(57)【要約】本発明は、ムチン３ポリペプチド、ムチン３ＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードする核酸を提供する。本発明はまた、このようなポリペプチドまたは核酸を使用して、消化管の疾患または状態を有するかまたは消化管の疾患または状態を発症する危険がある個体を処置する方法を提供する。一局面において、本発明は、ムチン３ＥＧＦ様ドメインをコードする核酸分子を含む単離された核酸を提供する。
2008506365.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムチン３ＥＧＦ様ドメインをコードする核酸分子を含む、単離された核酸。
【請求項２】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群より選択される配列を有する、核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号３に示される配列を有する、核酸分子。
【請求項４】
請求項３に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号１２に示される配列を有する、核酸分子。
【請求項５】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号４に示される配列を有する、核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号１４に示される配列を有する、核酸分子。
【請求項７】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号５に示される配列を有する、核酸分子。
【請求項８】
請求項７に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号９に示される配列を有する、核酸分子。
【請求項９】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号６に示される配列を有する、核酸分子。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号１１に示される配列を有する、核酸分子。
【請求項１１】
請求項１に記載の核酸を含む、構築物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の構築物であって、該構築物は２つのムチン３ＥＧＦ様ドメインを含む、構築物。
【請求項１３】
請求項１２に記載の構築物であって、リンカー領域をコードする核酸配列が、前記２つのムチン３ＥＧＦ様ドメインの間に位置する、構築物。
【請求項１４】
請求項１３に記載の構築物であって、前記リンカー領域は、少なくとも１００アミノ酸長である、構築物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の構築物であって、前記リンカー領域は、配列番号１０または配列番号１３に示される配列を有する、構築物。
【請求項１６】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、マウスのムチン３ＥＧＦ様ドメインである、核酸分子。
【請求項１７】
請求項１に記載の核酸分子であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、ヒトのムチン３ＥＧＦ様ドメインである、核酸分子。
【請求項１８】
消化管の疾患もしくは状態を有するかまたは消化管の疾患もしくは状態を発症する危険がある個体を処置する方法であって、該方法は、
ムチン３ＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチドの有効量を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に示される配列を有する、方法。
【請求項２０】
請求項１８に記載の方法であって、前記消化管の疾患は、胃炎、消化性潰瘍疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、および腸癌からなる群より選択される、方法。
【請求項２１】
請求項１８に記載の方法であって、前記有効量は、前記消化管における細胞遊走または創傷治癒を刺激するのに有効な量である、方法。
【請求項２２】
個体において上皮の損傷を処置または防止する方法であって、該方法は、
ムチン３ＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチドの有効量を投与する工程、
を包含する、方法。
【請求項２３】
請求項２２に記載の方法であって、前記ムチン３ＥＧＦ様ドメインが、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６に示される配列を有する、方法。
【請求項２４】
請求項２２に記載の方法であって、前記上皮の損傷は、上部消化管、食道、真皮、表皮、膣、頚部、子宮、胃腸管、遠位腸、気道上皮、または角膜上皮の損傷である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（連邦政府支援研究または連邦政府支援開発）
米国政府は、Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｍｅｒｉｔ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ａｗａｒｄに従い、本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ドメインに関連し、そしてより具体的には、ムチンポリペプチド内のＥＧＦドメインに関連する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
ムチンは、ほとんどの上皮組織によって分泌されるファミリー、およびほとんどの上皮組織によって発現される細胞表面の糖タンパク質である。ムチンは、上皮組織の表面に関し、そしてムチンは、保護的な役割を果たすと考えられる。ムチンタンパク質における変化は、胃炎および消化性潰瘍疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、ならびに腸癌のような状態において注目されてきた。ムチンは、２つの分類（分泌性ムチンタンパク質または膜結合性ムチンタンパク質）にグループ分けされる。分泌性ムチンは、高度に（ｈｅａｖｉｌｙ）グリコシル化される大きなセリンドメインおよびトレオニンリッチ（ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ）のドメインに隣接する、「フォン−ビルブラントＤ型」ドメインと称されるカルボキシルドメインおよびアミノ末端ドメインによって特徴付けられる。これらのムチンはまた、末端と末端とが接続されて、溶液中において高い粘性を生じる長いポリマーを形成する。膜結合性ムチンは、小さい細胞質ドメイン、膜を貫通する疎水性ドメインを含み、そしていくつかの場合において、システインリッチのドメイン、ならびにグリコシル化される大きなセリンドメインおよびトレオニンリッチのドメインによって特徴付けられる細胞外ドメインを含む、カルボキシル末端ドメインによって特徴付けられる。膜を貫通するドメインを有さないタンパク質をコードする、遺伝子のメッセンジャーＲＮＡのスプライシング改変体が記載され、このドメインは、そのタンパク質がモノマーの分泌性ムチンとして機能することを可能にする。この点に関して、膜を貫通するムチンは、膜関連タンパク質および分泌性タンパク質の両方として存在し、二機能性（ｂｉ−ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ）であると見なされ得る。
【０００４】
多くの異なるタンパク質は、ＧモジュールといわれるＥＧＦ様ドメインを含む。ＥＧＦ様ドメインは、数種の成長因子、および細胞外マトリックスの形成、細胞接着、化学走性、および創傷の治癒に関連する多くの細胞外タンパク質中に見出される。ＥＧＦ様ドメイン中に見出される６個のシステインは、構造ドメインを生じる３つの分子内ジスルフィド結合を形成し、この構造ドメインは、タンパク質−タンパク質相互作用、またはおそらくタンパク質−膜相互作用を維持するのに重要である。このドメインまたはＧモジュールは、ジスルフィド結合によって１つに保たれる２つの小さい二本鎖のβシートから構成される。全てとは限らないが、いくつかのＥＧＦ様ドメインは、ＥＧＦレセプターを結合し得る。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
一局面において、本発明は、ムチン３ＥＧＦ様ドメインをコードする核酸分子を含む単離された核酸を提供する。代表的な配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１４を含む。本発明は、このような核酸を含む構築物を提供する。構築物は、複数（例えば、２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上）のムチン３ＥＧＦ様ドメインを含み得る。複数のムチン３ＥＧＦ様ドメインが存在する場合、これらのドメインは、一般的に、リンカー領域によって隔てられる。リンカー領域は、少なくとも１００アミノ酸長であり得る。代表的なリンカー領域の配列は、配列番号１０または配列番号１３に示されるムチン３ＥＧＦ様ドメインは、マウスムチン３ＥＧＦ様ドメインまたはヒトムチン３ＥＧＦ様ドメインであり得る。あるいは、マウスムチン３ＥＧＦ様ドメインおよびヒトムチン３ＥＧＦ様ドメインは、構築物中で一緒に存在し得る。
【０００６】
別の局面において、本発明は、消化管の疾患もしくは状態を有するかまたは消化管の疾患もしくは状態を発症する危険がある個体を処置する方法を提供する。このような方法は、代表的に、ムチン３ＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチドの有効量を投与する工程を包含する。代表的なムチン３ＥＧＦ様ドメインは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１４に示される配列である。消化管の代表的な疾患としては、胃炎、消化性潰瘍疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、および腸癌が挙げられるが、これらに限定されない。代表的に、有効量は、消化管における細胞遊走または創傷治癒を刺激するのに有効な量である。
【０００７】
別の局面において、本発明は、個体において上皮の損傷を処置または防止する方法を提供する。このような方法は、代表的に、ムチン３ＥＧＦ様ドメインをを含むポリペプチドの有効量を投与する工程を包含する。代表的なムチン３ＥＧＦ様ドメインは、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号１４に示される配列を有する。代表的な上皮の損傷としては、例えば、上部消化管、食道、真皮、表皮、膣、頚部、子宮、胃腸管、遠位腸（ｄｉｓｔａｌ  ｂｏｗｅｌ）、気道上皮、および／または角膜上皮の損傷が挙げられる。
【０００８】
ムチン３ＥＧＦ様ドメインは、一般的に、ＥＧＦレセプターを直接活性化しない。さらに、ムチンＥＧＦ様ドメインは、タンパク質のリン酸化を刺激し得；このタンパク質は、通常約１６０ｋＤａ〜約２００ｋＤａのサイズであるタンパク質である。
【０００９】
特に明記されない限り、本明細書中で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって、一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料に類似するか、またはこれらと等価である方法および材料が、本発明の実施および試験に使用され得るが、適切な方法および材料は、以下に記載される。さらに、材料、方法および類例は、単なる例示であり、そして限定を意図しない。本明細書中に記載される全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合において、定義を含む本明細書は、こられの場合を制御する。
【００１０】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面および以下の記載に示される。本発明の他の特徴、目的、および利点は、図面および詳細な説明、ならびに特許請求の範囲から明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
種々の図面における類似の参照番号は、類似の要素を示す。
【００１２】
（詳細な説明）
腸の膜結合型ムチン遺伝子であるＭｕｃ３は、１つの大きなグリコシル化タンデムリピートドメインと、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）様モチーフまたはドメインといくらか類似性を有する２つのシステインリッチドメインを有する１つのドメインとから構成される細胞外ドメインを有する、大きな膜結合型ムチンをコードする。
【００１３】
（核酸）
本発明は、Ｍｕｃ３核酸分子およびＭｕｃ３核酸分子内のＥＧＦ様ドメインの同定に、部分的に基づく。本発明の核酸分子としては、配列番号１７または配列番号１９に示される配列が挙げられる。さらなるムチン３核酸は、例えばＧｅｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０５８７６８、ＡＦ４５０２４１、ＡＦ４５０２４２およびＡＦ４５０２４３で見出すことができる。本明細書中で使用される場合、用語「核酸分子」は、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子、ならびにヌクレオチドアナログを使用して生成されるＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を包含する。本発明の核酸分子は、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、鎖性（ｓｔｒａｎｄｅｄｎｅｓｓ）は、その意図される用途に依存する。
【００１４】
本発明はさらに、配列番号１７もしくは配列番号１９、またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０５８７６８、ＡＦ４５０２４１、ＡＦ４５０２４２およびＡＦ４５０２４３に示されるヌクレオチド配列とは異なる核酸分子を包含する。本発明の核酸分子としては、少なくとも１０アミノ酸長、かつ配列番号１７もしくは配列番号１９、またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０５８７６８、ＡＦ４５０２４１、ＡＦ４５０２４２およびＡＦ４５０２４３に示される任意の配列に対して少なくとも７５％の配列同一性（例えば、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％の配列同一性）を有する分子が挙げられる。配列番号１７もしくは配列番号１９、またはＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＢＣ０５８７６８、ＡＦ４５０２４１、ＡＦ４５０２４２およびＡＦ４５０２４３に示される核酸配列とは異なる核酸分子は、標準的な技術（例えば、部位特異的突然変異誘発またはＰＣＲ媒介突然変異誘発）により生成され得る。さらに、ヌクレオチド変化は、ＥＧＦをコードする核酸分子の全てまたは一部に沿って、（例えば、飽和突然変異誘発）ランダムに導入され得る。一般的に、ヒトムチン遺伝子およびヒトムチンタンパク質は、大文字で表され、一方マウスムチン遺伝子およびタンパク質は、小文字で表される。
【００１５】
配列同一性パーセントの算出において、２つの配列をアライメントし、その２つの配列間のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の同一マッチの数が決定される。同一マッチの数は、アライメントされた領域の長さ（すなわち、アライメントされたヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数）で除算され、１００をかけてパーセント配列同一性値に到る。アライメントされた領域は、最も短い配列の全長サイズまでの配列の一方または両方の一部であり得ることが理解される。一方の配列は他方の配列と様々にアライメントされ得、そしてそれゆえ、各アライメント領域に対して異なるパーセント配列同一性値を有し得ることが理解される。パーセント同一性値は通常、最も近い整数に丸められることに注意されたい。例えば、７８．１％、７８．２％、７８．３％および７８．４％は７８％に丸められ、一方７８．５％、７８．６％、７８．７％、７８．８％および７８．９％は７９％に丸められる。アライメントされる領域の長さは常に整数であることにも注意されたい。
【００１６】
パーセント配列同一性値を決定するための２つ以上の配列のアライメントは、ワールドワイドウェブ上のｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで利用可能なＢＬＡＳＴ（基本的局所的アライメント探索ツール）プログラムに組み込まれた、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２）によって記載されたアルゴリズムを使用して実施される。ＢＬＡＳＴ探索は、Ｍｕｃ３  ＥＧＦ様ドメインをコードする核酸分子と、Ａｌｔｓｃｈｕｌらのアルゴリズムを使用してアライメントされた任意の他の配列またはその一部との間のパーセント配列同一性を決定するために実施され得る。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列間をアライメントし、同一性を比較するのに使用され、一方ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列間をアライメントし、同一性を比較するのに使用されるプログラムである。ＢＬＡＳＴプログラムを使用して、本発明の配列と別の配列との間のパーセント同一性を算出する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメーターが使用される。
【００１７】
本明細書中で使用される場合「単離された」核酸分子は、この単離された核酸と通常は会合している他の核酸分子から分離された核酸分子である。従って、「単離された」核酸分子としては、その単離された核酸分子が由来する生物のゲノムにおける核酸の一端または両端の、天然には近接している配列から離れた核酸（例えば、ＰＣＲまたは制限酵素地図によって産生されるｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡフラグメント）である。このような単離された核酸分子は、操作を簡便にするため、または融合核酸分子を生成するために、ベクター（例えば、クローニングベクター、または発現ベクター）に導入される。さらに、単離された核酸分子は、組み換え核酸分子または合成核酸分子のような操作された核酸分子を包含し得る。例えば核酸ライブラリー（例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリー）または制限酵素処理されたゲノムＤＮＡを含むゲル（例えば、アガロースまたはポリアクリルアミン）の一部の中で、数百〜数万の他の核酸分子内で存在している核酸分子は、単離された核酸分子とはみなされない。
【００１８】
本発明の単離された核酸分子は、当該分野において慣習的な技術を使用して得ることができる。例えば、本発明の範囲内にある単離された核酸分子は、以下のいずれかの方法を使用して得ることができるが、これらに限定されない；組み換え核酸技術、および／またはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術。一般的なＰＣＲ技術は、例えばＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ＆  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９５に記載されている。組み換え核酸技術としては、例えば制限酵素消化およびライゲーションが挙げられ、本発明の核酸分子を単離するのに使用され得る。本発明の単離された核酸分子は、単一の核酸または一連のオリゴヌクレオチドのいずれかとして、化学的に合成され得る。さらに、本発明の単離された核酸分子は、突然変異誘発によっても得ることができる。例えば、当該分野で公知の配列を同一性を共有する単離された核酸分子が、一般的な分子クローニング技術（例えば、部位特異的突然変異誘発）を使用して変異させられ得る。可能な突然変異としては、欠失、挿入、置換およびこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１９】
核酸分子はまた、複数のムチン３様ドメインを含み得る。例えば、核酸分子は、２つのムチン３様ドメイン、３つのムチン３様ドメイン、４つのムチン３様ドメインまたはそれより多いムチン３様ドメインを含み得る。代表的には、各々のムチン３様ドメインはリンカー領域によって別のムチン３様ドメインから隔てられる。リンカー領域は、アミノ酸（例えば、５〜１５０アミノ酸）、化学的連結、またはこれらの組み合わせを包含し得る。
【００２０】
１つ以上のＭｕｃ３  ＥＧＦ様ドメインをコードする核酸分子を含む構築物もまた、本発明によって提供される。本発明における使用に適した構築物（発現ベクターが挙げられる）は、市販されており、そして／または当該分野において慣習的な組み換えＤＮＡ技術によって産生される。Ｍｕｃ３核酸分子を含む構築物は、そのようなＭｕｃ３核酸分子に操作可能に連結された、発現に必須なエレメントを有し得、さらに選択可能なマーカー（例えば、抗生物質耐性遺伝子）のような配列および／またはＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチドの精製において使用され得るような配列（例えば、６×Ｈｉｓタグ）を含み得る。
【００２１】
発現のために必要なエレメントとしては、核酸コード配列の発現を指示および制御する核酸配列が挙げられる。発現のために必要なエレメントの１例は、プロモーター配列である。発現のために必要なエレメントはまた、核酸の発現を調節する、イントロン、エンハンサー配列、応答配列、または誘導性エレメントが挙げられる。発現のために必要なエレメントは、細菌起源、酵母起源、昆虫起源、哺乳動物起源、またはウイルス起源であり得、そしてベクターは異なる起源のエレメントの組み合わせを含み得る。発現のために必要なエレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，１９９０，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡに記載される。本明細書中で使用される場合、作動可能に連結される、とは、プロモーターおよび／または他の制御エレメントが、ベクター中で核酸に対して、その核酸の発現を指示または制御するような方法で位置付けられる。インビボおよびインビトロ両方において核酸を細胞に導入するための多くの方法は、当業者に周知であり、そしてその方法としては、非限定的に、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション、熱ショック、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス媒介性核酸移入が挙げられる。
【００２２】
本発明の別の局面において、本発明のベクター（例えば、発現ベクター）または本発明の単離された核酸分子が導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」とは、特定の細胞をいうだけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫もいう。宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、Ｍｕｃ３  ＥＧＦ様ドメインをコードする核酸は、Ｅ．ｃｏｌｉのような微生物において、または昆虫細胞、酵母細胞もしくは哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵母細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）において発現され得る。他の適切な宿主細胞は、当業者に公知である。
【００２３】
Ｍｕｃ３核酸分子を含むベクターは、＿＿＿＿＿＿＿＿＿に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ  Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ  ２０１１０に寄託されており、そして受託番号は＿＿＿＿＿＿＿および＿＿＿＿＿＿＿を与えられた。各々の寄託は、特許手続上の微生物の国際的承認に関するブダペスト条約の下で維持される。この寄託は、当業者の都合上でのみなされており、そして寄託が米国特許法第１１２条の下で必要とされる承認ではない。
【００２４】
（ポリペプチド）
本発明の１局面は、精製されたムチン３  ＥＧＦ様ドメインポリペプチド、およびムチン３  ＥＧＦ様ドメインポリペプチドフラグメントに関する。代表的なムチン３  ＥＧＦ様ドメインは、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６に示され、これらは各々、固有のシステインパターンを示す。第一のマウスムチン３  ＥＧＦ様ドメインのアミノ酸配列およびヒトＭＵＣＩＮ３  ＥＧＦ様ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１２および配列番号９に示される；マウスムチン３リンカー領域のアミノ酸配列およびヒトＭＵＣＩＮ３リンカー領域のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１３および配列番号１０に示される；第二のマウスムチン３  ＥＧＦ様ドメインのアミノ酸配列およびヒトＭＵＣＩＮ３  ＥＧＦ様ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１４および配列番号１１に示される。ヒトムチン３のアミノ酸配列およびマウスムチン３のアミノ酸配列は、配列番号１８および配列番号２０に示される。ムチン１７ＥＧＦ様ドメインもまた、配列番号７および配列番号８に示され、そしてまた固有のシステインパターンを実証する。
【００２５】
用語「精製された」ポリペプチドは、本明細書中で使用される場合、天然でそのポリペプチドに随伴する細胞成分から分離されているかまたは精製されているポリペプチドをいう。代表的に、ポリペプチドは、それが天然において会合されるタンパク質および天然に存在する分子が除かれて、乾燥重量で少なくとも７０％（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％）である場合に、「精製された」とみなされる。化学合成されたポリペプチドは、本質的に、天然でそのポリペプチドに随伴する成分から分離されているので、合成ポリペプチドは「精製されて」いる。ポリペプチドは、公知の方法（例えば、ＤＥＡＥイオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、およびヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー）によって、天然の供給源（例えば、生物学的サンプル）から精製され得る。精製されたポリペプチドはまた、例えば、発現ベクター中の核酸を発現することによって得られ得る。さらに、精製ポリペプチドは、化学合成によって得られ得る。ポリペプチドの精製度は、任意の適切な方法（例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはＨＰＬＣ分析）によって測定され得る。
【００２６】
天然に存在するポリペプチドに加え、当業者は、さらに、本明細書中に考察されるように、核酸分子（例えば、配列番号１７もしくは配列番号１９に示される配列を有する核酸分子、またはＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＢＣ０５８７６８、ＡＦ４５０２４１、ＡＦ４５０２４２およびＡＦ４５０２４３）中に変化が導入され、これによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列における変化を導き得ることを理解する。例えば、Ｍｕｃ３核酸コード配列中に変化が導入されて、１つ以上のアミノ酸残基において保存的アミノ酸置換および／または非保存的アミン酸置換を導き得る。「保存的アミノ酸置換」は、１つのアミノ酸残基が類似の側鎖を有する別のアミノ酸に置き換えられることである。アミノ酸残基間の類似性は、当該分野で調べられている。例えば、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、第５巻、補遺３、ｐｐ３４５−３５２）は、アミノ酸類似性の尺度として使用され得る、アミノ酸置換に関する頻度表を提供する。非保存的置換は、１つのアミノ酸残基が類似の側鎖を有さない別のアミノ酸残基に置き換えられることである。
【００２７】
本発明はまた、キメラポリペプチドおよび融合ポリペプチドを提供する。本明細書中で使用される場合、用語「キメラ」ポリペプチドまたは「融合」ポリペプチドは、異種ポリペプチドと作動可能に連結された１つ以上のＭｕｃ３ポリペプチドを含む。異種ポリペプチドは、Ｍｕｃ３ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかにおいて存在し得る。キメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドにおいて、用語「作動可能に連結された」とは、２つのポリペプチドが互いに対してインフレーム（ｉｎ−ｆｒａｍｅ）でコードされることを指すことを意図される。融合ポリペプチドにおいて、異種ポリペプチドは、一般的に、その融合ポリペプチドを（例えば、アフィニティー精製によって）精製する能力のような、所望の特性を有する。本発明のキメラポリペプチドまたは融合ポリペプチドは、標準的なＤＮＡ組換え技術によって作製され得、そして市販の構築物を使用し得る。
【００２８】
精製のために融合タンパク質において通常使用されるポリペプチドは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）であるが、多くの他のポリペプチドが利用可能であり、使用され得る。さらに、タンパク質分解性切断部位が、Ｍｕｃ３ポリペプチドと非Ｍｕｃ３ポリペプチドとの間の連結において導入されて、この融合タンパク質の精製に続いて、これら２つのポリペプチドの分離を可能にし得る。このようなタンパク質分解性部位を切断する酵素としては、Ｘａ因子、トロンビン、またはエンテロキナーゼが挙げられる。Ｍｕｃ３ポリペプチドのアフィニティー精製において使用され得る異種ポリペプチドをコードする代表的な発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８，Ｇｅｎｅ，６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【００２９】
（ムチン３  ＥＧＦ様ドメインを使用する方法）
本発明は、消化管疾患を有するかまたは消化管疾患を発症する危険性のある個体において、その消化管疾患を要望または処置するための方法を、提供する。本発明はまた、個体における上皮損傷を処置するための方法を提供する。個体は、ＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチドまたはそのようなドメインをコードする核酸を投与することによって処置され得る。消化管疾患を発症する危険性のある個体は、消化管の疾患または状態に特徴的である症状の発症前にそのポリペプチドまたはその核酸を投与され得、その結果、その疾患または状態が、その進行を防止されるかまたは遅延される。
【００３０】
消化管疾患としては、胃炎、消化性潰瘍疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、または腸管癌が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書中で使用される場合、上皮の損傷とは、限定なしに、上部消化管の損傷、食道の損傷、真皮の損傷、表皮の損傷、膣の損傷、頸部の損傷、子宮の損傷、胃腸管の損傷、腸末端（ｄｉｓｔａｌ  ｂｏｗｅｌ）の損傷、気道上皮の損傷、または角膜上皮の損傷をいう。特に、上皮損傷は、口内炎、粘膜炎（ｍｕｃｏｓｉｔｉｔｓ）、歯肉炎、胃食道逆流性疾患により引き起こされる損傷、外傷性損傷、熱傷、圧迫潰瘍、湿疹、接触皮膚炎、乾癬、疱疹性損傷、ざ瘡、腸炎、直腸炎、クローン病または潰瘍性大腸炎により引き起こされる損傷、角膜炎、角膜の潰瘍、角結膜炎、円錐角膜、結膜、眼性炎症、または瘢痕性類天疱瘡（ｐｅｎｈｉｇｏｉｄ）であり得る。例によって、本明細書中で記載される場合の損傷とは、細菌感染、ウイルス感染、寄生虫感染、または真菌感染によって引き起こされ得るか；アレルギー性反応、喘息、慢性閉塞性肺疾患によって引き起こされ得るか；喫煙、特定の物質もしくは化学物質の吸入により引き起こされ得るか；または抗新生物化学療法もしくは抗新生物放射線療法によって引き起こされ得る。
【００３１】
１つの実施形態において、個体に投与される化合物は、Ｍｕｃ３ポリペプチドまたはＭｕｃ３  ＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチド（例えば、Ｍｕｃ３ＥＧＦ１またはＭｕｃ３ＥＧＦ２；例えば、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９、配列番号１１、配列番号１２または配列番号１４）であり得る。投与のための化合物は、融合ポリペプチドであり得る。別の実施形態において、個体に投与される化合物は、Ｍｕｃ３ポリペプチドまたは１つ以上のＭｕｃ３  ＥＧＦ様ドメインをコードする核酸分子であり得る。核酸がコードする配列（例えば、全長またはそれ以外）は、適切な発現ベクターに導入され得、その結果、Ｍｕｃ３またはＭｕｃ３  ＥＧＦ様ドメインまたは融合ポリペプチドが、その発現ベクターの適切な発現の際に産生され得る。
【００３２】
本発明の組成物において使用され得る化合物（例えば、Ｍｕｃ３ポリペプチドもしくはＭｕｃ３  ＥＧＦ様ドメインをコードする核酸分子、またはＭｕｃ３ポリペプチドもしくはＭｕｃ３  ＥＧＦ様ドメインを含むポリペプチド）は、投与のために適切な薬学的組成物に組み込まれ得る。このような組成物は、代表的に、その核酸分子またはポリペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む。本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」は、薬学的投与に適合性である、任意のあらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含むことが意図される。薬学的に活性な基質のためのこのような媒体および薬剤の使用は、当該分野で周知である。任意の従来の媒体または薬剤が活性化合物と非適合性である範囲を除き、組成物におけるその使用が企図される。補助的な活性化合物もまた、この組成物に組み込まれ得る。
【００３３】
本発明の薬学的組成物は、意図される投与経路に適合性であるように処方される。投与経路の例としては、非経口投与（例えば、静脈内投与、皮内投与、皮下投与）、経口投与（例えば、経口摂取、または吸入）、経皮投与（局所投与）、経粘膜投与、および結腸投与が挙げられる。非経口適用、皮内適用または皮下適用のために使用される溶液または懸濁剤は、以下の成分を含み得る：滅菌希釈剤（例えば、注射用水、生理食塩水溶液（例えば、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ））、不揮発性オイル、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール、など）、グリシン、または他の合成溶媒；抗細菌剤および抗真菌剤（例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザール、など）；防腐剤（例えば、アスコルビン酸または重硫酸ナトリウム）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸）；緩衝剤（例えば、アセテート、シトレート、またはホスフェート）および張度調整剤（例えば、塩化ナトリウムおよびデキストロース）。適切な流動性は、例えば、レクチンのようなコーティングの使用によって、分散の場合に必要とされる粒子サイズの維持によって、そして界面活性剤の使用によって、維持され得る。多くの場合、組成物において等張剤（例えば、糖、ポリアルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）、および塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能な組成物の長期投与は、吸収を遅延する薬剤を含めることによってもたらされ得る。このような薬剤としては、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンが挙げられる。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチックから作製されたアンプル、使い捨てシリンジまたは複数用量のバイアルに封入され得る。
【００３４】
経口組成物は、一般的に、不活性希釈剤または食用キャリアを含む。経口組成物は、液体であり得るか、またはゼラチンカプセル中に封入されるかまたは錠剤へと圧縮され得る。薬学的に適合性の結合剤および／またはアジュバント物質は、経口組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル、トローチなどは、以下の不活性化剤のうちの任意のいずれか、または類似の性質の化合物を含み得る：結合剤（例えば、微結晶性セルロース、ガムトラガカント、またはゼラチン）；賦形剤（例えば、デンプンまたはラクトース）；崩壊剤（例えば、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、またはコーンデンプン）；滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓ）；流動化剤（ｇｌｉｄａｎｔ）（例えば、コロイド状二酸化ケイ素）；甘味剤（例えば、ショ糖、またはサッカリン）；または矯味矯臭剤（例えば、ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料）。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐薬の使用を介して達成され得る。経粘膜投与のため、活性化合物は、一般に当該分野で公知のように、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲル、またはクリームに処方される。
【００３５】
投与の容易さおよび投薬の均一性のため、投薬量単位形態で経口組成物または非経口組成物を処方することは、特に有益である。投薬量単位形態は、本明細書中で使用される場合、処置されるべき個体に対する単位投薬量として適した、物理的に別個の単位をいう；各々の単位は、必要な薬学的キャリアと共に、所望の治療効果を生じるように計算された所定の量の活性化合物を含む。本発明の投薬量単位形態は、個体を治療的に処置するために必要な化合物の量に依存する。必要とされる化合物の量は、単回用量で処方され得るか、または複数用量単位で処方され得る。個体の処置は、１回分の用量を必要としてもよいし、または頻回の用量を必要としてもよい。
【００３６】
治療剤のポリペプチドに関して、用量は、代表的に、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜体重１ｋｇ当たり約１００ｍｇ（一般的に、約０．５ｍｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇ）である。脂質化（ｌｉｐｉｄａｔｉｏｎ）のような改変（Ｃｒｕｉｋｓｈａｎｋら，１９９７，Ｊ．Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｏｌｏｇｙ，１４：１９３）を使用して、ポリペプチドを安定化させ得、そして取り込みおよび組織透過を増強させ得る。核酸に関して、投与される用量は、発現ベクターの発現レベルに依存する。好ましくは、体重１ｋｇ当たり約０．１ｍｇ〜体重１ｋｇあたり約１００ｍｇの量のＭｕｃ３ポリペプチドまたはＭｕｃ３  ＥＧＦ様ドメインを産生するベクター量が、個体に投与される。本発明は、以下の実施例にさらに記載されるが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【００３７】
（実施例１−ＧＳＴ融合タンパク質）
マウス腸管由来のｃＤＮＡから、両方のＥＧＦ様ドメイン（ｍ３ＥＧＦ１、ｍ３ＥＧＦ２）を含むマウスＭｕｃ３の細胞外領域を増幅した。さらに、第一のＥＧＦ様ドメイン（ｍ３ＥＧＦ１）に対応する産物、または第二のＥＧＦ様ドメイン（ｍ３ＥＧＦ２）に対応する産物もまた増幅した。以前に記載されるように、増幅を実施した（Ｓｈｅｋｅｌｓら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ，３３０：１３０１−１３０８）。得られたフラグメントをｐＧＥＸ−２ＴＫベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）にクローニングし、配列決定し、そしてＥ−ｃｏｌｉ株ＢＬ２１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で発現させた。次いでＧＳＴ融合タンパク質を、０．５ｍＭ  ＩＰＴＧ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いた誘導によってＥ−ｃｏｌｉ中で発現させ、そしてグルタチオンアガロース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用したアフィニティークロマトグラフィーによって、このＧＳＴ融合タンパク質を精製した。両方のｍｕｃ３  ＥＧＦ様ドメイン（ｍ３ＥＧＦ１、ｍ３ＥＧＦ２）を含む融合ペプチド、または第一のＥＧＦ−１様ドメイン（ｍ３ＥＧＦ１）のみを含む融合ペプチド、もしくは第二のＥＧＦ−２様ドメイン（ｍ３ＥＧＦ２）のみを含む融合ペプチドを合成した（図１Ｃ）。
【００３８】
（実施例２−細胞培養）
ＥＧＦファミリーのレセプターを有することが公知であるマウス細胞およびヒト細胞を使用した。Ａ４３１細胞は、不死化したヒト類表皮癌細胞株であり、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （Ｍａｎａｓｓａｓ，  ＶＡ）より入手した。Ａ４３１細胞は、高レベルのＥＧＦ（ＥｒｂＢ１）レセプターを発現し、そしてＥＧＦに応答して遊走する。Ｌｏｖｏ細胞は、ヒト結腸腺癌細胞株であり、そしてＥｒｂＢ１レセプターおよび低レベルのＥｒｂＢ２を発現する。Ｌｏｖｏ細胞は、ＥＧＦ２ドメインの一部を欠失しそして完全な膜貫通ドメインを備えるヒトＭＵＣ３の短縮形態を発現することが、以前に示されている。
【００３９】
細胞を、１０％ウシ胎仔血清＋５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび０．０５μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を補充したＤＭＥＭを使用して、細胞遊走実験および細胞増殖実験のために２４ウェルプレートにおいて増殖させ、そしてイムノブロット実験のためにＴ−２５フラスコにおいて増殖させた。細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２、１０％  ＦＣＳで所望のコンフルーエンシーに達するまで培養した。実験の２４時間前に、単層をＰＢＳで洗浄し、そしてその細胞を、細胞遊走実験およびイムノブロット実験のために血清を含まない培地に切り換え、また細胞増殖実験のために０．５％血清を含む培地に切り換えた。若い成体マウスの結腸細胞（ＹＡＭＣ）は、条件付で不死化したマウス結腸細胞であり、５％  ＦＣＳ＋５０Ｕ／ｍｌ  ペニシリンおよび０．０５μｇ／ｍｌ  ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ１６４０中で増殖させた。
【００４０】
（実施例３−細胞遊走アッセイ）
Ａ４３１細胞またはＬｏｖｏ細胞のコンフルエントな２４ウェルプレートを、以前に記載されるように（Ｂｕｒｋら，１９７３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７０：３６９−３７２）、血清を含まない培地中で一晩培養し、この培地をＰＢＳに置き換え、そしてその単層を、片刃のカミソリの刃を用いて機械的に傷付けた。阻害実験の間、細胞を、１５０ｎＭトリプシンＡＧ１４７８（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）または１５μｇ／ｍｌ  ゲニステイン（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共に３７℃で３０分間インキュベートし、次いで傷害を与える前にＰＢＳで洗浄した。傷害を与えた後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、そして目的のペプチドを含むＤＭＥＭにおいてさらに１８時間〜２４時間（３７℃、５％  ＣＯ２、０％  ＦＣＳ）インキュベートした。阻害実験の間、細胞をインヒビターおよび目的のペプチドにより１８時間処置した。固定化および染色の後、傷の付いた端から遊走している細胞を、倒立顕微鏡を使用して１００倍の倍率で計数した。１つのウェル内で２つの首尾のよい領域を計数して平均化し、そして各々実験における各々の条件に対して、３〜１２個のウェルを平均化した。ＹＡＭＣ細胞をコンフルーエンシーまで増殖させ、次いで回転ディスクを使用して、２４ウェルプレート内の１領域からの細胞を断片化した。２０時間後、以前に記載されるように（Ｆｒｅｙら，２００４，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：４４５１３−２１）、残存する傷の付いた領域を測定した。
【００４１】
（実施例４−細胞増殖アッセイ）
細胞を、２４ウェルプレートで、その細胞が６０％コンフルーエンシーになるまで培養し、次いでその細胞を０．５％血清を含む培地に切り換え２４時間培養した。単層をＰＢＳで洗浄した後、その単層を目的のペプチドと共に、ＤＭＥＭ中で２４時間培養した。細胞をトリパンブルー染色（Ｋａｉｓｅｒら，１９９７，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１１２：１２３１−４０）によって定量化した。各々のウェル由来の２つの計数を平均化した；６個のウェルを処置毎に平均化した。各々の処置の増殖を、血清を含まないコントロールに対する割合として示した。また、細胞を９６ウェルプレートで増殖させ、そして細胞数を、以前に記載されるように（Ｓｈｅｋｅｌｓら，１９９５，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．，１２７：５７−６６）、ジメチルチアゾールジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ，Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を使用する、テトラゾリウムベースの比色定量アッセイによって推定した。
【００４２】
（実施例５−細胞溶解物および膜の調製）
細胞の単層をＰＢＳで洗浄し、次いで０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  ＮＰ４０、０．０５Ｍ  ＥＤＴＡ、２．９Ｍ  ＮａＦを含む細胞溶解緩衝液中に溶解した。細胞をフラスコから取り出し、そしてこの溶解物を１０〜１５分間氷上でインキュベートした。２０秒間ボルテックスした後、この溶解物を、１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。膜を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ（ｐＨ８．０）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  β−メルカプトエタノールを含む膜溶解緩衝液の添加によって、Ｔ−７５フラスコ中で増殖させた細胞から調製した。プロテアーゼインヒビターおよびホスファターゼインヒビターを、使用する前に添加した。単層を溶解緩衝液中に取り出し、氷冷した遠心チューブ中に入れ、この単層を、２８ゲージの針を使用して剥離した。この溶解物を、１０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、次いでその上清を１５，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。膜を含むペレットを、１００μｌのＲＩＰＡ溶解緩衝液中に再懸濁し、そして２８ゲージの針を使用して剥離した。試薬は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから購入した。
【００４３】
（実施例６−免疫沈降および免疫ブロット）
免疫沈降のために、（プロテインＡビーズ（３００μｌ溶解物あたり３０μｌ）を２時間添加した後に、細胞溶解物または膜調製物を、抗ＥＧＦレセプター抗体、抗ＥｒｂＢ２レセプター抗体、または抗ＥｒｂＢ３レセプター抗体（全て、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡから得た）のいずれかと一緒に、１：１００の希釈率にて４℃で一晩インキュベートした。免疫沈降物を遠心分離によって回収し、そして細胞溶解緩衝液中で３回洗浄した。ペレットを、２×ＳＤＳサンプル緩衝液中に再懸濁し、そして３０秒間ボルテックスした。免疫沈降物を、１００℃で５分間変性し、そしてニトロセルロース膜に移す前にＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ＴＢＳ中の５％脱脂粉乳によって２時間ブロックし、そして２回、ＴＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎによって５分間洗浄した後、ウェスタンブロッティングを、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用して、１：２０００の希釈率にて４℃で一晩行った。コントロールのウェスタン免疫ブロットを、１：２０００の希釈率にて４℃で一晩免疫沈降した特定のレセプターに対する抗体を使用して、同じサンプルで行った。膜を、ＴＢＳ中の０．０５％  Ｔｗｅｅｎで２回洗浄し、次いで１：２０００の希釈率にてペルオキシダーゼ結合体化二次抗体（Ｓｉｇｍａ）と一緒に１時間インキュベートした。それぞれ５分間で４回洗浄した後、タンパク質を、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｐｅｒｓｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を使用する化学発光検出によって可視化した。免疫ブロットを、抗ホスホチロシンモノクローナル抗体（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を使用し、事前に免疫沈降せずに細胞溶解物または膜調製物のサンプルに対して同様の様式で行った。
【００４４】
（実施例７−組換えペプチド中のチオールの定量化）
組換えムチンタンパク質中の遊離システインの測定を、Ｓｉｎｇｈら（Ｓｉｎｇｈら、１９９５、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２５１：２２９−３７）を改変した方法を使用して行った。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社製（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）のＴｈｉｏｌ  ａｎｄ  Ｓｕｌｆｉｄｅ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを、使用した。要約すると、組換えムチンタンパク質またはコントロールのペプチドを、不活化パパイン−ＳＳＣＨ３と一緒にインキュベートした。このタンパク質中の遊離チオールは、このパパイン−ＳＳＣＨ３を還元して活性形態にする。この還元型パパインの活性は、色素産生性のパパイン基質（Ｌ−ＢＡＰＮＡ（Ｎ−ベンゾイル−Ｌ−アルギニン、ｐ−ニトロアニリド））を使用して測定される。同じ方法を使用することによって、検量線が、既知のＬ−システイン濃度を使用して調製される。この検量線が使用されて、この組換えタンパク質中の遊離チオールを算出する。マウスＭｕｃ５ＡＣ（ＭＧＭｔｒ）のタンデムリピート配列に対応するペプチドを、システインを含まないコントロールのペプチドとして使用した（ＫＱＴＳＳＰＮＴＧＫＴＳＴＩＳＴＴ）（配列番号１）。ＥＧＦをまた、コントロールのペプチドとして使用した。ＥＧＦは、遊離チオールを有さないが、その全てがジスルフィド結合に関連する６個のシステインを有する。マウスＭｕｃ５ＡＣ（ＭＧＭｎｒ）の非反復部分に対応するペプチドを、２つの遊離チオールを含むコントロールのペプチドとして使用した（ＣＫＮＥＬＣＮＷＴＮＷＬＤＧＳＹＰＧＳＧＲＮＳＧＤ）（配列番号２）。
【００４５】
（実施例８−ヒトＭＵＣ３のシステインリッチ（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｒｉｃｈ）ドメイン構築物の安定なトランスフェクション）
ヒトＭＵＣ３ＥＧＦ１，２ドメインに対応するプライマーを合成し、そしてヒト結腸ｃＤＮＡを増幅するために使用した。９３６ｂｐのヒトＭＵＣ３  ＥＧＦ１，２  ＰＣＲ産物は、２つのヒトＭＵＣ３  ＥＧＦ様ドメイン、ＭＵＣ３膜貫通領域、およびＭＵＣ細胞質ドメインの２０個のアミノ酸をコードした。このＭＵＣ３  ＰＣＲフラグメントを、ｐＦＬＡＧ−ＣＭＶ−３（Ｓｉｇｍａ）に連結した。このベクターは、発現タンパク質の分泌を可能にする、プレプロトリプシンのリーダー配列をコードする。プレプロトリプシンのリーダー配列は、目的の発現タンパク質のアミノ末端にて、ＦＬＡＧタグに続く。ＭＵＣ３膜貫通配列は、細胞膜への挿入のためにタンパク質を標的化する。この挿入物の配列および方向の確認を、ＤＮＡ配列決定によって行った。
【００４６】
Ｌｏｖｏ細胞を、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ヒトＭＵＣ３膜貫通ＥＧＦ１，２構築物によってトランスフェクトした。トランスフェクションを開始してから４８時間後に、細胞を、８００μｇ／ｍＬ  Ｇ４１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の存在下で培養した。Ｇ４１８耐性クローンを、滅菌したクローニングリング（ｃｌｏｎｉｎｇ  ｒｉｎｇ）を使用して単離した。クローンＬｈＭ３ｃｌ４を、アポトーシスアッセイのために使用した。Ｌｏｖｏ細胞をまた、空ベクターによってトランスフェクトして、安定な偽トランスフェクト（ｍｏｃｋｔｒａｎｓｆｅｃｔ）クローン（Ｌｍｏｃｋ）を作製した。このトランスフェクト体を、８００μｇ／ｍｌ  Ｇ４１８を含む選択培地中で維持した。ヒトＭＵＣ３  ＥＧＦ１，２構築物の発現を、ウサギ抗ｆｌａｇ抗体（Ｓｉｇｍａ）を用いるウェスタンブロット分析によって決定した。
【００４７】
（実施例９−アポトーシスアッセイ）
アポトーシスを、３５ｍｍの滅菌したペトリ皿において１０％血清を含むＤＭＥＭ中で４８時間培養した若干密集（ｓｕｂ−ｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）したＬｏｖｏ細胞の培養物に、１００ｎｇ／ｍｌ  ＴＮＦα（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって誘導した。アポトーシスをまた、細胞を１０００Ｕ／ｍｌインターフェロンγと一緒に２４時間インキュベートし、次いでインターフェロンを除去し、そして１００〜５００ｎｇ／ｍｌの抗ｆａｓ抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を７２時間添加することによって誘導した。細胞を、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド中に５分間固定し、次いでＰＢＳで２回洗浄した。この細胞を、ＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌの濃度の核着色料（Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｗａｒｒｉｎｇｔｏｎ，ＰＡ））によって３０分間染色し、リンスし、Ｓｌｏｗｆａｄｅ  Ａｎｔｉｆａｄｅ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用してカバースリップで覆い、次いで直ちに紫外線顕微鏡を使用して画像化した。アポトーシスの核を、形態学によって同定した。正常な核およびアポトーシスの核の総数を、１皿あたり３つの４０倍レンズの視野（１皿あたり２００個を超える核を示す）で計測した。３つ以上の皿を、各実験条件のために使用した。
【００４８】
（実施例１０−実験的な大腸炎モデル）
全ての実験手順は、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ  Ｖｅｔｅｒａｎｓ  Ａｆｆａｉｒｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認された。
【００４９】
酢酸誘発大腸炎モデル。雌ＣＤ−１マウス（２０〜３０ｇｍ、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）を、一晩絶食させ、そして吸入による３％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）を使用して麻酔した。次いで、直腸を、０．２ｍｌ生理食塩水で洗浄した。大腸炎を、０．１ｍｌの５％酢酸の直腸内投与によって誘導した。この溶液を、肛門の近位の約３ｃｍに套管針を通して投与した。その後、マウスを、１２時間後および２４時間後に、リン酸緩衝化生理食塩水中の０．１ｍｌの組換えペプチド、または同様の濃度における同じ緩衝液中の０．１ｍｌのコントロールペプチドを、イソフルラン麻酔を使用して直腸内投与することによって処置した。全てのマウスを、大腸炎の誘導後、３０時間（最後の浣腸処置の６〜１２時間後）で捕獲した。遠位結腸を、肉眼での潰瘍化検査および顕微鏡検査のために取り出し、そして検査した。このモデルは、これまでに記載されてきた（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９７、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１１２：１０２２−１０２７；およびＴｏｍｉｔａら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．、３１１：２９３−２９７）。
【００５０】
デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発大腸炎。急性大腸炎を、これまでに記載される（Ｏｋａｙａｓｕら、１９９３、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、９８：６９４−７０２；Ｃｏｏｐｅｒら、１９９３、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．、６９：２３８−４９；Ｍｕｒｔｈｙら、１９９３、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．、３８：１７２２−３４）ような、飲料水中の５％デキストラン硫酸ナトリウム（分子量４０，０００〜５０，０００、ＵＳＢ，Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ，ＯＨ）の投与によって雌ＣＤ−１マウス（２０〜３０ｇｍ）において誘導した。７日後、ＤＳＳを、この飲料水から除去した。マウスを、ＤＳＳの除去後２４時間および４８時間にて、リン酸緩衝化生理食塩水中の０．１ｍｌの組換えペプチド、または同じ緩衝液中の０．１ｍｌのコントロールペプチドを、イソフルラン麻酔を使用して直腸内投与することによって処置した。全てのマウスを、ＤＳＳの除去後７２時間にて捕獲し、そしてその結腸を組織学的に検査した。
【００５１】
（実施例１１−組織学的粘膜傷害のスコア）
摘出した結腸を、１０％の緩衝化したホルマリン中に固定し、パラフィン中に包理し、そしてヘマトキシリンおよびエオシンによって染色した。粘膜傷害の重症度を、これまでに記載されるもの（Ｏｋａｙａｓｕら、１９９０、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、９８：６９４−７０２；Ｍｕｒｔｈｙら、１９９３、Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．、３８：１７２２−３４）と同様に等級分けした。傷害の大きさを、以下のように０〜ＩＩＩに等級分けした：等級０＝正常；等級Ｉ＝底面の腺の３分の１の変形および／または破壊、ならびに限局性の炎症性浸潤；等級ＩＩ＝全ての腺または底面の腺の３分の２の糜爛／破壊および保たれた表層上皮を伴う炎症性浸潤；ならびに等級ＩＩＩ＝腺および表層上皮全体の喪失。検体を、実験群の情報無しに検査した。
【００５２】
等級ＩＩＩの大腸炎を示す低倍率（１０×）の視野の総数を、各検体について決定した。全体の腺窩損傷のスコアをまた、等級Ｉ、等級ＩＩ、および等級ＩＩＩのスコアを、それぞれ１、２、および３を与えることによって算出した。低倍率の各視野を、等級分けし、そして各スコアの各検体の％を、最終的な腺窩損傷のスコア（０〜３．００の範囲）を得るために算出し、そして付与した。例えば、同じ長さの結腸を、各検体について検査し、そして１０％の１のスコアによる視野、２５％の２のスコアの視野、および２５％の３のスコアの視野を有する検体は、（０．１）１＋（．２５）２＋（．２５）３＝１．３５の腺窩損傷のスコアを有する。
【００５３】
（実施例１２−統計解析）
平均±ＳＥＭを、各実験群における変数について計算し、そしてステューデントのｔ−検定（両側）およびフィッシャーの正確検定を使用して分析した。０．０５未満のｐ値を、有意であると見なした。
【００５４】
（実施例１３−組換えｍｕｃ３タンパク質の設計）
両方のマウスＭｕｃ３  ＥＧＦ様ドメイン（ｍ３ＥＧＦｌ，２）（第１のＥＧＦ様ドメイン（ｍ３ＥＧＦｌ）または第２のＥＧＦ様ドメイン（ｍ３ＥＧＦ２））に対応する組換えＧＳＴ融合タンパク質を、構築し、Ｅ．ｃｏｌｉ中で発現し、そしてグルタチオン−アガロースカラムを使用して精製した。図１Ａは、マウスＭｕｃ３ならびにヒトＭＵＣ３およびヒトＭＵＣ１７のＥＧＦ様ドメインにおけるシステインのスペーシングを示す。ＥＧＦおよびトレフォイルドメインのシステインのスペーシングを、比較のために示す。マウスＭｕｃ３およびヒトＭＵＣ３のＥＧＦ様ドメイン中に高度に保存されたシステイン配置に注目のこと。Ｍｕｃ３の第１のＥＧＦ様ドメインおよび第２のＥＧＦ様ドメインは、それぞれ、８個および１０個のシステインを有する。各ＥＧＦ様ドメインにおける最後の６個のシステインは、スペーシングのより低い保存を示す第２のＥＧＦ様ドメインを含む、ＥＧＦに類似する空間的配置中に見出される。他の有意な配列類似性は、Ｍｕｃ３  ＥＧＦ様ドメインとＥＧＦとの間に見出されない。
【００５５】
表１は、ＥＧＦ１ドメイン、グリコシル化連結ドメイン、およびＥＧＦ２ドメインのシステイン配置ならびにアミノ酸配列を示し、これらのドメインは、マウスＭｕｃ３およびヒトＭＵＣ３に由来する。ヒトＭｕｃ３およびマウスＭｕｃ３は、第１のＥＧＦ様ドメインと第２のＥＧＦ様ドメインとの間に、６０％および４４％の全体的な配列類似性を共有する。マウスＭｕｃ３およびヒトＭＵＣ１７のシステインのスペーシングの比較は、より低い類似性を示すが、マウスＭｕｃ３とヒトＭＵＣ１７との全体的なアミノ酸配列類似性は、ヒトＭＵＣ３との類似性に匹敵する（第１のＥＧＦ様ドメインおよび第２のＥＧＦ様ドメインにおいて、それぞれ、５２％および６４％の配列類似性である）。
【００５６】
【表１】
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ラットＭｕｃ３は、２つのＥＧＦ様ドメインの間に存在するＳＥＡモジュールおよび第２の部位において、翻訳後に切断されることが示された。得られる２つのサブユニットは、２％  ＳＤＳおよび煮沸によって破壊され得る非共有結合を介して再度会合する。組換えｍ３ＥＧＦ１，２は、５４ｋＤａの予測分子量にて、クマ−シー染色した還元性ゲル中の顕著な単一バンドとして認められた。２％  ＳＤＳ中で５分間の煮沸による組換えｍ３ＥＧＦ１，２の処理は、分子量の変化を生じず、このことは、この型の切断が組換えＧＳＴ融合タンパク質において起こらなかったことを示した。同様に、組換えｍ３ＥＧＦ１および組換えｍ３ＥＧＦ２は、クマ−シー染色した還元性ゲル上で、それぞれ、３４ｋＤａおよび４０ｋＤａの単一バンドとして認められた。
【００５７】
組換えムチンタンパク質にジスルフィド結合が形成されたことを確かめるために、このタンパク質の遊離チオール含有量を測定した。このチオール含有量は、遊離チオールを欠くことが予想されるコントロールのペプチド（マウスの胃ムチンタンデムリピートペプチド（ＭＧＭｔｒ）およびＥＧＦ）において０に近いことが決定された。２つの遊離チオールを含むポジティブコントロールのペプチドであるマウスの胃粘素非反復ペプチドＭＧＭｎｒを測定し、このペプチドは、１ペプチドあたり１．６個の遊離システインを含んだ（表２）。また、ＧＳＴ単独ではまた、非常にわずかな遊離チオールを有した。ｍ３ＥＧＦ１，２およびｍ３ＥＧＦ１は、殆ど測定不可能なチオールを有し、このことは、全てのシステインがジスルフィド結合中に見出されることを示唆する。興味深いことに、ｍ３ＥＧＦ２は、遊離システインを有するようであった。
【００５８】
【表２】
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（実施例１４−細胞増殖に対するｍｕｃ３組換えペプチドの効果）
細胞増殖に対するｍｕｃ３組換えペプチドの効果を、２４時間にわたってＬｏｖｏ細胞およびＡ４３１細胞中で測定した。図２Ａに示すように、ｍ３ＥＧＦｌ、ｍ３ＥＧＦ２、およびｍ３ＥＧＦ１，２によるＬｏｖｏ細胞の処理は、２４時間後の細胞数の任意の有意な変化をもたらさなかった。同様に、１０〜５０μｇ／ｍｌのｍ３ＥＧＦ１，２によるＹＡＭＣ細胞およびＡ４３１細胞の処理後の細胞数について、有意な効果は存在しない（図２Ｂ）。細胞増殖に対する効果は、１０〜５０μｇ／ｍｌのｍ３ＥＧＦ１，２によって処理したＹＡＭＣ細胞において観察されなかった。
【００５９】
（実施例１５−組換えｍ３ＥＧＦ１，２は、細胞遊走を刺激する）
ＥｒｂＢレセプターを含むことが公知である、マウス結腸細胞（ＹＡＭＣ）、ヒト上皮細胞株Ａ４３１、およびＬｏｖｏヒト結腸癌細胞を、組換えＭｕｃ３  ＥＧＦドメインタンパク質が細胞遊走を刺激したか否かを決定するために検査した。
【００６０】
ｍ３ＥＧＦ１，２によって処理したＹＡＭＣ細胞は、コントロールの処理と比較して、２０時間を超えて有意（ｐ＜０．０５）に増加した創傷の閉鎖を実証し、そして用量反応が、実証された（図３）。１０μｇ／ｍｌ  ｍ３ＥＧＦｌ，２によって１８〜２４時間処理したヒトＡ４３１細胞は、細胞遊走においてコントロールを上回る２１５％の増加を実証した（ｐ＜０．０５）。
【００６１】
Ａ４３１細胞において、１ｎｇ／ｍｌの組換えＥＧＦは、細胞遊走を、コントロールのほぼ３００％刺激した。対照的に、短縮したＭｕｃ３のシステインリッチな組換えタンパク質であるｍ３ＥＧＦｌおよびｍ３ＥＧＦ２は、細胞遊走を変化させなかった（図４Ａ）。
【００６２】
１μｇ／ｍｌのｍ３ＥＧＦ１，２によって処理したＬｏｖｏヒト結腸癌細胞は、コントロールと比較して、２４時間にわたる細胞遊走の２倍の増加を実証した。このことは、１ｎｇ／ｍｌの組換えＥＧＦによって誘導した遊走と同様であった（図４Ｂ）。用量反応は、１０μｇ／ｍｌのｍ３ＥＧＦ１，２を用いて、細胞遊走の２．６倍のさらなる増加によって実証された。２０μｇ／ｍｌ以上の用量による細胞遊走のその後の増加は、観察されなかった。組換えＭｕｃ３のＥＧＦドメインタンパク質がＥＧＦレセプターの刺激を介して作用したか否かを決定するために、このレセプターのインヒビターであるＡＧ１４７８を使用して、Ａ４３１細胞を前処理した。ＡＧ１４７８の１５０ｎｍにおいて、このインヒビターは、ＥＧＦ誘導性の細胞遊走を阻害したが、ｍ３ＥＧＦ１，２によって誘導される細胞遊走を阻害しなかった（図５Ａ）。チロシンのリン酸化がｍ３ＥＧＦ１，２誘導性の細胞遊走に必要とされたか否かを決定するために、Ａ４３１細胞を、１５μｇ／ｍｌのゲニステインによって前処理した。これは、ＥＧＦ誘導性の細胞遊走の有意な阻害およびｍ３ＥＧＦ１，２によって誘導される細胞遊走の完全な阻害をもたらした（図５Ｂ）。
【００６３】
（実施例１６−組換えｍ３ＥＧＦ１，２は、ＥＧＦを活性化しない）
ｍ３ＥＧＦ１，２がＥＧＦ（ＥｒｂＢ１）レセプターの活性化またはリン酸化を生じるか否かをさらに分析するために、Ａ４３１細胞を組換えタンパク質によって処理し、そして細胞溶解物を全体のホスホチロシン内容物について検査した。ＥＧＦレセプターを、免疫沈降し、そして抗ホスホチロシン抗体を使用する免疫ブロットによって分析して、ＥＧＦレセプターのリン酸化を評価した。１ｎｇ／ｍｌの組換えＥＧＦによる１分間、３０分間および６０分間の細胞の処理は、コントロールの処理と比較して、ホスホチロシン内容物の１７５ｋＤのバンドの顕著な増加を生じた。対照的に、１７５ｋＤのバンドにおける１７５ｋｄのホスホチロシン反応性の変化は、ｍ３ＥＧＦ１，２またはコントロールのＧＳＴペプチドによって、１分間、３０分間および６０分間処理したＡ４３１細胞中で観察されなかった。このことを、ＥＧＦ（ＥｒｂＢ１）レセプターの免疫沈降を行い、次いでホスホチロシンのブロットを行うことによって確かめた。３連の実験は、６０分間において、組換えＥＧＦによるＥＧＦレセプターのリン酸化の顕著な増加を実証したが、ｍ３ＥＧＦ１，２またはコントロールのペプチドによるこのリン酸化の有意な増加を実証しなかった（図６Ａ）。ＹＡＭＣ細胞の若干密集した培養物を、１０μｇ／ｍｌのｍ３ＥＧＦ１，２によって同様に処理し、そして同様の濃度のＧＳＴで３０分間処理するか、または１ｎｇ／ｍｌの組換えＥＧＦで５分間処理した。細胞溶解物を、ＥＧＦレセプター、ＥｒｂＢ２、およびＥｒｂＢ３に対する抗体によって免疫沈降した。ＥＧＦｒおよびＥｒｂＢ２のリン酸化は、ＥＧＦに対する反応において生じたが、ｍ３ＥＧＦ１，２処理は、ＥＧＦｒ、ＥｒｂＢ２、またはＥｒｂＢ３のリン酸化を生じなかった（図６Ａ）。
【００６４】
（実施例１７−内在ＭＵＣ３ペプチドおよび外来ｍｕｃ３ペプチドは、アポトーシスを阻害する）
ヒトＭＵＣ３Ａ膜貫通ＥＧＦ１，２ドメイン構築物を、Ｌｏｖｏヒト結腸癌細胞中に、安定にトランスフェクトした。Ｌｏｖｏ細胞クローンＬｈＭ３ｃ１４は、細胞膜分画において、高レベルのｆｌａｇタグ化ヒトＭＵＣ３Ａ  ＥＧＦ１，２を発現し；これは、ｆｌａｇタグ化ヒトＭＵＣ３ＡＥＧＦ１，２は、ＬｈＭ３ｃ１４細胞質分画、偽トランスフェクトＬｏｖｏ細胞（Ｌｍｏｃｋ）および親のＬｏｖｏ細胞において欠けていた。アポトーシスを、ＴＮＦ−αを使用して、親のＬｏｖｏヒト結腸細胞およびＬｍｏｃｋ細胞において誘導した。安定なトランスフェクト体のクローンＬｈＭ３ｃ１４は、ＴＮＦ−α誘導性のアポトーシスをに対して著しく抵抗性であった（図７Ａ）。同様に、１００μｇ／ｍｌ  ｍ３ＥＧＦ１，２による親のＬｏｖｏ細胞の前処理は、ＴＮＦα誘導性のアポトーシスを減少させたが、一方で、コントロールのＧＴＳペプチドによる前処理は、ＴＮＦα誘導性のアポトーシスを減少させなかった（図７Ｂ）。インターフェロンγと抗ｆａｓ抗体とによる連続的な処理によって誘導したアポトーシスは、偽トランスフェクトＬｍｏｃｋと比較して、安定なトランスフェクト体のクローンＬｈＭ３ｃ１４において著しく減少した（図７Ｂ）。
【００６５】
（実施例１８−組換えｍ３ＥＧＦ１，２は、実験的な大腸炎の治癒を促す）
組換えペプチドが、腸管粘膜の治癒または再生に影響し得るか否かを決定するために、急性大腸炎の２つの異なるマウスモデルを使用した。第１のモデルにおいて、急性の結腸損傷を、５％酢酸の浣腸を行い、次いで１２時間および２４時間での組換えタンパク質またはコントロールの浣腸の施与によって、マウスにおいて誘導した。これらの動物を、３０時間にて屠殺して、粘膜損傷の程度を決定した。酢酸後の１２時間および２４時間において、直腸あたり１００μｇのｍ３ＥＧＦ１，２を用いたマウスの処置は、ＰＢＳ緩衝液中の１００μｇのＢＳＡを含む浣腸と比較して、腺窩損傷の総スコアを４５％減少させた（ｐ＝０．０５）（図８Ａ）。これは、コントロールの処置をしたマウスにおける、１検体あたり８．２±１．６の低倍率の視野から、１００μｇのｍ３ＥＧＦ１，２ペプチドの浣腸によって処置したマウスにおける、１検体あたり３．５±１．４の低倍率の視野への、全ての粘膜潰瘍または等級ＩＩＩの粘膜潰瘍の有意な減少に、ほぼ起因する（ｐ＝０．０３８）（図８Ｂ）。
【００６６】
組織学的な違いを、正常なマウス結腸粘膜と、等級Ｉの損傷と、等級ＩＩの損傷と、等級ＩＩＩの損傷との間で観察した。この実験を、１００μｇの組換えＧＳＴを有するＰＢＳ緩衝液を含むコントロールの浣腸を使用して繰り返し、１μｇ、５０μｇ、または１００μｇの組換えｍ３ＥＧＦ１，２；１００μｇ  ｍ３ＥＧＦ１；および１００μｇ  ｍ３ＥＧＦ２を含む浣腸と比較した。１２時間および２４時間にて、１００μｇのｍ３ＥＧＦ１，２を含む浣腸によって処置したマウスは、１００μｇのＧＳＴコントロールタンパク質を含む浣腸で処置したマウスと比較して、腺窩損傷のスコアにおける６２％の有意な減少（図８Ｃ）、および等級ＩＩＩの粘膜潰瘍における７９％の有意な減少（図８Ｄ）を実証した。１μｇのｍ３ＥＧＦ１，２および５０μｇのｍ３ＥＧＦ１，２を含む浣腸によって処置したマウスは、コントロールの浣腸処置と比較して、腺窩損傷のスコアにおける２９〜４０％の有意でない減少、および等級ＩＩＩの潰瘍における３８〜４０％の有意でない減少を有した。対照的に、１００μｇのｍ３ＥＧＦ１を含む浣腸または１００μｇのｍ３ＥＧＦ２を含む浣腸は、腺窩損傷のスコアまたは全ての粘膜潰瘍に対する効果を有さなかった（図８Ｃ、図８Ｄ）。
【００６７】
飲料水中の５％  ＤＳＳの７日間の投与は、遠位結腸において優勢な急性大腸炎を生じ、そしてこの大腸炎は、ＤＳＳの中止によって治癒する。ＤＳＳの中止後、１２時間および２４時間にて、直腸あたり１００μｇのｍ３ＥＧＦ１，２によって処置し、そしてＤＳＳの中止後、７２時間にて検査したマウスは、ＧＳＴまたはＢＳＡでのコントロールの浣腸で処置したマウスと比較して、遠位結腸における腺窩損傷のスコアの３８％の減少を実証した（ｐ＜０．００５）（図９Ａ）。このことは、主に、等級ＩＩＩの全ての粘膜潰瘍での、１検体あたりの視野の平均数における５３％の減少（全てのコントロールにおける１検体あたり８．５±１．１の視野の平均から、ｍ３ＥＧＦ１，２で処置したマウスにおける１検体あたり４．０±０．８の視野の平均までの減少）に起因した（ｐ＜０．００５）（図９Ｂ）。粘膜の損傷は、近位結腸において減少し、そして有意な違いを、処置したマウスおよびコントロールのマウスにおける等級ＩＩＩの潰瘍での、腺窩損傷のスコアまたは視野の数において観察しなかった（図９Ｃ、図９Ｄ）。
【００６８】
（他の実施形態）
本発明はその詳細な説明と組み合わせて記載される一方で、これまでの説明は、本発明の例示を意図し、そして添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定することを意図しないことが、理解されるべきである。他の局面、利点および改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１】（Ａ）マウスＭｕｃ３およびヒトＭＵＣ３およびヒトＭＵＣ１７のシステインリッチ領域の間隔。ＥＧＦおよび三葉型モチーフのシステイン間隔が比較のために示される。（Ｂ）マウスＭｕｃ３およびヒトＭＵＣ３のＥＧＦ１ドメイン、グリコシル化連結ドメイン、およびＥＧＦ２ドメインのアミノ酸配列。Ｃ．Ｅ．ｃｏｌｉで発現され、Ｅ．ｃｏｌｉから精製された組み換えマウスＧＳＴ−Ｍｕｃ３融合タンパク質の図。数字は、以前に記載された本来のｃＤＮＡ配列における塩基対（ｂｐ）に対応する。（Ｓｈｅｋｅｌｓら、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３３０：１３０１−１３０８）。
【図２−１】（Ａ）血清を含まない培地におけるコントロールの細胞数のパーセントとして表現した、２４時間後のＡ４３１細胞数についての、組み換えＧＳＴタンパク質のｍ３ＥＧＦ１，２および組み換えＥＧＦおよび組み換えＥＧＦの影響。
【図２−２】（Ｂ）２４時間後にＭＴＴによって測定された、Ｌｏｖｏ結腸癌細胞の増殖。ネガティブコントロールはＴｒｉｓ緩衝液中の血清を含まない培地から構成され、ポジティブコントロールは１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）中で増殖させた細胞であった。
【図３】創傷の閉鎖の合計パーセント。創傷は、若年成体マウス結腸（ＹＡＭＣ）細胞単層につけられ、２４時間で測定された。ＥＧＦ（１ｍｇ／ｍｌ）は、ポジティブコントロールとして使用され、２４時間後に１００％の創傷閉鎖をもたらした。
【図４】コントロールの血清を含まない（ＳＦ）培地におけるコントロールの遊走細胞数のパーセントとして表された、１８時間〜２４時間の、ｍ３ＥＧＦ１，２、ｍ３ＥＧＦ１、ｍ３ＲＧＦ２に応答したＡ４３１細胞の遊走。（Ｂ）２４時間後の、血清を含まない培地におけるコントロールの細胞遊走のパーセンテージで表された、種々の濃度のペプチドで処理されたＬｏｖｏ細胞の遊走。
【図５】（Ａ）特異的なＥＧＦ／ＥｒｂＢ１レセプターインヒビターチロホスチン（ｔｙｒｏｐｈｏｓｔｉｎ）のＡＧ１４７８（１５０ｎｍ）と一緒にかまたは含まずに、ｍ３ＥＧＦ１，２（１０μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）に応答して２４時間で遊走したｃＡ４３１細胞の平均数。（Ｂ）チロシンリン酸化の一般的なインヒビターであるゲニステイン（Ｇｅｎ，１５μｇ／ｍｌ）と一緒にかまたは含まずに、ｍ３ＥＧＦ１，２（１０μｇ／ｍｌ）またはＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）に応答して２４時間で遊走したｃＡ４３１細胞の平均数。ＳＦ＝血清を含まない培地、Ｎ＝各処理に対して６ウェル。
【図６】（Ａ）ＹＡＭＣ細胞を、ＥＧＦ（１ｎｇ／ｍｌ）に５分間曝露するか、または血清を含まない培地（ＳＦ）、ｍＥＧＦ１，２（１０μｇ／ｍｌ）もしくはＧＳＴ（１０μｇ／ｍｌ）に３０分間曝露した。
【図７】４８時間のＴＮＦ−α（１００ｎｇ／ｍｌ）処理あり（＋）またはなし（−）での、アポトーシスにおける変化パーセント。細胞株としては、親のＬｏｖｏ、ＬｈＭ３ｃ１４、Ｌｍｏｃｋ、およびＴＮＦ−αの添加１時間前にｍ３ＥＧＦ１，２（１０μｇ／ｍｌ）またはＧＳＴ（５μｇ／ｍｌ）で前処理された親のＬｏｖｏ細胞が挙げられる。（Ｂ）７２時間のインターフェロンγおよび抗ｆａｓ抗体連続処理あり（＋）またはなし（−）での、アポトーシスにおける変化パーセント。細胞株としては、ＬｈＭ３ｃ１４およびＬｍｏｃｋが挙げられる。
【図８−１】（Ａ）酢酸から１２時間および２４時間後に、直腸についてｍ３ＥＧＦ１，２（１００μｇ）またはＰＢＳ中のコントロールペプチドＢＳＡ（１００μｇ）での処置を受けたマウスにおける、酢酸投与から３０時間後での腺窩損傷スコア（ＣＤＳ）。（Ｂ）１００μｇのｍ３ＥＧＦ１，２またはＰＢＳ中１００μｇのコントロールペプチドであるＢＳＡで処置されたマウスにおける、酢酸投与から３０時間後での、等級ＩＩＩ潰瘍の標本当たりの低倍率（１０倍）視野の平均数。
【図８−２】（Ｃ）酢酸から１２時間および２４時間後に、直腸についてＧＳＴ、ｍ３ＥＧＦ（ＥＧＦ１）、ｍ３ＥＧＦ２（ＥＧＤ２）、またはｍ３ＥＧＦ１，２での処置を受けたマウスにおける、酢酸投与から３０時間後での腺窩損傷スコア（ＣＤＳ）。（Ｄ）ＧＳＴ、ｍ３ＥＧＦ（ＥＧＦ１）、ｍ３ＥＧＦ２（ＥＧＤ２）、またはｍ３ＥＧＦ１，２で処置されたマウスにおける、酢酸投与から３０時間後での、等級ＩＩＩ潰瘍の標本当たりの低倍率（１０倍）視野の平均数。
【図９−１】中央〜遠位マウス結腸（Ａ、Ｂ）および近位結腸（Ｃ）由来の等級ＩＩＩ潰瘍の、腺窩損傷スコアおよび視野／標本の平均数が示される。ＧＳＴおよびＢＳＡで処置されたコントロールマウス由来のスコアは、「総計」に一緒に加えられた。
【図９−２】中央〜遠位マウス結腸（Ａ、Ｂ）および近位結腸（Ｃ）由来の等級ＩＩＩ潰瘍の、腺窩損傷スコアおよび視野／標本の平均数が示される。ＧＳＴおよびＢＳＡで処置されたコントロールマウス由来のスコアは、「総計」に一緒に加えられた。
【図１０】ヒトムチン３およびマウスムチン３のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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