(57)【要約】  本発明は、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及び／又はＩｇ３モジュール間の相互作用を調整することができる化合物を提供することによって、ＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整する方法に関する。本発明は、本明細書に記載するスクリーニング法及び試験法を用いることによって、ＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及び／又はＩｇ３モジュール間の相互作用を調整することができる候補化合物を提供する。本発明はさらに、ＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及び／又はＩｇ３モジュール間の相互作用を調整することができる化合物を含む医薬組成物、及びＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整するための本医薬組成物及び化合物の使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整する方法であって、
ａ）ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣すること（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；
によってＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュールおよびＩｇ３モジュールを含むＮＣＡＭ同種親和性結合部位と相互作用できる化合物を提供する段階；
ｂ）ＮＣＡＭ提示細胞を提供する段階；
ｃ）（ｂ）のＮＣＡＭ提示細胞を（ａ）の化合物と接触させることによって、少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整する段階；
を含む方法。
【請求項２】
分化、接着及び生存にＮＣＡＭが介在する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＣＡＭが哺乳類のＮＣＡＭ又はその変異体又は断片である、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＣＡＭがＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１３５９１（配列番号４４）として登録された配列を有するか、又はその変異体又は断片である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記化合物がペプチド、炭水化物、脂質、及びアミノ酸と他の有機分子との共重合体を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ペプチドがＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号ＮＰ＿１１３７０９（配列番号４４）又はＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１３５９１（配列番号４５）として登録されたＮＣＡＭの配列に由来するペプチド断片であるか、又は該ペプチド断片の変異体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
化合物を、
ｉ）一つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉ）一つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉｉ）一つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールとの相互作用；
を調整することによって、該ＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールを含む同種親和性結合部位を介して２つの別個なＮＣＡＭ分子の間の相互作用を調整することができるかどうかについて試験する方法であって、
ａ）化合物を提供する段階；
ｂ）ＮＣＡＭ分子の少なくとも１つの別個な断片を提供する段階（ここで該断片は配列番号４４に示す配列の残基１〜２８９を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの配列に対応する連続するアミノ酸残基の配列、又は該別個な断片の断片を含む）；
ｃ）化合物を（ｂ）の断片と接触させることによって、その化合物が、
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは相互に作用する２つの（ｂ）の別個な断片からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは相互に作用する２つの（ｂ）の別個な断片からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣すること（ここで該モジュールは相互に作用する２つの（ｂ）の別個な断片からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは相互に作用する２つの（ｂ）の別個な断片からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここにで該モジュールは相互に作用する２つの（ｂ）の別個な断片からのものである）；
が可能かどうかを試験する段階；
ｅ）ＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整することができる候補化合物として（ｃ）の少なくとも１種の相互作用が可能な化合物を選択する段階；
を含む方法。
【請求項８】
前記候補化合物を、ペプチド、炭水化物、脂質、及びアミノ酸と他の有機分子との共重合体を含む群から選択する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドが、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号ＮＰ＿１１３７０９（配列番号４４）を有するＮＣＡＭの配列又はＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１３５９１（配列番号４５）を有するＮＣＡＭの配列に由来するペプチド断片であるか、又は該ペプチド断片の断片あるいは変異体である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＮＣＡＭの別個な断片又はその断片が可溶性蛋白質である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号ＮＰ＿１１３７０９（配列番号４４）を有するラットＮＣＡＭの配列からの少なくとも２８９の連続するアミノ酸残基を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールを含むポリペプチドの結晶。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが配列番号４４のアミノ酸１〜２８９を含む、請求項１１に記載の結晶。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、配列番号４４のアミノ酸１〜２８９と１〜４個のアミノ酸残基の余分なアミノ酸配列とから構成される、請求項１１に記載の結晶。
【請求項１４】
該結晶が、少なくとも４Åの解像度で原子座標を決定するようにＸ線を回折する、請求項１１に記載の結晶。
【請求項１５】
前記結晶が、多くとも５.０Åの解像度で原子座標を決定するようにＸ線を効果的に回折する、請求項１１に記載の結晶。
【請求項１６】
前記結晶が、１.５Åの解像度で原子座標を決定するようにＸ線を効果的に回折する、請求項１４又は１５に記載の結晶。
【請求項１７】
該結晶が、表２（図２）の構造座標によって、又はそれから２．５Å又はそれ以下の標準偏差を有する座標によって表される空間的関係に配置された原子を含む、請求項１１に記載の結晶。
【請求項１８】
該結晶が、単位格子の次元：ａ＝５１.５Å、ｂ＝１０８.５Å、ｃ＝１４９.０Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°を有する、請求項１１に記載の結晶。
【請求項１９】
ｉ）ポリペプチドを提供する段階；
ｉｉ）要すれば該ポリペプチドと相互作用し得る化合物を提供してもよい段階；
ｉｉｉ）該ポリペプチド、及び要すれば該化合物を、５〜２５％の範囲のポリエチレングリコール、０．０１Ｍ〜０．５Ｍの範囲の塩、１〜１０％の範囲のグリセロールと２−メチル−２，４−ペンタンジオールとから構成される群から選択したアルコールを含む、６〜９の範囲のｐＨを有する緩衝液中でインキュベートする条件下に結晶を生長させる段階；
ｉｖ）それによって該結晶を製造する段階；
を含む、請求項１１〜１８のいずれかに記載の結晶を製造する方法。
【請求項２０】
ｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールとの相互作用；
を調整することによってＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整することができる候補化合物を選択する方法であって、
ａ）ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールを含む可溶性又は結晶ポリペプチドを提供する段階：
ｂ）コンピュータモデリング技術を利用することによって（ａ）のＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの構造モデルを作製する段階；
ｃ）（ｂ）のＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの構造モデルを使用することによって、
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する能力（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；
について化合物をインシリコで評価する段階；
ｄ）少なくとも１つの（ｃ）の相互作用が可能な候補化合物を選択する段階；及び
ｅ）（ｄ）の候補化合物をＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整する能力についてインビトロ又はインビボ検定で試験する段階（該検定は少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞を含む）；及び／又は
ｆ）前記化合物と少なくとも１種のＮＣＡＭ分子の別個な断片とを接触させることによって（ｂ）の少なくとも１種の相互作用について化合物の能力を評価することを含む検定法で（ｄ）の候補化合物を試験する段階（該断片は配列番号４４に示す配列の残基１〜２８９を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの配列に対応する連続するアミノ酸残基の配列を含むものである）；
を含む方法。
【請求項２１】
前記コンピュータ作製モデルが、請求項１３〜２０のいずれか一項に記載の結晶蛋白質の構造モデルである、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項２２】
前記コンピュータ作製モデルが、溶液におけるＩｇ１−２−３モジュールの構造モデルである、請求項２０に記載のスクリーニング方法。
【請求項２３】
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣すること（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである；）及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；
によって、ＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールを含むＮＣＡＭ同種親和性結合部位と相互作用することができる化合物。
【請求項２４】
前記化合物が、ＷＦＳＰＮＧＥＫＬＳＰＮＱ（配列番号１）、
ＹＫＣＶＶＴＡＥＤＧＴＱＳＥ（配列番号２）、
ＴＬＶＡＤＡＤＧＦＰＥＰ（配列番号３）、
ＱＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４）、
ＤＶＲ（配列番号５）、
ＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号６）、
ＤＶＲＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号７）、
ＫＥＧＥＤ（配列番号８）、
ＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号９）、
ＫＥＧＥＤＧＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号１０）、
ＤＫＮＤＥ（配列番号１１）、
ＴＶＱＡＲＮＳＩＶＮＡＴ（配列番号１２）、
ＳＩＨＬＫＶＦＡＫ（配列番号１３）、
ＬＳＮＮＹＬＱＩＲ（配列番号１４）、
ＲＦＩＶＬＳＮＮＹＬＱＩ（配列番号１５）、
ＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹＬＱＩ（配列番号１６）、
ＱＥＦＫＥＧＥＤＡＶＩＶ（配列番号１７）、
ＫＥＧＥＤＡＶＩＶＣＤ（配列番号１８）、
ＧＥＩＳＶＧＥＳＫＦＦＬ（配列番号１９）、
ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥＬＴＩＲＮＶＤＫＮＤＥ（配列番号２０）、
ＡＦＳＰＮＧＥＫＬＳＰＮＱ（配列番号４０）、
ＡＫＳＶＶＴＡＥＤＧＴＱＳＥ（配列番号４１）、
ＤＶＲＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４２）、
ＱＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４３）
から構成される群から選択される、請求項２３に記載の化合物。
【請求項２５】
前記化合物が請求項７又は請求項２０に記載の方法によって選択される候補化合物である、請求項２３又は２４に記載の化合物。
【請求項２６】
該化合物が配列番号１に示すアミノ酸配列ＷＦＳＰＮＧＥＫＬＳＰＮＱを有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２７】
該化合物が配列番号２に示すアミノ酸配列ＹＫＣＶＶＴＡＥＤＧＴＱＳＥを有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２８】
該化合物が配列番号３に示すアミノ酸配列ＴＬＶＡＤＡＤＧＦＰＥＰを有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項２９】
該化合物が配列番号４に示すアミノ酸配列ＱＩＲＧＩＫＫＴＤを有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３０】
該化合物が配列番号５に示すアミノ酸配列ＤＶＲを有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３１】
該化合物が配列番号６に示すアミノ酸配列ＲＧＩＫＫＴＤを有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３２】
該化合物が配列番号７に示すアミノ酸配列ＤＶＲＲＧＩＫＫＴＤを有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３３】
該化合物が配列番号８に示すアミノ酸配列ＫＥＧＥＤを有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３４】
該化合物が配列番号９に示すアミノ酸配列ＩＲＧＩＫＫＴＤを有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３５】
該化合物が配列番号１０に示すアミノ酸配列ＫＥＧＥＤＧＩＲＧＩＫＫＴＤを有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３６】
該化合物がアミノ酸配列ＤＫＮＤＥ（配列番号１１）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３７】
該化合物がアミノ酸配列ＴＶＱＡＲＮＳＩＶＮＡＴ（配列番号１２）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３８】
該化合物がアミノ酸配列ＳＩＨＬＫＶＦＡＫ（配列番号１３）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項３９】
該化合物がアミノ酸配列ＬＳＮＮＹＬＱＩＲ（配列番号１４）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項４０】
該化合物がアミノ酸配列ＲＦＩＶＬＳＮＮＹＬＱＩ（配列番号１５）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項４１】
該化合物がアミノ酸配列ＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹＬＱＩ（配列番号１６）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項４２】
該化合物がアミノ酸配列ＱＥＦＫＥＧＥＤＡＶＩＶ（配列番号１７）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項４３】
該化合物がアミノ酸配列ＫＥＧＥＤＡＶＩＶＣＤ（配列番号１８）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
該化合物がアミノ酸配列ＧＥＩＳＶＧＥＳＫＦＦＬ（配列番号１９）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項４４】
該化合物がアミノ酸配列ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥＬＴＩＲＮＶＤＫＮＤＥ（配列番号２０）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項４５】
該化合物がアミノ酸配列ＡＦＳＰＮＧＥＫＬＳＰＮＱ（配列番号４０）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項４６】
該化合物がアミノ酸配列ＡＫＳＶＶＴＡＥＤＧＴＱＳＥ（配列番号４１）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項４７】
該化合物がアミノ酸配列ＤＶＲＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４２）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項４８】
該化合物がアミノ酸配列ＱＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４３）を有するか、その断片又は変異体である、請求項２５に記載の化合物。
【請求項４９】
ＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整するための、請求項７又は２０の方法で得られる化合物の使用。
【請求項５０】
薬剤を製造するための請求項２３〜４８のいずれかに記載の１個又はそれ以上の化合物の使用。
【請求項５１】
前記薬剤が正常な、変性した、又は損傷したＮＣＡＭ提示細胞を処置するためのものである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記薬剤がＮＣＡＭ提示細胞の分化及び／又は生存の刺激を含む処置のためのものである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５３】
前記薬剤が中枢神経系あるいは末梢神経系の、又は筋肉の、又は様々な器官の、疾患及び病状を処置するためのものである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５４】
前記薬剤が、例えば術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成不全、虚血後損傷、例えば発作に起因するもの、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、認知症、例えば多発梗塞性認知症、硬化症、糖尿病併発性神経変性、体内時計又は神経筋肉伝達に影響を与える障害、及び統合失調症、気分障害、例えば躁鬱病などの中枢神経系及び末梢神経系の疾患又は病状の処置のためのもの；例えば器官移植後の、又は例えば遺伝的又は外傷性萎縮性筋肉障害などの神経−筋肉連結の機能障害を有する病状を含む筋肉の疾患又は病状の処置のためのもの；又は、例えば生殖腺の変性状態、例えばＩ型及びII型糖尿病などの膵臓の変性状態、腎臓の変性状態、例えばネフローゼなどの尿細管の変性状態、及び心臓、肝臓及び腸管の変性状態などの様々な器官の疾患又は病状の処置のためのものである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５５】
前記薬剤が、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成不全、虚血後損傷、例えば発作に起因するもの、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、例えば多発梗塞性認知症、硬化症、糖尿病併発性神経変性、体内時計又は神経筋肉伝達に影響を与える障害、及び統合失調症、気分障害、例えば躁鬱病を処置するためのものである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５６】
前記薬剤が創傷の治癒を促進するためのものである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５７】
前記薬剤が癌を処置するためのものである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５８】
前記薬剤が、例えば急性心筋梗塞後又は血管形成後などの心筋細胞の細胞死を予防するためのものである、請求項５０に記載の使用。
【請求項５９】
前記薬剤が血管再生を促進するためのものである、請求項５０に記載の使用。
【請求項６０】
前記薬剤が学習及び／又は短期及び／又は長期記憶の能力を刺激するためのものである、請求項５０に記載の使用。
【請求項６１】
ＮＣＡＭ同種親和性接着依存性の神経可塑性、細胞の分化及び／又は生存を調整することができる候補化合物をインシリコでスクリーニングするためのＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの結晶の使用。
【請求項６２】
請求項２３〜４８のいずれか一項に記載の１種又はそれ以上の化合物を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本発明は、２種の別個な神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）の間の相互作用を調整できる化合物を提供することによって細胞の分化及び／又は生存を調整する方法に関する。本発明はさらに、２種の別個なＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及び／又はＩｇ３モジュール間の相互作用を調整することのできる候補化合物をスクリーニングする方法に関する。本発明はまた、薬剤製造のための同定された候補化合物の使用に関する。
【０００２】
背景技術
神経細胞接着分子ＮＣＡＭは、同種親和性（homophilic）（ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ）結合による細胞−細胞接着に介在する。ＮＣＡＭは、学習及び記憶の固定を含む神経の発達、ニューロンの分化及びシナプスの可塑性に重要な役割を果たす。
【０００３】
細胞間相互作用は、細胞の移動、生存及び分化を含む広範な生物学的過程にきわめて重要な役割を果たす。これらの現象は、細胞−細胞接着分子（ＣＡＭ）が介在する細胞表面での蛋白質認識に依存して変化する。
【０００４】
神経細胞接着分子ＮＣＡＭは、最初はシナプス膜蛋白質（Jorgensen and Bock, 1974）として記載され、後に細胞−細胞接着に介在することが証明されたものであって、哺乳類の最初に同定された細胞接着分子である。ＮＣＡＭは免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する。ｍＲＮＡの選択的スプライシング及び翻訳後修飾は多数のＮＣＡＭイソ型を生じさせる。３種の主なＮＣＡＭイソ型は、５個のＩｇモジュール及び２種のＩＩＩ型フィブロネクチン・モジュールから構成される同一の細胞外部分を有する。
【０００５】
ＮＣＡＭは、同種親和性相互作用（ＮＣＡＭへのＮＣＡＭの結合）及び異好性相互作用（他種分子へのＮＣＡＭの結合）を介するＣａ２＋非依存性の細胞−細胞接着及び細胞−基質接着を仲介することが知られている（Berezin et al, 2000）。ＮＣＡＭの異なるモジュールが別個な機能を果たすことが示されている。ＮＣＡＭは、例えばヘパリン／ヘパリン硫酸塩、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、及び各種コラーゲンのような様々な細胞外マトリックス成分に結合する。ヘパリン結合配列は、Ｉｇ２モジュールに局在する。ＮＣＡＭは神経細胞接着分子Ｌ１にも結合する。この相互作用は、ＮＣＡＭの第四ＩｇモジュールとＬ１に発現するオリゴマンノシド部分との間で起きると考えられている。
【０００６】
広範囲の研究にも拘わらず、ＮＣＡＭの同種親和性結合の明確な機序はまだ解明されておらず、発表されている結果にはある程度の矛盾がある。ＮＣＡＭの同種親和性結合は、最初は対向する２個のＮＣＡＭ分子からの各Ｉｇ３モジュールの間の逆平行的相互作用に依存すると報告された。様々な各Ｉｇモジュールを欠失したニワトリＮＣＡＭを発現するマウスＬ細胞で行われた細胞凝集実験で、Ｉｇ３モジュールの関与が示された。後に、ニワトリＮＣＡＭの別個な組換えＩｇモジュールでコーティングしたマイクロスフェアを用いて、Ｉｇ１モジュールとＩｇ５モジュールとの間、及びＩｇ２モジュールとＩｇ４モジュールとの間に結合が証明されたが、一方ではＩｇ３でコーティングしたマイクロスフェアは強い自己凝集を示した（Ranheim et al., 1996）。しかしながら、ニワトリＮＣＡＭのＩｇ３モジュールの溶液構造に関する超遠心分離実験を含むAtkins et al.（2001）の研究は、示唆されていたＩｇ３の二量体化を支持しなかった。
【０００７】
ラットＩｇ１とＩｇ２との組換えモジュール間の結合は、表面プラスモン共鳴分析を用いて証明された（Kiselyov et al., 1997）。ラットＩｇ１及びＩｇ２の各モジュールとニワトリＩｇ１モジュールの三次元構造が、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法によって決定され、Ｉｇ１及びＩｇ２の両モジュールの間の同種親和性結合に関与するアミノ酸残基の同一性が確認された（Thomsen et al., 1996； Jensen et al., 1999； Atkins et al., 1999）。ラットＮＣＡＭのＩｇ１−２断片の結晶構造は、十字形（cross-like）のＩｇ１−２二量体の詳細な情報を提供し、相互作用における決定的残基、すなわちＦ１９とＹ６５とを指摘した（Kasper et al., 2000）。最近、Ｆ１９の点変異（ＦＩ９Ｓ）は、それがなければ溶液中で起きるはずのＩｇ１−２−３断片の２量体化を止めるにも拘わらず、全長ＮＣＡＭが介在する細胞凝集には影響を与えないことが証明された（Atkins et al., 2001）。これらの結果は、今までに提唱されているＮＣＡＭ同種親和性結合のＩｇ３−Ｉｇ３（Rao et al., 1992； Ranheim et al., 1996）及びＩｇ１−Ｉｇ２（Kiselyov et al., 1997; Kasper et al., 2000）モデルに疑いを抱かせる。
【０００８】
かくして、ＮＣＡＭに２種の非重複的な同種親和性結合部位：Ｉｇ３−Ｉｇ３結合部位及びＩｇ１−Ｉｇ２結合部位が科学文献に記載されている。これら２つの部位に由来する配列は、神経突起の伸長を刺激し、神経細胞の接着を調整できることが示されている（WO03020749, Soroka et al, 2002; Rao et al., 1992; Ranheim et al., 1996）。Ｉｇ３−Ｉｇ３結合部位に結合できるペプチド配列は、Ｉｇ１−Ｉｇ２結合部位が介在する生物学的効果を妨害しないこと、及びその逆も示されている。後者の知見は、ＮＣＡＭの同種親和性接着が、多数の同種親和性結合部位を介する別個な２つのＮＣＡＭ分子の機械的な結合機序よりもはるかに複雑な機序を持つこと、及びＮＣＡＭが介在する過程への一つ又は別の同種親和性結合部位の関与が、例えば一つ又は別の結合部位のリガンドの存在、又は結合のための一つ又は別の部位の利用可能性のような、特定のＮＣＡＭの環境に依存するであろうことを示している。
【０００９】
本発明は、新規な同種親和性結合部位を経てＮＣＡＭのＩｇ１、Ｉｇ２及び／又はＩｇ３の各モジュールに結合できる化合物を提供することによって、かかる過程を調整する方法を提供する。
【００１０】
発明の概要
本発明によってＮＣＡＭの異なる同種親和性結合部位に指向するリガンドを提供することは、神経細胞の可塑性に関連する種々の過程に内在する分子機序におけるＮＣＡＭの関与を微調節し、それによってこれらの過程を調整することを可能にするであろう。そこで、本発明は、接着を調整し、分化を誘発し、ならびに再生、神経可塑性及びＮＣＡＭを発現する細胞の生存を促進することができる化合物、及びそのような化合物のスクリーニング方法及び使用方法に関する。
【００１１】
一局面において、本発明は、
ａ）ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは別個な２個のＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは別個な２個のＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する能力（ここに該モジュールは別個な２個のＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは別個な２個のＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは別個な２個のＮＣＡＭ分子からのものである）；
を有する候補化合物を提供する段階；
ｂ）少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞を提供する段階；
ｃ）少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞を該候補化合物と接触させ、それによって少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞の細胞分化及び／又は生存を調整する段階；
を含む、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）提示細胞の細胞分化及び／又は生存を調整する方法に関する。
【００１２】
他の一局面では、本発明は、
ｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールとの相互作用：
を調整することにより、２つの別個のＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールを含む同種親和性結合部位を経る該ＮＣＡＭ分子の間の相互作用を調整できるかどうかについてある化合物を試験する方法であって、
ａ）化合物を提供する段階；
ｂ）ＮＣＡＭ分子の少なくとも一つの別個な断片を提供する段階（ここに該断片は配列番号４４に示す配列の残基１〜２８９を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの配列に対応する連続するアミノ酸残基の配列を含む）；
ｃ）前記化合物が、その化合物と（ｂ）の断片とを接触させることによって、
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここに該モジュールは互いに相互作用する２つの別個な（ｂ）の断片からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここに該モジュールは互いに相互作用する２つの別個な（ｂ）の断片からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣すること（ここに該モジュールは互いに相互作用する２つの別個な（ｂ）の断片からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここに該モジュールは互いに相互作用する２つの別個な（ｂ）の断片からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここに該モジュールは互いに相互作用する２つの別個な（ｂ）の断片からのものである）；
ができるかどうかを試験する段階；
ｄ）ＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整することが可能な候補化合物として、（ｃ）の少なくとも１種の相互作用が可能な化合物を選択する段階；
を含む方法に関する。
【００１３】
なお別の局面では、本発明は、
ｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールとの相互作用；
を調整することによってＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整することが可能な候補化合物を選択する方法であって、
ａ）ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールを含む可溶性又は結晶ポリペプチドを提供する段階；
ｂ）コンピュータモデリング技術を用いることによって（ａ）のＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの構造モデルを作製する段階；
ｃ）（ｃ）のＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの構造モデルを使用することによって
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；
について化合物をインシリコで評価する段階；
ｄ）（ｂ）の少なくとも１つの相互作用が可能な候補化合物を選択する段階；及び
ｅ）ＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整する能力についてインビトロ又はインビボでの検定で（ｄ）の候補化合物を試験する段階（この検定法は少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞を含むものである）；及び／又は
ｆ）化合物を少なくとも１種のＮＣＡＭ分子の別個な断片と接触させることによって少なくとも１つの（ｂ）の相互作用について化合物の能力を評価することを含む検定法で（ｄ）の候補化合物を試験する段階（該断片は配列番号４４に示す配列の残基１〜２８９を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール配列に対応する連続するアミノ酸残基の配列を含む）；
を含む方法を提供する。
【００１４】
そこで、本発明の一目的はＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールを含む結晶蛋白質及び該結晶蛋白質の製造法を提供することにある。
【００１５】
本発明はさらに、
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；
を有する化合物を提供する。
【００１６】
本発明はまた、薬剤製造のための前記方法で選択された化合物の使用に関し、またそれを含む医薬組成物を特徴とする。
【００１７】
図面の説明
図１は、結晶学的データと精密な統計データを示す。
図２は、Ｉｇ１−２−３モジュール結晶の原子的構造座標を示す。
図３は、分解能２．０ÅにおけるラットＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片の結晶構造を示す。
（Ａ）１０残基毎に標識した立体的Ｃαバックボーンダイアグラム。
（Ｂ）Ｉｇ１セット命名法によるβ鎖を標識したリボンダイアグラム。
【００１８】
図４は、４個の主なモジュール−モジュール相互作用及び２種のＩｇ１−２−３アレイを示すＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片の結晶構造を示す。相互作用しているＩｇ１−２−３シス二量体の空間充填モデル（Ｉｇ１−Ｉｇ２結合が介在）を示す。Ｉｇ１−Ｉｇ２、Ｉｇ１−Ｉｇ３、Ｉｇ２−Ｉｇ２、及びＩｇ２−Ｉｇ３相互作用部位を白楕円で示す。Ｉｇ２モジュールのヘパリン結合部位（残基１３３〜１４８）を白正方形で示す。矢印はＡｓｎ２０３（Ａｓｎ２０３を白三角で示す）でのＮ結合グリコシル化の位置を示す。末端はＮ及びＣで示す。
（Ａ、Ｂ）Ｉｇ１−２−３断片のＩｇ１−２が介在するシス二量体は、対向する細胞上のＮＣＡＭ分子との間の相互作用を反映して、Ｉｇ２−Ｉｇ３介在トランス相互作用により「フラット」ジッパーを形成する。
（Ｃ、Ｄ）Ｉｇ１−２−３断片シス二量体はまた、Ｉｇ１−Ｉｇ３及びＩｇ２−Ｉｇ２トランス相互作用を経て、非対称「コンパクト」ジッパーを形成する。シス二量体２種は、ジッパーの一方は２種のＩｇ１−Ｉｇ３相互作用（実線楕円）によって、及びジッパーの他方は１種のＩｇ２−Ｉｇ２相互作用（点線楕円）によって結合している。Ｂ及びＤにおける視点は各々Ａ及びＣのそれと垂直である。
【００１９】
図５は、ＮＣＡＭＩｇ１−２−３断片の相互作用接点の拡大図である。
（Ａ）Ｉｇ１−Ｉｇ２相互作用インターフェース。Ｉｇ１モジュール及びＩｇ２モジュールは、１つのＩｇ１−２−３シス二量体を形成する２つの異なる別個なＩｇ１−２−３断片に属する。
（Ｂ）Ｉｇ２−Ｉｇ３相互作用インターフェース。
（Ｃ）Ｉｇ２−Ｉｇ２相互作用インターフェース。
（Ｄ）Ｉｇ１−Ｉｇ３相互作用インターフェース。
Ｂ〜Ｄでは、異なる別個なＩｇ１−２−３シス二量体に属する相互作用している２つのＩｇ１−２−３断片からのモジュールのリボン表示を示す。水素結合は破線で示す。
【００２０】
図６は、Ｉｇ３モジュール、Ｐ１−Ｂ、Ｐ３−ＤＥ、Ｐ３−Ｇ、Ｐ３−Ｂぺプチド、及びその誘導体の、ＮＣＡＭをトランスフェクトした繊維芽細胞のコンフルエント単層上に生育したＮＣＡＭ発現ＰＣ１２−Ｅ２細胞から伸びる神経突起に対する効果を示す。
（Ａ−Ｆ）ベクターをトランスフェクトしたＡ、Ｃ、Ｅ又はＮＣＡＭ−１４０をトランスフェクトしたＢ、Ｄ、ＦのＬ９２９繊維芽細胞のコンフルエント単層上に生育したＮＣＡＭ発現褐色細胞腫ＰＣ１２−Ｅ２細胞の共焦点顕微鏡写真。ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相互作用はＮＣＡＭ発現（ＬＢＮ）Ｂ対ＮＣＡＭ−陰性（ＬＶＮ）Ａ繊維芽細胞の上に生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞での神経突起伸長を刺激する。組換えＩｇ３モジュールの導入はベクターをトランスフェクトした繊維芽細胞Ｃ上に生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞には影響を与えないが、ＮＣＡＭをトランスフェクトした繊維芽細胞Ｄ上で生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞中の神経突起伸長をＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相互作用の崩壊の結果として明らかに阻害する。対照的に、Ｉｇ３mut２はベクターをトランスフェクトした繊維芽細胞Ｅ上で生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞にも影響を与えず、またＮＣＡＭ誘導神経突起伸長Ｆの阻害もしない。ペプチドＰ１−Ｂ、Ｐ３−ＤＥ、及びＰ３−ＧはＩｇ３wtＣ、Ｄの効果に匹敵する阻害効果を有するが、一方ではＩｇ３mut１、Ｐ３−Ｂペプチド、及び対照ペプチドの効果はＩｇ３mut２Ｅ、Ｆの効果と同様である。目盛線、２０μｍ。
（Ｇ）Ｉｇ３モジュール、Ｐ１−Ｂ、Ｐ３−ＤＥ、Ｐ３−Ｇ、Ｐ３−Ｂペプチド、及びその誘導体の効果は、ＮＣＡＭ−１４０をトランスフェクトした繊維芽細胞上及びベクターをトランスフェクトした繊維芽細胞上で生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞の平均神経突起長の差を１００％に設定して対照の割合として示す。結果は平均値±ＳＥＭ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１で示す（ＮＣＡＭをトランスフェクトした繊維芽細胞の単層上に生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞からの神経突起伸長の誘導と比較して）。
【００２１】
図７は、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片の結晶構造中に実測されたＮＣＡＭによって形成された「コンパクト」、「フラット」、及び「ダブル」の各ジッパー接着複合体を図で示す。個々のＮＣＡＭモジュールを円筒で示す。Ｉｇモジュール及びＦｎＩＩＩモジュールを各々、アラビア数字及びローマ数字で番号を付した。ＮＣＡＭの全部で７個の細胞外モジュールを説明するために、電子顕微鏡的研究に従ってＩｇ４の後ろにベンド（bend）を導入した（Hall and Rutishauser, 1987; Becker et al., 1989）。Ｉｇ１−２−３断片のサイズ及び対向する細胞膜との間の距離を示す。
（Ａ）「コンパクト」ジッパーは、対向する２つの細胞膜に由来するＩｇ１−２−３シス二量体の間のＩｇ１−Ｉｇ３及びＩｇ２−Ｉｇ２相互作用によって安定化される。
（Ｂ）「フラット」ジッパーは、対向する２つの細胞膜に由来するＩｇ１−２−３シス二量体の間のＩｇ２−Ｉｇ３相互作用によって安定化される。
（Ｃ）この２つの型のジッパーは結晶に実測されるように共存してもよく、「ダブル」ジッパー様接着複合体の形成を生じ得る。
【００２２】
図８は、生長培地内中様々な濃度でのペプチドの存在下に２４時間初代培養して単一ニューロンとして生育したＣＧＮのＰ２−ＣＤペプチドの神経突起伸長への効果を証明する。神経突起の長さは任意の単位（ＡＵ）で示す。処理した培養物中の神経突起の長さを非処理の培養物（対照）中の神経突起の長さと比較する（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０２；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００５）。ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールのペプチド断片であるＰ２ｄ（Soroka et al., 2002参照）をポジティブ対照に使用して、その処置に対する細胞の応答性を示した。
【００２３】
図９は、培養培地中様々な濃度のペプチドの存在下において、２４時間にわたるプライマリーカルチャーにおいて単一ニューロンとして生長したＣＧＮの神経突起伸長に及ぼすＰ３−Ｇペプチドの効果を証明する。神経突起の長さは任意の単位（ＡＵ）で示す。処理培養物中の神経突起の長さを非処理の培養物中の神経突起の長さ（対照）と比較する。Ｐ２ｄをポジティブ対照として使用した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０２；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【００２４】
図１０は、培養培地中様々な濃度のペプチドの存在下において、２４時間にわたるプライマリーカルチャーにおいて単一ニューロンとして生長したＣＧＮの神経突起伸長に及ぼすＰ２−ＥＦペプチドの効果を証明する。神経突起の長さは任意の単位（ＡＵ）で示す。処理した培養物中の神経突起の長さを非処理の培養物中の神経突起の長さ（対照）と比較する。Ｐ２ｄをポジティブ対照として使用した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０２；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【００２５】
図１１は、培養培地中様々な濃度のペプチドの存在下において、ＣＧＮとＮＣＡＭを発現する（ＬＢＮ）又はＮＣＡＭを発現しない（ＬＶＮ）遺伝子的に修飾した繊維芽細胞との共培養における、２４時間にわたるプライマリーカルチャーにおいて単一ニューロンとして生長したＣＧＮの神経突起伸長に及ぼすＰ１−ＣＤペプチドの効果を証明する。ペプチドは両培養中のＣＧＮのＮＣＡＭ−非依存性神経突起伸長には影響を与えないが、ＮＣＡＭ−依存性神経突起伸長をＣＧＮ及びＬＢＮ細胞との共培養中のＮＣＡＭ同種親和性接着を阻害することによって阻害することが見られる。神経突起の長さは任意の単位（ＡＵ）で示す。処理した培養物中の神経突起の長さを処理しない培養物中の神経突起の長さ（対照）と比較する。Ｐ２ｄをポジティブ対照として使用した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００２６】
図１２は培養基中の様々な濃度のペプチドの存在下において及びＣＧＮとＮＣＡＭ発現のある（ＬＢＮ）又はＮＣＡＭ発現のない（ＬＶＮ）遺伝子的に修飾した繊維芽細胞との共培養における、２４時間にわたるプライマリーカルチャーにおいて単一のニューロンとして生長したＣＧＮの神経突起伸長に及ぼすＰ２−ＡＢペプチドの効果を証明する。この図からペプチドは両培養基中におけるＮＣＡＭ依存性神経突起伸長には影響を与えず、またＣＧＮ細胞及びＬＢＮ細胞の共培養中ではＮＣＡＭの同種親和性接着を阻害することによってＮＣＡＭ依存性神経突起伸長を阻害することが判明する。軸策の長さは任意的単位（ＡＵ）で示す。処理した培養物中の神経突起の長さを非処理の培養物中の神経突起の長さ（対照）と比較する。Ｐ２ｄをポジティブ対照として使用した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【００２７】
発明の詳しい説明
神経突起伸長を促進し、並びに生存、再生を刺激し、及び神経細胞の接着を調整する可能性のある分子、例えばある種の内因性栄養因子及び接着分子など、例えばＮＣＡＭは、例えばニューロンの再生及び他の形態のニューロン可塑性を助長する化合物を探索するための最重要な標的である。化合物が細胞接着を妨害する能力、神経突起伸長を刺激する能力、ニューロン細胞の再生及び生存を刺激する能力を評価するためには、化合物がＮＣＡＭと相互作用する能力を研究してもよい。ＮＣＡＭ分子の１箇所又はそれ以上の位置に結合できる化合物を提供することが本発明の目的の一つである。殊に、ＮＣＡＭのＩｇ１、Ｉｇ２及び／又はＩｇ３の各モジュールにおけるＮＣＡＭの同種親和性結合部位を構成する位置を本明細書に記載する。
【００２８】
ＮＣＡＭは多機能的接着分子である。これは、胚生長期間中神経可塑性に関係のある様々な過程において、成体脳内において、及び疾患と関連して、重要な分子分子として包含される。神経可塑性の基礎をなす種々の過程におけるＮＣＡＭの関与は、シス−及びトランス−同種親和性相互作用へのＮＣＡＭの能力及び多数の細胞受容体ならびにその他の細胞内及び細胞外分子との異好性相互作用によって提供される。ＮＣＡＭ分子は、これらの分子との相互作用のために、様々な細胞外ＮＣＡＭモジュール及びＮＣＡＭの細胞内ドメインに存在する、多数の非重複及び重複の結合部位を有する。
【００２９】
本発明は、ＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整する方法に関し、該方法は、ＮＣＡＭのＩｇ１、Ｉｇ２及びＩｇ３の各モジュールにあるアミノ酸残基を含む新規なＮＣＡＭ同種親和性結合部位と相互作用できる化合物を提供することを含む。この結合部位のアミノ酸残基は下記の相互作用：
−その相互作用の一方のＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールに存在する結合部位のアミノ酸残基と他方のＮＣＡＭ分子、すなわち対の（counter）ＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールに存在する結合部位のアミノ酸残基との相互作用であるが、この対のＮＣＡＭ分子のＩｇ１又はＩｇ２モジュールに存在する結合部位の残基との相互作用ではないもの；
−その相互作用の一方のＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールに存在する結合部位のアミノ酸残基と他方のＮＣＡＭ分子、すなわち対のＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールに存在する結合部位のアミノ酸残基との相互作用であるが、この対のＮＣＡＭ分子のＩｇ１又はＩｇ３モジュールに存在する結合部位の残基との相互作用ではないもの；及び
−その相互作用の一方のＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールに存在する結合部位のアミノ酸残基と他方のＮＣＡＭ分子、すなわち対のＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールに存在する結合部位のアミノ酸残基との相互作用であるが、この対のＮＣＡＭ分子のＩｇ２又はＩｇ１モジュールに存在する結合部位の残基との相互作用ではないもの；
−その相互作用の一方のＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールに存在する結合部位のアミノ酸残基と他方のＮＣＡＭ分子、すなわち対のＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールに存在する結合部位のアミノ酸残基との相互作用であるが、この対のＮＣＡＭ分子のＩｇ３又はＩｇ１モジュールに存在する結合部位の残基との相互作用ではないもの；
−その相互作用の一方のＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールに存在する結合部位のアミノ酸残基と他方のＮＣＡＭ分子、すなわち対のＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールに存在する結合部位のアミノ酸残基との相互作用であるが、この対のＮＣＡＭ分子のＩｇ３又はＩｇ２モジュールに存在する結合部位の残基との相互作用ではないもの；
が可能である。
【００３０】
本発明に従えば、
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３とＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２とＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；
を示す化合物は、前記の同種親和性結合部位のリガンドであり、またこの結合部位と相互作用することによって前記結合部位を経てＮＣＡＭ同種親和性結合が援助する過程を調整することができる。
【００３１】
２個又はそれ以上の分子／モジュール／断片に関する用語「別個な」は、これら２個又はそれ以上の分子／モジュール／断片が、別個な、関連のない物質として存在することを示すために使用する。
【００３２】
用語「相互作用」は本明細書では用語「結合」と同義的に使用する。用語「リガンド」は、前記結合部位に結合し、かつＮＣＡＭ同種親和性結合を模倣する化合物として定義付けられる。用語「模倣する」は、前記結合部位を経る同種親和性相互作用を経てＮＣＡＭが介在する生物学的過程を誘導／刺激又は阻害するリガンドの能力と理解される。このリガンドは、例えばＮＣＡＭの結合部位ではない部分に結合することにより天然に生じる相互作用を阻害するものであってもよく、その阻害が単なる立体的阻害のようなものであってもよい。
【００３３】
本発明の結合部位と相互作用／結合ができる化合物は、神経突起伸長を促進するために好適である。故に、本発明の化合物は、ニューロン結合の再生の良好な促進剤であると考えられ、それによって損傷後に機能を回復し、並びに、かかる効果が必要な他の状態におけるニューロン機能の促進剤である。
【００３４】
本明細書中「分化」は、例えばニューロンの最後の細胞分裂終了の後に起きるニューロンからの神経突起の伸長のような、細胞の成熟の過程に関連している。本発明の化合物は細胞分裂を停止させ、また成熟及び／又は神経突起の伸張を開始させることが可能かもしれない。
本発明では、ある化合物が、例えば対照細胞と比較して培養細胞の神経突起伸長を刺激できるとき、例えば５０％又はそれ以上、例えば７５％、例えば１００％又はそれ以上も神経突起伸長を増進するように神経突起伸長を刺激できるときに、有望であると考えられる。
【００３５】
さらに、本明細書では用語「生存の刺激／促進」は用語「細胞死の予防」又は「神経保護」と同義的に使用する。生存の刺激／促進によって、神経変性疾患の個体での疾患の予防又は神経系のさらなる変性の予防が可能となる。
【００３６】
「生存」は、細胞が傷害を受けており、本発明の化合物を、該細胞を変性から予防し、故に、該傷害を受けた細胞の生存を促進又は刺激するために用いない限り、通常の環境下では高い確率で死滅する過程を示す。
【００３７】
用語「調整」は、例えば刺激又は阻害のいずれかのような変化を意味する。本発明の化合物はＮＣＡＭの同種親和性結合を介する過程を調整することができる。故に、本化合物は神経細胞の分化及び／又は生存の刺激又は阻害が可能である。後者の過程はＮＣＡＭシグナル伝達の活性化又は阻害を含んでよい。故に、前記ＮＣＡＭ依存性過程を調整できる化合物は、本発明ではＮＣＡＭシグナル伝達を調整できる化合物であると考える。「ＮＣＡＭのシグナル伝達を調整する」化合物の能力は、第二メッセンジャー分子生産開始の過程の調整及び／又は細胞内カスケード反応の活性化又は阻害による細胞の生理学的応答、例えば本発明の同種親和性結合部位へのリガンド結合に応答する神経突起長の増加などの分子の能力と理解される。
本発明はまた「細胞接着を妨害すること」ができる化合物を提供する。これは複数の細胞が相互に引き寄せ合う時に、本発明の化合物がその引き寄せ合いを刺激又は阻害のいずれかができる場合の過程を示す。
【００３８】
本発明の化合物は神経細胞死の予防にも関連する。末梢神経細胞は様々な損傷を受けた後に、限定された範囲でその標的との機能的結合を再生し、再構築する可能性を有する。しかしながら、機能回復が完全なことは稀であり、末梢神経細胞の損傷はかなり重大な問題である。中枢神経系では再生の能力はさらにずっと低い。それ故、末梢神経系及び中枢神経系において神経細胞死を予防する能力を持つ物質の同定は有意義であり、商業的価値も高い。
【００３９】
本発明の化合物は、例えばペプチド断片／結合部位の部分のようなペプチド、又は結合部位のアミノ酸配列を含むペプチドであってもよい。
【００４０】
本発明のさらなる態様では、この化合物は、例えば糖類、コレステロール、及び脂肪酸のような他種の化学物質を含んでいてもよい。好ましくは、その化学物質は本化合物のペプチドのＮ末端又はＣ末端に結合する。
【００４１】
この化合物が本発明の同種親和性結合部位におけるＮＣＡＭのＩｇ１及び／又はＩｇ２及び／又はＩｇ３の各モジュールに、又はＩｇ１、Ｉｇ２及びＩｇ３の各モジュールから構成されるＮＣＡＭモジュールのいずれか他の部分に結合できること、ならびに該同種親和性結合部位に存在する結合の効果を模倣できること、又はその効果を調整できることは本発明の一局面である。
【００４２】
理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、ＮＣＡＭのＩｇ１及び／又はＩｇ２及び／又はＩｇ３の各モジュールに対する活性リガンドは、ＮＣＡＭのＩｇ１及び／又はＩｇ２及び／又はＩｇ３モジュールに結合するリガンドであり、そのためそのモジュールの立体配座に変化を惹起し、その結果としてシグナル伝達のカスケードが開始され、そこで該シグナル伝達が、例えば細胞の生存、細胞の接着及び／又は神経突起伸長への影響のような細胞の生理学的変化を起すものと信じている。そこで、本発明の化合物はＮＣＡＭのＩｇ１及び／又はＮＣＡＭのＩｇ２及び／又はＮＣＡＭのＩｇ３モジュールの立体配座に変化を惹起し、下流のシグナル伝達カスケードに変化を起すことのできる、前記化合物のいずれであってもよい。
【００４３】
調整の方法
そこで、本発明の一目的は、次の段階：
ａ）ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力こと（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここに各モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものであるとする）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣すること（ここに各モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここに各モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここに各モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；
によってＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールのアミノ酸残基から構成されるＮＣＡＭの同種親和性結合部位と相互作用できる化合物を提供すること；
ｂ）少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞を提供すること；
ｃ）少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞を該化合物と接触させ、それによって少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞の細胞分化及び／又は生存を調整すること
によってＮＣＡＭ提示細胞の接着、分化及び／又は生存を調整する方法を提供することにある。
【００４４】
本発明は次のＮＣＡＭ提示細胞：すなわち
ｉ）ＮＣＡＭ分子を細胞表面に天然に発現する細胞、例えば神経細胞、筋肉細胞又は他の組織の細胞；
ｉｉ）ＮＣＡＭ分子を細胞表面に発現する癌細胞；
ｉｉｉ）ＮＣＡＭ分子を細胞表面に発現するように遺伝子的に修飾された組換え細胞；
に関する。
【００４５】
前記ＮＣＡＭ提示細胞は、例えば動物体の細胞のようなインビボ細胞であってもよく、又はインビトロで培養した細胞であってもよい。従って、前記方法はＮＣＡＭ提示細胞の分化、生存及び／又は接着を調整するためにインビボ及びインビトロの双方で使用できる。ある態様では本方法はインビトロでの使用のためのものであり、他の態様では本方法はインビボでの使用のためのものである。
【００４６】
前記方法は、ＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールのアミノ酸残基によって構成されるＮＣＡＭ同種親和性結合部位と相互作用できる化合物を提供することを含む。一態様では、それはＮＣＡＭのＩｇ１モジュールの残基と相互作用でき、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する化合物であってもよく、ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである。
【００４７】
他の態様では、これはＮＣＡＭのＩｇ３モジュールの残基と相互作用でき、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する化合物であってもよく、ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである。
【００４８】
さらにもう一つの態様では、本化合物はＩｇ２モジュールの残基と相互作用でき、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣でき、ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである。
【００４９】
なおもう一つの態様では、本化合物はＩｇ３モジュールの残基と相互作用でき、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整するものであってもよく、ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである。
【００５０】
さらになおもう一つの態様では、本化合物はＮＣＡＭのＩｇ２モジュールの残基と相互作用でき、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整するものであってもよく、ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである。
【００５１】
前記化合物は、
ａ）前記相互作用（ｉ）〜（ｖ）全部、又はその一部の相互作用、例えば（ｉ）と（ｉｉ）、又は（ｉ）と（ｉｉｉ）、又は（ｉ）から（ｖ）の相互作用のいずれか他の組合せの相互作用が可能な分子；又は
ｂ）相互作用（ｉ）から（ｖ）のいずれかから選択した１種の相互作用のみが可能な分子；
で表されてもよい。
【００５２】
１種又はそれ以上の前記相互作用が可能な化合物の提供は、一態様では、本出願に記載したような候補化合物の選択法を使用することによって行ってもよい。別な一態様では、それは本出願に後記する化合物の試験法を使用して行ってもよい。
【００５３】
ＮＣＡＭ分子による該機能の実行が前記相互作用（ｉ）から（ｖ）の１種又はそれ以上に関与するものであれば、（ａ）及び（ｂ）の化合物全てはＮＣＡＭ機能を調整できると推測される。
【００５４】
相互作用を「模倣」できる化合物とは、Ｉｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール又はＩｇ３モジュールに結合できる前記のものの同種親和性結合部位のリガンドとして作用する化合物を意味し、故に、各々前記他の対向するＮＣＡＭ分子のＩｇ３、Ｉｇ２又はＩｇ１モジュールのこれらのモジュールへの結合に入れ替わる。この模倣は、後者の結合に関連する生物学的過程の本発明による刺激又は阻害の結果である。
【００５５】
本発明者らは本明細書にＮＣＡＭ同種親和性結合のモデルを提示し、ここでそのＩｇ１モジュール及びＩｇ２モジュールは、同じ細胞表面に存在する別個なＮＣＡＭ分子の二量体化（シス相互作用）に介在し、そのＩｇ３モジュールは、Ｉｇ１モジュール及びＩｇ２モジュールへの同時結合を経て対する細胞の表面上に発現される別個なＮＣＡＭ分子の間の相互作用（トランス相互作用）に介在する。この配置は、ダブルジッパー様ＮＣＡＭ接着複合体の形成に帰着する。
【００５６】
ＮＣＡＭ由来の配列
本発明の化合物は、ＮＣＡＭの配列に由来するペプチド断片又はそのペプチド断片の変異体であってもよい。このペプチド断片はＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号ＮＰ＿１１３７０９（配列番号４４）又はＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号Ｐ１３５９１（配列番号４５）と同定されるＮＣＡＭ配列の断片であってもよい。
【００５７】
好適なペプチド断片は下記のアミノ酸配列：
ＷＦＳＰＮＧＥＫＬＳＰＮＱ（配列番号１）、
ＹＫＣＶＶＴＡＥＤＧＴＱＳＥ（配列番号２）、
ＴＬＶＡＤＡＤＧＦＰＥＰ（配列番号３）、
ＱＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４）、
ＤＶＲ（配列番号５）、
ＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号６）、
ＤＶＲＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号７）、
ＫＥＧＥＤ（配列番号８）、
ＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号９）、
ＫＥＧＥＤＧＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号１０）、
ＤＫＮＤＥ（配列番号１１）、
ＴＶＱＡＲＮＳＩＶＮＡＴ（配列番号１２）、
ＳＩＨＬＫＶＦＡＫ（配列番号１３）、
ＬＳＮＮＹＬＱＩＲ（配列番号１４）、
ＲＦＩＶＬＳＮＮＹＬＱＩ（配列番号１５）、
ＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹＬＱＩ（配列番号１６）、
ＱＥＦＫＥＧＥＤＡＶＩＶ（配列番号１７）、
ＫＥＧＥＤＡＶＩＶＣＤ（配列番号１８）、
ＧＥＩＳＶＧＥＳＫＦＦＬ（配列番号１９）、
ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥＬＴＩＲＮＶＤＫＮＤＥ（配列番号２０）、
ＡＦＳＰＮＧＥＫＬＳＰＮＱ（配列番号４０）、
ＡＫＳＶＶＴＡＥＤＧＴＱＳＥ（配列番号４１）、
ＤＶＲＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４２）、
ＱＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４３）
から選択してもよい。
【００５８】
前記アミノ酸配列は、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号ＮＰ＿１１３７０９（配列番号４０）を有するラットＮＣＡＭの配列から誘導される。
【００５９】
他の好適なペプチド断片は前記配列の断片又は変異体から選択してもよい。
【００６０】
「変異体」は、ＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及び／又はＩｇ３モジュールと相互作用できるペプチド配列のいずれかであり、その相互作用が分化を誘導し、細胞接着を調整し、再生、神経可塑性及び細胞の生存を刺激すると理解される。そこで、断片又は変異体は生物学的に活性な化合物であり、
ｉ）所定のＮＣＡＭアミノ酸配列も認識できる抗体により認識され得るアミノ酸配列を含む化合物；及び／又は
ｉｉ）所定のＮＣＡＭアミノ酸配列にも結合できる受容体部分に結合できるアミノ酸配列を含む化合物；及び／又は
ｉｉｉ）Ｉｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール又はＩｇ３モジュールの少なくとも一つに対して前記所定のＮＣＡＭアミノ酸配列と実質的に同様な結合親和性を持つ化合物；
であると定義され得る。
【００６１】
そこで、本発明によれば、前記定義の変異体は、前記の好適なペプチド断片の機能的等価物である。
【００６２】
全長ＮＣＡＭ蛋白質、例えば配列番号４４又は４５のＮＣＡＭなどの変異体は、例えばＮＣＡＭの天然の可溶性分子、選択的スプライシングの結果として生じるＮＣＡＭからのより短い又はより長いポリペプチドなどの蛋白質の天然イソ型で示されるものであってもよく；又はこれは全長蛋白質の残基の３０〜１００％を含むＮＣＡＭの断片を含む組換え蛋白質であってもよく；又はこれはＮＣＡＭと相同性を持つ天然蛋白質であってもよい。各アミノ酸配列間の相同性は、例えばＢＬＯＳＵＭ３０、ＢＬＯＳＵＭ４０、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ５０、ＢＬＯＳＵＭ５５、ＢＬＯＳＵＭ６０、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＢＬＯＳＵＭ６５、ＢＬＯＳＵＭ７０、ＢＬＯＳＵＭ７５、ＢＬＯＳＵＭ８０、ＢＬＯＳＵＭ８５、又はＢＬＯＳＵＭ９０などの良く知られているアルゴリズムを用いて計算され得る。相同体は、配列番号４４又は配列番号４５のＮＣＡＭと少なくとも約４０％相同性、例えば少なくとも約５０％相同性、例えば少なくとも約６０％相同性、例えば少なくとも約７０％相同性、例えば少なくとも約７５％相同性、例えば少なくとも約８０％相同性、例えば少なくとも約８５％相同性、例えば少なくとも約９０％相同性、例えば少なくとも９２％相同性、例えば少なくとも９４％相同性、例えば少なくとも９５％相同性、例えば少なくとも９６％相同性、例えば少なくとも９７％相同性、例えば少なくとも９８％相同性、例えば少なくとも９９％相同性がある時には本発明の範囲内にあると考えるべきである。本発明の一態様では、相同性割合は同一性割合を示す。
【００６３】
このＮＣＡＭ変異体は、本発明によれば機能的変異体、例えば本発明の結合部位を経る同種親和性結合について全長蛋白質の能力が残っており、この結合が援助する機能を実行する変異体である。
【００６４】
本発明の化合物の結合親和性は、本発明によれば好ましくはＮＣＡＭモジュールへの結合親和性（Ｋｄ値）、１０−３〜１０−１０Ｍの範囲、例えば好ましくは１０−４〜１０−８Ｍの範囲である。本発明によれば結合親和性は表面プラスモン共鳴分析又は核磁気共鳴分光法のいずれか一つの検定法によって決定される。
【００６５】
一つの態様では、変異体は同類置換の増加を含む、挿入、欠失及び置換の数及び範囲として好適な所定の配列とは段階的に相違するアミノ酸配列を示すものと理解されてもよい。この相違は所定の配列とこの変異体との間の相同性の減少として測定される。
【００６６】
「ペプチド配列の変異体」は、ペプチドが例えばアミノ酸残基１個又はそれ以上の置換によって修飾されていてもよいことを意味する。Ｌアミノ酸とＤアミノ酸の双方を使用できる。他の修飾は、例えばエステル、糖類などの誘導体を含んでいてもよい。その例は、メチル及びアセチルエステルである。反復配列などの重合又は様々なキャリアーへの付着の、例えば４ペプチド、８ペプチド、１６ペプチド又は３２ペプチドを持つリジンデンドリマーなどのリジン骨格は、当技術分野で良く知られている。他のキャリアーは、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、又は好脂性デンドリマー、又は好脂性誘導体により形成されるミセル様キャリアー、又はスターバースト（星状）炭素鎖ポリマー結合体、又はジエチルアミノメタンの誘導体に基づくリガンド提示会合（ＬＰＡ）のような蛋白質部分であってもよい。
【００６７】
本発明のペプチド断片の変異体は、同じ変異体又はその断片内に又は他の異なる変異体又はその断片間に、例えば互いに独立に導入された複数の置換のような少なくとも１個の置換を含んでいてもよい。そこで複合体の変異体又はその断片は、相互に独立して同類置換を含んでいてもよく、ここで該変異体又はその断片の少なくとも１つのグリシン（Ｇｌｙ）がＡｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれとは独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片の少なくとも１つのアラニン（Ａｌａ）が、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ及びＩｌｅから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれとは独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片のバリン（Ｖａｌ）の少なくとも１つがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｌｅｕ及びＩｌｅから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれとは独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片のロイシン（Ｌｅｕ）の少なくとも１つがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ及びＩｌｅから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれとは独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片のイソロイシン（Ｉｌｅ）の少なくとも１つがＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ及びＬｅｕから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれとは独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片のアスパラギン酸（Ａｓｐ）の少なくとも１つがＧｌｕ、Ａｓｎ及びＧｌｎから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれと独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片のアスパラギン（Ａｓｎ）の少なくとも１つがＡｓｐ、Ｇｌｕ及びＧｌｎから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれとは独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片のグルタミン（Ｇｌｎ）の少なくとも１つがＡｓｐ、Ｇｌｕ及びＡｓｎから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの；及びここに、該変異体又はその断片のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の少なくとも１つがＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏから構成されるアミノ酸群、好ましくはＴｙｒ及びＴｒｐから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれとは独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片のチロシン（Ｔｙｒ）の少なくとも１つがＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏから構成されるアミノ酸群、好ましくはＰｈｅ及びＴｒｐから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれとは独立にその変異体又は断片；ここに、該断片のアルギニン（Ａｒｇ）の少なくとも１つがＬｙｓ及びＨｉｓから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれと独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片のリジン（Ｌｙｓ）の少なくとも１つがＡｒｇ及びＨｉｓから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれとは独立にその変異体又は断片、及びそれとは独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片のプロリン（Ｐｒｏ）の少なくとも１つがＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ及びＨｉｓから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているもの、及びそれとは独立にその変異体又は断片；ここに、該変異体又はその断片のシステイン（Ｃｙｓ）の少なくとも１つがＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ及びＴｙｒから構成されるアミノ酸群から選択されるアミノ酸で置換されているものである。
【００６８】
そこで前記から、ペプチド断片の同じ機能的等価体又は該機能的等価体の断片は、本明細書に定義する同類アミノ酸２つ以上からの同類アミノ酸置換を２つ以上含んでいてもよいこととなる。用語「同類アミノ酸置換」は本明細書では「相同アミノ酸置換」と同義語的に使用する。
【００６９】
同類アミノ酸の群は次のようなものである：
Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ（中性、弱疎水性）：
Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｂ、Ｚ（親水性、酸性アミン）：
Ｈ、Ｋ、Ｒ（親水性、塩基性）：
Ｆ、Ｙ、Ｗ（疎水性、芳香族）：
Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ（疎水性）：
Ｃ（交差結合形成）。
【００７０】
同類置換は、本発明の好適な所定のペプチド又はその断片のどの位置に導入されてもよい。しかしながら、非同類置換、これに限定されるものではないが特に、１個又はそれ以上のいずれかの位置における非同類置換を導入することも好ましいであろう。
【００７１】
本発明のペプチドの機能的等価体断片の形成に至る非同類置換は、例えば
（ｉ）実質的に極性が異なる置換、例えば非極性側鎖を持つ残基（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ又はＭｅｔ）を、極性側鎖を持つ残基（例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ又はＧｌｎ）又は荷電アミノ酸（例えばＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ又はＬｙｓ）に代える置換；又は荷電あるいは極性残基を非極性残基に代える置換；及び／又は
（ｉｉ）実質的にペプチド骨格の配向への効果が異なる置換、例えばＰｒｏ又はＧｌｙのこれに代える他の残基による置換；及び／又は
（ｉｉｉ）実質的に電荷が異なる置換、例えば陰電荷残基（例えばＧｌｕ又はＡｓｐ）を陽電荷残基（例えばＬｙｓ、Ｈｉｓ又はＡｒｇ）に代える置換（及びその逆）；及び／又は
（ｉｖ）実質的に立体的バルク（bulk）が異なる置換、例えば大きな残基を持つもの（例えばＨｉｓ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ又はＴｙｒ）を小さな側鎖を持つもの（例えばＡｌａ、Ｇｌｙ又はＳｅｒ）に代える置換（及びその逆）；
などであろう。
【００７２】
アミノ酸の置換は、一態様では疎水性及び親水性の値及び、例えば荷電、サイズなどを含むアミノ酸側鎖置換基の相対的類似性に基づいて行ってもよい。前記の様々な特性を考慮するアミノ酸置換の例は当業者に良く知られており：アルギニンとリジン；グルタメートとアスパルテート；セリンとスレオニン；グルタミンとアスパラギン；ならびにバリン、ロイシン及びイソロイシンが含まれる。
【００７３】
アミノ酸の付加又は欠失は、２個から好ましくは１０個のアミノ酸、例えば２個〜８個のアミノ酸、例えば２個〜６個のアミノ酸、例えば２個〜４個のアミノ酸の付加又は欠失であってもよい。しかしながら、アミノ酸１０個又はそれ以上の付加、例えば２個〜１０個のアミノ酸の付加も本発明内に含まれる。多量体形では付加／欠失を、その多量体の各単量体について個々に行ってもよい。
【００７４】
本発明はまた本明細書に開示する化合物の非ペプチド変異体に関する。殊に、そのような変異体は、他の方法でＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール又はＩｇ３モジュールと結合し、又は他の方法で相互作用し、それによってＩｇ１、Ｉｇ２又はＩｇ３のシグナルを伝達し、及び／又は増殖を調整し、及び／又は分化を誘導し、及び／又は再生、神経可塑性及び／又はＮＣＡＭ受容体を提示する細胞の生存を刺激する、化合物であると理解されるべきであろう。
【００７５】
機能的等価体
機能的等価体は、配列内のアミノ酸置換によって得てもよく、それは本発明による機能的活性を有する。本発明内容における機能的類似性は、側鎖の主な特性、例えば疎水性、塩基性、中性又は酸性、又は立体的バルクの存在又は不存在を示す。従って、本発明の一態様では、ｉ）効果が可能な所与の機能的等価体；と、ｉｉ）所定の好適な断片との間の同一性の程度は、本発明による好適な所定のペプチド断片の変異体又は機能的等価体としてのその断片の主要な基準ではない。
【００７６】
少なくとも３アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸の好適な所定の断片と少なくともいくらかの相同性を共有する断片は、好適な所定のＮＣＡＭペプチド又はその断片と、少なくとも約２５％相同性、例えば少なくとも約３０％相同性、例えば少なくとも約４０％相同性、例えば少なくとも約５０％相同性、例えば少なくとも約５５％相同性、例えば少なくとも約６０％相同性、例えば少なくとも約６５％相同性、例えば少なくとも約７０％相同性、例えば少なくとも約７５％相同性、例えば少なくとも約８０％相同性、例えば少なくとも約８５％相同性である時には、本発明の範囲内にあると考えるべきである。
【００７７】
配列同一性は配列分析ソフトウェア（例えば、the Sequence Analysis Software Package of the Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Centre, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705）を製造社指定のデフォルトパラメータで使用して測定できる。
【００７８】
特に指定がないときは、本発明のポリペプチドのＣ末端アミノ酸は「−ＯＨ」で表してもよい遊離カルボン酸として存在すると理解されるべきである。しかしながら、本発明化合物のＣ末端アミノ酸は「−ＮＨ２」で表されるアミド化誘導体であってもよい。他に記載がない時は、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸は、「Ｈ−」で表してもよい遊離のアミノ基を含む。
【００７９】
その他の指定がない時は、アミノ酸は天然起源であると否とに拘らず、何れかのアミノ酸、例えばα−アミノ酸、β−アミノ酸及び／又はγ−アミノ酸から選択され得る。従って、この基はこれに限定するものではないが次の基：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｉｂ、Ｎａｌ、Ｓａｒ、Ｏｒｎ、リジン類似体ＤＡＰ及びＤＡＰＡ、４Ｈｙｐを含む。
【００８０】
試験方法
本発明によれば、ＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールからなる同種親和性結合部位を経る２つの別個なＮＣＡＭ分子の間の相互作用を調整できる化合物は、
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは互いに相互作用する（ｂ）の２つの別個な断片からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは互いに相互作用する（ｂ）の２つの別個な断片からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する能力（ここに該モジュールは互いに相互作用する（ｂ）の２つの別個な断片からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは互いに相互作用する（ｂ）の２つの別個な断片からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは互いに相互作用する（ｂ）の２つの別個な断片からのものである）；
能力を試験することによって確認してもよい。
本発明の方法は次の各段階：すなわち
ａ）化合物を提供する段階；
ｂ）ＮＣＡＭ分子の少なくとも１種の別個な断片を提供する段階（ここに該断片は配列番号４０に示す配列の残基１〜２８９を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの配列に対応する連続するアミノ酸残基の配列又はその断片を含む）；
ｃ）（ａ）の化合物と（ｂ）の別個なＮＣＡＭ断片とを接触させる段階、及び
ｄ）化合物が、
−ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは、互いに相互作用する（ｂ）の２つの別個な断片からのものである）、及び／又は
−ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは、互いに相互作用する（ｂ）の２つの別個な断片からのものである）、及び／又は
−ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する能力（ここに該モジュールは、互いに相互作用する（ｂ）の２つの別個な断片からのものである）、及び／又は
−ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによって、ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは、互いに相互作用する（ｂ）の２つの別個な断片からのものである）、及び／又は
−ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに両モジュールは、互いに相互作用する（ｂ）の２つの別個な断片からのものである）；
を持つかどうかを試験する段階；
ｄ）前記相互作用のいずれかが可能な候補化合物を提供する段階；
を含む。
【００８１】
本発明の好適な態様では、ＮＣＡＭの別個な断片はＮＣＡＭ配列からの少なくとも２８９個のアミノ酸の連続配列を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールによって表される。さらに好適な態様では、この配列はＮＣＡＭのアミノ酸１〜２８９を含むが、ここにＮＣＡＭはラットＮＣＡＭであって、本願明細書に配列番号４０と記載し、ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ_１１３７０９として登録されている。
【００８２】
本明細書では「ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール」は、Ｎ末端＜Ｉｇ１−（リンカー）−Ｉｇ２−（リンカー）−Ｉｇ３＞Ｃ末端の順序でＩｇ１、Ｉｇ２及びＩｇ３の配列と該モジュールを結合するリンカー配列とから構成される前記の連続アミノ酸配列を意味する。このＩｇ１−２−３モジュールは、Ｉｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールを含む組換え分子であってもよく；又はＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュール及び融合相手を含む組換え融合蛋白質であってもよく；又は、当技術分野で知られている方法の何れかで得られる全長ＮＣＡＭ分子の断片であってもよい。前記発明によれば、前記方法のＩｇ１−２−３モジュールは溶液である。一態様では、この溶液は水溶液である。好適な態様では、溶液は燐酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液であるか、又はＴＲＩＳ−ＨＣｌ緩衝液、ｐＨ７.４である。
【００８３】
化合物と段階（ｃ）の別個なＮＣＡＭ断片との接触は、好ましくはＩｇ１−２−３モジュールの溶液内で行う。
【００８４】
その化合物が前記相互作用をできるかどうかの試験は、当技術分野で蛋白質相互作用の検出に現用されている利用可能な方法のいずれかによって行ってもよい。例えば、適当な方法としてＮＭＲ分光法を選択してもよく、又はプラスモン共鳴分析によって行ってもよい。本発明では、ＮＭＲによる評価は好適である。
【００８５】
前記の相互作用ができる化合物は、本発明が定義する候補化合物として前記方法によって確認される。さらにこの候補化合物を少なくとも２つの別個なＮＣＡＭのモジュールの間の相互作用、例えば：
ｉ）Ｉｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉ）Ｉｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉｉ）Ｉｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの相互作用；
を調整する能力について試験してもよい。
【００８６】
例えば、後者の試験は選択された候補化合物の存在下に溶液でＩｇ１−２−３モジュールのゲル濾過を用いることによって行ってもよい。又はそれは、別個なＩｇ１モジュール及びＩｇ３モジュールの混合物；又は別個なＩｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールの混合物；又は各々Ｉｇ１モジュール及びＩｇ３モジュールの連続配列からなる２つの別個なＮＣＡＭ断片の混合物；又はＩｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールからなる断片の混合物のゲル濾過を用いることによって行ってもよい。ゲル濾過クロマトグラフィーは最も汎用されている実験技術であって、熟練した専門家は容易にそのような試験ができる。
【００８７】
本発明によれば、候補化合物は、前記ＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールの相互作用を調整できる何らかの分子であってもよい。そのような化合物は、例えば、ペプチド、脂質、炭水化物又はその他の有機分子、又はアミノ酸と他の有機化合物とのコポリマーのコンビナトリアルライブラリーを含む群から選択してもよい。好適な態様では、本発明の候補化合物はペプチドである。
【００８８】
前記試験法の目的は、本発明の結合部位でＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールと相互作用でき、それによって ＮＣＡＭ依存性の細胞分化、接着及び／又は生存を調整する目的化合物（候補化合物）の確認及び選択である。
【００８９】
結晶
本発明によれば、候補化合物の確認は、別個にＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールを含むか、又は該モジュールの組合せのいずれかを含む結晶蛋白質の使用を含んでいてもよい。
【００９０】
ラットＮＣＡＭ（ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ受託番号ＮＰ_１１３７０９）（配列番号４０）のアミノ酸残基１〜２８９に対応するアミノ酸配列からなるＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの結晶蛋白質は、ＮＣＡＭの同種親和性結合部位の構造を決定するために本発明者らが作製したものであり、コンピュータで作製したモジュールの３次元構造を、同定された同種親和性結合部位と結合できる化合物をインシリコでスクリーニングするための化合物として本明細書に示す。
【００９１】
好適な態様では、本発明の結晶蛋白質は、ＮＣＡＭの同種親和性結合部位を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールを含むポリペプチドの結晶である。この結晶は２個以上のポリペプチド、例えば２種のポリペプチドを含んでいてもよい。好適な態様では、この結晶はアミノ酸配列を相互に連結することによって１つの断片に組合わされたＮＣＡＭのＩｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールを含み、該断片の一つを本明細書では「Ｉｇ１−２−３断片」と称する。
【００９２】
それ故、結晶が原子座標を少なくとも４Å、好ましくは少なくとも３Å、より好ましくは少なくとも２．８Å、さらに好ましくは少なくとも２．５Å、最も好ましくは少なくとも２．０Åの解像度で決定できるようにＸ線を回折することは好適である。
【００９３】
本発明の極めて好適な態様においては、結晶は図２に示す表２の構造座標によって、又は最大２．５Å、好ましくは最大２．２５Å、さらに好ましくは最大２．０Å、さらになお好ましくは最大１．７５Å、なお好ましくは最大１．５Å、例えば最大１．２５Å、例えば最大１．０Åのそれからの標準偏差を持つ座標によって示される空間関係に配置される原子を含む。好ましくは、この座標は、最大２．５Å、好ましくは最大２．２５Å、さらに好ましくは最大２．０Å、さらになお好ましくは最大１．７５Å、なお好ましくは最大１．５Å、例えば最大１．２５Å、例えば最大１．０Åのそれからの標準偏差を持つ。
【００９４】
好ましくは、結晶はＩＤコード １ＱＺ１としてＰＤＢに寄託した構造を含むか、さらに好ましくはその構造から構成される。
【００９５】
結晶は非対称格子当りＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片の２種以上のポリペプチドを含んでいてもよく、本発明の好適な態様では、この結晶は非対称格子当りＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール一個を持つポリペプチドを含む。
【００９６】
結晶が次の範囲の単位格子寸法を持つことが好ましい：
ａ＝５０〜５２、好ましくは５０．５〜５１．０、さらに好ましくは約５１．５；
ｂ＝１０７．５〜１０９．５、好ましくは１０８〜１０９、さらに好ましくは約１０８．５；
ｃ＝１４６〜１５１、好ましくは１４８〜１５０、さらに好ましくは約１４９．０；
α＝８５．５〜９５．５、好ましくは８８〜９２、さらに好ましくは約９０；
β＝８５．５〜９５．５、好ましくは８８〜９２、さらに好ましくは約９０；
γ＝８５．５〜９５．５、好ましくは８８〜９２、さらに好ましくは約９０。
【００９７】
最も好ましくは、この結晶は次の特性値を有する：空間群：Ｉ２１２１２１；非対称単位格子当り１分子；単位格子寸法：ａ＝５１．５、ｂ＝１０８．５、ｃ＝１４９．０Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°。
【００９８】
結晶の製造
何回かの失敗の後、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールに対応するポリペプチドの結晶の製造に適する条件が確認された。
【００９９】
それ故、本発明の一局面は、ラットＮＣＡＭ（ＮＣＢＩ受託番号ＮＰ_１１３７０９）（配列番号４０）のアミノ酸残基１〜２８９に対応する少なくとも２８９個の連続アミノ酸残基を含むポリペプチドを含有する結晶を提供することにあり、該連続アミノ酸を結晶を製造する方法を用いてラットＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片に対応させ、ここで該方法は、
ｉ）該ポリペプチドを提供する段階；
ｉｉ）このポリペプチドを１４〜１７％の範囲内のポリエチレングリコール４０００（ＰＥＧ４ｋ）、ｐＨ４．８〜５．８の範囲内の０．１５０Ｍ〜０.５Ｍの範囲内の硫酸リチウムを含む緩衝液中でインキュベートする条件下で結晶を成長させる段階；
ｉｉｉ）該結晶を製造する段階；
を含む方法である。
【０１００】
本発明の一態様では、該ポリペプチドと該ポリペプチドと相互作用が可能な化合物との共結晶を製造する。この化合物は以下に略述する方法のいずれによって確認してもよい。それ故、本発明の一局面ではこの化合物は例えばＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールが介在するＮＣＡＭ同種親和性相互作用のモジュレータなどのモジュレータであってもよい。
【０１０１】
この共結晶は、結合性が強化され、最適化された化合物を設計するために有用である。殊に前記共結晶はＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールが介在する同種親和性相互作用の改良された阻害剤又はその相互作用の安定化剤を設計するために有用であろう。
【０１０２】
この緩衝液は、好ましくは５〜２５％の範囲内のポリエチレングリコール、さらに好ましくは１０〜２０％の範囲内、さらになお好ましくは１２〜１８％の範囲内、さらになお好ましくは１４〜１６％の範囲内、最も好ましくは約１５％のポリエチレングリコールを含む。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は適当なＰＥＧ、例えばＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００及びＰＥＧ８０００から構成される群から選択されたＰＥＧのいずれかであってもよく、好ましいポリエチレングリコールはＰＥＧ４０００である。
【０１０３】
この緩衝液は好ましくは、塩を０．１５Ｍ〜０．５Ｍの範囲、さらに好ましくは０．２〜０．５Ｍの範囲、さらになお好ましくは０．３〜０．５Ｍの範囲、なお好ましくは０．４〜０．５Ｍの範囲、最も好ましくは約０．４５Ｍ含む。この塩は何らかの有用な塩であってよく、好ましくは硫酸リチウム（Ｌｉ２ＳＯ４）である。
【０１０４】
この緩衝液は好ましくはｐＨが４．０〜８．５の範囲内、さらに好ましくは４．５〜７．５の範囲内、さらになお好ましくは５．０〜６．５の範囲内、なお好ましくは５.０〜５.２の範囲内である。この緩衝液は何らかの有用な緩衝液であってよく、好ましくは酢酸ナトリウム緩衝液である。
【０１０５】
インキュベーションは適当な温度、好ましくは５〜２５℃の範囲の温度、さらに好ましくは１０〜２５℃の範囲の温度、さらになお好ましくは１５〜２５℃の範囲の温度、さらになお好ましくは１７〜２１℃の範囲の温度、なお好ましくは約１８℃で行うべきである。
【０１０６】
結晶は、例えばハングドロップ法などの適当な方法で生長させてもよい。
【０１０７】
構造決定
結晶の構造は当業者に公知の何れの方法、例えばＸ線回析を用いるものによって決定され得る。一旦構造が確認されると、適当なソフトウェアを用いてその構造を精密化することができる。
【０１０８】
本発明の一態様では、分子置換法を使用してもよい。かかる技術は、三次元構造を決定すべきポリペプチド又は複合体の結晶についてＸ線回析データを得て構造を決定することを含む。次に、構造的類似蛋白質の既知構造座標を参照しつつ分子置換技術を用いてＸ線回析データを分析することによって、そのポリペプチド又は複合体の三次元構造を決定する。ＮＣＡＭのＩｇ１〜２モジュールを含むポリペプチドの場合には、そのモジュールの構造座標を使える。例えば米国特許第５３５３２３６号に記載のように、分子置換は未知の結晶試料の構造の原型を造るための出発点として既知の構造を持つ分子を用いる。この技術は、単位格子内で構造、配向及び位置が類似する２つの分子は、同様な回析を示すという原理に基づく。分子置換は単位格子内にある既知構造の位置が未知構造と同じ位置・配向にあることを含む。位置が決まると、単位格子内にある既知構造の原子を用いて仮説的回析実験の結果もたらされる構造因子を計算する。これには、既知構造を既知構造の配置と実験データとが合致するまで６個の寸法（３個の角度寸法及び３個の空間的寸法）について回転することを含む。この概略構造は、様々な精密化技術を使用してさらに正確でさらに解像度の高い構造になるように微調整できる。例えば、実験データによって定義された構造について得られたモデルを、６個の寸法についてそのモデルを限定された追加的回転をさせて約５％以下の位置シフトを得る、剛体精密化に付してもよい。精密化したモデルは次に既知の精密化法を用いてさらに改善されてもよい。
【０１０９】
ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールに対応するポリペプチド又はそのポリペプチドと相互作用する化合物との複合体の三次元構造を決定する別の方法は、相同性モデリング技術である。相同性モデリング法は、１種又はそれ以上の関連蛋白質、蛋白質ドメイン及び／又はサブドメインの構造座標を使用して未知構造のモデルを構築することを含む。相同性モデリング法は、相同的な構造要素の三次元構造について、三次元構造を解明すべき蛋白質又はペプチドの共通部分又は相同性部分を合致させることによって行ってもよい。相同性モデリング法は、解明すべき構造に関連するものによってアミノ酸（又は他の成分）を置換して三次元構造の一部又は全部を再構築することを含むことができる。
【０１１０】
構造決定の一例を実施例２に示す。
【０１１１】
本発明の結晶ポリペプチドの構造座標は、三次元形の表示のために；又はコンピュータ援用処理を含む他の使用のために；又はそれが定義する構造座標又は三次元構造に基づくコンピュータ計算のために、機械的に読み出せる形で機械的に読み出せる保存媒体、例えばコンピュータのハードドライブ、ディスケット、ＤＡＴテープ、ＣＤ−ＲＯＭなどに保存してもよい。例えば、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールに対応するポリペプチドの三次元構造を規定するデータは、機械的に読み出せる媒体に保存してもよく、蛋白質構造の三次元図形として表示してもよく、典型的にはこの保存媒体からデータを読み出すことができ、そのデータから表示を構築するプログラムを持つコンピュータを用いて表示してもよい。そこで、この発明は、この発明の結晶組成物の構造座標、例えば表２（図２）に示す座標を示すデータを、随意的な追加的データ及びデータを処理する命令と共に含むメモリーを有する機械、例えばコンピュータを含む。このようなデータは、例えば他の関連構造の決定及び創薬のような様々な目的に使用してもよい。
【０１１２】
このような機械的に読み出せるデータの第一のセットを機械的に読み出せるデータの第二のセットと組合せて、第一のデータセットと第二のデータセットとを使用するための命令がプログラムされている機械を用いて、機械的に読み出せるデータの第二のセットに対応する座標の少なくとも一部を決定してもよい。例えば、データの第一のセットは表２（図２）に示す複合体の座標の少なくとも一部のフーリエ変換を含んでいてもよいが、一方、データの第二のセットは分子又は分子複合体のＸ線回折データを含んでいてもよい。
【０１１３】
さらに特には、本発明の一つの目的はＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの同種親和性結合部位を含む共複合体の三次元構造情報を提供することにある。そのために、本発明者らは、例えば分子置換法又は相同性モデリング技術によって他の同様な細胞接着分子（ＣＡＭ）、例えば同種親和性相互作用が可能なＩｇモジュール又はポリペプチド：すなわち相互作用する化合物の複合体を含む別なＣＡＭの結晶型の三次元構造を解明するために、本発明の結晶組成物又はその一部の構造座標の使用を提供する。
【０１１４】
例えば、表２（図２）に示す座標のセットを利用するために、同種親和性結合部位及び相互作用する化合物を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールに対応するポリペプチドの結晶共複合体の構造を決定するために分子置換を使用してもよい。
【０１１５】
本構造の使用
本発明に記載するポリペプチドの３次元表示は、数種の目的、例えば同様な蛋白質又はポリペプチド（本明細書に前記した）の構造を決定するために、又は該ポリペプチドと相互反応できる化合物を設計するために有用であろう。
【０１１６】
例えば、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールのポリペプチドの機械的に読み出せるデータによって規定される三次元構造は、様々な化学物質又は被検化合物と関連する能力についてコンピュータで評価してもよい。本明細書に使用する「化学物質」は化合物、少なくとも２個の化合物の複合体、及びそのような化合物又は複合体の断片を示す。
【０１１７】
例えば、ＮＣＡＭ又はその複合体のＩｇ１−２−３モジュールに対応するポリペプチドの三次元構造を決定する機械で読み出せるデータの第一のセットを、化学物質又は化合物の能力を評価するための命令でプログラムされた機械を用いて、化学物質又は目的とする被検化合物の構造を規定する機械で読み出せるデータの第二のセットと合わせ、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール又はその複合体及び／又はその会合の位置及び／又は配向を合わせる。この方法は、その化学物質に関与する蛋白質表面の位置、配向及び会合エネルギーについての見識を提供する。
【０１１８】
このデータで規定された三次元構造は、構造の視覚的検討ならびにポリペプチド成分と相互作用する化合物との会合の視覚的検討を可能にするグラフ形式で表示してもよい。あるいは、より定量的な方法又はコンピュータによる方法を使用してもよい。例えば、本明細書に示す分子又は分子複合体のいずれかと会合する化学物質の能力を評価するための本発明の一つの方法は、（ａ）化学物質と結合部位又は他の分子又は分子複合体の表面の特徴部位との間の適合操作を行うためにコンピュータ法を用いる段階；及び（ｂ）その適合操作の結果を分析して化学物質と結合部位との間の会合を定量化する段階を含む。
【０１１９】
この発明はさらに、三次元構造内、好ましくは結合部位内又は結合部位に隣接する部位にある活性アミノ酸、例えばシステイン残基を確認するための；例えば水接近可能な表面又は全原子のファンデルワールス表面の空間を満たす表面のような分子表面を作製及び視覚化するための；蛋白質又は複合体、例えば基質結合部位などの表面特徴点のサイズ及び形態を計算又は可視化するための；好ましくはリガンド結合部位内又はリガンド結合部位に隣接する三次元構造内の潜在的水素結合供与体及び受容体の位置を特定するための；好ましくはリガンド結合部位内又はリガンド結合部位に隣接する三次元構造内の疎水性及び親水性の領域を計算するための；及び選択された目的とする官能基（例えばアミノ、ヒドロキシル、カルボキシル、メチレン、アルキル、アルケニル、芳香族炭素、芳香環、芳香族複素環など）に関して好ましい相互作用エネルギーの蛋白質表面上又は表面近辺の領域を計算し、可視化するための、本発明の結晶組成物又はその一部の構造座標の使用を提供する。前記手法を、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールに対応するポリペプチド及びそれが相互作用する可能性がある化合物の部分との相互作用を特徴付ける目的で；活性アミノ酸（例えばシステイン）に特異的共有結合ができる化合物を設計又は選択する目的で；及び蛋白質の表面特徴点の、あらかじめ選択され得るセットとの相補的特性（例えば大きさ、形、荷電、疎水性／親水性、水素結合に関与する能力など）を有する化合物を設計又は選択する目的で使用してもよい。構造座標を使用して、複合体状態における蛋白質へのリガンドの配向、結合定数又は相対的親和性を予測又は計算してもよく、また改善された親和性を持つ化合物を設計又は選択するためにその情報を使用してもよい。
【０１２０】
そのような場合、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールのポリペプチド又はその部分あるいは複合体の構造座標を、所望の操作を行う命令がプログラムされた機械に機械が読み込める形で入力し、また、それはいずれか必要な付加的データ、例えば潜在的に相互作用する化合物又はその部分の構造及び／又は機能的特性を規定するデータ、様々なアミノ酸の分子特性などを決定するデータを含む。
【０１２１】
この発明の一方法は、化学構造のデータベースからのＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールに結合できる化合物の選択を提供する。この方法は、本発明の結晶組成物の構造座標、例えばＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール又はその部分あるいは複合体の三次元構造を規定する座標から始める。三次元構造と会合する点は、１つ又はそれ以上の官能基と相互作用する好ましい能力に関して特徴付けられる。次に化学構造のデータベースを、事前の特徴付けに基づいて蛋白質との好ましい相互作用について１つ又はそれ以上の官能基を含む候補化合物について検索する。こうして三次元構造を有する好ましい相互作用の各点で最も良く適合する構造を有する化合物を同定する。
【０１２２】
必須ではないが、そのような検索はコンピュータを援用して行うのが好適であることが多い。この場合、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールに対応するポリペプチド又はその部分またはそのポリペプチド／相互作用する化合物複合体の３次元構造を規定する機械が読み取れるデータの第一のセットを、ポリペプチドの原子と官能基との間の好ましい相互作用のための好適な位置を確認するための命令をプログラムした機械を用いて、目的とする１つ又はそれ以上の部分又は官能基を規定する機械が読み取れるデータの第二のセットと合わせる。データの第三のセット、すなわちポリペプチドと官能基の間の好ましい相互作用の位置を規定するデータをこうして作成する。次にそのデータの第三セットを、ポリペプチドとの好ましい相互作用の位置に最適合致するようにした官能基を含む化学物質を確認するための命令をプログラムした機械を用いて、１つ又はそれ以上の化学物質の３次元構造を規定するデータの第四のセットと合わせる。
【０１２３】
前記手段のいずれかによって選択又は設計した構造を持つ化合物を、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールに結合する能力を試験してもよい。
【０１２４】
本発明の好適な態様では、前記化合物はＩｇ１−２−３断片が介在するＮＣＡＭの同種親和性相互作用のモジュレータであるのが好ましい。例えば、Ｉｇ１−２−３同種親和性結合部位と相互作用することができる化合物は、ＮＣＡＭの同種親和性結合及びこの結合を必要とするＮＣＡＭ機能の良好な阻害剤となろう。それ故、前記手段のいずれかによって選択又は設計された構造を有する化合物を、例えばＮＣＡＭ提示細胞の細胞分化及び／又は生存を調整するような、ＮＣＡＭ活性を調整する能力について試験してもよい。
【０１２５】
この分野の専門家が認識するであろうように、所与のポリペプチド（又はその部分あるいは複合体）の三次元構造と、本明細書に記載するようなＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール又はその複合体に対応するポリペプチドとの間の同一性の程度を決定するために、様々なコンピュータ分析を使用できる。そのような分析を、商業的に入手できるソフトウェア、例えばQUANTA（Molecular Simulations Inc., Waltham, Mass.）のMolecular Similarityアプリケーション３．３版と添付仕様書第３巻、１３４〜１３５頁の記載を利用して行ってもよい。
【０１２６】
このMolecular Similarityアプリケーションは様々な構造、同一構造の様々な配座、及び同一構造の様々な部分の間の比較を可能にする。Molecular Similarityで使用する構造比較操作は、（１）比較する構造の負荷；（２）構造内の原子等価性の規定；（３）適合操作の実行；及び（４）結果の分析の４段階に分けられる。
【０１２７】
各構造を次のように命名する。一つ目の構造は標的（すなわち固定構造）；残りの構造は全て作業構造（すなわち可動構造）とする。QUANTA内の原子価はユーザの入力で規定されるので、本発明者らは本発明の目的には比較する２つの構造間の同類残基全てについて等価な原子を蛋白質骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ及びＯ）と定義し、剛体フィッティング操作のみを考える。
【０１２８】
剛体フィッティング法を用いる時は、作業構造を移動し、回転して標的構造との最良適合を得る。このフィッティング操作は、等価原子の特定な対についての適合での標準偏差が絶対的に最小値になるように、作業構造に適用される最適な移動及び回転を計算する最小二乗法フィッティングアルゴリズムを使用する。オングストロームで示されるこの数をQUANTAによって記載する。
【０１２９】
この発明の目的に関して、標準偏差１．５Å又はそれ以下の同類残基骨格原子（Ｎ、Ｃα、Ｃ、Ｏ）を有し、この発明の蛋白質又は複合体の関連構造座標、例えば表２（図２）に示す座標について――骨格原子を用いて――重なり合う時は、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールに対応するポリペプチド又はその分子複合体の構造座標のいずれのセットも同一であると考える。さらに好ましくは、標準偏差は１.０Å又はそれ以下である。最も好ましくは、標準偏差は０.５Å又はそれ以下である。
【０１３０】
用語「標準偏差」は平均値からの偏差の二乗の相加平均値の平方根を意味する。これは傾向又は目的からの偏差又は変動を表す一方法である。この発明の目的では、「標準偏差」はこの発明の蛋白質の骨格における蛋白質骨格、例えば表２（図２）及び本記載に示す構造座標で定義するＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの同種親和性結合部位内の変動と定義する。
【０１３１】
用語「最小二乗法」はある値の最良推測値は実測値が示す偏差の二乗の合計が最小になる値であるという原理に基づく方法を示す。
【０１３２】
この発明の結晶性物質のために作製した構造座標、例えば表２（図２）に示す構造座標を使用するために、三次元形として表示するか又は三次元形に変換するか、そのように操作することが必要又は好ましいことが多い。これは典型的には構造座標のセットから分子又はその一部分の３次元グラフ表示を作製できるプログラムのような商業的に購入できるソフトウェアの使用によって達成される。
【０１３３】
例示として、蛋白質構造を観察又は取扱うコンピュータプログラムの非排他的リストには次を含む：
Midas（カリホルニア大学サンフランシスコ校）、
MidasPlus（カリホルニア大学サンフランシスコ校）、
MOIL（イリノイ大学）、
Yummie（イエール大学）、
Sybyl（トリポス社）、
Insight/Discover（バイオシムテクノロジー）、
MacroModel（コロンビア大学）、
Quanta（モレキュラーシミュレーションズ社）、
Cerius（モレキュラーシミュレーションズ社）、
Alchemy（トリポス社）、
LabVision（トリポス社）、
Rasmol（グラクソ研究開発）、
Ribbon（アラバマ大学）、
NAOMI（オックスフォード大学）
Explorer Eyechem（シリコングラフィックス社）、
Univision（クレイ研究所）、
Molscript（ウプサラ大学）、
Chem-3D（ケンブリッジサイエンティフィック）、
Chain（ベイラー医科大学）、
O（ウプサラ大学）、
GRASP（コロンビア大学）、
X-Plor（モレキュラーシミュレーションズ社、イエール大学）、
Spartan（ウエーブファンクション社）、
Catalyst（モレキュラーシミュレーションズ社）、
Molcadd（トリポス社）、
VMD（イリノイ大学／ベックマン研究所）、
Sculpt（インタラクティブシミュレーションズ社）、
Procheck（ブルックヘブン国立研究所）、
DGEOM（ＱＣＰＥ）、
RE_VIEW（ブルネル大学）、
Modeller（バーベック校、ロンドン大学）、
Xmol（ミネソタスーパーコンピュータセンター）、
Protein Expert（ケンブリッジサイエンティフィック）、
HyperChem（ハイパーキューブ）、
MD Display（ワシントン大学）、
PKB（国立バイオ技術情報センター、米国衛生研究所）、
ChemX（ケミカルデザイン社）、
Cameleon（オックスフォードモレキュラー社）
Iditis（オックスフォードモレキュラー社）。
【０１３４】
この発明の結晶性物質に対する構造座標のプログラムの記憶、転送又は使用のために、機械的に読み出せる記憶媒体は、機械的に読み出せるデータをコードしたデータ記憶材を含むものとして提供され、これはここに例えば前記のような種類のプログラムの１個又はそれ以上を負荷したコンピュータを用いてデータを用いる命令をプログラムした機械を用いる時は、本明細書に記載する分子又は分子複合体のいずれかの三次元グラフ表示を表示できる。データ記憶材を含む機械的に読み出せる記憶媒体はコンピュータでの使用に適合する常用のコンピュータハードドライブ、フロッピー（登録商標）ディスク、ＤＡＴテープ、ＣＤ−ＲＯＭ、その他の磁気、光磁気、光学、フロッピー（登録商標）、またはその他の媒体を含む。
【０１３５】
例えば表２（図２）に示す座標セット＋／−アミノ酸の保存された骨格原子からの標準偏差が１．５Å又はそれ以下である、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの構造座標で定義される分子又は分子複合体の図式的三次元表示ができる機械的に読み出せるデータ記憶媒体がさらに好適である。本発明のこの局面の例示的な態様は、常用の３．５”ディスケット、ＤＡＴテープ又はデータセットをコードするハードドライブ、好ましくは表２（図２）の座標を含むＰＤＢフォーマットのものである。図３はそのポリペプチドの図式的三次元表示のプリンター出力を示す。
【０１３６】
別な一態様では、機械的に読み出せるデータ記憶媒体は、表２（図２）（又は、その誘導物）に示す構造座標のフーリエ変換を含む機械的に読み出せるデータの第一のセットをコードするデータ記憶材を含み、またこれは、そのデータ使用に対する命令をプログラムされた機械を使用する時には、分子又は分子複合体のＸ線回析パターンを含む機械的に読み出せるデータの第二のセットと結合して、機械的に読み出せるデータの第二のセットに対応する構造座標の少なくとも一部を決定できる。
【０１３７】
例えばかかるシステムは、中央処理装置（「ＣＰＵ」）、例えばＲＡＭ（ランダムアクセスメモリー）又は「コア」メモリー、大容量記憶メモリー（例えば１個又はそれ以上のディスクドライブ又はＣＤ−ＲＯＭドライブ）であり得る作業用メモリー、１個又はそれ以上の陰極線管（「ＣＲＴ」）ディスプレー端末、１個又はそれ以上のキーボード、１個又はそれ以上の入力装置（ＩＰ）、及び１個又はそれ以上の出力装置（ＯＰ）を含むコンピュータを含み、それらは全て通常の双方向システムバスで相互に結合している。
【０１３８】
入力ラインによってコンピュータと接続している入力ハードウェアは様々な方法が装備されていてもよい。この発明の機械的に読み出せるデータは、電話線又は専用データラインに結合したモデムを用いて入力してもよい。これとは別に又はこれに加えて、入力ハードウェアはＣＤ−ＲＯＭドライブ又はディスクドライブであってもよい。ＣＲＴディスプレー端末に関連して、入力装置としてキーボードを用いてもよい。
【０１３９】
出力ラインでコンピュータに結合する出力ハードウェアは、同様にして常用の装置を装備していてもよい。例示としては、出力ハードウェアはこの発明の蛋白質（又はその部分）の図式的表示を、例えば本明細書に記載するQUANTAのようなプログラムを用いて表示するためにＣＲＴディスプレー端末を含んでいてもよい。出力ハードウェアはまたハードコピー出力を作れるプリンター、又は以後の使用のためのシステム出力を保存するためのディスクドライブを含んでいてもよい。
【０１４０】
処理中には、ＣＰＵは様々な入力及び出力装置の使用を調整し、大容量記憶装置からのデータアクセス及び作業メモリーへの入出力アクセスを調整し、そしてデータ処理段階の順序を決定する。多数のプログラムがこの発明の機械的に読み出せるデータを処理するために使用できる。そのようなプログラムの例を、本明細書に上記する。この目的に適するアルゴリズムは、例えばCast-3D（Chemical Abstracts Service)、3DB Unity (Tripos, Inc.)、Quest-3D (Cambridge Crystallographic Data Center)及びMACCS/ISIS-3D (Molecular Design Limited）のようなプログラムにも装備されている。この幾何学的検索は、結合部位のサイズ及び形体的要件を用いて禁止的寸法を持つヒットを排除する立体的検索によって助長され得る。FRAPのFRBに適用される検索での幾何学的及び立体的要件を同期化させるために使用できるプログラムにはCAVEAT(P. Bartlett, University of California, Berkeley), HOOK (MSI), ALADDIN (Daylight Software)及びDOCK(http://www. cmpharm.ucsf.edu/kuntz-/kuntz.htmlおよびその引用文献）が含まれる。これらの検索プロトコルは全て、現存する商業データベースCambridge Structural Database又は化学メーカーから入手可能な化学データベースと連係して使用してもよい。
【０１４１】
本発明の一態様では、この方法はＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール又はその断片と相互作用できる可能性のある多数の化合物を確認することを含み、例えばこの方法はＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール又はその断片と相互作用する可能性のある化合物のサブライブラリーの確認を含むことができる。これはどの常用の方法を使用して達成してもよい。例えば、最初にコンビナトリアルライブラリーの可能なメンバーずべてを、入手可能な試薬及び確立されている合成化学によって記録してもよい。次に個々のメンバーを別々にＭＡＳＰ−２のポリペプチドの結合部位にドッキングしてもよい。最後に最適なサブライブラリーを、ドッキング点数及び／又は相違量の順位に基づいて合成のために選択してもよい。高速のライブラリー計測のためのソフトウェア、例えばSybylのCombiLibMaker, Cerius2のAnalog Builder及びMOE (MOE Software, Chemical Computing Group, 1010 Sherbrooke Street W., Suite 910, Montreal, Canada H3A 2R7で購入できるQuaSAR-CombiGenモジュール）を含むソフトウェアが開発されている。これらのプログラムは殆どが断片に基づく又は反応に基づく計画を使用して莫大な数の化合物を含むコンビナトリアルライブラリーの２Ｄ又は３Ｄ構造の全てを容易に作製できる。ソフトウェアパッケージ内の他のツールを、ドッキング前にバーチャルライブラリーのサイズを減らすために利用可能である。例えば、CombiLibMakerで登録したライブラリーを次に様々な溶液（Sybylから購入可能）で分析して化学的空間を適当に抽出するサブライブラリーを提供できる。QuaSAR-CombiDesignは、コンビナトリアルライブラリー作製のための非列挙的方法を提供するMOEから入手可能なもう一つのコンビナトリアルライブラリー設計ツールであって、例えばユーザが規定する範囲の特性を持つより小さいサブライブラリーを作製するライブラリーを作製する間の統計的試料抽出技術を用いる５フィルターの基準に対して試験できる。原則として、ライブラリー作製に続くドッキング段階はDOCK又はFlexX（商標）のような入手可能なドッキングプログラムのいずれかを使用して行うことができ、一方、例えば多様性の選択は、Daylight, Tripos（diverse solution）、又はBCIから入手可能なソフトウェアを用いて、又は、例えばDiller及びMerzが記載した高能率ドッキングによって行ってもよい。
【０１４２】
他の例では「分割統治」手法を使用してもよい。この方式ではコンビナトリアルライブラリーにある全生成物の構造を共通の鋳型上の一重又は多重の部位を通して結合する様々な置換基を有するものとして観察する。この鋳型を第一に結合部位にドッキングし、その後の検討には最高点のポーズのみ保存する。次に別個な置換基を独立にその鋳型の各ポーズに結合させて、どの置換基が結合部位に良く適合できるかを評価する。最高点の置換基の組合せのみをさらに検討し、採点して、結合部位によくドッキングできる生成物の全構造を確認する。これは例えばPRO SELECT、CombiBUILD、CombiDOCK、DREAM ＋＋及びFlexX（商標）のような適当なソフトウェアを用いて行ってもよい。
【０１４３】
一態様では、本発明方法は活性部位マップを用いて得られる薬理作用構造（pharmacophore）の利用を含む。ここに用語「活性部位」は、化合物と相互作用するが触媒活性部位ではない部位を意味する。この方法は例えば多重な、有望な、構造的に多様な試験化合物の作製を含むコンピュータ手法であってもよい。多重構造シリーズの検索は蛋白質の構造情報をコンビナトリアルライブラリー設計と合わせることによって何らかの適当な方法を使用して達成してもよい。例えば「受容体の設計」法（Murrary et al., 1999）又は本明細書に下記する方法を使用してもよい。多重な蛋白質配座を解明する方法は、例えばMason et al., 2000が記載した分子動力学的シミュレーションからの動的な薬効構造モデル（例えばCarlson et al., 2000に記載）の作製を含むものを使用してもよい。また、分子断片を持つ活性部位をマッピングするために例えばBoehm et al., 2000に記載されている実験的及びコンピュータ・ニードル・スクリーニング手法を使用してもよい。部位の各点をマッピングする何らかの適するソフトウェアツール（例えばGRID及びSITEPOINT）を本発明で使用してもよい。また、部位マップを作製するMCSS技術を使用してもよい。
【０１４４】
適当な方法は、例えば蛋白質構造からの活性部位マップ作製を含んでいてもよい。それ故、可能な２−、３−及び４−点薬効構造を全てサイトマップから列挙し、ビット列（シグネチャ）としてコードすることができる。これらの薬効構造は、有益な情報を提供するライブラリー設計ツールを用いて選択される化合物が探り当てる空間を規定する。この手法の成功を評価するために使用される基準は、第二の手法としての活性化合物の数を有するライブラリー設計にて選択される活性骨格の数である。サイトマップ作製に適するアルゴリズム、例えば各活性部位について特徴位置１０〜８０個の間を作製するアルゴリズムを使用してもよい。そのような方法の例は例えばEksterowicz et al J Mol Graph Model. 2002 Jun; 20(6): 469-77に記載されている。
【０１４５】
Ｉｇ１−２−３モジュールの様々な結合部位の情報は本発明の結晶構造と共に、実測されたＩｇ１−Ｉｇ２、Ｉｇ１−Ｉｇ３及びＩｇ２−Ｉｇ３接点（contact）の生物学的意義を試験するツールを提供し、またＮＣＡＭのＩｇ１−Ｉｇ２、Ｉｇ１−Ｉｇ３、Ｉｇ３−Ｉｇ１、Ｉｇ２−Ｉｇ３、及びＩｇ２−Ｉｇ２の各モジュールの結合を模倣できる化合物をスクリーニングするためのツールを提供する。
【０１４６】
溶液中でのＩｇ１−２−３モジュールの構造
これとは別に、化合物のインシリコスクリーニングのために、可溶性Ｉｇ１−２−３モジュールの３Ｄ構造を決定し、モジュールを含む結合部位と相互作用する能力を評価するために使用してもよい。溶液中の蛋白質の構造を解明するために、最終的にはＮＭＲスペクトル術を使用してもよい。
【０１４７】
化合物のスクリーニング
ＮＣＡＭ提示細胞の接着、分化及び／又は生存を調整できる新しい化合物の同定は、一局面では例えば結晶性又は可溶性蛋白質としてＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの三次元構造のようなコンピュータモデル鋳型をスクリーニングすることによって行ってもよい。従って、本発明はまたＮＣＡＭ提示細胞の細胞分化及び／又は生存を調整できる化合物を選択するためのスクリーニング方法の提供に関し、その方法は、
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールを含むポリペプチドを提供する段階； 
ｉｉ）（ｉ）のポリペプチドを含む結晶蛋白質を調製する段階； 
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの構造モデルを（ｉｉ）の結晶蛋白質として作製する段階； 
ｉｖ）化合物を段階ｉ）で作製した該モデルの構造へ設計する段階； 
ｖ）（ｉｉｉ）の構造モデルに従って同種親和性結合部位と相互作用できる化合物を選択する段階： 
ｖｉ）段階（ｖｉ）の化合物をインビトロ又はインビボ検定でその化合物が神経細胞の分化、接着及び／又は生存を調整できるかどうかを試験する段階；
の各段階を含む方法である。
【０１４８】
前記スクリーニング方法はある態様では、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール又は該モジュールの断片、例えば溶液中のＩｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、又はＩｇ１−２又はＩｇ２−３の各モジュールのコンピュータで作製したモデルの使用を含む。そのようなモデルを、例えば、前記モジュールのサンプルの核磁気共鳴スペクトル術から得られたデータに基づいて作製してもよい。しかしながら、コンピュータ作製モデルは前記モジュールの結晶の構造モデルであるのが好ましい。
【０１４９】
本発明は、ＮＣＡＭの同種親和性結合依存性細胞の接着、生存及び分化を調整できる化合物をスクリーニングするためにＩｇ１−２−３モジュールのコンピュータ作製構造モデルを提供する。
【０１５０】
相互作用する化合物の設計
サイトマップの作製
活性部位に相補性の特徴点（feature point）は内部で開発したソフトウェアツールを用いて算出する。例えば、水素結合供与体の特徴点を、蛋白質活性部位内の水素結合受容体の近くにマッピングする。３Ｄ座標及びラベル（受容体、供与体、負電荷、正電荷、疎水基及び芳香族基）の集合をサイトマップと呼ぶ。技術的には、サイトマップはコンピュータで別々に作製した３個のマップ：静電的特徴点（Ｐ、Ｎ及びＨ）を含むESMap、水素結合特徴点（Ｄ及びＡ）を持つHBMap、及び芳香族特徴点（Ａｒ）を含むAroMapの結合である。
【０１５１】
静電的特徴マップESMapは、最初にプログラムPASSに採用されている球状配置アルゴリズムを用いて計算される(Brady et al., 2000)。これは蛋白質表面に沿って埋まった容積の領域に一様に分布した点のセット（ProbeMap）を作製する。ProbeMap内の点のサブセットは、蛋白質の局部的静電的特性に依存してＰ、Ｎ及びＨ特徴点を含む。CVFF分子力学の力場を使用して、ProbeMapの各点ｉにおける静電的電位φｉを、ProbeMapの全点にわたって平均した平均電位φ及び平均の大きさ｜φ｜と共に算出する。φｉの値は次の定義：
ｉ＞φ＋１．５＊σ（φ）、ｉ＝N特徴点；
ｉ＞φ−１．５＊σ（φ）、ｉ＝P特徴点；
｜φ｜−１．０＊σ（｜φ｜）＜｜φｉ｜＜（｜φ｜）＋１．０＊σ（｜φ｜）、ｉ＝H特徴点；
に従って点ｉがP、N又はHの特徴点として含んでいるかどうかを決定する。
【０１５２】
ここに、σ（X）は量Ｘの平均の標準偏差を示す。これはその活性部位の全静電的環境に関してその点の配置を標準化する。これは歪んだ特徴点の配置から非合理的に外れて、非荷電中性蛋白質構造（これは結晶構造には現れていないか又は存在する対イオンに基づくかもしれない）を与える。
水素結合特徴マップHBMapは蛋白質の既知水素結合原子から外側に相補的な点を投影して決定される。得られる点のスーパーセットを立体的な衝突、不十分な埋没及び同様な特徴点の最小近接に基づいてフィルタリングする。理想的水素結合ポイントを、ＰＤＢに実測される平均角度及び距離に基づいて配置する（例えば図１に示す表２参照）。蛋白質と衝突する点は除去する。しかしながら、ロバスト性に関して、小さな位置摂動を適用して、潜在的に重要な水素結合位置を保持する。分岐した水素結合の接続部は、中程度の又は強い水素結合に参画すると考えられる蛋白質原子の間に同等に分岐した点の完全な場（ring）を検討することによって発見的方法で計算する。
そのような場にある各点は、立体的衝突、埋没及び相互近接条件に反していなければ分岐したＨＢ点として保持する。最終HBMapを構築するために、残った理想的及び分岐したＨＢ点のセットを結合し、相互の近接性に基づいてフィルタリングする。
【０１５３】
芳香性特徴点のAroMapセットはベンゼン環を蛋白質の活性部位に反復してドッキングし、最高点の配置の重心を得ることによって計算する。この蛋白質は極性水素CVFF力場を用いて表示する。このドッキングは局所的最適モードで内部コードを用いて行う。出発位置の異なる別個な百個の部分的ドッキングの試行を行う。最低エネルギー配置が５ｋｃａｌ／ｍｏｌのエネルギーウィンドウ内にあるスコアがドッキングした配置はいずれもAroMapに含める。再び各点を埋没及び相互の近接性に基づいてフィルタリングする。
【０１５４】
薬効構造のシグネチャへの変換
薬効構造を、特徴点の二点、三点及び四点サブセット全ての網羅的列挙によって活性部位内の特徴点に基づいて作製する。全特徴点対について、その３Ｄ空間における距離を予測計算する。別個な薬効構造の表示に達するために、その距離を、ユーザ規定ビンニング形式を適用して保存する。キラル性は四点薬効構造の旋光性をコードすることによって示す。各薬効構造は、４個までの特徴点及び距離の可能な組合せのいずれかが示されるように独特のアドレスにマッピングする。アドレスは、シグネチャと呼ぶ薬効構造の２進法表示で示す。このシグネチャの長さは四点薬効構造をコードするために最大で可能なアドレスである。シグネチャ内のビットは全て、最初は０に設定する。薬効構造を示すためにシグネチャ内の各アドレスのビットを起動する（１に設定する）。活性部位表示のために、全薬効構造を徹底的に列挙して各ビットを起動する。
【０１５５】
多重構造のためのシグネチャの集合
複数のシグネチャを合わせてもよい。多重シグネチャの二元的集合は何らかの構造内に存在する全薬効構造を示す一重ビット列を与える。コンセンサス閾値ｃはいずれも多数の活性部位のコンセンサス表示を定義するために使用できる。すなわち、薬効構造は、活性部位配座の少なくともｃには存在する。多重活性部位スナップショットのこの取扱法は全く便宜的であることに注意されたい。
【０１５６】
分子シグネチャ
試験化合物は次のようにコードされる。最初に、配座異性体を、分子の完全な配座モデルを作製する内部ツールを用いて各化合物について作製する。特徴点はサブストラクチャーに基づくルールのセットを用いて配置される。各活性部位についてと同じプロトコルに従って、三次元特徴位置から薬効構造を列挙して、二元的コード法の適合性を確保する。しかしながら、多重の配座異性体はここに同時に示す必要がある。これは１個の配座異性体に対する薬効構造の完全な列挙をある化合物の全配座異性体にわたって別のループにラッピングすることによって行われる。すなわち、ある化合物のどの配座異性体上の薬効構造もシグネチャにある各ビットを回転することによって示される。
【０１５７】
分子シグネチャのマスキング
活性部位の二進法表示及びそれと同様に定義付けた分子の二進法表示を用いれば、あるアドレスにおけるビットの意味は同じになる（同じ薬効構造、距離ビンニングの公差内）。
【０１５８】
それ故、設計空間を表すと活性部位のシグネチャによって分子の全シグネチャがマスクされる。シグネチャをマスクすることは、その論理及び部位シグネチャ及び分子シグネチャのビットを取ることを意味する。所与の分子について、活性部位にない薬効構造を示すビットは消され、一方では活性部位にある薬効構造ビットを、分子内にあるかどうかに依存して開くか止めるかのいずれかにすることができる。この方法は活性部位によって定義される薬効構造空間のみを考慮に入れる。
【０１５９】
情報ライブラリーの設計
情報ライブラリーの設計は所与の仮想ライブラリーへの情報回帰を最適化する分子選択方針である。その目標は特定の試験化合物に対する活性を決定する特徴点（薬効構造）のセットを検出することにある。この情報設計は、得られるサブセットが試験化合物を異なってはいるが重複する方法で応答するように化合物のセットを選択することを目標とする。設計空間内にある各薬効構造がそのセットの分子内で独特の存在パターンを持つように、合成及びスクリーニングのために分子を選択する。この独特の「コード」が化合物のセットを検定する時に、実際の実験結果に係わりなく重要な薬効構造の確認と保持を可能にする。これは各分子内での薬効構造の特殊な存在パターンを作製しようとする様々な方法とは対照的である。
設計空間が与えられると、アルゴリズムは薬効構造クラスの各サイズにわたって最もスムーズな分布を持つ、できるだけ多数の薬効構造の解読を最適化するものを求める。薬効構造のクラスは全てが同じコード又はパターンを持つ薬効構造のサブセットを示す。最適な解は、各個別の薬効構造の解読を可能にする化合物セットであることに留意する。しかしながら、これはソースプール、ビット相関又は限定された選択サイズのいずれかのために可能ではなかろう。分子選択の意味で無理のない最適化のためのコスト係数はクラス分布のエントロピーであって、このエントロピーは次式：
【数１】
2008501620.tif 000002
［式中、Ｈは特徴クラスのエントロピーである；Cは別個なクラスの数である；ｆは設計空間にある特徴点の数である；|Ｃ|はクラスｉのサイズである］
で示される。最適化の過程で、例えばＨが最大になるように、分子を選択する。
【０１６０】
試験
前記インシリコにおけるスクリーニングで選択した化合物は、さらにＮＣＡＭ提示細胞の細胞接着、分化及び／又は生存を調整する能力を持つかどうか試験する。
【０１６１】
ＮＣＡＭ提示細胞の接着、分化及び／又は生存を調整する化合物の能力を試験するための生物検定は、当技術分野ではよく知られている。殊にWO03020749、WO0247719、WO03016351及び本出願に記載した検定を使用できる。
【０１６２】
確認された化合物（ｖｉ）の試験は、いくつかの態様によっては追加的に又は代替的に前記の試験方法を用いて行ってもよい。
【０１６３】
化合物
本発明の化合物は、好ましくは前記スクリーニング法のいずれかによって選択される。本発明によれば、選択した化合物が候補化合物である。
【０１６４】
用語「候補化合物」は、
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここにこの該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここにこの該モジュールは２つの個別なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する能力（ここにこの該モジュールは２つの個別なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここにこの該モジュールは２つの個別なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここにこの該モジュールは２つの個別なＮＣＡＭ分子からのものである）；
を有する化合物を意味する。
少なくとも一つの前記相互作用が可能な候補化合物は、本発明によれば本明細書に記載する同種親和性結合部位を経てＮＣＡＭの同種親和性結合が介在する細胞分化、接着及び生存を調整することもできる。
【０１６５】
態様の一つでは、候補化合物はＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとの相互作用が可能であり、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する。ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものであり、それによって本発明の同種親和性結合部位を経てＮＣＡＭ同種親和性結合が介在する細胞分化、接着及び生存を調整する。
【０１６６】
他の好ましい態様の一つでは、候補化合物はＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとの相互作用が可能であり、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する。ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものであり、それによって本発明の同種親和性結合部位を経てＮＣＡＭ同種親和性結合が介在する細胞分化、接着及び生存を調整する。
【０１６７】
ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとの相互作用が可能であり、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する候補化合物であって、ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものであり、それによって本発明の同種親和性結合部位を経てＮＣＡＭ同種親和性結合が介在する細胞分化、接着及び生存を調整するものである候補化合物は、本発明の好適な態様の一つである。
【０１６８】
なお別な好適な態様では、候補化合物はＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとの相互作用が可能であり、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整し、ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものであり、それによって本発明の同種親和性結合部位を経てＮＣＡＭ同種親和性結合が介在する細胞分化、接着及び生存を調整する。
【０１６９】
さらに別な好適な態様では候補化合物はＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとの相互作用が可能であり、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する。ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものであり、それによって本発明の同種親和性結合部位を経てＮＣＡＭ同種親和性結合が介在する細胞分化、接着及び生存を調整する。
【０１７０】
本発明の他の好適な態様は、
ｉ）同一なＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとのアミノ酸残基との同時的相互作用が可能であり、それによって該モジュールを経て相互作用する２つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ１−Ｉｇ３モジュールとＩｇ３−Ｉｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する候補化合物：
ｉｉ）同一なＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールとＩｇ２モジュールとのアミノ酸残基との同時的相互作用が可能であり、それによって該モジュールを経て相互作用する２つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ１−Ｉｇ３モジュールとＩｇ２−Ｉｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する候補化合物；
ｉｉｉ）同一なＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとのアミノ酸残基との同時的相互作用が可能であり、それによって該モジュールを経て相互作用する２つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ１−Ｉｇ３モジュールとＩｇ３−Ｉｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する候補化合物；
ｉｖ）同一なＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールとＩｇ２モジュールとのアミノ酸残基との同時的相互作用が可能であり、それによって該モジュールを経て相互作用する２つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ１−Ｉｇ３モジュールとＩｇ２−Ｉｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する候補化合物；
ｖ）同一なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとのアミノ酸残基との同時的相互作用が可能であり、それによって該モジュールを経て相互作用する２つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２−Ｉｇ３モジュールとＩｇ３−Ｉｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する候補化合物；
ｖｉ）同一なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとのアミノ酸残基との同時的相互作用が可能であり、それによって該モジュールを経て相互作用する２つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２−Ｉｇ２モジュールとＩｇ３−Ｉｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する候補化合物；
ｖｉｉ）同一なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとのアミノ酸残基との同時的相互作用が可能であり、それによって該モジュールを経て相互作用する２つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２−Ｉｇ３モジュールとＩｇ３−Ｉｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する候補化合物；
ｖｉｉｉ）同一なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとのアミノ酸残基との同時的相互作用が可能であり、それによって該モジュールを経て相互作用する２つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２−Ｉｇ３モジュールとＩｇ３−Ｉｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する候補化合物
に関する。
【０１７１】
候補化合物は、前記相互作用が可能な化合物のいずれであってもよい。例えば、そのような化合物はペプチド、脂質、炭水化物又はその他の有機分子又はアミノ酸と他の有機化合物との共重合体のコンビナトリアルライブラリーを含む群から選択してもよい。好適な態様では本発明の候補化合物はペプチドである。あるいは、この化合物は結合部位に内在又は近接するエピトープに選択的に結合できる抗体分子であってもよい。この近接は本明細書ではエピトープのアミノ酸残基と結合部位のアミノ酸残基との間の距離が約５０〜５００Åであると定義する。遠距離のエピトープ（結合部位のアミノ酸残基から５００Å又はそれ以上の距離）に結合し、その結合がＩｇ１−２−３モジュールの立体配座に変化を起し、それにより結合部位を経て同種親和性結合に影響を与える抗体分子も関係する。
【０１７２】
好適な候補化合物は本明細書に記載する結合部位に由来するアミノ酸配列を含む化合物である。「由来する」は、アミノ酸配列が、例えばＩｇ１−２−３ＮＣＡＭモジュールのアミノ配列igの断片を含むことを意味するが、この断片は結合部位又は結合部位の部分を含むか、又はアミノ酸配列は、結合部位を経て２つの別個なＮＣＡＭ分子の間の相互作用に関与する残基に相同的なアミノ酸残基の配列を含む。アミノ酸残基の相同性は約６０%、さらに好適なものは約７０%、さらになお好適なものは約８０%、例えば９０%、及び最も好適なものは約１００%であってもよい。アミノ酸残基１つの、他のものに対する相同性については前記した。
【０１７３】
そこで、好適な候補化合物はＮＣＡＭのＩｇ１モジュール及び／又はＩｇ２モジュール及び／又はＩｇ３モジュールに由来する配列を含んでいてもよい。その化合物の非限定的な例は本明細書に配列番号１〜２０、４０〜４３と記載する化合物であってもよい。
【０１７４】
そこで、本発明は態様の一つでは、配列番号１に示すアミノ酸配列ＷＦＳＰＮＧＥＫＬＳＰＮＱの化合物を提供する。
【０１７５】
別な態様では、本発明の化合物は配列番号２に示すアミノ酸配列ＹＫＣＶＶＴＡＥＤＧＴＱＳＥを有する。
【０１７６】
なお別な態様では、本発明は配列番号３に示すアミノ酸配列ＴＬＶＡＤＡＤＧＦＰＥＰを有する化合物を提供する。
【０１７７】
さらに別の態様では、本発明は配列番号４に示すアミノ酸配列ＱＩＲＧＩＫＫＴＤを有する化合物を提供する。
【０１７８】
なおさらに別の態様では、本発明は配列番号５に示すアミノ酸配列ＤＶＲを有する化合物を提供する。
【０１７９】
なお別な態様では、本発明の化合物は配列番号６に示すアミノ酸配列ＲＧＩＫＫＴＤを有する。
【０１８０】
なおさらに別な態様では、本発明は配列番号７に示すアミノ酸配列ＤＶＲＲＧＩＫＫＴＤを有する化合物を提供する。
【０１８１】
他の態様では、本発明は配列番号８に示すアミノ酸配列ＫＥＧＥＤを有する化合物に関する。
【０１８２】
なお別な局面では、化合物は配列番号９に示すアミノ酸配列ＩＲＧＩＫＫＴＤを有する。
【０１８３】
本発明はさらに配列番号１０で示されるアミノ酸配列ＫＥＧＥＤＧＩＲＧＩＫＫＴＤを有する化合物を提供する。
【０１８４】
さらにその上、別な態様では、本発明は配列番号１１に示されるアミノ酸配列ＤＫＮＤＥを有する化合物を提供する。
【０１８５】
さらに別な態様では、本発明は配列番号１２に示すアミノ酸配列ＴＶＱＡＲＮＳＩＶＮＡＴを有する化合物に関する。
【０１８６】
なお別な本発明の態様では、本化合物は配列番号１３に示すアミノ酸配列ＳＩＨＬＫＶＦＡＫを有する。
【０１８７】
なお別な態様では、本化合物は配列番号１４に示すアミノ酸配列ＬＳＮＮＹＬＱＩＲを有する。
【０１８８】
別な態様では、本発明は配列番号１５で示されるアミノ酸配列ＲＦＩＶＬＳＮＮＹＬＱＩを有する化合物を提供する。
【０１８９】
さらに別な態様では、本発明は配列番号１６に示すアミノ酸配列ＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹＬＱＩを有する化合物を提供する。
【０１９０】
その上、なお別な態様では、本発明は配列番号１７に示すアミノ酸配列ＱＥＦＫＥＧＥＤＡＶＩＶを有する化合物を提供する。
【０１９１】
本発明は更に配列番号１８で示すアミノ酸配列ＫＥＧＥＤＡＶＩＶＣＤを有する化合物を提供する。
【０１９２】
別な態様では、本発明は次のアミノ酸配列を有する化合物に関する：
ＧＥＩＳＶＧＥＳＫＦＦＬ（配列番号１９）；
ＫＨＩＦＳＤＤＳＳＥＬＴＩＲＮＶＤＫＮＤＥ（配列番号２０）；
ＡＦＳＰＮＧＥＫＬＳＰＮＱ（配列番号４０）；
ＡＫＳＶＶＴＡＥＤＧＴＱＳＥ（配列番号４１）；
ＤＶＲＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４２）；又は
ＱＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４３）。
【０１９３】
前記配列はまた本発明の好ましい候補化合物に関する。これらの配列の断片又は変異体はまた、元の配列の相互作用及び／又は効果を発揮できる候補化合物として、すなわち、元の配列に由来する配列又は元の配列と相同性の配列として、本発明の範囲内に含まれる。
【０１９４】
本発明による前記配列はＩｇ１−２−３モジュール内にあるＮＣＡＭの同種親和性結合部位の様々な断片を示し、ＮＣＡＭ提示細胞の分化及び／又は生存を調整できる。
【０１９５】
本発明によれば前記配列を、ＮＣＡＭ同種親和性相互作用の調整が改善又は救命をもたらす病状又は疾患を処置する薬剤の製造のために使用してもよい。
【０１９６】
これに加えて、前記配列を本発明の結合部位を認識し、特異的に結合できる抗体を製造するために使用してもよい。本発明によるそのような抗体は前記化合物の生物活性の少なくとも１つが可能であり、ある態様において本発明の化合物として有利に医学的適用に用いられ得るであろう。
【０１９７】
ペプチド配列の製造
本発明のペプチド化合物は、通常の合成法；組換えＤＮＡ技術；例えば様々な種に起源を持つＮＣＡＭ分子に由来するペプチド配列を持つ全長蛋白質の酵素的切断；又はこれらの方法の組合せ；のいずれかによって製造され得る。
【０１９８】
組換え製造
組換え製造は、例えばＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール、又は別個なモジュール、例えばＩｇ１、Ｉｇ２又はＩｇ３、又はその組合せ、例えばＩｇ１−２、Ｉｇ１−３又はＩｇ２−３など長鎖ポリペプチド配列の製造には好適な方法である。しかしながら、本発明の結合部位に由来する配列を含む１５〜５０アミノ酸長の短いペプチド断片も後記技術のいずれかを使用して組み換え的に製造してもよい。
【０１９９】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列又は対応する全長蛋白質、それを起源とするペプチド、又はその断片は、確立されている標準的合成法、例えばBeaucage and Caruthers, 1981, Tetrahedron Lett. 22:1859-1869に記載のホスホアミジン法又はMatthes et al., 1984, EMBO J. 3:801-805に記載の方法などによって合成的に製造され得る。ホスホアミジン法によれば、オリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成装置中で合成し、精製し、アニーリングし、適当なベクターに結合し、クローニングして合成する。
【０２００】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、対応する全長蛋白質、例えばＮＣＡＭ蛋白質をコードするＤＮＡ配列のＤＮＡアーゼＩを標準的プロトコルに従って使用する断片化によっても製造され得る（Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory manual. 2 rd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）。これとは別に全長蛋白質をコードするＤＮＡを、特異的な制限エンドヌクレアーゼを用いて断片化してもよい。ＤＮＡの断片を、さらにSambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory manual. 2 rd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載の標準的手法を用いてさらに精製する。
【０２０１】
全長蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、例えばゲノム又はｃＤＮＡのライブラリーを作製し、全長蛋白質の全部又は一部をコードするＤＮＡ配列について標準的技術に従って合成ヌクレオチドプローブを使用するハイブリッド形成によってスクリーニングして得られる、ゲノム又はｃＤＮＡ起源のものであってもよい（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989参照）。ＤＮＡ配列は、例えばUS 4,683,202又はSaiki et al., 1988, Science 239:487-491に記載の特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によっても製造され得る。
【０２０２】
ＤＮＡ配列を次に、便利に組み換えＤＮＡ操作に付すことができるいかなるベクターであってもよい組み換え発現ベクターに挿入する。ベクターの選択はそれを導入すべき宿主細胞に依存することが多い。そこで、ベクターは自働的に複製するベクター、すなわち染色体外物質として存在し、その複製が染色体複製とは独立なベクター、例えばプラスミドなどであってもよい。あるいは、そのベクターは宿主細胞に導入された時に宿主のゲノムに組込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。
【０２０３】
このベクターでは、ペプチド又は全長蛋白質をコードするＤＮＡ配列は、作動可能に適当なプロモータ配列に連結させる。このプロモータは、選択した宿主細胞内で転写活性を示すいかなるＤＮＡ配列であってもよく、宿主細胞にとって内在性又は外来性のいずれかである蛋白質をコードする遺伝子に由来するものであってもよい。哺乳類細胞内でコーディングＤＮＡ配列の転写を指向する適当なプロモータの例は、ＳＶ４０プロモータ（Subramani et al., 1981, Mol. Cell Biol. 1:854-864）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモータ（Palmiter et al., 1983, Science 222: 809-814）又はアデノウィルス２主要後期プロモータである。昆虫細胞で使用するために適当なプロモータはポリヘドリンプロモータ（Vasuvedan et al., 1992, FEBS Lett. 311:7-11）である。酵母宿主細胞内での使用に適するプロモータは酵母解糖遺伝子（Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:12073-12080; Alber and Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 419-434）又はアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Young et al., 1982, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al, eds., Plenum Press, New York）、又はＴＰＩ１（US 4599311）又はＡＤＨ２−４ｃ（Russell et al., 1983, Nature 304: 652-654）のプロモータを含む。糸状菌宿主細胞で使用する適当なプロモータは、例えばＡＤＨ３プロモータ（McKnight et al., 1985, EMBO J. 4:2093-2099）又はｔｐｉＡプロモータである。
【０２０４】
このコーディングＤＮＡ配列は適当なターミネータ、例えばヒト成長ホルモンターミネータ（Palmiter et al., op. cit.）又は（カビ宿主用）ＴＰＩ１（Alber and Kawasaki, op. cit.）又はＡＤＨ３（McKnight et al., op. cit.）のようなプロモータと作動可能に連結していてもよい。このベクターはさらに、例えばポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０又はアデノウィルス５のＥｌｂ領域から）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）及び翻訳エンハンサ配列（例えばアデノウィルスＶＡのＲＮＡをコードするもの）などのエレメントを含んでいてもよい。
【０２０５】
組み換え発現ベクターはさらに問題の宿主細胞でのベクター複製を可能にするＤＮＡ配列を含んでいてもよい。（宿主細胞が哺乳類細胞である時）そのような配列の例はＳＶ４０起源の複製である。ベクターは選択マーカー、例えば宿主細胞における欠陥を補充する産物を作る遺伝子、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子又は、例えばネオマイシン、ヒドロマイシン又はメトトレキセートなどの薬剤に対する耐性を与えるものなどを含んでいてもよい。
【０２０６】
ペプチド又は全長蛋白質をコードするＤＮＡ配列、プロモータ及びターミネータそれぞれを連結するために用いる操作、及び複製に必要な情報を含む適当なベクターに挿入する操作は当業者に良く知られている（例えばSambrook et al., op.cit.を参照）。
【０２０７】
本発明の組み換えペプチドを得るために、コーディングＤＮＡ配列を第二のペプチドをコードする配列及びプロテアーゼ切断部位をコードする配列と融合して、融合蛋白質をコードするＤＮＡ構築物を得ることができ、ここにプロテアーゼ切断部位をコードする配列はＨＢＰ断片と第二のペプチドをコードするＤＮＡとの間に置き、組み換え発現ベクターに挿入し、組み換え宿主細胞内に発現させる。一態様では、該第二ペプチドはこれに限定するものではないが、グルタチオン−Ｓ−還元酵素、子牛チモシン、細菌チオレドキシン又はヒトユビキチンの天然又は合成変異体又はそのペプチドを含む群から選択する。別な態様では、プロテアーゼ切断部位を含むペプチド配列は、アミノ酸配列IEGRを有するＸａ因子、アミノ酸配列DDDDKを有するエンテロキナーゼ、アミノ酸配列LVPR/GSを有するトロンビン、又はアミノ酸配列XKXを有するアクロモバクター・リチクス（Acharombacter lyticus）切断部位であってもよい。
【０２０８】
発現ベクターが導入される宿主細胞はペプチド又は全長蛋白質を発現できるいかなる細胞であってもよく、好ましくは例えば無脊椎動物（昆虫）細胞又は脊椎動物細胞、例えばアフリカツメガエル（Xenopus laevis）の卵母細胞又は哺乳類細胞のような真核細胞、殊に昆虫及び哺乳類の細胞である。適当な哺乳類細胞系列の例はＨＥＫ２９３（ATCC CRL-1573）、ＣＯＳ（ATCC CRL-1650）、ＢＨＫ（ATCC CRL-1632, ATCC CCL-10）又はＣＨＯ（ATCC CCL-61）細胞系列である。哺乳類細胞にトランスフェクションする方法及びその細胞内に導入したＤＮＡ配列を発現する方法は、例えばKaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, pp. 601-621; Southern and Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327-341; Loyter et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 422-426; Wigler et al., 1978, Cell 14:725; Corsaro and Pearson, 1981, in Somatic Cell Genetics 7, p. 603; Graham and van der Eb, 1973, Virol. 52:456;及びNeumann et al., 1982, EMBO J. 1:841-845に記載されている。
【０２０９】
あるいは、真菌細胞（酵母細胞を含む）を宿主細胞に用いてもよい。適当な酵母細胞の例はサッカロミセス属又はシゾサッカロミセス属の細胞、殊に出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）の株を含む。真菌細胞の他の例は糸状菌、例えばアスペルギルス属又はノイロスポラ属の細胞、殊にAspergillus oryzae又はAspergillus nigerの株の細胞である。蛋白質発現のためのアスペルギルス属の使用は、例えばEP 238 023に記載されている。
【０２１０】
細胞培養に用いる培地は哺乳類細胞の増殖に適する通常の培地、例えば適当な添加剤を含む血清含有培地又は血清不含有培地、又は昆虫、酵母又は真菌細胞を培養するために適当な培地のいずれであってもよい。適当な培地は製造業者から購入可能であり、又は公表されている手法に従って製造してもよい（例えばthe American Type Culture Collectionのカタログ）。
【０２１１】
細胞によって組み換え製造したペプチド又は全長蛋白質を、次に遠心分離又は濾過による培地からの宿主細胞の分離；塩、例えば硫酸アンモニウムによる上清液または濾液からの蛋白質成分の沈殿；様々なクロマトグラフ操作、例えばＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、その他による精製；を含む通常の操作によって培養培地から回収してもよい。
【０２１２】
合成製造法
合成製造法は、３〜５０アミノ酸の短い配列を扱う時に好適である。
【０２１３】
ペプチドの合成製造法は当技術分野で良く知られている。合成ペプチド製造のための詳細な記載並びに実際的アドバイスはSynthetic Peptides: A User's Guide (Advances in Molecular Biology), Grant G. A. ed., Oxford University Press, 2002；又はPharmaceutical Formulation: Development of Peptides and Proteins, Frokjaer and Hovgaard eds., Taylor and Francis, 1999にも記載がある。
ペプチドは例えばＦｍｏｃ化学及びＡｃｍ−保護システインを用いることによって合成してもよい。逆相ＨＰＬＣで精製後、ペプチドはさらに処理して例えば環状又はＣ末端修飾あるいはＮ末端修飾イソ型を得てもよい。環化及び末端修飾の方法は当技術分野で良く知られており、前記マニュアルに詳記されている。
【０２１４】
好適な態様では、本発明のペプチド配列は合成的、特に配列を援用したペプチド合成（ＳＡＰＳ）法によって製造される。ペプチドは濾過用にポリプロピレンフィルターを装着したポリエチレン容器中でバッチ方式によって、又はポリアミド固相法の連続流通方式（Dryland, A. and Sheppard, R.C., (1986) J.Chem. Soc. Perkin Trans. I, 125 - 137）のいずれかによって合成してもよい。完全自動化ペプチド合成機（Cameron ET al., (1987), J. Chem. Soc. Chem.Commun, 270-272）では９−フルオレニル−メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）又は３級ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）をＮ−α−アミノ保護基として用い、及び側鎖官能基に対して適当な共通保護基を使用する。
【０２１５】
医薬組成物
一旦本発明の候補化合物が同定されると、１種又はそれ以上の化合物を含む医薬組成物を提供することは、さらに本発明の範囲内である。本明細書では用語「医薬組成物」は、用語「薬剤」と同義語的に使用する。
【０２１６】
本発明はさらにＮＣＡＭ提示細胞の死を予防し；神経細胞の細胞分化及び神経可塑性を促進し、本明細書記載のようにインビボ又はインビトロで数種の組織及び器官中においてＮＣＡＭ提示細胞及び／又はＮＣＡＭリガンド提示細胞の生存及び再生を刺激することのできる医薬組成物に関し、該組成物は１種又はそれ以上の前記化合物の有効量を含有する。本発明の薬剤は１種又はそれ以上の前記化合物の有効量を医薬的に許容される添加剤と共に含んでいてもよい。そのような薬剤は経口投与、経皮投与、筋肉内投与、静脈内投与、頭蓋内投与、蜘蛛膜下投与、脳血管内投与、鼻内投与又は肺投与の目的で適宜製剤化してもよい。
【０２１７】
本発明はさらに、中枢末梢神経系及び末梢神経系の、筋肉の又は様々な器官の疾患及び病状を処置するための薬剤に関し、該薬剤は１種又はそれ以上の前記化合物又は前記組成物の有効量を、医薬的に許容される添加剤または単体と共に含む。そのような薬剤は経口投与、経皮投与、筋肉内投与、脈管内投与、頭蓋内投与、蜘蛛膜下投与、脳血管内投与、鼻内投与又は肺投与の目的で適宜製剤化してもよい。
【０２１８】
製剤
本発明化合物に基づく薬剤及び組成物の製剤開発方針は、一般に他のいずれかの蛋白含有薬品についての製剤化方針と符合する。この問題点及びこの問題の克服に必要な記載は数種の教科書、例えば「Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems」, Ed. A.K. Banga, Technomic Publishing AG, Basel, 1995が扱っている。
【０２１９】
注射剤は通常、溶液又は懸濁液のいずれかとして、又は注射前に溶液内又は懸濁液内の液剤とする固体として製造してもよい。製剤は乳化してもよい。活性成分は医薬的に許容され、活性成分に適合する賦形剤と混合することが多い。適当な賦形剤は、例えば水、塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなど、及びその組合せである。これに加えて、所望であれば、この製剤はその有効性又は輸送を強化する、例えば湿潤剤又は乳化剤、pH緩衝剤のような補助的物質を少量含んでいてもよい。
【０２２０】
本発明化合物の製剤は、当技術分野の当業者に知られた技術によって製造できる。この製剤は医薬的に許容される担体及び賦形剤、例えばマイクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子その他を含んでいてもよい。
【０２２１】
投与
殆どの処方では局所的な又は実質的に局所的な投与が好ましい。化合物は特に例えば人工神経ガイドのような人工器官と組合せて使用される。そこで、さらなる局面においては、本発明は人工神経ガイドに関し、それは１種又はそれ以上の前記化合物又は組成物を含むことを特徴とする。神経ガイドは当技術分野で公知である。
【０２２２】
この製剤は、要すれば活性成分がその効果を示すための部位への注射によって適宜に投与され得る。他の投与モードに適する別な製剤は、坐剤、鼻腔投与製剤、肺投与製剤及び、場合によっては、経口製剤を含む。坐剤には、常用の結合剤及び担体として、ポリアルキレングリコール又はトリグリセリドを含む。そのような坐剤は、０.５％〜１０％、好ましくは１〜２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成してもよい。経口剤は、通常用いられる賦形剤、例えば、医薬級のマンニトール、乳糖、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどを含む。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、錠剤、丸剤、カプセル剤、持続放出製剤又は粉末剤の剤形をとり、一般に活性成分１０〜９５％、好ましくは２５〜７０％を含む。
【０２２３】
別な製剤は鼻内投与又は経肺投与に適するようなもの、例えば吸入剤及びエアロゾル剤などである。
【０２２４】
活性化合物を、中性型又は塩型として製剤化してもよい。医薬的に許容される塩は酸付加塩（ペプチド化合物の遊離アミノ基と共に形成する）を含み、それは例えば塩酸又は燐酸のような無機酸と共に形成し、又は例えば酢酸、蓚酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸と共に形成する。遊離のカルボキシル基と共に形成する塩を、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム又は水酸化第二鉄のような無機塩基に由来してもよく、及び例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来してもよい。
【０２２５】
この製剤はその用量製剤に適合する方法で、治療的に有効な量で投与される。投与量は、例えば対象の体重及び年齢などを含む処置する対象、処置する疾患及び疾患の進行段階に依存して変化する。適当な用量範囲は投与当り活性成分数百μｇの桁であり、好適な範囲は約０．１μｇ〜１００ｍｇ、例えば約１μｇ〜１００ｍｇの範囲、及び特に約１０μｇ〜５０ｍｇの範囲内である。投与は１回で行ってもよく、又は後続の投与を伴ってもよい。用量は投与経路にも依存しようし、また処置する対象の年齢及び体重と共に変化するであろう。好適な用量は体重７０ｋｇ当り０．５ｍｇ〜５０ｍｇの間となろう。
【０２２６】
本発明のいくつかの候補化合物は十分に活性があるが、他のものでは、その製剤にさらに医薬的に許容される添加剤及び／又は担体を加えれば効果が強調されるであろう。そのような添加剤及び担体はその技術分野で公知であろう。場合によっては、標的への活性物質の放出を促進する化合物を含めることが有利となろう。
【０２２７】
その他の一態様では本発明の候補化合物を、相乗効果を得るための他種物質と共に投与することは有利であろう。そのような他種物質の例は、分化を誘導できる増殖因子又はホルモン又は幹細胞の移植を含む細胞の移植、又は遺伝子療法、又は免疫療法である。
【０２２８】
多くの場合、製剤を多回投与する必要があろう。投与は例えば心室内注入のような連続的注入、又は例えば１日に多回、１日１回、１週に多回、又は１週１回のような多回投与であってもよい。その個人が細胞死を起こすファクターを受ける前又は直後に薬剤の投与を開始するのが好ましい。好ましくは、例えばファクターの開始から５時間以内のようなファクターの開始から８時間以内に薬剤を投与する。多くの化合物は長期間効果を示し、その場合、化合物の投与を例えば１週間又は２週間のように長い間隔で投与してもよい。
【０２２９】
本発明の一態様では、本化合物が細胞生存に刺激効果を示すためには、本化合物の投与は、例えば急性発作のような、急性損傷直後であってもよく、又は発作後最高８時間以内であってもよい。さらに、増殖及び／又は分化に関する場合には、本発明による投与は時間依存性ではない、すなわち何時投与してもよい。
【０２３０】
薬剤の製造
別の局面では、本発明は、１種又はそれ以上の本発明の化合物又は本発明の医薬組成物の有効量を１種又はそれ以上の医薬的に許容される添加剤又は担体と混合することを含む医薬組成物を製造する方法、及び少なくとも１種の該化合物又は該医薬的組成物の有効量を対象に投与する方法に関する。
【０２３１】
さらに別な局面では、本発明は個々の本明細書に記載する化合物又はその化合物を含む医薬組成物を個体に投与することによって一種又はそれ以上の前記疾患に罹患した患者を処置する方法に関する。
【０２３２】
薬剤
本発明の候補化合物は、ＮＣＡＭ分子を提示する細胞を処理するために有利に使用できよう。ＮＣＡＭは生物の様々な細胞中で発現され、そこで細胞の型及び／又は細胞の環境に依存して接着分子、受容体及び／又はリガンドとして働く。本発明者らは本明細書に記載する結合部位の様々な部分に結合する候補化合物が、細胞の接着、分化及び／又は生存に様々な影響を与え、それ故この化合物について細胞の分化及び生存、例えば神経細胞の分化及び生存の直接的な刺激剤として、及び神経可塑性、例えばシナプス可塑性におけるＮＣＡＭ機能のモジュレータとしての使用が本明細書に示唆されるようにできることを発見した。そこで、本発明の候補化合物は、末梢及び／又は中枢神経系及び／又は筋肉及びＮＣＡＭを発現する他の組織の病的状態、例えば外傷及び／又は疾患、ならびにＮＣＡＭ機能の微細な調整、が有益であろうと思われる病状、例えば記憶及び学習の刺激のような様々な病理学的病状を処置するために使用する薬剤の製造に使用されるであろう。
【０２３３】
そこで、本発明の候補化合物は正常な、変性した又は損傷したＮＣＡＭ及び／又はＮＣＡＭリガンド提示細胞を処置するための薬剤の製造のためのものである。
【０２３４】
特に、本発明の化合物及び／又は医薬組成物は、次のような臨床的病状の処置に使用してもよい：例えば新生物例えば悪性新生物、良性新生物、上皮内癌及び性質不明な新生物、内分泌器官の疾患、例えば糖尿病、精神病、例えば老人性及び前老人性器質性精神症状、アルコール性精神病、薬剤精神病、一過性器質性精神病症状、アルツハイマー病、脳リポイド症、てんかん、一般不全麻痺［梅毒］、肝レンズ核変性症、ハンチントン舞踏病、ヤコブ−クロイツフェルト病、多発性硬化症、脳のピック病、梅毒、統合失調症性疾患、感情精神病、神経症疾患、人格異常、例えば性格神経症、器質性脳症候群に関連する非精神病性人格異常、妄想性人格異常、狂信型人格、偏執的人格（疾患）、偏執的習性、性的偏向及び疾患、精神発達遅滞、神経系及び感覚器官の疾患、認識異常、中枢神経系の炎症性疾患、例えば髄膜炎、脳炎、大脳変性、例えばアルツハイマー病、ピック病、老人性脳変性、交通性水頭、閉塞性水頭、パーキンソン病、その他の錐体外路系疾患及び異常運動障害、脊髄小脳疾患、小脳失調、マリー、サンガー−ブラウン、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、原発性小脳変性、例えば棘筋萎縮症、家族性、若年性、成人性棘筋萎縮症、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、進行性延髄麻痺、擬制延髄性麻痺、原発性側索硬化症、その他の前角細胞疾患、後角細胞疾患、非特定、他種脊髄疾患、脊髄空洞症及び延髄空洞症、血管脊髄障害、脊髄の急性梗塞（塞栓性）（非塞栓性）、脊髄の動脈血栓症、脊髄の浮腫、亜急性壊死脊髄障害、他種疾患に分類される脊髄の亜急性連合性変性、脊髄症、薬剤誘導、放射能誘導脊髄炎、自律神経系の疾患、末梢自律神経系の疾患、交感神経系の疾患、副交感神経系の疾患、又は自律神経系の疾患、家族性自律神経障害［ライリー−デイ症候群］、特発性末梢性自律性ニューロパチー、頚動脈洞性失神又は症候群、頚部交感神経ジストロフィー又は麻痺、他種に分類される疾患における末梢自律性ニューロパチー、アミロイドーシス、末梢神経系の疾患、腕神経叢病巣、頚肋症候群、肋骨鎖骨症候群、前斜角筋症候群、胸郭出口症候群、腕神経炎又は、新生児のものを含む神経根炎：炎症性及び毒性神経炎、急性感染性多発神経炎を含む、ギラン−バレー症候群；感染後多発神経炎、コラーゲン血管疾患における多発性神経炎、眼の多重構造に影響を与える疾患、化膿性内眼球炎、耳及び乳様突起の疾患、慢性リューマチ性心臓疾患、虚血性心疾患、不整脈、肺臓系の疾患、新生児の神経系を含む器官及び軟部組織の異常、陣痛及び分娩における麻酔剤その他の鎮静剤の投与の合併症、感染症を含む皮膚疾患、循環不全、外科手術を含む創傷、挫傷、火傷、神経の分裂を含む神経及び脊髄の創傷、連続における損傷（開放創の有又は無）、外傷性神経腫（開放創の有又は無）、外傷性一過性麻痺（開放創の有又は無）、医療処置中の偶発性穿刺又は裂創、視覚神経及び経路での創傷、視神経損傷、第二脳神経、視覚交差の損傷、視覚経路損傷、視覚野損傷、不特定失明、他の脳神経の損傷、他種及び不特定神経損傷；薬物、医療的及び生物学的物質による中毒、遺伝子的又は外傷性萎縮性筋肉疾患；又は様々な器官の疾患又は病状の処置用、例えば性腺の変性、膵臓の変性、例えばI型及びII型糖尿病、腎臓萎縮、例えばネフローゼ。
【０２３５】
ＣＮＳ／ＰＮＳの病状
本発明の他の局面では、この化合物は次の疾患又は病状の処置に用いられる：中枢又は末梢神経系、例えば手術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成不全、虚血後損傷、例えば卒中由来のもの、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、認知症例えば多発梗塞性認知症、硬化症、糖尿病併発神経変性、体内時計又は神経筋肉伝達に影響する疾患、及び統合失調症、気分障害、例えば躁うつ病；筋肉の疾患又は病状の処置用、例えば神経筋肉連結の機能不全を伴う病状、例えば臓器移植後、又は例えば遺伝的又は外傷的萎縮性筋障害；又は各種器官の疾患又は病状の処置用、例えば性腺の変性的病状、膵臓の変性的病状例えばＩ型及びII型糖尿病、腎臓の変性的病状例えばネフローゼ、及び心臓及び腸の変性的病状；及び次の処置用：手術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経繊維の髄鞘形成不全、虚血後、例えば発作後、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症例えば多発梗塞性認知症、硬化症、糖尿病併発神経変性、体内時計又は神経筋肉伝達に影響を与える疾患、及び統合失調症、気分疾患、例えば躁うつ病性抑うつ症。
【０２３６】
細胞死の予防
さらに、本発明による候補化合物は移植された細胞の細胞死を予防するために使用されるであろう。これは長期間の効果を持つ化合物を使用する時には特に有用である。
【０２３７】
本発明の他の局面では、候補化合物は移植又は注射された遺伝子操作細胞から合成され、分泌されるであろう。
【０２３８】
心筋
さらに、候補化合物及び／又は医薬組成物は、例えば急性心筋梗塞後又は血管形成後のような心筋細胞の細胞死を予防するためのものになり得る。さらにその上、一態様では、本化合物及び／又は医薬組成物は、例えば急性心筋梗塞後の生存のような心筋細胞の生存を刺激するためのものである。他の局面では、この化合物及び／又は医薬組成物は例えば創傷後のような血管形成のためのものである。
【０２３９】
記憶
別な一局面では、候補化合物及び／又は医薬組成物は学習能力及び／又は短期記憶及び／又は長期記憶の刺激用に使用される。
【０２４０】
再生
本発明の一局面では本発明の候補化合物を使用する処置は、様々な因子、例えば外傷又は創傷、急性疾患、慢性疾患及び／又は障害、特に通常細胞死に至る変性疾患、また他の外部因子、例えば医学的及び／又は外科的処置及び／又は遊離ラジカルの形成を起すか又は細胞障害性がある診断法、例えばＸ線及び化学療法などのために変性しつつある、又は変性又は死亡のおそれがある、細胞の再生を刺激するために有用である。
【０２４１】
プリオン病
候補化合物又はそれを含む医薬組成物は、プリオン病を処置するために使用してもよい。ＮＣＡＭは細胞プリオン蛋白質の分子間相互作用の相手であることが証明されている。
【０２４２】
創傷治癒
創傷治癒を促進するために候補化合物及び／又は医薬組成物を使用することは本発明の範囲内である。本化合物は細胞接着を妨害でき、それによって創傷治癒の過程を促進する。
【０２４３】
癌
本発明はさらに癌の処置における候補化合物及び／又は医薬組成物の使用を開示する。ＮＣＡＭは運動性を制御し、癌細胞の拡散を妨害する。
【０２４４】
参考文献
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【０２４５】
実施例
以下は本発明の候補化合物：例えばＩｇ１、Ｉｇ２、Ｉｇ３、又はＩｇ１−２、又はＩｇ２−３のようなＩｇ１−２−３モジュール及びその断片を含むＮＣＡＭの断片の製造；Ｉｇ１−２−３モジュールを含む結晶蛋白質の性質；及び選択した候補化合物の生物試験；の非限定的な実施例である。
【０２４６】
ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片及びＩｇ３断片の製造
ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片及びＩｇ３断片を、酵母P. pastoris発現系（Invitrogen）内で組み換え蛋白質として製造した。ラットＮＣＡＭのＩｇ１−２−３及びＩｇ３をコードするｃＤＮＡ（NCBI受託番号NP_１１３７０９）の各々１〜２８９及び１９１〜２８９に対応する断片を、ラットＮＣＡＭのｃＤＮＡを鋳型に用いるＰＣＲによって合成した。次のＤＮＡプライマー：上流（5’-TCT CTC GAG TTC TGC AGG TAG ATA TTG TT-3’）（配列番号３７）及び下流（5’-AAA CCC GGG TTA CTT TGC AAA GAC CTT-3’）（配列番号３０）、上流（5’-GAA TAC GTA ACT GTC CAG GCC AGA C-3’）（配列番号３１）及び下流（5’-AAA CCT AGG TTA CTT TGC AAA GAC CTT G-3’）（配列番号３２）を、Ｉｇ１−２−３及びＩｇ３のクローニングに使用した。増幅したｃＤＮＡ断片を各々ｐＨＩＬ−Ｓ１及びｐＰＩＣ９Ｋプラスミド（Invitrogen）にサブクローニングした。組換えプラスミドを各々ＮｓｉＩ及びＳａｃＩ制限酵素で線状化し、P. pastorisのＨｉｓ４ＧＳ−１１５株（Invitrogen）の形質転換に使用した。組み換え蛋白質の多量生産は高密度フィードバッチ発酵技術を採用してBiostat B発酵機（B. Braun Biotech Int. GmbH）で行った。Ｉｇ１−２−３とＩｇ３を、濃縮、脱塩した培地からHiTrap Qセファロース５ｍＬカラム（Pharmacia）を用いるアニオン交換クロマトグラフィーと、それに続くHiLoad 16/60 Superdex-75カラム（Pharmacia）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーによって精製した。Ｉｇ１−２−３は、ｐＨ７.４のＰＢＳ緩衝液中、３７℃でPNGase-F endo-N-グリコシダーゼ（New England Biolabs）を用いて酵素的に脱グリコシル化した。蛋白質断片の信頼性は１０〜１２個のＮ端残基のアミノ酸配列決定法及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによる組み換えプラスミドのＤＮＡ配列決定法によって確認した。組み換えＩｇ１−２−３断片及びＩｇ３断片はクローニングベクターに由来する各々２個（RV）及び５個（EAEAY）の追加的なＮ端残基を含んでいた。各蛋白質の純度はＳＤＳ−ＰＡＧＥによれば少なくとも９５％であった。
【０２４７】
Ｉｇ１−２−３及びＩｇ３突然変異体の製造
Ｅ１１Ａ、Ｅ１６Ａ、及びＫ１８Ａの各置換を含むＩｇ１−２−３突然変異体（Ｉｇ１−２−３mut）を、Ｉｇ１−２−３断片について記載した方法に従って、酵母P. pastoris発現系内で組み換え蛋白質として製造した。この３個の突然変異を、次のＤＮＡプライマー：上流（5’- CTG CAG GTA GAT ATT GTT CCC AGC CAA GGA GCC ATC AGC GTT GGA GCC TCC GCC TTC TTC CTG TGT CAA GTG GCA-3’）（配列番号３３）を用いるＰＣＲによって導入した。
Ｒ１９８Ａ、Ｄ２４９Ｇ、Ｅ２８７Ａ（Ｉｇ３mut１）の各置換及びＫ２８５Ａ、Ｆ２８７Ａ（Ｉｇ３mut２）の各置換を持つ２個のＩｇ３突然変異体を、酵母P. pastoris発現系内でＩｇ３断片について記載した操作法に従って組み換え蛋白質として製造した。突然変異を、次のＤＮＡプライマー：上流１（5’-AAA TAC GTA ACT GTC CAG GCC GCC CAG AGC ATC GTG-3’）（配列番号３８）、上流２（5’- GGC GAC AGT TCG GCG TTA ACC ATC AGG AAT GTG GAC-3’）（配列番号３４）、及びＩｇ３mut１用の下流（5’- GGT TAA CGC CGA ACT GTC GCC ACT GAA GAT GTG CTT CTC-3’）（配列番号３５）、及びＩｇ３mut２用の下流（5’- AAA CTT AGG TTA CTT TGC TGC GAC TGC GAG GTG GAT GGA GGC ATC-3’）（配列番号３６）を用いるＰＣＲによって導入した。Ｉｇ１−２−３mut、Ｉｇ３mut１、及びＩｇ３mut２のＤＮＡ構築物はＤＮＡ配列決定によって検証した。Ｉｇ３モジュール及びその突然変異体の折畳み並びに炭水化物の存在を、８００ＭＨｚのVarianＮＭＲ分光器（Varian Inc.）を用いてＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４中２５℃で記録した一次元プロトンＮＭＲスペクトルによって確認した。
【０２４８】
ペプチドの製造
ペプチドは９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護法を用いてTentaGel樹脂（Rapp Polymere）上でＦｍｏｃ保護アミノ酸（Calbiochem-Novabiochem）を使用して合成した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳによれば各ペプチドは少なくとも８５％の純度であった。ペプチドは全て遊離ＮＨ２及びカルボキシアミド化ＣＯＯＨ基で合成した。
【０２４９】
結晶化及びデータ収集
ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３の結晶を、等量の貯蔵溶液及び蛋白質溶液（５ｍＭ−燐酸Ｎａ、１５０ｍＭ−ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中、４ｍｇ／ｍＬ）の滴を用いるハンギング−ドロップ蒸気拡散法を用いて１８℃で生長させた。貯蔵溶液は１４〜１７％ｗ／ｖＰＥＧ４０００、４５０ｍＭ−硫酸Ｌｉ、１００ｍＭ−酢酸ナトリウム、ｐＨ５.２を含んでいた。結晶は非対称格子に分子１個を持つ空間群Ｉ２１２１２１に属し、格子の寸法はａ＝５１.５、ｂ＝１０８.５、及びｃ＝１４９.０Åである。結晶は凍結防止剤として１５％ｖ／ｖグリセリンを使用して液体窒素中で急速冷却した。同一の結晶について２組のデータセットを採集した。高解像度データを、beamline I711（Max-Lab, Lund, Sweden）を用いて２.０Å、１２０Ｋで測定し、低解像度データを、MAR345イメージプレート検出器を装着したRigaku RU300回転陽極装置を用いて３.５Å、１２０Ｋで測定した。両データセットを組合せて、DENZO/SCALEPACK（Otwinowski and Minor, 1997）およびCCP4 suiteプログラム（Collaborative Computational Project No. 4, 1994）で処理した。
【０２５０】
構造決定及び精密化
構造を、ＮＣＡＭのＩｇ２モジュール及びＩｇ１モジュールのＸ線構造（Kasper et al., 2000）をモデルに用いて、AmoReプログラム（Navaza and Saludjan, 1997）及びCNSプログラム１．０版（Bruenger et al., 1998）による分子置換法によって決定した。最初にＩｇ２モジュールの位置をAmoReで決定した。次に、Ｉｇ１モジュールの位置をCNSで決定した。電子密度マップをＩｇ１及びＩｇ２から得た位相の情報に基づいて算出した。このマップ内にＩｇ３の残基を徐々に組み入れた。マップの翻訳及びモデル構築はプログラムＯ（Jones et al., 1991）を用いて行った。数回の構築及び精密化サイクル後、ARP/wARP５．１版（Perrakis et al., 1999）を用いてＮＣＡＭのＩｇ１−２−３の２９１残基中の２３３残基を再構築した。CNSを用いて最終精密化を行った。最終モデルはアミノ酸（−１）〜２３８及び２４１〜２８９、及び２６６の水分子を含む。アミノ酸をＮＣＡＭの成熟配列に従って番号付けた。クローニング部位に由来するＡｒｇ残基及びＶａｌ残基には各々負の数字−２及び−１を与えた。解像度範囲５０〜２．０Åの反射全てを用いれば、Ｒｃｒｙｓｔは２１．８％、Ｒｆｒｅｅは２３．８％（８２８反射に対応する３％試験設定）であった。データの収集及び精密化の統計学を表１（図１）に示す。ドメイン間幾何学はBork et al. (1996)に従って決定し、埋没結合表面積は蛋白質−蛋白質相互作用サーバ（http：//www.biochem.ucl.ac.uk/bsm/PP/server）（Jones and Thornton, 1996）を用いて計算した。図はMOLSCRIPT、RASTER3Dプログラム（Kraulis, 1991； Merritt and Bacon, 1997）及びInsight II（Accelrys）プログラムで作製した。構造の原子座標を表２（図２）に示す。
【０２５１】
蛋白質データバンクＩＤコード
この構造の座標はProtein Data BankにＩＤコード１ＱＺ１として登録してある。
【０２５２】
細胞培養及び免疫染色
ＮＣＡＭ発現褐色細胞腫ＰＣ１２−Ｅ２細胞系統（Wu and Bradshaw, 1995）はDr. Klaus Seedorf, Hagedorn Research Institute, Denmarkから恵与を受けた。この細胞を５％ｖ／ｖウシ胎児血清（FCS）及び１０％ｖ／ｖウマ血清（ＨＳ）、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ（全てGibco BRL）添加ダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２含有加湿空気中、３７℃で培養した。
線維芽球様マウス細胞系列、Ｌ９２９（European Cell Culture Collection）を、ヒト１４０ｋＤａのＮＣＡＭ−Ｂをコードする全長ｃＤＮＡ又はベクターのみを含む真核細胞発現ベクターｐＨβ−Ａｐｒ−１−ｎｅｏ（Gunning et al., 1987）で安定にトランスフェクションした。ＮＣＡＭのｃＤＮＡはエクソンＶＡＳＥ、ａ、ｂ、ｃ、又はＡＡＧを含んでいなかった。この細胞を１０％ｖ／ｖ ＦＣＳ、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、及びストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ添加ＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ２下に常法に従って培養した。神経突起の伸長を分析するために、４ウェルのLabTek Tissue Culture Chamber Slides (NUNC)中でトランスフェクションした繊維芽球様Ｌ９２９細胞の密集単層の上部にＰＣ１２−Ｅ２細胞（ウェル当り８,０００細胞）を植菌した。細胞を１％ｖ／ｖＨＳ添加ＤＭＥＭ中で２４時間培養した後に分析した。
【０２５３】
小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）を、出生後３日目のWistarラットから調製した。小脳組織は切片にして氷上の修正クレブス−リンゲル溶液内に入れ、海馬ニューロンについて記載のように処理した。細胞培養物を全て５％ＣＯ２含有加湿空気下に３７℃でインキュベーションした。動物は全て動物福祉に関する国の指針に従って取扱った。ＣＧＮの初代培養物を２％（ｖ／ｖ）Ｂ２７、０.５％（ｖ／ｖ）グルタマックス、ペニシリン１００Ｕ／ｍＬ、ストレプトマイシン１００μｇ／ｍＬ及びＫＣｌを添加し、培地中ＫＣｌ最終濃度を４０ｍＭとしたNeurobasal-A培地（Gibco, BRL）中で、ポリ−Ｌ−リジンをコーティングした８ウェル・ペルマノックス（permanox）スライド上に１００,０００細胞／ｃｍ２の密度で塗布した。塗布から２４時間後、シトシン−β−Ｄ−アラビノフラノシド（Ａｒａ−Ｃ；Sigma-Aldrich）を加えて最終濃度１０μＭとしてグリア細胞の増殖を防ぎ、その後さらに６日間３７℃でニューロンを分化させた。
【０２５４】
細胞の接種後直ちにグリコシル化された組み換えラットＮＣＡＭのＩｇ３モジュール（野生型及び変異型）又は選択されたペプチドを加えて、接着に及ぼすＮＣＡＭ介在神経突起伸長の阻害を反映する阻害効果を評価した。Ｉｇ３wt、Ｉｇ３mut１及びＩｇ３mut２は５００μｇ／ｍＬの濃度で試験した。適切な対照を加え、実験者には突然変異体又はペプチドの正体を知らせなかった。
ＰＣ１２−Ｅ２細胞の過程の長さを評価するために、共培養物を４％ｗ／ｖパラホルムアルデヒド中で２５分間固定した。ＰＢＳで洗浄後、細胞を１０％ｖ／ｖヤギ血清（DAKO）で３０分間ブロックし、続いてマウスのモノクローナル抗Ｔｈｙ−１抗体（Caltag Laboratories）（１０％ｖ／ｖヤギ血清添加ＰＢＳ中１：１００）と共に室温で１時間インキュベーションした。洗浄後、細胞をAlexa-Fluor 568（登録商標）ヤギ抗マウスＩｇＧ（Molecular Probes）（１０％ｖ／ｖヤギ血清添加ＰＢＳ＝１：１０００）と共に室温で１時間インキュベーションした。洗浄は全てＰＢＳ中で１０分間行い、３回反復した。
【０２５５】
ＣＧＮの神経突起の長さを評価するために、培養液中のニューロンを２４時間後に４％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒドで２０分間固定し、その後にGAP４３に対する一次ウサギ抗体及びAlexa 蛍光二次ヤギ抗ウサギ抗体を用いる免疫染色を行った。個々の実験においては、各群当り少なくとも２００個のニューロンの映像を、コンピュータ援用蛍光顕微鏡を用いて系統的に得た。
細胞当りの神経突起長合計をProcessLengthソフトウェアを用いて分析した（Roenn et al., 2000）。Ｉｇ３モジュール、その突然変異体、及び個々のペプチドについて、独立した５回の実験を行った。各実験で細胞２００〜３００個の神経突起を分析した。個々の実験の結果を比較するために及び細胞実験に固有な高度の変動性のために、データを、ＮＣＡＭ−１４０をトランスフェクトした繊維芽細胞上で生長したＰＣ１２−Ｅ２細胞の平均神経突起長とベクターをトランスフェクトした繊維芽細胞上で生長したＰＣ１２−Ｅ２細胞の平均神経突起長との間の差を１００％に設定して標準化した。統計学的評価は両側スチューデント−ｔ−検定を用いて行った。
【０２５６】
動的光散乱（ＤＬＳ）の測定
測定はDynaPro-MS/X装置（Protein Solutions）を用いて１８℃で行った。ＰＢＳ、ｐＨ７.４中でＩｇ１−２−３（４ｍｇ／ｍＬ）、Ｉｇ１−２−３mut（４ｍｇ／ｍＬ）及びＩｇ３（１０ｍｇ／ｍＬ）の脱グリコシル化製品を用いて溶液内にある組み換え蛋白質の分子量を測定した。
【０２５７】
結果及び討論
ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールのＸ線構造
ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３のＸ線構造は、解像度２.０Å（図１の表１参照）で決定した。Ｉｇ１−２−３モジュールの構造の中で、Ｉｇ１モジュール及びＩｇ２モジュールは長軸方向に配置されており、Ｉｇ３はＩｇ１−Ｉｇ２軸に対して約４５°の角度に配向している（図３）。Ｉｇ１−Ｉｇ２間及びＩｇ２−Ｉｇ３間のリンカー領域は短く、それぞれ残基２個（Ｌｙｓ９８−Ｌｅｕ９９）及び残基１個（Ａｓｎ１９０）のみを含む。Ｉｇ１モジュール及びＩｇ２モジュールの構造全体は、以前に決定されているＩｇ１−２の構造（Kasper et al., 2000）に非常に類似しており、各標準偏差（r.m.s.d.）は０.７Å（９６Ｃα原子）及び０.８Å（９３Ｃα原子）である。Ｉｇ１−２−３の構造では、Ｉｇ１とＩｇ２との間の傾斜角は１１°であり、それによってＩｇ１−２構造と比較すると１３°異なる。
ラットＮＣＡＭの９８残基のＩｇ３モジュールは中間体型１（Ｉ１）セットのＩｇモジュール位相（Casasnovas et al., 1998）を取る。Ｉｇ３モジュールでは、古典的なβサンドウィッチは全部で９個のβ鎖を持つβシート２枚を含む（図３Ｂ）。Ａ、Ｂ、Ｄ、及びＥβ鎖がシート１枚を形成し、Ａ'、Ｃ、Ｃ'、Ｆ及びＧβ鎖が第二のシートを形成する。システイン架橋Ｃｙｓ２１６−Ｃｙｓ２６９はβシート２枚を連結する。Ｇ鎖のＣ端部分に平行に走るＡ'鎖以外の鎖は、全て逆平行である。Ｉｇ３はＡ'鎖に位置するＡｓｎ２０３にＮ結合グリコシル化部位１個を有する。Ｅ−Ｆループ（残基Ｌｙｓ２６１〜Ａｓｐ２６３）は３１０α−ヘリックス・ターンを形成する。ラットＩｇ３の構造全体は標準偏差１.６５Å（９５Ｃα原子）で、ニワトリＩｇ３の構造（Atkins et al., 2001）と類似している。
【０２５８】
Ｉｇモジュール間の平行的相互作用
ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片の構造には特徴的な相互作用がいくつか観察され、次の二群：相互作用するＩｇ１−２−３分子２個の長軸（Ｎ端からＣ端へ）が平行に配向している相互作用；及び長軸が逆平行に配向している相互作用；に分類され得る。結晶内には、平行相互作用１個及び主要な逆平行相互作用３個が観察される。
ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３の平行な、十字形二量体相互作用には、Ｉｇ１モジュール及びＩｇ２モジュールが関連している（図５）。この界面の埋没表面合計面積は１５９４Å２（二量体当たり）であり、以前にＩｇ１−２十字形二量体で実測されたもの（Kasper et al., 2000）に類似している。Ｉｇ１−Ｉｇ２相互作用の最も目立つ特徴はＩｇ１の芳香族残基２個、Ｐｈｅ１９及びＴｙｒ６５の、Ｉｇ２残基が形成する疎水性ポケットへの挿入であり（図５Ａ）、これはＩｇ１−２構造にも実測される。しかしながら、Ｉｇ１−２−３構造では、Ｉｇ１−２に観察される水介在水素結合の代わりに、Ｔｙｒ６５のヒドロキシル基がＧｌｕ１７１と直接的水素結合（水素結合）を形成する、さらに強固なＩｇ１からＩｇ２への結合界面が観察される。Ｔｙｒ６５はまた、Ｌｙｓ１３３、Ｇｌｕ１７１、及びＡｒｇ１７３の側鎖への水素結合３個を形成する。Ａｒｇ１７３はＩｇ２疎水性ポケットの一部を形成し、Ｔｈｒ６３への水素結合２個を形成する。Ａｒｇ１７３側鎖とＰｈｅ１９側鎖の配向が平行であること、及びＡｒｇ１７３グアニジウム基のＮ□１原子とＰｈｅ１９のベンゼン環のＣζ原子との距離（３．４Å）は、これら残基２個の間のカチオン−π型相互作用を示唆する（Flocco and Mowbray, 1994）。
【０２５９】
動的光散乱（DLS）測定では、脱グリコシル化Ｉｇ１−２−３が溶液中で分子量が約７８ｋＤａと、二量体に対応する単一な分子種を形成することを示した。Ｉｇ１−２−３二量体化には実測されたＩｇ１からＩｇ２への結合が介在することを証明するために、本発明者らはＡ３個のｌａ置換：Ｅ１１Ａ、Ｅ１６Ａ及びＫ１８Ａを有するＩｇ１−２−３の突然変異体（Ｉｇ１−２−３mut）を製造した。これらの突然変異が、Ｉｇ１−２ＮＣＡＭ断片の溶液中二量体化を完全に止めることが以前に証明されている（Jensen et al., 1999）。本構造ではＧｌｕ１１及びＧｌｕ１６は各々、Ｉｇ１からのＡｒｇ１７７及びＬｙｓ９８とＩｇ２のリンカー領域への分子内塩架橋を形成する（記載せず）。これらの塩架橋はおそらくＩｇ２に関してＩｇ１固有の配向に寄与し、それ故、Ｉｇ１−Ｉｇ２相互作用のために重要である。Ｌｙｓ１８は、Ｉｇ２モジュールにあるＡｒｇ１７７のカルボキシル基と水素結合を形成して、Ｉｇ１−Ｉｇ２相互作用を安定化する（図５Ａ）。Ｌｙｓ１８はＰｈｅ１９の近くに位置しており、それは以前に明らかに証明されたようにＩｇ１−Ｉｇ２相互作用に決定的な残基である（Atkins et al., 2001）。それ故、Ｌｙｓ１８−Ａｒｇ１７７水素結合の分裂はＰｈｅ１９の配向に影響を与え、Ｉｇ１−Ｉｇ２相互作用の消滅を起すであろう。このＩｇ１−２−３mut断片の分子量はＤＬＳによって約３４ｋＤａであると決定され、単量体を示す。これでＩｇ１−２−３の二量体化にはＩｇ１−Ｉｇ２結合が介在することが確認される。
【０２６０】
平行（シス）相互作用は、細胞接着分子の間では稀ではない。そこで、シス二量体化は、Ｉｇスーパーファミリーに属する細胞接着分子Ｃ−ＣＡＭ１、Ｃ−ＣＡＭ２、ＩＣＡＭ−１、ネクチン−２α、及びＪＡＭ（Hunter et al., 1996； Casasnovas et al., 1998； Miyahara et al., 2000； Kostrewa et al., 2001）ならびにＮ−、Ｅ−、及びＣ−カドヘリン（Shapiro et al., 1995； Takeda et al., 1999； Brieher et al., 1996）については証明されている。二量体型のＣ−カドヘリンは接着できるが、他方では単量体型は接着できないことが証明されている（Brieher et al., 1996）。
【０２６１】
Ｉｇモジュールの間の逆平行相互作用
逆平行相互作用がＩｇ１−２−３分子２個のＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間で起き、それによってＩｇ１−２−３二量体（図４Ａ、Ｂ）のアレイが形成される。第一の分子のＩｇ２が第二の分子のＩｇ３に結合するか、その逆になる（図３Ｂ）。関与する残基はＩｇ２のＢ鎖、ＣＤループ／Ｄ鎖及びＥ鎖からの１１２〜１１５、１４３〜１４６及び１５８〜１６１であり、Ｉｇ３のＡ'鎖、ＥＦループ及びＧ鎖からの残基２００〜２０５、２６１、及び２７８〜２８９である。この相互作用の中心的な要素はＩｇ３のＰｈｅ２８７の側鎖からＩｇ２モジュールのＶａｌ１４５、Ａｒｇ１４６及びＡｒｇ１５８及びＩｇ３のＬｙｓ２８５の側鎖が形成する疎水性ポケットへの挿入である。Ａｒｇ１５８はまた残基Ｌｙｓ２６１及びＡｌａ２８８への水介在水素結合にも関与し、Ｇｌｙ１５９はＡｓｎ２０３への直接的水素結合を作る。
結晶の充填はＡｓｎ２０３にあるグリコシル化の余地を作る。この部位でのＮ結合グリコシル化に対応するために、Ａｓｎ２０３の側鎖は別の回転異性体配座を取らなければならない。それによって、炭水化物は結合部位から遠くを向き、結晶内の溶媒チャネルを目指し、従ってＡｓｎ２０３はＩｇ２−Ｉｇ３相互作用を妨害しないであろう。Ｉｇ３モジュール２個の間の相互作用がその界面に実測され、Ｇｌｎ１９６はＧｌｎ２７８と水介在水素結合を形成する。Ｉｇ２−Ｉｇ３界面の全埋没表面は二量体当たり１４０７Å２である。Janin (1997) によれば、Ｉｇ２−Ｉｇ３接触のサイズが非特異的界面に見出される確率はたった１.９％である。
【０２６２】
Ｉｇ１−２−３分子２個の間の他の逆平行相互作用は、Ｉｇ２モジュール２個の間に形成される（図４C、D）。この相互作用にはＡＡ'ループ／Ａ'鎖／Ａ'Ｂループ及びＤＥループ／Ｅ鎖の残基１０３〜１２１及び残基１５０〜１５８が関与し、二量体当たり全埋没表面９５８Å２を持つ（図４C）。ここに、中心の残基はＧｌｕ１１４であり、これはＳｅｒ１５１（側鎖及び骨格）への水素結合２個を作ると思われる。広範な水素結合ネットワーク、特に水分子を経るものとは別に、両Ｉｇ２モジュールのＶａｌ１１７、Ｖａｌ１１９、Ｌｅｕ１５０、及びＴｙｒ１５４は、Ｉｇ２−Ｉｇ２界面において相互の疎水性接触を多数形成する（記載せず）。
【０２６３】
僅かに小さな逆平衡相互作用（二量体当たり全埋没表面８５８Å２）がＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュール（図４Ｃ、Ｄ）との間に形成されるが、これにはＩｇ１内のＣ鎖／ＣＣ’ループ／Ｃ’鎖／Ｃ’Ｄループの残基３２〜４７及び残基７６〜８８及びＦ鎖／ＦＧループ／Ｇ鎖、及びＩｇ３内のＡ鎖、Ｂ鎖／ＢＣループ、及びＤ鎖／ＤＥループからの残基１９８、２１３〜２２３、及び２４８〜２５３が関与する（図５Ｄ）。Ａｒｇ１９８及びＡｓｐ２４９は各々、Ａｌａ８１及びＧｌｕ８２の骨格酸素原子と直接的水素結合を形成し、Ｌｙｓ７６と塩架橋２個を形成する。これに加えて、Ｌｙｓ４２とＡｓｐ２５０との間に１つ、Ｓｅｒ４４とＧｌｙ２２０との間に１つ、及びＳｅｒ４４とＧｌｕ２２３との間に２つの水介在水素結合が形成される。保存Ｐｈｅ３６及びＰｈｅ２２１は各々、Ａｓｐ２４９及びＧｌｎ４７に対してパックされている。Ｉｇ１−Ｉｇ３相互作用部位２箇所及びＩｇ２−Ｉｇ２部位１箇所は共に結晶内でＩｇ１−２−３二量体の間に顕著な接触（２６５４Å２）を造り、Ｉｇ１−２−３二量体（図４Ｃ、Ｄ）の第二のアレイをＩｇ２−Ｉｇ３が介在するアレイと直角に形成する（図２Ａ、Ｂ）。類似サイズの接触範囲は他のＣＡＭに見出されている。ヒトＩＣＡＭ−１及びマウスＪＡＭのシス二量体は、各々１１００Å２及び１２００Å２の全埋没表面面積（二量体当たり）を持つ（Casasnovas et al. 1998; Kostrewa et al., 2001）が、一方ラットＣＤ２及びニワトリ・アキソニン−１／ＴＡＧ−１のトランス二量体はさらに大きな接触面積１３００Å２及び２０００Å２を持つ（Jones et al., 1992; Freigang et al., 2000）。
【０２６４】
Ｉｇ３はＮＣＡＭ依存性神経突起伸長を阻害する
ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相互作用がＮＣＡＭ発現繊維芽細胞の密集単層上に増殖したＮＣＡＭ発現ＰＣ１２−Ｅ２細胞からの神経突起の伸長を誘導することは知られている（Kolkova et al., 2000）。それ故、ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相互作用の阻害はＰＣ１２−Ｅ２細胞における神経突起伸長を阻害するであろう。
ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３の構造において観測されたＩｇ１−Ｉｇ３及びＩｇ２−Ｉｇ３接触の生物学的意義を試験するために、本発明者はＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ接着に対する組み換えＩｇ３モジュールの阻害効果を試験した。さらに、Ｉｇ１−Ｉｇ３接触部位のＲ１９８Ａ、Ｄ２４９Ｇ、Ｅ２５３Ａ残基（Ｉｇ３mut１）（図５Ｄ参照）及びＩｇ２−Ｉｇ３接触部位のＫ２８５Ａ、Ｆ２８７Ａ残基（Ｉｇ３mut２）（図５Ｂ参照）の突然変異を含むＩｇ３突然変異体２種を製造した。
図４では野生型Ｉｇ３モジュール（Ｉｇ３wt）は実際に阻害効果を持つが、一方では両突然変異体は不活性であることが見られ、それによってＩｇ１−Ｉｇ３接触部位とＩｇ２−Ｉｇ３接触部位との両方が同種親和性相互作用に寄与していることを強く支持する。
同様なＮＣＡＭ１４０をトランスフェクションしたマウスＬ細胞の上に増殖したＮＣＡＭ発現ニワトリ網膜神経節細胞の共培養試験系を使用して、Ｉｇ３モジュール同種親和性結合部位（本発明研究におけるＩｇ１−Ｉｇ３結合部位）での突然変異の破壊的効果を証明すること、並びにこの同種親和性結合部位を示す合成ペプチドによる神経突起伸長の阻害を証明することに成功している（Sandig et al. 1994）。
【０２６５】
相互作用表面ペプチドは神経突起伸長を阻害する
ＮＣＡＭのＩｇ３モジュール及びＩｇ２モジュールからの同種親和性結合配列を表すペプチドが、ＮＣＡＭが介在する細胞凝集を阻害することは既に証明されている（Rao et al., 1992; Sandig et al. 1994; Rao et al., 1994; Soroka et al. 2002）。それ故、観測されたＩｇ１−Ｉｇ２の接触、Ｉｇ１−Ｉｇ３の接触及びＩｇ２−Ｉｇ３の接触の、ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３の構造における生物学的意義をさらに試験するため、本発明者は観測された接触部分からのアミノ酸配列を示す一連のペプチドの阻害効果を試験した（図６、８〜１２）。
Ｉｇ１−Ｉｇ２接触は、Ｐ１−Ｂペプチド（10-GEISVGESKFFL-21）（配列番号１９）で示され、これはＩｇ１のＢβ鎖を含み、Ｉｇ１−Ｉｇ２結合にある重要なＰｈｅ１９残基を含む（Kasper et al., 2000; Atkins et al., 2001）。ネガティブ対照として、各々Ｆ１９の単一Ａｌａ置換及びＦ１９及びＦ２０の双Ａｌａ置換を含むペプチド２種GEISVGESKAFL（Ｐ１−Ｂ−Ｆ１９Ａ）（配列番号２１）及びGEISVGESKAAL（Ｐ１−Ｂ−Ｆ１９Ａ−Ｆ２０Ａ）（配列番号２２）を使用した。
【０２６６】
Ｉｇ１−Ｉｇ３接触はペプチド３個：AFSPNGEKLSPNQ（Ｐ１−ＣＤ）（配列番号４０）；AKSVVTAEDGTQSE（Ｐ１−ＦＧ）（配列番号４１）およびKHIFSDDSSELTIRNVDKNDE（Ｐ３−ＤＥ）（配列番号２０）で表される。Ｐ３−ＤＥペプチドはＤ鎖及びＥβ鎖の配列をカバーし、Ｉｇ３モジュールのＥＦループは、ニワトリＮＣＡＭのＩｇ３モジュールの同種親和性結合部位であると以前に示された配列（243- KYSFNYDGSELIIKKVDKSDE- 263）（配列番号２３）と相同的である（Rao et al., 1992）。ネガティブ対照としてトランケートしたＰ３−ＤＥペプチド244- KHIFSDDSSE-253（P３-ＤＥtrunc）（配列番号２４）を使用した。このＰ３−ＤＥtruncペプチドはニワトリ配列243-KYSFNYDGSE-252（配列番号２５）に相同的であり、これはさらに長い配列よりも弱い（Rao et al., 1992）。
Ｉｇ２−Ｉｇ２接触はペプチドＰ２−Ａ'Ｂ（QEFKEGEDAVIV：配列番号１７）で示される。
【０２６７】
Ｉｇ２−Ｉｇ３接触は、Ｉｇ２モジュールのＣＤ鎖及びＥＦβ鎖の配列をカバーするペプチドＰ２−ＣＤ（DVRRGIKKTD）（配列番号４２）及びＰ２−ＥＦ（QIRGIKKTD）（配列番号４３）及びＩｇ３モジュールからのペプチドＰ３−Ｇ（SIHLKVFAK）（配列番号１３）で示される。配列SIHLKVFAK（配列番号１３）は、溶媒露出したＰｈｅ２８７を含むＧβ鎖のＣ端部分をカバーする。ネガティブ対照として、Ｋ２８５とＦ２８７との置換を持つペプチド２種SIHLAVAAK（Ｐ３−Ｇ−Ｋ２８５Ａ−Ｆ２８７Ｓ）（配列番号２６）及びSIHLAVGAK（Ｐ３−Ｇ−Ｋ２８５Ａ−Ｆ２８７Ｇ）（配列番号２７）を使用した。Ｐ１−Ｂ及びＰ３−Ｇペプチドの双方はＮ端近くに疎水性残基２つ（Ｉｌｅ及びＶａｌ／Ｌｅｕ）を含み、及びＣ端近くにＰｈｅ残基を少なくとも１つ含む。同様な疎水性を持つ対照ペプチドとして、本発明者らはＩｇ３モジュールのＢβ鎖及びＢＣループをカバーし、またＩｇ１−Ｉｇ３結合に関与するＧｌｙ２２０、Ｐｈｅ２２１、及びＧｌｕ２２３を含むペプチド213- TLVADADGFPEP-224（Ｐ３−Ｂ）（配列番号３）を選択した。Ｐ１−Ｂ及びＰ３−Ｇペプチドとの配列類似性に拘らず、Ｐ３−Ｂペプチドは活性がなかった（図６Ｇ）。これはおそらくＩｇ３のＰｈｅ２２１が部分的に溶媒に露出しており、Ｇｌｙ２２０及びＧｌｕ２２３は水介在水素結合を形成している（図５Ｄ）という事実によるのであろう。これとは対照的に、ペプチドＰ１−Ｂ、ペプチドＰ３−ＤＥ及びペプチドＰ３−Ｇは疎水性ポケットに埋没したＰｈｅ又は直接的水素結合を形成する残基を含む（図５）。
【０２６８】
このペプチドの生物学的試験の結果は図４、６〜１０に示す。ＰＣ１２−Ｅ２又はＣＧＮ細胞とＮＣＡＭ発現繊維芽細胞との共培養ではＰ１−Ｂ、Ｐ１−ＣＤ、Ｐ２−Ａ'Ｂ、Ｐ３−ＤＥ、及びＰ３−Ｇペプチドは全てＮＣＡＭ刺激神経突起の伸長を阻害し、細胞層２つの間の減弱されたＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ結合を示す。対応する対照ペプチドには殆ど又は全く阻害効果がない（図６Ｇ）。対照的に、ペプチドＰ２−ＥＦ、Ｐ２−ＣＤ及びＰ３−Ｇは共培養中でＮＣＡＭ刺激神経突起伸長に影響を与えず、単一ＣＧＮの初代培養物における高能力な神経突起伸長刺激剤である（図８〜１０）。ペプチドＰ２−Ａ'Ｂ、及びＰ１−ＣＤ（図８〜１２）は、ＮＣＡＭ同種親和性接着−介在神経突起伸長を調整できるが、初代培養物中で単一ＣＧＮの分化は促進しない。
【０２６９】
P１−BペプチドはＩｇ１−Ｉｇ２相互作用を妨害し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１−Ｉｇ２介在シス二量体化を阻害する。ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールのジッパー様アレイの結晶ではＮＣＡＭのトランス相互作用を反映してシス二量体が観測される。トランス相互作用にはそれ故ＮＣＡＭ分子のシス二量体化が必要と思われる（図４）。Ｐ３−ＤＥ及びＰ３−Ｇの両ペプチドはシス相互作用には影響を与えないと思われるが、トランス相互作用は妨害する。ＮＣＡＭ依存性神経突起伸長は２つの細胞層の間のＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相互作用に依存するので、この相互作用の阻害はＮＣＡＭ介在神経突起伸長に直接的影響を与えるであろう。
この研究では、本発明者らはＩｇ３モジュールに由来するペプチドにおける突然変異がＩｇ３モジュールにおける同様な突然変異と同じ効果を表すことを証明する。これはこの実験の設定では、用いるペプチドはＩｇ３モジュールを模倣しており、そこでさらなる分析のために便利で及び簡単なツールとして使用できることを証明する。さらに、ニワトリＮＣＡＭ（本研究のＩｇ１−Ｉｇ３結合部位）のＩｇ３モジュール同種親和性結合部位の配列を表すペプチドは、以前にＩｇ３モジュールの同種親和性結合部位を確認し、特徴付けるために使用された（Rao et al., 1992; Sandig et al., 1994; Rao et al., 1994）。この結果はＩｇ３突然変異の研究と共に実測されたＩｇ１−Ｉｇ２、Ｉｇ１−Ｉｇ３及びＩｇ２−Ｉｇ３接触の生物学的役割について強力な証拠を提供する。
【０２７０】
ＮＣＡＭ同種親和性接着の新規なジッパー機序
Ｉｇ１−２−３断片の結晶構造はＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間及びＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の新規相互作用を示し、ならびに以前に観測されたＩｇ１−Ｉｇ２相互作用及びＩｇ２−Ｉｇ２相互作用（Kasper et al., 2000）を示す。それと共に、この接触は２つのＩｇ１−２−３二量体の直角なジッパー様アレイの形成に介在する（図４）。Ｉｇ１−Ｉｇ２接触が介在する結晶においてＮＣＡＭのＩｇ１−２−３分子の平行な相互作用は、同じ細胞表面に存在するＮＣＡＭ分子の間の相互作用――シス相互作用――を反映するのかもしれない。Ｉｇ１−Ｉｇ３、Ｉｇ２−Ｉｇ２、及びＩｇ２−Ｉｇ３接触が介在する逆平行相互作用は、対向する細胞上に存在するＮＣＡＭ分子間の相互作用――トランス相互作用――を反映するのかもしれない。提供された実測の全てに基づいて、本発明者らは２つのＮＣＡＭ分子のジッパー様アレイから構成されるＮＣＡＭ同種親和性接着のモデルを提出する（図７）。「密集（compact）」ジッパー（図７Ａ）では、対向する細胞膜を起源とするＮＣＡＭのシス二量体はＩｇ１−Ｉｇ３相互作用及びＩｇ２−Ｉｇ２相互作用を経るアレイとして配置される。「密集」ジッパーは対向する細胞膜の間では直角な「扁平（flat）」ジッパーよりも遠距離で形成できるので、本発明者は「密集」ジッパーが最初に形成されると推測される。「扁平」ジッパー（図７Ｂ）では、Ｉｇ２−Ｉｇ３相互作用はＮＣＡＭ「密集」ジッパー間の横方向の会合を示唆し、それによって二重ジッパー接着複合体（図７Ｃ）を形成することを示唆する。Ｉｇ３のＡｓｎ２０３におけるグリコシル化は（図２）、ＮＣＡＭ介在神経突起伸長をグリコシル化Ｉｇ３モジュールが阻害し、一方ではＩｇ２−Ｉｇ３結合部位における突然変異を含むグリコシル化Ｉｇ３mut２が不活性であるという事実によって支持されるように、ジッパー形成能を阻害するとは思われない（図６Ｆ、Ｇ）。「密集」ジッパーでは、Ｉｇ１−２−３分子のヘパリン結合部位（133-KHKGRDVILKKDVRFI-148）（配列番号３９）（Cole and Akeson, 1989）は溶媒に露出しており（図２Ｃ、Ｄ）、それ故ヘパリン及びヘパラン硫酸分子への結合のために接近できることで、ＮＣＡＭが同時に同種親和性及び異好性相互作用に関与できることを示唆する。
【０２７１】
ＮＣＡＭの細胞外モジュール７個全てを原形質膜との間の典型的な距離約３０ｎｍ（Hall and Rutishauser, 1987）内に収容するために、本発明のモデルではＮＣＡＭ分子にベンドを導入することになった（図７）。電子顕微鏡によるＮＣＡＭの分析は、ベンドした棒状の構造を示した（Hall and Rutishauser, 1987; Becker et al., 1989）。Ｎ端（約１８ｎｍ）部分及びＣ端（約１０ｎｍ）部分の間のヒンジ領域におけるベンド角はかなり変動し（５０〜１４０°）、平均値は９８°であって（Becker et al., 1989）、十分な内部柔軟性をＮＣＡＭに与えて細胞−細胞距離に適合させると推定される。この研究及びＩｇモジュールの平均長約４．３ｎｍ（本出願）及びＦｎＩＩＩモジュールの平均長約３．５ｎｍ（Leahy et al., 1996）に基づけば、ヒンジ領域はＩｇ４の後に存在する可能性が最も高い。様々な脊椎動物種からのＮＣＡＭの配列の多重配列比較でＩｇ４モジュール及びＩｇ５モジュールを結合するPKLQGP配列内に保存されているＰｒｏ残基、Ｌｙｓ残基、及びＧｌｙ残基が判明する。Ｐｒｏ及びＧｌｙは典型的にはポリペプチドベンドに関連するので、おそらくこの配列がＩｇ４モジュールとＩｇ５モジュールとの間にベンドを導入する。結晶内に実測される二重ジッパー（図７C）はＩｇモジュール１〜３に様々な高さを提供し、各ジッパー共存下のＮＣＡＭ分子が様々な角度でベンドしていることを示す。これは電子顕微鏡のデータと一致する（Hall and Rutishauser, 1987; Becker et al., 1989）。
【０２７２】
Ｉｇ１−Ｉｇ２モジュールの間のシス相互作用はそれ自体細胞−細胞相互作用に介在しないけれども、多分トランス相互作用の安定化には寄与するであろう。この主張はＩｇ２に結合するＩｇ１の部位に対応するＰ１−Ｂペプチドを用いる細胞共培養実験によって支持される（図６）。さらにその上、細胞凝集への阻害効果は最近、Ｉｇ１モジュールに結合するＩｇ２モジュールの部位を表すペプチド172-GRILARGEINFK-182（Ｐ２ペプチド）（配列番号２８）について証明された（Soroka et al., 2002）。それ故、本発明者はシス二量体の形成はトランス相互作用の樹立に必須であろうことを示唆する。
今のところ、接着分子を含むＩｇモジュールのＸ線構造３つのみが、Ｉｇモジュール３個又はそれ以上［アキソニン−１／ＴＡＧ１（Freigang et al., 2000）、ヘモリン（Su et al., 1998）、及びＣＤ４（Wu et al., 1997）］を含むことが判明している。トランス相互作用するシスホモ二量体の同様なジッパー様アレイは、連結接着分子（ＪＡＭ）の結晶構造内に観測される（Kostrewa et al., 2001）。同種親和性相互作用のジッパー様機序もアキソニン−１／ＴＡＧ１について示唆され（Freigang et al., 2000）、ここでは対向する膜が交互に提供する分子が線形のジッパー様アレイを形成する。しかしながら、ＮＣＡＭが形成する二重ジッパーは以前に報告されているジッパーとは基本的に異なる。
【０２７３】
結論として、本発明者はここにジッパーの形成に基づくＮＣＡＭ同種親和性結合の新規なモデルを提唱する。このモデルは、Ｉｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール、及びＩｇ３モジュールが全てＮＣＡＭ同種親和性結合に関与すること（Rao et al., 1992; Sandig et al., 1994; Kiselyov et al., 1997; Jensen et al., 1999; Kasper et al., 2000; Atkins et al., 2001）及び矛盾する生物学的データの大部分を満足させることを証明し、多数の研究と符合する。Ｉｇ１−２−３断片の結晶構造は、Ｉｇ１とＩｇ３との間及びＩｇ２とＩｇ３との間の今まで知られていなかった２つの相互作用の詳細を解明する。興味深いことに、ＮＣＡＭのＩｇ１モジュール及びＩｇ２モジュールは同時にシス相互作用及びトランス相互作用に介在するが、一方、Ｉｇ３はトランス相互作用のみに関与する。全てを勘案すると、本発明は、ＮＣＡＭ介在接着の強さを付与するのは最初のＩｇモジュール３種の力を合わせたものであることを示す。
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】結晶学的データと精密な統計データを示す。
【図２】Ｉｇ１−２−３モジュール結晶の原子的構造座標を示す。
【図３】分解能２．０ÅにおけるラットＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片の結晶構造を示す。（Ａ）１０残基毎に標識した立体的Ｃαバックボーンダイアグラム。（Ｂ）Ｉｇ１セット命名法によるβ鎖を標識したリボンダイアグラム。
【図４】４個の主なモジュール−モジュール相互作用及び２種のＩｇ１−２−３アレイを示すＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片の結晶構造を示す。相互作用しているＩｇ１−２−３シス二量体の空間充填モデル（Ｉｇ１−Ｉｇ２結合が介在）を示す。Ｉｇ１−Ｉｇ２、Ｉｇ１−Ｉｇ３、Ｉｇ２−Ｉｇ２、及びＩｇ２−Ｉｇ３相互作用部位を白楕円で示す。Ｉｇ２モジュールのヘパリン結合部位（残基１３３〜１４８）を白正方形で示す。矢印はＡｓｎ２０３（Ａｓｎ２０３を白三角で示す）でのＮ結合グリコシル化の位置を示す。末端はＮ及びＣで示す。（Ａ、Ｂ）Ｉｇ１−２−３断片のＩｇ１−２が介在するシス二量体は、対向する細胞上のＮＣＡＭ分子との間の相互作用を反映して、Ｉｇ２−Ｉｇ３介在トランス相互作用により「フラット」ジッパーを形成する。（Ｃ、Ｄ）Ｉｇ１−２−３断片シス二量体はまた、Ｉｇ１−Ｉｇ３及びＩｇ２−Ｉｇ２トランス相互作用を経て、非対称「コンパクト」ジッパーを形成する。シス二量体２種は、ジッパーの一方は２種のＩｇ１−Ｉｇ３相互作用（実線楕円）によって、及びジッパーの他方は１種のＩｇ２−Ｉｇ２相互作用（点線楕円）によって結合している。Ｂ及びＤにおける視点は各々Ａ及びＣのそれと垂直である。
【図５】ＮＣＡＭＩｇ１−２−３断片の相互作用接点の拡大図である。（Ａ）Ｉｇ１−Ｉｇ２相互作用インターフェース。Ｉｇ１モジュール及びＩｇ２モジュールは、１つのＩｇ１−２−３シス二量体を形成する２つの異なる別個なＩｇ１−２−３断片に属する。（Ｂ）Ｉｇ２−Ｉｇ３相互作用インターフェース。（Ｃ）Ｉｇ２−Ｉｇ２相互作用インターフェース。（Ｄ）Ｉｇ１−Ｉｇ３相互作用インターフェース。Ｂ〜Ｄでは、異なる別個なＩｇ１−２−３シス二量体に属する相互作用している２つのＩｇ１−２−３断片からのモジュールのリボン表示を示す。水素結合は破線で示す。
【図６】Ｉｇ３モジュール、Ｐ１−Ｂ、Ｐ３−ＤＥ、Ｐ３−Ｇ、Ｐ３−Ｂぺプチド、及びその誘導体の、ＮＣＡＭをトランスフェクトした繊維芽細胞のコンフルエント単層上に生育したＮＣＡＭ発現ＰＣ１２−Ｅ２細胞から伸びる神経突起に対する効果を示す。（Ａ−Ｆ）ベクターをトランスフェクトしたＡ、Ｃ、Ｅ又はＮＣＡＭ−１４０をトランスフェクトしたＢ、Ｄ、ＦのＬ９２９繊維芽細胞のコンフルエント単層上に生育したＮＣＡＭ発現褐色細胞腫ＰＣ１２−Ｅ２細胞の共焦点顕微鏡写真。ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相互作用はＮＣＡＭ発現（ＬＢＮ）Ｂ対ＮＣＡＭ−陰性（ＬＶＮ）Ａ繊維芽細胞の上に生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞での神経突起伸長を刺激する。組換えＩｇ３モジュールの導入はベクターをトランスフェクトした繊維芽細胞Ｃ上に生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞には影響を与えないが、ＮＣＡＭをトランスフェクトした繊維芽細胞Ｄ上で生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞中の神経突起伸長をＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ相互作用の崩壊の結果として明らかに阻害する。対照的に、Ｉｇ３mut２はベクターをトランスフェクトした繊維芽細胞Ｅ上で生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞にも影響を与えず、またＮＣＡＭ誘導神経突起伸長Ｆの阻害もしない。ペプチドＰ１−Ｂ、Ｐ３−ＤＥ、及びＰ３−ＧはＩｇ３wtＣ、Ｄの効果に匹敵する阻害効果を有するが、一方ではＩｇ３mut１、Ｐ３−Ｂペプチド、及び対照ペプチドの効果はＩｇ３mut２Ｅ、Ｆの効果と同様である。目盛線、２０μｍ。（Ｇ）Ｉｇ３モジュール、Ｐ１−Ｂ、Ｐ３−ＤＥ、Ｐ３−Ｇ、Ｐ３−Ｂペプチド、及びその誘導体の効果は、ＮＣＡＭ−１４０をトランスフェクトした繊維芽細胞上及びベクターをトランスフェクトした繊維芽細胞上で生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞の平均神経突起長の差を１００％に設定して対照の割合として示す。結果は平均値±ＳＥＭ＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１で示す（ＮＣＡＭをトランスフェクトした繊維芽細胞の単層上に生育したＰＣ１２−Ｅ２細胞からの神経突起伸長の誘導と比較して）。
【図７】ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３断片の結晶構造中に実測されたＮＣＡＭによって形成された「コンパクト」、「フラット」、及び「ダブル」の各ジッパー接着複合体を図で示す。個々のＮＣＡＭモジュールを円筒で示す。Ｉｇモジュール及びＦｎＩＩＩモジュールを各々、アラビア数字及びローマ数字で番号を付した。ＮＣＡＭの全部で７個の細胞外モジュールを説明するために、電子顕微鏡的研究に従ってＩｇ４の後ろにベンド（bend）を導入した（Hall and Rutishauser, 1987; Becker et al., 1989）。Ｉｇ１−２−３断片のサイズ及び対向する細胞膜との間の距離を示す。（Ａ）「コンパクト」ジッパーは、対向する２つの細胞膜に由来するＩｇ１−２−３シス二量体の間のＩｇ１−Ｉｇ３及びＩｇ２−Ｉｇ２相互作用によって安定化される。（Ｂ）「フラット」ジッパーは、対向する２つの細胞膜に由来するＩｇ１−２−３シス二量体の間のＩｇ２−Ｉｇ３相互作用によって安定化される。（Ｃ）この２つの型のジッパーは結晶に実測されるように共存してもよく、「ダブル」ジッパー様接着複合体の形成を生じ得る。
【図８】生長培地内中様々な濃度でのペプチドの存在下に２４時間初代培養して単一ニューロンとして生育したＣＧＮのＰ２−ＣＤペプチドの神経突起伸長への効果を証明する。神経突起の長さは任意の単位（ＡＵ）で示す。処理した培養物中の神経突起の長さを非処理の培養物（対照）中の神経突起の長さと比較する（＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０２；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００５）。ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールのペプチド断片であるＰ２ｄ（Soroka et al., 2002参照）をポジティブ対照に使用して、その処置に対する細胞の応答性を示した。
【図９】培養培地中様々な濃度のペプチドの存在下において、２４時間にわたるプライマリーカルチャーにおいて単一ニューロンとして生長したＣＧＮの神経突起伸長に及ぼすＰ３−Ｇペプチドの効果を証明する。神経突起の長さは任意の単位（ＡＵ）で示す。処理培養物中の神経突起の長さを非処理の培養物中の神経突起の長さ（対照）と比較する。Ｐ２ｄをポジティブ対照として使用した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０２；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【図１０】培養培地中様々な濃度のペプチドの存在下において、２４時間にわたるプライマリーカルチャーにおいて単一ニューロンとして生長したＣＧＮの神経突起伸長に及ぼすＰ２−ＥＦペプチドの効果を証明する。神経突起の長さは任意の単位（ＡＵ）で示す。処理した培養物中の神経突起の長さを非処理の培養物中の神経突起の長さ（対照）と比較する。Ｐ２ｄをポジティブ対照として使用した。＊ｐ＜０．０５；＊＊ｐ＜０．０２；＊＊＊ｐ＜０．００１；＊＊＊＊ｐ＜０．０００５。
【図１１】培養培地中様々な濃度のペプチドの存在下において、ＣＧＮとＮＣＡＭを発現する（ＬＢＮ）又はＮＣＡＭを発現しない（ＬＶＮ）遺伝子的に修飾した繊維芽細胞との共培養における、２４時間にわたるプライマリーカルチャーにおいて単一ニューロンとして生長したＣＧＮの神経突起伸長に及ぼすＰ１−ＣＤペプチドの効果を証明する。ペプチドは両培養中のＣＧＮのＮＣＡＭ−非依存性神経突起伸長には影響を与えないが、ＮＣＡＭ−依存性神経突起伸長をＣＧＮ及びＬＢＮ細胞との共培養中のＮＣＡＭ同種親和性接着を阻害することによって阻害することが見られる。神経突起の長さは任意の単位（ＡＵ）で示す。処理した培養物中の神経突起の長さを処理しない培養物中の神経突起の長さ（対照）と比較する。Ｐ２ｄをポジティブ対照として使用した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１２】培養基中の様々な濃度のペプチドの存在下において及びＣＧＮとＮＣＡＭ発現のある（ＬＢＮ）又はＮＣＡＭ発現のない（ＬＶＮ）遺伝子的に修飾した繊維芽細胞との共培養における、２４時間にわたるプライマリーカルチャーにおいて単一のニューロンとして生長したＣＧＮの神経突起伸長に及ぼすＰ２−ＡＢペプチドの効果を証明する。この図からペプチドは両培養基中におけるＮＣＡＭ依存性神経突起伸長には影響を与えず、またＣＧＮ細胞及びＬＢＮ細胞の共培養中ではＮＣＡＭの同種親和性接着を阻害することによってＮＣＡＭ依存性神経突起伸長を阻害することが判明する。軸策の長さは任意的単位（ＡＵ）で示す。処理した培養物中の神経突起の長さを非処理の培養物中の神経突起の長さ（対照）と比較する。Ｐ２ｄをポジティブ対照として使用した。＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１】
2008501620.tif 000003
【図２−１】
2008501620.tif 000004
【図２−２】
2008501620.tif 000005
【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図２−６】
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【図２−７】
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【図２−８】
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【図２−９】
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【図２−１０】
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【図２−１１】
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【図２−１２】
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【図２−１３】
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【図２−１４】
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【図２−１５】
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【図２−１６】
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【図２−１７】
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【図２−１８】
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【図２−１９】
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【図２−２０】
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【図２−２１】
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【図２−２２】
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【図２−２３】
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【図２−２４】
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【図２−２５】
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【図２−２６】
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【図２−２７】
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【図２−２８】
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【図２−２９】
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【図２−３０】
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【図２−３１】
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【図２−３２】
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【図２−３３】
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【図２−３４】
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【図２−３５】
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【図２−３６】
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【図２−３７】
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【図２−３８】
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【図２−３９】
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【図２−４０】
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【図２−４１】
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【図２−４２】
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【図２−４３】
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【図２−４４】
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【図２−４５】
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【図２−４６】
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【図２−４７】
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【図２−４８】
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【図２−４９】
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【図２−５０】
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【図２−５１】
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【図２−５２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年2月17日(2006.2.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールを含むポリペプチドの結晶であって、該ポリペプチドは配列番号４４のアミノ酸残基１〜２８９を含み、ここで該結晶は、表２（図２）の構造座標によって、又はそれから２．５Å又はそれ以下の標準偏差を有する座標によって表される空間的関係に配置された原子を含む、結晶。
【請求項２】
前記ポリペプチドが配列番号４４のアミノ酸１〜２８９と１〜４個のアミノ酸残基の余分なアミノ酸配列とから構成される、請求項１に記載の結晶。
【請求項３】
該結晶が、少なくとも４Åの解像度で原子座標を決定するようにＸ線を回折する、請求項１に記載の結晶。
【請求項４】
前記結晶が、多くとも５.０Åの解像度で原子座標を決定するようにＸ線を効果的に回折する、請求項１に記載の結晶。
【請求項５】
前記結晶が、１.５Åの解像度で原子座標を決定するようにＸ線を効果的に回折する、請求項３又は４に記載の結晶。
【請求項６】
該結晶が、単位格子の次元：ａ＝５１.５Å、ｂ＝１０８.５Å、ｃ＝１４９.０Å、α＝９０°、β＝９０°、γ＝９０°を有する、請求項１に記載の結晶。
【請求項７】
ｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールとの相互作用；
を調整することによってＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整することができる候補化合物を選択する方法であって、
ａ）請求項１に従って結晶ポリペプチドを提供する段階：
ｂ）コンピュータモデリング技術を利用することによって（ａ）のＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの構造モデルを作製する段階；
ｃ）（ｂ）のＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの構造モデルを使用することによって、
ｉ）Ｉｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュールおよびＩｇ３モジュールを含むＮＣＡＭ同種親和性結合部位にてＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと結合し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）Ｉｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュールおよびＩｇ３モジュールを含むＮＣＡＭ同種親和性結合部位にてＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと結合し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）Ｉｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュールおよびＩｇ３モジュールを含むＮＣＡＭ同種親和性結合部位にてＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと結合し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する能力（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｖ）Ｉｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュールおよびＩｇ３モジュールを含むＮＣＡＭ同種親和性結合部位にてＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと結合し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）Ｉｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュールおよびＩｇ３モジュールを含むＮＣＡＭ同種親和性結合部位にてＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと結合し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここで該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；
について化合物をインシリコで評価する段階；
ｄ）少なくとも１つの（ｃ）の相互作用が可能な候補化合物を選択する段階；及び
ｅ）（ｄ）の候補化合物をＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整する能力についてインビトロ検定で試験する段階（該検定は少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞を含む）；及び／又は
ｆ）前記化合物と少なくとも１種のＮＣＡＭ分子の別個な断片とを接触させることによって（ｂ）の少なくとも１種の相互作用について化合物の能力を評価することを含む検定法で（ｄ）の候補化合物を試験する段階（該断片は配列番号４４に示す配列の残基１〜２８９を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの配列に対応する連続するアミノ酸残基の配列を含むものである）；
を含む方法。
【請求項８】
Ｉｇ１モジュール、Ｉｇ２モジュール及びＩｇ３モジュールを含むＮＣＡＭ同種親和性結合部位と結合することができる化合物であって、
ｉ）ＮＣＡＭ同種親和性結合部位でＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと結合し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは対向して接触する細胞の２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭ同種親和性結合部位でＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと結合し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは対向して接触する細胞の２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭ同種親和性結合部位でＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと結合し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣すること（ここで該モジュールは対向して接触する細胞の２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである；）及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭ同種親和性結合部位でＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと結合し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは対向して接触する細胞の２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭ同種親和性結合部位でＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと結合し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整すること（ここで該モジュールは対向して接触する細胞の２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；
が可能であり、配列番号１、２、３、４、７、１０、１１、１２、１３、１４、１６、１７、１８、４０または４１として同定される請求項７に記載の方法により選択されるペプチド配列、または該配列の断片あるいは変異体である化合物。
【請求項９】
該化合物がアミノ酸配列ＷＦＳＰＮＧＥＫＬＳＰＮＱ（配列番号１）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
該化合物がアミノ酸配列ＹＫＣＶＶＴＡＥＤＧＴＱＳＥ（配列番号２）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
該化合物がアミノ酸配列ＴＬＶＡＤＡＤＧＦＰＥＰ（配列番号３）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１２】
該化合物がアミノ酸配列ＱＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号４）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１３】
該化合物がアミノ酸配列ＤＶＲ（配列番号５）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１４】
該化合物がアミノ酸配列ＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号６）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１５】
該化合物がアミノ酸配列ＤＶＲＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号７）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１６】
該化合物がアミノ酸配列ＫＥＧＥＤ（配列番号８）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１７】
該化合物がアミノ酸配列ＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号９）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１８】
該化合物がアミノ酸配列ＫＥＧＥＤＧＩＲＧＩＫＫＴＤ（配列番号１０）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項１９】
該化合物がアミノ酸配列ＤＫＮＤＥ（配列番号１１）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項２０】
該化合物がアミノ酸配列ＴＶＱＡＲＮＳＩＶＮＡＴ（配列番号１２）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項２１】
該化合物がアミノ酸配列ＳＩＨＬＫＶＦＡＫ（配列番号１３）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項２２】
該化合物がアミノ酸配列ＬＳＮＮＹＬＱＩＲ（配列番号１４）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項２３】
該化合物がアミノ酸配列ＲＦＩＶＬＳＮＮＹＬＱＩ（配列番号１５）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項２４】
該化合物がアミノ酸配列ＫＫＤＶＲＦＩＶＬＳＮＮＹＬＱＩ（配列番号１６）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項２５】
該化合物がアミノ酸配列ＱＥＦＫＥＧＥＤＡＶＩＶ（配列番号１７）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項２６】
該化合物がアミノ酸配列ＫＥＧＥＤＡＶＩＶＣＤ（配列番号１８）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項２７】
該化合物がアミノ酸配列ＡＦＳＰＮＧＥＫＬＳＰＮＱ（配列番号４０）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項２８】
該化合物がアミノ酸配列ＡＫＳＶＶＴＡＥＤＧＴＱＳＥ（配列番号４１）を有する、請求項８に記載の化合物。
【請求項２９】
ＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存の調整が処置に必要である疾患の処置のための薬剤の製造を目的とした、請求項８から２８のいずれか一項に記載の１種またはそれ以上の化合物の使用。
【請求項３０】
前記薬剤が、正常な、変性した、又は損傷したＮＣＡＭ提示細胞を処置するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
前記薬剤がＮＣＡＭ提示細胞の分化及び／又は生存の刺激を含む処置のためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３２】
前記薬剤が中枢神経系あるいは末梢神経系の、又は筋肉の、又は様々な器官の、疾患及び病状を処置するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３３】
前記薬剤が、例えば術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成不全、虚血後損傷、例えば発作に起因するもの、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、認知症、例えば多発梗塞性認知症、硬化症、糖尿病併発性神経変性、体内時計又は神経筋肉伝達に影響を与える障害、及び統合失調症、気分障害、例えば躁鬱病などの中枢神経系及び末梢神経系の疾患又は病状の処置のためのもの；例えば器官移植後の、又は例えば遺伝的又は外傷性萎縮性筋肉障害などの神経−筋肉連結の機能障害を有する病状を含む筋肉の疾患又は病状の処置のためのもの；又は、例えば生殖腺の変性状態、例えばＩ型及びII型糖尿病などの膵臓の変性状態、腎臓の変性状態、例えばネフローゼなどの尿細管の変性状態、及び心臓、肝臓及び腸管の変性状態などの様々な器官の疾患又は病状の処置のためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３４】
前記薬剤が、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成不全、虚血後損傷、例えば発作に起因するもの、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、例えば多発梗塞性認知症、硬化症、糖尿病併発性神経変性、体内時計又は神経筋肉伝達に影響を与える障害、及び統合失調症、気分障害、例えば躁鬱病を処置するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３５】
前記薬剤が創傷の治癒を促進するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３６】
前記薬剤が癌を処置するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３７】
前記薬剤が、例えば急性心筋梗塞後又は血管形成後などの心筋細胞の細胞死を予防するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３８】
前記薬剤が血管再生を促進するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項３９】
前記薬剤が学習及び／又は短期及び／又は長期記憶の能力を刺激するためのものである、請求項２９に記載の使用。
【請求項４０】
ＮＣＡＭ同種親和性接着依存性の神経可塑性、細胞の分化及び／又は生存を調整することができる候補化合物をインシリコでスクリーニングするためのＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの結晶の使用。
【請求項４１】
請求項８から２８のいずれか一項に記載の１種又はそれ以上の化合物を含む医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月26日(2007.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
なお別の局面では、本発明は、
ｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ１モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ３モジュールとの相互作用；及び／又は
ｉｉｉ）１つの別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールと他の別個なＮＣＡＭ分子のＩｇ２モジュールとの相互作用；
を調整することによってＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整することが可能な候補化合物を選択する方法であって、
ａ）ＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールを含む可溶性又は結晶ポリペプチドを提供する段階；
ｂ）コンピュータモデリング技術を用いることによって（ａ）のＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの構造モデルを作製する段階；
ｃ）（ｂ）のＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュールの構造モデルを使用することによって
ｉ）ＮＣＡＭのＩｇ１モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ１モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ１モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｉｉ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ３モジュールとの間の相互作用を模倣する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｉｖ）ＮＣＡＭのＩｇ３モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ３モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；及び／又は
ｖ）ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールと相互作用し、それによってＮＣＡＭのＩｇ２モジュールとＩｇ２モジュールとの間の相互作用を模倣及び／又は調整する能力（ここに該モジュールは２つの別個なＮＣＡＭ分子からのものである）；
について化合物をインシリコで評価する段階；
ｄ）（ｃ）の少なくとも１つの相互作用が可能な候補化合物を選択する段階；及び
ｅ）ＮＣＡＭ提示細胞の分化、接着及び／又は生存を調整する能力についてインビトロ又はインビボでの検定で（ｄ）の候補化合物を試験する段階（この検定法は少なくとも１種のＮＣＡＭ提示細胞を含むものである）；及び／又は
ｆ）化合物を少なくとも１種のＮＣＡＭ分子の別個な断片と接触させることによって少なくとも１つの（ｂ）の相互作用について化合物の能力を評価することを含む検定法で（ｄ）の候補化合物を試験する段階（該断片は配列番号４４に示す配列の残基１〜２８９を含むＮＣＡＭのＩｇ１−２−３モジュール配列に対応する連続するアミノ酸残基の配列を含む）；
を含む方法を提供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
情報ライブラリーの設計
情報ライブラリーの設計は所与の仮想ライブラリーへの情報回帰を最適化する分子選択方針である。その目標は特定の試験化合物に対する活性を決定する特徴点（薬効構造）のセットを検出することにある。この情報設計は、得られるサブセットが試験化合物を異なってはいるが重複する方法で応答するように化合物のセットを選択することを目標とする。設計空間内にある各薬効構造がそのセットの分子内で独特の存在パターンを持つように、合成及びスクリーニングのために分子を選択する。この独特の「コード」が化合物のセットを検定する時に、実際の実験結果に係わりなく重要な薬効構造の確認と保持を可能にする。これは各分子内での薬効構造の特殊な存在パターンを作製しようとする様々な方法とは対照的である。
設計空間が与えられると、アルゴリズムは薬効構造クラスの各サイズにわたって最もスムーズな分布を持つ、できるだけ多数の薬効構造の解読を最適化するものを求める。薬効構造のクラスは全てが同じコード又はパターンを持つ薬効構造のサブセットを示す。最適な解は、各個別の薬効構造の解読を可能にする化合物セットであることに留意する。しかしながら、これはソースプール、ビット相関又は限定された選択サイズのいずれかのために可能ではなかろう。分子選択の意味で無理のない最適化のためのコスト係数はクラス分布のエントロピーであって、このエントロピーは次式：
【数１】
2008501620.tif 000089
［式中、Ｈは特徴クラスのエントロピーである；Cは別個なクラスの数である；ｆは設計空間にある特徴点の数である；|Ｃ|はクラスｉのサイズである］
で示される。最適化の過程で、例えばＨが最大になるように、分子を選択する。
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月26日(2007.9.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008501620000001.app
【国際調査報告】
2008501620.tif 000090
2008501620.tif 000091
2008501620.tif 000092
2008501620.tif 000093
2008501620.tif 000094
2008501620.tif 000095