(57)【要約】本発明は、ポア形成修飾タンパク質（ＭＰＰ）を用いてＢＰＨを治療する方法を提供する。これらのＭＰＰは、細胞膜内にポアまたはチャネルを形成することによって細胞を殺し、細胞死をもたらす、天然起源の細胞毒性タンパク質（ｎＰＰ）に由来する。ＭＰＰは、正常前立腺細胞においてそれらが選択的に活性化されることができるように、ｎＰＰの修飾によって作られる。そのような修飾には、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位の活性化配列への付加、および／または前立腺細胞の選択的な標的を可能にするための前立腺特異的標的領域の付加が含まれてもよい。これらのＭＰＰは正常前立腺細胞をｉｎ ｖｉｖｏで選択的に標的として殺すことができる。ＭＰＰは、単独またはＢＰＨの治療のための他の療法との併用のいずれかで使用されてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の前立腺の大きさを縮小する際に使用されるポア形成修飾タンパク質であって、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的とすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は、選択的に前立腺細胞を殺すことができる、ポア形成修飾タンパク質。
【請求項２】
良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）の治療に使用されるポア形成修飾タンパク質であって、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的とすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は、選択的に前立腺細胞を殺すことができる、ポア形成修飾タンパク質。
【請求項３】
前記ポア形成修飾タンパク質が、良性前立腺肥大症のための一つ以上の他の治療法と併用して使用される、請求項２に記載の前記ポア形成修飾タンパク質。
【請求項４】
前記天然起源のポア形成タンパク質がプロアエロリジンまたはα毒素である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項５】
前記ポア形成修飾タンパク質が、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項６】
前記ポア形成修飾タンパク質が前立腺特異的標的領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項７】
前記ポア形成修飾タンパク質が、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列と、一つ以上の前立腺特異的標的領域を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項８】
前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な前記活性化配列が、前記天然起源のポア形成タンパク質の天然の活性化配列を機能的に置換する、請求項１、２、３、４、５、または７のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項９】
前記前立腺特異的プロテアーゼが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、またはヒト腺性カリクレイン２（ｈＫ２）である、請求項１、２、３、４、５、または７のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項１０】
前記前立腺特異的プロテアーゼが、前立腺特異抗原である、請求項１、２、３、４、５、または７のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項１１】
前記前立腺特異的標的領域が、黄体形成ホルモン放出ホルモン、または前立腺特異的膜抗原に対する抗体である、請求項１、２、３、４、６、または７のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項１２】
前記ポア形成修飾タンパク質が、前記天然起源のポア形成タンパク質の結合領域に一つ以上の変異をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項１３】
前記ポア形成修飾タンパク質が親和性標識をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項１４】
前記ポア形成修飾タンパク質が前立腺内投与用に調製される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項１５】
前記ポア形成修飾タンパク質が静脈内投与用に調製される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のポア形成修飾タンパク質。
【請求項１６】
前記天然起源のポア形成タンパク質がアエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）のプロアエロリジンである、請求項１または２に記載の前記ポア形成修飾タンパク質。
【請求項１７】
前記ポア形成修飾タンパク質が前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列を含む、請求項１６に記載の前記ポア形成修飾タンパク質。
【請求項１８】
前記ポア形成修飾タンパク質が、プロアエロリジンの結合領域中に一つ以上の変異をさらに含む、請求項１６に記載の前記ポア形成修飾タンパク質。
【請求項１９】
前記ポア形成修飾タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の前記ポア形成修飾タンパク質。
【請求項２０】
前記ポア形成修飾タンパク質が親和性標識を含む、請求項１６に記載の前記ポア形成修飾タンパク質。
【請求項２１】
前記ポア形成修飾タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の前記ポア形成修飾タンパク質。
【請求項２２】
前記一つ以上の変異が、Ｙ１６２の位置の変異、Ｗ３２４の位置の変異、Ｒ３２３の位置の変異、Ｒ３３６の位置の変異、およびＷ１２７の位置の変異から選択される、請求項１８に記載の前記ポア形成修飾タンパク質。
【請求項２３】
少なくとも一つの変異がＲ３３６Ａである、請求項１８に記載の前記ポア形成修飾タンパク質。
【請求項２４】
対象の前立腺の大きさを縮小するための薬物の調製におけるポア形成修飾タンパク質の使用であって、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的とすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は選択的に前立腺細胞を殺すことができる、ポア形成修飾タンパク質の使用。
【請求項２５】
良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）の治療のための薬物の調製におけるポア形成修飾タンパク質の使用であって、前記ポア形成修飾タンパク質は天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的とすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は選択的に前立腺細胞を殺すことができる、ポア形成修飾タンパク質の使用。
【請求項２６】
前記ポア形成修飾タンパク質が、良性前立腺肥大症のための一つ以上の他の治療法と併用して使用される、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
天然起源のポア形成タンパク質がプロアエロリジンまたはα毒素である、請求項２４〜２６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２８】
前記ポア形成修飾タンパク質が、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列を含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２９】
前記ポア形成修飾タンパク質が前立腺特異的標的領域を含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３０】
前記ポア形成修飾タンパク質が、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列と、一つ以上の前立腺特異的標的領域を含む、請求項２４〜２７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３１】
前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な前記活性化配列が、前記天然起源のポア形成タンパク質の天然の活性化配列を機能的に置換する、請求項２４、２５、２６、２７、２８、または３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３２】
前記前立腺特異的プロテアーゼが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、またはヒト腺性カリクレイン２（ｈＫ２）である、請求項２４、２５、２６、２７、２８、または３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３３】
前記前立腺特異的プロテアーゼが前立腺特異抗原である、請求項２４、２５、２６、２７、２８、または３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３４】
前記前立腺特異的標的領域が、黄体形成ホルモン放出ホルモン、または前立腺特異的膜抗原に対する抗体である、請求項２４、２５、２６、２７、２９、または３０のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３５】
前記ポア形成修飾タンパク質が、前記天然起源のポア形成タンパク質の結合領域に一つ以上の変異をさらに含む、請求項２４〜３４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３６】
前記ポア形成修飾タンパク質が親和性標識をさらに含む、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３７】
前記ポア形成修飾タンパク質が前立腺内投与用に調製される、請求項２４〜３５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３８】
前記ポア形成修飾タンパク質が静脈内投与用に調製される、請求項２４〜３６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項３９】
前記天然起源のポア形成タンパク質がアエロモナス・ハイドロフィラのプロアエロリジンである、請求項２４または２５に記載の使用。
【請求項４０】
前記ポア形成修飾タンパク質が前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列を含む、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
前記ポア形成修飾タンパク質が、プロアエロリジンの結合領域中に一つ以上の変異をさらに含む、請求項３９に記載の使用。
【請求項４２】
前記ポア形成修飾タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の使用。
【請求項４３】
前記ポア形成修飾タンパク質が親和性標識を含む、請求項３９に記載の使用。
【請求項４４】
前記ポア形成修飾タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の使用。
【請求項４５】
前記一つ以上の変異が、Ｙ１６２の位置の変異、Ｗ３２４の位置の変異、Ｒ３２３の位置の変異、Ｒ３３６の位置の変異、およびＷ１２７の位置の変異から選択される、請求項４１に記載の使用。
【請求項４６】
少なくとも一つの変異がＲ３３６Ａである、請求項４１に記載の使用。
【請求項４７】
効果的な量のポア形成修飾タンパク質を対象に投与するステップを含む、対象の前立腺の大きさを縮小する方法であって、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的とすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は、選択的に前立腺細胞を殺すことができる、対象の前立腺の大きさを縮小する方法。
【請求項４８】
効果的な量のポア形成修飾タンパク質を対象に投与するステップを含む、対象の良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）を治療する方法であって、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的とすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は選択的に前立腺細胞を殺すことができる、対象の良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）を治療する方法。
【請求項４９】
前記ポア形成修飾タンパク質が、良性前立腺肥大症のための一つ以上の他の治療法と併用して投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
天然起源のポア形成タンパク質がプロアエロリジンまたはα毒素である、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポア形成修飾タンパク質が、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列を含む、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記ポア形成修飾タンパク質が前立腺特異的標的領域を含む、請求項４７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポア形成修飾タンパク質が、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列と、一つ以上の前立腺特異的標的領域を含む、請求項４７もしくは５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列が、前記天然起源のポア形成タンパク質の天然の活性化配列を機能的に置換する、請求項４７、４８、４９、５０、５１、および５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記前立腺特異的プロテアーゼが、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、またはヒト腺性カリクレイン２（ｈＫ２）である、請求項４７、４８、４９、５０、５１、および５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記前立腺特異的プロテアーゼが前立腺特異抗原である、請求項４７、４８、４９、５０、５１、および５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記前立腺特異的標的領域が、黄体形成ホルモン放出ホルモン、または前立腺特異的膜抗原に対する抗体である、請求項４７、４８、４９、５０、５２、および５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記ポア形成修飾タンパク質が、前記天然起源のポア形成タンパク質の結合領域に一つ以上の変異をさらに含む、請求項４７〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ポア形成修飾タンパク質が親和性標識をさらに含む、請求項４７〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ポア形成修飾タンパク質が前立腺内投与用に調製される、請求項４７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポア形成修飾タンパク質が静脈内投与用に調製される、請求項４７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記天然起源のポア形成タンパク質がアエロモナス・ハイドロフィラのプロアエロリジンである、請求項４７または４８に記載の方法。
【請求項６３】
前記ポア形成修飾タンパク質が、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ポア形成修飾タンパク質が、プロアエロリジンの結合領域中に一つ以上の変異をさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポア形成修飾タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポア形成修飾タンパク質が親和性標識を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポア形成修飾タンパク質が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３１に記載のアミノ酸配列を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記一つ以上の変異が、Ｙ１６２の位置の変異、Ｗ３２４の位置の変異、Ｒ３２３の位置の変異、Ｒ３３６の位置の変異、およびＷ１２７の位置の変異から選択される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも一つの変異がＲ３３６Ａである、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
ラージローブ結合領域に一つ以上の変異と、前立腺細胞と前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列を選択的に標的とすることができる、前立腺特異的標的領域から選択される一つ以上の前立腺特異的修飾を含む、修飾プロアエロリジンタンパク質であって、前記修飾プロアエロリジンが選択的に前立腺細胞を殺すことができる、修飾プロアエロリジンタンパク質。
【請求項７１】
前記修飾プロアエロリジンタンパク質がアエロモナス・ハイドロフィラの修飾プロアエロリジンである、請求項７０に記載の修飾プロアエロリジンタンパク質。
【請求項７２】
前記ラージローブ結合領域が、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の８４〜４２６番目のアミノ酸として定義される、請求項７１に記載の修飾プロアエロリジンタンパク質。
【請求項７３】
ラージローブ結合領域中の前記一つ以上の変異が、Ｙ１６２の位置の変異、Ｗ３２４の位置の変異、Ｒ３２３の位置の変異、Ｒ３３６の位置の変異、およびＷ１２７の位置の変異から選択される、請求項７２に記載の修飾プロアエロリジンタンパク質。
【請求項７４】
前記修飾プロアエロリジンタンパク質が前立腺特異的標的領域を含む、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の修飾プロアエロリジンタンパク質。
【請求項７５】
前記修飾プロアエロリジンタンパク質が、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列を含む、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の修飾プロアエロリジンタンパク質。
【請求項７６】
前記修飾プロアエロリジンタンパク質が、前立腺特異的標的領域と前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列とを含む、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の修飾プロアエロリジンタンパク質。
【請求項７７】
前記前立腺特異的標的領域が、黄体形成ホルモン放出ホルモン、または前立腺特異的膜抗原に対する抗体である、請求項７０、７１、７２、７３、７４、または７６のいずれかに記載の修飾プロアエロリジンタンパク質。
【請求項７８】
前記前立腺特異的プロテアーゼが前立腺特異抗原、前立腺特異的膜抗原、またはヒト腺性カリクレイン２である、請求項７０、７１、７２、７３、７５、または７６のいずれかに記載の修飾プロアエロリジンタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、良性前立腺肥大症の分野に関し、特に、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）の治療のためのポア形成修飾タンパク質の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
多くの細胞溶解性タンパク質が説明されてきた（Ｌｅｓｉｅｕｒら、Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１４：４５０６４，１９９７（非特許文献１））。これらの天然起源の細胞毒性タンパク質には、パーフォリンなどの哺乳類のタンパク質と、アエロリジン（アエロモナス・ハイドロフィラ（Aeromonas hydrophila）によって産生される）、α−ヘモリジン（黄色ブドウ球菌によって産生される）、α毒素（クロストリジウム・セプチカムによって産生される）、δ毒素（バチルス・チューリンゲンシスによって産生される）、炭疽菌防御抗原、コレラ菌のＶＣＣ毒素、ブドウ球菌のロイコシジン、イカワタケのＬＳＬ毒素、ウェルシュ菌のε毒素、刺胞動物種によって産生されるヒドラリシン（ｈｙｄｒａｌｙｓｉｎ）などの細菌タンパク質が含まれる。
【０００３】
例えばプロアエロリジンやα毒素などの、これらの細胞毒性タンパク質の一部は、不活性のプロトキシンとして合成される。これらのプロトキシンは、細胞、毒素領域、ならびにプロテアーゼ切断部位を含むＮ末端またはＣ末端抑制ペプチド領域のどちらかにプロトキシンを結合できるようにする、束縛領域を含む個別の官能基を含む。プロテアーゼ切断部位における抑制ペプチド領域の切断は、プロトキシンの活性化をもたらし、形質膜中の細胞毒素のオリゴマー化につながり、細胞溶解性の急速な細胞死を導くポアを産生する（Ｒｏｓｓｊｏｈｎら、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２１：９２−１００，１９９８（非特許文献２））。ポアの形成は物理的に細胞膜を破壊し、非増殖期の細胞（すなわちＧ０停止期）を含む、細胞周期中の全ての段階で細胞の死をもたらす。これらの細胞毒素は、それらの結合領域が、大部分の細胞上に認められる分子を標的としており、またそれらは通常細胞特異的ではないプロテアーゼによって活性化されるため、これらが殺すことのできる細胞の種類に特異的でない。
【０００４】
細胞溶解性ポア形成タンパク質またはこれらのたんぱく質の修飾型は、癌の治療のための潜在的な治療薬として提唱されてきた。例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７７７，０７８（特許文献１）は細胞を溶解するために、タンパク分解などの多くの条件によって細胞表面で活性化されるポア形成物質を記載している。一般に、動物において、病態に関連する不要な細胞を破壊するために、これらのポア形成物質を使用できる。そのような細胞には、腫瘍細胞、ウィルスに慢性的に感染している細胞、または不適切に調節されたりまたは発現された場合に疾病状態をもたらす細胞、例えば免疫系の細胞などが含まれるが、これに限定されない。ＷＯ９８／０２０１３５（特許文献２）は、選択毒性のために修飾されたシュードモナス属の外毒素の前駆タンパク質に関する方法と組成物を記載する。プロテアーゼ感受性配列の前駆タンパク質への挿入によって、所望のプロテアーゼによって活性化されるように外毒素が修飾される。一つの例では、前立腺癌細胞を標的し、殺す目的で、外毒素は前立腺特異抗原（ＰＳＡ）切断部位を挿入するために修飾される。
【０００５】
Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００４／０２３５０９５（特許文献３）は、前立腺癌およびその他の癌の治療のための、細胞溶解性ポア形成修飾タンパク質の使用を記載する。細胞溶解性タンパク質を、前立腺特異的切断部位および／または前立腺特異的標的領域を含むように修飾でき、前立腺癌細胞を選択的に標的とし殺すために使用できる。
【０００６】
腫瘤を形成するように増殖する、正常組織に由来する異常細胞、または腫瘍細胞の数の増加、これらの腫瘍細胞による周囲組織の浸潤、ならびに転移と呼ばれる過程を通じて、血液またはリンパ系を介して局所リンパ節や遠隔部位に最終的に広がる、悪性細胞の産生によって癌は特徴付けられる。癌の状態では、正常細胞が成長しない条件下で細胞は増殖する。正常細胞とは違って、通常癌細胞は増殖し続けるが、分化、または成熟はせず、由来組織から体内の他の場所へ広がる能力を持っている。癌細胞のこれらの特性は、通常は、正常細胞におけるそれと比較した、これらの細胞内の遺伝子発現の相対的なパターンにおける変化に由来する。癌の治療のための治療法を開発するための多くの戦略が、正常細胞と癌細胞の遺伝子発現の違いを利用すること、癌細胞に特異的な分子マーカーを用いて癌細胞を標的とすることに焦点を当ててきた。
【０００７】
対照的に、良性前立腺肥大症（ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ,ＢＰＨ。Ｂｅｎｉｇｎ  ｐｒｏｓｔａｔｉｃ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｙとしても知られる）は、年齢に伴う前立腺の増殖の自然な進行の結果として、前立腺の肥大に起因する非癌性の状態である。前立腺の肥大は、前立腺細胞増殖の増加、または前立腺細胞の大きさにおける増加の結果であることもある。この進行性の前立腺の増殖は通常は晩年まで問題を引き起こさない。米国国立衛生研究所（ＮＩＨ）は、６０歳代の米国人男性の６０％がＢＰＨの何らかの症状を持ち、９０％を超える７０歳代と８０歳代の男性に症状が発症していると推定している。およそ１億１５００万人の世界中の５０歳以上の年齢層の男性が様々な程度のＢＰＨを持つ。人口の老齢化に伴い、今後２０年間で有病率は大幅に増加することが予想される。重度のＢＰＨは、尿路感染症、膀胱結石を含む膀胱および腎臓の障害、失禁、ならびに最も重大なものとして閉塞性尿路疾患による肉眼的血尿や腎不全などの深刻な問題の原因となりうる。
【０００８】
現在、ＢＰＨの治療には複数の戦略がある。これらには、経過観察、αブロッカー治療やフィナステリド治療などの薬物療法、バルーン拡張や、経尿道的前立腺切開術（ＴＵＩＰ）、経尿道的前立腺切除術（ＴＵＲＰ）、ならびに前立腺開腹摘除術などの様々な外科的手技が含まれる。有害な結果を全く持たない治療はほとんどなく、これは、利用できる治療の長所と短所の間で繊細なバランスが考慮されるＢＰＨの治療に関して特に当てはまる。ＢＰＨに対して現在利用できる治療の後に起こる有害事象には、インポテンス（各種の外科的手技についてはおよそ４％〜４０％で変動し、インポテンスの発生率は一部の薬物療法後にも増加する）、失禁（手術後のおよそ３％のストレス性失禁で、全尿失禁は１％近く）、再治療の必要が含まれる。発表データの複合解析では、周術期死亡（処置から９０日以内の死亡）の平均確率が、ＴＵＲＰに関しては１．５％であることが推定された。開腹手術では２．４％、バルーン拡張では３．５％であった。
【０００９】
現在では、最も一般的に使用されているホルモン療法は、フィナステリドの経口投与である。ニュージャージー州ホワイトハウスステーションのメルク社からプロスカー?の商標名で市販されているフィナステリドは、合成４−アザステロイド化合物であり、ステロイドＩＩ型５α−レダクターゼ、ならびにアンドロゲンテストステロンを５α−ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）に変換する細胞内酵素の特異的阻害剤である。フィナステリドは肥大した前立腺を縮小し、良性前立腺症状によって上昇したＰＳＡを低下させるのを助ける。しかし、フィナステリドは、好ましくない副作用を引き起こすことが知られており、これにはインポテンスまたは性欲の減退、射精に関する問題、乳房の増大および／または圧痛が含まれる。デュタステライド（デュアゲン）はＢＰＨの治療のための別の薬剤であり、タイプＩとＩＩの５α−レダクターゼの両方を阻害する効能がある。性的な副作用はフィナステリドのものと同様である。
【００１０】
α１アドレナリン受容体遮断薬も良性前立腺肥大症の臨床治療に現在使用されている。例としては、塩酸タムスロシン、塩酸テラゾシン、塩酸アルフゾシン、およびメシル酸ドキサゾシンが含まれる。α１アドレナリン受容体遮断薬の投与に続いて起こるＢＰＨの症状の緩和と尿流率の改善は、膀胱頸部と前立腺にあるアドレナリン受容体の阻害によってもたらされる平滑筋の弛緩と関連している。
【００１１】
さらに、植物性ステロールや抽出物も良性前立腺肥大症の治療に用いられてきた。
【００１２】
Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００４００８１６５９（特許文献４）は、１）ＰＳＡによって選択的かつタンパク質分解的に切断されるアミノ酸配列を持つオリゴペプチドを含み、２）ビンカ・アルカロイド細胞毒性薬に化学的に結合する、ＢＰＨを治療するのに有用な複合体を記載している。理論上は、アルカロイドの細胞毒性は、複合体中では低く、ＰＳＡによって結合が切断された場合に増加する。
【００１３】
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０６５２０１４（特許文献５）は、坑ＰＳＡ抗体の産生を誘発するために、免疫原性担体に結合しているＰＳＡ（前立腺特異抗原）の投与を含むＢＰＨの治療法を記載している。坑ＰＳＡ抗体もまた使用される。免疫原性担体は、破傷風毒素、ジフテリア毒素、またはコレラ毒素Ｂ鎖であってもよい。
【００１４】
Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ.６，３７９，６６９（特許文献６）は、治療薬を抗体またはそのフラグメントに結合することにより特定の臓器を標的とする方法を記載する。そのような結合された治療薬（または免疫複合体）を、前立腺癌、ＢＰＨ、前立腺炎の治療に使用できる。含まれる免疫複合体は、様々な生理活性剤に結合したＰＳＡに対する抗体である。生理活性剤は細菌毒素を含んでもよい。同様に、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００２０００１５８８（特許文献７）において、抗体と様々な生理活性治療薬の化学結合がさらに調査されている。
【００１５】
この背景情報は、申請者が信じている既知の情報を、本発明に関連する可能性があるものにする目的で提供される。先行する情報のいずれも、本発明に反する従来技術を構成するということを、承認することを必ずしも意図せず、またはそう解釈されるべできない。
【００１６】
【特許文献１】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．５，７７７，０７８
【特許文献２】ＷＯ９８／０２０１３５
【特許文献３】Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．２００４／０２３５０９５
【特許文献４】Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００４００８１６５９
【特許文献５】Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ０６５２０１４
【特許文献６】Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ.６，３７９，６６９
【特許文献７】Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００２０００１５８８
【非特許文献１】Ｌｅｓｉｅｕｒら、Ｍｏｌ．Ｍｅｍｂｒ．Ｂｉｏｌ．１４：４５０６４，１９９７
【非特許文献２】Ｒｏｓｓｊｏｈｎら、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．１２１：９２−１００，１９９８
【発明の開示】
【００１７】
発明の要約
本発明の目的は、ポア形成修飾タンパク質を用いて良性前立腺肥大症を治療または予防する方法を提供することである。
【００１８】
本発明の一つの態様によると、対象の前立腺の大きさを縮小させるのに使用するためにポア形成修飾タンパク質が提供され、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的にすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は、選択的に前立腺細胞を殺すことができる。
【００１９】
本発明の別の態様によると、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）の治療に使用するためのポア形成修飾タンパク質が提供され、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的にすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は、選択的に前立腺細胞を殺すことができる。
【００２０】
本発明の別の態様によると、対象の前立腺の大きさを縮小させるための薬物の調製における、ポア形成修飾タンパク質の使用を提供し、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的にすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は、選択的に前立腺細胞を殺すことができる。
【００２１】
本発明の別の態様によると、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）治療のための薬物の調製における、ポア形成修飾タンパク質の使用を提供し、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的にすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は、選択的に前立腺細胞を殺すことができる。
【００２２】
本発明の別の態様によると、対象の前立腺の大きさを縮小するための方法が提供され、前記対象へ有効量のポア形成修飾タンパク質の投与するステップを含む方法であり、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的にすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は、選択的に前立腺細胞を殺すことができる。
【００２３】
本発明の別の態様によると、対象の良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）を治療するための方法が提供され、前記対象に有効量のポア形成修飾タンパク質を投与するステップを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は、天然起源のポア形成タンパク質に由来し、前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択された一つ以上の前立腺選択的修飾と、選択的に前立腺細胞を標的にすることができる、一つ以上の前立腺特異的標的領域とを含み、前記ポア形成修飾タンパク質は、選択的に前立腺細胞を殺すことができる。
【００２４】
本発明の別の態様によると、修飾プロアエロリジンタンパク質が提供され、これはラージローブ（large lobe）結合領域中の一つ以上の変異と、前立腺細胞を選択的に標的にできる前立腺特異的標的領域、および前立腺特異的プロテアーゼによって切断可能な活性化配列から選択される一つ以上の前立腺特異的修飾とを含み、前記修飾プロアエロリジンタンパクは選択的に前立腺細胞を殺すことができる。
【００２５】
本発明のこれらおよびその他の特徴は、添付図を参照した以下の詳細な説明の中でさらに明白となるであろう。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、ＢＰＨの治療のためのポア形成修飾タンパク質の使用に関する。ＭＰＰは、細胞膜に進入し、標的細胞の細胞膜中にポアまたはチャネルを形成することにより細胞を殺し、細胞死をもたらす天然発生のポア形成タンパク質（ｎＰＰ）に由来する。一つの実施形態では、ＭＰＰは不可逆的に細胞膜に進入し、故にバイスタンダー細胞は影響を受けない。他の組織と比較して選択的に正常前立腺細胞を標的とするＭＰＰの能力をもたらす、前立腺選択的修飾をＭＰＰは含む。ＭＰＰは生体内で正常前立腺細胞を選択的に殺すことができ、生体内で正常前立腺の重量または体積を縮小させることができる。故に、本発明によるＭＰＰを単独で使用してもよく、またはＢＰＨのための他の治療法との組み合わせで使用してもよい。これは限局したまたは転移性の前立腺癌を治療するための細胞溶解性修飾タンパク質の使用を記載する、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００４０２３５０９５で記載される分子と対照的である。
【００２７】
定義
別に定義されない限り、本書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を持つ。
【００２８】
当技術分野で常用の方法と様々な一般的な参考文献（一般的にはＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．（１９８９）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．,を、そして、蛍光技術に関しては、Ｌａｋｏｗｉｃｚ，Ｊ．Ｒ． Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ（１９８３）を参照されたい）に従って、通常、技術および手技が実施される。化学合成、化学分析、または生物学的評価には通常の技術が使用される。開示を通じて用いているように、以下の用語は別記しない限り、以下の意味を持つものと理解されるものである。
本書で用いられているように、用語「およそ」は正常値から＋／−１０％の偏差を意味する。明確に言及されていてもいなくても、本書で示されるいかなる値にもこのような偏差が常に含まれることを理解すべきである。
【００２９】
実体や部分に関して本書で用いられる用語「前立腺特異的」は、実体／部分または実体／部分の特性が、他の細胞の種類と比較した場合に、前立腺細胞に対して選択的であることを示す。例えば、前立腺特異的実体／部分は、前立腺細胞によって選択的に発現されることができる、前立腺細胞と選択的に関連することができる、前立腺細胞によって選択的に活性化されることができる、前立腺細胞に選択的に結合できる、などが可能である。
【００３０】
本書で使用される用語「前立腺特異的活性化配列」は、一つ以上の前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を含み、前立腺特異的プロテアーゼによって選択的に切断され、加水分解される、アミノ酸残基の配列を意味する。
【００３１】
本書で用いられる用語「前立腺特異的標的領域」は、他の細胞種に結合できる能力と比較した場合、前立腺細胞に選択的に結合できる、ペプチドリガンド、毒素、または抗体などの分子を意味する。
【００３２】
本書で用いられる用語「遺伝子」 は、コード配列の上流または下流に位置してもよい、プロモーター、オペレーター、ターミネーター、ならびに同様のものなどの、関連する調節領域と一緒に、個々のタンパクまたはＲＮＡをコード化する核酸の断片を意味する（「コード配列」または「コード領域」としても用いられる）。
【００３３】
本書で用いられる用語「選択的にハイブリダイゼーションする」は、核酸が検出可能かつ特異的に第二の核酸へ結合する能力を意味する。ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、およびそれらの断片は、非特異的な核酸への検出可能な結合量が最小になるような、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で、標的核酸鎖に選択的にハイブリダイズする。当分野で周知のように、ならびに本書で論じられているように、選択的なハイブリダイゼーション条件を達成するために、高ストリンジェントな条件を用いることができる。一般的には、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、従来のハイブリダイゼーション処理に従って高ストリンジェンシーにて行われる。洗浄条件は一般的には、１〜３倍希釈のＳＳＣ、０．１〜１％ＳＤＳで５０〜７０℃で行われ、洗浄液をおよそ５〜３０分で交換する。
【００３４】
用語「〜と対応する」は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全てまたは一部と同一であることを示す。対照的に、用語「相補的な」は、参照ポリヌクレオチド配列の相補鎖の全てまたは一部と同一であることを示すために、本書で用いられる。例として、ヌクレオチド配列「ＴＡＴＡＣ」は参照配列「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に相補的である。
【００３５】
「参照配列」、「比較の枠」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的な同一性」。という用語は、二つ以上のポリヌクレオチド間または二つ以上のポリペプチド間の配列の関係を説明するために本書で使用される。「参照配列」は配列比較の基準として用いられる定義された配列であり、参照配列は、例えばｃＤＮＡ、遺伝子、またはタンパク質配列の全長の一部分として、より長い配列のサブセットであってもよく、または完全なｃＤＮＡ、遺伝子、またはタンパク質配列を含んでもよい。一般的には、参照ポリヌクレオチド配列は長さが少なくとも２０ヌクレオチドで、しばしば長さが少なくとも５０ヌクレオチドである。参照ポリペプチド配列は、一般的には長さが少なくとも７アミノ酸であり、しばしば長さが少なくとも１７アミノ酸である。
【００３６】
本書で用いられる「比較の枠」は、その断片について候補配列が参照配列と比較されてもよい、少なくとも１５の連続するヌクレオチドの位置または少なくとも５つの連続するアミノ酸位置の参照配列の概念的な断片を意味し、比較の枠中の候補配列部位は、二つの配列の最適なアラインメントに対する参照配列（付加や欠失を含まないもの）と比較すると、２０％以下の付加または欠失（すなわちギャップ）を含んでもよい。本発明は比較の枠について、参照配列または候補配列のいずれかの全長まで、ならびにそれを含む、様々な長さを意図するものである。比較の枠アライニングのための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．（１９８１）２：４８２）による局所相同アルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７０）４８：４４３）による相同アラインメントアルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（Ｕ．Ｓ．Ａ．）（１９８８）８５：２４４４）による類似法の検索を用いて、これらのアルゴリズムをコンピュータを用いて実行して（例えば、ウィスコンシン州マディソンのＳｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．５７３に所在する、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ＧｒｏｕｐによるＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）などの公的に利用できるコンピュータソフトウェアを用いて、または調査によって行われてもよい。最適なアラインメント（すなわち、比較の枠にわたって最大の割合の同一性をもたらす）が選択される。
【００３７】
用語「配列同一性」は、二つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列が比較の枠にわたって同一であることを意味する（すなわち、ヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の単位で）。
【００３８】
参照配列に関して本書で用いられる用語「配列同一性の割合（％）」は、同類置換を配列同一性の一部として考慮することなしに、最大の配列同一性の割合を達成するために、必要ならば配列の最適なアラインメントやギャップの導入を行った後で、比較の枠について、参照ポリペプチド配列中の残基と同一である、候補配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の百分率として定義される。
【００３９】
本書で用いられる用語「実質的な同一性」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の特徴を意味し、比較の枠にわたって参照配列と比較すると、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドが、少なくとも５０％の配列同一性を持つ配列を含む。比較の枠にわたって参照配列と比較して、少なくとも６０％の配列同一性、少なくとも７０％の配列同一性、少なくとも８０％の配列同一性、または少なくとも９０％の配列同一性を持つポリヌクレオチドとポリペプチド配列もまた、参照配列と実質的な同一性を持つと考えられる。
【００４０】
本書で用いられる用語「機能的欠失」は、遺伝子配列にもたらされる、その部分の遺伝子配列を機能しなくしてしまう、変異、部分欠失または完全欠失、挿入、またはその他の変化を意味する。例えば、プロアエロリジン（ＰＡ）結合領域の機能的欠失は、ＰＡが細胞膜に結合し、細胞膜上に集積する能力の減退につながる。この機能的欠失を、別の機能的結合領域、例えばＬＨＲＨペプチドなどの前立腺特異的標的領域をプロアエロリジンに挿入することで回復させることができる。機能的欠失のそのような回復を、本書では「機能的置換」と呼ぶ。別の例では、天然のＰＡフューリン切断部位の機能的欠失は、野生型ＰＡ分子と比較した場合、ＰＡがフューリンによって切断され活性化される能力の減退につながる。
【００４１】
本書では置き換えて使用されてもよい用語「療法」と「治療」は、対象の状態を改善する目的で行われる診療を意味する。改善は主観的または客観的であってもよく、治療されている病気または疾患に関連する症状を寛解させること、治療されている病気または疾患の発症を予防すること、または治療されている病気または疾患の病態を変化させることに関連している。従って、用語、療法と治療は最も広い意義で使用され、様々な段階の病気または疾患の予防（予防法）、緩和、縮小、および治癒を含む。対象の状態の悪化の予防もまた用語に含まれる。故に療法／治療が必要な対象には、既に病気または疾患を持つ対象のみならず、病気または疾患を発症しやすい、または発症する危険がある対象、病気または疾患が予防されるべき患者が含まれる。
【００４２】
用語「寛解する」は、一時的ならびに長期の両方における、治療されている病気または疾患の一つ以上の症状、徴候、および特徴の停止、予防、減退、または改善を含む。
【００４３】
本書で用いられる用語「対象」または「患者」は、治療が必要な動物を意味する。
【００４４】
本書で用いられる用語「動物」は、ヒトおよび非ヒトの動物の両方を意味し、哺乳類、鳥類、魚類が含まれるがこれに限定されない。
【００４５】
一つ以上の追加的な治療剤または追加的な治療と「併用して」、本発明のタンパク質またはポリペプチドを投与することは、同時（併用）投与と連続投与を含むように意図されている。連続投与は、治療剤または追加的治療と本発明の化合物を、様々な順番と様々な経路によって対象に投与することを含む。
【００４６】
用語「抗原」と「抗原性物質」は、動物における免疫応答を誘発できる、全ての細胞および組織をも含む、一つの分子、複数の分子、一つの分子の一部分または複数部分、または複数分子の組み合わせを指すために、本書では置き換えて使用されてもよい。抗原性物質は、単一のエピトープまたは抗原性決定基を含んでもよいか、あるいは複数のエピトープまたは抗原決定基を含んでもよい。
【００４７】
本書で用いられる用語「免疫応答」は抗原または抗原性物質に応えて動物の免疫系の応答性が変化することを意味し、抗体の産生、細胞性免疫の誘発、補体活性化および／または免疫寛容の進展を含んでもよい。
本書で用いられる用語「抑制する」は、低下させる、減少させる、遅らせる、または妨げることを意味する。
【００４８】
「結合対」は、互いに対して親和性を持つ二つの部分（例えば化学的または生化学的）を意味する。結合対の例には、ホモ二量体、ヘテロ二量体、抗原／抗体、レクチン／アビジン、標的ポリヌクレオチド／プローブ、オリゴヌクレオチド、抗体／抗抗体、受容体／リガンド、酵素／リガンド、および同様のものなどが含まれる。「結合対の一要素」は、抗原またはリガンドなどの、対の一つの部分を意味する。
【００４９】
「単離されたポリヌクレオチド」は、その「単離されたポリヌクレオチド」という起源のおかげで、（１）自然界ではその内部に「単離されたポリヌクレオチド」が認められる細胞と結びついていない、または（２）自然界では連結されていないポリヌクレオチドに操作可能に連結されている、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、または合成起源、またはそれらの一部の組み合わせのポリヌクレオチドを意味する。
【００５０】
用語「ポリペプチド」は本書で、野生型（天然起源の）タンパク質配列、野生型タンパク質配列の断片、野生型タンパク質配列の変異体、野生型タンパク質配列の誘導体、または野生型タンパク質配列の類似体であってもよい、長さが少なくとも２０アミノ酸のアミノ酸配列を意味するための総称として使用される。従って、本書で定義される天然のタンパク質配列および天然のタンパク質配列の断片、変異体、誘導体、類似体はポリペプチド類の種類と考えられる。
【００５１】
本書で用いられる用語「単離されたポリペプチド」は、その起源よって、自然界ではそれが通常結合している、他のポリペプチドと結びついておらず、および／または通常それが発生する細胞から単離されておりおよび／または同じ由来細胞からの他のポリペプチドを含んでいないおよび／または他の種由来の細胞によって発現され、および／または天然には発生しない、ポリペプチドを意味する。
【００５２】
本書で用いられる、対象物に適用される「天然起源の」または「天然の」は、対象物を天然に認めることができるという事実を意味する。例えば、天然にある原料から単離することができる微生物（ウィルスを含む）中に存在し、実験室で人間によって意図的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然起源である。
【００５３】
「操作可能に連結した」は、並べ替えを意味し、そのように説明される成分は、それらが意図された様態において機能することを可能にする関係にある。コード配列に「操作可能に連結した」制御配列は、制御配列に対応する条件の下でコード配列の発現が達成されるそのような様式でライゲーションされる。
【００５４】
「制御配列」は、それらがライゲーションされるコード配列および非コード配列の発現を達成するために必要な、ポリヌクレオチド配列を意味する。そのような制御配列の性質は宿主生物によって変わり、原核生物では、そのような制御配列は、一般的にプロモーター、リボソーム結合部位、および転写終結部位を含み、真核生物では、そのような制御配列は、一般的にプロモーターと転写終結部位を含む。用語「制御配列」はその存在が発現に影響する成分を最低限でも含むことを意図しており、またその存在が有利な追加的な成分、例えば、リーダー配列や融合パートナー配列などを含むことができる。
【００５５】
「ポリヌクレオチド」は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれか、またはいずれかの種類のヌクレオチドの修飾型である、長さが少なくとも１０塩基のヌクレオチドの多量体型を意味する。用語はＤＮＡまたはＲＮＡの一本鎖および二本鎖の形状を含む。
【００５６】
「ポリペプチド断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失を持つが、残存するアミノ酸配列が、例えば完全長のｃＤＮＡ配列などから排除された天然起源の配列中の対応する位置と通常同一であるポリペプチドを意味する。断片は一般的に少なくとも５、６、８ 、または１０アミノ酸長を持つ。一つの実施形態では、断片は少なくとも１４アミノ酸長である。別の実施形態では、断片は少なくとも２０アミノ酸長である。さらに別の実施形態では、断片は少なくとも５０アミノ酸長である。さらにまた別の実施形態では、断片は少なくとも７０アミノ酸長である。
【００５７】
用語「標識」または「標識された」は、放射性標識されたアミノ酸の結合、または標識化アビジン（例えば、光学的方法または比色法によって検出できる蛍光マーカーまたは酵素活性を含むストレプトアビジン）によって検出できる、ビオチン化部分のポリペプチドへの付着などによる、検出可能なマーカーの結合を意味する。ポリペプチドや糖タンパク質を標識する様々な方法が当分野では知られており、使用されてもよい。ポリペプチドに対する標識の例には、ラジオアイソトープ（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、３５Ｓ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）、蛍光標識（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、酵素標識 （またはレポーター遺伝子）（例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、βガラクトシダーゼ、βラクタマーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）、化学発光法、ビオチニル基、二次レポーターによって認識される既定ポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシン・ジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）が含まれるがこれに限定されない。一部の実施形態では、立体障害の可能性を減らすために、様々な長さのスペーサーアームによって標識が結合される。
【００５８】
天然起源のアミノ酸は、ペプチド技術において一般的に受け入れられており、生化学命名法において国際純正応用化学連合−国際生化学連合によって推奨される、下記に示す伝統的な３文字または１文字の略号によって完全に識別される。
【００５９】
（表１）アミノ酸コード
2008546650.tif 000002
【００６０】
本書で提示するペプチド配列は、一般的に受け入れられている慣例に従って、Ｎ末端のアミノ酸が左側、Ｃ末端のアミノ酸が右側に記載する。慣例により、Ｌ−アミノ酸は大文字で、Ｄ−アミノ酸は小文字で表す。
【００６１】
ポア形成修飾タンパク質（ＭＰＰ）
本発明のポア形成修飾タンパク質（ＭＰＰ）は、天然起源のポア形成タンパク質（ｎＰＰ）から導かれ、他の正常組織由来の細胞と比較して、それらが正常前立腺細胞を選択的に殺せるように、一つ以上の前立腺特異的修飾を含むように修飾された。他の正常組織由来の細胞と比較して、正常前立腺細胞を選択的に殺すことは、ＭＰＰが正常前立腺細胞を、例えば肺、脾臓、または血液細胞などの他の種類の正常細胞よりも効果的に殺せることを意味する。適切なＭＰＰには、Ｕｎｉｔｅｄ Ｓｔａｔｅｓ Ｐａｔｅｎｔ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ Ｎｏ．２００４０２３５０９５に記載されるものが含まれる。
【００６２】
１. 天然起源のポア形成タンパク質（ｎＰＰ）
本発明のＭＰＰを誘導できる適切なｍＰＰには、細胞死を導く、標的細胞の膜の中にポアまたはチャネルを形成できる様々な細菌毒素が含まれる。適切な細菌毒素には、活性体として産生され、追加的なプロセシングを必要としないものだけでなく、プロトキシンとして産生され、タンパク質分解的切断によって二次的に活性化されるものが含まれる。一つの実施形態では、ｎＰＰは、標的細胞の細胞膜内にポアまたはチャネルを形成するために、活性化配列でのプロテアーゼ切断によって活性化されるプロトキシンとして合成される大きな細胞毒性タンパク質であり、故に急速な細胞溶解性の細胞死を導く。この実施形態による適切なｎＰＰは、プロテアーゼ切断を介して阻害ドメインを取り除くことによって活性化されるポア形成活動、一つ以上の結合領域を介して細胞膜上に存在する受容体に結合する能力などの特徴を持つ。多数のそのようなｎＰＰがクローン化され、組み換え型が産生された（例えば、Ｉｍａｇａｗａら、ＦＥＭＳ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１７：２８７−９２，１９９４；Ｍｅｚａら．ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．１４５：３３３−９，１９９６を参照されたい）。
【００６３】
一つの実施形態では、ＭＰＰはアエロリジンまたはアエロリジン関連ポリペプチドなどのｎＰＰに由来する。例には、炭疽菌保護抗原、コレラ菌のＶＣＣ毒素、ウェルシュ菌由来のε毒素、およびバチルス・チューリンゲンシスのδ毒素（Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｄ００１１７）などのポリペプチドとともに、アエロモナス・ハイドロフィラ、アエロモナス・トロータ、アエロモナス・サルモニシダ由来のプロアエロリジンなどのアエロリジン同族体、クロストリジウム・セプチカム由来のα毒素（Ｂａｌｌａｒｄら，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：３４０−４，  １９９５；Ｇｏｒｄｏｎら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２７２７４−８０，１９９９；Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｓ７５９５４）が含まれるが、これに限定されない。
【００６４】
上記のアエロモナス属由来のプロアエロリジン（ＰＡ）ポリペプチドの特性が明らかにれた。これらのポリペプチドはそれらの間に、８０％より大きい対の配列同一性を示す（Ｐａｒｋｅｒら、Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ８８（２００５）９１−１４２）。これらのＰＡポリペプチドのそれぞれは、約４７０のアミノ酸残基を持つ約５２ｋＤａのプロトキシンである。アエロモナス・ハイドロフィラからの野生型ＰＡのｃＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１（図７）に示し、この野生型ＰＡの対応するアミノ酸配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２（図８）に示す。多くの天然起源のｎＰＰのヌクレオチドとタンパク質配列が当分野で知られている。限定されない例を以下の表に記載する。
【００６５】
（表２）ｎＰＰと対応するＧｅｎＢａｎｋ（商標）  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｕｍｂｅｒの例
2008546650.tif 000003
１Ｈｕｓｓｌｅｉｎら，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２（４），  ５０７−５１７（１９８８）
２Ｈｉｒｏｎｏら，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．１３（６），  ４３３−４４６（１９９２）
３Ｋａｈｎら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６４（７），２４７３−２４７８（１９９８）
４Ｈｉｒｏｎｏら，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．１５（４），２６９−２８２（１９９３）
【００６６】
アエロモナス・ハイドロフィラＰＡタンパク質は、ポリペプチドのスモールローブ（small lobe）として知られ、本書でスモールローブ結合領域（ＳＢＤ）と呼ばれるものの中に結合領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の約１〜８３のアミノ酸）を含み、またＰＡを活性化するための活性化配列においてプロテアーゼ切断によって除去される、Ｃ末端抑制ペプチド（ＣＩＰ）領域（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の約４２７〜４７０のアミノ酸）を含む。ＣＩＰ領域を除去するための活性化配列における切断を、フューリンやトリプシンを含む、多くの遍在するプロテアーゼによって行うことができる。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の約８４〜４２６からのアミノ酸残基がＰＡポリペプチドのラージローブとして知られており、本書でラージローブ結合領域（ＬＢＤ）と呼ばれる、毒素領域や第二の結合領域を含む、その他の機能領域を含む。野生型アエロモナス・ハイドロフィラＰＡのｃＤＮＡ配列をＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示す。
【００６７】
著しい配列同一性やその他の類似性に基づいて、クロストリジウム・セプチカム由来のα毒素は、プロアエロリジンの同族体と考えられる（Ｐａｒｋｅｒら、ｓｕｐｒａ）。α毒素は、Ｃ末端抑制ペプチド（ＣＩＰ）領域を除去するための活性化配列におけるプロテアーゼ切断によって活性化される、４６，４５０Ｄａのプロトキシン（約４４３アミノ酸）として分泌され、それはまたグリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）−アンカー型タンパク質に結合する。しかし、α毒素はＰＡのスモールローブに対応する領域を持たない。このポリペプチドの活性化は、フューリン切断部位におけるプロテアーゼ切断によって起こる（Ｇｏｒｄｏｎら、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．  ６５：４１３０−４、１９９７）。クロストリジウム・セプチカムのα毒素の核酸配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ?  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｓ７５９５４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３、図４０）に提示され、クロストリジウム・セプチカムα毒素のタンパク質配列の例はＧｅｎＢａｎｋ?  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＡＢ３２８９２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４、図４１）に提示されている。配列の相同性に基づくと、ＧＰＩ−アンカー型タンパク質に結合するような、同様の構造と同様の能力をα毒素が持つと考えられる。
【００６８】
バチルス・チューリンゲンシスδ毒素の活性化配列は、活性化内毒素を産生するような特定の昆虫の中腸内にあるプロテアーゼによって切断される（Ｍｉｒａｎｄａら，Ｉｎｓｅｃｔ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３１：１１５５−６３, ２００１）。この内毒素の構造は解明され、チャネル形成領域、結合領域、および安定化領域の三つの領域からなることが示された。
【００６９】
一つの実施形態では、本発明によるＭＰＰはプロアエロリジンポリペプチドに由来する。さらなる実施形態では、ＭＰＰはアエロモナス・ハイドロフィラに由来するプロアエロリジンポリペプチドに由来する。本発明の別の実施形態では、ＭＰＰ はα毒素ポリペプチドに由来する。
【００７０】
別の実施形態では、ＭＰＰは、活性化にプロテアーゼ切断を必要とせず、故に活性化配列を持たないｎＰＰに由来する。これらのｎＰＰを、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位をｎＰＰに挿入するために修飾し、前立腺細胞を殺すために選択的に活性化されることができるＭＰＰをもたらすことができる。そのようなｎＰＰの例には、黄色ブドウ球菌αヘモリジンが含まれる。このｎＰＰの場合は、当分野で周知のように、ポア形成領域の中心に活性化配列を挿入できる（Ｐａｎｃｈａｌら、（１９９６）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：８５２−８５６）。
【００７１】
本発明は、ｎＰＰの生物活性のある断片に由来するＭＰＰをさらに含む。ｎＰＰの生物活性のある断片とは、ポアを形成でき、細胞を殺せるものである。適切な断片には、ＣＩＰ領域の除去によって標的細胞内にポアを形成するために活性化されることができるものが含まれる。例えば、ＰＡの場合、適切な断片はＣＩＰ領域および活性化配列とともにタンパク質の結合領域を含むものである。故に、本発明の一つの実施形態では、ＭＰＰは結合領域、ＣＩＰ領域、 活性化配列を含むプロアエロリジンの断片に由来する。別の実施形態では、ＭＰＰは、結合領域、活性化配列を含むが、ＣＩＰ領域の一部分のみを含むプロアエロリジンの断片に由来する。
【００７２】
２．前立腺特異的修飾
本発明によると、選択されたｎＰＰは、一つ以上の前立腺特異的修飾を含むことによってＭＰＰを形成するために修飾される。本発明によって意図される前立腺特異的修飾には、前立腺特異的活性化配列および／または一つ以上の結合領域の機能的欠失（機能的置換を含む）、および／または前立腺特異的標的領域の付加が含まれる。
【００７３】
一つの実施形態では、本発明によるＭＰＰは前立腺細胞においてＭＰＰを選択的に活性化できるようにする、前立腺特異的活性化配列を含む。前立腺特異的活性化配列は、ｎＰＰの天然起源の活性化配列の修飾によって作られてもよく、または天然起源の活性化配列を持たないｎＰＰへの前立腺特異的活性化配列の付加によって作られてもよい。別の実施形態では、ＭＰＰは前立腺特異的活性化配列と一つ以上の前立腺特異的標的領域を含む。別の実施形態では、ＭＰＰは前立腺特異的活性化配列とＳＢＤへの修飾を含む。別の実施形態では、ＭＰＰは前立腺特異的活性化配列とＬＢＤへの修飾を含む。
【００７４】
一つの実施形態では、本発明によるＭＰＰは、前立腺細胞においてＭＰＰを選択的に活性化できるようにする、一つ以上の前立腺特異的標的領域を含む。別の実施形態では、ＭＰＰは一つ以上の前立腺特異的標的領域とＳＢＤへの修飾を含む。別の実施形態では、ＭＰＰは前立腺特異的標的領域とＬＢＤへの修飾を含む。
【００７５】
さらに別の実施形態では、ＭＰＰは前立腺特異的活性化配列、一つ以上の前立腺特異的標的領域、およびＬＢＤへの修飾を含む。別の実施形態では、ＭＰＰは前立腺特異的活性化配列、一つ以上の前立腺特異的標的領域、およびＳＢＤへの修飾を含む。
【００７６】
一つの実施形態では、ＭＰＰは前立腺特異的活性化配列と一つ以上の天然の結合領域への修飾を含む。別の実施形態では、ＭＰＰは前立腺特異的標的領域と天然の結合領域への一つ以上の修飾を含む。さらに別の実施形態では、ＭＰＰは前立腺特異的活性化配列、前立腺特異的標的領域、天然の結合領域への一つ以上の修飾を含む。
【００７７】
プロアエロリジンに対して加えることができる前立腺特異的修飾の組み合わせの代表的で限定されない例を図４、５、６に示す。
【００７８】
活性化配列の修飾
上述のとおり、前立腺特異的活性化配列を提供するために、天然起源の活性化配列の修飾によって、前立腺特異的活性化配列を組み込むようにｎＰＰを修飾でき、または前立腺特異的活性化配列を天然起源の活性化配列を持たないｎＰＰへ付加できる。本発明による前立腺特異的活性化配列は、一つ以上の前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を組み込むアミノ酸の配列である。前立腺特異的プロテアーゼ切断部位は、前立腺特異的プロテアーゼによって認識され、選択的かつ効率的に加水分解（切断）されるアミノ酸の配列である。一つの実施形態では、前立腺特異的プロテアーゼは、他の細胞種に比べて前立腺細胞に高濃度に発現されているプロテアーゼである。前立腺特異的プロテアーゼの例には、ＰＳＡ（前立腺特異抗原）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、およびＨＫ２（ヒト腺性カリクレイン２）切断配列が含まれるが、これに限定されない。これらの前立腺特異的プロテアーゼによって認識される切断部位の多くの例が当分野で知られており、さらに下記で説明する。
【００７９】
前立腺特異的プロテアーゼ活性化配列をもたらすための、天然起源の活性化配列への修飾は、当分野で周知のように達成されてもよい。天然起源の活性化配列の修飾は天然の活性化配列の機能的欠失をもたらす。それを不活性化させる天然起源の活性化配列に対して加えられる、変異、部分欠失または完全欠失、挿入、またはその他の変化によって、機能的欠失を達成することができる。一つの実施形態では、ｎＰＰの天然起源の活性化配列は前立腺特異的活性化配列の挿入によって機能的に欠失する。別の実施形態では、天然起源の活性化配列の機能的欠失は、前立腺特異的活性化配列を作り出す天然の活性化配列の一つ以上のアミノ酸残基中の変異を通じて達成される。代替的な実施形態では、活性化配列の天然のプロテアーゼ切断部位を前立腺特異的プロテアーゼ切断部位で置換することによって、ｎＰＰの天然起源の活性化配列は機能的に欠失する。
【００８０】
一つの実施形態では、一つ以上の前立腺特異的プロテアーゼ切断部位は、ＭＰＰの天然のプロテアーゼ切断部位を機能的に置換する。例えば、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位は、ＰＡの天然のフューリン切断部位を機能的に置換できる（図４Ｂ参照）。この置換は、酵素的に活性な前立腺特異的プロテアーゼ、例えばＰＳＡ、ＰＳＭＡ、またはＨＫ２の存在下で細胞溶解性に活性化するＭＰＰをもたらす。適切なＰＳＡ、ＰＳＭＡ、またはＨＫ２切断部位は当分野で知られており、下記に記載する。
【００８１】
本発明の別の実施形態では、ｎＰＰの天然のプロテアーゼ切断部位を欠失させることにより、および前立腺特異的活性化配列を挿入することにより本発明によるＭＰＰを作り出せる。例えば、ＰＡのフューリン切断部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．２の４２７〜４３２のアミノ酸）を欠失させることができ、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位、例えばＰＳＡ切断部位が挿入される（図４Ｂ参照）。
【００８２】
さらなる実施形態では、ｎＰＰの天然のプロテアーゼ切断部位は、それがもはや機能的でないように変異しており、前立腺特異的活性化配列は、変異プロテアーゼ切断部位内に挿入されるか、あるいは天然のプロテアーゼ切断部位のＮ末端またはＣ末端に付加される。例えば、ＰＡのフューリン切断部位に変異を導入でき、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位、例えばＰＳＡ切断部位が、変異フューリン部位のＮ末端またはＣ末端内に挿入されるか、あるいは付加される（図４Ｃ参照）。
【００８３】
さらに別の実施形態では、前立腺特異的活性化配列は天然起源の活性化配列を持たないｎＰＰへ付加される。例えば、細胞を殺すために活性化されるためにプロテアーゼ切断を必要としない、黄色ブドウ球菌α−ヘモリジンは、一つ以上の前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を含むように操作されてもよく、故にそれを前立腺細胞を殺すために選択的に活性化されることができるようにする。
【００８４】
前立腺特異的切断部位
上述のとおり、様々な前立腺特異的プロテアーゼと、それが認識するプロテアーゼ切断部位が当分野で知られている。例にはＰＳＡ、ＰＳＭＡ 、ＨＫ２が含まれるがこれに限定されない。
【００８５】
一つの実施形態では、ＭＰＰは、ＰＳＡ特異的切断部位を含む、前立腺特異的活性化配列を含むように修飾される。ＰＳＡ特異的切断部位は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）によって認識され、選択的かつ効率的に加水分解（切断）されるアミノ酸の配列である。ＰＳＡは、特定のペプチド配列を認識し加水分解する能力を持つセリンプロテアーゼである。これは、酵素的に活性な形態で前立腺細胞によって分泌され、血液の循環に入った時点で不活性化する。血液と前立腺以外の正常組織のどちらも酵素的に活性なＰＳＡを持たないため、前立腺においてＭＰＰを活性化するためにＰＳＡのタンパク質分解活性を使用できる。様々なＰＳＡ特異的切断部位が当分野で知られている。例には、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、８、１１、１４〜２１に示されるもの、ならびにＵ．Ｓ．ＰａｔＮｏ．５，８６６，６７９、５，９４８，７５０、５，９９８，３６２、６，２６５，５４０、６，３６８，５９８、６，３９１,３０５に開示されるものが含まれるが、これに限定されない。一つの実施形態では、ＭＰＰは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されるＰＳＡ切断部位を含む活性化配列を持つ。
【００８６】
ヒト精子タンパク質、セミノゲリンＩおよびＩＩのＰＳＡ切断地図、およびセルロース膜ベースアッセイ（表３およびＤｅｎｍｅａｄｅら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５７：４９２４−３０、１９９７参照）に基づいて、さらなるＰＳＡ特異的切断部位が知られており、本発明による修飾ＭＰＰを作り出すために使用できる。当分野で周知のように、例えば、プロアエロリジンの野生型フューリンプロテアーゼ活性化部位を置換できる、表３に示すようなＰＳＡ切断部位のうち一つを含むように、本発明によるＭＰＰを修飾できる（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の４２７〜４３２のアミノ酸）。
【００８７】
一つの実施形態では、ＭＰＰは、ＰＳＡ切断部位を含む活性化配列を含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３、４、６、７、９、１０、１２、１３、２４のうちの一つのアミノ酸配列を持つ。
【００８８】
（表３）ＰＳＡ基質（ＰＳＡ切断部位）とＰＳＡ加水分解の反応速度＊
2008546650.tif 000004
＊ペプチドを蛍光標識した（アミノメチルクマリン）。５０ｍＭトリス、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．８でアッセイを行った。
【００８９】
別の実施形態では、ＭＰＰはＰＳＭＡ特異的切断部位を含む前立腺特異的活性化配列を含む。適切なＰＳＭＡ特異的切断部位の例が当分野で知られており、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ０２／４３７７３に認められる。一般的に述べると、ＰＳＭＡ切断部位は、少なくともジペプチドＸ１Ｘ２を含む。このジペプチドは、Ｘ１の位置にアミノ酸ＧｌｕまたはＡｓｐを含む。Ｘ２はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＡｓｎであってもよい。前述の通り定義されるＸ１とＸ２を持ち、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＡｓｎとしてＸ３を持つ、トリペプチドＸ１Ｘ２Ｘ３もまた適切である。前述の通り定義されるＸ１〜３を持ち、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＡｓｎとしてＸ４を持つ、テトラペプチドＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４もまた適切である。前述の通り定義されるＸ１〜４を持ち、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＡｓｎをＸ５として持つ、ペンタペプチドＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５もまた適切である。前述の通り定義されるＸ１〜５を持ち、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＡｓｎをＸ６として持つ、ヘキサペプチドＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６もまた適切である。さらに長い配列のペプチドを同様の方式で構成できる。一般的には、ペプチドは、ｎが２〜３０、２〜２０、２〜１５、または２〜６であり、Ｘ１はＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、またはＡｓｎである場合の、Ｘ１．．．Ｘｎの配列である。一つの実施形態では、Ｘ１はＧｌｕまたはＡｓｐで、Ｘ２〜ＸｎはＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、およびＡｓｎから独立して選択される。他の可能性のあるペプチド配列は、Ｘ２〜Ｘｎ−１がＧｌｕとＡｓｐから独立して選択され、ＸｎがＧｌｕ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、およびＡｓｎから独立して選択されることを除くと上述のとおりである。ＰＳＭＡ切断部位の例は、Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ、Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ、Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｎである。
【００９０】
追加的な実施形態では、ＭＰＰは、ＨＫ２特異的切断部位を含む前立腺特異的活性化配列を含む。ＨＫ２特異的切断部位の例はまた当分野で知られており、例えばＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．ＷＯ０１／０９１６５に記載される。ＨＫ２によって認識される切断部位に少なくとも一つのアミノ酸配列Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１が隣接する。このアミノ酸配列はアミノ酸であるアルギニン、ヒスチジン、またはリジンをＸ１の位置に持つ。Ｘ２はアルギニン、フェニルアラニン、リジン、またはヒスチジンであってよい。Ｘ３はリジン、セリン、アラニン、ヒスチジン、またはグルタミンであってよい。Ｘ４は０〜２０のさらなるアミノ酸から選ばれてもよく、少なくとも二つのさらなるアミノ酸であってよい。一つの実施形態では、ＨＫ２切断部位は、認識されるセミノゲリン切断部位のＮ末端に対して４番目から２４番目のアミノ酸である、野生型のセミノゲリンＩまたはセミノゲリンＩＩ配列中の２０アミノ酸と実質的に同一であるＸ４の配列を含む。このアミノ酸配列は、アミノ酸配列Ｘ４Ｘ３Ｘ２Ｘ１Ｘ−１を作り出すために、Ｘ１のカルボキシ末端に連結される、Ｘ−１をさらに含むことができる。Ｘ−１は最大さらなる１０アミノ酸であり、様々なアミノ酸を含むことができる。Ｘ１は、Ｘ１のカルボキシ末端に連結されるロイシン、アラニン、またはセリンを持ってよい。Ｘ−１はＬアミノ酸またはＤアミノ酸を含んでよい。ＨＫ２切断部位はＸ１のカルボキシ末端側に位置する。
【００９１】
ＨＫ２切断部位の例を表４に示す（記号］［がＨＫ２切断部位を意味することに留意されたい）。
【００９２】
（表４）ＨＫ２切断部位の例
2008546650.tif 000005
【００９３】
前立腺特異的標的領域の付加
本発明の一つの実施形態では、前立腺細胞を選択的に標的にできるように、ＭＰＰは一つ以上の前立腺特異的標的領域を含む。前立腺特異的標的領域はＭＰＰを前立腺細胞に導くことができ、ここでＭＰＰは活性化され、続いて前立腺細胞を殺すことができる。標的領域はＭＰＰのＮ末端またはＣ末端、または両方に位置できる。代替的には、標的領域は、ＭＰＰのポア形成活動を妨げない限り、ＭＰＰの別の領域に位置できる。
【００９４】
適切な前立腺特異的標的領域の例には、他の細胞種よりも前立腺細胞に対して高い特異性を持つ、ペプチドリガンド、毒素、または抗体などの分子が含まれるが、これに限定されない。一つの実施形態では、前立腺組織特異的結合領域は、他の細胞種よりも前立腺組織または細胞に低いＫＤ、例えば少なくとも、１０分の１のＫＤ、少なくとも２０分の１、５０分の１、７５分の１、１００分の１、またはさらに２００分の１などのＫＤを持つ（すなわち、他の正常組織に比べて、前立腺組織に選択的に結合する）。ＭＰＰが前立腺を標的とするのに、そのような分子を使用できる。例には、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＨＫ２、プロスタシン、およびヘプシンなどの、相対的に前立腺特異的である、タンパク質を認識する抗体や、天然および合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）などの、前立腺特異的受容体を持つリガンドや、エンドセリン（同種のエンドセリン受容体への結合）が含まれるが、これに限定されない。
【００９５】
本発明の一つの実施形態では、前立腺特異的標的領域の付加はｎＰＰの天然の結合領域の機能的欠失をもたらす。別の実施形態では、プロアエロリジンの天然の非特異的ＧＰＩアンカー型タンパク質結合領域を機能的に欠失し、前立腺特異的標的領域と置換される。機能的に欠失した天然の結合領域を持つプロアエロリジンに由来するＭＰＰの特定の例を、図４Ｄと５Ｂに表す。天然のプロアエロリジン結合領域を機能的に置換する前立腺特異的標的領域を含む、プロアエロリジンに由来するＭＰＰの例を図４Ｅ、５Ａ、５Ｃ、および５Ｄと６Ａ〜６Ｄに示す。
【００９６】
一つ以上の前立腺組織特異的結合領域をＭＰＰの一つ以上のアミノ酸に結合させることができるが、理想的には、細胞膜内にポアを形成する能力を著しく妨げないこと、または、適用できる場合はＰＳＡなどの前立腺特異的プロテアーゼによって活性化されるＭＰＰの能力を妨げてはいけない。タンパク質またはペプチドをＭＰＰに結合させる方法は当分野で知られており、前立腺組織特異的結合領域のＭＰＰへの結合を支援するために、例えば、タンパク質のＮ末端のアミノ酸を、前立腺組織特異的結合領域と結合する前に、システインまたはその他のアミノ酸に修飾されるように変換するステップが含まれる。
【００９７】
一つの実施形態では、前立腺組織特異的結合領域は、プロアエロリジンに由来するＭＰＰのＮ末端および／またはＣ末端に連結しているか挿入されている（図４Ｅおよび５Ｃを参照）。ある実施例では、前立腺組織特異的結合領域のＮ末端への接着または結合がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または４の８４番のアミノ酸への結合をもたらすように、（図５Ｃおよび６Ｃ参照）、プロアエロリジンの天然の結合領域は欠損される（すなわちＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または４の１〜８３番のアミノ酸）。その他の実施例では、前立腺組織特異的結合領域のＮ末端への接着または結合がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または４の１番のアミノ酸（または天然のプロアエロリジン結合領域の機能的欠損後のＮ末端であるアミノ酸どちらでも）への結合をもたらすように、（図４Ｅおよび５Ｄ参照）、より小さな欠失または点変異がプロアエロリジンの天然の結合領域に導入される。
【００９８】
前立腺特異的標的領域としての抗体
一つの実施形態では、前立腺特異的標的領域は、前立腺細胞に関連する抗原に特異的に結合する抗体または抗体断片であり、故に前立腺細胞へＭＰＰを標的とする。そのような前立腺特異的標的領域によって特異的に結合されてもよい、前立腺細胞に関連する抗原には、その発現が前立腺細胞で上昇している、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、およびＬＨＲＨ受容体が含まれる。当分野でよく知られている遺伝子融合法を用いて、抗体をＭＰＰのＮ末端またはＣ末端に結合させることができる（例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ｐａｓｔａｎ，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１：１０１５〜２２，１９９５を参照）。代替的には、共有結合架橋によって抗体をＭＰＰに結合させることができる（例えば、Ｗｏｏら、Ａｒｃｈ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．２２（５）：４５９〜６３，１９９９およびＤｅｂｉｎｓｋｉおよびＰａｓｔａｎ、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．  Ｒｅｓ．ｌ（９）：１０１５〜２２，１９９５を参照）。架橋は、例えばホモ二官能性リジン反応性架橋剤を用いることによって、非特異的であってもよく、あるいは、例えば抗体上のアミノ基やＭＰＰ中に位置するシステイン残基と反応する架橋剤を用いることにより、特異的であってもよい。一つの実施形態では、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸１９番のシステイン、７５番のシステイン、１５９番のシステイン、および／またはｌ６４番のシステインなどのプロアエロリジンアミノ酸を、プロアエロリジン修飾分子に抗体を架橋するために使用できる。例えば、抗体はｎＰＰの天然の結合領域を修飾するために置換でき、あるいは抗体を既に天然の結合領域に変異を持つＭＰＰに付加できる。そのようなＭＰＰはまた、特異性を高めるために前立腺特異的活性化配列を含むことができる。一つの実施形態では、抗体は、ＰＡの毒素領域に融合されたＰＳＭＡに対する一本鎖の抗体である。
【００９９】
適切な抗体には、完全型抗体に加えて、抗体断片、例えば、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、およびＣＨｌ領域から成るＦａｂ断片、（ｉｉ）ＶＨとＣＨｌ領域から成るＦｄ断片、（ｉｉｉ）抗体の一つの腕のＶＬとＶＨ領域から成るＦｖ断片、（ｉｖ）ＶＨ領域から成るｄＡｂ断片（Ｗａｒｄら、Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−６，１９８９）、（ｖ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、および（ｖｉ）ジスルフィド架橋によってヒンジ部で連結された二つのＦａｂ断片を含む二価の断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片などが含まれる。適切な抗体には一本鎖のＦｖ抗体が含まれ、これは合成リンカーを介して連結されているＦｖ断片の二つの領域をもたらす組み換え法によって調製され（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２４２：４２３−６，１９８８、およびＨｕｓｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８５：５８７９−８３，１９８８）、また、ラクダ化抗体（例えばＴａｎｈａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２４７７４−８０，２００１参照）が含まれる。
【０１００】
別の実施形態では、抗体断片はそれらの標的抗原、例えばＦ（ａｂ'）２断片などの二価の断片を架橋することができる。代替的には、自身をその標的抗原に架橋しない抗体断片（例えばＦａｂ断片）を、抗体断片を架橋するように機能しする二次抗体と同時に使用でき、それにより標的抗原を架橋することができる。従来の技法を用いて抗体を断片化でき、この断片は、抗体全体について説明したものと同様の、当分野で既知の手法で、その有用性についてスクリーニングができる。抗体はさらにナノボディや標的抗原に特異的に結合する二重特異性分子およびキメラ分子を含むように意図される。
【０１０１】
抗体に関して使用される場合の「特異的に結合する」は、個々の抗体が特定の抗原と特異的に免疫反応する能力を意味する。結合は、抗体分子と抗原の抗原決定基の間の無作為でない結合反応である。所望の結合特異性は一般的に、特に二つの抗原が固有のエピトープを持つ場合に、抗体が特異的抗原や関連のない抗原を区別して結び付け、従って二つの異なる抗原を識別する能力の基準点から決定される。特定のエピトープに特異的に結合する抗体は「特異的な抗体」と呼ばれる。
【０１０２】
前立腺特異的標的領域としての小ペプチドリガンド
一つの実施形態では、前立腺特異的標的領域は、前立腺細胞の膜上に発現する、それと同種の前立腺特異的受容体に結合する小ペプチドリガンドである。例には、ＬＨＲＨ受容体と高い親和性で結合する、天然および合成黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニストペプチド（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＣＡＡ２５５２６およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：２２および２３を参照）や、ＰＳＭＡに選択的に結合できるペプチドが含まれるが、これに限定されない。ＬＨＲＨ受容体は、前立腺細胞と、その他のごく少数の細胞によって提示される。この差次的発現は結合特異性を提供する。
【０１０３】
小ペプチドリガンドは、ＭＰＰへのそれらの結合を促進するために当分野で周知のように修飾されてもよい。例えば、６番目の位置のＧｌｙ（Ｇｌｙ６）などのＬＨＲＨの特定の残基を、受容体結合親和性を低下させることなしに置換できる（Ｊａｎａｋｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：９７２−６，１９９２；Ｎｅｃｈｕｓｈｔａｎら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２：１１５９７−６０３，１９９７）。従って、精製ＬＨＲＨ  Ｄ−Ｌｙｓ６（このリジンのεアミンで）に共有結合するＭＰＰ（その内部で天然の結合領域が機能的に欠失している）を産生できる。
【０１０４】
ＬＨＲＨ  Ｄ−Ｌｙｓ６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を、前立腺特異的標的領域を持つＭＰＰを提供するためにｎＰＰ内の様々な位置で結合できる。上述のとおり、小ペプチドリガンドの結合はポアを形成するために毒素が膜内に進入する能力を著しく妨げない。例えば、Ｄ−Ｌｙｓ６類似体のεアミンを、当分野で知られている方法、例えばジカルボン酸リンカーを用いてＭＰＰのアミノ末端へ結合できる。活性化配列の切断によるＭＰＰの活性化は、毒素がＬＨＲＨ受容体に結合されたままで、Ｃ末端抑制部位の遊離をもたらす。
【０１０５】
代替的に、または加えて、小ペプチドリガンドをＭＰＰのＣ末端に直接結合できる。例えば、ＭＰＰのＣ末端へシステインを付加し、次にこのシステインをＬＨＲＨのＤ−Ｌｙｓ６類似体のεアミンへ架橋することにより、ＬＨＲＨのＤ−Ｌｙｓ６類似体のεアミンをＭＰＰのＣ末端のカルボキシに直接結合できる。この結合は、その内部でＬＨＲＨペプチドが Ｃ末端抑制領域に結合しているＭＰＰを産生する。活性化配列の切断によるＭＰＰの活性化はＭＰＰを遊離させ、抑制断片をＬＨＲＨ受容体に結合したままにする。さらに、その内部で修飾ＬＨＲＨペプチドがＭＰＰのＮ末端とＣ末端の両方と融合している、組み換え融合タンパク質を産生できる。
【０１０６】
小ペプチドリガンドが、ジスルフィド架橋を介してＭＰＰに結合されてもよいようにも意図されている。例えば、システイン残基はＬＨＲＨペプチドの６番目の位置と、ジスルフィド架橋を介してＭＰＰへ結合されるペプチドへ導入される。ペプチドが一緒にジスルフィド架橋を形成するシステインは、天然のｎＰＰ配列内に存在できるか、またはシステイン残基を含むためにｎＰＰを変異させることができる。一つの実施形態では、ＰＡに由来するＭＰＰは、導入されたシステイン残基を、例えばＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の２１５番および／または３００番のアミノ酸に持つことができ、ここでアミノ酸２１５番および／または３００番はシステインへと変異されている。
【０１０７】
別の実施形態では、その内部でＬＨＲＨペプチドがＭＰＰのアミノ末端と融合する、組み換えタンパク質が産生される。
【０１０８】
代替的に、または加えて、ＭＰＰは一つ以上の前立腺特異的標的領域をＭＰＰの他のアミノ酸に付着または結合することにより産生されてもよい。例えば、プロアエロリジンに由来するＭＰＰに関しては、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のまたは４の２１５番または３００番のアミノ酸（例えば、図５Ａ、５Ｄ、６Ｂ、６Ｄ参照）などのアミノ酸が一つ以上の前立腺特異的標的領域を付着させるために使用されてもよい。ある例では、システインアミノ酸は天然のアミノ酸をその位置で置換する。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２または４に対して以下の変更を行ってもよい：２１５番目のチロシンをシステインにする、または３００番目のアラニンをシステインにする。代替的には、ｎＰＰの天然の配列中に存在するシステイン残基を利用してもよい。プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰに関しては、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１９番のシステイン、７５番のシステイン、１５９番のシステイン、および／または１６４番のシステインなどのアミノ酸がこの目的に適している。
【０１０９】
一つの実施形態では、ＭＰＰはプロアエロリジンから誘導され、ＬＨＲＨを前立腺特異的標的領域として含む、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯｓ:２４および２５から選択される配列を持つ。
【０１１０】
ＭＰＰの天然の結合領域への修飾
本発明によるＭＰＰは、当分野で周知のように一つ以上の結合領域を含むｎＰＰから誘導される。本発明の文脈において、ｎＰＰが一つの結合領域を含むとき、それは「ラージローブ結合領域」と考えられる。本発明によるＭＰＰは、当てはまるならば、一つ以上の結合領域に対する修飾を含んでもよい。例えば、アエロモナス属由来の天然のプロアエロリジンは二つの結合領域である、スモールローブ結合領域とラージローブ結合領域を含む。対照的に、クロストリジウム・セプチカム由来の天然のα毒素はラージローブ結合領域のみを含む。一つの実施形態では、結合領域の修飾には結合領域の機能的欠失が含まれる。ＭＰＰ内の機能的に欠失した結合領域は、その細胞表面の受容体に結合する能力が低下しているが、なおポア形成能力を保持しているＭＰＰをもたらす。機能的欠失は、ＭＰＰの一つ以上の結合領域を欠失または変異させることによって加えられる。一つの実施形態では、結合領域全体またはその一部分が欠失されてもよい。追加的な実施形態では、結合領域を機能的に欠失させるために、結合領域への異種配列の挿入が使用されてもよい。これらの異種配列の付加は、ＭＰＰに付加的な機能性を与えてもよい（すなわち結合領域の機能的置換）。例えば、異種配列の付加は、本書に記載するように、前立腺特異的標的領域として機能することができる領域の付加をもたらすことができる。さらに別の実施形態では、ｎＰＰの天然の結合領域のアミノ酸配列に対する点変異もまた、結合領域がその受容体に結合する能力を低下させるために行われる。これらの修飾に関する詳細を下記に記載する。
【０１１１】
結合領域が不足しているＭＰＰは、それらの細胞溶解活性を保持するが、細胞膜内の毒素の濃度を確保するために高い用量で投与される必要があるかもしれない。当分野で知られている方法を用いて結合領域に機能的欠失を持つＭＰＰを調製してもよい。これらの方法には、上記Ｓａｍｂｒｏｏｋらに記載されるような組み換えＤＮＡ技術の使用が含まれる。代替的には、結合領域の機能的欠失は、続いて化学的に一緒に結合されてもよい、ＭＰＰの断片を産生するためのタンパク質分解などの、当分野で知られている方法に従ってタンパク質自身の修飾を導くことによって達成されてもよい。
【０１１２】
本発明の一つの実施形態では、ＭＰＰは自身のスモールローブ結合領域（ＳＢＤ）の機能的欠失によって修飾される。ＳＢＤの典型的機能的欠失は、以下のようにアエロモナス・ハイドロフィラのプロアエロリジンポリペプチド内に作られてもよい。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の１〜８３番のアミノ酸に対応するＳＢＤ全体が欠失されてもよいか、またはこの領域の一部分、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の４５〜６６番のアミノ酸が欠失されてもよい。代替的には、点変異は、Ｗ４５Ａ、Ｉ４７Ｅ、Ｍ５７Ａ、Ｙ６１Ａ、Ｋ６６Ｑのように（アミノ酸番号はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０：４参照）、ならびにＭａｃｋｅｎｚｉｅら．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：２２６０４−２２６０９，１９９９に記述されるように作成できる。結合領域に一つ以上の変異を持つＭＰＰの例を表す概略図を図４Ｄに示し、ここで＊は一つ以上の変異または欠失を表す。
【０１１３】
本発明の一つの実施形態では、ｎＰＰは自身のラージローブ結合領域（ＬＢＤ）の機能的欠失によって修飾される。ＭＰＰを提供するために加えられるてもよいプロアエロリジンのＬＢＤの典型的な機能的欠失（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の８４〜４２６番前後のアミノ酸残基に含まれる）は以下の通りである。プロアエロリジンのＬＢＤ全体が欠失してもよい。代替的には、本発明の一つの実施形態では、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰは、アミノ酸残基Ｙ１６２、Ｗ３２４、Ｒ３２３、Ｒ３３６、および／またはＷ１２７に対する一つ以上の点変異をＬＢＤ内に含む。本発明の別の実施形態では、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰはＷ１２７および／またはＲ３３６の位置に一つ以上の点変異を含む。さらに別の実施形態では、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰは点変異Ｙ１６２Ａおよび／またはＷ３２４Ａを含む。さらなる実施形態では、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰは点変異Ｒ３３６Ａ、Ｒ３３６Ｃ、および／またはＷ１２７Ｔを含む。別の実施形態では、ＭＰＰは、ＧＰＩ−タンパク質リガンドと直接反応する他の残基に対する変異を含む。
【０１１４】
α毒素から誘導されるＭＰＰのＬＢＤに対する典型的な変異は下記に記載され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３に示すような天然のα毒素の配列のアミノ酸残基５３、５４、６２、８４〜１０２、２５９〜２７４、および３０９〜３１５を含む、α毒素の受容体結合領域中に少なくとも一つの置換されたアミノ酸を含む。本発明の一つの実施形態では、α毒素から誘導されるＭＰＰは以下の残基：Ｗ８５、Ｙ１２８、Ｒ２９２、Ｙ２９３、Ｒ３０５の一つ以上に対する変異を含む。
【０１１５】
ＭＰＰのさらなる修飾
本発明は、ＭＰＰが前立腺細胞を選択的に標的とする能力に影響を与えない、ＭＰＰのさらなる修飾を意図する。そのような修飾には、アミノ酸置換、挿入または欠失、抗原性を低下させるための修飾、安定性を高めるためまたはＭＰＰの薬物動態を向上させるための修飾が含まれる。一つの実施形態では、ＭＰＰに対するさらなる修飾は、少数のアミノ酸だけによってＭＰＰと異なるポリペプチドをもたらす。そのような修飾には、ＭＰＰが正常前立腺細胞を選択的に標的し、殺す能力を妨げない、欠失（例えば、１〜３つ以上のアミノ酸の）、挿入（例えば、１〜３つ以上の残基の）、または置換が含まれる。一つの実施形態では、ＭＰＰへのさらなる修飾は、ＭＰＰに対して少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、またはそれ以上の配列同一性を保持し、ＭＰＰが前立腺細胞を選択的に標的し、殺す能力を維持するポリペプチドをもたらす。
【０１１６】
それによりアミノ酸配列中の少なくとも一つの残基が除去され、その場所に異なる残基が挿入される置換によって、ＭＰＰは修飾されてもよい。一つの実施形態では、置換は同類置換である。同類置換は、一つ以上のアミノ酸（例えば２、５、または１０残基）が同様の生化学的特性を持つアミノ酸残基と置換されるものである。一般的には、同類置換は、結果として得られるポリペプチドの活性にほとんど〜まったく影響を及ぼさない。例えば、理想的には、一つ以上の同類置換を含むＭＰＰは、対応するｎＰＰの活性を保持する。タンパク質中の元のアミノ酸と置換されてもよく、同類置換と見なされるアミノ酸の例には、Ａｌａに対するＳｅｒ、Ａｒｇに対するＬｙｓ、Ａｓｎに対するＧｌｎまたはＨｉｓ、Ａｓｐに対するＧｌｕ、Ｃｙｓに対するＳｅｒ、Ｇｌｎに対するＡｓｎ、Ｇｌｕに対するＡｓｐ、Ｇｌｙに対するＰｒｏ、Ｈｉｓに対するＡｓｎまたはＧｌｎ、Ｉｌｅに対するＬｅｕまたはＶａｌ、Ｌｅｕに対するＩｌｅまたはＶａｌ、Ｌｙｓに対するＡｒｇまたはＧｌｎ、Ｍｅｔに対するＬｅｕまたはＩｌｅ、Ｐｈｅに対するＭｅｔ、ＬｅｕまたはＴｙｒ、Ｓｅｒに対するＴｈｒ、Ｔｈｒに対するＳｅｒ、Ｔｒｐに対するＴｙｒ、Ｔｙｒに対するＴｒｐまたはＰｈｅ、Ｖａｌに対するＩｌｅまたはＬｅｕが含まれる。
【０１１７】
部位特異的変異導入またはＰＣＲなどの標準的な手技を用いて、そのポリペプチドをコード化するヌクレオチド配列を操作することにより、一つ以上の同類置換を含むようにＭＰＰを修飾できる。同類置換に関するより詳しい情報は、他の場所の中では、Ｂｅｎ−Ｂａｓｓａｔら、（Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：７５１−７，１９８７）、Ｏ’Ｒｅｇａｎら、（Ｇｅｎｅ  ７７：２３７−５１，１９８９）、Ｓａｈｉｎ−Ｔｏｔｈら、（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．３：２４０−７，１９９４）、Ｈｏｃｈｕｌｉら、（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１３２１−５，１９８８）、ＷＯ  ００／６７７９６（Ｃｕｒｄら）や、遺伝学および分子生物学の標準的なテキストに見つけることができる。
【０１１８】
別の実施形態では、置換は許容置換である。許容置換は非同類アミノ酸置換であるが、さらにＭＰＰ活性を著しく変化させない。例は、プロアエロリジンポリペプチド中のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２または４の３００番目の位置でのアラニンに対するシステインの置換である。
【０１１９】
一つの実施形態では、単一残基の一つ以上のアミノ酸置換を含むようにＭＰＰが修飾される。別の実施形態では、一つのアミノ酸置換を含むようにＭＰＰが修飾される。別の実施形態では、約２〜約１０のアミノ酸置換を含むようにＭＰＰが修飾される。別の実施形態では、約３〜約５のアミノ酸置換を含むようにＭＰＰが修飾される。
【０１２０】
プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰに対するさらなる修飾の限定されない例を表５に記載する。
【０１２１】
（表５）天然のプロアエロリジンポリペプチドから誘導されるＭＰＰの典型的な単一変異
2008546650.tif 000006
【０１２２】
ペプチド模倣薬およびオルガノミメティックの実施形態もまた意図され、それによりそのようなペプチド模倣薬およびオルガノミメティックスの化学成分の三次元配列は、ポリペプチド骨格の三次元配列とポリペプチド中の構成要素のアミノ酸側鎖を模倣し、前立腺細胞を溶解する能力を持つ、ＭＰＰのそのようなペプチド模倣薬およびオルガノミメティックスをもたらす。コンピュータモデリングの応用については、  薬理作用団は、生物学的活性のための構造条件の、理想化された三次元の定義である。最新のコンピュータモデリングソフトウェアを用いて（コンピュータ支援薬剤デザインすなわちＣＡＤＤを用いて）、ペプチド模倣薬およびオルガノミメティックスを、各薬理作用団に適合するようにデザインできる。ＣＡＤＤで用いられるテクニックの説明については、Ｗａｌｔｅｒｓの、「Ｃｏｍｐｕｔｅｒ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ」（Ｋｌｅｇｅｒｍａｎ  ＆  Ｇｒｏｖｅｓ，ｅｄｓ．，１９９３）、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ：Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，Ｉｌｌ．１６５〜１７４ページ、およびＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（ｅｄ．Ｍｕｎｓｏｎ，１９９５）、１０２章を参照されたい。
【０１２３】
ＭＰＰに加えられてもよいその他の修飾には、例えばカルボキシ末端または側鎖にかかわらず、ＭＰＰのカルボン酸基に対する修飾が含まれ、ここでこれらの基は、医薬的に許容できる陽イオンの塩の形で存在するか、またはＣ１−Ｃ１６エステルを形成するようにエステル化されている、あるいは式ＮＲ１Ｒ２のアミドに変換され、そこでは、Ｒ１とＲ２がそれぞれ独立してＨまたはＣ１−Ｃ１６アルキルであるか、または５員または６員環などの複素環を形成するように組み合わせられる。アミノ末端または側鎖にかかわらず、ポリペプチドのアミノ基は、例えば塩化水素、臭化水素、酢酸、安息香酸、トルエンスルホン酸、マレイン酸、酒石酸、その他の有機塩などの医薬的に許容できる酸付加塩の形であってもよく、またはＣ１−Ｃ１６アルキルまたはジアルキルアミノに修飾されるか、あるいはさらにアミドに変換されてもよい。
【０１２４】
その他の修飾には、広く認められたテクニックを用いた、ポリペプチド側鎖のヒドロキシル基からＣ１−Ｃ１６アルコキシまたはＣ１−Ｃ１６エステルへの変換が含まれる。ポリペプチド側鎖のフェニル環およびフェノール環を一つ以上のフッ素、塩素、臭素、またはヨウ素などのハロゲン原子と、またはＣ１−Ｃ１６アルキル、Ｃ１−Ｃ１６アルコキシ、カルボン酸、およびそのエステル、またはそのようなカルボン酸のアミドと置換できる。ポリペプチド側鎖のメチレン基を同族のＣ２−Ｃ４アルキレンに伸長できる。アセトアミド基などの、広く知られている多くの保護基のうち一つによってチオールを保護できる。当業者もまた、安定性の向上をもたらす構造に対する構造制約を選択し提供するための、本書に記載されるポリペプチドに環状構造を導入する方法を理解するであろう。例えば、酸化された場合にポリペプチドがジスルフィド結合を有し、環状ペプチドを作るように、カルボキシ末端またはアミノ末端システイン残基をポリペプチドに付加できる。その他のペプチドの環化法には、チオエーテルとカルボキシ末端およびアミノ末端アミドおよびエステル形成が含まれる。
【０１２５】
本発明はまた、ＭＰＰは表面、例えばビーズなどに結合または固定化される、ＭＰＰに対するさらなる修飾を意図する。ビーズはさらに、前立腺細胞に対する標的を高めるために、前立腺特異的リガンドを含むことができる。固定化は、固体表面などの表面への結合を意味する。固体表面は、ポリスチレンまたは ポリプロピレンなどの、重合体であってもよい。固体表面はビーズの形態であってもよい。一つの実施形態では、表面は固定化ＭＰＰを含み、他の実施形態は、ＬＨＲＨペプチド、ＰＳＭＡ抗体、およびＰＳＭＡ一本鎖抗体などの、一つ以上の前立腺特異的結合リガンドをさらに含む。別の実施形態では、ひとたび前立腺細胞標的にビーズが到達すると、ＭＰＰはビーズから遊離する。ペプチドを固体表面上に固定化する方法は当分野で知られており、ＷＯ９４／２９４３６およびＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，８５８，３５８に認められる。
【０１２６】
本発明は、対象に投与された場合に分子の薬物速度論的特性を向上することを目的とする、さらなる修飾をＭＰＰが含んでもよいことをさらに意図している。免疫原性を減少させるおよび／または治療上のタンパク質の半減期を伸ばす様々な修飾が当分野で知られている。例えば、当分野で知られている標準的な方法に従って、MMPは糖鎖付加、異性化、または脱グリコシル化を受けることができる。同様に、非天然起源の共有結合修飾、例えばポリエチレングリコール部分の付加（ＰＥＧ化）または脂質化によってＭＰＰを修飾できる。一つの実施形態では、本発明のＭＰＰは、それらの薬物動態プロファイルを向上させるために、ポリエチレングリコールと結合する（ＰＥＧ化）。結合は当業者に知られているテクニックによって行われてよい（例えば、Ｄｅｃｋｅｒｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：３８２−３９０，２０００；Ｋｎｉｇｈｔら、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  １５：４０９−４１８，２００４；Ｌｅｏｎｇら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６−１１９，２００１；Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６：７６１−７７０，２００３を参照）。一つの実施形態では、変異導入法によって、抗原性エピトープを識別し変化させることができる。抗原性エピトープを識別する方法は、そのような抗原性エピトープを変異させる方法と同様に当分野で知られている（例えば、Ｓｅｔｔｅら、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ２９：２７１−２７６参照）。
【０１２７】
ＭＰＰの調製方法
当分野で周知のように、多くの標準的な方法によって本発明によるＭＰＰを調製できる。例えば、ＭＰＰをコード化している核酸を組み換えＤＮＡ技術を用いて遺伝子操作することによってＭＰＰに対する修飾を行える。代替的には、化学修飾および／または制限タンパク質分解を用いて、ＭＰＰポリペプチド自身を修飾することによって、ＭＰＰに対する修飾が行われてもよい。当技術分野で周知のように、本発明によるＭＰＰを調製するために、これらの方法の組み合わせもまた用いられてもよい。
【０１２８】
組み換え法を用いたＭＰＰの調製
当分野で周知のように、タンパク質の遺伝子操作は、タンパク質をコード化している核酸がまず単離され、クローン化されることを一般的に必要とする。本書で述べるように、様々なｎＰＰの配列がＧｅｎＢａｎｋから入手できる。これらのタンパク質をコード化している核酸配列の単離とクローニングは故に、標準的なテクニックを用いることによって達成される［例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９７と改訂版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ−Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２００１）参照］。例えば、ｍＲＮＡを標準的なテクニックによって抽出し、次にｍＲＮＡの鋳型からｃＤＮＡを合成することによって（例えばＲＴ−ＰＣＲで）、アエロモナス・ハイドロフィラなどの適切な微生物から核酸配列を直接得ることができる。代替的には、標準的な手技によって、適切なｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリーから、ｎＰＰをコード化している核酸配列を得ることができる。次に、単離されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを適切なベクターに挿入する。使用されるこのベクターが本発明にとって重大なものではないことを当業者は理解するであろう。適切なベクターの例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロ・ウィルス、レトロウィルス、またはＤＮＡウィルスが含まれるが、これに限定されない。ベクターはクローニングベクターであってもよいか、または発現ベクターであってもよい。
【０１２９】
ひとたびｎＰＰをコードする核酸配列が得られたら、結合領域または活性化配列のうちの一つ以上における変異を、当分野で広く知られているｉｎ ｖｉｔｒｏ部位特異的変異導入技術を用いて、特定の前もって選択した場所に導入できる。コード配列を作っている一つ以上の適切なヌクレオチドの欠失、挿入、置換、逆位、またはそれらの組み合わせによって変異を導入できる。これは例えば、一つ以上のヌクレオチドの不一致、挿入、または欠失を組み込むようにプライマーが設計される、ＰＣＲベースのテクニックによって達成できる。変異の存在は、例えば限定解析またはＤＮＡ塩基配列決定法などの、多くの標準的なテクニックによって確認できる。
【０１３０】
必要ならば、適切な変異または複数の変異の導入後に、ＭＰＰをコード化する核酸配列を適切な発現ベクターに挿入できる。適切な発現ベクターの例には、プラスミド、ファージミド、コスミド、バクテリオファージ、バキュロ・ウィルスおよびレトロウィルス、ならびにＤＮＡウィルスが含まれるが、これに限定されない。
【０１３１】
発現ベクターが、ＭＰＰをコード化している配列の効率的な転写に必要とされる、転写要素などの調節要素をさらに含んでもよいことを当業者は理解するであろう。ベクターに組み込むことができる調節要素の例には、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター、およびポリアデニル化信号が含まれるが、これに限定されない。従って本発明は、遺伝子操作されたＭＰＰをコード化している核酸配列に操作して連結される調節要素を含むベクターを提供する。当業者は、適切な調節要素の選択が、遺伝子操作されたＭＰＰの発現のために選ばれた宿主細胞に依存し、そのような調節要素は、細菌、真菌、ウィルス、哺乳類、または昆虫の遺伝子を含む様々な起源から誘導されてもよいことを理解するであろう。
【０１３２】
例えば、前立腺細胞中の遺伝子発現を促進するために、テストステロンやその他のアンドロゲンに応答する前立腺特異的プロモーターを使用できる。例には、プロバシンプロモーター、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）プロモーター、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）プロモーター、およびヒト腺性カリクレイン２（ＨＫ２）プロモーターが含まれるが、これに限定されない。
【０１３３】
本発明の文脈において、発現ベクターは、発現したＭＰＰの精製を促進する異種核酸配列を追加的に含んでもよい。そのような異種核酸配列の例には、金属親和性標識などの親和性標識、ヒスチジン標識、アビジン／ストレパビジンコード化配列、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）コード化配列、およびビオチンコード化配列が含まれるが、これに限定されない。当分野で知られている方法に従って、使用する前に核酸の発現に対応するアミノ酸を、発現されたＭＰＰから除去することができる。代替的には、異種核酸配列の発現に対応するアミノ酸を、前立腺細胞を標的として殺すＭＰＰの能力をそれらが妨げないのであれば、ＭＰＰ上に残してもよい。
【０１３４】
本発明の一つの実施形態では、ヒスチジン標識タンパク質としてＭＰＰは発現される。別の実施形態では、ヒスチジン標識はＭＰＰのカルボキシ末端の位置にある。
【０１３５】
当分野で知られている様々な方法のうちの一つによって、発現ベクターを適切な宿主細胞または組織に導入することができる。そのような方法は、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９７と改訂版）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ−Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（２００１）に一般的に記載されているのを認めることができ、また、例えば安定なまたは一過性トランスフェクション、リポフェクション、電気せん孔法、ならびに組み換えウィルスベクターの感染を含む。ＭＰＰの発現のための適切な宿主細胞の選択が選択されたベクターに依存することを、当業者は理解するであろう。宿主細胞の例には、細菌、酵母、昆虫、植物、および哺乳類の細胞が含まれるが、これに限定されない。
【０１３６】
さらに、挿入された配列の発現を調節する、または遺伝子産物を特定の所望の方式において修飾および加工する、宿主細胞を選択してもよい。タンパク質産物のそのような修飾（例えば糖鎖付加）およびプロセシング（例えば切断）はタンパク質の機能にとって重要かもしれない。異なった宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後のプロセシングおよび修飾に関して、特徴と特定のメカニズムを持っている。発現された異種タンパク質の正しい修飾やプロセシングを確保するために、適切な細胞株または宿主システムを選ぶことができる。そのために、一次転写産物の適切なプロセシングや、遺伝子産物の糖鎖付加やリン酸化反応などの翻訳後の修飾に対する細胞の機構を持つ、真核生物の宿主細胞を使用できる。そのような哺乳類の宿主細胞には、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、ＷＩ３８が含まれるが、これに限定されない。
【０１３７】
タンパク質をクローニングし、発現させる方法は当分野でよく知られおり、組み換えタンパク質の発現のためのテクニックとシステムの詳細な説明は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅら、Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）などに認めることができる。組み換えタンパク質を提供するために、多種多様の発現システムを使用できることを、分子生物学の分野の業者は理解するであろう。正確にどの宿主細胞が使用されるかはは本発明にとって重大なものではない。結果として、本発明は、原核生物の宿主（例えば、大腸菌、アエロモナス・サルモニシダ、または枯草菌）中、または真核生物の宿主（例えば、サッカロミセス属またはピチア属、例えば、ＣＯＳ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、またはＨｅＬａ細胞などの哺乳類の細胞、または昆虫の細胞）中でＭＰＰが作られることを意図する。
【０１３８】
当分野で知られている標準的なテクニックによって、ＭＰＰを宿主細胞から精製することができる。必要ならば、完全型のタンパク質またはそのタンパク質分解断片のいずれかを用いて、標準的なペプチド配列決定法によって、タンパク質へ遺伝子操作により導入されたアミノ酸配列における変化を決定することができる。
【０１３９】
天然起源のポア形成タンパク質へ変異を導入するための直接法の代替法として、当分野で知られているテクニックによって、ポア形成タンパク質を発現しているクローン化した遺伝子に対してランダム変異導入法を行うことができる。このようにして作られたタンパク質の変異型の二次的な発現とスクリーニングは、本発明によるＭＰＰの識別と単離を可能にするものである。
【０１４０】
本発明によるＭＰＰを、断片または融合タンパク質として調製することもできる。融合タンパク質は、正常前立腺細胞を選択的に標的として殺すＭＰＰの能力を妨げない、他のアミノ酸配列に結合しているＭＰＰを含むものである。一つの実施形態では、他のアミノ酸配列は、長さが５、６、７、８、９、１０、２０、３０、または５０アミノ酸残基を超えない。
【０１４１】
融合タンパク質を作る方法は当業者に良く知られている。例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０５７，１３３は、ヒトインターロイキン３（ｈＩＬ−３）変異体、または第二のコロニー刺激因子、サイトカイン、リンフォカイン、インターロイキン、造血成長因子、またはＩＬ−３変異体に機能的に結合している変異タンパク質から成る、融合分子を作る方法を開示する。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．６，０７２，０４１（Ｄａｖｉｓら）は、治療用タンパク質と共有結合している膜貫通型受容体に向けられる一本鎖のＦｖ分子を含む融合タンパク質の作成を開示する。
【０１４２】
前立腺特異的標的領域（例えばＬＨＲＨまたは抗体）などの他のアミノ酸配列に結合している、ＭＰＰ（またはその変異体、断片など）を含む融合タンパク質を作成するために、同様の方法を用いることができる。タンパク質の二つの部分を互いに距離をあけて配置するため、またそれらの間に可動性を提供するために、リンカー領域を使用できる。リンカー領域は一般的には、長さが１から５００アミノ酸の間のポリペプチド、例えば長さが３０アミノ酸より短いものである。通常は、二つの分子をつなぐリンカーを、（１）二つの分子がフォールドし互いに独立して機能するのを可能にするように、（２）二つのタンパク質の機能領域を妨げるような二次秩序構造を発達させる傾向をもたないように、（３）機能性タンパク質領域と反応できる最低限の疎水性または荷電特性を持つように、および／または（４）二つの領域の立体構造の分離を提供するように設計できる。通常、可動タンパク質領域にある表面アミノ酸には、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒが含まれる。ＴｈｒやＡｌａなどのその他の中性アミノ酸もまた、リンカー配列において使用できる。融合の構成を促進するために、リンカー配列に独自の制限酵素部位を提供する目的で、追加的なアミノ酸をリンカーに含めてもよい。必要に応じて他の部分も含めてよい。これらは、アビジンまたはエピトープなどの結合領域、または融合タンパク質の精製やプロセシングに有用であるポリヒスチジン標識などの標識を含むことができる。さらに、体内または細胞内での融合タンパク質の移動を便利に監視できるように、検出可能なマーカーを融合タンパク質に付着させることもできる。そのようなマーカーには、放射性核種、酵素、蛍光プローブ、および同様のものが含まれる。
【０１４３】
ＭＰＰの核酸配列と別のタンパク質（またはその変異体、断片など）の核酸配列の融合を、中間ベクターを使用することによって行うことができる。代替的には、一つの遺伝子を、他の遺伝子を含むベクターに直接導入してもよい。核酸配列を結合するためだけでなく、制限酵素部位が関心領域の内部にある、失われた配列を置換するためにもリンカーやアダプターを使用できる。一つのポリペプチド、ペプチドリンカー、ならびに他のポリペプチドをコード化している遺伝物質（ＤＮＡ）は、原核細胞または真核細胞、例えば細菌、酵母、昆虫の細胞、または哺乳類の細胞を形質転換するために使用される、適切な発現ベクターに挿入される。形質転換された生物は成長し、タンパク質は、標準的なテクニック、もしポリヒスチジン標識を用いた場合は、例えばニッケルキレート親和性クロマトグラフィーなどの検出可能なマーカーを用いて単離される。従って、結果として得られる産物は、新しいタンパク質である、融合タンパク質であり、任意でリンカーを介して第二のタンパク質に結合されたＭＰＰを持つ。融合タンパク質が発現していることを確かめるために、精製タンパク質について、例えばＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動を行い、確立された方法を用いてニトロセルロース膜フィルター上に移してもよい。タンパク質産物を、個々の要素、すなわちポリヒスチジン標識および／またはＭＰＰに対する抗体を用いて、ウエスタンブロット解析によって識別できる。
【０１４４】
もし本発明によるＭＰＰが融合遺伝子の発現によって産生される場合は、ペプチド結合はＭＰＰと前立腺特異的標的領域の間のリンカーとして機能する。例えば、抗体の一本鎖Ｆｖ断片とポア形成タンパク質毒素の組み換え融合タンパク質は、当分野で知られている方法、例えば、Ｈｕｓｔｏｎら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３：４６−８８，１９９１に従って作成できる。
【０１４５】
コード化されたタンパク質の生物学的活性に影響することなしに、多くの方法でＤＮＡを変化させることができることを当業者は理解するであろう。例えば、ＭＰＰをコード化するＤＮＡ配列に変化をもたらすために、ＰＣＲを用いることができる。ＭＰＰをコード化しているＤＮＡ配列中のそのような変化は、宿主細胞中のコドン選択を最適化するためにタンパク質を発現するために使用されるてもよいし、または発現を促進する他の配列変化を含んでもよい。
【０１４６】
ＭＰＰを調製する他の方法
前立腺特異的標的領域や上述の任意のリンカーは、共有結合または非共有結合、あるいは両方を介して本発明のＭＰＰに付加されてもよい。非共有相互作用は、ロイシン・ジッパーに関与する相互作用または抗体‐タンパク質Ｇの相互作用など（Ｄｅｒｒｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５９：７５２，１９９２）の、イオン性、疎水性、または親水性であってもよい。追加的な非共有相互作用の例には、抗原またはハプテンと抗体、抗体と抗抗体、受容体とリガンド、酵素または酵素断片と基質、基質類似体、またはリガンド、ビオチンまたはレクチンとアビジンまたはストレプトアビジン、レクチンと炭水化物、ロイシンジッパー・モチーフの対（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ．  ５，６４３，７３１参照）とともに、当分野で知られている様々なホモ二量体やヘテロ二量体などの結合対が含まれるがこれに制限されない。当分野で周知のように、ＭＰＰは結合対の一つの要素を含むように修飾されてもよく、前立腺特異的標的領域は結合対の他の要素を含むように修飾されてもよい。
【０１４７】
共有結合はジスルフィド結合の形をとってもよい。固有のシステインコドンを含むように、要素のうちの一つをコード化するＤＮＡを遺伝子操作できる。代替的には、天然起源のシステイン残基を使用してもよい。第一の要素のシステインに反応性のスルフヒドリル基を用いて、第二の要素を誘導体化できる。代替的には、スルフヒドリル基は、それ自身またはシステイン残基の一部としてのいずれかで、固相ポリペプチド技術を用いて誘導されることができる。例えば、ペプチドへのスルフヒドリル基の誘導はＨｉｓｋｅｙ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ３：１３７，１９８１）によって記述されている。
【０１４８】
スルフヒドリル基を添加する標準的なテクニックによって、タンパク質を化学的に修飾できる。例えば、リジン残基またはＮ末端アミンなどの、１級アミン上にスルフヒドリル基を導入するために、トラウト試薬（２−イミノチオラン−ＨＣｌ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉ１１）を使用できる。トラウト試薬を用いて修飾されたタンパク質またはペプチドは次に、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）またはスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ社、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、Ｉ１１）などの試薬で修飾されたタンパク質またはペプチドと反応できる。ひとたび正しいスルフヒドリル基が各要素に存在すると、二つの要素は精製され、各要素上の硫黄基は還元され、要素が混合され、室温でジスルフィド結合形成が完了まで進行するのが許される。結合反応の効率を高めるために、要素のうち一つのシステイン残基、例えばシステイン−ＭＰＰを、５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾイック）アシッド（ＤＴＮＢ）または２，２’−ジチオピリジンを用いた反応混合物への添加の前に、当分野で知られている方法を用いて活性化することができる。反応後、複合していない分子を除去するために、リン酸緩衝生理食塩水で混合物を透析する。次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィーまたは同様のものを、本発明の化合物を、大きさに基づいてその成分から分離するために実施する。
【０１４９】
Ｍａｉｔｉら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．３：１７−２２，１９８８に記載されているように、ポリマー、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を用いても要素を結合できる。
【０１５０】
カルボジイミド媒介結合（例えば、ＤＣＣ、ＥＤＣ、または活性化ＥＤＣ）などの、当分野で知られている標準的な共役化学を用いて、また架橋のためにεアミノ基をチオールに変換するための２−イミノチオランと、ｍ−マレイミドベンゾイル−ｎ−ヒドロキシスクシンイミジルエステル（ＭＢＳ）を架橋剤として用いても、前立腺特異的標的領域とｎＰＰまたはＭＰＰを結合させることができる。前立腺特異的標的領域とｎＰＰまたはＭＰＰを結合させるために、当分野で知られている様々な他の結合の方法を用いることができる。
【０１５１】
ＭＰＰの大量調製
組み換えタンパク質の生産のための大量発酵処理や、組み換えタンパク質の精製のための限外ろ過、イオン交換クロマトグラフィー、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィーなどの、当分野で知られている標準的なテクニックを用いて、例えば製造目的のためにＭＰＰの調製を大規模に行うこともできる。
【０１５２】
ＭＰＰをテストする方法
本発明によるＭＰＰはそれらのポア形成活性を保持し、前立腺細胞を選択的に殺す。前立腺細胞を選択的に殺すＭＰＰの能力を、当分野で知られている標準的なテクニックを用いてテストできる。候補となるＭＰＰをテストする一般的な方法を下記と、本書に含まれる実施例に示す。候補となるＭＰＰをテストする他の方法は、当分野で知られており、また本発明によるＭＰＰをテストするのにも適していることを、当業者は理解するであろう。
【０１５３】
ｉｎ ｖｉｔｒｏの方法
前立腺特異的活性化配列を含む本発明によるＭＰＰを、当分野で知られている方法に従って、適切な前立腺特異的プロテアーゼによって切断されるそれらの能力についてテストできる。例えば、様々な濃度の適切なプロテアーゼを用いてＭＰＰをインキュベートでき、インキュベーション産物をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で電気泳動でき、ＭＰＰの切断をゲル上でのポリペプチドのサイズを調べることによって評価できる。
【０１５４】
プロテアーゼを用いてインキュベートしたＭＰＰがポア形成活性、従ってプロテアーゼを用いたインキュベーション後に細胞を殺す能力を持つかどうかを検討するために、当分野で知られている溶血アッセイで反応産物をテストできる。適切なアッセイの例はＨｏｗａｒｄ，Ｓ．ＰおよびＢｕｃｋｌｅｙ，Ｊ．Ｔ．１９８５．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｏｌｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ  ｔｏｘｉｎ  ａｅｒｏｌｙｓｉｎ  ｂｙ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６３：３３６−３４０に記述されている。
【０１５５】
本発明によるＭＰＰを、当分野で周知のように、前立腺細胞を殺すそれらの能力に関してテストできる。例えば、前立腺細胞を殺すＭＰＰの能力を、適切な前立腺細胞株を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで分析できる。一般的には、選択された試験細胞株の細胞は、適切な濃度まで増殖させ、候補となるＭＰＰを添加する。適切なインキュベーション時間の後、（例えば、およそ４８〜７２時間）、細胞生存率を評価する。細胞生存率を測定する方法は当分野でよく知られており、レザズリン還元試験（Ｆｉｅｌｄｓ  ＆  Ｌａｎｃａｓｔｅｒ（１９９３）Ａｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｌａｂ．１１：４８−５０；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、（２０００）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６７：５４２１−５４２６、およびＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，５０１，９５９参照）、スルホローダミンアッセイ（Ｒｕｂｉｎｓｔｅｉｎら、（１９９０）Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．８２：１１３−１１８）、ニュートラルレッド色素試験（Ｋｉｔａｎｏら、（１９９１）Ｅｕｒｏ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｇ．２１：５３−５８；  Ｗｅｓｔら、（１９９２）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｄｅｒｍ．９９：９５−１００）またはトリパンブルーアッセイが含まれるが、これに限定されない。また、例えばＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）  ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ（プロメガ）などの多くの市販のキットを用いてもよい。処理した培養液中の細胞生存率と一つ以上の対照培養液、例えば未処理の培養液および／または対照化合物（一般的には既知の治療薬）を用いて前処理された培養液、またはその他の適切な対照中の細胞生存率の比較によって、細胞毒性は測定される。正常な前立腺細胞を殺すのに効果的と考えられるＭＰＰは、例えば少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％、細胞生存率を減少させることができる。
【０１５６】
例えば、ＭＰＰが正常前立腺細胞を殺す能力をそれらがその他の組織由来の細胞を殺す能力と比較することによって、前立腺特異的標的領域を含むＭＰＰを、選択的に前立腺細胞を標的とするそれらの能力について評価できる。代替的には、当分野で周知のように、前立腺特異的標的領域を含むＭＰＰが前立腺細胞を選択的に標的とできるかどうかを決定するために、フローサイトメトリーによる方法を用いてもよい。さらに別の代替法として、前立腺特異的標的領域の結合リガンドを人工脂質膜に組み込むことができ、チャネルを形成するＭＰＰの能力を当業者に周知の方法を用いて測定できる。
【０１５７】
本発明によるＭＰＰを、特異的前立腺細胞を溶解するそれらの能力についてテストするために用いることができるアッセイを、例えば実施例２および３に記載する。例えばＰＳＡ切断部位を持つＭＰＰを、それが非ＰＳＡ産生細胞を溶解する能力と比較して、それがＰＳＡ産生細胞を特異的に溶解する能力について評価できる。本発明によるＭＰＰは、ＰＳＡ産生細胞（前立腺細胞など）と接触した場合、非ＰＳＡ産生細胞を殺すのに必要とされるよりも低い濃度、例えば、少なくとも２分の１、５分の１、１０分の１、または１００分の１の濃度で細胞の溶解と死を促進する。
【０１５８】
候補となるＭＰＰをテストするのに適切な様々な前立腺細胞株が当分野で知られており、多くは市販されている（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡから）。ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験に適切な前立腺細胞株の例には、ＰＮＴ１Ａ、ＰＮＴ２、ＢＰＨ−１、ＤｕＫ５０、ＮＲＰ１５２、ＰＳ−１細胞株が含まれるが、これに限定されない。
【０１５９】
必要ならば、非前立腺細胞に対するＭＰＰの毒性もまた、初めに標準的なテクニックを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価することができる。例えば、ヒト初代線維芽細胞をｉｎ ｖｉｔｒｏでＭＰＰを用いてトランスフェクションし、次に、処理後の異なる時点において、上述アッセイなどの標準的な生死判別試験、またはトリパンブルー排除アッセイを用いてそれらの生存率についてテストできる。細胞を、それらがＤＮＡを合成する能力については、チミジン取り込みアッセイなどを用いて、また細胞周期動態における変化については、ｆｌｕｏｒｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒセルソーター（ＦＡＣＳ）と併用して標準的な細胞選別アッセイなどを用いて評価できる。
【０１６０】
当分野で周知のように、血漿または血清中の本発明によるＭＰＰの活性もまたテストできる。例えば、血清を用いてＭＰＰを適切な時間インキュベートでき、その後、例えば電気泳動や電気泳動した活性化されたＭＰＰに対応するバンドの濃度解析を用いてＭＰＰの活性化の度合いが測定される。
【０１６１】
ｉｎ  ｖｉｖｏの方法
当分野で知られている方法に従って、本発明によるＭＰＰの毒性をｉｎ ｖｉｖｏでテストできる。例えば、実施例４に記述するように、単回の静脈注射後にマウスの１００％を殺す用量を測定することによって（すなわちＬＤ１００）ＭＰＰの総合的な全身毒性をテストできる。ＭＰＰの全身投与または前立腺内投与による毒性もまた、例えばＭＰＰをイヌ、ラット、またはサルに投与することにより、ｉｎ ｖｉｖｏで評価できる。
【０１６２】
本発明によるＭＰＰが前立腺の大きさを縮小する能力、故にＢＰＨの治療への適性を示す能力を、当分野で知られている動物モデルを用いてｉｎ ｖｉｖｏでテストできる。例えば、ＭＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの活性を、イヌ、または非ヒト霊長類、例えばカニクイザル、チンパンジー、およびヒヒを用いてテストできる。例えば肛門周囲前立腺内注射によって、ＭＰＰを投与できる。例えば、磁気共鳴映像法または前立腺組織の検視および／または前立腺の重量の測定によって、投与後の前立腺の体積の変化を評価できる。
【０１６３】
上述のように、動物モデルにおいて前立腺の大きさを縮小できる、または前立腺のさらなる増殖を抑えることができるＭＰＰはＢＰＨの治療に適していると考えられる。前立腺の大きさの縮小は、前立腺の重量または体積の減少を意味し、前立腺のさらなる増殖を抑えることは、試験化合物の投与後に、動物において、前立腺の重量または体積に最小の増加がある、または増加がない状態を意味する。一つの実施形態では、本発明によって意図されるＭＰＰは、動物に投与された場合、例えば少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％、前立腺の大きさを減少させることができる。
【０１６４】
ＭＰＰ抗原性の測定と低減
治療用タンパク質は、対象に投与された場合、ある程度の抗体反応を導く可能性があり、一部のケースでは、場合によって重篤な副作用につながることがある。従って、必要ならば、ＭＰＰの抗原性を当分野で周知のように評価でき、下記に記載する。さらに、潜在的な抗原性を減少させる方法を記載する。
【０１６５】
本書に記載するＭＰＰに対する抗体反応の反応速度と規模を、例えば、免疫応答マウスなどにおいて測定でき、免疫が保たれているヒトにおいて使用できる、投与計画の開発を促進するために使用できる。Ｃ５７−ＢＬ６系統などの、免疫応答マウスにＭＰＰの静脈内投与を行う。マウスを様々な間隔で屠殺し（例えば、単回投与後、複数回投与後）、血清を得る。抗ＭＰＰ抗体の存在を検出するために、ＥＬＩＳＡベースアッセイを使用できる。
【０１６６】
本発明によるＭＰＰの抗原性を減少させるために、ＭＰＰの天然の結合領域を、例えば上述のような前立腺特異的標的領域を用いて機能的に欠失させ、置換することができる。天然の結合領域の部位が欠如している、様々な計画のＭＰＰに曝露した後に、上述した方法を用いてそのようなＭＰＰの抗原性を測定できる。ＭＰＰを用いた継続治療を可能にするために用いられても良い別の方法は、連続的に投与される、抗原性の重複のない他のｎＰＰに由来する代替的なＭＰＰを使用することである。例えば、  プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰを、クロストリジウム・セプチカムのα毒素またはバチルス・チューリンゲンシスのδ毒素に由来するＭＰＰと一緒に交互に用いることができる。これらのＭＰＰの全ては、前立腺細胞を標的とするものだが、同一の抗体によって認識されない、または中和されない。別の例は、細胞傷害性ヒトＴ細胞によって産生されるヒトパーフォリンなどの、ヒト組織由来のＭＰＰを使用することである。そのようなＭＰＰが投与されてもよく、タンパク質がヒト由来であるため、抗体反応を引き起こすことができない。
【０１６７】
医薬品組成物
本発明は、ＭＰＰと一つ以上の非毒性の医薬的に許容できる担体、希釈剤、賦形剤および／またはアジュバントを含む、医薬品組成物を提供する。必要ならば、他の有効成分が化合物中に含まれてもよい。上記のとおり、そのような化合物はＢＰＨの治療に使用される。
【０１６８】
医薬品組成物は、およそ１％〜およそ９５％の本発明のＭＰＰを含んでもよい。単回投与用に調製される組成物は、例えば、およそ２０％〜およそ９０％の本発明のＭＰＰ含んでもよい一方で、単回投与用ではない組成物は、およそ５％〜およそ２０％の本発明のＭＰＰを含んでもよい。最終製剤中のＭＰＰの濃度は、０．０１μｇ／ｍＬまで低くても良い。例えば、最終製剤中の濃度は、およそ０．０１μｇ／ｍＬ〜およそ１，０００μｇ／ｍＬの間でもよい。一つの実施形態では、最終製剤中の濃度は、およそ０．０１μｇ／ｍＬ〜およそ１００μｇ／ｍＬの間である。単位用量の形態の限定されない例には、糖衣錠、錠剤表、アンプル、バイアル、坐薬、およびカプセルが含まれる。単位用量の形態の限定されない例には、糖衣錠、錠剤、アンプル、バイアル、坐薬、およびカプセルが含まれる。
【０１６９】
組成物は溶液、懸濁液、エマルジョン、錠剤、丸薬、カプセル、徐放製剤、またはパウダーであってもよい。固体組成物（例えば、パウダー、丸薬、錠剤、またはカプセルの形態）については、従来の非毒性固形担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、乳糖、でんぷん、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウム、またはステアリン酸マグネシウムを含むことができる。組成物は、トリグリセリドなどの伝統的な結合剤や担体を用いて、坐薬として調剤されてもよい。
【０１７０】
動物への投与については、医薬品組成物は、様々な経路での投与のために調剤されてもよい。例えば、組成物は経口的、経皮的、直腸、または注射投与、または吸入またはスプレーによる投与のために調剤されてもよい。本書で用いられる用語、注射には、皮下注射、静脈、筋肉、髄膜、胸骨内注射または注入技術が含まれる。前立腺への直接注射または注入もまた計画される。タンパク質毒素の標準的な投与技術である、対流増加投与（ＣＥＤ）もまた、本発明によって計画される。
【０１７１】
医薬的に許容できる賦形剤と一緒にＭＰＰを投与できる。理想的には、そのような賦形剤は安定性および／または投与特性を向上させる。従って、本発明は、人工膜小胞（リポソーム、ノイソーム、ナノソームおよび同様のものを含む）、微粒子、またはマイクロカプセルなどの適切な賦形剤を用いたＭＰＰの製剤、または医薬的に許容できるポリマーを含むコロイド製剤としてのＭＰＰの製剤も提供する。そのような賦形剤／ポリマーの使用は、ＭＰＰの持続放出を得るのに有用であるかもしれない。代替的に、または加えて、ＭＰＰ製剤は、ｉｎ ｖｉｖｏでタンパク質を安定化させるために、ヒト血清アルブミンなどの添加剤、あるいは当分野で知られているタンパク質治療薬のその他の安定化剤を含むことができる。
【０１７２】
錠剤、トローチ、薬用キャンディー、水性懸濁液または油性懸濁液、分散性パウダーまたは顆粒、エマルジョンハードカプセルまたはソフトカプセル、またはシロップまたはエリキシル剤として、経口投与用の医薬品組成物を調製できる。そのような組成物を、医薬品組成物の製造業者に知られている標準的な方法に従って調製でき、医薬的に洗練されていて口当たりのよい製剤を提供するために、甘味剤、着香料、着色料、および保存料のグループから選択される、一つ以上の物質を含んでもよい。錠剤は、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウム、またはリン酸ナトリウムなどの不活性希釈剤、コーンスターチ、またはアルギン酸などの造粒剤や崩壊剤、でんぷん、ゼラチンまたはアカシアなどの結合剤、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクなどの潤滑剤を含む、適切な非毒性の医薬的に許容できる賦形剤を用いた混合剤中に有効成分を含む。錠剤はコーティングされていなくてもよい、または消化管中での分解と吸収を遅らせ、それによりより長い時間持続作用を提供するために既知のテクニックによってコーティングされてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンなどの遅延材料などを用いてもよい。
【０１７３】
経口投与用の医薬品組成物は、有効成分は例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、またはカオリンなどの不活性固形希釈剤と混合される、硬ゼラチンカプセルとして、または有効成分は水またピーナツオイル、流動パラフィン、またはオリーブ油などの油性の溶媒と混合される軟ゼラチンカプセルとして提供されてもよい。
【０１７４】
水溶性懸濁液として調製される医薬品組成物は、カルボキシルメチル・セルロース・ナトリウム、メチル・セルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、トラガカントゴムおよびアカシアゴムなどの懸濁化剤、例えばレシチンなど天然起源のリン脂質、またはポリオキシエチレンステアレートなどのアルキレンオキサイドと脂肪酸の縮合生成物、またはヘプタデカエチレンオキシセタノールなどの、エチレンオキサイドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物、またはポリオキシエチレンソルビトールモノオレエートなどの、エチレンオキサイドと、脂肪酸とヘキシトール由来の部分エステルの縮合生成物、またはポリエチレンソルビタンモノオレエートなどの、エチレンオキサイドと、脂肪酸とヘキシトール無水物由来の部分エステルの縮合生成物などのなどの分散剤または湿潤剤を用いた一つ以上の適切な賦形剤との混合物中に、活性のある化合物を含む。水溶性懸濁液は、エチル−またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの一つ以上の保存料、一つ以上の着色料、一つ以上の着香料、またはショ糖またはサッカリンなどの一つ以上の甘味料を含んでもよい。
【０１７５】
活性のある化合物を、ラッカセイ油、オリーブ油、ごま油、またはココナッツ油などの植物性油脂、または流動パラフィンなどの鉱物油に懸濁させることによって、医薬品組成物を油性懸濁液として調製することができる。油性懸濁液は、蜜ろう、固形パラフィン、またはセチルアルコールなどの増粘剤を含んでもよい。上記で説明したものなどの甘味料および／または着香料を、口当たりのよい経口剤を提供するために添加してもよい。アスコルビン酸などの酸化防止剤を加えることによって、これらの組成物を保存できる。
【０１７６】
引き続き水を添加することによって水溶性の懸濁液を調製するために使用できる、分散性パウダーまたは顆粒として、医薬品組成物を調製できる。そのような分散性パウダーまたは顆粒は、一つ以上の分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および／または保存料を用いた混合物中に有効成分を提供する。上述したものが、適切な分散剤または湿潤剤と懸濁化剤の良い例となる。甘味剤、着香料、着色料、などの追加的な賦形剤もこれらの組成物中に含まれてもよい。
【０１７７】
本発明の医薬品組成物を水中油型乳剤として調製することもできる。油相はオリーブ油またはラッカセイ油などの植物性油脂、または流動パラフィンなどの鉱物油であってもよく、またはこれらの油の混合であってもよい。これらの組成物中に含まれるための適切な乳化剤には、アカシアゴムやトラガカントゴムなどの天然起源のゴム、大豆、レシチンなどの天然起源のリン脂質、またはソルビタンモノオレエートなどの、脂肪酸とヘキシトール、無水物由来のエステルまたは部分エステルや、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートなどの、前記部分エステルとエチレンオキシドの縮合生成物が含まれる。エマルジョンは、甘味料や着香料を任意で含んでもよい。
【０１７８】
医薬品組成物は、グリセロール、プロピレン・グリコール、ソルビトール、またはショ糖などの一つ以上の甘味料と有効成分を混合することによって、シロップまたはエリキシル剤として調製されてもよい。そのような製剤は、一つ以上の粘滑薬、保存料、着香料、および／または着色料を任意で含むこともできる。
【０１７９】
医薬品組成物は、当分野で知られている方法に従って、また上述したものなどの適切な一つ以上の分散剤または湿潤剤および／または懸濁化剤を使用して、無菌水溶性注射剤または油性懸濁液として調製されてもよい。無菌注射製剤は、無菌注射溶液または非毒性の母体として許容できる希釈剤または溶媒中の懸濁液、例えば１,３−ブタンジオール中の溶液などであってもよい。使用することができる許容できる賦形剤および溶媒には、水、リンガー溶液、乳酸リンガー溶液、および等張食塩水が含まれるが、これに限定されない。その他の例には、溶媒または懸濁化剤として従来用いられている無菌、不揮発性油や、合成モノグリセリドまたはジグリセリドを含む様々な無刺激不揮発性油が含まれる。オレイン酸などの脂肪酸も、注射剤の調製に使用されてもよい。
【０１８０】
他の医薬品組成物と医薬品組成物を調製する方法は当分野で知られており、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」（以前は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」）；Ｇｅｎｎａｒｏ，Ａ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌｉｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ（２０００）などに記載されている。
上述の本発明の医薬品組成物は、意図された目的を達成するのに効果的な量の一つ以上の本発明のＭＰＰを含む。従って、用語「治療上有効な投与量」は、ＢＰＨの症状や特徴を寛解するＭＰＰの量を意味する。化合物の治療上有効な投与量の測定は、当業者の能力の範囲内にある。例えば、治療上有効な投与量を、初めに細胞培養アッセイ、または本書で説明したような動物モデルのいずれかにおいて推定できる。適切な濃度の範囲と投与経路を決定するために動物モデルを使用することもできる。そのような情報は次に、当業者に知られている標準的な方法を用いて、ヒトを含む他の動物における有用な用量と経路を決定するために使用されてもよい。
【０１８１】
例えば、５０％有効量、すなわちＥＤ５０（つまり、集団の５０％に治療上有効な用量）や５０％致死量、すなわちＬＤ５０（つまり、集団の５０％に致死的な用量）を測定するなどの、標準的な製剤手技を用いて治療上の有効性と毒性も測定できる。治療効果と毒性効果間の用量比は、「治療指数」として知られ、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表すことができる。細胞培養アッセイと動物試験から得られるデータを、ヒトまたは動物に使用するための投薬量の範囲を調整するために使用することができる。そのような組成物に含まれる投薬量は、通常はＥＤ５０を含む濃度の範囲内にあり、毒性をほとんど示さないか、あるいはまったく示さない。投薬量は、用いられる投薬形態、対象の感受性、および投与経路、または同様のものに応じて、この範囲内で変化する。
【０１８２】
対象に投与されるべき正確な投薬量は、治療を必要とする対象に関連する要素の観点から、施術者によって決定されてもよい。投薬量と投与は、十分なレベルのＭＰＰを提供するためおよび／または所望の効果を維持するために調製される。適切な投薬量を決定する際に考慮されてもよい要素には、病状の重篤度、対象の総合的な健康、対象の年齢、体重、および性別、食事、投与の時間と頻度、複合薬、反応感受性、および治療に対する耐性／反応が含まれる。投与計画は、上記の要素に加えて特定の製剤の半減期や除去率に応じて施術者によって設計されてもよい。
【０１８３】
非経口、経口、経鼻、直腸、局所、経皮投与、または同様のもののために、従来の方法に従って、医薬的に許容できる担体を用いて、医薬的に効果的な量の本発明のＭＰＰを調製できる。製剤は一つ以上の希釈剤、充てん剤、乳化剤、保存料、緩衝液、賦形剤、および同様のものをさらに含んでもよく、たとえば、液体、パウダー、エマルジョン、坐薬、リポソーム、経皮貼布剤、および錠剤として提供されてもよい。多くの生物高分子（生物学に基づくシステム）、リポソームを用いるシステム、ポリマー輸送システムのどれかを含む、徐放性または持続放出輸送システムを、持続性を持たせ、あるいは、長期間ＭＰＰを提供するために、本書に記載される組成物と一緒に利用することもできる。そのような徐放システムを製剤、例えば、経口、局所および非経口使用に適用できる。用語「医薬的に許容できる担体」は有効成分の生物学的活性の有効性を妨げない、宿主または患者に毒性を示さない担体溶媒を意味する。当業者は、適切な様式において、またＲｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ  ＰＡ．，１９ｔｈ  ｅｄ．，１９９５に開示されるような慣例に従って、本発明の化合物を調剤してもよい。
【０１８４】
一つの実施形態では、例えば安定性または循環半減期を高めるため、または免疫原性を低下させるために、ＭＰＰは水溶性高分子と結合する。臨床的に許容できる水溶性高分子には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニル・アルコール（ＰＶＡ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、ポリプロピレングリコールホモ重合体（ＰＰＧ）、ポリオキシエチル化ポリオール（ＰＯＧ）（グリセロールなど）およびその他のポリオキシエチル化ポリオール、ポリオキシエチル化ソルビトール、またはポリオキシエチル化グルコース、および他の炭水化物ポリマーが含まれるが、これに限定されない。ポリペプチドを、ＰＥＧなどの水溶性高分子に結合させる方法は、例えばＵ．Ｓ．Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂ．Ｎｏ．２００５０１０６１４８やそれに引用されている参照文献に記載されている。
【０１８５】
良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）の治療に対するＭＰＰの使用
本発明によるＭＰＰは、他の正常組織と比較して、選択的に正常前立腺細胞を殺す。従って、本発明によるＭＰＰは、ＢＰＨの治療または予防に有用である。
【０１８６】
一つの実施形態では、ＢＰＨの治療は、ＢＰＨを持つ対象における前立腺の大きさの縮小を意味する。前立腺の大きさを、例えば、面積測定、長楕円体積計算（ＨＷＬ）、楕円体積測定技術を含む、当分野で知られている方法によってその体積に関して測定できる。直接、例えば直腸指診、直腸超音波検査または細胞検査によって、または間接的に、例えば血中ＰＳＡ濃度の変化や血液中の遊離ＰＳＡと総ＰＳＡの割合の変化を測定することによって、前立腺の大きさを測定できる。
【０１８７】
一つの実施形態では、ＭＰＰの投与は、対象の前立腺の体積を減少させる。例えば、開示された方法は、前立腺の体積を、例えば、少なくとも１０％、少なくとも２０％、または少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％減少させることができる。
【０１８８】
別の実施形態では、ＢＰＨの治療は一つ以上ＢＰＨのの症状の重篤度の減少を意味する。ＢＰＨの症状には、排尿躊躇、尿流出の途切れや弱さ、性急や漏れまたは尿滴下、または排尿回数の増加、特に夜間におけるものなどの、排尿に関する変化または問題が含まれる。これらの症状は下部尿路症状（ＬＵＴＳ）として知られている。当分野で周知のように、米国泌尿器科学会（ＡＵＡ）症状指数、Ｍａｄｓｅｎ−Ｉｖｅｒｓｅｎスコアシステム、またはＢｏｙａｒｓｋｙシステムを用いてＬＵＴＳを測定できる。
【０１８９】
別の実施形態では、ＢＰＨの治療は、前立腺の持続的な増殖の予防または抑制を意味し、体積の増加率または血中ＰＳＡの増加率における減少、または上述のようにＢＰＨの症状の減少によって測定できる。
【０１９０】
併用療法
本発明によるＭＰＰを、単独に、またはＢＰＨに対する一つ以上の追加的な治療法と併用して使用できる。ＢＰＨに対する追加的な治療法には、α−１−アドレナリン受容体拮抗薬や５−αレダクターゼ阻害剤などの薬の投与、植物療法、外科処置、および低侵襲手術手技が含まれる。
【０１９１】
α−１−アドレナリン受容体拮抗薬の例は、アルフゾシン／プラゾシン、タムスロシン、テラゾシン、およびドキサゾシンである。５−αレダクターゼ抑制剤の例は、フィナステリドとデュタステリドである。
【０１９２】
植物療法の例には、ノコギリパルメットの果実／チャボサバル（Ｓｅｒｅｎｏａ  ｒｅｐｅｎｓ）、アフリカンプラムバーク（Ｐｙｇｅｕｍ  ａｆｒｉｃａｎｕｍ）、南アフリカスターグラス／βシトステロール（Ｈｉｐｏｘｉｓ  ｒｏｏｐｅｒｉ）、ムラサキバレンギク（Ｅｃｈｉｎａｃｅａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ）、カボチャの種（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａ  ｐｅｐｏ）、ライ麦（Ｓｅｃａｌｅ  ｃｅｒｅａｌｅ）、およびイラクサ（Ｕｒｔｉｃａ  ｄｉｏｉｃａ）が含まれる。外科手技の例は、経尿道的前立腺切除術（ＴＵＲＰ）、経尿道的ニードルアブレーション（ＴＵＮＡ）、経尿道的前立腺切開術（ＴＵＩＰ）、経尿道的マイクロ波温熱療法（ＴＵＭＴ）、レーザー前立腺摘除術、バルーン拡張、電気的蒸気療法、前立腺開腹摘除術である。
【０１９３】
必要ならば、ＭＰＰに対する全身免疫応答を減少させるために、免疫抑制療法をＭＰＰと併用して施行してもよい。免疫抑制療法の例には、全身または局所性コルチコステロイド（Ｓｕｇａら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７３：１０９２−７，２００２）、シクロスポリンＡ（Ｆａｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１０３９−４４，１９９５）、シクロホスファミド（Ｓｍｉｔｈら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：４９６−５０２，１９９６）、デオキシスパーガリン（Ｋａｐｌａｎら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：１０９５−１１０４，１９９７）、Ｔ細胞および／またはＢ細胞に対する抗体［例えば、抗ＣＤ４０リガンド、抗ＣＤ４抗体、抗ＣＤ２０抗体（リツキシマブ）］（Ｍａｎｎｉｎｇら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９：４７７−８５，１９９８）が含まれるが、これに限定されない。ＭＰＰの投与前、投与中、または投与後にそのような薬剤を投与できる。本発明のＭＰＰは上述の治療法と個別に、連続的に、または同時に投与されてもよい。
【０１９４】
ＭＰＰの投与
治療上有効な量の本発明によるＭＰＰ、またはＭＰＰをコード化する核酸を、当分野で知られている方法を用いて、ＢＰＨを持つ対象に局所的または全身に投与できる。
【０１９５】
一つの実施形態では、ＢＰＨを持つ対象において、ＭＰＰは前立腺に注射される（前立腺内）。例えば、近接照射療法の多重注入法と同様の投与法を使用でき、この場合適切な投薬形態で組成物または製剤として適用される、多数に分割した精製ペプチドを会陰を介して針を用いて注射してもよい。
【０１９６】
さらに、または代替的には、例えば 静脈内、筋肉内、皮下、または経口的に、ＢＰＨを持つ対象に対してＭＰＰを全身に投与できる。
【０１９７】
治療上有効な量のＭＰＰは、所望の生物学的作用を達成するのに十分な量、例えば、前立腺の大きさ（すなわち体積および／または重量）を縮小させる、または前立腺のさらなる増殖を抑える、あるいは、ＢＰＨの症状を軽減するのに有効な量を意味する。一つの実施形態では、それは対象におけるＢＰＨの徴候または症状を軽減するのに十分な量である。特定の例では、前立腺の体積を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％だけ減少させるのに効果的な量である。別の実施形態では、前立腺の体積または重量におけるさらなる増加を予防するのに十分な量である。ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験システムから導かれる用量反応曲線から、効果的な用量を外挿によって推定できる。
【０１９８】
効果的な量のＭＰＰを、単回投与または例えば毎日数回投与で、治療期間中に投与できる。しかし、効果的な量のＭＰＰは、治療を受けている対象、治療されている症状の重篤度や種類、および投与の方式に依存する。一つの実施形態では、治療上有効な量のＭＰＰは、前立腺内投与で、前立腺の重量１グラム当たりおよそ０．０１〜５０μｇで変動してもよい。別の実施形態では、前立腺内投与で、治療上有効な量のＭＰＰは前立腺の重量１グラム当たりおよそ０．０２〜４０μｇで変動してもよい。別の実施形態では、治療上有効な量のＭＰＰは、前立腺内投与で、およそ０．０２〜３５μｇで変動してもよい。別の実施形態では治療上有効な量のＭＰＰは、前立腺内投与で、およそ０．０３〜２５μｇで変動してもよい。別の実施形態では、治療上有効な量のＭＰＰは、前立腺内投与で、およそ０．０４〜２０μｇで変動してもよい。別の実施形態では、治療上有効な量のＭＰＰは、前立腺内投与で、およそ０．０４〜１０μｇで変動してもよい。
【０１９９】
一つの実施形態では、７０ｋｇのヒトに対する効果的な前立腺内静脈投与量はおよそ１ｍｇ〜およそ１０ｍｇのＭＰＰである。別の実施形態では、効果的な静脈投与量はおよそ１ｍｇ〜およそ５ｍｇである。別の実施形態では、効果的な静脈投与量はおよそ１ｍｇ〜およそ３ｍｇである。さらに別の実施形態では、効果的な静脈投与量はおよそ２．８ｍｇである。一つの実施形態では、７０ｋｇのヒトに対するＭＰＰの効果的な前立腺内投与量は、およそ１０ｍｇ〜およそ１００ｍｇのＭＰＰである。別の実施形態では、７０ｋｇのヒトに対するＭＰＰの効果的な前立腺内投与量は、およそ１０ｍｇ〜およそ５０ｍｇのＭＰＰです。別の実施形態では、７０ｋｇのヒトに対するＭＰＰの効果的な前立腺内投与量は、およそ１０ｍｇ〜およそ３０ｍｇのＭＰＰである。別の実施形態では、効果的なＭＰＰの前立腺内投与量は、７０ｋｇのヒトに対しておよそ２８ｍｇである。
【０２００】
ＭＰＰのｉｎ ｖｉｖｏでの発現
ＢＰＨを治療するためのＭＰＰの投与に対する代替法（または追加法）として、ＭＰＰをコード化する核酸をｉｎ ｖｉｖｏで発現させることにより、ＢＰＨの長期または全身治療を達成できる。
【０２０１】
ＭＰＰをコード化する核酸
本発明は、ＢＰＨの治療のために、ＭＰＰをコード化する核酸またはＤＮＡ分子の使用を意図する。そのようなＤＮＡ分子は、標準的な分子生物学的実験テクニックと本書で開示される配列情報を介して得ることができる。
【０２０２】
それらが機能的ＭＰＰをコード化するのであれば、適切なＤＮＡ分子とヌクレオチドには、ストリンジェントな条件下で、開示されるＤＮＡ配列とハイブリダイズするもの、またはその断片が含まれる。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーションの条件は、ハイブリダイゼーション方法の種類と、使用されたハイブリダイズするＤＮＡの構成と長さに応じて変化する。一般的には、ハイブリダイゼーションの温度とハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（特にＮａ＋濃度）がハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。特定の量のストリンジェンシーを得るのに必要な、ハイブリダイゼーション条件に関する計算はＳａｍｂｒｏｏｋら、（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、チャプター９と１１）によって考察されている。［３２Ｐ］−ｄＣＴＰで標識した標的プローブを用いたハイブリダイゼーションは、溶融温度Ｔｍよりおよそ５〜２５℃低い温度で、一般的には、６倍希釈のＳＳＣなど高イオン強度の溶液中で行われる。ストリンジェントな条件の例は、ｐＨ７．０〜８．３で少なくともおよそ０．０１〜１．０ＭのＮａイオン濃度の塩の濃度（または他の塩）と、短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）に対して少なくともおよそ３０℃の温度である。ホルムアミドなどの不安定化剤を添加して、ストリンジェントな条件を得ることができる。例えば、２５〜３０℃で５倍希釈のＳＳＰＥ（７５０ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）の条件は、対立遺伝子特異的プローブハイブリダイゼーションに適している。
【０２０３】
遺伝暗号の縮重は、コード化されたタンパク質のアミノ酸配列を維持しながら、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列中の変異体をさらに可能にする。例えば、アミノ酸Ａｌａは、ヌクレオチドコドントリプレットＧＣＴ、ＧＣＧ、ＧＣＣ、およびＧＣＡによってコード化されている。従って、コード化されたタンパク質のアミノ酸組成物、またはタンパク質の特性に影響を与えることなしに、ヌクレオチド配列は変更されることができる。遺伝子暗号の縮重に基づいて、上述したような標準的なＤＮＡ変異導入技術を用いて、またはＤＮＡ配列の合成によって、参照ＤＮＡ分子から変異体ＤＮＡ分子が誘導されてもよい。ストリンジェントな条件下で、遺伝子暗号の縮重に基づく配列変異のおかげで、開示されるＤＮＡ配列にハイブリダイズしないＤＮＡ配列もまた、本開示に含まれる。
【０２０４】
本発明は、ＭＰＰ、例えば修飾プロアエロリジンポリペプチドをｉｎ ｖｉｖｏで細胞または組織内に発現させる方法を提供する。一つの実施例では、細胞または組織のトランスフェクションはｉｎ ｖｉｔｒｏで起こる。この実施例では、細胞または組織（例えば移植片）は対象から除去され、次に目的とするタンパク質をコード化しているｃＤＮＡを含む発現ベクターを用いてトランスフェクトされる。トランスフェクト細胞は機能的タンパク質を産生し、対象に再び導入されることができる。別の実施例では、目的とするタンパク質をコード化している核酸は、直接対象に投与され（例えば静脈、または前立腺内投与）、トランスフェクションはｉｎ ｖｉｖｏで起こる。
【０２０５】
ヒト細胞トランスフェクションに必要とされる科学的および医学的手技は現在では日常的なものである。遺伝子をドナー細胞に移入するための一般的な方法は、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，５２９，７７４に開示されている。一般的には、治療上望ましい効果を持つタンパク質をコード化している遺伝子は、ウィルスの発現ベクターにクローンされ、そのベクターは次に標的微生物に導入される。ウィルスは細胞に感染して、タンパク質配列をｉｎ  ｖｉｖｏで産生し、そこで、それが所望の治療上の効果を持つ（Ｚａｂｎｅｒら、Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−１６，１９９３）。
【０２０６】
ＤＮＡまたはタンパク質要素を特定の細胞または組織中、例えば前立腺に導入することだけが必要であるかもしれない。しかし、一部の例では、例えば血管内投与（ｉ．ｖ．）または経口投与によって、対象の細胞の全てを治療する、すなわちより広くベクターを分散させるのが、治療上より効果的および容易であるかもしれない。
【０２０７】
ＭＰＰをコード化する核酸配列は、適切なプロモーターの制御下にある。使用できる適切なプロモーターには、遺伝子の天然のプロモーター、レトロウィルスＬＴＲプロモーター、またはアデノウィルスの主要後期プロモーターなどのアデノウィルスプロモーター、ＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＭＭＴＶプロモーターなどの誘導できるプロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ヒストンプロモーター、（ｘ−ａｃｔｉｎプロモーター、ＴＫプロモーター、Ｂ１９パルボウィルスプロモーター、およびＡｐｏＡＩプロモーターが含まれるが、これに限定されない。一つの実施例では、プロモーターはプロバシンプロモーターなどの前立腺特異的プロモーターである。しかし、開示は特定の外来遺伝子またはプロモーターに限定されない。
【０２０８】
組み換え核酸が適切な細胞に到達できるようにする、既知の方法によって組み換え核酸を対象に投与できる。これらの方法には、注射、注入、沈着、移植、または局所投与が含まれる。注射は、皮内または皮下であってもよい。下記でさらに説明するように、組み換え核酸は、アビポックス・ウイルス、組み換えワクシニアウイルス、複製欠損性アデノウィルス株、またはポリオウィルスなどの、ウィルスベクターの一部として、または裸のＤＮＡまたはリポソーム封入されたＤＮＡなどの、非感染形態として投与されてもよい。
【０２０９】
アデノウィルスベクターは基本的に、完全なアデノウィルスのゲノムを含む（Ｓｈｅｎｋら、Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１１：１−３９，１９８４）。代替的には、アデノウィルスベクターは、アデノウィルスのゲノムの少なくとも一部が欠失している修飾アデノウィルスベクターである。一つの実施例では、ベクターは、アデノウィルス５’ＩＴＲ、アデノウィルス３’ＩＴＲ、アデノウィルス、キャプシド形成シグナル、治療剤をコード化するＤＮＡ配列、および治療剤をコード化するＤＮＡ配列の発現のためのプロモーターを含む。ベクターは、アデノウィルスＥ１およびＥ３ＤＮＡ配列の少なくとも大部分を含まないが、Ｅ２およびＥ４ＤＮＡ配列の全て、およびアデノウィルス主要後期プロモーターによって転写される、アデノウィルスタンパク質をコード化するＤＮＡ配列を必ずしも含まないわけではない。別の実施例では、ベクターはＵ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．４，７９７，３６８（Ｃａｒｔｅｒら．）やＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−７３，１９８８）に記載されるような、アデノ随伴ウィルス（ＡＡＶ）および４型ＡＡＶ（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６８２３−３３，１９９７）、５型ＡＡＶ（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：１３０９−１９，１９９９）である。
【０２１０】
標準的なテクニックに従って、５’末端から始まり、アデノウィルス５’ＩＴＲ、アデノウィルスキャプシド形成シグナル、およびＥ１ａエンハンサー配列、プロモーター（アデノウィルスプロモーターまたは外来プロモーターであってもよい）、三連のリーダー配列、複数のクローニング部位（本書に記載されるようなものであってもよい）、ポリＡシグナル、およびアデノウィルスゲノムの断片に対応するＤＮＡ断片を含む、シャトルプラスミドを用いてそのようなベクターを構成できる。ＤＮＡ断片は、修飾されたまたは変異されたアデノウィルスを用いた相同的組み換えの基質として機能し、３３２９塩基〜６２４６塩基の長さを超えないアデノウィルス５’ゲノムを含んでもよい。プラスミドも選択可能なマーカーと複製起点を含むことができる。複製起点は細菌性の複製起点であってもよい。治療剤をコード化する所望のＤＮＡ配列をプラスミドの複数のクローニング部位に挿入できる。
【０２１１】
本書で開示される方法を実施するのに使用できるベクターの例には、ＷＯ  ９５／２７５１２（Ｗｏｏら）、ＷＯ  ０１／１２７３０３（Ｗａｌｓｈら）、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．Ｎｏ．：６，２２１，３４９（Ｃｏｕｔｏら）、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．：６，０９３，３９２（Ｈｉｇｈら）で開示されるものが含まれるが、これに限定されない。
【０２１２】
臨床試験
ｉｎ ｖｉｔｒｏと動物モデルにおけるＢＰＨの治療のためのＭＰＰの有効性が示された後で、ＭＰＰは、ＢＰＨの治療におけるそれらの有効性をさらに評価するために、また治療上の使用に対する規制認可を得るために、臨床試験においてテストされるべきであることを当業者は理解するであろう。当分野で周知のように、臨床試験は第Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ相と特定される、試験の相を通じて進行する。
【０２１３】
初めに、ＭＰＰは第Ｉ相試験で評価される。一般的には、第Ｉ相試験は投与の最良の形態（例えば、丸薬または注入によって）、投与の頻度、化合物に対する毒性を決定するために使用される。第Ｉ相試験は、患者の体内における候補治療薬の効果を評価するために、血液検査や生検などの臨床試験を頻繁に含む。第Ｉ相試験については、ＢＰＨを持つ小人数の患者のグループのが特定の用量のＭＰＰで治療される。試験中は、化合物に関連する最大耐量（ＭＴＤ）や用量規定毒性（ＤＬＴ）を決定するために、用量は一般的にグループごとに増量される。この過程は続いて行われる第ＩＩ相試験において使用される適切な用量を決定する。
【０２１４】
ＭＰＰの有効性と安全性をさらに評価するために第ＩＩ相試験を行うことができる。第ＩＩ相試験では、第Ｉ相試験において効果があると認められた投薬量を用いて、ＢＰＨを持つ患者の複数のグループにＭＰＰを投与する。
【０２１５】
第ＩＩＩ相試験はＭＰＰが標準的な、または広く受け入れられている治療にどの程度匹敵するかを検討することに焦点を当てている。第ＩＩＩ相試験では、二つ以上の「治療群」のうちの一つに患者は無作為に割り当てられる。二つの治療群を用いた試験では、例えば、一つの治療群は基準治療を受け（対照群）、もう一つの治療群はＭＰＰ治療を受ける（治験群）。
【０２１６】
ＭＰＰの長期的安全性と有効性をさらに評価するために第ＩＶ相試験を用いる。第ＩＶ相試験は第Ｉ、ＩＩ、およびＩＩＩ試験と比べて一般的ではなく、ＭＰＰの標準的使用が認可された後に行われる。
【０２１７】
臨床試験に対する患者の適格性
参加者の適格基準は、一般的なもの（例えば、年齢、性別、病気の種類）から特定のもの（例えば、前治療の種類と数、病気の特徴、血球数、臓器機能）にわたる。一つの実施形態では、適格とされる患者はＢＰＨの診断を受けている。適格基準は、試験の相によっても変化するかもしれない。臨床試験に適格とされる患者は、尿路閉塞の客観的な判定や、ＢＰＨへの経口治療に対して反応しないことに基づいて選ばれても良い。例えば、第Ｉ相と第ＩＩ相試験では、臓器の異常機能やその他の要因により、治験治療により危険にさらされる可能性がある患者が基準から除外されることが多い。第ＩＩと第ＩＩＩ相試験では、病気の種類と病期、および前治療の数と種類に関して、追加的基準が含められることが多い。
【０２１８】
第Ｉ相試験には通常、他の治療オプションが有効でなかった１５〜３０人の参加者が含まれる。第ＩＩ相試験には一般的に、薬物療法あるいは手術を受けたが、治療が有効でなかった最大１００人の参加者が含まれる。第ＩＩ相試験への参加は、以前に受けた治療に基づいて制限されることが多い。第ＩＩＩ相試験には通常、数百から数千の参加者が含まれる。ＭＰＰと標準的な治療の有効性の間に真の違いがあるかどうかを検討するために、この多数の参加者が必要である。第ＩＩＩ相には、病気の連続性を対象とするために、ＢＰＨと新規に診断された患者から広範囲な疾患を持つ患者までが含まれてもよい。
【０２１９】
範囲を狭めて定義された集団と同様に治療が効果的であるかを検討するために、試験集団が多様になりすぎないようにしつつ、可能な限り包括的なものとなるように臨床試験をデザインするべきであることを、当業者は理解するであろう。試験に含められる集団が多様になればなるほど、特に第ＩＩＩ相試験においては、一般的な集団に対して結果がより適用されやすくなる。臨床試験の各相における適切な参加者の選択は、当業者の通常の技量の範囲内にあると考えられる。
【０２２０】
治療前の患者の評価
試験を開始する前に、最初に患者を分類するために、当分野で知られているいくつかの方策を用いることができる。例えば、Ｆａｍｉｌｙ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋウェブサイトの、良性過形成の症状指数を用いて、患者は最初に評価される。患者の病気の種類および／または病期、および／または前立腺の大きさに従って、患者を分類してもよい。
【０２２１】
臨床試験におけるＭＰＰの投与
ＭＰＰは一般的に、試験参加者に注射によって投与される。一つの実施形態では、ＭＰＰは前立腺内注射によって投与される。
さまざまなＭＰＰの投与量を試験することができる。前臨床試験による情報を与えられれば、熟練した施術者は、臨床試験で用いるための適切なＭＰＰの投与量を容易に決定することができる。一つの実施形態では、用量範囲はおよそ０．０１μｇ／ｇ前立腺〜およそ５０μｇ／ｇ前立腺である。一つの実施形態では、用量範囲はおよそ０．０２μｇ／ｇ前立腺〜およそ４０μｇ／ｇ前立腺である。一つの実施形態では、用量範囲はおよそ０．０２μｇ／ｇ前立腺〜およそ３５μｇ／ｇ前立腺である。一つの実施形態では、用量範囲はおよそ０．０３μｇ／ｇ前立腺〜およそ２５μｇ／ｇ前立腺である。一つの実施形態では、用量範囲はおよそ０．０４μｇ／ｇ前立腺〜およそ２０μｇ／ｇ前立腺である。一つの実施形態では、用量範囲はおよそ０．０４μｇ／ｇ前立腺〜およそ１０μｇ／ｇ前立腺である。一つの実施形態では、用量範囲はおよそ０．１μｇ／ｇ前立腺〜およそ５μｇ／ｇ前立腺である。一つの実施形態では、用量範囲はおよそ０．２μｇ／ｇ前立腺〜およそ３μｇ／ｇ前立腺である。一つの実施形態では、用量範囲はおよそ０．５μｇ／ｇ前立腺〜およそ２μｇ／ｇ前立腺である。
【０２２２】
薬物動態のモニタリング
第Ｉ相の基準を満たすために、定期的に採取された血液や尿などの試料の化学的分析などによって、ＭＰＰの分布をモニターする。例えば、注入の開始からおよそ７２時間後まで、試料を定期的に採取してもよい。
【０２２３】
もし分析をすぐに行わない場合は、採取後は試料をドライアイス上に静置し、続いて、分析を行える時まで、−７０℃で保存するために冷凍庫に移しても良い。当分野で知られている標準的なテクニックを用いて試料を分析のために調製することができ、例えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって存在するＭＰＰの量を測定できる。
【０２２４】
熟練した臨床薬理学者と共同で、薬物動態データを作成し、分析することができ、例えば、除去、半減期、および最大血漿濃度を決定するために使用できる。
【０２２５】
患者の予後の監視
臨床試験の評価項目は、評価中の化合物の有効性を示す測定可能な結果である。評価項目は、試験の開始前に設定され、臨床試験の種類と相に応じて変化する。 評価項目の例には、例えば、前立腺の体積の低下、血中ＰＳＡ濃度の低下、尿路症状の改善、尿流の改善、急性尿閉の減少がある。その他の評価項目には、毒性やＱＯＬが含まれる。
【０２２６】
医薬品キット
本発明は、ＢＰＨの治療に使用するための、一つ以上のＭＰＰ、または一つ以上のＭＰＰを含む医薬品組成物を含む、治療キットまたはパックをさらに提供する。キットでは、ＭＰＰを単位投与形態で提供できる。キットの個々の構成要素を、個別の容器に包装してもよく、該当する場合、調合薬または生物学的製品の製造、使用、または販売を規制する行政機関によって規定される書式の注意書きが添付されてもよく、この注意書きはヒトまたは動物への投与に関する製造、使用、または販売の機関による承認を反映する。本発明のＭＰＰと併用して使用するための、一つ以上の他の治療剤を、キットはさらに任意で含むことができる。ＭＰＰおよび／または追加的な治療剤のための使用方法または投与計画を大まかに説明する使用説明書または取り扱い説明書を、キットは任意で含んでもよい。
【０２２７】
キットの構成要素が一つ以上の溶液で提供される場合は、溶液は、滅菌水溶液などの水溶液であってもよい。この場合は、容器そのものが、そこから組成物を患者に投与してもよい、または他の構成要素に添加して混合することのできる、吸入容器、シリンジ、ピペット、点眼容器、または他の同様な器具であってよい。
【０２２８】
キットの構成要素は、乾燥または凍結乾燥状態で提供されてもよく、キットは凍結乾燥構成要素の溶解のために、適切な溶媒を追加的に含んでもよい。容器の数や種類にかかわらず、本発明のキットは、患者に組成物を投与するのを支援する器具を含んでもよい。そのような器具は、吸入器、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼容器、または類似の医学的に承認された投与手段であってもよい。
【０２２９】
ここで具体的な実施例を参照して本発明を説明する。以下の実施例は本発明の実施形態を説明することを意図しており、本発明をどのようにも限定することを意図していないことが理解されるであろう。
【０２３０】
実施例
実施例１：ＰＳＡによって活性化されたＭＰＰの作成
この実施例は、表６に示すような、ＰＳＡによって活性化される本発明の実施形態によるＭＰＰを作成するために使用される方法を記載する。これらのＭＰＰは、  プロアエロリジンから誘導される。ＰＳＡまたはその他の前立腺特異的プロテアーゼによって活性化される、その他のＭＰＰを作成するために類似の方法を使用できることを当業者は理解するであろう。そのようなタンパク質を、プロアエロリジンのフューリン配列を、ＰＳＡ特異的切断配列などの前立腺特異的プロテアーゼ切断部位で置換することによって産生してよい。
【０２３１】
（表６）ＰＳＡによって切断されるプロテアーゼ切断部位を持つ活性化配列を持つＭＰＰと野生型プロアエロリジンの比較
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【０２３２】
表６に示すＭＰＰには、その内部で、６つのアミノ酸フューリンプロテアーゼ認識部位（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の４２７〜４３２番のアミノ酸）がＰＳＡ切断部位と置換される、プロアエロリジン配列（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯＳ：１と２に示される野生型ＰＡ）が含まれる。例えば、ＭＰＰ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：３と４）は、その内部でフューリン切断部位がＰＳＡ基質ＨＳＳＫＬＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）で置換された、プロアエロリジン配列を含む。
【０２３３】
前述の方法を用いて（Ｖａｌｌｅｔｔｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７２３−３３，１９８８）、アエロリジンのフューリン部位（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の４２７〜４３２番のアミノ酸）をＰＳＡ特異的切断部位（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、８、１１、または１４）で置換するために組み換えＰＣＲを用いた。手短に言うと、ｐｆｕ反応バッファー［２０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ８．８）、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２ｍＭのＭｇＳＯ４、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および０．１ｍｇ／ｍｌのＢＳＡ］中に、０．２ｍＭのデオキシヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）、０．５μＭのフォワードおよびリバースプライマー、０．１μｇのテンプレートＤＮＡ、および２．５単位のクローン化ｐｆｕポリメラーゼを含む、５０μｌの最終量で組み換えＰＣＲを行った。
【０２３４】
プロアエロリジンの挿入のための形質転換細胞のスクリーニングを、Ｔａｑポリメラーゼを用いてＰＣＲで行った。０．２  ｍＭのｄＮＴＰ、０．５μＭのフォワードおよびリバースプライマー、および５単位のＴａｑポリメラーゼを含むＰＣＲ反応バッファー［５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、および１０ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ９．０）］中で混合物を調製した。この混合物の１０μｌの試料を０．２ｍｌのチューブに添加し、形質転換細胞を滅菌した爪楊枝を用いて加えた。
【０２３５】
最終ＰＣＲ産物を適切な制限酵素を用いて消化し、次に増幅のためにクローニングベクターｐＴＺ１８ｕ（バイオラッド社）に連結した。手短に言うと、ＤＮＡ１μｇに対して、およそ１単位の制限酵素を含む、ファルマシア社のＯｎｅ−Ｐｈｏｒ−Ａｌｌ  ｂｕｆｆｅｒ［１０ｍＭのトリスアセテート（ｐＨ７．５）、１０ｍＭのマグネシウムアセテート、および５０ｍＭのカリウムアセテート］中で、制限酵素消化を３７℃で９０分間行った。結果得られた挿入とｐＴＺ１８ｕベクターＤＮＡを約５：１の割合で混合し、１５分間４５℃で加熱した。続いて、Ｏｎｅ−Ｐｈｏｒ  Ａｌｌ  ｂｕｆｆｅｒ中で試料を希釈し、ＡＴＰの最終濃度が、付着末端ライゲーションに対しては１ｍＭ、または平滑末端ライゲーションに対しては０．５ｍＭになるように加えた。次に、１１単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを各資料に加え、試料を穏やかに混合した。ライゲーションを１３℃で４時間（付着末端ライゲーション）または１６時間（平滑末端ライゲーション）実施した。
【０２３６】
正しい置換が加えられたことを確認するために、ＤＮＡ塩基配列決定法を行った。続いてクローニングベクターから挿入を単離し、大腸菌での発現のために、広宿主域プラスミドｐＭＭＢ６６ＨＥにサブクローニングした（Ｆｕｒｓｔｅら、Ｇｅｎｅ  ４８：１１９−１３１，１９８６）。前述したＣａＣｌ２洗浄方法（Ｃｏｈｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２１１０−４，１９７２）を用いて大腸菌ＤＨ５α細胞をコンピテントにした。対数増殖期にある細胞（ＯＤ６００＝０．４〜０．７）を遠心分離で収集し、１／４量の１００ｍＭ冷ＭｇＣｌ２中で洗浄した。細胞を再びペレット状にし、２倍量の１００ｍＭ冷ＣａＣｌ２中に再懸濁した。次に細胞を約４５分間氷上でインキュベートした。その後細胞を遠心分離し、１／１０量の１００ｍＭ ＣａＣｌ２中に再懸濁した。１５％の最終濃度になるようにグリセロールを添加する前に、さらに４５分間インキュベーションを続けた。コンピテント細胞を使用まで−７０℃で保存した。
【０２３７】
組み換えプラスミドの、コンピテント大腸菌細胞への形質転換をＩｎｏｕｅら、（Ｇｅｎｅ  ９６：２３−８，１９９０）の方法に従って行った。コンピテント細胞（２００μｌ分注）を０．５〜１０ｎｇのＤＮＡと一緒に氷上で一時間インキュベートした。次に細胞に対して４２℃で４分間の熱ショックを行った。細胞を素早く５分間氷上に戻した。続いて、５００μｌのＬＢ培地を各試料に加え、穏やかに攪拌しながら細胞を３７℃で一時間インキュベートした。５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ寒天培地上で分注量（１５０μｌ）を培養した。これらの平板培地を３７℃で一晩培養した。
【０２３８】
Ｈａｒａｙａｍａら（Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１８０：４７−５６、１９８０）のフィルターメーティング（ｆｉｌｔｅｒ−ｍａｔｉｎｇ）技術を用いた結合によって、組み換えｐＭＭＢ６６ＨＥクローンを、アエロモナス属サルモニシダ株ＣＢ３（Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６８：２２１−４，１９９０参照）に移入した。アエロモナス・サルモニシダのこのプロテアーゼ欠乏株の使用は、活性化されたアエロリジンによって汚染されていないＭＰＰの産生をもたらし、また、多量のタンパク質の産生をもたらした。上述したように（Ｂｕｃｋｌｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６８：２２１−４，１９９０）、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィーとイオン交換クロマトグラフィーによってＭＰＰを精製した。この方法は、バッチ間で同一のＭＰＰの調製をもたらした。
【０２３９】
実施例２：ＭＰＰ１はｉｎ ｖｉｔｒｏで特異的にＰＳＡ産生細胞を溶解する
この実施例は、実施例１で述べたような本発明の実施形態によるＭＰＰの特異性を検討するために使用する方法を記載する。ＰＳＡ特異的切断部位を含むＭＰＰの特異性をテストするためにそのような方法を使用できる。
【０２４０】
ＭＰＰ１を、ＰＳＡ産生ＬＮＣａＰ細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．）と非ＰＳＡ産生ＴＳＵ細胞（Ｄｒ．Ｔ．Ｉｔｚｕｍｉ、帝京大学、日本）に対してテストした。１０−１２Ｍ〜１０−６Ｍ  ＭＰＰ１の存在下で２４時間細胞をインキュベートした。続いて、細胞をカウントし、トリパンブルーを排除する能力に基づいて、生存細胞の割合についてスコア化した。細胞の５０％（ＩＣ５０）を殺すのに必要な濃度を、ＬＮＣａＰとＴＳＵ細胞株の両方に対するＭＰＰ１について決定した。
【０２４１】
ＰＳＡ産生細胞に対するＭＰＰ１のＬＤ５０は１０−１０Ｍであった。対照的に、非ＰＳＡ産生ＴＳＵ細胞に対しては、ＬＤ５０はおよそ５×１０−８Ｍであった。この結果は、ＰＳＡ産生対非ＰＳＡ産生ヒト細胞株に対する毒性における５００倍の差から明らかなように、ＭＰＰ１はＰＳＡによって特異的に活性化されることを示す。
【０２４２】
実施例３：ＭＰＰ１はＰＳＡを含む血液中で活性化されない
過剰なモル濃度α１−抗キモトリプシンやα２−マクログロブリンなどの血清プロテアーゼ阻害剤の存在によりＰＳＡは血中で酵素的に不活性化されているので、ＰＳＡ切断部位を含むＭＰＰは血液中では活性化されないものである。
【０２４３】
その他の血清プロテアーゼとヒト血清中のＰＳＡによる、ＭＰＰ１の非特異的な活性化をテストするために、以下のように高感度溶血アッセイを実施した。赤血球（ＲＢＣ、２％ｖ／ｖ）を血漿またはＭＰＰ１±ＰＳＡを含む緩衝液に添加した。上清中に放出されるヘモグロビンを測定することによって、溶血の程度を分析した。０．１％トリトンの添加は、数秒間で１００％の溶血をもたらし、陽性コントロールとして使用した。加水分解の量は、Ｔｒｉｔｏｎ処理試料の吸光度に対する５４０ｎｍでの試料の吸光度の割合として表した。赤血球を加える前の１時間の水性緩衝液単独の中でＰＳＡと一緒のＭＰＰ１（１０−８Ｍ）のプレインキュベーションは、およそ４５％の溶血をもたらした（図２）。
【０２４４】
ヒト血漿中でＭＰＰ１が活性化されるかどうかを検討するために、ＭＰＰ１（１０−８Ｍ）を５０％ヒト血漿中で１時間インキュベートした。関連する実験では、過剰なＰＳＡ（１０，０００ｎｇ／ｍｌ）を最初にヒト血漿に加え、数時間インキュベートした。次に血漿±ＰＳＡを含むＭＰＰ１をヒト赤血球（２％ｖ／ｖ）とともにインキュベートした。ヒト血漿、または高濃度のＰＳＡでスパイクしたヒト血漿へののＭＰＰ１の添加は、明らかな溶血をもたらさなかった（すなわち図２のＴｒｉｔｏｎ対照の１％未満）。これらの結果は、たとえもし血液が測定可能なＰＳＡを含んでいたとしても、血中での著しい活性化なしにＭＰＰ１を全身に投与できることを示す。
【０２４５】
実施例４：ＭＰＰ１、ＭＰＰ２、およびＭＰＰ３のｉｎ ｖｉｔｒｏとｉｎ ｖｉｖｏでの毒性
この実施例は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏでのＭＰＰの毒性を測定するために使用される方法を記載する。
【０２４６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの毒性を測定するために、細胞の生死判別アッセイを以下のように実施した。ＥＬ４マウスＴ細胞リンパ腫細胞（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−３９）を、ＭＴＳ／ＰＭＳ  Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ９６（プロメガ社）中で１ウェルにつき１０５個の細胞で培養した。１×１０−１３Ｍ〜１×１０−７ＭのＭＰＰ１、ＭＰＰ２、およびＭＰＰ３を図３に示すように添加し、細胞とともに３７℃で４時間インキュベートした。続いて、ＭＴＳ／ＰＭＳキットの製造業者によって指示されるように、プレートリーダーでプレートを読み込むことにより細胞生存率を測定した。図３に示すように、野生型のＬＣ５０が１．５×１０−１０であるのと対照的に、ＬＣ５０は、４×１０−９（ＭＰＰ１）、１×１０−９（ＭＰＰ２）、および１×１０−７（ＭＰＰ３）で、ＭＰＰは野生型のプロアエロリジンよりも毒性が低い。
【０２４７】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの毒性を測定するために、ＭＰＰをマウスに静脈投与した。野生型プロアエロリジン（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）はマウスに対して高度な毒性を示し、１μｇの用量は、一時間以内の死をもたらし、単回ＩＶ注射後２４時間でのＬＤ１００（すなわち、動物の１００％を２４時間以内に殺す用量）は０．１μｇであった。対照的に、注射後２４時間でのＭＰＰ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）のＬＤ１００は２５倍高かった（すなわち２．５μｇの総投与量）。
【０２４８】
実施例５：ＭＰＰ５（ヒスチジン標識ＭＰＰ）の調製
本発明によるヒスチジン標識ＭＰＰ（ＭＰＰ５）を以下のように調製した。ＭＰＰ１をコードする遺伝子を含むプラスミド挿入を、精製と収率を容易にするために修飾した。転写された場合に、タンパク質の産生の低下をまねく二次ループ構造を形成する、リボソーム結合部位とＡＴＧ開始コドンを含む、一続きの３５ヌクレオチド（Ｂｕｒｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：５９５６−６３，２００１）を、ループ形成を防ぐために、ＡＴＧ開始コドンの上流の２３ヌクレオチドを残して修飾した（Ｄｉｅｐら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．３０：３４１−５２，１９９８）。これにより、ＣＢ３の培養上清中に放出されるＭＰＰの量が増加した（Ｂｕｒｒら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３：５９５６−６３，２００１）。新しい上流配列を持つ構造は、γ１２３プロモーター構造として設計される。ＭＰＰ１構造をＫｐｎＩとＥｃｏＲＩで切断することにより変更が行われ、続いて結果得られる断片を、γ１２３−αｅｒＡ：：ｐＴＺ１８ＵのＫｐｎＩ／ＥｃｏＲＩ部位に結合した。結果得られる構造をγ１２３−ＭＰＰ１：：ｐＴＺ１８Ｕと呼んだ。
【０２４９】
２−ｓｔｅｐ  ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（ストラタジーン社）のプロトコルを用いてＨｉｓ標識の付加を行った。二つのプライマー、ＥｎｄＨｉｓ１（センス）：５’−ＧＣＴ  ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）とＥｎｄＨｉｓ１（アンチセンス）５’−ＧＣＧ  ＣＴＧ  ＣＣＧ  ＴＴＡ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＴＴＧ  ＡＴＴ  ＧＧＣ  ＡＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ：２７）を合成することにより（３つのＣＡＴコドンは残りのＨｉｓ残基をコードする）、はじめの処理で、３つのＨｉｓ残基をγ１２３−ＭＰＰ１ＤＮＡの終端に付加した。
【０２５０】
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅキットについてストラタジーン社によって提案されるプロトコルにおいて、これらのプライマーを使用した。ひとたび３つのＨｉｓ残基に対するＤＮＡの付加が塩基配列決定法によって確認されたら、最後の３つのＨｉｓ残基に対してヌクレオチドを付加するために、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅの二次反応を行った。この処理において使用されたプライマーは、ＥｎｄＨｉｓ２（センス）５’−ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）とＥｎｄＨｉｓ２（アンチセンス）５’−ＧＣＣ  ＡＡＴ  ＣＡＡ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＣＡＴ  ＴＡＡ  ＣＧＧ  ＣＡＧ  ＣＧＣ−３’（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）であった。
【０２５１】
二回目のＰＣＲの後、６つのＨｉｓ残基が、正しいリーディング・フレームの中で正しくγ１２３−ＭＰＰ１の終端に挿入されたことと、γ１２３−ＭＰＰ１配列に対して他の変更が加えられていないことを確かめるために、クローンをスクリーニングし、配列を決定した。結果得られるプラスミドをγ１２３−ＭＰＰ５：：ｐＴＺ１８Ｕと名づけ、γｌ２３−ＰＳＡＨ６挿入領域の配列を決定した（図３４参照）。
【０２５２】
γｌ２３−ＭＰＰ５の核酸配列は、ＡＴＧ開始コドンの前の領域においてγｌ２３プロモーターが通常のａｅｒＡ上流配列を置換しており、ＭＰＰ１構造の核酸配列を異なる。配列はまた、ＴＡＡ停止コドンの直前で追加的なＣＡＴの反復を持つ。γｌ２３−ＭＰＰ５のオープン・リーディング・フレームがアミノ酸配列に翻訳された場合、ＭＰＰ１のアミノ酸配列と比べて認められる唯一の違いは、タンパク質のＣ末端への６つのヒスチジン残基の付加である。
【０２５３】
ｐＭＭＢ２０８発現ベクターへのγｌ２３−ＭＰＰ５の導入
γ１２３プロモーターとＨｉｓ標識の付加の結果によって作成された、γｌ２３−ＭＰＰ５をプラスミドｐＭＭＢ２０８に導入した。クロラムフェニコール耐性を持ち、ＩＰＴＧ誘導性ｔａｃプロモーターを含み、トランス接合によってアエロモナス属サルモニシダに動員することができるため、このプラスミドを選択した。従ってγ１２３−ＰＳＡ  ＰＡＨ６の挿入を、ｐＭＭＢ２０８プラスミドのＨｉｎｄＩＩＩとＥｃｏＲＩ部位に導入した。得られたプラスミド、γｌ２３−ＭＰＰ５：：２０８を、ＭＰＰ５の産生のためにアエロモナス・サルモニシダ株ＣＢ３にトランス接合した。
【０２５４】
ＧＬＰ  ＭＰＰ５を精製するために、初期ｐＨ６．９０±０．１５と温度２７℃に設定された３０Ｌの滅菌と定義された培地に、約１％ｖ／ｖの振盪フラスコ接種材料を接種した。発酵の間、滅菌済みの酸／アルカリを自動的に添加することによって、培地のｐＨを６．９０±０．１５に維持した。２０％を上回る容器内溶存酸素圧（ＤＯＴ）を常に保つために、発酵槽ＲＰＭとＳＬＭを調整した。ＭＰＰ５の発現は、細胞密度が６００ｎｍで０．３〜０．６のＯＤに達した時に、イソプロピルチオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導された。発現したタンパク質を培地中に分泌させ、誘導後数時間収集した。ＭＰＰ５を含む上清を６０ＳＰ  ＣＵＮＯフィルターを用いて回収した。細胞分離後、３０，０００ＮＭＷＣ  ＴＦＦ膜を用いて上清を濃縮させた。濃縮した上清を、 二度のクロマトグラフィー処理をし、許容できる純度のタンパク質をもたらした。すなわち、ニッケルキレートクロマトグラフィーと、その後の陰イオン交換クロマトグラフィーとを用いて精製した。陰イオン交換クロマトグラフィー処理からの画分を含むＭＰＰ５を貯留させ、得られる物質を限外ろ過によって約１ｍｇ／ｍＬまで濃縮し、続いてダイアフィルターを用いて調製緩衝液中に濾過した。０．２２μｍアブソリュートフィルタを用いて、認定された生物学的安全キャビネット中で精製ＭＰＰ５を滅菌濾過し、必要になるまで−７０℃に凍結した。この過程を用いた精製ＭＰＰ５の最終収量は約１００ｍｇ／Ｌであった。
【０２５５】
実施例６：アルビノラットにおけるＭＰＰ５の急性期前立腺内または静脈ボーラス注入毒性試験
この実施例は、ヒスチジン標識ＭＰＰ（ＭＰＰ５）のラットへの前立腺内投与が前立腺の重量を低下させることができることを示す、試験の予備段階の結果を示す。
【０２５６】
結果の概要
この試験の目的は、オスのラットに対する単回の前立腺内注射または静脈内ボーラス注入後、１、１４、または２８日の観察期間の後に、最大耐量（ＭＴＤ）を確認することと、ＭＰＰ（ＭＰＰ５）の潜在的毒性と毒性動態を調査することである。ＭＰＰ５は、ＰＳＡ切断部位を含むヒスチジン標識プロアエロリジン分子である。
【０２５７】
表７と８に試験デザインの詳細を示す。
【０２５８】
（表７）試験デザイン
ＭＴＤ試験
2008546650.tif 000008
ＩＰ−前立腺内、ＩＶ−静脈内、４８時間の観察期間後に動物を屠殺した。
【０２５９】
（表８）主要および毒性動態試験デザイン
2008546650.tif 000009
ＩＰ−前立腺内（２０μＬ）、ＩＶ−静脈内（０．０５ｍＬ）、ＴＫ−毒性動態
【０２６０】
臨床的徴候、体重、摂食量、眼科学、血液学、血清化学、尿検査、毒性動態、、剖検時の肉眼観察、臓器重量および組織病理学を評価した。体重、体重増加、摂食量、眼科学、または尿検査条件には影響がなかった。前立腺内４０μｇの投与を受けた一匹のＭＴＤの動物が、２日目に死んでいるのが認められた。死の前には、投与に関連した臨床的徴候はなかった。胃に黒い病巣が認められ、黒い領域と腫脹が注射部位（前立腺）に認められた。前立腺内２５μｇの投与を受けた主要試験の２匹の動物が、２日目に死んでいるのが認められた。死の前には、投与に関連した臨床的徴候は一匹の動物には見られなかったが、毛の着色（鼻口部）、青い皮膚、活動性の低下、衰弱、筋肉の緊張の低下、透明な液体排出物（眼窩周囲）、青白い目、苦しい呼吸、横向きに寝る、触ると冷たいのが、もう一匹の動物に認められた。一匹の動物の肉眼的所見には、注射部位（前立腺）に黒い領域、睾丸に黒い病巣、肝臓の近くの青白い物質を含む腹腔内の色の薄い透明な液体が含まれた。もう一方の動物には、変色を含む、脂肪と空腸中に病巣が認められた。肝臓に癒着が認められ、脾臓の肥大、胃と胸腺に複数の黒い領域、および副睾丸の近傍の腹部脂肪に黒い病巣が認められた。これらの２匹のオスに関して具体的な死亡原因は特定されていないが、腎臓の近傍での前立腺の炎症の重症度と、同時に起こった全身性の退行性変性がこれらの動物の死の一因となったことが推測される。
【０２６１】
投与に関連した臨床的徴候が、全てのＭＴＤのＩＰ投与レベルで投与された動物に認められた。１日目から４日目の間に、鼻口部、顎、前足、眼窩周囲、腹側／背側頸部を含むひとつ以上の部位での毛の赤い変色が、全てのグループの一部の動物に認められ。４０μｇの一匹の動物における泌尿生殖器の腫脹を含む、皮膚の青い変色（手術部位、腹部、泌尿生殖器、または鼠径部）が２０および４０μｇでそれぞれ１／３の動物に認められた。静脈投与を受けたＭＴＤの動物では、５０μｇの投与を受けた動物においてより高い頻度で、毛の赤い着色（鼻口部および／または眼窩周囲）が認められた。
【０２６２】
主要試験の対照を含む全ての前立腺内投与レベルからの動物において、毛の赤い着色（鼻口部）が主に認められたが、投与を受けた動物において概して頻度は高かった。この臨床的徴候は恐らく投与に関連があると考えられた。毛の赤い着色（鼻口部）は、全ての主要試験の静脈内投与動物にも認められた。追加的な臨床的徴候が注射部位（尾）に認められ、皮膚の痂皮および／または発赤またはその他の変色が含まれた。さらに、病変と自傷の疑いのために、２匹の動物は尾の切断を必要とした。これらの後者の変化は、試験製剤の刺激性の可能性を示唆し、これはその後の組織病理学的検査でさらに裏付けられた。
【０２６３】
主要試験の前立腺投与を受けた動物において、２日目に用量に関連した増加が一部の白血球要素に認められた。白血球、好中球、単球、および好塩基球数が、１０および／または２５μｇで投与された全てのグループにおいて増加した。２５μｇのＭＣＨＣと全ての投与レベルのＭＰＶにおいても増加が認められた。全ての投与レベルで、網状赤血球の割合と絶対数で減少が記録された。活性化部分トロンボプラスチン時間における、わずかではあるが、しかし投与関連性の増加が全ての前立腺内投与レベルに認められた。２５μｇの静脈内投与を受けた動物において同様の変化が認められた。白血球、好中球と好塩基球数が増加した。ＭＣＨＣ、ＭＰＶ、および赤血球分布幅（ＲＤＷ）も増加し、網状赤血球の割合と絶対数が減少した。１４日間の観察の後、屠殺された動物では、ＲＤＷとＭＰＶのみに増加が認められ、２８日間の後は、血液学の要素に違いは認められなかった。１日の観察の後で屠殺された動物に認められた変化は、試験物質に関連すると考えられた。１５日と２８日の観察期間後に示された結果はこれらの変化からの回復を示した。
【０２６４】
アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼとアラニン・アミノトランスフェラーゼの平均濃度の、投与量と関連した増加が２日目に認められ、２５μｇで著しいと考えられた。直接ビリルビン、尿素、クレアチニン、およびトリグリセリドにおける上昇も、２５μｇの前立腺投与で認められた。２５μｇでグルコース濃度に減少が認められ、１０μｇ以上で、グロブリンに対するアルブミンの割合の関連減少とともに、アルブミン濃度は減少し、総タンパク質濃度は２５μｇのみで減少した。２５μｇの静脈内投与を受けた動物では、尿素とカルシウム濃度にわずかな上昇が認められ、グロブリンに対するアルブミンの割合における対応する減少とともに、グロブリン濃度におけるわずかな上昇も認められた。これらの変化は、注射部位に認められた炎症に関連すると考えられた。２９日目には、アラニンアミノホスファターゼの濃度における上昇と、間接ビリルビンの濃度における減少が２５μｇの前立腺内投与にのみ認められた。
【０２６５】
化合物の終末半減期は、静脈内投与に関しては１２．８時間と推定された。Ｃｍａｘを、時間０まで逆算して値８１．３ｎｇ／ｍＬと推定することができた。観察されたピーク値（第一サンプリング時での）は７４．３ｎｇ／ｍＬであった。全身クリアランス（ＣＬ）と分配量（Ｖｚ）はそれぞれ４６．３ｍＬ／ｈと８４１ｍＬと推定された。前立腺内投与後、観察されたｔｍａｘは全てのケースについて投与後４時間で起こり、ピーク濃度は、１０と２５μｇでそれぞれ２．９５と３．５１ｎｇ／ｍＬであった。観察された異なるｔｌａｓｔのため、観察されたＡＵＣ０−ｔｌａｓｔはより高い用量で減少するように思われた。前立腺内経路に対する用量直線性をＣｍａｘとＡＵＣ０−ｔｌａｓｔを用いて推定した。用量標準化した暴露パラメータはともに１０μｇから２５μｇ減少し、対応する推定生体利用効率は２３.７と４.３８％であり、これらの全ては、投与レベルの増加に伴う、前立腺からの体循環中のＭＰＰ５の限定された吸収を示唆するものである。
【０２６６】
ＭＴＤ期では、オスのラットにおける４０μｇのＭＰＰ５の単回ＩＰ投与は明らかな死因をもたない死と関連していた。オスのラットにおけるＭＰＰ５の単回ＩＶ投与は、最大用量の５０μｇまで耐えることができた。
【０２６７】
主要試験期では、オスのラットにおけるＭＰＰ５の単回ＩＰ注射は、２５μｇでの２匹のラットの死と、２μｇ以上での、前立腺注射部位の肉眼的、顕微鏡的、および臓器重量の変化をもたらした。２匹のオスの死因は定かでないが、前立腺の炎症の重症度と関連変化がこれらの動物の悪化／死の一因となったことが予想される。その他の試験物質に関連する変化は回復期の２、１５、および／または２９日目に認められた。他の組織における肉眼的変化、顕微鏡的変化、臓器重量変化は、前立腺注射部位の変化に続発するものと考えられた。
【０２６８】
オスのラットにおけるＭＰＰ５の単回ＩＶ注射は、２５μｇ以上の用量で尾静脈注射部位の肉眼的および／または顕微鏡的変化ををもたらした。これらの変化は、２５μｇでの段階的な回復とともに、回復期の２、１５、および２９日目に認められ、試験物質の刺激作用を示唆するものである。他の組織における肉眼的および顕微鏡的変化は注射部位の変化に続発するものと考えられた。２日目の肝臓と脾臓の臓器重量の変化は顕微鏡学的相関はなく、１５日目までに回復した。
【０２６９】
結論として、最大４０μｇの投与レベルでの単回の前立腺内注射による、または最大５０μｇの投与レベルでの静脈内注射によるＭＰＰ５の投与は、２５μｇと４０μｇの前立腺内投与での、明らかな死因を示さない死をもたらしたが、腎臓に近い、試験物質に関連する前立腺の炎症の程度と、同時に起こる全身性退行が死の有力な要因であると考えられた。主に可逆性の変化が、臨床的徴候（２μｇ以上）、１０μｇ以上での血液学、および臨床生化学要素に認められた。病理学的変化は、全ての投与レベルで投与量依存的に存続したが、静脈内投与を受けた動物における退行の証拠は示さなかった。結果として、無影響濃度（ＮＯＥＬ）は前立腺内または静脈内経路のいずれにも決定されなかった。
【０２７０】
実験手順
３．１．  テストシステム
合計１８０匹のオスＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（Ｃｒｌ：ＣＤ（登録商標）  （ＳＤ）  ＩＧＳ  ＢＲ）ラット（ドブネズミ）を使用した。処置開始時での動物は、１２から１５週齢で３９９から４９５ｇの体重範囲であった。
【０２７１】
３．２  獣医学的処置
自傷の疑いがあるため、４日および７日目に、動物５０１０および５００４のそれぞれに尾部切断を実施した。これらの動物は経静脈的に処置したため、病理学的評価のために１０％の中性緩衝ホルマリン中に切断組織を保持した。
【０２７２】
処置前に、すべての動物の重さを量り、コンピュータによる無作為化手順を使用して処置グループへ無作為に割り当てた。無作為化は、パラメータとして体重を使用して階層化することにより行われた。病弱の動物は、グループに割り当てられなかった。研究デザインの詳細を、表９（ＭＴＤ）および表７（主要）に示す。
【０２７３】
（表９）ＭＴＤの研究
2008546650.tif 000010
ＩＰ―前立腺内、ＩＶ―静脈内
【０２７４】
ＭＴＤの研究に割り当てられた動物は、４８時間観察期間後で屠殺した。１日目に、技術的ミス（割り当てられた用量の１０倍の過剰摂取）があったため、ＩＰ用法に割り当てられた動物６００１および８００１をそれぞれの予備の動物６１０１および８１０１に取り換えた。同日の後で、動物８００１（４００μｇ）は、投与からおよそ４時間後に死亡が確認され、動物６００１（１００μｇ）は、健康状態が悪かったため、１日目の終りに安楽死させた。これらの動物に対し、外部および内部の精査を含め剖検を行ったが、組織病理学検査用の組織を保持しなかった。死亡前の動物６００１の臨床的徴候は、衰弱、筋緊張の減少、眼が半開きの状態、体温の低下、活動の低下および異常歩行などであった。動物８００１の臨床的徴候は、横向き寝、呼吸困難、呼吸数の低下、青白い肌、蒼白な眼、体温の低下、活動の低下、衰弱および筋緊張の減少などであった。動物６００１に対する肉眼的検査は、投与部位（前立腺）での単一の黒い領域のみを示した。動物８００１に関しては、下顎のリンパ節に相互的な黒い変色が認められ、注射部位（前立腺）で腫れが認められた。これらの死亡は、恐らく、ＭＰＰ５の多量投与に関連すると考えられ、本研究において、ＭＴＤに対するさらなる参考を提供するために報告される。
【０２７５】
４０μｇ以下での観察では限度があったため、１３日目に（ＭＴＤの研究）、静脈経路によるＭＰＰ５の毒性をさらに探求するために、さらに本経路による５０μｇの用量レベルでの動物を追加した。
【０２７６】
投薬開始前に、動物１０２５は歯列不整であるために不適切であると考えられ、予備の動物と取り替えられ、その動物は１１２５として割り当てられた。群に割り当てられなかったすべての動物は、研究の対象外とされ、その動物の処分は、文書で記録された。
【０２７７】
３．３．被験物質および賦形剤対照物質
被験物質は、３．２ｍｇ／ｍＬの濃度でのＭＰＰ５（Ｌｏｔ  Ｎｕｍｂｅｒ  ＰＴＩＣ−ＭＦ−ＰＡＬ−ＤＳ−００１）であり、冷凍時は、被験物質は無色固体であり、−２０℃の直射日光のない場所で保存された。賦形剤対照は、リン酸緩衝生理食塩水−ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４であった。
【０２７８】
３．４  投与製剤の調製
投与製剤を使用日に調製した。各日に、ＭＰＰ５の３．２ｍｇ／ｍＬの適量原液を測定し、ＰＢＳ，  １ｍＭ  ＥＤＴＡの適量で希釈した。
【０２７９】
３．５  被験物質／対照物質の投与
ＭＴＤ研究
３．２節および表９に説明されているように、各３匹から成るラットの群は、１日に前立腺内または静脈内のいずれかで投薬され、投薬後最大４８時間までの臨床的症状および潜在毒性を観察した。静脈内投与に関しては、尾静脈経由で静脈注射により０．５ｍＬの投与量の 被験物質を投与した。
【０２８０】
前立腺群に関しては、イソフルレンを使用して、投与前に動物に麻酔した。少なくとも術前１時間および術後２日まで、動物は筋肉内にベンザチンペニシリンＧおよびプロカインペニシリンＧ（０．１ｍＬ）の抗生物質注射を受けた。さらに、動物は手術日にブプレノルフィン（０．０５ｍｇ／ｋｇ）の皮下注射を受けた。
【０２８１】
手術用メスの刃を使用して、陰茎の頭側の０．５ｃｍから開始し、およそ２ｃｍの正中切開を行った。腹部を同様の長さに切った。前立腺の２つの腹葉を限局し、２０μＬの処方済みのＭＰＰ５またはＰＢＳ／ＥＤＴＡ  ｐＨ  ７．４を適切な注射器を使用して右腹葉に注射した。縫合前に、温かい（およそ３７℃）米国薬局方０．９％の塩化ナトリウム注射 で部位を洗浄した。適切な縫合材料を使用して層をなして部位を縫合した。
【０２８２】
静注経路へ割り当てられた動物に関しては、 尾静脈経由で静脈注射により０．５ｍＬの投与量の 被験物質を投与した。
【０２８３】
主要研究
ＭＴＤの段階中で決定された手順によって、動物は薬剤を投与された。静注経路へ割り当てられた動物に関しては、しては、 尾静脈経由で静脈注射により０．０５ｍＬの投与量の 被験物質を投与した。処置完了後、１日、１４日または２８日の回復期間中、主要研究の動物は投与しないで保持した。
【０２８４】
３．６  観察
臨床的観察： 
全研究期間を通して死亡および健康障害の徴候および／または 処置への反応に対して、すべての動物を１日２回（到着日および剖検日には１回）観察した。さらに、処置開始前に少なくとも１回、処置期間および回復期間には毎日精密検査を実施した。（主要およびＭＴＤ研究の動物）
【０２８５】
体重：
無作為割当した日、および処置期間および回復期間中、週２回、すべての動物のそれぞれの体重を量った（主要研究動物）。さらに、予定した剖検前にそれぞれの主要研究／回復した動物の体重を量った（絶食した）。投与前、および屠殺前に、ＭＴＤ研究の動物の体重を量った。
【０２８６】
飼料消費：
すべての主要研究の動物に対する個々の飼料消費を前治療期間の最終週に開始して、処置期間および回復期間中に毎週測定した。
【０２８７】
眼科学：
処置開始前に一回（すべての動物）および剖検前にもう一回（主要検査動物）、有資格の動物眼科医が眼底検査（間接検眼法）および生体顕微鏡検査（細隙灯）を実施した。
【０２８８】
実験室での検査：
血液学的検査および血液生化学的検査のための血液採取が２日、１５日および２９日目の剖検ですべての主要研究の動物に実施された。血液採取前に動物から飼料を一晩中除去した。イソフルラン麻酔下で、腹大動脈から血液試料を採取した。
【０２８９】
およそ１６時間の回収期間、飼料なしで代謝ケージに入れられた主要研究の動物から、２日、１５日および２９日目の剖検前に尿試料を回収した。
【０２９０】
検査を受けた血液学的パラメータは以下のものである：活性化した部分トロンボプラスチン時間、血球形態学、赤血球恒数（ＭＣＶ、ＭＣＨ、ＭＣＨＣおよびＲＤＷ）；ヘモグロビン・ヘマトクリット値、平均血小板容積、血小板数、プロトロンビン時間、赤血球数、網状赤血球数（絶対計数および割合）、白血球数（総数、分画絶対数および分画割合）。
【０２９１】
検査を受けた血液生化学検査、パラメータは以下のものである：Ａ／Ｇ比（算出された）アラニン・アミノトランスフェラーゼ、アルブミン、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、血中尿素窒素、塩化カルシウム、コレステロール、クレアチニン、グロブリン（算出された）、グルコース、無機リン、カリウム、ナトリウム、総ビリルビン、総タンパク量、トリグリセリド。
【０２９２】
検査を受けた尿検査のパラメータは以下のものである：ビリルビン、潜血、色および外観、クレアチニン、グルコース、ケトン体、遠心での沈殿物の亜硝酸塩の顕微鏡検査、ｐＨ、タンパク質、比重、ウロビリノーゲン、容積。
【０２９３】
免疫原性評価（１４日目および２８日目の主要研究のみ）
血液試料は、 主要研究のそれぞれのラットから、 投与前（ベースライン）は頸静脈で、 および屠殺時は、イソフルラン麻酔の後、腹大動脈で（臨床病理学のための血液試料とともに）採血した。試料は、血清分離管に置かれ、数回逆さにし、２０から３０分間室温で凝血させ、その後、およそ４℃で１０分間、ほぼ１２００ｇで遠心分離機にかけた。
【０２９４】
３．７  毒物動態学
研究１日目で、投与前、投与後１５分、３０分および１、２、４、８、２４および４８時間後の時点ごと、群ごとに３匹の毒物動態学から代わる代わるＫ３  ＥＤＴＡ管に頸静脈の静脈穿刺で血液試料（〜０．５ｍＬ）を採取した。１０分間、およそ２７００ｒｐｍで冷凍遠心（およそ２〜８℃）で分離するまで濡れた氷上に直ちに血液試料を置いた。血漿を分離し、２番目の管に移し、ドライアイス上に置いた。およそ−２０℃で血漿試料を保存し、ＭＰＰ５値について分析した。
【０２９５】
抗体サンドイッチ法に基づいた、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により血漿試料を分析した。９６ウェルマイクロタイタープレートにＭＰＰ５に特異性のある捕捉抗体（マウス抗アエロリジン単クローン抗体）を塗布して、固相を形成し、標準および品質管理試料にある検体を捕捉した。その後、検体分子の異なるエピトープに結合する二次抗体（ウサギ抗アエロリジンポリクローナル抗体）を抗体−検体−抗体のサンドイッチを完成するために追加した。その後、ウサギＩｇＧ抗体の定常領域に結合する検出抗体酵素複合体（ヤギ抗ウサギＩｇＧ、ｈｏｒｓｅ  ｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ複合体）を追加した。テトラメチルベンジジン基質を使用して、捕捉した複合体を視覚化し、ＳｐｅｃｔｒａＭＡＸプレートリーダーを使用して、４５０ｎｍで測定した。
【０２９６】
前立腺投与経路に関しては、血漿濃度データについての非コンパートメント毒物動態学分析を実施した。実用的に、毒物動態学分析は、ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、ｋおよびｔ１／２の評価を含んだ。ｔｍａｘおよびＣｍａｘは、測定値である。可能であれば、標準コンピュータソフトウェアプログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（バージョン３．２）を使用して、台形公式法によりＡＵＣパラメータを算出した（ＧｉｂａｌｄｉおよびＰｅｒｒｉｅｒ、１９８２）。濃度に対する時間の曲線の見掛け末期の選択した時点の直線回帰分析により、ｋを決定した。見掛け消失半減期は以下のように算出された：
ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋ。
【０２９７】
静脈内投与経路に関しては、血漿濃度データについての非コンパートメント毒物動態学分析を実施した。実用的に、毒物動態学分析は、ｔｍａｘ、Ｃｍａｘ、ＡＵＣ、ｋ、ｔ１／２、ＶｚおよびＣＬの評価を含んだ。Ｃｍａｘは、０時間の時点へ溯って外挿されるであろう。標準コンピュータソフトウェアプログラムＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（バージョン３．２）を使用して、台形公式法によりＡＵＣパラメータを算出した（ＧｉｂａｌｄｉおよびＰｅｒｒｉｅｒ、１９８２）。濃度に対する時間の曲線の見掛け末期の選択した時点の直線回帰分析により、ｋを決定した。見掛け消失半減期は以下のように算出された：
ｔ１／２＝ｌｎ２／ｋ。Ｄｏｓｅ／ＡＵＣでクリアランス（ＣＬ）を算出し、分布の見掛け体積（Ｖｚ）はＣＬ／ｋとして算出された。
【０２９８】
３．８  最終手順
肉眼的病理学：
研究中に死亡が確認されたＭＴＤ研究の動物は、組織保存することなく剖検の対象になった。研究中に死亡が確認されたすべての主要研究および回復した動物は、剖検の対象であり、組織試料は保存された。
【０２９９】
処置期間および回復期間の完了において、すべての生存動物は、イソフルラン麻酔後、腹大動脈から放血され、室内実験のために血液試料を採取した。自家融解の変化を避けるために、死体の完了肉眼的病理検査は、すべての主要研究動物の安楽死後、できるだけ早く実施された。
【０３００】
臓器の重量：
予定した剖検で安楽死したそれぞれの主要研究動物に関しては、以下の臓器を脂肪を残さずに解剖し、重量を量った：副腎、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、睾丸、下垂体、前立腺、脾臓、胸腺、甲状腺葉（副甲状腺付き）。対の臓器は、一緒に重量を量り、体重に対して臓器重量を算出した。
【０３０１】
組織保存：
それぞれの主要研究動物の剖検の完了において、以下の組織および臓器を保持した：異常部位、動物識別部、副腎（胸部）、骨および骨髄（胸骨）、脳（大脳、小脳、中脳および延髄）、盲腸、大腸、十二指腸、副睾丸、食道、眼、ハーダー腺、心臓（大動脈の切片を含む）、回腸、注射部位（前立腺）群１〜４、注射部位（尾静脈）群５、空腸、腎臓、涙腺、肝臓（２葉の試料）、肺（２葉の試料）、リンパ節（下顎および腸間膜）、乳腺（鼠径）、鼻腔および膿瘻（３レベル）、視神経、膵臓、下垂体、前立腺（注射されていない葉）、直腸、唾液腺、坐骨神経、精嚢、骨格筋、皮膚（鼠径）、脊髄（頚椎）、脾臓、胃、睾丸、胸腺、甲状腺葉（および副甲状腺）、舌、気管、尿管（両側性）、膀胱。
【０３０２】
副睾丸、眼、視神経および睾丸を除いて、組織固定法および保存のために中性緩衝液の１０％ホルマリンを使用し、副睾丸、眼、視神経および睾丸は、Ｚｅｎｋｅｒ’ｓ  ｆｌｕｉｄ（安楽死した動物のみ）に固定した。すべての安楽死した動物に関しては、３つの大腿骨髄の塗抹標本を準備し、着色した。塗抹標本を保存したが、評価しなかった。
【０３０３】
組織病理学：
パラフィンろうに組織を埋め込み、区分化され（区分化する前に鼻腔および膿瘻、胸骨および尾静脈注射部位を脱灰した）、ヘマトキシリンおよびエオシンで着色し、以下のように病理組織学的に検査を行った。
【０３０４】
第１、第４および第５群：組織保存下で記載された組織（動物識別部および直腸を除く）
第２群および第３群：処置関連の所見を示す組織、すべての肉眼的病変組織および以下に記載する標的組織。
【０３０５】
脳、心臓、腎臓、肝臓、リンパ節、注射部位（前立腺）、前立腺（注射されていない葉）、脾臓、甲状腺葉（および副甲状腺）、尿管および膀胱を含む標的組織の組織試料は、すべての投与群のすべての主要研究動物について処理し、検査を行った。眼、甲状腺および皮膚のそれぞれの所定の切断された部分にある場合にのみ、視神経、副甲状腺および乳腺の病理組織学的検査を行った。
【０３０６】
統計分析
研究実施中に得た数値データは、群平均および標準偏差の計算をほどこした。関心のそれぞれのパラメータについて、０．０５の有意水準でレーベンテストを使用して、群分散を比較した。群分散の間の違いに有意性が見られない場合には、パラメトリック一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実施した。平均間で有意な差異がＡＮＯＶＡ（ｐ≦０．０５）により示された場合、対照群とそれぞれの処置群の間で群平均の比較を実施するためにダネット「ｔ」検定を使用した。
【０３０７】
レーベンテストが不均一群分散を示す（ｐ≦０．０５）場合にはいつでも、すべての考慮された群を比較するためにノンパラメトリックのＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ｔｅｓｔを使用した。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ｔｅｓｔが有意あった（ｐ≦０．０５）場合、対照群とそれぞれの処置群との間の有意な差異をＤｕｎｎ’ｓ  ｔｅｓｔを使用して評価した。
【０３０８】
それぞれの関心の一対群比較に関しては、０．０５、０．０１および０．００１の水準で有意を報告した。
【０３０９】
結果および考察
１．  投与製剤の分析
研究で使用される投与製剤のｐＨ、重量オスモル濃度および密度評価の結果は、表１０に示される。
【０３１０】
（表１０）投与製剤ｐＨ、重量オスモル濃度および密度
2008546650.tif 000011
【０３１１】
２．  死亡
ＭＴＤ研究
２日目に、動物８１０１（４０μｇ、ＩＰ）の死亡が確認された。死亡前に、処置関連の臨床的徴候はなかった。剖検で、黒色の病巣が胃の中に見られ、注射部位（前立腺）に黒色領域および腫れが指摘された。明確な死亡原因は断定されなかった。
【０３１２】
主要研究
２日目に、動物４００５および４０１３（２５μｇ、ＩＰ）の死亡が確認された。死亡前に、動物４０１３に対する処置関連の臨床的徴候はなかった。毛の染色（鼻口部）、青い皮膚、活動の低下、衰弱、筋緊張の減少、透明の液体の放出（眼窩周囲）、蒼白な眼、呼吸困難、横向き寝、体温の低下などが動物４００５に対して指摘された。
【０３１３】
動物４００５に対する剖検で、肉眼で見える見解には以下のものが含まれた：注射部位（前立腺）の黒色領域、睾丸内の黒色病巣、腹腔内の薄い色の透明な液体、肝臓に隣接する薄い色の物質を含む。動物４０１３に関しては、脂肪および空腸内に変色を含む、病変が見られた。癒着が肝臓内で見られ、膵臓の肥大、胃および胸腺内の多数の黒色領域、副睾丸に隣接する腹部脂肪内の黒色病巣が見られた。双方の症例の死因は、不確かであるが、腎臓への隣接部で病理組織学的に観察された前立腺炎症の重症度、および、同時発症した全身変性変化は、これらの動物の死に一因すると推測された。
【０３１４】
３．  臨床的観察
ＭＴＤ研究
すべてのＭＴＤ  ＩＰの投与水準（１０〜４０μｇ）で処置された動物に処置関連の影響が見られた。１日目と４日目の間で、鼻口部、顎、前足、眼窩周囲、および腹部／背部頚椎を含む、一つ以上の部位ですべての群からの動物の２／３に赤い毛の染色が見られた。動物８００２（４０μｇ）の泌尿生殖器の腫れを含み、２０および４０μｇのそれぞれの動物の１／３で青い皮膚の変色（手術部位、腹部、泌尿生殖器または鼠蹊部位）が指摘された。これらの観察は外科手技に関連している場合もあるが、発生率と重症度は４０μｇで増加した。
【０３１５】
静脈投与で処置された動物において、処置関連の臨床的徴候は、赤い毛の染色（鼻口部および／または眼窩周囲）に限定され、５０μｇで処置された動物においてより発生率が高くなることが指摘された。１日目から４日目の間、５０μｇより少ない場合に、これらの徴候が観察された１／３と比較して、これらの徴候が高投与量の動物の最高５／５に見られた。
【０３１６】
主要研究
２日目の終了
対照動物の３／７、２μｇの動物の１／７、１０μｇの動物の５／７、２５μｇの動物の３／７を含む、すべてのＩＰ用量水準からのいくつかの動物に赤い毛の染色（鼻口部、眼窩周囲、および／または頭蓋）が指摘された。動物４０１４（２５μｇ）は、両眼から赤色の放出物が観察され、２日目の剖検前に、動物４０１５は、活動の低下、および体温の低下があった。
【０３１７】
４．飼料消費
飼料消費に影響がなかった。
【０３１８】
５．眼科学
眼科学の見解はなかった。
【０３１９】
６．血液学
２日目に終了したＩＰ動物において、投与関連の２倍またはそれ以上の増加がいくつかの白血球パラメータに見られた。白血球（ＷＢＣ）、好中球、単核細胞および好塩基球の数は、すべての処置群で増加し、１０および／または２５μｇで統計的に有意であった。統計的に有意な増加はまた、２５μｇでの平均赤血球ヘモグロビン濃度（ＭＣＨＣ）およびすべての投与水準での平均血小板容積（ＭＰＶ）に見られた。すべての投与水準での網赤血球の割合および絶対値の減少が記録された。わずかではあるが、活性部分的なトロンボプラスチン時間における投与関連の増加がすべてのＩＰ投与水準でみとめられ、２５μｇで統計的に有意であった。
【０３２０】
類似の変化がＭＰＰ５の２５μｇで静脈投与の処置をされた動物に観察された。ＷＢＣ、好中球および好塩基球の数は、増加した。さらに、ＭＣＨＣ、ＭＰＶおよび赤血球分布幅（ＲＤＷ）を増加し、網赤血球の割合および絶対値を減少した。観察の１４日後に終了した動物において、ＲＤＷおよびＭＰＶのみの増加が見られた。観察の２８日後に、血液学パラメータにおける差異は指摘されなかった。観察の１日後に終了した動物において指摘された変化は、被験物質関連であると考えられ、病理組織学的に相関性があった。１５日および２８日の観察期間後に示される結果は、これらの変化から回復の証拠を示す。その他のわずかな差異は、偶発的であり、処置に関係ないと考えられた。
【０３２１】
７．血清化学
２日目に、ＩＰの２５μｇで統計的有意な水準まで、投与関連の増加がアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの平均およびアラニン・アミノトランスフェラーゼ濃度に見られた。これらは、２５μｇで著しい変化があると考えられた。また、直接ビリルビン、尿素、クレアチニンおよびトリグルセリド濃度の増加がＩＰの２５μｇで指摘された。２５μｇでグルコース濃度の減少が見られた。アルブミン濃度は、アルブミンとグロブリンの比の減少に関連して１０μｇ以上の場合に減少し、総タンパク質濃度が２５μｇの場合のみ減少した。
【０３２２】
ＩＶの２５μｇで処置された動物において、わずかな増加が尿素およびカルシウム濃度に見られた。グロブリン濃度のわずかな増加もまた、それに対応するアルブミンとグロブリンの（Ａ／Ｇ）比の減少とともに指摘された。グロブリンの変化（および結果として、Ａ／Ｇ比）は、注射部位での炎症に関連する可能性があると考えられた。
【０３２３】
１５日目に、ＩＶ処理の動物を含むすべての投与水準で統計的に有意な減少がトリグリセリド濃度で見られた。これらは、毒物学的には有意ではなく、脂質代謝におけるわずかな変化に関連がある可能性があると考えられた。
【０３２４】
２９日目に、アラニンアミノホスファターゼ濃度の増加および間接ビリルビンの減少がＩＰの２５μｇのみに指摘された。これらの変化は、病理組織学的に説明される二次変化に関連かのうせいがある。
【０３２５】
その他の毒物学的に有意な変化はなかった。
【０３２６】
８．尿検査
尿検査パラメータにおいて明白な影響はなかった。
【０３２７】
９．毒物動態学
ＭＰＰ５の血漿濃度は、一般的にはそれぞれの時点でそれぞれの群の個々の動物間で類似したものであった。投与水準が体重または前立腺の重量により正規化されなかったので、血漿濃度値の変動が予想された。ＭＰＰ５は、対照動物から採取した試料または投与前に採取した試料において定量化することができなかった。
【０３２８】
検査群において、ＭＰＰ５の血漿濃度は、２μｇでの動物から採取したいずれの試料において、検出可能な濃度がなく、一般的には前立腺に投与した被験物質の投与レベルの増加に伴い増加した。ＭＰＰ５は、１０μｇで処置された動物において、最高２４時間、２５μｇで処置された動物において、８時間、第５群（２５μｇ、静脈投与）で４８時間まで検出可能であった。すべてにおいて、３つの複合プロファイルを取得し、さらなる評価のために検討した。
【０３２９】
末期は、複合ＩＶプロファイルのために推定でき、末期半減期は、１２．８時間として推定された。残りのプロファイルに関しては、信頼性をを持って末期を推定できなかった。従って、ｋから、誘導されるすべてのパラメータ（ｔ１／２、ＡＵＣ０−ｉｎｆおよび％の予想）は報告されなかった。ＩＶプロファイルに関しては、ＡＵＣ０−ｔｌａｓｔから外挿されたＡＵＣ０−ｉｎｆの割合は、６％より低く、このプロファイルが実験データからうまく特性化されたものであることを示した。
【０３３０】
前立腺投与後、観察されたｔｍａｘは、すべての場合において、投与後４時間後に起こり、１０および２５μｇでは、それぞれ、２．９５および３．５１ｎｇ／ｍＬのピーク水準であった。観察されたＡＵＣ０−ｔｌａｓｔは、高投与量（４８．５対２２．４ｎｇ・ｈ／ｍＬ）で減少した。しかしながら、この結果は、ＩＰの２５μｇ（ＩＰの１０μｇで８時間対２４時間）で観察されたより短いｔｌａｓｔにより偏向された。ＩＶ投与後、Ｃｍａｘは、８１．３ｎｇ／ｍＬの値で、０時間まで逆外挿することができた。観察されたピーク値（初試料時間）は、７４．３ｎｇ／ｍＬであった。全身クリアランス（ＣＬ）および分配量（Ｖｚ）は、それぞれ、４６．３ｍＬ／ｈおよび８４１ｍＬと推定された。
【０３３１】
前立腺投与後、、投与正規化平均ピーク血漿濃度および曲線暴露パラメータ（それぞれＣｍａｘおよびＡＵＣ０−ｔｌａｓｔ）の下の領域を使用して、１０から２５μｇの投与水準で投与量直線性を評価した。投与正規化暴露パラメータの双方は、１０μｇと２５μｇの間で減少した。これは、ＭＰＰ５の前立腺から全身循環への限定的な吸収をを示している可能性がある。
【０３３２】
前立腺投与後、中度から高投与量において観察された領域に基づいて（ＡＵＣ０−ｔｌａｓｔ）、これらの領域（投与水準へ正規化されている）を静脈内投与後に得た投与正規化領域と比較することにより、バイオアベイラビリティの割合を決定した。推定したバイオアベイラビリティは、２３．７および４．３８％であった。
【０３３３】
１０．臓器重量
前立腺注射
時折、統計的有意に水準まで、すべての屠殺日における前立腺において、および２日目の屠殺における脾臓において、絶対および相対臓器重量（体重に対する臓器の重量）の変化がみとめられた。前立腺の重量は、２日目の１０μｇおよび２５μｇの動物において、対照動物と比較すると２６％から４５％高くなっていた。前立腺の重量は、１５日目における処置された動物で、対照動物と比べると１６％から２４％低く、２９日目の１０μｇ以上の場合には、１９％から２１％低い。これらの変化は、観察した顕微鏡的所見と一致した。脾臓の重量は、対照動物と比べると２日目の２５μｇの場合、およそ３６％低かった。これは、二次変化と考えられ、１５日目に回復した。
【０３３４】
静脈注射
２日目に、ＩＶの２５μｇの動物は、組織学的相関なく、対照動物と比較すると肝臓および脾臓の重量はおよそ２１％高く、１５日目に回復した。
【０３３５】
１１．  肉眼的病理
ＭＴＤの研究
前立腺の注射部位の変化は、すべてのＩＰ投与水準で認識された。変化は、黒い変色／領域、まだら、および腫脹／腫れなどを含んだ。１日目に置換された動物（番号６００１、８００１）またはＩＰ注射後２日目に死亡が確認された動物（番号８１０１）は、上記に説明されているように前立腺の注射部位の変化がいくつかあった。特定の死因は、決定されなかった。尾静脈内の静脈（ＩＶ）注射は、第８群および第９群の動物の尾にある疥癬に関連があった。その他の変化は、処置関連ではなく、散発性、手順関連または末期であると考えられた。
【０３３６】
主要研究  
前立腺の注射部位の変化は、すべての屠殺日に認識された。２日目の変化は、すべての投与水準で黒い変色／領域／病巣、癒着、腫脹／腫れにより特徴付けられた。１５日目および２９日目の変化は、１０μｇ以上の動物において、蒼白領域、隆起、堅固、および／または小さいと記載された。癒着および蒼白領域は、しばしば１０μｇ以上の１５日目および２９日目の屠殺日に肝臓および脾臓にみとめられ、前立腺の注射部位の変化の二次症状のようであった。２日目に死亡が確認された動物４００５（ＩＰの２５μｇ）は、上記に説明されているように前立腺の注射部位に変化がいくつかあった。特定の死因は、決定されなかった。
【０３３７】
尾静脈内の静脈注射は、すべての殺処分日において、尾にある疥癬に関連があった。尾端の喪失の有無にかかわらず、１５日目と２９日目に潰瘍があった。肝臓の膨張が２日目の屠殺日にみとめられた。
【０３３８】
その他の変化は、処置関連ではなく、散発性、手順関連または末期であると考えられた。
【０３３９】
１２．  組織病理学
前立腺の注射
ＭＰＰ５によるものとされる顕微鏡的変化が、２日、１５日および２９日目に２μｇ以上の場合、前立腺の注射部位で観察された。軽度から重度の急性炎症が、２日目にはすべての投与で観察され、一般的には投与依存重症度において増加があった。炎症はフィブリン、混合細胞浸潤、および腺房腺の壊死などにより特徴付けられた。処置および対照動物において、浮腫および出血が観察され、従って、部分的に手順関連であると考えられた。軽度から著しい慢性炎症および／または繊維症が１５日目および２９日目のすべての投与水準で観測され、一般的には重症度において投与依存の増加があった。繊維症、単核球浸潤および腺房腺の壊死が炎症を特徴付けた。しばしば、同時発生の腺房萎縮／膨張がこれらの変化に付随して起こった。軽度の繊維症および腺房萎縮／膨張は、２９日目にほとんど観察されなかったため、主として処置関連であると考えられた。また、急性および慢性の変化は、隣接する前立腺葉で観察され、一般的には発生率の低下および重症度の変化があった。急性炎症、浮腫および出血は、２日目に前立腺の重量が多いことと関連し、繊維症および腺房萎縮／膨張は、１５日目および２９日目に前立腺の重量が少ないことと関連し、一般的には肉眼的所見と関連した。これらの変化は、前立腺の注射部位でＭＰＰ５の刺激性の効果を示す。
【０３４０】
他の組織における頻繁な顕微鏡上の観察は、隣接する骨盤内器官および腹腔を通じて、または全身反応および／または変性変化のいずれかによる前立腺の注射部位の炎症の二次的な症状あると考えられた。膨張皮膜表面または漿膜の表面の出血および繊維症を伴って、あるいは、伴わずに、急性および慢性炎症は、脂肪、肝臓、それぞれ大腸および小腸、膵臓、脾臓、胃、精嚢、副睾丸、睾丸よび膀胱で観察された。反応および／または変性変化は以下のものを含んだ：骨髄性の過形成、脾臓内の髄外造血の増加、リンパ節、脾臓および胸腺内のリンパ性の萎縮および／または過形成、肝臓の単核浸透物、単細胞壊死および有糸分裂像の増加、および精巣萎縮（副睾丸オリゴ／無精子症の同時発生を伴う）。脾臓のリンパ性の萎縮は、２日目の２５μｇの場合のオスにおいて、脾臓の重量が少ないことを説明し、従って、二次的であると考えられた。
【０３４１】
特定の死因は、２日目に死亡が確認された２匹のオス（２５μｇ）には認識されなかった。しかしながら、腎臓への隣接部で前立腺炎症の重症度および同時発症全身変性変化は、これらの動物の死に一因すると推測された。
【０３４２】
その他の変化は、散発性、偶発的、末期であり、またはこの年齢およびラットの系統には予期されることであり、直接に処置関連はなかった。
【０３４３】
静脈注射
ＭＰＰ５によるものとされる顕微鏡的変化が、２日、１５日および２９日目に、尾静脈の注射部位で観察された。２日目に皮膚および皮下組織の軽度から著しい急性炎症が、表皮腫瘍および痂皮形成を伴い、あるいは伴わず、動物の大部分において、フィブリン、出血、壊死および混合細胞浸潤などにより特徴付けられた。１匹の動物には、隣接した組織および所属リンパ節に広がる中度の壊死があった。１５日目および２９日目における発生率の低下および変化の重症度の低下は、段階的回復を示唆した。線維症および単核球浸潤により特徴付けられた慢性炎症は、表皮腫瘍および痂皮形成および希な壊死および隣接した骨の炎症を伴い、あるいは伴わずに、観察された。顕微鏡的所見は、一般的には肉眼的変化と関連した。これらの変化は、特に、注射部位での血管周囲の組織で、ＭＰＰ５の刺激性の効果を示す。
【０３４４】
その他の組織における変化の低発生率は、２日目に観察された注射部位の炎症性変化に対して二次的であると考えられ、一般的には１５日目および２９日目に回復した。これらには、脾臓内の壊死および炎症、血管周囲の好中球、単核球浸潤または混合細胞の副睾丸、精嚢、睾丸および肝臓への浸潤、骨髄性の過形成、リンパ節浮腫、リンパ節、脾臓および胸腺内のリンパ球萎縮、および２９日目に観察された睾丸の萎縮が含まれた。２日目における肝臓および脾臓の重量増加は、顕微鏡的な相関がなかった。
【０３４５】
５．結論
結論では、最高４０μｇまでの投与水準で単一前立腺注射または最高５０μｇまでの投与水準で静脈注射によるＭＰＰ５の投与は、ＩＰの２５μｇおよび４０μｇで死亡するという結果を生じ、これは、明確な死因はないが、前立腺炎症に関連する被験物質および腎臓への隣接部の範囲および併用全身変性変化は、死亡にいたる潜在的一因であると考えられた。ほとんどの可逆変化は、臨床的徴候（≧２μｇ）、１０μｇ以上の場合に、血液学および臨床生化学パラメータに見られた。病理学的変化は、投与関連の形態ですべての投与水準で持続したが、静脈投与で処置された動物において退行の証拠を示した。従って、無影響量（ＮＯＥＬ）は、前立腺経路または静脈経路のいずれかに対しても決定されなかった。
【０３４６】
参考文献
Ｄｕｎｎ，ＯＪ．１９６４，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍｓ，Ｔｅｃｈｎｏｍｅｔｒｉｃｓ，６，２４１−２５６．
ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，１９９９．ＳＡＳ／ＳＴＡＴ（登録商標）Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８，Ｃａｒｙ，ＮＣ：ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｉｎｃ．，３８８４  ｐｐ．
【０３４７】
実施例７：サルにおけるＭＰＰ５の急性毒性
本実施例は、ＰＳＡ切断部位（ＭＰＰ５）を備えるヒスチジンで標識されたＭＰＰの前立腺投与が前立腺に投与依存の損傷を生じることを示す研究の予備段階の結果を示す。本研究の目的は、性的に成熟しているオスのカニクイザルにおけるＭＰＰ５の単一前立腺注射の潜在的な局所毒性を２週間の間評価することであった。
【０３４８】
実験的設計の概要
概要：
合計１６匹のオスのカニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）を下記の表１１に示すように処置群に割り当てた。動物の年齢は、およそ３．６から１１．７歳であり、体重はおよそ２．８から７．９ｋｇであった。動物は、中国、ベトナム、インドネシア、およびモーリシャス共和国から輸入された。
【０３４９】
（表１１）
2008546650.tif 000012
１前立腺の重量は、前立腺の重量と体重との間の従来確立された関係から推定される。用量の２分の１が前立腺の各葉に注入される。
【０３５０】
すべての動物は、肛門周囲の前立腺注射によって全身麻酔のもとで一度投与された。投与初日を１日目と指定した。動物は、臨床的徴候（１日２回）、飼料消費（１日１回）、体重（１日目、３日目、８日目、および１５日目）、心電図（研究前および２日目および１４日目）、および眼科的状態（研究前および１４日目）の変化に対して評価された。研究前および３日目および１４日目に、臨床病理学指数（血清化学［Ｃ反応性タンパク質を含む］、血液学および凝固）を決定した。投与後、各時点で、毒物動態学分析、被験物質への抗体および前立腺特異抗原（ＰＳＡ）に対する血液試料を採取した。表１１に示すように、３日目および１５日目に８匹の動物を安楽死させた。終了時に、すべての動物において、全剖検を実施し、組織（選択した前立腺組織を含む）を採取し、保存し、処理し、顕微鏡によって検査した。本研究は、ＭＰＰ５の急性局所毒性を評価した。
【０３５１】
被験物質は、ＭＰＰ５、ロット番号ＰＴＩＣ−ＭＦ−ＰＡＬ−ＤＳ−００１であり、対照物質は、ＰＢＳ−ＥＤＴＡであった。被験物質の溶液は、その活性成分の濃度が、３．２ｍｇ／ｍＬであり、調製日に投与液を調製する前に、適切な０．２２ミクロンＰＶＤＦフィルターを通してフィルター処理された。対照賦形剤のよるフィルター処理済みの被験物質の保存液の希釈は、目的とする投与を達成するために適切な濃度で投与液を産出するために投与日に実施された。
【０３５２】
ＵＳＤＡ動物保護法（９  ＣＦＲ、Ｐａｒｔｓ  １、２および３）に定められ、動物実験に関する指針（ＩＬＡＲ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ、１９９６、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  Ｐｒｅｓｓ）にも説明されている方法に従って動物を収容した。
【０３５３】
最初に、下記の表に示すように、サルの原産に反映するＰｒｏｖａｎｔｉｓ番号を動物に割り当てた。６００１〜６００８のＰｒｏｖａｎｔｉｓ番号に割り当てられた動物は、中国産であった。７００１〜７００４のＰｒｏｖａｎｔｉｓ番号に割り当てられた動物は、インドネシア産であった。８００１〜８００３のＰｒｏｖａｎｔｉｓ番号に割り当てられた動物は、モーリシャス共和国産であった。９００１のＰｒｏｖａｎｔｉｓ番号に割り当てられた動物は、ベトナム産であった。
【０３５４】
動物の原産および体重が広範囲であるため、下表により、処置群へ無作為に動物を割り当てた。
2008546650.tif 000013
被験物質および対象物質の投与、群の割り当て、および投与水準：
2008546650.tif 000014
１前立腺の重量は、前立腺の重量と体重との間の従来確立された関係から推定される。
２投与の半分が前立腺の各葉に注射される、すなわち、一葉あたりおよそ２５μｌ／ｇ前立腺である。
【０３５５】
投与は以下のように実施された。注射経路は、肛門周囲の前立腺ボーラス注射であり、頻度は、一度であった。初めに、ケタミンの筋肉内注射でサルを落ち着かせ、外科手技中、鎮静剤および／または麻酔薬の投与で一時的な静脈内カテーテルを設置した。肛門下の肛門周囲領域に小さい皮膚切開を行い、前立腺の視覚化および識別をするために筋肉および皮下組織を鈍的切開した。被験物質および対象物質は、前立腺の重量に従って与された。前立腺のおよその重量は、動物の体重および体重と前立腺の重量との間の従来確立された関係から推定され（前立腺の重量（ｇ）＝０．０７２９４＋（−０．２３０９×ｋｇ）＋（０．０６２９６×ｋｇ２）、ｋｇは体重である）。被験物質および対象物質は、前立腺の左葉および右葉のそれぞれにほぼ同じ量でが投与された。
【０３５６】
被験物質を直接前立腺へ投与する最も的確な手段であるため、肛門周囲の経路を選択した。被験物質はまた、ヒトにおいて、前立腺へ局所的に投与されるであろう。
【０３５７】
ケージの横からの観察：これらは、投与日前の少なくとも７日目から始められ、試料採取の最終日まで継続され、１日２回（午前および午後）行われた。それぞれの動物は、全体的な様子および行動における変化を観察された。
【０３５８】
飼料消費は、投与日前の少なくとも７日目から始められ、試料採取の最終日まで継続され（下記に記載された場合を除く）、日常のケージの横からの観察の一部として、１日１回おこなわれた。前日の給餌から残っているビスケットの数を観察した。この手順の例外は、研究手順のために絶食日であった。
【０３５９】
体重の測定は、以下の手順により、第一投与前（１日目）、３日目、８日目および１５日目に行われた。飼料は、体重測定前には控えた。
【０３６０】
心電図は、導線：Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ａＶＲ、ａＶＬおよびａＶＦを使用して、研究前、２日目および１４日目に記録された。モンキーチェアーでケージ外の手順のためにサルを一時的に拘束したが、落ち着かせなかった。
【０３６１】
眼科的検査が獣医により研究前（１日目の３週間以内）および１４日目に行われた。ケタミンを使用した軽度の沈静のもとで、直接検眼鏡を眼の前眼房および後眼房を検査するために使用した。検査を容易にするために、数滴の散瞳薬液（通常、１％のトロピカミド）をそれぞれの眼にしみ込ませた。
【０３６２】
１週目および３日目（剖検前）および１４日目（眼科的検査前）にすべての動物から血清化学、血液学および凝固パラメータの評価用の血液試料を採取した。血清化学のための採血前に、少なくとも８時間（適切な正当化なしでは、１６時間を越えなかった。）、動物を絶食させた。
【０３６３】
研究前および投与後の午前（２日目、投与後およそ２４時間）にケージパンを回収、およびそれぞれ剖検で膀胱穿刺により終了した動物において（３日目および１５日目）尿を採取した。
【０３６４】
ａ）血清化学採取手順
採取方法：静脈注射―いずれの使用可能な静脈、好ましくは、大腿骨
（表１２）
2008546650.tif 000015
＊疑わしい被験物質関連の総ビリルビンの増加が起こった場合、直接および間接ビリルビン濃度は決定される。
【０３６５】
ｂ）血液学
いずれの使用可能な静脈、好ましくは大腿骨への静脈注射により、血液試料を採取した。採取量は、１ｍｌであり、使用した抗凝血剤は、ＥＤＴＡであった。
【０３６６】
分析されたパラメータ：
（表１３）
2008546650.tif 000016
＊総白血球、複数に分画された  好中球、バンド好中球、リンパ球、単核細胞、好酸性、好塩基球、および適切であれば、その他の細胞計数を含む。
＊＊各時点で、すべての動物からの血液塗抹標本を検査する（検査前を含む）。
【０３６７】
ｃ）凝固パラメータ
いずれの使用可能な静脈、好ましくは大腿骨への静脈注射により、試料を採取した。採取量は、１．８ｍｌであり、抗凝血剤は、クエン酸ナトリウムであった。血漿へ試料を処理し、以下のパラメータを分析した：活性部分的なトロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）、プロトロンビン時間（ＰＴ）、および線維素原。
【０３６８】
ｄ）尿検査
ケージパン回収方法（研究前および投与後およそ２４時間）、および剖検では膀胱穿刺により試料を採取した。採取量は、使用可能であれば、最高５ｍＬであった。従来知られている標準手順により試料を処理した。
【０３６９】
以下のパラメータを分析した：
2008546650.tif 000017
【０３７０】
Ｆ．実施された分析：
１．毒物動態学試料
いずれの使用可能な静脈、好ましくは大腿骨への静脈注射により、血液試料を採取した。投与前、および投与してから１、２、４、８、２４および４８時間後に試料を採取した。採取量は、２ｍＬであり、抗凝血剤は使用しなかった。血清に試料を処理した。
【０３７１】
ほぼ同量の２つのアリコットに血清を分割した。動物番号、投与群、採取日、日付、名目上の収集時間、研究番号およびアリコット番号でそれぞれの試料をラベル表示した。およそ−７０℃で試料を保存し、ＥＬＩＳＡ法でＭＰＰ５濃度を分析した。
【０３７２】
２．抗体試料
すべての使用可能な群／動物からの試料を検査した。研究前および１４日目に、いずれの使用可能な静脈、好ましくは大腿骨への静脈注射により試料を採取した。採取量は、２ｍＬであった。抗凝血剤は使用しなかった。血清に試料を処理した。およそ−７０℃で試料を保存した。
【０３７３】
前立腺特異抗原分析
すべての使用可能な群／動物からの試料を検査した。研究前および２、３、１０日目に、いずれの使用可能な静脈、好ましくは大腿骨への静脈注射により試料を採取した。採取量は、２ｍＬであった。抗凝血剤は使用しなかった。血清に試料を処理し、およそ−７０℃で試料を保存した。
【０３７４】
処分手順および解剖病理学
処分：ケタミンおよびＢｅｕｔｈａｎａｓｉａ（登録商標）−Ｄまたは同等物で誘導された深い麻酔下で、放血により動物を処分した。屠殺前の一晩は、食糧供給を控えた。以下の予定により動物を殺処分した：
2008546650.tif 000018
【０３７５】
最終体重：
すべての予定したおよび予定していない屠殺のために剖検で終了時の体重を量った。臓器／体重比および臓器／脳の重量比を計算するために本体重を使用した。
【０３７６】
肉眼的剖検：
研究中、死亡が確認、または屠殺された（予定および未予定の殺処分の双方）すべての動物において全肉眼的剖検を実施した。剖検には以下の検査を含んだ：死体および筋骨格系、すべての外部の表面および開口部、頭蓋腔および脳の外部の表面、随伴器官および組織がある首、胸部、随伴器官および組織がある腹腔および骨盤腔。
【０３７７】
尿試料：
剖検で膀胱から尿（使用可能であれば最高５ｍＬまで）を採取し、本プロトコルの臨床病理学のセクションに説明されているように分析した。
【０３７８】
臓器の重量：
固定前に以下の臓器（存在する場合）の重量を量った。肉眼的異常がなければ、一組の臓器は一緒に重量を量り、異常がある場合には、別々に重量を量る。下垂体は固定後に重量を量った。
2008546650.tif 000019
臓器／脳の重量比と同様に、臓器／体重比を計算した（剖検前に得た最終体重を使用）。
【０３７９】
組織採取および保存：
以下の組織および臓器（またはその一部）を採取し、中性緩衝化した１０％のホルマリン（眼は除く。眼は最適な固定のためにＤａｖｉｄｓｏｎの固定剤に保存された）で保存した。
2008546650.tif 000020
ａ日常組織セクションからの副甲状腺腺の不定期な不在は、セクションを再び切る必要がない。
【０３８０】
組織病理学：
剖検したすべての動物に関しては、上表に記載された組織（入れ墨を除く）をパラフィン内に埋め込み、区分化し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色し、ＡＣＶＰにより認定された獣医病理学者により検査された。
【０３８１】
統計分析
体重、臨床病理学パラメータ（非数値データを除く）、および臓器の重量データを含む、Ｓｉｅｒｒａ法により得たすべての数値データのために群平均および標準偏差値を計算した。
【０３８２】
さらなる統計分析は、ＳＡＳ（登録商標）システム、バージョン８．１で実施された。有意な群間の差異は、分散分析法（ＡＮＯＶＡ）の使用により評価され、多重比較テストに続いた。パラメトリックＡＮＯＶＡ法の使用を可能にする条件は、データの正規性のためのＳｈａｐｉｒｏ−Ｗｉｌｋｅｓテスト、分散の均一性のためのレーベンテストを使用して認証され、条件を拒絶するためにどちらのテストにも必要とするｐ≦０．００１の水準の有意性を用いた。双方の条件が満たされる場合、有意水準ｐ≦０．０５を使用して、動物群を要因とする、単一要因のＡＮＯＶＡ法を適用する。パラメトリックＡＮＯＶＡがｐ≦０．０５で有意である場合、有意水準０．０５で対照群とそれぞれの被験物質処置群との間で統計的に有意な差異を同定するためにダネット検定を使用する。パラメトリックの条件のどちらかが満たされない場合、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓのノンパラメトリック法の手順を群間の差異（ｐ≦０．０５）を評価するために使用する。本ＡＮＯＶＡ法が有意である場合、有意水準ｐ≦０．０５を再度使用して、ダンの多重比較検定を適用するであろう。
【０３８３】
予備の結果
前立腺：
すべての処置された動物は、前立腺内に病変があった（図３２Ｃ〜Ｈおよび３３Ｃ〜Ｈを参照）。第１群（対照）の動物は、注射への反応および回復と一致して、３日目にわずかな炎症、出血、繊維症、および１５日目に繊維症があった。第３群および第４群（図３２Ｅ〜３２Ｈ、図３３Ｅ〜Ｈ）および３３Ｆ）内に有意な重度の病変があった。第３群（５μｇ／ｇ、前立腺）と第４群（２５μｇ／ｇ、前立腺）との間で病巣の範囲または重症度において差異はなかった。第２群（１μｇ／ｇ、前立腺）では有意性があり、重度のより低い病変があった。（図３２Ｃ、３２Ｄ、３３Ｃ、３３Ｄ）
【０３８４】
３日目に、被験物質への一次反応は、大量の出血、および混合細胞の炎症を伴う、前立腺の大部分で凝固の壊死であった。炎症は、好酸性、リンパ球、およびマクロファージの数がより少ない、主として好中球であった。いくつかの領域では、液化壊死があった。凝固壊死は、第２群で軽度であり、第３群および第４群では、中度から著しかった。
【０３８５】
第２群の３日目には、扁平上皮化生に進展した上皮の著しい腺の再生過形成を伴う大規模な修復の進行があり、凝固壊死の領域端で、中度から著しい間質細胞の活性および増殖があった。第３群および第４群の３日目に、中度の間質細胞の活性および増殖が修復を示し始めたばかりであった。
【０３８６】
第２群の１５日目に、壊死および出血は消散した。前立腺のキャビテーションは、みとめられなかった。病巣は、軽度から中度の進行中の再生過形成および腺の扁平上皮化生を伴い繊維を形成した。炎症は、多形核白血球の数がより少ない、主としてマクロファージおよびリンパ球であった。ある動物では、これらは、主として好酸球であった。
【０３８７】
第３群および第４群の１５日目に、進行中の凝固壊死および出血があり、さらに重度の液化壊死および前立腺のキャビテーション、および進行中の混合細胞の炎症を伴った。これらの群における修復は、壊死性病巣端で間質における中度から著しい繊維症および線維増殖から成り、腺の扁平上皮化生に進展した再生過形成を伴った。炎症は、進行中の壊死の領域では主として好中球であり、繊維症の病巣領域端では、リンパ球およびマクロファージの割合が比較的高かった。
【０３８８】
前立腺組織：
３日目の処置された動物の第５／６群の精嚢は、腺内腔内に軽度から中度の分泌の無機化があった。これは、時折、背景所見として観察されるが、今回の程度ほどではなく、ここで見られるように頻繁ではない。従って、前立腺の変化の二次症状と考えられる。１５日目には、病気に冒された動物は対照のみであった。
【０３８９】
前立腺の尿道は、炎症細胞浸潤があり、前立腺変化の二次症状と考えられる。
【０３９０】
実施例８：前立腺組織によるＭＰＰ５の活性
本発明によるＭＰＰを活性化するために様々な動物の前立腺抽出物の能力を検査した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究は、ラット、イヌ、サル、およびヒトの前立腺組織の抽出物をＭＰＰ５と共にインキュベートし、ＭＰＰの活性の割合を決定することで実施した。
【０３９１】
実験プロトコルは以下の通りであった。１匹のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットおよび１匹のビーグル犬から新鮮な前立腺組織を取得した。１匹のカニクイザルおよび１人のヒトから冷凍した前立腺組織を取得した。Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ大学のＩＲＢの承認済みの臨床研究から保存された研究物質としてヒトの前立腺組織を取得した。本分析に関しては、前立腺を区分化し（〜１００から５００ｍｇの片）、同じ組織量あたりの媒体量の濃度で、無血清ＲＰＭＩ  １６４０細胞培養液に懸濁させた。組織試料を３７℃で２時間、この媒体にインキュベートした。遠心分離後、懸濁物を−８０℃で冷凍した。
【０３９２】
溶血アッセイ：
試料を３７℃で解凍し、遠心分離し、上清を採取した。ブラッドフォード分析を使用して、それぞれの上清のタンパク質濃度を決定した。試料を同じ初期たんぱく質濃度に希薄した。標準ＥＬＩＳＡ（Ｈｙｂｒｉｔｅｃｈ（登録商標）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）法を使用してＰＳＡを決定するために、サルおよびヒトの試料からの上清のアリコートを取得した。フェノールレッド不含のハンクス平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁した２％の新鮮なヒト赤血球（ＲＢＣ）溶液が、毎日調製された。赤血球をペレット化し、余分な血清を除去するために３倍量のＨＢＳＳに再懸濁し、フェノールレッド不含のＨＢＳＳ中の５０％の溶液を生成するために再懸濁した。被験試料を調製するために、５０％のＲＢＣ試料を軽くボルテックスし、ＲＢＣを懸濁した。ＲＢＣのアリコットを２３０μＬのフェノールレッド不含ＨＢＳＳに加え、４％（ｖ／ｖ）の溶液を生成した。この懸濁液にＲＰＭＩ培地に調製された前立腺の切片の２４０μＬのアリコットを加え、続いて、１００μｇ／ｍＬの保存からＭＰＰ５の１０μＬのアリコットを加え、アッセイごとに加えたＭＰＰ５の合計が１μｇでアッセイの最終用量が５００μＬになるようにした。このＲＢＣ／ＭＰＰ５／組織溶液を１時間、室温でインキュベートした。その後、試料を遠心分離し、溶解していないＲＢＣをペレット化し、それぞれの試料から上清の１００μＬのアリコットを取得し、ＲＢＣ溶解であるため、ヘモグロビン遊離のために５４０ｎｍで、分光光度法で直ちに測定した。対照は、偽の処置をされたＲＢＣ（負の対照）および１％のトリトン−ｘ１００で溶解されたＲＢＣ（正の対照）を含んだ。加水分解の程度を比較するために、前立腺組織を調製された培地のそれぞれの試料の連続希釈液を分析した。１：１、１：２、１：４、１：８、１：１６、および１：３２の希薄抽出物を本研究で使用した。すべての試料を３倍に溶血のために分析した。
【０３９３】
結果は、ヒト前立腺組織がＭＰＰ５を最も活発に切断することを示したのに対し、ラットおよびサルの前立腺組織がより低い反応を示し、イヌ前立腺組織は、ＭＰＰ５に対して活性化をまったく示さなかった（図３６）。ラットはＰＳＡ遺伝子が欠損しているが、ヒトＰＳＡ（Ｏｎｏｚａｗａら、２００１）と同族のＳ３カリクレインを持つことが示されている。ラットの腹部前立腺に同定されるＰＳＡ様タンパク質は、ヒトＰＳＡに対して、それぞれ６４％のヌクレオチドおよび４９％のアミノ酸配列のホモロジーを示す。さらに、ラットＳ３カリクレインおよびヒトＰＳＡは、類似の等電点および分子の重量を有する。従って、ラット前立腺組織中では、このＰＳＡ様のＳ３カリクレインによりＭＰＰ５を活性化することが起こり得る。
【０３９４】
イヌの前立腺による活性の欠損は、イヌがＰＳＡ遺伝子を所有しないという観察と一致する。
【０３９５】
実施例９：血漿／血清によるＭＰＰ５の活性
ヒト、サル、イヌ、ラットまたはマウスからの血清のＭＰＰ５を切断する能力は、以下のように決定された。
【０３９６】
ＭＰＰ５（１．０７３ｍｇ／ｍＬ）を４℃で氷上で解凍し、アリコット化され、−８０℃で再冷凍した。２つのアッセイは、それぞれの状態について実施された。５μｇのＭＰＰ５を１５０ｍＭのＮａＣｌおよび２５μＬのヒト、サル、イヌ、ラットまたはマウス血清を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積２５０μＬ中で、３７℃で１０分間、インキュベートした。対照実験において、血清を追加する前に、２５μｇのキモトリプシンを反応混合物に追加した（正の対照）。その他の対照実験において、血清を緩衝液の同一用量で置換した（負の対照）。５μＬの１００ｍＭのＰＭＳＦ含有イソプロピルアルコールを追加することにより、反応物を停止し、氷で冷却した。停止した反応混合物の１５μＬのアリコットを同量の０．５％のβ−メルカプトエタノールを含む２倍ＢｉｏＲａｄ試料ローディングバッファに追加し、９５℃で５分間加熱し、すべてのタンパク質を変性し、タンパク質−タンパク質の相互作用をブロックした。５μＬの試料は、１００Ｖで６０分間、ＸＴのＭＯＰＳのランニングバッファ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、あらかじめ成型された４〜１２％のＢｉｓ−トリスジェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動した。ジェル内のタンパク質をニトロセルロース（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）にトランスブロットし、その膜をノンファットミルクでブロックした（１時間、室温で、０．１％のＴｗｅｅｎ２０（ＴＢＳＴ）でトリス緩衝液にされた５％の生理食塩水）。１時間、室温で、ＴＢＳＴ中で１：２５０，０００の希薄で精製された多クローン性のラット抗ＭＰＰ５中で膜をインキュベートすることにより、ＭＰＰ５を検出した。ＴＢＳＴで３回洗浄後、ＴＢＳＴ中で１：２０，０００の希薄で、ＨＲＰにリンクしたヤギ抗−ラット抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）でブロットをインキュベートした。キット製造者（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）の説明に従がって、化学発光を使用して膜への抗体結合を検出し、飽和状態を防ぐため、化学発光自動露出設定とともに、４メガピクセルＣＣＤカメラを使用するＡｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  ＦｌｕｏｒＣｈｅｍ  ＳＰを使用してリアルタイムに記録した。ボクセルベースプログラム（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア、Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ、Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）を使用して、ブロットを濃度測定的に定量化した。バックグラウンドの修正後、切断したタンパク質の残りの割合を無傷のバンドと切断したバンドの合計により切断したバンドの密度で割ることによりそれぞれのレーンのために決定した。切断した割合は、その後、非血清および血清プラスキモトリプシンの対照と比較した。
【０３９７】
ＭＰＰ５の切断の割合の概算は、ウエスタンブロット法の電気泳動および濃度測定の定量化により達成された。その後、切断の割合をＭＰＰ５のみ（負）およびＭＰＰ５＋キモトリプシン（正）対照と比較し、ＭＰＰ５が血清酵素により切断されているか否かを決定した。これらの実験状態の下で、ヒト、サル、イヌ、ラットまたはマウスの血清によるＭＰＰ５の切断は検出されなかった。表１４は、さまざまな血清とのインキュベート後、切断されるＭＰＰ５の割合を示す。図３７は、様々な血清の有無における、１０分間のインキュベート後のＭＰＰ５のウエスタンブロット法を示す。パネルＡは、２５０μＬのアッセイ用量中で、ヒト男性（Ｈ）（レーン２〜５）またはカニクイザル（Ｍｋ）（レーン６〜７）のいずれかの２５μＬの血清でインキュベートしたＭＰＰ５を示す。レーン３は、ＭＰＰ５、ヒト血清およびキモトリプシンを含むが、インキュベートされなかった。レーン８は、分子重量マーカーである。（Ｂ）２５０μＬのアッセイ用量中で、マウス（Ｍｕ）（レーン２〜５）、イヌ（Ｄ）（レーン６〜７）またはラット（Ｒ）（レーン８〜９）のいずれかの２５μＬの血清でインキュベートしたＭＰＰ５を示す。レーン３は、ＭＰＰ５、ヒト血清およびキモトリプシンを含むが、インキュベートされなかった。レーン１０は、分子重量マーカーである。
【０３９８】
（表１４）血清中においてＭＰＰ５が切断された割合の種別の比較
2008546650.tif 000021
【０３９９】
これらの結果は、ＭＰＰ５が正常ヒト血清中で活性化されず、また、ＭＰＰ５が血清ＰＳＡの非常に高水準な男性にでさえ、前立腺注射後、血液への漏出の際に活性化されないことを暗示する。これらの結果は、ＰＳＡが血清プロテアーゼ抑制剤、主として、αｌ−抗キモトリプシンおよびα２−マクログロブリンにより血液内に酵素的に不活性であることを示す既報のデータと一致している（Ｌｉｌｊａら、１９９１；Ｏｔｔｏら、１９９８）。
【０４００】
実施例１０：ノンＰＳＡプロテアーゼによるＭＰＰ５の活性
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究を実施し、プロドラッグが前立腺外の組織に不注意にも露出される場合に、潜在的に遭遇可能なノンＰＳＡプロテアーゼへのＭＰＰ５の感度を決定した。特に、、ＰＳＡ、フューリン、トリプシン、キモトリプシン、トロンビン、ＭＭＰ−７、システインプロテアーゼカテプシンＢ、およびセリンプロテアーゼｈＫｌ、ｈＫ２、ｕＰＡを含む、いくつかの一般のプロテアーゼが、ＭＰＰ５を切断する潜在性を評価した。
【０４０１】
アッセイを以下のように実行した。１．０７３ｍｇ／ｍＬで、天然プロアエロリジン（ｗｔ  ＰＡ；０．８４ｍｇ／ｍＬ）およびＭＰＰ５は、フューリンを有するアッセイ２を除くすべてのプロテアーゼをアッセイ検査するために使用され、アッセイ２では、１ｍｇ／ｍｌで、ＭＰＰ５のロット番号Ｎ−ＰＴＩＣ−ＭＦ−ＰＡＬ−ＢＸを使用した。
【０４０２】
ＰＳＡ切断による活性化を測定するために、５μｇの天然のプロアエロリジンまたはＭＰＰ５を１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳの緩衝液（ｐＨ７．４）でインキュベートした。様々な量のＰＳＡを追加し（対数のスケールによる０〜１０μｇのＰＳＡ）、総容積２５０μＬ中で、３７℃で６０分間、インキュベートした。１００ｍＭのＰＭＳＦを含有するイソプロピルアルコール５μＬを追加することにより、反応物を停止し、氷で冷却した。停止した反応混合物の１５μＬのアリコットを０．５％のβ−メルカプトエタノールを含む同量の２倍ＢｉｏＲａｄ試料ローディングバッファに追加し、９５℃で５分間加熱した。試料は、２００Ｖで３０分間、ＸＴのＭＯＰＳのランニングバッファ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、あらかじめ成型された１０％のトリスＨＣｌジェル上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４０３】
研究１におけるフューリン切断による活性化を測定するために、５μｇの天然ＰＡまたはＭＰＰ５を１５０ｍＭのＮａＣｌおよび様々な量のフューリン（対数のスケールによる０〜３．２ｎｇのフューリン）を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積２５０μＬ中で、３７℃で１０分間、インキュベートした。１００ｍＭのＰＭＳＦを含有するイソプロピルアルコール５μＬを追加することにより、反応物を停止し、氷で冷却した。停止した反応混合物の１５μＬのアリコットを０．５％のβ−メルカプトエタノールを含む同量の２倍ＢｉｏＲａｄ試料ローディングバッファに追加し、９５℃で５分間加熱した。試料は、２００Ｖで３０分間、ＸＴのＭＯＰＳのランニングバッファ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、あらかじめ成型された１０％のトリスＨＣｌジェル上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４０４】
研究２におけるフューリン切断による活性化を測定するために、５μｇの天然ＰＡまたはＭＰＰ５を１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＣａＣｌ２および０から３単位のフューリンを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積２５０μＬ中で、３７℃で６０分間、インキュベートした。ここで留意すべきは、前述の実験（フューリン、研究１）では、インキュベートの時間は、同一酵素濃度で、１０分間であることである。１００ｍＭのＰＭＳＦを含有するエタノール２．５μＬを追加することにより、反応物を停止し、氷で冷却した。停止した反応混合物の１５μＬのアリコットを０．５％のβ−メルカプトエタノールを含む同量の２倍ＢｉｏＲａｄ試料ローディングバッファに追加し、９５℃で５分間加熱した。試料は、２００Ｖで５０分間、ＭＯＰＳ−ＳＤＳのランニングバッファを使用して、あらかじめ成型された１０％のＮｏｖｅｘビス−トリスＮｕｐａｇｅジェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４０５】
キモトリプシンによる活性化を測定するために、５μｇの天然ＰＡまたはＭＰＰ５を１５０ｍＭのＮａＣｌおよび様々な量のキモトリプシン（対数のスケールによる０〜５００ｎｇのキモトリプシン）を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳの緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積２５０μＬ中で、３７℃で１０分間、インキュベートした。１００ｍＭのＰＭＳＦを含有するイソプロピルアルコール５μＬを追加することにより、反応物を停止し、氷で冷却した。停止した反応混合物の１５μＬのアリコットを０．５％のβ−メルカプトエタノールを含む同量の２倍ＢｉｏＲａｄ試料ローディングバッファに追加し、９５℃で５分間加熱した。試料は、２００Ｖで３０分間、ＸＴのＭＯＰＳのランニングバッファ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、あらかじめ成型された１０％のトリスＨＣｌジェル上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４０６】
研究１におけるトロンビンによるＭＰＰ５の活性化を測定するために、５μｇのアエロリジン関連のタンパク質（天然のＰＡまたはＭＰＰ５）を１５０ｍＭのＮａＣｌおよび様々な量のトロンビン（対数のスケールによる０〜１２μｇの０．２３単位／μｇのトロンビン）を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積２５０μＬ中で、３７℃で１０分間、インキュベートした。１００ｍＭのＰＭＳＦを含有するイソプロピルアルコール５μＬを追加することにより、反応物を停止し、氷で冷却した。停止した反応混合物の１５μＬのアリコットを０．５％のβ−メルカプトエタノールを含む同量の２倍ＢｉｏＲａｄ試料ローディングバッファに追加し、９５℃で５分間加熱した。試料は、２００Ｖで３０分間、ＸＴのＭＯＰＳのランニングバッファ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、あらかじめ成型された１０％のトリスＨＣｌジェル上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４０７】
研究２におけるトロンビンによるＭＰＰ５の活性化を測定するために、２種類のトロンビン希釈液、１／６６および１／２５をこれらの実験に使用されるトロンビンキット（Ｎｏｖａｇｅｎ）に提供されているトロンビン希釈緩衝液内に作成した。トロンビンキットに提供されている、等倍の切断緩衝液中に１０μｇのＭＰＰ５（Ｎ−ＰＴＩＣ−ＭＦ−ＰＡＬ−ＢＸ）を含む２つの反応混合物を調製した。Ｈｉｓ  ｔａｇ（ＰＡ−ＥｎｄＨｉｓ）を有する天然のプロアエロリジンを含む２つの反応混合物を同一の方法で調製した。０．１５ユニットでＰＡ−ＥｎｄＨｉｓの混合物の一つおよび０．４ユニットでＭＰＰ５の混合物の一つにトロンビンを追加した。インキュベーション用量の合計は、それぞれの場合において、５０μＬであった。反応混合物を室温で６．５時間インキュベートし、フェニルメチル・スルホニル・フッ化物（Ｓｉｇｍａ）を１ｍＭの最終濃度に追加することによりタンパク質分解の抑制をした。試料を４℃で氷上で一晩中保存した。その後、等倍のＬＤＳ試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で調製し、７０℃で１０分間加熱した後、非還元状態の下で、２００Ｖの定電圧で５０分間、等倍のＭＯＰＳ−ＳＤＳランニングバッファ中で、１０％のＢｉｓ−トリスＮｕＰＡＧＥジェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を取り込み、処理した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４０８】
トリプシンによる活性化を測定するために、５μｇのアエロリジン関連のタンパク質（ｗｔＰＡまたはＭＰＰ５）を１５０ｍＭのＮａＣｌおよび様々な量のタイプＩトリプシン（対数のスケールによる０〜５００ｎｇのトリプシン）を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積μＬ中で、３７℃で１０分間、インキュベートした。１００ｍＭのＰＭＳＦを含有するイソプロピルアルコール５μＬを追加することにより、反応物を停止し、氷上で冷却した。停止した反応混合物の１５μＬのアリコットを０．５％のβ−メルカプトエタノールを含む同量の２倍ＢｉｏＲａｄ試料ローディングバッファに追加し、９５℃で５分間加熱した。試料は、２００Ｖで３０分間、ＸＴのＭＯＰＳのランニングバッファ（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して、あらかじめ成型された１０％のトリスＨＣｌジェル上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４０９】
ｕＰＡによる活性化を測定するために、５μｇのＰＡおよびＭＰＰ５を１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０〜０．１６μｇのｕＰＡを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積２５０μＬ中で、３７℃で４時間、別々にインキュベートした。１００ｍＭのＰＭＳＦを含有するイソプロピルアルコール５μＬを追加することにより、反応物を停止し、氷上で冷却した。停止した反応混合物の１５μＬのアリコットを０．５％の２−メルカプトエタノールを含む等倍の試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製し、９５℃で５分間加熱した。試料（１００ｎｇ）は、２００Ｖで５０分間、還元状態の下で、等倍のＭＯＰＳ−ＳＤＳランニングバッファ中を使用して、あらかじめ成型された１０％のＮｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−トリスＮｕＰＡＧＥジェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４１０】
カテプシンＢによる活性化を測定するために、５μｇのＰＡおよびＭＰＰ５を１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭのＬ−システイン、および２４〜０．３７５単位のカテプシンＢを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積２５０μＬ中で、３７℃で４時間、別々にインキュベートした。ロイペプチンを最終濃度の２μＭに追加すること（シグマ方式）により、反応物を停止し、氷上で冷却した。停止した反応混合物の１５μＬのアリコットを０．５％の２−メルカプトエタノールを含む等倍の試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製し、９５℃で５分間加熱した。試料（１００ｎｇ）は、２００Ｖで５０分間、還元状態の下で、等倍のＭＯＰＳ−ＳＤＳランニングバッファ中を使用して、あらかじめ形成された１０％のＮｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−トリスＮｕＰＡＧＥジェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４１１】
ＭＭＰ−７による活性化を測定するために、５μｇのＰＡおよびＭＰＰ５を１５０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＣａＣｌ２および１．５〜０．０２３４μｇのＭＭＰ−７を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積２５０μＬ中で、３７℃で３時間、別々にインキュベートした。８．４μＬの３１ｍＭの１、１０−フェナントロリン一水和物（１μＭの最終）を含有するエタノールを追加することにより、反応物を停止し、氷上で冷却した。停止した反応混合物の１５μＬのアリコットを０．５％の２−メルカプトエタノールを含む等倍の試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製し、９５℃で５分間加熱した。試料（１００ｎｇ）は、２００Ｖで５０分間、還元状態の下で、等倍のＭＯＰＳ−ＳＤＳランニングバッファ中を使用して、あらかじめ形成された１０％のＮｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−トリスＮｕＰＡＧＥジェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４１２】
ｈＫｌによる活性化を測定するために、５０μｌのＴＣＮ緩衝液（５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのＣａＣｌ２、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）の最終容積で、０．０５μｇのテルモリジンにより５μｇのｈＫｌを活性化し、３７℃で１時間、インキュベートし、さらに、２．５μｌの２００ｍＭ  １、１０−フェナントロリン一水和物を含有する９５％のエタノールで抑制した（Ｒ＆Ｄシステム方式）。１μｇのＰＡおよびＰＳＡ−ＰＡＨ１を１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１〜０．０１５６２５μｇの活性化したｈＫｌを含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積５０μＬ中で、３７℃で４時間、別にインキュベートした。ＰＭＳＦ含有のイソプロピルアルコールを加え、最終濃度２ｍＭで、反応物を停止し、氷上で冷却した。停止した反応混合物の５μＬのアリコットを０．５％の２−メルカプトエタノールを含む等倍の試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製し、９５℃で５分間加熱した。試料（１００ｎｇ）は、２００Ｖで５０分間、還元状態の下で、等倍のＭＯＰＳ−ＳＤＳランニングバッファを使用して、あらかじめ成型された１０％のＮｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−トリスＮｕＰＡＧＥジェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４１３】
ｈＫ２による活性化を測定するために、１μｇのＰＡおよびＭＰＰ５を１５０ｍＭのＮａＣｌ、および０．２５〜０．００３９μｇのｈＫ２を含む２０ｍＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）の総容積５０μＬ中で、３７℃で１時間、別々にインキュベートした。イソプロピルアルコールのＰＭＳＦを追加して最終濃度の２ｍＭで、反応物を停止し、氷上で冷却した。停止した反応混合物の１０μＬのアリコットを０．５％の２−メルカプトエタノールを含む等倍の試料緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で調製し、９５℃で５分間加熱した。試料（１００ｎｇ）は、２００Ｖで５０分間、還元状態の下で、等倍のＭＯＰＳ−ＳＤＳランニングバッファを使用して、あらかじめ成型された１０％のＮｏｖｅｘ  Ｂｉｓ−トリスＮｕＰＡＧＥジェル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で電気泳動した。タンパク質を銀染色法により検出した。
【０４１４】
この研究の結果は、感受性プロファイルが、ＭＰＰ５とプロアエロリジン（ＰＡ）間で非常に異なることを示し、それは、天然のプロアエロリジン（ＰＡ）は上記の様々なロテアーゼ（ＰＳＡを除く）に対して、ＭＰＰ５よりさらに感受性あるということである（表１５）。
【０４１５】
（表１５）Ｉｎ Ｖｉｔｒｏプロテアーゼの感受性に関する研究結果
2008546650.tif 000022
注意：報告されたユニットは、原データに記録されているユニットを反映する。
【０４１６】
実施例１１：ラットにおけるＭＰＰ５の生体内分布
単一の前立腺内投与後の前立腺において、および、可能性のある周囲の組織におけるＭＰＰ５の生体内分布を確立するために、１２５Ｉ−ＭＰＰ５を使用して放射性標識量的全身オートラジオグラフィーの研究をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットのオスにおいて実施した。投与製剤における放射能濃度（±Ｓ．Ｄ．）は、１．６×１０９±４４．０２×１０６ｄｐｍ／ｇ（７３０．９４μＣ／ｇ）であった。標準偏差および平均濃度の周りの分散係数に基づいて、投与製剤は均一であると考えられた。前立腺へ注射投与された調整済みのされた１２５Ｉ−ＭＰＰ５の平均被曝線量は、８．７３μｇ／動物であった（１０μＬの容積中で５．８６μＣｉ／動物）。
【０４１７】
血液の複製のアリコット（２×５０μＬ）を放射能分析のための試料とした。血液は、４℃でおよそ１０分間、３５００ｒｐｍで遠心分離機にかけ（採取の６０分以内）、血漿の複製のアリコット（２×５０μＬ）を放射能分析のための試料とした。全血の複製の計量済みのアリコットを可溶化し（Ｓｏｌｕｅｎｅ−３５０）、放射能測定のためにシンチレーション液と混合する前に過酸化水素（３０％ｗ／ｖ）で脱色した。血漿の複製アリコットを放射能測定のためにシンチレーション液と直接混合した。
【０４１８】
定量全身オートラジオグラフィーに関しては、ヘキサンとドライアイスの混合物内で２０分間、動物を凍結状態にした。その後、矢状の全身の部位を採取するために標準操作手順による冷凍フレームを使用して２％のＣＭＣ培地で右側を下向きにして動物を組み込んだ。１０の１２５Ｉ標準液および２つの品質管理液を連携させるためにそれぞれの冷凍ＣＭＣブロック内に１２の穴を作成した。１４Ｃまたは１２５Ｉを混ぜた血液をそれぞれのＣＭＣブロックの４つのドリル穴に挿入し、もし必要であれば、低い放射能水準または低い対照を示す構造の識別のために参照の点として使用された。それぞれの動物標本ブロックをＬｅｉｃａ  ＣＭ３６００人体冷凍を使用して、分割した。３０μｍの切片を採取し、動物番号、時点、区分日およびメスの位置を識別した。
【０４１９】
結果は、単一前立腺内投与に続いて、血液および血漿中の放射能濃度が低く、前立腺内投与に続いて、ほとんど目に見える吸収がないことを示す。最高の放射能濃度（９．４４５μｇＥｑ／ｇ）を右腹部前立腺の注射部位から初めのサンプリング時点（３時間）で取得した。高水準の放射能はまた、前立腺のその他の葉（左腹部、および左右背部葉）で観察されたが、９６時間の最終サンプリング点まで時間と共に減少した。この最終時点で、前立腺内の放射能濃度は、右腹部の前立腺注射部位（０．２６８μｇＥｑ／ｇ）を除いた前立腺のすべての領域で低かった。前立腺以外では、膀胱および甲状腺だけが血液か血漿のいずれかよりも高い放射能濃度を示した。放射能の甲状腺レベル（１２５Ｉ）は、投与後、１２から４８時間に時間とともにに増加し、処置してから最終時点の９６時間後まで高い状態であった。甲状腺内の１２５Ｉの腐骨化は、甲状腺への自由１２５Ｉ分布のを表している可能性がある。放射能濃度の低さは、副腎（≦０．０３４μｇＥｑ／ｇ）、腎臓（≦０．０３２μｇＥｑ／ｇ）、肝臓（≦０．０４５μｇＥｑ／ｇ）、肺（≦０．０４１μｇＥｑ／ｇ）および膵臓（≦０．０２２μｇＥｑ／ｇ）内に観察された。脳は、最低の放射能濃度を示した（≦０．００３μｇＥｑ／ｇ）。極端に低い放射能レベルは、常にすべてのほかの腫瘍臓器内で示され、有意な全身への分布が起こらなかったことを暗示した。血漿レベルへの組織レベルは、時間と共に増加し、ＭＰＰ５は、組織からよりも血漿レベルからより速く除去されることが明らかであることを示した。従って、この生体内分布研究では、ＭＰＰ５が主に投与の局所部位で残留し、限定された末梢分布および周囲の細胞への毒性のみがあることを示している。
【０４２０】
実施例１２：サルにおけるＭＰＰ５の毒物動態学
実施例７に説明されているように、性的に成熟しているオスのカニクイザルにおける前立腺投与に続くＭＰＰ５の毒物動態学も確立された。群あたり４匹のサルに２×２５μＬの注射（２５μＬ／葉）を使用して、対照塩水または０．３５、４．１４、または２５．７９μｇのＭＰＰ５／ｇ（前立腺組織）を、前立腺内に投与した。投与前、投与してから１、２、４、８、２４、および４８時間後に、血液試料をすべてのサル（１６）から採取した。本研究の準備段階結果はまた、実施例７に示されている。以下は、本研究の最終的な毒物動態学の結果を示す。
【０４２１】
有効なＥＬＩＳＡ法を使用して、ＭＰＰ５のために研究試料を分析した。ＥＬＩＳＡ法の定量限界値（ＬＬＯＱ）は、多重分析における５０μＬの血清を使用して５ｎｇ／ｍＬであった。ＭＰＰ５の感知できるほどの全身レベルは、前立腺内投与後、検出されなかった。第２群内のある動物は、すべての時点に対して、ＬＬＯＱ（５ｎｇ／ｍＬ）を越える濃度を示した。これは、同一投与群からの動物と比較して異常であると考えられ、この動物からすべての試料を確認のために、その後の分析評価に繰り返された。すべての本来の結果を反復分析において確認した。投与前の試料がまたＬＬＯＱを越えたていたので、この動物における観察された濃度がマトリクス干渉であるために起こったものであり、処置関連でないことを決定した。
【０４２２】
実施例１３：ＭＰＰ５で処置されたサルにおける前立腺形態学の評価
実施例７および１２で説明された研究において採取されたサル前立腺の切片のさらなる分析が実施された。処置された前立腺の形態学を調べるために、ヘマトキシリン＆エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を実施し、ＰＳＡの分布を調べるためにＰＳＡ用の免疫組織化学的染色を実施し、ＭＰＰ５の分布を調べるためにＭＰＰ５染色を実施した。使用したプロトコルを以下に説明する。
【０４２３】
材質および試薬：
対照およびＭＰＰ５で処置されたサルの前立腺からの切片の９６スライド（１匹のサルあたり６スライド）を密封容器に室温で保存した。賦形剤または０．３５、４．１または２５μｇＭＰＰ５／ｇ（前立腺）を伴う、前立腺内に投与したサルからの前立腺組織の切片を調製し、Ｈ＆Ｅで染色した。また、従来知られている方法によりＰＳＡおよびＭＰＰ５のために免疫組織化学的に切片を染色した。
【０４２４】
画像分析：
サルの前立腺の組織切片を１．２５倍の対物レンズを使用して評価した。損傷を起こした前立腺の総領域およびＭＰＰ５の総領域を概説するために、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ（商標）ソフトウェアパッケージ（分子素子、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を使用した。このソフトウェアは、ピクセル数として総領域を提供する。１×１ｃｍの正方形をピクセル／ｃｍ２の数を決定するために標準として、それぞれのスライド上に設置した。その後、ＭＰＰ５のそれぞれの投与からの損傷領域を決定し、損傷のｃｍ２に変換した。損傷領域／総前立腺領域の割合に１００を掛けることにより損傷の領域割合を決定した。
【０４２５】
対照（正常）サルの前立腺の分析は、カニクイザルの前立腺は、腺性形態学の観点では、ヒトの前立腺に類似しており、ＰＳＡの分布は、管を覆っている円柱状の上皮細胞に制限されていることを示した。ヒトの前立腺のように、サルの前立腺は、尿道を取り囲んでいる。従って、サルの前立腺は、前立腺内に注射する場合、活性化ＰＳＡの活性化したタンパク質毒素、ＭＰＰ５を研究するために最も使用可能な動物モデルであることを示す。
【０４２６】
本研究から前立腺におけるＰＳＡおよびＭＰＰ５の前立腺組織および分布の形態学的特殊化は、０．３５から４．１４μｇ／ｇの前立腺投与から前立腺の損傷領域／割合における用量反応を示したが、４．１４から２５．７９μｇ／ｇ（前立腺）までは有意な増加はなかった（表１５）。算出された損傷の最大領域は、４．１４μｇ／ｇの前立腺投与を受けるサルにおいて観察され、葉あたり２５μＬの単一注射は、総腺のおよそ５０％を損傷した。結果は、最大損傷が前立腺の葉あたりの２５μＬの注射用量の総分布により制限されていることを示す。
【０４２７】
ＭＰＰ５が正常の腺組織の有意な梗塞を起こす処置された領域において、ＰＳＡ染色が著しく減少し、それに対して、隣接した、前立腺の損傷していない領域において、ＰＳＡ染色が分布および程度において正常であった。これらの結果は、ＭＰＰ５は腺内の円柱状の上皮細胞を殺すと、ＰＳＡ生成を除外することを示す。また、結果は、ＭＰＰ５の分布は、図３８に示すように、中度および高度な投与水準で梗塞領域で重なり合うことを示した。１５日の投与後、ＭＰＰ５の残留が中度の投与水準では観察されなかった。さらに、ＭＰＰ５は、本研究で評価された切片のいずれにおいても、前立腺カプセルを浸透することを示さなかった。
【０４２８】
（表１５）ＭＰＰ５からの前立腺の損傷１の領域および割合
2008546650.tif 000023
１葉あたり２５μＬの注射に続く損傷（総腺の領域／割合）
【０４２９】
ＭＰＰ５が正常の腺組織の有意な梗塞を起こして処置された領域において、ＰＳＡ染色が著しく減少した。隣接した、前立腺の損傷していない領域において、ＰＳＡ染色が分布および程度において正常であった。これらの結果は、ＭＰＰ５が腺内の円柱状の上皮細胞を殺すと、ＰＳＡ生成を除外することを示す。しかしながら、ＭＰＰ５は、損傷していない領域において、ＰＳＡ生成を変えず、ＰＳＡのより低い水準を生成する上皮細胞に対しても選択しない。ＰＳＡ染色は、尿道周辺の筋性カフで観察されなかった。尿道組織内ＰＳＡ染色が示されないことは、尿道の有意な損傷が何も見られないことを部分的に説明してもよい。従って、前立腺の単一葉へのＭＰＰ５の少容量（２５μＬ）の注射は、非ＰＳＡ生成構造（例、尿道）への有意な損傷なく、正常サルの前立腺において、ＰＳＡ生成の腺組織の大きな領域の有意な梗塞を生成することができる。
【０４３０】
実施例１４：イヌにおけるＭＰＰ５の毒性
ＭＰＰ５の単一前立腺投与後、潜在的な直接前立腺の毒性およびＭＴＤを確立するために、オスのビーグル犬において、試験的な毒物学研究を実施した。１００μＬの投与用量において（前立腺の重量に基づいて、これらの投与は、それぞれ、０、２２、２４．４、４０、および７２．２μｇ／ｇ（前立腺）に同等した）、０、５０、１０７、２００、または４００μｇの前立腺注射を通して、オスのビーグル犬（１／群）にＭＰＰ５を投与した。投与してから１週間、動物を観察した。臨床的観察、体重、飼料消費、または臨床的病理学において死亡率、または処置関連の効果はなかった。前立腺の重量において、ＭＰＰ５関連の効果は示さなかった。肉眼的病理変化は、前立腺の左葉および隣接する腹部脂肪で認識され、前立腺の柔組織へ広がる前立腺の黒色の領域からなった。腹部脂肪内への癒着および／または黒色の領域は、前立腺内に示されたＭＰＰ５関連の影響に関連した。４００μｇで処置されたイヌにおいて、黒色の領域がさらに多くなり、前立腺の左葉を拡大した。これらの病理学的変化についての重症度の増加は、ＭＰＰ５の予想された薬理学的効果によるものと考えられた。有意な特別な前立腺毒性を何も示さなかった。全体的に見て、見かけの処置関連の肉眼的変化が前立腺中に観察され、腹部脂肪組織の周辺または隣接部に限定された関連効果があり、４００μｇ水準で重症度を増した。
【０４３１】
イヌの前立腺は、ヒトの前立腺と構造上の類似性を有し、腺房管の２つの葉構造、本質、および豊富な間質の存在を含む（Ｗｉｅｎｔｊｅｓら、２００５）。ヒトは、イヌの前立腺よりも高い間質組織の破片を所有するが、繊維質の区分のアーキテクチャ、および血液および腺病質排出パターンがどの程度ヒトとイヌの前立腺との間で異なるのかは知られていない。それにもかかわらず、イヌは前立腺注射の効果を研究するために役に立つモデルとして、前述に示されている（Ｒｏｓｓｅｒら、２００４）。しかしながら、ＭＰＰ５の場合では、ビーグル犬は、本化合物の細胞溶解の効果に対して顕著な感受性を示さなかった。これは、イヌにおけるＰＳＡ発現の欠失（またはＭＰＰ５を切断するのに可能なその他の非特定酵素）による結果と考えられる。イヌ科の動物モデルは、ＰＳＡの欠如において、非活性化のプロドラックの安全性を示し、ＭＰＰ５は極度に高い投与で、活性化されていないことを示す。対照的に、ラットおよびヒトでない霊長類は、ＰＳＡ様カリクレインおよびＰＳＡのそれぞれを発現すると知られており、低濃度のＭＰＰ５でさえ、感受性があることを示す。従って、イヌの前立腺が解剖学的にヒトの前立腺に類似しているが、ＭＰＰ５の活性化の点からヒトの腺との機能的な関係があることを示さない、故に、イヌはＭＰＰ５に対する毒性モデルとしてさらに追求されなかった。しかしながら、イヌの研究は、ＰＳＡにより切断されない場合、ＭＰＰ５が薬理学的に不活性であることを示すのに役立ち、非ＰＳＡ生成組織中にある場合、有意な毒性を生成しない確信を提供した。
【０４３２】
実施例１５：サルにおけるＭＰＰ５の毒性
内因性のＰＳＡを生成する齧歯動物でない種において、ＭＰＰ５の毒性を確立するために、実施例７に説明されているように、０．３５、４．１４、または２５．７９μｇＭＰＰ５／ｇの前立腺組織を注射したオスのカニクイザル（４／群）において、前立腺毒性研究を実施した。前立腺のそれぞれの葉に１つずつ（２５μＬ／葉）、２つの会陰部への注射を投与した。本研究の準備段階の結果を実施例７に示す。最終結果の説明は、以下に示す。
【０４３３】
直接前立腺内投与後、２日あるいは１４日の観察期間後に、ＭＰＰ５に関連する毒性は、周囲の組織またはその他の明白な全身的な効果への損傷がほとんどなく、前立腺に限定された。血液分析の結果は、オスのカニクイザルがＰＳＡの検出可能な水準を発現し、ＭＰＰ５の前立腺内投与がＰＳＡの有意な量を血液／血清に放出することを示した。ＰＳＡ水準は、処置してから１０日後、基準水準近くまで戻った。臨床的徴候、体重、眼科的状態、尿検査、または心電図（ＥＣＧ）評価において、いずれの投与水準でも、処置関連の効果は観察されなかった。血清化学および血液学評価は、一過性細胞および炎症反応を示した。一過性急性期免疫反応は、研究３日目にすべての群において観察され、外科手技に関連する炎症および前立腺への局部的な炎症であると考えられた。研究３日目にみとめられたＣ反応性タンパク質（ＣＲＰ）の増加は、一般的には投与関連であり、混合細胞の範囲の炎症および顕微鏡的に観察された前立腺の壊死と一致した。
【０４３４】
肉眼的および顕微鏡的な病理学変化は、３日目に、すべてのＭＰＰ５の投与水準で前立腺において観察された。これらの変化は、壊死、出血、および混合細胞の浸潤により特徴付けられ、中投与量および高投与量でＭＰＰ５を受けた動物において、さらに重症であった。低投与量群におけるサルはまた、３日目に、間質（間葉）組織中の上皮組織および線維増殖における再生過形成および扁平上皮化生を含む、修復で一致した組織学的変化を示した。中投与量および高投与量群における修復は、３日目には、最小〜全く無かった。１５日目には、壊死は分解し、修復は低投与量群において進行中であった。中投与量および高投与量群において、壊死は１５日には進行中で、修復と一致する変化は壊死の病巣端に制限された。対照的に、３日目か１５日目のいずにおいても、前立腺の周囲または全身性の組織においてＭＰＰ５に起因する変化はなかった。
【０４３５】
実施例１６：サルにおけるＭＭＰ５の免疫応答
ＭＰＰ５への潜在的な免疫応答はまた、評価された。実施例７に説明されているように、動物をＭＰＰ５で処置した。ＭＰＰ５への潜在的な免疫応答は、以下の通り決定された。
【０４３６】
サル群は、下表に示すように、ＭＰＰ５の様々な投与量を直接前立腺へ受けた。血清（およそ０．５ｍＬ）を注射日前および注射してから１４日後再度、動物から採取した。血清は、アッセイまで−７０℃で保存した。免疫グロブリン反応を別に説明されているように、ＥＬＩＳＡ法により測定した。簡潔には、プロアエロリジン（リン酸緩衝生理食塩水中の０．５μｇ／ｍＬ）を４℃で一晩中、コーティングすることによりＥＩＡ皿に固定した。非特異的結合は、室温で５％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ）でコーティングすることにより抑制された。正常サルのプ−ル血清の一連の１０倍の希薄液（１：１００〜１：１，０００，０００）を４つ１組で使用し、ＭＰＰ５の投与後、各回で採取した動物からの血清において、力価測定のための比較曲線を形成した。ＭＰＰ５で処置されたサルからの血清試料を１０倍（１：１００〜１：１，０００，０００）に希薄し、濃度を正常血清に提供した。ペルオキシダーゼ抱合されたヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）をプロアエロリジンでコーティングしたウェルに結合した抗体に結合した。製造者の説明に従ってＯＰＤのペルオキシダーゼ基質の追加により色を作成した。分子動力学ＶＥＲＳＡｍａｘマイクロプレートリーダーにおいて４９０ｎｍでの吸収を測定した。力価は、吸収値がは、正常プール血清希釈＋同血清の希釈の標準偏差X２より少なく希釈より高い希釈として定義した。
【０４３７】
ＭＰＰ５の投与前に、賦形剤の対照動物の一つを除いたすべてのサルには、検出可能な力価がなかった。その対照動物は、小さい力価の出現が１４日目の試料において確認され、再度アッセイすることにより再度確認されたので、研究前に免疫原に曝露されたことを示す。１μｇ／ｇのＭＰＰ５を受けた２匹の動物のうち１匹は、力価を示した。同様に、５μｇ／ｇのＭＰＰ５を受けた２匹の動物のうち１匹は、力価を示した。同様に、２５μｇ／ｇのＭＰＰ５を受けた双方の動物は、力価を示した。
【０４３８】
投与前および投与後の採血でのそれぞれの動物の力価を表１６に記載する。
【０４３９】
（表１６）ＭＰＰ５の投与後、サルにおける抗体力価
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＊本動物は投与前に同一の小さい力価を示した。
【０４４０】
図３９は、ＭＰＰ５の投与後、サルにおける抗体力価を示す。力価は、１０４を上回るものがなかった。これは、ＭＰＰ５の前立腺内投与が強い免疫応答を引き出さないことを示す。しかしながら、６匹の処置された動物のうち４匹は、プール血清を越える力価を示した。
０．３５または４．１４μｇ／ｇ（前立腺）で処置された２匹のサルのうち１匹が抗体力価を示し、２５．７９μｇ／ｇ（前立腺）を受けた双方の動物が、力価を示した。従って、ＭＰＰ５の投与は、何匹かのサルにおいて、検出可能であるが、免疫応答の低い力価を誘発した。
【０４４１】
実施例１１、１２および１５にある所見に基づいて、いずれかの投与水準においても前立腺毒性の徴候はなく、従って、全身性のＮＯＡＥＬは、２５．７９μｇ／ｇ（前立腺）（実際の前立腺の重量に基づく）で、検査されたＭＰＰ５の最高投与量であった。前立腺内で観察された効果は、投与量依存的であり、周知のＭＰＰ５の活性の機構に基づき、予想されたものであった。前立腺内での効果は、低投与量で検査された、０．３５μｇ／ｇ（前立腺）を含む、すべての投与水準で観察され、前立腺のおよそ２５％が損傷した。従って、局所前立腺の効果に対する最低副作用発現量（ＬＯＡＥＬ）は、本研究では、０．３５μｇ／ｇ（前立腺）であった。
【０４４２】
前述の実施例は、オスのアルビノラットにおける静脈または前立腺内投与後、およびヒトでない霊長類における前立腺注射後の、ＭＰＰ５の薬物代謝および毒物動態学の検査を説明する。ＭＰＰ５で行われた非臨床的薬物代謝薬物動態学（ＤＭＰＫ）研究の概要は、表１７に示される。
【０４４３】
（表１７）ＭＰＰ５で実施された非臨床的薬物代謝薬物動態学研究のリスト
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【０４４４】
実施例１７：ＢＰＨに対する治験におけるＭＰＰ５投与の用量の選択および方法
ＢＰＨ中のＭＰＰ５の治験に対する開始用量の選択のための模範的論拠は、下記に記述した。ＭＰＰ５投与の模範的な方法もまた記述した。
【０４４５】
カニクイザルの前立腺とヒトの前立腺との間のＰＳＡ発現および生理的類似に基づいて、ここに説明される単一投与のサルの研究は、ヒトにおける安全な前立腺への開始用量を推定するための基準として、選択される。イヌは、ラットおよびサルとの比較において、ＭＰＰ５の効果に感度がよくなかったため、イヌは、ＭＰＰ５の安全な開始用量を推定するための適切なモデルであると見なされなかった。ここに説明されるラットの研究からのデータは、ラットがＰＳＡのコーディング遺伝子を有さないという事実にもかかわらず、ＭＰＰ５がラットの腹部前立腺に識別されるＰＳＡ様Ｓ３カリクレインにより活性化されると示す（Ｏｎｏｚａｗａら、２００１）。
【０４４６】
ＢＰＨの治験におけるＭＰＰ５の開始用量は、０．０３μｇ／ｇから０．２５μｇ／ｇ（前立腺）の範囲から選択される。単一投与サルの研究（０．３５μｇ／ｇ、前立腺）において検査した最小用量の１０倍の安全要因の適用に基づいて、潜在的な開始用量を０．０３μｇ／ｇ（前立腺）に設定する。０．３５μｇ／ｇの前立腺投与を受けたサルにおいて、局地的な前立腺の変化が指摘されたが、全身毒性は観察されなかった。すべての３つの用量は、前立腺組織の局所切除を示したが、中用量および高用量は、注射してから１４日後、最も著しい変化および回復の欠如を示した。最小用量（０．３５μｇ／ｇ、前立腺組織）は、組織学か実験室分析のいずれかによる全身的所見を示さないことと、限定されているが、およそ２５％の前立腺除去を伴う明らかに観察可能な局所的な前立腺効果であることの、有用な組み合わせを有すると結論付けた。これは、サルにおいて安全用量であると考えられた。これらのデータを使用して、少なくとも１０倍の安全要因が適用され、ヒトの前立腺についてグラムあたり０．０３μｇのＭＰＰ５の開始用量をＢＰＨ治験の第一群に対して選択する。
【０４４７】
ＢＰＨ治験のＭＰＰ５投与の模範的な方法は、投与あたり４つのみの注射（それぞれの側葉に２つの注射）を用いるのが、一般的投与の経直腸的経路である。注射中の誘導に関しては、例えば、経直腸超音波を使用可能である。ＢＰＨ治験の投与される総容積は、５０μＬ／ｇ（前立腺）である。注射中の逆流を削減するために、例えば、ジェルまたは粘性剤形を使用可能である。
【０４４８】
ある特定の実施形態に関連して本発明を説明しているが、その様々な修正は、ここに添付されている請求項に概説されているように、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、当業者にとっては明白であろう。
【０４４９】
それぞれの当該の個々の特許、出版物、およびデータベースの登録が参照することにより組み込まれることを明確かつ個別に示したかのように、公開された特許出願、および本仕様に参照されているデータベースの登録を含む、すべての特許、出版物の公開は、同一範囲に対する権利を与えることにおいて、参照することにより明確に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０４５０】
【図１】図１は、プロアエロリジン領域図（正確な縮尺で描かれていない）を示し、フューリンによる活性化の結果を示す。
【図２】図２は、ＭＰＰｌをヒト血漿または酵素的に活性のあるＰＳＡでスパイクしたヒト血漿（１０，０００ｎｇ／ｍｌ）で前培養した溶血アッセイの結果を示す棒グラフを示す。
【図３】図３は、プロアエロリジンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性に対する本発明の実施形態による数種類のＭＰＰのｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性の比較のグラフを示す。ＭＰＰは、プロアエロリジンから誘導され、天然のフューリン部位のかわりにＰＳＡ切断部位を含む。
【図４】図４Ａ〜４Ｅは、本発明の実施形態によれば、プロアエロリジンから誘導される数種類の異なるＭＰＰを生成するために、プロアエロリジンタンパク質が、どのように変換可能であるかを示す略図（正確な縮尺ではない）である。「＊」の符号は、プロアエロリジン結合領域の機能（すなわち、細胞膜内で濃縮する能力）を減少させる一つ以上の点変異、および／または一つ以上の欠失を示す。図４Ａは、野生型プロアエロリジンの略図を示す。図４Ｂは、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を含む修飾した活性化配列を備える、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。図４Ｃは、一つ以上の前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を含む修飾した活性化配列を備える、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。図４Ｄは、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を含む修飾した活性化配列および機能的に欠失した天然の結合領域を備える、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。機能的に欠失した天然の結合領域は、一つ以上の点変異または一つ以上の欠失により生成される。図４Ｅは、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を含む修飾した活性化配列および機能的に置換された天然の結合領域を備える、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。機能的に欠失した天然の結合領域は、図４Ｄに説明されるように生成される。本実施形態において、一つ以上の前立腺特異的標的領域をＭＰＰのＮ末端、またはＭＰＰの毒素領域のＣ末端に位置できる。
【図５】図５Ａは、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を含む修飾した活性化配列および機能的に置換する天然の結合領域を備える、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。天然の結合領域を一つ以上の点変異または一つ以上の欠失により生成する。一つ以上の前立腺特異的標的領域をＹ２１５Ｃ、またはＡ３００ＣでＭＰＰに位置できる。図５Ｂは、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を含む修飾した活性化配列および機能的に欠失した天然の結合領域を備える、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。天然の結合領域をプロアエロリジンの天然の結合領域の一つの欠失により機能的に欠失する。図５Ｃは、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を含む修飾した活性化配列および機能的に置換する天然の結合領域を備える、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。本実施形態において、一つ以上の前立腺特異的標的領域をＭＰＰの毒素領域のＮ末端、またはＭＰＰの毒素領域のＣ末端のいずれかに位置できる。ＭＰＰの天然の結合領域の一つを図５Ｂに説明するように欠失する。図５Ｄは、前立腺特異的プロテアーゼ切断部位を含む修飾した活性化配列および機能的に置換する天然の結合領域を備える、プロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。一つ以上の前立腺特異的標的領域をＹ２１５Ｃ、またはＡ３００ＣでＭＰＰに位置できる。ＭＰＰの天然の結合領域の一つを図５Ｂに説明するように欠失する。
【図６】図６Ａは、本発明のある実施形態による、機能的に置換する天然の結合領域を備えるプロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。さらに、ＭＰＰは、一つ以上の前立腺特異的標的領域を備える。一つ以上のアミノ酸残基の変異または欠失は、ＭＰＰＰの天然の結合領域を機能的に欠失する。図６Ｂは、本発明の実施形態による、機能的に置換する天然の結合領域を備えるプロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。さらに、ＭＰＰは、Ｙ２１５ＣまたはＡ３００Ｃでプロアエロリジンに位置する一つ以上の前立腺特異的標的領域を備える。一つ以上のアミノ酸残基の変異または欠失は、ＭＰＰＰの天然の結合領域を機能的に欠失する。図６Ｃは、本発明のある実施形態による、機能的に置換する天然の結合領域を備えるプロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。さらに、ＭＰＰは、一つ以上の前立腺特異的標的領域を備える。プロアエロリジンの天然の結合領域の一つの欠失が天然の結合領域を機能的に欠失する。図６Ｄは、本発明のもう一つの実施形態による、機能的に置換する天然の結合領域を備えるプロアエロリジンから誘導されるＭＰＰの略図を示す。さらに、ＭＰＰは、Ｙ２１５ＣまたはＡ３００Ｃでプロアエロリジンに位置する一つ以上の前立腺特異的標的領域を備える。プロアエロリジンの天然の結合領域の一つの欠失が天然の結合領域を機能的に欠失する。
【図７】図７は、野生型プロアエロリジンのｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を示す。
【図８】図８は、野生型プロアエロリジンのアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を示す。
【図９】図９は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰｌ）のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を示し、プロアエロリジンのフューリン部位がＰＳＡ切断部位と置換されている。
【図１０】図１０は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰｌ）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を示し、プロアエロリジンのフューリン部位がＰＳＡ切断部位と置換されている。
【図１１】図１１は、ヒトｓｅｍｅｎｏｇｅｌｉｎ  ＩおよびＩＩのタンパク質にあるＰＳＡ切断部位のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を示す。
【図１２】図１２は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰ２）のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を示し、プロアエロリジンのフューリン部位がＰＳＡ切断部位と置換されている。
【図１３】図１３は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰ２）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を示し、プロアエロリジンのフューリン部位がＰＳＡ切断部位と置換されている。
【図１４】図１４は、ＰＳＡ切断部位（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８）の実施例を示す。
【図１５】図１５は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰ３）のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を示し、プロアエロリジンのフューリン部位がＰＳＡ切断部位と置換されている。
【図１６】図１６は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰ３）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）を示し、プロアエロリジンのフューリン部位がＰＳＡ切断部位と置換されている。
【図１７】図１７は、ＰＳＡ切断部位（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）の第二の実施例を示す。
【図１８】図１８は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰ４）のｃＤＮＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を示し、プロアエロリジンのフューリン部位がＰＳＡ切断部位と置換されている。
【図１９】図１９は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰ４）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を示し、プロアエロリジンのフューリン部位がＰＳＡ切断部位と置換されている。
【図２０】図２０は、本発明による代替のＰＳＡ切断部位のアミノ酸配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１４〜２１）を示す。
【図２１】図２１は、本発明による代替のＰＳＡ切断部位のアミノ酸配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１４〜２１）を示す。
【図２２】図２２は、本発明による代替のＰＳＡ切断部位のアミノ酸配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１４〜２１）を示す。
【図２３】図２３は、本発明による代替のＰＳＡ切断部位のアミノ酸配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１４〜２１）を示す。
【図２４】図２４は、本発明による代替のＰＳＡ切断部位のアミノ酸配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１４〜２１）を示す。
【図２５】図２５は、本発明による代替のＰＳＡ切断部位のアミノ酸配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１４〜２１）を示す。
【図２６】図２６は、本発明による代替のＰＳＡ切断部位のアミノ酸配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１４〜２１）を示す。
【図２７】図２７は、本発明による代替のＰＳＡ切断部位のアミノ酸配列（それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯｓ：１４〜２１）を示す。
【図２８】図２８は、天然の黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を示す。
【図２９】図２９は、修飾黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）を示す。
【図３０】図３０は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰ６）のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を示し、プロアエロリジンのフューリン部位がＰＳＡ切断部位と置換され、プロアエロリジンの天然の結合領域が修飾されている。
【図３１】図３１は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰ７）のアミノ酸配列を示し、プロアエロリジンのフューリン部位が保持され、プロアエロリジンの天然の結合領域が欠失され、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）で置換されている。
【図３２】図３２は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰ５）の、３日間処置したサルの前立腺における効果を示す。ＡおよびＢは、賦形剤のみで処置された対照サルの前立腺を示し、ＣおよびＤは、１μｇのＭＰＰで処置されたサルの前立腺を示し、ＥおよびＦは、５μｇのＭＰＰで処置されたサルの前立腺を示し、ＧおよびＨは、２５μｇのＭＰＰで処置されたサルの前立腺を示す。
【図３３】図３３は、本発明のある実施形態によるＭＰＰ（ＭＰＰ５）の、１５日間処置したサルの前立腺における効果を示す。ＡおよびＢは、賦形剤のみで処置された対照サルの前立腺を示し、ＣおよびＤは、１μｇのＭＰＰで処置されたサルの前立腺を示し、ＥおよびＦは、５μｇのＭＰＰで処置されたサルの前立腺を示し、ＧおよびＨは、２５μｇのＭＰＰで処置されたサルの前立腺を示す。
【図３４】図３４は、ＭＰＰ５のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を示す。ＡＴＧ開始コドンおよびＴＡＡ終止コドンの下に線を引き、太字で示す。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位は、太字テキストで示す。ＰＳＡ切断部位の下に線を引き、６つのＨｉｓのタグは、太字イタリック体テキストで示す。
【図３５】図３５は、ＭＰＰ５のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）を示す。アミノ酸配列は、図３４に示される核酸配列から誘導された。アミノ酸４２７〜４３２（ＰＳＡ切断部位）の下に線を引き、太字で示す。６つのＨｉｓのタグは、太字テキストで示す。
【図３６】図３６は、洗浄済みの赤血球の加水分解の程度により測定を行った前立腺組織の断片馴化培地におけるＭＰＰ５の活性化を示す。
【図３７】図３７は、様々な種からの血清の、ＭＰＰ５を開裂する能力を示す。
【図３８】図３８は、サルの前立腺におけるＭＰＰ５の効果を示す。
【図３９】図３９は、サルのＭＰＰ５の投与への体液性反応を示す。
【図４０】図４０は、野生型クロストリジウム・セプチカムのα毒素のヌクレオチド配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）を示す。
【図４１】図４１は、野生型クロストリジウム・セプチカムのα毒素のアミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１２−３】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３２Ｅ】
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【図３２Ｆ】
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【図３２Ｇ】
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【図３２Ｈ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３３Ｅ】
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【図３３Ｆ】
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【図３３Ｇ】
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【図３３Ｈ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008546650.tif 000095
2008546650.tif 000096
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