(57)【要約】本発明は、ホモシステインのためのカセットベースの自動アッセイを提供する。【選択図】図１
2008532006.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト又はヒト以外の血管を有する動物の被検体から採取された血液試料中の血漿ホモシステインを分析する方法であって、
前記被検体からの全血試料を以下の試薬−液体稀釈液、還元剤、ホモシステイン変換酵素、選択的に前記酵素のホモシステイン変換反応の阻害剤、細胞溶解剤、前記ホモシステイン変換酵素の変換産物に結合可能な色標識結合剤、及び前記変換産物と競合して前記結合剤に結合可能な微粒子に接触させること；
前記試薬との接触後、結合していない状態及び前記変換産物に結合した状態の前記結合剤を通過させるのには十分であるが、前記微粒子に結合した状態の前記結合剤を通過させるのには不十分な多孔性を示す膜を通して前記試料を引き込むこと；
前記膜上に保持された前記結合剤の色標識を検出すること；
前記全血試料中の赤血球細胞の濃度に依存する補正因子を適用することにより血漿ホモシステイン濃度の示度を前記検出から判断すること；
選択的ではあるが好ましくは、前記血漿ホモシステイン濃度を可視又は電子信号として提示することを含み、
前記試薬との接触が、下記規定に従うことを条件として連続して又は同時に行われる方法。
ｉ）前記溶解剤との接触が、前記稀釈剤、酵素、及び還元剤との接触後に起こること、
ｉｉ）前記阻害剤が存在する場合には前記阻害剤との接触が、前記稀釈剤、酵素、及び還元剤との接触後であって前記溶解剤との接触前に起こること、及び
ｉｉｉ）前記結合剤及び前記微粒子との接触が、前記結合剤及び前記微粒子を共に含む液体との接触を伴わないこと。
【請求項２】
前記膜を通して前記試料を引き込む前に、前記試料中のＤＮＡをフラグメント化する請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試薬の少なくとも１つがビーズ形態で提供される請求項１及び２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４】
前記色標識結合剤が、金属ビーズ標識結合剤である請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
全血を用いる血漿ホモシステインアッセイ用の使い捨てカートリッジであって、
前記カートリッジは、複数ウェルを備えたベース、先端にキャピラリーが付いた取り外し可能なピペット、及びカバーを有し、
前記カバーは、先端に膜が付いたピペットを担持し、
前記ベースのウェルは、以下のアッセイ試薬：液体稀釈剤、還元剤、ホモシステイン変換酵素、選択的に前記酵素のホモシステイン変換反応の阻害剤、細胞溶解剤、前記酵素の変換産物に結合可能な色標識結合剤、及び前記変換産物と競合して前記結合剤に結合可能な微粒子を含み、
前記結合剤及び前記微粒子は異なる前記ウェル内に存在し、
前記阻害剤が存在する場合には、前記阻害剤及び前記酵素は異なる前記ウェルに存在し、
前記溶解剤は、前記酵素並びに前記還元剤及び前記稀釈剤の少なくとも一部を含む１つ又は複数のウェルとは異なるウェルに存在するカートリッジ。
【請求項６】
前記ベースに少なくとも５つのウェルを線形配列で有する請求項５に記載のカートリッジ。
【請求項７】
前記ベースにおける少なくとも１つのウェル内に少なくとも１つの試薬含有ビーズを有する請求項５及び６のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項８】
前記ピペットの少なくとも１つに前記ビーズの少なくとも１つを有する請求項７に記載のカートリッジ。
【請求項９】
前記ベース内の前記ウェルのうちの少なくとも１つにヌクレアーゼを含む請求項５から８のいずれか１項に記載のカートリッジ。
【請求項１０】
血漿及び血液細胞中に存在する分析物を分析する方法であって、
（ａ）全血試料の血漿中の前記分析物の含有量を測定すること、
（ｂ）前記試料のヘマトクリット又はヘモグロビンの含有量を（好ましくは分光測光法で）測定すること、及び
（ｃ）前記測定から前記分析物の血漿濃度を測定することを含む方法。
【請求項１１】
診断用アッセイのための使い捨てカートリッジであって、
少なくとも１つが前記アッセイを実施するための試薬を含む複数のウェルを含むカートリッジ本体を有し、
少なくとも１つのウェルが、溶媒中で、少なくとも１つの前記試薬を放出するビーズを含んでいることを特徴とするカートリッジ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中のホモシステインを分析する方法、及びそのような方法に用いられるアッセイキット関する。
【背景技術】
【０００２】
ホモシステイン（ＨＣｙ）は、蛋白質の合成には用いられないが、細胞及び細胞外液中に低濃度（例えば、通常、成人の血漿中約１０μＭ）で存在する、硫黄を含有する小さなα−アミノ酸である。血漿ＨＣｙのレベルが高いことは、葉酸又はビタミンＢ欠乏及び心臓血管疾患に関係があった。したがって、血漿中のＨＣｙを分析することは臨床上重要な関心事である。
【０００３】
このようなアッセイシステムの１つは、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＡＳＡによって開発され、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから市販されている。販売開始後最初の６年間で、このシステムを使って２，６００万件を上回るこのようなＨＣｙアッセイが行われた。Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ／Ａｂｂｏｔｔ  ＨＣｙアッセイは、血漿中でのＨＣｙのＳ−アデノシル−ホモシステイン（ＳＡＨ）への酵素的変換、及びＳＡＨのイムノアッセイ検出を含む。しかし、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ／Ａｂｂｏｔｔ  ＨＣｙアッセイは、臨床実験室内で実施されるように設計されている。そのため、患者がアッセイの結果を聞くために再訪問する必要がないように、例えば診察室での治療時（ｐｏｉｎｔ−ｏｆ−ｃａｒｅ）に実施可能な形態のＨＣｙアッセイが依然として求められている。
【０００４】
治療時に用いられるアッセイ実施デバイスは、近年、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＡＳＡによって開発された。これは、Ａｆｉｎｉｏｎ（商標）の下で市販されており、例えばＷＯ  ０２／０９０９９５（特許文献１）に記載されている。本明細書では、その内容を参考のために援用する。Ａｆｉｎｉｏｎシステムでは、アッセイを実施するために必要な試薬が予め添加（プレロード）されたいくつかのウェルを含み、特定の試料タイプ及び目的の分析物に対してアッセイをどのように行うかをデバイスが判断できるようにするための十分なコンピュータ読出し可能情報を保持するアッセイカートリッジに試料（例えば、血液、血漿、尿、など）が配置される。
【特許文献１】ＷＯ  ０２／０９０９９５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
我々は、全血を用いて（すなわち、血液試料から細胞を分離する必要なく）、例えば、Ａｆｉｎｉｏｎデバイスを用いて、治療時に実施可能な血漿ＨＣｙのアッセイを開発した。
【０００６】
血漿ではなく、全血を用いることができることにより、医師に求められる試料の取扱いが大幅に簡略化される。
【０００７】
しかし、全血を用いると、血漿ＨＣｙアッセイの性能に深刻な問題を引き起こす。なぜなら、試料中の細胞内ＨＣｙが場合によっては血漿に漏れることがあるからである。実際、現在行われている血漿ＨＣｙの臨床実験室におけるアッセイでは、医師は、細胞内ＨＣｙによる汚染（コンタミネーション）を避けるために、３０分以内に血漿を全血から分離して血漿試料を冷えた状態で保管するように指示されている。細胞内ＨＣｙによる汚染は回避されなければならない。なぜなら、正常／異常血液ＨＣｙの現在の基準が血漿ＨＣｙ用になっており、細胞内ＨＣｙにおいて患者間でどの程度のばらつきがあるのか、これが患者の健康によってどの程度変化するのかについては分かっていないからである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
しかし、我々は、血漿ＨＣｙの酵素イムノアッセイにおいて、結合が起こるまで細胞溶解を遅らせ、ヘマトクリットを補正することによって、分離されていない全血試料を使用可能であることを見出した。
【０００９】
したがって、１つの局面によると、本発明は、ヒト又はヒト以外の血管を有する（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ）動物の被検体から採取された血液試料中の血漿ホモシステインを分析する方法であって、前記被検体からの全血試料を以下の試薬、すなわち、液体稀釈液、還元剤、ホモシステイン変換酵素（ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ）、選択的に前記酵素のホモシステイン変換反応の阻害剤、細胞溶解剤、前記ホモシステイン変換酵素の変換産物に結合可能な色標識結合剤、及び前記変換産物と競合して前記結合剤に結合可能な微粒子に接触させること；前記試薬との接触後、結合していない状態及び前記変換産物に結合した状態の前記結合剤を通過させるのには十分であるが、前記微粒子に結合した状態の前記結合剤を通過させるのには不十分な多孔性を示す膜を通して前記試料を引き込むこと；前記膜上に保持された前記結合剤の色標識を検出すること；前記全血試料中の赤血球細胞の濃度に依存する補正因子を適用することにより血漿ホモシステイン濃度の示度（ｉｎｄｉｃａｔｉｏｎ）を前記検出から判断すること；選択的ではあるが好ましくは、前記血漿ホモシステイン濃度を可視又は電子信号として提示することを含み、前記試薬との接触が、下記規定に従うことを条件として連続して又は同時に行われる方法を提供する。
ｉ）前記溶解剤との接触が、前記稀釈剤、酵素、及び還元剤との接触後に起こること、
ｉｉ）前記阻害剤が存在する場合には前記阻害剤との接触が、前記稀釈剤、酵素、及び還元剤との接触後であって前記溶解剤との接触前に起こること、及び
ｉｉｉ）前記結合剤及び前記微粒子との接触が、前記結合剤及び前記微粒子を共に含む液体との接触を伴わないこと。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明の方法においては、細胞溶解が開始される前（又は開始されるのと同時に）ホモシステイン変換酵素によってＨＣｙの変換を停止又は少なくとも減速させる方策を講じることが好ましい。これは、試料の温度を変化させ、例えば、酵素反応を減速させるか、若しくは酵素を変性させることにより、稀釈することにより、ｐＨを変更することにより、又は、反応を阻害若しくは酵素を変性させるように作用する薬剤を添加することにより（例えば、ＳＤＳなどの界面活性剤、ＮａＳＣＮなどのカオトロピック塩、尿素若しくは塩化グアニジニウムなどの他の公知の変性剤、又は（酵素反応が金属若しくは補助因子を必要とする場合には）金属若しくは補助因子結合剤を用いることにより）成し遂げられ得る。変性界面活性剤が用いられる場合、これは、溶解剤としても機能し得る。便宜上、酵素的ＨＣｙ変換反応に干渉するこのような薬剤を、本明細書では、阻害剤と呼び、本発明の方法の好ましい実施形態では、阻害剤は、用いられる試薬のセットに含まれる。
【００１１】
本発明の方法では、試薬との接触には、所定時間、かつ、好ましくは所定温度における、稀釈剤、還元剤、及び酵素との接触が行われる第一段階と、続いて、微粒子及び結合剤との接触が行われる第二段階との二段階のインキュベーションが含まれることが好ましい。
【００１２】
第１の好ましい実施形態では、接触シーケンスは、以下のとおりである。
ｉ）稀釈液との接触、
ｉｉ）酵素及び還元剤との接触、
ｉｉｉ）インキュベーション、
ｉｖ）微粒子、阻害剤、及び溶解剤との接触、
ｖ）結合剤との接触、
ｖｉ）インキュベーション、及び
ｖｉｉ）膜を通しての引き出し。
【００１３】
第２のさらに好ましい実施形態では、接触シーケンスは、以下のとおりである。
ｉ）稀釈剤との接触、
ｉｉ）還元剤、酵素、及び微粒子との接触、
ｉｉｉ）インキュベーション、
ｉｖ）溶解剤、阻害剤、及び結合剤との接触、
ｖ）インキュベーション、及び
ｖｉ）膜を通しての引き出し。
【００１４】
第３の好ましい実施形態では、接触シーケンスは、以下のとおりである：
ｉ）稀釈剤との接触、
ｉｉ）還元剤、酵素、及び微粒子との接触、
ｉｉｉ）インキュベーション、
ｉｖ）溶解剤及び阻害剤との接触、
ｖ）結合剤との接触、
ｖｉ）インキュベーション、及び
ｖｉｉ）膜を通しての引き出し。
【００１５】
試薬は、概して、使い捨ての複数のウェルを備えたアッセイカートリッジで提供されるのが好ましい。特に好ましくは、このようなカートリッジは、試薬、先端に膜が付いたピペット、及び先端にキャピラリーが付いた取り外し可能なピペットを含んでいなければならない。このようなカートリッジでは、少なくとも、結合剤及び酵素、並びに好ましくは結合剤が乾燥形態で提供され、結合剤と微粒子とが別個のウェルで提供される。
【００１６】
したがって、他の局面によると、本発明は、全血を用いる血漿ホモシステインアッセイ用の使い捨てカートリッジであって、前記カートリッジは、複数のウェルを備えたベース、先端にキャピラリーが付いた取り外し可能なピペット、及びカバーを有し、前記カバーは、先端に膜が付いたピペットを担持し、前記ベースのウェルは、以下のアッセイ試薬：液体稀釈剤、還元剤、ホモシステイン変換酵素、選択的に前記酵素のホモシステイン変換反応の阻害剤、細胞溶解剤、前記酵素の変換産物に結合可能な色標識結合剤、及び前記変換産物と競合して前記結合剤に結合可能な微粒子を含み、前記結合剤及び前記微粒子は異なる前記ウェル内に存在し、前記阻害剤が存在する場合には、前記阻害剤及び前記酵素は、異なる前記ウェルに存在し、前記溶解剤は、前記酵素並びに前記還元剤及び前記稀釈剤の少なくとも一部を含む１つ又は複数のウェルとは異なるウェルに存在するカートリッジを提供する。
【００１７】
第１の好ましい実施形態では、カートリッジは、少なくとも４つのウェルを有し、第１のウェルは、稀釈剤を含み、第２のウェルは、酵素及び還元剤を含み、第３のウェルは、微粒子、溶解剤、及び阻害剤を含み、第４のウェルは、結合剤を含む。第２の好ましい実施形態では、カートリッジは、少なくとも４つのウェルを有し、第１のウェルは、稀釈剤を含み、第２のウェルは、稀釈剤、阻害剤、及び溶解剤を含み、第３のウェルは、酵素、還元剤、及び微粒子を含み、第４のウェルは、結合剤を含む。第３の好ましい実施形態では、カートリッジは、少なくとも４つのウェルを有し、第１のウェルは、稀釈剤を含み、第２のウェルは、酵素、還元剤、及び微粒子を含み、第３のウェルは、稀釈剤、阻害剤、及び溶解剤を含み、第４のウェルは、阻害剤を含む。これら３つのカートリッジ形式は、特に、上記の好ましい接触シーケンスの実施に適切である。
【００１８】
本発明のカートリッジのウェルが液体を含む場合には、ウェルには、取り外し可能又は穿孔可能なクロージャ（例えば、フォイルシール）が設けられているのが好ましい。カバーは、このようなシールを貫通する穿孔管を有するのが好ましく、それ自体が全血試料を引き込んでカートリッジに導入するように用いられる取り外し可能なピペットを保持するように形成されているのが好ましい。
【００１９】
使用前、カートリッジは、密封容器（例えば、フォイルパック）に配置されているのが好ましく、密封容器も、乾燥剤（例えば、シリカゲル）又はモレキュラーシーブを含んでいるのが好ましい。
【００２０】
したがって、第１の好ましいカートリッジの実施形態を用いるアッセイの実施は、以下の工程を含むのが適切である。
１）キャピラリーを血液中に浸し、先端にキャピラリーが付いたピペットをカートリッジ内に配置する工程、
２）カートリッジをアッセイデバイス内に配置し、自動アッセイ作業を開始する工程（すなわち、以下に挙げられる工程は、自動的に実施される）、
３）カバーをベースから除去し、密封されたウェルのシールを取る工程、
４）稀釈剤を第１のウェルから先端にキャピラリーが付いたピペットに導入する工程、
５）血液及び稀釈剤を先端にキャピラリーが付いたピペットから第２のウェルに導入する工程、
６）第２のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
７）インキュベーションの間、先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤を第１のウェルから第３のウェルに導入する工程、
８）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、インキュベートされた液体を第２のウェルから第３のウェルに導入する工程、
９）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、結合剤及び稀釈剤を第４のウェルから第３のウェルに導入する工程、
１０）第３のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
１１）インキュベートされた液体を第３のウェルから先端に膜が付いたピペットへ膜を通過させることによって導入する工程、
１２）膜の外面に保持された結合剤を検出する工程、及び
１３）血漿ＨＣｙ含有量を測定し、その結果を表示及び／又はエクスポートする工程。
【００２１】
第２の好ましいカートリッジの実施形態のためのアッセイ実施シーケンスは、以下のとおりである。
１）キャピラリーを血液中に浸し、先端にキャピラリーが付いたピペットをカートリッジ内に配置する工程、
２）カートリッジをアッセイデバイス内に配置し、自動アッセイ作業を開始する工程（すなわち、以下に挙げられる工程は、自動的に実施される）、
３）カバーをベースから除去し、密封されたウェルのシールを取る工程、
４）稀釈剤を第１のウェルから先端にキャピラリーが付いたピペットに導入する工程、
５）血液及び稀釈剤を先端にキャピラリーが付いたピペットから第３のウェルに導入する工程、
６）第３のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
７）インキュベーションの間、先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤を第１のウェル及び／又は第２のウェルから第４のウェルに導入する工程、
８）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤、溶解剤、及び阻害剤を第２のウェルから第３のウェルに導入する工程、
９）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、結合剤及び稀釈剤を第４のウェルから第３のウェルに導入する工程、
１０）第３のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
１１）インキュベートされた液体を第３のウェルから先端に膜が付いたピペットへ膜を通過させることによって導入する工程、
１２）膜の外面に保持された結合剤を検出する工程、及び
１３）血漿ＨＣｙ含有量を測定し、その結果を表示及び／又はエクスポートする工程。
【００２２】
第３の好ましいカートリッジの実施形態のためのアッセイ実施シーケンスは、以下のとおりである。
１）キャピラリーを血液中に浸し、先端にキャピラリーが付いたピペットをカートリッジ内に配置する工程、
２）カートリッジをアッセイデバイス内に配置し、自動アッセイ作業を開始する工程（すなわち、以下に挙げられる工程は、自動的に実施される）、
３）カバーをベースから除去し、密封されたウェルのシールを取る工程、
４）稀釈剤を第１のウェルから先端にキャピラリーが付いたピペットに導入する工程、
５）血液及び稀釈剤を先端にキャピラリーが付いたピペットから第２のウェルに導入する工程、
６）第２のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
７）インキュベーションの間、先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤を第３のウェルから第４のウェルに導入する工程、
８）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、インキュベートされた液体を第２のウェルから第３のウェルに導入する工程、
９）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、結合剤及び稀釈剤を第４のウェルから第３のウェルに導入する工程、
１０）第３のウェルの内容物を所定期間インキュベートする工程、
１１）インキュベートされた液体を第３のウェルから先端に膜が付いたピペットへ膜を通過させることによって導入する工程、
１２）膜の外面に保持された結合剤を検出する工程、及び
１３）血漿ＨＣｙ含有量を測定し、その結果を表示及び／又はエクスポートする工程。
【００２３】
本発明のアッセイ方法に用いられる少なくとも１つの試薬は、固形状又は半固形状で（例えば、膜、粉、又はビーズとして）提供され得る。ビーズ状の試薬を用いる場合、本明細書に記載されているように、試薬が添加（ロード）されたカートリッジを用いてアッセイが実施される際には特に有利である。なぜなら、カートリッジ保管中に相互作用するかも知れない試薬が、保管中の相互作用の問題を引き起こさずに、同じカートリッジウェルにビーズ状で提供され得るだけでなく、カートリッジローディングの際の柔軟性が向上し、アッセイの実施が設計上向上するからである。さらに、個々の試薬の保管安定性は、溶液状よりもビーズ状の方が高いと思われる。
【００２４】
この結果、本発明のさらに３つの好ましい実施形態では、アッセイカートリッジは、ビーズ状の選択された試薬を含む。したがって、第４の好ましい実施形態では、カートリッジは、少なくとも５つのウェルを有し、第１のウェルは、稀釈剤及び細胞溶解剤を含み、第２のウェルは、稀釈剤を含み、第３のウェルは、結合剤を含む第１のビーズと微粒子を含む第２のビーズとを含み、第４のウェルは、阻害剤を含む第３のビーズを含み、第５のウェルは、酵素及び還元剤を含む第４のビーズ、並びに選択的であるが好ましくは、ヌクレアーゼを含む第５のビーズを含む。第５の好ましい実施形態では、カートリッジは、少なくとも５つのウェルを有し、第１のウェルは、稀釈剤及び細胞溶解剤を含み、第２のウェルは、稀釈剤、及び選択的であるが好ましくは、ヌクレアーゼを含み、第３のウェルは、結合剤を含む第１のビーズと微粒子を含む第２のビーズとを含み、第４のウェルは、阻害剤を含む第３のビーズを含み、第５のウェルは、酵素及び還元剤を含む第４のビーズを含む。第６の好ましい実施形態では、カートリッジは、少なくとも５つのウェルを有し、第１のウェルは、稀釈剤及び細胞溶解剤を含み、第２のウェルは、稀釈剤、及び選択的であるが好ましくは、ヌクレアーゼを含み、第３のウェルは、結合剤を含む第１のビーズと微粒子を含む第２のビーズとを含み、第４のウェルには、試薬は入っておらず、第５のウェルは、阻害剤、及び、それとは別に酵素及び還元剤を含む第３のビーズを含む。
【００２５】
これらの実施形態では、第５及び第４のウェル内のビーズは、先端にキャピラリーが付いたピペット又は先端に膜が付いたピペットのそれぞれ内部に配置されているのが望ましい。第５のウェルがビーズを含む場合、先端にキャピラリーが付いたピペットの貯蔵部（リザーバー）内であるのが好ましい。直前に記載された実施形態では、これらのビーズは、酵素及び還元剤を含む。第６の実施形態では、第５のウェルもまた、例えば、ウェルのベースにおける逆円錐形のプラスチックカップ内に（すなわち、ビーズとは別個に）乾燥形態で阻害剤を含む。
【００２６】
したがって、第４及び第５の好ましいカートリッジの実施形態を用いるアッセイの実施には、以下の工程を含むことが適切である。
１）キャピラリーを血液中に浸し、先端にキャピラリーが付いたピペットをカートリッジ内に配置する工程、
２）カートリッジをアッセイデバイス内に配置し、自動アッセイ作業を開始する工程（すなわち、以下に挙げられる工程は、自動的に実施される）、
３）カバーをベースから除去し、密封されたウェルのシールを取る工程、
４）稀釈剤を第２のウェルから先端にキャピラリーが付いたピペットに導入する工程、
５）血液、稀釈剤、及び酵素を先端にキャピラリーが付いたピペットから第２のウェルに流す工程、
６）第２のウェルの内容物をインキュベートする工程、
７）稀釈剤及び細胞溶解剤を第１のウェルから先端に膜が付いたピペットに導入し、第１のウェルに流し戻す工程、
８）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤、細胞溶解剤、及び阻害剤を第１のウェルから第２のウェルに導入する工程、
９）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、溶解した試料を第２のウェルから第３のウェルに導入する工程、
１０）第３のウェルの内容物をインキュベートする工程、
１１）インキュベートされた液体を第３のウェルから先端に膜が付いたピペットへ膜を通過させることによって導入する工程、
１２）膜の外面に保持された結合剤を検出する工程、及び
１３）血漿ＨＣｙ含有量を測定し、その結果を表示及び／又はエクスポートする工程。
【００２７】
第６の好ましいカートリッジの実施形態を用いるアッセイ実施には、以下の工程を含むことが適切である。
１）キャピラリーを血液中に浸し、先端にキャピラリーが付いたピペットをカートリッジ内に配置する工程、
２）カートリッジをアッセイデバイス内に配置し、自動アッセイ作業を開始する工程（すなわち、以下に挙げられる工程は、自動的に実施される）、
３）カバーをベースから除去し、密封されたウェルのシールを取る工程、
４）稀釈剤を第２のウェルから先端にキャピラリーが付いたピペットに導入する工程、
５）血液、稀釈剤、及び酵素を先端にキャピラリーが付いたピペットから第２のウェルに流す工程、
６）第２のウェルの内容物をインキュベートする工程、
７）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤及び細胞溶解剤を第１のウェルから第５のウェルに導入して阻害剤を溶解する工程、
８）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤、細胞溶解剤、及び阻害剤を第５のウェルから第１のウェルに移す工程、
９）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、稀釈剤、細胞溶解剤、及び阻害剤を第１のウェルから第２のウェルに移す工程、
１０）先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて、溶解した試料を第２のウェルから第３のウェルに導入する工程、
１１）第３のウェルの内容物をインキュベートする工程、
１２）インキュベートされた液体を第３のウェルから先端に膜が付いたピペットへ膜を通過させることによって導入する工程、
１３）膜の外面に保持された結合剤を検出する工程、及び
１４）血漿ＨＣｙ含有量を測定し、その結果を表示及び／又はエクスポートする工程。
【００２８】
それぞれの場合、試料のヘモグロビン含有量は、膜を通して試料を引き込む前に分光測光法によって測定されるのが好ましい。これは、試料が細胞溶解剤と接触した後に行われるのが望ましい。
【００２９】
液体が１つのウェルから他のウェルに移される場合、一般に、ドナーウェルの液体の全含有量ではなく、所定の容量が移される。
【００３０】
本発明の方法において用いられるホモシステイン変換酵素は、結合剤に直接的又は間接的に結合可能なホモシステイン変換産物を生成する任意の酵素であればよい。この場合、間接的な結合とは、最初の酵素的変換産物が、その産物が結合剤に結合可能であるさらなる反応において、反応物として用いられ得ることを意味する。いくつかのホモシステイン変換酵素が公知であり、使用できる。例えば、シスタチオニンβシンターゼ、ホモシステイナーゼ、ホモシステインデスルフラーゼ、メチオニンシンターゼ、ジメチルテチンホモシステインメチルトランスフェラーゼ、ベタイン−ホモシステインメチルトランスフェラーゼ、５−メチルテトラヒドロ葉酸−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、５−メチルテトラヒドロプテロイルトリグルタミン酸−ホモシステインＳ−メチルトランスフェラーゼ、Ｏ−スクシニルホモセリン−β−リアーゼ、及びＳ−アデノシルホモシステインヒドロラーゼ（ＳＡＨ−ヒドロラーゼ）などが挙げられる。ＳＡＨ−ヒドロラーゼ、特に、組換えＳＡＨ−ヒドロラーゼを用いるのが好ましい。これらの酵素を用いたホモシステインの酵素的変換には、ＳＡＨ−ヒドロラーゼの場合にはアデノシン若しくはアデノシン類似体、又はホモシステイナーゼの場合には水などのさらなる反応物「補助基質（ｃｏ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）」が必要な場合がある。補助基質が必要な場合、補助基質は、一般に、本発明のアッセイ方法及びカートリッジでは、試薬として提供される。このような補助基質は、１回目のインキュベーションに間に合うように血液試料と接触されるが、通常、稀釈剤中に又は酵素と共に存在させることができる。
【００３１】
酵素がＳＡＨ−ヒドロラーゼである場合、分析物は、一般に、アデノシン若しくはＳＡＨ、又はこれらのうちの１つの酵素的変換産物である。しかし、ＳＡＨが好ましい分析物である。酵素がホモシステインデスルフラーゼである場合、分析物は、一般に、α−ケトンブチラート（ａｌｐｈａ−ｋｅｔｏ  ｂｕｔｙｒａｔｅ）の酵素的変換産物である。
【００３２】
本発明により用いられる稀釈剤は、ｐＨが通常６から１０、より好ましくは７から９、特に７．２から８．５である水性のもの（例えば、水）又は水性緩衝剤（例えば、リン酸、炭酸、ホウ酸、ＭＯＢＳ、ＨＥＰＥＳ，トリス、又はグリシルグリシン緩衝剤）であるのが好ましい。このようなｐＨをもつ他の緩衝剤を用いてよいことは言うまでもない。
【００３３】
本発明により用いられる還元剤は、血漿中で生じ得る様々な形態のＨＣｙを遊離ホモシステインに変換するように作用する。還元剤のこのような使用は、血漿ＨＣｙアッセイにおいて従来から行われている。用いられ得る適切な還元剤の例としては、ジチオール類（特に、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ジチオエリスロール（ＤＴＥ）、及びビス−（２−メルカプトエチル）スルホン）、ホスフィン類（例えば、トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、トリフェニルホスフィン、及びトリ−ｎ−ブチル−ホスフィン）、ボラン類（例えば、ボラン−テトラヒドロフラン複合体、ジメチルスルフィド−ボラン、及びデカボラン）、ボロヒドリド類（例えば、ＮａＣＮＢＨ3、ＮａＢＨ4、及びトリアセトキシボロヒドリド）、ヒドリド類（例えば、ＬｉＡｌＨ4）、並びにシラン類（例えば、Ｅｔ3ＳｉＨなどのアルキルシラン類、フェニルシラン類、及びトリス（トリメチルシリル）シラン）が挙げられる。トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン：ＨＣｌ（ＴＣＥＰ）を用いるのが特に好ましい。
【００３４】
本発明により用いられる阻害剤は、試料中の細胞が溶解する前にホモシステイン変換を停止するように作用し、アッセイによって測定される血漿ＨＣｙ値の、細胞内ＨＣｙからの多大な影響力によるコンタミネーションを防止する。酵素阻害剤は、周知である。一般に、このような阻害剤は、例えば、天然の基質の特性を模倣することによって、酵素と直接結合してその作用を阻止し、それによって、例えば、酵素又は他の産物の生成を阻止する。しかし、他の阻害剤は、基質若しくはコファクター、又は酵素プロセス中に形成された分子若しくは中間物に作用し（それによって、通常の最終産物の形成を防止することができる）。ＳＡＨ−ヒドロラーゼの場合、例えば、チオール基と反応するか、又はチオール基に干渉する試薬は、阻害剤として機能する。なぜなら、遊離チオール基は、この酵素の生物学的作用に必要だからである。例としては、メルチオレート（Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ；チメロサール）及びマレイミド化合物（例えば、Ｎ−エチルマレイミド）が挙げられる。他の阻害剤の例としては、アデニン類似体及びアデニンヌクレオシド類が挙げられる。さらなる阻害剤としては、Ｄ−エリタデニン、９−β−Ｄ−キシロフラノシルアデニン、アデニン９−(−Ｄ−アラビノフラノシド、エリスロ−９−（２−ヒドロキシ−３−ノニル）−アデニン、過ヨウ素酸アデノシン、２’−デオキシアデノシン、３’−デオキシアデノシン、２’，３’−ジデオキシアデノシン、炭素環式アデノシン、２−クロロ−アデノシン、２−クロロデオキシアデノシン、アデノシンジアルデヒド、Ｎ６−メチルアデノシン、コホルマイシン、２’−デオキシコホルマイシン、ホルマイシン、２−アミノ−６−クロロ−プリンリボシド、ネブラリン、ピラゾマイシン（ｐｙｒａｚｏｍｙｃｉｎ）、３−デアザ（＋／−）−アリステロマイシン、アリステロマイシン（及びそのハロビニル誘導体）、ツベリシン、並びに、アラ−Ａ及びその誘導体（例えば、２−クロロ−アラ−Ａ）が挙げられる。メルチオレート（Ｍｅｒｔｈｉｏｌａｔｅ；チメロサール）を用いるのが好ましいが、例えば、３００μｇ／ｍＬの作用濃度で、Ｎ−エチルマレイミドを用いるのが特に好ましい。組換えＳＡＨ−ヒドロラーゼ及びその機能を阻害する様々な物質に関する刊行物へのリンクは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｐｄｇ．ｃｎｂ．ｕａｍ．ｅｓ／ＵｎｉＰｕｂ／ｉＨＯＰ／ｇｓ／９５８２２．ｈｔｍｌ．において見出せる。
【００３５】
本発明によって用いられる細胞溶解剤は、血液細胞が膜の外面に保持されないように血液細胞を破壊するように作用する。細胞溶解剤は、周知であり、本発明により用いられる適切な細胞溶解剤として、界面活性剤、例えば、尿素、デオキシコレート、エンピゲン、アモニクス（ａｍｍｏｎｙｘ）、ＳＤＳ、セシト（ｔｈｅｓｉｔ）（例えば、ルブロールＰＸ及びＣ１２Ｅ９）、及びトリトンＸ１００（例えば、ノニデットＰ４０）が挙げられる。０．４重量％での作用濃度でＳＤＳを用いるのが好ましい。
【００３６】
試料が多孔膜を通して引き出されて膜によって保持された物質が検出される前に試料中の細胞が溶解される、本発明のようなアッセイ方法では、細胞溶解によって放出されるＤＮＡが膜孔に少なくとも部分的に詰まる可能性がある。これは、特に、試料が高濃度の白血球を含んでいる場合に起こる。したがって、膜孔の詰まりは、ＤＮａｓｅ、すなわち、ヌクレアーゼを用いて、細胞溶解によって放出されるＤＮＡを消化させることによって低減され得る。ヌクレアーゼは、試料が膜を通して引き出される前の任意の時点で、試料と接触させればよい。
【００３７】
ヌクレアーゼは、アクチベータ、例えば、Ｍｇ2+などの２族金属イオンを必要とし、この場合、ヌクレアーゼとアクチベータとの接触は、試料が膜を通して引き出される前に試料とヌクレアーゼとの接触が起こるのであれば、試料とヌクレアーゼとの接触前、接触中、又は接触後でよい。しかし、ヌクレアーゼとアクチベータとの接触は、試料とヌクレアーゼとの接触と同時であることが好ましい。ヌクレアーゼ及びヌクレアーゼが必要とするアクチベータは、周知であり、例えば、Ｍｅｒｃｋからベンゾナーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）として市販されている。
【００３８】
本発明により用いられる結合剤は、試料中に存在する他の物質に対してよりも酵素的変換産物及びその競合剤（微粒子）に優先的に結合する任意の物質であればよい。結合剤は、共有結合又はその他の方法で共に結合若しくは保持された２つの機能部、すなわち、色標識及び結合部分から構成される。色標識は、可視範囲で光を吸収、放射、散乱、又は生成する材料、例えば、発色団又は蛍光体であるのが望ましい。しかし、赤外線又はＵＶの領域における光を吸収、放射、散乱、又は生成する色標識を用いてもよい。したがって、色標識は、発色団又は蛍光体などの分光測光法によって検出可能な任意の部分、又は分光測光法によって読み取り可能な色、蛍光、発光、若しくは散乱信号を生成することが可能な酵素標識（例えば、アルカリホスファターゼ、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、若しくはホタルルシフェラーゼ）であってよい。例えば、約１００から２００ｎｍのクラスター用のモード粒径を有する金又は他の金属のクラスタードコロイドを用いるのが特に好ましい。結合部分は、抗体、フラグメント、若しくはその構築物、又は小さな有機分子等であってよい。抗体及び抗体フラグメント又は構築物を用いるのが好ましい。用いられる酵素がＳＡＨ−ヒドロラーゼである場合、抗ＳＡＨ抗体、特にこのような抗体の組換え体を用いるのが好ましい。このタイプの抗体については、例えば、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＡＳＡの特許公報（例えば、ＷＯ  ００／４０９７３）に記載されている。本明細書では、その開示を参考のために援用する。具体的には、モノクローナル抗ＳＡＨ抗体は、ＷＯ  ４０９７３の実施例１に記載されているように製造され得る。このような抗体への金コロイドの結合は、ＵＳ−Ａ−５６９１２０７及びＵＳ−Ａ−５６５０３３３に記載されているように行われ得る。
【００３９】
本発明により用いられる微粒子は、稀釈剤に懸濁し、膜によって保持され得る任意の物質であればよい。微粒子は、同様に、２つの機能成分、すなわち、膜に保持されるバルキー部（ｂｕｌｋｙ  ｅｎｔｉｔｙ）及び結合剤に結合する競合部を有し、これら２つの機能成分は、共有結合又は他の相互作用によって結合している。バルキーな物質（ａｇｅｎｔ）は、好ましくは、白色又は無色の、例えば、ポリマー粒子（例えば、テックス粒子）である。競合部分は、通常、酵素的変換産物、又はその類似体若しくはフラグメントである。酵素がＳＡＨ−ヒドロラーゼである場合、競合部は、Ｓ−アデノシル−システインであるのが好ましい。競合部をバルキー部分にカップリングさせるために用いられる化学技術は、明らかに、反応のために利用できる後者の官能基の特性に依存する。通常、水溶性カルボジイミド類（例えば、１−エチル−３−（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ／ＥＤＡＣ））などの連結剤、ビス（スルホ−スクシンイミジル）スベレート（ＢＳ3）などのホモ二官能連結剤、を用いてもよいが、バルキー部がクロロメチル若しくはアルデヒドなどの反応性の基若しくは予め活性化された基を担持する場合には、連結は直接行われてもよい。好ましくは、競合部は、まず、蛋白質−競合部複合体がバルキー部にカップリングされる前に蛋白質（例えば、アルブミン、より好ましくはチログロブリン）にカップリングされる。このようなカップリングの化学的性質は、当該技術分野で十分確立されている。
【００４０】
本発明により用いられる膜は、微粒子を保持するが、結合剤とその変換産物との複合体を透過させるような多孔性を示す任意の物質であれよい。膜材料を選択する際に考慮されなければならない要因としては、孔径、強度、及び接着性が挙げられる。孔径は、所望の複合体を停止させるように十分に小さく、非複合物質及び望ましくない複合体を透過させるように十分に大きい。小さな微粒子（例えば、０．１から１．０μｍ）を用いることによって、大きな微粒子（例えば、１から１０μｍ）よりもより良好な信号が提供されるものの、膜の詰まりは激しくなる。したがって、好ましい微粒子の粒径は、１から２μｍであり、膜孔径は、これに従って選択されるのが好ましい。親水性ポリエーテルスルホン及びアクリルコポリマー膜（例えば、孔径が０．８μｍより大きい）が用いられるのが好ましい。このような膜は、ＰａｌｌからＳｕｐｏｒ及びＶｅｒｓａｐｏｒとして入手できる。膜は、そのピペットに付着又は溶着され得る。好ましくは、膜は平坦であり、ピペットの軸に対して傾斜して（すなわち、垂直と水平との間に）配置される。この配置については、ＷＯ  ０２／０９０９９５に記載され、Ａｘｉｓ−Ｓｈｉｅｌｄ  ＡＳＡから販売されているＡｆｉｎｉｏｎカートリッジにおいて見られる。
【００４１】
少なくとも、本発明により用いられるカートリッジ内のピペットを有さないウェルは、ウェルの軸に垂直な面に対してある角度で傾斜した平坦で透明なベースを有して、断面が長方形であるのが望ましい。
【００４２】
適切な分析物が生成されるように酵素反応が完全に起こるようにするためには、上記のように、試料をインキュベートすることが望ましい。同様に、適切な信号が生成されるように十分な結合剤の結合が起こるようにするためには、試料をもう一度インキュベートすることが望ましい。換言すると、いずれの反応も平衡になる必要はなく、ユーザがアッセイを最適に受け入れられるようにアッセイの所望の精度に適合しさえすれば、インキュベーション時間は、できるだけ短く保持されるのが望ましい。通常、このようなインキュベーションは、２０℃〜４５℃、好ましくは、３０℃〜４５℃、最も好ましくは３６℃〜４２℃である。適切なインキュベーション時間は、一般に、０．５分〜１０分、好ましくは０．７５分〜５分、より好ましくは１分〜３分の範囲である。酵素インキュベーションについては、１分〜２分が最も好ましい範囲である。
【００４３】
血漿ＨＣｙについて測定された値が血液試料の相対的な血漿含有量に対して補正され得るように（これは、ヘマトクリットは患者によって変化し得るためである）、医師がヘマトクリットについての（又はヘマトクリットを示す）値を入力するか、より好ましくは、アッセイ工程中にヘマトクリットについての（又はヘマトクリットを示す）値を測定しなければならない。このため、試料のヘモグロビンの含有量は、細胞溶解の前、又はより好ましくは細胞溶解の後に分光測光法によって測定され得る。測定が細胞溶解の前に行われる際には、バックグラウンド補正は、例えば、赤外線範囲でなされる分光測光測定を用いて行われるのが好ましい。測定されたヘマトクリットの値が異常に低い、例えば、０．３未満、特に、０．２５未満である場合、本発明の方法では、ヘマトクリット値、又はヘマトクリット値が低いことを知らせる警告を（視覚的又は電子的に）提示することも好ましい。必要に応じて、ヘマトクリット値をともかく提示してもよい。
【００４４】
ヘモグロビンの含有量は、光散乱、透過率、又は反射率によって測定され得る。ヘモグロビンの含有量は、例えば、光源として緑色又は青色ダイオードを用いて、吸収率によって測定されるのが好ましい。膜上に残存する結合剤の濃度は、一般に、例えば、光源として緑色又は青色ダイオードを用いて、反射率によって測定される。
【００４５】
大抵のアッセイについては、アッセイは、例えば、ＨＣｙ含有量が既知の標準物質を用いることによって較正されるのが好ましい。用いられる試薬用の較正データには、例えば、カートリッジ又はそのパッケージング上にバー若しくは他の機械読出し可能コードがエンコードされたカートリッジが設けられているのが好ましい。
【００４６】
本発明の方法は、３０μＭまでの血漿ＨＣｙレベルを定量化する際に特に効果的である。血漿ＨＣｙが３０μＭを上回る場合、アッセイ出力は、血漿ＨＣｙ含有量が異常に高いことだけを単に示してもよい。通常のレベルは、一般に、１０〜１５μＭ以下であり、これより高いレベルでは、例えば、ビタミンＢ若しくは葉酸の補給又は心臓血管障害の検査のために医師の介入が必要とされる。通常の血漿ＨＣｙ値よりも低い値は、一般に問題であるとはみなされず、子供及び総合ビタミン補給をしている患者では、値は、約５μＭ程度であればよい。
【００４７】
血液細胞内にも存在する細胞外分析物の血漿含有量を測定するために、全血に対して診断アッセイを実施することは、新規のことであり、本発明のさらなる態様を構成する。この態様によると、本発明は、血漿及び血液細胞中に存在する分析物を分析する方法であって、（ａ）全血試料の血漿中の前記分析物の含有量を測定すること、（ｂ）前記試料のヘマトクリット又はヘモグロビンの含有量を（好ましくは分光測光法で）測定すること、及び（ｃ）前記測定から前記分析物の血漿濃度を測定することを含む方法を提供する。
【００４８】
したがって、工程（ａ）は、全血試料中の細胞が無傷の状態で前記全血試料の血漿中の分析物を反応させて検出可能な種（産物）を生成すること、細胞内分析物が反応して前記産物を形成しない条件下で前記細胞を溶解すること、及び、前記産物を検出することを含み得る。
【００４９】
試薬がビーズの形態で提供される場合、これらの試薬は、乾燥試薬及び選択的に不活性かつ好ましくは非吸湿性のバインダー（例えば、トレハロース又はＰＥＧなどの糖）でコーティング又は含浸された不溶性ビーズであってよい。しかし、ビーズは、試薬及び不活性バインダーを含む水溶性のビーズであるのが好ましい。このようなビーズは、例えば、５〜１００μＬ（好ましくは１０〜５０μＬ）の緩衝試薬溶液の液滴を凍結させ、次いで、凍結された液滴を凍結乾燥させることによって調製され得る。
【００５０】
このような試薬ビーズを診断アッセイ、特に、カートリッジベースのアッセイに用いることは新規であり、本発明さらなる局面を構成する。したがって、本発明の他の局面によると、本発明は、診断用アッセイ、例えば、体液、塊、若しくは組織試料中の分析物のアッセイ用の使い捨てカートリッジであって、少なくとも１つ、好ましくは、少なくとも２つが前記アッセイを実施するための試薬を含む複数のウェルを備えたカートリッジ本体を有し、少なくとも１つのウェルが、溶媒（例えば、水）中で、少なくとも前記１つの試薬を放出するビーズを含んでいることを特徴とするカートリッジを提供する。ビーズ形態で提供可能な試薬としては、例えば、分析物結合剤、競合結合微粒子、酵素（例えば、ヌクレアーゼ、分析物（例えば、ホモシステイン）変換酵素、等）などが挙げられる。このようなカートリッジを用いて分析される分析物はホモシステインであることが好ましいが、他の任意の適切な分析物、例えば、Ｃ反応性蛋白質、凝固因子、トランスフェリン、フェリチン、等であってもよい。
【００５１】
これより、本発明の方法及びカートリッジを以下の限定しない実施例及び添付の図面を参照しながらさらに説明する。
【００５２】
図１を参照すると、内部に５つのウェル２、３、４、５、６（実施例では、それぞれ、ウェルＥ、Ｄ、Ｃ、Ｂ、及びＡと呼ぶ）と支持脚部７とを備えた透明なプラスチックベース１を有する５ウェルアッセイカートリッジが示されている。ウェル２、３、及び４は、フォイル８で密封されている。カートリッジカバー９（一部のみ図示）は、先端にキャピラリーが付いたピペット１０及び膜先端１２を有する固定ピペット１１を備える。ウェル２から４の内容物は、実施例１に記載されるとおりである。図示される矢印は、実施例２に記載される連続した物質の移動を示す。
【００５３】
図２は、ウェル２から４の内容物が実施例３に記載されるとおりであることを除いて、図１と類似しており、矢印は、実施例４に記載される連続した物質の転送を示す。
【００５４】
図３は、ウェル２から４の内容物が実施例５に記載されるとおりであることを除いて、図１と類似しており、矢印は、実施例６に記載される連続した物質の転送を示す。
【００５５】
図４は、ウェル２から４の内容物が実施例７に記載されるとおりであることを除いて、図１と類似しており、矢印は、実施例８に記載される連続した物質の転送を示す。
【００５６】
図５は、ウェル１から５の内容物が実施例９に記載されるとおりであることを除いて、図１と類似しており、矢印は、実施例１０に記載される連続した物質の転送を示す。
【００５７】
図６は、ウェル１から５の内容物が実施例１１に記載されるとおりであることを除いて、図１と類似しており、矢印は、実施例１２に記載される連続した物質の転送を示す。
【００５８】
図７は、ウェル１から５の内容物が実施例１３に記載されるとおりであることを除いて、図１と類似しており、矢印は、実施例１４に記載される連続した物質の転送を示す。
【００５９】
図８を参照すると、実施例２において設定されている物質転送のシーケンスが、図８Ａから図８Ｘに示されている。
【００６０】
実施例において、パーセントは、特に規定のない限り、重量に基づいている。
【実施例１】
【００６１】
図１のアッセイカートリッジ
ウェルＡ
このウェルは、ＷＯ  ００／４０９７３の実施例１に記載されるようにして調製され、ＵＳ−Ａ−５６９１２０７及びＵＳ−Ａ−５６５０３３３に記載されるように結合され、逆円錐形のプラスチックカップ上に真空乾燥された金コロイド（粒子径：約１００ｎｍ）と抗ＳＡＨ抗体との複合体を約２２μｇ含む。
ウェルＢ
このウェルは、約４ｍｍ×８ｍｍのＳｕｐｏｒ８００膜（Ｐａｌｌ−孔径０．８μｍ）が先端に付いたピペットを含む。
ウェルＣ
このウェルは、酵素阻害剤（０．２％メルチオレート（チメロサール））及び溶解剤（１％トリトンＸ−１００）を含有する１８５μｌの緩衝剤（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、又は、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１）を含む。
ウェルＤ
このウェルは、０．２７μｇアデノシン、５０μｇ微粒子（Ｓ−アデノシル−システインを結合した１μｍのラテックス粒子）又は３００μｇ微粒子（Ｓ−アデノシル−システインを結合した２μｍのラテックス粒子）、約５ユニットの組換えＳＡＨ−ヒドロラーゼ、及び、還元剤（２３μｇＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスファイン：ＨＣｌ））を含む。これらの内容物の濃縮水溶液がウェルに添加され、次いで真空乾燥されている。
ウェルＥ
このウェルは、３００〜３５０μＬの緩衝剤（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、又は、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１）を含む。
【実施例２】
【００６２】
図１／実施例１におけるアッセイ実施
ウェルＡに示されるキャピラリー中の血液試料（５〜１０μＬ）を、ウェルＥから２００μＬの緩衝剤を引き込むことによって稀釈し、空になるまでウェルＤに移す。キャピラリーピペットを用いてウェルＣの８５μＬの内容物をウェルＡに移して、金複合体を溶解させる。キャピラリーピペットを用いてウェルＤの１００μＬの内容物をウェルＣに移す前に、カートリッジを３７℃で３分間インキュベートする。次に、ヘマトクリットレベルを、ウェルＣの内容物による緑色又は青色ダイオードからの光の吸光度を検出ことによって測定する。次に、キャピラリーピペットを用いて、ウェルＡの６０μＬの内容物をウェルＣに移す。次に、カートリッジを３７℃で１分間インキュベートする。次に、ウェルＣの全内容物（選択的に、続いてウェルＥに残存する緩衝剤）を先端に膜が付いたピペットに引き込み、バックグラウンドを低減させる。次に、膜の外側に保持される（２回目のインキュベーションで形成される金／ラテックス複合体に対応する）金コロイドを、緑色又は青色ダイオード照射を用いて反射モードで検出する。
【００６３】
アッセイは、ＨＣｙ含有量が既知の標準物質にして較正され、同様に、ヘマトクリット測定（例えば、一連の血液試料についての遠心分離を利用したマトクリット測定）も標準物質に対して較正される。
【実施例３】
【００６４】
図２についてのアッセイカートリッジ
ウェルＡ
約２２μｇの複合体を用いること以外は実施例１と同様。
ウェルＢ
実施例１と同様。
ウェルＣ
このウェルは、０．２７ｇアデノシン、２０μｇ微粒子（Ｓ−アデノシル−システインを結合した１μｍのラテックス粒子）又は１６０μｇの微粒子（Ｓ−アデノシル−システインを結合した２μｍのラテックス粒子）、約５ユニットの組換えＳＡＨ−ヒドロラーゼ、及び、還元剤（２３μｇトリス（２−カルボキシエチル）ホスファイン：ＨＣｌ）を含む。これらの内容物の濃縮水溶液がウェルに添加され、次いで真空乾燥されている。
ウェルＤ
このウェルは、酵素阻害剤（０．４％メルチオレート（チメロサール））及び溶解剤（２％のトリトンＸ−１００）を含有する、２２５μＬの緩衝剤（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、又は、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１）を含む。
ウェルＥ
このウェルは、３５０μＬの緩衝剤（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、又は、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１）を含む。
【実施例４】
【００６５】
図２／実施例３におけるアッセイの実施
キャピラリーピペットに引き込まれた血液試料（５〜１０μＬ）を、１６０μＬの緩衝剤をウェルＥからキャピラリーピペットに引き込むことによって稀釈する。次に、キャピラリーピペットの内容物をウェルＣに排出する。キャピラリーピペットを用いて８５μＬの緩衝剤をウェルＥ（又はウェルＤ）からウェルＡに移す。次に、カートリッジを３７℃で３分間インキュベートする。次に、キャピラリーピペットを用いて、ウェルＤの４０μＬの内容物をウェルＣに移す。次に、ウェルＣの内容物を用いて、ヘマトクリット値を実施例２のように測定する。キャピラリーピペットを用いて、ウェルＡの６０μＬの内容物をウェルＣに移し、カートリッジを３７℃で１分間インキュベートする。ウェルＣの内容物（選択的に、続いてウェルＤ及び／又はＥの残りの内容物）を先端に膜が付いたピペットで引き込み、膜の外側に保持された金コロイドを実施例２のように測定する。較正を実施例２のように行う。
【実施例５】
【００６６】
図３におけるアッセイカートリッジ
ウェルＡ
実施例１と同様。
ウェルＢ
実施例１と同様。
ウェルＣ
このウェルは、２０μｇ微粒子（Ｓ−アデノシル−システインを結合した１μｍのラテックス粒子）又は１６０μｇ微粒子（Ｓ−アデノシル−システインを結合した２μｍのラテックス粒子）、７５μｇメルチオレート（チメロサール）、及び７５０μｇトリトンＸ−１００を含む。これらの内容物の濃縮水溶液がウェルに添加され、次いで真空乾燥されている。
ウェルＤ
このウェルは、０．２７μｇアデノシン、５ユニットの組換えＳＡＨ−ヒドロラーゼ、及び２３μｇＴＣＥＰ：ＨＣｌを含む。これらの内容物の濃縮水溶液がウェルに添加され、次いで真空乾燥されている。
ウェルＥ
このウェルは、３５０μＬの緩衝剤（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、又は、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１）を含む。
【実施例６】
【００６７】
図３／実施例５におけるアッセイの実施
キャピラリーピペット中の血液試料（５〜１０μＬ）を、ウェルＥから１７５μＬの緩衝剤を引き込むことによって稀釈し、ウェルＤに排出する。次に、キャピラリーピペットを用いて８０μＬの緩衝剤をウェルＥからウェルＡに移す。次に、カートリッジを３７℃で３分間インキュベートする。次に、キャピラリーピペットを用いてウェルＤの７５μＬの内容物をウェルＣに移す。次に、ウェルＣの内容物を用いて、ヘマトクリット値を実施例２のように測定する。次に、キャピラリーピペットを用いてウェルＡの５０μＬの内容物をウェルＣに移す。次に、カートリッジを３７℃で１分間インキュベートする。次に、ウェルＣの内容物（選択的に、続いてウェルＥの内容物）を先端に膜が付いたピペット内に引き込み、次に、膜の外側に保持された金コロイドを実施例２のように測定する。較正を実施例２のように行う。
【実施例７】
【００６８】
図４におけるアッセイカートリッジ
ウェルＡ
実施例３と同様。
ウェルＢ
実施例１と同様。
ウェルＣ
このウェルの内容物は、４．５μｇ／ｍｌアデノシン、３３０μｇ／ｍｌ微粒子（Ｓ−アデノショル−システインを結合した１μｍのラテックス粒子）又は２．７ｍｇ／ｍＬ（Ｓ−アデノシル−システインを結合した２μｍのラテックス粒子）、８０Ｕ／ｍＬ組換えＳＡＨ−ヒドロラーゼ、及び３８０μｇ／ｍＬ  ＴＣＥＰ：ＨＣｌを含有する６０μＬの水性組成物である。
ウェルＤ
このウェルは、０．４％メルチオレート（チメロサール）及び２％トリトンＸ−１００を含有する２２５μＬの緩衝剤（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、又は、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１）を含む。
ウェルＥ
このウェルは、２８５μＬの緩衝剤（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、又は、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１）を含む。
【実施例８】
【００６９】
図４／実施例７におけるアッセイの実施
キャピラリーピペット中の血液試料（５〜１０μＬ）を、ウェルＥから１００μＬの緩衝剤を引き込むことによって稀釈し、ウェルＣに排出する。次に、キャピラリーピペットを用いて８５μＬの緩衝剤をウェルＥ（ウェルＤ）からウェルＡに移す。次に、カートリッジを３７℃で３分間インキュベートする。次に、４０μＬのウェルＤの内容物をウェルＣに移し、次いで、ヘマトクリットを実施例２のように測定する。次に、キャピラリーピペットを用いてウェルＡの６０μＬの内容物をウェルＣに移し、カートリッジを３７℃で１分間インキュベートする。次に、ウェルＣの内容物（選択的に、続いてウェルＤ及び／又はＥの内容物）を先端に膜が付いたピペット内に引き込み、次に、膜の外側に保持された金コロイドを実施例２のように測定する。較正を実施例２のように行う。
【実施例９】
【００７０】
図５におけるアッセイカートリッジ
ウェルＡ
このウェルは、カートリッジ１内に配置されるとき先端にキャピラリーが付いたピペット１０の先端から過剰な試料を除去するように作用する吸着ワイパー１５を含む。ピペット１０の本体内にビーズ１６及び１７を含む試薬が配置される。ビーズ１６は、６５μｇのＴＥＣＰとともに約５ユニットのｒＳＡＨアーゼを含む。ビーズ１７は、４０μｇのＭｇＣｌ2とともに約０．１ユニットのヌクレアーゼ（例えば、Ｍｅｒｃｋからのベンゾナーゼ）を含む。両ビーズもまた、バインダーとしてトレハロースを含む。
ウェルＢ
このウェルは、ピペットの本体内に１２０μｇＮ−エチル−マレイミドを含む試薬含有ビーズ１８を含むこと以外は実施例１に記載されたとおりである。
ウェルＣ
このウェルは、２つの試薬含有ビーズ１９及び２０を含む。ビーズ１９は、実施例１においてウェルＡについて記載された約１００μｇの金複合体を含む。ビーズ２０は、０．１２μｇの微粒子（実施例１においてウェルＤについて記載されたＳ−アデノシル−システインを結合した１〜２μｍ、好ましくは１．６μｍのラテックス粒子）を含む。
ウェルＤ
このウェルは、２００μＬの緩衝剤（１０ｍＭリン酸塩、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４、又は、２５ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．１）中に０．２７μｇアデノシンを含む。
ウェルＥ
このウェルは、ウェルＤの緩衝剤中に３００μＬの０．４重量％ＳＤＳを含む。
【実施例１０】
【００７１】
図５／実施例９におけるアッセイの実施
ウェルＡにおいて示されるキャピラリー中４．５μＬの血液試料（３〜１０μＬ）とともに２００μＬの緩衝剤（１２５〜３００μＬ）をウェルＤから先端にキャピラリーが付いたピペット内に引き込み、ビーズ１６及び１７を溶解させる。内容物をウェルＤに流し戻し、３７℃で１分間（３分まで）インキュベートする。
【００７２】
このインキュベーション中、２００μＬの界面活性剤溶液（１２５〜３００μＬ）をウェルＥから先端に膜が付いたピペットに引き込み、ビーズ１８を溶解させる。次に、内容物をウェルＥに流し戻す。
【００７３】
次いで、先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて１００μＬの界面活性剤及び阻害剤溶液（２５〜２００μＬ）をウェルＥからウェルＤに移す。赤血球溶解後、ヘマトクリットを実施例２のようにウェルＤ内で測定する。
【００７４】
次に、先端にキャピラリーが付いたピペットを用いてウェルＤ内の２００μＬの混合物（１５０〜２７５μＬ）をウェルＤからウェルＣに移し、ビーズ１９及び２０を溶解させ、混合物を１分間（３分まで）インキュベートする。
【００７５】
次に、ウェルＣの全内容物、及び、選択的に、続いてウェルＥ内の残りの緩衝剤を、先端に膜が付いたピペット内に引き込む。膜の外側に保持された（２回目のインキュベーションで形成された金／ラテックス複合体に対応する）金コロイドを、緑色又は青色ダイオード照射を用いて反射モードで検出する。
【００７６】
アッセイを、ＨＣｙ含有量が既知の標準物質を用いて較正し、同様に、ヘマトクリットの測定（例えば、一連の血液試料についての遠心分離を利用したマトクリット測定）も標準物質に対して較正する。
【００７７】
ブラケット内の体積又は量の範囲は、移される量に対して自由に限定される。しかし、正確にアッセイ及び較正を実施するためには、これらの範囲内の所定値を用いるべきである。
【実施例１１】
【００７８】
図６におけるアッセイカートリッジ
ウェルＡ
ビーズ１７を省略すること以外は実施例９に記載されたとおりである。
ウェルＢ
実施例９に記載されたとおりである。
ウェルＣ
実施例９に記載されたとおりである。
ウェルＤ
０．１ユニットのヌクレアーゼ（実施例９のウェルＡの記載と同様）及び４０μｇＭｇＣｌ2を含むこと以外は実施例９に記載されたとおりである。
ウェルＥ
実施例９に記載されたとおりである。
【実施例１２】
【００７９】
図６／実施例１１におけるアッセイの実施
アッセイの工程は、実施例１０に記載されたとおりに実施される。
【実施例１３】
【００８０】
図７におけるアッセイのカートリッジ
ウェルＡ
先端にキャピラリーが付いたピペット及びその内部のビーズ（１６）は、実施例１１に記載されたとおりである。ウェルのベースは、８０〜２００μｇ（例えば、１２０μｇ）のＮ−エチル−マレイミドを含有する乾燥阻害剤組成物を含む（実施例１に記載された）挿入物を含む。
ウェルＢ
実施例１に記載されたとおりである。
ウェルＣ
実施例９に記載されたとおりである。
ウェルＤ
実施例１１に記載されたとおりである。
ウェルＥ
実施例９に記載されたとおりである。
【実施例１４】
【００８１】
図７／実施例１３におけるアッセイの実施
試料、酵素、及び還元剤をウェルＤに移し、そこで実施例１０のようにインキュベートする。
【００８２】
このインキュベーション中、先端にキャピラリーが付いたピペットを用いて５０μＬの界面活性剤溶液（４０〜１００μＬ）をウェルＥからウェルＡに移す。次に、この混合物をウェルＥに戻す。
【００８３】
次に、界面活性剤及び阻害剤を実施例１０のようにウェルＤに移し、実施例１０のようにアッセイを続ける。
【実施例１５】
【００８４】
試薬ビーズ
実施例９から１４で用いられるビーズを以下のように調製する。
【００８５】
一又は複数の試薬、トレハロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、２５ｍＭトリス緩衝剤中のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．５の水溶液を、ピペットを用いて冷えた（−５０℃より低い）金属プレートに滴下する。凍結した液滴を凍結乾燥させ、１５重量％トレハロース、０．５重量％ＰＥＧ、及び０．１重量％ＢＳＡを含有するビーズを得る。液滴のサイズは、５〜１００μＬが都合よく、１０〜５０μＬが好ましい。あるいは、溶液を液体窒素に滴状添加して、その後、凍結した液滴を収集して凍結乾燥させてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００８６】
【図１】図１は、本発明によるアッセイ方法の実施における物質移動段階を示す、本発明によるカートリッジの概略図である。
【図２】図２は、本発明によるアッセイ方法の実施における物質移動段階を示す、本発明によるカートリッジの概略図である。
【図３】図３は、本発明によるアッセイ方法の実施における物質移動段階を示す、本発明によるカートリッジの概略図である。
【図４】図４は、本発明によるアッセイ方法の実施における物質移動段階を示す、本発明によるカートリッジの概略図である。
【図５】図５は、本発明によるアッセイ方法の実施における物質移動段階を示す、本発明によるカートリッジの概略図である。
【図６】図６は、本発明によるアッセイ方法の実施における物質移動段階を示す、本発明によるカートリッジの概略図である。
【図７】図７は、本発明によるアッセイ方法の実施における物質移動段階を示す、本発明によるカートリッジの概略図である。
【図８Ａ】図８Ａは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｂ】図８Ｂは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｃ】図８Ｃは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｄ】図８Ｄは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｅ】図８Ｅは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｆ】図８Ｆは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｇ】図８Ｇは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｈ】図８Ｈは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｉ】図８Ｉは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｊ】図８Ｊは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｋ】図８Ｋは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｌ】図８Ｌは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｍ】図８Ｍは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｎ】図８Ｎは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｏ】図８Ｏは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｐ】図８Ｐは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｑ】図８Ｑは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｒ】図８Ｒは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｓ】図８Ｓは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｔ】図８Ｔは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｕ】図８Ｕは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｖ】図８Ｖは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｗ】図８Ｗは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図８Ｘ】図８Ｘは、図１に示される段階におけるカートリッジの成分の相対的な位置を示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図８Ｇ】
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【図８Ｈ】
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【図８Ｉ】
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【図８Ｊ】
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【図８Ｋ】
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【図８Ｌ】
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【図８Ｍ】
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【図８Ｎ】
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【図８Ｏ】
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【図８Ｐ】
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【図８Ｑ】
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【図８Ｒ】
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【図８Ｓ】
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【図８Ｔ】
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【図８Ｕ】
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【図８Ｖ】
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【図８Ｗ】
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【図８Ｘ】
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【国際調査報告】
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