(57)【要約】  本発明は、トリプトファニル‐ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の血管新生抑制断片とならびに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナリング阻害剤および血管成長阻害量インテグリンシグナリング阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物とを含む血管形成抑制薬の血管成長阻害量を新生血管病または腫瘍患者に投与することによる、例えば網膜新生血管疾病および腫瘍等の新生血管病を治療する組成物および方法を提供する。本方法に用いられる組成物は、薬学上許容できる添加剤と共に、トリプトファニル-ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の血管新生抑制断片とならびに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤の少なくとも１つとの混合物を含む。
2008501718.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トリプトファニル‐ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の血管新生抑制断片と治療薬を含む新生血管疾病の治療に適した組成物。
【請求項２】
前記ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片が約４８kDa以下の分子量を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片が約４６kDa以下の分子量を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片が約４３kDa以下の分子量を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＴｒｐＲＳの血管新生抑制の断片がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記治療薬がＶＥＧＦアプタマーおよび血管新生抑制インテグリンアンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つの抗血管新生剤を含む請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記少なくとも１つの抗血管新生剤がＶＥＧＦ‐１６５アプタマーを含む請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
ＶＥＧＦ-１６５アプタマーが２’‐フルオロピリミジンＲＮＡに基づくＶＥＧＦ‐１６５アプタマーである請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記２’‐フルオロピリミジンＲＮＡに基づくＶＥＧＦ‐１６５アプタマーがペガプタニブナトリウムである請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの抗血管新生剤がαvβ３インテグリンまたはαvβ５インテグリンの血管新生抑制性、ペプチド擬似アンタゴニストを含む請求項６に記載の組成物。
【請求項１１】
前記αvβ３インテグリンまたはαvβ５インテグリンのペプチド擬似アンタゴニストが化合物（１）の化学式を有する化合物である請求項１０に記載の組成物。
【化１】
2008501718.tif 000018
【請求項１２】
前記治療薬が血管新生抑制ステロイド、抗悪性腫瘍薬、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗炎症薬からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
トリプトファニル‐ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の血管新生抑制断片およびＶＥＧＦアプタマーおよび血管新生抑制インテグリンアンタゴニストからなる群から選択される少なくとも１つの抗血管新生薬剤を含む組成物。
【請求項１４】
前記ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記少なくとも１つの抗血管新生薬剤がＶＥＧＦ‐１６５アプタマーを含む請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＶＥＧＦ‐１６５アプタマーが２'-フルオロピリミジンＲＮＡに基づくＶＥＧＦ-１６５アプタマーである請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記２’‐フルオロピリミジンＲＮＡに基づくＶＥＧＦ‐１６５アプタマーがペガプタニブナトリウムである請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの抗血管新生剤がαvβ３インテグリンまたはαvβ５インテグリンの血管新生抑制アンタゴニストを含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
αvβ３インテグリンまたはαvβ５インテグリンの前記血管新生抑制のアンタゴニストが化合物（１）の化学式を有する請求項１８に記載の組成物。
【化２】
2008501718.tif 000019
【請求項２０】
前記少なくとも１つの抗血管新生剤がペガプタニブナトリウムおよび化合物（１）の化学式を有する化合物を含む請求項１３に記載の組成物。
【化３】
2008501718.tif 000020
【請求項２１】
血管新生抑制ステロイド、抗悪性腫瘍薬、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗炎症薬からなる群から選択される少なくとも１つの治療薬を更に含む請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片が二量体である請求項１３に記載の組成物。
【請求項２３】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片が二量体である請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
トリプトファニル‐ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の血管新生抑制断片と、ならびに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤からなる群から選択される少なくとも１つの化合物とを含む配合薬の血管成長阻害量を新生血管病に罹っている哺乳類へ投与することを含む新生血管疾病の治療方法。
【請求項２５】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択されるアミノ酸配列を持ち、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナリング阻害剤がペガプタニブナトリウムであり、およびインテグリンシグナリング阻害剤が化合物（１）の化学式を有する化合物である請求項２４に記載の方法。
【化４】
2008501718.tif 000021
【請求項２６】
哺乳類がヒトである請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
疾病が網膜新生血管病である請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
配合薬が網膜新生血管病に罹かっている哺乳類の眼球に硝子体注射によって投与される請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
疾病が虚血性の網膜症、血管出血、血管漏出、脈絡膜症、加齢に関係した黄斑部変性、糖尿病性網膜症、推定眼ヒストプラスマ症、未熟児網膜症、鎌形赤血球貧血および色素性網膜炎からなる群から選択される請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
腫瘍に罹っている哺乳類にトリプトファニル‐ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の血管新生抑制断片と、ならびに血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤を含む群から選択される少なくとも１つの化合物とを含む配合薬の血管成長阻害量を投与することを含む腫瘍の治療方法。
【請求項３１】
前記ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナリング阻害剤がペガプタニブナトリウムである請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記インテグリンシグナリング阻害剤が化合物（１）の化学式を有する化合物である請求項３０に記載の方法。
【化５】
2008501718.tif 000022
【請求項３４】
前記哺乳類がヒトである請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１の組成物およびこれのための薬学上許容できる担体を含む医薬品組成物。
【請求項３６】
請求項１３の組成物およびこれのための薬学上許容できる担体を含む医薬品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新生血管病（例えば網膜新生血管病）の治療に関する。より詳細には本発明は、患者に対して血管新生抑制と抗血管新生薬を併用投与することによる新生血管病の治療方法および当該方法に使用する組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
破滅的な失明を生じる大多数の病気は、眼の新生血管形成に起因する。例えば、加齢に関係した黄斑部変性（ＡＲＭＤ）は、６５才以上の米国人１２００万〜１５００万人に影響を与え、脈絡膜（網膜下）新生血管形成に直接作用することにより、その１０〜１５％が視力を失う。６５才未満の米国人の視力喪失の主要原因は糖尿病である。米国では１６００万人が糖尿病患者であり、年間に４万人が、多くの場合網膜新生血管形成の結果である糖尿病の眼の合併症を患う。ハイリスク糖尿病患者のサブグループにおいて、レーザー光凝固術は重度の視力喪失を防ぐことに有効であるが、１０年間の全体の網膜症発現頻度は実質的に横ばい状態である。ＡＲＭＤによる脈絡膜血管新生または眼ヒストプラスマ症のような炎症性眼疾患者にとって、一部の例外を除き、光凝固術は視力喪失を防ぐことに効果を示さない。最近開発された非破壊的な光感作療法により、これまで治療不能な脈絡膜血管新生患者個々の傷害の一時的な緩和が期待できるが、プラセボ投与群の４５．９％と比較して、３〜４ヵ月ごとに治療された患者のわずか６１．４％で視力が向上したか安定した。
【０００３】
ＡＲＭＤと糖尿病性網膜症は、先進国における視力喪失の主要原因であり、これは異常な網膜新生血管形成の結果である。網膜は神経細胞、グリアおよび脈管要素の明確に定義された層から構成されるため、脈管増殖または浮腫において観察される比較的小さな障害が、重大な視覚機能の喪失につながる。例えば色素性網膜炎（ＲＰ）のような遺伝性網膜変性は、細動脈狭窄や脈管萎縮のような脈管異常とも関係している。血管形成促進および阻害因子の同定に著しい進展が遂げられてきたが、現在眼疾患を具体的に治療するために利用できる有効な治療法はない。
【０００４】
網膜の遺伝性変性は、３５００人に１人の割合で発症し、多くの場合完全な失明へと進む進行性夜盲症、視野欠損、視神経委縮、細動脈の減衰、血管透過性変化および中心部失明によって特徴づけられる（Ｈｅｃｋｅｎｌｉｖｅｌｙ，Ｊ．Ｒ．編，１９８８；Ｒｅｔｉｎｉｔｉｓ  Ｐｉｇｍｅｎｔｏｓａ、Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ：ＪＢ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏ．）。これらの病気の分子遺伝分析から、１１０以上の異なる遺伝子の突然変異が同定されたが、それらの突然変異によるものが既知発症者の中で占める割合は比較的低かった（Ｈｕｍｐｈｒｉｅｓら，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０４‐８０８；Ｆａｒｒａｒら，２００２，ＥＭＢＯ  Ｊ．２１：８５７‐８６４．）。これらの突然変異の多くは、ロドプシン、ｃＧＭＰホスホジエステラーゼ、ｒｄｓペリフェリンおよびＲＰＥ６５を含む光伝達機構の酵素および構造要素に関係している。これらの知見にもかかわらず、この網膜変性疾患進行を遅らせるか食い止める有効な治療はまだ無い。最近の遺伝子治療の進展により、特異的な突然変異を有する動物の光受容器または網膜色素上皮（ＲＰＥ）に野生型遺伝子を導入して、マウスのｒｄｓ（Ａｌｉら，２０００，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２５：３０６‐３１０）とｒｄ（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，１９９９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：７８１２‐７８１６）の表現型および犬のＲＰＥ６５表現型（Ａｃｌａｎｄら，２００１，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：９２‐９５）の回復に成功した。
【０００５】
血管形成は新しい血管の形成過程である。特異的な化学シグナルに応答して、毛細管は既存の血管から出芽し、最終的に生物にとって必要なサイズに成長する。初期に血管内部を覆う血管内皮細胞が既存の血管と直角方向に分裂し、頑丈な芽を形成する。ついで隣接した血管内皮細胞は巨大な液胞を形成するが、液胞は末端同士で配向し、最終的に合体して新たな毛細管管腔を形成する（管形成）。
【０００６】
血管形成は傷害応答等のさまざまな状況により促進され、哺乳類のような脊椎動物では実質的に、全ての組織の発達を伴う。血管形成は特定のガンのようなある種の疾病状態においても役割を果たす。例えば腫瘍の増殖は、生長する腫瘍組織に酸素と栄養を与える血管の発達を必要とする。さらに、眼の新生血管形成は、破滅的な失明に至る大部分の眼疾と関係している。
【０００７】
血管形成は、血管形成過程を刺激する化学シグナルを妨害することで抑制あるいは阻害される可能性がある。例えば、血管由来の血管内皮細胞は血管を取り囲む基底層を消化するプロテアーゼを生産し、したがって新たな毛細管のための経路を開く。これらのプロテアーゼあるいはその形成を阻害することで、新たな血管形成を妨げることができる。同様に、血管内皮細胞は化学シグナルに応答して増殖する。特に重要な増殖シグナルとして、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）とタンパク質の繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーが挙げられる。ＶＥＧＦは、特定の腫瘍の血管新生に関係することが示されてきた。これらの増殖シグナリング過程に干渉することにより、血管形成阻害も可能となる。
【０００８】
複数の因子が血管形成に関係している。酸性および塩基性線維芽細胞成長因子は、血管内皮細胞と他の細胞型の分裂促進因子である。血管内皮細胞の高度選択性分裂促進因子はＶＥＧＦである。
【０００９】
健康な成人では、血管形成はしっかりと制御されており、創傷治癒、妊娠と子宮周期に限られる。血管形成は、特異的な血管由来の分子、例えば塩基性および酸性繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、ＶＥＧＦ、アンギオゲニン、形質転換成長因子（ＴＧＦ）、腫瘍壊死因子‐α（ＴＮＦ‐α）および血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）によって刺激される。血管形成は阻害性分子、例えばインターフェロン‐α、ロンボスポンジン‐１、アンギオスタチンおよびエンドスタチンにより抑制できる。通常では静止状態の毛細脈管系を制御するのは、これらの自然に分泌される刺激因子と阻害因子の均衡である。この均衡が混乱した場合、ある種の疾病状態で見られるように、毛細管内皮細胞は誘導されて増殖し、移動し、最終的に分化する。
【００１０】
血管形成は、ガンおよび眼の新生血管形成を含む様々な病気の中心的な役割を演ずる。腫瘍由来の血管形成因子に応答する腫瘍内への新たな宿主血管の成長に依存して、様々な腫瘍の増殖と転移が持続することが示された。様々な刺激に応答する新たな血管増殖は、増殖性糖尿病性網膜症、ＡＲＭＤ、血管新生緑内障、間質性角膜炎および未熟児網膜症のような大多数の眼疾と失明での主要所見として生じる。これらの病気では、組織傷害が血管形成因子放出を促進して毛細管の増殖を引き起こす。ＶＥＧＦは、虹彩新生血管形成と新生血管網膜症において支配的な役割を演ずる。眼内ＶＥＧＦレベルと虚血網膜性眼新生血管形成間の明らかな相関関係が報告されているが、ＦＧＦも同様な役割を果たす可能性がある。たとえ検出可能なレベルが常に新生血管形成と相関しないとしても、塩基性および酸性ＦＧＦは健康な成人網膜に存在することが知られている。これは主にＦＧＦが細胞外マトリックスの帯電成分に非常にしっかりと結合し、眼内分泌液の標準的なアッセイで検出される自由拡散型として直ちに検知できる状態でないことが主な原因である可能性がある。
【００１１】
血管形成応答の最終共通経路は、増殖血管内皮細胞と細胞外マトリックス間のインテグリン媒介性情報伝達交換に関係する。このクラスの接着受容体はインテグリンと呼ばれ、全細胞でαとβサブユニットを持つヘテロ二量体として発現する。このようなインテグリンαvβ３は、このファミリーで最も選択性の低いメンバーで、血管内皮細胞を様々な細胞外マトリックス構成要素と相互作用させる。このインテグリンのペプチドと抗体アンタゴニストは、増殖血管内皮細胞のアポトーシスを選択的に誘導して、血管形成を阻害する。血管形成には２つのサイトカイン依存性経路が存在し、異なる血管細胞インテグリン、αvβ３とαvβ５に対する依存性で定義できる。ウサギ角膜とニワトリ絨毛尿膜（ＣＡＭ）モデルでは、各インテグリン抗体アンタゴニストはこれらの血管形成経路中の一経路を選択的に遮断するので、特に塩基性ＦＧＦとＶＥＧＦ誘導性の血管形成はインテグリンαvβ３とαvβ５にそれぞれ依存する。全てのαvインテグリンを遮断するペプチドアンタゴニストは、ＦＧＦとＶＥＧＦ刺激性の血管形成を阻害する。健康なヒト眼球血管にはいずれのインテグリンも見出されないが、αvβ３とαvβ５インテグリンは活発な新生血管眼病の患者由来組織の血管に選択的にみられる。ＡＲＭＤ患者組織ではαvβ３のみが定常的に観察されたが、αvβ３とαvβ５のいずれもが増殖糖尿病性網膜症患者の組織に存在した。全身的に投与したインテグリンペプチドアンタゴニストは、網膜血管形成マウスモデルにおいて、新たな血管形成を遮断した。
【００１２】
したがって、抗血管新生剤は、これらの栄養性と成長因子の有害な作用を防止し、網膜変性を治癒する役割を持つ。血管形成剤には、細胞への血流を高めることによって、網膜変性遅延のための望ましい血管新生を促進する役割もある。
【００１３】
非常に大きな研究努力が疾患の増悪期間における血管形成機構の理解にはらわれており、これらの研究結果として、多数の血管新生抑制分子が臨床試験でテストされ、あるいは現在テストされている。しかし、これまでこれらの臨床試験結果は期待外れで、これらの抗血管新生治療による患者の利益は最小限度にとどまっている。
【００１４】
血管新生抑制治療が最終的に成功する前に、多数の因子を考慮する必要があるであろう。自然発生的な代償機構は、最終的に血管形成の単独療法を旧式なものにし得る。一般に血管新生抑制薬は単一のサイトカインまたは細胞内血管形成経路を標的とする。おそらくインビボでの血管形成は、複数経路のシグナリングの組み合わせによって開始される。したがって、新生血管病治療中での単一経路の遮断は、血管形成を妨げるには不十分であろう。さらに問題を難しくするのは、単一経路の遮断が補償および他の血管形成経路の役割の上昇を誘導すると考えられることである。
【００１５】
異なる経路を標的とした血管新生抑制化合物の併用同時投与が血管新生抑制の可能性を高め、さらに自然発生的な代償機構を妨害することが今わかった。
【発明の開示】
【００１６】
本発明は、新生血管病の哺乳類に新たな血管形成阻害に十分な血管形成抑制薬の配合薬の一定量を投与することで、例えば網膜新生血管病等の新生血管病を治療する組成物と方法を提供する。これらの薬剤は、トリプトファニル‐ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の血管新生抑制断片と治療薬の併用が可能である。好ましくは、前記治療薬はＶＥＧＦシグナリング阻害剤、インテグリンシグナリング阻害剤またはその併用である。さらに、前記治療薬には血管新生抑制ステロイド、抗悪性腫瘍薬、抗菌剤、抗ウイルス剤および抗炎症薬、などが挙げられる。好ましくは、哺乳類はヒトである。
【００１７】
特に好ましい方法の実施形態は、新生血管病の哺乳類にＴｒｐＲＳの血管新生抑制の断片（例えば、ここに記載されるＴ１断片、Ｔ２断片またはミニＴｒｐＲＳ断片）およびＶＥＧＦシグナリング阻害剤とインテグリンシグナリング阻害剤から選択される少なくとも１つの化合物を含む薬剤混合物の血管成長阻害量を投与することを含む。本目的のための特に好ましい実施形態は、Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ血管新生抑制の断片、ＶＥＧＦアプタマー等のＶＥＧＦシグナリング阻害剤、αvβ３およびαvβ５等のインテグリンシグナリング阻害剤の３剤併用である。特に好ましい３剤併用には、ヒトＴｒｐＲＳのＴ２断片、ＶＥＧＦ‐１６５に特異的なＶＥＧＦアプタマー（例えば、ペガプタニブ・ナトリウム）およびペプチド擬似αvβ３およびαvβ５インテグリンシグナリング阻害剤（例えば、ここに記載される化合物（１））が含まれる。この特定の３剤の併用は、哺乳類の眼の新生血管形成阻害に対して強い相乗効果を示す。
【００１８】
本発明の前記方法によって治療できる新生血管病は、新生児、若年のあるいは完全に成熟した哺乳類における眼球疾病、例えば網膜変性疾患、網膜血管変性疾患、虚血性の網膜症、血管出血、血管漏出および脈絡膜症等を含むが、これらに限定されるものではない。本発明の前記方法は、例えば、固形腫瘍ガン（例えば肺ガン、乳ガンおよび前立腺ガン）および慢性関節リウマチのような新生血管病の治療に利用することもできる。
【００１９】
新生血管病の阻害、したがって新生血管病の治療に役立つ治療組成物は、薬学上許容できる添加剤およびその担体と共にトリプトファニル‐ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）血管新生抑制断片、ＶＥＧＦシグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤の混合物を含む。本発明の治療的組成物は、場合によって、血管新生抑制ステロイド、抗悪性腫瘍薬、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症薬、などの治療薬を１つ以上含むこともできる。
【００２０】
新生血管病治療に適した組成物は、トリプトファニル‐ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の血管新生抑制断片と治療薬を含む。好ましくは、治療薬はＶＥＧＦシグナリング阻害剤（例えば、ＶＥＧＦアプタマー）とインテグリンシグナリング阻害剤（例えば、血管新生抑制インテグリンアンタゴニスト）からなる群から選択される少なくとも１つの抗血管新生薬剤を含む。
【００２１】
好ましいＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片は、４３kDaの断片（例えば、Ｔ２断片、「Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ」、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１；Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの変異体、「Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ‐ＧＤ」、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２；これら両方の配列を図１に示す。）、例えばミニＴｒｐＲＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３、図２に示す。）として知られる切断型のＴｒｐＲＳのような４８kDaの断片およびＴ１‐ＴｒｐＲＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、図２に示す。）として知られる切断型ＴｒｐＲＳのような４６kDaの断片を含む。Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ‐ＧＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）のアミノ酸配列は、２つのアミノ酸残基置換（すなわち、Ｓ１２１ＧとＹ１２２Ｄ）により、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と異なる。Ｔ１、Ｔ２とそのミニ断片の位置の表示とともに、完全長ヒトＴｒｐＲＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）のアミノ酸配列を、図３に示す。理論にとらわれることなく、ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片が非共有結合の二量体を形成することができると考えられており（例えば、Ｙｕら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００４，２７９：８３７８‐８３８８参照）この二量体は、その断片の生物学的活性に寄与する可能性がある。したがって、ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片（例えば、Ｔ１‐ＴｒｐＲＳ、Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ、ミニＴｒｐＲＳ）に対する添付の特許請求の範囲のあらゆる言及は、モノマー形、二量体形またはこれらの混合物についての言及として解釈されるべきである。
【００２２】
好ましいインテグリンシグナリング阻害剤は、αvβ３とαvβ５アンタゴニストであり（ＲＧＤペプチドを含む）、例えば米国特許第５，６９３，６１２号、米国特許第５，７６６，５９１号、米国特許第５，７６７，０７１号、米国特許第５，７８０，４２６号および米国特許第６，６１０，８２６号に記載され、これら文献の関連する開示を参照により本明細書に取り込む。ペプチド擬似インテグリンアンタゴニストは米国特許第５，６１４，５３１号、米国特許第５，６１４，５３５号、米国特許第６，３２６，４０３号、米国特許第６，４５５，５２９号、米国特許第６，５２１，６４６号、米国特許第６，５５９，１４４号、米国特許番号６，５７６，６３７、米国特許第６，６０２，８７６号、米国特許第６，６４５，９９１号および米国特許第６，６４９，６１３号に記載され、これら文献の関連する開示を本明細書に参照により取り込む。特に好ましいペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤は、化合物（１）の化学式を有する化合物であり、ＥＭＤ４７２５２３としてＭｅｒｃｋ  ＫＧａＡ（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）から入手できる。
【００２３】
化合物（１）
【化６】
2008501718.tif 000003
【００２４】
好ましいＶＥＧＦシグナリング阻害剤は、ＶＥＧＦ選択的アプタマー（オリゴヌクレオチド結合タンパク質）、好ましくはＶＥＧＦ‐１６５に結合するヌクレアーゼ抵抗性アプタマー（例えば、Ｒｕｃｋｍａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９８，２７３：２０５５６‐２０５６７（この関連する開示を参照により本明細書に取り込む。）に記載されているＶＥＧＦ‐１６５に結合する２’‐フルオロピリミジンＲＮＡに基づくアプタマーなど）、ＶＥＧＦに結合する抗ＶＥＧＦ抗体とその断片（例えば、Ｒｈｕ抗体（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ（Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡから入手可能）およびそのＦａｂ断片（ＲｈｕＦａｂ  Ｖ２））、可溶性ＶＥＧＦ受容体（例えば可溶性ＶＥＧＦＲ１）、およびＶＥＧＦを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）またはその受容体（例えばＲｅｉｃｈら，Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．２００３；９：２１０‐２１６（この関連する開示を参照により本明細書に取り込む。）に記載されているｓｉＲＮＡ）を含む。好ましいＶＥＧＦシグナリング阻害剤はヌクレアーゼ抵抗性ＶＥＧＦアプタマーであり、さらに好ましくは、ペガプタニブナトリウム（化合物（２））のようなＶＥＧＦ‐１６５に特異的な２’‐フルオロピリミジンＲＮＡに基づいたアプタマーであり、以下の式を有するポリエトキシレート化オリゴヌクレオチドである（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、図５９；図５９のＲは４０kDaのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）鎖である。）。
【００２５】
５’‐４０ＫのＰＥＧ‐Ｃ５アミノリンカー‐ＣｆＧｍＧｍＡｒＡｒＵｆＣｆＡｍＧｍＵｆＧｍＡｍＡｍＵｆＧｍＣｆＵｆＵｆＡｍＵｆＡｍＣｆＡｍＵｆＣｆＣｆＧｍ３’‐３’ｄＴ
Ｃｆ＝２’フルオロＣ  Ａｒ＝２’ＯＨ（リボ）Ａ
Ｕｆ＝２’フルオロＵ  ３’‐３’ｄＴ＝反転したデオキシＴ
Ａｍ＝２’ＯメチルＡ  Ｃ５アミノリンカー＝ペンチルアミノリンカー
Ｇｍ＝２’ＯメチルＧ
４０Ｋ  ＰＥＧ ＝ ４０Ｋ  ポリエチレングリコールアミド。
【００２６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のポリエトキシレート化オリゴヌクレオチドはＥｙｅｔｅｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社により商標ＭＡＣＵＧＥＮＲとして商業的に販売され、ＮＸ１８３８またはペガプタニブナトリウムとしても周知である。
【００２７】
１つの実施態様において、薬剤の併用は、少なくとも１つの付加的な治療薬、例えば血管新生抑制のステロイド、抗悪性腫瘍薬、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症薬なども含む。
【００２８】
適切な血管新生抑制ステロイドの例は、アネコルタブ酢酸塩およびトリアムシノロンアセトニドを含む。
【００２９】
適切な抗悪性腫瘍薬の例は、アクラルビシン；アコダゾール塩酸塩；アクロニン；アドゼレシン；アルデスロイキン；アルトレタミン；アムボマイシン；アメタントロン酢酸塩；アミノグルテチミド；アムサクリン；アナストロゾール；アントラマイシン；アスパラギナーゼ；アスペルリン；アザシチジン；アゼテパ；アゾトマイシン；バチマスタット；ベンゾデパ；ビカルタミド；ビサントレン塩酸塩；ビスナフィドジメシレート；ビゼレシン；ブレオマイシン硫酸塩；ブレキナルナトリウム；ブロピリミン；ブスルファン；カクチノマイシン；カルステロン；カラセミド；カルベチマー；カルボプラチン；カルムスチン；カルビシン塩酸塩；カルゼレシン；セデフインゴール；クロラムブシル；シロレマイシン；シスプラチン；クラドリビン；クリスナトールメシレート；シクロホスファミド；シタラビン；ダカルバジン；ダクチノマイシン；ダウノルビシン塩酸塩；デシタビン；デキソルマプラチン；デザグアニン；デザグアニンメシレート；ジアジコン；ドセタキセル；ドキソルビシン；ドキソルビシン塩酸塩；ドロロキシフェン；ドロロキシフェンクエン酸塩；ドロスタノロンプロピオン酸塩；ドウアゾマイシン；エダトレキサート；エフロルニチン塩酸塩；エラサミトルシン；エンロプラチン；エンプロメート；エピプロピジン；エピルビシン塩酸塩；エルブロゾール；エソルビシン塩酸塩；エストラムスチン；エストラムスチンリン酸ナトリウム；エタニダゾール；エチオダイズド油Ｉ１３１；エトポシド；エトポシドリン酸；エトプリン；ファドロゾール塩酸塩；ファザラビン；フェンレチニド；フロクスウリジン；フルダラビンリン酸塩；フルオロウラシル；フルロシタビン；ホスキドン；ホストリエシンナトリウム；ゲムシタビン；ゲムシタビン塩酸塩；金のＡｕ１９８；ヒドロキシ尿素；イダルビシン塩酸塩；イホスファミド；イモホシン；インターフェロンα‐２ａ；インターフェロンα‐２ｂ；インターフェロンα‐ｎ１；インターフェロンα‐ｎ３；インターフェロンβ‐Ｉａ；インターフェロンγ‐Ｉｂ；イプロプラチン；イリノテカン塩酸塩；ランレオチド酢酸塩；レトロゾール；ロイプロリド酢酸塩；リアロゾール塩酸塩；ロメトレキソールナトリウム；ロムスチン；ロソキサントロン塩酸塩；マソプロコール；メイタンシン；メクロレタミン塩酸塩；メゲストロール酢酸塩；メレンゲストロール酢酸塩；メルファラン；メノガリル；メルカプトプリン；メトトレキサート；メトトレキサートナトリウム；メトプリン；メツレデパ；ミチンドミド；マイトカルシン；マイトクロミン；マイトジリン；マイトマルシン；マイトマイシン；マイトスペル；ミトーテン；ミトキサントロン塩酸塩；ミコフェノール酸；ノコダゾール；ノガラマイシン；オルマプラチン；オキシスラン；パクリタキセル；ペガスパルガーゼ；ペリオマイシン；ペンタムスチン；ペプロマイシン硫酸塩；ペルホスファミド；ピポブロマン；ピポスルファン；ピラキサントロン塩酸塩；プリカマイシン；プロメスタン；ポルフィマーナトリウム；ポルフィロマイシン；プレドニマスチン；プロカルバジン塩酸塩；ピューロマイシン；ピューロマイシン塩酸塩；ピラゾフリン；リボプリン；ログレチミド；サフィンゴール；サフィゴール塩酸塩；セムスチン；シムトラゼン；スパルフォセートナトリウム；スパルソマイシンｌ；スピロゲルマニウム塩酸塩；スピロムスチン；スピロプラチン；ストレプトニグリン；ストレプトゾシン；塩化ストロンチウムＳｒ８９；スロフェヌル；タリソマイシン；タキサン；タキソイド；テコガランナトリウム；テガフール；テロキサントロン塩酸塩；テモポルフィン；テニポシド；テロキシロン；テストラクトン；チアミプリン；チオグアニン；チオテパ；チアゾフリン；チラパザミン；トポテカン塩酸塩；トレミフェンクエン酸塩；トレストロン酢酸塩；トリシリビンリン酸塩；トリメトレキサート；トリメトレキサートグルクロン酸；トリプロレリン；ツブロゾール塩酸塩；ウラシルマスタード；ウレデパ；バプレオチド；ベルテポルフィン；ビンブラスチン硫酸塩；ビンクリスチン硫酸塩；ビンデシン；ビンデシン硫酸塩；ビネピジン硫酸塩；ビングリシネート硫酸塩；ビンレウロシン硫酸塩；ビンオレルビン酒石酸塩；ビンロシジン硫酸塩；ビンゾリジン硫酸塩；ボロゾール；ゼニプラチン；および、ジノスタチン；ゾルビシン塩酸塩が挙げられる。
【００３０】
適切な抗細菌性剤の例としてはこれらに限定されないが、ペニシリン、アミノグリコシド、マクロライド、モノバクタム、リファマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、イミペネム、フシジン酸、ノボビオシン、ホスホマイシン、フシジン酸ナトリウム、ネオマイシン、ポリミキシン、カプレオマイシン、コリスチメタート、コリスチン、グラミシジン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、バノマイシン、バシトラシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシンおよびセファロスポリンが挙げられる。
【００３１】
適切な抗炎症薬の例として、アスピリン（アセチルサリチル酸）、インドメタシン、ナトリウムインドメタシン３水和物、サリチルアミド、ナプロキセン、コルヒチン、フェノプロフェン、スリンダク、ジフルニサル、ジクロフェナク、インドプロフェンおよびナトリウムサリチルアミドが挙げられるがこれらに限定はされない。
【００３２】
適切な抗ウイルス剤の例として、α‐メチル‐Ｐ‐アダマンタンメチルアミン、１‐Ｄ‐リボフラノシル‐１，２，４‐トリアゾール‐３カルボキサミド、９‐（２‐ハイドロキシエトキシ）メチルグアニン、アダマンタンアミン、５‐ヨード‐２’‐デオキシウリジン、トリフルオロチミジン、インターフェロン、アデニンアラビノシド、ＣＤ４、３’‐アジド‐３’‐デオキシチミジン（ＡＺＴ）、９‐（２‐ヒドロキシエトキシメチル）‐グアニン（アシクロビル）、ホスホノギ酸、１‐アダマンタンアミン、ペプチドＴおよび２’，３’ジデオキシシチジンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３３】
新生血管病治療の特に好ましい方法は、Ｔ２‐ＴｒｐＲＳと、少なくとも１つの ＶＥＧＦ‐１６５シグナリング阻害剤と、および場合によって少なくとも１つのαvβ３およびαvβ５インテグリンシグナリング阻害剤とを含む配合薬の血管成長阻害量を新生血管病に罹っている哺乳類に投与することを含む。
【００３４】
本発明の方法によって治療できる新生血管病は、眼（例えば、網膜と絨毛膜様の新生血管病）、血管新生緑内障、翼状片症、固形腫瘍癌（例えば、肺癌、乳癌および前立腺癌）、変形関節炎、慢性関節リウマチ、血管異常、奇形（例えば、血管腫、リンパ管腫など）および乾癬の新生血管病を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３５】
哺乳類の網膜新生血管病を治療する本方法は、好ましくはＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片、ＶＥＧＦシグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤を提供する、抗血管新生と血管新生抑制の配合薬の血管成長阻害量を新生血管病に罹っている哺乳類の眼への硝子体注射を含む。
【００３６】
この方法は、眼の疾病、例えば新生児、若年の、あるいは完全に成熟した哺乳類の血管変性疾患、虚血性の網膜症、血管出血、血管漏出および脈絡膜症などを治療するために利用できる。このような疾病の例は、網膜傷害と同様に、加齢に関係した黄斑部変性糖尿病性網膜症、推定の眼のヒストプラスマ症、未熟児網膜症、鎌形赤血球貧血、血管腫、翼状片症、虚血性の中心網膜静脈閉塞、網膜静脈分枝閉塞症、眼の黒色腫、網膜芽腫および色素性網膜炎を含む。
【００３７】
本発明のもう１つの態様は１つ以上の薬学上許容できる添加剤、ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片、ＶＥＧＦシグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤を含む新生血管病の治療に役立つ治療組成物である。
【００３８】
１つの好ましい実施形態において、組成物は少なくとも１つの付加的な治療薬、例えば血管新生抑制ステロイド、抗悪性腫瘍薬、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症薬などを更に含む。
【００３９】
新生血管疾病を治療する方法は、トリプトファニル‐ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の血管新生抑制断片ならびに少なくとも１つの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤からなる群から選択される化合物を含む配合薬の血管成長阻害量を新生血管病の哺乳類に投与することを含む。
【００４０】
全般に、本発明の組成物の血管成長阻害量は少なくとも約１０μg／kg体重であり、ほとんどの場合、全身治療には１日あたり約８mg／kg体重を超過しない。好ましい本投薬量は１日あたり約１０μg／kg〜１mg／kg体重の範囲である。ヒト患者の眼球の硝子体治療の好ましいこの投薬量は、所定の治療では１眼につき約０．１〜５mgの範囲である。本組成物は、時間の経過と共に、単回あるいは反復して投与してもよい。本医療分野の専門医師は、特定の患者、その組成物に存在する薬剤、病状と医術では既知の他の因子を考慮に入れて、本発明の組成物の最適有効治療用量を決定することができ得る。
【００４１】
本発明の治療的な組成物は、様々な物理的形態において実施できる。これらの形態は、固体剤形、半固体剤形および液体剤形、例えば、錠剤、ピル、粉、液体溶液または懸濁液、エアゾール、リポソーム、坐薬、注射可能薬物および注入性の溶液ならびに除放性形態等が挙げられる。本医療分野の専門医師は当技術分野で周知の薬理学的原則を用い、対象とする投与形態および治療する病気によって適切な投薬形態を選ぶであろう。
【００４２】
本発明による治療的な組成物は、従来の投与経路、例えば腸管外、皮下、静脈内、筋肉内、病巣内、胸骨内、硝子体内、頭蓋内、あるいは噴霧経路によって投与できる。局所的な投与経路は体の特定の部分（例えば目、皮膚、下部消化管、膣、直腸）への局所的な組成物の適用法として、必要に応じて用いることもできる。本治療組成物はまた、当業者に周知の、従来の薬学上許容できる担体と添加剤も含む。
【００４３】
全般に、本発明の治療的な組成物は、この組成物中に存在する個々のクラスの主成分に用いられた方法および組成物と同様な方法および組成物を使用して調製され、投与される。当業者は、従来の投与量が、この組成中の特定の主成分に依存して変化すること、また患者の健康、体重、年齢、性別、症状または疾病および望ましい投与形態に依存して変化することを知っている。
【００４４】
本発明の治療的組成物は、薬理学的に適切な、薬学上許容できる、担体、添加剤および媒体を含む。全般に、これら担体は、燐酸塩緩衝化食塩水（ＰＢＳ）などの生理塩水および緩衝媒体を含む、水性溶液またはアルコール性／水性溶液、エマルジョン類または懸濁液である。非経口の媒体として、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのブドウ糖、ブドウ糖および塩化ナトリウム、ラクトリンゲル液または不揮発性油を挙げることができる。加えて、静脈内媒体は、流動液および栄養分補液ならびに電解質補充薬、例えばリンゲルブドウ糖に基づくようなものを含むことができる。防腐剤のような賦形剤およびと他の添加物として、例えば抗微生物性物質、抗酸化剤、キレート薬および不活性ガスも存在することができる。適切な調合助剤、担体、他の添加剤および医薬品組成物を調製する方法はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１４ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，１９７０，ｐａｒｔｉｃｕｌａｒｌｙ  Ｐａｒｔ  VIII，「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅ」，頁１４６１‐１７６２に記載されており、この文献の関連する開示を本明細書に参照により取り込む。
【００４５】
本発明の治療的組成物は、多回用量または単位用量形態にて、十分に殺菌されたビンまたはバイアルに詰めることができる。好ましくは、これら容器を本発明の組成物で充填した後に密封する。好ましくは、本組成物はラベルのある容器に詰められる。このラベルはこの組成物中の薬剤を特定し、米国食品医薬品局のような政府機関によって規定された一定の書式での適正な法律に基づくこの組成物の承認を表す通知、投薬量情報およびその他を有する。好ましくは、このラベルは患者に組成物を投与するヘルス・ケアの専門家にとって有用な組成物に関する情報を含む。好ましくは、このパッケージは、この組成物の投与、指示、適用症および必要なあらゆる注意に関する、印刷された情報資料も含む。
【００４６】
方法
新生児のマウス網膜血管形成モデル
モデルの説明マウスにおいて、出生直後（出産後０日、「Ｐ０」）は網膜脈管系は実質的に存在しない。出生後４週目（Ｐ２８）までに、網膜は視覚の始まりと一致して網膜血管の成体型になる。網膜の生理的新生血管形成は、血管形成の定型的な二相性発達パターンを通して、この期間中に起こる。網膜血管成長の第１相の期間は、スポーク様の乳頭周囲の血管が網膜中心動脈と静脈から放射状に成長し、これらの間に形成する毛管網によって漸次相互接続する。この「内部の網膜叢」は出生後初めの７〜１０日の間、神経線維層内部で単層として、面積、容量と複雑性の面で遠心的に発達する。
【００４７】
網膜血管形成の第２相は、出産後７（Ｐ７）〜１０日（Ｐ１０）の間に始まり、側副枝が浅神経叢毛細管から出芽し、網膜に侵入し、そこでその先端は分岐し、側面で吻合して「深部血管網」平面を形成する。深部血管網はＰ１４まで配置されるが、Ｐ１４〜Ｐ２１にかけて広範囲にリモデリングされる。新生児マウスでのこれらの血管網形成が妊娠第３期で胎児に起こっている事象と著しく似ているという点は興味深い。
【００４８】
モデルの長所と定量化．マウス網膜発達過程の再現性と新生児動物での利用のしやすさは、血管形成の生理的関連モデルにおいて抗血管新生化合物の有効性の評価を行う機会を与える。新生児マウスモデルの別の長所は、推定上の血管形成アンタゴニストの血管新生抑制効果を質的・量的に評価する能力である。血管新生抑制活性は、Ｐ８〜Ｐ１２に発達する深部の外層網膜血管層（第２次層）の血管形成の程度に基づき評価した。内部の血管網（第１次層）の外観を、正常な発達と毒性徴候について評価した。内部血管層の異常性は、ここに記載され行われたいかなるアッセイでも観察されなかった。第２次層血管新生の定性的な評価は、適切に染色した切除網膜の表面と深部層を顕微鏡写真撮影し、深部血管層形成が完全にまたは部分的に阻害された眼球比率を測定して行うことができる。ここに示す全てのデータは、治療後の深部網膜血管網形成が７５〜１００％阻害されたことが示された眼球比率の定性分析に基づいている。ほとんどの場合において、深部網膜血管網目形成が＞９５％および１００％阻害されたマウスの比率も示す。
【００４９】
組成物の調製．ペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）をＰＢＳ（１×濃度）中、約２０mg／mlの濃度で、ＰＢＳに可溶化する。Ｔ２‐ＴｒｐＲＳは約０．５mg／ml（１×濃度）の濃度で、ＰＢＳに可溶化する。ＶＥＧＦアプタマー（ペガプタニブナトリウム；化合物（２））は、約２mg／ml（１×濃度）の濃度でＰＢＳに可溶化し、１×濃度で約１μg／眼球を注入する。全ての併用アッセイにおいて、これら化合物を各物質の１×濃度の２または３×で調製した後混合して、単独の使用と同じ濃度（例えば場合によっては、１×、０．５×、０．２５×または０．１×）で各化合物を含む最終溶液を作成した。全てのアッセイについて、注入すべき化合物の数とは無関係に、薬剤を含むＰＢＳ溶液０．５μlの単回注射を硝子体で実施した。ここに用いられる、用語「０．１×」は所定の物質の１×濃度の１／１０を指し、「０．２５×」は所定の物質１×濃度の１／４を指し、「０．５×」は所定の物質１×濃度の１／２を指す。以下同様である。
【００５０】
酸素誘導性網膜障害（ＯＩＲ）のマウスモデル．このモデルは、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．３５，１０１‐１１１（１９９４）にＳｍｉｔｈ，Ｌ．よって記載されている。マウスはＰ７〜Ｐ１２に高酸素（７５％のＯ２）下に置かれ、その後酸素正常状態に戻された。高酸素下では、中心網膜血管は閉塞し、深部脈管系は形成できない。酸素正常状態に戻されて同時に、網膜は低酸素症となり、病理学的新生血管形成を引き起こす。
【００５１】
ＯＩＲモデルの新生血管形成の定量化は、閉塞の定量化だけでなく血管内房状分岐形成の定量化も含んだ。網膜のホールマウントを調製し、その血管をイソレクチンＧＳ‐ＩＢ４で染色する。共焦点画像化は、表面の血管網の真上に焦点を当てて行われ、その後４つの四半部のモンタージュを製作する。新生血管房状分岐を同定し（Ａｄｏｂｅ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（Ｒ））、その後ピクセル化面積を定量化する。さらに、閉塞の面積をとレースし（Ａｄｏｂｅ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（Ｒ））、ピクセル化の面積を定量化する。μm2での値を得るために、ついで画像収集（解像度、サイズその他）に基づく換算係数を適用する。
【００５２】
一般的な血管形成アッセイ方法．
新生児マウス（Ｂａｌｂ／Ｃ，Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）のインビボ血管形成アッセイをインテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）、Ｔ２‐ＴｒｐＲＳおよびＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の血管新生抑制活性の評価に使用した。硝子体注射と網膜単離は解剖顕微鏡（ＳＭＺ６４５，Ｎｉｋｏｎ，日本）下で行われた。注射用に眼球を露出するために、出産後７日目（Ｐ７）に眼瞼亀裂を微細な刃で行った。サンプル（０．５μl）を３２ゲージ針を装着したハミルとンシリンジで注入した（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｅｎｏ，ＮＶ）。注射は、赤道と角膜縁の間で行った。注射の間、針先の位置を直接可視化でモニターし、硝子体腔中にあることを確認した。注射針によって水晶体または網膜を損傷した眼球は、試験から除外した。注射後、亀裂を閉じるために眼瞼を置き直した。
【００５３】
出産後１２日目（Ｐ１２）に、動物を安楽死させ、その後眼球を摘出した。４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で約１０分処理後、角膜、水晶体、強膜と硝子体は、角膜輪部切開で切除した。単離網膜を氷上で約１０分間メタノール中に浸漬後、ＰＢＳ中の２０％の通常のヤギ血清（Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）を用いて５０％のウシ胎児血清（Ｇｉｂｃｏ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で氷上で約１時間ブロッキングし、染色のために調製した。特にブロッキング緩衝液で１：２００希釈したウサギ抗マウスコラーゲンIV抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）または、蛍光抱合型イソレクチン（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で約４℃で約１８時間網膜を染色して血管を可視化した。網膜とＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（Ｒ）（Ａｌｅｘａ）５９４‐結合型ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）（ブロッキング緩衝液で１：２００希釈）を約４℃で約２時間インキューベートした。網膜はその後、ｓｌｏｗ‐ｆａｄｅマウンティングメディア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して、微視的評価のためにマウントした。
【実施例１】
【００５４】
ペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤とＶＥＧＦシグナリング阻害剤の併用による新生児マウス眼球の治療
上述の一般血管新生アッセイ方法（「一般的手順」）にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス出産後８日（Ｐ８）に新生児の眼球に０．２５×濃度のインテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）（５匹のマウス）または０．５×濃度のＶＥＧＦアプタマー化合物（２）（５匹のマウス）または０．２５×濃度化合物（１）および０．５×濃度の化合物（２）の併用（６匹のマウス）を硝子体に注射した。対照として、別の群の６匹のマウスは、ＰＢＳの硝子体注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、その後一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウントし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像を、対照眼球と比較して、血管新生の比率に基づき評価した。その結果を、表１および図４と５に示す。
【００５５】
【表１】
2008501718.tif 000004
【実施例２】
【００５６】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片とＶＥＧＦシグナリング阻害剤の併用による新生児マウス眼球の治療
一般的手順にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス新生児の眼球に、０．１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳの（８匹のマウス）または０．１×濃度のＶＥＧＦアプタマー化合物（２）（８匹のマウス）または０．１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳおよび０．１×濃度の化合物（２）併用（１０匹のマウス）をＰ４で硝子体注射した。対照として、別の群の８匹のマウスはＰＢＳの硝子体注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、その後一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウントし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像を、対照眼球と比較して血管新生の比率に基づいて評価した。その結果を、表２および図６、７、８と９に示す。
【００５７】
【表２】
2008501718.tif 000005
【実施例３】
【００５８】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片とＶＥＧＦシグナリング阻害剤の併用による新生児マウス眼球の治療
一般的手順にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス新生児の眼球に、１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳ（８匹のマウス）または１×濃度のＶＥＧＦアプタマー化合物（２）（８匹のマウス）または１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳと１×濃度の化合物（２）の併用（１０匹のマウス）をＰ４で硝子体に注射した。対照として、別の群の６匹のマウスは、ＰＢＳの硝子体注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、その後一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウントし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像を、対照眼球と比較して血管新生の比率に基づき評価した。その結果を表３および図１０、１１、１２と１３に示す。
【００５９】
【表３】
2008501718.tif 000006
【実施例４】
【００６０】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片とＶＥＧＦシグナリング阻害剤の併用による新生児マウス眼球の治療
一般的手順にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス新生児の眼球に、１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳ（８匹のマウス）または、０．５×濃度のＶＥＧＦアプタマー化合物（２）（１０匹のマウス）または、１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳと０．５×濃度の化合物（２）の併用（１０匹のマウス）をＰ４で硝子体に注射した。対照として、別の群の６匹のマウスは、ＰＢＳの硝子体注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、その後一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウントし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像を、対照眼球と比較して血管新生の比率に基づき評価した。その結果を、表４および、図１４、１５、１６と１７に示す。
【００６１】
【表４】
2008501718.tif 000007
【実施例５】
【００６２】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片とインテグリンシグナリング阻害剤の併用による新生児マウス眼球の治療
一般的手順にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス新生児の眼球に、１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳまたは０．５×濃度のインテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）または１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳと０．５×濃度の化合物（１）の併用をＰ４で、各治療に６匹のマウス群を使用して、硝子体に注射した。対照として、別の群の４匹のマウスは、ＰＢＳの硝子体注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、その後一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウントし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像を、対照眼球と比較して血管新生の比率に基づき評価した。その結果を、表５および図１８、１９、２０と２１に示す。
【００６３】
【表５】
2008501718.tif 000008
【実施例６】
【００６４】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片、ＶＥＧＦシグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤の併用による新生児マウス眼球の治療
一般的手順にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス新生児の眼球に、１×濃度 のＴ２‐ＴｒｐＲＳ、０．５×濃度 のインテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）、１×濃度のＶＥＧＦ濃度 のアプタマー化合物（２）、１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳと０．５×濃度 の化合物（１）の併用、１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳと１×濃度の化合物（２）の併用、または１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳ、０．５×濃度の化合物（１）および１×濃度の化合物（２）の併用をＰ４で、各治療に８匹のマウス群を使用して、硝子体に注射した。対照として、別の群の８匹のマウスは、ＰＢＳの硝子体注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、その後一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウントし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像を、対照眼球と比較して血管新生の比率に基づき評価した。その結果を、表６および図２２、２３、２４、２５、２６、２７と２８に示す。
【００６５】
【表６】
2008501718.tif 000009
【実施例７】
【００６６】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片、ＶＥＧＦシグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤の併用による新生児マウス眼球の治療
一般的手順にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス新生児の眼球に、１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳ、０．５×濃度インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）、１×濃度のＶＥＧＦアプタマー化合物（２）、０．５×濃度の化合物（１）と１×濃度の化合物（２）の併用、または１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳ、０．５×濃度の化合物（１）と１×濃度の化合物（２）の併用をＰ４で、各治療に８匹のマウス群を使用して、硝子体に注射した。対照として、別の群の６匹のマウスは、ＰＢＳの硝子体内注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、その後一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウンとし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像を、対照眼球と比較して血管新生の比率に基づき評価した。その結果を、表７および図２９、３０、３１、３２、３３と３４に示す。
【００６７】
【表７】
2008501718.tif 000010
【実施例８】
【００６８】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片とＶＥＧＦシグナリング阻害剤の併用による新生児マウス眼球の治療
一般的手順にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス新生児の眼球に、１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳ（１０匹のマウス）、０．２５×濃度のＶＥＧＦアプタマー化合物（２）（１１匹のマウス）または１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳと０．２５×濃度の化合物（２）（１１匹のマウス）の併用をＰ４で、硝子体に注射した。対照として、別の群の８匹のマウスは、ＰＢＳの硝子体注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、その後一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウントし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像を、対照眼球と比較することで血管新生の比率に基づき評価した。その結果を表８に示す。
【００６９】
【表８】
2008501718.tif 000011
【実施例９】
【００７０】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片、ＶＥＧＦシグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤の併用による新生児マウス眼球の治療
一般的手順にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス新生児の眼球（個々の群は８匹のマウス）に、１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳ、１×濃度のインテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）、１×濃度のＶＥＧＦアプタマー化合物（２）、１×濃度Ｔ２‐ＴｒｐＲＳと１×濃度化合物（１）の併用、１×濃度の化合物（１）と１×濃度の化合物（２）の併用、または１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳ、１×濃度の化合物（２）と１×濃度の化合物（２）の併用をＰ４で、硝子体注射した。対照として、別の群の８匹のマウスは、ＰＢＳの硝子体注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、その後一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウントし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像を、対照眼球と比較して血管新生の比率に基づき評価した。その結果を表９と図３５〜４２に示す。
【００７１】
【表９】
2008501718.tif 000012
【実施例１０】
【００７２】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片の異なる投与量による新生児マウス眼球の治療
一般的手順にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス新生児の眼球（個々の群は８〜１２匹のマウス）に０．１×濃度（８匹のマウス）、０．３×濃度（１２匹のマウス）、１×濃度（１２匹のマウス）、２×濃度（１２匹のマウス）および３×濃度（１２匹のマウス）のＴ２‐ＴｒｐＲＳをＰ４で、硝子体に注射した。対照として、別の群の１０匹のマウスは、ＰＢＳの硝子体注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、その後一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウントし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像は、対照眼球と比較して血管新生の比率に基づき評価した。その結果を表１０に示す。
【００７３】
【表１０】
2008501718.tif 000013
【実施例１１】
【００７４】
ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片の異なる投与量による新生児マウス眼球の治療
一般的手順にしたがって、Ｂａｌｂ／Ｃマウス新生児の眼球（個々の群は６〜１４匹のマウス）に０．３×濃度（６匹のマウス）、１×濃度（１４匹のマウス）、２×濃度（８匹のマウス）、３×濃度（７匹のマウス）と５×濃度（６匹のマウス）のＴ２‐ＴｒｐＲＳをＰ４で、硝子体注射した。対照として、別の群の１０匹のマウスは、ＰＢＳの硝子体注射のみを受けた。Ｐ１２で、マウスを安楽死させ、一般的手順に記載されているように、注射された眼球から網膜を摘出し、染色し、マウントし、微視的評価をした。第２次（外層網膜血管）層の血管分布像を、対照眼球と比較して血管新生比率に基づき評価した。その結果を表１１に示す。
【００７５】
【表１１】
2008501718.tif 000014
【００７６】
先行の実施例で＞９５％と１００％阻害を示すマウスのデータは、ＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片、ＶＥＧＦシグナリング阻害剤とインテグリンシグナリング阻害剤を含む群から選択される少なくとも２つの物質を含む組成物でさえ、新生児マウス眼球モデルにおいて各構成成分併用の単純な相加効果から期待される阻害レベルより、新生血管形成阻害に対して予想外に大きな有効性をもたらすことを証明する。このことは、種々の例から得られた結果を表１２のように組み合わせた場合にも明らかであり、化合物（１）、化合物（２）およびＴ２‐ＴｒｐＲＳのうちの少なくとも２つの併用を含む本発明の組成物（表１２で太字で示した阻害値）と同様に、１×から２×濃度のインテグリン阻害剤化合物（１）、０．５×から１×濃度のＶＥＧＦアプタマー化合物（２）および１×濃度のＴ２‐ＴｒｐＲＳの実施例の結果をまとめる。各群のマウスの数をそれぞれ括弧で示す。表１２のデータは、個々の阻害剤による治療の阻害レベルおよびその合計と比較して、本発明の組成物で治療したマウス眼球深部血管層では非常に高レベルの血管形成阻害を明らかに示す。
【００７７】
【表１２】
2008501718.tif 000015
【００７８】
実施例１０と１１（表１０と１１）から得られた結果では、Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの有効性は、約１×から２×濃度で最大に達し、深部血管層で７５〜１００％の阻害を示すマウスは５０％を超さなかった。その有効性は、２×とそれ以上の濃度で下がり始めた。したがって、投薬量を上昇しても、Ｔ２は９５〜１００％の阻害レベルで、約５０％を超す有効性を示さなかった。
【実施例１２】
【００７９】
Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ血管新生抑制断片、ＶＥＧＦアプタマーおよびペプチド擬似αvβ３とαvβ５インテグリンシグナリング阻害剤投与の相乗効果
異なる血管新生抑制分子の組み合わせによる影響を研究するために、重要であり異なる血管形成経路を標的することが知られている３つの血管新生抑制化合物を使用した：小分子インテグリンαvβ３およびαvβ５アンタゴニスト（化合物（１）；「ＥＭＤ４７２５２３」Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ，Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツから入手）；ＶＥＧＦ１６５アンタゴニスト（化合物（２）；ペガプタニブナトリウム）、および切断型トリプトファンｔＲＮＡシンセターゼ（Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ、Ａｎｇｉｏｓｙｎ  Ｉｎｃ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手）。Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの正確な作用機構は完全には解明されていないが、その作用機構はＶＥＧＦまたはインテグリン拮抗作用に直接関連していない。
【００８０】
新生児マウス網膜血管形成モデルを使用して、各単独療法の有効性とこれらの個別化合物の種々の併用をテストした。先に述べたように、マウスは網膜脈管系を持たずに生まれる。出生後の最初の３週で、成体様の脈管系が発達する。網膜脈管系は、出産後の最初の週に発達する表面の脈管叢を有する３つの異なる平面的な網状構造を形成する。出産後８日目（Ｐ８）に、浅神経叢血管は分岐し、内部の核層外縁部の深部叢の方向へ移動する。各単独療法または併用溶液の血管新生抑制の性質をテストするために、表面網状組織の形成の完成が近いが、深部叢形成の始まる前に、硝子体注射をＰ７で行った。深部血管網形成に対する影響をその５日後（Ｐ１２）に分析した。注射された個々の網膜阻害の程度は、０〜１０％、１０〜２５％、２５〜５０％、５０〜７５％または７５〜１００％（図４８）のスコアがつけられ、７５〜１００％阻害群を更に＞９０％と１００％阻害レベルに分けた（図４９）。前に形成された第１次血管網の外観および全体的な網膜形態について、毒性徴候を評価した。
【００８１】
試料調製．αvβ３とαvβ５インテグリンアンタゴニスト（化合物（１））を、凍結乾燥粉末としてデシケーター中に、室温（Ｉ．Ａ．）または−２０℃（Ｖ．Ａ．）で保存し、使用直前に滅菌済みのＲＮＡｓｅ混入のない１×ＰＢＳで可溶化した。公表された情報（Ｂｒｉｄｏｎｎｅａｕら，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ．Ｄｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ａｐｐ．７２６：２３７‐４７（１９９９））に基づき、ＶＥＧＦアプタマー（化合物（１））を、４０kDaのＰＥＧ結合化合物として合成した（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｃ，Ｂｏｕｌｄｅｒ，ＣＯ）。逆相液体クロマとグラフィーにより、この化合物が純品であることを確認した。ここに報告する濃度は、ＰＥＧ結合化合物の総濃度よりむしろ活性ＶＥＧＦアプタマーの最終濃度を指し、２６０／２８０nmで吸光光度法により測定した。Ｏｔａｎｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９９：１７８‐１８３（２００２）および米国仮出願第６０／５９８，０１９号（２００４年８月２日出願）（これらの全体を参照により取り込む。）に記載されているように、Ｔ２‐ＴｒｐＲＳペプチドを組み換え型化合物として作成した。精製産物を−２０℃で５０％グリセロール中に保存し、使用直前に滅菌済みの１×ＰＢＳに対して透析した。併用溶液は、最初に各個別化合物の３×原液を作成することで調製した。ついで、これら化合物は共に、および必要ならばＰＢＳと混合し、各対応する単独療法濃度に相当する濃度で所望の成分を含む最終的な溶液とした。
【００８２】
硝子体注射．全ての動物試験は人道的取り扱いと動物使用のための厳しいプロトコールガイドラインを厳守して行われた。硝子体に注射を行い、網膜を切除し、脈管系を視覚化した。ＳｍｉｔｈらのＩｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．，３５：１０１‐１１１（１９９４）に記載のプロトコールに従って、出産後７日目（Ｐ７）の子犬とその母犬を７５％の酸素（高酸素）の環境に５日間曝露後、大気（酸素正常状態）へ戻してＯＩＲを誘導した。硝子体注射をＰ１２に行い、その後直ちに酸素正常状態へ戻し、網膜をＰ１７に分析した。Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ（レクチンＧＳ）由来のイソレクチンＧＳ‐ＩＢ４を用いて血管を染色し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、ＰＢＳで１：１５０希釈）に結合させた。共焦点画像は４倍対物レンズを用いて撮影し、慎重に網膜の内部限極膜の真上に焦点をあて、予め薄層を形成する新生血管房状分岐を目立たせた。個々の網膜から４つのオーバーラップしたイメージを得、そのイメージを１インチにつき３００ピクセルの２×２インチのサイズに変換した。マスクされた個人によって網膜ホールマウントを使用して新生血管房状分岐面積を定量化した。その特徴のある外観とイソレクチン染色強度に基づき、Ａｄｏｂｅ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（Ｒ）ソフトウェアのマジックワンドツールを用いて、房状分岐を特に選択した。ついでピクセル中の総面積を測定した。新生血管房状分岐形成の面積は、ＰＢＳを注射した対照ＯＩＲに対して標準化した。
【００８３】
投薬．投薬実験は、各個別化合物の最大有効投与量を測定するために先ずに行った。各化合物は、１つの眼球につきインテグリンアンタゴニスでは５〜１０μg（１０〜２０nmoles）（図４６）、ＶＥＧＦアプタマー（図４４）では１．０〜２．０μg（１０８〜２１５pmoles）、Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ（図４３）では０．２５〜０．５μg（５．２〜１０．４pmoles）の最適有効量を有する、ベル型の有効性カーブを示すことが見いだされた。血管新生抑制活性の比較のために、最適投与量での各単独療法の単回注射と、等価な投与量での各化合物の適切な併用を含む溶液の単回注射を行った。最適の各投与量において、インテグリンアンタゴニスまたはＶＥＧＦアプタマーのいずれかの注射で網膜の約３５％は影響を受けなかった。他の６７％の網膜は、実質的に１０〜２５％、２５〜５０％、５０〜７５％または７５％〜１００％の範囲の中に均一に含まれた（表１３Ａ以下）。Ｔ２‐ＴｒｐＲＳペプチドによる深部血管網状組織阻害は、わずかに良好であった。Ｔ２‐ＴｒｐＲＳペプチドを注射した２４％の網膜は、正常で完全な深部脈管叢を発達したが、Ｔ２‐ＴｒｐＲＳペプチドを注射した３５％の網膜は、インテグリンアンタゴニストとＶＥＧＦアプタマーのそれぞれ１７％と２１％に比較して、７５％を超す阻害を示した。（表１３Ａ以下）。血管新生抑制化合物を併用で注射した場合、新生血管形成に対する血管新生抑制の作用は著しかった。各２剤の併用、インテグリンアンタゴニスト＋Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ、インテグリンアンタゴニスト＋ＶＥＧＦアプタマーおよびＴ２‐ＴｒｐＲＳ＋ＶＥＧＦアプタマーは、単独療法以上に血管新生抑制活性を著しく改善することを証明した。非常に少数の網膜が併用療法での血管新生抑制治療へ抵抗性を示した。新生血管形成は、任意の２剤併用治療でも大多数の網膜において７５％以上阻害された（下記表１３Ａ）。
【００８４】
すべての３化合物が対応する単独療法注射（１×３剤併用）と等しい最適投与量で同時に注射した場合、網膜の９０％以上は＞７５％阻害を示した。単独療法または２剤併用で治療した網膜と違って、この３剤併用で治療された全ての網膜はある程度の新生血管阻害を示した。さらに、注射した網膜のわずか８％が、何らの有意な新生血管形成レベルを依然として示した。他の９２％において、血管形成のほとんど完全な阻害が３剤併用化合物を注射した網膜で観察された（下記表１３Ａ以下、図４８）。血管新生抑制の有効性における違いは、＞７５％阻害カテゴリーを＞９０％阻害と１００％阻害レベルにサブグループ化した場合、さらに顕著であった（図４９）。３剤併用で注射した網膜の８０％以上は９０％を超す深部脈管叢形成阻害を示し、６３％は単一の新生血管発芽さえ観察されない１００％の新生血管形成阻害を示した。これは、治療された＜５％の網膜しか１００％の阻害を示さない単独療法と２剤併用療法の両方に対する実質的な改善である。さらに、３剤併用で治療した網膜の多くの表層脈管叢はＰ１２網膜よりむしろ正常のＰ７網膜に似ており、このことは浅神経叢内部のさらなる血管成長を３剤併用直後の注射が妨げることを示した。浅神経叢成長阻害は、単独または２剤療法で治療した網膜ではいずれも観察されなかった。注射に先だってすでに形成した表層脈管叢のより中心的な血管は正常なままであり、これは、既に存在する脈管系に対する毒性レベルが無視できることを示した。さらに、神経細胞毒性の徴候は観察されず、網膜形態学には変化が無かったことから、観察可能な副作用は３剤併用溶液の注射によって起こらないことを示した。１つの完全に典型的な実験から得られた表層と深部脈管叢の画像を図５０に示す。
【００８５】
相乗効果分析のため、強力な血管新生抑制活性が３剤併用の低投与量を用いて維持されるかどうかを連続希釈テストで調べた。１００倍（０．０１×３剤併用）まで希釈した場合でも、３剤併用はなお非常に有効に血管形成を阻害した（下記表１３Ｂ、図５２と５３）。３剤併用を個々の化合物の至適投与量の１０分の１の組み合わせで作成した場合、治療された網膜のほぼ８０％はなお＞７５％阻害を示し、その網膜の５０％は、新生血管形成の完全な（１００％）阻害を示した。０.１×濃度（１μg／眼球インテグリンアンタゴニスト、０．２μg／眼球ＶＥＧＦアプタマーおよび０．０２５μg／眼球Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ）で、個々の血管新生抑制化合物による新生血管形成阻害はごくわずかであった（下記表１３Ｃ、図５４）。０．１×Ｔ２‐ＴｒｐＲＳと０．１×ＶＥＧＦアプタマー２剤併用注射の後いくらかの有効性が観察された。しかし、この併用がテスとした全２剤併用で最も効果的に血管新生抑制を示した事実にもかかわらず、血管新生抑制活性は、０．１×３剤併用の注射で観察される阻害レベルと比較して、まだ最小のものであった。
【００８６】
【表１３】
2008501718.tif 000016
2008501718.tif 000017
【実施例１３】
【００８７】
「３剤治療法」の相乗効果
先に記載した酸素誘導性網膜症（ＯＩＲ）のマウスモデルは、網膜において低酸素誘導性新生血管形成のよく認められたモデルである。誘導に伴う血管変化は一貫しており、再現性があり、かつ定量化可能である。近年、このモデルの使用は、疾病に関連した虚血性脈管障害および関連した抗血管新生治療の一般的な疾病研究に拡大された。血管形成のより病理学的モデルでのこれらの血管新生抑制化合物の相乗的性質を研究するために、病理学的新生血管形成に対する単独療法と併用療法の効果を、マウスＯＩＲモデルで検証した。当初の実験のために、新生児血管形成モデルから得られる至適投与量を使用した。それぞれの場合、併用療法は、単独療法と比較して血管新生抑制活性の改善を実証した。しかし、各単独療法の血管新生抑制活性のために、種々の化合物の併用結果が相乗的か単に相加的かの決定は難しかった。したがって、比較的低投与量で併用療法の等価な有効性を実証した新生児マウスの網膜血管形成モデルを用いて観察される結果に基づき、各単独療法と種々の併用療法を至適投与量の１０分の１量で検証した。さらに、併用溶液での各化合物の濃度は、対応する単独療法での濃度と等価であった。低濃度において、病理学的新生血管房状分岐形成の著しい阻害は、単独療法治療後に観察されなかった。しかし、新生血管房状分岐形成の著しい低下が、各２剤併用を使用した場合に観察された（図５７）。インテグリンアンタゴニストをＴ２‐ＴｒｐＲＳペプチドと組み合わせた場合、病理学的房状分岐形成は＞５０％減少した。インテグリンアンタゴニストをＶＥＧＦアプタマーと組み合わせた場合、房状分岐形成は＞４０％減少した。Ｔ２‐ＴｒｐＲＳペプチドをＶＥＧＦアプタマーと組み合わせた場合、病理学的新生血管形成は対照の治療網膜と比較してほぼ８０％減少した。Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ／ＶＥＧＦアプタマー２剤併用で治療した網膜の多くは、実質的に明白な病理学的新生血管形成はなく、ほとんど正常に見えた（図５８）。
【００８８】
異なる血管形成経路を標的とする複数の血管新生抑制化合物の組み合わせによる血管新生抑制活性の劇的な増加が実証された。単一治療では活性を持たない投与量での化合物の併用後においてさえ、強い血管新生抑制活性が、血管形成の発達および病理学的モデルのいずれにおいても観察された。これは、単なる相加効果ではなく、むしろ相乗効果を示唆するものである。このデータはまた、複数経路を標的とすることが効果的な臨床の抗血管新生療法に必要とされ、新生血管疾病治療の新たなパラダイムを提供する可能性を示唆する。好ましくは、少なくとも２つの抗血管新生治療が組み合わせられる（例えば、ＶＥＧＦアプタマーのようなＶＥＧＦシグナリング阻害剤とＴｒｐＲＳのＴ２断片のようなＴｒｐＲＳの血管新生抑制断片、場合によってはインテグリンアンタゴニストの併用）。
【００８９】
３つの独立した血管形成の経路を標的とし、阻害することによって、ほぼ完全な血管形成阻害が、２つの別々の血管形成モデルで得られた。新生血管形成の完全な阻害は、血管新生抑制の治療を使用する血管形成関連の疾病の効果的治療にとっても重要である可能性がある。本モデルにおいて、単独療法注射から得られた最高の結果でさえ、概して新たな血管成長を５０〜７５％遮断するだけであった。これは、ほとんどの場合、新生血管形成のかなりの量が依然として成長したことを意味する。対照的に、３剤併用療法を注射した新生児マウス網膜の３分の２は、新生血管形成の完全に１００％の阻害を示した（表１３）。同様に、病理学的な血管形成のＯＩＲモデルにおいて、大部分の治療マウスは、病理学的な新生血管房状分岐形成をほとんど示さなかった（図５８）。癌治療中、高度の血管形成阻害が腫瘍細胞の完全な飢餓を生じ、更なる腫瘍の増殖を妨げるために要求されよう。わずか５０％の新生血管成長を阻害する単独療法は、急速に増殖する腫瘍細胞が利用できる酸素と栄養分を排除するというよりも単に減少させているだけのようである。これによって初期の増殖が遅延するかもしれないが、更なる腫瘍の増殖を妨げるのに十分ではないであろう。これらの例で、新生血管形成の完全阻害を達成できる併用療法は、癌治療中の、抗血管新生治療結果を大いに改善するであろう。さらに、強い血管新生抑制能力を維持しながら、比較的低投与量を用いることにより血管新生抑制治療で生ずる有害な副作用の可能性を最小にすることができる。合わせて、先述のデータは、疾病に伴う新生血管形成治療のために異なる血管新生抑制分子を組み合わせることの有益な有用性を示す。
【００９０】
トリプトファニル‐ｔＲＮＡシンセターゼ（ＴｒｐＲＳ）の血管新生抑制断片、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）シグナリング阻害剤およびインテグリンシグナリング阻害剤を含む本発明の組成物およびその使用方法は特に眼球の新生血管疾病のために、新たなそして驚くほど有効な治療療法を新生血管疾病に提供する。
【実施例１４】
【００９１】
腫瘍の治療
多様な神経グリア芽細胞腫は、不治の悪性脳腫瘍で、通常診断１年以内で死に至る。ラット９Ｌ神経膠肉腫株化細胞が、悪性膠腫のモデルとして使用される。神経膠腫の両方の形態において、腫瘍で血管が非常に発達し、腫瘍は正常な脳組織に浸潤する。大脳内に９Ｌ細胞をボーラス投与された未治療動物は、一度腫瘍細胞が移植されると、ほぼ３週の生存日数がある。０日目で、前もってケタミンとキシラジンで麻酔したＣＤ３４４フィッシャーラット右前頭葉にダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）約２μl中の約５０，０００の細胞を定位的接種することにより、大脳内の９Ｌ腫瘍を確立した。
【００９２】
６日目で、本発明組成物の１０μlボーラス投与（４．５mg／ＬのＴ２‐ＴｒｐＲＳ、３０mg／Ｌの化合物（１）と６mg／Ｌの化合物（２）;ペガプタニブナトリウム）を約２分にわたって、９Ｌ細胞が移植された場所と同じ脳領域に定位的に注射した。ボーラス注射後、ポンプを肩甲骨の間の皮下ポケットに挿入した。ポンプに管を経て連結したカテーテルを、９Ｌ細胞の導入のために作られた同じ頭蓋骨孔に挿入し、所定位置に固定した。各ポンプの流速は、毎時約８μlであった。本発明組成物の追加量を、約２４時間各動物の脳に連続的にポンプで送りこんた。連続ポンプ輸送により組成物は、腫瘍細胞を移植した全ての脳半球を通して分布した。９匹のラットに本発明組成物を与え、対照群として９匹のラットにＰＢＳのみを与えた。
【００９３】
１３日目に、肩甲骨の間を切開し、ポンプを摘出して新しいポンプと交換した。本発明組成物またはＰＢＳによる治療を新たなポンプを用いて、同じポンプ流速でさらに２４時間行った。ＰＢＳ治療の対照群と比較して、本発明組成物で治療したラットの生存率は２１パーセン増加した（図６０参照）。
【００９４】
上述の実施形態の多数のバリエーションと変形は、本発明の新規性の精神と範囲から逸脱することなく達成することができる。ここに例示する具体的な実施形態に関し、なんらの制限も意図しないし、また推論されるべきでない。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１およびＴ２‐ＴｒｐＲＳ‐ＧＤ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（その変異体）として表されトリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼの血管新生抑制断片のアミノ酸配列を示す図である。
【図２】ミニ‐ＴｒｐＲＳ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３およびＴ１‐ＴｒｐＲＳ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４として表されるトリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼの血管新生抑制の断片アミノ酸配列を示す図である。
【図３】完全長ＴｒｐＲＳのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）ならびにＴ１、Ｔ２およびそのミニ断片の位置を示す図である。
【図４】ＰＢＳを硝子体に注射した実施例１の対照マウスの一１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図５】（Ａ）ペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の ０．５×濃度（１０mg／ml）、（Ｂ）ＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の１×濃度（２mg／ml）と（Ｃ）インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）とＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の併用を硝子体に注射した実施例１のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図６】リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）を硝子体に注射した実施例２の対照マウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図７】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの０．１×濃度（０．０５mg／ml）を硝子体に注射した実施例２のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図８】ＶＥＧＦアプタマー化合物（２）を０．１×濃度で、硝子体に注射した実施例２のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図９】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの０．１×濃度とＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の０．１×濃度の併用を硝子体に注射した実施例２のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図１０】ＰＢＳを硝子体に注射した実施例３の対照マウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図１１】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度を硝子体に注射した実施例３のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図１２】ＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の１×濃度を硝子体に注射した実施例３のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図１３】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度とＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の１×濃度を硝子体内注射した実施例３のマウスの１次および２次の血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図１４】リン酸緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）を硝子体に注射した実施例４の対照マウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図１５】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度を硝子体に注射した実施例４のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図１６】ＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の０．５×濃度を硝子体に注射した実施例４のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図１７】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度とＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の０．５×濃度の併用を硝子体に注射した実施例４のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図１８】ＰＢＳを硝子体に注射した実施例５の対照マウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図１９】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度を硝子体に注射した実施例５のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図２０】ペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の０．５×濃度を硝子体に注射した実施例５のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図２１】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度とペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の０．５×濃度の併用を硝子体に注射した実施例５のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図２２】ＰＢＳを硝子体に注射した実施例６の対照マウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図２３】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度を硝子体に注射した実施例６のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図２４】ＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の１×濃度を硝子体に注射した実施例６のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図２５】ペプチド擬似のインテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の０．５×濃度を硝子体に注射した実施例６のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図２６】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度とＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の１×濃度の併用を硝子体に注射した実施例６のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図２７】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度とペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の０．５×濃度の併用を硝子体に注射した実施例６のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図２８】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度、ペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の０．５×濃度とＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の規定濃度の併用を硝子体に注射した実施例６のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図２９】ＰＢＳを硝子体に注射した実施例７の対照マウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図３０】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度を硝子体に注射した実施例７のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図３１】ＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の１×濃度を硝子体に注射した実施例７のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図３２】ペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の０．５×濃度を硝子体に注射した実施例７のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図３３】ペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の０．５×濃度とＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の１×濃度の併用を硝子体に注射した実施例７のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図３４】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度、ペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の０．５×濃度とＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の１×濃度の併用を硝子体に注射した実施例７のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図３５】ＰＢＳを硝子体に注射した実施例９の対照マウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図３６】ペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の１×濃度を硝子体に注射した実施例９のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図３７】ＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の１×濃度を硝子体に注射した実施例９のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図３８】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳの１×濃度を硝子体に注射した実施例９のマウスの１次および２次の血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図３９】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳとペプチド模倣薬のインテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）の個々の１×濃度を硝子体に注射した実施例９のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図４０】ペプチド擬似インテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）とＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の個々の１×濃度を硝子体に注射した実施例９のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図４１】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳとＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の個々の１×濃度の併用を硝子体に注射した実施例９のマウスの１次および２次血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図４２】阻害剤Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ、ペプチド擬似薬のインテグリンシグナリング阻害剤化合物（１）およびＶＥＧＦアプタマー化合物（２）の１×濃度のそれぞれ併用を硝子体に注射した実施例９のマウスの１次および２次の血管網膜層の顕微鏡写真を示す図である。
【図４３】Ｔ２‐ＴｒｐＲＳ投薬実験のグラフを示す図である。
【図４４】ＶＥＧＦ‐アプタマー投薬実験のグラフを示す図である。
【図４５】ＶＥＧＦアプタマーおよびＴ２‐ＴｒｐＲＳ化合物を単独または併用で最適濃度を投与した場合の深部の血管網形成阻害のグラフを示す図である。
【図４６】αvβ３およびαvβ５インテグリンアンタゴニスト投薬実験のグラフを示す図である。
【図４７】低分子αvβ３およびαvβ５インテグリンアンタゴニストならびにＴ２‐ＴｒｐＲＳを単独および併用で最適濃度を投与した場合の深部の血管網形成阻害のグラフを示す図である。
【図４８】種々の治療法の併用による深部の血管網形成阻害のグラフを示す図である。
【図４９】種々の治療法の併用による深部の血管網形成阻害程度のグラフを示す図である。
【図５０】図４９で示す投薬量での種々の治療法とその併用による１次および深部の（２次）血管層の一連の顕微鏡写真を示す図である。
【図５１】種々の投薬濃度での３剤併用治療による血管網形成阻害レベルをグラフで示す図である。
【図５２】＞７５％、＞９０％および１００％阻害を示すこと以外は図５１と同様のグラフを示す図である。
【図５３】種々の投薬濃度での単独療法および併用療法の比較による血管網形成阻害レベルのグラフを示す図である。
【図５４】種々の投薬濃度での単独療法と併用療法の比較による＞７５％、＞９０％および１００％の血管網形成阻害レベルのグラフを示す図である。
【図５５】単独または複数の治療薬の単回注射を利用する３剤併用療法と種々の単独療法による新生血管房状分岐面積のグラフを示す図である。
【図５６】単独または複数の治療薬の２回の注射以外は図５５と同様のデータを示す図である。
【図５７】種々の単独、２剤と３剤治療法による新生血管房状分岐面積のグラフを示す図である。
【図５８】血管新生抑制化合物単独および併用治療したマウスの網膜の一連の顕微鏡写真を示す図である。
【図５９】ＶＥＧＦアプタマー化合物（２）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）であるペガプタニブナトリウムの構造を示す図である。
【図６０】ＰＢＳのみで治療された（三角形）対照ラットと比較して本発明組成物で治療される（正方形）担癌ラットの生存のグラフを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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