(57)【要約】  ショットガン・ライブラリから得られるマップを使用し、オープンリーディングフレームのどちらかの側のクローン開始部位におけるギャップの存在を決定することにより、毒性タンパク質をコードする遺伝子を検出する方法を記載する。本方法は、以前は未知であった制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を同定することにより例証されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）標的ＤＮＡ配列に整列されたショットガン・ライブラリ由来の複数のショットガン・クローンのコンピュータ・シミュレーションによるマップを取得すること、
（ｂ）ＯＲＦにまたがっているクローンの数が統計的に不十分であるような領域において、ショットガン・クローンの開始部位における数値不足に対応する前記マップ中のギャップを検出すること、および
（ｃ）前記ＯＲＦのタンパク質産物が毒性タンパク質か否かを判断すること、
を含む、毒性タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するための方法。
【請求項２】
前記領域がＯＲＦのほぼ一つの末端で始まり、ＯＲＦを越えて延びている、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ＤＮＡ断片がゲノムである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ゲノムが細菌ゲノム、古細菌ゲノムおよびウイルスゲノムから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記毒性タンパク質が制限エンドヌクレアーゼである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記毒性遺伝子がメチラーゼに隣接するＯＲＦにマッピングされている、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記ＯＲＦから前記毒性タンパク質を発現する遺伝子を特定する段階が、インビボで前記ＯＲＦを発現することまたはインビトロ翻訳により前記ＯＲＦを発現することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
(ａ)標的ＤＮＡ配列上に整列されたショットガン・ライブラリ由来のショットガン・クローンのコンピュータ・シミュレーションによるマップを取得すること、
（ｂ）ＯＲＦにまたがるクローンの不足しているような領域において、ショットガン・クローンの開始部位の欠損に対応する前記マップ中のギャップを検出すること、および
（ｃ）前記ＯＲＦのタンパク質産物が毒性タンパク質か否かを判断すること
を含む、毒性タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を同定するための方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
毒性タンパク質はどのゲノムにも認められるものであり、さまざまな機能を果たす。微生物ゲノムの多くは、異なる分離株間で大きく変化し生物医学研究では著しい実用性がある制限エンドヌクレアーゼとして知られる毒性タンパク質を発現する。１つの細菌ゲノムにいくつもの制限エンドヌクレアーゼが含まれることがあり、活性があるものもあれば、ないものもある。互いに配列相同性をほとんど共有しないかまたは全く共有しない制限エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子を発見する１つの手がかりに、これらの遺伝子がメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子と空間的に隣接しているということがある。後者の（メチルトランスフェラーゼをコードする）遺伝子には保存された配列モチーフが存在するため、バイオインフォマティクスの手法を用いて同定することが可能である（米国特許第６，３８３，７７０号および第６，６８９，５７３号）。
【０００２】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）がメチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の近傍で同定されたとしても、制限エンドヌクレアーゼをコードするＯＲＦを識別する配列識別子は存在しない。さらに、クローニングすることなく推定した制限エンドヌクレアーゼに活性があるかまたは突然変異体であるかを判断することは今でも不可能である。
【０００３】
事実、不活性遺伝子へとつながる突然変異はきわめてよくあることである。（Ｋｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２８：  ３２１６‐３２２３  （２０００）  ；  Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ，  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９８：  ２７４０‐２７４５（２００１））。活性制限酵素を生成することができる制限酵素遺伝子を確実に同定することが可能なバイオインフォマティクス法を得ることがきわめて望ましいといえよう。これにより、クローニングおよび生物化学的分析が最も効率的な形で行えるようになる。
【０００４】
ショットガン・ライブラリはゲノム配列決定のために広く使用されてきた。ゲノムＤＮＡは物理的切断、制限エンドヌクレアーゼによる開裂、非特異的ヌクレアーゼまたは化学的方法により約２０００塩基の断片に分解される。次に、これらの断片をベクター内にクローニングした後、宿主細胞のなかでも最も一般的な大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）をこのベクターで形質転換する。次に、ベクターを複製してクローンを作製する。ひとつのライブラリには通常、約２５，０００クローンが含まれる（表１参照）。次に、これらのクローン内にある二重鎖のゲノムＤＮＡのうち一本鎖の配列決定を行ない、後にコンティグ・マップに組み込まれるリードが得られる。これらのゲノムマップは公開データベースで探し出すことが可能である。通常、マップが得られるショットガン・ライブラリは保存される。
【発明の開示】
【０００５】
本発明の一実施形態において、ＯＲＦが毒性タンパク質をコードしているか否かを確認する一方法を提供する。この方法には以下の段階が含まれる：（ａ）標的ＤＮＡ配列に整列されたショットガン・ライブラリからの、クローンのコンピュータ・シミュレーションによるマップを取得すること；（ｂ）前記ＯＲＦにまたがるクローンが統計的には不十分な数しか存在しないかまたは不足しているような領域において、ショットガン・クローンの開始部位の数値不足または欠損に対応する前記マップ中のギャップを検出すること；および（ｃ）前記ＯＲＦのタンパク質産物が毒性タンパク質かを判断すること。
【０００６】
本発明の一実施形態において、前記領域はＯＲＦの一端内から始まり、そのＯＲＦを越えて延びている。例えば、あるクローン開始部位は、そのクローンがＯＲＦを越えて延びているが、活性タンパク質が発現しないようなＯＲＦの末端から数ヌクレオチドのところにあり得る。このクローン開始部位は、したがってＯＲＦを越えて延びている開始部位においてギャップの境界を表し得、このＯＲＦはクローン化することが不可能な機能的な毒性タンパク質をコードしている配列を表している。
【０００７】
ある実施形態において、標的ＤＮＡ断片はゲノムであり、さらに具体的には、細菌、古細菌またはウイルスから得られるゲノムである。他の実施形態では、毒性タンパク質はメチラーゼに隣接したＯＲＦによってコードされた制限エンドヌクレアーゼである。
【０００８】
他の実施形態において、ＯＲＦをインビボで発現することまたはインビトロ転写／翻訳により発現することの追加の段階がこの方法に含まれる。
【０００９】
図面の説明
図１ａは、仮想の制限エンドヌクレアーゼ（Ｒ）およびメチルトランスフェラーゼ（Ｍ）遺伝子を含むゲノムのある部分の模式図である。重複したクローンにより、ゲノムのこの部分の配列を決定することができる。発現産物に毒性があるために、いずれの単一クローンにも完全なＲ遺伝子の配列は存在しないと予測されている。
図１ｂは、ショットガン・クローンの長さを平均２０００塩基対と想定した毒性遺伝子を示しているＯＲＦ周囲のギャップの位置の略図である。（７）は１０００塩基対の毒性遺伝子に対応する。（８）は毒性タンパク質の発現に必要な推定毒性遺伝子中の８５０塩基対に対応する。（９）は二重鎖ゲノムＤＮＡのトップ・ストランド上のクローン開始のギャップに対応する。（１０）は二重鎖ゲノムＤＮＡのボトム・ストランド上のクローン開始のギャップに対応する。（１１）はトップ・ストランドのギャップ（１０）の５’側および３’側の境界に対応するのに対して、（１２）はボトム・ストランドのギャップ（９）上の５’側および３’側の境界に対応する。遺伝子の大きさおよび毒性タンパク質の発現に必要とされる部位は仮想例であり、大きさについての制限を表そうとするものではない。実際の大きさは、種々の遺伝子によって変化する。
図２は、ショットガン・シーケンスのリードのコンピュータ解析のフロー図である。
図３ａは、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩをコードしていることで既知のヘモフィルス・インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ゲノム領域にわたるショットガン・ライブラリ中のクローンのクローン開始の分布を示す図である。（１）および（２）はギャップの位置を印す。予測したように、トップ・ストランドおよびボトム・ストランド上のＯＲＦの両端部に位置するギャップは、宿主の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して毒性を有する制限エンドヌクレアーゼ遺伝子（ＨｉｎｄＩＩ）の存在を反映している。それぞれの縦棒は５’から３’の方向に伸長した、標的ＤＮＡの一本鎖上にあるショットガン・クローンの開始部位を示す。
図３ｂは、図３（ａ）で示したヘモフィルス  インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ゲノム領域にわたるショットガン・クローンのリードの分布の模式図である。濃い線は整列された配列に対応し、薄い線は整列されていない配列に対応している。ＶｔはＤＮＡのトップ・ストランド上にマッピングされたクローン開始分布のギャップを示し、ＶｂはＤＮＡのボトム・ストランド上にマッピングされたクローン開始分布のギャップを示す。
図４は、ＭｊａＩＩをコードしていることで既知のメタノコッカス  ヤナシゲノム（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）領域にわたるショットガン・ライブラリ中のクローンのクローン開始の分布を示す図である。（３）および（４）はギャップの位置を印す。予測したように、トップ・ストランドおよびボトム・ストランド上のＯＲＦの両端部に位置するギャップは、宿主大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して毒性を有する制限エンドヌクレアーゼ遺伝子（ＭｊａＩＩ）の存在を反映している。ギャップ内にマッピングされた２つのクローン開始部位は、タンパク質を発現することができない突然変異クローンに対応している。
図５は、メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＭｃａＴＯＲＦ１６１６Ｐ）を、その後にｖｓｒ  ＤＮＡミスマッチエンドヌクレアーゼが続くＯＲＦによってコードすると考えられるメチロコッカス  カプスラーツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ゲノム領域にわたるショットガン・ライブラリ中のクローンのクローン開始分布を示す図である。（５）および（６）はギャップの位置を印す。ギャップと推定メチルトランスフェラーゼとの間のＯＲＦ領域をクローニングし、このクローンの遺伝子活性を検査したところ、ＯＲＦが制限酵素をコードしていることが明らかになった。これらの配列のインビトロ転写／翻訳により、Ｍ．ＭｃａＴＯＲＦ１６１６Ｐとｖｓｒ  ミスマッチエンドヌクレアーゼの間のＯＲＦは制限エンドヌクレアーゼ活性があることをさらに確認した。
図６は、Ｍｃａ１６１７のエンドヌクレアーゼ活性のアガロースゲル画像を示す図である。レーンを注釈する：Ｍ、２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー；１、ラムダＤＮＡのみ；２、ラムダＤＮＡ＋ＩＶＴ混合物２μl，ＤＮＡテンプレートなし;３、ラムダＤＮＡ＋ＩＶＴ反応混合物２μlとＭｃａ１６１７ＰＣＲ産物；４、ラムダＤＮＡ＋ＩＶＴ反応混合物２μlとＭｃａ１６１７ＰＣＲ産物，１Ｘ  ＮＥＢ  バッファー２を追加；５、ラムダＤＮＡ＋ＩＶＴ混合物２μlとＭｃａ１６１７ＰＣＲ産物，１Ｘ  ＮＥＢ  バッファー４を追加（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．、  マサチューセッツ州、ベバリー）。
図７は、粗抽出液中のＭｃａ１６１７エンドヌクレアーゼ活性を示す図である。各レーンは以下のとおりである。
レーン１およびレーン７：ｌａｍｂｄａ‐ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｈｉＸ‐ＨａｅＩＩＩサイズスタンダード（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、ベバリー）；
レーン２：粗抽出液９μl／反応物５０μl；
レーン３：粗抽出液３μl／反応物５０μl；
レーン４：粗抽出液１μl／反応物５０μl；
レーン５：粗抽出液０．３μl／反応物５０μl；
レーン６：粗抽出液０．１μl／反応物５０μl。
図８は、ＢｓｓＨＩＩ開裂活性と比較したＭｃａ１６１７エンドヌクレアーゼの開裂活性を示す図である。
レーン１およびレーン５：ｌａｍｂｄａ‐ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｈｉＸ‐ＨａｅＩＩＩサイズスタンダード（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、ベバリー）；
レーン２：Ｍｃａ１６１７で切断したラムダＤＮＡ；
レーン３：Ｍｃａ１６１７およびＢｓｓＨＩＩで切断したラムダＤＮＡ；
レーン４：ＢｓｓＨＩＩで切断したラムダＤＮＡ。
【００１０】
（実施例の詳細な説明）
活性制限酵素遺伝子を同定し、従ってそのような遺伝子の最も効率的な分子的構造ｋ解析を行うことが可能なバイオインフォマティクスの方法を提供する。これにより、新たな特異性を有する制限エンドヌクレアーゼの発見方法を提供する。
【００１１】
この明細書および特許請求の範囲で使用するために、以下の用語を定義する。
【００１２】
用語「毒性タンパク質」は、宿主細胞内で発現させると、宿主細胞が発育不能になるか細胞死に至るタンパク質を意味する。
【００１３】
用語「宿主細胞」は、外来性ＤＮＡによって形質転換が可能なあらゆる細胞を意味する。ここで、外来性ＤＮＡは遺伝子を含むプラスミドまたはベクターであってよく、この遺伝子は細胞内で発現することができる。
【００１４】
用語「ショットガン・ライブラリ」は、ゲノムまたは巨大ＤＮＡの断片化によりランダムに作製され、好適な宿主生物、通常は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内でクローン化されたＤＮＡ断片を含む一連のクローンを意味する。ショットガン配列決定法には、クローンに挿入されたＤＮＡ断片を配列決定することが含まれる。ゲノムまたは巨大ＤＮＡは、ヒト、哺乳類または植物を含む真核生物由来であってよく、原核生物、ウイルスまたは古菌類由来であってもよい。ゲノムまたはＤＮＡ断片の起源に関する制限はない。また、ショットガン・ライブラリがマッピングされるＤＮＡのサイズについても上限はない。各ショットガンＤＮＡ断片が２０００塩基であるならば、ショットガン断片をマッピングさせるＤＮＡまたはゲノムのサイズは２０００塩基よりも大きくなることがわかっている。ここに記載の方法は、ショットガン・ライブラリを用意し、ゲノムの配列決定に使用してしまえば廃棄されてしまう、多くの潜在的に有用な情報を活用するものである。上述のとおり、本解析に対するショットガン・ライブラリ内のクローンの重要性は、クローン開始部位をマッピングすることと関係がある。
【００１５】
ショットガン・ライブラリは配列全体の約５倍から２０倍に相当する断片を含むことになる（例えば、表１参照）。通常、断片の最初の調製はランダムに行われるので、産生されたそのランダムな配列データを、ジグソーパズルを元に戻すこととほぼ同じ要領で再構成する必要がある。クローン開始およびこれによりクローンから得られる配列は実質的にランダムであり、しかもゲノムに沿って一様に分布していることが確認されている。ここでは、ゲノム内に毒性タンパク質をコードしているＯＲＦが存在しているときには、ランダムなパターンを破壊することが可能であることを示している。
【００１６】
用語「ギャップ」はクローン開始部位が欠損している標的ＤＮＡ断片の領域を意味する。ＯＲＦにまたがる単一のクローンが存在せず、かつクローン開始にギャップが認められる状況では、そのＯＲＦは、宿主細胞に対して毒性のあるタンパク質をコードしていると推測される。したがって、適切な鎖の上で２つのギャップに囲まれたＯＲＦは、このＯＲＦがクローン化される宿主に対して毒性のあるタンパク質をコードしていると推測される。しかし、このギャップは統計的に不十分なクローンまたはわずか１つのクローンにより割り込まれていることがある。この１つまたはそれ以上のクローン開始部位が複数のクローンと対応することがあり、このクローンは発現タンパク質の機能を破壊する変異を有すると推定される。そのような変異の例には、フレームシフト、切断、欠失、翻訳阻害変異または外来性の配列への融合を含むキメラが含まれる。
【００１７】
ギャップは、ギャップの１つ目の境界が、ＯＲＦ内部のわずかなヌクレオチドにありおよびＯＲＦの全部ではないがほとんどを包含するように広がるクローン開始部位により表され、ならびに二つ目の境界が、ＯＲＦから離れた多くのヌクレオチドにあり、しかしＯＲＦ全体を包含するほど長くはないクローンを確定するクローン開始部位により表される、２つの境界開始部位によって同定し得る（図１ｂ）。
【００１８】
用語「リード」は、ショットガン・ライブラリからの約２０００塩基対断片の約５００塩基対に対応した配列を意味する。１回の配列決定事象において、２０００塩基対の断片に対する全配列が確実に決定できるわけではない。リード中の約５００塩基対の断片が、１回の配列決定事象で最も確実に決定することができる配列である。リードの重要な特徴は、クローン開始部位が決定されることである。あるクローンの存在を知りそのクローン開始部位をマッピングすることは、リードの正確な長さや配列を知ることよりも重要である。ある場合には、実際の配列は、この配列が機能を破壊する突然変異または同様に機能を破壊する外来性ＤＮＡを有するキメラクローンの存在を示すときには意味がある。
【００１９】
上記の所見は、制限エンドヌクレアーゼを含むことで知られている被験ＤＮＡゲノムについて検査し確認された。しかし、一般的な方法もまた他の毒性タンパク質に対して適用可能であることが予期される。図３‐４において、ＯＲＦの内側に広がるトップ・ストランド上およびボトム・ストランド上で、ヘモフィルス  インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）のＨｉｎｄＩＩおよびメタノコッカス  ヤナシ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）のＭｊａＩＩを発現するＯＲＦの特徴的なギャップが認められる。ＨｉｎｄＩＩ遺伝子およびＭｊａＩＩ遺伝子のボトム・ストランドに対応するクローンマップに印された単一クローンは、発現タンパク質がその機能を喪失させるような突然変異を有している。
【００２０】
さらに、この手順を、毒性遺伝子についてはかつて解析したことがないメタノコッカス  カプスラータ（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔａ）のゲノムＤＮＡについて検査した（図５）。図５には、ギャップを図示したように同定し、続いてインビトロ転写／翻訳（実施例１）およびクローニング（実施例２）によって、制限エンドヌクレアーゼをコードすることを示した。
【００２１】
毒性タンパク質をコードするＯＲＦを同定するための、ショットガン・ライブラリを用いるこの実際に機能する方法は確固たるものである。図および実施例が、新規の制限エンドヌクレアーゼタンパク質を発見するにあたり、この取り組みが実用的であることを明示している。この取り組みの優れた点は、機能性を直接測定することにある。従来、制限エンドヌクレアーゼのような毒性タンパク質をコードすると考えられるＯＲＦは、既知の毒性タンパク質との配列相同性などの配列の特徴、またはメチルトランスフェラーゼなどの他の遺伝子と隣接する位置により同定された。以前であれば、次に、この遺伝子産物の毒性が原因で問題が山積みの条件のもとで、これらの配列をクローン化し、発現させることにより、その機能性を明らかにするために発現させていた。メチラーゼに隣接するＯＲＦのいずれもが活性制限エンドヌクレアーゼをコードしていることが明らかになったわけではなかった。例えば、Ｍ．ＨｉｎｄＶのＯＲＦ(ヘモフィルス  インフルエンザ（Ｈ．  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ゲノムのＨＩ１０４１）に隣接する推定制限エンドヌクレアーゼをコードするＯＲＦが、不活性であることが明らかになった。このことは、本方法を用いたショットガンクローニングのマップにより容易に予測可能である。
【００２２】
データ解析
ショットガン・シーケンス実験からの最初のリードは、通常クローン化されたＤＮＡのより長い断片、通常１，５００から２，０００ヌクレオチド、の末端を表す４００〜５００ヌクレオチド長のＤＮＡ配列が含まれている。細菌のショットガン・ライブラリには一般に少なくとも２５，０００クローンが含まれる。３種の細菌株についての例を表１に示す。
【００２３】
潜在的な致死遺伝子を同定するためのリードの解析を以下のとおり実施する。
【００２４】
ＢＬＡＳＴＮ  （Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  Ｓ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３（１９９０））などの検索アルゴリズムを使用して、各配列リードの末端を、完成した完全なゲノム配列内の適切な位置にマッピングする。完成したゲノム配列上の各ＯＲＦをすべて収集した配列リードと対比して照合し、配列リードの末端をＯＲＦおよびその隣接する配列上にマッピングする。これをゲノム配列上のすべてのＯＲＦについて繰り返す。このようにして、ショットガン・シーケンスの開始部位とおおよその範囲を決定することが可能であり、図１から５に例示したように、元の配列上にショットガン・ライブラリがマッピングされることとなる。
【００２５】
同定されたすべてのＯＲＦの位置は、マッピングされた配列リードと対比してチェックする。配列リードは不正確であることが多いが、偶発的な配列エラーは重要でない。重要なことは、リードがクローンの存在を確認することである。
【００２６】
まれに、クローン化した配列が不活性化する変異を含むことから、クローン開始が推定される致死遺伝子にまたがるクローンを供することが予測される。これは珍しいことではあるが、ときどき起こり得ることである。したがって、無傷のＯＲＦは致死遺伝子の候補である。例えば、図１ａの模式図に示したＲ遺伝子とＭ遺伝子の場合、内部にＲ遺伝子を完全に含むクローンは全くないが、Ｍ遺伝子を含むものは示されている（図１ａ、リード９から１４）。以上から、Ｒ遺伝子は致死遺伝子の候補である。
【００２７】
配列リードが得られたクローンの平均サイズよりも短いＯＲＦについて、この手順が最も効果的であることに留意すべきである。ＯＲＦが約２０００塩基対よりも長いところでは、２回目に収集された、挿入断片の平均サイズが長めのショットガン・リードから得たデータを使用することが可能である。最初の配列のギャップを埋めるために８０００〜１００００塩基などの、大きめの挿入断片を用いたライブラリが作製されることから、そのような長めの一連のリードを利用することが可能である。
【００２８】
この過程を、致死遺伝子候補のリストを作製するために、ゲノム断片またはゲノム全体中のあらゆるＯＲＦに対して繰り返す。制限エンドヌクレアーゼの発見について特に重要なものは、メチルトランスフェラーゼ遺伝子に直接隣接するＯＲＦまたは１ＯＲＦ以上離れていないＯＲＦのどちらかである。これらは制限酵素遺伝子の好ましい候補である。
【００２９】
ショットガン配列決定法からの１つの断片が完全な毒性酵素遺伝子を有するのであれば、発現産物は宿主細胞にとって致命的となるため、クローン化することは無理である。したがって、ゲノム配列をクローン化しアッセンブルするために使用された最初のショットガン・リードから得た生データの試験は、ゲノム中のＯＲＦに対応する不連続性を示している。これらのＯＲＦは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または他の宿主細胞には通常認められないにもかかわらず宿主の原形質内に存在する基質を有する、デオキシリボヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、特定のプロテアーゼおよびその他の種類の加水分解酵素などの毒性遺伝子に対応している。
【００３０】
例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの宿主細胞内でクローン化され、適宜構成されたマップを有する細菌ゲノムは、無傷のＭ遺伝子を持つクローンを作製することもあるが、制限酵素が予測される隣接領域に対応するクローンは、致死的な制限酵素に関する完全なＯＲＦを含まない。したがって、このゲノムの機能するマップは、ゲノムのこの領域内のクローン開始の欠損に対応するギャップを含むことになる。まれに、制限エンドヌクレアーゼ遺伝子が制限エンドヌクレアーゼを不活性化する突然変異を含むと、制限エンドヌクレアーゼを発現するクローンが得られることがある。このような状況では、ギャップは存在せず、完全な遺伝子をクローン化することができる。上記の方法の優れた点は、毒性でない遺伝子はすべてショットガン・ライブラリ中に示されると想定して、クローン化できない配列を迅速に機能的に同定することである。
【００３１】
ここでは、制限エンドヌクレアーゼで例示される毒性遺伝子を以下の方法によって同定することが可能である。
【００３２】
（Ｉ）ショットガン配列決定実験で得たデータを解析する（図２）。このデータから、所与のＤＮＡメチトランスフェラーゼ遺伝子に隣接しているどのＯＲＦが制限酵素遺伝子をコードする最良の候補であるかを予測することが可能である。
【００３３】
（ＩＩ）いったんショットガン・データの解析により制限エンドヌクレアーゼ遺伝子の候補を同定すると、第一にメチルトランスフェラーゼ遺伝子をベクター内でクローン化することにより、宿主の完全なメチル化が行ない、第二に制限エンドヌクレアーゼ遺伝子を同じ宿主内でクローン化する、という二段階のクローニング手順により遺伝子を実験的に検査する（実施例２参照）。さらに、例えばｐＬＴＫ７を用いたクローニング手順が参照することにより本明細書に組み込まれる米国特許第６，６８９，５７３号に記載されている。
【００３４】
ショットガン配列決定法のデータ解析を含む、ここに記載の方法は、当技術分野に存在する遺伝情報および場合によって候補の制限修飾系などの毒性遺伝子の配列および位置の特徴を同定するためのバイオインフォマティクス技術と組み合わせて使用すると、強い予測力をもたらす。
【００３５】
米国仮出願番号６０／５７６，１９６号を含む本明細書中に引用したすべての参考文献は、本明細書に参照により組み込む。
【００３６】
【表１】
2008501340.tif 000003
【実施例１】
【００３７】
Ｍ．カプスラーツス（Ｍ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）のショットガン・シーケンスのクローン開始においてギャップにより同定されたＯＲＦが機能的な制限エンドヌクレアーゼであることの実証
１．Ｍｃａ１６１７のインビトロ転写／翻訳
プライマーＭｃａ１６１７ＦおよびＭｃａ１６１７Ｒを用いて、メチロコッカス  カプスラーツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）のゲノムＤＮＡから、第一にＭｃａ１６１７のＯＲＦを増幅した（表２）。第一のＰＣＲ産物を鋳型として用いて第二のＰＣＲを実施し、Ｔ７ユニバーサルプライマーおよびＭｃａ１６１７Ｒプライマーを用いて、Ｔ７プロモーターとリボゾーム結合部位を５’末端に付加した（表２）。ＱＩＡＧＥＮ  Ｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎμｋｉｔを用いてＰＣＲ産物を精製し、その濃度を測定したところ、４０ng／μlであった。いずれのＰＣＲもｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ．ｃｏｍ、フィンランド、エスポー）を用いて行った。プライマーはどれもＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．、  マサチューセッツ州、ベバリー）で合成された。
【００３８】
ＰＵＲＥＳＹＳＴＥＭ（株式会社ポストゲノム研究所、日本国、東京）を用いて対になっているインビトロ転写／翻訳（以降ＩＶＴ）を行った。反応物１０μlは、ＩＶＴ混合物７μl、ＰＣＲ産物１μlおよび水２μlを用いて組成した。この反応混合物を３７℃で２時間インキュベートし、インビトロ翻訳した。
【００３９】
２．エンドヌクレアーゼ活性の測定
インビトロ翻訳したＭｃａ１６１７のエンドヌクレアーゼ活性をラムダファージＤＮＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．、  マサチューセッツ州、ベバリー）の消化により検査した。ラムダファージＤＮＡ（濃度０．２μg／μl）１μgをＩＶＴ混合物２μlで消化し、３７℃で１．５時間インキュベートした。次に、濃度が０．１μg／μlのリボヌクレアーゼＡ（Ｑｉａｇｅｎ、カリフォルニア州、バレンシア）を１μl加え、この反応混合物をさらに３７℃で３０分間インキュベートした。次に、この消化反応混合物を１％アガロースゲルで電気泳動を行い分析した（図６）。
【００４０】
３．結果
図６に示すように、ラムダＤＮＡ断片を個別のバンドに分離することにより、Ｍｃａ１６１７のＰＣＲ産物を加えたＩＶＴ混合物はエンドヌクレアーゼ活性を示している（図６、レーン３、４、５）のに対して、ＩＶＴ混合物自体はそのような活性を示さなかった（図６、レーン２）。残余のラムダＤＮＡはＭｃａ１６１７の翻訳産物が不足したことによる不完全な消化によるものである。
【００４１】
【表２】
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【実施例２】
【００４２】
Ｍｃａ１６１７ＯＲＦでコードされたＭ．カプスラーツスのエンドヌクレアーゼの発現
推定メチルトランスフェラーゼＯＲＦ  Ｍｃａ１６１６および推定エンドヌクレアーゼＭｃａ１６１７を増幅するためにプライマーを設計した。順方向プライマーには、クローニングを促進する制限酵素認識部位、リボゾーム結合部位、Ｍｃａ１６１７のＡＴＧ翻訳開始コドンのＮｄｅＩ制限エンドヌクレアーゼ部位、およびＭ．カプスラーツスゲノムＤＮＡに対応する配列が組み込まれている。
【００４３】
逆方向プライマーはクローニングを促進する制限酵素認識部位を有している。合成したプライマーは以下のとおりである：
Ｍｃａ１６１６  順方向  
５’−ＧＴＴＣＴＧＣＡＧＴＴＡＡＧＧＡＧＴＡＧＡＧＣＣＡＴＧＧＣＴＡＴＴＧ−３’（配列番号５）
Ｍｃａ１６１６  逆方向  
５’−ＧＴＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＧＴＣＧＣＧＴＧＴＣＧＡＧＣＧＣＣＣＧＡＡ−３’（配列番号６）
Ｍｃａ１６１７  順方向  
５’−ＧＴＴＧＣＴＡＧＣＧＴＡＡＧＧＡＧＧＴＡＣＡＴＡＴＧＡＣＡＡＡＡＧＡＡＧＡＡＴＴＴＧＡＡ−３’（配列番号７）
Ｍｃａ１６１７  逆方向  
５’−ＧＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＣＡＡＣＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＴＴ−３’（配列番号８）
【００４４】
Ｂｅａｄ  Ｂｅａｔｉｎｇ  ｋｉｔ（ＭｏＢｉｏ，  Ｉｎｃ．、  カリフォルニア州、ソラナビーチ）を用いて、ゲノムＤＮＡをＭ．カプスラーツス細胞から単離した。このＲ−Ｍ系を発現させる最初の試みとして、順方向プライマーＭｃａ１６１６（配列番号５）および逆方向プライマーＭｃａ１６１７（配列番号８）を使用し、ホットスタートの標準的な条件のもとでＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、両遺伝子を同時に増幅させた。増幅した産物を製造業者（ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州、オレンジ）の使用指示書に従い、“ＤＮＡ精製および濃縮”スピンカラムにかけて精製した。精製したＤＮＡを標準的な条件のもとでＰｓｔＩとＢａｍＨＩで消化し、スピンカラムを用いて再度精製した。次に、このＤＮＡをあらかじめＰｓｔＩとＢａｍＨＩで切断して脱リン酸化したｐＵＣ１９ベクターに連結した。次に、連結されたベクターをＥＲ２６８３化学的コンピテントセルに形質導入し、形質転換した細胞をＬＢ培地＋アンピシリンプレート上で一晩増殖させた。約６５０コロニーが得られた。これらコロニーをプレートから剥がし、１．５mlの超音波破砕バッファー（２０mMトリス、１mM  ＤＴＴ，０．１mM  ＥＤＴＡ  pH７．５）中に置いて超音波で破砕した。その抽出物を１６，０００ｇにて１０分間遠心分離し、ラムダＤＮＡ２０μg／mlを含むＮＥバッファー２で抽出物を段階希釈することにより、上清の制限エンドヌクレアーゼについて分析した（図７）。ラムダＤＮＡの断片化を認めたことから、制限エンドヌクレアーゼ活性の存在が示された。粗抽出物を１mlのＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ  カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、スウェーデン、ウプサラ）に適用した。カラムを超音波破砕バッファー中の塩化ナトリウムのステップグラジエントにより溶出したところ、２５０mM塩化ナトリウムおよび３００mM塩化ナトリウムの段階でエンドヌクレアーゼ活性を認めた。部分的に精製したエンドヌクレアーゼを使用してｐＵＣ−ＡｄｅｎｏＢＣ４およびｐＵＣ−ＡｄｅｎｏＸｂａ  ＤＮＡ（これらのＤＮＡはｐＵＣ１９に挿入されたアデノウイルス２型のＤＮＡの一部分である）の切断部位をマッピングした。開裂部位はエンドヌクレアーゼのＧＣＧＣＧＣ部位での切断と一致していた。ＧＣＧＣＧＣはＢｓｓＨＩＩの認識配列である。ラムダＤＮＡをＭｃａ１６１７エンドヌクレアーゼで消化し、ＢｓｓＨＩＩで消化し、および２つの酵素を併せて消化した。仮にＭｃａ１６１７酵素がＢｓｓＨＩＩの部位で切断するならば、２つの酵素を併せた消化のパターンはどちらか一方の酵素だけの消化パターンと同じになるはずである。ＢｓｓＨＩＩ単独のパターンならびにＢｓｓＨＩＩとＭｃａ１６１７を併せた消化のパターンは同じである（図８）。完全に消化できるほど十分なＭｃａ１６１７酵素が存在しなかったため、Ｍｃａ１６１７単独のパターンは部分的な消化パターンを示している。興味深いことに、ＰｈｉＸ１７４  ＤＮＡ中の単一ＧＣＧＣＧＣ部位はＭｃａ１６１７酵素調製液により検出可能には切断されないが、ＢｓｓＨＩＩでは切断される。このことはＭｃａ１６１７とＢｓｓＨＩＩの間の相違を示している。
【００４５】
Ｍｃａ１６１７エンドヌクレアーゼの安定発現
Ｍｃａ１６１７エンドヌクレアーゼを安定的に発現させるため、最初にメチラーゼを細胞に導入し、細胞のＤＮＡを保護するように修飾する。その後、調節制御下エンドヌクレアーゼ遺伝子を２番目の適合性のあるベクター上に導入する。
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に制限修飾系を発現させるために、ホットスタートの標準的条件下Ｔａｑポリメラーゼを用いて、プライマー１および２でＭｃａ１６１６メチルトランスフェラーゼのＯＲＦを増幅させた。Ｍｃａ１６１７の推定エンドヌクレアーゼのＯＲＦを上記のとおりプライマー３および４で増幅させた。増幅した産物を製造業者（ＺＹＭＯ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、カリフォルニア州、オレンジ）の使用指示書に従い、“ＤＮＡ精製および濃縮”スピンカラムにかけて精製した。次に、精製したメチルトランスフェラーゼ（Ｍｃａ１６１６）のＤＮＡを標準的な条件下ＰｓｔＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、スピンカラムを用いて再度精製した。次に、このＤＮＡを、あらかじめＰｓｔＩおよびＢａｍＨＩで切断し脱リン酸化したｐＵＣ１９ベクターに連結した。連結されたベクターおよびＭｃａ１６１６のＯＲＦのＤＮＡをＥＲ２５６６化学的コンピテントセルに形質導入し、形質転換した細胞をＬＢ培地＋アンピシリンプレート上で増殖させた。１０個の個別の形質転換体が増殖した。このプラスミドＤＮＡのミニプレップを調製した。それぞれのプラスミドＤＮＡをＰｖｕＩＩで切断し、Ｍｃａ１６１６のＯＲＦが存在しているか否かを確かめた。調べた形質転換体１０個中８個はｐＵＣ１９ベクターに挿入されたＭｃａ１６１６のＯＲＦを有していた。
【００４６】
次に、これらのＭｃａ１６１６を含む細胞を増殖させて、標準的方法で化学的にコンピテント化した。推定エンドヌクレアーゼ遺伝子（ＯＲＦ  Ｍｃａ１６１７）の増幅させたＤＮＡをＮｄｅＩおよびＢａｍＨＩで切断し、スピンカラムで精製する。次に、ＤＮＡを、あらかじめＮｄｅＩとＢａｍＨＩで切断して脱リン酸化し精製してある、ｐＳＡＰＶ６などの制御される発現ベクター内に連結する。このベクター、ｐＳＡＰＶ６（米国特許第５，６６３，０６７号）はＴ７で制御される発現系を有しており、Ｔ７プロモーターの上流および下流の多数の転写終結部位の付加により増強されている。次に、連結された推定エンドヌクレアーゼおよびベクターを、推定メチルトランスフェラーゼのＯＲＦを保有しているＥＲ２５６６細胞に形質転換する。次に、ｐＳＡＰＶ６ベクター内のＭｃａ１６１７エンドヌクレアーゼのＤＮＡの存在について、個々の形質転換体を検査する。ＤＮＡを持つものを対数増殖期まで増殖させ、０．３mM  ＩＰＴＧで２時間誘導する。次に、これらの細胞を収集し、超音波破砕により溶解物を調製する。様々な量の溶解物をＮＥバッファー  ４中でラムダＤＮＡと混合し、３７＊で１時間インキュベートした後にアガロースゲル上でＤＮＡ断片の反応を検査することにより、エンドヌクレアーゼ活性について細胞抽出物を検査する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１ａ】仮想の制限エンドヌクレアーゼ（Ｒ）およびメチルトランスフェラーゼ（Ｍ）遺伝子を含むゲノムのある部分の模式図である。
【図１ｂ】ショットガン・クローンの長さを平均２０００塩基対と想定した毒性遺伝子を示しているＯＲＦ周囲のギャップの位置の略図である。（７）は１０００塩基対の毒性遺伝子に対応する。（８）は毒性タンパク質の発現に必要とされる推定毒性遺伝子中の８５０塩基対に対応する。（９）は二重鎖ゲノムＤＮＡのトップ・ストランド上のクローン開始のギャップに対応する。（１０）は二重鎖ゲノムＤＮＡのボトム・ストランド上のクローン開始のギャップに対応する。（１１）はトップ・ストランドのギャップ（１０）の５’側および３’側の境界に対応するのに対して、（１２）はボトム・ストランドのギャップ（９）上の５’側および３’側の境界に対応する。
【図２】ショットガン・シーケンスのリードのコンピュータ解析のフロー図である。
【図３ａ】制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩをコードしていることで既知のヘモフィルス  インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ゲノム領域にわたるショットガン・ライブラリ中のクローンのクローン開始の分布を示す図である。（１）および（２）はギャップの位置を印す。それぞれの縦棒は５’から３’の方向に伸長した、標的ＤＮＡの一本鎖上にあるショットガン・クローンの開始部位を示す。
【図３ｂ】図３（ａ）で示したヘモフィルス  インフルエンザ（Ｈｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）ゲノム領域にわたるショットガン・クローンのリードの分布の模式図である。濃い線はアラインメントされた配列に対応し、薄い線はアラインメントされていない配列に対応している。ＶｔはＤＮＡのトップ・ストランド上にマッピングされたクローン開始分布のギャップを示し、ＶｂはＤＮＡのボトム・ストランド上にマッピングされたクローン開始分布のギャップを示す。
【図４】ＭｊａＩＩをコードしていることで既知のメタノコッカス  ヤナシゲノム（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ）領域にわたるショットガン・ライブラリ中のクローンのクローン開始の分布を示す図である。（３）および（４）はギャップの位置を印す。
【図５】メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＭｃａＴＯＲＦ１６１６Ｐ）を、その後にｖｓｒ  ＤＮＡミスマッチエンドヌクレアーゼが続くＯＲＦによってコードすると考えられるメチロコッカス  カプスラーツス（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）ゲノム領域にわたるショットガン・ライブラリ中のクローンのクローン開始分布を示す図である。（５）および（６）はギャップの位置を印す。
【図６】Ｍｃａ１６１７のエンドヌクレアーゼ活性のアガロースゲル画像を示す図である。レーンを注釈する：Ｍ、２−ｌｏｇ  ＤＮＡラダー；１、ラムダＤＮＡのみ；２、ラムダＤＮＡ＋ＩＶＴ混合物２μl，ＤＮＡテンプレートなし;３、ラムダＤＮＡ＋ＩＶＴ反応混合物２μlとＭｃａ１６１７ＰＣＲ産物；４、ラムダＤＮＡ＋ＩＶＴ反応混合物２μlとＭｃａ１６１７ＰＣＲ産物，１Ｘ  ＮＥＢ  バッファー２を追加；５、ラムダＤＮＡ＋ＩＶＴ混合物２μlとＭｃａ１６１７ＰＣＲ産物，１Ｘ  ＮＥＢ  バッファー４を追加（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．、  マサチューセッツ州、ベバリー）。
【図７】粗抽出液中のＭｃａ１６１７エンドヌクレアーゼ活性を示す図である。各レーンは以下のとおりである：レーン１およびレーン７：ｌａｍｂｄａ‐ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｈｉＸ‐ＨａｅＩＩＩサイズスタンダード（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、ベバリー）；レーン２：粗抽出液９μl／反応物５０μl；レーン３：粗抽出液３μl／反応物５０μl；レーン４：粗抽出液１μl／反応物５０μl；レーン５：粗抽出液０．３μl／反応物５０μl；レーン６：粗抽出液０．１μl／反応物５０μl。
【図８】ＢｓｓＨＩＩ開裂活性と比較したＭｃａ１６１７エンドヌクレアーゼの開裂活性を示す図である。レーン１およびレーン５：ｌａｍｂｄａ‐ＨｉｎｄＩＩＩおよびＰｈｉＸ‐ＨａｅＩＩＩサイズスタンダード（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，  Ｉｎｃ．、マサチューセッツ州、ベバリー）；レーン２：Ｍｃａ１６１７で切断したラムダＤＮＡ；レーン３：Ｍｃａ１６１７およびＢｓｓＨＩＩで切断したラムダＤＮＡ；レーン４：ＢｓｓＨＩＩで切断したラムダＤＮＡ。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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