(57)【要約】  本発明は、止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法において、ＣＬＥＣ−２発現細胞をテスト化合物に接触させるステップであって、自由選択でＣＬＥＣ−２リガンドに、テスト化合物が存在しない場合にＣＬＥＣ−２のＣＬＥＣ−２リガンドへの結合を可能にする環境で接触させるステップと、コントロールと比較してＣＬＥＣ−２活性の指標に増強あるいは減弱が確認されるか否かを検出するステップとを具備し、コントロールに対する指標の増強あるいは減弱によりテスト化合物が止血疾患の治療候補であることを示す方法である。
2008539694.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法において、
ＣＬＥＣ−２を発現する細胞をテスト化合物に接触させるステップであって、自由選択でＣＬＥＣ−２リガンドに、テスト化合物が存在しない場合にＣＬＥＣ−２のＣＬＥＣ−２リガンドへの結合を可能にする環境で接触させるステップと、
コントロールと比較して、前記化合物によりＣＬＥＣ−２機能の指標が増強されているか、または減弱されているかを検出するステップとを具備し、
コントロールに対する指標の増強あるいは減弱により、テスト化合物が止血調節の治療候補であることが示される方法。
【請求項２】
前記指標が、ａ)細胞活性、ｂ)ＣＬＥＣ−２のチロシンリン酸化およびｃ）プロテインキナーゼのＳｙｋファミリーの一メンバーとのＣＬＥＣ−２の相互作用からなる群から選ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞活性が細胞凝集や細胞形態の変化で示される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＬＥＣ−２リガンドがＣＬＥＣ−２機能のアンタゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＣＬＥＣ−２リガンドがＣＬＥＣ−２機能のアゴニストである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＣＬＥＣ−２リガンドがロドサイチンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＬＥＣ−２リガンドが抗体である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞が血小板である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記指標の減弱が、前記テスト化合物が細胞凝集を減弱させる候補であることを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記指標の減弱が、前記テスト化合物が血小板凝集を減弱させる候補であることを示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、
ａ）ＣＬＥＣ−２を発現する細胞をテスト化合物に接触させるステップと、
ｂ）コントロールと比較して、ＣＬＥＣ−２機能の指標の変化を検出するステップとを具備する方法。
【請求項１２】
前記指標の増強が、前記テスト化合物が細胞凝集を増強させる候補であることを示す、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
止血を調節するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、
テスト化合物とＣＬＥＣ−２リガンドを、ＣＬＥＣ−２を発現する非ヒト動物に投与するステップと、
コントロール動物と比較して、該化合物により、該動物におけるＣＬＥＣ−２機能の指標が増強されているか、または減弱されているかを検出するステップとを具備し、
前記指標における減弱は、前記化合物がＣＬＥＣ−２の生体内での機能を減弱させることによって細胞凝集を減弱させるための候補であることを示し、
前記指標における増強は、前記化合物がＣＬＥＣ−２の生体内での機能を増強させることによって細胞凝集を増強させるための候補であることを示す方法。
【請求項１４】
前記動物が、ＣＬＥＣ−２をコードする外因性核酸配列に遺伝子組み換えされた遺伝子組み換え非ヒト動物であり、前記ＣＬＥＣ−２が前記動物に発現する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞凝集が血小板凝集である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記指標が、細胞形態の変化と、細胞凝集と、ＣＬＥＣ−２のチロシンリン酸化と、ＣＬＥＣ−２の細胞質尾部のプロテインキナーゼのＳｙｋファミリーの一員との相互作用からなる群から選ばれる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
止血を調節するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、
化合物と、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントとを接触させるステップと、
前記ＣＬＥＣ−２の結合ドメインと前記化合物との結合を検出するステップとを具備する方法。
【請求項１８】
前記ＣＬＥＣ−２のフラグメントがＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、
細胞質ドメインにリン酸化したチロシンを有するＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントと、テスト化合物とを接触させるステップと、
前記化合物が、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドへのシグナル伝達パートナーの結合を調節するか否か検出するステップとを具備し、
前記シグナル伝達パートナーがチロシンキナーゼＳｙｋファミリーの一メンバーである方法。
【請求項２０】
前記Ｓｙｋファミリーの一メンバーがＳｙｋである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記化合物が、選択的に前記ＣＬＥＣ−２のリン酸化された細胞質ドメインに結合することにより、前記ＣＬＥＣ−２のシグナル伝達パートナーへの結合を妨げる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記化合物が、選択的に前記シグナル伝達パートナーに結合することにより、前記ＣＬＥＣ−２のシグナル伝達パートナーへの結合を妨げる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記化合物が、前記ＣＬＥＣ−２と前記シグナル伝達パートナーとの相互作用を妨げ、ＣＬＥＣ−２発現細胞の細胞凝集を減弱させる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞凝集が血小板凝集である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
ＣＬＥＣ−２のシグナル伝達を介して病的状態の重症度を軽減させる方法であって、細胞質ドメインにリン酸化チロシンを有するＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントを、シグナル伝達パートナーの前記ＣＬＥＣ−２への結合を妨げる化合物に接触させる方法。
【請求項２６】
ＣＬＥＣ−２のシグナル伝達を介して病的状態の重症度を軽減させる方法であって、哺乳動物にＣＬＥＣ−２シグナル伝達のアンタゴニストを投与する方法。
【請求項２７】
前記病的状態が、深刻な冠不全症候群、心筋梗塞、不安定狭心症、難治性の狭心症、血栓溶解療後の冠動脈内血栓性閉塞、冠動脈血管形成術後の冠動脈内血栓性閉塞、血栓による脳血管疾患、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、一過性脳虚血発作、静脈血栓症、深部静脈血栓症、肺動脈塞栓、凝固障害、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、閉塞性血栓血管炎、ヘパリン起因性血小板減少症に伴う血栓症、体外循環による血栓合併症、心臓または他の血管内カテーテル、大動脈内バルーンポンプ、動脈ステントあるいは心臓弁などの器具による血栓合併症、および人工器官の取り付けを要する状態からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＣＬＥＣ−２のシグナル伝達の欠如により病的状態の重症度を軽減させる方法であって、哺乳動物にＣＬＥＣ−２シグナル伝達のアゴニストを投与する方法。
【請求項２９】
前記病的状態が大量出血である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
単独の抗体を備え、該抗体が特異的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２のポリペプチドあるいはそのフラグメントに結合するＣＬＥＣ−２アンタゴニスト。
【請求項３１】
さらに薬学的キャリアを備える、請求項３０に記載のＣＬＥＣ−２アンタゴニスト。
【請求項３２】
前記抗体が、ａ）キメラ抗体、ｂ）Ｆａｂフラグメント、ｃ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、あるいはｄ）ヒト化抗体である、請求項３０または３１に記載のＣＬＥＣ−２アンタゴニスト。
【請求項３３】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２のポリペプチドあるいはそのフラグメント、またはその塩、および薬学的キャリアを備える医薬組成物。
【請求項３４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２をコードした核酸あるいはそのフラグメント、またはその塩、および薬学的キャリアを備える医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はシグナル伝達に関し、特に、ＣＬＥＣ−２により血小板活性を調節する組成物および化合物スクリーニング方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
血小板は小さな円板状の血球であり、止血作用および創傷の治癒に欠かせないものである。循環している血小板は通常の状態ではかなり非活性（quiescent）の状態であるが、血管が破れたり損傷したりした際には活性化する。血小板の活性化は、コラーゲンなどの成分が露出し、それが血小板表面のレセプタと結合することで行われる。この結合によりシグナル伝達経路が刺激され、血小板凝集や血液凝固および血栓形成が引き起こされる。
【０００３】
血栓形成は広範囲に渡る人間の病気の中でも、特に血管疾患の中で主な病因因子の一つである。動脈や静脈で血小板凝集が過剰になるとアテローム性プラークや動脈硬化性プラークが起こり、それによって微細な細胞組織への血液の流れが低減される。最終的に、この血小板による血栓の増大や血小板凝集の積み重ねが、深刻な心筋梗塞や、慢性不安定狭心症、一過性虚血、末梢血管障害、動脈血栓症、子癇前症、肺塞栓症そして再狭窄として現れる。
【０００４】
血栓形成や関連する疾病を治療するために、レセプタのシグナル伝達を抑制し、血小板凝集を軽減する薬剤が開発されている。そのターゲットとされてきた表面レセプタの一つが、インテグリンαＩＩｂβ３レセプタである。このレセプタはフィブリノゲンと結合し、血小板凝集を引き起こす。臨床用途に承認されたインテグリンαＩＩｂβ３抑制剤には次の三つがある。（１）インテグリンαＩＩｂβ３の活性構造に対するヒト化マウスモノクローナル抗体、（２）フィブリノゲンの結合を阻止するＲＧＤ（Arg-Gly-Asp）配列を有するペプチド、そして（３）フィブリノゲンの結合に対抗するディスインテグリン模擬化合物である。これらの抑制剤は血小板凝集を低減させるには有効であるが、三つとも安全性が低い。
【０００５】
ＧＰＶＩもまた、同様に抗血栓剤のターゲットとして使用されてきた血小板表面レセプタである。高等動物の血液を常食する昆虫や無脊椎動物の唾液から得られる化合物がコラーゲン、ＧＰＶＩリガンドおよびＧＶＩ表面レセプタの接触を阻止することが示されている。これらの薬剤は抗血栓効果を示しているが、また出血の危険性が高いとされている。
【０００６】
以下は、本発明をより分かりやすく説明するため例として参照した文献であり、参照により本書に組み込むこととする。
【非特許文献１】Andrews RK,Kamiguti AS, Berlanga O, Leduc M, Theakston RD, Watson SP. The use of snakevenom toxins as tools to study platelet receptors for collagen and von Willebrandfactor. Haemostasis. 2001;31:155-172
【非特許文献２】Morita T. Structures and functions of snakevenom CLPs （C-typelectin-like proteins） withanti-coagulant-, procoagulant-, and platelet-modulating activities. Toxicon. Inpress
【非特許文献３】Clemetson JM, Polgar J, Magnenat E, Wells TN,Clemetson KJ. The platelet collagen receptor glycoprotein VI is a member of theimmunoglobulin superfamily closely related to FcalphaR and the natural killerreceptors. J Biol Chem. 1999;274:29019-29024
【非特許文献４】Polgar J, Clemetson JM, Kehrel BE, WiedemannM, Magnenat EM, Wells TN, Clemetson KJ. Platelet activation and signaltransduction by convulxin, a C-type lectin from Crotalus durissus terrificus （tropical rattlesnake） venom via the p62/GPVIcollagen receptor. J Biol Chem. 1997;272:13576-13583
【非特許文献５】Jandrot-Perrus M, Lagrue AH, Okuma M, Bon C.Adhesion and activation of human platelets induced by convulxin involveglycoprotein VI and integrin alpha2beta1. J Biol Chem. 1997;272:27035-27041
【非特許文献６】Suzuki-Inoue K, Tulasne D, Shen Y, Bori-SanzT, Inoue O, Jung SM, Moroi M, Andrews RK, Berndt MC, Watson SP. Association of Fyn and Lyn with the proline-rich domain of glycoprotein VI regulates intracellularsignaling. J Biol Chem. 2002;277:21561-21566
【非特許文献７】Bori-Sanz T, Inoue KS, Berndt MC, Watson SP,Tulasne D. Delineation of the region in the glycoprotein VI tail required forassociation with the Fc receptor gamma-chain. J Biol Chem. 2003;278:35914-35922
【非特許文献８】Lee WH, Du XY, Lu QM, Clemetson KJ, Zhang Y.Stejnulxin, a novel snake C-type lectin-like protein from Trimeresurusstejnegeri venom is a potent platelet agonist acting specifically via GPVI.Thromb Haemost. 2003;90:662-671
【非特許文献９】Asazuma N, Marshall SJ, Berlanga O, Snell D,Poole AW, Berndt MC, Andrews RK, Watson SP. The snake venom toxinalboaggregin-A activates glycoprotein VI. Blood. 2001;97:3989-3991
【非特許文献１０】Andrews RK, Gardiner EE,Asazuma N, Berlanga O, Tulasne D, Nieswandt B, Smith AI, Berndt MC, Watson SP.A novel viper venom metalloproteinase, alborhagin, is an agonist at theplatelet collagen receptor GPVI. J Biol Chem. 2001;276:28092-28097
【非特許文献１１】Shin Y, Morita T.Rhodocytin, a functional novel platelet agonist belonging to the heterodimericC-type lectin family, induces platelet aggregation independently ofglycoprotein Ib. BiochemBiophys Res Commun. 1998;245:741-745
【非特許文献１２】Huang TF, Liu CZ, Yang SH.Aggretin, a novel platelet-aggregation inducer from snake （Calloselasma rhodostoma） venom, activatesphospholipase C by acting as a glycoprotein Ia/IIa agonist. Biochem J. 1995;309（ Pt 3）:1021-1027
【非特許文献１３】Suzuki-Inoue K, Ozaki Y,Kainoh M, Shin Y, Wu Y, Yatomi Y, Ohmori T, Tanaka T, Satoh K, Morita T.Rhodocytin induces platelet aggregation by interacting with glycoprotein Ia/IIa（GPIa/IIa,Integrin alpha 2beta 1）. Involvement ofGPIa/IIa-associated src and protein tyrosine phosphorylation. J Biol Chem.2001;276:1643-1652
【非特許文献１４】Navdaev A, Clemetson JM,Polgar J, Kehrel BE, Glauner M, Magnenat E, Wells TN, Clemetson KJ. Aggretin, aheterodimeric C-type lectin from Calloselasma rhodostoma （malayan pit viper）, stimulates platelets bybinding to alpha 2beta 1 integrin and glycoprotein Ib, activating Syk andphospholipase Cgamma 2, but does not involve the glycoprotein VI/Fc receptorgamma chain collagen receptor. J Biol Chem. 2001;276:20882-20889
【非特許文献１５】Bergmeier W, Bouvard D, EbleJA, Mokhtari-Nejad R, Schulte V, Zirngibl H, Brakebusch C, Fassler R, NieswandtB. Rhodocytin （aggretin） activates platelets lackingalpha（2）beta（1） integrin, glycoprotein VI,and the ligand-binding domain of glycoprotein Ibalpha. J Biol Chem.2001;276:25121-25126
【非特許文献１６】Suzuki-Inoue K, Garcia A,Eble JA, Fuller G, Pohlmann S, Zitzmann N, Inoue O, Gartner TK, Morita T, OzakiY, Watson SP. Identification of CLEC-2 as a Novel Signalling Receptor forRhodocytin in Platelets [abstract]. J Thromb Haemost. 2005 Abstract P1494 in press
【非特許文献１７】Suzuki-Inoue K, Inoue O,Frampton J, Watson SP. Murine GPVI stimulates weak integrin activation inPLC{gamma}2-/- platelets: involvement of PLC{gamma}1 and PI 3-kinase. Blood.2003;102:1367-1373
【非特許文献１８】Poole A, Gibbins JM, TurnerM, van Vugt MJ, van de WinkelJG, Saito T, Tybulewicz VL, Watson SP. The Fcreceptor gamma-chain and the tyrosine kinase Syk are essential for activationof mouse platelets by collagen. EMBO J. 1997;16:2333-2341
【非特許文献１９】Pasquet JM, Gross B, Quek L,Asazuma N, Zhang W, Sommers CL, Schweighoffer E, Tybulewicz V, Judd B, Lee JR,Koretzky G, Love PE, Samelson LE, Watson SP. LAT is required for tyrosinephosphorylation of phospholipase cgamma2 and platelet activation by thecollagen receptor GPVI. Mol Cell Biol. 1999;19:8326-8334
【非特許文献２０】Clements JL, Lee JR, GrossB, Yang B, Olson JD, Sandra A, Watson SP, Lentz SR, Koretzky GA. Fetalhemorrhage and platelet dysfunction in SLP-76-deficient mice. J Clin Invest.1999;103:19-25
【非特許文献２１】Pearce AC, Senis YA,Billadeau DD, Turner M, Watson SP, Vigorito E. Vav1 and vav3 have critical butredundant roles in mediating platelet activation by collagen. J Biol Chem.2004;279:53955-53962
【非特許文献２２】Eble JA, Beermann B, HinzHJ, Schmidt-Hederich A. alpha 2beta 1 integrin is not recognized by rhodocytinbut is the specific, high affinity target of rhodocetin, an RGD-independentdisintegrin and potent inhibitor of cell adhesion to collagen. J Biol Chem.2001;276:12274-12284
【非特許文献２３】Shevchenko A, Jensen ON,Podtelejnikov AV, Sagliocco F, Wilm M, Vorm O, Mortensen P, Shevchenko A,Boucherie H, Mann M. Linking genome and proteome by mass spectrometry:large-scale identification of yeast proteins from two dimensional gels. ProcNatl Acad Sci U S A. 1996;93:14440-14445
【非特許文献２４】Garcia A, Prabhakar S,Hughan S, Anderson TW, Brock CJ, Pearce AC, Dwek RA, Watson SP, Hebestreit HF,Zitzmann N. Differential proteome analysis of TRAP-activated platelets:involvement of DOK-2 and phosphorylation of RGS proteins. Blood.2004;103:2088-2095
【非特許文献２５】Pohlmann S, Zhang J,Baribaud F, Chen Z, Leslie GJ, Lin G, Granelli-Piperno A, Doms RW, Rice CM,McKeating JA. Hepatitis C virus glycoproteins interact with DC-SIGN andDC-SIGNR. J Virol. 2003;77:4070-4080
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【非特許文献２８】Gibbins J, Asselin J,Farndale R, Barnes M, Law CL, Watson SP. Tyrosine phosphorylation of the Fcreceptor gamma-chain in collagen-stimulated platelets. J Biol Chem.1996;271:18095-18099
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【非特許文献３１】Marshall AS, Gordon S.Commentary: C-type lectins on the macrophage cell surface--recent findings. EurJ Immunol. 2004;34:18-24
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【非特許文献３８】Chen M, Kakutani M, NarukoT, Ueda M, Narumiya S, Masaki T, Sawamura T. Activation-dependent surfaceexpression of LOX-1 in human platelets. Biochem Biophys Res Commun.2001;282:153-158
【非特許文献３９】Dean YD, McGreal EP, GasqueP. Endothelial cells, megakaryoblasts, platelets and alveolar epithelial cellsexpress abundant levels of the mouse AA4 antigen, a C-type lectin-like receptorinvolved in homing activities and innate immune host defense. Eur J Immunol.2001;31:1370-1381
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
以上から、この分野では血小板凝集に関連する疾病の治療に役立つ薬剤を開発するためのターゲットとなる血小板表面レセプタをさらに同定する必要がある。さらに、新たな血小板表面レセプタとそのシグナル伝達経路を阻止するのに有効な薬剤の同定を可能とする方法が求められている。さらに、血栓症に結びつく血小板凝集を引き起こすのに使用することのできる組成物と、異常な血小板表面レセプタ機能による過剰な出血を処置するのに効果的な組成物が求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法において、（ａ）ＣＬＥＣ−２発現細胞をテスト化合物に接触させるステップであって、自由選択でＣＬＥＣ−２リガンドに、テスト化合物が存在しない場合にＣＬＥＣ−２のＣＬＥＣ−２リガンドへの結合を可能にする環境で接触させるステップと、（ｂ）コントロールと比較して、前記化合物によりＣＬＥＣ−２機能の指標が増強されているか、または減弱されているかを検出するステップとを具備し、コントロールに対する指標の増強あるいは減弱により、テスト化合物が止血調節の治療候補であることが示される方法を提供する。
【０００９】
また、本発明は、  止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）ＣＬＥＣ−２を発現する細胞をテスト化合物に接触させるステップと、ｂ）コントロールと比較して、ＣＬＥＣ−２機能の指標の変化を検出するステップとを具備する方法を提供するものである。
【００１０】
さらに、本発明は、止血を調節するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、テスト化合物と自由選択でＣＬＥＣ−２リガンドを、ＣＬＥＣ−２を発現する非ヒト動物に投与するステップと、コントロール動物と比較して、該化合物により、該動物におけるＣＬＥＣ−２機能の指標が増強されているか、または減弱されているかを検出するステップとを具備し、前記指標における減弱は、前記化合物がＣＬＥＣ−２の生体内での機能を減弱させることによって細胞凝集を減弱させるための候補であることを示し、前記指標における増強は、前記化合物がＣＬＥＣ−２の生体内での機能を増強させることによって細胞凝集を増強させるための候補であることを示す方法を提供するものである。
【００１１】
さらに、本発明は、止血を調節するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、化合物と、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントとを接触させるステップと、前記ＣＬＥＣ−２ペプチドと前記化合物との結合を検出するステップとを具備する方法を提供するものである。
【００１２】
さらに、本発明は、止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、細胞質ドメインにリン酸化したチロシンを有するＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントと、テスト化合物とを接触させるステップと、前記化合物が、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドへのシグナル伝達パートナーの結合を調節するか否か検出するステップとを具備し、前記シグナル伝達パートナーがチロシンキナーゼＳｙｋファミリーの一メンバーである方法を提供するものである。
【００１３】
さらに、本発明は、ＣＬＥＣ−２のシグナル伝達を介して病的状態の重症度を軽減させる方法であって、細胞質ドメインにリン酸化チロシンを有するＣＬＥＣ−２あるいはそのリン酸化した細胞質ドメインを有するフラグメントを、シグナル伝達パートナーの前記ＣＬＥＣ−２への結合を妨げる化合物に接触させる方法を提供するものである。
【００１４】
さらに、本発明は、ＣＬＥＣ−２のシグナル伝達を介して病的状態の重症度を軽減させる方法であって、哺乳動物にＣＬＥＣ−２シグナル伝達のアンタゴニストを投与する方法を提供するものである。
【００１５】
さらに、本発明は、ＣＬＥＣ−２のシグナル伝達の欠如により病的状態の重症度を軽減させる方法であって、哺乳動物にＣＬＥＣ−２シグナル伝達のアゴニストを投与する方法を提供するものである。
【００１６】
さらに、本発明は、単独の抗体を備え、該抗体が特異的にＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２のポリペプチドあるいはそのフラグメントに結合するＣＬＥＣ−２アンタゴニストを提供するものである。
【００１７】
さらに、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２のポリペプチドあるいはそのフラグメント、またはその塩、および薬学的キャリアを備える医薬組成物を提供するものである。
【００１８】
最後に、本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２をコードした核酸あるいはそのフラグメント、またはその塩、および薬学的キャリアを備える医薬組成物を提供するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
発明者は驚くべきことに、Ｃタイプレクチン様レセプタ（ＣＬＥＣ−２）がロドサイチン（蛇毒）あるいはＣＬＥＣ−２抗体により血小板を活性化させることを突き止めた。実施例で示すように、発明者は、ロドサイチンアフィニティークロマトグラフィーとマス・スペクトロメトリーを用いて、ロドサイチンによる血小板活性化を引き起こす一つまたは複数のレセプタの同定を試みた。この取り組みにより、レセプタＣＬＥＣ−２を同定した。これは単一の炭水化物認識ドメインと細胞内にチロシン残基を含むモチーフを示しているが、ＣＬＥＣ−２を強制発現させた培養細胞はロドサイチンにより活性化シグナルが惹起されることが認められた。意義深いことに、ＣＬＥＣ−２は細胞質内尾部に単一のチロシンを含み、このチロシンが、ＩＴＡＭモチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif）の半分の構造にあたるＹＸＸＬ配列の中にあり、Ｓｒｃキナーゼのロドサイチン下流による活性化の際、チロシンリン酸化を受ける。さらに、チロシンリン酸化したＣＬＥＣ−２は、チロシンキナーゼのＳｙｋファミリーに含まれるＳｙｋの２つのＳＨ２と結合する。ロドサイチン惹起血小板凝集はＳｙｋ欠損の場合には起こらなかった。これによりＣＬＥＣ−２は蛇毒素のロドサイチンによる活性化を引き起こす血小板活性化レセプタであることが示された。
【００２０】
これらの観察に基づき、本発明では細胞活性あるいは細胞活性の欠損により止血疾患を治療するための方法および組成物を提供する。好ましくは、細胞が血小板であり、細胞活性には、細胞凝集や細胞形態の変化が含まれるが、これらに限定されることはない。
【００２１】
本書で述べる「止血」とは、流血あるいは出血を効果的に適切に止めることを意味する。本書で使用する「止血疾患」には、過度の出血や異常な血液凝固を含む状態や疾患が含まれるが、これらに限定されることはない。異常な血液凝固は深刻な冠不全症候群、心筋梗塞、不安定狭心症、難治性の狭心症、血栓溶解療後の冠動脈内血栓性閉塞、冠動脈血管形成術後の冠動脈内血栓性閉塞、血栓による脳血管疾患、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、一過性脳虚血発作、静脈血栓症、深部静脈血栓症、肺動脈塞栓、凝固障害、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、閉塞性血栓血管炎、ヘパリン起因性血小板減少症に伴う血栓症、体外循環による血栓合併症、心臓または他の血管内カテーテル、大動脈内バルーンポンプ、動脈ステントあるいは心臓弁などの器具による血栓合併症、および人工器官の取り付けを要する状態を含む疾患に関連するものであるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
（本発明のアッセイ）
本発明は、細胞系アッセイおよび無細胞系アッセイを用いて止血疾患を治療するための治療候補を同定する化合物のスクリーニング方法を提供する。
【００２３】
［本発明の細胞系アッセイ］
いくつかの実施形態では、本発明の方法に、止血疾患を治療するための治療候補を同定する化合物をスクリーニングするための細胞を用いる。
【００２４】
一実施形態による本発明の方法は、ａ）ＣＬＥＣ−２の発現細胞をテスト化合物と、自由選択でＣＬＥＣ−２リガンドと、前記化合物がない状態ではＣＬＥＣ−２がＣＬＥＣ−２リガンドと結合できる状態で接触させるステップと、ｂ）ＣＬＥＣ−２機能の指標の増大あるいは低減をコントロール（実験対照）と比較するステップとを含む。指標の増大あるいは低減は、その化合物がＣＬＥＣ−２と相互作用することによって止血を緩和させる候補であることを示すものである。
【００２５】
この実施形態において、テスト化合物はＣＬＥＣ−２の発現細胞と細胞表面で接触させる。この接触ステップは、化合物がない状態では、ＣＬＥＣ−２とＣＬＥＣ−２リガンドとの結合を可能とする状態で行われる。したがって、たとえば、接触ステップは、生理的に許容されるバッファー溶液で行ったり、細胞が成長する細胞培地で実行したりすることができる。好ましくは、in vivo状態にほぼ等しい状態を選択する。
【００２６】
本書で使用する「ＣＬＥＣ−２リガンド」は細胞表面で発現するＣＬＥＣ−２の結合ドメインに結びつく分子を意味するものである。
【００２７】
一実施形態において、ＣＬＥＣ−２リガンドはＣＬＥＣ−２機能のアンタゴニストである。
【００２８】
他の実施形態では、ＣＬＥＣ−２リガンドはＣＬＥＣ−２機能のアゴニストである。好ましくは、アゴニストリガンドはＣＬＥＣ−２抗体であり、例として、R & D Systems（Minneapolis, MN）のＣＬＥＣ−２抗体が挙げられる。さらに好ましくは、ＣＬＥＣ−２アゴニストリガンドはロドサイチンである。
【００２９】
ＣＬＥＣ−２機能の指標は、血小板細胞がアゴニストである、ロドサイチンやＣＬＥＣ−２抗体と接触する際に観察される（実施例を参照のこと）。レセプタリガンドアゴニストと接触すると、ＣＬＥＣ−２はシグナル伝達カスケードを活性化させ、それにより、１）ＣＬＥＣ−２がリン酸化され、さらに好ましくは、ＣＬＥＣ−２細胞質ドメインのＹＸＸＬモチーフがリン酸化される、２）チロシンキナーゼのＳｙｋファイミリー成分がＣＬＥＣ−２の細胞質ドメイン、好ましくはＳｙｋ成分と相互作用する、３）細胞活性化が起こるといった指標が現れるが、指標はこれらに限定されない。
【００３０】
一実施形態において、細胞活性化は、活性化されてない細胞の形やむ活性状態の形と比較して、細胞の形に変化が現れている。
【００３１】
他の実施形態において、細胞活性化は細胞の凝集で現れる。
【００３２】
好ましくは細胞の凝集は血小板凝集である。
【００３３】
ＣＬＥＣ−２機能の指標測定方法を以下の実施例で説明する。細胞の活性化は、実施例１（ｈ）に示す方法を含めて周知の方法によって評価することができる。ＣＬＥＣ−２のチロシンリン酸化も、実施例５に示す方法を含めて周知の方法で評価することができる。ＳｙｋのＣＬＥＣ−２の細胞質尾部との相互作用は実施例６に示す方法により間接的に評価することができる。
【００３４】
これらの指標の存在の有無や数を、コントロール（実験対照）細胞と比較する。コントロール細胞は、自由選択でＣＬＥＣ−２リガンドと接触させるが、テスト化合物とは接触させていない。コントロール細胞と比較して指標が減ったり、存在がなくなったりしたテスト化合物はＣＬＥＣ−２のシグナリングのアンタゴニストであり、血液凝固、細胞凝集、好ましくは血小板凝集に関連する止血疾患の治療のための候補化合物として使用することができる。また、コントロール細胞と比較して指標の存在や数に増加が見られたテスト化合物は、過度の出血、たとえば、細胞凝集の低下や欠如、好ましくは血小板凝集の低下や欠如により止血疾患の治療のための候補化合物として使用することができる。
【００３５】
他の実施例によると、本発明は、止血疾患を治療するために治療候補を同定するための化合物のスクリーニング方法であって、ａ）ＣＬＥＣ−２の発現細胞をテスト化合物接触させるステップと、ｂ）コントロールに対してＣＬＥＣ−２機能の指標の変化を検出するステップを含む方法を提供する。指標における変化が意味するところは、化合物がＣＬＥＣ−２との相互作用により止血疾患を緩和させるための候補であることである。
【００３６】
好ましくは、細胞がまずＣＬＥＣ−２リガンドで活性する。一実施形態によると、ＣＬＥＣ−２リガンドはアゴニストである。他の実施形態によると、ＣＬＥＣ−２リガンドはアンタゴニストである。
【００３７】
好ましくは、本発明によるＣＬＥＣ−２を発現させる生体細胞を利用する止血疾患の治療候補を同定する化合物のスクリーニング方法は、ＣＬＥＣ−２を自然に発現させる細胞を使用する。他の実施形態では、本発明の方法では、ＣＬＥＣ−２の発現を引き起こす、あるいは高めるために遺伝子操作された細胞を使用する。
【００３８】
さらに、好ましい実施形態では、細胞の遺伝子構造を操作して、キメラタンパク質を遺伝子構造を記述した配列を使用する。キメラタンパク質はＹＸＸＬモチーフを含む細胞質ドメインおよび結合ドメインに記述されものである、自然のＣＬＥＣ−２とほぼ同様の機能を有する。
【００３９】
本発明の細胞は、好ましくは、哺乳類（ヒト、サル、マウス、ラット、イヌ科動物、ハムスター、ウサギ、ヤギなど）の細胞とし、他の真核細胞（昆虫細胞、イースト菌）あるいは原核細胞（細菌性細胞）を使用して、ヒトあるいは他の哺乳動物のＣＬＥＣ−２を発現するように遺伝子操作することもできる。細胞は不死化した細胞ライン、細胞培養あるいは主な細胞調合から得ることができ、または直接動物（ヒトあるいは他の哺乳動物、または非ヒトトランスジェニック動物）から得ることができる。
【００４０】
さらに好ましい実施形態において、細胞は、ヒトＣＬＥＣ−２を発現するヒト、マウス、ネズミ、ハムスターの細胞である。
【００４１】
さらに好ましい実施形態において、細胞は、ヒト、マウスであり、ヒトＣＬＥＣ−２を発現する。
【００４２】
さらに好ましい実施形態において、細胞は血小板である。さらに好ましい実施形態において、細胞は血小板であり、内生的にヒトＣＬＥＣ−２を発現する。
【００４３】
［遺伝子構造］
本発明の形質転換細胞および／または遺伝子組み換え非ヒト動物（以下参照のこと）を生成するため、様々な標準的遺伝子組み換え構造を採用することができる。
【００４４】
遺伝子構造を、特異的にあるいは非特異的にターゲット細胞のゲノムに組み込んだ幅広いベクターのいずれかの構造成分としてターゲット細胞に導入する。適当な発現ベクターとしては、バクテリアベクター、プラスミドベクター、酵母ベクター、ウィルスベクターがある。ウィルスベクターには、単純ヘルペスウィルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウィルスベクター、レトロウィルスベクター、レンチウイルスベクター、仮性狂犬病ウィルスベクター、アルファ−ヘルペスウィルスベクター等が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ウィルスベクターの徹底した見直しや対象のポリヌクレオチドの発現と併せてかかるベクターの利用方法については、Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications, Caplitt and Loewy, eds., Academic Press, San Diego, 1995に記載されている。
【００４５】
レトロウィルスパッケージング細胞ラインと併せてレトロウィルスベクターを用いることもでき、このことは米国特許第５,４４９，６１４号に記載されている。非マウス哺乳類細胞を遺伝子組み換えのターゲット細胞として利用する場合、両種性または汎親和性パッケージング細胞ラインを使用して適当なベクターをパッケージングすることができる（Ory et al. （1996）, Proc.Natl. Acad. Sci. （USA） 93:11400-11406）。代表的なレトロウィルスベクターは、たとえば、米国特許第５，５２１，０７６号に記載されている。
【００４６】
ＣＬＥＣ−２あるいはそのフラグメントの発現を惹起させる、または強化させるための遺伝子構造には通常、ＹＸＸＬモチーフを含む細胞質ドメインを少なくともコードする遺伝子配列があり、それは、ＣＬＥＣ−２配列に対し外因性の（およびターゲット細胞のゲノムに対して外因性となり得る）転写調節要素と作動可能に結合されている。これらの転写調節要素には、転写プロモーター領域と、自由選択でエンハンサー配列が含まれる。構造に組み込まれる転写プロモーターとエンハンサーには、細胞特異プロモーター、組織特異プロモーター、誘導プロモーターおよび調節可能プロモーターが含まれるが、これに限定されない。具体例としては、単純ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター、サイトメガロウイルス（CMV）プロモーター／エンハンサー、ＳＶ４０プロモーター、ＰＧＫプロモーター、メタロチオネインプロモーター、アデノウィルスレイトプロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、鳥類ベータグロビンプロモーター、ヒストンプロモーター（e.g.,mouse histone H3-614 promoter）、ベータアクチンプロモーター、およびカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓ プロモーター、（Sambrook et al., Molecular Cloning, Vols. I-III, Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. （1989）, and Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley& Sons （1989-2000 editions）を参照のこと）があるが、これらに限定されるわけではない。
【００４７】
上述の遺伝子構造は、以下で説明するＣＬＥＣ−２ポリペプチド配列をコードする核酸を利用するものである。本書で用いているように、「ペプチド」および「ポリペプチド」の用語は同じ意味で使用することとする。
【００４８】
本発明としては、「核酸」を、以下で定義するＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２を含むポリペプチド、その生体フラグメントをコードするＲＮＡあるいはＤＮＡ、またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２と同等の配列を有するポリペプチドまたはその生体フラグメントをコードするＲＮＡあるいはＤＮＡとする。または、かかるポリペプチドをコードする核酸配列に相補的であったり。かかる核酸の雑種となり、ストリンジェントな条件下ではそれに安定して結合している。具体的には、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンス分子そしてｓｉＲＮＡについて検討することとする。
【００４９】
ヌクレオチドやアミノ酸配列レベルの相同性や同一性を、配列の相同性検索用に作られたblastp,blastn, blastx, tblastn and tblastxプログラムを用いるＢＬＡＳＴ（BasicLocal Alignment Search Tool）分析（Karlin et al, Proc Nad Acad Sci USA （1990） 87: 2264-2268およびAltschul, S. F., J. Mol. Evol. （1993） 36: 290-300を参照のこと。また、この内容は参照により本書に組み込む）で判定する。このBLASTプログラムによる手法は、最初に、クエリ配列とデータベースの配列との類似のセグメントについて検討し、次いで同一であった一致その全てについて統計的有意性を評価し、最後にあらかじめ選択された有意性の閾値を満たしている一致のみをまとめるものである。配列データベースの相同性検索についての基本的事項の考察はAltschul et al. （Nature Genetics （1994） 6: 119-129）（参照により本書に組み込む）を参照されたい。ヒストグラム、説明、アラインメント、期待値（たとえば、データベース配列に対する一致を報告するための統計的有意性の閾値）、基準値、行列、フィルタなどのパラメータはデフォルト設定である。
【００５０】
blastp, blastx, tblastn, and tblastxが使用しているデフォルトのスコア行列は、ＢＬＯＳＵＭ６２行列（Henikoff et al., Proc Natl, Acad Sci USA （1992） 89: 10915- 10919，参照により本書に組み込む）である。Blastnについては、Ｎ（たとえば、不一致残基のペナルティスコア）に対するＭ（たとえば、一致残基対に対するリワードスコア）の比でスコア行列を設定し、ＭとＮのデフォルト値はそれぞれ、−５と−４である。
【００５１】
さらなる実施形態において、本発明で使用する核酸配列は、ストリンジェントな条件で開示された配列の雑種となるものである。本書で用いる「ストリンジェントな条件」とは、（１）イオン強度が低く洗浄温度が高い状態で、たとえば０．０１５ＭのＮａＣｌ／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム（チトラート）／０．１％ＳＤＳで温度５０℃、あるいは（２）ハイブリッド形成中にホルムアミド等の変性剤を使用して、たとえば、５０％（vol/vol）ホルムアミドに、０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％polyinylpyrrolidone／５０ｍＭリン酸ナトリウムバッファｐＨ６．５、７５０ｍＭＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムで温度４２℃とする。別の例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ，０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム），５０ｍＭ リン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）， ０．１％ピロリン酸ナトリウム, ５×デンハルト液、超音波処理されたサーモンスパームＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ），０．１％ＳＤＳ，１０％硫酸デキストラン，温度４２度，洗浄温度４２℃，０．２×ＳＳＣ，0.1％ＳＤＳ。当業者であれば、クリアで検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得るべく、「ストリンジェントな条件」を容易に決定氏適当に変更することができよう。
【００５２】
好ましくは、本発明の核酸がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２とその生体フラグメントをコードする。好ましいフラグメントは、ＹＸＸＬモチーフを有するＣＬＥＣ−２の細胞質ドメインをコードするものであり、それはチロシンキナーゼでリン酸化されるものである。
【００５３】
、
さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２の対立遺伝子変異体（Allelic Variant）の相同部分とそのフラグメントをコードする核酸と、同類（保存的）アミノ酸置換およびそのフラグメントについても検討する、本書で使用しているように、「対立遺伝子変異体」は本書で説明したものとは異なるアミノ酸配列を有する自然発生のＣＬＥＣ−２を指す。変異は、上述の配列とは異なるアミノ酸配列を有しているが、それでも細胞表面に発現する必須の結合ドメインおよび／またはＣＬＥＣ−２のシグナル伝達パートナーによって認識されるリン酸化可能なチロシン残基を有しており、関連するシグナル伝達カスケードの一部としてこのパートナーと結合したり作用したりする。
【００５４】
本書で使用している通り、「同類アミノ酸置換」は、ペプチドに対し大きな影響を与えることのないアミノ酸配列の改変を指している。置換とは、改変した配列が、細胞表面に発現したときにＣＬＥＣ−２の結合ドメインとのＣＬＥＣ−２リガンドの結合を妨げるとき、かつ／またはペプチドのリン酸化あるいはリン酸化したペプチドのシグナル伝達パートナーとの結合力が妨げられたときに、ペプチドに大きな（マイナスの）影響を与えるものと考えられている。たとえば、ペプチドにマイナス影響を与えることなく、ペプチドの全体変化、構造や、疎水性／親水性が改変されることもある。したがって、ペプチドのリガンドとの結合力にマイナスの影響を与えることなく、および／またはペプチドのリン酸化やおよび／またはリン酸化したペプチドのシグナル伝達パートナーとの結合力にマイナスの影響を与えることなく、上記ペプチドのアミノ酸配列を改変し、たとえば、ペプチドの疎水性または親水性を高めたりすることができる。
【００５５】
通常、本発明で使用している核酸は、説明したＣＬＥＣ−２のペプチドと少なくとも７５％のアミノ酸配列の相同性を有するアミノ酸配列を含むペプチドと類似物をコードするものであり、より好ましくは少なくとも８０％のアミノ酸配列を、さらには９０％、最適には９５％のアミノ酸配列の相同性を含むペプチドと類似物をコードする。かかる配列についての相同性や同一性は、本書では、配列のアラインメントを行い、必要ならばギャップを挿入して最高の相同性を得るようにした後の周知のペプチドと同一の候補配列におけるアミノ酸残基の割合で決まる。その際、配列の同一性に同類置換は考慮しない。
【００５６】
したがって、本発明で有用なペプチドおよび類似分子をコードする核酸には、本書で説明したペプチドを有するペプチドをコードする分子、そのフラグメントであって、ＹＸＸＬモチーフを含む対応するＣＬＥＣ−２の細胞質ドメインにより少なくとも３、４、５，１０または１５のアミノ酸残基の同類配列を有するもの、上述の周知の配列のアミノ酸配列変異体とそのフラグメントであって、他の残基と置換されているものが含まれる。検討している核酸はまた、所定の突然変異、たとえば、相同組換え、部位特異的あるいはＰＣＲ変異と、これらに限定されるわけではないが、ウサギ、ラット、マウス、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマそして非ヒト霊長類動物等の動物のＣＬＥＣ−２あるいはそのフラグメント、上記種のあるいはヒト配列のＣＬＥＣ−２細胞質ドメインの変異体あるいは自然発生の変異体と、ペプチドあるいはそのフラグメントが化学、酵素あるいは他の適切な手段で改質され自然発生のアミノ酸以外のmoietyに共有接合する（たとえば、酵素や放射性同位体などの検出可能なmoiety）と、糖鎖変異体（アミノ酸の欠失、挿入または置換による糖鎖結合部位の挿入あるいは糖鎖結合部位の欠失）と、可溶型や不可逆的リン酸化型が含まれる。
【００５７】
［動物アッセイ］
さらに、本発明は、止血調節のための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、全非ヒト動物を使用する方法を提供するものである。この点では、テスト化合物を上述のＣＬＥＣ−２リガンドとともに動物に投与し、該動物におけるＣＬＥＣ−２機能の指標の増強あるいは減弱をコントロール動物と比較して検出する。
【００５８】
一実施形態において、コントロール動物をＣＬＥＣ−２リガンドと接触させるが、テスト化合物は接触させない。
【００５９】
コントロール動物と比較して指標の増強は、上述のとおり、化合物がin vivoでのＣＬＥＣ−２機能を増強させることにより細胞凝集を増強させるのに有効な候補であることを示している。好ましくは、コントロールと比較して指標に減弱が見られると、それは、化合物がin vivoでのＣＬＥＣ−２機能を減弱させることにより細胞凝集を減弱させるのに有効な候補であることを示している。好ましくは、細胞凝集は血小板凝集である。
【００６０】
実施形態によっては、動物を、ＣＬＥＣ−２を通常発現する動物とし、レセプタに対し健常動物である。あるいは、動物は遺伝子組み換えの非ヒト動物、あるいはその子孫であり、ＣＬＥＣ−２コードする遺伝子構造に組み換えられており、ＣＬＥＣ−２はその動物に、好ましくは内因性のＣＬＥＣ−２を発現する細胞組織に現れる。組み換えベクターは生成することができ、胚盤胞やＥＳ細胞の組み換えに使用することができる。次いで、これらの組み換えが行われた細胞を用いて遺伝子組み換え動物を周知の方法で生成することができる。（例えば、 Solle et al. （2001）,J. Biol. Chem. 276:125-132を参照のこと。また、この内容は参照により本書に組み込むこととする）。
【００６１】
［ＣＬＥＣ−２発現のモジュレータのアッセイ］
さらに、本発明は、化合物をスクリーニングするための方法であって、その化合物がＣＬＥＣ−２遺伝子の転写を調節することによりＣＬＥＣ−２の発現を調節する方法を提供するものである。かかる化合物は止血疾患を調節するための治療候補である。
【００６２】
好ましくは、内因性ＣＬＥＣ−２を発現する細胞を使用して、ＣＬＥＣ−２をコードする配列の発現を、通常の周知の方法でＣＬＥＣ−２のｍＲＮＡあるいは蛋白のレベルを検出することで測る。
【００６３】
［無細胞結合アッセイ］
さらに本書で提供するのは、無細胞アッセイにおいてＣＬＥＣ−２に結合する化合物をスクリーニングする方法である。一実施形態において、本発明は、止血疾患を治療する治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、ａ）化合物をＣＬＥＣ−２ポリペプチドまたはそのフラグメントに接触させて、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドとテスト化合物の結合を検出することによって、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドとテスト化合物の結合によって該化合物が止血調節のための候補であることを示す方法を提供する。
【００６４】
好ましくは、ポリペプチドあるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２およびそのフラグメントをコードする核酸を本発明の方法で使用する。さらに好ましくは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:３のＣＬＥＣ−２フラグメントをコードする核酸を使用する。さらに好ましくは、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドには少なくともＹＸＸＬモチーフが含まれる。
【００６５】
さらに他の実施形態において、本発明は、止血疾患を治療するための治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、細胞質ドメインにリン酸化したチロシン残基を有するＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはリン酸化したチロシン残基を有するそのフラグメントをテスト化合物に接触させ、化合物がＣＬＥＣ−２ポリペプチドへのシグナル伝達パートナーの結合を調節するか否か検出する方法であって、シグナル伝達パートナーがチロシンキナーゼのＳｙｋファミリーの一メンバーである方法を提供する。
【００６６】
この実施形態において、少なくともリン酸化したＹＸＸＬモチーフを含むＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントを使用する。ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントは周知の方法でリン酸化することができる。ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントはテスト化合物とともに、またはテスト化合物を加えないでシグナル伝達パートナーと反応させる。
【００６７】
シグナル伝達パートナーはチロシンキナーゼのＳｙｋファミリーの一メンバーであり、さらに好ましくは、Ｓｙｋである。
【００６８】
本書で使用する「シグナル伝達パートナー」は分子を示し、それは、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントとの相互作用を通じて、細胞膜を超えるシグナルの伝達を調節する分子である。たとえば、チロシンキナーゼのＳｙｋファミリーがこの用語に含まれる。
【００６９】
インキュベートの後、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントとシグナル伝達パートナーとの結合を可能とする条件下で、二つの化学組成を分析し、テスト化合物がＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントとシグナル伝達パートナーとの結合を調節することができるかどうか判定する。
【００７０】
一実施形態において。テスト化合物が、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントのリン酸化した細胞質ドメインと選択的に結合することによって、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントとシグナル伝達パートナーとの結合を妨げる。
【００７１】
他の実施形態において、テスト化合物が、シグナル伝達パートナーと選択的に結合することによって、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントの結合を阻止する。
【００７２】
他の実施形態において、テスト化合物が、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントの相互作用を阻止し、ＣＬＥＣ−２発現細胞の細胞凝集を減弱させる。好ましくは、細胞凝集が血小板凝集である。
【００７３】
上記の実施形態の中には、化合物とＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメント、化合物とシグナル伝達パートナー、またはシグナル伝達パートナーとＣＬＥＣ−２ポリペプチドの結合の検出を容易にするために、化合物とシグナル伝達パートナーのいずれかに検出可能なラベルをすることが好ましい。ラベルした成分をＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントと接触させた後、結合されていないラベル成分を洗浄して除き、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントに結合されたラベル成分を検出する。
【００７４】
上述の結合アッセイにおいて使用するラベルには、ラジオアイソトープ（例：３２Ｐ, ３５Ｓ）、蛍光ラベル（例：フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、およびフルオレサミン）、化学発光法によるラベル（例：ルシフェリン、ルミノール反応、イソルミノール、芳香族アクリジンエステル、イミダゾール、シュウ酸エステル）、酵素ドメイン（例：ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、glucose-6-phosphate dehydrogenase、マレイン酸塩デヒドロゲナーゼ、ブドウ糖酸化酵素、そしてペルオキシダーゼ）、特異結合要素（例： ｃ−マイコエピトープ、ビオチン（ストレプト）アビジン、プロテインＡ、レクチン、免疫グロブリン）、および金属原子（例：Ａｕ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
上述の結合アッセイの好ましい実施形態において、ラベルしていない結合成分を固定する。そして実施形態によっては、化合物をラベルして、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントを基質上で固定させたり、あるいはシグナル伝達パートナーにラベルをして、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドを基質上で固定させたりする。
【００７６】
これらの成分の固定化に適した基質としては、アフィニティー・カラム、スライド、ウェル、パーティクルおよび／またはミクロパーティクルが含まれる。
【００７７】
また、止血疾患を調節する治療候補を同定するために化合物をスクリーニングする方法であって、凝集アッセイを使用する方法を提供する。この方法では、化合物を第一パーティクルで固定し、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントを第二パーティクルで固定する。
【００７８】
他の実施形態では、化合物を第一パーティクルで固定し、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドを第二パーティクルで固定し、シグナル伝達パートナーを第三パーティクルで固定する。シグナル伝達パートナーを含む実施形態では、パーティクルの接触を、テスト化合物が妨げない限りＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントのシグナル伝達パートナーへの結合が可能な条件下で行う。
【００７９】
化合物間の結合の検出は、パーティクルの凝集を検出することで行う。凝集は、化合物が、たとえば、ＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントとの、またはＣＬＥＣ−２ポリペプチドシグナル伝達パートナーとの相互作用により、止血を調節するための候補であることを示している。凝集の測定には、濁度計測などの通常の技術を使用する。本発明での使用に適したパーティクルにはラテックス，ポリ乳酸（ＰＬＡ：polylactic acid），ポリグリコール酸（ＰＧＡ：polyglycolicacid），poly co-lactic-glycolic acid（ＰＬＧＡ）, poly ethylene glycol （ＰＥＧ）および同等のマイクロスフェアが含まれ、大きさは１μｍ−１０００μｍである。
【００８０】
［テスト化合物］
ＣＬＥＣ−２アゴニストまたはアンタゴニストとなる化合物を同定するために上記の全ての実施形態でスクリーニングすることのでき、つまりは止血疾患を調節することのできる化合物クラスの例には、核酸（たとえば、ＤＮＡやＲＮＡ）、炭水化物、脂質、蛋白質、ペプチド、ペプチド・ミミックス、小分子が含まれるが、それらに限定されない。
【００８１】
テスト化合物は、自然発生の化合物のライブラリーやコンビナトリアルケミストリーで生成される合成物のライブラリーを含めて、当業界で周知の多数ある方法で得られる薬剤ライブラリーから同定することができる。
【００８２】
分子ライブラリーの合成（構築）方法は、例えば、米国特許第５，７３８，９９６号；米国特許第５，８０７，６８３号；DeWitt et al. （1993）,Proc. Natl. Acad. Sci. （USA）90:6909；Erb et al. （1994）, Proc. Natl. Acad. Sci. （USA） 91:11422； Zuckermann et al. （1994）, J. Med. Chem. 37:2678；Cho et al. （1993）, Science261:1303；Carrell et al. （1994）, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:  2059；Carell et al. （1994）,Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061；Gallop et al. （1994）, J. Med. Chem. 37:1233；およびLam （1997）, AnticancerDrug Des. 12:145に記載されている。
【００８３】
薬剤のライブラリーは、溶液については例えば、Houghten （1992）, Bio/Techniques13:412-421、ビーズについてはLam （1991）, Nature 354:82-84、チップについてはFodor （1993）, Nature 364:555-556、細菌については、米国特許第５，２２３，４０９号、胞子については米国特許第５，５７１，６９８号；米国特許第５，４０３，４８４号；および米国特許第５，２２３，４０９号、プラスミドについてはCull et al. （1992）, Proc.Natl. Acad. Sci. （USA）89:1865-1869、ファージについてはScott and Smith （1990）, Science 249:386-390，Devlin （1990）, Science249:404-406；Cwirla et al. （1990）, Proc. Natl. Acad. Sci. （USA） 87:6378-6382;およびFelici （1991）, J. Mol. Biol. 222:301-310）に開示されている。 
【００８４】
（本発明の組成物）
本発明はまた、止血調節に使用しうる化合物を提供するものである。
【００８５】
［抗体］
一実施形態において、本発明はＣＬＥＣ−２機能に拮抗する抗体を提供する。用語「抗体」は完全な（intact）免疫グロブリン分子と、そのフラグメントを指す。例としては、Ｆａｂ，Ｆ（ａｂ’）２、そしてＦｖフラグメントがあり、それらは抗原決定基を結合することができるものである。ＣＬＥＣ−２ポリペプチドに結合する抗体は、免疫抗原として完全なポリペプチドを用いて、あるいは対象となる小ペプチドを含むフラグメントを使用して生成することができる。ポリペプチドまたはオリゴペプチドは、動物（たとえば、マウス、ラット、ウサギ）に免疫を与えるのに使用するのだが、ＲＮＡの転写により得ることができ、化学的に合成したり、所望に応じてキャリア蛋白に共役させることもできる。一般に使用され、化学的にペプチドに結合されるキャリアには、ウシ血清アルブミン,サイログロブリン（thyroglobulin）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ：keyhole limpet hemocyanin）が含まれる。次いで、結合されたペプチドを利用して動物に免疫を与える。
【００８６】
用語「抗原決定基」とは、特定の抗体と接触する分子の一領域を指す（例：エピトープ）。蛋白または蛋白質フラグメントを用いてホスト動物に免疫を与える場合、該蛋白の複数の領域で抗体が生成され、それが特異的に抗原決定基（蛋白の特定領域あるいは立体構造）と結合する。抗原決定基は、抗体に結合する完全な抗原（例えば、免疫反応を引き出すのに使用するイムノゲン）に対抗させることもできる。
【００８７】
「特異的結合」および「特異的に結合する」はタンパク質あるいはペプチドの、アゴニスト、抗体、アンタゴニスト、小分子、または自然のあるいは合成結合組成物との相互作用を指す用語である。相互作用は、抗原決定基あるいはエピトープなど、結合分子によって認識されるタンパク質の固有の構造の存在による。
【００８８】
「ヒト化抗体」は、非抗原性の結合領域におけるアミノ酸配列が変更され、抗体をよりヒト抗体に酷似させているが、元来の結合能力は保持している抗体分子を指している。
【００８９】
「免疫原性フラグメント」はＣＬＥＣ−２のポリペプチドあるいはオリゴペプチドフラグメントであり、たとえば哺乳動物などの生体に取り込むと免疫反応を惹き起すことができるものである。「免疫原性フラグメント」にはまた、いかなるＣＬＥＣ−２のポリペプチドあるいはオリゴペプチドフラグメントも含まれ、本書に記載の、または周知の抗体生成方法のいずれにも有用である。
【００９０】
本発明はまた、リガンドの結合とレセプタ活性の両方を阻止するレセプタ特異抗体と、レセプタリガンド複合体を認識し、好ましくは非結合レセプタあるいは非結合リガンドを特異的に認識しない抗体を特徴とする。同様に、本発明には、中和抗体という、リガンドと結合してリガンドのレセプタへの結合を妨げる抗体と、リガンドと結合し、それによってレセプタの活性化を抑制するがリガンドのレセプタへの結合は妨げない抗体も含まれる。さらに、本発明には、レセプタを活性化させる抗体も含まれる。これらの抗体はレセプタアゴニストとして作用し、たとえば、レセプタの二重化を引き起こしてリガンドによるレセプタ活性の生物学的機能の全て、あるいは一部を可能にし、活性化させる。抗体は、本書で説明する本発明のペプチドの特定の生物学的機能を含む生物学的機能についてのアゴニスト、アンタゴニスト、インバースアゴニストとする。上記の抗体アゴニストは周知の方法により生成することができる。これについては、例えば、ＰＣＴ公開公報ＷＯ９６／４０２８１；米国特許第５，８１１，０９７号；Deng et al., Blood 92（6）:1981-1988 （1998）；Chenet al., Cancer Res. 58（16）:3668-3678（1998）；Harrop et al., J.Immunol. 161（4）:1786-1794（1998）；Zhu et al., Cancer Res. 58（15）:3209-3214（1998）；Yoon et al., J. Immunol. 160（7）:3170-3179（1998）；Prat et al., J. Cell. Sci. 111（Pt2）:237-247（1998）；Pitard et al., J. Immunol.Methods 205（2）:177-190 （1997）；Liautard et al., Cytokine 9（4）:233-241（1997）；Carlson et al., J. Biol. Chem.272（17）:11295-11301 （1997）；Taryman et al., Neuron 14（4）:755-762（1995）；Muller et al., Structure 6（9）:1153-1167（1998）；Bartunek et al., Cytokine 8（1）:14-20（1996）を参照のこと（また、これらの文献については参照により本書に組み込むこととする）。
【００９１】
好ましいフラグメントはリガンドの結合を減弱させる、または完全に抑制する抗体を生成する。抗体は、レセプタ全体あるいはレセプタの一部分に対して、たとえば、細胞内アミノ末端ドメイン、カルボキシ末端細胞外ドメイン、全膜貫通ドメイン、あるいは特異膜貫通セグメント、細胞内あるいは細胞外ロープのいずれか、またはこれらの領域のいずれかの箇所に対して生成することができる。また、たとえば、リガンド結合部位やグリコシル化されたりリン酸化されたりした部位等の特異的な機能部位に対して生成することもできる。
【００９２】
連続培養細胞ラインによる抗体分子の生成のための技術を使用してＣＬＥＣ−２に対するモノクローナル抗体を生成する。この技術には、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術が含まれるが、これに限定されるものではない（たとえば、Kohler, G. et al. （1975） Nature 256:495-497; Kozbor, D. et al. （1985） J.Immunol. Methods 81:31-42; Cote, R. J. et al. （1983） Proc. Natl. Acad. Sci. USA80:2026-2030；およびCole, S. P. et al. （1984） Mol.Cell Biol. 62:109-120を参照のこと）。
【００９３】
さらに、「キメラ抗体」の生成のために開発された技術、たとえは、マウス抗体遺伝子をヒト抗体遺伝子に挿入して適当な抗原特異性や生物学的機能を備えた分子を得る技術を用いることもできる（たとえば、Morrison, S. L. et al. （1984） Proc. Natl. Acad. Sci. USA81:6851-6855；Neuberger, M. S. et al. （1984）Nature 312:604-608；およびand Takeda, S. et al. （1985）Nature 314:452-454を参照のこと）。別の方法としては、単鎖抗体の生成について記載した技術を用いて、周知の方法でＣＬＥＣ−２特異的単鎖抗体を生成することもできる。イディオタイプ組成は異なるが、関連する特異性を備えた抗体をランダム組み合わせの免疫グロブリンライブラリーからchainシャフリングにより生成することもできる（たとえば、Burton, D. R. （1991） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10134-10137を参照のこと）。
【００９４】
また、リンパ球生成における生体内（in vivo）生成を惹起したり、以下の文献に開示されているような非常に特異的な結合試薬の免疫グロブリンライブラリーあるいはパネルをスクリーニングしたりすることによっても抗体を生成することができる（たとえば、Orlandi, R. et al. （1989） Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837；およびWinter, G. et al. （1991） Nature 349:293-299を参照のこと）。
【００９５】
抗体フラグメント、それはＣＬＥＣ−２に対する特定の結合部位を備えているが、それもまた生成することができる。たとえば、かかるフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により生成されたＦ（ａｂ’）２フラグメントや、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を低減させることによって生成されるＦａｂフラグメントが含まれるが、これらに限定されない。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構成して、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂフラグメントの同定を迅速にそして容易に行うことができるようにすることもできる（たとえば、Huse, W. D. et al. （1989） Science 246:1275-1281を参照のこと）。
【００９６】
スクリーニングして所望の特異性を有する抗体を同定するためには様々なイムノ（免疫学的）アッセイを使用することができる。確立された特異性を備えるモノクローナル抗体あるいはポリクローナル抗体のいずれかを用いた競合的結合アッセイまたはイムノラジオアッセイについては多数のプロトコルが知られている。かかるイムノアッセイは通常、ＣＬＥＣ−２とその特異抗体との複合体形成の測定が含まれる。二つの非干渉ＣＬＥＣ−２エピトープに反応するモノクローナル抗体を用いた二つの部位のモノクローナルベースのイムノアッセイを通常使用するが、競合的結合アッセイも使用することができる（Pound, supra）。
【００９７】
スキャッチャード（Scatchard）分析などの様々な方法をラジオイムノアッセイ技術と併せて使用して、ＣＬＥＣ−２抗体のアフィニティを評価することもできる。アフィニティは、関連性定数Ｋａで表され、それは平衡状態での遊離抗原と遊離抗体のモル濃度に分離されるＣＬＥＣ−２抗体複合体のモル濃度で定義される。多数のＣＬＥＣ−２エピトープについてアフィニティが異なるポリクローナル抗体の生成用に定めたＫａがＣＬＥＣ−２抗体の平均アフィニティ、あるいはアビディティを示している。特定のＣＬＥＣ−２エピトープについて単一特異的であるモノクローナル抗体の生成用に定めたＫａがアフィニティを示す真の測定となっている。１０９−１０１２Ｌ／ｍｏｌｅのＫａによる親和性が高い抗体の生成は、ＣＬＥＣ−２抗体複合体が厳しい操作に耐えなければならない免疫学的アッセイでの使用に好まれている。１０６−１０１２Ｌ／ｍｏｌｅのＫａによる親和性が低い抗体の生成は、免疫生成や同等の、最終的に抗体からのＣＬＥＣ−２の好ましくは活性状態での分離を要する処理での使用に好まれる。（Catty, D. （1988） Antibodies,Volume I: A Practical Approach, IRL Press,Washington D.C.; Liddell, J. E. and A. Cryer （1991）A Practical Guide to Monoclonal Antibodies, John Wiley & Sons, New York N.Y.を参照のこと）
【００９８】
ポリクローナル抗体生成の滴定濃度やアビディティをさらに評価して下流でのかかる生成の質および適合性を判定することもできる。たとえば、ポリクローナル抗体の生成には、１ｍｌにつき少なくとも１−２ｍｇの特異抗体が、好ましくは５−１０ｍｇの特異抗体が含まれ、通常ＣＬＥＣ−２抗体複合体の沈降を要する処理に使用される。抗体の特異性、滴定濃度やアビディティを評価する手続や、抗体の質や様々な応用での用途についてのガイドラインは一般に入手可能である（たとえば、Catty, supra, and Coligan et al. supra.を参照のこと）。
【００９９】
［ＣＬＥＣ−２を含む医薬組成物］
さらに本発明が提供するのは、ＣＬＥＣ−２シグナル伝達の消失による病的状態の重症度を軽減させる組成物である。組成物には、本書で定義したＣＬＥＣ−２の実質的に精製されたポリペプチドあるいはそのフラグメント、あるいはその塩と以下で説明する薬学的キャリアが含まれる。他の実施形態によると、本発明はＣＬＥＣ−２ポリペプチドあるいはそのフラグメントをコードした核酸および薬学的キャリアを提供する。精製したＣＬＥＣ−２またはＣＬＥＣ−２をコードした核酸のアミノ酸配列は、天然、合成、半合成成または組み換えにかかわらず、あらゆる種類の動物、特にウシ、ヒツジ、ブタ、マウス、ウマと、好ましくは、ヒトを含む哺乳類動物から得られる。
【０１００】
［止血疾患の治療方法］
また、本発明は、ＣＬＥＣ−２シグナル伝達による病的状態の重症度を軽減させる方法を提供する。この方法には、リン酸化された細胞質ドメインを含むＣＬＥＣ−２を、シグナル伝達パートナーのＣＬＥＣ−２への結合を妨げる化合物に接触させるステップを含む。
【０１０１】
好ましくは、病的状態には血小板活性が含まれるが、これに限定されない。
【０１０２】
好ましくは、シグナル伝達パートナーがプロテインキナーゼのＳｙｋファミリーの一員である。
【０１０３】
他の実施形態によると、本発明は、ＣＬＥＣ−２シグナル伝達による病的状態の重症度を軽減させる方法であって、哺乳動物にＣＬＥＣ−２シグナル伝達のアンタゴニストを投与する方法を含む方法を提供する。好ましくは、病的状態には、深刻な冠不全症候群、心筋梗塞、不安定狭心症、難治性の狭心症、血栓溶解療後の冠動脈内血栓性閉塞、冠動脈血管形成術後の冠動脈内血栓性閉塞、血栓による脳血管疾患、塞栓性脳卒中、血栓性脳卒中、一過性脳虚血発作、静脈血栓症、深部静脈血栓症、肺動脈塞栓、凝固障害、播種性血管内凝固症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、閉塞性血栓血管炎、ヘパリン起因性血小板減少症に伴う血栓症、体外循環による血栓合併症、心臓または他の血管内カテーテル、大動脈内バルーンポンプ、動脈ステントあるいは心臓弁などの器具による血栓合併症、および人工器官の取り付けを要する状態が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０４】
更なる実施形態において、本発明は、ＣＬＥＣ−２シグナル伝達の消失による病的状態の重症度を軽減させる方法であって、哺乳動物にＣＬＥＣ−２シグナル伝達のアゴニストを投与する方法を含む方法を提供する。好ましくは、病的状態には多量出血が含まれる。
【０１０５】
ＣＬＥＣ−２のアンタゴニストあるいはアゴニストの投与は、治療組成物として、生理学的におよび／または薬学的に許可されたキャリアにより行う。たとえば、ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストは、一般にHarrison'sPrinciples of Internal Medicine, 14th Edition, McGraw-Hill, NY （1998）に記載の方法により患者に投与することができる。キャリアの特徴は投与方法により異なる。
【０１０６】
投与は、状態と応答性に応じてボーラス投与、間欠投与あるいは連続投与とし、それは当業者が定めるとおりである。実施形態によっては、アゴニストを局所に（たとえば、intralesionally）および／または全体に（systemically）投与する。「局所投与（local administration）」は身体の所定箇所あるいは範囲に投与することであり、「全身投与（systemic administration）」は、経口摂取、筋内投与、静脈内投与、皮下投与あるいは腹腔内注入を含む器官全体への投与を意味する。
【０１０７】
かかる組成物には、ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストとキャリアに加えて、希釈剤、賦形剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、他の周知の材料が含まれる。医薬組成物にはまた、他の活性ファクタおよび／または薬剤を含めることができ、細胞活性を減弱させたり、あるいは細胞活性を増強させたりし、好ましくは血小板活性を減弱あるいは増強させることができる。かかる追加ファクタおよび／または薬剤は医薬組成物に含めて、ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストと相乗効果を生み出すこともでき、またはアンタゴニストあるいはアゴニストによる副作用を最小限に抑えることもできる。
【０１０８】
医薬組成物の形態は、ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを、他の薬学的に許容されるキャリアに加えて、水溶液中のラメラ層、液晶、不溶単層、そしてミセル等の凝集した形態で存在する脂質等の両親媒性薬剤と結合させたリポソムとすることもできる。リポソムに適した脂質には、モノグリセリド、ジグリセリド、スルファチド、リゾレシチン、リン脂質、サポニン、そして胆汁酸等が含まれるが、これらに限定されない。特に有用な一脂質キャリアはリポフェクチンである。かかるリポソムの調合は当業者の自由設計に基づくものであり、たとえば、米国特許第４，２３５，８７１; 米国特許第４，５０１，７２８; 米国特許第４，８３７，０２８; 米国特許第４，７３７，３２３に開示されている。医薬組成物にはさらに、細胞への薬剤の伝達を強化するためのシクロデキストリン等の化合物、あるいは持続放出ポリマーを含めることができる。  
【０１０９】
本発明による治療法を実施する際、治療上効果的な量の一つあるいは複数のＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを、血小板凝集の増強あるいは減弱による病気や疾患に悩む対象に投与する。アンタゴニストあるいはアゴニストの投与は、本発明の方法のみで行ってもよく、あるいは病気や疾患の他の治療法と組み合わせることもできる。他の一つまたは複数の治療と併せて投与する場合は、ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを他の治療薬と同時に投与しても、あるいは続けて投与しても良い。続けて投与する場合には、医師が、他の治療を含めてＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニスト投与の適切な順番を決める。
【０１１０】
医薬組成物にてＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを投与し本発明の方法を実施する場合、その方法には、移植、経口投与、吸入、皮膚、皮下、筋内、腹腔内注入など従来より様々な方法がある。
【０１１１】
ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを全身ではなく、局所的に、または部分的に投与する場合（たとえば、血栓の場所等）、通常の細胞組織の摂取を減らす必要がある。ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストは、アンタゴニストあるいはアゴニストを生体適合材料に混ぜ、治療部位付近にその混合物を当てることで局所的にまたは部分的に投与することができる。たとえば、polylactic acid （ＰＬＡ）, polyglycolic acid （ＰＧＡ）,poly co-lactic-glycolic acid （ＰＬＧＡ）, poly ethyleneglycol （ＰＥＧ）等のポリマーをＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを含む生物腐食可能な移植片（bioerodableimplants）に形成することもできる。あるいは別の方法として、周知の様々な湿布やワックスをＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストと混ぜて、身体内の該当の場所に（たとえば、血栓の場所）当てる。さらに、リポソムにＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを詰めたり、リポソム表面に蛋白を挿入しそのリポソムを、選択した細胞組織に処方したりする方法を使用することができる（Pagnan et al. （2000）,J. Natl. Can. Inst. 92:253-61; Yu et al. （1999）, Pharm. Res. 16:1309-15）. 
【０１１２】
治療上効果的な量のＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを経口投与する場合、ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストは、タブレット、カプセル、粉末、溶液またはエリキシル剤の形態とする。タブレットで投与すると、医薬組成物にさらにゼラチンやアジュバントなどの固体キャリアを含めることができる。タブレット、カプセルや粉末には５％から９５％のＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを含めることができ、好ましくは、２５％から９５％を含めることができる。液状で投与するとなると、水、石油、動物性油や、ピーナッツ油、ミネラルオイル、大豆油、ごま油、合成潤滑油などの植物性油を加えることができる。液状の医薬組成物にはさらに、生理食塩水、ブドウ糖あるいは他の糖溶液、またはエチレン・グリコール、プロピレン・グリコール、ポリエチレン・グリコールなどのグリコールを含めることができる。液状での投与では、医薬組成物に重量で０．５％から９５％のＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを含めることができ、好ましくは、１％から５０％のＣＬＥＣ−２アゴニストを含めることとする。
【０１１３】
治療的に効果的な量のＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを静脈内、皮下、筋内、腹腔内注入により投与する場合、ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストは発熱物質のない、非経口投与可能な水溶液として投与する。かかる非経口水溶液はｐＨ、isotonicity（等張性）、持続性等に期限があり、その調製は当業者の設計範囲内とする。静脈内、皮下、筋内、腹腔内注入による投与の好ましい医薬組成物には、ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストに加えて、isotonic vehicle（等張溶媒）を含めるべきである。また、医薬組成物には、安定剤、保存剤、緩衝剤、酸化防止剤や他の周知の添加剤を含めるべきである。
【０１１４】
ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストの医薬組成物中の量は、処理される状態の重症度や性質、患者が受ける事前処置によって異なる。最終的には、担当となる医師が個別の患者を治療する際にＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストの量を決める。同様に、医薬組成物を用いた静脈内治療の期間は、治療する病気の重症度や各患者の状態と潜在的な特異体質反応によって変わる。最終的に、本発明の医薬組成物を使用した静脈内治療の適切な治療期間は、担当の医者が決める。最初、医師は少ない量のＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを投与して患者の反応を観察する。最高の治療効果が出るまで、ＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストの量を増やし、最高の治療効果が出たら、投与量を増やすことはない。
【０１１５】
本発明の方法を実践するのに使用する様々な医薬組成物には、患者の体重１ｋｇ当たり約１０μｇから２０ｍｇのＣＬＥＣ−２アンタゴニストあるいはアゴニストを含めるべきであると考える。
【０１１６】
（実施例）
本書で説明してきた発明をよりよく理解するため、以下の例を説明する。これらの例は一例にすぎず、いかなる方法でも本発明を制限するものではないことを理解されたい。
【０１１７】
実施例１：ＣＬＥＣ−２のシグナル伝達の判定に用いる材料および方法
ａ）  動物と実験材料
遺伝子操作されたＰＬＣγ２、Ｓｙｋ、ＬＡＴ、ＳＬＰ−７６およびＶａｖ１／３欠損マウスは、先に説明したようにして入手した（非特許文献１７−２１）。ロドサイチンはCalloselasma rhodostomaの毒から精製した（非特許文献１１，２２）。ポリクローナルＣＬＥＣ−２抗体はR & D systems（アメリカ、ミネアポリス）から得た。ポリクローナルウサギロドサイチン抗体はTakashi MoritaとGavin Laingより得た。Gly-Arg-Gly-Asp-Ser（ＧＲＧＤＳ）ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:５）はペプチド研究所（大阪府）より購入した。Ser-Phe-Leu-Leu-Asn（ＳＦＬＬＮ）ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６）（トロンビン受容体アゴニストペプチド）はBachem Biochemica（ドイツ，ハイデルベルグ）より購入した。ＣＬＥＣ−２のＹＸＸＬモチーフを含むビオチンラベルしたリン酸化、あるいはリン酸を含まないペプチド（Biotin-6-Aminohexanoic acid （Ahx）-MQDEDGY（PO3H2）ITLNIK-OH（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:７）とBiotin-6-Aminohexanoic acid （Ahx）-MQDEDGYITLNIK-OH）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:７）はクラボウで合成した（大阪府）。その他の実験材料は先の報告通りである（非特許文献６，１７，２１）。
【０１１８】
ｂ）血小板の調整
薬を服用していない、健康な供血ボランティアの静脈血を１０％チトラート（クエン酸ナトリウム）にて採取した。マウスは二酸化炭素で安楽死させた後、門脈から１００μｌのＡＣＤ（acidcitrate dextrose）を用いて採血した。ヒトとマウスの洗浄血小板は、プロスタサイクリンを用いて隔離工程（非特許文献１７）の間の活性化を抑えつつ、遠心分離によって先の報告通りに得た。二つの洗浄血小板とも修飾Tyrodeバッファー（非特許文献１７）に、血小板数２×１０８あるいは１×１０９／ｍｌになるように浮遊させた。
【０１１９】
ｃ）ロドサイチンコートビーズを用いた免疫沈降
２００μｇの精製ロドサイチンを、１２２ｍｇのＣＮＢｒ活性化Sepharose 4Bビーズに、メーカーの取扱説明書にしたがって共有結合させた。グリシンコートビーズをネガティブコントロールに使用した。洗浄血小板表面の膜蛋白またはロドサイチンをECL Protein Biotinylation System （AmershamBiosciences Corp., Piscataway, NJ）を用いてビオチンラベルした。１ｍｌのビオチンラベルした、あるいはビオチンラベルしていない洗浄血小板（１×１０９／ｍｌ）を等量の２倍濃縮冷却溶解バッファー（非特許文献１７）で溶解し、１００μｌのSepharose 4B（５０％スラリー）で1時間プレクリアした。界面活性剤に溶解しない成分を１５０００gで１０分間遠心して除き、上清を２００μlのロドサイチンあるいはグリシンコートビーズと４℃で４時間反応させた。ビーズは溶解バッファーで５回洗浄し、蛋白を４０μｌの還元ＳＤＳサンプルバッファーで溶解し、５分間加熱した。免疫沈降した蛋白を４−２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に転写した。ビオチンラベルされた表面蛋白は西洋わさびペルオキシダーゼを結合したストレセプタトアビジンで検出した。ＰＶＤＦ膜に転写したラベルのない血小板蛋白はビオチンラベルされたロドサイチンと西洋わさびペルオキシダーゼを結合したストレセプタトアビジンでリガンドブロットし、続いてＣＬＥＣ−２抗体で再度調べた。マス・スペクトロメトリーの分析では、ラベルされていない洗浄血小板を使用して、ゲルをCoomassie Brilliant Blueで着色した。 
【０１２０】
ｄ）蛋白消化とマス・スペクトロメトリー分析
上述のようにゲル片をspeed-vacで乾燥させて、ゲル中でトリプシン処理した（非特許文献２３）。ＨＰＬＣ（CapLC,Waters, Milford, MA, USA）はナノエレクトロスプレーを備えたＱ−ＴＯＦマススペクトロメーター（Micromass, Manchester, UK）に結合していた。ＨＰＬＣの移動相は５％アセトニトリル、０．１％蟻酸（溶媒Ａ）と９５％アセトニトリル、０．１％蟻酸（溶媒Ｂ）であった。トリプシン処理したペプチドを３００μｍ径，５ｍｍ長のC18 PepMapプレカラム（LC packings, SanFrancisco,CA, USA）に加えて脱塩し、２００ｎｌ／ｍｉｎの速さで７５μｍ径，２５ｃｍ長のC18 PepMap ナノカラム（LC packings, SanFrancisco, CA, USA）に、５−４０％溶媒Ｂを４０分と、４０−８０％溶媒Ａを３分用いて溶出した。ＭＳ／ＭＳ分析は以前の報告通りに行った（非特許文献２４）。データベース検索はMASCOT search tool（Matrix Science, London,UK） を用いて、SWISS-PROTを検索した。図１（ｃ）はMASCOTMS searchによるSWISS-PROT検索の結果を示す編集データ出力ファイルを示している。八つの一致ペプチドには、TGTLQQLAK（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:８），YYGDSCYGFFR（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:９），THLIR（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１０），NYLQDENENR（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１１），RFCQVVVK（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１２），FCQYVVK（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１３），HYLMCER（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１４），MHPTFCENK（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１５）が含まれる。
【０１２１】
ｅ）細胞培養と細胞刺激
ＣＬＥＣ−２をtet repressor 蛋白の元で、２９３Ｔ−ＲＥｘＴＭセルラインに、以前の報告のように発現させた（Invitrogen Corp., Carlsbad, CA）（非特許文献２５）。ＣＬＥＣ−２の発現は、実験の２４−４８時間前に１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンを培地に加えることで誘導した。溶媒を加えた細胞をコントロールとした。細胞を分離させ、改変Tyrodeバッファーに浮遊させた（非特許文献６）。ドキシサイクリン処理あるいは溶媒で処理した細胞を、５００ｎＭロドサイチンで３７℃で１０分間刺激した。細胞を２倍濃縮ＳＤＳサンプルバッファーで溶解した後、反応を止めた。蛋白のチロシンリン酸化あるいはＣＬＥＣ−２の発現は、抗リン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０）と抗ＣＬＥＣ−２抗体でウェスタンブロットして検出した（非特許文献１７）。
【０１２２】
ｆ）フローサイトメーター
ヒト洗浄血小板（１×１０８／ｍｌ）と２９３Ｔ−ＲＥｘＴＭ細胞（５×１０６／ｍｌ）を、２μｇ／ｍｌの抗ＣＬＥＣ−２抗体で１５分処理した後、ＦＩＴＣラベル抗ヤギＩｇＧ抗体ともう１５分、室温で反応させた。ＰＢＳで３倍に希釈した後、ＦＡＣＳｃａｎフローサイトメーターと解析ソフトCellQuest software （Becton Dickinson, SanJose, CA）を用いて報告通りに解析した（非特許文献１７）。ロドサイチンの直接結合を検出するため、ドキシサイクリンを加えた２９３Ｔ−ＲＥｘＴＭ細胞（５×１０６／ｍｌ）あるいは加えてない２９３Ｔ−ＲＥｘＴＭ細胞（５×１０６／ｍｌ）を１００ｎＭロドサイチンと室温で１５分予め孵置した。余分なロドサイチンを遠心分離で取り除いた後、細胞を１０μｇ／ｍｌのコントロールウサギＩｇＧまたは抗ロドサイチン抗体と２０分室温で孵置した。ついで、サンプルをＦＩＴＣラベル抗ウサギＩｇＧ抗体と反応させ、上述の通り分析した。
【０１２３】
ｇ）免疫沈降とウェスタンブロット
１ｍＭのＧＲＧＤＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:５）ペプチドで処理したヒト洗浄血小板（１×１０９／ｍｌ）あるいは血小板凝集を抑制するロトラフィバン１０μＭを加えたマウス洗浄血小板（２×１０８／ｍｌ）を５０ｎＭのロドサイチン、１００μＭのＳＦＬＬＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６）、あるいは５０μｇ／ｍｌコラーゲンで一定時間刺激した。記載のあるところでは、３０μＭのＰＰ２（Ｓｒｃキナーゼ抑制剤）あるいはＰＰ３（ＰＰ２の不活性類似物）を加えて、３７℃で１０分間孵置した。２倍濃縮冷却溶解バッファーを加えて反応をとめた。血小板溶解液はプレクリアし、界面活性剤に溶解しない成分を上述の通り除いた（非特許文献１７）。上清の一部分を除き、ＳＤＳサンプルバッファーで溶解し、全細胞の蛋白質チロシンリン酸化検出用とした。残りの上清に抗ＣＬＥＣ−２抗体、抗ＰＬＣγ２抗体、抗Ｓｙｋ抗体、抗Ｂｔｋ抗体、抗ＳＬＰ−７６抗体、抗ＬＡＴ抗体、抗Ｖａｖ１抗体又は抗Ｖａｖ３抗体を加えて、一晩反応させた。記載のあるところでは、１０μｇのＣＬＥＣ−２のＹＸＸＬを含むペプチドとアビジンビーズ、あるいはＧＳＴ融合蛋白とグルタチオンビーズ（glutathione Sepharose）を反応させた。記載した実験では、洗浄ヒト血小板（１×１０９／ｍｌ）を、ＦｃγＲＩＩＡ抗体（ＩＶ．３，１０μｇ／ｍｌ）の抗Ｆ（ａｂ）’２フラグメントの存在下で１０μｇ／ｍｌの抗ＣＬＥＣ−２抗体あるいはコントロールヤギＩｇＧで刺激した。刺激の前と刺激の５分後でサンプルを２倍濃縮溶解バッファーに溶解させた。刺激前の溶解サンプルに５μｇ／ｍｌの抗ＣＬＥＣ−２抗体とコントロールヤギＩｇＧを加えた。コントロールヤギＩｇＧに刺激されたサンプルと、抗ＣＬＥＣ−２抗体に刺激されたサンプルにそれぞれ、５μｇ／ｍｌの抗ＣＬＥＣ−２抗体あるいはコントロールヤギＩｇＧを加えた。遠心分離により不溶成分を取り除いた後、蛋白質Ｇを加えることによってＣＬＥＣ−２を免疫沈降させた。免疫沈降された蛋白あるいは全血小板溶解液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動、ＰＶＤＦ膜に転写の後、記載の抗体でウェスタンブロットされた。
【０１２４】
ｈ）血小板凝集
ヒト洗浄血小板（２×１０８／ｍｌ）を、ＦｃγＲＩＩＡ抗体（ＩＶ．３，１０μｇ／ｍｌ）の抗Ｆ（ａｂ）’２フラグメントの存在下で１０μｇ／ｍｌの抗ＣＬＥＣ−２抗体あるいはコントロールヤギＩｇＧで刺激した。ヒトまたはマウス洗浄血小板（２×１０８／ｍｌ）を本文に記載の低濃度、高濃度のロドサイチンで刺激した。凝集は透過光法で、説明したBornの血小板凝集計を用いて測定した（非特許文献１７）。
【０１２５】
実施例２：ＣＬＥＣ−２はロドサイチンビーズに結合する。
膜表面蛋白をビオチンラベルした血小板溶解液から、蛇毒の結合蛋白を分離するため、我々はロドサイチンまたはグリシンを共有結合したSepharose 4Bビーズを使用した。ストレプトアビジンを使用したウェスタンブロットでは、グリシンではなくロドサイチンSepharose 4Bビーズが３２ｋＤａの表面蛋白を結合し、それが両方のビーズに非特異的に結合する他の複数の蛋白とともに沈降している（図１Ａ）。同じ３２ｋＤａバンドがまた、ビオチンラベルされていない血小板のグリシンではなくロドサイチンビーズに結合しており、それはロドサイチンを用いたリガンドブロットによって検出されている（図１Ｂ）。３２ｋＤａの部分に相当するゲルの部分を切り取り、トリプシン消化してＭＳ／ＭＳ分析にかけた。これにより、ＣＬＥＣ−２が３２ｋＤａの構成成分であると同定された （図１Ｃ）。ＣＬＥＣ−２の血小板表面への発現はＣＬＥＣ−２特異抗体を用いて、フローサイトメーターと、ウェスタンブロットで確認した（図１Ｄおよび１Ｅ）。興味深いことに、ＣＬＥＣ−２は、ウェスタンブロットで３２ｋＤａの主バンドと４０ｋＤａの副バンドの二重バンドとして検出された（図１Ｅ）。前者はロドサイチンビーズによる結合である。ロドサイチンアフィニティ溶出液中に４０ｋＤａバンドが明らかに欠如しているのは、非特異的蛋白と共に移動すること（図１Ａのみ）によるか、あるいは４０ｋＤａの発現のレベルが低いことに加えてリガンドブロットアッセイにおける感度に制限があることによると思われる。重要なことは、グリシンではなくロドサイチンビーズによる３２ｋＤａバンドと４０ｋＤａバンドの結合はＣＬＥＣ−２の特異抗体を使用して検出することができることであり、４０ｋＤａバンドのレベルが３２ｋＤａのレベルよりもはるかに低いが、そのことは血小板での結果に一致している（図１Ｆ）。複数の血小板サンプルからの抗ＣＬＥＣ−２ウェスタンブロット濃度分析により４０ｋＤａの発現レベルが３２ｋＤａバンドの２３．１±５．３％であることが明らかになった（図１Ｇ）。
【０１２６】
以上より、ＣＬＥＣ−２が血小板表面の新たなロドサイチン結合蛋白として同定された。興味深いことに、ＣＬＥＣ−２はタイプＩＩの膜貫通型Ｃタイプレクチンスーパーファミリーで、細胞内ドメインにひとつのチロシン残基をＹＸＸＬモチーフの中に持ち、チロシンキナーゼの経路を通じてシグナル伝達が可能であることを示唆している。ＣＬＥＣ−２の血小板での発現は以前に報告されていなかったし、シグナリング受容体としての機能も知られていなかった。
【０１２７】
実施例３：ロドサイチンはＣＬＥＣ−２発現細胞ラインでチロシンリン酸化を惹起する。
ＣＬＥＣ−２がロドサイチン受容体であること、そしてチロシンキナーゼの細胞内シグナルの生成能力を確認するため、我々は以前報告されていたtet repressorタンパクの制御下でＣＬＥＣ−２を発現する細胞ラインを利用した。ドキシサイクリンを、核酸を入れた２９３Ｔ−ＲＥｘＴＭ細胞に加えると、ＣＬＥＣ−２が表面に発現した。これはレクチンレセプタの特異抗体を用いるか（図２Ａ）、あるいはロドサイチンとロドサイチン抗体の結合（図２Ｂ）を用いて測定することができる。さらに、コントロールＩｇＧではなく特異抗体を用いたＣＬＥＣ−２のウェスタンブロットでは、ドキシサイクリン処理された非コントロール細胞におよそ３２と４０ｋＤａの主要な二つのバンドと、３４ｋＤａの薄いバンドが確認された（図２Ｃ）。ＣＬＥＣ−２に対して複数のバンドが認められるのは血小板と同様であった。３つのバンドは一つの細胞ラインより検出され、４０ｋＤａバンドが３２ｋＤａバンドと同じレベルで確認されている。重要なことに、ロドサイチンはドキシサイクリン処理（ＣＬＥＣ−２発現）細胞においていくつかの蛋白質チロシンリン酸化の増加を惹起したが、溶媒処理細胞では惹起しなかった （図２Ｄ）。以上より、ＣＬＥＣ−２がロドサイチンの機能的な受容体であることが確認された。
【０１２８】
実施例４：ＣＬＥＣ−２の抗体を用いた血小板の活性化
発明者はＣＬＥＣ−２抗体を使用して、レクチンレセプタが他のレセプタからのシグナル伝達がないときに血小板の活性化を惹起させることができるか否か調べた。この実験では、ロドサイチンが少なくとも他の二つの血小板レセプタ、すなわちインテグリンα２β１とＧＰＩｂαに結合することに注意する必要がある（非特許文献１２−１４）。図３Ａに示すように、ＣＬＥＣ−２抗体は特徴的な遅れの後で血小板凝集を惹起させている。この実験はモノクローナル抗体ＩＶ．３の存在下で行われ、抗体のＦｃ部分のＦｃγＲＩＩＡへの結合が妨げられている。コントロールヤギＩｇＧは凝集を惹起しなかった。重要なことに、コントロールヤギＩｇＧではなく、ＣＬＥＣ−２抗体が、ＣＬＥＣ−２の３２ｋＤａと４０ｋＤａ形態の基礎上にチロシンリン酸化の増強を惹起させ、これはＣＬＥＣ−２の免疫沈降とリン酸化チロシン、つまりはＣＬＥＣ−２についてのウェスタンブロットにより確認できた（図３Ｂ）。ＣＬＥＣ−２は細胞質尾部に単一のチロシンを有するので、リン酸化はＹＸＸＬモチーフで行われたと考えられる。これらの結果より明らかなのは、他のレセプタからのシグナル伝達がなくてもＣＬＥＣ−２の活性により十分に血小板活性を惹起させることである。さらに、レクチンレセプタがチロシンリン酸化の基礎となっていることが確認されたことにより、ＣＬＥＣ−２による血小板活性の潜在的なメカニズムが明らかになった。
【０１２９】
実施例５：ＣＬＥＣ−２はＳｒｃキナーゼによりチロシンリン酸化される
ロドサイチンは血小板凝集を、特徴的な長いラグタイムを伴って惹起し、そのラグタイムは毒濃度の増加に伴って減少する（図３Ａ）。比較的高い濃度のロドサイチン（３００ｎＭ）で、活性化はほぼ３０秒送れて開始される（図４Ａ）が、これは蛇毒素が低いのでかなり長い時間である。これを踏まえて、ロドサイチンによる細胞溶解物全体におけるチロシンリン酸化の惹起は、血小板凝集と同じようなタイムスケールで起こり、ロドサイチンの濃度が高ければ高いほど急速に惹起されることになる（図示せず）。意味深いことに、ＣＬＥＣ−２のほぼリン酸化と思われる現象がロドサイチンに応じて６０秒後に見受けられた。これは、形態変化の反応および凝集の始まりのピークに対応する（図４Ａ，Ｂ）。これは、同じく、量に応じて遅れて発生し、コラーゲンレセプタの一部をなすＦｃレセプタγ-chainと血小板溶解物のチロシンリン酸化の増加とともに、コラーゲンによる血小板凝集のタイムコースを思い出させるものである（非特許文献２７）。
【０１３０】
ロドサイチンによる血小板活性化におけるチロシンリン酸化の意義は、（図示しないが）ロドサイチン（非特許文献１３）の刺激に応じて全細胞と全ての機能的な反応においてチロシンリン酸化を抑制するＳｒｃファミリーキナーゼの抑制剤ＰＰ１あるいはＰＰ２によって示される。注目すべきは、ＰＰ２がまた、ＣＬＥＣ−２のチロシンリン酸化が血小板活性を惹起させる可能性と合わせてＣＬＥＣ−２の３２ｋＤａと４０ｋＤａの両方のチロシンリン酸化を抑制する（図４Ｃ）ことであり、不活性類似物であるＰＰ３にはこの作用はない。対照的に、ＣＬＥＣ−２は、タイムコース中５分までの間コラーゲンやトロンビン受容体ＰＡＲ−１の活性化ペプチドＳＦＬＬＮではリン酸化されず（図４Ｄ）、レクチンレセプタのみが直接的な活性化によりリン酸化されることを示している。
【０１３１】
発明者は以前、ロドサイチンが血小板中のＳｙｋをチロシンリン酸化することを報告した。このＣＬＥＣ−２が単一のＹＸＸＬモチーフでチロシンリン酸化を受け、ＹＸＸＬモチーフがＩＴＡＭ配列の半分をなしているという観察により、レクチンレセプタがＳｙｋを細胞質内尾部に結合させることによってシグナル伝達し、コラーゲンレセプタＧＰＶＩと同じようなシグナル伝達を起こしている可能性が高まった。この可能性を支持することに、ロドサイチンはＳｙｋとその他のＧＰＶＩカスケードにおける主要なシグナル伝達蛋白をチロシンリン酸化した。この中には、チロシンキナーゼＢｔｋ、アダプター蛋白ＬＡＴ、ＳＬＰ−７６、ＧＴＰａｓｅのＶａｖ１とＶａｖ３、そしてＰＬＣγ２が含まれる（図４Ｅ，図５Ａ）。これらの蛋白質チロシンリン酸化はＳｙｋと同じである（図４Ｅ）。これらの蛋白質チロシンリン酸化はＳｒｃキナーゼ抑制剤ＰＰ２で完全に抑制された（図示せず）。
【０１３２】
実施例６：Ｓｙｋはロドサイチンによる血小板活性化を起こしている。
チロシンキナーゼ欠損マウス血小板を使用して、ロドサイチンによるシグナル伝達におけるＳｙｋの機能的役割をさらに調べた。ロドサイチンは、マウス血小板の健常なチロシンリン酸化を惹起し、それはＳｙｋの欠損で完全に抑制される（図５Ａ）。ロドサイチンによるシグナル伝達におけるＳｙｋの重要な役割は、Ｓｙｋ欠損血小板におけるＶａｖファミリー、Ｖａｖ１とＶａｖ３の二つとＰＬＣγ２のリン酸化の完全な欠如によって示される（図５Ａ）。さらに、ロドサイチンによる凝集と形態変化はＳｙｋの欠損で完全に抑制される（図５Ｂ）。これらの結果よりロドサイチンの血小板活性におけるＳｙｋの最も上流での役割が確認できる。
【０１３３】
ＣＬＥＣ−２のチロシンリン酸化がＳｙｋの結合と、その下流でチロシンリン酸化のシグナル伝達カスケードを起こしているという可能性を、Ｓｙｋの二つのＳＨ２ドメインをコードするＧＳＴの融合蛋白を用いて検討した。Ｓｙｋの融合蛋白はロドサイチン刺激後の血小板で、３２／４２ｋＤａのＣＬＥＣ−２を同じレベルで結合したが、コントロール血小板では結合が見られなかった。一方でＣＬＥＣ−２の結合がＳｒｃキナーゼ抑制剤ＰＰ２によって抑制された（図５Ｃｉ）。さらに、Ｓｙｋの融合蛋白はロドサイチンの刺激から３０秒以内にＣＬＥＣ−２の結合を起こさせ、このことは、それが形態変化と凝集の開始と並行して起こっていることを示しており、ＧＰＶＩアゴニストコンバルキシンでは起こらず（図５Ｃｉｉ）、規則の特異性を確証した。この結果に沿って、Ｓｙｋは、ＣＬＥＣ−２の細胞質尾部のＹＸＸＬモチーフを含むリン酸化したペプチドに結合することができ、同等のリン酸化していないペプチドでは作用はなかった（図５Ｃｉｉｉ）。これらの結果から、ＳｙｋがＣＬＥＣ−２のリン酸化した尾部と結合し、下流のシグナル伝達を惹き起しているというモデルが支持される。しかしながら、発明者は、刺激した血小板でのこの結合をＣＬＥＣ−２とＳｙｋの抗体を使用した免疫沈降法を通じて確認することができなかったが、それは恐らくＳｙｋのＳＨ２ドメインと単一のＹＸＸＬ配列の結合が弱く、それにより複合体が不安定になったためと考えられる。
【０１３４】
実施例７：ロドサイチン惹起シグナル伝達におけるＬＡＴ，ＳＬＰ−７６，Ｖａｖ１／３，ＰＬＣγ２の重要性
我々は、遺伝子操作マウスの血小板を使用してロドサイチンの刺激によりチロシンリン酸化が行われる複数の蛋白の役割を確立させた。ロドサイチンについては低濃度（３−１０ｎＭ）と中間濃度（２０−３０ｎＭ）を使用して、濃度を増加させた蛇毒で抑制効果が克服できるかどうか確かめた。低濃度ロドサイチンに対する反応はＰＬＣγ２の欠損状態では完全に消失したが、中間濃度ではわずかに形態変化が認められる。これはおそらく、低レベルのＰＬＣγ１のためと考えられる(非特許文献１７)（図６Ａ）。ＬＡＴ，ＳＬＰ−７６，Ｖａｖ１／３の欠損状態では低濃度ロドサイチンに対する反応は大きく抑制されたが、高濃度の蛇毒に対してはほぼ凝集の完全な反応が認められた（図６Ｂ−Ｄ）。ＬＡＴとＰＬＣγ２の結果は、蛇毒コンバルキシンまたはＧＰＶＩ特異的コラーゲンペプチド（ＣＲＰ）をアゴニストとして使用してＧＰＶＩによる遺伝子操作マウスの刺激により得られた結果と同じであった(非特許文献１７，１９)。対照的に、高濃度のロドサイチンがＳＬＰ−７６欠損状態で、またはＶａｖ１とＶａｖ３が併せて欠けている状態で最大限の凝集を惹起するという観察は、凝集がかなり抑制されたコンバルキシンやＣＲＰの観察とは対照的である。これらの観察により、ＣＬＥＣ−２のシグナル伝達経路がコラーゲンレセプタのＧＰＶＩで使用するシグナル伝達経路と異なることが確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】ＣＬＥＣ−２のロドサイチンコートビーズとの結合を示す図である。Ａ）は、洗浄血小板をビオチン化して、等量の２倍濃縮溶解バッファーで溶解し、洗浄血小板をプレクリアし、ロドサイチンあるいはグリシンが結合したSepharose 4B（gly-Seph）と４℃で４時間反応させた。十分な洗浄の後、蛋白を還元ＳＤＳサンプルバッファーでビーズから溶出した。結合してきた血小板蛋白を４−２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、西洋わさびペルオキシダーゼラベルストレプトアビジン（avidin-HRP）で検出した。このデータは２回の実験を示している。Ｂ）（Ａ）に記載したように、ラベルを付していない洗浄血小板を用いて、沈降と電気泳動を行った。リガンドブロットをビオチンラベルしたロドサイチン（rhodocytin-biotin）とavidin-HRPにより行った。Ｃ）Mascot MSによるSwiss-protの検索結果の出力データ表である。Ｄ）洗浄ヒト血小板をコントロールヤギＩｇＧ抗体あるいは抗ＣＬＥＣ−２抗体と反応させ、続いてＦＩＴＣラベル抗ヤギＩｇＧと反応させてから、Becton DickinsonのＦＡＣＳｃａｎで分析した。Ｅ）洗浄血小板を４倍濃縮ＳＤＳサンプルバッファーで溶解した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、抗ＣＬＥＣ−２抗体（左図）とコントロールヤギＩｇＧ（右図）ウェスタンブロットで検出した。このデータは５回繰り返された実験のうちの一例である。Ｆ）（Ｂ）で使用した細胞膜を抗ＣＬＥＣ−２抗体で再度調べた。Ｇ）（Ｅ）における３２、４０ｋＤａのＣＬＥＣ−２バンドについてデンシトメトリック分析をMolecular Imager FX and Quantity One （BIO-RAD）ソフトウエアで行った。３２、４０ｋＤａバンドの比較強度を±Ｓ．Ｅ．（ｎ＝４）を基準として表した。
【図２】ロドサイチンに対するＣＬＥＣ−２発現２９３Ｔ−ＲＥｘＴＭ細胞の選択的応答を示す図である。（Ａ）tet repressor蛋白の元でＣＬＥＣ−２を発現する２９３Ｔ−ＲＥｘＴＭを、２４−４８時間１μｇ／ｍｌのドキシサイクリンで培養した。５×１０６／ｍｌの細胞を抗ＣＬＥＣ−２抗体あるいはisotype matched controlで培養し、Facscanで分析した。（Ｂ）ドキシサイクリンを加えた、あるいは加えない５×１０６／ｍｌの２９３Ｔ−ＲＥｘＴＭ細胞を１００ｎＭのロドサイチンであらかじめインキュベートした。過剰なロドサイチンを遠心分離により除き、細胞をコントロールウサギＩｇＧあるいは抗ロドサイチン抗体で処理し、続いてＦＩＴＣラベル抗ウサギＩｇＧで染色した。Ｃ）１０分間５００ｎＭロドサイチンで刺激した細胞と、刺激しなかった細胞をＳＤＳサンプルバッファーで溶解した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。蛋白のチロシンリン酸化を抗リン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０）を用いてブロットして検出した。Ｄ）１×１０７／ｍｌの細胞を４倍濃縮ＳＤＳサンプルバッファーで溶解した。蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＣＬＥＣ−２抗体（左図）とコントロールヤギＩｇＧ（右図）でウェスタンブロットして検出した。このデータは２−３回繰り返された実験のうちの一例である。
【図３】抗ＣＬＥＣ−２抗体を用いてＣＬＥＣ−２を架橋することにより惹起された血小板凝集およびＣＬＥＣ−２チロシンリン酸化を示す図である。Ａ）洗浄ヒト血小板（２×１０８／ｍｌ）を１０μｇ／ｍｌの抗ＣＬＥＣ−２抗体あるいはコントロールヤギＩｇＧで、抗ＦｃγＲＩＩＡ抗体（ＩＶ．３）のＦ（ａｂ）’２フラグメントの元で刺激した。血小板凝集を血小板凝集計で観察した。Ｂ）上記の刺激の後、洗浄ヒト血小板（１×１０９／ｍｌ）を２倍濃縮ＳＤＳ溶解バッファーで溶解した。ＣＬＥＣ−２は免疫沈降し、続いて、ＣＬＥＣ−２に対し、抗リン酸化チロシン抗体（４Ｇ１０）あるいはモノクローナル抗ＣＬＥＣ−２抗体によりウェスタンブロットを行った。このデータは４回繰り返された実験のうちの一例である。
【図４】ロドサイチン刺激によるＣＬＥＣ−２のチロシンリン酸化と、ＧＰＶＩ下流のシグナル伝達分子のチロシンリン酸化を示す図である。Ａ）洗浄ヒト血小板（２×１０８／ｍｌ）を３００ｎＭロドサイチンで刺激し、血小板凝集を血小板凝集計で測定した。Ｂ−Ｅ）洗浄ヒト血小板（１×１０９／ｍｌ，３００μＬ又は５００μＬ）を３００ｎＭロドサイチン（Ｂ）、５０ｎＭロドサイチン（Ｃ−Ｅ）、５０μｇ／ｍｌのコラーゲンまたは１００μＭ  ＳＦＬＬＲＮ （ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:６）で所定時間刺激した。Ｄ）血小板にはロドサイチン刺激の前に３０μＭのＰＰ２又はＰＰ３を加えた。等量の２倍濃縮溶解バッファーを加えて反応を終えた。溶解した血小板はプレクリアした後、不溶成分を遠心分離した。残りの上清には、それぞれ抗ＣＬＥＣ−２抗体（Ｂ）、抗ＰＬＣγ２抗体、抗Ｓｙｋ抗体、抗Ｂｔｋ抗体、抗ＳＬＰ−７６抗体、又は抗ＬＡＴ抗体（Ｅ）を加え、プロテインＡセファロースビーズ又はプロテインＧセファロースビーズを加え、一晩反応させた。結合してきた蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、上述の抗体を用いてウェスタンブロットし検出した。このデータは２−５回繰り返された実験のうちの一例である。
【図５】ＳｙｋがＣＬＥＣ−２による血小板活性化機構の下流で重要な役割を果たしていることを示す図である。（Ａ）洗浄マウス血小板をロドサイチン５０ｎＭで所定時間刺激する。細胞溶解物あるいは免疫沈降物全体をＰＬＣγ２、Ｖａｖ１またはＶａｖ３に対する抗体とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、上述の抗体を用いてウェスタンブロットした。（Ｂ）コントロールあるいはＳｙｋ欠損血小板を３０ｎＭロドサイチンで刺激し、血小板凝集を血小板凝集計で測定した。（Ｃ）（ｉ）（ｉｉ）洗浄したヒト血小板を、あらかじめ３０μＭのＰＰ２で、あるいはＰＰ２なしで処理し、５０ｎＭのロドサイチンあるいは１０μｇ／ｍｌのコンバルキシンで所定の時間刺激した。等量の２倍濃縮溶解バッファーを加えて反応を終えた。溶解した血小板はプレクリアした後、不溶成分を遠心分離した。残りの上清は、４０μｌのＳｙｋ−ＳＨ２ドメイン融合蛋白結合グルタチオンビーズを加え、反応させた。結合してきた蛋白をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＣＬＥＣ−２抗体を用いてウェスタンブロットし検出した。（ｉｉｉ）１０μｇのＣＬＥＣ−２リン酸ＹＸＸＬペプチドとアビジンセファロースの混合物に結合したＣＬＥＣ−２を抗ＣＬＥＣ−２抗体で検出した。このデータは２−５回繰り返された実験のうちの一例である。
【図６】ロドサイチン惹起血小板凝集がＰＬＣγ２欠損マウス、ＬＡＴ欠損マウス、ＳＬＰ−７６欠損マウス又はＶａｖ１／３欠損マウスで抑制されることを示す図である。洗浄した健常マウス血小板、ＰＬＣγ２欠損マウス血小板、ＬＡＴ欠損マウス血小板、ＳＬＰ−７６欠損マウス血小板又はＶａｖ１／３欠損マウス血小板を、示された濃度のロドサイチンで刺激し、血小板凝集を凝集計で測定した。このデータは３−６回繰り返された実験のうちの一例である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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