(57)【要約】出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、0.5〜50mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する、方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、0.5〜50mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する、方法。
【請求項２】
有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、1〜25mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する、請求項1記載の方法。
【請求項３】
有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、2〜20mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、4〜18mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、2.2〜13.3mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、セメントが、出発原料に加えられた原料1リットルあたり少なくとも33gの方解石の形成に起因する、方法。
【請求項７】
出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、セメントが、出発原料に加えられた原料1リットルあたり少なくとも22〜32gの方解石の形成に起因する、方法。
【請求項８】
出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、セメントが、出発原料に加えられた原料1リットルあたり少なくとも40〜75gの方解石の形成に起因する、方法。
【請求項９】
出発原料と混合する前に、(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンの少なくとも2つを混和する、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
出発原料と混合する前に、尿素とカルシウムイオンとを混和する、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
尿素およびカルシウムイオンの添加前に、出発原料と、有効量のウレアーゼ産生微生物とを混合する、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
尿素およびカルシウムイオンの添加前に、微生物を出発原料中に固定する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
微生物を適切な量のカルシウムイオンと接触させることによって、微生物を出発原料中に固定する、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
出発原料と混合する前に、微生物をカルシウムイオンと接触させる、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
微生物をカルシウムイオンの存在下で培養する、請求項14記載の方法。 
【請求項１６】
出発原料との混合と同時またはその後に、微生物をカルシウムイオンと接触させる、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
適切な量のカルシウムイオンが約10〜50mMである、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
適切な量のカルシウムイオンが約3〜8mMである、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
適切な量のカルシウムイオンが約6mMである、請求項14〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
出発原料とその他の試薬とを混合する段階が1回だけ実施される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
出発原料とその他の試薬とを混合する段階が複数回実施される、請求項1〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
(a)出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階；ならびに
(b)さらなる量の(i)〜(iii)の反応物の少なくとも1つを添加する段階
を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、0.5〜50mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する、方法。
【請求項２３】
段階(b)が、さらなる量の尿素およびカルシウムイオンの添加を含む、請求項22記載の方法。 
【請求項２４】
尿素の有効量が、少なくとも350mM、少なくとも1500mM、または少なくとも2000mMの最終濃度までである、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
カルシウムイオンの有効量が50〜200mMの最終濃度までである、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
カルシウムイオンの有効量が200〜500mMの最終濃度までである、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
カルシウムイオンの有効量が500〜1500mMの最終濃度までである、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
カルシウムイオンの有効量が、少なくとも100mM、少なくとも1500mM、または少なくとも2000mMの最終濃度までである、請求項1〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
カルシウムイオンが塩の形態で提供される、請求項1〜28のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０】
カルシウムイオンが硝酸カルシウムまたは塩化カルシウムとして提供される、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
カルシウムイオンがカルシウム塩の混合物として提供される、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
塩の混合物が硝酸カルシウムおよび塩化カルシウムを含む、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
硝酸カルシウムおよび塩化カルシウムが1：1の比で提供される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
微生物が細菌である、前記請求項のいずれか一項記載の方法。 
【請求項３５】
細菌がバチルス科(Bacillacae)ファミリーに属する、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
細菌が、バチルス(Bacillus)、スポロサルシナ(Sporosarcina)、スポロラクトバチルス(Sporolactobacillus)、クロストリジウム(Clostridium)、およびデスルホトマキュルム(Desulfotomaculum)を含む属の一覧から選択される属に由来する、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
微生物がスポロサルシナ・パストゥリ(Sporosarcina pasteurii)またはその機能的同等物である、請求項34〜36のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８】
微生物が真菌、酵母、植物、または動物の細胞である、請求項1〜33のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
微生物が、以下の条件の少なくとも一つの下での生存および/または増殖に適合化されている、前記請求項のいずれか一項記載の方法：(i)350〜2000mMの尿素濃度；(ii)50〜2000mMのカルシウムイオン濃度；(iii)少なくとも7.5〜10のpH；および(iv)少なくとも300Cの温度。
【請求項４０】
出発原料が粒状の構造を有する、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
出発原料が岩または石を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
出発原料が、未凝固であるかまたは部分的に凝固している、請求項40記載の方法。
【請求項４３】
出発原料が、石灰岩、石膏、砂岩、砂、土、粘土、堆積物、おが屑、ボール紙、パーティクルボード、モルタル、または軟材を含む、請求項40〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
請求項1〜43のいずれか一項記載のインサイチュー法。
【請求項４５】
出発原料の表面もしくは内部への流入、注入、噴霧、滴下、または細流、および浸漬からなる群より選択される技術によって、出発原料と試薬が混合される、前記請求項のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
実施例のいずれか一つを参照して本明細書において実質的に記載される、請求項1記載の方法。
【請求項４７】
前記請求項のいずれか一項記載の方法によって形成される、セメント。
【請求項４８】
細菌細胞を含み、かつ少なくとも0.05〜5MPaの強度を有する、請求項47記載のセメント。
【請求項４９】
実施例のいずれか一つを参照して本明細書において実質的に記載される、請求項47記載のセメント。 
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、ウレアーゼを産生することができる細菌などのウレアーゼの微生物供給源を利用して、高強度セメントを形成する方法に関する。また本発明は、本方法によって形成されたセメントのさまざまな適用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ウレアーゼ産生細菌は、透過性媒体の表面および表面下を修正する(remediate)ために用いられている。鉱物充填(mineral plugging)としても知られるこのプロセスは、石油産業において使用されており、ここでは、処置された媒体の透過性および空隙率の減少が流体流動を低下させ、かつしたがってタンクからの油の回収を増大させることができかつ／または流出部位からの汚染の拡大を制限できる。
【０００３】
鉱物栓子(Mineral plug)は、pH増大によって引き起こされた沈殿の結果として生じ、これは、それ自体が、ウレアーゼ酵素による尿素の酵素的分解の産物として形成されるアンモニアの結果である。しかし、これらの栓子は地質形成の際の割れ目および他の亀裂の空隙率/透過性を低下させるために用いられているが、得られるセメントは様々な他の適用のためには十分に強くない。さらに、鉱物栓子を形成するのに使用されるプロセスの対照の程度は制限されており、つまりこのことは、結果が矛盾しており、かつ、方法が現実的でないというだけの多くの用途が存在するという意味を有する。
【０００４】
従来のセメントは、さまざまな建築用途に用いられている。しかし、従来のセメントはかなり厚いスラリーとして適用されるので、噴霧用途には適しておらず、かつ、表面上もしくは表面下でセメントを形成することまたはセメント接着された原料の空隙率を保持することが必要または望ましいという適用には、特に有用でない。
【０００５】
本発明は、ウレアーゼ産生微生物および規定量の他の試薬を用いて高強度セメントを形成するための方法を提供することによって、上述の制限を扱おうとしている。本発明はまた、高強度セメントの様々な使用も提供しようとしている。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、0.5〜50mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する方法を提供する。
【０００７】
本発明の方法は、出発原料中での比較的高レベルの方解石の産生を通して、高強度セメントを形成することができる。したがって、本発明はまた、出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、セメントが、出発原料に加えられた原料1リットルあたり少なくとも33gの方解石の形成に起因する方法も提供する。
【０００８】
本発明の方法は、試薬の反復適用に適している。したがって、本発明はまた、
(a)出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階；ならびに
(b)さらなる量の(i)〜(iii)の反応物の少なくとも1つを添加する段階
を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、0.5〜50mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する方法も提供する。
【０００９】
本発明の利点の一つとは、本発明が、出発原料の不必要な崩壊または撹乱なしに適用されうることである。したがって、本発明はまた、出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成するインサイチュー法であって、有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、0.5〜50mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する方法も提供する。
【００１０】
本発明の別の局面とは、本発明の方法を用いて形成されるセメントである。したがって、本発明はまた、本明細書に記載の方法によって形成されるセメントも提供し、ここでセメントは、細菌細胞を含みかつ少なくとも0.05〜5MPaの強度を有する。
【００１１】
本発明は、土木工事、採鉱、砂防(erosion control)、環境の、および特別な材料の製造の際の適用における使用のためのセメントを作製するためにも適用されうる。土地改良適用は、本発明に特に適している。土木工事適用には、壁、堤防(例えば鉄道土手、ダム)、土壌を強化して安定させるためのトンネル用の土地、および、パイルの周辺摩擦(skin friction)を改善するための基礎(「遠くの場」へとそれらを結合する)を保持するため；パイルの末端地耐力(end-bearing capacity)を増大させるため；インサイチュー形成を補剛してパイルの設計長を低下させるため；パイルのない基礎に対する土壌の地耐力(bearing capacity)を改善するため；ならびに液状化のリスクのある地震帯の砂地を安定化するための、本方法の適用が含まれる。
【００１２】
本発明の方法はまた、道路、滑走路などのための天然または調製された砂表面の表面処置によって「即席の」舗装道路を作製するため、および、劣化した舗装道路補助基層(sub base)を迅速に修復するために、舗装道路においても使用されうる。
【００１３】
本発明の方法はまた、伝統構造などの建物において風雨にさらされるモルタルおよび石造物を保存し、修復し、強化し、かつ保護するため；壁の絵において腐食されている石灰の壁土を強固にし、かつ保全するため；庭における構築的特徴を作成し、合成の砂岩/石灰岩における装飾を複製するためにも使用されうる。 
【００１４】
採鉱における使用としては、トンネル掘りおよび採鉱の間、でこぼこの土地に支柱を提供するため；尾鉱ダムを強化して、侵食および傾斜による失敗を防ぐため；鉱山からの排液を可能にして酸性重金属排出を除去するために、透過性の反応性障壁を提供するため；露出表面上に粉塵粒子を結合させて、粉塵レベルを低下させるため；穿孔および抽出の間、石油試掘孔分解に対する耐性を増大させるため；重力基礎およびパイプラインの内部またはその下への沈降物の侵食に対する沖合構造の耐性を増大させるための、方法の使用が含まれる。
【００１５】
本発明の方法はまた、環境からの汚染物質(例えば重金属、繊維、放射性元素)と方解石結晶構造と結合させることによる、これらの安定化および除去、ならびに、露出表面を強化してそれにより浸食に供される領域を保護することによる、海岸領域および河川における浸食の調節などの環境適用も有する。
【００１６】
本発明のその他の用途には、水フィルタおよびボアホール(bore hole)フィルタなどのフィルタの作製、ならびに、セメント接着された活性バイオフィルタへの細菌細胞およびそれらの酵素の固定化が含まれる。
【００１７】
発明の詳細な説明
高強度セメントの作製法
出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、有効量のウレアーゼ産生生物が、標準的条件下で、0.5〜50mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供する、方法。
【００１８】
本発明の目的に関して、「セメント」という用語は、岩または砂などの特定の原料と一緒に結合する沈殿物質を指す。
【００１９】
本発明の目的に関して、「高強度セメント」という用語は、以下のセメントを指す：
(i)標準的条件下で、0.5〜50mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供するウレアーゼ産生微生物の適用に起因するセメント；または
(ii)出発原料に加えられた原料1リットルあたり少なくとも33gの方解石の形成に起因するセメント。
【００２０】
原料の方解石またはカルボネート含量を決定するために使用される技術は数多く存在する。一つの方法では、原料を酸で処理した場合に発生する二酸化炭素ガスの量が計測される。発生する二酸化炭素の量は、ガス圧(検圧法)またはガス容積の変化のいずれかを計測することにより、決定することができる。試料の質量およびガスの容積を知ることにより、カルボネートの存在量を計算することができる。方解石含量を測定するための2種の特定の技術が、G. E Rayment and F. R. Higginsonによる"Australian Laboratory Handbook of Soil and Water Chemical Methods"の第19章 - "Soil Carbonates", lnkata Press, Sydney, 1992, p206-210において認められる。
【００２１】
好ましくは、高強度セメントは以下も有する：
(i)好ましくは、強度は、原料を通って送られた超音波の速度を推定することによって決定される、少なくとも0.05〜0.5MPa/(mM尿素加水分解/min)の一軸圧縮強度；および/または
(ii)好ましくは、強度は、原料を通って送られた超音波の速度を推定することによって決定される、少なくとも0.05〜5MPaもしくは2〜5MPaの一軸圧縮強度；および/または
(iii)少なくとも1〜5％の方解石含量。
【００２２】
超音波速度測定およびUCSなどの圧縮強度測定は、市販の機器を用いて、または専門の工学研究所によって、行うことができる。一般に、超音波速度とUCSの間の関係は、処置されている各種の原料(または土壌)に関して確立されるべきである。一つの技術には、以下の段階が含まれる：(i)処置されている原料の、セメンテーション(cementation)の程度(および強度)が異なる多くの円筒形コア試料を調製する段階；(ii)処置される原料コアそれぞれを通る超音波速度を測定する段階(非破壊手法)；(iii)破壊点を得るためにUCSプレス中で粉砕することによる、処置されるコアそれぞれに関するUCS値(すなわちこれらを破壊するのに必要な圧力)を測定する段階(破壊手法)；および(iv)McNally, G. H. 1987. Estimation of coal measures rock strength using sonic and neutron logs. Geoexploration 24:381-395により使用されたもののような等式を用いた、2つの測定値の間の関係を計算する段階であるが、所与の原料タイプのために二つの定数の再計算を適用できる段階。
【００２３】
本発明の目的に関して、「透過性」という用語は、出発原料が、高強度セメントの形成を可能にするのに十分な、(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンの少なくとも1つの溶液の移動を可能にすることを意味する。
【００２４】
出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物の形態のウレアーゼ、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを「混合する」段階は、出発原料中で高強度セメントの形成をもたらす様式で3つの構成要素の集合をもたらす任意のプロセスを包含することが認識されよう。例えば、1つまたは2つの構成要素がすでに出発原料中に存在する適用も存在しうり、この場合、「混合」段階には、足りない構成要素のみの添加が含まれる。好ましくは、尿素およびカルシウムイオンが混和され、その後、出発原料への適用前に、ウレアーゼ産生微生物に添加される。しかし、本発明の方法を実施するための他の方法で構成要素を混合してもよいことが認識されよう。 
【００２５】
本発明は、特定の量の微生物、尿素、およびカルシウムイオンを反応させることによって高強度セメントを透過性出発原料中で形成できるという驚くべき発見に基づく。特に、本出願人らは、尿素の供給源として細菌を使用する他のセメンテーション技術と比較して、高いウレアーゼ活性レベルを輸送する微生物の量が特に有用であることを見出した。本発明の方法において使用される比較的多量の反応物により、多量の方解石の産生が可能になる。この点において、特定の量で提供される場合、反応物は、出発原料の内部および/または表面に配置された高強度セメントの形成をもたらす様式で混合される。使用された尿素およびカルシウムイオンなどの試薬の量は、ほとんどまたは全く方解石が産生されないという程度までウレアーゼ産生微生物に対して阻害性および/または毒性であることが予想されたので、この成果は特に驚くべきものである。
【００２６】
重要なことに、比較的有効な量の様々な構成要素を操作することによって、本発明の方法は、使用者が、形成される方解石の量およびそれが形成される速度を制御することによりセメンテーションを制御することを可能にする。この柔軟性は、本発明の方法が、出発原料における適度に少なめの強度増加を必要とするものからより大きな増加を必要とするものまで、広範な適用において使用可能であることを意味する。
【００２７】
したがって、本発明はまた、出発原料と、有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、セメントが、出発原料に加えられた原料1リットルあたり少なくとも33gの方解石の形成に起因する方法も提供する。
【００２８】
セメントは、出発原料に加えられた原料1リットルあたり少なくとも22〜32gの方解石の形成に起因しうる。または、セメントは、出発原料に加えられた原料1リットルあたり少なくとも33〜75gまたは40〜75gの方解石の形成に起因しうる。 
【００２９】
特定の作用機序に縛られることを望むわけではないが、本発明の方法を用いて得られる高強度セメントは、出発原料における方解石結晶形成の量および性質の結果であると考えられ、これは次に、得られるセメントの強度に影響する。また、本方法において使用された微生物のバイオマスの存在および量もまた方解石結晶形成に影響し得ることも考えられ、これはまた得られるセメントの強度に影響し得る。
【００３０】
本発明の方法によって混合される様々な反応物の有効量は、少なくとも、微生物のウレアーゼ産生能力、透過性出発原料の特徴、ならびにセメンテーションが起こる条件、セメントの望ましい最終強度、および反応混合物中のその他反応物の量に応じて変化しうる。本明細書における情報は、当業者が、所与の適用に必要な様々な反応物の相対量を日常的に決定することを可能にし、したがって、本方法を様々な出発原料に適用するのにおよび様々な最終用途のために必要な全てを、当業者に提供する。
【００３１】
本発明の特定の適用または使用様式の必要条件によっては、セメントの迅速形成が必要でありうる。本発明の目的に関して、迅速形成とは、出発原料が、本方法の適用後約1〜6時間以内にその最終強度の少なくとも約60％〜90％に到達することを意味する。より好ましくは、出発原料は、本方法の適用から約2〜5時間以内にその最終強度の少なくとも約60％〜90％に到達し、さらにより好ましくは、出発原料は、本方法の適用から約3〜4時間以内にその最終強度の少なくとも約60％〜90％に到達する。
【００３２】
または、セメントをゆっくりと形成することが好ましい場合もある。本発明の目的に関して、低速形成とは、出発原料が、本方法の適用後約1〜6週間でその最終強度の少なくとも約60％〜90％に到達することを意味する。より好ましくは、出発原料は、本方法の適用から約2〜5週間でその最終強度の少なくとも約60％〜90％に到達し、さらにより好ましくは、出発原料は、本方法の適用から約3〜4週間でその最終強度の少なくとも約60％〜90％に到達する。
【００３３】
本発明の方法は、必要に応じて、セメント形成速度の制御を可能にするために適用されうる。セメントの迅速形成が望ましい場合、それに応じて試薬の量および/または相対量を選択し、迅速形成をもたらすことができる。
【００３４】
迅速形成が望ましい場合、ウレアーゼ産生微生物の有効量は、標準的条件下で、0.5〜50mM尿素加水分解/min、より好ましくは1〜25mM尿素加水分解/min、さらにより好ましくは2〜20mM尿素加水分解/min、およびさらにより好ましくは4〜18mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供するのに必要な量でありうる。本発明のある特定の形式において、ウレアーゼ産生微生物の有効量は、標準的条件下で2.2〜13.3mM尿素加水分解/minの尿素加水分解速度を提供するのに必要な量である。本発明の目的に関して、「標準的条件」とは、1.5M尿素および25℃である。
【００３５】
セメントの迅速形成が望ましい場合、尿素の有効量は、その他の試薬の量に左右されると考えられ、かつ、高強度セメントの形成を確実にするのに十分であると考えられる。好ましくは、尿素の有効量は、少なくとも100〜200mM、より好ましくは少なくとも200〜300mM、さらにより好ましくは少なくとも300〜1500mMの最終濃度までである。本発明のある特定の形式において、尿素の有効量は、少なくとも350mM、1500mM、または2000mMの最終濃度までである。
【００３６】
セメントの迅速形成が望ましい場合、カルシウムイオンの有効量は、その他の試薬の量に左右されると考えられ、かつ、高強度セメントの形成を確実にするのに十分であると考えられる。好ましくは、カルシウムイオンの有効量は、少なくとも50〜200mM、より好ましくは少なくとも200〜500mM、さらにより好ましくは少なくとも500〜1500mMの最終濃度までである。本発明のある特定の形式において、カルシウムイオンの有効量は、少なくとも100mM、1500mM、または2000mMの最終濃度までである。
【００３７】
セメントの低速形成が望ましい場合、これは、少なくとも1つの試薬の量を制御することによって達成することができる。好ましくは、セメントの迅速形成に必要な量を下回るが、まとめた場合には、たとえ長期間にわたったとしても高強度セメントの形成をもたらすのに十分な量で、少なくとも1つの試薬を経時的に添加する。本発明のある形式において、経時的に添加される試薬はウレアーゼ産生微生物である。または、セメントの迅速形成に必要な量を下回るが、まとめた場合には、たとえ長期間にわたったとしても高強度セメントの形成をもたらすのに十分な量で、3つの試薬全てを経時的に添加してもよい。しかし、試薬全てを経時的に添加する場合、試薬の相対量を変更する必要がありうることが認識されねばならない。Ca2+によるウレアーゼの阻害減少および尿素によるウレアーゼの割合増加のせいで、縮小は直線的でない。したがって、セメント(方解石)の速すぎる形成を回避するため、相対的に言って、カルシウムイオンおよび尿素を下回る量でウレアーゼ産生微生物を添加する必要がある。低速形成を達成するために使用される試薬の量は、本明細書に含まれる情報を用いて当業者により日常的に決定することができる。
【００３８】
必要なウレアーゼ活性を供給できるという条件で、ウレアーゼ産生微生物を変更することができる。経済的な理由のために、微生物は、好ましくは非滅菌条件下でかつ比較的安価な培地を使用して、容易に培養可能であることが好ましい。微生物は、細菌などの原核生物でありうる。しかし、必要なウレアーゼを細胞が産生できるという条件で、これは、真菌、酵母、植物、または動物の細胞などの単細胞の真核生物であってもよい。
【００３９】
好ましくは、微生物は、少なくとも一つの以下の条件下での生存および/または増殖に適合化されている：(i)本明細書に記載の尿素の有効量などの、比較的高い尿素濃度；(ii)本明細書に記載のカルシウムイオンの有効量などの、比較的高いカルシウムイオン濃度；(iii)pH7.5〜10など、少なくともpH7.5の塩基性pH；および(iv)少なくとも30℃の比較的高い温度。
【００４０】
本発明の方法において使用される微生物は、天然でウレアーゼ産生可能であってもよく、かつ/または、本発明の方法における使用のためにこれを特に有用にする一つもしくは複数の特徴を有してもよい。または、ウレアーゼ産生可能にするために、および/または本発明の方法において有用にする一つもしくは複数の特徴を有するために、遺伝子的に改変または操作された微生物であってもよい。
【００４１】
好ましくは、微生物は、バチルス科(Bacillacae)ファミリー由来の細菌であり、より具体的には、バチルス(Bacillus)、スポロサルシナ(Sporosarcina)、スポロラクトバチルス(Sporolactobacillus)、クロストリジウム(Clostridium)、およびデスルホトマキュルム(Desulfotomaculum)を含む属の一覧から選択される属由来の細菌である。さらにより好ましくは、微生物は、スポロサルシナ・パストゥリ(Sporosarcina pasteurii)またはその機能的同等物である。
【００４２】
スポロサルシナ・パストゥリの機能的同等物とは、本発明の方法のためにこれらを有用にする、スポロサルシナ・パストゥリと共通の少なくとも一つの特徴を有する細菌である。当業者は日常的にそのような細菌を同定することができる。当然ながら、望ましいならば異なる微生物の組み合わせを使用することもできる。
【００４３】
尿素は様々な形態で提供されうる。好ましくは、尿素は水溶液として提供される。
【００４４】
カルシウムイオンは様々な形態で提供されうる。カルシウムイオンは、硝酸カルシウムまたは塩化カルシウムなどの塩の形態で提供されうる。好ましくは、カルシウムイオンは、高濃度の特定の陰イオンにより引き起こされる阻害効果を予防または低減するために、カルシウム塩の混合物として提供される。本発明のある特定の形式において、カルシウムイオンは、硝酸カルシウムおよび塩化カルシウムなどの少なくとも2つの塩の混合物の形態で提供される。塩の混合物は様々な比率で提供されうる。しかし、硝酸カルシウムと塩化カルシウムの50：50混合物が好ましい。
【００４５】
出発原料は、透過性であるという条件で、変更されうる。好ましくは、出発原料は粒状の構造を有する。出発原料が岩である場合、これは、礫岩、角礫岩、砂岩、シルト岩、頁岩、石灰岩、石膏、苦灰岩、泥炭、および褐炭を含む堆積岩の群より選択される、陸生の、化学的/生化学的な、または有機的な堆積岩などの堆積岩でありうる。または、出発原料は、砂、土、粘土、堆積物、おが屑、または、インサイチューセメンテーションに適用できるその他の原料などの、未凝固のまたは部分的に凝固した粒状の原料であってもよい。その他の出発原料には、ボール紙、パーティクルボード、および軟材が含まれる。出発原料の特性、例えばその組成、その粒径分布、および原料における％空隙率は、本発明の方法が適用される様式にも影響することが認識されよう。
【００４６】
反応物を混合する様式もまた、必要に応じて変更されうる。微生物、尿素、およびカルシウムイオンを一緒に混合して、その後出発原料に加えてもよい。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法も提供する：(a)有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンをあらかじめ混和する段階；ならびに(b)(a)由来の混合物と出発原料とを混合する段階。
【００４７】
反応物を、同時にまたは連続して出発原料に加えてもよい。例えば、微生物を出発原料に適用することができ、その後に、尿素およびカルシウムイオンが加えられるが、これらは別々に加えるかまたは出発原料への添加前にあらかじめ混和することができる。本発明の別の形式において、尿素およびカルシウムイオンを出発原料に添加することができ、その後、微生物が加えられるが、これは、連続してまたは同時に添加することができる。
【００４８】
反応物は、様々な方法で出発原料に適用されうる。出発原料の表面または内部への流入または注入、噴霧、滴下、または細流などによって、反応物を、圧力下で強制的に出発原料中に入れてもよい。または、出発原料の大きさおよび形状に応じて、反応物中に浸漬してもよい。
【００４９】
また、必要な高強度セメントを獲得するために、本発明の方法を繰り返してもよい。したがって、本発明はまた、出発原料と有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、この段階を少なくとも1回繰り返す方法も提供する。 
【００５０】
本方法を繰り返して漸進的な強度増加を得る場合、試薬の全てを毎回添加する必要がないことが理解されよう。例えば、最初の適用において添加された微生物によって提供された残りのウレアーゼ活性は、本方法のその後のラウンドのために十分なウレアーゼ活性を提供するのに未だ十分でありうる。当業者は、本発明の方法のその後のラウンドに使用するために必要な試薬の特定量を容易に決定できる。
【００５１】
出発原料への添加後の微生物の損失(洗浄などによる)は、本方法の効果を低減する可能性がある。この問題は特に、非凝集性微生物の使用に関連しうる。セメンテーションプロセスに貢献することなく出発原料から喪失しうるウレアーゼ産生微生物の損耗は、セメンテーション前に出発原料中で微生物を固定することによって、最小限にすることができる。また、その後の適用において必要な微生物がより少ないので、出発原料中での微生物の固定は、試薬の複数回の適用によって高強度セメントが形成されるべき場合にも好ましい。したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法も提供する：(i)微生物を出発原料に加える段階；(ii)出発原料中で微生物を固定する段階；ならびに(iii)固定された微生物を組み入れた出発原料と有効量の尿素およびカルシウムイオンとを混合する段階。
【００５２】
好ましくは、微生物は、有効量のカルシウムイオンを用いて出発原料中に固定される。有効量は変動しうるが、好ましくは約10〜50mMである。本出願人らは特定の作用機序に縛られることを望むわけではないが、カルシウムイオンは、低濃度のカルボネートを排出する微生物と接触し、その結果細胞表面に炭酸カルシウムが形成されると考えられる。炭酸カルシウムは、細胞が出発原料に結合するように、または、他の手段により微生物が出発原料中でより堅く保持されるように作用しうる。
【００５３】
重要なことに、本発明の方法は、出発原料を撹乱することなくインサイチューで適用されうる。出発原料が傷つきやすいもしくは脆いことまたは他の理由により動かしてはいけないことが大切である場合の適用に関して、これは特に重要である。例えば、土地改良目的で現場に適用される場合、出発原料に存在する土壌構造および地層などの、出発原料の一つまたは複数の既存の特徴を保持することは特に重要でありうる。
【００５４】
出発原料に応じておよび高強度セメントが形成されうる様々な条件に応じて、一つまたは複数の反応物を出発原料に複数回適用することが必要でありうる。したがって、本発明はまた、出発原料と有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、透過性出発原料中で高強度セメントを形成する方法であって、反応物(i)〜(iii)の少なくとも一つが複数回適用される方法も提供する。
【００５５】
好ましくは、尿素およびカルシウムイオンが複数回適用される。この点において、適用の際、微生物は、追加の尿素およびカルシウムイオンと反応すること、および、追加のセメントの形成をもたらしそれにより出発原料にさらなる強度を与えることが可能な様式で、透過性出発原料中で生き続ける。
【００５６】
使用
本発明により高強度セメントを形成する方法は、土木工事、採鉱、砂防、環境の、および特別な材料の製造といった多様な分野における様々な適用を有する。土地改良適用は、本発明に特に適している。
【００５７】
土木工事適用には、壁、堤防(例えば鉄道土手、ダム)、土壌を強化して安定させるためのトンネル用の土地、および、パイルの周辺摩擦を改善するための基礎(「遠くの場」へとそれらを結合する)を保持するため；パイルの末端地耐力を増大させるため；インサイチュー形成を補剛してパイルの設計長を低下させるため；パイルのない基礎に対する土壌の地耐力を改善するため；ならびに液状化のリスクのある地震帯の砂地を安定化するための、本方法の適用が含まれる。 
【００５８】
本発明の方法はさらに、道路、滑走路などのための天然または調製された砂表面の表面処理によって「即席の」舗装道路を作製するため、および、劣化した舗装道路補助基層を迅速に修復するために、舗装道路において使用されうる。
【００５９】
本発明の方法はまた、伝統構造などの建物において風雨にさらされるモルタルおよび石造物を保存し、修復し、強化し、かつ保護するため；壁の絵において腐食されている石灰の壁土を強固にし、かつ保全するため；庭における構築的特徴を作成し、合成の砂岩/石灰岩に装飾を複製するためにも使用されうる。
【００６０】
採鉱における使用としては、トンネル掘りおよび採鉱の間、でこぼこの土地に支柱を提供するため；尾鉱ダムを強化して、侵食および傾斜による失敗を防ぐため；鉱山からの排液を可能にして酸性重金属排出を除去するために、透過性の反応性障壁を提供するため；露出表面上に粉塵粒子を結合させて、粉塵レベルを低下させるため；穿孔および抽出の間、石油試掘孔分解に対する耐性を増大させるため；重力基礎およびパイプラインの内部またはその下への沈降物の侵食に対する沖合構造の耐性を増大させるための、本方法の使用が含まれる。
【００６１】
本発明の方法はまた、環境からの汚染物質(例えば重金属、繊維、放射性元素)と方解石結晶構造と結合させることによる、これらの安定化および除去、ならびに、露出表面を強化してそれにより浸食に供される領域を保護することによる、海岸領域および河川における浸食の調節などの環境適用も有する。
【００６２】
本発明のその他の用途には、水フィルタおよびボアホールフィルタなどのフィルタの作製、ならびに、セメント接着された活性バイオフィルタへの細菌細胞およびそれらの酵素の固定化が含まれる。
【００６３】
高強度セメント製品の作製法
本発明は、固体画分と有効量の(i)ウレアーゼ産生微生物、(ii)尿素、および(iii)カルシウムイオンとを混合する段階を含む、高強度セメント製品を形成する方法を提供する。 
【００６４】
固体画分は、共にセメント接着されて高強度セメント製品を形成するのに適した、任意の一つまたは複数の固体であってよい。固体は、様々な大きさの岩でありうる。または、固体は、共にセメント接着されてセメント製品を形成するのに適合化された岩石粉末または石灰岩などの粒状原料でありうる。
【００６５】
好ましくは、所定の形状のセメント製品を作製するために、反応物は型枠内で混合される。これらの形状は変更することができ、装飾的または建築的な適用で使用されうるブロックなどを含む。
【００６６】
全般
当業者は、本明細書に記載の本発明が、具体的に記載された以外の変更および改変を受け入れる余地がある事を認識するであろう。本発明には、そのような全ての変更および改変が含まれると理解すべきである。また本発明は、個々にまたは一括して本明細書中で言及または示された、全ての段階、特徴、組成物、および化合物も含み、かつ、任意のおよび全ての組み合わせまたは任意の二種類もしくはそれ以上の段階および特徴も含む。
【００６７】
本発明は、例示目的のみを意図した、本明細書に記載の特定の態様によって、範囲を限定されるべきではない。機能的に同等な製品、組成、および方法は明らかに本明細書に記載の本発明の範囲内に含まれる。
【００６８】
本明細書において引用された全刊行物(特許、特許出願、学術論文、研究室のマニュアル、書物、もしくはそれ以外の資料)の全開示は、参照により本明細書に組み入れられる。いかなる参照も、先行技術を構成する、または、本発明に関連する分野における当業者の共有の一般的な知識の一部であることを認めるものではない。
【００６９】
本明細書の全体を通して、文脈上必要とされない限り、「含む(comprise)」という用語、または「含む(comprises)」や「含んでいる(comprising)」のような変形は、提示された整数または整数の群を含むと理解されるが、その他のいかなる整数または整数の群を排除するものではない。 
【００７０】
本明細書で用いられている選択された用語の他の定義は、本発明の詳細な説明において見出すことができ、全体を通して適用される。特に定義されない限り、本明細書で用いられている他の全ての科学技術用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されて用いられているのと同じ意味を持つ。
【００７１】
次に、以下の実施例を参照しながら本発明を説明する。実施例の記載は、前述の説明の概略を限定するものでは決してない。
【００７２】
実施例
一般的な原料および方法
(A) S. パストゥリ(S. pasteurii)の培養
(i) アンモニウムYE培養
S. パストゥリを、バッチ条件下で、滅菌前に4M NaOHでpH9に調整した、20g/Lイーストエキストラクトおよび75mM (NH4)2SO4上で、28℃で培養した。
【００７３】
(ii) 尿素YE培養
尿素YE培養は、バッチ条件下で、20g/Lイーストエキストラクトおよび75mM CO(NH2)2上で行った。培地のpHは、高圧滅菌後pH7.5であった。高圧滅菌条件下での化学的分解を予防するために、尿素を、高圧滅菌後に0.2μmフィルター滅菌によって加えた。
【００７４】
(iii) 酢酸YE培養
酢酸YE培養は、培地が10g/Lイーストエキストラクト、100mM NaCH3COO、および75mM (NH4)2SO4を含むことを除き、アンモニウムYE培養と同様の条件下で行った。
【００７５】
(B) 分析法
(i) ウレアーゼ活性
以下の等式に従い、尿素の加水分解によって非イオン基質からイオン産物が遊離する。
2008524096.tif 000002
【００７６】
導電率増加の速度は、存在する活性ウレアーゼの濃度に比例する。25℃、1.5M尿素の標準的条件下で測定した、時間に対する導電率の変化の傾きを計算することにより、ウレアーゼ活性を3分間にわたって決定した。
【００７７】
25℃、1.5M尿素の標準的条件下で同じ生物に由来する市販の精製ウレアーゼ(Sigma Cat. No. U-7127)によって尿素の完全な加水分解に起因する導電率の変化を決定することにより、導電率増加の速度(mS/min)を尿素加水分解速度(mM尿素加水分解/min)に転換した。反応が完了したことを確実にするため、検量線を作成し(下記参照)、加水分解終了時に存在するアンモニウムの量も決定した。
2008524096.tif 000003
尿素の完全な加水分解後に存在する導電率の変化(■)およびアンモニウム濃度(□)の検量線
【００７８】
この図から、以下の関係が決定された。
加水分解された尿素(mM)＝導電率(mS)×11.11(R2＝0.9988)
加水分解された尿素(mM)＝アンモニウム(mM)×0.50(R2＝0.9991)
【００７９】
(ii) バイオマス決定
バイオマスは、600nmにおいて分光光度的に測定した。
【００８０】
(iii) NH4-N分析
アンモニウム濃度は、改変ネスラー法によって分光光度的に測定した。試料を、13,500rpmで5分間遠心分離して細胞を除去し、上清を0〜0.5mMの範囲になるよう希釈した。希釈試料2mlをネスラー試薬100μlと混和し、正確に1分間反応させた後、425nmでの吸光度を読み取った。
【００８１】
実施例1−珪砂におけるバイオセメンテーション
原料および方法
(A) コア内部へのセメンテーション試薬の適用
セメンテーション用コアは、密度を均一にするため連続振動下で300μm珪砂とともに乾パックされた50mlプラスチックシリンジからなるものであった。次に水をコアに上方流入させ(up-flush)、軽くたたいて、空気ポケットを除去した。水の流入の後、砂粒子間の潤滑効果によって砂が占める容積は減少し、封圧を維持するようにストッパーを調整した。
【００８２】
両液体を単一の容器へ注いで、適切な混和を確実にするためにもう一つの50mlシリンジで液体を2回吸引および排出することにより、Ca/尿素溶液および細胞を、コアへの注入直前にあらかじめ混和した。水の完全な置換を確実にするため、細孔容積の1.5倍量を流入させた。 
【００８３】
(B) インサイチューセメンテーション測定
全長に沿った3箇所(注入末端から15、45、および75mm)において各コアの直径を通る超音波を送ることによって、強度を測定した。測定は、実験の間に繰り返し行った。より高度な凝集(セメンテーション)は、音波をより速い速度で移動させると考えられる(すなわち、速度が速ければ速いほど、セメンテーションの程度が大きい)。同時に、超音波信号による崩壊を回避するため、試料1mlを、コア側面の下部に挿入されたキャピラリー管を通じてコアから回収した。試料を13,500rpmで遠心分離し、全ての懸濁粒子(砂や細菌)を除去した。次に上清を清潔な試験管に移し、アンモニウム分析を待ちながら-20℃で保存した。
【００８４】
超音波速度は、飽和状態の試料(湿潤速度)および乾燥試料(乾燥速度)の両方において測定することができる。乾燥試料中で測定された超音波速度については、0.300mm通過珪砂に関して以下の関係が決定された。
σ＝1272×exp(-14461/v)
式中、
σ＝一軸圧縮強度(MPa)
v＝超音波速度(m/s)
【００８５】
飽和(湿潤)試料中で測定された超音波速度については、測定された湿潤速度を、以下の関係を使用してその同等の乾燥速度に転換した後で、上記の関係を引き続き使うことができる。 
v(乾燥)＝v(湿潤)−600 m/s
式中、
v(乾燥)＝乾燥超音波速度(m/s)
v(湿潤)＝湿潤超音波速度(m/s) 
【００８６】
(C) NH4-N分析
アンモニウム濃度は、上述の一般的な原料および方法の項に記載されたように決定した。
【００８７】
(D) 酵素の割合が強度に与える影響
8つのコアを、1.5M等モルの尿素/カルシウム溶液(0.75M Ca(NO3)2および0.75M CaCl2としてカルシウムを添加)で処置し、異なる濃度のウレアーゼ(細菌ウレアーゼ活性)を用いて様々な速度でセメント接着させた。2回の流入を行い、超音波測定は24時間後に3箇所(A、B、およびC)において行った。
【００８８】
(E) セメンテーションの間の強度の発達
セメンテーションの間の強度の発達を調べるために、4つのコアの速度を42時間の間連続的にモニタリングし、その間に細菌および反応物の適用を2回行った。これにより、反応の進行に伴う強度変化の観察が可能になった。
【００８９】
また、細菌酵素系を、可溶性の植物酵素系と比較することもできた。最高のセメンテーション強度を生じた尿素加水分解速度を解明するため、加水分解された尿素1mMあたりの強度変化を計算し、各期間の尿素加水分解速度と比較した。
【００９０】
(F) 酵素の複数適用
複数の酵素適用の効果は、2回の連続した処置にわたって同量の細菌酵素および反応物を適用することにより定量化された。アンモニウムの産生は、コアに挿入されたキャピラリー管を介した試料の周期的除去により決定した。処置の間に、コアを通って水を流入させ、全ての使用済み液体を除去した。第二の処置は、第一の処置から24時間後に適用され、各処置は11mM尿素/minおよび1.5M等モルの尿素/Ca溶液の適用された酵素活性を含んだ。 
【００９１】
(G) 酵素の固定化および反応物による再処置
二回のセメンテーション処置後にコア内に存在する残りのウレアーゼ活性を再利用できるかどうかを判定するため、カルシウムおよび尿素反応物のみを含む(さらなる酵素は全く含まない)第三の適用を加えた。
【００９２】
結果
(A) 酵素の割合が強度に与える影響
各コア上の三箇所(A、B、およびC)における速度測定は±10％以内であり、このことは、コアの全長に沿ったセメンテーションの程度が均一であることを示す。全体的なコアの結果を得るため、三箇所の速度を平均した(図1を参照されたい)。1回のバイオセメンテーション処置の後、酵素活性の増加と共に強度が増加したことが観察された(図1を参照されたい)。
【００９３】
適用された酵素の量に対する強度の改善が、図2において示されている。強度の量は、系へ投入した酵素の量で割ることにより計算した(例えば、4.4mM尿素/minの2回の適用によって18MPaの強度が生じた場合、投入酵素に対する強度の改善は、18÷8.8＝2.05MPa/(mM尿素/min)でありうる)。
【００９４】
(B) セメンテーションの間の強度の発達
セメンテーションの間の強度の発達についてのデータを、図3に示す。
【００９５】
細菌酵素系により、可溶性の植物酵素系に対する速度および強度の改善の性質の著しい違いが示された(図4)。さらに、インサイチューでのアンモニウム産生速度は、細菌系において同様に適用された活性と比べて、可溶性の植物系において有意に小さい(図5)。
【００９６】
中程度(9mM尿素/min)および高い(12mM尿素/min)活性のコアに対する尿素加水分解速度のデータを、図6および図7に示す。
【００９７】
(C) 酵素の複数適用
セメンテーションの初めの数時間の間、第一の処置は7.2mM NH4+/minのアンモニウム産生速度を維持したが、これは、3.6mM尿素加水分解/minと関連する。第二の適用における初めの尿素加水分解速度はこの速度の2倍であったが(7.8mM尿素/min)、このことは、第一の処置に由来する細菌ウレアーゼ活性が、第二の処置においても依然として活性であったことを示す(図8を参照されたい)。第二の処置におけるより高い活性レベルは、反応のより迅速な完結をもたらす。
【００９８】
(D) 酵素の固定化および反応物による再処置
たとえさらなる酵素を追加しなかった場合でも、約1Mのアンモニウムが4時間で産生されたが(4.5mMアンモニウム産生/min)、このことは、2.25mM尿素加水分解/minの平均ウレアーゼ活性と関連する(図9を参照されたい)。コア内の残りの酵素は、適用後の最初の数時間しか活性でなく、4時間を超えると、さらなるアンモニウム産生は全く起こらない。
【００９９】
実施例2−その他の砂におけるバイオセメンテーション
原料および方法
(A) 酢酸ベジマイト(Vegemite Acetate)培地
酢酸ベジマイト培地は、13.5g/Lのベジマイトからなり、ここから重力沈降によって固体を除去し、次に上方画分をデカントして、150mMの酢酸を氷酢酸として加えた。6M NaOHを用いてpH7に調整した。
【０１００】
接種物培養については、培地を滅菌し、滅菌後に滅菌濾過により10g/L尿素を加えた。パイロット規模の培養については、培地を滅菌せず、滅菌濾過なしに尿素を加えた。 
【０１０１】
(B) 10Lのパイロット規模の接種物培養
パイロット規模の接種物を、滅菌条件下、10L滅菌タンク形反応器(Chemap, Germany)中で、30℃、pH8.25の開始pHで増殖させた。
【０１０２】
(C) 100Lのパイロット規模の培養
パイロット規模の培養を、非滅菌条件下、120Lの特注のガラス繊維エアリフト反応器(Andrew Brown & Co., Perth提供)中で、作業容積を100Lとして行った。
【０１０３】
容器の温度は30℃に制御され、開始pHはpH8.15であった。
【０１０４】
(D) ウレアーゼ活性およびバイオマス
ウレアーゼ活性、特定のウレアーゼ活性、およびバイオマスは、一般的な原料および方法の項に記載したとおりに計算された。
【０１０５】
(E) セメンテーション
セメンテーション試験は、<300μmの珪砂(すなわち全砂粒子が300μm未満)、多少の頁岩を含む市販のオランダ製建築用砂(Koolschijn)、または、各実験について示した、Koolschijn砂9に対して泥炭混合物1(Koolschijn、泥炭はGeoDelft, The Netherlandsより供給された)のいずれかにおいて行った。
【０１０６】
砂のコアについては約1.75g.cm3または砂/泥炭のコアについては1.65g.cm3の均一な密度を得るために、砂を連続振動させながら乾パックして、38(内径)×170mm PVCパイプカラムに入れた。次に水をコアに上方流入させ、軽くたたいて、空気ポケットを除去した。Ca/尿素溶液および酵素を、加圧容器を介したコアへの注入直前にあらかじめ混和した(図10を参照されたい)。セメンテーション反応物(カルシウム/尿素溶液および細菌細胞)を迅速に混和し、圧縮空気を用いて閉鎖および加圧された容器に入れた。次に液体ラインを開き、セメンテーション溶液を、砂のコアを通って上方流入させた。コアが完全に飽和されたら、液体ラインを閉め、セメンテーション溶液をコア内に24時間残留させた。最大4つのコアを一度に処置することができた。 
【０１０７】
水の完全な置換を確実にするため、細孔容積(空隙容積)の1.5倍量を流入させた。セメンテーション流入の間に、全ての使用済み液体を除去するためにコアを通して水を流入させた。各実験に関して、各コアに対するセメンテーション流入の回数を示す。セメンテーション後、コアに漂白液を流入させ、60℃の乾燥器で乾燥させた。
【０１０８】
(F) ウレアーゼ調製
10L滅菌タンク形反応器を使用して、100Lのパイロット規模の反応器用に適した接種物を作製した。S. パストゥリを、滅菌条件下、酢酸ベジマイト培地上で培養した。
【０１０９】
5Lの接種物を、接種物培養(上記)から、パイロット規模のエアリフト反応器(5％接種物)へと移し、非滅菌条件下、酢酸ベジマイト培地上で培養した。以前の実験により、S. パストゥリは、最大50％の雑菌混入を伴う非滅菌条件下で、ウレアーゼ活性のレベルに影響することなく培養可能であることが示されている。パイロット規模の培養は、接種直前に反応器の内部を5％次亜塩素酸溶液で洗浄する工程および水で十分洗浄する工程を伴う、非滅菌の「清潔な」条件下で行われた。最大ウレアーゼ活性は、約6mM尿素加水分解/minであった。
【０１１０】
(G) バイオセメンテーション後の強度特性の決定
Koolschijn砂のセメンテーションは、酢酸ベジマイトおよびアンモニウム培地で培養されて15psiでコアに注入された細胞由来の、8.75mM尿素/minのウレアーゼ活性を用いて行った。
【０１１１】
Koolschijn砂(K)または90％ Koolschijn＋10％泥炭混合物(w/w)(KP)のいずれかを用いて試料を調製し、2、3、または4回のバイオセメンテーション処置で処置した。
【０１１２】
セメンテーション後、コアの強度特性を三軸試験により調べ、剪断強度および剛性を決定した。三軸試験とは、封圧下での円筒形の岩石試料の加圧試験であり、ここで、負荷経路はコンピュータにより追跡される。この試験は、封圧および偏差応力(deviatoric stress)に供された場合にインサイチューでの岩石原料に起こりうる条件をまねることを目的としていた。三軸剪断フェーズ(triaxial shearing phase)の前に、試料にCO2を流入させて水不溶性気体を全て除去し、水で飽和させた。剛性は、ピーク圧力の50％におけるヤング率を用いて決定し、剪断強度は、最大偏差応力の50％において決定した。
【０１１３】
剪断強度とは、原料が剪断破壊を受けるまでに加えられる圧力(力÷面積)の量の尺度である(土壌がもはや耐えられないような状況では、過剰な変形および圧力の再分布がもたらされることなく、加えられる負荷が増加する)。剛性とは、剪断強度50％における圧力とひずみの比であり、これにより、特定のレベルのずれを与えるのに必要な力が評価される。
【０１１４】
セメンテーション後の細孔容積減少の程度を決定するために、処置後の細孔容積を、未凝固砂の細孔容積と比較した。透過性試験は、30cmの頭差(head difference)、300kPaの背圧、および100kPaの圧密化圧を用いて行った。
【０１１５】
結果
(A) バイオセメンテーション
バイオセメンテーションに供したKoolschijn砂は、強度および剛性が明確に改善され、剪断強度は平均で8倍増加し、剛性は3倍増加した(図11)。
【０１１６】
Koolschijn/泥炭試料(KP)は明らかに異なっており、K砂と比べて低い強度と低い剛性を示した。KP砂における2回のバイオセメンテーション処置は、セメント接着されていないK砂と比べて改善を示さなかった。しかし、セメント接着されていないKP砂の強度特性は決定されておらず、より低い可能性があることに留意されたい。KP砂における適用の回数増加により、剪断強度が改善された(図11)。
【０１１７】
細孔容積は2％から14％の間で減少し、セメンテーション後のわずかな減少を示したが、したがって、コアの透過性はほとんど変化しないままであった(図12)。 
【０１１８】
実施例3−バイオセメンテーションのための透過深度(penetration depth)の増大
原料/方法
6mM Ca2+の存在下で細菌を培養し、その後、細菌培養物650mL(約10mM尿素加水分解/minのウレアーゼ活性)を、11:39分間7.5psiの圧力下での上方流入(1.4L/hr)により、1m砂カラムに供した。細菌細胞を内含するカラムを、室温で48時間維持し、その後1.25M Ca2+および1.7M尿素をカラムに上方流入させた。
【０１１９】
結果
均一な強度が得られた。セメント接着されたカラムの均一性は、アンモニウム分析により確認した。図13を参照されたい。セメンテーション後のカラムの写真2枚を、図14Aおよび14Bに添付した。
【０１２０】
実施例4−バイオセメンテーションのための細菌の固定(固定化)
原料/方法
6mMのカルシウムを、バイオセメンテーションに使用するための細菌増殖培地に添加し、砂カラムを流入した後、砂カラムへの細菌の残留を評価した。
【０１２１】
結果
6mMカルシウムを増殖培地に添加することによって、使用した細菌株の「剛性」が増大した。細菌をカラム中に1mを上回って流入させ、2回目の流入後に、50％を上回る細菌がカラム中で保持された。カルシウム非存在下で細菌を培養した場合、二回目の流入後に80％を上回る細菌がカラムから失われた。 
【０１２２】
この技術により、出発原料に適用されるウレアーゼ活性の量を厳密に制御することが可能になり、かつ、試薬の複数回の適用を伴う方法からの細菌の損失が最小限になる。
【０１２３】
実施例5−細菌が固定化された珪砂におけるバイオセメンテーション
砂土における土壌安定化への特定の適用を有する珪砂のバイオセメンテーションの例を、以下に示す。
【０１２４】
原料/方法
内径29mmの60ml PVCシリンダを、0.300mmに達する洗浄SiO2砂(0.300 mm passing washed SiO2 sand)とともに乾パックした。ウレアーゼ活性細菌培養物(バチルス・パストゥリ(Bacillus pasteurii))を、1L振とうフラスコ内、0.3M尿素および6mM CaCl2を含む培地中で、振とうさせながら28℃で24時間増殖させた。
【０１２５】
細胞のウレアーゼ活性は、約0.5mS/minの導電率の変化により測定されたとおり、5.6mM尿素加水分解/minであった。この細菌ウレアーゼ活性のレベルは、細胞を濃縮する必要なしに、砂において強く迅速なセメンテーションを生じるのに十分であり、したがって、潜在的に高価な、細菌を濃縮するさらなる処理段階を回避するものである。
【０１２６】
細菌懸濁物の3空隙容積がポンプで注入されるまで、低速流動蠕動ポンプ(slow-flow peristaltic pump)(ポンプ速度15mL/分)を用いて、細菌細胞を含む培養物を、シリンダを通って上方流入させた。細菌を多少含む過剰な液体を、シリンダの上部において流出させた。細菌懸濁物の残りをカラム中で約48時間維持した。この付着時間により、細菌が、その後のカルシウム/尿素溶液の流入に伴い流出されることを回避しながら、砂粒子に付着できる。
【０１２７】
塩化カルシウムおよび尿素を含む等モル溶液(どちらも濃度1M)を、シリンダの空隙容積の1.3倍に等しい容積に適用されるまで、同様の蠕動ポンプを用いて上方流入させた。室温で24時間インキュベーションした後、同様の塩化カルシウム/尿素溶液の二度目の適用をシリンダを通って流入させ、さらなる方解石結晶を形成させた。この二度目の流入は、弱い強度が望ましい場合は省略することができる。
【０１２８】
結果
セメント接着された珪砂円筒形試料を、PVCシリンダから取り出し、その一軸(unconfined)圧縮強度を計測した。測定された一軸(unconfined)圧縮強度は1.7MPaであった。 
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
（図１）1.5M等モルの尿素およびカルシウム溶液を用いた第一(○)および第二(●)の処置に関して、24時間後にコア長全90mmにわたって記録された一軸圧縮強度を示すグラフである。
（図２）第一(○)および第二(●)のバイオセメンテーション処置に関して、ウレアーゼ活性投入量あたりの達成された強度を示すグラフである。
（図３）異なる細菌酵素濃度が、コアに沿った3箇所(15mm(●)、45mm(△)、および75mm(■))におけるセメンテーションの間の強度の発達に、および、付随する、尿素加水分解からのアンモニウムの産生(×)に与える効果を示すグラフである。ウレアーゼは、完全な細菌細胞として、6mM尿素加水分解/min(A)、9mM尿素加水分解/min(B)、および12mM尿素加水分解/min(C)で加えられる。
（図４）セメンテーション反応の間の、注入箇所からコア全長に沿った3箇所(15mm(●)、45mm(△)、および75mm(■))における可溶性植物酵素(9mM尿素加水分解/min)を用いた経時的な強度改善、およびアンモニウム濃度(×)を示すグラフである。
（図５）異なる完全な細胞の細菌ウレアーゼ活性(6mM尿素加水分解/min(□)、9mM尿素加水分解/min(●)、および12mM尿素加水分解/min(△))および可溶性植物酵素(9mM尿素加水分解/min(■))における、コア内部のインサイチュー尿素加水分解速度を示すグラフである。
（図６）高活性のコアに関するそれぞれの間隔における尿素加水分解速度(●)に対する、注入箇所から12mmにおける、加水分解された尿素
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あたりの強度の変化を示すグラフである。
（図７）中程度の活性のコアに関するそれぞれの間隔における尿素加水分解速度(●)に対する、注入箇所から45mm
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および75mm(□)における、加水分解された尿素あたりの強度の変化を示すグラフである。
（図８）砂のコア内部の酵素および反応物の第一(□)および第二(■)の適用の期間に対する、アンモニウムのインサイチュー産生を示すグラフである。両適用とも、標準的条件下で11mM尿素加水分解/minの酵素活性が加えられた。
（図９）酵素および反応物の2回の前述の適用後にコア内に固定化された残存ウレアーゼ活性を示すグラフである。
（図１０）セメンテーション液を砂コアに注入する方法の模式図である。
（図１１）バイオセメンテーション処置後(処置の番号を括弧内に示す)の、Koolschijn砂(K)および10％泥炭石と混和されたKoolschijn砂(KP)における剪断強度
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および剛性(□)を示すグラフである。
（図１２）3回バイオセメンテーション処置されたKoolschijn砂の、処置前後での空隙容積の違いを示すグラフである。
（図１３）連続的にセメント接着されたカラムの全長に沿った異なる距離から集めた試料についてのNH4+分析である。
（図１４）本発明の好ましい態様を用いてセメント接着されたカラムの、倍率の異なる2枚の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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