(57)【要約】  本発明は、ナノコンポジット粒子を含む逆ミセルマイクロエマルジョンを調製するステップと；マイクロエマルジョンをシランカップリング剤で処理するステップと；ナノコンポジット粒子の懸濁液をｐＨ約６〜７に維持するマイクロエマルジョンに酸／アルコール溶液を添加することによって、マイクロエマルジョンを破壊してナノコンポジット粒子の懸濁液を形成するステップと；ナノコンポジット粒子の懸濁液を、好ましくはナノコンポジット粒子が確実に非凝集となるように改変したサイズ排除ＨＰＬＣシステムで同時に洗浄し分散させるステップとを含む、非凝集性で高度に分散した安定なコア／シェル型ナノコンポジット粒子を合成する方法を提供する。ナノコンポジット粒子の一次粒子粒径は、約１〜１００ｎｍ、好ましくは約１０〜５０ｎｍ、より好ましくは約１０〜２０ｎｍ、最も好ましくは約２０ｎｍの範囲とすることができる。
2008501509.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ナノコンポジット粒子を含む逆ミセルマイクロエマルジョンを調製するステップと、
該逆ミセルマイクロエマルジョンを分散剤で処理するステップと、
該マイクロエマルジョンに破壊剤を添加することによって、該マイクロエマルジョンを破壊してナノコンポジット粒子の懸濁液を形成するステップと、
該ナノコンポジット粒子の懸濁液を洗浄し分散させるステップと
を含む、懸濁状の非凝集性分散コア／シェル型ナノコンポジット粒子を調製する方法。
【請求項２】
酸／アルコール溶液が、前記ナノコンポジット粒子の懸濁液をｐＨ約５〜９に維持し、前記破壊剤が、酸性化したアルコール溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記破壊剤が、酢酸／エタノール溶液であり、前記分散剤が、クエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩およびホスホン酸塩からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
追加ステップ、すなわち、
界面活性剤、溶媒、および水性コア前駆体で構成される混合物を室温で形成することによって、前記逆ミセルマイクロエマルジョンを調製するステップと、
該混合物を約２分〜２４時間攪拌するステップと、
塩基を添加して、懸濁液を形成するステップと、
該懸濁液を約２分〜２４時間攪拌するステップと、
シリカまたはチタニアシェル前駆体材料を添加するステップと、
該マイクロエマルジョンを約２４時間熟成させるステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記界面活性剤が、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）Ｃ−５２０）である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記溶媒が、シクロヘキサンである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記水性コア前駆体が、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、ＣｄＳ、Ｐｔ、有機顔料、有機染料；フルオレセインのナトリウム塩、ローダミン、ローダミン誘導体、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ルシフェリンなどの有機蛍光物質、および１種または複数の薬剤からなる群より選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記薬剤が、核酸を転写活性型で細胞に送達する遺伝子治療薬である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体が、
ＢＤＣＥＣＦ、ＢＣＥＣＦ−ＡＭ、Ｃａｌｃｉｅｎ−ＡＭ、５，（６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフオレセイン、５，（６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフオレセイン二酢酸塩  Ｎ−スクシンイミジルエステル、５，（６）−カルボキシエオシン、５，（６）−カルボキシエオシン二酢酸塩、５，（６）−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、５，（６）−カルボキシフルオレセイン酢酸塩、５，（６）−カルボキシフルオレセイン酢酸塩  Ｎ−スクシンイミジルエステル、５，（６）−カルボキシフルオレセイン  Ｎ−スクシンイミジルエステル、５，（６）−カルボキシフルオレセインオクタデシルエステル、５，（６）−カルボキシナフトフルオレセイン二酢酸塩、エオシン−５−イソチオシアネート、エオシン−５−イソチオシアネート二酢酸塩、フルオレセイン−５，（６）−カルボキサミドカプロン酸、フルオレセイン−５，（６）−カルボキサミドカプロン酸  Ｎ−スクシンイミジルエ
ステル、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセインイソチオシアネート異性体１、フルオレセインイソチオシアネート異性体２、フルオレセインイソチオシアネート二酢酸塩、フルオレセインオクタデシルエステル、フルオレセインナトリウム塩、ナフトフルオレセイン、ナフトフルオレセイン二酢酸塩、またはＮ−オクタデシル−Ｎ’−（５−フルオレセイニル）チオ尿素（Ｆ１８）からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ローダミンおよびローダミン誘導体が、
５，（６）−カルボキシテトラメチルローダミン、５−カルボキシテトラメチルローダミン  Ｎ−スクシンイミジルエステル、６−カルボキシテトラメチルローダミン  Ｎ−スクシンイミジルエステル、５，（６）−カルボキシテトラメチルローダミン  Ｎ−スクシンイミジルエステル、５，（６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ジヒドロローダミン１２３、ジヒドロローダミン６Ｇ、リサミンローダミン、ローダミン１１０塩化物、ローダミン１２３、ローダミンＢヒドラジド、ローダミンＢ、およびローダミンＷＴ
からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
前記有機顔料および染料が、
７，１２−ビス（１−ヒドロキシエチル）−３，８，１３，１７−テトラメチル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン−２，１８−ジプロパン酸などのヘマトポルフィリン染料；およびインドシアニングリーンなどのシアニン染料およびその誘導体；インドインブルー；Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）、ＰＥ−Ｃｙ５；ＰＥ−Ｃｙ５．５；ＰＥ−テキサスレッド；ＰＥ−Ｃｙ７；Ｃｙ３  ＮＨＳエステル；Ｃｙ３マレイミドおよびヒドラジド；Ｃｙ３Ｂ
ＮＨＳエステル；Ｃｙ３．５  ＮＨＳエステル；Ｃｙ３アミダイト；Ｃｙ５  ＮＨＳエステル；Ｃｙ−５；Ｃｙ５アミダイト；Ｃｙ５．５；Ｃｙ−５．５  ＮＨＳエステル；Ｃｙ５．５アネキシンＶ；Ｃｙ７；Ｃｙ７  ＮＨＳエステル；Ｃｙ７Ｑ  ＮＨＳエステル；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＰＣ−Ｃｙ７；ＡＰＣ  Ｃｙ５．５；ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）；クリスタルバイオレットラクトン；パテントブルーＶＦ；ブリリアントブルーＧ；またはカスケードブルーアセチルアジド
からなる群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
前記シェル前駆体材料が、ＳｉＯ2、ＴｉＯ2、ＺｎＯ、Ｆｅ2Ｏ3、ＺｒＯ2、ＮｉＯ、
およびＧｅＯ2、Ｓｎ、Ｐｂ、ＡｇおよびＡｕ、ＣａＰＯx、ＣａＣＯ3、テトラエトキシ
シラン（ＴＥＯＳ）、チタン（ＩＶ）イソプロポキシド、および一般式Ｃａx（ＰＯ4）y
（ＯＨ）z（ＳｉＯ2）aのカルシウムホスホシリケートからなる群より選択される、請求
項４に記載の方法。
【請求項１３】
前記前駆体がテトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記前駆体がチタン（ＩＶ）イソプロポキシド（ＴＩＰＯ）である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
ｘ、ｙ、ｚ、およびａが、ゼロからより大きな数値の範囲で変動し得る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記分散剤が、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルシルセスキオキサン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、トリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン、３−トリメトキシシリルプロピルコハク酸無水物、およびアミド結合型カルボキシル基からなる群より選択されるシランカップリング剤である、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記シランカップリング剤が３−アミノプロピルトリメトキシシランである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ナノコンポジット粒子のコアが、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、およびメタクリル酸２−ヒドロキシエチルからなる群より選択されるヒドロゲル材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
動物またはヒトにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで前記ナノコンポジット粒子を使用するために、前記分散剤に表面改質剤を添加するステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記表面改質剤がバインダーである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記バインダーが抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
有機基、金属、酵素、巨大分子およびプラスミドからなる群より選択される部分を前記シェル前駆体材料に結合させることをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項２３】
前記ナノコンポジット粒子の粒径が、水相と界面活性剤とのモル比、水相とシェル前駆体材料とのモル比、および塩基とシェル前駆体材料とのモル比を調整することによって改変される、請求項４に記載の方法。
【請求項２４】
粒径が約１μｍ〜約１００μｍの球状シリカビーズが充填されたＨＰＬＣカラムで構成されるサイズ排除ＨＰＬＣシステムを使用して、前記ナノコンポジット粒子を洗浄し分散させるステップと、
破壊剤を前記ＨＰＬＣカラムにポンプ給送するステップと、
前記ナノ粒子懸濁液を、前記ＨＰＬＣカラムに固定相を通して約１ｍｌ／分〜約１００ｍｌ／分の流速でポンプ給送するステップと、
該ＨＰＬＣ充填カラムのアウトフローに連結した検出器によってＵＶ吸光度または蛍光の変化を測定し、いつ該カラムがナノ粒子で完全に満たされたかを決定するステップと、
前記ナノ粒子を、最高約２５０容量％溶液である水混和性有機溶媒と水の溶液で溶出させ、再分散させるステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記球状シリカビーズは粒径が約２０μｍである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記水混和性有機溶媒と水の溶液が最高約７０容量％溶液である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＨＰＬＣカラムは長さが約５×５０ｍｍである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記固定相が前記分散剤で処理されたマイクロスフェアで構成される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記ナノコンポジット粒子が約１〜１００ｎｍの一次粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
前記ナノコンポジット粒子が約１０〜２０ｎｍの一次粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記ナノコンポジット粒子が約２０ｎｍの一次粒径を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
（ｉ）ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０）、シクロヘキサンおよび水性の有効薬剤前駆体で構成される混合物を室温で形成するステップと、
（ｉｉ）該混合物を約３０分間攪拌するステップと、
（ｉｉｉ）ＮＨ4ＯＨを添加して懸濁液を形成するステップと、
（ｉｖ）該懸濁液を約１５分間攪拌するステップと、
（ｖ）シェル前駆体を添加するステップと、
（ｖｉ）マイクロエマルジョンを約２４時間熟成させるステップとを含む、
逆ミセルマイクロエマルジョンを調製するステップと；
該逆ミセルマイクロエマルジョンを３−アミノプロピルトリメトキシシランで処理するステップと；
該マイクロエマルジョンに、後記懸濁液をｐＨ約６〜７に維持する酢酸／エタノール溶液を添加することによって該マイクロエマルジョンを破壊して、ナノコンポジット粒子の懸濁液を形成するステップと；
（ｉ）ＨＰＬＣカラムに粒径が約２０μｍの球状シリカビーズを充填するステップと、
（ｉｉ）エタノールを前記ＨＰＬＣカラムにポンプ給送するステップと、
（ｉｉｉ）該ナノ粒子懸濁液を、前記ＨＰＬＣカラムに固定相を通じて流速約１ｍｌ／分でポンプ給送するステップと、
（ｉｖ）該ＨＰＬＣ充填カラムのアウトフローに連結した検出器でＵＶ吸光度または蛍光の変化を測定して、いつ該カラムがナノ粒子で完全に満たされたかを決定するステップと、
（ｖ）該ナノ粒子を、水が最高約７０容量％のエタノール／水溶液で溶出させ、再分散させるステップとを含む、
前記ナノコンポジット粒子の懸濁液を、サイズ排除ＨＰＬＣシステムを使用して洗浄し分散させるステップとを含む、
非凝集性分散コア／シェル型ナノコンポジット粒子を合成する方法。
【請求項３３】
追加ステップ、すなわち、
界面活性剤、溶媒、ｐＨがｐＨ６〜８に調整されたある量の水性コア前駆体、およびＣａ++形態のカルシウムを含む第１混合物を形成するステップと；
界面活性剤、溶媒、ｐＨがｐＨ６〜８に調整されたある量の水性コア前駆体、およびＰＯ4-形態のリン、さらに任意選択のＳｉＯ3-を含む第２混合物を形成するステップと；
該第１混合物と該第２混合物とを一緒に混合して約２分間、熟成させるステップと
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
前記水性コア前駆体はｐＨがｐＨ７．４に調整されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記界面活性剤がポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）Ｃ−５２０）である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
前記溶媒がシクロヘキサンである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記水性コア前駆体が、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、ＣｄＳ、Ｐｔ、有機顔料、有機染料；フルオレセインのナトリウム塩、ローダミン、ローダミン誘導体、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ルシフェリンなどの有機蛍光物質、および１種または複数の薬剤からなる群より選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記薬剤が核酸を転写活性型で細胞に送達する遺伝子治療薬である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ナノコンポジット粒子の粒径が、水相と界面活性剤とのモル比、水相とシェル前駆体材料とのモル比、および塩基とシェル前駆体材料とのモル比を調整することによって改変される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
（ｉ）ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０）、シクロヘキサン、薬剤前駆体およびＣａ++で構成される第１混合物を室温で形成するステップと、
（ｉｉ）ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０）、シクロヘキサン、薬剤前駆体およびＰＯ4-、さらに任意選択でＳｉＯ2-で構成される第２混合物を形成するステップと、
（ｉｉｉ）前記第１混合物と第２混合物を約２分間混合し、熟成させるステップとを含む、
逆ミセルマイクロエマルジョンを調製するステップと；
該逆ミセルマイクロエマルジョンを３−アミノプロピルトリメトキシシランで処理するステップと；
該マイクロエマルジョンに、後記懸濁液をｐＨ約６〜７に維持する酢酸／エタノール溶液を添加することによって該マイクロエマルジョンを破壊して、ナノコンポジット粒子の懸濁液を形成するステップと；
（ｉ）ＨＰＬＣカラムに粒径が約２０μｍの球状シリカビーズを充填するステップと、
（ｉｉ）エタノールを前記ＨＰＬＣカラムにポンプ給送するステップと、
（ｉｉｉ）前記ナノ粒子懸濁液を、前記ＨＰＬＣカラムに固定相を通して流速約１ｍｌ／分でポンプ給送するステップと、
（ｉｖ）該ＨＰＬＣ充填カラムのアウトフローに連結した検出器でＵＶ吸光度または蛍光の変化を測定して、いつ該カラムがナノ粒子で完全に満たされたかを決定するステップと、
（ｖ）該ナノ粒子を、水が最高約７０容量％のエタノール／水の溶液で溶出させ、再分散させるステップとを含む、
前記ナノコンポジット粒子の懸濁液を、サイズ排除ＨＰＬＣシステムを使用して洗浄し分散させるステップと
を含む、非凝集性分散コア／シェル型ナノコンポジット粒子を合成する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ナノコンポジット粒子に関する。より詳細には本発明は、広範な用途に使用することができる、様々な粒径の安定で充分に分散した非凝集性コア／シェル型ナノコンポジット粒子を合成する方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
化学技術分野における最も重要な発展のうちの１つは、ナノ構造化の発展である。ナノ構造材料は、巨視的スケールではユニークな特徴的性質を示すナノ粒径ユニットの集合体（ａｓｓｅｍｂｌｙ）である。こうしたユニットのサイズ範囲は、コロイドの範囲内にあり、個々の特性は、原子／分子の特性とも、またバルクの特性のどちらとも異なる。したがって、ナノ構造集合体の特性は、構成要素のコロイド的特性、主に粒子の粒径、表面特性、粒子間の相互作用、および粒子間の距離を変えることによって調整され得る。
【０００３】
生物医学的用途でのナノ粒子の使用は、今日、多数の研究グループの主要焦点となっている。ナノ粒子は、診断用バイオイメージング、薬物送達、遺伝子治療などの生物医学的用途で役立ついくつかの特性を有する。ナノ粒子はまた、培養中の細胞、組織、または完全な生物を標識するバイオイメージング薬剤として使用することができる。
【０００４】
バイオイメージング用途で使用される現在のナノ粒子技術としては、磁性ナノ粒子、強磁性流体、および量子ドット（ＱＤ）が挙げられる。最近、コロイド状蛍光性半導体ナノ結晶の、ＺｎＳシェル−ＣｄＳｅコアナノ粒子など、生物標識に使用されるＱＤ（Ｑ−ｄｏｔｓ（登録商標）として市販）部類の開発に多くの進歩が見られる（Ｒ．Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ、６：３２０〜３２８頁、１９９８年）。研究者らは、バイオ結合スキームを開発し、こうしたプローブをバイオアッセイに適用する過程にあり、ナノ結晶は、既存の有機染料と比べた場合、生物学的標識として特に有益なものになり得る。量子ドットは、一連のバイオイメージング用途で広く試験されている。
【０００５】
半導体ナノ結晶は、半導体ナノ結晶の溶解性、物理化学的安定性、量子効率など、その使用に関わるいくつかの問題を有する。さらに、ＱＤ放射は、著しく断続的であり、凝集によりバイオイメージングツールとしての有効性が制限される恐れがある。ＱＤに関係するその他の問題としては、ＱＤの物理的特性の解釈を著しく困難にする表面の酸化が、ＱＤシェルの分解、有害金属の身体内放出、および不充分な結晶性を引き起こす恐れがあるため、表面の電子欠損および毒性効果が挙げられる。さらに、バイオ標識として蛍光性ナノ粒子を日常的に適用することは、特に、生物医学的診断におけるカドミウムといった、著しく有毒な化合物の使用に関する一般的な環境問題のために議論の的になっている。さらに、ナノメートル粒径の構造を設計し、それらの形状を制御して、新規な電子的、光学的、磁気的、輸送性、光化学的、電気化学的、および機械的な諸特性を有する新しい材料を生みだす方法は、めったに見つからず、潜在的に報われ得る挑戦が行われている。
【０００６】
こうしたナノ粒子はまた、薬物送達に関する機構として機能することもでき、それによって、多数の非水溶性で不安定な薬剤を利用することが可能になる。さらに、こうしたナノ粒子は、吸収性シェル(resorbable shell)技術に基づく薬物ターゲティングおよび持続的放出の用途に使用することができる。さらに、これらのナノコンポジットは、遺伝子治療において遺伝的物質の送達に使用することができる。現在のナノ粒子薬剤および遺伝子の「担体」としては、高分子ミセル、リポソーム、低密度リポタンパク質、高分子ナノスフェア、デンドリマー、および親水性の薬剤-ポリマー複合体が挙げられる。
【０００７】
過去１０年にわたり、エレクトロニクスおよびフォトニクスにおいてナノスケール複合粒子のユニークな特性および潜在的な用途のために、ナノスケール複合粒子の製造の分野で広範な研究が行われてきた。二酸化ケイ素（ＳｉＯ2）シェルと金属コア構造のナノコ
ンポジット粒子が、Ｍｕｌｖａｎｅｙら（Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１２：４３２９〜４３３５頁、１９９６年）およびＡｄａｉｒら（Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｓｃｉ．＆  Ｅｎｇ．Ｒ．２３：１３９〜２４２頁、１９９８年）によって最初に合成され、報告された。コアシェル構造を有する、ＳｉＯ2でコーティングされたナノコンポジット粒子のほとんどは、使
用された合成法に基づき２種のカテゴリーに分類される。Ｍｕｌｖａｎｅｙらによって開発された手法は、シリカシェルの形成前にシランカップリング剤の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）による金属クラスター表面の改質を必要とした。ＡＰＳは、ガラス質との親和性に欠けた（ｖｉｔｒｅｏｐｈｏｂｉｃ）金属クラスターコアとＳｉＯ2との間の接着促進剤として使用される。しかし、懸濁状にあるナノコンポジットの分散
状態は、ＭｕｌｖａｎｅｙらまたはＡｄａｉｒらによっても調査されなかった。Ａｄａｉｒらは、水相を有するシクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ／水の三成分系におけるテトラエトキシシラン（tetrethoxysilane;ＴＥＯＳ）の単純な加水分解および縮合によって、金属
およびＣｄＳのクラスターをＳｉＯ2でコーティングすることに成功した。この系により
、油中に水の小滴が閉じ込められるので、コアとシェル両方の厚みが調整可能であるとともに極めて均一なシリカ−シェルコーティングが可能になる。
【０００８】
治療薬送達の用途におけるナノ粒子の使用の主たる制限としては、ナノ粒子懸濁液でのコロイド安定性の欠如、凝集、粒径および形状の多分散性、膨潤、および漏出が挙げられる。その他の問題としては、合成および加工技術の難しさ、担体粒子内部での不適切な充填、および様々な医療薬剤に適用できないことが挙げられる。洗浄されていないナノ懸濁液中に存在する残留前駆体材料はまた、生理的な系への標的送達と毒性作用の両方の有害な影響を及ぼす恐れがある。典型的な化学合成法において、ナノ粒子の分散は、基本的には新たに調製したナノ粒子を洗浄することから始まる。しかしながらナノ粒子を洗浄し分散させることは、隣接するナノ粒子間の強いファンデルワールス力のために難題である。このため、ナノ粒子懸濁液を、通常は界面活性剤の表面コーティングによって安定化させ、それによってこの相互作用の力を、界面活性剤分子により創出される高斥力ポテンシャルと有効に釣り合わせる。しかし、ナノ粒子をベースとした適用およびデバイスに関してより良好な性能を獲得するのに、界面活性剤の分散を最小限にすることが必要である。これは、界面活性剤添加物が後続の加工処理ステップに移され、ナノ粒子から構築されたアレイの均質性に悪い影響を与える恐れがあるからである。さらに、保護用界面活性剤を遠心分離などの従来の洗浄技術で除去した場合、ナノ粒子は凝集する傾向がある。凝集体の存在はまた、粒子の有効歩留りを損なう恐れがある。ナノメーター粒径の一次粒子を所望する場合、一般に大規模または粒径がより大きな凝集体の存在は避けなければならない。例えば、Ｗ．Ｔａｎらの２００３年の米国特許第６，５４８，２６４号に記載され、以下により詳しく論じるような濾過法など、ナノコンポジット粒子を製造する従来技術の通例的方法は、凝集のサイズが約２５０ｎｍの、不可逆に凝集されるナノコンポジット粒子をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
ナノ医療における現在の制約を考えると、制御された徐放性、１種（または複数）の治療薬の高充填能力、製造の容易さ、安定性、およびスケールアップ能力を有する広く適用可能なナノ粒子が必要とされる。活性のある医薬剤を送達する、安定した非凝集性コロイドの製剤は、様々なバイオイメージングおよび治療の薬剤に、普遍的な、制御された、標的化された、全身性送達を付与することによって医学分野を変える可能性を有する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、結合するアルキルアミンもしくはアルキルカルボン酸シランカップリング剤などの（それだけに限らないが）シランカップリング剤を有する、安定した非凝集性の充分に分散された活性医薬剤のコア／シェル型ナノコンポジット粒子の製造方法を提供する。グラフト機構の詳細な考察は、他に記載されている（Ｅ．Ｐ．Ｐｌｕｅｄｄｅｍａｎｎ、「Ｓｉｌａｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ」、２９〜４８頁、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、１９８２年；Ｔ．Ｕｎｇら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１４：３７４０〜３７４８頁、１９９８年；Ｃ．Ｈ．Ｃｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．、７４（２）：３９６〜４０３頁、１９８０年；Ｃ．Ｈ．Ｃｈｉａｎｇら、Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．８６（１）：２６〜３４頁、１９８２年）。こうしたナノコンポジットの分散は、連続した洗浄および分散のステップを含む他の技術の代わりに、好ましくは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用して、ナノコンポジット粒子を同時に洗浄分散させることによって実現される。
【００１１】
本発明はまた、生理的な条件下、すなわち等張性の環境下においてｉｎ  ｖｉｖｏで使用される、安定的な分散ナノコンポジット粒子を、それらの分散状態を維持する、カルボジイミド介在型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）カップリング剤からシランカップリング剤などの表面改質剤によって製造する方法を提供する。その他の表面改質方法として、デンドリマー、両親媒性剤、および従来技術で知られたクエン酸塩などの帯電吸着物が挙げられる。さらに、本発明では抗体などのバインダーが結合され、それによってナノコンポジット粒子が細胞内薬物送達に対する特定部位を標的とすることが可能になる。
【００１２】
これらのナノコンポジット粒子は、シリカ、チタニア、リン酸カルシウム、またはカルシウムホスホシリケートのマトリックス内部にドープ（ｄｏｐｅ）され、有機蛍光物質や治療薬剤など、様々な医学的有効物質を含むことができる。合成技術を改変して、蛍光物質と治療用薬剤の組合せを含有するナノ粒子を製造することもできる。ナノコンポジット粒子コロイドの所期の生物医学的用途は、コアとシェルのマトリックス材料の選択を必要とする。
【００１３】
安定な充分に分散された非凝集性の有効薬剤ナノ粒子は、顔料、蛍光標識、インク、徐放性製剤、バイオイメージング、薬物送達、遺伝子治療、それらの組合せなど、これらだけに限らない、様々な用途に使用され得る。例えば範囲内では、本発明のナノ粒子は、癌、感染症、糖尿病、嚢胞性線維症およびその他の疾患および障害に対する医療診断および医学的治療用のカルシウム沈着輸送体として使用することができる。
【００１４】
蛍光性ナノコンポジット粒子は、イメージングおよび色素用途について特に魅力的なものとするいくつかの特性、例えば生体適合性の長所とともに、発光ピークの正確な調整が可能であること、従来の有機蛍光物質に比べて延長された蛍光寿命、ごくわずかな光退色、自己クエンチングなどを有する。さらにこのナノ粒子の蛍光性発光は、断続的ではない。ナノ粒子内では、色素分子と周囲環境との間の直接接触が避けられ、その結果、おそらくはほとんどのエルギーが吸収されるために蛍光物質の光劣化がなくなり、したがって励起光子の損失がなくなる。その結果、図３〜５に示すように、これらのナノコンポジット粒子は、従来の有機蛍光物質または量子ドットに比べて延長された蛍光寿命を示す。
【００１５】
図６〜９に示すようにこれらのナノコンポジット粒子は、制御された孔を有する金属酸化物シェル内および／または可溶性外殻シェル／コーティング内に治療薬をカプセル封入することに基づく薬物送達系であって、分解すると罹患範囲の近傍に直に治療薬を放出する薬物送達系として使用され得る。シェルマトリクス材料によってもたらされる治療薬の保護作用により、生理的溶液において高い水不溶性または不安定性を示す薬剤の送達が可能になる。さらに、こうしたシェルマトリクス材料の分解速度を設計して、標的部位に長期間にわたって治療薬の徐放性を提供することができる。
【００１６】
ナノコンポジット懸濁液はまた、セラミド、ＡＺＴ、およびドブタミンを含む、しかしそれらだけに限らない、薬剤を送達するのに使用され得る。インスリンを、リン酸カルシウムやカルシウムホスホシリケート（calcium phospho-silicate）などの可溶性シェル材料中にカプセル封入することもできる。表面を改質し、それによってナノコンポジット粒子が、胃腸管、血液脳関門、細胞膜などの生理的な膜を通過することを可能にすることができる。ターゲティングされ、時間制御された放出は、コアシェル型ナノ粒子からインスリンなどの治療薬を送達するのに使用され得る。
【００１７】
こうしたナノコンポジットはまた、治療用ＤＮＡを細胞に送達する遺伝子治療において使用し得る。このナノコンポジット粒子は、カプセル封入によって遺伝物質の安定性を向上させ、標的細胞中への取り込みを改善させることができる。さらに、このナノ粒子は、約２００ｎｍ未満の微小粒径を維持しながら転写活性型の遺伝子治療薬を送達することができる。
【００１８】
微小な粒子サイズは、強化されたナノ粒子の界面化学および分散とともに、ナノコンポジット粒子の有効性に寄与する。微小粒径の実現により、動物モデルまたは人体の細網内皮系（ＲＥＳ）による捕捉を回避することが可能になり、それによってナノ粒子が腸壁や血液脳関門などの膜を通過して生体系で機能することができるようになる。多数の生体バリアは、微小なナノコンポジット粒子によって通過され得て、それによって高濃度の治療薬を標的部位に送達することが可能になる。さらに、こうした分散ナノコンポジット粒子を容易に機能化させて、治療薬を人体中の標的細胞または組織に直接送達させることができる。凝集は、上記の生物医学的用途および非生物医学的用途のすべてに支障を来たす。
【００１９】
ナノコンポジット粒子の合成は、水、界面活性剤、およびシクロヘキサンなどの溶媒を含む逆ミセル系を使用して実現される。得られるナノコンポジットの粒径は、水−界面活性剤の比に依存し、水−界面活性剤の比がより高いとより大きなナノコンポジットが生成される。したがって本発明により、生体細胞膜を通過するのに充分に小さい、粒径が約１．０〜１００ｎｍ、好ましい粒径は約１〜２０ｎｍであるナノコンポジット粒子の合成が実現される。しかしながら、以下に定義するように、上記の合成によって得られる一次粒径は、懸濁状態にある粒子の実際の粒径ではない。従来、逆ミセル中で調製されたナノコンポジット粒子は凝集していた。合成後、ナノ粒子の洗浄および回収作業をしている間に凝集が起こる。したがって、一次ナノ粒子の合成だけでは、充分に分散された懸濁液を提供するには不充分である。
【００２０】
表１は、ＳｉＯ2ベースのナノコンポジット粒子の表面改質に使用されるシランカップ
リング剤のリストを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、非凝集性で高分散な安定したコア／シェル型ナノコンポジット粒子の合成方法を初めて提供する。好ましくは、こうしたナノコンポジット粒子は、その上に結合されるアルキルアミンやアルキルカルボン酸のシランカップリング剤などの分散剤を有し、あるいはこの分散剤を、特にカルシウム・ベースのナノ粒子の合成においてクエン酸塩、シュウ酸塩、コハク酸塩、およびホスホン酸塩からなる群より選択することができる。こうしたナノコンポジット粒子の分散は、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用して、ナノコンポジット粒子を同時に洗浄し分散させることによって実現される。
【００２２】
また、本発明により、カルボジイミド介在型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）カップ
リング剤などの表面改質剤によって、生理的条件下、すなわち等張性環境下においてｉｎ
ｖｉｖｏで使用される、非凝集性で充分に分散した安定ナノコンポジット粒子懸濁液を調製することが実現される。
【００２３】
さらに、本発明によりｉｎ  ｖｉｖｏでシェルを吸収性または生分解性にする、有機および／または無機コア上に、リン酸カルシウムシェルやカルシウムホスホシリケートシェルなどのカルシウムベースのシェルを形成することが実現される。根底となるシェルは、多孔性でも高密度（ｄｅｎｓｅ）でもよい。
【００２４】
さらに、本発明により抗体、アミンを含めたその他の官能基、カルボン酸塩、合成ポリマーなど、広範な機能性を備えたバインダーが結合され、それによってナノ粒子が細胞内薬物送達のための特定部位といった送達適用において使えることが可能になる。さらに、有機基、金属、酵素、巨大分子、プラスミドなど（これらだけに限らない）、その他の部分を、ナノコンポジット粒子表面に添加することができる。例えば、ナノコンポジット粒子は、癌細胞に結合させる葉酸といったターゲット材料で囲まれた徐放性シェル中にカプセル封入された化学療法剤を含むことができる。このターゲット材料を、細胞および／または細胞の核に入り込むことができ、次いでその中で放出されるタンパク質、酵素、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびその他の化合物を送達するのに使用することもできる。
【００２５】
充分に分散したナノコンポジット粒子の調製は、界面活性剤、疎水性溶媒、水性ベースのコア前駆体、例えば水性ベースの有効薬剤の前駆体、蛍光性分子、顔料、金属、その他の所望のコア材料などを含む逆ミセル系、ならびに好ましくはサイズ排除ＨＰＬＣシステムを用いる洗浄および分散の方法を使用する本発明の方法に従って実現される（図１、１１、および１２）。得られる一次のナノコンポジット粒子の粒径は、水−界面活性剤の比に依存し、水−界面活性剤の比がより高いとより大きなナノコンポジットが生成される。具体的には、一次のナノコンポジット粒子の粒径は、水と界面活性剤のモル比、水とシェル前駆体材料のモル比、ならびにシリカシェル粒子では塩基とシェル前駆体材料のモル比を含めた処理パラメーターの操作によって改変され得る。したがって、本発明により、粒径が約１．０〜１００ｎｍ、好ましくは約１〜２０ｎｍ、最も好ましくは約１０〜２０ｎｍの間にあるナノコンポジットの合成が実現される。例えば、Ｒ＝［水］／［界面活性剤］＝２、Ｈ＝［水］／［ＴＥＯＳ］＝１００、およびＸ＝［ＮＨ4ＯＨ］／［ＴＥＯＳ］
＝１を、シクロヘキサン／水／Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０系に適用した場合、直径が約１０ｎｍの球状ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子が合成され得る。粒径が約２０
ｎｍ以下のナノコンポジット粒子は、血液脳関門を含めた生体細胞膜を通過するのに充分小さいと考えられる。
【００２６】
本明細書では、「ナノ粒径」という用語は、粒子が、約１００ｎｍより小さい平均寸法を有し、通常バルク相とは関連しない特性、例えば量子光学効果を示すことを含意する細分化の特別な状態を指す。
【００２７】
本明細書では、「ナノコンポジット粒子」、「ナノコンポジット」、および「ナノ粒子」という用語は、交換可能である。
本明細書では、「凝集（ａｇｇｌｏｍｅｒａｔｉｏｎ）」という用語は、懸濁液中で物理的（ファンデルワールス、疎水性）または静電気的な力による凝集物（粒状サブユニットからなる結合体）の形成を指す。得られた構造は、「凝集体」と呼ばれる。
【００２８】
本明細書では、「非凝集」という用語は、「凝集」の反意語であり、懸濁液中において凝集物が分散した状態を指す。
本明細書では、「凝集物」という用語は、粒状サブユニットからなる凝集体を指す。
【００２９】
本明細書では、「一次粒子」というフレーズは、粒子系における最小の同定可能な細分を指す。一次粒子はまた、凝集物のサブユニットになることもできる。
本発明の方法に従って使用することができる界面活性剤の例としては、限定はしないが、ポリ（オキシエチレン（ｏｘｙｅｔｈｅｙｌｅｎｅ））ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０）が挙げられ、すなわち、疎水性溶媒と、エタノールが存在するような、低分子量疎水性溶媒を含むこともできる水溶液とを組み合わせた、油中水型の逆ミセルを形成する界面活性剤が、例として考えられる。
【００３０】
シェル前駆体の例としては、ＳｉＯ2、ＴｉＯ2、ＺｎＯ、Ｆｅ2Ｏ3、ＺｒＯ2、ＮｉＯ
、およびＧｅＯ2、Ｓｎ、Ｐｂ、Ａｇ、およびＡｕ、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）
、チタン（ＩＶ）イソプロポキシド、ＣａＰＯx、ＣａＣＯ3、または一般式Ｃａx（ＰＯ4）y（ＯＨ）z（ＳｉＯ2）aのカルシウムホスホシリケート（式中、ｘ、ｙ、ｚ、およびａは、ゼロからより大きな数値の範囲で変えることができる）が挙げられるが、それだけに限らない。
【００３１】
さらに、コア材料は、ドブタミン、ＡＺＴ、抗生物質およびセラミドを含むがそれらだけに限らない薬剤を含有することができ、したがって、伝染性微生物、癌、またはその他の外因性異物に対して使用され得る。さらにこうしたコア材料は、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、メタクリル酸２−ヒドロキシエチルなど、それらだけに限らない材料に基づく脱水性ヒドロゲルから構成され得る。さらに、このコア材料は、リン酸カルシウムコーティングを有するシリカで構成してもよい。リン酸カルシウムシェル／シリカコア材料は、生理的ｐＨ値（ｐＨ６．５〜７．４）でクエン酸塩などの薬剤を使用して充分に分散させることができ、したがって、こうしたナノ粒子は、懸濁状の充分に分散したナノ粒子が歯の象牙質に送達されたときに象牙細管中にカルシウムおよびリン酸塩を放出することにより、歯の知覚過敏に対する治療薬として使用することが可能になる。
【００３２】
さらに、こうしたナノコンポジット粒子のシェル前駆体材料は、ポリビニルアルコール、ポリメチルメタクリレート、およびメタクリル酸−２−ヒドロキシエチルからなる群より選択される細胞毒性剤を含有することができ、したがって、伝染性微生物、癌、またはその他の外因性異物の標的として使用され得る。さらに、このシェル前駆体材料は、クエン酸塩で安定化させたリン酸カルシウムを含むシリカシェルコーティングで構成され得る。したがって、こうしたナノ粒子は、ナノ粒子が歯の象牙質に送達されたときに象牙細管中にカルシウムを放出することにより、歯の知覚過敏に対する治療薬として使用することが可能になる。
【００３３】
水性コア前駆体の例としては、Ａｕ、Ａｇ、Ｃｏ、Ｎｉ、Ｃｕ、Ｐｔなどの金属；ＣｄＳなどの半導体；有機顔料；有機染料；フルオレセインのナトリウム塩、ローダミン１２３、ローダミンＷＴ、ローダミンＢおよびローダミン１２３などのローダミンＢ誘導体、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ルシフェリンなどの有機蛍光物質；および／または上記の２つ前のパラグラフに記載のものを含めた治療薬などの有効医薬剤も挙げられるが、それだけに限らない。
【００３４】
治療薬の例としては、治療用ＤＮＡまたはＲＮＡ（あるいは任意の核酸）を細胞に送達させる遺伝子治療で使用することができる遺伝子治療薬剤が挙げられるが、それだけに限らない。本発明のナノコンポジット粒子は、カプセル封入によって遺伝物質の安定性を向上させ、標的細胞内への取り込みを改善させる（図２）。さらに、これらのナノコンポジット粒子は、１００ｎｍ未満の微小粒径を維持しながら転写活性型の遺伝子治療薬を送達することができる。
【００３５】
フルオレセインおよびフルオレセイン誘導体の例としては、ＢＤＣＥＣＦ、ＢＣＥＣＦ
−ＡＭ、Ｃａｌｃｉｅｎ−ＡＭ、５，（６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフオレセイン、５，（６）−カルボキシ−２’，７’−ジクロロフオレセイン二酢酸塩  Ｎ−スクシンイミジルエステル、５，（６）−カルボキシエオシン、５，（６）−カルボキシエオシン二酢酸塩、５，（６）−カルボキシフルオレセイン、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、５，（６）−カルボキシフルオレセイン酢酸塩、５，（６）−カルボキシフルオレセイン酢酸塩  Ｎ−スクシンイミジルエステル、５，（６）−カルボキシフルオレセイン  Ｎ−スクシンイミジルエステル、５，（６）−カルボキシフルオレセインオクタデシルエステル、５，（６）−カルボキシナフトフルオレセイン二酢酸塩、エオシン−５−イソチオシアネート、エオシン−５−イソチオシアネート二酢酸塩、フルオレセイン−５，（６）−カルボキサミドカプロン酸、フルオレセイン−５，（６）−カルボキサミドカプロン酸  Ｎ−スクシンイミジルエステル、フルオレセインイソチオシアネート、フルオレセインイソチオシアネート異性体１、フルオレセインイソチオシアネート異性体２、フルオレセインイソチオシアネート二酢酸塩、フルオレセインオクタデシルエステル、フルオレセインナトリウム塩、ナフトフルオレセイン、ナフトフルオレセイン二酢酸塩、またはＮ−オクタデシル−Ｎ’−（５−フルオレセイニル）チオ尿素（Ｆ１８）が挙げられるが、それだけに限らない。
【００３６】
ローダミンおよびローダミン誘導体の例としては、５，（６）−カルボキシテトラメチルローダミン、５−カルボキシテトラメチルローダミン  Ｎ−スクシンイミジルエステル、６−カルボキシテトラメチルローダミン  Ｎ−スクシンイミジルエステル、５，（６）−カルボキシテトラメチルローダミン  Ｎ−スクシンイミジルエステル、５，（６）−カルボキシ−Ｘ−ローダミン、ジヒドロローダミン１２３、ジヒドロローダミン６Ｇ、リサミンローダミン、ローダミン１１０塩化物、ローダミン１２３、ローダミンＢヒドラジド、ローダミンＢ、およびローダミンＷＴが挙げられるが、それだけに限らない。
【００３７】
有機顔料および染料の例としては、７，１２−ビス（１−ヒドロキシエチル）−３，８，１３，１７−テトラメチル−２１Ｈ，２３Ｈ−ポルフィン−２，１８−ジプロパン酸などのヘマトポルフィリン染料；およびインドシアニングリーンなどのシアニン染料およびその誘導体；インドインブルー；Ｒ−フィコエリスリン（ＰＥ）、ＰＥ−Ｃｙ５；ＰＥ−Ｃｙ５．５；ＰＥ−テキサスレッド；ＰＥ−Ｃｙ７；Ｃｙ３  ＮＨＳエステル；Ｃｙ３マレイミドおよびヒドラジド；Ｃｙ３Ｂ  ＮＨＳエステル；Ｃｙ３．５  ＮＨＳエステル；Ｃｙ３アミダイト；Ｃｙ５  ＮＨＳエステル；Ｃｙ−５；Ｃｙ５アミダイト；Ｃｙ５．５；Ｃｙ−５．５  ＮＨＳエステル；Ｃｙ５．５アネキシンＶ；Ｃｙ７；Ｃｙ７  ＮＨＳエステル；Ｃｙ７Ｑ  ＮＨＳエステル；アロフィコシアニン（ＡＰＣ）；ＡＰＣ−Ｃｙ７；ＡＰＣ  Ｃｙ５．５；ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）；クリスタルバイオレットラクトン；パテントブルーＶＦ；ブリリアントブルーＧ；またはカスケードブルーアセチルアジドが挙げられるが、それだけに限らない。
【００３８】
本発明の方法に従ってナノコンポジット粒子に添加することができるシランカップリング剤の例としては、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）（ｐＨ域２．０〜９．０；ＳｉＯ2の表面を改質するのに広く使用される）、３−アミノプロピルシルセス
キオキサン（ｐＨ域２．０〜６．５；シリカ粒子とＡｇナノ粒子の間の接着促進剤）、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＳ）（ｐＨ域＜９．０；ＳｉＯ2ナノ
粒子を改変するのに使用される）、トリメトキシシリルプロピル−ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）（最適ｐＨ６．８；ＳｉＯ2ナノ粒子の表面コーティングに使用される）、
または３−トリメトキシシリプロピルコハク酸無水物（ｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｐｒｏｐｙｌｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）（ｐＨ域＞８．０；シリカ表面上に負の電荷を付与するのに使用される）が挙げられるが、それだけに限らない。
【００３９】
さらに、アミド結合型カルボキシル基（ｐＨ域＜７．０；末端開口カーボンナノチュー
ブを機能化するのに使用される）など、アルキルカルボン酸シランカップリング剤を、ナノコンポジット粒子に添加することができる。
【００４０】
さらに、動物またはヒトにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでこうしたナノコンポジット粒子を使用するために、カルボジイミド介在型ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）カップリング剤などの表面改質剤を、シランカップリング剤に添加することができる。デンドリマー表面改質剤もまた、生理的環境でのこれらのナノコンポジット粒子の使用を促進するのに使用することができる。
【００４１】
さらに、抗体などのバインダーを結合させ、それによってこれらのナノコンポジット粒子は、細胞内で薬剤および核酸の送達のために特定部位を標的とすることが可能になる。
ナノ粒子分散の成功度合い、つまり非凝集は、特定のナノコンポジット懸濁液の平均凝集数（ＡＡＮ）をコンピュータで計算することによって推定され得る（Ｖ．Ａ．ＨａｃｋｌｅｙおよびＣｈｉａｒａ  Ｆ．Ｆｅｒｒａｒｉｓ、「Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂｌ．９６０−３、米国立標準技術研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、米国商務省、７〜８頁、２００１年８月、文書監督指導、米国政府印刷局、私書箱ＳＳＯＰワシントン（ＤＣ）２０４０２−０００１）。このＡＡＮは、凝集体内に含まれる一次粒子の平均数として定義される。これは、準電気光散乱（ＱＥＬＳ）によって決定された粒子体積中央値と、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）キャラクタリゼーションによって決定された微視的粒子サイズの体積との比として計算され得る。具体的には、ＡＡＮは、以下の式のように、例えば、動的光散乱、沈降法、または電界検知技術によって決定される粒子の粒径中央値と、ＢＥＴガス吸着法から得られる平均等価球体積（ＶBET）と
の比から計算される。
【００４２】
【数１】
2008501509.tif 000003
【００４３】
式中、Ｖ50は、粒径中央値から計算された等価球体積であり、Ｄ50は、μｍであり、ＳＳＡは、単位がｍ2／ｇの比表面積であり、ρは、単位がｇ／ｃｍ3の粒子密度である。我々の経験に基づくと、ＡＡＮが１０未満では、充分に分散した懸濁液であり、ＡＡＮが≧１０〜３０では、適度に分散した懸濁液であり、ＡＡＮが３０より大きいと、分散が不充分な懸濁液である。時には、ナノコンポジット粒子の各々を囲む電気二重層のＱＥＬＳ測定のために、ＱＥＬＳおよびＴＥＭによってもたらされる粒子の粒径に差異が観測される恐れがあるが、本発明者らは、ナノコンポジットコロイド懸濁液のＱＥＬＳキャラクタリゼーション用の標準プロトコルを開発して、二重層感度に起因する流体力学的半径の影響を最小限にした。図２０〜２２に示すように、本発明の技術により、ＡＡＮ＜１０のナノコンポジット粒子懸濁液の確実な調製が可能になる。
【００４４】
本発明の一実施形態では、バイオテクノロジー用途において従来の有機染料が遭遇した様々な機能的制限を回避することができるローダミンＢ／ＳｉＯ2およびフルオレセイン
／ＳｉＯ2のナノコンポジットを、本発明の方法に従って合成する。例えば、それらは、
量子サイズ効果に起因する強いサイズ依存性発光スペクトルを示す（それぞれ図３および４）。さらにこれらのナノ粒子は、吸収の閾値の上ではほぼ連続的な励起スペクトルを有する。その結果、こうしたナノコンポジット粒子を、生体標識技術において格別の発光プローブとして使用するこができる。実際、ローダミンＢ／ＳｉＯ2およびフルオレセイン
／ＳｉＯ2のナノ粒子は、多くの分野において既存の有機発色団よりも優れている。例え
ば、このローダミンＢ／ＳｉＯ2およびフルオレセイン／ＳｉＯ2のナノ粒子は、高い量子収率および光劣化に対する高い耐性を有する（図５）。さらに、これらのナノコンポジット粒子からの光ルミネセンスが、有機染料が遭遇した濃度と同等な濃度で検知され、したがって、従来の蛍光法の使用が可能になり、さらに生体適合性の利益も追加される。したがって、本発明のナノコンポジット粒子は、現在の医療技術の不充分な点を軽減することができる。例えば、本発明の蛍光性ナノ粒子の一適用は、平滑筋細胞（図６Ａ、Ｂ）またはニューロン（図６Ｃ、Ｄ、および７Ａ〜Ｅ）など、生体細胞の内部を照らすことである。生きた細胞の有機染料を使用した染色は、広く受け入れられた慣行となっているが、こうした細胞は、大量の染料分子で飽和される必要があり、そうでないとその染色は、結局、光物理的劣化により退色してしまう。ローダミン１２３／ＳｉＯ2およびフルオレセイ
ン／ＳｉＯ2ナノ粒子によりこの問題は解決される。と言うのは、これらが、シリカシェ
ルによって付与される蛍光性コアの保護によって光分解に対して高い耐性を有するからである。理論に束縛されるものではないが、無機シェルは、ナノ粒子蛍光の維持に関与し、それは最高で７カ月およびそれ以降も持続すると考えられる。さらに、本発明の方法に従って合成されるナノコンポジット粒子は、図３に示すように、光退色の抑制および／または極度な低減を示し、ならびに約６カ月を超す寿命を有する。
【００４５】
さらに、こうしたナノコンポジット粒子は、化学的アッセイの「曳光弾（ｔｒａｃｅｒ
ｂｕｌｌｅｔ）」として使用され得る。例えば、こうしたナノコンポジット粒子は、リン酸カルシウムを用いてカプセル封入される、乾燥させたヒドロゲルを含有することができ、それは身体全体にわたって循環し、水で膨潤することができる。粒径が約２０ｎｍのナノコンポジット粒子は、腎臓のボーマン嚢の糸球体細胞といった細胞膜を通過することができる。したがって、それらは、尿中に排泄され得て、その後、その内容物を分析することができる。
【００４６】
本発明のナノコンポジット粒子は、通常血液循環による輸送ができない疎水性治療薬の全身送達に使用され得る（図８）。さらに、粒径が２０ｎｍ以下のナノコンポジット粒子は血液脳関門を通過することができるため、中枢神経系への薬剤の直接送達が実現され得る。多孔質シリカコーティングまたはリン酸カルシウムで構成されたナノコンポジット粒子は、インスリンなどのホルモンをカプセル封入するのに使用され得る。こうしたナノコンポジット粒子は、小腸管腔の微絨毛を通過することはできるが、尿細管の糸球体細胞を通過しない。したがってこうしたナノコンポジット粒子は、インスリン放出についてフィードバック機序を提供することができ、そこでは、グルコース代謝の結果として産生されるピルビン酸塩が、ナノ粒子のリン酸カルシウムシェルに結合して、このナノ粒子からのインスリン放出を促進する。さらにかかるナノコンポジット粒子を、特異的に膵臓細胞に対して標的化することができ、その後膵臓内でインスリンを放出する。
【００４７】
本発明ナノコンポジット粒子の別の用途として、バイオミネラリゼーション（biomineralization）を誘発する薬剤としての、リン酸カルシウム（ＣＰ）またはカルシウムホス
ホシリケート（ＣＰＳ）でコーティングされたシリカ粒子の使用が挙げられる。例えば、ＣＰまたはＣＰＳシェルシリカコア粒子の使用は、露出した象牙細管への取込み用に練り歯磨きで使用され得て、それによりバイオミネラリゼーションが誘発され、細管の閉鎖が促進され、したがって歯の過敏性が緩和される。
【００４８】
吸収性シェル型ナノコンポジット粒子を適用するその他の例としては、特定の細胞または組織への全身性または標的送達のための、エイズ治療で使用されるドブタミン、３’−アジド−３’−デオキシチミジン（ＡＺＴ）；癌に対する化学療法剤、または冠状動脈の平滑筋細胞増殖阻害の化学療法剤として使用されるセラミドなどの薬剤の組込みが挙げられる（図９）。
【００４９】
本発明蛍光性ナノ粒子のその他の適用としては、毛細管流を検査する蛍光標識、ニューロン細胞の結合性を規定すること、ギャップ結合による色素転位の研究、および汚水処理（ｓｅｐｔｉｃ  ｄｉｓｐｏｓａｌ）系の追跡への使用、ならびにその他の水輸送の研究が挙げられるが、それだけに限らない。
【００５０】
本発明の別の実施形態では、ナノコンポジット粒子を含有する逆ミセルマイクロエマルジョンを調製すること、この逆ミセルマイクロエマルジョンをシランカップリング剤で処理すること、約６〜８の所望のｐＨに維持されたマイクロエマルジョンに対し、酢酸／エタノールといった、酸／アルコール溶液を添加することによって、マイクロエマルジョンを破壊してナノコンポジット粒子の懸濁液を形成すること、およびこのナノコンポジット粒子の懸濁液を同時に洗浄し分散することからなる、油中水型合成プロトコルを使用する懸濁状ナノコンポジット粒子の調製方法が提供される。
【００５１】
この逆ミセルは、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０として市販）などの両親媒性界面活性剤、シクロヘキサンなどの疎水性溶媒、および水ベースの溶液（所望により親水性の有機共溶媒が存在していても存在していなくてもよい）で構成される混合物を形成し、この混合物を安定的な均質な油中水型逆ミセルが生成されるのに充分な時間、２５℃で攪拌することによって調製される。通常の攪拌時間は、５分〜２４時間の範囲であり、好ましい時間は３０分である。所望により、特にシリカおよびチタニアのシェル材料については、ＮＨ4ＯＨまたは水酸化テトラ
エチルアンモニウムを含めた（それだけに限らないが）塩基を添加し、得られた懸濁液を２分〜２４時間のさらなる時間、攪拌する。こうしたナノコンポジット材料に最適な熟成時間は、シェル材料に依存する。シリカおよびチタニアシェルのナノコンポジットでは、２４時間が好ましく、リン酸カルシウム、カルシウムホスホシリケート、およびその他のカルシウムベースのものでは、ナノコンポジット粒子の分散方法は、不可逆的な凝集を防ぐために好ましい時間の２分後に開始されなければならない。次いで、ＡＰＳなどの分散剤を懸濁液に添加して、ナノ粒子の表面電荷を改変させる。
【００５２】
マイクロエマルジョンは、逆ミセルを破壊する溶液と一緒に急速に攪拌することによって破壊され、それによって適度に均質な溶液が形成される。好ましい破壊溶液は、酢酸およびエタノールから構成される。水性溶液は、本発明のシクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０／水系からなるマイクロエマルジョンを効果的に破壊するのに使用することができないことが確認された。
【００５３】
本発明の別の実施形態では、チタニアナノコンポジット粒子を合成するのに、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０）などの界面活性剤、シクロヘキサンなどの疎水性溶媒、および水性の前駆体で構成される混合物を室温で形成すること、この混合物を好ましい時間である約３０分間攪拌すること、塩基を添加して懸濁液を形成すること、この懸濁液を約１５分間攪拌すること、ならびにシェル前駆体のチタン（ＩＶ）イソプロポキシド（ＴＩＰＯ）を添加することによって逆ミセルマイクロエマルジョンを調製することからなる方法が提供される。該ミセルの充分な熟成は、ＴＩＰＯを添加した約２４時間後に起こる。シランカップリング剤またはクエン酸溶液などの単純な吸着物を懸濁液に添加して、ナノ粒子の表面電荷を改変させた後、酢酸／エタノール溶液でマイクロエマルジョンを破壊する。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態では、別個の２種のマイクロエマルジョンが、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０と、シクロヘキサンと、マイクロエマルジョンの基剤として働く前駆体を含有する水溶液とで調製され、有効薬剤コアおよびＣａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2シェルで構成されるリン酸カルシウムナノコンポジット粒子を合成するための方法が
提供される。塩化カルシウム二水和物およびリン酸二水素ナトリウムは、リン酸カルシウ
ムシェルの前駆体として働く。メタケイ酸ナトリウムを添加して、選択した系における核形成を誘発させる。具体的には、特定量のＩｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０、シクロヘキサン、および水性前駆体溶液を各々含む２種のマイクロエマルジョンを、周囲温度で急速に混合することによって調製する。このマイクロエマルジョンを約５分間混合させる。マイクロエマルジョン＃２を、マイクロエマルジョン＃１に滴下する。ミセルを約２分間熟成させる。シランカップリング剤またはクエン酸塩の溶液形の分散剤を懸濁液に添加して、ナノ粒子の表面電荷を改変させる。
【００５５】
本発明の別の実施形態では、別個の２種のマイクロエマルジョンが、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０と、シクロヘキサンと、マイクロエマルジョンの基剤として働く前駆体を含有する水溶液とで調製される、有効薬剤コアおよびＣａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2
シェルで構成されるカルシウムホスホシリケート（ＣＰＳ）ナノコンポジット粒子を合成するための方法が提供される。塩化カルシウム二水和物およびリン酸二水素ナトリウムは、リン酸カルシウムシェルの前駆体として働く。メタケイ酸ナトリウムを添加して、選択した系における核形成を誘発させる。具体的には、特定量のＩｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０、シクロヘキサン、および水性前駆体溶液を各々含む２種のマイクロエマルジョンを、周囲温度で急速に混合することによって調製する。このマイクロエマルジョンを約５分間混合させる。マイクロエマルジョン＃２を、マイクロエマルジョン＃１に滴下する。ミセルを約５分間熟成させ、その後、ＮＨ4ＯＨ、次いでＴＥＯＳを添加する。次い
で、シランカップリング剤を懸濁液に添加して、表面電荷を改変させる。マイクロエマルジョンを、０．０２Ｍ酢酸／エタノール溶液５０ｍＬとともに急速に攪拌しながら破壊する。マイクロエマルジョンを、酢酸／エタノール溶液とともに急速に攪拌しながら破壊する。
【００５６】
本発明の方法にはまた、粒径が約１μｍ〜約１００μｍ、好ましくは約２０μｍの球状シリカビーズが充填された約５×５０ｍｍのＨＰＬＣカラムを有するサイズ排除ＨＰＬＣシステムを使用することからなるナノコンポジット粒子の同時的な洗浄分散も含まれる。脱水したエタノールを、特定のナノ粒子系に対してｐＨ調整し、それをＨＰＬＣにポンプ給送してカラム充填剤を湿らせた後、ナノ粒子懸濁液を導入する。次いで、このナノ粒子懸濁液を、シランカップリング剤で処理したマイクロスフェアから構成され得る固定相を介して、ＨＰＬＣシステムに約１ｍＬ／分〜約１００ｍＬ／分、好ましくは約１ｍＬ／分の流速でポンプで送り込む。ＨＰＬＣ充填カラムのアウトフローを検出器に連結して、ＵＶ吸光度または蛍光の変化を測定する。このカラムがナノ粒子で完全に満たされたとき、検出器は、監視し、識別する。次いで、これらの粒子を、水が最高で約２５０容量％、好ましくは約７０容量％のエタノール／蒸留水の溶液を使用して溶出させ、再分散させる。
【００５７】
洗浄には、ナノ粒子の分散を維持しながら残留前駆体材料および過剰な有効薬剤を除去することが含まれる。洗浄された粒子は、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）や準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）などの技術の妨げになる残留有機物が存在しないので、より容易にかつ正確に同定される。界面活性剤およびその他の有機物質は有害な毒性効果を有するので、生物学的用途のナノ粒子を洗浄することは、重要なステップである。分散計画（ｓｃｈｅｍｅ）には、ナノ粒子懸濁液に対する保護／分散理論の適用が必要とされる。ナノコンポジット粒子の分散はさらに、サイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を使用してこのナノコンポジット粒子を同時に洗浄し分散させることによって向上される。
【００５８】
本発明で教示するサイズ排除ＨＰＬＣシステムおよび方法により、沈降法、遠心分離法、ソックスレー抽出法といったその他の粒子回収技術よりも優れた、非凝集性の安定したナノコンポジット粒子懸濁液が生成される。ＨＰＬＣ洗浄手順は、複合液体(complex liquid) の分離に使用される分析技術の改変形態である。したがって、ＨＰＬＣ洗浄法は、
界面活性剤、残留前駆体材料、カプセルに封入されなかった有効薬剤の自動除去を可能に
する。廃棄物を含有する担体溶液からのナノ粒子の分離は、移動相と固定相の相互作用が異なるために実現される。
【００５９】
ＨＰＬＣの洗浄分散プロセスは、移動相および固定相の表面改質、懸濁液ｐＨ、溶出物溶液組成物、流速、およびカラム寸法を含めた可変的要因により影響を受ける。一般には、固体の充填が約１０〜２０重量％のナノコンポジット粒子懸濁液が、超音波法（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ、ＤＭＡ３５Ｎ、グラーツ、オーストリア）によって測定されるように、ＨＰＬＣ洗浄後に得られる。
【００６０】
本発明を以下の実施例でより詳細に説明するが、その多くの改変形態および変更形態は当業者に明白であるので、実施例は例示のみを意図するものである。
【実施例１】
【００６１】
４種の従来技術と比較した、ＨＰＬＣを使用するＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の
合成および分散
１．材料および方法
・合成
Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の合成に使用する方法は、Ｔ．Ｌｉらによってす
でに記載されている（Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１５［１３］：４３２８〜４３３４頁、１９９９年）。使用するすべての化学薬品は、入手してそのまま使用した。非イオン性界面活性剤のポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（ＩｇｅｐａｌＣＯ−５２０）、シクロヘキサン、硝酸銀、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、シランカップリング剤の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）、ヒドラジン、およびＮＨ4ＯＨ（２８
〜３０％）すべてを、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から購入した。無水エタノール（２００プルーフ、Ｐｈａｒｍｃａ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．、ブルックフィールド、コネチカット州）および氷酢酸（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をさらに精製することなく使用した。すべてのストック水溶液を、脱イオン水（比導電率＝０．４×１０-7Ｓ／ｍ）で調製した。
【００６２】
簡単に述べると、シクロヘキサン（１０ｍｌ）とＩｇｅｐａｌＣＯ−５２０（４ｍｌ）とを混合し、続いてＲ比に従って激しく攪拌しながらある量の０．０１ＭのＡｇＮＯ3水
溶液を添加することによって逆ミセルを形成させた。該マイクロエマルジョン中に少量のヒドラジンを添加することによってＡｇ+イオンを金属Ａｇに還元した。Ｈ比に基づき適
正量のＴＥＯＳを添加して金属クラスターをコーティングし、ＮＨ4ＯＨ水溶液の一滴を
触媒として導入して、アルカリｐＨ範囲でＴＥＯＳの加水分解を確実にした。マイクロエマルジョンを、攪拌下でＳｉＯ2コーティングを完成させるために２４時間密閉し沈降さ
せた。次いでＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子を含有する逆ミセルマイクロエマルジ
ョンを、ＡＰＳのエタノール溶液で処理した。Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の表
面は、ＡＰＳの表面グラフトのために約７．０より低いｐＨで正に帯電（約３０ｍＶ）された。マイクロエマルジョンを、激しく攪拌してｐＨ７．０未満を維持しながら０．０２Ｍ酢酸／エタノールのストック溶液、５０ｍｌで破壊した。懸濁液を、ＨＰＬＣ洗浄技術を使用してエタノールでさらに処理した。また、他の４種の従来技術、すなわち遠心分離法、ソックスレー抽出法、沈降法およびろ過法を、ナノコンポジット粒子の分散に関するＨＰＬＣ技術の有効性を比べるのに使用した。完全なプロセスを図１０に示す。界面活性剤ＩｇｅｐａｌＣＯ−５２０の残留濃度を、ＵＶ−可視スペクトルによって監視した。ランベルト−ベールの法則を使用して、２８０ｎｍでの吸光度を測定することによって、ＩｇｅｐａｌＣＯ−５２０の検量線を濃度の関数として作成した。
・ＨＰＬＣによる洗浄
Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子を含有する逆ミセルマイクロエマルジョンを、初
めにＡＰＳのエタノール溶液で処理した（ＡＰＳ１５ｇ（１重量％）を、無水エタノール１５ｍＬ、氷酢酸０．１５ｍＬおよびＤＩ水０．７５μＬと混合させる）。Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の表面は、ＡＰＳの表面グラフトのために７．０より低いｐＨで
正に帯電（〜３０ｍＶ）された。マイクロエマルジョンを、活発に攪拌してｐＨ７．０未満のｐＨを維持しながら０．０２Ｍの酢酸／エタノールのストック溶液５０ｍｌで破壊した。次いで懸濁液をＨＰＬＣシステムにポンプ給送した（Ｗａｔｅｒｓ  Ｄｅｌｔａ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ３０００  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ、ミルフォード、マサチューセッツ州）。空のＨＲ５／５カラムを、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（ピスカタウェイ、ニュージャージー州）から購入した。このカラムに、２０μｍのＡＰＳで処理された球状シリカビーズ（Ｓｔｅｌｌａｒ  Ｐｈａｓｅｓ，Ｉｎｃ．、ペンシルベニア州）を流速２ｍＬ／分で充填した。カラムの末端を、Ａｇ量子ドットコアの表面プラズモンピークの波長である４０５ｎｍの波長にセットしたＵＶ−可視スペクトル検出器に連結した。無水エタノールを洗浄溶媒としてＨＰＬＣシステムにポンプ給送し、ナノコンポジットをエタノールと水の溶液（容量比７：３）で回収した。フラクションコレクターを使用して、洗浄手順全体にわたりＨＰＬＣカラムからの溶出液を採取した。ＨＰＬＣシステムの配置概略図を図１１に示す。ＨＰＬＣシステムの概略を図１２Ａに示し、それにはＡｇ／ＳｉＯ2ナノ粒子の透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）（図１２Ｂ）お
よび固定相中の球状シリカビーズの走査型電子顕微鏡写真（ＳＥＭ）（図１２Ｃ）が含まれている。
・同定
Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット懸濁液のゼータ電位を、動的光散乱原理に基づきＺｅ
ｔａ  ＰＡＬＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏ．、ニューヨーク州）によって測定した。ｐＨを、０．１ＭのＨＮＯ2および０．１
ＭのＫＯＨ水溶液によって調整した。Ａｇ／ＳｉＯ2懸濁液の形態および分散性を、初め
にタッピングモード(tapping mode)を備えた原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）（ＭｕｌｔｉＭｏｄｅ、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）で調べた。ＡＦＭ実験用のサンプルを、新たに切断したマイカ基板上にＡｇ／ＳｉＯ2懸濁液の液滴を置き、その基板を１５０
０ｒｐｍで３０秒間スピンコーティングすることによって作製した。画像解析を、高解像度透過型電子顕微鏡（ＨＲＴＥＭ）（ＨＦ２０００、Ｈｉｔａｃｈｉ、日本；およびＪＥＯＬ ２０１０Ｆ、東京、日本）で行った。少量の新たに調製した懸濁液を、銅グリッド
上に支持された炭素フィルム上に添加し、真空オーブン中で一晩乾燥させた。最先端技術のＭａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｚｅｒ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、英国）を使用して、Ａｇ／ＳｉＯ2懸濁液の分散状態を決定した。入手したままのＳｉＯ2マイクロスフェアの形態を、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、Ｈｉｔａｃｈｉ  Ｓ−３０００Ｈ、日本）によって得た。ＳｉＯ2マイクロスフェアの表層構造を、洗浄と分散のサイクル
後にＡＦＭによって調べた。ｐＨ測定はすべて、標準バッファー水溶液に対して較正されたＳｅｎｔｒｏｎ  ｐＨメーター（Ａｒｇｕｓ  ＩＰ  ６５  ＩＳＦＥＴ  ｐｒｏｂｅ、Ｓｅｎｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．、ワシントン州）で行った。
２．結果および考察
・従来の４種の技術を使用したＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の分散および形態
（ａ）遠心分離法
遠心分離法で洗浄され再分散されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットの分散状態を、図
１１Ａ〜Ｂに示す。Ｒ＝２、Ｈ＝１００、およびＸ＝１のサンプルでは、ＴＥＭによる一次粒径は、３０±１．２ｎｍであった（図１１Ａ）。動的光散乱によって測定された集団粒径分布は、２３３ｎｍであった（図１１Ｂ）。Ａｄａｉｒら（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ
Ｃｅｒａｍｉｃｓ、１１１、１４２〜１５６頁、Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、オハイオ州、１９８４年）によって開発された平均凝集数（ＡＡＮ）概念を使用して、Ａｇ／ＳｉＯ2懸濁液のＡＡＮを、光散乱粒径（ＤＬＳ）と微視
的粒径（ＴＥＭ）との体積比を利用することによって計算した。遠心分離法のプロトコルでは、ＡＡＮは、かなり凝集した懸濁液であることを示す４６８と推定された。これは、
ＴＥＭ観察と一致していた。
（ｂ）ソックスレー抽出法
ソックスレー抽出法は、洗浄溶媒の効率性が改善する、材料を連続方式で洗浄し抽出する経路を提供する。Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットを、ソックスレー抽出器で洗浄し採
取した。洗浄溶媒をその沸点に加熱して溶媒貯留容器から蒸発させ、次いで調製したままのＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットを含む円筒ろ紙の下方まで濃縮させ、最後に貯留容器
中に流し戻した。洗浄サイクルは、約４０分間継続する。図４Ａ〜Ｂは、ソックスレー抽出器で洗浄されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットのＴＥＭ画像および粒径分布を示す。
このＡＡＮは、約１０６であると決定され、これはＴＥＭ分析によって確認された（図１２Ａ）。Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットの一部が１０ｎｍ未満の粒径を示したが、これ
は洗浄中にＳｉＯ2シェルの分解によって引き起こされた可能性がある（図１２Ｂ）。
（ｃ）沈降法
Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットを、ＡＰＳコーティングの後に沈降法によって洗浄し
た。ＴＥＭからの粒径（図１３Ａ）と比べると、このＡＡＮは、９２１であることが推定された。このＡＡＮは遠心分離のものに比べて高かったが、分散は、ろ過を使用してナノコンポジット凝集物を除去することによってさらに改善される可能性がある。しかし、この洗浄手順は、プロトコルがほとんど機器の使用を必要としないが、通常時間のかかるものである。ナノコンポジット懸濁液は、光散乱分析に従って約２５ｎｍの主要モードおよび２μｍの副次モードである双峰分布を示した（図１３Ｂ）。
（ｄ）ろ過法
ろ過洗浄法は、Ｗ．Ｔａｎら（米国特許第６，５４８，２６４号、２００３年、名称「Ｃｏａｔｅｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ」）およびＸ．Ｚｈａｏら（Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．、１６：１７３〜１７６頁、２００４年）によって報告されたプロトコルに従う。マイクロエマルジョンをアセトンで破壊し凝固させ、次いでナノコンポジットをろ過（２μｍフィルタ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ベッドフォード、マサチューセッツ州）し、アセトンおよびエタノールで３回洗浄した。Ｔａｎらのプロトコルは、ナノコンポジット懸濁液のｐＨレベルをｐＨ７未満、好ましくは約ｐＨ６〜７になるように制御しないものである。これは凝集を防ぐのに必要である。したがって図１４Ａに示すように、Ｔａｎらのプロトコルは、ナノコンポジット粒子の不可逆的な凝集をもたらした。動的光散乱の測定で得られた粒子粒径分布は、双峰分布であり（図１４Ｂ）、この凝集粒径は、約２５０ｎｍであった。Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットエタノール懸濁液のＡＡＮは、約３１８であっ
た。凝集は、ナノコンポジット同士を接触させて形成および成長させるアセトンによって誘発された凝固のために起きた可能性が最も高い。
【００６３】
図１５Ａ〜Ｂは、従来の４種の洗浄プロトコルを使用した、油中水型逆ミセル合成に由来するＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットの形態を示す。シクロヘキサン／Ｉｇｅｐａｌ／
水の逆ミセル系におけるナノコンポジットの生成メカニズムおよび化学反応速度論は、Ｆ．Ｊ．Ａｒｒｉａｇａｄａらによってすでに詳細に説明されている（Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ
Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．２１１：２１０〜２２０頁、１９９９年；Ｃｏｌｌｏｉｄｓ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅｓ  Ａ、１５４：３１１〜３２６頁、１９９９年；Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．２１８：６８〜７６頁、１９９９年）。合成されたままのナノコンポジット粒子を洗浄し回収するのに使用される従来法では、ＴＥＭ画像に明らかに示されるように、粒子間のファンデルワールス力によって誘発される凝集を防ぐことができなかった（図１５Ａ）。
【００６４】
逆ミセル合成で生成されたナノコンポジットの粒径および形は、水と界面活性剤のモル比Ｒおよび水とＴＥＯＳの比Ｈに依存する。Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットの成長に関
する一般的な傾向として、銀コアの粒径はＲに比例するが、シリカシェルの厚さはＨが増加するにつれて減少する。Ｒ＝２、Ｈ＝１００、およびＸ＝１（［ＮＨ4ＯＨ］対［ＴＥ
ＯＳ］）では、逆ミセル合成によって得られたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットの粒径は
、約３０±１．２ｎｍであり、銀の量子ドットは、約５±０．６ｎｍである（９５％信頼区間）。次いで、ＳｉＯ2層の厚さは、約１２ｎｍであった（図１５Ｂ）。
【００６５】
ナノコンポジット合成中の凝集形成ステップは、同定されていない。しかし、逆ミセル中に捕捉されたナノコンポジット粒子は界面活性剤の保護層のために凝集しないことが知られており、したがって、界面活性剤層を洗い流すことにより凝集が誘発されると考えられる。したがって、非凝集性のナノコンポジット粒子を合成するためには、ナノコンポジットを同時に洗浄し分散させることが重要であり必要である。
・ＨＰＬＣを使用したＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の分散および形態
サイズ排除ＨＰＬＣシステムを使用して、ナノコンポジット粒子を同時に洗浄し分散させて、充分に分散したＡｇ／ＳｉＯ2懸濁液を生成させた。図１６は、このＨＰＬＣシス
テムの固定相として使用されたシリカマイクロスフェアの形態を示す。このシリカ粒子は、均一な球体であり、平均粒子粒径が２０μｍ、孔サイズが６５Å（表面積４２５ｍ2／
ｇ）であった。シリカマイクロスフェアをＨＰＬＣカラムに乾燥充填したとき、ランダム充填密度５７％を得た。これにより４３％もの高いカラム孔隙率が生成され、ＨＰＬＣ作動中にナノコンポジットが移動する多数のマイクロチャネルを形成することができた。これらのシリカマイクロスフェアをＡＰＳで処理して正の電荷を生じさせ、それによって、正に帯電したＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットが固定相シリカの表面に固着するのを防い
だ。これはＨＰＬＣプロトコルの重要なステップである。
【００６６】
図１７に示すスペクトルは、ＨＰＬＣカラム内部でのＡｇ／ＳｉＯ2の洗浄プロセスを
反映している。抽出溶媒（エタノール／水（容量比７：３））を２ｍＬ／分でポンプ給送したとき、ＨＰＬＣカラムからのＡｇ／ＳｉＯ2の溶出に約３分かかった。スペクトル強
度は、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子が検出器内の通過開始点で著しく増加し、安
定した懸濁液が、ＨＰＬＣ末端で連続的に採取された。ＨＰＬＣスペクトルは、洗浄サイクルの範囲内に観察される副次的ショルダーを伴ない、高い強度を有する、比較的細いバンドのように現れ（ＨＰＬＣ検出器の設定のために電圧として記録されている）、これは充分に洗浄されたＡｇ／ＳｉＯ2懸濁液を採取する根拠となった。ＰＥＡＫＦＩＴ（登録
商標）によるスペクトルのデコンボリューション(deconvolution)により、３個の個別の
ピーク（３個のピークの面積比は、１．１：１．８：１であり、ピークの中央位置は、９５．１（ｓ）、１１２．２（ｓ）、および１５０．７（ｓ）であった）が得られ、それらは個々のＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子およびそれらの凝集物（ダブレット、トリ
プレットなど）に対するＨＰＬＣカラムの分解能と一致した。これは、Ａｇ／ＳｉＯ2ナ
ノコンポジット粒子の濃度がランベルト−ベールの法則にかなり基づいていることを示唆した。
【００６７】
洗浄手順全体は、実際の溶出液採取時間の約３分を含めて約４５分かかった。これは、遠心分離法や沈降法といった従来の洗浄手順よりはるかに効率的である。スペクトルのプロフィルから、大部分のＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子が、一定速度でＨＰＬＣカ
ラムを通って移動し、それによってこのナノコンポジット粒子が間隙チャネル内を連続的に移動する結果、該ナノコンポジットがＳｉＯ2マイクロスフェア固定相の表面上で凝集
して堆積する機会を減らすことができたことを示唆した。しかし、より小さな粒子がより大きな粒子に比べて溶出には、より長い時間を要する傾向があるというクロマトグラフィーの原理から述べられるように、スペクトルの非対称なプロフィルは、少数のＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子が粒子粒径変動のためにカラムを通過するのにより長い時間が
必要であったことを示していた。これは、少数のダブレット、トリプレット、さらにはより大きなクラスターが、洗浄工程で個々のＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子とともに
形成されたことを示している。
【００６８】
図１８Ａ〜Ｂは、ＨＰＬＣ方法で洗浄されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の形
態を示す。図１８Ａは、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の２種の懸濁液である。図
１８Ｂは、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の３種のデジタル画像である。２００〜
６００ｎｍのＵＶ−可視分析によれば、このＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子は、機
器による検出限界内の界面活性剤を含んでいなかった。と言うのは、ＩｇｅｐａｌＣＯ−５２０の特徴的な２８０ｎｍの吸収帯が確認されなかったからである。ゼータ電位（＋３０ｍＶ）は、ＨＰＬＣ洗浄後でさえＡＰＳでグラフト化された強固な表面を強く示している。このＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の平均粒径は、ＨＰＬＣ洗浄の前にＴＥＭ
によって決定されたのと同じままであり、Ａｇコアは５±０．６ｎｍであり、全体の粒径は約３０±１．２ｎｍ（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）であった。Ｒ＝８、Ｈ＝３００、およびＸ＝１では、ＨＰＬＣ洗浄の後、平均粒径の２０．３±１．５ｎｍが観察された。個々のナノコンポジットとともに、２個、３個、または４個の粒子で形成されたナノスケールのクラスターもＨＲＴＥＭで観察された。幸いにも、連続的な粒子間結合を有する凝集物は見つからなかった。これは、ＨＰＬＣ法により、ナノコンポジットの凝集が、ナノコンポジットが間隙チャネルを通過することができる粒径まで破壊されることを示唆している。
【００６９】
新たに切断されたマイカ基板上にスピンコーティングされたＡｇ／ＳｉＯ2エタノール
／水懸濁液（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）のＡＦＭ画像を、図１９に示す。回転速度１５００ｒｐｍで、ナノコンポジット粒子をマイカの表面上に薄く分散させた。さらなる分析では、平均粒子粒径が約６０ｎｍとなり、それによってＨＲＴＥＭでの主要ユニットとして粒子粒径が３０ｎｍであった場合、ＡＡＮが約２となることが示された。さらに、ＨＰＬＣで処理されたＡｇ／ＳｉＯ2懸濁液は、１カ月の期間にわたる沈降試験によって実
験的に確認されたように極めて安定していることが判明した。
【００７０】
Ａｇ／ＳｉＯ2エタノール／水懸濁液の分散状態を、動的光散乱法によって決定した。
Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の流体力学的粒径分布を図２０に示す（Ｒ＝８、Ｈ
＝３００、Ｘ＝１）。極端に細い単一モード(monomode)分布を示すＡｇ／ＳｉＯ2ナノコ
ンポジット粒子では、集団平均粒径が１８．６±１．５ｎｍであった。光散乱の結果は、ＴＥＭによって測定された粒径（２０．３±１．５ｎｍ）と非常によく一致した。ＨＰＬＣ洗浄されたサンプルのＡＡＮは、約１．０であった。光散乱はコロイド懸濁液の分散の全体の状態をより正確に明らかにするために、このことはＨＰＬＣ洗浄後にエタノール／水の共溶媒中でＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子が充分に分散していることを意味し
ている。動的光散乱データとＴＥＭの粒径分析との一致は流体力学的効果を要約し、それによって調製されたままの懸濁液中でイオン類が所定量で存在していることを示している。
・ＡＰＳグラフト化
シランカップリング剤は、シリカベースのナノ粒子表面を改質するのにしばしば使用される。表Ｉは、多くの用途に利用されるいくつかのシランカップリング剤を要約したものである。ＡＰＳは、最も一般に使用されるシランカップリング剤のうちの１つである。ＡＰＳによる表面グラフト化の有効性を図２１に示す。ＡＰＳがコーティングされていないＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子は、そのｐＨがエタノール／水溶液中でｐＨ２より
高い場合、弱い負電荷を示した。そのｐＨが７．０より高い場合、ゼータ電位曲線は水平となり、横ばいに達し、ピーク値は約−３０ｍＶとなった。しかし、ＡＰＳでグラフト化されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子は、比較的高い表面電荷を得て、負から正に
転化した。ｐＨ７．０より低い酸性領域では、ＡＰＳでコーティングされたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子は、３０ｍＶもの高いゼータ電位を示し、目立ったＡＰＳ濃度効
果は観察されなかった。対照的に、ＳｉＯ2マイクロスフェアは、ＡＰＳ濃度が１．５重
量％に達したとき、ゼータ電位の顕著な増加を示した（図２２）。これは最も可能性が高いのは、ＳｉＯ2マイクロスフェアの大きな表面積および多孔性によるものである。グラ
フトメカニズムの詳細な考察は、他に記載されている（Ｅ．Ｐ．Ｐｌｕｅｄｄｅｍａｎｎ
、「Ｓｉｌａｎｅ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ａｇｅｎｔ」、２９〜４８頁、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州、１９８２年；Ｔ．Ｕｎｇら、Ｌａｎｇｍｕｉｒ、１４：３７４０〜３７４８頁、１９９８年；Ｃ．Ｈ．Ｃｈｉａｎｇら、Ｊ．  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．７４（２）：３９６〜４０３頁、１９８０年；Ｃ．Ｈ．Ｃｈｉａｎｇら、Ｊ．  Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．８６（１）：２６〜３４頁、１９８２年）。主な反応は、以下の通りに記載されている。
【００７１】
３Ｓｉ−ＯＨ（表面）＋ＮＨ2Ｃ3Ｈ6Ｓｉ（ＯＣ2Ｈ5）3  →  （Ｓｉ−Ｏ）3−ＳｉＣ3Ｈ6ＮＨ2＋３Ｃ2Ｈ5ＯＨ
この反応は、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の表面上のシラン基がシロキサン基と
置換され、エタノールがＳｉ−Ｏ結合形成の結果として放出されたことを示唆している。アミン基の端部が溶媒の方を向き、ｐＨ＜７．０ではプロトン化するこの構成がもっぱら望ましい。その結果、正の帯電は、主としてＡＰＳからの正に帯電したアミン基に起因して、酸性ｐＨの範囲内で容易になされる。ゼータ電位測定から、処理されたサンプルの表面電荷がｐＨ＜７．０で一様に正であることが示されている。ｐＨがｐＨ６よりさらに低くなると、ゼータ電位は急速に増加して約＋３０ｍＶで横ばいの値となり、これは提案した理論的な解釈を支持している。
【００７２】
ＡＰＳを用いる、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子とＳｉＯ2マイクロスフェア両方の表面グラフトの重要性を図１５に示し、そこではＨＰＬＣ洗浄後の非処理ＳｉＯ2ナノ
コンポジットのＡＦＭ画像が示されている。ＨＰＬＣカラムは、ＡＰＳでＡｇ／ＳｉＯ2
表面をグラフト化する前では、洗浄工程で容易にブロックされる。このことは、図２３に示される表面の形態を考慮に入れると説明がつく。シリカマイクロスフェアの三次元の姿は、初めは平滑だった表面が、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子との相互作用により
著しく損なわれたことを示した。ＨＰＬＣ洗浄前のシリカマイクロスフェアの形態は、ＳＥＭ（図１６）およびＡＦＭ観察によれば、表面粗さが極めて低い均一な球状であった。しかし、この表面はＨＰＬＣ洗浄中に損なわれ、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の
凝集物が、大きなシリカマイクロスフェアの表面上に付着した。シリカマイクロスフェアに付着した凝集物の１個は、粒径が約０．５μｍであり、したがって、一次粒子のサイズが約３０ｎｍである場合、それは少なくとも１５０個の個々のナノコンポジット粒子から構成されていることになる。ＳｉＯ2マイクロスフェアの表面上へのＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の凝集についての正確なメカニズムは充分に理解されてはいないが、ＡＰＳでグラフト化したＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子と負に帯電した球状ＳｉＯ2マイクロスフェアとの間のクーロン（ｃｏｌｕｍｂｉｃ）相互作用は、凝集の発生に重要な役割を果たしている。ＨＰＬＣ洗浄は弱酸性ｐＨ域（ｐＨ５．０〜７．０）で行われるため、ナノコンポジットは、ＡＰＳコーティングのために正の電荷を得て、一方、ＳｉＯ2マ
イクロスフェアは、このｐＨ域で負に帯電される。２種の反対電荷に帯電したナノコンポジットが互いに接近した場合、凝集の傾向は、静電的引力により増強される。おそらく、これがＨＰＬＣカラムがブロックされ、その結果最初の洗浄および採取の試みが失敗する機構である。したがって表面電位を制御し、それによってナノコンポジットの凝集がなくなるように、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子に施したのと同様に、同じ表面グラフ
ト化をＳｉＯ2マイクロスフェアに施した。そうしたプロトコルが、サイズ排除クロマト
グラフィーに基づいた、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子のＨＰＬＣ洗浄において重
要なステップであることが解明された。このプロトコルに正確に従った場合、エタノール／水溶媒でのＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の安定した懸濁液が、型どおり合成さ
れた。ナノコンポジット粒子を合成する従来の方法（上記のＷ．Ｔａｎらによって使用された方法など）では、重要な特徴、すなわち、シランカップリング剤、エタノール／水溶液でのナノコンポジットの希釈、ならびにサイズ排除ＨＰＬＣまたは沈降およびろ過システムは、使用されていない。
・洗浄溶媒
移動相と固定相両方にとり分散剤によるナノコンポジット粒子の表面改質とともに、適切な抽出溶媒の選択もまた、ＨＰＬＣ洗浄プロトコルの操作の成功にとって重要である。洗浄溶液の選択が凝集を防ぐのに重要であることが分かった。例えば、ＤＩ水、純粋な無水エタノール、イソプロパノール、およびアセトン溶媒を使用した場合、Ａｇ／ＳｉＯ2
ナノコンポジット粒子は、ＨＰＬＣカラム上部でクラスター化し続ける。好ましいエタノール／水の共溶媒（エタノール：水＝７：３（容量））をポンプで送り入れた場合、このクラスターは、ナノ粒子が充分に分散されるにつれて、下方へ移動しはじめ、最終的にカラムから溶出された。
・懸濁液のｐＨ
充分に分散したナノコンポジット粒子分散物を作製する場合、懸濁液のｐＨに対する制御は、重要なパラメーターである。図２４Ａは、動的光散乱による粒径分布を示す。図２４Ｂに示すように、ｐＨが２．８では、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット懸濁液は、ＴＥ
Ｍおよび動的光散乱分析に基づくと相当な凝集を含み、ＡＡＮは、双峰性の粒径分布のために約１５となった。実測ｐＨが９．７であるアルカリ性域では、ＳｉＯ2シェルの分解
により、Ａｇ金属コアの接触ならびに小粒子粒径の形成がもたらされる。ほとんど分散していない懸濁液は、ＡＡＮがナノコンポジット構造への損傷を示す０．０２となった。ｐＨを約ｐＨ６．０に調整した場合、ＡＡＮが約１となり充分に分散したＡｇ／ＳｉＯ2ナ
ノコンポジット懸濁液が得られた。このサンプルの動的光散乱データは、粒径分布が単一モードであることを示唆し、これはＴＥＭ分析と一致している。対応するＡＡＮは約１であり、それによってｐＨが約６．０で懸濁液が充分に分散されることが示された。
・カラムの長さ
ＨＰＬＣ洗浄の効率に影響を及ぼす別のパラメーターは、ＨＰＬＣカラムのサイズである。大きな寸法のカラムには、より多い洗浄溶媒および時間が必要とされる。異なる特定のサイズ寸法を有する３タイプのＨＰＬＣカラムを検討した。カラムＨＲ１６（１６×５００ｍｍ）およびＨＲ１０／１０（１０×１００ｍｍ）は、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジ
ット粒子の溶出には長すぎたが、短いカラムのＨＲ５／５（５×５０ｍｍ）は、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット分散に適していることが証明された。粒径がＲ0のナノコンポジットにとり到達し得るポア（pore）容積（Ｖ）は、以下の式のように表される。
【００７３】
Ｖ＝π・（Ｒp−Ｒ0）2×（Ｌ−Ｒ0）
式中、Ｒpは、孔（pore）の半径であり、Ｌは、カラムの長さである。Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子では、条件のＬ＞＞Ｒ0は満たされ、全容積ＶはＬに比例する。したが
って、より長いカラムの長さＬは、洗浄時間を明らかに増加させる。
３．結論
シランカップリング剤のＡＰＳは、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子と効果的に反
応し、それによってＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の表面電荷が増大され、Ａｇ／
ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子が、ＨＰＬＣ操作中に、正に帯電した球状ＳｉＯ2固定相マトリクスを通じて分散することが保証される。この原理に基づいたサイズ排除クロマトグラフィーにより、シリカマイクロスフェア上のＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子の凝
集および堆積が除去された。したがって、このＨＰＬＣ法によって生成された溶出分散物は、優れた均一性および安定性を示し、ゼータ電位は最高＋３０ｍＶであった。得られたエタノール／水懸濁液は、巨視的デバイスにとり、コロイド化学に基づいた「ボトムアップ型」ナノスケール集合体の理想的な前駆体である。移動相と固定相の両方の表面改質、溶媒、懸濁液のｐＨ、カラムの寸法といった処理パラメーターは、ＨＰＬＣ分散プロトコルに極めて重要なものである。分離プロセスにおいては、この手法は、界面活性剤なしでの分散が主要な問題である多くの類似したナノ微粒子系に拡張される可能性がある。
【実施例２】
【００７４】
ローダミンＢ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子、ＡＡＮ＝１
油中水型合成法を使用してナノコンポジット粒子合成を行うのに、ポリオキシエチレン
（５）ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０）、シクロヘキサン、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）、３−アミノプロピルトリメトキシシラン（ＡＰＳ）、水酸化アンモニウムおよび酢酸を、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．（ミルウォーキー、ウィスコンシン州）から購入した。マイクロエマルジョンの合成プロセスで利用される各化学薬品を、入手したまま使用した。使用するストック水溶液を、脱イオン（ＤＩ）水（比導電率＝０．４×１０-7Ｓ／ｍ）で調製した。フルオレセインのナトリウム塩、ローダミン１２３、ローダミンＢ、インドシアニングリーン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、ミルウォーキー、ウィスコンシン州）、ローダミンＷＴ（Ｐｒｅｓｔｏ  Ｄｙｅ  Ｃｈｅｍ  Ｃｏ．、フィラデルフィア、ペンシルベニア州）、カスケードブルーアセチルアジド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、ユージーン、オレゴン州）、Ｃｙ３アミダイト、およびＣｙ５アミダイト（Ａｍｅｒｓｈａｍ
Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）を含めた様々な有機蛍光物質染料を、ナノコンポジット粒子にカプセル封入することができる。
【００７５】
Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０（４ｍＬ）、シクロヘキサン（１０ｍＬ）および１０-2ＭのローダミンＢ（０．３２５ｍＬ）溶液を、密閉したファルコンカップ(falcon cup)内で室温で一緒にして、逆ミセルマイクロエマルジョンを形成した。次いで、溶液を適度な速度で３０分間攪拌した。次に、ＮＨ4ＯＨ（０．０５ｍＬ）を添加し、懸濁液
を１５分間攪拌した。続いて、ＴＥＯＳ（０．０８ｍＬ）を添加した。ミセルを約２４時間熟成させ、続いてシランカップリング剤ＡＰＳ（０．０１３ｍＬ）を添加した。マイクロエマルジョンを、０．０２Ｍの酢酸／エタノール溶液（５０ｍＬ）とともに急速に攪拌しながら破壊した。
【００７６】
ナノコンポジットローダミンＢ／ＳｉＯ2懸濁液の分散状態を、平均凝集数（ＡＡＮ）
手法を用いて分析した。サンプルのパラメーターは、Ｒ＝４、Ｈ＝１００、Ｘ＝１であった。ＱＥＬＳ同定から、９５％信頼区間で、粒子の粒径Ｄ50＝３２．０ｎｍ、および標準偏差＝６．９ｎｍがもたらされた。ＴＥＭによる同定では、粒子粒径として２５ｎｍ±５ｎｍが得られた（３０個の粒子をカウントした）。ローダミンＢ／ＳｉＯ2ナノ懸濁液の
ＡＡＮは、１であった。したがってこの懸濁液は、充分に分散されたものとして分類することができる。図２７Ａ〜Ｂは、有機コア材料がローダミンＢである有機コア／シリカシェル型ナノコンポジット粒子のＴＥＭ画像を２種の異なる倍率で示している。
【実施例３】
【００７７】
リン酸カルシウムナノコンポジット粒子の合成
リン酸カルシウムシェルナノコンポジット粒子の合成には、２種の別個であるマイクロエマルジョンの調製が含まれる。非イオン性界面活性剤、ポリ（オキシエチレン）ノニルフェニルエーテル（Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、シクロヘキサン（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、および蒸留水が、マイクロエマルジョンの基剤として働く。この界面活性剤は、さらに精製することなく使用した。生じるナノ粒子の粒径を、水と界面活性剤の比（Ｒ＝［水］／［界面活性剤］）を変えることによって制御した。脱水塩化カルシウム（ＣａＣｌ2、９
９＋％、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）およびリン酸水素ナトリウム（Ｎａ2ＨＰＯ4、９９＋％、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）は、リン酸カルシウムシェルの前駆体として働く。メタケイ酸ナトリウム（ＳｉＯ2、４４〜４７％）、テ
トラエトキシシラン（ＴＥＯＳ、９９％）、および水酸化アンモニウム（ＮＨ4ＯＨ）（
２９％）（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃからすべて入手）を、入手したままで使用した。
【００７８】
Ｉｇｅｐａｌ（２ｍＬ）、シクロヘキサン（５ｍＬ）とともに治療薬／薬剤／有機蛍光物質材料を含有する脱イオン水、あるいはメタケイ酸ナトリウム含有脱イオン水からなる
合計量が１０ｍＬの２種のマイクロエマルジョンそれぞれを、周囲温度で調製した。これらのマイクロエマルジョンを急速に混合した。溶液が外見的に均質になった後、前駆体材料を添加し、約１５分間貯蔵した。次いで、マイクロエマルジョンを、分液漏斗を使用してゆっくり連続的に一緒にした。シランカップリング剤またはクエン酸塩の溶液形の分散剤を懸濁液に添加して、粒子表面の電荷を改変した。マイクロエマルジョンを、酸／アルコール溶液を使用して破壊し、ＨＰＬＣを使用して洗浄し分散させた。リン酸カルシウムシリケートナノコンポジット粒子は、実施例２および３を組み合わせて合成することができる。初めに、実施例２に記載したように、コア−ＳｉＯ2シェル型ナノコンポジット粒
子を、シェルが厚さ１〜３ｎｍとなるような方法で合成することができる。次いで、これらの粒子を、実施例３で示した前駆体マイクロエマルジョンのうちの一方に組み込み、引き続き、それに従って処理した。
【実施例４】
【００７９】
ローダミンＷＴ／Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2ナノコンポジット粒子、ＡＡＮ＝１
実施例２に記載したように、すべての材料を入手し、調製した。
各々がＩｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０、シクロヘキサン、および前駆体水溶液を含む２種の別個のマイクロエマルジョンを、密閉したファルコンカップでこれらの成分を周囲温度で急速に混合することによって調製した。マイクロエマルジョン＃１は、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０（４ｍＬ）、シクロヘキサン（１０ｍＬ）、１０-2Ｍの塩化カルシウム溶液（１．２ｍＬ）、および１０-3ＭのローダミンＷＴ溶液（１ｍＬ）からなっていた。マイクロエマルジョン＃２は、Ｉｇｅｐａｌ（登録商標）ＣＯ−５２０（４ｍＬ）、シクロヘキサン（１０ｍＬ）、６×１０-3Ｍのリン酸二水素ナトリウム溶液（１．２ｍＬ）、および脱イオン水（１ｍＬ）中のメタケイ酸ナトリウム（５００ｐｐｍ）からなっていた。どちらのマイクロエマルジョンも５分間混合させた。次いで、マイクロエマルジョン＃２を、使い捨てのプラスチックピペットを使用してマイクロエマルジョン＃１にゆっくりと滴下した。ミセルを２分間熟成させた。シランカップリング剤のトリメトキシシリルプロピルジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）を懸濁液に添加して、ナノ粒子表面の電荷を改変した。次いで、マイクロエマルジョンを、０．０２Ｍの酢酸／エタノール溶液（５０ｍＬ）とともに急速に攪拌しながら破壊した。
【００８０】
ナノコンポジットローダミンＷＴ／Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2懸濁液の分散状態を、
平均凝集数（ＡＡＮ）手法を使用して分析した。サンプルのパラメーターは、Ｒ＝１１、Ｈ＝１００、Ｘ＝１であった。ＱＥＬＳ同定から、粒子粒径Ｄ50＝６７．０ｎｍがもたらされた。ＴＥＭによる同定では、粒子粒径として６０ｎｍ±１０ｎｍが得られた。ローダミンＷＴ／Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2ナノ懸濁液のＡＡＮは、１であった。したがって
、この懸濁液は、充分に分散されたものとして分類することができる。
【００８１】
上述の実施形態の広範な本発明の概念から逸脱することなく、上述の実施形態に変更を施すことができるであろうことは、当業者なら理解されよう。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されるものではなく、添付の特許請求の範囲で定義される本発明の思想および範囲内にある改変形態を包含するものであることを理解されたい。
【００８２】
本出願は、２００４年６月１日出願の米国仮特許出願第６０／５７５，８８７号および２００４年６月１４日出願の米国仮特許出願第６０／５７９，２１４号の優先権を主張し、参照によりその両方を本明細書に組み込む。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、本発明の逆ミセルの合成、洗浄および回収法を示す概略図である。
【図２】図２は、ナノコンポジット粒子による有効薬剤の細胞内送達の機序を示す概略図である。
【図３】図３は、フルオレセイン／ＳｉＯ2ナノ粒子の蛍光発光スキャンを示す図である。
【図４】図４は、１ＭのローダミンＷＴ／ＳｉＯ2ナノコンポジット粒子および１０-5ＭのローダミンＷＴストック溶液について蛍光発光のタイムスキャンを示す図である。
【図５】図５は、ナノコンポジット粒子の光減衰（ｐｈｏｔｏｄｅｃａｙ）実験の結果を示す図である。
【図６】平滑筋細胞およびラット星状神経節の位相差（phase contrast）および蛍光画像を示す図である。図６Ａ〜Ｂは、それぞれフルオレセイン／ＳｉＯ2ナノ粒子を取り込んだ培養血管Ａ７ｒ５平滑筋細胞の位相差および蛍光画像である。図６Ｃ〜Ｄはナノ粒子を心臓に注射した５日後に急性摘出したラットの星状神経節ニューロンそれぞれの位相画像および蛍光画像である。
【図７】ラット星状神経節の位相差および蛍光画像を示す図である。図７Ａ〜Ｂはｉｎ  ｖｉｔｒｏで０．００２％の１０-2ＭローダミンＢ／ＳｉＯ2ナノ粒子にさらした（１５分間）星状神経節（ＳＧ）ニューロンそれぞれの位相差および蛍光画像である。図７Ｃ〜Ｄはｉｎ  ｖｉｔｒｏで０．００２％の１０-2Ｍフルオレセイン／ＳｉＯ2ナノ粒子にさらした（１５分間）ＳＧニューロンそれぞれの位相画像および蛍光画像を示す。図７Ｅは注射７日後のＳＧニューロンにおけるフルオレセイン／ＳｉＯ2含有ニューロンの蛍光画像である。
【図８】図８は、有機蛍光物質および治療用薬剤を含有する機能化されたナノコンポジット粒子を示す概略図である。
【図９】図９は、セラミド／Ｃａ10（ＰＯ4）6（ＯＨ）2ナノ粒子がヒトの冠状動脈平滑筋細胞の増殖阻害を誘発することを示す棒グラフである。
【図１０】図１０は、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット懸濁液を逆ミセル合成および様々な方法を用いる洗浄から得ることを示す流れ図である。
【図１１】図１１は、サイズ排除クロマトグラフィーに基づき、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットのエタノール／水懸濁液を洗浄かつ分散させるＨＰＬＣシステム装置を示す概略構成図であり、ＵＶ−可視検出波長はＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット用に４０５ｎｍに設定され、ＨＰＬＣカラムのサイズはＨＲ５／５（５×５０ｍｍ）である。
【図１２】ナノ粒子を洗浄し分散させるのに使用されるＨＰＬＣシステムを示す概略図であり、図１２ＡはＨＰＬＣシステムであり、図１２ＢはＡｇ／ＳｉＯ2ナノ粒子のＴＥＭであり、図１２Ｃは固定相中の球状シリカビーズのＳＥＭである。
【図１３】遠心分離法によって洗浄されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット懸濁液（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）を示す図であり、図１３Ａは一次粒子の粒径のＴＥＭ分析を示し、図１３Ｂは動的光散乱による粒径分布を示す。
【図１４】ソックスレー抽出法によって洗浄されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット懸濁液（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）を示す図であり、図１４Ａは一次粒子の粒径のＴＥＭ分析を示し、図１４Ｂは動的光散乱による粒径分布を示す。
【図１５】沈降法によって洗浄されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット懸濁液（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）を示す図であり、図１５Ａは一次粒子の粒径のＴＥＭ分析を示し、図１５Ｂは動的光散乱による粒径分布を示す。
【図１６】ろ過法によって洗浄されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット懸濁液（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）を示す図であり、図１６Ａは一次粒子の粒径のＴＥＭ分析を示し、図１６Ｂは動的光散乱による粒径分布を示す。
【図１７】従来の方法で洗浄されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット懸濁液（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）の形態を示す図であり、図１７Ａはコアシェル構造のＴＥＭ画像を示し、図１７ＢはＴＥＭ画像から得られた粒径分布を示す。
【図１８】ＨＰＬＣシステムの固定相として使用されるＳｉＯ2マイクロスフェアのＳＥＭ画像を示す図である。ＳｉＯ2マイクロスフェアをＡＰＳで処理し（ＳｉＯ2（９０ｇ）を、ＡＰＳ（０．３３６ｍＬ）、氷酢酸（１．５ｍＬ）、ＤＩ水（７．５ｍＬ）、およびエタノール（１５０ｍＬ）と混合し、一晩攪拌し、７０℃で乾燥）、表面積は４２５ｍ2／ｇであり、平均孔サイズは６．５ｎｍである。
【図１９】ＨＰＬＣシステムで洗浄された、Ａｇ／ＳｉＯ2エタノール／水懸濁液（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）のＨＰＬＣスペクトルを示す図である。スペクトルは、ＵＶ−可視検出器によって４０５ｎｍ（Ａｇ量子ドットの表面プラズモン共鳴）で得られる。洗浄溶媒は、エタノール／水溶液（容量比７：３）であり、流速は、２ｍＬ／分である。スペクトルは、ＰＥＡＫＦＩＴ（登録商標）によってデコンボリュート（deconvolute）されたものであり、ピークの中央位置は、９５．１、１１２．２、および１５０．７（ｓ）である。
【図２０】ＨＰＬＣで洗浄されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットエタノール／水（７：３容量比）懸濁液の形態を示す図であり、図２０Ａはナノコンポジットの２種の懸濁液ＡおよびＢであり、図２０Ｂはデジタル画像：懸濁液Ａ；Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１、Ｄ50＝３０ｎｍ、ＳＤ＝１．２ｎｍ、懸濁液Ｂ；Ｒ＝８、Ｈ＝１００、Ｘ＝１、Ｄ50＝２０．３ｎｍ、ＳＤ＝１．５ｎｍ（９５％信頼区間）を示し、ＴＥＭ画像は、粒径、コアシェル構造、および懸濁液ＡおよびＢの分散状態を示す。
【図２１】ＨＰＬＣ洗浄で得られたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）懸濁液のＡＦＭ画像を示す図である。画像は、ＴＡＰＰＩＮＧ  ＭＯＤＥ（商標）によって得られたものである。サンプルは、Ａｇ／ＳｉＯ2エタノール／水懸濁液の液滴を新たに切断したマイカ基板上に配置し、１５００ｒｐｍで３０秒間、スピンコートして作製されたものである。３Ｄ画像は、凝集粒径が約６０ｎｍであることを示している。
【図２２】動的光散乱（ＤＬＳ）およびＴＥＭ分析によって測定された、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット（Ｒ＝８、Ｈ＝３００、Ｘ＝１）の粒径分布を示す図である。ＤＬＳでは、Ｄ50＝１８．６ｎｍ、ＳＤ＝１．５ｎｍであり、ＴＥＭ分析からの粒径は、２０．３±１．５ｎｍである（３０個の粒子をカウントした）。ＤＬＳとＴＥＭ分析との間は、ほとんど合致しており、ＡＡＮはほぼ１に等しく、充分に分散された懸濁液であることを示していることに留意されたい。
【図２３】Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）エタノール／水懸濁液のゼータ電位を、ｐＨおよびＡＰＳ濃度の関数として示す図である。ＡＰＳを添加した後に、電荷が負から正に転換したことに注意されたい。懸濁液のｐＨは、標準バッファー水溶液に対して較正したＳｅｎｔｒｏｎ  ｐＨメーターを使用して測定した。誤差のバーは、９５％信頼区間である。
【図２４】ＳｉＯ2マイクロスフェアのゼータ電位を、ｐＨおよびＡＰＳ濃度の関数として示す図である。ＳｉＯ2の平均粒径は２０μｍであり、表面積は４２５ｍ2／ｇであり、平均孔サイズは６．５ｎｍである。ＳｉＯ2マイクロスフェアは、エタノール／水（７：３容量比）溶液に分散させたものである。懸濁液のｐＨは、標準バッファー水溶液に対して較正したＳｅｎｔｒｏｎ  ｐＨメーターを使用して測定した。誤差バーは９５％信頼区間である。
【図２５】ＳｉＯ2マイクロスフェアの表面上に形成されたＡｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジット（Ｒ＝２、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）凝集体のＡＦＭ画像を示す図である。ＡＰＳの表面コーティングのみを、Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットに施し（平均粒径３０ｎｍ）、ＳｉＯ2マイクロスフェアを別の処理なしに使用した（平均粒径２０μｍ）。ブロックされたＨＰＬＣカラムからのＳｉＯ2マイクロスフェアを、新たに切断したマイカ基板上に置いた。
【図２６】Ａｇ／ＳｉＯ2ナノコンポジットエタノール／水懸濁液（Ｒ＝８、Ｈ＝１００、Ｘ＝１）について分散状態へのｐＨの影響を示す図であり、図２６Ａは、動的光散乱による粒径分布を示し、図２６Ｂは、レース状炭素グリッドに懸濁液の液滴を置き、２５℃で乾燥させることによって得られたＴＥＭ画像である。ＳｉＯ2シェルはｐＨ９．７で溶解し、それによって双峰分布を生じることに留意されたい。
【図２７】有機コア材料として、（Ａ）低および（Ｂ）高密度にローダミンＢを含有する有機コア／シリカシェルナノコンポジット粒子の粒径および形態を示す透過型電子顕微鏡写真（ＴＥＭ）の画像を示す図である。
【図１】
2008501509.tif 000004
【図２】
2008501509.tif 000005
【図３】
2008501509.tif 000006
【図４】
2008501509.tif 000007
【図８】
2008501509.tif 000008
【図１０】
2008501509.tif 000009
【図１９】
2008501509.tif 000010
【図２２】
2008501509.tif 000011
【図２３】
2008501509.tif 000012
【図２４】
2008501509.tif 000013
【図５】
2008501509.tif 000014
【図６】
2008501509.tif 000015
【図７】
2008501509.tif 000016
【図９】
2008501509.tif 000017
【図１１】
2008501509.tif 000018
【図１２】
2008501509.tif 000019
【図１３】
2008501509.tif 000020
【図１４】
2008501509.tif 000021
【図１５】
2008501509.tif 000022
【図１６】
2008501509.tif 000023
【図１７】
2008501509.tif 000024
【図１８】
2008501509.tif 000025
【図２０】
2008501509.tif 000026
【図２１】
2008501509.tif 000027
【図２５】
2008501509.tif 000028
【図２６】
2008501509.tif 000029
【図２７】
2008501509.tif 000030
【図２８】
2008501509.tif 000031