(57)【要約】  アフィニティーカラムに使用するのに適した硬質の支持体、アフィニティーカラム、および例えば高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）のカラムのような分析カラムと流体的に連絡されたアフィニティーカラムを含む装置構成要素が記載されている。１種またはそれ以上の被検体の存在を検出するためにこれらの構成機素を使用する方法も記載されている。
2008506961.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析カラムと流体的に連絡したアフィニティーカラムを備えている装置であって、該アフィニティーカラムが最高約２００バールのカラムの圧力に耐え得る硬質の支持体を含み、該硬質の支持体はそれに結合した１種またはそれ以上のリガンドを有し、該１種またはそれ以上のリガンドは与えられた試料溶液の内部で１種またはそれ以上の被検体と選択的に結合することができることを特徴とする、上記装置。
【請求項２】
硬質の支持体が多数の無機粒子を含むことを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項３】
各無機粒子が（ｉ）無機基質、および（ｉｉ）望ましくない物質の該無機基質に対する不特異的な結合を減少させるように修飾された基質表面を備えることを特徴とする請求項２記載の装置。
【請求項４】
修飾された基質の表面が無機基質に取り付けられた１種またはそれ以上のＲ１０基を含んで成り、各Ｒ１０基は独立に−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選ばれることを特徴とする請求項３記載の装置。
【請求項５】
各Ｒ１０基が−ＣＨ２ＯＨを含むことを特徴とする請求項４記載の装置。
【請求項６】
１種またはそれ以上のリガンドが、モノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、モノクローナル抗ビスフェノールＡ抗体、モノクローナル抗２，４−ジクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗４−クロロ−２−メチル酢酸抗体、モノクローナル抗４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸抗体、モノクローナル抗エストロン抗体、モノクローナル抗１７−β−エストラジオール抗体、モノクローナル抗１７−α−エチニルエストラジオール抗体、モノクローナル抗ラクトフェリン抗体、モノクローナル抗テストステロン抗体、モノクローナル抗ノルテストステロン抗体、モノクローナル抗フェニル尿素抗体、モノクローナル抗ビンクロゾリン抗体、モノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、モノクローナル抗フェニトロチオン抗体、モノクローナル抗クロルピリフォス抗体、モノクローナル抗ピリミフォス抗体、モノクローナル抗カテコールアミン抗体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）、およびこれらの組合せ物を含むことを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項７】
１種またはそれ以上の被検体がアフラトキシンＢ１、アフラトキシンＧ１、アフラトキシンＱ１、アフラトキシンＢ２、アフラトキシンＧ２、ビスフェノールＡ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、４−クロロ−２−メチル酢酸、４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸、エストロン、１７−β−エストラジオール、１７−α−エチニルエストラジオール、ラクトフェリン、テストステロン、ノルテストステロン、メトブロムロン、シノスルフロン、トリアスルフロンおよびプロスルフロン、ビンクロゾリン、葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、フェニトロチオン、クロルピリフォス、ピリミフォス、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン、エストロゲン活性をもった化合物、或いはそれらの組み合わせ物を含むことを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項８】
１種またはそれ以上のリガンドが、モノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノク
ローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、或いはそれらの組み合わせ物を含むことを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項９】
１種またはそれ以上のリガンドがモノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、或いはそれらの組み合わせ物を含むことを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項１０】
１種またはそれ以上のリガンドが組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）を含んで成ることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項１１】
アフィニティーカラムが管状の連結装置で分析カラムに連結されていることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項１２】
分析カラムが逆相高圧液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）装置の分析カラムの一部をなしていることを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項１３】
さらに蛍光検出装置を備えていることを特徴とする請求項１２記載の装置。
【請求項１４】
硬質の支持体が多数のシリカゲル粒子を含むことを特徴とする請求項１記載の装置。
【請求項１５】
シリカゲル粒子が、回転楕円体状の形をし、細孔の平均の大きさが約５００〜８００Åであることを特徴とする請求項１４記載の装置。
【請求項１６】
アフィニティーカラムに使用するのに適した硬質の支持体であって、該硬質の支持体が多数の無機粒子を含んで成り、ここで各粒子は
無機基質；
被検体でない物質およびリガンド特異性被検体物質の無機基質に対する非特異的な結合を減少させるように修飾された基質表面；および
無機基質に結合した１種またはそれ以上のリガンドを含んで成り、該１種またはそれ以上のリガンドはモノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、モノクローナル抗ビスフェノールＡ抗体、モノクローナル抗２，４−ジクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗４−クロロ−２−メチル酢酸抗体、モノクローナル抗４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸抗体、モノクローナル抗エストロン抗体、モノクローナル抗１７−β−エストラジオール抗体、モノクローナル抗１７−α−エチニルエストラジオール抗体、モノクローナル抗ラクトフェリン抗体、モノクローナル抗テストステロン抗体、モノクローナル抗ノルテストステロン抗体、モノクローナル抗フェニル尿素抗体、モノクローナル抗ビンクロゾリン抗体、モノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、モノクローナル抗フェニトロチオン抗体、モノクローナル抗クロルピリフォス抗体、モノクローナル抗ピリミフォス抗体、モノクローナル抗カテコールアミン抗体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）、およびこれらの組合せ物を含むことを特徴とする硬質の支持体。
【請求項１７】
修飾された基質の表面が無機基質に取り付けられた１種またはそれ以上のＲ１０基を含んで成り、各Ｒ１０基は独立に−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選ばれることを特徴とする請求項１６記載の硬質の支持体。
【請求項１８】
１種またはそれ以上のＲ１０基が２価の部分−Ｘ−を介して無機基質に取り付けられていることを特徴とする請求項１７記載の硬質の支持体。
【請求項１９】
１種またはそれ以上のリガンドが、無機基質上の反応部位と１種またはそれ以上のリガンド上の官能基との間に連結をつくる一つまたはそれ以上の連結子を介して無機基質に取り付けられていることを特徴とする請求項１６記載の硬質の支持体。
【請求項２０】
一つまたはそれ以上の連結子がジアルデヒドと組み合わされたアミノ置換シロキサンを含むことを特徴とする請求項１９記載の硬質の支持体。
【請求項２１】
アミノ置換シロキサンがアミノプロピルトリメトキシシランを含んで成り、ジアルデヒドはグルタルアルデヒドを含むことを特徴とする請求項２０記載の硬質の支持体。
【請求項２２】
１種またはそれ以上のリガンドは無機基質上の反応部位に直接取り付けられていることを特徴とする請求項１６記載の硬質の支持体。
【請求項２３】
修飾された基質の表面が反応部位を含んで成り、該反応部位の約５０〜約９９％は修飾を行う前の基質の表面上のどの官能基よりも反応性の低いＲ基で覆われており、該反応部位の約１〜約５０％は１種またはそれ以上のリガンドまたは随時存在する連結子で覆われていることを特徴とする請求項１６記載の硬質の支持体。
【請求項２４】
反応部位の約７０〜約９５％が修飾を行う前の基質の表面上のどの官能基よりも反応性の低いＲ基で覆われており、該反応部位の約５〜約３０％は１種またはそれ以上のリガンドまたは随時存在する連結子で覆われていることを特徴とする請求項２３記載の硬質の支持体。
【請求項２５】
１種またはそれ以上のリガンドが、モノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、或いはそれらの組み合わせ物を含むことを特徴とする請求項１６記載の硬質の支持体。
【請求項２６】
１種またはそれ以上のリガンドがモノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、或いはそれらの組み合わせ物を含むことを特徴とする請求項１６記載の硬質の支持体。
【請求項２７】
１種またはそれ以上のリガンドが組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）を含むことを特徴とする請求項１６記載の硬質の支持体。
【請求項２８】
硬質の支持体が多数のシリカゲルの粒子を含むことを特徴とする請求項１６記載の硬質の支持体。
【請求項２９】
シリカゲルの粒子が回転楕円体状の形をし、細孔の平均の大きさが約５００〜８００Åであることを特徴とする請求項２８記載の硬質の支持体。
【請求項３０】
請求項１６〜２９のいずれか一つに記載された硬質の支持体を含むことを特徴とするアフィニティーカラム。
【請求項３１】
流体的に連絡したアフィニティーカラムを具備し、該アフィニティーカラムは請求項３０記載のアフィニティーカラムを含んで成ることを特徴とする装置。
【請求項３２】
或るカラム容積をもつカラム構造物；および
該カラム構造物のカラム容積の中にある硬質の支持体を備えており、該硬質の支持体は多数の無機粒子を含んで成り、ここで各粒子は
無機基質；
被検体でない物質およびリガンド特異性被検体物質の無機基質に対する非特異的な結合を減少させるように修飾された基質表面；および
無機基質に結合した１種またはそれ以上のリガンドを含んで成り、該１種またはそれ以上のリガンドはモノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、モノクローナル抗ビスフェノールＡ抗体、モノクローナル抗２，４−ジクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗４−クロロ−２−メチル酢酸抗体、モノクローナル抗４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸抗体、モノクローナル抗エストロン抗体、モノクローナル抗１７−β−エストラジオール抗体、モノクローナル抗１７−α−エチニルエストラジオール抗体、モノクローナル抗ラクトフェリン抗体、モノクローナル抗テストステロン抗体、モノクローナル抗ノルテストステロン抗体、モノクローナル抗フェニル尿素抗体、モノクローナル抗ビンクロゾリン抗体、モノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、モノクローナル抗フェニトロチオン抗体、モノクローナル抗クロルピリフォス抗体、モノクローナル抗ピリミフォス抗体、モノクローナル抗カテコールアミン抗体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）、およびこれらの組合せ物を含むことを特徴とするアフィニティーカラム。
【請求項３３】
修飾された基質の表面が無機基質に取り付けられた１種またはそれ以上のＲ１０基を含んで成り、各Ｒ１０基が独立に−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選ばれることを特徴とする請求項３２記載のアフィニティーカラム。
【請求項３４】
１種またはそれ以上のＲ１０基が２価の部分−Ｘ−を介して無機基質に取り付けられていることを特徴とする請求項３３記載のアフィニティーカラム。
【請求項３５】
１種またはそれ以上のリガンドが、無機基質上の反応部位と１種またはそれ以上のリガンド上の官能基との間に連結をつくる一つまたはそれ以上の連結子を介して無機基質に取り付けられていることを特徴とする請求項３２記載のアフィニティーカラム。
【請求項３６】
一つまたはそれ以上の連結子がジアルデヒドと組み合わされたアミノ置換シロキサンを含むことを特徴とする請求項３５記載のアフィニティーカラム。
【請求項３７】
アミノ置換シロキサンがアミノプロピルトリメトキシシランを含み、ジアルデヒドはグルタルアルデヒドを含むことを特徴とする請求項３６記載のアフィニティーカラム。
【請求項３８】
１種またはそれ以上のリガンドが無機基質上の反応部位に直接取り付けられていることを特徴とする請求項３２記載のアフィニティーカラム。
【請求項３９】
修飾された基質の表面が反応部位を含んで成り、該反応部位の約５０〜約９９％が修飾を行う前の基質の表面上のどの官能基よりも反応性の低いＲ基で覆われており、該反応部位の約５０〜約１％が１種またはそれ以上のリガンドまたは随時存在する連結子で覆われていることを特徴とする請求項３２記載のアフィニティーカラム。
【請求項４０】
反応部位の約７０〜約９５％が修飾を行う前の基質の表面上のどの官能基よりも反応性の低いＲ基で覆われており、該反応部位の約３０〜約５％が１種またはそれ以上のリガンドまたは随時存在する連結子で覆われていることを特徴とする請求項３９記載のアフィニティーカラム。
【請求項４１】
１種またはそれ以上のリガンドが、モノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、或いはそれらの組み合わせ物を含むことを特徴とする請求項３２記載のアフィニティーカラム。
【請求項４２】
１種またはそれ以上のリガンドがモノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、或いはそれらの組み合わせ物を含むことを特徴とする請求項３２記載のアフィニティーカラム。
【請求項４３】
１種またはそれ以上のリガンドが組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）を含むことを特徴とする請求項３２記載のアフィニティーカラム。
【請求項４４】
硬質の支持体が多数のシリカゲルの粒子を含むことを特徴とする請求項３２記載のアフィニティーカラム。
【請求項４５】
シリカゲルの粒子が回転楕円体状の形をし、細孔の平均の大きさが約５００〜８００Åであることを特徴とする請求項４４記載のアフィニティーカラム。
【請求項４６】
流体的に連絡したアフィニティーカラムを備え、該アフィニティーカラムが請求項３０、および３２〜４５のいずれか一つに記載されたアフィニティーカラムであることを特徴とする装置。
【請求項４７】
試験試料を分析する方法であって、試験試料を請求項１〜４６のいずれか一つに記載された装置、硬質の支持体、またはアフィニティーカラムと接触させる段階を含んで成ることを特徴とする上記方法。
【請求項４８】
溶離試料を分析する方法であって、溶離試料をアフィニティーカラムから該アフィニティーカラムと流体的に連絡している分析カラムへと移動させ、分析カラムの内容を分析して溶離試料中における１種またはそれ以上の被検体の存在を決定する段階を含んで成ることを特徴とする上記方法。
【請求項４９】
溶離試料が溶媒中に１種またはそれ以上の被検体を含んで成り、該１種またはそれ以上の被検体がアフラトキシンＢ１、アフラトキシンＧ１、アフラトキシンＱ１、アフラトキシンＢ２、アフラトキシンＧ２、ビスフェノールＡ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、４−クロロ−２−メチル酢酸、４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸、エストロン、１７−β−エストラジオール、１７−α−エチニルエストラジオール、ラクトフェリン、テストステロン、ノルテストステロン、メトブロムロン、シノスルフロン、トリアスルフロンおよびプロスルフロン、ビンクロゾリン、葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、フェニトロチオン、クロルピリフォス、ピリミフォス、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン、エストロゲン活性をもった化合物、或いはそれらの組み合わせ物から成る群から選ばれることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
溶離試料が少なくとも１種のマイコトキシンを検出し得る量で含んで成っていることを特徴とする請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
溶離試料がアフラトキシンＢ１、アフラトキシンＧ１、アフラトキシンＱ１、アフラトキシンＢ２、アフラトキシンＧ２、またはそれらの組み合わせ物を検出し得る量で含むことを特徴とする請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
溶離試料が葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、またはそれらの組み合わせ物を検出し得る量で含むことを特徴とする請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
溶離試料が少なくとも１種のエストロゲン活性をもった化合物を検出し得る量で含むことを特徴とする請求項４９記載の方法。
【請求項５４】
移動段階が溶離試料に流体の圧力をかけ溶離試料をアフィニティーカラムから分析カラムへと運ぶことを含んで成ることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５５】
ポンプによって流体の圧力をかけることを特徴とする請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
分析段階が溶離試料中における１種またはそれ以上の被検体の存在を検出し、１種またはそれ以上の被検体を互いに分離し、溶離試料中の１種またはそれ以上の被検体またはそれらの組み合わせ物を定量する段階を含んで成ることを特徴とする請求項４８記載の方法。
【請求項５７】
分析段階が溶離試料に対して逆相高圧液体クロマトグラフ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）法、蛍光検出法、またはその両方を適用することを特徴とする請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
アフィニティーカラムが最高約３００バールのカラム圧力に耐え得る硬質の支持体を含み、該硬質の支持体はそれに結合した１種またはそれ以上のリガンドを有し、該１種またはそれ以上のリガンドは試験試料の内部で１種またはそれ以上の被検体に選択的に結合することができることを特徴とする請求項４８〜５７のいずれか一つに記載された方法。
【請求項５９】
硬質の支持体が多数の無機粒子を含むことを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６０】
各無機粒子が無機基質；および被検体でない物質およびリガンド特異性被検体物質の無機基質に対する非特異的な結合を減少させるように修飾された基質の表面を備えていることを特徴とする請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
修飾された基質の表面が無機基質に取り付けられた１種またはそれ以上のＲ１０基を含んで成り、各Ｒ１０基は独立に−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選ばれることを特徴とする請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
各Ｒ１０基が−ＣＨ２ＯＨを含むことを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
１種またはそれ以上のＲ１０基が２価の部分−Ｘ−を介して無機基質に取り付けられていることを特徴とする請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
１種またはそれ以上のリガンドが、無機基質上の反応部位と１種またはそれ以上のリガンド上の官能基との間に連結をつくる一つまたはそれ以上の連結子を介して無機基質に取り付けられていることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６５】
該一つまたはそれ以上の連結子がジアルデヒドと組み合わされたアミノ置換シロキサン
を含むことを特徴とする請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
アミノ置換シロキサンがアミノプロピルトリメトキシシランを含み、ジアルデヒドがグルタルアルデヒドを含むことを特徴とする請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
１種またはそれ以上のリガンドが無機基質上の反応部位に直接取り付けられていることを特徴とする請求項５８記載の方法。
【請求項６８】
修飾された基質の表面が反応部位を備えており、該反応部位の約５０〜約９９％が修飾を行う前の基質の表面上のどの官能基よりも反応性の低いＲ基で覆われており、該反応部位の約５０〜約１％は１種またはそれ以上のリガンドまたは随時存在する連結子で覆われていることを特徴とする請求項６０記載の方法。
【請求項６９】
反応部位の約７０〜約９５％が修飾を行う前の基質の表面上のどの官能基よりも反応性の低いＲ基で覆われており、該反応部位の約３０〜約５％が１種またはそれ以上のリガンドまたは随時存在する連結子で覆われていることを特徴とする請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
硬質の支持体が多数のシリカゲルの粒子を含んで成っていることを特徴とする請求項５９記載の方法。
【請求項７１】
シリカゲルの粒子が回転楕円体状の形をし、細孔の平均の大きさが約５００〜８００Åであることを特徴とする請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
試験試料を最高約２００バールのカラム圧力に耐え得る硬質の物質を含むアフィニティーカラムの中に導入し、ここで該支持体はそれに結合した１種またはそれ以上のリガンドを有しており、且つ該１種またはそれ以上のリガンドは１種またはそれ以上の被検体に特異的に結合することができ；
試験試料を硬質の支持体およびその上のリガンドと接触させ；
硬質の支持体を濯いで該１種またはそれ以上の被検体以外の試験試料の成分を洗滌し去り；
溶離溶液をアフィニティーカラムの中に導入して溶離溶液が硬質の支持体の上のリガンドに結合した１種またはそれ以上の被検体と接触させ；
或る期間の間溶離溶液を硬質の支持体と接触させたままにして溶離試料をつくる段階をさらに含んで成ることを特徴とする請求項４８〜７１のいずれか一つに記載された方法。
【請求項７３】
期間が約５分〜約１５分の範囲であることを特徴とする請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
第１の緩衝溶液をアフィニティーカラムの中に急激に流し；
第２の試験試料をアフィニティーカラムの中に導入する段階をさらに含んで成ることを特徴とする請求項７２記載の方法。
【請求項７５】
少なくとも１種のマイコトキシンを潜在的に含む溶離試料を分析する方法であって、
溶離試料をアフィニティーカラムから該アフィニティーカラムと流体的に連絡している分析カラムへ移動させ、
分析カラムの内容を分析して溶離試料中における少なくとも１種のマイコトキシンの存在を決定する段階を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項７６】
溶離試料がアフラトキシンＢ１、アフラトキシンＧ１、アフラトキシンＱ１、アフラトキシンＢ２、アフラトキシンＧ２、またはそれらの組み合わせ物を検出し得る量で含んで成っていることを特徴とする請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、またはそれらの組み合わせ物を潜在的に含む溶離試料を分析する方法であって、
溶離試料をアフィニティーカラムから該アフィニティーカラムと流体的に連絡している分析カラムへ移動させ、
分析カラムの内容を分析して溶離試料中における葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、または両者の存在を決定する段階を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項７８】
少なくとも１種のエストロゲン活性をもつ化合物を潜在的に含む溶離試料を分析する方法であって、
エストロゲン活性をもった１種またはそれ以上の化合物に選択的に結合し得る１種またはそれ以上のリガンドが結合した硬質の支持体を含むアフィニティーカラムの中に試験試料を導入する段階を含んで成ることを特徴とする上記方法。
【請求項７９】
１種またはそれ以上のリガンドが生のヒト・エストロゲン受容体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）またはそれらの誘導体、エストロゲン受容体の生物活性部分を模倣した組換え蛋白質またはその誘導体、或いは生物活性をもつ化合物を内分泌阻害剤として選択的に認識する他のリガンドを含んで成ることを特徴とする請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
１種またはそれ以上のリガンドが組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）を含むことを特徴とする請求項７８記載の方法。
【請求項８１】
試験試料を硬質の支持体およびその上にあるリガンドと接触させ；
硬質の支持体を濯いで試験試料のエストロゲン活性を示さない成分を洗滌し去り；
溶離溶液をアフィニティーカラムに導入し、溶離溶液を硬質の支持体上のリガンドに結合した１種またはそれ以上のエストロゲン活性をもつ化合物と接触させ；
或る期間の間溶離溶液を硬質の支持体と接触させたままにしてエストロゲン活性をもつ化合物を含んだ溶離試料をつくり；
分析カラムの内容を分析して溶離試料中におけるエストロゲン活性をもった１種またはそれ以上の化合物の存在を決定する段階をさらに含んで成ることを特徴とする請求項７８記載の方法。
【請求項８２】
硬質の支持体が最高約２００バールのカラムの圧力に耐えることができ、アフィニティーカラムが分析カラムと流体的に連絡していることを特徴とする請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
少なくとも１種の被検体を潜在的に含む試験試料を分析する方法であって、
多数の無機粒子を含んで成る硬質の支持体を含むアフィニティーカラムの中に試験試料を導入し、ここで各粒子は
無機基質；
被検体でない物質およびリガンド特異性被検体物質の無機基質に対する非特異的な結合を減少させるように修飾された基質表面；および；
無機基質に結合した１種またはそれ以上のリガンドを含んで成り、該１種またはそれ以上のリガンドはモノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、モノクローナル抗ビスフェノールＡ抗体、モノクローナル抗２，４−ジクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗４−クロロ−２−メチル酢酸抗体、モノクローナル抗４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸抗体、モノクローナル抗エストロン抗体、モノクローナル抗１７−β−エストラジオール抗体、モノクローナル抗１７−α−エチニルエストラジオール抗体、モノクローナル抗ラクトフェリン抗体、モノクローナル抗テストステロン抗体、モノクローナル抗ノルテストステロン抗体、モノクローナル抗フェニル尿素抗体、モノクローナル抗ビンクロゾリン抗体、モノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、モノクローナル抗フェニトロチオン抗体、モノクローナル抗クロルピリフォス抗体、モノクローナル抗ピリミフォス抗体、モノクローナル抗カテコールアミン抗体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）、およびこれらの組み合わせ物を含み；
試験試料を硬質の支持体およびその上にあるリガンドと接触させ；
硬質の支持体を濯いで試験試料のエストロゲン活性を示さない成分を洗滌し去り；
溶離溶液をアフィニティーカラムに導入し、溶離溶液を硬質の支持体上のリガンドに結合した１種またはそれ以上のエストロゲン活性をもつ化合物と接触させ；
或る期間の間溶離溶液を硬質の支持体と接触させたままにしてエストロゲン活性をもつ化合物を含んだ溶離試料をつくり；
分析カラムの内容を分析して溶離試料中における１種またはそれ以上の被検体の存在を決定する段階を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項８４】
修飾された基質の表面が無機基質に取り付けられた１種またはそれ以上のＲ１０基を含み、各Ｒ１０基が独立に−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）から成る群から選ばれることを特徴とする請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
１種またはそれ以上のＲ１０基が２価の部分−Ｘ−を介して無機基質に取り付けられていることを特徴とする請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
１種またはそれ以上のリガンドが、無機基質上の反応部位と１種またはそれ以上のリガンド上の官能基との間に連結をつくる一つまたはそれ以上の連結子を介して無機基質に結合していることを特徴とする請求項８３記載の方法。
【請求項８７】
一つまたはそれ以上の連結子がジアルデヒドと組み合わされたアミノ置換シロキサンを含むことを特徴とする請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
アミノ置換シロキサンがアミノプロピルトリメトキシシランを含み、ジアルデヒドはグルタルアルデヒドを含むことを特徴とする請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
１種またはそれ以上のリガンドが無機基質上の反応部位に直接取り付けられていることを特徴とする請求項８３記載の方法。
【請求項９０】
修飾された基質の表面が反応部位を備えており、該反応部位の約５０〜約９９％が修飾を行う前の基質の表面上のどの官能基よりも反応性の低いＲ基で覆われており、該反応部位の約５０〜約１％が１種またはそれ以上のリガンドまたは随時存在する連結子で覆われていることを特徴とする請求項８３記載の方法。
【請求項９１】
反応部位の約７０〜約９５％が修飾を行う前の基質の表面上のどの官能基よりも反応性の低いＲ基で覆われており、該反応部位の約３０〜約５％は１種またはそれ以上のリガンドまたは随時存在する連結子で覆われていることを特徴とする請求項９０記載の方法。
【請求項９２】
無機粒子が多数のシリカゲルの粒子を含むことを特徴とする請求項８３記載の方法。
【請求項９３】
シリカゲルの粒子が回転楕円体状の形をし、平均の細孔の大きさが約５００〜８００Åであることを特徴とする請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
無機基質を含む硬質の支持体を製造する方法であって、次の段階：即ち
（１）無機基質の表面の少なくとも第１の部分にＲ基を取り付け、ここで該Ｒ基はこの取り付け段階の前においては無機基質の表面上にあるどの官能基よりも低い反応性をもっており；
（２）アルデヒド官能基を含む少なくとも一つの連結子を無機基質の少なくとも第２の部分に取り付け；
（３）１種またはそれ以上のリガンドを一つまたはそれ以上の連結子に選択的に結合させる段階を含んで成ることを特徴とする方法。
【請求項９５】
段階（２）が段階（１）の前に行われる請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
一つまたはそれ以上の連結子がジアルデヒドと組み合わされたアミノ置換シロキサンを含むことを特徴とする請求項９４記載の方法。
【請求項９７】
アミノ置換シロキサンがアミノプロピルトリメトキシシランを含み、ジアルデヒドがグルタルアルデヒドを含むことを特徴とする請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
アフィニティーカラムを製造する方法であって、次の段階、即ち：
（１）管状の構造物の第１の端を密封し；
（２）該管状の構造物のカラムのキャビティーに、請求項１６〜２９のいずれか一つに記載された硬質の支持体、或いは請求項９４〜９７のいずれか一つに記載された方法でつくられた硬質の支持体を充填し；
（３）該管状の構造物のカラムのキャビティーに第１の緩衝溶液を少なくとも部分的に充填して硬質の支持体物質を包み込み；
（４）管状の構造物の反対側の端を密封する段階を含んで成ることを特徴とする上記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般にアフィニティーカラムに使用するのに適した硬質の支持体、アフィニティーカラム、および高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＣＬ）のカラムのような分析用カラムと流体的に連絡しているアフィニティーカラムを備えた装置を含む装置構成要素に関する。さらに本発明は該装置構成要素を使用して１種またはそれ以上の被検体の存在を検出する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
１種またはそれ以上の被検体を潜在的に含んでいる試験試料を分析する装置構成要素および方法は公知である。しかし試料を分析する技術分野においては下記のような利点が一つまたはそれ以上存在することが必要がある：
（１）試料の調製段階および試料の処理段階の数を少なくできる単独で或いは互いに組み合わせて使用される装置構成要素；
（２）試料の調製段階および試料の処理段階の数を少なくすることができる方法；
（３）（ｉ）複合試験試料の内部に存在する非被検体成分による妨害（即ち目標の被検体以外の物質が装置に使用される１種またはそれ以上のリガンドと望ましくない結合をすることによる妨害）および（ｉｉ）目標の被検体が装置に使用されるリガンド以外の反応部位に対し望ましくない結合を行うことによる妨害を最低限度に抑制することが可能な、或る与えられた被検体に対し複合試験試料を高い精度で分析することができる単独でまたは互いに組み合わせて使用される装置構成要素；
（４）（ｉ）複合試験試料の内部に存在する被検体でない成分による妨害（即ち目標の被検体以外の物質が装置に使用される１種またはそれ以上のリガンドと望ましくない結合をすることによる妨害）および（ｉｉ）目標の被検体が装置に使用されるリガンド以外の反応部位に対し望ましくない結合を行うことによる妨害を最低限度に抑制することが可能な、特定の被検体（例えばエストロゲン活性（卵胞ホルモン活性）をもった被検体）に対し複合試験試料を高い精度で分析することができる単独でまたは互いに組み合わせて使用される装置構成要素；および
（５）アフィニティーカラムをオンラインで、或いは分析用カラムと流体的に連絡させて使用できる能力。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の概要
本発明はアフィニティーカラムに使用するのに適した硬質の支持体、硬質の支持体を含むアフィニティーカラム、および分析カラム、例えば高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）のカラムと流体的に連絡されたアフィニティーカラムを含む装置を含んだ装置構成要素に関する。この装置構成要素は種々の複合混合物から１種またはそれ以上の被検体を捕捉し定量するのに使用することができる。
【０００４】
本発明の一具体化例においては、装置構成要素はアフィニティーカラムに使用するのに適した硬質の支持体を含んで成っている。本発明の典型的な硬質の支持体は多数の無機粒子を含んで成り、各粒子は（ｉ）無機基質；（ｉｉ）非被検体物質の非特異的な結合（即ち目標とする被検体以外の物質の非特異的な結合）およびリガンド特異性被検体物質の無機基質に対する非特異的な結合（即ち１種またはそれ以上のリガンドによって与えられる反応部位以外の反応部位に対する目標とする被検体の非特異的な結合）を減少させるように修飾された基質の表面；および（ｉｉｉ）該無機基質に結合した１種またはそれ以上のリガンドを含んで成り、ここで該１種またはそれ以上のリガンドはモノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフ
ラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、モノクローナル抗ビスフェノールＡ抗体、モノクローナル抗２，４−ジクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗４−クロロ−２−メチル酢酸抗体、モノクローナル抗４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸抗体、モノクローナル抗エストロン抗体、モノクローナル抗１７−β−エストラジオール抗体、モノクローナル抗１７−α−エチニルエストラジオール抗体、モノクローナル抗ラクトフェリン抗体、モノクローナル抗テストステロン抗体、モノクローナル抗ノルテストステロン抗体、モノクローナル抗フェニル尿素抗体、モノクローナル抗ビンクロゾリン抗体、モノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、モノクローナル抗フェニトロチオン抗体、モノクローナル抗クロルピリフォス抗体、モノクローナル抗ピリミフォス抗体、モノクローナル抗カテコールアミン抗体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）、およびこれらの組合せを含んで成っている。
【０００５】
さらに本発明は硬質の支持体を含むアフィニティーカラムに関する。本発明の典型的な一具体化例においては、アフィニティーカラムはカラム容積をもった管状のカラム構造物；および該カラム構造物のカラム容積の中にある硬質の支持体を含んで成っている。ここで該硬質の支持体は多数の無機粒子を含んで成り、各粒子は（ｉ）無機基質；（ｉｉ）非被検体物質およびリガンド特異性被検体物質の無機基質に対する非特異的な結合を減少させるように修飾された基質の表面；および（ｉｉｉ）該無機基質に結合した１種またはそれ以上のリガンドを含んで成り、ここで該１種またはそれ以上のリガンドはモノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、モノクローナル抗ビスフェノールＡ抗体、モノクローナル抗２，４−ジクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗４−クロロ−２−メチル酢酸抗体、モノクローナル抗４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸抗体、モノクローナル抗エストロン抗体、モノクローナル抗１７−β−エストラジオール抗体、モノクローナル抗１７−α−エチニルエストラジオール抗体、モノクローナル抗ラクトフェリン抗体、モノクローナル抗テストステロン抗体、モノクローナル抗ノルテストステロン抗体、モノクローナル抗フェニル尿素抗体、モノクローナル抗ビンクロゾリン抗体、モノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、モノクローナル抗フェニトロチオン抗体、モノクローナル抗クロルピリフォス抗体、モノクローナル抗ピリミフォス抗体、モノクローナル抗カテコールアミン抗体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）、およびこれらの組合せを含んで成っている。
【０００６】
さらに本発明は分析カラムと流体的に連絡したアフィニティーカラムを具備した装置に関し、ここで該アフィニティーカラムは（ｉ）最高約２００バールのカラム圧力に耐えることができ、（ｉｉ）１種またはそれ以上のリガンドが結合している硬質の支持体を含み、ここで該１種またはそれ以上のリガンドは与えられた試料溶液の内部で１種またはそれ以上の被検体に選択的に結合することができる。典型的な一具体化例においては、該装置のアフィニティーカラムは本発明の硬質の支持体物質を含んでいる。
【０００７】
また本発明は硬質の支持体、免疫アフィニティーカラム、および免疫アフィニティーカラムを含む装置を製造する方法、並びに該硬質の支持体、免疫アフィニティーカラム、および装置を使用して与えられた試料中における１種またはそれ以上の被検体の存在を検出する方法に関する。本発明方法は少なくとも１種の被検体を潜在的に含む試験試料を分析するのに用いることができる。
【０００８】
本発明の典型的な一具体化例においては、本発明は無機基質を含んで成る硬質の支持体
物質の製造法に関する。一つの典型的な方法においては、該方法は次の段階を含んで成っている：即ち（１）無機基質の表面の少なくとも第１の部分にＲ基を取り付け（ａｔｔａｃｈ）、ここでＲ基はそのような取り付け段階の前では無機基質の上にあるどのような官能基よりも低い反応性を有しており；（２）アルデヒド官能基を含んで成る一つまたはそれ以上の連結子（ｌｉｎｋｅｒ）を無機基質の表面の少なくとも第２の部分に取り付け；（３）１種またはそれ以上のリガンドを該一つまたはそれ以上の連結子に選択的に結合させる。
【０００９】
本発明の典型的な一具体化例においては、本発明は少なくとも１種の被検体を潜在的に含む試験試料を分析する方法に関する。一つの典型的な方法においては、該方法は（ａ）多数の無機粒子を含んで成る硬質の支持体を含むアフィニティーカラムの中に試験試料を導入し、ここで該粒子の各々は（ｉ）無機基質；（ｉｉ）非被検体物質およびリガンド特異性被検体物質の無機基質に対する非特異的な結合を減少させるように修飾された基質の表面；および（ｉｉｉ）該無機基質に結合した１種またはそれ以上のリガンドを含んで成り、ここで該１種またはそれ以上のリガンドはモノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、モノクローナル抗ビスフェノールＡ抗体、モノクローナル抗２，４−ジクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗４−クロロ−２−メチル酢酸抗体、モノクローナル抗４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸抗体、モノクローナル抗エストロン抗体、モノクローナル抗１７−β−エストラジオール抗体、モノクローナル抗１７−α−エチニルエストラジオール抗体、モノクローナル抗ラクトフェリン抗体、モノクローナル抗テストステロン抗体、モノクローナル抗ノルテストステロン抗体、モノクローナル抗フェニル尿素抗体、モノクローナル抗ビンクロゾリン抗体、モノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、モノクローナル抗フェニトロチオン抗体、モノクローナル抗クロルピリフォス抗体、モノクローナル抗ピリミフォス抗体、モノクローナル抗カテコールアミン抗体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）、およびこれらの組合せを含んで成っている。
【００１０】
少なくとも１種の被検体を潜在的に含む試験試料を分析する一つの典型的な方法はさらに次の段階を含んで成っていることができる：（ａ）試験試料を硬質の支持体およびその上のリガンドと接触させ；（ｂ）硬質の支持体を濯いで試験試料のリガンドと結合していない成分を洗滌し去り；（ｃ）溶離溶液をアフィニティーカラムに導入して溶離溶液を硬質の支持体上のリガンドと結合した１種またはそれ以上の被検体と接触させ；（ｄ）溶離溶液を或る期間の間硬質の支持体と接触させたままにして１種またはそれ以上の被検体を潜在的に含む溶離試料をつくり；（ｅ）分析カラムの内容を分析して試験試料中における１種またはそれ以上の被検体の存在を決定する。
【００１１】
さらに他の典型的な一具体化例においては、本発明はエストロゲン活性をもった少なくとも１種の化合物を潜在的に含む試験試料を分析する方法に関し、ここで該方法は、エストロゲン活性をもった１種またはそれ以上の化合物と選択的に結合することができる１種またはそれ以上のリガンドが結合した硬質の支持体を含むアフィニティーカラムの中に試験試料を導入する段階を含んで成っている。
【００１２】
さらに本発明は溶離試料を分析する方法であって、該方法は溶離試料をアフィニティーカラムから該アフィニティーカラムと流体的に連絡した分析カラムへと移動させ、分析カラムの内容を分析して溶離試料中における１種またはそれ以上の被検体の存在を決定する段階を含んで成っている。例えば溶離試料はマイコトキシン、葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、またはこれらの組合せであることができる。
【００１３】
典型的な一具体化例においては、溶離試料を分析する方法は少なくとも１種のマイコトキシンを潜在的に含む溶離試料を分析することを含んで成り、該方法は溶離試料をアフィニティーカラムから該アフィニティーカラムと流体的に連絡している分析カラムへと移動させ、分析カラムの内容を分析して溶離試料中における少なくとも１種のマイコトキシンの存在を決定する段階を含んで成っている。
【００１４】
さらに他の典型的な具体化例においては、溶離試料を分析する方法は葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、またはこれらの組合せを潜在的に含む溶離試料を分析することを含んで成り、該方法は溶離試料をアフィニティーカラムから該アフィニティーカラムと流体的に連絡している分析カラムへと移動させ、分析カラムの内容を分析して溶離試料中における葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、またはこれらの組合せの存在を決定する段階を含んで成っている。
【００１５】
下記に記載された具体化例の詳細な説明および添付特許請求の範囲を検討すれば、本発明の上記のおよび他の特徴および利点は明らかになるであろう。
【００１６】
次に添付図面を参照して本発明をさらに説明する。
【００１７】
本発明の詳細な説明
本発明は（ｉ）アフィニティーカラムに使用するのに適した硬質の支持体、（ｉｉ）硬質の支持体を含むアフィニティーカラム、（ｉｉｉ）硬質の支持体、および／または分析カラム、例えば高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）のカラムと組み合わされた本発明のアフィニティーカラムを含む装置、および（ｉｖ）分析カラム、例えば高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）のカラムと流体的に連絡されたアフィニティーカラムを含んだ装置を含む装置構成要素に関する。さらに本発明は一つまたはそれ以上の装置構成要素をつくる方法、並びに潜在的に１種またはそれ以上の被検体を含む複合混合物を含んだ試験試料を分析するために一つまたはそれ以上の装置構成要素を使用する方法に関する。さらにまた本発明は種々の複合混合物から１種またはそれ以上の被検体を捕捉および／または定量するために一つまたはそれ以上の装置構成要素を使用する方法に関する。
【００１８】
本発明の一つの典型的な装置１０を図１に示す。典型的な装置１０はアフィニティーカラム１１、分析カラム１２、検出器１３、第１のポンプ１４、第２のポンプ１５、第１の弁１６、第２の弁１７、試験試料の入口２０、第１の緩衝液の入口２１、溶離緩衝液の入口２２、第１の廃液の出口２３、およびアフィニティーカラムの廃液の出口２４を具備している。本発明の望ましい一具体化例においては、アフィニティーカラム１１および分析カラム１２は連結装置（図示せず）によって互いに連結され、アフィニティーカラム１１が分析カラム１２と流体的に連絡されている。本明細書において使用される場合、「流体的に連絡されている」という言葉は、アフィニティーカラムを出た溶離試料がアフィニティーカラムと分析カラムとの間にある連結装置を介して直接分析カラムの中に流れ込む本発明の具体化例を記述するものとする。このような配置（本明細書においてはまた「オンライン構成」とも呼ばれる）では、アフィニティーカラムと分析カラムとの間で溶離試料を処理および／または貯蔵する必要がない。
【００１９】
本発明の他の具体化例においては、アフィニティーカラム１１および分析カラム１２は互いに流体的に連絡されていない。この具体化例においては、アフィニティーカラムを出た溶離試料は、これをさらに使用するために（即ち将来分析カラム１２の中に導入するために）捕集および／または貯蔵することができる。本明細書においてはこのような配置はまた「オフライン構成」と呼ばれる。
【００２０】
上記に示したように、本発明の典型的な装置１０はいくつかの構成要素を具備している。個々の構成要素および該構成要素を単独でまたは組み合わせて使用する方法を下記に説明する。
【００２１】
Ｉ．装置構成要素
本発明の装置はこれだけに限定されないが下記の構成要素を一つまたはそれ以上具備している。
【００２２】
Ａ．アフィニティーカラム
本発明は、下記の構成要素を一つまたはそれ以上具備した図１の典型的なアフィニティーカラム１１のようなアフィニティーカラムに関する。本明細書において使用される場合、「アフィニティーカラム」という言葉は免疫アフィニティーカラム（ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ）のようなアフィニティーカラムを含む下記の構成要素を一つまたはそれ以上有するカラムを含むものとする。
【００２３】
１．カラム構造物
本発明のアフィニティーカラムは、所望の寸法、カラム容積、および構造的な一体性を有するカラム構造物を具備している。典型的には、このカラム構造物は管状の構造物であり、該管状の構造物の両端に取り外し得るエンド・キャップを有している。エンド・キャップは、物質が管状構造物から望ましくない方法で逃げ出すのを防ぐために、管状の構造物と共に漏れを防止する密封材をつくっている。本発明の典型的なアフィニティーカラム１１を図２に示す。
【００２４】
図２に示されているように、典型的なアフィニティーカラム１１は第１の端１１１および第２の端１１２をもった管状の構造物１１０を具備している。エンド・キャップ１１３および１１４はそれぞれ第１および第２の端１１１および１１２の所で漏れを防ぐ密封材をつくっている。エンド・キャップ１１３および１１４は、典型的なアフィニティーカラム１１の貯蔵中において、（ｉ）典型的なアフィニティーカラム１１の内部における物質の漏れ、および／または（ｉｉ）典型的なアフィニティーカラム１１の内部の物質の乾燥を防ぐのに特に有用である。典型的なアフィニティーカラム１１はさらに、そのカラムのキャビティー３２の内部にある硬質の支持体物質３０および第１の緩衝液３１（下記に説明する）を含んで成っている。
【００２５】
管状構造物１１０は種々の物質からつくることができ、管状構造物１１０の内部の比較的高い圧力に耐える壁構造をもっている。管状構造物１１０は望ましくは最高約６０００ｐｓｉ（約４００バール）、さらに望ましくは約３０００ｐｓｉ（２００バール）〜約４５００ｐｓｉ（３００バール）の一定の圧力に耐える構造的な一体性をもっている。管状構造物をつくるのに適した物質には、これだけには限定されないが、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）およびポリプロピレンのような重合体；ステンレス鋼のような金属；およびガラスのような無機物質が含まれる。本発明の望ましい一具体化例においては、管状構造物１１０はポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）を含んで成っている。
【００２６】
管状構造物１１０は、これだけには限定されないが、粒子の大きさおよび幾何学的形状、流速、注入容積、必要なプレートの数などを含むいくつかの因子に依存して変動する寸法をもっていることができる。典型的には管状構造物１１０は円形の断面積をもち、外径は約２〜約２０ｍｍ、内径は約１〜約１０ｍｍであり、全体的な長さは約２〜約２５０ｍｍの範囲である。本発明の望ましい一具体化例においては、管状構造物１１０は円形の断面積をもち、外径は約１１ｍｍ、内径は約４．６ｍｍ、全体的な長さは約５０ｍｍである。
【００２７】
管状構造物１１０に使用されるエンド・キャップ１１３および１１４は典型的にはＰＥＥＫからつくられ、管状構造物１１０の端で漏れを防止する密封材がつくられるような寸法をもっている。
【００２８】
円形の断面積をもった管状構造物が望ましいが、他の断面積をもった管状構造物も本発明の範囲内に入ることを注意すべきである。種々の管状構造物に対する適当な断面積には、これだけには限定されないが正方形、矩形、三角形、長楕円形、五角形、および六角形の断面の形状が含まれる。
【００２９】
２．硬質の支持体物質
さらに本発明は、図２に示されている典型的な硬質の支持体物質３０のようなアフィニティーカラムに使用するのに適した硬質の支持体物質に関する。本発明の硬質の支持体物質は一つまたはそれ以上の下記の構成機素を具備している。
【００３０】
ａ．無機基質
本発明に使用するのに適した無機基質はクロマトグラフの媒体として市販されている製品を含んでいる。無機基質は当業界に公知の方法を用いて製造することができる。無機基質は無機基質の表面に被覆された一つまたはそれ以上の他の成分に対する支持体を提供する。一般に、無機基質は無機酸化物、さらに適切には無機金属酸化物、珪酸塩またはアルミノ珪酸塩、または制御された細孔をもったガラスである。無機金属酸化物が望ましい。本発明に使用するのに適した無機酸化物は典型的には他の化学的な官能基と結合または反応し得る遊離のヒドロキシル基を有している。望ましくは無機酸化物は固体の無機酸化物１ｎｍ２（平方ナノメートル）当たり約１〜１０個のヒドロキシル基をもっている。
【００３１】
適当な無機金属酸化物には、これだけには限定されないが、シリカ、例えばクロマトグラフ級のシリカまたはシリカゲル、アルミナ、シリカ−アルミナ、ジルコニア、ジルコン酸塩、制御された細孔もったガラス、またはチタニアが含まれる。本発明の望ましい一具体化例においては、無機金属酸化物はシリカであり、さらに望ましくはクロマトグラフ級のシリカまたはシリカゲルである。磁気的な応答性をもった金属酸化物、例えば国際公開第９８／３１４６１号パンフレット（その中に記載された事項は引用により本明細書に包含される）に記載された珪素酸化物を被覆した磁性粒子も本発明に使用することができる。混合無機金属酸化物、例えばシリカとアルミナとの共ゲル（ｃｏ−ｇｅｌ）、または共沈物も使用できる。
【００３２】
固体の無機金属酸化物は粒子、繊維状の小板、またはこれらの組合せの物理的な形状をもっていることができる。望ましくは、固体の無機金属酸化物は粒子の形、または実質的に球形をした粒子の形の物理的形状をもっている。物理的形状とは無関係に、固体の無機金属酸化物は典型的には最大の寸法（即ち長さ、幅、または直径の中の最大の値）が最高約１００μｍである。固体の無機金属酸化物が実質的に球形の多数の粒子を含んで成っている場合、これらの多数の粒子は望ましくは平均粒径が約１〜約１００μｍである。本発明の望ましい一具体化例においては、固体の無機金属酸化物は多数の実質的に球形のシリカまたはシリカゲルの粒子を含んで成っており、この場合多数のシリカまたはシリカゲルの粒子は約１５〜約２０μｍの平均粒径をもっている。
【００３３】
本発明においては多くの種類の市販されている固体の無機金属酸化物を使用することができる。適当な固体の無機金属酸化物には、これだけには限定されないが、ＤＡＶＩＳＩＬ（Ｒ）の商品名でＧｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃ（米国メリーランド州、Ｃｏｌｕｍｂｉａ）から市販されているシリカ粒子、例えば平均の細孔の大きさが約５００〜約３０００Å、望ましくは約５００〜約１５００Åの不規則な形をしたＤＡＶＩＳＩＬ（Ｒ）ＸＷＰ（極めて幅の広い細孔をもつ）シリカ媒質、または球形であって平均の細孔の大きさが約３０
０ÅのＶＹＤＡＣ（Ｒ）シリカが含まれる。本発明の望ましい一具体化例においては、球形をした初期の平均の細孔の大きさが約３００ÅのＶＹＤＡＣ（Ｒ）シリカを、修飾して平均の細孔の大きさを約８００Åに増加させた後に使用する。
【００３４】
ｂ．修飾された無機基質の表面
上記の無機基質の表面は、無機基質の上への非被検体物質の非特異的で非特異的な結合（即ち目標の被検体以外の物質の非特異的な結合）および／または吸着、およびリガンド特異性被検体物質の非特異的で非特異的な結合（即ち１種またはそれ以上のリガンドによって与えられる反応部位以外の反応部位に対する目標の被検体の非特異的に結合）を減少させるために処理され修飾される。修飾して得られた基質の表面は、（ｉ）無機基質の表面上には比較的不活性な基Ｒが存在するために、非被検体物質（即ち目標の被検体以外の物質）に対する親和性が小さく、（ｉｉ）直接または連結子を介して無機基質の表面に１種またはそれ以上のリガンドが選択的に結合するための反応部位は制御された量しか存在しない（下記に説明する）。１種またはそれ以上のリガンドに選択的に結合する反応部位がこのように制御された量であるために、問題としている１種またはそれ以上の被検体は無機基質の表面に取り付けられている１種またはそれ以上のリガンドに選択的に制御された方法で結合する。
【００３５】
修飾された基質の表面は、無機基質の表面の少なくとも一部に取り付けられた比較的不活性な基Ｒを含んで成っている。本明細書において「比較的不活性な基Ｒ」という言葉は無機基質表面に取り付けられた基Ｒであって、該基Ｒは元の（即ち修飾されていない）無機基質表面におけるよりも反応性が低い基Ｒを記述するのに用いられる。例えば、無機基質がシリカ粒子を含んで成っている場合、無機基質表面の少なくとも一部の表面に取り付けられた比較的不活性の基Ｒは元の、即ち未修飾のシリカ表面の上に存在するヒドロキシル基よりも反応性が低い。
【００３６】
比較的不活性な基Ｒは種々の方法を使用して無機基質の表面の少なくとも一部の表面に取り付けることができる。このような方法には、これだけには限定されないが、本明細書に記載された方法、並びに「複合混合物から選択的に吸着を行うための固体組成物（ＳＯＬＩＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ  ＡＤＳＯＲＰＴＩＯＮ  ＦＲＯＭ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＭＩＸＴＵＲＥＳ）」と題する２００１年８月１４日出願の米国特許出願第０９／９２９，６２１号明細書に記載されている方法が含まれる。この特許出願の主要部分は引用により本明細書に包含される。
【００３７】
本発明の典型的な一具体化例においては、比較的不活性な基Ｒは無機表面の少なくとも一部の表面に取り付けられており、この場合比較的不活性な基ＲはＲ１０表面部分を含んで成っている。適当なＲ１０表面部分には、これだけには限定されないが、−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）２、ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、−Ｃ（ＯＨ）２ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ（ＯＨ）２および−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）が含まれる。本発明の典型的な一具体化例においては、Ｒ１０表面部分は−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨまたは−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２（ＯＨ）を含んで成っている。本発明の望ましい一具体化例においては、Ｒ１０表面部分は−ＣＨ２ＯＨ、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ３または−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨを含んでなり、さらに望ましくはＲ１０表面部分は−ＣＨ２ＯＨを含んで成っている。
【００３８】
Ｒ１０部分は無機物質の少なくとも一つの表面の上に位置している。「位置している」と云う言葉は、原料の無機物質の表面上にある官能基にＲ１０を直接取り付けることができることを意味している。Ｒ１０は無機物質の周辺部分に存在する表面の区域に位置することができ、或いは無機物質の内部に侵入し該物質の周辺部に（細孔の）開口部をもつ細孔の中に存在する表面区域に位置していることができる。
【００３９】
またＲ１０は、２価の原子団または原子（−Ｘ−）を介して無機物質の表面に取り付け式−Ｘ−Ｒ１０の基をつくることにより無機物質の表面に「位置させる」ことができる。この具体化例においては、Ｒ１０を取り付ける原子団または原子は、該無機物質と反応物とが反応する前では原料の無機物質の組成物の中には存在していない。該原子団または原子はＲ１０をつくるのに用いられる反応物、例えばシラン反応物に由来する残留金属原子（例えば珪素原子）から生じることができる。この残留原子団または原子は無機基質に、望ましくは無機基質の表面のヒドロキシル基を介して直接取り付けられる。このような反応物の中の−Ｘ−基は反応物によって変わることができ、金属原子または他の化学的な原子団であることができる。例えばＸは珪素、アルミニウム、ジルコニウムなどのような金属から誘導することができる。選ばれる無機基質も−Ｘ−およびそれに付随した反応物を選ぶことにより決定することができる。一般に−Ｘ−を含む反応物は無機基質の上の反応性官能基と反応し得る反応物であろう。無機酸化物の場合、適当な反応物は典型的にはヒドロキシル基と反応し得るものでる。
【００４０】
反応性の化合物、例えば無機基質の上にＲ１０をつくり得る化合物の化学は公知であり、例えばＳｍｉｔｈ著，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９４年発行；Ｍａｒｃｈ著，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２年発行；Ｌａｒｏｃ著，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，第２版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９年発行；Ｇｒｅｅｎｅ等著，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９９年発行；Ｂｒｏｏｋ著，Ｓｉｌｉｃｏｎ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ，Ｏｒｇａｎｏｍｅｔａｌｌｉｃ，ａｎｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，２０００年発行；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ等著，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９２年発行；Ｋ．Ｍｏｓｂａｃｈ編，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，第ＸＬＩＶ巻，１３４〜１４８頁，１９７６年に収録された題名「Ｃｏｖａｌｅｎｔ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ」のＷｅｅｔａｌｌの論文；Ａｂｂｏｔｔの国特許第４，２９８，５００号明細書；およびＡｒｋｌｅの米国特許第５，３７１，２６２号明細書に記載されている。これらの文献は引用により全文が本明細書に包含される。例えば無機物質の表面に位置したＲ１０基を含んで成る硬質の支持体は、反応物または被覆剤、例えばＲ１０の前駆基をもつアルコキシシラン、ジアルコキシシランまたはトリアルコキシシランからつくることができる。例えばアセトキシメチルはヒドロキシメチルの前駆基であることができる。次に被覆剤を無機物質の表面と反応させた後、前駆体を加水分解してＲ１０基が取り付けられた無機物質をつくる。
【００４１】
修飾された基質の表面はさらに１種またはそれ以上のリガンドに選択的に結合するための制御された量の反応部位を含んで成っている（下記に説明）。反応部位は無機基質の表面上に直接存在するか、または無機基質の表面に結合した連結子を介してつくることができる。リガンドは当業界に公知の方法（例えばＨｅｒｍａｎｓｏｎ等著，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ
Ｐｒｅｓｓ，１９９２年発行、およびＲ１０原子団に関して上記に引用した他の参照文献参照のこと）を用い無機基質の表面に直接取り付けることができる。例えば表面の官能基（即ち反応部位）、例えばヒドロキシルを介して原料の無機酸化物の上にリガンドを取り付けることができる。
【００４２】
別法として、無機基質の表面に結合した連結子（即ち代替反応部位）を介してリガンドを無機物質に取り付けることができる。連結子は随時置換基をもった２価の化学的な基で
あることができる。随時置換基をもった２価の化学的な基はｎ個の−Ｒ−基を含んで成ることができ、ここでｎは少なくとも１の整数、好ましくは３０より大きくない整数、さらに好ましくは１５より大きくない整数である。もっと典型的には２価の化学的な基は、リガンドから無機物質まで測定した長さが約１〜約３０、好ましくは約１〜約２０、さらに好ましくは約５〜約１５である。化学的な基−Ｒ−は−Ｃ（Ｒ１）Ｈ−、−Ｃ（Ｒ２）＝Ｃ（Ｒ３）−および−Ｃ≡Ｃ−から成る基から選ばれ、ここでＲ１、Ｒ２およびＲ３は独立にＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、または置換アラルキルであり、該−Ｒ−基は随時−Ｏ−、−Ｓ−、カルボニル、チオカルボニル、−ＯＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＳＣ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｓ−、−ＯＣ（Ｓ）−、−Ｃ（Ｓ）Ｏ−、Ｃ（Ｓ）Ｓ−、−ＳＣ（Ｓ）−、−Ｎ（Ｒ４）−、−Ｎ（Ｒ４）Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｒ４）−、−Ｃ（Ｒ５）＝Ｎ−、−Ｎ＝Ｃ（Ｒ５）−，Ｃ（Ｒ５）＝ＮＯ−、−ＯＮ＝Ｃ（Ｒ５）−、−Ｐ−、−Ｐ（ＯＨ）Ｏ−、アリーレン、置換アリーレン、シクロアルキレン、シクロアルケニレン、置換シクロアルケニレン、２価の複素環式の基、または２価の置換複素環式の基で随時置換されており、さらにここでＲ４およびＲ５はそれぞれ独立にＨ、アルキル、置換アルキル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、アルケニル、置換アルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキニル、置換シクロアルキニル、アリール、置換アリール、アラルキル、または置換アラルキルである。化学的な基の例としてはｎ個の−Ｒ−を含んで成る「ヒドロカルビル」であり、ここでｎは上記の通りであり、少なくとも一つの−Ｒ−基は−ＣＨ２−があり、（ｎ−１）個の−Ｒ−基は随時上記のＲ基、例えば−Ｏ−、−Ｓ−等で置き換えられている。
【００４３】
無機基質に対して連結子を反応させる場合の化学は文献に詳細に記載されている（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ等著，Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１９９２年発行、およびＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ誌、第ＸＬＩＶ巻，１３４〜１４８頁，１９７６年のＷｅｅｔａｌｌｎｏ論文参照のこと）。或る一つの連結子と一つの無機基質との反応の特定の化学は使用する無機基質および連結子に依存する。同様に、連結子とリガンドとの反応の化学は使用する連結子およびリガンドに依存する。適当な連結子／リガンドをカップリングさせる化学の特定の例は「複合混合物から選択的に吸着を行うための固体組成物（ＳＯＬＩＤ  ＣＯＭＰＯＳＩＴＩＯＮＳ  ＦＯＲ  ＳＥＬＥＣＴＩＶＥ  ＡＤＳＯＲＰＴＩＯＮ  ＦＲＯＭ  ＣＯＭＰＬＥＸ  ＭＩＸＴＵＲＥＳ）」と題する２００１年８月１４日出願の米国特許出願第０９／９２９，６２１号明細書に記載されている方法を含んでいる。この特許出願の主要部分は引用により本明細書に包含される。例えば該米国特許出願第０９／９２９，６２１号明細書に記載されているように、リガンドはアミノ、スルフヒドリル、カルボニル、またはヒドロキシ基、或いはリガンドおよび／または連結子上の活性水素原子を介して連結子とカップリングすることができる。
【００４４】
本発明の典型的な一具体化例においては、少なくとも１個のアルデヒド官能基を有する連結子を介して一つまたはそれ以上のリガンドを無機基質にカップリングさせる。アルデヒド官能基を用い、リガンド、無機基質に結合した第１の連結子、または両方に結合させることができる。本発明の望ましい一具体化例においては、第１および第２の連結子を介して一つまたはそれ以上のリガンドを無機基質にカップリングさせ、この場合第１の連結子を無機基質に結合させ、第２の連結子を第１の連結子に結合させる。本発明の望ましい一具体化例においては、第１の連結子はアミノ官能基をもったシロキサン、例えばアミノプロピルトリメトキシシロキサンを含んで成り、第２の連結子はジアルデヒド、例えばグルタルアルデヒドを含んで成っている。この具体化例においては、遊離のアルデヒド原子団を使用してリガンドを無機基質に結合させる。本発明のこの典型的な具体化例を実施例
１に示す。
【００４５】
硬質の支持剤が連結子の基を含んで成る修飾された基質表面をもった本発明の硬質の支持剤をつくる場合、無機物質にＲ１０基を付加することと関連して連結子の基をつくる順序を変えることができる。連結子を取り付けた後にＲ１０基を無機物質の表面の上につくるか、或いは無機物質を連結子と反応させる前にＲ１０基をつくることができる。別法として、Ｒ１０または連結子のいずれか或いは両方に対する前駆体をつくるかおよび／または取り付け、後でこの前駆体を反応させてＲ１０および／または連結子をつくることができる。
【００４６】
修飾された無機表面の連結子の基の濃度は変えることができる。本発明の或る種の具体化例においては、リガンドは大きな蛋白質分子を含んで成り、これは硬質の支持体の表面積の大きな区域を「覆う」ことができる。その結果硬質の支持体の表面上で連結子の部位の濃度が比較的高い必要はない。この濃度はいま考えられているリガンド／被検体複合体の大きさに基づいて最適化することができる。Ｒ１０およびリガンドの濃度を決定する因子は、これだけには限定されないが、Ｒ１０基およびリガンドの種類、無機物質上の反応部位の濃度、連結子の基の濃度、および被検体の種類を含んでいる。
【００４７】
一般に、Ｒ１０の濃度はＢＥＴ法によって測定された表面積に基づき、硬質の支持体の表面積１ｎｍ２当たり約１〜約１０個の基が存在するような範囲であることができる。或る具体化例においては、リガンドの濃度は主として該組成物を用いた場合に回収しようとする被検体に依存する。上記のように、リガンドの濃度はまた随時使用される連結子の濃度に依存する。しかし一般にリガンドは１ｎｍ２当たり０．０４〜約４個の基が存在する範囲の濃度をもっていることができる。これに加えて、或る与えられたリガンドは必ずしも１：１の化学量論的な割合で連結子に取り付けられているとは限らない。或る具体化例、例えばリガンドが大きな蛋白質分子からつくられている場合、リガンドはいくつかの連結子の基によって取り付けられていることができる。小さいリガンドを使用する他の具体化例においては、化学量論的な量よりも少ない量のリガンドが使用され、本発明を分離に使用する場合には、妨害を避けるために未反応の連結子の基は「キャッピング」される。
【００４８】
またＲ１０およびリガンドまたは随時存在する連結子の量は、（ｉ）Ｒ１０基および（ｉｉ）リガンドおよび／または随時存在する連結子により、原料の無機物質の上のいくつの官能基が反応するか即ち「被覆される」かによって記述することができる。例えば無機基質の上で例えば表面のヒドロキシ基のような反応部位の約５０〜約９９％がＲ１０表面原子団で被覆され、約５０〜１％の反応部位がリガンドおよび／または随時存在する連結子で被覆されていることができる。
【００４９】
本発明の或る種の具体化例においては、無機基質の表面上の反応部位の約７０〜約９５％がＲ１０表面原子団で被覆され、反応部位の約３０〜約５％がリガンドおよび／または随時存在する連結子で被覆されている。
【００５０】
ｃ．リガンド
本発明の硬質の支持体物質はさらに上記の無機基質に結合した１種またはそれ以上のリガンドを含んで成っている。この１種またはそれ以上のリガンドは無機基質の上にある反応部位に直接結合しているか、或いは随時上記の無機基質に結合した連結子を介して結合している。リガンドは他の原子団または分子をベースにした被検体に結合し得る、例えば疎水性相互作用、共有結合、またはクーロン相互作用により結合し得る任意の分子または分子の断片であることができる。このようなリガンドは分離技術の業界の専門家には公知である。生体物質分離技術に典型的に使用されるリガンドは、これだけには限定されないが、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジン、生の（ｎａｔｉｖｅ）または生でない蛋
白質、抗原、および核酸が含まれる。本発明においてはリガンドは好ましくは受容体または抗体である。
【００５１】
本発明に使用される適当なリガンドには、或る与えられた被検体に選択的に結合する任意のリガンドが含まれる。本発明に使用するのに適した本発明を限定をしないリガンドの例には、これだけには限らないが、モノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、モノクローナル抗ビスフェノールＡ抗体、モノクローナル抗２，４−ジクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗４−クロロ−２−メチル酢酸抗体、モノクローナル抗４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸抗体、モノクローナル抗エストロン抗体、モノクローナル抗１７−β−エストラジオール抗体、モノクローナル抗１７−α−エチニルエストラジオール抗体、モノクローナル抗ラクトフェリン抗体、モノクローナル抗テストステロン抗体、モノクローナル抗ノルテストステロン抗体、モノクローナル抗フェニル尿素除草剤抗体（例えばメトブムロン、シノスルフロン、トリアスルフロン、および／またはプロスルフロンのモノクローナル抗体）、モノクローナル抗ビンクロゾリン抗体、モノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、モノクローナル抗有機燐殺虫剤抗体（例えばフェニトロチオン、クロルピリフォス、および／またはピリミフォスのモノクローナル抗体）、モノクローナル抗カテコールアミン抗体（例えばアドレナリン、ノルアドレナリン、および／またはドーパミンのモノクローナル抗体）、組換えヒト・エステロン受容体（ｈＥＲ）、およびこれらの組合せが含まれる。
【００５２】
表１に示されているように、与えられた被検体を捕捉するために種々のリガンドを使用することができる。
【００５３】
【表１】
2008506961.tif 000003
【００５４】
上記の典型的なリガンドはいくつかの製造元から市販されている。本発明に使用するのに適した市販されているリガンドを下記表２に示すが、これだけには限定されるものではない。
【００５５】
【表２】
2008506961.tif 000004
【００５６】
本発明の望ましい一具体化例においては、リガンドは複合混合物からマイコトキシンを選択的に結合させ得る抗体を含んで成っている。この具体化例においては、リガンドは望
ましくはモノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、またはこれらの組合せを含んで成っている。さらにこの具体化例においては、複合混合物は、これだけには限定されないが、ナッツおよびナッツ製品、穀類、乾燥果物、香草、種子類、コーヒー、ココア、ココナツ、動物の試料、植物油、ビール、水、生物体の流体等が含まれる。
【００５７】
本発明のさらに望ましい具体化例においては、リガンドは葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、または両方を複合混合物から選択的に結合させ得る抗体を含んで成っている。この具体化例においては、リガンドは望ましくはモノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、またはこれらの組み合わせを含んで成っている。さらにこの具体化例においては複合混合物は、これだけには限定されないが、食品試料（例えば幼児用調合乳、ペットの飼料、スポーツ・ドリンク、およびビタミン錠剤）、生体試料（例えば動物の組織、生物標本等）を含んでいることができる。
【００５８】
本発明のさらに他の望ましい具体化例においては、リガンドは生のエストロゲン受容体、組換えエステロゲン受容体またはこれらの任意の誘導体、組換え蛋白質、および／または複合混合物から一つまたはそれ以上の内分泌阻害剤を選択的に結合させ得る受容体の生物活性をもった部分を模倣した他のリガンドを含んで成っている。「内分泌阻害剤（ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｅｒ）」という言葉は人および野生動物の内分泌系を阻害すると思われる化合物の種類を規定するのに使用される。「内分泌阻害剤」（またキセノエストロゲン（ｘｅｎｏ−ｅｓｔｒｏｇｅｎ）と呼ばれる）はホルモン・バランスを乱し、人、動物およびそれらの子孫に悪影響を及ぼすことができる。内分泌阻害剤の公知の例には、これだけには限定されないが、ビスフェノールＡ、エストロン、１７−α−エストラジオール、１７−β−エストラジオール、１７−α−エチニルエストラジオール、アルキルフェノール、ジエチルスチルベストロール、メトキシクロール、ゼアラレノン、ゲニステイン、ｏ，ｐ’−ＤＤＴ、ｐ，ｐ’−ＤＤＴ、およびフタル酸ブチルベンジルが含まれる。しかし、人および野生動物の正常な内分泌系の機能を潜在的に阻害する未知の内分泌阻害剤が多数存在すると信じられている。従って本発明のこの具体化例は、複合混合物中の１種またはそれ以上の公知または未知の内分泌阻害剤を同定するのに役立つことができる。この具体化例において複合混合物には、これだけには限定されないが、人および牛の体液（例えば漿液および尿）、水道水、地下水、処理水、地面、汚泥、表面水一般、および特に可能な医薬品の汚染物を含む表面水、工業的な化学組成物、包装物質から化学薬品が漏れ出すことにより生じた汚染された食品、および包装物質を含む環境試料が含まれる。
【００５９】
この具体化例においては、リガンドは望ましくはエストロゲン受容体を含んで成っている。エストロゲン受容体のリガンドは、エストロゲン活性を有する一方、混合物の中にあるエストロゲン活性をもたない化合物に対しては実質的に親和性を有しない化合物を複合混合物から抽出する。ここで使用されている「エストロゲン活性をもった化合物」という言葉は内分泌阻害剤として定義された化合物（例えばホメオスタシス（恒常性）の維持および発育過程の調節に責任をもつ体内での天然ホルモンの生産、放出、輸送、代謝、結合または除去を阻害する外因性の試薬、Ｋａｖｌｏｃｋ等の「Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｎｅｅｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｓｋ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｄｉｓｒｕｐｔｏｒｓ：Ａ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕ．Ｓ．ＥＰＡ−ｓｐｏｎｓｏｒｅｄ  ｗｏｒｋｓｈｏｐ」、Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．１０４巻、Ｓｕｐｐｌ  ４：７１５〜７４０頁（１９９６年））を意味し、ＦＤＡの公式のウエッブサイト：ｈｔｔｐ：／／ｅｄｋｂ．ｆｄａ．ｇｏｖ．からアクセスできるＥｎｄｏｃｒｉｎｅ  Ｄｉｓｒｕｐｔｏｒ  Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅ  Ｂａｓｅ（ＥＤＫＢ）に記載されている
。本発明に使用される適当なエストロゲン受容体のリガンドは生のヒト・エストロゲン受容体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）またはそれらの誘導体、エストロゲン受容体の生物活性をもった部分を模倣した組換え蛋白質またはそれらの誘導体、または生物活性に関し内分泌阻害剤として化合物を選択的に認識する任意のリガンドを含んでいる。望ましくはエストロゲン受容体のリガンドは組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）を含んで成っている。
【００６０】
本発明のさらに他の望ましい具体化例においては、リガンドは複合混合物から１種またはそれ以上のステロイド・ホルモンを選択的に結合し得る抗体を含んで成っている。ステロイド・ホルモンは、これだけには限定されないが、エストラジオール、エストロン、エチニルエストラジオール、テストステロンおよびノルテストステロンを含んでいる。この具体化例において複合混合物には、これだけには限定されないが、水道水、地下水、処理水、地面、汚泥、表面水一般、および特に可能な医薬品の汚染物を含む表面水のような環境試料、医薬品組成物、人および動物の体液（例えば漿液および尿）、および他の生物試料（例えば動物の組織、生物標本等）が含まれる。
【００６１】
本発明のアフィニティーカラムは望ましくは最小限度の被検体捕捉能力をもっている。与えられたアフィニティーカラムに対する被検体捕捉能力は、これだけには限定されないが被検体の含量および種類、得られる試験試料の大きさ、測定装置の感度および検出限界等のいくつかの因子に依存して変化する。典型的には本発明のアフィニティーカラムは与えられた被検体を最高約５００ピコモル（ｐＭｏｌ）の量で捕捉することができる。望ましくは、アフィニティーカラムは与えられた被検体を約５０〜約１０００ピコモルの量で捕捉することができる。
【００６２】
３．緩衝溶液
本発明のアフィニティーカラムはさらに緩衝溶液、例えば図２に示された典型的な第１の緩衝溶液３１を含んで成っている。アフィニティーカラムを貯蔵しおよび／または使用する際、適切な第１の緩衝溶液はアフィニティーカラムの内部において硬質の支持体物質に対して非反応性の保護媒質を提供する。本発明に使用される適当な第１の緩衝溶液には、これだけには限定されないが、約０．０２重量％のアジ化ナトリウムを含む燐酸塩で緩衝された塩水（ＰＢＳ）緩衝液、即ちＰＢＳ緩衝液である。特定の第１の緩衝溶液には、これだけには限定されないが、ｐＨ約７．０の０．０１Ｍの燐酸塩＋０．１５ＭのＮａＣｌ緩衝液が含まれるる。
【００６３】
典型的には、第１の緩衝溶液は約６．０〜約８．０範囲のｐＨをもっている。望ましくは第１の緩衝溶液は約６．８〜約７．４、さらに望ましくは約７．０〜約７．４範囲のｐＨ、もっと望ましくは約７．０のｐＨをもっている。
【００６４】
望ましくは、上記の硬質の支持体物質を含むアフィニティーカラムを貯蔵する際、第１の緩衝溶液は０．０２重量％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝溶液を含んで成っている。アフィニティーカラムは望ましくは約＋４〜約＋８℃の範囲の温度においてＰＢＳ緩衝液の中に貯蔵される。さらに、硬質の支持体物質を含むアフィニティーカラムを使用する際、第１の緩衝溶液はｐＨ約７．０のＰＢＳ緩衝液を含んで成っている。
【００６５】
Ｂ．分析カラム
本発明の装置はさらに一つまたはそれ以上の分析カラム、例えば図１に示されているような典型的な分析カラム１２を含んで成っている。各分析カラムは溶離試料の中に存在する一つまたはそれ以上の被検体を捕捉するのに使用することができる。任意の市販の分析カラムを上記の装置構成要素と組み合わせて本発明に使用することができる。
【００６６】
市販の適当な分析カラムは、これだけには限定されないが、登録商品名がＧＥＮＥＳＩＳ（Ｒ）およびＥＮＡＬＩＴＭでＧｒａｃｅ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．ＫＧ（Ｗｏｒｍｓ，ドイツ）から市販されている分析カラム、例えば５μｍ，４．６ｘ２５０ｍｍおよび５μｍ，４．６ｘ１５０ｍｍを含む種々の大きさのＧＥＮＥＳＩＳ（Ｒ）Ｃ８  ｅ／ｃ；４μｍ，４．６ｘ２５０ｍｍを含む種々の大きさのＧＥＮＥＳＩＳ（Ｒ）Ｃ１８：および５μｍ、４．６×１５０ｍｍの種々の大きさをもつＤＥＮＡＬＩＴＭ  Ｃ１８；Ｇｒｏｍ  Ａｎａｌｙｔｉｋ  ＋  ＨＰＬＣ  ＧｍｂＨ（Ｒｏｔｔｅｎｂｕｒｇ−Ｈａｉｌｆｉｎｇｅｎ、ドイツ）から登録商品名ＧＲＯＭ−Ｓｉｌの名で市販されている分析カラム、例えば５μｍ、４．６×１５０ｍｍを含む種々の大きさのＧＲＯＭ−Ｓｉｌ  ＯＤＳ型のカラム；およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｕｐｐｓａｌａ、スエーデン）からＭｏｎｏ  Ｓの登録商品名で市販されている陽イオン交換カラム、例えば１０μｍ、１ｍｌを含む種々の大きさのＭｏｎｏ  Ｓ  ｈｒ５／５が含まれる。
【００６７】
本発明の望ましい一具体化例においては、アフィニティーカラムと分析カラムとが流体的に連絡するように分析カラムをアフィニティーカラムに連結する。この具体化例においては、管状構造物の内部における比較的高い圧力（即ち最高約６０００ｐｓｉ（４００バール）、さらに望ましくは約３０００ｐｓｉ（２００バール）〜約４５００ｐｓｉ（３００バール））に耐えるのに十分な壁の構造が得られる物質から分析カラムの管状構造物をつくることが望ましい。適当な管状構造物の物質は本発明のアフィニティーカラムの管状構造物に対して上記に述べた物質を含んでいる。
【００６８】
典型的には、分析カラムは液体クロマトグラフ装置、例えば高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＣＬ）装置の一部をなしている。本発明に使用するのに適した液体クロマトグラフ装置は、これだけには限定されないが、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，米国メリーランド州）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，米国デラウェア州）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒｃｉｔｙ，米国カリフォルニア州）、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，米国カリフォルニア州）、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，米国カリフォルニア州）、およびＷａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ，米国マサチューセッツ州）のような会社から市販されている液体クロマトグラフ装置を含んでいる。
【００６９】
Ｃ．検出器
本発明の装置はさらに図１に示した典型的な検出器１３のような検出器を一つまたはそれ以上具備している。検出器は移動相の試料の中に存在する被検体を検出し定量するのに使用することができる。本発明においては任意の市販の検出器を上記の装置構成要素と組み合わせて使用することができる。
【００７０】
適当な市販の検出器には、これだけには限定されないが、Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｌｕｍｂｉａ，米国メリーランド州）から市販されているＵＶ−ＶＩＳ（紫外−可視）検出器、例えばＳＰＤ１０  ＵＶ／Ｖｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ、または他の型の検出器、例えば蛍光検出器、屈折率検出器、質量選択性検出器、電気化学検出器が含まれ、これらはこれだけには限定されないが、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，米国デラウェア州）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒｃｉｔｙ，米国カリフォルニア州）、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，米国カリフォルニア州）、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，米国カリフォルニア州）、およびＷａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ，米国マサチューセッツ州）から市販されている。望ましくは、検出器は約２３０ｎｍ〜約４００ｎｍの波長範囲で動作するＵＶ−ＶＩＳ検出器を含んで成っている。本発明においては例えば下記のような波長が有用である：ＵＶ−ＶＩＳで２３０ｎｍ；ＵＶ−ＶＩＳで２４０ｎｍ（ビンクロゾリン）；およびＵＶ−ＶＩＳで３６１ｎｍ（ビタミンＢ１２）。
【００７１】
Ｄ．連結装置
本発明の装置はさらにアフィニティーカラムと一つまたはそれ以上の分析カラムの間に一つの連結装置を具備している。本発明においてはクロマトグラフ法に通常使用される連結装置の物質を使用することができる。典型的には連結装置はプラスティックス、金属、またはガラスの管からつくられたデッドスペースが小さい連結部を具備している。アフィニティーカラムが分析カラムと流体的に連絡している本発明の具体化例においては、連結装置は最高約６０００ｐｓｉ（４００バール）、さらに望ましくは約３０００ｐｓｉ（２００バール）〜約４５００ｐｓｉ（３００バール））の比較的高い圧力にに耐えるのに十分な物質からつくられ、且つそのような壁の構造をもっている。
【００７２】
Ｅ．ポンプ
本発明の装置はさらに図１に示す典型的な第１のポンプ１４および第２のポンプ１５のようなポンプを一つまたはそれ以上具備していることができる。各ポンプは上記の装置構成要素を通して流体を流す。本発明においては任意の市販のポンプを上記の装置構成機素と組み合わせて使用することができる。
【００７３】
適当な市販のポンプには、これだけには限定されないが、Ｓｈｉｍａｄｚｕ（Ｃｏｌｕｍｂｉａ、米国マサチューセッツ州）、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、米国デラウェア州）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒｃｉｔｙ、米国カリフォルニア州）、Ｄｉｏｎｅｘ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、米国カリフォルニア州Ａ）、Ｖａｒｉａｎ  Ｉｎｃ．（Ｐａｌｏ
Ａｌｔｏ、米国カリフォルニア州）、および  Ｗａｔｅｒｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｉｌｆｏｒｄ、米国マサチューセッツ州）が含まれる。望ましくはポンプは、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、米国デラウェア州）から市販されている登録商品名１１００シリーズ、例えば１１００型クォータナリー・ポンプ（ｑｕａｒｔｅｒｎａｒｙ  ｐｕｍｐ）のような低圧または高圧ポンプを含んで成っている。
【００７４】
本発明の望ましい一具体化例においては、アフィニティーカラムを通る第１のポンプは第１の緩衝液および試験試料を通る流体の流れを制御するのに使用され、他方第２のポンプは分析カラムを通る溶離緩衝液および溶離試料の流体の流れを制御するのに使用される。
【００７５】
Ｆ．弁
本発明の装置はさらに図１の典型的な第１の弁１６および第２の弁１７のような弁を一つまたはそれ以上具備していることができる。各弁は上記の装置構成要素を通る流体の流れを調節することができる。本発明においては任意の市販の弁を上記の装置構成要素と組み合わせて使用することができる。
【００７６】
適当な市販の弁には、これだけには限定されないが、ＶＩＣＩ  Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、米国テキサス州）またはＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．（Ｄｏｒｓｅｔ、英国）から市販されている弁が含まれる。望ましくは、弁はＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．（Ｄｏｒｓｅｔ、英国）から登録商標名ＲＨＥＯＤＹＮＥで市販されている７７２５型試料注入器のようなプログラミング可能な二位置六方弁を含んで成っている。
【００７７】
本発明の望ましい一具体化例においては、第１のプログラミング可能な六方弁はアフィニティーカラムを通る第１の緩衝液および／または試験試料の流体の流れを制御し、他方第２のプログラミング可能な六方弁は分析カラムを通る溶離緩衝溶液およびより試料の流体の流れを制御するのに使用される。
【００７８】
ＩＩ．  装置構成要素の製造法
さらに本発明は上記の装置構成要素を製造する方法に関する。硬質の支持体物質は例えば上記の説明および下記の実施例のようにしてつくることができる。一般に、本発明の硬質の支持体物質をつくる方法は次の段階を含んで成っている：
（１）無機基質の外側の表面を修飾し、非被検体が無機基質に非特異的且つ非特異的に結合および／または吸着することを減少させ；
（２）１種またはそれ以上のリガンドが無機基質の表面に選択的に結合するようにする。
【００７９】
上記のように、無機基質の表面を修飾する段階は（ｉ）比較的不活性の基Ｒを無機基質の表面の少なくとも一部に取り付け、また随時（ｉｉ）無機基質の表面の少なくとも一部に１種またはそれ以上の連結子を取り付ける段階を含んで成っている。無機基質の表面の少なくとも一部に比較的不活性な基Ｒを取り付ける段階は、無機基質の表面の少なくとも一部に１種またはそれ以上の連結子を取り付ける随時行われる段階の前または後に行うことができる。無機基質の表面に１種またはそれ以上のリガンドを選択的に結合させる段階は、（ｉ）制御された量の１種またはそれ以上のリガンドを無機基質の表面上の反応部位に直接結合させるか、または（ｉｉ）制御された量のリガンドを無機基質の表面から延び出した１種またはそれ以上のリガンドに結合させる段階を含んで成っている。制御された量の１種またはそれ以上のリガンドを無機基質の表面上の反応部位に直接結合させる場合、無機基質の表面に１種またはそれ以上のリガンドを選択的に結合させる段階は、無機基質の表面の少なくとも一部に比較的不活性な基Ｒを取り付ける段階の前または後に行うことができる。
【００８０】
本発明の望ましい一具体化例においては、硬質の支持体物質の製造法は次の段階を含んで成っている：
（１）無機基質の表面の少なくとも第１の部分に比較的不活性な基Ｒを取り付け、ここで基Ｒはこの取り付け段階の前において無機基質の表面上にあるどの官能基よりも反応性が低いものを用い；
（２）１種またはそれ以上の連結子を無機基質の表面の少なくとも第２の部分に取り付け；
（３）この１種またはそれ以上の連結子に１種またはそれ以上のリガンドを選択的に結合させる。段階（１）および（２）は任意の順序で行うことができる。望ましくは、１種またはそれ以上の連結子はアミノ置換シロキサンとジアルデヒドの組合せを含んで成っている。もっと望ましくは、１種またはそれ以上の連結子はグルタルアルデヒドと組み合わされたアミノプロピルトリメトキシシロキサンを含んで成っている。
【００８１】
本発明のアフィニティーカラムは次の段階を用いてつくることができる：
（１）管状構造物の第１の端を密封し；
（２）該管状構造物のカラムのキャビティーを硬質の支持体物質、例えば上記の任意の硬質の支持体物質で少なくとも部分的に充填し；
（３）該管状構造物のカラムのキャビティーを第１の緩衝溶液で少なくとも部分的に充填して硬質の支持体物質を包み込み；さらに随時
（４）該管状構造物の反対側の端（即ち第２の端）を密封する。このアフィニティーカラムは将来使用するために保存しておくか、或いは次に上記の装置構成要素の一つまたはすべてを含んで成る装置に連結することができる。
【００８２】
ＩＩＩ．試料の分析法
またさらに本発明は、潜在的に１種またはそれ以上の問題とする被検体を含む試験試料を分析する方法に関する。本発明の典型的な一具体化例においては、この方法は（ａ）硬
質の支持体を含むアフィニティーカラムの中に試験試料を導入する段階を含んで成っている。この際硬質の支持体は多数の無機金属酸化物の粒子を含んで成り、各粒子は（ｉ）金属酸化物の基質；（ｉｉ）無機基質に対する非被検体物質の非特異的な結合（即ち目標とする被検体以外の物質の非特異的な結合）、およびリガンド特異性被検体物質の非特異的な結合（即ち１種またはそれ以上のリガンドによって与えられる反応部位以外の反応部位に対する目標とする被検体の非特異的な結合）を減少させるように修飾された基質の表面；および（ｉｉｉ）該無機基質に結合した１種またはそれ以上のリガンドを含んで成っている。
【００８３】
本発明の試験試料を分析する方法は種々のリガンドを使用することができ、その中にはこれだけには限定されないがモノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＱ１抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＢ２抗体、モノクローナル抗アフラトキシンＧ２抗体、モノクローナル抗ビスフェノールＡ抗体、モノクローナル抗２，４−ジクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸抗体、モノクローナル抗４−クロロ−２−メチル酢酸抗体、モノクローナル抗４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸抗体、モノクローナル抗エストロン抗体、モノクローナル抗１７−β−エストラジオール抗体、モノクローナル抗１７−α−エチニルエストラジオール抗体、モノクローナル抗ラクトフェリン抗体、モノクローナル抗テストステロン抗体、モノクローナル抗ノルテストステロン抗体、モノクローナル抗フェニル尿素抗体、モノクローナル抗ビンクロゾリン抗体、モノクローナル抗葉酸抗体、モノクローナル抗ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）抗体、モノクローナル抗フェニトロチオン抗体、モノクローナル抗クロルピリフォス抗体、モノクローナル抗ピリミフォス抗体、モノクローナル抗カテコールアミン抗体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）、およびこれらの組合せが含まれる。
【００８４】
本発明の試験試料を分析する方法はさらに、（ｂ）試験試料を硬質の支持体およびその上にあるリガンドと接触させ；（ｃ）硬質の支持体を濯いでリガンドに結合していない試験試料の成分を洗い去り；（ｄ）溶離溶液をアフィニティーカラムの中に導入して溶離溶液が硬質の支持体上のリガンドに結合した１種またはそれ以上の被検体と接触するようにし；（ｅ）或る期間の間溶離溶液を硬質の支持体と接触させたままにして１種またはそれ以上の被検体を潜在的に含む溶離試料を生じるようにし；（ｆ）分析カラムを分析して試験試料中における１種またはそれ以上の被検体の存在を決定する段階を含んで成っている。
【００８５】
図３〜６には一つまたはそれ以上の上記の装置構成要素を使用して試験試料を分析する典型的な方法を示す。図３〜６に示されているように、典型的な装置４０はアフィニティーカラム４１、分析カラム４２、検出器４３、第１のポンプ４４、第２のポンプ４５、第１の弁４６、第２の弁４７、試験試料のループ４８、試験試料の入口５０、第１の緩衝液の入口５１、溶離緩衝液の入口５２、第１の廃液の出口５３、およびアフィニティーカラムの廃液の出口５４を具備している。本発明のこの具体化例においては、アフィニティーカラム４１および分析カラム４２は互いに流体的に連絡している。さらに、試験試料のループ４８は、試験試料をアフィニティーカラム４１を通って流れる第１の緩衝液と混合する前に、一時的に試験試料を貯蔵するために使用される。
【００８６】
図３は試験試料を装入する段階における典型的な装置４０を示す。試験試料を試験試料の入口５０の中に装入する。図３に示されているように、この段階の間プログラム可能な第１の六方弁４６は「位置Ａ」にあり、プログラム可能な第２の六方弁４７は「位置Ｂ」にあり、これによって（ｉ）試験試料は試験試料の入口５０から試験試料のループ４８へ流れることができ、（ｉｉ）第１の緩衝液はアフィニティーカラム４１を通って流れることができる。可能な試験試料は複合混合物中において上記の任意の被検体を含んでいるこ
とができる。典型的な装置４０に使用できる適当な第１の緩衝液は上記の第１の緩衝液を含んでいる。
【００８７】
別の段階においては、試験試料は図４に示されているようにアフィニティーカラム４１を通って流れる。この段階の間プログラム可能な第１の六方弁４６は「位置Ｂ」にあり、プログラム可能な第２の六方弁４７は「位置Ａ」にあり、これによって（ｉ）試験試料は第１の緩衝液と共に試験試料のループ４８からアフィニティーカラム４１へ至りその中を通って流れ、（ｉｉ）試験試料の入口からの流体の流れは第１の廃液の出口５３へと進み、（ｉｉｉ）溶離緩衝溶液は溶離緩衝溶液の入口５２から分析カラム４２を通って流れることができるが、アフィニティーカラム４１は通らない。
【００８８】
この段階の間種々の溶離緩衝溶液を使用することができる。適当な溶離緩衝溶液は、溶離緩衝溶液がアフィニティーカラム４１を通る際に、硬質の支持体物質に結合した被検体を効果的に放出する。本発明に使用するのに適した溶離緩衝溶液には、これだけには限定されないが、０．１Ｍのグリシン、ｐＨ２．５、５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭの燐酸塩、ｐＨ７．２、３．５ＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭの燐酸塩、ｐＨ７．２、２〜８Ｍの尿素、２Ｍのグアニジン塩酸塩、３〜５Ｍのチオシアン酸塩、１０％のジオキサン、５０％のエチレングリコール、アセトニトリル含有水溶液、およびこれらの組合せが含まれる。特定の溶離緩衝溶液は、これだけには限定されないが、３５％ｖ／ｖのアセトニトリル／６５％ｖ／ｖの水の溶離緩衝溶液（例えばビスフェノールＡ、１７−α−エストラジオール、１７α−エチニルエストラジオール、テストステロン、およびノルテストステロンに対し）；１０％ｖ／ｖのアセトニトリル／９０％ｖ／ｖの水の溶離緩衝溶液（例えばクロロフェノキシ酢酸除草剤に対し）；０．０１ＭのＨＣ１＋０．１５ＭのＮａＣｌ緩衝溶液（例えばラクトフェリンおよびビタミンＢ１２に対し）；および０．０１ＭのＨＣｌ＋０．１５ＭのＮａＣｌ中に１０％ｖ／ｖのメタノールを含む緩衝溶液（例えばビンクロゾリンに対し）が含まれる。
【００８９】
図５に示されているさらに別の段階では、溶離緩衝溶液はアフィニティーカラム４１および分析カラム４２を通って流れる。この段階の間プログラム可能な第１の六方弁４６は「位置Ｂ」にあり、プログラム可能な第２の六方弁４７も「位置Ｂ」にあり、これによって（ｉ）第１の緩衝溶液の入口５１からアフィニティーカラムの廃液の出口５４へと流体を流し、（ｉｉ）また試験試料の入口５０から第１の廃液の出口５３へと流体を流し、（ｉｉｉ）溶離緩衝溶液を溶離緩衝溶液の入口５２からアフィニティーカラム４１を通り直接分析カラム４２へと流すことができる。
【００９０】
図６に示されているさらに他の段階では、移動相の溶液は分析カラム４２を通って流れる。この段階の間プログラム可能な第１の六方弁４６は「位置Ｂ」にあり、プログラム可能な第２の六方弁４７は「位置Ａ」にあり、これによって（ｉ）第１の緩衝液の入口５１からアフィニティーカラム４１を通りアフィニティーカラムの廃液の出口５４へと流体を流し、（ｉｉ）また試験試料の入口５０から第１の廃液の出口５３へと流体を流し、（ｉｉｉ）移動相溶液を溶離緩衝液の入口５２から分析カラム４２を通って検出器４３へと流すことができる。
【００９１】
本発明においては種々の移動相溶液を使用することができる。適当な移動相溶液は、移動相溶液が分析カラム４２を通る際、分析カラム４２の中の支持体構造物に結合した被検体を効果的に放出する。本発明に使用するのに適した移動相溶液には、これだけには限定されないが、メタノールまたはアセトニトリルを含む水溶液、ＨＣｌ溶液、メタノール／ＨＣｌ溶液、燐酸塩／ＮａＣｌ溶液、酢酸ナトリウム溶液、メタノール／酢酸ナトリウム溶液、アセトニトリル／ＨＣｌ溶液、およびメタノール／ＨＣｌ／ＮａＣｌ溶液、並びにこれらの組合せが含まれる。
【００９２】
本発明に使用するのに適した特定の移動相溶液には、これだけには限定されないが、４５％ｖ／ｖのアセトニトリル／５５％ｖ／ｖの水の移動相溶液（例えばビスフェノールＡ被検体に対し）；０．０１ＭのＨＣｌ移動相溶液（例えばクロロフェノキシ酢酸除草剤被検体に対し）；０．０１ＭのＨＣｌ中に６０％ｖ／ｖのメタノールを含む移動相溶液（例えばクロロフェノキシ酢酸除草剤被検体に対し）；７０％ｖ／ｖのアセトニトリル／３０％ｖ／ｖの水の移動相溶液（例えば１７−α−エストラジオール、１７−α−エチニルエストラジオール、テストステロン、およびノルテストステロンに対し）；０．１０Ｍの燐酸塩＋１．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７．０）移動相溶液（例えばラクトフェリンに対し）；５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）移動相溶液（例えばフェニル尿素除草剤に対し）；５５％ｖ／ｖのメタノールを含む５０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）移動相溶液（例えばフェニル尿素除草剤に対し）；０．０１ＭのＨＣｌ中に６４％ｖ／ｖのアセトニトリルを含む移動相溶液（例えばビンクロゾリンに対し）；および３０％ｖ／ｖのメタノール／７０％ｖ／ｖの０．０１ＭのＨＣｌ＋０．１５ＭのＮａＣｌ移動相溶液（例えばビタミンＢ１２に対し）が含まれる。
【００９３】
本発明の望ましい一具体化例においては、試料を分析する方法は溶離試料を分析する方法を含んで成り、ここで該方法は溶離試料を分析カラムと流体的に連絡しているアフィニティーカラムから分析カラムへと移し、分析カラムの内容物を分析して溶離試料中における１種またはそれ以上の被検体の存在を決定する段階を含んで成っている。例えば溶離試料を分析するこの方法は、アフラトキシンＢ１、抗アフラトキシンｇ１、アフラトキシンＱ１、アフラトキシンＢ２、アフラトキシンＧ２、ビスフェノールＡ、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、２，４，５−トリクロロフェノキシ酢酸、４−クロロ−２−メチル酢酸、４−（２，４−ジクロロフェノキシ）酪酸、エストロン、１７−β−エストラジオール、１７−α−エチニルエストラジオール、ラクトフェリン、テストステロン、ノルテストステロン、メトブロムロン、シノスルフロン、トリアスルフロン、プロスルフロン、ビンクロゾリン、葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、フェニトロチオン、クロルピリフォス、ピリミフォス、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミン、内分泌阻害剤（例えばエストロゲン活性を有する化合物）およびこれらの組み合わせから成る群から選ばれる１種またはそれ以上の被検体を潜在的に含む試料を分析するのに使用することができる。
【００９４】
この具体化例において、アフィニティーカラムを分析カラムと流体的に連絡させて溶離試料を分析する方法は、さらに次の一つまたはそれ以上の段階を含んで成っている：
（１）最高約２００バールのカラムの圧力に耐え得る、１種またはそれ以上のリガンドが結合した硬質の支持体を含むアフィニティーカラムの中に試験試料を導入し；
（２）試験試料を硬質の支持体およびその上のリガンドと接触させ；
（３）硬質のい支持体を濯いで該１種またはそれ以上の被検体以外の試験試料の成分を洗滌し去り；
（４）溶離溶液をアフィニティーカラムに導入し、溶離溶液が硬質の支持体の上のリガンドと結合した１種またはそれ以上の被検体と接触するようにし；
（５）或る期間の間溶離溶液を硬質の支持体と接触させたままにして溶離試料が生じるようにする。典型的には溶離溶液を約５分〜約１５分の範囲の時間の間硬質の支持体と接触させたままにする。
【００９５】
溶離試料を分析する一つの典型的な方法では、該方法は潜在的にマイコトキシンを含む溶離試料を分析する方法を含んで成っている。この典型的な方法では、該方法は溶離試料をアフィニティーカラムから該アフィニティーカラムと流体的に連絡した分析カラムへと移動させ、分析カラムの内容を分析して溶離試料中における少なくとも１種のマイコトキシンの存在を決定する段階を含んで成っている。アフラトキシンＢ１、アフラトキシンＧ
１、アフラトキシンＱ１、アフラトキシンＢ２、アフラトキシンＧ２、またはこれらの組み合わせの存在に対して溶離試料を分析することができる。
【００９６】
溶離試料を分析するさらに他の典型的な方法では、該方法は潜在的に葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）、またはこれらの組み合わせを含む溶離試料を分析する方法を含んで成り、この際該方法は溶離試料をアフィニティーカラムから該アフィニティーカラムと流体的に連絡した分析カラムへと移動させ、分析カラムの内容を分析して溶離試料中における葉酸、ビタミンＢ１２（シアノコバラミン）またはその両方の存在を決定する段階を含んで成っている。
【００９７】
本発明はさらに、潜在的に少なくとも１種のエストロゲン活性をもつ化合物を含む試験試料を分析する方法に関する。この具体化例においては、該方法は少なくとも１種のリガンドが結合した硬質の支持体を含むアフィニティーカラムの中に試験試料を導入する段階を含んで成り、この際該１種またはそれ以上のリガンドはエストロゲン活性をもった１種またはそれ以上の化合物、例えば生のヒト・エストロゲン受容体、組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）またはその誘導体、エストロゲン受容体の生物活性をもった部分を模倣した組換え蛋白質またはそれらの誘導体に選択的に結合することができるか、或いは内分泌阻害剤として生物活性に関し選択的に化合物を認識させる任意のリガンドである。一具体化例においては、該１種またはそれ以上のリガンドは組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）である。
【００９８】
エストロゲン活性をもった１種またはそれ以上の化合物を潜在的に含む試験試料を分析するこの典型的な方法は、さらに一つまたはそれ以上の次の段階：即ち
（１）試験試料を硬質の支持体およびその上にあるリガンドと接触させ；
（２）硬質の支持体を濯いで試験試料のエストロゲン活性を示さない成分を洗滌し去り；
（３）溶離溶液をアフィニティーカラムの中に導入して溶離溶液をエストロゲン活性をもった１種またはそれ以上の化合物と接触させて硬質の支持体上のリガンドと結合させ；
（４）或る期間の間溶離溶液を硬質の支持体と接触させたままにしてエストロゲン活性をもった化合物を含む溶離試料をつくり、
（５）分析カラムの内容を分析して溶離試料中における１種またはそれ以上のエストロゲン活性をもった化合物の存在を決定する段階を含んで成っている。この具体化例の望ましい一変形法においては、硬質の支持体は最高２００バールまでカラムの圧力に耐えることができ、アフィニティーカラムは流体的に分析カラムと連絡している。
【００９９】
本発明のアフィニティーカラムは再利用することができる。従って、上記のどの典型的な方法もさらに次の段階を含んで成っている：
（１）第１の緩衝溶液を急激にアフィニティーカラムの中に流し、
（２）第２の試験試料をアフィニティーカラムの中に導入する。
【０１００】
上記に説明した本発明を下記の実施例によりさらに例示する。これらの実施例はいかなる方法においても本発明の範囲に限定を加えるものではない。それとは反対に、これらの説明を読んだ後では本発明の精神および／または添付特許請求の範囲を逸脱することなく当業界の専門家に示唆を与え得る種々の他の具体化例、変形、並びに同等な手段を行い得ることを明白に理解するべきであろう。
【実施例１】
【０１０１】
モノクローナル抗ビタミンＢ１２抗体を含んで成る硬質の支持体の製造
下記のようにして典型的な硬質の支持体をつくった。５００ｇのトルエン、および１．５２ｇの３−アミノプロピルトリエトキシシランを１０００ｍｌの丸底フラスコに加えた
。予め２００℃において２時間カ焼して拡大細孔を拡大した細孔の平均の大きさが８００ÅのＧｒａｃｅ  Ｖｙｄａｃのシリカ（平均粒径は約１５〜約２０μ）１００ｇをこの丸底フラスコに加えた。丸底フラスコを加熱マントルの上に載せ、凝縮器を取り付ける。この加熱マントルを１１５ｒｐｍの速度で動作する軌道振盪機（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）の上に取り付けた。全反応期間中、丸底フラスコおよび凝縮器の中にＮ２を通して空気を除去した。
【０１０２】
丸底フラスコの内容物を４時間加熱沸騰させる（約１１０℃）。試料を濾過し、１００ｍｌのトルエンで２回洗滌し、１１５℃で乾燥した後、１５０℃で２時間カ焼した。得られた試料を中間体Ａと名付けた。
【０１０３】
シリカ上の−Ｃ３Ｈ６ＮＨ２基の濃度は０．５４であると計算され、この値はシリカの支持体の表面積（ＢＥＴ表面積）（４３ｍ２／ｇ）およびこの中間体の炭素含量（ＬＥＣＯ）（０．４１％）に基づいた値であった。ＡＳＴＭ  Ｄ５３７３（石炭に対する規格）およびＡＳＴＭ  ５２９１参照。
【０１０４】
ビーカーの中で４００ｍｌの１ＭのＮａＣｌを中間体Ａと混合し、磁気撹拌機で撹拌した。初期ｐＨは４．７９であった。ｐＨが２．０に達するまで１ＭのＨＣｌを滴下した。１５分間ｐＨを２．０に保った。次いで試料を濾過し、１００ｍｌの脱イオン水で５回洗滌し、１１５℃で乾燥し、次いで２００℃で２時間カ焼した。この試料を中間体Ｂと名付けた。
【０１０５】
丸底フラスコ中で４００ｇのトルエンおよび４８．７８ｇのアセトキシメチルトリエトキシシランを中間体Ｂと混合した。丸底フラスコを取り付けられた凝縮器と共に加熱マントルの上に載せた。１１５ｒｐｍの速度で動作する軌道振盪機の上部に加熱マントルを取り付けた。全反応期間中、丸底フラスコおよび凝縮器の中にＮ２を通して空気を除去した。この試料を２４時間加熱沸騰させ（約１１０℃）、濾過し、１００ｍｌのトルエンで３回洗滌し、１１５℃で乾燥した後、１５０℃で２時間カ焼した。得られた試料を中間体Ｃと名付けた。
【０１０６】
次の反応段階においては、２０ｇの中間体Ｃを８０ｍｌの０．１Ｍ塩酸に加えて４時間沸騰させた。シリカを濾過し、６０ｍｌの脱イオン水で４回洗滌した。この試料を中間体Ｄと名付けた。
【０１０７】
２０ｇの中間体Ｄおよび３００ｍｌのカップリング緩衝液（０．１ＭのＮａ２ＰＯ４＋０．１５ＭのＮａＣｌ；ｐＨ＝７．０）を１０００ｍｌのビーカー中で混合し、５分間撹拌した。試料を濾過して湿ったフィルターケーキをつくった。次に５７．５３ｇの５０重量％グルタルアルデヒドおよび２．８９ｇのＮａＣＮＢＨ３をビーカーに加えた後、中間体Ｄの湿ったフィルターケーキを加えた。試料を４時間撹拌し、濾過し，４００ｍｌのカップリング緩衝液（ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）で洗滌し、４００ｍｌのカップリング緩衝液の中で再スラリ化して新しい試料をつくり、これを濾過し，２００ｍｌのカップリング緩衝液で洗滌し、さらに２回２００ｍｌのカップリング緩衝液の中で再スラリ化した。再洗滌し再スラリ化した試料を濾過した後、４００ｍｌのカップリング緩衝液で洗滌した。この試料を中間体Ｅと名付けた。
【０１０８】
１．５ｇのカップリング緩衝液、および１ｍｌ中の抗体濃度が１０〜１５ｍｇのモノクローナル抗ビタミンＢ１２抗体２５０μｌ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）社から市販されているＮｏ．Ｖ９５０５の製品）を１０ｍｌの丸底フラスコに加えた。１６０ｍｇのＮａＣＮＢＨ３および１ｇの中間体Ｅをこのフラスコに加え、振盪機の上で４時間混合した。次いで１．５ｇのカップリング緩衝液、１６０ｍ
ｇのＮａＣＮＢＨ３および５０ｍｇのエタノールアミンを１０ｍｌの丸底フラスコに加えた後、振盪機の上で４時間混合した。この試料を濾過し、１０ｍｌのカップリング緩衝液で４回洗滌した。得られた硬質の支持体物質を０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液の中に入れ、４℃で貯蔵した。
【実施例２】
【０１０９】
ビタミンＢ１２を検出するためのアフィニティーカラムの製造
実施例１でつくった硬質の支持体物質を内径４．６×５０ｍｍのアフィニティーカラムに充填して典型的なアフィニティーカラムをつくった。次にこの充填したカラムに０．０２％のアジ化ナトリウムを含む燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）を充たした。この得られた典型的なアフィニティーカラムを４℃で貯蔵した。
【実施例３】
【０１１０】
ビタミンＢ１２を含む組成物の分析
実施例２の典型的なアフィニティーカラムを図３に示すような典型的な装置４０と同様な装置に連結した。この装置は高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）（米国デラウェア州、ＷｉｌｍｉｎｇｔｏｎのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、１１００型シリーズ）を含んで成っている。注入は２００μｌの試料ループを装着したＲＨＥＯＤＹＮＥ  ７７２５ｉ型試料注入器（英国、ＤｏｒｓｅｔのＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．製）を用いて行った。ＲＨＥＯＤＹＮＥ  ７７２５型試料注入器を用いることにより、アフィニティーカラムをオンラインの構成（即ちアフィニティーカラムがＨＰＬＣと流体的に連絡している状態）からＨＰＬＣに対しオフラインの構成（即ちアフィニティーカラムがＨＰＬＣと流体的に連絡していない状態）に切り換えることができた。ＬＣ１０ＡＤ型高圧液体ポンプ（米国メリーランド州、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用い、試料を試料注入器からアフィニティーカラムの中に移した。１１００型ＵＶ−ＶＩＳ検出器（米国デラウェア州、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用い３６１ｎｍにおいてピークを検出した。
【０１１１】
（０．０１ＭのＮａ２ＰＯ４＋０．１５ＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．０）を含んで成る結合緩衝液（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）をアフィニティーカラムに圧入し、カラムを平衡化させる。全部でカラムの１０倍の容積の結合緩衝液を使用した。
【０１１２】
ビタミンＢ１２を含む試験試料は次のようにしてつくった。約１ｍｇ／ｇのビタミンＢ１２を含む固体物質および重さ０．１ｇの試験試料を１００ｍｌの結合緩衝液に溶解して混合物をつくった。０．２２μｍのフィルターを用いてこの混合物を濾過した。
【０１１３】
試験試料を装入する前に、次の段階を行った。
【０１１４】
（１）下記に指定するようにＲＰ−ＨＰＬＣをプログラムした。
【０１１５】
（２）すべての緩衝液の脱ガスを行い、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した。
【０１１６】
（３）アフィニティーカラムおよび分析カラムを装置に連結する前に、ポンプの配管に適当な緩衝溶液を充填して空気がカラムの中に入るのを防いだ。
【０１１７】
（４）カラムからエンド・キャップを外し、カラムを装置に連結した。
【０１１８】
（５）カラムの少なくとも１０倍の容積の結合緩衝液を用いるか、或いは溶離液中にシグナルが検出されなくなるまで各カラムを平衡化させた。
【０１１９】
（６）試験試料を試料ループの中に装入した。
【０１２０】
下記のクロマトグラフ条件を用いた。
【０１２１】
カラム１：  抗ビタミンＢ１２免疫アフィニティーカラム
カラム２：  ＧＥＮＥＳＩＳ（Ｒ）Ｃ１８，４μｍ、４．６×２５０ｍｍ
流速：  １ｍｌ／分
検出：  ＵＶ−ＶＩＳ、３６１ｎｍ
結合緩衝液：  ０．０１Ｍの燐酸塩＋０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０
溶離緩衝液：  ０．０１ＭのＨＣｌ＋０．１５ＭのＮａＣｌ
移動相：  ３０％ｖ／ｖのメタノール／７０％ｖ／ｖの０．０１ＭのＨＣｌ＋０．１５ＭのＮａＣｌ
下記の時間間隔をプログラムし、装置の設定を行った。
【０１２２】
【表３】
2008506961.tif 000005
【実施例４】
【０１２３】
モノクローナル抗アフラトキシンＢ１を含んで成る硬質の支持体の製造
次のようにして典型的な硬質の支持体をつくった。１．５ｇのカップリング緩衝液、および濃度が１ｍｌ当たり抗体約７．６ｍｇの２５０μｇのモノクローナル抗アフラトキシンＢ１抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（米国ミズーリ州、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）社から市販されているＮｏ．Ａ９５５５の製品）を１０ｍｌの丸底フラスコに加えた。１６０ｍｇのＮａＣＮＢＨ３および１ｇの実施例１で得られた中間体Ｅをフラスコに加え、振盪機で４時間混合した。試料を濾過し、１０ｍｌのカップリング緩衝液で４回洗滌した。次いで１．５ｇのカップリング緩衝液、１６０ｍｇのＮａＣＮＢＨ３および５０ｍｇのエタノールアミンを１０ｍｌの丸底フラスコに加えた後、振盪機の上で４時間混合した。試料を濾過し、１０ｍｌのカップリング緩衝液で４回洗滌した。得られた硬質の支持体物質を０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液の中に入れ、４℃で貯蔵した。
【実施例５】
【０１２４】
アフラトキシンＢ１を検出するためのアフィニティーカラムの製造
実施例４でつくった硬質の支持体物質を内径４．６×５０ｍｍのアフィニティーカラムに充填して典型的なアフィニティーカラムをつくった。次にこの充填したカラムに０．０２％のアジ化ナトリウムを含む２０ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）を充した。得られたこの典型的なアフィニティーカラムを４℃で貯蔵した。
【実施例６】
【０１２５】
アフラトキシンを含む組成物の分析
実施例５の典型的なアフィニティーカラムを図３に示すような典型的な装置４０と同様な装置に連結した。この装置は高圧液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）（米国デラウェア州、ＷｉｌｍｉｎｇｔｏｎのＡｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製、１１００型シリーズ）を含んで成り、カラムの後方にＣｏｂｒａ型のセル（Ｌａｍｅｒｓ  ＆  Ｐｌｅｕｇｅｒ’ｓ製、オランダ、Ｈｅｒｔｏｇｅｎｂｏｓｃｈ）が取り付けられている。注入は２００μｌの試料ループを装着したＲＨＥＯＤＹＮＥ  ７７２５ｉ型試料注入器（英国、ＤｏｒｓｅｔのＶＷＲ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．製）を用いて行った。ＲＨＥＯＤＹＮＥ  ７７２５型試料注入器を用いることにより、ＨＰＬＣに対しアフィニティーカラムをオンラインおよびオフラインの構成の間で切り換えることができた。ＬＣ１０ＡＤ型高圧液体ポンプ（米国メリーランド州、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社製）を用い、試料を試料注入器からアフィニティーカラムの中に移した。１１００型ＵＶ−ＶＩＳ検出器（米国デラウェア州、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用い３６１ｎｍにおいて、またプログラム可能な１０４６Ａ型蛍光検出器（米国デラウェア州、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を用い３６５／４３０ｎｍにおいてピークを検出した。
【０１２６】
（０．０１ＭのＮａ２ＰＯ４＋０．１５ＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．０）を含んで成る結合緩衝液をアフィニティーカラムに圧入し、カラムを平衡化させた。全部でカラムの１０倍の容積の結合緩衝液を使用した。
【０１２７】
アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１およびＧ２を含む試験試料は次のようにしてつくった。１０〜１００ｎｇ／ｇのアフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１およびＧ２を含み重さが２５ｇの固体物質を１００ｍｌのアセトニトリルに懸濁させた。超音波を用いて試料を１５分間抽出した。液体の分画部分を６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。１００μｌの上澄液を９００μｌの結合緩衝液で希釈した。
【０１２８】
試験試料を装入する前に、次の段階を行った。
【０１２９】
（１）下記に指定するようにＲＰ−ＨＰＬＣをプログラムした。
【０１３０】
（２）すべての緩衝液の脱ガスを行い、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した。
【０１３１】
（３）アフィニティーカラムおよび分析カラムを装置に連結する前に、ポンプの配管に適当な緩衝溶液を充填して空気がカラムの中に入るのを防いだ。
【０１３２】
（４）カラムからエンド・キャップを外し、カラムを装置に連結した。
【０１３３】
（５）カラムの少なくとも１０倍の容積の結合緩衝液を用いるか、或いは溶離液中にシグナルが検出されなくなるまで各カラムを平衡化させた。
【０１３４】
（６）試験試料を試料ループの中に装入した。
【０１３５】
下記のクロマトグラフ条件を用いた。
【０１３６】
カラム１：  抗アフラトキシンＢ１免疫アフィニティーカラム
カラム２：  ＧＥＮＥＳＩＳ（Ｒ）Ｃ１８、４μｍ、４．６×２５０ｍｍ
検出１：  ＵＶ−ＶＩＳ、３６１ｎｍ
検出２：  蛍光による検出（３６５／４３０ｎｍ）
結合緩衝液：  ０．０１Ｍの燐酸塩＋０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０
流速：  ０．５ｍｌ／分
溶離緩衝液：  水中に２０％ｖ／ｖのアセトニトリルを含む液
移動相：  ６００ｍｌのメタノール＋８０ｍｌのアセトニトリル＋２００μｌの濃硝酸＋５０ｍｇの臭化カリウム、水を用いて１０００ｍｌに調節
流速：  ０．８ｍｌ／分
下記の時間間隔をプログラムして装置の設定を行った。
【０１３７】
【表４】
2008506961.tif 000006
【実施例７】
【０１３８】
活性リガンドとしての組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）を含んで成る硬質の支持体の製造
次のようにして典型的な硬質の支持体をつくった。１．５ｇのカップリング緩衝液、および５０μｇの組換えヒト・エストロゲン受容体（１ＯＰ’ｓ（オランダ、Ｂｒｅｄａ）から市販されている製品番号ＡＢ  ＲＰ−３１０の製品）を１０ｍｌの丸底フラスコに加えた。１６０ｍｇのＮａＣＮＢＨ３および１ｇの実施例１で得られた中間体Ｅをフラスコに加え、振盪機で４時間混合した。試料を濾過し、１０ｍｌのカップリング緩衝液で４回洗滌した。次いで１．５ｇのカップリング緩衝液、１６０ｍｇのＮａＣＮＢＨ３および５０ｍｇのエタノールアミンを１０ｍｌの丸底フラスコに加えた後、振盪機の上で４時間混合した。試料を濾過し、１０ｍｌのカップリング緩衝液で４回洗滌した。得られた硬質の支持体物質を０．０２％のアジ化ナトリウムを含むＰＢＳ緩衝液の中に入れ、４℃で貯蔵した。
【実施例８】
【０１３９】
内分泌阻害剤を検出するためのアフィニティーカラムの製造
実施例７でつくった硬質の支持体物質を内径４．６×５０ｍｍのアフィニティーカラムに充填して典型的なアフィニティーカラムをつくった。次にこの充填したカラムに０．０２％のアジ化ナトリウムを含む２０ｍＭの燐酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）を充した。得られたこの典型的なアフィニティーカラムを４℃で貯蔵した。
【実施例９】
【０１４０】
内分泌阻害剤を含む組成物の分析
実施例８の典型的なアフィニティーカラムを図３に使用した装置と同様な装置に連結した。（０．０１ＭのＮａ２ＰＯ４＋０．１５ＭのＮａＣｌ；ｐＨ７．０）を含んで成る結合緩衝液をアフィニティーカラムに圧入し、カラムを平衡化させた。全部でカラムの１０倍の容積の結合緩衝液を使用した。
【０１４１】
１７−β−エストラジオール、１７−α−エストラジオール、１７−α−エチニルエストラジオール、エストロン、ビスフェノールＡ、ノニルフェノールおよびフタル酸ブチルベンジルを含む試験試料を次のようにしてつくった。２５０〜１０００ｍｇ／ｌの１７−β−エストラジオール、１７−α−エストラジオール、１７−α−エチニルエストラジオール、エストロン、ビスフェノールＡ、ノニルフェノールおよびフタル酸ブチルベンジルを含む貯蔵溶液を１００ｍｌの結合緩衝液中で１０００倍に希釈して混合物をつくった。
【０１４２】
試験試料を装入する前に、次の段階を行った。
【０１４３】
（１）下記に指定するようにＲＰ−ＨＰＬＣをプログラムした。
【０１４４】
（２）すべての緩衝液の脱ガスを行い、０．４５μｍのフィルターを用いて濾過した。
【０１４５】
（３）アフィニティーカラムおよび分析カラムを装置に連結する前に、ポンプの配管に適当な緩衝溶液を充填して空気がカラムの中に入るのを防いだ。
【０１４６】
（４）カラムからエンド・キャップを外し、カラムを装置に連結した。
【０１４７】
（５）カラムの少なくとも１０倍の容積の結合緩衝液を用いるか、或いは溶離液中にシグナルが検出されなくなるまで各カラムを平衡化させた。
【０１４８】
（６）試験試料を試料ループの中に装入した。
【０１４９】
下記のクロマトグラフ条件を用いた。
【０１５０】
カラム１：  組換えヒト・エストロゲン受容体（ｈＥＲ）アフィニティーカラム
カラム２：  ＧＥＮＥＳＩＳ（Ｒ）Ｃ１８、４μｍ、４．６×２５０ｍｍ
流速：  ０．８ｍｌ／分
検出：  ＵＶ−ＶＩＳ、２３０ｎｍ
結合緩衝液：  ０．０１Ｍの燐酸塩＋０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０
溶離緩衝液：  ２５％ｖ／ｖの６Ｍのチオシアン酸カリウム、５０％ｖ／ｖの結合緩衝液、２５％ｖ／ｖのメタノール
移動相Ａ：  ０．０１ＮのＨＣｌ水溶液
移動相Ｂ：  アセトニトリル
下記の時間間隔をプログラムして装置の設定を行った。
【０１５１】
【表５】
2008506961.tif 000007
【０１５２】
以上本明細書においては特定の具体化例について詳細な説明を行ったが、当業界の専門家には、これらの説明を理解すれば、これらの具体化例の代替、変形、および同等物を容易に想像し得ることが理解できるであろう。従って本発明の範囲は添付特許請求の範囲並びにそれと同等な範囲として考えるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】本発明の典型的な装置の模式図。
【図２】本発明の一つの典型的なアフィニティーカラムを示す図。
【図３】試料を試料ループの中に装入する際、装置を通る流体の流れを示す本発明の他の典型的な装置を示す図。
【図４】試料をアフィニティーカラムに注入する際の図３の典型的な装置を示す図。
【図５】アフィニティーカラムから試料を溶離する際の図３の典型的な装置を示す図。
【図６】試料の検出を行う際の図３の典型的な装置を示す図。
【図１】
2008506961.tif 000008
【図２】
2008506961.tif 000009
【図３】
2008506961.tif 000010
【図４】
2008506961.tif 000011
【図５】
2008506961.tif 000012
【図６】
2008506961.tif 000013
【国際調査報告】
2008506961.tif 000014
2008506961.tif 000015
2008506961.tif 000016
2008506961.tif 000017