(57)【要約】本発明は、組換えスパイダーシルクタンパク質、該組換えスパイダーシルクタンパク質をコードする核酸、ならびに該核酸を発現させるのに適した宿主に関する。さらに本発明は、スパイダーシルクタンパク質の凝集方法に関するとともに、該タンパク質のバイオテクノロジー、医学および他の工業分野における使用、特に自動車部品の製造、航空機建造、織物および皮革の加工、ならびに紙などの製造および加工における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えスパイダーシルクタンパク質であって、
ａ）１つ以上の合成のスパイダーシルクタンパク質反復配列、および
ｂ）１つ以上の天然型のスパイダーシルクタンパク質非反復配列
のうち少なくともいずれか一方を含んでなる組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項２】
前記配列が、大瓶状腺からのクモの牽引糸シルクタンパク質由来であるか、または鞭毛状腺からのタンパク質由来であるかのうち少なくともいずれかである、請求項１に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項３】
天然型の非反復配列は、天然のスパイダーシルクタンパク質の、アミノ末端非反復領域（鞭毛状タンパク質）およびカルボキシ末端非反復領域（鞭毛状タンパク質および牽引糸タンパク質）のうち少なくともいずれか一方に由来する、請求項１または２に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項４】
天然型の非反復配列は、宿主内での前記配列の発現に適合するように改変されており、好ましくは配列番号１４、１５、３２および３４またはそれらのバリアントである、請求項３に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項５】
牽引糸タンパク質および鞭毛状タンパク質のうち少なくともいずれか一方が、円網性種（コガネグモ科（Ａｒａｎｅｉｄａｅ））の牽引糸タンパク質または鞭毛状タンパク質から選択される、請求項１〜４のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項６】
牽引糸タンパク質はニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来し、鞭毛状タンパク質はアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する、請求項５に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項７】
牽引糸タンパク質は野生型のＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐＩ、またはＭａＳｐＩＩであり、鞭毛状タンパク質はＦＬＡＧである、請求項１〜６のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項８】
牽引糸タンパク質が、配列番号１でコードされるＡＤＦ−３および配列番号２でコードされるＡＤＦ−４のうち少なくともいずれか一方であるか、または鞭毛状タンパク質が、配列番号６（Ｆｌａｇ−Ｎ）および配列番号７（Ｆｌａｇ−Ｃ）のうち少なくともいずれか一方であるか、あるいはそれらのバリアントである、請求項１〜６のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項９】
合成反復配列が、共通配列を含んでいる１以上のポリアラニンを含む、請求項１〜８のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１０】
共通配列を含んでいるポリアラニンはＡＤＦ−３に由来し、配列番号３のアミノ酸配列（モジュールＡ）またはそのバリアントを有している、請求項９に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１１】
合成反復配列はＡＤＦ−３に由来し、配列番号４のアミノ酸配列（モジュールＱ）またはそのバリアントの１以上の繰り返しを含む、請求項１〜１０のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１２】
合成反復配列は、反復単位として（ＡＱ）および（ＱＡＱ）のうち少なくともいずれか
一方を１つ以上含む、請求項９〜１１のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１３】
合成反復配列は（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、（ＱＡＱ）８または（ＱＡＱ）１６である、請求項１２に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１４】
合成反復配列がＡＤＦ−４に由来し、配列番号５のアミノ酸配列（モジュールＣ）またはそのバリアントの１つ以上の繰り返しを含む、請求項１〜１３のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１５】
合成反復配列はＣ１６またはＣ３２である、請求項１４に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１６】
合成反復配列は鞭毛状タンパク質に由来し、モジュールＫ（配列番号３５）、モジュールｓｐ（配列番号３７）、モジュールＸ（配列番号３９）、ならびにモジュールＹ（配列番号４１）である、請求項１〜１５のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１７】
Ｙ８、Ｙ１６、Ｘ８、Ｘ１６、Ｋ８、またはＫ１６である、請求項１６に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１８】
完全長の組換えスパイダーシルクタンパク質は、式（ＱＡＱ）８ＮＲ３、（ＱＡＱ）１６ＮＲ３、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＡＱ）２４ＮＲ３、Ｃ１６ＮＲ４、またはＣ３２ＮＲ４、（ＱＡＱ）８、（ＱＡＱ）１６、（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、Ｃ１６、またはＣ３２である、請求項１〜１７のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１８のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸配列を含み、好ましくは図６または配列番号５５のクローニングベクターまたはそのバリアントに由来するベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸配列と、１つ以上の調節配列とを含む発現ベクター。
【請求項２２】
プラスミドベクターまたはウイルスベクターであり、好ましくはバキュロウイルス系または牛痘ウイルスベクター系である、請求項２０または２１に記載のべクター。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のべクターで形質転換された宿主。
【請求項２４】
原核細胞である、請求項２３に記載の宿主。
【請求項２５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項２４に記載の宿主。
【請求項２６】
真核細胞である、請求項２５に記載の宿主。
【請求項２７】
哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞または昆虫細胞である、請求項２６に記載の宿主。
【請求項２８】
ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＨＥＨまたはＢＨＫ細胞である、請求項２７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２９】
酵母細胞である、請求項２７に記載の宿主。
【請求項３０】
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である、請求項２９に記載の宿主。
【請求項３１】
昆虫細胞が、鱗翅類の昆虫細胞、好ましくはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来およびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来の細胞である、請求項２７に記載の宿主。
【請求項３２】
昆虫細胞はＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞である、請求項３１に記載の宿主。
【請求項３３】
植物細胞は、タバコ、じゃがいも、トウモロコシ、マメおよびトマトに由来する、請求項２７に記載の宿主。
【請求項３４】
スパイダーシルクタンパク質の凝集方法であって、
ａ）請求項１〜１７のうち１以上に記載の配向していないスパイダーシルクタンパク質を含んでいるタンパク質溶液を準備する工程と、
ｂ）工程ａ）で準備された溶液を凝集トリガーに曝露する工程と、
ｃ）沈殿したスパイダーシルクタンパク質を回収する工程と
を含む方法。
【請求項３５】
工程ａ）で使用されるスパイダーシルクタンパク質は、請求項２０〜２２に記載のベクターまたは請求項１９に記載の核酸を用いて請求項２３〜３３のうち１以上に記載の適切な宿主を形質転換し、適切な条件の下でスパイダーシルク遺伝子を発現させることにより生産される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
凝集トリガーは、酸性化、好ましくはｐＨを約１にすること、リン酸カリウム、および機械的ストレス、好ましくはタンパク質溶液を回転させて剪断力を加えること、から選択される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程ａ）で準備された、または工程ｃ）で回収された前記タンパク質を、適切な方法によってフィラメント、ナノ繊維および糸へと紡糸するか、またはフィルムを形成する工程を含む、請求項３４〜３６のうち１以上に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜３７のうち１以上に記載のタンパク質／糸の、バイオテクノロジーおよび医学のうち少なくともいずれか一方の分野における使用。
【請求項３９】
請求項１〜３８のうち１以上に記載のタンパク質／糸の、創傷閉鎖システムもしくは創傷被覆システムの製造のための使用。
【請求項４０】
縫合材料の製造のための、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
縫合材料は神経外科もしくは眼科手術で使用されるためのものである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
請求項１〜４１のうち１以上に記載のタンパク質／糸の、置換材料、好ましくは人工軟骨または腱材料の製造のための使用。
【請求項４３】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質／糸の、自動車部品および航空機部品の製造における使用。
【請求項４４】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質／糸を含むか、あるいは請求項３３〜３６のうち１以上に記載の方法によって得ることができることを特徴とする、創傷閉鎖システムまたは創傷被覆システム、縫合材料、置換材料、好ましくは人工軟骨、腱材料、自動車部品、または航空機建造に使用される部品。
【請求項４５】
請求項１〜１７のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質を含んでなる紙製品。
【請求項４６】
請求項１〜１７のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質を含んでなる織物製品または皮革製品。
【請求項４７】
組換えスパイダーシルクタンパク質がコーティングとして存在する、請求項４５に記載の織物製品または皮革製品。
【請求項４８】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質を含んでなるかまたは該タンパク質で構成されるゲルまたは発泡体。
【請求項４９】
（ＱＡＱ）８ＮＲ３、（ＱＡＱ）１６ＮＲ３、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＡＱ）２４ＮＲ３、Ｃ１６ＮＲ４、またはＣ３２ＮＲ４、（ＱＡＱ）８、（ＱＡＱ）１６、（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、Ｃ１６、またはＣ３２に基づいたタンパク質を含んでなるかまたは該タンパク質で構成される、請求項４８に記載のゲル。
【請求項５０】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質を含んでなるかまたは該タンパク質で構成される、インプラントおよびステント用のコーティング。
【請求項５１】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質／糸と、さらに、クモ由来ではなくかつ好ましくは植物由来の繊維または合成繊維である繊維とをさらに含むことを特徴とする、糸または繊維。
【請求項５２】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質、あるいは（ＱＡＱ）８ＮＲ３、（ＱＡＱ）１６ＮＲ３、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＡＱ）２４ＮＲ３、Ｃ１６ＮＲ４、またはＣ３２ＮＲ４、（ＱＡＱ）８、（ＱＡＱ）１６、（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、Ｃ１６、またはＣ３２に基づいたタンパク質を含んでなるかまたは該タンパク質で構成されていることを特徴とするフィルム。
【請求項５３】
（ＡＱ）２４ＮＲ３またはＣ１６に基づいたタンパク質を含んでなるかまたは該タンパク質で構成されている、請求項５２に記載のフィルム。
【請求項５４】
フィルムの表面が、有機小分子および生体高分子のうち少なくともいずれか一方、例えばタンパク質、フルオレセインまたはβ−ガラクトシダーゼで修飾されている、請求項５２または５３に記載のフィルム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えスパイダーシルクタンパク質、該組換えスパイダーシルクタンパク質をコードする核酸、ならびに該核酸を発現するのに適した宿主に関する。更に、本発明は、スパイダーシルクタンパク質の凝集方法に関するとともに、該タンパク質のバイオテクノロジー、医学および他の工業分野における使用、特に自動車部品の製造、航空機建造、織物および皮革の加工、ならびに紙、化粧品、食品、電子装置の製造および加工、薬物送達などにおける使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
本願においては、次の略語が使用される：ＮＲ、非反復性；Ａｐｒ、アンピシリン耐性遺伝子；ＩＰＴＧ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド；ＧｄｍＣｌ、塩酸グアニジン；ＧｄｍＳＣＮ、チオシアン酸グアニジン；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＰＡＧＥ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動；トリス、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン；ＣＤ、円偏光二色性；ｒｅｐタンパク質、反復性タンパク質；Ｄａ、ダルトン；ｃｐｓ、毎秒カウント数；ＭＲＷ、平均残基分子量；ｎ．ｄ．、未実施。
【０００３】
スパイダーシルク（蜘蛛絹糸）は驚くべき物性を示すタンパク質ポリマーである（１）。様々な種類のスパイダーシルクの中でも、牽引糸は最も盛んに研究されている。牽引糸シルクは、造網性のクモが、網の枠および径を構築するために、かつ常に後方に引かれる命綱として利用している。これらの目的のためには、高い引張強さと弾性とが必要である。そのような特性が組み合わさると、ほとんどの他の既知材料よりも高い靭性が得られる（１、２）。牽引糸シルクは一般に、一次構造が共通の反復構造を共有している２つの主なタンパク質から構成されている（３、４）。
【０００４】
最大で６０アミノ酸を含みうる単一の反復単位（繰り返し単位）のバリエーションが数回繰り返されて、牽引糸シルクの配列の大部分を構成している。これらの反復単位は、限られた独特のアミノ酸モチーフのセットを含んでいる。すべての牽引糸シルクの反復単位に見出される１つのモチーフは、典型的には６〜９個のアラニン残基の連なりである。シルク糸においては、いくつかのポリアラニンモチーフが結晶性のβシートの積層を形成して引張強さをもたらしている（５、６）。
【０００５】
ＧＧＸまたはＧＰＧＸＸのようなグリシンに富むモチーフは、結晶性領域を接続するとともに糸に弾性を与える、可撓性のらせん構造をとる（７）。
さらに、調査された牽引糸シルクタンパク質はすべて、そのカルボキシル末端に明白な反復パターンを示さない領域（非反復領域またはＮＲ領域）を含む。これまでのところ、この究極の糸における同領域の機能を見出すことはできていない。
【０００６】
生体内におけるシルクのアセンブリは卓越したプロセスである。クモの牽引糸シルクタンパク質は、いわゆる大瓶状腺（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｇｌａｎｄ）の中に最大５０％（ｗ／ｖ）の濃度で（８）貯蔵される。「動的な緩いらせん構造」が大瓶状腺内のタンパク質について提案されてきたが（８）、より最近のデータは、大瓶状腺の大部分に相当するいわゆるＡゾーンのタンパク質についてランダムコイル構造を示唆している（９、１０）。この高度に濃縮されたタンパク質溶液がシルクのドープ液（紡糸液）を形成し、該ドープ液は液晶の特性を示す（１１−１３）。
【０００７】
糸のアセンブリは、水、ナトリウムおよび塩化物の抽出を伴ってドープ液が紡糸管（ｓｐｉｎｎｉｎｇ  ｄｕｃｔ）を通過する間に開始される（１４、１５）。同時に、よりリ
オトロピックなカリウムイオンおよびリン酸イオンの濃度が上昇し、ｐＨが６．９から６．３に低下する（１４−１６）。アセンブリは最終的には機械的ストレスが引き金となって起きるが、機械的ストレスはクモの腹から糸を引き出すことにより引き起こされる（１７）。
【０００８】
いくつかの目的については、天然のシルク糸を直接使用することはできず、溶解してフィルム、発泡体、球体、ナノ繊維、ヒドロゲルなどのような他の形態へと再アセンブリする必要がある。
【０００９】
シルクタンパク質から作られたフィルムに関するほとんどの研究は、シルクフィブロイン（カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）由来のシルクの主要タンパク質成分）を用いて行なわれている。シルクフィブロイン・フィルムは、水溶液から、あるいはヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）、ギ酸およびトリフルオロ酢酸を含む溶液から成型することが可能である。シルクフィブロインは、溶液中では使用される溶媒に依存してらせん構造やランダムコイル構造をとる傾向がある。フィルムに成型された時、タンパク質は可溶状態の構造を維持するか、あるいはよりβシートに富んだ構造をとる。ほとんどの場合、フィルムをメタノールで処理するとβシート含量および結晶度が一層増大する。シルクフィブロインに加えて、他のシルクタンパク質もフィルムの成型に使用されてきた。ボルラス（Ｖｏｌｌｒａｔｈ）と共同研究者らは、クモ（ネフィラ・セネガレンシス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ））の大瓶状腺から抽出されたタンパク質で作られるフィルムについて研究した。水溶液から調製された場合、成型フィルムは主としてランダムコイル構造のタンパク質を含んでいた。その構造は、塩化カリウムを添加するとβシートに変化した。さらに、溶媒としてＨＦＩＰを使用して、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）の牽引糸シルクタンパク質ＭａＳｐＩ由来の合成シルクタンパク質からフィルムが作られている。該タンパク質は、溶液ではαらせん構造をとるが、フィルムへと成型されるとよりβシートに富む構造へと変化する。
【００１０】
残念ながら、天然シルクフィブロイン由来の機能的フィルム材料の生成は、そのアミノ酸配列によって抑制されている。シルクフィブロインの選択的な化学修飾は、チオール基、アミノ基、またはカルボキシル基を含む化学的に反応性のアミノ酸側鎖が少量（＜１．５％）であるために、非常に限定的にしか可能でない。さらに、シルクタンパク質を変化させ、したがってフィルムの特性を変化させるために、天然の宿主において遺伝学的改変を行うのは面倒である。
【００１１】
スパイダーシルクタンパク質のいくつかの構造上の特性は解明されているが、個々のシルクタンパク質およびそれらの一次構造の要素の、アセンブリ過程への寄与については、まだほとんど知られていない。ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｎｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の２つの主な牽引糸シルクタンパク質であるＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の比較試験から、それらのアミノ酸配列はかなり似ている（４）が、これらのタンパク質が著しく異なる溶解度およびアセンブリ特性を示すことが明らかになった。すなわち、ＡＤＦ−３は高濃度でも可溶性であるが（１８）、ＡＤＦ−４は事実上不溶性で、特定の条件下でフィラメント状の構造へと自己アセンブリする（未発表の結果）。
【００１２】
科学的および商業的関心から、スパイダーシルクを工業規模で製造する研究が開始された。天然スパイダーシルクの生産は、クモが共食いすることから非実用的であり、人工的生産は、十分なタンパク質収率と高品質の糸へのアセンブリとの両方を達成するには問題があった。細菌による発現は、恐らくは細菌とクモとのコドン利用の違いに起因して、タンパク質収量レベルが低かった。発現用宿主に適したコドン利用の合成遺伝子により収量が高まったが、該遺伝子から合成されたタンパク質は、天然のスパイダーシルクと比較すると異なる特性を示した。哺乳動物細胞株における牽引糸シルクｃＤＮＡの一部の発現に
より、まだ品質が劣るとはいえ、人工的に「シルクのような」糸へと紡糸できるシルクタンパク質（例えばＡＤＦ−３）が生産された。
【００１３】
特許文献１は、バイオフィラメントタンパク質を繊維へと紡糸するための方法および装置に関する。この発明は、水溶液から組換えシルクタンパク質を紡糸し、繊維の強度を高め、商業的生産およびそのような繊維の実用的用途を与える実用的製造を増強するのに特に有用である。同文献には、哺乳動物細胞、例えばヤギ乳腺のトランスジェニック細胞でスパイダーシルクタンパク質を発現することが開示されている。
【００１４】
いくつかの遺伝子部分が細菌中では効率的に翻訳されないコドンを含んでいるので、細菌宿主において天然型のスパイダーシルク遺伝子を発現するのは（上述のとおり）非能率的である（２４）。さらに、ＰＣＲによる遺伝子操作および増幅は、シルクが反復性を有するため困難である。スパイダーシルクタンパク質の特性を研究するために、相応の発現用宿主に適したコドン利用の合成ＤＮＡモジュールを使用するクローニング戦略がとられた。スパイダーシルクの反復領域に類似したタンパク質をコードする合成遺伝子が得られた（２５−２８）。しかしながら、これらのタンパク質の構造はどれもカルボキシル末端のＮＲ（すべての牽引糸シルクに見出される領域）を含んでいなかった。
【特許文献１】国際公開公報第０３０６００９９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
したがって、本発明の基礎となる目的は、特性が強化された組換えスパイダーシルクタンパク質、特に高収率での発現能が改善され、かつ強度および可撓性が改善された（つまりより良い品質の）組換えスパイダーシルクタンパク質を提供することである。更に、本発明の目的は、既知の発現系で都合よく発現可能な組換えスパイダーシルクタンパク質を提供することである。本発明は、スパイダーシルクタンパク質の凝集のための改良法、およびこれらのタンパク質で作られる糸を形成する方法を提供することをもう一つの目的とする。さらに、本発明は、改善された紙製品、織物製品および皮革製品を提供することを目的とする。さらなる目的は、スパイダーシルクタンパク質に基づいた新しいタンパク質およびさらなる材料、例えば球体、ナノ繊維、ヒドロゲル、糸、発泡体、フィルムなど、バイオテクノロジー、医学、医薬および食品の用途、化粧品、電子装置、ならびにその他の商業目的のために使用する材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
これらの目的は独立請求項の主題によって解決される。好ましい実施形態は、従属請求項で述べられる。
本発明のタンパク質工学手法は、合成のスパイダーシルクタンパク質反復配列および天然型のＮＲ（非反復性）領域のうち少なくともいずれか一方を含んでなるかまたはそれらで構成される組換えスパイダーシルクタンパク質を提供するものであり、天然型のシルクタンパク質に非常によく似たタンパク質を高収率で生産可能であることが明らかである。特に、本明細書において提示される細菌の発現系ならびに単純で安価な精製工程は、スケールアップが容易であり、スパイダーシルク様タンパク質の資金効率の良い工業規模生産のための基礎を提供する。
【００１７】
スパイダーシルクタンパク質は、シルク糸の機械的性質への寄与に関して主に研究されてきた。しかしながら、シルクのアセンブリの分子メカニズムについてはほとんど知られていない。このプロセスを特徴解析する第一歩として、本発明者らは、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）の主要な牽引糸シルクタンパク質ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の、タンパク質の溶解度を決定する一次構造要素を同定した。さらに、タンパク質凝集時の自然な糸のアセンブリの仲介に関与する条件の影響について研究した。ス
パイダーシルク様タンパク質をコードする遺伝子は、合成ＤＮＡモジュールとＰＣＲ増幅された天然型遺伝子配列との組合せに基づく新しく開発されたクローニング戦略を使用して生成された。合成されたタンパク質の二次構造、溶解度および凝集特性の比較から、単一の一次構造要素がタンパク質の特性に種々の影響を有していることが明らかとなった。牽引糸シルクタンパク質の大部分を占める反復領域は、該合成タンパク質の溶解度を決定付けており、溶解度はＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４由来の構造間で大きく異なっていた。酸性化およびリン酸塩濃度の増大のような、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でシルクのアセンブリを促進する要因は、一般に生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）ではシルクタンパク質の溶解度を低下させた。驚くべきことに、この作用は、ＡＤＦ−３またはＡＤＦ−４のカルボキシル末端非反復領域を含む組換えタンパク質において顕著であり、これらの領域が、スパイダーシルクタンパク質のアセンブリ開始の際に重要な役割を果たすことが示唆された。
【００１８】
第一の態様によれば、本発明は、
ａ）１つ以上の合成のスパイダーシルクタンパク質反復配列、および
ｂ）１つ以上の天然型のスパイダーシルクタンパク質非反復配列
のうち少なくともいずれか一方を含んでなる、組換えスパイダーシルクタンパク質に関する。
【００１９】
本明細書において使用される用語「合成（の）反復配列」とは、天然には見出されないが、スパイダーシルクタンパク質に本来存在する反復単位に由来する組換えタンパク質配列として理解されることになっている。上述のように、該反復配列は１つ以上の単一反復単位を含み、該単位は最大６０アミノ酸を含む。天然に存在する反復単位は、限られた独特のアミノ酸モチーフのセットを含んでいる。それらの反復単位は、後でスパイダーシルクタンパク質から形成されうる糸に、とりわけ引張強さおよび弾性を与える。
【００２０】
本発明の合成反復配列の基礎となりうる様々な種類の反復単位については、以降に詳細に説明する。
本発明の組換えスパイダーシルクタンパク質の第２の構成成分は、合成反復配列に加えて存在しても、単独で存在してもよく、１つ以上の天然型の非反復タンパク質配列を含む。これらの非反復配列は糸のアセンブリに重要な機能的役割を果たす。
【００２１】
留意すべきことは、本発明が、合成反復配列のみを含む組換えスパイダーシルクタンパク質も企図することである。両方の構成成分、すなわち合成反復配列ならびに天然型の非反復配列を示す本発明の組換えタンパク質は、利用範囲が広く、大量生産可能である（下記の実施例の章を参照）が、合成反復配列だけを含んでいる組換えスパイダーシルクタンパク質は、一部の特定の用途について使用可能である。
【００２２】
これらの用途は、とりわけ自動車部品および航空機部品、表面コーティング、ならびに創傷閉鎖システムおよび創傷被覆材である。あるいは言いかえれば、スパイダーシルクタンパク質の糸状構造物を必要としない用途である。
【００２３】
本明細書に使用されるように用語「天然型（の）」は、基礎となる核酸配列が、その配列自体に実質的な改変を加えずに天然の環境から単離されていることを意味する。許容される唯一の改変は、天然型の非反復核酸配列を、宿主内で発現するように適合させるために、コードされるアミノ酸配列を変えることなく改変する場合である。好ましい配列は、ＮＲ３（配列番号１０、ＡＤＦ−３由来）およびＮＲ４（配列番号１１、ＡＤＦ−４由来）である。いずれの配列においても、より効率よく翻訳させるために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ではほとんど翻訳されないコドンＡＧＡ（アルギニン）についてＰＣＲ突然変異誘発を使用してＣＧＴ（アルギニン）に変異させた。
【００２４】
好適な鞭毛状タンパク質の天然型非反復配列は、ＦｌａｇＮ−ＮＲ（配列番号３１および３２）およびＦｌａｇＣ−ＮＲ（配列番号３３および３４）のアミノ酸配列および核酸配列である。
【００２５】
好ましい実施形態によれば、本発明の組換えスパイダーシルクタンパク質は、一般にクモの大瓶状腺からのクモ牽引糸タンパク質および／または鞭毛状腺からのタンパク質に由来する。
【００２６】
さらに好ましい実施形態によれば、天然型非反復配列は、天然のスパイダーシルクタンパク質の、アミノ末端非反復領域（鞭毛状タンパク質）および／またはカルボキシ末端非反復領域（鞭毛状タンパク質および牽引糸タンパク質）に由来する。それらのタンパク質の好ましい例を以下に示す。
【００２７】
一般に、円網性種（コガネグモ科（Ａｒａｎｅｉｄａｅ）およびアラネオイド（Ａｒａｎｅｏｉｄｓ））の牽引糸タンパク質または鞭毛状タンパク質から牽引糸および／または鞭毛の配列を選択することが好ましい。
【００２８】
より好ましくは、牽引糸タンパク質および／または鞭毛状タンパク質は、次のクモのうち１以上に由来する：Ａｒａｃｈｎｕｒａ  ｈｉｇｇｉｎｓｉ、Ａｒａｎｅｕｓ  ｃｉｒｃｕｌｉｓｓｐａｒｓｕｓ、ニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）、Ａｒｇｉｏｐｅ  ｐｉｃｔａ、バンデッドガーデンスパイダー（Ｂａｎｄｅｄ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ）、バティックゴールデンウェブスパイダー（Ｂａｔｉｋ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｅｂ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｎｅｐｈｉｌａ  ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ）、ベッカリズテントスパイダー（Ｂｅｃｃａｒｉ’ｓ
Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｂｅｃｃａｒｉｉ）、トリノフンダマシ（Ｂｉｒｄ−ｄｒｏｐｐｉｎｇ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｃｅｌａｅｎｉａ  ｅｘｃａｖａｔａ）、ブラックアンドホワイトスピニースパイダー（Ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−Ｗｈｉｔｅ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｋｕｈｌｉｉ）、キマダラコガネグモ（Ｂｌａｃｋ−ａｎｄ−ｙｅｌｌｏｗ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｕｒａｎｔｉａ）、ナゲナワグモ（Ｂｏｌａｓ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ  ｆｕｒｃａｔｕｓ）、ナゲナワグモ〜マグニフィセントスパイダー（Ｂｏｌａｓ  Ｓｐｉｄｅｒｓ−Ｍａｇｎｉｆｉｃｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｏｒｄｇａｒｉｕｓ  ｍａｇｎｉｆｉｃｕｓ）、ブラウンセーラースパイダー（Ｂｒｏｗｎ  Ｓａｉｌｏｒ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｎｅｏｓｃｏｎａ  ｎａｕｔｉｃａ）、ブラウンレッグドスパイダー（Ｂｒｏｗｎ−Ｌｅｇｇｅｄ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｎｅｏｓｃｏｎａ  ｒｕｆｏｆｅｍｏｒａｔａ）、キャップトブラックヘッディドスパイダー（Ｃａｐｐｅｄ  Ｂｌａｃｋ−Ｈｅａｄｅｄ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｚｙｇｉｅｌｌａ  ｃａｌｙｐｔｒａｔａ）、コモンガーデンスパイダー（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｐａｒａｗｉｘｉａ
ｄｅｈａａｎｉ）、コモンオーブウィーバー（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｏｒｂ  Ｗｅａｖｅｒ）（Ｎｅｏｓｃｏｎａ  ｏｘａｎｃｅｎｓｉｓ）、クラブライクスピニーオーブウィーバー（Ｃｒａｂ−ｌｉｋｅ  Ｓｐｉｎｙ  Ｏｒｂ  Ｗｅａｖｅｒ）（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓ（ｅｌｉｐｓｏｉｄｅｓ）））、カーブドスピニースパイダー（Ｃｕｒｖｅｄ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ａｒｃｕａｔａ）、Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｍｏｌｕｃｃｅｎｓｉｓ、Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｐａｒｎａｓｉａ、Ｄｏｌｏｐｈｏｎｅｓ  ｃｏｎｉｆｅｒａ、Ｄｏｌｏｐｈｏｎｅｓ  ｔｕｒｒｉｇｅｒａ、ドリアズスピニースパイダー（Ｄｏｒｉａ’ｓ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｄｏｒｉａｅ）、ダブルスポッテッドスピニースパイダー（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｍａｍｍｏｓａ）、ダブルテイルドテントスパイダー（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｔａｉｌｅｄ  Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｅｘａｎｔ
ｈｅｍａｔｉｃａ）、Ａｃｕｌｅｐｅｒｉａ  ｃｅｒｏｐｅｇｉａ、Ｅｒｉｏｐｈｏｒａ
ｐｕｓｔｕｌｏｓａ、フラットアネプション（Ｆｌａｔ  Ａｎｅｐｓｉｏｎ）（Ａｎｅｐｓｉｏｎ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｕｍ）、フォースパインドジュエルスパイダー（Ｆｏｕｒ−ｓｐｉｎｅｄ  Ｊｅｗｅｌ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｑｕａｄｒｉｓｐｉｎｏｓａ）、ガーデンオーブウェブスパイダー（Ｇａｒｄｅｎ  Ｏｒｂ  Ｗｅｂ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｅｒｉｏｐｈｏｒａ  ｔｒａｎｓｍａｒｉｎａ）、ジャイアントライケンオーブウィーバー（Ｇｉａｎｔ  Ｌｉｃｈｅｎ  Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ）（Ａｒａｎｅｕｓ  ｂｉｃｅｎｔｅｎａｒｉｕｓ）、ジョロウグモ（Ｇｏｌｄｅｎ  Ｗｅｂ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｃｕｌａｔａ）、ハッセルツスピニースパイダー（Ｈａｓｓｅｌｔ’ｓ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｈａｓｓｅｌｔｉｉ）、Ｔｅｇｅｎａｒｉａ  ａｔｒｉｃａ、Ｈｅｕｒｏｄｅｓ  ｔｕｒｒｉｔａ、アイランドサイクローサスパイダー（Ｉｓｌａｎｄ  Ｃｙｃｌｏｓａ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｃｙｃｌｏｓａ  ｉｎｓｕｌａｎａ）、ジュエルスパイダーもしくはスピニースパイダー（Ｊｅｗｅｌ  ｏｒ  Ｓｐｉｎｙ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ａｓｔｒａｃａｎｔｈａ  ｍｉｎａｘ）、キドニーガーデンスパイダー（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ａｒａｎｅｕｓ  ｍｉｔｉｆｉｃｕｓ）、ラグライジズガーデンスパイダー（Ｌａｇｌａｉｓｅ’ｓ  Ｇａｒｄｅｎ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｅｒｉｏｖｉｘｉａ  ｌａｇｌａｉｓｅｉ）、ロングベリードサイクローサスパイダー（Ｌｏｎｇ−Ｂｅｌｌｉｅｄ  Ｃｙｃｌｏｓａ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｃｙｃｌｏｓａ  ｂｉｆｉｄａ）、マラバルスパイダー（Ｍａｌａｂａｒ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｍａｌａｂａｒｅｎｓｉｓ）、マルチカラードセントアンドリューズクロススパイダー（Ｍｕｌｔｉ−Ｃｏｌｏｕｒｅｄ  Ｓｔ  Ａｎｄｒｅｗ’ｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ）、オーナメンタルツリートランクスパイダー（Ｏｒｎａｍｅｎｔａｌ  Ｔｒｅｅ−Ｔｒｕｎｋ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｈｅｒｅｎｎｉａ  ｏｒｎａｔｉｓｓｉｍａ）、オーバルセントアンドリューズクロススパイダー（Ｏｖａｌ  Ｓｔ．  Ａｎｄｒｅｗ’ｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｅｍｕｌａ）、レッドテントスパイダー（Ｒｅｄ  Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｕｎｉｃｏｌｏｒ）、ロシアンテントスパイダー（Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｔｅｎｔ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｃｙｒｔｏｐｈｏｒａ  ｈｉｒｔａ）、セントアンドリューズクロススパイダー（Ｓａｉｎｔ  Ａｎｄｒｅｗ’ｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｋｅｙｓｅｒｌｉｎｇｉ）、スカーレットアクシラス（Ｓｃａｒｌｅｔ  Ａｃｕｓｉｌａｓ（Ａｃｕｓｉｌａｓ  ｃｏｃｃｉｎｅｕｓ）、ギンコガネグモ（Ｓｉｌｖｅｒ  Ａｒｇｉｏｐｅ）（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｒｇｅｎｔａｔａ）、スピニーバックトオーブウィーバー（Ｓｐｉｎｙｂａｃｋｅｄ  Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ）（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｃａｎｃｒｉｆｏｒｍｉｓ）、スポッテッドオーブウィーバー（Ｓｐｏｔｔｅｄ  Ｏｒｂｗｅａｖｅｒ）（Ｎｅｏｓｃｏｎａ  ｄｏｍｉｃｉｌｉｏｒｕｍ）、セントアンドリューズクロス（Ｓｔ．  Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｃｒｏｓｓ）（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｅｔｈｅｒｉａ）、セントアンドリューズクロススパイダー（Ｓｔ．  Ａｎｄｒｅｗｓ  Ｃｒｏｓｓ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ａｒｇｉｏｐｅ  Ｋｅｙｓｅｒｌｉｎｇｉ）、ツリースタンプスパイダー（Ｔｒｅｅ−Ｓｔｕｍｐ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｐｏｌｔｙｓ  ｉｌｌｅｐｉｄｕｓ）、トライアングルスパイダー（Ｔｒｉａｎｇｕｌａｒ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ａｒｋｙｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ）、トライアングルスパイダー（Ｔｒｉａｎｇｕｌａｒ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ａｒｋｙｓ  ｌａｎｃｅａｒｉｕｓ）、ツースパインドスパイダー（Ｔｗｏ−ｓｐｉｎｅｄ  Ｓｐｉｄｅｒ）（Ｐｏｅｃｉｌｏｐａｃｈｙｓ  ａｕｓｔｒａｌａｓｉａ）、ジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ）種、例えば、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）、Ｎｅｐｈｉｌａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ、Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓなど、ならびにさらに多くのクモ（さらなるクモ類に関しては、以下も参照のこと）。最も好ましくは、牽引糸タンパク質はニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来し、鞭毛状タンパク質はアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する。
【００２９】
本発明の枠内では、組換えスパイダーシルクタンパク質は１つの生物種由来のタンパク質配列を含むだけでなく、異なる種のクモに由来する配列をも含みうることは明らかである。例として、１つ以上の合成のスパイダーシルクタンパク質反復配列が１つの種に由来するもので、１つ以上の天然型のスパイダーシルクタンパク質非反復配列が他の種に由来する場合が考えられる。さらに別の例として、異なる種に由来する２以上の種類の反復配列を含む組換えスパイダーシルクタンパク質を設計することも可能である。
【００３０】
１つの好ましい実施形態によれば、牽引糸タンパク質は野生型のＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐＩ、ＭａＳｐＩＩであり、鞭毛状タンパク質はＦＬＡＧである。用語ＡＤＦ−３／−４は、Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓによって生産されたＭａＳｐタンパク質（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓのフィブロイン−３／−４）に関係して使用される。ＡＤＦ−３および−４いずれのタンパク質も、ＭａＳｐＩＩタンパク質（大瓶状腺スピドロインＩＩ（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ＩＩ）のクラスに属する。
【００３１】
シルク繊維は、液晶ポリマーに似た、弾性の非定形セグメントがちりばめられたβシートの結晶性領域を有する。これらの２つのセグメントは、異なる遺伝子にコードされた２つの異なる種類のタンパク質、ＭａＳｐＩ（大瓶状腺スピドロインＩ）およびＭａＳｐＩＩ（大瓶状腺スピドロインＩＩ）によって表わされる。
【００３２】
さらなる実施形態では、提供される核酸配列は、ＡＤＦ−３（配列番号１）および／またはＡＤＦ−４（配列番号２）、あるいはそのバリアントである。
留意すべきことは、２つの異なる種類のＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４をコードする配列およびタンパク質が、本発明において企図されることである。すなわち、第１に、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の既に公表されている配列（本明細書では「野生型」配列）、ならびに第２に、それらのバリアントであって配列番号１（ＡＤＦ−３）および２（ＡＤＦ−４）によってコードされるものである。野生型配列は既に公表されており、受入番号Ｕ４７８５５およびＵ４７８５６により利用可能である（配列番号８および９）。
【００３３】
本発明において使用可能（つまり単独または別のタンパク質と組み合わせて使用可能）な別のスパイダーシルクタンパク質およびそのデータベース受入番号は次のとおり、すなわち：
スピドロイン２［Ａｒａｎｅｕｓ  ｂｉｃｅｎｔｅｎａｒｉｕｓ］ｇｉ｜２９１１２７２大瓶状腺牽引糸シルクタンパク質−１（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｇｌａｎｄ  ｄｒａｇｌｉｎｅ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ‐１）［Ａｒａｎｅｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ］ｇｉ｜２７２２８９５７
大瓶状腺牽引糸シルクタンパク質−２［Ａｒａｎｅｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ］ｇｉ｜２７２２８９５９
瓶状腺スピドロイン１（ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １）［Ｎｅｐｈｉｌａ
ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ］ｇｉ｜１３５６２００６
大瓶状腺スピドロイン１（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  １）［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ］ｇｉ｜１３５６２０１０
大瓶状腺スピドロイン１［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ］ｇｉ｜１３５６１９９８
大瓶状腺スピドロイン１［Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ］ｇｉ｜１３５６１９８４
大瓶状腺スピドロイン１［Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｕｒａｎｔｉａ］ｇｉ｜１３５６１９７６牽引糸シルクタンパク質スピドロイン２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ］ｇｉ｜１６９７４７９１
大瓶状腺スピドロイン２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｓｅｎｅｇａｌｅｎｓｉｓ］ｇｉ｜１３５６２０１２
大瓶状腺スピドロイン２［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ］ｇｉ｜１３５６２００８
大瓶状腺スピドロイン２［Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｇｅｏｍｅｔｒｉｃｕｓ］ｇｉ｜１３５６２００２
である。
【００３４】
別の好ましい実施形態によれば、鞭毛状タンパク質は、配列番号６（Ｆｌａｇ−Ｎ）および／または配列番号７（Ｆｌａｇ−Ｃ）あるいはそれらのバリアントであって、本発明者らによって誘導された新規な配列を構成するものである。
【００３５】
しかしながら、既に知られた公表されている鞭毛状タンパク質の配列、特に、下記：
鞭毛状シルクタンパク質の部分ｃｄｓ［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］ｇｉ｜２８３３６４６
鞭毛状シルクタンパク質の部分ｃｄｓ［Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ］ｇｉ｜２８３３６４８
がここで使用されてもよい。
【００３６】
１つの好ましい実施形態では、組換えスパイダーシルクタンパク質は、共通配列を含んでいる１以上のポリアラニンを含む１つ以上の合成反復配列を含んでなる。それらのポリアラニン配列は６〜９個のアラニン残基を含みうる。例えば、配列番号１は、６アラニン残基のポリアラニンモチーフをいくつか含んでいる。
【００３７】
好ましくは、共通配列を含んでいるポリアラニンはＡＤＦ−３に由来し、配列番号３のアミノ酸配列（モジュールＡ）またはそのバリアントを有している。モジュールＡは、６つのアラニン残基を有するポリアラニンを含んでいる。ＡＤＦ−４由来の、共通配列を含んでいる別の好ましいポリアラニンは、８つのアラニン残基を含んでいるモジュールＣ（配列番号５）である。
【００３８】
別の好ましい実施形態によれば、本発明の組換えスパイダーシルクタンパク質では、合成反復配列はＡＤＦ−３に由来し、配列番号４のアミノ酸配列（モジュールＱ）またはそのバリアントの１以上の繰り返しを含む。
【００３９】
より一般的に言えば、合成反復配列は、一般的なモチーフ：ＧＧＸまたはＧＰＧＸＸ（すなわちグリシンに富む領域）を含む場合もある。上述のように、これらの領域は該タンパク質に可撓性を提供し、従って前記モチーフを含んでいる組換えスパイダーシルクタンパク質から形成された糸に可撓性を提供することになる。
【００４０】
本発明の合成反復配列の特定のモジュールは、互いに組み合わせることもできる、つまりＡとＱ、ＱとＣなどを組み合わせたモジュール（反復単位）も本発明に包含されることに留意すべきである。スパイダーシルクタンパク質に導入すべきモジュールの数は制限されないが、各組換えタンパク質について、５−５０個のモジュール、より好ましくは１０−４０個のモジュールならびに最も好ましくは１５−３５個のモジュール数である合成反復配列を使用することが好ましい。
【００４１】
合成反復配列は、反復単位として（ＡＱ）および／または（ＱＡＱ）を１つ以上含むことが好ましい。さらに一層好ましくは、合成反復配列は（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、（ＱＡＱ）８または（ＱＡＱ）１６である。
【００４２】
合成反復配列がＡＤＦ−４に由来する場合は常に、上述のように、配列番号５のアミノ酸配列（モジュールＣ）またはそのバリアントの１つ以上の繰り返しを含み、合成反復配列全体ではＣ１６またはＣ３２であることが好ましい。
【００４３】
本発明の完全長の組換えスパイダーシルクタンパク質の好ましい実施形態は、（ＱＡＱ）８ＮＲ３、（ＱＡＱ）１６ＮＲ３、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＡＱ）２４ＮＲ３、Ｃ１６ＮＲ４、およびＣ３２ＮＲ４（つまり前記配列を含むかまたは前記配列で構成されるタンパク質）である。
【００４４】
合成反復配列（Ａ、ＱおよびＣ系を使用）の上記の配置構成は、上記に示された他のすべての反復単位にも当てはまることがわかる。例えば、ポリアラニンを含んでいる配列はすべて、Ａおよび／またはＣをとることが可能であり、また、グリシンに富む配列はすべて、Ｑモジュールとして使用されうる。
【００４５】
鞭毛状タンパク質の配列に由来する合成反復配列の新しいモジュールは、モジュールＫ（配列番号３５および３６）、モジュールｓｐ（配列番号３７および３８）、モジュールＸ（配列番号３９および４０）、ならびにモジュールＹ（配列番号４１および４２）である。
【００４６】
合成反復配列が、Ｙ８、Ｙ１６、Ｘ８、Ｘ１６、Ｋ８、Ｋ１６を含んでなるか、またはそれらで構成されることも好ましい。
さらに、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４およびＦｌａｇに由来する上記配列を１つの組換え配列内で組み合わせることも可能である。
【００４７】
上記に説明されるように、本明細書に開示されるアミノ酸配列は配列番号で提示される正確な配列に制限されるものではない。本明細書に示されたアミノ酸配列はバリアントも含む。したがって、本発明のタンパク質のアミノ酸配列は、アミノ酸の挿入、欠失および置換によって本明細書に示された配列とは異なっている配列もすべて包含する。
【００４８】
好ましくは、アミノ酸の「置換」は、１つのアミノ酸を、構造上の特性および／または化学的性質が類似している別のアミノ酸に置き換える（つまり保存的アミノ酸置換）の結果である。アミノ酸置換は、含まれる残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、および／または両親媒性の類似性に基づいて実施することができる。例えば、非極性の（疎水性の）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる；極性の中性アミノ酸には、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる；正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが挙げられる；また、負に荷電した（酸性）アミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。
【００４９】
「挿入」または「欠失」は一般に、約１〜５アミノ酸の範囲内であり、好ましくは約１、２または３アミノ酸である。本発明のタンパク質に付加および／または挿入されるアミノ酸の付加は、１００アミノ酸以下であって、好ましくは８０アミノ酸以下、より好ましくは５０アミノ酸以下、最も好ましくは２０アミノ酸以下である。留意されることは、本明細書で開示されるタンパク質の所望の特性に悪影響を及ぼさないアミノ酸付加だけが本発明において企図されることである。
【００５０】
許容される変異は、組換えＤＮＡ技術を使用してタンパク質中にアミノ酸の挿入、欠失または置換を系統的に作製し、得られた組換えバリアントの活性を分析することによって実験的に決定されうる。これは当業者にとってルーチン実験以上のことを要求するもので
はない。
【００５１】
本発明は、第２の態様によれば、上に示されるような組換えスパイダーシルクタンパク質をコードする核酸配列に関する。好ましいタンパク質をコードする好ましい配列は、配列番号１２（ＡＤＦ−３）、１３（ＡＤＦ−４）、１４（ＮＲ３）、１５（ＮＲ４）、１６（ＦＬＡＧ−ＮＴ）、１７（ＦＬＡＧ−ＣＴ）、３２（ＦｌａｇＮ−ＮＲ）、３４（ＦｌａｇＣ−ＮＲ）である。
【００５２】
本発明は、それらの核酸のバリアントも包含する。これらのバリアントは各々、配列番号１２−１７、３２および３４の配列と比較して１つ以上の置換、挿入および／または欠失を有するものであって、適度にストリンジェントな条件の下で配列番号１２−１７、３２および３４の配列を含む核酸にハイブリダイズするか、あるいは、配列番号１２−１７、３２および３４の核酸配列と同一または機能的に等価なアミノ酸をコードする、遺伝コードの縮重に起因する核酸変異を含むものと定義される。
【００５３】
用語「核酸配列」は、ヌクレオチドのヘテロポリマーあるいはこれらのヌクレオチドの配列を指す。「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドのヘテロポリマーを意味するために本明細書において互換的に使用される。
【００５４】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、本明細書で使用されるように、ポリヌクレオチドの二重鎖が安定である条件を指す。当業者には知られているように、二重鎖の安定性は、ナトリウムイオン濃度および温度の関数である（例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」第２版（コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８９年）。ハイブリダイゼーションに使用されるストリンジェンシーのレベルは、当業者が容易に変えることが可能である。
【００５５】
本明細書において使用されるように、用語「適度にストリンジェントな条件」とは、ＤＮＡが、該ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、より好ましくは約８５％の同一性、特に好ましくは前記ＤＮＡに約９０％を越える同一性を有する相補的な核酸に結合することを可能にする条件を意味する。好ましくは、適度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｔ）溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で４２℃でハイブリダイゼーションした後、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中で６５℃で洗浄するのと等価な条件である。
【００５６】
第３の態様によれば、上述の核酸を含むベクターが提供される。好ましくは、前記核酸を含む発現ベクターが提供される。この発現ベクターは好ましくは１つ以上の調節配列を含む。用語「発現ベクター」は一般に、ＤＮＡ（ＲＮＡ）配列からポリペプチド／タンパク質を発現するための、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはベクターを指す。発現ベクターは、（１）遺伝子発現において調節的役割を有する遺伝因子、例えばプロモータまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡへ転写され、タンパク質に翻訳される構造配列またはコード配列、ならびに（３）適切な転写開始配列および終結配列、のアセンブリを含む転写単位を含むことが可能である。酵母または真核生物の発現系で用いるための構造単位は、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質の細胞外分泌を可能にするリーダー配列を含んでいることが好ましい。あるいは、組換えタンパク質がリーダー配列または輸送配列なしで発現される場合、該タンパク質はアミノ末端にメチオニン残基を含みうる。この残基は、最終生産物を提供するために発現された組換えタンパク質から後で切断される場合もあれば切断されない場合もある。
【００５７】
好ましい実施形態によれば、ベクターはプラスミドベクターまたはウイルスベクターで
あり、好ましくはバキュロウイルス系または牛痘ウイルスベクター系である。別のウイルスベクター系が本発明において使用されてもよい。場合によって、ベクターの修飾が必要なこともある。さらなるウイルスベクターの例は、アデノウイルスおよびすべてのマイナス鎖ＲＮＡウイルス（例えば狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、ＲＳＶなど）である。
【００５８】
好ましい実施形態によれば、ベクターは、図６または配列番号５５で定義されるようなクローニングベクターｐＡＺＬ、あるいは上に定義されるようなそのバリアントである。このベクターは次の特性および利点：
１．高度な増幅（他のクローニングベクターより高い）
２．合成遺伝子を制御された継ぎ目のない構造とすることが可能（この能力を提供する他のベクターは知られていない）
を示す。
【００５９】
本発明の第４の態様は、上に定義されるようなベクターで形質転換された宿主を含む。宿主は原核細胞であってもよい。この場合、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が好ましい。
【００６０】
更に、宿主は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞または昆虫細胞であってもよい。
哺乳動物細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＨＥＨまたはＢＨＫ細胞であることが好ましい。
【００６１】
さらに、宿主細胞として酵母菌を使用すること、好ましくは出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）またはハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）を使用することが好ましい。
【００６２】
昆虫細胞としては鱗翅類の昆虫細胞が使用するのに好ましく、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来およびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来の細胞がより好ましい。最も好ましくは、昆虫細胞はＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ（商標）細胞である。
【００６３】
例えば細菌の系に関して、昆虫細胞発現系の１つの利点は、生産されたタンパク質がグリコシル化されることにより、微生物による分解の標的となるという事実にある。この特性は、例えば、医学の分野で、該シルクタンパク質が生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での使用を意図され、生体内で生分解されることが望まれる場合に重要でありうる。この特性は、縫合材料ならびに創傷の閉鎖および被覆システムにおいて特に適用を見出しうる。
【００６４】
宿主が植物細胞である場合は常に、該植物細胞は、タバコ、じゃがいも、トウモロコシおよびトマトに由来することが好ましい。
第５の態様によれば、スパイダーシルクタンパク質の凝集方法であって：
ａ）本明細書において定義されるような配向していないスパイダーシルクタンパク質を含んでいるタンパク質溶液を準備する工程と；
ｂ）工程ａ）で準備された溶液を凝集トリガーに曝露する工程と；
ｃ）沈殿したスパイダーシルクタンパク質を回収する工程と
を含む方法が提供される。
【００６５】
好ましくは、工程ａ）で使用されるスパイダーシルクタンパク質は、本明細書に示されたベクターまたは核酸を用いて上に定義されるような適切な宿主を形質転換し、適切な条
件の下でスパイダーシルク遺伝子を発現させることにより生産される。
【００６６】
凝集トリガーは、酸性化（好ましくはｐＨを約１にする）、リン酸カリウムおよび機械的ストレス（好ましくはタンパク質溶液を回転させて剪断力を加える）から選択されることが好ましい。トリガーの工程は、本発明の方法の実施にとって不可欠であることが判明した。
【００６７】
驚くべきことに、本発明者らによって、特に上記のトリガー要因が、特に産業上の観点から強く求められるスパイダーシルクタンパク質の凝集を増強することが示された。このことについては、以下の「結果」の章において言及する。「結果」の章では、本発明の組換えスパイダーシルクタンパク質に対するこれらのトリガー要因の影響について説明する。すなわち、各トリガー要因の影響は本発明の異なる組換えスパイダーシルクタンパク質の間で異なる可能性があるが、それらの生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）のトリガー要因が本発明の構成成分（すなわち反復領域および／または非反復領域）を含むすべての組換えタンパク質に対して予想外に高い影響を示すということは一般的な概念と見なすことが可能である。さらに、本明細書に提供される結果から、単一のトリガー要因だけでなくトリガー要因の組合せが本発明のスパイダーシルクタンパク質凝集の最良の方法に結びつく場合も考えられる。
【００６８】
しかしながら、留意すべきことは、本方法が本発明のスパイダーシルクタンパク質に限定されるものではなく、天然に存在するものであれ合成のものであれ利用可能な他のすべてのスパイダーシルクタンパク質にも適用可能であることである。
【００６９】
該方法は、工程ａ）で準備された、または工程ｃ）で回収された前記タンパク質を、適切な方法によってフィラメント、ナノ繊維および糸へと紡糸する工程を含むことがさらに好ましい。
【００７０】
この目的のために、当分野で周知の紡糸方法を使用可能である。例えば、スパイダーシルクタンパク質のドープ溶液を出糸突起（ｓｐｉｎｎｅｒｅｔ）から押し出させてバイオフィラメントを形成する。得られるバイオフィラメントは延伸または伸長させてもよい。分子の結晶構造およびアモルファス（不定形）構造がいずれもバイオフィラメント中に存在する場合は常に、延伸または伸長により、分子を配向させるのに十分なせん断応力が分子に加わり、分子をフィラメントの壁に対して一層平行にし、かつバイオフィラメントの引張強さおよび靭性を高めることになる。
【００７１】
該ドープ溶液は、１種類以上のクモ類由来の本発明の組換えシルクタンパク質および／または天然型シルクタンパク質、あるいはシルクを生産する別の属由来のシルクタンパク質、例えばクモ類およびカイコ（Ｂ．ｍｏｒｉ）由来のシルクタンパク質混合物を含みうる。最も好ましい実施形態では、シルクタンパク質はアメリカジョロウグモ（Ｎ．ｃｌａｖｉｐｅｓ）またはニワオニグモ（Ａ．ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）由来の牽引糸シルクおよび／または鞭毛状シルク、特にタンパク質ＭａＳｐＩ、ＭａＳｐＩＩ、ＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４およびＦｌａｇである。代替実施形態では、ドープ溶液は、シルクタンパク質および１つ以上の合成ポリマーまたは天然もしくは合成のバイオフィラメントタンパク質の混合物を含んでいる。
【００７２】
好ましくは、ドープ溶液は、少なくとも１％、５％、１０％、１５％（重量／容量（ｗ／ｖ））のシルクタンパク質である。より好ましくは、ドープ溶液は、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％または５０％（ｗ／ｖ）のシルクタンパク質である。好ましい実施形態では、ドープ溶液は本質的に純粋なスパイダーシルクタンパク質を含んでいる。好ましい実施形態では、ドープ液のｐＨはおよそ６．９である。
【００７３】
「ドープ溶液」とは、シルクタンパク質を含み、かつバイオフィラメントの形成またはフィルム成型のために押し出し可能な任意の液体混合物を意味する。ドープ溶液は、タンパク質モノマーに加えて、より高次の凝集物、例えば、二量体、三量体および四量体を含んでいてもよい。通常、ドープ溶液は、ｐＨ４．０−１２．０の水溶液であって４０％未満の有機物またはカオトロピック剤（ｗ／ｖ）を有する。好ましくは、ドープ溶液は有機溶媒またはカオトロピック剤を含まず、溶液の保存性、安定性または加工性を増強するための添加剤を含んでいてもよい。
【００７４】
「フィラメント」とは、ナノスケールの微視的な長さから１マイルまたそれ以上の長さまで、長さが不定の繊維を意味する。シルクは天然のフィラメントであり、一方、例としてナイロン（商標）およびポリエステルは合成フィラメントである。
【００７５】
スパイダーシルクタンパク質の繊維を紡糸する方法に関するさらに詳しい情報は、本願に援用される２００３年７月２４日公開の国際公開公報第０３０６００９９号パンフレット（カラツァス（Ｋａｒａｔｚａｓ）ら）に見出すことができる。
【００７６】
さらに、本発明のスパイダーシルクタンパク質はフィルムなどとして、つまり、紡糸工程の不要なスパイダーシルクタンパク質生成物として提供されてもよい。
フィルムを製造する手法のより詳細な説明については、実施例の章で言及する。
【００７７】
さらに、本発明の方法は、工程ａ）および／またはｃ）において精製法を含むことが好ましく、該精製法は、発現させたスパイダーシルクタンパク質を６０〜９０℃、好ましくは７０〜８０℃で加熱変性させた後に、６００〜１４００ｍＭ、好ましくは８００〜１２００ｍＭの硫酸アンモニウムを添加する工程を含む。
【００７８】
既に上記に説明したように、本明細書に定義されるタンパク質／糸は、バイオテクノロジーおよび／または医学の分野において、好ましくは創傷閉鎖システムもしくは創傷被覆システム、神経外科もしくは眼科手術で使用される縫合材料の製造に使用されうる。
【００７９】
さらに、タンパク質／糸は、置換材料、好ましくは人工軟骨または腱材料の製造に使用されることが好ましい。
さらに、本発明の糸／繊維は、医療用粘着ストリップ、皮膚移植材、置換靭帯および外科用メッシュなどの医療用デバイスの製造において；ならびに服地、防弾チョッキのライニング、包装用織物、バッグもしくは財布用ストラップ、ケーブル、ロープ、粘着性接着材、非粘着性接着材、ストラップ用材料、自動車のカバーおよび部分、航空機建造資材、全天候型素材、可撓性仕切材、スポーツ用品のような広範囲の商工業製品において；そして、実際、高い引張強さと弾性が所望の特性である繊維または織物のほとんどあらゆる用途において、使用することが可能である。その他の形態、例えばドライスプレー・コーティング、ビーズ状粒子における該安定な繊維生成物の適用性および用途、または他の組成物を含んだ混合物での使用も本発明によって企図される。
【００８０】
明らかなのは、本発明のスパイダーシルクタンパク質の最も好ましい適用が、服地（織物）および皮革、自動車のカバーおよび部品、航空機建造材料の製造および加工、ならびに紙の製造および加工にあることである。
【００８１】
本発明の組換えスパイダーシルクタンパク質をセルロースおよびケラチンおよびコラーゲンの製品に加えてもよく、したがって、本発明は、セルロース、ケラチンおよび／またはコラーゲンと本発明のスパイダーシルクタンパク質とを含んでなる紙またはスキンケアおよびヘアケア製品にも関する。本発明のタンパク質が組み込まれた紙およびスキンケア
およびヘアケア製品は、改善された特性、特に引張強さまたは引裂き強さの改善を示す。
【００８２】
さらに、本発明の組換えスパイダーシルクタンパク質は、織物および皮革製品のコーティングとして使用されることによって、コーティングを施した製品に安定性および耐久性を与えうる。該シルクタンパク質は、特に皮革製品のコーティングへの適用可能性を示すが、この場合、タンニングおよびタンニングの環境への悪影響を回避または少なくとも低減することが可能であるからである。
【００８３】
別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語はすべて本発明が関係する分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書において言及された全ての出版物、特許出願明細書、特許文献、および他の参照文献は、その全体が援用される。矛盾がある場合には、定義を含めて本願明細書に従うものとする。さらに、材料、方法および実施例は単なる例であって、限定されることを意図するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００８４】
ここで本発明を、実施例および添付の図面によりさらに説明する。
【実施例】
【００８５】
［実験手順］
材料
化学薬品はメルク社（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ）（ドイツ連邦共和国ダルムシュタット（Ｄａｒｍｓｔａｄｔ）所在）から入手し、そうでない場合には記載してある。ＤＮＡの操作および修飾は、以前に報告されているようにして（１９）実施した。制限酵素はニューイングランドバイオラボ（米国マサチューセッツ州ベヴァリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）所在）から、リガーゼはプロメガバイオサイエンシズ社（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）（米国カリフォルニア州サンルイスオビスポ（Ｓａｎ  Ｌｕｉｓ  Ｏｂｉｓｐｏ）所在）から入手した。ＤＮＡ精製はキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）（ドイツ連邦共和国ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）所在）のキットを使用して実施した。合成オリゴヌクレオチドはエムヴェーゲーバイオテクアーゲー（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）（ドイツ連邦共和国エーバースベルク（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）所在）から入手した。クローニング工程はすべて、ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ）（米国ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）所在）の大腸菌株ＤＨｌＯＢで実施した。
【００８６】
クローニングベクターｐＡＺＬの構造
ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩによって生成される粘着末端に相補的な粘着末端を備えたクローニングカセットを、２つの合成オリゴヌクレオチドＣＣ１（ＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＡＡＴＴＣＡＣＧＧＣＴＡＡＴＧＡＡＡＧＣＴＴＡＣＴＧＣＡＣ）（配列番号１８）およびＣＣ２（ＡＧＣＴＧＴＧＣＡＧＴＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＧＣＣＧＴＧＡＡＴＴＣＧＴＣＣＣＡＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＴＣ）（配列番号１９）をアニーリングすることにより作成した。アニーリングは、５０ｐｍｏｌ／μｌ（各々）のオリゴヌクレオチド溶液の温度を０．１℃／秒で９５℃から２０℃まで低下させることにより遂行した。ミスマッチな二本鎖は、７０℃で変性させた後でやはり温度を低下させて２０℃とした。２０℃‐７０℃‐２０℃のサイクルを１０回繰り返した後に、６５℃の変性温度で追加の１０サイクルを実施した。得られたクローニングカセットを、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化したｐＦａｓｔｂａｃ１ベクター（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、米国カリフォルニア州カールスバード（Ｃａｒｌｓｂａｄ）所在）とライゲーションした。いずれの制限酵素認識配列もこのクローニング工程で破壊された。得られた新しいクローニングベクターをｐＡＺＬと命名した。
【００８７】
ｐＡＺＬベクター内へのシルクのモジュールおよびＮＲ領域のクローニング
牽引糸シルクタンパク質ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４に由来する３つのアミノ酸モジュール（図１Ｅ）を細菌のコドン利用を考慮してＤＮＡ配列に逆翻訳した。対応する相補的ＤＮＡオリゴヌクレオチド、Ａ１（ＴＣＣＧＴＡＣＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＧＣＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＡＣＧＧＴＣＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＧ）（配列番号２０）およびＡ２（ＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＣＧＧＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＣＣＡＧＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＧＣＧＧＣＧＣＴＡＧＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＧＴＡＣＧＧＡＣＣ）（配列番号２１）、Ｑ１（ＴＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＧＣＣＣＧＧＧＴＣＡＡＣＡＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＴＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＡＧＧＧ）（配列番号２２）およびＱ２（ＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＧＣＴＧＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＴＧＴＴＧＡＣＣＣＧＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＡＣＣ）（配列番号２３）、Ｃ１（ＴＴＣＴＡＧＣＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＴＡＣＧＧＴＣＣＧＧＡＡＡＡＣＣＡＧＧＧＴＣＣＡＴＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＴＡＣＧＧＴＣＣＴＧＧＣＧＧＴＣＣＧＧＧ）（配列番号２４）およびＣ２（ＣＧＧＡＣＣＧＣＣＡＧＧＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＧＧＡＣＣＣＴＧＧＴＴＴＴＣＣＧＧＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＡＣＧＣＡＧＣＴＧＣＣＧＣＧＧＣＴＧＣＡＧＣＣＧＣＧＣＴＡＧＡＡＣＣ）（配列番号２５）を合成し、上述のようにアニーリングし、ＢｓｇｌおよびＢｓｅＲＩで消化したｐＡＺＬベクターとライゲーションした。スパイダーシルク遺伝子ａｄｆ−３（ｇｉ｜１２６３２８６）およびａｄｆ−４（ｇｉ｜１２６３２８８）のＮＲ領域（カナダ国バンクーバーのゴスリン教授（Ｐｒｏｆ．Ｇｏｓｌｉｎｅ）から入手）を、次のプライマー：ＮＲ３ｆ（ＧＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＧＧＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＴＧＴＡＴＣＴＧ）（配列番号２６）、ＮＲ３ｒ（ＧＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＧＣＣＡＧＣＡＡＧＧＧＣＴＴＧＡＧＣＴＡＣＡＧＡＴＴＧ）（配列番号２７）、ＮＲ４ｆ（ＧＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＣＡＴＡＴＧＧＣＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＣ）（配列番号２８）およびＮＲ４ｒ（ＧＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＧＣＣＴＧＡＡＡＧＡＧＣＴＴＧＧＣＴＡＡＴＣＡＴＴＴＧ）（配列番号２９）を使用してＰＣＲによって増幅した。
【００８８】
Ｆｌａｇの配列については、次のプライマーおよびカセットが使用できる：
ＰＣＲプライマー：
ＦＬＡＧ−Ｎ−ｃｈｒ−センス：（配列番号４３）
５’−ＧＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＣＧＡＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＧＡＴ−３’
ＦＬＡＧ−Ｎ−ｃｈｒ−アンチセンス：（配列番号４４）
５’−ＧＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＴＡＴＧＧＴＣＣ−３’
ＦＬＡＧ−Ｃ−ｃｈｒ−センス：（配列番号４５）
５’−ＧＡＡＡＡＡＣＣＡＴＧＧＧＴＧＣＴＴＡＴＴＡＴＣＣＴＡＧＣＴＣＧＣ−３’
ＦＬＡＧ−Ｃ−ｃｈｒ−アンチセンス：（配列番号：４６）
５’−ＧＡＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＡＧＣＣＡＴＡＡＧＣＧＡＡＣＡＴＴＣＴＴＣＣＴＡＣ−３’
カセット作製に使用した反復配列用のオリゴ：
モジュールＹ−（ＧＰＧＧＸ）−ｄｓ：（配列番号４７）
５’−ＴＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＣＴＡＴＧＧＴＣＣＧＧＧＣＧＧＴＴＣＴＧＧＧＣＣＧＧＧＴＧＧＣＴＡＣＧＧＴＣＣＴＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＣＣＣＧＧＧＴＧＧＣＴＡＣＧＧ−３’
モジュールＹ−（ＧＰＧＧＸ）−ｃｓ：（配列番号４８）
５’−ＧＴＡＧＣＣＡＣＣＣＧＧＧＣＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＡＧＧＡＣＣＧＴＡＧＣＣＡＣＣＣＧＧＣＣＣＡＧＡＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＡＧＣＣＡＣＣＴＧＧＧＣＣＣＧＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣ−３’
モジュールｓｐ−（スペーサー）−ｄｓ：（配列番号４９）
５’−ＴＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＴＣＡＴＴＧＡＡＧＡＴＣＴＧＧＡＣＡＴＣＡＣＴＡＴＴＧＡＴＧＧＴＧＣＧＧＡＣＧＧＣＣＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＧＣＴＧＡＣＣＡＴＣＧＧ−３’
モジュールｓｐ−（スペーサー）−ｃｓ：（配列番号５０）
５’−ＧＡＴＧＧＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＡＧＡＧＡＴＣＧＴＧＡＴＣＧＧＧＣＣＧＴＣＣＧＣＡＣＣＡＴＣＡＡＴＡＧＴＧＡＴＧＴＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＴＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＡＣＣ−３’
モジュールＫ−（ＧＰＧＧＡＧＧＰＹ）−ｄｓ：（配列番号５１）
５’−ＴＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＣＴＧＧＣＧＧＴＣＣＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＧＧＧＣＣＡＴＡＴＧＧＴＣＣＧＧＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＧＴＣＣＧＴＡＣＧＧ−３’
モジュールＫ−（ＧＰＧＧＡＧＧＰＹ）−ｃｓ：（配列番号５２）
５’−ＧＴＡＣＧＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣＡＴＡＴＧＧＣＣＣＡＣＣＴＧＣＧＣＣＡＣＣＡＧＧＧＣＣＧＴＡＣＧＧＡＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＡＣＣ−３’
モジュールＸ−（ＧＧＸ）−ｄｓ：（配列番号５３）
５’−ＴＧＧＣＧＣＴＧＧＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＧＧＣＧＣＡＧＧＴＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＣＧＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧ−３’
モジュールＸ−（ＧＧＸ）−Ｃｓ：（配列番号５４）
５’−ＧＧＡＡＣＣＧＣＣＣＧＣＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＣＣＴＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＣＧＣＣＡＣＣＡＧＣＧＣＣＡＣＣ−３’
ＰＣＲ生成物およびｐＡＺＬベクターを、ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した後でライゲーションした。ＰＣＲ生成物ならびに合成モジュールのクローニングによりクローニングカセットのスペーサーが置換されたが、その構成要素の配置構成は保持された。より効率的な翻訳のために、ＮＲ３およびＮＲ４において、大腸菌ではほとんど翻訳されないコドンＡＧＡ（Ａｒｇ）を、ＰＣＲ突然変異誘発（７９）を使用してＣＧＴ（Ａｒｇ）に変異させた。
【００８９】
合成スパイダーシルク遺伝子の構築
２つの遺伝子断片（例えば単一モジュール、モジュール多量体またはＮＲ領域）の接続は、クローニング戦略の基礎的なステップに相当した。この目的のために、指定の５’末端遺伝子断片を含んでいるｐＡＺＬベクターをＢｓａＩおよびＢｓｇＩで消化し、３’末端遺伝子断片を含む該ベクターをＢｓｅＲＩおよびＢｓａＩでそれぞれ消化した（図１Ｂ）。この適切なプラスミド断片のライゲーションにより、２つの遺伝子断片が接続され、その結果正しい構築物の特定を容易にするｐＡＺＬベクターのアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）が再構成された。
【００９０】
遺伝子の構築については、単一モジュールを最初に接続して反復単位を作製した（図１Ｄ＋図５）。これらを徐々に多量体化し、任意選択でＮＲ領域と連結した。最後に、合成遺伝子構築物ならびにＮＲ領域をＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩでｐＡＺＬベクターから切り出し、同様に消化した、Ｔ７タグ（ＭＡＳＭＴＧＧＱＱＭＧＲ）（配列番号３０）コード配列（２０）を提供する細菌の発現ベクターｐＥＴ２１ａ（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））とライゲーションした。すべての構築物の忠実度はＤＮＡ塩基配列決定により確認した。
【００９１】
遺伝子発現
シルクの遺伝子はすべて大腸菌株ＢＬＲ［ＤＥ３］（ノバジェン）中で発現させた。細胞をＬＢ培地中３７℃で増殖させてＯＤ６００＝０．５とした。１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）で誘導する前に、細胞を、（ＡＱ）１２、（ＡＱ
）１２ＮＲ３、（ＱＡＱ）８および（ＱＡＱ）８ＮＲ３の場合には３０℃、ならびにＣ１６、Ｃ１６ＮＲ４、ＮＲ３およびＮＲ４の場合は２５℃にそれぞれシフトした。あるいは、細胞を複合培地（２１）および流加培養技術（２２）を使用して発酵槽でＯＤ６００＝４０〜５０に増殖させた。この場合も同様に、１ｍＭのＩＰＴＧで誘導する前に細胞を２５℃または３０℃へそれぞれシフトした。（ＡＱ）１２、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＱＡＱ）８、（ＱＡＱ）８ＮＲ３、Ｃ１６およびＣ１６ＮＲ４を発現する細胞は誘導の３−４時後にハーベストし、ＮＲ３およびＮＲ４を発現する細胞は１６時間後にハーベストした。
【００９２】
タンパク質精製
細胞を、２０ｍＭのＮ−（２−（ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）ｐＨ７．５、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍｇ／ｍｌのリゾチーム（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）（米国ミズーリ州セントルイス所在））を含んでいる５ｍｌ／ｇのバッファーに再懸濁し、４０℃で３０分間インキュベートした。細胞を、ＨＤ／ＵＷ２２００／ＫＥ７６超音波破砕機（ドイツ連邦共和国ベルリン所在のバンデリン社（Ｂａｎｄｅｌｉｎ））を用いた超音波処理によって溶解し、細胞溶解物を０．１ｍｇ／ｍｌのデオキシリボヌクレアーゼＩ（ドイツ連邦共和国マンハイム所在のロッシュ（Ｒｏｃｈｅ））および３ｍＭのＭｇＣｌ２とともに４℃で６０分間インキュベートして、ゲノムＤＮＡを消化した。不溶性の細胞断片を、５０，０００×ｇ、４℃で３０分間沈殿させた。（ＡＱ）１２、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＱＡＱ）８、（ＱＡＱ）８ＮＲ３、Ｃ１６およびＣ１６ＮＲ４を含んでいる溶解物の可溶性大腸菌タンパク質を、８０℃で２０分間加熱変性して沈殿させ、ＮＲ３およびＮＲ４を含んでいる溶解物は７０℃で同じ時間加熱した。沈殿したタンパク質を、５０，０００×ｇで３０分間沈降させて除去した。加熱変性の間可溶性を維持していたシルクタンパク質を、室温で２０％硫酸アンモニウム（８００ｍＭ）（（ＡＱ）１２、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＱＡＱ）８、（ＱＡＱ）８ＮＲ３、Ｃ１６およびＣ１６ＮＲ４）または３０％硫酸アンモニウム（１２００ｍＭ）（ＮＲ３およびＮＲ４）で沈殿させ、１０，０００×ｇで１０分間遠心分離してハーベストした。（ＡＱ）１２、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＱＡＱ）８、（ＱＡＱ）８ＮＲ３、ＮＲ３およびＮＲ４のペレットを、沈殿に使用したのと同じ濃度の硫酸アンモニウムを含む溶液ですすぎ、６Ｍの塩化グアニジン（ＧｄｍＣｌ）に溶解した。一方、Ｃ１６およびＣ１６ＮＲ４は８Ｍ尿素で洗浄し、６Ｍのチオシアン酸グアニジン（ＧｄｍＳＣＮ）に溶解した。全てのタンパク質を１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３に対して透析した。透析中に形成された沈殿を、５０，０００×ｇで３０分間沈降させて除去し、残った可溶性シルクタンパク質を凍結乾燥した。分析に先立って、凍結乾燥したタンパク質を６ＭのＧｄｍＳＣＮに溶解してから適切なバッファーに対して透析した。１２５，０００×ｇで３０分間沈降させて凝集物を除去した。タンパク濃度は、光路長１ｃｍのキュベット中で、消光係数計算値（表１）（２３）を使用して２７６ｎｍで測光により決定した。タンパク質の同一性は、硫酸ドデシルナトリウム‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；＞２０ｋＤａのタンパク質については１０％トリス‐グリシンゲル、＜２０ｋＤａのタンパク質については１０〜２０％のトリス−トリシンゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を実施した後にポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）メンブレン（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国マサチューセッツ州ビレリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ）））にブロッティングし、一次抗体としてマウス抗Ｔ７モノクローナル抗体（ノバジェン、１：１０，０００）および二次抗体として抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼ共役抗体（シグマ・ア��ドリッチ、１：５，０００）を使用して検出することにより確認した。ペルオキシダーゼ活性を、アマシャムバイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（米国ニュージャージー州ピスカタウェイ））のＥＣＬｐｌｕｓ（商標）ウエスタンブロット検出キットを使用して視覚化した。
【００９３】
蛍光
蛍光スペクトルは、ＦｌｕｏｒｏＭａｘ（Ｒ）分光蛍光計（ジョバンイボン社（Ｊｏｂ
ｉｎ  Ｙｖｏｎ  Ｉｎｃ．）、米国ニュージャージー州エジソン）で記録した。スペクトルは、室温で１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中でタンパク質濃度１００μｇ／ｍｌとして測定した。積分時間は１秒、ステップサイズは０．５ｎｍ、帯域幅はそれぞれ５ｎｍ（励起）および５ｎｍ（発光）とした。
【００９４】
二次構造分析
遠紫外線円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルは、温度調節装置を装備したＪａｓｃｏ７１５型分光旋光計（ジャスコインターナショナル株式会社（Ｊａｓｃｏ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）、日本国東京）を使用して得られた。スペクトルはすべて、光路長０．１ｃｍの石英キュベットで、５ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中でタンパク質濃度１５０μｇ／ｍｌとして２０℃で測定した。スキャン速度を２０ｎｍ／分とし、ステップサイズを０．２ｎｍとし、積分時間を１秒にセットし、帯域幅は１ｎｍとした。４回のスキャンを平均してバッファーで補正した。熱転移は２２０ｎｍで１℃／分の加熱／冷却変化率として分析した。
【００９５】
溶解度分析
可溶性タンパク質の最大濃度を決定するために、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１ｍｇ／ｍｌ（＝０．１％（ｗ／ｖ））の溶液を、カットオフ分子量１０，０００Ｄａのポリエーテルスルホンメンブレン（ビバサイエンス・アーゲー（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＧ）、ドイツ連邦共和国ハノーバー）を使用して限外濾過によって濃縮した。タンパク質が沈殿し始めるまで、該溶液から異なる間隔でサンプルを採取した。サンプルを１０ｍＭトリス（ｐＨ８．０）で希釈して測光分析によりタンパク濃度を決定した。
【００９６】
凝集分析
すべてのサンプルを、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ（ｐＨ８．０）中の１ｍｇ／ｍｌに調節した。シルクタンパク質の凝集に対するイオンの影響を試験するために、塩を加えて終濃度３００ｍＭとした。酸性化の影響は、ＨＣｌを加えて終濃度１００ｍＭ（ｐＨ＝１）とすることにより調査した。サンプルはすべて室温で１時間インキュベートした。１２５，０００×ｇで２５分間沈降させることによって、すべてのサンプルからタンパク質沈殿物を取り除き、残った可溶性タンパク質の量を測光分析により決定した。可溶性タンパク質および凝集タンパク質の合計は最初の可溶性タンパク質の量と等しいはずので、最初に用いたタンパク質の量から可溶性タンパク質の量を差し引くことにより、凝集タンパク質の割合（％）を計算することができた。
【００９７】
［結果］
シルク様タンパク質を設計するためのクローニング戦略
遺伝子の一部が細菌中で効率的に翻訳されないコドンを含んでいるので、細菌宿主において天然型のスパイダーシルク遺伝子を発現させるのは非能率的である（２４）。さらに、ＰＣＲによる遺伝子操作および遺伝子増幅は、シルクの反復性により困難である。スパイダーシルクタンパク質の特性を調査するために、対応する発現用宿主に適したコドン利用の合成ＤＮＡモジュールを使用するクローニング戦略が用いられてきた。スパイダーシルクの反復領域に似たタンパク質をコードする合成遺伝子が得られている（２５−２８）。重要なことには、これらのタンパク質の設計はいずれも、すべての牽引糸シルクに見出されるカルボキシル末端ＮＲ領域を含んでいなかった。
【００９８】
本発明者らは、様々な合成ＤＮＡモジュールならびに天然型遺伝子断片を制御して組み合せることを可能にする、継ぎ目のない（シームレスの）クローニング戦略（２９）を開発した。合成遺伝子のプレースホルダーとして作用するスペーサーと、制限酵素ＢｓｅＲＩおよびＢｓｇＩの認識部位とを備えたクローニングカセットを含むクローニングベクタ
ーｐＡＺＬを設計した（図１Ａ）。これらの酵素の認識部位および切断部位が８ヌクレオチド（ＢｓｅＲＩ）あるいは１２ヌクレオチド（ＢｓｇＩ）離れているので、翻訳開始コドンおよび停止コドンならびに組み立てた遺伝子の切り出しに必要な追加の制限酵素切断部位を、前記スペーサーに近接して配置することが可能であった。
【００９９】
最初のクローニング工程で、ｐＡＺＬのスペーサー領域を、合成したＤＮＡモジュール（モジュールの設計については以下を参照のこと）で置き替えた。続いて、部位特異的な方法（材料および方法および図１Ｂを参照）で２つのモジュールを連結することができた。ＢｓｇＩとＢｓｅＲＩによる切断で生じた相補的な一本鎖の３’延長部分であるＧＧ（センス鎖）およびＣＣ（アンチセンス鎖）を、２つのモジュールの接続のために使用した（図１Ｃ）。したがって、２つのモジュールを連結するのに必要なＤＮＡ塩基配列は、グリシン・コドン（ＧＧＸ）に限定された。グリシンは、スパイダーシルクタンパク質において元来豊富であり（〜３０％）、したがって、翻訳後に天然型のアミノ酸配列と一致する制限酵素認識部位を探索する必要なくモジュールを設計することが可能であった。クローニングカセットの構成要素の配置構成はクローニングおよび多量体化の際に変化しないので、様々なモジュールの組合せを構築することが可能であった（図１Ｄ）。
【０１００】
合成スパイダーシルクの設計、合成および精製
本発明者らは、合成構築物の鋳型としてニワオニグモＡｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来の牽引糸シルクタンパク質ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４（３）を選択した。部分的に同定されたＡＤＦ−３の一次構造は、大部分は反復単位で構成されており、該反復単位はいずれもポリアラニンモチーフを含む共通配列を含んでなる。個々の反復単位の長さはモチーフＧＰＧＱＱの数を変えることにより決定される。ＡＤＦ−３の反復配列を模倣するために、本発明者らは２つのモジュールを設計した。Ａと名付けた１つのモジュールは、ポリアラニンを含む共通配列に由来するものとした（図１Ｅ）。別のモジュールはＱと名付け、ＧＰＧＱＱモチーフが４回繰り返したものを含めた。異なる長さの反復単位を研究するために、１つあるいは２つのＱモジュールを１つのＡモジュールと組み合わせて（ＡＱ）または（ＱＡＱ）を得た。これらの反復単位を多量体化して、反復タンパク質（ｒｅｐタンパク質）（ＡＱ）１２および（ＱＡＱ）８をコードする合成遺伝子を生成させた。
【０１０１】
ＡＤＦ−４の反復部分は一般に、変異のごく少ない保存的な単一反復単位で構成されている。本発明者らはこれらの変異を組み合わせて、１つの共通モジュールを設計してＣと名付け（図１Ｅ）、該モジュールを多量体化してｒｅｐタンパク質Ｃ１６を得た。すべての合成遺伝子におけるモジュールの繰り返し数を、同程度の分子量（〜５０ｋＤａ）のタンパク質をコードするように選択した。
【０１０２】
ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４はいずれもそのカルボキシル末端に、それぞれ１２４および１０９アミノ酸からなる相同的なＮＲ領域を示す。これらの領域をコードする遺伝子配列をＰＣＲによって増幅し、細菌での発現には問題のあるコドンを、部位特異的突然変異誘発（材料と方法を参照）によってより適切なコドンに変更した。したがって、すべての使用した合成遺伝子を適切な天然型ＮＲ領域と結合させて、ｒｅｐＮＲタンパク質（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＱＡＱ）８ＮＲ３およびＣ１６ＮＲ４をコードする遺伝子を生成させることが可能であった。さらに、ＮＲ３およびＮＲ４を単独で発現させることも可能であった。
【０１０３】
細菌で合成した後、シルクタンパク質を加熱工程に続いて硫安沈澱することによって精製した。タンパク質の同一性は、イムノブロッティングにより、すべてのシルクタンパク質のアミノ末端に結合しているＴ７ペプチドタグ配列に対する抗体を使用して確認した（図２Ａ）。すべてのｒｅｐタンパク質およびすべてのｒｅｐＮＲタンパク質が同程度の分
子量を有していた（表１）が、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに供すると異なる移動速度を示した。この結果は、アミノ酸組成の違いに起因する硫酸ドデシルの該タンパク質への結合の違いにより、タンパク質の総電荷の変化がもたらされることが原因かもしれない。イムノブロッティングにより、完全長タンパク質に加えて、ｒｅｐＮＲタンパク質調製物中の分子量の低い微量のタンパク質が見出された。これらのタンパク質に抗Ｔ７タグ抗体が結合したことから、該タンパク質はカルボキシル末端部分が欠損しているシルクタンパク質であることが確認された。各精製タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび銀染色法によって分析したところ、すべてのタンパク質調製物において別のタンパク質は検出されなかった（図２Ｂ）。タンパク質純度を、蛍光発光の測定によりさらに測定した。波長２８０ｎｍの入射光はチロシンとトリプトファンの励起および蛍光発光をもたらし、一方２９５ｎｍの光は専らトリプトファンを励起する。設計したスパイダーシルクタンパク質はいずれもトリプトファンを含まないので、２９５ｎｍで励起した際の蛍光発光は、平均１．５％のトリプトファンを含んでいる（３０）大腸菌タンパク質の混入を示すことになる。すべてのシルクタンパク質調製物の蛍光測定により、シルクタンパク質中に豊富に存在するチロシンのスペクトルと同種の発光スペクトルが示された。対照的に、トリプトファンの蛍光は検出されず、該タンパク質調製物が高純度であることが示された（データをＣ１６ＮＲ４について図２Ｂに典型的に示す）。
【０１０４】
エルレンマイヤーフラスコにおける合成シルクタンパク質の細菌による生産で、すべての構築物について同様のタンパク質を生成させた。個々の調製物の収率は、培地１リットル当たり精製タンパク質１０〜３０ｍｇの範囲であった。タンパク質合成のスケールアップの可能性を調査するために、細胞の発酵を用いた。こうして、（ＱＡＱ）８ＮＲ３およびＣ１６ＮＲ４の収率をそれぞれ１４０ｍｇ／ｌおよび３６０ｍｇ／ｌに増大させることができた。
【０１０５】
ｒｅｐＮＲタンパク質は、あまり構造化していない反復性領域と高度に構造化した非反復ドメインとで構成される
二次構造をＣＤ分光法によって調査した。ｒｅｐタンパク質は、本質的に構造化しないタンパク質に典型的なスペクトルを示した。対照的に、ＮＲタンパク質は高い二次構造含有率を示すスペクトルを示した。これらの領域は、独立にフォールディングするタンパク質ドメインを表わすように見える。ｒｅｐＮＲタンパク質のスペクトルは、ｒｅｐＮＲタンパク質中での占有率によって重み付けされたｒｅｐスペクトルおよびＮＲスペクトルの組合せにほぼ相当した。相互に連結された際のｒｅｐ領域またはＮＲドメイン内の小さな構造変化は排除できないが、ｒｅｐＮＲタンパク質は、主としてランダムコイル構造を示す領域およびカルボキシル末端の折りたたまれた（フォールディングした）タンパク質ドメインで構成されている。特筆すべきことに、ｒｅｐＮＲタンパク質のスペクトルは、クモ（アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ））から直接抽出された大瓶状（ｍａｊｏｒ  ａｍｐｕｌｌａｔｅ）シルクドープから得られたＣＤスペクトルに類似していた（９）。
【０１０６】
シルクタンパク質は熱変性および化学変性の後でリフォールディングする
加熱の際にＣＤ分光法によって構造変化を調査すると、２０℃〜９０℃ではｒｅｐタンパク質について協同的な熱転移は観察されなかった。協同的な熱転移は本質的にアンフォールディングしている他のタンパク質についても観察されている効果である（３１；３２）（図３）。ｒｅｐＮＲタンパク質は少なくとも部分的に構造化しているので、高温では該構造化領域の熱によるアンフォールディングが検知できるはずである。結果的に、協同的な熱転移が観察された。熱転移の中間点は、それぞれ６７℃（（ＱＡＱ）８ＮＲ３）、６６℃（（ＡＱ）１２ＮＲ３）および７２℃（Ｃ１６ＮＲ４）であった（図３Ｂおよび表１）。さらに、熱転移はすべて完全に可逆的であった。加熱時の構造変化の可逆性から、タンパク質精製中に使用された加熱工程の後で可溶性のシルクタンパク質が高回収率で得
られたことが説明付けられた。トリスは、分光特性が良いことやシルクタンパク質の凝集を促進しにくいことから、ＣＤ分光法によって測定した全ての溶液の緩衝剤として使用した。トリス緩衝液の強い温度依存性により、サンプルのｐＨは２０℃から９０℃まで加熱する際にｐＨ８からｐＨ６へと変化することが予想された（１９）。しかしながら、温度非依存的なｐＫ値を示すｐＨ８のリン酸緩衝液中のシルクタンパク質の熱転移は、恐らくタンパク質凝集が原因で完全に可逆的ではなかったが（以下を参照）、等しい中間点温度（データは示さない）を示した。このことから、シルクタンパク質の熱転移が、熱により引き起こされたトリス緩衝液のｐＨ変化による影響を受けないことが示された。
【０１０７】
二次構造に対する化学的な変性および再生の影響について、６ＭのＧｕａＨＣｌに対する透析およびトリス緩衝液に対する透析による再生の後で、トリス緩衝液中でｒｅｐＮＲタンパク質の円偏光二色性を測定することにより調査した。初期およびリフォールディングしたタンパク質のスペクトルが同一であることから、化学的変性が可逆的であることが示された（データは示さない）。
【０１０８】
シルクタンパク質の溶解度は該タンパク質の反復配列によって決まる
ドープ中で高いタンパク濃度を獲得するためには、シルクタンパク質は高度に可溶性でなければならない。本発明者らは、溶解度を決定する一次構造の構成要素を特定するために、ｒｅｐタンパク質およびｒｅｐＮＲタンパク質が可溶性を維持する最大濃度を試験した。モジュールＡおよびＱを含む全てのタンパク質が、ＮＲドメインの存在とは無関係に、眼に見える凝集物の形成を伴わずに限外濾過によって３０％（ｗ／ｖ）超まで濃縮することが可能であった。対照的に、モジュールＣを含むタンパク質は、それぞれ８％（ｗ／ｖ）（Ｃ１６）および９％（ｗ／ｖ）（Ｃ１６ＮＲ４）までしか濃縮できなかった（表１）。いずれのタンパク質もさらに濃縮するとゲル様の固体を形成した（データは示さない）。したがって、シルクタンパク質の溶解度は、その反復配列によって専ら決定され、ＮＲドメインによる影響は受けなかった。
【０１０９】
カリウムは、合成シルクタンパク質の凝集を、その一次構造に関わらず促進しない
ｐＨ、カリウムやリン酸のようなイオン、および機械的ストレスが、天然のシルクのアセンブリに関与する。ここで、本発明者らは、これらの要因が合成シルクタンパク質のアセンブリをどのように促進するか調査したいと考えた。液晶ドープに見出されるような関連タンパク質の予備的配向を要する天然のアセンブリ過程（３３）を真似ることはできないので、本発明者らは配向秩序を示さないタンパク質溶液から始めて凝集分析を行なった。試験したｒｅｐタンパク質、ｒｅｐＮＲタンパク質およびＮＲタンパク質はいずれも緩衝液中でインキュベートしても有意な凝集を示さず（＜５％）、全てのタンパク質が試験条件では本質的に可溶性であることが示された（図４）。イオンの添加がイオン強度の増大による凝集を引き起こすかどうか調べるために、タンパク質を塩化ナトリウムとともにインキュベートした。しかしながら、凝集は観察されなかった。ナトリウムとは対照的に、カリウムはシルクの凝集を特異的に促進することが以前に報告されている（３４）。しかし、塩化カリウムも、合成シルクタンパク質の溶解度に対する影響を示さなかった（図４）。
【０１１０】
酸性化およびリン酸塩の添加は、ｒｅｐタンパク質の一次構造に依存して該タンパク質の凝集を開始させる
スパイダーシルクのアセンブリの際の酸性化の正確な機能はまだ決定されていない。しかしながら、負に荷電した基（例えばホスホリル基）がプロトン化されてスパイダーシルクタンパク質の総電荷および斥力が低下することはありそうに見える。合成シルクタンパク質が紡糸プロセス中に観察されたｐＨ変化の範囲内のｐＫＡ値を示す化学基を含んでいなかったので、本発明者らは末端および側鎖のカルボキシル基すべてをプロトン化することによりこの効果を模倣することを目指した。末端カルボキシル基しかない（ＱＡＱ）８
および（ＡＱ）１２は、凝集を示さない（＜５％）かまたはｐＨ１で弱い凝集（１８％）を示した。興味深いことに、Ｃ１６の１６個のグルタミン酸残基のプロトン化もごく弱い凝集（８％）を引き起こした（図４）。紡糸プロセスの際にドープに加えられると報告されているリン酸塩は、（ＱＡＱ）８の凝集は引き起こさず、Ｃ１６の弱い沈殿（１２％）を引き起こした。対照的に、（ＡＱ）１２は、リン酸カリウム処理の後で凝集しやすい傾向の増大（４７％）を示した。同様の結果がリン酸ナトリウムを用いて得られ、この効果がリン酸イオンによって特異的に引き起こされることが示された（データは示さない）。
【０１１１】
ＮＲドメインは、凝集を促進する要因に対する反応を増幅する
ＮＲドメインの影響を調べるために、低ｐＨおよびリン酸塩処理時のｒｅｐＮＲタンパク質ならびにＮＲタンパク質の凝集について試験した。（ＱＡＱ）８ＮＲ３および（ＡＱ）１２ＮＲ３、ならびにＮＲ３の酸性化により、弱い凝集（１０％、１５％および１３％）が引き起こされたが、その凝集は対応するｒｅｐタンパク質が示した範囲内にあった。興味深いことに、ＮＲ４ドメインはｐＨ１で沈殿しなかったが（０％）、Ｃ１６ＮＲ４はｐＨ１で強い凝集を示した（７０％）。したがって、反復性のＣ１６と、酸性化では有意に凝集しなかったＮＲ４ドメインとの組合せが、この凝集促進要因に対する感度の高いタンパク質をもたらした。同様の結果はリン酸塩の添加についても得られた。ＮＲ３もＮＲ４もリン酸塩の存在下で凝集を示さなかった（１％および０％）が、ＮＲドメインを反復領域に付加することにより、ｒｅｐＮＲタンパク質の凝集はｒｅｐタンパク質に比べて増大した（（ＱＡＱ）８ＮＲ３：５７％、（ＡＱ）１２ＮＲ３：８１％、Ｃ１６ＮＲ４：８０％）。
【０１１２】
継ぎ目のない、制御されたＤＮＡモジュールのアセンブリを可能にするクローニング戦略を使用して、スパイダーシルク様タンパク質をコードする合成遺伝子が構築された。タンパク質の設計により、反復単位と天然型ＮＲ領域との様々な組合せを生産して、そのような単一の一次構造要素の特性を系統的に試験した。ＣＤ分光法による構造分析から、反復領域が可溶状態ではほとんど非構造化しており、他の本質的にアンフォールディングしたタンパク質に共通する特性（３１；３２）を示すことが明らかとなった。同じ構造状態が、反復タンパク質配列を特徴とする大瓶状部含有物の大部分について提示されている（１０）。対照的に、ＮＲ領域は、熱変性ならびにカオトロピック剤処理の後でもその構造をとる、独立にフォールディングするタンパク質ドメインに相当することが分かった。ＮＲ領域は反復領域と比較して相対的に大きさが小さいため、ｒｅｐＮＲにおいて、構造全体の特性に対する影響は小さかった。
【０１１３】
数百ｋＤａの反復領域を示す天然のスパイダーシルクでは、ＮＲ領域の構造上の寄与はさらに小さいと予想することが可能であり、このことは大瓶状部含有物の研究においてＮＲ領域の存在の証明がないことを説明するものである。ｒｅｐＮＲタンパク質の熱変性および化学変性の可逆性、ならびに本研究で提示する天然シルクドープ液から得られたＣＤデータの類似性から、精製および試料調製の際に熱やカオトロピック剤で処理した後でも、水溶液中の調べた全てのスパイダーシルク構成成分がドープ液内の天然シルクタンパク質に匹敵する構造状態にあったと仮定することが可能である。
【０１１４】
ウベルスキー（Ｕｖｅｒｓｋｙ）らによれば、タンパク質の本質的なアンフォールディングは該タンパク質の総電荷および平均的疎水性親水性指標に基づいて予測することが可能である。タンパク質の総電荷は、「境界の」疎水性親水性指標を計算するために使用される。タンパク質の平均的疎水性親水性指標が「境界」値未満である場合、該タンパク質は本質的にアンフォールディングすると予測される（３５；３６）。提示した結果に従えば、反復配列（ＱＡＱ）８および（ＡＱ）１２は本質的にアンフォールディングしていると予測される（表１）。タンパク質の本質的なアンフォールディングとは、周囲の溶剤とアミノ酸残基との相互作用が、同じもしくは他のポリペプチド鎖のアミノ酸との相互作用
よりも有利であることを意味する。従って、（ＱＡＱ）８および（ＡＱ）１２は高濃度でも可溶である。これに対し、Ｃ１６は、境界値よりわずかに高い疎水性親水性指標を示す。本質的にアンフォールディングしたタンパク質の特性をさらに示す一方、ポリペプチド鎖間の相互作用が高濃度では一層有利となり、タンパク質の凝集をもたらし、結果として（ＱＡＱ）８および（ＡＱ）１２と比較してより低い溶解度となる（表１）。
【０１１５】
反復配列はスパイダーシルクタンパク質の中で大部分を構成するので、反復配列が該タンパク質の特性の多くを決定すると思われる。従って、ｒｅｐＮＲタンパク質の溶解度は、ｒｅｐタンパク質と著しくは異ならない。（ＱＡＱ）８および（ＡＱ）１２の溶解度および計算上の疎水性親水性指標は、天然型のＡＤＦ−３の値とよく相関する（表１）。Ｃ１６およびＡＤＦ−４はいずれも比較的低い溶解度を示すが、Ｃ１６はＡＤＦ−４のような本質的な高度の不溶性は共有しない。この違いは、ＡＤＦ−４がＣ１６に比べて疎水性親水性指標が高く、総電荷が低いことにより説明することが可能である。
【０１１６】
反復領域とは対照的に、ＮＲドメインはスパイダーシルクタンパク質のごく一部分に相当する。ＮＲドメインはいずれもαへリックスに富んだ構造を示す。ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４のＮＲドメイン間の高い類似性（類似性８１％および同一性６７％）から、両方とも関連する機能を果たすと仮定することができる。生体内でシルクタンパク質のアセンブリを引き起こすことが知られている要因で処理してシルクタンパク質の凝集について調べると、ＮＲドメインの機能に関するさらに詳しい情報が得られた。シルクタンパク質のカルボキシル基のプロトン化によって陰性荷電を低減すると、Ｃモジュールを含むタンパク質に主として影響すると予想された。従って、モジュールＡおよびＱで構成された、アスパラギン酸またはグルタミン酸を含んでいないタンパク質は、弱い凝集しか示さなかった。Ｃ１６は、その１６個の陰性荷電を中和した後でもほとんど可溶のままだった。驚くべきことに、単独では酸性化に対して何ら反応を示さなかったＮＲ４ドメインと、弱い凝集を示すＣ１６とを組み合わせると、プロトン化に対する感度の高いタンパク質となった。したがって、反復領域の電荷の低減およびＮＲドメインの存在が効率的な凝集に必要である。同様の結果は、リン酸塩をタンパク質溶液に加えると得られた。他のリオトロピック・イオンのように、リン酸塩は、水の表面張力を増加させて疎水的相互作用を促進することが知られている（３７）。スパイダーシルクタンパク質の場合には、リン酸塩の添加により、疎水性のポリアラニンモチーフ間の相互作用が生じ、その結果タンパク質の凝集を引き起こすようである。従って、（ＡＱ）１２の凝集は、（ＡＱ）１２より３分の１だけポリアラニンモチーフが少ない（ＱＡＱ）８よりも高かった。しかしながら、ポリアラニンモチーフが最も長く最も数の多いＣ１６は、リン酸塩で処理しても最大の凝集を示さなかった。この予想外の結果についての可能な説明としては、負に荷電したグルタミン酸側鎖およびリン酸イオンの斥力により、周囲の溶媒から排斥され、かつリオトロピックな作用が弱まることが考えられる。両方のＮＲドメインがリン酸塩の添加に応答したとは限らないが、ｒｅｐタンパク質へのＮＲドメインの付加により、リン酸塩に対する感度が大きく増大した。提示したデータは最終的な結論を引き出すのには十分ではないが、凝集促進要因に対する感度の非特異的なエンハンサーとしてＮＲドメインが機能することはありそうである。効率的な凝集に関して、ＮＲドメインの存在は、反復領域がこれらの要因に応答する能力と同じくらい重要である。
【０１１７】
この増強のメカニズムには、シルクタンパク質のオリゴマー状態の変化が関与している可能性がある。ＮＲドメインは、ジスルフィドで架橋された二量体を形成することが見出されている（３８）。さらにオリゴマー化すると、分子間相互作用の形成を促進する溶媒条件によって支援された凝集の開始に必要な、ポリペプチド配列の局所濃度の増大に結びつく可能性が考えられる。
【０１１８】
合成反復配列を天然型のＮＲ領域と組み合わせる本発明のタンパク質工学的手法は、天
然型のシルクタンパク質に非常によく似ているタンパク質を高収率で生産することが可能であることを明らかにするものである。容易にスケールアップすることが可能な、細菌の発現系ならびに簡単で安値な精製工程により、スパイダーシルク様タンパク質を資金効率良く工業規模生産するための基礎が提供される。本研究に基づいて、スパイダーシルクのアセンブリの分子メカニズムがさらに研究され、組換えタンパク質からシルク糸を人工的に紡糸し、バイオテクノロジーおよび医学のための新素材を獲得するのに必要な知見を得ることができよう。
【０１１９】
スパイダーシルク由来タンパク質のアセンブリ
次の実験は、スパイダーシルク配列ＡＤＦ−３（配列番号１）またはＡＤＦ−４（配列番号２）に由来するタンパク質をアセンブリさせて形態学的に別個の形態にすることが可能であることを実証するために行なわれた。タンパク質（ＡＱ）２４ＮＲ３およびＣ１６ＮＲ４を、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００４年、第４３巻、ｐｐ．１３６０４−１１３６２に記述されているように、構築し、生産し、水溶液に調製した。別途記載のないかぎり、タンパク質溶液には１０ｍＭトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）ｐＨ８．０が含まれていた。
【０１２０】
１．球体
０．２％（ｗ／ｖ）のＣ１６溶液に０．８Ｍの硫酸アンモニウムを加えることにより、直径０．５〜２μｍのタンパク質球体（図７ａ）が生成された。
【０１２１】
２．ナノ繊維
１％（ｗ／ｖ）のＣ１６ＮＲ４溶液を室温で２週間インキュベートすることにより、直径０．７〜４ｎｍのナノ繊維（図７ｂ）が形成された。
【０１２２】
３．ミクロフィブリル
ミクロフィブリルの形成については、５〜１０μｌの２５％（ｗ／ｖ）（ＡＱ）２４ＮＲ３溶液を、０．５Ｍのリン酸カリウムｐＨ８．０にゆっくり注入し、タンパク質溶液の安定な液滴を形成した。１分間のインキュベーションの後、このタンパク質滴を溶液からピンセットで取り出した。空気中でさらに１分間インキュベーションした後、別のピンセットを使用して、およそ２ｃｍ／秒の速度でタンパク質滴からタンパク質原繊維を取り出すことができた。この原繊維は、直径４μｍの円形の断面を示した（図７ｃ、ｄ）。
【０１２３】
４．発泡体
タンパク質の発泡体（図７ｅ、ｆ）は、２．５ｍＭのペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、１００μＭのトリス（２，２’−ビピリジル）ジクロロルテニウム（ＩＩ）（Ｒｕｂｐｙ）および１０％（ｗ／ｖ）の（ＡＱ）２４ＮＲ３または２％（ｗ／ｖ）のＣ１６ＮＲ４を含んでいる溶液から生成された。該タンパク質溶液を、空気を用いて発泡させた。得られた発泡体構造を安定させるために、タングステンランプの可視光に１分間曝露してタンパク質を架橋させた（プロトコール：ＰＮＡＳ、１９９９年、第９６巻、ｐｐ．６０２０−６０２４）。続いて発泡体を９５℃で乾燥させた。
【０１２４】
５．ゲル
濃度１％（ｗ／ｖ）のＣ１６ＮＲ４ナノ繊維は、撹拌または剪断力によって容易に崩壊しうるゲル様の外観を示した。該ゲルの機械的性質を改善するために、ＡＰＳおよびＲｕｂｐｙをゲル中に拡散させて、最終濃度１０ｍＭ  ＡＰＳおよび１００μＭ  Ｒｕｂｐｙとした。光により架橋を誘導した後（第４節を参照）、寸法の安定したゲルを得ることができた（図７ｇ）。
【０１２５】
６．フィルム
６．１  スパイダーシルクタンパク質の可溶状態
フィルムを成型するために、本発明者らは、ニワオニグモＡｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ由来の牽引糸シルクタンパク質ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４に由来する２つの合成シルクタンパク質、（ＡＱ）２４ＮＲ３およびＣ１６（さらなる説明については上記参照のこと）を使用した。本発明者らは、ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４ならびにその誘導体が溶解度およびアセンブリに関して著しく異なる挙動を示すという過去の観察に基づいて上記異なる２つのタンパク質を選択した。いずれのタンパク質の水溶液も、凍結乾燥されたタンパク質を６Ｍのチオシアン酸グアニジンに溶解した後、５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）のような低塩緩衝液に対し透析して塩を除くことによって調製することができた。凍結乾燥されたタンパク質をＨＦＩＰに直接溶解することもできた。タンパク質溶液の円偏光二色性（ＣＤ）の測定により、二次構造に対する２つの溶媒の影響が異なることが明らかとなった。水溶液中では、いずれのタンパク質も、主としてランダムコイル状のタンパク質を示す波長２００ｎｍ未満での単一の極小を備えたＣＤスペクトルを示した（図８）。対照的に、ＨＦＩＰ中の両タンパク質のスペクトルは、２０１〜２０２ｎｍで１つの極小、および２２０ｎｍで別の極小（（ＡＱ）２４ＮＲ３）またはショルダー（Ｃ１６）を示したが、このことはα−らせん含量の増大を示すものである（図８）。
【０１２６】
６．２  フィルム形成
フィルムは、２％（ｗ／ｖ）のタンパク質を含んでいるＨＦＩＰ溶液からポリスチレン表面上（またはＣＤ測定用石英ガラス上）で成型した。溶媒を蒸発させた後、（ＡＱ）２４ＮＲ３およびＣ１６はいずれも表面から容易に剥離しうる透明フィルムを形成した（図９および非表示データ）。溶媒が完全に蒸発し、タンパク質フィルムの密度がクモの牽引糸シルクについて報告されている値１．３ｇ／ｃｍ３と同一であると仮定すると、フィルムの厚さは０．５〜１．５μｍと算出された。いずれかのタンパク質で作製した鋳放しの（調製したての）フィルムは、水と接触させると溶解した。水に不溶であることがタンパク質フィルムのほとんどの用途についての前提条件であるので、本発明者らはフィルムを不溶性にするための加工方法を捜した。リン酸カリウムは、使用した該シルクタンパク質の凝集および化学的に安定な構造の形成を引き起こすことがわかっている。従って、１Ｍのリン酸カリウムで鋳放しフィルムを加工（インキュベート）した結果、フィルムは水に不溶な状態へと変換した。
【０１２７】
６．３  二次構造
タンパク質フィルムの構造上の特性を調べるために、その二次構造をＣＤ分光法によって調査した。鋳放しフィルムは、２０８ｎｍおよび２２０ｎｍに２つの極小を伴うスペクトルを示したが、これはα−らせん含量が高いことを示すものである（図１０）。１Ｍのリン酸カリウムで処理した後、フィルムはβシートに富む構造に典型的な２１８ｎｍで単一の極小を伴うスペクトルを示した。したがって、水溶性から水不溶性への移行は、タンパク質の二次構造がα−らせんからβシートへ変換するのと並行していた。
【０１２８】
６．４  化学的安定性
化学的安定性を試験するために、フィルムを８Ｍ尿素、６Ｍ塩酸グアニジンおよび６Ｍチオシアン酸グアニジンに曝露した（表２）。両タンパク質の鋳放しフィルムならびに（ＡＱ）２４ＮＲ３の加工フィルムは、これらの変性剤に可溶であった。これに対し、Ｃ１６の加工フィルムはチオシアン酸グアニジンにしか溶解できなかった。Ｃ１６フィルムのこの著しい化学的安定性は、組換え生産してアセンブリさせたＡＤＦ−４および天然牽引糸シルクの化学的安定性と同じである。前記の研究は、アセンブリ構造のアセンブリ特性および安定性をシルクタンパク質のアミノ酸配列と直接関連付けるものであった。したがって、スパイダーシルク・フィルムの特性は、対応するシルク遺伝子の操作によってシルクタンパク質の一次構造を変えることにより直接改良することが可能であると結論付けることができる。
【０１２９】
６．５  フィルムの改良
タンパク質フィルムの用途の多くは、フィルム表面上に特定の官能性が存在することを必要とする。本発明者らのスパイダーシルクタンパク質フィルムを、有機小分子ならびにタンパク質などの生体高分子で修飾することが可能であることを実証するために、発色体フルオレセインおよびβ−ガラクトシダーゼ酵素を加工Ｃ１６フィルムに化学的にカップリングさせた。カップリングは、表面に露出しているＣ１６のカルボキシル基を、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を使用して活性化することにより達成された（反応の詳細については、以降に示す補足資料を参照のこと）。その後、フィルムをエチレンジアミンとともにインキュベートしてアミドを形成させた。続いて、残存しているエチレンジアミンの遊離アミノ基を、フルオレセインイソチオシアネートとカップリングして、安定なチオ尿素誘導体の形成を介してフルオレセインと効率的に共有結合させた（図１１Ａ）。同様に、β−ガラクトシダーゼをＥＤＣで活性化したＣ１６フィルムとともにインキュベートして、Ｃ１６のカルボキシル基と、β−ガラクトシダーゼ表面のアクセス可能な（例えばリジン残基からの）第一アミンとの間のアミド結合を形成させた。この修飾フィルムを繰り返し洗浄した後、基質として５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を使用して、β−ガラクトシダーゼ活性を検出することができた（図１１Ｂ）。
【０１３０】
６．６  結論
本明細書において、合成スパイダーシルクタンパク質からタンパク質フィルムが得られることを実証することができた。最初は水溶性であったフィルムは、リン酸カリウムで処理することにより、多くの用途についての主たる必要条件である水への不溶性を獲得することが可能である。２つの異なる合成スパイダーシルクタンパク質から作製されたフィルムの化学的安定性の比較から、フィルムの特性はタンパク質の一次構造に基づいていることが示唆される。したがって、特定の性質を示すフィルムを形成するシルクタンパク質を生成させることが可能であろう。様々な機能性分子をフィルム表面に共有結合させることが可能であるので、今後は種々様々な技術的用途または医学的用途を検討することが可能である。
【０１３１】
６．７  補足資料および結果
タンパク質溶液の調製
すでに記述したようにしてタンパク質の生産および精製を実施した。（ＡＱ）２４ＮＲ３およびＣ１６の水溶液を得るために、凍結乾燥されたタンパク質を、６Ｍのチオシアン酸グアニジンに溶解して濃度１０ｍｇ／ｍｌとし、続いて５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）に対して透析した。１５，０００×ｇで１０分間沈降させて凝集物を除去した。タンパク濃度は、光路長１ｃｍのキュベット中２７６ｎｍでの測光分析により、（ＡＱ）２４ＮＲ３については７３９５０のＭ−１ｃｍ−１およびＣ１６については４６４００Ｍ−１ｃｍ−１の理論上の消光係数を使用して決定した。あるいは、凍結乾燥されたシルクタンパク質を、ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に直接溶解した。
【０１３２】
二次構造分析
遠紫外線円偏光二色性（ＣＤ）スペクトルを、Ｊａｓｃｏ  ７１５型分光旋光計（Ｊａｓｃｏインターナショナル株式会社（日本国東京））を使用して得た。可溶性タンパク質のスペクトルは、５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）中またはＨＦｌＰ中でタンパク濃度２００μｇ／ｍｌとして、光路長０．１ｃｍの石英キュベットで２０℃にて測定した。フィルムの測定については、２ｍｇ／ｍｌのＨＦＩＰ中タンパク質溶液１００μｌを、４ｃｍ２の平坦な石英グラス上に広げ、ＣＤ測定の前に空気乾燥させた。走査速度を２０ｎｍ／分、ステップサイズを０．２ｎｍとし、積分時間は１秒にセットし、帯域幅は１ｎｍとした。４回のスキャンを平均した。
【０１３３】
フィルムの修飾
１．Ｃ１６フィルム表面へのフルオレセインのカップリング
ＨＦＩＰ中の２０ｍｇ／ｍｌのＣ１６を、２４ウェルプレートの底に１ウェルあたり１５μｌ塗り拡げることによってフィルムを調製した。ＨＦＩＰを蒸発させた後、フィルムを１Ｍのリン酸カリウムとともに５分間インキュベートした。水ですすいだ後、１００ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ５．０）、１００ｍＭ  １−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）および２０ｍＭ  Ｎ−ヒドロキシスルホ−スクシンイミド（ＮＨＳ）とともに１５分間インキュベートすることによってカルボキシル基を活性化した。続いて、エチレンジアミンを添加して終濃度５００ｍＭとした。２時間インキュベートした後、フィルムを水で徹底的にすすいだ。最後に、１００ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９．０）中１ｍｇ／ｍｌのフルオレセインイソチオシアネートとともにフィルムを１時間インキュベートした後、水ですすいで空気乾燥した。
【０１３４】
２．Ｃ１６フィルム表面へのβ−ガラクトシダーゼのカップリング
フィルムを上述のように調製して活性化した。ＥＤＣ／ＮＨＳとともに１５分間インキュベートした後、フィルムを水ですすぎ、続いて１００μｇ／ｍｌのβ−ガラクトシダーゼ、４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１６ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１１５ｍＭのＮａＣｌを含む溶液（ＰＢＳ）で２時間インキュベートした。ＰＢＳで完全にすすいだ後、フィルム表面上で酵素活性を試験した。
【０１３５】
β−ガラクトシダーゼ分析
β−ガラクトシダーゼを連結させたフィルムを、１００ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．０）、１０ｍＭ塩化カリウム、１ｍＭ硫酸マグネシウム、５０ｍＭのβ−メルカプトエタノールおよび２ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−Ｇａｌ）を含む溶液とともに室温で１６時間インキュベートした。
【０１３６】
７．別のヒドロゲル
ＡＤＦ−４の反復部分は一般に、変異をごくわずかしか示さない保存的な単一反復単位から構成されている。本発明者らは、これらの変異を組み合わせて、１つの共通モジュールＣ（ＧＳＳＡＡＡＡＡＡＡＡＳＧＰＧＧＹＧＰＥＮＱＧＰＳＧＰＧＧＹＧＰＧＧＰ）（配列番号５）を設計した。モジュールＣが多量体化するとｒｅｐタンパク質Ｃ１６が得られ、その結果分子量４８ｋＤａのタンパク質となる。
【０１３７】
Ｃ１６シルク遺伝子を大腸菌株ＢＬＲ［ＤＥ３］（ノバジェン（Ｎｏｖａｇｅｎ））中で発現させた。細胞をＬＢ培地中３７℃でＯＤ６００＝０．５まで増殖させた。１ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド）で誘導する前に、細胞を２５℃にシフトした。細胞を誘導の３〜４時間後にハーベストした。
【０１３８】
Ｃ１６タンパク質を、ヒュンメリッヒ（Ｈｕｅｍｍｅｒｉｃｈ）らの文献（４０）に記述されるようにして精製した。Ｃ１６のペレットを８Ｍの尿素で洗浄し、６Ｍのチオシアン酸グアニジン（ＧｄｍＳＣＮ）に溶解した後で１０ｍＭのＮＨ４ＨＣＯ３に対して透析した。透析中に形成された沈殿を、５０，０００×ｇで３０分間沈降させて除去し、残った可溶性のシルクタンパク質を凍結乾燥した。分析に先立って、凍結乾燥したタンパク質を６ＭのＧｄｍＳＣＮに溶解した後、１０ｍＭトリス／ＨＣｌに対して透析した。１２５，０００×ｇで３０分間沈降して凝集物を除去した。タンパク濃度は、光路長１ｃｍのキュベット中２７６ｎｍでの測光分析により、理論上の消光係数を使用して決定した（４０）。
【０１３９】
Ｃ１６は、濃度５〜３０ｍｇ／ｍｌで、１０％（ｗ／ｖ）メタノールの追加後にナノ繊維へと自己アセンブリした（図１２）。特筆すべきことに、使用した濃度では、ナノ繊維は、ヒドロゲルに相当する繊維ネットワークの形成をもたらした。Ｃ１６ヒドロゲルは、撹拌または剪断力によって容易に分断可能であった。該ゲルの機械的性質を改善するために、ペルオキソ二硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）、およびトリス（２，２’−ビピリジル）ジクロロルテニウム（ＩＩ）（Ｒｕｂｐｙ）をゲル内に拡散させ、終濃度１０ｍＭ  ＡＰＳおよび１００μＭ  Ｒｕｂｐｙとした。寸法的に安定したゲルを得るために、タングステンランプの可視光線への１分間の曝露によってタンパク質を架橋させた（ＩＶ）（図１３）。
【０１４０】
架橋ヒドロゲルおよび非架橋ヒドロゲルの動的なレオロジー測定を、２５ｍｍのプレート‐プレート配置のＰｈｙｓｉｃａ  ＭＣＲ  ３０１を使用して実施した。上側プレートとサンプル皿との間の間隔は、最初にサンプル表面のおよそ２ｍｍ上方に上側プレートを移動させることによりセットした。垂直抗力をモニターしながら上側プレートを非常にゆっくり（５μｍ／秒）低下させ、限界の垂直抗力０．１Ｎで停止させた。
【０１４１】
サンプルに対して適切な大きさの間隔を見つけた後で、垂直抗力が一定の値に平衡化するまでサンプルを０．５Ｈｚおよび変形１％で剪断した。動的なレオロジー測定は、サンプルに定荷重を加えることにより室温で実施した。レオロジー測定は、タンパク質濃度５〜３０ｍｇ／ｍｌのサンプルについて実施した。
【０１４２】
乾燥ヒドロゲルのＡＦＭ画像は、ナノ繊維が直径およそ３ｎｍであり、長さと同じ規模の持続長を備えた半屈曲性のようであることを示している（図１２）。ナノ繊維の多くは、分岐した構造を有するようにも見える。ＡＦＭ画像からは、分岐様の構造が、各ポリマー繊維中の物理的な分岐であるか、ナノ繊維の束化の結果であるかを決定することはできなかった。
【０１４３】
ほとんどの凝縮されたポリマーネットワークと同様に、組換えＣ１６スパイダーシルクタンパク質のヒドロゲルは粘弾性の挙動を示す。粘弾性のＣ１６シルクネットワークに応力を加えると、ひずみは時間とともにゆっくり変化し、加えられた応力に釣り合う。図１４は、濃度１０ｍｇ／ｍｌの架橋ヒドロゲルおよび非架橋ヒドロゲルの応力／ひずみ挙動を示す。架橋されていないＣ１６シルクヒドロゲルは３８Ｐａの初期剪断弾性係数を有する。しかしながら、応力が増大するにつれて、この非架橋ヒドロゲルは応力に対してより高い変形応答を示し、２０％ひずんだ後は、応答は比較的線形である。応力を増大させると、ネットワークは９０％のひずみに到達するまで変形し続けるが、９０％のひずみでは非架橋ヒドロゲルは断裂および流動する。架橋されていない繊維ネットワークとは異なり、架橋ネットワークは、あらゆるひずみについて線形の粘弾性の応答を示し、はるかに高い８２０Ｐａの剪断弾性係数を有し、より低い３０％のひずみで断裂する。
【０１４４】
ポリマー濃度２０ｍｇ／ｍｌの非架橋繊維ネットワークの動的な粘弾性の測定から、貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ”）が、周波数（ω）に、高いω範囲および低いω範囲のいずれにおいても高度に依存することが明らかである（図１５）。該ネットワークは、０．４９Ｈｚを交差点として低周波では粘着性の挙動、中周波では弾性の挙動を示す。観察されたヒドロゲルの挙動は、混乱した（エンタングルした）ポリマーネットワークについて予想される挙動に似ており、液晶溶液または強粘液から期待される挙動には似ていない。
【０１４５】
架橋されていないＣ１６シルクヒドロゲルは、化学的に架橋されたヒドロゲル中で観察されるのとは非常に異なる動的な粘弾性挙動も示す（図１５）。架橋されていない繊維ネットワークの挙動とは異なり、架橋された繊維ネットワークの貯蔵弾性率は、試験した最
も高い周波数を除き、すべての周波数でほとんど一定である。架橋されたＣ１６シルクヒドロゲルはまた、架橋されていないネットワーク中で観察されるよりも高い貯蔵弾性率および低い損失弾性率を示す。
【０１４６】
予想されるように、架橋ヒドロゲルの貯蔵弾性率は、試験したすべての濃度について、架橋されていないネットワークより高い（図１６）。しかしながら、予想外なことに、架橋ネットワークおよび非架橋ネットワーク両方の貯蔵弾性率が、濃度［ｃ］につれて増大し、［ｃ］２依存性を有している。持続長がメッシュサイズより大きい、架橋された線形の半屈曲性バイオポリマーネットワークの場合には、該ポリマーネットワークの貯蔵弾性率は、架橋されたＣ１６シルクヒドロゲルに近い［ｃ］依存性を有すると予想される。混乱しているが架橋していない線形の半屈曲性のバイオポリマーネットワークの場合には、貯蔵弾性率は［ｃ］のはるかに低い濃度依存性を有すると予想される。そのような依存性は、Ｆアクチンのような他のバイオポリマーについて妥当であることが示されているが、架橋されていないシルクヒドロゲルの依存性について述べるものではない。
【０１４７】
この不一致については、ＡＦＭ画像で観察された分岐様の構造がポリマーネットワーク中の実際の物理的な分岐であれば説明することができるかもしれない。分岐した半屈曲性のポリマーネットワークの貯蔵弾性率は、架橋ポリマーネットワークおよび非架橋ポリマーネットワークについて予想される濃度依存性の間の濃縮依存性を示すと予想されるだろう。
【０１４８】
ＡＦＭ画像およびレオロジー測定データは、分岐した半屈曲性のポリマーネットワークのモデルと矛盾しない。しかしながら、該ヒドロゲルの貯蔵弾性率が増大減少する挙動は、線形の半屈曲性ポリマーネットワークを最も広く除外したモデルの枠内では説明することができない。
【０１４９】
【表１】
2008506409.tif 000002
【０１５０】
上記表中、
ａ人工的に改変したタンパク質の分子量にはＴ７タグが含まれている。
ｂ消光係数はギル（Ｇｉｌｌ）およびヒッペル（Ｈｉｐｐｅｌ）の文献（２３）に従って算出した。
ｃ荷電したアミノ酸残基はシルク遺伝子配列のみに関するものである；Ｔ７タグはさらにアルギニンを含んでいる。
ｄ疎水性親水性指標は過去に報告（３９）されているようにして計算した。疎水性親水性指標の値とともに疎水性が増大する。
ｅ疎水性親水性指標を０〜１の範囲に正規化した。「境界の」疎水性親水性指標はウベルスキー（Ｕｖｅｒｓｋｙ）らによって計算された（３５；３６）。正規化された疎水性親水性指標の値が「境界の」値未満である場合、タンパク質は本質的にアンフォールディングしていると予想される。ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の値は、反復配列のみに関するものである。
ｆ中間温度はＣＤ分光法によって測定した。
ｇＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４の値は（７５）および未公開の結果から得たものである。
【０１５１】
【表２】
2008506409.tif 000003
【０１５２】
【表３】
2008506409.tif 000004
2008506409.tif 000005
2008506409.tif 000006
2008506409.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】合成スパイダーシルク遺伝子用のクローニング戦略を示す図。（Ａ）クローニングカセットにはモジュールの多量体化に必要な制限酵素切断部位（ＢｓｇＩおよびＢｓｅＲＩ）ならびに組み立てた遺伝子を切り出すための制限酵素切断部位（ＮｃｏＩ、ＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ）を含んでいた。遺伝子構築の際にスペーサー領域をモジュールおよびモジュール多量体で置き換えた。（Ｂ）２つのモジュールの部位特異的な連結は、２つの適切なプラスミド断片のライゲーションによって実施した。ベクターのアンピシリン耐性遺伝子（Ａｐｒ）が再構築された。（Ｃ）２つのモジュールの連結に必要なヌクレオチドは、各モジュールの最初のコドン内にとどめた。（Ｄ）モジュール多量体を単一モジュールと同様に連結して合成遺伝子の組み立てを調節した。（Ｅ）設計したシルクモジュールのアミノ酸配列は、牽引糸シルクタンパク質ＡＤＦ−３およびＡＤＦ−４に由来するものとした。
【図２】スパイダーシルクタンパク質の分析を示す図。（Ａ）組換えシルクタンパク質のＴ７タグが、抗Ｔ７タグ抗体を用いたウエスタンブロッティング後に検出された。（Ｂ）タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、銀染色した。（ＡＱ）１２および（ＱＡＱ）８の染色が弱いため、画像のコントラストを電気的に高めた。（Ｃ）励起波長をそれぞれ２８０ｎｍ（実線）または２９５ｎｍ（点線）とした精製Ｃ１６ＮＲ４の蛍光発光スペクトルを示す。
【図３】スパイダーシルクタンパク質の二次構造および熱転移を示す図。（Ａ）ｒｅｐタンパク質（実線）、ｒｅｐＮＲタンパク質（点線）およびＮＲタンパク質（長破線）のＣＤスペクトルを２０℃で記録した。（Ｂ）可溶性スパイダーシルクタンパク質の平均残基分子量（ＭＲＷ）楕円率を、合成シルクタンパク質を９０℃に加熱（実線）、続いて２０℃に冷却（点線）しながら２２０ｎｍで測定した。
【図４】合成スパイダーシルクタンパク質の凝集を示す図。緩衝液中（対照）、３００ｍＭのＮａＣｌもしくは３００ｍＭのＫＣｌ存在下（ｐＨ１）、または３００ｍＭのリン酸カリウムの存在下で１時間インキュベートした後にタンパク質の凝集を測定した。棒グラフは、ＡＤＦ−３由来タンパク質：明灰色、ＡＤＦ−４由来タンパク質：暗灰色である。
【図５】合成フラジェリン型スパイダーシルク遺伝子用のクローニング戦略（図１参照）を示す図。単一モジュールをホモ多量体（ａ）ならびにヘテロ多量体（ｂ）に連結した。（ｃ）は、アメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）のフラジェリン型シルクタンパク質（Ｆｌａｇ）由来の設計されたフラジェリン型シルクモジュールのアミノ酸配列を示す。
【図６】ベクターｐＡＺＬの制限酵素切断地図を示す図。
【図７】スパイダーシルクタンパク質のアセンブリ形態を示す図。（Ａ）走査電子顕微鏡（ＳＥＭ）で視覚化した、Ｃ１６で形成された球体。（Ｂ）原子力間顕微鏡（高さ情報）によりで視覚化した、Ｃ１６ＮＲ４で形成されたナノ繊維。（Ｃ，Ｄ）ＳＥＭで調査した、（ＡＱ）２４ＮＲ３で形成されたミクロフィブリル（Ｃ）。該フィブリルを切断してその断面を視覚化するために、Ｇａ＋集束イオンビームを用いた（Ｄ）。（Ｅ）（ＡＱ）２４ＮＲ３溶液から生成させた発泡体。（Ｆ）Ｃ１６ＮＲ４溶液から生成させた発泡体。（Ｇ）Ｃ１６ＮＲ４ナノ繊維で形成された架橋ゲル。
【図８】合成シルクタンパク質（ＡＱ）２４ＮＲ３およびＣ１６を６Ｍチオシアン酸グアニジンに溶解してから５ｍＭリン酸カリウム（ｐＨ８．０）に対して透析したもの（実線）およびＨＦＩＰに溶解したもの（点線）のＣＤスペクトルを示す図。
【図９】Ｃ１６のＨＦＩＰ中の２％（ｗ／ｖ）溶液から成型したフィルムを示す図。
【図１０】（ＡＱ）２４ＮＲ３およびＣ１６から作製したタンパク質フィルムのＣＤスペクトルを示す図。フィルムはタンパク質のＨＦＩＰ溶液から直接平坦な石英ガラス上で成型し、ＣＤ分光法により分析した（点線）。続いてフィルムを１Ｍリン酸カリウムで加工処理して再分析した。フィルム厚が正確ではないため、□ΘＭＲＷは測定できなかった。
【図１１】ＨＦＩＰ溶液から成型してリン酸カリウムで加工処理したＣ１６フィルムの改良について示す図。（Ａ）Ｃ１６のカルボキシル基がＥＤＣを用いて活性化された場合（＋）にのみ効率よくフルオレセイン（黄色）がカップリングした。これに対し、ＥＤＣにより活性化されていない場合（−）はフィルムにフルオレセインがほとんど結合しなかった。（Ｂ）カップリングしたβ−ガラクトシダーゼの活性を、Ｘ−Ｇａｌを基質として用いてモニターした。ＥＤＣで活性化されたフィルム上にのみ青色の沈殿が出現して酵素活性を示し（＋）、活性化されていないフィルムは残存酵素活性を示すのみであった（−）。
【図１２】Ｃ１６ナノ繊維のＡＦＭ画像を示す図。
【図１３】Ｃ１６ナノ繊維で調製したヒドロゲルを示す図。
【図１４】濃度１０ｍｇ／ｍｌの架橋ヒドロゲルおよび非架橋ヒドロゲルの応力／ひずみ挙動を示す図。
【図１５】濃度２０ｍｇ／ｍｌの架橋および非架橋いずれの繊維ネットワークも、貯蔵弾性率（Ｇ’）および損失弾性率（Ｇ”）が周波数に依存することを示す図。
【図１６】架橋ヒドロゲルおよび非架橋ヒドロゲルのいずれについても周波数０．５Ｈｚでの貯蔵弾性率が濃度依存性であることを示す図。いずれのネットワークも濃度の二乗［ｃ］２に比例する貯蔵弾性率を有している。
【図１】
2008506409.tif 000008
【図２】
2008506409.tif 000009
【図３】
2008506409.tif 000010
【図４】
2008506409.tif 000011
【図５】
2008506409.tif 000012
【図６】
2008506409.tif 000013
【図７】
2008506409.tif 000014
【図８】
2008506409.tif 000015
【図９】
2008506409.tif 000016
【図１０】
2008506409.tif 000017
【図１１】
2008506409.tif 000018
【図１２】
2008506409.tif 000019
【図１３】
2008506409.tif 000020
【図１４】
2008506409.tif 000021
【図１５】
2008506409.tif 000022
【図１６】
2008506409.tif 000023
【配列表】
2008506409000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月22日(2006.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えスパイダーシルクタンパク質であって、
ａ）多量体化した反復単位を含む、１つ以上の合成のスパイダーシルクタンパク質反復配列、および、任意選択で
ｂ）１つ以上の天然型のスパイダーシルクタンパク質非反復配列
を含んでなる組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項２】
前記配列が、大瓶状腺からのクモの牽引糸シルクタンパク質由来であるか、または鞭毛状腺からのタンパク質由来であるかのうち少なくともいずれかである、請求項１に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項３】
天然型の非反復配列は、天然のスパイダーシルクタンパク質の、アミノ末端非反復領域（鞭毛状タンパク質）およびカルボキシ末端非反復領域（鞭毛状タンパク質および牽引糸タンパク質）のうち少なくともいずれか一方に由来する、請求項１または２に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項４】
天然型の非反復配列は、宿主内での前記配列の発現に適合するように改変されており、好ましくは配列番号１４、１５、３２および３４またはそれらのバリアントである、請求項３に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項５】
牽引糸タンパク質および鞭毛状タンパク質のうち少なくともいずれか一方が、円網性種（コガネグモ科（Ａｒａｎｅｉｄａｅ））の牽引糸タンパク質または鞭毛状タンパク質から選択される、請求項１〜４のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項６】
牽引糸タンパク質はニワオニグモ（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）に由来し、鞭毛状タンパク質はアメリカジョロウグモ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）に由来する、請求項５に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項７】
牽引糸タンパク質は野生型のＡＤＦ−３、ＡＤＦ−４、ＭａＳｐＩ、またはＭａＳｐＩ
Ｉであり、鞭毛状タンパク質はＦＬＡＧである、請求項１〜６のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項８】
牽引糸タンパク質が、配列番号１でコードされるＡＤＦ−３および配列番号２でコードされるＡＤＦ−４のうち少なくともいずれか一方であるか、または鞭毛状タンパク質が、配列番号６（Ｆｌａｇ−Ｎ）および配列番号７（Ｆｌａｇ−Ｃ）のうち少なくともいずれか一方であるか、あるいはそれらのバリアントである、請求項１〜６のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項９】
合成反復配列が、共通配列を含んでいる１以上のポリアラニンを含む、請求項１〜８のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１０】
共通配列を含んでいるポリアラニンはＡＤＦ−３に由来し、配列番号３のアミノ酸配列（モジュールＡ）またはそのバリアントを有している、請求項９に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１１】
合成反復配列はＡＤＦ−３に由来し、配列番号４のアミノ酸配列（モジュールＱ）またはそのバリアントの１以上の繰り返しを含む、請求項１〜１０のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１２】
合成反復配列は、反復単位として（ＡＱ）および（ＱＡＱ）のうち少なくともいずれか一方を１つ以上含む、請求項９〜１１のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１３】
合成反復配列は（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、（ＱＡＱ）８または（ＱＡＱ）１６である、請求項１２に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１４】
合成反復配列がＡＤＦ−４に由来し、配列番号５のアミノ酸配列（モジュールＣ）またはそのバリアントの１つ以上の繰り返しを含む、請求項１〜１３のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１５】
合成反復配列はＣ１６またはＣ３２である、請求項１４に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１６】
合成反復配列は鞭毛状タンパク質に由来し、モジュールＫ（配列番号３５）、モジュールｓｐ（配列番号３７）、モジュールＸ（配列番号３９）、ならびにモジュールＹ（配列番号４１）である、請求項１〜１５のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１７】
Ｙ８、Ｙ１６、Ｘ８、Ｘ１６、Ｋ８、またはＫ１６である、請求項１６に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１８】
完全長の組換えスパイダーシルクタンパク質は、式（ＱＡＱ）８ＮＲ３、（ＱＡＱ）１６ＮＲ３、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＡＱ）２４ＮＲ３、Ｃ１６ＮＲ４、またはＣ３２ＮＲ４、（ＱＡＱ）８、（ＱＡＱ）１６、（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、Ｃ１６、またはＣ３２である、請求項１〜１７のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質。
【請求項１９】
請求項１〜１８のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質をコードする核酸配列。
【請求項２０】
請求項１９に記載の核酸配列を含み、好ましくは図６または配列番号５５のクローニングベクターまたはそのバリアントに由来するベクター。
【請求項２１】
請求項１９に記載の核酸配列と、１つ以上の調節配列とを含む発現ベクター。
【請求項２２】
プラスミドベクターまたはウイルスベクターであり、好ましくはバキュロウイルス系または牛痘ウイルスベクター系である、請求項２０または２１に記載のべクター。
【請求項２３】
請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のべクターで形質転換されたヒト以外の宿主。
【請求項２４】
原核細胞である、請求項２３に記載の宿主。
【請求項２５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である、請求項２４に記載の宿主。
【請求項２６】
真核細胞である、請求項２５に記載の宿主。
【請求項２７】
哺乳動物細胞、植物細胞、酵母細胞または昆虫細胞である、請求項２６に記載の宿主。
【請求項２８】
ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、２９３Ｔ、ＨＥＨまたはＢＨＫ細胞である、請求項２７に記載の哺乳動物細胞。
【請求項２９】
酵母細胞である、請求項２７に記載の宿主。
【請求項３０】
出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ
ｐａｓｔｏｒｉｓ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）である、請求項２９に記載の宿主。
【請求項３１】
昆虫細胞が、鱗翅類の昆虫細胞、好ましくはスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）由来およびイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）由来の細胞である、請求項２７に記載の宿主。
【請求項３２】
昆虫細胞はＳｆ９細胞、Ｓｆ２１細胞またはＨｉｇｈＦｉｖｅ細胞である、請求項３１に記載の宿主。
【請求項３３】
植物細胞は、タバコ、じゃがいも、トウモロコシ、マメおよびトマトに由来する、請求項２７に記載の宿主。
【請求項３４】
スパイダーシルクタンパク質の凝集方法であって、
ａ）請求項１〜１７のうち１以上に記載の配向していないスパイダーシルクタンパク質を含んでいるタンパク質溶液を準備する工程と、
ｂ）工程ａ）で準備された溶液を凝集トリガーに曝露する工程と、
ｃ）沈殿したスパイダーシルクタンパク質を回収する工程と
を含む方法。
【請求項３５】
工程ａ）で使用されるスパイダーシルクタンパク質は、請求項２０〜２２に記載のベクターまたは請求項１９に記載の核酸を用いて請求項２３〜３３のうち１以上に記載の適切な宿主を形質転換し、適切な条件の下でスパイダーシルク遺伝子を発現させることにより
生産される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
凝集トリガーは、酸性化、好ましくはｐＨを約１にすること、リン酸カリウム、および機械的ストレス、好ましくはタンパク質溶液を回転させて剪断力を加えること、から選択される、請求項３４または３５に記載の方法。
【請求項３７】
工程ａ）で準備された、または工程ｃ）で回収された前記タンパク質を、適切な方法によってフィラメント、ナノ繊維および糸へと紡糸するか、またはフィルムを形成する工程を含む、請求項３４〜３６のうち１以上に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１〜３７のうち１以上に記載のタンパク質／糸の、バイオテクノロジーおよび医学のうち少なくともいずれか一方の分野における使用。
【請求項３９】
請求項１〜３８のうち１以上に記載のタンパク質／糸の、創傷閉鎖システムもしくは創傷被覆システムの製造のための使用。
【請求項４０】
縫合材料の製造のための、請求項３９に記載の使用。
【請求項４１】
縫合材料は神経外科もしくは眼科手術で使用されるためのものである、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
請求項１〜４１のうち１以上に記載のタンパク質／糸の、置換材料、好ましくは人工軟骨または腱材料の製造のための使用。
【請求項４３】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質／糸の、自動車部品および航空機部品の製造における使用。
【請求項４４】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質／糸を含むか、あるいは請求項３３〜３６のうち１以上に記載の方法によって得ることができることを特徴とする、創傷閉鎖システムまたは創傷被覆システム、縫合材料、置換材料、好ましくは人工軟骨、腱材料、自動車部品、または航空機建造に使用される部品。
【請求項４５】
請求項１〜１７のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質を含んでなる紙製品。
【請求項４６】
請求項１〜１７のうち１以上に記載の組換えスパイダーシルクタンパク質を含んでなる織物製品または皮革製品。
【請求項４７】
組換えスパイダーシルクタンパク質がコーティングとして存在する、請求項４５に記載の織物製品または皮革製品。
【請求項４８】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質を含んでなるかまたは該タンパク質で構成されるゲルまたは発泡体。
【請求項４９】
（ＱＡＱ）８ＮＲ３、（ＱＡＱ）１６ＮＲ３、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＡＱ）２４ＮＲ３、Ｃ１６ＮＲ４、またはＣ３２ＮＲ４、（ＱＡＱ）８、（ＱＡＱ）１６、（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、Ｃ１６、またはＣ３２に基づいたタンパク質を含んでなるかまたは該タンパク質で構成される、請求項４８に記載のゲル。
【請求項５０】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質を含んでなるかまたは該タンパク質で
構成される、インプラントおよびステント用のコーティング。
【請求項５１】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質／糸と、さらに、クモ由来ではなくかつ好ましくは植物由来の繊維または合成繊維である繊維とをさらに含むことを特徴とする、球体、ビーズ、糸または繊維。
【請求項５２】
請求項１〜１７のうち１以上に記載のタンパク質、あるいは（ＱＡＱ）８ＮＲ３、（ＱＡＱ）１６ＮＲ３、（ＡＱ）１２ＮＲ３、（ＡＱ）２４ＮＲ３、Ｃ１６ＮＲ４、またはＣ３２ＮＲ４、（ＱＡＱ）８、（ＱＡＱ）１６、（ＡＱ）１２、（ＡＱ）２４、Ｃ１６、またはＣ３２に基づいたタンパク質を含んでなるかまたは該タンパク質で構成されていることを特徴とするフィルム。
【請求項５３】
（ＡＱ）２４ＮＲ３またはＣ１６に基づいたタンパク質を含んでなるかまたは該タンパク質で構成されている、請求項５２に記載のフィルム。
【請求項５４】
フィルムの表面が、有機小分子および生体高分子のうち少なくともいずれか一方、例えばタンパク質、フルオレセインまたはβ−ガラクトシダーゼで修飾されている、請求項５２または５３に記載のフィルム。
【国際調査報告】
2008506409.tif 000024
2008506409.tif 000025
2008506409.tif 000026
2008506409.tif 000027
2008506409.tif 000028
2008506409.tif 000029
2008506409.tif 000030