(57)【要約】  トランスフェリン、軸成分および細胞壁連結要素を含む融合タンパク質、さらにそれらのペプチドライブラリーを開示する。本発明は、宿主細胞によって発現された融合タンパク質に提示されたペプチドライブラリーのスクリーニング方法を含む。本発明の融合タンパク質は、酵母で発現させることができるトランスフェリン融合タンパク質を含む。【選択図】  図９
2008546392.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）トランスフェリン（Ｔｆ）成分；
（ｂ）軸成分；および、
（ｃ）細胞壁連結要素、
を含む融合タンパク質。
【請求項２】
トランスフェリン成分は、軸成分に直接融合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
融合タンパク質は、アンカー成分をさらに含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
トランスフェリン成分は、トランスフェリンタンパク質、改変されたトランスフェリンタンパク質、またはそのフラグメントである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
トランスフェリンタンパク質は、ヒトトランスフェリンタンパク質である、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
トランスフェリン成分は、配列番号３を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
Ｔｆ成分は、Ｔｆタンパク質のＮドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
Ｔｆ成分は、Ｔｆタンパク質のＮドメインからなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
Ｔｆ成分は、Ｔｆタンパク質のＮドメインの一部を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｔｆ成分は、低いグリコシル化を示す、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｔｆ成分は、鉄への低い親和性を示すように改変される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
Ｔｆ成分は、ビカーボネートへの低い親和性を有するように改変される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
Ｔｆ成分は、ビカーボネートに結合しない、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
Ｔｆ成分は、グリコシル化部位、鉄結合部位、ヒンジ部位、ビカーボネート部位、および受容体結合部位からなる群より選択される１個またはそれ以上の部位で改変される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
Ｔｆ成分は、グリコシル化を防ぐ突然変異を少なくとも１つ含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
突然変異は、配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを含むＮ結合型のグリコシル化部位中にある、請求項１５に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔは、配列番号３のＮ４１３またはＮ６１１に相当するアミノ酸で始まる、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
Ｎ、Ｘ、ＳまたはＴがプロリンに変えられている、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
トランスフェリン成分は、グリコシル化を示さないように改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
Ｔｆ成分は、一つのリガンドまたは複数のリガンドに融合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
リガンドは、単鎖抗体、抗体、抗体フラグメント、抗体の可変領域、ランダムペプチド、または抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）からなる群より選択される１種またはそれ以上である、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
リガンドは、Ｔｆ成分のＮ末端に融合している、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
リガンドは、Ｔｆ成分のＣ末端に融合している、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
リガンドは、トランスフェリン成分内に挿入される、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
リガンドは、トランスフェリン成分の表面に露出したループ中に挿入される、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
リガンドは、３個もしくはそれ以上、４個もしくはそれ以上、５個もしくはそれ以上、６個もしくはそれ以上、７個もしくはそれ以上、８個もしくはそれ以上、９個もしくはそれ以上、１０個もしくはそれ以上、１１個もしくはそれ以上、１２個もしくはそれ以上、１３個もしくはそれ以上、１４個もしくはそれ以上、１５個もしくはそれ以上、または２０個もしくはそれ以上のアミノ酸からなる、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
トランスフェリン成分およびリガンドは、細胞透過性の抗体を含む、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
リガンドは、ペプチド、抗原、受容体、抗体、毒素、代謝産物および核酸からなる群より選択される１種またはそれ以上に結合することができる、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
トランスフェリン成分は、軸成分のＮ末端に融合している、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
軸成分は、Ｔｆ成分のＣ末端に融合している、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
軸成分は、高度にグリコシル化されたペプチドである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
軸成分は、ムチンドメインを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
ムチンドメインは、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、およびＭＵＣ９、ならびにそれらの変異体およびフラグメントからなる群から選択される１種またはそれ以上のタンパク質を含む、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
軸成分は、ヒトＭＵＣ１タンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
軸成分は、配列番号５の核酸によってコードされる、請求項３４に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
軸成分は、ヒトＭＵＣ３タンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
軸成分は、酵母ＡＧＡ１タンパク質、またはそのフラグメントを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
軸成分は、トランスフェリン成分と、宿主細胞または基質との間の立体障害を減少させるように機能する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
軸成分は、アンカー成分のＮ末端に融合している、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
アンカー成分は、軸成分のＣ末端に融合している、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
アンカー成分は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）、またはその誘導体もしくはフラグメントである、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
ＧＰＩは、酵母ＧＰＩシグナル配列、またはそのフラグメントを含む、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
ＧＰＩシグナル配列は、配列番号１５を含む、請求項４２に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
ＧＰＩは、哺乳動物のＧＰＩシグナル配列、またはそのフラグメントを含む、請求項４１に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
アンカー成分は、改変されたＧＰＩシグナル配列を含む、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
改変されたＧＰＩシグナル配列は、配列番号２６の位置１にシステイン残基を含む、請求項４５に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
改変されたＧＰＩシグナル配列は、配列番号３４の最初の２個のアミノ酸、ならびに配列番号３４、３６および３８からなる群より選択されるアミノ酸配列である、請求項４５に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
細胞壁連結要素は、細胞壁に共有結合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４９】
細胞壁連結要素は、細胞壁に非共有結合で結合している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５０】
細胞壁連結要素は、軸成分である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５１】
細胞壁連結要素は、アンカー成分である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５２】
アンカー成分は、膜貫通ドメインである、請求項５１に記載の融合タンパク質。
【請求項５３】
細胞壁連結要素は、細胞壁中の１個またはそれ以上のタンパク質とジスルフィド結合を形成することができる遊離のシステイン残基を１個またはそれ以上含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５４】
細胞壁連結要素は、細胞壁のβ−グルカンと架橋を形成することができる軸成分のグリカンを１個またはそれ以上含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５５】
請求項１〜５４のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項５６】
請求項５５に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項５７】
請求項１〜５４のいずれか一項に記載の融合タンパク質を発現する宿主細胞。
【請求項５８】
細胞は、酵母細胞である、請求項５６に記載の宿主細胞。
【請求項５９】
酵母細胞は、サッカロミセス属またはピチア属である、請求項５８に記載の宿主細胞。
【請求項６０】
請求項５７に記載の宿主細胞のライブラリーを物質に曝露すること、および少なくとも１種の宿主細胞の該物質への結合を検出することを含む、リガンドの結合活性に関してスクリーニングする方法。
【請求項６１】
宿主細胞のライブラリーは、酵母細胞の収集体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
物質は、抗原または受容体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６３】
（ａ）アルブミン成分；
（ｂ）軸成分；および、
（ｃ）細胞膜要素、
を含む融合タンパク質。
【請求項６４】
アルブミン成分は、アルブミンタンパク質、改変されたアルブミンタンパク質、またはそのフラグメントである、請求項６３に記載の融合タンパク質。
【請求項６５】
アルブミンタンパク質は、ヒトアルブミンタンパク質である、請求項６４に記載の融合タンパク質。
【請求項６６】
アンカー成分をさらに含む、請求項６３に記載の融合タンパク質。
【請求項６７】
膜貫通ドメインをさらに含む、請求項６３に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００５年６月１７日付けで出願された米国仮出願第６０／６９１，２２９号の利益を請求する。本願は、２００４年１１月２３日付けで出願された米国特許出願第１０／５１５，４２９号；２００３年７月９日付けで出願された米国仮出願第６０／４８５，４０４号；２００３年３月１０日付けで出願された米国特許出願第１０／３８４，０６０号；および２００２年８月３０日付けで出願された米国仮出願第６０／４０６，９７７号（これらは全て、それら全体として参照により組み込まれる）に関係する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、融合タンパク質、融合タンパク質ライブラリー、およびリガンドの結合活性に関してスクリーニングするための融合タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞表層提示系
コンビナトリアルライブラリーによるスクリーニングおよび選択方法は、一般的な研究ツールになっている（Ｐｈｉｚｉｃｋｙ等（１９９５）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５９：９４〜１２３）。最も普及した技術の一つはファージディスプレイであり、この技術によれば、タンパク質はバクテリオファージコートタンパク質へのポリペプチド融合として発現し、後で、固定化または可溶性ビオチン化リガンドに結合させることによってスクリーニングされる。ランダムペプチドの提示は、Ｍ１３、ｆｄおよびｆ１のような線状バクテリオファージの外面上に発現されるキメラタンパク質を構築することによって達成されることが多い。ファージディスプレイは、抗体、ＤＮＡ結合タンパク質、プロテアーゼ阻害剤、および酵素への応用が成功している。Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ等（１９９７）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２〜７０；Ｌａｄｎｅｒ（１９９５）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：４２６〜４３０；Ｌｏｗｍａｎ等（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２〜１０８３８；Ｍａｒｋｌａｎｄ等（１９９６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：８０４５〜８０５７；および、Ｍａｔｔｈｅｗｓ等（１９９３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：１７２７〜１７３４を参照。
【０００４】
ファージディスプレイに加えて、数種の細菌細胞表層提示法が開発されている。Ｇｅｏｒｇｉｏｕ等（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２９〜３４を参照。細菌細胞表層提示法において取られるアプローチの一つでは、ピリンタンパク質（ＴｒａＡ）またはそれらの部分を含む融合タンパク質や、繊毛を形成することができる細菌宿主細胞の外表面にライブラリーペプチドを提示する異種ポリペプチドを使用してきた。米国特許第５，５１６，６３７号（これは参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）を参照。
【０００５】
ＦＬＩＴＲＸTMランダムペプチドライブラリー（インビトロジェンTMライフ・テクノロジーズ（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎTM  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）の表面にコンホメーション的に制限された形式で１２ｍｅｒのランダムペプチドライブラリーを提示するために、細菌の鞭毛タンパク質、ＦｌｉＣ、およびチオレドキシン、ＴｒｘＡを使用している。Ｌｕ等（１９９５）ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３６６を参照。これらの系は、抗体エピトープマッピング、細菌の生ワクチンの送達系の開発および構築、ならびに環境の浄化目的および診断のための全細胞生物学的吸着剤の生成に応用されている。また、腫瘍由来上皮細胞上で腫瘍特異的な標的に結合するペプチド配列も、ＦＬＩＴＲＸTMシステムを用いて同定されている。Ｂｒｏｗｎ等（２０００）Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，７（１０）：７４３を参照。
【０００６】
ライブラリースクリーニングのために酵母細胞表層提示系が開発されており、ファージや細菌の提示系の限界のいくつかを克服することに成功している。酵母表層提示系、例えばｐＹＤ１酵母提示ベクターキット（ｐＹＤ１  Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ，インビトロジェンTMライフ・テクノロジーズ）は、細胞表層上に外来タンパク質を提示するためにＳ．セレビジエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のａ−凝集素受容体を使用している。ａ−凝集素受容体は、ＡＧＡ１およびＡＧＡ２遺伝子によってコードされた２つのサブユニットからなる。Ａｇａ１タンパク質（Ａｇａ１ｐ，７２５個のアミノ酸）は、酵母細胞から分泌されて、酵母細胞壁の細胞外マトリックス中のβ−グルカンに共有結合するようになる。Ａｇａ２タンパク質（Ａｇａ２ｐ，６９個のアミノ酸）は、２個のジスルフィド結合を介してＡｇａ１ｐに結合し、分泌後、それとＡｇａ１ｐとの接触によって細胞に結合したままになる。Ａｇａ２ｐのＮ末端部分はＡｇａ１ｐへの付着に必要であり、その一方でタンパク質およびペプチドは、酵母細胞表層上での提示のためにＣ末端に融合することができる。凝集素は、天然型の酵母タンパク質であり、通常は、交配の間に酵母細胞を融合させるための特異的な付着による接触部として機能する。そのようなものとして、凝集素は、細胞壁成分との過剰な立体障害が起こらないようにタンパク質−タンパク質結合に関して進化してきた。Ｂｏｄｅｒ等の“タンパク質発現、親和性および安定性の定向進化に関する酵母表面提示（Ｙｅａｓｔ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａｆｆｉｎｉｔｙ，ａｎｄ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）”、キメラ遺伝子およびハイブリッドタンパク質の応用（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）（Ｊｅｒｅｍｙ  Ｔｈｏｒｎｅｒ等），アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），２０００，第３２８巻，４３０〜４３９頁；ＵＳ６，６９９，６５８；および、ＵＳ６，４２３，５３８（これらは参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）。
【０００７】
しかしながら、この系の欠点の一つは、Ａｇａ２ｐタンパク質を細胞壁に連結させるためには、Ａｇａ２ｐ融合タンパク質とＡｇａ１ｐがジスルフィド結合を形成することが必要であるため、提示の効率が比較的低く、表面にタンパク質を有効に提示する酵母細胞がわずか４０％〜６０％である点である。Ｆｅｌｄｈａｕｓｅ等（２００３）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２１（２）：１６３〜７０を参照。ライブラリーの（全てとは限らないが）ほとんどのタンパク質を細胞表層に提示する酵母提示系の必要がある。
【０００８】
Ａｇａ１ｐおよびＡｇａ２ｐ酵母提示系のその他の欠点は、スクリーニングしようとするリガンドを、Ａｇａ２ｐのＣ末端に付着させることを必要とする点である。その結果として、この系は、遊離のＮ末端が結合に必要であるペプチド、および／または遊離のＮ末端が活性に必要であるペプチドを選択するのに用いることができない。従って、リガンドＮ末端の酵母細胞タンパク質への結合を必要としないフレキシブルな提示系の必要がある。
【０００９】
トランスフェリン融合タンパク質
血清トランスフェリン（Ｔｆ）は、８０，０００ダルトンの分子量を有する単量体の糖タンパク質であり、血液循環中で鉄に結合し、その鉄をトランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を介して様々な組織に輸送する（Ａｉｓｅｎ等（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：３５７〜３９３；ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ等（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：３５４３〜３５５３；および米国特許第５，０２６，６５１号）。Ｔｆは、最も一般的な血清中の分子の一種であり、総血清タンパク質の約５〜１０％以下で含まれる。糖鎖欠損トランスフェリンは、アルコール症の個体の血液中に高レベルで存在し、グリコシル化トランスフェリンの半減期（約７〜１０日間）よりも長い半減期（約１４〜１７日間）を示す。ｖａｎ  Ｅｉｊｋ等（１９８３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １３２：１６７〜１７１；Ｓｔｉｂｌｅｒ（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：２０２９〜２０３７；Ａｒｎｄｔ（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７（１）：１３〜２７；およびＳｔｉｂｌｅｒ等の“Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ”，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｅｄ  Ｎｏｒｄｍａｎｎ等），Ｐｅｒｇａｍｏｎ，１９８８，第７１巻，３５３〜３５７頁）を参照。Ｔｆの構造はよく特徴付けられており、受容体結合、鉄結合および放出、ならびに炭酸イオン結合のメカニズムが解明されている。米国特許第５，０２６，６５１号、５，９８６，０６７号、および、ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ等（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（６）：３５４３〜３５４６（これらの全ては、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）を参照。
【００１０】
ムチンは、高度にグリコシル化されたタンパク質であり、マイクロアレイから実質的な距離をおいて融合タンパク質のリガンドドメインを持ち上げるのに用いられている。リガンドを基質から有意な距離に持ち上げることによって、リガンドの受容体を発現する細胞に提示された受容体への結合が増加すると仮説を立てられている。ＷＯ０１／４６６９８（これは参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）を参照。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
これまで本発明の発明者等は、トランスフェリン融合タンパク質ライブラリーを開発してきた。米国特許出願第１０／５１５，４２９号（これは参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）を参照。本発明は、立体障害を減少させ、リガンドの結合が増加するように設計されたムチンのような軸様の成分を含むトランスフェリン融合タンパク質を提供する。発現されたトランスフェリン融合タンパク質が、ペプチドスクリーニングのプラットフォームとして用いることができるように、本融合タンパク質を、酵母のような宿主細胞の表面で発現させ提示させることができる。さらに、本融合タンパク質のトランスフェリンとリガンド部分を切断して、治療剤としてとして用いることができる。Ｎ末端が融合したＡｇａ２タンパク質を除去すると、トランスフェリンに連結した小さいリガンドのコンホメーションに影響を与える可能性が高いため、これを既存の酵母提示技術で達成することは不可能と思われる。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
以下でより詳細に説明されているように、本発明は、トランスフェリン（Ｔｆ）成分、軸成分、および細胞壁結合基を含む融合タンパク質を含む。Ｔｆ成分は、トランスフェリンタンパク質またはそれらの部分を含み、酵母細胞表層上に提示される。例えば、トランスフェリン成分は、トランスフェリンタンパク質のＮドメインの一部、換言すればローブであってもよい。Ｔｆ成分は、本融合タンパク質のＴｆ部分が、野生型Ｔｆと比較して低いグリコシル化を示すように改変されたＴｆタンパク質であってもよい。本発明の一実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を示さない。本発明のその他の実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン成分は、野生型トランスフェリンに比べて低い鉄、ビカーボネートへの親和性、および／または低いトランスフェリン受容体への親和性を示すように改変される。トランスフェリン成分は、トランスフェリン受容体、鉄またはビカーボネートに結合することができなくなるように改変されていてもよい。従って、本発明は、トランスフェリン成分が、グリコシル化部位、鉄結合部位、ヒンジ部位、ビカーボネート部位、および受容体結合部位からなる群より選択される１個またはそれ以上の部位で改変された、改変されたトランスフェリン成分を含む。
【００１３】
ここで特許請求される発明のリガンドは、様々な方法でトランスフェリン成分と複合体化させてもよいし、またはトランスフェリン成分と融合させてもよい。さらに、トランスフェリン成分は、それに連結した１個より多くのリガンドを有していてもよい。リガンド成分は、トランスフェリン成分のＮ末端、Ｃ末端に融合していてもよいし、または、トランスフェリン成分内に位置していてもよい。本発明の一実施態様において、このようなリガンドは、アミノ酸位置Ａｓｐ３３、Ａｓｎ５５、Ａｓｎ７５、Ａｓｐ９０、Ｇｌｙ２５７、Ｌｙｓ２８０、Ｈｉｓ２８９、Ｓｅｒ２９８、Ｓｅｒ１０５、Ｇｌｕ１４１、Ａｓｐ１６６、Ｇｌｎ１８４、Ａｓｐ１９７、Ｌｙｓ２１７、Ｔｈｒ２３１、およびＣｙｓ２４１からなる群より選択されるＮ−ローブ（Ｎ1またはＮ2）のアミノ酸位置の１つまたはそれ以上に挿入される。
【００１４】
本発明のその他の実施態様において、リガンドは、トランスフェリン成分の露出したループ上に位置する。ランダムペプチドのようなリガンド成分は、トランスフェリン成分と共にフレーム内に存在し得るように、トランスフェリン融合タンパク質がコードされたベクターで宿主細胞によって発現され得る。トランスフェリン成分と共に発現されるランダムペプチドのリガンド成分は、当業界既知の多くの方法によって作出することができ、このような方法としては、これらに限定されないが、エラープローンＰＣＲ、およびＤＮＡシャフリングが挙げられる。また、トランスフェリン融合タンパク質がそれまでに翻訳され終わった後に、リガンド成分をトランスフェリン融合タンパク質に付加することもできる。
【００１５】
リガンドは多くの形態をとることができ、このような形態としては、これらに限定されないが、単鎖抗体、抗体、抗体フラグメント、抗体の可変領域、ランダムペプチド、または抗体相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。リガンドは、可変またはランダム領域、および非可変領域を含んでいてもよい。リガンドは、研究対象のリガンドであってもよいし、またはリガンドのライブラリー中の一種のリガンドであってもよい。リガンドは、多数の受容体または物質、例えばペプチド、抗原、受容体、抗体、毒素、代謝産物、および核酸に結合する可能性がある。
【００１６】
軸成分は、そのＮ末端がトランスフェリン成分に融合し、そのＣ末端が細胞中に（例えば細胞壁中に）位置するように配置させることができる。一実施態様において、軸成分のＣ末端は、アンカー成分に融合される。本発明の軸成分は酵母細胞の細胞壁に伸びており、通常は中程度ないし高度にグリコシル化されたペプチドである。細胞壁に伸びていることによって、軸成分は、細胞壁を介して融合タンパク質を結びつけるための細胞壁連結要素として作用することが可能である。本発明の一実施態様において、軸成分は細胞壁に伸びており、細胞表層上に部分的に提示されている。軸成分の組成は、それにロッド様のコンホメーションを付与することができ、このようなコンホメーションにより、もしもそれながければ融合タンパク質（とりわけリガンド）と宿主細胞との間に存在するはずの立体障害を少なくすることができる。
【００１７】
軸成分は、ムチン、ムチン変異体、またはそれらのフラグメントを含んでいてもよいし、またはそれらからなっていてもよい。ムチンドメインは、例えば、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、およびＭＵＣ９、ならびにそれらの変異体を含んでいてもよい。一実施態様において、軸成分は、ヒトＭＵＣ１ドメインを含み、例えば配列番号５の核酸配列またはそれらのフラグメントに相当するペプチドを含む。その他の実施態様において、軸成分は、２回またはそれ以上のムチンの反復を含み、例えば２回またはそれ以上のＭＵＣ１またはＭＵＣ３の反復を含む。さらなる実施態様において、軸成分は、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ６、ＭＵＣ７、ＭＵＣ８、およびＭＵＣ９からなる群より選択される２種またはそれ以上のムチンタンパク質、またはそれらの変異体もしくはフラグメントを含む。
【００１８】
さらに軸成分は、天然型の酵母の細胞壁タンパク質などの中程度から高度にグリコシル化されたその他のタンパク質を含んでいてもよいし、またはそれらからからなっていてもよい。例えば、本発明の一実施態様において、軸成分は、Ａｇａ１、Ａｇａ１の変異体、もしくはそれらのフラグメントを含むか、またはそれらからなる。
【００１９】
本発明の融合タンパク質は、融合タンパク質を宿主細胞に固定するまたは結びつけるように作用する細胞壁連結要素を含む。細胞壁連結要素は、本発明の融合タンパク質を酵母細胞壁に共有結合または非共有結合によって結合させることができる。本発明の一実施態様において、本融合タンパク質の軸成分は、細胞壁連結要素である。例えば、軸成分からのＯ−グリカンは、細胞壁のβ−グルカンに架橋することができる。その他の細胞壁連結要素としては、これらに限定されないが、遊離のシステイン残基を含むペプチドが挙げられる。例えば、対になっていないシステイン残基を１個またはそれ以上含む軸成分またはアンカー成分は、細胞壁中のタンパク質の対になっていないシステイン残基の１個またはそれ以上とジスルフィド結合を形成することができる。
【００２０】
本発明の融合タンパク質は、場合により、アンカー成分を含んでいてもよく、このアンカー成分も、トランスフェリン融合タンパク質を宿主細胞に固定するまたは結びつけるように作用する。アンカー成分は、細胞壁連結要素であってもよいし、または本融合タンパク質を酵母細胞膜に結びつけてもよい。
【００２１】
なかでも、本発明の融合タンパク質を酵母細胞膜に結びつけることができるアンカードメインの一つは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）ペプチドアンカーであり、これは翻訳後タンパク質修飾によってＧＰＩシグナルペプチド配列（例えば配列番号１５で示されるシグナルペプチド配列）のオメガ部位（ω−ｓｉｔｅ）に付加される。本発明の一実施態様において、アンカー（例えば改変されたＧＰＩシグナル配列によって提供されるアンカー）は、切断される前に、融合タンパク質を宿主細胞膜または細胞壁を一時的に繋ぐ。一旦切断されると、融合タンパク質は、細胞壁のβ−グルカンに架橋されている軸成分からのグリカンにより、細胞壁連結要素を介して細胞に連結したままになる。
【００２２】
本発明のその他の実施態様において、アンカーは、膜貫通ドメインである。膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）は、１回膜貫通型ＩまたはII膜タンパク質の領域でもよいし、またはマルチスパン型膜タンパク質の数個の膜貫通領域のいずれか一つでもよい。
【００２３】
本発明はまた、特許請求される融合タンパク質をコードする核酸分子も含む。このような核酸は、ベクターに挿入することができ、酵母のような宿主細胞を形質転換させるのに用いることができる。宿主細胞は、本発明の核酸で形質転換されると、本融合タンパク質を発現することができる。本融合タンパク質の発現の誘導は当業界既知の方法によって制御することができ、例えば誘導性プロモーターの使用によって制御することができる。本発明は、宿主細胞の集合体、例えば、ランダム化ペプチドを提示する本発明の融合タンパク質を発現する酵母細胞の集合体に発現された融合タンパク質のライブラリーを含む。
【００２４】
本発明のその他の実施態様において、本融合タンパク質は、リガンドまたは物質の結合活性についてスクリーニングするのに用いられる。特許請求される融合タンパク質を発現することができる宿主細胞のライブラリーを、これらに限定されないが抗原または受容体などの物質に曝露し、それから結合活性に関してスクリーニングすることができる。細胞表層提示ライブラリーは、これらに限定されないがＦＡＣＳや磁気ビーズなどの当技術分野既知の方法を用いてスクリーニングすることができる。
【００２５】
詳細な説明
一般的な説明
本発明の発明者等は、ライブラリー、例えばランダムペプチドまたはＣＤＲライブラリーをスクリーニングするための、例えば細胞表層提示系の一部として用いることができる多機能の融合タンパク質を開発した。本融合タンパク質は、１またはそれ以上のリガンドと複合体化または融合したトランスフェリン成分を含む。本発明は、以下を条件とする限りにおいて、トランスフェリン以外のタンパク質を含む融合タンパク質を想定しており、上記条件は、上記その他のタンパク質が可溶性であり、融合タンパク質の残分の部分から切断されたときに融合した１またはそれ以上のリガンドに高い血清中半減期を付与することができる場合である。例えば、トランスフェリンの代わりに、アルブミンまたはその変異体もしくはフラグメントを用いることができる。
【００２６】
本融合タンパク質のトランスフェリン成分は、中程度から高度にグリコシル化された軸成分に融合している。本融合タンパク質は、本融合タンパク質を酵母細胞の細胞壁に共有結合または非共有結合で結合させることができる細胞壁連結要素を含む。本発明の一実施態様において、本融合タンパク質は、アンカー成分（例えば膜貫通ドメイン）をも含む。
【００２７】
本融合タンパク質は、酵母提示系して用いられる場合、Ａｇａ１ｐおよびＡｇａ２ｐ酵母提示系と比較して、ペプチドを提示した細胞表層を有するクローンを高い割合で提供すること等を含む従来技術を超える利点を提供する。また本発明の融合タンパク質は、結合に利用可能なＮ末端を必要とするリガンドをスクリーニングすることのフレキシビリティーをも提供する。
【００２８】
本発明はまた、本融合タンパク質またはそれらの部分を含む治療用組成物、および治療を必要とする対象に本融合タンパク質またはそれらの部分を投与することによって、疾患または障害を治療、予防または改善する方法も含む。本発明の融合タンパク質は、リガンド成分として、推定上の治療用タンパク質の少なくともフラグメントまたは変異体を含む。本発明の一実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリンおよびリガンド（すなわち治療薬）部分は、軸成分（すなわち本融合タンパク質の酵母細胞と結合した部分）から切断することができ、生物薬剤またはワクチンを調製するのに用いることができる。
【００２９】
定義
本明細書で用いられる用語「生物活性」は、生物学的な環境において、すなわち生体内またはインビトロのその模擬環境において、治療的な分子、リガンド成分、タンパク質またはペプチドによって行われる機能または一連の活性を意味する。生物活性としては、これらに限定されないが、特許請求される融合タンパク質の治療的分子部分の機能が挙げられ、例えばこれらに限定されないが、応答細胞系からの細胞外マトリックス分泌の誘導、ホルモン分泌の誘導、走化性の誘導、有糸分裂誘発の誘導、分化の誘導、または応答細胞の細胞分裂の阻害が挙げられる。本発明の融合タンパク質またはペプチドは、その治療用タンパク質の天然型の対応物が示す１種またはそれ以上の生物活性を示す場合、生物学的に活性であるとされる。
【００３０】
本明細書で用いられるように、トランスフェリン配列における「〜に相当するアミノ酸」または「等価なアミノ酸」は、第一のトランスフェリン配列と、少なくとも第二のトランスフェリン配列との間の同一性または類似性が最大になるようにアラインメントによって同定される。第二のトランスフェリン配列における等価なアミノ酸を同定するのに用いられる番号は、第一のトランスフェリン配列におけるそれに相当するアミノ酸を同定するのに用いられる番号に基づく。特定の場合において、これらの語句は、ヒトトランスフェリンにおけるアミノ酸残基を、ウサギ血清トランスフェリンにおける特定の残基と比較して説明するのに用いる場合もある。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「Ｔｆ成分」、「Ｔｆタンパク質のフラグメント」または「Ｔｆタンパク質」または「Ｔｆタンパク質の部分」は、天然に存在するＴｆタンパク質、またはその突然変異体の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含むアミノ酸配列を意味する。
【００３２】
本明細書で用いられる用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連するＤＮＡのあらゆるセグメントを意味する。従って、遺伝子は、これらに限定されないが、それらの発現に必要なコード配列および／または調節配列を含む。また遺伝子は、例えば他のタンパク質に関する認識配列を形成する発現されないＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。遺伝子は、関心対象の源からクローニングすること、または既知のもしくは予測された配列情報から合成することによって、様々な源から得ることができ、さらに望ましいパラメーターを持つように設計された配列を含んでいてもよい。
【００３３】
本明細書で用いられる「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」または「異種遺伝子」または「異種配列」または「外因性ＤＮＡセグメント」は、特定の宿主細胞にとって外来の起源であるポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントを意味するか、または同じ源由来の場合、その元の形態から改変されたポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントを意味する。宿主細胞における異種遺伝子には、特定の宿主細胞にとって内在性であるが、修飾されている遺伝子が含まれる。従って、この用語は、細胞にとって外来または異種であるＤＮＡセグメント、または細胞に相同であるが、その構成要素が通常は見出されない宿主細胞の核酸内の位置に存在するＤＮＡセグメントを意味する。一例として、酵母細胞にとっては天然型であるが、ヒトＴｆ配列に付着したシグナル配列は、異種である。
【００３４】
本明細書で用いられる「単離した」核酸配列は、その他の核酸配列を実質的に含まない核酸配列を意味し、例えば、アガロースゲル電気泳動によって決定した場合に、少なくとも約２０％純粋な、好ましくは少なくとも約４０％純粋な、より好ましくは約６０％純粋な、さらにより好ましくは約８０％純粋な、最も好ましくは約９０％純粋な、さらに最も好ましくは約９５％純粋な核酸配列である。例えば、単離された核酸配列は、その天然の位置から異なる部位（そこで核酸配列が複製されることになる）に核酸配列を移転させるための、遺伝子工学で用いられる標準的なクローニング法により得ることができる。クローニング法は、上記ポリペプチドをコードする核酸配列を含む所望の核酸フラグメントを切り出して単離し、このフラグメントをベクター分子に挿入し、組換えベクターを核酸配列の複数のコピーまたはクローンが複製されることになる宿主細胞に組み込ませることを含み得る。核酸配列は、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来のものでもよいし、またはそれらのあらゆる組み合わせでもよい。
【００３５】
本明細書で用いられるように、２個またはそれ以上のＤＮＡコード配列間のフレーム内融合の結果として、ＤＮＡコード配列が融合ポリペプチドに翻訳される場合、２またはそれ以上のＤＮＡコード配列は、「連結した」または「融合した」と言う。用語「融合」は、融合タンパク質に関して用いられる場合、リガンド成分、軸成分、およびアンカー成分を含む。Ｔｆ融合タンパク質は、トランスフェリン成分が軸成分に融合したものであり、細胞壁連結要素を含む。
【００３６】
本明細書で用いられる「改変されたトランスフェリン」は、そのアミノ酸配列に、野生型トランスフェリンに比べて少なくとも１つの改変を示すトランスフェリン分子を意味する。
【００３７】
本明細書で用いられる「改変されたトランスフェリン融合タンパク質」は、軸成分に融合しているリガンドと複合体化した、またはそれらに融合した、改変されたトランスフェリン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子の融合によって形成されたタンパク質を意味する。
【００３８】
本明細書で用いられる用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、およびそれらの一本鎖または二本鎖いずれかの形態のポリマーを意味する。特に限定されない限り、これらの用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドと同様にして代謝される天然ヌクレオチドの類似体を含む核酸を包含する。特に他の指定がない限り、特定の核酸配列はまた、当然ながら、保存的に改変されたそれらの変異体（例えば、縮重コドンの置換）および相補配列、加えて、明確に示された配列も包含する。特に、縮重コドンの置換は、１またはそれ以上の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が、混合型の塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作製することによって達成することもできる（Ｂａｔｚｅｒ等（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ等（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８；Ｃａｓｓｏｌ等（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされたｍＲＮＡと同じ意味で用いられる。
【００３９】
本明細書で用いられるように、ＤＮＡセグメントが、その他のＤＮＡセグメントと機能的に関係するように置かれると、「機能するように連結した」と表現される。例えば、シグナル配列に関するＤＮＡが、融合タンパク質の分泌に関与する前駆タンパク質として発現される場合、そのシグナル配列に関するＤＮＡは、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡに機能するように連結しており、プロモーターまたはエンハンサーが、配列の転写を刺激する場合、そのプロモーターまたはエンハンサーはコード配列に機能するように連結している。一般的に、機能するように連結しているＤＮＡ配列は隣接しており、さらにシグナル配列または融合タンパク質の場合は、機能するように連結しているＤＮＡ配列は、隣接し、かつリーディング相中にある。しかしながら、エンハンサーは、それらが転写を制御するコード配列と隣接していなくてもよい。このような状況において、連結は、便利な制限部位でのライゲーション、またはその代わりに挿入されるリンカーもしくはアダプターでのライゲーションによって達成される。
【００４０】
本明細書で用いられる用語「プロモーター」は、転写を開始させるためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与するＤＮＡ領域を意味する。
【００４１】
本明細書で用いられる用語「組換え」は、組換えＤＮＡでの形質転換を受けている細胞、組織または生物を意味する。
【００４２】
本明細書で用いられるように、標的化の実体、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドは、特定の細胞型（例えばリンパ球のような正常な細胞または癌細胞のような異常細胞）に特異的に結合する分子を意味し、それゆえにこれは細胞型が特異的であるＴｆ融合タンパク質または化合物（薬物または細胞毒性薬）を、標的とするために用いられ得る。
【００４３】
本明細書で用いられる「治療用タンパク質」は、１またはそれ以上の治療活性および／または生物活性を有するタンパク質、ポリペプチド、抗体、ペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体を意味する。本発明に包含される治療用タンパク質としては、これらに限定されないが、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、および生体物質が挙げられる。本明細書において、ペプチド、タンパク質およびポリペプチドという用語は交換可能に用いられる。加えて、用語「治療用タンパク質」は、治療用タンパク質に相関する内在性のまたは天然に存在するものを意味する場合もある。「治療活性」を示すポリペプチド、または「治療的に活性である」タンパク質は、本明細書で説明されている治療用タンパク質または当技術分野で既知のその他のものの１種またはそれ以上のような治療用タンパク質に関連する既知の生物学的および／または治療活性を１種またはそれ以上有するポリペプチドを意味する。非限定的な例として、「治療用タンパク質」は、疾患、状態または障害を治療、予防または改善するのに有用なタンパク質である。このような病気、状態または障害は、ヒトにおけるものでもよいし、またはヒト以外の動物におけるものでもよく、例えば獣医学での使用が考えられる。
【００４４】
本明細書で用いられる用語「形質転換」は、核酸、すなわちヌクレオチドポリマーの細胞への転移を意味する。本明細書で用いられる用語「遺伝学的な形質転換」は、ＤＮＡ（特に組換えＤＮＡ）の細胞への転移および組み込みを意味する。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「形質転換体」は、形質転換を受けた細胞、組織または生物を意味する。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「導入遺伝子」は、生物、宿主細胞またはベクターに、確実に機能する形で挿入される核酸を意味する。
【００４７】
本明細書で用いられる用語「トランスジェニック」は、様々な形質転換法の１つによって、外来または改変された遺伝子、特に改変されたＴｆ融合タンパク質をコードする遺伝子を受け入れた細胞、細胞培養、生物、細菌、菌類、動物、植物、およびこれらのうちいずれかの後代を意味し、ここにおいて、外来または改変された遺伝子は、外来もしくは改変された遺伝子を受け入れる生物種と同一種由来であるか、または外来もしくは改変された遺伝子を受ける生物種とは異なる種由来である。
【００４８】
「変異体（ｖａｒｉａｎｔｓ）または変異体（ｖａｒｉａｎｔ）」は、参照核酸またはポリペプチドとは異なるが、それらの必須の特性を保持するポリヌクレオチドまたは核酸を意味する。一般的に、変異体は、全体的に極めて類似しており、多くの領域において参照核酸またはポリペプチドと同一である。本明細書で用いられる「変異体」は、天然型の治療用タンパク質とは配列が異なっているが、本明細書の別のところで記載されている、または当技術分野で既知の別のもののようなそれらの少なくとも１つの機能的および／または治療的な特性を保持する、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療用タンパク質部分を意味する。
【００４９】
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、広範囲に、外因性核酸をコードするあらゆるプラスミド、ファージミドまたはウイルスを意味する。また、この用語には、例えばポリリジン化合物などのような、核酸のウィリオンまたは細胞への転移を容易にする、非プラスミド、非ファージミドおよび非ウイルス化合物も含まれると解釈されるものでもある。ベクターは、核酸またはそれらの突然変異体を細胞に送達するための送達媒体として適するウイルスベクターでもよく、または同じ目的に適する非ウイルスベクターでもよい。ＤＮＡを細胞および組織に送達するためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｍａ等（１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４〜１２７４６）に記載されている。ウイルスベクターの例としては、これらに限定されないが、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換え  鳥類ポックスウイルスなどが挙げられる（Ｃｒａｎａｇｅ等，１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３０５７〜３０６３；１９９４年８月１８日に公開された国際特許出願公開番号ＷＯ９４／１７８１０；１９９４年１０月２７日に公開された国際特許出願公開番号ＷＯ９４／２３７４４）。非ウイルスベクターの例としては、これらに限定されないが、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが挙げられる。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「野生型」は、天然に生じるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。
【００５１】
本明細書で用いられる「スカフォールドタンパク質」、「スカフォールドポリペプチド」または「スカフォールド」は、アミノ酸配列（例えばランダムペプチド）が融合することができるタンパク質を意味する。このようなペプチドはスカフォールドにとって外来性である。
【００５２】
本明細書で用いられる「ランダムペプチド配列」は、２個またはそれ以上のアミノ酸単量体で構成され、ストカスティック過程またはランダム過程によって構築されたアミノ酸配列を意味する。ランダムペプチドは、フレームワークまたはスカフォールドのモチーフを含んでいてもよく、これらはインバリアント配列を含んでもよい。ランダムペプチド配列は、変異体ではない、すなわちランダムではないアミノ酸の一部を含んでいてもよい。
【００５３】
本明細書で用いられる「ランダムペプチドライブラリー」は、一連のランダムペプチドをコードする一連のポリヌクレオチド配列を意味し、ならびにそれらのポリヌクレオチド配列によってコードされる一連のランダムペプチド、およびそれらのランダムペプチドを含む融合タンパク質を意味する。
【００５４】
本明細書で用いられる用語「擬似ランダム」（“ｐｓｅｕｄｏｒａｎｄｏｍ”）は、例えば一つの位置における残基の可変性の程度が、その他の位置における残基の可変性の程度と異なっているが、あらゆる擬似ランダム位において、かなり制限されるがある程度の残基の多様性が許容されるように、限定された可変性を有する一連の配列を意味する。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「定義された配列フレームワーク」は、一般的に実験データまたは構造データに基づいてランダムではない方式で選択される一連の定義された配列を意味し、例えば定義された配列フレームワークは、β−シート構造を形成すると予測される一連のアミノ酸配列を含んでいてもよく、またはいくつかあるバリエーションのなかでも、ロイシンジッパーヘプタッド反復モチーフ、ジンクフィンガードメインを含んでいてもよい。「定義された配列核」（ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｋｅｒｎａｌ）は、限られた可変性の範囲を包含する一連の配列である。２０種の通常のアミノ酸からなる完全にランダムな１０−ｍｅｒの配列が、（２０）10の配列のいずれかである可能性があり、そして２０種の通常のアミノ酸からなる擬似ランダムな１０−ｍｅｒの配列が、（２０）10配列のいずれかである可能性があるが、特定の位置および／または全体において特定の残基に関する偏りを示すことになるので、それぞれの残基の位置が許容できる２０種の通常のアミノ酸（および／または許容できる非必須アミノ／イミノ酸）のいずれかであることが許容されたならば、定義された配列核は可能な配列の最大数より少ない配列の部分集合である。定義された配列核は、一般的に、変異した残基位置とインバリアントの残基位置とを含むか、および／またはアミノ酸残基の定義された部分集合から選択される残基などを含むことが可能な変異した残基位置を、これは選択された個々のライブラリー要素配列のセグメント単位で、またはその全長にわたってのいずれかで含む。定義された配列核は、アミノ酸配列、または、ポリヌクレオチド配列のいずれかを意味する場合もある。
【００５６】
本明細書で用いられる「リンカー」または「スペーサー」は、ＤＮＡ結合タンパク質とランダムペプチドのような２つの分子を連結させる分子または分子群を意味し、これらは、２つの分子を望ましい立体配置に配置するのに役立ち、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質との立体障害を最小にしてランダムペプチドが受容体に結合できるようになる。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「可変性のセグメント」は、ランダム、擬似ランダム、または定義された核配列を含む新生のペプチド部分を意味する。可変性のセグメントは、変異した残基位置とインバリアントな残基位置の両方を含んでいてもよく、変異した残基位置における残基のバリエーションの程度は、制限される可能性があり、いずれの選択肢も技術者の裁量で選択される。典型的には、可変性のセグメントは、長さが約３〜２０個のアミノ酸残基、例えば長さが８〜１０個のアミノ酸であるが、それより長い可変性のセグメントも可能であり、抗体部分または受容体タンパク質、例えば抗体フラグメント、核酸結合タンパク質、受容体タンパク質などを含んでもよい。
【００５８】
本明細書で用いられる用語「エピトープ」は、抗原の一部、または抗体の可変領域結合ポケットと相互作用する結合相互作用を形成することができるその他の高分子を意味する。典型的には、このような結合相互作用は、ＣＤＲの１個またはそれ以上のアミノ酸残基との分子間接触として示される。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「受容体」、「標的」または「物質」は、所定のリガンドへの親和性を有する分子を意味する。受容体は、天然に存在する分子でもよいし、または合成分子でもよい。受容体は、改変されていない状態で用いてもよいし、またはその他の種との集合体として用いてもよい。受容体は、共有結合または非共有結合で、直接的に、または特異的な結合物質を介して、結合要素（すなわちリガンド）に結合することができる。受容体の例としては、これらに限定されないが、抗体、例えばモノクローナル抗体、および（例えば、ウイルス、細胞またはその他の物質における）特異的な抗原決定基との反応性を有する抗血清、細胞膜受容体、抗原、エピトープ含有分子、複合糖質および糖タンパク質、酵素、ならびにホルモン受容体が挙げられる。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「リガンド」または「リガンド部分」は、特定の受容体または物質によって認識されるランダムペプチドまたは可変性のセグメント配列のような分子を意味する。当業者であれば理解できると予想されるが、このような分子（または高分子複合体）は、受容体でもよいし、リガンドでもよい。
【００６１】
本明細書で用いられる「融合した」、「複合体化した」または「機能するように連結した」とは、ランダムペプチドとスカフォールドタンパク質とが、スカフォールド構造の安定性の破壊が最小化されるような形で一緒に連結していることを意味する。
【００６２】
本明細書で用いられる用語「単鎖抗体」は、ポリペプチドリンケージにＶHドメインおよびＶLドメインを含むポリペプチドを意味し、これは、一般的に、スペーサーペプチド（例えば、配列番号１７の［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］x）を介して連結しており、さらにアミノおよび／またはカルボキシ末端に追加のアミノ酸配列を含んでもよい。例えば、単鎖抗体は、コーディングポリヌクレオチドに連結させるための固定セグメントを含んでもよい。一例として、ｓｃＦｖは、単鎖抗体である。単鎖抗体は、一般的に、実質的に免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子によってコードされた少なくとも１０個の隣接したアミノ酸のポリペプチドセグメント１個またはそれ以上からなるタンパク質であり（例えば、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ａ．Ｆ．ＷｉｌｌｉａｍｓおよびＡ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ，ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，Ｔ．Ｈｏｎｊｏ，Ｆ．Ｗ．ＡｌｔおよびＴ．Ｈ．Ｒａｂｂｉｔｔｓ編（１９８９）アカデミックプレス：サンディエゴ，カリフォルニア州，３６１〜３８７頁を参照、これらは、参照により本明細書に組み込まれる）、最も多くは、げっ歯類、非ヒト霊長類、鳥類、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギまたはヒトの重鎖または軽鎖遺伝子配列によってコードされた少なくとも１０個の隣接したアミノ酸のポリペプチドセグメント１個またはそれ以上からなるタンパク質である。機能的な単鎖抗体は、一般的に、特異的な標的分子、典型的には受容体または抗原（エピトープ）への結合特性が保持されるように、免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子産物の十分な部分を含む。
【００６３】
本明細書で用いられる用語「相補性決定領域」および「ＣＤＲ」は、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａのＣＤＲの定義で例示されたような当技術分野で認められている用語を意味し、これはまた、一般的には、超可変領域または超可変ループとしても知られている。ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ等（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４２：８７７；Ｅ．Ａ．Ｋａｂａｔ等，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，ベセスダ，メリーランド州）（１９８７）；およびＴｒａｍｏｎｔａｎｏ等（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：１７５を参照。可変領域ドメインは、典型的には、天然の免疫グロブリン鎖のアミノ末端の約１０５〜１１５個のアミノ酸（例えばアミノ酸１〜１１０）を含むが、可変ドメインは、多少短くても、または長くても、単鎖抗体を形成するのに適している。
【００６４】
免疫グロブリンの軽鎖または重鎖可変領域は、３つの超可変領域（ＣＤＲともいう）で分断された「フレームワーク」領域からなる。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、正確に定義されている。“Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，Ｅ．Ｋａｂａｔ等，第４版，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ベセスダ，メリーランド州（１９８７）を参照。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。本明細書で用いられる「ヒトフレームワーク領域」は、天然のヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域に実質的に（約８５％またはそれ以上、通常は９０〜９５％またはそれ以上）同一なフレームワーク領域である。構成要素である軽鎖と重鎖とが一緒になったフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、ＣＤＲを配置し並べるのに役立つ。ＣＤＲは、主として、抗原のエピトープへの結合に関与する。
【００６５】
特に他の指定がない限り、本明細書で用いられる技術用語や科学用語はいずれも、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているのと同じ意味を有する。本発明の実施または試験において、本明細書で説明されている方法および材料と類似した、またはそれらと同等のあらゆる方法および材料を用いることができるが、好ましい方法と材料を説明する。
【００６６】
トランスフェリンおよびトランスフェリンの改変
本発明の融合タンパク質は、受容体または物質にランダムペプチドまたはＣＤＲのようなリガンドを提示することができるトランスフェリン（Ｔｆ）タンパク質、またはそれらの部分を含む。Ｔｆ成分は、軸成分のＮ末端に融合している。本融合タンパク質のＴｆタンパク質またはそれらの部分を、本融合タンパク質のＴｆ「部分」、「領域」または「成分」と称する場合もある。本明細書で用いられるように、トランスフェリン融合タンパク質は、軸成分に融合したトランスフェリンタンパク質または成分であり、さらに細胞壁連結要素を含む。本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、場合によりアンカー成分を含んでいてもよい。
【００６７】
本発明の改変されたＴｆ融合タンパク質を作製するためにどのようなトランスフェリンでも使用可能である。一例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、約７５ｋＤａの６７９個のアミノ酸からなるタンパク質であり（グリコシル化は考慮に入れない）、これは遺伝子重複によって生じると思われる２つの主要なローブまたはドメイン、Ｎ（約３３０個のアミノ酸）およびＣ（約３４０個のアミノ酸）を有する。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００１０６３、ＸＭ００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ０３９８４５、ＸＭ０３９８４７、およびＳ９５９３６（www.ncbi.nlm.nih.gov）（これらはいずれも、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）、ならびに配列番号１、２および３を参照。この２つのドメインは長い時間をかけて分岐しているが、大きい同一性／類似性を保持する。
【００６８】
ＮおよびＣドメインはそれぞれ、さらに２つのサブドメイン、Ｎ１およびＮ２、Ｃ１およびＣ２に分けられる。これは、鉄を体の細胞に輸送するように機能する。これは、全ての細胞で、特に活発に増殖する細胞で発現されるＴｆ受容体（ＴｆＲ）が介在するプロセスである。ＴｆＲは、Ｔｆの鉄が結合した形態を認識し（１受容体につきその２つの分子を結合する）、続いてエンドサイトーシスが起こり、それによってＴｆＲ／Ｔｆ複合体が、エンドソームに輸送され、その時点で、局所的なｐＨ低下によって、結合した鉄の放出、および細胞表層へのＴｆＲ／Ｔｆ複合体の再利用、およびＴｆ放出（その鉄が結合していない形態で、アポＴｆとして知られている）が起こる。受容体結合は、主として、ＴｆのＣドメインを介する。グリコシル化されていない鉄が結合したＴｆが受容体と結合するため、Ｃドメイン中の２つのグリコシル化部位は、受容体結合に関与しないようである。
【００６９】
Ｔｆ分子はそれぞれ、２個の鉄イオン（Ｆｅ3+）を運搬することができる。これらは、Ｎ１およびＮ２サブドメイン、Ｃ１およびＣ２サブドメインの間のスペースで複合体化され、分子においてコンホメーション変化が起こる。
【００７０】
ヒトトランスフェリンにおいて、鉄結合部位は、少なくとも、配列番号３のアミノ酸Ａｓｐ６３（天然型のＴｆシグナル配列を含む配列番号２では、Ａｓｐ８２）、Ａｓｐ３９２（配列番号２では、Ａｓｐ４１１）、Ｔｙｒ９５（配列番号２では、Ｔｙｒ１１４）、Ｔｙｒ４２６（配列番号２では、Ｔｙｒ４４５）、Ｔｙｒ１８８（配列番号２では、Ｔｙｒ２０７）、Ｔｙｒ５１４または５１７（配列番号２では、Ｔｙｒ５３３またはＴｙｒ５３６）、Ｈｉｓ２４９（配列番号２では、Ｈｉｓ２６８）、およびＨｉｓ５８５（配列番号２では、Ｈｉｓ６０４）を含む。ヒンジ領域は、配列番号３の少なくともＮドメインのアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７および／または３１６〜３１８、同様にＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２および／または６５２〜６５８を含む。カーボネート結合部位は、配列番号３の、少なくともアミノ酸Ｔｈｒ１２０（配列番号２では、Ｔｈｒ１３９）、Ｔｈｒ４５２（配列番号２では、Ｔｈｒ４７１）、Ａｒｇ１２４（配列番号２では、Ａｒｇ１４３）、Ａｒｇ４５６（配列番号２では、Ａｒｇ４７５）、Ａｌａ１２６（配列番号２では、Ａｌａ１４５）、Ａｌａ４５８（配列番号２では、Ａｌａ４７７）、Ｇｌｙ１２７（配列番号２では、Ｇｌｙ１４６）、およびＧｌｙ４５９（配列番号２では、Ｇｌｙ４７８）を含む。
【００７１】
本発明の一実施態様において、本融合タンパク質は、改変されたヒトトランスフェリンを含むが、本発明の融合タンパク質を生産するのにあらゆる動物のＴｆ分子が使用可能であり、例えば、ヒトＴｆ変異体、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ハリモグラ（ｅｃｈｎｉｄａ）、カモノハシ、ニワトリ、カエル、イモムシ、サル、類人猿が挙げられ、加えてその他のウシ属、イヌ科および鳥類の種も挙げられる。これらのＴｆ配列はいずれも、ＧｅｎＢａｎｋやその他の公開データベースで容易に入手することができる。ヒトＴｆのヌクレオチド配列が利用可能であり（配列番号１、２および３、ならびに上述の登録番号を参照、さらにwww.ncbi.nlm.nih.govで入手可能である）、これらは、ＴｆまたはＴｆのドメインと、選択された治療的分子との遺伝学的な融合体を作製するのに用いることができる。また、融合は、ラクトトランスフェリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２３４３のラクトフェリン）、またはメラノトランスフェリンのような関連の分子から作製してもよい。
【００７２】
ラクトフェリン（Ｌｆ）は、防御作用のある天然の鉄結合性タンパク質であり、これは抗菌性、抗真菌性、抗ウイルス性、抗腫瘍性および抗炎症性の活性を有することが見出されている。このようなタンパク質は、通常は正常フローラに晒される外分泌物に存在しており、このような外分泌物としては、乳、涙、鼻の滲出物、唾液、気管支粘液、胃腸液、頚膣部粘液、および精液が挙げられる。加えて、Ｌｆは、循環する多形核好中球（ＰＭＮ）の二次的な特殊顆粒の主成分である。アポタンパク質は、化膿した領域においてＰＭＮが脱顆粒する際に放出される。Ｌｆの主要な機能は、体液中や炎症を起こしている領域中の遊離の鉄を捕捉することであり、このようにして、フリーラジカルが介在するダメージを抑制し、微生物細胞や新生細胞の侵入における金属の利用可能性を減少させることができる。成人の125ＩＬｆの代謝回転速度を試験した研究では、Ｌｆは迅速に肝臓および脾臓に取り込まれ、放射活性は、肝臓および脾臓中で数週間持続することが示された（Ｂｅｎｎｅｔｔ等（１９７９），Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ．）５７：４５３〜４６０）。
【００７３】
一実施態様において、本発明の融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンのスプライス変異体を含む。一例において、トランスフェリンのスプライス変異体は、ヒトトランスフェリンのスプライス変異体であり得る。特定の一実施態様において、ヒトトランスフェリンのスプライス変異体は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ６１１４０のスプライス変異体であり得る。
【００７４】
その他の実施態様において、本発明の融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ラクトフェリンのスプライス変異体を含む。一例において、ヒト血清のラクトフェリンのスプライス変異体は、好中球のラクトフェリンの新規なスプライス変異体であり得る。特定の一実施態様において、好中球のラクトフェリンのスプライス変異体は、ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＡＡ５９４７９のスプライス変異体であり得る。その他の特定の実施態様において、好中球のラクトフェリンのスプライス変異体は、以下のアミノ酸配列ＥＤＣＩＡＬＫＧＥＡＤＡ（配列番号４）を含んでいてもよく、この配列は、新規なスプライス変異の領域を含む。
【００７５】
また、メラノトランスフェリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１３９００、マウスのメラノトランスフェリン）との融合を行ってもよい。メラノトランスフェリンは、悪性黒色腫細胞において高レベルで見出されるグリコシル化タンパク質であり、元々はヒト黒色腫抗原ｐ９７と命名されていた（Ｂｒｏｗｎ等，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ，２９６：１７１〜１７３）。これは、ヒト血清トランスフェリン、ヒトラクトフェリン、およびニワトリトランスフェリンと高い配列相同性を有する（Ｂｒｏｗｎ等，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ，２９６：１７１〜１７３；Ｒｏｓｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８６，８３：１２６１〜１２６５）。しかしながら、これらのタンパク質とは異なり、メラノトランスフェリンに関する細胞受容体は同定されていない。メラノトランスフェリンは、鉄と可逆的に結合し、２つの形態で存在し、そのうちの一方の形態は、グリコシルホスファチジルイノシトールのアンカーによって細胞膜に結合し、他方の形態は、可溶性であり、かつ活発に分泌される（Ｂａｋｅｒ等，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，２９８：２１５〜２１８；Ａｌｅｍａｎｙ等，１９９３，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１０４：１１５５〜１１６２；Ｆｏｏｄ等，１９９４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７０１１〜７０１７）。
【００７６】
改変されたＴｆ融合体は、あらゆるＴｆタンパク質、フラグメント、ドメインまたは加工されたドメインで作製することができる。例えば、融合タンパク質は、全長Ｔｆ配列を用いて作製することができ、天然型のＴｆシグナル配列を含んでいてもよいし、またはそれらを含まなくてもよい。また、細胞透過性の抗体（Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ）は、単一のＴｆドメイン（例えばＮまたはＣドメインそれぞれ）を用いて作製することもできる。また、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｙ（細胞透過性）の抗体も、二つのＴｆドメイン（例えば二つのＮドメイン、または二つのＣドメイン）を用いて作製してもよい。ある実施態様では、単一のＣドメインへ治療用タンパク質を融合させることができ、ここにおいてＣドメインは、グリコシル化、鉄結合および／またはＴｆ受容体結合を、減少させる、阻害する、または防ぐように変更される。その他の実施態様において、Ｔｆグリコシル化部位はＣドメインに存在しており、Ｎドメインは、そのままでは鉄またはＴｆ受容体と結合しないため、単一のＮドメインの使用が有利である。一実施態様において、Ｔｆ融合タンパク質は、高レベルで発現される単一のＮドメインを有する。
【００７７】
本明細書で用いられるように、Ｎ様ドメインとして機能するように改変されたＣ末端ドメインまたはローブは、天然型または野生型のＮドメインまたはローブと実質的に類似したグリコシル化パターンまたは鉄結合特性を示すように改変される。一実施態様において、Ｃドメインまたはローブは、グリコシル化されず、かつ鉄と結合しないように改変され、改変は、それに関連するＣドメイン領域またはアミノ酸を、それに対応する天然型または野生型のＮドメインの領域または部位に存在するドメイン領域またはアミノ酸で置換することによってなされる。
【００７８】
本明細書で用いられる「２つのＮドメインまたはローブ」を含むＴｆ成分は、天然型のＣドメインまたはローブを、第二の天然型または野生型のＮドメインもしくはローブ、または改変されたＮドメインもしくはローブで置き換えて改変されたＴｆ分子を含むか、または実質的に野生型または改変されたＮドメインのように機能するように改変されているＣドメインを含む。米国仮出願第６０／４０６，９７７号を参照（これは参照によりその全体として本発明に組み込まれる）。
【００７９】
２つのドメインの三次元構造を重ね合わせること（スイスＰＤＢビューワー３．７ｂ２（Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ  ３．７ｂ２）、イタラティブ・マジック・フィット（Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｆｉｔ））、および直接のアミノ酸アライメント（クラスタルＷ（ＣｌｕｓｔａｌＷ）マルチプルアライメント）による２つのドメインの解析によって、２つのドメインは時間とともに分岐しているが明らかである。アミノ酸アライメントによれば、２つのドメイン間で４２％同一性、および５９％の類似性が示される。しかしながら、構造的な等価性に関して、Ｎドメインの約８０％がＣドメインと適合している。またＣドメインは、Ｎドメインと比較して数個の余分なジスルフィド結合も有する。
【００８０】
ＮおよびＣドメインに関する分子モデルのアライメントから、以下の構造的な等価体が明らかになる：
【表１】
2008546392.tif 000003
【００８１】
２つのドメインのジスルフィド結合は、以下のようにアラインされる：
【表２】
2008546392.tif 000004
【００８２】
一実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンのＮ末端ローブを少なくとも２つ有する。さらなる実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリンから誘導されたトランスフェリンのＮ末端ローブを少なくとも２つ含む。
【００８３】
その他の実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、およびＨｉｓ２４９からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンのＮ末端ローブを少なくとも２つ有する、それらを含む、またはそれらからなる。
【００８４】
その他の実施態様において、改変された融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７において突然変異を有する、組換えヒト血清トランスフェリンのＮ末端ローブの突然変異体を有する。
【００８５】
その他の実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンのＣ末端ローブを少なくとも２つ有する、それらを含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる。さらなる実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリンから誘導されたトランスフェリンのＣ末端ローブを少なくとも２つ有する。
【００８６】
さらなる実施態様において、Ｃ末端ローブの突然変異体はさらに、グリコシル化が不可能な配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１の少なくとも１つの突然変異を有する。
【００８７】
その他の実施態様において、トランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンのＣ末端ローブを少なくとも２つ有し、ここにおいて、該突然変異体は、金属イオンと結合する能力を保持する。代替の実施態様において、トランスフェリン部分は、配列番号３のＴｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンのＣ末端ローブを少なくとも２つ有し、ここにおいて、該突然変異体は、金属イオンと結合する能力が減少している。その他の実施態様において、トランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンのＣ末端ローブを少なくとも２つ有し、ここにおいて、該突然変異体は、金属イオンと結合する能力を保持せず、実質的にＮドメインのように機能する。
【００８８】
いくつかの実施態様において、本融合タンパク質のＴｆまたはＴｆ部分およびリガンドが融合タンパク質の残余から切断される場合、ＴｆまたはＴｆ部分は、非融合状態、すなわちＴｆに融合していない状態でのリガンドのインビボでの循環半減期、血清中安定性（半減期）、インビトロでの安定性または生物学的利用率と比較して、リガンド（すなわち治療剤）のインビボでの循環半減期、血清中安定性、インビトロでの溶液安定性または生物学的利用率を増加させるのに十分な長さを有する。このような安定性、インビボ循環半減期、または生物学的利用率の増加は、融合していないリガンド成分領域を超える約３０％、５０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の増加であり得る。場合によっては、改変されたトランスフェリンを含むリガンド成分は、非融合状態のリガンドと比較して、約１日またはそれ以上、１〜２日またはそれ以上、３〜５日またはそれ以上、５〜１０日またはそれ以上、１０〜１５日またはそれ以上、１０〜２０日またはそれ以上、約１２〜１８日間、または約１４〜１７日間の血清中半減期を示す。
【００８９】
ＴｆのＣドメインが本融合タンパク質の一部である場合、グリコシル化または過剰なマンノシル化を防ぎ、本融合タンパク質の血清中半減期を延長させるために（アシアロ−、または場合によってはモノシアロ−Ｔｆもしくはジシアロ−Ｔｆが生産されるように）、２つのＮ結合型のグリコシル化部位、配列番号３のＮ４１３およびＮ６１１に相当するアミノ酸残基は、酵母系での発現のために突然変異していてもよい。Ｎ４１３およびＮ６１１に相当するＴｆアミノ酸に加えて、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の、またはそれに隣接する残基への突然変異は、グリコシル化を防ぐか、または実質的に減少させる。Ｆｕｎｋ等の米国特許第５，９８６，０６７号を参照。また、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現されたＴｆのＮドメインは、Ｓ３２において単一のヘキソースでＯ結合型グリコシル化されることになることも報告されているが、これを、このようなグリコシル化を防ぐために突然変異または改変することができる。その上、１またはそれ以上のＰＭＴ遺伝子に突然変異を有する酵母宿主細胞では、Ｏ連結型糖付加は減少するか、または除去される可能性がある。
【００９０】
従って、本発明の一実施態様において、本融合タンパク質は、トランスフェリンが低いグリコシル化を示す改変されたトランスフェリン分子を有し、このようなトランスフェリン分子としては、これらに限定されないが、Ｔｆのアシアロ−、モノシアロ−およびジシアロ型が挙げられる。その他の実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防ぐために突然変異した組換えトランスフェリン突然変異体を有する。その他の実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン部分は、完全にグリコシル化された組換えトランスフェリン突然変異体を有する。さらなる実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防ぐために突然変異した組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１の少なくとも一方が、グリコシル化が不可能なアミノ酸に突然変異している。その他の実施態様において、本融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防ぐために、または実質的に減少させるために突然変異した組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の残基で突然変異していてもよい。さらに、セリンまたはスレオニン残基を突然変異させることによってグリコシル化を減少させるか、または防ぐことができる。さらに、グリコシル化を阻害するために、Ｘをプロリンに変化させることが既知である。
【００９１】
また、以下でより詳細に考察されるように、本発明の改変されたＴｆを含む改変されたＴｆ融合タンパク質は、鉄と結合しないように、および／またはＴｆ受容体と結合しないように遺伝子操作してもよい。本発明のその他の実施態様において、鉄結合を保持させ、Ｔｆの鉄結合能を、治療用タンパク質またはペプチドを、細胞の内部に送達、および／または血液脳関門（ＢＢＢ）を通過させるために使用可能である。Ｎドメインは鉄をローディングすると、単独ではＴｆＲに結合せず、鉄と結合したＣドメインは、ＴｆＲと結合することになるが、分子全体と同じ親和性は示さない。
【００９２】
その他の実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、該突然変異体は、金属イオンと結合する能力を保持しない。代替の実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、該突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりも金属イオンに対する結合親和性が弱い。代替の実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、該突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりも金属イオンに対する結合親和性が強い。
【００９３】
その他の実施態様において、トランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、該突然変異体は、トランスフェリン受容体に結合する能力を保持しない。代替の実施態様において、トランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、該突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりもトランスフェリン受容体に対する結合親和性が弱い。代替の実施態様において、トランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、該突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりもトランスフェリン受容体に対する結合親和性が強い。
【００９４】
その他の実施態様において、トランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、該突然変異体は、炭酸イオンに結合する能力を保持しない。代替の実施態様において、トランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、該突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりも炭酸イオンに対する結合親和性が弱い。代替の実施態様において、トランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、該突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりも炭酸イオンに対する結合親和性が強い。
【００９５】
その他の実施態様において、トランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を有し、ここにおいて、該突然変異体は、金属イオンと結合する能力を保持する。代替の実施態様において、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が挙げられ、ここにおいて、該突然変異体は、金属イオンと結合する能力が減少している。その他の実施態様において、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７、およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体が挙げられ、ここにおいて、該突然変異体は、金属イオンと結合する能力を保持しない。
【００９６】
その他の実施態様において、トランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７において突然変異を有する、組換えヒト血清トランスフェリンの突然変異体を有し、ここにおいて、突然変異体は、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも強い金属イオンへの結合活性を有する（米国特許第５，９８６，０６７号を参照。これは参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）。代替の実施態様において、トランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７において突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、該突然変異体は、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも金属イオンへの結合活性が弱い。さらなる実施態様において、トランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７において突然変異を有する、組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、該突然変異体は、金属イオンと結合しない。
【００９７】
あらゆる利用可能な技術が本発明の融合タンパク質を製造するために使用可能であり、このような技術としては、これらに限定されないが、一般的に利用できる分子技術が挙げられ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等のＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），１９８９に記載された技術である。当技術分野でよく知られた部位特異的突然変異誘発を達成する技術を用いてヌクレオチド置換を行う場合、コードされたアミノ酸の変化は、好ましくは軽度のもの、すなわち保存的アミノ酸置換であるが、その他の非保存的な置換も同様に可能なものとして取扱われ、改変されたトランスフェリン部分、例えば、改変された融合タンパク質が、低いグリコシル化、低い鉄結合などを示すものを製造する場合に特にそうである。特に可能なものとして取扱われるのは、アミノ酸の置換、わずかな欠失または挿入したもの（典型的には約３０個のアミノ酸に対して１個の割合で）；トランスフェリンドメイン間への挿入したもの；小規模のアミノまたはカルボキシル末端の伸長したもの、例えばアミノ末端のメチオニン残基、またはトランスフェリンドメイン間、もしくは、トランスフェリンタンパク質と治療用タンパク質もしくはペプチド、リガンド、もしくは抗体の可変領域もしくは軸領域との連結の５０、４０、３０、２０または１０残基未満の小さいリンカーペプチド；または、精製を容易にする小規模の伸長したもの、例えばポリヒスチジントラクト（ｐｏｌｙ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）、抗原エピトープ、もしくは結合ドメインである。
【００９８】
保存的アミノ酸置換の例としては、同じグループ内でなされる置換が挙げられ、例えば、塩基性アミノ酸のグループ（例えば、アルギニン、リシン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸のグループ（例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸のグループ（例えば、グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸のグループ（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸のグループ（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、および低分子量のアミノ酸のグループ（例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）の中でなされる置換である。
【００９９】
非保存的置換は、あるグループのアミノ酸を、その他のグループのアミノ酸で置換することを包含する。例えば、非保存的置換は、極性アミノ酸を疎水性アミノ酸で置換することを含む。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、例えば、Ｆｏｒｄ等（１９９１），Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．２：９５〜１０７を参照。鉄への結合を示さない、もしくはそれらが減少した、および／または、本融合タンパク質のＴｆ受容体への結合を示さない、もしくはそれらが減少した本発明のＴｆ融合タンパク質、好ましくは細胞透過性の抗体ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓを製造するために、非保存的置換、欠失および挿入が特に有用である。
【０１００】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質において、アミノ酸の命名は、以下の規則にのっとった一覧に記載のシステムに従ってなされる：
【表３】
2008546392.tif 000005
【０１０１】
鉄結合および／または受容体結合は、配列番号３のＴｆＮドメイン残基Ａｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、および／またはＣドメイン残基Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、および／またはＨｉｓ５８５の１つまたはそれ以上に相当するアミノ酸残基への欠失、置換または挿入などの突然変異によって、減少する場合もあるし、または破壊される場合もある。また、鉄結合も、配列番号３のアミノ酸Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７、またはＡｒｇ６３２の突然変異によって影響を受ける可能性がある。炭酸結合は、配列番号３のＴｆＮドメイン残基Ｔｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７、および／またはＣドメイン残基Ｔｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８、および／またはＧｌｙ４５９の１つまたはそれ以上に相当するアミノ酸残基の欠失、置換またはそれへの挿入などの突然変異によって減少するか、または破壊される可能性がある。炭酸結合の減少または破壊は、鉄および／または受容体結合に逆の影響を与える可能性がある。
【０１０２】
Ｔｆ受容体への結合は、鉄結合について上述したＴｆＮドメイン残基の１つまたはそれ以上に相当するアミノ酸残基の欠失、置換またはそれへの挿入などの突然変異によって減少するか、または破壊される可能性がある。
【０１０３】
上記で考察したように、グリコシル化は、Ｃドメイン残基Ｎ４１３および／またはＮ６１１に相当するＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ部位内のＴｆのＣドメイン残基の１つまたはそれ以上に相当するアミノ酸残基の欠失、置換またはそれへの挿入などの突然変異によって減少するか、または防止される可能性がある。米国特許第５，９８６，０６７号を参照。例えば、Ｎ４１３および／またはＮ６１１は、隣接するアミノ酸の可能性があるＧｌｕ残基に突然変異していてもよい。
【０１０４】
本発明のＴｆ融合タンパク質が、グリコシル化、鉄結合、カーボネート結合および／または受容体結合を防ぐように改変されていないような場合には、グリコシル化、鉄および／またはカーボネートイオンを、本融合タンパク質から取り除くか、または切断することができる。例えば、利用可能なデグリコシラーゼ（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）を用いて、本融合タンパク質からグリコシル化残基を切断してもよく（特に、Ｔｆ部分に結合した糖残基）、グリコシル化酵素欠損酵母を用いて、グリコシル化を防いでもよいし、および／またはグリコシル化を防ぐ物質（例えばツニカマイシン）の存在下で組換え細胞を増殖させてもよい。
【０１０５】
また、本融合タンパク質上の糖質も、本融合タンパク質をデグリコシラーゼで処理することによって、酵素的に減少させてもよいし、または完全に除去してもよい。デグリコシラーゼは当技術分野でよく知られている。デグリコシラーゼの例としては、これらに限定されないが、ガラクトシダーゼ、ＰＮＧアーゼＡ、ＰＮＧアーゼＦ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ、およびＥｎｄｏＨデグリコシラーゼが挙げられる。
【０１０６】
Ｔｆの三次元構造を変更するために、Ｔｆに、追加の突然変異を作製してもよく、このような突然変異としては、例えばヒンジ領域への改変が挙げられ、それにより、鉄結合およびＴｆ受容体の認識に必要なコンホメーション変化を防ぐことができる。例えば、突然変異は、Ｎドメインアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７、および／または３１６〜３１８、ならびにＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２、および／または６５２〜６５８に、またはその周辺に作製してもよい。加えて、Ｔｆの構造および機能を変更するために、これらの部位のフランキング領域に、またはその周辺に突然変異を作製してもよい。
【０１０７】
本発明の一側面において、本融合タンパク質をキャリアータンパク質として機能させて、リガンドの半減期または生物学的利用率を伸ばすことができ、加えて、場合によってはリガンドを細胞の内部に運搬したり、血液脳関門を通過する能力を保持させたりすることができる。代替の実施態様において、本融合タンパク質は、改変されたトランスフェリン分子を有し、ここにおいて、トランスフェリンは、血液脳関門を通過する能力を保持しない。
【０１０８】
その他の実施態様において、本融合タンパク質は、改変されたトランスフェリン分子を有し、ここにおいて、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合し、抗体の可変領域を細胞の内部に輸送する能力を保持する。代替の実施態様において、本融合タンパク質は、改変されたトランスフェリン分子を有し、ここにおいて、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合し、抗体の可変領域を細胞の内部に輸送する能力を保持しない。
【０１０９】
さらなる実施態様において、本融合タンパク質は、改変されたトランスフェリン分子を有し、ここにおいて、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合し、抗体の可変領域を細胞の内部に輸送する能力を保持するが、血液脳関門を通過する能力を保持しない。代替の実施態様において、本融合タンパク質は、改変されたトランスフェリン分子を有し、ここにおいて、トランスフェリン分子は、血液脳関門を通過する能力を保持するが、トランスフェリン受容体に結合し、抗体の可変領域を細胞の内部に輸送する能力を保持しない。
【０１１０】
トランスフェリン融合タンパク質
本発明の融合タンパク質は、Ｔｆタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に付着したリガンド、抗体の可変領域、またはランダムペプチドの１個またはそれ以上のコピーを含んでいてもよい。一実施態様において、リガンド成分は、Ｔｆタンパク質のＮ末端に結合している。いくつかの実施態様において、これらリガンド、可変領域またはペプチドは、Ｔｆタンパク質のＮおよびＣ末端の両方に付着しており、本融合タンパク質は、Ｔｆ末端のいずれか、またはその両方に、これらの領域の１またはそれ以上の等価体を含んでいてもよい。
【０１１１】
その他の実施態様において、１またはそれ以上のリガンドは、トランスフェリンペプチド、例えば１またはそれ以上のＴｆのループなどのＴｆタンパク質の既知のドメインの場所に挿入される。Ａｌｉ等（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３を参照。
【０１１２】
本発明の一実施態様において、リガンドは、トランスフェリンのＮローブに挿入される。例えば、本発明はまた、１またはそれ以上の挿入も含み、このような挿入は、以下の表で示されるように、Ｎ−ローブのＮ1およびＮ2ドメインに、またはＮ−ローブのＮ1およびＮ2ドメイン周辺の他の位置に行うことができる。
【表４】
2008546392.tif 000006
【０１１３】
一般的に、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、一つの改変されたトランスフェリンから誘導された領域、および一つの抗体の可変領域を有していてもよい。しかしながら、それぞれのタンパク質の複数の領域を用いて、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を作製してもよい。同様に、１種より多くの抗体の可変領域を用いて、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を作製してもよく、それによって、多機能の改変されたＴｆ融合タンパク質を生産することができる。
【０１１４】
一実施態様において、本発明の融合タンパク質は、トランスフェリン分子またはその部分に融合した、抗体の可変領域またはその部分を含む。その他の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、トランスフェリン分子のＮ末端に融合した抗体の可変領域を含む。代替の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、トランスフェリン分子のＣ末端に融合した抗体の可変領域を含む。さらなる実施態様において、本発明の融合タンパク質は、抗体の可変領域のＮ末端に融合したトランスフェリン分子を含む。代替の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、抗体の可変領域のＣ末端に融合したトランスフェリン分子を含む。
【０１１５】
本発明はまた、改変されたトランスフェリン分子またはその部分に融合した抗体の可変領域またはその部分を含む融合タンパク質を提供する。
【０１１６】
その他の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、改変されたトランスフェリンのＮ末端およびＣ末端の両方に融合した抗体の可変領域を含む。その他の実施態様において、ＮおよびＣ末端で融合した抗体の可変領域は、同じ抗原に結合する。また、同じ抗原に結合する抗体の可変領域は、異なる抗体から誘導されてもよく、従って、同じ標的上の異なるエピトープに結合する。代替の実施態様において、ＮおよびＣ末端で融合した抗体の可変領域は、異なる抗原と結合する。その他の代替の実施態様において、ＮおよびＣ末端に融合した抗体の可変領域は、異なる抗原と結合し、これは病気、障害または状態を治療または予防するための２種の異なる細胞を活性化するのに有用である可能性がある。その他の実施態様において、ＮおよびＣ末端で融合した抗体の可変領域は、異なる抗原と結合し、これは一般的に患者に同時に起こることが当技術分野で既知である病気または障害を治療または予防するための２種の異なる抗原との架橋形成に有用である可能性がある。
【０１１７】
加えて、本発明のトランスフェリン融合タンパク質はまた、対象の抗体の可変領域（例えば、治療用タンパク質またはそのフラグメントまたは変異体と結合する単鎖抗体）を、改変されたトランスフェリンの内部領域に挿入することによって生産してもよい。改変されたトランスフェリンの内部領域としては、これらに限定されないが、ループ領域、鉄結合部位、ヒンジ領域、ビカーボネート結合部位、または、受容体結合ドメインが挙げられる。
【０１１８】
改変されたトランスフェリン分子のタンパク質配列内に、多数のループまたはターンが存在しており、これらはジスルフィド結合によって安定化されている。これらのループは、治療活性を有するペプチド、好ましくは抗体の可変領域の挿入または内部融合、特に、機能的なタンパク質または治療用タンパク質、好ましくは抗体の可変領域となるのに二次構造を必要とするものに有用であり、特異的な生物活性を有する改変されたトランスフェリン分子を生成させることができる。
【０１１９】
リガンド、例えば抗体の可変領域、好ましくはＣＤＲが、Ｔｆ分子の少なくとも１つのループに挿入されるか、またはそれと置き換えられる場合、挿入は、Ｔｆの他の領域に加えて、いずれかの表面に露出したループ領域内に作製してもよい。例えば、挿入は、Ｔｆアミノ酸３２〜３３、７４〜７５、２５６〜２５７、２７９〜２８０および２８８〜２８９を含むループ内に作製してもよい。上記のＡｌｉ等を参照。これまでに説明したように、挿入は、Ｔｆの他の領域、例えば以下でより詳細に説明されるような鉄およびビカーボネート結合のための部位、ヒンジ領域、および受容体結合ドメイン内に作製してもよい。また、タンパク質またはペプチドを挿入するための改変／置き換えを受けやすいＴｆタンパク質配列中のループを、ランダムペプチドインサートのスクリーニング可能なライブラリーを開発するために用いてもよい。ペプチドライブラリーを生成させるための核酸インサートを生産するために、Ｔｆドメインにクローニングしたり、および／またはＴｆの末端に融合したりする前に利用可能なファージおよび細菌の提示系などのあらゆる手法が使用可能である。
【０１２０】
ＴｆのＮ末端は遊離であり、本融合タンパク質の本体から外を向いている。トランスフェリンのＮ末端における一つまたは複数のリガンドの融合体は、本発明の一実施態様である。このような融合体は、リンカー領域、例えば、ただしこれらに限定されないが、リガンドをＴｆから離すための、ポリグリシンストレッチ、またはＰＥＡＰＴＤリンカー（配列番号１８）を含んでいてもよい。
【０１２１】
ＴｆのＣ末端の外観は、埋め込まれているか、または部分的に埋め込まれており、Ｃ末端からの６個のアミノ酸のジスルフィド結合で固定されているように見える。ヒトＴｆにおいて、Ｃ末端のアミノ酸はプロリンであり、このプロリンは、配向している方法に応じて、融合タンパク質から外に向いているか、または分子の本体の内部に向いているかのいずれかと予想される。本発明のいくつかの実施態様において、Ｃ末端にリンカーまたはスペーサー成分を用いてもよい。またＮ末端の付近にプロリンが存在していてもよい。本発明の一側面において、Ｎおよび／またはＣ末端のプロリンは、改変されていてもよいし、またはその他のアミノ酸で置換されていてもよい。本発明のその他の側面において、Ｃ末端のジスルフィド結合を除去して、Ｃ末端を開放してもよい。
【０１２２】
軸成分
本発明の軸成分は、そのＮ末端で、トランスフェリン成分またはリガンドに融合され、そのＣ末端ではアンカー成分と場合により融合されていてもよい。酵母細胞で発現させる場合、軸成分のＣ末端は、細胞内、例えば細胞壁内に位置する。本発明の一実施態様において、軸成分は、細胞壁連結要素として作用し、本融合タンパク質を、共有結合または非共有結合によって酵母細胞の細胞壁に結合させる。
【０１２３】
本発明の軸成分は、ロッド様またはブラシ様のコンホメーションを有する。このタイプのコンホメーションは、中度〜高度にグリコシル化されたペプチドに典型的である。本発明の軸成分は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンを含む。米国特許第６，１１４，１４７号を参照（これは参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）。Ｎ−グリカンよりもＯ−グリカンの存在が好ましく、これはなぜなら、Ｏ−グリカンは、Ｎ−グリカンよりも多く、伸長したロッド様のコンホメーションを軸成分に取らせることが可能であるためである。また、軸成分は、中程度〜高度にグリコシル化されたセリンおよびスレオニングリコシル化部位を含んでいてもよい。
【０１２４】
本発明の融合タンパク質の軸成分は、中程度〜高度のパーセンテージのセリンまたはスレオニン残基を含む。例えば、本発明は、少なくとも約５％またはそれ以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約１０％もしくはそれ以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約２０％もしくはそれ以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約３０％もしくはそれ以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約４０％もしくはそれ以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約５０％もしくはそれ以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約６０％もしくはそれ以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約７０％もしくはそれ以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、少なくとも約８０％もしくはそれ以上のセリン、および／もしくは、スレオニン残基、または少なくとも約９０％もしくはそれ以上のセリンおよび／もしくはスレオニン残基を有する軸成分を含む。本発明の一実施態様において、軸成分は、約２０〜３０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、約２０〜４０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、約３０〜４０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、約２０〜５０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、約３０〜５０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基、約２０〜６０セリンおよび／もしくはスレオニン残基、または約３０〜６０％のセリンおよび／もしくはスレオニン残基を含む。
【０１２５】
軸成分は、少なくとも約５質量％もしくはそれ以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約１０質量％もしくはそれ以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約２０質量％もしくはそれ以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約３０質量％もしくはそれ以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約４０質量％もしくはそれ以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約５０質量％もしくはそれ以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約６０質量％もしくはそれ以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約７０質量％もしくはそれ以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、少なくとも約８０質量％もしくはそれ以上のＮ−もしくはＯ−グリカン、または少なくとも約９０質量％もしくはそれ以上のＮ−もしくはＯ−グリカンを含んでいてもよい。本発明の一実施態様において、軸成分は、約２０〜３０質量％のＯ−グリカン、約２０〜４０質量％のＯ−グリカン、約３０〜４０質量％のＯ−グリカン、約２０〜５０質量％のＯ−グリカン、約３０〜５０質量％のＯ−グリカン、約２０〜６０質量％のＯ−グリカン、または約３０〜６０％のＯ−グリカンを含む。その他の実施態様において、グリカン、特にＯ−グリカンの存在は、軸成分と、細胞壁のタンパク質に存在するβ−グルカンとの架橋を可能にする。そのようなものとして、本発明の軸成分は、細胞壁連結要素として機能することができる。
【０１２６】
軸成分は、ムチンタンパク質またはムチンタンパク質の部分、すなわちＭＵＣ型タンパク質のメンバーを含んでいてもよい。ＭＵＣ型のムチンとは、高度にグリコシル化された構造的に関連した分子のファミリーであり、気道、胃腸管および生殖管の上皮で発現し、例えばＭＵＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１２５５２５）、ＭＵＣ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２１９９８）、ＭＵＣ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１１３６１６）、ＭＵＣ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０００２８１）、ＭＵＣ５ＡＣ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ８３１３９）、ＭＵＣ５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ００１４０２）、ＭＵＣ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ９７６９８）、ＭＵＣ７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１３２８３）、ＭＵＣ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１４３８３）、ＭＵＣ９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＷ２７１４３０）が挙げられる。本発明の一実施態様において、軸成分は、ｈＭＵＣ１またはｈＭＵＣ１タンパク質の部分、例えば配列番号７０の核酸によってコードされた配列番号７１、さらに配列番号５の核酸によってコードされたポリペプチドを含む。本発明のその他の実施態様において、軸成分は、ｈＭＵＣ３またはｈＭＵＣ３タンパク質の部分を含む。例えば、本発明は、配列番号６８の核酸によってコードされる配列番号６９のｈＭＵＣ３の軸を含む。また本発明の融合タンパク質は、ムチンタンパク質およびそれらの部分の類似体および誘導体のような変異体を含む軸も包含する。
【０１２７】
また本発明の軸成分は、ムチン以外のグリコシル化タンパク質からも誘導することができ、このようなタンパク質としては、これらに限定されないが、ＡＧＡ１（例えば、配列番号７２の核酸配列によってコードされた配列番号７３）、ＭＡｄＣＡＭ−１、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＣＤ３４；Ｅ−セレクチン、Ｐ−セレクチンまたはＬ−セレクチンからのコンセンサス反復；またはウイルス糖タンパク質スパイク（例えば、インフルエンザ、単純ヘルペス、ヒト免疫不全またはタバコモザイクウイルス）、ならびにそれらの変異体およびフラグメントが挙げられる。ＷＯ０１／４６６９８、Ｇｉｒａｒｄ等（１９９５）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２：１１３〜１２３、およびＶａｎ  Ｋｉｎｋｅｎ等（１９９８）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６５：１０３〜１１６を参照（これらはいずれも、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）。本発明は、２種またはそれ以上のグリコシル化タンパク質またはそれらのフラグメントの反復、ならびに、２種またはそれ以上のタイプのグリコシル化タンパク質の組み合わせを含む。
【０１２８】
本発明のその他の実施態様において、軸は、１またはそれ以上の遊離のシステイン残基を含むように遺伝子操作される。１またはそれ以上の遊離のシステイン残基は、酵母細胞の細胞壁中のタンパク質の遊離のシステイン残基とジスルフィド結合を形成することができる。細胞壁中の１またはそれ以上のジスルフィド結合の形成は、細胞壁結合要素として機能することができる軸成分を遺伝子操作するのに使用可能なその他の方法の代表である。
【０１２９】
本発明の軸成分は、酵母細胞の全細胞壁を橋わたすのに十分な長さを有していなければならない。好ましくは、軸成分のＮ末端を、細胞壁の外側に位置させることであり、最も好ましくは、ロッド様の立体配置で、酵母細胞から外に向かって伸長させて、トランスフェリン成分およびリガンドと、宿主の酵母細胞との間の立体障害を低減させることである。軸成分は、長さが、少なくとも約２５個のアミノ酸、少なくとも約５０個のアミノ酸、少なくとも約７５個のアミノ酸、少なくとも約１００個のアミノ酸、少なくとも約１２５個のアミノ酸、少なくとも約１５０個のアミノ酸、少なくとも約１７５個のアミノ酸、少なくとも約２００個のアミノ酸、少なくとも約２２５個のアミノ酸、少なくとも約２５０個のアミノ酸、少なくとも約２７５個のアミノ酸、少なくとも約３００個のアミノ酸、少なくとも約３２５個のアミノ酸、少なくとも約３５０個のアミノ酸、少なくとも約３７５個のアミノ酸、少なくとも約４００個のアミノ酸、少なくとも約４２５個のアミノ酸、少なくとも約４５０個のアミノ酸、少なくとも約４７５個のアミノ酸長さが、少なくとも約５００個のアミノ酸長さが、少なくとも約５２５個のアミノ酸長さが、少なくとも約５５０個のアミノ酸長さが、少なくとも約５７５個のアミノ酸長さが、少なくとも約６００個のアミノ酸長さが、少なくとも約６２５個のアミノ酸、または長さが、少なくとも約６５０個のアミノ酸が必要である。一実施態様において、軸成分は、長さが約５００個のアミノ酸である。その他の実施態様において、軸成分は、長さが約３００〜６００個のアミノ酸である。
【０１３０】
アンカー成分
本発明の融合タンパク質の任意のアンカー成分は、本融合タンパク質を宿主細胞表層または基質表面に物理的に連結する本融合タンパク質の部分である。例えば、アンカー成分は、本融合タンパク質を酵母細胞膜または酵母細胞壁に連結または固定するすることができる。アンカーが本融合タンパク質を酵母細胞壁に連結する場合、アンカーは、細胞壁結合部材である。
【０１３１】
アンカー成分は、融合タンパク質を、一時的に酵母細胞壁または細胞膜に繋ぐすることができる。本発明の一実施態様において、アンカー成分は、融合タンパク質を、一時的に酵母細胞壁または細胞膜に繋いで、軸成分が細胞壁に共有結合または非共有結合で結合する機会を提供する。例えば、酵母細胞におけるアンカーの一時的な係留によって、軸成分からのＯ−グリカンと、細胞壁のβ−グルカンとを架橋させることが可能になる。
【０１３２】
本発明の一実施態様において、アンカー成分は、微生物、好ましくは下等真核生物、例えば酵母およびカビの細胞膜または細胞壁に固着する。この成分は、プロリンのようなアミノ酸で細胞膜または細胞壁にＣ末端を固定する長いＣ末端を有していてもよい（Ｋｏｋ（１９９０）ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ８７：１５〜４２）。
【０１３３】
アンカー成分は、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの使用によって細胞に固定することができる。Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ等，ＥＭＢＯ  ９：６５３〜６６１、ならびにＬｉｐｋｅおよびＯｖａｌｌｅ（１９９８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：３７３５〜３７４０を参照。ＧＰＩシグナル配列ペプチド、例えば本明細書で開示されたＧＰＩシグナルペプチドは、ＧＰＩを本融合タンパク質のＣ末端に付着させるためにシグナル伝達する。ＧＰＩシグナルそれ自体は、以下の３つのドメイン：ＧＰＩ付着部位（そのω部位）ω部位下流の第一および第二のアミノ酸を含む領域、５〜１０個のアミノ酸のスペーサー、ならびに１０〜１５個のアミノ酸の疎水性ストレッチを有する。ＧＰＩシグナルを含むタンパク質は、ω部位で切断され、生じたタンパク質のカルボキシ末端は、ＧＰＩ成分に共有結合する。この反応は、小胞体内で起こる。ＧＰＩ成分によって膜と結合する、ＧＰＩが付着したタンパク質は、続いて細胞表層に輸送され、タンパク質が短いω−マイナス領域に塩基性残基（Ｒおよび／またはＫ）を含む場合、ＧＰＩで固定されたタンパク質として原形質膜に留まる。ω−４／−５部位にＶ、ＩまたはＬ、およびω−２部位にＹまたはＮを有するＧＰＩと結合したタンパク質は、細胞膜中に組み込まれる。Ｈａｍａｄａ等（１９９９）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８１：３８８６〜３８８９；Ｎｕｏｆｆｅｒ等（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１０５５８〜１０５６３；Ｄｅ  Ｎｏｂｅｌ等（１９９４）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．４：４２〜４５；Ｈａｍａｄａ等（１９９８）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．２５８：５３〜５９；およびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｖａａｒｔ等（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ．１５：３８７〜４１１を参照。
【０１３４】
本発明の一実施態様において、酵母ＧＰＩ  ＹＩＲ０１９Ｃは、トランスフェリン融合タンパク質のアンカー成分を提供するのに用いられる。図２は、ＧＰＩ  ＹＩＲ０１９Ｃの図解を提供する。アミノ酸配列（配列番号１５）におけるω部位はグリシンであり、そのどちらかの側にスペースを有するものとして図示されている。スペースは、ω部位のいずれかの側にあるスペーサー領域の指標である。太字で示したＩおよびＹアミノ酸は、それぞれω−５／−４および−２部位である。
【０１３５】
数種のサッカロミセスのアンカー成分が当技術分野で既知であり、本発明の融合タンパク質を構築するのに用いることができる。酵母のＧＰＩシグナルタンパク質のその他の例としては、これらに限定されないが、ＹＤＲ５３４Ｃ、ＹＮＬ３２７Ｗ、ＹＯＲ２１４Ｃ、ＹＤＲ１３４Ｃ、ＹＰＬ１３０、ＹＯＲ００９Ｗ、ＹＥＲ１５０Ｗ、ＹＤＲ０７７Ｗ、ＹＯＲ３８３Ｃ、ＹＪＲ１５１Ｃ、ＹＪＲ００４、ＹＪＬ０７８Ｃ、ＹＬＲ１１０ＣおよびＹＮＬ３００Ｗが挙げられる。さらに、他の生物由来のＧＰＩシグナルタンパク質も用いることができ、例えばカンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｉｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）のＥＰＡ１のＧＰＩ、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）のＨｗｐｌｐ、またはトリパノソーマ−ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）のＶＳＧである。
【０１３６】
本発明の一実施態様において、アンカー成分は、哺乳動物の成分、またはそれらの誘導体もしくはフラグメントである。本発明のその他の実施態様において、ＧＰＩシグナルペプチドは、哺乳動物のＧＰＩシグナルタンパク質である。例えば、本発明は、ヒトＭＤＰＧＰＩシグナルタンパク質の誘導体を含み、例えば表１で開示されたものが挙げられる（実施例５を参照）。
【０１３７】
本発明はまた、１またはそれ以上の未結合のシステイン残基を含むアンカー成分を含む融合タンパク質も包含する。このようなシステイン残基は、細胞壁中のタンパク質のシステイン残基とジスルフィド結合を形成することによって、本融合タンパク質と細胞とを結びつけるように作用することができる。
【０１３８】
本発明は、アンカー成分として膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）を含む融合タンパク質を包含する。本発明の一実施態様において、ＴＭＤは、１回膜貫通Ｉ型またはＩＩ型膜タンパク質の領域である。例えば、本発明は、これらに限定されないが、ＦＵＳ１の残基７０〜９８を含む。
【０１３９】
本発明のその他の実施態様において、ＴＭＤは、マルチスパン膜タンパク質の数種の膜貫通領域のうち１つまたはそれ以上を含む。本発明の一実施態様において、ＴＭＤは、マルチスパン膜タンパク質の疎水性領域であり、約１０〜６０個のアミノ酸、約１５〜６０個のアミノ酸、約２０〜６０個のアミノ酸、約３０〜６０個のアミノ酸、または約２５〜５０個のアミノ酸を含む。例えば、本発明は、サッカロミセスのＳＴＥ６由来の１種またはそれ以上のＴＭＤを含み、このようなＴＭＤは、これらに限定されないが、残基２５〜３０、７３〜１００、１７１〜１９８、２４９〜２７７、７１４〜７４２、７６１〜７８９、８３８〜８５８、８６４〜８８４、９４０〜９６７および９７９〜１０００（サッカロミセスゲノムデータベースアノテーション（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ））からなる群より選択される。
【０１４０】
その他の実施態様において、アンカー成分は、トランスフェリン融合タンパク質を、マイクロアレイのような固体基板に固定するのに用いられる。アンカー成分は、好ましくは、短いエピトープタグであり（すなわち、抗体、典型的にはモノクローナル抗体によって認識される配列）、例えば、ポリヒスチジン、ＳＥＡＰまたはＭ１およびＭ２フラグである。Ｂｕｓｈ等（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１３８１１〜１３８１４，Ｂｅｒｇｅｒ等（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６６：１〜１０，米国特許第５，０１１，９１２号、米国特許第４，８５１，３４１号、米国特許第４，７０３，００４号、および米国特許第４，７８２，１３７号を参照、これらは全て、それら全体として参照により開示に組み込まれる。一実施態様において、軸ドメインは、抗ムチン抗体のような抗軸配列抗体によって基質に結びつけられる。
【０１４１】
アルブミン
本発明はまた、標的にリガンドを「提示する」ためにトランスフェリン以外のタンパク質またはタンパク質フラグメントを用いる融合タンパク質も含む。適切なタンパク質は、可溶性であり、長さが少なくとも約５０個のアミノ酸であるか、またはそれより長いタンパク質である。本発明の一実施態様において、このようなタンパク質またはタンパク質フラグメントは、トランスフェリンの二次構造に類似した二次構造を含む。
【０１４２】
上記タンパク質またはそれらのフラグメントが、本融合タンパク質の軸部分から切断されたときに、リガンドの半減期を増加させることができ、治療剤として用いることができることが好ましい。例えば、本発明は、アルブミン成分、軸成分、および細胞壁連結要素を含む融合タンパク質の使用を想定する。本融合タンパク質のアルブミンおよびリガンド部分が、融合タンパク質のそれ以外の部分から切断され、治療剤としてのリガンドが必要な患者に投与される場合、アルブミン成分はリガンド（すなわち治療剤）に増加した血清中半減期を付与することができる。
【０１４３】
アルブミン成分を含む融合タンパク質は、アルブミンタンパク質、アルブミン変異体またはそれらのフラグメントを含んでいてもよい。一実施態様において、アルブミンタンパク質は、配列番号６６の核酸配列によってコードされる配列番号６７のアミノ酸配列を含む。本発明は、当技術分野で既知のアルブミンの改変を含む。
【０１４４】
核酸
本発明は、核酸分子も提供する。これらは、リガンド成分に共有結合で連結または結合したトランスフェリンタンパク質、またはトランスフェリンタンパク質の部分を含む改変されたＴｆ融合タンパク質をコードする。本融合タンパク質は、リンカー領域、例えば、約５０、４０、３０、２０または１０個のアミノ酸残基未満のリンカーをさらに含んでいてもよい。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはそれらの部分と、リガンド部分に、またはそれらの間に共有結合で連結させることができる。本発明の核酸分子は、精製されてもよいし、または精製されていなくてもよい。
【０１４５】
また、核酸分子を複製するための、およびコードされた融合タンパク質を発現させるための宿主細胞およびベクターも提供される。あらゆるベクターまたは宿主細胞が使用可能であり、これらは原核性でもよいし、または真核性でもよいが、真核性の発現系、特に酵母発現系が好ましい場合がある。このような目的のための多くのベクターおよび宿主細胞が当技術分野で既知である。所望の適用に適したセットを選択することは十分に当分野の技術の範囲内である。
【０１４６】
トランスフェリン、トランスフェリンの部分、および、関心対象の治療用タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、当技術分野で既知の様々なゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることができる。プローブに基づく方法を用いてこのようなＤＮＡ配列を単離する技術は、従来技術であり、当業者によく知られている。このようなＤＮＡ配列を単離するためのプローブは、公開されたＤＮＡまたはタンパク質配列をベースにしたものが可能である（例えば、Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｇ．Ｓ．（１９９３）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６Ｂ／１：２０３〜２１８を参照、そこで引用された全ての文献は、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）。あるいは、Ｍｕｌｌｉｓ等（米国特許第４，６８３，１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４，６８３，２０２号）に記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法（参照により本明細書に組み込まれる）を用いてもよい。このようなＤＮＡ配列を単離するためのライブラリーの選択およびプローブの選択は、当技術分野における通常の技術レベルの範囲内である。
【０１４７】
当技術分野で既知のように、２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の「類似性」は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列、および一種のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの、第二のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列に対する、保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸置換を比較することによって決定される。「同一性」も当技術分野で既知であり、これは、このような配列の２つの鎖間におけるマッチングの同一性によって決定されるような、２種のポリペプチドまたは２種のポリヌクレオチド配列間の配列の関連の程度を意味する。同一性および類似性はいずれも容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ編，オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，アカデミックプレス，ニューヨーク，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ），ニュージャージー州，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，アカデミックプレス、１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編集，Ｍストックトンプレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，１９９１）。
【０１４８】
２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性および類似性を測定する多数の方法があるが、用語「同一性」および「類似性」は当技術分野ではよく知られている（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，アカデミックプレス，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍストックトンプレス，ニューヨーク，１９９１；およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）。２種の配列間の同一性または類似性を決定するのに一般的に用いられる方法としては、これらに限定されないが、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ編，アカデミックプレス，サンディエゴ，１９９４、およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）に記載されたものが挙げられる。
【０１４９】
同一性を決定する好ましい方法は、試験される２種の配列間の最も大きいマッチングが得られるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラムで体系化されている。２種の配列間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータープログラム法としては、これらに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））が挙げられる。上述した類似性または同一性の程度は、２種の配列間の同一性の程度として決定され、第二の配列からの第一の配列の起源を示すことが多い。２種の核酸配列間の同一性の程度は、当技術分野で既知のコンピュータープログラムによって決定してもよく、例えばＧＣＧプログラムパッケージに備えられているＧＡＰである（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０））。本発明に関する２種の核酸配列間の同一性の程度を決定する目的で、ギャップ（ＧＡＰ）は、以下の設定：５．０のギャップクリエーションペナルティー、０．３のギャップ伸長ペナルティーで用いられる。
【０１５０】
コドンの最適化
天然型のＤＮＡ配列によってコードされたポリペプチドと同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドが生成されるが、遺伝子コードの縮重によって、トランスフェリンタンパク質および／または関心対象の治療用タンパク質のヌクレオチドの配列の変異が可能になる。「コドン最適化」として知られる手順（米国特許第５，５４７，８７１号に記載されており、これはこの参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）では、このような変更されたＤＮＡ配列を設計する手段を用いてコドン最適化が提供される。コドン最適化遺伝子の設計は、生物におけるコドンの使用頻度、最隣接の頻度、ＲＮＡ安定性、二次構造形成の可能性、合成経路、およびその遺伝子の目的とするその後のＤＮＡ操作などの様々な因子を考慮すべきである。特に、利用可能な方法を用いて、酵母発現系が用いられる場合、酵母によって最も容易に認識されるコドンを用いて所定の融合タンパク質をコードするコドンを変更することができる。
【０１５１】
遺伝子コードの縮重によって、同じアミノ酸配列を多くの異なる方法でコードし、翻訳させることを可能にする。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギニンはそれぞれ６種の異なるコドンによってコードされるが、バリン、プロリン、スレオニン、アラニンおよびグリシンはそれぞれ４種の異なるコドンによってコードされる。しかしながら、このような同義的なコドンの使用頻度は、真核生物および原核生物の間でゲノム毎に異なる。例えば、哺乳動物間での同義的なコドンの選択パターンは、極めて類似しているが、進化的に遠い生物、例えば酵母（Ｓ．セレビジエ）、細菌（例えばＥ．コリ）、および昆虫（例えば、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）は、ゲノムコドンの使用頻度において明らかに異なるパターンを示す（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，８，４９〜６２（１９８０）；Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，９，４３〜７４（１９８１）；Ｍａｒｏｙａｍａ，Ｔ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１４，１５１〜１９７（１９８６）；Ａｏｔａ，Ｓ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ
Ｒｅｓ．，１６，３１５〜４０２（１９８８）；Ｗａｄａ，Ｋ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９  Ｓｕｐｐ．，１９８１〜１９８５（１９９１）；Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２８５，１６５〜１６９（１９９１））。このようなコドンの選択パターンの差は、ペプチドの伸長速度を調節することによる個々の遺伝子の総体的な発現レベルに寄与するようである。（Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２８５，１６５〜１６９（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，２８９５〜２８９８（１９８４）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０７，３６５〜３７７（１９８９）；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｌ．等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７，３７５〜３７９（１９８０）；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．Ｆ．、およびＹａｒｕｓ，Ｍ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０９，６５〜７７（１９８９）；Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０，５４９〜５７６（１９８４），Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．等，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．，１８０，５４９〜５７６（１９８４）；Ｇａｒｅｌ，Ｊ．−Ｐ．，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，４３，２１１〜２２５（１９７４）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４６，１〜２１（１９８１）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５１，３８９〜４０９（１９８１））。
【０１５２】
合成遺伝子のコドンの使用頻度は、組換えタンパク質発現に用いることを目的とする細胞／生物の（具体的には酵母種の）正確な（または可能な限り密接に関連した）ゲノムから誘導された核遺伝子のコドンの使用を反映することが必要である。上記で考察したように、一実施態様において、ヒトＴｆ配列は、治療用タンパク質のヌクレオチド配列になるように、酵母発現に関して本明細書で説明されているような改変の前に、または改変の後にコドンが最適化される。
【０１５３】
ベクター
本発明で使用するための発現単位は、一般的に、５’から３’方向に機能するように連結した以下の構成要素：転写プロモーター、分泌シグナル配列、治療用タンパク質または関心対象のペプチドをコードするＤＮＡ配列に結合したトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の部分を含む改変されたＴｆ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、および転写ターミネーターを含む。上記で考察したように、本発明のベクターでは、治療用タンパク質またはペプチドがＴｆ部分に融合した配置、またはＴｆ部分内の配置のいずれでも使用可能である。適切なプロモーター、シグナル配列、およびターミネーターの選択は、選択された宿主細胞に応じて決定され、当業者には明白であろうが、以下でより具体的に考察する。
【０１５４】
本発明で使用するのに適した酵母ベクターは、米国特許第６，２９１，２１２号に記載されており、例えば、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１０３５〜１０３９，１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ等，Ｇｅｎｅ  ８：１２１〜１３３，１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：１０４〜１０８，１９７８）、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｅＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、ｐＣ４、およびそれらの誘導体が挙げられる。また、有用な酵母のプラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３−４０６、ｐＲＳ４１３−４１６、およびストラタジーン・クローニング・システム（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ラホヤ，カリフォルニア州９２０３７，米国）より入手可能なピチア属のベクターも挙げられる。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５、およびｐＲＳ４０６は、酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐｓ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３が組み込まれている。プラスミドｐＲＳ４１３−４１．６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐｓ）である。
【０１５５】
このようなベクターは、一般的に、形質転換株の選択を可能にする表現型の分析が存在する優性表現型を示す多数の遺伝子のうちの１つとなり得る選択マーカーを含む。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補い、抗生物質耐性を提供するか、または、細胞の特異的な炭素源の利用を可能にするマーカーであり、例えばＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈ等，前記の箇所），ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等，Ｇｅｎｅ  ８：１７，１９７９）、ＨＩＳ３（Ｓｔｒｕｈｌ等，前記の箇所）、またはＰＯＴ１（ＫａｗａｓａｋｉおよびＢｅｌｌ，ＥＰ１７１，１４２）が挙げられる。その他の適切な選択マーカーとしては、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するＣＡＴ遺伝子が挙げられる。酵母に使用するのに好ましいプロモーターとしては、酵母の解糖系遺伝子由来のプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２５：１２０７３〜１２０８０，１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９〜４３４，１９８２；Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号）、またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子由来のプロモーター（Ｙｏｕｎｇ等のＧｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ等（編），ｐ．３５５，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２〜２０１，１９８３）が挙げられる。これに関連して、使用可能なプロモーターは、ＴＰＩ１プロモーター（Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４，５９９，３１１号）およびＡＤＨ２−４cである（米国特許第６，２９１，２１２号のプロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ等，Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：６５２〜６５４，１９８３）を参照。また、発現単位は、転写ターミネーターを含んでいてもよい。一つの転写ターミネーターは、ＴＰＩ１ターミネーター（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，前記の個所）である。
【０１５６】
酵母に加えて、本発明の改変された融合タンパク質は、糸状菌で、例えばアスペルギルス属の菌株で発現させることができる。有用なプロモーターの例としては、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）の解糖系遺伝子から誘導されたもの、例えばａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３〜２０９９，１９８５）、およびｔｐｉＡプロモーターが挙げられる。適切なターミネーターの例は、ａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ等，前記の個所）である。このような成分を利用する発現単位は、例えば、アスペルギルスの染色体ＤＮＡに挿入できるベクターにクローニングしてもよい。
【０１５７】
本発明の実施に使用するための哺乳動物の発現ベクターは、改変されたＴｆ融合タンパク質の転写を指示することができるプロモーターを含む。好ましいプロモーターとしては、ウイルスプロモーターおよび細胞性のプロモーターが挙げられる。好ましいウイルスプロモーターとしては、アデノウイルス２由来の主要後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４〜１３１９９，１９８２）、およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４〜８６４，１９８１）が挙げられる。好ましい細胞性のプロモーターとしては、マウスメタロチオネイン１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２：８０９〜８１４，１９８３）、およびマウスＶ６（米国特許第６，２９１，２１２号を参照）プロモーター（Ｇｒａｎｔ等，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５４９６，１９８７）が挙げられる。このようなプロモーターの一つは、マウスＶH（米国特許第６，２９１，２１２号を参照）プロモーター（Ｌｏｈ等，前記の個所）である。また、このような発現ベクターは、プロモーターの下流、且つトランスフェリン融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列の上流に位置する一連のＲＮＡスプライス部位を含んでいてもよい。好ましいＲＮＡスプライス部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得られたものでもよい。
【０１５８】
また発現ベクターには、関心対象のコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルも含まれる。ポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，前記の個所）、アデノウイルス５Ｅ１Ｂ領域由来のポリアデニル化シグナル、およびヒト成長ホルモン遺伝子ターミネーター（ＤｅＮｏｔｏ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．９：３７１９〜３７３０，１９８１）が挙げられる。このようなポリアデニル化シグナルの一つは、ＶH（米国特許第６，２９１，２１２号を参照）遺伝子ターミネーター（Ｌｏｈ等，本明細書前記）である。発現ベクターは、非コードウイルスリーダー配列、例えばプロモーターとＲＮＡスプライス部位との間に位置するアデノウイルス２のトリパータイトリーダーを含んでいてもよい。また、好ましいベクターは、エンハンサー配列、例えばＳＶ４０エンハンサー、およびマウス：（米国特許第６，２９１，２１２号を参照）エンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｃｅｌｌ  ３３：７１７〜７２８，１９８３）。また、発現ベクターは、アデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードする配列を含んでいてもよい。
【０１５９】
形質転換
菌類を形質転換する技術は、文献においてよく知られており、例えばＢｅｇｇｓ（前記の個所）、Ｈｉｎｎｅｎ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１９２９〜１９３３，１９７８），Ｙｅｌｔｏｎ等，（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：１７４０〜１７４７，１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ３０１：１６７〜１６９，１９８３）によって説明されている。宿主細胞の遺伝子型は、一般的に、発現ベクターに存在する選択マーカーによって補足される遺伝的欠陥を含む。特定の宿主および選択マーカーの選択は、十分に当分野における通常の技術のレベルの範囲内である。
【０１６０】
本発明の改変されたＴｆ融合タンパク質を含むクローニングしたＤＮＡ配列を培養した哺乳動物細胞に導入されてもよく、これは、例えば、リン酸カルシウム介在トランスフェクション（Ｗｉｇｌｅｒ等，Ｃｅｌｌ  １４：７２５，１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３，１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６，１９７３）によってなされる。また、クローニングしたＤＮＡ配列を哺乳動物細胞に導入するその他の技術、例えばエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１〜８４５，１９８２）、またはリポフェクションも使用可能である。クローニングしたＤＮＡを組み込んでいる細胞を同定するために、一般的に細胞に、関心対象の遺伝子またはｃＤＮＡと共に選択マーカーが導入される。培養した哺乳動物細胞に使用するのに好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。増幅可能な選択マーカーの一種は、ＤＨＦＲ遺伝子である。増幅可能なマーカーの一種は、ＤＨＦＲr（米国特許第６，２９１，２１２号を参照）ｃＤＮＡ（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２４９５〜２４９９，１９８３）である。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙによって総論されており（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ストーンハム，マサチューセッツ州）、選択マーカーの選択は、十分当業界における通常の技術レベルの範囲内である。
【０１６１】
宿主細胞
本発明はまた、本発明の改変されたトランスフェリン融合タンパク質が発現されるように形質転換した細胞、好ましくは酵母細胞も含む。形質転換宿主細胞それ自体に加えて、本発明はまた、これら細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均一な）培養物、または栄養培地中でモノクローナル培養物から誘導された培養物も含む。上記ポリペプチドが分泌されると、上記ポリペプチドは、細胞と共に培地に含まれるか、または細胞をろ過もしくは遠心分離で除去している場合細胞なしで含まれることになる。
【０１６２】
本発明を実施する際に使用される宿主細胞としては、外来性ＤＮＡで形質転換またはトランスフェクションさせて、培養した哺乳動物、昆虫、真菌性、植物および細菌細胞のような培養物中で増殖させることができる真核細胞、場合によっては原核細胞が挙げられる。
【０１６３】
真菌細胞、例えば酵母種（例えば、サッカロミセス属ｓｐｐ．、シゾサッカロミセス属ｓｐｐ．、ピチア属ｓｐｐ．）は、本発明の範囲内で宿主細胞としても使用可能である。本発明の実施の際に、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を発現するための宿主として有用であると考えられる典型的な酵母の属は、ピチア属（以前はハンセヌラ属として分類された種を含む）、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、アスペルギルス属、カンジダ属、トルロプシス属、トルラスポラ属、シゾサッカロミセス属、シテロミセス属、パチソレン属、チゴサッカロミセス属、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ属、セファロスポリウム属、フミコーラ属、ムコール属、アカパンカビ属、ヤロウイア属、メッシュニコヴィア属、ロドスポリディウム属、ロイコスポリジウム属、ボトリオアスカス属、スポリディオボラス属、エンドマイコプシス属などである。サッカロミセス属ｓｐｐ．の例は、Ｓ．セレビジエ、Ｓ．イタリカス（Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ）、およびＳ．ルキシー（Ｓ．ｒｏｕｘｉｉ）である。クルイベロミセス属ｓｐｐ．の例は、Ｋ．ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、およびＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）である。適切な種は、Ｔ．デルブルッキー（Ｔ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）である。ピチア属（ハンセヌラ属）ｓｐｐ．の例は、Ｐ．アングスタ（Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ）（以前はＨ．ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））Ｐ．アノマーラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）（以前はＨ．アノマーラ（Ｈ．ａｎｏｍａｌａ））、およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【０１６４】
本発明のＴｆ融合タンパク質を生産するのに特に有用な宿主細胞は、メタノール要求性のピチア・パストリス（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ等（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ，Ｐｕｒｉｆ．６：６１９〜６２４）である。ピチア・パストリスのアルコールオキシダーゼプロモーターが単離され、クローニングされてから、ピチア・パストリスは、外来タンパク質の生産において優れた宿主となるように開発されている；１９８５年に、その形質転換がまず報告された。Ｐ．パストリスは、グルコースの非存在下で、炭素源としてメタノールを利用することができる。Ｐ．パストリス発現系は、アルコールオキシダーゼの発現をコードする遺伝子を制御するメタノール誘導性のアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを使用でき、この酵素は、メタノール代謝における第一工程を触媒する。このプロモーターは特徴付けが行われており、一連のＰ．パストリス発現ベクターに組み込まれている。Ｐ．パストリスで生産されたタンパク質は、通常は正確に折り畳まれて培地に分泌されるため、遺伝子操作されたＰ．パストリスの発酵は、Ｅ．コリ発現系の優れた代替物を提供する。この系を用いて、破傷風毒素のフラグメント、百日咳菌（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のパータクチン、ヒト血清アルブミン、およびリゾチームなどの多数のタンパク質が生産されている。
【０１６５】
Ｆ．オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）の形質転換は、例えば、Ｍａｌａｒｄｉｅｒ等（１９８９）Ｇｅｎｅ  ７８：１４７〜１５６に記載されているように行うことができる。
【０１６６】
その他の好ましい宿主は、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株である。一実施態様において、糖タンパク質のアスパラギン連結型のグリコシル化に必要な遺伝子の遺伝子欠損を含む酵母細胞、またはより詳しくはサッカロミセス・セレビジエ宿主細胞が用いられる。このような欠損を有するＳ．セレビジエ宿主細胞は、標準的な突然変異および選択の技術を用いて生産することができるが、多くの利用可能な酵母株が、グリコシル化または過剰なマンノシル化を防ぐように、または減少するように改変されている。Ｂａｌｌｏｕ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：５９８６〜５９９１，１９８０）は、アスパラギン結合型糖付加に影響を与える遺伝子が欠損したマンノプロテインの生合成突然変異体の単離を記載している。ＧｅｎｔｚｓｃｈおよびＴａｎｎｅｒ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７：４８１〜４８６，１９９７）は、酵母におけるタンパク質のＯ−グリコシル化の第一工程に関与する酵素をコードする少なくとも６種の遺伝子（ＰＭＴ１−６）のファミリーを記載している。これらの遺伝子の１種またはそれ以上が欠損した突然変異体は、低いＯ結合型糖付加および／またはＯ−グリコシル化の変更された特異性を示す。
【０１６７】
異種タンパク質の生産を最適化するために、宿主株が、突然変異を有することが好ましい場合があり、このような突然変異としては、タンパク質分解活性の減少が起こるＳ．セレビジエｐｅｐ４突然変異（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：２３〜３３，１９７７）が挙げられる。多量の本発明のＴｆ融合タンパク質を生産するために、さらなるプロテアーゼコード領域に突然変異を含む宿主株が特に有用である。
【０１６８】
本発明のＤＮＡコンストラクトを含む宿主細胞は、適切な増殖培地で増殖させる。本明細書で用いられる用語「適切な増殖培地」は、細胞の増殖に必要な栄養素を含む培地を意味する。細胞増殖に必要な栄養素として、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、無機質、および増殖因子が含まれていてもよい。増殖培地は、一般的に、ＤＮＡコンストラクトを含む細胞に応じて、例えば、薬物選択、またはＤＮＡコンストラクトに存在する、もしくはＤＮＡコンストラクトでコトランスフェクションされた選択マーカーによって補足された必須栄養素の欠失により選択される。酵母細胞は、例えば、化学的に規定された培地で増殖させることが好ましく、このような培地は、炭素源、例えばスクロース、非アミノ酸窒素源、無機塩、ビタミン、および必須アミノ酸の追加物質を含む。培地のｐＨは、好ましくは、２より大きく８未満のｐＨに維持され、好ましくはｐＨ５．５〜６．５に維持される。安定なｐＨを維持する方法は、好ましくは水酸化ナトリウムの添加を介した緩衝化と一定したｐＨ制御を含む。好ましい緩衝剤としては、コハク酸、およびビストリス（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．），セントルイス，ミズーリ州）が挙げられる。アスパラギン結合型糖付加に必要な遺伝子の欠損を有する酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定剤を含む培地中で増殖させる。このような浸透圧安定剤の一つは、０．１Ｍ〜１．５Ｍの濃度、好ましくは０．５Ｍまたは１．０Ｍの濃度で培地に添加されたソルビトールである。
【０１６９】
培養した哺乳動物細胞は、一般的に、市販の血清含有または無血清培地で増殖させる。用いられる特定の細胞系に適した培地の選択は、当分野における通常の技術レベル内である。トランスフェクションされた哺乳動物細胞は、所定期間、典型的には１〜２日間成長させて、関心対象のＤＮＡ配列の発現を開始させることができる。続いて、薬物選択を適用して、選択マーカーを安定して発現する細胞増殖について選択する。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクションされている細胞に関して、薬物濃度を段階的に増加させて、クローニングした配列のコピー数の増加、従って発現レベルの増加について選択することができる。
【０１７０】
また、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系も、本発明の改変されたＴｆ融合タンパク質を生産するのに使用可能である。ＢａｃＰＡＫTMバキュロウイルス発現系（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）））は、昆虫宿主細胞中で組換えタンパク質を高レベルで発現する。標的遺伝子は、トランスファーベクターに挿入され、これが昆虫宿主細胞に直線状にしたＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡと共にコトランスフェクションされる。ＢａｃＰＡＫ６ＤＮＡは、バキュロウイルスゲノムの必須部分が欠失している。このＤＮＡをこのベクターで組換えると、必須の構成要素が回復し、標的遺伝子はバキュロウイルスゲノムに移される。組換え後、２〜３個のウイルスプラークを採取し、精製し、組換え表現型を検証する。続いて、新たに単離した組換えウイルスを増幅し、これを昆虫細胞培養を感染させるのに用いて、大量の所望のタンパク質を生産する。
【０１７１】
分泌シグナル配列
用語「分泌シグナル配列」または「シグナル配列」または「分泌リーダー配列」は、交換可能に用いられ、例えば米国特許第６，２９１，２１２号および米国特許第５，５４７，８７１号で説明されている（これらの両方は参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は、分泌ペプチドをコードする。分泌ペプチドは、細胞からの成熟ポリペプチドまたはタンパク質の分泌を指示させるように作用するアミノ酸配列である。分泌ペプチドは、一般的に、疎水性アミノ酸のコアを特徴とし、典型的には、これに限定されないが、新たに合成されたタンパク質のアミノ末端に見出される。分泌ペプチドは、分泌中に成熟タンパク質から切断されることがかなり多い。分泌ペプチドは、分泌経路を通過する際に成熟タンパク質からシグナルペプチドを切断させるプロセシング部位を含んでいてもよい。プロセシング部位は、シグナルペプチド内にコードされてもよく、または、例えばインビトロでの変異誘発でシグナルペプチドに付加されていてもよい。
【０１７２】
本発明の改変されたＴｆ融合タンパク質の分泌を指示させるために分泌ペプチドを用いてもよい。このような他の分泌ペプチドと併用が可能な分泌ペプチドの一つは、酵母のバリアタンパク質（Ｂａｒｒｉｅｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の第三のドメインである。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は、タンパク質の分泌が起こる複雑な一連の翻訳後プロセシング工程に必要である。インタクトシグナル配列が存在する場合、発現されるタンパク質は粗面小胞体の内腔に入り、続いてゴルジ体を介して分泌小胞に輸送され、最終的に細胞外に輸送される。一般的に、シグナル配列は開始コドンの直後にあり、分泌しようとするタンパク質のアミノ末端でシグナルペプチドをコードする。ほとんどの場合、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特異的なプロテアーゼで切断される。好ましいシグナル配列はプロセシングを改善し、ウイルス、哺乳動物または酵母発現ベクターを用いた組換えタンパク質発現の効率を伝える。場合によっては、天然型のＴｆシグナル配列を用いて、本発明の融合タンパク質を発現させ、分泌させてもよい。
【０１７３】
リンカー
本発明の改変されたトランスフェリン融合タンパク質のＴｆ成分およびリガンドは、直接融合させてもよいし、または様々な長さのリンカーペプチドを用いて融合させてもよく、このようにして、より大きい物理的な隔たりを提供し、さらに融合したタンパク質間のより大きい空間的な移動を可能にし、従って例えばその同源の受容体に結合するのに抗体の可変領域の接近しやすさを最大にすることができる。リンカーペプチドは、フレキシブルであるか、または比較的固定されたアミノ酸からなる可能性がある。一実施態様において、本発明は、実質的に非らせん状のリンカー、例えば（ＰＥＡＰＴＤ）n（配列番号１８）を含む。その他の実施態様において、本発明の融合タンパク質は、ポリグリシンストレッチを有するリンカーを含む。リンカーは、約５０、４０、３０、２０または１０個のアミノ酸残基より少ないものでもよい。リンカーは、トランスフェリンタンパク質またはそれらの部分と、抗体の可変領域との間を共有結合で結合させることができる。
【０１７４】
また、リンカーは、１つ又は複数のリガンドに抗体の可変領域を組み込むためにも使用できる。抗体の可変領域を組み込むのに適切なリンカーは、抗体の可変領域を、抗体全体の結合特異性を維持しながら三次元構造にフォールディングすることができるものである。
【０１７５】
スクリーニング方法
本発明の融合タンパク質ライブラリーをスクリーニングすることによってリガンドを同定することが可能な可能性のある標的分子の数は、実質的には限定がない。例えば、標的分子（すなわち受容体または物質）は、抗体（またはそれらの結合部分）または抗原であり得る。抗体が結合する抗原がわかっており、おそらく配列解析もされている場合があり、このようなケースにおいて、本発明は、抗原のエピトープをマッピングするのに用いることができる。例えば所定の自己免疫疾患に関する抗原が未知の場合、その病気に罹った患者からの例えば血清、体液、組織または細胞を、本発明のスクリーニング方法で用いて、ペプチドを同定することができ、その結果として自己免疫反応を惹起する抗原も同定することができる。ペプチドが同定されれば、そのペプチドは、ワクチン、治療剤、診断試薬などの開発のための基準として役立たせたり、または、それらを提供したりすることができる。リガンドをスクリーニング可能な標的分子の一覧に関しては、ＷＯ０１／４６６９８を参照（全ての目的についてこれは参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）。
【０１７６】
スクリーニングは、当分野における技術者によく知られた方法の１つ、例えばバイオパニング、ＦＡＣＳまたはＭＡＣＳを用いることによって行うことができる。本発明の一実施態様において、スクリーニングは、受容体を活性化するために行われる。標的は、精製して溶液中に存在させてもよいし、または、表面に結合させたり細胞に結合させたりしてもよい。標的は、例えばビオチンで標識してもよいし、または、当分野既知の他の方法で標識してもよい。
【０１７７】
所望の特性を有するポリペプチドおよびペプチドを単離して、それに対応する核酸配列の配列解析によって、または、アミノ酸の配列解析もしくはマススペクトロメトリーによって同定することができる。それに続いて、サブ配列を、異なる配列（好ましくはランダム配列）で繰り返し交換し、１回またはそれ以上スクリーニング工程を実施することよって最適化を行ってもよい。
【０１７８】
ペプチドライブラリーを構築したら、宿主細胞をライブラリーベクターで形質転換する。成功した形質転換株は、典型的には、用いられるベクターに応じて、選択培地中での増殖、または選択的な条件下での増殖、例えば適切な増殖培地中での増殖などによって選択される。この選択は、固体の増殖培地で行ってもよいし、または液体の増殖培地で行ってもよい。細菌細胞を固体培地で増殖させるために、例えば、選択的な抗生物質を含むＬ−寒天の広い表面上で、実質的にコンフルエントな芝状態が形成されるまで細胞を高密度で増殖させる（１ｍ2あたり約１０8〜１０9個の形質転換株）。液体培養での増殖のためには、細胞は、Ｌ−液体培地（抗生物質での選択を含む）で約１０回またはそれを超えて倍加するように増殖させてもよい。ライブラリーのサイズによって液体培養での増殖の方が比較的便利である場合もあるし、一方、固体培地での増殖の方が、増幅工程中に偏りを生じる可能性が少なくなる場合もある。
【０１７９】
トランスフェリン融合タンパク質ペプチドライブラリーを、酵母細胞表層提示によってスクリーニングしようとする場合、酵母細胞は、トランスフェリン融合タンパク質をコードする発現ベクターで形質転換される。あらゆる変異誘発方法が、酵母表面提示ライブラリーの構築、例えばエラープローンポリメラーゼ連鎖反応、およびＤＮＡシャフリングと両立する。Ｂｏｄｅｒ等（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：４３０〜４４４を参照。あるいは、発現された融合タンパク質のトランスフェリン成分は、ランダムペプチド配列またはＣＤＲのスカフォールドとして機能させることができる。
【０１８０】
酵母細胞のトランスフェリン融合タンパク質ペプチドライブラリーが作出されれば、所望のペプチドを同定するための数種のアプローチが当分野既知である。例えば、新規の結合特異性を単離するためにライブラリーをスクリーニングしようとする場合、ペプチドは、適度に低い親和性濃度（Ｋd＞ｎＭ、または親和性なし）のケースにおいて、低濃度の蛍光標識した標的（すなわち受容体または物質）で平衡化させた結合によって区別することができる。堅く結合するタンパク質が得られるように設計された適用に関して、過度に大量の希釈した標的溶液が、リガンドを過剰モルに維持するのに必要な場合があり、サンプルの取り扱いを複雑にする。このようなケースにおいて、結合親和性の改善は、解離速度論における変化によって近接させる場合がある。化学量論的に制限された標的の反応速度論の競合を用いて、集団内の改善されたクローンを同定することができる（Ｈａｗｋｉｎｓ等（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９）；しかしながら、このアプローチはスクリーニングアプローチの定量的な予測精度を欠いており、一般的に推奨されていない。Ｂｏｄｅｒ等（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：４３０〜４４４を参照。
【０１８１】
標的は、ビオチン化してもよいし、または蛍光標識してもよく、その代わりに、関心対象のリガンド、すなわちトランスフェリンに提示されたペプチドを標識してもよい。好ましくは、標的が標識される。標識された標的、例えばビオチン化した標的は、トランスフェリン融合タンパク質ペプチドライブラリーとインキュベートすることができる。このようなライブラリーは、少なくとも約１０4種の構成要素（すなわち提示されたペプチド）、少なくとも約１０5種の構成要素、少なくとも約１０6種の構成要素、少なくとも約１０7種の構成要素、少なくとも約１０8種の構成要素、少なくとも約１０9種の構成要素、少なくとも約１０10種の構成要素、少なくとも約１０11種の構成要素、少なくとも約１０12種の構成要素、少なくとも約１０13種の構成要素、少なくとも約１０14種の構成要素、少なくとも約１０15種の構成要素、または、少なくとも約１０16種の構成要素を有していてもよい。
【０１８２】
インキュベート後、細胞は、第二の標識で標識することができ、例えば、二次抗体、ストレプトアビジンで標識された分子または当分野既知のその他の方法で標識することができる。二次抗体は、抗ビオチン抗体であり得る。ストレプトアビジンで標識された分子としては、これらに限定されないが、ストレプトアビジン−フィコエリトリンまたはストレプトアビジンマイクロビーズが挙げられる。
【０１８３】
当分野既知のように細胞集団を分析するために、フローサイトメトリーを用いることができる。これがなされる場合、集団の提示する分画だけを分析する。Ｂｏｄｅｒ等（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：４３０〜４４４、および、Ｋｏｎｄｏ等（２００４）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４：２８〜４０を参照、これらの両方は参照によりその全体として本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
あるいは、標識されたビーズ、すなわち抗ビオチンまたはストレプトアビジンで標識されたビーズからなる第二の標識が用いられる場合、Ｙｅｕｎｇ等（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．１８：２１２〜２２０（これは参照によりその全体として本明細書に組み込まれる）に記載されているような磁気によるソーティングプロトコールを用いて、リガンドおよび標的分子の混合物をソートすることができる。このスクリーニングプロトコール（ミルテニー・バイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  ＧｍｂＨ））と共に、ＭＡＣＳ(R)マイクロビーズキットを用いることができる。磁気によるソーティングは、ＦＡＣＳと共に用いることができる。
【０１８５】
本発明の一実施態様において、酵母細胞で発現された対象の単一のリガンドを特徴付けることが望ましい。発現されたタンパク質は、様々な方法でスクリーニングすることが可能である。このようなタンパク質が機能を有する場合、直接的に分析することができる。例えば、酵母表面で発現された単鎖抗体は十分に機能的であり、抗原への結合に基づいてスクリーニングすることが可能である。このようなタンパク質が、容易に分析できる検出可能な機能を有さない場合、抗体を用いてリガンドの発現をモニターすることが可能である。酵母細胞はファージよりもかなり大きいため、フローサイトメトリーを使用して、単一の酵母細胞におけるタンパク質の表現型をモニターすることができる。
【０１８６】
本発明のその他の実施態様において、リガンド成分と受容体または物質との結合は、細胞表層提示以外の当分野既知の手段によって行われ、例えばＥＬＩＳＡ、競合結合分析（標的の天然型の結合パートナーが既知の場合）、サンドイッチ分析、ペプチドライブラリーなどで結合がブロックされる放射性のリガンドを用いた放射性受容体分析である。これらの方法において、Ｔｆ融合タンパク質ペプチドライブラリーで形質転換した宿主細胞を溶解させる。Ｔｆ融合タンパク質のペプチドを、これらに限定されないが抗ＭＵＣ１抗体のような適切なアンカー成分を介して分析基質に固定させる。スクリーニングプロセスは、Ｔｆペプチドライブラリーと関心対象の標的とを反応させて、基準の結合レベルを確立し、それと、それに続くペプチドライブラリーの結合活性とを比較することを含む。標的に結合する、または標的への結合に関して競合する少量のペプチドを検出するのに十分な感受性を有してさえいれば、分析の性質は重要ではない。分析条件は様々であってよく、関心対象の様々な結合物質またはその他の生物活性に最適な結合条件を考慮に入れることができる。従って、ｐＨ、温度、塩濃度、体積および結合の持続時間などは全て、関心対象の環境の条件と類似した条件下でのペプチドの標的への結合が達成されるように変動させることができる。
【０１８７】
Ｔｆペプチドライブラリーが、関心対象の標的に結合する一つ又は複数のペプチドを有することが決定されたら、本発明の方法を用いて、混合物中でペプチドの配列を同定することができる。標的と結合するペプチドを提示する細胞は、ＭＡＣＳまたはＦＡＣＳスクリーニングによってライブラリーの総集団から単離することができる。スクリーニングプロセスを最初の分離物に対して２〜３回繰り返し、非特異的に結合したもの全てを除外する。続いて、結合親和性に基づいて単離することができるＦＡＣＳソーティングによる最後のスクリーニングが行われる。単離した細胞からプラスミドＤＮＡを回収し、挿入物の領域に関するＤＮＡを配列解析して、タンパク質配列を決定する。続いて単離物間の共通のモチーフを決定することができる。
【０１８８】
治療用リガンド分子
本発明のリガンドは、推定の治療的分子でもよいし、または既知の治療的分子でもよい。本明細書で用いられるように、治療的分子は、典型的には、インビトロまたはインビボで有益な生物学的作用を発揮することができるタンパク質またはペプチドであり、例えば、正常なホメオスタシス、生理機能または病状に対して有益な作用を発揮するタンパク質またはペプチドが挙げられる。治療的分子は、マーカーとして一般的に使用される融合パートナー、またはガラクトシダーゼのようなタンパク質精製の助剤を含まない（例えば、米国特許第５，９８６，０６７号、およびＡｌｄｒｅｄ等（１９８４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２２：９６０〜９６５を参照）。例えば、病状に関する有益な作用としては、治療される治療対象に有利なあらゆる作用が挙げられ、このような作用としては、治療される治療対象に有益な作用を生じるような、疾患の予防、疾患の安定化、疾患の症状の低減もしくは緩和、または根本的な欠陥の調節、緩和もしくは治癒が挙げられる。
【０１８９】
治療用リガンドは、トランスフェリン成分に直接融合していてもよいし、または、上述したようなリンカー成分を介して間接的に融合していてもよい。一実施態様において、本融合タンパク質を切断して、本融合タンパク質のトランスフェリンとリガンド部分を、本融合タンパク質のそれ以外の部分から分離することが望ましい場合がある。その他の実施態様において、リガンドを本融合タンパク質のそれ以外の部分から切断することが望ましい場合がある。
【０１９０】
本発明の融合タンパク質のリガンド成分は、治療用タンパク質の少なくともフラグメントもしくは変異体、および／または抗体の少なくともフラグメントもしくは変異体を含んでいてもよい。さらなる実施態様において、本融合タンパク質は、タンパク質または抗体の、ペプチドフラグメントまたはペプチド変異体を含んでいてもよく、ここにおいて、これらの変異体またはフラグメントは、生物学的活性または治療活性の少なくとも１つを保持する。本融合タンパク質は、治療用タンパク質を含んでいてもよく、このような治療用タンパク質としては、長さが少なくとも約３個、少なくとも約４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、少なくとも１５個、少なくとも２０個、少なくとも２５個、少なくとも３０個、少なくとも３５個、または少なくとも約４０個、少なくとも約５０個、少なくとも約５５個、少なくとも約６０個、または少なくとも約７０個またはそれ以上のアミノ酸からなり、Ｎおよび／またはＣ末端に融合し、改変されたトランスフェリンのループ内に挿入されているか、または改変されたトランスフェリンのループに挿入されているペプチドフラグメントまたはペプチド変異体が挙げられる。
【０１９１】
その他の実施態様において、本発明の融合タンパク質のリガンド成分は、治療用タンパク質部分を含み、このタンパク質部分は、全長タンパク質、同様に、アミノ酸配列のアミノ末端から１個またはそれ以上の残基が欠失したポリペプチドなどを含む治療用タンパク質のフラグメントであり得る。
【０１９２】
その他の実施態様において、本発明の融合タンパク質のリガンド成分は、治療用タンパク質部分を含み、このタンパク質部分は、全長タンパク質、同様に、アミノ酸配列のカルボキシ末端から１個またはそれ以上の残基が欠失したポリペプチドを含む治療用タンパク質のフラグメントであり得る。
【０１９３】
その他の実施態様において、本発明の融合タンパク質のリガンド成分は、治療用タンパク質部分を含み、このタンパク質部分は、アミノ末端およびカルボキシ末端の両方から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失していてもよい。
【０１９４】
その他の実施態様において、本融合タンパク質は、本明細書で記載された参照の治療用タンパク質に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一な治療用タンパク質部分、すなわちリガンド成分、またはそれらのフラグメントを含む。さらなる実施態様において、トランスフェリン融合分子は、アミノ酸配列に上述のようなＮおよびＣ末端の欠失を有する参照のポリペプチドと少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一な治療用タンパク質部分を含む。
【０１９５】
その他の実施態様において、本融合タンパク質は、例えば治療用タンパク質の天然型または野生型のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一な治療用タンパク質部分を含む。これらのポリペプチドのフラグメントも提供される。
【０１９６】
細胞表層タンパク質や分泌タンパク質のような本発明の改変されたトランスフェリン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質は、１またはそれ以上のオリゴ糖基を付着させることによって改変することができる。グリコシル化と称される改変は、タンパク質の物理特性に有意に影響を与えることができ、さらに、タンパク質の安定性、分泌および局在化にとって重要なものにすることができる。グリコシル化は、ポリペプチド主鎖に沿って特異的な位置で起こる。グリコシル化には、通常、以下の２つの主要なタイプがあり、すなわち、グリコシル化は、セリンまたはスレオニン残基に結合しているＯ結合型のオリゴ糖を特徴とし；およびグリコシル化は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列（ここにおいてＸは、プロリン以外のアミノ酸が可能である）におけるアスパラギン残基に結合しているＮ結合型のオリゴ糖を特徴とする。タンパク質構造や細胞型のような可変値は、様々なグリコシル化部位における鎖内の糖質単位の数および性質に影響を与える。グリコシル化の異性体もまた、は、所定の細胞型内の同じ部位に共通している。例えば、ヒトインターフェロンの数種のタイプは、グリコシル化されている。
【０１９７】
本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質、ならびに、それらの類似体および変異体は、それらが発現される宿主細胞によって、またはそれらの発現のその他の条件に起因して、それらの核酸配列を操作した結果として１またはそれ以上の部位でのグリコシル化が変更されるように改変されていてもよい。例えば、グリコシル化の異性体は、例えば、アミノ酸残基の置換または欠失、例えばグルタミンのアスパラギンへの置換によってグリコシル化部位を無効にしたり、または導入したりすることによって生産してもよいし、またはグリコシル化されていない組換えタンパク質は、それらをグリコシル化しないと予想される宿主細胞中で、例えばグリコシル化能に欠陥のある酵母中でタンパク質を発現させることによって生産してもよい。これらのアプローチは当分野既知である。
【０１９８】
治療用タンパク質およびそれらの核酸配列は当分野周知であり、公開データベース、例えば、ケミカル・アブストラクツ・サービス・データベース（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ）（例えばＣＡＳレジストリ）、ＧｅｎＢａｎｋ、および、ＧｅｎＳｅｑから入手可能である。以下で述べる登録番号および配列は、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる。
【０１９９】
本発明はさらに、本明細書で説明される治療用タンパク質のフラグメントを含む融合タンパク質を対象とする。タンパク質のＮ末端から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失して、治療用タンパク質部分の生物学的機能の１種またはそれ以上に改変または減少が生じたとしても、その他の治療活性および／または機能的な活性（例えば、生物活性、マルチマー化する能力、リガンドと結合する能力）がなお保持させることができる。例えば、一般的に、Ｎ末端に欠失を有するポリペプチドの、ポリペプチドの完全な形態または成熟した形態を認識する抗体を誘導する、および／またはそれらに結合する能力は、完全なポリペプチドの残基の半数未満がＮ末端から除去されても保持されると予想される。完全なポリペプチドのＮ末端の残基が欠失した特定のポリペプチドが、このような免疫学的な活性を保持するかどうかは、本明細書で説明されているルーチン的な方法や、それ以外の当分野既知の方法で分析することができる。多数のＮ末端のアミノ酸残基が欠失した突然変異体が、いくつかの生物学的活性または免疫原性活性を保持する可能性があることはありそうもないことでない。実際に、６個もの少ないアミノ酸残基で構成されるペプチドでもしばしば免疫反応を誘発することがある。
【０２００】
上述したように、治療用タンパク質のＮ末端またはＣ末端から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失していることによって、タンパク質の１種またはそれ以上の生物学的機能の改変または減少が生じる場合でさえも、その他の機能的な活性、例えば生物活性、マルチマー化する能力、リガンドと結合する能力および／または治療活性は、なお保持させることができる。一般的に、例えばＣ末端に欠失を有するポリペプチドの、ポリペプチドの完全な形態または成熟した形態を認識する抗体を誘導する、および／またはそれらに結合する能力は、完全なポリペプチドまたは成熟ポリペプチドの残基の半分未満がＣ末端から除去されても保持されると予想される。参照のポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の残基が欠失した特定のポリペプチドが治療活性を保持するかどうかは、本明細書で説明されているルーチン的な方法および／または当分野既知のそれ以外の方法によって容易に決定することができる。
【０２０１】
治療用タンパク質のペプチドフラグメントは、アミノ酸配列がフラグメントである治療用タンパク質のポリペプチド配列の、治療活性および／または機能的な活性（例えば生物活性）を提示するアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなるフラグメントであってもよい。
【０２０２】
その他のポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明で用いられる治療用タンパク質の活性に類似しているが、必ずしも同一ではない活性を示すものである。このようなフラグメントの生物活性は、改善された所望の活性、または低減された望ましくない活性を含んでいてもよい。
【０２０３】
一般的に、タンパク質の変異体は、総体的に極めて類似しており、多くの領域において本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質のアミノ酸配列と同一である。これらの変異体をコードする核酸も本発明に包含される。
【０２０４】
本発明で使用可能なさらなる治療用ポリペプチドは、当業者既知のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で治療用タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補物とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドである。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等編集，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，グリーン・パブリッシング・アソシエイツ社（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、およびジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ニューヨーク）を参照。これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。
【０２０５】
例えば本発明のアミノ酸配列クエリーに少なくとも９５％「同一な」アミノ酸配列を有するポリペプチドとは、対象のポリペプチドのアミノ酸配列がクエリー配列と同一である（ただし、対象のポリペプチド配列は、アミノ酸配列のアミノ酸クエリー１００個あたり５個までのアミノ酸の変更を含んでいてもよい）ことを意味する。言い換えれば、アミノ酸配列がアミノ酸配列クエリーに少なくとも９５％同一なポリペプチドを得るためには、その他のアミノ酸で挿入、欠失または置換されてもよい対象の配列中のアミノ酸残基は、５％以下である。これらの参照配列の変更は、参照のアミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置に、またはこれら末端の位置の間のどこかに、参照配列中のそれぞれの残基に、または参照配列内の１個またはそれ以上の連続した基のいずれかに散在して存在する可能性がある。
【０２０６】
実際問題として、あらゆる特定のポリペプチドが、例えば、本発明の融合タンパク質またはそれらのフラグメント（例えば、本融合タンパク質の治療用タンパク質部分またはそれらの部分）のアミノ酸配列に少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータープログラムを用いてルーチン的に決定することができる。クエリー配列（本発明の配列）と、対象の配列（またはグローバル配列アライメントとも言う）との間の最良の全体のマッチングを決定する方法の一つは、Ｂｒｕｆｌａｇ等（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ  ２４５〜（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定することができる。
【０２０７】
本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域またはその両方に変更を含んでいてもよい。サイレント置換、付加または欠失を生じるが、コードされたポリペプチドの特性または活性を変更しない変更を含むポリヌクレオチド変異体を用いて、改変されたリガンド成分を生産してもよい。遺伝子コードの縮重によるサイレント置換によって生産されたヌクレオチド変異体を利用することができる。その上、約５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満、または５〜５０個、５〜２５個、５〜１０個、１〜５個、もしくは、１〜２個のアミノ酸が、あらゆる組み合わせで置換、欠失または付加されているポリペプチド変異体も利用することができる。ポリヌクレオチド変異体は、様々な理由に応じて作製することができ、例えば、特定の宿主に対してコドンの発現を最適化する（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、宿主、例えば上述のような酵母またはＥ．コリにとって好ましいコドンに変化させる）ことによってなされる。
【０２０８】
その他の実施態様において、治療用タンパク質成分、すなわちリガンド成分は、野生型配列と比較して保存的置換を有する。「保存的置換」は、グループ内での入れ替えを意味し、例えば、脂肪族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、およびＩｌｅの交換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの交換；塩基性残基Ｌｙｓ、Ａｒｇ、およびＨｉｓの交換；芳香族残基Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐの交換；および小型のアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｍｅｔ、およびＧｌｙの交換が挙げられる。表現型においてサイレントなアミノ酸置換をどのように作製するかに関する指針は、例えば、Ｂｏｗｉｅ等の“Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）に示されている。特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、本明細書で説明されている治療用タンパク質、および／または本発明の血清トランスフェリンおよび改変されたトランスフェリンタンパク質のアミノ酸配列のフラグメントまたは変異体を含むか、あるいはそれらからなり、ここにおいて、これらのフラグメントまたは変異体は、参照のアミノ酸配列と比較して、１〜５個、５〜１０個、５〜２５個、５〜５０個、１０〜５０個、または５０〜１５０個のアミノ酸残基付加、置換および／または欠失を有する。さらなる実施態様において、アミノ酸置換は保存的である。これらのポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含される。
【０２０９】
本発明の改変された融合タンパク質は、互いにペプチド結合または改変されたペプチド結合で結合したアミノ酸で構成されていてもよく、２０種の遺伝子コードアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。このようなポリペプチドは、天然のプロセス、例えば翻訳後プロセシング、または当分野でよく知られた化学修飾技術のいずれかによって改変されていてもよい。このような改変は基本的な教本でよく説明されており、研究論文、加えて膨大な研究文献でより詳細に説明されている。
【０２１０】
改変は、ポリペプチド中のあらゆる場所で発生する可能性があり、このような場所としては、ペプチド主鎖、アミノ酸側鎖、およびアミノまたはカルボキシ末端が挙げられる。当然のことながら、同じタイプの改変が、所定のポリペプチド内の同じ部位に存在していてもよいし、または様々な程度でいくつかの部位に存在していてもよい。また、所定のポリペプチドに多くのタイプの改変が含まれていてもよい。ポリペプチドは、例えばユビキチン化の結果として分岐していてもよいし、ポリペプチドは環状でもよく、分岐を含んでいてもよいし、または含んでいなくてもよい。環状、分岐状および分岐状環状ポリペプチドは、翻訳後の天然のプロセスによって生じたものでもよいし、または合成法によって製造したものでもよい。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム成分の共有結合、ヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質または脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトールの共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル、共有結合の架橋の形成、システインの形成、グリコシル化、ＧＰＩアンカーの形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク質分解によるプロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、硫酸化、アミノ酸のタンパク質への付加を介するトランスファーＲＮＡ、例えばアルギニル化、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第二版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，アカデミックプレス，ニューヨーク，１〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ等（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎ等，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８〜６２を参照）。
【０２１１】
リガンド成分として用いることができる治療的分子としては、これらに限定されないが、ホルモン、マトリックスタンパク質、免疫抑制剤、気管支拡張剤、心血管作動薬、酵素、ＣＮＳ剤、神経伝達物質、受容体タンパク質またはペプチド、成長ホルモン、増殖因子、抗ウイルス性ペプチド、膜融合阻害ペプチド、サイトカイン、リンフォカイン、モノカイン、インターロイキン、コロニー刺激因子、分化因子、血管新生因子、受容体リガンド、癌関連タンパク質、抗腫瘍薬、ウイルスペプチド、抗生物質ペプチド、血液タンパク質、アンタゴニストタンパク質、転写因子、抗血管新生因子、アンタゴニストタンパク質またはペプチド、受容体アンタゴニスト、抗体、単鎖抗体、および細胞接着分子が挙げられる。単一の融合タンパク質に異なる治療的分子を組合せて、二機能性または多機能性の治療的分子を生産することができる。また、異なる分子を併用して、治療実体および標的実体を有する融合タンパク質を生産してもよい。治療的分子は、本発明の軸成分に直接融合させることができ、またはＴｆ成分またはアルブミン成分のような提示成分と融合してもよいし、もしくはそれらに挿入してもよい。
【０２１２】
サイトカインは、免疫系の細胞によって放出される可溶性タンパク質であり、非酵素的に特異的な受容体を介して作用して、免疫反応を調節することができる。サイトカインは、低濃度で作用し、高親和性で特異的な受容体に結合するという点で、ホルモンに似ている。本明細書において用語「サイトカイン」とは、そのサイトカインについての受容体を有する細胞において特異的な生物学的反応を惹起する、天然に存在する、または組換えタンパク質、それらの類似体およびそれらのフラグメントを示すものとして用いられる。サイトカインとしては、好ましくは、インターロイキン、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｓ７７８３４）、ＩＬ−３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１４７４３）、ＩＬ−４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２３４４２）、ＩＬ−５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０３４７８）、ＩＬ−６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１４５８４）、ＩＬ−７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００８８０）、ＩＬ−１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５７２）、ＩＬ−１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１８０５６２およびＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１８０５６３）、ＩＬ−１３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１０３０７）、ＩＬ−１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿１７０９２４）、ＩＬ−１５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ９１２３３）、ＩＬ−１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４５１３）、ＩＬ−１７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１９０）およびＩＬ−１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１５６２）、造血因子、例えば顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３０２１）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３６５６）、血小板活性化因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００４３７）およびエリスロポエチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２１５８）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、例えばＴＮＦα（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２９１０）、リンフォカイン、例えばリンフォトキシン−α（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２９１１）、リンフォトキシン−β（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１１０１６）、ロイコレグリン（ｌｅｕｋｏｒｅｇｕｌｉｎ）、マクロファージ遊走阻止因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２５６３９）、およびニューロロイキン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｋ０３５１５）、代謝プロセスの調節因子、例えばレプチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ４３４１５）、インターフェロン、例えばインターフェロンα（ＩＦＮα）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ５４８８６）、ＩＦＮβ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ００５３４）、ＩＦＮγ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ００２１９）、ＩＦＮｏ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１７７）、トロンボスポンジン１（ＴＨＢＳ１）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３２４６）、ＴＨＢＳ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ１２３５０）、ＴＨＢＳ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３８９６９）、ＴＨＢＳ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３２４８）、およびケモカインが挙げられる。好ましくは、改変されたトランスフェリン−サイトカイン融合タンパク質は、サイトカインの生物活性を提示する。
【０２１３】
本明細書における用語「ホルモン」は、所定の細胞または組織で生産され、体内のどこかに位置するその他の細胞または組織で特異的な生物学的な変化または活性が生じるように作用する多数の生物学的に活性な物質のいずれか一つを述べる際に用いられる。ホルモンとしては、好ましくは、プロインスリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ００５６５）、インスリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００２０７）、成長ホルモン１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ００５２０）、成長ホルモン２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｆ００６０６０）、成長ホルモン放出因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０２１０８１）、インスリン様増殖因子Ｉ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２７５４４）、インスリン様増殖因子ＩＩ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００６１２）、インスリン様増殖因子結合タンパク質１（ＩＧＦＢＰ−１）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ５９３１６）、ＩＧＦＢＰ−２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１６３０２）、ＩＧＦＢＰ−３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５９８）、ＩＧＦＢＰ−４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１２５０８）、ＩＧＦＢＰ−５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ６５０６２）、ＩＧＦＢＰ−６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１７８）、ＩＧＦＢＰ−７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ００１５５３）、絨毛性ゴナドトロピンβ鎖（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０３３１４２）、絨毛性ゴナドトロピンα鎖（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０００７３５）、黄体形成ホルモンβ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ００２６４）、胞刺激ホルモンβ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５１０）、甲状腺刺激ホルモンβ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５４９）、プロラクチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００９４８）、プロオピオメラノコルチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｖ０１５１０）、コルチコトロピン（ＡＣＴＨ）、β−リポトロピン、α−メラニン細胞刺激ホルモン（α−ＭＳＨ）、γ−リポトロピン、β−ＭＳＨ、β−エンドルフィン、およびコルチコトロピン様中葉ペプチド（ＣＬＩＰ）が挙げられる。
【０２１４】
また用語「ホルモン」は、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）も包含し、これは、いわゆる腸島軸（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ  ａｘｉｓ）に属するインスリン分泌を調節する胃腸ホルモンであり、さらにエキセンディン（例えば、エキセンディン−４およびそれらの変異体）も包含し、これは、ＧＬＰ−１受容体アゴニストである。
【０２１５】
本明細書における用語「増殖因子」は、細胞増殖を刺激する受容体に結合するあらゆるタンパク質またはペプチドを述べる際に用いられる。増殖因子としては、好ましくは、血小板由来増殖因子−α（ＰＤＧＦ−α）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３７９５）、ＰＤＧＦ−β（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２８１１）、ステロイドホルモン、上皮増殖因子（ＥＧＦ）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１９６３）、線維芽細胞増殖因子、例えば線維芽細胞増殖因子１（ＦＧＦ１）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００８００）、ＦＧＦ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２００６）、ＦＧＦ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５２４７）、ＦＧＦ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２００７）、ＦＧＦ５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ３７８２５）、ＦＧＦ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５７０７５）、ＦＧＦ７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２００９）、ＦＧＦ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＨ００６６４９）、ＦＧＦ９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２０１０）、ＦＧＦ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ００２０９７）、ＦＧＦ１１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４１１２）、ＦＧＦ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２１０３２）、ＦＧＦ１３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４１１４）、ＦＧＦ１４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４１１５）、ＦＧＦ１６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＢ００９３９１）、ＦＧＦ１７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８６７）、ＦＧＦ１８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０７５２９２）、ＦＧＦ１９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５１１７）、ＦＧＦ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１９８５１）、ＦＧＦ２１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１９１１３）、ＦＧＦ２２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２０６３７）、およびＦＧＦ２３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ０２０６３８）、アンギオゲニン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１１５６７）、脳由来神経栄養因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ６１１７６）、毛様体神経栄養因子（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６０５４２）、トランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７０３４０）、ＴＧＦ−β（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２８１２）、神経成長因子−α（ＮＧＦ−α）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１０９１５）、ＮＧＦ−β（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５２５９９）、メタロプロテイナーゼ１の組織阻害剤（ＴＩＭＰ１）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３２５４）、ＴＩＭＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３２５５）、ＴＩＭＰ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ０２５７１）、ＴＩＭＰ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７６４５６）、およびマクロファージ刺激因子１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＬＩ１９２４）が挙げられる。
【０２１６】
本明細書における用語「マトリックスタンパク質」は、通常、細胞外マトリックスで見出されるタンパク質またはペプチドを述べる際に用いられる。これらのタンパク質は、強度、ろ過または付着に関して機能的に重要な可能性がある。マトリックスタンパク質としては、好ましくは、コラーゲン、例えばＩ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｚ７４６１５）、ＩＩ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＩ６７１１）、ＩＩＩ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１４４２０）、ＩＶ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１８４５）、Ｖ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００３９３）、ＶＩ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０５８１７５）、ＶＩＩ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ０２８７０）、ＶＩＩＩ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１８５０）、ＩＸ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５４４１２）、Ｘ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ６０３８２）、ＸＩ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｊ０４１７７）およびＸＩＩ型コラーゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７３７７８）、ラミニンタンパク質、例えばＬＡＭＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００４２６）、ＬＡＭＡ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３４１５５）、ＬＡＭＡ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２２９０）、ＬＡＭＢ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２２９１）、ＬＡＭＢ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ２５５４１）、ＬＡＭＣ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２２９３）、ニドゲン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２５０８）、α−テクトリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５４２２）、β−テクトリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０５８２２２）、およびフィブロネクチン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２７６１）が挙げられる。
【０２１７】
用語「血液タンパク質」は、一般的に、血漿由来のタンパク質と定義され、現在、そのうち多くが、一般的に組換え法によって生産されており、このようなタンパク質としては、これらに限定されないが、天然の血清タンパク質、それらの誘導体、フラグメントおよび突然変異体または変異体、血液凝固因子、誘導体、突然変異体、変異体およびフラグメント（例えば、ＶＩＩ、ＶＩＩＩ、ＩＸ、Ｘ因子など）、プロテアーゼ阻害剤（アンチトロンビン３、アルファ−１アンチトリプシン）、ウロキナーゼ型プラスミノゲン活性化因子、免疫グロブリン、フォン−ヴィレブランド因子、およびフォン−ヴィレブランド突然変異体、フィブロネクチン、フィブリノーゲン、トロンビン、およびヘモグロビンが挙げられる。
【０２１８】
本明細書における用語「酵素」は、それ自体永久的に変化したり、または破壊されたりすることなく特異的な反応を触媒するあらゆるタンパク質またはタンパク質様物質を述べる際に用いられる。酵素としては、好ましくは、凝固因子、例えばＦ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿１７０６８８）、Ｆ７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿０２７５０８）、Ｆ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿０１３１２４）、Ｆ９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００１３３）、Ｆ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ５０３５１０）など、マトリックスメタロプロテイナーゼ、例えばマトリックスメタロプロテイナーゼＩ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＭＭＰ１）（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２４２１）、ＭＭＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４５３０）、ＭＭＰ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２４２２）、ＭＭＰ７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２４２３）、ＭＭＰ８（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２４２４）、ＭＭＰ９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４９９４）、ＭＭＰ１０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２４２５）、ＭＭＰ１２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２４２６）、ＭＭＰ１３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７５３０８）、ＭＭＰ２０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４７７１）、アデノシン−デアミナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００００２２）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ、例えばＭＡＰＫ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿０５５７６６）、ＭＡＰ２Ｋ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０３０６６２）、ＭＡＰ２Ｋ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２７５５）、ＭＡＰ２Ｋ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３０１０）、ＭＡＰ２Ｋ７（ＡＦ０１３５８８）、およびＭＡＰＫ１２（ＮＭ＿００２９６９）、キナーゼ、例えばＪＮＫＫ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１７７４３）、ＪＮＫＫ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ０１４４０１）、ＪＡＫ１（Ｍ６４１７４）、ＪＡＫ２（ＮＭ＿００４９７２）、およびＪＡＫ３（ＮＭ＿０００２１５）、およびホスファターゼ、例えばＰＰＭ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０２１００３）およびＰＰＭ１Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３６２０）が挙げられる。
【０２１９】
本明細書における用語「転写因子」は、タンパク質をコードする遺伝子の転写に関与するあらゆるタンパク質またはペプチドを述べる際に用いられる。転写因子としては、Ｓｐ１、Ｓｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３１１０）、Ｓｐ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＹ０７０１３７）、Ｓｐ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３１１２）、ＮＦＹＢ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００６１６６）、Ｈａｐ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ５９０７９）、ＧＡＴＡ−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２０４９）、ＧＡＴＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２０５０）、ＧＡＴＡ−３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５５１２２）、ＧＡＴＡ−４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ３４３５７）、ＧＡＴＡ−５、ＧＡＴＡ−６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５２５７）、ＦＯＧ２（ＮＭ＿０１２０８２）、Ｅｒｙｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１７２５４）、ＴＲＰＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０１４１１２）、ＮＦ−Ｅ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００６１６３）、ＮＦ−Ｅ３、ＮＦ−Ｅ４、ＴＦＣＰ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５６５３）、Ｏｃｔ−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１３４０３）、ホメオボックスタンパク質、例えばＨＯＸＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１４５）、ＨＯＸ２Ｈ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１６６６５）、ヘアレス（ｈａｉｒｌｅｓｓ）同族体（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５１４４）、デカペンタプレジックタンパク質に対する親物質、例えばＭＡＤＨ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５９００）、ＭＡＤＨ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５９０１）、ＭＡＤＨ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５９０２）、ＭＡＤＨ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５３５９）、ＭＡＤＨ５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ００９６７８）、ＭＡＤＨ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５５８５）、ＭＡＤＨ７（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５９０４）、ＭＡＤＨ９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５９０５）、および転写タンパク質のシグナルトランスデューサーおよび活性化因子、例えばＳＴＡＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿０１０８９３）、ＳＴＡＴ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５４１９）、ＳＴＡＴ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＪ０１２４６３）、ＳＴＡＴ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３１５１）、ＳＴＡＴ５（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｌ４１１４２）、および、ＳＴＡＴ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３１５３）が挙げられる。
【０２２０】
さらに本発明のその他の実施態様において、治療的分子は、非ヒトまたは非哺乳動物タンパク質である。例えば、ＨＩＶｇｐ１２０、ＨＩＶＴａｔ、他のウイルスの表面タンパク質、例えば肝炎、ヘルペス、インフルエンザ、アデノウイルスおよびＲＳＶ、他のＨＩＶ成分、寄生虫の表面タンパク質、例えばマラリアの抗原、および細菌の表面タンパク質が使用可能である。これらの非ヒトタンパク質は、これらは有用な活性を有するため、例えば抗原として使用可能である。例えば、治療的分子は、ストレプトキナーゼ、スタフィロキナーゼ、アスパラギナーゼ、ウロキナーゼ、または有用な酵素活性を有するその他のタンパク質であり得る。
【０２２１】
本発明の代替の実施態様において、治療的分子は、生物活性を有するリガンド結合タンパク質である。このようなリガンド結合タンパク質は、例えば、（１）細胞表層で受容体−リガンドの相互作用をブロックしたり；または（２）血液の流動相において分子の生物活性を中和したりすることができ、それによって、上記タンパク質がその細胞の標的に到達することを防ぐことができる。いくつかの実施態様において、改変されたトランスフェリン融合タンパク質は、以下からなる群より選択される受容体のリガンド−結合ドメインに融合した改変されたトランスフェリン分子を含む：低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体、アセチル化ＬＤＬ受容体、腫瘍壊死因子α受容体、トランスフォーミング増殖因子β受容体、サイトカイン受容体、免疫グロブリンＦｃ受容体、ホルモン受容体、グルコース受容体、グリコリピド受容体、およびグリコサミノグリカン受容体（ただしこれらに限定されない）。その他の実施態様において、リガンド結合タンパク質としては、ＣＤ２（Ｍ１４３６２）、ＣＤ３Ｇ（ＮＭ＿００００７３）、ＣＤ３Ｄ（ＮＭ＿０００７３２）、ＣＤ３Ｅ（ＮＭ＿０００７３３）、ＣＤ３Ｚ（Ｊ０４１３２）、ＣＤ２８（ＮＭ＿００６１３９）、ＣＤ４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００６１６）、ＣＤ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２８８２５）、ＣＤ１Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７６４）、ＣＤ１Ｃ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７６５）、ＣＤ１Ｄ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１７６６）、ＣＤ８０（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５１９１）、ＧＮＢ３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ５０１８８４）、ＣＴＬＡ−４（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５２１４）、細胞間接着分子、例えばＩＣＡＭ−１（ＮＭ＿０００２０１）、ＩＣＡＭ−２（ＮＭ＿０００８７３）、およびＩＣＡＭ−３（ＮＭ＿００２１６２）、腫瘍壊死因子受容体、例えばＴＮＦＲＳＦ１Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５５３１３）、ＴＮＦＲ１ＳＦＢ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１０６６）、ＴＮＦＲＳＦ９（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１５６１）、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８４２）、ＴＮＦＲＳＦ１１Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２５４６）、および、ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００６５７３）、ならびにインターロイキン受容体、例えばＩＬ２ＲＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００４１７）、ＩＬ２ＲＧ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００２０６）、ＩＬ４Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ４２１８５５）、ＩＬ７Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２１８５）、ＩＬ９Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿０１５９８９）、およびＩＬ１３Ｒ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ９５３０２）が挙げられる。好ましくは、本発明のリガンド結合タンパク質の融合体は、そのリガンド結合タンパク質の生物活性を提示する。
【０２２２】
本明細書における用語「癌関連タンパク質」は、その発現が癌または制御された細胞増殖の維持に関連するタンパク質またはポリペプチドを述べる際に用いられ、例えば腫瘍抑制遺伝子または腫瘍遺伝子によってコードされたタンパク質である。癌関連タンパク質としては、ｐｌ６（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＨ００５３７１）、ｐ５３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿０００５４６）、ｐ６３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３７２２）、ｐ７３（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５４２７）、ＢＲＣＡ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ１４６８０）、ＢＲＣＡ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００００５９）、ＣＴＢＰ相互作用タンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｕ７２０６６）、ＤＭＢＴ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４４０６）、ＨＲＡＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５３４３）、ＮＣＹＭ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００６３１６）、ＦＧＲ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５２４８）、ｍｙｂ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＦ１０４８６３）、ｒａｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２８８０）、ｅｒｂＢ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００４４４８）、ＶＡＶ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ１６３１６）、ｃ−ｆｏｓ（ＶＧｅｎＢａｎｋ登録番号０１５１２）、ｃ−ｆｅｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ５２１９２）、ｃ−ｊｕｎ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００２２２８）、ＭＡＳ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１３１５０）、ｐｉｍ−１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１６７５０）、ＴＩＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００３８５２）、ｃ−ｆｍｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０３６６３）、ＥＧＦＲ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００５２２８）、ｅｒｂＡ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０４７０７）、ｃ−ｓｒｃチロシンキナーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＸＭ＿０４４６５９）、ｃ−ａｂｌ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１４７５２）、Ｎ−ｒａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ０２７５１）、Ｋ−ｒａｓ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ５４９６８）、ｊｕｎ−Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２９０３９）、ｃ−ｍｙｃ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＡＨ００１５１１）、ＲＢ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ２８４１９）、ＤＣＣ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｘ７６１３２）、ＡＰＣ（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００００３８）、ＮＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ８９９１４）、ＮＦ２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｙ１８０００）、および、ｂｃｌ−２（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号Ｍ１３９９４）が挙げられる。
【０２２３】
本明細書における「融合阻害ペプチド」は、抗ウイルス活性、抗膜融合能、および／または細胞内プロセスを調節する能力を示すペプチドを述べる際に用いられ、例えば、コイルドコイルペプチド構造を含むものである。抗ウイルス活性としては、これらに限定されないが、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＲＳＶ、ＳＩＶ、ＥＢＶ、麻疹ウイルス、インフルエンザウイルスの阻害、または感染していない細胞へのＣＭＶ伝達が挙げられる。加えて、抗融合形成（ａｎｔｉｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）能力、抗ウイルス活性、またはペプチドの細胞内調節活性は、単にペプチドの存在を必要とするに過ぎず、このようなペプチドに対して向けられた宿主の免疫応答の刺激を特に必要としない。抗融合形成は、２またはそれ以上の成分間における膜融合事象を阻害する、またはそのレベルを、ペプチドの非存在下で前記成分間に起こる膜融合のレベルに比べて減少させるペプチドの能力を意味する。このような成分は、例えば細胞膜またはウイルス構造である可能性があり、例えばウイルスエンベロープまたは繊毛である。本明細書で用いられる用語「抗ウイルス性ペプチド」は、細胞のウイルス感染、または例えば細胞間融合もしくは遊離のウイルスによる感染を介した、増殖を起こすウイルス感染および／またはウイルス病原性に必要ないくつかのウイルス活性を阻害するペプチドの能力を意味する。このような感染は、エンベロープウイルスケースで起こるような、またはいくつかのその他のウイルス構造および細胞構造に関連する融合事象で起こるような膜融合に関与する可能性がある。膜融合阻害ペプチドおよび抗ウイルス性ペプチドは、１種より多くのタンパク質から誘導されるアミノ酸配列を有することが多い（例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＲＳＶ、およびＳｌＶから誘導されたポリペプチド）。
【０２２４】
膜融合阻害ペプチド、および、抗ウイルス性ペプチドの例は、ＷＯ９４／２８２０、ＷＯ９６／１９４９５、ＷＯ９６／４０１９１、ＷＯ０１／６４０１３、および米国特許第６，３３３，３９５号、６，２５８，７８２号、６，２２８，９８３号、６，１３３，４１８号、６，０９３，７９４号、６，０６８，９７３号、６，０６０，０６５号、６，０５４，２６５号、６，０２０，４５９号、６，０１７，５３６号、６，０１３，２６３号、５，４６４，９３３号、５，３４６，９８９号、５，６０３，９３３号、５，６５６，４８０号、５，７５９，５１７号、６，２４５，７３７号；６，３２６，００４号、および６，３４８，５６８号に見出すことができ、これらはいずれも参照により本明細書に組み入れられる。
【０２２５】
その他のタイプのペプチドの例としては、本明細書で説明したような治療用タンパク質のフラグメントが挙げられ、特に、親分子の活性の少なくとも１種を保持するヒトタンパク質のフラグメントである。また、本発明のリガンド成分を生産するのに使用可能なペプチドとしては、模倣ペプチド、および治療用タンパク質の生物活性を示すペプチドも挙げられるが、全長の治療用タンパク質とは配列または三次元構造の点で異なる。非限定的な例として、ペプチドとしては、Ｊｏｈｎｓｏｎ等（２０００）Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  １５（９）：１２７４〜７，Ｋｕａｉ等（２０００）Ｊ．Ｐｅｐｔ  Ｒｅｓ．５６（２）：５９〜６２，Ｂａｒｂｏｎｅ等（１９９９）Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．１４  Ｓｕｐｐ  ２：８０〜４，Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎ等（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（２０）：１４１６３〜９，Ｊｏｈｎｓｏｎ等（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７（１１）：３６９９〜７１０，Ｊｏｈｎｓｏｎ等（１９９７）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．１２：９３９〜５０，Ｗｒｉｇｈｔｏｎ等（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５（１２）：１２６１〜５，Ｌｉｖｎａｈ等（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：４６４〜７１、および、Ｗｒｉｇｈｔｏｎ等，（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７３：４５８〜６４によって開示されたエリスロポエチン模倣ペプチドが挙げられる。
【０２２６】
また治療的分子としては、アレルゲンタンパク質、およびそれらの消化されたフラグメントも挙げられる。これらの例としては、ブタクサ、ライ、ジューングラス（Ｊｕｎｅ  ｇｒａｓｓ）、カモガヤ、ハルガヤ、レッドトップグラス（ｒｅｄ  ｔｏｐ  ｇｒａｓｓ）、オオアワガエリ、イエロードッグ、コムギ、トウモロコシ、ヤマヨモギ、イチゴツナギ，カリフォルニアの一年草（ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｎｎｕａｌ  ｇｒａｓｓ）、アカザ、ギョウギシバ、ロシアアザミ（Ｒｕｓｓｉａｎ  ｔｈｉｓｔｌｅ）、マウンテンシーダー（ｍｏｕｎｔａｉｎ  ｃｅｄａｒ）、オーク、ネグンドカエデ、スズカケノキ、カエデ、ニレなどが由来の花粉アレルゲン、チリダニ、ハチ毒、食物アレルゲン、動物の鱗屑およびその他の昆虫毒が挙げられる。
【０２２７】
その他の治療的分子としては、ウイルス、細菌および原生動物性のワクチンなどの微生物性ワクチン、およびそれらの様々な成分、例えば表面抗原が挙げられる。これらの例としては、糖タンパク質、タンパク質またはこれらのタンパク質から誘導されたペプチドを含むワクチンが挙げられる。このようなワクチンは、スタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、ナイセリア・メニンギチジス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、サルモネラ属、シゲラ属、エシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クレブシエラ属ｓｐｐ．、プロテウス属ｓｐｐ．、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、カンピロバクター・ピロリ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、ヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、ボルデテラ・ペルツッシス（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、トレポネーマ・パリダム（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、クラミジア属、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、インフルエンザウイルス、アデノウイルス、パラミクソウイルス（流行性耳下腺炎、麻疹）、風疹ウイルス、ポリオウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、狂犬病ウイルス、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＲＳＶ、および乳頭腫ウイルスから調製される。
【０２２８】
好ましい融合分子は、抗ＨＩＶウイルスペプチド、抗ＲＳＶペプチド、ヒト成長ホルモン、αおよび／またはβインターフェロン、エリスロポイエチン（ＥＰＯ）、ＥＰＯ様ペプチド、顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭＣＳＦ）、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、トロンボポエチン、抗体のＣＤＲに相当するペプチド、膵島新生関連タンパク質（Ｉｓｌｅｔ  Ｎｅｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ；ＩＮＧＡＰ）、カルシトニン、アンギオスタチン、エンドスタチン、インターロイキン−２、成長ホルモン放出因子、ヒト副甲状線ホルモン、抗腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ペプチド、インターロイキン−１（ＩＬ−１）受容体、および／または単鎖抗体を含んでいてもよい。
【０２２９】
また本発明の融合タンパク質は、新しい機能または新規な機能を有する分子に関してスクリーニングするために、ペプチドライブラリーから誘導されたペプチドまたはポリペプチドが含まれるように調製してもよい。このようなペプチドライブラリーとしては、商業的または公共的に利用可能なペプチドライブラリー、例えば、アメリカン・ペプチド社（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．）、セル・サイエンス社（Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、フェニックス・ファーマシューティカルズ社（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、ユナイテッド・ステイツ・バイオロジカル（Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）のペプチドライブラリーが挙げられ、加えて、利用可能な技術、例えば標準的手法を用いて作製されたバクテリオファージや細菌のディスプレイライブラリーによって生産されたペプチドライブラリーも挙げられる。
【０２３０】
本発明のさらにその他の実施態様において、融合タンパク質は、当分野既知の治療用タンパク質の成分を用いることによって調製してもよく、このようなタンパク質の成分の例としては、現在のところ食品医薬品局（Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）（www.fda.gov/cber/efoi/approve.htm）によって承認された、ペプチドおよびタンパク質、加えてＰＣＴ特許出願公開ＷＯ０１／７９２５８、ＷＯ０１／７７１３７、ＷＯ０１／７９４４２、ＷＯ０１／７９４４３、ＷＯ０１／７９４４４、およびＷＯ０１／７９４８０（これらはいずれも、参照によりその全体として本明細書に組み入れられる）が挙げられる。
【０２３１】
ＰＣＴ国際公開ＷＯ０３／０２０７４６（参照により本明細書に加入させる）の表１に、完全ではないが、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分、すなわちリガンド成分に相当する治療用タンパク質の一覧が提供されている。「治療用タンパク質Ｘ」の列は、治療用タンパク質分子を記載しており、それに続く括弧内には、その治療用タンパク質分子またはそれらのフラグメントもしくは変異体が含まれる、あるいはそれらで構成される科学名とブランド名を含む。本明細書で用いられる「治療用タンパク質Ｘ」は、個々の治療用タンパク質分子（ＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋ登録番号より入手できるアミノ酸配列で定義されるような）、またはこの列で開示された所定の治療用タンパク質分子に関連する治療用タンパク質のグループ全体のいずれかを意味する場合がある。「典型的な識別子」の列は、ケミカル・アブストラクツ・サービス（ＣＡＳ）のレジストリナンバー（米国化学会によって公開）、および／またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号（例えば、遺伝子座ＩＤ、ＮＰ−ＸＸＸＸＸ（参照配列タンパク質）、およびＸＰ−ＸＸＸＸＸ（モデルタンパク質）という識別子を示しており、このような識別子は、国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ；ＮＣＢＩ）のウェブページ（www.ncbi.nlm.nih.gov）を介して利用可能であり、タンパク質分子、または治療用タンパク質分子のフラグメントもしくは変異体のアミノ酸配列を含む、ＣＡＳレジストリまたはＧｅｎＢａｎｋデータベースにおけるエントリーに相当する。加えて、ＧｅｎＳｅｑ登録番号および／またはジャーナル出版物の引用が、いくつかのポリペプチドに関する典型的なアミノ酸配列を同定するために与えられている。
【０２３２】
これらＣＡＳおよびＧｅｎＢａｎｋ、ならびにＧｅｎＳｅｑ登録番号、同様に、引用されたジャーナル出版物それぞれに関連する要約の頁が利用可能であり（例えば、パブメドＩＤ番号（ＰｕｂＭｅｄ  ＩＤ  ｎｕｍｂｅｒ；ＰＭＩＤ））、これは参照によりその全体として本明細書に組み込まれる。ＰＣＴ／特許の参照の列は、治療用タンパク質分子を記載している特許および／または特許出願公開に相当する米国特許またはＰＣＴ国際公開番号を示す（これらはいずれも、参照によりその全体として本明細書に加入される）。生物活性の列は、治療用タンパク質分子に関連する生物活性を記載している。典型的な活性分析の列は、治療用タンパク質Ｘ部分を含む本発明の治療用タンパク質またはトランスフェリン融合タンパク質の治療活性および／または生物活性を試験するのに使用することができる分析を記載している参考文献を示す。また、これらの参考文献も、参照によりその全体として本明細書に加入される。「好ましい指標Ｙ」の列は、治療用タンパク質Ｘ、または治療用タンパク質Ｘ部分を含む本発明のトランスフェリン融合タンパク質によって治療、予防、診断または改善が可能な疾患、障害および／または状態を記載している。本発明は、ＷＯ０３／０２０７４６で提供された治療用タンパク質を含む（これは参照によりその全体として本明細書に加入される）。
【実施例】
【０２３３】
実施例１−  ＧＰＩアンカー、ｈＭＵＣ１、およびｍＴｆ発現カセットの製造
ｍＴｆ発現カセット（配列番号１６）を含むｐＲＥＸ０５４９ベクターを、ＳａｌＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した。図３は、ｐＲＥＸ０５４９に関するベクターのマップを示す。プライマーＰ０９２２およびＰ０９２３（配列番号７および配列番号８）を一緒にアニールし、ＳａｌＩ／ＨｉｎｄＩＩＩの消化部位でｐＲＥＸ０５４９にライゲーションした。Ｐ０９２２およびＰ０９２３によって形成されたリンカーには、ＳｐｅＩ、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩ制限部位が含まれ、ＧＰＩアンカーおよびＭＵＣ１軸をコードする核酸分子が受け入れられるように設計された。得られたベクターｐＲＥＸ０６２８には、Ｐ０９２２／Ｐ０９２３リンカーと共にｍＴｆ発現カセットが含まれる。
【０２３４】
ｐＲＥＸ０６２８を、ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｂａＩで消化した。プライマーＰ０９２４およびＰ０９２５（配列番号９および配列番号１０）をアニールして、ＧＰＩアンカーＹＩＲ０１９ｃを形成させた。ＹＩＲ０１９ｃを、消化したｐＲＥＸ０６２８にライゲーションし、ベクターｐＲＥＸ０６３４を形成させた。
【０２３５】
ｈＭＵＣ１のｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲで、プライマーＰ０９５８およびＰ０９５９（配列番号１１および配列番号１２）を用いて、ヒト乳腺腫瘍トータルＲＮＡライブラリー（クロンテック）から増幅した。得られたｃＤＮＡを、プライマーＰ１０１９およびＰ１０２０（配列番号１３および配列番号１４）で増幅して、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を作出した。このようにして得られたＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するｈＭＵＣ１は、配列番号６で示される。
【０２３６】
ｐＲＥＸ０６３４を、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化し、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位を有するｈＭＵＣ１をベクターにライゲーションした。このようにして得られたベクターｐＲＥＸ０６６３を、提示発現カセット（ｍＴｆ−ＭＵＣ１−ＧＰＩ）として用いた。
【０２３７】
ｐＲＥＸ０６６３を用いて、高および低コピー数の酵母発現ベクターを作出した。高コピー数の酵母発現ベクターを作出するために、４．１ｋｂの提示発現カセットを、ベクターをＮｏｔＩで消化することによってｐＲＥＸ０６６３から除去した。次に、この発現カセットを、ＮｏｔＩで消化し、脱リン酸化したｐＳＡＣ３５ベクターにライゲーションし、ベクターｐＲＥＸ０６６７（酵母提示ベクターＩ）を得た。
【０２３８】
低コピー数の酵母発現ベクターを、ｐＲＥＸ０６６３をＮｏｔＩで消化し、この発現ベクターを、ＮｏｔＩで消化し、脱リン酸化したｐＲＥＸ０６９９にライゲーションし、ｐＲＥＸ０７２１酵母提示（酵母提示ベクターＩＩ）を得ることによって作製した。
【０２３９】
上述の酵母発現ベクターを用いて当技術分野で既知のように酵母細胞および細菌細胞を形質転換させることができる。このようなベクターは、当技術分野で既知のように酵母で発現させることができる。さらに、ランダムペプチドまたはＣＤＲのようなリガンド成分のライブラリーを提示することができる発現したトランスフェリン融合タンパク質を収集物を作成することができ、さらに、当技術分野で既知のように結合に関してスクリーニングするのに用いることができる。
【０２４０】
実施例２−  １５−ｍｅｒのランダムライブラリーの構築
新規な結合特性を有するトランスフェリン変異体を選択するために、当技術分野で既知のＰＣＲニッティング法によって、トランスフェリンの２８９〜２９０のアミノ酸位置におけるランダムな１５−ｍｅｒのライブラリーを構築した（ＭａｒｔｉｎおよびＳｍｉｔｈ（２００６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３９６（２）：２８７〜９５を参照）。通常、結合エピトープを形成するのに必要なのはわずか約７個のアミノ酸であり、約１０9のライブ
ラリーは、設計されるライブラリー（３．３×１０19）のうちの小さなフラクションをカバーするに過ぎないが、１５−ｍｅｒのライブラリーを設計した。しかしながら、１０9のライブラリーサイズの場合、１５−ｍｅｒのライブラリーは、同じ規模の７−ｍｅｒのライブラリーよりも６．４倍多い７−ｍｅｒをカバーする。
【０２４１】
Ｐ１１７４／Ｐ１２２７を用いてトランスフェリンのＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩ配列を含むＤＮＡフラグメントを得た後、２回のＰＣＲ反応（それぞれ単一のプライマー−Ｐ１１７２およびＰ１１７３を使用）を行い、一本鎖ＤＮＡを得た。ｓｓＤＮＡを単離し、アニールして、結合した１５−ｍｅｒのライブラリーを形成した。この操作によって、ライブラリーが、合成オリゴヌクレオチドのもともとの複雑さを確実に維持するようにした。二本鎖のニットした１５−ｍｅｒのライブラリーを、Ｐ１１７４／Ｐ１２２７を用いてさらに増幅し、十分な量のＤＮＡを得た。ＰＣＲ産物を精製し、ＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩで消化し、適切なプラスミドベクター、例えばｐＲＥＸ０９９５（図４）またはｐＲＥＸ０６６７にクローニングした。
Ｐ１１７２（配列番号１９）
２８９〜２９０  １５−ｍｅｒのランダムペプチドライブラリーの挿入物がニットしたフォワードバックフラグメント
【化１】
2008546392.tif 000007
ＤＮＡ配列中の各位置にランダム性を導入するために、ＬａＢｅａｎおよびＫａｕｆｆｍａｎ（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．２：１２４９〜５４に従って、その位置にヌクレオチドの混合物（Ａ、Ｇ、ＴおよびＣ）を予め決められた比率で組み込んだ。以下で既定される混合物は、停止コドンの頻度を最小化し、アミノ酸組成を天然タンパク質に適合する。
５  １３％Ｔ，３２％Ｇ，２０％Ｃ，３５％Ａ
６  ２４％Ｔ，２４％Ｇ，２２％Ｃ，３０％Ａ
７  ３７％Ｔ，２６％Ｇ，３７％Ｃ。
Ｐ１１７３（配列番号２０）
フロントフラグメントのための２８９〜２９０  １５−ｍｅｒのランダムペプチドライブラリーがニットしたバックプライマー
【化２】
2008546392.tif 000008
Ｐ１１７４（配列番号２１）
フロントフラグメントのための２８９〜２９０  １５−ｍｅｒのランダムペプチドライブラリーがニットしたフォワードプライマー
【化３】
2008546392.tif 000009
Ｐ１２２７（配列番号２２）
バックフラグメントのための２８９〜２９０  １５−ｍｅｒのランダムペプチドライブラリーが結合したバックプライマー
【化４】
2008546392.tif 000010
【０２４２】
実施例３−  酵母細胞を提示するフラグの選択
酵母提示系を確立し、それを用いて、軸領域、ｈｕＭＵＣ１およびＧＰＩシグナル配列に融合させることによって酵母表面にトランスフェリンのＮ−ローブを提示した。この系の結合選択における有用性実証するために、フラグ−タグ配列
【化５】
2008546392.tif 000011
またはランダムな１５−ｍｅｒペプチドライブラリーを、トランスフェリンＮ−ローブのアミノ酸２８９番目に挿入した。次に、フラグタグを付けたトランスフェリンＮ−ローブ、ｐＲＥＸ１０１２を提示する酵母（図６）を、ランダムな１５−ｍｅｒのペプチドを有するトランスフェリンＮ−ローブを提示する酵母のプールに添加した。この混合群から、フラグタグを付けたトランスフェリンＮ−ローブを提示する酵母だけを、抗フラグ抗体を用いた選択によって回収した。
【０２４３】
フラグタグ配列を、トランスフェリンのアミノ酸２８９番目に挿入するために、フラグタグ配列を組み込んだオリゴを合成し、ＰＣＲでｐＲＥＸ０６６７ベクターにニットし、ｐＲＥＸ０７５９を生成させた（図７）。次に、ｐＲＥＸ０７５９のフラグタグ配列を含むＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩフラグメントを用いて、ｐＲＥＸ０９９５の同じ制限フラグメントを置換した（図４）。得られたプラスミドｐＲＥＸ１０１２は、フラグタグを付けたトランスフェリンＮ−ローブ−ＭＵＣ１−ＧＰＩ融合タンパク質を発現した。
【０２４４】
また、１５−ｍｅｒのライブラリーも、ｐＲＥＸ０９９５のＢａｍＨＩ／ＢｓｐＥＩ部位の間にクローニングした。１５−ｍｅｒのライブラリーの製造を以下で説明する。ライゲーションサンプルを、Ｅ．コリＤＨ５αに形質転換し、全ての形質転換混合物を、２ＬＢ／Ａｍｐ（５０μｇ／ｍＬ）の寒天プレートで平板培養した。全てのコロニーを回収し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）プラスミド・プレップ・プロトコールを用いて、数種のミニプレップカラムを用いてプラスミドＤＮＡを抽出した。
【０２４５】
ｐＲＥＸ１０１２と１５−ｍｅｒライブラリーの両方のプラスミドＤＮＡを、サッカロミセス・セレビジエ株ＤＳ１１０１ｃｉｒ°に形質転換した。ｐＲＥＸ１０１２の単一のコロニーを、スクロースを含む緩衝化した最小培地（ＢＭＭ／Ｓ）に植え付け、一晩培養した。１５−ｍｅｒライブラリーの全てのコロニーを回収し、ＢＭＭ／Ｓに植え付けた。これら二種の一晩培養したもの細胞数をヘマサイトメーターによって測定し、以下の細胞混合物を調製した：
（Ａ）１０9の１５−ｍｅｒライブラリー酵母細胞と１０：１０7の割合で混合された、１０3個のｐＲＥＸ１０１２酵母細胞
（Ｂ）１０8の１５−ｍｅｒライブラリー酵母細胞と１００：１０7の割合で混合された、１０3個のｐＲＥＸ１０１２酵母細胞。
【０２４６】
この細胞混合物を、細胞ブロック溶液（１×ＰＢＳ／０．０５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０、１％ＢＳＡ）１ｍｌ中、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離（１３０００ｒｐｍで３０秒）後、細胞ペレットを、ビオチン化抗フラグ抗体（シグマ・アルドリッチ、１：２５希釈）を含む洗浄溶液（１×ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ、２ｍＭのＥＤＴＡ）１ｍｌに懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄溶液１ｍｌで２回洗浄し、（Ａ）８００μｌまたは（Ｂ）１６０μｌのブロック溶液に懸濁した。細胞懸濁液（Ａ）２００μｌまたは（Ｂ）４０μｌにストレプトアビジンＭＡＣＳマイクロビーズ（ミルテニー・バイオテク）を添加し、氷上で３０分間インキュベートした。ＭＳカラムを製造元の説明書（ミルテニー・バイオテク）に従って用いて、非標識細胞から標識された細胞を分離した。標識された細胞を回収し、ＢＭＭ／Ｓアガロースプレート上で平板培養し、小さいコロニーが出現するまで３０℃でインキュベートした。
【０２４７】
各プレートから全てのコロニーを回収し、それらをＢＭＭ／Ｓ５ｍｌ中３０℃で一晩増殖させることによって、二回目の選択を行った。１．５のＯＤ600に等しいこれら培養細胞を、上述のようなさらなるＭＡＣＳ分離で処理した。この二回目のスクリーニングから得られた細胞を、ＢＭＭ／Ｓ５ｍｌ中で３０℃で一晩培養した。各選択の前および後の酵母細胞培養物を、アジレント・テクノロジー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ）製のバイオアナライザーで抗フラグモノクローナル抗体（シグマ・アルドリッチ）およびＡＰＣ標識ヤギ抗マウス検出抗体を用いたＦＡＣＳで分析した。ＦＡＣＳ分析は製造元の説明書に従って行われた。２回目のＭＡＣＳ分離の後、フラグタグを付けた酵母の存在が明らかになった（図８）。
【０２４８】
実施例４−  Ａｇａ１軸提示
酵母遺伝子ＡＧＡ１のコア領域のＤＮＡ配列（残基ＸＸＸ−ＸＸＸ）を、以下のプライマーを用いてＳ２８８ｃの酵母ゲノムＤＮＡをＰＣＲで処理することによって得た：
【化６】
2008546392.tif 000012
【０２４９】
約１．５ｋｂのＰＣＲ産物を単離し、ＸｂａＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化した。このフラグメントを、ＳｐｅＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＲＥＸ０８５５にライゲーションし（図９）、Ｅ．コリＤＨ５αに形質転換した。得られた全てのコロニーを回収し、プラスミドＤＮＡを細胞から単離した。発現カセットをＮｏｔＩ消化によって回収し、ｐＳＡＣ３５にライゲーションして、酵母発現ベクターを得た。
【０２５０】
上述したように、酵母に形質転換し、抗フラグ抗体でＦＡＣＳ分析した。酵母コロニーは、高レベルのＮ−ローブ提示を示し、匹敵するＭＵＣ１からなる軸をベースとするコンストラクトよりも約１０倍高かった（データ示さず）。
【０２５１】
酵母のシングルコロニーを単離し、この酵母細胞からプラスミドＤＮＡを抽出した。抽出されたプラスミドＤＮＡをＮｏｔＩで消化した後に、ＮｏｔＩ発現カセットを回収し、ＮｏｔＩで消化したｐＲＥＸ０８５５にライゲーションし、プラスミドｐＲＥＸ１０８７（図１０）、フラグ−Ｎ−ローブ−Ａｇａ１−ＧＰＩ発現カセットを含むＰＵＣベースのベクターを得た。Ａｇａ１に相当するＤＮＡ配列の領域を配列分析し、その同一性を確認した。さらにこの発現カセットもｐＳＡＣ３５に戻し、ｐＲＥＸ１１０６を得た（図１１）。
【０２５２】
実施例５−  酵母細胞で機能する哺乳動物のＧＰＩ変異体の選択
哺乳動物のＧＰＩシグナルは、それらの酵母カウンターパートが果たさない役割、例えば細胞内トラフィッキング、膜貫通シグナルの伝達、およびクラスリン非依存性のエンドサイトーシスといった役割を果たす（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９３，２９４：３０５〜３２４）。酵母細胞は、細胞膜を有するだけでなく、哺乳動物細胞にはない細胞壁も有し、酵母ＧＰＩの多くは、タンパク質を酵母細胞壁に標的化する特有の配列を有する（Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１９９９，１８１：３８８６〜３８８９）。ヒト胎盤のアルカリホスファターゼのＧＰＩは、酵母細胞では全く機能しないことが示されている（Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １９９９，３４：２４７〜２５６）。発現された組換えタンパク質を酵母細胞壁に付着させることができる新規な配列を得る手段として、ｐＲＥＸ０８８５をベースとするがｈｕＭＤＰのＧＰＩ配列
【化７】
2008546392.tif 000013
を用いた酵母提示ベクター（図９）を用いた。この配列を、４つの完全にランダムなコドン（Ｘ）、加えて数種の（下線で示した）合理的な改変が組み込まれるように改変した：
【化８】
2008546392.tif 000014
ここにおいて、Ｘはあらゆるアミノ酸である。
【０２５３】
以下の融合タンパク質、ＧＰＩ配列が上述の通りに改変されたフラグタグ−Ｎ−ローブ−ＭＵＣ１からなる軸−ＧＰＩを発現する酵母ライブラリーを、サッカロミセス・セレビジエ株ＤＳ１１０１ｃｉｒ°に形質転換した。本融合タンパク質が細胞壁に付着した全ての酵母細胞を、ビオチン化抗フラグ抗体を用いたＭＡＣＳによって単離した。
【０２５４】
２つのオリゴＰ２０３５およびＰ２０３６（以下を参照）をアニールし、Ｔａｑポリメラーゼを用いて伸長させた。得られたＤＮＡフラグメントを精製し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化したｐＲＥＸ０８５５にライゲーションした（以下および図９を参照）。
プライマー
【化９】
2008546392.tif 000015
【０２５５】
ライゲーション混合物をＥ．コリＤＨ５αに形質転換し、約５ｘ１０5個のコロニーを得た。全てのコロニーを回収し、プラスミドＤＮＡを単離した。プラスミドＤＮＡをＮｏｔＩで消化し、発現カセットを回収し、ＳＡＣ３５にクローニングし、酵母発現ライブラリーを作出した。このライブラリーをエレクトロポレーションでＤＳ１１０１ｃｉｒ°細胞に形質転換した。上述のライブラリーを一晩培養したものを、ビオチン化抗フラグ抗体を用いたＭＡＣＳで処理した。再度、単離した細胞を同じ抗体を用いたＭＡＣＳによって即座に精製した。得られた細胞をＢＭＭＳプレートに平板培養し、２４個のコロニーをＦＡＣＳとＤＮＡ配列分析によって特徴付けた（フラグの付加の説明を参照）。
【０２５６】
読取り可能な配列を示した２２個のクローンのうち７個が、全長のＧＰＩアンカーを有しており（表１）、その提示レベルは様々であり、そのうち最良のものは、酵母ＧＰＩアンカーを有する同じ融合タンパク質を発現するｐＲＥＸ１００３ベクターよりも優れていた。
【０２５７】
【表５】
2008546392.tif 000016
【表６】
2008546392.tif 000017
【０２５８】
意外なことに、ＧＰＩアンカーシグナルを有効に欠失させるランダム化したコドンのうち１つにおける停止コドンによってクローンの５０％がトランケーションされた。これらの１２種のクローンのうち２種が、ｐＲＥＸ１００３よりも有意に優れた提示レベルを有することが測定され、停止コドンの直前にシステイン残基を含むことがわかった（ＣＱＩＧＧＳ*（配列番号３４）およびＣＱ*、ここにおいて*は停止コドン）（図１２）。恐らく、これらのコンストラクトは、細胞壁タンパク質中の遊離のシステイン残基にジスルフィド結合することを介して細胞壁に架橋された。
【０２５９】
上記の実施例を参照として本発明を詳細に説明したが、当然ながら、本発明の本質から逸脱することなく様々な改変を施すことができる。従って、本発明は以下の請求項によってのみ限定される。本願において言及された全ての引用された特許、特許出願および出版物を、参照によりその全体として本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
【図１】トランスフェリン融合タンパク質上に提示されたランダムペプチドまたはＣＤＲライブラリー、およびリガンドと標的との結合を示す。
【図２】酵母ＹＩＲ０１９ＣＧＰＩアンカーペプチド配列を示し、細胞膜への付着に関与するアミノ酸を強調表示した。
【図３】ｐＲＥＸ０５４９に関するベクターのマップを示す。
【図４】ｐＲＥＸ０９９５に関するベクターのマップを示す。
【図５】ｐＲＥＸ０６６７に関するベクターのマップを示す。
【図６】ｐＲＥＸ１０１２に関するベクターのマップを示す。
【図７】ｐＲＥＸ０７５９に関するベクターのマップを示す。
【図８】２回のＭＡＣＳ分離の後のフラグタグを付けた酵母の存在を示す。
【図９】ｐＲＥＸ０８５５に関するベクターのマップを示す。
【図１０】ｐＲＥＸ１０８７に関するベクターのマップを示す。
【図１１】ｐＲＥＸ１１０６に関するベクターのマップを示す。
【図１２】ＭＵＣ１およびＡＧＡ１を用いたＦＡＣＳ分析を示す。
【図１】
2008546392.tif 000018
【図２】
2008546392.tif 000019
【図３】
2008546392.tif 000020
【図４】
2008546392.tif 000021
【図５】
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【図６】
2008546392.tif 000023
【図７】
2008546392.tif 000024
【図８】
2008546392.tif 000025
【図９】
2008546392.tif 000026
【図１０】
2008546392.tif 000027
【図１１】
2008546392.tif 000028
【図１２】
2008546392.tif 000029
【配列表】
2008546392000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年4月16日(2008.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008546392000001.app
【国際調査報告】
2008546392.tif 000072