又は核酸（例えば、具体的には、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ））が含まれ得る。核酸は、具体的には、ＲＮＡ（リボ核酸）であってよい。本発明の好ましい実施形態によれば、工程ａ）で抽出された生物材料には、核酸、好ましくはＲＮＡ、より好ましくは総ＲＮＡが含まれる。総ＲＮＡには、転移ＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）（例えば、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、及び、他の任意の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ）、及び、リボソームＲＮＡが含まれる。この生物材料には標的遺伝子に特異的な材料（例えば、具体的には、標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、又は、これらのｍＲＮＡに由来するタンパク質）が含まれるが、標的遺伝子に特異的ではない材料（例えば、具体的には、標的遺伝子以外の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ、標的遺伝子以外の遺伝子に由来するｔＲＮＡ若しくはｒＲＮＡ）が含まれる場合もある。
【００１３】
例えば、核酸の抽出は以下の手段によって実施することができる：
−生物試料中に存在している細胞の溶解によって、患者の細胞中に含まれる核酸を放出させる工程。例えば、特許出願ＷＯ００／０５３３８、ＷＯ９９／５３３０４及びＷＯ９９／１５３２１に記載されている溶解方法を使用することができる。当業者は、熱ショック若しくは浸透圧ショック、又は、カオトロピック剤（例えば、グアニジウム塩）を使用する化学的溶解などの、他の周知の溶解方法（ＵＳ５，２３４，８０９号）を使用することができる；
【００１４】
−溶解工程において放出される他の細胞構成成分から核酸を分離するための精製工程。この工程により、通常は、核酸を濃縮することができ、そしてこれをＤＮＡ又はＲＮＡの精製に適応させることができる。例えば、吸着又は共有原子価による、状況に応じてオリゴヌクレオチドでコーティングされた磁性粒子を使用することができ（これについては、米国特許第４，６７２，０４０号及び同第５，７５０，３３８号を参照のこと）、そしてこれらの磁性粒子に結合している核酸は、洗浄工程により精製することができる。この核酸精製工程は、その後に上記核酸を増幅させることが望まれる場合には特に有効である。これらの磁性粒子の特に有効な実施形態は、特許出願：ＷＯ−Ａ−９７／４５２０２及びＷＯ−Ａ−９９／３５５００に記載されている。核酸精製方法の他の有用な例は、カラムの形態、又は、不活性粒子若しくは磁性粒子の形態のいずれかにおけるシリカの使用である。非常に広く使用されている他の方法は、カラム内における、又は、常磁性粒子の形態での、イオン交換樹脂に基づくものである。他の方法として金属酸化物基体上に吸着させる方法があり、この方法は本発明に極めて関連が深いが、限定的ではない。
【００１５】
工程ｂ）において、そして本発明の目的について、用語「特異的試薬」は、上記で定義された生物材料と接触した場合に、上記標的遺伝子に特異的な材料と結合する試薬を意味するものとする。例えば、特異的試薬及び生物材料が核酸起源である場合には、特異的試薬と生物材料とを接触させることによって、特異的試薬を標的遺伝子に特異的な材料とハイブリダイズさせることができる。用語「ハイブリダイゼーション」は、適切な条件下で、２つのヌクレオチド断片が安定かつ特異的な水素結合によって互いに結合して、その結果、二本鎖複合体を形成するプロセスを意味するものとする。この水素結合は、相補的な塩基アデニン（Ａ）とチミン（Ｔ）（又はウラシル（Ｕ））との間で（これは、Ａ−Ｔ結合と記載される）、又は、相補的な塩基グアニン（Ｇ）とシトシン（Ｃ）との間で（これは、Ｇ−Ｃ結合と記載される）形成される。２つのヌクレオチド断片のハイブリダイゼーションは完全であってもよい（それゆえ、相補的な配列又はヌクレオチド断片と呼ばれる）、すなわち、このハイブリダイゼーションによって得られる二本鎖複合体にはＡ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合だけが含まれる。このハイブリダイゼーションは部分的であってもよい（それゆえ、十分に相補的である配列又はヌクレオチド断片と呼ばれる）、すなわち、得られる二本鎖複合体には、二本鎖複合体を形成できるＡ−Ｔ結合及びＣ−Ｇ結合が含まれているが、相補的な塩基には結合していない塩基も含まれている。２つのヌクレオチド断片の間でのハイブリダイゼーションは、使用される操作条件、及び、具体的にはストリンジェンシーに依存する。
【００１６】
ストリンジェンシーは、具体的には、２つのヌクレオチド断片の塩基組成によって、そして２つのヌクレオチド断片の間でのミスマッチの程度によっても規定される。また、ストリンジェンシーは、反応パラメーター、例えば、ハイブリダイゼーション溶液中に存在するイオン種の濃度及び種類、変性剤の性質及び濃度、並びに／又は、ハイブリダイゼーション温度に応じて様々であってよい。これらのデータは全て周知であり、適切な条件は、当業者であれば容易に決定することができる。一般的には、ハイブリダイズをさせたいヌクレオチド断片の長さに応じて、ハイブリダイゼーション温度は、約２０〜７０℃、具体的には、濃度およそ０．５〜１Ｍの生理食塩溶液において３５〜６５℃である。配列、又は、ヌクレオチド断片、又は、オリゴヌクレオチド、又は、ポリヌクレオチドは、リン酸エステル結合で互いに会合した一続きのヌクレオチドモチーフであって、ヌクレオチド断片とハイブリダイズできる天然核酸の情報配列を特徴とするものであって、この一続きのヌクレオチドモチーフは、構造の異なるモノマーを含んでよく、かつ、天然核酸分子から、及び／又は、遺伝子組み換えによって、及び／又は、化学合成によって得ることができる。
【００１７】
モチーフは、核酸の天然ヌクレオチドであってよいモノマーに由来するものであり、その構成要素は、糖、リン酸基及び窒素含有塩基である：ＤＮＡにおいては、糖はデオキシ−２−リボースであり、ＲＮＡにおいては、糖はリボースである；ＤＮＡに関するか又はＲＮＡに関するかによって、窒素含有塩基は、アデニン、グアニン、ウラシル、シトシン及びチミンから選択される；あるいは、モノマーは、３種類の構成要素の少なくとも１つが修飾されているヌクレオチドである；例えば、修飾は、塩基のレベルで修飾塩基（例えば、イノシン、メチル−５−デオキシシチジン、デオキシウリジン、ジメチルアミノ−５−デオキシウリジン、ジアミノ−２，６−プリン、ブロモ−５−デオキシウリジン）若しくはハイブリダイズできる他の任意の修飾塩基によってなされ得る、又は、糖のレベルで（例えば、少なくとも１つのデオキシリボースのポリアミドによる置換）なされ得る、又は、リン酸基のレベルで（例えば、具体的には、ジホスフェート、アルキルホスホネート、アリールホスホネート及びホスホロチオエートから選択されるエステルでの置換）なされ得る。
【００１８】
本発明の特定の実施形態によれば、特異的な試薬には、少なくとも１つの増幅プライマーが含まれる。本発明の目的について、用語「増幅プライマー」は、５個〜１００個の核酸モチーフ、好ましくは、１５個〜３０個の核酸モチーフを含む、酵素による重合（例えば、具体的には、酵素による増幅反応）を開始させるためのヌクレオチド断片を意味するものとする。好ましくは、配列番号１又は２の配列の全体又は一部を含むプライマー、好ましくは、配列番号１を含むプライマーと配列番号２を含むプライマーとの対が使用される。用語「酵素による増幅反応」は、少なくとも１つの酵素の作用により複数のヌクレオチド断片のコピーを生じるプロセスを意味するものとする。このような増幅反応は当業者には周知であり、具体的には、以下の技術を挙げることができる：
−  米国特許第４，６８３，１９５号、米国特許第４，６８３，２０２号及び米国特許第４，８００，１５９号に記載されている、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、
−  例えばヨーロッパ特許出願ＥＰ０２０１１８４に開示されている、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、
−  特許出願番号ＷＯ９０／０１０６９に記載されている、ＲＣＲ（修復連鎖反応）、
−  特許出願番号ＷＯ９０／０６９９５に記載されている、３ＳＲ（自己維持配列複製）、
−  特許出願番号ＷＯ９１／０２８１８に記載されている、ＮＡＳＢＡ（核酸配列をベースとする増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、及び、
−  米国特許第５，３９９，４９１号に記載されている、ＴＭＡ（転写によって媒介される増幅（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ））。
【００１９】
酵素による増幅がＰＣＲである場合には、特異的試薬は標的遺伝子に特異的な少なくとも２種類の増幅プライマーを含み、これによって、標的遺伝子に特異的な材料を増幅することができる。好ましくは、配列番号１又は配列番号２の配列の全体又は一部を含むプライマーが使用される。それゆえ、標的遺伝子に特異的な材料は、標的遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られた相補性ＤＮＡ（それゆえ、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡと呼ばれる）、又は、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの転写によって得られた相補性ＲＮＡ（それゆえ、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡと呼ばれる）を含むことが好ましい。酵素による増幅が逆転写反応の後に実施されるＰＣＲである場合には、これは、ＲＴ−ＰＣＲと呼ばれる。
【００２０】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、工程ｂ）の特異的試薬は、少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む。
【００２１】
用語「ハイブリダイゼーションプローブ」は、任意の条件下でのハイブリダイゼーション特異性を有する少なくとも５個のヌクレオチドモチーフ、例えば５〜１００個の核酸モチーフ、具体的には１０〜３５個の核酸モチーフを含み、標的遺伝子に特異的な材料と共にハイブリダイゼーション複合体を形成できる、ヌクレオチド断片を意味するものとする。本発明においては、標的遺伝子に特異的な材料は、標的遺伝子に由来するメッセンジャーＲＮＡ（それゆえ、標的遺伝子特異的ｍＲＮＡと呼ばれる）に含まれるヌクレオチド配列、上記メッセンジャーＲＮＡの逆転写によって得られた相補性ＤＮＡ（それゆえ、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡと呼ばれる）に含まれるヌクレオチド配列、又は、上記のようなｃＤＮＡの転写によって得られる相補性ＤＮＡ（それゆえ、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡと呼ばれるであろう）に含まれるヌクレオチド配列であってよい。ハイブリダイゼーションプローブは、上記プローブの検出のための標識を有する場合がある。用語「検出」は、物理的方法による直接的な検出、又は、標識を使用する検出方法による間接的な検出のいずれかを意味するものとする。核酸を検出するためには多くの検出方法がある（例えば、Ｋｒｉｃｋａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９９，Ｎｏ．４５（４），４５３−４５８頁又はＫｅｌｌｅｒ  Ｇ．Ｈ．ら、ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ，第２版，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３，セクション５及び６，１７３−２４９頁を参照のこと）。用語「標識」は検出することができるシグナルを生じ得るトレーサーを意味するものとする。これらのトレーサーの限定ではないリストには、例えば、比色、蛍光又は発光によって検出できるシグナルを生じる酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又は、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）；発色団（例えば、蛍光化合物、発色化合物又は色素化合物）；電子顕微鏡によって、又は、その電気的特性（例えば、伝導率）によって、電流測定法によって、又は、ボルタンメトリー方法によって検出できる電子密度の高い基；回折、表面プラズモン共鳴若しくは接触角バリエーションなどの光学的方法によって、又は、原子間力顕微鏡、トンネル効果などの物理的方法によって検出できる基；放射性分子（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ又は１２５Ｉ）が含まれる。
【００２２】
本発明の目的について、ハイブリダイゼーションプローブは、「検出プローブ」と呼ばれるプローブである場合がある。この場合、「検出」プローブは、上記で定義されたような標識によって標識される。検出プローブは、具体的には、Ｔｙａｇｉ  ＆  Ｋｒａｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ  ｂｉｏｔｅｃｈ，１９９６，１４：３０３−３０８）によって記載されているような「分子ビーコン」検出プローブであってよい。これらの「分子ビーコン」はハイブリダイゼーションの間に蛍光を発する。これらはステム−ループ型の構造を有しており、これには、フルオロフォア及び「消光剤」基が含まれる。特異的なループ配列のその相補的な標的核酸配列との結合によりステムが広げられ、そして適切な波長で励起させられると、蛍光シグナルの発光が生じる。
【００２３】
ハイブリダイゼーション反応を検出するためには、直接（具体的には、標的配列内に標識を取り込ませることによる）又は間接的（具体的には、上記で定義されたような検出プローブを使用する）で標識した標的配列を使用することができる。具体的には、ハイブリダイゼーション工程の前に、例えば、酵素による増幅反応の間に、標識されたデオキシリボヌクレオチド３リン酸を使用して、標的配列の標識及び／又は切断からなる工程を実施する場合がある。切断は、具体的には、イミダゾール又は塩化マンガンの作用によって実施することができる。標的配列はまた、例えば、文献ＷＯ９１／１９８１２に記載されているサンドイッチハイブリダイゼーション技術にしたがって検出プローブをハイブリダイズすることによって、増幅工程の後で標識する場合もある。核酸を標識する別の特異的な好ましい方法は、フランス特許出願ＦＲ２７８００５９に記載されている。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態によれば、検出プローブにはフルオロフォア及び消光剤が含まれる。
【００２５】
ハイブリダイゼーションプローブはまた、「捕捉プローブ」とも呼ばれるプローブである場合がある。この場合、「捕捉」プローブは、任意の適切な手段によって、すなわち、直接又は間接的に、例えば、共有原子価又は吸着によって、固体基体上に固定するか又は固定することができる。固体基体としては、状況に応じて化学的に修飾された、合成材料又は天然材料、具体的には、セルロース系材料、例えば、紙、セルロース誘導体（例えば、酢酸セルロース及びニトロセルロース）、又は、デキストラン、ポリマー、コポリマー（具体的には、スチレン型モノマーをベースとするもの）、天然繊維（例えば、綿）及び合成繊維（例えば、ナイロン）；無機材料（例えば、シリカ、石英、ガラス又はセラミック）；格子；磁性粒子；金属誘導体、ゲルなどを使用することができる。固体基体は、マイクロタイタープレートの形態である場合も、特許出願番号ＷＯ−Ａ−９４／１２６７０に記載されているような膜の形態である場合も、また、粒子の形態である場合もある。基体上でのこれらのハイブリダイゼーション工程の前には、上記で定義されたような酵素による増幅反応工程を実施することによって、標的の遺伝的材料の量を増加させる場合がある。
【００２６】
工程ｃ）においては、標的遺伝子の発現の決定は、当業者に公知のプロトコルの任意のものによって実施することができる。
【００２７】
一般的には、標的遺伝子の発現は、所定の時間に標的遺伝子から転写されるｍＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を検出することによって、又は、これらのｍＲＮＡに由来するタンパク質を検出することによって分析することができる。
【００２８】
本発明は、好ましくは、この標的遺伝子に由来するｍＲＮＡの検出による標的遺伝子の発現の決定に関する。
【００２９】
特異的な試薬が１つ以上の増幅プライマーを含む場合には、本発明の方法の工程ｃ）において、以下の方法で標的遺伝子の発現を決定することが可能である。
【００３０】
１）上に示されたような生物試料から、生物材料として、総ＲＮＡ（転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）及びメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）が含まれる）を抽出した後、逆転写工程を実施することによって、上記ｍＲＮＡの相補性ＤＮＡ（すなわち、ｃＤＮＡ）を得る。例えば、この逆転写反応は、ＲＮＡ断片から相補性ＤＮＡ断片を得ることができるようにする逆転写酵素を使用して実施することができる。具体的には、ＡＭＶ（鳥類筋芽細胞腫ウイルス（Ａｖｉａｎ  Ｍｙｏｂｌａｓｔｓｉｓ  Ｖｉｒｕｓ））又はＭＭＬＶ（モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏｌｏｎｙ  Ｍｕｒｉｎｅ  Ｌｅｕｋａｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ））に由来する逆転写酵素を使用することができる。ｍＲＮＡのｃＤＮＡだけを得ることがさらに具体的に望まれる場合には、この逆転写工程を、チミン塩基だけを含むヌクレオチド断片（ポリＴ）の存在下で実施する。ポリＴは、ｍＲＮＡのポリＡ配列に対して相補性によりハイブリダイズすることによって、逆転写酵素によって実施される逆転写のための開始点として作用する、ポリＴ−ポリＡ複合体を形成する。次いで、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）と、標的遺伝子以外の遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的であるｃＤＮＡ（標的遺伝子に特異的ではないｃＤＮＡ）とが得られる。
【００３１】
２）標的遺伝子に特異的な増幅プライマーを、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ、及び、標的遺伝子に特異的ではないｃＤＮＡと接触させる。標的遺伝子に特異的な増幅プライマーは、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡとハイブリダイズし、そして、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡを起源とするｃＤＮＡの、既知の長さの、予め決定された領域が特異的に増幅される。標的遺伝子に特異的ではないｃＤＮＡは増幅されないが、次いで、大量の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが得られる。本発明の目的について、「標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ」又は「標的遺伝子に由来するｍＲＮＡを起源とするｃＤＮＡ」が、区別なく記載される。この工程は、具体的には、ＰＣＲ型の増幅反応によって、又は、上記で定義されたような任意の他の増幅技術によって実施することができる。
【００３２】
３）標的遺伝子の発現は、上記の工程２）で得られた標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを検出し、定量することによって決定する。この検出は、その大きさにしたがって、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの電気泳動での泳動後に実施することができる。泳動用のゲル及び媒体はエチジウムブロマイドを含んでいてよく、これによって、ゲルを所定の期間泳動させた後にＵＶ（紫外）線照明下のテーブルの上に置くと、光シグナルの発光により、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを直接検出することが可能となる。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの量が多いほど、この光シグナルは明るくなる。これらの電気泳動技術は当業者には周知である。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡはまた、増幅反応を飽和まで実施することによって得られる定量範囲を使用して、検出し、定量することもできる。様々な工程（逆転写、ＰＣＲなど）において観察される酵素効率の変化を考慮するために、様々なグループの患者の標的遺伝子の発現を、様々なグループの患者の間で発現が類似している「ハウスキーピング」遺伝子の発現を同時に決定することによって、正規化することができる。ハウスキーピング遺伝子の発現に対する標的遺伝子の発現の割合を理解することにより、すなわち、ハウスキーピング遺伝子特異的ｃＤＮＡの量に対する標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの量の割合を理解することにより、種々の実験の間での任意の可変性が補正される。当業者は、具体的に以下の刊行物を参照することができる：Ｂｕｓｔｉｎ  ＳＡ，Ｊ  Ｍｏｌ Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ，２００２，２９：２３−３９；Ｇｉｕｌｉｅｔｔｉ  Ａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００１，２５：３８６−４０１。
【００３３】
特異的試薬が少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む場合には、標的遺伝子の発現は以下の方法によって決定することができる。
【００３４】
１）上に示されたような生物試料から総ＲＮＡを抽出して生物材料とした後、逆転写工程を上記のように実施することによって、標的遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ）及び標的遺伝子以外の遺伝子に由来するｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ（標的遺伝子に特異的ではないｃＤＮＡ）を得る。
【００３５】
２）ｃＤＮＡの全てを、発現を分析したい標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが固定されている基体と接触させることによって、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡ（このｃＤＮＡは、捕捉プローブにハイブリダイズしない標的遺伝子には特異的ではない）と捕捉プローブとの間でハイブリダイゼーション反応を実施する。ハイブリダイゼーション反応は、上記の材料の全てを含む固体基体上で実施することができる。好ましい実施形態によれば、ハイブリダイゼーションプローブは基体上に固定する。ハイブリダイゼーション反応の前には、上記のような標的遺伝子特異的ｃＤＮＡの酵素による増幅からなる工程を実施する場合があり、これにより、大量の標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが得られ、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブに対して標的遺伝子特異的ｃＤＮＡがハイブリダイズする可能性が増大する。また、ハイブリダイゼーション反応の前には、例えば、増幅反応のために、標識されたデオキシリボヌクレオチド３リン酸を使用して、上記のような標的遺伝子特異的ｃＤＮＡを標識及び／又は切断することからなる工程を実施する場合もある。切断は、具体的には、イミダゾール又は塩化マンガンの作用によって実施することができる。また、標的遺伝子特異的ｃＤＮＡは、例えば、文献ＷＯ−Ａ−９１／１９８１２に記載されているサンドイッチハイブリダイゼーション技術にしたがって標識プローブをハイブリダイズさせることによって、増幅工程の後で標識される場合もある。核酸の標識及び／又は切断のための他の好ましい特異的な方法は、特許出願ＷＯ９９／６５９２６、ＷＯ０１／４４５０７、ＷＯ０１／４４５０６、ＷＯ０２／０９０５８４、ＷＯ０２／０９０３１９に記載されている。
【００３６】
３）続いて、ハイブリダイゼーション反応の検出からなる工程を実施する。検出は、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブがその上で標的遺伝子特異的ｃＤＮＡとハイブリダイズしている基体と、標識で標識された「検出」プローブとを接触させ、そして標識によって放射されるシグナルを検出することによって実施することができる。標的遺伝子特異的ｃＤＮＡが標識で予め標識されている場合には、標識によって放射されるシグナルを直接検出する。
【００３７】
本発明の方法の工程ｂ）において接触させた少なくとも１つの特異的試薬が少なくとも１つのハイブリダイゼーションプローブを含む場合には、標的遺伝子の発現は、以下の方法で決定することもできる。
【００３８】
１）上記に示されたような生物試料から、総ＲＮＡを抽出して生物材料とした後、逆転写工程を上記のように実施することによって、生物材料のｍＲＮＡのｃＤＮＡを得る。続いて、プロモーターの制御下で機能し、これによりＤＮＡ鋳型から相補性ＲＮＡを得ることを可能にするＴ７ポリメラーゼ酵素を使用して、ｃＤＮＡの相補性ＲＮＡの重合が実施される。これにより、標的遺伝子に特異的なｍＲＮＡのｃＤＮＡのｃＲＮＡ（それゆえ、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡと呼ばれる）と、標的遺伝子に特異的ではないｍＲＮＡのｃＤＮＡのｃＲＮＡが得られる。
【００３９】
２）ｃＲＮＡの全てを、発現を分析したい標的遺伝子に特異的な捕捉プローブが固定されている基体と接触させることによって、標的遺伝子特異的ｃＲＮＡ（このｃＲＮＡは、捕捉プローブにハイブリダイズしない標的遺伝子には特異的ではない）と捕捉プローブとの間でハイブリダイゼーション反応を実施する。ハイブリダイゼーション反応の前には、上記のような標的遺伝子特異的ｃＲＮＡの標識及び／又は切断からなる工程を実施する場合もある。
【００４０】
３）続いて、ハイブリダイゼーション反応の検出からなる工程を実施する。検出は、標的遺伝子に特異的な捕捉プローブがその上で標的遺伝子特異的ｃＲＮＡとハイブリダイズさせられる基体を、標識で標識された「検出プローブ」と接触させ、そして標識によって放射されるシグナルを検出することによって実施することができる。標的遺伝子特異的ｃＲＮＡが標識で予め標識されている場合には、標識によって放射されるシグナルを直接検出する。ｃＲＮＡの使用は、その上に多数のプローブがハイブリダイズされているバイオチップ型の基体を使用する場合に、特に有効である。
【００４１】
本発明の特定の実施形態によれば、工程Ｂ及びＣを同時に実施する。この好ましい方法は、具体的には、「リアルタイムＮＡＳＢＡ」によって実施することができる。ここでは、ＮＡＳＢＡ増幅技術と「分子ビーコン」を使用するリアルタイム検出とが１つの工程において組み合わせられる。ＮＡＳＢＡ反応はチューブ内で実施され、これによって１本鎖ＲＮＡが生じ、これと同時に、特異的な「分子ビーコン」がハイブリダイズして蛍光シグナルを生じるであろう。新しいＲＮＡ分子の形成は、蛍光リーダーにおけるシグナルの連続的な解析によってリアルタイムで測定する。
【００４２】
本発明はまた、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、上記疾患に罹患している患者の応答を決定するための、あるいは、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、上記疾患に罹患している患者の応答を経時的にモニタリングするための、上記で定義されたような、シノビオリンをコードする遺伝子に特異的な少なくとも１つの試薬の使用にも関する。好ましくは、処置は、ＴＮＦ−αサイトカインに対するものである。これについて、ＴＮＦ（例えば、具体的には、インフリキシマブ（登録商標）、エタネルセプト及びアダリムマブ）の作用を阻害する処置を挙げることができる。
【００４３】
最後に、本発明は、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、上記疾患に罹患している患者の応答の予後診断用キットであって、上記処置は、上記で定義されたように、上記で定義されたようなシノビオリンをコードする遺伝子に特異的な少なくとも１つの試薬を含むことを特徴とするキットに関する。
【００４４】
また、本発明は、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、上記疾患に罹患している患者の応答をモニタリングするためのキットであって、上記処置は、上記で定義されたように、上記で定義されたようなシノビオリンをコードする遺伝子に特異的な少なくとも１つの試薬を含むことを特徴とするキットにも関する。
【００４５】
次いで、シノビオリンの発現の分析により、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての、上記疾患に罹患している患者の応答の予後診断用のツールを提供することが可能となる。例えば、関節リウマチの炎症プロセスに関与しているサイトカインに対する処置に対しての応答が未知であるような患者において標的遺伝子の発現を分析すること、並びに、上記処置に応答する患者の標的遺伝子についての既知の平均発現値、及び、上記処置に応答しない患者の標的遺伝子についての既知の平均発現値と比較することができる。これにより、患者がレスポンダーであるか又はノンレスポンダーであるかを決定することができ、それによって、上記患者に適切な処置を提供すること、又は、上記患者の治療を通じて上記患者の処置を状況に合わせて変えることが可能になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
以下の実施例は例として提供され、なんら限定するものではない。これにより、本発明をより明確に理解できるようになるであろう。
【００４７】
（実施例）関節リウマチの診断／予後診断のためのシノビオリンをコードする遺伝子の発現の研究
患者−この実験は、対照患者（Ｃ、ｎ＝２３）又は関節リウマチに罹患している患者（ＲＡ、ｎ＝４７）について実施した。ＲＡグループ及びＣグループの患者について、性別の割合及び平均年齢は同様であった。ＲＡ患者は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ（Ａｒｎｅｔｔら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  １９８８；３１：３１５−３２４）の修正された基準にしたがって分類した。血液試料を採血し、ＰＡＸＧｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブ（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に回収した。
【００４８】
処置−関節リウマチに罹患している患者には全て、３ｍｇ／ｋｇのインフリキシマブ（登録商標）の静脈内注射を、０週目、２週目、６週目、１４週目及び２２週目に投与した。インフリキシマブ（登録商標）はＴＮＦ−α阻害剤である。ＴＮＦ−α阻害剤は、他の処置（具体的には、メトトレキセート）では治療が困難である関節リウマチの臨床的及び生物学的兆候を迅速に改善する。インフリキシマブ（登録商標）又はレミケード（登録商標）は、キメラ抗ＴＮＦ−α抗体である。メトトレキセート（ＭＴＸ）処置もまた処方した。臨床応答は、１回目の注射（０週目）の後、及び５回目の注射（２２週目）の直後に、以下の基準を使用して評価した：関節痛、関節の腫れ、患者による痛みの評価、患者の視点からの疾患の全体的な評価、医師の視点からの疾患の全体的な評価、健康状態質問票（Ｈｅａｌｔｈ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  Ｑｕｅｓｔｉｏｎｎａｉｒｅ）、Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）血清濃度、及び、赤血球沈降速度（ＥＳＲ）。処置に対して良好なレスポンダー（ＧＲ）である患者と、処置に対して良好でないレスポンダー（ＰＲ）である患者とを区別した。
【００４９】
滑膜細胞培養物−滑膜線維芽細胞（ＦＬＳ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ  ｓｙｎｏｖｉｏｃｙｔｅ）細胞株を、患者（ＲＡ）に由来する試料から得た。ＲＡ患者由来の皮膚試料に由来する対照細胞（ＣＴ）についても分析した。ＦＬＳとＣＴとを消化酵素によって単離し、そして以前に報告されたように（Ｔｏｈら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４年１０月；５０（１０）：３１１８−３１２８）、５％のＣＯ２を含む高湿度インキュベーターにおいて３７℃で、１０％のウシ胎児血清（インビトロジェン社）を含むＲＰＭＩ培地の培養物に入れた。続いて、滑膜細胞及び対照細胞を、１０％のＦＣＳを補充した最終容量２００μｌの培養培地において、９６ウェルマイクロプレートで培養し（細胞１００００個／ウェル）、ＩＬ−１β（０．１ｎｇ／ｍｌ、イムノツールズ社（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｏｌｓ），ドイツ国フリゾイテ（Ｆｒｉｅｓｏｙｔｈｅ））又はＴＮＦα？（１ｎｇ／ｍｌ、イムノツールズ社，ドイツ国フリゾイテ）で処理した。
【００５０】
シノビオリンをコードする遺伝子の発現の分析−シノビオリンをコードする遺伝子の発現は、対照患者（Ｃ）及び関節リウマチに罹患している患者（ＲＡ）の末梢血においてリアルタイムＰＣＲによって、インフリキシマブ（登録商標）での処置の前及び処置の６ヵ月後に測定した。シノビオリンをコードする遺伝子の発現はまた、ＦＬＳ細胞株及びＣＴ対照細胞においても測定した。シクロフィリンＢ（ＰＰＩＰ）をコードする遺伝子を、血液試料についてのハウスキーピング遺伝子として使用し、β−アクチンをコードする遺伝子を、以前に報告されたように（Ｐａｃｈｏｔら、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００４；１１４：１２１−１２４；Ｔｏｈら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ  ２００４；５０：３１１８−３１２８）、ＦＬＳ細胞株及びＣＴ対照細胞についてのハウスキーピング遺伝子として使用した。総ＲＮＡを、ＰＡＸＧｅｎｅ（商標）Ｂｌｏｏｄ  ＲＮＡキット（プレアナリティックス社（ＰｒｅＡｎａｌｙｔｉｘ））を使用して全血から抽出し、ＲＮＡ−ｅａｓｙキット（キアゲン社，ドイツ国ヒルデン）を使用して精製した。ＲＮＡをＦＬＳ及びＣＴ細胞から、ＴＲＩｚｏｌ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使用して抽出し、そしてＲＮＡ−ｅａｓｙキット（キアゲン社，ドイツ国ヒルデン）を使用して精製した。ｃＤＮＡは、Ｔｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社，米国カリフォルニア州）を使用して１μｇの総ＲＮＡから調製した。１μｇの量のＲＮＡをＴｈｅｒｍｏｓｃｒｉｐｔ  ＲＴ−ＰＣＲシステム（インビトロジェン社，米国カリフォルニア州）を使用して逆転写させ、そしてＰＣＲ増幅を、Ｆａｓｔ−Ｓｔａｒｔ（商標）ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＩリアルタイムＰＣＲキット（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（ロシュ社）にて実施した。使用したシノビオリンに特異的なプライマーは以下である：
配列番号１：５’−ＧＴＴ  ＴＡＣ  ＡＧＧ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＣＡＡ  ＧＧ−３’及び
配列番号２：５’−ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＧＧＣ  ＡＴＣ  ＴＧＴ  ＣＡＣ  ＡＧ−３’。
【００５１】
シクロフィリンＢについて、プライマーはＬＣ−Ｓｅａｒｃｈ（ＰＰＩＢ、受託番号：Ｍ６０８５７、アンプリコン１０５から３３８）から入手した。β−アクチンについては、使用したプライマーは以下である（Ｔｏｈら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．２００４年１０月；５０（１０）：３１１８−３１２８）：
配列番号３：５’−ＴＧＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＣＣＴＣＴＧＧＴ−３’及び
配列番号４’−ＧＡＴＧＴＣＡＣＧＣＡＣＧＡＴＴＴＣＣ−５’
【００５２】
１０μｌの容量の標準ｃＤＮＡ及び試料を起源とするｃＤＮＡ希釈物を、キャピラリーチューブに添加した。増幅は、プライマー濃度１０μＭ、塩化マグネシウム（ＭｇＣｌ２）２５ｍＭ、並びに、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  Ｆａｓｔ−Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉキット（ロシュ社）に入っているＴａｑ酵素及びＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ標識が含まれている、最終容量２０μｌ中で実施した。ＰＣＲは、４５回の増幅サイクル（９５℃で１０秒間、６８℃で１０秒間、及び、７２℃で１６秒間）で実施した。目的の遺伝子のそれぞれについて、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅を飽和するまで実施することによって、標準物を調製した。得られたアンプリコンを精製し（ＰＣＲ精製キット、キアゲン社）、そして１つのアンプリコンの存在を、アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色とによって確認した。ｍＲＮＡの発現を、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒソフトウェアを使用して決定した。
【００５３】
統計分析−結果は平均±ＳＥＭで表した。値の差を、ＡＮＯＶＡ検定を使用して計算し、そして０．０５未満の確率を有している値を有意な差と考えた。
【００５４】
結果
対照患者及び関節リウマチに罹患している患者におけるシノビオリンの発現の分析
得られた結果を以下の表１に提供する。
【００５５】
【表１】
2008531033.tif 000002
【００５６】
この表１により、対照患者（Ｃ）及び関節リウマチに罹患している患者（ＲＡ）におけるシノビオリンをコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルが提供される。結果は、標的遺伝子のｍＲＮＡと、シクロフィリンＢハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡとの間での相対的な量の割合として表される。結果は、それぞれのグループの患者について得られた割合の平均として表される。ＳＥＭ（平均の標準誤差）もまた、それぞれのグループについて計算した。表１に示した値は、得られた平均±ＳＥＭである。値は、得られたｐの値が０．０５未満であった場合に統計学的に有意であると考えた。
【００５７】
ＲＡ患者は、対照患者と比較するとシノビオリンｍＲＮＡ発現レベルが明らかに高かった。
【００５８】
ＥＬＳ細胞株及びＣＴ対照細胞におけるシノビオリンの発現の分析
得られた結果を以下の表３及び４に提供する。
【００５９】
【表２】
2008531033.tif 000003
【００６０】
表２には、ＩＬ１−β（０．１ｎｇ／ｍｌ）又はＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養したＦＬＳ細胞中での、標的遺伝子のｍＲＮＡの量とβ−アクチンハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量との相対的な割合を提供する。ＴＮＦにより、６時間にわたってシノビオリンの発現が増加した。ＩＬ１もまたシノビオリンの発現を増大させ、これは２４時間まで高いままであった。
【００６１】
【表３】
2008531033.tif 000004
【００６２】
表３には、様々な濃度のＩＬ１−β又はＴＮＦ−αの存在下で培養したＦＬＳ細胞中での、標的遺伝子のｍＲＮＡの量とβ−アクチンハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量との相対的な割合を提供する。この割合は、ＩＬ１−βの濃度及びＴＮＦ−αの濃度に応じて様々である。
【００６３】
これらの結果は、ＴＮＦ−α及びＩＬ１−βによるシノビオリンの上方制御が関節リウマチにおけるＦＬＳの増殖の混乱の一因となり得ることを示している。
【００６４】
【表４】
2008531033.tif 000005
【００６５】
表４には、ＩＬ１−β（０．１ｎｇ／ｍｌ）又はＴＮＦ−α（１ｎｇ／ｍｌ）の存在下で培養したＣＴ対照細胞中での、標的遺伝子のｍＲＮＡの量とβ−アクチンハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量との相対的な割合を提供する。ＩＬ１又はＴＮＦの存在下でのシノビオリンの発現の有意な増大は、観察されなかった。
【００６６】
インフリキシマブ（登録商標）での処置に応答する関節リウマチに罹患している患者、及び、インフリキシマブ（登録商標）での処置には応答しない関節リウマチに罹患している患者におけるシノビオリンの発現の分析
得られた結果を以下の表５に提供する。
【００６７】
【表５】
2008531033.tif 000006
【００６８】
この表５には、処置前及び処置の６ヵ月後の、応答した患者（ＧＲ）及び応答しなかった患者（ＰＲ）における、シノビオリンをコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現のレベルを提供する。この結果は、標的遺伝子のｍＲＮＡの量とシクロフィリンＢハウスキーピング遺伝子のｍＲＮＡの量との間での相対的な割合として表される。これらの結果は、それぞれのグループの患者について得られた割合の平均として表される。ＳＥＭ（平均の標準誤差）もまた、それぞれのグループについて計算した。表５に示した値は、得られた平均±ＳＥＭである。ＰＲ患者はＧＰ患者と比較して、処置前及び処置後に、有意に高いシノビオリンｍＲＮＡ発現レベルを示した。シノビオリンｍＲＮＡの発現は、ＧＰ患者においては処置の６ヵ月後に低下したが、ＰＲ患者においては低下しなかった。シノビオリンの発現は、対照患者と比較して、ＧＰ患者において有意に高かった。
【００６９】
結論−したがって、全血試料を使用したシノビオリンをコードする遺伝子のｍＲＮＡの発現の研究により、関節リウマチに罹患している患者と対照患者とを非常に効率よく区別することができるようになり、これによってはまた、インフリキシマブ（登録商標）での処置に対して良好なレスポンダーである患者と、インフリキシマブ（登録商標）での処置に対して良好でないレスポンダーである患者とを区別することも可能になる。したがって、シノビオリンは、関節リウマチの診断のための、特に、処置に対する患者の応答に関する予後診断用の優れたマーカーである。シノビオリンはまた、インフリキシマブ（登録商標）で処置されている患者をモニタリングするための優れたマーカーでもある。これにより、医師はインフリキシマブ（登録商標）に応答しない患者を迅速に同定することができ、それにより、より適している別の処置を彼らに提供することが可能となる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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