(57)【要約】本発明は、(a)生物学的試料の酵素反応抑制を克服するための両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を含む反応混合物において、生物学的試料を直接利用して酵素反応を行う段階(前記生物学的試料内に存在する核酸分子は、前記酵素反応前に精製されていないものである)と、(b)前記酵素反応から生成物を収得する段階とを含む、核酸分子が関与する直接酵素反応方法に関するものである。【選択図】図４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)生物学的試料の酵素反応抑制を克服するための両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を含む反応混合物において、生物学的試料を直接利用して酵素反応を行う段階(前記生物学的試料内に存在する核酸分子は、前記酵素反応前に精製されていないものである)と、
(b)前記酵素反応から生成物を収得する段階とを含むことを特徴とする、
核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項２】
前記核酸を含む酵素反応は、増幅反応、逆転写反応、ＤＮＡライゲーション(ligation)、核酸分解酵素−媒介反応、またはＤＮＡメチル化反応であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項３】
前記生物学的試料は、ウイルス、バクテリア、組織、細胞、血液、リンパ、骨髄液、唾液、牛乳、小便、糞便、眼球液、精液、脳抽出物、脊髄液、関節液、胸腺液、腹水、羊膜液、または細胞組織液であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項４】
前記両性イオン性緩衝液はHEPES(4-(2-Hydroyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、Tricine(N-Tris(hydroxymethyl)methylglycine)、Bicine(NN-bis(2-hydroxyethyl)glycine)、Taps(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulphonic acid)、ACE(N-(2-acetamido)-2-aminoethane-sulfonic acid)、ADA(N-(2-acetamido)-iminodiacetic acid)、MES(2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid)、MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)、及びMOPSO(3-N-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項５】
前記両性イオン性緩衝液は、HEPES、Tricine、またはBicineであることを特徴とする、請求項４に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項６】
前記両性イオン性緩衝液は、Tricineであることを特徴とする、請求項５に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項７】
前記非還元性炭水化物は、グリコール、ポリグリコール、ポリグリセロール、非還元性二糖類、三糖類、四糖類、糖アルコール、アルドン酸またはそのラクトン、アルダル酸またはそのラクトン、またはウロン酸であることを特徴とする、請求項１に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項８】
前記非還元性炭水化物は、非還元性二糖類、三糖類、四糖類、または単糖類由来の糖アルコールであることを特徴とする、請求項７に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項９】
前記非還元性炭水化物は、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、またはスクロースであることを特徴とする、請求項８に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項１０】
前記酵素反応は、増幅反応であることを特徴とする、請求項２に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項１１】
前記増幅反応は、ホットスタート(Hot Start)PCR(重合酵素連鎖反応)であることを特徴とする、請求項１０に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項１２】
前記増幅反応は、RT-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)反応であることを特徴とする、請求項１０に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項１３】
前記酵素反応は、核酸分解酵素−媒介反応であることを特徴とする、請求項２に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項１４】
前記核酸分解酵素−媒介反応は、インベーダーアッセイ(Invader assay)であることを特徴とする、請求項１３に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項１５】
前記反応混合物は、両性イオン性界面活性剤、牛血清アルブミン、ポリアミン、またはこれらの組み合せを追加的に含むことを特徴とする、請求項１に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項１６】
前記生物学的試料は、血液であることを特徴とする、請求項３に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項１７】
前記生物学的試料は、血液であり、血液に存在する前記核酸分子は、低いコピー数(Low copy number)を有することを特徴とする、請求項１６に記載の核酸分子が関与する直接酵素反応方法。
【請求項１８】
生物学的試料の酵素反応抑制を克服するための両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を含む反応混合物を含み、これにより、前記酵素反応前に前記生物学的試料内に存在する核酸分子に対する精製が不要であることを特徴とする、生物学的試料を直接利用して核酸分子が関与する直接酵素反応を行うためのキット。
【請求項１９】
前記核酸を含む酵素反応は、増幅反応、逆転写反応、ＤＮＡライゲーション(ligation)、核酸分解酵素−媒介反応、またはＤＮＡメチル化反応であることを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記生物学的試料は、ウイルス、バクテリア、組織、細胞、血液、リンパ、骨髄液、唾液、牛乳、小便、糞便、眼球液、精液、脳抽出物、脊髄液、関節液、胸腺液、腹水、羊膜液、または細胞組織液であることを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
【請求項２１】
前記両性イオン性緩衝液は、HEPES(4-(2-Hydroyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、Tricine(N-Tris(hydroxymethyl)methylglycine)、Bicine(NN-bis(2-hydroxyethyl)glycine)、Taps(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulphonic acid)、ACE(N-(2-acetamido)-2-aminoethane-sulfonic acid)、ADA(N-(2-acetamido)-iminodiacetic acid)、MES(2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid)、MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)、及びMOPSO(3-N-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid)からなる群から選択されることを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
【請求項２２】
前記両性イオン性緩衝液は、HEPES、Tricine、またはBicineであることを特徴とする、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記両性イオン性緩衝液は、Tricineであることを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記非還元性炭水化物は、グリコール、ポリグリコール、ポリグリセロール、非還元性二糖類、三糖類、四糖類、糖アルコール、アルドン酸またはそのラクトン、アルダル酸またはそのラクトン、またはウロン酸であることを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
【請求項２５】
前記非還元性炭水化物は、非還元性二糖類、三糖類、四糖類、または単糖類から誘導された糖アルコールであることを特徴とする、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記非還元性炭水化物は、ソルビトール、マンニトール、トレハロース、ラフィノース、またはスクロースであることを特徴とする、請求項２５に記載のキット。
【請求項２７】
前記酵素反応は、増幅反応であることを特徴とする、請求項１９に記載のキット。
【請求項２８】
前記増幅反応は、ホットスタート(Hot Start)PCR(重合酵素連鎖反応)であることを特徴とする、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記増幅反応は、逆転写-PCR(reverse transcription-polymerase chain reaction)反応であることを特徴とする、請求項２７に記載のキット。
【請求項３０】
前記酵素反応は、核酸分解酵素−媒介反応であることを特徴とする、請求項１９に記載のキット。
【請求項３１】
前記核酸分解酵素−媒介反応は、インベーダーアッセイ(Invader assay)であることを特徴とする、請求項３０に記載のキット。
【請求項３２】
前記反応混合物は、両性イオン性界面活性剤、牛血清アルブミン、ポリアミン、またはこれらの組み合せを追加的に含むことを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
【請求項３３】
前記生物学的試料は、血液であることを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
【請求項３４】
前記生物学的試料は、血液であり、血液に存在する前記核酸分子は、低いコピー数を有することを特徴とする、請求項３３に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸分子が含まれる生物学的試料を直接的に利用する直接酵素反応を行う方法、及びこれのためのキットに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
ワッソンとクリックによりＤＮＡ二重螺旋構造が明かされた以後、核酸分子は、分子生物学分野で最も重要な実験の主体及び対象となった。さらに、このような核酸分子を基質あるいは鋳型として使用する酵素に関しても活発な発達と研究がなされてきて、複製(cloning)と突然変異の誘発(mutagenesis)などを含む核酸分子操作のための様々な技術などが提案されてきた。Mullisら(1-3)により、１９８０年代末に開発された重合酵素連鎖反応(polymerase chain reaction: PCR)は、分子生物学において、一つの大きな成果を上げたと言える。その他にも、連結酵素重合反応(ligase chain reaction: LCR)、分枝ＤＮＡ技術(branched DNA technology: bDNA)、遺伝子増幅法(transcription mediated amplification: TMA)、 ＨＰＡ法(hybridization protection assay)、hybrid captureシステム、ＳＤＡ法(strand displacement amplification)、ＣＴＰ法(cycling probe technology)、リアルタイムＰＣＲ法(Real-time PCR)、インベーダーアッセイ(Invader assay)、そして、ＬＡＭＰ法(loop-mediated isothermal amplification)などのように、幅広くて多様な核酸操作関連技術が開発されて、研究者及び遺伝子工学、タンパク質工学、診断と治療などのような関連産業分野の多様な欲求を満たしている。
【０００３】
このように、核酸の操作技術は、幅広い分野で応用されているが、これの適用のためには、核酸の精製過程が不可欠である。換言すると、核酸を含んでいる生物学的試料は、核酸変形酵素作用に邪魔となる活性抑制剤、特に、酵素の活性抑制剤を含んでいる可能性が非常に高いため、増幅に先立って、必ずこの抑制剤を除去する過程が必要である。例えば、重合酵素連鎖反応時、生物学的試料を使用する場合、試料に内在されている多様な抑制剤のため、満足できるような結果が期待できないため、一般に生物学的試料から抽出して精製した核酸分子を鋳型として使用する。
【０００４】
生物学的試料から核酸を抽出して精製するために、現在は、フェノール−クロロホルム抽出法とイオン交換クロマトグラフィー、またはガラスビード利用法が主に使用されている。それにもかかわらず、これらの方法は、時間と費用の面で経済的ではなく、人体と環境に有害であると知られているフェノールのような物質を使用しなければならないという問題点を有している。したがって、生物学的試料を核酸関連酵素反応に直接的に適用できるような方法が案出されたら、多い利点が誘発されるだろう。
【０００５】
血液試料は、増幅反応、特にＰＣＲにより分析される試料として使用される。しかしながら、血液内に存在する多様な重合酵素抑制剤のため、血液を直接的な試料として使用するには限界がある。血液内に本来から固有に存在する活性抑制剤としては、ヘム[heme、(4)]、免疫グロブリンＧ[Ig G、(5)]、塩(例えば、K+及びNa+)、胆汁塩と血液細胞に内在されているＤＮＡ分解酵素とタンパク質分解酵素がある。さらに、ＥＤＴＡ、ヘパリン及びクエン酸ナトリウムのような血液凝固抑制剤は、重合反応、特にＰＣＲに対する強い抑制作用を示す。
【０００６】
仮に、核酸精製過程のない直接的増幅反応が実質化されたら、核酸精製に係わる多い問題点、例えば、(i)研究者の感染；(ii)核酸試料間の交差汚染；(iii)核酸の損失、特に、微量の試料が存在する場合；(iv)時間と費用の損失；そして、(v)自動化の困難を克服することができる。これと関連し、多い研究者らがこれまで、直接酵素反応のための方法を提案してきた。
【０００７】
実際に、Mercierら(6)と、Panaccioら(7)、そしてMcCuskerら(8)は、血液試料を直接的に利用する重合酵素連鎖反応法を報告して、Panaccioら(9)も、血液試料を利用した直接的な重合酵素連鎖反応法を提案した。しかしながら、このような一連の過程は、血液試料をホルムアミドと混合した後、予備反応を経なければならないという欠点を有している(9、10)。Burckhardtは、重合酵素連鎖反応において、カチオンの濃度を変化させることにより、最大８０％(v/v)の血液を利用して結果を得ることができることを明かした(11)。しかしながら、Burckhardtの提案によると、血液試料の量により、重合酵素連鎖反応物の組成を多様に変えなければならなく、また増幅反応前に血液試料を予備加熱しなければならないという短所がある。
【０００８】
上記の方法は、血液試料を直接的に利用した重合酵素連鎖反応の可能性を提示してはいるが、一本鎖ＤＡＮ−結合タンパク質(T4遺伝子32タンパク質(gp32))(12)を必要とするか、特別な前処理過程が必要であるという短所は、依然として残っている(8、13)。
【０００９】
最近、Makowskiら(14)、Kreader(12)、そしてSatohら(15)を含む科学者らも、直接的ＰＣＲ反応法を報告した。
【００１０】
Al-Soudらは、バクテリアからＤＮＡ試料を抽出して、これに血液、糞便、チーズ浮遊物及び肉のような生物学的試料を様々な量で混合した後、多様な種類の熱安定性ＤＡＮ合成酵素とＰＣＲ促進剤を使用してＰＣＲ−増幅した(16)。実験結果、彼らは、牛の血清アルブミン(BSA)、ベタイン(betaine)、そしてｇｐ３２がＰＣＲの抑制を克服することができることを究明した。しかしながら、この方法は、生物学的試料そのものを使用したものではなく、血液のような生物学的試料と人為的に混合されたＤＡＮ試料を使用したため、直接的増幅反応の実際的な環境を反映することができなかった。しかも、上記方法は、比較的高い濃度のＤＮＡ試料(1ng/25μl反応液)を利用したため、微量のＤＮＡ試料を、前記ＰＣＲ促進剤を利用して増幅することができるかどうかは評価していなかった。
【００１１】
Nishimuraらは、ＰＣＲ反応時、ｐＨ範囲を８．９以上に上げると、ＰＣＲ反応に対する血液の抑制作用を非常に克服することができることを報告した(米国特許第5,935,825号)。彼らはまた、高濃度のポリアミンが、糞便を利用した直接的ＰＣＲ反応を可能にすると報告した(米国特許第6,413,747号)。しかしながら、彼らの接近方法は、高いｐＨで適用しなければならないため、AmpliTaq Gold DNA重合酵素(Applied Biosystems, Inc.)、FastStart Taq DNA重合酵素(Roche Applied Science,Inc.)、そして、HotStarTaq DNA重合酵素(Qiagen, Inc.)のようなホットスタートＰＣＲ用化学的−変形されたＤＮＡ重合酵素は、上記した条件では作動せず、多様な種類のＤＮＡ重合酵素を上記したＰＣＲ反応に適用することができない。
【００１２】
Katoらも、ポリアミンを利用した低いコピー数のＤＮＡ分子を直接的に増幅できる方法を提案した(米国特許第6,413,747号)。しかしながら、Katoらは、血液試料を直接的に使用しなかった。その代わりに、彼らは、ヘムのようなＰＣＲ抑制剤がなく、人体免疫欠乏ウイルスタイプＩ(HIV-I)ＤＮＡが添加された白血球試料を間接的に利用した。したがって、Katoらが得た結果は、ＰＣＲ活性抑制を克服して得たものとは認められない。
【００１３】
結果的に、核酸精製過程のない新規な直接酵素反応(特に、増幅反応)に対する要求が、当業界に長い間残っている。
【００１４】
本明細書全体にかけて多数の特許文献及び論文が参照されて、その引用が表示されている。引用された特許文献及び論文の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上述した従来技術の状況下で、本発明者らは、生物学的試料を直接的に利用した核酸分子の直接的な酵素反応を行う独特の方法を開発するために鋭意研究した結果、反応混合物に含まれる両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物が、生物学的試料内の核酸分子の精製をしなくても、直接的な酵素反応を可能にすることを見出した。
【００１６】
したがって、本発明の目的は、生物学的試料を直接的に使用して、核酸分子−関与直接酵素反応を行う方法を提供することにある。
【００１７】
本発明の他の目的は、生物学的試料を直接的に使用して、核酸分子−関与直接酵素反応を行うためのキットを提供することにある。
【００１８】
本発明のまた他の目的は、核酸分子−関与直接酵素反応に対する生物学的試料の妨害作用を抑制する方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、核酸分子−関与直接酵素反応のための反応混合物を製造するための両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物の用途を提供することにある。
【００２０】
本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲、及び図面により、さらに明確にされる。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
本発明の一様態によると、(a)生物学的試料の酵素反応抑制を克服するための両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を含む反応混合物において、生物学的試料を直接利用して酵素反応を行う段階(前記生物学的試料内に存在する核酸分子は、前記酵素反応前に精製されていないものである)と、(b)前記酵素反応から生成物を収得する段階とを含む、核酸分子が関与する直接酵素反応方法(Direct enzymatic reaction)を提供する。
【００２２】
本発明の他の様態によると、本発明は、生物学的試料の酵素反応抑制を克服するための両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を含む反応混合物を含み、これにより、前記酵素反応前に前記生物学的試料内に存在する核酸分子に対する精製が不要であることを特徴とする、生物学的試料を直接利用して核酸分子が関与する直接酵素反応を行うためのキットを提供する。
【００２３】
本発明者らは、生物学的試料を直接使用して、核酸分子が関与する直接酵素反応の実施のための独特の方法を開発するために鋭意研究し、結果的に、前記酵素反応前に前記生物学的試料内に存在する核酸分子に対する精製が不要であることを特徴とする、生物学的試料を直接利用して核酸分子が関与する直接酵素反応を可能にする両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を含む反応混合物を開発した。
【００２４】
生物学的試料を利用した直接酵素反応の成功は、生物学的試料の酵素反応抑制をどのように克服するかに掛かっている。本明細書に記載された用語“直接酵素反応(Direct enzymatic reaction)”は、生物学的試料に含まれている特定生物学的物質を抽出または精製するための前処理過程を経ず、生物学的試料を直接的に利用する酵素触媒反応を意味する。
【００２５】
生体液(例えば、血液、唾液、及びリンパ)と細胞培養のような生物学的試料は、一般に、内在的な酵素反応抑制剤、特に、酵素活性抑制剤を含む。本発明は、生物学的試料に存在する酵素抑制剤による限界の克服を確保することにより、生物学的試料を利用して、高度の効率性と応用性を有する成功的な直接酵素反応を可能にする。
【００２６】
本明細書に記述された用語“核酸を含む酵素反応(enzymatic reaction involving nucleic acid molecules)”は、核酸を基質、鋳型、またはプライマーとして使用する酵素による触媒反応をいう。核酸を含む酵素反応は、核酸分子の変形を生じる。本明細書に記述された用語“核酸”は、一本鎖あるいは二本鎖のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体を意味する。
【００２７】
本発明は、生物学的試料を直接利用する高度の効率性と応用性を有する直接酵素反応を可能にして、生物学的試料に存在する核酸分子の抽出または精製のような、如何なる前処理過程も必要としない。
【００２８】
本発明は、多様な種類の核酸(NA)−含有酵素反応に適用できる。好ましくは、本発明は、増幅反応、逆転写、ＤＮＡライゲーション、核酸分解酵素−媒介反応(nuclease-mediated reaction)、ＤＮＡメチル化、トポイソメラーゼ(topoisomerase)−媒介反応、またはテロメラーゼ(telomerase)−媒介反応に適用される。
【００２９】
本明細書に記述された用語“増幅反応”は、核酸分子を増幅する反応を意味する。多様な増幅反応が当業界に報告されており、これは、重合酵素連鎖反応(以下、PCRという)(米国特許第4,683,195号、4,683,202号、及び4,800,159号)、逆転写−重合酵素連鎖反応(以下、RT-PCRという)(Sambrookら, Molecular Cloning. A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold  Spring Harbor Press(2001))、Miller, H. I.(WO 89/06700)及びDavey, C.ら(EP 329,822)の方法、ＬＣＲ(ligase chain reaction)(17, 18)、Gap-LCR(WO 90/01069)、復旧連鎖反応(repair chain reaction; EP 439,182)、ＴＭＡ(transcription-mediated amplification)(19)(WO 88/10315)、３ＳＲ(self−sustained sequence replication)(20)(WO 90/06995)、ターゲットポリヌクレオチド塩基配列の選択的増幅(selective amplification of target polynucleotide sequences)(米国特許第6,410,276号)、ＣＰ−ＰＣＲ(consensus sequence primed polymerase chain reaction)(米国特許第4,437,975号)、ＡＰ−ＰＣＲ(arbitrarily primed polymerase chain reaction)(米国特許第5,413,909号及び第5,861,245号)、ＮＡＳＢＡ(nucleic acid sequence based amplification)(米国特許第5,130,238号、第5,409,818号、第5,554,517号、及び6,063,603号)、ＳＤＡ(strand displacement amplification)(21, 22)、及びＬＡＭＰ(loop-mediated isothermal amplification)(23)を含むが、これに限定されない。使用可能な他の増幅方法は、米国特許第５，２４２，７９４号、５，４９４，８１０号、４，９８８，６１７号、及び米国特許出願第０９/８５４，３１７号に記述されている。
【００３０】
本明細書に記述された用語“逆転写”は、ＲＮＡ鋳型でＤＮＡを合成する反応を意味する。例えば、逆転写過程は、ＲＴ−ＰＣＲに含まれる。“ＤＮＡライゲーション”という用語は、２つのＤＮＡ分子間の共有結合形成反応を意味する。例えば、ＤＮＡライゲーション過程は、ＬＣＲに含まれる。
【００３１】
本明細書に記載された“核酸分解酵素−媒介反応”という用語は、核酸分子においてホスホジエステル結合(phosphodiesteric  bond)を切断する核酸分解酵素により触媒される反応を意味する。多い種類の核酸分解酵素が当業者に知られている。例えば、核酸分解酵素は、エンドヌクレアーゼ(例えば、FEN-1エンドヌクレアーゼ、制限酵素、DNase  I、DNase  II、及びRNase  I)及びエキソヌクレアーゼ[蛇毒ホスホジエステラーゼ(phosphodiesterase)及び脾臓ホスホジエステラーゼ(phosphodiesterase)]を含むが、これに限定されない。例えば、ＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼは、インベーダーアッセイ(Invader assay)において中枢的な役割をする。
【００３２】
本明細書に記載された“ＤＮＡメチル化”という用語は、ＤＮＡ上の特定な位置の塩基をメチル化させる反応を意味する。本明細書に記載された“トポイソメラーゼ−媒介反応”は、共有的に閉じた環状ＤＮＡのある位相異性体を他の位相異性体に変換させるトポイソメラーゼ(例えば、type  I及びIIトポイソメラーゼ)により触媒される反応を意味する。本明細書に記述された“テロメラーゼ−媒介反応”は、テロメアにおける一本の繰り返しユニットの生成を生じるテロメラーゼにより触媒される反応を意味する。
【００３３】
本発明の好ましい具現例によると、前記酵素反応は、増幅反応である。本発明の方法がターゲット核酸分子を増幅するために行われる場合、本発明の方法は、本明細書の参考文献に記載された方法により、両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を含む反応混合物を使用して行うことができる。より好ましくは、本発明の直接増幅(direct amplification)方法は、次の段階を含む：(i)ターゲット核酸を含む生物学的試料を収得する段階：(ii)生物学的試料の増幅反応の妨害を抑制するための両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物、そして酵素を含む増幅反応用反応混合物に前記生物学的試料を接触させる段階；及び(iii)前記ターゲット核酸分子を増幅させる段階。
【００３４】
本明細書において、用語“直接増幅(direct amplification)”は、抽出または精製のようないかなる前処理過程も経ず、生物学的試料を直接利用する増幅反応を意味する。
【００３５】
前記反応混合物に含まれる酵素は、ＰＣＲ−基盤増幅用熱安定性ＤＮＡ重合酵素、ＬＣＲ用熱安定性リガーゼ、及びＮＡＳＢＡ及びＴＭＡのための逆転写酵素、ＲＮＡ分解酵素ＨとＲＮＡ重合酵素を含むが、これに限定されない。
【００３６】
本発明のより好ましい具現例によると、酵素反応は、ＰＣＲ−基盤増幅である。
【００３７】
ＰＣＲは、最もよく知られた核酸増幅方法であって、それに対する数多い変形と応用が開発されている。例えば、ＰＣＲの特異性または敏感性を増進させるために、伝統的なＰＣＲ過程を変形させて、タッチダウン(touchdown)ＰＣＲ(24)、ホットスタート(hot start)ＰＣＲ(25,  26)、ネステッド(nested)ＰＣＲ(2)、及びブースター(booster)ＰＣＲ(27)が開発された。また、リアルタイム(real-time)ＰＣＲ、ＤＤ−ＰＣＲ(differential display PCR)、ＲＡＣＥ(rapid amplification of cDNA ends)ＰＣＲ、マルチプレックスＰＣＲ、ＩＰＣＲ(inverse polymerase chain reaction)、Ｖｅｃｔｏｒｅｔｔｅ  ＰＣＲ、ＴＡＩＬ  ＰＣＲ(thermal asymmetric interlaced PCR)、及びマルチプレックスＰＣＲが特定な応用のために開発された。ＰＣＲに対する詳しい内容は、McPherson, M.J.,及びMoller, S.G. PCR. BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin  Heidelberg, N.Y. (2000)に記載されており、その教示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。
【００３８】
多いＰＣＲ−基盤増幅方法が開発されたが、これらの増幅方法は、温度サイクリング及び熱安定性ＤＮＡ重合酵素のような共通的な段階に従う。
【００３９】
本発明がＰＣＲ−基盤増幅反応により行われる場合、本発明は、次の段階を含む：(i)ターゲット核酸を含む生物学的試料を収得する段階：(ii)生物学的試料の増幅反応の抑制を遮断するための両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物とＰＣＲ用熱安定性ＤＮＡ重合酵素を含む反応混合物に、前記生物学的試料を接触させる段階；及び(iii)前記ターゲット核酸分子を増幅させる段階。
【００４０】
前記ＰＣＲ反応に含まれた熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、好熱性真正細菌(Eubacteria)または古細菌(Archaebacteria)、例えば、Thermus aquaticus, T. thermophilus, T. bockianus, T. flavus, T. rubber, Thermococcus litoralis, Pyrococcus furiousus, P. wosie, Pyrococcus spec. KGD, Thermatoga maritime, Thermoplasma acidophilus、及びSulfolobus spec.から分離することができる。好ましくは、前記熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素、Ｔｔｈ  ＤＮＡ重合酵素、Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素、Ｐｗｏ  ＤＮＡ重合酵素、及び常温で非活性である変形熱安定性重合酵素である。
【００４１】
常温で非活性の変形された熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、化学的に変形された熱安定性ＤＮＡ重合酵素及び抗体−結合熱安定性ＤＮＡ重合酵素を含む。本明細書で用語“化学的に変形された(または、化学−変形された)熱安定性ＤＮＡ重合酵素”は、ホットスタートＰＣＲのために、常温で活性を有しないように化学的に変形された熱安定性ＤＮＡ重合酵素を意味する。化学的に変形された熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、初期再生段階(例えば、９５℃で１０分間加熱する段階)で再生された後、ＰＣＲを行う。商業的に購入可能な化学的に変形された熱安定性ＤＮＡ重合酵素の非−制限的例は、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ  ＤＮＡ重合酵素(Applied Biosystem社)、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素(Roche Applied Science社)、及びＨｏｔＳｔａｒＴａｑ  ＤＮＡ重合酵素(Qiagen社)を含む。抗体−結合された熱安定性ＤＮＡ重合酵素は、結合された抗体により常温では活性を有しなく、高い温度で抗体が変性されるにつれて活性を有する。
【００４２】
増幅反応を行うに際して、前記反応に要求される構成成分を、反応に過量入れることが好ましい。増幅反応に必要な構成成分と関連し、過量の意味は、所望の増幅反応を達成できる能力が、前記成分により実質的に制限を受けない程度のそれぞれの構成成分の量を意味する。反応混合物に、Ｍｇ2+及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰのような補助剤を、目的とする増幅反応が得られる程度の十分な量として入れることが好ましい。
【００４３】
増幅のための条件は、当業者によく知られており、Joseph Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001)、及びMcPherson, M.J.,及びMoller, S.G. PCR.
BIOS Scientific Publishers, Springer-Verlag New York Berlin Heidelberg, N.Y. (2000)のような多様な文献に記述されており、前記文献の教示事項は、その全体が本明細書に参考文献として取り込まれる。本発明の直接ＰＣＲは、抽出されたＤＮＡ鋳型の代わりに、生物学的試料を直接利用して、両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を反応混合物に使用するという点を除いては、当業者に知られた一般的なＰＣＲ過程と条件により実施できる。
【００４４】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、ＲＴ−ＰＣＲの方法により行われる。本発明は、ＲＮＡ抽出過程の不要な、直接ＲＴ−ＰＣＲを実現可能にする。本発明の直接ＲＴ−ＰＣＲは、増幅段階に先立って、ｍＲＮＡからｃＤＮＡを作り出すための逆転写段階を含み、この過程に対する詳しい説明は、Joseph Sambrookら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2001);及びNoonan, K. F. ら(28)に記述されている。逆転写反応のために、ｍＲＮＡのポリＡ末端に混成化可能なオリゴヌクレオチドｄＴ(oligonucleotide dT)プライマーが使用される。逆転写反応は、逆転写酵素、例えば、ＭＭＬＶ(Moloney Murine Leukemia Virus; Moloneyマウス白血病ウイルス)、ＡＭＶ(Avian Myeloblastosis Virus;鳥類骨髄芽球症ウイルス)、またはＨＩＶ(Human Immunodeficiency Virus;ヒト免疫欠乏ウイルス)由来の逆転写酵素を用いて行うことができる。
【００４５】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、ホットスタートＰＣＲに適用される。ホットスタートＰＣＲは、ＰＣＲ敏感性と特異性を増加させるために開発された(25)。感染性疾病や法医学で使用される増幅反応は、一般に、少ないコピー数の核酸試料を使用する。特に、ＨＩＶ−、及びＨＢＶ−連関疾病のような感染性疾病の診断のために、細菌感染の早期診断が非常に重要である。即ち、正確且つ信頼性のある診断結果を算出するために、少ないコピー数を有するウイルス核酸分子は、増幅されなければならない。本発明によると、少ないコピー数を有する核酸分子は、ホットスタートＰＣＲにより生物学的試料を直接利用して増幅できる。上記した本発明の成果は、生物学的試料の酵素反応抑制を遮断できる両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物の使用によりなされる。両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物の上記作用は、既に報告されたｐＨ(例えば、pH9.0)(米国特許第5,9325,825号)より比較的低いｐＨ(例えば、pH8.3)で発揮され、これに化学的に変形された重合酵素を使用するホットスタートＰＣＲは、本発明により提供された条件下で生物学的試料を使用して成功的に行うことができる。
【００４６】
また、本発明は、デキストラン硫酸塩[dextran sulfate(米国特許第6,667,165号)、またはアプタマー(aptamer; 29, 30)のように、常温で重合酵素活性を抑制する抑制剤を使用するホットスタートＰＣＲの他の応用法にも適用できる。
【００４７】
ホットスタートＰＣＲの一般的な過程と条件は、本明細書に参考文献として添付されているD’Aquila, R. T.などによく記述されている(25,26,31,32)。本発明の直接ホットスタートＰＣＲは、抽出された核酸の代わりに、生物学的試料を直接利用して、両性イオン性緩衝撃液及び/または非還元性炭水化物を反応混合物に使用するという点を除いては、当業者によく知られた一般的なホットスタートＰＣＲ方法と条件により行われる。
【００４８】
本発明に使用できる生物学的試料は、好ましくは、ウイルス、バクテリア、組織、細胞、血液、リンパ、骨髄液、唾液、牛乳、小便、糞便、眼球液、精液、脳抽出物、脊髄液、関節液、胸腺液、腹水、羊膜液、及び細胞組織液、より好ましくは、組織、細胞、血液、唾液、牛乳、小便、及び糞便、さらに好ましくは、ウイルス、細菌、組織、細胞及び血液、最も好ましくは、血液を含むが、これに限定されない。生物学的試料として血液は、全血、血漿、、または血清であり、より好ましくは、全血試料である。
【００４９】
本発明において、全血は、反応混合物に添加される前に、ヘパリン、ＥＤＴＡ(ethylene diaminetetraacetic acid)及びクエン酸のような抗凝固剤で前処理することが好ましい。しかしながら、抗凝固剤は、酵素反応、特に、ＰＣＲ作用を抑制しやすく、このような理由から、抗凝固剤は、ＰＣＲ反応に添加される血液の量を決定するに制限要素となる。両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を使用する本発明は、抗凝固剤による前記欠点を克服することができ、直接増幅において、既存に使用する血液量より多い量の血液使用、例えば、実施例IIIに記載されたように、反応混合物の総容量の１０％(v/v)まで使用可能にする。
【００５０】
本発明の最も独特な特徴は、生物学的試料による酵素反応抑制を克服するための添加剤として、両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を使用するということである。多様な物質(例えば、ヘム、免疫グロブリンＧ、無機塩、胆汁酸塩、ＤＮＡ分解酵素、及びタンパク質分解酵素)が生物学的試料に存在して、前記物質は、反応に参与する酵素の活性を抑制する。本発明者らは、両性イオン性緩衝液及び非還元性炭水化物が、生物学的試料に存在して酵素反応を抑制する物質による障害を克服することができることを見出した。本発明のこのような大きな成果は、両性イオン性緩衝液または非還元性炭水化物のそれぞれによっても得られる。好ましくは、本発明では、両性イオン性緩衝液と非還元性炭水化物とを両方とも使用する。
【００５１】
本明細書において、用語“両性イオン性緩衝液”とは、同じ分子に酸性と塩基性グループを両方とも有する化合物を含む緩衝液を意味する。したがって、中性のｐＨにおいて、ほとんどの両性イオン性緩衝液は、陽イオンと陰イオンとを同時に有するようになる。 両性イオン性緩衝液は、時々“グッド 緩衝液(Good buffer)”と呼ばれる(33)。本発明において、当業者に知られたどんな両性イオン性緩衝液でも利用できて、好ましくは、HEPES(4-(2-Hydroyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)、Tricine(N-Tris(hydroxymethyl)methylglycine)、Bicine(NN-bis(2-hydroxyethyl)glycine)、Taps(N-Tris(hydroxymethyl)methyl-3-aminopropanesulphonic acid)、ACE(N-(2-acetamido)-2-aminoethane-sulfonic acid)、ADA(N-(2-acetamido)-iminodiacetic acid)、MES(2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid)、MOPS(3-(N-morpholino)propanesulfonic acid)、及びMOPSO(3-N-morpholino)-2-hydroxypropanesulfonic acid)、より好ましくは、MOPSO(3-[N-Morpholino]-2-hydroxypropanesulphonic acid)、PIPES(Piperazine-1,4-bis(2-ethanesulfonic acid))、及びCAPS(N-Cyclohexyl-3-aminopropanesulfonic acid)、最も好ましくは、HEPES、Tricine及びBicineを含む。 
【００５２】
本発明で使用された両性イオン性緩衝液の濃度は、特に制限されず、好ましくは５〜６０ｍＭ、より好ましくは、１０〜６０ｍＭ、最も好ましくは、１０〜５０ｍＭである。両性イオン性緩衝液により調節される反応混合物のｐＨは、酵素の種類のような反応条件により様々であり、好ましくは、ｐＨ６．８〜９．５、より好ましくは、ｐＨ７．５〜９．０、最も好ましくは、ｐＨ８．０〜８．７である。
【００５３】
直接酵素反応を可能にする本発明の特徴は、非還元性炭水化物を単独使用しても達成することができる。
【００５４】
本明細書に記載された用語“非還元性炭水化物”は、２つ以上のヒドロキシグループを有して、還元力のない炭化水素を意味する。非還元性炭水化物は、ポリオール(ポリヒドロキシ化合物)及びこれの誘導体を含む。前記非還元性炭水化物の代表的な例は、グリコール、ポリグリコール(例えば、ポリエチレングリコール)及びポリグリセロールを含む。また、非還元性炭水化物の代表的な例は、非還元性糖または糖類(saccharides)と呼ばれる炭素の水和物、及びこれの誘導体を含む。例示的な非還元性糖は、スクロース及びトレハロースのような二糖類、ラフィノース及びメレジトースのような三糖類、スタチオース(stachyose)のような四糖類を含むが、これに限定されない。非還元性糖の誘導体は、ソルビトール、マンニトール、エリスリトール及びキシリトール(単糖類由来)、ラシトール(lacitol)及びマルチトール(maltitol)(二糖類由来)のような糖アルコール(アルドースとケトースの水酸化物)；グルコン酸及びグルコン酸γ−ラクトンのようなアルドン酸及びそのラクトン誘導体; リバラ酸(ribaraic acid)、アラビナル酸(arabinaric acid)及びガラクタル酸(galactaric acid)のようなアルダル酸(aldaric acid) 及びそのラクトン誘導体；グルクロン酸(glucuronic acid)、ガラクツロン酸(galacturonic acid)及びマンヌロン酸(mannuronic acid)のようなウロン酸(uronic acid)；トレハロースオクタアセテート、スクロースオクタアセテート、及びセロビオースオクタアセテートようなエステル誘導体(好ましくは、Ｃ1〜Ｃ4脂肪酸エステル誘導体)；そして、ヒドロキシグループがエーテルに転換されたエーテル誘導体(好ましくは、Ｃ1〜Ｃ4アルキルエーテル誘導体)を含むが、これに限定されない。前記非還元性炭水化物のＤとＬ、両方の形態とも使用できる。
【００５５】
好ましくは、本発明に有用な非還元性炭水化物は、非還元性二糖類、三糖類、四糖類、及び単糖類由来の糖アルコールを含み、より好ましくは、非還元性二糖類及び単糖類由来の糖アルコール、最も好ましくは、ソルビトール、マンニトール、ラフィノース、及びスクロースを含む。
【００５６】
本発明に使用された前記非還元性炭水化物の量は、特に制限されないが、反応混合物の総重量に対し、好ましくは、少なくとも１．５％(w/v)以上、より好ましくは、少なくとも２％(w/v)以上、最も好ましくは、２〜３０％(w/v)である。
【００５７】
本発明の好ましい具現例によると、本発明は、核酸分解酵素−媒介反応に適用できる。より好ましくは、本発明は、インベーダーアッセイ[Invader assay(34-36)](米国特許第5,846,717号、第6,090,543号、第6,001,567号、第5,985,557号及び第5,994,069号)により行う。生物学的試料を直接利用した直接インベーダーアッセイにおいて、両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物は、生物学的試料がＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼ−媒介反応のような酵素反応を妨害することを抑制する。
【００５８】
オーバーラッピングされたオリゴヌクレオチドプローブの混成化により形成された複合体を切断するＦＥＮ−１エンドヌクレアーゼのような構造−特異酵素を利用することにより、インベーダーアッセイは、特定のＤＮＡ及びＲＮＡを検出する。増加された温度及び複数のプローブの中で一つのプローブの過量使用は、温度サイクルがなくても存在するそれぞれのターゲット配列に対して複数のプローブが切断されるようにする。切断されたプローブは、二番目の標識プローブの切断を誘導する。前記二番目のプローブオリゴヌクレオチドは、蛍光ｄｙｅで５’−末端に標識され得て、この標識は、二番目ｄｙｅまたは他のクェンチング部分によりクェンチングされ得る。切断がなされた直後、標準蛍光プレートリーダー、または反応過程の間に蛍光データを収集できる機械を使用して、クェンチングされたｄｙｅ−標識生成物を検出することができる。インベーダーアッセイは、増幅されなかったヒト遺伝体ＤＮＡから特定な突然変異及びＳＮＰｓ(single nucleotide polymorphisms：単一ヌクレオチド多形性)を検出することができる。インベーダーアッセイは、マルチプレックスＰＣＲと結合された形態で、遺伝体関連研究に幅広く利用できる(36)。
【００５９】
本発明に使用される反応混合物は、両性イオン性界面活性剤、牛血清アルブミン、ポリアミン、または前記物質の組み合わせを追加的に含むことができる。前記の添加剤も生物学的試料の酵素反応抑制を克服することができる。しかしながら、本発明において、直接酵素反応に前記添加剤は必須的ではない。本発明において有用な両性イオン性界面活性剤は、n-オクチル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート(n-octyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-  propanesulfonate)、n-デシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート(n-decyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate)、n-ドデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート(n-dodecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate)、n-テトラデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート(n-tetradecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate)、n-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート(n-hexadecyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propanesulfonate)、CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)及びzwittergent(Nalkyl-N,N-dimethyl-3-ammonio-1-propane-sulfonate)を含むが、これに限定されるものではなく、好ましくは、CHAPS及びzwittergent、より好ましくは、CHAPSである。本発明において有用なポリアミンは、好ましくは、スペルミン、プトレスシン(putrescine)、スペルミジン及びトリエチレンテトラミン、より好ましくは、スペルミン及びトリエチレンテトラミン、最も好ましくは、トリエチレンテトラミンである。
【００６０】
本発明の利点は、生物学的試料、特に血液にある少ないコピー数の核酸分子を直接増幅した時に最も明確に現れる。本明細書に、鋳型としての核酸分子を言及しながら使用する用語“少ないコピー数(low-copy number)”は、ターゲット核酸分子の１〜１０００コピーを意味する。少ないコピー数を有する生物学的試料を使用する直接増幅は、まだ報告されたことがない。本発明は、実施例Ｖに述べたように、血液を利用して、少ないコピー数(例えば、総反応容量５０μｌに含まれたＨＩＶ−１核酸１０コピー)のＨＩＶ−１核酸を直接増幅することができる。
【００６１】
本発明は、生物学的試料に存在する酵素抑制剤による障害を克服することにより、直接酵素反応(好ましくは、増幅反応、より好ましくは、ＰＣＲ−基盤増幅反応)の実現を可能にする新しい接近に関するものである。本発明者らが知っている限り、本発明により達成された結果は、現在まで報告された他の直接増幅過程、例えば、Nishimuraら(米国特許第5,935,825号及び第6,413,747号)及びAl-Soud ら(16, 37)の方法と比較し、最も卓越である。
【００６２】
より具体的には、Nishimuraらの方法によると、AmpliTaq Gold DNA重合酵素(Applied Biosystems, Inc.)、FastStart Taq DNA重合酵素(Roche Applied Science,Inc.)、及びHotStarTaq DNA重合酵素(Qiagen, Inc.)のようなホットスタートＰＣＲ用化学的−変形重合酵素が、Nishimuraらが提案した条件で作動できないという深刻な問題を有している。また、Al-Soudらの試みによると、少ないコピー数を有するＤＮＡ鋳型に対する増幅結果を得ることができない。前記従来の技術とは違って、本発明は、ほぼ全ての増幅反応において、優れた作動性を示す。
【００６３】
Nishimuraらの方法は、Tris(hydroxyamino)methane(Tris)反応緩衝液(10mM Tris-HCl, 25℃でpH 8.9以上, 50mM KCl)を使用することにより、一般的なＰＣＲ反応緩衝液のｐＨを８．９以上まで増加させることにより、ＰＣＲ抑制を克服する戦略を提案した。その反面、本発明は、両性イオン性緩衝液(またはグッド緩衝液、25℃でpH 8.3〜8.9)及び/または非還元性炭水化物を使用して生物学的試料によるＰＣＲ抑制を完璧に克服する。本明細書の実施例に記載されたように、血液内の核酸分子を増幅するための本発明のＰＣＲ反応は、低いｐＨであっても、Ｔｒｉｓ緩衝液−使用技術より非常に卓越なＰＣＲ抑制克服能力を示す。
【００６４】
さらに、Nishimuraらは、ただ Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素を使用して得た結果だけを報告した。Shimadzu社のAmpdirect（登録商標）に関する報告は、Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素を使用した血液−使用直接増幅において、何の成果も提示できなかった。前記の報告とは違って、本発明は、Ｔａｑ  ＤＮＡ重合酵素と同様に、Ｔｔｈ  ＤＮＡ重合酵素、Ｐｆｕ  ＤＮＡ重合酵素、及びＰｗｏ  ＤＮＡ重合酵素を含む多様な熱安定性重合酵素を使用して実施することができる。
【００６５】
AmpFLSTR（登録商標） Identifiler キット(Applied Biosystems社)は、遺伝子検査または同定に最も広く使用されるキットである。血液試料を直接前記キットに適用した時、増幅物が生成されない。しかしながら、反応混合物に両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物が添加されると、実施例ＩＸに述べたように、前記キットは、所望の分析結果を生産する。また、本発明によると、Guthrieカード、FTAカード及びろ過紙についた血痕を鋳型として直接利用し、遺伝子実験を行うことができる。
【００６６】
本発明は、また、直接酵素反応を行うためのキットを提供する。直接酵素反応を行うことができる本キットは、酵素反応に必要な酵素、基質及び補助因子のような他の付加的な要素を選択的に含むことができる。本発明のキットがＤＮＡ分子の増幅のために製造される場合、前記キットは、ＰＣＲ反応に必要なＤＮＡ重合酵素、補助因子、及びジオキシヌクレオチド−５−三燐酸(dNTPs)のような試薬を選択的に含むことができる。選択的に、前記キットは、多様な種類のポリヌクレオチド分子、逆転写酵素、多様な緩衝液及び試薬、及びＤＮＡ重合酵素の作用を抑制する抗体を含むことができる。前記キットはまた、陽性及び陰性対照反応を行う試薬を含むことができる。与えられた反応に使用される試薬の適量は、本明細書の開示内容が把握できる当業者により容易に決定され得る。本発明のキットは、典型的に、前記成分を含む多数の別途パッケージングまたはコンパートメントに製作できる。
【００６７】
本発明のまた他の様態によると、本発明は、両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を含む反応混合物に生物学的試料を接触させる段階を含み、前記生物学的試料内に存在する核酸分子は、前記酵素反応前に精製されないことを特徴とする生物学的試料の核酸分子−関与酵素反応の妨害を抑制する方法を提供する。
【００６８】
本発明の他の様態によると、本発明は、核酸分子−関与直接酵素反応のための反応混合物を製造するための両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物の用途を提供する。
【００６９】
上記の本発明の二様態は、上述の本発明の方法の原理に従うため、その共通する内容は、本明細書の複雑性を招来する過度なる重複記載を避けるために、その記載を省略する。
【００７０】
退屈な過程と見なされる核酸精製(分離)は、時間と費用が所要されて、一般に、フェノールのような有害な試薬が使用される。また、前記過程は、次のような問題点を有する：(i)研究者の感染；(ii)核酸試料間の交差汚染；(iii)核酸の損失、特に、微量の試料が存在する場合。したがって、核酸の精製過程のない直接酵素反応(特に、増幅反応)の開発が長年の課題として残っている。また、多様な試料を利用した比較研究時、核酸の精製は、各資料間の精製効率の差異による誤りを誘発する可能性がある。したがって、上記問題点は、核酸を精製せず、生物学的試料を直接使用することにより克服できる。
【００７１】
本発明によると、酵素反応の自動化(特に、増幅反応)は、簡単な試料準備により容易に具現できて、微量の試料を利用する場合も、酵素反応を行うことができる。また、本発明によると、時間が大いに節約されるため、急迫な状況に対処し迅速に増幅結果が得られるようにして、ＤＮＡ精製に利用される装備と試薬が必要ないため、簡単な方式で、実験室外部における分析も可能にする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７２】
以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明する。これら実施例は本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとって自明なことであろう。
【００７３】
他に明確な表記がされていない以上、固体内の固体、液体内の液体、及び液体内の固体混合物に対する百分率表示は、それぞれ、ｗ/ｗ、ｖ/ｖ、及びｗ/ｖにしたがって記載されたものである。
【実施例】
【００７４】
実施例Ｉ：血液試料を利用した核酸増幅(多様な緩衝液種類を利用)
Taq DNA重合酵素を利用したPCR反応は、10倍濃縮されたPCR緩衝液 (100mM Tris-HCl, 500mM KCl及び15 mM MgCl2含有)を一般に使用して、Trisの緩衝力により調節されるpHは、主に8.3であり、高くは、9.0まで緩衝して使用される。
【００７５】
グッド緩衝液(Good buffer)が血液によるPCR活性抑制を克服できるかどうかを究明するために、100mM Trisまたはグッド緩衝液(Tricine, HEPES及びBicine)と100mM KCl及び15mM MgCl2を含有した緩衝液を用意して、血液試料を直接PCR反応に使用した。Tris-緩衝液のpHは、8.3〜9.0(0.1ずつ増加)に、Tricine-緩衝液とHEPES-緩衝液は、8.0〜9.0(0.1ずつ増加)、そしてBicine-緩衝液は、8.0〜8.8(0.1ずつ増加)に調節した。全ての緩衝液のpHは、25℃で測定されたものである。
【００７６】
PCR反応のために、全体5μlの反応混合液を使用して、この反応液には、10倍濃縮されたPCR緩衝液5μl、0.2mM  dNTPs混合物及びヒトβ-グロビン(3)に対するGH20(センスプライマー, 5'-CAACTTCATCCACGTTCACC-3')とGH21(アンチセンスプライマー, 5'-GGAAAATAGACCAATAGGCAG-3')を0.4μM含有させた。AmpliTaq DNA 重合酵素(5unit/μl、Applied Biosystems社)、そしてヘパリンが前処理された血液試料1μlを直接PCRに使用した。PCR反応は、次のような温度条件で行った：94℃で10分間反応した後、94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で1分間の反応を40回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を7分間行った。血液内に存在する細胞を破壊して、タンパク質分解酵素やDNA分解酵素のようなPCR抑制剤を変性させるために、94℃で10分間初期変性過程を行った。増幅された生成物は、0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含む2%アガロースゲルで電気泳動した後、UV放射光で分析した。
【００７７】
図１は、GH20/GH21プライマーを使用した408 bp β-グロビンの増幅結果を示す。Tris-緩衝液の使用時、pH8.5以上の範囲でのみPCR生成物が算出されたのに対し(レーン3-9)、グッド緩衝液は、低いpH範囲でも、即ち、Tricine-緩衝液は、pH8.3で(レーン12)、Bicine-緩衝液は、pH8.1(レーン22)、HEPES-緩衝液は、pH8.0(レーン30)でもPCR生成物を算出した。したがって、グッド緩衝液は、血液試料のPCR活性抑制を成功的に克服するということが分かる。
【００７８】
図２は、GH20/KM38プライマー(KM38プライマー、5'-TGGTCTCCTTAAACCTGTCTTG-3')を使用した325 bp β-グロビンの増幅結果である。PCR条件は、GH20/GH21プライマーを使用した時と同一であった。図１の結果と同様に、Tris-緩衝液を使用した場合、pH8.5以下の範囲で血液試料により増幅が抑制されたが、グッド緩衝液であるTricine-緩衝液を使用した場合、pH8.3で血液試料を利用した直接PCR増幅が可能であった。
【００７９】
489 bpのPCR生成物を得るためにセンスプライマー(E6f、 5'-TGTTCACTTGTGCCCTGACT-3')及びアンチセンスプライマー(E6r, 5'-GGAGGGCCACTGACAACCA-3')を利用して、p53遺伝子を増幅した。0.2 mM dNTPs混合液、0.4μMプライマー、0.4μl  AmpliTaq DNA重合酵素、そして、1μlの血液が添加された全体50μlのPCR反応混合液を使用した。PCR反応は、次のような温度条件で行った：94℃で10分間反応した後、94℃で30秒、56℃で30秒、72℃で1分間の反応を40回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を7分間行った。増幅された生成物は、2%アガロースゲルで電気泳動して分析した。図３から分かるように、Tris-緩衝液を利用して増幅した場合、pH8.8から弱いバンドを示し始め、pH9.0と9.2で強いバンドを示した。その反面、Tricine-、Bicine-及びHEPES-緩衝液を使用した場合は、著しく低いpHでPCR増幅バンドを示した。
【００８０】
HEPES-緩衝液は、図1及び3から分かるように、より広いpH範囲でより優れた結果を示した。このような優れた結果が出た理由は、dNTPとプライマーのようなPCR反応物がpH8.3以上のHEPESに添加されると、HEPESの緩衝地域(pH6.8〜8.2)のため、PCR混合物のpHを8.3近くに急激に減少させるためであり、これは、多様なpH範囲で類似したPCR結果が出るようにすることに寄与する。
【００８１】
成功的な直接増幅のために、血液内に存在するPCR抑制剤の作用は、抑制されなければならない。代表的な血液内抑制剤であるヘモグロビンの作用が、変性−誘導性pHと温度条件下で、ヘモグロビン分子間の相互結合を通じて抑制され得ると、本発明者らは判断した。本発明者らは、前記論理を、直接増幅を可能にする適切な緩衝液を選択するに適用した。
【００８２】
Nishimuraらは、高いpHが血液試料を利用する直接PCR増幅を可能にすると報告した。一方、グッド緩衝液を使用した時の卓越な結果は、グッド緩衝液を含有しているPCR反応混合物が高いpHを有するためではなく、このような事実は、温度によるTricineのpH値が、他のグッド緩衝液に比べてより大きく変化するにもかかわらず(Merck Index, Tricine:ΔpKa/℃ -0.021, Bicine: ΔpKa/℃ -0.018, HEPES: ΔpKa/℃ -0.014)、Tricine緩衝液が低いpHで血液試料からPCR増幅物を産出したという点から分かる。Tris緩衝液のpHは、5〜25℃で0.03単位で、そして25〜37℃で0.025単位で減少すると知られている(Sigma, Inc.資料)。
【００８３】
本発明者らは、グッド緩衝液のpH範囲特性を利用したのではなく、次の特性を利用した：両性イオン性を有して、反応性がなく、低いイオン強度を有する。Tris緩衝液とは違って、グッド緩衝液は、陽電荷と陰電荷とを両方とも有しており、陽電荷または陰電荷を生体分子と結合することができる。さらに、本発明者らは、グッド緩衝液が、その低いイオン強度のため、タンパク質の高温変性を強化させることができることを認識した。タンパク質の沈殿は、等電点近傍のpHで誘導されて、低いイオン強度で促進される。したがって、このような事実により、本発明者らは、グッド緩衝液を使用したPCR反応物が低いイオン強度を有するようになり、温度減少により、pH範囲がPCR抑制タンパク質の等電点近傍に到達することにより、血液内にあるタンパク質の凝集を誘導して、PCR抑制剤の作用を遮断するという論理を導出した。
【００８４】
実施例II：血液資料を利用した核酸増幅(多様な添加剤を利用)
血液資料を利用した直接増幅において、添加剤の効果を調べるために、非還元性炭水化物、界面活性剤、または一般的なPCRに利用される他の公知された添加剤(例えば、ポリアミン、BSA及びベタイン)を使用してPCR増幅を行った。
【００８５】
実施例II-1：非還元性炭水化物の効果
直接増幅において、非還元性炭水化物とこれの誘導体の肯定的な効果を究明するために、血液試料から、精製過程を経なかったDNAを鋳型としてPCRを行って、p53を増幅した。Tricine-緩衝液(pH8.3)を使用したことを除いては、利用されたプライマーと条件は、実施例Iと同様である。
【００８６】
図４から分かるように、グルコース[パネルA、レーン3〜6、それぞれ、0.18、0.38、0.75及び1.5％(w/v)]を使用したPCR増幅は、増幅物を生産できなかった。これと同様に、ラクトース[写真A、レーン11〜14、それぞれ、0.18、0.38、0.75及び1.5％(w/v)]も、高濃度である場合、p53遺伝子を増幅するに失敗した反面、低い濃度では、弱い生成物バンドを示した。これは、正常対照群のバンド(パネルA及びB、レーン1)と比較してみると、低濃度のラクトースが直接増幅の成功に寄与するのではないと評価することができ、高濃度で直接PCRの活性を抑制すると考えられる。このような結果から、還元性炭水化物は、増幅抑制剤を含有している生物学的試料を利用した直接増幅を可能にするのではないという結論が得られる。
【００８７】
血液の増幅反応抑制を克服できる能力を立証するために、代表的な非還元性糖である、スクロース[図4、パネルA、レーン7〜10、それぞれ、1.25、2.5、5及び10％(w/v)]、トレハロース[図4、パネルB、レーン3〜6、それぞれ、0.94、1.8、3.8及び7.5%(w/v)]、そして、ラフィノース[図4、パネルB、レーン7〜10、それぞれ、0.87、1.8、3.5及び7％(w/v)]を試験してみた。還元糖は、それらの濃度増加により、増加した克服能力を示す。また、メレジトース[図4、パネルA、レーン15〜18、それぞれ、0.6、1.25、2.5及び5%(w/v)]、そして、スタチオース(stachyose)[図4、パネルA、レーン19〜22、それぞれ、0.6、1.25、2.5及び5%(w/v)]のような他の非還元糖も、血液の増幅反応抑制を克服することを明かした。
【００８８】
血液試料を直接増幅するに対する成功は、ソルビトール[図4、パネルB、レーン11〜14、それぞれ、1.25、2.5、5及び10％(w/v)]とマンニトール[図4、パネルB、レーン15〜18、それぞれ、0.6、1.25、2.5及び5%(w/v)]のような非還元性アルジトール[alditols(糖アルコール)]の場合でも確認することができた。
【００８９】
その他に、本明細書に記載された非還元性炭水化物の定義に属しないポリビニルピロリドン[図4、パネルB、レーン19〜22、それぞれ、0.25、0.5、1及び2％(w/v)]は、血液試料を直接増幅に利用するに失敗した。
【００９０】
結論的に、前記結果は、非還元性炭水化物が、増幅抑制剤を含有する生物学的試料を直接増幅に利用することを可能にする卓越な添加剤の役割をすることを示す。
【００９１】
実施例II-2：トレハロース及びラフィノースの効果に対する具体的な評価
直接増幅において、トレハロース(代表的な二糖類)とラフィノース(代表的な三糖類)の効果をより具体的に調べるために、血液試料内にある精製されなかったDNAを鋳型として使用するPCR増幅を行って、p53を増幅した。Tris-緩衝液(pH8.3)またはTricine-緩衝液(pH8.3)、そしてヘパリンが前処理された2.5μlの血液試料[5%(v/v)、全体PCR反応容量の相対的容量]を使用したことを除いては、プライマーと条件は、実施例Iと同様にした。
【００９２】
図5から分かるように、非還元性炭水化物を添加しなかった5%の血液試料と2.0ユニットのTaqDNA重合酵素を使用した、既によく知られたPCR反応(レーン1、13)は、血液試料により抑制された。その反面、Tris-緩衝液が使用された場合、7%ラフィノースが弱いバンドを示して(レーン6)、トレハロースは、濃度が増加するにつれて、より明らかなバンドを示した(レーン8〜12)。これとは違って、高濃度では、ラフィノースとトレハロース、両方ともTricine-緩衝液の中で明確な増幅バンドを示した(レーン16〜18、22〜24)。
【００９３】
さらに、トレハロースの効果は、図6に示されたように、濃度増加(0〜30%(w/v))により再び確認された。このようなトレハロース効果は、濃度増加に比例してさらに明確に究明された。
【００９４】
したがって、非還元性炭水化物が血液試料に含有された抑制剤の活性を完璧に克服することができて、それにより、生物学的試料を利用した直接増幅が可能であることを確認することができる。
【００９５】
緩衝液(pHと種類による)と非還元性炭水化物の連合効果を調べるために、トレハロースの有・無下で、Tris-緩衝液(pH8.3〜9.0、9.2)またはTricine-緩衝液(pH8.0〜9.0)を使用して、p53を直接増幅した。プライマーと条件は、1.0ユニットのTaqDNA重合酵素を使用したことを除いては、上述と同様にした。いかなる添加剤も使用しなかった。Tris-緩衝液を使用した場合、相対的に高いpH(pH9.0以上など)でのみPCR増幅生成物を示したのに対し、Tricine-緩衝液の使用時、相対的に低いpH(8.6以上など)でPCR増幅生成物を示した(図8、パネルA)。3%(w/v)のトレハロースが添加された場合、増幅物を生成するpHが低くなった：Tris-緩衝液使用時、pH8.5以上、Tricine-緩衝液使用時、pH8.2以上(図8、パネルB)。
【００９６】
したがって、適切な緩衝液の種類と適切なpH条件と共に、非還元性炭水化物の利用は、生物学的試料が増幅反応を妨害する効果を非常に大いに抑制することができることが分かる。
【００９７】
実施例II-3：界面活性剤の効果
CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate)のような中性界面活性剤が血液試料の直接増幅を増進させることができるかどうかを実験した。実施例Iと同様な方法により、p53を増幅するためのPCR反応を行った。図8から分かるように、Tricine-緩衝液(ｐH8.3 または8.7)使用時、CHAPSは、濃度-依存的に血液試料を直接使用した増幅を促進した。
【００９８】
実施例II-4：ポリアミンの効果
ポリアミンの代表的な物質としてのスペルミジンのPCR増幅効能性の増進は、既に報告されている。Katoらは、高濃度のポリアミンが血液、小便、そして糞便に含まれているPCR抑制剤の活性を克服することができると言及した(米国特許第6,413,747号)。
【００９９】
Tris緩衝液とグッド緩衝液を使用した時、ポリアミンの効果を比較するために、PCR反応を通じてp53を増幅した。多様な濃度のスペルミジンまたはトリエチレンテトラミンとヘパリンが前処理された2%(v/v)血液を使用した。PCRのためのプライマーと反応条件は、実施例Iと同様にした。
【０１００】
図9から分かるように、pH8.3のTris-緩衝液で、全ての濃度(4mMでさえも)のスペルミジン及びトリエチレンテトラミンが増幅物を生産できなかった反面(レーン1〜6)、pH8.7のTris-緩衝液では、0.5mMと1mMの濃度では、それぞれPCR生成物の増加を示した(レーン13〜18)。したがって、pH8.3または8.7のTricine-緩衝液を使用したPCRでポリアミンの効果を評価することが難しかった。しかも、Tris-緩衝液とTricine-緩衝液で、さらに高い濃度のポリアミンは、PCR活性を抑制した。ヘパリン前処理した4%(v/v)の血液を使用した実験で、図10から分かるように、血液試料を利用したポリアミンの陽性効果がTricine-緩衝液を使用した時に確認された。
【０１０１】
実施例II-5：BSAの効果
Kreader(12)とAl-Soudら(16,37)は、高い濃度のBSAが血液試料のPCR抑制を克服できると提案した。Tris緩衝液とグッド緩衝液におけるこのようなBSAの効果を試験するために、PCR反応を行ってp53を増幅して、2%(v/v)のヘパリン前処理された血液を使用した。PCRのためのプライマーと反応条件は、実施例Iと同様にした。
【０１０２】
図11に示されたように、BSAを含有したpH8.3または8.7のTris-緩衝液を使用したPCR反応で、p53増幅物が生成された；BSAを使用しなかった場合は、p53増幅物が生成されなかった(レーン1と13)。その反面、BSAを含有するか、または含有していないpH8.3または8.7のTricine-緩衝液を使用した増幅反応の場合、p53増幅物が生成された。特に、pH8.3のTricine-緩衝液を使用した場合、その濃度の増加により、BSAの効果がさらに明確になることが明らかに確認された。
【０１０３】
したがって、BSAが増幅反応液に追加的に添加される場合、両性イオン性緩衝液を含む本発明の緩衝液システムを使用した直接増幅は、さらに高い効率性を有することができることが分かる。
【０１０４】
Al-Soudらは、BSA効果がタンパク質分解酵素からDNA重合酵素を防衛して、Taq重合酵素に結合することにより、ヘムグループから保護されると記述した。それにもかかわらず、高いpHのTris-緩衝液とpH8.3のTricine-緩衝液が血液の直接PCRを可能にするという点を考慮すると、BSAの効果は、タンパク質分解酵素に対する防衛能力よりは、ヘムグループを保護する機能によるものであると考えられる。さらに、多分、高い温度における変性された形態のBSAがPCR活性阻害に関与するタンパク質の凝集を容易に誘導して、タンパク質の抑制活動を減少させると判断される。
【０１０５】
実施例III：抗凝固剤の効果分析
増幅のための血液試料は、主にヘパリン、EDTA及びクエン酸のような抗凝固剤で前処理されて用意される。しかしながら、このような抗凝固剤は、PCR活性を阻害し易いため、PCR反応に添加される血液の量を決定するに制限要素となった。
【０１０６】
本発明の直接増幅システムに適合した血液量を評価するために、グッド緩衝液を使用しPCR反応を行って、p53を増幅した。PCRのためのプライマーと反応条件は、実施例Iと同様にした。
【０１０７】
図12から分かるように、pH8.7のTricine-緩衝液を使用した直接PCR反応は、2.5%(v/v)のヘパリン前処理された血液及び5%(v/v)のEDTA-またはクエン酸処理された血液を収容することができた。抽出されたヒトDNA(Promega社)を鋳型として利用したPCR反応は、非特異的な結果を示して、p53バンド以外の数種の他のバンドが観察された。即ち、血液試料そのものを鋳型として使用すると、PCR反応がホットスタートPCRと同様な条件となり、ターゲットDNAが一回目のサイクルのアニール段階で、初期にプライマーと結合するようになるが、これは、血液内の細胞が高温で破壊されるためである。
【０１０８】
Tricine-緩衝液(pH8.7)に2.4%トレハロースと4mg/ml BSAを添加して使用した場合、本発明の直接増幅反応は、5%(v/v)までのヘパリン−またはクエン酸処理された血液、そして10%(v/v)EDTA-処理された血液に対して増幅物を生産した。
【０１０９】
実施例IV：高いGC含量を有する鋳型DNAに対する直接PCR
高い含量のGCを有する鋳型DNAは、ベタインとテトラメチルアンモニウムクロライド(TMAC)またはジメチルスルホキシド(DMSO)を利用してPCR-増幅をすることができると報告されている。
【０１１０】
このような添加剤を入れた時、高いGC含量を有する鋳型またはプライマーに対する直接PCRが成功的であるかどうかを調べるために、Tricine-緩衝液(pH8.7)及びベタインを使用した直接PCRを行った。網膜芽細胞腫[retinoblastoma(RB)]遺伝子に対する増幅反応のために、180bpの増幅物を得るために、センスプライマー(E1SD, 5'-CAGGACAGCGGCCCGGAG-3')とアンチセンスプライマー(I1SD, 5'-CTGCAGACGCTCCGCCGT-3')を; apolipoprotien E(apoE)に対する遺伝子に対する268 bpの増幅物を得るために、センスプライマー(apoE-f, 5'-GGCACGGCTGTCCAAGGA-3')とアンチセンスプライマー(apoE-r, 5'-CTCGCGGATGGCGCTGAG-3')を使用した。両方のプライマーセットとも、高いGC含量を有するため、一般的なPCR方法では、増幅物を生産できなかった。
【０１１１】
10倍濃縮されたPCR緩衝液5μl、0.2mM dNTPs混合液、0.4μMプライマー、2.0ユニットのAmpliTaq DNA重合酵素(Applied Biosystems社)と、ヘパリン前処理された1μlの血液試料を含む、全体50μl容量のPCR反応液を使用して直接PCRを行った。PCR反応は、次のような温度条件下で行われた：94℃で10分間反応した後、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で１分間の反応を40回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を7分間行った。ヒト遺伝体DNA鋳型(Promega社)のためにTris-緩衝液(pH8.3)を、そしてヘパリン前処理された血液鋳型のためにトレハロースを含むTricine-緩衝液(pH8.7)を使用した。使用されたベタインの濃度を0、0.5、1.0、1.5、2.0及び2.5Mに合わせた。
【０１１２】
図14に示されたように、グッド緩衝液と1.0Mベタインを使用した直接PCRは、所望の増幅物を生産した。したがって、高いGC含量を有する鋳型に対する直接増幅は、高いGC含量を有する鋳型により引き起こされた問題点を克服できる添加剤(ベタイン、TMAC、DMSO)と共に、グッド緩衝液及び/または非還元性炭水化物を使用する場合、成功的に行われることが確認できる。
【０１１３】
実施例V：化学的に変形されたTaq重合酵素を利用した少ないコピー鋳型の増幅
Nishimuraらは、血液試料の直接PCRが、pH 9.0以上で、Tris、CHESまたはCAPSOの使用により達成できると報告した。しかしながら、もしPCR反応液のpHが高ければ、AmpliTaq Gold DNA重合酵素(Applied Biosystems社)、FastStart Taq DNA重合酵素(Roche Applied Science社)、そしてHotStarTaq DNA重合酵素(Qiagen社)のようなホットスタートPCRのための化学的に変形された重合酵素は、再活性がほとんどない。
【０１１４】
グッド緩衝液及び/または非還元性炭水化物は、上述したように、低いpH(例えば、pH8.3)でさえも、生物学的試料に存在する抑制剤の活性を遮断することができるため、このような化学的に変形された重合酵素を使用するホットスタートPCRは、本発明の条件下でも成功的に行うことができる。
【０１１５】
感染性疾患または法医学における増幅反応は、主に少ないコピー数の核酸試料を利用する。特に、HIV-及びHBV-関連疾患のような感染性疾患の診断は、ウイルス性感染の早期診断が非常に重要である。即ち、少ないコピー数のウイルス核酸分子は、正確且つ信頼できるような診断結果を得るために、増幅されなければならない。本発明によると、グッド緩衝液と非還元性炭水化物を使用する条件下で、化学的に変形されたTaq重合酵素を利用して、少ないコピー数のHIV-1を増幅することができる。
【０１１６】
Al-Soudら(37)は、AmpliTaq Gold DNA重合酵素と高濃度のBSAを使用して血液試料にあるListria単核細胞遺伝子からDNA分子を増幅した。しかしながら、彼らは、少ないコピー数のDNA分子からは増幅結果を提供できなかった。Katoら(米国特許第6,413,747号)は、少ないコピー数のDNA分子において、ポリアミンを使用して増幅結果を提示したが、血液試料を直接的に使用してはいなかった。その代わりに、彼らは、HIV DNA分子が添加された収集された白血球試料、即ち、ヘモグロビンと免疫グロブリンG分子のようなPCR抑制剤が欠如された試料を間接的に使用した。
【０１１７】
Tricine-緩衝液(pH 8.3)と、0.2mM dNTPs混合液、0.5μMプライマー、2.5mM MgCl2、2.5ユニットのAmpliTaq Gold DNA重合酵素またはHotStarTaq DNA重合酵素と、ヘパリン−前処理1μlの血液試料を含む全体容量50μlのPCR反応液を使用して、少ないコピー数のHIV-1(26, 31, 38)に対するPCR反応を行った。使用されたプライマーセットの塩基配列は、次のようである：SK145 (5'-AGTGGGGGGACATCAAGCAGCCATGCAAAT-3')とSK431(5'-TGCTATGTCAGTTCCCCTTGGTTCTCT-3');または SK38(5'-ATAATCCACCTATCCCAGTAGGAGAAAT-3')とSK39(5'-TTTGGTCCTTGT CTTATGTCCAGAATGC-3')。
【０１１８】
HIV-1 DNA(HIV-1陽性対照群DNA, Applied Biosystems社)のコピー数は、0から50まで、10ずつ増加させた。血液濃度の変化による増幅を測定するために、20コピーのHIV-1 DNAをヘパリン処理された血液試料にそれぞれ、0、1、2、3、4、5及び6μlずつ添加した。
【０１１９】
SK145とSK431プライマーセットのPCR反応は、次のような温度条件下で行った: 95℃で15分間反応した後、94℃で30秒、60℃で1分間の反応を45回繰り返した後、60℃で最後の延長反応を10分間行った。増幅物の大きさは、142bpであった。SK38とSK39プライマーセットのためには、115 bpの増幅物を得るために、次のような温度条件下で増幅を行った：95℃で15分間反応した後、94℃で30秒、55℃で1分、72℃で1分間の反応を45回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を7分間行った。
【０１２０】
AmpliTaq Gold DNA重合酵素を使用した図15に示されているように、ヘパリン前処理した6μlの血液試料に含有された10コピーと、最大6 %(v/v)の血液試料に含有された20コピーとの全てを、本発明によるPCRにより明白に検出することができた。8〜12%(v/v)の血液に存在する20コピーも増幅物を生成した。図16に示されたように、HotStarTaq DNA重合酵素を利用した増幅は、AmpliTaq Gold DNA重合酵素を使用した時の結果と類似していた。
【０１２１】
したがって、グッド緩衝液及び/または非還元性炭水化物を使用する本発明は、ホットスタートPCR用化学的−変形DNA重合酵素を再生により作動するようにして、血液のように少ないコピーの核酸を有する生物学的試料の直接検出を可能にするということが分かる。
【０１２２】
実施例VI：他の熱安定性DNA重合酵素に対する実験
Taq DNA重合酵素の他に、今まで開発された熱安定性DNA重合酵素は、高い充実度を有するPfu DNA重合酵素(Stratagene社)とPwo DNA重合酵素(Roche Applied Science社)、そして、逆転写活性を有するTth DNA重合酵素(Roche Applied Science社)を含む。本発明により提供された条件下で、このような多様な種類の熱安定性DNA重合酵素を使用して直接的な増幅が可能であるかを実験した。比較のために、本発明者らは、商業的に市販される反応液[Pfu DNA重合酵素に対する20mM Tris(pH 8.8),  10mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 0.1% Triton X-100, 100μg/ml BSA 及び2mM MgSO4; Pwo DNA重合酵素に対する10mM Tris (pH 8.85), 25mM KCl, 5mM (NH4)2SO4及び2mM MgSO4;そしてTth DNA重合酵素に対する10mM Tris(pH 8.9), 100mM KCl, 50μg/ml BSA, 0.05 %(w/v) Tween 20及び1.5mM MgCl2]を使用した。それぞれの重合酵素2.0ユニットを使用して、p53遺伝子増幅のための直接PCRを行った。使用されたプライマーは、次のようである:正方向プライマー、E8f(5'-GACAAGGGTGGTTGGGAGTAGATG-3')及び逆方向プライマー、ER2(5'-CACAAACACGCACCTCA AAG-3')。生成された増幅物の大きさは、357 bpである。PCR温度循環条件は、実施例Iと同様な方法により行った。
【０１２３】
図17から分かるように、市販の反応液は、増幅物を生成できなかたのに対し(レーン5、10、及び15)、本発明の反応液(pH8.3及び8.7)は、アガロースゲル上で検出可能な増幅物を示した。
【０１２４】
実施例VII：細胞培養液−由来増幅抑制
分子生物学において、動物細胞培養は、よく実施される一般的な方法である。細胞内に存在するPCR抑制剤は、培養された細胞を直接利用した増幅に非常に大きい障害物である。今まで開発された増幅によると、培養細胞は、遠心分離を通じて得られた後、DNA精製過程を経た後、PCRに適用される。
【０１２５】
本発明が細胞培養に係わる障害物を克服できるかどうかを証明するために、Tricine-緩衝液(pH 8.7)、2.4%トレハロース、細胞培養培地、そして鋳型として10ngのヒト遺伝体DNA(Promega社)を含む反応液を使用して、p53遺伝子を増幅するための直接増幅を行った。細胞培養培地としては、10%牛胎児血清(FBS)が添加されたDMEM(Dulbecco'smodified Eagle's medium)、100μg/mlペニシリン及び100μg/mlストレプトマイシンを使用した。プライマーとPCR条件は、実施例Iと同様である。
【０１２６】
実験結果、本発明は、細胞培養による増幅抑制を完璧に克服した(図18)。
【０１２７】
実施例VIII：口腔上皮細胞を利用した増幅
口腔上皮細胞をブラシを利用して収集、乾燥させて、500μl  TE(10mM Trisと0.1mM EDTA, pH 8.0)に浮遊させた後、2.5μlの細胞浮遊物を取ってAmpFLSTR（登録商標） Identifiler（登録商標）キット(Applied Biosystems社)を、使用者説明書により増幅させた。反応液(25μl)は、2.4%トレハロースと4mg/ml BSA、0.2mM dNTP、2.5ユニットのAmpliTaq GoldDNA重合酵素とAmpFLSTR Identifilerプライマーセットを含有するTricine-緩衝液(pH 8.3)を新しく用意した。AmpFLSTR Identifilerキットによる増幅産物は、ABI Prism Genotyper 3.7(Applied Biosystems社)を利用して分析した。
【０１２８】
図19のパネルAは、ABI Prism Genotyper 3.7により分析したAmpFLSTR Identifilerキットを使用して増幅した口腔上皮細胞DNA分子に関する結果の中で、ブルー染色結果を示すもので、グッド緩衝液及び/または非還元性炭水化物を使用する本発明が、細胞浮遊物に含有されたPCR抑制剤の活性を遮断させて、これは、精製されたDNAを利用する方法より細胞を直接利用した方が、さらに成功的なDNA指紋分析を可能にするということを証明する。さらに、注目すべきことは、本発明の反応液が細胞懸濁液を利用する増幅反応において、AmpliTaq Gold DNA重合酵素の活性を可能にするということである。
【０１２９】
実施例IX：法医学遺伝子検査
法医学において、遺伝子検査は、注目を浴びており、関連技術も速く発展している。しかしながら、法医学遺伝子検査は、一般に、多様な種類と状態の試料を分析しなければならないという問題点を有している。即ち、きれいな試料、あるいは腐敗されているか汚染された試料、または微量の試料のように、多様な試料を利用して遺伝子増幅反応を行うことになる。また、法医学において、遺伝子増幅は、主に、即刻的な結果を要求する。
【０１３０】
本発明が法医学遺伝子増幅に対するこのような要求条件を満たすことができるかどうかを実験した。DNA指紋分析のために、TE緩衝液により40〜50倍に希釈された2.5μlの血液を試料として利用した。増幅反応と分析は、実施例VIIIと同様にした。
【０１３１】
図19のパネルBから分かるように、グッド緩衝液及び/または非還元性炭水化物を利用した本発明は、血液に含まれたPCR抑制剤の作用を遮断することができて、精製されたDNAを使用した場合より、血液を使用した方がさらに成功的なDNA指紋分析を可能にするということを確認した。さらに、血液試料を利用した増幅反応において、本発明の反応液は、AmpliTaq Gold DNA重合酵素の活性を可能にするという点は、注目すべきことである。
【０１３２】
実施例X：培養された細胞におけるcDNA合成
培養された細胞(hepG2-SK, 5×106細胞)をリン酸塩−緩衝塩水(PBS)で1×103~4細胞/μl濃度に希釈した。ヒトβ-アクチン遺伝子に特異的なプライマーを使用して、逆転写-PCR(RT-PCR)を行うために、1μlの希釈された細胞を50μlの反応液に添加した。対照群として、精製されたRNAを利用した一般的なRT-PCR実験のために、hepG2-SK細胞でRNeasy Miniキット(Qiagen社)を使用して、全RNAを精製した後、1μgの精製されたRNAからoligo(dT)18を有するcDNA合成キットを使用してcDNAを合成した。
【０１３３】
RT-PCRにおいて、DNAによる生成物とRNAによる生成物とを区別するために、イントロン距離分、DNAによる生成物(370 bp)がRNAによる生成物(264 bp)より107 bp長くなるようにプライマーを設計した。使用されたプライマーの塩基配列は、次のようである：β-アクチン-f(5'-CAA GAG ATG GCC ACG GCT GCT-3')とβ-アクチン-r(5'- TCC TTC TGC ATC CTG TCG GCA-3')。RT-PCRは、RT反応生成物にPCR反応液を添加して行った。
【０１３４】
RT反応は、50mM Tricine(pH 8.7)、80mM KCl、2.5mM MgCl2、250μM dNTPs 混合液、5mM DTT、0.4μM β-アクチン-rプライマー、20ユニットのRNA分解酵素抑制剤(Promega社)、そして4.5ユニットのAMV逆転写酵素(Roche Applied Science社)を含む全体25μlのRT反応液を使用して行った。RT-陰性対照群としてRNA分解酵素が除去された蒸留水を添加した。60℃で60分間RT反応した後、逆転写酵素の非活性化のために、95℃で10分間反応した。
【０１３５】
RT反応後、10pmolのβ-アクチン-fプライマーと2ユニットのTaqDNA重合酵素を添加して、次のPCR反応を行った。PCR反応において、10ngのヒト遺伝子DNA(Promega社)とhepG2-SKから合成したcDNAがPCR対照群として使用された。PCR反応は、次のような温度条件下で行った：94℃で2分間反応した後、94℃で30秒、65℃で30秒、72℃で30秒間の反応を45回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を5分間行った。増幅生成物を0.5μg/mlのエチジウムブロマイドを含む2%アガロースゲルで電気泳動した後、UV放射線下で分析した。
【０１３６】
図20から分かるように、ヒトβ-アクチンmRNAに特異的な増幅生産物は、逆転写酵素がある反応液に培養された細胞を直接添加したRT-PCR反応から得ることができた。
【０１３７】
実施例XI：肉のRELP分析
牛肉溶解物を得るために、1mgまたは10mgの牛肉試料を0.2mgタンパク質分解酵素K(Sigma-Aldrich社)、0.3% SDS、0.6% Tween 20、5mM EDTA、そして400mM NaClを含有した20mM Tricine緩衝液(pH 8.0)に浸して、56℃で2時間、85℃で45分間、段階的に反応した。牛MC1-R遺伝子を増幅するために得られた溶解物を直接PCRに適用し、次いで1ユニットのMspA1Iで37℃で45分間処理した後、RELP(restriction fragment length polymorphism)分析に直接使用した。PCR反応は、200μM dNTPs混合液、0.2μMプライマー、1.25ユニットのAmpliTaq DNA 重合酵素、そして10mM Tricine(pH 8.3)、50mM KCl、2.5mM MgCl2、そして2.4 %(w/v)トレハロースを含む全体25μMのPCR反応液を使用して行った。使用されたプライマーの塩基配列は、次のようである：MC1R-f(5'-CAAGAACCGCAACCTGCACT-3')、そしてMC1R-r(5'-TGATGAAGAGCAGGCTGGTG-3')。PCR反応は、次のような温度条件下で行った：94℃で5分間反応した後、94℃で30秒、62℃で30秒、72℃で1分間の反応を40回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を10分間行った。
【０１３８】
図21から分かるように、牛組織溶解物を直接使用した直接増幅は、本発明が提供した条件下で増幅物を明らかに生産し、なお、RFLP分析の結果物も得ることができた。
【０１３９】
実施例XII：糞便における食中毒−誘発微生物の検出
本発明が、糞便のPCR抑制を克服できるかどうかを評価した。代表的な食中毒誘発微生物であるShigella flexneriを血液寒天培地に37℃で24時間培養した。生成されたコロニーの一つを0.2ml PBSに浮遊させた後、これのコロニー形成単位[colony forming unit(CFU)]を決定した。健康な成人の糞便試料をPBSで10倍(v/w)希釈し攪拌させた後、上澄み液を得るために、4℃で真っすぐに立てて一晩中放置した。1μlの上澄み液とCFUが決定された7μlのShigella flexneri浮遊物を混合し、PCR増幅鋳型として使用した。ウイルスShigella flexneriのvir A遺伝子を増幅するためのPCR反応を200μM dNTPs混合液、それぞれ0.2μMプライマー、vir-f(センスプライマー、5'-CTGCATTCTGGCAATCTCTTCACATC-3')とvir-r(アンチセンスプライマー、5'-TGATGAGCTAACTTCGTAAGCCCTCC-3')、1ユニットのAmpliTaq DNA重合酵素と2.4%トレハロースを含有するTricine-緩衝液を含む全体20μlのPCR反応液を使用して行った。全体反応液容量の5%に該当する128,000 CFU、6,400 CFU、320 CFU、16 CFU、8 CFU、4 CFU、2 CFU、そして1 CFUを含有する糞便浮遊物8μlを使用した。PCR反応は、次のような温度条件下で行った：95℃で5分間反応した後、94℃で40秒、55℃で40秒、72℃で40秒間の反応を40回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を10分間行った。
【０１４０】
また、本発明が、ヒト糞便試料から関連病原体を検出して、これを定量できる正確なリアルタイムPCR[real-time PCR(qPCR)]分析に使用できるかどうかを評価した。健康な成人糞便試料をPBSで10倍(v/w)希釈し攪拌した後、上澄み液を得るために4℃で一晩中放置した。1μlの上澄み液とコピー数を知っている7μlのShigella flexneri浮遊物を混ぜたものを鋳型として使用し、標準曲線を作った。即ち、全体反応液容量の5%に該当する128,000 CFU、6,400 CFU、320 CFU、16 CFU、8 CFU、4 CFU、2 CFU、そして1 CFUを含有する糞便浮遊物8μlを使用した。
【０１４１】
Mx3000P（登録商標） QPCR System(Stratagene社)を利用して、リアルタイムホットスタートPCRを行った。全体20μlの反応液は、200μM dNTPs混合液、それぞれの0.2μM vir-fとvir-rプライマー、1ユニットのHotStarTaq DNA重合酵素(Qiagen社)、2.4%トレハロースが添加されたTricine-緩衝液(pH 8.3)、1×SYBR Green I(Molecular Probes社)、そして、標準化のための0.4×ROX standardを含有している。温度条件は、次のようである：95℃で15分間反応した後、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を50回繰り返した(試料拾得)。
【０１４２】
図22Aから分かるように、本発明により提供された条件下では、直接PCRが8 CFUの病原体を有している糞便試料でさえも増幅産物を生産したのに対し、Tris緩衝液を使用した時は、128,000 CFUの病原体を有する糞便試料においても増幅物を生産できないことが分かる。このような結果から、グッド緩衝液及び/または非還元性炭水化物が、糞便により誘発されたPCR抑制を確実に克服するということが確認できる。図22Bから分かるように、本発明の条件下では、2 CFUの病原体を有している糞便試料でさえも、直接PCR生成物が得られて、使用説明書通りのリアルタイムSYBER GREEN定量PCR分析により、迅速に分析された。
【０１４３】
実施例XIII：植物組織を利用した遺伝子増幅
凍結乾燥したOryza sativaの葉を挽いて粉末試料を用意した。4〜10mgの粉末試料を100μlの浮遊物緩衝液(0.3% SDS, 0.6% Tween 20, 5mM EDTA, 400mM NaClを含有した20mM Tricine緩衝液, pH 8.0)に浮遊させて、Oryza sativa葉の葉浮遊物を得た。β-アクチン遺伝子増幅のためのPCRには、0.041mgの粉末試料、または1μlの試料浮遊物を直接使用した。PCR反応は、200μM dNTPs混合液、0.2μMプライマーセット、そして1.25ユニットのAmpliTaq DNA重合酵素を含有する全体25μl容量のPCR反応液を使用して行った。緩衝液としては、2.4 %(w/v)トレハロース(図23、パネルA)を含有したTricine-緩衝液(pH 8.3)を使用した。比較のために、Tris-緩衝液(pH 8.3)をも使用して実験した(図23、パネルB)。使用されたプライマーの塩基配列は、次のようである：センスプライマー、5'-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3'と、アンチセンスプライマー、5'-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3'。PCR反応は、次のような温度条件下で行った：94℃で5分間反応した後、94℃で30秒、62℃で30秒、72℃で1分間の反応を40回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を10分間行った。
【０１４４】
2.4 %(w/v)トレハロースが含まれたTricine-緩衝液(pH 8.3)を使用した場合、鋳型試料の種類(精製されたDNA、葉粉末、葉浮遊物)に係わらず、全ての反応で増幅物を生産した(図23、パネルA)。その反面、Tris-緩衝液では、精製されたDNAを使用した場合しか、増幅物を生産できなかった(図23、パネルB)。
【０１４５】
したがって、両性イオン性緩衝液及び/または非還元性炭水化物を使用する場合、植物組織の直接増幅を可能にするということが分かる。
【０１４６】
実施例XIV：組織スライドにおける遺伝子増幅
肺組織において、特に肺癌組織において、EGFR(epidermal growth factor receptor)遺伝子のエキソン18、19、20、21の突然変異に焦点を合わせた研究が、gefitinib (Iressa)、elrotilib (tarceva)(39)のような肺癌治療剤の適合性を究明するために、よく成されている。スライド組織を利用した直接PCRの可能性を評価するために、組織マイクロアレイ(ISU Abxis社)からスポットを抽出し、これを直接PCRに適用した。4セットのプライマーを利用した：425 bpの増幅物を得るための18番エキソン増幅のためのE18F1、5'-AATGAGCTGGCAAGTGCCGTGTCCTG-3'とE18R1, 5'-CCTCTCAATAACTTGGGAAAAACACTG-3'；446 bpの増幅物を得るための19番エキソン増幅のためのE19F1、5'-AGCCCCCAGCAATATCAGCCTTAGGTG-3'とE19R1、5'-ATGGGAGA GGCCAGTGCTGTCTCTAAG-3'；385 bpの増幅物を得るための20番エキソン増幅のためのE20F1、5'-GCATTCATGCGTCTTCACCTGGAAGG-3'とE20R1、5'-GCACACACATATCCCCATGGCAAA CTC-3'; そして386 bpの増幅物を得るための21番エキソン増幅のためのE21F1、5'-CGCCAGCCATAAGTCCTCGACGTGGAG-3'とE21R1、5'-TCTGGAGAGCATCCTCCCCTGCATGTG-3'。
【０１４７】
30%グリセロール10μlを組織マイクロアレイのあるスポットに点滴して、1〜2分後、継続的なピペット操作によりスポットを溶解させた。溶解された組織スポット1μlを、増幅のためのPCRに直接使用した。PCR反応は、200μM dNTPs混合液、0.3μMプライマーセットと1.25ユニットのAmpliTaq DNA重合酵素を含む全体25μl容量の反応物混合液を使用して行った。2.4 %(w/v)トレハロースを含有するTricine-緩衝液(pH 8.3)を使用した。PCR反応は、次のような温度条件下で行った：94℃で5分間反応した後、94℃で30秒、62℃で30秒、72℃で1分間の反応を40回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を10分間行った。
【０１４８】
図24から分かるように、組織スライドは、本発明により、DNA精製無しに、直接に増幅することができる。
【０１４９】
実施例XV：SNPジェノタイピング
SNPは、"一塩基多型性(single nucleotide polymorphism)"をいう。SNPsは、最も有り触れた遺伝的変異であって、100〜300塩基毎に一つずつ発生する。最近の何年間、たくさんのSNPジェノタイピング(genotyping)技術が発達された。しかしながら、迅速で信頼できるような、且つ安価のSNPジェノタイピング方法に対する要求が当業界に残っている。
【０１５０】
本発明をSNPジェノタイピングに適用できるかを実験してみた。SNPジェノタイピングのために、プライマーを設計し、EGFR遺伝子のプロモータ部位に-216G/T多型性を有する525bpの増幅物を得た。使用されたプライマーの塩基配列は、次のようである：egfr-f(5'-GGCCCGCGCGAGCTAGACGT-3')とegfr-r(5'-CAGGTGGCCTGTCGTCCGGTCT-3')。
【０１５１】
0.5μlの血液を、200μM dNTPs混合液、0.3μMプライマーと1.25ユニットのAmpliTaq DNA重合酵素を含有する全体容量25μlのPCR反応混合液に直接添加した。2.4%(w/v)トレハロースを含有したTricine-緩衝液(pH 8.3)を緩衝液として使用した。 PCR反応は、次のような温度条件下で行った：94℃で5分間反応した後、94℃で30秒、60℃で30秒、72℃で30秒間の反応を40回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を10分間行った。そして、PCR生成物をExoSAP-IT(USB社)、またはQIAquick PCR精製キット(Qiagen社)を処理して精製した。egfr-sbe (5'-GCGCGGCCGCAGCAGCCTCC-3')プライマーとSNaPshotキット(Applied Biosystems社)を使用者指針に従って利用し、前記精製されたPCR生成物から一塩基延長をして、次いで、遺伝子型を記録した。
【０１５２】
図25から分かるように、本発明により提供された条件下で、血液から直接PCR 生成物を得て、これを鋳型として、ABI PRISM（登録商標） SNaPshot（登録商標） ddNTP Prime-Extension Assayを使用説明書の指針通りに使用して、正確なSNPジェノタイピング結果を得た。
【０１５３】
実施例XVI：蛍光ダイターミネーターサイクル塩基配列分析(Fluorescent Dye-Terminator Cycle Sequencing)
DNA塩基配列分析は、DNA試料の正確な塩基配列を決定するものである。これを実行するに最もよく使用する方法は、蛍光ジデオキシ法(fluorescent dideoxy method)と呼ばれる方法である。本発明が、自動化された蛍光ダイターミネーター塩基配列分析に適用可能であるかを実験した。自動化されたサイクル塩基配列分析のために、ヒトミトコンドリアDNAのD-loop部分のHVI分節を含む406 bpの増幅物を生成するプライマーを設計した。使用されたプライマーの塩基配列は、次のようである：L15996(5'-CTCCACCATTAGCACCCAAAG-3')とH16401(5'-TGATTTCACGGAGGATGGTG-3')。200μM dNTPs混合液、0.2μMプライマーセットと1.25ユニットのAmpliTaq DNA重合酵素(Applied Biosystems社)を含有する全体容量25μlのPCR反応混合液に1μlの血液を直接使用した。緩衝液としては、2.4%(w/v)トレハロースを含有するTricine-緩衝液(pH 8.3)を使用した。PCR反応は、次のような温度条件下で行った：94℃で5分間反応した後、94℃で45秒、58℃で45秒、72℃で45秒間の反応を35回繰り返した後、72℃で最後の延長反応を5分間行った。
【０１５４】
PCR生成物の半分は、NucleoSpin（登録商標） Extract II(Macherey-Nagel社)またはExoSAP-IT(USB社)を処理して精製し、残りの半分は、精製しなかった。その後、精製した、あるいは精製しなかったPCR生成物を、BigDye terminator v3.1 cycle sequencing reaction(Applied Biosystems社)を使用し、使用者説明書にしたがって、前/後方延長のためのL15996/H406プライマーを持って塩基配列を分析した。
【０１５５】
図26A〜26Bから分かるように、PCR生成物を、本発明が提供した条件にしたがって血液から直接収得し、この生成物を、使用説明書の指針通りにABIPRISMP BigDye terminator v3.1 cycle塩基配列分析反応に鋳型として使用し、究極的にDNA塩基配列分析結果を得ることができた。
【０１５６】
以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎず、これらに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。
【図面の簡単な説明】
【０１５７】
【図１】GH20/GH21プライマーセットを使用したβ-グロビン遺伝子(408 bp)の直接PCR(polymerase chain reaction)結果を示す。レーン1〜9は、Tris-緩衝液(それぞれ、pH 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0及び9.2)、レーン10〜20は、Tricine-緩衝液(それぞれ、pH 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9及び9.0)、レーン21〜29は、Bicine-緩衝液(それぞれ、pH 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7及び8.8)、そしてレーン30〜40は、HEPES-緩衝液(それぞれ、pH 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9及び9.0)を使用した結果である。Lは、100から1500 bpの範囲のDNAサイズマーカーを表示する。
【図２】GH20/KM38プライマーセットを使用したβ-グロビン遺伝子(408 bp)の直接PCR結果を示す。レーン1〜9は、Tricine-緩衝液(それぞれ、pH 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9及び9.0)、レーン10〜19は、Tris-緩衝液(それぞれ、pH 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0, 9.2及び9.5)を使用した結果である。Lは、100から1500 bpの範囲のDNAサイズマーカーを表示する。
【図３】p53遺伝子の直接PCR結果を示す。レーン1〜9は、Tris-緩衝液(それぞれ、pH 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0及び9.2)、レーン10〜20は、Tricine-緩衝液(それぞれ、pH 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9及び9.0)、レーン21〜29は、Bicine-緩衝液(それぞれ、pH 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7及び8.8)、そして、レーン30〜40は、HEPES-緩衝液(それぞれ、pH 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9及び9.0)を使用した結果を示す。Lは、100から1500 bpの範囲のDNAサイズマーカーを表示する。
【図４】多様な非還元性炭水化物の血液試料による増幅反応抑制克服能力に対する分析結果を示す：グルコース(パネルA、レーン3〜6)、スクロース(パネルA、レーン7〜10)、ラクトース(パネルA、レーン11〜14)、メレジトース(パネルA、レーン15〜18)、スタチオース(パネルA、レーン19〜22)、トレハロース(パネルB、レーン3〜6)、ラフィノース(パネルB、レーン7〜10)、ソルビトール(パネルB、レーン11〜14)、マンニトール(パネルB、レーン15〜18)、及びポリビニルピロリドン(パネルB、レーン19〜22)。パネルA及びBにおいて、レーン1は、非還元性添加剤を添加しなかった結果であり、レーン2は、血液の代わりに2ngのヒト遺伝体DNAを使用した結果である。
【図５】血液試料の増幅抑制作用を遮断するための添加剤としてラフィノースとトレハロースを使用した直接PCR結果を示す。Tris-緩衝液(pH 8.3)(レーン1〜12)、または、Tricine-緩衝液(pH 8.3)(レーン13〜24)を使用した。ラフィノースの最終濃度(%(w/v))は、0(レーン1及び13)、1.4(レーン2及び14)、2.8(レーン3及び15)、4.2(レーン4及び16)、5.6(レーン5及び17)、及び7.0 (レーン6及び18)である。使用されたトレハロースの最終濃度(%(w/v))は、1.5(レーン8及び20)、3.0(レーン9及び21)、4.5(レーン10及び22)、6.0(レーン11及び23)及び7.5(レーン12及び24)である。
【図６】血液試料の増幅抑制作用を遮断するための添加剤としてトレハロースを使用した直接PCR結果を示す。Tricine-緩衝液(pH 8.3)及び2.0ユニットのAmpliTaq DNA重合酵素を使用した。レーン1〜8に使用されたトレハロースの最終濃度は、それぞれ、0, 2.4, 4.8, 6, 12, 18, 24及び30%(w/v)である。
【図７】直接増幅反応において、pHによるトレハロースの効果に対する分析結果を示す。レーン1〜9は、Tris-緩衝液(それぞれ、pH 8.3, 8.4, 8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9, 9.0及び9.2)、レーン10〜20は、Tricine-緩衝液(それぞれ、pH 8.0, 8.1, 8.2, 8.3, 8.4,8.5, 8.6, 8.7, 8.8, 8.9及び9.0)に対する結果である。1ユニットのAmpliTaq DNA重合酵素を使用した。パネルAは、0%トレハロース、そしてパネルBは、3 % (w/v)トレハロースを使用した結果である。
【図８】p53遺伝子の増幅をするためのCHAPSを利用した直接PCR結果を示す。Tricine-緩衝液(pH 8.3)(レーン1〜9)またはTricine-緩衝液(pH 8.7)(レーン10〜15)を使用して、p53遺伝子を増幅した直接PCR結果を示す。0.4mMトリエチレンテトラミン(レーン2)または2.4%トレハロース(レーン3-15)を含む総容量50μlのPCR反応液を使用した。使用されたCHAPSの濃度は、0mM(レーン1, 2及び3)、0.3mM(レーン4及び10)、0.6mM(レーン5及び11)、1.25mM(レーン6及び12)、2.5mM(レーン7及び13)、5mM(レーン8及び14)、及び10mM(レーン9及び15)である。
【図９】ポリアミンとスペルミジン(パネルA)及びトリエチレンテトラミン(パネルB)を添加した直接PCRを通じてp53遺伝子を増幅した結果である。1μlのヘパリン−前処理血液を直接に使用した。レーン1〜6は、Tris-緩衝液(pH 8.3)、レーン7〜12は、Tricine-緩衝液(pH 8.3)、レーン13〜18は、Tris-緩衝液(pH 8.7)、及びレーン19〜24は、Tricine-緩衝液(pH 8.7)を使用した結果である。使用したスペルミジンとトリエチレンテトラミンの最終濃度は、0mM(レーン1, 7, 13及び19)、0.25mM(レーン2, 8, 14及び20)、0.5mM(レーン3, 9, 15及び21)、1.0mM(レーン4, 10, 16及び22)、2.0mM(レーン5, 11, 17及び23)、及び4mM(レーン6, 12, 18及び24)である。
【図１０】多様な濃度のスペルミジン(レーン1〜6及び13〜18)またはトリエチレンテトラミン(レーン7〜12及び19〜24)を含むTricine-緩衝液(pH 8.3、レーン1〜12、pH 8.7、レーン13〜24)を使用した直接PCR結果を示す。2μlのヘパリン−前処理血液を直接に使用した。 使用したスペルミジンとトリエチレンテトラミンの最終濃度は、0mM(レーン1, 7, 13及び19)、0.25mM(レーン2, 8, 14及び20)、0.5mM(レーン3, 9, 15及び21)、1.0mM(レーン4, 10, 16及び22)、2.0mM(レーン5, 11, 17及び23)、及び4mM(レーン6, 12, 18及び24)である。
【図１１】多様な濃度のBSA(bovine serum albumin)を使用した直接PCRを利用したp53遺伝子増幅結果である。レーン1〜6は、Tris-緩衝液(pH 8.3)、レーン7〜12は、Tricine-緩衝液(pH 8.3)、レーン13〜18は、Tris-緩衝液(pH 8.7)、そしてレーン19〜24は、Tricine-緩衝液(pH 8.7)を使用した結果である。使用されたBSAの最終濃度は、0mg/ml(レーン1, 7, 13及び19)、0.62mg/ml(レーン2, 8, 14及び20)、1.25mg/ml(レーン3, 9, 15及び21)、2.5mg/ml(レーン4, 10, 16及び22)、5mg/ml(レーン5, 11, 17及び23)、そして10mg/ml(レーン6, 12, 18及び24)である。
【図１２】多様な鋳型を利用してp53遺伝子を増幅した直接PCR結果である。レーン1〜6は、ヒト遺伝体DNA(それぞれ、0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5及び10ng)、レーン7〜12は、ヘパリン−前処理血液(それぞれ、0.6, 1.25, 2.5, 5, 10及び20μl)、レーン13〜18は、EDTA-前処理血液(それぞれ、0.6, 1.25, 2.5, 5, 10及び20μl)、そして、レーン19〜24は、クエン酸−前処理血液(それぞれ、0.6, 1.25, 2.5, 5, 10及び20μl)を使用した結果である。Tricine-緩衝液(pH 8.7)を使用した。
【図１３】多様な鋳型を利用してp53遺伝子を増幅した直接PCR結果である。レーン1〜6は、ヒト遺伝体DNA(それぞれ、0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5及び10ng)、レーン7〜12は、ヘパリン−前処理血液(それぞれ、0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5及び10μl)、レーン13〜18は、EDTA-前処理血液(それぞれ、0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5及び10μl)、及びレーン19〜24は、クエン酸−前処理血液(それぞれ、0.3, 0.6, 1.25, 2.5, 5及び10μl)を使用した結果である。Tricine-緩衝液(pH 8.7)、2.4%(w/v)トレハロース及び4mg/ml BSAを含むPCR反応液を使用した。
【図１４】本発明にしたがって、ベタインを使用し、ヒト網膜芽細胞腫遺伝子(human retinoblastoma gene)(180 bp、パネルA及びB)、またはアポリポプロテインE遺伝子(apolipoprotein E gene)(268 bp、パネルC及びD)を、直接PCRを行って増幅した結果である。20ngのヒト遺伝体DNA(パネルA及びC)、または1μlのヘパリン−前処理血液(パネルB及びD)を鋳型として使用した。レーン1〜5に使用されたベタインの最終濃度は、それぞれ、0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0及び2.5Mである。
【図１５】コピー数の変化及び血液試料量による直接PCRによるHIV-1(human immunodeficiency virus-1)の塩基配列増幅結果を示す。Tricine-緩衝液(pH 8.3)、2.8%(w/v)トレハロース及び4mg/ml BSAが含まれたPCR反応液を使用した。レーン1-6はそれぞれ、1μlの0, 10, 20, 30, 40及び50コピー数のHIV-1プラスミドを含むヘパリン−前処理血液、そしてレーン7〜13は、20コピー数のHIV-1プラスミドを含むそれぞれ、0, 1, 2, 3, 4, 5及び6μlのヘパリン−前処理血液を使用した結果である。142 bpの増幅物を生成するために、SK145及びSK431プライマーセットを使用した。
【図１６】コピー数の変化及び血液試料量による直接PCRによるHIV-1(human immunodeficiency virus-1)の塩基配列増幅結果を示す。Tricine-緩衝液(pH 8.3)、2.8%(w/v)トレハロース及び4mg/ml BSAが含まれたPCR反応液を使用した。レーン1-6はそれぞれ、1μlの0, 10, 20, 30, 40及び50コピー数のHIV-1プラスミドを含むヘパリン−前処理血液、そしてレーン7〜13は、20コピー数のHIV-1プラスミドを含むそれぞれ、0, 1, 2, 3, 4, 5及び6μlのヘパリン−前処理血液を使用した結果である。115 bpの増幅物を生成するために、SK38及びSK39プライマーセットを使用した。
【図１７】多様な温度安定性DNA重合酵素を使用したp53遺伝子の増幅結果を示す。レーン1〜5は、Pfu DNA重合酵素、レーン6〜10は、Pwo DNA重合酵素、そしてレーン11〜15は、Tth DNA重合酵素を使用した結果である。レーン1, 6及び11は、Tris-緩衝液(pH 8.3)、レーン2, 7及び12は、Tris-緩衝液(pH 8.7)、レーン3, 8及び13は、Tricine-緩衝液(pH 8.3)、そしてレーン4, 9及び14は、Tricine-緩衝液(pH 8.7)を使用した結果であり、全ての緩衝液は、2.4%トレハロースを含む。レーン5, 10及び15のそれぞれは、市販の反応液を使用した結果である。
【図１８】細胞培養培地でp53遺伝子を増幅したPCR結果を示す。2.4%トレハロースを含むTricine-緩衝液(pH 8.7)を使用した。10ngのヒト遺伝体DNAを鋳型として使用した。レーン1〜6は、それぞれ、2, 5, 10, 15及び20μlの細胞培養培地(10% FBSを含むDMEM)を使用した結果である。
【図１９】唾液(パネルA)または血液(パネルB)を使用して、AmpFLSTR Identifiler kit(Applied Biosystems社)により得られた結果の中で、Blue-ダイ結果を示す。生物学的試料の増幅反応の抑制を遮断する添加剤としてトレハロースを使用した反応液を使用した。
【図２０】hepG2-SK細胞を直接使用し、β-actin遺伝子(264 bp)を増幅したRT-PCR(reverse transcriptionpolymerase chain reaction)結果を示す。レーン1及び2はそれぞれ、ヒト遺伝体DNA及びtotal cDNAを利用したRT-PCR結果を示す。レーン3〜4は、1×103個の細胞を、そしてレーン5〜6は、1×104個の細胞を直接利用したRT-PCR結果を示す。レーン3及び5は、逆転写反応をしなかった(RT-陰性)結果である；レーン4及び6は、逆転写反応を行った結果である(RT-陽性)。
【図２１】牛肉組織の溶解物試料を利用した直接PCR及びRFLP(restriction fragment length polymorphism)分析結果を示す。レーン1〜2は、抽出したDNA、レーン3〜4は、1mgの肉溶解質、そしてレーン5〜6は、10mgの肉溶解質を鋳型として使用した結果である。レーン2, 4及び6は、増幅物にMspA1Iを処理した結果を示す。
【図２２ａ】Shigella flexneriを含む糞便を直接使用して、virA遺伝子を増幅した直接PCR結果である。レーン1〜8は、Tris-緩衝液(pH 8.3)、そしてレーン9〜16は、2.4%(w/v)トレハロースを含むTricine-緩衝液(pH 8.3)を使用した結果を示す。Shigella flexneriの適量は、128,000 CFU(レーン1及び9)、6,400 CFU(レーン2及び10)、320 CFU(レーン3及び11)、16 CFU(レーン4及び12)、8 CFU(レーン5及び13)、4 CFU(レーン6及び14)、2 CFU(レーン7及び15)、及び1 CFU(レーン8及び16)に合わせた。
【図２２ｂ】リアルタイムPCR結果を示す。上の図表は、標準曲線を示し、下の図表は、糞便に添加された(spiked) Shigella flexneriのvirA遺伝子検出を示すSYBR Green I分析により得られた溶解曲線分析を示す。
【図２３】稲葉から得られた20ngの抽出されたDNA(レーン1)、0.04mg(レーン2)及び0.1mg(レーン3)の凍結乾燥粉末、それぞれ、1μlの0.04mg/μl葉懸濁液(レーン4)及び0.1mg/μlの葉懸濁液(レーン5)のような多様な植物試料を利用して、稲のβ-アクチン遺伝子を増幅した直接PCR結果を示す。パネルAは、2.4%トレハロースを含むTricine-緩衝液(pH 8.3)、そしてパネルBは、Tris-緩衝液(pH 8.3)を使用した結果である。
【図２４】上皮成長因子受容体(epidermal growth factor receptor: EGFR)遺伝子を組織マイクロアレイ(ISU Abxis社)を通じて得た組織スポットを直接利用して増幅した直接PCR結果を示す。レーン1〜4はそれぞれ、EGFR遺伝子のエキソン18. 19. 20及び21に対する結果である。2.4%トレハロースを含むTricine-緩衝液(pH 8.3)を使用した。
【図２５】ABI 3100 Genetic analyzer上で分析された遺伝子プロモータ部位の多型性を検出するためのジェノタイピングに対するSNaPshot ddNTPプライマー−延長分析のelectropherogramを示す(上部グラフ、TT同種接合体；中間グラフ、GT異種接合体；下部グラフ、GG同種接合体)。
【図２６ａ】蛍光ダイダイターミネーターサイクル塩基配列分析を示す。サイクル塩基配列分析の前に、直接PCR生成物は、NucleoSpin Extract IIを利用したPCRクリーンアップを利用して精製した場合(図26a)と、精製をしなかった場合(図26b)とに分けて実験した。
【図２６ｂ】蛍光ダイダイターミネーターサイクル塩基配列分析を示す。サイクル塩基配列分析の前に、直接PCR生成物は、NucleoSpin Extract IIを利用したPCRクリーンアップを利用して精製した場合(図26a)と、精製をしなかった場合(図26b)とに分けて実験した。
【０１５８】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【国際調査報告】
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