(57)【要約】  本発明は、２つ以上のサンプルにおいて２つ以上のライブラリーを産出するために複雑度の減少を行なうこと、ライブラリーの少なくとも一部をシークエンシングすること、同定された配列をアライメントすること、任意の推定上の一塩基多型を決定すること、任意の推定上の一塩基多型を確認すること、確認された一塩基多型のための検出プローブを生成すること、検査ライブラリーを提供するために、検査サンプルに同様な複雑度の減少を行なうこと、及び検出プローブを使用して一塩基多型の存在又は一塩基多型の非存在について検査ライブラリーをスクリーニングすることによる、一塩基多型のハイスループット同定のための方法に関する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ又は複数の多型性を同定する方法であって、
ａ）対象となる第１の核酸サンプルを提供する工程と、
ｂ）対象となる前記第１の核酸サンプルについて複雑度の減少を行ない、該第１の核酸サンプルの第１のライブラリーを提供する、工程と、
ｃ）対象となる第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルにより、連続的に又は同時に工程ａ）及び工程ｂ）を行ない、対象となる該第２の核酸サンプルの第２のライブラリー又は該さらなる核酸サンプルのさらなるライブラリーを得る、工程と、
ｄ）前記第１のライブラリー及び前記第２のライブラリー又は前記さらなるライブラリーの少なくとも一部をシークエンシングする工程と、
ｅ）工程ｄ）において得られた配列をアライメントさせる工程と、
ｆ）工程ｅ）のアライメントにおいて、前記第１の核酸サンプル及び前記第２の核酸サンプル又は前記さらなる核酸サンプルの間の１つ又は複数の多型性を決定する工程と、
ｇ）工程ｆ）において決定された１つ又は複数の多型性を用い、検出プローブを設計する、工程と、
ｈ）対象となる検査サンプルの核酸を提供する工程と、
ｉ）対象となる前記検査サンプルの核酸について工程ｂ）の複雑度の減少を行ない、該検査サンプルの核酸の検査ライブラリーを提供する、工程と、
ｊ）前記検査ライブラリーをハイスループットスクリーニングして、工程ｇ）において設計された前記検出プローブを用いて、工程ｆ）において決定された多型性の存在、多型性の非存在、又は多型性の量を同定する、ハイスループットスクリーニングする工程と
を含む、１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項２】
工程ｂ）が、タグを付けたライブラリーを得るための前記ライブラリーをタグ付けする工程をさらに含み、組合せライブラリーを得るために第１のタグを付けたライブラリー及び第２のタグを付けたライブラリー又はさらなるタグを付けたライブラリーを組み合わせる工程ｃ１）をさらに含む、請求項１に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項３】
対象となる第１の核酸サンプル及び対象となる第２の核酸サンプル又は対象となるさらなる核酸サンプルのタグ付けが、各々のサンプルに対して異なるタグを使用して行なわれる、請求項２に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項４】
複雑度の減少が、
−  少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼにより前記核酸サンプルを消化して、制限断片へ断片化すること、
−  １つ又は両方の前記制限断片の末端と合うような１つの末端を有する、少なくとも１つの二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターで得られた該制限断片をライゲーションして、アダプターにライゲーションされた制限断片を生成すること、
−  ハイブリダイズする条件下で、アダプターにライゲーションされた前記制限断片を、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、及び
−  前記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって、アダプターにライゲーションされた前記制限断片を増幅することにより行なわれ、
−  ここで前記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、前記制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドを含み、アダプターで存在するヌクレオチドの少なくとも一部を含む、アダプターにライゲーションされた前記制限断片の末端で前記鎖の端末部分と同じヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含み、ここで任意で、該プライマーの少なくとも１つが、その３’末端で、該制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与する該ヌクレオチドにすぐに隣接して位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む選択された配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項５】
前記アダプター及び／又は前記プライマーがタグを含む、請求項４に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項６】
前記タグが識別子配列である、請求項５に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項７】
前記プライマーの少なくとも１つがリン酸化される、請求項４に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項８】
シークエンシングが、ビーズのような固体支持体上で行なわれる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項９】
シークエンシングが、ダイデオキシ連鎖停止シークエンシングに基づく、請求項１〜８のいずれか一項に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項１０】
前記シークエンシングが、
−  各々のビーズがアダプターにライゲーションされた単一の断片とアニーリングされるビーズへ、アダプターにライゲーションされた断片をアニーリングする工程と、
−  各々の油中水滴型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水滴型マイクロリアクター中の前記ビーズを乳化する工程と、
−  各々のウェルが単一のビーズを含む、ウェル中に前記ビーズを充填する工程と、
−  ピロリン酸シグナルを生成する工程と
を含む、請求項８に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項１１】
シークエンシングアダプターが、前記アニーリングする工程に先行して、第１のタグを付けたライブラリー及び第２のタグを付けたライブラリー又は組合せライブラリー中の断片にライゲーションされる、請求項１０に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項１２】
前記シークエンシングアダプターが、３’−Ｔ突出部を伴う、請求項１１に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項１３】
ハイスループットスクリーニングがアレイ上に工程ｈ）で設計されたプローブの固定化によって行なわれ、その後ハイブリダイズする条件下で、プローブを含む該アレイを検査ライブラリーと接触させる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項１４】
１つ又は複数の多型性を同定する方法であって、
ａ）対象となる複数の核酸サンプルを提供する工程と、
ｂ）各々の前記サンプル上で複雑度の減少を行ない、該核酸サンプルの複数のライブラリーを提供する、工程であって、該複雑度の減少が、
−  少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼにより各々の核酸サンプルを消化して、制限断片へ断片化すること、
−  １つ又は両方の前記制限断片の末端と合うような１つの末端を有する、少なくとも１つの二本鎖の合成オリゴヌクレオチドアダプターで得られた該制限断片をライゲーションして、アダプターにライゲーションされた制限断片を生成すること、
−  ハイブリダイズする条件下で、前記アダプターにライゲーションされた制限断片を、１つ又は複数のリン酸化されたオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、及び
−  前記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によってアダプターにライゲーションされた前記制限断片を増幅することであって、ここで前記１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、前記制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドを含み、アダプターで存在するヌクレオチドの少なくとも一部を含む、アダプターにライゲーションされた該制限断片の末端で前記鎖の端末部分と同じヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含み、ここで任意で、該プライマーの少なくとも１つが、その３’末端で、該制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与する該ヌクレオチドにすぐに隣接して位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む選択された配列を含み、ここで該アダプター及び／又は該プライマーがタグを含むこと、
によって行なわれる工程と、
ｃ）組合せライブラリーへ前記ライブラリーを組み合わせる工程と、
ｄ）ビーズへアニーリングすることが可能なシークエンシングアダプターを、前記組合せライブラリー中の増幅されたアダプターでキャッピングされた前記断片へライゲーションし、３'−Ｔ突出部を伴うシークエンシングアダプターを用い、ビーズにアニーリングされた断片をエマルジョン重合する工程と、
ｅ）前記組合せライブラリーの少なくとも一部をシークエンシングする工程と、
ｆ）工程ｅ）において得られた各々のサンプルからの前記配列をアライメントさせる工程と、
ｇ）工程ｆ）のアライメントにおいて複数の前記核酸サンプル間で１つ又は複数の多型性を決定する工程と、
ｈ）工程ｇ）において決定された前記１つ又は複数の多型性を用い、検出プローブを設計する、工程と、
ｉ）対象となる検査サンプルの核酸を提供する工程と、
ｊ）対象となる前記検査サンプルの核酸について工程ｂ）の複雑度の減少を行ない、該検査サンプルの核酸の検査ライブラリーを提供する、工程と、
ｋ）前記検査ライブラリーでハイスループットスクリーニングを行ない、工程ｈ）において設計された検出プローブを用いて、工程ｇ）において決定された多型性の存在、多型性の非存在、又は多型性の量を同定する、工程と
を含む、１つ又は複数の多型性を同定する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１１に記載の方法の使用であって、濃縮されたマイクロサテライトライブラリーのスクリーニング、転写プロファイリングｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ（デジタルノーザン）の実行、複雑なゲノムのシークエンシング、発現配列タグライブラリーのシークエンシング（全体のｃＤＮＡ又はｃＤＮＡ−ＡＦＬＰについて）、マイクロＲＮＡの発見（小さなインサートライブラリーのシークエンシング）、バクテリア人工染色体（コンティグ）シークエンシング、ＡＦＬＰ／ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰと組み合わせたバルクセグレガント分析（Bulked Segregant analysis：バルク分離体分析）アプローチ、ＡＦＬＰ断片のルーチン検出（マーカー利用戻し交配）に関する、請求項１〜１１に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び遺伝学の分野に関する。本発明は、核酸サンプルにおける複数の多型性の迅速な同定に関する。同定された多型性は、検査サンプルの多型性のためのハイスループットスクリーニング系の開発に対して使用されてもよい。
【背景技術】
【０００２】
ゲノムＤＮＡの調査は、科学関係者、特に医療関係者によって長く望まれてきた。ゲノムＤＮＡは、癌及びアルツハイマー病のような疾患の同定、診断、及び治療の鍵を握る。ゲノムＤＮＡの調査は、疾患の同定及び治療だけでなく、植物及び動物品種改良事業において著しい利点を提供し、食品栄養学の問題に対する答えを世界に示すかもしれない。
【０００３】
多くの疾患が、特異的な遺伝子の多型性を伴う特異的な遺伝的要素に特に関連することが知られている。ゲノムのような大きなサンプルにおける多型性の同定は、現在、困難且つ多くの時間を要する課題である。しかしながら、そのような同定は、製薬産物、組織適合試験、遺伝子型決定、及び集団研究を開発する生物医学研究のような領域に対して非常に価値がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明は、複雑な、例えば非常に大きな核酸サンプル（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）における多型性を、ハイスループット方法の組合せを使用して、迅速及び経済的な様式で、効率的に同定し確実に検出する方法を提供する。
【０００５】
ハイスループット方法のこの統合は、従来の多型性の同定及びマッピングが困難且つ多くの時間を要するような、非常に複雑な核酸サンプルにおいて、迅速及び確実な多型性の同定及び検出に対して特に適しているプラットフォームを共に提供する。
【０００６】
本発明者が発見したものの１つは、多型性、好ましくは一塩基多型の同定のため、また同様に、特に大きなゲノム中の（マイクロ）サテライト及び／又は挿入・欠失（indels：インデル）の同定のための解決法である。本発明の方法は、大きなゲノム及び小さなゲノムの両方への適用の可能性という点において独特であるが、大きなゲノム、特に倍数体種における特定の利点を提供する。
【０００７】
ＳＮＰを同定する（及び続いて同定されたＳＮＰを検出する）ために、当該技術分野において利用可能ないくつかの可能性がある。第１の選択では、全ゲノムはシークエンシングすることが可能であり、いくつかの個体についてはそのようなことを行うことができる。これは煩わしく費用のかかることであるので、大半は理論的な試行であり、技術の迅速な発展にもかかわらず、単純に全ての生物、特により大きなゲノムの生物で行うのは実現可能でない。第２の選択は、ＥＳＴライブラリーのような利用可能な（断片化した）配列情報を使用することである。これは、ＰＣＲプライマーの生成、再シークエンシング、及び個体間の比較を可能にする。さらに、これは、利用可能でないか、又は限られた量でのみ利用可能な、初期の配列情報を必要とする。各々の領域については、さらに個別のＰＣＲ分析を開発しなければならず、費用及び開発時間は桁外れに増してしまう。
【０００８】
第３の選択は、同定自体を各々の個体に対するゲノムの一部に限定することである。成功するＳＮＰ同定に匹敵する結果を提供するためには、提供されるゲノムの部分は、異なる個体にとっても同じでなくてはならないという問題点が存在する。本発明者等は、サンプル調製及びハイスループット同定プラットフォームで統合された、多型性の同定のためのハイスループットシークエンシングによるゲノムの一部を選択するための高度に再現可能な方法の統合によって、今やこの難問を解決している。本発明は、多型性発見の過程を加速し、次の過程で、効果的で確実なハイスループット遺伝子型決定を可能にするように、同一の要素を発見した多型性の利用のために使用する。
【０００９】
本発明の方法のさらに想定される適用は、濃縮マイクロサテライトライブラリーのスクリーニング、転写プロファイリングｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ（デジタルノーザン）の実行、複雑なゲノムのシークエンシング、ＥＳＴライブラリーのシークエンシング（全体のｃＤＮＡ又はｃＤＮＡ−ＡＦＬＰについて）、マイクロＲＮＡの発見（小さなインサートライブラリーのシークエンシング）、バクテリア人工染色体（ＢＡＣ）（コンティグ）シークエンシング、バルクセグレガント分析アプローチのＡＦＬＰ／ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ、例えばマーカー利用戻し交配（ＭＡＢＣ）のための、ＡＦＬＰ断片のルーチンの検出等を含む。
【００１０】
定義
以下の説明及び実施例において、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む、明細書及び請求項についての明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。特別に本明細書において定義されないならば、使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照によりそれら全体は本明細書において援用される。
【００１１】
多型性：多型性は、集団中のヌクレオチド配列の２つ以上の変異型の存在を指す。多型性は１つ又は複数の塩基変化、塩基挿入、塩基反復、又は塩基欠失を含んでもよい。多型性は、例えば、単純反復配列（ＳＳＲ）及び一塩基多型（ＳＮＰ）を含み、それらはアデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、又はグアニン（Ｇ）の単一のヌクレオチドが変わったときに生じる変異である。集団の通常少なくとも１％で変異が生じたものが、ＳＮＰと考えられる。ＳＮＰは、例えば全てのヒト遺伝的変異の９０％を占め、ヒトゲノムにわたって１００〜３００塩基ごとに起こるものである。３つのＳＮＰ当たり２つのＳＮＰは、チミン（Ｔ）によってシトシン（Ｃ）が置換される。ＤＮＡ塩基配列の変異は、例えば、ヒト又は植物がどのように疾患、細菌、ウイルス、化学薬品、薬剤等を扱うかに影響し得る。
【００１２】
核酸：本発明に記載の核酸は、ピリミジン塩基及びプリン塩基の任意のポリマー又はオリゴマー、好ましくはシトシン、チミン及びウラシル、並びにアデニン及びグアニンをそれぞれ含んでもよい（Albert L. Lehninger著「生化学の原理（Principles of Biochemistry）」,793-800（Worth Pub. 1982）を参照、これは全ての目的のためにその全体を参照により本明細書において援用される）。本発明は、下記の塩基のメチル化された形式、ヒドロキシメチル化された形式又は糖鎖が付加した形式等のような、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はペプチド核酸、及びそれら任意の化学的な変異型も検討する。ポリマー又はオリゴマーは、組成物中で不均質また均質であってもよく、天然に存在するソースから単離するか又は人為的若しくは合成的に生成されてもよい。さらに核酸は、ＤＮＡ又はＲＮＡ、又はそれらの混合物であってもよく、恒久的に又は一時的に、ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、及びハイブリッド状態を含む、一本鎖型又は二本鎖型で存在してもよい。
【００１３】
複雑度の減少：用語「複雑度の減少」は、サンプルのサブセットの生成によって、ゲノムＤＮＡのような核酸サンプルの複雑度を減少させる方法を意味するために使用する。このサブセットはサンプル全体（すなわち複雑である）の代表になることができ、好ましくは再現可能なサブセットである。本文脈において、再現可能は、同一の方法を使用して、同一のサンプルの複雑度が減少される場合、同じ又は少なくとも同程度のサブセットが得られることを意味する。複雑度の減少のために使用される方法は、当該技術分野において既知である複雑度の減少のための任意の方法であってもよい。複雑度の減少のための方法の例は、例えば、ＡＦＬＰ（登録商標）（Keygene N.V．、オランダ；例えば欧州特許第０，５３４，８５８号を参照）、Dongにより記述された方法（例えば、国際公開特許第ＷＯ０３／０１２１１８号、同第ＷＯ００／２４９３９号を参照）、インデックスリンク（indexed linking）（Unrau et al.、以下参照）等を含む。本発明で使用される複雑度の減少方法は、それらが再現可能であることが共通である。同一のサンプルが同一の様式で複雑度が減少される場合に、サンプルの同一のサブセットが得られるという意味における再現性については、顕微解剖、又は選択された組織で転写されたゲノムの一部を表わし、その再現性については、組織の選択、単離時期等への依存があるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の使用のような、より無作為な複雑度の減少に対立するものである。
【００１４】
タグ付け：用語「タグ付け」は、核酸サンプルを第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルと区別することを可能にするために、核酸サンプルへタグを追加することを指す。タグ付けは、例えば、複雑度の減少の間の配列識別子の追加により、又は当該技術分野において既知である任意の他の手段により行なうことができる。そのような配列識別子は、特異的な核酸サンプルの同定のために独自に使用される、例えば一様でないが、定義された長さのユニーク塩基配列であり得る。その代表例は、例えばＺＩＰ配列である。そのようなタグを使用して、その後の加工に際して、サンプルの起源を決定することができる。異なる核酸サンプルから生じる加工生成物を組み合わせる場合には、異なる核酸サンプルは異なるタグを使用して同定されるべきである。
【００１５】
タグ付けしたライブラリー：用語「タグ付けしたライブラリー」は、タグを付けた核酸のライブラリーを指す。
【００１６】
シークエンシング：用語「シークエンシング」は、核酸サンプル、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ中のヌクレオチド（塩基配列）の順番を決定することを指す。
【００１７】
アライメントさせること及びアライメント：用語「アライメントさせること」及び「アライメント」により、同一又は同様のヌクレオチドの、短い又は長い一続きのものの存在に基づいた、２つ以上のヌクレオチド配列の比較が意味される。さらに以下で説明されるように、ヌクレオチド配列のアライメントのためのいくつかの方法は、当該技術分野において既知である。
【００１８】
検出プローブ：用語「検出プローブ」は、特異的なヌクレオチド配列、特に１つ又は複数の多型性を含む配列の検出のために設計されたプローブを示すために使用される。
【００１９】
ハイスループットスクリーニング：ＨＴＳとしばしば略されるハイスループットスクリーニングは、特に生物学分野及び化学分野に関連する、科学的な実験作業のための方法である。最新のロボット工学と他の特殊な研究室ハードウェアとの組合せによって、研究者が効果的に同時に大量のサンプルをスクリーニングすることを可能にする。
【００２０】
検査サンプルの核酸：用語「検査サンプルの核酸」は、本発明の方法を使用して、多型性について調査される核酸サンプルを示すために使用される。
【００２１】
制限エンドヌクレアーゼ：制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子中の特異的なヌクレオチド配列（標的部位）を認識し、標的部位ごとにＤＮＡ分子の両方の鎖を切断する酵素である。
【００２２】
制限断片：制限エンドヌクレアーゼによる消化により生成されたＤＮＡ分子は制限断片と呼ばれる。任意の所定のゲノム（又はその起源にかかわらず核酸）は、特定の制限エンドヌクレアーゼにより、制限断片の不連続なセットへと消化されるだろう。制限エンドヌクレアーゼ切断に由来するＤＮＡ断片は、様々な技法の中でさらに使用することができ、例えばゲル電気泳動法により検出することができる。
【００２３】
ゲル電気泳動法：制限断片を検出するために、サイズに基づいて二本鎖ＤＮＡ分子を分画するための分析方法が必要になる。そのような分画を達成するために、最も一般に用いられている技法は、（キャピラリー）ゲル電気泳動法である。ＤＮＡ断片のそのようなゲル中での移動率は、ＤＮＡ断片の分子量に依存する。したがって、断片長が増加するにつれて、移動距離は減少する。ゲル電気泳動法により分画されたＤＮＡ断片は、染色手順、例えば、パターンの中に含まれた断片数が十分に少ない場合には、銀染色法又はエチジウムブロマイドを使用する染色により直接可視化することができる。或いは、ＤＮＡ断片のさらなる処理では、蛍光色素分子又は放射性標識のような、断片において検出可能な標識を取り込んでもよい。
【００２４】
ライゲーション：２つの二本鎖ＤＮＡ分子を共有結合で共に連結させるリガーゼ酵素により触媒された酵素反応は、ライゲーションと呼ばれる。一般に、両方のＤＮＡ鎖は共有結合で共に連結されるが、鎖の末端の１つの化学的修飾又は酵素的修飾によって、２つの鎖のうちの１つの鎖のライゲーションを防ぐことも可能である。その場合には、共有結合が２つのＤＮＡ鎖のうちの１つだけにおいて起こるだろう。
【００２５】
合成オリゴヌクレオチド：化学的に合成することができる、好ましくは約１０〜約５０塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子は、合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。関連した配列を有する分子のファミリーを合成することは可能であり、それはヌクレオチド配列中の特異的な位置で異なるヌクレオチド組成を有しているが、一般に、これらの合成ＤＮＡ分子は、特有なヌクレオチド配列又は望ましいヌクレオチド配列を有するように設計される。用語「合成オリゴヌクレオチド」は、設計されたヌクレオチド配列又は望ましいヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を指すために使用されるだろう。
【００２６】
アダプター：限られた数の塩基対、例えば約１０〜約３０塩基対の長さを有する短い二本鎖ＤＮＡ分子は、制限断片の末端にライゲーションすることができるように設計されている。アダプターは、通常互いに部分的に相補的なヌクレオチド配列がある２つの合成オリゴヌクレオチドから成る。適切な条件下で、溶液中で２つの合成オリゴヌクレオチドを混合した場合、それらはアニーリングして、互いに二本鎖構造を形成するだろう。アニーリング後、アダプター分子の１つの末端は制限断片の末端と適合し、末端でライゲーションすることができるように設計されている。アダプターのもう１つの末端は、ライゲーションできないように設計することができるが、そうである必要はない（二重にライゲーションされたアダプター）。
【００２７】
アダプターにライゲーションされた制限断片：アダプターによりキャッピングされた制限断片。
【００２８】
プライマー：一般に、用語「プライマー」は、ＤＮＡの合成をプライミングすることができるＤＮＡ鎖を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーなしではＤＮＡをデノボ合成することができない：アセンブリングされるヌクレオチドの順序を指定するために、鋳型として相補的な鎖が用いられるような反応において、ＤＮＡポリメラーゼは既存のＤＮＡ鎖のみを伸長することができる。本発明者等は、プライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において用いられる合成オリゴヌクレオチド分子を指すだろう。
【００２９】
ＤＮＡの増幅：用語「ＤＮＡの増幅」は、典型的には、ＰＣＲを用いた二本鎖ＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏの合成を示すために用いられるだろう。他の増幅方法が存在し、それらは主旨から外れずに、本発明において用いられてもよいことが留意される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明は、１つ又は複数の多型性の同定のための方法を提供し、
ａ）対象となる第１の核酸サンプルを提供する工程と、
ｂ）対象となる第１の核酸サンプルについて複雑度の減少を行ない、第１の核酸サンプルの第１のライブラリーを提供する、工程と、
ｃ）対象となる第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルにより、連続的に又は同時に工程ａ）及び工程ｂ）を行ない、対象となる第２の核酸サンプルの第２のライブラリー又はさらなる核酸サンプルのさらなるライブラリーを得る、工程と、
ｄ）第１のライブラリー及び第２のライブラリー又はさらなるライブラリーの少なくとも一部をシークエンシングする工程と、
ｅ）工程ｄ）において得られた配列をアライメントさせる工程と、
ｆ）工程ｅ）のアライメントにおいて、第１の核酸サンプル及び第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルの間の１つ又は複数の多型性を決定する工程と、
ｇ）工程ｆ）において決定された１つ又は複数の多型性を用い、１つ又は複数の検出プローブを設計する、工程と、
ｈ）対象となる検査サンプルの核酸を提供する工程と、
ｉ）対象となる検査サンプルの核酸について工程ｂ）の複雑度の減少を行ない、検査サンプルの核酸の検査ライブラリーを提供する、工程と、
ｊ）検査ライブラリーをハイスループットスクリーニングして、工程ｇ）において設計された１つ又は複数の検出プローブを用いて、工程ｆ）において決定された多型性の存在、多型性の非存在、又は多型性の量を同定する、ハイスループットスクリーニングする工程と
を含む。
【００３１】
工程ａ）では、対象となる第１の核酸サンプルが提供される。対象となる上記第１の核酸サンプルは、好ましくは、全ゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡライブラリーのような複雑な核酸サンプルである。複雑な核酸サンプルが全ゲノムＤＮＡであることが好ましい。
【００３２】
工程ｂ）では、複雑度の減少は、第１の核酸サンプルの第１のライブラリーを提供するために、対象となる第１の核酸サンプルについて行なわれる。
【００３３】
本発明の１つの実施形態において、核酸サンプルの複雑度の減少の工程は、制限断片の核酸サンプルを酵素で切断すること、制限断片を分離すること、及び制限断片の特定のプールを選択することを含む。その後任意で、選択された断片は、ＰＣＲプライマー鋳型／結合配列を含むアダプター配列にライゲーションされる。
【００３４】
複雑度の減少の１つの実施形態において、ＩＩ型エンドヌクレアーゼは核酸サンプルを消化するために用いられ、制限断片はアダプター配列に選択的にライゲーションされる。アダプター配列は、ライゲーションされる突出部に様々なヌクレオチドを含むことが可能であり、突出部でヌクレオチドの適合セットを有するアダプターのみが、断片にライゲーションされ、続いて増幅される。この技術は、当該技術分野において、「インデックスリンカー」として表現される。この原理の例は、とりわけUnrau P.及びDeugau K.V.（1994）Gene 145:163-169で見出すことができる。
【００３５】
別の実施形態において、複雑度の減少の方法は、異なる標的部位及び異なる頻度を有する２つの制限エンドヌクレアーゼ、及び２つの異なるアダプター配列を利用する。
【００３６】
本発明の別の実施形態において、複雑度の減少の工程は、サンプルで任意配列プライマーＰＣＲを行なうことを含む。
【００３７】
本発明のさらに別の実施形態において、複雑度の減少の工程は、ＤＮＡの変性及びＤＮＡ再アニーリングによって反復配列を除去すること、及びその後二本鎖二重鎖（double-stranded duplexes）を除去することを含む。
【００３８】
本発明の別の実施形態において、複雑度の減少の工程は、望ましい配列を含むオリゴヌクレオチドプローブに結合された磁気ビーズへ核酸サンプルをハイブリダイズすることを含む。この実施形態は、ハイブリダイズされたサンプルを一本鎖ＤＮＡヌクレアーゼに暴露し、一本鎖ＤＮＡを除去する暴露すること、クラスＩＩ制限酵素を含むアダプター配列をライゲーションし、磁気ビーズを遊離するライゲーションすることをさらに含んでもよい。この実施形態は、単離されたＤＮＡ配列の増幅を含んでもよいし、含まなくてもよい。さらに、アダプター配列は、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマーのための鋳型として用いられてもよいし、用いられなくてもよい。この実施形態において、アダプター配列は配列識別子又はタグを含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００３９】
別の実施形態において、複雑度の減少の方法は、ミスマッチ結合タンパク質にＤＮＡサンプルを暴露すること、及びサンプルをエキソヌクレアーゼそしてその後一本鎖ヌクレアーゼで、３’から５’方向へ消化することを含む。この実施形態は、ミスマッチ結合タンパク質に結合された磁気ビーズの使用を含んでもよいし、含まなくてもよい。
【００４０】
本発明の別の実施形態において、複雑度の減少は、本明細書の他の部分に記述されるようなＣＨＩＰ法、又はＳＳＲ、ＮＢＳ領域（ヌクレオチド結合領域）、プロモーター／エンハンサー配列、テロマーコンセンサス配列、ＭＡＤＳボックス遺伝子、ＡＴＰアーゼ遺伝子ファミリー、及び他の遺伝子ファミリーのような保存モチーフに対するＰＣＲプライマーの設計を含む。
【００４１】
工程ｃ）において、対象となる第２の核酸サンプルの第２のライブラリー又はさらなる核酸サンプルのさらなるライブラリーを得るために、対象となる第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルにより、工程ａ）及び工程ｂ）は連続的又は同時に行なわれる。対象となる当該第２の核酸サンプル又は当該さらなる核酸サンプルは、好ましくは全ゲノムＤＮＡのような複雑な核酸サンプルでもある。複雑な核酸サンプルが全ゲノムＤＮＡであることが好ましい。当該第２の核酸サンプル又は当該さらなる核酸サンプルが、第１の核酸サンプルに関連していることがさらに好ましい。第１の核酸サンプル及び第２の核酸又はさらなる核酸は、例えば異なるコショウ系統のような異なる植物の系統又は異なる変種であってもよい。工程ａ）及び工程ｂ）は、単に対象となる第２の核酸サンプルについて行なわれてもよいが、さらに対象となる第３の核酸サンプル、第４の核酸サンプル、第５の核酸サンプル等で行なわれてもよい。
【００４２】
第１の核酸サンプル及び第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルに、同様な方法を用いて、実質的に同等の条件下、好ましくは同一の条件下で、複雑度の減少が行なわれた場合、本発明に記載の方法が最も有用になることに留意されたい。そのような条件下では、（複雑な）核酸サンプルの同様の（匹敵する）画分が得られるだろう。
【００４３】
工程ｄ）において、第１のライブラリー及び第２のライブラリー又はさらなるライブラリーの少なくとも一部はシークエンシングされる。第１のライブラリー、第２のライブラリー又はさらなるライブラリーからシークエンシングされた断片のオーバーラップの量は、少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、さらにより好ましくは少なくとも７０％、より一層好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９５％が好ましい。
【００４４】
シークエンシングは、ダイデオキシ連鎖停止法のような、当該技術分野において既知である任意の手段によって、原則としては行われてもよい。しかしながら、シークエンシングは、国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号（Seo et al. （2004） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:5488-93）に（全て４５４コーポレーションの名で）開示された方法のようなハイスループットシークエンシング法、及びヘリオス（Helios）、ソレクサ（Solexa）、ＵＳゲノミクス（US Genomics）等の技術（これらは参照により本明細書において援用される）を用いて行なわれることが好ましい。シークエンシングは、国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号、及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号に（全て４５４コーポレーションの名で）開示された装置及び／又は方法を用いて行なわれることが最も好ましく、それらは参照により本明細書において援用される。記述された技術は、一回の実行において４０００万塩基のシークエンシングを可能にし、競合技術よりも１００倍速く、より安い。シークエンシング技術は、１）ＤＮＡの切断及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のライブラリーに特異的なアダプターのライゲーションと、２）ビーズに対するｓｓＤＮＡのアニーリング、及び油中水滴型マイクロリアクター中のビーズの乳化と、３）ＰｉｃｏＴｉｔｅｒＰｌａｔｅ（登録商標）におけるＤＮＡを伴うビーズの沈着と、４）ピロリン酸光シグナルの生成による１００，０００ウェルの同時シークエンシングとのおおまかには４つの工程から成る。この方法はより詳細に以下で説明されるだろう。
【００４５】
工程ｅ）において、工程ｄ）で得た配列はアライメントを提供するためにアライメントされる。比較目的のための配列のアライメントの方法は、当該技術分野において既知である。様々なプログラム及びアライメントアルゴリズムは、Smith及びWaterman（1981）Adv. Appl. Math. 2:482; Needleman及びWunsch（1970）J. Mol. Biol. 48:443; Pearson及びLipman（1988）Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444; Higgins及びSharp（1988）Gene 73:237-244; Higgins及びsharp（1989）CABIOS 5:151-153; Corpet et al.（1988）Nucl. Acids Res. 16:10881-90; Huang et al.（1992）Computer Appl. in the Biosci. 8:155-65;及びPearson et al.（1994）Meth. Mol. Biol. 24:307-31において記述され、これらは本明細書において参照により援用される。Altschul et al.（1994）Nature Genet. 6:119-29（本明細書において参照により援用される）は、配列アラインメントの方法及び相同性の計算について詳細な考察を提供する。
【００４６】
ＮＣＢＩの基本的局所アライメント検索ツール（Basic Local Alignment Search Tool）（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., 1990）は、配列解析プログラムのｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘに関連する使用について、国立生体情報センター（National Center for Biological Information）（ＮＣＢＩ、メリーランド州ベテスダ）及びインターネット上を含むいくつかのソースから利用可能である。それは＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/＞でアクセスすることができる。このプログラムを用いて、配列同一性を決定する方法の説明は、＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html＞で利用可能である。さらなる適用は、マイクロサテライトの抽出において可能である（Varshney et al. （2005） Trends in Biotechn. 23（1） :48-55を参照）。
【００４７】
典型的には、アライメントは、アダプター／プライマー及び／又は識別子をトリミングした（すなわち、核酸サンプルから生じる断片からの配列データのみを用いて）配列データ上で行なわれる。典型的には、得られた配列データは、断片の起源を同定するため（すなわち、どのサンプルから）に用いられ、アダプター及び／又は識別子に由来した配列はデータから取り除かれ、アライメントはこのトリミングされたセット上で行なわれる。
【００４８】
工程ｆ）において、１つ又は複数の多型性は、アライメントにおいて、第１の核酸サンプル及び第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルの間で決定される。第１の核酸サンプル及び第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルに由来した配列を比較することができるように、当該アライメントは作られる。その後、違いは多型性を反映して同定することができる。
【００４９】
工程ｇ）において、工程ｇ）で決定された１つ又は複数の多型性は、例えばＤＮＡチップ又はビーズに基づいた検出プラットフォーム上のハイブリダイゼーションによる検出のための、検出プローブを設計するために用いられる。多型性が反映されるように、検出プローブは設計される。一塩基多型（ＳＮＰ）の場合には、検出プローブは、典型的には、対立遺伝子識別を最大限にするような中央の位置での変異ＳＮＰ対立遺伝子を含む。そのようなプローブは、或る特定の多型性がある検査サンプルをスクリーニングするのに有利に用いることができる。プローブは、当該技術分野において既知の任意の方法を用いて合成することができる。プローブは、典型的にはハイスループットスクリーニング法に適切なように設計される。
【００５０】
工程ｈ）において、対象となる検査サンプルの核酸が提供される。検査サンプルの核酸は任意のサンプルであってもよいが、好ましくは多型性についてマップされる別の系統又は変種であってもよい。一般に、研究された生物の生殖質を表わす検査サンプルのコレクションを、（ＳＮ）多型性が純種であり検出可能であることを実験的に検証するために、及び観察された対立遺伝子の対立遺伝子頻度を計算するために用いる。任意で、遺伝学的マッピング集団のサンプルも、多型性の遺伝学的地図の位置を決定するために、検証工程に含まれる。
【００５１】
工程ｉ）において、工程ｂ）の複雑度の減少は、検査サンプルの核酸の検査ライブラリーを提供するために、対象となる検査サンプルの核酸について行なわれる。本発明に記載の方法の全体にわたって、複雑度の減少のために同様な方法が、実質的に同等な、好ましくは同一の条件を用いて、それによりサンプルの同様の画分をカバーして、用いられることは非常に好ましい。しかしながら、タグが検査ライブラリーにおいて断片上に存在してもよいが、タグを付けた検査ライブラリーを得ることは必要とされない。
【００５２】
工程ｊ）において、工程ｇ）で設計された検出プローブを用いて、工程ｆ）で決定された多型性の存在、多型性の非存在、又は多型性の量を同定するために、検査ライブラリーでハイスループットスクリーニングを行なう。当業者は、プローブを用いたハイスループットスクリーニングのためのいくつかの方法を知っている。工程ｇ）で得られた情報を用いて設計された１つ又は複数のプローブが、ＤＮＡチップのようなアレイ上に固定され、続いてそのようなアレイが、ハイブリダイズする条件下で検査ライブラリーと接触されることが好ましい。アレイ上の１つ又は複数のプローブに相補的な検査ライブラリー中のＤＮＡ断片は、そのような条件下でそのようなプローブにハイブリダイズし、したがって検出することができる。工程ｊ）で得られた検査ライブラリーを固定化させること、及びハイブリダイズする条件下で、上記の固定された検査ライブラリーを、工程ｈ）で設計されたプローブと接触させることのような、ハイスループットスクリーニングの他の方法も、本発明の範囲内で意図される。
【００５３】
別のハイスループットシークエンシングスクリーニング技法は、とりわけＳＮＰのチップに基づいた検出を用いてAffymetrixによって提供され、ビーズ技術がIlluminaによって提供される。
【００５４】
有利な実施形態において、本発明に記載の方法の工程ｂ）は、タグを付けたライブラリーを得るためにライブラリーをタグ付けする工程をさらに含み、当該方法は、組合せライブラリーを得るための第１のタグを付けたライブラリー及び第２のタグを付けたライブラリー又はさらなるタグを付けたライブラリーを組み合わせる工程ｃ１）をさらに含む。
【００５５】
タグ付けは、第１の核酸サンプルの第１のタグを付けたライブラリーを得るのに必要な工程の量を減少させるように、複雑度の減少の工程の間に行なわれることが好ましい。そのような同時のタグ付けは、例えば、各々のサンプルに対する特有の（ヌクレオチド）識別子を含むアダプターを用いて、ＡＦＬＰにより達成することができる。
【００５６】
タグ付けは、２つ以上の核酸サンプルのライブラリーが、組合せライブラリーを得るために組み合わせられる場合、異なる起源の、例えば異なる植物系統から得られたサンプルを識別するように意図される。したがって好ましくは、異なるタグは、第１の核酸サンプル及び第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルのタグを付けたライブラリーの調製に用いられる。例えば、５つの核酸サンプルが用いられる場合、５つの異なるタグ（それぞれのもとのサンプルを示す５つの異なるタグ）を付けられたライブラリーを得ることが意図される。
【００５７】
タグは、核酸サンプルの識別のための当該技術分野において既知の任意のタグであってもよいが、好ましくは短い識別子配列である。そのような識別子配列は、例えば、複雑度の減少によって得られたライブラリーの起源を示すために用いられる、長さが変化する非反復塩基配列であり得る。
【００５８】
好ましい実施形態において、第１のライブラリー及び第２のライブラリー又はさらなるライブラリーのタグ付けは、異なるタグを用いて行なわれる。上に説明されるように、核酸サンプルのライブラリーは、各々自身のタグによって同定されることが好ましい。検査サンプルの核酸はタグ付けの必要はない。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態において、複雑度の減少は、ＡＦＬＰ（登録商標）（Keygene N.V．（オランダ）；例えば、欧州特許第０，５３４，８５８号及びVos et al.（1995）著「ＡＦＬＰ：ＤＮＡフィンガープリントのための新しい技法（AFLP: a new technique for DNA fingerprinting）」Nucleic Acids Research, vol. 23, no. 21, 4407-4414を参照、これらは参照によってそれらの全体を本明細書において援用される）によって行なわれる。
【００６０】
ＡＦＬＰは選択的制限断片増幅のための方法である。ＡＦＬＰは任意の事前配列情報は無く、任意の開始ＤＮＡで行なうことができる。一般にＡＦＬＰは、
（ａ）核酸、特にＤＮＡ又はｃＤＮＡを１つ又は複数の特異的な制限エンドヌクレアーゼで消化して、対応する一連の制限断片へとＤＮＡを断片化する工程と、
（ｂ）このように得られた制限断片を、１つの末端が１つ又は両方の制限断片の末端と適合する二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターとライゲーションして、アダプターでライゲーションされた（好ましくは、タグ付けされた）開始ＤＮＡの制限断片を生成する工程と、
（ｃ）アダプターでライゲーションされた（好ましくは、タグ付けされた）制限断片を、ハイブリダイズする条件下で、その３’−末端で少なくとも１つの選択的なヌクレオチドを含む少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程と、
（ｄ）プライマーとハイブリダイズされたアダプターでライゲーションされた（好ましくは、タグ付けされた）制限断片を、プライマーがハイブリダイズする開始ＤＮＡの制限断片に沿ってハイブリダイズされたプライマーのさらなる伸長を引き起こすように、ＰＣＲ又は同様の技術によって増幅する工程と、
（ｅ）このように得られた増幅又は伸長したＤＮＡ断片を、検出、同定、又は回収する工程
を含む。
【００６１】
ＡＦＬＰは、このようにアダプターにライゲーションされた断片の再現可能なサブセットを提供する。他の複雑度の減少に適切な方法は、クロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）である。これは、転写因子のようなタンパク質がＤＮＡに結合している間に、核ＤＮＡが単離されることを意味する。ＣｈｉＰでは、最初に抗体はタンパク質に対して用いられ、Ａｂ−タンパク質−ＤＮＡ複合体をもたらす。この複合体を精製し、それを沈殿させることによって、このタンパク質が結合するＤＮＡが選択される。続いて、ＤＮＡはライブラリー構築及びシークエンシングに用いることができる。すなわち、これは、特異的な機能的領域に向けられた、無作為でない様式において複雑度の減少を行なう方法であり、本発明の例では特異的転写因子である。
【００６２】
１つのＡＦＬＰ技術の有用な変形は、非選択的なヌクレオチド（すなわち＋０／＋０プライマー）を用い、これはしばしばリンカーＰＣＲと呼ばれる。これは、さらに非常に適切な複雑度の減少を提供する。
【００６３】
ＡＦＬＰ、その利点、技法と同様にその実施形態、酵素、アダプター、プライマー及びさらなる化合物、並びに本明細書で使用した道具のさらなる説明のために、米国特許第６，０４５，９９４号、並びに欧州特許第０，５３４，８５８号（Ｂ）及び同第９７６８３５号及び同第９７４６７２号、国際公開特許第ＷＯ０１／８８１８９号、及びVos et al.Nucleic Acids Research, 1995, 23, 4407-4414が言及され、これらはそれら全体が本明細書に援用される。
【００６４】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、複雑度の減少は、
−  少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼにより核酸サンプルを消化して、制限断片へ断片化すること、
−  １つ又は両方の制限断片の末端と合うような１つの末端を有する、少なくとも１つの二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターで得られた制限断片をライゲーションして、アダプターにライゲーションされた制限断片を生成すること、
−  ハイブリダイズする条件下で、アダプターにライゲーションされた上記制限断片を、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、及び
−  １つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって、アダプターにライゲーションされた上記制限断片を増幅することにより行なわれ、
ここで１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、上記制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドを含み、アダプターの存在するヌクレオチドの少なくとも一部を含む、アダプターにライゲーションされた上記制限断片の末端で鎖の端末部分と同じヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含み、ここで任意で、当該プライマーの少なくとも１つは、その３’末端で、当該制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドにすぐに隣接して位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む選択された配列を含む。
【００６５】
ＡＦＬＰは、複雑度の減少のための高度に再現可能な方法であり、したがって本発明に記載の方法に対して特に適している。
【００６６】
本発明に記載の方法の好ましい実施形態において、アダプター又はプライマーはタグを含む。個別のライブラリーに由来した配列を識別することが重要な場合、特に実際の多型性の同定についてはそうである。ライブラリーにタグ付けするために追加の工程が要求されないので、アダプター又はプライマーにオリゴヌクレオチドタグを組み入れることは非常に便利である。
【００６７】
別の実施形態において、タグは識別子配列である。上で議論されるように、そのような識別子配列は、比較される核酸サンプルの量に依存して変化する長さであってもよい。区別されるサンプル間で、タグ配列が１塩基を超えて異なることが好ましいが、約４塩基長（４４＝２５６、可能な異なるタグ配列）は、限られた数のサンプル（２５６個まで）の起源を区別するのに十分である。必要に応じて、タグ配列の長さは結果的に調節することができる。
【００６８】
一実施形態において、シークエンシングは、ビーズのような固体支持体上で行なわれる（例えば国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号、及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号（全て４５４コーポレーションの名で）を参照、それらは参照により本明細書において援用される）。そのようなシークエンシング法は、多くのサンプルの安価で効率的な同時シークエンシングに特に適切である。
【００６９】
好ましい実施形態において、シークエンシングは、
−  各々のビーズがアダプターにライゲーションされた単一の断片とアニーリングされるビーズへ、アダプターにライゲーションされた断片をアニーリングする工程と、
−  各々の油中水滴型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水滴型マイクロリアクター中のビーズの乳化する工程と、
−  各々のウェルが単一のビーズを含む、ウェル中にビーズを充填する工程と、
−  ピロリン酸シグナルを生成する工程と
を含む。
【００７０】
第１の工程において、シークエンシングアダプターは、組合せライブラリー中の断片へライゲーションされる。当該シークエンシングアダプターは、少なくともビーズへのアニーリングのための「キー」領域、シークエンシングプライマー領域、及びＰＣＲプライマー領域を含む。それにより、アダプターにライゲーションされた断片が得られる。
【００７１】
さらなる工程において、アダプターにライゲーションされた断片は、各々のビーズが単一アダプターにライゲーションされた断片にアニーリングする、ビーズへアニーリングされる。大多数のビーズについて、１つのビーズ当たりに、１つの単一アダプターにライゲーションされた断片のアニーリングを保証するように、アダプターにライゲーションされた断片のプールへ、ビーズが過剰に加えられる（ポアソン分布）。
【００７２】
次の工程において、各々の油中水滴型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水滴型マイクロリアクターでビーズが乳化される。ＰＣＲ試薬は、ＰＣＲ反応がマイクロリアクター中で起こることを可能にする油中水滴型マイクロリアクターに存在する。続いて、マイクロリアクターは破壊され、ＤＮＡを含むビーズ（ＤＮＡ陽性ビーズ）が濃縮される。
【００７３】
以下の工程において、各々のウェルが単一のビーズを含む、ウェルにビーズが充填される。ウェルは、好ましくは、大量の断片の同時シークエンシングを可能にするＰｉｃｏＴｉｔｅｒ（商標）プレートの一部である。
【００７４】
酵素を伴うビーズの追加後、断片の配列はピロシークエンシングを用いて決定される。引き続いての工程において、ＰｉｃｏＴｉｔｅｒプレート及びビーズは、その中の酵素ビーズと同様に、従来のシークエンシング試薬の存在下で異なるデオキシリボヌクレオチドへ曝され、デオキシリボヌクレオチドの取り込みの際、記録される光シグナルが生成される。正確なヌクレオチドの取り込みにより、検出可能なピロシークエンシングシグナルが生成されるだろう。
【００７５】
ピロシークエンシング自体は、当該技術分野において既知であり、とりわけ、www.biotagebio.com；www.pyrosequencing.com / tab technologyで記述される。技術は、例えば、国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号、同第ＷＯ０３／０５４１４２号、同第ＷＯ２００４／０６９８４９号、同第ＷＯ２００４／０７０００５号、同第ＷＯ２００４／０７０００７号、及び同第ＷＯ２００５／００３３７５号で（全て４５４コーポレーションの名で）、さらに適用され、それらは本明細書において参照により援用される。
【００７６】
工程ｋ）のハイスループットスクリーニングは、好ましくはアレイ上に工程ｈ）で設計されたプローブの固定化によって行なわれ、その後ハイブリダイズする条件下で、プローブを含むアレイを、検査ライブラリーと接触させる。好ましくは、接触の工程は、ストリンジェントなハイブリダイズ条件下で行なわれる（Kennedy et al.（2003）Nat. Biotech.; published online 7 september 2003: 1-5を参照）。当業者は、アレイ上へのプローブの固定化に適切な方法、及びハイブリダイズする条件下で接触させる方法を承知している。この目的に適切な典型的な技術は、Kennedy et al.（2003）Nat. Biotech.; published online 7 september 2003: 1-5に概説される。
【００７７】
１つの特に有利な適用は、倍数体作物の品種改良において見出される。高範囲での倍数体作物のシークエンシング、ＳＮＰ及び様々な対立遺伝子の同定、並びに対立遺伝子特異的な増幅のためのプローブの開発によって、倍数体作物の品種改良の著しい進歩が可能となった。
【００７８】
本発明の一部として、選択的増幅を複数のサンプルに対して用いて無作為に選択されたサブセットの生成と、及びハイスループットシークエンシング技術との組合せは、多型性の効率的なハイスループット同定について、本明細書において記述された方法のさらなる改良のために解決しなければならない、或る特定の複雑な問題を提示することが発見された。より詳細には、複数の（すなわち、第１の及び第２の又はさらなる）サンプルが複雑度の減少を行なった後にプール中で組み合わせられる場合、多くの断片が２つのサンプルに由来するように見える、又は言い換えれば、１つのサンプルへ独自に割り当てることができなかった多くの断片が同定され、したがって多型性を同定する過程の中で用いることができないという問題が起こることが発見された。これは、方法の信頼性の低下及び適切に同定され得る多型性（ＳＮＰ、インデル、ＳＳＲ）の減少をもたらす。
【００７９】
割り当てることができなかった断片のヌクレオチド配列全体の注意深く詳しい分析の後、それらの断片は２つの異なるタグ含有アダプターを含んでおり、この断片は複雑度を減少させたサンプルの生成とシークエンシングアダプターのライゲーションとの間で恐らく形成されたことが発見された。この現象は「混合したタグ付け」として表現される。したがって本明細書において用いられるように、「混合したタグ付け」として表現される現象は、断片を１つのサンプルへ関連付けるタグを片側で含むが、断片の反対側では断片を他のサンプルへ関連付けるタグを含む断片を指す。したがって、１つの断片は、２つのサンプルに由来するかのように見える（両方とも（quod non））。これは多型性の誤った同定をもたらし、したがって不適当である。
【００８０】
２つのサンプル間でヘテロ二本鎖断片の形成が、この異常に進行して存在することが理論付けられた。
【００８１】
この問題の解決は、複雑度が減少させられるサンプルを、ハイスループットシークエンシング前に増幅することが可能であるビーズにアニーリングされた断片へ変換するための戦略の再計画において発見された。この実施形態において、各々のサンプルでは複雑度の減少及び任意の精製が行なわれる。その後、各々のサンプルをブラント（末端を平滑）にし、その後ビーズへアニーリング可能なシークエンシングアダプターへライゲーションする。その後、シークエンシングアダプターにライゲーションされた断片のサンプルは組み合わせられ、エマルジョン重合及び続くハイスループットシークエンシングのために、ビーズへライゲーションされる。
【００８２】
本発明のさらなる部分として、コンカテマーの形成が多型性の適切な同定を妨げるということが分かった。コンカテマーは、複雑度を減少させた産物が、例えばＴ４  ＤＮＡポリメラーゼによって、「ブラントにされた」又は「平滑にされた」後に形成される断片として同定され、ビーズへのアニーリングを可能にするアダプターへライゲーションする代わりに、互いにライゲーションし、これによってコンカテマーを生成する、すなわちコンカテマーはブラントにされた断片の二量体化の結果である。
【００８３】
この問題の解決は、特異的に修飾される或る特定のアダプターの使用において発見された。複雑度の減少から得られた増幅された断片は、典型的には、３’−５’エキソヌクレアーゼプルーフリーディング活性がない或る特定の好ましいポリメラーゼの特性による、３’−Ａ突出部を含む。そのような３’−Ａ突出部の存在もまた、アダプターライゲーション前に、断片をブラントにする理由である。アダプターが３’−Ｔ突出部を含み、ビーズへアニーリングすることが可能なアダプターの提供によって、「混合したタグ」及びコンカテマーの両方の問題が、１つの工程の中で解決できることが発見された。これらの修飾したアダプターを用いることのさらなる利点は、従来の「ブラントにする」工程及び続くリン酸化工程を省略することができるということである。
【００８４】
したがって、各々のサンプルの複雑度の減少工程の後のさらなる好ましい実施形態において、工程は、複雑度の減少工程から得られたアダプターにライゲーションされた増幅された制限断片上で行なわれ、それによってこれらの断片へシークエンシングアダプターがライゲーションされ、シークエンシングアダプターは３’−Ｔ突出部を含み、ビーズへアニーリングすることができる。
【００８５】
複雑度の減少工程において用いられるプライマーがリン酸化される場合、ライゲーション前の末端を平滑にする（ブラントにする）工程及び中間のリン酸化は回避できることがさらに発見された。
【００８６】
したがって、本発明の非常に好ましい実施形態において、本発明は、１つ又は複数の多型性を同定する方法に関し、
ａ）対象となる複数の核酸サンプルを提供する工程と、
ｂ）各々のサンプル上で複雑度の減少を行ない、核酸サンプルの複数のライブラリーを提供する、工程であって、複雑度の減少が、
−  少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼにより各々の核酸サンプルを消化して、制限断片へ断片化すること、
−  １つ又は両方の制限断片の末端と合うような１つの末端を有する、少なくとも１つの二本鎖の合成オリゴヌクレオチドアダプターで得られた制限断片をライゲーションして、アダプターにライゲーションされた制限断片を生成すること、
−  ハイブリダイズする条件下で、前記アダプターにライゲーションされた制限断片を、１つ又は複数のリン酸化されたオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、及び
−  １つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によってアダプターにライゲーションされた上記制限断片を増幅することであって、ここで１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、上記制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドを含み、アダプターの存在するヌクレオチドの少なくとも一部を含む、アダプターにライゲーションされた当該制限断片の末端で鎖の端末部分と同じヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含み、ここで任意で、当該プライマーの少なくとも１つが、その３’末端で、該制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドにすぐに隣接して位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む選択された配列を含み、ここでアダプター及び／又はプライマーがタグを含むこと
によって行なわれる工程と、
ｃ）組合せライブラリーへ上記ライブラリーを組み合わせる工程と、
ｄ）ビーズへアニーリングすることが可能なシークエンシングアダプターを、組合せライブラリー中の増幅されたアダプターでキャッピングされた断片へライゲーションし、３’−Ｔ突出部を伴うシークエンシングアダプターを用い、ビーズにアニーリングされた断片をエマルジョン重合する工程と、
ｅ）組合せライブラリーの少なくとも一部をシークエンシングする工程と、
ｆ）工程ｅ）において得られた各々のサンプルからの配列をアライメントさせる工程と、
ｇ）工程ｆ）のアライメントにおいて複数の核酸サンプル間で１つ又は複数の多型性を決定する工程と、
ｈ）工程ｇ）において決定された１つ又は複数の多型性を用いて、検出プローブを設計する工程と、
ｉ）対象となる検査サンプルの核酸を提供する工程と、
ｊ）対象となる検査サンプルの核酸について工程ｂ）の複雑度の減少を行ない、検査サンプルの核酸の検査ライブラリーを提供する、工程と、
ｋ）検査ライブラリーでハイスループットスクリーニングを行ない、工程ｈ）において設計された検出プローブを用いて、工程ｇ）において決定された多型性の存在、多型性の非存在、又は多型性の量を同定する、工程と
を含む。
【実施例１】
【００８７】
ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ制限ライゲーション混合物（１）は、コショウの系統ＰＳＰ−１１及びＰＩ２０２３４のゲノムＤＮＡから生成された。制限ライゲーション混合物を１０倍に希釈し、５マイクロリットルの各々のサンプルは、ＥｃｏＲＩ＋１（Ａ）及びＭｓｅＩ＋１（Ｃ）プライマー（セットＩ）により前増幅された（２）。増幅後に、２つのコショウのサンプルの前増幅産物の品質を、１％アガロースゲル上でチェックした。前増幅産物を２０倍に希釈し、その後ＫＲＳＥｃｏＲＩ＋１（Ａ）及びＫＲＳＭｓｅＩ＋２（ＣＡ）ＡＦＬＰ前増幅を行なった。下記のプライマー配列番号１〜４の３’−末端で、ＫＲＳ（識別子）区分には下線が引かれており、選択的なヌクレオチドは太字とする。増幅後に、２つのコショウのサンプルの前増幅産物の品質を、１％アガロースゲル上で、並びにＥｃｏＲＩ＋３（Ａ）及びＭｓｅＩ＋３（ｃ）  （３）  ＡＦＬＰ  フィンガープリント（４）によりチェックした。２つのコショウ系統の前増幅産物を、キアゲン（Qiagen）ＰＣＲカラムの上で別々に精製した（５）。サンプルの濃度をナノドロップ（nanodrop）で測定した。合計５００６．４ｎｇのＰＳＰ−１１及び５００６，４ｎｇのＰＩ２０２３４を混合し、シークエンシングした。
【００８８】
ＰＳＰ−１１の前増幅に用いられるプライマーセットＩ
【００８９】
【化１】
2008546404.tif 000002
【００９０】
ＰＩ２０２３４の前増幅に用いられるプライマーセットＩＩ
【００９１】
【化２】
2008546404.tif 000003
【００９２】
（１）ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ制限ライゲーション混合物
制限混合物（４０ｕｌ／サンプル）
ＤＮＡ              ６μｌ（±３００ｎｇ）
ＥＣｏＲＩ（５Ｕ）  ０．１μｌ
ＭｓｅＩ（２Ｕ）    ０．０５μｌ
５×ＲＬ            ８μｌ
ＭＱ                ２５．８５μｌ
合計                ４０μｌ
３７℃における１時間のインキュベーション
ライゲーション混合物（１０μｌ／サンプル）
１０ｍＭ  ＡＴＰ                          １μｌ
Ｔ４  ＤＮＡ  リガーゼ                    １μｌ
ＥＣｏＲＩアダプター（５ｐｍｏｌ／μｌ）  １μｌ
ＭｓｅＩアダプター（５０ｐｍｏｌ／μｌ）  １μｌ
５×ＲＬ                                  ２μｌ
ＭＱ                                      ４μｌ
合計                                      １０μｌ
の添加
３７℃における３時間のインキュベーション
ＥｃｏＲＩアダプター
【００９３】
【化３】
2008546404.tif 000004
【００９４】
ＭｓｅＩアダプター
【００９５】
【化４】
2008546404.tif 000005
【００９６】
（２）前増幅
前増幅（Ａ／Ｃ）：
ＲＬ混合物（１０×）                              ５μｌ
ＥｃｏＲＩプライマー  Ｅ０１Ｌ（５０ｎｇ／ｕｌ）  ０．６μｌ
ＭｓｅＩプライマー  Ｍ０２Ｋ（５０ｎｇ／ｕｌ）    ０．６μｌ
ｄＮＴＰｓ（２５ｍＭ）                            ０．１６μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ）                        ０．０８μｌ
１０×ＰＣＲ                                      ２．０μｌ
ＭＱ                                              １１．５６μｌ
１反応につき合計２０μｌ
【００９７】
前増幅の温度プロフィール
選択的な前増幅を５０μｌの反応容量中で行なった。ＰＣＲをＰＥ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００で行ない、２０サイクルのプロフィールは、９４℃３０秒間の変性工程でスタートし、その後、５６℃６０秒間のアニーリング工程、及び７２℃６０秒間の伸張工程を行なった。 
ＥｃｏＲＩ＋１（Ａ）１
【００９８】
【化５】
2008546404.tif 000006
【００９９】
ＭｓｅＩ＋１（Ｃ）１
【０１００】
【化６】
2008546404.tif 000007
【０１０１】
事前増幅  Ａ／ＣＡ：
ＰＡ＋１／＋１−混合物（２０×）  ：５μｌ
ＥｃｏＲＩプライマー              ：１．５μｌ
ＭｓｅＩプライマー                ：１．５μｌ
ｄＮＴＰｓ（２５ｍＭ）            ：０．４μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ）        ：０．２μｌ
１０×ＰＣＲ                      ：５μｌ
ＭＱ                              ：３６．３μｌ
合計                              ：５０μｌ
【０１０２】
選択的な前増幅を５０μｌの反応容量中で行なった。ＰＣＲをＰＥ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００で行ない、３０サイクルのプロフィールは、９４℃３０秒間の変性工程でスタートし、その後、５６℃６０秒間のアニーリング工程、及び７２℃６０秒間の伸張工程を行なった。
【０１０３】
（３）ＫＲＳＥｃｏＲＩ＋１（Ａ）及びＫＲＳＭｓｅＩ＋２（ＣＡ）２
【０１０４】
【化７】
2008546404.tif 000008
【０１０５】
太字の選択的なヌクレオチド及び下線を引いたタグ（ＫＲＳ）
【０１０６】
【化８】
2008546404.tif 000009
【０１０７】
（４）ＡＦＬＰのプロトコル
選択的な前増幅を２０μｌの反応容量中で行なった。ＰＣＲをＰＥ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム９７００で行なった。１３サイクルのプロフィールは、９４℃３０秒間の変性工程でスタートし、その後、アニーリング温度が各々のサイクルにおいて０．７℃低下するタッチダウンフェーズを伴う、６５℃３０秒間のアニーリング工程、及び７２℃６０秒間の伸張工程を行なった。このプロフィールの後で、９４℃３０秒間の変性工程、５６℃３０秒間のアニーリング工程、及び７２℃６０秒間の伸張工程を伴う、２３サイクルのプロフィールを行なった。
【０１０８】
【化９】
2008546404.tif 000010
【０１０９】
（５）キアゲンカラム
キアゲン精製は製造者の説明書に従って行なった：ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）スピンハンドブック（http://www1.qiagen.com/literature/handbooks/PDF/DNACleanupAndConcentration/QQSpin/1021422 HBQQSpin 072002ww.pdf）
【実施例２】
【０１１０】
コショウ
コショウの系統ＰＳＰ−１１及びＰＩ２０２３４からのＤＮＡを、ＡＦＬＰの鍵遺伝子の認識部位に特異的なプライマーの使用により、ＡＦＬＰ産物を生成するために用いた。これらのＡＦＬＰプライマーは本質的に従来のＡＦＬＰプライマーと同じであり（例えば、欧州特許第０，５３４，８５８号に記述されている）、認識部位領域、定常領域、及び選択的領域において１つ又は複数の選択的なヌクレオチドを通常含むだろう。コショウの系統ＰＳＰ−１１又はＰＩ２０２３４からの１５０ｎｇのＤＮＡを、制限エンドヌクレアーゼのＥｃｏＲＩ（１反応につき５Ｕ）及びＭｓｅＩ（１反応につき２Ｕ）により、３７℃で１時間消化させ、その後８０℃で１０分間不活性化を行なった。得られた制限断片を、１つの末端がＥｃｏＲＩ及び／又はＭｓｅＩ制限断片の１つ又は両方の末端と合う二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターとライゲーションした。＋１／＋１  ＡＦＬＰプライマーによるＡＦＬＰ前増幅反応（１反応につき２０μｌ）を、１０倍に希釈した制限ライゲーション混合物で行なった。ＰＣＲプロフィール：２０＊（９４℃で３０秒＋５６℃で６０秒＋７２℃で１２０秒）。異なる＋１  ＥｃｏＲＩ及び＋２  ＭｓｅＩ  ＡＦＬＰ鍵遺伝子の認識部位に特異的なプライマーによる追加のＡＦＬＰ反応（１反応につき５０μｌ）を（下記の表、タグは太字とし、選択的なヌクレオチドは下線が引かれている）、２０倍に希釈した＋１／＋１  ＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩ  ＡＦＬＰ前増幅産物で行なった。ＰＣＲプロフィール：３０＊（９４℃で３０秒＋５６℃で６０秒＋７２℃で１２０秒）。ＡＦＬＰ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）スピンハンドブック（０７／２００２）の１８ページに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（QIAGEN）を用いることによって精製し、濃度はナノドロップ（NanoDrop）（登録商標）ＮＤ−１０００分光測光器により測定した。５μｇの＋１／＋２  ＰＳＰ−１１  ＡＦＬＰ産物及び５μｇの＋１／＋２  ＰＩ２０２３４  ＡＦＬＰ産物の合計を一緒にし、２３．３μｌのＴＥ中で溶解した。最終的に、４３０ｎｇ／μｌの濃度で＋１／＋２  ＡＦＬＰ産物の混合物が得られた。
【０１１１】
【表１】
2008546404.tif 000011
【実施例３】
【０１１２】
トウモロコシ
トウモロコシの系統Ｂ７３及びＭ０１７からのＤＮＡを、ＡＦＬＰの鍵遺伝子の認識部位に特異的なプライマーの使用により、ＡＦＬＰ産物を生成するために用いた。これらのＡＦＬＰプライマーは本質的に従来のＡＦＬＰプライマーと同じであり（例えば、欧州特許第０，５３４，８５８号に記述されている）、認識部位領域、定常領域、及び３’末端において１つ又は複数の選択的なヌクレオチドを通常含むだろう。 
コショウ系統のＢ７３又はＭ０１７からのＤＮＡを、６５℃１時間制限エンドヌクレアーゼＴａｑＩ（１反応につき５Ｕ）で、及び３７℃で１時間ＭｓｅＩ（１反応につき２Ｕ）で消化し、その後８０℃で１０分間不活性化を行なった。得られた制限断片を、１つの末端がＴａｑＩ及び／又はＭｓｅＩ制限断片の１つ又は両方の末端と合う二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターとライゲーションした。 
＋１／＋１  ＡＦＬＰプライマーによるＡＦＬＰ前増幅反応（１反応につき２０μｌ）を、１０倍に希釈した制限ライゲーション混合物で行なった。ＰＣＲプロフィール：２０＊（９４℃で３０秒＋５６℃で６０秒＋７２℃で１２０秒）。異なる＋２  ＴａｑＩ及びＭｓｅＩ  ＡＦＬＰ鍵遺伝子の認識部位に特異的なプライマーによる追加のＡＦＬＰ反応（１反応につき５０μｌ）が（下記の表、タグは太字とし、選択的なヌクレオチドは下線が引かれている）、２０倍に希釈した＋１／＋１  ＴａｑＩ／ＭｓｅＩ  ＡＦＬＰ前増幅産物で行なわれた。ＰＣＲプロフィール：３０＊（９４℃で３０秒＋５６℃で６０秒＋７２℃で１２０秒）。ＡＦＬＰ産物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）スピンハンドブック（０７／２００２）の１８ページに従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（QIAGEN）を用いることによって精製し、濃度はナノドロップ（登録商標）ＮＤ−１０００分光測光器により測定した。各々異なる１．２５μｇのＢ７３  ＋２／＋２  ＡＦＬＰ産物及び各々異なる１．２５μｇのＭ０１７  ＋２／＋２  ＡＦＬＰ産物の合計を一緒にし、３０μｌのＴＥ中で溶解した。最終的に、３３３ｎｇ／μｌの濃度で＋２／＋２  ＡＦＬＰ産物の混合物が得られた。
【０１１３】
【表２】
2008546404.tif 000012
【０１１４】
最終的に、４つのＰ１サンプル及び４つのＰ２サンプルがプール及び濃縮された。合計量２５μｌのＤＮＡ産物及び最終濃度４００ｎｇ／ｕｌ（合計１０μｇ）が得られた。中間の品質査定を図３に示す。
【０１１５】
４５４によるシークエンシング
本明細書において以前に記述されたように調製されたコショウ及びトウモロコシのＡＦＬＰ断片サンプルは、以下に記述されるような454 Life Sciencesにより加工された（Margulies et al., 2005「微細加工高密度ピコリッターリアクター中のゲノムシークエンシング（Genome sequencing in microfabricated high-density picolitre reactors）」Nature 437 （7057） :376-80. Epub July 31, 2005）。
【０１１６】
データ処理
加工パイプライン：
入力データ
未加工配列データが各々の実行に対して受け取られた：
−２００，０００〜４００，０００の読み取り
−ベースコール（塩基呼び出し）品質スコア
【０１１７】
トリミング及びタグ付け
これらの配列データを、読み取りの始め及び末端で、鍵遺伝子認識部位（ＫＲＳ）の存在について分析する。これらのＫＲＳ配列はＡＦＬＰアダプター及びサンプル標識配列の両方から成り、特定のサンプルの特定のＡＦＬＰプライマーの組合せに対して特異的である。ＫＲＳ配列は、ＢＬＡＳＴによって同定及びトリミングされ、制限部位が回復される。読み取りは、ＫＲＳ起源の同定のためのタグでマークされる。トリミングされた配列は、その後の処理を行なうために、長さ（最低３３ヌクレオチド）で選択される。
【０１１８】
クラスタリング及びアセンブリー
ＭｅｇａＢｌａｓｔ分析は、相同配列のクラスターを得るために全てのサイズ選択且つトリミングされた読み取りで行なわれる。引き続いて全てのクラスターは、アセンブリングされたコンティグをもたらすために、ＣＡＰ３によりアセンブリングされる。両方の工程からの、他の読み取りと一致しないユニーク配列の読み取りが同定される。これらの読み取りはシングルトンとしてマークされる。本明細書において以前に記述された工程を行なう加工パイプラインを図４の（Ａ）に示す。
【０１１９】
多型性抽出及び品質査定
アセンブリー解析からの最終的なコンティグは、多型性検出の根拠を成す。各々のクラスターのアライメントにおける各々の「ミスマッチ」は、可能性のある多型性である。選択基準を、品質スコアを得るために定義する：
−  １つのコンティグ当たりの読み取りの数
−  １つのサンプル当たりの「対立遺伝子」の頻度
−  ホモポリマー配列の発生
−  近隣する多型性の発生
閾値を超えた品質スコアにより、ＳＮＰ及びインデルは、推定上の多型性として同定される。ＳＳＲ抽出については、ＭＩＳＡ（ＭＩｃｒｏＳＡｔｅｌｌｉｔｅ同定）ツール（http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa）を用いる。このツールはジヌクレオチド、トリヌクレオチド及びテトラヌクレオチド及び化合物ＳＳＲモチーフをあらかじめ定められた基準により同定し、これらのＳＳＲの発生を要約する。 
多型性抽出過程及び品質割当過程を図４の（Ｂ）に示す。
【０１２０】
結果
下記の表は、組み合わせたコショウのサンプルについて２回の４５４シークエンスの実行、及び組み合わせたトウモロコシサンプルについて２回の実行から得られた配列を組み合わせた分析の結果を要約する。
【０１２１】
【表３】
2008546404.tif 000013
【実施例４】
【０１２２】
コショウ中の一塩基多型（ＳＮＰ）の発見
ＤＮＡの単離
ゲノムＤＮＡは、コショウ組換え近交系（ＲＩＬ）集団の親の２系統及び１０のＲＩＬの子孫から単離された。親系統はＰＳＰ１１及びＰＩ２０１２３４である。ゲノムＤＮＡを、Stuart及びViaによって記述された修飾ＣＴＡＢ手順を用いて、個々の苗木の葉材料から単離した（Stuart, C.N., Jr and Via,L.E. （1993）「ＲＡＰＤフィンガープリンティング及び他のＰＣＲ用途のために有用な高速ＣＴＡＢ  ＤＮＡ分離方法（A rapid CTAB DNA isolation technique useful for RAPD fingeprinting and other PCR applications）」Biotechniques, 14, 748-750）。ＤＮＡサンプルを、ＴＥ（１０ｍＭトリスＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で１００ｎｇ／μｌの濃度に希釈し、−２０℃で保存した。
【０１２３】
タグ付けしたＡＦＬＰプライマーを用いたＡＦＬＰ鋳型の調製
Zabeau及びVos（１９９３：「選択的制限断片増幅；ＤＮＡフィンガープリントのための一般法（Selective restriction fragment amplification; a general method for DNA fingerprinting）」欧州特許第０５３４８５８号（Ａ１）及び（Ｂ１）；米国特許第６０４５９９４号）、並びにVos他（Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijans, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A.,  Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. et al. （1995）「ＡＦＬＰ：ＤＮＡフィンガープリントのための新しい技術（AFLP: a new technique for DNA fingerprinting）」Nucl. Acids Res., 21, 4407-4414）によって記述されたように、制限エンドヌクレアーゼの組合せＥｃｏＲＩ／ＭｓｅＩを用いて、コショウの親系統のＰＳＰ１１及びＰＩ２０１２３４のＡＦＬＰ鋳型を調製した。
【０１２４】
具体的には、ＥｃｏＲＩ及びＭｓｅＩによるゲノムＤＮＡの制限は以下のように行なわれた：
ＤＮＡ制限
ＤＮＡ          １００〜５００ｎｇ
ＥｃｏＲＩ      ５単位
ＭｓｅＩ        ２単位
５×ＲＬ緩衝液  ８μｌ
４０μｌまでのＭｉｌｌｉＱ水
インキュベーションは３７℃で１時間行なった。酵素の制限後に、８０℃で１０分間インキュベーションによって、酵素を不活性化した。
【０１２５】
アダプターのライゲーション
１０ｍＭ  ＡＴＰ                          １μｌ
Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ                      １μｌ
ＥｃｏＲＩアダプター（５ｐｍｏｌ／μｌ）  １μｌ
ＭｓｅＩアダプター（５０ｐｍｏｌ／μｌ）  １μｌ
５×ＲＬ緩衝液                            ２μｌ
４０μｌまでのＭｉｌｌｉＱ水
インキュベーションは３７℃で３時間行なった。
【０１２６】
選択的なＡＦＬＰ増幅
制限−ライゲーションに続いて、制限／ライゲーション反応物をＴ１０Ｅ０．１で１０倍に希釈し、希釈混合物５μｌを、選択的増幅工程において鋳型として用いた。＋１／＋２選択的増幅が意図されたので、最初に＋１／＋１選択的前増幅工程（標準ＡＦＬＰプライマーで）が行なわれたことに留意されたい。＋１／＋１（＋Ａ／＋Ｃ）増幅の反応条件は以下のとおりであった。
【０１２７】
制限ライゲーション混合物（１０倍希釈）                  ５μｌ
ＥｃｏＲＩプライマー＋１（５０ｎｇ／μｌ）：            ０．６μｌ
ＭｓｅＩプライマー＋１（５０ｎｇ／μｌ）                ０．６μｌ
ｄＮＴＰｓ（２０ｍＭ）                                  ０．２μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ  Ａｍｐｌｉｔａｑ、PE）  ０．０８μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液                                      ２．０μｌ
２０μｌまでのＭｉｌｌｉＱ水
プライマー配列は、
【０１２８】
【化１０】
2008546404.tif 000014
【０１２９】
であった。
【０１３０】
ＰＣＲ増幅は、以下の条件を用いて、金又は銀のブロックでＰＥ９７００を用いて行なわれた：２０回（９４℃で３０秒、５６℃で６０秒及び７２℃で１２０秒）。
【０１３１】
生成された＋１／＋１前増幅産物の品質を、断片長の分布をチェックするために、１００塩基対ラダー及び１Ｋｂラダーを用いて、１％のアガロースゲルでチェックした。＋１／＋１選択的増幅に続いて、反応物をＴ１０Ｅ０．１で２０倍希釈し、希釈混合物５μｌをタグ付けしたＡＦＬＰプライマーを用いて、＋１／＋２選択的増幅工程において鋳型として用いた。
【０１３２】
最終的に、＋１／＋２（Ａ／＋ＣＡ）選択的ＡＦＬＰ増幅は以下のように行なわれた：
＋１／＋１選択的な増幅産物（２０倍希釈）                      ５．０μｌ
ＫＲＳ  ＥｃｏＲＩプライマー＋Ａ（５０ｎｇ／μｌ）            １．５μｌ
ＫＲＳ  ＭｓｅＩプライマー＋ＣＡ（５０ｎｇ／μｌ）            １．５μｌ
ｄＮＴＰｓ（２０ｍＭ）                                        ０．５μｌ
Ｔａｑポリメラーゼ（５Ｕ／μｌ  Amplitaq、Perkin Elmer）      ０．２μｌ
１０×ＰＣＲ緩衝液                                            ５．０μｌ
５０μｌまでのＭＱ
タグ付けされたＡＦＬＰプライマー配列は、
ＰＳＰ１１：
【０１３３】
【化１１】
2008546404.tif 000015
【０１３４】
ＰＩ２０１２３４：
【０１３５】
【化１２】
2008546404.tif 000016
【０１３６】
であった。
【０１３７】
シークエンシング過程の終わりでそれぞれのコショウ系統から生じる増幅産物を区別するために、これらのプライマーの５’末端に４ｂｐタグ（上記で下線が引かれた）が含まれることに留意されたい。
【０１３８】
４ｂｐの５つのプライムタグ配列を含むＡＦＬＰプライマーによる増幅後のコショウＡＦＬＰ＋１／＋２増幅産物の略図。
【０１３９】
【化１３】
2008546404.tif 000017
【０１４０】
ＰＣＲ増幅（１つのサンプル当たり２４）を金又は銀のブロックでＰＥ９７００を用いて、以下の条件を用いて行なった：３０回（９４℃で３０秒＋５６℃で６０秒＋７２℃で１２０秒）。
【０１４１】
生成された増幅産物の品質を、断片長の分布をチェックするために、１００塩基対ラダー及び１Ｋｂラダーを用いて、１％のアガロースゲルでチェックした。
【０１４２】
ＡＦＬＰ反応物の精製及び定量化。
１つのコショウサンプル当たり、２つの５０マイクロリットルの＋１／＋２選択的なＡＦＬＰ反応をプールした後、最終的な１２の１００μｌ  ＡＦＬＰ反応生成物を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）スピンハンドブック（１８ページ）に従って、ＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キット（QIAGEN）を用いて精製した。各々のカラムに最高１００μｌの産物を充填した。増幅された産物を、Ｔ１０Ｅ０．１で溶出した。精製された産物の品質を１％アガロースゲルでチェックし、濃度をナノドロップで測定した（図２）。
【０１４３】
ナノドロップ濃度測定を、各々の精製されたＰＣＲ産物の最終的な濃度を、１マイクロリットル当たり３００ナノグラムに合わせるために用いた。５マイクログラムのＰＳＰ１１の精製増幅産物及び５マイクログラムのＰＩ２０１２３４の精製増幅産物を混合し、４５４シークエンシングライブラリーの調製のための１０マイクログラムの鋳型材料を生成した。
【０１４４】
シークエンスライブラリーの調製及びハイスループットシークエンシング
両方のコショウ系統からの混合増幅産物を、Margulies他によって記述されるような、４５４ライフサイエンスシークエンシング技術を用いて、ハイスループットシークエンシングした（Margulies et al., Nature 437, pp. 376-380及びオンライン上の補足）。具体的には、Margulies及び共同研究者等によって記述されるように、エマルジョンＰＣＲ増幅及び続く断片シークエンシングを促進するために、ＡＦＬＰ  ＰＣＲ産物を最初に末端を平滑にし、続いてアダプターにライゲーションした。４５４のアダプター配列、エマルジョンＰＣＲプライマー、配列プライマー及びシークエンスの実行条件は、全てMargulies及び共同研究者等によって記述されるものであった。図１Ａに例示されるように、４５４シークエンシング過程におけるセファロースビーズ上で増幅されたエマルジョン−ＰＣＲ断片中の機能要素の直線的な順序は、以下のとおりだった：
【０１４５】
４５４  ＰＣＲアダプター  −  ４５４シークエンスアダプター  −  ４ｂｐ  ＡＦＬＰプライマータグ１  −  選択的なヌクレオチド（複数可）を含むＡＦＬＰプライマー配列１  −  ＡＦＬＰ断片内部配列−選択的なヌクレオチド（複数可）を含むＡＦＬＰプライマー配列２、４ｂｐ  ＡＦＬＰプライマータグ２  −  ４５４配列アダプター  −  ４５４ＰＣＲアダプター  −  セファロースビーズ
【０１４６】
２つのハイスループット４５４シークエンスの実行は、454 Life Sciences（アメリカ合衆国コネチカット州ブランフォード）によって行なわれた。
【０１４７】
４５４シークエンス実行のデータ処理
２回の４５４シークエンスの実行に由来する配列データを、バイオインフォマティクスパイプライン（Keygene N.V．）を用いて加工した。具体的には、未加工の４５４ベースコール済みシークエンス読み取りを、ＦＡＳＴＡフォーマットで変換し、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いて、タグ付けしたＡＦＬＰアダプター配列の存在の有無を検査した。既知のタグを付けたＡＦＬＰプライマー配列への高い信頼性の一致に際して、配列をトリミングし、制限エンドヌクレアーゼ部位を回復し、適切なタグを割り当てた（それぞれ、サンプル１  ＥｃｏＲＩ（ＥＳ１）、サンプル１  ＭｓｅＩ（ＭＳ１）、サンプル２  ＥｃｏＲＩ（ＥＳ２）、又はサンプル２  ＭｓｅＩ（ＭＳ２））。次に、３３塩基よりも長いトリミングされた配列の全てを、全体の配列相同性に基づくｍｅｇａＢＬＡＳＴ手順を用いてクラスターに分けた。次に、クラスターを、ＣＡＰ３の多重アライメントアルゴリズムを用いて、１つのクラスター当たり１つ又は複数のコンティグ及び／又はシングルトンへアセンブリングした。１つより多くの配列を含むコンティグは、推定上の多型性を表わす配列ミスマッチの有無を検査された、配列ミスマッチには、以下の基準に基づく品質スコアを割り当てた：
＊コンティグ中の読み取りの数
＊観察された対立遺伝子の分布
上の２つの基準は、各々の推定上のＳＮＰ／インデルに対応する、いわゆるＱスコアのための根拠を成す。Ｑスコアは０〜１にわたる；両方の対立遺伝子が少なくとも２度観察された場合にのみ、Ｑスコア０．３が達成される。 
＊特定の長さのホモポリマー中の位置（調整可能；３塩基以上のホモポリマーに位置する多型性を回避するための初期設定）
＊クラスター中のコンティグの数。 
＊最も近い隣接する配列ミスマッチへの距離（調整可能；フランキング配列を調べる特定の型の遺伝子型決定分析にとって重要）
＊サンプル１又はサンプル２で観察された対立遺伝子の関連のレベル；
推定上の多型性並びにサンプル１及び２の対立遺伝子間で一貫して完全な関連が存在する場合には、多型性（ＳＮＰ）が推定上の「エリート」多型性（ＳＮＰ）として示される。エリート多型性は、２つのホモ接合体系統が発見過程で用いられた場合に、ユニークゲノム配列又は低コピーのゲノム配列に位置する確率が高いと考えられる。反対に、サンプル起源との多型性の弱い関連は、コンティグ中の非対立遺伝子配列のアライメントから生じる誤った多型性を発見してしまうリスクが高い。
【０１４８】
ＳＳＲモチーフを含む配列は、ＭＩＳＡ検索ツール（MIcroSAtellelite同定ツール；http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/から利用可能。）を用いて同定された。
【０１４９】
実行の全体の統計を、以下の表で示す。
【０１５０】
【表４】
2008546404.tif 000018
【０１５１】
＊ＳＮＰ／インデル抽出基準は以下のとおりであった：
いずれかの側にも１２塩基以内の０．１よりも大きいＱスコアを有する隣接する多型性はなく、３塩基以上のホモポリマー中に存在しない。抽出基準は、サンプル１及び２で一貫した関連を考慮しなかった、すなわち、ＳＮＰ及びインデルは必ずしも推定上のエリートＳＮＰ／インデルではない。
【０１５２】
推定上のエリート単一ヌクレオチド多型を含む多重アライメントの一例を、図７に示す。
【実施例５】
【０１５３】
ＰＣＲ増幅及びサンガーシークエンシングによるＳＮＰ妥当性の検証
実施例１において同定された推定上のＡ／Ｇ  ＳＮＰを検証するために、このＳＮＰのためのタグ付き配列部位（ＳＴＳ）分析を、隣接するＰＣＲプライマーを用いて設計した。ＰＣＲプライマー配列は以下のとおりであった：
【０１５４】
【化１４】
2008546404.tif 000019
【０１５５】
プライマー１．２ｒが、５’末端でＭ１３配列プライマー結合部位及び長さスタッファーを含むことに留意されたい。ＰＣＲ増幅を、鋳型として、実施例４に記述されるように調製したＰＳＰ１１及びＰＩ２１０２３４の＋Ａ／＋ＣＡ  ＡＦＬＰ増幅産物を用いて行なった。ＰＣＲ条件は以下のとおりであった：
１つのＰＣＲ反応に対して、下記成分を混合した：
５μｌ  １／１０に希釈したＡＦＬＰ混合物（ａｐｐ．１０ｎｇ／μｌ）
５μｌ  １ｐｍｏｌ／μｌプライマー  １．２ｆ（５００μＭストックから直接希釈したもの）
５μｌ  １ｐｍｏｌ／μｌプライマー  １．２ｒ（５００μＭストックから直接希釈したもの）
５μｌ  ＰＣＲ混合物      −２μｌ  １０×ＰＣＲ緩衝液
−１μｌ  ５ｍＭ  ｄＮＴＰｓ
−１．５μｌ  ２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２
−０．５μｌ  Ｈ２Ｏ
５μｌ  酵素混合物        −０．５μｌ  １０×ＰＣＲ緩衝液
（Applied Biosystems）
−０．１μｌ  ５Ｕ／μｌ  ＡｍｐｌｉＴａｑ
ＤＮＡポリメラーゼ（Applied Biosystems）
−４．４μｌ  Ｈ２Ｏ
以下のＰＣＲプロフィール：
サイクル１  ２分間；９４℃
サイクル２〜サイクル３４  ２０秒間；９４℃
３０秒間；５６℃
２分３０秒間；７２℃
サイクル３５  ７分間；７２℃
∞；４℃
を使用した。
【０１５６】
ＰＣＲ産物をＴＡクローニング法を用いてベクターｐＣＲ２．１（ＴＡクローニングキット；Invitrogen）へクローニングし、ＩＮＶαＦ’コンピテント大腸菌細胞へ形質転換させた。形質転換体を青／白のスクリーニングにかけた。ＰＳＰ１１及びＰＩ−２０１２３４について各々独立した白色の３つの形質転換体を選択し、プラスミド単離のための液体の選択培地中で、一晩、増殖させた。
【０１５７】
プラスミドをＱＩＡｐｒｅｐスピンＭｉｎｉｐｒｅｐキット（QIAGEN）を用いて単離した。続いて、これらのプラスミドのインサートを、以下のプロトコルに従ってシークエンシングし、ＭｅｇａＢＡＣＥ  １０００（Amersham）で溶解した。得られた配列をＳＮＰ対立遺伝子の有無について検査した。ＰＩ−２０１２３４インサートを含む独立した２つのプラスミド、及びＰＳＰ１１インサートを含む１つのプラスミドは、ＳＮＰに隣接する期待されたコンセンサス配列を含んでいた。ＰＳＰ１１断片に由来する配列は期待されたＡ対立遺伝子（下線が引かれた）を含み、ＰＩ−２０１２３４断片に由来する配列は期待されたＧ対立遺伝子（二重下線が引かれた）を含んでいた：
ＰＳＰ１１（配列１）：（５’−３’）
【０１５８】
【化１５】
2008546404.tif 000020
【０１５９】
ＰＩ−２０１２３４（配列１）：（５’−３’）
【０１６０】
【化１６】
2008546404.tif 000021
【０１６１】
ＰＩ−２０１２３４（配列２）：（５’−３’）
【０１６２】
【化１７】
2008546404.tif 000022
【０１６３】
この結果は、推定上のコショウＡ／Ｇ  ＳＮＰが、設計されたＳＴＳ分析を用いて検出可能な真の遺伝的多型を表わすことを示す。
【実施例６】
【０１６４】
ＳＮＰＷａｖｅ検出によるＳＮＰ妥当性の検証
実施例１において同定された推定上のＡ／Ｇ  ＳＮＰを検証するために、コンセンサス配列を用いて、ＳＮＰＷａｖｅライゲーションプローブセットは、このＳＮＰの両方の対立遺伝子について定義された。ライゲーションプローブの配列は以下のとおりであった：
【０１６５】
ＳＮＰＷａｖｅプローブ配列（５’−３’）
【０１６６】
【化１８】
2008546404.tif 000023
【０１６７】
共通の遺伝子座特異的プローブ０６Ａ１６４へのライゲーションに際して、９４（４２＋５４）塩基及び９６（４４＋５２）塩基のライゲーション産物サイズをもたらすように、Ａ及びＧの対立遺伝子について、それぞれの対立遺伝子特異的プローブの０６Ａ１６２及び０６Ａ１６３が、２塩基のサイズで異なることに留意されたい。
【０１６８】
van Eijk及び共同研究者等によって記述されるように、出発物質として１００ｎｇのコショウ系統ＰＳＰ１１及びＰＩ２０１２３４のゲノムＤＮＡ及び８つのＲＩＬ子孫を用いて、ＳＮＰＷａｖｅライゲーション及びＰＣＲ反応が実行された（M. J. T. van Eijk, J. L.N. Broekhof, H. J.A. van der Poel, R. C. J. Hogers, H. schneiders, J. Kamerbeek, E. Verstege, J.W. van Aart, H. Geerlings, J. B. Buntjer, A. J. van Oeveren, and P. Vos. （2004）「ＳＮＰＷａｖｅ（商標）：柔軟な多重化ＳＮＰ遺伝子型決定技術（SNPWaveTM: a flexible multiplexed SNP genotyping technology）」Nucleic Acids Research 32: e47）。ＰＣＲプライマーの配列は次のとおりであった：
【０１６９】
【化１９】
2008546404.tif 000024
【０１７０】
ＰＣＲ増幅に続いて、ＰＣＲ産物の精製及びＭｅｇａＢＡＣＥ１０００での検出は、van Eijk及び共同研究者等（上記参照）によって記述された通りであった。ＰＳＰ１１、ＰＩ２０１２３４、及び８つのＲＩＬ子孫から得られた増幅産物の擬似ゲル画像を、図８Ｂに示す。
【０１７１】
ＳＮＰＷａｖｅ結果は、Ｐ１（ＰＳＰ１１）及びＲＩＬ子孫（１、２、３、４、６、及び７）に対して９２ｂｐ産物（＝ＡＡのホモ接合体遺伝子型）、及びＰ２（ＰＩ２０１２３３）及びＲＩＬ子孫５及び８に対して９４ｂｐ産物（＝ＧＧのホモ接合体遺伝子型）をもたらし、Ａ／Ｇ  ＳＮＰが、ＳＮＰＷａｖｅ分析によって検出されることを明確に実証する。
【実施例７】
【０１７２】
低コピー配列のＡＦＬＰ断片ライブラリーを濃縮するための戦略
この実施例は、実施例４に記述されていたようなエリート多型性の収率を増加させるために、ユニークゲノム配列の低コピーを標的とする、いくつかの濃縮法を記述する。この方法は４つのカテゴリーに分類することができる：
【０１７３】
１）葉緑体配列を除いて高品質ゲノムＤＮＡを調製することを目標とする方法
ここで、大量の葉緑体ＤＮＡの共単離を除外するために、実施例４に記述されているような全ゲノムＤＮＡの代わりに、核ＤＮＡを調製することを提案する。この調製により、断片ライブラリー調製方法で用いられる制限エンドヌクレアーゼ及び選択的なＡＦＬＰプライマーに依存して、植物ゲノムＤＮＡ配列数の減少がもたらされ得る。高度に純粋なトマト核ＤＮＡの単離のプロトコルは、Peterson, DG., Boehm, K.S. & Stack S.M. （1997）「トマト（Lycopersicon esculentum）からのミリグラム量の核ＤＮＡの単離、高レベルのポリフェノール化合物を含む植物（Isolation of Milligram Quantities of Nuclear DNA From Tomato （Lycopersicon esculentum）, A Plant Containing High Levels of Polyphenolic Compounds）」Plant Molecular Biology Reporter 15 （2）, pages 148-153により記述されている。
【０１７４】
２）低コピー配列のレベルの増加をもたらすと期待される、ＡＦＬＰ鋳型の調製過程で制限エンドヌクレアーゼを用いることを目標とする方法
ここで、ＡＦＬＰ鋳型調製方法において特定の制限エンドヌクレアーゼを用いることを提案する。この使用は、低コピーのゲノム配列又はユニークゲノム配列を標的とすると予想され、遺伝子型決定分析への転換能力の増加により、多型性について濃縮された断片ライブラリーをもたらす。植物ゲノムにおける低コピー配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼの一例は、ＰｓｔＩである。他のメチル化感受性の制限エンドヌクレアーゼも、低コピーのゲノム配列又はユニークゲノム配列を優先的に標的とし得る。
【０１７５】
３）反復配列対低コピー配列の再アニーリング速度論に基づく、高度に重複した配列を選択的に除去することを目標とした方法
ここで、選択的増幅の前に、全ゲノムＤＮＡサンプル又は（ｃＤＮＡ−）ＡＦＬＰ鋳型材料のいずれかから、高度に重複した（反復）配列を選択的に除去することを提案する。
【０１７６】
３ａ）高Ｃ０ｔ  ＤＮＡ調製は、複雑な植物ゲノムＤＮＡ混合物から低コピー配列を濃縮して徐々にアニーリングする一般に用いられる技術である（Yuan et al. 2003;「トウモロコシゲノムの高Ｃｏｔの配列分析（High-Cot sequence analysis of the maize genome）」Plant J. 34: 249-255）。低コピー配列中に位置する多型性のために、濃縮する出発物質として、全ゲノムＤＮＡの代わりに高Ｃ０ｔ  ＤＮＡを採用することが示唆される。
【０１７７】
３ｂ）面倒な高Ｃ０ｔ調製の代替案は、Zhulidov及び共同研究者等（２００４；「カムチャツカガニの二重鎖特異的ヌクレアーゼを用いる単純なｃＤＮＡ正規化（simple cDNA normalization using Kamchatka crab duplex-specific nuclease）」Nucleic Acids Research 32, e37）、並びにShagin及び共同研究者等（２００６；「カニ肝膵臓からの新しい二重鎖特異的ヌクレアーゼを用いるＳＮＰ検出のための新規方法（a novel method for SNP detection using a new duplex-specific nuclease from crab hepatopancreas）」Genome Research 12: 1935-1942）によって記述されるように、不完全に一致したＤＮＡ二本鎖よりも高い率で、短い完全に一致したＤＮＡ二本鎖を切断する、カムチャツカガニからの新規ヌクレアーゼで、変性した再アニーリングｄｓＤＮＡをインキュベートすることである。具体的には、それは高度に重複した配列の混合物を枯渇させるために、このエンドヌクレアーゼでＡＦＬＰ制限／ライゲーション混合物をインキュベートし、その後残存する低コピーのゲノム配列又はユニークゲノム配列の選択的なＡＦＬＰ増幅を行なうことが提案される。
【０１７８】
３ｃ）メチル濾過は、Ｃがメチル化される場合に、配列［Ａ／Ｇ］Ｃでメチル化されたＤＮＡを切断する制限エンドヌクレアーゼＭｃｒＢＣを用いて、低メチル化ゲノムＤＮＡ断片について濃縮する方法である（Pablo D. Rabinowicz , Robert Citek, Muhammad A. Budiman, Andrew Nunberg, Joseph A. Bedell Nathan Lakey, Andrew L. O' Sshaughnessy， Lidia U. Nascimento, W. Richard McCombie and Robert A. Martienssen、「陸上植物における遺伝子の差異的なメチル化及び反復（Differential methylation of genes and repeats in land plants）」Genome Research 15:1431-1440, 2005を参照）。ＭｃｒＢＣは、多型性発見のための出発物質としてのゲノムの低コピー配列画分を濃縮するために用いられてもよい。
【０１７９】
４）遺伝子配列を標的とするための、ゲノムＤＮＡとは対照的なｃＤＮＡの使用
最終的に、ここで、任意で、正規化のために上の３ｂ中に記述した、二重鎖特異的なカニのヌクレアーゼの使用と組み合わせて、多型性の発見のための出発物質としてのゲノムＤＮＡとは対照的なオリゴｄＴでプライミングしたｃＤＮＡを用いることが提案される。オリゴｄＴでプライミングしたｃＤＮＡの使用により、葉緑体配列も除外されることに留意されたい。或いは、オリゴｄＴでプライミングしたｃＤＮＡの代わりに、ｃＤＮＡ−ＡＦＬＰ鋳型を、ＡＦＬＰと同様に、残存する低コピー配列の増幅を促進するために用いる（上の３ｂも参照）。
【実施例８】
【０１８０】
単純反復配列濃縮のための戦略
この実施例は、実施例４において記述されたＳＮＰ発見と同様に、単純反復配列の発見のために提案された戦略を記述する。
【０１８１】
具体的には、２つ以上のサンプルのゲノムＤＮＡの制限ライゲーションは、例えば、制限エンドヌクレアーゼＰｓｔＩ／ＭｓｅＩを用いて行なわれる。実施例４において記述されているように、選択的なＡＦＬＰ増幅が行なわれる。次に、選択されたＳＳＲモチーフを含む断片は、２つの方法のうちの１つによって濃縮される。
【０１８２】
１）Armour及び共同研究者等によって記述されたものと同様の方法での、意図したＳＳＲモチーフと一致するオリゴヌクレオチドを含むフィルター上へのサザンブロットハイブリダイゼーション（例えば、ＣＡ／ＧＴ反復の濃縮の場合には、（ＣＡ）１５）と、その後の結合断片の増幅（Armour, J., Sismani, C., Patsalis, P., and Cross, G. （2000）「増幅可能なプローブとのハイブリダイゼーションによる遺伝子座コピー数の測定（Measurement of locus copy number by hybridization with amplifiable probes）」Nueleic Acids Research vol 28, no. 2, pp. 605-609）又は
【０１８３】
２）Kijas及び共同研究者等によって記述された解決法での、（ＡＦＬＰ）断片を取り込むためにビオチン化された捕獲オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを用いる濃縮（Kijas, J.M,. Fowler, J.C., Garbett C.A., and Thomas, M.R., （1994）「ストレプトアビジンがコートされた磁気微粒子に結合したビオチン化オリゴヌクレオチド配列を用いた、柑橘類のゲノムからのマイクロサテライトの濃縮（Enrichment of microsatellites from the citrus genome using biotinylated oligonucleotide sequences bound to streptavidin-coated magnetic particles）」Biotechniques, vol. 16, pp. 656-662）。
【０１８４】
次に、ＳＳＲモチーフが濃縮されたＡＦＬＰ断片は、前増幅工程で用いられるのと同様のＡＦＬＰプライマーを用いて、シークエンスライブラリーを生成するために増幅される。増幅された断片の一部分をＴ／Ａクローニングし、９６のクローンを陽性のクローン画分（意図したＳＳＲモチーフ、例えば５反復単位よりも長いＣＡ／ＧＴモチーフを含むクローン）を推定するためのシークエンスとする。ＳＳＲを含む断片が濃縮されるかを視覚的に検査するために、任意で、読取り可能なフィンガープリントを得るさらなる選択的増幅の後に、濃縮されたＡＦＬＰ断片混合物の他の部分を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）によって検出する。これらの制御工程の首尾良く完了させた後、シークエンスライブラリーで、ハイスループット４５４シークエンシングを行なう。
【０１８５】
新たなＳＳＲ発見のための上の戦略は、図８Ａにおいて概略的に示され、捕獲オリゴヌクレオチド配列を置換することによって、他の配列モチーフに対して適応させることができる。
【実施例９】
【０１８６】
混合したタグの回避ための戦略
混合したタグは、１つのサンプル当たりに、タグ付けされたＡＦＬＰプライマーの期待される組合せに加えて、サンプル１のタグを１つの末端に及びサンプル２のタグを他方の末端に含む配列の画分が少量観察されるという観察を示す（実施例４中の表１も参照）。図式的に、混合したタグを含んでいる配列の配置は本明細書において以下で表現される。
【０１８７】
期待されるサンプルタグの組合せの配置図。
【０１８８】
【化２０】
2008546404.tif 000025
【０１８９】
混合タグの配置図。
【０１９０】
【化２１】
2008546404.tif 000026
【０１９１】
混合したタグの観察によって、配列が、ＰＳＰ１１又はＰＩ−２０１２３４のいずれかへ正確に割り当てられることは除外される。
【０１９２】
実施例４において記述されるコショウのシークエンス実行において観察された混合したタグの配列の一例を、図５Ａに示す。期待されるタグ及び混合したタグを含む、観察された断片の配置の概観を、図５Ａのパネル２において示す。
【０１９３】
混合したタグに対して提案された分子的な説明は、シークエンスライブラリーの調製工程の間、３’突出末端を除去するＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ又はクレノウ酵素の使用によって、アダプターライゲーション前に、ＤＮＡ断片がブラントにされるということである（Margulies et al., 2005）。単一のＤＮＡサンプルが加工される場合にはこれはうまくいくのだろうが、異なってタグ付けされたＤＮＡサンプルの２つ以上のサンプルの混合物を使用する場合には、ポリメラーゼによって埋められると、異なるサンプルに由来する相補的な鎖の間にヘテロ二本鎖が形成される際に、間違ったタグ配列の取り込みをもたらす（図５Ｂパネル３混合したタグ）。その解決法は、図５Ｃのパネル４において示されるような４５４シークエンスライブラリーの構築工程において、アダプターライゲーションに続く精製工程の後にサンプルをプールすることであることが見い出された。
【実施例１０】
【０１９４】
４５４シークエンスライブラリー調製のための改善された設計を使用する、混合したタグ及びコンカテマーの回避ための戦略
実施例９において記述されるような混合したタグを含む低頻度のシークエンス読み取りについての観察の他に、コンカテマーになったＡＦＬＰ断片から観察された低頻度のシークエンス読み取りが観察された。
【０１９５】
コンカテマーに由来するシークエンス読み取りの一例を図６Ａパネル１において示す。期待されるタグ及びコンカテマーを含む配列の配置を、図式的に図６Ａパネル２において示す。
【０１９６】
コンカテマーになったＡＦＬＰ断片の発生に対して提案された分子的な説明は、４５４シークエンスライブラリー調製工程の間に、ＤＮＡ断片は、３’突出末端を除去するＴ４  ＤＮＡポリメラーゼ又はクレノウ酵素を使用して、アダプターライゲーション前にブラントにされるということである（Margulies et al., 2005）。その結果、ブラントな末端のサンプルＤＮＡ断片はライゲーション工程の間にアダプターを競合し、アダプターにライゲーションされる前に互いにライゲーションされるであろう。この現象は、実際、ライブラリーの調製工程において、単一のＤＮＡサンプルが含まれるか、又は複数の（タグ付けされた）サンプルの混合物が含まれているか否かに依存せず、したがって、Margulies及び共同研究者等によって記述されるような従来のシークエンシングの間にも起こってもよい。実施例４において記述されているような複数のタグを付けられたサンプルの使用の場合には、コンカテマーは、タグ情報に基づきサンプルに対する配列読み取りの正確な割り当てを複雑にし、したがって、回避されるべきである。
【０１９７】
コンカテマー（及び混合したタグ）の形成に対する提案された解決法は、図６Ｂパネル３において示されるように、ブラント末端アダプターライゲーションを、ＰＣＲ産物のＴ／Ａクローニングと同様に、３’Ｔ突出部を含むアダプターのライゲーションと置換することである。便利なように、これらの修飾された３’Ｔ突出部含むアダプターは、アダプター配列のブラント末端コンカテマー形成を防ぐために、反対側の３’末端（それはサンプルＤＮＡ断片にライゲーションされないであろう）でＣ突出部を含むように提案される（図６Ｂパネル３を参照）。修飾されたアダプターのアプローチを使用する場合の、シークエンスライブラリー構築過程の最終的な適応ワークフローを、図６Ｃのパネル４において図式的に示す。
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１Ａ】ビーズ（「４５４ビーズ」）上にアニーリングされた本発明に記載の断片、及び２つのコショウ系統の前増幅に用いられたプライマーの配列を示す図である。「ＤＮＡ断片」は制限エンドヌクレアーゼで消化後に得られた断片を表わし、「鍵遺伝子アダプター」はライブラリーを生成するために用いられる（リン酸化された）オリゴヌクレオチドプライマーのためのアニーリング部位を提供するアダプターを表わし、「ＫＲＳ」は識別子配列（タグ）を表わし、「４５４ＳＥＱ．アダプター」はシークエンシングアダプターを表わし、「４５４ＰＣＲアダプター」はＤＮＡ断片のエマルジョン増幅を可能にするアダプターを表わす。ＰＣＲアダプターはビーズへのアニーリング及び増幅を可能にし、３’−Ｔ突出部を含んでもよい。
【図１Ｂ】複雑度の減少工程において用いられる図解プライマーを示す図である。そのようなプライマーは、通常（２）として示された認識部位領域、（１）として示されたタグセクションを含む定常領域、及びその３’末端で（３）として示された選択的領域の１つ又は複数の選択的なヌクレオチドを含む。
【図２】２％のアガロースゲル電気泳動を用いた、ＤＮＡ濃度の推定を示す図である。Ｓ１はＰＳＰ１１を表わし、Ｓ２はＰＩ２０１２３４を表わす。５０、１００、２５０及び５００ｎｇは、Ｓｌ及びＳ２のＤＮＡ量を推定するために、５０ｎｇ、１００ｎｇ、２５０ｎｇ及び５００ｎｇをそれぞれ表わす。（Ｃ）及び（Ｄ）は、ナノドロップ分光測光法を用いた、ＤＮＡ濃度測定を示す図である。
【図３】実施例３の中間の品質査定の結果を示す図である。
【図４】（Ａ）は配列データの加工パイプラインのフローチャート、すなわち、トリミング及びタグ付け（Trimming & Tagging）においてトリミングされた配列データをもたらす既知の配列情報の除去の工程を介して、シークエンシングデータの生成から、推定上のＳＮＰ、ＳＳＲ及びインデルを同定する工程で、コンティグ及びシングルトン（コンティグ中にアセンブリングできない断片）を産出するためにクラスタリング及びアセンブリングを行い、その後推定上の多型性を同定及び評価することができる工程を示す図である。（Ｂ）は、さらに多型性抽出の過程を詳述する図である。
【図５Ａ】混合したタグの問題に焦点を当て、パネル１に、サンプル１（ＭＳ１）及びサンプル２（ＭＳ２）に関連したタグを伴う、混合したタグの例を提供する図である。パネル２は、この現象の図解の説明を提供する。サンプル１（Ｓ１）及びサンプル２（Ｓ２）に由来したＡＦＬＰ制限断片は、サンプル特異的なタグのＳ１及びＳ２を伴う両側で、アダプター（「鍵遺伝子アダプター」）とライゲーションされる。増幅及びシークエンシングの後で、ｅ期待された断片はＳ１−Ｓ１タグを有する断片及びＳ２−Ｓ２タグを有する断片である。さらに、予想外に観察されるものはタグＳ１−Ｓ２を伴う断片又はＳ２−Ｓ１を伴う断片でもある。
【図５Ｂ】パネル３は、ヘテロ二本鎖産物がサンプル１及びサンプル２からの断片から形成される、混合したタグの生成の仮説的な原因について説明する。Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ又はクレノウの３’−５’エキソヌクレアーゼ活性により、続いてヘテロ二本鎖では３’突出末端が無くなる。重合の間に、ギャップはヌクレオチドで満たされ、間違ったタグが導入される。これは、ほぼ同様の長さ（上部のパネル）のヘテロ二本鎖に作動するが、より長さが変化するヘテロ二本鎖に対しても作動する。
【図５Ｃ】パネル４は、混合したタグの形成をもたらす従来のプロトコルを右側に、及び修飾されたプロトコルを右側に提供する。
【図６Ａ】コンカテマー形成の問題に焦点を当て、パネル１においてコンカテマーの代表例を挙げ、様々なアダプター及びタグ区分には、それらの起源で下線を引く（すなわち、サンプル１からのＭｓｅＩ制限部位アダプター、サンプル２からのＭｓｅＩ制限部位アダプター、サンプル１からのＥｃｏＲＩ制限部位アダプター、サンプル２からのＥｃｏＲＩ制限部位アダプターに、それぞれ対応するＭＳ１、ＭＳ２、ＥＳ１及びＥＳ２）。パネル２は、Ｓ１−Ｓ１タグ及びＳ２−Ｓ２タグを伴う、期待された断片、及び観察されたが期待されないサンプル１及びサンプル２からの断片のコンカテマーである、Ｓ１−Ｓ１−Ｓ２−Ｓ２を明示する。
【図６Ｂ】混合したタグと同様に、ＡＦＬＰアダプターに突出部を導入すること、修飾されたシークエンシングアダプター、及びシークエンシングアダプターをライゲーションする場合の末端を平滑にする工程の省略によって、コンカテマーの生成を回避するパネル３の解決法。ＡＬＰ断片が互いにライゲーションすることができないのでコンカテマー形成が見られず、末端を平滑にする工程が省略できないので混合した断片は発生しない。
【図６Ｃ】パネル４は、混合したタグと同様に、コンカテマー形成を回避するために、修飾されたアダプターを用いた修飾されたプロトコルを提供する。
【図７】推定上の一塩基多型（ＳＮＰ）を含む、コショウＡＦＬＰ断片配列の多重アライメント「１００３７＿ＣＬ９８９ｃｏｎｔｉｇ２」を示す図である。ＳＮＰ（黒い矢印によって示された）は、上部の２つの読み取りの名称中のＭＳ１タグの存在によって表わされた、サンプル１（ＰＳＰ１１）の両方の読み取りにあるＡ対立遺伝子、及び下部２つ読み取りの名称中のＭＳ２タグの存在によって表わされた、サンプル２（ＰＩ２０１２３４）にあるＧ対立遺伝子によって定義されることに留意されたい。読み取りの名称は左側に示される。この多重アライメントのコンセンサス配列は次のとおりである（５’−３’）：
【０１９９】
【化２２】
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【０２００】
【図８Ａ】新たな単純反復配列（ＳＳＲ）の発見のためのハイスループットシークエンシングと組み合わせたＳＳＲを標的とした濃縮戦略の略図である。
【図８Ｂ】ＳＮＰＷａｖｅ検出を用いるコショウ中のＧ／Ａ  ＳＮＰの検証を示す図である。Ｐ１＝ＰＳＰ１１、Ｐ２＝ＰＩ２０１２３４。８つのＲＩＬの子孫が番号１〜８によって示される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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