(57)【要約】  ホスホジエステラーゼＰＤＥ４Ｂ上で活性な化合物を提供する。ＰＤＥ４Ｂ媒介疾患または症状の処置に有用な組成物及びその使用法も提供する。
2008503446.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の化学構造：
【化１】
2008503446.tif 000211
｛式中，Xは，O，S，及びNR7からなる群から選択され；
R1，R2，R4，R5，R7，R9及びR10は，水素，アシル，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択され，
但し，R1とR2，またはR4とR5，またはR9とR10，またはR2とR3は結合して場合により置換された複素環を形成することができる；
R3は，シアノ，ニトロ，-C(Z)R8，-S(O2)NR9R10，-S(O2)R11，及び場合により置換された低級アルキルからなる群から選択される；
Y及びZはO及びSからなる群から独立して選択される；
R6及びR8は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，及び場合により置換された複素環からなる群から選択される；並びに
R11は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択される｝
を有する化合物並びにその塩，プロドラッグ，及び異性体。
【請求項２】
式中，R6は置換された単環式複素環であり，ここでR6の少なくとも一つの置換基は，場合により置換されたアリール及び場合により置換されたヘテロアリールからなる群から選択される置換基を含む，請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物：
【化２】
2008503446.tif 000212
｛式中，R3は，シアノ，ニトロ，-C(Z)R8，-S(O2)NR9R10，-S(O2)R11，及び場合により置換された低級アルキルからなる群から選択され；
ZはO及びSからなる群から独立して選択され；
R1，R2，R4，R5，R7，R9及びR10は，水素，アシル，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択され，
但し，R1とR2，またはR4とR5，またはR9とR10，またはR2とR3は，結合して場合により置換された複素環を形成することができる；
R8は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，及び場合により置換された複素環からなる群から選択され；
R11は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択され；
R6は，
【化３】
2008503446.tif 000213
であり；
Z1，Z2，Z3，及びZ4は，-O-，-S-，-CR6a-，-CR6b-，-CR6c-，及び-NR6d-からなる群から独立して選択され；
ここでZ1，Z2，Z3，及びZ4の少なくとも一つはヘテロ原子であり；及び
Z1，Z2，Z3，及びZ4は安定な化合物を形成するように選択され；
R6a，R6b，及びR6cは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択されるか；または
R6a，R6b，及びR6cは，Z1，Z2，Z3，及びZ4を含む五員環と組み合わせて場合により置換された融合複素環系を形成することができる；
R6dは，場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドからなる群から選択され；
但し，R6がチオフェン-2-イルであるとき，R1及びR2は，フェニル，低級アルキル，及び低級アルケニルからなる群から選択されない；
R6がフラン-2-イルであるとき，R1及びR2は場合により置換されたフェニル及び場合により置換されたフェニルアルキルからなる群から選択されない；及び
R1またはR2がフラン-2-イルメチレンまたはフラン-2-イル-エチレンであるとき，R6は場合により置換されたフェニルではない｝。
【請求項４】
式中，R1は，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，アシル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択され；及び
R2，R4及びR5は水素である，請求項３に記載の化合物。
【請求項５】
式中，Xは，O，S，及びNR7からなる群から選択され；
Y及びZは，O及びSからなる群から独立して選択され；
R3は，シアノ，ニトロ，-C(Z)R8，-S(O2)NR9R10，-S(O2)R11，及び場合により置換された低級アルキルからなる群から選択され；
R1，R2，R4，R5，R7，R9及びR10は，水素，アシル，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択され，
但し，R1とR2，またはR4とR5，またはR9とR10，またはR2とR3は，結合して場合により置換された複素環を形成することができる；
R8は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，及び場合により置換された複素環からなる群から独立して選択され；
R11は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択され；
R6は，以下のものからなる群から選択され：
【化４】
2008503446.tif 000214
R6a，R6b，及びR6cは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；及び
R6dは，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドからなる群から選択され；
但し，R6がチオフェン-2-イルであるとき，R6aは水素でもハロでもない，請求項１に記載の化合物。
【請求項６】
式中，Xは，O，S，及びNR7からなる群から選択され；
Y及びZは，O及びSからなる群から独立して選択され；
R3は，シアノ，ニトロ，-C(Z)R8，-S(O2)NR9R10，-S(O2)R11，及び場合により置換された低級アルキルからなる群から選択され；
R1，R2，R4，R5，R7，R9及びR10は，水素，アシル，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択され，
但し，R1とR2，またはR4とR5，またはR9とR10，またはR2とR3は，結合して場合により置換された複素環を形成することができる；
R8は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，及び場合により置換された複素環からなる群から選択され；
R11は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択され；
R6は，以下のものからなる群から選択され：
【化５】
2008503446.tif 000215
R6a及びR6bは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；
但し，R6がチオフェン-2-イルであるとき，R6aは水素でもハロでもない，請求項５に記載の化合物。
【請求項７】
R1及びR2の少なくとも一つが，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，及び場合により置換されたヘテロシクロアルキルからなる群から選択される，請求項１に記載の化合物。
【請求項８】
以下の構造を有する請求項１に記載の化合物：
【化６】
2008503446.tif 000216
｛式中，R1は，水素，アシル，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択され；
R3は，シアノ，ニトロ，-C(Z)R8，-S(O2)NR9R10，-S(O2)R11，及び場合により置換された低級アルキルからなる群から選択され；及び
R6aは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から選択される｝。
【請求項９】
以下の化学構造を有する化合物：
【化７】
2008503446.tif 000217
｛式中，Xは，S，O，及びNR15からなる群から選択され；
R12は，水素，-OR16，-SR16，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択され；
R13は，-OR16，-SR16，及び場合により置換されたアミンからなる群から選択され；
R14は，-OR16，-SR16，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，-C(Z)R19，-C(Z)NR20R21，-S(O2)NR20R21，及び-S(O2)R22からなる群から選択され；
R15は，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，-C(Z)R19，-C(Z)NR20R21，-S(O2)NR20R21，及び-S(O2)R22からなる群から選択され；
R16は，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，及び-C(Z)R19からなる群から選択され；
ZはO及びSからなる群から選択され；
R19は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択され；
R20及びR21は，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択されるか，または
R20とR21は結合して５〜７員の炭素環または複素環を形成することができる；及び
R22は，ヒドロキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択される｝並びにその塩，プロドラッグ，及び異性体。
【請求項１０】
以下の構造を有する，請求項９に記載の化合物：
【化８】
2008503446.tif 000218
｛式中，Z1，Z2，Z3，及びZ4は，-O-，-S-，-CR19a-，-CR19b-，-CR19c-，及び-NR19d-からなる群から独立して選択され，
ここで，Z1，Z2，Z3，及びZ4の少なくとも一つはヘテロ原子であり；
Z1，Z2，Z3，及びZ4は，安定な化合物を形成するように選択され；
R12aは，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたアリールからなる群から選択され，但し，スルホンアミドはアリール，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，及びスルホニルを置換しなくてもよい；及び
R19a，R19b，及びR19cは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；
ここでR19a，R19b及びR19cの少なくとも一つは，場合により置換されたアリール，場合により置換されたヘテロアリール，またはカルボキシルであるか；あるいは
R19a，R19b，及びR19cは，Z1，Z2，Z3及びZ4を含む五員環と組み合わさって，場合により置換された融合複素環系を形成することができる；並びに
R19dは場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドからなる群から選択される｝。
【請求項１１】
以下の構造を有する，請求項９に記載の化合物：
【化９】
2008503446.tif 000219
｛式中，Z1，Z2，Z3，及びZ4は，-O-，-S-，-CR19a-，-CR19，-CR19c-及び-NR19d-からなる群から独立して選択され，
ここでZ1，Z2，Z3，及びZ4の少なくとも一つはヘテロ原子であり，
Z1，Z2，Z3，及びZ4は安定な化合物を生成するように選択され；
R12aは，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたアリール，及び場合により置換されたヘテロアリールからなる群から選択され，ここでアリールはアシル，アミン，及びスルホニルアミドで置換されていなくてもよい；
R19a，R19b及びR19cは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択されるか；または
R19a，R19b及びR19cは，Z1，Z2，Z3，及びZ4を含む五員環と組み合わせて，場合により置換された融合複素環系を形成することができる；及び
R19dは，場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドからなる群から選択される｝。
【請求項１２】
以下の構造を有する，請求項９に記載の化合物：
【化１０】
2008503446.tif 000220
｛式中，R19は，以下のものからなる群から選択され：
【化１１】
2008503446.tif 000221
R19a，R19b及びR19cは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；及び
R19dは場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドである｝。
【請求項１３】
以下の構造を有する，請求項１２に記載の化合物：
【化１２】
2008503446.tif 000222
｛式中，R19は，以下のものからなる群から選択され：
【化１３】
2008503446.tif 000223
R19aは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；
R19bは，水素及び低級アルキルからなる群から選択され；及び
R19dは場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドである｝。
【請求項１４】
式中，R14はC(O)R19であり；
R19は場合により置換されたシクロアルキルであり；及び
R12は，場合により置換されたアリールアミン，場合により置換されたヘテロアリールアミン，及び場合により置換されたシクロアルキルからなる群から選択され，
但し，R12がフェニルアミンであるとき，R19はシクロプロピルではない，請求項９に記載の化合物。
【請求項１５】
式中，R14はC(O)R19であり；
R19は場合により置換されたアリール，場合により置換されたヘテロアリール，または場合により置換されたシクロアルキルであり；及び
R12は場合により置換されたシクロアルキルアミンであり，ここでR12がシクロヘキシルアミンであるとき，R19は場合により置換されたフェニルではない，請求項９に記載の化合物。
【請求項１６】
以下の構造を有する化合物：
【化１４】
2008503446.tif 000224
｛式中，R12aは，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたヘテロアリール，アシル及びスルホニルからなる群から選択され，及び
R19aは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から選択される｝。
【請求項１７】
以下の構造を有する，請求項１６に記載の化合物：
【化１５】
2008503446.tif 000225
｛式中，R12aは，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，及びスルホニルからなる群から選択され；及び
R19aは，アルコキシ，アミノ，カルボキシル，場合により置換されたアリール，及び場合により置換されたヘテロアリールからなる群から選択される｝。
【請求項１８】
以下の構造を有する，請求項１６に記載の化合物：
【化１６】
2008503446.tif 000226
｛式中，R12aは，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，及び場合により置換されたアリールからなる群から選択され；及び
R19aは，アルコキシ，アミノ，カルボキシル，場合により置換されたアリール，及び場合により置換されたヘテロアリールからなる群から選択される｝。
【請求項１９】
以下の構造を有する，請求項１６に記載の化合物：
【化１７】
2008503446.tif 000227
｛式中，R12aは，低級アルキル，シクロアルキル，及び場合により置換されたアリールからなる群から選択され；及び
R19aはアルコキシ，アミノ，カルボキシル，場合により置換されたアリール，及び場合により置換されたヘテロアリールからなる群から選択される｝。
【請求項２０】
以下の構造を有する，請求項９に記載の化合物：
【化１８】
2008503446.tif 000228
｛式中，R12aは，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたアリール，但し，スルホンアミドは，アリールを置換しなくてもよい，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニルからなる群から選択される｝。
【請求項２１】
以下の構造を有する，請求項９に記載の化合物：
【化１９】
2008503446.tif 000229
｛式中，R12aは，場合により置換されたアリールである｝。
【請求項２２】
以下の構造を有する，請求項９に記載の化合物：
【化２０】
2008503446.tif 000230
｛式中，R12aは，場合により置換されたフェニルである｝。
【請求項２３】
以下の化学構造を有する化合物：
【化２１】
2008503446.tif 000231
｛式中，R23は，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択されるか；または
R23は，R26，(R25)m若しくは，R26と(R25)mの両方と結合して，５〜７員の場合により置換された炭素環または場合により置換された複素環系を形成することができる；
R24は，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択され；
但し，R24が置換アリールであるとき，前記アリール置換基は置換イソプロピルではなく；
R24が場合により置換された低級アルケニルであるとき，R24の全ての二重結合は，R24が結合しているスルホニルSから少なくとも二つの結合だけ離れ；及び
R24が場合により置換された低級アルキニルであるとき，R24の全ての三重結合は，R24が結合しているスルホニルSから少なくとも二つの結合だけ離れ；
R25は，存在する場合には，場合により置換された低級アルキレンであり；
R26は，場合により置換された３〜１４個の環原子を有する炭素環または場合により置換された複素環構造であり，ここでR26がアリールであるとき，R26の置換基は，存在する場合には置換イソプロピルではない；ｍは０〜３である｝及びその塩，プロドラッグ及び異性体。
【請求項２４】
以下の構造を有する，請求項２３に記載の化合物：
【化２２】
2008503446.tif 000232
｛式中，R26a，R26b，R26c，R26d，R26e，及びR26fは，水素，ハロ，低級アルキル，及びアルコキシからなる群から独立して選択される｝。
【請求項２５】
式中，R24は，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリールアミノ，場合により置換されたヘテロアリールアミノ，場合により置換されたアリールスルホニル，及び-RNHC(O)R'で場合により置換されたアリールからなる群から選択され，ここで：
Rは，アルキレンであり，及び
R'は，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアリール，または場合により置換されたヘテロアリールであるか；または
R24は，場合により置換されたヘテロアリールであり，
但し，R24はテトラゾールでもトリアゾロピリミジン環でもない，請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
以下の構造を有する請求項２３に記載の化合物：
【化２３】
2008503446.tif 000233
｛式中，nは０または１であり；及び
Z1，Z2，Z3，Z4，及びZ5は，-O-，-S-，CR24a-，-CR24b-，-CR24c-，-CR24d-，及び-NR24e-からなる群から独立して選択され；
ここでZ1，Z2，Z3，Z4，及びZ5は，安定な化合物を形成するように選択される；
R24a，R24b，R24c，及びR24dは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；及び
R24eは，場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，またはスルホンアミドである｝。
【請求項２７】
請求項１に記載の化合物と医薬的に許容可能なキャリヤとを含む組成物。
【請求項２８】
請求項９に記載の化合物と医薬的に許容可能なキャリヤとを含む組成物。
【請求項２９】
請求項２３に記載の化合物と医薬的に許容可能なキャリヤとを含む組成物。
【請求項３０】
ＰＤＥ４Ｂ調節によって治療的利益を提供する疾患または症状に罹患しているか，その危険性のあるヒト患者の処置方法であって，以下の化学構造：
【化２４】
2008503446.tif 000234
を有するＰＤＥ４Ｂの調節剤の有効量を前記患者に投与することを含む，前記方法｛式中，Xは，O，S，及びNR7からなる群から選択され；
R1，R2，R4，R5，R7，R9及びR10は，水素，アシル，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択され，
但し，R1とR2，またはR4とR5，またはR9とR10，またはR2とR3は結合して場合により置換された複素環を形成することができる；
R3は，シアノ，ニトロ，-C(Z)R8，-S(O2)NR9R10，-S(O2)R11，及び場合により置換された低級アルキルからなる群から選択され；
Y及びZは，O及びSからなる群から独立して選択され；
R6及びR8は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，及び場合により置換された複素環からなる群から選択され；及び
R11は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択される｝。
【請求項３１】
前記疾患または症状がＰＤＥ４Ｂ媒介疾患または症状である，請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法であって，前記疾患または症状が，喘息，慢性閉塞性肺疾患(COPD)，気管支炎，アレルギー性気管支炎，気腫，嚢胞性線維症，特発性肺線維症，サルコイドーシス，肺高血圧症，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン舞踏病，多発性硬化症，リウマチ様関節炎，クローン病，脳虚血，炎症性腸疾患，潰瘍性大腸炎，骨粗鬆症，骨石化病，パジェット病，びまん性大細胞型リンパ腫，慢性リンパ性白血病，急性リンパ性白血病，重症急性呼吸器症候群，及び早期分娩からなる群から選択される，前記方法。
【請求項３３】
ＰＤＥ４Ｂ調節によって治療的利益を提供する疾患または症状に罹患しているか，その危険性のあるヒト患者の処置方法であって，以下の化学構造：
【化２５】
2008503446.tif 000235
｛式中，Xは，S，O，及びNR15からなる群から選択され；
R12は，水素，-OR16，-SR16，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択され；
R13は，-OR16，-SR16，及び場合により置換されたアミンからなる群から選択され；
R14は，-OR16，-SR16，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，-C(Z)R19，-C(Z)NR20R21，-S(O2)NR20R21，及び-S(O2)R22からなる群から選択され；
R15は，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，-C(Z)R19，-C(Z)NR20R21，-S(O2)NR20R21，及び-S(O2)R22からなる群から選択され；
R16は，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，及び-C(Z)R19からなる群から選択され；
Zは，O及びSからなる群から選択され；
R19は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択され；
R20及びR21は，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択されるか，または
R20及びR21は結合して５〜７員の炭素環または複素環を形成してもよい；及び
R22は，ヒドロキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択される｝
を有するＰＤＥ４Ｂの有効量を前記患者に投与することを含む，前記方法。
【請求項３４】
前記疾患または症状がＰＤＥ４Ｂ媒介疾患または症状である，請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項３４に記載の方法であって，前記疾患または症状が，喘息，慢性閉塞性肺疾患(COPD)，気管支炎，アレルギー性気管支炎，気腫，嚢胞性線維症，特発性肺線維症，サルコイドーシス，肺高血圧症，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン舞踏病，多発性硬化症，リウマチ様関節炎，クローン病，脳虚血，炎症性腸疾患，潰瘍性大腸炎，骨粗鬆症，骨石化病，パジェット病，びまん性大細胞型リンパ腫，慢性リンパ性白血病，急性リンパ性白血病，重症急性呼吸器症候群，及び早期分娩からなる群から選択される，前記方法。
【請求項３６】
ＰＤＥ４Ｂ調節によって治療的利益を提供する疾患または症状に罹患しているか，その危険性のあるヒト患者の処置方法であって，以下の化学構造：
【化２６】
2008503446.tif 000236
｛式中，R23は，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択されるか；または
R23は，R26，(R25)mまたはR26と(R25)mの両方と結合して，５〜７員の場合により置換された炭素環系または場合により置換された複素環系を形成することができる；
R24は，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択され；
但し，R24が置換アリールであるとき，前記アリール置換基は，置換イソプロピルではない；
R24が場合により置換された低級アルケニルであるとき，R24の全ての二重結合は，R24が結合しているスルホニルSから少なくとも二つの結合だけ離れ；及び
R24が場合により置換された低級アルキニルであるとき，R24の全ての三重結合は，R24が結合しているスルホニルSから少なくとも二つの結合だけ離れ；
R25は，存在する場合には，場合により置換された低級アルキレンであり；
R26は，３〜１４個の環原子を含む場合により置換された炭素環または場合により置換されたヘテロ環構造であり，ここでR26がアリールであるとき，R26の置換基は，存在する場合には，置換イソプロピルではない；
mは０から３である｝
を有するＰＤＥ４Ｂの有効量を前記患者に投与することを含む，前記方法。
【請求項３７】
前記疾患または症状がＰＤＥ４Ｂ媒介疾患または症状である，請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項３７に記載の方法であって，前記疾患または症状が，喘息，慢性閉塞性肺疾患(COPD)，気管支炎，アレルギー性気管支炎，気腫，嚢胞性線維症，特発性肺線維症，サルコイドーシス，肺高血圧症，アルツハイマー病，パーキンソン病，ハンチントン舞踏病，多発性硬化症，リウマチ様関節炎，クローン病，脳虚血，炎症性腸疾患，潰瘍性大腸炎，骨粗鬆症，骨石化病，パジェット病，びまん性大細胞型リンパ腫，慢性リンパ性白血病，急性リンパ性白血病，重症急性呼吸器症候群，及び早期分娩からなる群から選択される，前記方法。
【請求項３９】
ＰＤＥ４Ｂ上で活性な改良された調節剤をスクリーニングする方法であって，
請求項１に従った複数の試験化合物のいずれかが，ＰＤＥ４Ｂ上で活性な参照化合物に対して一つ以上の所望の薬理学的特徴において改良点を提供するかを測定する；及び
前記所望の薬理学的特徴において改良点を提供する（単数または複数種類の）化合物がもしあれば，これを選択して，改良された調節剤を提供する，各段階を含む前記方法。
【請求項４０】
ＰＤＥ４Ｂ上で活性な改良された調節剤をスクリーニングする方法であって，
請求項９に従った複数の試験化合物のいずれかが，ＰＤＥ４Ｂ上で活性な参照化合物に対して一つ以上の所望の薬理学的特徴において改良点を提供するかを測定する；及び
前記所望の薬理学的特徴において改良点を提供する（単数または複数種類の）化合物がもしあれば，これを選択して，改良された調節剤を提供する，各段階を含む前記方法。
【請求項４１】
ＰＤＥ４Ｂ上で活性な改良された調節剤をスクリーニングする方法であって，
請求項２３に従った複数の試験化合物のいずれかが，ＰＤＥ４Ｂ上で活性な参照化合物に対して一つ以上の所望の薬理学的特徴において改良点を提供するかを測定する；及び
前記所望の薬理学的特徴において改良点を提供する（単数または複数種類の）化合物がもしあれば，これを選択して，改良された調節剤を提供する，各段階を含む前記方法。
【請求項４２】
ＰＤＥ４Ｂに特異的なリガンドを最適化する方法であって，
複数のホスホジエステラーゼに結合する化合物を同定する；及び
前記化合物の誘導体が，前記化合物よりもＰＤＥ４Ｂに対して高い特異性をもつか  どうかを決定する，各段階を含む前記方法。
【請求項４３】
前記化合物が，前記複数のホスホジエステラーゼのいずれかに結合するよりも少なくとも１０倍高い親和性でＰＤＥ４Ｂに結合する，請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記化合物が少なくとも一つの保護化ＰＤＥ４Ｂ活性部位残基と相互作用する，請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記化合物が複数のホスホジエステラーゼに弱く結合する，請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記複数のホスホジエステラーゼがＰＥＤ４Ｂ及びＰＤＥ４Ｄを含む，請求項４２に記載の方法。
【請求項４７】
前記複数のホスホジエステラーゼがＰＥＤ４Ｂ及びＰＤＥ５Ａを含む，請求項４２に記載の方法。
【請求項４８】
改質化合物であって，ＰＤＥ４Ｂ結合化合物と，ＰＤＥ４Ｂに前記改質化合物を結合させるためのエネルギー的に許容された部位でこれに結合しているリンカー部分とを含む，前記化合物。
【請求項４９】
前記リンカーが固相に結合している，請求項４８に記載の化合物。
【請求項５０】
前記リンカーが標識に結合している，請求項４８に記載の化合物。
【請求項５１】
前記リンカーが痕跡を残さないリンカーである，請求項４８に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する特許出願に対するクロスリファレンス
本出願は，全ての目的に関してその全体を参照として含む，2004年５月６日出願の米国仮特許出願第６０／５６９４３５号に対して米国特許法119条のもと，優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は，ホスホジエステラーゼ4B(ＰＤＥ４Ｂ)のリガンドの開発及び前記リガンドの開発用ＰＤＥ４Ｂの結晶構造の使用に関する。提供した情報は読者が理解しやすいようにと意図するだけのものである。本明細書中に提供した情報も引用した文献もいずれも本発明の先行技術とは認められない。引用した参考文献はそれぞれ，本明細書中，参照として含まれる。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
ホスホジエステラーゼ(PDE)は，最初にSutherland及び共同研究者(Railら，J．Biol．Chem.，232巻：1065-1076頁(1958年)；Butcherら，J．Biol．Chem.，237巻：1244-1250頁(1962年))によって発見された。PDEのスーパーファミリーは二つの大きな分類，クラスIとクラスIIに分けられ(Charbonneau．H.，Cyclic  Nucleotide  Phosphodiesterases：Structure，Regulation  and  Drug  Action，Beavo，J.，及びHouslay，M.D.編)267-296頁，John  Wiley  &  Sons，Inc.，New  York(1990年))，これは，認識可能な配列類似性をもたない。クラスIとしては，全ての公知の哺乳類PDEが挙げられ，別々の遺伝子の産物である11個の特定されたファミリーから構成される(Beavoら，MoI．Pharmacol.，46巻：399-405頁(1994年)；Contiら，Endocr．Rev.，16巻：370-389頁(1995年)；Degermanら，J．Biol．Chem.，272巻：6823-6826頁(1997年)；Houslay，M.D.，Adv．Enzyme  Regul，35巻：303-338頁(1995年)；Bolger，G.B.，Cell  Signal，6巻：851-859頁(1994年)；Thompsonら，Adv．Second  Messenger  Phosphoprotein  Res.，25巻：165-184頁(1992年)；Underwoodら，J．Pharmacol．Exp．Ther.，270巻：250-259頁(1994年)；Michaeliら，J.．Biol．Chem.，268巻：12925-12932頁(1993年)；Soderlingら，Proc．Natl．Acad．Sci  U.S.A.，95巻：8991-8996頁(1998年)；Soderlingら，J．Biol．Chem.，273巻：15553-15558頁(1998巻)；Fisherら，J．Biol．Chem.，273巻：15559-15564頁(1998年))。PDEによっては，cAMPの加水分解に対して非常に特異的である(PDE4，PDE7，PDE8)が，あるものは非常にcGMP-特異的(PDE5，PDE6，PDE9)であり，あるものは混合特異性をもつ(PDE1，PDE2，PDE3，PDE10)。
【０００４】
特徴付けされた哺乳類PDEは全て二量体であるが，PDEそれぞれの機能に関してこの二量体構造の重要性というのは知られていない。PDEはそれぞれPDEファミリーのアミノ酸配列の高い保存率(25〜30%)で約270個のアミノ酸の保存された触媒的ドメインを有し，これはその調節ドメインに関してカルボキシル末端に向かって配置されている。特定のPDEのアクチベーターは，酵素構造内に配置された自己阻害ドメインの影響を緩和するようである(Sonnenbergら，J．Biol．Chem.，270巻：30989-31000頁(1995年)；Jinら，J．Biol．Chem.，267巻：18929-18939頁(1992年))。
【０００５】
PDEは，リン原子で構造の反転によってその３'-位置でリン原子と酸素原子との間の環式2'−3'ヌクレオチドホスホジエステル結合を開裂する(Goldbergら，J．Biol．Chem.，255巻：10344-10347頁(1980年)；Burgersら，J．Biol．Chem.，254巻：9959-9961頁(1979年))。これは明らかに，イオン化したH2OのOH-によるインライン求核攻撃によるものである。PDE内の保存された金属結合モチーフに結合した金属は，OH-を攻撃し易くすると提案されてきた(Francisら，J．Biol．Chem.，269巻：22477-22480頁(1994年))。触媒の動的特性は，触媒に必要な(単数または複数種類の)二価カチオンと環式ヌクレオチドに関してランダムオーダーメカニズムと一致する(Srivastavaら，Biochem．J.，308巻：653-658頁(1995年))。全ての公知の哺乳類PDEの触媒ドメインは，縦に一列に並んだ二つの配列(HX3  BXn(E/D))を含み，そのそれぞれはサーモリシンなどのメタロエンドプロテアーゼの単一のZn2+-結合部位に似ている(Francisら，J．Biol．Chem.，269巻：22477-22480頁(1994年))。PDE5はZn2+を特異的に結合し，PDE4，PDE5，及びPDE6の触媒活性は，サブマイクロモル濃度のZn2+によって支持される(Francisら，J．Biol．Chem.，269巻：22477-22480頁(1994年)；Percivalら，Biochem．Biophys．Res．Commim.，241巻：175-180頁(1997年))。Zn2+-結合モチーフのそれぞれが独立してZn2+に結合するか，または二つのモチーフが相互作用して新規なZn2+-結合部位を形成するのかは知られていない。PDEによる環式ヌクレオチドのホスホジエステラーゼ結合を開裂する触媒機構は，ペプチドのアミドエステルを開裂する特定のプロテアーゼの触媒機構と似ているかもしれないが，PDEに縦に一列に並んで配列された二つのZn2+モチーフの存在が新しい。
【０００６】
SutherlandとRallのグループ(Berthetら，J．Biol．Chem.，229巻：351-361頁(1957年))は，1950年代後半になって，それによってカフェインがcAMP  PDE活性の肝臓か関与するグリコーゲン分解及びｃAMP蓄積におけるグルカゴンの作用，アデニリルシクラーゼの刺激剤の作用を強める，(単数または複数種類の)メカニズムの少なくとも一部に気づいた。以来，化学者は，広く使用されていた3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)を含む，多くのPDE阻害剤を合成してきた。その多くの化合物並びにカフェインは，非選択性であり，且つPDEファミリーの多くを阻害する。PDE研究における重要な一つの利点は，PDE4阻害剤，ロリプラム及びPDE5阻害剤，シルデナフィルなどのファミリー-特異的阻害剤の発見/設計であった。
【０００７】
細胞におけるPDE機能を正確に調節するには，環式ヌクレオチドレベルを狭い濃度範囲に維持することが重要である。基底レベルの２〜４倍以上のcGMPに上昇すると，通常，最大の生理学的応答を生じる。PDEの調節には三つの一般的なスキームがある：(a)基質利用性による調節，たとえば二重特異性PDE(たとえばPDE1，PDE2，PDE3)のどれかで起こりえる，他方との競合により一方の環式ヌクレオチドの加水分解速度を変えたり，環式ヌクレオチドレベルを増加させた後の，質量的作用によってPDE活性を刺激する；(b)インスリンによるPDE3活性の刺激(Degermanら，J．Biol．Chem.，272巻：6823-6826頁(1997年))；この酵素によりPDE6相互作用を変えるトランスデューシンシステム(Yamazakiら，J．Biol．Chem.，255巻：11619-11624頁(1980年))を介するフォトンによるPDE6活性の刺激；またはCa2+/カルモジュリンとの高い相互作用によるPDE1活性の刺激となる，細胞間シグナル伝達(たとえば，リン酸化事象，Ca2+，ホスファチジン酸，イノシトールホスフェート，タンパク質-タンパク質相互作用)を変える細胞外シグナルによる調節；(c)フィードバック調節，たとえば，cAMP上昇後にPKAにより触媒作用を受けたPDE１，PDE3，若しくはPDE4(Contiら，Endocr．Rev.，16巻：370-389頁(1995年)；Degermanら，J．Biol．Chem.，272巻：6823-6826頁(1997年)；Gettysら，J．Biol．Chem.，262巻：333-339頁(1987年)；Florioら，Biochemistry，33巻：8948-8954頁(1994年))，PDE2へのアロステリックcGMP結合によって，cGMP上昇後のcAMP若しくはcGMPの分解を促進させることにより，またはcAMP-上昇剤に細胞を長期暴露させた後に高濃度のPDE3若しくはPDE4によって発生する脱感作などのPDEタンパク質レベルの調節により(Contiら，Endocr．Rev.，16巻：370-389頁(1995年)，Shethら，Throm．Haemostasis，77巻：155-162頁(1997年))または，PDE5含有量における発生的に関係する変化によって調節される。上記に概説したこの三つのスキームのどれかに影響を与え得る他の因子は，プレニル化などによる共有結合の修飾または，細胞内の区画の間のPDEの転座及びPDE一次構造における特異的な標的配列により作用を受ける，細胞の区画化である(cellular  compartmentalization)(Houslay，M.D.，Adv．Enzyme  Regul，35巻：303-338頁(1995年))。
【０００８】
PDEスーパーファミリーの中で，10個のファミリーのうち四つのPDE(PDE2，PDE5，PDE6，及びPDE10)は，種々の基質特異性の触媒作用部位に加えて，高いcGMP-特異的アロステリック(非触媒作用的)cGMP-結合部位を含む。これらの二量体dGMP-結合PDEのモノマーはそれぞれ，タンパク質のアミノ末端部分に縦に一列に含まれ且つ配置された約110個のアミノ酸の二つの同族dGMP-結合部位を含む(Charbonneau，H.，Cyclic  Nucleotide  Phosphodiesterases：Structure，Regulation  and  Drug  Action，Beavo，J.，及びHouslay，M.D.，編)267-296頁(1990年)；McAllister-Lucasら，J．Biol．Chem.，270巻：30671-30679頁(1995年))。PDE2では，これらの部位へのcGMPの結合によって，触媒的部位でcAMPの加水分解を刺激する(Beavoら，MoI．Pharmacol，46巻：399-405頁(1994年))。PDE2で加水分解されたcGMP並びにcAMP，及びcGMP加水分解は，正の協同的速度論に従ってアロステリックサイトにおけるcGMP結合により刺激される(Manganielloら，Cyclic  Nucleotide  Phosphodiesterases：Structure，Regulation，and  Drug  Action，Beavo，J.，及びHouslay，M.D.，編，61-85頁，John  Wiley  &  Sons，Inc.，New  York(1990年))。これは，組織cGMPレベルの調節の負のフィードバックプロセスを示し(Manganielloら，Cyclic  Nucleotide  Phosphodiesterases：Structure，Regulation，and  Drug  Action，Beavo，J.，及びHouslay，M.D.編，61-85巻，John  Wiley  &  Sons，Inc.，New  York(1990年))，これはcAMP機能停止のcGMP刺激により表される環式ヌクレオチド経路の間のクロストークに加えて起きる。PDE6のアロステリック部位へのcGMPの結合は，触媒作用に影響を与えることは示されていないが，この結合は，調節タンパク質，トランスデューシン，及びPDE6の阻害γサブユニットの相互作用を調節することができる(Yamazakiら，Adv．Cyclic  Nucleotide  Protein  Phosphorylation  Res.，16巻：381-392頁(1984年))。
【０００９】
PDE4サブファミリーは，４つの構成員から構成される：PDE4A(SEQ  ID  NO：14)，ＰＤＥ４Ｂ(SEQ  ID  NO：12)，PDE4C (SEQ  ID  NO：15)，及びPDE4D(SEQ  ID  NO：13)(Contiら，(2003年)J．Biol  Chem．278年：5493-5496頁)。このPDE4酵素は，基質としてcGMPよりもcAMPに対して優先傾向を示す。これらの酵素は，おそらく二量体形成を媒介するN-末端調節ドメインを有し，これにより最適にPDE活性が調節される。さらに，活性は，このアップストリーム調節ドメインのcAMP-依存性プロテインキナーゼリン酸化部位を介して調節される。これらの酵素は，偏在的に発現されるが，重要なことにはリンパ球中で発現される。
【００１０】
PDE4酵素の阻害剤は，炎症性疾患の処置で有用であると提案されてきた。ＰＤＥ４Ｂのノックアウトによって生存応力のあるマウスが得られたが(Jin及びConti(2002年)Proc  Natl  Acad  Sci，USA，99巻，7628-7633頁)，ＰＤＥ４Ｄのノックアウトでは生存率が低下した(Jinら，(1999年)Proc  Natl  Acad  Sci，USA，96巻，11998-12003頁)。PDE4Dノックアウト遺伝子型は，他の生育環境のマウス系で繁殖させることによって奪回できる。これらのPDE4Dノックアウト胎児からの気道上皮細胞は，アドレナリンアゴニストに対して非常に低い過敏性を示し，このことは，気道炎症疾患において治療標的としてPDE4Dを示唆している(Hansenら，(2000年)Proc  Natl  Acad  Sci，USA，97巻，6751-6756頁)。PDE4B-ノックアウトマウスは，症状が殆どなく，且つ正常な気道感受性を有する。
【００１１】
対照的に，ＰＤＥ４Ｂノックアウトマウスからの単球は，LPSに対する応答が低い(Jin及びConti(2002年)Proc  Natl  Acad  Sci，USA，99巻，7628-7633頁)。このことは，種々のPDE4Dに対して選択性を有するPDE4B化合物は，副作用が少ない，抗炎症活性を示すことを示唆している。
【００１２】
PDE4B(Xuら，(2000年)，Science，288巻，1822-1825頁)及びPDE4D(Leeら，(2002年)FEBS  Lett，530巻，53-58頁)の結晶構造が文献に報告された。このPDE4B構造は，活性部位に存在するリガンド無しで溶解するので，活性部位特性に関する情報は，二つの金属イオン部位(おそらく亜鉛とマグネシウム)の検出に限定されていた。cAMPに対する結合様式は，コンピューターによるモデリングをベースとして提案されていた。従って，ＰＤＥ４Ｂのより強力且つ特異的な阻害剤及び調節剤並びにこれらを設計する方法に対する需要が当業界に存在する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
発明の概要
本発明は，ＰＤＥ４Ｂ上で活性な化合物及び，さらにＰＤＥ４Ｂの調節剤を設計するためにＰＤＥ４Ｂに関する構造情報の使用に関する。特に本発明は，以下に記載の式I，式II及び式IIIの化合物に関する。従って，本発明は，ＰＤＥ４Ｂの調節に関与し並びに，ＰＤＥ４Ｂ及び他のPDEの追加の調節剤を開発するための分子骨格を提供するための治療法に使用し得る化合物を提供する。
【００１４】
式Iの化合物は，以下の構造：
【化２７】
2008503446.tif 000003
｛式中，Xは，O，S，及びNR7であり；
Y及びZは独立してOまたはSであり；
R1，R2，R4，R5，R7，R9及びR10は，水素，アシル，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，または場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から独立して選択され，R1とR2，またはR4とR5，またはR9とR10，またはR2とR3は独立して結合して複素環または場合により置換された複素環を形成することができる；
R3は，シアノ，ニトロ，-C(Z)R8，S(O2)NR9R10，-S(O2)R11，及び場合により置換された低級アルキルであり；
R6及びR8は，独立してヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，及び場合により置換された複素環であり；並びに
R11は，独立してヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，または場合により置換されたヘテロアラルキルである｝を有する。本発明は，本発明の化合物の全ての塩，プロドラッグ及び異性体を含む。
【００１５】
特定の態様において，XはSであり，R1はHであるか，または場合により置換された低級アルキルであり，R2はフェニル，メトキシフェニル，及びベンジルなどの環式基であるか，これを含む。
【００１６】
特定の態様において，XはSであり；あるいはXはOであり；またはXはNR7である。特定の態様において，XはそれぞれS，XはO，及びXはNR7，YはOであり；YはS；R3はシアノ；R3はC(Z)R8；R3はS(O2)NR9R10；R3はS(O2)R11，R3はC(O)NH2であるか，またはR3は低級アルキルである。
【００１７】
特定の態様において，R2は場合により置換された環式基，たとえば炭素環基若しくは複素環基であるか，これを含み，これは芳香族基であってもよい。例としては，シクロペンチル，シクロヘキシル，フェニル，ピロリル，ピリミジルが挙げられ，R2はHであると上記のそれぞれの態様においては，R2は低級アルキルである。さらなる態様では，R2に関する上記選択のそれぞれにおいて，R3はカルボニトリルまたはカルボン酸アルキルエステル，たとえばカルボン酸エチルエステル(たとえば化合物３３に示されているようなもの)である。
【００１８】
特定の態様において，R6は，
【化２８】
2008503446.tif 000004
であり，Z1，Z2，Z3，及びZ4は，-O-，-S-，-CR6a-，-CR6b-，-CR6c-，及び-NR6d-からなる群から独立して選択され；
ここでZ1，Z2，Z3，及びZ4の少なくとも一つはヘテロ原子であり，ここでZ1，Z2，Z3，及びZ4は安定な化合物を形成するように選択され；
R6a，R6b及びR6cは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択されるか；または
R6a，R6b，及びR6cは，Z1，Z2，Z3，及びZ4を含む五員環と組み合わさって，場合により置換された融合複素環系を形成することができる；
R6dは，場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドからなる群から選択され；
但し，R6がチオフェン-2-イルであるとき，R1及びR2は，フェニル，低級アルキル及び低級アルケニルからなる群から選択されず；且つ
R6がフラン-2-イルであるとき，R1及びR2は，場合により置換されたフェニル，及び場合により置換されたフェニルアルキルからなる群から選択されない。
【００１９】
さらなる態様において，R1は，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，アシル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択され；R2，R4及びR5は水素である。
【００２０】
さらなる態様において，場合により置換された複素環は，場合により置換されたシクロヘテロアルキル，たとえば場合により置換されたピロリジンまたはピペリジンである。
【００２１】
特定の態様において，R6は，以下のもの：
【化２９】
2008503446.tif 000005
からなる群から選択され，
R6a，R6b，及びR6cは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；及び
R6dは，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドからなる群から選択され；
但し，R6がチオフェン-2-イルであるとき，R6aは水素でもハロでもない。
【００２２】
さらなる態様において，R6aは，ハロ，場合により置換された低級アルキル，アルコキシ，アルキルチオ，アルキニル，アミノ，アミド，カルボキシル，ヒドロキシ，アリール，置換アリール，アリールオキシ，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミドからなる群から選択される。
【００２３】
さらなる態様において，R6は，以下のもの：
【化３０】
2008503446.tif 000006
からなる群から選択され，
R6a及びR6bは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；但し，R6がチオフェン-2-イルであるとき，R6aは水素でもハロでもない。
【００２４】
特定の態様において，式Ｉの化合物は，構造：
【化３１】
2008503446.tif 000007
を有し，ここでR1は，水素，アシル，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール及び場合により置換されたヘテロアラルキルからなる群から選択され；
R3は，シアノ，ニトロ，-C(Z)R8，-S(O2)NR9R10，-S(O2)R11，及び場合により置換された低級アルキルからなる群から選択され；及び
R6aは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から選択される。
【００２５】
上記化合物のいずれかの特定の態様において，R3は，シアノ，C(O)NH2及び場合により置換された低級アルキルからなる群から選択される。
【００２６】
上記化合物のいずれかの特定の態様において，R1及びR2の少なくとも一つは，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換された複素環，及び場合により置換されたヘテロシクロアルキルからなる群から選択される。さらなる態様において，場合により置換された複素環は，場合により置換されたシクロヘテロアルキルである。上記式の態様は，その全ての塩，プロドラッグ及び異性体を含む。
【００２７】
同様に，式IIの化合物は，以下の構造：
【化３２】
2008503446.tif 000008
を有し，
式中，X＝S，O，NR15であり；
R12は水素，OR16，SR16，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリールまたは場合により置換されたヘテロアラルキルであり；
R13はOR16，SR16，または場合により置換されたアミンであり；
R14はOR16，SR16，場合により置換されたアミン，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，C(Z)R19，C(Z)NR20R21，S(O2)NR20R21，またはS(O2)R22であり；
R15は，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，C(Z)R19，C(Z)NR20R21，S(O2)NR20R21，またはS(O2)R22であり；
R16は，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキル，またはC(Z)R19であり；
R19は，ヒドロキシ，アルコキシ，チオアルコキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，または場合により置換されたヘテロアラルキルであり；
R20及びR21は，独立して水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，場合により置換されたヘテロアラルキルであるか，またはこれらは結合して５〜７員の炭素環若しくは複素環を形成してもよい；
R22は，ヒドロキシ，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，または場合により置換されたヘテロアラルキルであり；
Zは，OまたはSである。
【００２８】
式IIの化合物の特別な態様では，XはSであり，R12は二級アミン，好ましくは場合により置換されたアリール若しくはヘテロアリール基であり，R13は-NH2であり，R14は-C(O)-アリール若しくはC(O)-ヘテロアリールであり，ここで前記アリール若しくはヘテロアリール基は場合により置換されている。さらなる態様では，R12の前記アリールまたはヘテロアリール基は，たとえばハロ（たとえばフルオロ若しくはクロロ）またはハロ置換低級アルキルで一または二置換されており，ここで好ましくは６員環のパラ位置で置換されている。さらなる態様では，前記アリールまたはヘテロアリールは，ハロまたはハロ置換低級アルキルで一または二置換されており，ここで好ましくは６員環のパラ位置で置換されている。
【００２９】
式IIのさらなる態様では，R14はC(O)R19であり；
R19は場合により置換されたシクロアルキルであり；及び
R12は，場合により置換されたアリールアミン，場合により置換されたヘテロアリールアミン，及び場合により置換されたシクロアルキルからなる群から選択され，但し，R12がフェニルアミンであるとき，R19はシクロプロピルではない。
【００３０】
式IIの化合物のさらなる態様では，R14はC(O)R19であり；
R19は，場合により置換されたアリール，場合により置換されたヘテロアリール，または場合により置換されたシクロアルキルであり；及び
R12は場合により置換されたシクロアルキルアミンであり，ここでR12がシクロヘキシルアミンであるとき，R19は場合により置換されたフェニルではない。
【００３１】
特定の態様において，式IIの化合物は，構造：
【化３３】
2008503446.tif 000009
を有する｛式中，Z1，Z2，Z3，及びZ4は，-O-，-S-，-CR19a-，-CR19b-，-CR19c-，及び-NR19d-からなる群から独立して選択され，
ここで，Z1，Z2，Z3，及びZ4の少なくとも一つはヘテロ原子であり；
Z1，Z2，Z3，及びZ4は，安定な化合物を形成するように選択され；
R12aは，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたアリールからなる群から選択され，但し，スルホンアミドはアリール，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，及びスルホニルを置換しなくてもよい；及び
R19a，R19b，及びR19cは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；
ここでR19a，R19b及びR19cの少なくとも一つは，場合により置換されたアリール，場合により置換されたヘテロアリール，またはカルボキシルであるか；あるいは
R19a，R19b，及びR19cは，Z1，Z2，Z3及びZ4を含む五員環と組み合わさって，場合により置換された融合複素環系を形成することができる；並びに
R19dは場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドからなる群から選択される｝。
【００３２】
さらなる態様において，R12aは，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたアリール，及び場合により置換されたヘテロアリールからなる群から選択され，ここでアリールは，アシル，アミン，及びスルホニルアミドで置換されていなくてもよい。
【００３３】
特定の態様において，式IIの化合物は，構造：
【化３４】
2008503446.tif 000010
を有し，式中，R19は，以下の：
【化３５】
2008503446.tif 000011
からなる群から選択され，式中，R19a，R19b及びR19cは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；及び
R19dは場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドである。
【００３４】
さらなる態様において，R19は，以下のものからなる群から選択され：
【化３６】
2008503446.tif 000012
R19aは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；
R19bは，水素及び低級アルキルからなる群から選択され；及び
R19dは，場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，及びスルホンアミドである。
【００３５】
上記構造のさらなる態様において，R19aは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合したハロ，場合により置換された低級アルキル，アルコキシ，アルキルチオ，アルキニル，アミノ，アミド，カルボキシル，ヒドロキシ，場合により置換されたアリール，アリールオキシ，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，及びスルホンアミドから選択される。
【００３６】
特定の態様では，式IIの化合物は，構造：
【化３７】
2008503446.tif 000013
を有し，式中，R12aは，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，及びスルホニルからなる群から選択され；及び
R19aは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から選択される。
【００３７】
特定の態様では，式IIの化合物は，構造：
【化３８】
2008503446.tif 000014
を有し，式中，R12aは，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，及びスルホニルからなる群から選択され；及び
R19aは，アルコキシ，アミノ，カルボキシル，場合により置換されたアリール，及び場合により置換されたヘテロアリールからなる群から選択される。
【００３８】
特定の態様において，式IIの化合物は，構造：
【化３９】
2008503446.tif 000015
を有し，式中，R12aは，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，及び場合により置換されたアリールからなる群から選択され；及び
R19aは，アルコキシ，アミノ，カルボキシル，場合により置換されたアリール，及び場合により置換されたヘテロアリールからなる群から選択される。
【００３９】
特定の態様において，式IIの化合物は，構造：
【化４０】
2008503446.tif 000016
を有し，式中，R12aは，低級アルキル，シクロアルキル，及び場合により置換されたアリールからなる群から選択され；及び
R19aは，アルコキシ，アミノ，カルボキシル，場合により置換されたアリール，及び場合により置換されたヘテロアリールからなる群から選択される。
【００４０】
特定の態様において，式IIの化合物は，構造：
【化４１】
2008503446.tif 000017
を有し，式中，R12aは，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたアリールからなる群から選択され，但し，スルホンアミドは，アリール，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，及びスルホニルを置換しなくてもよい。さらなる態様では，R12aは，場合により置換されたアリールである。さらなる態様では，R12aは，場合により置換されたフェニルである。上記式の態様は，その全ての塩，プロドラッグ及び異性体を含む。
【００４１】
式IIIの化合物は，以下の構造：
【化４２】
2008503446.tif 000018
を有し，式中，
Aは，結合または一連の結合原子，a（式中，ｍは０〜３である）によってNに結合した，アリールまたはヘテロアリールであってもよい，３〜14個の環原子を有する炭素環または複素環である；
R23は，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルであるか，またはA及び/または(a)mと結合して，５〜７員の場合により置換された炭素環若しくは複素環系または，場合により置換されたアリール若しくはヘテロアリールを形成することができる；
R24は，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルである。
【００４２】
特定の態様において，R24上の置換基は，場合により置換された低級アルキル，場合により置換された低級アルケニル，場合により置換された低級アルキニル，場合により置換されたシクロアルキル，場合により置換されたヘテロアルキル，場合により置換されたヘテロシクロアルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換されたアラルキル，場合により置換されたヘテロアリール，及び場合により置換されたヘテロアラルキルであり，ここで任意選択として，これは炭素若しくは酸素若しくは硫黄または場合により置換された窒素を介してR24に結合することができる。
【００４３】
式IIIの化合物の特定の態様において，R24は，場合により置換されたチオフェン環であり；R24は，場合により置換されたフェニル環であり；R24は，場合により置換された炭素環であり；R24は，場合により置換された複素環であり；R24は，場合により置換されたアリール基であり；R24は，場合により置換されたヘテロアリール基であり；R24は，(それ自体置換されていてもよい)５-若しくは6-員の炭素環で置換されたチオフェン環であり；R24は，(それ自体置換されていてもよい)5-若しくは6-員の複素環で置換されたチオフェン環であり；R24は，場合により置換されたピリミジン環で置換されたチオフェン環であり；R24は，アルキルエステル基で置換されたフェニル基であり；R24は，アルコキシ基で置換されたフェニル基である。
【００４４】
上記R24のそれぞれの選択に関する特定の態様では，Aは，場合により置換された炭素環であり；あるいは，Aは場合により置換された複素環であり；あるいは，Aは場合により置換されたアリール基であり；あるいは，Aは場合により置換されたヘテロアリール基であり；あるいは，Aは場合により置換されたインドール基であり；あるいは，Aは場合により置換されたフェニル基であり；あるいは，Aは場合により置換されたキノリン基である。
【００４５】
上記R23のそれぞれの選択に関する特定の態様では，R23はHであり；R23はアルキルであり；R23はメチルであり；R23はエチルであり；R23はプロピルであり；R23は場合により置換された炭素環基であり；R23は場合により置換された複素環基であり；または，R23は，場合により置換されたフェニル基である。
【００４６】
場合により，(a)mは，Sを含み；(a)mはOを含み；(a)mはNを含み；(a)mは炭素鎖を含み；(a)mはアルキレン鎖であり；(a)mは鎖-S-アルキレン-であり；または(a)mは鎖-O-アルキレン-である。
【００４７】
(a)m及び(b)mに関しては，結合した原子の数は，それぞれ式IIIaに示されているように，Nと識別可能な最大部分Aと，または識別可能な最大部分BとSとを結合する最小の原子数である。
【００４８】
特定の態様において，式IIIの化合物で，R24は，-Ar-置換イソプロピルではなく，且つ-(a)m-Aはアリールでもアリールアルキルでもない。特定の態様において，-(a)m-Aは，Ar-置換イソプロピルではない。特定の態様において，式IIIの化合物は，本明細書中，参照として含まれる，LiらのPCT/USOO/06611号，WO00/54759号に記載の化合物ではない。
【００４９】
式IIIの化合物の特定の態様において，本化合物は，式IIIa：
【化４３】
2008503446.tif 000019
の構造を有し，式中，m＝０〜３個の原子であり；
n＝０〜３個の原子であり；
A＝環式基であり；及び
B＝環式基である。
【００５０】
特定の態様において，式IIIの化合物は，構造：
【化４４】
2008503446.tif 000020
を有し，式中，R26a，R26b，R26c，R26d，R26e，及びR26fは，水素，ハロ，低級アルキル，及びアルコキシからなる群から独立して選択される。R24は上記定義の通りである。
【００５１】
さらなる態様において，R24は，場合により置換されたヘテロシクロアルキルで場合により置換されたアリール，場合により置換されたアリールアミノ，場合により置換されたヘテロアリールアミノ，場合により置換されたアリールスルホニル，及び-RNHC(O)R'からなる群から選択され，式中，
Rはアルキレンであり，及び
R'は，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアリール，または場合により置換されたヘテロアリールであるか；または
R24は，場合により置換されたヘテロアリールであり，但し，R24はテトラゾールでもトリアゾロピリミジン環でもない。
【００５２】
特定の態様において，式IIIの化合物は，構造：
【化４５】
2008503446.tif 000021
を有し，式中，nは０または１であり；及び
Z1，Z2，Z3，Z4，及びZ5は，-O-，-S-，-CR24a-，-CR24b-，-CR24c-，-CR24d-，及び-NR24e-からなる群から独立して選択され，式中，
Z1，Z2，Z3，Z4，及びZ5は，安定な化合物を形成するように選択され；
R24a，R24b，R24c，及びR24dは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，場合により置換されたアリール，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，カルボキシル，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，場合により置換されたアルキル，場合により置換されたアルケニル及び場合により置換されたアルキニルからなる群から独立して選択され；及び
R24eは場合により存在し，存在する場合には，水素，場合により置換された低級アルキル，場合により置換されたアリール，場合により置換された複素環，場合により置換されたヘテロアリール，アシル，スルホニル，アミド，チオアミド，またはスルホンアミドである。
【００５３】
さらなる態様において，Z1-Z4を含む環はフェニル，チオフェニル，またはフラニルである。上記式の態様は，その全ての塩，プロドラッグ及び異性体を含む。
【００５４】
式I，II，及びIIIの化合物に関連して，以下の定義を適用する。
【００５５】
"ハロ"及び"ハロゲン"なる用語は，全てのハロゲン類を指し，即ち，クロロ(Cl)，フルオロ(F)，ブロモ(Br)，またはヨード(I)を指す。
【００５６】
"ヒドロキシル"及び"ヒドロキシ"は，基：-OHを指す。
【００５７】
"チオール"及び"メルカプト"なる用語は，基：-SHを指す。
【００５８】
"アルキル"なる用語は，１〜20個，好ましくは１〜15個の炭素原子を含むアルカン-誘導基を指す。アルキルとは，直鎖アルキル，分岐アルキル及びシクロアルキルを含む。直鎖または分岐アルキル基は，１〜15個，好ましくは１〜８個，より好ましくは１〜６個，さらに好ましくは１〜４個，及び最も好ましくは１〜２個の炭素原子を含み，たとえば，メチル，エチル，プロピル，イソプロピル，ブチル，t-ブチルなどが挙げられる。アルキルは，１つ以上のシクロアルキル部分を含むか，これによって中断された直鎖または分岐アルキル基も含む。これらの例としては，4-(イソプロピル)-シクロヘキシルエチルまたは2-メチル-シクロプロピルペンチルが挙げられるが，これらに限定されない。このアルキル基は，任意の利用可能な位置で結合して安定な化合物を形成する。
【００５９】
"置換アルキル"とは，安定な化合物を生成するように任意の利用可能な位置で結合した水素，ハロ，ヒドロキシ，アルコキシ，アルキルチオ，アルキルスルフィニル，アルキルスルホニル，アシルオキシ，アリール，場合により置換されたアリール，アリールオキシ，ヘテロアリールオキシ，アミノ，アミド，アミジノ；アルキル，アリール，ヘテロアリール若しくはヘテロサイクリル基で場合により置換された尿素；アルキル，アリール若しくはヘテロアリール基で場合によりN-一-若しくはN,N-二置換されたアミノスルホニル，アルキルスルホニルアミノ，アリールスルホニルアミノ，ヘテロアリールスルホニルアミノ，アルキルカルボニルアミノ，アリールカルボニルアミノ，ヘテロアリールカルボニルアミノ，アシル，カルボキシル，複素環，置換された複素環，ヘトアリール，場合により置換されたヘトアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルホンアミド，オキソなどの，一つ以上，または１，２若しくは３個の基または置換基で独立して置換されたアルキル基である。
【００６０】
“低級アルキル”とは，１−６個の炭素原子を有するアルキル基を表す。
【００６１】
"置換低級アルキル"は，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で置換されて安定な化合物を生成している低級アルキルである。
【００６２】
"シクロアルキル"とは，１つの環あたり３−８個，より好ましくは３−６個の環メンバーを有する一環，二環または三環系を表し，例えば，シクロプロピル，シクロペンチル，シクロヘキシル，アダマンチルなどがある。
【００６３】
"置換シクロアルキル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，アルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルで独立して置換されて安定な化合物を生成しているシクロアルキルである。
【００６４】
"アルキレン"とは，１−２０個，好ましくは１−１５個の炭素原子を含み，同じ炭素原子から，または異なる炭素原子から２つの水素原子が除かれている，２価のアルカン誘導性ラジカルを表す。アルキレンの例としては，限定されないが，メチレン−ＣＨ2−，エチレン−ＣＨ2ＣＨ2−などが挙げられる。
【００６５】
"置換アルキレン"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成しているアルキレンである。
【００６６】
“低級アルキレン”とは，１−６個の炭素原子を含むアルキレンである。
【００６７】
"置換低級アルキレン"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成している低級アルキレンである。
【００６８】
“アルケニル”とは，２−２０個，好ましくは２−１７個，より好ましくは２−１０個，さらに好ましくは２−８個，最も好ましくは２−４個の炭素原子を含み，少なくとも１つ，好ましくは１−３個，より好ましくは１−２個，最も好ましくは１個の炭素−炭素二重結合を含む直鎖，分枝鎖または環状の炭化水素を表す。シクロアルキル基の場合，２個以上の炭素−炭素二重結合の共役は環に芳香族性を付与しないようなものである。炭素−炭素二重結合は，シクロアルキル部分中に含まれていてもよく（ただしシクロプロピルを除く），または直鎖または分枝鎖部分中に含まれていてもよい。アルケニル基の例としては，限定されないが，エテニル，プロペニル，イソプロペニル，ブテニル，シクロヘキセニル，シクロヘキセニルアルキル等が挙げられる。
【００６９】
"置換アルケニル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成しているアルケニルである。
【００７０】
“アルキニル”とは，２−２０個，好ましくは２−１７個，より好ましくは２−１０個，さらに好ましくは２−８個，最も好ましくは２−４個の炭素原子を含み，少なくとも１つ，好ましくは１つの炭素−炭素三重結合を含む，直鎖または分枝鎖の炭化水素を表す。アルキニル基の例としては，現的されないが，エチニル，プロピニル，ブチニル等が挙げられる。
【００７１】
"置換アルキニル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成しているアルキニルである。
【００７２】
“アルキルアルケニル”とは，基−Ｒa−ＣＲb＝ＣＲcＲdを表し，ここで，Ｒaは低級アルキレンまたは置換低級アルキレンであり，Ｒb，Ｒc，およびＲdは，独立して，水素，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，アシル，アリール，置換アリール，ヘタリール，または置換ヘタリールである。
【００７３】
“アルキルアルキニル”とは，基−ＲaＣ≡ＣＲeを表し，ここで，Ｒaは低級アルキレンまたは置換低級アルキレンだえり，Ｒeは，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アシル，アリール，置換アリール，ヘタリール，または置換ヘタリールである。
【００７４】
“アルコキシ”とは，基−ＯＲfを表し，ここで，Ｒfは，低級アルキル，置換低級アルキル，アシル，アリール，置換アリール，アラルキル，置換アラルキル，ヘテロアルキル，置換ヘテロアルキル，ヘテロアリールアルキル，置換ヘテロアリールアルキル，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロヘテロアルキル，または置換シクロヘテロアルキルである。
【００７５】
“アルキルチオ”または“チオアルコキシ”とは，基−Ｓ−Ｒを表し，ここで，Ｒは，低級アルキル，置換低級アルキル，アシル，アリール，置換アリール，アラルキル，置換アラルキル，ヘテロアルキル，置換ヘテロアルキル，ヘテロアリールアルキル，置換ヘテロアリールアルキル，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，シクロアルキル，置換シクロアルキル，シクロヘテロアルキル，または置換シクロヘテロアルキルである。
【００７６】
“スルフィニル”は基−Ｓ（Ｏ）−を表す。
【００７７】
“スルホニル”は基−Ｓ（Ｏ）2−を表す。
【００７８】
“アルキルスルフィニル”は基−Ｓ（Ｏ）−Ｒyを表し，ここで，Ｒyは，任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいアリール，または任意に置換されていてもよいアラルキルである。
【００７９】
“アルキルスルホニル”は基−Ｓ（Ｏ）2−Ｒyを表し，ここで，Ｒyは任意に置換されていてもよい低級アルキル，任意に置換されていてもよいアリール，または任意に置換されていてもよいアラルキルである。
【００８０】
“アミノスルホニル”とは，基−Ｓ（Ｏ）2−ＮＨＲuを表し，ここで，Ｒuは，結合，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【００８１】
“アルキルアミノスルホニル”とは，基−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲvＲwを表し，ここで，Ｒvは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルであり，Ｒwは，任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【００８２】
“アリールアミノスルホニル”とは，基−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲvＲxを表し，ここで，Ｒvは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルであり，Ｒxは，任意に置換されていてもよいアリール，または任意に置換されていてもよいアラルキルである。
【００８３】
“ヘテロアリールアミノスルホニル”とは，基−Ｓ（Ｏ）2−ＮＲvＲzを表し，ここで，Ｒvは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルであり，Ｒzは，任意に置換されていてもよいヘテロアリール，または任意に置換されていてもよいヘテロアラルキルである。
【００８４】
“アシル”とは，基−Ｃ（Ｏ）Ｒhを表し，ここで，Ｒhは，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール等である。
【００８５】
“アシルオキシ”とは，基−ＯＣ（Ｏ）Ｒhを表し，ここで，Ｒhは，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール等である。
【００８６】
“アリールオキシ”とは，基−ＯＡｒを表し，ここで，Ａｒは，アリール，置換アリール，ヘテロアリール，または置換ヘテロアリール基である。
【００８７】
“ヘテロアリールオキシ”とは，基−ＯＨｅｔを表し，ここで，Ｈｅｔは任意に置換されていてもよいヘテロアリール基である。
【００８８】
“アミノ”または"置換アミン"とは，基−ＮＲiＲjを表し，ここで，ＲiおよびＲjは，独立して，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘタリール，置換ヘテロアリール，アシルまたはスルホニルである。さらに，Ｎ，ＲiおよびＲjは，一緒になって，任意に置換されていてもよい複素環を形成してもよい。
【００８９】
“アミド”とは，基−Ｃ（Ｏ）ＮＲkＲlを表し，ここで，ＲkおよびＲlは，独立して，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，アリール，置換アリール，ヘタリール，または置換ヘテロアリールである。さらに，Ｎ，ＲkおよびＲlは，一緒になって，任意に置換されていてもよい複素環を形成してもよい。
【００９０】
“チオアミド”とは，基−Ｃ（Ｓ）ＮＲkＲlを表し，ここで，ＲkおよびＲlは，独立して，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，アリール，置換アリール，ヘタリール，または置換ヘテロアリールである。
【００９１】
“スルホンアミド(sulfonamido)”および"スルホンアミド(sulfonamide)"および"スルファミド"とは，基−Ｓ（Ｏ）2ＮＲkＲlを表し，ここで，ＲkおよびＲlは，独立して，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，シクロアルキル，置換シクロアルキル，アリール，置換アリール，ヘタリール，または置換ヘテロアリールである。
【００９２】
“アミジノ”とは，基−Ｃ（＝ＮＲm）ＮＲnＲoを表し，ここで，Ｒm，Ｒn，およびＲoは，独立して，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【００９３】
“スルホニルアミノ”とは，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2−を表し，ここで，Ｒqは，水素または任意に置換されていてもよい低級アルキルである。
【００９４】
“アルキルスルホニルアミノ”とは，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒpを表し，ここで，Ｒpは，任意に置換されていてもよいアルキルであり，Ｒqは，水素または低級アルキルである。
【００９５】
“アリールスルホニルアミノ”とは，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒsを表し，ここで，Ｒsは，任意に置換されていてもよいアリールであり，Ｒqは，水素または低級アルキルである。
【００９６】
“ヘテロアリールスルホニルアミノ”とは，基−ＮＲqＳ（Ｏ）2Ｒtを表し，ここで，Ｒtは，任意に置換されていてもよいヘテロアリールであり，Ｒqは，水素または低級アルキルである。
【００９７】
“アルキルカルボニルアミノ”とは，基−ＮＲqＣ（Ｏ）2Ｒpを表し，ここで，Ｒpは任意に置換されていてもよいアルキルであり，Ｒqは，水素または低級アルキルである。
【００９８】
“アリールカルボニルアミノ”とは，基−ＮＲqＣ（Ｏ）2Ｒsを表し，ここで，Ｒsは任意に置換されていてもよいアリールであり，Ｒqは，水素または低級アルキルである。
【００９９】
“ヘテロアリールカルボニルアミノ”とは，基−ＮＲqＣ（Ｏ）2Ｒtを表し，ここで，Ｒtは任意に置換されていてもよいアリールであり，Ｒqは，水素または低級アルキルである。
【０１００】
“カルボキシル”とは，基−Ｃ（Ｏ）ＯＲrを表し，ここで，Ｒrは，水素，低級アルキル，置換低級アルキル，アリール，置換アリール，ヘタリール，または置換ヘタリールである。
【０１０１】
“アリール”とは，フェニルまたはナフチルを意味し，好ましくは５−７員環，より好ましくは５−６員環のシクロアルキルと縮合していてもよい。
【０１０２】
"置換アリール”とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，任意に置換されていてもよいアルキニル，任意に置換されていてもよい複素環，または任意に置換されていてもよいヘテロアリールで独立して置換されて安定な化合物を生成しているアリールである。
【０１０３】
“炭素環”とは，連結した炭素原子から構成される単環または複数の縮合した環を有する，飽和，不飽和，または芳香族性の基を意味する。環は，例えば，ハロゲン，低級アルキル，アルコキシ，アルキルチオ，アセチレン，アミノ，アミド，カルボキシル，ヒドロキシル，アリール，アリールオキシ，複素環，ヘタリール，置換ヘタリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルファミド等で置換されていてもされていなくてもよい。
【０１０４】
“複素環”とは，単環（例えば，モルホリノ，ピリジルまたはフリル），または複数の縮合環（例えば，ナフトピリジル，キノキサリル，キノリニル，インドリジニルまたはベンゾ［ｂ］チエニル）を有し，環の中，または複数の縮合環の１またはそれ以上の中に１またはそれ以上の，例えば１個のＮ，ＯまたはＳ等の複素原子を有する，飽和，不飽和，または芳香族性の炭素環基を意味する。
【０１０５】
"置換複素環”とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルで置換されて安定な化合物を生成している複素環である。
【０１０６】
"オキソ”とは，結合した炭素に二重結合している酸素置換基を表す。
【０１０７】
“ヘテロアリール”および"ヘタリール"とは，Ｏ，Ｓ，およびＮからなる群より独立して選択される１またはそれ以上の，好ましくは１−４個，より好ましくは１−３個，さらに好ましくは１−２個の複素原子を含み，５または６個の環原子を含む単環芳香族性環構造または８−１０個の原子を有する二環芳香族基を表す。ヘテロアリールはまた，酸化されたＳまたはＮ，例えば，スルフィニル，スルホニルおよび３級環窒素のＮオキシドを含むことが意図される。炭素または窒素原子は，安定な芳香族環が保持されるような，ヘテロアリール環構造の結合点である。ヘテロアリール基の例としては，ピリジニル，ピリダジニル，ピラジニル，キナゾリニル，プリニル，インドリル，キノリニル，ピリミジニル，ピロリル，オキサゾリル，チアゾリル，チエニル，イソオキサゾリル，オキサチアジアゾリル，イソチアゾリル，テトラゾリル，イミダゾリル，トリアジニル，フラニル，ベンゾフリル，インドリル等が挙げられる。
【０１０８】
"置換ヘテロアリール”および"置換ヘタリール"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルで独立して置換されて安定な化合物を生成しているヘテロアリールを表す。
【０１０９】
“ヘテロシクリル”とは，５−１０個の原子を有し，このうち環中の１−３個の炭素原子は複素原子，例えば，Ｏ，ＳまたはＮで置き換えられている非芳香族性のシクロアルキル基を意味し，これはベンゾ縮合または５−６員環の縮合ヘテロアリールであってもよく，および／またはシクロアルキルの場合と同様に任意に置換されていてもよい。ヘテロシクリルはまた，酸化されたＳまたはＮ，例えば，スルフィニル，スルホニルおよび３級環窒素のＮオキシドを含むことが意図される。結合点は炭素または窒素原子である。ヘテロシクリル基の例は，テトラヒドロフラニル，ジヒドロピリジニル，ピペリジニル，ピロリジニル，ピペラジニル，ジヒドロベンゾフリル，ジヒドロインドリル等である。
【０１１０】
"置換ヘテロシクリル"とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基，任意に置換されていてもよいアルキル，任意に置換されていてもよいアルケニル，または任意に置換されていてもよいアルキニルで独立して置換されて安定な化合物を生成しているヘテロシクリルである。
【０１１１】
“アラルキル”とは，基−Ｒ−Ａｒを表し，ここで，Ａｒは，アリール基であり，Ｒは，低級アルキレンまたは置換低級アルキレン基である。アラルキルのアリール官能基は，例えば，ハロゲン，低級アルキル，アルコキシ，アルキルチオ，アセチレン，アミノ，アミド，カルボキシル，ヒドロキシル，アリール，アリールオキシ，複素環，置換複素環，ヘタリール，置換ヘタリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルファミド等で置換されていてもされていなくてもよい。
【０１１２】
“ヘテロアルキル”および"ヘテロシクロアルキル"とは，基−Ｒ−Ｈｅｔを表し，ここで，Ｈｅｔは複素環基であり，Ｒは低級アルキレンまたは置換低級アルキレン基である。ヘテロアルキル基は，例えば，ハロゲン，低級アルキル，アルコキシ，アルキルチオ，アセチレン，アミノ，アミド，カルボキシル，アリール，アリールオキシ，複素環，置換複素環，ヘタリール，置換ヘタリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルファミド等で置換されていてもされていなくてもよい。
【０１１３】
“ヘテロアリールアルキル”および"ヘテロアラルキル"とは，基−Ｒ−ＨｅｔＡｒを表し，ここで，ＨｅｔＡｒはヘテロアリール基であり，Ｒは低級アルキレンまたは置換低級アルキレンである。ヘテロアリールアルキルおよびヘテロアラルキル基は，例えば，ハロゲン，低級アルキル，置換低級アルキル，アルコキシ，アルキルチオ，アセチレン，アリール，アリールオキシ，複素環，置換複素環，ヘタリール，置換ヘタリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルファミド等で置換されていてもされていなくてもよい。
【０１１４】
“シクロヘテロアルキル”とは，環炭素原子の１またはそれ以上が複素原子（例えば，Ｎ，Ｏ，ＳまたはＰ）で置き換えられているシクロアルキル基を表す。
【０１１５】
"置換シクロヘテロアルキル”とは，任意の部位に結合した，置換アルキルの定義の段落において定義される１またはそれ以上，例えば，１，２，または３個の基または置換基で独立して置換されて安定な化合物を生成しているシクロヘテロアルキルである。
【０１１６】
“アルキルシクロアルキル”とは，基−Ｒ−ｃｙｃｌｏａｌｋを意味し，ここで，ｃｙｃｌｏａｌｋはシクロアルキル基であり，Ｒは，低級アルキレンまたは置換低級アルキレンである。アルキルシクロアルキル基のシクロアルキル官能基は，例えば，ハロゲン，低級アルキル，アルコキシ，アルキルチオ，アセチレン，アミノ，アミド，カルボキシル，ヒドロキシル，アリール，アリールオキシ，複素環，置換複素環，ヘタリール，置換ヘタリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルファミド等で置換されていてもされていなくてもよい。
【０１１７】
“アルキルシクロヘテロアルキル”とは，基−Ｒ−ｃｙｃｌｏｈｅｔｅｒｏａｌｋを意味し，ここで，ｃｙｃｌｏｈｅｔｅｒｏａｌｋは，シクロヘテロアルキル基であり，Ｒは低級アルキレンまたは置換低級アルキレンである。アルキルシクロヘテロアルキル基のシクロヘテロアルキル官能基は，例えば，ハロゲン，低級アルキル，アルコキシ，アルキルチオ，アミノ，アミド，カルボキシル，アセチレン，ヒドロキシル，アリール，アリールオキシ，複素環，置換複素環，ヘテロアリール，置換ヘテロアリール，ニトロ，シアノ，チオール，スルファミド等で置換されていてもされていなくてもよい。
【０１１８】
すなわち，第１の観点においては，本発明は，本明細書に記載される式ＩまたはＩＩまたは式ＩＩＩの新規化合物に関する。特に示さない限り，特定の化合物を参照する場合には，すべての異性体形，例えば，これらのラセミ体他の混合物が含まれる。そのような異性体形の製造（例えば，不斉合成）および分離（例えば，機能的結晶化およびクロマトグラフィー手段）は，当該技術分野において知られているか，または本明細書に教示される方法を既知の方法で適用することにより容易に得ることができる。異性体の文脈において以下に説明されるように，不飽和のために異性体が許容される場合，例えば，シスおよびトランス，ＥおよびＺ等，およびこれらの組み合わせが許容される場合には，特に記載しない限り，１つの異性体を参照する場合にはすべてのそのような異性体が参照されていると考えられる点に注意すべきである。特に記載しない限り，特定の化合物を参照する場合には，これらのイオン，塩，溶媒和物（例えば水和物），保護された形，およびプロドラッグ，例えば以下に説明されるものも含まれる。
【０１１９】
本発明の追加の観点は，治療上有効量の式ＩまたはＩＩまたはＩＩＩの化合物（またはこれらの一般式のいずれかの化合物のサブグループに属する化合物）および少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体または賦形剤を含む医薬製剤に関する。
【０１２０】
特定の態様においては，組成物は，複数の異なる薬学的に活性な化合物を含み，これは，式Ｉおよび／またはＩＩおよび／またはＩＩＩの複数の化合物であってもよく，式Ｉおよび／またはＩＩおよび／またはＩＩＩの１またはそれ以上の化合物との組み合わせで他の化合物を含んでいてもよい。
【０１２１】
本発明の関連する観点は，式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物および少なくとも１つの薬学的に許容しうる担体，賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物に関する。本発明の組成物は，複数の異なる薬学的に活性な化合物を含むことができる。
【０１２２】
別の関連する観点においては，式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物を，ＰＤＥ４Ｂ媒介性疾病または状態の治療用の医薬品の製造において用いることができる。
【０１２３】
別の観点においては，本発明は，哺乳動物に治療上有効量の式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物，そのような化合物のプロドラッグ，またはそのような化合物またはプロドラッグの薬学的に許容しうる塩を投与することにより，哺乳動物において疾病または状態を治療または予防する方法に関する。化合物は単独で投与してもよく，組成物の一部として投与してもよい。本明細書において用いる場合，"プロドラッグ"との用語は，代謝されたときに所望の活性な化合物を与える化合物を表す。典型的には，プロドラッグは不活性であるかまたは活性化合物より低い活性を有するが，取り扱い，投与，または代謝特性において利点を与えることができる。例えば，あるプロドラッグは活性化合物のエステルであり；代謝の間にエステル基が切断されて活性な薬剤が生ずる。また，あるプロドラッグは酵素的に活性化されて，活性な化合物またはさらなる化学反応により活性な化合物となる化合物を生ずる。
【０１２４】
すなわち，さらに別の観点においては，本発明は，動物の患者，例えば，ヒトなどの哺乳動物において，ＰＤＥＢ４媒介性疾病または状態，例えば，異常なＰＤＥ４Ｂ活性により特徴づけられる疾病または状態を治療する方法に関する。本発明の方法は，有効量の式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物または式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物を含む組成物を，これを必要とする患者に投与することを含む。本明細書において用いる場合，"有効量の”化合物または組成物には，その意味の中に，毒性がなく，言及される特定の化合物または組成物が所望の治療効果を与えるのに十分な量を含む。
【０１２５】
本明細書において用いる場合，ＰＤＥ４Ｂ媒介性疾病または状態との用語は，ＰＤＥ４Ｂの生物学的機能が疾病または状態の発達および／または経過に影響を与えるか，および／またはＰＤＥ４Ｂの調節がその発達，経過，および／または症状を変化させる疾病または状態を表す。
【０１２６】
疾病または状態の治療または予防を含む観点および態様においては，疾病または状態としては，例えば，限定されないが，急性または慢性の肺疾病，例えば閉塞性疾病（例えば，喘息，慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ），嚢胞性線維症），間質性肺疾患（例えば，特発性肺線維症，サルコイドーシス），血管肺疾病（例えば，肺高血圧），気管支炎，アレルギー性気管支炎，および気腫が挙げられる。本発明の態様により治療が意図される別の疾病または状態としては，例えば，限定されないが，ＣＮＳ疾病，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病およびハンティングトン舞踏病；炎症性自己免疫疾患，例えば多発性硬化症，慢性関節リウマチおよびクローン病，ならびに他の炎症性疾患，例えば，脳虚血，炎症性大腸疾患，および潰瘍性大腸炎；骨疾病，例えば，骨粗鬆症，大理石骨病，およびパジェット病；癌，例えば，散在性大細胞Ｂ細胞リンパ腫，慢性リンパ性白血病，急性リンパ芽球性白血病；重症急性呼吸器症候群；および早期陣痛が挙げられる。
【０１２７】
ＰＤＥ４Ｂに対して活性な式Ｉ，式ＩＩ，および式ＩＩＩの化合物を同定することはまた，ＰＤＥ４Ｂに対して活性な式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩの複数の試験化合物のいずれかがＰＤＥ４Ｂに対して活性な参照化合物と比較して１またはそれ以上の所望の薬理学的特性の改良を与えるか否かを判定し，所望の薬理学的特性の改良を有する化合物が存在すればこれを選択し，このことにより改良された調節剤を与えることにより，ＰＤＥ４Ｂに対して活性な別の化合物，例えば改良された調節剤を同定または開発する方法を提供する。
【０１２８】
調節剤開発という特定の観点においては，所望の薬理学的特性は，２時間より長いか４時間より長いか８時間より長い血清半減期，水溶性，１０％より高い経口生物学的利用能，２０％より高い経口生物学的利用能である。
【０１２９】
また，調節剤開発という特定の観点では，参照化合物は式Ｉまたは式IIまたは式IIIの化合物である。このプロセスは複数回，すなわち，複数ラウンドの誘導体の調製および／またはさらなる関連化合物の選択およびこのような関連化合物のさらなる誘導体の評価を，例えば，１，２，３，４，５，６，７，８，９，１０回またはそれよい多くのラウンドで反復してもよい。
【０１３０】
別の観点においては，ＰＤＥ４Ｂに関する構造情報を種々の目的に，例えばＰＤＥ４Ｂ活性の調節剤の設計に利用することができる。さらに，本発明は，ＰＤＥ４Ｂに関する構造情報を，式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物，または式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩの分子スキャフォールドまたはスキャフォールドコアと組み合わせて，ＰＤＥ４Ｂ活性の調節剤の設計に用いる方法を提供する。さらに，１またはそれ以上の他のＰＤＥ，例えば，ＰＤＥ５Ａ，ＰＤＥ４Ｄに関する構造情報を，ＰＤＥ４Ｂ活性の調節剤の設計において利用することができる。
【０１３１】
本発明はまた，ＰＤＥ４Ｂに結合するリガンドを開発する方法を提供し，本方法は分子スキャフォールドとして，ＰＤＥの結合部位と結合する１種以上の化合物を同定すること，ＰＤＥまたは代替物との共結晶中での少なくとも１種の分子スキャフォールドの配向を決定すること，修飾されている場合には，分子スキャフォールドとＰＤＥ間の結合親和性または結合特異性またはその双方を変更する，１種以上の分子スキャフォールドの化学構造を同定すること，および分子スキャフォールドの１種以上の化学構造が，変更された結合親和性または結合特異性またはその双方でＰＤＥと結合するリガンドを提供するよう修飾されているリガンドを合成することを含む。このようなスキャフォールドは例えば式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩの化合物であり得るか，式Ｉまたは式ＩＩまたは式ＩＩＩのコアを含み得る。
【０１３２】
“ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ”および“ＰＤＥ４Ｂ”との用語は，同じ長さのセグメントにわたる最大アラインメントについて，天然のＰＤＥ４Ｂ（配列番号１）のＧｅｎＢａｎｋポリペプチド配列ＪＣ１５１９を参照してアミノ酸残基１５２−５２８（Ｓ１５２−Ｓ５２８）と９０％より高いアミノ酸配列同一性を有する部分を含むか，または，天然のＰＤＥ４ＢのＪＣ１５１９のアミノ酸残基１５２−５２８からの少なくとも２００個の連続するアミノ酸と９０％より高いアミノ酸配列同一性を有する部分を含み，天然のＰＤＥ４Ｂリガンドへの結合を保持している，酵素的に活性なホスホジエステラーゼを意味する。好ましくは，配列同一性は少なくとも９５，９７，９８，９９％，またはさらに１００％である。好ましくは，特定される配列同一性のレベルは，少なくとも３００個の連続するアミノ酸残基の長さの配列にわたる。ＪＣ１５１９のアミノ酸残基１５２−５２８で特定される配列はまた，ＮＰ＿００２５９１（ＮＭ＿００２６００によりコードされる，配列番号２）のＳ３２４−Ｓ７００，ＡＡＢ９６３８１（配列番号３）のＳ３０９−Ｓ６８５，およびＡＡＡ３５６４３（配列番号４）のＳ１９４−Ｓ５７０としても入手可能である。したがって，挙げられる配列の１つにより同定されるアミノ酸残基もまた，挙げられる配列のいずれか別のものまたは他のマッチした配列においてマッチしたアミノ酸残基として表現することができる。
【０１３３】
用語「ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメイン」とは，ＰＤＥ４Ｂ中のホスホジエステラーゼ触媒領域を含む，長さの短いＰＤＥ４Ｂ（すなわち，全長ＰＤＥ４Ｂよりも少なくとも１００アミノ酸短い）を指す。本発明において使用するためには，ホスホジエステラーゼドメインがホスホジエステラーゼ活性を保持していることが極めて好ましく，天然ＰＤＥ４Ｂと比較して少なくとも５０％レベルのホスホジエステラーゼ活性が好ましく，天然活性の少なくとも６０，７０，８０，９０または１００％がより好ましい。
【０１３４】
本明細書において，用語「リガンド」および「調節剤」とは，同等に用いられて，標的生体分子，例えばキナーゼまたはホスホジエステラーゼなどの酵素の活性をアップレギュレートまたはダウンレギュレートする化合物を指す。一般に，リガンドまたは調節剤は小分子であり，「小分子」とは，分子量１５００ダルトン以下，好ましくは１０００ダルトン以下，８００ダルトン以下，または６００ダルトン以下の化合物を指す。したがって，「改良されたリガンド」とは，参照化合物より良好な薬理学的および／または薬物動態学的特性を有するものであり，「良好な」とは特定の生物系または治療的使用に関して定義され得る。スキャフォールドからのリガンドの開発という点では，リガンドはスキャフォールドの誘導体である。
【０１３５】
本明細書において用いる場合，用語「調節すること」または「調節する」とは，生物学的活性，特にＰＤＥ４Ｂ等の特定の生物分子に関連する生物学的活性を変更させる効果を表す。例えば，特定の生物分子のアゴニストまたはアンタゴニストは，その生物分子，例えば酵素の活性を調節する。
【０１３６】
結合化合物，分子スキャフォールドおよびリガンドの関連では，用語「誘導体」または「誘導化合物」とは，親または参照化合物と共通のコア化学構造を含むが，少なくとも１つの構造上の相違を有することによって，例えば１個以上の置換基が付加されている，かつ／または除去されている，かつ／または置換されていることで，ならびに／あるいは１個以上の原子が異なる原子で置換されていることで異なる化学構造を有する化合物を指す。明確に別に指示しない限りは，用語「誘導体」は，親化合物を出発物質として，または中間体として用いて合成された誘導体を意味しないが，誘導体が親から合成され得る場合もある。
【０１３７】
したがって，用語「親化合物」とは，誘導化合物において維持されている構造上の特徴を有する，別の化合物にとっての参照化合物を指す。必ずしもそうではないが，親化合物が誘導体よりも単純な化学構造を有することが多い。
【０１３８】
「化学構造」または「化学基礎構造」とは，分子の一部を構成する，いずれかの定義可能な原子または原子の群を意味する。通常，スキャフォールドまたはリガンドの化学基礎構造は，スキャフォールドまたはリガンドの標的分子との結合において役割を有し得るか，スキャフォールドまたはリガンドの三次元形状，帯電および／または配座特性に影響を及ぼし得る。
【０１３９】
「標的分子」との用語は，リガンド，例えばＰＤＥ４Ｂ等のホスホジエステラーゼと結合するタンパク質を包含する。
【０１４０】
標的と，潜在的結合化合物間の相互作用に関連して，用語「結合する」とは，潜在的結合化合物が，標的と，一般的なタンパク質との会合（すなわち，非特異的結合）と比較して統計学的に有意な程度に会合することを示す。したがって，用語「結合化合物」とは，標的分子と統計学的に有意な会合を有する化合物を指す。結合化合物は特定の標的と１ｍＭ以下の解離定数（ｋd）で相互作用することが好ましい。結合化合物は，本明細書に記載されるような「低い親和性」，「極めて低い親和性」，「極端に低い親和性」，「中程度の親和性」，「中程度に高い親和性」または「高い親和性」で結合し得る。
【０１４１】
標的と結合する化合物に関連して，用語「より高い親和性」とは，化合物が参照化合物よりも，または参照条件における，すなわち，より低い解離定数での同一化合物よりも強固に結合することを示す。特定の実施形態では，より高い親和性とは，少なくとも２，３，４，５，８，１０，５０，１００，２００，４００，５００，１０００または１０，０００倍高い親和性である。
【０１４２】
また，生体分子標的と結合する化合物に関連して，用語「より高い特異性」とは，化合物が，適切な結合条件下で存在し得る別の生体分子または複数の生体分子とよりも特定の標的とより高い程度で結合することを示し，ここでこのような他の生体分子との結合によって特定の標的との結合とは異なる生物活性が生じることを示す。通常，特異性はその他の生体分子の限定されたセット，例えば，ＰＤＥ４Ｂの場合には，その他のホスホジエステラーゼ（例えばＰＤＥ４Ｄ）またはさらにその他の種類の酵素に対するものである。特定の実施形態では，より高い特異性とは，少なくとも２，３，４，５，８，１０，５０，１００，２００，４００，５００または１０００倍高い特異性である。
【０１４３】
化合物の標的との結合に関連して，用語「相互作用する」とは，結合している化合物から特定のアミノ酸残基までの距離が５．０オングストローム以下となることを示す。特定の実施形態では，化合物から特定のアミノ酸残基までの距離は４．５オングストローム以下，４．０オングストローム以下，または３．５オングストローム以下である。このような距離は，例えば，共結晶学を用いて求めることができ，または活性部位における化合物のコンピュータフィッティングを用いて推定することができる。
【０１４４】
ポリペプチド残基番号によるＰＤＥ４Ｂの特定のアミノ酸残基の参照は，ＮＣＢＩタンパク質配列受託番号ＪＣ１５１９（例えば，ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（９），６４７０−６４７６（１９９３）；Ｏｂｅｒｎｏｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １２９（２），２３９−２４７（１９９３）；およびＢｏｌｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３（１０），６５５８−６５７１（１９９３）に記載される）に対応する番号付けにより規定される。上述したように，他のマッチしたＰＤＥ４Ｂ配列からの別の番号付けを用いることもできる。
【０１４５】
関連する観点においては，本発明は，ＰＤＥ４Ｂに特異的なリガンドを開発する方法を提供し，この方法は，複数のホスホジエステラーゼに結合する化合物の誘導体が，この特定のホスホジエステラーゼに対して，親化合物が他のホスホジエステラーゼに対して有するより高い特異性を有するか否かを判定することを含む。
【０１４６】
本明細書において，結合化合物またはリガンドに関連して使用されるとき，用語「ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼに特異的」，「ＰＤＥ４Ｂに特異的」および同様の意味の用語は，特定の化合物がＰＤＥ４Ｂと，特定の生物中に存在し得るその他のホスホジエステラーゼとよりも統計学的により高い程度に結合することを意味する。また，結合以外の生物活性が示される場合には，用語「ＰＤＥ４Ｂに特異的」とは，特定の化合物が他のホスホジエステラーゼとよりもＰＤＥ４Ｂと結合することと関連して，高い生物活性を有することを示す。特異性はまた，生物に由来して存在し得るその他の生体分子（ホスホジエステラーゼに限定しない）に関しても同様であることが好ましい。
【０１４７】
もう１つの態様では，本発明は，ＰＤＥ４Ｂと結合する，改良リガンドを得る方法を提供する。この方法はその特定のPDEと結合する化合物を同定すること，その化合物が１個以上の保存された活性部位残基と相互作用するかどうかを調べること，およびその化合物の誘導体がそのPDEと，親の結合化合物よりも高い親和性でまたはより高い特異性でまたはその双方で結合するかどうかを調べることを含む。親化合物よりも高い親和性または高い特異性または双方での結合は，誘導体が改良リガンドであることを示す。また，このプロセスを，選択および誘導体化という連続ラウンドで，かつ／または複数の親化合物を用いて実施し，リガンド特性の改良された化合物または複数の化合物を提供することができる。同様に，誘導化合物を調べ，そのPDEに対して高選択性を示すよう，または標的の特定のセットに対して，例えばＰＤＥ４Ｂおよび／またはＰＤＥ４Ｄを含むホスホジエステラーゼのサブセットに対して交差反応性を示すよう選択することができる。特定の実施形態では，既知のＰＤＥ４Ｂ阻害剤を使用でき，より高い親和性および／またはより高い特異性を有する誘導体を開発することができ，ＰＤＥ４Ｂおよび／またはＰＤＥ４Ｄ構造情報を用いて，ＰＤＥ４Ｄと比べ，ＰＤＥ４Ｂに対してより高い特異性が開発されることが好ましい。
【０１４８】
「分子スキャフォールド」または「スキャフォールド」とは，共通構造要素を含む複数の分子を形成するよう，１以上のさらなる化学部分を共有結合，修飾，排除させることができる，簡単な標的結合分子を意味する。このような部分としては，それだけには限らないが，ハロゲン原子，ヒドロキシル基，メチル基，ニトロ基，カルボキシル基，またはそれだけには限らないが，本願に列挙されたものを含むいずれかのその他の種類の分子基が挙げられる。分子スキャフォールドは少なくとも１種の標的分子と，好ましくはタンパク質ファミリー中の複数の分子と結合し，標的分子は酵素，受容体またはその他のタンパク質であることが好ましい。スキャフォールドの好ましい特性としては，スキャフォールド上の１以上の置換基が標的分子結合部位中の結合ポケット中に位置するような標的分子結合部位での結合；特に合成反応によって化学修飾でき，その結果コンビナトリアルライブラリーを容易に構築できる，化学的に扱いやすい構造を有すること；スキャフォールドとタンパク質結合部位との結合を妨害しない部分を結合でき，その結果スキャフォールドまたはライブラリーメンバーを，リガンドを形成し，さらなる所望の特性を達成するよう修飾できる，例えばリガンドが細胞および／または指定の器官に活性に輸送されるようにできる，またはさらなる分析のためにリガンドがクロマトグラフィーカラムに結合されるようにできる，化学位置を有することを挙げることができる。したがって，分子スキャフォールドは，結合親和性および／または特異性，またはその他の薬理学的特性を改良するための修飾に先立って同定された標的結合分子である。
【０１４９】
用語「スキャフォールドコア」とは，種々の置換基を結合できる，分子スキャフォールドの基礎をなす化学構造を指す。したがって，特定の化学的分類のいくつかのスキャフォールド分子については，スキャフォールドコアはすべてのスキャフォールド分子に共通している。多くの場合，スキャフォールドコアは１以上の環構造を含む。
【０１５０】
式Ｉについては，スキャフォールドコアは，５員環，２つのアミノ窒素，および−Ｃ＝Ｙ基を含み，特に，式ＩのスキャフォールドコアＹのそれぞれの選択と組み合わせたＸのそれぞれの選択により記述される。
【０１５１】
式ＩＩについては，スキャフォールドコアは，Ｒ13およびＲ14を有する５員環を含む。特に，式ＩＩのスキャフォールドコアは，５員環に結合したＲ13原子についてのＯ，Ｓ，またはＮのそれぞれの選択，および５員環に結合したＲ14原子についてのＯ，Ｓ，Ｎ，Ｃのそれぞれの選択と組み合わせたＸのそれぞれの選択により記述される。
【０１５２】
式ＩＩＩについては，スキャフォールドコアは，スルホンアミド成分を含み；ある態様においては，スキャフォールドコアは５員環，例えばチオフェン環（例えば，環イオウに隣接したＣに結合）に結合したイオウを有するスルホンアミド成分を含む。
【０１５３】
「結合部位」とは，リガンドが非共有結合できる，標的分子の領域を意味する。結合部位は特定の形を具現しており，結合部位内に存在する複数の結合ポケットを含むことが多い。特定の形は分子の分類，例えば分子ファミリー内で保存されていることが多い。ある分類内の結合部位はまた，保存された構造，例えば，化学部分，結合ポケットの存在および／または結合部位または結合部位のある部分での帯電などを含む場合があり，そのすべてが結合部位の形に影響を及ぼし得る。
【０１５４】
「結合ポケット」とは，結合部位内の具体的な容積を意味する。結合ポケットは，しばしば結合部位中の特定の形，窪み，または空洞であり得る。結合ポケットは，別の分子の非共有結合において重要である，特定の化学基または構造，例えば分子間のイオン性，水素結合またはファンデルワールス相互作用に寄与する基などを含み得る。
【０１５５】
標的分子に結合している結合化合物に関連して「配向」とは，結合ポケットおよび／または少なくとも部分的に結合ポケットを決定づける標的分子の原子に対する，結合化合物（少なくともその構成原子のいくつかを参照して定義できる）の空間的関係を意味する。
【０１５６】
本発明における標的分子の関連では，用語「結晶」とは，Ｘ線結晶学にとって適した種類の標的分子の規則正しい集合を指す。すなわち，Ｘ線のビームで照射されると，集合からＸ線回析パターンが生じる。したがって，結晶は，回析パターンを生じない標的分子の集塊またはその他の複合体とは区別される。
【０１５７】
「共結晶」とは，標的分子と非共有結合しており，Ｘ線またはタンパク質結晶学による解析にとって適当な結晶形で存在している，化合物，分子スキャフォールドまたはリガンドの複合体を意味する。好ましい実施形態では，標的分子−リガンド複合体はタンパク質−リガンド複合体であり得る。
【０１５８】
語句「結合親和性または結合特異性を変更する」とはそれぞれ，第１の化合物のもう１つのものに対する結合定数を変化させること，または第１の化合物の第２の化合物に対する結合レベルを，第１の化合物の第３の化合物に対する結合レベルと比較して変化させることを指す。例えば，特定のタンパク質に対する化合物の結合特異性は，その特定のタンパク質との結合の相対レベルが，化合物の無関係のタンパク質との結合と比較して増加する場合に増加する。
【０１５９】
本明細書において試験化合物，結合化合物および調節剤（リガンド）に関連して，用語「合成すること」および同様の用語は，１種以上の前駆体物質からの化学合成を意味する。
【０１６０】
語句「分子スキャフォールドの化学構造が修飾される」とは，誘導分子が，分子スキャフォールドのものとは異なるが依然として共通コア化学構造上の特徴を含む化学構造を有することを意味する。この語句は，誘導体の合成の前駆体として分子スキャフォールドが用いられることを必ずしも意味するわけではない。
【０１６１】
「アッセイすること」とは，実験条件の作製および実験条件の特定の結果に関するデータの収集を意味する。例えば，酵素は，検出可能な基質に対して作用するその能力に基づいてアッセイできる。化合物またはリガンドは，特定の標的分子または複数の分子と結合するその能力に基づいてアッセイできる。
【０１６２】
化合物の「セット」とは，化合物を集めたもの意味する。化合物は構造上関連があるものでも，ないものでもあり得る。
【０１６３】
もう１つの態様では，ＰＤＥ４Ｂに関する構造情報はまた，ＰＤＥ４Ｂ構造の電子表示から相同モデルを作製することによって，別のホスホジエステラーゼの構造の決定を補助するために使用できる。
【０１６４】
通常，このような相同モデルの作製は，既知構造を有する既知ＰＤＥ，例えばＰＤＥ４Ｂと，注目する他のホスホジエステラーゼ間で保存されたアミノ酸残基を同定すること，既知構造中の複数の保存されたアミノ酸の原子座標を，その他のホスホジエステラーゼの対応するアミノ酸に移してそのホスホジエステラーゼの概構造を提供すること，およびその他のホスホジエステラーゼ中の残りのアミノ酸残基の構造の電子表示を用いてその他のホスホジエステラーゼの残り部分を表す構造を構築することを含む。詳しくは，ＰＤＥ４Ｂについては，米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願，すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１からの座標を使用することができる。結合部位中の保存された残基を使用できる。
【０１６５】
ホスホジエステラーゼ構造のその他のタンパク質の開発を補助するために，相同モデルも利用できる，すなわち，保存された残基の結合を補助するために，および／またはポリペプチドの末端部分の座標をより良好に特定するために，１種以上のホスホジエステラーゼの結晶から得た低分解能Ｘ線回析データとフィティングすることができる。
【０１６６】
用いるＰＤＥ４Ｂ構造情報は，全長野生型，天然変異体（例えば，対立遺伝子多型およびスプライスバリアント），野生型または天然変異体の末端切断型変異体および全長もしくは末端切断型野生型もしくは天然変異体の突然変異体（１以上の部位で突然変異している場合もある）をはじめとする種々の異なる変異体のためのものであり得る。例えば，種々の他のホスホジエステラーゼ構造と近いＰＤＥ４Ｂ構造を与えるためには，結合部位中の保存された残基に変異を含む変異ＰＤＥ４Ｂを用いることができる。
【０１６７】
別の観点においては，本発明は結晶形のＰＤＥ４Ｂを提供し，これは，短い長さのＰＤＥ４Ｂ，例えばホスホジエステラーゼドメインでありうる。結晶形は，１またはそれ以上の重金属原子，例えば，Ｘ線結晶学に有用な原子を含むことができる。結晶形はまた，共結晶中の結合化合物，例えば，ＰＤＥ中の１またはそれ以上の保存活性部位残基，またはこれらの残基の任意の２つ，任意の３つ，任意の４つ，任意の５つ，任意の６つと相互作用する結合化合物を含むことができ，例えば，既知のＰＤＥ阻害剤でありうる。そのようなＰＤＥ結晶は，種々の環境中にあることができ，例えば，Ｘ線結晶学用にマウントされた結晶学プレート中および／またはＸ線ビーム中にあることができる。ＰＤＥは種々の形態，例えば，本明細書に記載されるような，野生型，変種，切断型，および／または変異型でありうる。
【０１６８】
本発明はさらに，ＰＤＥ４Ｂの共結晶に関し，これは，短い長さのＰＤＥ，例えばホスホジエステラーゼドメインとＰＤＥ４Ｂ結合化合物でありうる。このような共結晶は少なくとも３オングストローム，２．５オングストローム，２．０オングストローム，１．８オングストローム，１．７オングストローム，１．５オングストローム，１．４オングストローム，１．３オングストロームまたは１．２オングストロームのＰＤＥの構造決定を可能にするほど十分な大きさおよび質であることが有利である。共結晶は，例えばＸ線結晶学のためにマウントされた結晶学プレート中，および／またはＸ線ビーム中にあり得る。このような共結晶は，例えばＰＤＥと結合化合物間の相互作用に関する構造情報を得るために有益である。
【０１６９】
特定の態様においては，結合化合物は，式Ｉ，式ＩＩ，または式ＩＩＩのコア構造を含む。
【０１７０】
ＰＤＥ４Ｂ結合化合物は，ＰＤＥ中の保存活性部位残基の少なくとも１つ，またはこれらの残基の任意の２，３，４，５，または６個と相互作用する化合物を含むことができる。ＰＤＥ４Ｂに結合する例示的化合物としては，本明細書に引用される参考文献に記載されるものが挙げられる。
【０１７１】
同様に，別の観点においては，ＰＤＥ４Ｂ結晶および共結晶を得る方法が提供される。本発明の１つの観点においてはＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの結晶を得る方法が提供され，この方法は，ＰＤＥ４Ｂタンパク質を，５−２０ｍｇ／ｍｌ（例えば８−１２ｍｇ／ｍｌ）で，３０％ＰＥＧ４００，０．２Ｍ  ＭｇＣｌ2，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５，１ｍＭの結合化合物，４℃；または２０％  ＰＥＧ３０００，０．２Ｍ  Ｃａ（ＯＡｃ）2，０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．０，１ｍＭの結合化合物，１５．９ｍｇ／ｍｌタンパク質，４℃；または１．８Ｍ−２．０Ｍ  硫酸アンモニウム，０．１Ｍ  ＣＡＰＳ，ｐＨ１０．０−１０．５，０．２Ｍ  硫酸リチウムと実質的に同等の結晶化条件に供することを含む。
【０１７２】
結晶化条件はまず，スクリーニングキット，例えばハンプトン・リサーチ(Hampton Research)（カリフォルニア州，リバーサイド）スクリーニングキット１を用いて同定できる。結晶をもたらす条件を選択し，結晶化条件を，実証された結晶化条件に基づいて最適化できる。その後の結晶学を補助するために，PDEをセレノ−メチオニン標識できる。また，前記で示したように，PDEは種々の型のいずれであってもよく，例えばホスホジエステラーゼドメインを提供する末端切断型であってよく，これは種々の長さであるよう選択できる。
【０１７３】
別の観点においては，ＰＤＥ４Ｂに対して活性な化合物（例えば本明細書に記載される方法を用いて開発される化合物）を提供することはまた，ＰＤＥを，ＰＤＥに結合し，もう１つの保存された活性部位残基と相互作用する化合物と接触させることによりＰＤＥ活性を調節する方法を提供する。化合物は，好ましくは，ＰＤＥの活性を少なくとも１０％，より好ましくは少なくとも２０％，３０％，４０％または５０％調節するのに十分なレベルで提供される。多くの態様においては，化合物は約１μＭ，１００μＭ，または１ｍＭ，または１−１００ｎＭ，１００−５００ｎＭ，５００−１０００ｎＭ，１−１００μＭ，１００−５００μＭ，または５００−１０００μＭの範囲内の濃度であろう。
【０１７４】
「ＰＤＥ４Ｂ活性」との用語は，ＰＤＥ４Ｂの生物学的活性，特にホスホジエステラーゼ活性を表す。
【０１７５】
調節剤であるかまたは調節剤であり得る化合物の使用，試験またはスクリーニングの文脈においては，用語「接触させること」とは，化合物が特定の分子，複合体，細胞，組織，生物，または化合物とその他の特定の物質との間に結合相互作用および／または化学反応が生じる可能性があるように，その他の指定の物質に対して十分に近接させることを意味する。
【０１７６】
関連する観点においては，本発明は異常なＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ活性を特徴とする疾病または状態を患う患者を治療する方法を提供する。本発明の方法は，本明細書に記載の方法によって同定される有効量の化合物を患者に投与することを含む。
【０１７７】
治療または予防され得る特定の疾病または疾患としては，本明細書の詳細な説明に，および本明細書に引用した参照文献に記載されるものが挙げられる。
【０１７８】
ＰＤＥ４Ｂの結晶を開発し，分析し，結合様式を調べたので，本発明のもう１つの態様は，このようなＰＤＥ（長さの短いＰＤＥであり得る）の電子表示，例えば，米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願，すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１中のＰＤＥ４Ｂについて記載される座標に対応するＰＤＥ４Ｂの原子座標表示を含む電子表示，あるいは二次構造および／または鎖の折畳みを示し，また保存された活性部位残基も示し得るものなどの略図に関する。ＰＤＥは，野生型，アレル変異体，突然変異型，または改変型，例えば本明細書に記載されるものでありうる。
【０１７９】
電子表示はまた，特定の残基の電子表示をその他の残基の電子表示と置き換えることによって修飾できる。したがって，例えば，米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願，すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１，２，３，または４に挙げられるＰＤＥ４Ｂの座標に対応する原子座標表示を含む電子表示は，結合部位中の特定の保存された残基の座標を異なるアミノ酸と置き換えることによって修飾できる。修飾または複数の修飾の後，修飾または複数の修飾によって影響を受ける既知の相互作用を可能にするよう構造全体の表示を調節できる。ほとんどの場合，２以上の残基が関する修飾は反復法で実施される。
【０１８０】
さらに，結合部位中のＰＤＥ４Ｂ結合化合物または試験化合物の電子表示を含めることができる例としては，例えば，加水分解できないｃＡＭＰ類似体またはシルデナフィルのコア構造を含む化合物が挙げられる。
【０１８１】
同様に，関連態様では，本発明は結合部位でありうるＰＤＥ４Ｂの一部（活性部位であり得る）またはホスホジエステラーゼドメイン，例えばＪＣ１５１９のＰＤＥ４Ｂ残基１５２−５２８，または本明細書に記載される他のホスホジエステラーゼドメインの電子表示に関する。結合部位またはホスホジエステラーゼドメインは，種々の方法で，例えば結合部位周辺の残基の原子座標の表示としておよび／または結合部位表面のでこぼことして表示でき，結合部位での特定の残基，例えば保存された残基の結合特性の表示を含み得る。好ましくは，結合部位は重金属原子を１個だけ含み；式Ｉ，式ＩＩ，または式ＩＩＩのコア構造を含む化合物などの結合化合物または試験化合物が結合部位に存在してもよく，結合部位はＰＤＥ４Ｂの野生型，変異体，突然変異型または改変型であることができ，電子表示は，米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願，全ての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１，２，３，または４中にあるような保存された残基の表示座標を含む。
【０１８２】
さらにもう１つの態様では，ＰＤＥ４Ｂの構造および配列情報は，別のＰＤＥの相同モデルで使用できる。ＰＤＥ４Ｂの高分解能，例えば少なくとも１．７，１．５，１．４，１．３または１．２オングストローム分解能構造情報をこのようなモデルに使用する場合には役立つ。
【０１８３】
さらにもう１つの態様では，本発明は，米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願，すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１，２，３，および／または４の原子座標に基づく修飾されたＰＤＥ４Ｂの原子座標の電子表示を含む，修飾されたＰＤＥ４Ｂ結晶構造の電子表示を提供する。例示的実施形態では，保存された残基の原子座標を異なるアミノ酸の原子座標で置き換えることによって列挙された表の１つの原子座標を修飾できる。修飾としては，置換，欠失（例えば，Ｃ末端および／またはＮ末端欠失），挿入（内部，Ｃ末端および／またはＮ末端）および／または側鎖修飾が挙げられる。
【０１８４】
もう１つの態様では，ＰＤＥ４Ｂ構造情報により，ＰＤＥ４Ｂ構造を解析し，生物学的因子を形成する少なくとも１つの基礎構造を同定することによって，ＰＤＥ４Ｂに基づいて有用な生物学的因子を開発する方法を提供する。このような基礎構造としては，抗体形成のためのエピトープが挙げられ，方法としては，例えば，エピトープ提示組成物を哺乳類，例えば，ウサギ，モルモット，ギニアブタ，ブタ，ヤギまたはウマに注入することによるエピトープに対する抗体の開発が挙げられる。基礎構造としてはまた，ＰＤＥ４Ｂの活性を変更する突然変異が予想されるか，知られている突然変異部位が挙げられ，方法としては，その部位に突然変異を作製することが挙げられる。さらに，基礎構造としては，分離部分，例えばペプチド，ポリペプチド，固相物質（例えば，ビーズ，ゲル，クロマトグラフィー媒体，スライド，チップ，プレートおよびウェル表面），リンカーおよび標識（例えば，フルオロフォアなどの直接標識またはビオチンなどの間接標識またはその他の特異的結合対のメンバー）を付着するための付着点が挙げられる。方法としては，分離部分の付着が挙げられる。
【０１８５】
もう１つの態様では，本発明は，化合物の少なくとも１つの電子表示を，ＰＤＥ結合部位の電子表示にフィッティングすることによる，潜在的ＰＤＥ４Ｂ結合化合物を同定する方法を提供する。結合部位の表示は，大きな部分の電子表示の一部またはＰＤＥ分子のすべてであってもよく，触媒ドメインのみの表示もしくは結合部位もしくは活性部位の表示であってもよい。電子表示は前記の通りであってもよく，別に本明細書に記載される通りであってもよい。ＰＤＥ４Ｂについて，電子表示は，米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願，すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１，２，３，または４の座標の表示を含み，特にこれまでに提唱されているＰＤＥ４Ｂ構造とは有意に異なる座標を有する残基の表示を含む。
【０１８６】
特定の実施形態では，本方法はコンピュータデータベースから得た化合物のコンピュータ表示を，ＰＤＥの活性部位のコンピュータ表示とフィッティングすることを含み，ＰＤＥ分子と複合体を形成している化合物のコンピュータ表示を除くこと，および潜在的結合化合物として好都合な幾何学的適合性およびエネルギー的に好都合な相補的相互作用に基づいて活性部位と最良にフィッティングする化合物を同定することを含む。特定の実施形態では，化合物は既知のＰＤＥ４Ｂ阻害剤，例えば本明細書に引用された参照文献に記載されるものまたはその誘導体である。
【０１８７】
その他の実施形態では，本方法は，１個以上の化学基の欠失または付加またはその双方によって，ＰＤＥ分子と複合体を形成している化合物のコンピュータ表示を修飾すること，コンピュータデータベースから得た化合物のコンピュータ表示を，ＰＤＥ分子の活性部位のコンピュータ表示とフィッティングすること，および潜在的結合化合物として好都合な幾何学的適合性およびエネルギー的に好都合な相補的相互作用に基づいて活性部位と最良にフィッティングする化合物を同定することを含む。
【０１８８】
さらにその他の実施形態では，本方法は，ＰＤＥと複合体を形成している化合物のコンピュータ表示を除くことおよび化合物検索コンピュータプログラムを用いてデータベースを複合化合物と構造類似性を有する化合物について検索すること，または化合物構造コンピュータプログラムを用いて複合体を形成している化合物の部分を同様の化学構造で置き換えることを含む。
【０１８９】
化合物をフィッティングすることは，化合物がＰＤＥの１個以上の保存された活性部位残基と相互作用するかどうかを調べることを含み得る。フィッティングのために選択された化合物またはＰＤＥと複合体を形成している化合物は，例えば，既知のＰＤＥ４Ｂ阻害剤化合物，またはこのような化合物のコア構造を含む化合物であり得る。
【０１９０】
もう１つの態様では，本発明は，ＰＤＥ４Ｂ結合化合物を付着成分と付着する方法ならびにＰＤＥ４Ｂ結合化合物上の付着部位を同定する方法に関する。本方法は，ＰＤＥ４Ｂの結合部位に結合している結合化合物の付着成分の付着についてエネルギー的に許容される部位を同定すること，およびエネルギー的に許容される部位で化合物またはその誘導体を付着成分と付着させることを含む。
【０１９１】
「エネルギー的に許容される部位」とは，付着した成分の存在に伴う自由エネルギーの変化が，結合を破壊する程度に化合物のホスホジエステラーゼへの結合を不安定化させない特性を有する，分子の領域である。
【０１９２】
付着成分としては，例えば，固相または別の分子またはその他の部分との付着のためのリンカー（トレースレスリンカーを含む）が挙げられる。このような付着は，例えば，複数の化合物におけるコンビナトリアル合成において固相媒体に付着しているリンカー上に化合物または誘導体を合成することによって形成できる。同様に，固相媒体との付着によってアフィニティー媒体（例えば，アフィニティークロマトグラフィー用の）が提供され得る。
【０１９３】
付着成分としてはまた，フルオロフォアなどの直接検出可能な標識，または特異的結合対のメンバー，例えばビオチンなどの間接的に検出可能なものであり得る標識が挙げられる。
【０１９４】
関連態様では，ＰＤＥ４Ｂ結合化合物上のエネルギー的に許容される部位を同定する能力はまた，好ましくは，修飾された化合物とＰＤＥ４Ｂとの結合についてエネルギー的に許容される部位でリンカーが付着されている修飾された結合化合物を提供する。リンカーは前記の付着成分と付着できる。
【０１９５】
本発明の別の観点は，修飾されたＰＤＥ４Ｂを別のホスホジエステラーゼに対して天然ＰＤＥ４Ｂよりも類似性にする修飾を含む，またその他の突然変異またはその他の修飾も含み得る，修飾されたＰＤＥ４Ｂポリペプチドに関する。種々の実施形態では，ポリペプチドは全長ＰＤＥ４Ｂポリペプチドを含み，修飾されたＰＤＥ４Ｂ結合部位を含み，保存された部位を含む，ＰＤＥ４Ｂに由来する少なくとも２０，３０，４０，５０，６０，７０または８０個の連続するアミノ酸残基を含む。
【０１９６】
本発明のさらにもう１つの態様は，それぞれ保存されたＰＤＥ４Ｂ活性部位残基のいずれか１個，２個，３個，４個，５個または６個とマッチする保存された残基を含むホスホジエステラーゼのリガンドを開発する方法に関し，この方法は，米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願，すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１，２，３，および／または４におけるような座標を有する，ＰＤＥ４Ｂ結晶またはＰＤＥ４Ｂ結合モデルにおいて，化合物がホスホジエステラーゼと結合し，このような活性部位残基と相互作用するかどうかを調べることを含む。本方法はまた，化合物がホスホジエステラーゼの活性を調節するかどうかを調べることを含み得る。ホスホジエステラーゼは，同じ長さのホスホジエステラーゼドメインセグメントにわたって少なくとも５０，５５，６０または７０％の同一性を有することが好ましい。
【０１９７】
特定の実施形態では，調べることは，ホスホジエステラーゼの結合部位において化合物をコンピュータフィッティングすることを含み，および／または，この方法はホスホジエステラーゼと化合物の共結晶を形成することを含む。このような共結晶は，化合物とホスホジエステラーゼとの結合配向を調べるために使用でき，および／またはホスホジエステラーゼに関する，例えば，結合部位および相互作用するアミノ酸残基に関する構造情報を提供できる。このような結合配向および／またはその他の構造情報は，Ｘ線結晶学を用いて達成できる。
【０１９８】
本発明はまた，ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ活性と結合し，および／または調節する（例えば，阻害する）化合物，例えば，本明細書に記載される方法によって同定される化合物を提供する。したがって，ＰＤＥ４Ｂ結合化合物，分子スキャフォールドおよびリガンドまたは調節剤に関する態様および実施形態では，化合物は弱い結合化合物，中程度の結合化合物，強い結合化合物であり，化合物はＰＤＥ中の１以上の保存された活性部位残基と相互作用し，化合物は小分子であり，化合物は複数の異なるホスホジエステラーゼ（例えば，少なくとも２，３，４，５，７，１０またはそれより多くの異なるホスホジエステラーゼ）と結合する。特に，本発明は，同定または選択される化合物に関する。
【０１９９】
さらに別の態様においては，本発明は，特定の異なる部位を利用してＰＤＥ４ＢとＰＤＥ４Ｄとの間の選択性を有する化合物を同定する方法に関する。この方法は，化合物が異なる部位の少なくとも１つにおいてＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄと異なるように相互作用するか否かを分析することを含み，ここで，相互作用が異なることはそのような選択性を有することを示す。"異なる部位"は，結晶構造比較から同定され，異なる化学的特性，例えば，電荷密度，原子配置，水和の程度等を有する部位を表す。
【０２００】
特定の態様においては，分析は，化合物の電子表示をＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの結合部位の電子表示中でフィットさせ，そして前記フィッティングに基づいて化合物が異なるように相互作用するか否かを判定することを含み；この方法は，ＰＤＥ４ＢとＰＤＥ４Ｄとの両方に結合する最初の化合物を選択し，最初の化合物の電子表示をＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄの結合部位の電子表示中でフィットさせ，少なくとも異なる部位と相互作用する少なくとも１つの成分を有する最初の化合物の電子表示を変更し，そして変更された化合物がＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄに異なるように結合するか否かを判定することを含み；変更された化合物は最初の化合物と異なるように高い程度で結合し；この方法はまた，ＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄに対する異なる活性について異なるように相互作用する化合物をアッセイすることを含み；最初の化合物はシルデナフィルのスキャフォールド構造を含み；最初の化合物はシルデナフィルのコアを含む。
【０２０１】
結合化合物との組み合わせにおけるＰＤＥ４Ｂの原子座標を含む上述の種々の観点において，座標は，本明細書に記載される方法により作成したＸ線結晶学構造により与えられる。次に，慣用のモデリング法を用いてこれらの座標を調節して，シルデナフィルと異なる構造を有する化合物をフィットさせ，したがって，これを用いてこれまでに記述されているＰＤＥ４Ｂ調節剤と異なるＰＤＥ４Ｂ調節剤を開発することができる。これまでに記述されているＰＤＥ４Ｂ結晶座標の代わりに，本明細書に記載される方法により与えられるＰＤＥ４Ｂ結晶座標を用いることができる。
【０２０２】
追加の観点および態様は以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２０３】
好ましい態様の詳細な説明
式Ｉの例示的化合物が表１Ａに示される。表１Ｂは，式Ｉの化合物の例示的活性データを示す。表１Ｃは本発明の追加の例示的化合物を示す。
【０２０４】
式ＩＩの例示的化合物が表２Ａに示される。表２Ｂは式ＩＩの化合物の例示的活性データを示す。
【０２０５】
表３Ａは，式ＩＩＩの化合物の例示的化合物および活性データを示す。表３Ｂは，本発明の追加の例示的化合物を示す。
【０２０６】
表１Ａ，２Ａ，および３Ａに提供される系統的化学名は，ＩＳＩＳプログラムのＡｕｔｏＮｏｍ２０００アドイン機能（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  ＭＤＬ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）により自動的に生成したものである。化学種の図表示と前記化学種に帰する系統的命名法とが異なる範囲では，図表示が意図される化学構造を表す。
【０２０７】
Ｉ．一般
本発明は，ＰＤＥ４Ｂの阻害剤である式Ｉ，式ＩＩ，および式ＩＩＩの化合物，およびＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ活性を調節する構造を有する改良された化合物を開発するための，ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ構造，構造情報，および関連する組成物の使用に関する。
【０２０８】
ＰＤＥ４阻害剤およびその使用に関する多数の公開特許がある。そのような公開のほとんどは，ＰＤＥ４Ｄに焦点を当てている。例えば，Ｍａｒｆａｔら，米国特許６，５５９，１６８は，ＰＤＥ４阻害剤，特にＰＤＥ４Ｄ阻害剤を記載しており，別のＰＤＥ４阻害剤を記載する別の公開特許を引用する。そのような別の公開には，Ｍａｒｆａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ＷＯ９８／４５２６８；Ｓａｃｃｏｏｍａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許４，８６１，８９１；Ｐｏｎ，米国特許５，９２２，５５７；およびＥｇｇｌｅｓｔｏｎ，ＷＯ９９／２０６２５が含まれる。
【０２０９】
Ａｉｔ  Ｉｋｈｌｅｆら（米国特許公開２００３００６４３７４，出願番号１０／９８３，７５４）は，ＰＤＥ４Ｂに活性な化合物および神経毒の治療，例えば，神経変性性疾患，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，ハンティングトン舞踏病，および脳虚血の治療におけるその使用を記載する。
【０２１０】
ＰＤＥ４Ｂと関連する例示的疾病
ＰＤＥ４Ｂの調節は，多数の種々の疾病および状態の治療と関連づけられてきた。例えば，Ａｉｔ  Ｉｋｈｌｅｆら（米国特許公開２００３００６４３７４，出願番号１０／９８３，７５４）は，ＰＤＥ４Ｂに活性な化合物および神経毒の治療，例えば，神経変性性疾患，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病，多発性硬化症，ハンティングトン舞踏病，および脳虚血の治療におけるその使用を記載する。
【０２１１】
すなわち，ＰＤＥ４Ｂ調節剤は，ＰＤＥ４，特にＰＤＥ４Ｂに関連するそのような状態の治療または予防に用いることができる。治療しうる追加の状態としては，限定されないが，急性または慢性の肺疾病，例えば閉塞性疾病（例えば，喘息，慢性閉塞性肺疾病（ＣＯＰＤ），嚢胞性線維症），間質性肺疾患（例えば，特発性肺線維症，サルコイドーシス），血管肺疾病（例えば，肺高血圧），気管支炎，アレルギー性気管支炎，および気腫が挙げられる。本発明の態様により治療が意図される別の疾病または状態としては，例えば，限定されないが，ＣＮＳ疾病，例えば，アルツハイマー病，パーキンソン病およびハンティングトン舞踏病；炎症性自己免疫疾患，例えば多発性硬化症，慢性関節リウマチおよびクローン病，ならびに他の炎症性疾患，例えば，脳虚血，炎症性大腸疾患，および潰瘍性大腸炎；骨疾病，例えば，骨粗鬆症，大理石骨病，およびパジェット病；癌，例えば，散在性大細胞Ｂ細胞リンパ腫，慢性リンパ性白血病，急性リンパ芽球性白血病；重症急性呼吸器症候群；および早期陣痛が挙げられる。
【０２１２】
ＩＩ．結晶性ＰＤＥ４Ｂ
結晶性ＰＤＥ４Ｂには，天然結晶，ホスホジエステラーゼドメイン結晶，誘導体結晶および共結晶が含まれる。天然結晶は通常，結晶型のＰＤＥ４Ｂに相当する実質的に純粋なポリペプチドを含む。ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメイン結晶は，通常，結晶型の実質的に純粋なＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインを含む。ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ機能の阻害剤の開発に関連して，ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインをそれぞれ構造決定に使用することが有利であるが，これは短い配列を使用することで構造決定が単純になるからである。この目的のために有用であるには，ホスホジエステラーゼは活性でなくてはならず，かつ／または天然型結合を保持していなくてはならず，したがって，このことはホスホジエステラーゼが実質的に正常な３Ｄ構造をとるということを示す。
【０２１３】
本発明の結晶性ホスホジエステラーゼおよびホスホジエステラーゼドメインは天然に存在するかまたは天然のホスホジエステラーゼに限定されるものではないということは理解されなくてはならない。実際，本発明の結晶は，天然ホスホジエステラーゼの突然変異体の結晶を含む。天然ホスホジエステラーゼの突然変異体は，天然ホスホジエステラーゼ中の少なくとも１個のアミノ酸残基を，異なるアミノ酸残基で置き換えることによって，または天然ポリペプチド内のもしくは天然ポリペプチドのＮもしくはＣ末端でアミノ酸残基を付加もしくは欠失することによって得られ，突然変異体が由来する天然ホスホジエステラーゼと実質的に同じ三次元構造を有する。
【０２１４】
実質的に同じ三次元構造を有することとは，天然ホスホジエステラーゼドメインの少なくとも約５０％〜１００％のＣα原子がスーパーポジション中に含まれる場合に，突然変異体が由来する天然ホスホジエステラーゼの原子構造座標とともにスーパーインポーズすると，二乗平均平方根偏差が約２Å以下である原子構造座標のセットを有することを意味する。
【０２１５】
ホスホジエステラーゼの三次元構造を大きく妨害しないアミノ酸置換，欠失および付加は，幾分かは，置換，付加または欠失が生じるホスホジエステラーゼの領域に応じて変わる。分子の高度に可変性の領域では，分子の三次元構造を大きく破壊することなく非保存的置換ならびに保存的置換が許容され得る。高度に保存された領域または重大な二次構造を含む領域では，保存的アミノ酸置換が好ましい。このような保存された領域および可変領域は，ＰＤＥ４Ｂと，その他のホスホジエステラーゼとの配列アラインメントによって同定できる。
【０２１６】
保存的アミノ酸置換は当分野ではよく知られており，関連するアミノ酸残基の極性，電荷，可溶性，疎水性，親水性および／または両親媒性の性質の類似性に基づいて行われる置換が挙げられる。例えば，負に帯電したアミノ酸としては，アスパラギン酸とグルタミン酸が挙げられ，正に帯電したアミノ酸としては，リシンとアルギニンが挙げられ，同様の親水性値を有する帯電していない極性頭部を含むアミノ酸としては，以下のものが挙げられる：ロイシン，イソロイシン，バリン；グリシン，アラニン；アスパラギン，グルタミン；セリン，トレオニン；フェニルアラニン，チロシン。その他の保存的アミノ酸置換は当分野ではよく知られている。
【０２１７】
化学合成によって全体としてまたは一部分として得られるホスホジエステラーゼについては，置換または付加に利用できるアミノ酸の選択は，遺伝的にコードされるアミノ酸に限定されない。実際，本明細書に記載される突然変異体は，遺伝的にコードされないアミノ酸を含んでいてもよい。一般的に知られている遺伝的にコードされないアミノ酸の多数の保存的アミノ酸置換は，当技術分野ではよく知られている。その他のアミノ酸の保存的置換は，遺伝的にコードされるアミノ酸の特性と比較した，それらの物理的特性に基づいて決定できる。
【０２１８】
いくつかの例では，ｃＤＮＡをコードするポリペプチド中に好都合なクローニング部位を提供するために，ポリペプチドの精製を補助するために，およびポリペプチドの結晶化のために，天然ホスホジエステラーゼのアミノ酸残基を置換，欠失および／または付加することが特に有利または好都合であり得る。天然ホスホジエステラーゼドメインの三次元構造を実質的に変更しないこのような置換，欠失および／または付加は，当業者には明らかであろう。
【０２１９】
本明細書において考慮される突然変異体はすべてホスホジエステラーゼ活性を示す必要はないことに注目すべきである。実際，ホスホジエステラーゼ活性を妨害するが，ドメインの三次元構造を大きくは変更しないアミノ酸置換，付加または欠失が本発明によって特に考慮される。このような結晶ポリペプチドまたはそれから得られる原子構造座標を，天然ドメインと結合する化合物を同定するために使用できる。これらの化合物は，天然ドメインの活性に影響を及ぼし得る。
【０２２０】
本発明の誘導体結晶は，１個以上の重金属原子と共有結合している結晶ホスホジエステラーゼポリペプチドを含み得る。このポリペプチドは天然または突然変異ホスホジエステラーゼに相当し得る。誘導体結晶を提供するのに有用な重金属原子としては，それだけには限らないが例として，金，水銀，セレンなどが挙げられる。
【０２２１】
本発明の共結晶は通常，1種以上の化合物と結合している結晶ホスホジエステラーゼドメインポリペプチドを含む。結合は共有結合であってもよく，非共有結合であってもよい。このような化合物としては，それだけには限らないが，補因子，基質，基質類似体，阻害剤，アロステリックエフェクターなどが挙げられる。
【０２２２】
III．Ｘ線結晶学を用いる三次元構造決定
Ｘ線結晶学は，分子の三次元構造を解き明かす方法である。分子の構造は，回析格子として結晶を用いてＸ線回析パターンから算出する。タンパク質分子の三次元構造は，そのタンパク質の濃縮した水溶液から成長した結晶から生じる。Ｘ線結晶学のプロセスは以下のステップを含み得る：
（ａ）ポリペプチドを合成および単離すること（あるいは得ること），
（ｂ）調節剤を伴ってか伴わずに，ポリペプチドを含む水溶液から結晶を成長させること，
（ｃ）結晶からＸ線回析パターンを集めること，単位セル寸法および対称性を決定すること，電子密度を決定すること，ポリペプチドのアミノ酸配列を電子密度に対してフィッティングすること，および構造を精密化すること。
【０２２３】
ポリペプチドの製造
本明細書に記載される天然および突然変異型ホスホジエステラーゼポリペプチドは，当技術分野で周知の技術を用いて，全体または一部を化学合成できる（例えば，クレートン(Creighton)（１９８３）バイオポリマーズ(Biopolymers)２２（１）：４９〜５８頁参照）。
【０２２４】
あるいは，当業者に周知の方法を使用して，天然または突然変異型ホスホジエステラーゼポリペプチドコード配列と適当な転写／翻訳制御シグナルとを含む発現ベクターを構築してもよい。これらの方法としては，インビトロ組換えＤＮＡ技術，合成技術およびインビボ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。例えば，マニアティス(Maniatis)，Ｔ（１９８９）モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル(Molecular cloning : A laboratory Manual.)。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Cold Spring Harbor Laboratory)，ニューヨーク。コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；およびオーズベル(Ausubel)，Ｆ．Ｍ．ら（１９９４）カレント・プロトコール・イン・モレキュラー・バイオロジー(Current Protocols in Molecular Biology.)，ジョン・ウィレー・アンド・サンズ(John Wiley & Sons)，ニュージャージー州，セコーカス(Secaucus)に記載される技術を参照。
【０２２５】
種々の宿主発現ベクター系を利用してホスホジエステラーゼコード配列を発現できる。これらとしては，それだけには限らないが，ホスホジエステラーゼドメインコード配列を含む，組換えバクテリオファージＤＮＡ，プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌；ホスホジエステラーゼドメインコード配列を含む，組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ホスホジエステラーゼドメインコード配列を含む，組換えウイルス発現ベクター（例えば，バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系，ホスホジエステラーゼドメインコード配列を含む，組換えウイルス発現ベクター（例えば，カリフラワーモザイクウイルス，ＣａＭＶ，タバコモザイクウイルス，ＴＭＶ）に感染したか，組換えプラスミド発現ベクター（例えば，Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または動物細胞系などの微生物が挙げられる。これらの系の発現エレメントはその強度および特異性の点で様々である。
【０２２６】
用いる宿主／ベクター系に応じて，構築プロモーターおよび誘導プロモーターをはじめとするいくつかの適した転写および翻訳エレメントのいずれをも発現ベクターに使用できる。例えば，細菌系におけるクローニングの際には，誘導プロモーター，例えばバクテリオファージλのｐＬ，ｐｌａｃ，ｐｔｒｐ，ｐｔａｃ（ｐｔｒｐ−ｌａｃハイブリッドプロモーター）などを使用でき，昆虫細胞系におけるクローニングの際には，バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターなどのプロモーターを使用でき，植物細胞系におけるクローニングの際には，植物細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば，熱ショックプロモーター，ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットのプロモーター），クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質のプロモーター）または植物ウイルス由来のプロモーター（例えば，ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター，ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）を使用でき，哺乳類細胞系におけるクローニングの際には，哺乳類細胞のゲノムに由来するプロモーター（例えば，メタロチオネインプロモーター）または哺乳類ウイルスに由来するプロモーター（例えば，アデノウイルス後期プロモーター，ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）を使用でき，ホスホジエステラーゼドメインＤＮＡの多重コピーを含む細胞株の作製の際には，ＳＶ４０，ＢＰＶおよびＥＢＶベースのベクターを適当な選択マーカーとともに使用できる。
【０２２７】
用いるＤＮＡ操作，ベクター，種々の種類の細胞についての方法，ベクターを細胞に組み込む方法，発現技術，タンパク質精製および単離法，およびタンパク質濃縮法を説明する例示的方法は，ＰＣＴ公開ＷＯ９６／１８７３８に詳細に開示されている。この公開は参照により，図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる。当業者には，このような記載を本発明に適用でき，それに容易に適応させることができることは当然であろう。
【０２２８】
結晶成長
結晶は，種々の技術によって精製および濃縮されたポリペプチドを含有する水溶液から成長させる。これらの技術としては，バッチ，液体，ブリッジ，透析，蒸気拡散および水滴法が挙げられる。参照により，すべての図，表および図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる，マクファーソン(McPherson)（１９８２）ジョン・ウィレー，ニューヨーク，マクファーソン（１９９０）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)１８９：１〜２３頁，ウェバー(Webber)（１９９１）アドバンセズ・イン・プロテイン・ケミストリー(Advances in Protein Chemistry)４１：１〜３６頁。
【０２２９】
本発明の天然結晶は，概して，沈殿物をポリペプチドの濃縮溶液に添加することによって成長させる。沈殿物はタンパク質を沈殿させるのに必要な濃度のすぐ下の濃度で添加する。制御蒸発によって水を除去し，沈殿条件を生じさせ，これを結晶成長が終わるまで維持する。
【０２３０】
本発明の結晶のための，例示的結晶化条件を実施例に記載する。当業者ならば，例示的結晶化条件を変更できることは認識するであろう。このような変化量は，単独または組合せて使用できる。さらに，その他の結晶化条件は，例えば，このようなその他の条件を同定するための結晶化スクリーニングプレートを用いることによって見出すことができる。次いで，それらの代替条件を，必要に応じて最適化し，より大きなまたはより良質な結晶を提供することができる。
【０２３１】
本発明の誘導体結晶は，天然結晶を，重金属原子の塩を含有する母液に浸すことによって得ることができる。天然結晶を，約０．１ｍＭ〜約５ｍＭのチメロサル，４−クロロメルリ安息香酸(chloromeruribenzoic acid)またはＫＡｕ（ＣＮ）2を含有する溶液に約２時間〜約７２時間浸すことによって，Ｘ線結晶構造の決定における同形置換として使用するのに適した誘導体結晶が得られることがわかっている。
【０２３２】
本発明の共結晶は，天然結晶を，ホスホジエステラーゼと結合する化合物を含有する母液に浸すことによって得ることができ，または結合化合物の存在下でホスホジエステラーゼポリペプチドを共結晶化することによって得ることができる。
【０２３３】
一般に，ホスホジエステラーゼと結合化合物の共結晶化は，対応するホスホジエステラーゼを結合化合物を含まずに結晶化するために同定した条件を用いて達成できる。ホスホジエステラーゼに対して複数の異なる結晶化条件が同定されている場合には，どの条件が最良の共結晶をもたらすかを決定するためにこれらを試験することができることが有利である。共結晶化のための条件を最適化することも有益であり得る。
【０２３４】
あるいは，例えば，結晶化についてスクリーニングし，次いでそれらの条件を最適化することによって，共結晶を得るための新規結晶化条件を決定することができる。例示的共結晶化条件を実施例に示す。
【０２３５】
ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の単位セル寸法および三次元構造の決定
結晶が成長すると，ガラスキャピラリーチューブまたはその他の封入装置に入れ，Ｘ線発生器およびＸ線検出装置と連結している保持装置上にマウントすることができる。Ｘ線回析パターンの収集は，当業者によって十分に立証されている。例えば，デュクルー(Ducruix)およびゲイジ(Geige)，（１９９２），ＩＲＬプレス，英国，オックスフォードおよび本明細書に引用される参照文献参照。Ｘ線のビームは結晶に入り，次いで結晶から回析する。Ｘ線検出装置を利用して結晶から広がる回析パターンを記録できる。こういった機器の古いモデルのＸ線検出装置は，１つのフィルムであるが，最新機器はＸ線回析散乱をデジタル記録する。Ｘ線供給源は種々の型のものであり得るが，高輝度供給源，例えばシンクロトロンビーム供給源を用いることが有利である。
【０２３６】
ペプチド分子または分子複合体の結晶型の三次元構造を得る方法は，当技術分野では周知である。例えば，デュクルーおよびゲイジ（１９９２）ＩＲＬプレス，英国，オックスフォードおよび本明細書に引用される参照文献を参照。以下は，Ｘ線回析データから分子または複合体の三次元構造を決定するプロセス中のステップである。
【０２３７】
結晶からＸ線回析パターンを収集した後，結晶中の単位セル寸法および配向を決定できる。それらは回析放射ならびにこういった放射から作られるパターン間の間隔から決定できる。単位セル寸法はオングストローム（１Å＝１０-10メートル）単位で三次元で，および各頂点の角度によって特徴づけられる。結晶中の単位セルの対称性もこの段階で特徴づけられる。結晶中の単位セルの対称性によって，反復パターンを同定することによって収集したデータの複雑性が単純化される。単位セルの対称性および寸法の適用を以下に説明する。
【０２３８】
各回析パターン放射は，ベクトルとして特徴づけられ，方法のこの段階で収集したデータにより各ベクトルの振幅が決まる。ベクトルの位相は複数の技術を用いて決定できる。一方法では，同形置換と呼ばれる方法であるが，重原子を結晶にソークすることができ，これらの重原子をＸ線回析における参照点として用いることによってベクトルの位相を調べることができる（オトウィノウスキ(Otwinowski)，（１９９１），英国，ダーズベリー，８０〜８６）。同形置換法は通常２種以上の重原子誘導体を利用する。
【０２３９】
もう１つの方法では，すでに構造の決定されている結晶性ポリペプチドからのベクトルの振幅および位相を，構造未知の結晶性ポリペプチドからのベクトルの振幅に適用し，続いてこれらのベクトルの位相を決定することができる。この第２の方法は分子置換として知られており，参照として用いられるタンパク質構造は，注目するタンパク質と密接に関連した構造を有していなくてはならない。（ナラザ(Naraza)（１９９４）プロテインズ(Proteins)１１：２８１〜２９６頁）。したがって，構造既知のホスホジエステラーゼからのベクトル情報，例えば本明細書に報告されているものは，構造未知の別のホスホジエステラーゼの分子置換解析にとって有用である。
【０２４０】
結晶の単位セルを表すベクトルの位相を決定すると，ベクトル振幅および位相，単位セル寸法および単位セル対称性をフーリエ変換関数中の項として使用できる。フーリエ変換関数によって，これらの測定値から単位セル中の電子密度を算出する。単位セル中の分子の１つまたは分子複合体の１つを表す電子密度は，電子密度マップと呼ぶことができる。次いで，種々のコンピュータプログラムを用いて，配列のアミノ酸構造または結晶性ポリペプチドと複合体を形成している化合物の分子構造を，電子密度とフィッティングすることができる。プロセスのこのステップはモデルビルディングとも称され，Ｔｕｒｂｏ／ＦＲＯＤＯまたは「Ｏ」などのコンピュータプログラムを用いることによって達成できる。（ジョーンズ(Jones)（１９８５）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)１１５：１５７〜１７１頁）。
【０２４１】
次いで，実験的に求めた電子密度にフィッティングしたアミノ酸構造から理論上の電子密度マップを算出できる。理論上の電子密度マップおよび実験的電子密度マップを互いに比較することができ，これら２つのマップ間の一致はＲ因子と呼ばれるパラメーターによって表すことができる。低い値のＲ因子は，理論上の電子密度マップと実験的電子密度マップの間の高度にオーバーラップする電子密度を表す。
【０２４２】
次いで，理論上の電子密度マップを精密化するコンピュータプログラムを用いてＲ因子を最小化する。当業者によって，Ｘ−ＰＬＯＲなどのコンピュータプログラムをモデル精密化のために使用できる。（ブルンガー(Brunger)（１９９２）ネイチャー(Nature)３５５，４７２〜４７５頁）。精密化は反復プロセスで達成できる。第1のステップは，電子密度マップにおいて規定される原子の構造の変化を引き起こし得る。原子の構造は温度の上昇をシミュレートすることによって変更でき，これにより結合の振動周波数が増加し，構造中の原子の位置が改変される。原子撹乱プロセスにおける特定の点では，通常，原子間の相互作用を許容結合角および結合の長さ，ファンデルワールス相互作用，水素結合，イオン性相互作用および疎水性相互作用という点で規定する力場を，原子の系に適用できる。好都合な相互作用は自由エネルギーという言葉で表すことができ，原子は，自由エネルギー最小が達成されるまで多数の反復の間を動かされ得る。精密化プロセスは，Ｒ因子が最小値に達するまで反復され得る。
【０２４３】
分子または分子複合体の三次元構造は，最小Ｒ値を特徴とする理論上の電子密度にフィッティングする原子によって表される。次いで，当該技術分野においてよく知られているように，各原子を座標によって三次元に規定する三次元構造のファイルを作製することができる。
【０２４４】
ＩＶ．ＰＤＥ４Ｂの構造
例示的結合化合物と共に複合体形成している，結晶性ＰＤＥ４ＢホスホジエステラーゼドメインおよびＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの高解像度三次元構造および原子構造座標を説明する。構造座標を得るために用いた方法は実施例に示す。結晶性ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの原子構造座標は，米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願,すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１に列挙される。共結晶座標は，例えば，本明細書に記載される種々の態様において，単独でタンパク質の座標と同様に使用できるが，このような共結晶は結合化合物の結合モードを示すか裏付けるものであるので有利であり得，また結合化合物の存在に応じたタンパク質原子のシフトを含み得る。
【０２４５】
当業者ならば，Ｘ線結晶学によって決定される原子構造座標には誤差を伴うということは認識するであろう。したがって，一般に，天然結晶，ホスホジエステラーゼドメイン結晶，誘導体結晶または共結晶であろうとなかろうと，対象の構造に，主鎖原子（Ｎ，Ｃａ，ＣおよびＯ）を用いてスーパーインポーズすると，約１．５Å以下の二乗平均平方根偏差（「ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．」）を有する，PDEの結晶について得られた構造座標のいずれかのセットは，結晶化しているタンパク質の少なくとも約５０％〜１００％の主鎖原子がスーパーポジションに含まれる場合には，対象の構造と同一であると考えられるということは理解されなくてはならない。
【０２４６】
Ｖ．結晶および原子構造座標の使用
本発明の結晶，特にそれから得られた原子構造座標は多種多様な用途を有する。例えば，本明細書に記載される結晶は，当技術分野で公知のまたは後に開発されるホスホジエステラーゼの使用法のいずれかにおいて出発点として使用できる。このような使用法としては，例えば，ホスホジエステラーゼの天然または突然変異型触媒ドメインと結合する分子を同定することが挙げられる。結晶および構造座標は，新規治療薬を開発することに向けたアプローチとして，ホスホジエステラーゼ活性を調節するリガンドを同定するためには特に有用である。詳しくは，結晶および構造情報は，分子スキャフォールドを利用してリガンドを開発する方法において有用である。
【０２４７】
本明細書に記載される構造座標は，さらなるホスホジエステラーゼの結晶構造，ならびに阻害剤，アゴニスト，アンタゴニストおよびその他の分子などのリガンドとこのようなホスホジエステラーゼとの共結晶との構造を決定するための位相合わせモデルとして使用できる。構造座標，ならびにそれから得られた三次元構造のモデルもまた，天然または突然変異型ホスホジエステラーゼの溶液ベースの構造，例えばＮＭＲによって得られたものの解明を補助するために使用できる。
【０２４８】
ＶＩ．ホスホジエステラーゼ構造の電子表示
ホスホジエステラーゼまたはホスホジエステラーゼの一部（例えば，ホスホジエステラーゼ活性部位）の構造情報は，多数の異なる方法で表すことができる。特に有用なものは電子表示であり，これは表示により迅速かつ好都合なデータ操作および構造修飾が可能となるためである。電子表示は多数の種々のストレージ媒体または記憶媒体，しばしばコンピュータにより読み取り可能な媒体に埋め込むことができる。それだけには限らないが例としては，コンピュータランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ），フローピーディスク，磁気ハードドライブ，磁気テープ（アナログまたはデジタル），コンパクトディスク（ＣＤ），光学ディスク，ＣＤ−ＲＯＭ，メモリーカード，デジタルビデオディスク（ＤＶＤ）などが挙げられる。ストレージ媒体は分離できるか，コンピュータシステムの一部であり得る。このようなコンピュータシステムは，専用の，特殊用途の，または内蔵されたシステム，例えばＸ線結晶学システムの一部を形成するコンピュータシステムであってもよく，汎用コンピュータであってもよい（Ｘ線結晶学システム中のセンサー装置などのその他の設備とデータ接続を有することができる）。多くの場合，このような電子表示によって示される情報はまた，例えば，紙に，画像表示として（例えば，２次元としてまたは疑似三次元画像としてコンピュータモニター上に）または三次元物理的モデルとして，物理的にまたは視覚的に二次元または三次元で表すことができる。このような物理的表示はまた，単独または電子表示と関連して使用できる。例示的な有用な表示としては，それだけには限らないが，以下のものが挙げられる。
【０２４９】
原子座標表示
表示の１つの型として，分子構造，構造の一部または複合体（例えば，共結晶）中の特定の原子の位置を表す原子座標の羅列または表がある。このような表示はまた，さらなる情報，例えば特定の座標の占有率に関する情報を含み得る。１つのこのような原子座標表示は，米国特許仮出願 ６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願, すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１の座標情報を電子形式で含む。
【０２５０】
エネルギー表面または相互作用表面表示
別の表示としては，例えば，活性部位またはその他の結合部位のエネルギー表面表示があり，これは電子および立体相互作用のエネルギー表面を表す。このような表示もまたその他の特徴を含み得る。例としては，特定のアミノ酸残基または特定のアミノ酸残基上の基，例えば，Ｈ結合もしくはイオン性相互作用に参加し得る残基または基の表示を含むことができる。このようなエネルギー表面表示は種々の利用可能なコンピュータプログラムのいずれかを用いて原子座標表示から容易に作製することができる。
【０２５１】
構造表示
さらにもう１つの表示として構造表示，すなわち，物理的表示またはこのような物理的表示の電子表示がある。このような構造表示としては，分子または複合体の特定の特徴の関連位置の表示が挙げられるが，これは構造的特徴間の結合に関することが多い。例えば，中でも，すべての原子が結合している；水素以外の原子が結合している；重大な電子相互作用に参加し得る側鎖原子の表示は含むか含まない，主鎖原子が結合している構造を表すことができる。しかし，すべての特徴が結合している必要はない。例えば，分子または複合体の一部の構造表示については，特徴を表すことができるために構造的特徴（例えば，結合部位でリガンドとの有意な結合相互作用を有し得るアミノ酸残基の原子）は重大である。そのようなアミノ酸残基は互いに結合していない場合もある。
【０２５２】
構造表示はまた，図式表示でもあり得る。例えば，図式表示は図式的に二次および／または三次構造を表すことができる。このようなポリペプチドの図式表示内に，特定のアミノ酸残基もしくは残基上の基，例えば，結合部位中の保存された残基，および／または結合化合物と相互作用し得る残基もしくは基を含めることができる。電子構造表示は，例えば，その機能のために設計されたコンピュータプログラムを用いて原子座標情報から，および／または別の形の構造情報の解釈に基づいて手動入力で電子表示を構築することによって作製できる。物理的表示は，例えば，コンピュータ生成画像の画像を印刷することによって，または３Ｄモデルを構築することによって作製できる。
【０２５３】
ＶＩＩ．構造座標を用いる，構造未知のホスホジエステラーゼの構造決定
構造座標，例えば米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願,すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１に示されるものを用いて，構造未知のホスホジエステラーゼの三次元構造を決定することができる。以下に記載した方法は，構造既知のポリペプチドの構造座標を，別のデータセット，例えばアミノ酸配列，Ｘ線結晶学回析データまたは核磁気共鳴（ＮＭＲ）データに適用することができる。本発明の好ましい実施形態は，修飾されたホスホジエステラーゼ，その他の天然ホスホジエステラーゼおよび関連ポリペプチドの三次元構造を決定することに関する。
【０２５４】
アミノ酸相同性を用いる構造
ホモロジーモデリングは，構造既知のポリペプチドの構造座標を，構造未知のポリペプチドのアミノ酸配列に適用する方法である。この方法は，ポリペプチドまたはポリペプチド複合体の三次元構造のコンピュータ表示，構造既知および未知のポリペプチドのアミノ酸配列のコンピュータ表示，およびアミノ酸の構造の標準コンピュータ表示を用いて達成する。ホモロジーモデリングは一般に，（ａ）既知構造を有する，および有さないポリペプチドのアミノ酸配列をアラインすることと，（ｂ）既知構造中の保存されたアミノ酸の座標を，構造未知のポリペプチドの対応するアミノ酸に移すこと，その結果生じる三次元構造を精密化することと，（ｄ）残りのポリペプチドの構造を構築することとを含む。当業者ならば，ステップ（ａ）における配列アラインメントステップから，２つのタンパク質間で保存されたアミノ酸を決定できることは承知している。
【０２５５】
前記の方法は当業者にはよく知られている（グリア(Greer)（１９８５）サイエンス(Science)２２８：１０５５頁）；ブランデル(Blundell)ら．Ａ（１９８８）ヨーロピアン・ジャーナル・オブ・バイオケミストリー(European Journal of Biochemistry)１７２：５１３頁。当業者によってホモロジーモデリングに利用できる例示的コンピュータプログラムとしては，アクセレリス社(Accelerys Inc.)によって流通されているインサイト(Insight)IIモデリングパッケージ中のホモロジーモジュールがある。
【０２５６】
アミノ酸配列のアラインメントは，まず構造既知のポリペプチドのアミノ酸配列のコンピュータ表示を，構造未知のポリペプチドのアミノ酸配列の上に置くことによって達成する。次いで，配列中のアミノ酸を比較し，相同であるアミノ酸の群（例えば，化学的性質−脂肪族，芳香族，極性または帯電において同様であるアミノ酸側鎖）を一緒にしてグループ化する。この方法によって，ポリペプチドの保存された領域が検出され，アミノ酸挿入または欠失が明らかとなる。このようなアラインメントおよび／または，配列アラインメントおよび解析ソフトウェアを用いて完全に電子的に実施できる。
【０２５７】
構造既知および未知のポリペプチドのアミノ酸配列をアラインすると，構造既知のポリペプチドのコンピュータ表示中の保存されたアミノ酸の構造を，構造が未知であるポリペプチドの対応するアミノ酸に移す。例えば，既知構造のアミノ酸配列中のチロシンをフェニルアラニン，未知構造のアミノ酸配列中の対応する相同アミノ酸で置き換えることができる。
【０２５８】
非保存領域中に位置するアミノ酸の構造は，標準ペプチド幾何学または分子シミュレーション技術，例えば分子ダイナミクスのいずれかを用いて手作業で割り当てるべきものである。プロセスの最終ステップは，分子ダイナミクスおよび／またはエネルギー最小化を用いて全構造を精密化することによって達成する。ホモロジーモデリング法は当業者にはよく知られており，種々のタンパク質分子を用いて実施されている。例えば，セリン／トレオニンタンパク質キナーゼ，ミオシン軽鎖タンパク質キナーゼの触媒ドメインに相当するポリペプチドの三次元構造が，ｃ−ＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ触媒サブユニットからホモロジーモデリングされた。（ナイトン(Knighton)ら（１９９２）サイエンス２５８：１３０〜１３５頁）。
【０２５９】
分子置換を用いる構造
分子置換は，構造既知のポリペプチドのＸ線回析データを，配列未知のポリペプチドのＸ線回析データに適用する方法である。この方法を利用して，振幅が既知である場合にのみ構造未知のポリペプチドのＸ線回析データを表す位相を規定することができる。Ｘ−ＰＬＯＲは，分子置換のために用いられる，広く用いられているコンピュータソフトウェアパッケージである。ブルンガー(Brunger)（１９９２）ネイチャー３５５：４７２〜４７５頁。ＡＭＯＲＥは，分子置換に用いられるもう１つのプログラムである。ナバザ(Navaza)（１９９４）アクタ・クリスタログラフィカ(Acta Crystallographica)Ａ５０：１５７〜１６３頁。得られた構造は３Åより大きい二乗平均平方根偏差を示さないことが好ましい。
【０２６０】
分子置換の目標は，２種の結晶から得た電子回析データをマッチさせることによって単位セル中の原子の位置をアラインすることである。Ｘ−ＰＬＯＲなどのプログラムは４つのステップを含み得る。第1のステップは，単位セル中の分子数を決定することおよびそれらの間の角度を規定することであり得る。第２のステップは，単位セル中の分子の配向を規定するために回析データを回転させることを含み得る。第３のステップは，単位セル中の分子を正しく位置づけるために三次元の電子密度を翻訳することであり得る。Ｘ回析データの振幅および位相が決定されると，参照データセットから実験によって算出された電子回析マップと新規データセットから算出された電子回析マップとを比較することによってＲ因子を算出することができる。３０〜５０％の間のＲ因子は，この方法によって単位セル中の原子の配向が合理的に決定されていることを示す。プロセスの第４のステップは，本明細書に記載される，および当業者に公知の反復精密化技術を用いて新規電子密度マップを精密化することによってＲ因子を約２０％に低下させることであり得る。
【０２６１】
ＮＭＲデータを用いる構造
Ｘ線結晶学技術から得られたポリペプチドまたはポリペプチド複合体の構造座標を，核磁気共鳴（ＮＭＲ）データからのポリペプチドの三次元構造の解明に向けて適用することができる。この方法は当業者には用いられている。（ビュートリッヒ(Wuthrich)（１９８６），ジョン・ウィレー・アンド・サンズ，ニューヨーク：１７６〜１９９頁；プフルグラス(Pflugrath)ら（１９８６）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)１８９：３８３〜３８６頁；クライン(Kline)ら（１９８６）ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー１８９：３７７〜３８２頁）。ポリペプチドの二次構造は二次元ＮＮＲデータを用いることによって容易に決定されることが多いが，二次構造の個々の要素間の空間的関係は同じようには容易に決定できない。Ｘ線結晶学技術から得られたポリペプチドの三次元構造を規定する座標は，ＮＭＲ分光学者を，関連構造のポリペプチド中の二次構造要素間のこういった空間的相互関係の理解へ導き得る。
【０２６２】
二次構造要素間の空間的相関関係についての知識によって，二次元ＮＭＲ実験から得られる核オーバーハウザー効果（ＮＯＥ）データが大幅に単純化され得る。さらに，ＮＭＲ技術によって二次構造を決定した後に結晶学座標を適用することは，ポリペプチド配列中の特定のアミノ酸に関連するＮＯＥの割り当てが単純化されるだけで，ポリペプチド構造のＮＭＲ解析に大きくバイアスをかけるものではない。逆に言えば，ポリペプチドの二次構造を決定しながらＮＯＥデータを単純化するために結晶学座標を用いることは，タンパク質構造のＮＭＲ解析にバイアスをかける。
【０２６３】
ＶＩＩＩ．構造座標を用いるホスホジエステラーゼ機能の調節剤の構造ベースの設計
構造ベースの調節剤設計および同定法は強力な技術であり，これは多種多様な潜在的調節剤および化学官能基を含むコンピュータデータベースの検索を含み得る。調節剤のコンピュータ化した設計および同定は，コンピュータデータベースが，化学ライブラリーよりも，しばしば１桁規模で多くの化合物を含むので有用である。構造ベースの薬物設計および同定の概説については，カンツ(kuntz)ら（１９９４），アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ(Accounts of Chemical Research)２７：１１７頁，ガイダ(Guida)（１９９４）カレント・オピニオン・イン・ストラクチャラル・バイオロジー(Current Opinion in Structural Biology)４：７７７頁，コールマン(Colman)（１９９４）カレント・オピニオン・イン・ストラクチュラル・バイオロジー４：８６８頁参照。
【０２６４】
構造座標によって規定されるポリペプチドの三次元構造を，これらの設計法，例えば，米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願,すべての目的のためにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１の構造座標によって利用できる。さらに，本明細書に記載される，ホモロジー，分子置換およびＮＭＲ技術によって決定されるホスホジエステラーゼの三次元構造もまた調節剤設計および同定法に適用できる。
【０２６５】
調節剤を同定するために，天然ホスホジエステラーゼの構造情報，特に，ホスホジエステラーゼの活性部位の構造情報を使用できる。しかし，ホスホジエステラーゼと1種以上の結合化合物との1種以上の共結晶から得られる構造情報を利用することは有利であり得る。また，結合化合物が試験化合物に共通する構造コアを有する場合にも有利であり得る。
【０２６６】
分子データベースの検索による設計
合理的設計の一方法では，分子のデータベースから得た化合物のコンピュータ表示をドッキングすることによって調節剤を検索する。公的に入手可能なデータベースとしては，例えば以下のものがある：
ａ）モレキュラー・デザインズ・リミテッド(Molecular Designs Limited)製のＡＣＤ
ｂ）国立癌研究所製のＮＣＩ
ｃ）ケンブリッジ結晶データセンター製のＣＣＤＣ
ｄ）ケミカル・アブストラクト・サービス(Chemical Abstract Service)製のＣＡＳＴ
ｅ）ダーウェント・インフォメーション・リミテッド(Derwent Information Limited)製のダーウェント(Derwent)
ｆ）メイブリッジ・ケミカル・カンパニー(Maybridge Chemical Company)ＬＴＤ製のメイブリッジ(Maybridge)
ｇ）アルドリッチ・ケミカル・カンパニー(Aldrich Chemical Company)製のアルドリッチ(Aldrich)
ｈ）チャップマン＆ホール(Chapman & Hall)製の天然物のディレクトリ。
【０２６７】
このようなデータベースの１つ（モレキュラー・デザインズ・リミテッド・インホメーション・システムズ(Molecular Designs Limited Information Systems)によって流通されているＡＣＤ）には，合成によって誘導されたか，天然物である化合物が含まれている。当業者に利用できる方法によって，二次元で表されるデータセットを，三次元で表されるものへ変換することができる。これらの方法は，トライポス・アソシエイテス(Tripos Associates)製のＣＯＮＣＯＲＤまたはモレキュラー・シミュレーションズ・リミテッド(Molecular Simulations Limited)製のＤＥ−コンバーター(Converter)のようなコンピュータプログラムによって可能である。
【０２６８】
当業者には，構造ベースの調節剤設計の複数の方法が知られている。（カンツ(Kuntz)ら，（１９８２），ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)１６２：２６９頁，カンツら，（１９９４），アカウンツ・オブ・ケミカル・リサーチ(Accounts of Chemical Research)２７：１１７頁；メン(Meng)ら，（１９９２），ジャーナル・オブ・コンピュータ・ケミストリー(Journal of Computer Chemistry)１３：５０５頁；ボーム(Bohm)，（１９９４），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン(Journal of Computer-Aided Molecular Design)８：６２３頁）。
【０２６９】
合理的調節剤設計の当業者に広く用いられているコンピュータプログラムとして，カリフォルニア大学サンフランシスコ校製のＤＯＣＫがある。このコンピュータプログラムおよびそのようなプログラムによって利用される一般的な方法を，以下の３つの適用で説明する。これらの技術のいくつかに関するより詳細な情報は，アクセレリス・ユーザー・ガイド１９９５に見出すことができる。この目的に用いられる通常のコンピュータプログラムは，以下のステップまたは機能を含むプロセスを実施できる：
（ａ）タンパク質から既存の化合物を除去すること，
（ｂ）コンピュータプログラム（ＤＯＣＫなど）を用いて，または化合物を活性部位にインタラクティブに移動させることによって，別の化合物の構造を活性部位にドッキングすること，
（ｃ）化合物と活性部位原子間の空間を特性決定すること，
（ｄ）（ｉ）化合物と活性部位の間の空の空間にフィッティングでき，（ｉｉ）化合物と結合できる分子断片のライブラリーを検索すること，
（ｅ）前記で見出した断片を化合物に結合させ，新規の修飾された化合物を評価すること。
【０２７０】
パート（ｃ）は，活性部位の原子と化合物の間に形成される幾何学および相補的相互関係を特性決定することを指す。好都合な幾何学的適合性は，化合物と活性部位原子間に，都合の悪い立体的相互作用を形成せずに相当な表面積が共有される場合に得られる。当業者ならば，本方法はパート（ｄ）および（ｅ）を省略し，多数の化合物のデータベースをスクリーニングすることによって実施できるということは気付くであろう。
【０２７１】
ホスホジエステラーゼ機能の調節剤の構造ベースの設計および同定はアッセイスクリーニングとともに使用できる。化合物のより大きなコンピュータデータベース（約１０，０００種の化合物）を，ほんの数時間またはさらに短い間で検索できるので，コンピュータベースの方法によって，ホスホジエステラーゼ機能の潜在的調節剤として生化学または細胞アッセイにおいて試験される化合物を縮小できる。
【０２７２】
構造ベースの調節剤設計についての前記の説明は，すべてを包含しているわけではなく，文献にはその他の方法も報告されており，使用することができる。例えば：
（１）ＣＡＶＥＡＴ：ケミカル・アンド・バイオロジカル・プロブレムズ・イン・モレキュラー・レコグニション(Chemical and Biological Problems in Molecular Recognition)，中のバートレット(Bartlett)ら，（１９８９），ロバート(Roberts) ，Ｓ．Ｍ．，レイ(Ley) ，Ｓ．Ｖ．，キャンベル(Campbell)，Ｍ．Ｍ．編，ロイヤル・ソサイエティー・オブ・ケミストリー(Royal Society of Chemistry，ケンブリッジ１８２〜１９６頁。
（２）ＦＬＯＧ：ミラー(Miller)ら，（１９９４），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン(Journal of Computer-Aided Molecular Design)８：１５３頁。
（３）ＰＲＯ  調節剤：クラーク(Clark)ら，（１９９５），ジャーナル・オブ・コンピュータ−エイデド・モレキュラー・デザイン９：１３頁。
（４）ＭＣＳＳ：ミランカー(Miranker)およびカープラス(karplus)，（１９９１），プロテインズ(Proteins)：ストラクチャー，ファンクション，アンド・ジェネティクス(Structure, Function, and Genetics)１１：２９頁。
（５）ＡＵＴＯＤＯＣＫ：グッドセル(Goodsell)およびオルソン(Olson)，（１９９０），プロテインズ：ストラクチャー，ファンクション，アンド・ジェネティクス８：１９５頁。
（６）ＧＲＩＤ：グッドフォード(Goodford)，（１９８５），ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry)２８：８４９頁。
【０２７３】
ＰＤＥ４Ｂとの複合体中の化合物を修飾することによる設計
潜在的調節剤として化合物を同定するもう１つの方法は，既存の調節剤をポリペプチド活性部位において修飾することである。例えば，調節剤のコンピュータ表示を，ＰＤＥ４Ｂ活性部位のコンピュータ表示内で修飾することができる。この技術のための詳細な指示は，例えば，ＬＵＤＩ中，アクセレリス・ユーザー・マニュアル(Accelerys User Manual)，１９９５に見出すことができる。調節剤のコンピュータ表示は，通常，化学基または複数の化学基を欠失させることまたは化学基または複数の化学基を付加することによって修飾する。
【０２７４】
化合物への各修飾の際に，修飾される化合物および活性部位の原子を，立体構造中でシフトすることができ，２つの分子間に形成される何らかの相補的相互作用とともに調節剤と活性部位原子間の距離のスコアをつけることができる。スコアリングは，好都合な幾何学的適合性および好都合な相補的相互作用が得られた時に完了できる。好都合なスコアを有する化合物が潜在的調節剤である。
【０２７５】
ＰＤＥ４Ｂと結合する化合物の構造を修飾することによる設計
構造ベースの調節剤設計の第３の方法は，調節剤構築または調節剤検索コンピュータプログラムによって設計された化合物をスクリーニングすることである。こういった種類のプログラムの例は，モレキュラー・シミュレーションズ・パッケージ，カタリスト(Molecular Simulations Package,Catalyst)に見出すことができる。このプログラムを用いるための説明はモレキュラー・シミュレーションズ・ユーザー・ガイド（１９９５）に記録されている。この適用に用いられるその他のコンピュータプログラムとしては，モレキュラー・デザインズ・リミテッド(Molecular Designs Limited)製のＩＳＩＳ／ＨＯＳＴ，ＩＳＩＳ／ＢＡＳＥ，ＩＳＩＳ／ＤＲＡＷおよびトライポス・アソシエーテス(Tripos Associates)製のＵＮＩＴＹがある。
【０２７６】
これらのプログラムは，化合物−ホスホジエステラーゼ複合体の三次元構造の活性部位から除去された化合物の構造上で動作させることができる。このような化合物上でプログラムを動作させることは，それが生物学的に活性な立体構造にあるために好ましい。
【０２７７】
調節剤構築コンピュータプログラムとは，ホスホジエステラーゼまたはその他の生体分子と複合体を形成している化合物中の複数の化学基のコンピュータ表示を，コンピュータデータベースから得た複数の基で置き換えるために使用できるコンピュータプログラムである。調節剤検索コンピュータプログラムとは，コンピュータデータベースから，特定の生体分子と結合している化合物と同様の三次元構造および同様の化学基を有する化合物のコンピュータ表示を検索するために使用できるコンピュータプログラムである。
【０２７８】
通常のプログラムは，以下の一般的なステップを用いることによって動作し得る：
（ａ）化合物を，水素結合ドナーまたはアクセプター，疎水性／親油性部位，正にイオン化可能な部位または負にイオン化可能な部位などの化学的特徴によってマッピングすること；
（ｂ）マッピングされた特徴に幾何学的制約を加えること；および
（ｃ）（ｂ）で作製したモデルでデータベースを検索すること。
【０２７９】
当業者ならば，（ｂ）のモデルには化合物のすべての可能な化学的特徴が存在する必要はないということも認識している。モデルのいずれかのサブセットを使用して，データベース検索のための種々のモデルを作製することができる。
【０２８０】
分子スキャフォールドを用いる調節剤設計
本発明はまた，分子ファミリーに広く作用できる分子スキャフォールドと称される化合物を設計する方法，および／または分子スキャフォールドを使用して，そのようなファミリーの個々のメンバーまたは複数のメンバーを標的とするリガンドを設計する方法を利用できることが有利である。このような分子スキャフォールドを用いる設計は，参照によりその全文が本明細書に組み込まれる，ヒルト(Hirth)およびミルバーン(Milburn)，米国特許出願１０／３７７，２６８に記載されている。このような分子スキャフォールドを用いる設計および開発を，一部，以下に記載する。
【０２８１】
好ましい実施形態では，分子はタンパク質であることができ，１）特定のタンパク質ファミリーに作用するよう化学的に設計されており，かつ／または，２）より分子スキャフォールドに近い挙動をする特性を有する，つまり，それらが，それらを注目するファミリー中の1種以上のタンパク質との結合に対して特異的にする化学的部分構造を有することを意味する化学化合物のセットを集めることができる。あるいは，個々の標的分子に対して選択的に活性である分子スキャフォールドを設計できる。
【０２８２】
分子スキャフォールドの有用な化学的特性は，以下の特徴のうちの１以上を含み得るがそれに限定されるものではない：約３５０ダルトンより小さい，または約１５０〜約３５０ダルトンの間，または約１５０〜約３００ダルトンの間の平均分子量；ｃｌｏｇＰが３より低いこと；回転可能な結合数が４未満である；水素結合ドナーおよびアクセプターの数が５より少ないか，または４より少ないこと；極性表面積が５０Å2未満であること；スキャフォールドと結合しているコンビナトリアルライブラリーから得た化学置換基がタンパク質結合部位中のポケット中に突き出ることができるような配向でのタンパク質結合部位での結合；および置換基結合点に化学的に扱いやすい構造を有し，それを修飾でき，それによって迅速にライブラリー構築が可能となること。
【０２８３】
「ｃｌｏｇＰ」とは，化合物の算出されたｌｏｇＰを意味し，「Ｐ」はオクタノールと水の間の分配計数を指す。
【０２８４】
用語「分子の極性表面積（ＰＳＡ）」とは，分子中の極性原子（通常，酸素，窒素および結合されている水素）の表面寄与の合計を指す。極性表面積は薬物輸送特性，例えば腸内吸収または血液脳関門透過と十分に相関があることがわかっている。
【０２８５】
コンビナトリアルライブラリーに含めるための，別個の化合物のさらなる有用な化学的特性としては，化合物の，少なくとも１種の注目するタンパク質との結合を妨害せず，ライブラリーメンバーに所望の特性を付与する化学部分を化合物に結合させる，例えば，ライブラリーメンバーを，注目する細胞および／または器官に活発に輸送されるようにする能力，または組織などの用途のため，およびプロテオミクスプロファイリング目的のクロマトグラフィーカラム（例えば，ビオチンなどの分子を介するストレプトアビジンカラム）などの装置を結合させる能力が挙げられる。
【０２８６】
当業者ならば，使用するための特定の必要条件に応じてスキャフォールドまたはライブラリーメンバーが有すること望ましいものであり得るその他の特性，およびこういった特性を有する化合物も，同様に探し，同定することができるということを認識するであろう。アッセイのために化合物を選択する方法は，当業者には知られており，例えば，米国特許題６，２８８，２３４号，同６，０９０，９１２号，同５，８４０，４８５号に記載された方法および化合物があり，これらの各々は参照により，すべての図表および図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる。
【０２８７】
種々の実施形態では，本発明は，分子ファミリーの複数のメンバーと結合し，共通の分子スキャフォールドを含むリガンドを設計する方法を提供する。すなわち，化合物セットを，分子ファミリー，例えば，タンパク質ファミリーの複数のメンバーとの結合についてアッセイすることができる。複数のファミリーメンバーと結合する１種以上の化合物を，分子スキャフォールドとして同定できる。標的分子の結合部位でのスキャフォールドの配向が決定されており，化学的に扱いやすい構造が同定されている場合は，１種または数種の分子スキャフォールドから開始してリガンドのセットを合成して，複数のリガンドに到達することができ，ここで各リガンドは，スキャフォールドに対して変更されたまたは変化した結合親和性または結合特異性で分子ファミリーの別個の標的分子と結合する。したがって，同一の分子スキャフォールドに基づいて分子ファミリーの個々のメンバーを選択的に標的とし，それらに対して特異的に作用する複数の薬物リード分子が設計できる。
【０２８８】
ＩＸ．結合アッセイ
本発明の方法は，化合物と標的分子との結合を検出できるアッセイを含み得る。統計的に有意水準でのこのような結合は，アッセイシグナルが標的分子との結合を表す，すなわちバックグラウンドとは区別されるという，少なくとも９０％の信頼水準を有することが好ましく，少なくとも９５，９７，９８，９９％またはより大きな信頼水準を有することがより好ましい。対照を用いて標的結合を非特異的結合と区別することが好ましい。本発明のアッセイはまた，標的分子との低親和性結合について化合物をアッセイすることを含み得る。種々の標的型について，結合を示す多種多様なアッセイが知られており，本発明に使用できる。タンパク質ファミリーにわたって広く作用する化合物は，その結合性が広いことから個々の標的に対して高親和性を有する可能性は低い。したがって，本明細書に記載されるアッセイは，低親和性，極めて低い親和性，および極度に低い親和性で結合する化合物の同定を考慮する。したがって，作用強度（すなわち結合親和性）は，有用である可能性のある結合化合物の第一義的なものでもなく，さらに最も重要なものでもない，同定のしるしである。むしろ，低親和性，極めて低い親和性または極度に低い親和性で結合する化合物でさえ，リガンド設計プロセスの次のフェーズに続けることができる分子スキャフォールドとして考えることができる。
【０２８９】
「低親和性」での結合とは，標準条件下での解離定数（ｋd）が１μＭより大きい標的分子との結合を意味する。「極めて低い親和性」での結合とは，標準条件下での前記のｋdが約１００μＭである結合を意味する。「極めて低い親和性」での結合とは，標準条件下での前記のｋdが約１ｍＭである結合を意味する。「中程度の親和性」とは，標準条件下でのｋdが約２００ｎＭ〜約１μＭである結合を意味する。「中程度に高い親和性」とは，ｋdが約１ｎＭ〜約２００ｎＭの結合を意味する。「高親和性」での結合とは，標準条件下でのｋdが約１ｎＭより低い結合を意味する。例えば，低親和性結合は，標的分子の結合部位への低い適合のために，またはスキャフォールドもしくはリガンドの標的分子の結合部位との結合を引き起こすよう存在する，より高い親和性結合が生じる場合と比較して少数の非共有結合，もしくは弱い共有結合のために生じ得る。結合の標準条件とは，ｐＨ７．２，３７℃で１時間である。例えば，ＨＥＰＥＳ  ５０ｍＭバッファー，ｐＨ７．２，ＮａＣｌ  １５ｍＭ，ＡＴＰ  ２μＭおよびウシ血清アルブミン１μｇ／ウェルの１００μｌ／ウェルを３７℃で１時間使用できる。
【０２９０】
結合化合物はまた，標的分子の活性に対するその作用によって特性決定できる。したがって「低活性」化合物は，標準条件下で１μＭより高い阻害濃度（ＩＣ50）または励起濃度（ＥＣ50）を有する。「極めて低い活性」とは，標準条件下で約１００μＭというＩＣ50またはＥＣ50を意味する。「極度に低い活性」とは，標準条件下で約１ｍＭというＩＣ50またはＥＣ50を意味する。「中程度の活性」とは，標準条件下で２００ｎＭ〜１μＭというＩＣ50またはＥＣ50を意味する。「中程度に高い活性」とは，１ｎＭ〜２００ｎＭというＩＣ50またはＥＣ50を意味する。「高い活性」とは，標準条件下で１ｎＭより低いＩＣ50またはＥＣ50を意味する。ＩＣ50（またはＥＣ50）は，化合物が存在しない場合の活性と比較して，測定されている標的分子（例えば，酵素またはその他のタンパク質）活性の５０％の活性が失われる（または獲得される）化合物の濃度として規定される。活性は当業者に公知の方法を用いて，例えば，酵素反応の出現によって生じたいずれかの検出可能な産物またはシグナル，または測定されているタンパク質によるその他の活性を測定することによって測定できる。
【０２９１】
結合アッセイに関連して，「バックグラウンドシグナル」とは，標的分子と結合する，試験化合物，分子スキャフォールド，またはリガンドの不在下において特定のアッセイの標準条件下で記録されるシグナルを意味する。当業者ならば，バックグラウンドシグナルを決定するための認められた方法が存在し，広く利用可能であるということは理解されよう。
【０２９２】
「標準偏差」とは，分散の平方根を意味する。分散は分布がどのように広がっているかという尺度である。その平均から各数の平均偏差平方としてコンピュータによって計算される。例えば，数１，２および３については，平均は２であり，分散は以下である：
【数１】
2008503446.tif 000022
【０２９３】
タンパク質ファミリーにわたって広く作用するスキャフォールドを設計または発見するためには，注目するタンパク質を，化合物収集物またはセットに対してアッセイできる。アッセイは酵素アッセイまたは結合アッセイであり得ることが好ましい。いくつかの実施形態では，スクリーニングされている化合物の可溶性を高め，次いで，低親和性で結合するものまたはバックグラウンドシグナルの標準偏差の約３倍大きなシグナルを生じるものを含む，アッセイにおいて活性を示すすべての化合物を解析することが望ましい場合がある。アッセイは適したアッセイであればいずれであってもよく，例えば，２種の結合パートナー間の結合親和性を測定する結合アッセイなどがある。本発明の実施において有用であり得る各種スクリーニングアッセイは当技術分野では公知であり，例えば米国特許第５，７６３，１９８号，同５，７４７，２７６号，同５，８７７，００７号，同６，２４３，９８０号，同６，２９４，３３０号および同６，２９４，３３０号に記載されたものがあり，これらの各々は参照により，すべての図表および図面を含むその全文が本明細書に組み込まれる。
【０２９４】
アッセイの種々の実施形態では，少なくとも１種の化合物，少なくとも約５％，少なくとも約１０％，少なくとも約１５％，少なくとも約２０％または少なくとも約２５％の化合物が低親和性で結合し得る。一般に，化合物の約２０％までが，スクリーニングアッセイにおいて活性を示すことができ，次いで，これらの化合物をハイスループット共結晶学，化合物を共通の構造特性（例えば，構造コアおよび／または形および極性特性）を有するクラスに分類するコンピュータによる解析，および活性を示す化合物間の共通化学構造の同定を用いて直接解析できる。
【０２９５】
当業者ならば，決定は特定の状況の必要性にとって適切である基準に基づいたものであり得るということ，および決定はコンピュータソフトウェアプログラムによってなすことができるということは理解されよう。ほとんどどんな数のスキャフォールドも含んでクラスを作製でき，選択される基準は，任意の数のスキャフォールドが，有利であると思われる各クラスに到達するまで，徐々に厳しい基準に基づくものであり得る。
【０２９６】
表面プラスモン共鳴
結合パラメーターは表面プラスモン共鳴を用いて，例えば，固定化された結合成分でコーティングされたビアコア(BIAcore)（登録商標）チップ（ビアコア，ジャパン(Biacore， Japan)）を用いて測定できる。表面プラスモン共鳴を用いて，ｓＦｖまたは標的分子に対するその他のリガンド間の反応の微視的結合定数および解離定数を特性決定する。このような方法は，参照により本明細書に組み込まれる以下の参照文献に概説されている。ベリー(Vely)Ｆら，（２０００）ホスホペプチド−ＳＨ２ドメイン相互作用を調べるためのビアコア（登録商標）解析(BIAcore(R) analysis to test phosphopeptide-SH2 domain interactions)，メソッズ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods in Molecular Biology)１２１：３１３〜２１頁，リパロト(Liparoto)ら，（１９９９）インターロイキン−２受容体複合体のバイオセンサー解析(Biosensor analysis of the interleukin-2 receptor complex)，ジャーナル・オブ・モレキュラー・レコグニッション(Journal of Molecular Recognition)１２：３１６〜２１頁，リップシュルツ(lipschultz)ら，（２０００）表面プラスモン共鳴を用いる複合体動力学の解析のための実験設計(Experimental design for analysis of complex kinetics using surface plasmon resonance)，メソッヅ(Methods)２０（３）：３１０〜８頁，マルムクヴィスト(Malmqvist)，（１９９９）ビアコア：生体分子の相互作用を特性決定するための親和性バイオセンサーシステム(BIACORE: an affinity biosensor system for characterization of biomolecular interactions)，バイオケミカル・ソサイエティー・トランサクションズ２７：３３５〜４０頁，アルサン(Alfthan)，（１９９８）抗体工学におけるツールとしての表面プラスモン共鳴バイオセンサー(Surface plasmon resonance biosensors as a tool in antibody engineering)，バイオセンサーズ＆バイオエレクトロニクス(Biosensors & Bioelectronics)１３：６５３〜６３頁，フィバッシュ(Fivash)ら，（１９９８）高分子相互作用のためのビアコア(BIAcore for macromolecular interaction)，カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー(Current Opinion in Biotechnology)９，９７〜１０１頁，プライス(Price)ら，（１９９８）ＩＳＯＢＭ  ＴＤ−４ワークショップでの概略報告：ＭＵＣ１ムチンに対する５６種のモノクローナル抗体の解析(Summary report on the ISOBM TD-4 Workshop: analysis of 56 monoclonal antibodies against the MUC1 mucin.)チューモア・バイオロジー(Tumour Biology)１９付録１：１〜２０頁，マルムクヴィスト(Marmqvist)ら，（１９９７）生体分子相互作用解析：タンパク質の機能解析のための親和性バイオセンサー技術(Biomolecular interaction analysis: affinity biosensor technologies for functional analysis of proteins)，カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Current Opinion in Chemical Biology)１：３７８〜８３頁，オーシャネシー(O'Shannessy)ら，（１９９６），バイオセンサー技術によるリガンド結合の特性決定における偽一次速度式挙動から得た偏差の解釈(Interpretation of deviations from pseudo-first-order kinetic behavior in the characterization of ligand binding by biosensor technology)，アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)２３６：２７５〜８３頁，マルムボリ(Malmborg)ら，（１９９５）抗体工学におけるツールとしてのビアコア(BIAcore as a tool in antibody engineering)，ジャーナル・オブ・イムノロジカル・メソッヅ(Journal of lmmunological Methods.)１８３：７〜１３頁，ヴァン・レゲンモルテ��(Van Regenmortel)，（１９９４）組換えタンパク質を特性決定するためのバイオセンサーの使用(Use of biosensors to characterize recombinant proteins)，デベロップメンツ・イン・バイオロジカル・スタンダーダイゼーション(Developments in Biological Standardization)８３：１４３〜５１頁およびオーシャネシー(O'Shannessy)，（１９９４）高分子相互作用の運動速度定数および平衡結合定数の決定：表面プラスモン共鳴文献の批評(Determination of kinetic rate and equilibrium binding constants for macromolecular interactions: a critique of the surface plasmon resonance literature)，カレント・オピニオンズ・イン・バイオテクノロジー(Current Opinions in Biotechnology)５：６５〜７１頁。
【０２９７】
ビアコア（登録商標）は表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）の光学特性を使用して，金／ガラスセンサーチップインターフェース，デキストランバイオセンサーマトリックスの表面に位置するデキストランマトリックスに結合しているタンパク質濃度の変化を検出する。簡潔には，タンパク質は既知の濃度でデキストランマトリックスと共有結合しており，タンパク質のリガンドをデキストランマトリックスを通して注入する。センサーチップ表面の反対側に向けられた近赤外線が反射され，また，金フィルム中にエバネセント波を誘導し，これが順に，共鳴角として知られる特定の角度での反射光の強度低下を引き起こす。センサーチップ表面の屈折率が変更されれば（例えば，リガンドの，結合されるタンパク質への結合によって），共鳴角のシフトが生じる。この角度シフトを測定でき，１０００ＲＵが１ｎｇ／ｍｍ2という表面タンパク質濃度の変化に相当するような共鳴単位（ＲＵ）として表す。これらの変化は，センサーグラム(sensorgram)のｙ軸に沿って時間に関して表示され，これはいずれかの生物反応の会合および解離を表す。
【０２９８】
ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）アッセイ
ＨＴＳは通常自動化アッセイを用いて，所望の活性について多数の化合物を検索する。通常，ＨＴＳアッセイは，特定の酵素または分子に対して作用する化学物質についてスクリーニングすることによって新規薬物を見出すために用いる。例えば，ある化学物質が酵素を不活化する場合に，疾病を引き起こす細胞内プロセスの阻止において有効であるとわかる場合がある。ハイスループット法によって研究者が，ロボットハンドリングシステムおよび結果の自動解析を用いて各標的分子に対して何千もの種々の化学物質を極めて迅速にアッセイすることが可能になる。
【０２９９】
本明細書において，「ハイスループットスクリーニング」または「ＨＴＳ」とは，ロボットスクリーニングアッセイを用いる，多数の化合物（ライブラリー），通常，数十〜数十万の化合物の迅速なインビトロスクリーニングを指す。ウルトラハイスループットスクリーニング（ｕＨＴＳ）は通常，１日当たり１００，０００より多くの試験に加速されたハイスループットスクリーニングを指す。
【０３００】
ハイスループットスクリーニングを達成するためには，サンプルをマルチコンテナ担体またはプラットフォームに保管することが有利である。マルチコンテナ担体によって，複数の候補化合物の同時測定反応が容易になる。マルチウェルマイクロプレートも担体として使用できる。このようなマルチウェルマイクロプレートおよび多数のアッセイにおけるその使用方法は当技術分野では公知であるだけでなく，市販もされている。
【０３０１】
スクリーニングアッセイには，校正目的およびアッセイの要素の適切な操作を確認する目的で対照を含めることができる。通常は反応物のすべてを含むが化学ライブラリーのメンバーは含まないブランクウェルを含める。もう１つの例として，調節剤が探索されている酵素の既知の阻害剤（またはアクチベーター）を，アッセイの一サンプルと共にインキュベートしてもよく，得られた酵素活性の低下（または増加）をコンパレータまたは対照として用いる。当然のことながら，調節剤を酵素アクチベーターまたは阻害剤と組合せて，さもなくば既知の酵素調節剤の存在によって引き起こされる酵素活性化または抑圧を阻害する調節剤を見出すこともできる。同様に，スフィンゴ脂質標的に対するリガンドを探索する場合には，標的の既知のリガンドを対照／校正アッセイウェル中に存在させることができる。
【０３０２】
スクリーニングアッセイの際の酵素反応および結合反応の測定
例えば，マルチコンテナ担体中で酵素反応および結合反応の進行を測定する技術は当技術分野では公知であり，それだけには限らないが，以下のものが挙げられる。
【０３０３】
分光光度アッセイおよび分光蛍光アッセイは当技術分野では周知である。このようなアッセイの例としては，ゴードン(Gordon)，Ａ．Ｊ．およびフォード(Ford)，Ｒ．Ａ．（１９７２）ザ・ケミスツ・コンパニオン：ア・ハンドブック・オブ・プラティカル・データ，テクニーク・アンド・リファレンシズ(The Chemist's Companion: A Handbook Of Practical Data, Techniques, And References)ジョン・ウィレー・アンド・サンズ，ニューヨーク，４３７頁に記載されるような過酸化物の検出のための比色アッセイの使用が挙げられる。
【０３０４】
蛍光分光分析法を使用して反応生成物の生成をモニターできる。蛍光法は，一般に，吸収法よりも感度が高い。蛍光プローブの使用は当業者にはよく知られている。概説については，バッシュフォード(Bashford)ら，（１９８７）スペクトロフォトメトリー・アンド・スペクトロフルオロメトリー：ア・プラクティカル・アプローチ(Spectrophotometry and Spectrofluorometry : A Practical Approach)，９１〜１１４頁，ＩＲＬプレス社(IRL Press Ltd.)およびベル(Bell)，（１９８１）スペクトロスコーピー・イン・バイオケミストリー(Spectroscopy In Biochemistry)，第１巻，１１５〜１９４頁，ＣＲＣプレス(CRC Press)。
【０３０５】
分光蛍光法では，酵素を，標的酵素によって処理されるとその内部蛍光が変化する基質に曝露する。通常，基質は非蛍光であり，1以上の反応によってフルオロフォアに変換される。それだけには限らない例として，アンプレックス(Amplex)（登録商標）レッド試薬（モレキュラー・プローブス，オレゴン州，ユージーン）を用いてＳＭアーゼ活性を検出できる。アンプレックス（登録商標）レッドを用いてスフィンゴミエリナーゼ活性を測定するために，以下の反応が生じる。まず，ＳＭアーゼがスフィンゴミエリンを加水分解してセラミドとホスホリルコリンが生じる。第２に，アルカリホスファターゼがホスホリルコリンを加水分解してコリンが生じる。第３に，コリンがコリンオキシダーゼによって酸化されてベタインとなる。最後に，Ｈ2Ｏ2が，ホースラディッシュぺルオキシダーゼの存在下で，アンプレックス（登録商標）レッドと反応して蛍光生成物，レゾルフィンを生じ，それからのシグナルは蛍光分光分析を用いて検出する。
【０３０６】
蛍光偏光法（ＦＰ）は，大きな分子，例えば受容体タンパク質との結合の際に生じる，フルオロフォアの分子回転速度の低下と，それによって結合しているリガンドによる偏光蛍光発光が可能になることに基づいている。ＦＰは，平面偏光光での励起後にフルオロフォア発光の垂直および水平成分を測定することによって実験的に定まる。偏光発光は，フルオロフォアの分子回転が低下する場合に増加する。フルオロフォアは，大きな分子（すなわち，受容体）と結合し，フルオロフォアの分子回転を低下させる場合に大きな偏光シグナルを生じる。偏光シグナルの規模は，蛍光リガンド結合の程度と定量的に関連している。したがって，「結合している」シグナルの偏光は，高親和性結合の維持に応じて変わる。
【０３０７】
ＦＰは均質な技術であり，反応は極めて迅速であり，平衡に到達するのに数秒〜数分かかる。試薬は安定であり，大きなバッチを調製でき，その結果高い再現性が得られる。これらの特性のために，ＦＰは高度に自動化可能であるとわかっており，単一の，予混，トレーサー−受容体試薬を用いて単一のインキュベーションで実施されることが多い。概説については，オーウィック(Owicki)ら，（１９９７），ハイスループットスクリーニングにおける蛍光偏光アッセイの適用(Application of Fluorescence Polarization Assays in High-Throughput Screening)，ジェネティック・エンジニアリング・ニュウス(Genetic Engineering News)１７：２７頁参照。
【０３０８】
ＦＰは，その読み出した情報が発光光度と独立しているので特に望ましく(チェコビッチ(Checovich)，Ｗ．Ｊ．ら，（１９９５）ネイチャー３７５：  ２５４〜２５６頁，ダンドリカー(Dandliker)，Ｗ．Ｂ．ら，（１９８１）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)７４：３〜２８頁）したがって，蛍光発光をクエンチする着色化合物の存在には非感受性である。ＦＲおよびＦＲＥＴ（以下参照）は，スフィンゴ脂質受容体とそのリガンド間の相互作用をブロックする化合物を同定するのに適している。例えば，パーカー(Parker)ら，（２０００）蛍光偏光を用いるハイスループットスクリーニングアッセイの開発：核受容体−リガンド結合およびキナーゼ／ホスフェートアッセイ(Development of high throughput screening assays using fluorescence polarization: nuclear receptor-ligand-binding and kinase/phosphatase assay)，ジャーナル・オブ・バイオモレキュラー・スクリーニング(Journal of Biomolecular Screening)５：７７〜８８頁参照。
【０３０９】
ＦＰアッセイに使用できるスフィンゴ脂質に由来するフルオロフォアは市販されている。例えば，モレキュラープローブス(Molecular Probes)（オレゴン州，ユージーン）は，現在，スフィンゴミエリンおよび１種のセラミドフルオロフォアを販売している。これらは，それぞれＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）スフィンゴシルホスホコリン（ボディピー(BODIPY)（登録商標）ＦＬ  Ｃ５−スフィンゴミエリン），Ｎ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ドデカノイル）スフィンゴシルホスホコリン（ボディピー(BODIPY)（登録商標）ＦＬ  Ｃ１２−スフィンゴミエリン）およびＮ−（４，４−ジフルオロ−５，７−ジメチル−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン−３−ペンタノイル）スフィンゴシン（ボディピー(BODIPY)（登録商標）ＦＬＣ５−セラミド)。米国特許第４，１５０，９４９号，(ゲンタマイシンのイムノアッセイ)には，フルオレセインチオカルバニルゲンタマイシンをはじめとするフルオレセイン標識したゲンタマイシンが開示されている。当業者に周知の方法を用いてさらなるフルオロフォアを調製できる。
【０３１０】
例示的正常および偏光蛍光リーダーとしては，ポラリオン(POLARION)（登録商標）蛍光偏光システム（テカン(Tecan)  ＡＧ，スイス，ホンブレッヒティコン(Hombrechtikon)）が挙げられる。その他のアッセイ用の一般的なマルチウェルプレートリーダー，例えばヴェルサマックス(VERSAMAX)（登録商標）リーダーおよびスペクトラマックス(SPECTRAMAX)（登録商標）マルチウェルプレートスペクトロフォトメーター（双方ともモレキュラー・デバイシズ(Molecular Devices)）も利用できる。
【０３１１】
蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）は，相互作用を検出するためのもう1つの有用なアッセイであり，これは記載されている。例えば，ハイム(Heim)ら，（１９９６）カレント・バイオロジー(Current Biology)６：１７８〜１８２頁，ミトラ(Mitra)ら，（１９９６）ジーン(Gene)１７３：１３〜１７頁およびセルビン(Selvin)ら，（１９９５）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)２４６：３００〜３４５頁参照。ＦＲＥＴは，既知の励起および発光波長を有する，近接近している２種の蛍光物質間のエネルギーの移動を検出する。例としては，タンパク質を緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）との融合タンパク質として発現できる。２種の蛍光タンパク質が近接している場合，例えばタンパク質が標的分子と特異的に相互作用する場合に，共鳴エネルギーが，励起された分子から別のものへ移動し得る。結果として，サンプルの発光スペクトラムがシフトし，これを蛍光光度計，例えばｆＭＡＸマルチウェル蛍光光度計（モレキュラー・デバイシズ(Molecular Devices），カリフォルニア州，サニーベール）によって測定することができる。
【０３１２】
シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）は，標的分子との相互作用を検出するために特に有用なアッセイである。ＳＰＡは製薬産業において広く用いられており，記載されている（ハンゼルマン(Hanselman)ら，（１９９７）ジャーナル・オブ・リピッド・リサーチ(Journal of Lipid Research)３８：２３６５〜２３７３頁，カール(kahl)ら，（１９９６）アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)２４３：２８２〜２８３頁，アンデンフレンド(Undenfriend)ら，（１９８７）アナリティカル・バイオケミストリー(Analytical Biochemistry)１６１：４９４〜５００頁）。米国特許第４，６２６，５１３号および同４，５６８，６４９号および欧州特許第０，１５４，７３４号も参照。ある市販のシステムは，フラッシュプレート(FLASHPLATE)（登録商標）シンチラントコートされたプレート（ＮＥＮライフ・サイエンス・プロダクツ(NEN Life Science Products)，マサチューセッツ州，ボストン）を用いている。
【０３１３】
標的分子は，種々の周知の手段によってシンチレータープレートと結合できる。融合タンパク質，例えば，ＧＳＴ，Ｈｉｓ６またはＦｌａｇ融合タンパク質と結合するよう誘導体化されているシンチラントプレートを利用できる。標的分子がタンパク質複合体または多量体である場合には，まず一方のタンパク質またはサブユニットをプレートに結合することができ，次いで，結合条件下で複合体のもう一方の成分を後で加えることができ，その結合している複合体が得られる。
【０３１４】
通常のＳＰＡアッセイでは，発現プール中の遺伝子産物を放射標識しておき，これをウェルに加え，固定化された標的分子である固相およびウェル中のシンチラントコーティングとの相互作用を可能にする。アッセイを直ちに測定してもよいし，平衡に到達させることもできる。どちらにしても，放射標識がシンチラントコーティングと十分に近接する場合に，トップカウントＮＸＴ(TOPCOUNT NXT)（登録商標）マイクロプレートシンチレーションカウンター（パッカード・バイオサイエンス社(Packard BioScience Co.)，コネチカット州，メリデン）などの装置によって検出可能なシグナルが生じる。放射標識された発現産物が標的分子と結合する場合には，放射標識は，検出可能なシグナルを生じるのに十分なほど長くシンチラントと近接しているままである。
【０３１５】
対照的に，標的分子と結合しないか，短時間しか結合しない，標識されたタンパク質は，バックグラウンドを上回るシグナルを生じるのに十分なほど長い間シンチラントと近いままではない。ランダムなブラウン運動によって引き起こされるシンチラントの近くで過ごす時間もいずれも，有意な量のシグナルをもたらさない。同様に，発現ステップの際に用いられる，残存する組み込まれていない放射標識も存在し得るが，標的分子と相互作用しているというよりもむしろ溶液中にあるため，有意なシグナルは生成しない。これらの非結合相互作用は，それゆえ，あるレベルのバックグラウンドシグナルを引き起こすが，これは数学的に除去できる。多すぎるシグナルが得られる場合には，塩またはその他の修飾因子を，所望の特異性が得られるまでアッセイプレートに直接加えることができる（ニコールズ(Nichols)ら，（１９９８）アナリティカル・バイオケミストリー，２５７：１１２〜１１９頁）。
【０３１６】
化合物および分子スキャフォールドのアッセイ
スキャフォールドの好ましい特徴としては，低分子量（例えば，３５０Ｄａ未満，または約１００〜約３５０ダルトン，または約１５０〜約３００ダルトン）であることが挙げられる。スキャフォールドのｃｌｏｇＰは−１〜８であることが好ましく，６，５または４未満がより好ましく，３未満が最も好ましい。特定の実施形態では，ｃｌｏｇＰは，−１〜上限２，３，４，５，６または８の範囲であるか，０〜上限２，３，４，５，６または８の範囲である。回転可能な結合の好ましい数は，５未満であり，４未満がより好ましい。水素結合ドナーおよびアクセプターの数は６より小さいことが好ましく，５より小さいことがより好ましい。有用であり得るさらなる基準は，極性表面積が５未満である。特定の適用についての基準を同定するのに有用であり得る手引きは，リピンスキ(Lipinski)ら，（１９９７）アドバンスド・ドラッグ・デリバリー・レビュー２３，３〜２５頁に見出すことができ，これは参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０３１７】
スキャフォールドは，スキャフォールドの置換部分をタンパク質結合部位のポケット中に位置させる立体配置で，所定のタンパク質結合部位と結合できることが好ましい。また，特に合成反応によって，化学的に修飾し，コンビナトリアルライブラリーを容易に作製できる，化学的に扱いやすい群を有することが，スキャフォールドの好ましい特徴であり得る。また，スキャフォールド上にその他の部分を結合でき，スキャフォールドと注目するタンパク質との結合を妨害しないが，スキャフォールドを所望の特性，例えば，スキャフォールドの細胞および／または器官への活発な輸送，解析を容易にするためにスキャフォールドをクロマトグラフィーカラムに結合されることを可能にすること，または別の所望の特性を達成させる位置を有することも好ましいことであり得る。分子スキャフォールドは標的分子と何らかの親和性で，例えば高親和性，中程度の親和性，低親和性，極めて低い親和性または極端に低い親和性で結合できる。
【０３１８】
したがって，前記の基準を利用して，所望の特質を有する，試験するための多数の化合物を選択することができる。記載した基準を有する多数の化合物は，市場で入手でき，方法が適用される個々の必要性に応じてアッセイのために選択できる。
【０３１９】
「化合物ライブラリー」または「ライブラリー」とは，種々の化学構造を有する種々の化合物の収集物である。化合物ライブラリーはスクリーニング可能である。すなわち，その中の化合物ライブラリーメンバーをスクリーニングアッセイに付すことができる。好ましい実施形態では，ライブラリーメンバーは，約１００〜約３５０ダルトン，または約１５０〜約３５０ダルトンという分子量を有し得る。ライブラリーの例は前記で示されている。
【０３２０】
本発明のライブラリーは，標的分子と低親和性で結合する少なくとも１種の化合物を含み得る。候補化合物のライブラリーは，多数の異なるアッセイ，例えば前記のもの，例えば蛍光偏光アッセイによってアッセイできる。ライブラリーは，化学合成されたペプチド，ペプチドミメティックス，または大きいものであるか小さいものであり，焦点が絞られたものであるか焦点が絞られたものでない，コンビナトリアルケミカルのアレイからなっていてもよい。「焦点が絞られた」とは，化合物の収集物が，従前に特性決定された化合物および／またはファルマコフォア構造を用いて調製されていることを意味する。
【０３２１】
化合物ライブラリーは，自然源から単離された分子，人工的に合成された分子，または１種以上の部分，例えば独立に単離されるか無作為に合成された部分を有するような方法で合成され，単離され，そうでなければ調製された分子を含み得る。化合物ライブラリー中の分子の種類としては，それだけには限らないが，有機化合物，ポリペプチドおよび核酸（それらの用語は本明細書に用いられる通りである），ならびにそれらの誘導体，コンジュゲートおよび混合物が挙げられる。
【０３２２】
本発明の化合物ライブラリーは市場で購入でき，または調製でき，またはそれだけには限らないが，コンビナトリアルケミストリー技術，発酵法，植物および細胞抽出物手順などをはじめとするいずれかの手段によって獲得できる（例えば，クウィルラ(Cwirla)ら，（１９９０）バイオケミストリー(Biochemistry)，８７，６３７８〜６３８２頁，ホーテン(Houghten)ら，（１９９１）ネイチャー(Nature)，３５４，８４〜８６頁，ラム(Lam)ら，（１９９１）ネイチャー，３５４，８２〜８４頁，ブレナー(Brenner)ら，（１９９２），プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ(Prociidings of the National Academy of Sciences of the United States of America)，８９，５３８１〜５３８３頁，Ｒ．Ａ．ホーテン(Houghten)，（１９９３）トレンヅ・イン・ジェネティクス(Trends in Genetics)，９，２３５〜２３９頁，Ｅ．Ｒ．フェルダー(Felder)，（１９９４），チミア(Chimia)，４８，５１２〜５４１頁，ギャロップ(Gallop)ら，（１９９４）ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー(Journal of Medicinal Chemistry)，３７，１２３３〜１２５１頁，ゴードン(Gordon)ら，（１９９４）ジャーナル・オブ・メディシナル・ケミストリー，３７，１３８５〜１４０１，カレル(Carell)ら，（１９９５），ケミストリー・アンド・バイオロジー(Chemistry and Biology)，３，１７１〜１８３頁，マッデン(Madden)ら，パースペクティブス・イン・ドラッグ・ディスカベリー・アンド・デザイン(Perspectives in Drug Discovery and Design)２，２６９〜２８２頁，エレブル(Lebl)ら，（１９９５）バイオポリマーズ(Biopolymers)，３７，１７７〜１９８頁参照）；共有分子構造の周りに集められた小分子，種々の市販のおよび市販されていない群，天然物によって集められた化学物質の収集物，海洋生物，真菌，細菌および植物の抽出物。
【０３２３】
好ましいライブラリーは，均一な反応混合物中に調製でき，ライブラリーのメンバーからの反応していない試薬の分離はスクリーニングに先立って必要ではない。多数のコンビナトリアルケミストリーアプローチが固体化学に基づいたものであるが，液相コンビナトリアルケミストリーはライブラリーを作製可能である（サン(Ｓｕｎ)ＣＭ．（１９９９）液相コンビナトリアルケミストリーにおける最近の進歩(Recent advances in liquid-phase combinatorial chemistry)，コンビナトリアル・ケミストリー＆ハイスループットスクリーニング(Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening)２：２２９〜３１８頁。
【０３２４】
種々の種類の分子のライブラリーを，それから1以上の事前に選択した特質を有するメンバーを獲得するために調製するが，これは，それだけには限らないが，パラレルアレイ合成(ホートン(Houghton)，（２０００）アニュアル・レビュー・オブ・ファーマコロジー・アンド・トキシコロジー(Annual Reviews of Pharmacology and Toxicology)４０：２７３〜８２頁)，パラレルアレイおよび混合物ベースの合成コンビナトリアルケミストリー，液相コンビナトリアルケミストリー（メリット(Merritt)，（１９９８）コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング(Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening)１（２）：５７〜７２頁，液相コンビナトリアルケミストリー，コー(Coe)ら，（１９９８〜９９）モレキュラー・ディバーシティー(Molecular Diversity)４（１）：３１〜８頁，液相コンビナトリアルケミストリー，サン(Sun)（１９９９）コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング２（６），２９９〜３１８頁，液相コンビナトリアル・ケミストリーにおける最近の進歩(Recent advances in liquid-phase combinatorial chemistry)；可溶性ポリマーでの合成(synthesis on soluble polymer)（グラバート(Gravert)ら，(１９９７)カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Current Opinion in Chemical Biology)１（１）：１０７〜１３頁），可溶性ポリマーでの合成：新規反応および小分子の構築(Synthesis on soluble polymers: new reactions and the construction of small molecules)などを含む種々の技術によって調製できる。例えば，ドーレ(Dolle)ら，（１９９９）ジャーナル・オブ・コンビナトリアル・ケミストリー(Journal of Combinatorial Chemistry)１（４）：２３５〜８２頁，コンビナトリアルライブラリー合成の広範囲にわたる調査(Comprehensive survey of cominatorial library synthesis)：１９９８，フレイジンガー(Freidinger)ＲＭ．，(１９９９)ペプチドおよびタンパク質受容体の非ぺプチド性リガンド(Nonpeptidic ligands for peptide and protein receptors)，カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー(Current Opinion in Chemical Biology)およびクンヅ(Kundu)ら，プログレス・イン・ドラッグ・リサーチ(Progress in Drug Research)，５３：８９〜１５６頁，コンビナトリアルケミストリー：ペプチドおよび非ペプチドライブラリーの，ポリマーによって支持される合成(Combinatorial chemistry: polymer supported synthesis of peptide and non-peptide libraries)参照。化合物には，同定を容易にするために臨床的にタグをつけることができる（チャバラ(Chabala)（１９９５）カレント・オピニオン・イン・バイオテクノロジー６（６）：６３３〜９頁，固相コンビナトリアルケミストリーおよびリードを同定するための新規タギング法(Solid-phase combinatorial chemistry and novel tagging methods for identifying leads)）。
【０３２５】
炭水化物のコンビナトリアル合成およびオリゴサッカライドを含むライブラリーは記載されている（シュバイツァー(Schweizer)ら，（１９９９）カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー３（３）：２９１〜８頁，炭水化物のコンビナトリアル合成(Combinatorial synthesis of carbohydrate)）。天然物ベースの化合物ライブラリーの合成も記載されている（ウェスヨハン(Wessjohann)，（２０００）カレント・オピニオン・イン・ケミカル・バイオロジー４（３）：３０３〜９頁，天然物ベースの化合物ライブラリーの合成(Synthesis of natural-product based compound libraries)）。
【０３２６】
核酸のライブラリーは，それだけには限らない例として，アプタマーの単離のために，本明細書に記載されたものをはじめとする種々の技術によって調製される。ストレプトアビジン磁性ビーズ上に提示されたオリゴヌクレオチドおよびポリアミノオリゴヌクレオチドを含むライブラリーが知られている（マルキエヴィッツ(Markiewicz)ら，（２０００）合成オリゴヌクレオチドコンビナトリアルライブラリーおよびその適用(Synthetic oligonucleotide combinatorial libraries and their applications)，ファルマコ(Farmaco)５５:１７４〜７頁）。核酸ライブラリーは，パラレルサンプリングと合わせることができ，自動質量分析（エンジャルバル(Enjalbal)Ｃ．マルチネス(Martinez)Ｊ．オーバグナック(Aubagnac)ＪＬ，(２０００)コンビナトリアルケミストリーにおける質量分析(Mass  spectrometry in combinatorial chemistry)，マス・スペクトロメトリー・レビューズ(Mass Spectrometry Reviews)１９：１３９〜６１頁）およびパラレルタギング（ペリン(Perrin)ＤＭ，認識および触媒のための核酸：特色，制限および将来の展望(Nucleic acids for recognition and catalysis: landmarks, limitations, and looking to the future)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング３：２４３〜６９頁）などの複雑な手順をともなわず複雑度を低下できることが知られている。
【０３２７】
ペプチドミメティックスは，コンビナトリアルケミストリーおよび固相合成を用いて同定されている（キム(Kim)ＨＯ．カーン(kahn)Ｍ．（２０００）合理的薬物設計とコンビナトリアルケミストリーの融合：ぺプチド二次構造ミメティックスの開発および適用(A merger of rational drug design and combinatorial chemistry : development and application of peptide secondary structure mimetics)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング３：１６７〜８３頁，アルオベイディ(al-obeidi)，（１９９８）モレキュラー・バイオテクノロジー(Molecular Biotechnology)９（３）：２０５〜２３頁，ペプチドおよびぺプチドミメリックライブラリー(Peptide and peptidomimetric libraries)。分子多様性および薬物設計(Molecular diversity and drug design)）。合成は完全に無作為であってもよく，一部既知ポリペプチドに基づいたものであってもよい。
【０３２８】
ポリペプチドライブラリーは，種々の技術にしたがって調製できる。簡潔には，ファージディスプレイ技術を用いてポリペプチドリガンドを製造でき（グラム(Gram)Ｈ．，（１９９９）タンパク質分解およびシグナル伝達におけるファージディスプレイ(Phage display in proteolysis and signal transduction)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング２：１９〜２８頁），これをペプチドミメティックスの合成の基礎として使用できる。ポリペプチド，制約されたペプチド，タンパク質，タンパク質ドメイン，抗体，一本鎖抗体断片，抗体断片および抗体混合領域が，選択のために繊維状ファージ上にディスプレイされる。
【０３２９】
ヒト一本鎖Ｆｖ抗体の個々の変異体の大きなライブラリーが製造されている。例えば，シーゲル(Siegel)ＲＷ．アレン(Allen)Ｂ，パブリック(Pavlik)Ｐ．マークス(Marks)ＪＤ．ブラッドブリー(Bradbury)Ａ．，（２０００）ペプチド標的上で選択された一本鎖抗体を用いるタンパク質複合体のマススペクトル解析：機能ゲノム学への適用(Mass spectral analysis of a protein complex using single-chain antibodies selected on a peptide target: applications to functional genomics)，ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)３０２：２８５〜９３頁，ポール(Poul)ＭＡ．ベセリル(Becerril)Ｂ．ニールセン(Nielsen)ＵＢ．モリソン(Morisson)Ｐ．マークス(Marks)ＪＤ．，（２０００）ファージライブラリーからの腫瘍特異的インターナライジングヒト抗体の選択(Selection of tumor-specific internalizing human antibodies from phage libraries.)出典ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー(Journal of Molecular Biology)３０１：１１４９〜６１頁，アメルスドーファー(Amersdorfer)Ｐ．マークス(Marks)ＪＤ．，（２００１）抗ボツリヌス菌ｓｃＦｖ抗体を作製するためのファージライブラリー(Phage libraries for generation of anti-botulinum scFv antibodies)，メソッヅ・イン・モレキュラー・バイオロジー(Methods in Molecular Biology)１４５：２１９〜４０頁，ヒューズ−ジョーンズ(Hughes-Jones)ＮＣ．バイ(Bye)ＪＭ．ゴリック(Gorick)ＢＤ．マークス(Marks)ＪＤ．アウエハント(Ouwehand)ＷＨ．，（１９９９）ＶＨおよびＶＬ生殖系列遺伝子を用いるＲｈ  Ｆｖファージ−抗体の合成(Synthesis of Rh Fv phage-antibodies using VH and VL germline genes)，ブリティッシュ・ジャーナル・オブ・ヘマトロジー(British Journal of Haematology)１０５：８１１〜６頁，マッコール(McCall)ＡＭ．アモロソ(Amoroso)ＡＲ．ソーテス(Sautes)Ｃ．マークス(Marks)ＪＤ．ウェイナー(Wiener)ＬＭ．，（１９９８）ヒトファージディスプレイライブラリーに由来する抗マウスＦｃγＲＩＩ一本鎖Ｆｖ断片の特性決定(Characterization of anti-mouse Fc gamma RII single-chain Fv fragments derived from human phage display libraries)，イムノテクノロジー(Immunotechnology)４：７１〜８７頁，シーツ(Sheets)ＭＤ．アメルスドーファー(Amersdorfer)Ｐ．フィナーン(Finnern)Ｒ．サージェント(Sargent)Ｐ．リンドクイスト(Lindquist)Ｅ．シーア(Schier)Ｒ．ヘミングセン(Hemingsen)Ｇ．ウォン(Wong)Ｃ．ゲルハルト(Gerhart)ＪＣ．マークス(Marks)ＪＤ．リンドクイスト(Lindquist)Ｅ．，（１９９８）大きな非免疫ファージ抗体ライブラリーの効率的な構築：タンパク質抗原に対する高親和性ヒト一本鎖抗体の作製（プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ１９９９  ９６：７９５で現れる印刷された誤植）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ジ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ９５：６１５７〜６２頁参照。
【０３３０】
計算機化学（例えば，クンヅ(Kundu)Ｂ．カーレ(khare)ＳＫ．ラストギ(Rastogi)ＳＫ．，（１９９９）コンビナトリアルケミストリー：ペプチドおよび非ペプチドライブラリーのポリマーによって支持された合成(Combinatorial chemistry:polymer supported synthesis of peptide and non-peptide libraries)，プログレス・イン・ドラッグ・リサーチ(Progress in Drug research)５３：８９〜１５６頁）およびデータベース検索およびドッキング，ｄｅ  ｎｏｖｏ薬物設計およびリガンド結合親和性の推定を用いる構造ベースのリガンドの使用（ジョセフ−マッカーシーＤ．，（１９９９）構造ベースのリガンド設計に対する計算論的アプローチ(Computational approaches to structure-based ligand design)，ファーマコロジ・アンド・セラピューティクス(Pharmacology & Therapeutics)８４：１７９〜９１頁，カークパトリック(Kirkpatrick)ＤＬ．ワトソン(Watson)Ｓ．ウルハク(Ulhaq)Ｓ．，（１９９９）構造ベースの薬物設計：コンビナトリアルケミストリーおよび分子モデリング(Stracture-based drug design: combinatorial chemistry and molecular modeling)，コンビナトリアル・ケミストリー・アンド・ハイスループット・スクリーニング２：２１１〜２１頁，エリゼーエフ(Eliseev)ＡＶ．レーン(lehn)ＪＭ．，（１９９９）ダイナミックコンビナトリアルケミストリー：分子ライブラリーの進化的形成およびスクリーニング(Dynamic combinatorial chemistry: evolutionary formation and screening of molecular libraries)，カレント・トピックス・イン・マイクロバイオロジー・アンド・イムノロジー(Current Topics in Microbiology & Immunology)２４３：１５９〜７２頁，ボルガー(bolger)ら，（１９９１）メソッヅ・イン・エンジモロジー(Methods in Enzymology)２０３：２１〜４５頁，マーチン(Martin)，（１９９１）メソッヅ・イン・エンジモロジー２０３：５８７〜６１３頁，ニードル(Niedle)ら，（１９９１）メソッヅ・イン・エンジモロジー２０３：４３３〜４５８頁，米国特許第６，１７８，３８４号）を含む精巧な戦略の助けを借りて，焦点が絞られた化学物質またはスマートケミカルおよびファルマコフォアライブラリーを設計することができる。
【０３３１】
Ｘ．結晶学
結合化合物を決定した後，標的に結合している化合物の配向を決定する。この決定には，分子スキャフォールド化合物と標的との共結晶についての結晶学が含まれることが好ましい。大部分のタンパク質の結晶学的プラットフォームは，機器の物理的パラメーターと操作上の都合により最大約５００の，タンパク質標的に結合している化合物，リガンドまたは分子スキャフォールドの共複合体を解析するように，設計することができることが好ましい。結合活性を有するスキャフォールドの数が結晶学法の適用に都合のよい数を超える場合には，少なくとも１つの共通の化学構造を有していることまたは他の所望の特徴を有していることに基づいて，スキャフォールドを群別してもよいし，１以上のクラスから代表的な化合物を選択してもよい。所望の数のクラス（例えば，５００）が得られるまで，一層厳しい判定基準によってクラスを作成することができる。クラスは，例えば，全てがピロール環，ベンゼン環，または他の化学的特徴を有するクラスでは，分子スキャフォールド間の化学構造類似性に基づいたものであり得る。同様に，クラスが形態特徴，例えば，空間充填特徴に基づいたものであってよい。
【０３３２】
共結晶学解析は，各スキャフォールドを，スクリーニングアッセイにおいて活性を示したスキャフォールドの濃度においてその標的と共複合体化することにより実施することができる。この共複合体化は，標的分子とともに低濃度の有機溶媒を使用し，その後，各スキャフォールドを有する標的を濃縮することにより達成することができる。好ましい実施形態では，これらの溶媒は５％未満の有機溶媒，例えば，水または別の水性溶媒中のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ），エタノール，メタノールまたはエチレングリコールなどである。標的分子と複合体化した各スキャフォールドを，次いで，適した数（４および２０程度）の結晶化スクリーニング条件を用いてスクリーニングすることができる。好ましい実施形態では，約９６の結晶化スクリーニング条件を実施して，共複合体化および結晶化条件，ならびに標的分子の結合部位におけるスキャフォールドの配向についての十分な情報を得ることができる。さらに，結晶構造を解析して，結合しているスキャフォールドが，物理的に，分子ファミリーメンバーの結合部位内または１以上の結合ポケット内でどのように配向しているかを決定することができる。
【０３３３】
タンパク質ファミリーに対してどれが最も適したスキャフォールドであるかを決定するためには，標的タンパク質に結合した化合物の原子座標を決定することが望ましい。そのため，原子座標を決定するにはＸ線結晶学的解析が最も好ましい。選択された化合物は，医薬品化学の適用についてさらに試験することができる。化合物は，医薬品化学用に選択することができ，標的分子におけるそれらの結合位置に基づいて試験される。例えば，化合物が結合部位に結合する場合には，標的分子の結合部位におけるその化合物の結合位置を，化合物の化学的に扱いやすい構造または部分構造において行われ得る化学に関して，さらに化合物のそのような修飾が標的の結合部位の構造または部分構造とどのように相互作用するのかについて検討することができる。従って，標的の結合部位およびスキャフォールドの化学を調査することで，より高い有効性および／または選択性でリガンドに到達するためのスキャフォールドの改変方法について決定することができる。このプロセスによって，共複合体から直接得られた構造および化学情報を利用することにより，有益な薬物製品をもたらすであろうリード化合物をより効率的かつ迅速に設計することが可能であり，結果，より直接的なリガンドの設計を可能にする。種々の実施形態では，結合する全てのスキャフォールドについて，または特定の親和性で結合するものだけ，例えば，高親和性，中程度の親和性，低親和性，極めて低い親和性または極端に低い親和性で結合するものだけについて共結晶学を実施することが望ましい。また，親和性の任意の組合せで結合するスキャフォールドの選択について，共結晶学を実施することも有利であろう。
【０３３４】
標準的なＸ線タンパク質回折研究，例えば，Ｘ線イメージプレート検出器またはシンクロトロンビームラインを用いるＲｉｇａｋｕ  ＲＵ−２００（登録商標）（リガク(Rigaku)，日本，東京）を使用することによるなどを共結晶で実施し，標準的なＸ線検出器，例えばＣＣＤ検出器またはＸ線イメージプレート検出器などで回折データを測定することができる。
【０３３５】
約２００の共結晶にＸ線結晶学を実施すると，通常，約５０の共結晶の構造がもたらされ，それによって化学における検証に約１０のスキャフォールドが提供され，最終的には標的分子に対して約５の選択的リードがもたらされる。
【０３３６】
仮想アッセイ
提供する一セットの座標から複合体化された標的と化合物の三次元グラフを作成する市販のソフトウェアを使用して，化合物が標的に結合した場合にどのように配向されているかを図で示し，研究することができる（例えば，ＱＵＡＮＴＡ（登録商標），アクセレリス(Accelerys)，カリフォルニア州，サンディエゴ）。従って，標的の結合部位における結合ポケットの存在は，本発明において特に有用であり得る。これらの結合ポケットは，結晶学的構造決定によって示され，標的の結合部位への化合物の結合に関与する正確な化学的相互作用を示す。当業者ならば，その図を用いて，複合体において非占有スペースがどこに存在し，どの化学的部分構造がそのスペースを埋めるのに適したサイズおよび／または電荷特性を有しているのかを検討することにより，結合または別の所望の効果を強化するために，化学基を付加し，置換し，修飾し，または除去するスキャフォールドの場所を決定できることが分かるであろう。また，当業者ならば，結合部位内の領域がフレキシブルであり得，スキャフォールドの結合の結果としてその特性が変化することができ，所望の効果を達成するために，化学基をそういった領域に特異的にターゲッティングできることも分かるであろう。分子スキャフォールド上の特定の位置を，適した化学的部分構造が結合できる場所および立体構造，ならびにどの部位が最も有利な化学を利用可能にするのかについて検討することができる。
【０３３７】
標的タンパク質への化合物の結合力を理解することにより，どの化合物をスキャフォールドとして使用するのが最も有利なのか，そしてリガンドの設計においてどの特性を操作するのが最も効果的なのかが明らかになる。当業者ならば，立体結合，イオン結合，水素結合，および他の影響力が標的−化合物複合体の維持または強化の一因として考えられるということが分かるであろう。脱溶媒和ペナルティーのような他のエネルギー効果を明らかにするために，自動計算法，例えばドッキングおよび／または自由エネルギー摂動（ＦＥＰ）でさらなるデータを得てもよい。選択された化合物は，標的との化学的相互作用についての情報を得るために，または化合物の結合の選択性を高め得る化学修飾を解明する目的で使用することができる。
【０３３８】
共結晶構造のデータを用いて，コンピュータモデル，例えば，相同性モデル（すなわち，既知の，実験的に得られた構造に基づくもの）を構築することができる。標的分子がタンパク質または酵素である場合には，相同性モデルの作成に好ましい共結晶構造が，モデリングされるタンパク質配列の結合部位において高い配列同一性を有し，それらのタンパク質は選択的に同じクラスおよび／またはフォールドファミリー内のものとなる。タンパク質クラスの活性部位において保存される残基の知識を用いて，結合部位を厳密に表す相同性モデルを選択することができる。さらに，相同性モデルを使用して，標的タンパク質に対するアポまたは共結晶構造が存在する代替物タンパク質の構造情報をマッピングすることができる。
【０３３９】
仮想スクリーニング法，例えば，ドッキングはまた，スキャフォールド，化合物および／またはコンビナトリアルライブラリーメンバーの，相同性モデルとの結合形態ならびに親和性の予測にも使用できる。このデータを用い，コンピュータソフトウェアを使って「仮想実験」を実施することにより，多大な資源をセーブすることができ，当業者ならば，実際にリガンドを合成し，共結晶化を行う必要なく，どの化合物が適したスキャフォールドまたはリガンドであるのかを決定することが可能になる。このようにして，どの化合物が実際の合成および共結晶化に値するかを決定することができる。このような化学的相互作用を理解することは，標的タンパク質とより有利に相互作用し，および／または他のものよりも一タンパク質ファミリーメンバーに対して選択性の高い薬物の発見および設計に役立つ。従って，これらの原理を適用することにより，優れた特性を有する化合物を発見することができる。
【０３４０】
もちろん，共結晶の形成を促すために，標的分子製剤に共結晶化を促進する添加剤を含めることができる。タンパク質または酵素の場合では，調べるスキャフォールドをタンパク質製剤に添加し，それが濃度約１ｍｇ／ｍｌで存在することが好ましい。また，製剤が０％〜１０％（ｖ／ｖ）間の有機溶媒，例えば，ＤＭＳＯ，メタノール，エタノール，プロパンジオールもしくは１，３  ジメチルプロパンジオール（ＭＰＤ）またはそれらの有機溶媒のいくつかの組合せを含んでいてもよい。化合物を，好ましくは有機溶媒に濃度約１０ｍＭに溶かし，それをタンパク質サンプルに濃度約１００ｍＭに添加する。次いで，タンパク質−化合物複合体をタンパク質の終濃度，約５〜約２０ｍｇ／ｍｌまで濃縮する。複合体化および濃縮ステップは，９６-ウェルフォーマットの濃縮装置（例えば，アミコン社(Amicon  Inc.)，ニュージャージー州，ピスカタウェイ）を用いて実施できることが好都合である。結晶化している製剤中に存在するバッファーおよび他の試薬は，結晶化を促進するかまたは結晶化条件に適合する他の成分，例えばＤＴＴ，プロパンジオール，グリセロールを含み得る。
【０３４１】
結晶化実験は，濃縮したタンパク質−化合物複合体の少分量（１μｌ）を９６ウェルフォーマットに入れ，９６結晶化条件下でサンプリングすることにより準備できる（他のスクリーニングフォーマット，例えば，９６ウェルより大型のプレートも使用できる）。結晶は，一般に９６ウェル結晶化プレートを異なる温度に置くことを含み得る標準的な結晶化プロトコールを用いて得ることができる。必要に応じて，各タンパク質−化合物複合体について温度以外の因子を変えた共結晶化も検討することができる。例えば，大気圧，光または酸素の有無，重量の変化および多くの他の変数は全て調べることができる。当業者ならば，変化させ，検討することが有利であり得る他の変数が分かるであろう。
【０３４２】
リガンドの設計および調製
リガンドの設計および調製は，活性なスキャフォールドセット間で共通する化学構造を検討することにより，構造および／または共結晶化データがあってもなくても実施することができる。このプロセスでは，構造−活性仮説を立てることができ，相当な数のスキャフォールド（低親和性で結合するものを含む）に存在することが分かった化学構造が，スキャフォールドの結合にいくらかの影響を及ぼしていると仮定することができる。この結合が生物系（例えば，治療される哺乳類）において起こる場合には，それが所望の生化学的効果を誘導すると推測することができる。最大結合数および／または構造−活性仮説の誤りを立証するために，新規または改変スキャフォールドまたはスキャフォールドから得られたコンビナトリアルライブラリーを調べることができる。次いで，残った仮説を用いて，所望の結合および生化学的効果を達成するリガンドを設計できる。
【０３４３】
しかし，多くの場合では，所望の結合効果（例えば，より高い親和性でのまたはより高い選択性での結合）を達成するためのスキャフォールド改変法の検討には，共結晶学データを有していることが好ましい。タンパク質および酵素の場合では，共結晶学データにより，分子スキャフォールドが結合部位に結合しているタンパク質の結合ポケットが示され，スキャフォールド上の化学的に扱いやすい基に修飾を加えることができることは明らかである。例えば，タンパク質結合部位またはポケットにある小容量のスペースが，スキャフォールドをその容量を埋める小さな化学基を含むように修飾することによって埋めることができる。空隙容量が埋まることによって，より強い結合親和性が生じ，またはタンパク質ファミリーの別のメンバーとの望ましくない結合がなくなると考えられる。同様に，共結晶学データにより，スキャフォールド上の化学基を欠失させることで結合の障害が少なくなり，その結果としてより強い結合親和性または特異性が生じ得ることも示すことができる。
【０３４４】
タンパク質の結合部位またはポケットに位置する帯電した化学基の存在をうまく利用することが望ましい。例えば，正電荷を有する基に，分子スキャフォールド上に導入した負に帯電した基を補ってもよい。こうすることによって結合親和性または結合特異性が高まり，その結果，より所望のリガンドが得られると考えられる。多くの場合では，タンパク質結合部位またはポケットの領域は，それらの領域におけるアミノ酸の違いに基づいて，あるファミリーメンバーが別のものに変わることが知られている。このような領域が化学的付加を受けると，化合物を，あるタンパク質標的に対して他のものよりも特異的であることを可能にし，またはより強い親和性で結合することを可能にする特定の相互作用（例えば，疎水性相互作用，静電相互作用またはエントロピー相互作用）が生じるか，または消失する場合があり，そうすることによって，特定のファミリーメンバーに対してより強い選択性または親和性を有する化合物を合成することが可能になる。加えて，特定の領域に，他の領域よりもフレキシブルであることが知られているアミノ酸が含まれていてもよい。これは，タンパク質の二次構造，例えばαヘリックスまたはβ鎖の要素を結ぶループに含まれるアミノ酸に見られることが多い。これらのフレキシブルな領域を化学的部分の付加の対象として，注目するタンパク質標的と化合物との間で生じる特定の相互作用の可能性を高めることもできる。また，インシリコで仮想スクリーニング法を行って，タンパク質ファミリーまたはクラスのメンバーに関する化学的付加，除去，修飾および／または置換の化合物への影響を評価することもできる。
【０３４５】
スキャフォールドへの化学構造または部分構造の付加，除去または修飾は，任意の適した化学的部分を用いて実施することができる。例えば，以下の部分（一例として挙げており，限定を意図したものではない）を利用することができる：水素，アルキル，アルコキシ，フェノキシ，アルケニル，アルキニル，フェニルアルキル，ヒドロキシアルキル，ハロアルキル，アリール，アリールアルキル，アルキルオキシ，アルキルチオ，アルケニルチオ，フェニル，フェニルアルキル，フェニルアルキルチオ，ヒドロキシアルキル−チオ，アルキルチオカルバミルチオ，シクロヘキシル，ピリジル，ピペリジニル，アルキルアミノ，アミノ，ニトロ，メルカプト，シアノ，ヒドロキシル，ハロゲン原子，ハロメチル，酸素原子（例えば，ケトンまたはＮ−オキシドを形成する）または硫黄原子（例えば，チオール，チオン，ジアルキルスルホキシドまたはスルホンを形成する）が利用できる部分の例の全てである。
【０３４６】
利用できる構造または部分構造のさらなる例として，アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，カルボキサミド，ニトロおよびエステル部分からなる群から独立に選択される１つ，２つまたは３つの置換基で場合によって置換されていてもよいアリール；式−ＮＸ2Ｘ3のアミン（式中，Ｘ2およびＸ3は，水素，飽和または不飽和アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から独立に選択される）；ハロゲンまたはトリハロメチル；式−ＣＯＸ4のケトン（式中，Ｘ4はアルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択される）；式−（Ｘ5）nＣＯＯＨのカルボン酸または式（Ｘ6）nＣＯＯＸ7のエステル（式中，Ｘ5，Ｘ6およびＸ7はアルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から独立に選択され，ｎは０または１である）；式（Ｘ8）nＯＨのアルコールまたは式−（Ｘ8）nＯＸ9のアルコキシ部分（式中，Ｘ8およびＸ9は飽和または不飽和アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から独立に選択され，前記環はアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，ニトロおよびエステルからなる群から独立に選択される１つ以上の置換基で場合によって置換されていてもよく，ｎは０または１である）；式ＮＨＣＯＸ10のアミド（式中，Ｘ10はアルキル，ヒドロキシルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択され，前記環はアルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，ニトロおよびエステルからなる群から独立に選択される１つ以上の置換基で場合によって置換されていてもよい）；ＳＯ2，ＮＸ11Ｘ12（式中，Ｘ11およびＸ12は水素，アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択される）；アルキル，アルコキシ，ハロゲン，トリハロメチル，カルボン酸，カルボキサミド，ニトロおよびエステル部分からなる群から独立に選択される１つ，２つまたは３つの置換基で場合によって置換されていてもよい，単素環または複素環部分；式−ＣＨＯのアルデヒド；式−ＳＯ2Ｘ13のスルホン（式中，Ｘ13は飽和または不飽和アルキルおよび単素環または複素環部分からなる群から選択される）；ならびに式−ＮＯ2のニトロである。
【０３４７】
分子スキャフォールドおよびリガンド上の結合部位の同定
ホスホジエステラーゼおよびその他の酵素のリガンドの同定および開発に加えて，結合部位における分子スキャフォールドまたは他の結合化合物の配向を決定することにより，結合分子の別の成分への結合についてエネルギー的に許容される部位の同定が可能になる。このような部位では，結合される成分の存在に伴ういかなる自由エネルギーの変化も，化合物とホスホジエステラーゼとの結合を，結合が壊れる程度に不安定化することはないはずである。好ましくは，結合に伴う結合エネルギーが少なくとも４ｋｃａｌ／ｍｏｌであるべきであり，より好ましくは少なくとも６ｋｃａｌ／ｍｏｌ，８ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１２ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１５ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは２０ｋｃａｌ／ｍｏｌであるべきである。特定の部位に結合が存在することによって結合エネルギーが３ｋｃａｌ／ｍｏｌ以下，４ｋｃａｌ／ｍｏｌ，５ｋｃａｌ／ｍｏｌ，８ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ，１２ｋｃａｌ／ｍｏｌまたは１５ｋｃａｌ／ｍｏｌしか低下しないことが好ましい。
【０３４８】
多くの場合では，適した結合部位が，結合化合物が結合部位に結合される際に溶媒に露出される部位である。いくつかの場合では，過剰のエネルギーコストを負担することなく酵素の一部に微小変位を起こす結合部位を使用できる。露出部位は種々の方法によって同定することができる。例えば，図形表示または三次元モデルを利用して露出部位を同定できる。図形表示（コンピュータディスプレーなど）では，結合部位に結合されている化合物のイメージを視覚的に検証して，この原子または基が，溶媒に露出し，こうした原子または基での結合が酵素と結合化合物の結合を妨げないように配向されている，化合物の原子または基を明示することができる。結合のエネルギーコストは，結合とエントロピー変化によってもたらされるであろう変化または変形に基づいて算出することができる。
【０３４９】
数多くの異なる種類の成分を結合することができる。熟練者ならば，種々の結合に用いられる化学を熟知している。結合することができる成分の例としては，それだけには限らないが，中でも，固相成分，例えばビーズ，プレート，チップおよびウェル；直接または間接標識；リンカー（トレースレスリンカーであってよい）が挙げられる。このようなリンカーは，それら自身が他の成分，例えば，固相媒体，標識および／または結合部分と結合していてもよい。
【０３５０】
化合物の結合エネルギーと分子を別の成分と結合するための結合エネルギーへの影響は，種々の入手可能なソフトウェアのいずれかを使用するかまたは手動計算により概算することができる。一例が以下のとおりである。
【０３５１】
２種類のキナーゼ：ＰＩＭ−１およびＣＤＫ２に対する異なる有機分子の結合エネルギーを評価するために計算を行った。検討する有機分子に，スタウロスポリン，ＰＤＥ５Ａと結合すると確認されている化合物，そしていくつかのリンカーを含めた。
【０３５２】
タンパク質−リガンド複合体間の結合エネルギー計算値は，トライポス(Tripos)製ソフトウェアスイートのＦｌｅｘＸ  ｓｃｏｒｅ（Ｂｏｈｍスコアリング関数の実行）を使用して得た。その方程式の形を以下の式で示す：
ΔＧbind＝ΔＧtr＋ΔＧhb＋ΔＧion＋ΔＧlipo＋ΔＧarom＋ΔＧrot
（式中，ΔＧtrはリガンドの回転および並進エントロピーの総合損失である定数項であり，ΔＧhbはリガンドとタンパク質間で形成される水素結合であり，ΔＧionはリガンドとタンパク質間のイオン相互作用であり，ΔＧlipoはタンパク質−リガンド接触面に相当する親油性相互作用であり，ΔＧaromはタンパク質の芳香環とリガンド間の相互作用であり，そしてΔＧrotは結合時にリガンドにおける回転可能な結合を制限するエントロピーペナルティーである）。
【０３５３】
この方法により，結晶構造が存在する標的タンパク質に対してリード化合物が有するべき自由エネルギーが評価される（その自由エネルギーがフレキシブルリンカーのエントロピーペナルティーである）。従って，それを用いて，リンカーがスクリーニングされた分子と結合することによって生じた自由エネルギーペナルティー，およびリンカーの自由エネルギーペナルティーを克服するためにリード化合物が有するべき結合エネルギーを評価することができる。この方法では溶媒和を計上していないため，リンカーを別の結合複合体，例えばビオチン：ストレプトアビジン複合体などを介して固相に結合する場合ではエントロピーペナルティーを過大評価する可能性がある。
【０３５４】
共結晶は，ＰＩＭ−１の残基とＣＤＫ２の対応する残基とをスーパーインポーズすることによりアラインした。これらの算出に使用したＰＩＭ−１構造はＰＩＭ−１と結合化合物との共結晶であった。使用したＣＤＫ２：スタウロスポリン共結晶は，ブルックヘブン(Brookhaven）データベースファイル  ｌａｑｌのものであった。タンパク質に水素原子を添加し，Ｓｙｂｙｌ内のアンバー(AMBER)９５パラメーターを用いて原子電荷を得た。トライポス製Ｓｙｂｙｌモデルリングスイートで，記載した化合物の修飾を行った。
【０３５５】
これらの計算により，所与の標的（スタウロスポリン：ＣＤＫ２など）と強く結合する化合物の結合エネルギー計算値が−２５ｋｃａｌ／ｍｏｌより低く，一方，優れたスキャフォールドまたは最適化されていない結合化合物の結合親和性計算値が−１５〜−２０の範囲であり得ることが示される。リンカー，例えばエチレングリコールまたはヘキサトリエンとの結合に対する自由エネルギーペナルティーは，一般に＋５〜＋１５ｋｃａｌ／ｍｏｌの範囲であると推定される。
【０３５６】
リンカー
本発明において使用するのに適したリンカーには多くの異なる種類のものが有り得る。リンカーは，結合化合物や特定用途に利用する別の成分との結合に適合するリンカー化学などの因子に基づき，特定用途に向けて選択することができる。さらなる因子としては，それだけには限らないが，リンカー長，リンカーの安定性およびリンカーを適切な時期に除去する能力が挙げられる。例示的リンカーとしては，それだけには限らないが，ヘキシル，ヘキサトリエニル，エチレングリコールおよびペプチドリンカーが挙げられる。また，例えば，プラケット(Plunkett)，Ｍ．Ｊ．およびエルマン(Ellman)，Ｊ．Ａ．，（１９９５），ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリー(Journal of Organic Chemistry)６０：６００６頁に記載されているように，トレースレスリンカーを使用することもできる。
【０３５７】
結合化合物との結合に利用される典型的な官能基としては，それだけには限らないが，カルボン酸，アミン，ヒドロキシルおよびチオールが挙げられる（それらの例は，「低分子量化合物ライブラリーの固体支持体上でのコンビナトリアルおよびパラレル合成(Solid-supported combinatorial and parallel synthesis of small molecular weight compound libraries)」；（１９９８）テトラヘドロン・オーガニック・ケミストリー・シリーズ第１７巻;ペルガモン(Tetrahedron organic chemistry series Vol. 17; Pergamon);８５頁；に見出すことができる）。
【０３５８】
標識
前記のとおり，結合化合物または結合化合物と結合しているリンカーに，標識を結合することもできる。このような結合は，直接的（結合化合物に直接結合される）でもよいし，または間接的（結合化合物と直接または間接的に結合している成分に結合される）でもよい。このように標識することによって化合物の検出が直接あるいは間接的に可能になる。標識の結合は，従来の化学を用いて実施することができる。標識としては，例えば，蛍光標識，放射性同位元素，光散乱粒子，吸光性粒子，磁性粒子，酵素および特異的結合剤（例えば，ビオチンまたは抗体標的部分）が挙げられる。
【０３５９】
固相媒体
結合化合物と直接または間接的に結合できる成分のさらなる例として，種々の固相媒体が挙げられる。リンカーと標識の結合と同様に，固相媒体との結合も従来の化学を用いて実施できる。このような固相媒体としては，例えば，ビーズ，ナノ粒子および繊維などの小型成分（例えば，懸濁液中またはゲルもしくはクロマトグラフィーマトリックス中のもの）が挙げられる。同様に，固相媒体として，プレート，チップ，スライドおよびチューブなどのより大きなものも挙げられる。多くの場合では，このようなものの一部分にのみ（例えば，一般に平面上の一スポットもしくは他の局所要素にまたは一ウェルもしくはウェルの一部に）結合化合物が結合される。
【０３６０】
生物剤の同定
タンパク質についての構造情報を入手することによってまた，有用な生物剤，例えば抗体開発のためのエピトープの同定，活性に影響を及ぼすと思われる突然変異部位の同定，標識，リンカー，ペプチドおよび固相媒体などの物質とタンパク質の結合を可能にする結合部位の同定もなされる。
【０３６１】
抗体（Ａｂｓ）には，バイオテクノロジー，医薬および診断法をはじめとする種々の分野で多様な用途があり，実際に，生命科学研究では抗体は最も有効なツールの１つである。タンパク質抗原に対して向けられたＡｂｓは，線状または天然の三次元（３Ｄ）エピトープのいずれかを認識することができる。３Ｄエピトープを認識するＡｂｓの獲得には，免疫原として天然タンパク質全体（または未変性のコンホーメーションをとる一部分）を使用する必要があるが，残念ながら，これは様々な技術的な理由（例えば，天然タンパク質があまり入手できず，タンパク質が毒性を有し，または高密度抗原提示を利用することが望ましい）から必ずしも選択されない。このような場合には，ペプチドを用いた免疫を代替法とする。もちろん，この方法によって生じたＡｂｓは，線状エピトープを認識するが，起源の天然タンパク質については認識する場合も認識しない場合もある。それでもやはり，それらのＡｂｓは標準的な実験室応用（ウエスタンブロットなど）にとって有用である。免疫原として使用するペプチドの選択は，特定の選抜ルールに従い，および／またはエピトープ予測ソフトウェアを使用することにより成し遂げることができる。
【０３６２】
抗原ペプチドの予測法は絶対確実というものではないが，タンパク質由来のどのペプチド断片に抗原性がある可能性が高いかを判定するのに従うことができるいくつかのルールがある。これらのルールもまた，特定のペプチドに対するＡｂが天然タンパク質を認識する可能性を高めることに基づく。
【０３６３】
１．抗原ペプチドは，溶媒露出領域に位置し，疎水性および親水性残基の両方を含まなければならない。
既知３Ｄ構造のタンパク質の場合，種々のプログラム（とりわけ，ＤＳＳＰ，ＮＡＣＥＳＳまたはＷＨＡＴＩＦなど）を使用して溶媒露出度を決定できる。
３Ｄ構造が分かっていない場合は，以下のウェブサーバーのいずれかを用いて，露出度を予測する：ＰＨＤ，ＪＰＲＥＤ，ＰｒｅｄＡｃｃ（ｃ）  ＡＣＣｐｒｏ
【０３６４】
２．ヘリックス領域に位置するペプチドを避け，二次構造（ＳＳ）モチーフを結ぶ長いループに存在するペプチドを選択することが好ましい。これにより，Ａｂが天然タンパク質を認識する可能性が高まる。このようなペプチドは，例えば，結晶構造または結晶構造をベースとする相同性モデルから同定できる。
既知３Ｄ座標を有するタンパク質の場合，ブルックヘブンデータバンクにある関連エントリーの配列関連性からＳＳを得ることができる。ＰＤＢｓｕｍサーバーでは，ｐｄｂレコードのＳＳ解析も提供している。
二次構造が全く得られない場合には，以下のサーバーのいずれかから予測を得る：ＰＨＤ，ＪＰＲＥＤ，ＰＳＩ−ＰＲＥＤ，ＮＮＳＰなど
【０３６５】
３．可能ならば，タンパク質のＮおよびＣ末端領域にあるペプチドを選択する。タンパク質のＮおよびＣ末端領域は，通常溶媒露出し，構造化されていないため，それらの領域に対するＡｂｓも天然タンパク質を認識する可能性が高い。
【０３６６】
４．細胞表面糖タンパク質の場合，最初のペプチドからＮ−グリコシル化に関するコンセンサス部位を含むものを排除する。
Ｎ−グリコシル化部位は，ＳｃａｎｐｒｏｓｉｔｅまたはＮｅｔＮＧｌｙｃを使用して，検出することができる。
【０３６７】
さらに，抗原決定基の予測を目的とする，実験により決定したエピトープの種々の生理化学的性質（フレキシビリティ，親水性度，露出度）に基づくいくつかの方法が公開されており，それらの方法を使用することができる。Ｔｈｅ  ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｉｎｄｅｘおよびＰｒｅｄｉｔｏｐがその例である。
【０３６８】
抗原決定基の予測を目的とする望ましい方法は，恐らく，実験により決定したエピトープのアミノ酸残基の頻度に基づくコラスカー(Kolaskar)およびトンガオンカー(Tongaonkar)の方法であろう（コラスカーおよびトンガオンカー（１９９０）タンパク質抗原の抗原決定基の予測のための半経験的方法(A semi-empirical method for prediction of antigenic determinants on protein antigens.)。ＦＥＢＢＳレター(Letter)  ２７６（１〜２）：１７２〜１７４頁）。予測アルゴリズムは以下のとおり動作する：
１．各オーバーラッピング７量体の平均的な傾向を算出し，その結果を７量体の中央の残基（ｉ＋３）に割り当てる。
２．タンパク質全体の平均を算出する。
３．（ａ）タンパク質全体の平均が１．０より大きい場合には，平均的な傾向が１．０より大きい全ての残基が抗原性を有する可能性がある。
３．（ｂ）タンパク質全体の平均が１．０より小さい場合には，タンパク質全体の平均より大きい全ての残基が抗原性を有する可能性がある。
４．全ての残基が上記ステップ３により選択される８量体（原本書類では６量体）を見つけ出す。
【０３６９】
コラスカーおよびトンガオンカーの方法は，ＧＣＧパッケージからでも入手することが可能であり，その方法はコマンドｅｇｃｇで動作する。
【０３７０】
また，結晶構造により，その残基での突然変異によってタンパク質の活性が変更する可能性がある残基の同定も可能になる。このような残基としては，例えば，基質と相互作用する残基，保存された活性部位の残基，および三次の相互作用に関わる秩序二次構造の領域内にある残基が挙げられる。活性に作用する可能性が高い突然変異は，異なる分子関係によって異なる。活性に作用する活性部位での突然変異は，通常，電荷−電荷または水素結合相互作用を排除し，または立体的干渉をもたらす置換または欠失である。活性に作用する可能性が高い二次構造領域または分子相互作用領域での突然変異としては，例えば，領域の疎水性／親水性を変更するか，または活性部位付近もしくはその部位を含む領域に，活性部位の重要な残基が置き換わるのに十分な変形を導入する置換が挙げられる。このような置換および／もしくは欠失ならびに／または挿入は認識されるため，突然変異の予測される構造および／またはエネルギー効果は，従来のソフトウェアを使用して算出できる。
【０３７１】
ＸＩ．ホスホジエステラーゼ活性アッセイ
活性調節剤についてアッセイしおよび／または特定のホスホジエステラーゼもしくは群またはホスホジエステラーゼ群の調節剤の特異性を決定するために，ホスホジエステラーゼ活性についてのいくつかの異なるアッセイを利用できる。以下の実施例に記載されているアッセイの他，当業者ならば，利用できる他のアッセイを知っており，特定の用途に向けてアッセイを改変できる。例えば，使用できるアッセイはPDEに関する多数の研究論文に記載されている。例えば，有用なアッセイは，Fryburgら，米国特許公開2002/0165237,Thompsonら，米国特許公開2002/0009764,Pamukcuら，米国特許出願09/046,739,およびPamukcuら,米国特許6,500,610に記載されている。
【０３７２】
ＰＤＥ４Ｂに使用できるホスホジエステラーゼ活性についてのアッセイは，実施例に記載した手順を用い，精製されたＰＤＥ４Ｂを用いる以下の手順に従って実施できる。
【０３７３】
さらなる代替アッセイでは結合測定を使用できる。例えば，この種のアッセイは，蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）フォーマット，またはストレプトアビジンまたはリン特異的抗体と結合しているドナーおよびアクセプター試薬を変更することによるアルファスクリーン(ΑlphaScreen)（増幅ルミネッセンス近接ホモジニアスアッセイ法(amplified luminescent proximity homogeneous assay)）フォーマットの使用のいずれかにフォーマットできる。
【０３７４】
ＸＩＩ．有機合成技術
コンピュータベースの調節剤設計および同定の汎用性は，コンピュータプログラムによってスクリーニングされる構造の多様性にある。コンピュータプログラムにより，極めて多数の分子を含むデータベースを検索することができ，酵素とすでに複合体を形成している調節剤を多種多様な化学的官能基で修飾することができる。この化学的多様性の結果として，ホスホジエステラーゼ機能調節剤候補が予測できない化学形態をとり得る。これらの調節剤候補を構築するという課題に対応する技術分野では，多様な有機合成技術が存在する。これらの有機合成法の多くは当業者が利用する標準的な参照文献情報源に詳述されている。このような参照文献の一例に，１９９４年３月，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌがある。従って，有機化学合成の当業者ならば，コンピュータベースの方法で同定されたホスホジエステラーゼ機能の調節剤候補を合成するのに有用な技術を容易に利用することができる。
【０３７５】
ＸＩＩＩ．投与
本方法および化合物は，一般にヒト患者に対する治療に使用することができるが，同様に，他の脊椎動物，例えば，他の霊長類，スポーツ用動物およびペット，例えば，ウマ，イヌおよびネコにおける類似または同一疾病を治療する目的でも使用することができる。
【０３７６】
適した投与形は，一部，使用または投与経路，例えば，経口経路，経皮経路，経粘膜経路，吸入または注射（非経口）による経路に応じて変わる。このような投与形によって化合物を標的細胞に到達させることが可能にならなくてはならない。他の因子については，当技術分野では周知であり，それらには，毒性や化合物または組成物の作用を遅延させる投与形などの考慮が含まれる。技術および製剤については，一般にレミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第１８版，マックパブリッシング社(Mack Publishing Co.)，ペンシルバニア州，イーストン，１９９０（参照により本明細書の一部とされる）に見られる。
【０３７７】
化合物は，製薬上許容される塩として製剤できる。製薬上許容される塩は，それらの投与量および投与濃度において無毒の塩である。このような塩を調製することで，化合物の生理学的作用を妨げることなく，その物理的特徴が変わり，薬理学的使用が容易になり得る。物理的性質の有用な変化としては，経粘膜投与を容易にするための融点の低下および，より高濃度の薬物の投与を容易にするための溶解度の上昇が挙げられる。
【０３７８】
製薬上許容される塩としては，酸付加塩（硫酸塩，塩化物，塩酸塩，フマル酸塩，マレイン酸塩，リン酸塩，スルファミン酸塩，酢酸塩，クエン塩，乳酸塩，酒石酸塩，メタンスルホン酸塩，エタンスルホン酸塩，ベンゼンスルホン酸塩，ｐ−トルエンスルホン酸塩，シクロヘキシルスルファミン酸塩およびキナ酸塩を含むものなど）が挙げられる。製薬上許容される塩は，酸（塩酸，マレイン酸，硫酸，リン酸，スルファミン酸，酢酸，クエン酸，乳酸，酒石酸，マロン酸，メタンスルホン酸，エタンスルホン酸，ベンゼンスルホン酸，ｐ−トルエンスルホン酸，シクロヘキシルスルファミン酸，フマル酸およびキナ酸など）から得ることができる。
【０３７９】
また，製薬上許容される塩として，塩基性付加塩（酸性官能基（カルボン酸またはフェノールなど）が存在している場合にベンザチン，クロロプロカイン，コリン，ジエタノールアミン，エチレンジアミン，メグルミン，プロカイン，アルミニウム，カルシウム，リチウム，マグネシウム，カリウム，ナトリウム，アンモニウム，アルキルアミンおよび亜鉛を含むものなど）も含まれる。例えば，レミントンズ・ファーマシューティカル・サイエンシズ(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第１９版，マックパブリッシング社(Mack Publishing Co.)，ペンシルバニア州，イーストン第２巻，１４５７頁，１９９５参照。このような塩は，適した対応塩基を用いて調製することができる。
【０３８０】
製薬上許容される塩は，標準的な技術により調製することができる。例えば，遊離塩基形態の化合物を適した溶媒（適した酸を含む水溶液またはアルコール水溶液など）に溶かし，その後，溶液を蒸発させることにより単離する。もう１つの例では，遊離塩基と酸を有機溶媒中で反応させることにより塩を調製する。
【０３８１】
異なる化合物の製薬上許容される塩が複合体として存在していてもよい。複合体の例としては，８−クロロテオフィリン複合体（例えば，ジメンヒドリナート：ジフェンヒドラミン  ８−クロロテオフィリン（１：１）複合体；ドラマミン(Dramamine)に類似）および種々のシクロデキストリン包接化合物が挙げられる。
【０３８２】
医薬組成物を製造するために担体または賦形剤を使用することができる。担体または賦形剤は，化合物の投与を容易にするように選択する。担体の例としては炭酸カルシウム，リン酸カルシウム，種々の糖（ラクトース，グルコースまたはスクロースなど）またはデンプンタイプ，セルロース誘導体，ゼラチン，植物油，ポリエチレングリコールおよび生理的に適合する溶媒が挙げられる。生理的に適合する溶媒の例としては，注射用蒸留水（ＷＦＩ）の滅菌溶液，生理食塩水およびデキストロースが挙げられる。
【０３８３】
化合物は，静脈内，腹腔内，皮下，筋肉内，経口，経粘膜，直腸，吸入または経皮をはじめ，種々の経路によって投与することができる。経口投与が好ましい。経口投与用には，例えば，化合物をカプセル剤，錠剤および液体製剤（シロップ剤，エリキシル剤および濃縮ドロップ剤など）のような従来の経口投与形に製剤することができる。
【０３８４】
経口用医薬製剤は，例えば，活性化合物を固体賦形剤と合わせ，得られた混合物を場合によって粉砕し，必要に応じて，錠剤または糖衣錠コアを得るために適した補助剤を加えた後，その顆粒混合物を加工することにより得ることができる。適した賦形剤としては，特に，糖類（ラクトース，スクロース，マンニトールまたはソルビトールを含む）；セルロース調製物（例えば，トウモロコシデンプン，コムギデンプン，コメデンプン，ジャガイモデンプン，ゼラチン，トラガカントガム，メチルセルロース，ヒドロキシプロピルメチルセルロース，カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）），および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ：ポビドン）のような増量剤がある。必要に応じて，架橋ポリビニルピロリドン，寒天またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）のような崩壊剤を添加してよい。
【０３８５】
糖衣錠コアには適したコーティングを施す。このために，濃縮糖溶液を使用でき，濃縮糖溶液には，例えば，アラビアガム，タルク，ポリ−ビニルピロリドン，カルボポール(carbopol)ゲル，ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および／または二酸化チタン，ラッカー溶液，ならびに適した有機溶媒または溶媒混合物を場合によって含めてもよい。確認用または活性化合物用量の異なる組合せを特徴付けるために，錠剤または糖衣錠コーティング剤に染料または色素を添加してよい。
【０３８６】
経口使用可能な医薬製剤としては，ゼラチンからできた押し込み型カプセル剤（「ゲルキャップ」），ならびにゼラチンと可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）からできた密閉ソフトカプセル剤が挙げられる。押し込み型カプセル剤には，有効成分が，増量剤（ラクトースなど），結合剤（デンプンなど）および／または滑沢剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど），さらに，場合によって安定剤と混合した状態で含まれる。ソフトカプセル剤では，活性化合物が適した液体（脂肪油，流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）に溶解または懸濁してもよい。さらに，安定剤を添加してもよい。
【０３８７】
また，注射（非経口投与）（例えば，筋肉内，静脈内，腹腔内および／または皮下）を用いてもよい。注射用には，本発明の化合物を滅菌溶液，好ましくは生理的に適合するバッファーまたは溶液（生理食塩水，ハンクス溶液またはリンガー溶液など）中に製剤する。さらに，化合物を固体形態に製剤し，それを使用直前に再溶解しまたは懸濁してもよい。凍結乾燥形態もまた製造することができる。
【０３８８】
経粘膜，経皮手段，または吸入による投与もまたあり得る。経粘膜，経皮投与または吸入用には，バリアに浸透させるのに適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は，当技術分野では一般に知られており，それらとしては，例えば，経粘膜投与には，胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。さらに，浸透しやすくするために界面活性剤を使用してよい。経粘膜投与は，例えば，鼻腔用スプレーまたは坐剤（直腸または膣）によって行ってよい。
【０３８９】
吸入用には，本発明の化合物を乾燥粉体または適当な溶液，懸濁液，またはエアロゾルとして製剤することができる。粉体および溶液は，当該技術分野において知られる適当な添加物とともに製剤することができる。例えば，粉体は，適当な粉体ベース，例えば，ラクトースまたはスターチを含むことができ，溶液は，プロピレングリコール，滅菌水，エタノール，塩化ナトリウムおよび他の添加物，例えば，酸，アルカリおよびバッファ塩を含むことができる。そのような溶液または懸濁液は，スプレー，ポンプ，アトマイザー，またはネブライザなどを用いて吸入により投与することができる。本発明の化合物はまた，他の吸入療法，例えば，プロピオン酸フルチカゾン，ジプロピオン酸ベクロメタゾン，トリアムシノロン・アセトニド，ブデソニド，およびフロ酸モメタゾン等のコルチコステロイド；アルブテロール，サルメテロールおよびホルモテロール等のベータアゴニスト；臭化イプラトロプリウムまたはチオトロピウム等の抗コリン剤；トレプロスチナールおよびイロプロスト等の血管拡張剤；ＤＮＡａｓｅ等の酵素；治療用タンパク質；イムノグロブリン抗体；一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ等のオリゴヌクレオチド；トブラマイシン等の抗生物質；ムスカリンレセプターアンタゴニスト；ロイコトリエンアンタゴニスト；サイトカインアンタゴニスト；プロテアーゼ阻害剤；クロモリンナトリウム；ネドクリルナトリウム；およびナトリウムクロモグリケートとともに用いてもよい。
【０３９０】
組み合わせでの使用には，本発明の化合物と１またはそれ以上の他の吸入治療剤，および任意の製剤，例えば，投与されたときにその治療活性を維持するように２つの化合物が化学的に結合している製剤とを一緒にデリバリーすることも含まれることが理解される。組み合わせ使用には，共製剤または化学的に結合した化合物の製剤を投与すること，または，化合物を別々の製剤として投与することが含まれる。別々の製剤は，同じ吸入デバイスからデリバリーすることにより一緒に投与してもよく，別々の吸入デバイスから一緒に投与してもよく，この場合，一緒に投与するとは，互いに短時間の間に投与されることを意味する。本発明の化合物と１またはそれ以上の追加の吸入治療剤との共製剤には，１つの吸入デバイスにより投与することができるように材料を一緒にした調製物が含まれ，これは例えば，１つの製剤中に組み合わせられた別々の化合物，または化学的に結合しているがなおそれらの生物学的活性を維持するように修飾されている化合物を含む。
【０３９１】
投与すべき種々の化合物の量は，標準的な手順により化合物ＩＣ50，化合物の生物学的半減期，患者の年齢，背格好および体重，ならびに患者の関連疾患などの因子を考慮して決定することができる。これらの重要性およびその他の因子については，当業者には周知である。一般に，用量は治療される患者のｋｇ当たり約０．０１〜５０ｍｇ間，好ましくは０．１〜２０ｍｇ間である。複数回投与を用いてよい。
【０３９２】
ＰＤＥ４Ｂの操作
ヒトをはじめとする種々の哺乳類由来のＰＤＥ４Ｂの全長コード配列およびアミノ酸配列が分かっているため，組換えＰＤＥ４Ｂのクローニング，構築，組換えタンパク質の生産および精製，ＰＤＥ４Ｂの他の生物への導入，ならびにＰＤＥ４Ｂのその他の分子生物学的操作は容易に行われる。
【０３９３】
核酸操作，例えば，サブクローニング，プローブ標識（例えば，クレノウポリメラーゼ，ニックトランスレーション，増幅を用いるランダム−プライマー標識），配列決定，ハイブリダイゼーションなどのための技術については，科学文献や特許文献（例えば，サムブロック(Sambrook)編，モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル（第２版）第１〜３巻，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(Molecular Cloning: a Laboratory Manual (2nd ed.), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory)，（１９８９）；カレント・プロトコールズ・イン・モレキュラー・バイオロジー，オーズベル編，ジョン・ウィレー・アンド・サンズ，ニューヨーク(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, ed. John Wiley & Sons, Inc., New York)（１９９７）；ラボラトリー・テクニークス・イン・バイオケミストリー・アンド・モレキュラー・バイオロジー：ハイブリダイゼーション・ウィズ・ヌクレイック・アシッド・プローブズ，パートＩ。セオリー・アンド・ヌクレイック・アシッド・プレパレーション，ティーセン編，エルゼビア，ニューヨーク(Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Part I. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen, ed. Elsevier, N. Y.)（１９９３）参照）において詳細に開示されている。
【０３９４】
核酸配列は，ＰＣＲ，等温法，ローリングサークル法などのような増幅法を用いて，さらなる使用のために必要に応じて増幅することができ，それらの方法は当業者ならば周知である。例えば，サイキ，ＰＣＲプロトコール中の「ゲノムＤＮＡの増幅」，イニス編，アカデミック・プレス，カリフォルニア州，サンディエゴ(Saiki, "Amplification of Genomic DNA" in PCR Protocols, Innis et al., Eds., Academic Press, San Diego, CA)１９９０，１３〜２０頁；ワラム(Wharam)ら，ヌクレイック・アシッズ・リサーチ（Nucleic Acids Research)。２００１年６月１日，２９（１１）：Ｅ５４−Ｅ５４；ハフナー(Hafner)ら，バイオテクニークス(Biotechniques)２００１年４月；３０（４）：８５２〜６頁，８５８頁，８６０頁各所；チョン(Zhong)ら，バイオテクニークス２００１年４月；３０（４）：８５２〜６頁，８５８頁，８６０頁各所参照。
【０３９５】
核酸，ベクター，キャプシッド，ポリペプチドなどは，当業者ならば周知の，多数ある一般的手段のいずれかによって解析し，定量することができる。これらの手段としては，例えば，分析生化学的方法（ＮＭＲ，分光測光法，Ｘ線撮影法，電気泳動，キャピラリー電気泳動，高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ），薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）およびハイパーディフュージョンクロマトグラフィー(hyperdiffusion chromatography)など），種々の免疫学的方法（例えば，液体またはゲル沈降反応，免疫拡散法，免疫電気泳動，放射性免疫測定法（ＲＩＡ），酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ），免疫蛍光測定法），サザン解析，ノーザン解析，ドットブロット解析，ゲル電気泳動（例えば，ＳＤＳ−ＰＡＧＥ），核酸もしくは標的またはシグナル増幅法，放射性標識法，シンチレーション計測およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【０３９６】
本発明の方法の実施に使用される核酸の準備および操作は，ゲノムサンプルからクローニングし，必要に応じて，例えば，ゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンから単離または増幅したインサートをスクリーニングし，再クローニングすることにより行うことができる。本発明の方法に使用される核酸の供給源としては，例えば，哺乳類人工染色体（ＭＡＣ），例えば，米国特許第５，７２１，１１８号；同６，０２５，１５５号参照；ヒト人工染色体，例えば，ローゼンフェルド(Rosenfeld)（１９９７）ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)１５：３３３〜３３５頁参照；酵母人工染色体（ＹＡＣ）；細菌人工染色体（ＢＡＣ）；Ｐ１人工染色体，例えば，ウーン(Woon)（１９９８）ゲノミクス(Genomics)５０：３０６〜３１６頁参照；Ｐ１由来ベクター（ＰＡＣ），例えば，カーン(Kern)（１９９７）バイオテクニークス２３：１２０〜１２４頁参照；コスミド，組換えウイルス，ファージまたはプラスミドに含まれるゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。
【０３９７】
本発明の核酸は，プロモーターに機能しうる形で連結され得る。プロモーターは，核酸の転写を命令する核酸制御配列の一モチーフまたはアレイであり得る。プロモーターは，転写開始部位付近に必須核酸配列（例えば，ポリメラーゼII系プロモーターの場合には，ＴＡＴＡエレメント）を含む。プロモーターはまた，場合によって，転写開始部位から数千塩基対ほどのところに存在し得る遠位エンハンサーまたはレプレッサーエレメントも含む。「構成的」プロモーターとは，大抵の環境および発生条件下で機能するプロモーターである。「誘導」プロモーターとは，環境または発生調節下にあるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターとは，ある生物の特定の組織タイプでは機能するが，同じ生物のそれ以外の組織タイプでは機能しないプロモーターである。「機能しうる形で連結される」とは，核酸発現制御配列（プロモーターまたは転写因子結合部位のアレイなど）と第２核酸配列との機能的連結（この連結により，発現制御配列が第２配列に対応する核酸の転写を命令する）を意味する用語である。
【０３９８】
本発明の核酸はまた，発現ベクターおよびクローニング媒体（例えば，本発明のポリペプチドをコードする配列）にも提供され得る。本発明の発現ベクターおよびクローニング媒体には，ウイルス粒子，バキュロウイルス，ファージ，プラスミド，ファージミド，コスミド，フォスミド，細菌人工染色体，ウイルスＤＮＡ（例えば，ワクシニア，アデノウイルス，ファウルポックスウイルス(foul pox virus)，仮性狂犬病およびＳＶ４０誘導体），Ｐ１由来人工染色体，酵母プラスミド，酵母人工染色体および特定の目的宿主に特異的な他のベクター（バチルス属(Bacillus)，アスペルギルス属(Aspergillus)および酵母など）が含まれる。本発明のベクターには，染色体，非染色体および合成ＤＮＡ配列が含まれる。数多くの適したベクターが，当業者には公知であり，市販されている。
【０３９９】
本発明の核酸を，必要に応じて，通常の分子生物学的方法を用いて種々のベクターのいずれかにクローニングすることができる；増幅した核酸をインビトロでクローニングする方法については，例えば，米国特許第５，４２６，０３９号に開示されている。増幅した配列のクローニングを容易にするために，制限酵素部位をＰＣＲプライマー対に「組み込む」ことができる。科学文献や特許文献において詳細に記載されている種々の従来の技術によって，ベクターをゲノムに導入するかまたは細胞の細胞質または核に導入し，発現させてもよい。例えば，ロバーツ(Roberts)（１９８７）ネイチャー(Nature)３２８：７３１頁；シュネイダー(Schneider)（１９９５）プロテイン・エクスプレッション・アンド・プリフィケーション(Protein Expression and Purification)６４３５：１０；サムブロック(Sambrook)，ティーセンまたはオーズベル参照。ベクターは自然源から単離することができるし，ＡＴＣＣもしくはＧｅｎＢａｎｋライブラリーのような供給元から入手することができるし，または合成または組換え法により調製することもできる。例えば，本発明の核酸は，細胞で安定してまたは一時的に発現される発現カセット，ベクターまたはウイルス（例えば，エピソーム発現系）で発現させることができる。発現カセットおよびベクターに選択マーカーを組み込んで，形質転換細胞および配列に選択可能な表現型を与えることができる。例えば，宿主ゲノムへ組み込む必要がないように，選択マーカーがエピソームでの保持および複製のためにコードするものであってよい。
【０４００】
本発明のペプチドまたはポリペプチドのインシトゥー発現のために，核酸をインビボで投与することができる。核酸は，「裸のＤＮＡ」として（例えば，米国特許第５，５８０，８５９号参照）投与することができるし，または発現ベクター（例えば，組換えウイルス）の形で投与することもできる。核酸は下記のように，腫瘍周辺または腫瘍内を含む任意の経路によって投与することができる。インビボで投与されるベクターは，組換えにより改変したエンベロープまたは非エンベロープＤＮＡおよびＲＮＡウイルス（好ましくはバキュロウイルス科(baculoviridiae)，パルボウイルス科(parvoviridiae)，ピコルノウイルス科(picornoviridiae)，ヘルペスウイルス科(herpesveridiae)，ポックスウイルス科(poxviridae)，アデノウイルス科(adenoviridiae)，またはピコルナウイルス科(picornnaviridiae)から選択される）を含むウイルスゲノム由来のものであってよい。親ベクターの性質それぞれの有利な長所を生かしたキメラベクターもまた使用してよい（例えば，フェン(Feng)（１９９７）ネイチャー・バイオテクノロジー(Nature Biotechnology)１５：８６６〜８７０頁参照）。このようなウイルスゲノムは，組換えＤＮＡ技術により，本発明の核酸を含むように改変することができ，複製欠損性であるか，条件付きで複製するかまたは複製能を有するようにさらに操作することができる。別の態様では，ベクターがアデノウイルスゲノム（例えば，ヒトアデノウイルスゲノム由来の複製能のないベクター，例えば，米国特許第６，０９６，７１８号；同６，１１０，４５８号；同６，１１３，９１３号；同５，６３１，２３６号参照）；アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルスゲノム由来のものである。レトロウイルスベクターとしては，ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ），ギボンザル(gibbon ape)白血病ウイルス（ＧａＬＶ），サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ），ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ），およびそれらの組合せに基づくものが挙げられる。例えば，米国特許第６，１１７，６８１号；同６，１０７，４７８号；同５，６５８，７７５号；同５，４４９，６１４号；ブッシュシェール(Buchscher)（１９９２）ジャーナル・オブ・ヴィロロジー（Journal of Virology)６６：２７３１〜２７３９頁；ヨハン(Johann)（１９９２）ジャーナル・オブ・ヴィロロジー６６：１６３５〜１６４０頁）参照。例えば，核酸およびペプチドのインビトロ生産において，ならびにインビボおよびエクスビボ遺伝子療法において，標的核酸を細胞に形質導入するために，アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）系ベクターを使用することができる，例えば，米国特許第６，１１０，４５６号；同５，４７４，９３５号；オカダ(Okada)（１９９６）ジーン・セラピー(Gene Therapy)３：９５７〜９６４頁参照。
【０４０１】
本発明はまた，融合タンパク質，ならびにそれらをコードする核酸にも関する。本発明のポリペプチドは，異種ペプチドまたはポリペプチド（安定性の上昇または精製の簡易化などの所望の特徴を与えるＮ末端同定ペプチドなど）と融合することができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドを合成し，例えば，より免疫原性の高いペプチドを生産する目的で，組換えにより合成されたペプチドをより容易に単離するために，抗体および抗体を発現しているＢ細胞を同定および単離するために，など，それに連結される１以上のさらなるドメインとの融合タンパク質として発現させることもできる。検出および精製を容易にするドメインとしては，例えば，固定化金属上での精製を可能にするポリヒスチジントラクトおよびヒスチジン−トリプトファンモジュールのような金属キレートペプチド，固定化免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン，ならびにＦＬＡＧＳ  エクステンション／アフィニティー精製システム（イムネックス社(Immunex Corp)，ワシントン州，シアトル）で利用されるドメインが挙げられる。精製ドメインとモチーフを含むペプチドまたはポリペプチドとの間に，切断可能なリンカー配列（第Ｘａ因子またはエンテロキナーゼ（インビトロゲン(Invitrogen)，カリフォルニア州，サンディエゴ）など）を含めることにより精製が容易になる。例えば，発現ベクターには，６個のヒスチジン残基と連結されたエピトープをコードする核酸配列，それに続いてチオレドキシンとエンテロキナーゼ切断部位が含まれる（例えば，ウィリアムス(Williams)（１９９５）バイオケミストリー３４：１７８７〜１７９７頁；ドベリ(Dobeli)（１９９８）プロテイン・エクスプレッション・アンド・プリフィケーション(Protein Expression and Purification)１２：４０４〜４１４頁参照）。ヒスチジン残基により検出および精製を容易にする一方で，エンテロキナーゼ切断部位により融合タンパク質の残留物からエピトープを精製するための手段を提供する。一態様では，本発明のポリペプチドをコードする核酸が，翻訳されたポリペプチドまたはその断片の分泌を命令することが可能なリーダー配列により適切な段階で構成される。融合タンパク質をコードするベクターおよび融合タンパク質の適用に関する技術については，科学文献や特許文献（例えば，クロール(Kroll)（１９９３）  ＤＮＡ・アンド・セル・バイオロジー（DNA and Cell Biology)１２：４４１〜５３頁参照）において詳細に開示されている。
【０４０２】
本発明の核酸およびポリペプチドは，例えば，スクリーニングおよび診断法に用いるために固相支持体に結合することができる。固相支持体としては，例えば，メンブレン（例えば，ニトロセルロースまたはナイロン），マイクロタイターディッシュ（例えば，ＰＶＣ，ポリプロピレンまたはポリスチレン），試験管（ガラスまたはプラスチック），ディップスティック（例えば，ガラス，ＰＶＣ，ポリプロピレン，ポリスチレン，ラテックスなど），微量遠心管，またはガラス，シリカ，プラスチック，金属もしくはポリマービーズ，あるいは他の支持体（紙など）が挙げられる。一固相支持体には，ペプチドに対して操作したヒスチジンタグに対する特異性によって結合する金属（例えば，コバルトまたはニッケル）含有カラムを使用する。
【０４０３】
固相支持体への分子の結合は，直接（すなわち，分子が固相支持体と接する）でもよいし，または間接（「リンカー」が支持体に結合されており，このリンカーと目的の分子が結合する）的でもよい。分子は，共有結合により（例えば，システイン残基の単一反応性チオール基を利用（例えば，コリウオド(Colliuod)（１９９３）バイオコンジュゲート・ケミストリー(Bioconjugate Chemistry)４：５２８〜５３６頁参照））または非共有結合により，具体的に言えば，例えば，固定化抗体（例えば，シューマン(Schuhmann)（１９９１）  Ａｄｖ．  Ｍａｔｅｒ．  ３：  ３８８〜３９１頁；ルー(Lu)（１９９５）アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)６７：８３〜８７頁参照；ビオチン／ストレプトアビジン系（例えば，イワネ(Iwane)（１９９７）バイオフィジオロジー・アンド・バイオケミストリー・リサーチ・コミュニケーションズ(Biophysiology . Biochemistry Research Communications)２３０：７６〜８０頁を参照）；金属キレート化，例えば，Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔフィルム（例えば，Ｎｇ  （１９９５）ラングミュア(Langmuir)１１：４０４８〜５５頁を参照）；ポリヒスチジン融合物の結合用，金属キレート化自己組織化単分子膜（例えば，シーガル(Sigal)（１９９６）アナリティカル・ケミストリー(Analytical Chemistry)６８：４９０〜４９７頁参照）を介して，固定化することができる。
【０４０４】
間接結合は，市販されている種々のリンカーを用いて得ることができる。反応性末端は，種々の官能基のいずれかであり，それらとしては，それだけには限らないが：アミノ反応末端（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル，イミドエステル，アルデヒド，エポキシド，ハロゲン化スルホニル，イソシアネート，イソチオシアネートおよびハロゲン化ニトロアリールなど）；およびチオール反応末端（二硫化ピリジル，マレイミド，チオフタルイミドおよび活性ハロゲンなど）が挙げられる。ヘテロ二官能性架橋剤は，２つの異なる反応性末端（例えば，アミノ反応性末端とチオール反応性末端）を有するものであり，一方，ホモ二官能性試薬は，２つの同じ反応性末端（例えば，スルフヒドリル含有化合物の架橋を可能にするビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ））を有するものである。スペーサーは，さまざまな長さであってよく，脂肪族でも芳香族でもよい。市販のホモ二官能性架橋剤の例としては，それだけには限らないが，ジメチルアジポイミデート二塩酸塩（ＤＭＡ）；ジメチルピメリミデート二塩酸塩（ＤＭＰ）；およびジメチルスベリミデート二塩酸塩（ＤＭＳ）などのイミドエステルが挙げられる。ヘテロ二官能性試薬としては，市販の活性ハロゲン−ＮＨＳ活性エステルカップリング剤（Ｎ−スクシンイミジルブロモアセテートおよびＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（ＳＬＡＢ）など）およびスルホスクシンイミジル誘導体（スルホスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノベンゾエート（スルホ−ＳＩＡＢ）（ピアス(Pierce)）など）が挙げられる。別のカップリング剤がＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）（ピアス・ケミカルズ(Pierce Chemicals)，イリノイ州，ロックフォード）のようなチオール開裂可能なヘテロ二官能性薬剤である。
【０４０５】
また，本発明のポリペプチドおよびペプチドを固相支持体に結合するために抗体を使用することもできる。これはペプチド特異的抗体をカラムに結合することによって直接行われるか，または例えば，既知エピトープ（例えば，タグ（例えば，ＦＬＡＧ，ｍｙｃ）または適した免疫グロブリン定常領域配列（「イムノアドヘシン」，例えば，カポン(Capon)（１９８９）ネイチャー３７７：５２５〜５３１頁（１９８９）参照）に結合された，モチーフを有するペプチドを含むように融合タンパク質キメラを作製することによっても行われる。
【０４０６】
本発明の核酸またはポリペプチドをアレイに固定化するか，または塗布してもよい。組成物（例えば，小分子，抗体，核酸など）のライブラリーを本発明の核酸またはポリペプチドの活性と結合し，またはそれを調整するそれらの能力についてスクリーニングし，またはモニタリングするために，アレイを使用することができる。例えば，本発明の一態様では，モニタリングパラメーターが本発明の核酸を含む遺伝子の転写物発現である。アレイまたは「バイオチップ」上に固定化された核酸とのハイブリダイゼーションによる，細胞の転写物，または細胞の転写物を代表するか，もしくは細胞の転写物と相補的である核酸を含むサンプルのハイブリダイゼーションにより，細胞の１以上または全ての転写物を測定することができる。マイクロチップ上の核酸の「アレイ」を用いることによって，細胞の転写物の一部または全てを同時に定量することができる。また，ゲノム核酸を含むアレイを用いて，本発明の方法によって作製した新たな操作株の遺伝子型を決定することもできる。また，ポリペプチドアレイを用いて，複数のタンパク質を同時に定量することもできる。
【０４０７】
本明細書において「アレイ」または「マイクロアレイ」または「バイオチップ」または「チップ」とは，複数の標的エレメントであり，各標的エレメントが，支持体表面の規定範囲に固定化された，規定量の１以上のポリペプチド（抗体を含む）または核酸を含んでいる。本発明の方法の実施において，既知アレイならびに／またはアレイの作製および使用の方法全て，またはそれらの変形を，例えば，米国特許第６，２７７，６２８号；同６，２７７，４８９号；同６，２６１，７７６号；同６，２５８，６０６号；同６，０５４，２７０号；同６，０４８，６９５号；同６，０４５，９９６号；同６，０２２，９６３号；同６，０１３，４４０号；同５，９６５，４５２号；同５，９５９，０９８号；同５，８５６，１７４号；同５，８３０，６４５号；同５，７７０，４５６号；同５，６３２，９５７号；同５，５５６，７５２号；同５，１４３，８５４号；同５，８０７，５２２号；同５，８００，９９２号；同５，７４４，３０５号；同５，７００，６３７号；同５，５５６，７５２号；同５，４３４，０４９号に開示されているように，全部または一部において組み込むことができる；例えば，ＷＯ９９／５１７７３；ＷＯ９９／０９２１７；ＷＯ９７／４６３１３；ＷＯ９６／１７９５８も参照；例えば，ジョンストン(Johnston)（１９９８）カレント・バイオロジー(Current Biology)８：Ｒ１７１〜Ｒ１７４頁；シューマー(Schummer)（１９９７）バイオテクニークス２３：１０８７〜１０９２頁；カーン(Kern)（１９９７）バイオテクニークス２３：１２０〜１２４頁；ソリナス−トルド(Solinas-Toldo)（１９９７）ジーンズ・クロモソームス・アンド・キャンサー(Genes,Chromosomes & Cancer)２０：３９９〜４０７頁；ボウテル（Bowtell）（１９９９）ネイチャー・ジェネティクス(Nature Genetics)付録２１：２５〜３２頁も参照。公開されている米国特許出願番号２００１００１８６４２；同２００１００１９８２７；同２００１００１６３２２；同２００１００１４４４９；同２００１００１４４４８；同２００１００１２５３７；同２００１０００８７６５も参照。
【０４０８】
宿主細胞および形質転換細胞
本発明はまた，本発明の核酸配列，例えば，本発明のポリペプチドをコードする配列または本発明のベクターを含む形質転換細胞も提供する。宿主細胞は，当業者ならばよく知っている，原核細胞，真核細胞（細菌細胞，真菌細胞，酵母細胞，哺乳類細胞，昆虫細胞または植物細胞など）を含む宿主細胞のいずれかであり得る。典型的な細菌細胞としては，大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ），放線菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ），枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ），ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ならびにシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ），ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびブドウ球菌属（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の属内のさまざまな種が挙げられる。典型的な昆虫細胞としては，ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９が挙げられる。典型的な動物細胞としては，ＣＨＯ，ＣＯＳもしくはボーズ(Bowes)黒色腫またはマウスもしくはヒト細胞系が挙げられる。適切な宿主の選択は，当業者の能力の範囲内である。
【０４０９】
ベクターは，種々の技術のいずれかを用いて宿主細胞に導入でき，それらの技術には，形質転換，トランスフェクション，形質導入，ウイルス感染，遺伝子銃またはＴｉ媒介性遺伝子導入が含まれる。具体的な方法として，リン酸カルシウムトランスフェクション，ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション，リポフェクションまたはエレクトロポレーションが挙げられる。
【０４１０】
操作した宿主細胞は，プロモーターを活性化し，形質転換体を選択し，または本発明の遺伝子を増幅する必要に応じて改変した従来の培養液で培養することができる。適した宿主株を形質転換し，宿主株を適当な細胞密度まで増殖させた後，適切な手段（例えば，温度シフトまたは化学的誘導）によって選択したプロモーターを誘導でき，細胞に所望のポリペプチドまたはその断片を生産させるために，それらをさらなる期間培養できる。
【０４１１】
細胞は，遠心分離により回収し，物理的または化学的手段により破砕することができ，得られた未精製の抽出物をさらなる精製用に確保しておく。タンパク質の発現に使用した微生物細胞は，任意の便宜な方法によって破砕することができ，その方法としては，凍結融解サイクリング，音波処理，機械的破砕または細胞溶解剤の使用が挙げられる。このような方法については，当業者ならば周知である。発現したポリペプチドまたは断片は，回収し，組換え細胞培養物から，硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿，酸抽出，陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー，ホスホセルロースクロマトグラフィー，疎水性相互作用クロマトグラフィー，アフィニティークロマトグラフィー，ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーをはじめとする方法によって精製することができる。必要に応じて，ポリペプチド構造を完成させる際に，タンパク質リフォールディング段階を用いることができる。必要に応じて，最終精製段階で高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用することができる。
【０４１２】
組換えタンパク質を発現させるために，種々の哺乳類細胞培養系も使用することができる。哺乳類発現系の例としては，サル腎臓繊維芽細胞ＣＯＳ−７系および適合ベクター由来のタンパク質を発現することが可能な他の細胞系（Ｃ１２７，３Ｔ３，ＣＨＯ，ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系など）が挙げられる。
【０４１３】
宿主細胞による構築物を従来どおりに使用して，組換え配列によりコードされる遺伝子産物を生産することができる。組換え生産方法において使用する宿主によって，ベクターを含む宿主細胞によって生産されるポリペプチドは，グリコシル化されていてもよく，グリコシル化されていなくてもよい。本発明のポリペプチドはまた，開始メチオニンアミノ酸残基を含んでいても含まなくてもよい。
【０４１４】
また，本発明のポリペプチドを生産するために，無細胞翻訳系を使用することもできる。無細胞翻訳系は，ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸に機能しうる形で連結されたプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを使用する。いくつかの態様では，インビトロ転写反応を行う前にＤＮＡ構築物を線状化する。次いで，転写されたｍＲＮＡを適した無細胞翻訳抽出物（ウサギ網状赤血球抽出物など）とともにインキュベートして，所望のポリペプチドまたはその断片を生産する。
【０４１５】
発現ベクターには，形質転換宿主細胞選択用の表現型形質を提供するために１以上の選択マーカー遺伝子を含めることができる。（真核細胞培養物にはジヒドロ葉酸レダクターゼもしくはネオマイシン耐性など，または大腸菌においてはテトラサイクリンもしくはアンピシリン耐性など）。
【０４１６】
哺乳類細胞における一時的発現では，目的のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを，哺乳類発現ベクター，例えば，インビトロゲン社(Invitrogen Corporation)（米国，カリフォルニア州，サンディエゴ；カタログ番号Ｖ４９０−２０）から市販されているｐｃＤＮＡ１に組み込むことができる。このベクターは，真核細胞系でのｃＤＮＡ発現用および原核生物におけるｃＤＮＡ解析用に設計された４．２ｋｂの多機能プラスミドベクターであり，ベクターには，ＣＭＶプロモーターおよびエンハンサー，スプライスセグメントおよびポリアデニル化シグナル，ＳＶ４０およびポリオーマウイルス複製起点，ならびに配列決定および突然変異誘発のために一本鎖ＤＮＡをレスキューするＭ１３複製起点，センスおよびアンチセンスＲＮＡ転写物の生産のためのＳｐ６およびＴ７  ＲＮＡプロモーターおよびＣｏｌ  Ｅ１様高コピープラスミド複製起点が組み込まれている。ポリリンカーは，ＣＭＶプロモーターの下流（およびＴ７プロモーターの３'）に適切に配置されている。
【０４１７】
まず，ｐｃＤＮＡＩポリリンカーの適切な制限部位に組み込まれた上記ファージミドからｃＤＮＡインサートを外す。ジャンクションから配列決定を実施して，ｐｃＤＮＡＩにおける正確な挿入方向を確認する。次いで，得られたプラスミドを，一時的発現のために，選択した哺乳類細胞宿主，例えば，サル由来の，繊維芽細胞様ＣＯＳ−１系統細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，メリーランド州，ロックビルよりＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０として入手可能）に導入する。
【０４１８】
タンパク質をコードするＤＮＡの一時的発現では，例えば，サムブロックら，モレキュラー・クローニング：ア・ラボラトリー・マニュアル１９８９，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス，コールド・スプリング・ハーバー・ニューヨーク１６．３０〜１６．３７によって記載されている手法に従って，ＤＥＡＥ媒介性ＤＮＡトランスフェクションによりＣＯＳ−１細胞を１０6  ＣＯＳ細胞当たり約８μｇ  ＤＮＡでトランスフェクトし，クロロキンで処理する。典型的な方法は以下のとおりである。簡潔には，ＣＯＳ−１細胞を密度５×１０6細胞／ディッシュにてプレーティングし，その後，ＦＢＳ補給ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で２４時間増殖させる。次いで，培地を除去し，細胞をＰＢＳ，続いて，培地で洗浄する。ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中にＤＥＡＥデキストラン（０．４ｍｇ／ｍｌ），１００μＭクロロキン，１０％ＮｕＳｅｒｕｍ，ＤＮＡ（０．４ｍｇ／ｍｌ）を含むトランスフェクション溶液を細胞に１０ｍｌ量適用する。３７℃にて３時間のインキュベーション後，上記のように細胞をＰＢＳと培地で洗浄し，その後，１０％ＤＭＳＯのＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で１分間ショックを与える。細胞を１０％ＦＢＳ補給培地で２〜３日間増殖させ，インキュベーション終了時にディッシュを氷上に置き，氷冷ＰＢＳで洗浄した後，細胞を掻きとって取り出す。次いで，細胞を１０００ｒｐｍにて１０分間の遠心分離により回収し，タンパク質発現にその後使用するために細胞ペレットを液体窒素で凍結する。凍結細胞の一定分量の融解物のノーザンブロット解析により，保存下の細胞における受容体コードｃＤＮＡの発現を確認する。
【０４１９】
同様に，安定したトランスフェクト細胞系も，例えば，宿主として２つの異なる細胞種：ＣＨＯ  Ｋ１およびＣＨＯ  Ｐｒｏ５を使用して調製することができる。これらの細胞系を構築するために，関連タンパク質についてコードするｃＤＮＡを，安定した発現が可能な哺乳類発現ベクターｐＲＣ／ＣＭＶ（インビトロゲン(Invitrogen)）に組み込むことができる。この部位への挿入ではｃＤＮＡがサイトメガロウイルスプロモーターの発現制御下，ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化部位とターミネーターの上流，選択マーカーとしてネオマイシン耐性遺伝子（ＳＶ４０初期プロモーターにより制御される）を含むベクターバックグラウンド内に置かれる。
【０４２０】
上記のように構築したプラスミドを導入するための典型的なプロトコールは，以下のとおりである。まず，宿主ＣＨＯ細胞を１０％ＦＢＳ補給ＭＥＭ培地に密度５×１０5にて播種する。２４時間増殖させた後，プレートに新鮮培地を追加し，３時間後，リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈法（サムブロックら，前掲）により細胞をトランスフェクトする。簡潔には，ＤＮＡ  ３μｇを混合し，カルシウム緩衝液とともに室温にて１０分間インキュベートする。同量のリン酸緩衝液を加え，懸濁液を室温にて１５分間インキュベートする。次ぎに，インキュベートした懸濁液を細胞に４時間適用し，除去し，１５％グリセロール含有培地で細胞にショックを与える。３分後，細胞を培地で洗浄し，通常の増殖条件において２４時間インキュベートする。Ｇ４１８（１ｍｇ／ｍｌ）含有１０％ＦＢＳ補給α−ＭＥＭ培地でネオマイシンに耐性を示す細胞を選択する。約２〜３週間後，Ｇ４１８耐性細胞のコロニーをそれぞれ単離し，クローン選抜した後，アッセイ用に増殖させる。
【実施例】
【０４２１】
本発明の多くの実施例について以下に記載する。殆どの場合において，別法も使用し得る。本実施例は例示的であって，本発明の範囲を限定するものではない。追加の化合物は，当業者に公知または容易に利用可能な好適な物質を置換して，以下に記載の方法に従って合成した。これらの化合物は，質量分析と共に，場合により表３，４及び５の生物学的データに示す。
【０４２２】
実施例１：式Iの化合物の合成：
スキーム−１
【化４６】
2008503446.tif 000023
式Iにより表された四置換チオフェン化合物は，スキーム１に示されているようにして合成することができる(Abdelhamidら，J．Chem．Res.，1999年，184-185頁及び当該文献中の参考文献)。
【０４２３】
段階−１：式（３）の製造
式（３）の化合物は，不活性溶媒（たとえばDMF）中，塩基（たとえばK2CO3)の存在下，通常，周囲温度で12〜36時間，式（２）の化合物｛式中，R1＝アルキル，ヘテロアルキル，ヘテロアリールまたはアリール(たとえばフェニルチオシアネート)である｝と式（１）のニトリルとを反応させることによって製造することができる。この反応が実質的に完了したら，式（３）の生成物は，たとえば蒸留などによる慣用法により単離する。
【０４２４】
段階−２：式Iaの製造
式Iaの化合物は，式（３）の化合物と，式（４）の化合物，塩基性媒体(たとえば，K2CO3/DMF)とを，周囲温度で数時間反応させることにより好都合に製造することができる。この反応が実質的に完了したら，式Iaの生成物は，慣用法（たとえば逆相HPLC）により単離することができる(Smithら，J．Comb．Chem.，1999年，1巻，368-370頁；及び当該文献中の参考文献)。
【０４２５】
式Iの製造
式Iの化合物は，一般的なアミンアルキル化反応を使用して製造することができる(たとえばBorch還元)(Borchら，J．Am．Chem．Soc，1969年，91巻，3996-3997頁)。
【０４２６】
実施例２：式Ibの化合物の合成
スキーム−２
【化４７】
2008503446.tif 000024
式Ibにより表される四置換チオフェンは，J．Chem．Res.，1999年，184-185頁に記載のAbdelhamidらの方法に従ってスキーム−２に示されているようにして製造することができる。
【０４２７】
段階−１：式Ibの製造
式Ibの化合物は，式（５）のβ-シアノカルボニル化合物｛式中，R3＝アルキル，ヘテロアルキル，ヘテロアリール，N(H)R，OR，またはアリール(たとえば2-シアノアセトアミド)である｝と，式（６）のイソチオシアネート｛式中，R4＝アルキル，アリール，ヘテロアルキルまはたヘテロアリール(たとえばメチルイソチオシアネート)である｝とを，塩基(たとえばK2CO3)の存在下，不活性溶媒(たとえばDMF)中で，通常，周囲温度で数時間反応させることによって好都合に製造することができる。この反応が実質的に完了したら，式（７）のβ-ハロカルボニル化合物をこの反応混合物に添加して，周囲温度で数時間，実施することができる。生成物は，慣用法（たとえば逆相HPLC）によって単離することができる(Smithら，J．Comb．Chem.，1999年，1巻，368-370頁)。
【０４２８】
実施例３：式Ibの化合物の合成：
スキーム−３
【化４８】
2008503446.tif 000025
式Ibにより表される四置換チオフェンは，スキーム３に記載のように製造することができる(Sommenら，Tetrahedron  Lett，2002年，43巻，257-259頁)。
【０４２９】
段階−１：式（９）の製造
式（９）の化合物は，式（５）のβ-シアノカルボニル化合物｛式中，R3＝アルキル，ヘテロアルキル，ヘテロアリール，NR，OR，またはアリール(たとえば2-シアノアセトアミド)である｝と，式（６）のイソチオシアネート｛式中，R4＝アルキル，アリール，ヘテロアルキルまたはヘテロアリール(たとえばメチルイソチオシアネート)である｝とを，不活性溶媒(たとえばDMF)中，塩基(たとえばK2CO3)の存在下，通常，周囲温度で数時間，反応させることによって好都合に製造することができる。この反応が実質的に完了したら，ヨードメタン(式８)を反応混合物に添加し，周囲温度で数時間撹拌する。この反応が実質的に完了したら，式（９）の生成物を慣用法(たとえば，逆相HPLC；Smithら，J．Comb．Chem.，1999年，1巻，368-370頁)により単離する。
【０４３０】
段階−２：式Ibの製造
式Ibの化合物は，式（９）の化合物と式（１０）のチオグリコレート｛式中，R5＝アルキル，アリール，ヘテロアルキル，ヘテロアリール，OR，またはNR(たとえばエチルチオグリコレート)である｝とを，不活性溶媒(たとえばEtOH)中，塩基(たとえばK2CO3)の存在下，通常，周囲温度で数時間，反応させることにより好都合に製造する。この反応が実質的に完了したら，式Ibの生成物は，慣用法(たとえば，逆相HPLC)により単離する(Smithら，J．Comb．Chem.，1999年，1巻，368-370頁；及び当該参考文献中の文献)。
【０４３１】
実施例４：式Icの化合物の合成：
スキーム−４
【化４９】
2008503446.tif 000026
式Icにより表される四置換チオフェンは，スキーム４に示されているように製造することができる(Sommenら，Tetrahedron  Lett.，2002年，43巻，257-259頁)。
【０４３２】
段階−１：式（１１）の製造
式（１１）の化合物は，マロノニトリルと，式（６）のイソチオシアネート｛式中，R4＝アルキル，アリール，ヘテロアルキルまたはヘテロアリール(たとえばメチルイソチオシアネート)である｝とを，不活性溶媒(たとえばDMF)中，塩基(たとえばK2CO3)の存在下，通常，周囲温度で数時間，反応させることにより好都合に製造することができる。この反応が実質的に完了したら，ヨードメタン（式８）を反応混合物に添加し，周囲温度で数時間撹拌することができる。式（１１）の生成物は，慣用法により単離することができる(たとえば逆相HPLC；Smithら，J．Comb．Chem.，1999年，1巻，368-370頁)。
【０４３３】
段階−式Icの製造
式Icの化合物は，式（１１）の化合物と，式（１２）のチオグリコレート｛式中，R5＝アルキル，アリール，ヘテロアルキル，ヘテロアリール，OR，またはNR(たとえばエチルチオグリコレート)である｝とを，不活性溶媒(たとえばEtOH)中，塩基(たとえばK2CO3)の存在下，通常，周囲温度で数時間，反応させることにより製造することができる。この反応が実質的に完了したら，式Icの生成物は，慣用法により単離する(たとえば逆相HPLC；Smithら，J．Comb．Chem.，1999年，1巻，368-370頁)。
【０４３４】
実施例５：式Icの化合物の合成：
スキーム−５
【化５０】
2008503446.tif 000027
式Icにより表される四置換チオフェンは，J．Chem．Res.，1999年，184-185頁に記載の如く，Abdehamidらの方法に従って，スキーム−２に示されているように製造した。
【０４３５】
段階−１：式Icの製造
式Icの化合物は，マロノニトリルと，式（６）のイソチオシアネート｛式中，R4＝アルキル，アリール，ヘテロアルキルまたはヘテロアリール(たとえばメチルイソチオシアネート)である｝とを，不活性溶媒(たとえばDMF)中，塩基(たとえばK2CO3)の存在下，周囲温度で数時間，反応させることによって製造した。この反応が実質的に完了したら，式（７）のβ-ハロカルボニル化合物を反応混合物に添加し，周囲温度で数時間，実施した。生成物は結晶化により単離した。
【０４３６】
実施例６：式IIa(式中，X＝OまたはNR4である；R1＝アルキル，アリール，またはヘテロアリールである；R2＝置換アミン，エーテル，またはニトリルである；R3＝アルキル，アリール，またはヘテロアリールである)の化合物の合成：
【化５１】
2008503446.tif 000028
スキーム−６
【化５２】
2008503446.tif 000029
【０４３７】
段階−１：式（１４）の製造
式（１４）の化合物は，塩化水素ガスを，エタノール中の式（１３）の化合物の溶液に，通常，０℃で１時間，吹込み，室温で16時間撹拌することによって製造することができる。式（１４）の化合物は，標準的な仕上げ手順，通常，溶媒の蒸発によって得ることができる｛Journal  of  American  Chemical  Society，68巻，2393-2395頁，1946年及び当該文献中の参照文献]。
【０４３８】
段階−２：式（１６）の製造
式（１６）の化合物は，式（１４）の化合物とチオカルボニル試薬(15，たとえば1,1'-チオカルボニルジイミダゾール)とを不活性溶媒(たとえばTHF)中で混合することによって製造することができる。この混合物は，全ての出発物質が消失するまで撹拌することができる。式（１６）の化合物は，慣用手段(たとえばカラムクロマトグラフィー)により単離することができる。
【０４３９】
段階−３：式（１７）の製造
式（１７）の化合物は，式（１６）の化合物と，一級アルキルまたはアリールアミンとを，不活性溶媒(たとえばアセトニトリル)中で混合することによって製造することができる。得られる混合物は，必要により加熱することができる。式（１７）の化合物は，Khimiya(Geterotsiklicheskikh  Soedineii，８巻，1129-1130頁，1987年)に記載の仕上げ手順のあとで得ることができる。
【０４４０】
段階−４：式（１８）の製造
式（１８）の化合物は，式（１７）の化合物を，塩化水素水溶液中，出発物質が消失するまで撹拌することにより製造することができる。この混合物は，必要により加熱することができる。不活性溶媒(たとえば酢酸エチル)を添加することができ，無水塩（たとえば硫酸マグネシウム）上で乾燥することができる。全ての溶媒が蒸発できたら，残渣を不活性溶媒（たとえばクロロホルム）に溶解することができる。得られた溶液に，三塩化リンを添加し，撹拌することができる。式（１８）の化合物は，参照文献(Synthetic  Communications，32巻，12号，1791-1795頁，2002年；Heterocycles，31巻，4号，637-641頁，1990年及び，当該参考文献中の参照文献)に記載の仕上げ手順のあとに得ることができる。
【０４４１】
段階−５：式（１９）の製造
式（１９）の化合物は，式（１８）の粗な化合物と，アルコールまたは一級アルキル若しくはアリールアミンとを混合することによって製造できる。この混合物は，必要により加熱することができる。式（１９）の化合物は，参考文献に記載のような仕上げ手順のあとに得ることができる(Bioorganic  Medicinal  chemistry，9巻，4号，897-907頁，2001及び当該参考文献中の参照文献)。
【０４４２】
段階−６：式IIaの製造
式IIaの化合物は，式（１９）の混合物を，不活性溶媒（たとえば塩化メチレン)中，塩化アンモニウムと混合することにより製造することができ，式（２０）の化合物をこの混合物に添加することができる。式（１９）の化合物は，Heterocylic  Chemistry，34巻，2号，567-572頁，1997年及び当該参考文献中の参照文献に記載の仕上げ手順のあとに得ることができる。
【０４４３】
実施例７：式IIbの化合物の合成(式中，R1＝アルキル，アリール，またはヘテロアリールであり；R2＝アルキル，アリール，アミノ，置換アミン，またはエーテルであり；R＝アルキル，アリール，またはヘテロアリールである)：
【化５３】
2008503446.tif 000030
スキーム−７
【化５４】
2008503446.tif 000031
【０４４４】
段階−１：式（２３）の製造
式（２３）の化合物は，式（２１）の化合物を，不活性溶媒（たとえばTHF）中，水性塩基(たとえばNaOH)及び式（２２）の化合物を０℃で混合することにより製造することができる。式（２３）の化合物は，Tetrahedron，57巻，1号，153-156頁，2001年及びJournal  of  Organic  Chemistry，65巻，21号，7244-7247頁，2000年に記載の仕上げ手順のあとに得ることができる。
【０４４５】
段階−２：式（２５）の製造
式（２５）の化合物は，式（２３）の化合物を不活性溶媒（たとえばトルエン）中，塩基(たとえばトリエチルアミン)と混合し，通常，室温で式（２４）の化合物を添加することにより製造できる。この反応が実質的に完了したら，式（２５）の化合物は，Tetrahedron，57巻，1号，153-156頁，2001年及びJournal  of  Organic  Chemistry，65巻，21号，7244-7247頁，2000年に記載の仕上げ手順のあとに得ることができる。
【０４４６】
段階−３：式（IIb）の製造
式(IIb)の化合物は，式（２５）の化合物を，窒素雰囲気下で不活性溶媒（たとえばトルエン）中で混合し，還流温度で加熱することによって製造することができる。本反応が実質的に完了したら，式(IIb)の化合物は，Tetrahedron，57巻，1号，153-156頁，2001年及びJournal  of  Organic  Chemistry，65巻，21号，7244-7247頁，2000年に記載の仕上げ手順の後に得ることができる。
【０４４７】
実施例８：化合物２-25の合成（表２A）
【化５５】
2008503446.tif 000032
式IIの実施例の化合物2-25（4-アミノ-2-フェニルアミノ-チアゾール-5-イル)-フェニル-メタノンは，以下のスキーム８に従って製造することができる。
スキーム−８
【化５６】
2008503446.tif 000033
【０４４８】
段階−１：式（２９）の製造
テトラヒドロフラン（21mL）中の2-(4-クロロベンジル)-2-チオシュードウレア塩酸塩(化合物27，1.24g，5.21mmol)の懸濁液に，０℃で水酸化ナトリウム水溶液(1.00M，5.5mL)を滴下添加し，続いてフェニルイソチオシアネート(化合物28，655μL，5.47mmol)を添加した。得られた溶液を０℃で１時間，室温でさらに１時間撹拌した。次いで，これを酢酸エチル(40mL)及び水(10mL)で希釈し，二つの層を分離した。有機層を塩水で洗浄し，無水硫酸マグネシウム上で乾燥し，蒸発させた。固相残渣をジクロロメタンとヘキサンとの混合物で洗浄すると，白色固体状の化合物２９が得られた(1.28g，3.78mmol)。
【０４４９】
段階−２：式（３１）の製造
チオカルバモイルアミジン(化合物29，122mg，0.363mmol)のテトラヒドロフラン(1.5mL)中の溶液に，窒素雰囲気下で，トリエチルアミン(56μL)，続いて2-ブロモアセトフェノン(30，72mg，0.363mmol)を室温で添加した。この反応混合物を５時間撹拌し，次いで酢酸エチル(20mL)で希釈した。得られた混合物を塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウム上で乾燥し，蒸発させると，化合物３１が得られた。
【０４５０】
段階−３：式（2-25）の製造
S-アルキル化化合物(化合物31，0.363mmol)及び1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]ウンデク-7-エン(DBU，54μL)のトルエン(10mL)中の溶液を，窒素雰囲気下，還流温度で２時間加熱した。得られた溶液を室温に冷却し，酢酸エチル(20mL)で希釈した。次いで水と飽和塩化アンモニウム溶液で洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウム上で乾燥し，蒸発させ，カラムクロマトグラフィー(酢酸エチル/ヘキサン＝2/3)で精製すると，白色固体の化合物２-25が得られた；(M+H)：296。
【０４５１】
実施例９：式IIｃの化合物の合成(式中，R1＝アルキル，アリール，またはヘテロアリール；R3＝アルキル，アリール，またはヘテロアリール)：
【化５７】
2008503446.tif 000034
スキーム−９
【化５８】
2008503446.tif 000035
段階−１：式(IIc)の製造
式（IIc）の化合物は，不活性溶媒(たとえばCH3CN)中，式（３３）の化合物と式（２２）の化合物を溶解し，温めたtert-ブチルアルコール中のカリウムtert-ブトキシドを添加することによって製造することができる。通常，室温で30分間撹拌した後，不活性溶媒(たとえばCH3CN)中の化合物(24)の化合物を添加する。得られた溶液を室温で撹拌するか，３〜10時間，加熱（通常80℃）する。この反応物を水でクエンチし，生成物を濾過により単離する(Chong，W.ら，WO9921845号)。
【０４５２】
実施例１０：化合物２-33の合成(表２A)
【化５９】
2008503446.tif 000036
スキーム−10
【化６０】
2008503446.tif 000037
【０４５３】
段階−１：化合物4-(4-アミノ-5-ベンゾイル-チアゾール-2-イルアミノ)-安息香酸エチルエステル(化合物２-33，表2A)の製造
シアナミド(化合物33，0.0467g，1.1mmol)及び4-エトキシカルボニルフェニルイソチオシアネート(化合物35，0.211g，1.0mmol)をアセトニトリル(10.0mL)に溶解し，室温で撹拌した。温tert-ブチルアルコール(10.0mL)とアセトニトリル(1mL)との混合物中のカリウムtert-ブトキシド(0.130g，1.1mmol)の溶液を添加した。得られた溶液を室温で30分間撹拌した。アセトニトリル(2mL)中の2-ブロモアセトフェノン(化合物30，0.203g，1.0mmol)を室温で添加し，得られた混合物を室温で２時間撹拌した。この反応物を水(100mL)でクエンチし，沈殿した固体を濾過し，水とジエチルエーテルで洗浄した。化合物２-33は黄色固体状で得られた(298mg；M+H＝368.1)。
【０４５４】
実施例１１：式IIIの化合物の合成
【化６１】
2008503446.tif 000038
式IIIの化合物は，塩基（たとえばピリジン）中の式(36)のアミンの溶液に，式(35)の塩化スルホニルを添加し，室温で通常16時間撹拌し，続いて，標準的な手順，溶媒の蒸発及び精製によって仕上げて製造する。
【０４５５】
実施例１２：5-(2-メチルスルファニル-ピリミジン-4-イル)-チオフェン-2-スルホン酸キノ
リン-8-イルアミド(表３Aの化合物３-16)の合成
【化６２】
2008503446.tif 000039
8-キノリンアミン(化合物(38)，0.0998g，0.692mmol)及びチオフェンスルホニルクロリド(0.212g，0.692mmol)をピリジン(10.0mL，0.124mol)に溶解した。4-ジメチルアミノピリジン(0.010g，0.082mmol)を添加し，得られた溶液を室温で一晩撹拌した。全ての溶媒を除去し，生成物を溶媒として10〜30%酢酸エチルを使用するバイオテージカラムにより精製した。精製した生成物は，黄色固体状であった(M+1＝415.4)。
【０４５６】
実施例１３：化合物１-29の合成(表１A)
【化６３】
2008503446.tif 000040
4-アミノ-5-(4-メチル-ベンゾイル)-2-フェニルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物１-29，表１A)
マロノニトリル(0.661g，0.0100mol)を，N,N-ジメチルホルムアミド(50mL，0.6mol)に溶解し，アルゴン雰囲気下で撹拌した。炭酸カリウム(1.52g，0.0110mol)を添加し，30分間撹拌した。イソチオシアナトベンゼン(1.49g，0.0110mol)を添加し，反応混合物を２時間撹拌した。2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノン(2.34g，0.0110mol)を添加し，反応混合物を一晩撹拌しておいた。得られた暗赤溶液を酢酸エチル150mLで希釈し，順に1/2飽和NaHCO3溶液，１N  LiCl(2回)及び１N  Na2S2O3100mLで洗浄した。混合した水性層を廃棄し，有機層を乾燥し，濾過し，蒸発させて，薄黄色-橙色結晶状の所望の生成物1.46gを集めた。MS(ESI)[M+H+]+＝334.2。
【０４５７】
実施例１４：化合物１-30の合成(表１A)
【化６４】
2008503446.tif 000041
4-アミノ-5-(ベンゾイル)-2-(2-メトキシフェニル)アミノ-チオフェン-3-カルボニトリル(化合物１-30，表１A)の製造
4-アミノ-5-(ベンゾイル)-2-(2-メトキシフェニル)アミノ-チオフェン-3-カルボニトリルは，イソチオシアナトベンゼン及び2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンと2-メトキシフェニルイソチオシアネート及び2-ブロモアセトフェノンとをそれぞれ置き換えて，実施例１３に記載のように製造すると，化合物１-30が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝350.11。
【０４５８】
実施例１５：化合物１-32の合成(表１A)
【化６５】
2008503446.tif 000042
4-アミノ-5-ベンゾイル-2-(4-メトキシ-フェニルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリル(化合物１-32，表１A)の製造
4-アミノ-5-ベンゾイル-2-(4-メトキシ-フェニルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリルは，イソチオシアナトベンゼン及び2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンと，4-メトキシフェニルイソチオシアネート及び2-ブロモアセトフェノンをそれぞれ置き換えて，実施例１３に記載の如く製造すると，化合物１-32が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝350.14。
【０４５９】
実施例１６：化合物１-33の合成(表１A)
【化６６】
2008503446.tif 000043
4-アミノ-5-(3'-メトキシベンゾイル-2-フェニルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物１-33，表１A)
4-アミノ-5-(3'-メトキシベンゾイル-2-フェニルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルは，2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンと2-ブロモ-1-(3-メトキシフェニル)-エタノンを置き換えて，実施例１３に記載の如く製造すると，化合物１-33が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝350.14。
【０４６０】
実施例１７：化合物１-143の合成(表１A)
【化６７】
2008503446.tif 000044
4-アミノ-2-シクロペンチルアミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物１-143，表１A)
4-アミノ-2-シクロペンチルアミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボニトリルは，イソチオシアナトベンゼン及び2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンとシクロペンタンイソチオシアネート及び2-ブロモ-1-(3-フェニル-イソキサゾール-5-イル)-エタノンをそれぞれ置き換えて，実施例１３に記載の如く製造すると，化合物１-143が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝378.99。
【０４６１】
実施例１８：化合物１-28の合成(表１A)
【化６８】
2008503446.tif 000045
4-アミノ-5-シクロプロパンカルボニル-2-フェニルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物１-28，表１A)
4-アミノ-5-シクロプロパンカルボニル-2-フェニルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルは，2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンと2-ブロモ-1-シクロプロピル-エタノンを置き換えて，実施例１３に記載の如く製造すると，化合物１-28が得られた。1H-NMR(DMSO-d6)；10.49(s，1H)，7.62(bs，2H)，7.45(s，4H)，7.24(m，1H)，1.79(m，1H)，0.87(m，2H)，0.82(m，2H)。
【０４６２】
実施例１９：化合物１-173の合成(表１A)
【化６９】
2008503446.tif 000046
4-アミノ-5-((4-クロロフェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物1-173，表１A)
4-アミノ-5-((4-クロロフェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルは，イソチオシアナトベンゼン及び2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンと，シクロペンタンイソチオシアネート及び5-ブロモアセチル-3-(4-クロロフェニル)イソキサゾールとをそれぞれ置き換えて，実施例１３に記載の如く製造すると，化合物１-173が得られた。MS(ESI)[M-H+]-＝411.0。
【０４６３】
実施例２０：化合物１-172の合成(表１A)
【化７０】
2008503446.tif 000047
4-アミノ-5-((3,4-ジクロロフェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物１-173，表１A)
4-アミノ-5-((3,4-ジクロロフェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルは，イソチオシアナトベンゼン及び2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンと，シクロペンタンイソチオシアネート及び5-ブロモアセチル-3-(3,4-ジクロロフェニル)イソキサゾールとをそれぞれ置き換えて，実施例１３に記載の如く製造すると，化合物１-172が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝448.9。
【０４６４】
実施例２１：化合物１-179の合成(表１A)
【化７１】
2008503446.tif 000048
4-アミノ-シクロペンチルアミノ-5-シクロプロパンカルボニル-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物１-179，表１A)
4-アミノ-2-シクロペンチルアミノ-5-シクロプロパンカルボニル-チオフェン-3-カルボニトリルは，イソチオシアナトベンゼン及び2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンと，シクロペンタンイソチオシアネート及び2-ブロモ-1-シクロプロピル-エタノンをそれぞれ置き換えて，実施例１３に記載の如く製造すると，１-179が得られた。MS(ESI)[M+H+]+：276.13。
【０４６５】
実施例２２：化合物１-192の合成(表１A)
【化７２】
2008503446.tif 000049
4-アミノ-5-(フェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-フェニルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物１-192，表１A)
4-アミノ-5-(フェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-フェニルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルは，2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンと2-ブロモ-1-(3-フェニル-イソキサゾール-5-イル)-エタノンとを置き換えて，実施例１３に記載の如く製造すると，化合物１-192が得られた。MS(ESI)[M-H+]-＝385.05。
【０４６６】
実施例２３：化合物P1の机上合成
【化７３】
2008503446.tif 000050
3-[4-アミノ-3-シアノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-2-イルアミノ]-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルの製造(化合物1-P1)
3-[4-アミノ-3-シアノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-2-イルアミノ]-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルは，イソチオシアナトベンゼン及び2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンと，3-イソチオシアナト-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル及び2-ブロモ-1-(3-フェニル-イソキサゾール-5-イル)-エタノンをそれぞれ置き換えて，実施例１３に記載の如く製造すると，化合物1-P1が得ることができる。
【０４６７】
実施例２４：化合物1-P2の机上合成
【化７４】
2008503446.tif 000051
4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物1-P2)
4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリルは，3-[4-アミノ-3-シアノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-2-イルアミノ]-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステル(化合物1-P1)を強酸(たとえばトリフルオロ酢酸，硫酸，HClなど)で処理し，この反応混合物を水性仕上げ（たとえば塩基水溶液による中和，生成物の有機溶媒による抽出)にかけることによって製造すると，化合物１-P2を単離することができる。
【０４６８】
実施例２５：化合物1-P3の机上合成
【化７５】
2008503446.tif 000052
4-アミノ-2-(1-メチル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物1-P3)
4-アミノ-2-(1-メチル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボニトリルは，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリル(化合物1-P2)を，塩基性条件下，ヨウ化メチル，ジメチルサルフェートまたは好適なアルキル化試薬で処理し，この反応混合物を標準的な仕上げ処理(たとえば水の添加及び，有機溶媒による生成物の抽出)にかけて製造することにより，生成物である化合物1-P3を製造することができる。
【０４６９】
実施例２６：化合物1-P4の机上合成
【化７６】
2008503446.tif 000053
4-アミノ-2-(1-メタンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物1-P4)
4-アミノ-2-(1-メタンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボニトリルは，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリル(化合物1-P2)を，塩基性条件下，メタンスルホニルクロリドで処理し，この反応混合物を標準的な仕上げ手段(たとえば水の添加及び，生成物の有機溶媒による抽出)にかけて製造することにより，生成物である化合物1-P4を単離できる。
【０４７０】
実施例２７：化合物1-P5の机上合成
【化７７】
2008503446.tif 000054
4-アミノ-2-(1-エタンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物1-P5)
4-アミノ-2-(1-エタンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボニトリルは，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリル(化合物1-P2)を，塩基性条件下，エタンスルホニルクロリドで処理しこの反応混合物を標準的な仕上げ手段(たとえば水の添加及び，生成物の有機溶媒による抽出)にかけて製造することにより，生成物である化合物1-P5を単離できる。
【０４７１】
実施例２８：化合物1-P6の机上合成
【化７８】
2008503446.tif 000055
4-アミノ-2-(1-ベンゼンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物1-P6)
4-アミノ-2-(1-ベンゼンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボニトリルは，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリル(化合物1-P2)を，塩基性条件下，ベンゼンスルホニルクロリドで処理し，この反応混合物を標準的な仕上げ手段(たとえば水の添加及び，生成物の有機溶媒による抽出)にかけて製造することにより，生成物である化合物1-P6を単離できる。
【０４７２】
実施例２９：化合物1-251の製造(表１A)
【化７９】
2008503446.tif 000056
4-アミノ-5-[3-フェニルイソキサゾール-5-カルボニル]-2-シクロペンチルアミノチオフェン-3-カルボン酸アミドの製造(化合物1-251，表１A)
4-アミノ-5-(フェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリル(化合物1-143)(40mg，0.0001mol)を，濃硫酸(1mL，0.02mol)にゆっくりと溶解した。この反応混合物を室温で45分間撹拌した。氷を添加し，混合物を水(4mL)で希釈し，続いて飽和炭酸カリウム溶液を添加して，酸を中和した。この生成物を酢酸エチルで抽出し，分取TLCで精製すると，化合物1-251が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝397.2。
【０４７３】
実施例３０：化合物1-236の合成(表１A)
【化８０】
2008503446.tif 000057
4-アミノ-5-[3-フェニルイソキサゾール-5-カルボニル]-2-イソブチルアミノチオフェン-3-カルボン酸アミドの製造(化合物1-236，表１A)
4-アミノ-5-[3-フェニルイソキサゾール-5-カルボニル]-2-イソブチルアミノチオフェン-3-カルボン酸アミドは，4-アミノ-5-(フェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルを4-アミノ-5-(フェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-イソブチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリル(化合物１-209，表１A)で置き換えることにより実施例２９に記載の如く製造すると，化合物１-236が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝385.2。
【０４７４】
実施例３１：化合物１-253の合成(表１A)
【化８１】
2008503446.tif 000058
段階１：4-アミノ-5-[3-(4-ニトロ-フェニル)-イソキサゾール-5-カルボニル]-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物１-220，表１A)
【化８２】
2008503446.tif 000059
4-アミノ-5-[3-(4-ニトロ-フェニル)-イソキサゾール-5-カルボニル]-2-フェニルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルは，2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンを1-[3-(4-ニトロ-フェニル)-イソキサゾール-5-イル]-2-ブロモ-エタノンで置き換えて，実施例１３に記載の如く製造した。
【化８３】
2008503446.tif 000060
【０４７５】
段階２：4-アミノ-5-[3-(4-アミノ-フェニル)-イソキサゾール-5-カルボニル]-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルの製造(化合物１-250，表１A)
4-アミノ-5-[3-(4-ニトロ-フェニル)-イソキサゾール-5-カルボニル]-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリル(化合物1-220，20mg，0.05mmol)を，メタノール（3mL）にゆっくりと溶解した。パラジウム(炭酸カルシウム上10%)(5mg，0.02mmol)を添加した。反応容器に水素ガス雰囲気を充填し，一晩撹拌した。この反応混合物を濾過し，減圧下で濃縮すると，化合物１-250が得られ，これをさらに精製することなく使用した。
【０４７６】
段階３：4-アミノ-5-[3-(4-アミノフェニル)イソキサゾール-5-カルボニル]-2-シクロペンチルアミノチオフェン-3-カルボン酸アミドの製造(化合物１-253，表１A)
4-アミノ-5-[3-(4-アミノフェニル)イソキサゾール-5-カルボニル]-2-シクロペンチルアミノチオフェン-3-カルボン酸アミドは，4-アミノ-5-(フェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルを4-アミノ-5-(4-アミノ-フェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリル(化合物１-250)で置き換えて，実施例２９に記載の如く製造すると，化合物１-253が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝412.41。
【０４７７】
実施例３２：化合物１-254の合成(表１A)
【化８４】
2008503446.tif 000061
段階１：4-アミノ-5-[3-(4-ニトロ-フェニル)-イソキサゾール-5-カルボニル]-2-イソブチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルの製造
【化８５】
2008503446.tif 000062
4-アミノ-5-[3-(4-ニトロ-フェニル)-イソキサゾール-5-カルボニル]-2-イソブチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルは，イソチオシアナトベンゼン及び2-ブロモ-1-(4-メチルフェニル)-エタノンを，イソブチルイソチオシアネート及び1-[3-(4-ニトロ-フェニル)-イソキサゾール-5-イル]-2-ブロモ-エタノンで置き換えて，実施例１３に記載の如く製造した。
【０４７８】
段階２：4-アミノ-5-[3-(4-アミノ-フェニル)-イソキサゾール-5-カルボニル]-2-イソブチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルの製造
【化８６】
2008503446.tif 000063
4-アミノ-5-[3-(4-アミノ-フェニル)-イソキサゾール-5-カルボニル]-2-イソブチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルは，4-アミノ-5-[3-(4-ニトロ-フェニル)-イソキサゾール-5-カルボニル]-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルを4-アミノ-5-[3-(4-ニトロ-フェニル)-イソキサゾール-5-カルボニル]-2-イソブチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルで置き換えて，実施例３１，段階２に記載の如く製造した。
【０４７９】
段階３：4-アミノ-5-[3-(4-アミノフェニル)イソキサゾール-5-カルボニル]-2-イソブチルアミノチオフェン-3-カルボン酸アミドの製造(化合物１-254，表１A)
4-アミノ-5-[3-(4-アミノフェニル)イソキサゾール-5-カルボニル]-2-イソブチルアミノチオフェン-3-カルボン酸アミドは，4-アミノ-5-(フェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルを，4-アミノ-5-(4-アミノ-フェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-イソブチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルに置き換えて，実施例２９に記載の如く製造すると，化合物1-254が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝400.44。
【０４８０】
実施例３３：化合物１-P7の机上合成
【化８７】
2008503446.tif 000064
4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボン酸アミドの製造
4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボン酸アミドは，4-アミノ-5-(フェン-3-イル)イソキサゾール-5-イル)カルボニル-2-シクロペンチルアミノ-チオフェン-3-カルボニトリルを，3-[4-アミノ-3-シアノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-2-イルアミノ]-ピロリジン-1-カルボン酸tert-ブチルエステルに置き換えて，実施例２９に記載の如く製造することができる(化合物1-P1)。
【０４８１】
実施例３４：化合物1-P8の机上合成
【化８８】
2008503446.tif 000065
4-アミノ-2-(1-メチル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボン酸アミドの製造
4-アミノ-2-(1-メチル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボン酸アミドは，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリルを4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボン酸アミドで置き換えて，実施例２５に記載の如く製造することができる(化合物1-P7)。
【０４８２】
実施例３５：化合物1-P9の机上合成
【化８９】
2008503446.tif 000066
4-アミノ-2-(1-メタンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボン酸アミドの製造
4-アミノ-2-(1-メタンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボン酸アミドは，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリルを，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボン酸アミドで置き換えて，実施例２６に記載の如く製造することができる(化合物1-P7)。
【０４８３】
実施例３６：化合物1-P10の机上合成
【化９０】
2008503446.tif 000067
4-アミノ-2-(1-エタンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボン酸アミドの製造
4-アミノ-2-(1-エタンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボン酸アミドは，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリルを，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボン酸アミドで置き換えて，実施例２７に記載の如く製造することができる(化合物1-P7)。
【０４８４】
実施例３７：化合物1-P11の机上合成
【化９１】
2008503446.tif 000068
4-アミノ-2-(1-ベンゼンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-チオフェン-3-カルボン酸アミドの製造
4-アミノ-2-(1-ベンゼンスルホニル-ピロリジン-3-イルアミノ)-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニルチオフェン-3-カルボン酸アミドは，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボニトリルを，4-アミノ-5-(3-フェニル-イソキサゾール-5-カルボニル)-2-(ピロリジン-3-イルアミノ)-チオフェン-3-カルボン酸アミドで置き換えて，実施例２８に記載の如く製造することができる(化合物1-P7)。
【０４８５】
実施例３８：化合物2-30の合成(表２A)
【化９２】
2008503446.tif 000069
2-(2,6-ジクロロフェニル)アミノ-4-アミノ-5-ベンゾイルチアゾールの製造(化合物2-30，表2A)
シアナミド(0.0701g，0.00165mol)及び2,6-ジクロロフェニルイソチオシアネート(0.312g，0.00150mol)をアセトニトリル(15.0mL，0.287mol)に溶解した。もう一つの容器に，カリウムtert-ブトキシド(0.195g，0.00165mol)をtert-ブチルアルコール(15.0mL，0.157mol)に溶解し，この容器の中身を最初の容器に添加した。得られた溶液を室温で30分間撹拌した。2-ブロモアセトフェノン(0.305g，0.00150mol)を添加し，得られた混合物を２時間撹拌した。水100mLを添加し，得られた固体を濾過した。固体を水，及びジエチルエーテルで洗浄すると，黄色固体状の化合物２-30が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝365.1。
【０４８６】
実施例３９：化合物2-33の合成(表2A)
【化９３】
2008503446.tif 000070
2-(4-エトキシカルボニルフェニル)アミノ-4-アミノ-5-ベンゾイルチアゾールの製造(化合物2-33，表2A)
2-(4-エトキシカルボニルフェニル)アミノ-4-アミノ-5-ベンゾイルチアゾールは，2,6-ジクロロフェニルイソチオシアネートを4-エトキシカルボニルフェニルイソチオシアネートで置き換えて，実施例３８に記載の如く製造すると，化合物2-33が得られた。MS(ESI)[M-H]+＝366.1。
【０４８７】
実施例４０：化合物2-1の合成(表2A)
【化９４】
2008503446.tif 000071
5-[4-アミノ-2-(2-フルオロ-フェニルアミノ)-チアゾール-5-カルボニル]-イソキサゾール-3-カルボン酸エチルエステルの製造(化合物2-1，表2A)
5-[4-アミノ-2-(2-フルオロ-フェニルアミノ)-チアゾール-5-カルボニル]-イソキサゾール-3-カルボン酸エチルエステルは，2,6-ジクロロフェニルイソチオシアネート及びブロモアセトフェノンを，2-フルオロフェニルイソチオシアネート及び5-(2-ブロモ-アセチル)-イソキサゾール-3-カルボン酸エチルエステルでそれぞれ置き換えて，実施例３８に記載の如く製造すると，化合物2-1が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝377.1。
【０４８８】
実施例４１：化合物2-9の合成(表2A)
【化９５】
2008503446.tif 000072
(4-アミノ-2-シクロペンチルアミノ-チアゾール-5-イル)-(3-フェニル-イソキサゾール-5-イル)メタノンの製造(化合物2-9)
(4-アミノ-2-シクロペンチルアミノ-チアゾール-5-イル)-(3-フェニル-イソキサゾール-5-イル)-メタノンは，2,6-ジクロロフェニルイソチオシアネート及びブロモアセトフェノンを，シクロペンチルイソチオシアネート及び2-ブロモ-1-(3-フェニル-イソキサゾール-5-イル)-エタノンとそれぞれ置き換えて，実施例３８に記載の如く製造すると，化合物2-9が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝355.1。
【０４８９】
実施例４２：化合物2-16の合成(表2A)
【化９６】
2008503446.tif 000073
4-アミノ-2-イソブチルアミノ-チアゾール-5-イル-[3-(4-クロロフェニル)-イソキサゾール-5-イル]-メタノンの製造(化合物2-16)
4-アミノ-2-イソブチルアミノ-チアゾール-5-イル-[3-(4-クロロフェニル)-イソキサゾール-5-イル]-メタノンは，2,6-ジクロロフェニルイソチオシアネート及びブロモアセトフェノンを，イソブチルイソチオシアネート及び2-ブロモ-1-(3-(4-クロロフェニル-イソキサゾール-5-イル)-エタノンとそれぞれ置き換えて，実施例３８に記載の如く製造すると，化合物2-16が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝377.01。
【０４９０】
実施例４３：化合物1-240の合成(表１A)
【化９７】
2008503446.tif 000074
(3-アミノ-5-シクロペンチルアミノ-4-メチル-チオフェン-2-イル)-(3-フェニル-イソキサゾール-5-イル)-メタノンの製造(化合物1-240，表１A)
リチウムヘキサメチルジシラジド(214mg，0.00124mol)を，窒素雰囲気下，テトラヒドロフラン5mlに溶解した。−87℃で，プロパンニトリル(0.0659g，0.00118mol)を添加した。30分後，イソチオシアナト-シクロペンタン(0.164mL，0.00130mol)を−40℃で添加した。１時間後，この反応混合物を室温に温め，２時間撹拌した。この反応混合物を−78℃に冷却し，テトラヒドロフラン中のリチウムヘキサメチルジシラジド(0.214g，0.00124mol)を添加した。30分後，2-ブロモ-1-(3-フェニル-イソキサゾール-5-イル)-エタノン(0.378g，0.00142mol)を−40℃で添加した。得られた反応混合物を徐々に室温に温め，一晩撹拌しておいた。反応は，飽和NH4Cl溶液を添加してクエンチし，酢酸エチルで抽出した。有機層を塩水で洗浄し，無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。この反応混合物を減圧下で濃縮し，シリカゲルのクロマトグラフィーにより精製すると，化合物1-240が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝368.1。
【０４９１】
実施例４４：化合物1-243の合成(表１A)
【化９８】
2008503446.tif 000075
[3-アミノ-4-エチル-5-(4-フェノキシ-フェニルアミノ)-チオフェン-2-イル]-フェニル-メタノンの製造
[3-アミノ-4-エチル-5-(4-フェノキシ-フェニルアミノ)-チオフェン-2-イル]-フェニル-メタノンは，プロパンニトリル，イソチオシアナト-シクロペンタン及び2-ブロモ-1-(3-フェニル-イソキサゾール-5-イル)-エタノンと，ブタンニトリル，4-フェノキシフェニルイソチオシアネート及び2-ブロモ-1-フェニル-エタノンとをそれぞれ置き換えて，実施例４３に記載の如く製造すると，化合物1-243が得られた。MS(ESI)[M+H+]+＝415.0。
【０４９２】
実施例４５：4-(2-メチルスルファニル-キナゾリン-4-イルアミノ)-N-キノリン-8-イル-ベンゼンスルホンアミドの製造(化合物3-62，表3A)
【化９９】
2008503446.tif 000076
段階−１：4-ブロモ-N-キノリン-8-イル-ベンゼンスルホンアミド2の製造
ピリジン(5mL)中の4-ブロモベンゼンスルホニルクロリド(1.10g，4.32mmol)の溶液に，8-キノリンアミン(1，623mg，4.32mmol)を添加し，この反応混合物を25℃で一晩撹拌した。酢酸エチルをこの反応混合物に添加し，有機相を飽和炭酸ナトリウムで洗浄し（３回），硫酸マグネシウム上で乾燥し，濾過し，減圧下で濃縮すると，薄茶色固体が得られた(2，1.57g，3.80mmol)。MS(ESI)[M+H+]+＝363.1；365.1(1：1)。
【０４９３】
段階−２：4-(2-メチルスルファニル-キナゾリン-4-イルアミノ)-N-キノリン-8-イル-ベンゼンスルホンアミド3の製造
1,4-ジオキサン(2mL)中の(4-ブロモ-N-キノリン-8-イル-ベンゼンスルホンアミド(2，111mg，0.307mmol)の溶液に，2-メチルスルファニル-キナゾリン-4-イル-アミン(165mg，0.863mmol)，炭酸セシウム(140mg，0.429mmol)，トリス(ジベンジリデンアセトン)ジパラジウム(0)(9.6mg，0.010mmol)，及びキサントフォス(xanthphos)(6.4mg，0.011mmol)を添加した。この反応混合物を高圧管中，150℃で一晩加熱し，冷却し，セライト床を通して濾過した。酢酸エチルを得られた濾液に添加し，この溶液を飽和炭酸ナトリウムで洗浄し，硫酸マグネシウム上で乾燥し，濾過し，減圧下で濃縮した。粗な物質は，分取HPLC(5-95%アセトニトリル：水と1.5%蟻酸)で精製すると，白色固体状の化合物3-62が得られた(52mg，0.110mmol)。MS(ESI)[M+H+]+＝474.2。
【０４９４】
実施例４６：3-(2-メチルスルファニル-キナゾリン-4-イルアミノ)-N-キノリン-8-イル-ベンゼンスルホンアミドの製造(化合物3-63，表3A)
【化１００】
2008503446.tif 000077
3-(2-メチルスルファニル-キナゾリン-4-イルアミノ)-N-キノリン-8-イル-ベンゼンスルホンアミド4は，4-ブロモベンゼンスルホニルクロリドを3-ブロモベンゼンスルホニルクロリドで置き換えて，実施例４５に記載のものと同一プロトコルを使用して製造した。MS(ESI)[M+H+]+：474.2。
【０４９５】
実施例４７：3-(ピリミジン-4-イルアミノ)-N-キノリン-8-イル-ベンゼンスルホンアミドの製造(化合物3-61，表3A)
【化１０１】
2008503446.tif 000078
3-(ピリミジン-4-イルアミノ)-N-キノリン-8-イル-ベンゼンスルホンアミド5は，4-ブロモベンゼンスルホニルクロリドを，3-ブロモベンゼンスルホニルクロリドに，及び2-メチルスルファニル-キナゾリン-4-イル-アミンを，4-アミノピリミジンに置き換えて，実施例４５に記載のものと同一プロトコルを使用して製造した。MS(ESI)[M+H+]+＝378.0。
【０４９６】
実施例４８：ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインのクローニング
ＰＤＥ４ＢｃＤＮＡ配列は，ヒト脳海馬ＱＵＩＣＫ−ＣｌｏｎｅｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，＃７１６９−１）から以下のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。
ＰＤＥ４Ｂ−Ｓ：
５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＣＡＣＧＣＴＴＴＧＧＡＧＴＣ−３’（配列番号５）
ＰＤＥ４Ｂ−Ａ：
５’−ＴＧＴＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列番号６）
次に，以下のプライマーを用いて，部位特異的変異誘発により内部ＮｄｅＩ部位を除く処理をした。
ＰＤＥ４Ｂ−ＮＤＥ１：
５’−ＧＡＴＡＴＧＴＣＴＡＡＡＣＡＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’（配列番号７）
ＰＤＥ４Ｂ−ＮＤＥ２：
５’−ＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＡＴＡＴＣ−３’（配列番号８）
得られたＰＣＲフラグメントをＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化し，ｐＥＴ１５Ｓベクターにサブクローニングした。
【０４９７】
この発現プラスミド中では，ＰＤＥ４Ｂ（ＮＣＢＩ配列ＪＣ１５１９，配列番号１）の残基１５２−５２８はＮ末端Ｈｉｓタグおよびそれに続くトロンビン切断部位とインフレームである。
【０４９８】
ｐＥＴ１５Ｓの配列をマルチクローニングサイトとともに図１に示す。
【０４９９】
ｐＥＴ１５Ｓベクターは，細菌で発現させてＮ末端Ｈｉｓ６を有するタンパク質を生成するためのｐＥＴ１５ｂベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）に由来する。このベクターを，ＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを別のものに置き換えてＳａｌＩ部位および停止コドン（ＴＡＧ）を生成することにより改変した。ベクターのサイズは５８１４ｂｐである。ＮｄｅＩ−ＳａｌＩ部位を用いて挿入を行うことができる。使用したＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの核酸配列およびアミノ酸配列を図２−３に示す。
【０５００】
実施例４９：ＰＤＥ４Ｂの精製
ＰＤＥ４Ｂは，０．２ｍＭ酢酸亜鉛および１ｍＭＭｇＣｌ２を補充したテリフィック（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ）培地で成長させ，１ｍＭＩＰＴＧで２２℃で１６−２０時間誘導したＥ．ｃｏｌｉ細胞［ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｃｏｄｏｎ  Ｐｌｕｓ（ＲＩＬ）（Ｎｏｖａｇｅｎ）］から精製した。遠心分離した細菌ペレット（典型的には１６Ｌから２００−２５０ｇ）を溶解バッファ（０．１Ｍリン酸カリウムバッファ，ｐＨ８．０，１０％グリセロール，１ｍＭＰＭＳＦ）に懸濁した。１００ｕｇ／ｍｌのリゾチウムを溶解物に加え，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ（Ｍｉｃｒｏ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ）で細胞を溶解した。細胞抽出物をＳｏｒｖａｌｌ  ＳＡ６０００ローターで５０００ｒｐｍで１時間で清澄にし，上清をＳｏｒｖａｌｌ  ＳＡ６００ローターで１７０００ｒｐｍでさらに１時間遠心分離する。清澄にした上清に５ｍＭイミダゾール（ｐＨ８．０）を加え，２ｍｌのコバルトビーズ（５０％スラリー）を各３５ｍｌの抽出物に加える。Ｎｕｔａｔｏｒ上でビーズを４℃で３−４時間混合し，４０００ｒｐｍで３分間の遠心分離によりビーズを回収する。ペレット化したビーズを溶解バッファで数回洗浄し，ビーズをＢｉｏＲａｄディスポーザブルカラムに充填する。結合したタンパク質を３−４カラム容量の０．１Ｍイミダゾール，次に０．２５Ｍイミダゾール（いずれも溶解バッファ中で調製）で溶出する。コバルトビーズから溶出されたタンパク質をＣｅｎｔｒｉｐｒｅｐ−１０膜（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（２６／６０）で低塩バッファ（２５ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８．０，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１４ｍＭベータ−メルカプトエタノール）中で分離する。この時点で，ＰＤＥタンパク質をトロンビンで室温で１６−２０時間処理する。ＰＤＥタンパク質は，Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｓｏｕｒｃｅ  Ｑカラム（１０／１０）でアニオン交換クロマトグラフィーにより，２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）および１４ｍＭベータ−メルカプトエタノール中ＮａＣｌ勾配を用いてＡＫＴＡ−ＦＰＬＣ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）でさらに精製する。
【０５０１】
実施例５０：ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの結晶
ＰＤＥ４Ｂの結晶は，Ｉｎｔｅｌｌｉｐｌａｔｅ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ）を用いて，３０％ＰＥＧ４００，０．２ＭＭｇＣｌ2，０．１ＭＴｒｉｓｐＨ８．５，１ｍＭ化合物１−２，１５．９ｍｇ／ｍｌタンパク質中で，１μｌのタンパク質と１μｌの沈殿剤を混合することにより，４℃で成長させた。データは１．４オングストロームまで収集した。
【０５０２】
ＰＤＥ４Ｂ結晶はさらに，Ｉｎｔｅｌｌｉｐｌａｔｅ（Ｒｏｂｂｉｎｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｈａｍｐｔｏｎ）を用いて，２０％ＰＥＧ３０００，０．２ＭＣａ（ＯＡｃ）2，０．１ＭＴｒｉｓｐＨ７．０，１ｍＭ化合物１−２，１５．９ｍｇ／ｍｌタンパク質中で，１μｌのタンパク質を１μｌの沈殿剤と混合することにより４℃で成長させた。データは１．７オングストロームまで収集した。
【０５０３】
実施例５１：ＰＤＥ４Ｂの構造決定
ＰＤＥ４Ｂの構造は，分子置換法を用い，先に寄託されているＰＤＥ４Ｂの座標を用いて解釈した。決定したＰＤＥ４Ｂ構造の原子座標は米国特許仮出願６０／５６９４３５（２００４年５月６日出願，すべての目的のあめにその全体を本明細書の一部としてここに引用する）の表１に示され，共結晶構造の座標は表２，３，および４に示される。
【０５０４】
さらに，本明細書に記載される結晶および結晶学の方法を用いて，複数の化合物，例えば，限定されないが，化合物２−２３，２−２４，２−２５，２−２６，３−１６，２−３０，２−８９，２−３４，２−９３，１−１９１，２−９８，２−１００，２−５１，２−８０，２−６，２−８２，２−８０，２−５４，１−２１９，１−２５０，１−２４２，３−６３，および１−２４９（化合物の構造については表３Ａ，４Ａ，および５Ａを参照）について，ＰＤＥ４Ｂおよび／またはＰＤＥ４Ｄと組み合わせた共結晶および／または共結晶構造を得た。
【０５０５】
実施例５２：ＰＤＥ結合アッセイ
結合アッセイは種々の方法，例えば，当該技術分野において知られる種々の方法により実施することができる。例えば，上述するように，結合アッセイは，蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）フォーマットを用いて，またはＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎを用いて実施することができる。
【０５０６】
あるいは，リガンドのＡＴＰ−結合部位への結合を測定しうる任意の方法を用いることができる。例えば，蛍光リガンドを用いることができる。ＰＤＥ４Ｂに結合すると，放出される蛍光は偏光される。阻害剤の結合により一旦置き換えられれば，偏光は減少する。
【０５０７】
競合結合アッセイによる化合物のＩＣ５０の測定（ただし，ＫIは阻害剤結合の解離定数であり；ＫDは，基質結合の解離定数である）
この系についてＩＣ５０，すなわち阻害剤結合定数および基質結合定数は，以下の式にしたがって相互に関係づけることができる。
【０５０８】
放射性標識した基質を用いた場合：
【数２】
2008503446.tif 000079
標識基質の量が少ない場合：
ＩＣ５０〜ＫI
【０５０９】
実施例５３：ＰＤＥ活性のアッセイ
例示的ホスホジエステラーゼアッセイとして，ＰＤＥ４Ｂ，ＰＤＥ５Ａ，および他のＰＤＥのホスホジエステラーゼ活性に及ぼす潜在的調節剤の影響を，以下のアッセイフォーマットで測定した。
【０５１０】
試薬
アッセイバッファ
５０ｍＭＴｒｉｓ，７．５
８．３ｍＭＭｇＣｌ2
１．７ｍＭＥＧＴＡ
０．０１％ＢＳＡ
４℃で保存
ＲＮＡ結合ＹＳｉＳＰＡビーズ
ビーズは水中１００ｍｇ／ｍｌである。１Ｍ酢酸Ｚｎ／ＺｎＳＯ4溶液（３：１）および水を用いて１８ｍＭＺｎ中に５ｍｇ／ｍｌで希釈する。４℃で保存する。
低対照化合物    ２０ＸＤＭＳＯストックの濃度
ＰＤＥ１Ｂ：８−メトキシメチルＩＢＭＸ    ２０ｍＭ
ＰＤＥ２Ａ：ＥＨＮＡ                      １０ｍＭ
ＰＤＥ３Ｂ：Ｍｉｌｒｉｎｏｎｅ              ２ｍＭ
ＰＤＥ４Ｄ：Ｒｏｌｉｐｒａｍ              １０ｍＭ
ＰＤＥ５Ａ：Ｚａｐｒｉｎａｓｔ            １０ｍＭ
ＰＤＥ７Ｂ：ＩＢＭＸ                      ４０ｍＭ
ＰＤＥ１０Ａ：Ｄｉｐｙｒｉｄａｍｏｌｅ      ４ｍＭ
酵素濃度（２Ｘ最終濃度，アッセイバッファで希釈）
ＰＤＥ１Ｂ５０ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ２Ａ５０ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ３Ｂ１０ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ４Ｄ５ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ５Ａ２０ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ７Ｂ２５ｎｇ／ｍｌ
ＰＤＥ１０Ａ５ｎｇ／ｍｌ
放射性リガンド
［3Ｈ］ｃＡＭＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＴＲＫ５５９）。アッセイバッファ中に２０００Ｘで希釈する。
［3Ｈ］ｃＧＭＰ（ＡｍｅｒｓｈａｍＴＲＫ３９２）。ＰＤＥ５Ａアッセイ用のみ。アッセイバッファ中に２０００Ｘで希釈する。
【０５１１】
プロトコル
２ｍＭの９６ウエルマスタープレートからＢｉｏｍｅｋＦｘを用いて１μｌの化合物を３８４ウエルプレートに移すことにより，アッセイプレートを作製する。化合物の最終濃度は約１００μＭである。化合物を二重にアッセイするために各マスタープレートから二重のアッセイプレートを調製する。アッセイプレートのカラム２３に適当な対照化合物の２０ＸＤＭＳＯストックを１μｌ加える。これらは低対照である。
【０５１２】
Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅライブラリアッセイプレートのカラム１および２，およびＭａｙｂｒｉｄｇｅライブラリアッセイプレートのカラム２１および２２は，１μｌのＤＭＳＯを含む。これらは高対照である。
ＢｉｏｍｅｋＦｘを用いて，１０μｌの放射性リガンドを各アッセイウエルにピペットで加え，次に同じチップを用いて１０μｌの酵素を各ウエルにピペットで加える。
アッセイプレートを透明のカバーで覆う。１０００ＲＰＭで軽く遠心分離し，プレートシェーカーで１０秒間混合する。３０℃で３０分間インキュベートする。ＢｉｏｍｅｋＦｘを用いて，各アッセイウエルに１０μｌのビーズ混合物を加える。ビーズは各アッセイプレートに加える直前にリザーバー中でよく混合する。プレートを新たな透明の覆いで再び密封する。プレート振盪器で１０秒間混合し，次に，１０００ＲＰＭで１分間遠心分離する。
プレートを計数ラックに置く。３０分以上放置し，次にＷａｌｌａｃ  ＴｒｉＬｕｘでプログラム８を用いて計数する。
【０５１３】
データを酵素活性の％阻害として分析する。高対照の平均＝０％阻害。低対照の平均＝１００％阻害。
【０５１４】
実施例５４．ＰＤＥ４ＩＣ50の決定
ＩＣ50は，シンチレーションプロキシミティーアッセイ（ＳＰＡ）により決定した。このアッセイの原理は，ＰＤＥ４の基質であるｃＡＭＰはＹｉｔｔｒｉｕｍ  Ｓｉｌｉｃａｔｅ  ＳＰＡビーズに弱く結合するのに対し，ＰＤＥ４の加水分解の生成物であるＡＭＰはこれに強く結合することに基づく。したがって，ＰＤＥ４加水分解により生じた［3Ｈ］ＡＭＰのみがＳＰＡビーズに結合し，シンチレーションシグナルを生ずるため，［3Ｈ］ｃＡＭＰのサンプルのＰＤＥ４加水分解の程度を測定することができる。
【０５１５】
ＩＣ50アッセイに用いたＰＤＥ４酵素は以下のとおりである。
ＰＤＥ４Ｂ：Ｎ末端Ｈｉｓ６タグおよびトロンビン切断部位を有するヒトＰＤＥ４ＢのＳ１５２−Ｓ５２８からの触媒ドメインをＥ．ｃｏｌｉで発現させ，金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。酵素は５０％グリセロール中で−２０℃で保存した。
ＰＤＥ４Ｄ：Ｎ末端Ｈｉｓ６タグおよびトロンビン切断部位を有するヒトＰＤＥ４ＢのＳ３１６−Ｖ６９２からの触媒ドメインをＥ．ｃｏｌｉで発現させ，金属イオンアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。酵素は５０％グリセロール中で−２０℃で保存した。
【０５１６】
ＰＤＥ４Ｂ２：バキュロウイルスに感染した昆虫細胞で発現される全長ヒトＰＤＥ４Ｂ２アイソザイムであり，Ｎ末端Ｈｉｓ６タグおよびＴＥＶ切断部位を有する。酵素は細胞溶解物から精製せず，したがって，酵素濃度は測定しなかった。酵素は５０％グリセロール中で−２０℃で保存した。
【０５１７】
ＰＤＥ４Ｄ５：バキュロウイルス感染昆虫細胞で発現させた，Ｎ末端Ｈｉｓ６タグおよびＴＥＶ切断部位を有する全長ヒトＰＤＥ４Ｄ５アイソザイム。細胞溶解物から酵素を精製せず，したがって，酵素濃度は測定しなかった。酵素は５０％グリセロール中で−２０℃で保存した。
【０５１８】
ＩＣ50方法
試験した化合物（化合物および結果については表３Ｂ，４Ｂおよび５Ａを参照）は，化合物の強度により４ｍＭまたは４０μＭの出発濃度からＤＭＳＯ中で３倍で１１回連続希釈した。１μｌの各希釈物を白色ポリスチレン３８４ウエルアッセイプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ＃３７０５）の二重のウエルに移した。化合物希釈物に加えて，各アッセイプレートには，１μｌのＤＭＳＯ（０％酵素阻害を規定するため）または１μｌの２００μＭロフルミラスト（ｒｏｆｌｕｍｉｌａｓｔ）（１００％の酵素阻害を規定するため）を加えた対照ウエルを含めた。ＢｅｃｋｍａｎＦＸロボットを用いて，アッセイバッファ（５０ｍＭＴｒｉｓ，ｐＨ７．５；８．３ｍＭＭｇＣｌ；１．７ｍＭＥＧＴＡ；０．０１％ＢＳＡ）中の１０μｌの［3Ｈ］ｃＡＭＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＴＲＫ５５９）を２ｍＣｉ／ｍｌで各アッセイウエルに移した。次に，アッセイバッファ中１０μｌのＰＤＥ４酵素を加え，プレートを１０００ｒｐｍで３０秒間振盪して，ｃＡＭＰ加水分解反応を開始させた。用いた酵素の濃度は以下のとおりである：ＰＤＥ４Ｂ，８０ｎｇ／ｍｌ；ＰＤＥ４Ｄ，４ｎｇ／ｍｌ；ＰＤＥ４Ｂ２，２．５μｌの５０％グリセロールストック／ｍｌ；ＰＤＥ４Ｄ５０．０８３μｌの５０％グリセロールストック／ｍｌ。アッセイプレートを覆い，３０℃で３０分間インキュベートした。ロボットで１８ｍＭＺｎＳＯ4中の５ｍｇ／ｍｌＳＰＡビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＲＰＮＱ００１３）を１０μｌ加えることにより反応を停止した。アッセイプレートを透明なプラスチックフィルムで覆い，１０００ＲＰＭで１分間遠心分離してＳＰＡビーズを沈殿させ，Ｗａｌｌａｃ  ＴｒｉＬｕｘシンチレーションカウンターを用いて計数した。ＩＣ50は，生のアッセイデータから，ＭＤＬからのＡｓｓａｙ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒソフトウエアパッケージを用いて，非線形回帰曲線適合から計算した。
【０５１９】
実施例５５．全血培養物におけるＬＰＳ刺激によるＴＮＦα産生
実施例５４に記載されるようにして，以下のアッセイプロトコルを用いて化合物をアッセイして，ＩＣ50数を求めた（化合物および結果については表３Ｂおよび４Ｂを参照）。
【０５２０】
プロトコル
１．所望の濃度の化合物の２０ｍＭＤＭＳＯアリコートを得る（試験した化合物および結果については表３Ｂおよび４Ｂを参照）。２μｌ／ウエルのＤＭＳＯ中化合物を希釈プレートの最上列に入れる。９８μｌの２．５％熱不活性化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地を加える。
２．同じ培地で２％ＤＭＳＯを含むよう作製する。ウエルに６０μｌ／ウエルで加えて，化合物滴定を作製する。最上段から３０μｌを取り出し，プレートの下方向に１：３の希釈列を作製する。カラム１１には，４ウエルの５０μＭロフルミラストおよびピクラミラストを加える。カラム１２には，２％ＤＭＳＯ培地を加える。
３．２０μｌ／ウエルをアッセイプレートに二重に移す。
４．ヒトバフィーコートを得る。
５．１％Ｐ／Ｓおよび２．５％熱不活性化ＦＢＳを含む７倍容量のＲＰＭＩ１６４０培地で血液を希釈する（１：８希釈）。
６．１６０μｌ／ウエルの希釈した血液をアッセイプレートに加える。
７．３７℃，５％ＣＯ２で１時間インキュベートする。
８．ＬＰＳ（既にＰＢＳ中で１ｍｇ／ｍｌに希釈されており，２０μｌのアリコートが−２０℃で凍結されている）を所望の最終濃度の１０倍に希釈して，１０００倍希釈を作製する（最終濃度は１００ｎｇ／ｍｌとなるはずである）。
９．１時間インキュベートした後，２０μｌ／ウエルのＬＰＳをプレートに加える。非ＬＰＳ処理バックグラウンドも調製する。サンプルを振盪器に９００ｒｐｍで１分間置く。
１０．インキュベータで４時間インキュベートする。
１１．インキュベーション後，振盪器に９００ｒｐｍで１分間置き，プレートを１００ｇで１０分間，Ｄｅｃｅｌ５で回転させる。
１２．上から７５μｌの上清を新たなプレートに注意深くピペットで移す。必要に応じてサンプルを凍結する。
【０５２１】
Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  ｈｕ−ＴＮＦアルファＥＬＩＳＡ
使用する試薬
ＤＰＢＳ１０Ｘ：ＶＷＲ４５０００−４２８（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ水で１：１０に希釈）
ＴＷＥＥＮ２０：ＦＩＳＨＥＲ  ＢＰ３３７−５００
捕捉および検出抗体：Ｒ＆Ｄ  ＤＹ５１０Ｅ
ＳＴＲＥＰ−ＨＲＰ：Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  ｐａｒｔ  ＳＮＮ４００４Ｘ
発色試薬：Ｒ＆Ｄ  ＤＹ９９４
停止溶液：化学的に調製，またはＲ＆Ｄ  ＤＹ９９９
１．必要であればサンプルを溶解して室温にする。
２．ウエルあたり５０μｌのインキュベーションバッファを加える。
３．５０μｌの血液サンプルおよび５０μｌの希釈バッファを加える。
４．室温で２時間インキュベートする。
５．マイクロフィルを用いてプレートを３００μｌ／ウエルの洗浄バッファで４回洗浄する。洗浄バッファは０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＤＰＢＳ（ｐＨ７．２−７．４）である。
６．１００μｌビオチン化抗ＴＮＦアルファを加える。
７．室温で１時間インキュベーションする。
８．マイクロフィルを用いてプレートを３００μｌ／ウエルの洗浄バッファで４回洗浄する。洗浄バッファは，０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＤＰＢＳ（ｐＨ７．２−７．４）である。
９．１００ μｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ作業溶液を加える。
１０．室温で３０分間インキュベートする。
１１．マイクロフィルを用いてプレートを３００μｌ／ウエルの洗浄バッファで４回洗浄する。洗浄バッファは，０．０５％Ｔｗｅｅｎを含むＤＰＢＳ（ｐＨ７．２−７．４）である。
１２．１００ μｌのＣｈｒｏｍａｇｅｎを加える。
１３．十分に青色に発色するまで暗所で３０分間インキュベートする。
１４．１００μｌ／ウエルのストップ溶液（２ＮＨ2ＳＯ4）を加える。
１５．Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒにて４５０ｎｍで０．１ｓｅｃ／ウエルでプレートを読む。
【０５２２】
実施例５６．ラット阻害実験
すべての実験は，５匹ずつの群に分けた雄ラットＣＤ（ＳＤ）ＩＧＳＢＲ（Ｃｒｌ）（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて行った。化合物の投与量は表３Ｂおよび４Ｂに示されるとおりであり，表中に特に示さない限り，１００ｍｇ／ｋｇ  ｐｏで投与した。
【０５２３】
順化期間終了時，絶食していないラットの体重を量り，永久マーカーで個別に識別し，ベヒクル，参照化合物または試験化合物のいずれかを体重に合わせて１０ｍＬ／ｋｇの容量で経口（ｐｏ）または腹腔内（ｉｐ）経路で投与した。動物をポリスチレンで標識し床におがくずを入れたケージに５匹ずつ集めた。ベヒクル，参照物質または試験物質を投与した２時間後，ラットに０．１ｍｇ／ｋｇのＬＰＳを１ｍＬ／ｋｇ体重の容量で静脈内（ｉｖ）注射した。ＬＰＳチャレンジの２時間後（または表３Ｂおよび４Ｂに示されるように），ガス（イソフルラン）麻酔下で眼窩後方穿刺を行うことにより，抗凝血剤なしで血液サンプルをチューブ内に回収した。サンプルを室温で５−１０分間凝固させ，次に氷上に置き，遠心分離（６０００ｘｇ，３分間，４℃）により調製し，使用するまで−２０℃で保存した。ＴＮＦαのレベルは，製造元の方法にしたがってＥＬＩＳＡ法により血清サンプル中で二重に測定した（Ｒａｔ  ＴＮＦαキット  ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＭ（ＲＴＡ００，Ｒ＆ＤＳｙｓｔｅｍ，Ｆｒａｎｃｅ））。データは，観察されたＴＮＦαレベルの，ベヒクルを投与した動物群について観察されたＴＮＦαレベルに対する減少のパーセントで表した。
【０５２４】
実施例５７：ＰＤＥ４Ｂの部位特異的変異誘発
ＰＤＥ４Ｂの変異誘発は，例えば，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｔｒｅｎｄｓ．Ｅｄｓ．Ａ．Ｍ．Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｈ．Ｇ．Ｇｒｉｆｆｉｎ．（１９９５）ＩＳＢＮ１−８９８４８６−０１−８，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ＰＯ  Ｂｏｘ１，Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ，Ｎｏｒｆｏｌｋ，Ｕ．Ｋ．，に記載されている方法にしたがって行うことができる。
【０５２５】
インビトロ部位特異的変異誘発はタンパク質構造−機能相関，遺伝子発現およびベクターの改変を研究するために非常に貴重な手法である。文献にはいくつかの方法がみられるが，これらの方法の多くはテンプレートとして一本鎖ＤＮＡを必要とする。その理由は，歴史的に，再アニーリングを防止するために相補鎖を分離することが必要であったからである。部位特異的変異誘発においてＰＣＲを用いることによって，変性工程を用いて相補鎖を分離し，ＰＣＲプライマーの効率的な重合を可能とすることにより，鎖分離を行うことができる。したがって，ＰＣＲ部位特異的方法は，事実上いかなる二本鎖プラスミド中にも部位特異的変異を取り込ませることができ，Ｍ１３系のベクターや一本鎖レスキューを必要としない。
【０５２６】
ＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発を行う場合には，任意の（望ましくない）二次部位変異のクローン増殖を防止するためにＰＣＲの間のサイクル数を減少させることがしばしば望ましい。限定されたサイクリングにより生成物の収率が低下することは，出発テンプレート濃度を増加させることにより補う。選択を用いて反応から来る親分子の数を減少させる。また，１つのＰＣＲプライマーセットを用いるために，長いＰＣＲ法を最適化することが望ましい。さらに，いくつかの熱安定性ポリメラーゼのエクステンダーゼ活性のため，ＰＣＲプライマーの一方または両方に変異が組み込まれているＰＣＲ生成産物の末端と末端とをライゲーションさせる前に，手順の中に末端を磨く工程を組み込むことがしばしば必要である。
【０５２７】
以下のプロトコルは，部位特異的変異誘発のための容易な方法を提供し，以下の工程を組み込むことにより上述の望ましい特徴を達成する：（ｉ）テンプレート濃度を慣用のＰＣＲ条件より約１０００倍増加させる；（ｉｉ）サイクル数を２５−３０から５−１０に減少させる；（ｉｉｉ）制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（認識標的配列：５−Ｇｍ６ＡＴＣ−３，ここでＡ残基はメチル化されている）を加えて，親ＤＮＡに対して選択する（注：Ｅ．ｃｏｌｉのほぼすべての一般的な株から単離されたＤＮＡは配列５−ＧＡＴＣ−３でＤａｍ−メチル化されている）；（ｉｖ）ＰＣＲの信頼性を１０ｋｂまで高めるためにＰＣＲミックス中でＴａｑＥｘｔｅｎｄｅｒを使用する；（ｖ）ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲ産物の末端を磨く，および（ｖｉ）Ｔ４ＤＮＡリガーゼの存在下で効率的な分子内ライゲーションを行う。
【０５２８】
プラスミドテンプレートＤＮＡ（約０．５ｐｍｏｌｅ）を，２５μｌの１ｘ変異誘発バッファ（２０ｍＭＴｒｉｓＨＣｌ，ｐＨ７．５；８ｍＭＭｇＣｌ２；４０ｕｇ／ｍｌＢＳＡ）中に１２−２０ｐｍｏｌｅの各プライマー（このうちの１つは５’リン酸を含んでいなければならない），各２５０μＭのｄＮＴＰ，２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ，２．５ＵのＴａｑＥｘｔｅｎｄｅｒ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を含むＰＣＲカクテルに加える。
【０５２９】
ＰＣＲサイクルパラメータは以下のとおりである：９４℃４分間，５０℃２分間，７２℃２分間を１サイクル，次に，９４℃１分間，５４℃２分間および７２℃１分間を５−１０サイクル（工程１）。
【０５３０】
親テンプレートＤＮＡおよび新たに合成されたＤＮＡを取り込んだ直線化した変異誘発プライマーをＤｐｎＩ（１０Ｕ）およびＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）で処理する。これにより，インビボメチル化親テンプレートおよびハイブリッドＤＮＡがＤｐｎＩで消化され，ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼにより直線状ＰＣＲ産物上のＴａｑＤＮＡポリメラーゼ伸長塩基が除かれる。
【０５３１】
反応液を３７℃で３０分間インキュベートし，次に７２℃に移してさらに３０分間インキュベートする（工程２）。
【０５３２】
変異誘発バッファ（１ｘ，１１５μｌ，０．５ｍＭＡＴＰを含む）を，ＤｐｎＩ消化，ＰｆｕＤＮＡポリメラーゼ処理ＰＣＲ産物に加える。
【０５３３】
溶液を混合し，１０μｌを新たなマイクロフュージチューブに入れ，Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（２−４Ｕ）を加える。
【０５３４】
ライゲーション溶液を３７℃で６０分以上インキュベートする（工程３）。
【０５３５】
処置した溶液をコンピテントＥ．ｃｏｌｉにトランスフォーメーションする（工程４）。
【０５３６】
上述したＰＣＲに基づく部位特異的変異誘発に加えて，他の方法も利用可能である。例えば，以下に記載されている方法：Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：４８８−４９２；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１３：８７６４−８７８５；およびＰｒｏｍｅｇａのＧｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒ（商標）部位特異的変異誘発システムを用いる方法がある。
【０５３７】
【表１】
2008503446.tif 000080
【０５３８】
【表２】
2008503446.tif 000081
【０５３９】
【表３】
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【０５４０】
【表４】
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【０５４１】
【表５】
2008503446.tif 000084
【０５４２】
【表６】
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【０５４３】
【表７】
2008503446.tif 000086
【０５４４】
【表８】
2008503446.tif 000087
【０５４５】
【表９】
2008503446.tif 000088
【０５４６】
【表１０】
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【０５４７】
【表１１】
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【０５４８】
【表１２】
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【０５４９】
【表１３】
2008503446.tif 000092
【０５５０】
【表１４】
2008503446.tif 000093
【０５５１】
【表１５】
2008503446.tif 000094
【０５５２】
【表１６】
2008503446.tif 000095
【０５５３】
【表１７】
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【０５５４】
【表１８】
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【０５５５】
【表１９】
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【０５５６】
【表２０】
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【０５５７】
【表２１】
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【０５５８】
【表２２】
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【０５５９】
【表２３】
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【０５６０】
【表２４】
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【０５６１】
【表２５】
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【０５６２】
【表２６】
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【０５６３】
【表２７】
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【０５６４】
【表２８】
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【０５６５】
【表２９】
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【０５６６】
【表３０】
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【０５６７】
【表３１】
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【０５６８】
【表３２】
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【０５６９】
【表３３】
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【０５７０】
【表３４】
2008503446.tif 000113
【０５７１】
【表３５】
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【０５７２】
【表３６】
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【０５７３】
【表３７】
2008503446.tif 000116
【０５７４】
【表３８】
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【０５７５】
【表３９】
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【０５７６】
【表４０】
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【０５７７】
【表４１】
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【０５７８】
【表４２】
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【０５７９】
【表４３】
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【０５８０】
【表４４】
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【０５８１】
【表４５】
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【０５８２】
【表４６】
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【０５８３】
【表４７】
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【０５８４】
【表４８】
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【０５８５】
【表４９】
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【０５８６】
【表５０】
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【０５８７】
【表５１】
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【０５８８】
【表５２】
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【０５８９】
【表５３】
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【０５９０】
【表５４】
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【０５９１】
【表５５】
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【０５９２】
【表５６】
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【０５９３】
【表５７】
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【０５９４】
【表５８】
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【０５９５】
【表５９】
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【０５９６】
【表６０】
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【０５９７】
【表６１】
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【０５９８】
【表６２】
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【０５９９】
【表６３】
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【０６００】
【表６４】
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【０６０１】
【表６５】
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【０６０２】
【表６６】
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【０６０３】
【表６７】
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【０６０４】
【表６８】
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【０６０５】
【表６９】
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【０６０６】
【表７０】
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【０６０７】
【表７１】
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【０６０８】
【表７２】
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【０６０９】
【表７３】
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【０６１０】
【表７４】
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【０６１１】
【表７５】
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【０６１２】
【表７６】
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【０６１３】
【表７７】
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【０６１４】
【表７８】
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【０６１５】
【表７９】
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【０６１６】
【表８０】
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【０６１７】
【表８１】
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【０６１８】
【表８２】
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【０６１９】
【表８３】
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【０６２０】
【表８４】
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【０６２１】
【表８５】
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【０６２２】
【表８６】
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【０６２３】
【表８７】
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【０６２４】
【表８８】
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【０６２５】
【表８９】
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【０６２６】
【表９０】
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【０６２７】
【表９１】
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【０６２８】
【表９２】
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【０６２９】
【表９３】
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【０６３０】
【表９４】
2008503446.tif 000173
【０６３１】
【表９５】
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【０６３２】
【表９６】
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【０６３３】
【表９７】
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【０６３４】
【表９８】
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【０６３５】
【表９９】
2008503446.tif 000178
【０６３６】
【表１００】
2008503446.tif 000179
【０６３７】
【表１０１】
2008503446.tif 000180
【０６３８】
【表１０２】
2008503446.tif 000181
【０６３９】
【表１０３】
2008503446.tif 000182
【０６４０】
【表１０４】
2008503446.tif 000183
【０６４１】
【表１０５】
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【０６４２】
【表１０６】
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【０６４３】
【表１０７】
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【０６４４】
【表１０８】
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【０６４５】
【表１０９】
2008503446.tif 000188
【０６４６】
【表１１０】
2008503446.tif 000189
【０６４７】
【表１１１】
2008503446.tif 000190
【０６４８】
【表１１２】
2008503446.tif 000191
【０６４９】
【表１１３】
2008503446.tif 000192
【０６５０】
【表１１４】
2008503446.tif 000193
【０６５１】
【表１１５】
2008503446.tif 000194
【０６５２】
【表１１６】
2008503446.tif 000195
【０６５３】
【表１１７】
2008503446.tif 000196
【０６５４】
【表１１８】
2008503446.tif 000197
【０６５５】
【表１１９】
2008503446.tif 000198
【０６５６】
【表１２０】
2008503446.tif 000199
【０６５７】
【表１２１】
2008503446.tif 000200
【０６５８】
【表１２２】
2008503446.tif 000201
【０６５９】
【表１２３】
2008503446.tif 000202
【０６６０】
【表１２４】
2008503446.tif 000203
【０６６１】
【表１２５】
2008503446.tif 000204
【０６６２】
【表１２６】
2008503446.tif 000205
【０６６３】
【表１２７】
2008503446.tif 000206
【０６６４】
【表１２８】
2008503446.tif 000207
【０６６５】
【表１２９】
2008503446.tif 000208
【０６６６】
【表１３０】
2008503446.tif 000209
【０６６７】
【表１３１】
2008503446.tif 000210
【０６６８】
本明細書において引用されるすべての特許および他の参考文献は，本発明の属する技術分野の技術者のレベルを示しており，表および図面を含めその全体を，それぞれの参考文献の全体が個々に本明細書の一部としてここに引用されることと同じ程度に，本明細書の一部として引用される。
【０６６９】
当業者は，本発明は，記載される結果および利点，ならびに本明細書に固有のものを得るのによく適合していることを容易に理解するであろう。本明細書に好ましい態様の代表的なものとして記載される方法，変種および組成物は，例示的なものであって，本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者は，その改変および他の用途をなすであろう。これらの改変は本発明の精神の中に包含され，特許請求の範囲により定義される。
【０６７０】
当業者は，本発明の範囲および精神から逸脱することなく，本明細書に開示される本発明に対して種々の置換および改変をなすことができることを容易に理解するであろう。例えば，ＰＤＥ４Ｂタンパク質についての結晶化または共結晶化条件および／または種々のホスホジエステラーゼドメイン配列についての変形物を用いることができる。すなわち，そのような追加の態様も本発明および特許請求の範囲の範囲内である。
【０６７１】
本明細書に例示的に記載されている発明は，本明細書に特定的に開示されていない任意の要素または限定なしでも適切に実施することができる。本明細書において用いた用語および表現は，説明の用語として用いるものであり，限定ではなく，そのような用語および表現の使用においては，示されかつ記載されている特徴またはその一部の同等物を排除することを意図するものではなく，特許請求の範囲に記載される本発明の範囲中で種々の変更が可能であることが理解される。すなわち，好ましい態様および任意の特徴により本発明を特定的に開示してきたが，当業者には本明細書に記載される概念の変更および変種が可能であり，そのような変更および変種も特許請求の範囲に定義される本発明の範囲内であると考えられることが理解されるべきである。
【０６７２】
さらに，発明の特徴および局面がマーカッシュグループの用語または他の代替物のグループの用語で記載されている場合，当業者は，本発明が，マーカッシュグループまたは他のグループのすべての個々のメンバーまたはメンバーのサブグループに関してもまた記載されていることを認識するであろう。
【０６７３】
また，特に断らない限り，ある態様について種々の数値が与えられている場合，追加の態様は，任意の２つの異なる数値を範囲の終点としてとることにより記述される。そのような範囲もまた本明細書に記載される発明の範囲内である。
【０６７４】
すなわち，追加の態様も本発明の範囲内であり，特許請求の範囲の範囲内である。
【０６７５】
配列番号1  GenBank ポリペプチド 配列 JC1519
配列番号2  NP＿002591のS324 − S700 
配列番号3   AAB96381のS309 − S685
配列番号4   AAA35643のS194 − S570
配列番号5  5'-CCGAATT CATATG AGCATCTCACGCTTTGGAGTC-3'
配列番号6  5'-TGTGCT CTCGAG TTA GCTGTGTCCCTCTCCCTCC-3'
配列番号7  5'-GATATGTCTAAACACATGAGCCTGCTGGC-3'
配列番号8  -GCCAGCAGGCTCATGTGTTTAGACATATC-3'
配列番号9 
AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCC
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGATCCGG
AATTCAAAGGCCTACGTCGACTAGAGCCTGCAGTCTCGACCATCATCATCATCATCATTAATAAAAGGGCG 
AATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGG
CTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG 
配列番号10
ag catctcacgc tttggagtca acactgaaaa tgaagatcac
1261 ctggccaagg agctggaaga cctgaacaaa tggggtctta acatctttaa tgtggctgga
1321 tattctcaca atagacccct aacatgcatc atgtatgcta tattccagga aagagacctc
1381 ctaaagacat tcagaatctc atctgacaca tttataacct acatgatgac tttagaagac
1441 cattaccatt ctgacgtggc atatcacaac agcctgcacg ctgctgatgt agcccagtcg
1501 acccatgttc tcctttctac accagcatta gacgctgtct tcacagattt ggaaatcctg
1561 gctgccattt ttgcagctgc catccatgac gttgatcatc ctggagtctc caatcagttt
1621 ctcatcaaca caaattcaga acttgctttg atgtataatg atgaatctgt gttggaaaat
1681 catcaccttg ctgtgggttt caaactgctg caagaagaac actgtgacat cttcatgaat
1741 ctcaccaaga agcagcgtca gacactcagg aagatggtta ttgacatggt gttagcaact
1801 gatatgtcta aacacatgag cctgctggca gacctgaaga caatggtaga aacgaagaaa
1861 gttacaagtt caggcgttct tctcctagac aactataccg atcgcattca ggtccttcgc
1921 aacatggtac actgtgcaga cctgagcaac cccaccaagt ccttggaatt gtatcggcaa
1981 tggacagacc gcatcatgga ggaatttttc cagcagggag acaaagagcg ggagagggga
2041 atggaaatta gcccaatgtg tgataaacac acagcttctg tggaaaaatc ccaggttggt
2101 ttcatcgact acattgtcca tccattgtgg gagacatggg cagatttggt acagcctgat
2161 gctcaggaca ttctcgatac cttagaagat aacaggaact ggtatcagag catgatacct
2221 caaagtccct caccaccact ggacgagcag aacagggact gccagggtct gatggagaag
2281 tttcagtttg aactgactct cgatgaggaa gattctgaag gacctgagaa ggagggagag
2341 ggacacagct aa
配列番号11
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MSISRFGVNT ENEDHLAKEL EDLNKWGLNI FNVAGYSHNR
PLTCIMYAIF QERDLLKTFR ISSDTFITYM MTLEDHYHSD VAYHNSLHAA DVAQSTHVLL
STPALDAVFT DLEILAAIFA AAIHDVDHPG VSNQFLINTN SELALMYNDE SVLENHHLAV
GFKLLQEEHC DIFMNLTKKQ RQTLRKMVID MVLATDMSKH MSLLADLKTM VETKKVTSSG
VLLLDNYTDR IQVLRNMVHC ADLSNPTKSL ELYRQWTDRI MEEFFQQGDK ERERGMEISP
MCDKHTASVE KSQVGFIDYI VHPLWETWAD LVQPDAQDIL DTLEDNRNWY QSMIPQSPSP
PLDEQNRDCQ GLMEKFQFEL TLDEEDSEGP EKEGEGHS
配列番号12  図 4のPDB4B アミノ酸 配列
配列番号13  図 4のPDB4D アミノ酸 配列
配列番号14  PDB4A
配列番号15  PDB4C
【図面の簡単な説明】
【０６７６】
【図１】図１は，ｐＥＴ１５Ｓの核酸配列をマルチクローニングサイトとともに示す。
【図２】図２は，本明細書に記載される研究で用いられたＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインの核酸配列を示す。
【図３】図３は，本明細書に記載される研究で用いられたＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインのアミノ酸配列を示す。
【図４】図４はＰＤＥ４ＢおよびＰＤＥ４Ｄのホスホジエステラーゼドメインのアラインメントを示し，選択的リガンドを設計するために利用しうる３つの領域が丸で示されている。
【図５】図５はＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインのリボンダイアグラムの略図を示す。
【図１】
2008503446.tif 000237
【図２】
2008503446.tif 000238
【図３】
2008503446.tif 000239
【図４】
2008503446.tif 000240
【図５】
2008503446.tif 000241
【配列表】
2008503446000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年4月5日(2007.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００９】
PDE4サブファミリーは，４つの構成員から構成される：PDE4A(配列14)，ＰＤＥ４Ｂ(配列12)，PDE4C (配列15)，及びPDE4D(配列13)(Contiら，(2003年)J．Biol  Chem．278年：5493-5496頁)。このPDE4酵素は，基質としてcGMPよりもcAMPに対して優先傾向を示す。これらの酵素は，おそらく二量体形成を媒介するN-末端調節ドメインを有し，これにより最適にPDE活性が調節される。さらに，活性は，このアップストリーム調節ドメインのcAMP-依存性プロテインキナーゼリン酸化部位を介して調節される。これらの酵素は，偏在的に発現されるが，重要なことにはリンパ球中で発現される。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
“ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼ”および“ＰＤＥ４Ｂ”との用語は，同じ長さのセグメントにわたる最大アラインメントについて，天然のＰＤＥ４Ｂ（配列１）のＧｅｎＢａｎｋポリペプチド配列ＪＣ１５１９を参照してアミノ酸残基１５２−５２８（Ｓ１５２−Ｓ５２８）と９０％より高いアミノ酸配列同一性を有する部分を含むか，または，天然のＰＤＥ４ＢのＪＣ１５１９のアミノ酸残基１５２−５２８からの少なくとも２００個の連続するアミノ酸と９０％より高いアミノ酸配列同一性を有する部分を含み，天然のＰＤＥ４Ｂリガンドへの結合を保持している，酵素的に活性なホスホジエステラーゼを意味する。好ましくは，配列同一性は少なくとも９５，９７，９８，９９％，またはさらに１００％である。好ましくは，特定される配列同一性のレベルは，少なくとも３００個の連続するアミノ酸残基の長さの配列にわたる。ＪＣ１５１９のアミノ酸残基１５２−５２８で特定される配列はまた，ＮＰ＿００２５９１（ＮＭ＿００２６００によりコードされる，配列２）のＳ３２４−Ｓ７００，ＡＡＢ９６３８１（配列３）のＳ３０９−Ｓ６８５，およびＡＡＡ３５６４３（配列４）のＳ１９４−Ｓ５７０としても入手可能である。したがって，挙げられる配列の１つにより同定されるアミノ酸残基もまた，挙げられる配列のいずれか別のものまたは他のマッチした配列においてマッチしたアミノ酸残基として表現することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４９６】
実施例４８：ＰＤＥ４Ｂホスホジエステラーゼドメインのクローニング
ＰＤＥ４ＢｃＤＮＡ配列は，ヒト脳海馬ＱＵＩＣＫ−ＣｌｏｎｅｃＤＮＡライブラリ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，＃７１６９−１）から以下のプライマーを用いるＰＣＲにより増幅した。
ＰＤＥ４Ｂ−Ｓ：
５’−ＣＣＧＡＡＴＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＡＴＣＴＣＡＣＧＣＴＴＴＧＧＡＧＴＣ−３’（配列５）
ＰＤＥ４Ｂ−Ａ：
５’−ＴＧＴＧＣＴＣＴＣＧＡＧＴＴＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＣＴＣＴＣＣＣＴＣＣ−３’（配列６）
次に，以下のプライマーを用いて，部位特異的変異誘発により内部ＮｄｅＩ部位を除く処理をした。
ＰＤＥ４Ｂ−ＮＤＥ１：
５’−ＧＡＴＡＴＧＴＣＴＡＡＡＣＡＣＡＴＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＣ−３’（配列７）
ＰＤＥ４Ｂ−ＮＤＥ２：
５’−ＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＴＣＡＴＧＴＧＴＴＴＡＧＡＣＡＴＡＴＣ−３’（配列８）
得られたＰＣＲフラグメントをＮｄｅＩおよびＳａｌＩで消化し，ｐＥＴ１５Ｓベクターにサブクローニングした。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４９７】
この発現プラスミド中では，ＰＤＥ４Ｂ（ＮＣＢＩ配列ＪＣ１５１９，配列１）の残基１５２−５２８はＮ末端Ｈｉｓタグおよびそれに続くトロンビン切断部位とインフレームである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０６７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０６７５】
配列1  GenBank ポリペプチド 配列 JC1519
配列2  NP＿002591のS324 − S700 
配列3   AAB96381のS309 − S685
配列4   AAA35643のS194 − S570
配列5  5’-CCGAATT CATATG AGCATCTCACGCTTTGGAGTC-3’  （配列番号１）
配列6  5’-TGTGCT CTCGAG TTA GCTGTGTCCCTCTCCCTCC-3’  （配列番号２）
配列7  5’-GATATGTCTAAACACATGAGCCTGCTGGC-3’  （配列番号３）
配列8  -GCCAGCAGGCTCATGTGTTTAGACATATC-3’  （配列番号４）
配列9 
AGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCC
TCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACC
ATGGGCAGCAGCCATCATCATCATCATCACAGCAGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGATCCGG
AATTCAAAGGCCTACGTCGACTAGAGCCTGCAGTCTCGACCATCATCATCATCATCATTAATAAAAGGGCG 
AATTCCAGCACACTGGCGGCCGTTACTAGTGGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGG
CTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTG   （配列番号５）
配列10 
ag catctcacgc tttggagtca acactgaaaa tgaagatcac
1261 ctggccaagg agctggaaga cctgaacaaa tggggtctta acatctttaa tgtggctgga
1321 tattctcaca atagacccct aacatgcatc atgtatgcta tattccagga aagagacctc
1381 ctaaagacat tcagaatctc atctgacaca tttataacct acatgatgac tttagaagac
1441 cattaccatt ctgacgtggc atatcacaac agcctgcacg ctgctgatgt agcccagtcg
1501 acccatgttc tcctttctac accagcatta gacgctgtct tcacagattt ggaaatcctg
1561 gctgccattt ttgcagctgc catccatgac gttgatcatc ctggagtctc caatcagttt
1621 ctcatcaaca caaattcaga acttgctttg atgtataatg atgaatctgt gttggaaaat
1681 catcaccttg ctgtgggttt caaactgctg caagaagaac actgtgacat cttcatgaat
1741 ctcaccaaga agcagcgtca gacactcagg aagatggtta ttgacatggt gttagcaact
1801 gatatgtcta aacacatgag cctgctggca gacctgaaga caatggtaga aacgaagaaa
1861 gttacaagtt caggcgttct tctcctagac aactataccg atcgcattca ggtccttcgc
1921 aacatggtac actgtgcaga cctgagcaac cccaccaagt ccttggaatt gtatcggcaa
1981 tggacagacc gcatcatgga ggaatttttc cagcagggag acaaagagcg ggagagggga
2041 atggaaatta gcccaatgtg tgataaacac acagcttctg tggaaaaatc ccaggttggt
2101 ttcatcgact acattgtcca tccattgtgg gagacatggg cagatttggt acagcctgat
2161 gctcaggaca ttctcgatac cttagaagat aacaggaact ggtatcagag catgatacct
2221 caaagtccct caccaccact ggacgagcag aacagggact gccagggtct gatggagaag
2281 tttcagtttg aactgactct cgatgaggaa gattctgaag gacctgagaa ggagggagag
2341 ggacacagct aa   （配列番号６）
配列11 
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MSISRFGVNT ENEDHLAKEL EDLNKWGLNI FNVAGYSHNR
PLTCIMYAIF QERDLLKTFR ISSDTFITYM MTLEDHYHSD VAYHNSLHAA DVAQSTHVLL
STPALDAVFT DLEILAAIFA AAIHDVDHPG VSNQFLINTN SELALMYNDE SVLENHHLAV
GFKLLQEEHC DIFMNLTKKQ RQTLRKMVID MVLATDMSKH MSLLADLKTM VETKKVTSSG
VLLLDNYTDR IQVLRNMVHC ADLSNPTKSL ELYRQWTDRI MEEFFQQGDK ERERGMEISP
MCDKHTASVE KSQVGFIDYI VHPLWETWAD LVQPDAQDIL DTLEDNRNWY QSMIPQSPSP
PLDEQNRDCQ GLMEKFQFEL TLDEEDSEGP EKEGEGHS    （配列番号７）
配列12  図 4のPDB4B アミノ酸 配列   （配列番号８）
配列13  図 4のPDB4D アミノ酸 配列   （配列番号９）
配列14  PDB4A
配列15  PDB4C
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008503446000001.app
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2008503446.tif 000244
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２】
2008503446.tif 000245
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図３】
2008503446.tif 000246
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４】
2008503446.tif 000247
【国際調査報告】
2008503446.tif 000248