(57)【要約】【課題】  存在を決定しおよび／または化学療法中に急速に最適な薬物濃度を決定するために人間の生体液中のドキソルビシン及び薬学的な活性代謝産物の存在を検出し量を定量化する免疫測定法の提供。【解決手段】  ドキソルビシンの１３及び１４位から誘導される新規のドキソルビシンの共役と新規のドキソルビシン免疫原及び生体液中のドキソルビシンの定量化及びモニタリングのための免疫測定法に有用な免疫原に連結されたこれらのドキソルビシンによって生成された抗体。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）試料と、
ｂ）ドキソルビシンに実質的に反応し、ドキソルビシンアグリコンに実質的に交差反応しない抗体と、
ｃ）一般式
【化１】
2008537110.tif 000042
（式中、Ａは
【化２】
2008537110.tif 000043
＝Ｎ−Ｏ−
又は
【化３】
2008537110.tif 000044
であって、Ｙは有機スぺーシング基、Ｘはアミノ又はチオール基を介して担体に結合可能な官能基、ｐは０から１の整数である）の化合物、
一般式
【化４】
2008537110.tif 000045
（式中、Ｘ，Ｙ及びｐは上述のとおりであり、Ｂは−ＣＨ２−又は
【化５】
2008537110.tif 000046
である）
の化合物、又はその混合物を伴う、反応性前記チオール基又はアミノ基のどちらかを有する前記担体の共役と
の混合物を準備することを含む前記試料中のドキソルビシン検出のための免疫測定法であって、
試料中のドキソルビシン及び前記混合物中の前記共役を前記混合物中で前記抗体と結合させ、その後、前記抗体に結合又は未結合の前記混合物中の前記共役量を測定し、それによって試料中のドキソルビシンの存在を測定することができることを特徴とする免疫測定法。
【請求項２】
請求項１記載の方法であって、試料はヒトの試料であることを特徴とする免疫測定法。
【請求項３】
請求項２記載の免疫測定法であって、前記抗体は、一般式
【化６】
2008537110.tif 000047
（式中、ｐ，Ｘ，Ｙ及びＡは上述のとおり）
の化合物、又は
一般式
【化７】
2008537110.tif 000048
（式中、ｐ，Ｙ，Ｘ及びＢは上述のとおり）
の化合物、又はその混合物に共役された反応性チオール又はアミノ基を有する免疫原担体を含む免疫原から生成されることを特徴とする免疫測定方法。
【請求項４】
請求項３記載の免疫測定法であって、抗体を生成するための前記免疫原担体に共役する化合物は、一般式
【化８】
2008537110.tif 000049
（式中、ｐ，Ｘ，Ｙ及びＡは上述のとおり）を有することを特徴とする免疫測定法。
【請求項５】
請求項４記載の免疫測定法であって、担体はチオール基を含み、Ｘは免疫原ポリマーに連結する化合物であり、前記チオールに反応可能な官能基であることを特徴とする免疫測定法。
【請求項６】
請求項５記載の免疫測定法であって、Ｘは
【化９】
2008537110.tif 000050
であることを特徴とする免疫測定法。
【請求項７】
請求項６記載の免疫測定法であって、Ｙは低級アルキルであることを特徴とする免疫測定法。
【請求項８】
請求項７記載の免疫測定法であって、免疫原担体は官能基
【化１０】
2008537110.tif 000051
（ｖは１から６の整数である）
を含むことを特徴とする免疫測定法。
【請求項９】
請求項２記載の免疫測定法であって、前記抗体は固形支持体に付着していることを特徴とする免疫測定法。
【請求項１０】
請求項９記載の免疫測定法であって、前記固形支持体はマイクロタイタープレートであることを特徴とする免疫測定法。
【請求項１１】
請求項９記載の免疫測定法であって、前記固形支持体は微粒子であることを特徴とする免疫測定法。
【請求項１２】
ドキソルビシンに選択的に結合し、ドキソルビシンアグリコンに実質的に結合しないことを特徴とする抗体。
【請求項１３】
請求項１２記載の抗体であって、前記抗体はマウス、羊、ウサギ又はラットから誘導されることを特徴とする抗体。
【請求項１４】
請求項１２記載の抗体であって、前記抗体はモノクロナール抗体であることを特徴とする抗体。
【請求項１５】
請求項１２記載の抗体であって、前記抗体は、一般式
【化１１】
2008537110.tif 000052
（式中、Ａは
【化１２】
2008537110.tif 000053
＝Ｎ−Ｏ−
又は
【化１３】
2008537110.tif 000054
であり、Ｙは有機スぺーシング基であり、Ｘはアミノ又はチオール基を通して担体に結合することが可能な官能基であり、ｐは０から１の整数である）
の化合物、又は一般式
【化１４】
2008537110.tif 000055
（式中、Ｘ，Ｙ，及びｐは上記のとおりであり、Ｂは−ＣＨ２−または
【化１５】
2008537110.tif 000056
である）
の化合物又はその混合物からなるグループから選択された化合物に共役された反応性アミノ又はチオール基ポリマーを有する免疫原担体から誘導されることを特徴とする抗体。
【請求項１６】
請求項１５記載の抗体であって、前記抗体を生成するために免疫原担体に共役する化合物は、一般式
【化１６】
2008537110.tif 000057
（式中、ｐ，Ｘ，Ｙ及びＡは上記のとおり）
を有することを特徴とする抗体。
【請求項１７】
請求項１６記載の抗体であって、担体はチオール基を含み、Ｘは免疫原ポリマーに連結する化合物であり、前記チオールに反応可能な官能基であることを特徴とする抗体。
【請求項１８】
請求項１７記載の抗体であって、前記化合物におけるＸは、
【化１７】
2008537110.tif 000058
であることを特徴とする抗体。
【請求項１９】
請求項１８記載の抗体であって、前記化合物におけるＹは低級アルキルであることを特徴とする抗体。
【請求項２０】
請求項１９記載の抗体であって、免疫原担体は、官能基として
【化１８】
2008537110.tif 000059
（式中、ｖは１から６の整数である）
を含むことを特徴とする抗体。
【請求項２１】
請求項２０記載の抗体であって、前記抗体は、マウス、羊、ウサギ又はラットから誘導されることを特徴とする抗体。
【請求項２２】
一般式が
【化１９】
2008537110.tif 000060
（式中、Ａは
【化２０】
2008537110.tif 000061
＝Ｎ−Ｏ−
又は
【化２１】
2008537110.tif 000062
であり、Ｙは有機スぺーシング基であり、Ｘはチオール又はアミノ基に結合可能な官能基であり、ｐは０から１の整数である）
であることを特徴とする化合物。
【請求項２３】
請求項２２記載の化合物であって、Ｘは
【化２２】
2008537110.tif 000063
−Ｎ＝Ｃ＝Ｒ４、
【化２３】
2008537110.tif 000064
又は
【化２４】
2008537110.tif 000065
（式中、Ｒ３は水素又はそれに結びつく酸素原子と一緒に得られる反応性エステルであり、Ｒ４は酸素又は硫黄である）
であることを特徴とする化合物。
【請求項２４】
請求項２３記載の化合物であって、Ｘは、
【化２５】
2008537110.tif 000066
であり、Ｒ３は水素であることを特徴とする化合物。
【請求項２５】
請求項２３記載の化合物であって、Ｘは、
【化２６】
2008537110.tif 000067
であり、Ｒ３は反応性エステルを形成することを特徴とする化合物。
【請求項２６】
請求項２５記載の化合物であって、形性されたエステルは低級アルキルエステル、イミドエステル又はアミドエステルであることを特徴とする化合物。
【請求項２７】
請求項２２記載の化合物であって、Ｘはチオール基に結合可能な官能基であることを特徴とする化合物。
【請求項２８】
請求項２７記載の化合物であって、Ｘは
【化２７】
2008537110.tif 000068
であることを特徴とする化合物。
【請求項２９】
請求項２８記載の化合物であって、Ｙは１から１０の炭素原子を含むアルキレンであることを特徴とする化合物。
【請求項３０】
一般式が
【化２８】
2008537110.tif 000069
（式中、Ｙは有機スぺーシング基、Ｘはチオール又はアミノ基に結合可能な官能基であり、Ｂは−ＣＨ２−又は
【化２９】
2008537110.tif 000070
である）
であることを特徴とする化合物又はその混合物。
【請求項３１】
請求項３０記載の化合物であって、ｐは０であることを特徴とする化合物。
【請求項３２】
請求項３１記載の化合物であって、Ｘは、
【化３０】
2008537110.tif 000071
−Ｎ＝Ｃ＝Ｒ４、
【化３１】
2008537110.tif 000072
又は
【化３２】
2008537110.tif 000073
（式中Ｒ３は水素又はそれに結びつく酸素原子と一緒に得られる反応エステルであり、Ｒ４は酸素又は硫黄である）
であることを特徴とする化合物。
【請求項３３】
請求項３２記載の化合物であって、Ｘは、
【化３３】
2008537110.tif 000074
であり、Ｒ３は水素であることを特徴とする化合物。
【請求項３４】
請求項３３記載の化合物であって、Ｘは、
【化３４】
2008537110.tif 000075
であり、Ｒ３は反応性エステルを形成することを特徴とする化合物。
【請求項３５】
請求項３４記載の化合物であって、形成されたエステルは低級アルキルエステル、イミドエステルまたはアミドエステルであることを特徴とする化合物。
【請求項３６】
請求項３０記載の化合物であって、ｐは１であることを特徴とする化合部。
【請求項３７】
請求項３６記載の化合物であって、Ｘは
【化３５】
2008537110.tif 000076
−Ｎ＝Ｃ＝Ｒ４、
【化３６】
2008537110.tif 000077
又は
【化３７】
2008537110.tif 000078
（式中Ｒ３は水素又はそれに結びつく酸素原子と一緒に得られる反応性エステルであり、Ｒ４は酸素又は硫黄である）
であることを特徴とする化合物。
【請求項３８】
請求項３７記載の化合物であって、Ｙは１から１０の炭素原子を含むアルキレン、
【化３８】
2008537110.tif 000079
【化３９】
2008537110.tif 000080
又は
【化４０】
2008537110.tif 000081
又は
【化４１】
2008537110.tif 000082
（式中ｎ及びＯは０から６の整数であり、ｍは１から６の整数である）
であることを特徴とする化合物。
【請求項３９】
一般式
【化４２】
2008537110.tif 000083
（式中、Ａは
【化４３】
2008537110.tif 000084
＝Ｎ−Ｏ−
又は
【化４４】
2008537110.tif 000085
であって、Ｙは有機スぺーシング基、Ｘはチオール又はアミノ基に結合可能な官能基、ｐは０から１の整数である）
の化合物を伴う官能前記チオール又はアミノ基を含むことを特徴とする担体の共役。
【請求項４０】
請求項３９記載の共役であって、ｐは０であることを特徴とする共役。
【請求項４１】
請求項４０記載の共役であって、Ｘは
【化４５】
2008537110.tif 000086
−Ｎ＝Ｃ＝Ｒ４、
【化４６】
2008537110.tif 000087
又は
【化４７】
2008537110.tif 000088
（式中Ｒ３は水素又はそれに結びつく酸素原子と一緒に得られる反応性エステルであり、Ｒ４は酸素又は硫黄である）
であることを特徴とする化合物。
【請求項４２】
請求項３９記載の共役であって、ｐは１であり、Ｙは１から１０の炭素原子を含むアルキレン、
【化４８】
2008537110.tif 000089
【化４９】
2008537110.tif 000090
又は
【化５０】
2008537110.tif 000091
又は
【化５１】
2008537110.tif 000092
であり、ｎ及びoは、０から６の整数であり、ｍは１から６の整数であることを特徴とする共役。
【請求項４３】
請求項４２記載の共役であって、前記担体は反応性官能チオール基を有し、Ｘは前記チオール基と結合可能な官能基であることを特徴とする共役。
【請求項４４】
請求項４３記載の共役であって、Ｘは
【化５２】
2008537110.tif 000093
であることを特徴とする共役。
【請求項４５】
請求項４４記載の共役であって、Ｙは低級アルキレンであることを特徴とする共役。
【請求項４６】
請求項４５記載の共役であって、前記担体は一般式
【化５３】
2008537110.tif 000094
（式中、ｖは１から６の整数である）
の官能基を含む重合体ポリアミンを含むことを特徴とする共役。
【請求項４７】
次の一般式の化合物を伴うチオール又はアミン基を有することを特徴とする担体の共役。
【化５４】
2008537110.tif 000095
（式中、Ｂは−ＣＨ２−又は
【化５５】
2008537110.tif 000096
であり、Ｙは有機スぺーシング基であり、Ｘは前記担体における前記チオール又はアミノ基に結合可能な官能基であり、ｐは０から１の整数である）。
【請求項４８】
請求項４７記載の共役であって、ｐは０であることを特徴とする共役。
【請求項４９】
請求項４７記載の共役であって、ｐは１であることを特徴とする共役。
【請求項５０】
請求項４９記載の共役であって、Ｙは１から１０の炭素原子を含むアルキレン、
【化５６】
2008537110.tif 000097
【化５７】
2008537110.tif 000098
又は
【化５８】
2008537110.tif 000099
又は
【化５９】
2008537110.tif 000100
（式中ｎ及びＯは０から６の整数であり、ｍは１から６の整数である）
であることを特徴とする化合物。
【請求項５１】
請求項５０記載の共役であって、担体は
【化６０】
2008537110.tif 000101
又は
【化６１】
2008537110.tif 000102
（Ｒ４は酸素又は硫黄である）
によって連結された更に多くのアミノ基を含む免疫原重合体ポリマーを含むことを特徴とする共役。
【請求項５２】
分離した容器に詰められた試薬を含む患者試料中のドキソルビシンの存在を検出するキットであって、
試薬の１つは一般式
【化６２】
2008537110.tif 000103
（式中、Ａは
【化６３】
2008537110.tif 000104
＝Ｎ−Ｏ−
又は
【化６４】
2008537110.tif 000105
であり、Ｙは有機スぺーシング基、Ｘは担体におけるアミノ又はチオール基に結合可能な官能基であり、ｐは０から１の整数である）
の化合物又は
【化６５】
2008537110.tif 000106
（式中、Ｘ，Ｙ及びｐは上記のとおりであり、Ｂは−ＣＨ２−又は
【化６６】
2008537110.tif 000107
である）
の１４−置換ドキソルビシン又はその混合物を含むグループから選択された化合物を伴う官能アミノ又はチオール基を含む前記担体の共役からなり、
２つめの容器にはドキソルビシンに実質的に選択的に反応し、ドキソルビシンアグリコンに実質的に交差反応しない抗体を含むことを特徴とするキット。
【請求項５３】
請求項５２記載のキットであって、前記共役は前記１つめの容器に予め決められた量で存在することを特徴とするキット。
【請求項５４】
請求項５３記載のキットであって、前記キットは前記試料中のドキソルビシン量を測定するのに使われることを特徴とするキット。
【請求項５５】
請求項５２記載のキットであって、前記抗体は、前記１３−置換又は１４−置換ドキソルビシンに連結された末端官能アミノ又はチオール基を有する免疫原担体の共役から生成されることを特徴とするキット。
【請求項５６】
請求項５５記載のキットであって、前記共役は１３−置換ドキソルビシンであることを特徴とするキット。
【請求項５７】
請求項５６記載のキットであって、前記担体は反応性末端官能チオール基を有し、Ｘは前記チオール基と結合可能な末端官能基であることを特徴とするキット。
【請求項５８】
請求項５７記載のキットであって、Ｘは
【化６７】
2008537110.tif 000108
であることを特徴とするキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学療法中に急速に最適な薬物濃度を決定するために人間の生体液中のドキソルビシン及び薬学的な活性代謝産物の存在を検出し及び／又は量を定量化する免疫学的分析の技術分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、身体の一部の細胞がコントロールできずに成長し始める場合に発展するという共通の特性をすべて共有する一群の悪性腫瘍について記述するために使用される用語である。ほとんどの癌は腫物として生ずるが、血液にも同様に現れ、それらが成長する他の組織を通して循環することもある。癌悪性腫瘍には、外科、化学療法、放射線治療、及びこれらの組み合わせが最も一般に扱われる。特定の癌を治療するために使用される治療のタイプは、癌悪性のタイプ、およびそれが診断された段階を含むいくつかの要因に依存する。
【０００３】
ドキソルビシン（アドリアマイシンとしても知られている）は、乳癌の治療に使用される一般的な細胞毒性薬である。ドキソルビシンの量産品の塩酸塩であるアドリアマイシンは次の一般式を有する。
【０００４】
【化６８】
2008537110.tif 000002
【０００５】
この化合物は、心臓毒性、骨髄抑制、知覚過敏症、吐き気及び嘔吐といった衰弱させる副作用に関係している。身体中のドキソルビシンのレベルのモニターおよび服用量の調整によって、これらの副作用を、患者において一層よくコントロールし制限することができる。
【０００６】
同時に、多くの場合ドキソルビシンの服用量と、治療効果に影響する血清薬物濃度の結果との間に非常に可変関係がある。個人間でのドキソルビシンの薬物動能学の可変性の程度は５倍にもなることがあり、次のものを含む多くの要因によって強い影響が生じる。
・器官機能
・遺伝子調節
・病状
・年齢
・薬物間相互作用
・薬物接摂取時間
・投薬の方法
・投薬に関するテクニック
この可変性の結果、異なる個人が同じ薬を等しい量で服用して、結果的に劇的に異なる臨床結果をもたらされることもある（非特許文献１参照）。同じドキソルビシン投薬の有効性は、個々の薬物クリアランスおよび患者の中の最終の血清薬物濃度に基づいて著しく変わる。治療薬管理によって、臨床医は静脈注射用薬の投与で患者の個々の変化を洞察することができるだろう。治療薬管理によって、患者への投薬を個別的に取り扱うことができるかもしれない。また、望まない副作用なしで癌を有効に治療する見込みは、はるかに高くなるだろう。
【０００７】
さらに、ドキソルビシンの治療薬管理は、実際に処方された投薬及び効果的な血清濃度レベルの達成を備えた投薬化学療法を施す際にコンプライアンスを保証する優れたツールとして役立つだろう。血清濃度における変動性は、生理的な要素だけでなく投薬テクニックにおける変化からの結果もまたある。ドキソルビシンの治療薬管理のルーチンは、通常の実験室の装置に適応できる簡単な自動的なテストの有用性を必要とするだとう。これらの基準に適当なテストは、放射標識免疫測定法及び酵素免疫測定法などの免疫測定法である。
【非特許文献１】Hon  et. al.  Clinical Chemistry 44，pp 388−400，1998
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかし、これらの免疫測定法に用いられる対応する抗体は、非薬学的に活性なドキソルビシン代謝産物に実質的に活性でなく、ドキソルビシンに広い交差反応性を明らかにしなければならない。ドキソルビシンの薬物濃度をモニタリングするのに効果的であるために、抗体は、活性化合物であるドキソルビシンに最も特異的でなければならず、次の一般式を有するドキソルビシンの非薬学的活性代謝産物、特にドキソルビシンアグリコンへの交差反応性に対してとても低い交差反応性を示さなければならない。
【０００９】
【化６９】
2008537110.tif 000003
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、非薬学的活性ドキソルビシン代謝産物、特にドキソルビシンアグリコンに実質的に交差反応することなくドキソルビシンに結合するために、ドキソルビシンに実質的に選択的に反応する新しい抗体クラスが生産される。選択的反応によって、本抗体が薬学的に活性ドキソルビシン分子と反応だけし、非薬学的活性ドキソルビシン代謝産物である最も重要な阻害代謝産物であるドキソルビシンアグリコンと、実質的に反応しないことを意味する。
【００１１】
一般式
【００１２】
【化７０】
2008537110.tif 000004
（式中、Ａは、
【００１３】
【化７１】
2008537110.tif 000005
＝Ｎ−Ｏ−
又は、
【００１４】
【化７２】
2008537110.tif 000006
であり、
Ｙは有機スぺーシング（spacing）基、Ｘはアミノ又はチオール基を通して担体に結合可能な官能基であり、ｐは０から１の整数である）、
の１３置換化合物、又は
一般式
【００１５】
【化７３】
2008537110.tif 000007
の化合物
（式中、ｐ、Ｙ及びＸは上記のとおりであり、Ｂは
−ＣＨ２−
又は
【００１６】
【化７４】
2008537110.tif 000008
である。）
またはそれの混合物に伴う反応性の前記チオール又はアミノ官能基を有する免疫原担体の共役である免疫原の使用によって、ドキソルビシンに特異的で、非薬学的活性代謝産物、特にドキソルビシンアグリコンに実質的に反応しない、又は結合しない抗体を生成することがわかった。実質的に選択的にドキソルビシンに反応し、非薬学的不活性代謝産物、特にドキソルビシンアグリコンに交差反応しないこれらの抗体を準備することにより、ドキソルビシンで治療されている患者の体液試料中のドキソルビシンを特に検出しモニターすることができる免疫測定法を生ずることを可能とする。さらに、前記免疫測定法のための試薬およびキットが本発明内に含まれている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明によれば、実質的に選択的にドキソルビシンに反応し、上述した薬学的不活性ドキソルビシン代謝産物に実質的に反応しない又は交差反応しない新しいクラスの抗体か供給される。免疫原として一般式ＩＩ−Ａの１３−オキソ置換ドキソルビシン及び／又は一般式ＩＩ−Ｂの１４−ヒドロキシ置換ドキソルビシン又はその混合物のこれらの誘導体の使用を通して、本発明の抗体のこの新しいクラスが準備されることがわかった。これらの抗体の使用を通して、血液、血漿または他の体液料中のドキソルビシンの検出及び／または定量のためのそのような免疫測定のための試薬およびキットを含む免疫測定法が開発された。この免疫測定法の使用によって、体液試料中、好ましくは血液又は血漿試料中のドキソルビシンの存在及び量を検出及び／又は定量することができる。この方法で、ドキソルビシンで治療されている患者を、前記モニタリングに従って調整された治療及び処置の間にモニターすることができる。本発明によって、化学療法薬としてドキソルビシンで治療されている癌患者においてドキソルビシンの治療の薬管理が達成される。
【００１８】
本発明の測定方法において使用される試薬は、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂまたはその混合物を伴う、反応性チオール又はアミノ基を含む担体の共役である。好ましくは、担体は反応性チオール又はアミノ基を含むポリアミンポリマーを含む。免疫原において、担体は、好ましくは反応性チオール又はアミノ基を含むポリアミンポリマーを含む。これらの共役は、本発明の抗体との結合のための試料中にあるドキソルビシンと結合する競合的結合パートナーである。したがって、抗体に結合する共役試薬の量は試料中のドキソルビシンの量に反比例するだろう。本発明によれば、測定方法は、抗体に結合又は未結合の前記共役の検出及びその量の測定に対してどんな従来の測定手段も利用する。前記手段の使用を通じて、結合又は未結合共役の量を測定することができる。一般に、試料中のドキソルビシンの量は、試料中のドキソルビシンによって生成された結合又は未結合共役の測定量と、既知量（既知量は、テストされる試料に予想される範囲内にある）のドキソルビシンを含んでいる標準または較正曲線の試料から測定された結合又は未結合共役の値とを、相互に関連付けることにより決定される。較正曲線を作るためのこれらの研究は試料に使用されるのと同じ免疫測定法手順を使用して決定される。
【００１９】
免疫原を含む共役は、一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂ又はそれの混合物から生成される。反応性末端アミノ又はチオール基を有する免疫原を含む担体は、一般式
【００２０】
【化７５】
2008537110.tif 000009
（式中、Ｙ，Ａ及びｐは上述のとおりであり、Ｘ´は−ＣＨ２−または官能結鎖基である）、
一般式
【００２１】
【化７６】
2008537110.tif 000010
（式中、Ｘ´Ｙ、Ｂ及びｐは上述のとおりである）
の化合物を有する配位子部分に連結する。
【００２２】
これらの配位子部分は、ポリアミンポリマーを含む担体上の１つ以上の反応性チオール又はアミノ部位に連結されていてもよい。好ましくはこれらの担体は、ポリマー、最も好ましくは反応性のチオール又はアミノ基を有するポリアミンポリマーを含んでいる。
【００２３】
（定義）
この記述の全体にわたって、次の定義の意に解釈される。
【００２４】
「ドキソルビシン」という用語は、ドキソルビシン及び薬学的に許容のドキソルビシンの塩を含む。
【００２５】
「免疫原」、「免疫原の」という用語は、有機体中の免疫反応を誘発する、作り出す、又は生じさせることが可能な物質を指す。
【００２６】
「共役」という用語は、２つの部分をともに結合することから形成された物質を指す。本発明に従う代表的な共役は、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物のような小さな分子と、担体又はポリアミンポリマー（特にタンパク質）のような大きな分子とがともに結合することによって作られたものを含む。共役では、小さな分子は大きな分子の１つ以上の活性部位と結合されていてもよい。共役という用語は免疫原という用語を含む。
【００２７】
「ハプテン」は部分的または不完全な抗原である。それらは、抗体形成を刺激することができないが、抗体と反応する、担体なしの物質（ほとんど低い分子量物質）である。後者は、高い分子量の免疫原担体にハプテンが結合し、その後この結合物、例えば免疫原、を人間または動物の被験者に注射することによって形成される。本発明のハプテンは、ドキソルビシンである。
【００２８】
ここで使用されるように、「スぺーシング基」あるいは「スペーサ」は、ＣＨ２あるいは官能結鎖基により、ハプテン、担体、免疫原、標識あるいはトレーサのような２つ以上の基礎構造を接続する化学構造の一部を指す。これらのスペーサ基は、本出願で後述で列挙する。スぺーシング基の原子及びスぺーシング基内の鎖の原子は、化学結合によってそれら自身接続される。好ましいスペーサは、直鎖か分岐鎖か、飽和か不飽和の炭素鎖である。これらの炭素鎖は、さらに鎖内で、あるいは鎖の末端で、１つ以上のヘテロ原子を含んでいてもよい。「ヘテロ原子」は、酸素、窒素および硫黄からなる基から選ばれる、炭素以外の原子を意味する。スぺーシング基は、さらに鎖の一部として又は鎖内の原子のうちの１つと置換して、環式又は芳香族基を含んでいてもよい。
【００２９】
スぺーシング基中の原子の数は水素以外の原子を数えることにより決定される。スぺーシング基内の鎖中の原子の数は、接続している基礎構造間の最短のルートに沿った水素以外の原子の数を数えることにより決定される。官能結鎖基は、ハプテンと標識又は担体又はポリアミンポリマーとの共役を合成するためのハプテン又はスぺーシング基を活性化する、例えば、利用可能な官能部をオンする、ために使用されてもよい。
【００３０】
ここで使用される「免疫原担体」という用語は、免疫原物質（一般にタンパク質又は反応性チオール又はアミノ基を運ぶために変化させられたタンパク質）であり、それはハプテン、本ケースではドキソルビシン、と結合することができ、それによってこれらのハプテン誘導体が免疫反応を引き起こすことができるようにし、これらのハプテンと特異的に結合することができる抗体の生成を誘発する。免疫原担体及び結鎖基は、本明細書で後述して列挙されるだろう。免疫原担体物質中で、宿主から異物として認識され、それによって免疫原反応を誘発する、タンパク質、糖タンパク質、複合ポリアミノ−多糖類、粒子、及び核酸が含まれる。ポリアミノ−多糖類は、この生成で知られている従来の手段を使用して、多糖から生成されてもよい。
【００３１】
さらに様々なタンパク質タイプが、ポリ（アミノ酸）免疫原担体として使用されてもよい。これらのタイプは、アルブミン、血清蛋白質、リポタンパク質などを含んでいる。実例となるタンパク質はウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、卵オボアルブミン、牛のチログロブリン（ＢＴＧ）などを含んでいる。あるいは、合成ポリ（アミノ酸）を利用してもよい。あるいは、これらのタンパク質を反応性チオール基を含むように変更させてもよい。
【００３２】
免疫原担体はさらにポリアミノ多糖類を含んでもよい。それは、単糖の繰り返しの縮合によって作られた高分子量ポリマーである。多糖類の例は、デンプン、グリコーゲン、セルロース、アラビアゴムのような炭水化物ガム、寒天などである。多糖類はさらにポリアミノ酸残基および／または脂肪酸残基を含んでいる。
【００３３】
免疫原の担体は、さらに単独または上述のポリ（アミノ酸）又は多糖類の内の１つに共役するポリ（核酸）であってもよい。
【００３４】
免疫原担体はさらに固形粒子を含んでいてもよい。粒子は、大体少なくとも約０．０２ミクロン(μm)で約１００μm以下であり、そして通常およそ０．０５〜１０μｍの直径である。粒子は有機又は無機であってもよく、膨張可能又は膨張不可能であってもよく、多孔性又は非多孔性であってもよく、最適にはおおよそ水の密度である通常約０．７〜１．５ｇ／ｍＬであり、透明な、又は部分的に透明な、又は不透明な物質から構成されている。粒子は、赤血球、白血球、リンパ細胞、ハイブリドーマ、連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、大腸菌およびウィルスのような例に制限されない細胞及び微生物のような生体物質であってもよい。粒子は、更に有機および無機ポリマー、リポソーム、ラテックス、リン脂質小胞あるいはリポタンパク質で構成されていてもよい。
【００３５】
「ポリ（アミノ酸）」あるいは「ポリペプチド」は、アミノ酸から形成されたポリアミドである。ポリ（アミノ酸）は、約２，０００分子量から、分子量の上限はなく、通常１０，０００，０００未満、通常多くても約６００，０００ダルトンの範囲にある。免疫原担体あるいは酵素が含まれているかどうかに依存して、通常範囲が異なるだろう。
【００３６】
「ペプチド」は、アミド（ペプチド）結合による２つ以上のアミノ酸の連結によって形成された化合物であり、通常α―アミノ酸のポリマーであり、各アミノ酸残基（ＮＨ２末端を除く）のα―アミノ基が線鎖中の隣の残基のα―カルボキシ基に連結している。ここでは、ペプチド、ポリペプチドおよびポリ（アミノ酸）という用語を、サイズに関する制限なく、この種の化合物を現すために同じ意味で使用する。この種の最大の部分はタンパク質と言う。これらのポリマーペプチドは、反応性ＮＨ２末端基を末端ＳＨ基に変えるために、通常の手段によって変化させることができる。
【００３７】
「標識」、「検出分子」あるいは「トレーサ」は、検出信号を作る、あるいは作ることを引き起こすことができるあらゆる分子である。標識は、分析物、免疫源、抗体、又は、配位子（特にハプテン）のような受容体に結合し得る受容体や分子のような他の分子に、共役することができる。標識の制限されない例は、放射性同位体および酵素、酵素破片、酵素基質、酵素阻害物、補酵素、触媒、蛍光物質、染料、化学ルミネセンス、ルミネセンス、又は感光剤を含み、磁性がない又は磁性のある粒子、固形支持体、リポソーム、配位子あるいは受容体を含む。
【００３８】
用語「抗体」は、抗原の結合パートナーである特異タンパク質を指し、他の物質を除外して抗原に対して特異結合親和力を持つ物質又は物質のグループである。一般的な用語の抗体は、ポリクロナール抗体、モノクロナール抗体および抗体断片を包含する。
【００３９】
用語「誘導体」は、１つ以上の化学反応によって母化合物から作られた化合物か分子を指す。
【００４０】
用語「担体」は、上述したような免疫原ポリマーのような固形粒子及び／又は重合体ポリマーを指す。担体が固形粒子である場合、固形粒子は、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物中の官能基Ｘに結合するための１つ以上の反応部位を提供するためにポリアミンポリマーに結合される、覆われる、あるいは付着されていてもよい。
【００４１】
用語「試薬キット」又は「テストキット」は、測定を行うのに使われる用具一式を指す。試薬は、それらの交差反応性および安定性、液中かあるいは凍結乾燥状態下であるかによって、同じ又は個別の容器の中に化合物がパッケージされた状態で提供することができる。キット中に供給される試薬の量および割合は、個々の用途に最適の結果がでるように選択することができる。本発明の特徴を具体化する試薬キットは、ドキソルビシンに特異な抗体を含んでいる。キットは、さらに分析物の配位子及び較正制御物質を含んでいてもよい。試薬は液体の形態にしてもよいし、凍結乾燥されていてもよい。
【００４２】
「較正制御物質」という表現は、測定される薬の既知量を含んでいる任意の標準あるいは参照物質を指す。薬の濃度は、標準に対して得られた結果と未知の資料に対して得られた結果との比較により計算される。これは、較正曲線を描くことにより一般に行われる。
【００４３】
用語「生体試料」は、生き物あるいは以前は生きているものからの物質の任意の量を含むが、これに限定されるものではない。そのような生き物は、人間、マウス、猿、ラット、ウサギ、馬、及び他の動物を含むが、これらに限定されるものではない。そのような物質は、血液、血清、血漿、尿、細胞、臓器、組織、骨、骨髄、リンパ液、リンパ節、滑膜組織、軟骨細胞、骨膜マクロファージ、内皮細胞、及び皮膚を含むが、これらに限定されるものではない。
【００４４】
（試薬と免疫原）
免疫測定法を構築する際、ドキソルビシンの共役は、抗体上の結合部位に対して試料中のドキソルビシンと競合するように構築される。本発明の免疫測定法では、試薬は、一般式ＩＩＩ−Ａの化合物の１３−置換ドキソルビシン誘導体及び一般式ＩＩＩ−Ｂの１４−置換ドキソルビシン誘導体である。一般式ＩＩＩ−Ａ及びＩＩＩ−Ｂの化合物では、リンカースぺーサは、この分子の−ＣＨ２−（Ｙ）ｐ−Ｘ´−または−Ｂ−（Ｙ）ｐ−Ｘ´部分を構成する。これらのリンカーＸ´及びスぺーサ−ＣＨ２−（Ｙ）ｐ−または−Ｂ−（Ｙ）ｐ−Ｘ´は、共役及び免疫原の生成において一般的である。免疫測定法のために共役と免疫原を生成するために利用される、従来のスペーサー結鎖基（spacer-linking  group）のうちのどれでも、一般式ＩＩＩ-Ａ及びＩＩＩ−Ｂの化合物において使用することができる。そのような従来のリンカーおよびスペーサは米国特許５，５０１，９８７及び米国特許５，１０１，０１５に開示されている。
【００４５】
好ましいスペーサ基中に、前述したスペーサ基が含まれている。特に好ましいスぺーシング基は、１から１０の炭素原子を含むアルキレンのような基、
【００４６】
【化７７】
2008537110.tif 000011
【００４７】
【化７８】
2008537110.tif 000012
又は
【００４８】
【化７９】
2008537110.tif 000013
又は
【００４９】
【化８０】
2008537110.tif 000014
である。式中、ｎ及びｏは０から６の整数であり、ｍは特に好ましいスぺーシング基であるアルキレンを伴う１から６の整数である。Ｙによって示されるスぺーシング基の上述の構造においては、官能基Ｘは構造の右側の末端位置、例えば（ＣＨ２）ｍ及び（ＣＨ２）ｏが位置する位置、に接続する。
【００５０】
一般式ＩＩＩ−Ａ及びＩＩＩ−Ｂの化合物では、Ｘ´は、−ＣＨ２−又は重合体担体上のアミン又はチオール基にスぺーサを連結する官能基である。基Ｘ´は、担体又は免疫原として使用されるポリアミンポリマーにおけるアミノ又はチオール基に結合可能な一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物における末端官能基Ｘの結果である。アミン又はチオール基に反応可能な末端官能基は、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物中の官能基Ｘとして利用することができる。これらの末端官能基は、好ましくはＸが、
【００５１】
【化８１】
2008537110.tif 000015
−Ｎ＝Ｃ＝Ｒ４、
【００５２】
【化８２】
2008537110.tif 000016
又は
【００５３】
【化８３】
2008537110.tif 000017
であるものを含む。式中、Ｒ３は水素又はそれに結びつく酸素原子と一緒に得られる反応性エステルであり、Ｒ４は酸素又は硫黄である。ラジカル−Ｎ＝Ｃ＝Ｒ４はイソシアン酸塩またはイソチオシアン酸塩になりえる。ＯＲ３によって形成された活性エステルは、Ｎ-ヒドロキシスクシンアミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール及びｐ−ニトロフェニルエステルのようなイミドエステルを含む。しかしながら、アミン又はチオール基と反応することができるどんな反応性エステルも使用することができる。カルボキシル基及び反応性エステルは、従来の手段によって担体又は免疫原のポリマーに結合する。タンパク質のようなポリアミンポリマー上のアミン基は、本発明の共役を形成するために、重合体免疫原又は担体にスペーサを接続するアミド基を生成する。
【００５４】
一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂの化合物中のＸが
【００５５】
【化８４】
2008537110.tif 000018
−Ｎ＝Ｃ＝Ｒ４、
又は
【００５６】
【化８５】
2008537110.tif 000019
であるとき、これらの化合物は、好ましくは重合体または免疫原の担体の自由なアミノ基と反応する。他方、一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂの化合物中のＸが
【００５７】
【化８６】
2008537110.tif 000020
のマレイミド  ラジカルであるとき、この化合物は、
【００５８】
【化８７】
2008537110.tif 000021
及び
【００５９】
【化８８】
2008537110.tif 000022
を有する一般式ＩＩＩ−Ａ及びＩＩＩ−Ｂの化合物中のＸ´を生成するために、免疫原を含む重合体またはタンパク質担体に存在してもよいチオール（又はＳＨ）基と好ましくは反応する。
【００６０】
好ましい実施形態によれば、これらの一般式ＩＩＩ-Ａ１及びＩＩＩ−Ｂ１の化合物は、アミノ基をチオール基に変えるために変えられた重合体タンパク質に結合される。これは、一般式
【００６１】
【化８９】
2008537110.tif 000023
（式中、Ｒ１５はチオール保護基、Ｒ３は上述のとおり、ｖは１〜１４の整数である）
の化合物と重合体タンパク質の自由なアミノ基とを反応させることによって行われる。
【００６２】
このように、チオール基、ＳＨ−は担体の残りに結合する担体の官能基になる。
【００６３】
この反応は、担体を含むタンパク質と一般式Ｖの化合物を水性の媒体中で混合することによって水性の媒体中で行われる。この反応において、温度及び圧力は決定的ではなく、反応は室温で大気圧で行うことができる。１０℃から２５℃までの温度が一般に選ばれる。次の工程では、その時までにチオール変性担体が一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物と反応し、後に担体のチオール保護基は、結果として生じる担体を伴う一般式Ｖの化合物の反応生成物から従来の方法によって取り除かれる。チオール保護基を取り除くための従来のどんな方法もこの反応の実行に用いることができる。しかし、チオール保護基を取り除くための手段を利用する際、反応物が水性の媒体に溶解でき、担体で含まれるポリアミンポリマーを決して破壊又は傷つけないように注意しなければならない。この保護基の除去に好ましい手段は、結果として生じる凝縮生成物を還元するための薬品としてジチオスレイトールを使用することである。この還元は高い圧力又は温度を利用することなしに、単純に還元剤を反応媒体に加えることによって行なわれる。この還元は、室温及び大気圧で行われる。どんな従来のチオール保護材も、一般式Ｖの化合物でこれを行うのに用いることができる。チオール保護基は、好ましい保護基となる２−ピリジルジチオを伴う分野で知られている。
【００６４】
上述の方法が、チオール基に対する担体を含むポリアミン重合体における反応性末端アミノ基を転化させるためのある方法を表わすのと同時に、この転化を行うための従来のどんな方法も使用することができる。担体を含むポリアミン重合体上の末端アミノ基を転化する方法は当業者に知られており、本発明に従って使用される。本発明の好ましい形態によれば、担体を含む免疫原重合体ポリアミンによって運ばれたチオール基に結合するＸ´を有する一般式ＩＩＩ−Ａ及びＩＩＩ−Ｂの化合物は、ドキソルビシンに顕著な特異性を示す抗体を生成する。従って、Ｘが担体を含む免疫原重合体ポリアミン重合体の末端チオール基に結合する一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物の使用は、本発明の免疫原の好ましい形態を構成する。
【００６５】
Ｘが担体によって運ばれた末端チオール基に結合可能な官能基である一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂの化合物を伴う末端反応性チオール基を有する担体を含む重合体ポリアミンの反応は、従来の方法によって行うことができる。好ましい形態では、一般式ＩＩＩ−Ａ１及びＩＩＩ−Ｂ１のマレイミドは、ポリアミン重合体担体によって運ばれるチオール基と反応する。マレイミド二重結合を横切ってチオールを添加する既知の方法を、チオールブリッジによって共役する一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの共役を生成するのに用いることができる。
【００６６】
共役が本発明の免疫原を含むアミド結合を通して結合された共役において、担体又は免疫原上のドキソルビシンハプテンを含むカルボキシル基とアミノ基との化学結合は、当業者によって知られているさまざまな方法を用いて入手することができる。カルボキシル基と脱離基試薬（例えばＮ-ヒドロキシスクシンイミド、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ｐ−ニトロフェノールなど）とを反応させることにより、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物中のドキソルビシンハプテンのカルボン酸半分を最初に活性化することによりアミド結合を形成することがしばしば好ましい。ジシクロヘキシルカルボジイミド、ジイソプロピルカルボジイミドなどのような活性化試薬を使用することができる。その後、タンパク質担体を含む緩衝液と、一般式ＩＩ-Ａ及びＩＩ−Ｂのドキソルビシンハプテン中のカルボキシル基の活性化形態とを反応させる。
【００６７】
アミノ結合い要訳を生成する際、一般式ＩＩ-Ａ又はＩＩ−Ｂのドキソルビシン誘導体が、カルボキシル基と同様に第１又は第２アミノ基を含む場合は、共役がそれら自身で反応するのを防ぐために、活性化及びカップリング反応中にアミン保護基を使用することが必要である。典型的には、一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂのドキソルビシン誘導体上のアミンは、対応するＮ-トリフルオロアセトアミド、Ｎ−第三ブチルオキシカルボニルウレタン（Ｎ−ｔ−ＢＯＣウレタン）、Ｎ−カルボベンジルオキシウレタンまたは同様の構造を形成することによって保護される。上述されるように、一旦、免疫原のポリマー又は担体へのカップリング反応が行われたならば、アミン保護基は、免疫原か共役の構造を他の状態に変えない試薬を使用して除去することができる。そのような試薬および方法は、当業者に知られており、弱い又は強い水又は無水の酸、弱い又は強い水又は無水の塩基、水素化ホウ素ナトリウムやシアノ水素化ホウ素ナトリウムのような水素化物を含む試薬及び接触的水素添加を含んでいる。ハプテン及び担体を共役させる様々な方法も、米国特許３，９９６，３４４及び米国特許４，０１６，１４６に開示され、ここでは参照によって組込まれる。
【００６８】
他方、アミノ共役を生成する際、、一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂの化合物においてＸが末端イソシアン酸塩又はイソチオシアン酸塩ラジカルである場合、ポリアミンポリマーの自由なアミンと反応させられた時、これらのラジカルは、ポリアミン担体又は免疫原ポリペプチド上のアミノ基に機能的に結合するＸ´が
【００６９】
【化９０】
2008537110.tif 000024
（式中、Ｒ４は上述のとおり）
である一般式ＩＩＩ−Ａ又はＩＩＩ−Ｂの化合物の担体又は免疫原を生成する。
【００７０】
一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物（式中、Ｘはアルデヒド基）のアミノ共役の生成において、これらの化合物は還元アミノ化によってアミン連結を通してポリアミンポリペプチドや担体のアミン基に結合してもよい。還元アミノ化によってのようなアミンとアルデヒドを縮合する従来の方法をこの連結形成に用いることができる。この場合、一般式ＩＩＩ−Ａ及びＩＩＩ−Ｂの化合物の配位子部分中のＸ´は、−ＣＨ２−である。
【００７１】
一般式Ｉの化合物のドキソルビシン及びその１３−ケト基は、一般式
【００７２】
【化９１】
2008537110.tif 000025
によって置き換えられることができ、
式中
【００７３】
【化９２】
2008537110.tif 000026
は、ドキソルビシンを示されたその１３−ケト基に置き換える。１３−ケトドキソルビシンは、一般式
【００７４】
【化９３】
2008537110.tif 000027
（式中、ｐ、Ｙ及びＸは上記のとおり）
の化合物を生成するために、
【００７５】
【化９４】
2008537110.tif 000028
のメトキシンアミンとドキソルビシンを反応させることによってＡが＝Ｎ−Ｏ−である一般式ＩＩ−Ａの化合物に転化させることができる。
【００７６】
ＵＳ特許４，０３９，３８５に開示されているような一般式ＶＩ−Ｂのオキシルアミンを形成するためにカルボニル基とメトキシアミンを縮合する従来の方法によって一般式ＶＩ−Ｂの化合物を形成するために、一般式Ｉの化合物はその１３−オキシ基で一般式ＶＩ−Ａのメトキシアミンと反応する。もし、一般式ＶＩ−Ａの化合物が任意の官能置換基を含んでいたら、これらの置換基は、ＶＩ−Ａの化合物を伴うドキソルビシンの反応に先立って通常の保護基と反応することができる。共役が一般式ＶＩ−Ｂの化合物から生成されたのち、これらの保護基は、一般式ＶＩ−Ｂの化合物のオキシルアミン連結を保ちながらそのような保護基を除去する当業者に知られている手順によって除去することができる。
【００７７】
Ａが
【００７８】
【化９５】
2008537110.tif 000029
の一般式ＩＩ−Ａの化合物は、最初にドキソルビシン上の１３−オキソ基を１３−アミノ基に転化し、その後一般式
【００７９】
【化９６】
2008537110.tif 000030
（式中、Ｙ，Ｐ及びＸは上述のとおり）
の酸ハロゲン化物とこの１３−アミノドキソルビシンを縮合することによって生成することができる。
【００８０】
ドキソルビシン上の１３−オキソ基は、塩化アンモニウム及びシアノ水素化ホウ素ナトリウムのような還元剤を使用する還元アミノ化によって、１３−アミノ基に転化されることができる。
【００８１】
還元アミノ化において従来のどんな状態でもドキソルビシン上の１３−オキソ基をアミノ基に転化するのに使用することができる。Ａが
【００８２】
【化９７】
2008537110.tif 000031
の一般式ＩＩ−Ａのアミドを形成するために、１３−アミノドキソルビシンは、縮合によって酸ハロゲン化物と反応する。
【００８３】
アミドを形成するためにアミンと酸ハロゲン化物を縮合するどんな方法もその縮合に行うために用いることができる。
【００８４】
Ａが一般式
【００８５】
【化９８】
2008537110.tif 000032
のヒドラゾンである一般式ＩＩ−Ａの化合物は、一般式
【００８６】
【化９９】
2008537110.tif 000033
（式中、ｐ、Ｙ及びＸは上述のとおり）
のヒドラジドと一般式Ｉのドキソルビシンの１３−オキソとを反応させることによって生成することができる。
【００８７】
ヒドラゾンを生成するためにケトンとヒドラジドとを反応するどんな方法も、この転化を行うために用いることができる。通常、この反応は、通常好ましい酸ｐＨであるｐＨ３から６の低アルカノールのような不活性の有機溶媒媒質中で、一般式Ｉの化合物上の１３−オキソ基とＩＸ−Ｂの化合物のアンモニウム塩とを反応することによって行うことができる。この反応を行う際、温度及び圧力は重大でなく、この反応は室温及び大気圧下で行うことができる。
【００８８】
Ｂが−ＣＨ２−である一般式ＩＩ−Ｂの１４−置換化合物は、ドキソルビシンの１４−ヒドロキシ基と一般式
【００８９】
【化１００】
2008537110.tif 000034
（式中、ｐ、Ｙ及びＸは上述のとおり）
のハロゲン化物とを反応することによって形成される。
【００９０】
ドキソルビシンから一般式ＩＩ−Ｂの化合物を形成する際、エーテルを形成するためにアルコールを反応させる通常のどんな手段も、ドキソルビシン上の１４−ヒドロキシ位置と一般式ＶＩＩＩ−Ｂの化合物を縮合するために使用することができる。他方、一般式ＶＩＩＩ−Ｂの化合物中のＹが官能基（一般式ＩＩ−Ｂの化合物を形成するためにこの反応を妨げてもよい）を含む場合、これらの官能基は上述したこの反応後に除去することができる適当な保護基の手段によって保護される。
【００９１】
Ｂが
【００９２】
【化１０１】
2008537110.tif 000035
である一般式ＩＩ−Ｂの１４−置換化合物は、ドキソルビシン上の１４−ヒドロキシ基と一般式
【００９３】
【化１０２】
2008537110.tif 000036
（式中、Ｘ，Ｙ及びｐは上述のとおり）
のアミノ化合物とを反応させることによって生成される。
【００９４】
ドキソルビシン上の１４−ヒドロキシ基をクロロホルマティック基（chloroformatic  group）
【００９５】
【化１０３】
2008537110.tif 000037
に転化する最初の転化後。
【００９６】
ヒドロキシ基をクロロホルマティック基に転化する従来のどんな方法も使用することができる。
【００９７】
クロロホルメート調合後、クロロホルメートのハロ基は、一般式ＩＸの化合物中のアミン基と縮合される。この反応に先立って、ドキソルビシン及び／または一般式ＩＸの化合物における反応性の基は、上述したように従来の保護基によって保護される。これらの保護基は、上述したような従来の方法によってこのハロゲン化縮合後に取り除かれる。
【００９８】
一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物は、末端アミノ基を含むポリアミン又はポリペプチド担体とこれらの化合物を反応させることにより本発明の免疫原及び／または共役試薬に転化することができる。同じポリペプチドを、抗原を形成するのに用いられるポリアミド又はポリペプチド担体を免疫学的に活性であるようにさせる本発明の免疫原において担体として及び免疫原ポリマー担体として使うことができる。しかし、共役を形成するために、これらのポリマーは免疫原に対して必要とされるような免疫学的な応答を必要としない。本発明によれば、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物においてＸによって表わされる様々な官能基は、重合体担体中に含まれるアミンまたはチオール基に官能基を結合する従来の方法によって重合体物質に共役することができる。
【００９９】
（抗体）
本発明は、さらに前述の免疫原を用いて生成されたドキソルビシンに対するモノクロナール抗体を含む新規の抗体に関する。本発明によれば、本発明に従って生成されたこれらの抗体は、ドキソルビシンに選択的に反応的で、従来の抗体と違ってドキソルビシン免疫測定法を邪魔する非薬学的活性代謝産物に反応しない。これらのドキソルビシン代謝産物のうち最も問題のあるものは、ドキソルビシンアグリコンである。これらの不活性な代謝産物に反応しない本発明の抗体能力は、ドキソルビシン免疫測定法を行うにあたって、これらの抗体をとりわけ有益にさせる。
【０１００】
本発明は新規抗体及びドキソルビシンのモノクロナール抗体に係る。発明の抗血清は、
発明の免疫原を宿主動物に免疫することにより好都合に生成することができる。適切な宿主動物は、例えばネズミ、ラット、ウサギ、モルモットおよびその他同種のもののようなげっ歯動物、またはヤギ、羊、馬およびその他同種のもののような高等哺乳動物を含んでいる。初回量、出血および追加免疫注射は、動物（例えば、好ましい形態においては、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で初回量１００μｇの免疫を受け、６か月を超えて５０から１００μｇの１以上の連続追加免疫注射を受けたネズミ）中の免疫反応を誘発するために認められた試験計画書（ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）に従って与えることができる。周期的な出血を通して、免疫されたネズミの血液試料は、従来の免疫測定法を利用するドキソルビシンに対して抗体を作ることが観察された。これらの方法は、好ましい活性を有する抗血清を生成している宿主を選別するための便利な方法を提供する。抗体は、またドキソルビシンの主な代謝産物に対して選別され、これらの化合物に実質の結合がないことを示した。
【０１０１】
モノクロナール抗体は、細胞融合に先立って４日のスタートを切る連続３日に腹腔内投与（ｉ．ｐ．）又は静脈内投与（ｉ．ｖ．）で１００μｇの免疫原をマウスに注射することによる上述のスケジュールに従って、Ｂａｌｂ／ｃマウスを免疫することにより好都合に生成される。抗体技術において周知の他の試験計画書をもちろん同様に利用してもよい。ここに詳述された完全な免疫処置試験計画書は、ドキソルビシンの抗体用の血清抗体反応に最適な試験計画書を提供した。
【０１０２】
脾臓、末梢血、リンパ節または宿主の他の組織から得られたＢリンパ球は、細胞を生成するモノクロナール抗体として使用されてもよい。最も好まれるものは、脾臓から得られるＢリンパ球である。発明の望むモノクロナール抗体を生成することができるハイブリドーマは、そのようなＢリンパ球と無限増殖できる細胞系（それはハイブリッド細胞上の長期的な組織培養安定性を与える細胞系である）を融合させることにより得られる。発明の好ましい実施形態では、無限増殖できる細胞は、骨髄腫細胞のようなリンパ芽球状細胞あるいはプラズマ細胞腫細胞でもよい。ドキソルビシンモノクロナール抗体を生成するマウスのハイブリドーマは、ドキソルビシン−タンパク質共役に対して免疫されたマウスからのマウス骨髄腫細胞および脾臓細胞の融合によって生成される。キメラ的及びヒトモノクロナール抗体は、ハイブリドーマ細胞から遺伝子を発現させる抗体をクローン化し、ヒトの定常部領域にマウス可変領域の続きを結合するか、あるいは、ドナーマウスかラットの免疫グロブリンから相補性決定領域（ＣＤＲの）とヒトのフレームワーク領域を組み合わせる現在当業者によって知られている組み換えＤＮＡ方法を使用することによって生成することができる。親和力が高められた抗体を提供するマウスのモノクロナール抗体をヒトに適用するための改良方法は、国際特許出願ＷＯ９２／１１０１８に述べられる。
【０１０３】
一次抗体構造の一部だけを含むポリペプチド断片を生成してもよく、その断片は１つ以上の免疫グロブリン活性を有している。これらのポリペプチド断片は、当業者によって知られている方法によって手をつけていない抗体のタンパク質分解開裂によって、又は、Ｆａｂ断片又は（Ｆａｂ´）２断片を生成するために部位特異的突然変異誘発を用いる抗体遺伝子を含んでいる発現ベクターに望ましい位置に終止コドンを挿入することによって、生成してもよい。単鎖抗体は、ＤＮＡリンカーにＶＬとＶＨの部位を結合することによって生成してもよい（ヒューストンら、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,８５：５８７９−５８８３（１９８８）及びバードら、Science, ２４２：４２３−４２６（１９８８）参照）。
【０１０４】
本発明の抗体は、上述した代謝産物のようなドキソルビシンの非薬学的活性代謝産物と実質的に交差反応性を持たないドキソルビシンに選択的である。実質的な交差反応性を持たないことによって、本発明の抗体が、２０％以下のこれらの代謝産物を伴うドキソルビシンに関する交差反応性を持つことを意味している。１５％以下の交差反応性を示すそれらの抗体が好ましい。本発明の抗体は、ドキソルビシノールのような化合物のような他の薬学的に活性なドキソルビシンと反応してもよい。
【０１０５】
（免疫測定法）
本発明によれば、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物又はそれの混合物の免疫原から生じた共役および抗体は、患者試料中のドキソルビシンの測定試薬として利用することができる。この測定は免疫測定法によって行なわれる。一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物から形成された試薬共役が、本発明に従って生成された抗体中の結合部位に対して試料中のドキソルビシンと競合するどんな免疫測定法も、患者試料中のドキソルビシンの存在を決定するために使用することができる。ドキソルビシンを含んでいるという疑いをかけられた試料中のドキソルビシンの測定を行うための方法は、（ａ）水性媒質試料、（ｂ）本発明に従って生成されたドキソルビシンの抗体、（ｃ）一般式ＩＩ−Ａ又はＩＩ−Ｂの化合物又はそれの混合物から形成された共役を、混合することを含む。試料中のドキソルビシン量は、試料と抗体との混合物に既知量で加えられた共役の特異抗体への結合の阻害を測定することにより決定することができる。未知の試料による既知量の共役のそのような結合の阻害の結果は、ドキソルビシンの既知の標準溶液を使用して同じ測定で得られた結果と比較される。
【０１０６】
抗体に結合した一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物から形成された共役の量を測定するために、様々な手段を使用することができる。１つの方法は、抗体への共役の結合が蛍光団共役の回転率の減少を引き起こす点である。液体混合物中の蛍光団共役の回転率の減少量は、米国特許４，２６９，５１１及び米国特許４，４２０，５６８に開示されているような蛍光性の極性化技術によって検出することができる。
【０１０７】
他方で、粒子が一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物から形成されたドキソルビシン共役と反応する時、これらの微粒子が集合体を形成するように、抗体は微粒子に覆われているか吸収されていてもよい。しかしながら、微粒子に覆われた或いは吸収された抗体が試料中のドキソルビシンと反応するとき、これらの微粒子に結合する試料からのドキソルビシンは、抗体微粒子の集合を生じさせない。集合または凝集の量は、吸光度による混合測定で測定することができる。
【０１０８】
他方、これらの測定は、マイクロタイタープレートのような固形支持体あるいは固形微粒子を含む他の従来の固形支持体に、抗体あるいはドキソルビシン共役のいずれかを付着することにより実行することができる。そのような固形微粒子に抗体とタンパク質を付着することは当業者によって知られている。どんな従来方法もそのような付着を行うために使用することができる。多くの場合では、測定を促進するために、放射性標識や酵素標識のような標識を、抗体と結合または結合していない一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物から形成された共役量の検出を助けるものとして、抗体、共役あるいは固形微粒子に配置してもよい。他の適切な標識としては、発色団、蛍光団などがある。
【０１０９】
便宜の問題として、本発明の測定コンポーネントは、ドキソルビシンを測定するのに使用される所定量の新しい試薬を備えた化合物がパッケージされた状態でキットとして提供することができる。これらの試薬は、本発明の抗体を含んでいることに加え、一般式ＩＩ−Ａ及びＩＩ−Ｂの化合物又はその混合物から生成された共役も含んでいる。行われる免疫測定法において、もし一般式ＩＩ−Ａの化合物から形成された共役が利用されるならば、一般式ＩＩ−Ａの化合物から形成された免疫原によって生じた抗体であることが通常好ましい。同様の方法で、もし一般式ＩＩ−Ｂの化合物から形成された共役が利用されるならば、一般式ＩＩ−Ｂの化合物から形成された免疫原によって生じる抗体であることが好ましい。しかし、これは、事例にならないことを要し、行われる測定法での抗体及び共役は、これらの共役及び免疫原の任意の１つから誘導されることができる。
【０１１０】
これらの必要な試薬に加えて、補助試薬のような添加物には、例えば安定剤、緩衝材などが含まれていてもよい。様々な試薬の相対量は、実質的に測定の感度を最適化するような試薬の溶液濃度を提供するために、広く変わってもよい。試薬は、溶液又は乾燥パウダー（通常は凍結乾燥されたもの）として供給され、溶解して測定を行うのに適した濃度の試薬溶液を提供する補形薬を含む。
【０１１１】
（例）
例において、次の略語は、下記に指し示すように使用される。
ＣＨＣｌ３    クロロホルム
ＢＭＰＨ      Ｎ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジド，トリフルオロ酢酸塩
ＭｅＯＨ    メタノール
ＤＭＦ      ジメチルホルムアミド
ＴＦＡ      トリフルオロ酢酸
ＤＭＳＯ    ジメチルスルホキシド
ＣＡＰＳ    ３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸
ＮＨＳ      Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド
ＥＤＣ      １−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩
ＫＰｉ      リン酸カリウム緩衝剤ｐＨ７．５
ＳＰＤＰ    ３−（２−ピリジルヂチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル
ＭＥＳ      ２−（Ｎ−モノホリノ）エタンスルホン酸緩衝剤ｐＨ６
ＡＮＳ      ８−アニリノ-１-ナフタリンスルホン酸
ｉ．ｐ．    腹腔内の
ＨＲＰ      西洋わさびペルオキシダーゼ
ＴＦＡ      トリフルオロ酸の
ＴＭＢ      ３，３´，５，５´−テトラメチルベンチジン
ＴＲＩＳ    トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン塩酸塩
ＢＳＡ      ウシ血清アルブミン
ＫＬＨ      キーホールリンペット・ヘモシアニン
ＢＴＧ      ウシチログロブリン
ＰＢＳ      リン酸塩緩衝生理的食塩水
ｄｉ        脱イオン水
例において、図式１及び図式２は、例の番号に従って生成され言及された特異化合物を下記に示す。図式は以下の通りである。
【０１１２】
【化１０４】
2008537110.tif 000038
【０１１３】
【化１０５】
2008537110.tif 000039
【０１１４】
（例１）
ドキソルビシン  トリフルオロアセトアミド活性エステル４の生成（図式１）
０℃のドキソルビシン（１）（０．８ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）のＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１：１）（１５ｍＬ）攪拌懸濁液を、窒素雰囲気下で滴下で加えられたＳ−エチルトリフルオロチオアセテート（０．８９ｍＬ、７．０２ｍｍｏｌ）が添加された０．５Ｍメタノリック（methanolic）ナトリウムメトキシド２．７６ｍＬで処理した。室温で１６時間暗中で攪拌した後、反応は真空内で濃縮された。残留物をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（１：１）１０ｍＬ、４ｍＬのトルエンに溶解し、濃縮した。再び、残留物をＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９：１）５０ｍＬに溶解し、０．１Ｍくえん酸１０ｍＬ、塩水（２×１０ｍＬ）で洗浄した。これを硫酸マグネシウム及び溶媒蒸発で乾燥し、塩化メチレン／エーテル／ヘキサン中の粉砕によって赤色固形物として２（０．８１４，９２％）を得た。
【０１１５】
化合物２（０．４９ｇ、０．７６６ｍｍｏｌ）、カルボキシメトキシルアミン半塩酸塩（０．３０ｇ、１．３８ｍｍｏｌ）、及び酢酸ナトリウム（０．３８ｇ、４．６０ｍｍｏｌ）の混合物のＭｅＯＨ（１５ｍＬ）液を室温で暗中で一晩攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残留物を水（２５ｍＬ）及びＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ（９：１）（３×２５ｍＬ）に溶解した。３（０．４５ｇ、８２％）を得るために、すべての混合有機相を硫酸マグネシウムで乾燥し、蒸発させ、塩化メチレン／エーテル／ヘキサンで粉砕した。
【０１１６】
０℃の塩化メチレン／ＤＭＦ（１：５）（１２ｍＬ）中に化合物３（０．４５ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）を溶解した溶液に、ＥＤＣ（０．１１ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）及びＮＨＳ（０．１８ｇ、０．９５ｍｍｏｌ）を窒素雰囲気下で加えた。室温で１８時間攪拌した後、反応混合物を塩化メチレン（５０ｍＬ）で希釈し、水（２×１５ｍＬ）で洗浄した。硫酸マグネシウムでの乾燥、溶媒の蒸発により赤色固形物の化合物４（０．４４５ｇ、８６％）を得た。この物質は直接次の工程で用いられる（例３ａ及び３ｂ）
（例２）
ドキソルビシンの（３−マレイミドプロピル）ヒドラゾンの生成（図式２）
チオ−エーテル結合を通して結果として起こるタンパク質への共役のためのマレイミド基を挿入するために、ドキソルビシン［１］をＮ−［β−マレイミドプロピオン酸］ヒドラジドで誘導する。無水ＭｅＯＨ１０ｍＬ中にドキソルビシン塩酸塩（２９ｍｇ、０．０５×１０−３ｍｍｏｌ）、ＢＭＰＨ（５０ｍｇ、３．４当量）を溶解した溶液に、３μＬのＴＦＡを加えた。反応混合物を光から保護しながら室温で２４時間攪拌した。メタノリック（methanolic）溶液を２ｍＬ量に濃縮し、攪拌しながらアセトニトリル（３０ｍＬ）に滴下で加えた。ドキソルビシンＣ１３ヒドラゾンマレイミド誘導体［５］の結晶化のために、得られる懸濁液を一晩４℃の状態にした。この生成物を遠心分離によって分離し、新鮮なメタノール−アセチニトリル（１：１０）で洗浄し、減圧下で乾燥し、ドキソルビシンの（６−マレイミドカプロイル）ヒドラゾン（５）を得た。構造をＮＭＲで確認した。
【０１１７】
（例３ａ）
活性化ハプテン４を伴うＢＴＧ免疫原の生成
１：１のリン酸緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）：ＤＭＳＯ中にＢＴＧ（７．１ｍｇ／ｍＬ）を溶解した１８．８ｍｌの溶液に、１．３ｍＬの例１（ＤＭＳＯ中に２０ｍｇ／ｍＬ）からの化合物４を、氷上でタンパク質溶液を攪拌しながら加えた。添加後、ｐＨを再び８にチェックした。混合物を室温で１８時間攪拌した。アミノ糖上のトリフルオロアセトアミド保護基はｐＨ１１のＣＡＰＳ緩衝剤での透析によって取り除いた。最初の透析は室温で５０％５０ｍＭ  ＣＡＰＳ及び５０％ＤＭＳＯで行った。その後、ＤＭＳＯ比率を段階的に４０％、３０％、２０％、１０％及び０％と減らしていった。最後のＣＡＰＳ透析では、緩衝剤濃度を２５ｍＭまで減らし、透析は４℃で行った。その後、リン酸緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）に対して免疫原共役を透析によって精製した。共役はＵＶ／ＶＩＳ分光検査法によって特性を調べた。
【０１１８】
（例３ｂ）
活性化ハプテン４を伴うＫＬＨ免疫原の生成
１：１のリン酸緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）：ＤＭＳＯ中にＫＬＨ（７．３５ｍｇ／ｍＬ）を溶解した１８．０ｍｌの溶液に、１．３ｍＬの例１（ＤＭＳＯ中に２０ｍｇ／ｍＬ）からの化合物４を、氷上でタンパク質溶液を攪拌しながら加えた。添加後、ｐＨを再び８にチェックした。混合物を室温で１８時間攪拌した。アミノ糖上のトリフルオロアセトアミド保護基はｐＨ１１のＣＡＰＳ緩衝剤での透析によって取り除いた。最初の透析は室温で５０％５０ｍＭ  ＣＡＰＳ及び５０％ＤＭＳＯで行った。その後、ＤＭＳＯ比率を段階的に４０％、３０％、２０％、１０％及び０％と減らしていった。最後のＣＡＰＳ透析では、緩衝剤濃度を２５ｍＭまで減らし、透析は４℃で行った。その後、リン酸緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）に対して免疫原共役を透析によって精製した。共役はＵＶ／ＶＩＳ分光検査法によって特性を調べた。
【０１１９】
（例４ａ）
活性化ハプテン５を伴うＢＴＧ免疫原の生成
タンパク質に対するドキソルビシンＣ１３ヒドラゾンマレイミド誘導体を共役するために、タンパク質のリジン残基を、スルフヒドリル基を導入するために変更した。ウシのチオグロブリン（ＢＴＧ）のｐＨ７．５のリン酸カリウム緩衝剤（１４．９ｍｇ／ｍＬ、３ｍＬ）溶液中に、プロピオン酸ピリジルジチオ）基でリジンを誘導するために、４ｍｇの３−（２−ピリジルジチオ）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＳＰＤＰ）（２０当量）の５０μＬのＤＭＳＯ溶液を加えた。室温で１．５時間攪拌したのち、ジチオピリジル半分の還元によってスルフヒドリルを形成するために１００μＬのＫｐｉに溶解した４０ｍｇのジチオトレイトールを混合物に加えた。スルフヒドリル基を放すためのタンパク質上でのピリジイジチオ誘導体の還元を、窒素下で室温で３０分間攪拌しながら行った。その後、チオール化（thiolated）ＢＴＧをゲルろ過クロマトグラフィによって精製した。ゲルろ過カラムとして、１５ｇのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を室温で１時間５０ｍＭ  ＫＰｉ緩衝剤中で膨潤させ、減圧下でガス除去し、カラム（１．５ｃｍ×５０ｃｍ）内に充填したものを準備した。充填されたカラムを１時間、緩衝剤で平衡化した。反応混合物をカラムの中へ充填し、ＫＰｉ緩衝剤で抽出した。エルマン試薬をタンパク質溶出をモニターするために用いた。タンパク質を含む画分を集め、ためた。チオール基のモル濃度をエルマン手順によって測定した（Riddles,P.W.et al., 分析生化学、エルマン試薬 ：５，５´−ジチオビス（２−ニトロ安息香酸）−Ａ  reexamination、９４，７５−８１（１９７９））。
【０１２０】
氷水浴中の精製されたチオール化−ＢＴＧタンパク質（Ｋｐｉ中５ｍｇ／ｍＬ，４４．７ｍｇ）へ滴下で、例２で生成された３ｍＬのドキソルビシンヒドラゾン誘導体５（２．３３ｍｇ／ｍＬ）を加え、反応混合物を４℃で１６時間攪拌し、光から保護した。免疫共役を上述のようにゲルろ過クロマトグラフィによって精製した。免疫原共役はＵＶ／ＶＩＳ分光検査法によって特性を調べた。
【０１２１】
（例４ｂ）
活性化ハプテン５を伴うＫＬＨ免疫原の生成
ｐＨ７．５のリン酸カリウム緩衝剤（５．５８ｍｇ／ｍＬ、４ｍＬ）中にＫＬＨを溶解した溶液に、５０μＬのＤＭＳＯ中に３ｍｇのＳＰＤＰを加えたものを加えた。室温で１．５時間攪拌した後、５０μＬのＫＰｉ中に２５ｍｇのジチオトレイトールを溶解したものを混合物に加えた。還元を室温で３０分間攪拌しながら窒素下で行った。その後、チオール化ＫＬＨを、例４ａで記述したようなゲルろ過クロマトグラフィによって精製した。
【０１２２】
氷水浴中の精製されたチオール化ＫＬＨタンパク質（ＫＰｉ中に４ｍｇ／ｍＬ、５ｍＬ）に、滴下で例２（１．４１ｍｇ／ｍＬ）で精製したドキソルビシンヒドラゾン誘導体５を２．１２４ｍＬ加え、反応混合物を４℃で１６時間攪拌し、光から保護した。免疫原共役を例４ａで記述したゲルろ過によって精製した。免疫原共役ＵＶ／ＶＩＳ分光検査法によって特性を調べた。
【０１２３】
（例５）
活性化ハプテン４を伴うＢＳＡ共役（１：１比率）の生成
氷上でタンパク質溶液を攪拌しながら１：１のリン酸塩緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）：ＤＭＳＯ中にＢＳＡ（２５ｍｇ／ｍＬ）を加えたもの４０ｍＬに、例１からの化合物４（ＤＭＳＯ中に２０ｍｇ／ｍＬ）を０．６２ｍＬ加えた。添加後、ｐＨを再び８にチェックした。混合物を室温で１８時間攪拌した。アミノ糖上のトリフロオロアセトアミド保護基をｐＨ１１のＣＡＰＳ緩衝剤での透析によって取り除いた。はじめの透析は室温で５０％５０ｍＭ  ＣＡＰＳと５０％ＤＭＳＯで行った。その後、ＤＭＳＯ比率を段階的に４０％、３０％、２０％、１０％及び０％と減らしていった。最後のＣＡＰＳ透析では、緩衝剤濃度を２５ｍＭまで減らし、透析は４℃で行った。その後、リン酸緩衝剤（５０ｍＭ、ｐＨ７．５）に対して免疫原共役を透析によって精製した。共役はＵＶ／ＶＩＳ分光検査法によって特性を調べた。
【０１２４】
（例６ａ）
活性化ハプテン５との反応のためのチオール化ＢＳＡの生成
ｐＨ７．５のリン酸カリウム緩衝剤（５０ｍｇ／ｍＬ、６ｍＬ）中にＢＳＡを溶解した溶液に、ＤＭＳＯ８４μＬ中にＳＰＤＰ（３当量）４．２ｍｇを加えたものを加えた。室温で１．５時間攪拌した後、０．１３５ｍＬのＫＰｉ中に溶解したジチオトレイトール２７ｍｇを混合物に加えた。還元を窒素下で、室温で３０分間攪拌しながら行った。その後、チオール化ＢＳＡをゲルろ過クロマトグラフィによって精製した。
【０１２５】
ゲルろ過カラムは、１２ｇのＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−２５を室温で１時間１０ｍＭ  ＭＥＳ緩衝剤（ｐＨ６）中で膨潤させ、減圧下でガス除去し、カラム（１．５ｃｍ×５０ｃｍ）内に充填して準備した。充填されたカラムを１時間、緩衝剤で平衡化した。反応混合物をカラムの中へ充填し、ＭＥＳ緩衝剤で抽出した。エルマン試薬を、タンパク質溶出をモニターするために用いた。タンパク質を含む画分を集め、ためた。チオール基のモル濃度をエルマン手順によって測定した。
【０１２６】
（例６ｂ）
活性化ハプテン５を伴うＢＳＡ共役（３：１比率）の生成
氷水浴中の例６ａで生成された精製チオール化−ＢＳＡタンパク質（ＭＥＳ中に５ｍｇ／ｍＬ、３５ｍｇ）に、例２で精製されたドキソルビシンヒドラゾン誘導体５（８ｍｇ／ｍＬ）を滴下で０．１３５ｍＬ加えた。反応混合物を４℃で１６時間攪拌し、光から保護した。免疫原共役を例６ａで記載したようなゲルろ過によって精製した。免疫原共役はＵＶ／ＶＩＳ分光検査法によって特性を調べた。
【０１２７】
（例６ｃ）
活性化ハプテン５を伴うＢＳＡ共役（１：１比率）の生成
氷水浴中の例６ａで生成した精製チオール化−ＢＳＡタンパク質（ＭＥＳ中に５ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ）へ例２で生成したドキソルビシンヒドラゾン誘導体５（８ｍｇ／ｍＬ）を０．１０７ｍＬ滴下で加えた。反応混合物を１６時間４℃で攪拌し、光から保護した。免疫原共役（６ｍＬ）を例６ａで記載したようなゲルろ過によって精製した。精製免疫原共役はＵＶ／ＶＩＳ分光検査法によって特性を調べた。免疫原共役反応混合物の残りを更に精製することなくキャッピング反応のために用いた。
【０１２８】
（例６ｄ）
ドキソルビシンヒドラゾン５−ＢＳＡ共役（１：１比率）のキャッピング
例６ｃで精製した１：１ドキソルビシン［５］−ＢＳＡ共役（ＭＥＳ緩衝剤中に５ｍｇ／ｍＬ）５ｍＬに、ドキソルビシンによって変化しないチオール基をキャップするために、０．０４７ｍＬのＮ−エチルマレイミド（２当量、ＭＥＳ緩衝剤中２ｍｇ／ｍＬ）を加えた。反応物を室温で３時間攪拌し、その後例６ａのように精製した。
【０１２９】
（例７）
ドキソルビシン［４］抗体の生成
２グループの１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃのマウスを、完全フロイントアジュバントで乳化された、１グループは例３ａで生成したドキソルビシン［４］−ＢＴＧ免疫原を１匹につき１００μｇで、他のグループは例３ｂで生成したドキソルビシン［４］−ＫＬＨを１匹につき１００μｇで、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で免疫した。マウスに、不完全フロイントアジュバントで乳化された同じ免疫原を一匹につき１００μｇで最初の注射の４週間後に追加免疫した。追加免疫テストの１０日後、各マウスからの出血を、眼窩出血によって得た。融合前の４日のスタートを切るマウスの免疫原、年齢及び安静期間に依存するモノクロナール抗体のために、マウスに、連続３日間、ＰＢＳに例３ａで生成したドキソルビシン［４］−ＢＴＧ免疫原を加えたものを４００μｇ（融合前３日）、２００μｇ（融合前２日）、２００μｇ（融合前１日）で、または、ＰＢＳに例３ｂで生成したドキソルビシン［４］−ＫＬＨ免疫原を加えたものを各日１００μｇ腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で注射した。コリガン（Ｃｏｌｉｇａｎ）などの試験計画書に従って、脾臓細胞を選択されたマウスから分離し、５０％ポリエチレングリコール１５００を用いる骨髄腫融合パートナー細胞系（ＳＰ２／Ｏ）の２×１０７細胞と融合した［Coligan, J.E. et.,al., eds., Current Protoclos in Immunology,2.5.1-2.5.8,(1992), Wiley&Sons,NY.］。融合細胞をコリガンなどの方法に従ってコロニーを作る抗体に育てるために、２０％ウシ胎児血清代替物が追加され、２％Ｌ−グルタミン（１００ｍＭ）、２％５０Ｘ  ＨＡＴを含むＤＭＥＭ／Ｆ１２（１：１のＬ−グルタミンとＨＥＰＥＳを伴うダルベッコの変性したイーグル培養液）のような通常のＨＡＴ（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジン）選択発育培地に、融合細胞を、１０個の９６ウェル形式プレートで培養した。２週間後、ハイブリドーマ上澄みを例１０ｂに記載するようなＥＬＩＳＡによって抗-ドキソルビシン抗体の存在を測定した。陽性ウェルを拡大し、再び同じ方法によって選別した。陽性クローンは、例１１に記載されるような競合的ＥＬＩＳＡによって結合するドキソルビシンとして確認される、または直接サブクローン化される。ＥＬＩＳＡによる陽性クローンは、Coligan、J.E.et al., Current Protocols in Immunology, 2.5.8-2.5.17,(1992),Wiley & Sons, NYで開示されている方法による限界希釈によって、一、二度サブクローン化される。ドキソルビシンに選択的で、１５％以下のドキソルビシンのアグリコンを伴うドキソルビシンに関連した交差反応性を有するモノクロナール抗体だけが、測定によるこれらの選別手順により選択された。
【０１３０】
（例８）
ドキソルビシン［５］抗体の生成
２グループの１０匹の雌のＢＡＬＢ／ｃのマウスを、完全フロイントアジュバントで乳化された、１グループは例４ａで生成したドキソルビシン［５］−ＢＴＧ免疫原を１匹につき１００μｇで、他のグループは例４ｂで生成したドキソルビシン［５］−ＫＬＨ免疫原を１匹につき１００μｇで、腹腔内投与（ｉ．ｐ．）で免疫した。マウスに、不完全フロイントアジュバントで乳化された同じ免疫原を一匹につき１００μｇで最初の注射の４週間後に１回追加免疫した。追加テストの１０及び２８日後、各マウスからの出血を、眼窩出血によって得た。２８日テスト出血からの抗血清は例１０ａ及び１１で評価されたドキソルビシン抗体を含んでいた。ドキソルビシンに選択的で、１５％以下のドキソルビシンのアグリコンを伴うドキソルビシンに関連した交差反応性を有する抗体を有する抗血清だけが、測定によるこれらの選別手順により選択された。
【０１３１】
（例９ａ）
ドキソルビシン［４］−ＢＳＡ１：１共役を用いたマイクロタイタープレート感作手順
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって抗体を選別し、ドキソルビシン濃度を測定する目的のために、タンパク質結合に最適化されたプレートにつき９６ウェルを含むポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules）を用いた。ｐＨ６の０．０１Ｍ  ＭＥＳ中に１０μｇ／ｍＬでドキソルビシン［４］−ＢＳＡ共役を加えたもの３００ｍＬを加え、室温で３時間培養することによって、各ウェルをドキソルビシン［４］−ＢＳＡ１：１共役（例５でのように生成）でコーティングした。ウェルをｐＨ６の０．００５Ｍ  ＭＥＳで洗浄し、その後５％スクロース、０．２％カゼインナトリウム溶液３７５μＬで室温で３０分間ブロックした。ポストコート溶液を除去したのち、プレートを３７℃で夜通し乾燥した。
【０１３２】
（例９ｂ）
ドキソルビシン［５］−ＢＳＡ３：１共役を用いたマイクロタイタープレート感作手順
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって抗体を選別しドキソルビシン濃度を測定する目的のために、タンパク質結合に最適化されたプレートにつき９６ウェルを含むポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules）を用いた。ｐＨ６の０．０１Ｍ  ＭＥＳ中に１０μｇ／ｍＬでドキソルビシン［５］−ＢＳＡ共役を加えたもの３００ｍＬを加え、室温で３時間培養することによって、各ウェルをドキソルビシン［５］−ＢＳＡ３：１共役（例６ｂでのように生成）でコーティングした。ウェルをｐＨ６の０．００５Ｍ  ＭＥＳで洗浄し、その後５％スクロース、０．２％カゼインナトリウム溶液３７５μＬで室温で３０分間ブロックした。ポストコート溶液を除去したのち、プレートを３７℃で夜通し乾燥した。
【０１３３】
（例９ｃ）
ドキソルビシン［５］−ＢＳＡ１：１共役を用いたマイクロタイタープレート感作手順
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって抗体を選別しドキソルビシン濃度を測定する目的のために、タンパク質結合に最適化されたプレートにつき９６ウェルを含むポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules）を用いた。ｐＨ６の０．０１Ｍ  ＭＥＳ中に１０μｇ／ｍＬでドキソルビシン［５］−ＢＳＡ共役を加えたもの３００ｍＬを加え、室温で３時間培養することによって、各ウェルをドキソルビシン［５］−ＢＳＡ１：１共役（例６ｃでのように生成）でコーティングした。ウェルをｐＨ６の０．００５Ｍ  ＭＥＳで洗浄し、その後５％スクロース、０．２％カゼインナトリウム溶液３７５μＬで室温で３０分間ブロックした。ポストコート溶液を除去したのち、プレートを３７℃で夜通し乾燥した。
【０１３４】
（例９ｄ）
ドキソルビシン［５］−ＢＳＡ３：１共役（キャップされたチオール）を用いたマイクロタイタープレート感作手順
酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって抗体を選別しドキソルビシン濃度を測定する目的のために、タンパク質結合に最適化されたプレートにつき９６ウェルを含むポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc MaxiSorp F8 Immunomodules）を用いた。ｐＨ６の０．０１Ｍ  ＭＥＳ中に１０μｇ／ｍＬでドキソルビシン［５］−ＢＳＡ共役を加えたもの３００ｍＬを加え、室温で３時間培養することによって、各ウェルをドキソルビシン［５］−ＢＳＡ１：１キャップ共役（例６ｄでのように生成）でコーティングした。ウェルをｐＨ６の０．００５Ｍ  ＭＥＳで洗浄し、その後５％スクロース、０．２％カゼインナトリウム溶液３７５μＬで室温で３０分間ブロックした。ポストコート溶液を除去したのち、プレートを３７℃で夜通し乾燥した。
【０１３５】
（例１０ａ）
抗体選別手順−滴定量
抗体を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって選別した。ドキソルビシン抗体（例７及び８で生成）を選別するこの方法は、例９ｂ、ｃ、ｄで生成されたドキソルビシン［５］−ＢＳＡで感作されたマイクロタイタープレートで行なった。抗体選別検査を、ドキソルビシン抗体を含む抗血清を、０．１％ＢＳＡ及び０．０１％チメロサールを含むリン酸緩衝生理食塩水で１：１００、１：１０００、１：１０，０００及び１：１００，０００に希釈することによって行った。モノクロナール抗体の評価のために、例１０ｂの手順によって抗体の存在に対して陽性であることが見出された例７のハイブリドーマ上澄み液を、１：２、１：４、１：８、１：１６等に希釈した。ドキソルビシン［５］−ＢＳＡ感作ウェル（例９ｂ、ｃ、ｄで生成）の各ウェルに、１００μＬの希釈抗体を加え、振動させながら室温で１０分間培養した。この培養の間、抗体はドキソルビシン［５］−共役にウェル内で結合する。未結合抗体を除去するために、プレートのウェルを、３回、０．０２Ｍのトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び０．００１％チメロサール、ｐＨ７．８で、洗浄した。ウェル内でドキソルビシン［５］−ＢＳＡ共役に結合するドキソルビシン抗体の量を検出するために、培養基で培養する時、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ＡＮＳ、０．０１％チメロサールを伴うＰＢＳに比活性に希釈（約１／２８００）されたヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役（ジャクソン  イムノリサーチ）１００μＬを、各ウェルに加えた。振動させながら室温で１０分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役がウェル内でドキソルビシン抗体に結合する間、未結合ヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役を除去するために、プレートを再び３回洗浄した。ウェル内に適度な色をつけるために、洗浄後ＴＭＢ（ＴＭＢ  Liquid  Substrate、ＨＲＰ用培養基）１００μＬを加え、室温で振動させながら１０分培養する間に適度な色をつけた。着色のための培養に続いて、停止液（１．５％フッ化ナトリウムの脱イオン水）５０μＬを着色を停止するために各ウェルに加え、１０秒間の振動後、６５０ｎｍの吸光度を９６ウェルプレートリーダ-で測定した。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例し、１．５の吸光度となる希釈（滴定量）として表わされる。滴定量は、測定された抗体の抗体希釈（ｘ軸）対６５０ｎｍでの吸光度（ｙ軸）をログで図示し、１．５の吸光度での滴定量を推定することによって測定される。滴定量は、例１１に記載された間接競合マイクロタイタープレート測定で使用された抗体の濃度（希釈）を決定した。
【０１３６】
（例１０ｂ）
抗体選別手順―モノクロナール選別
抗体を酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって選別した。ドキソルビシンモノクロナール抗体（例７で生成される）を選別するこの方法は、例９ｂで記載されるようなドキソルビシン［５］−ＢＳＡで感作されたマイクロタイタープレートで行なった。ドキソルビシン［５］−ＢＳＡ感作ウェル（例９ｂで生成）の各ウェルに、０．１％ＢＳＡ及び０．０１％チメロサールを含む５０μＬリン酸緩衝生理食塩水と、そして次にモノクロナール培養上澄み５０μＬを加え、１０分間室温で振動させながら培養した。この培養の間、抗体はウェル内でドキソルビシン［５］−共役に結合する。未結合抗体を除去するために、プレートのウェルを３回、０．０２Ｍトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び０．００１％チメロサール、ｐＨ７．８で、洗浄した。ウェル内でドキソルビシン［５］−ＢＳＡ共役に結合するドキソルビシン抗体の量を検出するために、培養基で培養する時、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ＡＮＳ、０．０１％チメロサールを伴うＰＢＳ中に予め決められた比活性に希釈（約１／２８００）されたヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役（ジャクソン  イムノリサーチ）１００μＬを各ウェルに加えた。振動させながら室温で１０分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役がウェル内でドキソルビシン抗体に結合する間、未結合ヤギ抗マウス抗体―ＨＲＰ酵素共役を除去するためにプレートを再び３回洗浄した。ウェル内に適度な色をつけるために、洗浄後ＴＭＢ（ＴＭＢ  Liquid  Substrate、ＨＲＰ用培養基）１００μＬを加え、室温で振動させながら１０分培養する間に着色した。着色のための培養に続いて、停止液（１．５％フッ化ナトリウムの脱イオン水）５０μＬを着色を停止するために各ウェルに加え、１０秒間の振動後、９６ウェルプレートリーダ−で６５０ｎｍの吸光度を測定した。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例した。バックグラウンドの３倍以上の大きい吸光度を有する試料を陽性とした。
【０１３７】
（例１１）
ドキソルビシンの抗体におけるＩＣ５０及び交差反応性を測定する間接競合マイクロタイタープレート免疫測定手順
ドキソルビシン濃度を間接競合酵素免疫測定法（ＥＬＩＺＡ）によって測定した。ドキソルビシン濃度を測定するこの方法は、例９ｂ、ｃ、ｄに記載するドキソルビシン［５］−ＢＳＡで感作したマイクロタイタープレートで行った。ドキソルビシン及びドキソルビシンアグリコンは、０．０１〜１０，０００ｎｇ／ｍＬの濃度範囲の間で、０．１％ＢＳＡ及び０．０１％チメロサールを伴うＰＢＳ中に１０倍希釈された。測定は、例１０ａで測定された滴定量に希釈された５０μＬの抗体（例３ａ、３ｂ、４ａ及び４ｂの免疫原を用いて例７及び８で生成）で測定するために、５０μＬの分析物を培養することによって行った。１０分間の培養（振動を伴うローテーター（Ｒ．Ｔ.））の間、ウェル内のドキソルビシン共役及び溶液中の分析物に結合する抗体の競合が生じる。この培養に続いて、結合しないあらゆる物質を除去するために、プレートのウェルを、０．０２Ｍトリス、０．９％塩化ナトリウム、０．５％Ｔｗｅｅｎ−８０及び０．００１％チメロサール、ｐＨ７．８で、３回洗浄した。ウェル内のドキソルビシン［５］−ＢＳＡ共役に結合したドキソルビシン抗体の量を検出するために、培養基で培養するとき、特にマウス科の免疫グロブリンに結合可能で有色の生成物を生成することが可能な、０．１％ＢＳＡ、０．０５％ＡＮＳ、０．０１％チメロサールを伴うＰＢＳ中に予め決められた比活性に希釈（約１／２８００）されたヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素共役（ジャクソン  イムノリサーチ）１００μＬを、各ウェルに加えた。振動させながら室温で１０分間培養した後、ヤギ抗マウス抗体−ＨＲＰ酵素共役がウェル内のドキソルビシン抗体に結合する間、結合していない第二の共役を除去するために、プレートを再び３回洗浄した。ウェル内で測定可能な色をつけるために、洗浄後、ＴＭＢ（ＴＭＢ  Liquid  Substrate、ＨＲＰ用培養基）を１００μＬ加え、室温で振動させながら１０分培養して着色した。着色のための培養に続いて、停止液（１．５％フッ化ナトリウムの脱イオン水）５０μＬを、着色を停止するために各ウェルに加え、１０秒間の振動後、９６ウェルプレートリーダ−で６５０ｎｍの吸光度を測定した。ウェル内の抗体量は、測定される吸光度に比例し、試料中のドキソルビシン量に反比例した。分析物を含むウェル内の色の吸光度を、分析物のないものと比較し、標準曲線を形成した。与えられた分析物に対するＩＣ５０値は、分析物を含んでいないウェルにおける吸光度の５０％を阻害するために欠かせない分析物の濃度と定義した。与えられた分析物の交差反応性は、ドキソルビシンに対するＩＣ５０とドキソルビシンアグリコンに対するＩＣ５０との比率で、パーセント表示で計算した。例３ａ、３ｂ、４ａ及びｂの免疫原で例７及び８で生成した抗体で測定するとき、ドキソルビシンアグリコンに対するドキソルビシンに関連するパーセント表示で表わした交差反応性は１０％以下であった。結果は下の表１及び２にある。
【０１３８】
表１：ドキソルビシン［５］−ＢＳＡ共役（例９ｂ、９ｃ、９ｄ）をコーティングしたプレートでドキソルビシン［５］−ＢＴＧ及びＫＬＨ（例８）に対する抗体を用いた競合免疫測定法の交差反応性。
【０１３９】
【表１】
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【０１４０】
表２：ドキソルビシン［５］−ＢＳＡ共役（例９ｂ、９ｃ、９ｄ）をコーティングしたプレートでドキソルビシン［４］−ＢＴＧ及び−ＫＬＨ（例７）に対するモノクロナール抗体を用いた競合免疫測定法の交差反応性。
【０１４１】
【表２】
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【０１４２】
これらの表からわかるように、本発明の抗体はドキソルビシンの活性な親形態に実質的に反応性であり、ドキソルビシンの不活性なアグリコン代謝産物に実質的に交差反応性がない。
【国際調査報告】
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