(57)【要約】  本発明は、宿主生物内／内部のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させるためにＲＮＡ注入溶液を調製する際の、ＲＮＡ、及び水性の注入緩衝液の利用であって、注入緩衝液は、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び必要に応じてカリウム塩を含有する、利用に関する。また、本発明は、インビトロ及びインビボで、宿主生物内／内部のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させるための、ＲＮＡ注入溶液及び方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主生物内／内部のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させるためにＲＮＡ注入溶液を調製する際の、ＲＮＡ、及び水性の注入緩衝液の利用であって、
注入緩衝液は、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び必要に応じてカリウム塩を含有する、利用。
【請求項２】
請求項１に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、塩化物、ヨウ化物、臭化物、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩を含む群から選択される陰イオンを有する塩を含有し、特に、塩として、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、及び必要に応じてＫＣｌを含有する、利用。
【請求項３】
請求項２に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも０．０１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、及び必要に応じて少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有する、利用。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、
５０ｍＭから８００ｍＭまで、好ましくは６０ｍＭから５００ｍＭまで、より好ましくは７０ｍＭから２５０ｍＭまで、さらに好ましくは６０ｍＭから１１０ｍＭまでの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
０．０１ｍＭから１００ｍＭまで、好ましくは０．５ｍＭから８０ｍＭまで、より好ましくは１．５ｍＭから４０ｍＭまでの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）；及び、
必要に応じて、３ｍＭから５００ｍＭまで、好ましくは４ｍＭから３００ｍＭまで、より好ましくは５ｍＭから２００ｍＭまでの塩化カリウム（ＫＣｌ）
を含有する、利用。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、さらに、乳酸塩を含有する、利用。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，Ｎａ（Ｋ）２ＨＰＯ４／Ｎａ（Ｋ）Ｈ２ＰＯ４等の緩衝系を含有しない、利用。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、単糖類、二糖類、または多糖類を含有しない、利用。
【請求項８】
請求項１〜７の何れか１項に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも０．１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２）、少なくとも１５ｍＭの乳酸塩、及び必要に応じて少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有する、利用。
【請求項９】
請求項８に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、１５ｍＭから５００ｍＭまで、好ましくは１５ｍＭから２００ｍＭまで、より好ましくは１５ｍＭから１００ｍＭまでの乳酸塩を含有する、利用。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の利用であって、
ＲＮＡは、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、または好ましくはｍＲＮＡである、利用。
【請求項１１】
請求項１〜１０の何れか１項に記載の利用であって、
ＲＮＡは、むき出しのＲＮＡ（特にむき出しのｍＲＮＡ）、またはＲＮＡ（特にポリ陽イオンと複合体と成すｍＲＮＡ）である、利用。
【請求項１２】
請求項１１に記載の利用であって、
ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、プロタミンと複合体を成す、利用。
【請求項１３】
請求項１０〜１２の何れか１項に記載の利用であって、
ｍＲＮＡは、少なくとも１つの天然または非天然の改変を有し、
上記改変は、特に、
コードされるアミノ酸配列を変えずに、ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量を増加させること、
少なくとも１つのリボヌクレオチドアナログを導入すること、
ＷＴ配列における非安定化配列を除去すること、または、
リボソーム結合部位の領域のＡ／Ｕ含量を増加させること、からなる群から選択される、利用。
【請求項１４】
請求項１〜１３にて定義された、ＲＮＡ、及び水性の注入緩衝液を含有する、宿主生物内／内部のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させるためのＲＮＡ注入溶液。
【請求項１５】
請求項１４に記載のＲＮＡ注入溶液であって、
上記注入緩衝液は、さらに、乳酸塩を含有する、ＲＮＡ注入溶液。
【請求項１６】
請求項１５に記載のＲＮＡ注入溶液であって、
上記注入緩衝液は、少なくとも１５ｍＭ、好ましくは１５ｍＭから１００ｍＭまでの乳酸塩を含有する、ＲＮＡ注入溶液。
【請求項１７】
請求項１４〜１６の何れか１項に記載のＲＮＡ注入溶液であって、
ＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、または好ましくはｍＲＮＡである、ＲＮＡ注入溶液。
【請求項１８】
請求項１４〜１７の何れか１項に記載のＲＮＡ注入溶液であって、
ＲＮＡは、むき出しのＲＮＡ、特にむき出しのｍＲＮＡである、ＲＮＡ注入溶液。
【請求項１９】
宿主生物内／内部のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させる方法であって、上記方法は、次の工程、
ａ．請求項１４〜１８の何れか１項に記載のＲＮＡ注入溶液を調製、及び
ｂ．工程ａ．のＲＮＡ注入溶液の、宿主生物への投与、
を含む、方法。
【請求項２０】
請求項１９に記載の方法であって、
上記宿主生物は、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、およびヒトからなる群より選ばれる哺乳類であり、特にヒトである、方法。
【請求項２１】
細胞のインビトロトランスフェクション方法であって、
請求項１４〜１８の何れか１項に記載のＲＮＡ注入溶液が、必要に応じてエレクトロポレーションにより、細胞、特に実験細胞または細胞株に投与される、方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、宿主生物内／内部のＲＮＡ移送、及び／またはＲＮＡ翻訳を向上させるために、ＲＮＡ注入溶液を調製する際の、ＲＮＡ、及び、ナトリウム塩、カルシウム塩、カリウム塩（必要に応じて）、並びに乳酸塩（必要に応じて）を含む水溶性の注入緩衝液の利用に関する。
【０００２】
遺伝子治療、遺伝子ワクチン注射といった、分子医学的処置は、数多くの疾患の治療及び予防に重要な役割を果たす。そのような処置は、患者の細胞または組織内への核酸の導入、次いで導入された核酸によりコードされる情報のプロセッシング（すなわち、所望のポリペプチドまたはタンパクの翻訳）に基づくものである。ＤＮＡ及びＲＮＡはともに、導入可能な核酸として考えられている。
【０００３】
むき出しのプラスミドＤＮＡを注入する遺伝子ワクチン接種が、１９９０年代初期に、マウスにおいて示された。しかしながら、この技術が、ヒトにおいて、マウスの研究１ により生じた期待を満足できないことが、臨床試験のフェーズＩ／ＩＩの間で明らかになった。数多くの遺伝子ワクチン接種、及びＤＮＡの細胞への導入方法（特に、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリプレントランスフェクション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、ＤＮＡウィルスのＤＮＡ移送手段としての利用）が開発されてきた。
【０００４】
１５年前、Wolff らは、マウスに、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、またはｍＲＮＡの形態で、むき出しの遺伝情報を注入することにより、タンパクを発現することができることを示した２ 。これらの結果に次いで、むき出しのｐＤＮＡがワクチン接種に利用され得ることを示す研究が成された３-５ 。しかしながら、ワクチン接種のためのｍＲＮＡの利用は、１９９０年代後半まで、ほとんど注意が払われていなかった。１９９０年代後半に、樹状細胞へのｍＲＮＡの移送が免疫応答の引き金になることが示された６ 。しかしながら、ワクチン接種のための、むき出しのｍＲＮＡの直接注入は、ほんの少しのテーマが残されおり、３つの異なる研究グループによる４つの論文のみで議論されている７-１０。この主な理由の１つは、リボヌクレアーゼによる迅速な消化に起因するｍＲＮＡの不安定性にあり、これに関連して、インビボでの遺伝ツールとしてのｍＲＮＡの有効性に限界がある。しかしながら、先頃、数多くのｍＲＮＡを安定化する方法が、従来技術（例えば、ＥＰ−Ａ−１０８３２３２，ＷＯ９９／１４３４６，ＵＳ５，５８０，８５９、及びＵＳ６，２１４，８０４）に示されている。
【０００５】
遺伝子移送手段としてのＲＮＡは、ＤＮＡに対し、数多くの利点を有している。この利点は、
ｉ）細胞内へ導入されるＲＮＡは、ゲノムに挿入されない（これに対し、ＤＮＡは、一定量ゲノムに挿入され、これにより、宿主細胞ゲノムの無傷な遺伝子に挿入される。その結果、この遺伝子が変異し、遺伝情報が部分的もしくは全部欠損するか、もしくは情報が誤り得る）。
ｉｉ）ＲＮＡの効率的な転写のために、プロモーターなどといった、ウィルスの配列を必要としない（これに対し、細胞内に導入されたＤＮＡの発現のためには、強力なプロモーター（例えばウィルスのＣＭＶプロモーター）が必要になる。宿主細胞ゲノムへこのようなプロモーターを挿入することにより、遺伝子の発現制御に予期しない変化が生じる。）。
ｉｉｉ）導入されたＲＮＡの消化は、限られた時間（数時間）に起きる１１，１２ 。このため、一過的な遺伝子発現を実現することができる。この発現は、必要な治療期間後に、中断され得る（これに対し、ゲノムに挿入されたＤＮＡでは、これは不可能である）。
ｉｖ）ＲＮＡにより、患者に病原性抗ＲＮＡ抗体が導入されない（これに対し、抗ＤＮＡ抗体の導入により、望ましくない免疫応答が起きることが知られている）。
ｖ）ＲＮＡは、広範に利用できる。ワクチン接種のために、患者個人ベースで、所望の所定タンパクのための任意の所望のＲＮＡが、間際に調製され得る。
を包含する。
【０００６】
要するに、インビボでの外因性遺伝情報の移送に適したベクターするのに必要な前提条件があるＤＮＡと異なり、ｍＲＮＡは、全ての生物のコードされる遺伝情報の一過的なコピーを示し、タンパク合成のモデルとして使われることが注目され続ける。
【０００７】
上記した核酸の宿主生物（特に哺乳類）への移送に、特に適した処置は、核酸の注入である。従来、このような注入のために、ＤＮＡが、水、ＮａＣｌ、またはＰＢＳ注入緩衝液に希釈されるのに対し、ＲＮＡは、従来注入緩衝液のみに希釈されていた。ＲＮＡ注入緩衝液として、リン酸緩衝塩溶液（特にＰＢＳ及びＨＥＰＥＳ緩衝塩溶液（ＨＢＳ））等の、標準緩衝液が用いられていた。ｍＲＮＡを移送する場合、このようなＲＮＡ注入溶液は、投与前に、ｍＲＮＡの２次構造を取り去るために、好ましくは短時間加熱されていた。ＲＮＡ注入溶液としてこのような標準緩衝液を用いたとき、ＲＮＡの皮内への移送が非常に困難になるという不都合が生じる。さらに、移送されたＲＮＡの翻訳率が非常に低いという不都合が生じる。さらに、標準緩衝液では、ＲＮＡが、しばしば２次構造（例えば、いわゆるヘアピン構造）を形成することがあり、この２次構造が、細胞質ゾルへのＲＮＡ取り込みの効率を顕著に低減させ得るという不都合が生じる。
【０００８】
したがって、本発明の目的は、宿主生物への皮内ＲＮＡ移送が向上する一方、移送したＲＮＡの翻訳効率が増加したシステムを提供することにある。
【０００９】
この目的は、請求項に特徴付けられた本発明の形態により達成される。
【００１０】
本発明の一形態は、宿主生物内／内部のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させるためにＲＮＡ注入溶液を調製する際の、ＲＮＡ、及び水性の注入緩衝液の利用であって、注入緩衝液は、ナトリウム塩（好ましくは少なくとも５０ｍＭ）、カルシウム塩（好ましくは少なくとも０．０１ｍＭ）、及び必要に応じてカリウム塩（好ましくは少なくとも３ｍＭ）を含有する、利用を提供する。本発明のさらなる態様はまた、そのように調製された注入液を提供する。よって、上記注入液は、上記注入緩衝液、及び該注入緩衝液に溶解したＲＮＡから得られる。
【００１１】
好ましい形態によれば、上記注入緩衝液に含有される、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び必要に応じてカリウム塩は、ハロゲン化合物（塩化物、ヨウ化物、または臭化物）、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩の形態である。ここで言及した例として、ナトリウム塩は、ＮａＣｌ、ＮａＩ、ＮａＢｒ、Ｎａ２ ＣＯ３ 、ＮａＨＣＯ３ 、Ｎａ２ ＳＯ４ であり、必要に応じて存在するカリウム塩は、ＫＣｌ、ＫＩ、ＫＢｒ、Ｋ２ ＣＯ３ 、ＫＨＣＯ３ 、Ｋ２ ＳＯ４ であり、カルシウム塩は、ＣａＣｌ２ 、ＣａＩ２ 、ＣａＢｒ２ 、ＣａＣＯ３ 、ＣａＳＯ４ 、Ｃａ（ＯＨ）２ である。上述の陽イオンの有機陰イオンはまた、上記注入緩衝液に含有され得る。
【００１２】
本発明におけるＲＮＡ及び注入緩衝液の利用の、特に好ましい形態では、本発明の注入緩衝液は、塩として、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２ ）、及び必要に応じて塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有し、上記塩化物に加え、他の陰イオンが存在し得る。通常、これらの塩は、上記注入緩衝液中に、少なくとも５０ｍＭの濃度で塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも０．０１ｍＭの濃度で塩化カルシウム（ＣａＣｌ２ ）、及び必要に応じて少なくとも３ｍＭの濃度で塩化カリウム（ＫＣｌ）が存在する。
【００１３】
本発明の注入緩衝液は、高浸透圧性、または等張性、あるいは低浸透圧性の注入緩衝液として存在し得る。本発明と関係して、注入緩衝液は、各基準媒体(reference medium)に対し、高浸透圧性、または等張性、あるいは低浸透圧性である。換言すると、本発明の注入緩衝液は、各基準媒体と比較して、塩の含有量が、高いか、または、等しいか、あるいは低い。用いられる上述の塩の濃度は、好ましくは、浸透作用、または他の濃度の影響により細胞にダメージが生じない濃度である。ここで、基準媒体は、例えば、血液、リンパ液、細胞質ゾル液、または体内で起こる他の流体といった、インビボ(in vivo) 処理で起こる液体、あるいは、インビトロ(in vitro)処理で通常用いられる液体または緩衝液である。このような液体は、当業者にとって公知である。
【００１４】
上記注入緩衝液は、さらなる化合物、例えば糖類（単糖類、二糖類、三糖類、または多糖類）、特にグルコースまたはマンニトールを含み得る。しかしながら、好ましい形態では、本発明の利用のために使用される注入緩衝液に、糖類が存在しないだろう。本発明の緩衝液は、例えば糖類といった、無電荷の化合物を全く含有しないことが好ましい。通常、本発明の緩衝液は、特に、アルカリ金属またはアルカリ土類金属、または陰イオン、特に上述の陰イオンの群からの金属陽イオンのみを含有する。
【００１５】
本発明の注入緩衝液のｐＨ値は、好ましくは１から８．５まで、好ましくは３から５まで、より好ましくは５．５から７．５まで、特に好ましくは５．５から６．５までである。注入緩衝液は、必要に応じて、注入緩衝液を緩衝されるｐＨ値に固定する緩衝系を含み得る。このような系は、例えば、リン酸緩衝系、ＨＥＰＥＳ、Ｎａ２ ＨＰＯ４ ／ＮａＨ２ ＰＯ４ であり得る。しかしながら、注入緩衝液が、上述の緩衝系を含有しないか、または緩衝系が全く存在しないときに、本発明に基づいて用いられる注入緩衝液に与えられることが、特に好ましい。
【００１６】
本発明に基づいて用いられる注入緩衝液は、上述のように、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び必要に応じてカリウム塩を含有する。ナトリウムまたはカリウムは、通常、注入緩衝液中で、一価の陽イオン（Ｎａ＋、Ｋ＋）の形態で存在している。カルシウムは、二価の陽イオン（Ｃａ２＋）の形態で存在している。好ましい形態によれば、これらに加え、あるいは、本発明に基づいて用いられる注入緩衝液に含まれる一価及び二価の陽イオンの代わりに、二価の陽イオン（特に、例えば、マグネシウム（Ｍｇ２＋）、鉄（Ｆｅ２＋）といった、アルカリ土類金属の群からの陽イオン）、及び一価の陽イオン（特に、例えばリチウム（Ｌｉ＋）といった、アルカリ金属の群からの陽イオン）が存在し得る。これらの一価の陽イオンは、塩の形態（例えば、ハロゲン化合物（塩化物、ヨウ化物、または臭化物）の形態、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、または硫酸塩の形態）で存在することが好ましい。ここで言及した例として、リチウム塩は、ＬｉＣｌ、ＬｉＩ、ＬｉＢｒ、Ｌｉ２ ＣＯ３ 、ＬｉＨＣＯ３ 、Ｌｉ２ ＳＯ４ であり、マグネシウム塩は、ＭｇＣｌ２ 、ＭｇＩ２ 、ＭｇＢｒ２ 、ＭｇＣＯ３ 、ＭｇＳＯ４ 、及びＭｇ（ＯＨ）２ であり、鉄の塩は、ＦｅＣｌ２ 、ＦｅＢｒ２ 、ＦｅＩ２ 、ＦｅＦ２ 、Ｆｅ２ Ｏ３ 、ＦｅＣＯ３ 、ＦｅＳＯ４ 、Ｆｅ（ＯＨ）２ である。同様に、上述の一価及び／または二価の陽イオンの全ての組み合わせが含まれる。よって、本発明の注入緩衝液には、二価の陽イオンのみを含有するもの、一価の陽イオンのみを含有するもの、または、二価及び一価の陽イオンを含有するものが含まれる。また、本発明の注入緩衝液には、１種類のみの二価または一価の陽イオン（特に好ましくは、例えばＣａ２＋陽イオンのみ）、またはその塩（例えばＣａＣｌ２ ）を含有するものが含まれる。
【００１７】
注入液調製用に本発明に基づいて用いられる注入緩衝液に、Ｃａ２＋、及びＮａ１＋に代えて、異なる一種の二価または一価の陽イオン、または異なる複数種の二価または一価の陽イオン（特にアルカリ金属またはアルカリ土類金属の群からの異なる陽イオン）が用いられるとき、注入緩衝液において、（二価の陽イオンとしての）Ｃａ２＋、及び（一価の陽イオンとしての）Ｎａ１＋として示されるモル濃度（すなわち、通常少なくとも５０ｍＭのＮａ＋、少なくとも０．０１ｍＭのＣａ２＋、及び必要に応じて少なくとも３ｍＭのＫ＋）が、考慮されることが好ましい。上述のように、本発明に基づいて用いられる注入緩衝液において、Ｃａ２＋及びＮａ１＋は、異なる二価または一価の陽イオン（例えば、（Ｃａ２＋に代えて）異なる二価の陽イオンの組み合わせ、及び／または（Ｎａ１＋に代えて）異なる一価の陽イオンの組み合わせ；特にアルカリ土類金属の群からの異なる二価の陽イオンの組み合わせ、またはアルカリ金属の群からの異なる一価の陽イオンの組み合わせ）により完全に変換され得る。とはいえ、部分的にＣａ２＋及びＮａ１＋を変換することが好ましい。すなわち、Ｃａ２＋及びＮａ１＋は、Ｃａ２＋及びＮａ１＋を有する注入緩衝液中の一価または二価の陽イオンの総モル濃度に対し、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは８０％を占める。しかしながら、本発明に基づいて用いられる注入緩衝液は、二価の陽イオンとしてＣａ２＋のみを含有し、一価の陽イオンとしてＮａ１＋を含有する（すなわち、Ｃａ２＋が二価の陽イオンの総モル濃度の１００％を示し、Ｎａ１＋が一価の陽イオンの総モル濃度の１００％を示す）ことが、特に好ましい。
【００１８】
注入緩衝液の調製は、好ましくは、室温（２５℃）及び常圧で行われる。この調製は、従来技術の任意の所望の処理に基づいて、行われ得る。好ましくは、これに含まれるイオンまたは塩が水性溶液に希釈される。これにより、濃度比が、特定の条件に基づいて選択される。上記特定の条件は、ＲＮＡ注入溶液が注入された宿主生物（特に哺乳類）、宿主生物の健康状態、宿主生物の年齢、化合物の溶解度及び干渉の条件、反応温度、反応時間等である。
【００１９】
水性の注入緩衝液に含有する化合物（ナトリウムイオン、カルシウムイオン、塩化物イオン、カリウムイオン（必要に応じて）、及び乳酸（必要に応じて）（後述の実施形態参照））は、注入緩衝液またはＲＮＡ注入溶液の調製中の反応温度及び反応圧力と同様に、特に、これら化合物の水に対する溶解度、互いの化合物の干渉に依存する。
【００２０】
本発明に基づいて用いられる注入緩衝液は、水性溶液（すなわち、水、注入緩衝液用に本発明に基づいて用いられる塩、及び乳酸（必要に応じて）からなる溶液）に基づいている。上述の一価または二価の陽イオンの塩は、必要に応じて、水性溶液に対し、難溶性、または、不溶性であり得る。上記塩の溶解度は、溶解度積から計算され得る。溶解度及び溶解度積を正確に定量する処理は、当業者に公知である。この水性溶液は、該溶液に含まれる塩の３０モル％以下、好ましくは２５モル％以下、さらに好ましくは２０モル％以下、さらに好ましくは１５モル％、さらに好ましくは１０モル％、さらに好ましくは５モル％、さらに好ましくは２モル％の、不溶性または難溶性の塩を含有する。本発明の範囲内において、その溶解度積が１０−４よりも小さい（＜１０−４）塩は、難溶性であると考えられる。その溶解度積が１０−４よりも大きい（＞１０−４）塩は、可溶性であると考えられる。
【００２１】
水に対する、塩、イオン、またはイオン化合物の溶解度は、生じるエントロピーを考慮すると、格子エネルギー及び水和エネルギーに依存する。溶解度積という用語は、より正確には、塩、イオン、またはイオン化合物が水中で溶解したときに生じる平衡状態に用いられる。一般的に、溶解度積は、飽和電解液中でのイオン濃度の積として定義される。例えば、アルカリ金属（例えば、Ｎａ＋，Ｋ＋といった）は、アルカリ土類金属塩（例えばＣａ２＋塩といった）よりも、水に対し、高濃度で溶解する。すなわち、これらは、より大きい溶解度積を有する。換言すると、本発明における注入緩衝液の水性溶液中のカリウム及びナトリウムの塩は、存在するカルシウム塩よりも溶解しやすくなっている。それゆえ、これらイオンの濃度を決定するに際し、とりわけ、カリウム、ナトリウム、及びカルシウム塩間の干渉を考慮する必要がある。
【００２２】
本発明の利用においては、注入緩衝液は、５０ｍＭから８００ｍＭまで、好ましくは６０ｍＭから５００ｍＭまで、より好ましくは７０ｍＭから２５０ｍＭまで、さらに好ましくは６０ｍＭから１１０ｍＭまでの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；０．０１ｍＭから１００ｍＭまで、好ましくは０．５ｍＭから８０ｍＭまで、より好ましくは１．５ｍＭから４０ｍＭまでの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２ ）；及び、必要に応じて、３ｍＭから５００ｍＭまで、好ましくは４ｍＭから３００ｍＭまで、より好ましくは５ｍＭから２００ｍＭまでの塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有することが好ましい。
【００２３】
上述の無機の陰イオン（例えば、ハロゲン化物、硫酸塩、または炭酸塩）に加え、有機の陰イオンが、さらなる陰イオンを起こし得る。これらの間で、記述は、コハク酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、リンゴ酸塩、マロン酸塩(maleonate) 等（これらは、組み合わさって存在する）を構成する。本発明に基づいて用いられる注入緩衝液は、乳酸塩を含有する。特に好ましくは、このような、有機の陰イオンが存在する注入緩衝液は、有機の陰イオンとして乳酸塩のみを含有する。本発明の範囲内において、乳酸塩は、任意の所望の乳酸塩、例えばＬ‐乳酸塩及びＤ‐乳酸塩であり得る。本発明と関連して、注入緩衝液が、一価の陽イオンとしてＮａ＋のみ、二価の陽イオンとしてＣａ２＋のみを含有するとき、乳酸塩として、乳酸ナトリウム、及び／または乳酸カルシウムが生じる。
【００２４】
本発明の利用の好ましい形態では、本発明の注入緩衝液は、好ましくは１５ｍＭから５００ｍＭまで、より好ましくは１５ｍＭから２００ｍＭまで、さらに好ましくは最も好ましくは１５ｍＭから１００ｍＭまでの乳酸塩を含有する。
【００２５】
本発明によれば、ＲＮＡ注入溶液（すなわち、ＲＮＡを含有し、そのＲＮＡの注入に適した注入液）のために、上述の化合物を含有する注入緩衝液（必要に応じて乳酸塩を有するか、または有しないか；後述のように、化合物の乳酸塩が存在しない場合、「ＲＬ注入緩衝液」、または化合物の乳酸塩が存在する場合、「乳酸塩を有するＲＬ注入緩衝液」）を利用することにより、当業者により従来用いられてきた注入緩衝液と比較して、宿主細胞体（哺乳類）の細胞／組織内／内部へのＲＮＡの移送及び翻訳が顕著に増加することがわかる。
【００２６】
上述の化合物、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カルシウム（ＣａＣｌ２ ）、乳酸塩（特に乳酸ナトリウム）、及び必要に応じて塩化カリウム（ＫＣｌ）を有する溶液は、「リンゲル液」、または「リンゲル乳酸塩」として知られている。リンゲル乳酸塩は、例えば適合性薬物処理のために（血液）容量負荷及びキャリア溶液として用いられる、結晶性の完全電解液(full electrolyte solution) である。例えば、リンゲル乳酸塩は、特に幼児及び小児の（嘔吐、下痢、腸閉塞、または火傷による）流動及び電解のロスの場合、初期の容量負荷剤として用いられる。また、リンゲル乳酸塩は、抹消及び／または中心静脈の通路を開いた状態に保つのに用いられる。しかしながら、本発明における、リンゲル乳酸塩の、ＲＮＡ注入溶液の注入緩衝液としての利用は、従来技術で示されていない。
【００２７】
本発明の範囲内において、ＲＮＡは、任意の所望のＲＮＡであり、例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ，一本鎖または二本鎖のＲＮＡ、ヘテロ二本鎖のＲＮＡ等である。用いられる上記ＲＮＡは、所定の任意のタンパクをコードし得る。本発明に基づいて用いられるＲＮＡは、好ましくはむき出しのＲＮＡである。特に好ましくは、ｍＲＮＡであり、より好ましくは、むき出しのｍＲＮＡである。
【００２８】
本発明の範囲内において、むき出しのＲＮＡ、特にむき出しのｍＲＮＡは、例えばポリカチオン分子と複合体を形成しないＲＮＡであるとして理解される。むき出しのＲＮＡは、一本鎖の形態だけでなく、二本鎖の形態、すなわち二次構造（例えば、いわゆるヘアピン構造）で存在し得る。このような二本鎖の形態は、その分子内に相補するリボヌクレオチド配列が存在するとき、特にむき出しのＲＮＡ内、とりわけむき出しのｍＲＮＡ内で起きる。
【００２９】
しかしながら、本発明によれば、上記ＲＮＡ、特にｍＲＮＡは、複合体の形態で存在し得る。本発明の上記ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の、このような複合体化／凝縮の結果、ＲＮＡの、被処理生物における被処理細胞または被処理組織内部への効果的な移送が改善され得る。上記複合体化／凝縮は、上記ＲＮＡを、（ポリ）陽イオン性の重合体、ペプチド、またはタンパクと一体にする、または結合させることによりなされる。このようなＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、好ましくは、少なくとも１つの陽イオン性またはポリ陽イオン性の薬剤で、複合体化または凝縮される。このような陽イオン性またはポリ陽イオン性の薬剤は、好ましくは、プロタミン、ポリ‐Ｌ‐リジン、ポリ‐Ｌ‐アルギニン、ヌクレオリン、スペルミン、及び、ヒストンまたはヒストンあるいはプロタミンの誘導体からなる群から選択される薬剤である。ポリ陽イオン性核酸結合タンパクとして、プロタミンを使用することが特に好ましい。ＲＮＡを安定化するための手順は、例えばＥＰ‐Ａ‐１０８３２３２に記載されており、関連する対応開示内容は、全て本発明に含まれる。
【００３０】
本発明のＲＮＡは、さらに改変され得る。これらの改変は、特にＲＮＡの安定性を増加させるためのものである。ＲＮＡは、好ましくは、１つ以上（自然に生じる、または人工的）の改変（特に化学的改変）を有している。この改変により、生物でのＲＮＡの半減期が増加するか、または、ｍＲＮＡの細胞質ゾル内翻訳効率が、改変していないｍＲＮＡの細胞質ゾル内翻訳効率よりも向上する。本発明の改変により、上記翻訳効率は、改変していないｍＲＮＡの細胞質ゾル内翻訳効率と比較して、少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、さらに好ましくは少なくとも６０％、さらに好ましくは少なくとも７５％、さらに好ましくは少なくとも８５％、最も好ましくは少なくとも１００％向上している。
【００３１】
例えば、改変ｍＲＮＡのコーディング領域のＧＣ含量は、対応する野生型ｍＲＮＡのコーディング領域のＧＣ含量と比較して、増加され得る。好ましくは、改変ｍＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列が、野生型ｍＲＮＡによりコードされるアミノ酸配列に対し変化しないままになっている。この改変は、翻訳されるｍＲＮＡ領域の配列が、ｍＲＮＡの効率的な翻訳に重要であるという事実に基づいている。ここで、種々のヌクレオチドの配置及び配列に重要性がある。特に、Ｇ（グアノシン）／Ｃ（シトシン）含量が高い配列は、Ａ（アデノシン）／Ｕ（ウラシル）含量が高い配列よりも安定している。さらに、翻訳されるアミノ酸配列をそのままに保持する一方、より多くのＧ／Ｃヌクレオチドを含有するように、野生型ｍＲＮＡに照らしてコドンを改変することが有利である。同一のアミノ酸をコードするコドンが複数ある（いわゆる、遺伝コードの縮重）という事実から、安定性に有利な（好ましくは最大Ｇ／Ｃ含量を有する）コドンを決定することが可能になる。結果として、注入緩衝液中のＲＮＡは、Ｇ／Ｃ含量が、最大Ｇ／Ｃ含量（すなわち、Ｇ／Ｃ含量を最大にする目的で、遺伝コードの縮重を用いてコードされるアミノ酸配列を変えずに、生来の配列を根幹としてコード領域の潜在的なトリプレット全てを改変した後のＧ／Ｃ含量）を基に、好ましくは少なくとも３０％まで、より好ましくは少なくとも５０％まで、さらに好ましくは少なくとも７０％まで、さらに好ましくは少なくとも８０％まで増加している。最も好ましくは、注入緩衝液中のＲＮＡは、Ｇ／Ｃ含量が最大Ｇ／Ｃ含量になっている。最大Ｇ／Ｃ含量は、コードされるアミノ酸配列が変化せずに、そのＧ／Ｃ含量が最大化した配列により与えられる。
【００３２】
改変ｍＲＮＡによりコードされるアミノ酸に依存して、野生型ｍＲＮＡと比較してｍＲＮＡを改変するための、種々の可能性が存在する。アミノ酸が、ＧまたはＣのヌクレオチドのみを含有するコドンによりコードされている場合、コドンの改変は必要ない。このような例として、Ｐｒｏ（ＣＣＣまたはＣＣＧ）、Ａｒｇ（ＣＧＣまたはＣＧＧ）、Ａｌａ（ＧＣＣまたはＧＣＧ）、及びＧｌｙ（ＧＧＣまたはＧＧＧ）のコドンが挙げられる。
【００３３】
一方、Ａ及び／またはＵのヌクレオチドを含有するコドンは、同じアミノ酸をコードしＡ及び／またはＵを含有しない、異なるコドンへの置換により改変され得る。このような例として、
‐Ｐｒｏのコドンは、ＣＣＵまたはＣＣＡから、ＣＣＣまたはＣＣＧへ改変され得る。
‐Ａｒｇのコドンは、ＣＧＵ、ＣＧＡ、ＡＧＡまたはＡＧＧから、ＣＧＣまたはＣＧＧへ、改変され得る。
‐Ａｌａのコドンは、ＧＣＵまたはＧＣＡから、ＧＣＣまたはＧＣＧへ、改変され得る。
‐Ｇｌｙのコドンは、ＧＧＵまたはＧＧＡから、ＧＧＣまたはＧＧＧへ、改変され得る。
【００３４】
コドンからＡ及びＵのヌクレオチドを除去することが不可能であるが、Ａ及び／またはＵのヌクレオチドの含量が小さいコドンを用いることで、Ａ及びＵの含量を低減することが可能である場合がある。このような例として、
‐Ｐｈｅのコドンは、ＵＵＵからＵＵＣへ改変され得る。
‐Ｌｅｕのコドンは、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵまたはＣＵＡから、ＣＵＣまたはＣＵＧへ、改変され得る。
‐Ｓｅｒのコドンは、ＵＣＵ、ＵＣＡまたはＡＧＵから、ＵＣＣ、ＵＣＧまたはＡＧＣへ、改変され得る。
‐Ｔｙｒのコドンは、ＵＡＵからＵＡＣへ改変され得る。
‐Ｃｙｓのコドンは、ＵＧＵからＵＧＣへ改変され得る。
‐Ｈｉｓのコドンは、ＣＡＵからＣＡＣへ改変され得る。
‐Ｇｌｎのコドンは、ＣＡＡからＣＡＧへ改変され得る。
‐Ｉｌｅのコドンは、ＡＵＵまたはＡＵＡから、ＡＵＣへ改変され得る。
‐Ｔｈｒのコドンは、ＡＣＵまたはＡＣＡから、ＡＣＣまたはＡＣＧへ、改変され得る。
‐Ａｓｎのコドンは、ＡＡＵからＡＡＣへ改変され得る。
‐Ｌｙｓのコドンは、ＡＡＡからＡＡＧへ改変され得る。
‐Ｖａｌのコドンは、ＧＵＵまたはＧＵＡから、ＧＵＣまたはＧＵＧへ、改変され得る。
‐Ａｓｐのコドンは、ＧＡＵからＧＡＣへ改変され得る。
‐Ｇｌｕのコドンは、ＧＡＡからＧＡＧへ改変され得る。
‐終止コドンＵＡＡは、ＵＡＧまたはＵＧＡへ改変され得る。
【００３５】
野生型ｍＲＮＡ（オリジナル配列）に比べ改変ｍＲＮＡのＧ／Ｃ含量を増加させるために、上記でリストした置換は、個々に用いるか、あるいは可能な限り組み合わせて用いることが可能である。好ましくは、上記の置換の組み合わせの可能性として、例えば以下の置換が用いられる。すなわち、
‐オリジナル配列（野生型ｍＲＮＡ）におけるＴｈｒをコードする全てのコドンをＡＣＣ（またはＡＣＧ）に置換する。元々Ｓｅｒをコードする全てのコドンをＵＣＣ（ＵＣＧまたはＡＧＣ）に置換する、
‐オリジナル配列におけるＩｌｅをコードする全てのコドンをＡＵＣに置換する。元々Ｌｙｓをコードする全てのコドンをＡＡＧに置換する。元々Ｔｙｒをコードする全てのコドンをＵＡＣに置換する、
‐オリジナル配列におけるＶａｌをコードする全てのコドンをＧＵＣ（またはＧＵＧ）に置換する。元々Ｇｌｕをコードする全てのコドンをＧＡＧに置換する。元々Ａｌａをコードする全てのコドンをＧＣＣ（またはＧＣＧ）に置換する。元々Ａｒｇをコードする全てのコドンをＣＧＣ（またはＣＧＧ）に置換する、
‐オリジナル配列におけるＶａｌをコードする全てのコドンをＧＵＣ（またはＧＵＧ）に置換する。元々Ｇｌｕをコードする全てのコドンをＧＡＧに置換する。元々Ａｌａをコードする全てのコドンをＧＣＣ（またはＧＣＧ）に置換する。元々Ｇｌｙをコードする全てのコドンをＧＧＣ（またはＧＧＧ）に置換する。元々Ａｓｎをコードする全てのコドンをＡＡＣに置換する、
‐オリジナル配列におけるＶａｌをコードする全てのコドンをＧＵＣ（またはＧＵＧ）に置換する。元々Ｐｈｅをコードする全てのコドンをＵＵＣに置換する。元々Ｃｙｓをコードする全てのコドンをＵＧＣに置換する。元々Ｌｅｕをコードする全てのコドンをＣＵＧ（またはＣＵＣ）に置換する。元々Ｇｌｎをコードする全てのコドンをＣＡＧに置換する。元々Ｐｒｏをコードする全てのコドンをＣＣＣ（またはＣＣＧ）に置換する、等といった置換が用いられる。
【００３６】
改変ｍＲＮＡのタンパクコード領域におけるＧ／Ｃ含量の変化に関しては、このＧ／Ｃ含量は、野生型ｍＲＮＡのタンパクコード領域におけるＧ／Ｃ含量と比較して、少なくとも７％ポイントまで、より好ましくは少なくとも１５％ポイントまで、さらに好ましくは少なくとも２０％ポイントまで、さらに好ましくは少なくとも３０％ポイントまで、増加されるであろう。これに関連して、改変ｍＲＮＡ（特にタンパクコード領域）のＧ／Ｃ含量を、野生型配列と比較して、最大限増加させることが特に好ましい。
【００３７】
また、野生型ｍＲＮＡのリボソーム結合部位の領域のＡ／Ｕ含量と比較して、改変ｍＲＮＡのリボソーム結合部位の領域のＡ／Ｕ含量を増加させることが好ましい。この改変により、リボソームのｍＲＮＡへの結合効率が増加する。リボソームの効率的なリボソーム結合部位（コザック(Kozak) 配列：ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧＧ、ＡＵＧは開始コドンを形成する）への結合は、代わりに、ｍＲＮＡの効率的な翻訳に影響する。上記増加は、上記結合部位（すなわち、ＡＵＧ開始コドンのＡから、−２０〜＋２０）に、少なくとも１つ（通常、少なくとも３つ）の付加的なＡ／Ｕユニットを導入して成される。
【００３８】
さらに好ましい改変は、次のｍＲＮＡに関連する。すなわち、このｍＲＮＡでは、改変ｍＲＮＡにおける、コード領域、及び／または、５’‐及び／または３’‐非翻訳領域が、野生型ｍＲＮＡと比較して改変されており、非安定化配列エレメントを全く含有しない。そして、好ましくは、改変ｍＲＮＡにおけるコードされるアミノ酸配列が、野生型ｍＲＮＡと比較して、変化していない。非安定化配列エレメント（ＤＳＥｓ）は、例えば真核生物のｍＲＮＡの配列で生じ、このｍＲＮＡに非安定化配列エレメントシグナルタンパクが結合し、インビトロで酵素によるｍＲＮＡの分解を制御することが知られている。よって、本発明によれば、さらに改変ｍＲＮＡを安定化させるために、非安定化配列エレメントが領域内に全く存在しないか、またはほとんど存在しなくなるように、タンパクのコード領域に、野生型ｍＲＮＡの対応領域と比較して１つ以上の改変が行われ得る。本発明によれば、このような改変により、ｍＲＮＡから、非翻訳領域（５’‐及び／または３’‐ＵＴＲ）に存在するＤＳＥｓを除去することが可能になる。
【００３９】
このような非安定化配列エレメントは、例えば、ＡＵリッチ配列（「ＡＵＲＥＳ」）である。この配列は、エンドヌクレアーゼ認識配列モチーフ（例えば、Binderら，EMBO J. 1994, 13: 1969〜1980）と同様に、多くの不安定なｍＲＮＡにおける３’‐ＵＴＲ領域にもある（Caput ら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670〜1674）。
【００４０】
また、好ましくは、改変ｍＲＮＡは、安定化のために、５’‐キャップ構造を有している。本発明にしたがって用いられるキャップ構造の一例は、ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ、５’（Ａ，Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ａ、及びＧ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇである。
【００４１】
改変ｍＲＮＡは、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも７０ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも１００ヌクレオチド、さらに好ましくは少なくとも２００ヌクレオチドのポリＡテールを有していることが好ましい。
【００４２】
また、改変ｍＲＮＡは、少なくとも１つのＩＲＥＳ、及び／または、少なくとも１つの５’‐及び／または３’‐安定化配列を有していることが好ましい。本発明によれば、１つ以上のいわゆるＩＲＥＳ（リボソーム内部進入配列）が改変ｍＲＮＡに導入され得る。ＩＲＥＳは、翻訳される複数のタンパク、ペプチド、またはポリペプチドをコードするｍＲＮＡを、リボソーム（マルチシストロンのｍＲＮＡ）により互いに独立して提供する機能を有する以外に、単一のリボソーム結合部位として機能する。本発明にしたがって用いられ得るＩＲＥＳ配列は、例えば、ピコルナウィルス（例えばＦＭＤＶ）、ペストウィルス（ＣＦＦＶ）、ポリオウィルス（ＰＶ）、脳心筋炎ウィルス（ＥＣＭＶ）、口蹄疫ウィルス（ＦＭＤＶ）、Ｃ型肝炎ウィルス（ＨＣＶ）、豚コレラウィルス（ＣＳＦＶ）、マウス白斑ウィルス（ＭＬＶ）、サル免疫不全症候群ウィルス（ＳＩＶ）、またはコオロギ麻痺病ウィルス（ＣｒＰＶ）に由来する配列である。
【００４３】
また、改変ｍＲＮＡは、少なくとも１つの５’‐及び／または３’‐安定化配列を有していることが好ましい。５’‐及び／または３’‐非翻訳領域におけるこれら安定化配列は、細胞質ゾルでのｍＲＮＡの半減期を増加させるという効果を奏する。このような安定化配列は、（ウィルス、バクテリア、及び真核生物で生じる）天然(naturally occurring) の配列と、１００％配列ホモロジーがある。しかしながら、この配列は、部分的または全体的に合成した天然物であり得る。本発明にしたがって用いられ得る安定化配列の一例として、（例えばホモサピエンス(Homosapiens) またはアフリカツメガエル(Xenopus laevis)の）グロブリン遺伝子における非翻訳配列（ＵＴＲ）が挙げられる。安定化配列の他の例は、一般式（Ｃ／Ｕ）ＣＣＡＮｘ ＣＣＣ（Ｕ／Ａ）Ｐｙｘ ＵＣ（Ｃ／Ｕ）ＣＣを有している。この配列は、α‐グロブリン、（Ｉ）‐コラーゲン、１５‐リポキシゲナーゼ、または、チロシン‐ハイドロキシラーゼをコードする、非常に安定化したｍＲＮＡの３’‐ＵＴＲに含まれている（Holcikら，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 〜2414参照）。もちろん、このような安定化配列は、個々に用いられるか、もしくは互いに組み合わせて用いられ得る。当業者に公知な他の安定化配列とも組み合わせて用いられ得る。
【００４４】
本発明の好ましい形態では、改変ｍＲＮＡは、少なくとも１つの、天然ヌクレオチドのアナログを含有している。この／これらアナログは、改変ｍＲＮＡをさらに安定にするのに働く。これは、細胞内に生じるＲＮＡ‐分解酵素(RNA-degrading enzymes) が、優先的に、基質として天然ヌクレオチドを認識するという事実に基づいている。よって、上記ＲＮＡにヌクレオチドアナログを導入することにより、ＲＮＡの分解は、より起こり難くなる。しかしながら、特にｍＲＮＡのコード領域への、これらアナログの導入は、翻訳効率に正または負の効果を与える。本発明にしたがって用いられ得るヌクレオチドアナログは、特に限定されないが、例えば、ホスホロアミダート、ホスホロチオエート、ペプチドヌクレオチド、ホスホン酸メチル、７‐デアザグアノシン、５‐メチルシトシン、及びイノシンが挙げられる。このようなアナログの調製は、例えば、ＵＳ特許４，３７３，０７１、ＵＳ４，４０１，７９６、ＵＳ４，４１５，７３２、ＵＳ４，４５８，０６６、ＵＳ４，５００，７０７、ＵＳ ４，６６８，７７７、ＵＳ４，９７３，６７９、ＵＳ５，０４７，５２４、ＵＳ５，１３２，４１８、ＵＳ５，１５３，３１９、ＵＳ５，２６２，５３０及び５，７００，６４２から、当業者に公知である。このようなアナログは、改変ｍＲＮＡの非翻訳領域及び翻訳領域の両方で生じ得る。
【００４５】
本発明のさらに好ましい形態では、改変ｍＲＮＡは、付加的に、シグナルペプチドをコードする配列を含有する。シグナルペプチドをコードするこの配列は、好ましくは、１０アミノ酸から１００アミノ酸までをコードする、３０ベースから３００ベースまでの長さである。より好ましくは、シグナルペプチドをコードするこの配列は、１５アミノ酸から６０アミノ酸までをコードする、４５ベースから１８０ベースまでの長さである。本発明にしたがって用いられるＲＮＡを改変するために、一例として、表１に示された以下の配列が用いられ得る。表１に示されたこれら配列は、表１に示された配列の比較して、１ベースから２０ベースまで、好ましくは１ベースから１０ベースまで、さらに好ましくは１ベースから５ベースまでのＡ、Ｔ、Ｃ、またはＧの置換を有するものも含まれる。
【００４６】
【表１】
2008540601.tif 000002
【００４７】
上述の改変を行うための、種々の処理が、当業者にとって公知である。例えば、本発明の改変ｍＲＮＡのコドンの置換のために、コード領域が比較的短い場合、標準的な技術を用いて、ｍＲＮＡ全長を化学的に合成することが可能である。しかしながら、従来のターゲット変異導入(target-oriented mutagenesis) （例えばManiatisら，Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3rd ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001参照）技術を用いて改変ｍＲＮＡを調製するために、塩基の改変、付加、または除去は、好ましくは、ＤＮＡマトリックスを用いて導入される。このような処理では、上記ｍＲＮＡを調製するために、対応するＤＮＡ分子が、インビトロで転写される。このＤＮＡマトリックスは、インビトロ転写のために、適切なプロモーター（例えばＴ７またはＳＰ６プロモーター）、それに続いて、調製されるｍＲＮＡの所望のヌクレオチド配列、及びインビトロ転写の終止シグナルを有している。調製されるＲＮＡ構造体のマトリックスを形成するＤＮＡ分子は、発酵による増殖、それに続いて、バクテリア内で複製されたプラスミドの一部分の分離(isolation) により、調製され得る。そして、所望のヌクレオチド配列は、当業者に公知な分子生物学の方法に従って、適切なプラスミドにクローン化され得る。この方法では、結果となる切断部位で短い一本鎖（塩基）転位を有する短い合成ＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いるか、あるいは、化学合成により調製された遺伝子を用いる（Maniatisら、supra 参照）。そして、ＤＮＡ分子は、プラスミド内で、１コピーまたは多コピー存在し得、制限酵素消化により、プラスミドから切断される。
【００４８】
本発明の範囲内において、上述の、ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の改変は、単独で、または互いに組み合わせて、起こり得る。そして、１つ以上の改変は、上述したＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の複合体化と組み合わせ得る。
【００４９】
本発明の目的は、宿主生物内のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させることである。本発明の範囲内では、宿主生物は、生物内へ細胞または組織のＲＮＡが移送され得、それに続いてＲＮＡが翻訳される任意の生物であると理解される。本発明の範囲において、宿主生物は、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サルおよびヒトからなる群より選ばれる哺乳類であることが好ましく、特にヒトである。
【００５０】
本発明では、ルシフェラーゼをコードするＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）が本発明の（乳酸塩を有する、もしくは乳酸塩を有さない）ＲＬ注入緩衝液に希釈されており、このＲＮＡが、ＲＮＡ用に従来用いられる（ＨＢＳまたはＰＢＳといった）標準緩衝液で希釈したｍＲＮＡよりも翻訳率が有位に高くなっていることが示されている（図１参照）。さらに、注入されたｍＲＮＡの移送及び翻訳の効率が、高い度合いで、カルシウムイオンの存在に依存していることが示されている。これに対応して、（乳酸塩を有するか、もしくは乳酸塩を有する）ＲＬ注入緩衝液中のカルシウムイオンの有無でおこなった対照試験では、カルシウム非存在下では、ＲＮＡ移送効率が、標準緩衝液ＰＢＳ及びＨＢＳのものに匹敵するレベルに顕著に減少することがわかった（図２参照）。
【００５１】
よって、第１に、本発明の、（乳酸塩を有するか、もしくは乳酸塩を有する）ＲＬ注入緩衝液は、ＲＮＡ移送を顕著に増加させること、第２に、この向上したＲＮＡ移送は、さらに他の因子、カルシウム濃度が１００ｍＭまで高くなった、本発明の（乳酸塩を有するか、もしくは乳酸塩を有する）ＲＬ注入緩衝液により増加することがわかった。
【００５２】
好ましくは、本発明の注入緩衝液は、ＲＮＡ注入溶液中のＲＮＡと組み合わせて、用いられる。よって、本発明は、さらに、ＲＮＡ、及び注入緩衝液を含有する、宿主生物内／内部のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させるためのＲＮＡ注入溶液を提供する。この注入緩衝液は、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも０．０１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２ ）、及び必要に応じて少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有する。好ましくは、本発明のＲＮＡ注入溶液は、上記注入緩衝液が、５０ｍＭから８００ｍＭまで、好ましくは６０ｍＭから５００ｍＭまで、より好ましくは７０ｍＭから２５０ｍＭまで、さらに好ましくは６０ｍＭから１１０ｍＭまでの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、０．０１ｍＭから１００ｍＭまで、好ましくは０．５ｍＭから８０ｍＭまで、より好ましくは１．５ｍＭから４０ｍＭまでの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２ ）、及び、必要に応じて、３ｍＭから５００ｍＭまで、好ましくは４ｍＭから３００ｍＭまで、より好ましくは５ｍＭから２００ｍＭまでの塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有する。
【００５３】
本発明のＲＮＡ注入溶液の注入緩衝液は、さらに乳酸塩を含有することが好ましい。本発明のＲＮＡ注入溶液の注入緩衝液は、好ましくは、１５ｍＭの乳酸塩を含有する。好ましくは、本発明のＲＮＡ注入溶液は、上記注入緩衝液が、１５ｍＭから５００ｍＭまで、好ましくは１５ｍＭから２００ｍＭまで、より好ましくは１５ｍＭから１００ｍＭまでの乳酸塩を含有する。
【００５４】
ＲＮＡ注入溶液は、従来技術からの任意の処理にしたがって、調製され得る。好ましくは、ＲＮＡは、ＲＬ注入緩衝液、または乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液に希釈され得る。また、ＲＮＡは、乾燥（例えば凍結乾燥）ＲＮＡの形態で用いられ得る。ＲＬ注入緩衝液、または乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液は、このＲＮＡに添加され得る。そして、必要に応じて、希釈を促進するために、温度上昇、攪拌、超音波処理等を行う。濃度比は、特定の条件（例えば、ＲＮＡ注入溶液が注入される宿主生物（特に、哺乳類）、宿主生物の健康状態、宿主生物の年齢など）に依存して選ばれる。
【００５５】
本発明のＲＮＡ注入溶液のＲＮＡは、上で既に定義したように、好ましくは、むき出しのＲＮＡ、より好ましくはｍＲＮＡ、好ましくは、むき出しのｍＲＮＡである。
【００５６】
説明したように、本発明のＲＮＡ注入溶液は、特に、宿主生物内／内部のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させるために、用いられ得る。
【００５７】
したがって、本発明は、さらに、宿主生物内／内部のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させるための、上述したＲＮＡ注入溶液の利用を提供する。
【００５８】
（乳酸塩を有するか、もしくは乳酸塩を有する）ＲＬ注入緩衝液中の、移送されるＲＮＡの（特に臨床応用のための量及び持続時間に関する）量が調査されてきた。この調査では、マウスにおいて、（１００μｌの注入容量で）ｍＲＮＡの量が０．１μｇ増加する、ヒトにおいては、（１５０μｌの注入容量で）ｍＲＮＡの量が３μｇ増加するとき、ルシフェラーゼの発現の増加が見られる。ｍＲＮＡの翻訳は、一過的に起き、その結果、持続的に、外来分子（タンパク）の発現が一様になるように制御される。繰り返し注入は、発現する外来分子、意図的な作用、生物の（健康）状態と同様に、注入を受ける生物、などといった種々の因子に依存しており、２日毎または毎日を除いて、約３日毎に行われるべきである。同様に、ＲＮＡの量は、特に上述した種々の因子に依存的であり、１００μｌの注入容量で、０．０１μｇから１０００μｇまで、好ましくは１μｇから８００μｇまで、より好ましくは２μｇから５００μｇまで、さらに好ましくは５μｇから１００μｇまで、さらに好ましくは１０μｇから９０μｇまで、さらに好ましくは２０μｇから２０μｇまでであり得る。ＲＮＡの量は、１００μｌの注入容量で６０μｇであることが特に好ましい。
【００５９】
本発明によれば、ＲＮＡと、ＲＬ注入緩衝液または乳酸塩を有するＲＬ注入緩衝液と、本発明のＲＮＡ注入溶液との両方の利用は、例えば、癌もしくは腫瘍という疾患、アレルギー、自己免疫疾患（多発性硬化症など）、または、ウィルスおよび／もしくは細菌感染の、治療および／もしくは予防、ならびに、治療及び／または予防のための薬剤調製における利用である。上記癌もしくは腫瘍は、例えば、メラノーマ（悪性メラノーマ、皮膚メラノーマなど）、上皮性悪性腫瘍（大腸癌、肺癌（小細胞肺癌など）、腺癌、前立腺癌、食道癌、乳癌、腎癌など）、非上皮性悪性腫瘍、骨髄腫、白血病（特にＡＭＬ（急性骨髄性白血病））、神経膠腫、リンパ腫、および、芽細胞腫である。
【００６０】
例えば、本発明は、特に、上述の疾患を予防する遺伝子治療および／またはワクチン接種（例えば抗ウィルス性または抗腫瘍性ワクチン接種）のための、ＲＮＡと、ＲＬ注入緩衝液または乳酸塩を有するＲＬ注入緩衝液と、ＲＮＡ注入溶液との両方の利用を包含する。
【００６１】
本発明の範囲内において、遺伝子治療は、特に、疾患のある細胞へ機能遺伝子を導入することによる体または細胞における欠如した機能の回復、または、対応する遺伝情報による悪化した機能の阻害を意味する。例えば、癌抑制遺伝子の場合、例えばｐ５３は、欠如しているか、もしくは、少量だけ発現している。これは、ｍＲＮＡの、またはＤＮＡに挿入された形態で、細胞に導入され得る。そして、元々発現に欠陥があったタンパクが、生理的に関連する量に、再び産生され得る。本発明の範囲内において、癌抑制遺伝子として、例えば、ｐ５３，ＴＰ５３，ＲＢ１，ＡＰＣ，ＷＴ１，ＮＦ１，ＮＦ２，ＶＨＬ，ＢＲＣＡ１，ＢＲＣＡ２，ＤＣＣ，ＭＥＮ１，ＭＥＮ２， ＰＴＣＨ，ｐ５７／ＫＩＰ２，ＭＳＨ２，ＭＬＨ１，ＦＭＳ１，ＦＭＳ２，ＭＥＴ，ｐ１６／ＩＮＫ４ａ／ＣＤＫＮ２，ＣＤＫ４，ＲＥＴ，ＥＸＴ１，ＥＸＴ２，ＥＸＴ３，ＰＴＥＮ／ＭＭＡＣ１，ＡＴＭ，ＢＬＭ，ＸＰＢ，ＸＰＤ，ＸＰＡ，ＸＰＧ，ＦＡＣＣ，ＦＡＣＡ，ＳＭＡＤ４／ＤＰＣ４，ｐ１４Ａｒｔ（ｐ１９Ａｒｔ），ＤＰＣ４，Ｅ−ＣＡＤ，ＬＫＢ１／ＳＴＫ１，ＴＳＣ２，ＰＭＳ１，ＰＭＳ２，ＭＳＨ６，ＩＩＲ型ＴＧＦ-β，ＢＡＸ，α−ＣＡＴ，ＭＡＤＲ２／ＳＭＡＤ２，ＣＤＸ２，ＭＫＫ４，ＰＰ２Ｒ１Ｂ，ＭＣＣ，等が挙げられる。
【００６２】
本発明の範囲内において、ワクチン接種は、ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の形態の遺伝情報の、生物（特に生物の１またはいくつかの細胞、あるいは、組織）への導入を意味する。そのようにして投与されるｍＲＮＡは、生物内において標的分子（例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質）へと翻訳される。すなわち、ｍＲＮＡによってコードされる標的分子が発現し、免疫反応を引き起こす。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、免疫反応が引き起こされている間、欠かすことのできない役割を担う。なぜなら、抗原提示細胞は、活性化しているときに、抗原特異的免疫細胞の増殖の開始に必要な全てのシグナルを引き起こす唯一の細胞種であるからである。本発明の範囲内において、ワクチン接種を、例えば抗原をコードするＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を用いることによって実施することができる。上記抗原は、腫瘍に対するワクチン接種の場合に腫瘍抗原であり、外来の病原体に対するワクチンの場合に外来の病原体である。本発明における腫瘍抗原としては、例えばＴ細胞に認識される腫瘍抗原が挙げられ、例えば「癌／精巣」抗原（ＭＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＮＹ‐ＥＳＯ‐１など）、分化抗原（ＭＡＲＴ‐１／Ｍｅｌａｎ‐Ａ、チロシナーゼ、ｇｐ１００、ＰＳＡ、ＣＤ２０など）、突然変異遺伝子の抗原エピトープ（ＣＤＫ４、カスパーゼ‐８など）、または、腫瘍胎児抗原（ＣＥＡ、ＡＦなど）などである。他の腫瘍抗原としては、例えば、Ｔ細胞リンパ腫ならびにＢ細胞リンパ腫に存在する腫瘍抗原のＣＤ５およびＣＡＭＰＡＴＨ‐１（ＣＤｗ５２）、非ホジキンＢ細胞リンパ腫に存在するＣＤ２０、固形腫瘍、特に上皮腫瘍（乳房、腸、および肺）に存在する腫瘍抗原のＣＥＡ（癌胎児抗原）、ムチン、ＣＡ‐１２５およびＦＡＰ‐ａ、膠芽腫において付加的に存在するテネイシンおよびメタロプロテアーゼが挙げられる。さらに、腫瘍抗原としては、例えば、肺、乳房、頭、および、首、ならびに、Ｔ細胞腫瘍およびＢ細胞腫瘍に存在する腫瘍抗原のＥＧＦ（上皮細胞成長因子）、ｐ１８５ＨＥＲ２ならびにＩＬ‐２受容体、または、腫瘍抗原のＳＶ４０などが挙げられる。
【００６３】
上記のような抗原を複数コードするＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）も用いることが可能である。その結果、特定の腫瘍に特異的な異なる抗原を組み合わせることにより、作用の範囲が極めて広くなるので、メラノーマ、上皮性悪性腫瘍、ＡＭＬ、または、神経膠腫を効果的に制御することができる。本発明のＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、免疫原性タンパク質をさらにコードしてもよい。そのような免疫原性タンパク質は、免疫反応の再活性化を仲介することができる。そのような再活性化は、ほとんど全ての生物が特定の外来分子（例えばタンパク質、特にウィルスタンパク質）の抗原に対する、いわゆる「記憶免疫反応」を有するというの知見に基づく。このことは、生物がそのような外来分子により早い時期に既に感染し、この感染によってその外来分子（例えばウィスルタンパク質）に対する免疫反応がすでに引き起こされ、この免疫反応が「記憶」の中に留まることを、換言すれば貯蔵されることを意味する。生物が同じ外来分子に再び感染したとき、免疫反応が再活性化される。本発明によれば、免疫反応のそのような再活性化を、少なくとも１つの免疫原性タンパク質をコードする領域を少なくとも１つ含むＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）を有するワクチン接種によってもたらすことができる。ＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）は、１以上の抗原と１以上の免疫原性タンパク質とを両方コードすることが好ましい。
【００６４】
本発明の範囲内において、免疫原性タンパク質は、ウィルスの構造タンパク質（特にマトリックスタンパク質、キャプシドタンパク質、および、脂質膜の表面タンパク質）であることが好ましい。また、そのようなウィルスタンパク質としては、例えば、アデノウィルス、ライノウィルス、コロナウィルス、レトロウィルスのタンパク質が挙げられる。本発明において特に好ましいウィルスタンパク質は、Ｂ型肝炎ウィルス表面抗原（以下、「ＨＢＳ抗原」と称する。）、インフルエンザウィルスのマトリックスタンパク質（特に、インフルエンザウィルスのマトリックスタンパク質（Ｍ１））である。
【００６５】
また、本発明は、「インビトロ」の処理におけるＲＮＡのＲＮＡ移送および／またはＲＮＡ翻訳のための（例えば、遺伝子発現分析またはＨＴＳ（ハイ・スループット・スクリーニング）によるインビトロのスクリーニングのための）、ＲＮＡの、および、上述したＲＬ注入緩衝液または乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液の、あるいは、上述したＲＮＡ注入溶液の使用に関する。
【００６６】
また、本発明は、例えば、癌もしくは腫瘍という疾患、アレルギー、自己免疫疾患（多発性硬化症など）、または、ウィルスおよび／もしくは細菌感染の、治療および／もしくは予防のための、ならびに、上記疾患を予防する遺伝子治療および／またはワクチン接種（必要に応じて抗ウィルス性のワクチン接種）のための、宿主生物におけるＲＮＡのＲＮＡ移送および／またはＲＮＡ翻訳を増加する方法であって、上記方法は、本発明のＲＮＡ注入溶液を調製する工程（ａ）、および、上記工程（ａ）に由来するＲＮＡ注入溶液を宿主生物に投与する工程（ｂ）、を含み、上記癌もしくは腫瘍は、例えば、メラノーマ（悪性メラノーマ、皮膚メラノーマなど）、上皮性悪性腫瘍（大腸癌、肺癌（小細胞肺癌など）、腺癌、前立腺癌、食道癌、乳癌、腎癌など）、非上皮性悪性腫瘍、骨髄腫、白血病（特にＡＭＬ（急性骨髄性白血病））、神経膠腫、リンパ腫、および、芽細胞腫である、方法を提供する。
【００６７】
工程（ａ）に由来するＲＮＡ注入溶液を、上述したようにして、すなわち、先行技術に由来する任意の所望の処理に従って（好ましくはＲＬ注入緩衝液または乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液中にＲＮＡを希釈することによって）調製することができる。また、濃度比は上記条件（例えば、ＲＮＡ注入溶液が注入される宿主生物（特に、哺乳類）、宿主生物の健康状態、宿主生物の年齢など）に依存して選ばれる。ＲＮＡ注入溶液を、例えば注射器（例えば、Ｓｕｂ‐Ｑ、ベクトン・ディッキンソン、ハイデルベルグ、ドイツ）を用いて任意の適切な様式で投与することができる。この適切な様式としては、例えば、経皮内投与、上皮内投与、皮下投与、静脈内投与、血管内(intravasally)投与、動脈内投与、腹内投与、腹腔内投与、節内（intranodally、例えばリンパ節）投与などの様式を挙げることができる。
【００６８】
本発明の方法における宿主生物は、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サルおよびヒトからなる群より選ばれる哺乳類であることが好ましく、特にヒトである。
【００６９】
しかしながら、本発明にしたがって調製される注入溶液も、インビトロでのＲＮＡ（特にｍＲＮＡ）の細胞へのトランスフェクションに用いることができる。このインビトロでのトランスフェクションは、実験室において適切に使用することができるか、または、エキソビボでの遺伝子治療の一環として使用することができる。エキソビボでの遺伝子治療は、すなわち、患者からの細胞の除去、本発明における注入溶液に含まれるＲＮＡのエキソビボでのトランスフェクション、および、その後の患者への再移植である。トランスフェクションを、エレクトロポレーション処理を利用して実行することができる。このとき必要に応じて、パルス幅を１０μｓから２００μｓまでに設定して、電流密度を少なくとも２Ａｃｍ−２に設定して、２ｋＶｃｍ−１から１０ｋＶｃｍ−１まで以下の電界強度を有する電圧パルスを印加する。しかしながら、それがトランスフェクションに必要とされない場合、１ｍｓから１００ｍｓまでの範囲のより長いパルス時間を用いることができる。本発明の注入溶液が実験室での用途に用いられる場合、考えられる全ての実験室に存在する細胞株に、この様式でＲＮＡをトランスフェクションすることができる。エキソビボでの遺伝子治療では、多数の細胞種がトランスフェクションについて配慮される。そのような細胞種は、特に、ヒトの初代血液細胞、多分化能を有する前駆血液細胞、繊維芽細胞、神経細胞、内皮細胞、または筋肉細胞である。なお、このリストは例として挙げられたものであって、限定することを意図していない。
【００７０】
本出願に引用された全ての参考文献の全文は、本出願に組み込まれる。
【００７１】
以下の図面および実施例は、本発明をそれらに限定することなく、本発明の説明および図解に用いられる。
【００７２】
〔図面〕
図１から図５において示されている実験において、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属ｐｙｒａｌｉｓ種のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（図４の１００μｌのＰＢＳにおけるｐＤＮＡ）を含んでいる、それぞれの場合に示されている１００μｌの緩衝液（緩衝液の組成は、下記の（材料）の１．注入緩衝液の項に与えられている）が、ＢＡＬＢ／ｃマウス１３の耳介の中に皮内的に注入された。完全なマウスの耳のルシフェラーゼ活性が測定された。上記ルシフェラーゼ活性は、１００万分子のルシフェラーゼを単位として表されている。ルシフェラーゼ活性の検出限界は、この図表において、数値が振られた太線によって示されている。この図表の点のそれぞれは、単一の耳のルシフェラーゼの発現を示している。図に与えられている短い棒は、種々の群の平均値を表している。（マンホイットニー検定にしたがって）上記平均値同士の間に有為に差がある群に対してｐ値が与えられている。図１、２および５の実験において、上記耳は、注入後１５時間において取り出された。示されているこのデータは、各群に対して少なくとも３回の独立した実験から得た結果である。
【００７３】
図１は、ｍＲＮＡ用の異なる注入緩衝液：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）と、乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液（ＲＬ）と、の比較を示している。ｌａｃＺ  ｍＲＮＡは、陰性対照として用いられている。乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液に希釈されたｍＲＮＡは、ＨＢＳまたはＰＢＳに希釈されたｍＲＮＡよりも有為に高い（ｐ＜０．００１）ルシフェラーゼの発現が生じることが、本発明にしたがって示されている（図１Ａ）。
【００７４】
図２は、上記ｍＲＮＡの取り込み効率に対する、（カルシウムまたはカリウムの有無、および乳酸塩の有無の）上記ＲＬ注入緩衝液におけるカルシウム（‐ＣａＣｌ）、カリウム（‐ＫＣｌ）またはナトリウム乳酸塩（‐ＮａＬａ）の非存在の影響を示している。（カルシウムの有無の）ＲＬ注入緩衝液、または乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液との比較として、ＰＢＳとＨＢＳとの間の主な違いは、（ＨＢＳまたはＰＢＳにおける）乳酸塩およびカルシウムの非存在である。したがって、ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡの移入および翻訳が、一方において完全なＲＬ注入緩衝液（乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液）と、他方において、カルシウムのないまたはカリウムのない、あるいは乳酸塩のない、ＲＬ注入緩衝液の製剤形態とを用いて比較されるという研究が行われた。これらの研究は、乳酸塩の非存在が、完全なＲＬ注入緩衝液（乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液）を用いたルシフェラーゼの発現と同等の、ルシフェラーゼの発現を生じるということを示した。対照的に、ＲＬ注入緩衝液または乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液におけるカルシウムの非存在は、ＰＢＳおよびＨＢＳのＲＮＡの移入効率と同等の水準に対して、ＲＮＡの移入効率を有為に（ｐ＝０．００４）低下させた。
【００７５】
図３および４は、インビボにおけるｍＲＮＡの翻訳の動態を直接に示している。本発明に係る乳酸塩を含むＲＬにおけるＲＮＡ、およびＰＢＳの標準的な緩衝液におけるＤＮＡを用いた並行的な動態実験が行われ、かつ比較された。注入から１０日間後における、（乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液における）ｍＲＮＡの翻訳（図３）または（ＰＢＳにおける）ｐＤＮＡ（図４）が記録され、かつ図表に示されている。両方の試験手法（ＲＮＡまたはＤＮＡ）において、生きているマウスにおけるルシフェラーゼの活性が、記録された。代表的な耳の結果が示されている。乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液における（ルシフェラーゼをコードしている）ｍＲＮＡの注入後に検出されたルシフェラーゼの発現は、非常に早く（１７時間）最大値に達し、かつ９日後には検出不可能であった（図３）。これに対して、ＰＢＳにおける（ルシフェラーゼをコードしている）ｐＤＮＡの注入は、注入から３日後に最大値に達し、かつ９日間以上も残っているという、より遅いタンパク質の発現を生じた（図４）。これらは、本発明に係る乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液の効率性をふたたび確かめるだけでなく、ＲＮＡが、宿主の、特に動物の器官において一過性の遺伝子発現用の手段として、ＤＮＡよりもはるかに適しているという結果である。ＲＮＡは、一方においてより速やかに、かつ他方において一過性に発現される。つまり、これは、所望の遺伝子が、より速やかに、かつ限られた時間の間に、したがってより標的にされ、かつ特種化された方法によって、標的にされることを可能にする。これらの研究によれば、増大され、成功するＲＮＡの移入および移入に続く効率的な翻訳の両方を明確に示すことができる。
【００７６】
図５は、ルシフェラーゼ発現に対するｍＲＮＡの異なる量の効果を示している。これらの実験は、乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液において移入されるＲＮＡの用量を、特に臨床応用のために、量および持続時間について、より厳密に決定するために特に実施された。増量したＲＮＡが、複数のマウスに注入された。ｍＲＮＡの量を（１００μｌの注入量における）５μｇまで増加させたとき、ルシフェラーゼの発現における増加が検出された。５μｇ以上の投与量によって、ルシフェラーゼ発現のさらなる向上は生じなかった。対応するヒトにおける実験（図示せず）において、１２０μｇの量のｍＲＮＡが使用された。ｍＲＮＡの量は、２００μｇまで増やされ、発現が向上された。マウスにおける５μｇと比べて、ヒトにおけるｍＲＮＡの２００μｇという量は、特に、ヒトにおいて約４０倍大きい注入部位の大きさによるものであり得る。ヒトの実験は、研究の背景および予想される結果を説明し、同意が得られた後に、健康なボランティアに対して行われた。
【００７７】
時間の経過と上記投与量について、ｍＲＮＡの翻訳は、一過性に起こり（図３に示すように、ｍＲＮＡの翻訳は、１２時間後に最大値に達し、かつ９日後には検出されない）、結果として制御されている。このため、外来分子（タンパク質）の一様な翻訳を持続するには、（上記外来分子またはｍＲＮＡが注入される器官に依存して）およそ毎日、２日ごとにまたは３日ごとにおける繰り返しの注入が適当である。
【００７８】
図６は、ルシフェラーゼ活性に対するＣａＣｌ２ の影響を示している。このために、ＣａＣｌ２ のルシフェラーゼ溶解緩衝液溶液（最終濃度は、図面に与えられている）の連続希釈法が準備され、かつ同じく規定量の組換えルシフェラーゼタンパク質を試料のすべてに対して添加した（最終濃度は、約４．７ｐＭ）。この混合物の光の放射は、（ＡＴＰおよびルシフェリンの添加の後に）照度計を用いて試験された。それから、ルシフェラーゼ活性に対するＣａＣｌ２ 濃度の影響は、以下の式：
％相対的なルシフェラーゼ活性（ＲＬＡ）＝（規定のＣａＣｌ２ 濃度を有する試料のＲＬＡ−単なる溶解緩衝液のＲＬＡ）／（ＣａＣｌ２ を有していない試料のＲＬＡ−単なる溶解緩衝液のＲＬＡ）×１００％
にしたがって、計算された。比較的に高濃度のＣａ２＋イオンの存在は、ルシフェラーゼの酵素活性を増強することはなかった。
【００７９】
図７は、インビボにおけるｍＲＮＡの移入に対するＣａＣｌ２ の影響をふたたび示している。種々の濃度を有する、乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液が、同じ量の、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属ｐｙｒａｌｉｓ種のルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡ（２０μｇ）を有しているが、異なる浸透圧（オスモル）を有しているＲＮＡ注入溶液（１００μｌ）を準備するために使用された。上記ＲＮＡ注入溶液は、ＢＡＢＬ／ｃマウスの耳介に注入された。１５時間後に、上記マウスは犠牲にされ、かつ耳の溶解物が調整された。耳ごとに産生されたルシフェラーゼ分子の計算された総量、種々の群の平均値（数字つきの棒）、各群の大きさ（ｎ）および上記試験における検出限界（数字つきの太線）が、示されている。上記試験の結果として、インビボにおけるｍＲＮＡの、効率的な移入、およびゆえに続く効率的な翻訳は、１７０ｍＯｓｍの最小のイオン濃度を要求することがわかった。
【００８０】
図８Ａ〜Ｅは、インビボにおける供給されたｍＲＮＡを発現する細胞の特徴づけを示している。乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液１００μｌを含むＲＮＡ注入溶液の総量に希釈された、大腸菌β‐ガラクトシダーゼをコードする２０μｇのｍＲＮＡが注入された。注入から１４時間後に、マウスは犠牲にされ、マウスの耳が取り外され、かつ横断する凍結切片が調製された。図８Ａおよび８Ｃ〜Ｅに示された上記切片は、色によって特徴付けられている。
【００８１】
さらに、（乳酸塩を含むまたはなしの）ＲＬ注入緩衝液におけるＲＮＡの導かれた遺伝子発現が示されている。このために、（乳酸塩を含むまたはなしの）ＲＬ注入緩衝液において、移入された外因性のＲＮＡを取り込み、かつ翻訳するのがどの型の細胞であるのかが、明確にされた（実施例５、図８Ａ〜Ｅ、ならびに同じように図１１、１２、１６および１７を参照すればよい）。これにしたがって、本発明に係るｍＲＮＡに基づく種痘の範囲内において、免疫応答が、免疫系の明確な標的細胞において、（乳酸塩入りまたは無しの）ＲＬ注入緩衝液における外因性のＲＮＡの翻訳によって、どのように誘導されるのかが解析された。
【００８２】
図８Ａに示されている実験において、５つの個々の切片のそれぞれが、Ｘ‐ｇａｌを含んでいる溶液を用いて染色された。連続した２０μｍの厚さの凍結切片において、１０個以下のβ‐ガラクトシダーゼ陽性細胞が検出された。（矢印によって示されている）β‐ガラクトシダーゼ陽性細胞と呼んでいる発現の領域は、上記耳の長軸方向および矢状方向に１から２ｍｍの範囲に及び、耳筋の上皮と軟骨との間の狭い層に局在化されていた。
【００８３】
本発明によれば、ＡＰＣが、移入された上記ＲＮＡの直接的な取り込みおよび自己翻訳、あるいは他の細胞によって移入されたＲＮＡの翻訳産物の取り込みによる外因性の抗原を検出（“交差提示”と呼ばれる）する場所について、さらに調べられた。上記細胞の局在、上記細胞の形状および上記細胞のＭＨＣクラスＩＩ表現系が原因となって、上記注入部位において外因性のむき出しのｍＲＮＡを取り込み、かつ発現する細胞は、主に筋細胞および／または線維芽細胞であるということが推測された（図８Ａ）。この結果は、他の細胞によって移入された抗原の上述の“交差提示”と一致している。このような手法が、同様に、核酸ワクチンによってコードされたタンパク質に対する抗体の形成を説明することができるであろう。本発明によれば、このようにして、移入された上記ＲＮＡおよび上記ＡＰＣを取り込み、かつ発現する筋細胞または真皮細胞において、いわゆる“交差初回免疫”を介して結果的に起こる免疫応答の引き金が、これらの細胞によって活性化されるということの確認が、１度において可能になる。
【００８４】
図８Ｂにおける棒グラフは、連続する切片におけるβ‐ガラクトシダーゼ陽性細胞の数を示している。棒のそれぞれは、１つの切片を表している。
【００８５】
図８Ｃ〜８Ｅの実験において、５つの個々の切片のそれぞれが、より詳細には、ＭＨＣクラスＩＩ発現（Ａｌｅｘａ５４６免疫蛍光染色によって検出された緑）およびβ‐ガラクトシダーゼ発現（マジェンタガル染色によって検出されたすみれ色）が、染色された。左手の縦列における画像は、β‐ガラクトシダーゼ陽性細胞をすみれ色＝（深く）暗い領域に染色する、単独のマジェンタガル染色を示している。中央および右手の縦列において、マジェンタガル染色（中央および右手の縦列において所定の領域によって示されている）と単独のＭＨＣクラスＩＩ染色（オレンジ＝中央の縦列における明るい領域）（緑＝右手の縦列における明るい領域）との重ね合わせ。見れば分かるように、ほとんどのβ‐ガラクトシダーゼ陽性細胞は、ＭＨＣクラスＩＩ陰性細胞であることが、はっきりと現れている。
【００８６】
図９Ａ〜Ｂは、マウスおよびヒトにおけるむき出しのｍＲＮＡのインビボにおける移入を示している。ルシフェラーゼをコードしているｍＲＮＡが、調整され、かつＲＬ注入緩衝液を含んでいるＲＬ注入溶液に溶解された。検出限界は、この図において数字つきの太線によって示されている。
【００８７】
図９Ａに示されている実験において、２０μｇのｍＲＮＡを含んでいる１００μｌの総量が、マウスの上記耳筋に注入された。注入から１４時間後に、マウスは犠牲にされ、その耳の細胞が溶解され、かつその溶解物は、ルシフェラーゼ発現について調べられた。耳ごとのルシフェラーゼ分子の数が計算された（組換えルシフェラーゼが基準として用いられた）。このデータは、各群に対して、少なくとも３回の独立した実験によってもたらされている。
【００８８】
図９Ｂに示されている実験において、２００μｌの総量における同じＲＮＡ（１２０μｇ）が、ヒトの皮膚（ボランティアの足）に注入された。１６時間後に、２ｍｍの直径を有する生検材料が、局部麻酔条件下において、つまり、上記注入部位の中央（“ＲＮＡ”）から、および上記注入部位から離れて（“模擬”）取り出さ（打ち抜か）れた。ルシフェラーゼ活性は、上記注入部位の真ん中においてのみ、検出されてもよい。２つの独立した実験の内の１つが示されている。これらの結果によれば、インビボにおいて、ヒトの皮膚中に対するむき出しのｍＲＮＡの直接的な移入が、明らかにされた。したがって、本発明は、ヒトにおいて、ｍＲＮＡに基づく直接の種痘を効率的に行うことが可能である。
【００８９】
図１０Ａ〜Ｄは、乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液における注入された上記ｍＲＮＡの組み込みおよび移入能を示している。上記組み込みが、フォルムアルデヒドアガロースゲル（１．２％体積あたりの重量）電気泳動を用いて、試験された。このために、Ｐｈｏｔｉｎｕｓ属ｐｙｒａｌｉｓ種のルシフェラーゼ（ｌｕｃ、１．９ｋＢ、図９）または大腸菌β‐ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ、３．５ｋＢ、図１０Ｃ）のいずれかをコードする１μｇのｍＲＮＡが分離された。注入緩衝液（ストック溶液）のそれぞれへの希釈前、および注入緩衝液（ストック溶液）のそれぞれへの希釈後における（注入前の）ｍＲＮＡの組み込みにおいて、差は検出されなかった。これに対して、ＲＮＡ注入溶液の残余物が、注入シリンジから回収されたとき、（注入後の）上記ｍＲＮＡの可視的な完全な分解が、検出された。これらの残余物は、上記注入シリンジのマウスまたはヒトとの接触によって、リボヌクレアーゼによって明らかに汚染されている。
【００９０】
注入された上記ｍＲＮＡの移入能は、１０μｇのｍＲＮＡを用いたＢＨＫ２１細胞による電気穿孔法によって試験された。１０μｇの無関係なｍＲＮＡまたはｍＲＮＡがない（模擬）のいずれかを対照として用いられている。続いて、上記細胞は、溶解され、かつ照度計を用いて上記細胞のルシフェラーゼ活性が調べられた（図１０Ｂ）、またはＸ‐ｇａｌを用いて染色され、かつ光学顕微鏡を用いて上記細胞のルシフェラーゼ活性が調べられた（図１０Ｄ）。
【００９１】
図１１は、細胞レベルにおけるｍＲＮＡ移入の同定を示している。上記図面は、マウスを観察したものを示している。上記図面において、外側（背側）は、観察者にとって直接に見えている。乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液におけるｍＲＮＡは、マウスの上記耳筋に注入された。上記耳の連続する横断切片（１，２，３，４）が、用意された。上記切片は、種々の組（１，２，３，４）が集められ、風乾され、かつ種々の染色操作まで−２０℃に保存された。
【００９２】
図１２Ａ〜Ｃは、細胞レベルにおけるｍＲＮＡの移入を示している。乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液における、大腸菌のβ‐ガラクトシダーゼをコードしている５μｇのｍＲＮＡが、マウスの耳に注入された。注入から１５時間後に、上記耳がＴｉｓｓｕｅＴｅｋのＯ．Ｃ．Ｔ培地に埋め込まれて、６０μｍの厚さの凍結切片が調製された。上記切片は、Ｘ‐ｇａｌを用いて夜通し染色された。図１２Ａは、ｍＲＮＡ移入陰性の耳の凍結切片を示している。図１２Ｂは、全体図を示している。図１２Ｃは、ｍＲＮＡ移入陽性の耳の詳細な観察を示している。
【００９３】
図１３は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６のマジェンタガル陽性細胞の色との両立性を示している。マジェンタガル陽性細胞におけるＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６の検出が陽性であるか否かを決定するために、ＢＨＫ細胞が、ｅＧＦＰ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）のｍＲＮＡまたはｌａｃＺのｍＲＮＡの組み合わせを用いてトランスフェクトされた。トランスフェクト細胞は、以下の組み合わせ：
ｅＧＦＰのｍＲＮＡまたはｌａｃＺのｍＲＮＡのみを用いた単独トランスフェクション；
個々にトランスフェクトされた細胞（ｅＧＦＰ／ｌａｃＺ）の混合物；および
２重にトランスフェクトされた細胞（ｅＧＦＰ＋ｌａｃＺ）
が解析された。
【００９４】
上記細胞は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６検出を有する抗ｅＧＦＰを用いて染色され、つづいて、マジェンタガルを用いて染色された。（ｌａｃＺを発現している）陽性細胞を染色したマジェンタガルは、広視野の光学顕微鏡によって検出され（上列）、（ｅＧＦＰを発現している）陽性砂防を染色したＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６は、蛍光顕微鏡によって検出された（中列）。この２つの結果が、他方の細胞と比較した細胞の局在について正確な結果を得るために、重ね合わせられた（下列）が、上記図面におけるＡｌｅｘａ  ５４６のシグナルは、上記光学顕微鏡の画像を覆っている。上記ＡＰＣに供給されたｍＲＮＡの取り込み、および自己移入が、起こり、かつ免疫応答を引き起こすために十分であることは、除外し得ない。いくつかのＡＰＣにおいて、微かなまたは不完全な、検出不可能な移入が、起こっているかも知れず、かつ（不完全な移入の場合に）外因性の抗原のプロセシングおよび提示をもたらしているかもしれない。
【００９５】
図１４Ａ〜Ｂは、凍結切片のＭＨＣクラスＩＩ染色の特異性を示している。乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液の総量１００μｌにおける、大腸菌のβ‐ガラクトシダーゼをコードする２０μｇのｍＲＮＡが、注入された。注入から１４時間後に、上記マウスは、犠牲にされ、かつその耳が取り除かれた。横断する凍結切片が調製された。上記凍結切片が、まず、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体（図１４Ａ）、またはアイソタイプの対照抗体（図１４Ｂ）を用いて染色され、Ａｌｅｘａ  ５４６を用いて免疫蛍光染色によって検出された。それから、上記凍結切片は、（β‐ガラクトシダーゼ発現について）マジェンタガルを用いて染色された。上記図は、マジェンタガル染色（左手縦列）、ＭＨＣクラスＩＩ（中の縦列、ｌａｃＺ陽性細胞の位置が、輪郭によって示されている）および両方の染色の重ね合わせ（右手縦列、上記図において、ｌａｃＺ陽性細胞が輪郭によって示され、ＭＨＣクラスＩＩ陽性細胞が明るい領域に相当する）。
【００９６】
図１５は、Ｘ‐ｇａｌ色素およびＡＣＥ色素に陽性である細胞の両立性を示している。Ｘ‐ｇａｌの沈降物が、ＡＥＣ陽性細胞の検出と両立可能か否かを決定するために、ＢＨＫ細胞が、ｅＧＦＰのｍＲＮＡおよびｌａｃＺのｍＲＮＡを用いてコトランスフェクトされた。上記細胞が、ＡＣＥ（赤：ｅＧＦＰを発現している陽性細胞）、Ｘ‐ｇａｌ溶液（青緑：ｌａｃＺを発現している陽性細胞）、およびＡＣＥとＸ‐ｇａｌとの組み合わせとともに、抗ｅＧＦＰ抗体免疫染色を用いて染色された。染色された上記細胞が、広視野の光学顕微鏡によって解析された。２重陽性細胞は、黒（黒矢印）を呈している。個々の染色が強く、それゆえ黒を呈する傾向にあるとき、染色された個々の陽性の細胞を区別することが困難である。
【００９７】
図１６Ａ〜Ｂは、ＭＨＣクラスＩＩ陽性およびｍＲＮＡ移入陽性の細胞の共局在を示している。乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液の総量１００μｌにおけるβ‐ガラクトシダーゼをコードする２０μｇのｍＲＮＡが注入された。注入から１４時間後に、上記マウスが犠牲にされ、かつその耳が取り除かれた。横断する凍結切片が調製され、かつ、まず、抗ＭＨＣクラスＩＩ抗体（図１６Ａ＋Ｂ）またはこれに対応する対照抗体（図１６Ｃ）を用いて染色され（Ａｌｅｘａ  ５４６を用いて検出された）、それから、（β‐ガラクトシダーゼ発現について）Ｘ‐ｇａｌを用いて染色された。ｍＲＮＡの移入について陽性である細胞は青緑を呈し、ＭＨＣクラスＩＩについて陽性である細胞は赤を呈し、かつ２重に陽性の細胞は黒を呈する。ｍＲＮＡ陽性細胞は、ＭＨＣクラスＩＩの発現とは独立して、矢印によって示されている。
【００９８】
図１７は、ｍＲＮＡの移入および耳筋の形態を示している。乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液の総量１００μｌにおける、β‐ガラクトシダーゼをコードする２０μｇのｍＲＮＡが注入された。注入から１４時間に、上記マウスが犠牲にされ、かつその耳が取り除かれた。横断する凍結切片が調製され、かつ、まず、（β‐ガラクトシダーゼ発現について）Ｘ‐ｇａｌを用いて染色され、それから、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色された。ｍＲＮＡの移入について陽性である細胞は、矢印によって示され、柔細胞層の近くに局在化された。
【００９９】
〔実施例〕
‐材料‐
＜１．注入緩衝液＞
以下の緩衝液を用いた：
２×リン酸緩衝液（ＰＢＳ）
（ＰＢＳ＝２７４ｍＭの塩化ナトリウム、５．４ｍＭの塩化カリウム、２０ｍＭのリン酸水素２ナトリウム、４ｍＭのリン酸２水素カリウム、２０．８℃においてｐＨ７．３）
２×ＨＥＰＥＳ緩衝液（ＨＢＳ）
（ＨＢＳ＝３００ｍＭの塩化ナトリウム、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２０．８℃においてｐＨ７．３）
１×乳酸塩を含まないＲＬ注入緩衝液
（他の組成および濃度が示されていなかった場合、８２．２ｍＭの塩化ナトリウム、４．３ｍＭの塩化カリウム、１．４４ｍＭの塩化カルシウム）
１×乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液
（他の組成および濃度が示されていなかった場合、１０２．７ｍＭの塩化ナトリウム、５．４ｍＭの塩化カリウム、１．８ｍＭの塩化カルシウム、２０ｍＭの乳酸ナトリウム）
１×乳酸塩を含み、塩化ナトリウムを含まないＲＬ注入緩衝液
（他の組成および濃度が示されていなかった場合、４．３ｍＭの塩化カリウム、１．４４ｍＭの塩化カルシウム、２２．４ｍＭの乳酸ナトリウム）
１×乳酸塩を含み、塩化カリウムを含まないＲＬ注入緩衝液
（他の組成および濃度が示されていなかった場合、８２．２ｍＭの塩化ナトリウム、１．４４ｍＭの塩化カルシウム、２２．４ｍＭの乳酸ナトリウム）
１×乳酸塩を含み、塩化カルシウムを含まないＲＬ注入緩衝液
（他の組成および濃度が示されていなかった場合、８２．２ｍＭの塩化ナトリウム、４．３ｍＭの塩化カリウム、２２．４ｍＭの乳酸ナトリウム）。
【０１００】
２×ＰＢＳ、および、２×ＨＢＳを用いたとき、全ての成分を水に溶かして、ｐＨを調節した。それからジエチルピロカルボネートを（ＤＥＰＣ、シグマ、シュネルドルフ、ドイツ）、濃度が０．１％（ｖ／ｖ）になるように添加した。緩衝液を３７℃で１時間以上インキュベートして、それから緩衝液をオートクレーブした。
【０１０１】
１×乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液を、それ自身、４つの異なる塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、および、乳酸ナトリウム）の２０×保存液（ストック溶液）から調製した。同様に、１×注入緩衝液を、３つの異なる塩（塩化ナトリウム、塩化カリウム、および塩化カルシウム）の２０×保存液から調製した。さらに別の実施例では、塩化ナトリウム、塩化カリウム、または、塩化カルシウムを、より低くなった浸透圧を補整することなく、除いた。乳酸塩を含み、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、またはＣａＣｌ２ を含まないこれらのＲＬ注入緩衝液も、２０×保存液から調製した。乳酸ナトリウムのラセミ化合物溶液（フルカ（Ｆｌｕｋａ）、シュネルドルフ、ドイツ）を除く、これらの各成分を、２×ＰＢＳおよび２×ＨＢＳについて記載されているように、ＤＥＰＣを用いて処理してから、オートクレーブした。
【０１０２】
全ての緩衝液および緩衝液の成分のリボヌクレアーゼ活性を、１μｇのｍＲＮＡを１×緩衝液において３７℃で２時間以上インキュベートすることによって検査した。ホルムアルデヒド‐アガロースゲル電気泳動によるｍＲＮＡの分析において、分解が観察されなかった緩衝液を用いた。
【０１０３】
＜２．マウス＞
全ての動物実験を、制度的指針および大綱的指針にしたがって実施した。８〜１５週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスを、チャールス・リバー（スルズフェルド、ドイツ）から入手した。
【０１０４】
皮内に注入する前に、マウスを麻酔して、イソプロパノールを用いて耳の筋肉を処理した。ｍＲＮＡの取り込みと翻訳とを分析するために、特定期間の後、マウスを犠牲にして、耳を切除した。それから、煩わしい毛を除去するためにこの耳をカミソリの刃を用いて剃った。
【０１０５】
＜３．ヒト＞
健康な男性の志願者を用いて人体実験を実施した。この志願者は、この調査の背景および起こりうる結果の説明を受け、同意した。
【０１０６】
〔実施例１：核酸の調製〕
‐ｍＲＮＡ‐
「キャップされた」ｍＲＮＡを、インビトロでのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７‐オプチｍＲＮＡキット(T7-Opti mRNA kits) 、キュアバック(CureVac) 、テュービンゲン、ドイツ）を用いた「ラン‐オフ」転写により調製した。
【０１０７】
このｍＲＮＡ（受入番号（Ａｃｃ．）Ｕ０２４４５からクローン化された大腸菌のβ‐ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）、または、受入番号Ｕ４７２９５からクローン化されたホタル(Photinus pyralis) のルシフェラーゼ（ｌｕｃ）のどちらか）のコード配列を、その３’末端においてアルファ‐グロブリンの非翻訳領域および人工ポリＡ末端部に隣接させた。マウスの実験では、上記ｍＲＮＡをフェノール／クロロホルム／イソアミル・アルコールを用いて抽出して、塩化リチウムを用いて沈殿した。それから、ｍＲＮＡを水に再懸濁して、２６０ｎｍにおける分光分析によって収率を測定した。最後に、酢酸アンモニウムを用いてｍＲＮＡを沈殿して、水に滅菌状態で再懸濁した。
【０１０８】
‐ｐＤＮＡ‐
エンドトキシンフリーのｐＣＭＶ‐ｌｕｃＤＮＡを、エンドフリー・プラスミド・マキシ・キット（EndFree Plasmid Maxi Kit（キアゲン、ヒルデン、ドイツ））を用いて調製した。酢酸アンモニウムを用いてｐＤＮＡを沈殿して、最終的に、水に滅菌状態で再懸濁した。ｐＧＬ３（受入番号Ｕ４７２９５）のＸｂａＩ‐ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、ｐＣＭＶ‐ＨＢ‐Ｓ（受入番号Ａ４４１７１）のＮｓｉＩ‐ＨｉｎｄＩＩＩより消化されたプラスミドに挿入することによって、ｐＣＭＶ‐ｌｕｃプラスミドを改変した。なお、上記ＸｂａＩおよびＮｓｉＩの部位は、クレノー断片を用いて平滑末端化されていた。ｐＤＮＡのレポーター遺伝子は、ＣＭＶプロモーターの制御下であった。
【０１０９】
‐保存溶液‐
保存溶液を、滅菌水においてｍＲＮＡまたはＤＮＡを希釈することによって調製した。そして、２６０ｎｍ、２８０ｎｍ、および、３２０ｎｍにおける分光分析によって濃度と純度とを測定した。
【０１１０】
‐品質管理‐
全ての核酸試料では、分光分析によって濃度を測定し、ホルムアルデヒド‐アガロース電気泳動によりｍＲＮＡの品位を、または、制限消化およびＴＢＥ‐アガロース電気泳動によりＤＮＡの品位を検査した（図１０）。品位に加えて、全ての核酸試料の翻訳能力をＢＨＫ２１細胞の電気穿孔法により分析した。このために、１０μｇの核酸を含む２００μｌのＰＢＳが入った０．４ｃｍのキュベットにおいて、３００Ｖおよび１５０μＦで、１００〜３００万個の細胞を電気穿孔した。トランスフェクトされた細胞における、電気穿孔後の８〜２４時間のタンパク質発現を、適切な検出方法（Ｘ‐ｇａｌ染色または発光の検出）によって解析した（図１０）。インビボでの実験では、ＢＨＫ２１細胞においてタンパク質発現を示し、且つ、ゲル電気泳動において品位が適切である核酸試料だけが、注入された。
【０１１１】
〔実施例２：ＲＮＡ注入溶液の調製〕
ＨＢＳおよびＰＢＳでは、ｍＲＮＡを１×濃縮緩衝液に希釈した。乳酸塩を含有するか、または、含有しないＲＬ注入緩衝液、および、乳酸塩を含有するＲＬ注入緩衝液の（Ｃａ２＋、Ｋ＋、およびＮａ＋の１つが欠乏している）各変形物では、ｍＲＮＡを０．８×濃縮緩衝液に希釈した。なお、これらのＲＬ注入緩衝液の組成および濃度は、‐材料‐の＜１．注入緩衝液＞を参照のこと。別の方法が示されない限り、マウスの耳１つ当たりに、２０μｇのｍＲＮＡを含む１００μｌの注入緩衝液を用いた。ｍＲＮＡの２次構造を取り除くために、ＲＮＡ注入溶液を５分間８０℃で加熱した。それから、このＲＮＡ注入溶液をさらに５分間氷上に置いた。最後に、ＲＮＡ注入溶液をＳｕｂ‐Ｑ（ベクトン・ディッキンソン、ハイデルブルグ、ドイツ）注射器の中に吸引した。別々の注射器を、各注入に用いた。プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を１×濃縮ＰＢＳに希釈した。
【０１１２】
〔実施例３：エキソビボでのルシフェラーゼ活性の検出〕
エキソビボでのルシフェラーゼ活性を検出するために、組織の溶解物を調製した。このために、乳棒と乳鉢とを用いて液体窒素下において組織を粉砕して、残存する「塊」を８００μｌの溶解緩衝液中において均一化した。上記溶解緩衝液の組成は、２５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、１０％（ｗ／ｖ）のグリセリン、１％（ｗ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ‐１００、ならびに、添加されたての２ｍＭのＤＴＴおよび１ｍＭのＰＭＳＦである。小型遠心分離機にて４℃で１０分間、１３０００ｒｐｍで遠心することによって、ホモジュネートの上清を得た。この溶解物の１１０μｌのアリコートを−８０℃で保存した。
【０１１３】
ルシフェラーゼ活性を測定するために、アリコートを氷上にて解凍して、５０μｌの溶解物における光の放射を、ルミノメーター（ＬＢ９５０７、ベルトールド、バート・ヴィルトバート、ドイツ）を用いて１５秒間測定した。測定の前に、ルミノメーターによって、３００μｌの緩衝液Ａおよび１００μｌの緩衝液Ｂが溶解物に自動的に添加された。上記緩衝液Ａの組成は、２５ｍＭのグリシル・グリシン、１５ｍＭの硫酸マグネシウム、ならびに、添加されたての５ｍＭのＡＴＰであり、ｐＨは７．８である。上記緩衝液Ｂの組成は、水に溶けた２５０μＭのルシフェリンである。
【０１１４】
全ての測定において組み換えルシフェラーゼタンパク質の段階希釈を用いて、標準化を行った（QuantiLum （登録商標）、プロメガ、マディソン、米国）。この標準を用いて、ルシフェラーゼ分子の量を個々の測定について計算した。各溶解物に関するルシフェラーゼ活性を２つの異なる日に２回測定して、ルシフェラーゼ活性の平均値を計算した。ルシフェラーゼ分子の量に関する変動係数（ｎ＝４）は、検出限界を超えるルシフェラーゼ活性を有する全ての溶解物において１０％を下回った。この検出限界（全ての図に番号付きの太線で示される）を、溶解緩衝液のみ測定の平均値と当該平均値の標準偏差の３倍の値とを加えた値を用いて計算した（ｎ＝８０）。
【０１１５】
〔実施例４：インビボでの生物発光の検出〕
生きている動物におけるルシフェラーゼの注入物を検出するため、核酸注入後に特定の時間においてマウスを麻酔した。マウスを３つの異なる群に分割した。マウスの群Ｉでは、１００μｌのＲＬ注入溶液を左耳に注入して、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを２０μｇ含む１００μｌのＲＬ注入緩衝液を左耳に注入した。群ＩＩでは、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを２０μｇ含む１００μｌのＲＬ注入緩衝液を左耳および右耳のそれぞれに注入した。マウスの群ＩＩＩでは、１００μｌのＲＬ注入緩衝液を右耳に注入して、ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを２０μｇ含む１００μｌのＲＬ注入緩衝液を左耳に注入した。それから、フィルター滅菌された２０ｍｇ／ｍｌのルシフェリン（シンケム(Synchem) 、カッセル、ドイツ）のＰＢＳ（フィルター滅菌済み）を２００μｌ、マウスの腹腔内に注入した。ルシフェリンの注入から５分後に、マウスの光の放出を２０分間集めた。このために、マウスを暗い箱の中の予め３７℃に加熱されたプレートに配置した。なお、左側が群Ｉであり、中央が群ＩＩであり、右側が群ＩＩＩである。上記箱には、エクオリア・マクロイメージングカメラ（浜松、日本）が備えられていた。光の放出は擬似カラーイメージにて示され、このイメージに普通の光の下でのマウスのグレースケールイメージが重ね合わされた。ルシフェラーゼをコードするｍＲＮＡを２０μｇ含有する、（ｉ）乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液、または、（ｉｉ）乳酸塩を含み、塩化ナトリウムを含まないＲＬ注入緩衝液、（ｉｉｉ）乳酸塩を含み、塩化カリウムを含まないＲＬ緩衝液、および、（ｉｖ）乳酸塩を含み、塩化カルシウムを含まないＲＬ緩衝液、を用いて同じ実験を同じように行った。
【０１１６】
〔実施例５：β‐ガラクトシダーゼの活性、および、組織の微細構造〕
毛が剃られたマウスの耳を切り裂き、ティッシュ‐テック（Tissue-Tek（登録商標））Ｏ．Ｃ．Ｔ（登録商標）コンパウンド（サクラ社(Sakura)、ズーテルヴァウデ(Zoeterwuode) 、オランダ）を含む溶媒に包埋して、−８０℃で保存した。これらのブロックに由来する、２０の厚さ２０μｍの横断面の連続凍結切片を、スパーフロストプラス標本保持器（SperFrost （登録商標）plus specimen holder、ランゲンブリンク(Langenbrinck)、エメンディンゲン、ドイツ）に、１組のうちの２つの切片間の垂直距離が約１００μｍになるように５組配置した。それから、上記切片を空気乾燥して、染色するまで−２０℃で保存した。移送されたｍＲＮＡ（大腸菌のβ‐ガラクトシダーゼ）が取り込まれて、翻訳される領域を１次スクリーニングするために、Ｘ‐ｇａｌと一緒に１組の切片を染色した。このために、上記標本保持器を室温に曝して、ＩｍｍＥｄｇｅ（登録商標）ペン（ベクター(Vektor)、バーリンゲーム、米国）を用いて輪郭を描いた。それから２％ホルマリンを含むＰＢＳに１５分間浸すことにより、切片を固定した。ＰＢＳ中に標本保持器を２分間浸すことを３回繰り返して、標本保持器を洗浄した。その後、湿度室において、一晩３７℃で、Ｘ‐ｇａｌ染色溶液とインキュベートすることにより染色した。ここで、Ｘ‐ｇａｌ染色溶液の組成は、添加されたての１ｍｇ／ｍｌのＸ‐ｇａｌ、５ｍＭのフェリシアン化カリウム、５ｍＭのフェロシアン化カリウム、１ｍＭの塩化マグネシウム、１５ｍＭの塩化ナトリウム、６０ｍＭのリン酸１水素２ナトリウム、および、４０ｍＭのリン酸２水素ナトリウムである。上記標本保持器の２分間の洗浄を２回行い、ハイドロ‐マトリックス（Hydro-Matrix（登録商標）、マイクロ‐テック‐ラボ(Micro-Tech-Lab)、グラーツ、オーストリア、水で２倍に希釈）溶媒を用いて上記標本保持器を処理することによって、染色を終了させた。
【０１１７】
組織形態の情報を得るために、Ｘ‐ｇａｌ染色とヘマトキシリン‐エオシン染色とを組み合わせて、もう１つ別の組の切片を染色した。このために、Ｘ‐ｇａｌ染色の後に、ＰＢＳ中に切片を２分間浸すことを３回繰り返して、切片を洗浄した。さらに再蒸留水により５分間洗浄した。それからマイヤーズ・ヘイマラウム（Mayers haemalaum、メルク、ダルムシュタット、ドイツ）中に２秒間浸して、染色した。流水の水道水により１０分間染色を発達させた後に、０．１％のエオシンＹ（シグマ、シュネルドルフ、ドイツ）を含有する水に１０分間浸して、対染色を行った。再蒸留水により短時間洗浄することによって、染色を停止させた。その後、アルコール濃度を増加させて（８０％エタノール２分間、９５％エタノール２分間、１００％エタノール２分間、１００％キシレン５分間）脱水した。最終的に、ロチ‐ヒストキット（Roti（登録商標）-Histokitt、ロス(Roth)、カルルスルーエ、ドイツ）溶媒を用いて、乾燥した切片を処理した。
【０１１８】
ｍＲＮＡがトランスフェクトされた標的細胞が抗原提示細胞であるかどうかを決定するために、ＡＰＣによって発現されるＭＨＣのクラスＩＩの分子と、β‐ガラクトシダーゼの発現に関連するｍＲＮＡの移送との２重染色を行った。ＭＨＣのクラスＩＩの分子について、免疫組織化学的検出および免疫蛍光的検出の両方を行った。両方の検出のプロトコールにおいて、全３工程の間に、ＰＢＳ中に組織を２分間浸すことを３回繰り返して、組織を洗浄した。免疫組織化学的手法では、１％のホルマリン（フルカ）を含むＰＢＳに浸して、切片を固定した。それから、純粋なアセトン中で３０秒間インキュベーションすることによって、脂質を除去した。その後、直ちに４％のヤギの血液（ベクターラボラトリー(Vektor laboratories Inc.)、バーリンゲーム、カリフォルニア州）および５０μｇ／ｍｌのアビジンＤ（ベクターラボラトリー、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を含むＰＢＳに室温で３０分間浸すことにより、ブロッキングを行った。５０μｇ／ｍｌのビオチン（アプリケム(AppliChem) 、ダルムシュタット、ドイツ）に浸すことにより、残存するビオチン結合部位をブロックすると同時に、モノクローナル抗体２Ｇ９（ベクトン・ディッキンソン、ハイデルベルグ、ドイツ）に浸すか、または、適切なアイソタイプの対照抗体（ラットのＩｇＧ２ａ、Ｒ３５‐９５、ベクトン・ディッキンソン、ハイデルベルグ、ドイツ）に浸すことにより、ＭＨＣのクラスＩＩの分子の染色を行った。なお、各場合では、抗体を１μｇ／ｍｌにＰＢＳにより希釈した。その後、ビオチン化されたヤギ／抗ラットＩｇＧ（３μｇ／ｍｌ、ベクター(vector)）および２％のマウス血清（CCPro 、ノイシュタット、ドイツ）を含むＰＢＳ中で、３０分間室温で切片をインキュベートした。それから、ＡＢＣ複合体（ＰＢＳ中において、試薬Ａと試薬Ｂとの比が１：１００である。ベクターラボラトリー、バーリンゲーム、カリフォルニア州）を室温で３０分間添加した。新しく調製したばかりの３‐アミノ‐９‐エチルカルバゾール（ＡＥＣ、シグマ）基質溶液を用いて検出することによって、ＭＨＣのクラスＩＩの分子の染色を達成した。なお、ＡＥＣ基質溶液の組成は、０．５ｍｇ／ｍｌのＡＥＣ、０．０１５％の過酸化水素、５０ｍＭの酢酸ナトリムであり、ｐＨは５．５である。また、上記ＡＥＣ基質溶液は、０．４５μｍのフィルターを通してろ過された。その後、水に５分間浸すことを２回繰り返し、さらに、ＰＢＳに５分間浸すことを３回繰り返して、洗浄した。これらの洗浄により、基質反応を停止させた。それから、上述したようなＸ‐ｇａｌ染色を行った。
【０１１９】
同様の染色のプロトコールを用いて、免疫蛍光的検出を行った。アセトン工程の後に、ブロッキング緩衝液（１％のウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ）中に室温で５０分間切片を浸して、切片をブロックした。その後、ブロッキング緩衝液を用いて１μｇ／ｍｌに希釈された１次抗体（２Ｇ９またはアイソタイプの対照抗体）に切片を浸して、４０分間インキュベートした。それから、ブロッキング緩衝液を用いて希釈されたアレクサ・フルオロ・５４６ヤギ／抗ラットＩｇＧ（１：４００、モルキュラー・プローブ(Molecular Probes)、ライデン、オランダ）に切片を浸して、室温で４０分間インキュベートした。最終的に、マゼンタ‐ｇａｌ染色を行った。このため、染色溶液中のＸ‐ｇａｌを０．１ｍｇ／ｍｌのマゼンタ‐ｇａｌ（ペクラボ(Peqlab)、エアランゲン、ドイツ）に変更した。
【０１２０】
アキシオカム(Axiocam) ＨＲｃカメラおよびアキシオビジョン(Axiovision)４．０ソフトウェアを備える、ツァィス（オーバーコッヘン、ドイツ）アキシオプラン(Zeiss Axioplan)２顕微鏡を用いて切片を分析した。写真の色およびコントラストを、直線的に調整した。
【０１２１】
〔実施例６：ヒトにおけるＲＮＡの移送および翻訳〕
健康な男性の志願者により、この実験が実施された。注入部位の毛を剃り、殺菌を行い、ＲｎａｓｅＺａｐ（アンビオン、オースチン、米国）溶液を用いて処理した。それから、１２０μｇのｍＲＮＡを含む０．８×ＲＬ注入緩衝液を、１バッチにおいて全容積の２００μｌで、注入した。さらに同様のバッチにおいて、ＲＬ注入緩衝液に替わって、（ｉ）乳酸塩を含み、塩化ナトリウムを含まないＲＬ注入緩衝液、（ｉｉ）乳酸塩を含み、塩化カリウムを含まないＲＬ注入緩衝液、および、（ｉｉｉ）乳酸塩を含み、塩化カルシウムを含まないＲＬ注入緩衝液を用いた。
【０１２２】
注入から１５時間後、直径４ｍｍの検査用生体組織を局所麻酔下において摘出（打ち抜いた）した。この検査用生体組織を液体窒素下においてショックフリーズして、実施例３のようにして調製した。磨り潰された検査用生体組織を、６００μｌの溶解緩衝液に再懸濁した。
【０１２３】
‐統計的評価‐
２つの異なる群の平均値を、いわゆる「ノンパラメトリックなマンホイットニーの順位和検定」により比較した。０．０５よりも小さいｐ値は、有意差としてみなされ、図に示されている。
【０１２４】
〔実施例７：実施された様々な染色処理に対するコメント〕
細胞種に特異的な染色と、ｍＲＮＡの移送の検出とを同時に可能にする組織学的な処理を用いて、インビボにおいてｍＲＮＡを取り込み、且つ、発現する細胞種を同定した。
【０１２５】
ｍＲＮＡの移送を、蛍光プローブを用いて検出することができなかったので、大腸菌のβ‐ガラクトシダーゼをコードするｍＲＮＡが、様々な藍色の染料（Ｘ‐ｇａｌまたはマゼンタ‐ｇａｌ）と組み合わせて用いられる、処理が実施された。
【０１２６】
‐１．β‐ガラクトシダーゼ検出システムの特殊機能‐
マウスの耳の薄い切片を調製して、全ての細胞が藍色染色処理において単一層に存在していることを確かめた。（ｉ）マウスの耳の筋肉の形態（約０．５ｍｍ〜約１ｍｍの厚みの薄層）、（ｉｉ）凍結切片のみを用いることができること（パラフィン切片の調製に必須であるいくつかの工程の間にβ‐ガラクトシダーゼは、加熱により不活性化される）、および、（ｉｉｉ）切片とできるだけ多くの高品質なサブ切片とが必要とされることに注意すると、これらの切片の調製は、非常に困難であることが判明した。それにもかかわらず、２０μｍの厚みを有する良質のいくつかの組の切片を、調製することができた。２つの異なる染料を用いてβ‐ガラクトシダーゼの活性を検出した。陽性細胞が青緑に染色されるＸ‐ｇａｌの方が、陽性細胞が紫に染色されるマゼンタ‐ｇａｌよりも良好なコントラストを示す結果になった。しかしながら、これと同時に、（例えば毛包によって引き起こされる）バックグラウンドの非特異的な染色が、Ｘ‐ｇａｌ染色では非常に目立った。それでもなお、ｍＲＮＡの移送の明確な区別が可能であった。マゼンタ‐ｇａｌ染色では、バックグラウンドの非特異的な染色は、目立たなかった。
【０１２７】
‐２．組み合わされた藍色染色および免疫染色における必要事項‐
ｍＲＮＡの移送の染色（藍色染料）と細胞特異的なマーカーの染色（特異的抗体）の組み合わせは、固定剤および組み合わされた染色の手順（藍色染色は３７℃で１４時間のインキュベートを含む）に関するいくつかの適応を要求する。第１にアセトンを用いて固定を行い、その後抗体染色を行った場合に、ＭＨＣＩＩ分子に対する抗体染色の最良の結果が得られた。これに反して、第１にホルムアルデヒドとグルタルジアルデヒドとの混合物を用いて固定を行い、その後藍色染色を行った場合に、β‐ガラクトシダーゼの活性に対する最良の結果が得られた。これらの様々な事情を考慮して、次の処理を選択した。すなわち、グルタルジアルデヒドを用いずに、ホルムアルデヒドを用いて固定を行い、抗体染色を行った。グルタルアルデヒドにより組織の自己蛍光が劇的に増加するので、グルタルアルデヒドが、藍色染色の質に対して僅かな効果をもしも有しているときは、グルタルアルデヒドを除外する必要があった。次のいくつかの理由から、ホルムアルデヒドを用いる固定を用いた：
１．アセトンを用いた固定よりも、組織の形態がより良好に保護される、
２．メリハリがあり、且つ、強い藍色染色には、ホルムアルデヒドを用いる固定が要求される、そして、
３．それにもかからわらず、抗ＭＨＣＩＩ抗体の染色の質は、ホルムアルデヒドを用いても許容できる。
【０１２８】
その後、純粋なアセトン中で短時間インキュベートすることにより、脂質および脂肪を除去した。これにより、水溶性の溶媒を用いて、（泡が少ないか、または、ない）良好な品質を実現することができる。最後に、抗体染色が第１に実施されたときに、良質の抗体染色が唯一達成される。ホルムアルデヒドを用いる固定の染色手順は、藍色染色の質に対して僅かな影響だけを有していた。
【０１２９】
‐３．組み合わされた藍色染色および免疫染色における染料の適合性‐
２つの異なる染色の組み合わせには、２つのプロトコールの様々な工程の適合性だけでなく、検出に用いられるプローブの適合性も要求される。原理上は、免疫染色に沈殿性の染料（酵素プローブ）、または、蛍光染料（標識されたプローブ）を用いることが可能である。藍色染色と沈殿性の染料とを組み合わせるために、Ｘ‐ｇａｌとＡＥＣとを用いた。そのような染色では、２重に陽性を示す細胞は、黒色にみえた（図１５  ８）。これでは、個々の陽性細胞を強度によって区別することは困難である。そのため、蛍光染料のアレクサ・フルオロ(Alexa Fluor) ５４６とマゼンタ‐ｇａｌとの組み合わせが好ましい。次の２つの理由から、Ｘ‐ｇａｌに替えてマゼンタ‐ｇａｌを用いることが好ましい：
１．（染料が飽和量で添加されたときであっても）マゼンタ‐ｇａｌの染色強度は非常に弱かった、
２．マゼンタ‐ｇａｌの陽性細胞の色は、アレクサ・フルオロ５４６の蛍光染料の発光波長とより良好に調和した。
【０１３０】
この２つの要因より、アレクサ・フルオロ５４６の蛍光シグナルの消光が、最小になる。この染料の組み合わせにより、少なくとも藍色染色があまりに強くなかったときに、両方のシグナルを実際に検出することができた（図１３）。このことは、切片におけるｍＲＮＡの移送の陽性細胞に関する場合であった。
【０１３１】
〔参考文献の一覧表〕
１．Ulmer J. B., Curr. Opin. Drug Discov. Devel., 2001, 4:192-197
２．J. A. Wolffら, Science 247, 1465-1468 (1990).
３．H. L. Robinson, L. A. Hunt, R. G. Webster, Vaccine 11, 957-960 (1993).
４．J. B. Ulmerら, Science 259, 1745-1749 (1993).
５．J. A. Wolffら, Science 247, 1465-1468 (1990).
６．D. Boczkowski, S. K. Nair, D. Snyder, E. Gilboa, J.Exp.Med 184, 465-472 (1996).
７．J. P. Carralotら, Cell Mol. Life Sci. (2004).
８．R. M. Conryら, Cancer Res. 55, 1397-1400 (1995).
９．R. D. Granstein, W. Ding, H. Ozawa, J Invest Dermatol 114, 632-636 (2000).
１０．I. Hoerr, R. Obst, H. G. Rammensee, G. Jung, Eur. J Immunol. 30, 1-7 (2000).
１１．J. Donnelly, K. Berry, J. B. Ulmer, Int J Parasitol. 33, 457-467 (2003).
１２．D. M. Klinmanら, Springer Semin. lmmunopathol. 19, 245-256 (1997).
１３．P. Forg, P. von Hoegen, W. Dalemans, V. Schirrmacher, Gene Ther. 5, 789-797 (1998).
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
【図１】ｍＲＮＡ用の異なる注入緩衝液：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）と、ＨＥＰＥＳ緩衝生理食塩水（ＨＢＳ）と、乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液（ＲＬ）と、の比較を示している。
【図２】上記ｍＲＮＡの取り込み効率に対する、（カルシウムまたはカリウムの有無、および乳酸塩の有無の）上記ＲＬ注入緩衝液におけるカルシウム（‐ＣａＣｌ２ ）、カリウム（‐ＫＣｌ）またはナトリウム乳酸塩（‐ＮａＬａ）の非存在の影響を示している。
【図３】インビボにおけるｍＲＮＡの翻訳の動態を直接に示している。本発明に係る乳酸塩を含むＲＬにおけるＲＮＡ、およびＰＢＳの標準的な緩衝液におけるＤＮＡを用いた並行的な動態実験が行われ、かつ比較された。注入から１０日間後における、（乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液における）ｍＲＮＡの翻訳が記録され、かつ図表に示されている。
【図４】インビボにおけるｍＲＮＡの翻訳の動態を直接に示している。本発明に係る乳酸塩を含むＲＬにおけるＲＮＡ、およびＰＢＳの標準的な緩衝液におけるＤＮＡを用いた並行的な動態実験が行われ、かつ比較された。注入から１０日間後における、（ＰＢＳにおける）ｐＤＮＡが記録され、かつ図表に示されている。
【図５】ルシフェラーゼ発現に対するｍＲＮＡの異なる量の効果を示している。
【図６】ルシフェラーゼ活性に対するＣａＣｌ２ の影響を示している。
【図７】インビボにおけるｍＲＮＡの移入に対するＣａＣｌ２ の影響をふたたび示している。
【図８】Ａ〜Ｅは、インビボにおける供給されたｍＲＮＡを発現する細胞の特徴づけを示している。
【図９Ａ】マウスおよびヒトにおけるむき出しのｍＲＮＡのインビボにおける移入を示している。
【図９Ｂ】マウスおよびヒトにおけるむき出しのｍＲＮＡのインビボにおける移入を示している。
【図１０】Ａ〜Ｄは、乳酸塩を含むＲＬ注入緩衝液における注入された上記ｍＲＮＡの組み込みおよび移入能を示している。
【図１１】細胞レベルにおけるｍＲＮＡ移入の同定を示している。
【図１２】Ａ〜Ｃは、細胞レベルにおけるｍＲＮＡの移入を示している。
【図１３】Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６のマジェンタガル陽性細胞の色との両立性を示している。
【図１４】Ａ〜Ｂは、凍結切片のＭＨＣクラスＩＩ染色の特異性を示している。
【図１５】Ｘ‐ｇａｌ色素およびＡＣＥ色素に陽性である細胞の両立性を示している。
【図１６】Ａ〜Ｂは、ＭＨＣクラスＩＩ陽性およびｍＲＮＡ移入陽性の細胞の共局在を示している。
【図１７】ｍＲＮＡの移入および耳筋の形態を示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１１】
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【図１６】
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【図１７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年4月5日(2007.4.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主生物内／内部のＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させるためにＲＮＡ注入溶液を調製する際の、ｍＲＮＡ、及び水性の注入緩衝液の利用であって、
注入緩衝液は、ナトリウム塩、カルシウム塩、及び必要に応じてカリウム塩を含有し、リンゲル‐乳酸塩‐溶液ではない、利用。
【請求項２】
請求項１に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、塩化物、ヨウ化物、臭化物、水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩、硫酸塩を含む群から選択される陰イオンを有する塩を含有し、特に、塩として、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２ 、及び必要に応じてＫＣｌを含有する、利用。
【請求項３】
請求項２に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、少なくとも５０ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、少なくとも０．０１ｍＭの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２ ）、及び必要に応じて少なくとも３ｍＭの塩化カリウム（ＫＣｌ）を含有する、利用。
【請求項４】
請求項１〜３の何れか１項に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、
５０ｍＭから８００ｍＭまで、好ましくは６０ｍＭから５００ｍＭまで、より好ましくは７０ｍＭから２５０ｍＭまで、さらに好ましくは６０ｍＭから１１０ｍＭまでの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；
０．０１ｍＭから１００ｍＭまで、好ましくは０．５ｍＭから８０ｍＭまで、より好ましくは１．５ｍＭから４０ｍＭまでの塩化カルシウム（ＣａＣｌ２ ）；及び、
必要に応じて、３ｍＭから５００ｍＭまで、好ましくは４ｍＭから３００ｍＭまで、より好ましくは５ｍＭから２００ｍＭまでの塩化カリウム（ＫＣｌ）
を含有する、利用。
【請求項５】
請求項１〜４の何れか１項に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ，Ｎａ（Ｋ）２ ＨＰＯ４ ／Ｎａ（Ｋ）Ｈ２ ＰＯ４ 等の緩衝系を含有しない、利用。
【請求項６】
請求項１〜５の何れか１項に記載の利用であって、
上記注入緩衝液は、単糖類、二糖類、または多糖類を含有しない、利用。
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の利用であって、
ＲＮＡは、むき出しのｍＲＮＡ、またはポリ陽イオンと複合体と成すｍＲＮＡである、利用。
【請求項８】
請求項７に記載の利用であって、
ｍＲＮＡは、プロタミンと複合体を成す、利用。
【請求項９】
請求項７または８に記載の利用であって、
ｍＲＮＡは、少なくとも１つの天然または非天然の改変を有し、
上記改変は、特に、
コードされるアミノ酸配列を変えずに、ｍＲＮＡのコード領域のＧ／Ｃ含量を増加させること、
少なくとも１つのリボヌクレオチドアナログを導入すること、
ＷＴ配列における非安定化配列を除去すること、または、
リボソーム結合部位の領域のＡ／Ｕ含量を増加させること、からなる群から選択される、利用。
【請求項１０】
請求項１〜９にて定義された、ｍＲＮＡ、及び水性の注入緩衝液を含有する、宿主生物内／内部のｍＲＮＡ移送及び／またはｍＲＮＡ発現を増加させるためのＲＮＡ注入溶液。
【請求項１１】
請求項１０に記載のＲＮＡ注入溶液であって、
ＲＮＡは、むき出しのｍＲＮＡである、ＲＮＡ注入溶液。
【請求項１２】
宿主生物内におけるｍＲＮＡの、ＲＮＡ移送及び／またはＲＮＡ翻訳を増加させる方法であって、上記方法は、次の工程、
ａ．請求項１０または１１に記載のｍＲＮＡ注入溶液を調製、及び
ｂ．工程ａ．のｍＲＮＡ注入溶液の、宿主生物への投与、
を含む、方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法であって、
上記宿主生物は、マウス、ラット、ブタ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、およびヒトからなる群より選ばれる哺乳類であり、特にヒトである、方法。
【請求項１４】
細胞のインビトロトランスフェクション方法であって、
請求項１０または１１に記載の注入溶液が、必要に応じてエレクトロポレーションにより、細胞、特に実験細胞または細胞株に投与される、方法。
【国際調査報告】
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2008540601.tif 000022
2008540601.tif 000023
2008540601.tif 000024
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