(57)【要約】  本出願は、乳房細胞増殖性疾患を検出し区別するための方法および核酸を提供する。これは、遺伝子パネルまたはそのサブセットのメチル化を分析することによって実現される。本発明は、乳癌および良性乳房疾患ならびに他の癌および組織型を含む、様々な組織型の検出および／または区別に使用しうる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象中の乳房細胞増殖性疾患の検出方法、またはその疾患間で検出区別する方法であって、SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, SNAP25, HOXB13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, Q8NAN2, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48, KOX7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, COL5A1, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, BRCA2, CDKN2A, EYA4, GSTP1, SYK, AR, PLAU, LEF1, ALX4, APC, BRCA1, CDKN1A, SERPINB5, SFN, CDH13, CASP8, PRSS8, SNCG, IGSF4, ESR1, FHIT, FABP3, HOXA5, CDH1, TP53, THBS1, APAF1, PGR, TMS1/ASC, HIC1, TP73, CLDN7, RARB, MLH1, RASSF1A, ESR2, TERT, TGFBR2, IGFBP7, LOT1, S100A7, ARH1/NOEY2, DAPK1, IL6, TWIST, MCT1, SASH1, TIMP3, CCND2, SOD2, THRB, NME1, RARA, STAT1, TPM1, GJB2, SLIT2, HS3ST2, PRDM2, SCGB3A1, SLC19A1, SEQ ID NO: 117, GPC3からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の発現を定量すること、および乳房細胞増殖性疾患の有無、またはサブクラスからの判定を含む方法。
【請求項２】
乳癌の有無を判定する方法であって、遺伝子または配列が、APC, ARH1/NOEY2, BRCA2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, MLH1, PGR, SERPINB5, RARB, SFN, SOD2, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, IL6, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, RARA, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, BRCA1, LOT1, PRSS8, SNCG, TPM1, GPC3, CLDN7, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子または配列が、PRDM2, PLAU, GSTP1, SLIT2, CCND2, HOXA5, RASSF1A, HS3ST2, ARH1/NOEY2, SCGB3A1, LIMK-1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 31からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記乳房細胞増殖性疾患が他の癌と区別される乳癌であり、かつ前記遺伝子または配列が、ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, SERPINB5, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, IL6, APAF1, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, LOT1, GPC3, CLDN7, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), LIM DOMAIN KINASE 1, MGC34831, SEQ ID NO: 54, MSF, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, NR2E1, PCDH7, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, MGC10561, LMX1A, SENP3, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 45, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子または配列が、PRDM2, GSTP1, ALX4, HOXA5, PLAU, RASSF1A, IGSF4, SLIT2, DAPK1, CDKN1A, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 35, LIMK-1, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 47からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
乳癌の有無を血液または血液成分のバックグラウンドで判定する方法であって、前記遺伝子または配列が、APC, ARH1/NOEY2, CCND2, CDH1, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, PGR, SERPINB5, RARB, SFN, SOD2, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, IL6, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, BRCA1, LOT1, PRSS8, SNCG, GPC3, CLDN7, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記遺伝子または配列が、FABP3, RASSF1A, MSF, PRDM6, LMX1A, SEQ ID NO: 4 , SCGB3A1, SLIT2, NR2E1, EYA4, PRDM2, SERPINB5, TWIST, STAT1, ALX4, IGFBP7, DAPK1, THBS1, PLAU, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 6, LIMK-1, SEQ ID NO: 46からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
非浸潤性乳管癌が健康な乳房組織または良性乳房細胞増殖性疾患と区別され、かつ前記遺伝子または配列が、APC, ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, MLH1, PGR, SERPINB5, RARB, SOD2, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, RARA, TWIST, ESR2, PLAU, SEQ ID NO: 4, SNCG, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 36, LMX1A, SENP3, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記遺伝子または配列が、HS3ST2, SLIT2, RASSF1A, GSTP1, GJB2, IGFBP7, CDH13, ARH1/NOEY2, SCGB3A1, FHIT, SEQ ID NO: 27, LIMK-1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 24からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
乳癌が健康な乳房組織または良性乳房細胞増殖性疾患と区別され、かつ前記遺伝子または配列が、ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, SERPINB5, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, IL6, APAF1, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, LOT1, GPC3, CLDN7, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記遺伝子または配列が、SLIT2, HS3ST2, HOXA5, ARH1/NOEY2, IGFBP7, PLAU, CDH13, TIMP3, CCND2, GSTP1, SEQ ID NO: 117, LIMK-1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 41,SEQ ID NO: 27,SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 4からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子または配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドの配列を含むか、またはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記発現が、ＣｐＧのメチル化を分析することによって定量される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
対象から得た生物試料から単離したゲノムＤＮＡと、該標的核酸の一つまたは複数の中のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも一種の試薬または一連の試薬を接触させることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ｉ）対象から対象のゲノムＤＮＡを有する生物試料を得ること
ｉｉ）該ゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントと、メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するための一試薬または複数の試薬とを接触させること
ｉｉｉ）その配列が、配列番号４９３〜配列番号９６４およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される塩基配列の少なくとも１６塩基対長のセグメントと逆相補的であるか、同一であるか、または該配列とストリンジェントまたは高度にストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも一個のプライマー対によって、該ＤＮＡの少なくとも一個の標的配列を増幅すること
ｉｖ）少なくとも部分的に前記区別に基づいて、少なくとも一個の標的ＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、あるいは複数の標的ＣｐＧジヌクレオチド配列の平均的メチル化状態を反映する平均または値を定量し、乳房細胞増殖性疾患を検出し、またはその疾患間で検出区別することによって少なくとも部分的に与えられる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｉｉ）において、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、およびそれらの組合せからなる群から選択される試薬の使用を含む、請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記生物試料が、乳頭吸引液、リンパ液、乳管洗浄液、極細針吸引物、血漿、血清、全血、単離した血液細胞、血液から単離した細胞からなる群から選択される、請求項１４または１５のいずれかの方法。
【請求項１７】
配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される配列に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の隣接配列をいずれの場合にも含む、少なくとも一個の核酸分子またはペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の使用を含む、請求項１４〜１６のいずれかの方法。
【請求項１８】
前記隣接配列が、少なくとも一個のＣｐＧ、ＴｐＧ、またはＣｐＡジヌクレオチド配列を含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
少なくとも２個のそのような核酸分子またはペプチド核酸（ＰＮＡ）分子の使用が含まれる、請求項１８の方法。
【請求項２０】
ｉｉｉ）において、その増幅酵素として耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用、５'‐３'エクソヌクレアーゼ活性を欠損しているポリメラーゼの使用、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の使用、検出可能な標識を有する増幅核酸分子の生成、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも一つの方法の使用を含む、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記プライマーが、メチル化特異的プライマーである、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
ｉｉｉ）において、配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される配列およびその相補鎖に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の隣接配列をいずれの場合にも含む、少なくとも一個の核酸分子またはペプチド核酸分子の使用がさらに含まれる方法であって、該核酸分子またはペプチド核酸分子が、それとハイブリッド形成する核酸の増幅を抑制する、請求項１４〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
ｉｖ）において、配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される配列およびその相補鎖に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の隣接配列をいずれの場合にも含む少なくとも一個の核酸分子またはペプチド核酸分子のハイブリッド形成を含む、請求項１４〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも一個のそのようなハイブリッド形成する核酸分子またはペプチド核酸分子が固相に結合されている、請求項２３の方法。
【請求項２５】
少なくとも一個のヌクレオチド塩基によって、少なくとも一個のそのようなハイブリッド形成した核酸分子を伸長することをさらに含む、請求項２４の方法。
【請求項２６】
ｉｖ）の定量において、増幅物の配列決定を含む、請求項１４の方法。
【請求項２７】
配列番号１〜配列番号１１８に由来する処理した核酸であって、該処理が、そのゲノムＤＮＡ配列の少なくとも一個の非メチル化シトシン塩基を、ウラシルまたはハイブリッド形成の点でシトシンと検出可能に異なる別の塩基に転換するのに適している核酸。
【請求項２８】
配列番号４９３〜配列番号９６４およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される処理したゲノムＤＮＡ配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含む核酸であって、該処理が、そのゲノムＤＮＡ配列の少なくとも一個の非メチル化シトシン塩基を、ウラシルまたはハイブリッド形成の点でシトシンと検出可能に異なる別の塩基に転換するのに適している核酸。
【請求項２９】
前記近接する塩基配列が、少なくとも一個のＣｐＧ、ＴｐＧ、またはＣｐＡジヌクレオチド配列を含む、請求項２７および２８の核酸。
【請求項３０】
その処理が、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、およびそれらの組合せからなる群から選択される試薬の使用を含む、請求項２７〜２９のいずれかの核酸。
【請求項３１】
配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される処理したゲノムＤＮＡ配列に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも９個の近接するヌクレオチド配列を含むオリゴマー。
【請求項３２】
少なくとも一個のＣｐＧ、ＣｐＡ、またはＴｐＧジヌクレオチドを含む、請求項３１のオリゴマー。
【請求項３３】
いずれの場合にも、請求項３１または３２のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドを少なくとも２つ含むオリゴマーのセット。
【請求項３４】
対象の乳房細胞増殖性疾患を検出し、またはその疾患間で検出区別するのに有用なキットであって、
‐  重亜硫酸塩試薬またはメチル化感受性制限酵素の少なくとも一種、および
‐  配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される配列およびその相補鎖に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも９個のヌクレオチドの隣接配列をいずれの場合にも含む少なくとも一個の核酸分子またはペプチド核酸分子
を含むキット。
【請求項３５】
ＭＳ‐ＳＮｕＰＥ法、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ法、核酸の配列決定、およびそれらの組合せからなる群から選択されるメチル化アッセイを実施するための標準試薬をさらに含む、請求項３４のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、正常状態に比較して疾患状態でＣｐＧの修飾されたメチル化パターンを示すゲノムＤＮＡ配列に関する。特定の実施形態は、乳房細胞増殖性疾患を検出し、またはその疾患間で検出区別するのに有用な方法、核酸、核酸アレイ、およびキットを提供する。
【背景技術】
【０００２】
病態の病因には、個々の遺伝子またはゲノムの変化したメチル化パターンが関与することが分かっている。ＣｐＧジヌクレオチド配列の構成において、５‐メチルシトシンは、真核細胞ＤＮＡ中で最も多く共有結合により修飾される塩基であり、転写、遺伝子刷り込み、および腫瘍形成の調節における役割を担う。従って、特定の検体中で、または複数の検体間で５‐メチルシトシン部位を同定し数量化することは、研究だけでなく、特に、様々な疾患の分子診断に極めて重要である。
【０００３】
ＤＮＡの異常なメチル化と癌との相関。ＣｐＧ「アイランド」内のＤＮＡの異常なメチル化は、広範な遺伝子の抑止または過剰発現をもたらすＣｐＧジヌクレオチド配列の高メチル化または低メチル化によって特徴付けられ、ヒト悪性腫瘍において見いだされ、相関している最も初期の、そして最も一般的な変化の一つである。加えて、異常なメチル化は、ある種の腫瘍では、遺伝子のイントロン部分およびコーディング部分のＣｐＧ高含有調節エレメントに生じることが示されている。大腸癌では、例えば、ＤＮＡの異常なメチル化は、最も顕著な変化の一つを構成し、ｐ１４ＡＲＦ、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ＴＨＢＳ１、ＭＩＮＴ２、ＭＩＮＴ３１などの多くの腫瘍サプレッサ遺伝子、およびｈＭＬＨ１などのＤＮＡミスマッチ修復遺伝子を不活化する。
【０００４】
腫瘍サプレッサ遺伝子の特定の高メチル化とは対照的に、ＤＮＡの全体的低メチル化は、腫瘍細胞に認められる。全体的メチル化のこの低下は初期に、明らかな腫瘍形成の発生のかなり前に検出される。低メチル化と遺伝子の発現増加の相関は、多くの発癌遺伝子で判定されている。
【０００５】
乳癌。アメリカ人女性において、乳癌は最も頻繁に診断される癌である。女性８人のうち１人が、一生のうちに乳癌を生じる。乳癌は、癌死亡の二番目に主要な原因であり、４０〜５５歳の女性では乳癌は第一の死亡原因である。２００４年には、米国内のみで２１５９９０件の乳癌の新規症例および４０１１０件の死亡が見込まれ、さらにヨーロッパでも同程度の数字が見込まれる。
【０００６】
乳癌の分類
１．乳癌
乳房新生物のほとんどは、乳管癌を伴う、上皮を起源とするものであり、全腫瘍の８０％を占める。さらに、あまり一般的ではない数種の乳癌サブタイプがある。延髄癌および小葉癌は共に、乳癌と診断された患者の約５％に見られる。他の頻度の低い腫瘍組織には、純粋な管状癌、粘液癌もしくはコロイド癌、乳頭癌、およびページェット病が含まれる。これらの癌の予後は、特に、リンパ節陰性期で見つかった場合非常に良い。癌腫および腺嚢胞腫瘍は孤発でしか生じない。
【０００７】
非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）は非浸潤性前癌状態である。ＤＣＩＳは、進行して浸潤性癌にもなりうるが、この可能性予測は様々に異なる。ＤＣＩＳを乳癌統計に含める人もいる。米国では、ＤＣＩＳの診断頻度はマンモグラフィースクリーニングの広範な使用以来顕著に増加してきた。１９９８年、米国では、ＤＣＩＳは、全ての新たに診断された浸潤性乳房腫瘍に非浸潤性乳房腫瘍を加えた和の約１８％を占めた。ＤＣＩＳの触診可能な瘤としての稀有な事例は、マンモグラフィーのみによって８０％が診断される。
【０００８】
２．良性乳房状態
最も一般的な良性乳房状態には、乳腺線維症状態、良性乳房腫瘍、および乳房炎が含まれる。線維嚢胞疾患は、最も頻発する良性乳房状態であり、女性２人に１人が生涯で少なくとも一度は罹患する。乳房の乳腺線維嚢胞症には、嚢胞（蓄積された液包）、線維症（瘢痕様結合組織の形成）、塊、肥厚領域、圧痛、または乳房疼痛が含まれる。乳腺線維嚢胞は、マンモグラフィーで乳癌を検出するのをさらに難しくする恐れもある。
【０００９】
線維腺腫は、細かすぎて触診できないことも多いありふれた良性乳房腫瘍であるが、時には直径数インチに成長することもある。線維腺腫は、腺および間質（結合）乳房組織からなり、通常２０〜３０歳の女性に発生する。米国癌学会によれば、アフリカ系アメリカ人女性は、他の人種または民族グループの女性よりも線維腺腫にかかり易い。葉状腫瘍も、腺および間質乳房組織の良性乳房腫瘍であるが、線維腺腫に比べて極めて珍しい。葉状腫瘍と線維腺腫の違いは、葉状腫瘍には線維結合組織の過剰増殖が見られる。葉状腫瘍は、通常良性であるが、大変稀有ではあるが悪性（癌）の場合もあり転移する恐れもある。顆粒細胞腫は、通常、口内または皮膚に見られるが、稀に乳房にも検出されることもある。しかし、顆粒細胞腫が乳癌に発展する危険性は高くない。乳腺炎は、一般に授乳期に生じる乳房組織の炎症である。
【００１０】
ＴＮＭ病期
ＴＮＭ分類は、国際対がん連合（ＵＩＣＣ）が考案し、米国がん病期分類合同委員会により承認されている。ＴＮＭは、腫瘍（Ｔ）、局所リンパ節（Ｎ）の臨床特徴、および遠隔転移（Ｍ）の有無に基づく。腫瘍は、そのサイズによって特徴付けられ、したがってＴ１は２ｃｍ未満、Ｔ２は２〜５ｃｍ、およびＴ３は５ｃｍを超える腫瘍である。非浸潤性（in-situ）乳癌は、Ｔｉｓと表示され、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、およびページェット病に区別される。同様に、Ｎ０は、陰性または正常局所リンパ節、Ｍ０は遠隔転移の不在をそれぞれ表す。同側性腋下リンパ節を含めることが、原発性乳癌にとって最も確実で再現性ある予後の指標になる。一般に、陽性リンパ節患者の５０〜７０％が再発し、それに対して転移性疾患陰性リンパ節患者全てにおいては、局所領域的治療のみを施した後に２０〜３５％しか再発しない。
【００１１】
等級
腫瘍等級は、腫瘍の分化状態を反映する。乳癌の分化は、通常、それぞれ、高分化（等級１）、中分化（等級２）、または低分化（等級３）と記載される。低分化腫瘍はより攻撃的になり易い。高核等級の腫瘍患者の８６％が８年生存し、他方で核等級が低度と判定された人では６４％であった。
【００１２】
ホルモン受容体状態
ホルモン受容体レベルは、予後および治療計画ついて乳癌を分類するための重要なパラメータである。ＥＲ陽性腫瘍患者は、低悪性度コースへ進み、選択的に柔組織および骨に転移する傾向があり、それに反してＥＲ陰性腫瘍患者は早期に再発し、肝臓、肺、および中枢神経系への転移する可能性がより高い。ＥＲ陽性腫瘍は、より十分に分化していることが多く、他の好ましい予後の特性を伴う。ＥＲ陽性腫瘍患者は、ＥＲ陰性腫瘍患者よりも短期無疾患率および全体的生存率が高くなりやすいが、時間の経過と共に２群の差は減少し、または消失さえする傾向にある。ＰｓＲは、幾つかの研究でＥＲよりも有益な予後の指標として登場した。さらに、高レベルのエストロゲン受容体の発現は、内分泌療法に対する好ましい応答の前兆である。
年齢および閉経状態
【００１３】
長期の追跡を伴う大規模な研究によって、年齢４５〜４９歳の女性が最も予後が良く、非常に若い患者（年齢３５歳未満の患者）または高齢患者で乳癌生存率は最低であったことが示された。しかし、他の、より重要な腫瘍の特性を考慮すると、年齢および閉経状態は重要な予後の指標ではない。
診断および治療。
【００１４】
診断
乳癌は、患者が自己検査することによって、または内科医による臨床的乳房検査中に触診可能な瘤として診断されることが多い。乳癌スクリーニングにおけるマンモグラフィーの使用の増加によって、触診可能な瘤が検出されない段階で既に多くの癌が見つかるようになった。疑わしい瘤は、通常、さらに超音波やＭＲＩなどの画像化によって追跡し、針生検によって最終的診断を確証する。
【００１５】
スクリーニング
現在、米国癌学会は、無症候の女性で乳癌を検出するために以下のガイドラインを推奨している。
・年齢２０歳以上の女性は、毎月、乳房自己検査（ＢＳＥ）を実施するのが望ましい。
・２０〜３９歳の女性は、少なくとも３年毎に内科医、内科医助手、看護士、臨床看護士など、医療専門家が実施する乳房の理学的検査（ＣＢＥまたは臨床的乳房検査）を受けるのが望ましい。ＣＢＥは、しばしば、子宮頸癌検査（Pap smear）と同じ予約で受けることができる。
・２０〜３９歳の女性も、月一回ＢＳＥを実施するのが望ましい。
・４０歳以上の女性は、年一回、内科医、内科医助手、看護士、臨床看護士など、医療専門家が実施する乳房の理学的検査（ＣＢＥまたは臨床的乳房検査）を受けるのが望ましい。ＣＢＥは、しばしば、マンモグラムと同じ受診で実施できる。月一回のＢＳＥも実施するのが望ましい。
・年齢４０歳以上の女性は、年一回のＣＢＥと月一回のＢＳＥに加えて、年一回のスクリーニングマンモグラムを受けるのが望ましい。
【００１６】
３．乳房自己検査（ＢＳＥ）および臨床的乳房検査（ＣＢＥ）
２００１年に、臨床的乳房検査および乳房自己検査について新たな分析が行なわれた。ＣＢＥが乳癌死亡率を減少させる直接的証拠はないが、幾つかの間接的証拠がある。患者の年齢および瘤の大きさ、さらに臨床検査での施術者の技術によって異なるが、ＣＢＥの全体的感受性は５４％である。直接的証拠がない場合、ＣＢＥの推奨は一致した意見に基づくものであった。乳房自己検査に関しては、制御された６回の大規模試行のメタ分析から、ＢＳＥを実施した女性対ＢＳＥを実施しなかった女性では、死亡率の相対リスクで減少は見られなかった（０．９４、９５％  Ｃ．Ｉ．０．８３〜１．０６）。近年、慣例となったＢＳＥは乳癌死亡率を減少させるか、有害ですらないかとさらに疑問視された。この証拠にも関わらず、乳房自己検査（ＢＳＥ）および臨床的乳房検査（ＣＢＥ）は依然として、乳癌スクリーニングの現在のガイドラインの一部である。
【００１７】
４．マンモグラフィー
現在、マンモグラフィーは、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって認可されている、無症候の女性の乳癌をスクリーニングするための唯一の検査である。米国および欧州数ヵ国で実施された無作為制御の試行では、慣例となったマンモグラフィースクリーニングも毎年実施すれば、乳癌死亡率を２０〜４０％減少できることが実証されている。平均して、マンモグラフィーの感受性は８５％までである。しかし、マンモグラフィーは、高濃度乳房または線維嚢胞変化や瘤などの良性乳房状態の患者では感受性が低い。スクリーニングマンモグラムの結果の５〜１０％が、異常であり要精査である。偽陽性割合は、若い女性ほど、その乳房が高濃度なために高くなる。
【００１８】
米国では、マンモグラフィースクリーニングは一般市民に浸透している。マンモグラフィーは、被験者に低い線量と不快感を与えるが、承諾率はおよそ７０％である。マンモグラフィースクリーニングの平均料金は＄１４１であり、技術料＄１０１、解析料＄４０である。マンモグラフィーの成功は明らかであるにも関わらず、マンモグラフィー診療所に訓練されたスタッフ、つまり医師および看護士を招くことはますます困難になり、過去４年にわたって施設は８％減少したと報告されている。これは、時間がかかる、払い戻し額が少ない、規制が厳しい、および訴訟を恐れるためであろうと推測された。
【００１９】
５．ＭＲＩスクリーニング
ＭＲＩイメージングは、主として、陽性マンモグラフィーの結果を追跡するために使用される。ＭＲＩは非常に感受性が高く、高濃度乳房および若い女性の解析に非常に適しているが、時間がかかり、高価であり、乳房生検試料をガイドするのが難しい。現在、乳癌感受性遺伝子変異保因者など、高危険集団でのスクリーニングに向けてＭＲＩを評価するために試行が進められている。
乳癌治療
【００２０】
現在のスクリーニングプログラムおよび自己検査の利便性のおかげで、乳癌は比較的初期に診断される。つまり、新たに診断された全事例の約６５％で、癌は乳房のみに限定され、まだリンパ節までには広がっていない。従って、器官内に限定された乳癌と診断された多くの患者で、提案される第一の治療的介入は手術であり、続いて放射線療法であることが多い。
【００２１】
ほとんどの初期乳癌患者で、手術により腫瘍を完全に除去することができる。しかし、それ以上の治療を受けないと、これらの約３分の１が追跡中に転移を生ずる。これは、手術の時点で既に存在した潜在的転移（または微小転移）のためであると思われる。この観察に基づき、全身的アジュバント治療がリンパ節陰性乳癌にも導入されている。全身的アジュバント治療は、腫瘍を外科的に除去した後に施し、再発の危険性を著しく減少させると思われてきた（初期乳癌被験者協同的グループ、１９９８）。数種のアジュバント治療、つまり（ホルモン受容体陽性腫瘍には）内分泌治療、異なる化学療法レジメン、およびハーセプチンなどの新規薬剤を利用することができる。個々の患者の治療レジメンは、腫瘍の病理学的分類（主としてＴＮＭ、等級、ＥＲ状態）に基づくSt. GallenやＮＩＨなどのガイドラインによって選択する。
【００２２】
米国癌学会の図に基づき、乳癌の予後は癌の段階と明瞭に相関する。腫瘍の検出が早いほど、生存への予後は良い。従って、初期に癌を検出する乳癌スクリーニング検査によって乳癌死亡率は低下する。
【００２３】
メチル化と乳癌
ＤＮＡのメチル化など、エピジェネティックな調節は、発癌でよくある初期事象として確立されている。特に、ＤＮＡのメチル化が乳癌に寄与することは十分に実証されている。WidschwendterおよびJones（Oncogene. 2002 Aug 12;21(35):5462-82.）は、近年の概説で、乳房の発癌に関連する段階全ての状況において、ＤＮＡのメチル化の変化が報告されてきたと実証し、その段階には１）アポトーシスの回避、２）抗増殖シグナルに対して非感受性、３）増殖シグナルでの自給自足、４）無限の複製の可能性、５）組織浸潤および転移、ならびに６）持続する血管新生が含まれる。あまり実証されていないものには、ＤＣＩＳなどの初期前癌病変、および小葉癌などの低頻度癌病変におけるＤＮＡのメチル化の役割がある。Facklerらは、ＤＣＩＳ病変（Ｎ＝４４）の９５％が、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＨＩＮ‐１、ＲＡＲ‐β、サイクリンＤ２、およびＴｗｉｓｔを含む５個の遺伝子のうち少なくとも一個で高メチル化したことを指摘した。同著者らは、これらの遺伝子の高メチル化の頻度を乳管癌と小葉癌の間で比較し、小葉癌で過剰なメチル化が少ないことが分かったＴＷＩＳＴを除いて、同様のメチル化パターンを見出した。同様に、Lehmannらは、ＲＡＳＳＦ１Ａおよびストラチフィン（stratifin）のメチル化で極初期変化を報告し、乳管癌と比較して小葉癌でＤＡＰＫがより頻繁に不活化することを見出した。ＤＣＩＳでＲＡＳＳＦ１Ａおよびストラチフィンが初期にメチル化変化することが他の群により確認された。
【００２４】
無症候集団をスクリーニングするためには、候補分子マーカーは、非浸潤性スクリーニングアッセイを可能にするために、離れた試料中で検出可能でなければならない。乳房腫瘍のＤＮＡが、血清および血漿中で遊離核酸として検出できることは十分に証明されている。あるいは、乳頭吸引液（ＮＡＦ）または乳管洗浄液など、乳房から直接得た液体も、分子検査を行うための体液源として提案されてきた。しかし、ＮＡＦおよび乳管洗浄液を得るための手順が、その信頼性を疑問視され、患者にも不快感を与えるため、スクリーニングアッセイには血液を基にした検査が明らかに好ましい。
【００２５】
血液を基にした分子癌スクリーニングアッセイは、他の組織から得た正常ＤＮＡバックグラウンド中で微量な腫瘍ＤＮＡを検出するという難題に直面している。ＤＮＡのメチル化に基づく腫瘍マーカーは、ＭＳＰやＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）など、メチル化特異的方法でＤＮＡを増幅するというアッセイを使用し検出することができる。これらのアッセイによって、過剰な正常ＤＮＡバックグラウンド中で、メチル化したＤＮＡの極めて少ない複製物を高感度に検出できるようになる。
【００２６】
多因子的手法。癌診断は、従来、単一分子マーカーの検出（例えば、遺伝子変異、高ＰＳＡレベル）に頼ってきた。残念ながら典型的には、癌は、単一マーカーでは多くの疾患形態を検出しまたは区別できない疾患状態である。従って、本明細書でも手短に述べるように、単一マーカーのみを認識するアッセイでは、的中率に限界があることが示されている。メチル化をベースにした癌診断、ならびにそのような疾患のスクリーニング、診断、および治療モニタリングで探求され、現在成功している手法は、多数マーカーの選択の使用である。特に、癌は単純疾患ではないので、多重分析手法は癌診断に非常に適しており、この多因子「パネル」手法は、細胞学的にも臨床学的にも不均一な癌の性質に適合している。
【００２７】
メチル化をベースにした診断検査に対するパネル手法を首尾よく実行するための鍵は、疾患状態を特徴付け区別できる最適化したマーカーパネルを設計し開発することである。本特許出願は、パネルメンバーの一つまたは組合せをメチル化分析することで、極めて高い感度、特異性、および／または的中率で前立腺細胞増殖性疾患が検出できるようになる効率的で独創的な遺伝子パネルについて記載している。
【００２８】
医学的検査の開発。任意の医学的スクリーニングまたは診断検査の鍵となる２つの評価基準は、その感受性と特異性であり、それにより標的疾患を有しない個人を誤って包含することなく、全ての患者個人を例外なく正確に検出（的中率）するために、いかに首尾よく検査を実施されたかが測定される。歴史的には、感受性および特異性が低いために多くの診断検査が批判されてきた。
【００２９】
真陽性（ＴＰ）結果とは、検査が陽性であり、その状態が存在する場合である。偽陽性（ＦＰ）結果とは、検査は陽性であるが、その状態が存在しない場合である。真陰性（ＴＮ）結果とは、検査が陰性であり、その状態も存在しない場合である。偽陰性（ＦＮ）結果とは、検査が陰性であるが、その状態は存在する場合である。
感受性＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）
特異性＝ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）
的中率＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＰ）
【００３０】
感受性は、検査を受ける個人において標的疾患を正確に検出する検査能力を測定することである。感受性が低い検査では、偽陰性、すなわち、疾患を有するのに、その特定の疾患を有しないと誤って同定されてしまう個人の割合が高くなる。偽陰性の潜在的危険性は、病気の個人が、しばらくの間診断未確定および未治療のままに放置され、その間に、治療法があったとしても余り有効でなくなる後期にまで、疾患が進行しかねないことである。感受性が低い検査の一例は、蛋白質をベースにしたＨＩＶ血液検査である。この疾患が十分に定着し、かなりの数のウイルスが血流中に侵入するまでは、ウイルスの存在を検出できないので、この種の検定は感受性が低い。それに反して、高感度検査の一例はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するウイルス量検出である。この種の検定は、非常に少量のウイルスでも検出できるので高感度が実現する。高感度は、誤診断の結果率が高い場合特に重要である。
【００３１】
その一方で、特異性は、疾患状態ではない患者を正確に同定する検査能力を測定することである。特異性が低い検査では、偽陽性、すなわち、疾患を有するとして誤って同定される個人の割合が高くなる。偽陽性の欠点は、不要な医療手順の治療を患者に無理やり受けさせることであり、それには付随する危険性、感情的および経済的ストレスが伴い、そして患者の健康状態に有害作用を及ぼす恐れもある。高特異性診断検査の開発を困難なものにする疾患の特徴は、疾患機序に、特に癌の機序に、しばしば複数の遺伝子および蛋白質が関与することである。加えて、ある種の蛋白質は疾患状態に無関係な理由で増加しうる。特異性が高い検査の一例は、ｐ５３変異を検出できる遺伝子ベースの検査である。それ以上の診断手順またはそれ以上の医療介入に伴うコストまたは危険性が非常に高くなる場合、特異性は重要である。
【００３２】
乳汁のメチル化分析。乳癌患者の体液のメチル化の検出法が確立されている。Silvaら（Br J Cancer. 1999 Jun;80(8):1262-4.）は、ｐ１６ＩＮＫ４ａエクソン１の腫瘍メチル化を伴う乳癌の患者８人を検査し、うち５人の血漿にメチル化したｐ１６ＩＮＫ４ａエクソン１を検出したと記載した。それ以来、その分析の感受性は、遺伝子パネルを分析することによって改善されている。Krassensteinら（Clin Cancer Res. 2004 Jan 1;10(1 Pt 1):28-32.）は、マッチした腫瘍および乳頭吸引液（本明細書ではＮＡＦともいう）中の６個の遺伝子（ＧＳＴＰ１、ＲＡＲＢ２、ｐ１６ＩＮＫ４ａ、ｐ１４ＡＲＦ、ＲＡＳＳＦ１Ａ、およびＤＡＰＫ）パネルの分析を記載した。小さな試料セット（２２人の腫瘍患者、５人の健康な患者、および５人の良性乳房患者）を用いて、パネルの少なくとも一個の遺伝子が腫瘍でメチル化し、このメチル化が乳癌２２人中１８人のＮＡＦ中に検出できたことを確認した。
【００３３】
Krassensteinらによる研究によって、腫瘍組織で観察されるメチル化は、乳房由来液体中に検出されることが確認されたが、体液をベースにした検査を提供することに関連しては幾つかの技術的な問題があり、その問題の幾つかは知られていたが、満足のいくように解決されなかった。第一に、Krassensteinが使用したマーカーは、乳癌中では特異的にメチル化しなかったが、一般的な癌マーカーは癌の範囲内でメチル化した。従って、前記パネルを臨床設定の中で使用したならば、おそらく偽陽性数が増加し、その際、他の組織の癌からメチル化したＤＮＡ（またはそこからの自由浮遊ＤＮＡ）が検出されたであろう。
【００３４】
Krassensteinらは、乳癌スクリーニング検査の提供を目的としたが、ＮＡＦ（または例えば乳管洗浄液）などの手順に対して患者の承諾が得られる可能性は、最も危険にさらされた集団を除いて低い。患者の承諾率が高いスクリーニング検査の好ましい試料の種類は、より好ましくは血液をベースにしたものであろう。組織またはＮＡＦで検査したパネルの性能は、血液試料のその性能に関しては指標にはならない。従って、マーカーが血液中でもメチル化されなかったことを証明するために、どのパネルも血液試料で確かめる必要があるはずである。
【００３５】
これら２つの問題には、Evronら（Lancet. 2001 Apr 28;357(9265):1335-6.）が直ちに取り組んだ。この研究では、サイクリンＤ２、ＲＡＲＢ、およびＴｗｉｓｔからなる遺伝子パネルを選択したが、白血球中のそれらのメチル化状況を含む要因を元にした。次いで、マッチした組織および乳管洗浄液でこれらの遺伝子のメチル化状況を分析した。この遺伝子パネルによって５０個の試料のうち４８個に浸潤性乳癌が検出された。
【００３６】
スクリーニング検査の主な目的は、ＤＣＩＳなどの低悪性度腫瘍の検出であり、より高い悪性度腫瘍は、例えば、自己検査やマンモグラフィーによって容易に検出され治療はより難しくなる。Krassensteinらは、これを可能にできなかった。使用した試料セットは、大部分が高悪性度（２および３）腫瘍からなった。１等級の腫瘍は一つしかなかった。従って、低悪性度腫瘍を検出するためのパネルの適合性は、特に、当該ＮＡＦ試料が検査でメチル化陽性であったかどうかを確認できないので、完全には確立されていないと結論付けることができる。さらに、メチル化は進行性の腫瘍形成特徴であると一般的には考えられている。高悪性度腫瘍組織中のメチル化状況用に選択するマーカーパネルとは対照的に、高度に特異的に選択した遺伝子マーカーパネルが必要となるのは、腫瘍形成初期の検出においてであると結論付けられよう。Evronらが調査したパネルでは、１４症例のＤＣＩＳのうち８例しか検出されず、それによって乳癌検出に適当なパネルが、必ずしもＤＣＩＳ検出に適当ではないことが確認された。
【００３７】
乳汁分析用のメチル化遺伝子パネル類が知られているが、前記パネル全てに関連して欠点があるという点で、当技術分野の水準を要約することができる。こうした技術的困難さのために、これらの遺伝子パネルのどれも、乳癌スクリーニング検査の要件を満たさず、すなわち、その検査は体液、最も好ましくは血液での使用に適当であり、そしてその検査によってＤＣＩＳなどの初期細胞増殖性疾患を検出することができる。
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
近年、浸潤性乳癌と正常乳房組織を区別するために、ＲＡＳＳＦ１Ａ、ＴＷＩＳＴ、サイクリンＤ２、およびＨＩＮ１からなるメチル化マーカーパネルの使用が、Facklerらによって記載されている。高感度定量的多重メチル化特異的ＰＣＲアッセイを使用することによって、研究では（正常乳房組織とは対照的に）乳癌での遺伝子パネルのプロモータの高メチル化が存在することが、感受性８４％、特異性９４％で検出された。従って、この研究は、非癌細胞バックグラウンド中で乳癌細胞を高感度検出するためのメチル化マーカーの使用を確立する際に重要である。しかし、Facklerらが使用した試料は、（乳管洗浄液によって抽出されたものを含め）組織をベースにしており、従って体液をベースにした試料を使用して、そのような感受性および特異性が得られるかどうかは証明されていない。さらに、非浸潤性乳管癌を検出するのは不可能ということを同パネルは証明した。従って、この方法は、初期スクリーニング検査としての使用に不適当である。
【課題を解決するための手段】
【００３９】
本発明は、乳房細胞増殖性疾患を検出し、かつ／またはその疾患間で区別するための新規な方法を提供する。好ましい実施形態では、本発明は、乳癌を初期検出するために、危険に直面している集団をスクリーニングできるようにする。さらに乳癌と良性乳房細胞増殖性疾患を区別するための細胞学的スクリーニングの代替法として、本方法の別の実施形態を使用することもできる。
【００４０】
本発明は、表３に記載の遺伝子パネルおよび／またはゲノム配列を提供することによって、当技術分野でこの長年の必要性を解決するに至り、これらの遺伝子の発現は乳房細胞増殖性疾患の有無またはその特徴の指標となる。好ましい遺伝子選択および組合せを提供するが、それを分析することによって、様々なクラスの乳房細胞増殖性疾患の区別および検出が可能になる。すなわち、
・乳房細胞増殖性疾患の検出、
・良性乳房細胞増殖性疾患との区別を含む初期乳癌の検出、
・乳癌と他の癌の区別、
・血液または血液由来液体のバックグラウンド中の乳癌細胞の検出、
・ＤＣＩＳと（健康な乳房組織を含む）良性乳房細胞増殖性疾患の区別
である。
そのＣｐＧ位置のメチル化状況によって、前記遺伝子および／またはゲノム配列の発現状態を定量するのが特に好ましい。
【００４１】
この分析を可能にするために、本発明は、乳房細胞増殖性疾患の発生に付随するゲノムのメチル化について、生物試料を分析するための方法を提供する。前記方法は、配列番号１〜配列番号１１８からなる群の少なくとも一個の核酸またはそのフラグメントを、ゲノム配列または当該配列中のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別することができる試薬または一連の試薬と接触させることを特徴とする。
【００４２】
本発明は、配列番号１〜配列番号１１８の遺伝子パラメータおよび／またはエピジェネティックパラメータを確認するための別の方法も提供し、さらにｍＲＮＡ発現分析、蛋白質発現分析、およびメチル化分析を含むがそれだけには限らない。その方法は、乳房細胞増殖性疾患の診断、区別、および治療の改良に有用であり、より詳細には、改良された、前記疾患のサブクラスの検出およびサブクラス間の区別によって行う。本発明は、当技術分野の水準にわたっていくつかの改良を提供する。体液で乳癌を検出するメチル化アッセイが知られているが、現在、血液で確認する判定基準を満たし、市販用に適当な精度を有してＤＣＩＳを検出することができるアッセイはない。
【００４３】
その供給源は、任意の適当な供給源、例えば、株化細胞、組織切片、生検試料、パラフィン包埋組織、体液、血漿、血清、全血、単離した血液細胞、血液から単離した細胞、およびそれらの可能な組合せ全てであってよい。前記ＤＮＡ源は、乳頭吸引液、リンパ液、乳管洗浄液、極細針吸引物、血漿、血清、全血、単離した血液細胞、血液から単離した細胞からなる群から選択される体液であることが好ましい。
【００４４】
具体的には、本発明は、乳房細胞増殖性疾患を検出する方法であって、ゲノムの核酸を含む生物試料を得ること、その核酸またはそのフラグメントと、対象核酸の標的配列中のメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するのに十分な一試薬または複数の試薬を接触させることであって、その標的配列が、配列番号１〜配列番号１１８の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを有する配列を含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成し、前記近接するヌクレオチドが少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチド配列を含むこと、そして少なくとも部分的に該区別に基づいて、少なくとも一個の標的ＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、あるいは複数の標的ＣｐＧジヌクレオチド配列の平均的メチル化状態を反映する平均または値を定量することを含む方法を提供する。好ましくは、標的配列内でのメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列の区別は、少なくとも一個のそのようなＣｐＧジヌクレオチド配列を、配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される配列、およびその標的配列に対応するその近接領域内で、その対応する転換したあるいは非転換のジヌクレオチド配列に、メチル化状態依存的に転換しまたは転換しないことを含む。
【００４５】
その他の実施形態は、乳房細胞増殖性疾患を検出する方法であって、対象のゲノムＤＮＡを含む生物試料を得ること、ゲノムＤＮＡを抽出すること、ゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントを一個または複数の試薬で処理して、５位の非メチル化シトシン塩基をウラシルまたはハイブリッド形成特性の点でシトシンと検出可能に異なる別の塩基に転換すること、その処理したゲノムＤＮＡまたは処理したそのフラグメントと、増幅酵素および少なくとも９ヌクレオチド長の隣接配列をいずれの場合にも含む少なくとも２個のプライマーを接触させることであって、この隣接配列は配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される配列およびその相補鎖に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成し、その際、その処理したＤＮＡまたはそのフラグメントが増幅して増幅物を生成し、または増幅しないこと、ならびに前記増幅物が存在するか否か、または前記増幅物の特性に基づいて、配列番号１〜配列番号１１８からなる群から選択される少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、あるいはその複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均的メチル化状態を反映する平均または値を定量することを含む方法を提供する。好ましくは、少なくとも一個のそのようなハイブリッド形成する核酸分子またはペプチド核酸分子が固相に結合されている。好ましくは、定量は、以下からなる群から選択される少なくとも一つの方法の使用を含む。配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される配列、およびその相補鎖に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の隣接配列を含む少なくとも一個の核酸分子をハイブリッド形成すること、配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される配列、およびその相補鎖に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の隣接配列を含む、固相に結合した少なくとも一個の核酸分子をハイブリッド形成すること、配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される配列、およびその相補鎖に相補的であり、または中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で該配列とハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の隣接配列を含む少なくとも一個の核酸分子をハイブリッド形成し、少なくとも一個のヌクレオチド塩基によって、少なくとも一個のそのようなハイブリッド形成した核酸分子を伸長すること、ならびに増幅物を配列決定すること。
【００４６】
別の実施形態は、乳房細胞増殖性疾患を分析するための方法を提供し、対象のゲノムＤＮＡを含む生物試料を得ること、ゲノムＤＮＡを抽出すること、配列番号１〜配列番号１１８からなる群から選択される一個または複数の配列、あるいはその配列とストリンジェント条件下でハイブリッド形成する配列を含むゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントと、一個または複数のメチル化感受性制限酵素を接触させることであって、前記ゲノムＤＮＡがそれによって消化されて消化フラグメントを生成し、またはそれによって消化されないこと、ならびに少なくとも一個のそのようなフラグメントが存在するか否か、またはそのようなフラグメント特性に基づいて、配列番号１〜配列番号１１８からなる群から選択される一個または複数の配列の少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、あるいはその複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均的メチル化状態を反映する平均または値を定量することを含む。消化された、または消化されないゲノムＤＮＡを増幅した後、前記定量を行うのが好ましい。
【００４７】
その他の実施形態は、配列番号１〜配列番号１１８からなる群に由来する配列中、シトシンのメチル化パターンを分析するための新規なゲノムの、および化学的に修飾された核酸配列、ならびにオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマーを提供する。
【００４８】
別の実施形態では、本発明は、一般的な癌の存在に関連するＤＮＡマーカーを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
定義
「観察／推定率」（「Ｏ／Ｅ率」）という語は、特定のＤＮＡ配列内のＣｐＧジヌクレオチドの頻度をさし、［ＣｐＧ部位数／（Ｃ塩基数×Ｇ塩基数）］×各フラグメントのバンド長に対応する。
【００５０】
「ＣｐＧアイランド」という語は、（１）「観察／推定率」＞０．６に対応するＣｐＧジヌクレオチド頻度を有する、および（２）「ＧＣ含量」＞０．５を有するという判定基準を満たすゲノムＤＮＡの近接領域をさす。ＣｐＧアイランドは、必ずしもというわけではないが、典型的には約０．２〜約１ｋｂまたは約２ｋｂ長である。
【００５１】
「メチル化状態（state）」または「メチル化状況（status）」という語は、ＤＮＡ配列中の一つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドに５‐メチルシトシン（「５‐ｍＣｙｔ」）が存在するかしないかをさす。ＤＮＡ配列中の一個または複数の特定のＣｐＧのメチル化部位でのメチル化状態（それぞれ、２個のＣｐＧ  ＣｐＧジヌクレオチド配列を含む）には、「非メチル化」、「完全メチル化」および「半メチル化」が含まれる。
【００５２】
「半メチル化（hemi-methylation）」または「半メチル化（hemimethylation）」という語は、二本鎖核酸のメチル化状態をさし、その場合、その一本の鎖のＣｐＧ位置しかメチル化していない（例えば、５'‐ＣＣＭＧＧ‐３'（最上鎖）：３'‐ＧＧＣＣ‐５'（最下鎖））。
【００５３】
本明細書で使用する「ＡＵＣ」という語は、曲線下面積の略号である。特に、それは、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積をさす。ＲＯＣ曲線は、診断検査の異なる可能カット値について、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。それは、選択したカット値に応じた、感受性と特異性の間のトレードオフを示す（感受性におけるどんな上昇にも、特異性における低下が伴う）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断検査を正確にするための測定である（面積が大きいほど良く、最適条件は１であり、ランダム試験ではＲＯＣ曲線は対角線上に伸び面積は０．５になるであろう。参照：J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975）。
【００５４】
「高メチル化」という語は、検査ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列中の一つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの５‐ｍＣｙｔの存在が、正常な対照ＤＮＡ試料中の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見出される５‐ｍＣｙｔの量に比べて高いことに対応する平均的メチル化状態をさす。
【００５５】
「低メチル化」という語は、検査ＤＮＡ試料のＤＮＡ配列中の一つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチドの５‐ｍＣｙｔの存在が、正常な対照ＤＮＡ試料中の対応するＣｐＧジヌクレオチドに見出される５‐ｍＣｙｔの量に比べて低いことに対応する平均的メチル化状態をさす。
【００５６】
「マイクロアレイ」という語は、当技術分野で認識されるように、広く「ＤＮＡマイクロアレイ」および「ＤＮＡチップ」をさし、当技術分野で認識されている固体支持体全てを包含し、そしてそこに核酸分子を固定し、またはその上で核酸を合成する方法全てを包含する。
【００５７】
「遺伝子パラメータ」は、それらを調節するためにさらに必要となる遺伝子および配列の変異および多型である。変異と呼ぶべきは、特に、挿入、欠失、点変異、逆位、および多型であり、ＳＮＰ（単ヌクレオチド多型）が特に好ましい。
【００５８】
「エピジェネティックパラメータ」は、特に、シトシンのメチル化である。別のエピジェネティックパラメータには、例えば、ヒストンのアセチル化が含まれるが、このアセチル化は記載した方法を使用して直接分析することはできないが、それはＤＮＡのメチル化と順次関連する。
【００５９】
「重亜硫酸塩試薬」という語は、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩またはそれらの組合せを含む試薬をさし、本明細書に開示した通りメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するのに有用である。
【００６０】
「メチル化アッセイ」という語は、ＤＮＡ配列中の一個または複数のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を定量する任意のアッセイをさす。
【００６１】
「ＭＳ．ＡＰ‐ＰＣＲ」（メチル化感受性オービトラリープライムド（Arbitrarily-Primed）ポリメラーゼ連鎖反応）という語は、ＣｐＧジヌクレオチドを含む可能性が最も高い領域に焦点を当てるため、ＣＧ高含有プライマーを使用するゲノムの全体的なスキャンを可能にする、当技術分野で認識されている技術をさし、Gonzalgoら, Cancer Research 57:594-599, 1997により記載されている。
【００６２】
「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」という語は、Eadsら, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999によって記載されている、当技術分野で認識されている蛍光をベースとしたリアルタイムＰＣＲ法をさす。
【００６３】
本明細書で実施されるその実施形態で「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）」アッセイという語は、核酸試料のメチル化特異的選択増幅を可能にする、増幅プライマー相互間のＣｐＧ位置、またはその増幅プライマーによって包含されるＣｐＧ位置を包含するメチル化特異的ブロッキングプローブ（本明細書ではブロッカーともいう）アッセイをさす。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌアッセイは、既に、国際公開公報第０２／０７２８８０号およびCottrellら Nucleic Acids Res. 2004 Jan 13;32(1):e10に記載されている。
【００６４】
本明細書で実施されるその実施形態で「ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」アッセイという語は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイをさし、このアッセイはＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイの変形形態であり、その際、前記ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、増幅プライマー相互間のＣｐＧ位置を包含するメチル化特異的ブロッキングプローブと組み合わせられている。
【００６５】
「Ｍｓ‐ＳＮｕＰＥ」（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長法）という語は、GonzalgoおよびJones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997によって記載されている、当技術分野で認識されているアッセイをさす。
【００６６】
「ＭＳＰ」（メチル化特異的ＰＣＲ）という語は、Hermanら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996、および米国特許第５，７８６，１４６号によって記載されている、当技術分野で認識されているメチル化アッセイをさす。
【００６７】
「ＣＯＢＲＡ」（組合せ重亜硫酸塩制限分析（Combined Bisulfite Restriction Analysis））という語は、XiongおよびLaird、Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997によって記載されている、当技術分野で認識されているメチル化アッセイをさす。
【００６８】
「ＭＣＡ」（メチル化ＣｐＧアイランド増幅）という語は、Toyotaら, Cancer Res. 59:2307-12, 1999、および国際公開公報００／２６４０１Ａ１号によって記載されているメチル化アッセイをさす。
【００６９】
「ハイブリッド形成」という語は、試料ＤＮＡ中のワトソンクリック塩基対のラインに沿う相補的配列に結合し、二重鎖構造を形成するオリゴヌクレオチドの結合と理解されたい。
【００７０】
本明細書で定義する「ストリンジェントなハイブリッド形成条件」は、６８℃にて５×ＳＳＣ／５×デンハート液／１．０％ＳＤＳでハイブリッド形成し、室温にて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄するステップを含み、あるいは当技術分野で認識されているそれと等価なもの（例えば、６０℃にて２．５×ＳＳＣ緩衝液中でハイブリッド形成を実施し、続いて３７℃にて低濃度緩衝液中で数回洗浄し、そして安定させておく条件）を含む。本明細書で定義する中程度にストリンジェント条件は、４２℃にて３×ＳＳＣで洗浄すること、または当技術分野で認識されているそれと等価なものを含む。塩濃度および温度パラメータは、プローブと標的核酸間の同一性の最適のレベルを実現するために変えることができる。このような条件に関する指針は、当技術分野で、例えば、Sambrookら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.；およびAusubelら (編), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John WileyおよびSons, N.Y.) at Unit 2.10により得ることができる。
【００７１】
「アレイ配列番号」、「複合アレイ配列番号」、または「複合アレイ配列」という語は、仮説にせよそうでないにせよ、対象アレイの個々の隣接配列全てのヘッド‐トゥ‐テール（５'→３'）直鎖複合体からなる配列（例えば、配列番号１〜配列番号１１８のその順のヘッド‐トゥ‐テール複合体）をさす。
【００７２】
「アレイ配列番号ノード」、「複合アレイ配列番号ノード」、または「複合アレイ配列ノード」という語は、「アレイ配列番号」、「複合アレイ配列番号」、または「複合アレイ配列」の任意の２個の個々の隣接配列間の連結部をさす。
【００７３】
複合アレイ配列に関して、「近接するヌクレオチド」という用語は、複合アレイの任意の個々の隣接する配列の隣接配列領域をさすが、本明細書に上記した「ノード」を含む複合アレイ配列の領域は含まない。
【００７４】
概要
本発明は、遺伝子発現分析に有用な新規性を備える分子遺伝学的マーカー、最も好ましくは乳房細胞増殖性疾患の発生に付随し、そのメチル化で発現されるマーカーを提供する。前記マーカーは、乳房細胞増殖性疾患を検出し、かつ／またはその疾患間で区別するために使用され、それによって前記疾患を検出し、分類し、処理するための改良された手段を提供することができる。
【００７５】
ＤＮＡの重亜硫酸塩修飾は、ＣｐＧのメチル化状況を評価するために使用される、当技術分野で認識されているツールである。５‐メチルシトシンは、真核細胞ＤＮＡ中、最も頻発する共有結合性塩基修飾である。それは、例えば、転写の調節、遺伝子刷り込み、および腫瘍形成で役割を担う。従って、遺伝情報の成分として５‐メチルシトシンを同定することは非常に関心が高い。しかし、５‐メチルシトシンの位置は、配列決定によって同定することができない。というのは、５‐メチルシトシンは、シトシンと同じ塩基対挙動をとるからである。さらに、５‐メチルシトシンが有するエピジェネティック情報は、例えば、ＰＣＲ増幅中に完全に消失する。
【００７６】
ＤＮＡの５‐メチルシトシンの存在を分析するために最も繁用される方法は、重亜硫酸塩とシトシンの特異的反応に基づき、それによって続いて生じるアルカリ加水分解と同時に、シトシンは、その塩基対挙動中のチミンに対応するウラシルに転換される。しかし、５‐メチルシトシンがこうした条件下で未修飾のまま残ることは重大である。従って、標準的な当技術分野で認識されている分子生物学的技術を使用し、例えば、増幅とハイブリッド形成、あるいは配列決定によって、本来ならそのハイブリッド形成挙動によってはシトシンと区別できないメチルシトシンを唯一残ったシトシンとして、今回検出することができるように、本来のＤＮＡは転換される。これらの技術の全ては、差次的塩基対特性に基づき、今回これを完全に利用することができる。
【００７７】
本発明は、配列番号１〜配列番号１１８からなる群から得た配列中のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状況を定量するために、一つまたは複数のメチル化アッセイを組み合せて、重亜硫酸塩法の使用を提供する。本発明により、配列番号１〜配列番号１１８からなる群から得た配列中のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状況の定量には、診断的有用性および予後有用性がある。
【００７８】
メチル化アッセイ手順。様々なメチル化アッセイ手順が、当技術分野で公知であり、本発明と併せて使用することができる。これらのアッセイによって、ＤＮＡ配列中の一つまたは複数のＣｐＧジヌクレオチド（例えば、ＣｐＧアイランド）のメチル化状態を定量できるようになる。そのようなアッセイは、他の技術の中でも、重亜硫酸塩処理したＤＮＡのＤＮＡ配列決定、（配列特異的増幅用）ＰＣＲ、サザンブロット分析、およびメチル化感受性制限酵素の使用を含む。
【００７９】
例えば、ゲノムの配列決定は、ＤＮＡのメチル化パターンおよび５‐メチルシトシン分布を分析するために、重亜硫酸塩処理の使用によって簡略化されてきた（Frommerら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992）。さらに、重亜硫酸塩転換ＤＮＡから増幅したＰＣＲ生成物の制限酵素消化が使用される。例えば、SadriおよびHornsby（Nucl. Acids Res. 24:5058-5059, 1996）、あるいはＣＯＢＲＡ（組合せ重亜硫酸塩制限分析）（XiongおよびLaird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997）により記載される方法。
【００８０】
ＣＯＢＲＡ。ＣＯＢＲＡ分析は、少量のゲノムＤＮＡ中の特異的遺伝子座位でＤＮＡのメチル化レベルを定量するのに有用な定量メチル化アッセイである（XiongおよびLaird, Nucleic Acids Res. 25:2532-2534, 1997）。手短に言えば、制限酵素消化を使用して、重亜硫酸ナトリウム処理したＤＮＡのＰＣＲ生成物のメチル化依存的配列の差異を明らかにする。最初に、メチル化依存的配列の差異をFrommerら（Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:1827-1831, 1992）が記載した手順に従って、標準的重亜硫酸塩処理によりゲノムＤＮＡに導入する。次いで、当該ＣｐＧアイランドに特異的なプライマーを使用し、重亜硫酸塩転換ＤＮＡをＰＣＲ増幅し、続いて制限エンドヌクレアーゼによる消化、ゲル電気泳動、および特異的な標識ハイブリッド形成プローブを使用する検出を行う。本来のＤＮＡ試料中のメチル化レベルは、消化および未消化ＰＣＲ生成物の相対量により、広範囲なＤＮＡメチル化レベルにわたって直線的な定量的方式で表される。さらに、この技術は、顕微鏡で切片化したパラフィン包埋組織試料から得たＤＮＡに確実に適用することができる。（例えば、典型的なＣＯＢＲＡベースのキット中に見られるであろう）典型的なＣＯＢＲＡ分析用試薬には、それだけには限らないが、特異的遺伝子用ＰＣＲプライマー（または重亜硫酸塩処理したＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランド）、制限酵素および適当な緩衝液、遺伝子ハイブリッド形成オリゴ、対照ハイブリッド形成オリゴ、オリゴプローブ用キナーゼ標識化キット、ならびに標識したヌクレオチドが含まれうる。加えて、重亜硫酸塩転換試薬には、ＤＮＡ変性化緩衝液、スルホン化緩衝液、ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティカラム）、脱スルホン化緩衝液、ならびにＤＮＡ回収成分が含まれうる。
【００８１】
好ましい、「ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）」（蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ法）（Eadsら, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999）、Ｍｓ‐ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長法）反応（GonzalgoおよびJones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997）およびメチル化特異的ＰＣＲ（「ＭＳＰ」；Hermanら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996；米国特許第５，７８６，１４６号）などのアッセイは、単独でまたはこうした方法の他の方法と共に組み合わせて使用される。
【００８２】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ＰＣＲステップ後にそれ以上の操作を必要としない、蛍光を基にしたリアルタイムＰＣＲ（TaqMan（商標））技術を利用するハイスループット定量メチル化アッセイである（Eadsら, Cancer Res. 59:2302-2306, 1999）。手短に言えば、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）過程は、ゲノムＤＮＡの試料を混合することから始まり、この混合試料は、標準手順に従って重亜硫酸ナトリウム反応中に、メチル化依存的な配列の違いを混合したプールに転化される（重亜硫酸塩過程によって、メチル化していないシトシン残基はウラシルに転換される）。次いで、蛍光ベースのＰＣＲを（既知のＣｐＧのメチル化部位と重複しないプライマーによる）「不偏的な」ＰＣＲ反応、または（既知のＣｐＧジヌクレオチドと重複するプライマーによる）「偏った」反応中で実施する。配列の判別は、その増幅過程のレベル、その蛍光検出過程のレベル、またはその両方のレベルで行うことができる。
【００８３】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）アッセイは、ゲノムＤＮＡ試料中のメチル化パターンについての定量試験として使用することができ、その際、配列の判別はプローブのハイブリッド形成のレベルで行う。この定量型では、ＰＣＲ反応によって、特定の推定メチル化部位に重複する蛍光プローブの存在下で、不偏的な増幅が行われる。プライマーだけでなくプローブも、どのＣｐＧジヌクレオチドにも重ならない反応によって、投じたＤＮＡ量について不偏的な制御がなされる。あるいは、既知のメチル化部位を「包含」しない対照オリゴヌクレオチド（「ＭＳＰ」技術の蛍光ベース型）で、または潜在的メチル化部位を包含するオリゴヌクレオチドで、偏ったＰＣＲプールをプロービングすることによってゲノムのメチル化に関して定性試験を行う。
【００８４】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）過程は、増幅過程で「TaqMan（登録商標）」プローブと共に使用することができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムで処理し、TaqMan（登録商標）プローブを使用し、例えば、偏ったプライマーとTaqMan（登録商標）プローブと共に、あるいは不偏的なプライマーとTaqMan（登録商標）プローブと共に２セットのＰＣＲ反応の一つにかける。TaqMan（登録商標）プローブは、蛍光「レポーター」および「クエンチャー」分子で二重標識し、比較的高ＧＣ含量領域に特異的であるように設計されており、その結果、ＰＣＲサイクル中に前進または逆進プライマーよりも約１０℃高い温度で融解する。これにより、ＰＣＲアニーリング／伸長ステップ中に、TaqMan（登録商標）プローブを完全にハイブリッド形成したまま残すことができる。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲ中に新規な鎖を酵素により合成するので、結果としてアニールしたTaqMan（登録商標）プローブがもたらされる。次いで、Ｔａｑポリメラーゼ５'→３'エンドヌクレアーゼ活性は、TaqMan（登録商標）プローブを消化することによってこのプローブを転置して蛍光レポーター分子を遊離し、リアルタイム蛍光検出システムを使用して、今回消光していないシグナルを定量検出する。
【００８５】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）分析用の（例えば、典型的なＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）ベースのキット中に見られるであろう）典型的な試薬には、それだけには限らないが、特異的遺伝子用ＰＣＲプライマー（または重亜硫酸塩処理したＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランド）、TaqMan（登録商標）プローブ、最適化したＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド、ならびにＴａｑポリメラーゼが含まれうる。
【００８６】
Ｍｓ‐ＳＮｕＰＥ。Ｍｓ‐ＳＮｕＰＥ技術は、ＤＮＡの重亜硫酸塩処理、続いて単一ヌクレオチドプライマー伸長法に基づく、特異的ＣｐＧ部位でのメチル化の違いを評価するための定量法である（GonzalgoおよびJones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997）。手短に言えば、ゲノムＤＮＡを重亜硫酸ナトリウムと反応させて、５‐メチルシトシンを変化させずに、メチル化していないシトシンをウラシルに転換する。次いで、重亜硫酸塩転換ＤＮＡに特異的なＰＣＲプライマーを用いて、所望の標的配列を増幅し、得られた生成物を単離し、当該ＣｐＧ部位でのメチル化を分析するための鋳型として使用する。少量のＤＮＡは、分析することができ（例えば、顕微鏡で切り取った病理切片）、それによりＣｐＧ部位のメチル化状況を定量するための制限酵素を利用しない。
【００８７】
Ｍｓ‐ＳＮｕＰＥ分析用の典型的な試薬（例えば、典型的なＭｓ‐ＳＮｕＰＥベースのキットに見られるであろう）には、それだけには限らないが、特異的遺伝子用ＰＣＲプライマー（または重亜硫酸塩処理したＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランド）、最適化したＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド、ゲル抽出キット、正の対照プライマー、特異的遺伝子用Ｍｓ‐ＳＮｕＰＥプライマー、反応緩衝液（Ｍｓ‐ＳＮｕＰＥ反応用）、ならびに標識したヌクレオチドが含まれうる。加えて、重亜硫酸塩転換試薬には、ＤＮＡ変性化緩衝液、スルホン化緩衝液、ＤＮＡ回収試薬またはキット（例えば、沈殿、限外濾過、アフィニティカラム）、脱スルホン化緩衝液、ならびにＤＮＡ回収成分が含まれうる。
【００８８】
ＭＳＰ。ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）によって、メチル化感受性制限酵素の使用に依存せずに、ＣｐＧアイランド中のＣｐＧ部位の事実上どんな基のメチル化状況も評価できるようなる（Hermanら Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93:9821-9826, 1996；米国特許第５，７８６，１４６号）。手短に言えば、ＤＮＡは、メチル化したシトシン以外の全ての非メチル化シトシンをウラシルに転換する重亜硫酸ナトリウムによって修飾され、続いてそのＤＮＡは、非メチル化ＤＮＡに対してメチル化したＤＮＡに特異的なプライマーによって増幅される。ＭＳＰは、少量のＤＮＡしか必要とせず、所与のＣｐＧアイランド座位の０．１％メチル化した対立遺伝子にも感受性であり、パラフィン包埋試料から抽出したＤＮＡに対して実施することができる。（例えば、典型的なＭＳＰベースのキットに見られるであろう）ＭＳＰ分析用典型的な試薬には、それだけには限らないが、メチル化した、および非メチル化特異的遺伝子用ＰＣＲプライマー（または重亜硫酸塩処理したＤＮＡ配列もしくはＣｐＧアイランド）、最適化したＰＣＲ緩衝液およびデオキシヌクレオチド、ならびに特異的プローブが含まれうる。
【００８９】
配列番号１〜配列番号１１８に記載のゲノム配列、および配列番号４９３〜配列番号９６４に記載の自然に存在しない処理したその変異体を乳房細胞増殖性疾患の検出、分類、および／または治療に使用するために定量した。
【００９０】
一実施形態では、本発明は、対象である乳房細胞増殖性疾患を検出し、かつ／またはその疾患間で検出区別する方法を提供する。前記方法は以下のステップを含む。
ｉ）対象から得たゲノムＤＮＡと、そのゲノムＤＮＡの少なくとも一個の標的領域中のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも一種の試薬または一連の試薬を接触させる、前記近接するヌクレオチドが少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、そして
ｉｉ）乳房細胞増殖性疾患を検出し、またはその疾患間で検出区別すること。
【００９１】
前記ゲノムＤＮＡは、対象の体液から単離するのが特に好ましい。前記体液は、乳頭吸引液、リンパ液、乳管洗浄液、極細針吸引物、血漿、血清、全血、単離した血液細胞、血液から単離した細胞からなる群から選択されるのがさらに好ましい。
【００９２】
ゲノムＤＮＡは、市販キットの使用を含め、当技術分野で標準的な任意の手段によって単離することができる。手短に言えば、当該ＤＮＡが細胞膜に包まれている場合、生物試料は酵素的、化学的、または機械的手段によって破壊され溶解するはずである。次いで、例えば、プロテイナーゼＫで消化することによって、ＤＮＡ溶液から蛋白質や他の夾雑物を除去することができる。次いで、その溶液からゲノムＤＮＡを回収する。これは、塩析、有機抽出、または固相支持体へのＤＮＡの結合を含む様々な方法によって実施することができる。方法の選択は、時間、費用、および必要なＤＮＡ量を含む幾つかの要因によって影響される。
【００９３】
次いで、５'位置で非メチル化シトシン塩基が、ウラシル、チミン、またはハイブリッド形成挙動の点でシトシンと異なる別の塩基に転換されるようにそのゲノムＤＮＡ試料を処理する。本明細書では、これは「処理」として理解されたい。
【００９４】
これは、重亜硫酸塩試薬で処理することによって実現するのが好ましい。「重亜硫酸塩試薬」という語は、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩またはそれらの組合せを含む試薬をさし、本明細書に開示した通りメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するのに有用である。前記処理法は当技術分野で公知である（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５、その全体を参照により組み込む）。重亜硫酸塩処理は、それだけには限らないが、ｎ‐アルキレングリコール、特に、ジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）などの変性化溶媒の存在下で、あるいはジオキサンまたはジオキサン誘導体の存在下で実施するのが好ましい。好ましい実施形態では、変性化溶媒は１％〜３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用する。重亜硫酸塩反応は、それだけには限らないが、クロマン誘導体、例えば、６‐ヒドロキシ‐２，５，７，８，‐テトラメチルクロマン２‐カルボン酸などのスカベンジャーの存在下で実施するのも好ましい（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照。その全体を参照により組み込む）。重亜硫酸塩転換は、３０℃〜７０℃の反応温度で実施し、それによって反応中短時間に温度を８５℃以上に上昇させるのが好ましい（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照。その全体を参照により組み込む）。重亜硫酸塩処理したＤＮＡは、精製した後、さらに分析するのが好ましい。これは、それだけには限らないが、限外濾過などの当技術分野で公知の任意の手段によって実施することができ、Microcon（商標）カラム（Millipore（商標）社製）によって実施するのが好ましい。精製は、手直しした製造業者のプロトコルに従って実施する（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照。その全体を参照により組み込む）。
【００９５】
次いで、乳癌の発生に付随する、一個または複数の（処理前）標的遺伝子配列のメチル化状態を定量するために処理したＤＮＡを分析する。その標的領域は、表３に示す遺伝子およびゲノム配列からなる群から選択される、少なくとも一個の遺伝子またはゲノム配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成するのが特に好ましい。添付の配列表に記載されている、表３の前記遺伝子配列を分析するのがさらに好ましい。分析方法は、本明細書に収載されているものを含め、当技術分野で公知のものから選択しうる。特に好ましいものは、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）、ＭＳＰ、および本明細書に記載するようなブロッキングオリゴヌクレオチドの使用である。そのような分析で使用される、（プライマー、ブロッキングオリゴヌクレオチドおよび検出プローブを含む）任意のオリゴヌクレオチドは、配列番号４９３〜配列番号９６４およびそれらに相補的な配列の一つまたは複数の塩基配列の少なくとも１６塩基対長のセグメントと逆相補的であり、同一であり、またはストリンジェントまたは高度にストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成するのがさらに好ましい。
【００９６】
異常なメチル化、より好ましくは、表３に示すものから得た一個または複数の遺伝子またはゲノム配列の高メチル化は乳癌の存在に関連する。その配列の一つまたは複数を分析することによって、乳房細胞増殖性疾患を検出し、またはその疾患間で検出区別できるようになる。
【００９７】
一実施形態では、本方法は、乳癌検出用マーカーとして、APC, ARH1/NOEY2, BRCA2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, MLH1, PGR, SERPINB5, RARB, SFN, SOD2, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, IL6, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, RARA, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, BRCA1, LOT1, PRSS8, SNCG, TPM1, GPC3, CLDN7, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される一個または複数の遺伝子またはゲノム配列の使用を開示している。
【００９８】
前記遺伝子および／または配列の使用は、任意の遺伝子発現分析、ｍＲＮＡ発現分析、または蛋白質発現分析によって可能となりうる。しかし、本発明の最も好ましい実施形態では、乳房細胞増殖性疾患の検出は、前記遺伝子またはゲノム配列、ならびにそのプロモータまたは調節エレメントのメチル化状況を分析することによって可能になる。遺伝子のメチル化を分析する方法は本明細書に記載されている。
【００９９】
PRDM2, PLAU, GSTP1, SLIT2, CCND2, HOXA5, RASSF1A, HS3ST2, ARH1/NOEY2, SCGB3A1, LIMK-1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 31からなる群から得た唯一の遺伝子またはゲノム配列の発現レベルを分析するのも好ましい。これは、メチル化を分析することによって実施するのが特に好ましい。
【０１００】
一実施形態では、本方法は、乳癌と他の癌の区別するためのマーカーとして、ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, SERPINB5, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, IL6, APAF1, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, LOT1, GPC3, CLDN7, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), LIM DOMAIN KINASE 1, MGC34831, SEQ ID NO: 54, MSF, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, NR2E1, PCDH7, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 28, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, MGC10561, LMX1A, SENP3, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 45, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される一個または複数の遺伝子またはゲノム配列の使用を開示している。前記のそれらの遺伝子および／または配列の使用は、任意の遺伝子発現分析、ｍＲＮＡ発現分析、または蛋白質発現分析によって可能となりうる。しかし、本発明の最も好ましい実施形態では、乳房細胞増殖性疾患の検出は、前記遺伝子またはゲノム配列、ならびにそのプロモータまたは調節エレメントのメチル化状況を分析することによって可能になる。遺伝子のメチル化を分析する方法は本明細書に記載されている。
【０１０１】
前記実施形態では、PRDM2, GSTP1, ALX4, HOXA5, PLAU, RASSF1A, IGSF4, SLIT2, DAPK1, CDKN1A, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 35, LIMK-1, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 47からなる群から得た唯一の遺伝子またはゲノム配列の発現レベルを分析するのがさらに好ましい。これは、メチル化を分析することによって実施するのが特に好ましい。
【０１０２】
一実施形態では、本方法は、乳癌細胞と末梢血リンパ球を区別することによる、血液または血液由来液体中の乳癌細胞検出用マーカーとして、APC, ARH1/NOEY2, CCND2, CDH1, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, PGR, SERPINB5, RARB, SFN, SOD2, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, IL6, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, BRCA1, LOT1, PRSS8, SNCG, GPC3, CLDN7, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される一個または複数の遺伝子またはゲノム配列の使用を開示している。前記のそれらの遺伝子および／または配列の使用は、任意の遺伝子発現分析、ｍＲＮＡ発現分析、または蛋白質発現分析によって可能となりうる。しかし、本発明の最も好ましい実施形態では、乳房細胞増殖性疾患の検出は、前記遺伝子またはゲノム配列、ならびにそのプロモータまたは調節エレメントのメチル化状況を分析することによって可能になる。遺伝子のメチル化を分析する方法は本明細書に記載されている。
【０１０３】
前記実施形態では、 乳癌細胞と末梢血リンパ球を区別することによって、血液または血液由来液体中で乳癌細胞を検出するために、FABP3, RASSF1A, MSF, PRDM6, LMX1A, SEQ ID NO: 4 , SCGB3A1, SLIT2, NR2E1, EYA4, PRDM2, SERPINB5, TWIST, STAT1, ALX4, IGFBP7, DAPK1, THBS1, PLAU, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 6, LIMK-1, SEQ ID NO: 46からなる群から得た唯一の遺伝子またはゲノム配列の発現レベルを分析するのがさらに好ましい。前記のそれらの遺伝子および／または配列の使用は、任意の遺伝子発現分析、ｍＲＮＡ発現分析、または蛋白質発現分析によって可能となりうる。しかし、本発明の最も好ましい実施形態では、乳房細胞増殖性疾患の検出は、前記遺伝子またはゲノム配列、ならびにそのプロモータまたは調節エレメントのメチル化状況を分析することによって可能になる。遺伝子のメチル化を分析する方法は本明細書に記載されている。
【０１０４】
一実施形態では、本方法は、ＤＣＩＳと良性乳房疾患を区別するためのマーカーとして、APC, ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, MLH1, PGR, SERPINB5, RARB, SOD2, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, RARA, TWIST, ESR2, PLAU, SEQ ID NO: 4, SNCG, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 36, LMX1A, SENP3, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される一個または複数の遺伝子またはゲノム配列の使用を開示している。本明細書で使用する「良性乳房疾患」という語は、健康な乳房組織、線維腺腫、線維嚢胞疾患、および異型乳管過形成を含むと理解されたい。前記のそれらの遺伝子および／または配列の使用は、任意の遺伝子発現分析、ｍＲＮＡ発現分析、または蛋白質発現分析によって可能となりうる。しかし、本発明の最も好ましい実施形態では、乳房細胞増殖性疾患の検出は、前記遺伝子またはゲノム配列、ならびにそのプロモータまたは調節エレメントのメチル化状況を分析することによって可能になる。遺伝子のメチル化を分析する方法は本明細書に記載されている。
【０１０５】
HS3ST2, SLIT2, RASSF1A, GSTP1, GJB2, IGFBP7, CDH13, ARH1/NOEY2, SCGB3A1, FHIT, SEQ ID NO: 27, LIMK-1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 24からなる群から得た唯一の遺伝子またはゲノム配列の発現レベルを分析するのも好ましい。これは、メチル化を分析することによって実施するのが特に好ましい。
【０１０６】
一実施形態では、本方法は、乳癌と良性乳房疾患の区別するためのマーカーとして、ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, SERPINB5, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, IL6, APAF1, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, LOT1, GPC3, CLDN7, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される一個または複数の遺伝子またはゲノム配列の使用を開示している。本明細書で使用する良性乳房疾患という語は、健康な乳房組織、線維腺腫、線維嚢胞疾患、および異型乳管過形成を含むと理解されたい。前記のそれらの遺伝子および／または配列の使用は、任意の遺伝子発現分析、ｍＲＮＡ発現分析、または蛋白質発現分析によって可能となりうる。しかし、本発明の最も好ましい実施形態では、乳房細胞増殖性疾患の検出は、前記遺伝子またはゲノム配列、ならびにそのプロモータまたは調節エレメントのメチル化状況を分析することによって可能になる。遺伝子のメチル化を分析する方法は本明細書に記載されている。
【０１０７】
SLIT2, HS3ST2, HOXA5, ARH1/NOEY2, IGFBP7, PLAU, CDH13, TIMP3, CCND2, GSTP1, SEQ ID NO: 117, LIMK-1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 41,SEQ ID NO: 27,SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 4からなる群から得た唯一の遺伝子またはゲノム配列の発現レベルを分析するのも好ましい。これは、メチル化を分析することによって実施するのが特に好ましい。
【０１０８】
それらの遺伝子、表３に記載のゲノム配列により調節されるゲノム配列または遺伝子の異常なｍＲＮＡの発現レベルは、乳房細胞増殖性疾患に関連付けられる。従って、ＰＲＤＭ２およびＳ１００Ａ７を除く、前記遺伝子または配列の全ての発現レベルの低下は、乳癌および他の乳房細胞増殖性疾患の発生に関連付けられる。ＰＲＤＭ２およびＳ１００Ａ７の発現レベルの上昇は、乳癌および他の乳房細胞増殖性疾患の発生に関連付けられる。
【０１０９】
乳癌検出系中の遺伝子またはゲノム配列をコードするｍＲＮＡの存在を検出するためには試料を患者から得る。試料は、組織生検試料または血液試料、血漿、血清などであってよい。試料は、その中に含まれる核酸を抽出するために処理してよい。試料から得た核酸は、ゲル電気泳動または他の分離技術にかける。検出には、その試料の核酸、特にｍＲＮＡと、プローブとして役立つＤＮＡ配列を接触させて、ハイブリッド二重鎖を形成することが含まれる。ハイブリッド形成のストリンジェンシーは、温度、イオン強度、時間、およびホルムアミド濃度を含む、ハイブリッド形成中および洗浄手順中のいくつかの要因によって決定する。これらの要因は、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning: A Laboratory Manual,第２版, 1989）に概略されている。得られた二重鎖の検出は、通常、標識したプローブの使用によって行う。あるいは、プローブは未標識でもよいが、直接的または間接的に標識したリガンドとの特異的結合によって検出可能である。プローブおよびリガンドを標識するのに適当な標識および方法は、当技術分野で公知であり、例えば、公知の方法（例えば、ニックトランスレーションまたはキナーゼ処理）によって組み込みうる放射性標識、ビオチン、蛍光基、化学発光基（例えば、ジオキセタン、特に誘発したジオキセタン）、酵素、抗体などが含まれる。
【０１１０】
それらの遺伝子またはゲノム配列から転写されたｍＲＮＡ試料中で検出感受性を高めるために、逆転写／重合連鎖反応技術をｍＲＮＡから転写したｃＤＮＡを増幅するために使用することができる。逆転写／ＰＣＲの方法は、当技術分野で周知である（例えば、上記WatsonおよびFlemingを参照）。
【０１１１】
逆転写／ＰＣＲ法は、以下のように実施することができる。全細胞ＲＮＡを、例えば、標準的イソチオシアン酸グアニジウム法によって単離し、全ＲＮＡを逆転写する。逆転写法には、逆転写酵素および３'末端プライマーを使用するＲＮＡ鋳型でのＤＮＡの合成が関与する。典型的には、そのプライマーはオリゴ（ｄＴ）配列を含む。次いで、そのようにして生成されたｃＤＮＡをＰＣＲ法および特異的プライマーを使用し増幅する。（Belyavskyら, Nucl Acid Res 17:2919-2932, 1989；KrugおよびBerger, Methods in Enzymology, Academic Press,N.Y., Vol.152, pp. 316-325, 1987これらを参照により組み込む）
【０１１２】
本発明は、生物試料を検査することにより乳房細胞増殖性疾患状態を検出する際に使用されるキットとしてある実施形態に記載することができる。代表的なキットは、ｍＲＮＡと選択的にハイブリッド形成する一個または複数の核酸セグメント、ならびに一個または複数の核酸セグメントのそれぞれを入れるための容器を含みうる。ある実施形態では、それらの核酸セグメントは一本の試験管中に混合されている。別の実施形態では、それらの核酸セグメントには、その標的ｍＲＮＡを増幅するための１対のプライマーを含みうる。そのようなキットには、任意の緩衝液、溶液、溶媒、酵素、ヌクレオチド、またはハイブリッド形成、増幅または検出反応させるための他の成分を含めることができる。好ましいキット成分は、逆転写ＰＣＲ、ｉｎ‐ｓｉｔｕハイブリッド形成、ノーザン分析および／またはＲＰＡのための試薬を含む。
【０１１３】
本発明は、患者から得た試料中で前記遺伝子または遺伝子配列によってコードされるポリペプチドの存在を検出する方法をさらに提供する。
【０１１４】
遺伝子、表３に示すゲノムの領域の遺伝子およびゲノム配列全てからなる群のゲノム配列によって調節されるゲノム配列または遺伝子によってコードされるポリペプチドのポリペプチド発現の異常なレベルは乳癌に関連する。従って、ＰＲＤＭ２およびＳ１００Ａ７遺伝子によってコードされるポリペプチドを除いて、前記ポリペプチドの過剰発現は、乳癌および他の乳房細胞増殖性疾患の発生に関連する。ＰＲＤＭ２およびＳ１００Ａ７の過剰発現は、乳癌および他の乳房細胞増殖性疾患の発生に関連付けられる。
【０１１５】
蛋白質を検出するための当技術分野で公知の任意の方法を使用することができる。そのような方法には、それだけには限らないが免疫拡散法、免疫電気泳動法、免疫化学的方法、バインダー‐リガンドアッセイ、免疫組織化学的技術、凝集反応、および補体アッセイが含まれる。（例えば、Basic and Clinical Immunology, SitesおよびTerr, 編, Appleton and Lange, Norwalk, Conn. pp 217-262, 1991を参照。これを参照により組み込む）。好ましいものは、抗体を一個のエピトープまたは複数のエピトープと反応させることおよび標識蛋白質またはその誘導体を競合的に転置することを含むバインダー‐リガンドイムノアッセイ法である。
【０１１６】
本発明のある実施形態は、下表３に示すゲノムの領域の遺伝子およびゲノム配列全てからなる群の遺伝子またはゲノム配列によってコードされるポリペプチドに特異的な抗体の使用を含む。
【０１１７】
そのような抗体は、患者の乳房疾患マーカー発現レベルと、健常な個人での同じマーカーの発現を比較することにより、疾患状態の検出において、診断および予後の適用に使用することができる。ある実施形態では、モノクローナルまたはポリクローナル抗体の生成は、そのコードされたポリペプチドを抗原として使用することによって誘発することができる。発現した蛋白質を検出するために、そのような抗体をヒトの疾患状態用のマーカーとして順次使用してよい。患者の末梢血または組織試料中に存在する、そのような蛋白質のレベルは慣用法によって数量化しうる。抗体‐蛋白質結合は、蛍光性または放射性リガンドによる標識など、当技術分野で公知の様々な手段によって、検出し数量化することができる。本発明は、さらに、上記の手順を実施するためのキット含み、その場合、そのようなキットには検査したポリペプチドに特異的な抗体が含まれる。
【０１１８】
多数の競合的および非競合的な蛋白質結合イムノアッセイは当技術分野で周知である。そのようなアッセイで使用する抗体は、例えば、凝集反応試験で使用するものなど、未標識でもよく、または広範なアッセイ法で使用するために標識してよい。使用できる標識には、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ例えば酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、蛍光イムノアッセイなどで使用するための放射性核種、酵素、蛍光剤、化学冷光剤、酵素基質または補助因子、酵素阻害剤、粒子、色素などが含まれる。ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体またはそのエピトープは、イムノアッセイで使用するために、当技術分野で公知のいくつかの方法のどれかによって作製することができる。蛋白質に対する抗体を調製するための一手法は、蛋白質の全てまたは一部のアミノ酸配列を選択し調製し、その配列を化学的に合成し、適当な動物、通常ウサギまたはマウスにそれを注入することである（MilsteinおよびKohler Nature 256:495-497, 1975；GulfreおよびMilstein, Methods in Enzymology: Immunochemical Techniques 73:1-46, LangoneおよびBanatis 編, Academic Press, 1981これらを参照により組み込む）。ポリペプチドまたはそのエピトープの調製方法には、それだけには限らないが化学合成、組換えＤＮＡ技術、または生物試料からの単離が含まれる。
【０１１９】
別の実施形態では、本発明は、表３に示すゲノムの領域の遺伝子およびゲノム配列全ておよび／またはその調節配列からなる群から得た２個以上の遺伝子またはゲノム配列内のメチル化レベルの分析に基づく。前記遺伝子配列またはゲノム配列は配列番号１〜配列番号１１８に記載のものであることがさらに好ましい。
【０１２０】
本発明の特定の実施形態は、乳房細胞増殖性疾患の正確な検出および／または特徴付けを可能にする、前記配列中のメチル化状況、メチル化レベル、および／またはメチル化パターンの分析の新規な適用を提供する。乳房細胞増殖性疾患の初期検出は、疾患の予後に直接関連し、従って開示した方法によって内科医および患者が早くより納得のいく治療決定を行えるようになる。
【０１２１】
さらなる改良
本発明は、配列番号１〜配列番号１１８からなる群から選択されるゲノム配列の新規な使用を提供する。別の実施形態は、配列番号１〜配列番号１１８の修飾された変異体、特に化学的に修飾された変異体、ならびに配列番号１〜配列番号１１８からなる群内の、シトシンのメチル化パターンを分析するためのオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマーを提供する。
【０１２２】
本発明の目的は、配列番号１〜配列番号１１８からなる群から選択されるゲノム配列およびそれらに相補的な配列の少なくとも一個中の一個または複数のＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の分析を含む。
【０１２３】
開示した発明は、ゲノムの配列番号１〜配列番号１１８に由来する処理した核酸であって、その処理が、そのゲノムＤＮＡ配列の少なくとも一個の非メチル化シトシン塩基を、ウラシルまたはハイブリッド形成の点でシトシンと検出可能に異なる別の塩基に転換するのに適している核酸を提供する。当該ゲノム配列は、一つ以上の連続的なまたはランダムにメチル化したＣｐＧ位置を含みうる。前記処理は、重亜硫酸塩、亜硫酸水素塩、二亜硫酸塩、およびそれらの組合せからなる群から選択される試薬の使用を含むのが好ましい。好ましい実施形態では、本発明は、配列番号４９３〜配列番号９６４からなる群から選択される配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチド塩基長の配列を含む自然に存在しない修飾核酸であって、その際、前記配列は少なくとも一個のＣｐＧ、ＴｐＡまたはＣｐＡジヌクレオチドならびにそれらに相補的な配列を含む核酸を提供する。配列番号４９３〜配列番号９６４の配列は、配列番号１〜配列番号１１８に記載の核酸の自然に存在しない修飾型を提供し、その際、各ゲノム配列を修飾することによって、特有かつ以下の前記ゲノム配列とは異なる配列の核酸が合成される。特に好ましいものは、一個または複数のメチル化したＣｐＧ位置を有するヒトゲノムＤＮＡを含む、ヒトゲノムＤＮＡの一部と同一ではない配列を有する核酸である。
【０１２４】
各センス鎖ゲノムＤＮＡ、例えば、配列番号１には、４つの転換されたバージョンが開示されている。「Ｃ」が「Ｔ」に転換されているが、「ＣｐＧ」は依然として「ＣｐＧ」のままである第一のバージョン（すなわち、ゲノム配列では、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化し、従って転換していないという事例に対応する）、第２バージョンは、開示したゲノムＤＮＡ配列の相補鎖（すなわちアンチセンス鎖）を開示し、その場合、「Ｃ」は「Ｔ」に転換しているが、「ＣｐＧ」は依然として「ＣｐＧ」のままである（すなわち、ＣｐＧジヌクレオチド配列の全ての「Ｃ」残基がメチル化し、従って転換していないという事例に対応する）。配列番号１〜配列番号１１８の「高メチル化」転換した配列が配列番号４９３〜配列番号７２８に対応する。第３の各ゲノム配列の化学的に転換したバージョンを提供するが、その場合「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のものも含め、全「Ｃ」残基について「Ｃ」は「Ｔ」に転換されている（すなわち、ゲノム配列について、ＣｐＧジヌクレオチド配列の「Ｃ」残基が全て、メチル化していないという事例に対応する）、最後の各配列の化学的に転換したバージョンは、開示したゲノムＤＮＡ配列の相補鎖（すなわちアンチセンス鎖）を開示しており、その場合、全ての「Ｃ」残基について「Ｃ」は「Ｔ」に転換され、「ＣｐＧ」ジヌクレオチド配列のものが含まれる（すなわち、各ゲノム配列の相補鎖（アンチセンス鎖）について、ＣｐＧジヌクレオチド配列の「Ｃ」残基は全て、メチル化していないという事例に対応する）。配列番号１〜配列番号１１８の「低メチル化」転換した配列が配列番号７２９〜配列番号９６４に対応する。
【０１２５】
代替的な好ましい実施形態では、本発明による方法は、配列番号１〜配列番号９６４に記載のゲノムＤＮＡまたは処理した（化学的に修飾された）ＤＮＡ中のシトシンのメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を含む。前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、配列番号４９３〜配列番号９６４に記載の処理した核酸配列および／またはそれらに相補的な配列、あるいは配列番号１〜配列番号１１８に記載のゲノム配列および／またはそれらに相補的な配列と、（本明細書に上記した）中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下で、ハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の核酸配列を含む。
【０１２６】
従って、本発明は、中程度にストリンジェントおよび／またはストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、配列番号１〜配列番号９６４の配列またはその相補鎖の、すべてまたは一部とハイブリッド形成する、少なくとも９ヌクレオチド長の核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）分子（ＰＮＡオリゴマー）を提供する。
【０１２７】
特に好ましいものは、中程度にストリンジェントおよび／またはストリンジェントなハイブリッド形成条件下で、配列番号４９３〜配列番号９６４の配列またはその相補鎖のすべてまたは一部とハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）分子であり、その際、前記配列は少なくとも一個のＣｐＧ、ＴｐＡまたはＣｐＡジヌクレオチドを含み、さらに前記配列は、一個または複数のメチル化したＣｐＧ位置を有するヒトゲノムＤＮＡを含むヒトゲノムＤＮＡの一部と同一ではない。
【０１２８】
ハイブリッド形成核酸のハイブリッド形成部分は、典型的には、少なくとも９、１５、２０、２５、３０または３５ヌクレオチド長である。しかし、分子が長いほど、発明的有用性があり、すなわち本発明の範囲に含まれる。
【０１２９】
本発明のハイブリッド形成核酸のハイブリッド形成部分は、配列番号１〜配列番号９６４またはその相補鎖の配列またはその一部と少なくとも９５％、少なくとも９８％、または１００％同一であるのが好ましい。
【０１３０】
本明細書に記載した種類のハイブリッド形成核酸は、例えば、プライマー（例えば、ＰＣＲプライマー）として、または診断および／または予後用のプローブまたはプライマーとして使用することができる。オリゴヌクレオチドプローブと核酸試料のハイブリッド形成は、ストリンジェント条件下で実施し、プローブは標的配列と１００％同一であることが好ましい。核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性は、融解温度すなわちＴｍとして表され、この温度はプローブが標的ＤＮＡから解離する温度である。この融解温度を使用して必要なストリンジェンシー条件を限定する。
【０１３１】
配列番号１〜配列番号９６４（対立形質変異体やＳＮＰなど）の対応する配列に関連し、同一というよりは実質的に同一である標的配列には、まず、特定の塩濃度（例えばＳＳＣやＳＳＰＥ）で相同のハイブリッド形成しか生じない最低温度を定めるのが有用である。次いで、１％のミスマッチングがＴｍを１℃低下させると仮定して、ハイブリッド形成反応の最終洗浄温度をそれに応じて低下させる（例えば、プローブと＞９５％同一である配列を探し求める場合、最終洗浄温度を５℃低下させる）。実際には、ミスマッチ１％につきＴｍの変化は０．５℃〜１．５℃であろう。
【０１３２】
例えば、配列番号１に関するポリヌクレオチド位置によって示されるように、長さＸ（ヌクレオチド中）の本発明のオリゴヌクレオチドの例には、長さＸの連続重複するオリゴヌクレオチドセット（センスおよびアンチセンスセット）に対応するものが含まれ、その場合、（所与のＸ値に対応する）各連続重複するセット内のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド位置からＺオリゴヌクレオチドの有限セットとして定義される。
ｎ〜（ｎ＋（Ｘ‐１））、
その場合、ｎ＝１、２、３、…（Ｙ‐（Ｘ‐１））、
その場合、Ｙは配列番号１（６４３５）の長さ（ヌクレオチドまたは塩基対）に等しく、
その場合、Ｘはセット中の各オリゴヌクレオチドに共通する長さ（ヌクレオチド中）に等しく（例えば、連続重複する２０‐ｍｅｒのセットではＸ＝２０）、かつ
その場合、長さＹの所与の配列番号では、長さＸの連続重複するオリゴマーの数（Ｚ）はＹ‐（Ｘ‐１）に等しい。
例えば、配列番号１（Ｘ＝２０）のセンスまたはアンチセンスセットでは、Ｚ＝６４３５‐１９＝６４１６。
【０１３３】
本発明の２０‐ｍｅｒオリゴヌクレオチドの例には、配列番号１：１〜２０、２〜２１、３〜２２、４〜２３、５〜２４など．．．６４１６〜６４３５に関して、ポリヌクレオチド位置によって示される、以下の６４１６オリゴマーセット（およびその相補的なアンチセンスセット）が含まれる。 
【０１３４】
同様に、本発明の２５‐ｍｅｒオリゴヌクレオチドの例には、配列番号１：１〜２５、２〜２６、３〜２７、４〜２８、５〜２９など．．．６４０８〜６４３３、６４０９〜６４３４および６４１０〜６４３５に関してポリヌクレオチド位置によって示される、以下の６４１０オリゴマーセット（およびそれに相補的アンチセンスセット）が含まれる。
【０１３５】
セットは、少なくとも一個のＣｐＧ、ＴｐＧ、またはＣｐＡジヌクレオチドを含むようなオリゴマーに限定するのが好ましい。
【０１３６】
本発明は、配列番号１〜配列番号９６４のそれぞれ（センスおよびアンチセンス）に向けて、長さＸ（例えば、Ｘ＝９、１０、１７、２０、２２、２３、２５、２７、３０、または３５ヌクレオチド）のオリゴヌクレオチドまたは修飾されたオリゴヌクレオチドの多数の連続した重複セットを包含する。
【０１３７】
本発明によるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、配列番号１〜配列番号１１８に対応するゲノム配列の遺伝子的およびエピジェネティックパラメータを確認するのに有用な効率的ツールを構成する。そのような長さＸのオリゴヌクレオチドまたは修飾されたオリゴヌクレオチドの好ましいセットは、配列番号１〜配列番号９６４（およびその相補鎖）に対応するオリゴマーのそのような連続重複セットである。前記オリゴマーは、少なくとも一個のＣｐＧ、ＴｐＧ、またはＣｐＡジヌクレオチドを含むのが好ましい。
【０１３８】
特に好ましくは、本発明によるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、ＣｐＧジヌクレオチド（またはその対応する転換されたＴｐＧもしくはＣｐＡジヌクレオチド）配列のシトシンが、そのオリゴヌクレオチドの中１／３内にあり、すなわち、オリゴヌクレオチドが、例えば、１３塩基長であり、ＣｐＧ、ＴｐＧ、またはＣｐＡジヌクレオチドが５'端から５〜９番目のヌクレオチド内に位置するようなものである。
【０１３９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドと一個または複数の部分（ｍｏｉｅｔｙ）またはコンジュゲートを化学的に結合することによって修飾し、そのオリゴヌクレオチドの活性、安定性、または検出率を高めることもできる。そのような部分またはコンジュゲートには、発色団、フルオロフォア、コレステロールなどの脂質、コール酸、チオエーテル、脂肪鎖、リン脂質、ポリアミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、パルミチル部分他が含まれ、例えば、米国特許第５，５１４，７５８号、同第５，５６５，５５２号、同第５，５６７，８１０号、同第５，５７４，１４２号、同第５，５８５，４８１号、同第５，５８７，３７１号、同第５，５９７，６９６号、および同第５，９５８，７７３号に開示されている。プローブは、特に好ましいペアリング特性を有するＰＮＡ（ペプチド核酸）の形態で存在してもよい。従って、オリゴヌクレオチドは、ペプチドなど、他の付属基を含んでよく、ハイブリッド形成誘発切断剤（Krolら, BioTechniques 6:958-976, 1988）または挿入剤(Zon, Pharm. Res. 5:539-549, 1988）を含んでもよい。そのために、オリゴヌクレオチドは、別の分子、例えば、発色団、フルオロフォア、ペプチド、ハイブリッド形成誘発架橋剤、輸送剤、ハイブリッド形成誘発切断剤などにコンジュゲートしうる。
【０１４０】
このオリゴヌクレオチドは、少なくとも一個の当技術分野で認識されている修飾糖および／または塩基部分を含んでもよく、あるいは、修飾された主鎖または非天然ヌクレオチド間の結合を含みうる。
【０１４１】
本発明の特定の実施形態によるオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、典型的には「セット」で使用され、このセットには配列番号１〜配列番号１１８ゲノム配列およびそれらに相補的な配列のＣｐＧジヌクレオチド、あるいは配列番号４９３〜配列番号９６４に記載の処理した核酸配列およびそれらに相補的な配列中のその対応するＣｐＧ、ＴｐＧ、またはＣｐＡジヌクレオチドに相補的な配列のそれぞれを分析するための少なくとも一個のオリゴマーが含まれる。しかし、経済的または他の要因で、前記配列中のＣｐＧジヌクレオチドの限られた選択物を分析するのが好ましく、それに応じてオリゴヌクレオチドセットの内容が変化すると推測される。
【０１４２】
従って、特定の実施形態では、本発明は、処理したゲノムＤＮＡ（配列番号４９３〜配列番号９６４）、またはゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号１１８およびそれらに相補的な配列）中、シトシンのメチル化状態の検出に有用な少なくとも２セット（オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー）を提供する。これらのプローブによって、乳房細胞増殖性疾患の診断ならびに／あるいは遺伝子的およびエピジェネティックパラメータ分類が可能になる。処理したゲノムＤＮＡ（配列番号４９３〜配列番号９６４）、またはゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号１１８およびそれらに相補的な配列）中の単ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を検出するためにオリゴマーのセットを使用することもできる。
【０１４３】
好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドセットの少なくとも一個、より好ましくは全てのメンバーを固相に結合する。
【０１４４】
別の実施形態では、本発明は、配列番号１〜配列番号１１８および配列番号４９３〜配列番号９６４、ならびにそれらに相補的な配列またはそれらのセグメントの一つのＤＮＡ配列を増幅するための「プライマー」オリゴヌクレオチドとして使用される、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドのセットを提供する。
【０１４５】
このオリゴヌクレオチドは、「アレイ」または「ＤＮＡチップ」（すなわち、固相に結合した異なるオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマーの配列）の全てまたは一部を構成しうると期待される。そのような異なるオリゴヌクレオチド‐および／またはＰＮＡ‐オリゴマー配列のアレイは、例えば、固相上に長方形または六角形の格子形で整列しているという点で特徴付けることができる。固相表面は、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、または金から構成されていてよい。ニトロセルロース、ならびにペレット、またはさらに樹脂マトリックスの形態で存在させることができるナイロンなどのプラスチックを使用することもできる。オリゴマーアレイ製造における従来技術の概要は、Nature Geneticsの特別編から集めることができる（Nature Genetics Supplement, Volume 21, January 1999、およびその中で引用される文献から）。蛍光標識したプローブを、固定したＤＮＡアレイのスキャニングに使用することも多い。Ｃｙ３色素およびＣｙ５色素を特異的プローブの５'‐ＯＨに単純に取付けることは蛍光標識に特に適している。ハイブリッド形成したプローブの蛍光の検出は、例えば、共焦点顕微鏡によって実施しうる。他の多くのものに加えて、Ｃｙ３およびＣｙ５色素も市販されている。
【０１４６】
このオリゴヌクレオチドまたはその特定の配列は、「バーチャルアレイ」の全てまたは一部を構成することができ、このアレイでは、分析物の複素混合物を分析するために、前記オリゴヌクレオチドまたはその特定の配列は、例えば、特有の標識したプローブの多様な集団の一部である「指定物」として、またはその集団を組み合せて使用されることもまた予期する。そのような方法は、例えば、ＵＳ２００３／００１３０９１（米国出願番号第０９／８９８，７４３号、２００３年１月１６日公開）に記載されている。そのような方法では、十分な標識が発生するので、複素混合物中の各核酸（すなわち各分析物）は、唯一の標識によって唯一結合し、従って検出することができる（各標識は直接カウントされ、混合物中の各分子種はデジタル式で読取られる）。
【０１４７】
本発明によるオリゴマーは、乳房細胞増殖性疾患の検出、該疾患間で検出区別もしくはそのサブクラス間で検出区別、診断、予後、治療、モニタリング、ならびに治療およびモニタリングの少なくとも一つに使用するのが特に好ましい。これは、表１４に記載の組織型を区別しかつ／または検出するための前記セットを使用することによって可能になる。特に好ましいものは、以下のオリゴヌクレオチドセットの一つから選択した少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むようなオリゴマーセットである。
【０１４８】
本方法の一実施形態では、乳癌組織が検出される。これは、APC, ARH1/NOEY2, BRCA2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, MLH1, PGR, SERPINB5, RARB, SFN, SOD2, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, IL6, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, RARA, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, BRCA1, LOT1, PRSS8, SNCG, TPM1, GPC3, CLDN7, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される遺伝子または配列ならびにその相補鎖の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成する少なくとも一個の標的配列のＣｐＧのメチル化状況を分析することによって実現される。
【０１４９】
別の実施形態では、少なくとも一個の標的配列のＣｐＧのメチル化状況は、PRDM2, PLAU, GSTP1, SLIT2, CCND2, HOXA5, RASSF1A, HS3ST2, ARH1/NOEY2, SCGB3A1, LIMK-1, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 31からなる群から選択される遺伝子または配列ならびにその相補鎖の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成する。
【０１５０】
両事例では、これは、1475 - 1477, 1477, 1478, 1478, 1479, 1479, 1480, 1480 - 1497, 1497, 1498, 1498, 1499, 1499, 1500, 1500, 1501, 1501, 1502, 1502 - 1511, 1511, 1512, 1512 - 1527, 1527, 1528, 1528 - 1557, 1557, 1558, 1558 - 1567, 1567, 1568, 1568, 1569, 1569, 1570, 1570 - 1573, 1573, 1574, 1574 - 1607, 1607, 1608, 1608 - 1619, 1619, 1620, 1620 - 1623, 1623, 1624, 1624 - 1639, 1639, 1640, 1640 - 1655, 1655, 1656, 1656 - 1693, 1693, 1694, 1694, 1695, 1695, 1696, 1696, 1697, 1697 - 1702, 1702, 1703, 1703 - 1706, 1706, 1706, 1706, 1707 - 1720, 1720, 1721, 1721 - 1724, 1724, 1725, 1725 - 1728, 1728, 1729, 1729 - 1734, 1734, 1735, 1735 - 1738, 1738, 1739, 1739 - 1752, 1752, 1753, 1753 - 1758, 1758, 1759, 1759 - 1762, 1762, 1763, 1763 - 1770, 1770, 1771, 1771 - 1778, 1778, 1779, 1779, 1780, 1780, 1781, 1781 - 1790, 1790, 1791, 1791 - 1798, 1798, 1799, 1799 - 1838, 1838, 1839, 1839, 1840, 1840, 1841, 1841 - 1852, 1852, 1853, 1853, 1854, 1854, 1855, 1855 - 1870, 1870, 1871, 1871 - 1874, 1874, 1875, 1875 - 1878, 1878, 1879, 1879, 1880, 1880, 1881, 1881, 1882, 1882, 1883, 1883 - 1886, 1886, 1887, 1887 - 1890, 1890, 1891, 1891 - 1906, 1906, 1907, 1907 - 1940, 1940, 1941, 1941, 1942, 1942, 1943, 1943 - 1946, 1946, 1947, 1947 - 1952, 1952, 1953, 1953 - 1966, 1966, 1967, 1967, 1968, 1968, 1969, 1969, 1970, 1970, 1971, 1971 - 1978, 1978, 1979, 1979 - 1982, 1982, 1983, 1983 - 1992, 1992, 1993, 1993 - 1998, 1998, 1999, 1999 - 2006, 2006, 2007, 2007 - 2016, 2016, 2017, 2017 - 2022, 2022, 2023, 2023 - 2030, 2030, 2031, 2031 - 2036, 2036, 2037, 2037 - 2050, 2050, 2051, 2051 - 2060, 2060, 2061, 2061 - 2070, 2070, 2071, 2071 - 2076, 2076, 2077, 2077 - 2104, 2104, 2105, 2105, 2106, 2106, 2107, 2107 - 2114, 2114, 2115, 2115 - 2128, 2128, 2129, 2129, 2130, 2130, 2131, 2131 - 2134, 2134, 2135, 2135, 2136, 2136, 2137, 2137, 2138, 2138, 2139, 2139からなる群の一つから選択される少なくとも一個のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２個のオリゴヌクレオチドからなるセットの使用によって実現されることが好ましい。
【０１５１】
本方法の一実施形態では、乳癌組織を他の癌と区別する。これは、APC, ARH1/NOEY2, BRCA2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, MLH1, PGR, SERPINB5, RARB, SFN, SOD2, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, IL6, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, RARA, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, BRCA1, LOT1, PRSS8, SNCG, TPM1, GPC3, CLDN7, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される遺伝子または配列ならびにその相補鎖の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成する少なくとも一個の標的配列のＣｐＧのメチル化状況を分析することによって実現される。別の実施形態では、少なくとも一個の標的配列のＣｐＧのメチル化状況は、下記からなる群から選択される遺伝子または配列ならびにその相補鎖の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成する：PRDM2, GSTP1, ALX4, HOXA5, PLAU, RASSF1A, IGSF4, SLIT2, DAPK1, CDKN1A, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 35, LIMK-1, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 47。
【０１５２】
両事例では、これは、1475, 1476, 1485 - 1497, 1497, 1498, 1498, 1499, 1499, 1500, 1500, 1501, 1501, 1502, 1502 - 1504, 1509 - 1511, 1511, 1512, 1512 - 1522, 1525 - 1527, 1527, 1528, 1528 - 1540, 1551 - 1554, 1569, 1569, 1570, 1570 - 1573, 1573, 1574, 1574 - 1580, 1585, 1586, 1591 - 1600, 1603, 1604, 1609 - 1619, 1619, 1620, 1620 - 1623, 1623, 1624, 1624 - 1626, 1629, 1630, 1633 - 1639, 1639, 1640, 1640 - 1642, 1649, 1650, 1667, 1668, 1675 - 1680, 1683 - 1688, 1710 - 1717, 1724, 1724, 1725, 1725 - 1728, 1728, 1729, 1729 - 1731, 1736 - 1738, 1738, 1739, 1739, 1748, 1749, 1752, 1752, 1753, 1753, 1760, 1761, 1764, 1765, 1774 - 1778, 1778, 1779, 1779, 1780, 1780, 1781, 1781 - 1783, 1788, 1789, 1792 - 1798, 1798, 1799, 1799 - 1801, 1804 - 1819, 1830, 1831, 1858 - 1865, 1870, 1870, 1871, 1871, 1874, 1874, 1875, 1875 - 1878, 1878, 1879, 1879, 1880, 1880, 1881, 1881, 1882, 1882, 1883, 1883, 1900, 1901, 1904 - 1906, 1906, 1907, 1907 - 1909, 1916, 1917, 1924 - 1931, 1942, 1942, 1943, 1943, 1948, 1949, 1952, 1952, 1953, 1953 - 1957, 1966, 1966, 1967, 1967, 1968, 1968, 1969, 1969, 1970, 1970, 1971, 1971, 1980 - 1982, 1982, 1983, 1983 - 1985, 1994 - 1998, 1998, 1999, 1999, 2004, 2005, 2010 - 2015, 2020, 2021, 2028 - 2030, 2030, 2031, 2031 - 2033, 2036, 2036, 2037, 2037 - 2049, 2054 - 2059, 2066 - 2070, 2070, 2071, 2071 - 2073, 2076, 2076, 2077, 2077, 2080 - 2089, 2092 - 2099, 2104, 2104, 2105, 2105, 2108, 2109, 2116 - 2119, 2130, 2130, 2131, 2131 - 2134, 2134, 2135, 2135, 2136, 2136, 2137, 2137, 2138, 2138, 2139, 2139, 2140, 2140, 2141, 2141 - 2144, 2144, 2145, 2145, 2146, 2146 - 2149, 2149, 2150, 2150 - 2154, 2163, 2164, 2169, 2170, 2177 - 2180からなる群の一つから選択される少なくとも一個のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２個のオリゴヌクレオチドからなるセットの使用によって実現されることが好ましい。
【０１５３】
本方法の別の一実施形態では、乳癌細胞と末梢血リンパ球を区別することによって、乳癌細胞が血液または血液由来液体のバックグラウンドに対して検出される。これは、APC, ARH1/NOEY2, CCND2, CDH1, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, PGR, SERPINB5, RARB, SFN, SOD2, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, IL6, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, BRCA1, LOT1, PRSS8, SNCG, GPC3, CLDN7, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, RAP2B, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される遺伝子または配列ならびにその相補鎖の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成する少なくとも一個の標的配列のＣｐＧのメチル化状況を分析することによって実現される。
【０１５４】
別の実施形態では、少なくとも一個の標的配列のＣｐＧのメチル化状況は、FABP3, RASSF1A, MSF, PRDM6, LMX1A, SEQ ID NO: 4 , SCGB3A1, SLIT2, NR2E1, EYA4, PRDM2, SERPINB5, TWIST, STAT1, ALX4, IGFBP7, DAPK1, THBS1, PLAU, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 37, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 6, LIMK-1, SEQ ID NO: 46からなる群から選択される遺伝子または配列ならびにその相補鎖の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成する。
【０１５５】
両事例では、これは、1475 - 1477, 1477, 1478, 1478, 1479, 1479, 1480, 1480, 1485 - 1497, 1497, 1498, 1498, 1501, 1501, 1502, 1502 - 1511, 1511, 1512, 1512 - 1522, 1525 - 1527, 1527, 1528, 1528 - 1540, 1543 - 1546, 1549 - 1557, 1557, 1558, 1558 - 1567, 1567, 1568, 1568, 1569, 1569, 1570, 1570 - 1572, 1583 - 1596, 1599, 1600, 1603, 1604, 1607, 1607, 1608, 1608 - 1619, 1619, 1620, 1620 - 1623, 1623, 1624, 1624 - 1626, 1631 - 1639, 1639, 1640, 1640, 1645, 1646, 1649 - 1655, 1655, 1656, 1656 - 1660, 1663 - 1668, 1671 - 1693, 1693, 1694, 1694, 1695, 1695, 1696, 1696, 1697, 1697 - 1699, 1704 - 1706, 1706, 1707, 1707 - 1720, 1720, 1721, 1721, 1724, 1724, 1725, 1725 - 1728, 1728, 1729, 1729 - 1733, 1738, 1738, 1739, 1739, 1742, 1743, 1746, 1747, 1750, 1751, 1758, 1758, 1759, 1759 - 1762, 1762, 1763, 1763 - 1770, 1770, 1771, 1771 - 1778, 1778, 1779, 1779, 1782 - 1789, 1792 - 1798, 1798, 1799, 1799 - 1838, 1838, 1839, 1839, 1840, 1840, 1841, 1841 - 1845, 1848 - 1852, 1852, 1853, 1853, 1854, 1854, 1855, 1855 - 1869, 1872, 1873, 1878, 1878, 1879, 1879, 1880, 1880, 1881, 1881, 1882, 1882, 1883, 1883 - 1885, 1888 - 1890, 1890, 1891, 1891 - 1906, 1906, 1907, 1907 - 1935, 1938 - 1940, 1940, 1941, 1941, 1942, 1942, 1943, 1943 - 1946, 1946, 1947, 1947 - 1952, 1952, 1953, 1953 - 1966, 1966, 1967, 1967, 1968, 1968, 1969, 1969, 1970, 1970, 1971, 1971 - 1973, 1976 - 1978, 1978, 1979, 1979 - 1982, 1982, 1983, 1983 - 1987, 1990 - 1992, 1992, 1993, 1993 - 1998, 1998, 1999, 1999 - 2006, 2006, 2007, 2007 - 2016, 2016, 2017, 2017 - 2022, 2022, 2023, 2023 - 2025, 2028 - 2030, 2030, 2031, 2031 - 2036, 2036, 2037, 2037 - 2049, 2052 - 2060, 2060, 2061, 2061 - 2070, 2070, 2071, 2071 - 2076, 2076, 2077, 2077 - 2104, 2104, 2105, 2105, 2106, 2106, 2107, 2107 - 2114, 2114, 2115, 2115 - 2117, 2120 - 2128, 2128, 2129, 2129, 2130, 2130, 2131, 2131 - 2134, 2134, 2135, 2135, 2136, 2136, 2137, 2137, 2138, 2138, 2139, 2139, 2140, 2140, 2141, 2141 - 2143, 2147 - 2149, 2149, 2150, 2150 - 2156, 2161, 2162, 2171, 2172, 2181, 2181, 2182, 2182 - 2187, 2187, 2188, 2188 - 2199, 2199, 2200, 2200 - 2218からなる群の一つから選択される少なくとも一個のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２個のオリゴヌクレオチドからなるセットの使用によって実現されることが好ましい。
【０１５６】
本方法の一実施形態では、ＤＣＩＳと良性乳房細胞増殖性疾患を区別する。これは、APC, ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, MLH1, PGR, SERPINB5, RARB, SOD2, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, ESR1, APAF1, CASP8, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, RARA, TWIST, ESR2, PLAU, SEQ ID NO: 4, SNCG, SLC19A1, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, HS3ST2, PRDM2, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, SASH1, S100A7, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 36, LMX1A, SENP3, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される遺伝子または配列ならびにその相補鎖の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成する少なくとも一個の標的配列のＣｐＧのメチル化状況を分析することによって実現される。
【０１５７】
別の実施形態では、少なくとも一個の標的配列のＣｐＧのメチル化状況は、HS3ST2, SLIT2, RASSF1A, GSTP1, GJB2, IGFBP7, CDH13, ARH1/NOEY2, SCGB3A1, FHIT, SEQ ID NO: 27, LIMK-1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 24からなる群から選択される遺伝子または配列ならびにその相補鎖の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成する。
【０１５８】
両事例では、これは、1475 - 1477, 1477, 1478, 1478, 1479, 1479, 1480, 1480 - 1482, 1485 - 1497, 1497, 1498, 1498, 1501, 1501, 1502, 1502 - 1508, 1513, 1514, 1517, 1518, 1521 - 1527, 1527, 1528, 1528 - 1534, 1541 - 1544, 1547 - 1550, 1555 - 1557, 1557, 1558, 1558 - 1560, 1567, 1567, 1568, 1568, 1569, 1569, 1570, 1570 - 1573, 1573, 1574, 1574 - 1578, 1581 - 1592, 1595 - 1600, 1605 - 1607, 1607, 1608, 1608 - 1618, 1623, 1623, 1624, 1624 - 1626, 1631 - 1636, 1639, 1639, 1640, 1640, 1663 - 1668, 1671 - 1676, 1689, 1690, 1695, 1695, 1696, 1696, 1697, 1697 - 1701, 1706, 1706, 1707, 1707 - 1713, 1720, 1720, 1721, 1721, 1726 - 1728, 1728, 1729, 1729, 1732 - 1734, 1734, 1735, 1735, 1740, 1741, 1746 - 1752, 1752, 1753, 1753, 1756 - 1758, 1758, 1759, 1759, 1772 - 1778, 1778, 1779, 1779, 1780, 1780, 1781, 1781, 1784 - 1790, 1790, 1791, 1791 - 1798, 1798, 1799, 1799 - 1805, 1812 - 1835, 1842 - 1845, 1848, 1849, 1852, 1852, 1853, 1853, 1854, 1854, 1855, 1855 - 1869, 1872, 1873, 1876 - 1878, 1878, 1879, 1879, 1882, 1882, 1883, 1883 - 1886, 1886, 1887, 1887 - 1890, 1890, 1891, 1891 - 1895, 1902 - 1906, 1906, 1907, 1907, 1910, 1911, 1914 - 1923, 1932 - 1935, 1938 - 1940, 1940, 1941, 1941, 1952, 1952, 1953, 1953, 1958 - 1963, 1966, 1966, 1967, 1967, 1968, 1968, 1969, 1969, 1970, 1970, 1971, 1971, 1974 - 1977, 1980 - 1982, 1982, 1983, 1983 - 1987, 1992, 1992, 1993, 1993, 1996 - 1998, 1998, 1999, 1999 - 2005, 2010 - 2013, 2028 - 2030, 2030, 2031, 2031 - 2036, 2036, 2037, 2037 - 2039, 2042 - 2050, 2050, 2051, 2051, 2060, 2060, 2061, 2061 - 2070, 2070, 2071, 2071 - 2076, 2076, 2077, 2077, 2092, 2093, 2104, 2104, 2105, 2105, 2106, 2106, 2107, 2107, 2110, 2111, 2116, 2117, 2120 - 2127, 2130, 2130, 2131, 2131 - 2134, 2134, 2135, 2135, 2136, 2136, 2137, 2137, 2138, 2138, 2139, 2139, 2155, 2156, 2161, 2162, 2183, 2184, 2187, 2187, 2188, 2188, 2199, 2199, 2200, 2200 - 2202, 2219 - 2222からなる群の一つから選択される少なくとも一個のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２個のオリゴヌクレオチドからなるセットの使用によって実現されることが好ましい。
【０１５９】
本方法の一実施形態では、乳癌と良性乳房細胞増殖性疾患を区別する。これは、ARH1/NOEY2, CCND2, CDKN1A, CDKN2A, SEQ ID NO: 9, DAPK1, SEQ ID NO: 2, EYA4, FHIT, GSTP1, HIC1, IGFBP7, SERPINB5, TERT, TGFBR2, THRB, TIMP3, TP73, NME1, CDH13, THBS1, TMS1/ASC, IL6, APAF1, SYK, HOXA5, FABP3, RASSF1A, SEQ ID NO: 3, TWIST, ESR2, PLAU, STAT1, SEQ ID NO: 4, LOT1, GPC3, CLDN7, GJB2, SLIT2, IGSF4, MCT1, PRDM2, ALX4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SCGB3A1, SEQ ID NO: 1, PROSTAGLANDIN E2 RECEPTOR, EP4 SUBTYPE (PROSTANOID EP4 RECEPTOR) (PGE RECEPTOR, EP4 SUBTYPE), ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 (ALPHA-1-FETOPROTEIN TRANSCRIPTION FACTOR) (HEPATOCYTIC TRANSCRIPTION FACTOR) (B1-BINDING FACTOR) (HB1F) (CYP7A PROMOTER BINDING FACTOR), LIM DOMAIN KINASE 1, BCL11B, SEQ ID NO: 51, MGC34831, SEQ ID NO: 54, PDLIM1, MSF, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, PRDM6, NR2E1, PCDH7, DKK3, RTTN, SNAP25, SEQ ID NO: 26, GIRK2, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, ARL7, SEQ ID NO: 31, THH, HOXB13, SEQ ID NO: 35, SEQ ID NO: 36, MGC10561, LMX1A, SENP3, GS1, TITF1, SEQ ID NO: 42, DDX51, SEQ ID NO: 117 , SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46, O60279, SEQ ID NO: 48からなる群から選択される遺伝子または配列ならびにその相補鎖の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成する少なくとも一個の標的配列のＣｐＧのメチル化状況を分析することによって実現される。
【０１６０】
別の実施形態では、少なくとも一個の標的配列のＣｐＧのメチル化状況は、SLIT2, HS3ST2, HOXA5, ARH1/NOEY2, IGFBP7, PLAU, CDH13, TIMP3, CCND2, GSTP1, SEQ ID NO: 117, LIMK-1, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 41,SEQ ID NO: 27,SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 4からなる群から選択される遺伝子または配列ならびにその相補鎖の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成する。
【０１６１】
両事例では、これは、1475, 1476, 1485 - 1497, 1497, 1498, 1498, 1499, 1499, 1500, 1500, 1501, 1501, 1502, 1502 - 1504, 1509 - 1511, 1511, 1512, 1512 - 1522, 1525 - 1527, 1527, 1528, 1528 - 1540, 1551 - 1554, 1569, 1569, 1570, 1570 - 1573, 1573, 1574, 1574 - 1580, 1585, 1586, 1591 - 1600, 1603, 1604, 1609 - 1619, 1619, 1620, 1620 - 1623, 1623, 1624, 1624 - 1626, 1629, 1630, 1633 - 1639, 1639, 1640, 1640 - 1642, 1649, 1650, 1667, 1668, 1675 - 1680, 1683 - 1688, 1710 - 1717, 1724, 1724, 1725, 1725 - 1728, 1728, 1729, 1729 - 1731, 1736 - 1738, 1738, 1739, 1739, 1748, 1749, 1752, 1752, 1753, 1753, 1760, 1761, 1764, 1765, 1774 - 1778, 1778, 1779, 1779, 1780, 1780, 1781, 1781 - 1783, 1788, 1789, 1792 - 1798, 1798, 1799, 1799 - 1835, 1842 - 1852, 1852, 1853, 1853, 1854, 1854, 1855, 1855 - 1870, 1870, 1871, 1871 - 1873, 1876 - 1878, 1878, 1879, 1879, 1880, 1880, 1881, 1881, 1882, 1882, 1883, 1883 - 1886, 1886, 1887, 1887 - 1890, 1890, 1891, 1891 - 1895, 1898, 1899, 1902 - 1906, 1906, 1907, 1907 - 1925, 1932 - 1940, 1940, 1941, 1941, 1942, 1942, 1943, 1943, 1958 - 1966, 1966, 1967, 1967, 1968, 1968, 1969, 1969, 1970, 1970, 1971, 1971 - 1977, 1980 - 1982, 1982, 1983, 1983 - 1987, 1992, 1992, 1993, 1993, 1998, 1998, 1999, 1999 - 2006, 2006, 2007, 2007, 2010 - 2015, 2020 - 2022, 2022, 2023, 2023, 2028 - 2030, 2030, 2031, 2031 - 2036, 2036, 2037, 2037 - 2045, 2048 - 2050, 2050, 2051, 2051 - 2057, 2060, 2060, 2061, 2061 - 2070, 2070, 2071, 2071 - 2076, 2076, 2077, 2077 - 2079, 2082, 2083, 2086, 2087, 2092 - 2101, 2104, 2104, 2105, 2105, 2106, 2106, 2107, 2107 - 2111, 2116, 2117, 2120 - 2128, 2128, 2129, 2129, 2130, 2130, 2131, 2131 - 2134, 2134, 2135, 2135, 2136, 2136, 2137, 2137, 2138, 2138, 2139, 2139, 2140, 2140, 2141, 2141 - 2144, 2144, 2145, 2145, 2146, 2146 - 2149, 2149, 2150, 2150 - 2167, 2167, 2168, 2168 - 2175, 2175, 2176, 2176からなる群の一つから選択される少なくとも一個のオリゴヌクレオチド、より好ましくは少なくとも２個のオリゴヌクレオチドからなるセットの使用によって実現されることが好ましい。
【０１６２】
本発明は、シトシンのメチル化および単ヌクレオチド多型を分析することによって、対象中の配列番号１〜配列番号１１８に記載のゲノム配列の遺伝子的および／またはエピジェネティックパラメータを確認する方法をさらに提供する。前記方法は、対象から得た生物試料中の配列番号１〜配列番号１１８の一つまたは複数を含む核酸と、少なくとも一種の試薬または一連の試薬を接触させることを含み、その際、前記試薬または一連の試薬が、その標的核酸中のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する。
【０１６３】
前記方法は、以下のステップを含むのが好ましい。第１のステップでは、分析する組織の試料を得る。その供給源は、任意の適当な供給源であってよく、例えば、株化細胞、組織切片、生検試料、パラフィン包埋組織、体液、血漿、血清、全血、単離した血液細胞、血液から単離した細胞、およびそれらの可能な組合せ全てであってよい。前記ＤＮＡ源は、乳頭吸引液、リンパ液、乳管洗浄液、極細針吸引物、血漿、血清、全血、単離した血液細胞、血液から単離した細胞からなる群から選択される体液であることが好ましい。
【０１６４】
次いで、ゲノムＤＮＡを試料から単離する。ゲノムＤＮＡは、市販キットの使用を含め、当技術分野で標準的な任意の手段によって単離することができる。手短に言えば、当該ＤＮＡが細胞膜に包まれている場合、生物試料は酵素的、化学的、または機械的手段によって破壊され溶解するはずである。次いで、例えば、プロテイナーゼＫで消化することによって、ＤＮＡ溶液から蛋白質や他の夾雑物を除去することができる。次いで、その溶液からゲノムＤＮＡを回収する。これは、塩析、有機抽出、または固相支持体へのＤＮＡの結合を含む様々な方法によって実施することができる。方法の選択は、時間、費用、および必要なＤＮＡ量を含む幾つかの要因によって影響される。核酸を抽出した後は、分析にはゲノム二本鎖ＤＮＡを使用する。
【０１６５】
方法の第２のステップでは、５’位置で非メチル化シトシン塩基が、ウラシル、チミン、またはハイブリッド形成挙動の点でシトシンと異なる別の塩基に転換されるようにそのゲノムＤＮＡ試料を処理する。本明細書では、これは、「前処理」または「処理」として理解されたい。
【０１６６】
これは、重亜硫酸塩試薬で処理することによって実現するのが好ましい。「重亜硫酸塩試薬」という語は、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩またはそれらの組合せを含む試薬をさし、本明細書に開示した通りメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するのに有用である。前記処理法は当技術分野で公知である（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５、その全体を参照により組み込む）。重亜硫酸塩処理は、それだけには限らないが、ｎ‐アルキレングリコール、特に、ジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）などの変性化溶媒の存在下で、あるいはジオキサンまたはジオキサン誘導体の存在下で実施するのが好ましい。好ましい実施形態では、変性化溶媒は１％〜３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用する。重亜硫酸塩反応は、それだけには限らないが、クロマン誘導体、例えば、６‐ヒドロキシ（hydroxy）‐２，５，７，８，‐テトラメチルクロマン（tetramethylchromane）２‐カルボン酸（carboxylic acid）などのスカベンジャーの存在下で実施するのも好ましい（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照。その全体を参照により組み込む）。重亜硫酸塩転換は、３０℃〜７０℃の反応温度で実施し、それによって反応中短時間に温度を８５℃以上に上昇させるのが好ましい（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照。その全体を参照により組み込む）。重亜硫酸塩処理したＤＮＡは、精製した後、さらに分析するのが好ましい。これは、それだけには限らないが、限外濾過などの当技術分野で公知の任意の手段によって実施することができ、Microcon（商標）カラム（Millipore（商標）社製）によって実施するのが好ましい。精製は、手直しした製造業者のプロトコルに従って実施する（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照。その全体を参照により組み込む）。
【０１６７】
本方法の第３のステップでは、少なくとも一個の本発明によるプライマーオリゴヌクレオチド対および増幅酵素を使用し、処理したＤＮＡの少なくとも一個の標的配列を増幅する。一つの同じ反応槽で同時に数個のＤＮＡセグメントの増幅を行うことができる。典型的には、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用し実施する。プライマーオリゴヌクレオチドセットには、その配列が、配列番号４９３〜配列番号９６４およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される塩基配列の少なくとも１６塩基対長のセグメントと逆相補的であるか、同一であるか、または前記配列とストリンジェントまたは高度にストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドが含まれる。本方法の別の実施形態では、増幅は、メチル化特異的プライマーによって、かつ／または本明細書に記載するブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下で実施しうる。
【０１６８】
本方法の第一の代替実施形態では、メチル化特異的プライマーオリゴヌクレオチドを使用することによって、配列番号１〜配列番号１１８の一つまたは複数を含む核酸配列中の予め選択したＣｐＧ位置のメチル化状況を定量することができる。この技術（ＭＳＰ）は、Hermanに賦与された米国特許第６，２６５，１７１号に記載されている。重亜硫酸塩処理したＤＮＡを増幅するために、メチル化状況特異的プライマーを使用することによって、メチル化した核酸とメチル化していない核酸が区別できるようになる。ＭＳＰプライマー対は、重亜硫酸塩処理したＣｐＧジヌクレオチドとハイブリッド形成する少なくとも一個のプライマーを含む。従って、前記プライマーの配列は、少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチドを含む。メチル化していないＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧのＣ位置の位置に「Ｔ」を含む。従って、好ましくは、前記プライマーの塩基配列は、配列番号４９３〜配列番号９６４の一つに記載の処理した核酸配列およびそれらに相補的な配列とハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の配列を含む必要があり、その際、前記オリゴマーの前記塩基配列は少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチドを含む。
【０１６９】
本方法のさらに好ましい実施形態は、ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用を含む。そのようなブロッカーオリゴヌクレオチドの使用は、Yuら, BioTechniques 23:714-720, 1997によって記載されている。ブロッキングプローブオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲプライマーと同時に重亜硫酸塩処理した核酸にハイブリッド形成する。その核酸のＰＣＲ増幅は、核酸の増幅が抑制されるように、ブロッキングプローブの５'位置で停止するが、そこにはブロッキングプローブに相補的な配列が存在する。プローブは、メチル化状況に特異的な方式で重亜硫酸塩処理した核酸とハイブリッド形成するように設計することができる。例えば、メチル化した核酸をメチル化していない核酸の集団中で検出するには、メチル化した核酸の増幅を抑制したい場合の「ＣｐＧ」とは対照的に、当該位置に「ＣｐＡ」または「ＴｐＡ」を含むブロッキングプローブを使用することによって、当該位置でメチル化していない核酸の増幅を抑制する。
【０１７０】
ブロッカーオリゴヌクレオチドを使用するＰＣＲ法では、ポリメラーゼ介在増幅の効率的破壊には、ポリメラーゼによって伸長されないブロッカーオリゴヌクレオチドが必要となる。これは、３'‐デオキシオリゴヌクレオチドであるブロッカー、または３'位置で「遊離」ヒドロキシル基以外により誘導体化されたオリゴヌクレオチドを用いて実現するのが好ましい。例えば、３'‐Ｏ‐アセチルオリゴヌクレオチドは好ましいブロッカー分子クラスの代表である。
【０１７１】
さらに、ブロッカーオリゴヌクレオチドのポリメラーゼ介在分解を防止しなければならない。好ましくは、そのような防止には、５'‐３'エクソヌクレアーゼ活性を欠損しているポリメラーゼの使用、または例えばブロッカー分子をヌクレアーゼ耐性にするチオ酸塩ブリッジをその５'端に有する修飾ブロッカーオリゴヌクレオチドの使用が含まれる。特定の適用では、ブロッカーにそのような５'修飾を施す必要はないであろう。例えば、ブロッカー結合部位とプライマー結合部位が重なる場合、それによってプライマーの結合が（例えば過剰なブロッカーによる）防止され、ブロッカーオリゴヌクレオチドの分解は実質的に妨害される。これは、ポリメラーゼがプライマー方向におよび、通常ハイブリッド形成したブロッカーオリゴヌクレオチドを分解する工程となる（５'‐３'方向において）ブロッカーを通過して伸長しないためである。
【０１７２】
本発明を目的とし、かつ本明細書で実施する、特に好ましいブロッカー／ＰＣＲ実施形態は、ブロッキングオリゴヌクレオチドとしてペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの使用を含む。そのようなＰＮＡブロッカーオリゴマーが理想的には好適である。そのようなオリゴマーはポリメラーゼによって分解も伸長もされないからである。
【０１７３】
従って、好ましくは、前記ブロッキングオリゴヌクレオチドの塩基配列は、配列番号４９３〜配列番号９６４の一つに記載の処理した核酸配列およびそれらに相補的な配列とハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の配列を含む必要があり、その際、前記オリゴヌクレオチドの塩基配列は、少なくとも一個のＣｐＧ、ＴｐＧ、またはＣｐＡジヌクレオチドを含む。
【０１７４】
増幅によって得られたフラグメントは、直接的または間接的に検出可能な標識を担持することができる。好ましいものは、蛍光標識、放射性核種、または質量分析計で検出できる定型的な質量を有する着脱自在な分子フラグメントの形態をした標識である。前記標識が質量標識（mass label）である場合、標識した増幅物は単一の正または負の正味電荷を担い、質量分析計での検出率を高めるのが好ましい。検出は、例えば、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ）によって、または電子スプレー質量分析（ＥＳＩ）を使用し実施および視覚化しうる。
【０１７５】
マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ）は、生体分子分析用の非常に効率的な成果である（Karas and Hillenkamp, Anal Chem., 60:2299-301, 1988）。分析物を光吸収マトリックスに包埋する。そのマトリックスを短レーザーパルスによって蒸発させ、それによって分析物分子を崩壊させないように気相に輸送する。分析物をマトリックス分子を衝突させることによってイオン化する。電圧をかけると、イオンは無電界フライトチューブ中へ加速する。その異なる質量のために、イオンは異なる速度で加速される。イオンが小さいほど、大型のイオンよりも検出器に早く到達する。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分光測定は、ペプチドおよび蛋白質の分析に非常に適している。核酸の分析は、それよりもやや難しい（GutおよびBeck, Current Innovations and Future Trends, 1:147-57, 1995）。核酸分析に関する感受性は、ペプチドの約１００分の１未満であり、フラグメントのサイズが大きくなるにつれ不均衡に低下する。さらに、何倍もの負荷電主鎖を有する核酸では、マトリックスによるイオン化過程は非常に効率性が低い。ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦ分光測定では、マトリックスの選択が非常に重要な役割を果たす。ペプチドの脱離では、非常に微細な結晶を生成する非常に効率的マトリックスが数個見つかっている。現在、ＤＮＡ用に幾つかの応答マトリックスがあるが、ペプチドと核酸間の感受性の差は減少していない。この感受性の差は、減少させることができるが、よりペプチドに類似するようにＤＮＡを化学的に修飾することによる。例えば、単純アルキル化化学を利用し、主鎖の通常のリン酸がチオリン酸塩で置換されているホスホロチオ酸核酸を電荷中性ＤＮＡに転換させることができる（GutおよびBeck, Nucleic Acids Res. 23: 1367-73, 1995）。電荷タグとこの修飾したＤＮＡをカップリングさせると、ＭＡＬＤＩ‐ＴＯＦの感受性が、ペプチドで見られたものと同程度まで上昇した。電荷タギングの別の利点は、未修飾基質の検出を非常に困難なものにする不純物に対する分析の安定性を向上させることである。
【０１７６】
本方法の第４のステップでは、処理前にＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況を定量するために、本方法の第３のステップでは中に得られた増幅物を分析する。
【０１７７】
増幅物をＭＳＰ増幅によって得た実施形態では、増幅物の有無それ自体が、前記プライマーの塩基配列に従い、プライマーによって被覆されたＣｐＧ位置のメチル化状態を示す。
【０１７８】
同様に、ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下で、増幅物を増幅によって得た実施形態では、増幅物の有無それ自体が、前記ブロッカーの塩基配列に従い、ブロッカーによって被覆されたＣｐＧ位置のメチル化状態を示す。
【０１７９】
ブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下で増幅物をＭＳＰ増幅によって得た実施形態では、増幅物の有無それ自体が、前記プライマーおよびブロッカーオリゴヌクレオチドの塩基配列に従って、プライマーおよびブロッカーオリゴヌクレオチドによって被覆されたＣｐＧ位置のメチル化状態を示す。
【０１８０】
標準的およびメチル化特異的ＰＣＲによって得られた増幅物は、それだけには限らないが、アレイ技術およびプローブを基にした技術などのハイブリッド形成をベースとした方法、ならびに配列決定や鋳型指示伸長反応などの技術によってさらに分析しうる。
【０１８１】
本方法の一実施形態では、ステップ３で合成した増幅物を続いて、アレイまたはオリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡプローブセットとハイブリッド形成する。この意味において、ハイブリッド形成は以下の方式で行われる。ハイブリッド形成中に使用したプローブセットは、好ましくは少なくとも２オリゴヌクレオチドまたはＰＮＡオリゴマーから構成される；この過程では、増幅物は、予め固相に結合させたオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成するプローブとして機能し；続いてハイブリッド形成しなかったフラグメントを除去し；前記オリゴヌクレオチドは、本発明の配列表に特記した塩基配列のセグメントに逆相補的または同一である、少なくとも９ヌクレオチド長の、少なくとも一個の塩基配列を含み；かつそのセグメントは、少なくとも一個のＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。
【０１８２】
好ましい実施形態では、前記ジヌクレオチドはオリゴマーの中１／３に存在する。例えば、前記オリゴマーが一個のＣｐＧジヌクレオチドを含む場合、前記ジヌクレオチドは、１３‐ｍｅｒの５'端から５〜９番目のヌクレオチドであることが好ましい。配列番号１〜配列番号１１８に記載の群から選択される配列、および配列番号４９３〜配列番号９６４中の同等の位置中の各ＣｐＧジヌクレオチドを分析するために、一個のオリゴヌクレオチドが存在する。前記オリゴヌクレオチドは、ペプチド核酸の形態で含まれてもよい。次いで、ハイブリッド形成しなかった増幅物を除去する。次いで、ハイブリッド形成した増幅物を検出する。この意味において、増幅物に取り付けた標識は、オリゴヌクレオチド配列が位置する固相の各位置で同定可能であることが好ましい。
【０１８３】
さらに本方法の別の実施形態では、ＣｐＧ位置のゲノムのメチル化状況は、ＰＣＲ増幅プライマーと同時に、重亜硫酸塩処理したＤＮＡとハイブリッド形成する、オリゴヌクレオチドプローブによって確認しうる（前記プライマーはメチル化特異的または標準であってよい）。
【０１８４】
本方法の特に好ましい実施形態は、蛍光ベースのリアルタイム定量ＰＣＲ（Heidら, Genome Res. 6:986-994, 1996、同様に米国特許第６，３３１，３９３号参照）を使用し、二重標識蛍光オリゴヌクレオチドプローブ（TaqMan（商標）ＰＣＲ、ABI Prism 7700 Sequence Detection System使用、Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, California）を利用する。TaqMan（商標）ＰＣＲ反応は、TaqMan（商標）プローブと称する伸長不可能な調査用オリゴヌクレオチドを使用し、好ましい実施形態では、このプローブは、前進と逆進増幅プライマーの間に位置するＧｐＣリッチ配列とハイブリッド形成するように設計されている。TaqMan（商標）プローブは、TaqMan（商標）オリゴヌクレオチドのヌクレオチドに取り付けられたリンカー部分（例えば、ホスホラミダイト(phosphoramidite））に共有結合している蛍光「レポーター部分」および「クエンチャー部分」をさらに含む。重亜硫酸塩処理に続く核酸中のメチル化の分析では、MethylLight（商標）アッセイとして知られている米国特許第６，３３１，３９３号（これによりその全体を参照により組み込む）に記載されているように、プローブはメチル化特異的でなければならない。記載した発明での使用にも適しているTaqMan（商標）検出法の変形には、二重プローブ技術（Lightcycler（商標））または蛍光増幅プライマー（Sunrise（商標）技術）の使用も含まれる。これらの両技術は、重亜硫酸塩処理したＤＮＡでの使用に、さらにＣｐＧジヌクレオチド中のメチル化分析にも適当となるように適合させうる。
【０１８５】
重亜硫酸塩処理した核酸分析による、メチル化を評価するためのプローブオリゴヌクレオチドの使用にさらに適当な方法。本方法のさらに好ましい実施形態では、本方法の第５のステップには、GonzalgoおよびJones, Nucleic Acids Res. 25:2529-2531, 1997に記載されるＭＳ‐ＳＮｕＰＥなど、鋳型指示オリゴヌクレオチド伸長の使用が含まれる。
【０１８６】
さらに本方法の別の実施形態では、本方法の第５のステップには、本方法の第３のステップで生成された増幅物の配列決定、続いて配列分析が含まれる（Sanger F.,ら, Proc Natl Acad Sci USA 74:5463-5467, 1977）。
【０１８７】
本方法の最も好ましい実施形態では、前述の方法中の初めの３つのステップに従ってゲノム核酸を単離し、処理する。すなわち
ａ）対象から対象のゲノムＤＮＡを含む生物試料を得ること
ｂ）ゲノムＤＮＡを抽出する、もしくはそれ以外では単離すること
ｃ）ｂ）のゲノムＤＮＡまたはそのフラグメントを一種または複数の試薬で処理して、その５位で非メチル化シトシン塩基を、ウラシルに、またはハイブリッド形成特性の点でシトシンと検出可能に異なる別の塩基に転換すること、その場合
ｄ）ｃ）の処理に続く増幅をメチル化特異的方法、すなわちメチル化特異的プライマーおよび／またはブロッキングオリゴヌクレオチドの使用によって実施し、さらにその場合
ｅ）増幅物の検出は、上記のようにリアルタイム検出プローブによって実施する。
【０１８８】
上記のように、メチル化特異的プライマーによって続くｄ）の増幅を行う場合、前記メチル化特異的プライマーは、配列番号４９３〜配列番号９６４の一つに記載の処理した核酸配列およびそれらに相補的な配列とハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の配列を含み、その際、前記オリゴマーの前記塩基配列は少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチドを含むのが好ましい。
【０１８９】
代替法であり、本方法の最も好ましい実施形態では、続くｄ）の増幅は、上記のようにブロッキングオリゴヌクレオチドの存在下で実施する。前記ブロッキングオリゴヌクレオチドは、配列番号４９３〜配列番号９６４の一つに記載の処理した核酸配列およびそれらに相補的な配列とハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の配列を含み、その際、前記オリゴマーの前記塩基配列は、少なくとも一個のＣｐＧ、ＴｐＧ、またはＣｐＡジヌクレオチドを含む。本方法のｅ）、すなわち、配列番号１〜配列番号１１８に記載の一個または複数のＣｐＧ位置のメチル化状況を示す特異的増幅物の検出は、上記のようにリアルタイム検出法によって実施する。
【０１９０】
本発明の追加の実施形態は、前処理を必要とせずに、本発明によるゲノムＤＮＡ（配列番号１〜配列番号１１８、およびその相補鎖）のメチル化状況を分析する方法を提供する。
【０１９１】
そのような追加の実施形態の第１のステップでは、ゲノムＤＮＡ試料を組織または細胞源から単離する。好ましくは、そのような供給源には、株化細胞、組織切片、体液、またはパラフィンに包埋した組織が含まれる。第２のステップでは、ゲノムＤＮＡを抽出する。抽出は、それだけには限らないが、洗浄ライセートの使用、超音波処理、およびガラスビーズでのボルテックス処理を含む当業者には標準的な手段によって行いうる。核酸を抽出した後は、ゲノムの二本鎖ＤＮＡを分析に使用する。
【０１９２】
好ましい実施形態では、ＤＮＡは処理する前に切断してよく、これは当技術分野の水準で標準的な任意の手段、特に、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによって行いうる。
【０１９３】
第２のステップでは、次いで、ＤＮＡを一個または複数のメチル化感受性制限酵素で消化する。消化は、制限部位でのＤＮＡの加水分解が、特異的ＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状況の参考になるように実施する。
【０１９４】
好ましい実施形態であるが任意選択である第３のステップでは、制限フラグメントを増幅する。これは、ポリメラーゼ連鎖反応を使用し、実施することが好ましく、前記増幅物は、先に述べたように適当な検出可能な標識、すなわち、フルオロフォア標識、放射性核種、および質量標識を担持しうる。
【０１９５】
第４のステップでは、増幅物を検出する。検出は、当技術分野で標準的な任意の手段、例えば、それだけには限らないが、ゲル電気泳動分析、ハイブリッド形成分析、ＰＣＲ生成物中への検出可能なタグの組込み、ＤＮＡアレイ分析、ＭＡＬＤＩ、またはＥＳＩ分析によって行いうる。
【０１９６】
ゲノム核酸のメチル化状態を定量した後、配列番号１〜配列番号１１８の少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態、あるいは配列番号１〜配列番号１１８の複数のＣｐＧジヌクレオチド配列の平均的メチル化状態を反映する値に基づいて、乳房細胞増殖性疾患が存在するか否か、またはサブクラスであるかを導き出す。ＰＲＤＭ２およびＳ１００Ａ７を除き、表３の遺伝子のいずれかの中のＣｐＧ位置のメチル化は、乳房細胞増殖性疾患の存在を示すものである。遺伝子ＰＲＤＭ２およびＳ１００Ａ７中のＣｐＧ位置のメチル化は、乳房細胞増殖性疾患の存在を示さない。
【０１９７】
本方法の別の実施形態（例えば、リアルタイム分析）では、分析したＣｐＧ位置でメチル化レベルを数量化（またはその平均、もしくはその平均を反映する値）することができ、そのような実施形態では、予め定めたカットオフ値は、測定したメチル化レベルがそれより高い場合を「メチル化した」と決定し、測定したメチル化レベルがそれより低い場合を「メチル化していない」と決定することとして、定めることが好ましい。特に好ましいものは、カットオフが０％〜１０％のメチル化または同等値、同様に好ましいのはカットオフ値が３％〜７％のメチル化または同等値、さらに好ましいものは、カットオフ値が４％〜６％のメチル化または同等値である。
【０１９８】
さらに、本発明の追加の態様はキットであり、例えば、重亜硫酸塩含有試薬；その配列が、配列番号１〜配列番号９６４（最も好ましくは配列番号４９３〜配列番号９６４）の配列の１６塩基長のセグメントにいずれの場合にも対応し、相補的、またはストリンジェントまたは高度にストリンジェント条件下で前記セグメントとハイブリッド形成する少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドセット；オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー；および記載した方法を実施し評価するための使用説明書を含む。さらに好ましい実施形態では、前記キットには、さらに、ＣｐＧ位置特異的メチル化分析を実施するための標準試薬を含めてよく、その場合、前記分析は以下の技術の一つまたは複数を含む：ＭＳ‐ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ（商標）、ＣＯＢＲＡ、および核酸の配列決定。しかし、本発明の道筋に沿うキットは、前述の成分の一部しか含まなくてもよい。
【０１９９】
別の実施形態では、本発明は、表２６に記載のAPC, BCL11B, CASP8, CDKN2A, DAPK1, DDX51, DKK3, ESR1, ESR2, FABP3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 46, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 117, GIRK2, GJB2, GS1, HS3ST2, MCT1, MGC34831, MLH1, NME1, ORPHAN NUCLEAR RECEPTOR NR5A2 , PGR, PRDM6, RARA, RARB, S100A7, SASH1, SEQ ID NO:42, SERPINB5, SLC19A1, SNCG, SOD2, TERT, TGFBR2, TP73からなる群から選択される分子遺伝学的マーカーであって、癌、特に肺癌、乳癌、および大腸癌の発生に付随するメチル化パターンを分析するための新規な有用性を備えるマーカーを提供する。前記マーカーは、癌、特に、肺癌、乳癌、および大腸癌を検出し、それによって前記疾患を検出し初期治療するための改良された手段を提供するために使用しうる。本明細書で使用する癌という語は、無制御な細胞増殖によって特徴付けられ、隣接組織（浸潤）中に直接増殖し、かつ／または離れた部位へ細胞遊走（転移）することによって他の組織へ浸潤することができる悪性新生物の全クラスをさす総称として理解されよう。
【０２００】
前記遺伝子および／または配列の使用は、任意の遺伝子発現分析、ｍＲＮＡ発現分析、または蛋白質発現分析によって可能となりうる。しかし、本発明の最も好ましい実施形態では、乳房細胞増殖性疾患の検出は、前記遺伝子またはゲノム配列、ならびにそのプロモータまたは調節エレメントのメチル化状況を分析することによって可能になる。遺伝子のメチル化を分析する方法は本明細書に記載されている。
【０２０１】
さらに、SEQ ID NO: 65, 50, 71, 57, 98, 43, 24, 75, 91, 77, 4, 7, 9, 14, 16, 17, 19, 28, 29, 36, 46, 48, 51, 117, 27, 111, 40, 113, 101, 52, 89, 107, 11, 83, 20, 108, 88, 96, 102, 42, 68, 116, 73, 105, 92, 93, 86に記載の表２６の前記遺伝子配列および添付の配列表に記載されている８６を分析するのが好ましい。
【０２０２】
好ましい実施形態では、本発明は対象での癌の検出方法を提供する。前記方法は、以下のステップを含む。
ｉ）対象から得たゲノムＤＮＡと、そのゲノムＤＮＡの少なくとも一個の標的領域中のメチル化ＣｐＧジヌクレオチドと非メチル化ＣｐＧジヌクレオチドを区別する少なくとも一種の試薬または一連の試薬を接触させるものであり、その際、前記近接するヌクレオチドが少なくとも一個のＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、そして
ｉｉ）乳房細胞増殖性疾患を検出し、またはその疾患間で検出区別すること。
【０２０３】
前記ゲノムＤＮＡは、対象の体液から単離して得るのが特に好ましい。
【０２０４】
ゲノムＤＮＡは、市販キットの使用を含め、当技術分野で標準的な任意の手段によって単離することができる。手短に言えば、当該ＤＮＡが細胞膜に包まれている場合、生物試料は酵素的、化学的、または機械的手段によって破壊され溶解するはずである。次いで、例えば、プロテイナーゼＫで消化することによって、ＤＮＡ溶液から蛋白質や他の夾雑物を除去することができる。次いで、その溶液からゲノムＤＮＡを回収する。これは、塩析、有機抽出、または固相支持体へのＤＮＡの結合を含む様々な方法によって実施することができる。方法の選択は、時間、費用、および必要なＤＮＡ量を含む幾つかの要因によって影響される。体液が好ましいＤＮＡ源であり、特に好ましいものは、血漿、血清、全血、単離した血液細胞および血液から単離した細胞である。
【０２０５】
次いで、５'位置で非メチル化シトシン塩基が、ウラシル、チミン、またはハイブリッド形成挙動の点でシトシンと異なる別の塩基に転換されるようにそのゲノムＤＮＡ試料を処理する。本明細書では、これは「処理」として理解されたい。
【０２０６】
これは、重亜硫酸塩試薬で処理することによって実現するのが好ましい。「重亜硫酸塩試薬」という語は、重亜硫酸塩、二亜硫酸塩、亜硫酸水素塩またはそれらの組合せを含む試薬をさし、本明細書に開示した通りメチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列と、非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するのに有用である。前記処理法は当技術分野で公知である（例えば、ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５、その全体を参照により組み込む）。重亜硫酸塩処理は、それだけには限らないが、ｎ‐アルキレングリコール、特に、ジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）などの変性化溶媒の存在下で、あるいはジオキサンまたはジオキサン誘導体の存在下で実施するのが好ましい。好ましい実施形態では、変性化溶媒は１％〜３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用する。重亜硫酸塩反応は、それだけには限らないが、クロマン誘導体、例えば、６‐ヒドロキシ‐２，５，７，８，‐テトラメチルクロマン２‐カルボン酸などのスカベンジャーの存在下で実施するのも好ましい（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照。その全体を参照により組み込む）。重亜硫酸塩転換は、３０℃〜７０℃の反応温度で実施し、それによって反応中短時間に温度を８５℃以上に上昇させるのが好ましい（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照。その全体を参照により組み込む）。重亜硫酸塩処理したＤＮＡは、精製した後、さらに分析するのが好ましい。これは、それだけには限らないが、限外濾過などの当技術分野で公知の任意の手段によって実施することができ、Microcon（商標）カラム（Millipore（商標）社製）によって実施するのが好ましい。精製は、手直しした製造業者のプロトコルに従って実施する（ＰＣＴ／ＥＰ２００４／０１１７１５を参照。その全体を参照により組み込む）。
【０２０７】
次いで、癌の発生に付随する、一個または複数の（処理前）標的遺伝子配列のメチル化状態を定量するために処理したＤＮＡを分析する。その標的領域は、表２６に示す遺伝子およびゲノム配列からなる群から選択される少なくとも一個の遺伝子またはゲノム配列の少なくとも１６個の近接するヌクレオチドを含み、またはストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成するのが特に好ましい。さらに、添付の配列表に記載されているSEQ ID NO: 65, 621, 622, 857, 858, 50, 591, 592, 827, 828, 71, 633, 634, 869, 870, 57, 605, 606, 841, 842, 98, 687, 688, 923, 924, 43, 577, 578, 813, 814, 24, 539, 540, 775, 776, 75, 641, 642, 877, 878, 91, 673, 674, 909, 910, 77, 645, 646, 881, 882, 4, 499, 500, 735, 736, 7, 505, 506, 741, 742, 9, 509, 510, 745, 746, 14, 519, 520, 755, 756, 16, 523, 524, 759, 760, 17, 525, 526, 761, 762, 19, 529, 530, 765, 766, 28, 547, 548, 783, 784, 29, 549, 550, 785, 786, 36, 563, 564, 799, 800, 46, 583, 584, 819, 820, 48, 587, 588, 823, 824, 51, 593, 594, 829, 830, 117, 725, 726, 961, 962, 27, 545, 546, 781, 782, 111, 713, 714, 949, 950, 40, 571, 572, 807, 808, 113, 717, 718, 953, 954, 101, 693, 694, 929, 930, 52, 595, 596, 831, 832, 89, 669, 670, 905, 906, 107, 705, 706, 941, 942, 11, 513, 514, 749, 750, 83, 657, 658, 893, 894, 20, 531, 532, 767, 768, 108, 707, 708, 943, 944, 88, 667, 668, 903, 904, 96, 683, 684, 919, 920, 102, 695, 696, 931, 932, 42, 575, 576, 811, 812, 68, 627, 628, 863, 864, 116, 723, 724, 959, 960, 73, 637, 638, 873, 874, 105, 701, 702, 937, 938, 92, 675, 676, 911, 912, 93, 677, 678, 913, 914, 86, 663, 664, 899, 900に記載の表２６の前記遺伝子配列を分析するのが好ましい。分析方法は、本明細書に収載されているものを含め、当技術分野で公知のものから選択しうる。特に好ましいものは、本明細書で先に述べた通り、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ（商標）、ＭＳＰおよびブロッキングオリゴヌクレオチドの使用である。そのような分析で使用する（プライマー、ブロッキングオリゴヌクレオチド、および検出プローブを含む）任意のオリゴヌクレオチドは、表２６に記載の65, 621, 622, 857, 858, 50, 591, 592, 827, 828, 71, 633, 634, 869, 870, 57, 605, 606, 841, 842, 98, 687, 688, 923, 924, 43, 577, 578, 813, 814, 24, 539, 540, 775, 776, 75, 641, 642, 877, 878, 91, 673, 674, 909, 910, 77, 645, 646, 881, 882, 4, 499, 500, 735, 736, 7, 505, 506, 741, 742, 9, 509, 510, 745, 746, 14, 519, 520, 755, 756, 16, 523, 524, 759, 760, 17, 525, 526, 761, 762, 19, 529, 530, 765, 766, 28, 547, 548, 783, 784, 29, 549, 550, 785, 786, 36, 563, 564, 799, 800, 46, 583, 584, 819, 820, 48, 587, 588, 823, 824, 51, 593, 594, 829, 830, 117, 725, 726, 961, 962, 27, 545, 546, 781, 782, 111, 713, 714, 949, 950, 40, 571, 572, 807, 808, 113, 717, 718, 953, 954, 101, 693, 694, 929, 930, 52, 595, 596, 831, 832, 89, 669, 670, 905, 906, 107, 705, 706, 941, 942, 11, 513, 514, 749, 750, 83, 657, 658, 893, 894, 20, 531, 532, 767, 768, 108, 707, 708, 943, 944, 88, 667, 668, 903, 904, 96, 683, 684, 919, 920, 102, 695, 696, 931, 932, 42, 575, 576, 811, 812, 68, 627, 628, 863, 864, 116, 723, 724, 959, 960, 73, 637, 638, 873, 874, 105, 701, 702, 937, 938, 92, 675, 676, 911, 912, 93, 677, 678, 913, 914, 86, 663, 664, 899, 900、およびそれらに相補的な配列からなる群から選択される転換した配列の一つまたは複数の塩基配列の少なくとも１６塩基対長のセグメントに逆相補的であり、または同一であり、またはストリンジェントまたは高度にストリンジェント条件下で前記配列とハイブリッド形成するのがさらに好ましい。
【０２０８】
表２６に記載の遺伝子のＣｐＧのメチル化分析は、遺伝子パネルの形で実施するのが特に好ましく、その際、前記遺伝子パネルは、表２６から選択される一個または複数のマーカー、ならびに一個または複数の組織特異性メチル化マーカーからなる。組織特異性メチル化マーカーという語は、少なくとも一個のＣｐＧ位置を含むＤＮＡ配列を意味し、そのメチル化状況は特異的組織型に特有かつ特徴的であり、それによって前記組織起源の生物学的物質が同定できるようになると理解されたい。前記遺伝子パネルは、表２６から選択される一個または複数のマーカー、ならびに乳房、大腸、および肺の個々の組織特異的マーカーからなる群から選択される一個または複数の組織特異性メチル化マーカーからなるのがさらに好ましい。別の実施形態では、前記遺伝子パネルは、表２６から選択される一個または複数のマーカー、ならびに膀胱、乳房、大腸、肺、直腸、膵臓、子宮内膜、前立腺、腎臓、および皮膚の組織の個々の組織特異的マーカーからなる群から選択される一個または複数の組織特異性メチル化マーカーからなる。
【０２０９】
検出および／または特徴付け用に、本明細書に記載した核酸、オリゴヌクレオチドおよびキットが、全ての癌、より好ましくは乳癌、肺癌および大腸癌を検出するための追加の有用性を有することは当業者よって理解されよう。
【０２１０】
より詳細には、本発明の好ましい実施形態は、表２６に記載のゲノムＤＮＡまたは処理した（化学的に修飾された）ＤＮＡ中のシトシンのメチル化状態を検出するためのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの使用を含む。前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、表２６に記載の処理した核酸配列および／またはそれらに相補的な配列、あるいは表２６に記載のゲノム配列および／またはそれらに相補的な配列と、（本明細書に上記した）中程度にストリンジェントまたはストリンジェント条件下でハイブリッド形成する少なくとも９ヌクレオチド長の核酸配列を含む。
【０２１１】
さらに、本発明は、例えば、重亜硫酸塩含有試薬；その配列がいずれの場合にも、表２６に記載の配列（最も好ましくは表２６に示す転換した配列）の１６塩基長のセグメントに対応し、相補的であり、またはストリンジェントまたは高度にストリンジェント条件下で前記セグメントとハイブリッド形成する、少なくとも２つのオリゴヌクレオチドを含むプライマーオリゴヌクレオチドのセット；オリゴヌクレオチドおよび／またはＰＮＡオリゴマー；および記載した方法を実施し評価するための使用説明書を含む癌検出キットも提供する。さらに好ましい実施形態では、前記キットには、さらに、ＣｐＧ位置特異的メチル化分析を実施するための標準試薬を含めてよく、その場合、前記分析は、以下の技術の一つまたは複数を含む：ＭＳ‐ＳＮｕＰＥ、ＭＳＰ、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌ、ＣＯＢＲＡ、および核酸の配列決定。しかし、本発明の道筋に沿うキットは、前述の成分の一部しか含まなくともよい。
【０２１２】
本発明は、いくつかのその好ましい実施形態に従って特異性を記載してきたが、以下の実施例は、本発明を例示するためにのみ役立ち、その最も広い解釈および同等の形態の原理および範囲内に本発明を制限しないものとする。
【実施例１】
【０２１３】
マイクロアレイ分析
マーカー候補を評価するために、本出願人独自のメチル化感受性マイクロアレイ技術を使用し、非常に多くの患者および対照試料を分析した。マイクロアレイ研究では、４７５個の試料収集物について２つの遺伝子パネルを分析した。
【０２１４】
患者試料
マイクロアレイ研究用に収集した患者試料の概要を表２５に提供する。
【０２１５】
患者試料：乳癌
初期乳癌試料をオランダ国ロッテルダムのErasmus Medical Centreから得た。腫瘍細胞率を３０％〜９０％の範囲、平均して６０％と推定した。浸潤性乳管癌（ＩＤＣ）が最大の組織サブタイプであった。ＩＤＣ患者試料の中には、エストロゲン受容体（ＥＲ）陽性および陰性、閉経前および閉経後、ならびに攻撃的（リンパ節転移陽性）および低攻撃的（リンパ節転移陰性）腫瘍が含まれた。さらに、浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）および非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）を分析した。全てのＤＣＩＳ試料で、診断は病理学的再調査によって確認し、腫瘍細胞の含有量を見積もった。最後に、確認されたＢＲＣＡ１変異を伴う腫瘍を分析して、全乳癌発生率の約５〜１０％を占める遺伝子的乳癌試料が、異なるＤＮＡのメチル化パターンを示したかどうかを評価した。
【０２１６】
試料：良性乳房状態
正常乳房試料は、主として乳房縮小術、または最初ＤＣＩＳと診断されたが、病理学的再調査中に正常と分類された患者試料から得た。乳癌のほぼ排他的な起源である乳房上皮細胞のＤＮＡのメチル化パターンを分析するために、上皮細胞表面マーカーを使用し上皮細胞を選別した。さらに、線維腺腫、線維嚢胞疾患および異型乳管過形成と診断された試料を良性乳房状態群に加えた。
【０２１７】
試料：他の癌
他の癌試料でマーカーの性能を評価するために、数種の他の癌型から得た腫瘍ＤＮＡを分析した。女性に最も頻繁に発生した癌クラス（肺、大腸）および女性生殖系（子宮内膜、卵巣）の腫瘍に重点を置いた。
【０２１８】
リンパ球
同年齢の女性のリンパ球試料を使用して、血液細胞中の候補マーカーのメチル化レベルを評価した。
【０２１９】
対照試料
対照目的として、追加の試料を両マイクロアレイ研究に加えた。検出オリゴの質と機能性を制御するために、人工的に高メチル化および低メチル化させたＤＮＡ（Promega）を使用した。８人の男性リンパ球試料を含めて、男性と女性のリンパ球試料間の差次的メチル化の比較によって、全体的マイクロアレイ過程の正の対照を準備した。
【０２２０】
遺伝子選択
６３個の候補遺伝子または配列の初期選択を同定した。さらに、男性起源と女性起源のＤＮＡを区別することが知られている一遺伝子フラグメントＥＬＫ１を正の対照として含めた。第２のマイクロアレイ研究用の遺伝子パネルは、当初ＡＰ‐ＰＣＲ、ＭＣＡまたはＤＭＨを使用して同定し、配列決定および正の対照としてＥＬＫ１遺伝子によって確認した５９個の配列からなった。第２のパネルの配列が全て、既知の遺伝子へ現在マップされているわけではないことに留意しなければならない。両チップからの候補マーカーを全て表３に示す。
【０２２１】
ＤＮＡ抽出
外部協力者または商業的提供者から、凍結組織、細胞核ペレット、または抽出したゲノムＤＮＡとして試料を入手した。QiaAmp Miniキット（Qiagen, Hilden, Germany; No: 51306）を使用し、組織試料および細胞核ペレットからＤＮＡを単離した。
【０２２２】
届けられた試料および抽出試料の全てのＤＮＡ質を最初に測光法による測定によって評価した。２６０ｎｍおよび２８０ｎｍで吸光度を測定し、Ａ２６０／２８０率を定量し、得られたＤＮＡ濃度を算出した。
【０２２３】
測光法による測定後、各ゲノムＤＮＡ試料をゲル電気泳動によって分析してＤＮＡの統合性を評価した。分解の軽微な徴候しか観察されず、抽出したＤＮＡの全体的な質が良好であることが示された。
【０２２４】
ＰＣＲの確立および多重ＰＣＲ最適化
全ての遺伝子フラグメントを増幅するために、ＰＣＲアッセイを設計して、重亜硫酸塩処理したＤＮＡに適合させ、それぞれのフラグメントのメチル化状況から独立した増幅を可能にした。重亜硫酸塩処理したＤＮＡ用に本出願人によって最適化した標準化プライマー設計ワークフローを使用した。重亜硫酸塩処理したリンパ球ＤＮＡで好首尾な増幅が三つ組で複製され、ゲノムＤＮＡのバックグラウンド増幅が検出されず、重亜硫酸塩ＤＮＡ特異的増幅が確実になったとき、個々のＰＣＲアッセイが確立したとみなされた。プライマーを表１に示す。
【０２２５】
効率的増幅を可能にするために、個々のＰＣＲアッセイを多重ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）アッセイに組み合わせて、通常、８個までのプライマー対を一つのｍＰＣＲアッセイに組み入れた。個々のＰＣＲ増幅物のプライマー配列に基づいて、数個の多重ＰＣＲセットを算出し、リンパ球ＤＮＡで検査した。ＡＬＦ  ｅｘｐｒｅｓｓ分析に基づいて、最良の性能の多重ＰＣＲセットの組合せを選択した。
【０２２６】
重亜硫酸塩処理および多重ＰＣＲ
全ての試料および対照の全ゲノムＤＮＡを重亜硫酸塩処理し、メチル化していないシトシンをウラシルに転換した。メチル化したシトシンを保存する。本出願人が最適化し独自の重亜硫酸塩処理手順に従って重亜硫酸塩処理を実施した。潜在的な過程の偏りを回避するために、試料を加工バッチにランダムに割り付けた。主要な診断クラスに従って、最初に患者試料をグループ分けした。
・ＩＬＣ
・ＩＤＣ、Ｎ０、ＥＲ＝ｎｅｇ
・ＩＤＣ、Ｎ０、ＥＲ＝ｐｏｓ
・ＩＤＣ、Ｎ１またはＮ２、ＥＲ＝ｎｅｇ
・ＩＤＣ、Ｎ１またはＮ２、ＥＲ＝ｐｏｓ
・他の腫瘍：
・良性疾患／ＤＣＩＳ
・リンパ球：
・正常乳房および上皮細胞
・ＢＲＣＡ１
【０２２７】
５０個の試料のバッチを作成した。各バッチには、主要な診断クラスからの試料を同じ比率で含めた。２個の独立した重亜硫酸塩反応を各ＤＮＡ試料について実施した。１０ｎｇの重亜硫酸塩処理したＤＮＡを各多重ＰＣＲ（ｍＰＣＲ）反応に使用した。ｍＰＣＲ結果をモニターするために、２つの方法、つまりＡＬＦ分析およびゲル電気泳動を使用した。
【０２２８】
ハイブリッド形成
次いで、分析下各ＣｐＧ位置用に、個々の試料それぞれから全てのＰＣＲ生成物を、１対の固定したオリゴヌクレオチドを担持するガラススライドにハイブリッド形成した。ハイブリッド形成には、プロセスの潜在的偏りを回避するために試料を加工バッチにグループ分けした。試料は、重亜硫酸塩バッチにランダムに割り付けた８０個の試料のバッチ中で加工した。元々メチル化していない（ＴＧ）またはメチル化した（ＣＧ）一ＣｐＧ部位周辺で、重亜硫酸塩転換した配列とハイブリッド形成させるために、各検出オリゴヌクレオチドを設計した。使用した全てのハイブリッド形成オリゴヌクレオチド（情報的に有用および無用）のさらに詳しい説明は表２を参照されたい。ハイブリッド形成条件を選択して、ＴＧ変異体とＣＧ変異体間の単一ヌクレオチドの差異を検出できるようにした。
【０２２９】
ｇｅｎｅｐｉｘスキャナおよびソフトウェアを使用し、各ハイブリッド形成したオリゴヌクレオチドから蛍光シグナルを検出した。蛍光シグナルの強度の比較に基づき、２個のシグナルの比率を（各ＣｐＧ位置を分析するために使用したＣＧオリゴヌクレオチドおよびＴＧオリゴヌクレオチドから）算出した。
【０２３０】
性別、診断、組織についてランダム化した８０個の試料のバッチおよび重亜硫酸塩バッチで試料を加工した。各重亜硫酸塩処理したＤＮＡ試料について、２回のハイブリッド形成を実施した。これは、試料ごとに、総数４チップを加工したことを意味する。
【０２３１】
データ分析
チップデータの分析では、Epigenomics独自のソフトウェア（「Episcape」）を使用した。EpiScapeは、それぞれ、試料に対してクエリを支持するデータ保管庫、ゲノム、および研究室管理データベースを備える。それは、メチル化アレイデータを分析し視覚化するための様々な統計ツールを備える。以下の章では、本発明者らは、データを分析するために利用した最も重要なデータ分析技術を要約する。
【０２３２】
未加工ハイブリッド形成強度からメチル化率
各ＣｐＧ位置の対数メチル化率（ｌｏｇ（ＣＧ／ＴＧ））は、以下のステップを含む標準化した予備プロセシングパイプラインによって定量した。
・各スポットでは、中央値フォアグラウンドピクセル強度から中央値バックグラウンドピクセル強度を減算する。これにより、バックグラウンド修正したハイブリッド形成強度の良好な評価が得られる。
・各ＣｐＧ位置のＣＧおよびＴＧ検出オリゴヌクレオチドでは、４重複性スポット強度のバックグラウンド修正した中央値を得る。
・各チップおよび各ＣＧ／ＴＧオリゴ対では、ｌｏｇ（ＣＧ／ＴＧ）比を算出する。
・試料ごとに、重複性チップ反復に対するｌｏｇ（ＣＧ／ＴＧ）強度の中央値を得る。
【０２３３】
この対数比は、ハイブリッド形成ノイズが、可能なメチル化率の全範囲にわたって、およそ一定の分散性を有するという特性を保有する（例えば、Huber W, Von Heydebreck A, Sultmann H, Poustka A, Vingron M. 2002.を参照。Variance stabilization applied to Microarray data calibration and to the quantification of differential expression, Bioinformatics. 18 Suppl 1: S96-S104）
【０２３４】
主成分分析
主成分分析（ＰＣＡ）は、新規な座標系上に測定ベクトルを投影する（例えば、数個のＣｐＧ部位上のチップデータ、メチル化プロフィールなど）。新規な座標軸を主成分と称する。第１の主成分は、データの最大分散方向にスパンする。次の成分は、減少する分散によって順序付けられ、互いに直交する。異なるＣｐＧ位置が、異なるウェイトで、異なる成分に沿うデータクラウド伸展に寄与する。ＰＣＡは無管理技術であり、すなわち、データ点のどんな基または標識情報も考慮されない（さらに詳しい説明については、例えば、Ripley, B. D. 1996. Pattern Recognition and Neural Networks, Cambridge, UK, Cambridge University Press.を参照）。
【０２３５】
典型的には、ＰＣＡは、データから高分散性を備えた特徴を視覚化しまたは抽出するために、高次元データ（本発明者らの事例ではメチル化アレイデータ）を低次元部分空間に投影する目的で使用される。本報告では、本発明者らは、データの統計品質を管理するために２次元投影を使用した。本発明者らは、処理パラメータの変化が測定値で大きな変化を招くことを排除するために、チップデータに及ぼす異なる処理パラメータの作用を調査した。
【０２３６】
ＰＣＡの確固たるバージョンを使用して単一異常チップを検出し、それ以上の分析からそれらを除外する（Model F, Koenig T, Piepenbrock C, Adorjan P. 2002. Statistical process control for large scale Microarray experiments. Bioinformatics. 18 Suppl 1:S155-163.）。
【０２３７】
Ｔ２コントロールチャート
チップ生成プロセスの全体的な安定性を制御するために、本発明者らは、多変量統計プロセスコントロール（ＭＶＳＰＣ）の分野の方法を利用する。本発明者らの主要なツールは、Ｔ２コントロールチャートであり、これは通常作業条件からチッププロセスの有意な偏差を検出するために使用される（Model F, Koenig T, Piepenbrock C, Adorjan P. 2002. Statistical process control for large scale Microarray experiments. Bioinformatics. 18 Suppl 1:S155-163.）。
・プロセスパラメータに関してチップデータをオーダーする（例えば、ハイブリッド形成データまたはスポッティングロボット）。
・歴史的データセットを定義する。これは通常作業条件下でチッププロセスについて記載している（例えば、第１の７５個のハイブリッド形成チップ）。チャートでは、特殊なプロット記号によって歴史的データセットのデータが示される。
・歴史的データセットに対してあらゆる新規なチップの距離を計算する。数個の連続的なチップの距離が、所与のコントロールリミットを超える場合、プロセスを制御不能とみなす必要がある。
【０２３８】
チップ生成プロセスをモニターするためにＴ２チャートを使用することによって、本発明者らはほとんどのシステムエラー源を効率よく検出し除去することができるようになる。
【０２３９】
群の比較：一変量方法
ウィルコクソンの順位和検定を使用して単一ＣｐＧ部位の測定値の点で群を比較する（例えば、男性対女性のリンパ球）。有意（ｐ＜０．０５）な検査結果は、それぞれのメチル化対数比すなわちｌｏｇ（ＣＧ／ＴＧ）の分布間での移行を示す。
【０２４０】
Promega  ＤＮＡとハイブリッド形成させた高メチル化対低メチル化チップの比較では、フィッシャーの得点を使用して、その判別力にしたがって単一ＣｐＧ部位を順位付ける。各メチル化率では、ｙ＝ＣＧ／ＴＧ、フィッシャースコアを次のように算出する。
【数１】
2008506407.tif 000002
【０２４１】
群の比較：多変量方法
本明細書に示す通り、マーカー（単に遺伝子または単位複製配列と称する場合もある）は、当該ゲノムの領域をさす（本明細書では略記ＲＯＩの使用もさす）。通常、ＲＯＩは数個のＣｐＧ位置を含む。マーカーが何一つ予測力を持たないとする帰無仮説を試験するために、本発明者らはロジスティック回帰モデル用に尤度テストを使用した（Venables, W. N.およびRipley, B. D. Modern Applied Statistics with S-PLUS, 第３版 edition. New York: Springer, 2002.参照）。単一マーカー用ロジスティック回帰モデルは、それぞれのＲＯＩで、全てのＣｐＧ位置からのメチル化測定の一次結合である。適合させたロジスティック回帰モデルを、メチル化に独立して、帰無仮説を表す一定確率モデルと比較する。マーカーのＰ値を尤度試験によって計算する。
【０２４２】
マーカーの有意なＰ値とは、このＲＯＩのメチル化がサンプルクラスによって得られた当該問題となんらかの系統だった相関を有するということを意味する。一般に、有意なＰ値は、必ずしも良好な分類性能を意味しない。しかし、ロジスティック回帰により、本発明者らは検査の基本として線形予測子を使用しているので、統計的に小さいＰ値は良好な臨床性能を示すであろう。
【０２４３】
複数検定修正
５％レベルで多数の検査を実施することは、多数の偽陽性検査結果につながるであろう。群相互間に差がないならば、約２００回の検査を実施した場合、等式の少なくとも一つの仮説を拒絶する確率は約１である。従って、多重度の修正は、検査結果が本当に有意であると確実に結論付けるために必要である。保存的であるが単純方法は、実施した検査数と全てのＰ値を掛けるボンフェローニ補正であり、その際、修正値＞１は１．０に切り捨てる。
【０２４４】
ボンフェローニ補正を全分析に使用する。補正は、偽の結果を回避するのに役立つが、これは非常に保守的な方法であり偽陰性結果（「外れマーカー」）が頻繁な結果である。従って、保守性の少ない過誤発見率（ＦＤＲ）法によって補正された結果も得られる。
【０２４５】
管理学習によるクラス予測
どれくらい首尾よく、選択されたマーカーのＣｐＧの組が、異なる組織クラス間を区別することができるかを確実に推定するために、本発明者らは分類によってその予測精度を定量することができる。その目的において、本発明者らは、特異的クラス標識を有するある組織試料セットを使用し、メチル化プロフィールをベースとした予測関数を計算する。このステップは、トレーニングと呼ばれ、データ標識によって表される先行の知識を利用する。次いで、その関数の予測精度を独立した試料セットで試験する。選択方法として、本発明者らは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズム（例えば、Cristiannini, N.およびShawe-Taylor, J. An introduction to support vector machines. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 2000.；Duda, R. O., Hart, P. E., およびStork, D. G. Pattern Classification. New York: John Wiley & Sons, 2001.参照）を使用して予測関数を学習した。この報告では、感受性と特異性は等しく重点が置かれる。これは、偽陽性および偽陰性分類に付随するリスクをそれぞれのクラスサイズに反比例して設定することによって実現される。従って、得られた分類指標の感受性と特異性は、ほぼ同等であると推定することができる。この調整は、臨床要件に従って適合させることができることに留意されたい。
【０２４６】
組織クラス予測性能の見積：交差検証法
限られた標本サイズでの交差検証法によって、判別関数の予測精度のための有効で確実な見積が得られ、従ってマーカーの有意性に加えて、本発明者らは、交差検証法の精度、感受性および特異性見積も提供する。各分類タスクには、試料をおよそ同じサイズ５群に分類した。次いで、これら５個の試料群のうち４個で学習アルゴリズムを訓練した。次いで、この方法によって得られた予測因子を独立した検査試料の残余の群で試験した。正確な陽性および陰性分類の数は、独立した検査群の全ての可能な選択のための学習アルゴリズム用に、先行のランから得たどんな知識も使用することなしに、１０ランを超えてカウントした。試料セットの１０回のランダム置換順列でこの手順を繰り返すと、単純に試料を一つのトレーニング試料セットと一つの独立した検査セットに分けることによってこれを実施した場合に比べて、良好な予測性能の見積が得られる。
【０２４７】
結果
乳癌試料と良性乳房状態を比較する場合、アレイデータの分析の第１のステップは、判別マーカーを同定することである。この試験の好ましい目的は初期病変を検出することであるので、ＤＣＩＳと良性乳房状態を区別することは主要な焦点であった。血液を基にしたスクリーニング検査の要件を満たすために、乳癌とリンパ球および癌と他の起源それぞれを区別するマーカー候補遺伝子の機能を分析した。
【０２４８】
最後に、全ての乳癌試料を他の全対照試料に対して比較し、多数のマーカーが特記した統計判定基準を満たすことを確認した。
【０２４９】
あらゆる比較について、２データ分析法を使用した。多変量ロジスティック回帰分析を実施し、ボンフェローニ法による複数検定用に得られたＰ値を補正した。２‐６検出オリゴ対によって測定したメチル化率を含む別個のモデルを各増幅物に合致させる。複数検定用のボンフェローニ補正を観察した後、Ｐ値が０．０５未満ならば、マーカーは好ましかった。さらに、直線サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムを訓練し、それぞれのクラスを区別するために精度、感受性および特異性を交差検証法に基づいて推定した。
【０２５０】
さらに、ＣｐＧ部位の共メチル化を、個々の検出オリゴを一変量分析によって分析して見積った。同じ遺伝子フラグメントの少なくとも２個の検出オリゴが、統計的有意性を有してそれぞれのクラスを区別した場合、共メチル化が推定された（ｐ＜０．０５、複数検定用のボンフェローニ補正後）。
【０２５１】
乳癌対良性乳房状態
マイクロアレイ１：結果は表１２を参照。
この比較では、陽性は、それぞれ、１９７個のＩＤＣ、２４個のＩＬＣ、２２個のＤＣＩＳおよび２０個のＢＲＣＡ１試料からなる２６３個の乳癌試料であった。陰性クラスは、線維腺腫、線維嚢胞疾患および異型乳管過形成を含む良性乳房状態を有する２８個の正常乳房試料および４６個の乳房試料からなった。多変量ロジスティック回帰分析に基づき、４９個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち２８個のマーカーは、一変量分析に基づく少なくとも２個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
【０２５２】
マイクロアレイ２：結果は表１３を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、１９１個のＩＤＣ、２２個のＩＬＣ、２１個のＤＣＩＳおよび２２個のＢＲＣＡ１試料からなる２５６個の乳癌試料であった。陰性は、線維腺腫、線維嚢胞疾患および異型乳管過形成を含む、良性乳房状態を有する２６個の正常乳房試料および４２個の乳房試料からなった。多変量ロジスティック回帰に基づき、４８個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち、３２個のマーカーは、一変量分析に基づく少なくとも２個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
【０２５３】
結果も図１９〜３０に図形にして提供する。前記の図のそれぞれは、各重要なオリゴマーのメチル化レベルのマトリックスを表し、各遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーは一つの分離したブロックに分類する。各オリゴマーの配列番号はマトリックスの左側に示し、マトリックスの右側には、各個人の遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーのＦＤＲ修正多変量Ｐ値を示す。メチル化レベルは、マトリックスの右側のスケールに示すように、全メチル化（＋２）を表す黒色から全非メチル化（‐２）を表す白色まで各マトリックスの四角のカラーによって示される。マトリックスの各垂直線は一試料を表し、試料の種類はマトリックス上部に示す。
【０２５４】
ＤＣＩＳ対良性乳房状態
マイクロアレイ１：結果は表１０を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、１９７個のＩＤＣ、２４個のＩＬＣ、２２個のＤＣＩＳおよび２０個のＢＲＣＡ１試料からなる２６３個の乳癌試料であった。陰性クラスは、線維腺腫、線維嚢胞疾患および異型乳管過形成を含む良性乳房状態を有する２８個の正常乳房試料および４６個の乳房試料から構成される。多変量ロジスティック回帰分析に基づき、３１個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち１３個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも２個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
【０２５５】
マイクロアレイ２：結果は表１１を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、１９１個のＩＤＣ、２２個のＩＬＣ、２１個のＤＣＩＳおよび２２個のＢＲＣＡ１試料からなる２５６個の乳癌試料であった。陰性クラスは、線維腺腫、線維嚢胞疾患および異型乳管過形成を含む良性乳房状態を有する２６個の正常乳房試料および４２個の乳房試料からなる。多変量ロジスティック回帰に基づき、３５個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち１７個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも２個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
【０２５６】
結果も図３１〜４２に図形にして提供する。前記の図のそれぞれは、各重要なオリゴマーのメチル化レベルのマトリックスを表し、各遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーは一つの分離したブロックに分類する。各オリゴマーの配列番号はマトリックスの左側に示し、マトリックスの右側には、各個人の遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーのＦＤＲ修正多変量Ｐ値を示す。メチル化レベルは、マトリックスの右側のスケールに示すように、全メチル化（＋２）を表す黒色から全非メチル化（‐２）を表す白色まで各マトリックスの四角のカラーによって示される。マトリックスの各垂直線は一試料を表し、試料の種類はマトリックス上部に示す。
【０２５７】
乳癌対リンパ球
マイクロアレイ１：結果は表８を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、１９７個のＩＤＣ、２４個のＩＬＣ、２２個のＤＣＩＳおよび２０個のＢＲＣＡ１試料からなる２６３個の乳癌試料であった。陰性クラスは２８個のリンパ球試料からなった。多変量ロジスティック回帰分析に基づき、４９個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち３０個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも２個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
【０２５８】
マイクロアレイ２：結果は表９を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、１９１個のＩＤＣ、２２個のＩＬＣ、２１個のＤＣＩＳおよび２２個のＢＲＣＡ１試料からなる２５６個の乳癌試料であった。陰性クラスは３４個のリンパ球試料からなった。多変量ロジスティック回帰に基づき、４７個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち、３７個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも２個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
【０２５９】
結果も図４３〜５４に図形にして提供する。前記の図のそれぞれは、各重要なオリゴマーのメチル化レベルのマトリックスを表し、各遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーは一つの分離したブロックに分類する。各オリゴマーの配列番号はマトリックスの左側に示し、マトリックスの右側には、各個人の遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーのＦＤＲ修正多変量Ｐ値を示す。メチル化レベルは、マトリックスの右側のスケールに示すように、全メチル化（＋２）を表す黒色から全非メチル化（‐２）を表す白色まで各マトリックスの四角のカラーによって示される。マトリックスの各垂直線は一試料を表し、試料の種類はマトリックス上部に示す。
【０２６０】
乳癌対他の癌
マイクロアレイ１：結果は表６を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、１９７個のＩＤＣ、２４個のＩＬＣ、２２個のＤＣＩＳおよび２０個のＢＲＣＡ１試料からなる２６３個の乳癌試料であった。陰性クラスは、１２個の大腸試料、１９個の肺試料、１６個の卵巣試料、および小さい組織群のさらに２８個の試料から構成される７１個の他の癌試料からなった。多変量ロジスティック回帰分析に基づき、２８個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち、１６個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも２個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
【０２６１】
マイクロアレイ２：結果は表７を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、１９１個のＩＤＣ、２２個のＩＬＣ、２１個のＤＣＩＳおよび２２個のＢＲＣＡ１試料からなる２５６個の乳癌試料であった。陰性クラスは、１８個の大腸試料、１８個の肺試料、１６個の卵巣試料、および小さな組織群のさらに２１個の試料からなる他の７３個の癌試料からなった。多変量ロジスティック回帰に基づき、２５個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち、を有する１５個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも２個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
【０２６２】
結果も図５５〜６６に図形にして提供する。前記の図のそれぞれは、各重要なオリゴマーのメチル化レベルのマトリックスを表し、各遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーは一つの分離したブロックに分類する。各オリゴマーの配列番号はマトリックスの左側に示し、マトリックスの右側には、各個人の遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーのＦＤＲ修正多変量Ｐ値を示す。メチル化レベルは、マトリックスの右側のスケールに示すように、全メチル化（＋２）を表す黒色から全非メチル化（‐２）を表す白色まで各マトリックスの四角のカラーによって示される。マトリックスの各垂直線は一試料を表し、試料の種類はマトリックス上部に示す。
【０２６３】
乳癌対他の全対照
マイクロアレイ１：結果は表４を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、１９７個のＩＤＣ、２４個のＩＬＣ、２２個のＤＣＩＳおよび２０個のＢＲＣＡ１試料からなる２６３個の乳癌試料であった。陰性クラスは、７４個の乳房試料（正常および良性疾患）、他の７１個の癌試料および２８個のリンパ球試料からなった。多変量ロジスティック回帰分析に基づき、５０個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち２９個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも２個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
【０２６４】
マイクロアレイ２：結果は表５を参照。
この比較では、陽性クラスは、それぞれ、１９１個のＩＤＣ、２２個のＩＬＣ、２１個のＤＣＩＳおよび２２個のＢＲＣＡ１試料からなる２５６個の乳癌試料であった。陰性クラスは、６８個の乳房試料（正常および良性疾患）、他の７３個の癌試料、および３４個のリンパ球試料からなった。多変量ロジスティック回帰に基づき、４８個のマーカーは、統計的有意性を有して乳癌と良性乳房状態を区別する。これらのうち３２個のマーカーは、一変量分析に基づく統計上有意な少なくとも２個の検出オリゴで共メチル化判定基準を満たした。
【０２６５】
結果も図６７〜７８に図形にして提供する。前記の図のそれぞれは、各重要なオリゴマーのメチル化レベルのマトリックスを表し、各遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーは一つの分離したブロックに分類する。各オリゴマーの配列番号はマトリックスの左側に示し、マトリックスの右側には、各個人の遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーのＦＤＲ修正多変量Ｐ値を示す。メチル化レベルは、マトリックスの右側のスケールに示すように、全メチル化（＋２）を表す黒色から全非メチル化（‐２）を表す白色まで各マトリックスの四角のカラーによって示される。マトリックスの各垂直線は一試料を表し、試料の種類はマトリックス上部に示す。
【０２６６】
一般的な癌マーカーの選択
表２７に示す、乳癌と良性乳房状態を区別するのに有意であるが、乳癌と他の癌の区別には有意ではなかった両マイクロアレイのマーカーは、一般的な癌マーカーとして有用であると判断された。
【実施例２】
【０２６７】
乳癌マーカーのリアルタイムアッセイ分析
以下の実施例では、様々なリアルタイムアッセイが、以下のメチル化分析用に開発された：
SEQ ID NO: 104 (CCND2) 
SEQ ID NO: 77 (FABP3) 
SEQ ID NO: 90 (RASSF1A) 
SEQ ID NO: 13 (MSF) 
SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 20 (PRDM6) 
SEQ ID NO: 38 (LMX1A)
SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 29
SEQ ID NO: 22 (NR2E1)
SEQ ID NO: 115 (SCGB3A1)
SEQ ID NO: 112 (SLIT2)
SEQ ID NO: 6
SEQ ID NO: 98 (DAPK1)。
【０２６８】
LightCyclerプラットフォーム（Roche Diagnostics）で作動させるために本アッセイを設計したが、当技術分野で通常使用されている他のそのような機器も適当である。本アッセイは、重亜硫酸塩処理したＤＮＡを分析するためのＭＳＰおよびＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌアッセイであった。
【０２６９】
ＭＳＰアッセイは、重亜硫酸塩転換した標的配列の増幅に適当な一対のメチル化特異的プライマーを含み、各プライマーは少なくとも一個のＣｐＧ位置を含む。従って、（重亜硫酸塩処理する前に）関連するＣｐＧ位置でメチル化した標的ＤＮＡしか増幅しない。次いで、Taqman型蛍光標識検出プローブによって増幅物を検出する。
【０２７０】
ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌアッセイでは、重亜硫酸塩転換した標的配列の増幅に特異的な１対のプライマーによって、その標的ＤＮＡを増幅し、その場合、重亜硫酸塩処理する前に、前記プライマーはＣｐＧジヌクレオチドを含む位置とハイブリッド形成しない。少なくとも一個のＡｐＣジヌクレオチドを含み、２個のプライマー間に位置する、重亜硫酸塩転換したがメチル化していないＣｐＧ位置とハイブリッド形成するブロッカーオリゴヌクレオチドの存在下で増幅を実施する。ブロッカーオリゴヌクレオチドは、そのプライマーによって標的配列の増幅を抑制するために適切に修飾されている。従って、（重亜硫酸塩処理する前に）関連するＣｐＧ位置でメチル化した標的ＤＮＡしか増幅しない。Lightcycler型蛍光標識二重検出プローブによって増幅物を検出する。
【０２７１】
プライマー、プローブおよび表２２に記載する関連のブロッカーオリゴヌクレオチドを使用した。以下の試薬および反応温度を使用した。
配列番号１０４（ＣＣＮＤ２）（アッセイ４）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
変性  ９５℃で            １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                          濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                                ０．３０μＭ
混合プライマー                                ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                    ３．５０ｍＭ
配列番号７７（ＦＡＢＰ３）（アッセイ１‐５）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
変性  ９５℃で            １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                          濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                                ０．３０μＭ
混合プライマー                                ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                    ３．５０ｍＭ
配列番号９０（ＲＡＳＳＦ１Ａ）（アッセイ１）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
初期変性  ９５℃で１５秒間
アニーリング  ６２℃で４５秒間
試薬：
試薬                                        濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                              ０．３０μＭ
混合プライマー                              ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                  ３．５０ｍＭ
配列番号１３（ＭＳＦ）（アッセイ２）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
初期変性  ９５℃で        １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                          濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                                ０．３０μＭ
混合プライマー                                ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                    ３．５０ｍＭ
配列番号１５（アッセイ５）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
活性化：        ９５℃        １０分
５５サイクル：        ９５℃        １０秒
５６℃        ３０秒
７２℃        １０秒
融解曲線：        ９５℃        １０秒
４０℃        １０秒
７０℃        ０秒
冷却：            ４０℃        ５秒
試薬：
試薬                                        濃度
ＭｇＣｌ２                                  ３．５０ｍＭ
混合プライマー                              ０．３０μＭ（各）
ブロッカー                                  ４．００μＭ
検出プローブ                                ０．１５μＭ（各）
１ａ＋１ｂ試薬ＦａｓｔＳｔａｒｔ混合物      １．００
配列番号２０（ＰＲＤＭ６）（アッセイ１００）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
初期変性  ９５℃で        １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                          濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                                ０．３０μＭ
混合プライマー                                ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                    ３．５０ｍＭ
配列番号３８（ＬＭＸ１Ａ）（アッセイ３）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
初期変性  ９５℃で        １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                        濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                              ０．３０μＭ
混合プライマー                              ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                  ３．５０ｍＭ
配列番号３（アッセイ８）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
変性  ９５℃で            １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                        濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                              ０．３０μＭ
混合プライマー                              ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                  ３．５０ｍＭ
配列番号２９（アッセイ２）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
変性  ９５℃で            １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                          濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                                ０．３０μＭ
混合プライマー                                ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                    ３．５０ｍＭ
配列番号２２（ＮＲ２Ｅ１）（アッセイｏ）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
変性  ９５℃で            １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                        濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                              ０．３０μＭ
混合プライマー                              ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                  ３．５０ｍＭ
配列番号１１５（ＳＣＧＢ３Ａ１）（アッセイ１）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
変性  ９５℃で            １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                          濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                                ０．３０μＭ
混合プライマー                                ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                    ３．５０ｍＭ
配列番号１１２（ＳＬＩＴ２）（アッセイ２‐２）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性  ９５℃で１０分間
５５サイクル：
変性  ９５℃で            １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                        濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                              ０．３０μＭ
混合プライマー                              ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                  ３．５０ｍＭ
配列番号６（アッセイ５）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
活性化：        ９５℃        １０分
５５サイクル：        ９５℃        １０秒
５６℃        ３０秒
７２℃        １０秒
融解曲線：            ９５℃        １０秒
４０℃        １０秒
７０℃        ０秒
冷却：                ４０℃        ５秒
試薬：
試薬                                        濃度
ＭｇＣｌ２                                  ３．５０ｍＭ
混合プライマー                              ０．３０μＭ（各）
ブロッカー                                  ４．００μＭ
検出プローブ                                ０．１５μＭ（各）
１ａ＋１ｂ試薬ＦａｓｔＳｔａｒｔ混合物      １．００
配列番号９８（ＤＡＰＫ１）（アッセイ２）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
初期変性９５℃で１０分間
５５サイクル：
変性  ９５℃で            １５秒間
アニーリング  ６２℃で    ４５秒間
試薬：
試薬                                        濃度
１ａ＋１ｂ混合試薬        １．００×
Taqmanプローブ                              ０．３０μＭ
混合プライマー                              ０．６０ｐｍｏｌ／μｌ（各）
ＭｇＣｌ２                                  ３．５０ｍＭ
配列番号２２（ＮＲ２Ｅ１）（アッセイ２）
Lightcycler熱サイクリングプログラム：
活性化：        ９５℃        １０分
５５サイクル：        ９５℃        １０秒
５６℃        ３０秒
７２℃        １０秒
融解曲線：            ９５℃        １０秒
４０℃        １０秒
７０℃        ０秒
冷却：                ４０℃        ５秒
試薬：
試薬                                        濃度
ＭｇＣｌ２                                  ３．５０ｍＭ
混合プライマー                              ０．３０μＭ（各）
ブロッカー                                  ４．００μＭ
検出プローブ                                ０．１５μＭ（各）
１ａ＋１ｂ試薬ＦａｓｔＳｔａｒｔ混合物      １．００
【０２７２】
試料
本アッセイを異なる２つの設定で試験した。第１の設定では、血液を基にしたスクリーニング検査での使用に適当な診断マーカーとしてのその有用性を判定するために、上記マイクロアレイ実験に従って確認された以下の乳癌マーカーを血液および乳癌試料で分析した。
SEQ ID NO: 104 (CCND2) 
SEQ ID NO: 77 (FABP3) 
SEQ ID NO: 90 (RASSF1A) 
SEQ ID NO: 13 (MSF) 
SEQ ID NO: 15
SEQ ID NO: 20 (PRDM6) 
SEQ ID NO: 38 (LMX1A)
SEQ ID NO: 3
SEQ ID NO: 4
SEQ ID NO: 29
SEQ ID NO: 22 (NR2E1)
SEQ ID NO: 115 (SCGB3A1)
SEQ ID NO: 112 (SLIT2)
SEQ ID NO: 6
SEQ ID NO: 98 (DAPK1)
【０２７３】
１０個の全血試料および１４個の乳癌試料を分析した。
【０２７４】
第２の設定では、これらのマーカーが一般的な癌マーカーであるか（すなわち、血液を基にしたスクリーニング検査において、より癌型特異的マーカーと併用する必要があるか）、またはこれらのマーカーは（他の癌とは対照的に）乳癌のみで特異的にメチル化したかを判断するために、上記マイクロアレイ実験に従って確認された以下の乳癌マーカーを分析した。
SEQ ID NO: 104 (CCND2) 
SEQ ID NO: 77 (FABP3) 
SEQ ID NO: 90 (RASSF1A) 
SEQ ID NO: 13 (MSF) 
SEQ ID NO: 20 (PRDM6) 
SEQ ID NO: 38 (LMX1A)
【０２７５】
２４個の乳癌試料、ならびに１２個の肺癌および１２個の大腸癌試料からなる「他の癌」試料群で、１７３７８を除く全試料を分析した。その際、データは、１２個の肺癌試料からなる「他の癌」群についてのみ表している。
【０２７６】
結果
各アッセイによって測定した、メチル化したＤＮＡの量の数量化は、検査試料の増幅曲線と検量線を比較することによって算出した。検量線は、参照として使用した希釈系列に従って導き出した。
【０２７７】
図１〜１２は、血液と乳癌試料の比率（Ｙ軸）の二値分布プロット（図の左側）を示し、測定したメチル化レベルは特記したカットオフ値（Ｘ軸）より高い。各図の右側は、特異性に対する感受性のＲＯＣプロットである。ＲＯＣ曲線は、診断検査の異なる可能カット値について、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。それは、選択したカット値に応じた、感受性と特異性の間のトレードオフを示す（感受性におけるどんな上昇にも、特異性における低下が伴う）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断検査を正確にするための測定である（面積が大きいほど良く、最適条件は１であり、ランダム試験ではＲＯＣ曲線は対角線上に伸び面積は０．５になるであろう。参照：J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975）。検出された各血液試料は、偽陽性とみなし、検出されなかった各乳癌は偽陰性とみなした。
【０２７８】
図１３〜１８は、血液対他の癌試料の比率（Ｙ軸）の二値分布プロット（図の左上側）を示し、測定したメチル化レベルは、特記したカットオフ値（Ｘ軸）より高い。下左側プロットは、各癌型試料の比率（Ｙ軸）を示す二値分布プロット（図の左上手側）を示し、測定したメチル化レベルは特記したカットオフ値（Ｘ軸）より高い。
【０２７９】
各図の右側は、特異性に対する感受性のＲＯＣプロットである。ＲＯＣ曲線は、診断検査の異なる可能カット値についての、偽陽性率に対する真陽性率のプロットである。それは、選択したカット値に応じた、感受性と特異性の間のトレードオフを示す（感受性におけるどんな上昇にも、特異性における低下が伴う）。ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、診断検査を正確にするための測定である（面積が大きいほど良く、最適条件は１であり、ランダム試験ではＲＯＣ曲線は対角線上に伸び面積は０．５になるであろう。参照：J.P. Egan. Signal Detection Theory and ROC Analysis, Academic Press, New York, 1975）。
【０２８０】
検出した他の癌試料それぞれは、偽陽性とみなし、検出されなかった各乳癌は偽陰性とみなした。
【０２８１】
どの図がどのアッセイに対応するか判断するためには表２３および２４を参照。
【０２８２】
表２３は、血液対乳癌の比較にしたがって、アッセイした遺伝子それぞれのＡＵＣ、特に好ましい感受性、および特異性を示す。
【０２８３】
表２４は、他の癌対乳癌の比較に従ってアッセイした遺伝子それぞれのＡＵＣ、特に好ましい感受性、および特異性を示す。
【図面の簡単な説明】
【０２８４】
【図１】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号４０４８の分析（アッセイ１）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図２】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号２２（ＮＲ２Ｅ１）の分析（アッセイｏ）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図３】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号２９の分析（アッセイ２）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図４】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号９０（ＲＡＳＳＦ１Ａ）の分析（アッセイ１）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図５】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号７７（ＦＡＢＰ３）の分析（アッセイ１‐５）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図６】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号１０４（ＣＣＮＤ２）の分析（アッセイ４）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図７】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号３８（ＬＭＸ１Ａ）の分析（アッセイ３）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図８】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号２０（ＰＲＤＭ６）の分析（アッセイｏ）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図９】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号１３（ＭＳＦ）の分析（アッセイ２）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図１０】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号１１２（ＳＬＩＴ２）の分析（アッセイ２‐２‐５）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図１１】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号９８（ＤＡＰＫ１）の分析（アッセイ２）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図１２】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号１１５（ＳＣＧＢ３Ａ１）の分析（アッセイ１）を示す二値分布曲線であり、結果を表２３に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図１３】３個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号９０（ＲＡＳＳＦ１Ａ）の分析（アッセイ１）を示す２本の二値分布曲線であり、結果を表２４に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図１４】３個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号３８（ＬＭＸ１Ａ）の分析（アッセイ３）を示す２本の二値分布曲線であり、結果を表２４に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図１５】２個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号１３（ＭＳＦ）の分析（アッセイ２）を示す二値分布曲線であり、結果を表２４に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図１６】３個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号１０４（ＣＣＮＤ２）の分析（アッセイ４）を示す２本の二値分布曲線であり、結果を表２４に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図１７】３個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号７７（ＦＡＢＰ３）の分析（アッセイ１‐５）を示す２本の二値分布曲線であり、結果を表２４に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図１８】３個のプロット図である。左側は、実施例２に従い表２２に示す定量アッセイによる、配列番号２０（ＰＲＤＭ６）の分析（アッセイｏ）を示す２本の二値分布曲線であり、結果を表２４に示す。Ｙ軸は、メチル化レベルがＸ軸に示した測定値より大きい分析試料の割合を示す。右側は、実施例２に従って算出した前記アッセイのＲＯＣプロットである。
【図１９】実施例１によるマイクロアレイ分析の結果のグラフである。前記の図のそれぞれは、重要なオリゴマーのメチル化レベルのマトリックスを表し、各遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーは一つの分離したブロックに分類する。各オリゴマーの配列番号はマトリックスの左手側に示し、マトリックスの右手側には、各個人の遺伝子またはゲノム配列に属しているオリゴマーのＦＤＲ修正多変量Ｐ値を示す。メチル化レベルは、マトリックスの右手側のスケールに示すように、全メチル化（＋２）を表す黒色から全非メチル化（‐２）を表す白色まで各マトリックスの四角のカラーによって示される。マトリックスの各垂直線は一試料を表し、試料の種類はマトリックス上部に示す。
【図２０】図１９と同じ
【図２１】図１９と同じ
【図２２】図１９と同じ
【図２３】図１９と同じ
【図２４】図１９と同じ
【図２５】図１９と同じ
【図２６】図１９と同じ
【図２７】図１９と同じ
【図２８】図１９と同じ
【図２９】図１９と同じ
【図３０】図１９と同じ
【図３１】図１９と同じ
【図３２】図１９と同じ
【図３３】図１９と同じ
【図３４】図１９と同じ
【図３５】図１９と同じ
【図３６】図１９と同じ
【図３７】図１９と同じ
【図３８】図１９と同じ
【図３９】図１９と同じ
【図４０】図１９と同じ
【図４１】図１９と同じ
【図４２】図１９と同じ
【図４３】図１９と同じ
【図４４】図１９と同じ
【図４５】図１９と同じ
【図４６】図１９と同じ
【図４７】図１９と同じ
【図４８】図１９と同じ
【図４９】図１９と同じ
【図５０】図１９と同じ
【図５１】図１９と同じ
【図５２】図１９と同じ
【図５３】図１９と同じ
【図５４】図１９と同じ
【図５５】図１９と同じ
【図５６】図１９と同じ
【図５７】図１９と同じ
【図５８】図１９と同じ
【図５９】図１９と同じ
【図６０】図１９と同じ
【図６１】図１９と同じ
【図６２】図１９と同じ
【図６３】図１９と同じ
【図６４】図１９と同じ
【図６５】図１９と同じ
【図６６】図１９と同じ
【図６７】図１９と同じ
【図６８】図１９と同じ
【図６９】図１９と同じ
【図７０】図１９と同じ
【図７１】図１９と同じ
【図７２】図１９と同じ
【図７３】図１９と同じ
【図７４】図１９と同じ
【図７５】図１９と同じ
【図７６】図１９と同じ
【図７７】図１９と同じ
【図７８】図１９と同じ
【表１−１】
2008506407.tif 000003
【表１−２】
2008506407.tif 000004
【表１−３】
2008506407.tif 000005
【表１−４】
2008506407.tif 000006
【表１−５】
2008506407.tif 000007
【表２−１】
2008506407.tif 000008
【表２−２】
2008506407.tif 000009
【表２−３】
2008506407.tif 000010
【表２−４】
2008506407.tif 000011
【表２−５】
2008506407.tif 000012
【表２−６】
2008506407.tif 000013
【表２−７】
2008506407.tif 000014
【表２−８】
2008506407.tif 000015
【表２−９】
2008506407.tif 000016
【表２−１０】
2008506407.tif 000017
【表２−１１】
2008506407.tif 000018
【表２−１２】
2008506407.tif 000019
【表２−１３】
2008506407.tif 000020
【表２−１４】
2008506407.tif 000021
【表２−１５】
2008506407.tif 000022
【表２−１６】
2008506407.tif 000023
【表２−１７】
2008506407.tif 000024
【表２−１８】
2008506407.tif 000025
【表２−１９】
2008506407.tif 000026
【表２−２０】
2008506407.tif 000027
【表２−２１】
2008506407.tif 000028
【表３−１】
2008506407.tif 000029
【表３−２】
2008506407.tif 000030
【表３−３】
2008506407.tif 000031
【表４−１】
2008506407.tif 000032
【表４−２】
2008506407.tif 000033
【表４−３】
2008506407.tif 000034
【表５−１】
2008506407.tif 000035
【表５−２】
2008506407.tif 000036
【表６−１】
2008506407.tif 000037
【表６−２】
2008506407.tif 000038
【表６−３】
2008506407.tif 000039
【表７−１】
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【表７−２】
2008506407.tif 000041
【表８−１】
2008506407.tif 000042
【表８−２】
2008506407.tif 000043
【表８−３】
2008506407.tif 000044
【表９−１】
2008506407.tif 000045
【表９−２】
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【表９−３】
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【表１０−１】
2008506407.tif 000048
【表１０−２】
2008506407.tif 000049
【表１０−３】
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【表１１−１】
2008506407.tif 000051
【表１１−２】
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【表１１−３】
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【表１２−１】
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【表１２−２】
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【表１２−３】
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【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【表１４−７】
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【表１４−８】
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【表１４−９】
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【表１４−１０】
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【表１５−１】
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【表１５−２】
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【表１５−３】
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【表１５−４】
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【表１５−５】
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【表１５−６】
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【表１５−７】
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【表１５−８】
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【表１５−９】
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【表１５−１０】
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【表１６−１】
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【表１６−２】
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【表１６−３】
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【表１６−４】
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【表１６−５】
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【表１６−６】
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【表１６−７】
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【表１６−８】
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【表１６−９】
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【表１６−１０】
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【表１６−１１】
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【表１６−１２】
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【表１６−１３】
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【表１６−１４】
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【表１６−１５】
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【表１６−１６】
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【表１６−１７】
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【表１７−１】
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【表１７−２】
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【表１７−３】
2008506407.tif 000100
【表１７−４】
2008506407.tif 000101
【表１７−５】
2008506407.tif 000102
【表１７−６】
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【表１７−７】
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【表１７−８】
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【表１７−９】
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【表１７−１０】
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【表１８−１】
2008506407.tif 000108
【表１８−２】
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【表１８−３】
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【表１８−４】
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【表１８−５】
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【表１８−６】
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【表１８−７】
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【表１８−８】
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【表１８−９】
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【表１８−１０】
2008506407.tif 000117
【表１８−１１】
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【表１８−１２】
2008506407.tif 000119
【表１８−１３】
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【表１８−１４】
2008506407.tif 000121
【表１８−１５】
2008506407.tif 000122
【表１８−１６】
2008506407.tif 000123
【表１８−１７】
2008506407.tif 000124
【表１９−１】
2008506407.tif 000125
【表１９−２】
2008506407.tif 000126
【表１９−３】
2008506407.tif 000127
【表１９−４】
2008506407.tif 000128
【表１９−５】
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【表１９−６】
2008506407.tif 000130
【表１９−７】
2008506407.tif 000131
【表１９−８】
2008506407.tif 000132
【表１９−９】
2008506407.tif 000133
【表１９−１０】
2008506407.tif 000134
【表１９−１１】
2008506407.tif 000135
【表１９−１２】
2008506407.tif 000136
【表２０−１】
2008506407.tif 000137
【表２０−２】
2008506407.tif 000138
【表２０−３】
2008506407.tif 000139
【表２０−４】
2008506407.tif 000140
【表２０−５】
2008506407.tif 000141
【表２０−６】
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【表２０−７】
2008506407.tif 000143
【表２０−８】
2008506407.tif 000144
【表２０−９】
2008506407.tif 000145
【表２０−１０】
2008506407.tif 000146
【表２０−１１】
2008506407.tif 000147
【表２０−１２】
2008506407.tif 000148
【表２０−１３】
2008506407.tif 000149
【表２１】
2008506407.tif 000150
【表２２−１】
2008506407.tif 000151
【表２２−２】
2008506407.tif 000152
【表２２−３】
2008506407.tif 000153
【表２３−１】
2008506407.tif 000154
【表２３−２】
2008506407.tif 000155
【表２４】
2008506407.tif 000156
【表２５】
2008506407.tif 000157
【表２６−１】
2008506407.tif 000158
【表２６−２】
2008506407.tif 000159
【表２７−１】
2008506407.tif 000160
【表２７−２】
2008506407.tif 000161
【表２７−３】
2008506407.tif 000162
【図１】
2008506407.tif 000163
【図２】
2008506407.tif 000164
【図３】
2008506407.tif 000165
【図４】
2008506407.tif 000166
【図５】
2008506407.tif 000167
【図６】
2008506407.tif 000168
【図７】
2008506407.tif 000169
【図８】
2008506407.tif 000170
【図９】
2008506407.tif 000171
【図１０】
2008506407.tif 000172
【図１１】
2008506407.tif 000173
【図１２】
2008506407.tif 000174
【図１３】
2008506407.tif 000175
【図１４】
2008506407.tif 000176
【図１５】
2008506407.tif 000177
【図１６】
2008506407.tif 000178
【図１７】
2008506407.tif 000179
【図１８】
2008506407.tif 000180
【図１９】
2008506407.tif 000181
【図２０】
2008506407.tif 000182
【図２１】
2008506407.tif 000183
【図２２】
2008506407.tif 000184
【図２３】
2008506407.tif 000185
【図２４】
2008506407.tif 000186
【図２５】
2008506407.tif 000187
【図２６】
2008506407.tif 000188
【図２７】
2008506407.tif 000189
【図２８】
2008506407.tif 000190
【図２９】
2008506407.tif 000191
【図３０】
2008506407.tif 000192
【図３１】
2008506407.tif 000193
【図３２】
2008506407.tif 000194
【図３３】
2008506407.tif 000195
【図３４】
2008506407.tif 000196
【図３５】
2008506407.tif 000197
【図３６】
2008506407.tif 000198
【図３７】
2008506407.tif 000199
【図３８】
2008506407.tif 000200
【図３９】
2008506407.tif 000201
【図４０】
2008506407.tif 000202
【図４１】
2008506407.tif 000203
【図４２】
2008506407.tif 000204
【図４３】
2008506407.tif 000205
【図４４】
2008506407.tif 000206
【図４５】
2008506407.tif 000207
【図４６】
2008506407.tif 000208
【図４７】
2008506407.tif 000209
【図４８】
2008506407.tif 000210
【図４９】
2008506407.tif 000211
【図５０】
2008506407.tif 000212
【図５１】
2008506407.tif 000213
【図５２】
2008506407.tif 000214
【図５３】
2008506407.tif 000215
【図５４】
2008506407.tif 000216
【図５５】
2008506407.tif 000217
【図５６】
2008506407.tif 000218
【図５７】
2008506407.tif 000219
【図５８】
2008506407.tif 000220
【図５９】
2008506407.tif 000221
【図６０】
2008506407.tif 000222
【図６１】
2008506407.tif 000223
【図６２】
2008506407.tif 000224
【図６３】
2008506407.tif 000225
【図６４】
2008506407.tif 000226
【図６５】
2008506407.tif 000227
【図６６】
2008506407.tif 000228
【図６７】
2008506407.tif 000229
【図６８】
2008506407.tif 000230
【図６９】
2008506407.tif 000231
【図７０】
2008506407.tif 000232
【図７１】
2008506407.tif 000233
【図７２】
2008506407.tif 000234
【図７３】
2008506407.tif 000235
【図７４】
2008506407.tif 000236
【図７５】
2008506407.tif 000237
【図７６】
2008506407.tif 000238
【図７７】
2008506407.tif 000239
【図７８】
2008506407.tif 000240
【配列表】
2008506407000001.app
【国際調査報告】
2008506407.tif 000241
2008506407.tif 000242
2008506407.tif 000243
2008506407.tif 000244
2008506407.tif 000245
2008506407.tif 000246
2008506407.tif 000247