(57)【要約】  本発明は特に細胞内原虫寄生虫によって引き起こされた主に寄生虫感染症の感染症治療のための塩水中のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン（Amphotericin）挿入リポソームに関する。本発明はさらにリポソーム化薬剤を投与前に超音波処理を受けさせることによって血液中のリポソーム内のカプセル化された薬剤の循環時間を増加することに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
感染症治療のためのアンフォテリシンＢ（Amphotericin B）の濃度が１〜１５ｍｇ／ｍｌである水懸濁液中のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン（Amphotericin）挿入リポソーム。
【請求項２】
水懸濁液は０．９％の塩水を任意に含有してもよい水懸濁液中のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン挿入リポソーム。
【請求項３】
前記ステロールはコレステロール含有又は非含有のエルゴステロールである請求項１に記載のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン挿入リポソーム。
【請求項４】
前記ステロールはリン脂質と結合している請求項２に記載のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン挿入リポソーム。
【請求項５】
前記リン脂質はホスファチジルコリンである請求項４に記載のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン挿入リポソーム。
【請求項６】
前記エルゴステロールはリポソームの総脂質の５０％を構成する請求項２に記載のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン挿入リポソーム。
【請求項７】
前記ホスファチジルコリン、前記エルゴステロール及び前記アンフォテリシンＢの比率は５：２：１である請求項1〜５のいずれかに記載のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン挿入リポソーム。
【請求項８】
前記感染症はリーシュマニアを含む細胞内原虫寄生虫によるものである請求項１に記載のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン挿入リポソーム。
【請求項９】
前記構成は、細胞質の半減期を増加するために及びよりよい生体分布のために製造中及び投与前に超音波処理を行われる請求項１に記載のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン挿入リポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は塩水中のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン（Amphotericin）挿入リポソーム及びその調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
リーシュマニアは細胞内原虫寄生虫、Leishmania donovani,Leishmania infantum及びLeishmania chagasiに常在性のマクロファージによって引き起こされる。寄生虫の伝播は感染した雌のphlebotomine属サシチョウバエのかみ傷を通しておこる。サシチョウバエは彼らの寄生する担体宿主から血を吸う一方で感染した血液を得る。リーシュマニアは人において異なる臨床的発現を有する４つの異なる型が存在する。これらの異なる型のうち、カラアザールとしても知られる内臓リーシュマニア症（ＶＬ）が最も重篤であり、治療しなければほぼ１００％の死亡率を有する。頻繁な発熱、体重減少、貧血を伴う脾臓及び肝臓の肥大が内臓リーシュマニア症の特徴的な徴候及び症状である。
【０００３】
アンフォテリシンＢ（AmphotericinＢ）は土壌バクテリアStreptomyces nodosusによって産生されるポリエン抗生物質である。アンフォテリシンＢは１９５０年代のその発見以来最も薬効の高い抗真菌薬剤であることが知られている。後にカラアザールにとっても効果的な治療であることが発見された。（Trans Royal Soc.Trop.Med.Hyg.1963;57:266-268）。
【０００４】
一般に使用され第１選択薬である、すなわちスチボグルコン酸ナトリウム（Sodium Stibogluconate）及びペンタミジン（Pentamidine）に対する耐性の驚くべき出来事と異なり、アンフォテリシンＢは薬物耐性問題がない。（CP Thakur et.al.1993.The National Medical Journal of India;6:57-60 及びCP Thakur et.al.1993.Indian Journal of Medical Research;97:170-175）。
【０００５】
効果的な抗リーシュマニア薬剤であるにもかかわらず、アンフォテリシンＢは副作用及び毒性、主として腎毒性、心臓毒性、及び神経毒性に関連して点滴による第２選択薬としてのみ慎重に使用されている。アンフォテリシンＢの広域スペクトル及び効能に置き換わる他の薬剤が無いので、理解できるように、様々な方法がアンフォテリシンＢの毒性に関する服用量を克服するために実験され更に限られた成功を伴って実行されている。
【０００６】
毒性に関してアンフォテリシンＢを克服するための最も非科学的で不確かな容認できない矛盾した従って最も小さい実行方法は、加熱し、冷却してから従来のアンフォテリシンＢを与えることである。真のアンフォテリシンＢの脂質製剤の代用品として内部脂質（IV脂質懸濁液）と従来のアンフォテリシンＢとの結合の有用性を評価するための臨床試験が行われた。（Dupont B.2002,J.Antimicrobial Chemotherapy;49,Suppl.S1,31-36）。
【０００７】
アンフォテリシンＢのデオキシコレート懸濁液を単独及び内部脂質との混合物とを使用する８２人の子供におけるそのような比較研究の一つの中で、混合による恩恵はアンフォテリシンＢの安全性又は耐性の改善において見いだせなかった。（Nath,CE et.al.1999,Antimicobial Agents and Chemotherapy;43:1417-1423）。アンフォテリシンＢの両方の形は成人患者において他の研究でも比較されて評価され、アンフォテリシンＢを内部脂質と共に或いは内部脂質なしで与えられたグループにおいて腎毒性に対する顕著な違いは見いだされないという観察結果が示された。（Nucci,M et.al.1999,Antimicrobial Agents and Chemotherapy;43:1445-1448）。
【０００８】
内部脂質混合物の有利な点が無いことのほかにもアンフォテリシンＢ内部脂質混合物の投与に関連して著しい問題がある。それはより低い治療剤活性、血小板減少症、肝機能異常、胆汁鬱滞性黄疸及び肺毒性である。（Deray,G.2002,J.Antimicrobial Chemotherapy;49,Suppl.S1,37-41）。
【０００９】
またアンフォテリシンＢの毒の影響を減ずるために通常考えられる他のとりうる道はより遅い速度での点滴である。しかし予期される研究が腎不全をもつ患者においてより遅い点滴速度はアンフォテリシンＢの毒性を減ずることはなかったと結論づけたが、（Ellis,M.E.1992, Antimicrobial Agents and Chemotherapy;36:172-179）、急激な点滴は重症な高カリウム血症及び潜在的に致命的な不整脈を克服するために避けるよう忠告される。（Bell,N.H.et.al.1962,American Journal of Medicine;340:64-69及びCraven P.C.1985,Antimicrobial Agents and Chemotherapy;27:868-871）。アンフォテリシンＢの毒性は非常に重大であるため非常に限られた増大な長所と共にアンフォテリシンＢのすべての製剤の遅い点滴が標準的実施となっている。
【００１０】
アンフォテリシンＢの副作用はしかしながらアンフォテリシンＢ脂質製剤によって幸運にも克服される。（Sunder S and Murray HW,1996:173:762-765及びSeaman et.al.1995;21:188-193）。リポソーマルアンフォテリシンＢは薬物耐性問題もなく最も効果的で安全な薬として今では確立されている。
【００１１】
内臓リーシュマニア症の治療に対するアンフォテリシンＢのリポソーム化製剤の戦略的適性はリーシュマニアが例えばマクロファージのようなスカベンジャー細胞内に存在すること、リポソームは急速にマクロファージによって取り込まれること、アンフォテリシンＢは効果的な抗リーシュマニア薬剤であること、アンフォテリシンＢはリポソーム化調合剤として製剤されることができることというような要因を含む様々な要因から発する。これらのすべてはリポソーマルアンフォテリシンＢの駆虫作用の決定部位への標的送達を促進し、アンフォテリシンＢの毒性を減じる。付け加えるとリポソームは作用部位に送達されたそれぞれのリポソーム粒子において薬剤の巨大分子の濃縮被膜を通じて増幅効果を提供する。（Gregoriadis G,1995.Engineering liposomes for drug delivery:Progress and Problems.TIBTECH;13:527-537）。リポソーム内でアンフォテリシンＢをカプセル化することによる毒性の防御がリポソーマルアンフォテリシンＢを内臓リーシュマニア症の治療の最も良い選択とする。
【００１２】
全身性の真菌症の治療に使用するための製剤のアンフォテリシンＢの毒性を最小にするための重大な脂質成分はステロールである。製剤に利用できるステロールのうちコレステロール、コレステロール琥珀酸塩及び硫酸コレステリルは実験的或いは商業的アンフォテリシンＢ脂質調合剤の中で使用される。あるリン脂質と共にエルゴステロールで構成されるアンフォテリシンＢの製剤が試験管内で赤血球の溶解を引き起こすことが報告されており、それゆえ不適当であると信じられている。(Mehta,R.et.al.1984,Biochimica et Biophysica Acta;770:230-234)。
【００１３】
限られた数のリン脂質の組み合わせとエルゴステロールを有する不成功に終わった試みがアンフォテリシンＢ製剤に含まれるエルゴステロールの開発の更なる努力を妨げた。（New,P.R.C.et.al.1981,J.Antimicrobial Agents and Chemotherapy;8:371-381及びGraybill,J.R.et.al.1982,J.Infectious Diseases;145:748-752）。
【００１４】
アンフォテリシンＢの細胞溶解性作用は細胞内に存在するステロールとアンフォテリシンＢとの相互作用を通じて仲裁される。薬剤は哺乳類の細胞膜に最も存在するステロールであるコレステロールよりも真菌類の細胞膜の主要な要素であるエルゴステロール（Szoka,F.C.and Tang,M.1993,J.Liposome Research;3:363-375）、及びリーシュマニアの寄生によってひきおこされたカラアザールに存在するエルゴステロールの前駆体（Meyerhoff,A.1999,Clinical Infectious Diseases;28:42-48）とのより強い親和力を有する。細胞膜内のステロールとアンフォテリシンＢとの結合は、結果として薬剤の細胞溶解性作用を引き起こす小穴の形成となる。哺乳類の細胞に対する治療的抗菌作用と毒性は両者とも同じメカニズムによって引き起こされる。
【００１５】
病原体を標的にし哺乳類の宿主を忌避することによって獲得される宿主細胞への毒性を減ずるために、リポソームを含むコレステロールが１５ｍｇ／ｋｇ体重／日までの高い服用量の攻撃的な治療ですらある全身的真菌症治療のずばぬけた方法として出現した。そのような攻撃的な治療のためにより高濃度のアンフォテリシンＢの製剤の投与がよりよいアプローチであると思われる。アンフォテリシンＢの濃縮調整から予期される毒性の明白な懸念はゆっくり点滴をすることを勧めると共にアンフォテリシンＢのすべての調整は1mg/mlに限定した。
【００１６】
アンフォテリシンＢの毒性のそのような懸念は内在する内部細胞に寄生するマクロファージによって引き起こされるリーシュマニア症のリポソーマルアンフォテリシンＢを用いる治療にとってより重要と憶測する。リポソームはマクロファージ内に急速に食作用を受けることが知られており、明らかにマクロファージ内にアンフォテリシンＢがカプセル化されたリポソームの濃縮が結果としておこるだろう。戦略を要求される毒性を引き起こすことなしにより高濃度のアンフォテリシンＢを有するリポソームを製剤することはまだ報告されていない。
【００１７】
ステロール合成の理解はリポソーマルアンフォテリシンＢを用いる急速な効果的でかつ特殊なリーシュマニア症治療の理論設計のために重要である。脂質はリーシュマニア細胞の乾燥重量の１５％の割合を占める。（Meyer and IIoIz,1966,J.Biol.Chem.24:5000-5007）。脂質代謝はいくつかの生体の生理学的プロセスにとって重要であり、また寄生体の生存に影響を及ぼす。エルゴステロール或いはその前駆体エピステロールはアセチルＣｏＡからevalonateへ、スクアレンヘ、ラノステロールへ又更に続く４つのステップを経て最終的にエルゴステロールへ新たに合成される。(Coppens and Courtoy.1995,Mol.Bichem.Parasitol.73,179-188 及び US特許No.6,403,576B1)。
【００１８】
リーシュマニアが彼らの維持のためにコレステロールを要求し、彼らの宿主マクロファージ細胞からコレステロールを回収することによってその要求を満たすことに注目することは適切なことである。有効な薬剤設計は逆にリーシュマニアのコレステロール要求を奪うことによってリーシュマニアの効果的な生き残りを慎重に包含すべきである。
【００１９】
リポソームを含むコレステロールの細網内皮系細胞の貧食性活動を通じるある程度の送達はリーシュマニアの巣であるマクロファージ内のアンフォテリシンＢの標的送達の利点を否定する。
【００２０】
より短い期間のアンフォテリシンＢの２０−２１ｍｇの投与も又糖尿病患者に望ましくない蔗糖の投与の結果となる。従来のアンフォテリシンＢと０．９％塩化ナトリウムとの混合物は結果としてアンフォテリシンＢの沈殿となることが知られている。（Martindale,p315）。さらにグルコース、マンニトール、トレハロース、蔗糖及びラクトースのような一糖類及び二糖類もまたリポソーム化製剤に安定を与えることが報告されている。（ＵＳ特許No.5,180,713）。これらの観察はリポソーマルアンフォテリシンＢ懸濁液に塩化ナトリウム溶液の使用を反論し、また使用法は塩水を使用しないように忠告している。（AmBisome product information）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２１】
本発明の主な目的は、それによってアンフォテリシンＢの毒性を減じる、リポソーマルアンフォテリシンＢの標的送達による伝染病の治療のためにステロール濃縮混合層状アンフォテリシン挿入リポソームを提供することである。
【００２２】
本発明の他の目的は、適当なコレステロールの置き換えを伴うリポソーマルアンフォテリシンＢを作製することである。コレステロールは通常リポソーム化薬剤／ワクチンの漏れを防ぐために使用され、またアンフォテリシンＢ製剤の場合コレステロールは標的とするため及び毒性を最小にするために用いられる。コレステロールはしかしながら宿主の内部でリーシュマニアが生き残ることを援助し、従って製剤の成分として採用すべきではない。
【００２３】
また本発明の更に他の目的は毒性を引き起こさずに標的領域へより高濃度のアンフォテリシンＢを送達することである。
【００２４】
本発明の他の目的は身体内のよりよい生体分布を促進するためにリポソーム化薬の細胞質半減期を増加するために投与前にリポソーム化薬剤に超音波をかけることである。
【００２５】
またその発明の更なる他の目的は、リポソーマルアンフォテリシンＢを含みそれゆえに糖尿病患者によって自由に使用できる糖を含まない構成を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
前述の目的を達成するためにこの発明は伝染病治療のためにアンフォテリシンＢの濃度が１〜１５ｍｇ／ｍｌである０．９％塩水中のステロール濃縮混合層状アンフォテリシン挿入リポソームを提供する。これはリポソーム中のアンフォテリシンＢの濃度が高いものである。
【００２７】
ステロールはコレステロール含有或いは非含有のエルゴステロールである。ステロールはリン脂質と結合している。前記リン脂質はホスファチジルコリンである。エルゴステロールはリポソームの合計脂質の５０％を構成する。ホスファチジルコリン、エルゴステロール及びアンフォテリシンＢの好ましい比率の一例は５：２：１である。
【００２８】
投与前に超音波をかけることは細胞質の半減期を増加しよりよい生体分布を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
リポソームの特にステロールの脂質構成の選択は力価が高く有効なそして安全な抗リーシュマニア症薬の慎重な設計に重要である。適切なステロールの封入は哺乳類宿主細胞とリポソーマルアンフォテリシンＢとの結合を妨げるために必要である。リポソーマルアンフォテリシンＢを含むコレステロールの貧食性の取り込みを通じたリーシュマニアの巣であるマクロファージ内へのコレステロールの送達はアンフォテリシンＢの標的送達の最適な利点を無効にする。リポソーム内のある脂質と結合したエルゴステロールの他のステロールの選択は上記で概要を述べたように試験管内で赤血球へ毒性を引き起こすことが示された。この発明はコレステロールなしでリポソーマルアンフォテリシンＢを含む最適なステロールを設計することを取り上げた。
【００３０】
コレステロール含有或いは非含有のエルゴステロール及び割合の範囲内で合成の或いは豆のような自然源からの脂肪酸構成にかかわらずホスファチジルコリンのようなリン脂質と結合したエルゴステロールは、リーシュマニアのような伝染病に対して安全で力価が高く有効なリポソーマルアンフォテリシンＢを製剤するのに適していることが発見された。アンフォテリシンＢの濃度範囲は最終調合で１−１５ｍｇ／ｍｌの間で用いられた。脂質すなわちリン脂質好ましくはホスファチジルコリンとエルゴステロールは、エルゴステロールがリポソーム化製剤の合計脂質の５０モル％以上を構成するような割合で採用される。例えば一つの好ましい製剤は水性媒体中でＰＣ：エルゴステロール：アンフォテリシンＢのモル比率が５：２：１のものである。
【００３１】
アンフォテリシンＢは塩水の中で沈殿することが良く実証される。これより前に報告されたリン脂質構成のリポソーム内のアンフォテリシンＢは安定させられ長期間の貯蔵においてすら沈殿は全くおこらない。本発明は緩衝液有り或いはなしの塩水内のぶどう糖の置き換えを許す。一つの好ましい例はリポソーマルアンフォテリシンＢの懸濁液として０．９％塩化ナトリウムを用いることである。このようなリポソーム化製剤は懸濁液内でまた凍結乾燥後の貯蔵時の両方ともにおいて安定である。
【００３２】
換言すれば凍結乾燥されたリポソーマルアンフォテリシンＢは０．９％塩化ナトリウムのような水溶液中で再構成されてもよい。
【００３３】
リポソーマルアンフォテリシンＢの調整方法は限定されるものではないが以下の実施例によって説明される。
【実施例】
【００３４】
リポソームは単独で或いは結合して様々な方法を使用することによって製造されることが出来る。(Szoka,F.Jr.and Papahadjopoulos,D.,1980.Ann.Rev.Biophys.Bioeng.9:467-508)。
【００３５】
実施例１：リポソーム化された構成要素のメタノール性溶液は構成要素の薄膜を与えるために乾燥させられる。この薄膜は水溶液を用いて水和され、多薄膜のリポソームが薄膜の向きを変えることによって製造される。
【００３６】
実施例２：リポソーム化された構成要素のメタノール性溶液はスプレードライヤー法で製造され、それから混合層状リポソーム化調合剤を与えるような最適の水性媒体内で水和され再構成される。
【００３７】
実施例３：リポソーム化された構成要素のメタノール性溶液は構成要素の薄膜を与えるために乾燥させられ、最適の水溶液を加えられ、それから超音波を受けさせられ、結果として優勢的に単一層リポソーム化調合剤となる。
【００３８】
［生体治療特性］
より高いリポソーム濃度を有するエルゴステロールＰＣリポソームは良い耐用性があり慢性及び急性毒性の両方に関して安全であることが見いだされている。調合剤のｍｌ中アンフォテリシンＢ１５ｍｇまでを有するこれらのリポソーム化製剤は副作用の関係するあらゆる点滴なしに投与されることができる。これらの製剤のＬＤ５０はコレステロール−ＰＣリポソーマルアンフォテリシンＢによって報告されたものより高い。
【００３９】
腎毒性はこの薬の投与後の様々な時間の期間における血清クレアチニン値の変化を測定されることによって決定される。血清クレアチニン値はリーシュマニア症の完全な治療のために要求される完全投与量すなわち２１ｍｇ／ｋｇ体重の投与まで大きく変化しないで保たれた。
【００４０】
リーシュマニアはここで報告されたリポソーム内のアンフォテリシンＢを２１ｍｇの投与後のエルゴステロールＰＣリポソームにカプセル化された濃縮アンフォテリシンＢのうちのいくらかを使用して完全に片づけられた。ただ少しの場合のみ、リポソーマルアンフォテリシンＢの追加服用量が完全な寄生虫の片づけに要求された。
【００４１】
この発見を支持するためにここで記述されたように準備されたこの発明のステロール構成物を用いて耐性研究がねずみで行われた。１０ｍｇ／ｍｌまでのアンフォテリシンＢのより高い濃度が投与された。耐性研究はリポソーム化製剤のためにエルゴステロール内で一回の服用量として１００ｍｇアンフォテリシンＢ／ｋｇはよく耐性されることを示した。
［参考資料］
Nath,CE et.al.1999,Antimicrobial Agents and Chemotherapy;43:1417-1423
Ellis,M.E.1992,Antimicrobial Agents and Chemotherapy;36:172-179
Bell,N.H. et.al.1962,American Journal of Medicine;340:64-69
Craven P.C.1985, Antimicrobial Agents and Chemotherapy;27:868-871
【国際調査報告】
2008501782.tif 000002
2008501782.tif 000003
2008501782.tif 000004