(57)【要約】  本発明は、Gタンパク質βサブユニットのタンパク質相互作用部位の特定のアミノ酸残基と結合する物質を同定する方法に関する。本方法のアッセイにしたがって同定された化合物、及び前記化合物をGタンパク質の少なくとも1つの活性を調節するために用いる方法もまた提供される。【選択図】  なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する物質を同定する方法であって、前記方法が、Gタンパク質βサブユニットをテスト物質と接触させ、さらに前記物質がβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用するか否かを決定し、それによってGタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する物質を同定することを含む、前記同定方法。
【請求項２】
請求項1に記載の方法によって同定される物質。
【請求項３】
βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定する方法であって、前記方法が、Gタンパク質βサブユニットをテスト物質と、βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合するペプチドの存在下において接触させ、さらに、前記物質が、前記ペプチドとβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基との結合を阻害するか否かを決定し、それによってβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定することを含む、前記同定方法。
【請求項４】
請求項3に記載の方法によって同定された物質。
【請求項５】
SIGKペプチド又はSIGKペプチド誘導体を含む、βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定することを目的とするキット。
【請求項６】
Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する方法であって、前記方法が、Gタンパク質の少なくとも1つの活性が調節されるように、Gタンパク質とGタンパク質βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用する物質の有効量とを接触させることを含む、前記調節方法。
【請求項７】
少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患若しくは症状を予防又は治療する方法であって、前記方法が、少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患又は症状を有するか、又は前記を有するリスクが有る患者に、Gタンパク質の少なくとも1つの活性が調節されるように、Gタンパク質βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用する物質の有効量を投与し、それによって少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患若しくは症状を予防又は治療することを含む、前記予防又は治療方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
序：本発明は、米国立衛生研究所（グラント番号GM60286及びDK46371）によって援助を受けた研究過程で達成された。合衆国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００２】
発明の背景
哺乳動物のGタンパク質βサブユニット（37kDa）の5つのアイソフォーム及びGタンパク質γ（7.8kDa）の12のアイソフォームが同定された（Offermanns (2003) Prog Biophys Mol Biol 83:101-30）。Gタンパク質βおよびγサブユニットで構成される偏性ヘテロダイマー（Gβγ）は、真核細胞の種々の経路において調節分子として機能する（Neves et al. (2002) Science 296:1636-9；Clapham and Neer (1997) Annu Rev Pharmacol Toxicol 37:167-203）。最初にグアニンヌクレオチド解離阻害因子（GDI）として性状が明らかにされたように、Gβγは、GDP結合Gタンパク質αサブユニット（Gα）と堅固に結合し、それによって、GαもGβγもシグナリングにおいて活性をもたないGタンパク質ヘテロダイマーの基本形を構成する。アゴニスト刺激Gタンパク質カップリング形成レセプター（GPCR）は、Gα上でGDPとGTPとの交換及びヘテロトリマーからGβγの遊離を触媒し、2つの活性なシグナリング種：Gα・GTP及びGβγを解き放つ。Gβγシグナリングの標的には以下が含まれる：Gタンパク質調節内向き整流カリウムチャネル（GIRK）（Krapivinsky et al. (1993) J Biol Chem 273:16945-52）；アデニルシクラーゼI型、II型及びIV型アイソフォーム（Tang and Gilman (1991) Science 254:1500-3；Sunahara et al. (1996) Annu Rev Pharmacol Toxicol 36:461-80）；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）（Schwindinger and Robishaw (2001) Oncogene 20:1653-60）；ホスホチジルイノシトール-3-キナーゼ（PI3K）（Schwindinger and Robishaw (2001)上掲書）；フォスデュシン（Schulz (2001) Pharmacol Res 43:1-10）；Gタンパク質レセプターキナーゼ（GRK）ファミリーの少なくとも2つのメンバー（Koch et al. (1993) J Biol Chem 268:8256-60；Inglese et al. (1994) Proc Natl Acad Sci USA 91:3637-41）；及び他のプレキシトリンホモロジー（PH）ドメイン含有タンパク質[ダイナミン（Lin et al. (1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:5057-60；Scaife and Margolis (1997) Cell Signal 9:395-401）及びホスホリパーゼC β（PLC β）のβ1、β2及びβ3アイソフォーム（Sternweis and Smrcka (1992) Trends Biochem Sci 17:502-6；Li et al. (1998) J Biol Chem 273:16265-72）を含む]、並びにその他多くのもの。
【０００３】
Gβは、中心軸の周囲に放射状に配置された7つの4鎖βシートで構成された円錐形のトロイダル構造を有する（Wall et al. (1995) Cell 83:1047-58；Lambright et al. (1996) Nature 379:311-9）。各β-シートは、2つの連続するWD-40リピート（各リピート内の保存されたC-末端のTrp-Asp配列に因んで命名された）の構成成分から形成される（Gettemans et al. (2003) Sci STKE 2003:PE27）。Gγサブユニット（伸長ヘリックス分子）は、前記円錐の基部を横断する疎水性チャネル内に配置されている。わずかに狭まった、Gβ円錐の“先端部”表面は、Gα（そのスイッチII領域を介する）（Wall et al. （1995）上掲書；Lambright et al. (1996)上掲書）、フォスデュシン（Loew et al. (1998) Structure 6:1007-19；Gaudet et al. (1996) Cell 87:577-88）及びGRK2（Lodowski et al. (2003) Science 300:1256-62）の主要な結合部位である（このことはこれら複合体の結晶構造によって示される）。変異解析によって、Gβγの多くの相互作用パートナー（PLC β及びアデニルシクラーゼを含む）は同じ表面と結合することが示された（Li et al. (1998)上掲書；Ford et al. (1998) Science 280:1271-4）。Gβのトーラスの側面に沿って存在する部位は、ある種のGβγ標的によって特異的に認識される補助的結合表面として機能し、前記はGα及びGβγ結合フォスデュシンの結晶構造で実証された（Wall et al. (1995) 上掲書；Loew et al. (1998) 上掲書；Gaudet et al. (1996) 上掲書；Wall et al. (1998) Structure 6:1169-83）。
【０００４】
任意抽出ペプチドライブラリーのファージディスプレーを用いて、Gβ1γ2ダイマーと結合するペプチドの結合及び遮蔽のための配列要件が特定された（Scott et al. (2001) EMBO J 20:767-76）。何十億という個々のクローンがスクリーニングされたが、Gβ1γ2と結合するペプチドの大半は、アミノ酸配列を基準にして４つの無関係のグループに分類された。これらのグループの1つは、配列Ser-Ile-Arg-Lys-Ala-Leu-Asn-Ile-Leu-Gly-Tyr-Pro-Asp-Tyr-Asp（配列番号:1）を有する直鎖状ペプチド（“SIRK”ペプチド）を含んでいた。SIRKペプチドは、Gβ1γ2サブユニットによるPLC β2活性化を5μMのIC50で阻害し、さらにPI3Kの活性化を遮断した。対照的に、SIRKペプチドは、I型アデニリルシクラーゼのGβ1γ2調節又は電圧作動性N-型Ca++チャネル活性に対してはほとんど又は全く影響を示さなかった（Scott et al. (2001) 上掲書）。このことは、Gβγ結合パートナーの選択的阻害が達成され得ることを明示した。4グループのいずれかに属するペプチドは、Gβ1γ2との結合に対する親和性の範囲で互いに競合し、ファージディスプレースクリーンから単離された全てのクローンがGβ1γ2上の共通の結合部位を共有することを示唆した（Scott et al. (2001) 上掲書）。
【０００５】
その後の実験によって、SIRKペプチドはヘテロトリマー形成を遮断するだけでなく、Gαli活性化の非存在下でGβ1γ2・Gαil複合体からGαilを追い出し、無傷の細胞でGタンパク質依存ERK1及びERK2経路を活性化させることが示された（Ghosh et al. (2003) J Biol Chem 278:34747-50；Goubaeva et al. (2003) J Biol Chem 278:19634-41）。in vitro実験は、SIRKがヌクレオチド交換非依存性ヘテロダイマー解離を促進することを示し（Goubaeva et al. (2003) 上掲書；Ghosh et al. (2003) 上掲書）、無傷の細胞におけるERKの活性化を暗示した。他のGβγ結合ペプチド、例えばアデニリルシクラーゼII由来QEHA（Weng et al. (1996) J Biol Chem 271:26445-26448；Chen et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:2711-2714）及びβARK（GRK2）のC-末端領域からアミノ酸643−670（Koch et al. (1993) 上掲書）は、Gαサブユニット結合に競合するにもかかわらず、ヘテロトリマーの解離を促進することはできなかった（Ghosh et al. (2003) 上掲書）。このことは、Gα−Gβγサブユニット結合に対する競合は、これらペプチドがサブユニットの解離を促進するために十分ではないことを示している。
ドーピング変異導入及び再スクリーニング手法を用いて、Gβ1γ2に対しより高い親和性を有するSIRKペプチド類似ペプチドを誘導した。このペプチドの配列はSer-Ile-Gly-Lys-Ala-Phe-Lys-Ile-Leu-Gly-Tyr-Pro-Asp-Tyr-Asp（配列番号:2）（SIGK）である。SIGKを用いたin vitro実験は、前記もまたヘテロトリマー複合体からGαilを追い出し、さらにヘテロトリマー形成を効率的に妨げることができることを示した（Ghosh et al. (2003) 上掲書）。SIRK/SIGKがGβ1γ2からGαil・GDPの解離を仲介するメカニズムは不明であるが、ペプチドの存在下でGαilサブユニットの解離速度の増加を説明するためにGβ1γ2サブユニットにおける配座変化が必要であることが提唱された（Ghosh et al. (2003) 上掲書）。
【０００６】
発明の要旨
本発明は、Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する物質を同定する方法に関する。本方法は、Gタンパク質βサブユニットをテスト物質と接触させ、さらに前記物質がβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用するか否かを決定し、それによってGタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する物質を同定することを含む。
本発明はまた、βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定する方法に関する。本方法は、Gタンパク質βサブユニットをテスト物質と、βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合するペプチドの存在下で接触させる工程、及び前記物質が、前記ペプチドとβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基との結合を阻害するか否かを決定し、それによってβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定する工程を含む。
本発明はさらに、Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節する方法に関する。本方法は、Gタンパク質の少なくとも1つの活性が調節されるように、Gタンパク質βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用する物質の有効量とGタンパク質を接触させることを含む。
本発明はまた、少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患（disease）若しくは症状（condition）を予防又は治療する方法に関する。本方法は、少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患又は症状を有するか、又は前記を有するリスクが有る患者に、Gタンパク質の少なくとも1つの活性が調節されるように、Gタンパク質βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用する物質の有効量を投与し、それによって少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患若しくは症状を予防又は治療することを含む。Gタンパク質βγサブユニット活性が関与する疾患又は症状には心不全、中毒、炎症、及びオピオイド耐性が含まれる。
βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合する物質を同定するキットもまた提供される。本発明のキットは、SIGKペプチド又はSIGKペプチド誘導体を含む。
さらに本発明のスクリーニング方法にしたがって同定される物質も提供され、ここで前記物質は式I、II又はIIIの構造を有する。
【０００７】
発明の詳細な説明
Gタンパク質のためのタンパク質相互作用部位は今や理解されている。SIGKと結合したGβγの構造が解明され、SIGKは、ヘテロトリマー内のGαのスイッチIIドメインのαヘリックス領域が占有する場所で、Gαの相互作用表面を縦断するαヘリックスのようにGβγと結合していることを示した。SIGKの存在下及び非存在下のGβγの配座は非常に類似している。したがって、結晶構造は、どのようにしてペプチドがGα−Gβγ相互作用をブロッキングするかを明らかにする。前記構造はさらに、多様なタンパク質パートナーとの相互作用のためにGβは高度に反応性で特殊化した表面を進化させてきたことを示している。この特殊化された表面は、本明細書では“タンパク質相互作用部位”又は“Gβのタンパク質相互作用部位”と称される。前記タンパク質相互作用部位の種々の特徴の解析によって、好ましい相互作用表面としてのこの表面の基本は、この部位の固有の配座可撓性でも異常に高い表面接近許容性でもなく、むしろこの単一結合表面で多数のタイプの潜在的相互作用化学が存在し得ることであるということが理解されるに至った。このタンパク質相互作用部位におけるアミノ酸配列の認識のために要求されるこの表面の特定のアミノ酸の組合せもまた決定された。さらにまた、ヘテロトリマーの解離又はタンパク質複合体形成の促進に必要な固有の分子相互作用が示された。
【０００８】
したがって、本発明は、Gタンパク質βサブユニットをテスト物質と（例えば高処理スクリーニングで）接触させ、さらに前記テスト物質が、Gタンパク質βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用するか否かを決定することによって、Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節（すなわち遮断若しくは阻害又は活性化若しくは有効性を強化）する物質を同定する方法に関する。Gタンパク質βサブユニットには哺乳動物の公知の5つのGタンパク質βサブユニットアイソフォームのいずれも含まれることが意図される（Offermanns (2003) 上掲書）。Gタンパク質の活性は、Gタンパク質を介する、1つ以上の下流のタンパク質（Gタンパク質調節内向き整流カリウムチャネル（GIRK）；アデニルシクラーゼのI型、II型及びIV型アイソフォーム；マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（MAPK）；ホスホチジルイノシトール-3-キナーゼ（PI3K）；Gタンパク質レセプターキナーゼ（GRK）ファミリーメンバー；及び他のプレキシトリンホモロジー（PH）ドメイン含有タンパク質（ダイナミン及びホスホリパーゼC β（PLC β）のβ1、β2及びβ3アイソフォームを含む）が含まれるが、ただしこれらに限定されない）へのシグナルトランスダクションを指すことが意図される。Gタンパク質活性の調節は、前記物質と前記タンパク質の相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基とが結合し、それによりGβγサブユニットとGαサブユニットとの間又はGβγサブユニットと本明細書に記載の下流のタンパク質との間の相互作用が遮断されることによって生じる。
【０００９】
SIGKと結合したGβγ1の結晶構造によって、SIGKペプチドは、Gβ1サブユニットの残基（いくつかのGβγ結合タンパク質、例えば下流のタンパク質が利用する）と相互作用することが示された。例えば、Gβ1のLys57、Tyr59、Trp99、Met101、Leu117、Tyr145、Met188、Asp246、及びTrp332は、Gβ1γ2・GRK2複合体の結晶構造においてGRK2 PHドメインとの接触に必要とされ、さらにGβ1のこれら残基はいずれもSIGKとの接触で同様に必要とされる（表1）。このことは、Gβ1（RH-PHループ、αCT領域、及びβ4鎖）と接触するPHドメインの二次構造は純粋なヘリックスのSIGKペプチドと完全に類似していないという事実にもかかわらない（Lodowski et al. (2003) 上掲書）。このテーマは、Gβ1とフォスデュシンとの複合体で繰り返され（Ford et al. (1998) 上掲書）、この場合、Gβ1残基の共通のサブセットが、GRK2とは異なる二次構造をもつ結合パートナーと接触する。とりわけ、Gαi1のスイッチII領域は、SIGKペプチドとほぼ同じ向きで結合するα-へリックスを形成する。しかしながら、Gαi1のスイッチIIはSIGKペプチドと配列類似性をもたない。ただし前記は、SIGKのLys4とほぼ同じ位置で向きを定められたリジン（Lys210）を含む（Goubaeva et al. (2003) 上掲書）。
【００１０】
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欄の見出しに対する略語一覧：Gαi1、Gαi1・Gβ1γ2ヘテロダイマーの結晶構造（Wall et al. (1995) 上掲書；Wall et al. (1998) 上掲書）；フォスデュシン、フォスデュシン・Gβ1γ2複合体（Gaudet et al. (1996) 上掲書）；GRK2、GRK2・Gβ1γ2・複合体（Lodowski et al. (2003) 上掲書）；SIGK、SIGK・Gβ1γ2複合体；PLC β、PLC β2/3・Gβ1γ2複合体の変異解析（Li et al (1998) 上掲書；Ford et al. (1998) 上掲書）；AC、アデニリルシクラーゼI/II型・Gβ1γ2複合体（Ford et al. (1998) 上掲書）；GIRK、Gβ1γ2とGIRK1/4チャネルとの相互作用の変異解析（Ford et al. (1998) 上掲書）；Ca++、Gβ1γ2とN又はP/Q型カルシウムチャネルとの相互作用の変異解析（Ford et al. (1998) 上掲書；Agler et al. (2003) J Gen Physiol 121:495-510）；下線を付した残基はSIGK・Gβ1γ2相互作用に重要な残基を示す。最下段は、標的とSIGK接触面との間で共有される残基百分率を示す。
【００１１】
Gβγの標的、PLC β2、アデニルシクラーゼ、及びGIRK並びにCCα1Bカルシウムチャネルのための変異データがこの解析に含まれるときは、Gβ上のSIGKのフットプリントはこれら前者の標的のフットプリントと同様である（Li et al. (1998) 上掲書；Ford et al. (1998) 上掲書）。タンパク質相互作用部位を包含するGβの13の残基のうちで、9つの残基（Lys57、Tyr59、Trp99、Met101、Leu117、Tyr145、Met188、Asp246、及びTrp332）がまた、Gα、GRK2及びフォスデュシン複合体における接触残基として見出される（表1）。これらの残基は、多くのGβ結合パートナーが利用するコンセンサス残基セットを表している。前記13の残基のまた別の3つ（Asp186、Asn228及びAsn230）は、SIGK及び他のタンパク質複合体構造の2つとの間で共有される。13残基のうちの1つ、Val100は、SIGKとその主鎖の酸素を介して接触し、他の複合体における結合反応では必要とされない。変異による混乱にもっとも敏感なSIGK結合残基はまた、他のGβ結合パートナーとの相互作用でしばしば必要とされる。SIGKはランダムペプチドファージディスプレーから同定され、前記ディスプレーでは、配列的に無関係の多数のペプチドがGβ1上の共通のタンパク質相互作用部位と結合しているようであった。
【００１２】
SIGKが接近するGβ1の残基とタンパク質Gβγ標的の結合に必要な残基との間の広範囲のオーバーラップのために、SIGKは多数のGβγ結合反応の競合的阻害物質である。密接な関係を有するSIRKペプチドはいくつかのGβγ依存経路に対して影響を有し、前記は、酵素アッセイでPLC β2、PLC β3及びPI3KのGβγ仲介活性化を遮断し、細胞性アッセイでERK I/II活性化を誘発する（Scott et al. (2001) 上掲書；Goubaeva et al. (2003) 上掲書）。これらの作用は、SIGKのLys4、Ala5、Phe6、Ile8、Leu9及びGly10がいずれもGβ1γ2によるPLCβ2活性化の阻害に重要であることがアラニンスキャンによって示されたように、Gβの表面と相互作用するSIGK内の残基の変異に敏感である（Scott et al. (2001) 上掲書）。さらにまた、SIGKのLeuは、細胞培養でMAPK経路を活性化するSIGKの能力にとって重要である（Goubaeva et al. (2003) 上掲書）。しかしながら、SIRKは、アデニルシクラーゼI型又はN-型Ca2+チャネル調節の阻害を、それらのフットプリントがGα及びPLCβ2フットプリントときわめて類似しているとはいえ遮断しない（Scott et al. (2001) 上掲書）。逆に、SIGK結合を停止させるGβにおける変異は、他のGβγ結合パートナーとの相互作用に等しく影響を与えるわけではない。例えば、Leu117からアラニンへの変異は、アデニルシクラーゼII型及びPLCβ3を活性化させ、GRK2及びSIGKと結合するGβ1γ2の能力を低下させるが、GIRK1/GIRK4カリウムチャネルの活性化、CCα1Bカルシウムチャネルの活性化、又はPLCβ2の活性化には影響を与えない（表1）（Li et al. (1998) 上掲書；Ford et al. (1998) 上掲書）。同様に、Gβ1γ2のTrp332のアラニンへの変異は、SIGKに対するGβ1γ2の親和性を低下させ、アデニルシクラーゼII型、CCα1B並びにPLCβ2及びPLCβ3の双方に対する刺激活性を障害するが、GRK2との相互作用、GIRK1/GIRK4の活性化、又はアデニルシクラーゼI型の阻害に対しては影響しない（Li et al. (1998) 上掲書；Ford et al. (1998) 上掲書）。Gβ1γ2のLeu117及びTrp332の双方は、Gβ1のGαt及びGαi1結合部位の部分を形成し（Wall et al. (1995) 上掲書；Lambright et al. (1996) 上掲書；Wall et al. (1998) 上掲書）、さらにLeu117の変異はまたGαi1とGβ1γ2との結合に影響を与える（Li et al. (1998) 上掲書；Ford et al. (1998) 上掲書）。
【００１３】
ヘテロトリマー形成を遮断する（Ghosh et al. (2003) 上掲書）他のペプチドとは異なり、SIGKは、Gαi1からGβ1γ2のヌクレオチド交換非依存性解離を促進する（Ghosh et al. (2003) 上掲書；Goubaeva et al. (2003) 上掲書）。例えば、GRK2のC-末端由来ペプチドはヘテロトリマー形成を遮断するが（Ghosh et al. (2003) 上掲書）、Gαi1・Gβ1γ2サブユニット解離は、たとえGRK2・Gβ1γ2複合体の構造が、このペプチドがSIGKの場合と極めて類似するGβ1の表面を利用することを示唆しているとしても促進されない（Lodowski et al. (2003) 上掲書）。理論に拘束されないが、SIGKは2つのメカニズムのどちらかによってヘテロトリマーの解離を促進することができよう。SIGKはGβ1上で配座の変化を誘発することができ、これはSIGK結合部位を越えて広がり、Gβ1とGαi1との間の他の相互作用を破壊することができる。しかしながら、Gβ1γ2・SIGK構造は、SIGKがSIGK結合部位そのものの外側でGβ1内の実質的配座変化を誘発しないことを示している。第二のメカニズムは、Gαi1はGβ上の2つの表面のどちらかから活発に脱離しさらに再結合することができるという仮定を根拠にしている。前記2つの表面とはすなわち、Gβ1の最上部面スイッチII相互作用部位（ここでSIGKは同様な向きで結合する）及びGβ1のブレード面上のN-末端相互作用表面である。スイッチII接触面のGαi1から一過性に遊離されることによってSIGKはGβ1に近づくことができる。SIGKの脱離速度（off-rate）がGαi1のN-末端の解離速度よりも遅い場合には、GβからGαi1の完全な遊離が生じる。したがって、GRK2ペプチド（前記はGβの最上部表面と結合する）はあまりにも迅速に解離しGαの解離を促進することができない。このGβγ相互作用の動的モデルは、多くのGβγ結合標的がGβ最上部表面の外側での結合を示し、さらにGβ上の交互の面を一過性に示すことができるので、生物学的に適切である。
【００１４】
Gβ1γ2のタンパク質相互作用部位が多様な二次構造により一連のタンパク質リガンドを認識する能力は、前記が弁別的タンパク質結合部位の例であり得ることを示している（例えば以下を参照されたい：Delano et al. (2000) Science 287:1279-1283）。弁別的結合表面は、高い溶媒接近許容性、低い極性及び高度な配座可撓性を特徴とする（Scott et al. (2001) 上掲書；Ma et al. (2001) Curr Opin Struct Biol 11:364-9；Bogan and Thorn (1998) J Mol Biol 280:1-9；Clackson and Wells (1995) Science 267:383-6；Delano (2002) Curr Opin Struct Biol 12:14-20）。さらにまた、弁別的結合部位は、おそらく異常に高濃度のいわゆる“ホットスポット”、すなわち（アラニンに変異したとしたら）少なくとも1/10に結合エネルギーを低下させる残基を含むであろう。ホットスポットは、タンパク質-タンパク質及びタンパク質-小分子接触面の両方についてこれまで記載されてきた。ある表面の任意のホットスポットに対する点変異は、たとえ結合接触面が全表面積の数百Å2を深く埋没させているときですら、しばしば複合体形成を完全に停止させる（Bogan and Thorn (1998) 上掲書；Clackson and Wells (1995) 上掲書；Thanos et al. (2003) J Am Chem Soc 125:15280-1；Zhang et al. (2003) J Biol Chem 278:33097-104）。本明細書ではこれらの基準を用いて、表面の化学組成及び表面特性によってタンパク質結合部位として機能し易くされたタンパク質表面としてGβ1のタンパク質相互作用部位を評価した。Gβのタンパク質相互作用部位の12の残基のうち、8つ（Lys57、Tyr59、Leu117、Tyr145、Asp186、Met188、Asn230及びTrp332）は、ホットスポット残基のエネルギー基準を満たす。これらの残基のどれをアラニンに置き換えてもSIGKに対するGβ1γ2の親和性は1/10に低下する。これらの残基のいずれも、SIGK結合に有利に働くエネルギー的に重要な節点として機能することは明らかである。Gβ1のSIGK結合表面は、ホットスポットにおいて豊富であることが示されたいくつかの残基を含む（Bogan and Thorn (1998) 上掲書）。これらにはチロシン、トリプトファン及びアルギニン；極性及び非極性相互作用の両反応を生じることができる大型の残基が含まれる。Gβのタンパク質相互作用部位にはGβの残余の部分よりもはるかに多くの芳香族残基が存在する。表面の接近を許容する非グリシン全Gβ残基の8.5%に対し、SIGK結合表面では38%がPhe、Tyr、His又はTrpで構成される。したがって、Gβのタンパク質相互作用部位はより非極性であり、Gβの接近許容残基の29%に対し、合計してGβのタンパク質相互作用部位の62%が非極性である。さらにまた、アスパラギン及びアスパラギン酸（これらはホットスポット表面間で中等度に良好な分布を有する）は、Gβのタンパク質相互作用部位内の13残基のうちの4つを占める。芳香族残基と荷電残基のこの組合せは、多様な化学的特性をもつ結合パートナーをGβタンパク質相互作用部位に収容することを可能にする。弁別的結合表面は、高い表面接近許容性を有すると期待される（DeLano et al. (2000) 上掲書）。Gβのタンパク質相互作用部位のこの特性を解析するために、接近許容全表面面積を残基、主鎖及び側鎖ベースでGβ分子について計算した。Gβのタンパク質相互作用部位のほとんどのアミノ酸がGβの前記タイプの他のものよりはるかに接近許容性であるというわけではなかった。しかしながら、5つの残基（Tyr59、Tro99、Met101、Leu117及びTrp332）は平均から顕著な逸脱を示した。Trp99の場合には、側鎖表面の接近許容性はタイプ平均よりはるかに大きく、Tyr59、Trp99及びMet101の主鎖は平均より接近許容性であった。Leu117は、平均よりもはるかに高い主鎖及び側鎖の接近許容性を有していた。
【００１５】
配座の可撓性又は順応性は弁別的結合表面の重要な決定要素として挙げられた。なぜならば、そのような表面は、構造的に無関係なタンパク質標的と結合する能力が高いからである（DeLano et al. (2000) 上掲書）。残基融通性は、いくつかのタンパク質複合体環境における相対的位置変動に関して定量することができる。4つの結晶構造（Gβ1γ2・SIGK；Gβ1γ2・Gαi1；Gβ1γ2・フォスデュシン）における全てのGβ残基の複合体未形成Gβ1γ2に対するRMSDの柱状図の解析によって、Gβのタンパク質相互作用部位の残基は、側鎖の平均的位置分散性よりもわずかに大きいだけであることが示され（1.35Åに対して1.42Å）、Trp99、Asn228、及びTrp332の側鎖は平均からもっとも大きな正の偏差を示した（各々2Åよりも大きい）。特にブレード７内のArg314及びTrp332は、Gβ1トーラスの外側に向かって10Å以上移動してフォスデュシンと相互作用する。アトミックB因子もまた配座可撓性の手段を提供する。複合体を形成していないGβ1γ2の構造では、Trp99、Val100、及びMet101のB因子は、平均値が少なくとも1標準偏差を超える（Trp99では平均から2標準偏差を超える）。Gαi1、GRK2、フォスデュシン及びSIGKとの複合体では、これらの結合部位の残基はより秩序をもつようになり平均に近いB値を示し、いくつかの事例では標準偏差は平均から1未満までである。したがって、構造的に多様な結合パートナーを認識するGβの能力は、Gβのタンパク質相互作用部位内のほとんどの残基に対し高度な配座可撓性を要求しない。一連の同時に出現する結合パートナーを収容するために、Gβ1の小さな構造順応性で十分である。構造解析及び変異分析は、Gβ上のタンパク質相互作用部位は、多数のタンパク質標的との堅固な結合のために同時に誘導されたホット表面とみなし得ることを明らかにした。しかしながら、Gβγがホット表面として作用するメカニズムは複雑である。Trp332は、ホットスポットのための4つの基準を全て満たすただ1つの残基であるが、ただしTyr59及びTrp99は、調査したホットスポット残基の4つの特徴のうち3つを有している。Gβの最上部面には、突然変異による混乱に敏感であり、多くの結合パートナー相互作用で利用されるが、ホットスポットに期待される配座可撓性、溶媒接近許容性、又は非極性の特徴を示さない他の残基が存在する。これらの群で特に重要なものは、Lys57及びMet188であり、これら残基は、変異分析及び公知のGβγ複合体の構造との比較によって示されたように、両方ともエネルギー的には重要な結合決定要素であるが、ホットスポット残基のためのまた別の統計的基準のいずれも満たさない。
【００１６】
したがって、Gβのタンパク質相互作用部位のアミノ酸残基には、Lys57、Tyr59、Trp99、Val100、Met101、Leu117、Tyr145、Asp186、Met188、Asp228、Asn230、Asp246及びTrp332が含まれると考えられる。例示すれば、これらの残基の位置は、以下のラットGβアミノ酸配列で提供される：
MGEMEQLKQE AEQLKKQIAD ARKACADITL AELVSGLEVV GRVQMRTRRT 
LRGHLAKIYA MHWATDSKLL VSASQDGKLI VWDTYTTNKV HAIPLRSSWV 
MTCAYAPSGN FVACGGLDNM CSIYSLKSRE GNVKVSRELS AHTGYLSCCR 
FLDDNNIVTS SGDTTCALWD IETGQQKTVF VGHTGDCMSL AVSPDYKLFI 
SGACDASAKL WDVREGTCRQ TFTGHESDIN AICFFPNGEA ICTGSDDASC 
RLFDLRADQE LTAYSHESII CGITSVAFSL SGRLLFAGYD DFNCNVWDSL 
KCERVGVLSG HDNRVSCLGV TADGMAVATG SWDSFLKIWN
（GenBank アクセッション番号AAA62620；配列番号:3）、この配列でタンパク質相互作用部位の残基には下線が付されている。
同様に、これらの残基は、以下のアミノ酸配列を有するヒトGβで同じ場所に配置されている：
MSELEQLRQE AEQLRNQIRD ARKACGDSTL TQITAGLDPV GRIQMRTRRT 
LRGHLAKIYA MHWGTDSRLL VSASQDGKLI IWDSYTTNKV HAIPLRSSWV 
MTCAYAXSGN FVACGGLDNI CSIYSLKTRE GNVRVSRELP GHTGYLSCCR 
FLDDNQIITS SGDTTCALWD IETGQQTVGF AGHSGDVMSL SLAPNGRTFV 
SGACDASIKL WDVRDSMCRQ TFIGHESDIN AVAFFPNGYA FTTGSDDATC 
RLFDLRADQE LLMYSHDNII CGITSVAFSR SGRLLLAGYD DFNCNIWDAM 
KGDRAGVLAG HDNRVSCLGV TDDGMAVATG SWDSFLKIWN
（GenBank アクセッション番号AAA35922；配列番号:4）、この配列でタンパク質相互作用部位の残基には下線が付されている。
【００１７】
Gβのタンパク質相互作用部位のこれらアミノ酸残基の少なくとも1つと相互作用する物質は、種々の不均質な非結合相互作用（ファンデルワールス接触（例えばメチオニン又はロイシンと）、極性接触（例えばアスパルテート又はアスパラギン）又は両者（例えばリジン、トリプトファン又はチロシンと）を含むが、ただしこれらに限定されない）を介して結合し、結合のエネルギーに寄与することができる。一般的には、前記物質は、Gβのタンパク質相互作用部位のアミノ酸残基の2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12又は13と相互作用して、1つ以上のGタンパク質相互作用タンパク質に対する、したがって1つ以上のGタンパク質仲介シグナリング経路に対する物質の特異性を強化することが所望される。
物質がβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用するか否かの決定は、Gβγサブユニットと前記サブユニットと相互作用することが判明している他のペプチド又はタンパク質（例えばSIGKペプチド、Gαサブユニット又は下流のタンパク質）との間のタンパク質-タンパク質相互作用を検出することによる種々のin vitro又はin vivoアッセイを用いて達成することができる。例示的なin vitroアッセイは本明細書で開示されている。このアッセイは以下の工程から成る：単離されたGβγ複合体を入手する工程；βサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と結合するペプチド（例えばSIGKペプチド又は配列番号:1、配列番号:2、配列番号:5、配列番号:6、配列番号:7、配列番号:8、配列番号:9、配列番号:10、配列番号:11、配列番号:12、若しくは配列番号:13のSIGKペプチド誘導体）の存在下で、前記Gβγ複合体をテスト物質と接触させる工程；及び前記ペプチドとβサブユニットのタンパク質相互作用部位との結合を阻害する物質の能力を、例えばELISAアッセイを用いて検出する工程。最初のスクリーニングで同定された他のファージディスプレーペプチド（Scott et al. (2001) 上掲書）もまた用いることが可能である。
【００１８】
また別には、in vivoアッセイを用いて、テスト物質がβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用するか否かを決定することができる。例示すれば、Gβγ及び例えばSIGKのようなペプチドを発現する細胞とテスト物質を接触させる2-ハイブリッドアッセイが意図される。この場合、βサブユニットは例えばDNA-結合ドメインと融合され、SIGKペプチドは活性化ドメインと融合される。SIGKペプチドがGβγのタンパク質相互作用部位と結合するとき、レポータータンパク質発現が誘発される。テスト物質が、Gβγのタンパク質相互作用部位とSIGKペプチドとの結合を崩壊させるならば、レポータータンパク質発現は遮断される。
さらに別のスクリーニング、例えば確立されたコンピューターによるスクリーニング、又はG-タンパク質依存下流タンパク質の活性（例えばPLC β酵素活性）を検出するスクリーニングもまた、本明細書に開示したアッセイと併用することができる。
本発明の方法にしたがってスクリーニングすることができるテスト物質（本明細書では化合物とも称される）は、一般的には物質ライブラリー又は化合物ライブラリーに由来する。そのようなライブラリーは、純粋物質の集合物又は混合物質の集合物のいずれかを含むことができる。純粋物質の例にはタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、核酸、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質、合成若しくは半合成化学物質、及び精製された天然の生成物が含まれるが、ただしこれらに限定されない。混合物質の例には、原核若しくは真核細胞及び組織の抽出物が、発酵ブロス及び細胞若しくは組織培養上清と同様に含まれるが、ただしこれらに限定されない。混合物質の場合には、本発明の方法は、所望の活性を有する粗混合物を同定するために用いられるだけでなく、治療薬としての性状決定及び開発のために前記混合物から活性物質の精製をモニターするための手段もまた提供する。特に、そのようにして同定した混合物を、当業者に一般的に知られている方法により引き続いて分画することができる。前記方法には、沈殿、遠心分離、ろ過、限外ろ過、選択消化、抽出、クロマトグラフィー、電気泳動、又は複合体形成が含まれるが、ただしこれらに限定されない。得られた各サブフラクションを、純粋で生物学的に活性な物質が得られるまで、所望の活性について最初のアッセイを用いて分析することができる。
【００１９】
ライブラリースクリーニングは本明細書で例証するように実施するか、又は多数の反応物の迅速な調製及び処理を可能にする任意の様式で実施することができる。テスト物質と同様にアッセイ成分のストック溶液は手動で調製し、その後の全てのピペット操作、稀釈、混合、洗浄、インキュベーション、サンプルの読み取り及びデータ収集は、市販の自動ピペット操作装置、自動化ワークステーション、及びアッセイにより発生したシグナルの検出用分析装置を用いて実施される。そのような検出装置の例には、ルミノメーター、分光光度計、蛍光測定計、及び放射性同位元素の崩壊を測定する装置が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
本発明のスクリーニング方法を用いて同定される化合物の有効性をさらに判定するために、Gタンパク質シグナリングが中心的に関与する具体的な任意の疾患又は異常のモデル系を利用して、化合物の吸着、分布、代謝及び排泄と同様、その潜在的毒性を急性、亜急性及び慢性実験で判定することができることは、当業者には理解されよう。例えば、NG108-15/D2細胞及びラットの海馬ニューロン初代細胞におけるβγ阻害因子の過剰発現は、アデニルシクラーゼのβγ活性化を妨げることによって、δ-オピオイド及びカンナビノイドレセプター誘発PKA Cα転座並びに遺伝子発現を遮断することが示された（Yao et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100:14379-84）。したがって、中毒の治療における本発明の化合物の有効性を分析するために、NG108-15/D2細胞及び/又はラットの海馬ニューロン初代細胞を前記化合物と接触させ、PKA Cα転座に対する影響が決定される。δ-オピオイド及びカンナビノイドレセプター誘発PKA Cα転座を遮断する化合物は、中毒の治療で有用であろう。
【００２０】
心不全の予防又は治療に対する本発明の化合物の有効性は、筋LIMタンパク質（MLP-/-）をコードする筋拘束遺伝子の除去を必要とするネズミの拡張型心筋症の遺伝モデルで解析することができる（Arber et al. (1997) Cell 88:393-403）。このモデルを用いて、ベータ-アドレナリン作動性レセプターキナーゼ1阻害因子、BARK-ct（前記はβγと結合し、ベータ-アドレナリン作動性レセプターキナーゼ1活性のβγ依存性活性化を遮断する）は、イソプロテレノールの存在下又は非存在下でin vivoで心臓収縮性を強化し（Koch et al. (1995) Science 268:1350-3）、左心室のサイズ及び機能を回復させることができることが示された（Rockman et al. (1998) Proc Natl Acad Sci 95:7000-7005）。同様に、ベータ-アドレナリン作動性レセプターキナーゼ1活性のβγ依存性活性化を遮断する本発明の化合物は、心不全の予防又は治療で有用であろう。
オピオイド耐性を防ぐ本発明の化合物の有効性は、急性（Jiang et al. (1995) J Pharmacol Exp Ther 273:680-8）及び慢性（Wells et al. (2001) J Pharmacol Exp Ther 297:597-605）依存性モデル系で解析することができる。前記モデル系では、本発明の化合物がマウスの脳室内に注射され、選択オピオイド（例えばモルヒネ）に対する耐性が決定される。鎮痛効果を達成するために必要なオピオイド量を低下させる化合物はオピオイド耐性の防止に有用であろう。
【００２１】
PLC-β2及び-β3並びにPI3Kγは、ケモアトラクタント仲介シグナルトランスダクション経路において中心的に関与することが示された。PI3Kγ欠損マウスは、好中球のPtdIns(3,4,5)P3産生、好中球遊走、及びT細胞非依存性抗原ヒドロキシルニトロフェニル-FICOLLTMによる免疫時のλ鎖含有抗体産生を欠く（Li et al. (2000) Science 287:1046-1049）。PLC-β2及び-β3を欠くマウスは、好中球におけるCa2+放出、超酸化物産生及びMAC-1アップレギュレーションで不完全である（Li et al. (2000) 上掲書）。さらにまた、PLC-β2欠損マウスは、種々の白血球集団の化学走性の強化を示し、さらに細菌、ウイルス及び免疫複合体に対して感作される（Jiang et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(15):7971-5）。したがって、炎症性応答を調節する本発明の化合物の有効性を分析するために、前記化合物をマウスに投与し、好中球のPtdIns(3,4,5)P3産生、好中球遊走、Ca2+流出、超酸化物産生、及びT細胞非依存性抗原ヒドロキシルニトロフェニル-FICOLLTMによる免疫時のλ鎖含有抗体の産生が決定される。PLC-β2及び-β3を選択的に強化するか、及び/又はPI3Kγ活性化を遮断して、それによってPtdIns(3,4,5)P3の産生、好中球遊走、及びTI-IgλLの産生を阻害する化合物は、炎症性症状（例えば関節炎、アレルギー、クローン病など）の治療に有用であろう。選択的に、例えばPLC-β2活性化を遮断し、それによって好中球遊走を促進する化合物は、細菌及びウイルス感染に対する免疫応答の促進で有用であろう。
本発明のスクリーニング方法を用いることにより、Gβサブユニットのタンパク質相互作用部位と結合して、関連するタンパク質の相互作用（例えばGαサブユニットおよびPLC β相互作用）を妨害するか、又は前記反応を生理学的に強化し、それによってGタンパク質シグナリング経路の活性を調節する種々の化合物が今や同定された。
【００２２】
したがって、本発明のある実施態様は下記式Iの構造を有する化合物である：
【００２３】
【化１】
2008537481.tif 000004
【００２４】
種々の置換基Rが示されている式Iの構造を有する例示的化合物には、以下の物質並びに医薬的に許容されるその塩及び複合体が含まれる（ただしこれらに限定されない）：
【００２５】
【化２】
2008537481.tif 000005
【００２６】
【化３】
2008537481.tif 000006
【００２７】
本発明のまた別の実施態様は、下記式IIの構造を有する化合物である：
【００２８】
【化４】
2008537481.tif 000007
【００２９】
種々の置換基Rが示されている式IIの構造を有する例示的化合物には、以下の物質並びに医薬的に許容されるその塩及び複合体が含まれる（ただしこれらに限定されない）：
【００３０】
【化５】
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【００３１】
Gβのタンパク質相互作用部位と結合するさらに別の例示的化合物には、以下の物質並びに医薬的に許容されるその塩及び複合体が含まれる（ただしこれらに限定されない）：
【００３２】
【化６】
2008537481.tif 000009
【００３３】
本明細書に開示される例示的化合物は、全ての鏡像体、異性体、又は互変異性体と同様に、最初の化合物と同じ生物学的活性を保持するそのような化合物の任意の誘導体を含むことが意図される。
本発明の例示的化合物は、Gβの新規なタンパク質相互作用部位と結合するリガンドを同定するために、先ず初めにコンピューターによるスクリーニングから選択された。前記コンピュータースクリーニングは、本明細書に開示するX-線構造で決定されるようなGβのタンパク質相互作用部位のモデルを作成するために、SYBYL分子モデリングソフトを用いることを必要とした。コンピュータードッキングスクリーニングは、米国立癌研究所の1900の化合物ライブラリーを用いて実施された。この場合、化合物は、ドッキングについてはFLEXXTM（Tripos, Inc., St. Louis, MO）を用い、さらにドッキングさせた構造のエネルギー学及び適合の評価にはCSCORETM（Tripos, Inc.）を用いて、Gβのタンパク質相互作用部位とのドッキングについて試験した。Gβのタンパク質相互作用部位と相互作用すると予想される化合物のアルゴリズム依拠リスト及び前記相互作用の構造的モデルを作成した。続いて、選別化合物を本明細書に開示するファージELISA結合アッセイで解析し、これらの化合物がGβのタンパク質相互作用部位と結合し、その表面でのタンパク質相互作用を妨害し得るか否かを判定した。化合物NSC201400及びNSC119916は、IC50値がそれぞれ100nM及び5μMであり、残余の化合物は、ELISA系アッセイで少なくとも50μMの親和性でGβγと結合し、タンパク質相互作用部位でペプチド相互作用を妨害することが見出された（図1）。これらの化合物をファージELISAアッセイでさらに分析し、Gβのタンパク質相互作用部位に対して高い親和性を有することが見出され、SIGKと類似のアミノ酸残基と相互作用した。
【００３４】
表2
2008537481.tif 000010
2008537481.tif 000011
下線を付した残基は、SIGK・Gβ1γ2相互作用のために重要な残基を示す。最後の列は各化合物のIC50値を示している。
【００３５】
これら化合物の有用性をさらに示すために、NSC119910が、GαサブユニットとGβγサブユニットとの相互作用を遮断し（図2）、さらに生理学的標的（例えばPLC β）との相互作用をin vitroで阻害するGβγサブユニットの能力を阻害する（図3）ことをPLCβの酵素活性の低下により示した。
PI3Kγ及びPLC-β2/-β3のGβγ調節活性は、ケモアトラクタント誘引応答及び炎症で重要である。PI3KγはTI-IgλLの産生に必要であり、PI3Kγ欠損マウスでは好中球の遊走は見られない（Li et al. (2000) Science 287:1046-9）。PLC経路は、化学走性の抑制調節及び過剰炎症症状において中心的に関与する（Li et al. （2000） 上掲書）。したがって、NSC119910がGβγ/PLC相互作用を阻害し、PLC活性化を遮断することができるか否かが決定された。fura-2系実験から得られたデータによって、FMLP-刺激好中球における細胞質ゾルCa2+の急激に生じる増加（細胞内貯蔵から放出される陽イオンによる応答である（Anderson and Mahomed (1997) Clin Exp Immunol 110:132-138；Geiszt et al. (1997) J Biol Chem 272:26471-26478））は、10μMのNSC119910によって抑制されることが示された（図4）。ATPによる[Ca2+]の増加はNSC119910の存在下で顕著には抑制されず（図4）、FMLP依存Ca2+増加における前記化合物の作用は特異的であることを示唆している。さらに、蛍光がピーク値の半分に低下するために要する時間は実質的な影響を受けなかった（図5）。これらの結果は、NSC119910は、PLCのin vivo活性化をもたらすPLC/G-タンパク質相互作用を阻害することを示している。
【００３６】
オピオイドレセプター、μ、Δ及びκは、α及びβγサブユニットを介してGi及びGoタンパク質と結合し、多数のシグナリング経路を調節する。特に、PLC-β3-欠損マウスにおけるオピオイドシグナルトランスダクションの有効性は増加することが示され、PLCはオピオイド依存シグナリング成分を改変することによってオピオイドシグナリングを抑制することが示唆された（Xie et al. (1999) Proc Natl Acad Sci USA 96:10385-10390）。PLC-β3はオピオイド応答の負の調節物質として重要な役割を果たすと仮定して、NSC119910がPLC-β3活性化を阻害し、それによってモルヒネ誘発痛覚脱失を強化し得るか否かを決定した。標準的プロトコル（Xu et al. (1998) J Pharmacol Exp Therapeut 284:196-201）にしたがって、マウスの脳室内に100nmolのNSC119910を種々の用量のモルヒネ（0.1、0.3、1及び3nmol）と組み合わせて注射した。注射後20分して55℃温水の尾反射テスト（Wells et al. (2001) J Pharmacol Exp Therapeut 297:597-605）で痛覚脱失応答についてマウスを試験した。モルヒネ単独のED50値は0.74nmolであり、一方、NSC119910＋モルヒネのED50値は0.065nmolであった。前記ED50値の相違は、モルヒネの用量-応答曲線において左側へ11倍の移動を示し（表3）、モルヒネをNSC119910と一緒に投与したとき、同様な痛覚脱失効果を生じるために要求されるモルヒネが減少することを示唆した。したがって、本発明の化合物と一緒にオピオイドを投与することによって、より低い用量のオピオイドを患者で使用することが可能になり、それによってオピオイド耐性の発達を減少させることができよう。
【００３７】
表3
2008537481.tif 000012
NSC119910は効果的にG-タンパク質相互作用を調節することを示したので、NSC119910の一連の構造的類似体（モデリングソフトを用いて同定した）をGβのタンパク質相互作用部位との結合について分析した。これらの類似体及びGβγに対するそれらの対応する親和性は以下のとおりであった：
【００３８】
【化７】
2008537481.tif 000013
【００３９】
【化８】
2008537481.tif 000014
【００４０】
【化９】
2008537481.tif 000015
【００４１】
【化１０】
2008537481.tif 000016
【００４２】
この分析から、NSC119910の類似体の一般構造が特定され、下記式IIIとして表される：
【００４３】
【化１１】
2008537481.tif 000017
式ＩＩＩ
【００４４】
式中、R1は置換若しくは非置換アルキル、置換若しくは非置換アルケニル、置換若しくは非置換シクロアルキル、又は置換若しくは非置換シクロアルケニルであることができ、R2及びR3は、それぞれ別個に水素又はヒドロキシル基である。具体的な実施態様では、R2及びR3はともにヒドロキシルである。
本明細書で用いられる、アルキルは直鎖又は分枝炭化水素鎖を指し、前記はもっぱら炭素及び水素原子から成り、置換を含まず、1つから8つの炭素原子を有する。
アルケニルは、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を含む脂肪族炭化水素基を指すことが意図され、さらに前記は2つから約10の炭素原子を有する直鎖又は分枝鎖であり得る。
シクロアルキルは、約3から12の炭素原子の非芳香族単環式又は多環式環系を指す。
本明細書で用いられる、シクロアルケニルという用語は、少なくとも1つの炭素-炭素二重結合を有し約3から12の範囲の炭素原子を含む単環式又は多環式環系を指す。
置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル又はシクロアルケニル中の置換基にはヒドロキシル、カルボキシル、ハロゲン（例えばフッ素、塩素、臭素又はヨウ素）、又は置換若しくは非置換アルキルが含まれるが、ただしこれらに限定されない。NSC157411及びNSC122390を例外とし、NSC119910の類似体は、一般的には、式IIIのR2及びR3の位置にヒドロキシル基を（前記は結合を促進するようであった）、さらに式IIIのR1にカルボキシル置換アルキル、シクロアルキル、アルケニル又はシクロアルケニル置換基（前記は活性を調節するようであったが、結合には必要とされなかった）を含んでいた。
【００４５】
したがって、本発明の更なる実施態様は、式IIIの構造を有する化合物並びに医薬的に許容されるその塩及び複合体である。
PLC-β2及び-β3の活性を選択的に調節するNSC119910類似体の能力を分析した。このアッセイでは、PLC-β2及び-β3を精製し、PLC酵素活性を精製βγの存在下又は非存在下及び類似体の存在下又は非存在下で測定した。この分析の結果は、NSC119911はPLC-β2の活性化をPLC-β3の活性化よりも効果的に遮断するようであり、NSC201400は、βγとのペプチドの結合を遮断するにもかかわらず、選択的にPCL-β3活性化を強化することを示した。さらにまた、NSC119910、NSC及び類似体NSC119893はCa2+の動員を遮断するが、それらはfMLP依存ERK活性化を妨害することなくCa2+の動員を達成する。同様に、NSC119911、NSC158110及びNSC201400もまたfMLP依存ERK活性化を妨害しない。
本明細書に開示した化合物は、Gβのタンパク質相互作用部位と結合しこの表面でのタンパク質相互作用を妨害することが判明した化合物と同様に、Gタンパク質の少なくとも1つの活性を調節（すなわち遮断若しくは抑制、又は強化若しくは潜在的強化）する方法で用いることができる。そのような方法は、Gタンパク質をβサブユニットのタンパク質相互作用部位の少なくとも1つのアミノ酸残基と相互作用する物質の有効量とin vitro又はin vivoで接触させ、それによってGタンパク質の少なくとも1つの活性を調節することを必要とする。物質の有効量とは、Gタンパク質の活性を10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%又は100%低下又は増加させる量である。そのような活性は、タンパク質-タンパク質相互作用、又は下流タンパク質の活性を検出する酵素アッセイによりモニターすることができる。
【００４６】
当業者には理解されるところであるが、1つ以上のGタンパク質を調節することは、Gタンパク質βγサブユニットが中心的に関与する疾患及び異常の予防又は治療におけると同様に、モデル系でのGタンパク質シグナリング事象の選択的分析において有用であり得る。具体的な疾患又は異常の予防又は治療で使用される化合物の選択は、前記疾患又は異常で中心的に関与する具体的なGタンパク質依存下流タンパク質に左右されるであろう。例えば、GβのLys57、Trp99、Met101、Leu117、Asp186、Asn228、Asp246及び/又はTrp332と相互作用する化合物は、アデニリルシクラーゼ関連疾患又は異常の予防又は治療で有用であり、一方、Lys57、Tyr59、Trp99、Met101、Leu117、Tyr146、Met188、Asp246及び/又はTrp332と相互作用する化合物は、GRK2-関連疾患又は異常に対してより適切であろう。特定の下流タンパク質に対するこの選択性は、Gタンパク質βγサブユニットシグナリングに関連する全ての活性を阻害するアンタゴニストに付随する副作用を減少させることができると考える。
【００４７】
予防又は治療は典型的には、少なくとも1つのGタンパク質βγサブユニット活性が中心的に関与する疾患又は異常（例えばうっ血性心不全、中毒、過剰炎症若しくは炎症低下、又はオピオイド耐性）のおそれがあるか、又は前記を罹患している患者を先ず初めに特定する工程を必要とする。例えば標準的な臨床技術を用いてそのような個体がいったん特定されたら、前記個体に本明細書に開示した又は本発明のスクリーニング方法で同定された選択的化合物の有効量を含む医薬組成物が投与される。ほとんどの事例で前記は人間であるが、農業動物（例えば家畜及び家禽）及び愛玩動物（例えばイヌ、ネコ及びウマ）の治療も本明細書に明らかに含まれる。化合物の用量又は有効量は、Gタンパク質βγサブユニットシグナリングが中心的に関与する疾患又は症状の少なくとも1つの徴候又は症状が患者で減少又は回復するという所望の成果をもたらすものである。例えば、うっ血性心不全に付随する一般的な徴候又は症状のいくつかには以下が含まれる：心拍増加、呼吸数の増加、通常よりも速くかつ深い呼吸、無呼吸、被刺激性、不眠、理由のない興奮、むくみ、息切れ、浮腫、急激な体重増加若しくは体重増加の低下、食欲減退、発汗、咳、うっ血、又はぜん鳴、活動レベルの低下、だるさ（listlessness）、尿量の低下、又は蒼白、まだら模様若しくは灰白色の肌の色の出現。中毒に付随する一般的な徴候又は症状のいくつかには、態度、風貌及び他者との関係の変化（家庭であれ、学校であれ、職場であれ）、並びに行動における他の変化が含まれるが、ただしこれらに限定されない。
【００４８】
炎症症状を予防又は治療するときは、PLC経路又はPI3Kγの選択的調節が種々の炎症症状の治療で有用であろう。例えば、好中球の炎症部位への遊走を低下させるために（例えば関節炎で）、PI3Kγの活性化を選択的に阻害し、それによって炎症性疾患の病理生理学的反応に寄与する組織に対する損傷を低下させる化合物を投与することが所望される。逆に、炎症性応答を促進するために、例えば細菌又はウイルス感染に対する免疫応答の強化のためには、PLC経路の活性化を選択的に阻害する化合物を投与することが所望される。
医薬組成物は、医薬的に許容される塩及び複合体の形で、さらに医薬的に許容される担体中で適切な用量で提供することができる。そのような医薬組成物は、当業者に公知の方法で調製され、さらに当業者に公知の担体を含むことができる。一般的に周知されているそのような方法及び成分の概説は以下のものである（Remington, TheScience and Practice of Pharmacy, Alfonso R. Gennaro, ed., 20th ed. Lippincott Williams & Wilkins: Philadelphia, PA, 2000）。医薬的に許容できる担体、組成物又はベヒクル、例えば液状若しくは固体充填剤、稀釈剤、賦形剤又は溶媒被包化物質は、ある器官又は身体の部分から別の器官又は身体の別の部分へ対象化合物を運搬又は輸送する場合に必要とされる。各担体は、処方物の他の成分と適合し、さらに患者にとって有害ではないという意味で許容可能でなければならない。
【００４９】
医薬的に許容できる担体として機能し得る物質の例には以下が含まれる：糖類、例えばラクトース、グルコース及びシュクロース；デンプン、例えばトウモロコシデンプン及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及び酢酸セルロース；粉末アラビアゴム；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えばココア脂及び座薬ロウ；油、例えば落花生油、綿実油、紅花油、胡麻油、オリーブ油、トウモロコシ油及び大豆油；グリコール、例えばプロピレングリコール；ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコール；エステル、例えばオレイン酸エチル及びラウリン酸エチル；寒天；緩衝剤、例えば水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；無発熱因子水；等張食塩水；リンゲル溶液；エチレナルコール；pH緩衝溶液；ポリエステル、ポリカーボネート及び/又はポリ酸無水物；及び医薬処方物で用いられる他の非毒性適合物質。湿潤剤、乳化剤及び滑沢剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム及びステアリン酸マグネシウム）の他に着色剤、放出剤、被覆剤、甘味剤、香料及び芳香剤、保存料並びに抗酸化剤もまた組成物に存在し得る。
本発明の組成物は、標準的な医療技術にしたがって、非経口的に（例えば静脈内、腹腔内、皮下又は筋肉内注射）、局所的に（頬部および舌下を含む）、経口的に、鼻内に、膣内に又は直腸内に投与することができる。
【００５０】
選択される用量レベルは以下を含む多様な要因に左右されるであろう：用いられる本発明の個々の化合物の活性、投与経路、投与時間、用いられる個々の化合物の排泄又は代謝速度、治療の器官、用いられる個々の化合物と併用される他の薬剤、化合物及び/又は物質、治療される患者の年齢、性別、体重、症状、一般的健康状態及び以前の治療歴、及び医療分野で周知の同様な要因。
当分野で通常の技量を有する医師又は獣医師は、必要とされる本医薬組成物の有効量を容易に決定し処方することができる。例えば、医師又は獣医師は、所望の治療効果を達成するために必要な用量よりも低レベルの用量の化合物で開始し、所望の効果が達成されるまで徐々に投与量を増加させることができる。前記は当業者の技術範囲内であると考えられ、さらに、最適用量を決定するために特定の化合物又は類似の化合物に関して存在する文献を精査することができる。
本開示を熟読するとき当業者には理解されるところであるが、本明細書に例示した化合物以外のまた別の化合物が、本明細書に教示したスクリーニング方法にしたがって日常的に特定されよう。さらにまた別のスクリーニング用化合物を、当業者は、コンピューターによる予想を基に、及び/又はそれらが有する式I、II若しくはIIIの構造又は本明細書開示の例示的化合物の構造と類似する構造を基にランダムに選択することができる。
本発明を以下の非限定的な実施例によってさらに詳しく説明する。
【００５１】
実施例1：材料
ペプチドは、Alpha Diagnostic International（San Antonio, TX）又はSIGMA(商標)-Genosys（St. Louis, MO）から購入し、90%以上に精製し、質量は質量分析計で確認した。Ni-NTAアガロースはQIAGEN(商標)（Valencia, CA）から得た。ストレプトアビジン被覆ポリスチレンビーズはSpherotec（Libertyville, IL）から得た。HRP-結合抗M13抗体はAmersham Biosciences（Piscataway, NJ）から得た。HRP-結合ニュートラビジンはPierce（Rockford, IL）から得た。全ての分子生物学試薬は、特段の指示がないかぎりINVITROGENTM（Carlsbad, CA）から得た。
実施例2：Gβ1γ2及びSIGKペプチドの発現と精製
野生型ウシGβ1及びN-末端(His)6タグ付加ウシGγ2のためのcDNAを保有するバキュロウイルスを用いて、前記のタンパク質を生成した。High５細胞（INVITROGENTM, Carlsbad, CA；2ｘ106細胞/mL）に高力価のGβ1及びGγ2バキュロウイルスを感染させた。標準的方法（Kozaza and Gilman (1995) J Biol Chem 270:1734-41）に改変を加えてGβ1γ2を精製した。全工程を4℃で実施した。細胞を感染後60時間で遠心分離（2600g）によって採集し、続いて細胞培養1リットルにつき50mLの溶解緩衝液（20mMのHEPES（pH8）、150mMのNaCl、5mMのβ-ME、1mMのEDTA、1mLのSIGMA(商標)プロテアーゼ阻害剤カクテルP-2714）に再懸濁した。超音波処理によって細胞を溶解し、2600gで遠心して膜を沈殿させた。膜の再懸濁及び均質化は、100mLの溶解緩衝液中でドウンスホモジナイーザーを用いて達成された。攪拌しながら1%のルブロール（C12E10, SIGMA, St. Louis, MO）を添加して膜を溶解し、得られた溶液を125,000gで超遠心分離して清澄にした。溶解緩衝液＋1%ルブロールで平衡化したNi-NTAアガロース（QIAGEN(商標)（Valencia, CA））に上清をローディングした。前記カラムを洗浄し、さらに、緩衝液Ni-A（20mMのHEPES（pH8）、0.4MのNaCl、5mMのβ-ME、0.5%ルブロール、0.15%コール酸塩）及びNi-B（20mMのHEPES（pH8）、0.1MのNaCl、5mMのβ-ME、0.25%ルブロール、0.3%コール酸塩）を用いて、ルブロールをコール酸ナトリウムと交換した。Gβ1γ2はNi-C（20mMのHEPES（pH8）、0.01MのNaCl、5mMのβ-ME、1%コール酸塩、200mMのイミダゾール）に溶出させた。QA（20mMのHEPES（pH8）、5mMのβ-ME、0.7%のCHAPS、1mMのEDTA）で平衡化させたHITRAPTM Q（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）カラムに前記溶出液をローディングした。Gβ1γ2はQB（QA＋1.0MのNaCl）を用いたグラジエントで溶出させた。Gβ1γ2を含む分画をSDS-PAGEで分析し、プールした。緩衝液GF＋CHAPS（20mMのHEPES（pH8）、150mMのNaCl、10mMのβ-ME、1mMのEDTA、0.7%のCHAPS）で平衡化したSEPHADEX(商標)75：SEPHADEX(商標)200タンデムカラム（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ）を用いてゲルろ過を実施した。精製収量は、典型的には細胞培養1リットル当り1mgのGβ1γ2であった。
SIGKペプチド（Ser-Ile-Gly-Lys-Ala-Phe-Lys-Ile-Leu-Gly-Tyr-Pro-Asp-Tyr-Asp；配列番号:2）は、十分に確立された方法を用いて合成した。ペプチド末端に改変は加えず、精製はVYDAC(商標)C4半調製用カラムで逆相HPLCクロマトグラフィーにより実施した。
【００５２】
実施例3：結晶学
SIGKペプチドをGβ1γ2に1.5モル過剰で加え、Gβ1γ2・SIGK複合体を結晶化のために7mg/mLで用いた。等体積（2μL）のタンパク質溶液及び溜め液（15−17%のPEG 4000、100mMのHEPES（pH7.5）、0.01−0.05Mの酢酸ナトリウム、10%のグリセロール）を用い、20℃で蒸気拡散によって結晶を成長させた。1週間以内に寸法が150μmｘ50μmｘ20μmの結晶が得られた。15%のグリセロールで結晶を凍結から保護し、液体窒素中で凍結させた。
生成されたそのままのGβ1γ2・SIGKの結晶を、Advanced Light Source（ALS）ビームライン8.2.1及び8.2.2（Berkeley, CA）及びAdvanced Photon Source（APS）ビームラインBM-19（Chicago, IL）でスクリーニングした。ALS8.2.2のデータ一式を用いて構造を決定した。100を超える結晶をスクリーニングした。回折限界は7Åから構造決定に用いた2.7Åデータセットまで変動した。回折データを指数化し、統合し、ソフトウェアパッケージHKL2000を用いて評価した（Otwinowski and Minor (1997) In: Methods in Enzymology, Vol. 276:307-326）（表4）。結晶の空間群はP212121であった。
【００５３】
表4
2008537481.tif 000018
最終モデルは、（340残基の）Gβ1の残基2-340、（68残基の）Gγ2の残基7−52、（15残基の）SIGKの残基1−13及び37の水分子を含んでいた。
1カッコ内の数はもっとも高い解像殻2.8−2.7Åに対応する。
2Rsym＝Σh Σi｜Ii(h)−＜I(h)＞|／Σh Σi Ii(h)、式中、Ii(h)及び＜I(h)＞は、それぞれith及び反射hの強度の平均測定値である。
3最終モデルは、（340残基の）Gβ1の残基2-340、（68残基の）Gγ2の残基7−52、（15残基の）SIGKの残基1−13を含んでいた。
4Rwork＝Σh||Fo(h)−|Fc(h)||／Σh|Fo(h)|、式中、Fo(h)及びFc(h)は、それぞれ観察及び計算で得られた構造係数である。Ι/σカットオフはR係数の最終的計算では用いられなかった。
5Rfreeは、ランダムに選択した8％のデータのから成る反射のテスト一式について得られたR係数である。
6N-末端（Gβ1残基2−41及びGγ2残基7−13を含む）のB-係数は80Å2よりも大きい。
【００５４】
Gβ1γ2・SIGK複合体の構造は、プログラムPHASERを用いて分子置換法によって解明された（Storoni et al. (2004) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 60:432-8；Read (2001) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 57:1373-82）。Gβ1γ2・GRK2複合体（1OMW、100％配列同一性）におけるGβ1γ2の座標を検索モデルとして用いた。CNSヴァージョン1.1（Adams et al. (1997) Proc Natl Acad Sci USA 94:5018-23；Brunger et al. (1998) Acta Crystallographica Section D 54:905-921）での最大公算最小化標的を用いた剛体リファインメントの後で、刺激アニーリング、パウエル最小化及びB係数リファインメントの組合せを用いて前記モデルをさらにリファイニングした。リファイニングした相を用いてコンピューター処理したシグマA-偏向2Fo−Fc電子密度マップによって、SIGKペプチドの10残基についての明瞭な主鎖密度が、いくつかのSIGK残基についての特定可能な側鎖密度とともに明らかにされた。引き続いてモデル構築をOで実施し（Jones et al. (1991) Acta Crystallographica Section D 47:110-119）、続いて刺激アニーリング、エネルギー最小化及びB係数リファインメントをCNSを用いて実施した。PROCHECK（Laskowski et al. (1993) J Appl Crystallography 26:283-291）解析は、全ての残基は、もっとも都合がよいか、又はφ、ψ空間のまた別に許容される領域における主鎖配座を示した（表4）。表面接近許容性、Gβ1γ2・SIGK接触および構造間のRMSDの計算はCNSシュートにおけるプログラムを用いて実施した。
【００５５】
実施例4：ビオチニル化Gβ1γ2（b-βγ）及びb-βγ変異体の構築及び部分的精製
野生型Gβ1及びGβ1変異体をバキュロウイルスベクターPDW464で作出した（前記は、Gβ1のアミノ末端の上流のリジンでビオチニル化部位をコードする）（Goubaeve et al. (2003) 上掲書）。変異体は、オーバーラップ伸長PCRにより標準的プロトコルを用いて作出された。野生型及び変異体Gβ1構築物は、ラットのGβ1サブユニットのアミノ末端にin-frame融合された20アミノ酸のビオチンアクセプターペプチド（BAP）配列から成っていた。Sf9細胞でビオチンホロ酵素シンターゼ（BirA）と一緒に発現されたとき、Gβ1サブユニットは、BAP内の特定のリジンアクセプター残基でin vivoで共有結合によりビオチニル化される。このアプローチを用いて、Sf9昆虫細胞1リットル当り1−2mgの精製タンパク質を得ることができる。45ngのタンパク質をファージELISAアッセイで用いるとき、10,000から30,000の結合アッセイのためにただ1回の精製で十分である。
バキュロウイルスはBAC-TO-BAC(商標)システムを用い、製造業者（GIBCO/BRL, Gaithersburg, MD）の指示にしたがって作成した。Sf9細胞（200mL）は、(His)6-Gαi1をコードする0.5mLのバキュロウイルス、4mLのGγ2ウイルス及び4mLの野生型若しくは変異Gβ1ウイルスで三重に感染させた。Gβ1γ2ダイマーは、十分に確立された方法に表示の改変を加えた方法を用いて感染60時間後に精製した（Kozasa and Gilman (1995) 上掲書）。細胞ペレットを4mLの溶解緩衝液（50mMのHEPES（pH8.0）、3mMのMgCl2、10mMのβ-メルカプトエタノール、1mMのEDTA、100mMのNaCl、10μMのGDP、及びプロテアーゼ阻害剤）中で液体窒素にて凍結-融解を4サイクル実施することによって溶解した。1％のコール酸ナトリウムを用いて膜を可溶化し、100,000gで20分超遠心分離して清澄にし、0.5％ルブロール含有緩衝液で稀釈し、さらにNi-NTA樹脂と混合した。十分に洗浄した後、50mMのMgCl2、10mMのNaF、10μMのAlCl3、1％のコール酸塩及び5mMのイミダゾールを含む緩衝液とビーズを室温にて1時間混合することによってGβ1γ2サブユニットを結合-Gαi1から溶出させた。b-βγ及びb-βγ変異体の濃度は、競合的イムノブロッティング及びケミルミネッセンスによって分析した。タンパク質はSDS-PAGEで分離し、ニトロセルロースに移し、HRP-結合ニュートラビジン（Pierce, Rockford, IL）で調べた。ケミルミネッセンスシグナルは、EPI-CHEM IITM暗室システム（UVP Bioimaging Systems, Upland, CA）を用いて測定した。溶出b-βγダイマーの濃度は、少なくとも2つの別個のゲルから得た完全精製100％ビオチニル化Gβ1γ2の標準曲線と比較することによって決定した。
【００５６】
実施例5：b-βγ結合アッセイ
野生型及び変異体b-βγとのペプチド結合の判定に用いたファージELISAアッセイは、標準的方法にしたがって実施した（Smrcka and Scott (2002) Methods Enzymol 344:557-76）。簡単に記せば、1μgのストレプトアビジンを96ウェルプレートのウェルに4℃で一晩固定した。前記ウェルをトリス緩衝食塩水（TBS）中の2％ウシ血清アルブミン（BSA）100μLで1時間4℃にてブロッキングし、続いて1ｘのTBS/0.5％TWEEN(商標)で3回洗浄した。TBS/0.5％TWEEN(商標)中の25nMのbGβ1γ2（40μL）を各ウェルに添加し、1.5時間4℃でインキュベートした。ウェルを洗浄し、続いて1ｘ106から1ｘ1010のファージ粒子を添加し、3時間4℃でインキュベートした。続いてウェルをTBS/0.5％TWEEN(商標)で6回洗浄し、次に1：5000希釈の抗M13抗体（Pharmacia, Uppsala, Sweden）40μLを添加し、室温で1時間インキュベートした。ウェルを洗浄し、続いて40μLの2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン)-6-スルホン酸（ABTS）を添加し、比色反応を405nmでモニターした。非特異的結合を各読取り値から差し引いた。
部分精製したb-βγサブユニットにより得たシグナルは、完全精製b-βγサブユニットから得たシグナルと同様であった。Gαi・Gβ1γ2結合の遮断は、SIGKの存在下又は非存在下で50pMの固定b-βγに200pMのFITC-Gαi1を同時添加し、ビーズに結合したFITC-Gαiの量をフローサイトメトリーで標準的方法にしたがって測定することによって判定した（Ghosh et al. (2003) 上掲書；Sarvazyan et al. (1998) J Biol Chem 273:7934-40）。
【００５７】
実施例6：Gβ1γ2・SIGK複合体の構築様式
特段の指示がなければ、接頭辞“ｓ”をもつアミノ酸残基はSIGK残基であることを示している。
Gβ1は、7つの4本鎖βシート（“ブレード”）及びGγ2と強く相互作用するN-末端伸長ヘリックスを含むβ-プロペラーである。各シートは、種々の長さのループによって連結されたWD-40リピートを含む。Gβ1の残基2−340は前記モデルに含まれている。Gβ1のコア全体のB係数は40Å2未満である。B係数が＞60Å2である残基は以下の3つのループ領域で見出されている：ブレード２内のLys127−Ser136、ブレード４内のArg214−Met217、及びブレード６とブレード７を連結するループ内のSer265−Ile269。Gγ2は、残基Asn24−Lys29によって作られる捩れをもつヘリックス及び残基His44で始まるコイル領域を形成する。Gγ2分子内の平均B係数は44Å2である。Gγ2のN-末端の7つの残基及びC-末端の16残基、又はGγ2のC-末端におけるプレニル脂質改変については、電子密度は観察されなかった。
SIGKは、10位のグリシンによって破壊されるαヘリックスを形成する。C-末端の3つの残基は伸長構造を形成し、前記構造はGβ1分子から伸びており、sPro12とAsp13の間で対称関係のGβ1分子のThr47及びLys337との結晶接触によって支えられている。SIGKのN-末端（sSer1、sIle2）及びC-末端（sGly10−Asp13）残基のB係数は50Å2より大きい（他の全ての残基のB係数は30−50Å2である）。残基1−13における主鎖原子の電子密度は明瞭に規定されているが、Gβ1と接触しないSIGK側鎖の3つ（sIle2、sLys7及びsAsp13）は無秩序である。ペプチドはGβ1の“最上部”面を横断して結合し、溶媒が接近し得る全表面積の970Å2に埋没する。ペプチドはGγ2サブユニットとは接触しない（前記はGβ1トーラスの“底部”表面と結合する）。
Gβ1上のSIGK接触表面は以下の2つの領域に分けられる：ペプチドのN-末端と相互作用するGβ1上の酸性領域及びペプチドのC-末端と相互作用する主に非極性の領域。総合すれば、13のGβ1残基はSIGKと直接接触し、β-プロペラーの7つのブレードのうち6つが寄与する（表5）。
【００５８】
表5
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【００５９】
N-末端の結合表面は静電気的相互作用に集中し、前記では、sLys4はGβ1γ2上の陰性荷電結合ポケットに張り出し、前記はそこでAsp228、Asn230及びAsp246と水素結合を形成するか、又は前記と荷電性相互作用する。Asp228のカルボニル酸素とAsp246の主鎖窒素との間の水素結合は、Gβ1上の3つの酸性残基を安定化させる。Met188は、sLys4のアルキル鎖とのファンデルワールス相互作用に参画し、さらにAsp186はsSer1のカルボニル酸素との極性接触を形成し、さらにまたCys204のアミドと水素結合する。さらにまた、Tyr145は、sSer1の主鎖酸素、sLys4側鎖、及びsAla5のCβ原子とファンデルワールス相互作用を形成し、さらにGly162の近傍のアミドと水素結合を形成する。Leu117の側鎖は、sIle2及びsAla5の側鎖のファンデルワールス接触の距離内に存在する。総合すれば、これら9つの残基は、荷電性及び非極性相互作用を用いてSIGKをGβ1に結びつける表面を形成する。
SIRK及びSIGKペプチドの変異解析によって、今はSIGK・Gβ1γ2構造に関して説明することができる（Scott et al (2001) 上掲書；Goubaeva et al. (2003) 上掲書）。野生型SIRKペプチドは、Gβ1γ2によるPLC β2の活性化を5μMのIC50で阻害する。SIRKペプチドのsLys4のアラニンによる置換はこのペプチドのIC50を1/12に低下させ、sAla5のグリシンへの変異はIC50を1/13に低下させる。sIle2のアラニンへの変異はこのペプチドのIC50を1/4に低下させ、sSer1のアラニンへの変異はIC50に影響を与えない（Scott et al. (2001) 上掲書）。SIGK・Gβ1γ2構造は、sSer1の主鎖並びにsIle2、sLts4及びsAla5の側鎖がGβ上の多数の残基と接触することを示し、それによってこの変異データを説明する。
Gβ1γ2・SIGK複合体のための結合エネルギーに対する、Gβ1γ2・SIGK接触面で観察されるGβ1残基の寄与を測定するために、2つのアプローチを利用した。第一に、ELISAアッセイを用いて、固定Gβ1γ2サブユニットとSIGK配列をディスプレーするファージとの結合を測定した（表6）。次にこのELISA結合データを、Gβ1γ2とGαi1との結合の競合物質としてSIGKのIC50値と相関させた（表7）。続いて、Gβ1サブユニット内に変異を含むGβ1γ2ヘテロダイマーを用いて両アッセイを実施した。N-末端結合表面において、Gβ1のAsn230のアラニンへの変異はペプチドに対するGβ1γ2の親和性を1/10に低下させた（表6）。Gβ1残基Asp186、Met188、Tyr145及びLeu117のアラニンへの単一変異はまた、SIGKに対する親和性が劇的に低下するGβ1γ2ダイマーを生じた（表6）。Asp228又はAsp246のどちらかがアラニンで置換されたGβ1変異体はGγ2とダイマーを形成せず、したがって解析されなかった。しかしながら、Asp228がセリンで置換された変異体は、SIGKペプチドに対する結合親和性においてわずかな低下を引き起こしただけであった（表6）。したがって、N-末端のSIGK結合接触面を作り出すGβ1残基の多くは結合エネルギーに大きく寄与する。
【００６０】
表6
2008537481.tif 000020
SIGKペプチドと接触するアミノ酸を個々にアラニンに（又はAsp246のためにはセリンに）変異させ、ファージELISAを用いてペプチドとの結合をアッセイした。固定b-βγをSIGKペプチドディスプレーファージと一緒にインキュベートした。ファージの結合をα-ファージ抗体を用いて検出した。未加工データは405nmでの吸収であった。表示のデータは3つの別個の実験から得たトリプリケートの測定値の平均±SDである。
【００６１】
表7
2008537481.tif 000021
代表的なGβ1サブユニット変異体とのFITC-Gαi1Gβ1γ2相互作用に対するSIGKの競合。野生型又は変異体b-βγタンパク質を被覆したストレプトアビジンビーズにSIGK及びFITC-Gαi1を同時に添加し、ビーズに結合したFITC-Gαi1をフローサイトメトリーでアッセイした。データは代表的な実験のトリプリケートの測定値の平均±標準偏差として示されている。実験は2回（Met188A）又は3回（野生型、Arg314A、Trp332A）繰り返され、同様な結果が得られた。SIGK結合親和性領域に広がる変異体の選別に対する2つのアッセイの比較によって、結合の50％低下はIC50の5倍増加になり、結合の75％低下は10倍増加に相当し、90％低下は20倍のシフトであり、98％低下は50倍のシフトであることが示された。IC50値は以下のとおりである：野生型＝0.47μM、Arg314A＝1.5μM、Trp332A＝9μM、及びMet188A＝22μM。
【００６２】
結合の第二の領域はSIGKのC-末端残基の大半（sAla5−sGly11）を含み、前記はGβ1上の極めて疎水的なポケットに対して集合する。このポケットは、ブレード7上のTrp332からブレード2内のMet188へ11Å伸長する。8つのGβ1残基は、SIGKのC-末端表面と直接接触し、さらに2つのGβ1残基がSIGK相互作用に直接必要とされる残基を支える。Met188（N-末端接触面内のsLys4と相互作用する）もまたsLeu8の側鎖の接触距離内に存在する。SIGK残基、sAla5、sLeu8及びsLeu9は、Leu117、Met101、Trp99、Tyr59、及びLys57のアルキル鎖とのファンデルワールス相互作用によって支持される。Val100の主鎖酸素はsLeu9の側鎖と相互作用する。Trp99のインドールイミンは、sTyr11のヒドロキシル基と水素結合を形成し、さらにTrp332の側鎖はsIle8の主鎖酸素及びsGly10のCαと接触する。Lys57及びArg314の側鎖はTrp332のどちらかの側に位置し、結合部位における前記が正しい方向に向くのを助ける。Arg314はまたTrp332と水素結合し、さらにLys57とGln75の窒素との水素結合とともにGβ1上でこの相互作用を安定化させる。ペプチドのアラニンスキャンから得たデータ（Scott et al. (2001) 上掲書；Goubaeva et al. (2003) 上掲書）はこれらの構造的観察の正当性を証明する。sIle8、sLeu9又はsGly10のアラニンへの変異は、PLC活性化阻害のIC50を40倍（5μMから200μM）、60倍及び12倍それぞれ増加させる（Scott et al. (2001) 上掲書）。sLeu9の同じ変異によって、PASM細胞でERK1/2のリン酸化を強化させるSIRKの能力もまた遮断される（Goubaeva et al. (2003) 上掲書）。
SIGK C-末端結合表面を構成するGβ1内のアミノ酸の変異はSIGKペプチドに対する親和性の低下をもたらすが、ただしその程度は様々である。Leu117、Met188又はTro332のアラニンへの変異はSIRK結合をほとんど停止させ、Lys57、Tyr59、Met101及びArg314の変異体はより軽度の影響を示した（表6及び表8）。Trp99は親和性を1/4に低下させた。本明細書で提示した全Gβ1変異（すなわちアラニンへの変換）及びそれらの影響の要旨は表8に列挙される。
【００６３】
表8
2008537481.tif 000022
【００６４】
N-末端及びC-末端SIGK結合接触面についての全てのデータを考慮すれば、調べたSIGKペプチドの15残基のうちの7つ及び12のGβ残基のうちの10残基が、顕著な結合エネルギーを表面に提供し、構造モデルと良好な相関性を示す。
Gβ1γ2・SIGK複合体におけるGβ1の結合表面はSIGKの結合に際して顕著には変化しない。Gβ1γ2・SIGK複合体内のGβ1のコア残基と複合体未形成Gβ1γ2ヘテロダイマーのコア残基（１TBG（Sondek et al. (1996) Nature 379:369-74）；Val40−Asn340, Cαのみ）との間のRMSDは0.88Åである。しかしながら、Trp99、Tyr59、Asn228、Leu117及びMet101の側鎖は回転してSIGKを収容し、これらの残基内の原子は、複合体未形成Gβ1のそれらに位置と比較してそれぞれ最大4.0Å、3.6Å、2.9Å、2.8Å及び2.3Åの変位を受ける。SIGK結合表面の残基に対するB係数は複合体に対する全体平均に近い。しかしながら、Trp99のB係数は、対応する構造の標準化B係数の比較によって示されるように、SIGKとの結合に際して1/2に低下する。この分析では、SIGK結合に際してGβにおける大きな配座変化も又は無秩序秩序転移も存在しない。SIGK・Gβ1γ2複合体は、以下の5つのGβ1γ2複合体とタンパク質標的との複合体と比較することができる：Gβ1γ2・Gαi1ヘテロダイマー（1GG2）（Wall et al. (1995) 上掲書；Wall et al. (1998) 上掲書）及びGβ1γ2・Gαt/iヘテロトリマー（1GOT）（Lambright et al. (1996) 上掲書）、Gβ1γ2・フォスデュシン複合体（1AOR及び2TRC）（Loew et al. (1998) 上掲書；Gaudet et al. (1996) 上掲書）、並びにGβ1γ2・GRK2複合体（1OMW）（Lodowski et al. (2003) 上掲書）。これらの構造の各々を有するGβ1γ2・SIGKのスーパーポジションは、Gβ1残基40−340について1.0Å（Cαのみ）未満の平均RMS偏差を生じる。Gβ1γ2・フォスデュシン複合体に必要とされるいくつかの残基を例外として、Gβγヘテロダイマーは、タンパク質標的と結合するために顕著な構造的再編成を受けず、Gβ1γ2・SIGK構造においても顕著な構造的再編成を受けない。
【００６５】
実施例7：フローサイトメトリーによるα-βγ相互作用の測定
蛍光標識Gαi1（Fαi1）を標準的方法にしたがって調製した（Sarvazyan et al. (1998) 上掲書）。Gα-Gβγ相互作用に対するペプチドの作用を決定するために用いたアッセイには競合アッセイ及び解離アッセイが含まれていた（Ghosh et al. (2003) 上掲書）。簡単に記せば、競合によるアッセイのためには、100pMのFαi1及び表示の濃度のペプチドを50pMのb-Gβ1γ2（1mL当たり105のビーズに固定）に添加し、室温で30分インキュベートして平衡させた。続いて、ビーズ結合蛍光をBD Biosciences FACSCALIBURTMフローサイトメトリーで記録した。バックグラウンド蛍光についてデータを修正し、Graph Padプリズム4を用いてS字形用量応答曲線に合わせた。b-Gβ1γ2からFαi1の解離を測定するために、100pMのFαi1を50pMの固定b-Gβ1γ2と室温で15−20分インキュベートした。結合したFαi1サブユニットの蛍光を測定し、続いて200倍過剰の非標識Gαi1又はペプチドを添加し、ビーズに結合したままのFαi1の量を表示の時間に測定した。
【００６６】
実施例8：タンパク質相互作用部位での分子の認識
SIGKペプチド結合のための接触面は以下の2つの広い相互作用に分割されることが判明したので、前記ペプチド認識のための分子的根拠を明らかにした：C-末端結合接触面（前記はペプチドの疎水性コアと接触する；アミノ酸8−10、Ile-Leu-Gly）及びN-末端接触面（前記はペプチドのN-末端（主としてLys4）と結合する）。したがって、Gβ1の共通の結合表面を個々にアラニンで置換し、どのアミノ酸が、Gβ1γ2と9つの別個のSIGKペプチド誘導体との相互作用にもっとも重要であるかを決定した（表9）。
【００６７】
表9
2008537481.tif 000023
*下線を付した残基はN-末端と接触するリジン残基及び疎水性コア残基を示す
以前に同定された種々のコンセンサスペプチド群（Scottらの文献（上掲書(2001)；表9を参照されたい）を代表する9つのペプチドを選択し、コンセンサス群内又は群間で結合の特徴を比較した。これらのペプチドをディスプレーするファージと野生型Gβ1γ2との結合は、異なっているが同様な範囲に入るELISAシグナルを生じた（ファージ3.14に対して25％から100％の結合）。本明細書に開示するように、ELISAアッセイで得られた結合シグナルを、溶液系アッセイにおけるペプチドの反応態様と前記の結果を比較することによって親和性の低下に対して修正した。例えば、ELISAで80％の結合低下を示す変異体は、溶液のペプチド親和性では10倍シフトに一致した。本開示の目的のために、野生型の結合の20％未満の結合に低下させるいずれの置換も当該ペプチドにとって決定的な結合接触であると判断した。この分析から得られたデータは表10に提示される。
【００６８】
【表１】
2008537481.tif 000024
【００６９】
表10脚注：
野生型又はアラニン置換ビオチニル化Gβ1γ2サブユニットをストレプトアビジン被覆96ウェルプレートに固定し、続いてファージを添加した。ファージの結合を本明細書に記載するように判定した。データはファージのプレートとの非特異的結合について修正し、野生型結合のパーセントとして表した。提示したデータは3つの別個の実験のデュープリケートの決定値の平均±SDである。
【００７０】
予想に反して、各々のペプチドは、その個々の相互作用のためにSIGK結合表面内のアミノ酸の固有の組合せを利用した。ペプチド間で優勢な特徴は、C-末端接触面内でのTrp332に対する強い要求であった。この接触面内ではまた、一般的にLys57、Tyr59、Leu117はこのペプチドとの結合に顕著に寄与した。ただし、それらの作用が絶対的に必要というわけではない事例もあった。残りのアミノ酸は各ペプチドの結合に対してより変動性のある作用を有していた。例えば、SIGKはTrp99に対して最小限の要求を示すが、一方、Ser-Cys-Lys-Arg-Thr-Lys-Ala-Gln-Ile-Leu-Leu-Ala-Pro-Cys-Thr（C1；配列番号:7）は結合のためにTrp99を絶対的に要求する。Tyr145については逆もまた真なりで、この場合SIGK結合はTyr145を絶対的に要求し、Ser-Cys-Lys-Arg-Thr-Lys-Ala-Gln-Ile-Leu-Leu-Ala-Pro-Cys-Thr（C1；配列番号:7）の結合はこの変異によって影響を受けない。
SIGKのN-末端は、以下の2つの主要な接触を介してGβサブユニットと相互作用する：βAsp186及びβTyr145とsSer1の相互作用、並びにファンデルワールス相互作用によるβMet188と、及び水素結合又は荷電を介する相互作用によるβAsn230、βAsp246及びβAsp228とsLys4の相互作用。本明細書で利用される発現系では、Asp228Ala及びAsp246Alaはガンマによりダイマー化されることはなく精製できなかったが、しかしながらAsp246Serは発現され精製された。一般的に、I、II及びIV群のペプチドはN-末端領域との結合のために相当な要求を示し（Met188Ala及びAsp246Ser（SIGKを除く）変異体とのほぼ完全な結合消失によって示される）、さらにAsn230に対しては種々の要求を示す。
I、II及びIV群のペプチドは保存モチーフを有し、前記モチーフでリジンは疎水コアモチーフから3アミノ酸置いて配置される（表9参照）。SIGK内のこのモチーフは、N-末端結合表面と相互作用するリジンとC-末端と相互作用するIle-Leu-Glyモチーフとの間の単一αヘリックスターンで適切な間隙を提供する。他のペプチドのいくつかも、この間隙を決定的に重要なものとし得る同様なαヘリックス構造を採用すると考えられる。III群のペプチドはC-末端の相互作用領域と結合するが、Met188に対する要求を欠き、Asn230及びAsp246に対しては最小限の要求を示し、III群ペプチドはβとそれらの相互作用のためにN-末端結合表面を用いないことを示唆している。
SIGKと外見的には直接結合しない2つのアミノ酸、Arg314およびHis311もまた解析した。Arg314の置換はSIGK結合の軽度の低下をもたらすが、他のペプチドについてはArg314は絶対的に要求され、それらペプチドはこのアミノ酸と直接相互作用し得ることを示唆している。His311は、SIGKペプチド結合部位の十分に外側に存在するが、βγサブユニットの配座変化におけるその潜在的な必要性のために変異させた（Gaudet et al. (1996) 上掲書；Loew et al. (1998) 上掲書）。His311のイミダゾール側鎖はArg314のグアニド窒素から13Å離れている（Arg314は前記ペプチドのいずれとも明瞭に相互作用するもっとも近傍のアミノ酸である）。His311がファージディスプレー由来ペプチドのアミノ酸と直接相互作用することは、おそらくなさそうである。それにもかかわらず、His311のアラニンへの変異は多様なペプチドの結合に種々の程度で影響を与えた。その結合がHis311Aによって影響を受けるペプチドはまた結合のためにArg314を要求した（おそらくArg314の位置における変化による作用）。
【００７１】
Gα-Gβγ接触面で結合すると予想される2つのペプチド（βARK-ctペプチド（アミノ酸643−670）及びQEHA）はヘテロダイマー形成を遮断するが、ヘテロダイマー解離を促進することはできないことが示された（Ghosh et al. (2003) 上掲書）。GRK2（βARK）-Gβγ複合体の結晶構造は、βARK-ctペプチドと相互作用する表面はSIGK及びGα-スイッチII結合部位と部分的にオーバーラップすることを示している（Lambright et al. (1996) 上掲書；Wall et al. (1995) 上掲書；Lodowski et al. (2003) 上掲書）。特に、疎水性ポケット内のアミノ酸、Trp99、Trp332、及びTyr59は全ての3構造において共通の相互作用部位である。SIGKペプチド及びαスイッチIIはGβ上でほぼ同一の場所を占拠するリジン残基を有する。βARK-ctペプチドは同様な位置にリジン残基を有するが、その相互作用の幾何学及び性質は異なっている。βARKはAsp228とのみ相互作用するが、一方、SIGKおよびGαはAsp228、Asp246、Asn230及びMet188と相互作用する。この相違を基準にして、この接触面でのSIGKの特異的な相互作用は解離促進に必須であるか否かを決定した。
【００７２】
サブユニットの解離を調べるために、SCARペプチド（ファージディスプレースクリーニングに由来するまた別のペプチド）を用いた。N-末端の相互作用接触面内のアミノ酸、Asn230、Asp246及びMet188（SIGKのsLys4と接触する）はSCARとの結合にとって重要ではない。SCARは、疎水性コアモチーフに対して正確に配置された、リジン結合N-末端表面に到達するためのリジン残基を欠く（表9）。したがって、SCARはサブユニット解離を促進することはできないであろう。SIGKもSCARもともに、それぞれ0.5μM及び1.7μMのIC50でGβ1γ2との結合についてGαiと競合することができる。しかしながら、SIGKペプチドと異なり、飽和濃度のSCARペプチドは予め形成させたヘテロダイマーの解離を促進することはできなかった。160μMまでのSCARの濃度（飽和濃度の4倍）は解離を引き起こさなかった。SCARがヘテロダイマー解離を促進できないことはその低い結合親和性のためではない。なぜならば、SIRKは同様な親和性を有し、解離を促進するからである。これらの結果は、ペプチドとN-末端接触面との結合はヘテロダイマー解離の加速に必要であることを示している。
N-末端ペプチド結合接触表面とのペプチドの結合の重要性をより直接的に判定するために、SIRKのsLys4残基をアラニンに変異させ、N-末端結合ポケットとの極めて重要な接触を排除した。このペプチドは、Gα-Gβγ相互作用の遮断についてはSIRKよりもはるかに低い親和性を示した（IC50は1.4μMに対して60μM）が、高濃度においては前記ペプチドはSIRKのレベルに近いレベルで遮断した。Gα-Gβγ相互作用の遮断にもかかわらず、SIRK(Lys4Ala)はヘテロダイマーの解離を加速することができなかった。Fαi1の見かけの脱離速度は、固有の解離速度と比較してSIRK(Lys4Ala)については遅いように見える。これは、SIRK(Lys4Ala)は低親和性ブロッカーであるためかもしれず、Fαi1の再結合を防止するには有効ではない。SIRK(Lys4Ala)の低親和性が解離を加速できないことの原因ではないことを確認するために、SIRK（Lys4Ala）に対して相応の親和性を有するペプチド、SIRK(Gly10Ala)（IC50約80μM）を調べた。このペプチドはLys4を有するが、10位でGlyがAlaで置換されている。したがってSIRK(Gly10Ala)はN-末端接触表面との結合を維持するが、C-末端領域との相互作用の低下のために親和性が低下している。SIRK（Gly10Ala)は高いペプチド濃度でヘテロダイマーの形成を遮断し、Gβγに対する低親和性にもかかわらず、ヘテロトリマー解離を加速することができた。
【００７３】
SIGKは、ヘテロトリマー内のGαサブユニットのスイッチIIドメインによって占拠された領域でGβ1と結合する。ヘテロトリマーの結晶構造は、Gαのスイッチ接触面（スイッチI及びスイッチIIを含む）は多数の接触を介してGβのほぼ1,800Åを覆い隠していることを明らかにした（Lambright et al. (1996) 上掲書；Wall et al. (1995) 上掲書）。しかしながら、この接触面におけるβサブユニットアミノ酸変異のαサブユニット結合に対する影響は、Gα-Gβγ相互作用のKd近くの直接的結合アッセイでは未だ測定されていない。スイッチI及びスイッチIIはGTP結合に際して大きな配座の変化を受け、これらの変化はヘテロトリマー解離を仲介すると考えられる。
本明細書に開示したGβ1サブユニット変異体は、Gγ2と6ヒスチジンタグ付加Gαi1との複合体として昆虫細胞から単離され、結晶構造から予想されるサブユニット間のこれらの接触の多くは、それぞれ1つ１つはGαサブユニット結合にとって重大ではないことを示した。どのアミノ酸が、解離速度定数を増加させるペプチドの能力に寄与するかを決定するために、個々に置換したb-β1γ2変異体の各々からのFαi1の解離速度定数（Koff）を測定した。野生型についての固有の脱離速度は0.123 s-1であり、以前の測定値によく対応している（Sarvazyan et al. (1998) J Biol Chem 273:7934-7940）。これら変異体の全てのデータは表11に示されている。
【００７４】
表11
2008537481.tif 000025
**4つの別個の実験の平均±SD。
#ワンウェーANOVAに続いて独立直線対比によって決定したとき野生型と比較して統計的に有意である。
*F-αiの十分に安定な結合が検出できなかったのでKoffは測定できなかった。
【００７５】
結果は、調べた12の変異体のうち、Trp99Ala、Leu117Ala及びTrp332Alaは野生型と統計的に異なり、Koffで比較的小さな増加を示した。他方で、Asp246Serは6HisGαi結合により精製可能であるにもかかわらず（ただし大量培養から低収量である）、このアッセイで用いた低濃度ではフローサイトメトリーで安定的にF-αi1と結合することができなかった。このことは、Asp246との相互作用は安定的なGαサブユニット相互作用に必須であることを示しているが、一方、主として疎水的なC-末端の接触面における個々の相互作用はそれほど重要ではない。
【００７６】
実施例9：小分子ライブラリースクリーニング
ファージELISAアッセイを用いて、コンピュータースクリーニングで同定された小分子がGβγタンパク質相互作用表面と相互作用することができるか否かを決定した。SIGKをディスプレーするファージを既に確立された方法にしたがって用いた（Scott et al. (2001) 上掲書；Smrck and Scott (2002) 上掲書）。スクリーニングは、Gβγサブユニット及びファージを含むウェルの光学密度（OD）の低下によった。各プレートでは、3つのウェルが結合について陽性コントロールを含み、前記コントロールはb-βγサブユニット、SIGK-ファージ及び適切な量のベヒクルを含んでいた。3つのバックグラウンドウェルはβγサブユニットを含んでいなかった。
本明細書に開示したように、ビオチニル化Gβγサブユニットをストレプトアビジンで被覆した96ウェルプレートの表面に固定し、続いて、Gβγ結合ペプチドをディスプレーするファージを添加し、テスト化合物の存在下及び非存在下で結合を抗ファージ抗体により検出した。
【００７７】
実施例10：好中球におけるGβγシグナリングの阻害
弁別したHL-60好中球培養（0.2ｘ106細胞/mL）の35mL培養を2組使用してCa2+流を測定した。細胞はDMSO（1.2％）を添加して3日間培養し、HSSで洗浄し、さらに2mLのHBSSに7ｘ106細胞/mLの濃度で再懸濁した。増殖培養液へのDMSOの添加は、これら細胞の形態学的及び機能的に成熟した好中球への分化を誘発した（Collins et al. (1978) Proc Natl Acad Sci USA 75:2458；Collins et al. (1979) J Exp Med 149:969）。好中球にはfura-2（蛍光性Ca2+感受性インジケーター）（1μM）（Suh et al. (1996) J Biol Chem 271:32753）を45分間予めローディングし、HBSSで洗浄し、さらに2mLのインジケーター非含有HBSSに再懸濁した。140μLの細胞を総量2mLのHBSSに添加した。340及び380nmの二重励起並びに510nmの発光によって蛍光比を得た。安定な基準線が得られた後、DMSO又はNSC119910のどちらかを添加し、5分インキュベートした。続いて、fMLP又はATPアゴニストのどちらかを添加して細胞内貯蔵からCa2+の放出を活性化させた。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】Gβタンパク質相互作用部位と結合すると予想される小分子は、前記タンパク質相互作用部位でペプチドの相互作用を妨害することができることを示す。1、コントロール（DMSO）；2、NSC30820；3、NSC12155；4、NSC13984；5、NSC117079；6、NSC610930；7、NSC293161；8、NSC23128；9、NSC402959；10、NSC109268；11、NSC125910；12、DMSO中のSIGK。アッセイには20μMのSIGK及び200μMの各小分子を用いた。
【図２】NSC119910はGβγと結合し、生理学的に関連するタンパク質相互作用（例えばGαサブユニット）を妨害することを示す。
【図３】NSC119910によるホスホリパーゼC−Gβγ相互作用の阻害を示す。ホスホリパーゼ酵素活性は、確立された方法を用いて決定した（Ghosh and Smrcka (2003) Meth Mol Biol 237:67-75）。
【図４】10μMのNSC119910の存在下又は非存在下でfMLP又はATPアゴニストで活性化した好中球のピーク細胞質ゾルCa2++濃度を示す。fMLP、n＝3；ATP、n＝2
【図５】10μMのNSC119910の存在下又は非存在下でfMLP又はATPで活性化した好中球についてのピーク細胞質ゾルCa2++濃度とともに、蛍光強度が1/2ピーク値に減少するために要する時間（t1/2）を示す代表的な実験である。
【図６】本発明の例示的化合物の存在下におけるPLC−β2及びPLC−β3活性化の阻害を示す。
【図１】
2008537481.tif 000026
【図２】
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【図３】
2008537481.tif 000028
【図４】
2008537481.tif 000029
【図５】
2008537481.tif 000030
【図６】
2008537481.tif 000031
【配列表】
2008537481000001.app
【国際調査報告】
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2008537481.tif 000033