(57)【要約】  唾液などの体液サンプルから核酸を抽出するための、変性剤、キレート剤、緩衝剤およびプロテアーゼを含む含水組成物であり、これにより抽出された核酸は室温で少なくとも１４日間安定であり、さらなる処理をしなくても増幅反応に直接利用することができる組成物。特に前記組成物は、ＳＤＳ、シクロヘキサンジアミン・テトラ酢酸、トリスＨＣｌおよびプロテイナーゼＫを含む。体液からＤＮＡを直接増幅するための、前記組成物を含む方法およびキットがさらに提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液サンプルから核酸を抽出するための含水組成物であって、
前記サンプル内の前記核酸は、前記含水組成物と混合された後、室温で少なくとも１４日間安定であり、
増幅反応混合物に、前記増幅反応混合物の総体積に対して少なくとも２％の量の前記組成物が添加されても、前記核酸の増幅は阻害されない、含水組成物。
【請求項２】
前記体液は唾液である、請求項１に記載の含水組成物。
【請求項３】
（ａ）変性剤と、（ｂ）キレート剤と、（ｃ）緩衝剤と、（ｄ）プロテアーゼとを含む、請求項１または２に記載の含水組成物。
【請求項４】
前記変性剤はＳＤＳであり、前記キレート剤はＣＤＴＡであり、前記緩衝剤はトリスＨＣｌであり、前記プロテアーゼはプロテアーゼＫである、請求項３に記載の含水組成物。
【請求項５】
０．０５％のＳＤＳと、２０ｍＭのＣＴＤＡと、２００ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８．０と、４００ｍＭのＮａＯＡｃと、１０μｇ/ｍｌのプロテアーゼＫとを含む、請求項４に記載の含水組成物。
【請求項６】
塩基性物質を含む、請求項１または２に記載の含水組成物。
【請求項７】
前記塩基性物質は、アルカリ金属水酸化物、可溶性アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属酸化物または有機塩基である、請求項６に記載の含水組成物。
【請求項８】
前記塩基性物質は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、および炭酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項７に記載の含水組成物。
【請求項９】
前記塩基性物質は、５０ｍＭ〜４００ｍＭの濃度で存在する水酸化ナトリウムである、請求項８に記載の含水組成物。
【請求項１０】
前記濃度は約１００ｍＭである、請求項９に記載の含水組成物。
【請求項１１】
前記塩基性物質は、約１００ｍＭの濃度で存在する水酸化カリウムである、請求項８に記載の含水組成物。
【請求項１２】
前記塩基性物質は、約２００ｍＭの濃度で存在する炭酸ナトリウムである、請求項８に記載の含水組成物。
【請求項１３】
前記組成物は、核酸増幅混合物に、前記増幅反応混合物の全体積に対して２％〜１０％の量を添加されたとき、核酸増幅を阻害しない、請求項９に記載の含水組成物。
【請求項１４】
前記核酸は、室温で少なくとも３６５日間安定である、請求項２〜１３のいずれか一項に記載の含水組成物。
【請求項１５】
（ａ）体液サンプルを、それと等体積の請求項１に記載の含水組成物に混合すること、および
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合物の一部をＰＣＲ増幅処理すること
を含む、体液からのＤＮＡを直接増幅するための方法。
【請求項１６】
前記体液は唾液である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ａ）で得られた混合物は、室温で少なくとも１４日間にわたり安定である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ａ）で得られた混合物は、室温で少なくとも３６５日間にわたり安定である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｂ）の前に、約１５〜６０分間、約４５℃〜８０℃の温度で混合物を加熱するステップをさらに含む、請求項１５〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）請求項１に記載の含水組成物と、（ｂ）それを使用するための指示事項とを含む、体液からのＤＮＡを増幅するためのキット。
【請求項２１】
前記体液は唾液である、請求項１６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は、広義には、ヌクレオチド配列を検出する目的で、唾液などの体液から核酸を分離および保存するための組成物および方法に関する。より具体的には、核酸増幅反応に使用する前に核酸を抽出するための別途のステップを必要としない組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸の増幅を含む分子技法は、科学捜査、法執行、軍隊、人間医学、獣医学、および研究においてますます利用されるようになってきている。科学捜査、軍隊、集団災害の状況においては、死者を特定する補助として、事故または犯罪行為の身元不明の犠牲者の血縁者と考えられる生存者から、例えば、ＤＮＡサンプルを採取することが今や当然になっている。生命の危険もあり得るような危険な状況に遭遇することが予想される軍人や兵士またはその他の個人には、そのような危険に自らをさらす前にＤＮＡサンプルを保存しておくことを望む者もいる。法執行の分野では、カナダでも米国でも、現在、重罪犯人はＤＮＡサンプルを提供するように求められる。ＤＮＡに基づいた試験の利用は、医学面で、いくつか例を挙げると、嚢胞性線維症、シトクロムＰ４５０イソタイプ、伝染性の自己免疫疾患への感染しやすさに影響をもつ多型性、ＨＬＡタイピング、父子確定問題のための試験で増加が予想される。臨床研究での例は、結腸がん素因遺伝子を発見するために集団を検査したり、あるいは乳がん素因遺伝子を発見するために乳がん患者の家族を検査したりすることである。ＤＮＡの増幅のための一つの技法は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。
【０００３】
ＰＣＲは、多様な原物質からＤＮＡ分子のコピーを増幅する、迅速で、安価で、比較的簡便な手段である。しかしながらＰＣＲの限界は、ＤＮＡソースが、概して増幅反応を阻害する色素、タンパク質、糖類および／またはその他の不純物などの、様々な阻害物質を含有することにある。例えば、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（サーマス・アクアチクス由来の典型的な熱安定性のＤＮＡポリメラーゼ）を含む種々のＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ混合物中の体液から由来の微量不純物によって、阻害されることが知られている。ＤＮＡソースに含まれる阻害物質の問題を克服するには、増幅前にＤＮＡソースからＤＮＡを精製することが通常要求される。しかしながら精製手順は、ほとんどの場合、時間がかかり、高コストな複数のステップを含む。
【０００４】
ＤＮＡは人体中のほとんどあらゆる種類の細胞から、そして細胞を含む様々な体液から抽出可能である。本明細書で使用される「体液」という用語は、唾液、痰、血清、血漿、血液、尿、粘液、胃液、膵液、精液、乳の分泌または生理の生成物、涙、またはリンパ液など、動物から自然に分泌される流動体を意味し得る。ＤＮＡの抽出のための典型的な体液源は、静脈血中の白血球である。しかし、ＤＮＡソースとして血液を使用することは多くの欠点がある。血液の収集はささいな処置とはいえない。静脈血の採血は、熟練者を必要とする。さらに、これは供血者にある程度の苦痛と痛みをしばしば引き起こす侵襲的な処置である。採血を行う人が血液感染性の病原菌にさらされることを最小限にするように注意を払う必要がある。いったん収集された血液サンプルは冷凍されるか、またはすぐにＤＮＡの抽出を行う試験室へ輸送されなければならない。血液採取のためのより簡便な手順は、指先を針で刺した後、数滴の血液を収集し、それを一片の濾紙に吸い取らせることである。これは非熟練者であっても可能である。乾燥してしまえば、ＤＮＡか非常に安定である。回収されるＤＮＡの量は少ないが、多くの科学捜査の目的には十分である。しかし、指先を針で刺すことは依然として侵襲的な行為であり、赤血球中のヘモグロビン由来のヘムが、ある種のＤＮＡ分析を妨げることがある。
【０００５】
ブラシ（口腔用綿棒）で頬の内側を擦り取ることは、ＤＮＡを含有する細胞を採取する別の方法である。この処置は、採血に比べてそれほど侵襲的ではなく、血液の収集に必要とされるほどの熟練者でなくても収集が可能である。いったん収集後、有用なＤＮＡを回収できる時間は比較的短い。口中の細菌がＤＮＡを分解する可能性はある。しかし、この時間は、綿棒を乾燥させるか、または綿棒を濾紙にこすりつけて乾燥させるかのいずれかによって延ばすことができる。
【０００６】
唾液は、大唾液腺（耳下腺、顎下腺、および舌下線）により主に分泌される、かなり透明で無色な流動体である。その機能は、口腔内を潤滑にし浄化するとともに、消化プロセスを開始することである。耳下腺は、漿液性の（水っぽい）唾液を主に分泌するが、それ以外の腺は漿液性と粘液性（粘つく）唾液の混合物を分泌する。唾液の成分は、ムチンと消化酵素を含む。
【０００７】
ムチンは、上皮細胞の表面に保護生物膜の主要部分を形成する高分子量の糖化タンパク質であり、この膜形成によって粒状物質に対するバリアを設け、微生物を拘束する。これらの糖タンパク質は、唾液の粘性に大きく寄与する。
【０００８】
唾液には細胞ＤＮＡが存在し、このＤＮＡは科学捜査の目的に適することは以前から知られている。科学捜査での利用は、犯罪現場で回収できるか、または切手の裏側から回収できる唾液から得た少量のＤＮＡを用いて、犠牲者または被疑者の特定におおよそ限定される。唾液は確実なゲノムＤＮＡソースであり得るとともに、この目的に用いられる静脈血サンプルに匹敵しうるという考えが、van Schie等によって研究された（van Schie等、(1997) J. lmmunol. Methods. 208: 91-101）。van Schie等は、収集直後のまたは凍結した唾液サンプルを使用し、かなり複雑な抽出手順によってＤＮＡを精製した。回収したＤＮＡの量は、２６０ｎｍでの光吸収に基づいて推定されたが、ＲＮＡなどのその他の一般的な生体高分子も同様の紫外線光吸収スペクトルを有することから、信頼性の劣る方法の手順による推定であった。それにもかかわらず上記の著者は、特定の対立遺伝子多型を分析するためのゲル電気泳動およびポリメラーゼ連鎖反応によって、質の高いゲノムＤＮＡが確かに存在するとした。Terasaki等 (Terasaki等 (1998) Hum Immunol. 59: 597-598) は、ポリメラーゼ連鎖反応分析によって、ＨＬＡタイピングのためのＤＮＡソースとして唾液が適切であるという同様の結果を報告した。回収されたＤＮＡの量は報告されたが、ＤＮＡを測定するために用いた方法は報告されていない。上記の著者は、濾紙上で乾燥させた唾液が分析に適するＤＮＡを生成したことを示す例を３つ提示した。
【０００９】
ＤＮＡソースとして血液サンプルよりむしろ唾液サンプルを提供すると、顕著な利点が得られる。静脈切開つまり針穿刺による不快感、痛みまたは不安のために、提供者は、たいていの場合、血液よりもむしろ唾液を提供することを好む。唾液採取は専門家を必要としないというさらなる利点を有し、これにより大量のサンプル収集が実施される場合にコストを削減する。唾液は好ましいＤＮＡソースであるが、しかしながら、血液を含むその他の体液も使用できることは当業者には明白であろう。
【００１０】
さらに最近になって、いかなるＤＮＡ精製手順もなしに唾液を直接リアルタイムＰＣＲに使用できることが見出された。French等（French等(2002) Molecular And Cellular Probes. 16: 319-326）は、採取直後の唾液全体を水で１：１に希釈し、この混合物をすぐに、または４℃で（２〜３日）または−２０℃で保存後に、ライトサイクラー装置（ロシュ・ダイアグノスティックス）によるリアルタイムＰＣＲに使用した。ＰＣＲ反応体積は、典型的には２μｌの唾液（水で５０％に希釈されている）を含む２０μｌであった。ＰＣＲに使用できるＤＮＡの算出濃度は、異なる個人から得たサンプル間や、異なる日数により変わるが、０．１ｎｇ/μｌから３．５ｎｇ/μｌの間であることがわかった。著者は、未精製の唾液中の増幅に使用できるＤＮＡの量は唾液サンプル中に存在するＤＮＡのすべてではないと考えられること、全ＤＮＡのうちの一定量は口腔細胞内に残存している可能性があること、または所望の増幅ができないほど分解している可能性があることを、コメントした。４℃で（２〜３日）または−２０℃で保存したサンプルについて、分析効率の著しい減少は見られなかった。
【００１１】
科学捜査、法執行、軍隊、人間医学、獣医学および研究におけるＤＮＡに基づいた分析の利用の増加に伴い、唾液などの体液を、（現在の標準である血液に代わって）標準的かつ信頼できる個人からのＤＮＡソースとさせうる組成物および方法が必要になっている。好ましくは、ＤＮＡを検出するためのこのような組成物および方法を、唾液からのＤＮＡの抽出と精製のための別途のステップを必要とさせることなく適用できることが好ましい。さらに、体液を周囲温度で数日間保存できるようにすることが好ましい。このことは、唾液サンプルの輸送が必要である場合および／または冷却源が得られない場合に、特に有利になる。さらに、唾液サンプル中のゲノムＤＮＡの濃度を、付加ステップを必要とせずに、従来のＰＣＲとリアルタイムＰＣＲのどちらにとっても十分高くすることが好ましい。従来のＰＣＲは、通常、１０ｎｇを超える量ではＤＮＡテンプレートを必要とする。ロシュ・モールキュラー・バイオケミカルズ・ＰＣＲアプリケーション・マニュアル（第２版、1999、ロシュ・ダイアグノスティックス）によれば、低量のテンプレート（１０ｎｇ未満のヒトゲノムＤＮＡ）を使用する従来のＰＣＲは、サイクル数の変更、プライマーの再設計、「ホット・スタート」の使用など、反応を適宜変更する必要がある。対照的に、リアルタイムＰＣＲは、従来のＰＣＲよりはるかに感度がよい。例えば、ライトサイクラー・リアルタイムＰＣＲ装置（ロシュ・ダイアグノスティックス）は、３０ｐｇの対照ヒトゲノムＤＮＡの検出において１００％の感度を有する（ライトサイクラー・コントロール・キットＤＮＡマニュアル、バージョン３、2003）。
【００１２】
ここに記載された背景情報は、出願人が本発明に関係する可能性があると考える情報を開示するために記載された。上記の情報のいずれかが本発明に対する先行技術を構成することを認める意味は必ずしもなく、またそう解釈すべきでない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、核酸増幅反応にＤＮＡサンプルを直接使用することを可能にする、唾液などの体液から得たＤＮＡを保存するための組成物および方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一つの態様によれば、体液サンプルから核酸を抽出するための含水組成物が提供されるが、前記サンプル内の前記核酸は室温で少なくとも１４日間安定である。ここで前記組成物は、増幅反応混合物に、前記増幅反応混合物の総体積に対して少なくとも２％の量を添加されても、核酸の増幅を阻害しない。
【００１５】
本発明の別の態様によれば、（ａ）体液サンプルを、等体積の本発明の含水組成物に混合することと、（ｂ）ステップ（ａ）で調整された混合物の一部を、ＰＣＲ増幅処理することを含む、体液からのＤＮＡを直接増幅するための方法が提供される。
【００１６】
本発明の別の態様によれば、（ａ）本発明の含水組成物と、（ｂ）それを使用するための指示事項を含む、体液からのＤＮＡを増幅するためのキットが提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
以下にさらに詳細に説明するように、本発明は唾液などの体液からＤＮＡを抽出し保存するための含水組成物および方法に関し、これにより生成された組成物中のＤＮＡは室温で少なくとも１４日間安定である。本発明の組成物は、何らかの追加的処理ステップをすることなく、唾液またはその他の体液からＤＮＡを分離し、核酸増幅反応に直接使用できるようにする。
【００１８】
本明細書で使用される「約」という用語は、化学物質の表示値またはその明白な等価量の＋／−１０％を意味する。
【００１９】
本明細書で使用される「体液」という用語は、唾液、痰、血清、血漿、血液、尿、粘液、胃液、膵液、精液、乳の分泌または生理の生成物、涙、またはリンパ液など、動物から自然に分泌する流動体を意味する。
【００２０】
本明細書で使用される「ムチン」という用語は、それを分泌する細胞の周囲の媒質の粘性を上げる何らかの粘性タンパク質（ムコタンパク質）を意味する。本明細書で使用される「ムコイド」という用語は、ムチンを含有する何らかの体液を意味する。
【００２１】
本明細書で使用される「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含むヌクレオチド鎖を意味する。核酸は、自然界で典型的に、染色体、クロマチン、ミトコンドリア、細胞質、リボソーム、バクテリア、菌類および／またはウイルスに見られる。
【００２２】
本明細書で使用される「ＤＮＡポリメラーゼ」という用語は、プライマー結合とその後のヌクレオチドの取り込みを介して、デオキシリボ核酸合成を触媒する酵素を意味する。適当なポリメラーゼは、これらに限定されないが、エシェリヒア・コリ由来のＤＮＡポリメラーゼＩ、エシェリヒア・コリ由来のＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、T. litoralisＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼおよびＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。
【００２３】
本明細書で使用される「プライマー」という用語は、ＤＮＡテンプレート、重合のための試薬などの存在下で合成が開始する起点として作用するオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは好ましくは一本鎖であるが、二本鎖のプライマーも使用できる。二本鎖のプライマーを使用する場合、増幅反応に使用する前に一本鎖に変換することが望ましい。プライマーは、周知の方法により合成してもよいし、または生物から単離してもよい。
【００２４】
本明細書で使用される「唾液」という用語は、耳下腺、顎下腺、および舌下線を含む唾液腺のいずれかからの分泌物またはそれらの混合物を意味し、状況に応じて、口の内側を覆う多数の小さな口唇腺、頬腺、および口蓋腺からの分泌物と混合される。
【００２５】
本明細書で使用される「痰」という用語は、哺乳類の鼻腔または口腔に含まれたまたは吐き出された粘液物質を意味し、唾液や肺を含む気道からの排出物を含む。
【００２６】
唾液サンプル内の核酸を表現するのに、本明細書で使用される「安定」という用語は、検出可能な生成物中でのＰＣＲ増幅をサポートする核酸の能力を意味する。例えば、本発明の含水組成物と混合後少なくとも１４日経ってもＰＣＲ生成物が得られるとすれば、唾液サンプル内の核酸は少なくとも１４日間安定である、という。
【００２７】
本明細書で使用される「被検者（体）」という用語は、動物またはヒトを意味する。望ましくは被検体は、核酸を検出するための唾液を分泌する哺乳類である。最も望ましくは、被検者はヒトである。 
【００２８】
組成物
本発明の組成物は、体液から核酸を抽出するための組成物であって、当該組成物に含有した核酸を室温で少なくとも１４日間安定に維持する組成物である。好適な実施形態では、体液は唾液である。本発明の組成物は、核酸を含有する組成物を付加的に処理することなく、抽出した核酸を増幅反応に直接使用することを可能にする。特に、組成物の成分の濃度は、全反応体積の少なくとも２％が増幅反応系に添加されても、核酸増幅が可能になる程度に十分に低い。本明細書で使用される「処理」という用語は、保存組成物から核酸を単離または精製するための機械的または化学的ステップを意味する。
【００２９】
組成物の特定の成分は、例えば、コスト、利用可能性、下流の用途、および安全を含む様々な基準に基づいて選択される。当業者には容易に理解されようが、成分の濃度は、体液から抽出した核酸を室温で少なくとも１４日間安定させる程度に十分に高いが、核酸含有組成物の一部を増幅反応に直接使用することを妨げない。例えば、唾液サンプルを本発明の組成物と１：１（ｖ／ｖ）で混合するときに、組成物が１００ｍＭのＮａＯＨを含む水溶液であれば核酸増幅の阻害は観察されず、かつある量の組成物／体液が反応系に添加されて、反応系の全体積の２０％からをなす（すなわち、本発明の組成物は、反応系の全体積の２％から２０％である）。
【００３０】
生体サンプル中で核酸の安定性が低い主要原因は、デオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼの存在にある。デオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼは、それぞれ、ＤＮＡまたはＲＮＡを分解する酵素である。消化管中でのこれらの主なソースは、膵臓の分泌物であるが、唾液中および唾液腺や頬粘膜の細胞にも、より低いレベルで存在し得る。さらに口内の寄生微生物または摂取直後の食物からの微生物が、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼを放出する可能性がある。時間の経過とともに、水中に保存した唾液サンプル内の核酸は、より小さな断片へ退化または分解すると予想される。
【００３１】
望ましくは組成物は、デオキシリボヌクレアーゼを含むヌクレアーゼの阻害と、核酸の化学的安定性をもたらす。ヌクレアーゼの阻害は、変性剤、プロテアーゼおよび／または加熱によって達成される。唾液サンプル中の核酸の化学的安定性は、適切なｐＨを維持するｐＨ緩衝剤の使用、および／または金属酸化還元サイクリング現象の抑制、または核酸のリン酸骨格に金属イオンが結合することを抑制するキレート剤によって達成される。
【００３２】
デオキシリボヌクレアーゼとリボヌクレアーゼの作用は、これらの酵素（タンパク質）の複雑な構造を破壊する変性剤によって抑制可能である。したがって、本発明の組成物は変性剤を含みうる。適当な変性剤の非制限的な例は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。
【００３３】
プロテイナーゼＫなどの特異性の低いプロテアーゼは、タンパク質を消化するためにしばしば使用される。本発明の一つの実施形態では、唾液との混合前、混合後または混合時に、プロテアーゼが組成物に添加される。プロテアーゼはそれ自体タンパク質であるので、その作用は変性剤によって抑制され得る。したがって、デオキシリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼを抑制し、かつ唾液中のその他のタンパク質を変性させる一方で、他方ではタンパク質分解酵素を著しく抑制しないように、変性剤の濃度のバランスをとらなければならない。
【００３４】
本発明の方法は、唾液含有混合物を加熱するステップを任意的に含む。唾液サンプルの加熱（４５〜９０℃の範囲）は、特に変性剤と併用した場合、「可逆的」変性剤として作用しうる。すなわち、熱の変性作用と組み合わせれば、化学的変性剤の濃度をより低くできることがわかった。本発明の方法は、ＤＮＡをより放出し（release）、増幅反応の収率を向上させるために、増幅ステップの前に加熱ステップを選択的に含む。この付加的な加熱ステップは、サンプル中の核酸を単離または精製するための処理ステップには相当しないことを理解されたい。
【００３５】
ＤＮＡは金属イオンに強い親和性をもつ。金属イオンのうち、一般的な遷移金属、鉄または銅などの金属は、活性酸素種の形成を触媒することができる。したがって、本発明の一つの実施形態は、一つ以上のキレート剤を含む組成物を提供する。キレート剤は、金属イオンと複合体を形成するため、金属イオンがＤＮＡに結合するのを抑制し、すでにＤＮＡに結合した金属イオンを取り除き、または金属イオンどうしを十分に強く結合させてそれらの酸化還元サイクリングを抑制する。その結果、活性酸素種が形成される。キレート剤の量または濃度は、キレート剤の強度に依存し、実験により決定される必要がある。シクロヘキサンジアミン・テトラ酢酸（ＣＤＴＡ）が、一般に使用されるキレート剤である。具体的な例では、２０ｍＭのＣＤＴＡが使用されているが、当業者はＣＤＴＡの他の適当な濃度を認識し、容易に決定するであろう。
【００３６】
ＤＮＡの化学骨格とプリン塩基は、ややアルカリ性ｐＨで最も安定すると理解されており、安定するｐＨ範囲は約７〜１１であり、望ましくは約８であると一般に認識されている。約６のｐＨ以下では、脱プリン反応（すなわち、デオキシリボシド・リン酸塩骨格からプリン塩基が自然消失する反応）が起こる可能性がある。約１０のｐＨ以上では、シトシンからアミノ基が自然消失し、シトシンをウラシルに変換する可能性がある。約１２のｐＨ以上では、ＤＮＡが変性され、ＤＮＡを二本鎖形から一本鎖形に変換する。対照的にＲＮＡは、ｐＨ範囲が５．０〜７．０、望ましくは６．５〜６．８で最も安定する。したがって、本発明の一つの実施形態では、緩衝剤、望ましくはｐＨを約５〜１１の範囲内に制御する緩衝剤を含ませることによって、組成物のｐＨを維持する。ｐＨを６．５〜９．５の範囲とする適当な緩衝剤の非制限的な例の一つは、トリス塩酸塩である。
【００３７】
本発明の一つの実施形態によれば、組成物は、変性剤と、選択的にプロテイナーゼＫ、キレート剤およびｐＨを７〜１１の範囲内に維持するためのｐＨ緩衝剤を含む。
本発明の代替的な実施形態によれば、組成物は、変性剤、プロテイナーゼＫ、キレート剤またはｐＨ緩衝剤を含まない。そうせずにむしろ、ヌクレアーゼの抑制とＤＮＡの抽出と保存を、塩基性ｐＨを維持することによって達成する。
【００３８】
例えば、アルカリ金属水酸化物、可溶性アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属酸化物または有機塩基などの塩基性物質を含む含水組成物と、唾液などの体液との混合物は、意外なことに体液からＤＮＡを放出でき、放出されたＤＮＡがＰＣＲ反応においてテンプレートとして機能し得ることがわかった。理論的に限定されるわけではないが、組成物のｐＨを塩基性に維持することによって、タンパク質の変性、ヌクレアーゼの抑制およびＤＮＡの抽出と保存が達成されると考えられる。適切な塩基を選択する上で、ＤＮＡと反応しやすい金属を含む塩基や、増幅反応に採用されるＤＮＡポリメラーゼを阻害する金属を含む塩基は、本発明の組成物中での使用に適さないことがわかる。
【００３９】
本発明の具体的な実施形態によれば、唾液からＤＮＡを抽出し保存するための組成物は、５０ｍＭ〜４００ｍＭの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を含む溶液である。
【００４０】
前述のように、増幅反応に直接使用されるようにするには、本発明の組成物の様々な成分が、確実に増幅反応を阻害しない程度の濃度とする必要がある。それらの成分が増幅反応へ阻害するかどうかを決定するための方法の一例は、反応を阻害することなく反応に添加できる組成物の最大量を決定するために、段階的に種々の濃度を有する組成物を加えることである。このような方法の第二の例は、まず組成物と唾液を混合し、次に反応を阻害することなく反応に添加できる唾液／組成物の混合物の最大量を決定するために、段階的に種々の体積の唾液／組成物の混合物をＰＣＲ増幅反応内に加えることを含む。
【００４１】
ＰＣＲまたはその他の増幅反応で許容できる成分量がいったん決定されれば、この情報により、本発明の組成物に含まれるべき成分量を計算することができる。
【００４２】
方法
本発明の別の態様によれば、唾液から得た核酸サンプルを保存し、増幅するための方法が提供される。当該方法は、唾液サンプルを本発明の組成物と混合するステップと、それにより得た唾液含有混合物の一定分量を増幅反応混合物に混合するステップと、唾液含有混合物の一定分量内の核酸を増幅するステップを含む。
【００４３】
被検者から唾液を収集するために、サンプル採取の前に口をゆすぐことが好ましい。食物片は異質なＤＮＡを取り込む可能性があり、キスにより転移された唾液は別人のＤＮＡソースである。約５０ｍｌのぬるま湯で活発に口内をゆすぐか、または歯磨きを使わずに歯ブラシでブラッシングして口をゆすぐことができる。非刺激唾液は通常、粘度が高く、分泌速度が遅い。刺激唾液（おいしそうな食べ物、甘いまたは酸っぱいキャンディを期待して）は漿液（水っぽい）であり、分泌速度がより早い。２ｍｌの非刺激唾液には、２ｍｌの刺激唾液よりも、より多くのＤＮＡが存在することがわかった。口をゆすいでから口から水がなくなるように約２、３分待った後、提供者はある量（例えば、１ｍｌ)の「非刺激」唾液を受けチューブに吐出すればよい。これが困難な場合は、ＤＮＡの安定性やその後の増幅を阻害しない、数粒のテーブル・シュガーまたはその他の同様の唾液刺激物質を使って、唾液流を適宜に活性化してもよい。
【００４４】
本発明の方法は、唾液含有混合物を加熱するステップを選択的に含む。唾液サンプルの加熱（４５〜９０℃の範囲）は、特に変性剤を併用した場合、「可逆的」変性剤として作用しうる。すなわち、熱による物理的な変性作用と組み合わせれば、化学的変性剤の濃度をより低くできることがわかった。したがって、本発明の方法の増幅ステップの前に含まれる選択的な加熱ステップは、ＤＮＡの放出を改良し、増幅反応の収率を向上させる。
【００４５】
この方法に使用される組成物を、キットの形態で提供することによって、本発明の方法は都合よく実行される。このようなキットは好ましくは、適切な溶液、酵素、塩または浄化剤（またはこれらの相当物）を含む。少なくとも一種類の標準が提供されてもよく、この標準は目的の遺伝子またはＤＮＡの検出に有用な核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）テンプレート、またはプライマーのどちらかを含みうる。
【００４６】
選択的に、キットは国際出願番号ＷＯ０３/１０４２５１に記載したような容器を含み、この容器は本発明の組成物を収容し、唾液の回収に適合する。
【００４７】
本明細書に記載された発明のよりよい理解を得るために、以下に実施例を説明する。これらの実施例は、例示のためだけに示すものであることを理解されたい。したがって、これらは、本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００４８】
［実施例１］指示事項に準じて被検者から唾液サンプルを採取するためのプロトコル
被検者は、最後の食事の前に３０〜６０分間、待機するように指示される。被検者は、できるだけ歯磨きを使わずに歯をブラッシングする。被検者は、５０ｍｌの冷水またはぬるま湯で自分の口をゆすぐ。被検者は、口から水分がなくなるように２分間待つように求められ、その後、唾液量が１ｍｌに達するまで、特別な回収チューブに唾液を吐出する。最後の食事の後に待機して口をゆすぐことが望ましいが、必ずしも必要ではない。唾液の回収は数分間かかってもよい。被検者が十分な唾液を吐出できないと感じたら、被験者は数粒の食用テーブル・シュガーを与えられ、少量の砂糖がチューブに吐出されても問題ないと告げられる。
【００４９】
二つの組成物を比較する目的で提供者から２つ以上のサンプルを採取する場合、提供者は、２つ以上のチューブのそれぞれに、１ｍｌになるまで交互に少量の唾液を吐出するように求められる。吐き出す過程を通じて唾液の組成が変化することがあり得るので、交互に吐出する必要がある。
【００５０】
所定量の唾液が回収されると、唾液は１ｍｌの含水組成物と混合される。含水組成物を正確に取り込む方法は容器の設計に依存する。含水組成物が取り込まれたらすぐに、容器の蓋で密閉する。ＤＮＡ含有サンプルは、室温で少なくとも１４日間保存することができる。１４日間の間はいつでも、水溶液中のＤＮＡ含有サンプルの一部を、ＰＣＲ反応系へ直接添加するためのＤＮＡテンプレートとして使用できる。
【００５１】
［実施例２］唾液中のＤＮＡの安定性、および加熱ステップを伴う唾液から抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅
方法
実施例１で述べたプロトコルによって、１の提供者から唾液を回収し、唾液の個別サンプルを溶液と１：１で混合した。溶液は、２０ｍＭのＣＤＴＡ、４００ｍＭのＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム）、２００ｍＭのトリスＨＣｌ、０．０５％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）からなり、ｐＨを８．０に調整した。次に、この混合物に２０μｌのプロテイナーゼＫ（濃度１ｍｇ/ｍｌ）を添加した（最終濃度１０μｇ/ｍｌ）。サンプルを撹拌混合して、その後室温（約２４℃）にて放置した。１日経過時、１４日経過時および３６５日経過時に、６０℃で１時間インキュベーションした。その後、２μｌの唾液／溶液サンプルを標準の５０μｌのＰＣＲ反応系に直接添加した。
【００５２】
ＰＣＲ条件
ＰＣＲ反応は、Eppendorf MastercyclerＴＭグラディエントＰＣＲ装置で行った。全反応体積は５０μｌである。各反応は、Invitrogen PCR Mastermixに加えて、トリスＨＣｌ（ｐＨ８．０、最終濃度１０ｍＭ)、ＭｇＣｌ２（最終濃度２ｍＭ）、４個のｄＮＴＰのそれぞれ１つ（最終濃度４００μＭ）、チミジル酸生成酵素遺伝子の５６０ｂｐの断片に対する１０ピコモルの各ＰＣＲプライマー（順方向: 5’-ATGCTTAGTAGGCAATTCTG-3’、逆方向: 5’-TTTGGTTGTCAGCAGAGG-3’）、および２ユニットのTaq ＤＮＡポリメラーゼを含む。
【００５３】
熱サイクリング条件は、１分間９４℃を１サイクル；３０秒間９４℃、６０秒間５５℃、１２０秒間７２℃を３０サイクル；４分間７２℃を１サイクルで構成した。
【００５４】
アガロース・ゲル電気泳動
各ＰＣＲ反応系からの８μｌを、１％アガロース・ゲル上に載せた。１００ｂｐラダーをマーカーとした。電気泳動後、アガロース・ゲルを臭化エチジウム（１μｇ/ｍｌ、15 min）で染色し、UVP Digi Doc-itＴＭシステムを使用して、３００ｎｍの透照下で撮影した。
【００５５】
概要
図１に示されるように、唾液からのＤＮＡは、組成物と１：１で混合され、室温で１日、１４日、および３６５日間保存されても安定していた。
【００５６】
［実施例３］唾液中のＤＮＡの安定性、および唾液から抽出したＤＮＡのＰＣＲ増幅
方法
実施例１で述べたプロトコルにより１の提供者から唾液を回収し、唾液サンプルのそれぞれを以下に示す各溶液と１：１で混合した。
【００５７】
- 水
- １００ｍＭ  ＮａＯＨ（水酸化ナトリウム）
- １００ｍＭ  ＫＯＨ（水酸化カリウム）
- ２００ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３（炭酸ナトリウム）
【００５８】
サンプルを撹拌混合して、その後室温（約２４℃）に放置した。１日経過時、７日経過時、１４日経過時、２１日経過時および３６５日経過時に、２μｌの唾液／溶液サンプルを、５０μｌの標準ＰＣＲ反応系に直接添加した。
【００５９】
ＰＣＲ条件
ＰＣＲ反応条件は実施例２と同じである。熱サイクリング条件は実施例２の場合と同じである。
【００６０】
アガロース・ゲル電気泳動
アガロース・ゲル電気泳動は、実施例２に示した通りに行った。
【００６１】
概要
図２に示されたように、唾液からのＤＮＡは、１００ｍＭのＮａＯＨ、１００ｍＭのＫＯＨおよび２００ｍＭのＮａ２ＣＯ３と１：１で混合され、さらに室温で１日、７日、１４日、２１日、３６５日間保存されても、安定しており使用可能であった。
【００６２】
［実施例４］ＰＣＲ反応を阻害しない水酸化ナトリウムの濃度の決定
方法
それぞれ異なるＮａＯＨの最終濃度となる、一連の９つの反応管を用意した。ＮａＯＨの最終濃度は、図３に示すように０〜１４ｍＭまでの範囲にわたる。この範囲は、初期濃度５０〜４００ｍＭに相当する（すなわち、１ｍｌの４００ｍＭのＮａＯＨに、１ｍｌの唾液を加え、次にこの混合物の２μｌが５０μｌのＰＣＲ反応に使用される）。ＮａＯＨの影響だけを個別に観察するため、唾液を反応管に添加しなかった。 
【００６３】
ＰＣＲ条件
各反応系には、ＮａＯＨに加えて、ＫＣｌ（最終濃度５０ｍＭ）、トリスＨＣｌ（最終濃度３０ｍＭ、ｐＨ８．４）、ＭｇＣｌ２（最終濃度２ｍＭ）、４個のｄＮＴＰのそれぞれ１つ（最終濃度４００μＭ）、チミジル酸生成酵素遺伝子の５６０ｂｐの断片に対する１０ピコモルの各ＰＣＲプライマー（順方向: 5’-ATGCTTAGTAGGCAATTCTG-3’、逆方向: 5’-TTTGGTTGTCAGCAGAGG-3’）、および２ユニットのTaq ＤＮＡポリメラーゼが含まれる。５０ｎｇの精製した対照ヒトＤＮＡ（採取した唾液から、OrageneＴＭを使用して精製して得た）をテンプレートとして添加した。ＰＣＲ反応は、Eppendorf MastercyclerＴＭグラディエントＰＣＲ装置で行った。全反応体積は、５０μｌである。熱サイクリング条件は実施例２の場合と同じである。
【００６４】
アガロース・ゲル 電気泳動
アガロース・ゲル電気泳動は、実施例２に記載したとおりに行った。
【００６５】
概要
図３に示されるように、反応を強く阻害することなく、５０μｌの従来のＰＣＲ反応で許容されるＮａＯＨの最高の最終濃度は８ｍＭであった。これは、初期濃度４００ｍＭのＮａＯＨに相当し、次に、このＮａＯＨ溶液は唾液サンプルで１：１に希釈されて、その後ＰＣＲに使用された。
【００６６】
［実施例５］ＰＣＲ反応を阻害しないＮａＯＨ／唾液混合物の体積の決定
方法
１ｍｌの唾液を１の提供者から回収し、同量の１００ｍＭの水酸化ナトリウム溶液と混合した。このサンプルを撹拌混合後、室温で保存した。室温で７日間保存後、一定分量（アリコット、１〜２０μｌの範囲で調整）を標準の５０μｌのＰＣＲ反応系に添加した。
【００６７】
ＰＣＲ条件
ＰＣＲ条件は実施例２と同じである。全反応体積は、一定に５０μｌに保たれた。熱サイクリング条件は実施例２と同じである。
【００６８】
アガロース・ゲル電気泳動
アガロース・ゲル分析は、実施例２に記載したとおりに行った。
【００６９】
概要
図４に示されるように、反応を阻害することなく、５０μｌの従来のＰＣＲ反応系に、１０μｌまでのＮａＯＨ／唾液混合物を添加することができた。
【００７０】
［実施例６］OrageneＴＭによるＰＣＲ反応の阻害
OrageneＴＭ(DNA Genotek Inc.)は、唾液中のＤＮＡを室温で安定化する水溶液を含む唾液回収装置である 
方法
１００ｍＭの水酸化ナトリウム、１００ｍＭの水酸化カリウム、２００ｍＭの炭酸ナトリウム、またはOrageneＴＭDNA保存溶液を、蒸留水で１：１に希釈した。それぞれの希釈組成物の２μｌを標準のＰＣＲ反応系に添加した。
【００７１】
ＰＣＲ条件
ＰＣＲ条件は実施例２と同じである。熱サイクリング条件は実施例２の場合と同じである。５０ｎｇの精製したＤＮＡを各反応にテンプレートとして添加した。
【００７２】
アガロース・ゲル電気泳動
アガロース ・ゲル分析は、実施例２に記載したとおりに行った。
【００７３】
概要
図５に示されるように、OrageneＴＭＤＮＡ保存溶液はＰＣＲを阻害する。対照的に本実施例は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウムおよび炭酸ナトリウムの組成物は、反応を阻害することなく、ＰＣＲ反応系に直接添加できることを示す。
【００７４】
［実施例７］唾液からのＤＮＡ抽出の改良
French等（French等 (2002) Molecular and Cellular Probes. 16: 319-326)は、採取直後の全唾液を水で１：１に希釈し、この混合物を定量的なリアルタイムＰＣＲに使用した。希釈した唾液サンプルは、希釈直後に使用するか、または４℃で（２〜３日）または−２０℃で保存した。リアルタイムＰＣＲに使用できるサンプルからのＤＮＡの算出濃度は、異なる個人から得たサンプル間で違いがあるが、０．１ｎｇ/μｌ〜３．５ｎｇ/μｌであることがわかった。
【００７５】
表Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの例は、唾液と水の混合物よりも、本発明の組成物により、より多くのＤＮＡが使用できるようになることを示す。 
【００７６】
方法
１ｍｌの唾液を１の提供者から回収し、１ｍｌの１００ｍＭの水酸化ナトリウム、１００ｍＭの水酸化カリウム、２００ｍＭの炭酸ナトリウムまたは蒸留水と混合した。混合物を室温で保存した。１日経過時（表Ｉ）、１４日経過時（表ＩＩ）および３６５日経過時（表ＩＩＩ）に、各混合物の１μｌを、下記に述べるリアルタイムＰＣＲ反応系に直接添加した。
【００７７】
さらに、同一提供者から１ｍｌの唾液を回収し、２０ｍＭのＣＤＴＡ、４００ｍＭのＮａＯＡｃ（酢酸ナトリウム）、２００ｍＭのトリスＨＣｌ、および０．０５％のＳＤＳを含む、ｐＨ８．０に調整した溶液と混合した。唾液の回収後、保存する前に、２０μｌのプロテイナーゼＫ（濃度１ｍｇ/ｍｌ）を混合物に添加した（最終濃度１０μｇ/ｍｌ）。サンプルを室温で保存した。１日経過時、１４日経過時および３６５日経過時に、６０℃で１時間インキュベーションした後に、１μｌの上記混合物を下記のリアルタイムＰＣＲ反応系に直接添加した。
【００７８】
リアルタイムＰＣＲ条件
リアルタイムＰＣＲ反応は、Rotor-GeneＴＭ 3000 リアルタイム・サーマル・サイクラー（Corbett Research）で行った。 全反応体積は２５μｌである。
各反応系には、ＫＣｌ（最終濃度５０ｍＭ）、トリスＨＣｌ（２０ｍＭ、ｐＨ８．４）、ＭｇＣｌ２（３ｍＭ）、４つのｄＮＴＰのそれぞれ１つ（４００μＭ）、ヒトのチミジル酸生成酵素遺伝子の１４３ｂｐの断片の５ピコモルの各プライマー（順方向プライマー: 5’-GCCCTCTGCCAGTTCTA-3’、逆方向プライマー: 5’-TTCAGGCCCGTGATGT-3’）、２ユニットのTaq ＤＮＡポリメラーゼ、YBR Green I 色素（Molecular Probes）が含まれる（最終濃度 1:25,000）。
【００７９】
熱サイクリング条件は、５分間９６℃を１サイクル；２０秒間９５℃、２０秒間５５℃、３０秒間７２℃を４０サイクル、とした。融解曲線分析条件は次のようにした。７２℃で４５秒後、１℃ずつ５秒きざみで、７２から９７℃まで上げる。
既知の濃度の精製したＤＮＡを用いて、標準の曲線を作成した。
【００８０】
結果
入力サンプルのＤＮＡ濃度は、標準の曲線を基準にして、Rotor GeneＴＭ 3000ソフトウェアを用いて自動的に計算された。
【００８１】
【表１】
2008532528.tif 000002
【００８２】
【表２】
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【００８３】
【表３】
2008532528.tif 000004
【００８４】
概要
この研究の目的は、ＤＮＡの保存に水だけを使用した場合と比較して、本発明の組成物により、ＤＮＡを保存するための性能の改良を実証することであった。本研究に使用したリアルタイムＰＣＲ技術は半定量的であり、この技術に存在する本質的なエラー度により、算出されたＤＮＡ濃度値が実際のＤＮＡ濃度に一致しない可能性があることを理解されたい。しかし、当業者には容易に理解されるものと思うが、この方法は試験したサンプル間の的確な比較を提供する。
【００８５】
表Ｉ，ＩＩおよびＩＩＩに示されるように、唾液を水に１日、１４日または３６５日間保存した場合、リアルタイムＰＣＲによって検出可能なＤＮＡはごくわずかである。対照的に、本発明の種々の組成物中のＤＮＡの濃度は、１日経過時（表Ｉ）では２．５４〜７．３２ｎｇ/μｌ、１４日経過時（表ＩＩ）では３．１５〜６．０６ｎｇ/μｌ、３６５日経過時（表ＩＩＩ）では１．２０〜７．０７ｎｇ/μｌである。
【００８６】
本明細書で言及したすべての刊行物、特許および特許出願は、本発明が関係する技術における当業者の技術レベルを示すものである。各々の刊行物、特許または特許出願が参照により援用されることが明確に示されていたならば、それと同一程度に、参照することにより本明細書に援用される。
【００８７】
ここに記述した発明は、種々の変形がありうることは明らかであろう。このような変形は当業者には明らかであろうが、本発明の精神と範囲から逸脱するとみなすべきものではなく、すべて添付の請求の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】ＰＣＲ生成物の電気泳動後、臭化エチジウムで染色されたアガロース・ゲルを示す。含水組成物と混合し、室温で１日、１４日または３６５日間保存した唾液からのＤＮＡの直接増幅を示す。ＰＣＲの前にサンプルを６０℃で１時間インキュベートした。アガロース・ゲル中の各レーンの内容は以下のとおりである。
【表４】
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【図２】ＰＣＲ生成物の電気泳動後、臭化エチジウムで染色されたアガロース・ゲルを示す。下記に示す等体積の含水組成物と混合し、室温で１日、７日、１４日または３６５日間保存した後の唾液からのＤＮＡの直接増幅を示す。アガロース・ゲル中の各レーンの内容は以下のとおりである。
【表５】
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【図３】ＰＣＲ生成物の電気泳動後、臭化エチジウムで染色されたアガロース・ゲルを示す。精製したヒトＤＮＡを含むＰＣＲ増幅反応系に対する、段階化した各ＮａＯＨ濃度の影響を示す。アガロース・ゲル中の各レーンの内容は以下のとおりである。
【表６】
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【図４】ＰＣＲ生成物の電気泳動後、臭化エチジウムで染色されたアガロース・ゲルを示す。５０μｌのＰＣＲ増幅反応に対するＮａＯＨ／唾液混合物の体積の増加の影響を示す。アガロース・ゲル中の各レーンの内容は以下のとおりである。
【表７】
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【図５】ＰＣＲ生成物の電気泳動後、臭化エチジウムで染色されたアガロース・ゲルを示す。ＰＣＲ増幅反応に対する、他の組成物と比較したOrageneＴＭの阻害作用を示す。アガロース・ゲル中の各レーンの内容は以下のとおりである。
【表８】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年1月16日(2007.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
体液サンプルから核酸を抽出するための含水組成物であって、
前記サンプル内の前記核酸は、前記含水組成物と混合された後、室温で少なくとも１４日間安定であり、
（ａ）（i）変性剤と、（ii）キレート剤と、（iii）緩衝剤と、（iv）プロテアーゼとを含むか、または
（ｂ）アルカリ金属水酸化物、可溶性アルカリ土類金属水酸化物、アルカリ金属酸化物または有機塩基である塩基性物質を含み、
増幅反応混合物に、前記増幅反応混合物の総体積に対して少なくとも２％（vol./vol.）の量の前記組成物が添加されても、前記核酸の増幅は阻害されない、含水組成物。
【請求項２】
前記体液は唾液である、請求項１に記載の含水組成物。
【請求項３】
前記変性剤はＳＤＳであり、前記キレート剤はＣＤＴＡであり、前記緩衝剤はトリスＨＣｌであり、前記プロテアーゼはプロテアーゼＫである、請求項１または２に記載の含水組成物。
【請求項４】
０．０５％のＳＤＳと、２０ｍＭのＣＴＤＡと、２００ｍＭのトリスＨＣｌ ｐＨ８．０と、４００ｍＭのＮａＯＡｃと、１０μｇ/ｍｌのプロテアーゼＫとを含む、請求項３に記載の含水組成物。
【請求項５】
前記塩基性物質は、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、および炭酸ナトリウムからなる群から選択される、請求項１または２に記載の含水組成物。
【請求項６】
前記塩基性物質は、５０ｍＭ〜４００ｍＭの濃度で存在する水酸化ナトリウムである、請求項５に記載の含水組成物。
【請求項７】
前記濃度は約１００ｍＭである、請求項６に記載の含水組成物。
【請求項８】
前記塩基性物質は、約１００ｍＭの濃度で存在する水酸化カリウムである、請求項５に記載の含水組成物。
【請求項９】
前記塩基性物質は、約２００ｍＭの濃度で存在する炭酸ナトリウムである、請求項５に記載の含水組成物。
【請求項１０】
前記組成物は、核酸増幅混合物に、前記増幅反応混合物の全体積に対して２％（vol.）〜１０％（vol.）の量を添加されたとき、核酸増幅を阻害しない、請求項６に記載の含水組成物。
【請求項１１】
前記核酸は、室温で少なくとも３６５日間安定である、請求項２〜１０のいずれか一項に記載の含水組成物。
【請求項１２】
（ａ）体液サンプルを、それと等体積の請求項１に記載の含水組成物に混合すること、および
（ｂ）ステップ（ａ）で得られた混合物の一部をＰＣＲ増幅処理すること
を含む、体液からのＤＮＡを直接増幅するための方法。
【請求項１３】
前記体液は唾液である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ（ａ）で得られた混合物は、室温で少なくとも１４日間にわたり安定である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ステップ（ａ）で得られた混合物は、室温で少なくとも３６５日間にわたり安定である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
ステップ（ｂ）の前に、約１５〜６０分間、約４５℃〜８０℃の温度で混合物を加熱するステップをさらに含む、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の含水組成物と、（ｂ）それを使用するための指示事項とを含む、体液からのＤＮＡを増幅するためのキット。
【請求項１８】
前記体液は唾液である、請求項１７に記載のキット。
【国際調査報告】
2008532528.tif 000015
2008532528.tif 000016
2008532528.tif 000017
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