(57)【要約】免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの発現のための１つのＡＡＶベクター構築物、およびそれを作製し使用する方法が記載される。ＡＡＶベクターには、第１の免疫グロブリンコード配列と第２の免疫グロブリンコード配列との間に自己プロセシング切断配列が含まれており、これによって、１つのプロモーターを使用して機能性の抗体分子を発現することができる。ベクター構築物にはさらに、さらなるタンパク質分解的切断配列が含まれる場合があり、この切断配列は、発現させられた免疫グロブリン分子またはそのフラグメントから自己プロセシングペプチド配列を除去するための手段を提供する。ベクター構築物は、インビトロおよびインビボでの生物学的に活性な免疫グロブリンまたはそのフラグメントの産生の増強において有用性を見出す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
５’から３’の方向に向かって、免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの第１鎖のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、自己プロセシング切断部位をコードする配列、および免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの第２鎖のコード配列を含む、組換え免疫グロブリンの発現のためのＡＡＶベクターであって、ここで、該自己プロセシング切断部位をコードする配列は、該免疫グロブリン分子の該第１鎖のコード配列と該第２鎖のコード配列との間に挿入されている、ＡＡＶベクター。
【請求項２】
前記自己プロセシング切断部位をコードする配列は２Ａ配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３】
前記２Ａ配列が口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）配列である、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４】
前記２Ａ配列が、アミノ酸残基ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）またはＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２）を含むペプチドをコードする、請求項３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５】
前記免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの第１鎖のコード配列が免疫グロブリン重鎖をコードする、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６】
前記免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの第１鎖のコード配列が免疫グロブリン軽鎖をコードする、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項７】
免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの前記第１鎖のコード配列と免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの前記第２鎖のコード配列のと間にさらなるタンパク質分解的切断部位をさらに含む、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項８】
前記さらなるタンパク質分解的切断部位が、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有しているフリン切断部位である、請求項７に記載のＡＡＶベクター。
【請求項９】
前記プロモーターが、伸張因子１−αプロモーター（ＥＦ１−α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、テトラサイクリン反応性プロモーター（ＴＲＥ）、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、およびＣＫ６プロモーターからなる群より選択される、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１０】
前記プロモーターがＣＡＧハイブリッドプロモーター／エンハンサーである、請求項９に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１１】
前記プロモーターが伸張因子１−α（ＥＦ１α）プロモーターである、請求項９に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１２】
前記免疫グロブリンコード配列の重鎖および軽鎖が、等モル比またはほぼ等しいモル比で発現させられる、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１３】
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ６ベクターである、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１４】
前記ＡＡＶベクターがＡＡＶ８ベクターである、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１５】
請求項１０に記載のベクターが形質導入された細胞によって産生された組換え免疫グロブリン分子。
【請求項１６】
請求項１２に記載のベクターが形質導入された細胞によって産生された組換え免疫グロブリン分子。
【請求項１７】
請求項１０に記載のベクターが形質導入された宿主細胞。
【請求項１８】
請求項１２に記載のベクターが形質導入された宿主細胞。
【請求項１９】
組換え免疫グロブリン分子を産生するための方法出会って、該方法は、以下：
ａ．請求項２に記載のベクターを宿主細胞に形質導入する工程；および
ｂ．該形質導入された宿主細胞中で該組換え免疫グロブリンを発現させる工程であって、ここで、前記第１の免疫グロブリンコード配列と前記第２の免疫グロブリンコード配列は実質的に等モル比で発現させられる工程、
を、包含する方法。
【請求項２０】
前記自己プロセシング切断部位をコードする配列が２Ａ配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記２Ａ配列が口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）配列である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記２Ａ配列が、アミノ酸残基ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）またはＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号２）を含むペプチドをコードする、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ベクターは、前記第１のタンパク質またはポリペプチド鎖のコード配列と前記自己プロセシング部位をコードする配列との間にさらなるタンパク質分解的切断部位をさらに含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記さらなるタンパク質分解的切断部位が、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有しているフリン切断部位である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
カルボキシペプチダーゼで発現させられた前記免疫グロブリンを処理する工程がさらに包含される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＡＡＶが、門脈注射、筋肉内注射、腫瘍内注射、および腹腔内注射からなる群より選択される経路によってインビボで投与される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記全長の組換え免疫グロブリンが少なくとも３ヶ月間インビボで発現させられる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記全長の組換え免疫グロブリンが少なくとも１ｍｇ／ｍｌのレベルで発現させられる、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／５８７，０８２号（２００４年７月１３日出願）および同第６０／６５９，８７１号（２００５年３月１０日出願）の優先権を主張する。これらの仮特許出願の全体は、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、組換え体である全長の免疫グロブリンまたはそのフラグメントを発現させるように設計された、新規なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター構築物に関する。ＡＡＶベクターは、細胞または器官による異種免疫グロブリンコード配列のエキソビボまたはインビボでの発現のために使用することができ、あるいは、ＡＡＶが形質導入された細胞による組換え免疫グロブリンの産生のためにインビトロで使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
（背景技術）
モノクローナル抗体は、ガンおよび他の疾患の有効な治療薬であることが証明されている。現在の抗体療法には、多くの場合には、反復投与と長期処置計画が含まれ、これらには多数の不利益（例えば、一貫しない血清レベル、１回の投与の効力の持続時間が限られており、その結果、頻繁な再投与が必要とされることならびに高いコスト）が伴う。診断ツールおよび治療様式としての抗体の使用は、近年、その使用が拡大していることが明らかになっている。ガン処置について最初にＦＤＡによって承認されたモノクローナル抗体であるＲｉｔｕｘａｎ（登録商標）（リツキシマブ）は、１９９７年に、非ホジキンリンパ腫の患者の処置について承認され、その直後、１９９８年に、転移性乳ガンの患者の処置のためのヒト化モノクローナル抗体であるＨｅｒｃｅｐｔｉｎ（登録商標）が承認された。様々な臨床開発段階にある多数の抗体による治療は将来性を示している。抗体技術の幅広い臨床的応用に対する１つの制限は、通常は、多量の抗体が治療効果のためには必要であり、産生に伴うコストがかなりかかることである。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＳＰ２０、およびＮＳＯ２骨髄腫細胞は、グリコシル化されたヒトタンパク質（例えば、抗体）の商業的規模での産生のために最も一般的に使用されている哺乳動物細胞株である。哺乳動物細胞株での産生によって得られる収量は、通常は、回分培養用の発酵槽での５〜７日間の培養については５０〜２５０ｍｇ／Ｌの範囲、または流加培養用の発酵槽での７〜１２日間では３００〜１０００ｍｇ／Ｌの範囲である。高レベルの産生は、多くの場合は遺伝子増幅と優良（ｂｅｓｔ  ｐｅｒｆｏｒｍｉｎｇ）クローンの選択とに依存し、これらは、時間がかかり、そして開発および産生のコストをさらに増加させる。加えて、抗体を産生する細胞株に関する安定性の問題が、多くの場合は、何代もの継代の後に生じる。
【０００４】
治療的な使用のためにインビトロおよびインビボで全長の免疫グロブリンおよびそのフラグメントを産生するための改良されたシステムが依然として必要とされている。
【０００５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、その安全性プロフィールおよびインビボでの長期にわたる遺伝子発現の能力の理由から、治療用遺伝子の送達のための好ましいベクターである。単鎖抗体をインビボで発現させるためは、組換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）が以前から使用されている。ＡＡＶの限られたトランスジーンパッケージング能力およびその低い形質導入効率に起因して、全長の抗体を作製するために１つのＡＡＶベクターを使用して抗体の重鎖および軽鎖を発現させるための技術的な挑戦が行われている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、組換えＡＡＶベクターの単回注射後に、全長の抗体について高く一貫した血清レベルを得るための新規なアプローチの実現可能性を実証することにより、この必要性に取り組む。
【０００７】
（発明の要旨）
本発明により、単一のプロモーターの転写制御下での免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする配列の発現に基づく、全長の免疫グロブリンまたはそのフラグメントの高レベルでの発現のためのＡＡＶベクター組成物、ならびにそのための方法が提供される。
【０００８】
本発明により、組換え免疫グロブリンの発現のためのＡＡＶベクター（例えば、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８）が提供される。ここでは、ＡＡＶベクターには、作動可能に連結された構成成分として、プロモーター、免疫グロブリン分子の第１鎖のコード配列の一部または全体、自己プロセシング切断部位をコードする配列、免疫グロブリン分子の第２鎖のコード配列の一部または全体が含まれる。ここでは、自己プロセシング切断部位をコードする配列は、免疫グロブリン分子の第１鎖のコード配列と第２鎖のコード配列との間に配置される。関連する態様においては、本発明により、組換え免疫グロブリン分子、および本発明のＡＡＶベクターを使用して作製された細胞、およびこのＡＡＶベクターを作製するための方法が提供される。
【０００９】
１つの好ましい態様においては、自己プロセシング切断部位には、２Ａ配列（例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）配列）が含まれる。例示的な２Ａペプチド配列は、配列番号１および配列番号２として示される。
【００１０】
別の好ましい態様においては、ＡＡＶベクターには、さらなるタンパク質分解的切断部位（例えば、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有しているフリン（ｆｕｒｉｎ）切断部位）が含まれる。
【００１１】
本発明のＡＡＶベクターは、以下を含むがこれらに限定はされない多数のプロモーターの任意のものを含み得る：伸張因子１−αプロモーター（ＥＦ１−α）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１プロモーター（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子プロモーター（ＣＭＶ）、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチンプロモーター（ＣＡＧ）、テトラサイクリン反応性プロモーター（ＴＲＥ）、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、およびＣＫ６プロモーター。
【００１２】
さらに好ましい態様においては、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖をコードする配列は、等モル比で、またはほぼ等モル比で発現される。
【００１３】
本発明により、さらに、ガンの処置；感染性疾患の処置および予防；自己免疫疾患の処置および予防；ならびに本明細書中に記載されるＡＡＶを使用する予防ワクチンの開発のために、インビボでの組換え免疫グロブリンの長期にわたる発現のための方法が提供される。ここでは、ベクターは、門脈（ＰＶ）注射、筋肉内（ｉｍ）注射、腫瘍内（ｉｔ）注射、または腹腔内（ｉｐ）注射を含むがこれらに限定されない多数の経路のいずれかによって投与することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明により、組換え体である免疫グロブリンまたはそのフラグメントの発現のためのＡＡＶウイルスベクター構築物、ならびに、これをインビトロまたはインビボで使用するための方法が提供される。このベクターは、１つのプロモーターによって駆動される１つの発現カセットからの機能性の抗体分子の発現を可能にする自己プロセシング配列を免疫グロブリンの重鎖コード配列と軽鎖コード配列との間に有している。例示的なＡＡＶベクター構築物には、２つのＩｇポリペプチド鎖の間に自己プロセシング切断部位をコードする配列が含まれており、そして、切断後に残っている自己プロセシング部位から導かれたアミノ酸を除去するための、自己プロセシング切断部位に隣接しているさらなるタンパク質分解的切断部位がさらに含まれ得る。本発明のＡＡＶベクター構築物は、インビトロおよびインビボでの全長の生物学的に活性な免疫グロブリンまたはそのフラグメントの産生の増強に関係する方法において有用性を見出す。
【００１５】
本発明の種々の組成物および方法は以下に記載される。特定の組成物と方法とが本明細書中で説明されるが、任意の多数の代替の組成物および方法が適用可能であり、本発明の実施での使用に適していることが理解される。本発明のＡＡＶ免疫グロブリン発現構築物および方法の評価は、当該分野で標準である手順を使用して行うことができることもまた理解されるであろう。
【００１６】
本発明の実施には、他の場所に明確に記載されていない限りは、細胞生物学、分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、生化学、および免疫学の従来技術が使用されるであろう。これらは、当業者の範囲内である。このような技術は、文献、例えば、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，編，１９８４）；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，編，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，編，）；“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，編，１９８７）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら，編，１９８７）；“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓら，編，１９９４）；および“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら，編，１９９１）（これらのそれぞれは参考として本明細書中で援用される）に完全に説明されている。
【００１７】
（定義）
他の場所に明記されていない限りは、本明細書中で使用される全ての用語は、その分野の当業者が使用する意味と同じ意味を有し、そして、本発明の実施では、当業者の知識の範囲内にある微生物学および組換えＤＮＡ技術の従来技術が使用されるであろう。
【００１８】
用語「ベクター」は、本明細書中で使用される場合は、１つ以上の異種ＤＮＡ配列または組換えＤＮＡ配列を含む、プラスミド、ウイルス、または他のビヒクルのようなＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を意味する。ベクターは、種々の宿主細胞間での輸送のために設計される。用語「ＡＡＶ発現ベクター」および「ＡＡＶ遺伝子治療ベクター」は、細胞内に異種ＤＮＡ配列を取り込み、これを発現させるために有効である任意のＡＡＶベクターを意味する。細胞内への核酸の導入に有効であり、その結果、タンパク質またはポリペプチドの発現をもたらす任意の適切なＡＡＶベクターを使用することができる。発現のために有効な任意の細胞（例えば、昆虫細胞、および酵母もしくは哺乳動物細胞のような真核生物細胞）が本発明の実施に有用である。
【００１９】
用語「異種ＤＮＡ」および「異種ＲＮＡ」は、それらが存在する細胞またはゲノムの一部に対して内因性（天然）ではないヌクレオチドを意味する。一般的には、異種ＤＮＡまたは異種ＲＮＡは、以下にさらに記載されるように、形質導入、感染、トランスフェクション、形質転換などによって細胞に加えられる。このようなヌクレオチドには、通常、少なくとも１つのコード配列が含まれるが、このコード配列は必ずしも発現される必要はない。用語「異種ＤＮＡ」は「異種コード配列」または「トランスジーン」を意味し得る。
【００２０】
本明細書中で使用される場合は、用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は交換可能に使用することができ、通常は、本発明の自己プロセシング切断部位を含むベクターを使用して発現させられる目的の「タンパク質」および「ポリペプチド」を意味する。このような「タンパク質」および「ポリペプチド」は、さらに以下に記載されるように、研究、診断、または治療の目的に有用なタンパク質またはポリペプチドであり得る。
【００２１】
用語「複製欠損」は、本明細書中で使用される場合には、本発明のＡＡＶウイルスベクターと比較して、そのゲノムから独立して複製することはできず、そしてそのゲノムをパッケージすることができないＡＡＶベクターを意味する。例えば、被験体の細胞がｒＡＡＶビリオンで感染させられ、異種遺伝子が感染細胞の中で発現させられる。しかし、感染細胞はＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子、ならびにアクセサリー機能遺伝子を有していないという事実が原因で、ｒＡＡＶをさらに複製することはできない。
【００２２】
用語「作動可能に連結された」は、本明細書中で使用される場合には、組換えＤＮＡ構築物またはベクターに関して、組換えＤＮＡ構築物またはベクターのヌクレオチド構成成分が、選択されたコード配列の作動可能な制御のために別の配列に対して機能できるような関係にあることを意味する。一般的には、「作動可能に連結された」ＤＮＡ配列は連続しており、そして分泌リーダーの場合には、連続しておりかつリーディングフレームの中にある。しかし、エンハンサーは連続している必要はない。
【００２３】
本明細書中で使用される場合は、用語「遺伝子」または「コード配列」は、適切な調節配列に作動可能に連結されている、インビトロまたはインビボのヌクレオチドポリペプチドを意味する。この遺伝子には、コード領域の前および後の領域、例えば、５’非翻訳（５’ＵＴＲ）（すなわち、「リーダー」）配列および３’ＵＴＲ（すなわち、「トレイラー」）配列、さらには、個々のコードセグメント（エキソン）の間の介在配列（イントロン）が含まれる場合も、またそれらが含まれない場合もある。
【００２４】
本明細書中で使用される場合は、「免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの第１鎖のコード配列」は、タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を意味する。これには、抗体または免疫グロブリンの軽鎖または重鎖、あるいはそれらのフラグメントが含まれるが、これらに限定はされない。
【００２５】
本明細書中で使用される場合は、「免疫グロブリン分子またはそのフラグメントの第２鎖のコード配列」は、タンパク質分子をコードするヌクレオチド配列を意味する。これには、抗体または免疫グロブリンの軽鎖または重鎖、あるいはそれらのフラグメントが含まれるが、これらに限定はされない。
【００２６】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を指向し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列、すなわち、転写を指示するために十分な最小配列である。プロモーターおよび対応するタンパク質またはポリペプチドの発現は細胞型特異的、組織特異的、または種特異的であり得る。本発明の核酸構築物またはベクターには、エンハンサー配列もまた含まれ、これは、プロモーター配列と連続している場合も、また連続していない場合もある。エンハンサー配列は、プロモーター依存性の遺伝子発現に影響を与え、そして天然の遺伝子の５’または３’領域に配置され得る。
【００２７】
「エンハンサー」はシス作用性エレメントであり、これは、隣接している遺伝子の転写を刺激または阻害する。転写を阻害するエンハンサーはまた「サイレンサー」とも呼ばれる。エンハンサーは、いずれの方向でも、コード配列から数キロ塩基対（ｋｂ）までの距離を越えて、かつ転写される領域の下流の位置から、機能し得る（すなわち、コード配列と関係し得る）。
【００２８】
「調節可能プロモーター」は、その活性がシス作用性因子またはトランス作用性因子（例えば、外部シグナルまたは外来物質のような誘導性プロモーター）によって影響を受ける任意のプロモーターである。
【００２９】
「構成性プロモーター」は、ほとんどの場合、多くまたはすべての組織型／細胞型においてＲＮＡの産生を指示する任意のプロモーターであり、例えば、哺乳動物細胞中にクローニングされたＤＮＡ挿入物の構成的発現を促進するヒトＣＭＶ前期初期エンハンサー／プロモーター領域である。
【００３０】
用語「転写調節タンパク質」、「転写調節因子」、および「転写因子」は本明細書中では交換可能に使用され、そしてＤＮＡ応答エレメントに結合し、それによって関連する遺伝子（単数または複数）の発現を転写によって調節する核タンパク質を意味する。転写調節タンパク質は、一般的には、ＤＮＡ応答エレメントに直接結合するが、いくつかの場合には、ＤＮＡへの結合は、別のタンパク質への結合によって間接的に行われ得、続いてこれがＤＮＡ応答エレメントに結合するかまたはＤＮＡ応答エレメントに結合される。
【００３１】
本発明の意味における「終結シグナル配列」は、任意の遺伝的エレメントであり、これは、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させる（例えば、ポリアデニル化シグナル配列）。ポリアデニル化シグナル配列は、ＲＮＡ転写物のエンドヌクレアーゼの切断に不可欠な認識領域であり、これにはその後にポリアデニル化コンセンサス配列ＡＡＴＡＡＡが続く。ポリアデニル化シグナル配列によって「ポリＡ部位」、すなわち、翻訳後のポリアデニル化によってアデニン残基が付加されるＲＮＡ転写物上の部位が提供される。
【００３２】
本明細書中で使用される場合は、「内部リボソーム侵入部位」すなわち「ＩＲＥＳ」は、シストロン（タンパク質をコードする領域）の開始コドン（例えば、ＡＴＧ）への直接の内部リボソームの侵入を促進し、それによって遺伝子のｃａｐ非依存性翻訳を導くエレメントを意味する。例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＲＪ，Ｈｏｗｅｌｌ  Ｍ  Ｔ，Ｋａｍｉｎｓｋｉ，Ａ．（１９９０）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  １５（１２）：４７７−８３）およびＪａｃｋｓｏｎ  Ｒ  ＪおよびＫａｍｉｎｓｋｉ，Ａ．（１９９５）ＲＮＡ  １（１０）：９８５−１０００を参照のこと。本明細書中に記載される実施例は、任意のＩＲＥＳエレメントの使用に関し、このＩＲＥＳエレメントは、シストロンの開始コドンへの直接の内部リボソームの侵入を促進することができる。「ＩＲＥＳの翻訳制御下」は、本明細書中で使用される場合には、翻訳はＩＲＥＳに関係しており、ｃａｐ依存性様式で進行することを意味する。
【００３３】
「自己プロセシング切断部位」または「自己プロセシング切断配列」は、翻訳後または翻訳と同時のプロセシング切断部位または配列として本明細書中で定義される。このような「自己プロセシング切断」部位または配列は、ＤＮＡまたはアミノ酸配列を意味し、本明細書中では、２Ａ部位、２Ａ配列、もしくは２Ａドメイン、または２Ａ様部位、２Ａ様配列、もしくは２Ａ様ドメインによって例示される。本明細書中で使用される場合は、「自己プロセシングペプチド」は、本明細書中では、自己プロセシング切断部位または自己プロセシング切断配列をコードするＤＮＡ配列のペプチド発現産物として定義される。このＤＮＡ配列は、翻訳されると、自己プロセシング切断部位を含むタンパク質またはポリペプチドの迅速な分子内（シス）切断を媒介して、成熟タンパク質産物または成熟ポリペプチド産物の分泌を生じる。
【００３４】
本明細書中で使用される場合は、用語「さらなるタンパク質分解的切断部位」は、２Ａ配列または２Ａ様配列のような自己プロセシング切断部位に隣接して本発明の発現構築物の中に組み込まれ、そして自己プロセシング切断配列による切断の後も維持されるさらなるアミノ酸を除去するための手段を提供する配列を意味する。例示的な「さらなるタンパク質分解的切断部位」は本明細書中に記載され、これには、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有しているフリン切断部位（配列番号１０）が含まれるがこれに限定はされない。このようなフリン切断部位は、内因性サブチリシン様プロテアーゼ（例えば、フリンおよびタンパク質分泌経路の中の他のセリンプロテアーゼ）によって切断することができる。
【００３５】
本明細書中で使用される場合は、用語「免疫グロブリン」および「抗体」は、完全な分子、ならびにそれらのフラグメント（例えば、Ｆａ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ）を意味し、これらは抗原決定基に結合することができる。このような「免疫グロブリン」および「抗体」は、およそ２３，０００ダルトンの分子量の２つの同一の軽鎖ポリペプチド鎖と、５３，０００〜７０，０００ダルトンの分子量の２つの同一の重鎖から構成される。４つの鎖は「Ｙ」配置のジスルフィド結合によって連結されている。重鎖はγ（ＩｇＧ）、μ（ＩｇＭ）、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、またはε（ＩｇＥ）として分類され、そして免疫グロブリンのクラスの名称の根拠となっている。これによって、所定の抗体のエフェクター機能が決定される。軽鎖は、κまたはλのいずれかに分類される。「免疫グロブリンまたはそのフラグメント」について本明細書中で言及が行われる場合には、このような「そのフラグメント」は免疫学的に機能的な免疫グロブリンフラグメントであることが理解されるであろう。
【００３６】
用語「ヒト化抗体」は、その中の１つ以上のアミノ酸が、ヒト抗体により似せるために非抗原結合領域において置き換えられているが、抗体のもともとの結合活性はなおも残っている抗体分子を意味する。例えば、米国特許第６，６０２，５０３号を参照のこと。
【００３７】
用語「抗原決定基」は、本明細書中で使用される場合は、特定の抗体との接触をもたらす分子のフラグメント（すなわち、エピトープ）を意味する。タンパク質またはタンパク質のフラグメントの多数の領域は、タンパク質上の所定の領域またはタンパク質の三次元構造に特異的に結合する抗体の産生を誘導し得る。これらの領域または構造は、抗原決定基と呼ばれる。抗原決定基は、抗体への結合について完全な抗原（すなわち、免疫応答を誘発させるために使用される免疫原）と競合し得る。
【００３８】
用語「フラグメント」は、本発明の組換えタンパク質または組換えポリペプチドについて言及される場合には、対応する全長のタンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列の一部（全てではない）と同じであり、対応する全長のタンパク質またはポリペプチドの機能または活性の少なくとも１つを保持しているアミノ酸配列を有しているポリペプチドを意味する。フラグメントには、好ましくは、全長のタンパク質またはポリペプチドの少なくとも２０〜１００個の連続しているアミノ酸残基が含まれる。
【００３９】
用語「投与する」または「導入する」は、本明細書中で使用される場合は、細胞に対する、または被験体の細胞および／または器官に対する、組換えタンパク質の発現用のベクターの送達を意味する。このような投与または導入は、インビボ、インビトロ、またはエキソビボで行われ得る。組換えタンパク質または組換えポリペプチドの発現用のベクターは、トランスフェクションによって細胞に導入することができる。通常、これは、物理的手段（例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはリポフェクション）；感染（通常、これは感染因子、すなわち、ウイルスによる導入を意味する）；または形質導入（通常、これはウイルスを用いた細胞の安定的な感染、またはウイルス因子（例えば、バクテリオファージ）による１つの微生物から別の微生物への遺伝的物質の移動を意味する）による、細胞への異種ＤＮＡの挿入を意味する。
【００４０】
「形質転換」は、通常、異種ＤＮＡを含む細菌を意味するか、またはオンコジーンを発現し、それによって、腫瘍細胞のように連続的な増殖形式に変換されている細胞を意味するために使用される。細胞を「形質転換」するために使用されるベクターは、プラスミド、ウイルス、または他のビヒクルであり得る。
【００４１】
通常、細胞は、細胞内への異種ＤＮＡ（すなわち、ベクター）の投与、導入、または挿入のために使用された手段に応じて、「形質導入された」、「感染させられた」、「トランスフェクトされた」、または「形質転換された」と呼ばれる。用語「形質導入された」、「トランスフェクトされた」、および「形質転換された」は、異種ＤＮＡの導入方法とは無関係に、本明細書中では交換可能に使用することができる。
【００４２】
本明細書中で使用される場合は、用語「安定的に形質転換された」、「安定的にトランスフェクトされた」および「トランスジェニック」は、ゲノムの中非天然（異種）核酸配列が組み込まれている細胞を意味する。安定なトランスフェクションは、それらのゲノムの中に安定的に組み込まれたトランスフェクトされたＤＮＡを含んでいる娘細胞の集団から構成される細胞株またはクローンの確立によって実証される。いくつかの場合には、「トランスフェクション」は安定的ではなく、すなわち、一時的である。一時的なトランスフェクションの場合には、外因性ＤＮＡまたは異種ＤＮＡは発現させられるが、導入された配列はゲノムには組み込まれず、エピソームとみなされる。
【００４３】
本明細書中で使用される場合は、「エキソビボ投与」は、初代細胞が被験体から取り出され、ベクターが細胞に投与されて、形質導入された組換え細胞、感染させられた組換え細胞、またはトランスフェクトされた組換え細胞が作られ、そして組換え細胞が同じ被験体または異なる被験体に再度投与されるプロセスを意味する。
「多シストロン性転写物」は、１つより多いタンパク質コード領域すなわちシストロンを含むｍＲＮＡ分子を意味する。２つのコード領域を含むｍＲＮＡは、「２シストロン性転写物」と記載される。「５’−近位」コード領域またはシストロンは、その翻訳開始コドン（通常は、ＡＵＧ）が多シストロン性ｍＲＮＡ分子の５’末端の最も近くにあるコード領域である。「５’−遠位」コード領域またはシストロンは、その翻訳開始コドン（通常は、ＡＵＧ）がｍＲＮＡの５’末端に最も近い開始コドンではないコード領域である。用語「５’−遠位」および「下流」は、ｍＲＮＡ分子の５’末端に隣接していないコード領域を言うように同義的に使用される。
【００４４】
本明細書中で使用される場合は、「同時転写される」は、２つ（またはそれより多く）のコード領域またはポリヌクレオチドが、１つの転写制御エレメントまたは転写調節エレメントの転写制御下にあることを意味する。
【００４５】
本明細書中で使用される場合は、「治療用」遺伝子は、発現した場合、この遺伝子が中に存在する細胞または組織に対して、あるいは、この遺伝子が中で発現される哺乳動物に対して、有用な効果を付与する遺伝子を意味する。有用な効果の例としては、症状または疾患の兆候もしくは症候の緩和、症状または疾患の予防もしくは阻害、あるいは、所望される特性の付与が挙げられる。治療用遺伝子としては、細胞または哺乳動物の遺伝的欠損を補正する遺伝子が挙げられる。
【００４６】
用語「異種」および「外来性」は、プロモーターおよびコード配列のような核酸分子に関して本明細書中で使用される場合は、特定のベクター、ウイルス、または宿主細胞に対して外来である供給源に起源する配列を意味するか、または、同じ供給源に由来する場合は、そのもともとの形態から改変されている配列を意味する。したがって、ウイルスまたは細胞内の異種遺伝子としては、特定のウイルスまたは細胞に対して内因性であるが、例えば、コドン最適化によって改変されている遺伝子が挙げられる。この用語にはまた、天然に存在している核酸配列の天然には存在しない多コピー数も含まれる。したがって、この用語は、ベクター、ウイルス、または細胞に対して外来性であるかまたは異種である核酸セグメント、あるいは、ベクター、ウイルス、または細胞に対して同種の核酸セグメントであるが、このセグメントが通常では見出されないベクターまたは細胞性ゲノム中の位置にある核酸セグメントを意味する。
【００４７】
用語「同種」は、核酸分子に関して本明細書中で使用される場合には、宿主ウイルスまたは細胞に天然において付随している核酸を意味する。
【００４８】
用語「同一」またはパーセント「同一性」は、２つ以上のヌクレオチド配列に関しては、最大の態様について比較しかつ並べた場合に、本明細書中に記載される配列比較アルゴリズム（例えば、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、または目視試験）の１つを使用して測定した場合に、同じであるかまたは特定の割合の同じであるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有していることを意味する。
【００４９】
本明細書中で使用される場合には、用語「配列同一性」は、配列アラインメントプログラムを使用して並べられた場合、２つ以上の並べられた配列の中のヌクレオチド間の同一の程度を意味する。用語「％相同性」は、本明細書においては、本明細書中の用語「％同一性」と交換可能に使用され、配列アラインメントプログラムを使用して並べられた、２つ以上の並べられた配列の間での核酸またはアミノ酸配列同一性のレベルを意味する。例えば、本明細書中で使用される場合には、８０％の相同性は、定義されたアルゴリズムによって決定された８０％の配列同一性と同じことを意味し、したがって、所定の配列のホモログが所定の配列の長さにわたって８０％を超える配列同一性を有していることを意味する。
【００５０】
用語「相補的」および「相補性」は、逆平行なヌクレオチド配列における相補的な塩基残基の間で水素結合の形成の際に互いに対合することができる２つの逆平行ヌクレオチド配列を意味する。
【００５１】
用語「天然に存在している」は、野生型のウイルスまたは細胞のゲノム中に存在している遺伝子またはタンパク質を意味する。
【００５２】
用語「宿主細胞」は、本明細書中で使用される場合は、ベクターによって、形質導入された細胞、感染させられた細胞、トランスフェクトされた細胞、または形質転換された細胞を意味する。ベクターは、プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどであり得る。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞とともに以前使用されたものであり、当業者に明らかであろう。用語「宿主細胞」が、もともと形質導入されていた細胞、感染させられていた細胞、トランスフェクトされていた細胞、または形質転換されていた細胞、およびそれらの子孫を意味することが明らかであろう。
【００５３】
用語「発現」は、細胞内での内因性遺伝子、トランスジーン、またはコード領域の転写および／または翻訳を意味する。アンチセンス構築物の場合には、発現は、アンチセンスＤＮＡのみの転写を意味し得る。
【００５４】
本明細書中で使用される場合は、用語「生物学的活性」および「生物学的に活性」は、培養物中の細胞株の中またはインビボでの、特定のタンパク質に起因すると考えられる活性を意味する。「免疫グロブリン」、「抗体」、またはそれらのフラグメントの「生物学的活性」は、抗原決定基に結合し、それによって免疫グロブリン機能を促進する能力を意味する。
【００５５】
本明細書中で使用される場合は、用語「腫瘍」および「ガン」は、制御されていない増殖を示し、異常なほどの大きさの細胞のクローンを形成する細胞を意味する。腫瘍細胞またはガン細胞は、通常、接触阻止が欠損しており、そして侵襲性であり得、そして／または転移する能力を有し得る。
【００５６】
（免疫グロブリンおよびそのフラグメント）
抗体は、重鎖および軽鎖のヘテロ二量体であり、哺乳動物培養発現システムにおいては１つのベクターから全長形態で発現させることが難しいことが証明されている、免疫グロブリンタンパク質である。脊椎動物の抗体の産生のためには、現在、３つの方法が使用されている：「ポリクローナル」抗体を産生するための動物のインビボでの免疫化、モノクローナル抗体を産生するためのＢ細胞ハイブリドーマのインビトロでの細胞培養（Ｋｏｈｌｅｒ，ら，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：５１１，１９７６；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８；参考として本明細書中で援用される）、および組換えＤＮＡ技術（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら，米国特許第６，３３１，４１５号（参考として本明細書中で援用される）に記載されている）。
【００５７】
免疫グロブリンポリペプチドの基本的な分子構造は、およそ２３，０００ダルトンの分子量の２つの同一の軽鎖と、５３，０００〜７０，０００ダルトンの分子量の２つの同一の重鎖を含んでいることが周知である。４つの鎖は「Ｙ」配置のジスルフィド結合によって連結されている。アミノ酸配列は、Ｙの先端にあるＮ末端からそれぞれの鎖の下端にあるＣ末端に向かって続く。Ｎ末端には、抗原結合の特異性を提供する（およそ１００アミノ酸の長さの）可変領域が存在している。
【００５８】
本発明は、全てのタイプの免疫グロブリンの産生のための改良された方法に関する。この免疫グロブリンには、天然に存在している配列を有している全長の抗体および抗体フラグメント（すなわち、抗原による刺激に応答して産生される配列）、単鎖抗体（これは、一本鎖の安定的に折り畳まれたポリペプチド鎖の中に重鎖と軽鎖の両方の抗原結合可変領域が組み合わせられている）；一価抗体（これには、第２の重鎖のＦｃ領域に結合させられた重鎖／軽鎖二量体が含まれている）；「Ｆａｂフラグメント」（これには、免疫グロブリン分子の「Ｙ」領域全体、すなわち、「Ｙ」の分岐、軽鎖または重鎖のいずれかだけ、またはそれらの一部（すなわち、Ｆａｂ’として一般に公知である１つの重鎖と１つの軽鎖の凝集物）が含まれている）；「ハイブリッド免疫グロブリン」（これは、２つ以上の異なる抗原に対する特異性を有している（例えば、例えば米国特許第６，６２３，９４０号に記載されているようなクアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）または二重特異的抗体））；「複合免疫グロブリン」（ここでは、重鎖および軽鎖が異なる種または特異性に由来するものを模倣する）；ならびに「キメラ抗体」（ここでは、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列のそれぞれの部分が１つより多い種に由来する（すなわち、可変領域はマウス抗体のような１つの供給源に由来し、一方、定常領域はヒト抗体のような別の供給源に由来する））が含まれるが、これらに限定はされない。
【００５９】
本発明の組成物および方法は、重鎖または軽鎖が「哺乳動物」であるか、「キメラ」であるか、またはその効率を高めるための様式で改変されている、免疫グロブリンまたはそのフラグメントの産生において、有用性を見出す。改変された抗体には、未改変の形態の抗体と同じ生物学的活性を保持しているアミノ酸配列改変体およびヌクレオチド配列改変体、ならびに、活性が変化する（すなわち、補体結合、膜との相互作用、および他のエフェクター機能を改善する、定常領域内での変化、または抗原結合特性を改善する可変領域内での変化）ように改変された抗体の両方が含まれる。本発明の組成物および方法には、さらに、触媒性免疫グロブリンまたはそのフラグメントが含まれる。
【００６０】
「改変体」免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチド配列は、参照ポリペプチド配列から１つ以上のアミノ酸が変化させられた「改変体」免疫グロブリンアミノ酸配列をコードし得る。改変体ポリヌクレオチド配列は、「保存的」置換を含む改変体アミノ酸配列をコードし得る。この場合、置換されたアミノ酸は、置き換わるアミノ酸と類似する構造的または化学的特性を有している。さらに、またはあるいは、改変体ポリヌクレオチド配列は、「非保存的」置換を含む改変体アミノ酸配列をコードし得る。この場合、置換されたアミノ酸は、置き換わるアミノ酸とは類似していない構造的または化学的特性を有する。改変体免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドはまた、アミノ酸の挿入もしくは欠失、またはそれらの両方を含む改変体アミノ酸配列をコードし得る。さらに、「改変体」免疫グロブリンをコードするポリヌクレオチドは、参照ポリヌクレオチド配列と同じポリペプチドをコードし得るが、遺伝子コードの縮重が原因で、参照ポリヌクレオチド配列から１つ以上の塩基が変化させられたポリヌクレオチド配列を有し得る。
【００６１】
用語「フラグメント」は、本発明の組換え免疫グロブリンについて言及される場合には、対応する全長の免疫グロブリンタンパク質のアミノ酸配列全体ではなく一部と同じである、アミノ酸配列を有しているポリペプチドを意味する。これは、対応する全長のタンパク質と同じ生物学的機能または活性を本質的に保持しているか、あるいは、対応する全長のタンパク質の機能または活性の少なくとも１つを保持しているかのいずれかである。フラグメントには、全長の免疫グロブリンの少なくとも２０〜１００個の連続するアミノ酸残基が含まれることが好ましい。
【００６２】
治療様式としての抗体の可能性は、現在は、現行技術の産生能力と高すぎるコストによって制限されている。本発明の一ｒＡＡＶベクター免疫グロブリン発現システムは、２つ以上のコード配列（すなわち、１つのＡＡＶベクターからの二重特異性または多特異性を有している免疫グロブリン）の発現および送達を可能にする。本発明は、先行技術の制限に取り組み、そして本明細書にさらに詳細に記載されるように、操作された抗体（例えば、単鎖抗体、全長の抗体、または抗体フラグメントを含む）任意の免疫グロブリン（すなわち、抗体）またはそのフラグメントに適用可能である。
【００６３】
本発明は、１つのプロモーターを使用する免疫グロブリン重鎖および軽鎖の発現を利用する。この場合、重鎖および軽鎖は、実質的に等しい割合で発現させられる。ポリタンパク質の形態でのタンパク質の連結は、ピコルナウイルス科を含む多くのウイルスの複製に適応させられた戦略である。翻訳されると、ウイルスによってコードされる自己プロセシングペプチドによってポリタンパク質の迅速な分子内（シス）切断が媒介されて、成熟タンパク質産物の分泌がもたらされる。本発明により、１つのプロモーターを使用して免疫グロブリン重鎖コード配列および軽鎖コード配列の発現を促進する、自己プロセシングペプチド（本明細書中では２Ａペプチドによって例示される）を含む組換え免疫グロブリンの発現のためのベクターが提供されるという点でＩＲＥＳの使用を上回る利点が提供される。この場合、免疫グロブリン重鎖コード配列と軽鎖コード配列は、実質的に等しいモル比で発現させられる。実質的に等しいモル比での重鎖と軽鎖の発現は、例えば、ウェスタンブロット分析によって実証され得る。ウエスタンブロット分析において、重鎖タンパク質および軽鎖タンパク質は還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させられ、抗ラットＩｇＧポリクローナル抗体または抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体を使用してプローブ探査（ｐｒｏｂｅ）され、そして市販されているキットを使用して製造業者の説明書にしたがって視覚化される。
【００６４】
（アゴニスト抗ＶＥＧＦＲ２抗体）
本発明により、本質的に任意の免疫グロブリンの産生のためのＡＡＶ組成物および方法が提供される。本発明の組成物および方法を使用して産生することができる、臨床的有用性を有している免疫グロブリンの一例は、アゴニスト抗ＶＥＧＦＲ２抗体である。
【００６５】
背景としては、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、血管系の発達および新脈菅形成（血管形成）において重要な役割を担っている増殖因子である。ＶＥＧＦは、血管内皮細胞の増殖、移動、および分化を刺激し、そして生理学的条件および病理学的条件の両方において血管の形成を誘導する。ＶＥＧＦは３種類の細胞表面チロシンレセプター：ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）、およびＶＥＧＦＲ３に結合する。ＶＥＧＦＲ２はＶＥＧＦによって活性化されるシグナル伝達を媒介することにおいて重要である。
【００６６】
血液の供給が不十分である病理学的条件（例えば、冠状動脈疾患、骨格虚血、心筋虚血、脳虚血、四肢虚血、抹消血管疾患、虚血性皮膚創傷など）において、多くの場合、血管形成および新脈菅形成が、局所的な血液循環を改善するために所望される。血管由来増殖因子（特に、ＶＥＧＦ）の投与が新脈菅形成が行われている虚血組織において有効であることが、前臨床的モデルにおいて示されている。ＶＥＧＦは、現在、心虚血および骨格虚血についての臨床評価の段階にある。しかし、組換えＶＥＧＦはヒトにおいておよそ３０分間の半減期を有する。ＶＥＧＦの短い半減期によってその臨床応用が制限されている。したがって、ＶＥＧＦ機能を提供するが、長い半減期を有しているアゴニスト抗ＫＤＲ抗体によって血管形成治療が改良されるであろう。
【００６７】
本発明の組成物および方法により、免疫グロブリンの高レベルの発現のための手段が提供される。その一例は、インビボでのアゴニストヒト抗ＶＥＧＦＲ２抗体である。本発明は、抗体自体が投与される際の、短い半減期およびそれによって生じるインビボでの一貫しない免疫グロブリンレベルが原因である低い治療効率、加えて、反復投与の不便およびコストを示し得る状況において、特定の有用性を見出す。組換えタンパク質としてＶＥＧＦが投与され得るが、本発明のＡＡＶベクターを使用したアゴニスト抗ＶＥＧＦＲ抗体の発現は一貫した高レベルの免疫グロブリン発現の利点を提供する。
【００６８】
本発明により、ＣＧＩ２．２０と命名されたアゴニストヒト抗ＶＥＧＦＲ２抗体が提供される。この抗体は、ＶＥＧＦによって媒介される血管形成についての主要なレセプターであるヒトＶＥＧＦＲ２に特異的に結合する。ＣＧＩ２．２０は、用量依存性の様式でインビトロでの血管内皮細胞の増殖を刺激し、そしてＶＥＧＦ機能を模倣できることが観察されている。さらに、ＣＧＩ２．２０は、ヒトＩｇＧ遺伝子を有しているトランスジェニックマウス（ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ）において発現させられており、したがって、ヒト患者にインビボで投与された場合に宿主免疫応答を引き起こすことはおそらくない完全なヒト抗体である。この抗体は、血管疾患において新脈菅形成を誘導するための血管形成促進剤（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）として使用され得る。
【００６９】
ＣＧＩ２．２０  ｍＡｂは、当業者に慣用的に使用されている任意のベクターシステム（ウイルスまたは非ウイルス）によって、局所的または全身的に投与され得る。ベクターとしては、ＡＡＶ、アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルスなどのようなウイルスベクター、およびプラスミドのような非ウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７０】
ＣＧＩ２．２０  ｍＡｂは、冠状動脈疾患、骨格虚血、心筋虚血、脳虚血、四肢虚血、抹消血管疾患、虚血性皮膚創傷などを含むがこれらに限定はされない疾患の処置のために新脈菅形成を誘導するための手段として治療的に使用され得る。組換え体抗体は、抗体全体または抗体フラグメント（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）２など）であり得る。実施例７には、ＣＧＩ２．２０  ｍＡｂを使用する研究が記載される。
【００７１】
（自己プロセシング切断部位または自己プロセシング切断配列）
「自己プロセシング切断部位」または「自己プロセシング切断配列」は、上記で定義されたように、ＤＮＡまたはアミノ酸を意味し、ここで、翻訳の際、自己プロセシング切断部位を含むポリペプチドの迅速な分子内（シス）切断が起こって、成熟タンパク質産物の分泌がもたらされる。このような「自己プロセシング切断部位」はまた、翻訳後、または翻訳と同時のプロセシング切断部位とも呼ばれ、本明細書中では２Ａ部位、２Ａ配列、もしくは２Ａドメインによって例示される。２Ａ部位、２Ａ配列、または２Ａドメインは、リボソームの活性を改変してエステル結合の加水分解を促進し、それによって分離した下流での翻訳産物の合成を進行させるような様式で翻訳複合体からポリペプチドを放出することにより、翻訳に対する効果を示す（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，２００１）。あるいは、２Ａ部位または２Ａドメインは、シスでその自身のＣ末端を切断して一次切断産物を生じることにより、「自動タンパク質分解」または「切断」を示す（Ｆｕｒｌｅｒ；Ｐａｌｍｅｎｂｅｒｇ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６０３−６２３（１９９０））。
【００７２】
メカニズムは本発明の一部ではないが、２Ａの活性は、コドンの間のリボソームスキップ（ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｓｋｉｐｐｉｎｇ）に関係し得、これはペプチド結合の形成を妨げる（ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅら，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １１：１９２１−１９３１（２０００）；Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０１３−１０２５（２００１））；しかし、このドメインはむしろ自己分解酵素のように作用すると考えられている（Ｒｙａｎら，Ｖｉｒｏｌ．１７３：３５−４５（１９８９））。口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａコード領域が発現ベクター内にクローニングされ、標的細胞の中にトランスフェクトされた実験により、人工のレポーターポリタンパク質のＦＭＤＶ  ２Ａ切断が広い範囲の異種発現システムにおいて有効であることが確立された（小麦胚芽溶解物およびタバコトランスジェニック植物（Ｈａｐｌｉｎら，ＵＳＰＮ  ５，８４６，７６７（１９９８）、およびＨａｐｌｉｎら，Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １７：４５３−４５９（１９９９））；Ｈｓ  ６８３ヒト神経膠腫細胞株（ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ６：１９８−２０８（１９９９）；本明細書中では以後、「ｄｅ  Ｆｅｌｉｐｅ  ＩＩ」と呼ばれる）；ウサギ網状赤血球溶解物およびヒトＨＴＫ−１４３細胞（Ｒｙａｎら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１３：９２８−９３３（１９９４））；ならびに昆虫細胞（Ｒｏｏｓｉｅｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７１：１７０３−１７１１（１９９０）））。異種ポリタンパク質のＦＭＤＶ  ２Ａによって媒介される切断は、ＩＬ−２について明らかにされている（ｐ４０／ｐ３５ヘテロ二量体；Ｃｈａｐｌｉｎら，Ｊ．Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１９：２３５−２４１（１９９９））。トランスフェクトされたＣＯＳ−７細胞においては、ＦＭＤＶ  ２Ａによって、ｐ４０−２Ａ−ｐ３５ポリタンパク質の、ＩＬ−１２と関連する活性を有している生物学的に機能的なサブユニットｐ４０およびｐ３５への切断が媒介された。
【００７３】
ＦＭＤＶ  ２Ａ配列は、２シストロン性ベクター、３シストロン性ベクター、および４シストロン性ベクターを構築するために、単独で、または種々のＩＲＥＳ配列と組み合わせてレトロウイルスベクターに取り込まれている。動物の中での２Ａによって媒介される遺伝子発現の効率は、ＦＭＤＶ  ２Ａ配列を介して連結された、ａ−シヌクレイン（ａ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）およびＥＧＦＰ、またはＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ−１）およびＥＧＦＰをコードする組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを使用して、Ｆｕｒｌｅｒ（２００１）によって明らかにされた。ＥＧＦＰおよびａ−シヌクレインは、対応するＩＲＥＳをベースとするベクターと比較して２Ａ配列が含まれるベクターからは実質的に高いレベルで発現され、一方、ＳＯＤ−１は同等かまたはわずかに高いレベルで発現された。Ｆｕｒｌｅｒはさらに、２Ａ配列が、２Ａを含むＡＡＶベクターのラットの黒質への注射後にインビボで２シストロン性遺伝子の発現を生じることも明らかにした。最近、２Ａペプチドおよび２Ａ様配列がレトロウイルスベクターを使用する４シストロンの効率のよい翻訳に有効であることが明らかにされた（Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ＡＬら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００４  Ｍａｙ  ２２（５）：５８９−９４）。
【００７４】
本発明については、自己プロセシング切断部位をコードするＤＮＡ配列は、ピコルナウイルスに由来するウイルス配列によって例示され、このピコナウイルスには、エンテロウイルス、ライノウイルス、カルジオウイルス、アフトウイルス、または口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）が含まれるが、これらに限定はされない。好ましい実施形態においては、自己プロセシング切断部位をコードする配列は、ＦＭＤＶに由来する。自己プロセシング切断部位としては、２Ａドメインおよび２Ａ様ドメイン（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１））（その全体が参考として本明細書中で援用される）が挙げられるが、これに限定はされない。
【００７５】
本発明のベクター構築物についての２つ以上の異種ＤＮＡ配列の間の２Ａ配列の位置的なサブクローニングにより、１つの発現ベクターを介した２つ以上の遺伝子の送達および発現が可能である。好ましくは、自己プロセシング切断部位（例えば、ＦＭＤＶ  ２Ａ配列）により、１つのウイルスベクターから、例えば、抗体、ヘテロ二量体レセプター、またはヘテロ二量体タンパク質の別々の部分であり得る２つまたは複数のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを発現させ、そして送達するための特有の手段が提供される。
【００７６】
ＦＭＤＶ  ２Ａは、自身のＣ末端での１つの切断を指示し、したがってシスで作用するようにＦＭＤＶゲノムの中で機能するポリタンパク質領域である。ＦＭＤＶ  ２Ａドメインは通常、約１９アミノ酸の長さであることが報告されている（ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号１）；（ＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号２；Ｒｙａｎら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７２：２７２７−２７３２（１９９１））。しかし、１４個のアミノ酸残基（ＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ；配列番号３）のような短いオリゴペプチドが、天然に存在しているＦＭＤＶポリタンパク質のプロセシングにおける役割と同様の様式で２Ａ  Ｃ末端での切断を媒介することが示されている。
【００７７】
２Ａ配列のバリエーションが、ポリタンパク質の効率のよいプロセシングを媒介するそれらの能力について研究されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ＭＬら，２００１）。２Ａ配列のホモログおよび改変体は本発明の範囲に含まれ、そしてこれには以下の表１に示される配列が含まれるが、これらに限定はされない。
【００７８】
（表１．例示的な２Ａ配列の表）
【００７９】
【表１】
2008506389.tif 000002
２Ａ配列およびその改変体の特徴的な利点は、ポリタンパク質の自己プロセシングの促進におけるそれらの使用である。本発明には、自己プロセシング切断部位を介して連結されたタンパク質またはポリペプチドのコード配列を含み、その結果、個々のタンパク質が自己プロセシング切断部位（例えば、２Ａドメイン）の存在が原因でポリタンパク質の切断後に等モルで発現させられるかまたはほぼ等モルで発現させられる、任意のベクター（プラスミドまたはウイルスをベースとするもの）が含まれる。これらのタンパク質は、ベクター自体に対しては互いに異種であってもよく、また、自己プロセシング切断部位に対して異種であってもよい（例えば、ＦＭＤＶ）。
【００８０】
２Ａコード配列の大きさが小さいことにより、さらに、ＡＡＶのようなコード配列について限られたパッケージング能力を有しているベクターにおいて２Ａコード配列を使用することができる。ＡＡＶベクターの有用性は、２Ａ配列によって二重プロモーターの必要性が排除されるので、さらに拡大することができる。２Ａと組み合わせた２つより多いコード配列を含む１つのオープンリーディングフレームを駆動するプロモーターからの個々のタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの発現レベルは、ＩＲＥＳ配列または二重プロモーターを使用して達成することができる発現レベルと比較して、ほぼ等モルである。二重プロモーターの排除によってはまた、各コード配列の発現レベルの低下および／または減少を生じ得るプロモーターの干渉も減少させられる。
【００８１】
１つの好ましい実施形態においては、本発明に従うベクターに含まれるＦＭＤＶ  ２Ａ配列は、ＬＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号１）を含むアミノ酸残基をコードする。あるいは、本発明に従うベクターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙら，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１（２００１）で議論されているような他の２Ａ様領域のアミノ酸残基をコードし得る。これには、ピコルナウイルス、昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、トリパノソーマ反復配列、または細菌、Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａに由来する、２Ａ様ドメインが含まれるが、これらに限定されない。
【００８２】
本発明により、２Ａポリペプチドまたは２Ａ様ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列改変体、（例えば、親ヌクレオチドのコドンと比較して１つ以上のアミノ酸について異なるコドンを有している２Ａポリペプチドまたは２Ａ様ポリペプチドについての核酸コード配列）の使用が想定される。このような改変体は、本発明によって具体的に想定され、包含される。２Ａペプチドおよびポリペプチドの配列改変体も、本発明の範囲内に含まれる。
【００８３】
比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ＆  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４（１９８８）の類似性の検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、ＢＬＡＳＴアルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））によって、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公に入手可能なソフトウェアを用いて、あるいは、目視検査（一般的には、Ａｕｓｕｂｅｌら，後出を参照のこと）によって行うことができる。本発明の目的のために、比較のための配列の最適なアラインメントは、Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所相同性アルゴリズムによって行われることが最も好ましい。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，１９９０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ、Ｓ．Ｆ．ら，１９９７もまた参照のこと。
【００８４】
本発明にしたがい、天然に存在している配列に対して８０、８５、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有している自己プロセシング切断ポリペプチドをコードする配列改変体およびポリペプチド自体もまた含まれる。
【００８５】
核酸配列は、２つの配列が中程度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションおよび洗浄条件下で互いに特異的にハイブリダイズする場合には、参照ヌクレオチド配列に対して「選択的にハイブリダイズできる」と考えられる。ハイブリダイゼーション条件は、核酸結合複合体またはプローブの融解温度（Ｔｍ）に基づく。例えば、「最大ストリンジェンシー」は、通常、およそＴｍ−５℃（プローブのＴｍよりも５℃低い）で生じる；「高いストリンジェンシー」は、Ｔｍよりも約５〜１０℃低く；「中程度のストリンジェンシー」はプローブのＴｍよりも約１０〜２０℃低く；そして「低いストリンジェンシー」はＴｍよりも約２０〜２５℃低い。機能的には、最大ストリンジェンシーの条件は、ハイブリダイゼーションプローブと厳密な同一性またはほぼ厳密な同一性を有している配列を同定するために使用することができる；一方、高いストリンジェンシーの条件は、プローブと約８０％以上の配列同一性を有している配列を同定するために使用される。
【００８６】
中程度および高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件は当該分野では周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ら，１９８９，第９章および第１１章，ならびにＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，ら，１９９３を参照のこと）。高いストリンジェンシーの条件の一例としては、５０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、５×デンハルト溶液、０．５％のＳＤＳ、および１００ｍｇ／ｍｌの変性させられたキャリアーＤＮＡの中で約４２℃でのハイブリダイゼーション、その後の、２×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳ中で室温での２回の洗浄、および０．１×ＳＳＣおよび０．５％のＳＤＳの中での４２℃での２回のさらなる洗浄が挙げられる。本明細書中に記載される２Ａポリペプチドと同じ生物学的活性を有しているポリペプチドをコードし、そして中程度から高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする２Ａ配列改変体は、本発明の範囲内に含まれると考えられる。
【００８７】
遺伝子コードの縮重の結果として、同じ２Ａポリペプチドまたは２Ａ様ポリペプチドをコードする多数のコード配列が生じ得る。例えば、トリプレットＣＧＴはアミノ酸アルギニンをコードする。アルギニンは、また、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＡＧＡ、およびＡＧＧによってもコードされる。したがって、コード領域の中のこのような置換が本発明にカバーされる配列改変体に入ることは明らかである。
【００８８】
さらに、このような配列改変体は、高いストリンジェンシーの条件下で親配列にハイブリダイズしても、またハイブリダイズしなくてもよいことが理解される。これは、例えば、配列改変体に親ヌクレオチドによってコードされるアミノ酸の各々について異なるコドンが含まれる場合に起こり得る。それでもなお、このような改変体は、本発明によって具体的に想定され、包含される。
【００８９】
（自己プロセシングペプチド配列の除去）
自己プロセシングペプチド（例えば、２Ａ配列または２Ａ様配列）の使用に伴う１つの懸念は、最初のポリペプチドのＮ末端に自己プロセシングペプチドに由来するアミノ酸（すなわち、２Ａ由来のアミノ酸残基）が含まれることである。これらのアミノ酸残基は、宿主にとっては「外来性」であり、そして組換えタンパク質がインビボで発現させられたかまたは送達された（すなわち、遺伝子治療に関連してウイルスベクターまたは非ウイルスベクターによって発現させられたか、あるいは、インビトロで産生された組換えタンパク質として投与された）場合には免疫応答を誘発し得る。加えて、２Ａ由来のアミノ酸残基は、除去されない場合、産生細胞においてタンパク質の分泌を妨害し得るか、そして／またはタンパク質の立体構造を変化させ得、組換えタンパク質の最適な発現レベルの低下、および／または組換えタンパク質の生物学的活性の低下をもたらし得る。本発明には、切断後に残っている自己プロセシング切断部位由来アミノ酸残基の除去のための手段として、ポリペプチドをコードする配列と自己プロセシング切断部位（すなわち、２Ａ配列）の間にさらなるタンパク質分解的切断部位が提供されるように操作された、遺伝子発現構築物が含まれる。
【００９０】
さらなるタンパク質分解的切断部位の例は、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有しているフリン切断部位である。これは、内因性のサブチリシン様プロテアーゼ（例えば、フリン）およびタンパク質分泌経路の中の他のセリンプロテアーゼによって切断することができる。ＵＳＳＮ  １０／８３１３０２（参考として本明細書中で援用される）に示されているように、本発明者らにより、第１のポリペプチドと２Ａ配列との間にフリン切断部位ＲＡＫＲ（配列番号１１）を導入することによって、第１のタンパク質のＮ末端にある２Ａ残基を効率よく除去できることが明らかにされた。加えて、２Ａ配列をコードするヌクレオチド配列と２Ａ部位に隣接しているフリン切断部位を含むプラスミドの使用により、２Ａ配列のみを含むプラスミドよりも高いレベルのタンパク質の発現を生じることが示された。この改良により、２Ａ残基がタンパク質のＮ末端から除去される場合には、より長い２Ａ配列もしくは２Ａ様配列または他の自己プロセシング配列を使用できるというさらなる利点が提供される。このようなより長い自己プロセシング配列（例えば、２Ａ配列または２Ａ様配列）によって、１つのプロモーターにより２つ以上のポリペプチドの良好な等モル量での発現を促進させることができる。
【００９１】
完全なヒトの特性を有している抗体またはそのアナログを使用することは有利である。これらの試薬によって、非ヒト種を起源とする抗体またはアナログによって誘導される望ましくない免疫応答が回避される。自己プロセシングペプチド由来のアミノ酸残基に対して起こり得る宿主免疫応答を解決するために、タンパク質分解的切断部位のコード配列が、第１のタンパク質のコード配列と自己プロセシングペプチドのコード配列との間に（当該分野で公知の標準的な方法論を使用して）挿入され得、それによって、発現させられたポリペプチド（すなわち、抗体）から自己プロセシングペプチド配列を除去する。このことは、インビボでの使用のための治療用抗体または診断用抗体における特定の有用性を見出す。
【００９２】
組換えＤＮＡ技術ベクターを使用して発現させることができる当該分野で公知の任意のさらなるタンパク質分解的切断部位が、本発明の実施において使用され得る。ポリペプチドまたはタンパク質をコードする配列と自己プロセシング切断配列（例えば、２Ａ配列）との間に挿入することができる例示的なさらなるタンパク質分解的切断部位としては、以下が挙げられるがこれらに限定はされない：
ａ）フリン切断部位：ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）；
ｂ）第Ｘａ因子切断部位：ＩＥ（Ｄ）ＧＲ（配列番号１２）；
ｃ）シグナルペプチダーゼＩ切断部位：例えば、ＬＡＧＦＡＴＶＡＱＡ（配列番号１３）；および
ｄ）．トロンビン切断部位：ＬＶＰＲＧＳ（配列番号１４）。
【００９３】
本明細書中に詳細に記載されるように、２Ａペプチド配列により、翻訳プロセスの間の免疫グロブリンの両方の鎖または他のタンパク質の作製を促進する「切断」部位が提供される。１つの例示的な実施形態においては、第１のタンパク質（例えば、免疫グロブリン重鎖）のＣ末端には、２Ａ配列自体に由来するおよそ１３個のアミノ酸残基が含まれる。残っているアミノ酸の数は使用される２Ａ配列に依存する。上記に示されており、そして実施例で示されるように、フリン切断部位配列（例えば、ＲＡＫＲ（配列番号１１））が第１のタンパク質と２Ａ配列との間に挿入されている場合には、２Ａ残基は第１のタンパク質のＣ末端から除去される。しかし、質量スペクトル分析データは、ＲＡＫＲ−２Ａ構築物（配列番号１１として開示されたＲＡＫＲ）から発現させられた第１のタンパク質のＣ末端に、フリン切断部位ＲＡＫＲ（配列番号１１）に由来するさらなる２つのアミノ酸残基ＲＡが含まれていることを示している。
【００９４】
１つの実施形態においては、本発明により、残っているアミノ酸の除去のための方法、およびその発現のための組成物が提供される。タンパク質のＣ末端からのこれらのさらなるアミノ酸の除去を提供する多数の新規な構築物が設計されている。フリンによる切断は、コンセンサス配列ＲＸＲ（Ｋ）Ｒ（配列番号２７）を有している切断部位のＣ末端で生じ、ここでは、Ｘは任意のアミノ酸である。１つの態様においては、本発明により、カルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）（これには、カルボキシペプチダーゼＤ、Ｅ、およびＨ（ＣＰＤ、ＣＰＥ、ＣＰＨ）が含まれるがこれらに限定はされない）と呼ばれる酵素のグループから選択される酵素の使用による、タンパク質のＣ末端からの新たに露出させられた塩基性アミノ酸残基ＲまたはＫの除去のための手段が提供される。ＣＰはタンパク質のＣ末端にある塩基性アミノ酸残基を除去することができるので、塩基性アミノ酸ＲまたはＫだけを含むフリン切断部位（例えば、ＲＫＫＲ（配列番号１５）、ＲＫＲＲ（配列番号１６）、またはＲＲＲＲ（配列番号１７）など）に由来する全てのアミノ酸残基を、ＣＰによって除去することができる。２Ａ配列およびフリン切断部位を含み、そしてＣ末端に塩基性アミノ酸残基を有している一連の免疫グロブリン発現構築物が、切断および残基の除去の効率を評価するために構築されている。例示的な構築物の設計は以下である：Ｈ鎖−フリン（例えば、ＲＫＫＲ（配列番号１５）、ＲＫＲＲ（配列番号１６）、ＲＲＫＲ（配列番号１８）、またはＲＲＲＲ（配列番号１７））−２Ａ−Ｌ鎖、またはＬ鎖−フリン（例えば、ＲＫＫＲ（配列番号１５）、ＲＫＲＲ（配列番号１６）、ＲＲＫＲ（配列番号１８）、またはＲＲＲＲ（配列番号１７））−２Ａ−Ｈ鎖。例示的な構築物の模式図は、それぞれ図１４および１５に提供される。
【００９５】
当業者に明らかであるように、免疫グロブリン重（Ｈ）鎖のＣ末端には塩基性アミノ酸残基（Ｋ）（Ｈ鎖をカルボキシペプチダーゼによる切断に供する）が存在し、一方、免疫グロブリン軽（Ｌ）鎖には、塩基性ではないアミノ酸Ｃが末端にある。本発明の１つの好ましい実施形態においては、フリン部位および２Ａ配列を含む抗体発現構築物が提供され、ここでは、免疫グロブリンＬ鎖は免疫グロブリンＨ鎖に対して５’の位置にあり、その結果、翻訳後には、さらなるフリンアミノ酸残基がカルボキシペプチダーゼによって切断される。
【００９６】
（本発明の実施において使用されるベクター）
本発明により、免疫グロブリンの発現が生じる限りは、免疫グロブリン重鎖および軽鎖のコード配列および自己プロプロセシング切断配列を含む構築物を細胞内に導入するための任意のＡＡＶウイルスベクター血清型の使用が想定される。多数のＡＡＶベクターが当該分野で公知である。組換えＡＡＶウイルスベクターの作製においては、必須ではない遺伝子が目的のタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子と置き換えられる。初期の研究はＡＡＶ２血清型を使用して行われていた。しかし、ＡＡＶ２以外の代替のＡＡＶ血清型の使用により（Ｄａｖｉｄｓｏｎら，（２０００），ＰＮＡＳ  ９７（７）３４２８−３２；Ｐａｓｓｉｎｉら，（２００３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７７（１２）：７０３４−４０）は、種々の細胞向性と形質導入能力の増大が示された。１つの態様においては、本発明は、インビトロまたはインビボでの免疫グロブリンまたは他の治療用化合物の最適なＡＡＶベクターによって媒介される送達および発現を可能にする、ＡＡＶベクターならびに方法に関する。
【００９７】
ベクターには、通常、複製起点が含まれ、そしてベクターには、さらに、ベクターを同定および選択することができる「マーカー」すなわち「選択マーカー」機能が含まれても、または含まれなくてもよい。任意の選択マーカーを使用することができるが、組換えベクターにおいて使用される選択マーカーは当該分野で一般的に公知であり、適切な選択マーカーの選択は宿主細胞に依存するであろう。抗生物質または他の毒素に対する耐性を付与するタンパク質をコードする選択マーカー遺伝子の例としては、アンピシリン、メトトレキセート、テトラサイクリン、ネオマイシン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎら，Ｊ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎｅｔ．１９８２；１（４）：３２７−４１（１９８２））、ミコフェノール酸（Ｍｕｌｌｉｇａｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２−７（１９８０））、ピューロマイシン、ゼオマイシン、ハイグロマイシン（Ｓｕｇｄｅｎら，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５（２）：４１０−３（１９８５））、およびＧ４１８が挙げられるが、これらに限定はされない。当業者に理解されるように、発現ベクターには、通常、複製起点、発現させられるコード配列（単数または複数）に作動可能に連結させられたプロモーター、ならびにリボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位、および転写終結配列が、発現させられるコード配列（単数または複数）に適切であるように含まれる。
【００９８】
ベクターまたは他のＤＮＡ配列についての「組換え体」との言及は、通常は作動可能に連結されない（天然から単離されるか、または天然において見出される）ＤＮＡ配列の、動可能な連結を認めるに過ぎない。調節（発現および／または制御）配列は、発現配列および／または制御配列が、ヌクレオチド配列の転写を調節し、そして適切である場合には翻訳を調節する場合に、核酸コード配列に作動可能に連結されている。したがって、発現調節および／または制御配列には、プロモーター、エンハンサー、転写終結因子、コード配列の５’にある開始コドン（すなわち、ＡＴＧ）、イントロンのスプライシングシグナル、および終止コドンが含まれ得る。
【００９９】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、染色体への組み込みによって細胞に潜在的に感染することができる、ヘルパー依存性ヒトパルボウイルスである。染色体に組み込むその能力と、その非病原性の性質が原因で、ＡＡＶはヒト用の遺伝子治療ベクターとしてかなりの可能性を有している。本発明の実施における使用のためには、ｒＡＡＶビリオンは、当業者に公知である標準的な方法論を使用して産生され得、そして、転写の方向で、転写開始配列および転写終結配列を含む制御配列、目的の免疫グロブリンコード配列（単数または複数）、および自己プロセシング切断配列を、作動可能に連結された成分として含むように、構築され得る。より具体的には、本発明の組換えＡＡＶベクターには以下が含まれる：（１）複製欠損ＡＡＶビリオンにベクターが取り込まれることを可能にするパッケージング部位；（２）２つ以上の目的のポリペプチドまたはタンパク質（例えば、目的の免疫グロブリンの重鎖および軽鎖）のコード配列；ならびに（３）単独の、またはさらなるタンパク質分解的切断部位と組み合わせられた、自己プロセシング切断部位をコードする配列。本発明の実施において使用されるＡＡＶベクターはまた、転写の方向で作動可能に連結された成分として、転写開始配列および転写終結配列を含む制御配列をも含むように構築される。これらの成分には、機能性ＡＡＶ  ＩＴＲ配列が５’末端および３’末端に隣接している。「機能性ＡＡＶ  ＩＴＲ配列」により、ＩＴＲ配列がＡＡＶビリオンのレスキュー、複製、およびパッケージングを意図するように機能することが意味される。
【０１００】
組換えＡＡＶベクターはまた、それらが標的細胞の中での組換え免疫グロブリンの発現および産生を指向し得ることによっても特徴付けられる。したがって、組換えベクターには、少なくとも、キャプシド化に不可欠なＡＡＶ配列全体、および組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ビリオンの感染のための物理的構造が含まれる。したがって、本発明のベクターにおいて使用されるＡＡＶ  ＩＴＲは、野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく（例えば、Ｋｏｔｉｎ，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．，５：７９３−８０１，１９９４に記載されている）、そしてヌクレオチドの挿入、欠失、もしくは置換によって変化させられ得るか、あるいは、ＡＡＶ  ＩＴＲはいくつかのＡＡＶ血清型のいずれかに由来し得る。一般的には、ＡＡＶベクターはアデノ随伴ウイルス血清型に由来するベクターであり、これには、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８などが含まれるがこれらに限定はされない。好ましいｒＡＡＶベクターは、全体または一部が欠失している野生型ＲＥＰ遺伝子および野生型ＣＡＰ遺伝子を有しているが、機能性の隣接ＩＴＲ配列は維持している。表２には、本発明の実施において使用される例示的なＡＡＶ血清型が示される。
【０１０１】
（表２．遺伝子導入に使用されるＡＡＶ血清型）
【０１０２】
【表２】
2008506389.tif 000003
通常、ＡＡＶ発現ベクターは、産生細胞に導入され、その後、ＡＡＶヘルパー構築物が導入される。ここでは、へルパー構築物には、産生細胞中で発現させることができるＡＡＶコード領域が含まれ、そして補体ＡＡＶヘルパー機能はＡＡＶベクターにおいては存在しない。ヘルパー構築物は、大きなＲｅｐタンパク質（Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８）の発現を、通常は、米国特許第６，５４８，２８６号（参考として本明細書中で援用される）に記載されているようにＡＴＧからＡＣＧに開始コドンの後のｐ５を変異させることによって、ダウンレギュレートさせるように設計することができる。これにはその後に、産生細胞へのへルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターの導入が続く。ここでは、ヘルパーウイルスおよび／またはさらなるベクターにより、効率的なｒＡＡＶウイルスの産生を支持し得るアクセサリー機能が提供される。その後、産生細胞が培養されてｒＡＡＶが産生される。これらの工程は、標準的な方法論を使用して行われる。本発明の組換えＡＡＶベクターをカプセル化する複製欠損ＡＡＶビリオンは、ＡＡＶパッケージング細胞およびパッケージング技術を使用して当該分野で公知の標準的な技術によって作製される。これらの方法の例は、例えば、米国特許第５，４３６，１４６号；同第５，７５３，５００号、同第６，０４０，１８３号、同第６，０９３，５７０号、および同第６，５４８，２８６号（これらはそれらの全体が参考として本明細書中で援用される）において見出され得る。パッケージングのためのさらなる組成物および方法は、Ｗａｎｇら，（ＵＳ２００２／０１６８３４２）（これもまたその全体が参考として本明細書中で援用される）に記載されており、これには、当業者の知識の範囲内にある技術が含まれる。
【０１０３】
ＡＡＶのおよそ４０種類の血清型が現在公知である。しかし、新規な血清型、および既存の血清型の改変体が、今日もなお同定されており、本発明の範囲内に含まれるとみなされる。Ｇａｏら，（２００２），ＰＮＡＳ  ９９（１８）：１１８５４−６；Ｇａｏら，（２００３），ＰＮＡＳ  １００（１０）：６０８１−６；ＢｏｓｓｉｓおよびＣｈｉｏｒｉｎｉ（２００３），Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７（１２）：６７９９−８１０を参照のこと。種々のＡＡＶ血清型は、特定の標的細胞の形質導入を最適化するため、または特定の標的組織内の特異的な細胞型を標的化するために使用される。種々のＡＡＶ血清型の使用により、疾患組織の標的化が促進され得る。特定のＡＡＶ血清型は、特異的な標的組織型または細胞をより効率よく標的化し得、そして／または複製し得る。１つの自己相補性ＡＡＶベクターが、形質導入効率を増大させるために本発明の実施において使用され得、トランスジーンの発現のより早い開始をもたらし得る（ＭａＣａｒｔｙら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００１  Ａｕｇ；８（１６）：１２４８−５４）。
【０１０４】
本発明の実施においては、ｒＡＡＶビリオンを産生するための宿主として、哺乳動物細胞、昆虫細胞、微生物、および酵母が挙げられる。宿主細胞はまた、ＡＡＶベクターのゲノムが安定的に維持されそしてパッケージされる宿主細胞または産生細胞の中で、ＡＡＶ  ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ  ｃａｐ遺伝子が安定的に維持される、パッケージング細胞であってもよい。例示的なパッケージング細胞および産生細胞は、２９３細胞、Ａ５４９細胞、またはＨｅＬａ細胞に由来する。ＡＡＶベクターは、当該分野で公知の標準的な技術を使用して精製され、そして処方される。
【０１０５】
本発明のベクターには、通常、異種制御配列が含まれ、異種制御配列としては、構成性プロモーター（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、およびＰＧＫプロモーター、組織特異的プロモーターまたは細胞型特異的プロモーター（ｍＴＴＲ、ＴＫ、ＨＢＶ、ｈＡＡＴを含む）、調節性プロモーターまたは誘導性プロモーター、エンハンサーなどが挙げられるが、これらに限定はされない。好ましいプロモーターとしては、ＬＳＰプロモーター（Ｉｌｌら，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌ．Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ  ８Ｓ２：２３−３０（１９９７））、ＥＦ１−αプロモーター（Ｋｉｍら，Ｇｅｎｅ  ９１（２）：２１７−２３（１９９０））、およびＧｕｏら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３（９）：８０２−１０（１９９６））が挙げられる。最も好ましいプロモーターとしては、伸張因子１−α（ＥＦ１ａ）プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ−１（ＰＧＫ）プロモーター、サイトメガロウイルス前初期遺伝子（ＣＭＶ）プロモーター、キメラ肝臓特異的プロモーター（ＬＳＰ）、サイトメガロウイルスエンハンサー／ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター、テトラサイクリン反応性プロモーター（ＴＲＥ）、トランスサイレチンプロモーター（ＴＴＲ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０）、およびＣＫ６プロモーターが挙げられる。これらおよび多数のさらなるプロモーターのヌクレオチド配列が当該分野で公知である。関連する配列は、公的なデータベースから容易に入手することができ、そして本発明の実施において使用されるＡＡＶベクターに組み入れられ得る。
【０１０６】
本発明により、また、免疫グロブリンコード配列の制御された発現のための遺伝子調節システムを含めることも企図される。遺伝子調節システムは、特定の遺伝子（単数または複数）の調節された発現に有用である。１つの例示的なアプローチにおいては、遺伝子調節システムまたはスイッチには、リガンド結合ドメイン、転写活性化ドメイン、およびＤＮＡ結合ドメインを有しているキメラ転写因子が含まれる。これらのドメインは、実質的にあらゆる供給源から得ることができ、そして新規なタンパク質を得るための多数の方法のいずれかにおいて組み合わせることができる。調節可能な遺伝子システムにはまた、キメラ転写因子と相互作用するＤＮＡ応答エレメントも含まれる。このエレメントは調節される遺伝子に隣接して配置される。
【０１０７】
本発明の実施において使用することができる例示的な遺伝子調節システムとしては、ショウジョウバエのエクジソンシステム（Ｙａｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９３：３３４６（１９９６））、カイコガのエクジソンシステム（Ｓｕｈｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９５：７９９９（１９９８））、Ｖａｌｅｎｔｉｓ  ＧｅｎｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）合成プロゲステロンレセプターシステム（ＲＵ−４８６をインデューサーとして使用する）（Ｏｓｔｅｒｗａｌｄｅｒら，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ９８（２２）：１２５９６−６０１（２００１））；ＴｅｔＯ  ＆  ＲｅｖＴｅｔＯシステム（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）（標的の転写を調節する（オンにするか、またはオフにする）ためにテトラサイクリン（Ｔｃ）またはアナログ（例えば、ドキシサイクリンまたはアンヒドロテトラサイクリン）のような小さい分子を使用する）（Ｋｎｏｔｔら，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ３２（４）：７９６，７９８，８００（２００２））；ＡＲＩＡＤ調節技術（２つの細胞内分子を一緒に輸送するための低分子の使用に基づき、これら分子のそれぞれは転写活性化因子またはＤＮＡ結合タンパク質のいずれかに連結される）。これらの成分が一緒に連結されると、目的の遺伝子の転写が活性化される。Ａｒｉａｄは２つの主要なシステムを有する：ホモ二量体化に基づくシステム、およびヘテロ二量体化に基づくシステム（Ｒｉｖｅｒａら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ，２（９）：１０２８−１０３２（１９９６）；Ｙｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８８−９１（２０００））。これら両方が、本発明の実施において使用され得る。
【０１０８】
本発明の実施において使用される好ましい遺伝子調節システムは、ＡＲＩＡＤ調節技術およびＴｅｔＯ  ＆  ＲｅｖＴｅｔＯシステムである。
【０１０９】
（免疫グロブリンをコードする配列を含む核酸構築物の細胞への送達）
自己プロセシング組換えポリペプチドの形態で抗体またはそのフラグメントをコードするヌクレオチド配列を含む本発明のｒＡＡＶベクター構築物は、細胞（例えば、体細胞）への治療用遺伝子の送達のために、またはＡＡＶベクターが形質導入された細胞による組換え免疫グロブリンの産生のために、インビトロ、エキソビボ、またはインビボで細胞に導入され得る。
【０１１０】
本発明のｒＡＡＶベクター構築物は、当該分野で公知の標準的な方法論を使用して、インビトロまたはエキソビボで細胞に導入され得る。このような技術としては、リン酸カルシウムを使用するトランスフェクション、培養細胞へのマイクロインジェクション（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｃｅｌｌ  ２２：４７９−４８８（１９８０））、エレクトロポレーション（Ｓｈｉｇｅｋａｗａら，Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎ．，６：７４２−７５１（１９８８））、リポソーム媒介遺伝子導入（Ｍａｎｎｉｎｏら，ＢｉｏＴｅｃｈｎ．，６：６８２−６９０（１９８８））、脂質媒介形質導入（Ｆｅｌｇｎｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：７４１３−７４１７（１９８７））、および高速マイクロプロジェクタイル（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ）を使用する核酸の送達（Ｋｌｅｉｎら，Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３（１９８７））が挙げられる。
【０１１１】
本発明のｒＡＡＶ構築物は、当業者によって慣用的に使用されている標準的な感染技術を使用して細胞に導入され得る。
【０１１２】
インビトロまたはエキソビボでの発現のためには、機能性免疫グロブリンを発現させるために有効な任意の細胞を使用することができる。タンパク質の発現に使用される細胞および細胞株の多数の例は当該分野で公知である。例えば、原核生物細胞および昆虫細胞が発現のために使用され得る。加えて、真核生物である微生物（例えば、酵母）が使用され得る。原核生物システム、昆虫システム、および酵母システムでの組換えタンパク質の発現は、当該分野で一般的に公知であり、本発明の組成物および方法を使用して抗体の発現に適応させることができる。
【０１１３】
免疫グロブリンの発現に有用な細胞の例としては、さらに、哺乳動物細胞（例えば、線維芽細胞、非ヒト哺乳動物に由来する細胞（例えば、ヒツジ、ブタ、マウス、およびウシの細胞）、昆虫細胞などが挙げられる。哺乳動物細胞の特異的な例としては、ＣＯＳ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、２９３細胞、ＮＳＯ細胞、ＳＰ２０細胞、３Ｔ３線維芽細胞、Ｗ１３８細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＥＰＧ２細胞、ＤＵＸ細胞、およびＭＤＣＫ細胞が挙げられる。
【０１１４】
宿主細胞は、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、または所望される配列をコードする遺伝子の増幅のために適切であるように改変された従来の栄養培地の中で培養される。哺乳動物宿主細胞は、種々の培地で培養することができる。市販されている培地（例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ  １６４０（Ｓｉｇｍａ）、およびＤａｌｂｅｃｃｏ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ，Ｓｉｇｍａ）が、通常は宿主細胞の培養に適している。任意の培地には、通常、ホルモンおよび／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または表皮増殖因子）、ＤＨＦＲ、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、およびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生物質、微量元素、およびグルコースもしくは同等のエネルギー源が必要に応じて補充される。任意の他の必須の補助物質もまた、当業者に公知である適切な濃度で含まれ得る。特定の細胞株についての適切な培養条件（例えば、温度、ｐＨなど）は当該分野で一般的に公知であり、例えば、＜“ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／Ｓｅａｒｃｈ  ｃａｔａｌｏｇｓ／ＡｌｌＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ．ｃｆｍ．”＞でオンラインで入手することができるＡＴＣＣカタログに提供されている多数の細胞株の培養について提案されている培養条件が用いられる。本発明のｒＡＡＶベクターは、動物モデルまたはヒト被験体にｒＡＡＶを送達するために有効な多数の経路（例えば、皮内、静脈内、腫瘍内、脳内、門脈内、腹腔内、筋肉内、膀胱内など）のいずれかによってインビボで投与され得る。投与経路に応じて、組換え免疫グロブリンは局所的または全身的に作用を誘発するであろう。免疫グロブリンのオープンリーディングフレーム（単数または複数）に対して５’の位置での組織特異的プロモーターの使用は、組織非特異的プロモーターの制御下で発現させられる組換え免疫グロブリンの発現に関して、より大きな組織特異性をもたらす。
【０１１５】
例えば、本発明の組換えＡＡＶベクターのインビボでの送達は、脳、肝臓、血管、筋肉、心臓、肺、および皮膚を含むがこれらに限定はされない広い範囲の様々な器官のタイプに対して標的化され得る。本発明の組換えＡＡＶベクターのインビボでの送達はまた、細胞の状態に基づいて広い範囲の様々な細胞のタイプに対しても標的化され得る。すなわち、ガン細胞は、細胞周期、細胞環境の低酸素状態、またはガン性ではない場合の（正常な生理学的条件下にある分裂していないかまたは調節されて分裂している状態である）同じ細胞の典型的な生理学的状態または正常な生理学的状態とは異なる他の生理学的状態に基づいて、標的化され得る。細胞状態に関係するプロモーターの例は、テロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ＴＥＲＴ）およびＥ２Ｆプロモーターである。
【０１１６】
エキソビボでの遺伝子の導入の場合には、標的細胞は、本発明の組換えＡＡＶベクターおよび当該分野で周知の方法を使用して宿主細胞から取り出され、そして研究室において遺伝子改変される。
【０１１７】
本発明の組換えＡＡＶベクターは、上記の形式を含むがそれらに限定はされない従来の投与形式を使用して投与され得、そして様々な処方物中に存在し得る。この処方物としては、液体溶液および懸濁液、微小胞、リポソーム、および注射可能溶液もしくは注入可能溶液が挙げられるが、これらに限定はされない。好ましい形態は、投与の形式および治療用途に依存する。
【０１１８】
本明細書中に提供される実験結果が示すように、本発明の組換えＡＡＶベクター構築物をインビボでの免疫グロブリンの産生において使用すること（例えば、長期間にわたる１つのベクターの投与および患者の中での持続的な抗体の発現、あるいは抗体または完全な生物学的活性を有しているそのフラグメントのインビボでの発現であって、ここで、抗体の天然の翻訳後修飾は、ヒト細胞の中で起こる）において、実現される多くの利点がある。
【０１１９】
本発明の組換えＡＡＶベクター構築物は、さらに、治療で使用される組換え体抗体のインビトロでの産生においても有用性を見出す。組換えタンパク質の産生のための方法は当該分野で周知であり、そして、本明細書中に記載される自己プロセシング切断部位を含むベクター構築物を使用する組換え抗体の発現に利用することができる。
【０１２０】
１つの態様においては、本発明により、上記のようなＡＡＶベクターを細胞の中に導入してＡＡＶに感染した細胞を得ることによる、組換え免疫グロブリンまたはそのフラグメントの産生のための方法が提供される。ここでは、ベクターには、５’から３’の方向に向かって：免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖またはそれらのフラグメントのコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、自己プロセシング配列（例えば、２Ａ配列または２Ａ様配列）、ならびに免疫グロブリン重鎖もしくは軽鎖またはそれらのフラグメントのコード配列が含まれ、ここでは、自己プロセシング切断配列は、第１の免疫グロブリンコード配列と第２の免疫グロブリンコード配列との間に挿入される。免疫グロブリンの重鎖のコード配列、または免疫グロブリン軽鎖のコード配列のいずれかが、所定のＡＡＶ構築物において２Ａ配列に対して５’（すなわち、第１）の位置に存在し得ることが理解されるであろう。
【０１２１】
関連する態様においては、本発明により、細胞に上記のようなＡＡＶベクターを導入することによる、組換え免疫グロブリンまたはそのフラグメントを産生するための方法が提供される。ここでは、ＡＡＶベクターには、さらに、第１の免疫グロブリンコード配列と第２の免疫グロブリンコード配列との間にさらなるタンパク質分解的切断部位が含まれる。好ましいさらなるタンパク質分解的切断部位は、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有しているフリン切断部位である。
【０１２２】
本発明の１つの例示的な態様においては、インビトロでの細胞へのＡＡＶベクターの導入の後に、以下の工程の１つ以上が続く：
（１）免疫グロブリンまたはそのフラグメントを発現する細胞を選択するための条件下で、トランスフェクトされた細胞を培養する工程；
（２）免疫グロブリンまたはそのフラグメントの発現を測定する工程；および
（３）免疫グロブリンまたはそのフラグメントを収集する工程。
【０１２３】
本発明の別の例示的な態様においては、インビボでの患者へのＡＡＶベクターの投与の後には、以下の工程の１つ以上が続く：
（１）患者から血清、血漿、または他の組織試料を収集する工程；
（２）免疫グロブリンまたはそのフラグメントの発現レベルを測定する工程；および
（３）免疫グロブリンまたはそのフラグメントの検出レベルに依存して治療レジメンを調整する工程。
【０１２４】
本発明の別の態様により、組換え免疫グロブリンまたはそのフラグメントを発現させるための細胞が提供される。ここでは、細胞には、２つ以上の免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントの第１のコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、自己プロセシング切断配列（例えば、２Ａ配列または２Ａ様配列）、ならびに免疫グロブリン鎖またはそのフラグメントの第２のコード配列の発現のためのＡＡＶベクターが含まれる。ここでは、自己プロセシング切断配列は、第１のコード配列と第２のコード配列との間に挿入される。関連する態様においては、細胞には、上記のようなＡＡＶベクターが含まれる。ここでは、発現ベクターには、さらに、第１の免疫グロブリンコード配列と第２の免疫グロブリンコード配列との間にさらなるタンパク質分解的切断部位が含まれる。好ましいさらなるタンパク質分解的切断部位は、コンセンサス配列ＲＸＫ（Ｒ）Ｒ（配列番号１０）を有しているフリン切断部位である。
【０１２５】
なお別の態様においては、本発明により、本発明のＡＡＶベクターで宿主細胞を形質導入することによる、インビボで組換え免疫グロブリン分子を産生させるための方法が提供される。ここでは、第１の免疫グロブリンコード配列および第２の免疫グロブリンコード配列は、実質的に等しいモル比で発現させられる。いくつかの用途において、本発明の方法は、ガンの処置、または組換え抗体ワクチンの調製における有用性を見出す。
【０１２６】
（抗体の産生）
抗体もしくは免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントの第１鎖または第２鎖をコードするヌクレオチド配列には、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＡの重鎖もしくはそのフラグメントが含まれる。抗体もしくは免疫グロブリンまたはそれらのフラグメントの鎖をコードする配列にはまた、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＡの軽鎖もしくはそのフラグメントも含まれる。抗体分子全体についての遺伝子、ならびにその改変形態または誘導された形態についての遺伝子には、Ｆａｂ、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、およびＦ（ａｂ’）２のようなフラグメントが含まれる。抗体およびフラグメントは動物に由来するものであっても、ヒト−マウスキメラであっても、ヒト化されたものであっても、ＤｅＩｍｍｕｎｉｚｅｄＯであっても、または、完全なヒトのものであってもよい。抗体は二重特異的であり得、これには、ダイアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ）、クアドローマ（ｑｕａｄｒｏｍａ）、ミニ抗体、ＳｃＢｓ抗体、およびｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ抗体が含まれるがこれらに限定はされない。
【０１２７】
抗体自体の産生および回収は、当該分野で公知の種々の方法で行うことができる（Ｈａｒｌｏｗら，“Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ，（１９８８））。
【０１２８】
本発明の実施においては、組換えＤＮＡ技術を使用する抗体またはその改変体（アナログ）の産生は、宿主細胞の増殖およびコード配列の発現に適切な培養条件下で改変組換え宿主細胞を培養することによって得ることができる。発現の成功をモニタリングするために、抗原に対する抗体レベルが、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどのような標準的な技術を使用してモニタリングされ得る。抗体は、当該分野で公知の標準的な技術を使用して培養上清から回収される。これらの抗体の精製された形態は、もちろん、標準的な精製技術によって容易に調製することができ、これには好ましくは、プロテインＡカラム、プロテインＧカラム、またはプロテインＬカラムを介するアフィニティークロマトグラフィー、あるいは、特定の抗原に対するアフィニティークロマトグラフィー、またはさらには、特異性が所望される抗原の特定のエピトープに対するアフィニティークロマトグラフィーが含まれる。抗体は、他の技術（例えば、硫酸アンモニウム沈殿、およびサイズ限定膜濾過）と組み合わせた従来のクロマトグラフィー（例えば、イオン交換カラムまたはサイズ排除カラム）でもまた精製することができる。好ましい発現システムは、得られる抗体が培養培地または上清の中に分泌されるようにシグナルペプチドを含むように設計されるが、細胞内産生もまた可能である。
【０１２９】
ヒトＩｇ遺伝子座で操作されたマウス由来の抗原特異的完全ヒトモノクローナル抗体の産生および選択は以前に記載されている（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ａ．ら，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，Ｖｏｌ．３１，ｐｐ．３３−４２（１９９８）；Ｍｅｎｄｅｚ  Ｍ，ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．１５，ｐｐ：１４６−１５６（１９９７）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ａ．ら，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６，Ｎｏ．５，ｐｐ：５６１−５６６（１９９５）；Ｇｒｅｅｎ  Ｌ，ら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｖｏｌ．７，Ｎｏ．１，ｐｐ：１３−２１（１９９４））。
【０１３０】
自己プロセシングペプチドのコード配列を単独で、またはタンパク質分解的切断部位についてのさらなるコード配列と組み合わせて含む本発明のＡＡＶベクターは、インビトロでの任意の細胞型の中での組換え免疫グロブリンまたはそのフラグメントの発現、その後の多数のインビボ経路のいずれかによる投与（多数のインビボ経路が当該分野で公知であり、その例が本明細書中に記載される）において有用性を見出す。当業者は、任意のタンパク質発現システムにおける使用のために本発明のベクターを容易に適応させることができる。
【０１３１】
本発明の目的は一連の実験によって達成されており、そのいくつかが以下の限定ではない実施例によって記載される。
【実施例】
【０１３２】
（実施例１）
（ＡＡＶ  ２Ａ発現構築物の構築）
自己プロセシング切断配列（２Ａ）を有している、ラット抗ＦＬＫ−１モノクローナル抗体および完全ヒト抗ＫＤＲモノクローナル抗体の全長の重鎖および軽鎖をコードするＡＡＶベクターを、図１Ａに示すように構築した。抗体重鎖および軽鎖の可変領域と定常領域を、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して親ハイブリドーマ細胞のｃＤＮＡからクローニングした。ｃＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎの全ＲＮＡ精製キットを使用してハイブリドーマ細胞から単離した全ＲＮＡから逆転写酵素を用いて合成した。モノクローナル抗体のヌクレオチド配列を、自動配列決定システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して分析し、そしてコンセンサス配列を、複数回の独立したＰＣＲ反応から導いた配列データから得た。
【０１３３】
重鎖、２Ａ配列、およびラットｍＡｂまたはヒトｍＡｂのいずれかの抗体軽鎖をコードするＤＮＡフラグメントを、ＰＣＲによる伸張によって互いに連結させた。人工のＦＭＤＶ  ２Ａオリゴヌクレオチドを、２Ａペプチド配列ＡＰＶＫＱＴＬＮＦＤＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ（配列番号６）に基づいて合成した。重鎖および軽鎖のフラグメントを、それぞれ、全長の抗体重鎖および軽鎖をコードするクローニングしたプラスミドから増幅した。ＰＣＲの際に、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位を重鎖の５’末端および軽鎖の３’末端に付け加えた。融合重鎖−２Ａ−軽鎖ＤＮＡフラグメントをＥｃｏＲＩで消化し、アガロースゲルから精製した。精製されたＤＮＡフラグメントを、ＥｃｏＲＩ部位が隣接しているＡＡＶプラスミド骨格の中に、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して挿入した。抗体重鎖−２Ａ配列−軽鎖の発現を駆動するＥＦ１−αプロモーターまたはＣＡＧプロモーターを含むＡＡＶベクター構築物を調製した。改変体形態には、天然のシグナルペプチド（リーダー）をそれぞれ、重鎖または軽鎖の中に含め、これによって合成されたポリペプチドの分泌を容易にした。
【０１３４】
（実施例２）
（フリン切断部位を有しているＡＡＶ  ２Ａ発現構築物の構築）
上記のＨ−２Ａ−Ｌ構築物から発現させられた抗体重鎖は、自己切断後には２Ａ配列由来の残留アミノ酸をそれらのＣ末端に残している。発現システムをさらに最適化して、宿主に対して外来性であるアミノ酸／配列を排除するために、第１のポリペプチド（すなわち、この例示的な構築物中では免疫グロブリン重鎖）と２Ａ配列との間にプロテアーゼ切断部位を含むベクターを構築した。使用した切断部位は、ＲＡＫＲ（配列番号１１）であり、これはフリンコンセンサス切断配列のカテゴリーに属する。実施例１に記載した方法を使用して、抗体重鎖−フリン切断部位−２Ａ−ラット抗体ＦＬＫ−１抗体およびヒト抗ＫＤＲ抗体の両方の軽鎖ＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって融合させ、それぞれをＡＡＶ骨格プラスミド内にクローニングした。構築物は、５’から３’の方向に向かって、５’ＡＡＶ  ＩＴＲ、プロモーター、抗体重鎖（Ｈ）のコード配列、さらなるタンパク質分解的切断部位のコード配列（例えば、この場合はフリン切断部位のコード配列）、自己プロセシング切断配列のコード配列（この場合は２Ａ配列）、抗体軽鎖（Ｌ）のコード配列、およびポリＡ配列（例えば、ＣＡＧ  Ｈ−Ｆ２Ａ−Ｌ）から構成されている（図１Ｂ）。
【０１３５】
（実施例３）
（インビトロでのＡＡＶ  Ｈ−２Ａ−ＬウイルスおよびＡＡＶ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−ＬウイルスからのＡＡＶの産生およびラットＩｇＧの発現）
本発明により、抗ＦＬＫ−１重鎖−２Ａ−軽鎖（Ｈ−２Ａ−Ｌ）または抗ＦＬＫ−１重鎖フリン切断部位−２Ａ−軽鎖（Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌ）の発現のために１つのプロモーターを使用することにより、生物学的に活性な抗体を高レベルで産生するＡＡＶベクターが提供される。これによって、抗体重鎖および軽鎖を同じ細胞の中で１つのオープンリーディングフレームとして発現させることができる。ＡＡＶベクターは２９３細胞の中で産生させた。ＡＡＶ  ＤＮＡは、プラスミドＤＮＡメガ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。２９３細胞を１５ｃｍの組織培養プレートの中でコンフルエンス未満まで増殖させ、その後、ＡＡＶ６ベクタープラスミドまたはＡＡＶ８ベクタープラスミド（ＡＡＶ  Ｈ−２Ａ−ＬまたはＡＡＶ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌ）、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８のためのＲｅｐ／Ｃａｐプラスミドおよびアデノウイルスヘルパープラスミドで同時トランスフェクションした。トランスフェクションの後、ＡＡＶウイルスを、二重ＣｓＣｌ勾配遠心分離によって２９３細胞溶解物から精製し、その後、ＰＢＳに対して一晩、十分に透析した。ｒＡＡＶウイルスの物理学的力価を、鋳型としてＡＡＶプラスミドを使用してプローブ探査したドットブロット分析によって決定した。全長のラット抗ＦＬＫ−１  ｍＡｂのためのＡＡＶベクターを、ＡＡＶ６骨格およびＣＡＧプロモーター（ＡＡＶ６  ＣＡＧ  Ｈ２ＡＬ）、ＡＡＶ８骨格およびＥＦ１−αプロモーター（ＡＡＶ８  ＥＦ１α  Ｈ２ＡＬ）、ＡＡＶ８骨格およびＣＡＧプロモーター（ＡＡＶ８  ＣＡＧ  Ｈ２ＡＬ）、ならびにＣＡＧプロモーターを有しているＡＡＶ８骨格（ここで、このベクターにはさらに、例示的なさらなるタンパク質分解的切断部位としてフリン切断部位が含まれる）（ＡＡＶ８  ＣＡＧ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌ）を使用して調製した。
【０１３６】
種々のＡＡＶベクターからインビトロでモノクローナル抗体を発現させるために、２９３細胞またはＨｕＨ７細胞を６ウェルプレートで培養した。細胞を、それぞれの精製したＡＡＶベクターを、（ヘルパーとしての）アデノウイルス−５とともに、またはアデノウイルス−５を伴わずに、培養プレートに添加することによって、ＡＡＶベクターに感染させた。４８時間後、細胞培養上清を収集し、ＩｇＧ１を定量した。Ｂｅｔｈｙｌ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓによるラットＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡキットをラットＩｇＧ１の分析に使用した。ラットモノクローナル抗体タンパク質を、１×１０５ｖｐのＡＡＶ６  ＣＡＧ  Ｈ２ＡＬウイルス、ＡＡＶ８  ＥＦ１α  Ｈ２ＡＬウイルス、ＡＡＶ８  ＣＡＧ  Ｈ２ＡＬウイルス、およびＡＡＶ８  ＣＡＧ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌウイルスにそれぞれ感染させた２９３細胞またはＨｕＨ７細胞の細胞培養上清中で検出した（表３）。しかし、抗体をコードするＡＡＶウイルスに感染させなかった対照ウェルから採取した上清の中では検出されなかった（上記）。
【０１３７】
表３に示す結果は、様々な血清型（例えば、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８）のＡＡＶウイルスベクターを使用して全長の抗体をインビトロで発現させることができたことを示している。ここでは、抗体重鎖および軽鎖を、２Ａのような自己プロセシング配列を使用して１つのオープンリーディングフレームとして発現させた。
【０１３８】
（表３．ＡＡＶ感染（１×１０５ｖｐ／ウェル）後のインビトロでのラットＩｇＧ１の発現）
【０１３９】
【表３】
2008506389.tif 000004
（実施例４）
（ヌードマウスでのＡＡＶ  Ｈ２ＡＬベクターまたはＡＡＶ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクターからのラット抗ＦＬＫ−１  ｍＡｂの発現）
この実験では、１つのプロモーターおよび抗体重鎖コード配列と抗体軽鎖コード配列との間に配置された自己プロセシング切断配列（本明細書中では２Ａによって例示する）を使用することによって発現が生じるモノクローナル抗体をコードするＡＡＶウイルスベクターの投与後に、マウスにおいて抗体の高い血清レベルが得られたことを示す。高レベルの抗体発現は、ラット抗ＦＬＫ−１  ｍＡｂ重鎖−２Ａ−軽鎖（Ｈ−２Ａ−Ｌ）ＡＡＶベクターおよびｍＡｂ重鎖−フリン切断部位−２Ａ−軽鎖（Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌ）ＡＡＶベクターを使用してそれぞれ示された。
【０１４０】
抗体レベルは、実施例３に記載したようにラットＩｇＧ１キットを使用して分析した。
【０１４１】
図２に示すように、２×１０１１ｖｐのＡＡＶ６  ＣＡＧラットｍＡｂ  Ｈ−Ｆ−Ｌウイルスベクターの筋肉内（ｉ．ｍ．）注射による投与によっては、マウス血清中で４．５μｇ／ｍｌまでの抗体レベルが生じ、少なくとも５０日目まで発現が持続した。
【０１４２】
図３に示すように、４×１０１１ｖｐのＡＡＶ８  ＥＦ１αラットｍＡｂ  Ｈ−２Ａ−Ｌウイルスベクターの門脈（ｐｖ）注射による投与によっては、マウス血清中で約１００μｇ／ｍｌのＩｇＧ１レベルが生じ、ここで、注射後２００日を越えてＩｇＧ１が持続し、そして３０μｇ／ｍｌを上回るＩｇＧ１レベルが３２０日よりも長い期間観察された。
【０１４３】
図４に示すように、１×１０１１ｖｐ、２×１０１１ｖｐ、または４×１０１１ｖｐのＡＡＶ８  ＣＡＧラットｍＡｂ  Ｈ−２Ａ−Ｌウイルスベクターの門脈注射による投与によっては、試験した３種類の用量（１×１０１１ｖｐ、２×１０１１ｖｐ、および４×１０１１ｖｐ）の全てで、マウスの血清中で高いレベルの用量依存性のＩｇＧの発現が生じた。４×１０１１ｖｐで処置した動物においては、血清ｍＡｂ（ＩｇＧ）レベルは２８日目に２倍を上回るレベルに達し、３ヶ月よりも長くにわたって５００μｇ／ｍｌよりも高いままであり、３２０日を越えても２１０μｇ／ｍｌを上回るレベルで持続した。
【０１４４】
最初の１００日間のうちで最も高い抗体発現レベルは、ＣＡＧプロモーターの制御下でラットｍＡｂをコードし、フリン切断配列および２Ａ配列をも含むＡＡＶ８ウイルスベクターを注射した動物から採取したマウスの血清の中で観察された。図５に示すように、ＡＡＶ８  ＣＡＧラットｍＡｂ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌウイルスの門脈注射による投与によっては、マウスの血清中で極めて高レベルの抗体発現が生じ、これは用量依存性の発現であった。２×１０１１ウイルス粒子／マウスおよび４×１０１１ウイルス粒子／マウスを注射したマウスのグループについては、約１０ｍｇ／ｍｌのラットｍＡｂが２８日目に検出され、１ｍｇ／ｍｌよりも高い発現レベルの持続的な発現が、ＡＡＶウイルスベクターの注射後３ヶ月よりも長く検出され、１００μｇ／ｍｌを超えるＩｇＧ１レベルが３２０日目にも存在していた。
【０１４５】
これらの結果は、全長の抗体を、免疫グロブリン重鎖ｃＤＮＡおよび免疫グロブリン軽鎖ｃＤＮＡの１つのオープンリーディングフレームを駆動するＡＡＶベクターからインビボで極めて高レベルで発現させることができたことを示している。ここでは、ベクターには、２つの鎖の間に配置された自己プロセシング切断配列（例えば、２Ａ）とともに１つのプロモーターが含まれている。５’コード配列と２Ａ配列との間にタンパク質分解的切断部位（例えば、フリン切断部位）を加えることによっては、第１のポリペプチドからの２Ａ残基の除去を容易にしただけではなく、インビボでの血清モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の発現レベルの増大もまた生じた。この方法論はＵＳＳＮ１０／８３１３０２およびＵＳＳＮ１０／８３１３０４に詳細に記載されており、これらのそれぞれはそれらの全体が参考として本明細書中で援用される。以前の研究の結果により、自己プロセシング切断配列（例えば、２Ａ）および、５’コード配列と２Ａ配列との間のさらなるタンパク質分解的切断部位（例えば、フリン切断部位）の両方を含むＡＡＶ８ベクター（例えば、ＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクター）を使用した場合には、最初の１００日間にインビボで検出されたｍＡｂの血清レベルが一貫して高かったことを確認した。
【０１４６】
（実施例５）
（２Ａ自己プロセシング配列およびフリン切断部位を有しているＡＡＶ８  ＣＡＧベクターによって誘導されるラット抗ＦＬＫ−１  ｍＡｂによるインビボでの腫瘍の増殖の阻害）
さらなる研究を、本発明のＡＡＶベクターを使用して発現させたモノクローナル抗体の生物学的活性を評価するために行った。これらの研究では、全長のラット抗ＦＬＫ−１  ｍＡｂをコードするヌクレオチド配列のＡＡＶによって媒介される遺伝子導入は、インビボのマウス腫瘍モデルにおいて腫瘍の増殖を抑制することが示された。
【０１４７】
ＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクターを実施例３に記載したように２９３細胞中で産生させた。ウイルス感染を、ＡＡＶ感染後のＨｕＨ７細胞中でのｍＡｂの発現によって確認した。ＡＡＶ８−ＣＡＧ−Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクター、またはＡＡＶ８対照ベクター（２×１０１１ウイルス粒子／マウス）をヌードマウスに静脈内投与した。ＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、上記）によるラット抗体の血清レベルを決定するために、マウスを毎週採血した。ベクターの投与後２３日目に、マウスに１×１０５個のＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞または５×１０６のＵ８７神経膠腫細胞（Ｍａｄｒｉｇａｌで１：１の容積で混合した）のいずれかを皮下注射し、腫瘍の大きさをキャリパーを使用して１週間に２回測定した。高い血清ｍＡｂ濃度が、ＡＡＶ８  ＣＡＧラットｍＡｂ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌウイルスで処置したマウスにおいて検出された（図６）。対照マウスに由来する血清においてはラットｍＡｂは検出されなかった。ＡＡＶ８  ＣＡＧラットｍＡｂ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクターを注射したマウスにおいては、有意な抗腫瘍活性がＢ１６黒色腫モデルにおいて観察された（Ｐ＜０．０５；図７）。Ｂ１６Ｆ１０黒色腫モデルにおけるＡＡＶ８  ＣＡＧラットｍＡｂ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクターの投与もまた、マウスの生存時間中央値を有意に延長させた（Ｐ＜０．０１；図８）。さらに、ＡＡＶ８  ＣＡＧラットｍＡｂ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクターを注射したマウスにおいては、有意な抗腫瘍活性がＵ８７神経膠腫モデルにおいて観察された（Ｐ＜０．０５；図９）。Ｕ８７神経膠腫モデルにおけるＡＡＶ８  ＣＡＧラットｍＡｂ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクターの投与によってもまた、マウスの生存時間中央値が有意に延長させられた（Ｐ＜０．０１；図１０）。
【０１４８】
これらの結果は、生物学的に活性な全長のモノクローナル抗体を、インビボでの１つのＡＡＶベクターの投与によって導くことができ、これによって、マウスの血清の中で長期間にわたる治療的な抗体の発現レベルが生じることを示している。
【０１４９】
（実施例６）
（ＡＡＶベクターの調製およびインビトロでのＡＡＶ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−ＬウイルスからのヒトＩｇＧの発現）
本発明の別の実施例においては、全長のヒト抗ＫＤＲ  ｍＡｂを、ラットモノクローナル抗体について上記に記載したものと同様のＡＡＶベクターから発現させた。ＡＡＶ−８ベクターには、抗体重鎖をコードする配列、フリン切断部位、２Ａ配列、および全長のヒト抗ＫＤＲ  ｍＡｂの抗体軽鎖をコードする配列から構成される１つのオープンリーディングフレームを駆動する１つのプロモーター（ＣＡＧ）が含まれる。ＣＡＧプロモーターによって駆動されるヒト抗ＫＤＲ  ｍＡｂをコードし、そして自己プロセシング切断配列（２Ａ）およびさらなるタンパク質分解的切断部位（例えば、フリン）をさらに含む、ＡＡＶプラスミドを、実施例１に記載したように構築した。ＡＡＶベクターを産生するために、ＡＡＶプラスミドをプラスミドＤＮＡメガ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製した。２９３細胞をＡＡＶベクタープラスミド、ＡＡＶ８のためのＲｅｐ／Ｃａｐプラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドで同時トランスフェクトした。トランスフェクション後、ＡＡＶウイルスを、二重ＣｓＣｌ勾配遠心分離によって細胞溶解物から精製し、その後、ＰＢＳに対して十分に透析した。ｒＡＡＶウイルスの物理的力価を、鋳型としてＡＡＶプラスミドを使用したプローブを用いたドットブロットによって決定した。
【０１５０】
ＡＡＶウイルスベクターを使用してインビトロでヒト抗ＫＤＲ  ｍＡｂを発現させるために、ＨｕＨ７神経膠腫細胞を６ウェルプレートで培養し、精製したＡＡＶ８  ＣＡＧヒトｍＡｂ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクターを細胞に対して加えることによってＡＡＶベクターに感染させた。７２時間後、ヒトＩｇＧ１キット（Ｚｙｍｅｄ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用したヒトＩｇＧ１の発現の分析のために細胞培養上清を収集した。ＫＤＲに対するヒトモノクローナル抗体は、１×１０５ｖｐのＡＡＶ８  ＣＡＧ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクターに感染させた細胞培養上清の中で検出されたが、いずれのトランスジーンをも発現しない対照ベクターに感染させた上清の中では検出されなかった（図１１）。
【０１５１】
（実施例７）
（インビボでのＡＡＶ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌウイルスからの２つのヒトＩｇＧサブクラスの発現）
実施例２に記載し、そして生物学的に活性な全長のＩｇＧ４抗体をインビトロで産生することを実施例６において明らかにした、全長のヒト抗ＫＤＲ  ｍＡｂをコードするＡＡＶベクターを、ヌードマウスにおいて全長のＩｇＧ４抗体をインビボで発現させるために使用した。ＡＡＶ８  ＣＡＧ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−ＬベクターまたはＡＡＶ対照ベクター（１×１０１１ウイルス粒子／マウスまたは２×１０１１ウイルス粒子／マウス）をヌードマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）または筋肉内（ｉ．ｍ．）に投与した。マウスを示した間隔で採血し、ヒト抗ＫＤＲ  ｍＡｂの血清レベルを、抗ヒトＩｇＧ４抗体およびヒトＩｇＧ４タンパク質標準物を使用したことを除いて、本質的に実施例５でラット抗体レベルについて記載したように、ＥＬＩＳＡによって決定した。いずれの投与経路によっても、２×１０１１ｖｐ／マウスを注射したマウスは１ｍｇ／ｍｌよりも高い血清ｍＡｂ（ＩｇＧ４）濃度を示し、静脈内注射については８８１μｇ／ｍｌのヒト抗体の持続的レベル、または筋肉内注射については４５９μｇ／ｍｌのヒト抗体の持続的レベルが、１８週間目に観察された（図１２）。ヒトｍＡｂは対照マウスの血清の中では検出されなかった（データは示さない）。
【０１５２】
ＩｇＧ１サブクラスの発現のために、上記のＡＡＶ８  ＣＡＧ  Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌベクターのヒト抗ＫＤＲ抗体の重鎖の定常領域をコードするヌクレオチド配列を、ヒトＩｇＧ１サブクラスの重鎖の定常領域をコードする対応するヌクレオチド配列で置き換えた。ＩｇＧ１をコードするＡＡＶ８ベクターを、本質的に実施例６に記載したように調製しそして精製し、そして２×１０１１ｖｐ／マウスをヌードマウスに静脈内（ｉ．ｖ．）で投与した。マウスを、１０日目、２１日目、および３５日目に採血し、ヒトＩｇＧ１  ｍＡｂ血清レベルを、抗ヒトＩｇＧ１抗体およびヒトＩｇＧ１タンパク質標準物を使用したことを除いて、本質的に上記に記載したように、ＥＬＩＳＡによって決定した。漸増濃度のヒト抗ＫＤＲ（ＩｇＧ１）ｍＡｂが血清中で観察され、３５日目には約１００μｇ／ｍｌのヒト抗体のレベルであった。
【０１５３】
これらの実験の結果は、種々のＩｇＧサブクラスの全長のヒト抗体が本発明のＡＡＶベクターの単回投与によってインビボで高レベルで発現され得ることを示している。
【０１５４】
（実施例８）
（ヒト抗ＫＤＲ  ｍＡｂはインビトロでヒト内皮細胞の増殖を刺激する）
ヒトＩｇＧを発現するＸｅｎｏＭｏｕｓｅトランスジェニックマウスを、ヒト抗ＫＤＲ抗体を作製するために組換えＫＤＲで免疫化した。免疫化したマウスに由来するリンパ球を収集してハイブリドーマ細胞を作製した。抗体クローンをＥＬＩＳＡをベースとするアッセイにおいてＫＤＲに対するそれらの結合に基づいてスクリーニングした。クローンの１つであるＣＧ２．２０はＫＤＲに対して高い親和性を示し、内皮細胞アッセイでアゴニスト効果を示した（以下にさらに記載する）。この抗体をＩｇＧ４κおよび全ヒトとして性質決定した。
【０１５５】
抗ＫＤＲ抗体（ＣＧ２．２０）の生物学的活性をヒト内皮細胞増殖アッセイにおいて決定した。このアッセイにおいて、ＨＵＶＥＣ細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ）を９６ウェルプレートに５０００細胞／ウェルで播種し、そしてＥＧＭ完全培地で一晩培養した。翌日、各ウェルをＰＢＳでリンスし、１％のウシ胎児血清および種々の量の精製した抗ＫＤＲ抗体（ＣＧ２．２０）または対照ＩｇＧを含む２００μｌのＥＢＭ基本培地を供給した。ＶＥＧＦまたは他の成長因子は培地には含めなかった。３日後、ＣＣＫ８試薬（ＣＣＫ８キット、Ｄｏｊｉｎｄｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を添加し、相対的な細胞密度を４５０ｎｍでのＯＤの読取値に基づいて決定した。図１３に示すように、ＣＧ２．２０抗体の添加によって用量依存性の様式でＨＵＶＥＣ細胞の細胞増殖が増大した。
【０１５６】
（表４．配列の簡単な表）
【０１５７】
【表４】
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【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】図１ＡおよびＢは、実施例１に記載されるような、抗体の重鎖および軽鎖をコードするＡＡＶ発現カセットを示す。ここでは、このカセットには、５’ＡＡＶ  ＩＴＲ、プロモーター、抗体重鎖のコード配列、自己プロセシング切断配列のコード配列（２Ａによって例示される）、抗体軽鎖のコード配列（Ｈ−２Ａ−Ｌ）、ポリＡ配列、および３’ＩＴＲが含まれる（図１Ａ）。いくつかの実施形態においては、ベクターにはまた、自己プロセシング切断配列のコード配列に対して５’にあるさらなるタンパク質分解的切断部位（フリン切断部位によって例示される）のコード配列も含まれる（図１Ｂ）。
【図２】図２は、抗体重鎖、２Ａ配列、およびラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の抗体軽鎖（Ｈ２ＡＬ）をコードする、２×１０１１ｖｐ（ウイルス粒子）のＡＡＶ６ベクターの筋肉内（ｉ．ｍ．）注射後のマウスの血清中のインビボでの抗体発現レベル（μｇ／ｍｌ）を示す。ここでは、抗体は、サイトメガロウイルスプロモーター配列およびサイトメガロウイルスエンハンサー配列、ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター配列およびＣＡＧエンハンサー配列、ならびにキメライントロンから構成されるハイブリッドプロモーター／エンハンサーの制御下で発現させられる。
【図３】図３は、抗体重鎖、２Ａ配列、およびラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の抗体軽鎖（Ｈ２ＡＬ）をコードする、４×１０１１ｖｐのＡＡＶ８ベクターの門脈（ｐｖ）注射後のマウスの血清中のインビボでの抗体（ＩｇＧ１）発現レベル（μｇ／ｍｌ）を示す。ここでは、抗体は、伸張因子１−α（ＥＦ１ａ）プロモーターの制御下で発現させられる。
【図４】図４は、抗体重鎖、２Ａ配列、およびラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の抗体軽鎖（Ｈ２ＡＬ）をコードする、１×１０１１ｖｐ、２×１０１１ｖｐ、または４×１０１１ｖｐのＡＡＶ８ベクターの門脈（ｐｖ）注射後のマウスの血清中のインビボでの抗体（ＤＣ１０１）発現レベル（μｇ／ｍｌ）を示す。ここでは、抗体は、サイトメガロウイルスプロモーター配列およびサイトメガロウイルスエンハンサー配列、ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター配列およびＣＡＧエンハンサー配列、ならびにキメライントロンから構成されるハイブリッドプロモーター／エンハンサーの制御下で発現させられる。
【図５】図５は、抗体重鎖、フリン切断部位、２Ａ配列、およびラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の抗体軽鎖（ＨＦ２ＡＬ）をコードする、１×１０１１ｖｐ、２×１０１１ｖｐ、または４×１０１１ｖｐのＡＡＶ８ベクターの門脈（ｐｖ）注射後のマウスの血清中のインビボでの抗体（ＤＣ１０１）発現レベル（μｇ／ｍｌ）を示す。ここでは、抗体は、サイトメガロウイルスプロモーター配列およびサイトメガロウイルスエンハンサー配列、ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター配列およびＣＡＧエンハンサー配列、ならびにキメライントロンから構成されるハイブリッドプロモーター／エンハンサーの制御下で発現させられる。
【図６】図６は、抗体重鎖、フリン切断部位、２Ａ配列、およびラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の抗体軽鎖（ＨＦ２ＡＬ）をコードする、２×１０１１ｖｐのＡＡＶ８ベクターの静脈内（ｉｖ）注射後７、１４、２１、３０、３７、および４４日目のマウスの血清中でのインビボでの抗体（ラットＩｇＧ）発現レベル（μｇ／ｍｌ）を示す。ここでは、抗体は、サイトメガロウイルスプロモーター配列およびサイトメガロウイルスエンハンサー配列、ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター配列およびＣＡＧエンハンサー配列、ならびにキメライントロンから構成されるハイブリッドプロモーター／エンハンサーの制御下で発現させられる。
【図７】図７は、抗体重鎖、フリン切断部位、２Ａ配列、およびラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の抗体軽鎖（ＨＦ２ＡＬ）をコードする、２×１０１１ｖｐのＡＡＶ８ベクターの静脈内（ｉｖ）注射後２４日までに、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍モデルにおいてＡＡＶ８によって媒介されるラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の発現が、擬似処置した対照において観察された発現と比較して、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍の増殖を減少させたことを示している。
【図８】図８は、擬似処置した対照動物と比較して、Ｂ１６Ｆ１０腫瘍でチャレンジした動物においてＡＡＶ８によって媒介されたラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の発現が、このような動物の高い生存を導いたことを示している。抗体重鎖、２Ａ配列、およびラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の抗体軽鎖（ＨＦ２ＡＬ）を発現する、２×１０１１ｖｐのＡＡＶ８ベクターの静脈内（ｉｖ）注射を投与した４匹の動物は、より大きな腫瘍を負っていることが原因で３２日目までに全てが死亡した擬似処置した対照動物と比較して長い期間生存していた。
【図９】図９は、抗体重鎖、フリン切断部位、２Ａ配列、およびラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の抗体軽鎖（ＨＦ２ＡＬ）をコードする、２×１０１１ｖｐのＡＡＶ８ベクターの静脈内（ｉｖ）注射後に、Ｕ８７神経膠腫モデルにおいてＡＡＶ８によって媒介されたラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の発現が、擬似処置した対照において観察された発現と比較して、Ｕ８７腫瘍の増殖の減少を生じたことを示している。
【図１０】図１０は、抗体重鎖、フリン切断部位、２Ａ配列、およびラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の抗体軽鎖（ＨＦ２ＡＬ）をコードする、２×１０１１ｖｐのＡＡＶ８ベクターの静脈内（ｉｖ）注射後に、Ｕ８７神経膠腫モデルにおいてＡＡＶ８によって媒介されたラット抗ＦＬＫ−１抗体（ＤＣ１０１）の発現が、擬似処置した対照について観察された生存と比較して、高い生存をもたらしたことを示している。
【図１１】図１１は、実施例６に記載されるような、ヒト抗ＫＤＲモノクローナル抗体重鎖、フリン切断部位、２Ａ配列、および抗体軽鎖（ＨＦ２ＡＬ）をコードするＡＡＶ８ベクターが形質導入されたＵ８７細胞の細胞培養上清の中の全長のヒト抗ＫＤＲ抗体の発現レベルを示す。
【図１２】図１２は、抗体重鎖、フリン切断部位、２Ａ配列、およびヒト抗ＫＤＲ抗体の抗体軽鎖（ＨＦ２ＡＬ）をコードする、１×１０１１ｖｐまたは２×１０１１ｖｐのＡＡＶ８ベクターの静脈内（ｉ．ｖ．）注射または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射後のマウスの血清中のインビボでの抗体（ＩｇＧ４）発現レベル（μｇ／ｍｌ）を示す。ここでは、抗体は、サイトメガロウイルスプロモーター配列およびサイトメガロウイルスエンハンサー配列、ニワトリβ−アクチン（ＣＡＧ）プロモーター配列およびＣＡＧエンハンサー配列、ならびにキメライントロンから構成されるハイブリッドプロモーター／エンハンサーの制御下で発現させられる。
【図１３】図１３は、例示的なアゴニスト抗ＫＤＲモノクローナル抗体ＣＧ２．２０のインビトロでのＨＵＶＥＣ細胞の増殖に対する用量応答効果を示す。
【図１４】図１４は、ヒト抗体Ｈ−Ｆ−２Ａ−Ｌ構築物中の、２Ａ、フリン、およびカルボキシペプチダーゼ（ＣＰ）の連続する分子内切断の模式図である。この図面は、表示の順に、配列番号１９〜配列番号２２をそれぞれ開示する。
【図１５】図１５は、ヒト抗体Ｌ−Ｆ−２Ａ−Ｈ構築物中の２Ａ切断、フリン切断、およびＣＰ切断の模式図である。この図面は、表示の順に、配列番号２３〜配列番号３６をそれぞれ開示する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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