(57)【要約】  本発明は、一般に、インビボおよびインビトロの両方においてヌクレオシドアナログに対して低減した感受性を示すＢ型肝炎変種の分野に関する。より詳細には、逆転写酵素変異ｒｔＡ１８１Ｓが提供される。本発明は、そのような変種を検出するためのアッセイおよび方法を提供し、該アッセイは、抗ウイルス療法レジメンをモニターし、患者治療を調整するのに有用である。生物学的サンプルにおけるＨＢＶ変種の存在を検出するための診断キットについても記載している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
アラニンからセリンへのアミノ酸置換、ｒｔＡ１８１Ｓを生じるコドン位置１８１におけるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の少なくとも１つのヌクレオチド変異を含んでなる、単離されたＨＢＶ変種。
【請求項２】
ヌクレオシドアナログに対して低減した感受性を示す、請求項１に記載の単離されたＨＢＶ変種。
【請求項３】
ヌクレオシドアナログアデフォビルおよび／またはラミブジンに対して低減した感受性を示す、請求項２に記載の単離されたＨＢＶ変種。
【請求項４】
ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子における少なくとも１つのさらなるヌクレオチド変異を含んでなり、ここで、前記さらなるヌクレオチド変異は、ポリメラーゼ遺伝子のコドン位置２０４にあり、メチオニンからメチオニン以外の任意のアミノ酸へのアミノ酸置換を生じる、請求項１、２および３のいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶ変種。
【請求項５】
前記さらなるヌクレオチド変異が、メチオニンからイソロイシンへのアミノ酸置換を生じる、請求項４に記載の単離されたＨＢＶ変種。
【請求項６】
ＨＢＶ変種におけるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のアミノ酸置換ｒｔＡ１８１Ｓを生じるヌクレオチド変異を含んでなる請求項１〜５のいずれか一項に記載のＨＢＶ変種から得られる単離されたＨＢＶポリ核酸、または前記ヌクレオチド変異を含んでなる前記ＨＢＶポリ核酸のフラグメント。
【請求項７】
ＨＢＶ変種におけるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のコドン位置２０４を生じ、かつメチオニンからメチオニン以外任意のアミノ酸へのアミノ酸置換を生じるさらなるヌクレオチド変異を含んでなる請求項６に記載の単離されたＨＢＶポリ核酸、または該ヌクレオチド変異を含んでなる前記ＨＢＶポリ核酸のフラグメント。
【請求項８】
ＨＢＶ変種におけるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のドメインＢにおいてｒｔＡ１８１Ｓ置換を生じるヌクレオチド変異およびＨＢＶ変種におけるＤＮＡポリメラーゼ遺伝子のドメインＣにおいてｒｔＭ２０４Ｉ置換を生じるヌクレオチド変異を含んでなる請求項７に記載の単離されたＨＢＶポリ核酸、または該ヌクレオチド変異を含んでなる前記ＨＢＶポリ核酸のフラグメント。
【請求項９】
配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択されるポリ核酸を含んでなる請求項６〜８のいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶポリ核酸。
【請求項１０】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメント由来のＨＢＶ発現産物。
【請求項１１】
配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択されるポリアミノ酸を含んでなる請求項１０に記載のＨＢＶ発現産物。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶ変種を含んでなる組成物。
【請求項１３】
請求項６〜９のいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメントを含んでなる組成物。
【請求項１４】
請求項１０または１１に記載のＨＢＶ発現産物を含んでなる組成物。
【請求項１５】
少なくとも１つの非交差耐性な抗ＨＢＶ薬の選択のためのプロセスにおける、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶ変種、あるいは請求項６〜９のいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶポリ核酸あるいは請求項１０または１１に記載のＨＢＶ発現産物あるいは請求項１２または１３に記載の組成物の使用。
【請求項１６】
ＨＢＶ変種の検出のためのプロセスにおける、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶ変種、あるいは請求項６〜９のいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶポリ核酸あるいは請求項１０または１１に記載のＨＢＶ発現産物あるいは請求項１２または１３に記載の組成物の使用。
【請求項１７】
前記被験体にヌクレオシドアナログを投与すること、被験体が請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離されたＨＢＶ変種に感染しているかどうかを決定すること、および感染していれば、少なくとも１つの非交差耐性な抗ＨＢＶ薬を前記被験体に投与すること、を含んでなる、ＨＢＶ感染症に感染した被験体の処置のための方法。
【請求項１８】
生物学的サンプルにおいて請求項１〜５のいずれか一項に記載のＨＢＶ変種の存在を検出するための方法であって、請求項６〜９のいずれか一項に記載のポリ核酸またはそのフラグメントの存在を検出する工程を含んでなる方法。
【請求項１９】
ａ．前記生物学的サンプルから標的ＨＢＶポリ核酸を得ること、ここで、前記標的ＨＢＶポリ核酸は、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインのセリンをコードするコドン１８１、ならびに場合により、ＨＢＶウイルスのＨＢＶ逆転写酵素ドメインのメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４またはバリンをコードするコドン２０４またはセリンをコードするコドン２０４、およびスレオニンをコードするコドン２３６からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のコドンを含んでなることが疑われるものであり；
ｂ．（ａ）の標的ＨＢＶポリ核酸の核酸配列を得ること；
ｃ．（ｂ）において得られる核酸配列から、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインの前記セリンをコードするコドン１８１、および場合により、（ａ）に記載の群から選択される１つもしくはそれ以上のコドンの存在、ならびにそれらから、前記生物学的サンプルにおける前記ＨＢＶウイルスの存在および／または前記生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスの抗ウイルス薬に対する前記耐性を推察すること
を含んでなる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
ａ．前記生物学的サンプルに存在する標的ＨＢＶポリ核酸を得る工程および／またはそのヌクレオチド配列を得ること；
ｂ．適切な場合、（ａ）において得られるポリ核酸を部分的もしくは完全に変性するか、または酵素的に修飾すること；
ｃ．適切な場合、好ましくは、ＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメントにおいて、ＨＢＶ逆転写酵素ドメイン中のセリンをコードするコドン１８１とＨＢＶ逆転写酵素ドメイン中のアラニンもしくはバリンをコードするコドン１８１とを識別することが可能な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの存在下で、工程（ｂ）において得られる変性されたポリ核酸を再生させる工程、ならびに必要であれば、前記オリゴヌクレオチドを酵素的に修飾する（伸長することを含む）工程を含むこと；
ｄ．適切な場合、工程（ｂ）において得られる部分的もしくは完全に変性されたＨＢＶポリ核酸、ならびに／あるいは工程（ｃ）において形成されるハイブリッド、ならびに／あるいは工程（ｂ）および／または（ｃ）において得られる酵素修飾を検出すること；
ｅ．以下の群：部分的もしくは完全に変性されたポリ核酸、ハイブリッド、酵素修飾（すべて工程（ｄ）において検出される）のうちの１つもしくはそれ以上のデータ、ならびに（ａ）において得られるヌクレオチド配列から、前記生物学的サンプルにおける前記ＨＢＶの存在および／または前記生物学的サンプルに存在するＨＢＶの抗ウイルス薬に対する前記耐性を推察すること
を含んでなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ａ．前記生物学的サンプルから標的ＨＢＶポリ核酸を得ること、ここで、前記標的ＨＢＶポリ核酸は、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインのセリンをコードするコドン１８１を、場合により、ＨＢＶのＨＢＶ逆転写酵素ドメインのメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４またはバリンをコードするコドン２０４またはセリンをコードするコドン２０４、およびスレオニンをコードするコドン２３６からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のコドンとともに含んでなることが疑われるものであり；
ｂ．（ａ）の標的ＨＢＶポリ核酸を、セリンをコードするコドン１８１とアラニンまたはバリンをコードするコドン１８１とを識別することが可能であり、場合により、ロイシンをコードするコドン１８０とメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４とメチオニン、バリンまたはセリンをコードするコドン２０４、およびアスパラギンをコードするコドン２３６とスレオニンをコードするコドン２３６からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のコドンを識別することが可能なオリゴヌクレオチドと接触させること；
ｃ．（ｂ）において得られる識別シグナルから、場合により、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインの前記メチオニンをコードするコドン１８０または前記イソロイシンをコードするコドン２０４または前記アスパラギンをコードするコドン２３６とともにＨＢＶ逆転写酵素の前記セリンをコードするコドン１８１の存在、ならびにそれから、前記生物学的サンプルにおける前記ＨＢＶの存在および／または前記生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスの抗ウイルス薬に対する前記耐性を推察すること
を含んでなる、請求項１８に記載のＨＢＶ変種の存在を検出するための方法。
【請求項２２】
生物学的サンプルにおけるＨＢＶ変種の存在を検出するためおよび／または生物学的サンプルに存在するＨＢＶの抗ウイルス薬に対する耐性を検出するための診断キットであって、請求項６〜９のいずれか一項に記載のポリ核酸の存在を検出するための手段を含んでなるキット。
【請求項２３】
ａ．場合により、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインのメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４およびアスパラギンをコードするコドン２３６からなる群からの１つもしくはそれ以上のコドンをとともにＨＢＶ逆転写酵素ドメインのセリンをコードするコドン１８１を含んでなることが疑われる標的ポリ核酸の核酸配列から、
場合により、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインのメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４およびアスパラギンをコードするコドン２３６からなる群からの１つもしくはそれ以上のコドンとともにＨＢＶ逆転写酵素ドメインの前記セリンをコードするコドン１８１の存在、
ならびにそれから、前記生物学的サンプルにおける前記ＨＢＶの存在を推察するための手段と、場合により、
ｂ．標的ポリ核酸の核酸配列を得るための手段と、
を含んでなる、請求項２２に記載の診断キット。
【請求項２４】
セリンをコードするコドン１８１とアラニンまたはバリンをコードするコドン１８１とを識別することが可能なオリゴヌクレオチドを含んでなる請求項２２または２３に記載の診断キット。
【請求項２５】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のポリ核酸を含んでなるＨＢＶに対して活性な薬物をスクリーニングするための方法であって、
ａ．前記薬物の非存在下で前記ＨＢＶの複製を測定すること；
ｂ．前記薬物の存在下で前記ＨＢＶの複製を測定すること；
ｃ．（ａ）および（ｂ）から、前記ＨＢＶの複製に対する前記薬物の阻害効果を推察すること
を含んでなる方法。
【請求項２６】
請求項６〜９のいずれか一項に記載のＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメントにおいて、セリンをコードするコドン１８１と他の任意のアミノ酸をコードするコドン１８１とを識別することが可能なオリゴヌクレオチド。
【請求項２７】
セリンをコードするコドン１８１とアラニンまたはバリンをコードするコドン１８１とを識別することが可能な請求項２８に記載のオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特定の薬剤に対して低減した感受性を示すＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ（また、ＨＢＶウイルスとも示される））変種の分野に関する。より詳細には、本発明は、ＨＢＶ感染を処置するために使用される抗ウイルス薬に対するＨＢＶサンプルの感受性を診断する分野ならびに薬剤耐性に関与するコドンの範囲の同時特徴付けを可能にするＨＢＶ遺伝子における薬物誘導性変異の迅速かつ信頼できる検出のための方法および／またはアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＨＢＶは、ヘパドナウイルス科に属する約３２００ｂｐ長の小さなエンベロープＤＮＡウイルスである。ウイルスはＲＮＡ仲介物を介して複製し、その複製ストラテジーにおいて逆転写を利用する（非特許文献１）。ＨＢＶゲノムは、（ｉ）それぞれ、分泌型ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）およびヌクレオカプシドコアタンパク質（ＨＢｃＡｇ）をコードするｐｒｅＣ／Ｃ  ＯＲＦ；（ｉｉ）ウイルスポリメラーゼ／逆転写酵素をコードするＰ  ＯＲＦ；（ｉｉｉ）それぞれ、ウイルスエンベロープタンパク質、大型（ｌａｒｇｅ）、中型（ｍｉｄｄｌｅ）および小型（ｓｍａｌｌ）のｓ抗原（ＨＢｓＡｇ）をコードするｐｒｅＳ１／ｐｒｅＳ２／Ｓ  ＯＲＦ；ならびに（ｉｖ）表面、コア、ポリメラーゼおよびＸ遺伝子をコードする転写トランスアクチベータータンパク質をコードするＸ  ＯＲＦである重複するオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を伴う部分的な二本鎖ＤＮＡ構造を有する複雑な性質のゲノムである。
【０００３】
Ｂ型肝炎ウイルスは、それらのゲノムにおいて大きな遺伝的多様性を示し、現在、７つのＨＢＶ遺伝子型（Ａ〜Ｇ）が認識されている（非特許文献２；非特許文献３）。感染血液との接触を介して広がるウイルスは、衰弱性の病態を引き起こし得、急性肝不全をもたらし得る。ほとんどの成人は、処置を伴わずに感染を撃退することができるが、Ｂ型肝炎感染は、慢性形態に発達し得る。実際に、世界中で約４億人の人々がＨＢＶに慢性的に感染しており、慢性ＨＢＶキャリアの約１５〜４０％が肝硬変および末期の肝臓疾患に進行することが予想される。処置を伴わなければ、これらの患者の予後は不良であり、その結果、ＨＢＶのための有効な抗ウイルス療法の開発は以前として重要な目的である。治療の根本的目的は、ＨＢＶの複製を制御し、肝硬変および肝癌への進行を停止するために肝疾患の寛解を誘導することである。肝臓細胞の破壊、および１００，０００コピー／ｍｌより高いＨＢＶ  ＤＮＡのレベル（ウイルスの複製レベル）のため、処置は、活動性炎症、上昇したアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルを伴う患者に必要である。
【０００４】
慢性Ｂ型肝炎の処置のために現在承認されている薬物は、α−インターフェロン、およびヌクレオシドアナログまたは薬物の組み合わせである。ヌクレオシドアナログは、ウイルスの複製プロセスにおける置換基礎単位として作用し、ＨＢＶの複製を阻害するように化学的に操作されたヌクレオチドである。
【０００５】
インターフェロン（ＩＦＮ）療法は、小グループのキャリアにおいてのみ部分的に有効であることが示されており（非特許文献４）、重度の副作用のため、それはまた制限されてもいる。慢性ＨＢＶ感染の処置のためのＩＦＮ−αのこのような相対的欠陥により、さらなる治療用薬剤およびレジメンのための調査が促されている。特に、多くのヌクレオシドアナログが、ヘパドナウイルスＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の阻害を介してヘパドナウイルスの複製を阻害することが示されている。これらの化合物のうちのいくつかは、毒性（ロブカビル）または効力の欠如（ファムシクロビル）のため、臨床用途から既にはずされている（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。現時点で、慢性Ｂ型肝炎の処置のために最も成功しているヌクレオシドアナログは、疑いもなく、医薬品として承認されている３’−チアシチジンの（−）エナンチオマー（３ＴＣまたはラミブジン（ＬＡＭ））である（非特許文献８）。薬物は、ウイルスに対して強力な抗ウイルス活性を有し、良好に忍容されており、有害作用をほとんど有さない。しかし、ラミブジンによる長期治療は、しばしば、ウイルス体制の出現に関連する。ラミブジン耐性を付与し、ウイルスのインビトロでの複製効率を減少する一般的な変異の１つは、ＨＢＶ  ＲＮＡ依存性ＤＮＡのコドン２０４におけるメチオニンからイソロイシンまたはメチオニンからバリンへの置換である（非特許文献９；非特許文献１０；非特許文献１１）。保存されたＹＭＤＤモチーフにおけるこのＭｅｔからＶａｌまたはＩｌｅへのアミノ酸置換（ｒｔＭ２０４Ｖ／Ｉ）の変更の他に、逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｃｒｉｐｔａｓｅ）遺伝子の他の部位における変異された遺伝子型パターンもラミブジン耐性に関連している。特に、ポリメラーゼのＢドメインにおけるコドン１８０（ｒｔＬ１８０Ｍ）でのロイシンからメチオニンへの変異は、複製適応度を部分的に回復し、ならびにインビトロでの薬剤耐性を増大させることが報告された。ＨＢＶ／ＨＩＶ同時感染患者では、ラミブジン耐性の発達は、ＨＢＶ単一感染患者よりも頻回であり、ラミブジンアプリケーションの代替治療を不可欠にしている（非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。
【０００６】
慢性Ｂ型肝炎の処置に適用可能な別のヌクレオシドアナログは、アデフォビル・ジピボキシル、アデフォビルのプロドラック（ＡＤＦ）である。インビトロおよびインビボでの研究は、この薬物が野生型ＨＢＶ株ならびにラミブジン耐性を示すものを阻害することが可能であることを実証している。従って、ラミブジン耐性が生じている場合、ＡＤＦは、慢性ＨＢＶ感染の処置のための代替的療法としての役割を果たし得る。これまで、ＡＤＦは、第ＩＩＩ相臨床試験まで首尾よく通過した（非特許文献１６）。ＡＤＦに対する耐性を仲介する２つの変異が既に記載されている。これらの変異は、逆転写酵素遺伝子のコドン１８１（Ｂドメイン）およびコドン２３６（Ｄドメイン）に局在し、それぞれアミノ酸置換ＡｌａからＶａｌ（ｒｔＡ１８１Ｖ）およびＡｓｎからＴｈｒ（ｒｔＮ２３６Ｔ）を生じる（非特許文献１７；非特許文献１８；特許文献１；特許文献２）。変異ｒｔＡ１８１Ｖの頻度は約２．５％であり、これまでのところ臨床的関連性は不明である一方、アデフォビル処置患者の１．７〜２．５％は耐性変異ｒｔＮ２３６Ｔを示す。
【０００７】
非特許文献１９ならびに非特許文献２０により最近公開された研究は、ラミブジン耐性を伴う患者の約８５％〜９２％が、ＡＤＦを服用する一方、２対数を超えるかまたは等しい彼らのＨＢＶ  ＤＮＡレベルの減少を有することを実証している。これは、ＡＤＦが治療に追加される場合、８〜１５％の患者がＨＢＶ  ＤＮＡレベルの有意な減少を達成しないことを暗示する。従って、ＡＤＦ療法でウイルス学的応答を達成しないラミブジン耐性ＨＢＶを伴う患者のサブグループの先例がある。ＡＤＦに対する非応答性の理由は依然として不明である。
【０００８】
従って、ラミブジンおよびアデフォビルが強力な抗ウイルス効果を有するが、薬剤耐性を引き起こす変異体の発達は、慢性ＨＢＶ感染の処置において重要な問題を提示する。さらに、交差耐性プロファイルを伴うＨＢＶ変異体パターンの存在は、併用療法の欠陥の可能性のため、大きな問題を提起している。ＨＢＶ変異体に対する異なる抗ウイルス薬の交差耐性について試験する研究が報告されている（非特許文献２１、非特許文献２２が、アデフォビルおよびラミブジンの両方に対するインビボおよびインビトロ耐性を担う変異パターンについては、これまで報告されていない。
【０００９】
前記から、新規治療レジメンにおいてそれらを有用にするのに適切な特定を有する他の薬剤をスクリーニングおよび／または開発および／または設計するために、特定の薬剤に対して低減した感受性を示すＨＢＶ変種の出現または存在をモニターする必要性が存在するように思われる。本発明に従って、本発明者らは、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子において、ヌクレオシドアナログに対するＨＢＶの感受性を減少する変異を伴うＨＢＶの変種を同定した。
【特許文献１】国際公開第２００３／０８７３５２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００４／０３１２２４号パンフレット
【非特許文献１】サマーズ  Ｊ．（Ｓｕｍｍｅｒｓ  Ｊ．）、マソン  Ｗ．（Ｍａｓｏｎ  Ｗ．）Ｃｅｌｌ（１９８２年）２９：４０３−４１５
【非特許文献２】ストイヴェル，Ｌ．Ｊ．（Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｌ．Ｊ．）、ロカルニニ，Ｓ．Ａ．（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ，Ｓ．Ａ．）、ロク，Ａ．（Ｌｏｋ，Ａ．）、リッチマン，Ｄ．Ｄ．（Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｄ．）、カーマン，Ｗ．Ｆ．（Ｃａｒｍａｎ，Ｗ．Ｆ．）、ディーンスタグ，Ｊ．Ｌ．（Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｊ．Ｌ．）およびシナジ，Ｒ．Ｆ．（Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．）（２００１年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３３、７５１−７５７
【非特許文献３】ストイヴェル，Ｌ．（Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｌ．）、デ・ゲント，Ｓ．（Ｄｅ  Ｇｅｎｄｔ，Ｓ．）、バン・ゲイト，Ｃ．（Ｖａｎ  Ｇｅｙｔ，Ｃ．）、ゾウリム，Ｆ．（Ｚｏｕｌｉｍ，Ｆ．）、フリード，Ｍ．（Ｆｒｉｅｄ，Ｍ．）、シナジ，Ｒ．Ｆ．（Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．）およびロッサウ，Ｒ．（Ｒｏｓｓａｕ，Ｒ．）（２０００年）Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ８１  Ｐｔ１、６７−７４
【非特許文献４】ロク，Ａ．Ｓ．（Ｌｏｋ，Ａ．Ｓ．）（１９９４年）Ｊ  Ｖｉｒａｌ．Ｈｅｐａｔ．１、１０５−１２４
【非特許文献５】デ・クレーク，Ｅ．（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．）（１９９９年）Ｉｎｔ．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ１２、８１−９５
【非特許文献６】シナジ，Ｒ．（Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．）（１９９７年）ｉｎ    Ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ（リッゼット，Ｍ．（Ｒｉｚｚｅｔｔｏ，Ｍ．）、パーセル，Ｒ．（Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．）、ゲリン，Ｊ．（Ｇｅｒｉｎ，Ｊ．）およびベルメ，Ｇ．（Ｖｅｒｍｅ，Ｇ．）編、Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ．７３６−７４２頁、ミネルヴァメディカ（Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄｉｃａ）、トリノ（Ｔｏｒｉｎｏ）
【非特許文献７】ルスコーム，Ｃ．Ａ．（Ｌｕｓｃｏｍｂｅ，Ｃ．Ａ．）およびロカルニニ，Ｓ．（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ，Ｓ．）（１９９６年）Ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２、１−３５
【非特許文献８】ジャービス，Ｂ．（Ｊａｒｖｉｓ，Ｂ．）およびファウルズ，Ｄ．（Ｆａｕｌｄｓ，Ｄ．）（１９９９年）Ｄｒｕｇｓ  ５８，１０１−１４１
【非特許文献９】リング  Ｒ．（Ｌｉｎｇ  Ｒ．）ら、１９９６年
【非特許文献１０】バーソロミュー  Ｍ．（Ｂａｒｔｈｏｌｏｍｅｗ  Ｍ．）ら、１９９７年
【非特許文献１１】ティッペルズ  Ｇ．Ａ．（Ｔｉｐｐｌｅｓ  Ｇ．Ａ．）ら、１９９６年
【非特許文献１２】ベンハモウ  Ｙ．（Ｂｅｎｈａｍｏｕ  Ｙ．）ら、Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ−１  ａｎｄ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ：  ａｎ  ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ  ｐｉｌｏｔ  ｓｔｕｄｙ．Ｌａｎｃｅｔ（２００１年）３５８：７１８−７２３
【非特許文献１３】ベンハモウ  Ｙ．（Ｂｅｎｈａｍｏｕ  Ｙ．）ら、Ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ  ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ  ａｎｄ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（２００３年）  ３４８（２）：１７７−１７８
【非特許文献１４】ベンハモウ  Ｙ．（Ｂｅｎｈａｍｏｕ  Ｙ．）ら、Ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ＨＩＶ／ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｉｎｆｅｃｔｉｏｎ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００４年）３８補遺２：Ｓ９８−１０３
【非特許文献１５】ドレ  Ｇ．Ｊ．（Ｄｏｒｅ  Ｇ．Ｊ．）ら、Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ  ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｎａｉｖｅ  ａｎｄ  −ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｃｏｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ−１  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００４）１８９（７）：１１８５−１１９２
【非特許文献１６】ウェストランド  ＣＥ（Ｗｅｓｔｌａｎｄ  ＣＥ）ら、Ｗｅｅｋ  ４８  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｐｈａｓｅ  ３  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００３年）  ３８（１）：９６−１０３
【非特許文献１７】アンガス  Ｐ．（Ａｎｇｕｓ  Ｐ．）ら、Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＨＢＶ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００３年）１２５（２）：２９２−２９７
【非特許文献１８】ヤン  Ｈ（Ｙａｎｇ  Ｈ）ら、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ＨＢＶ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ＨＢｅＡｇ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ９６  Ｗｅｅｋｓ  ｏｆ  Ａｄｅｆｏｖｉｒ  Ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ  （ＡＤＶ）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００３年）３８：７０５Ａ
【非特許文献１９】ペリロ  Ｒ．（Ｐｅｒｒｉｌｌｏ  Ｒ．）ら、Ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ  ａｄｄｅｄ  ｔｏ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｗｉｔｈ  ＹＭＤＤ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００４年）１２６（１）：８１−９０
【非特許文献２０】ペータース  Ｍ．Ｇ．（Ｐｅｔｅｒｓ  Ｍ．Ｇ．）ら、Ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ  ａｌｏｎｅ  ｏｒ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００４年）１２６（１）：９１−１０１
【非特許文献２１】ディレーニー（Ｄｅｌａｎｅｙ）ら、（２００１年）
【非特許文献２２】ション（Ｘｉｏｎｇ）ら、（２００１年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、ヌクレオシドアナログに対して低減した感受性を示すＨＢＶ変種の出現または存在の不適切なモニタリングの問題を解決することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子において少なくとも１つのヌクレオチド変異を含んでなる単離されたＨＢＶ変種に関し、ここで、前記ヌクレオチド変異は、ＨＢＶポリメラーゼにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を生じ、かつここで、前記変種は、ヌクレオシドアナログＡＤＦおよび／またはＬＡＭならびに／あるいはそれらの組み合わせに対する低減した感受性を示す。
【００１２】
本発明はさらに、これらのＨＢＶ変種由来の単離されたポリ核酸であって、該単離されたポリ核酸は、ポリメラーゼ遺伝子において少なくとも１つのアミノ酸置換および／または欠失を生じるヌクレオチド変異を含んでなり、該ヌクレオチド変異は、ヌクレオチドアナログＡＤＦおよび／またはＬＡＭならびに／あるいはそれらの組み合わせに対して低減した感受性をもたらす、上記単離されたポリ核酸；ならびに前記ヌクレオチド変異を含んでなる前記ＨＢＶポリ核酸のフラグメントに関する。
【００１３】
本発明はさらに、これらの単離されたポリ核酸由来の発現産物およびそのフラグメントに関する。
【００１４】
本発明のさらなる態様は、本発明のＨＢＶ変種またはポリ核酸または発現産物を含んでなる組成物に関し、好ましくは、ＨＢＶ変種のモニタリングおよび／または同定においてそれらのアプリケーションが見出される。
【００１５】
本発明の別の態様は、臨床判断における上記の単離されたＨＢＶ変種ならびに／あるいはそれらのポリ核酸および／または発現産物および／または組成物の使用に関する。特に、本発明のＨＢＶ変種あるいはポリ核酸もしくは発現産物または組成物は、少なくとも１つの非交差耐性な抗ＨＢＶ薬の選択のためのプロセスにおいて使用される。特に、ＨＢＶ変種あるいはポリ核酸もしくは発現産物または組成物は、ＨＢＶ変種ポリ核酸の検出のためのプロセスにおいて使用される。
【００１６】
本発明は、さらに、ＨＢＶ感染の処置のための方法であって、ＨＢＶに感染した被験体にヌクレオシドアナログを投与すること、被験体が上記のＨＢＶ変種に感染しているかどうかを決定すること、および感染していれば、被験体に少なくとも１つの非交差耐性な抗ＨＢＶ薬を投与することを含んでなる方法に関する。
【００１７】
さらに、本発明には、生物学的サンプルにおいて本発明に従うＨＢＶ変種の存在を検出することを目的とする方法が含まれる。前記方法は、その中にＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメントの存在を検出することを含んでなる。
【００１８】
最終的に、本発明は、生物学的サンプルにおいてＨＢＶ変種の存在を検出するおよび／または生物学的サンプルに存在するＨＢＶの抗ウイルス薬に対する耐性を検出するための診断キットに関する。さらに、上記のポリ核酸を含んでなるＨＢＶ対して活性な薬物をスクリーニングするための方法が提供される。
【００１９】
さらに、ＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメントにおいて、アラニンまたはバリンをコードする既知のコドン１８１とは異なるセリンをコードする新規のコドン１８１を識別することが可能なオリゴヌクレオチドが提供されている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
本発明に従って、本発明者らは、ＡＤＦもしくはＡＤＦを含んでなる治療および／またはＬＡＭもしくはＬＡＭを含んでなる治療ならびに／あるいはこれらの抗ＨＢＶ剤の組み合わせにウイルス学的に非応答性であったＨＢＶに慢性的に感染した患者においてＨＢＶの変種を同定した。単離されたＨＢＶ  ＤＮＡの配列解析により、ＨＢＶポリメラーゼにおける新規の核酸多型の出現が示された。前記多型の発生は、ヌクレオチドアナログ療法（アデフォビル耐性ＨＢＶ変種の出現／存在への強力な指示）中のウイルス進展の持続と一致する。インビトロでの所見により、高濃度のヌクレオシドアナログで処置される場合であっても、これらのＨＢＶ変異体がアデフォビルおよびラミブジンの両方に耐性であることが確認された。
【００２１】
より詳細には、本発明は、ＨＢＶ感染を処置するために使用される抗ウイルス薬に対するＨＢＶサンプルの感受性の改善された診断ならびに薬剤耐性に関与するコドンであって、新規の核酸多型を含む該コドンの範囲の同時特徴付けを可能にするＨＢＶ遺伝子における薬物誘導性変異の迅速かつ信頼できる検出のための方法および／または改善されたアッセイを提供する。
【００２２】
下記のように本発明を通して、多様な刊行物が参照される。前記刊行物の内容は、これによって、参照により本出願に援用される。前記刊行物は、本出願が関する分野をより詳細に説明することが意図される。
【００２３】
本発明の第１の態様は、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子において少なくとも１つのヌクレオチド変異を含んでなる単離されたＨＢＶ変種に関し、ここで、前記ヌクレオチド変異は、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＢにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換を生じ、かつここで、前記変種は、ヌクレオシドアナログおよび／またはＨＢＶに対する他の抗ウイルス薬に対する低減した感受性を示す。好適なＨＢＶ変種は、ポリメラーゼ遺伝子のコドン位置１８１におけるアラニンの少なくとも１つのアミノ酸置換を生じる少なくとも１つのヌクレオチド変異、より詳細には、ポリメラーゼ遺伝子のコドン１８１においてアラニンからセリンへのアミノ酸置換（ｒｔＡ１８１Ｓとしても示される）を生じる少なくとも１つのヌクレオチド変異を含んでなる。本発明に従う単離されたＨＢＶ変種は、好ましくは、ヌクレオシドアナログに対して低減した感受性を示し、好ましくは、ヌクレオシドアナログはアデフォビルおよび／またはラミブジンである。
【００２４】
本発明はまた、ｒｔＡ１８１Ｓの他に、ＨＢＶポリメラーゼの他の部位においてさらなる変異された遺伝子型パターンを含んでなる単離されたＨＢＶ変種を含む。好ましくは、さらなる変異は、ポリメラーゼ遺伝子の任意の異なるドメインにおいて変更されたアミノ酸配列を生じる。これらは、薬剤耐性に関連する既知のアミノ酸の変更を含む。従って、本発明は、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＢにおいて１つのｒｔＡ１８１Ｓ置換および１８０位におけるロイシン、２０４位におけるメチオニンおよび２３６位におけるアスパラギンの置換からなる群から選択されるアミノ酸置換をコードする少なくとも１つのさらなる変異を含んでなる単離されたＨＢＶ変種にまで及ぶ。特に、単離された変種は、ｒｔＡ１８１ＳおよびｒｔＭ２０４Ｉ、またはｒｔＡ１８１ＳおよびｒｔＭ２０４Ｖ、またはｒｔＡ１８１ＳおよびｒｔＭ２０４Ｓ、またはｒｔＡ１８１ＳおよびｒｔＬ１８０Ｍ、またはｒｔＡ１８１ＳおよびｒｔＮ２３６Ｔ置換の結果を含んでなる。
【００２５】
本発明はまた、ｒｔＡ１８１Ｓの他に、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＣに局在するさらなる変異された遺伝子型パターンを含んでなる単離されたＨＢＶ変種を含む。より好ましくは、ヌクレオチド置換は、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＣにおけるコドン位置２０４でのメチオニンの置換を生じる。特に、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子において少なくとも２つのヌクレオチド変異を含んでなる単離されたＨＢＶ変種が含まれ、ここで、前記ヌクレオチド変異は、少なくとも２つのアミノ酸置換、ポリメラーゼのドメインＢにおけるコドン位置１８１でのアラニンの１つの置換およびポリメラーゼのドメインＣにおけるコドン位置２０４でのメチオニンの１つの置換を生じる。コドン位置２０４でのメチオニンの置換は、メチオニン以外の任意のアミノ酸を含むことが意図され、好ましくは、置換は、イソロイシンおよびバリンおよびセリンからなる群から選択されるアミノ酸への置換である。
【００２６】
例示的ＨＢＶ変種は、ＨＢＶポリメラーゼのドメインＢにおける１つのｒｔＡ１８１Ｓ置換およびＨＢＶポリメラーゼのドメインＣにおける１つのｒｔＭ２０４Ｉ置換を含んでなる。本発明の単離されたＨＢＶ変種は、ＨＢＶに対する抗ウイルス薬、好ましくは、ヌクレオシドアナログへの低減した感受性を示す。
【００２７】
用語「変異」は、その最も広範な状況において読まれなければならず、複数の変異を含む。本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子において少なくとも１および／または２および／または３および／または４および／または５および／または６つのヌクレオチド変異を含んでなる単離されたＨＢＶ変種にまで及び、ここで、前記ヌクレオチド変異は、少なくとも１および／または２および／または３および／または４および／または５および／または６つのアミノ酸置換を生じ、１つの置換は、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＢにおけるコドン位置１８１でのアラニンからアラニン以外の任意のアミノ酸への置換、好ましくは、アラニンからセリンへの置換であることが理解されるべきである。
【００２８】
「単離された」は、本発明のＨＢＶ変種ならびに／あるいはＨＢＶポリ核酸および／または発現産物に関連して使用される場合、変種またはポリ核酸が少なくとも１つの精製工程に供されて、天然に存在する体液および／または組織から分離されること、あるいはそれがその生来の環境には存在しないことを意味する。あるいは、変種は、単離された体液および／もしくは組織において維持されてもよく、またはポリ核酸形態であってもよい。典型的に、これは、ウイルス変種またはポリ核酸が少なくとも１つの宿主タンパク質および／または宿主核酸を含まないことを意味する。一般に、単離されたウイルス変種またはポリ核酸は、インビトロでの環境において存在する。「単離された」は、ウイルス変種またはポリ核酸が精製されるかまたは均質でなければならないことを意味するものではないが、そのような調製物は該用語の範囲内に当てはまる。「単離された」は、単純に、純度に対して、天然物および特許請求の範囲からの偶発的な新規性の喪失（ａｃｃｉｄｅｎｔａｌ  ａｎｔｉｃｉｐａｔｉｏｎ）を含まずに要求される程度にまで引き上げられることを意味する。「単離された」は、感染したヒトもしくは動物から直接、または培養（富化）後のいずれかから採取される任意の生物学的材料を含むことが意図される。「生物学的材料」は、例えば、任意の種類の気管支洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｅｏｌａｖａｇｅ）、血液、皮膚組織、生検、リンパ球の血液培養材料、コロニー、液体培養物、糞便サンプル、尿などであってもよい。「生物学的材料」はまた、人工的に感染された細胞培養物またはその液相であってもよい。
【００２９】
ヌクレオシドアナログに関して「低減された」または「減少した」感受性への言及は、ヌクレオシドアナログに対する完全もしくは実質的な耐性ならびに部分的耐性を含み、そして包含し、ヌクレオシドアナログの存在下で野生型を超える複製速度または複製効率を含む。１つの態様では、これは、処置中のウイルス量の増加によって簡便に測定されるか、あるいは、処置中の前処置ＨＢＶ  ＤＮＡレベルからのＨＢＶ  ＤＮＡウイルス量の実質的減少が認められない（即ち、処置に対して非応答性）。好ましくは、「低減した感受性」はＡＤＦに関するものである。あるいは、「低減した感受性」はＬＡＭに関するものである。あるいは、「低減した感受性」はＬＡＭおよびＡＤＦの両方に関するものである。あるいは、「低減した感受性」は、ＡＤＦおよび／もしくはＬＡＭおよび／または他のヌクレオシドアナログならびに／あるいはＨＢＶに対する他の抗ウイルス薬に関するものである。ＨＢＶに対する多くの抗ウイルス薬（ＨＢＶ抗ウイルス薬）が既知であり、次のものを含む：ロブカビル、ペンシクロビルまたはファムシクロビル、ラミブジン（３ＴＣ；β−Ｌ−（−）−２’，３’−ジデオキシ−３’−チアシチジン）、インターフェロン−α、アデフォビル・ジピボキシル（ビス−ＰＯＭ−ＰＭＥＡ）またはアデフォビル（ＰＭＥＡ；９−（２−ホスホニル−メトキシエチル）−アデニン）、エンテカビル（ＢＭＳ２００４７５）、エムトリシタビン［（−）ＦＴＣ；（−）−β−Ｌ−２’，３’−ジデオキシ−５−フルオロ−３’−チアシチジン］、ＤＸＧ［（−）−β−Ｄ−２，６−ジアミノプリンジオキソラン］、ＤＡＰＤ（ジアミノプリンジオキソラン）、クレブジン（Ｌ−ＦＭＡＵ；２’−フルオロ−５−メチル−β−Ｌ−アラビノフラノシルウラシル）、Ｌ−ｄＴ（β−Ｌ−チミジン）、Ｌ−Ｆｄ４Ｃ（２’，３’−ジデオキシ−２’，３’−ジデヒドロ−β−Ｌ（−）−５−フルオロシチジン）、フォスカルネット、カルボビル、ラシビル、ガンシクロビル、テノフォビル、ネビラピン、（−）ＢＣＨ１８９（オノ（Ｏｎｏ）ら、２００１年）、ＱＹＬ８６５（フー（Ｆｕ）ら、２０００年）、チモシンα、およびＨＢＩｇ、ＨＢｓＡｇに対する抗体。２つもしくはそれ以上のＨＢＶ抗ウイルス薬を組み合わせて使用することもできる。
【００３０】
末端タンパク質とタンパク質の触媒成分との間のリンカーまたはスペーサードメイン内の挿入もしくは欠失の存在のため、すべてのＨＢＶゲノムが正確に同じ長さを有するわけではなく、ポリメラーゼも同様に等しくない。この乱雑を克服するために、研究者のグループは、ポリメラーゼの遺伝子型非依存的番号付けスキームを開発した。ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子における変異されたコドンを示す１つの可能な方法は、ストイヴェル（Ｓｔｕｙｖｅｒ）ら、２００１年に従い、ここで、ポリメラーゼの触媒部ＣドメインのＹＭＤＤ座位におけるメチオニン（Ｍ）は、５３９、５４９、５５０または５５２ではなく、ｒｔＭ２０４と番号付けされる。この番号付けシステムを本特許出願において使用する。従って、慢性Ｂ型肝炎のヌクレオシドアナログ処置に関連するＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子における変異は、ドメインＢではｒｔＬ１８０ＭおよびｒｔＡ１８１Ｖとして、ドメインＣではｒｔＭ２０４ＩおよびｒｔＭ２０４Ｖとして、ならびにドメインＤではｒｔＮ２３６Ｔとして記載されている。
【００３１】
本発明の別の態様は、本発明のＨＢＶ変種に従う単離されたポリ核酸に関する。これらの単離されたポリ核酸は、ＨＢＶポリメラーゼにおいて少なくとも１つのアミノ酸置換および／または欠失を生じるヌクレオチド変異を含んでなる。特に、本発明は、ポリメラーゼ遺伝子のコドン１８１においてヌクレオチド変異を含んでなる、より詳細には、ポリメラーゼのコドン１８１にいてアラニンの置換を生じる少なくとも１つのヌクレオチド変異を含んでなる単離されたポリ核酸に関する。より詳細には、単離されたポリ核酸は、アミノ酸置換ｒｔＡ１８１Ｓを生じるヌクレオチド変異を含んでなる。
【００３２】
本発明はまた、ｒｔＡ１８１Ｓの他に、ＨＢＶポリメラーゼの他の部位においてさらなる変異された遺伝子型パターンを含んでなる単離されたポリ核酸を含む。好ましくは、さらなる変異は、ポリメラーゼ遺伝子の任意の異なるドメインにおいて変更されたアミノ酸配列を生じる。これらの変異は、薬剤耐性に関連する既知のアミノ酸の変更を含む。従って、本発明は、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＢにおいてｒｔＡ１８１Ｓ置換をコードする１つの変異ならびにｒｔＬ１８０Ｍ、ｒｔＭ２０４ＩまたはｒｔＭ２０４ＶまたはｒｔＭ２０４ＳおよびｒｔＮ２３６Ｔの群から選択されるアミノ酸置換をコードする少なくとも１つのさらなる変異を含んでなる単離されたポリ核酸にまで及ぶ。
【００３３】
本発明はまた、ｒｔＡ１８１Ｓをコードする変異の他に、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＣに局在するさらなる変異された遺伝子型パターンを含んでなる単離されたポリ核酸を含む。より好ましくは、さらなるヌクレオチド変異は、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＣにおけるコドン位置２０４でのメチオニンの置換を生じる。特に、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子において少なくとも２つのヌクレオチド変異を含んでなる単離されたＨＢＶ変種が含まれ、ここで、前記ヌクレオチド変異は、少なくとも２つのアミノ酸置換、ポリメラーゼのドメインＢにおけるコドン位置１８１でのアラニンの１つの置換およびポリメラーゼのドメインＣにおけるコドン位置２０４でのメチオニンの１つの置換を生じる。コドン位置２０４でのメチオニンの置換は、メチオニン以外の任意のアミノ酸を含むことが意図され、好ましくは、置換は、イソロイシンおよび／またはバリンおよび／またはセリンへの置換である。
【００３４】
例示的ポリ核酸は、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＢにおけるｒｔＡ１８１Ｓ置換、および例えば、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＣにおけるｒｔＭ２０４Ｉ置換をコードするＤＮＡポリメラーゼ遺伝子におけるヌクレオチド変異を含んでなる。特定の実施態様では、前記単離されたＨＢＶポリ核酸は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択される配列を含んでなる。より具体的には、前記単離されたＨＢＶポリ核酸は、配列番号２、配列番号３、配列番号５、配列番号６および配列番号７からなる群から選択される配列によって規定される。
【００３５】
本発明の別の態様は、上記の単離されたポリ核酸のフラグメントに関し、該フラグメントは、ヌクレオシドアナログおよび／または他の抗ＨＢＶ剤に対する低減した感受性をもたらす記載のヌクレオチド変異を含んでなる。これらのフラグメントは、少なくとも、ｒｔＡ１８１Ｓ置換を生じる遺伝子型パターンを含んでなる。
【００３６】
さらなる実施態様では、前記その単離されたＨＢＶポリ核酸は、ＤＮＡ、もしくはＲＮＡ（ここで、ＴはＵに置き換えられる）であってもよく、または合成ポリ核酸であってもよい。
【００３７】
本発明の変種をコードするポリ核酸は、長さにばらつきがあり、変異残基コドンに隣接する塩基の選択において変動し得る。ポリ核酸の長さはそれほど重要ではないが、但し、それは、意図する目的のために、Ｂ型肝炎ウイルス配列の一部であることが認識される。相当な配列変動がウイルスのゲノム内に存在し、従って、変種部位に隣接する核酸配列は、天然に存在する配列においてさえも相当に変動し得る。変種をコードする配列に新規かつ有用性を提供するのに十分なポリ核酸の必要性が唯一存在し、しかしその他の点について、選択されるコドンに隣接する配列の長さは重要ではない。典型的に、（変種コドンを含む）配列の長さは、９〜２００ｂｐの範囲内の任意の整数であり、通常、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５ｂｐまでである。また、変種全体およびさらに以下に記載のフラグメントをコードするのに十分な長さの配列が含まれる。
【００３８】
本発明の「単離されたポリ核酸またはそのフラグメント」は、サンプルから直接得られるまたは重複、増殖もしくは増幅後に得られる一本鎖ポリ核酸、二本鎖ポリ核酸または三重鎖形成ポリ核酸を含んでなることが意図される。「得られる」は、本明細書において、生物学的サンプルからの前記ポリ核酸の単離および／または精製および／または増幅を含むことが意図される。「サンプル」は、感染したヒトもしくは動物から直接、または培養（富化）後のいずれかから採取される任意の生物学的材料であり得る。「重複、増殖または増幅」は、任意の配列決定技術を含む任意の核酸増幅方法を使用することによって産生される任意の核酸を含むことが意図される。従って、前記のいずれか、または前記核酸多型の組み合わせを含んでなる核酸分子を産生する任意の配列決定技術は、用語「重複、増殖または増幅」に含まれると理解されるべきである。
【００３９】
本明細書において言及する用語「合成ポリ核酸」は、一本鎖ポリ核酸、二本鎖ポリ核酸または三重鎖形成ポリ核酸であることが意図される。ポリ核酸は、ヌクレオチド配列増幅方法によってインビトロで作製することができる。そのような増幅されるポリ核酸が二本鎖である場合、所望される一本鎖ポリ核酸が前記エキソヌクレアーゼ活性に対して保護されるのであれば、一本鎖分子への変換は、適切なエキソヌクレアーゼによって達成することができる。あるいは、ポリ核酸は、必要であれば、適切なヌクレアーゼを使用してクローニングされたプラスミドから後者を切断し、例えば、分子量に従う分画によってそれらを回収することによって、対応するポリヌクレオチド配列を含む挿入物を含有する組換えプラスミドから誘導される。インビトロで合成ポリ核酸を作製する別の手段は、核酸配列決定の任意の方法内に含まれる。従って、配列決定反応の産物は、明らかに、用語「合成ポリ核酸」に含まれる。本発明に従うポリ核酸はまた、例えば、従来のホスホトリエステルまたはホスホルアミダイト化学によって、化学的に合成することもできる。
【００４０】
「ヌクレオチド配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）増幅」は、標的ヌクレオチド配列コピーの数の増殖を生じるすべての方法を含むことが意図される。ヌクレオチド配列増幅方法として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；ＤＮＡ増幅）、鎖置換増幅（ＳＤＡ；ＤＮＡ増幅）、転写に基づく増幅システム（ＴＡＳ；ＲＮＡ増幅）、自己支持配列複製（３ＳＲ；ＲＮＡ増幅）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ；ＲＮＡ増幅）、転写仲介増幅（ＴＭＡ；ＲＮＡ増幅）、Ｑβ−レプリカーゼ仲介増幅およびラン・オフ転写が挙げられる。
【００４１】
用語「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「プローブ」または「プライマー」は、本明細書において使用される場合、任意の長さまたは任意の形状（例えば、分岐ＤＮＡ）のポリマー形態のヌクレオチド、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、ペプチドヌクレオチドもしくは固定ヌクレオチドのいずれかまたはそれらの組み合わせを指す。前記用語は、さらに、二本鎖（ｄｓ）および一本鎖（ｓｓ）ポリヌクレオチドならびに三本鎖ポリヌクレオチドを含む。前記用語はまた、メチル化、環化および「キャップ」のような既知のヌクレオチド修飾ならびにイノシンのようなアナログまたはＨＥＧ（ヘキサエチレングリコール（ｈｅｘｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ））のような増幅不能なモノマーによる１つもしくはそれ以上の天然に存在するヌクレオチドの置換を含む。
【００４２】
リボヌクレオチドはＮＴＰ、デオキシリボヌクレオチドはｄＮＴＰ、およびジデオキシリボヌクレオチドはｄｄＮＴＰとして示される。
【００４３】
ヌクレオチドは、一般的に、放射性標識、化学発光標識、蛍光標識、リン光標識あるいは赤外染料または表面増強ラマン標識もしくはプラスモン共鳴粒子（ＰＲＰ）によって標識することができる。
【００４４】
ヌクレオチドの修飾の例として、アクリジンまたはその誘導体、アクリダイト（Ａｃｒｙｄｉｔｅ）ＴＭ、アミン、ビオチン、ＢＨＱ−１ＴＭ、ＢＨＱ−２ＴＭ、ＢＨＱ−３ＴＭ、ボランｄＮＴＰ、炭素スペーサー（例えば、Ｃ３、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ９、Ｃ１２もしくはＣ１８）、カスケードブルー、コレステロール、クマリンまたはその誘導体、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）ＤＡＢＣＹＬ、ダンシルクロリド、ジゴキシゲニン、ジニトロフェニル、デュアルビオチン、ＥＤＡＮＳ、６−ＦＡＭ、フルオレセイン、３’−グリセリル、ＨＥＸ、ＩＡＥＤＡＮＳ、倒置ｄＡ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＡ）、倒置ｄＧ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＧ）、倒置ｄＣ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＣ）、倒置ｄＧ（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄＧ）、ＩＲＤ−７００、ＩＲＤ−８００、ＪＯＥ、ラホーヤブルー（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｂｌｕｅ）、金ナノ粒子のような金属クラスター、フェニルボロン酸、リン酸ソラレン、３’−もしくは５’−リン酸化、ピレン、３’リボ−アデノシン、３’リボ−グアノシン、３’リボ−シチジン、（ＬＣ）レッド（Ｒｅｄ）６４０、（ＬＣ）レッド（Ｒｅｄ）７０５、ローダミン、ＲＯＸ、チオール（ＳＨ）、スペーサー、ＴＡＭＲＡ、ＴＥＴ、ＡＭＣＡ−Ｓ（登録商標）、ＳＥ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）、マリンブルー（Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ）（登録商標）、オレゴングリーン（Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ）（登録商標）、パシフィックブルー（Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ）（登録商標）、ＱＳＹ７ＴＭ、ローダミングリーン（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｇｒｅｅｎ）（登録商標）、ローダミンレッド（Ｒｈｏｄａｍｉｎｅ  Ｒｅｄ）（登録商標）、ロードルグリーン（Ｒｈｏｄｏｌ  Ｇｒｅｅｎ）（登録商標）、テトラメチルローダミン、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）（登録商標）、ユニ−リンク（Ｕｎｉ−Ｌｉｎｋ）  ＮＨ２モディファイアー、放射性標識（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ）およびナノ粒子の添加が挙げられる。
【００４５】
ポリヌクレオチドの骨格および塩基の修飾として、さらに、２’−デオキシアリステロマイシン（２’−ｄｅｏｘｙａｒｉｓｔｅｒｏｍｅｃｙｉｎ）、メチルホスホネート、２’−ＯＭｅ−メチルホスホネートＲＮＡ、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）、ホスホロチオレート（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏｒａｔｅ）、アルキルホスホロチエート（ａｌｋｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉａｔｅ）、ホスホルアミダイト、ＲＮＡ、２’−ＯＭｅＲＮＡ、２−アミノ−ｄＡ、２−アミノプリン、３’−（ｄｄＡ）、３’ｄＡ（コルディセピン）、７−デアザ−ｄＡ、８−Ｂｒ−ｄＡ、８−オキソ−ｄＡ、Ｎ６−Ｍｅ−ｄＡ、脱塩基部位（ｄＳｐａｃｅｒ）、ビオチンｄＴ、２’−ＯＭｅ−５Ｍｅ−Ｃ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｃ、３’−（５−Ｍｅ−ｄＣ）、３’−（ｄｄＣ）、５−Ｂｒ−ｄＣ、５−Ｉ−ｄＣ、５−Ｍｅ−ｄＣ、５−Ｆ−ｄＣ、カルボキシ−ｄＴ、変換可能なｄＡ、変換可能なｄＣ、変換可能なｄＧ、変換可能なｄＴ、変換可能なｄＵ、７−デアザ−ｄＧ、８−Ｂｒ−ｄＧ、８−オキソ−ｄＧ、Ｏ６−Ｍｅ−ｄＧ、Ｓ６−ＤＮＰ−ｄＧ、４−メチルインドール、５−ニトロインドール、２’−ＯＭｅ−イノシン、２’−ｄＩ、０６−フェニル−ｄＩ、４−メチルインドール、２’−デオキシネブラリン、５−ニトロインドール、２−アミノプリン、ｄＰ（プリンアナログ）、ｄＫ（ピリミジンアナログ）、３−ニトロ−ピロール、２−チオ−ｄＴ、４−チオ−ｄＴ、ビオチン−ｄＴ、カルボキシ−ｄＴ、Ｏ４−Ｍｅ−ｄＴ、Ｏ４−トリアゾールｄＴ、２’−ＯＭｅ−プロピニル−Ｕ、５−Ｂｒ−ｄＵ、２’−ｄＵ、５−Ｆ−ｄＵ、５−Ｉ−ｄＵ、Ｏ４−トリアゾールｄＵが挙げられる。
【００４６】
ポリヌクレオチドのさらなる修飾として、ハプテンまたはタンパク質ラベリングが挙げられる。ハプテンは、例えば、ビオチンおよびジゴキシゲニンを含む一方、タンパク質は、ダイズもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼまたはジヒドロ葉酸レダクターゼのような酵素を含むか、あるいは（ヒスチジン）６−タグ、タンパク質Ａ、マルトース結合タンパク質、Ｔａｇ・１００エピトープ（ＥＥＴＡＲＦＱＰＧＹＲＳ；配列番号１５）、ｃ−ｍｙｃエピトープ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号１６）、ＦＬＡＧ（登録商標）−エピトープ（ＤＹＫＤＤＤＫ；配列番号１７）、ｌａｃＺ、ＣＭＰ（カルモジュリン結合ペプチド）、ＨＡエピトープ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号１８）、タンパク質Ｃエピトープ（ＥＤＱＶＤＰＲＬＩＤＧＫ；配列番号１９）およびＶＳＶエピトープ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ；配列番号２０）のような異種エピトープを構成し得る。他のタンパク質として、ヒストン、一本鎖結合タンパク質（ｓｓＢ）ならびに緑色、赤色、青色、黄色、シアン蛍光タンパク質のような生来および操作された蛍光タンパク質が挙げられる。クマリン類、フロクマリン類もしくはベンゾピロン類またはそれらの任意の誘導体のような架橋部位もまた、組み入れることができる。
【００４７】
さらなる実施態様では、前記用語「ポリヌクレオチド」、「ポリ核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「核酸分子」、「オリゴヌクレオチド」、「プローブ」または「プライマー」もまた、ペプチド核酸（ＰＮＡ）（骨格が糖ではなく、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシン単位からなる擬ペプチドであるＤＮＡアナログ）を包含する。ＰＮＡはＤＮＡの挙動を模倣し、相補核酸鎖に結合する。ＰＮＡの中性骨格は、通常達成されるよりも強力な結合性および大きな特異性を生じる。さらに、ＰＮＡの独特な化学的、物理的および生物学的特性が、強力な生体分子ツール、アンチセンスおよびアンチジーン剤、分子プローブならびにバイオセンサーを生成するために活用されている。ＰＮＡプローブは、一般的に、ＤＮＡプローブより短く、一般的に、６〜２０塩基の長さであり、より随意的には１２〜１８塩基の長さである（ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）、２００１年）。
【００４８】
さらなる実施態様では、前記用語は、リボース環が２’位の酸素と４’位の炭素との間のメチレン連結によって束縛されるＲＮＡ誘導体である固定核酸（ＬＮＡ）をさらに包含する。ＬＮＡは、ＤＮＡまたはＲＮＡ標的配列に対する先例のない結合親和性を示す。ＬＮＡヌクレオチドは、オリゴマー化され得、キメラまたはミックスマー（ｍｉｘ−ｍｅｒｉｃ）のＬＮＡ／ＤＮＡもしくはＬＮＡ／ＲＮＡ分子に組み入れられ得る。ＬＮＡは、培養細胞に対して非毒性であるように思われる（オルム（Ｏｒｕｍ）ら、２００１年；ウォーレステッド（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ）ら、２０００年）。一般に、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡおよびＬＮＡのうちのいずれかならびにチミンがウラシルで置き換えられているこれらのうちのいずれかのキメラまたはミックスマーもまた考慮される。
【００４９】
用語「核酸多型」または「ヌクレオチド配列多型」は、１つもしくはそれ以上の参照核酸の一次ヌクレオチド配列に対する調査対象の核酸の一次ヌクレオチド配列における任意の差異を含むことが意図される。ほとんどの単一核酸多型は、一ヌクレオチド、即ち、一塩基多型またはＳＮＰに影響を及ぼす多型である。核酸多型は、１つもしくはそれ以上の参照核酸の主要なヌクレオチド配列に対する調査対象の核酸の一次ヌクレオチド配列における任意の数の連続および／または非連続的差異をさらに含む。上記の説明はまた、「多型変種」のような用語を明らかにする。
【００５０】
潜在的ウイルス変種の評価は、適切な治療プロトコルの選択に重要である。そのような評価は、ソフトウェアによってプログラム化されたコンピュータの支援によって適切に容易にされる。従って、なお別の実施態様では、前記単離されたＨＢＶポリ核酸配列もしくはそのフラグメント、またはそれから誘導されるアミノ酸配列は、ＡＳＣＩＩ、１６進もしくはＵＮＩＣＯＤＥコード、１バイト、２バイトまたはマルチバイト文字セットあるいは２進コードであり得る。さらなる実施態様では、ＡＳＣＩＩ、１６進またはＵＮＩＣＯＤＥコード、１、２もしくはマルチバイト文字セットあるいは２進コードの前記配列は、コンピュータによって読み取り可能である。さらなる実施態様では、ＡＳＣＩＩ、１６進またはＵＮＩＣＯＤＥコード、１、２もしくはマルチバイト文字セットあるいは２進コードの前記配列は、コンピュータ読み取り可能なキャリア上において記憶可能であるか、あるいはコンピュータ読み取り可能なデータベース上において組み入れ可能である。さらなる別の実施態様では、ＡＳＣＩＩ、１６進またはＵＮＩＣＯＤＥコード、１、２もしくはマルチバイト文字セットあるいは２進コードの前記配列を含んでなるコンピュータ読み取り可能なキャリアが含まれる。さらなる別の実施態様では、ＡＳＣＩＩ、１６進またはＵＮＩＣＯＤＥコード、１、２もしくはマルチバイト文字セットあるいは２進コードの前記配列を含んでなるコンピュータ読み取り可能なデータベースが想定される。なお別のさらなる実施態様では、ＡＳＣＩＩ、１６進またはＵＮＩＣＯＤＥコード、１、２もしくはマルチバイト文字セットあるいは２進コードの前記配列が、配列を比較することが可能または配列を整列することが可能なアルゴリズムにおいて使用される。
【００５１】
本発明のさらなる態様では、本発明に従う単離されたＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメントを含んでなるベクターが含まれる。特定の実施態様では、前記ベクターは発現ベクターである。別の特定の実施態様では、前記ベクターは、ウイルスまたはレトロウイルスベクターである。
【００５２】
さらなる実施態様では、前記ベクターは、ｐＵＣシリーズもしくはｐＥＭＢＬシリーズのベクターのような普遍的クローニングベクター、またはクローニングのためのＤＮＡトポイソメラーゼ反応に必要なクローニングベクター、ＴＡクローニングベクターおよびゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）システム（インビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））において使用されるもののような組換えに基づくクローニングベクターのようなクローニングベクターである。ベクターは、プラスミド、ファージミド、コスミドまたはバクミド（バキュロウイルスベクター）を含んでなる。ベクターは、単にクローニングツールおよび／またはビヒクルとして機能することができるか、またはプロモーター、エンハンサーおよびターミネーターもしくはポリアデニル化シグナルのような調節配列をさらに含んでなり得る。前記調節配列は、前記調節配列を含んでなるベクターへクローニングされる目的のＤＮＡフラグメント内に含有される情報の発現を可能にし得る。発現は、ＲＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子の産生、場合により、そのタンパク質分子の産生であってもよい。発現は、目的のＤＮＡの５’または３’末端へ導入されるウイルスポリメラーゼプロモーター（例えば、ＳＰ６、Ｔ７もしくはＴ３プロモーター）によるＲＮＡ分子の産生であってもよい。
【００５３】
発現は、さらに、一過性発現または安定な発現あるいは、制御可能な発現であってもよい。制御可能な発現は、例えば、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ）調節性プロモーター、ストレス誘導性（例えば、ヒトｈｓｐ７０遺伝子プロモーター）、メタロチオニン（ｍｅｔｈａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）プロモーター、グルココルチコイドプロモーターまたはプロゲステロンプロモーターを使用する誘導性発現を含んでなる。プロモーターとしては、さらに、コアプロモーターのようなＨＢＶプロモーターおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期（ＩＥ）プロモーターのような異種プロモーターが挙げられる。
【００５４】
プロモーターはまた、好ましくは、肝腫瘍細胞における発現を駆動することができ、例えば、α−フェトプロテイン遺伝子のプロモーターおよびエンハンサーである。細菌（例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）種）、真菌（例えば、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロマイセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ））、昆虫細胞（ヨウトガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞、Ｓｆ９細胞）、植物細胞（例えば、ポテトウイルスＸに基づく発現ベクター、（例えば、バンス（Ｖａｎｃｅ）ら１９９８年、国際特許公開第国際公開第９８／４４０９７号パンフレットを参照のこと）および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯまたはＣＯＳ細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＨｅＬａ細胞系統由来の細胞）において発現を仲介する発現ベクターが、当該分野において公知である。本発明に関して特に適切な宿主細胞は、哺乳動物、例えば、ヒト、初代肝細胞、肝細胞癌細胞系統（例えば、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐＴ１、ＨｅｐＴ３、Ｈｕｈ６、Ｈｕｈ７）、Ｃｈａｎｇ肝臓細胞、げっ歯類肝臓細胞、霊長類肝臓細胞、ヒト上科の肝臓細胞、または他のいずれかの哺乳動物、例えば、ヒトの、宿主細胞もしくは細胞系統である。
【００５５】
ベクター、あるいは発現ベクターは、さらに、宿主細胞における自律複製が可能であってもよく、または組込みベクター、即ち、宿主細胞のゲノムにおいて完全もしくは部分的に、および安定に組込むベクターであってもよい。宿主細胞の他の任意の第２のＤＮＡフラグメント、例えば、ゲノムにおける任意の第１のＤＮＡフラグメント、例えば、ベクターまたはそのフラグメントの組込みは、前記第１のＤＮＡフラグメントが、例えば、部位特異的組換え部位もしくはトランスポゾンに典型的な反復配列によって隣接される場合、反転され得る。あるいは、前記部位特異的組換え部位またはトランスポゾン反復配列は、前記第２のＤＮＡフラグメントに含まれ、前記第１のＤＮＡフラグメントに隣接している。なお別の代替物では、前記第１のＤＮＡフラグメントは、おそらく、相同組換えによって、それに適切な第２のＤＮＡフラグメントに導入することができ、同じプロセスを使用して、前記第１のＤＮＡフラグメントとそれに適切な別のＤＮＡフラグメントとを交換することができる。
【００５６】
ベクター、または発現ベクターの宿主細胞への導入は、当該分野において既知の前記宿主細胞に適用可能な任意の利用可能な形質転換もしくはトランスフェクション技術によって、成し遂げられ得る。そのような形質転換またはトランスフェクション技術は、（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の）熱ショック仲介形質転換、接合ＤＮＡトランスファー、エレクトロポレーション、ＰＥＧ仲介ＤＮＡ取り込み、リポソーム仲介ＤＮＡ取り込み、リポフェクション、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、例えば、マイクロインジェクション粒子ボンバードメントによる直接導入、またはウイルス、ビリオンもしくはウイルス粒子による導入を含んでなる。
【００５７】
例えば、（例えば、患者の血清または細胞培養から誘導される）ＨＢＶウイルスによるＨｅｐＧ２細胞培養の感染は、通常生じないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ；（パラン（Ｐａｒａｎ）ら、２００１年））による宿主細胞の前処置によって刺激され得る。あるいは、Ｖ８プロテアーゼによるＨＢＶの消化は、感染性ＨＢＶウイルスを生じる（ルー（Ｌｕ）ら、１９９６年）。少なくとも１つの他のヘパドナウイルス、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）の類似のプロテアーゼ修飾も同様に、ヒト肝芽腫細胞について感染性であるＷＨＶウイルスを生じる（ルー（Ｌｕ）ら、２００１年）。肝芽腫細胞におけるＨＢＶ遺伝子の発現は、インキュベーション温度を３７℃から３２℃に減少することによって、有意に増加することが報告された（コソボスキー（Ｋｏｓｏｖｓｋｙ）ら、２０００年）。
【００５８】
ウイルスの複製効率をアッセイするため、より詳細には、ＨＢＶ複製効率をアッセイするのに適切なベクターとして、少なくとも１単位（全長）のＨＢＶゲノム、好ましくは、１単位を超えるＨＢＶゲノム、例えば、１．１〜４、特に、１．１、１．２、１．２８、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、３．０もしくは４．０倍のＨＢＶゲノムを含んでなるウイルスベクターまたはベクターが挙げられる。ＨＢＶウイルスの複製を可能にするウイルスベクターシステムの１つの例は、バキュロウイルスシステムであり、例えば、イソム（Ｉｓｏｍ）およびハリエット（Ｈａｒｒｉｅｔ）、国際特許公開第国際公開第９９／３７８２１号パンフレットまたはデレーニー（Ｄｅｌａｎｅｙ）ら（デレーニー（Ｄｅｌａｎｅｙ）ら、１９９９年）によって記載されている。ウイルスの複製の程度は、（ｉ）ＨＢＶ抗原（ＨＢｓＡｇまたはＨＢｅＡｇ）の分泌、（ｉｉ）ＨＢＶ転写物（３．５ｋｂ、２．４ｋｂ、２．１ｋｂ、０．７ｋｂ転写物）の発現、（ｉｉｉ）ＨＢＶ複製中間物（弛緩型環状ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＤＮＡ）の量、（ｉｖ）ＨＢＶスーパーコイル状環状（ｃｃｃ）ＤＮＡの量、（ｖ）分泌型細胞外ＨＢＶ  ＤＮＡの量、（ｖｉ）細胞外に産生されるＨＢＶ粒子の量、（ｖｉｉ）産生されるＨＢｃＡｇタンパク質の量、（ｖｉｉｉ）産生されるＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素タンパク質の量、および（ｉｘ）産生されるＨＢＶ  Ｘタンパク質の量のうちのいずれか１つもしくはそれ以上を測定または検出することによってモニターすることができる。ＨＢＶウイルスの複製を可能にするウイルスベクターシステムのもう１つの例は、指標遺伝子（例えば、選択マーカー遺伝子またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子；例えば、ケイポン（Ｃａｐｏｎ）およびペトロポーロス（Ｐｅｔｒｏｐｏｕｌｏｓ）、米国特許第６２４２１８７号明細書に記載されている）（その発現はウイルスの複製の程度の指標である）を含むベクターシステムである。
【００５９】
ＨＢＶウイルスの複製を可能にするウイルスベクターシステムは、野生型ＨＢＶウイルスの複製効率と変異体ＨＢＶウイルスの複製効率とを比較するのに適切である。変異ＨＢＶウイルスは、ＨＢＶ  ＯＲＦおよび／またはＨＢＶ調節配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターもしくはポリアデニル化シグナル、ε−ループ、キャプシド形成シグナル、反復配列、パッケージングシグナル、内部リボソーム進入部位）のうちのいずれか１つもしくはそれ以上において変異またはポリ核酸多型を含んでなるＨＢＶウイルスであると理解される。
【００６０】
本発明のさらなる態様は、本発明に従うＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメントを含んでなるか、または本発明に従うＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素タンパク質もしくはそのフラグメントを含んでなるか、または本発明に従うＨＢＶ変種を含んでなるか、または本発明に従うベクターを含んでなる宿主細胞に関する。特定の実施態様では、前記宿主細胞は、哺乳動物肝臓細胞または上掲のような哺乳動物の肝細胞癌の細胞である。
【００６１】
本発明はさらに、単離されたポリ核酸由来の発現産物に関する。これらの発現産物は、上掲のポリ核酸および／またはフラグメントのいずれかの発現から生じる。
【００６２】
前記発現産物は、タンパク質、ペプチド、オリゴペプチド、ＲＮＡまたはｍＲＮＡを含んでなる。用語「タンパク質」、「ペプチド」または「オリゴペプチド」は、本明細書において使用される場合、任意の長さのポリマー形態のアミノ酸を指す。前記用語はまた、ジスルフィド結合形成、システイン化、酸化、グルタチオン化、メチル化、アセチル化、ファルネシル化、ビオチン化、ステアロイル化、ホルミル化、リポ酸付加、リン酸化、硫酸化、ユビキチン化、ミリストイル化、パルミトイル化、ゲラニルゲラニル化、環化（例えば、ピログルタミン酸形成）、酸化、脱アミド、脱水、グリコシル化（例えば、ペントース類、ヘキソサミン類、Ｎ−アセチルヘキソサミン類、デオキシヘキソース類、ヘキソース類、シアル酸など）およびアシル化のような既知のアミノ酸修飾ならびに天然に存在しないアミノ酸残基、Ｌ−アミノ酸残基およびＤ−アミノ酸残基を含む。多くの前記アミノ酸修飾は、当業者によって認識される翻訳後修飾の結果として生じ得る。他の修飾としては、タンパク質、ペプチドまたはオリゴペプチドの１つもしくはそれ以上のアミノ酸への化学基の付加が挙げられる。前記化学基として、例えば、ビオチンが挙げられる。タンパク質、ペプチドまたはオリゴペプチドは、一般的に、放射性標識、化学発光標識、蛍光標識、リン光標識、赤外染料または表面増強ラマン標識もしくはプラスモン共鳴粒子によってさらに標識することができる。
【００６３】
本発明は、ポリメラーゼ遺伝子における少なくとも１つのアミノ酸置換および／または欠失を含んでなる発現産物にまで及ぶ。特に、本発明は、ポリメラーゼ遺伝子のコドン１８１におけるアミノ酸置換、より詳細には、ポリメラーゼ遺伝子のコドン１８１におけるアラニンからセリンへのアミノ酸置換を生じるものを含んでなる発現産物に関する。より詳細には、発現産物は、アミノ酸置換ｒｔＡ１８１Ｓを含んでなる。
【００６４】
本発明はまた、ｒｔＡ１８１Ｓの他に、ポリメラーゼのドメインＣに局在するさらなるアミノ酸置換を含んでなる発現産物を含む。より好ましくは、ポリメラーゼのドメインＣにおけるコドン位置２０４でのメチオニンの置換である。特に、ＤＮＡポリメラーゼにおいて少なくとも２つのアミノ酸置換、ポリメラーゼ遺伝子のドメインＢにおけるコドン位置１８１でのアラニンからセリンへの１つの置換、およびポリメラーゼ遺伝子のドメインＣにおけるコドン位置２０４でのメチオニンの１つの置換を含んでなる発現産物が含まれる。コドン位置２０４でのメチオニンの置換は、メチオニン以外の任意のアミノ酸を含むことが意図され、好ましくは、置換は、イソロイシンまたはバリンまたはセリンへの置換である。
【００６５】
本発明はまた、ｒｔＡ１８１Ｓの他に、ＨＢＶポリメラーゼの他の部位におけるさらなるアミノ酸置換、好ましくは、ｒｔＬ１８０Ｍ、ｒｔＭ２０４ＩまたはｒｔＭ２０４ＶまたはｒｔＭ２０４ＳおよびｒｔＮ２３６Ｔの群から選択される少なくとも１つのアミノ酸置換を含んでなる発現産物を含む。群内のコドン２０４における異なる変異は、２つの「または」によって示されている。
【００６６】
例示的発現産物は、ポリメラーゼのドメインＢにおけるｒｔＡ１８１Ｓ置換を含んでなり、場合によりポリメラーゼのドメインＣにおけるｒｔＭ２０４Ｉ置換を伴う。特定の実施態様では、前記単離されたＨＢＶ発現産物は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択される配列を含んでなる。より具体的には、前記単離されたＨＢＶポリ核酸は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１３および配列番号１４からなる群から選択される配列によって規定される。
【００６７】
本発明の別の態様は、上記の発現産物のフラグメントに関し、該フラグメントは、ヌクレオシドアナログおよび／または他の抗ＨＢＶ剤に対する低減した感受性をもたらす、記載されたアミノ酸置換を含んでなる。これらのフラグメントは、少なくともｒｔＡ１８１Ｓ置換を含んでなる。
【００６８】
発現産物は、全長Ｂ型肝炎ポリメラーゼならびに／あるいは少なくとも変異残基または部位を含んでなる逆転写酵素およびそのフラグメント、ならびに／あるいは異種ポリペプチドに融合されたこれらのうちのいずれか一方を含むポリペプチドを含んでなる。
【００６９】
発現は、開示された変異された遺伝子型パターンを含んでなるＲＮＡ分子またはｍＲＮＡ分子の産生を含む。「異種」は、ポリ核酸またはタンパク質配列に関して使用される場合、生来もしくは公知のフランキング配列と同じではないことを意味する。異種配列としては、他のＨＢＶ、ヒト、動物もしくは微生物配列、ポリＨｉｓもしくは他のアフィニティータグ、または全体的に組み立てられた配列が挙げられる。フラグメントは、典型的には、変種残基および少なくとも約４個の隣接残基を含み、隣接残基は変異残基の一方または両側の側面に分配されており、通常、該フラグメントは合計１０ないし２０残基である。
【００７０】
本発明はさらに、本発明に従うＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメントにおいて、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインにおいてセリンをコードするコドン１８１と、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインにおいてアラニンまたはバリンをコードするコドン１８１とを識別することが可能なオリゴヌクレオチドの態様を包含する。
【００７１】
本明細書において言及する用語「オリゴヌクレオチド」は、プライマーもしくはプローブであることが意図され、一本鎖であっても、もしくは二本鎖であってもよく、または三重鎖形成ポリ核酸の一部であってもよい。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド配列増幅方法によってインビトロで作製することができる。そのような増幅されるオリゴヌクレオチドが二本鎖である場合、所望される一本鎖オリゴヌクレオチドが前記エキソヌクレアーゼ活性に対して保護されるのであれば、一本鎖分子への変換は、適切なエキソヌクレアーゼによって達成することができる。あるいは、オリゴヌクレオチドは、必要であれば、適切なヌクレアーゼを使用してクローニングされたプラスミドから後者を切断し、例えば、分子量に従う分画によってそれらを回収することによって、対応するヌクレオチド配列を含む挿入物を含有する組換えプラスミドから誘導される。本発明に従うオリゴヌクレオチドはまた合成物であり、即ち、例えば、従来のホスホトリエステルまたはホスホルアミダイト化学によって、化学的に合成することもできる。オリゴヌクレオチドは、固相オリゴヌクレオチド合成を介するかまたはフォトリソグラフィック合成（ｐｈｏｔｏｌｉｔｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）を介してガラススライド上でインサイチュでさらに合成することができる（ベアウカゲ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）、２００１年）。
【００７２】
別の特定の実施態様では、本発明に従うオリゴヌクレオチドはさらに、前記オリゴヌクレオチドを固相支持体に付着させるための修飾を含んでなる。前記修飾は、例えば、オリゴヌクレオチドのアミン−、チオール−、３−’プロパノラミンもしくはアクリダイト（Ａｃｒｙｄｉｔｅ）修飾であってもよく、またはオリゴヌクレオチドへのホモポリマーテイル（例えば、ターミナルトランスフェラーゼ酵素を介して酵素的に付加されるかもしくは合成的に付加されるオリゴ（ｄＴ）テイル）の付加を含んでなり得る。前記ホモポリマーテイルがオリゴヌクレオチドの３’末端に位置する場合、または酵素伸長を防止する他の任意の３’末端修飾がオリゴヌクレオチドに組み入れられる場合、オリゴヌクレオチドのプライミング能は低減もしくは廃止され得る。他の修飾については、例えば（ベアウカゲ（Ｂｅａｕｃａｇｅ）、２００１年）に記載されている。明らかに、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡもしくはＬＮＡであるか、またはその任意のキメラである本発明に従うオリゴヌクレオチドは、本発明に包含される。さらに、本発明に従う少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでなる組成物も包含される。
【００７３】
「ハイブリダイゼーション」は、実質的に相同な相補的ヌクレオチド配列が相互にアニーリングするプロセスである。ハイブリダイゼーションプロセスは全体的に溶液中で生じ得、即ち、両方の相補的核酸が溶液中にある。そのようなプロセスに依存する分子生物学におけるツールとして、ＰＣＲ、サブトラクティブハイブリダイゼーションおよびＤＮＡ配列決定が挙げられる。ハイブリダイゼーションプロセスはまた、磁気ビーズ、セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）ビーズまたは他の任意の樹脂もしくはタイプのビーズのようなマトリックスに固定化される相補的核酸の一方によって生じ得る。そのようなプロセスに依存する分子生物学におけるツールとして、ポリ（Ａ＋）ｍＲＮＡの単離が挙げられる。ハイブリダイゼーションプロセスは、さらに、ニトロセルロースまたはナイロンメンブラン、ガラススライドまたは溶融シリカ（石英）スライド（後者は核酸アレイもしくはマイクロアレイもしくは核酸チップとして公知である）、金フィルム、ポリピロールフィルム、例えば、ポリアクリルアミドゲルまたはマイクロプレートウェル中の光ファイバーのような固相支持体に固定化される相補的核酸の一方によって生じ得る。そのようなプロセスに依存する分子生物学におけるツールとして、ＲＮＡおよびＤＮＡゲルブロット分析、コロニーハイブリダイゼーション、プラークハイブリダイゼーション、逆ハイブリダイゼーションおよびマイクロアレイハイブリダイゼーションが挙げられる。ハイブリダイゼーションが生じることを可能にするために、核酸分子は、一般的に、熱的、化学的（例えば、ＮａＯＨによる）または電気化学的に変性されて、二本鎖が２つの一本鎖に融解されるそして／あるいは一本鎖核酸からヘアピンもしくは「モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）」プローブ（シングルデュアル標識）もしくは他の二次構造が除去される。
【００７４】
本発明の核酸配列は、さらに、外部ガイド配列（ＥＧＳ）または短い外部ガイド配列（ＳＥＧＳ）に連結され得る。標的配列に連結された前記ガイド配列は、ＲＮＡｓｅＰ酵素によって基質として認識される最小構造を提供する（ベルナー（Ｗｅｒｎｅｒ）およびジョージ（Ｇｅｏｒｇｅ）、米国特許第５，８７７，１６２号明細書）。ＥＧＳまたはＳＥＧＳに連結される本発明の核酸配列は、ＨＢＶ感染患者を処置する治療アプリケーションを見出し得る。
【００７５】
本発明のさらなる態様は、生物学的サンプルにおけるＨＢＶウイルスの存在を検出するため；ならびに／あるいは生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスの抗ウイルス薬に対する耐性を検出するため；ならびに／あるいは生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスのＨＢＶ逆転写酵素ドメインにおけるセリンをコードするコドン１８１、またはセリンをコードするコドン１８１、ならびにメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４、バリンをコードするコドン２０４、セリンをコードするコドン２０４、およびスレオニンをコードするコドン２３６からなる群から選択されるコドンの存在を検出するための方法である。
【００７６】
「コドン」とは、遺伝子暗号に従って、アミノ酸をコードする３連続ヌクレオチドの組み合わせを意味する。本発明における「コドン」は、さらに、一本鎖（センスもしくはアンチセンス）または二本鎖（ポリ）核酸において含まれ得る。アンチセンス鎖からアミノ酸配列を引き出すために、対応するアミノ酸配列への翻訳のために、対応するセンス鎖（逆向きの相補物）を使用する必要がある。
【００７７】
ヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列多型（例えば、変異）を検出することが可能な多数のアッセイが、現在利用可能である。これらのアッセイのいくつかは物理的方法に基づく一方、他のものは、酵素的アプローチを使用する。
【００７８】
「物理的検出方法」とは、検出のために１つもしくはそれ以上の物理的プロセスを必要とするが、１つもしくはそれ以上ヌクレオチド配列多型を含んでなる標的ＤＮＡ配列の先のＰＣＲ増幅の酵素プロセスを含まないヌクレオチド配列多型検出の本発明に関する方法を意味する。前記物理的プロセスとして、電気泳動、クロマトグラフィー、分光測定、光シグナルの感知および分光学が挙げられる。
【００７９】
物理的ヌクレオチド配列多型検出アッセイとして、一本鎖構造多型（ＳＳＣＰ）、変性剤定濃度キャピラリー電気泳動（ＣＤＣＥ）および変性剤定濃度ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）、例えば、クリステンセン（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）ら、２００１年を参照のこと；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）、二重勾配キャピラリー電気泳動（ＤＧＣＥ）、（キャピラリゾーン電気泳動（ＣＺＥ）はまた、フリーソリューションキャピラリー電気泳動（ＦＳＣＥ）、非均一ＣＺＥ、もしくは温度勾配キャピラリー電気泳動（ＴＧＣＥ）としても公知である）、２次元遺伝子スキャニング（ＴＤＧＳ）、コンフォメーション高感度ゲル電気泳動（ＣＳＧＥ）、例えば、コルッコ（Ｋｏｒｋｋｏ）ら、１９９８年を参照のこと、マイクロプレートアレイダイアゴナルゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）、例えば、デイ（Ｄａｙ）ら、１９９８年を参照のこと、および二本鎖構造解析（ＤＳＣＡ）、例えば、（アルゲロ（Ａｒｇｕｅｌｌｏ）ら、１９９８年）を参照のことのような電気泳動方法が挙げられる。同様の技術は、ＨＭＡ（ヘテロ二重鎖移動アッセイ）と呼ばれるが、ＤＮＡ二重鎖の検出は、ＤＮＡのゲル染色に依存する（デルワート（Ｄｅｌｗａｒｔ）ら、１９９３年）。ＨＴＡ（ヘテロ二重鎖トラッキングアッセイ）では、放射性標識プローブをＰＣＲ産物にアニーリングさせ、プローブ−ＰＣＲ産物ヘテロ二重鎖をゲル電気泳動によって分離する。多部位特異的ＨＴＡについて記載されている（レッシュ（Ｒｅｓｃｈ）ら、２００１年；デルワート（Ｄｅｌｗａｒｔ）ら、１９９４年）。
【００８０】
二本鎖構造解析クロマトグラフィー方法として、変性高速液体クロマトグラフィー（ＤＨＰＬＣ）が挙げられる。物理的ヌクレオチド配列多型検出アッセイは、既知または新規変異の同定に有効であり得、変性電気泳動によるホモ−およびヘテロ二重鎖標的ＤＮＡ分子の分離を生じる直接ＤＮＡ配列決定による確認を必要とし得る。前記分離はまた、変性液体クロマトグラフィーによって実施することができ、ここで、温度は感受性を決定する。ＤＨＰＬＣはさらに、アレイシステムの設定を可能にするモノリシックキャピラリーカラムにおいて実施することができる。蛍光に基づく検出、ならびに質量分析計へのオンライン接続が可能である。ＤＨＰＬＣによるヌクレオチド多型検出の効率は、ＧＣクランプを標的ＤＮＡフラグメントの末端に付加することによって、増加することができる（フーバー（Ｈｕｂｅｒ）ら、２００１年；ナラヤマスワミ（Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｉ）ら、２００１年；シャオ（Ｘｉａｏ）ら、２００１年）。
【００８１】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化飛行時間型質量分析）は、１００ｂｐ未満のＤＮＡフラグメントのための直接ＤＮＡ配列決定ツールおよび一塩基多型の検出のためのツールの両方として、首尾よく使用されている。対立遺伝子特異的ＰＮＡオリゴマー（ペプチド核酸）と一本鎖標的ＤＮＡとのハイブリダイゼーションは、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析と高度に匹敵することが証明された（（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）ら、２０００年）、および本明細書に記載の参考文献）。
【００８２】
例えば、マキサム（Ｍａｘａｍ）およびギルバート（Ｇｉｌｂｅｒｔ）によって設計された直接ＤＮＡ配列決定（マキサム（Ｍａｘａｍ）ら、１９７７年）は、ヌクレオチド配列多型の決定のための「絶対的標準」としてなお認められている。最も一般的かつ広範なＤＮＡ配列決定方法は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）反応またはジデオキシヌクレオチドチェーンターミネーション反応（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）ら、１９７７年）に基づく。シーケンスプライマーは、終結された鎖の検出のために標識することができ、または伸長産物の内部標識が可能である。他のＤＮＡ配列決定方法は、ピロシーケンス（例えば、ウィリアムス（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）２０００年を参照のこと）およびサイクルシーケンス（ヤガー（Ｙａｇｅｒ）ら、１９９９年；ルアノ（Ｒｕａｎｏ）ら、１９９１年）である。
【００８３】
近い将来、ナノポア配列決定も利用可能になるかもしれない（メラー（Ｍｅｌｌｅｒ）ら、２０００年）。他のＤＮＡ配列決定方法として、分子共鳴配列決定、およびＤＮＡの特異的切断、続くフラグメントの質量分析を組み合わせることによる診断的配列決定（例えば、スタンスセンス（Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ）およびザベアウ（Ｚａｂｅａｕ）２０００年−国際公開第００／６６７７１号パンフレットを参照のこと）が挙げられる。
【００８４】
ヌクレオチド配列変動を決定する別の方法は、ジデオキシヌクレオチド配列決定（サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）反応）を含んでなり、ここで、通例のｄＮＴＰは、（α−チオｄＮＴＰのような）修飾されたｄＮＴＰおよび他の変種に置き換えられる（ダールハウザー（Ｄａｈｌｈａｕｓｅｒ）２０００年−米国特許第６１５０１０５号明細書）。
【００８５】
なお別のＤＮＡ配列決定方法論は、すべての可能なｎ−ヌクレオチドオリゴマー（ｎマー）のアレイを使用して、不明なＤＮＡサンプルに含まれるｎマーを同定するＳＢＨまたはハイブリダイゼーションによるハイブリダイゼーションとして公知である（デルマナック（Ｄｒｍａｎａｃ）ら、１９９３年）。
【００８６】
前記高密度オリゴヌクレオチドアレイまたはＤＮＡチップは、同じ条件下で多型ヌクレオチド配列の組に特異的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの組を設計する必要性をなくす。後者のアプローチは、オリゴヌクレオチドプローブにおいて不一致のヌクレオチドの長さ、極性および位置を注意深く調整することによって、従来の逆ブロットアッセイにおいて適用される（サイキ（Ｓａｉｋｉ）ら、１９８９年）。しかし、遺伝子型決定およびヌクレオチド配列多型の検出のための従来の逆ブロットハイブリダイゼーションアッセイは、例えば、ＬｉＰＡ（ラインプローブアッセイ（Ｌｉｎｅ  Ｐｒｏｂｅ  Ａｓｓａｙ））形式（イノジェネティクス（Ｉｎｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ）、ゲント（Ｇｈｅｎｔ）、ベルギー（Ｂｅｌｇｉｕｍ））において首尾よく市販されている。（ストイヴェル（Ｓｔｕｙｖｅｒ）ら、１９９７年；ストイヴェル（Ｓｔｕｙｖｅｒ）ら、１９９６年）。
【００８７】
上掲のヌクレオチド配列ならびにヌクレオチド配列多型検出方法に多くの変更および組み合わせを行うことができることは、当業者に明らかであろう。これらは、本発明に援用される。
【００８８】
上掲の本発明のオリゴヌクレオチドは、それらが、上掲のような本明細書に記載のヌクレオチド配列または多型の検出のための方法のいずれかにおいて使用され得るように、適応することができる。
【００８９】
従って、本発明のさらなる実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、末端伸長および／またはヘアピンもしくは「モレキュラービーコン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎｓ）」プローブ構造をさらに含んでなり、ここで、前記伸長および／またはヘアピン構造は、前記オリゴヌクレオチドのいずれか一方の末端または両方の末端に組み入れられる。前記末端伸長は、例えば、別の核酸分子と特異的にハイブリダイズする、および／または前記オリゴヌクレオチドの固相支持体への付着を容易にする、および／または酵素、リボザイムもしくはＤＮＡｚｙｍｅによる前記テイル化オリゴヌクレオチドの修飾に有用である。
【００９０】
本発明のさらなる実施態様では、本発明に従うオリゴヌクレオチドは、標的ＤＮＡへのアニーリング後、連結することができるいずれかの末端プライマーにおいて組み入れるパドロックプローブ内、またはヘアピン構造内に含まれる。
【００９１】
別の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、検出を可能にするおよび／または前記オリゴヌクレオチドを捕捉する修飾を有する。検出および／または前記オリゴヌクレオチドの捕捉は、さらに、それとハイブリダイズした標的核酸の検出および／または捕捉を可能にする。前記オリゴヌクレオチドと前記標的核酸との間の相互作用は、前記オリゴヌクレオチドおよび／または前記標的核酸における架橋修飾の導入を介して両方を架橋することによって、安定化することができる。
【００９２】
なお別の実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、３’−末端の不一致ヌクレオチド、および場合により、３’−近接の不一致ヌクレオチドを含んでなる。前記オリゴヌクレオチドは、多型特異的ＰＣＲおよびＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）またはＧＡＰ−ＬＣＲを実施するのに特に有用である。
【００９３】
さらに、上掲の説明に従う少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含んでなる組成物も本発明に含まれる。
【００９４】
本明細書に記載のヌクレオチド配列および多型を検出するための上掲の方法のいずれも、生物学的サンプルにおけるＨＢＶウイルスの存在を検出するため；ならびに／あるいは生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスの抗ウイルス薬に対する耐性を検出するため；ならびに／あるいは生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスのＨＢＶ逆転写酵素ドメインのセリンをコードするコドン１８１、またはセリンをコードするコドン１８１、ならびにメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４、バリンをコードするコドン２０４、セリンをコードするコドン２０４、およびスレオニンをコードするコドン２３６からなる群から選択されるコドンの存在を検出するための方法に、利用することができることは、当業者に明らかであろう。
【００９５】
従って、そのような検出方法および診断キット、例えば、そのような検出方法に基づくラインプローブアッセイ（ｌｉｎｅ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ）を含む以下の態様もさらに本発明に含まれる。
【００９６】
本発明の１つの態様は、生物学的サンプルにおけるＨＢＶウイルスの存在を検出するための方法および／または生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスの抗ウイルス薬に対する耐性を検出するための方法に関し、前記方法は、本発明に従うＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメントの存在を検出することを含んでなる。本発明に対する特定の実施態様は、以下の工程を含んでなる前記方法を含む：
ａ．前記生物学的サンプルから標的ＨＢＶポリ核酸を得る工程であって、ここで、前記標的ＨＢＶポリ核酸は、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインのセリンをコードするコドン１８１、ならびに場合により、ＨＢＶウイルスのＨＢＶ逆転写酵素ドメインのメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４またはバリンをコードするコドン２０４またはセリンをコードするコドン２０４、およびスレオニンをコードするコドン２３６からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のコドンを含んでなることが疑われること；
ｂ．（ａ）の標的ＨＢＶポリ核酸の核酸配列を得ること；
ｃ．（ｂ）において得られる核酸配列から、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインの前記セリンをコードするコドン１８１、および場合により、（ａ）に記載の群から選択される１つもしくはそれ以上のコドンの存在、ならびにそれらから、前記生物学的サンプルにおける前記ＨＢＶウイルスの存在および／または前記生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスの抗ウイルス薬に対する前記耐性を推察すること。
【００９７】
本発明に対する別の特定の実施態様は、以下を含んでなる前記方法を含む：
ａ．前記生物学的サンプルに存在する標的ＨＢＶポリ核酸を得る工程および／またはそのヌクレオチド配列を得ること；
ｂ．適切な場合、（ａ）において得られるポリ核酸を部分的もしくは完全に変性するか、または酵素的に修飾すること；
ｃ．適切な場合、好ましくは、ＨＢＶポリ核酸またはそのフラグメントにおいて、ＨＢＶ逆転写酵素ドメイン中のセリンをコードするコドン１８１とＨＢＶ逆転写酵素ドメイン中のアラニンもしくはバリンをコードするコドン１８１とを識別することが可能な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドの存在下で、工程（ｂ）において得られる変性されたポリ核酸を再生させる工程、ならびに必要であれば、前記オリゴヌクレオチドを酵素的に修飾する（伸長することを含む）工程を含むこと；
ｄ．適切な場合、工程（ｂ）において得られる部分的もしくは完全に変性されたＨＢＶポリ核酸、ならびに／あるいは工程（ｃ）において形成されるハイブリッド、ならびに／あるいは工程（ｂ）および／または（ｃ）において得られる酵素修飾を検出する工程と、
ｅ．以下の群：部分的もしくは完全に変性されたポリ核酸、ハイブリッド、酵素修飾（すべて工程（ｄ）において検出される）のうちの１つもしくはそれ以上のデータ、ならびに（ａ）において得られるヌクレオチド配列から、前記生物学的サンプルにおける前記ＨＢＶの存在および／または前記生物学的サンプルに存在するＨＢＶの抗ウイルス薬に対する前記耐性を推察すること。
【００９８】
本発明に対するなお別の特定の実施態様では、前記方法は以下を含んでなる：
ａ．前記生物学的サンプルから標的ＨＢＶポリ核酸を得ること、ここで、前記標的ＨＢＶポリ核酸は、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインのセリンをコードするコドン１８１を、場合により、ＨＢＶのＨＢＶ逆転写酵素ドメインのメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４またはバリンをコードするコドン２０４またはセリンをコードするコドン２０４、およびスレオニンをコードするコドン２３６からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のコドンとともに含んでなることが疑われるものであり、
ｂ．（ａ）の標的ＨＢＶポリ核酸を、セリンをコードするコドン１８１とアラニンまたはバリンをコードするコドン１８１とを識別することが可能であり、場合により、ロイシンをコードするコドン１８０とメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４とメチオニン、バリンまたはセリンをコードするコドン２０４、およびアスパラギンをコードするコドン２３６とスレオニンをコードするコドン２３６からなる群から選択される１つもしくはそれ以上のコドンを識別することが可能なオリゴヌクレオチドと接触させること；
ｃ．（ｂ）において得られる識別シグナルから、場合により、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインの前記メチオニンをコードするコドン１８０または前記イソロイシンをコードするコドン２０４または前記アスパラギンをコードするコドン２３６とともにＨＢＶ逆転写酵素の前記セリンをコードするコドン１８１の存在、ならびにそれから、前記生物学的サンプルにおける前記ＨＢＶの存在および／または前記生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスの抗ウイルス薬に対する前記耐性を推察すること。
【００９９】
後者の方法では、（ｂ）において前記識別することは、一般的にハイブリダイゼーションに基づき、（ｃ）における前記識別シグナルはハイブリダイゼーションシグナルである。
【０１００】
「（ポリ）核酸において、アミノ酸Ｘ１（任意のアミノ酸）をコードするコドンと、アミノ酸Ｘ２（Ｘ１とは異なる任意のアミノ酸）をコードするコドンとを識別することが可能なオリゴヌクレオチド」とは、アミノ酸Ｘ１をコードする前記コドンを含んでなる（ポリ）核酸と接触される場合にはシグナルを産出するが、アミノ酸Ｘ２をコードするコドンを含んでなる（ポリ）核酸と接触される場合にはシグナルを産出しないオリゴヌクレオチドを意味する。前記シグナルは、「識別シグナル」とも称され、上掲のようなヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列多型を検出することが可能なアッセイのいずれかにおいて前記オリゴヌクレオチドを使用することによって入手可能な任意のシグナルであり得る。前記シグナルとして、例えば、蛍光シグナル、（化学）発光シグナル、放射性シグナル、光シグナル、ハイブリダイゼーションシグナル、質量分析シグナル、分光シグナル、クロマトグラフィーシグナル、電気シグナル、電子シグナル、電気泳動シグナル、リアルタイムＰＣＲシグナル、ＰＣＲシグナル、ＬＣＲシグナル、ＣＦＬＰアッセイシグナルおよびインベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）アッセイシグナルが挙げられる。
【０１０１】
「オリゴヌクレオチドを（ポリ）核酸と接触させること」またはその逆は、一般的に、前記オリゴヌクレオチドと前記（ポリ）核酸とのアニーリングまたは前記オリゴヌクレオチドと前記（ポリ）核酸とをハイブリダイズすることを意味する。「オリゴヌクレオチドを（ポリ）核酸と接触させること」は、排他的な意味ではなく、従って、前記オリゴヌクレオチドの酵素修飾をさらに含んでなることができ、ここで、前記修飾は、前記オリゴヌクレオチドの端部および／または前記オリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列の内部において生じ得る。オリゴヌクレオチドの酵素修飾の例は、例えば、本明細書に記載のヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列多型を検出することが可能なアッセイにおいて認められる。
【０１０２】
本発明の別の実施態様では、前記方法は、適切である場合、データベース内に含有されるＨＢＶ核酸配列の組によって得られる核酸配列を整列することおよび／または比較することをさらに含んでなる。
【０１０３】
「データベース」とは、本明細書において、核酸またはアミノ酸配列、より具体的には、ＨＢＶ核酸もしくはアミノ酸配列の収集を意味する。データベースは、少なくとも１つの核酸または少なくとも１つのアミノ酸配列を含んでなると理解すべきである。データベースは、様々なキャリア上に記憶させることができる。そのようなキャリアとして、コンピュータ読み取り可能なキャリアが挙げられる。
【０１０４】
本発明の別の態様は、生物学的サンプルにおけるＨＢＶウイルスの存在を検出するためおよび／または生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスの抗ウイルス薬に対する耐性を検出するための診断キットに関し、前記キットは、少なくとも、本発明に従うＨＢＶポリ核酸の存在を検出するための手段を含んでなる。
【０１０５】
本発明に対する特定の実施態様は、以下を含んでなる前記診断キットを含む：
ａ．場合により、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインのメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４およびアスパラギンをコードするコドン２３６からなる群からの１つもしくはそれ以上のコドンとともにＨＢＶ逆転写酵素ドメインのセリンをコードするコドン１８１を含んでなることが疑われる標的ポリ核酸の核酸配列から、
場合により、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインのメチオニンをコードするコドン１８０、イソロイシンをコードするコドン２０４およびアスパラギンをコードするコドン２３６からなる群からの１つもしくはそれ以上のコドンとともにＨＢＶ逆転写酵素ドメインの前記セリンをコードするコドン１８１の存在、
ならびにそれから、前記生物学的サンプルにおける前記ＨＢＶの存在を推察するための手段と、場合により、
ｂ．標的ポリ核酸の核酸配列を得るための手段。
【０１０６】
さらなる特定の実施態様では、前記診断キットは、前記ＨＢＶポリ核酸において、セリンをコードするコドン１８１と、アラニンまたはバリンをコードするコドン１８１とを識別することが可能なオリゴヌクレオチド、および前記ＨＢＶポリ核酸において、メチオニンをコードするコドン１８０とロイシンをコードするコドン１８０とを識別することが可能なさらなるオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【０１０７】
さらなる特定の実施態様では、前記診断キットは、前記ＨＢＶポリ核酸において、セリンをコードするコドン１８１と、アラニンまたはバリンをコードするコドン１８１とを、およびまたメチオニンをコードするコドン１８０とロイシンをコードするコドン１８０を識別することが可能な１つのオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【０１０８】
なおさらなる特定の実施態様では、前記診断キットは、前記ＨＢＶポリ核酸において、セリンをコードするコドン１８１と、アラニンまたはバリンをコードするコドン１８１とを識別することが可能なオリゴヌクレオチド、およびリゴヌクレオチドの次の群：スレオニンをコードするコドン２３６と、アスパラギンをコードするコドン２３６とを識別することが可能なオリゴヌクレオチド；前記ＨＢＶポリ核酸において、イソロイシンをコードするコドン２０４と、メチオニンまたはバリンまたはセリンをコードするコドン２０４とを識別することが可能なオリゴヌクレオチドから選択される少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つのさらなるオリゴヌクレオチドを含んでなる。
【０１０９】
なお別の実施態様では、前記診断キットは、前記ＨＢＶポリ核酸を、前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドと接触させることによって得られる識別シグナルを検出するための手段をさらに含んでなる。
【０１１０】
さらに、前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが固相支持体に付着もしくは固定化される前記診断キットも包含される。
【０１１１】
本発明に対する別の特定の実施態様は、以下を含んでなる前記診断キットを含む：
ａ．前記生物学的サンプルに存在する標的ＨＢＶポリ核酸を得るおよび／またはそのヌクレオチド配列を得るための手段；
ｂ．適切な場合、本発明に従う標的ＨＢＶポリ核酸の増幅に適切な少なくとも１つのオリゴヌクレオチド対；
ｃ．適切な場合、核酸を変性するための手段；
ｄ．適切な場合、本発明の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド；
ｅ．適切な場合、二本鎖または一本鎖核酸分子を修飾することが可能な酵素；
ｆ．適切な場合、ハイブリダイゼーション緩衝液、または前記緩衝液を生成するのに必要な成分；
ｇ．適切な場合、洗浄液、または前記洗浄液を生成するのに必要な成分；
ｈ．適切な場合、部分的または完全に変性されたポリ核酸を検出するための手段および／または先のハイブリダイゼーションにおいて形成されたハイブリッドを検出するための手段および／または核酸の酵素修飾を検出するための手段；
ｉ．適切な場合、オリゴヌクレオチドを固相支持体上の既知の位置に付着させるための手段；
ｊ．部分的もしくは完全に変性されるポリ核酸および／またはハイブリッドおよび／または酵素修飾（すべて（ｈ）において検出される）ならびに／あるいは（ａ）において得られるヌクレオチド配列から、前記生物学的サンプルにおける前記ＨＢＶウイルスの存在を推察するための手段。
【０１１２】
「核酸配列から、アミノ酸Ｘ（Ｘは表示されるアミノ酸）をコードするコドンＹ（Ｙは表示される数字）の存在を推察するための手段」とは、（ｉ）前記核酸配列において前記コドンＹを局在化するため、（ｉｉ）前記コドンＹを、コドンＹによってコードされるアミノ酸に翻訳するため、および（ｉｉｉ）（ｉｉ）から、前記コドンＹによってコードされるアミノ酸が前記アミノ酸Ｘと同じであるかもしくは異なるかを結論付けるための任意の技術または方法を意味する。前記手段は、（ｉ）〜（ｉｉｉ）のすべてが手動および／またはコンピュータ処理により実施される方法を含むことができる。前記手段は、データベース内に含有される核酸配列の組によって得られる核酸配列を整列することおよび／または比較することを含むことができる。前記手段は、さらに、報告の形態で示されている（ｉ）〜（ｉｉｉ）の結果を含み、ここで、前記報告は、紙形態、電子形態もしくはコンピュータ読み取り可能なキャリアまたは媒体においてあり得る。前記手段はさらに、（核酸および／またはアミノ酸）配列データベースの検索ならびに／あるいは（核酸および／またはアミノ酸）配列アラインメントの作成を含んでもよく、その結果は、前記報告に含まれてもまたは含まれなくてもよい。
【０１１３】
さらなる実施態様は、前記方法が、核酸配列を決定することに基づくことをさらに特徴とする本発明の上記の方法のいずれかを含む。
【０１１４】
さらなる実施態様は、前記方法が、ハイブリダイゼーションアッセイに基づくことをさらに特徴とする本発明の上記の方法のいずれかを含む。
【０１１５】
さらなる実施態様は、前記方法が、逆ハイブリダイゼーションアッセイに基づくことをさらに特徴とする本発明の上記の方法のいずれかを含む。
【０１１６】
さらなる実施態様は、前記診断キットが、核酸配列を決定することに基づくことをさらに特徴とする本発明の上記の診断キットのいずれかを含む。
【０１１７】
さらなる実施態様は、前記診断キットが、ハイブリダイゼーションアッセイに基づくことをさらに特徴とする本発明の上記の診断キットのいずれかを含む。
【０１１８】
さらなる実施態様は、前記診断キットが、逆ハイブリダイゼーションアッセイに基づくことをさらに特徴とする本発明の上記の診断キットのいずれかを含む。
【０１１９】
さらなる実施態様は、前記診断キットが、ラインプローブアッセイ（ｌｉｎｅ  ｐｒｏｂｅ  ａｓｓａｙ）に基づくことをさらに特徴とする本発明の上記の診断キットのいずれかを含む。
【０１２０】
本発明は、さらに、生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルスの抗ウイルス薬に対する耐性を検出するための方法を提供し、前記方法は、本発明に従うＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素タンパク質またはフラグメントの存在を検出する工程を含んでなる。前記検出は、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素タンパク質、あるいは例えば、クロマトグラフィーおよび／または電気泳動手段を介して得られるタンパク質フラグメントのタンパク質分解消化および分離後に得られるその一部から、アミノ酸配列を決定する工程を含んでもよい。電気泳動後、配列決定の前にタンパク質フラグメントをゲルから切り出し、最後に溶出させてもよい。あるいは、タンパク質ゲル電気泳動は、タンパク質がメンブランキャリア（例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、ナイロン）に移されるブロッティングと組み合わされる。配列決定しようとするタンパク質またはタンパク質フラグメントは、後者の場合、メンブランキャリアから切り出すことができる。あるいは、本発明に従うＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／転写酵素タンパク質は、ＨＢＶ逆転写酵素ドメインの１８１位でセリンを特異的に認識する抗体を使用して検出される。特に、前記抗体は、前記１８１位においてアラニンまたはバリンを認識すべきではない。なお別の代替物において、本発明に従うＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素は、表現型が検出され、即ち、前記ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／転写酵素は、アラニンまたはバリンをコードするコドン１８１を含んでなるＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素とは共有しない抗ウイルス薬感受性の独特なパターンを示し得る。従って、本発明に従うＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の表現型検出は、例えば、生物学的サンプルに存在するＨＢＶウイルス由来のＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の活性の感受性を、抗ウイルス薬のパネルに対して決定する工程を含む。あるいは、生物学的サンプルに存在し、本発明に従うポリ核酸を含んでなることが疑われるＨＢＶウイルス由来のＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素は、組換え系において産生され、組換え発現されるＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の活性の抗ウイルス薬のパネルに対する感受性が決定される。
【０１２１】
ＨＢＶウイルスの複製を可能にするまたはＨＢＶコードタンパク質、もしくはその機能的部分の酸性を可能にするベクターシステムが、それぞれ、ＨＢＶウイルスの複製またはＨＢＶコードタンパク質（もしくはその一部）の機能に対する抗ウイルス薬の効果を試験あるいはアッセイするのに適切であることは、当業者に明らかであろう。特に、そのようなアッセイは、本発明に従う変異ＨＢＶポリ核酸または本発明に従う変異ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼもしくは変異ＨＢｓＡｇタンパク質によって実施することができる。そのようなアッセイの結果は、野生型ＨＢＶポリ核酸もしくは野生型ＨＢＶタンパク質、またはそれらの機能的部分によって実施される類似のアッセイの結果と比較することができる。
【０１２２】
当業者であれば、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素が、プライマーゼ活性、逆転写酵素活性（ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）、ＤＮＡポリメラーゼ活性（ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性）およびＲＮＡｓｅ（ＲＮＡｓｅＨ）活性を含む複数の認識される生物学的／生化学的機能を有し、さらに、コア抗原タンパク質（ＨＢｃＡｇ）との相互作用およびウイルスＤＮＡのキャプシド形成に関与することを理解するであろう。野生型または変異ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼは、患者の血清に存在するＨＢＶ粒子から単離することができるか、または例えば、安定に形質転換された肝細胞癌細胞系統によって産生させることができる。あるいは、前記ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼは、異種の系（例えば、出芽酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））において、またはバキュロウイルス発現系、ミトコンドリア翻訳系（例えば、米国特許第６，１００，０６８号明細書に記載されている）を使用することによって、もしくは無細胞系、例えば、ウサギ網状赤血球溶解物により連結された転写−翻訳系（リー（Ｌｉ）ら、１９９９年）において、発現および産生される。変異ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡ配列は、インビトロ変異誘発によって産生させることができる。産生されるＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の実質的な精製は、例えば、異種エピトープ（例えば、ＦＬＡＧエピトープ、ｃｆｒ（上掲））が前記ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素に導入または融合される場合、達成することができる。前記エピトープは、例えば、固定化された抗異種エピトープ抗体（例えば、抗ＦＬＡＧ  Ｍ２モノクローナル抗体）を含有するアフィニティーカラム上でのＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の精製を可能にする。あるいは、組換えＨＢＶポリメラーゼ／逆転写酵素は融合タンパク質の一部であり、前記融合タンパク質は、例えば、ヒスチジンタグ、炭水化物結合部分（例えば、レクチン、マルトース結合タンパク質）またはβ−ガラクトシダーゼをさらに含んでなる。前記融合タンパク質の実質的精製は、例えば、金属アフィニティークロマトグラフィー（ヒスチジンタグが存在する場合）、炭水化物アフィニティークロマトグラフィー（炭水化物結合部分が存在する場合）またはイムノアフィニティークロマトグラフィーにより、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素、例えば、β−ガラクトシダーゼに融合されたタンパク質に対する抗体を使用して、達成される。場合により、前記融合タンパク質は、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素が、例えば、上掲のような別のラウンドの精製によって、融合タンパク質の他の部分から入手可能に分離されるように、適切なプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼ、第Ｘａ因子）により切断可能である。あるいは、ＨＢＶウイルス粒子は、親和性捕捉（例えば、ＨＢＶウイルス表面抗原に対する抗体を使用するかまたは前記表面抗原に対するタンパク質受容体もしくは前記タンパク質受容体、ｃｆｒ．（下記）に対する抗イデオタイプ抗体を使用する）あるいは勾配遠心分離のような技術によって、生物学的サンプルから単離される。これらまたは他の方法によって入手可能なＨＢＶウイルス粒子は、さらに、例えば、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラ���ゼ／逆転写酵素またはＨＢＶ核酸の分析に従う。
【０１２３】
なお別の代替物では、マルチタンパク質複製コア複合体または細胞内複製コアが感染肝臓細胞から精製され、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素を含んでなる得られる調製物を使用して、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の機能および活性がアッセイされる（アーバン（Ｕｒｂａｎ）ら、２０００年）。明らかに、ウイルス粒子または複製コア複合体の前記精製は、本発明の変異（単数または複数）を含んでなるＨＢＶ変種によって感染された前記粒子またはコア複合体を得るために適用することができる。
【０１２４】
ウイルス逆転写酵素活性をアッセイするための改善された条件は、（バード（Ｂｉｒｄ）およびチャン−エ（Ｃｈａｎｇ−Ｙｅｈ）、米国特許第５，８１７，４５７号明細書）に記載されており、酸性ｐＨおよび上昇した温度を含む。ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素から誘導されるＲＮＡｓｅＨの活性をアッセイするための反応条件については、例えば、ヨーン（Ｙｏｏｎ）ら、米国特許第６，０７１，７３４号明細書に記載されている。インビトロで産生されるＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素、またはそのフラグメントのプライマーゼ、ポリメラーゼ、および逆転写酵素活性を決定するためのアッセイ条件については、リー（Ｌｉ）ら（リー（Ｌｉ）ら、１９９９年）によって記載されている。タンパク質−タンパク質相互作用、例えば、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｉｐｔａｓｅ）とＨＢｃＡｇとの間の相互作用を決定するためのアッセイは、２−および３−ハイブリッドアッセイならびにリアルタイム生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）を含む。（バーテル（Ｂａｒｔｅｌ）ら、１９９７年および米国特許第５，９２８，８６８号明細書）。
【０１２５】
本発明の別のさらなる態様は、本発明に従う変異ＨＢｓＡｇの機能に対する抗ウイルス薬の効果を決定するアッセイを含んでなる。当業者であれば、ＨＢＶ  ＨＢｓＡｇが、宿主細胞へのウイルス付着／進入（即ち、ＨＢＶの感染性における役割）、ウイルス粒子集成およびウイルス粒子の分泌における役割を含む複数の認識された生物学的／生化学的機能を有することを理解するであろう。ＨＢｓＡｇは、さらに、宿主の免疫系の標的であり、「エスケープ」変異が報告されている。ＨＢｓＡｇに対する抗体、ＨＢＩｇは、しばしば、肝臓移植を経験している患者における受動免疫化手段として使用される。野生型または変異ＨＢｓＡｇは、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼについて上掲のようにして得ることができる。あるいは、ＨＢｓＡｇは、ＨＢｓＡｇに対する抗体またはＨＢｓＡｇ受容体タンパク質または前記ＨＢｓＡｇ受容体タンパク質、単量体および多量体ヒトアルブミン（それぞれ、エイブル（Ｅｉｂｌ）ら、米国特許第５，５７６，１７５号明細書およびマチダ（Ｍａｃｈｉｄａ）ら、１９８４年）ならびにエンドネキシンＩＩ／アネキシンＶ（ヤップ（Ｙａｐ）、ＥＰ０６７２１３６号明細書）を含む前記報告された受容体タンパク質に対する抗イデオタイプ抗体との親和性相互作用によって回収される。ＨＢＶおよびＨＤＶ（δ型肝炎ウイルス）ウイルス粒子は、親和性捕捉のような技術によって、例えば、ＨＢＶウイルス表面抗原に対する抗体を使用するかまたはＨＢＶウイルス表面抗原もしくはそれに対する抗イデオタイプ抗体に対する受容体を使用して、生物学的サンプルから単離することができる。
【０１２６】
本発明の別の態様では、本発明の変異ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素を含むＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の活性、またはそれに対する抗ウイルス化合物の感受性は、内因性ＤＮＡポリメラーゼにおける条件変異を含有する宿主細胞においてアッセイされる。従って、ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の発現は、おそらく、制限的条件下で前記変異宿主細胞の増殖を援助することができる。抗ウイルス化合物に対するＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の感受性は、制限的条件下および抗ウイルス化合物の存在下で前記変異宿主細胞の増殖の程度を測定することによって、アッセイすることができる。続いて、前記増殖は、制限的条件下および前記抗ウイルス化合物の非存在下で前記宿主細胞の増殖と比較される。
【０１２７】
本発明のさらなる別の態様では、ヒトＨＢＶ感染のモデルまたは抗ＨＢＶ化合物、治療および予防（ｐｒｏｈｙｌａｘｅｓ）を評価するためのモデルとして有用である非ヒト動物へ感染させるための本発明に従う変異ＤＮＡを含んでなるＨＢＶ粒子を含む変異ＨＢＶ粒子の使用が含まれる。前記モデルの非ヒト動物は、例えば、ライスナー（Ｒｅｉｓｎｅｒ）、米国特許第５，８４９，９８７号明細書および同第５，８５８，３２８号明細書によって記載されている。ＨＢＶに対する多くの抗ウイルス薬（ＨＢＶ抗ウイルス薬）は、上記に記載されている。
【０１２８】
従って、本発明のさらなる態様は、本発明に従うポリ核酸を含んでなるかまたは本発明に従うＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素を含んでなるＨＢＶウイルスに対して活性な薬物をスクリーニングするための方法を含み、該方法は以下を含んでなる：
ａ．前記薬物の非存在下で前記ＨＢＶの複製を測定すること；
ｂ．前記薬物の存在下で前記ＨＢＶの複製を測定すること；
ｃ．（ａ）および（ｂ）から、前記ＨＢＶの複製に対する前記薬物の阻害効果を推察すること。
【０１２９】
本発明に対する特定の実施態様では、前記方法は、野生型ＨＢＶウイルスにより工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を実施すること、ならびに前記野生型ＨＢＶウイルスの複製に対する前記薬物の阻害効果と、本発明に従うポリ核酸を含んでなる前記ＨＢＶウイルスの複製に対する前記薬物の阻害効果とを比較することをさらに含んでなる。本発明に対するなお別のさらなる実施態様では、生物学的サンプルから前記ＨＢＶウイルスを得ることをさらに含んでなる前記方法が含まれる。
【０１３０】
本発明のなお別のさらなる態様は、本発明に従うポリ核酸を含んでなるかまたは本発明に従うＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素を含んでなるＨＢＶウイルスに対して活性な薬物をスクリーニングするための方法を含み、該方法は以下を含んでなる：
ａ．前記薬物の非存在下で前記ＨＢＶウイルスのＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素活性を測定すること；
ｂ．前記薬物の非存在下で前記ＨＢＶウイルスの（ａ）と同じＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素活性を測定すること；
ｃ．（ａ）および（ｉｂ）から、前記ＨＢＶウイルスの前記ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素活性に対する阻害効果を推察すること。
【０１３１】
本発明に対する特定の実施態様では、前記方法は、野生型ＨＢＶウイルスにより工程（ａ）、（ｂ）および（ｃ）を実施すること、ならびに前記野生型ＨＢＶウイルスのＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素活性に対する前記薬物の阻害効果と、本発明に従うポリ核酸を含んでなる前記ＨＢＶウイルスのＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素活性に対する前記薬物の阻害効果とを比較することをさらに含んでなる。本発明に対するなお別のさらなる特定の実施態様では、生物学的サンプルから前記ＨＢＶウイルスを得ることをさらに含んでなる前記方法が含まれる。「ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素活性」とは、上掲のようなＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素の生物学的または生化学的活性のうちのいずれか一方を意味する。
【０１３２】
本発明は、前記単離されたＨＢＶ変種ならびに／あるいは前記単離されたＨＢＶ小型（ｓｍａｌｌ）ウイルス表面抗原、もしくはその前記部分、ならびに／あるいは前記ＨＢＶ中型（ｍｉｄｄｌｅ）および／または大型（ｌａｒｇｅ）ウイルス抗原に対する抗体ならびに抗イデオタイプ抗体をさらに包含する。本発明に対する特定の実施態様では、前記抗体はモノクローナル抗体である。さらなる特定の実施態様では、前記抗体はヒト化モノクローナル抗体である。
【０１３３】
生物学的サンプルにおいて、前記ＨＢＶ変種ならびに／あるいは前記ＨＢＶ小型（ｓｍａｌｌ）ウイルス表面抗原、もしくはその前記部分、ならびに／またはあるいは前記ＨＢＶ中型（ｍｉｄｄｌｅ）および／または大型（ｌａｒｇｅ）ウイルス抗原を検出するための免疫学的方法における前記抗体の使用がさらに包含される。本発明に対する特定の実施態様では、前記抗体は、ＨＢＶ感染を診断するための方法において使用される。さらなる実施態様では、前記抗体は、ＨＢＶ感染を検出することが可能な診断キットの一部である。
【０１３４】
本発明の別の実施態様では、ＨＢＶ感染の進行を追跡するための本発明の方法または本発明の診断キットの使用が含まれる。
【０１３５】
さらなる実施態様は、抗ウイルス薬に対する耐性の発生をモニターするための本発明の方法または本発明の診断キットの使用を含む。
【０１３６】
さらなる別の実施態様は、抗ウイルス薬に対する耐性の発生によるＨＢＶ感染症に対する治療レジメンを適応するための本発明の方法または本発明の診断キットの使用を含む。
【０１３７】
「抗体」として、モノクローナル、ポリクローナル、合成または重鎖キャメル（camel）抗体ならびにＦａｂ、ＦｖもしくはｓｃＦｖフラグメントのような抗体のフラグメントが挙げられる。モノクローナル抗体は、免疫動物から誘導される脾臓細胞へのマウス骨髄腫細胞の融合を含んでなる例えば、リデル（Ｌｉｄｄｌｅ）ら（リデル（Ｌｉｄｄｌｅ）ら、１９９１年）に記載のような技術によって調製することができる。さらに、分子もしくはそのフラグメントに対する抗体またはそのフラグメントは、例えば、ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら（ハーロー（Ｈａｒｌｏｗ）ら、１９８８年）に記載のような方法を使用して得ることができる。本発明のタンパク質のフラグメントのような小さなペプチドに対して指向される抗体の場合、前記ペプチドは、一般的に、動物の免疫前のキャリアタンパク質に結合される。そのようなタンパク質キャリアとして、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミンおよび破傷風トキソイドが挙げられる。キャリアタンパク質は、動物の免疫応答を増強し、Ｔ細胞受容体結合部位のためのエピトープを提供する。用語「抗体」は、さらに、標識抗体のようなその誘導体を含む。抗体は、一般的に、放射性標識、化学発光標識、蛍光標識、リン光標識、赤外染料または表面増強ラマン標識もしくはプラスモン共鳴粒子によって標識することができる。抗体標識として、アルカリホスファターゼ、ＰＫＨ２、ＰＫＨ２６、ＰＫＨ６７、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、ヘキスト（Ｈｏｅｃｓｔ）３３２５８、Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）、ローダミン（ＴＲＩＴＣ）、クォンタムレッド（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｒｅｄ）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、Ｃｙ３、ビオチン、アガロース、ペルオキシダーゼおよび金粒子（ｇｏｌｄ  ｓｐｈｅｒｅ）が挙げられる。タンパク質に対する抗体に依存する分子生物学におけるツールとして、タンパク質ゲルブロット解析、遺伝子同定を可能にする発現ライブラリーのスクリーニング、ＥＬＩＳＡ（酵素免疫測定法）を含むタンパク質定量方法、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）およびＬＩＡ（ラインイムノアッセイ（ｌｉｎｅ  ｉｍｍｕｎｏ−ａｓｓａｙ））、タンパク質のイムノアフィニティー精製、タンパク質の免疫沈降およびタンパク質の免疫局在性が挙げられる。
【０１３８】
本発明に従って、ラミブジンおよびアデフォビルの両方に対して交差耐性を示す新規の変異パターン、Ａ１８１Ｓ＋Ｍ２０４Ｉが最初に見出された。この変異パターンは、アデフォビル処置の前および後の両方において得られる血清サンプルから抽出されるＨＢＶ  ＤＮＡのダイレクトシーケンシングによって見出され、この交差耐性変異パターンがアデフォビルに対して元来非応答性であることが示された（図２）。
【０１３９】
ラミブジンおよびアデフォビルは強力な抗ウイルス効果を有するが、薬剤耐性を引き起こす変異体の発達は、慢性ＨＢＶ感染の処置において重要な問題を提示する。さらに、交差耐性プロファイルを伴うＨＢＶ変異体パターンの存在は、併用療法の欠陥の可能性のため、大きな問題を提起している。アデフォビルは、一般的に、薬物耐性ＨＢＶのため、ラミブジン療法に失敗した患者の処置において良好な処置選択として認識されている。
【０１４０】
しかし、本発明に従えば、治療中にラミブジンと組み合わされたアデフォビル・ジピボキシルの使用は、ＨＢＶ複製も血清ＡＬＴレベルの減少も抑制しなかった（特に、図１を参照のこと）ことから、Ａ１８１ＳおよびＡ１８１Ｓ＋Ｍ２０４Ｉ変異体が、アデフォビルおよびラミブジンの両方に対してインビボでの交差耐性を実証することが示唆される。Ａ１８１Ｓ変異は、抗ウイルス処置施行の２８箇月目、即ち、ウイルス学的および生化学的進展の前から開始したすべての利用可能な血清サンプルにおいて検出された。一方、Ｍ２０４Ｉ変異は、２８箇月目の最初に利用可能な血清サンプルでは検出されなかったが、３箇月後の３１箇月目、即ち、進展時に出現した。
【０１４１】
インビトロ所見では、このＨＢＶ変異体は、１０μＭのアデフォビル・ジピボキシルのような高濃度で処置された場合であっても、アデフォビルに対して耐性であることが確認された（特に、表２を参照のこと）。同様に、この変種は、試験したラミブジンすべての濃度において、インビトロでラミブジンに対し耐性であることが見出されたが、これは、ＹＭＤＤモチーフにおいて変異の先に報告された耐性プロファイルと一致する（ボズダイ（Ｂｏｚｄａｙｉ）ら、２００３年；セタ（Ｓｅｔａ）ら、２０００年）。まとめて考えると、上記のデータは、Ａ１８１Ｓ＋Ｍ２０４Ｉ変種が、インビボならびにインビトロの両方においてアデフォビルおよびラミブジンに交差耐性を呈することを示す。
【０１４２】
残念ながら、併用療法の使用は、新規の薬物耐性変異の発生を防止することができないが、遅延させるように思われる。いずれにせよ、今日の臨床実践においてＨＢＶ感染を攻撃するために最も重要なことはなお、異なる耐性プロファイルを伴う抗ウイルス薬を組み合わせることである。
【０１４３】
以下の実施例は、本発明をさらに例示することのみに役立つ。これらの実施例が本発明の範囲を決して限定するものではない。
【実施例】
【０１４４】
実施例１：３ＴＣ処置中にＨＢＶ株において発達した新規変異パターンは、アデフォビル・ジピボキシル処置に対して交差耐性を示す。
症例研究
本発明をもたらす研究において、本発明者らは、ＨＢＶにより慢性感染した患者を同定した。患者は、定期診断で診断された１９９０年より既知のＨＢＶ感染を伴う患者ＡＡで示される４３歳の白人（Ｃａｕｃａｓｉａｎ）男性である。１９９９年における肝生検は、クノーデル（Ｋｎｏｄｅｌｌ）らに従って６の組織学的活性指標を伴う慢性活動性肝炎（ＣＡＨ）を表した。患者は、ＨｂｅＡｇポジティブ、抗ＨｂｅネガティブならびにＨＢＶ  ＤＮＡについてポジティブであった。ＨＢＶ  ＤＮＡレベルは、市販の液相ハイブリダイゼーションアッセイ（ダイジーン（Ｄｉｇｅｎｅ）、メリーランド州、米国）（このアッセイの検出の下限は５ｐｇ／ｍＬのウイルスＤＮＡであった）を使用して測定した。
【０１４５】
図１において示されるように、（１９９９年において）９箇月間、ＩＦＮ療法、９ＭＵ／ＴＩＷ（百万単位／１週間に３回）を施した。患者は、ＡＬＴの減少またはウイルス学的応答を示さなかった（ＨＢＶ  ＤＮＡレベルは、ＩＦＮ処置の終了時で３９６ｐｇ／ｍｌであった）。ウイルス量はこの期間内に減少することができなかったため、患者は、処置の９箇月後にＩＦＮ療法を中止し、ラミブジン（ＬＡＭ）処置（１００ｍｇ／日）を開始した。ＬＡＭ処置中、ＡＬＴレベルの正常化およびＨＢＶの複製阻害が認められた。ＬＡＭ処置の１９箇月後、ＡＬＴフレアおよびハイブリダイゼーションアッセイによるＨＢＶ  ＤＮＡの検出によって特徴付けられる臨床的進展が生じる。臨床的進展の発達後もラミブジン（ｌａｍｕｖｉｄｉｎｅ）を継続した。セロコンバージョンの徴候（抗ｈｂｅの出現およびＨｂｅＡｇの消失）が認められる場合、ＩＦＮ（９ＭＵ／ＴＩＷ）を６箇月間、再度追加した。しかし、併用療法は肝臓酵素の正常化をもたらさず、期間中、ＨＢＶ  ＤＮＡレベルは高値を保持した。その追加の６個月後および持続したセロコンバージョンが生じた後に、ＩＦＮを停止した。初期抗ウイルス療法の４４箇月目およびＩＦＮの停止の３箇月後に、ヘプセラ（Ｈｅｐｓｅｒａ）ＴＭ（アデフォビル・ジピボキシル（ｄｉｐｏｖｏｘｉｌ））１０ｍｇ／日を、ラミブジン単剤療法に追加した。ヘプセラ（Ｈｅｐｓｅｒａ）ＴＭは、より長期の１４箇月間使用した；ＨＢＶ複製の阻害もＡＬＴの正常化のいずれも生じなかった。
【０１４６】
抗ウイルス療法の効果
ＬＡＭ処置は最初は成功であった。ＡＬＴのレベルの正常化およびＨＢＶの複製阻害が認められた。ＬＡＭ処置の１９箇月目に、臨床的進展が生じた。ヘプセラ（Ｈｅｐｓｅｒａ）ＴＭのラミブジン単剤療法への添加は、ＨＢＶ複製の阻害およびＡＬＴ正常化をもたらさなかった。血球数および肝臓機能試験（アラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）を、日常的な手順（オリンパス（Ｏｌｙｍｐｕｓ）  ＡＵ２７００自動分析器、日本）に従って行った。
【０１４７】
ＨＢＶ  ＤＮＡの単離および配列決定
抗ウイルス処置の開始から異なる間隔（２８、３１、４２、５１、５７、６１箇月目）で、患者から血清を採取した。ＨＢＶ−ＤＮＡは、製造者の指示に従って、キアアンプ（Ｑｉａｍｐ）  ＤＮＡミニキット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、独国）の使用によって、患者の血清から各時間に単離した。ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をＰＣＲにより増幅した。簡単に説明すると、５マイクロリットルのＤＮＡサンプルを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ、ｐＨ：８．３、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２ｍＭ  ｄＮＴＰ、２５ｐｍｏｌ／μＬのセンスおよびアンチセンスプライマーならびに２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ロシェダイアグノティックス（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ）、ペンツブルグ（Ｐｅｎｚｂｕｒｇ）、独国）を含有するＰＣＲ混合物で５０μＬまでにした。ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子を増幅するため、サーマルサイクラー（ジーンアンプ（ＧｅｎｅＡｍｐ）  ＰＣＲシステム９７００、ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＰＥ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州；米国）を、９４℃で１分間の変性、４５℃で１分間のアニーリングの３５サイクルについてプログラム化し、２分間のポリマー化を実施した。２回目のラウンドのＰＣＲの条件は、１回目のラウンドのＰＣＲ由来の５μＬのサンプルを使用する１回目のラウンドの条件と同じであった。さらに、２組のネステッドプライマー対を使用して、ＨＢＶポリメラーゼ遺伝子を増大させた。アウタープライマーは、５’ＣＡＣ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＣＴ  ＣＡＴ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  Ａ３’（配列番号２１）および５’ＣＡＴ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＣＡＣ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＴＡＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＡＴ３’（配列番号２２）であり、インナープライマーは、５’ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＴＴＴ  ＧＴＧ  ＧＧＴ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  ＡＴＴ  ＣＴＴ  Ｇ３’（配列番号２３）および５’ＧＡＣ  ＡＡＧ  ＣＴＴ  ＴＴＧ  ＡＣＡ  ＴＡＣ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＡＴＣ  ＡＡＴ  ＡＧ３’（配列番号２４）であった（オガタ（Ｏｇａｔａ）ら、１９９９年；各配列において、ヌクレオチド４〜９は、ＰｓｔＩおよびヒンディー（Ｈｉｎｄ）ＩＩＩの酵素認識部位を示す）。増幅した産物を、エチジウムブロマイドで染色した２％アガロースゲル上で走行させた。配列決定は、増幅したＰＣＲ産物に対して直接行った。ＰＣＲ産物を、製造者の指示に従って、市販のＰＣＲクリーニングキット（ＰＣＲ  ｃｌｅａｎｉｎｇ  ｋｉｔ）（ヌクレオスピンエクストラクトキット（Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｔ  ｋｉｔ）、マッハライ−ナーゲル（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）、デューレン（Ｄｕｅｒｅｎ）、独国）によって精製した。ＰＣＲに使用されるプライマーおよびビッグダイターミネータサイクルシーケンシングキット（ｂｉｇ  ｄｙｅ  ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｃｙｃｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｋｉｔ）（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州、米国）を使用して、ＰＣＲ産物のダイレクトシーケンシングを実施した。各配列決定反応について、センスインナープライマーだけでなく、アンチセンスインナープライマーも、配列を確認するために使用した。反応産物を、ＡＢＩ３１０（ＰＥアプライドバイオシステムズ（ＰＥ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、カリフォルニア州、米国）自動化シークエンサーに供した。結果を図２に示す。
【０１４８】
４２箇月目（２００２年６月）に採取した血清から得られたＰＣＲ産物もまた、続いて、日常的なクローニング手順に従って、ＴＡベクター（トポＴＡクローニングキット（Ｔｏｐｏ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｋｉｔ）、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）、カリフォルニア州、米国）にクローニングした。９つのクローンのうち、７つを配列決定した。結果を図３に示す。クローン４において見出された変異パターンＤ２０５Ｇは、再度確認（ｃｏｎｎｆｉｒｍｅｄ）しなければならない。
【０１４９】
ヌクレオチド変化
図２の配列結果は、異なる間隔で患者から採取したすべてのサンプルにおいて、アミノ酸置換ｒｔＡ１８１ＳおよびｒｔＭ２０４Ｉを生じるヌクレオチド変異が存在したことを示す。従って、ｒｔＭ２０４Ｉ変異は、ｒｔＡ１８１Ｓ変異と一緒に、ラミブジン耐性の発達以来得られるすべてのサンプルにおいて検出された。ｒｔＡ１８１について、これまで、２つの変異パターンが示された。しかし、ｒｔＡ１８１Ｓは新規のパターンである。
【０１５０】
４２箇月目に得られた血清から増幅されたクローニングされたＰＣＲ産物から得られた配列情報を、図３に示す。配列結果は、７つのクローンのうち２つが、アミノ酸置換ｒｔＬ１８０ＭおよびｒｔＭ２０４Ｓを生じるヌクレオチド変異を含んでなったことを示した。これらの変異は、ＬＡＭ耐性に関連していた。７つのクローンのうちの他の５つは、アミノ酸置換ｒｔＡ１８１ＳおよびｒｔＭ２０４Ｉを生じるヌクレオチド変異を含んでなった。１つのクローンは、アミノ酸置換ｒｔＡ１８１Ｓ、ｒｔＭ２０４ＩおよびｒｔＤ２０５Ｇを生じるヌクレオチド変異を含んでなることが見出された。
【０１５１】
ＲｔＡ１８１Ｓは、配列決定された結果の間で一般に見出される変異パターンである。本結果（１４箇月目の終了時にＨＢＶ複製の阻害およびＡＬＴレベルの変動が認められない）により、本発明者らは、ラミブジン処置下で生じる変異パターンｒｔＡ１８１Ｓがアデフォビル・ジピボキシルに対する交差耐性を示すと結論付けることが可能である。より詳細には、ｒｔＭ２０４Ｉと組み合わされた変異パターンｒｔＡ１８１Ｓは、アデフォビル・ジピボキシルに対する交差耐性を示す。
【０１５２】
ラミブジン処置下で選択される新規の変異パターンを伴う薬物耐性株もまた、アデフォビル処置に対して交差耐性であることが結論付けられる。
【０１５３】
実施例２：新たに変異されたＨＢＶ株の薬物耐性のインビトロでの確認
血清サンプル由来のＨＢＶ  ＤＮＡの単離および全長ＨＢＶゲノムの増幅
製造者の指示に従ってハイピュアウイルス核酸キット（Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｋｉｔ）（ロシェ（Ｒｏｃｈｅ）、インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、米国）を使用して、２００μｌの血清サンプルからＤＮＡを抽出した。全長ＨＢＶ  ＤＮＡゲノムを、グンター（Ｇｕｎｔｈｅｒ）ら、１９９５年によって先に報告されているように、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．３５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、２００μＭ  ｄＮＴＰ、５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび０．３μＭの次の各プライマー：［Ｐ１、５’−ＣＣＧＧＡ  ＡＡＧＣＴＴ  ＧＡＧＣＴＣ  ＴＴＣＴＴＴＴＴ  ＣＡＣＣＴＣ  ＴＧＣＣＴ  ＡＡＴＣＡ−３’（ヌクレオチド１８２１−１８４１；配列番号２５）；Ｐ２、５’−ＣＣＧＧＡ  ＡＡＧＣＴＴ  ＧＡＧＣＴＣ  ＴＴＣＡＡＡＡＡ  ＧＴＴＧＣ  ＡＴＧＧＴＧ  ＣＴＧＧ−３’（ヌクレオチド１８２３−１８０６；配列番号２６）］を含有するＰＣＲシステムを使用して増幅し、５０μｌのＰＣＲ反応の全容積において、２μｌの抽出されたＤＮＡを、「エッペンドルフマスターサイクラーパーソナル（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ）」における９４℃で４０秒間の変性、６０℃で１．５分間のアニーリングおよび６８℃で３分間の伸長（各１０サイクル後に２分間の追加を伴う）の４０サイクルに対して進行させた。
【０１５４】
全長ＨＢＶゲノムのダイレクトシーケンシング
ダイレクトＤＮＡシーケンシングを、血清サンプルから直接抽出された増幅された産物およびＴＡクローニングの構築物の両方について、「ＡＢＩプリズム３１０ジェネティックアナライザ（ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ  ３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）」（パーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）、フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）、米国）における製造者の指示に従い、「ビッグダイターミネータｖ３．１  サイクルシーケンシングキット（Ｂｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｖ３．１  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ）」（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒｃｉｔｙ）、米国）を使用して、実施した。ＰＣＲ産物を、配列決定前に「キアクイックＰＣＲ精製キット（Ｑｉａｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）」（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、独国）を使用して精製した。ダイレクトシーケンシングにおいて使用されるプライマーを、表１に列挙する。
【０１５５】
【表１】
2008537483.tif 000002
【０１５６】
全長ＨＢＶゲノムのＴＡクローニングおよびＰＣＲおよび配列決定によるＨＢＶゲノムの特徴付け
増幅された全長ＨＢＶゲノムを、製造者の指示に従って、「トポ−ＸＬ  ＰＣＲクローニング（Ｔｏｐｏ−ＸＬ  ＰＣＲ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州、米国）を使用して、ＴＡベクターにクローニングした。次いで、構築物を配列決定した。Ａ１８１Ｓ＋Ｍ２０４Ｉ変異パターンを有するクローン内の全長ＨＢＶゲノムを、先に記載のようにさらに増幅した。また、同じ手順を、野生型ＨＢＶゲノムを有するクローンにも適用した。
【０１５７】
直接トランスフェクションのためのＨＢＶ  ＤＮＡの調製
アンプリコンは、キットより提供される取扱説明書に従って、「キアクイックゲル抽出キット（ＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｋｉｔ）」（キアゲン（ＱＵＩＡＧＥＮ）、バーゼル（Ｂａｓｅｌ）、瑞国）を使用してゲル精製し、プールした。１μｇのＤＮＡあたり５ＵのｓａｐＩ制限エンドヌクレアーゼによる以後の消化により、ベクターおよび異種のプライマー配列を欠くｓａｐＩ粘着部位を伴う線状ＨＢＶゲノムが放出された。
【０１５８】
抗ウイルス感受性試験のためのＨＢＶ  ＤＮＡのトランスフェクションおよびインビトロ複製
全長ゲノムＨＢＶ  ＤＮＡのインビトロ複製能を、Ｈｕｈ７細胞系統への一過性トランスフェクションによって測定した。２４ウェルプレートは、Ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬（ロシェダイアグノティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））を使用してトランスフェクション効率を決定するために使用されるμｇＧＦＰ含有プラスミドであった。トランスフェクションの８時間後、細胞に、複製効率を試験するための新鮮培地単独かまたは抗ウイルス感受性を試験するための０．１μＭ、１μＭ、１０μＭラミブジンもしくはアデフォビル単独を含有する培地を供給した。新鮮培地のみを供給された細胞の上清を、５日間、連日回収し、抗ウイルス剤含有培地を供給された細胞の上清を、５日目終了時に回収した。ウイルスＤＮＡ抽出を、製造者の指示に従い、「キアアンプＤＮＡミニキット（ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）」（キアゲン（ＱＵＩＡＧＥＮ）、バーゼル（Ｂａｓｅｌ）、瑞国）を使用して実施した。ＨＢＶ  ＤＮＡを、ボズカヤ（Ｂｏｚｋａｙａ）ら、２００５年において使用されたプロトコルに従って、「ファストスタートＤＮＡハイブリダイゼーションキット（Ｆａｓｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）」（ロシェダイアグノティックスＧｍｂＨ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＧｍｂＨ）、インディアナポリス（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）、ＡＢＤ）を使用するリアルタイムＰＣＲ方法によって測定した。
【０１５９】
一過的にトランスフェクトされたＨＵＨ７細胞系統におけるＨＢＶ複製
全長ＨＢＶゲノムの複製能をインビトロで分析した。各日の上清から抽出されたＨＢＶ複製物によって実施されたリアルタイムＰＣＲ分析は、細胞培養物において測定された全ＨＢＶ産生が５日目の終了時にほぼ５の対数コピー数に到達したことを実証した（図４）。この結果から、トランスフェクトされたＨＢＶ  ＤＮＡがインビトロで複製可能であることが確認される。
【０１６０】
野生型および変異（Ａ１８１Ｓ＋Ｍ２０４Ｉ）ウイルスに対するラミブジンおよびアデフォビルの効果の分析
３つの独立した実験（表２を参照のこと）を実施することによって、ラミブジン（０．１μＭ、１μＭ、１０μＭ）またはアデフォビル（０．１μＭ、１μＭおよび１０μＭ）の上昇濃度を使用し、野生型ＨＢＶに対して、Ａ１８１Ｓ＋Ｍ２０４Ｉ変異パターンの薬物感受性を試験した。
【０１６１】
【表２】
2008537483.tif 000003
【０１６２】
Ａ１８１Ｓ＋Ｍ２０４Ｉ変異パターンを担持するＨＢＶゲノムは、高い抗ウイルス剤の濃度であってもラミブジンおよびアデフォビルの両方に対し耐性であることが見出された。１０μＭのラミブジンおよびアデフォビルで処置したサンプルにおける野生型ＨＢＶのＨＢＶ  ＤＮＡは検出することができなかったが、４．６８±０．８２および４．１２±０．９８のｌｏｇコピー数が、それぞれ、変異ＨＢＶについて測定された（表２）。
【０１６３】
実施例３：別の患者におけるＨＢＶ株の変異パターンの確認
３３歳の男性が、ＨＢｓＡｇ（＋）および抗ＨＢｅ（＋）を伴う患者である。彼は、１９９８年に、ＨＢｓＡｇに対してポジティブであることが見出された。彼は、１２箇月間、２００３年において、週３回、ＩＦＮ  ９ＭＩＵで処置された（ＩＦＮ処置の開始前は、ダイジーン（Ｄｉｇｅｎｅ）、米国の液相ハイブリダイゼーションアッセイによりＡＬＴ：２４２ＩＵ／Ｌ、ＡＳＴ：１５５ＩＵ／ＬおよびＨＢＶ  ＤＮＡ：３２６０ｐｇ／ｍＬ）。不完全奏効のため、２００４年にラミブジンを開始した（ゼフィックス（Ｚｅｆｆｉｘ）、１００ｍｇ／日）。ラミブジン処置後、ＡＬＴ正常化が得られ、ＨＢＶ  ＤＮＡレベルは５ｐｇ／ｍＬ未満であった。しかし、ｌａｍ処置の２０箇月目に、ＡＬＴフレアおよびＨＢＶ複製の再発によって特徴付けられる臨床的進展（ＡＬＴ：１９９ＩＵ／ｍＬ、ＡＳＴ：１４５ＩＵ／ｍＬおよびＨＢＶ  ＤＮＡ：６５４０ｐｇ／ｍＬ）が生じた。ｌａｍ処置および臨床的進展の開始後に得られた２つの血清サンプルを抽出し、抽出された材料の両方において、グンター（Ｇｕｎｔｈｅｒ）ら、１９９５年による方法に従ってＨＢＶ  ＤＮＡの完全なゲノムを増幅した。次いで、ＰＣＲ産物を、ＴＡベクターにクローニングし、それぞれから得られる８つのクローンを、３１０ＡＢＩ（米国）におけるサイクルシーケンス方法によって配列決定した。ラミブジン処置のすぐ後に属する４つのクローンの配列は、野生型配列を示していた。しかし、臨床的進展の後から得られるすべての８つのクローンの配列は、Ａ１８１Ｓ＋Ｍ２０４Ｉパターン（１８１番目のコドンにおけるＧＣＴからＴＣＴ、ならびに２０４番目のコドンにおけるＡＴＴからＡＴＣ）を示した。
【０１６４】
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ボズダイ，Ａ．Ｍ．（Ｂｏｚｄａｙｉ，Ａ．Ｍ．）、ボズカヤ，Ｈ．（Ｂｏｚｋａｙａ，Ｈ．）、ツキルマズ，Ａ．Ｒ．（Ｔｕｅｒｋｙｉｌｍａｚ，Ａ．Ｒ．）、サリオグル，Ｍ．（Ｓａｒｉｏｇｌｕ，Ｍ．）、チェインカヤ，Ｈ．（Ｃｅｔｉｎｋａｙａ，Ｈ．）、カラヤルチン，Ｓ．（Ｋａｒａｙａｌｃｉｎ，Ｓ．）、ヤーデイヂン，Ｃ．（Ｙｕｒｄａｙｄｉｎ，Ｃ．）、ウズナリモグル，Ｏｅ．（Ｕｚｕｎａｌｉｍｏｇｌｕ，Ｏｅ．）（２００１年）：Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｅｃｏｒｅ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｓｉｓｔｅｎｔｌｙ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｏｒ  ｎｏｒｍａｌ  ＡＬＴ  ｌｅｖｅｌｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｖｉｒｏｌ．２１（１）：  ９１−１０１
ボズダイ  Ａｍ（Ｂｏｚｄａｙｉ  Ａｍ）、ウズナリモグル  Ｏ（Ｕｚｕｎａｌｉｍｏｇｌｕ  Ｏ）、ツキルマズ  Ａｒ（Ｔｕｒｋｙｉｌｍａｚ  Ａｒ）、アスラン  Ｎ（Ａｓｌａｎ  Ｎ）、セズギン  Ｏ（Ｓｅｚｇｉｎ  Ｏ）、サヒン  Ｔ（Ｓａｈｉｎ  Ｔ）、ボズダイ  Ｇ（Ｂｏｚｄａｙｉ  Ｇ）、チナル  Ｋ（Ｃｉｎａｒ  Ｋ）、パイ  Ｓｂ（Ｐａｉ  Ｓｂ）、パイ  Ｒ（Ｐａｉ  Ｒ）、ボズカヤ  Ｈ（Ｂｏｚｋａｙａ  Ｈ）、カラヤルチン  Ｓ（Ｋａｒａｙａｌｃｉｎ  Ｓ）、ヤーデイヂン  Ｃ（Ｙｕｒｄａｙｄｉｎ  Ｃ）、シナジ  Ｒｆ（Ｓｃｈｉｎａｚｉ  Ｒｆ）、（２００３年）．ＹＳＤＤ：ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＨＢＶ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｏｎｆｅｒｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ．Ｊ．Ｖｉｒａｌ  Ｈｅｐａｔ．，１０：２５６−６５．
ボズカヤ  Ｈ（Ｂｏｚｋａｙａ  Ｈ）、ヤーデイヂン  Ｃ（Ｙｕｒｄａｙｄｉｎ  Ｃ）、イヂルマン  Ｒ（Ｉｄｉｌｍａｎ  Ｒ）、ツズン  Ａ（Ｔｕｚｕｎ  Ａ）、シナル  Ｋ（Ｃｉｎａｒ  Ｋ）、エルカン  Ｏ（Ｅｒｋａｎ  Ｏ）、ボズダイ  ＡＭ（Ｂｏｚｄａｙｉ  ＡＭ）、エルデン  Ｅ（Ｅｒｄｅｎ  Ｅ）、ウズン  Ｙ（Ｕｚｕｎ  Ｙ）、セチンカヤ  Ｈ（Ｃｅｔｉｎｋａｙａ  Ｈ）およびウズナリモグル  Ｏ（Ｕｚｕｎａｌｉｍｏｇｌｕ  Ｏ）．（２００５年）Ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｉｎ  ＨＢｅＡｇ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｌｅｖｅｌ  ｖｉｒａｅｍｉａ．Ａｎｔｉｖｉｒ  Ｔｈｅｒ．１０（２）：３１９−２５
デイ，Ｉ．Ｎ．（Ｄａｙ，Ｉ．Ｎ．）、スパナキス，Ｅ．（Ｓｐａｎａｋｉｓ，Ｅ．）、パラマンド，Ｄ．（Ｐａｌａｍａｎｄ，Ｄ．）、ウィーヴィンド，Ｇ．Ｐ．（Ｗｅａｖｉｎｄ，Ｇ．Ｐ．）およびＯ’デル，Ｓ．Ｄ．（Ｏ’Ｄｅｌｌ，Ｓ．Ｄ．）（１９９８年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６，２８７−２９０
デ・クレーク，Ｅ．（Ｄｅ  Ｃｌｅｒｃｑ，Ｅ．）（１９９９年）Ｉｎｔ．Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ１２，８１−９５
ディレーニー，Ｗ．Ｅ．（Ｄｅｌａｎｅｙ，Ｗ．Ｅ．）、ミラー，Ｔ．Ｇ．（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｔ．Ｇ．）およびイソム，Ｈ．Ｃ．（Ｉｓｏｍ，Ｈ．Ｃ．）（１９９９年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ４３，２０１７−２０２６
ディレーニー  Ｗ（Ｄｅｌａｎｅｙ  Ｗ）、ヤン  Ｈ（Ｙａｎｇ  Ｈ）、ウェストランド  Ｃ（Ｗｅｓｔｌａｎｄ  Ｃ）、ダス  Ｋ（Ｄａｓ  Ｋ）、アーノルド  Ｅ（Ａｒｎｏｌｄ  Ｅ）、ミラー  Ｍ．（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｍ．）（２００２年）．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｒｔＶ１７３Ｌ，ａｎ  ＨＢＶ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｆｒｅｑｕｅｎｔｌｙ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｉｎ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，３６：３７３Ａ
デルワート，Ｅ．Ｌ．（Ｄｅｌｗａｒｔ，Ｅ．Ｌ．）、シェパード，Ｈ．Ｗ．（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｈ．Ｗ．）、ウォーカー，Ｂ．Ｄ．（Ｗａｌｋｅｒ，Ｂ．Ｄ．）、ゴードスミット，Ｊ．（Ｇｏｕｄｓｍｉｔ，Ｊ．）およびムリンス，Ｊ．Ｉ．（Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｉ．）（１９９４年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６８，６６７２−６６８３
デルワート，Ｅ．Ｌ．（Ｄｅｌｗａｒｔ，Ｅ．Ｌ．）、シュパール，Ｅ．Ｇ．（Ｓｈｐａｅｒ，Ｅ．Ｇ．）、ロウワギー，Ｊ．（Ｌｏｕｗａｇｉｅ，Ｊ．）、マックカットチャン，Ｆ．Ｅ．（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ，Ｆ．Ｅ．）、グレズ，Ｍ．（Ｇｒｅｚ，Ｍ．）、ルブサメン−ワイグマン，Ｈ．（Ｒｕｂｓａｍｅｎ−Ｗａｉｇｍａｎｎ，Ｈ．）およびムリンス，Ｊ．Ｉ．（Ｍｕｌｌｉｎｓ，Ｊ．Ｉ．）（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６２，１２５７−１２６１
ドレ  Ｇ．Ｊ．（Ｄｏｒｅ  Ｇ．Ｊ．）ら、Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｔｅｎｏｆｏｖｉｒ  ｄｉｓｏｐｒｏｘｉｌ  ｆｕｍａｒａｔｅ  ｉｎ  ａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ−ｎａｉｖｅ  ａｎｄ  −ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｄ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｃｏｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＨＩＶ−１  ａｎｄ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．（２００４）１８９（７）：１１８５−１１９２．
デルマナック，Ｒ．（Ｄｒｍａｎａｃ，Ｒ．）、デルマナック，Ｓ．（Ｄｒｍａｎａｃ，Ｓ．）、ストレゾスカ，Ｚ．（Ｓｔｒｅｚｏｓｋａ，Ｚ．）、パウネスク，Ｔ．（Ｐａｕｎｅｓｋｕ，Ｔ．）、レイバット，Ｉ．（Ｌａｂａｔ，Ｉ．）、ゼレムスキ，Ｍ．（Ｚｅｒｅｍｓｋｉ，Ｍ．）、スノッディ，Ｊ．（Ｓｎｏｄｄｙ，Ｊ．）、フンクハウサー，Ｗ．Ｋ．（Ｆｕｎｋｈｏｕｓｅｒ，Ｗ．Ｋ．）、クープ，Ｂ．（Ｋｏｏｐ，Ｂ．）およびフッド，Ｌ．（Ｈｏｏｄ，Ｌ．）（１９９３年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２６０，１６４９−１６５２
フー，Ｌ．（Ｆｕ，Ｌ．）およびチェン，Ｙ．Ｃ．（Ｃｈｅｎｇ，Ｙ．Ｃ．）（２０００年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ４４，３４０２−３４０７
グリフィン，Ｔ．Ｊ．（Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ｔ．Ｊ．）およびスミス，Ｌ．Ｍ．（Ｓｍｉｔｈ，Ｌ．Ｍ．）（２０００年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８，７７−８４
グンター  Ｓ（Ｇｕｎｔｈｅｒ  Ｓ）、リー  ＢＣ（Ｌｉ  ＢＣ）、ミスカ  Ｓ（Ｍｉｓｋａ  Ｓ）、クルガー  ＤＨ（Ｋｒｕｇｅｒ  ＤＨ）、マイセル  Ｈ（Ｍｅｉｓｅｌ  Ｈ）およびウィル  Ｈ．（Ｗｉｌｌ  Ｈ．）（１９９５年）Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｗｈｏｌｅ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅｓ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｒａｐｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ６９，５４３７−５４４４．
ハーロー，Ｅ．（Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．）およびレーン，Ｄ．（Ｌａｎｅ，Ｄ．）（１９８８年）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）
フーバー，Ｃ．Ｇ．（Ｈｕｂｅｒ，Ｃ．Ｇ．）、プレムスター，Ａ．（Ｐｒｅｍｓｔａｌｌｅｒ，Ａ．）、シャオ，Ｗ．（Ｘｉａｏ，Ｗ．）、オベラチャー，Ｈ．（Ｏｂｅｒａｃｈｅｒ，Ｈ．）、ブン，Ｇ．Ｋ．（Ｂｏｎｎ，Ｇ．Ｋ．）およびオエフナー，Ｐ．Ｊ．（Ｏｅｆｎｅｒ，Ｐ．Ｊ．）（２００１年）Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ４７，５−１９
ジャービス，Ｂ．（Ｊａｒｖｉｓ，Ｂ．）およびファウルズ，Ｄ．（Ｆａｕｌｄｓ，Ｄ．）（１９９９年）Ｄｒｕｇｓ  ５８，１０１−１４１
クノーデル，Ｒ．Ｇ．（Ｋｎｏｄｅｌｌ，Ｒ．Ｇ．）、イシャク，Ｋ．Ｇ．（Ｉｓｈａｋ，Ｋ．Ｇ．）、ブラック，Ｗ．Ｃ．（Ｂｌａｃｋ，Ｗ．Ｃ．）、チェン，Ｔ．Ｓ．（Ｃｈｅｎ，Ｔ．Ｓ．）、クライグ，Ｒ．（Ｃｒａｉｇ，Ｒ．）、カプロウィズ，Ｎ．（Ｋａｐｌｏｗｉｔｚ，Ｎ．）、キールナン，Ｔ．Ｗ．（Ｋｉｅｒｎａｎ，Ｔ．Ｗ．）およびウォールマン，Ｊ．（Ｗｏｌｌｍａｎ，Ｊ．）（１９８１年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  １，４３１−４３５
コルッコ，Ｊ．（Ｋｏｒｋｋｏ，Ｊ．）、アンヌネン，Ｓ．（Ａｎｎｕｎｅｎ，Ｓ．）、ピラジャマ，Ｔ．（Ｐｉｈｌａｊａｍａａ，Ｔ．）、プロコップ，Ｄ．Ｊ．（Ｐｒｏｃｋｏｐ，Ｄ．Ｊ．）およびアラ−コッコ，Ｌ．（Ａｌａ−Ｋｏｋｋｏ，Ｌ．）（１９９８年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９５，１６８１−１６８５
コスブスキー，Ｍ．Ｊ．（Ｋｏｓｏｖｓｋｙ，Ｍ．Ｊ．）、カウストブ，Ｖ．Ｉ．（Ｋｈａｏｕｓｔｏｖ，Ｖ．Ｉ．）、ルストン，Ｍ．（Ｒｕｓｈｔｏｎ，Ｍ．）およびヨッフェ，Ｂ．（Ｙｏｆｆｅ，Ｂ．）（２０００年）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １４９０，６３−７３
クリステンセン，Ｖ．Ｎ．（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｖ．Ｎ．）、ケレフィオティス，Ｄ．（Ｋｅｌｅｆｉｏｔｉｓ，Ｄ．）、クリステンセン，Ｔ．（Ｋｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，Ｔ．）およびボーレッセン−ダレ，Ａ．Ｌ．（Ｂｏｒｒｅｓｅｎ−Ｄａｌｅ，Ａ．Ｌ．）（２００１年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３０，３１８−２２，３２４，３２６
リー，Ｚ．（Ｌｉ，Ｚ．）およびチレル，Ｄ．Ｌ．（Ｔｙｒｒｅｌｌ，Ｄ．Ｌ．）（１９９９年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７７，１１９−１２６
リデル，Ｊ．Ｅ．（Ｌｉｄｄｌｅ，Ｊ．Ｅ．）およびクライヤー，Ａ．（Ｃｒｙｅｒ，Ａ．）（１９９１年）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．ウィリー（Ｗｉｌｅｙ），ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）
ロク，Ａ．Ｓ．（Ｌｏｋ，Ａ．Ｓ．）（１９９４年）Ｊ  Ｖｉｒａｌ．Ｈｅｐａｔ．１，１０５−１２４
ルー，Ｘ．（Ｌｕ，Ｘ．）、ブロック，Ｔ．Ｍ．（Ｂｌｏｃｋ，Ｔ．Ｍ．）およびゲーリッヒ，Ｗ．Ｈ．（Ｇｅｒｌｉｃｈ，Ｗ．Ｈ．）（１９９６年）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７０，２２７７−２２８５
ルー，Ｘ．（Ｌｕ，Ｘ．）、ハズボウン，Ｔ．（Ｈａｚｂｏｕｎ，Ｔ．）およびブロック，Ｔ．（Ｂｌｏｃｋ，Ｔ．）（２００１年）Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｓ  ７３，２７−４０
ルスコーム，Ｃ．Ａ．（Ｌｕｓｃｏｍｂｅ，Ｃ．Ａ．）およびロカルニニ，Ｓ．（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ，Ｓ．）（１９９６年）Ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｒｅｖｉｅｗｓ  ２，１−３５
マチダ，Ａ．（Ｍａｃｈｉｄａ，Ａ．）、キシモト，Ｓ．（Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｓ．）、オオヌマ，Ｈ．（Ｏｈｎｕｍａ，Ｈ．）、ババ，Ｋ．（Ｂａｂａ，Ｋ．）、イトウ，Ｙ．（Ｉｔｏ，Ｙ．）、ミヤモト，Ｈ．（Ｍｉｙａｍｏｔｏ，Ｈ．）、フナツ，Ｇ．（Ｆｕｎａｔｓｕ，Ｇ．）、オダ，Ｋ．（Ｏｄａ，Ｋ．）、ウスダ，Ｓ．（Ｕｓｕｄａ，Ｓ．）およびトガミ，Ｓ．（Ｔｏｇａｍｉ，Ｓ．）（１９８４年）Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  ８６，９１０−９１８
マキサム，Ａ．Ｍ．（Ｍａｘａｍ，Ａ．Ｍ．）およびギルバート，Ｗ．（Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｗ．）（１９７７年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ７４，５６０−５６４
メラー，Ａ．（Ｍｅｌｌｅｒ，Ａ．）、ニボン，Ｌ．（Ｎｉｖｏｎ，Ｌ．）、ブランディン，Ｅ．（Ｂｒａｎｄｉｎ，Ｅ．）、ゴロベビチェンコ，Ｊ．（Ｇｏｌｏｖｃｈｅｎｋｏ，Ｊ．）およびブラントン，Ｄ．（Ｂｒａｎｔｏｎ，Ｄ．）（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，１０７９−１０８４
ナラヤナスワミ，Ｇ．（Ｎａｒａｙａｎａｓｗａｍｉ，Ｇ．）およびテイラー，Ｐ．Ｄ．（Ｔａｙｌｏｒ，Ｐ．Ｄ．）（２００１年）Ｇｅｎｅｔ  Ｔｅｓｔ．５，９−１６
ニールセン，Ｐ．Ｅ．（Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｐ．Ｅ．）（２００１年）Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ８，５４５−５５０
オガタ  Ｎ．（Ｏｇａｔａ  Ｎ．）、フジイ  Ｋ．（Ｆｕｊｉｉ  Ｋ．）、タキガワ  Ｓ．（Ｔａｋｉｇａｗａ  Ｓ．）、ノモト  Ｍ．（Ｎｏｍｏｔｏ  Ｍ．）、イチダ  Ｔ．（Ｉｃｈｉｄａ  Ｔ．）およびアサクラ  Ｈ．（Ａｓａｋｕｒａ  Ｈ．）（１９９９年）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．５９，２７０−２７６．
オノ，Ｓ．Ｋ．（Ｏｎｏ，Ｓ．Ｋ．）、カトウ，Ｎ．（Ｋａｔｏ，Ｎ．）、シラトリ，Ｙ．（Ｓｈｉｒａｔｏｒｉ，Ｙ．）、カトウ，Ｊ．（Ｋａｔｏ，Ｊ．）、ゴトウ，Ｔ．（Ｇｏｔｏ，Ｔ．）、シナジ，Ｒ．Ｆ．（Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．）、カリルホ、Ｆ．Ｊ．（Ｃａｒｒｉｌｈｏ，Ｆ．Ｊ．）およびオマタ，Ｍ．（Ｏｍａｔａ，Ｍ．）（２００１年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０７，４４９−４５５
オルム，Ｈ．（Ｏｒｕｍ，Ｈ．）およびウェンゲル，Ｊ．（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．）（２００１年）Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３，２３９−２４３
パラン，Ｎ．（Ｐａｒａｎ，Ｎ．）、ゲイガー，Ｂ．（Ｇｅｉｇｅｒ，Ｂ．）およびシャウル，Ｙ．（Ｓｈａｕｌ，Ｙ．）（２００１年）ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０，４４４３−４４５３
ペリロ  Ｒ．（Ｐｅｒｒｉｌｌｏ  Ｒ．）ら、Ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ  ａｄｄｅｄ  ｔｏ  ｏｎｇｏｉｎｇ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  ｉｎ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｗｉｔｈ  ＹＭＤＤ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００４年）１２６（１）：８１−９０．
ペータース  Ｍ．Ｇ．（Ｐｅｔｅｒｓ  Ｍ．Ｇ．）ら、Ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ  ａｌｏｎｅ  ｏｒ  ｉｎ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（２００４年）１２６（１）：９１−１０１．
レシュ，Ｗ．（Ｒｅｓｃｈ，Ｗ．）、パーキン，Ｎ．（Ｐａｒｋｉｎ，Ｎ．）、スルエルケ，Ｅ．Ｌ．（Ｓｔｕｅｌｋｅ，Ｅ．Ｌ．）、ワトキンス，Ｔ．（Ｗａｔｋｉｎｓ，Ｔ．）およびスワンストーム，Ｒ．（Ｓｗａｎｓｔｒｏｍ，Ｒ．）（２００１年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８，１７６−１８１
ルアノ，Ｇ．（Ｒｕａｎｏ，Ｇ．）およびキッド，Ｋ．Ｋ．（Ｋｉｄｄ，Ｋ．Ｋ．）（１９９１年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，２８１５−２８１９
サイキ，Ｒ．Ｋ．（Ｓａｉｋｉ，Ｒ．Ｋ．）、ワルシュ，Ｐ．Ｓ．（Ｗａｌｓｈ，Ｐ．Ｓ．）、レベンソン，Ｃ．Ｈ．（Ｌｅｖｅｎｓｏｎ，Ｃ．Ｈ．）およびエールリッヒ，Ｈ．Ａ．（Ｅｒｌｉｃｈ，Ｈ．Ａ．）（１９８９年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６，６２３０−６２３４
サンガー，Ｆ．（Ｓａｎｇｅｒ，Ｆ．）、ニッケルン，Ｓ．（Ｎｉｃｋｌｅｎ，Ｓ．）およびコールソン，Ａ．Ｒ．（Ｃｏｕｌｓｏｎ，Ａ．Ｒ．）（１９７７年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７４，５４６３−５４６７
シナジ，Ｒ．（Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．）（１９９７年）ｉｎ  Ｖｉｒａｌ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ａｎｄ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ（リッゼット，Ｍ．（Ｒｉｚｚｅｔｔｏ，Ｍ．）、パーセル，Ｒ．（Ｐｕｒｃｅｌｌ，Ｒ．）、ゲリン，Ｊ．（Ｇｅｒｉｎ，Ｊ．）およびベルメ，Ｇ．（Ｖｅｒｍｅ，Ｇ．）編、Ｉｍｐａｃｔ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｏｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ．７３６−７４２頁、ミネルヴァメディカ（Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄｉｃａ），トリノ（Ｔｏｒｉｎｏ）
セタ，Ｔ．（Ｓｅｔａ，Ｔ．）、Ｏ．ヨコスカ（Ｏ．Ｙｏｋｏｓｕｋａ），Ｆ．イマゼキ（Ｆ．Ｉｍａｚｅｋｉ）、Ｍ．タガワ（Ｍ．Ｔａｇａｗａ）、およびＨ．サイスホ（Ｈ．Ｓａｉｓｈｏ）（２０００年）．Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ＹＭＤＤ  ｍｏｔｉｆ  ｍｕｔａｎｔｓ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｔｙｐｅ  Ｂ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．６０：８−１６．
ストイヴェル，Ｌ．（Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｌ．）、デ・ゲント，Ｓ．（Ｄｅ  Ｇｅｎｄｔ，Ｓ．）、バン・ゲイト，Ｃ．（Ｖａｎ  Ｇｅｙｔ，Ｃ．）、ゾウリム，Ｆ．（Ｚｏｕｌｉｍ，Ｆ．）、フリード，Ｍ．（Ｆｒｉｅｄ，Ｍ．）、シナジ，Ｒ．Ｆ．（Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．）およびロッサウ，Ｒ．（Ｒｏｓｓａｕ，Ｒ．）（２０００年）Ｊ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ  ８１  Ｐｔ１，６７−７４
ストイヴェル，Ｌ．（Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｌ．）、ウィセウル，Ａ．（Ｗｙｓｅｕｒ，Ａ．）、ロンボート，Ａ．（Ｒｏｍｂｏｕｔ，Ａ．）、ロウガギー，Ｊ．（Ｌｏｕｗａｇｉｅ，Ｊ．）、スカルセズ，Ｔ．（Ｓｃａｒｃｅｚ，Ｔ．）、ベルホフステデ，Ｃ．（Ｖｅｒｈｏｆｓｔｅｄｅ，Ｃ．）、リムランド，Ｄ．（Ｒｉｍｌａｎｄ，Ｄ．）、シナジ，Ｒ．Ｆ．（Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．）およびロッサウ，Ｒ．（Ｒｏｓｓａｕ，Ｒ．）（１９９７年）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４１，２８４−２９１
ストイヴェル，Ｌ．（Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｌ．）、ウィセウル，Ａ．（Ｗｙｓｅｕｒ，Ａ．）、バン・アーンヘム，Ｗ．（ｖａｎ  Ａｒｎｈｅｍ，Ｗ．）、ヘルナンデス，Ｆ．（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｆ．）およびマエルテンス，Ｇ．（Ｍａｅｒｔｅｎｓ，Ｇ．）（１９９６年）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ３４，２２５９−２２６６
ストイヴェル，Ｌ．Ｊ．（Ｓｔｕｙｖｅｒ，Ｌ．Ｊ．）、ロカルニニ，Ｓ．Ａ．（Ｌｏｃａｒｎｉｎｉ，Ｓ．Ａ．）、ロク，Ａ．（Ｌｏｋ，Ａ．）、リッチマン，Ｄ．Ｄ．（Ｒｉｃｈｍａｎ，Ｄ．Ｄ．）、カーマン，Ｗ．Ｆ．（Ｃａｒｍａｎ，Ｗ．Ｆ．）、ディーンスタグ，Ｊ．Ｌ．（Ｄｉｅｎｓｔａｇ，Ｊ．Ｌ．）およびシナジ，Ｒ．Ｆ．（Ｓｃｈｉｎａｚｉ，Ｒ．Ｆ．）（２００１年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３３，７５１−７５７
サマーズ  Ｊ．（Ｓｕｍｍｅｒｓ  Ｊ．）、マソン  Ｗ．（Ｍａｓｏｎ  Ｗ．）Ｃｅｌｌ（１９８２年）２９：４０３−４１５．
アーバン，Ｓ．（Ｕｒｂａｎ，Ｓ．）およびチレル，Ｄ．Ｌ．（Ｔｙｒｒｅｌｌ，Ｄ．Ｌ．）（２０００年）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ  ４５，１８５−１９７
ウォーレステッド，Ｃ．（Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ，Ｃ．）、サルミ，Ｐ．（Ｓａｌｍｉ，Ｐ．）、グッド，Ｌ．（Ｇｏｏｄ，Ｌ．）、ケラ，Ｊ．（Ｋｅｌａ，Ｊ．）、ジョンソン，Ｔ．（Ｊｏｈｎｓｓｏｎ，Ｔ．）、ホクフェルト，Ｔ．（Ｈｏｋｆｅｌｔ，Ｔ．）、ブロベーガー，Ｃ．（Ｂｒｏｂｅｒｇｅｒ，Ｃ．）、ポレッカ，Ｆ．（Ｐｏｒｒｅｃａ，Ｆ．）、ライ，Ｊ．（Ｌａｉ，Ｊ．）、レン，Ｋ．（Ｒｅｎ，Ｋ．）、オッシポブ，Ｍ．（Ｏｓｓｉｐｏｖ，Ｍ．）、コスキン，Ａ．（Ｋｏｓｈｋｉｎ，Ａ．）、ヤコブセン，Ｎ．（Ｊａｋｏｂｓｅｎ，Ｎ．）、スコウブ，Ｊ．（Ｓｋｏｕｖ，Ｊ．）、オエルム，Ｈ．（Ｏｅｒｕｍ，Ｈ．）、ヤコブセン，Ｍ．Ｈ．（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｍ．Ｈ．）およびウェンゲル，Ｊ．（Ｗｅｎｇｅｌ，Ｊ．）（２０００年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７，５６３３−５６３８
ウェストランド  ＣＥ（Ｗｅｓｔｌａｎｄ  ＣＥ）ら、Ｗｅｅｋ  ４８  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｐｈａｓｅ  ３  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ  ｆｏｒ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００３年）  ３８（１）：９６−１０３．
シャオ，Ｗ．（Ｘｉａｏ，Ｗ．）およびオエフナー，Ｐ．Ｊ．（Ｏｅｆｎｅｒ，Ｐ．Ｊ．）（２００１年）Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ  １７，４３９−４７４
ション，Ｘ．（Ｘｉｏｎｇ，Ｘ．）、Ｃ．フローレス（Ｃ．Ｆｌｏｒｅｓ）、Ｈ．ヤン（Ｈ．Ｙａｎｇ）、Ｊ．Ｊ．ツーレ（Ｊ．Ｊ．Ｔｏｏｌｅ）、およびＣ．Ｓ．ギブス（Ｃ．Ｓ．Ｇｉｂｂｓ）（１９９８年）．Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｌａｍｉｖｕｄｉｎｅ  ｄｏ  ｎｏｔ  ｃｏｎｆｅｒ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ａｄｅｆｏｖｉｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ２８：１６６９−１６７３．
ヤガー，Ｔ．Ｄ．（Ｙａｇｅｒ，Ｔ．Ｄ．）、バロン，Ｌ．（Ｂａｒｏｎ，Ｌ．）、バトラ、Ｒ．（Ｂａｔｒａ，Ｒ．）、ボーエビッチ，Ａ．（Ｂｏｕｅｖｉｔｃｈ，Ａ．）、チャン，Ｄ．（Ｃｈａｎ，Ｄ．）、チャン，Ｋ．（Ｃｈａｎ，Ｋ．）、ダラシュ，Ｓ．（Ｄａｒａｓｃｈ，Ｓ．）、ギルヒリスト，Ｒ．（Ｇｉｌｃｈｒｉｓｔ，Ｒ．）、イズマイロフ，Ａ．（Ｉｚｍａｉｌｏｖ，Ａ．）、ラクロイクス，Ｊ．Ｍ．（Ｌａｃｒｏｉｘ，Ｊ．Ｍ．）、マーチェレタ，Ｋ．（Ｍａｒｃｈｅｌｌｅｔａ，Ｋ．）、レンフリュー，Ｊ．（Ｒｅｎｆｒｅｗ，Ｊ．）、ルシュロー，Ｄ．（Ｒｕｓｈｌｏｗ，Ｄ．）、ステインバッハ，Ｅ．（Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ，Ｅ．）、トン，Ｃ．（Ｔｏｎ，Ｃ．）、ウォーターハウス，Ｐ．（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ，Ｐ．）、ザレスキー，Ｈ．（Ｚａｌｅｓｋｉ，Ｈ．）、デュン，Ｊ．Ｍ．（Ｄｕｎｎ，Ｊ．Ｍ．）およびスティーブンズ，Ｊ．（Ｓｔｅｖｅｎｓ，Ｊ．）（１９９９年）Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  ２０，１２８０−１３００
ヤン  Ｈ（Ｙａｎｇ  Ｈ）ら、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｇｅｎｏｔｙｐｉｃ  ａｎｄ  Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  Ａｎａｌｙｓｅｓ  ｏｆ  ＨＢＶ  Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ  ｉｎ  ＨＢｅＡｇ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ９６  Ｗｅｅｋｓ  ｏｆ  Ａｄｅｆｏｖｉｒ  Ｄｉｐｉｖｏｘｉｌ（ＡＤＶ）．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ（２００３年）３８：７０５Ａ．，Ｃ．Ｔ．，チェン，Ｒ．Ｎ．（Ｃｈｉｅｎ，Ｒ．Ｎ．）、チュ，Ｃ．Ｍ．（Ｃｈｕ，Ｃ．Ｍ．）およびリャウ，Ｙ．Ｆ．（Ｌｉａｗ，Ｙ．Ｆ．）（２０００年）Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ３１，１３１８−１３２６
【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】患者病歴の模式図を表す。Ｘ軸は時系列を表す。Ｘ軸の下側は、ＨＢＶ感染患者ＡＡの連続処置を月数で示す（ＭＵ／ＴＩＷは、１週間に３回の数百万単位のインターフェロンを表す）。左側のＹ軸では、（ダイジーン（Ｄｉｇｅｎｅ）、米国の液体ハイブリダイゼーションアッセイを使用して決定されるｐｇＨＢＶ  ＤＮＡ／ｍＬ血清での）ウイルスＤＮＡ量を示す。患者ＡＡの血清サンプルにおけるＨＢＶ  ＤＮＡレベルを黒実線で示す。右側のＹ軸では、ＡＬＴ−レベル（１００ＩＵ／ｍＬ（１００国際単位／ｍＬ）でのアラニンアミノトランスフェラーゼ）を示す。図の頂部の垂直矢印は、ウイルス進展の発生に一致するＡＬＴフレアを示す。
【図２ａ−２ｂ】抗ウイルス処置の開始から異なる時間間隔でのＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ配列のアラインメントを表す。ジェンバンク（Ｇｅｎｅｂａｎｋ）受託番号Ｘ０２４９６由来の配列番号１によって示されるＨＢＶ  Ｄ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素ヌクレオチド配列のフラグメントおよび配列番号９によって示される対応するアミノ酸配列と、抗ウイルス処置の開始から異なる時間間隔で患者ＡＡから得られる６つのＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素ヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列とを整列した。これらの６つのヌクレオチド配列を配列番号２および３に示し、対応するアミノ酸配列をそれぞれ配列番号１０および１１に示す。血清採取日をＸＸ／ＹＹで示し、ここで、ＸＸは採取の月を示し、ＹＹは年を示す。抗ウイルス処置の開始からの期間を、月数でＭＺＺによって示す。
【図３ａ−３ｃ】ＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ配列のアラインメントを表す。図２に記載のＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素ならびに４２箇月目の患者ＡＡから得られる７つのＨＢＶ  ＤＮＡポリメラーゼ／逆転写酵素ヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列のフラグメントを整列する。血清採取日は０６／０２である。これらの７つのヌクレオチド配列を配列番号４〜８に示し、対応するアミノ酸配列を配列番号１２〜１４に示す。
【図４】一過的にトランスフェクトされたＨｕｈ７細胞系統の細胞培養上清におけるＨＢＶ産生を表す。Ｙ軸におけるＨＢＶ産生のＬｏｇコピー数を、Ｘ軸上のＡ１８１Ｓ＋Ｍ２０４Ｉ変異パターンを有するクローン内の全長ＨＢＶゲノムによるトランスフェクション後のアッセイ培地における日数に従ってグラフで示す。０日目は、Ｈｕｈ７細胞系統のトランスフェクションの前日を指す。
【図１】
2008537483.tif 000004
【図２ａ】
2008537483.tif 000005
【図２ｂ】
2008537483.tif 000006
【図３ａ】
2008537483.tif 000007
【図３ｂ】
2008537483.tif 000008
【図３ｃ】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年9月20日(2007.9.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008537483000001.app
【国際調査報告】
2008537483.tif 000019
2008537483.tif 000020
2008537483.tif 000021
2008537483.tif 000022
2008537483.tif 000023