(57)【要約】  本願発明は、内皮細胞の接着または遊走を促進する方法、組成物およびデバイスを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
内皮細胞の接着を促進させる方法であって、当該内皮細胞を、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を内皮細胞の接着を促進させるのに有効な量含む組成物と接触させるステップを含む、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に同一なアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項４】
請求項１に記載の方法であって、前記組成物が基本的に、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に少なくとも80%同一なアミノ酸配列からなる、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、前記組成物が基本的に、配列番号5番に示される生物学活性断片の少なくとも1回の反復からなる、方法。
【請求項６】
請求項４に記載の方法であって、前記組成物が基本的に、配列番号6番に示される生物学活性断片からなる、方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列にハイブリダイズした核酸によってコードすることができるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項８】
請求項１に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片がデバイスに共有結合し、トロポエラスチンまたはその生物活性断片のその量が前記デバイスへの内皮細胞の接着を促進するのに有効である、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、前記デバイスが、金属、プラスチック、シリコーン、ダクロン、またはPTFEからつくられるか、またはそれらでコーティングされる、方法。
【請求項１０】
請求項８に記載の方法であって、トロポエラスチンまたはその生物活性断片の当該量が、生理学的に関連する流体の流速および／または管圧における内皮細胞の接着を促進および維持するのに有効である、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記の生理学的に関連する流体の流速および／または管圧が、静脈または動脈の流速または圧と同等な流速または圧である、方法。
【請求項１２】
請求項1に記載の方法であって、前記内皮細胞が内皮幹細胞である、方法。
【請求項１３】
内皮細胞を、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を、内皮細胞の遊走を促進させるのに有効な量含む組成物と接触させるステップを含む、内皮細胞の遊走を促進させる方法。
【請求項１４】
請求項１３に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に同一なアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項１６】
請求項１３に記載の方法であって、前記組成物が基本的に、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に少なくとも80%同一なアミノ酸配列からなる、方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、前記組成物は基本的に、配列番号5番に示される生物学活性断片の少なくとも1回の反復からなる、方法。
【請求項１８】
請求項１６に記載の方法であって、前記組成物は基本的に、配列番号6番に示される生物学活性断片からなる、方法。
【請求項１９】
請求項１３に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列にハイブリダイズした核酸によってコードすることができるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２０】
内皮細胞を、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片をある量含む組成物を含むデバイスと接触させるステップを含む、内皮細胞とデバイスの接着を促進する方法であって、前記量が、内皮細胞の前記デバイスへの接着を促進させるのに有効な量であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を前記デバイスに共有的に結合させる、方法。
【請求項２１】
請求項２０に記載の方法であって、トロポエラスチンまたはその生物活性断片の量が生理学的に関連する流体の流速および／または管圧における内皮細胞の接着を促進および維持するのに有効である、方法。
【請求項２２】
請求項２１に記載の方法であって、前記の生理学的に関連する流体の流速および／または管圧が、静脈または動脈の流速または圧と同等である、方法。
【請求項２３】
請求項２０に記載の方法であって、前記デバイスがステンレス鋼デバイスである、方法。
【請求項２４】
請求項２０に記載の方法であって、前記デバイスが、プラスチック、ダクロン、シリコーン、またはPTFEからつくられる、またはそれらによってコーティングされる方法。 
【請求項２５】
請求項２０に記載の方法であって、前記デバイスがカテーテル、ステント、シャント、ワイヤ、またはその他の腔内デバイスから選択される、方法。
【請求項２６】
請求項２０に記載の方法であって、前記デバイスがペースメーカ、心臓徐細動器、心室補助装置、血管移植片、人工弁、経鼻胃チューブ、人工呼吸管、または胸腔チューブから選択される、方法。
【請求項２７】
請求項２０に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２８】
請求項２０に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に同一なアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項２９】
請求項２０に記載の方法であって、前記組成物が基本的に、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に少なくとも80%同一なアミノ酸配列からなる、方法。
【請求項３０】
請求項２８に記載の方法であって、前記組成物は基本的に、配列番号5番に示される生物学活性断片の少なくとも1回の反復からなる、方法。
【請求項３１】
請求項２８に記載の方法であって、前記組成物は基本的に、配列番号6番に示される生物学活性断片からなる、方法。
【請求項３２】
請求項２０に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列にハイブリダイズした核酸によってコードすることができるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項３３】
再狭窄を治療または予防的に処置するのに有効な量のトロポエラスチンまたは生物活性断片を含む組成物を投与するステップを含む、再狭窄の治療または予防の方法であって、前記トロポエラスチンまたはその生物活性断片はデバイスに共有的に結合しており、前記組成物の投与が前記デバイスへの内皮細胞の接着を促進して再狭窄を治療または予防する、方法。
【請求項３４】
請求項３３に記載の方法であって、前記デバイスがステント、カテーテル、シャント、ワイヤ、またはその他の腔内デバイスから選択される、方法。
【請求項３５】
請求項３３に記載の方法であって、前記デバイスがステンレス鋼デバイスである、方法。
【請求項３６】
請求項33に記載の方法であって、前記デバイスが、プラスチック、シリコーン、ダクロン、ポリウレタン、ポリプロピレン、またはPTFEからつくられるか、またはそれらによってコーティングされる、方法。
【請求項３７】
請求項３３に記載の方法であって、その方法が、体内の管の中の細胞損傷の部位に経脈管的に前記デバイスを投与するステップを含む、方法。
【請求項３８】
請求項３３に記載の方法であって、その方法が、1つ以上のさらなる薬剤を併用投与するステップを含む、方法。
【請求項３９】
請求項３７に記載の方法であって、前記の体内の管は動脈、静脈、総胆管、膵管、腎管、食道、気管、尿道、膀胱、尿道、卵管、ファローピウス管、輸精管、前立腺管、またはリンパ管のいずれかから選択される、方法。
【請求項４０】
請求項３３に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項４１】
請求項３３に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に同一なアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項４２】
請求項３３に記載の方法であって、前記組成物が基本的に、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に少なくとも80%同一なアミノ酸配列からなる、方法。
【請求項４３】
請求項４２に記載の方法であって、前記組成物は基本的に、配列番号5番に示される生物学活性断片の少なくとも1回の反復からなる、方法。
【請求項４４】
請求項４２に記載の方法であって、前記組成物は基本的に、配列番号6番に示される生物学活性断片からなる、方法。
【請求項４５】
請求項３３に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列にハイブリダイズした核酸によってコードすることができるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項４６】
血栓症を治療または予防的に処置するのに有効な量の、トロポエラスチンまたは生物活性断片を含む組成物を投与するステップを含む、血栓症の治療または予防の方法であって、前記トロポエラスチンまたはその生物活性断片はデバイスに共有的に結合しており、前記組成物の投与が内皮細胞の前記デバイスへの接着を促進して血栓症を治療または予防する、方法。
【請求項４７】
請求項４６に記載の方法であって、前記デバイスがステント、カテーテル、シャント、ワイヤ、またはその他の腔内デバイスから選択される、方法。
【請求項４８】
請求項４６に記載の方法であって、前記デバイスがペースメーカ、心臓徐細動器、血管移植片、心室補助装置、人工弁、経鼻胃チューブ、人工呼吸管、または胸腔チューブから選択される、方法。
【請求項４９】
請求項４６に記載の方法であって、前記デバイスがステンレス鋼デバイスである、方法。
【請求項５０】
請求項４６に記載の方法であって、前記デバイスが、プラスチック、ダクロン、シリコーン、ポリウレタン、ポリプロピレン、またはPTFEからつくられる、またはそれらによってコーティングされる方法。 
【請求項５１】
請求項４６に記載の方法であって、その方法が、1つ以上のさらなる薬剤を併用投与するステップを含む、方法。
【請求項５２】
請求項４６に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項５３】
請求項４６に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に同一なアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項５４】
請求項４６に記載の方法であって、前記組成物が基本的に、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、または配列番号6に少なくとも80%同一なアミノ酸配列からなる、方法。
【請求項５５】
請求項５４に記載の方法であって、前記組成物は基本的に、配列番号5番に示される生物学活性断片の少なくとも1回の反復からなる、方法。
【請求項５６】
５４に記載の方法であって、前記組成物は基本的に、配列番号6番に示される生物学活性断片からなる、方法。
【請求項５７】
請求項４６に記載の方法であって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列にハイブリダイズした核酸によってコードすることができるアミノ酸配列を含む、方法。
【請求項５８】
トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を含むデバイスであって、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片が前記デバイスに共有的に結合し、前記デバイスが内皮細胞の前記デバイスへの接着を促進させるのに有効な量のトロポエラスチンまたはその生物活性断片を含む、デバイス。
【請求項５９】
請求項５８に記載のデバイスであって、前記デバイスがステンレス鋼デバイスである、デバイス。
【請求項６０】
請求項５８に記載のデバイスであって、前記デバイスが、プラスチック、シリコーン、ダクロン、ポリウレタン、ポリプロピレン、またはPTFEからつくられるか、またはそれらによってコーティングされるデバイス。
【請求項６１】
請求項５８に記載のデバイスであって、前記デバイスがカテーテル、ステント、シャント、ワイヤ、またはその他の腔内デバイスから選択される、デバイス。
【請求項６２】
請求項５８に記載のデバイスであって、前記デバイスがペースメーカ、心臓徐細動器、人工弁、心室補助装置、血管移植片、経鼻胃チューブ、人工呼吸管、または胸腔チューブから選択される、デバイス。
【請求項６３】
請求項５８に記載のデバイスであって、トロポエラスチンまたはその生物活性断片の前記有効量が、生理学的に関連する流体の流速および／または管圧における内皮細胞の接着を促進および維持するのに十分である、方法。
【請求項６４】
請求項６３に記載のデバイスであって、前記の生理学的に関連する流速および／または圧が、静脈または動脈の流速または圧と同等である、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容全体を引用をもって本願明細書に援用するものとする、2005年2月25日に提出された米国特許仮出願第60/656,360号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
心血管疾患と閉塞性血管疾患の治療の進歩が、さまざまな疾患および症状の治療法を生み出した。多様な薬剤溶出性および非薬剤溶出性デバイスの移植を含む、これらの治療法は、患者の生存率と生活の質を劇的に向上させてきた。しかし、これらの治療法には限界があり、副作用がある。
【０００３】
医学的療法は、閉塞性血管疾患に伴うリスク因子の低下に焦点を置いている。抗血栓薬、降圧薬、およびコレステロール降下薬の目的は、閉塞のリスクを低下させることだが、ベータ遮断薬とアンギオテンシン転換酵素阻害剤は、心臓の負荷を軽減させることによって作用する。これらの血管閉塞と心臓イベントのリスクを低下させる薬学的進歩にもかかわらず、心血管疾患と血管閉塞症を直接治療するためのインターベンション心臓学と外科的心臓手術の必要性は大きいままだ。
【０００４】
血管形成術は冠状動脈病の主要な介入法で、米国だけでも年間680,000件の手術が行われている。簡単に説明すると、閉塞した動脈にバルーンを置き、それを膨らませて閉塞を回復させる。ほとんどの場合、そのような装置を付けた動脈内にステントを置く。しかし、血管形成術の70%しか、血管閉塞の長期（6ヶ月）回復に至らない。再狭窄とよばれるプロセスでは、血管平滑筋細胞が、血管形成術によって生じた血管損傷に応答して、動脈を再閉塞させる。そのような再狭窄は、いずれかの体内の管（たとえば動脈、静脈、尿管、尿道、ファローピウス管、総胆管、膵管、腎管、食道、気管、膀胱、子宮、卵管、輸精管、前立腺管、またはリンパ管など）の中のステント、ワイヤ、カテーテル、シャント、またはその他の腔内装置の配置を含む、体内の管壁への損傷を生じるその他の手術にも認められる。ステントの配置および組成物の相次ぐ進歩の影響で、ステントの輸送が大幅に容易になってきたが、再狭窄の合併症は減少していない。最近、放射能およびその他の細胞毒性剤（たとえば、パクリタキセル、アクチノマイシンD、およびラパマイシンなど）を用いて再狭窄を治療する戦略が、大きく注目されている。このような戦略は、数多くの細胞種の増殖を阻害する毒性剤の一時的および局所的輸送に依存する。現在、長期間の効果が試験されているが、これらの薬剤の毒性には、慢性心臓病および心血管病の症状を管理することが多い長期間の治療オプションとして用いることができるかどうかについて、重大な疑問がある。  
【０００５】
現在の心血管疾患および閉塞性血管疾患のための治療法の目的は、血管内皮の血管平滑筋細胞の過剰増殖を予防または阻害して、血管の閉塞を予防または阻害することである。しかし、血管平滑筋細胞の増殖を阻害するために用いる、ラパマイシンおよびタキソールを含む多くの治療法は、細胞毒性メカニズムによって機能する。これらの治療法は閉塞を予防するが、その細胞毒性は、管の中にあるまたは隣接する内皮細胞を阻害する。内皮細胞成長または構造への損傷は、これらの治療剤およびその他の治療剤の送達によく用いられる腔内装置の挿入によって、さらに悪化する。治療剤によって生じる損傷および／または各種装置の挿入によって生じる損傷が合わさると、再狭窄が引き起こされることが多い。再狭窄の結果、心血管疾患および閉塞性血管疾患の患者には、ステント挿入、カテーテル挿入、またはその他の治療法を繰り返し行わなければならないことが多い。そのような治療の繰り返しによって、患者は入院または侵襲的手術のいずれかに伴う高いリスクにさらされる。さらに、これらの治療法を繰り返す必要性によって、これらの症状の管理に伴う費用が劇的に増加する。再狭窄を減少または予防する方法および組成物は、当業に、相当な改善をもたらすだろう。
【０００６】
再狭窄の問題に加えて、血栓症は、心血管疾患および閉塞性血管疾患の現在の治療法の多くに伴う重大な問題である。実際、血栓症のリスクは、装置が体内に留置されればいつでも存在し、多くの外科手術に潜在する合併症である。したがって、血栓症は心臓および血管内手術に伴うだけでなく、体内または体内の管腔への装置の配置を含むその他の介入的アプローチにも伴う、重篤な合併症である。特に、そして上述のとおり、現在の薬物療法の多くは内皮細胞に損傷を与え、その増殖を阻害する。これは、挿入された装置の内皮化を著しく阻害する。その結果、遅発性の血栓症が、薬物溶出性または非薬物溶出性装置を用いて治療された患者に生じるかもしれない。致死的な可能性のある血栓症の予防を促すために、患者は抗血小板および／または抗凝固療法で攻撃的に治療することが多い。これらの治療法はそれ自体、リスクと費用を課す。したがって、挿入された装置（たとえば血管内または腔管内装置など）の内皮化を促進し、血栓症の可能性を予防または低下させる方法および組成物は、当業を顕著に改善するだろう。
【０００７】
本願発明は、たとえば内皮細胞の移植可能・生体適合性装置への接着を促進するためなど、内皮細胞の接着を促進するための方法および組成物を提供する。たとえば生体適合性デバイスなどへの内皮細胞の接着を促進する方法および組成物は、再狭窄および／または血栓症の治療または予防に用いることができる。        
【０００８】
発明の概要
本願発明は、内皮細胞の接着および／または遊走を調節する組成物および方法を提供する。本願発明は、さまざまな心血管疾患および閉塞性血管疾患のための薬物療法およびデバイスによる療法が、致命的にもなりうる副作用を生じることが多い、再狭窄または血栓症を治療および予防するための組成物および方法を提供する。本願発明はさらに、内皮接着を促進し、それによって再狭窄または血栓症を予防するようにデザインされた移植可能なデバイスを提供する。
【０００９】
第一の局面では、本願発明は内皮細胞の接着を促進する方法を提供する。この方法は、前記内皮細胞を、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を有効量含む、ある量の組成物に接触させるステップであって、前記有効量が内皮細胞の接着を促進させるのに十分である、ステップを含む。トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、未変性のトロポエラスチンの1つ以上の生物学的活性を有する。
【００１０】
ある実施態様では、内皮細胞の接着を促進する方法は、in vitroの方法である。別の実施態様では、内皮細胞の接着を促進する方法は、in
vivoの方法である。  
【００１１】
ある実施態様では、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、配列番号2、3、4、5、または6番に少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、配列番号2、3、4、5、または6番に同一なアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号2、3、4、5、または6番に少なくとも80%同一なアミノ酸配列からなる。さらに別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号5番に示される生物活性断片の少なくとも1回の反復からなる。別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号6番に示される生物活性断片からなる。さらに別の実施態様では、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列とハイブリダイズした核酸によってコードすることができるアミノ酸配列を含む。前述のいずれかにおいて、前記組成物は、未変性のトロポエラスチンの1つ以上の生物学的活性を維持する、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を含むか、または基本的にそれらから構成される。本願発明において、および本願発明のデバイスにおいて使用するための、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を保持する未変性トロポエラスチンの例示的な生物学的／機能的活性には、(i)  in vitroにおける内皮細胞の接着の促進、(ii)  in vivoにおける内皮細胞の接着の促進、(iii)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の接着の促進、(iv)  in vitroにおけるヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）の接着の促進、(v)  in vitroにおける内皮細胞の遊走の促進、(vi)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の遊走の促進、(vii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の接着の促進、(viii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の遊走の促進、(ix)  in vitroにおけるヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）の接着の促進が、それらに限定されずに含まれる。 
【００１２】
別の実施態様では、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、デバイスに共有的に結合する。例示的なデバイスは、金属、シリコーン、ダクロン、プラスチック、またはPTFEからつくられるか、またはコーティングされる。例示的な金属デバイスには、ステンレス鋼デバイスが含まれる。有効量のトロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を前記デバイスに結合し、その有効量は、前記デバイスへの内皮細胞の接着を促進するのに十分である。
【００１３】
第二の局面では、本願発明は内皮細胞の遊走を促進する方法を提供する。この方法は、前記内皮細胞を、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を有効量含む、ある量の組成物に接触させるステップであって、前記有効量が内皮細胞の遊走を促進させるのに十分である、ステップを含む。トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、未変性のトロポエラスチンの1つ以上の生物学的活性を有する。
【００１４】
ある実施態様では、内皮細胞の遊走を促進する方法は、in vitroの方法である。別の実施態様では、内皮細胞の遊走を促進する方法は、in
vivoの方法である。  
【００１５】
ある実施態様では、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、配列番号2、3、4、5、または6番に少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、配列番号2、3、4、5、または6番に同一なアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号2、3、4、5、または6番に少なくとも80%同一なアミノ酸配列からなる。さらに別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号5番に示される生物活性断片の少なくとも1回の反復からなる。別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号6番に示される生物活性断片からなる。さらに別の実施態様では、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列とハイブリダイズした核酸によってコードすることができるアミノ酸配列を含む。前述のいずれかにおいて、前記組成物は、未変性のトロポエラスチンの1つ以上の生物学的活性を維持する、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を含むか、または基本的にそれらから構成される。本願発明において、および本願発明のデバイスにおいて使用するための、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を保持する未変性トロポエラスチンの例示的な生物学的／機能的活性には、(i)  in vitroにおける内皮細胞の接着の促進、(ii)  in vivoにおける内皮細胞の接着の促進、(iii)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の接着の促進、(iv)  in vitroにおけるヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）の接着の促進、(v)  in vitroにおける内皮細胞の遊走の促進、(vi)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の遊走の促進、(vii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の接着の促進、(viii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の遊走の促進、(ix)  in vitroにおけるヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）の接着の促進が、それらに限定されずに含まれる。  
【００１６】
別の実施態様では、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、デバイスに共有的に結合する。例示的なデバイスは、金属、プラスチック、ダクロン、PTFE、シリコーン、またはプラスチックからつくられる。例示的な金属デバイスには、ステンレス鋼デバイスが含まれる。有効量のトロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を前記デバイスに結合し、その有効量は、前記デバイスへの内皮細胞の遊走を促進するのに十分である。
【００１７】
第三の局面では、本願発明は内皮細胞のデバイスへの接着を促進する方法を提供する。本願方法は、前記内皮細胞をデバイスに接触させるステップを含む。前記デバイスは、有効量のトロポエラスチンポリペプチド、またはその生物活性断片が含まれる組成物を含み、そのトロポエラスチンまたはその生物活性断片は前記デバイスに共有結合する。有効量のトロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を前記デバイスに結合し、その有効量は前記デバイスへの内皮細胞の接着を促進するのに十分である。
【００１８】
ある実施態様では、その方法はin vitro の方法である。別の実施態様では、その方法はin vivo の方法である。  
【００１９】
ある実施態様では、前記デバイスは、たとえばステンレス鋼デバイスなどの金属デバイスである。別の実施態様では、前記デバイスは、プラスチック、シリコーン、PTFE、またはダクロンからつくられるか、またはそれらでコーティングされる。ある実施態様では、前記デバイスはカテーテル、ステント、シャント、ワイヤ、またはその他の腔内デバイスから選択される。別の実施態様では、前記デバイスはペースメーカ、心臓徐細動器、人工弁、心室補助装置、血管移植片、経鼻胃チューブ、人工呼吸管、または胸腔チューブから選択される。
【００２０】
ある実施態様では、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、配列番号2、3、4、5、または6番に少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、配列番号2、3、4、5、または6番に同一なアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号2、3、4、5、または6番に少なくとも80%同一なアミノ酸配列からなる。さらに別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号5番にある生物活性断片の少なくとも1回の反復からなる。別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号6番に示される生物活性断片からなる。さらに別の実施態様では、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列とハイブリダイズした核酸によってコードすることができるアミノ酸配列を含む。前述のいずれかにおいて、前記組成物は、未変性のトロポエラスチンの1つ以上の生物学的活性を維持する、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を含むか、または基本的にそれらから構成される。本願発明において、および本願発明のデバイスにおいて使用するための、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を保持する未変性トロポエラスチンの例示的な生物学的／機能的活性には、(i)  in vitroにおける内皮細胞の接着の促進、(ii)  in vivoにおける内皮細胞の接着の促進、(iii)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の接着の促進、(iv)  in vitroにおけるヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）の接着の促進、(v)  in vitroにおける内皮細胞の遊走の促進、(vi)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の遊走の促進、(vii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の接着の促進、(viii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の遊走の促進、(ix)  in vitroにおけるヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）の接着の促進が、それらに限定されずに含まれる。 
【００２１】
第四の局面では、本願発明は再狭窄の治療または予防の方法を提供する。本願方法は、再狭窄を治療または予防的に処置するのに有効な量のトロポエラスチンまたはその生物活性断片を含むある量の組成物を投与するステップを含む。トロポエラスチンまたはその生物活性断片は装置に共有的に結合し、前記組成物の投与が、前記デバイスの内皮細胞の接着を促進して、再狭窄を治療または予防する。
【００２２】
ある実施態様では、前記方法を、血管形成術、カテーテル法、ステント留置術、外科手術、またはその他の介入療法の後に行う。別の実施態様では、前記方法を、血管形成術、カテーテル法、ステント留置術、外科手術、またはその他の介入療法に付随して行う。さらに別の実施態様では、閉塞を予防するために用いる同デバイスも、再狭窄を防ぐために本願発明にしたがってコーティングする。  
【００２３】
ある実施態様では、1つ以上の薬剤を、同時にまたは併用して、ある心血管または閉塞性血管症状に適切な治療法の一部分として、投与する。  
【００２４】
ある実施態様では、前記デバイスはステント、カテーテル、シャント、ワイヤ、またはその他の腔内デバイスから選択される。ある実施態様では、前記デバイスは、たとえばステンレス鋼デバイスなどの金属デバイスである。
【００２５】
ある実施態様では、本願発明は、体内の管の中の細胞損傷の部位に、経脈管的または腔内的に、前記デバイスを投与するステップを含む。別の実施態様では、体内の管は動脈、静脈、尿管、総胆管、膵管、腎管、食道、気管、尿道、膀胱、尿道、卵管、ファローピウス管、輸精管、前立腺管、またはリンパ管のいずれかから選択される。
【００２６】
ある実施態様では、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、配列番号2、3、4、5、または6番に少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、配列番号2、3、4、5、または6番に同一なアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号2、3、4、5、または6番に少なくとも80%同一なアミノ酸配列からなる。さらに別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号5番にある生物活性断片の少なくとも1回の反復からなる。別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号6番に示される生物活性断片からなる。さらに別の実施態様では、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列とハイブリダイズした核酸によってコードすることができるアミノ酸配列を含む。前述のいずれかにおいて、前記組成物は、未変性のトロポエラスチンの1つ以上の生物学的活性を維持する、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を含むか、または基本的にそれらから構成される。本願発明において、および本願発明のデバイスにおいて使用するための、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を保持する未変性トロポエラスチンの例示的な生物学的／機能的活性には、(i)  in vitroにおける内皮細胞の接着の促進、(ii)  in vivoにおける内皮細胞の接着の促進、(iii)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の接着の促進、(iv)  in vitroにおけるヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）の接着の促進、(v)  in vitroにおける内皮細胞の遊走の促進、(vi)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の遊走の促進、(vii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の接着の促進、(viii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の遊走の促進、(ix)  in vitroにおけるヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）の接着の促進が、それらに限定されずに含まれる。 
【００２７】
第五の局面では、本願発明は血栓症の治療または予防の方法を提供する。本願方法は、血栓症を治療または予防的に処置するのに有効な量のトロポエラスチンまたはその生物活性断片を含むある量の組成物を投与するステップを含む。トロポエラスチンまたはその生物活性断片は装置に共有的に結合し、前記組成物の投与が、前記デバイスの内皮細胞の接着を促進して、血栓症を治療または予防する。
【００２８】
ある実施態様では、前記方法を、血管形成術、カテーテル法、ステント留置術、外科手術、またはその他の介入療法の後に行う。別の実施態様では、前記方法を、血管形成術、カテーテル法、ステント留置術、またはその他の介入療法に併用して行う。さらに別の実施態様では、閉塞を予防するために用いる同デバイスも、血栓症を防ぐために本願発明にしたがってコーティングする。  
【００２９】
ある実施態様では、1つ以上の薬剤を、同時にまたは併用して、ある心血管または閉塞性血管症状に適切な治療法の一部分として、投与する。  
【００３０】
ある実施態様では、前記デバイスはステント、カテーテル、シャント、ワイヤ、またはその他の腔内デバイスから選択される。別の実施態様では、前記デバイスはペースメーカ、心臓徐細動器、人工弁、心室補助装置、血管移植片、経鼻胃デバイス、人工呼吸管、または胸腔チューブから選択される。ある実施態様では、前記デバイスは金属デバイスである。別の実施態様では、前記金属デバイスはステンレス鋼デバイスである。別の実施態様では、前記デバイスは、プラスチック、シリコーン、ダクロン、またはPTFEからつくられるか、またはそれらでコーティングされる。
【００３１】
ある実施態様では、本願発明は、体内の管の中の細胞損傷の部位に、経脈管的または腔内的に、前記デバイスを投与するステップを含む。別の実施態様では、体内の管は動脈、静脈、尿管、総胆管、膵管、腎管、食道、気管、尿道、膀胱、尿道、卵管、ファローピウス管、輸精管、前立腺管、またはリンパ管のいずれかから選択される。
【００３２】
ある実施態様では、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、配列番号2、3、4、5、または6番に少なくとも80%同一なアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、配列番号2、3、4、5、または6番に同一なアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号2、3、4、5、または6番に少なくとも80%同一なアミノ酸配列からなる。さらに別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号5番に示される生物活性断片の少なくとも1回の反復からなる。別の実施態様では、前記組成物は基本的に、配列番号6番に示される生物活性断片からなる。さらに別の実施態様では、前記トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列とハイブリダイズした核酸によってコードすることができるアミノ酸配列を含む。前述のいずれかにおいて、前記組成物は、未変性のトロポエラスチンの1つ以上の生物学的活性を維持する、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を含むか、または基本的にそれらから構成される。本願発明において、および本願発明のデバイスにおいて使用するための、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を保持する未変性トロポエラスチンの例示的な生物学的／機能的活性には、(i)  in vitroにおける内皮細胞の接着の促進、(ii)  in vivoにおける内皮細胞の接着の促進、(iii)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の接着の促進、(iv)  in vitroにおけるヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）の接着の促進、(v)  in vitroにおける内皮細胞の遊走の促進、(vi)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の遊走の促進、(vii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の接着の促進、(viii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の遊走の促進、(ix)  in vitroにおけるヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）の接着の促進が、それらに限定されずに含まれる。
【００３３】
第六の局面では、本願発明はデバイスを提供する。そのデバイスは、トロポエラスチンポリペプチド、またはその生物活性な断片を含む。トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、前記デバイスに共有的に結合する。そのデバイスは、トロポエラスチンポリペプチド、またはその生物活性な断片を、内皮細胞の前記デバイスへの接着を促進するのに有効な量含む。
【００３４】
ある実施態様では、前記デバイスは金属デバイスである。別の実施態様では、前記金属デバイスはステンレス鋼デバイスである。別の実施態様では、前記デバイスはカテーテル、ステント、シャント、ワイヤ、またはその他の腔内デバイスから選択される。別の実施態様では、前記デバイスはペースメーカ、心臓徐細動器、人工弁、心室補助装置、血管移植片、経鼻胃チューブ、人工呼吸管、または胸腔チューブから選択される。
【００３５】
第七の局面では、本願発明は、トロポエラスチンの1つ以上の生物学的活性を保持するトロポエラスチンの生物活性断片をスクリーニングする方法を提供する。ある実施態様では、そのスクリーニング法は、in vitroにおいて内皮細胞の接着および／または遊走を促進する能力を保持するトロポエラスチンの生物活性断片を同定および／または特徴付けするために、培養液中の内皮細胞または内皮前駆細胞を用いて行う。  
【００３６】
ある実施態様では、培養液中の内皮細胞は哺乳類の細胞である。別の実施態様では、培養液中の内皮細胞はマウス細胞またはラット細胞である。別の実施態様では、培養液中の内皮細胞はブタ細胞である。さらに別の実施態様では、培養液中の内皮細胞はヒト細胞である。別の実施態様では、内皮細胞はヒト微小血管内皮細胞である。さらに別の実施態様では、内皮細胞はヒト動脈内皮細胞である（HuAEC）。
【００３７】
ある実施態様では、前記スクリーニング法はハイスループットスクリーニング法である。
【００３８】
本願発明は、上述の局面および実施態様のいずれかの組み合わせを考慮する。前述のいずれかのある実施態様では、本願発明は内皮細胞の接着を促進する方法を提供する。ある実施態様では、本願発明は内皮幹細胞の接着を促進する方法を提供する。  
【００３９】
前述のいずれかのある実施態様では、本願発明は、たとえばデバイスへの接着を促進する方法など、内皮細胞または内皮幹細胞の接着を促進する方法を提供する。本願発明はさらに、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片に共有的に結合または付着する、デバイスを提供する。ある実施態様では、内皮細胞または内皮幹細胞の接着は、生理的に関連する流速および／または圧力下において、接着細胞を前記デバイス上に保持するのに十分である。生理学的に関連するとは、トロポエラスチンまたはその生物活性断片を有するデバイスへに接着する細胞が、静脈および／または動脈の流速および／または圧力に匹敵する流速および／または圧力下で、前記デバイスに保持されることを意味する。デバイスが動脈または静脈以外の管の腔内に配置される実施態様では、生理学的に関連するという文言は、特定の管（たとえば、輸精管、尿道、尿道、前立腺管、胆管など）にかかるものに匹敵する圧力および／または流速を意味する。  
【００４０】
前述のいずれかにおいて、トロポエラスチンまたはその生物活性断片は、内皮細胞の接着および／または遊走を促進するために、単体で用いることもできる。代替的には、トロポエラスチンまたはその生物活性断片は、処置される特定の症状に適切な1つ以上のその他の治療法を併用することもできる。さらに、トロポエラスチンまたはその生物活性断片は、単体で用いてもよく、または別の接着促進剤と併用してもよい。ある実施態様では、内皮細胞の接着を、トロポエラスチンまたはその生物活性断片でコーティングされたデバイスを用いて促進する。別の実施態様では、前記デバイスを、トロポエラスチンまたはその生物活性断片と、抗CD34抗体の両方でコーティングする。 
【００４１】
前述のいずれかにおいて、トロポエラスチンまたは1つ以上のその生物活性断片を結合させる本願発明のデバイスは、プラスチック、シリコーン、ダクロン、ポリウレタン、ポリプロピレン、PTFE、またはその誘導体でつくられるか、またはそれらでコーティングすることができる。結合は、たとえば多糖結合など、共有結合的であってよい。代替的には、結合は、一般的に用いられる架橋剤を用いた架橋であってもよい。    
【００４２】
前述のいずれかのある実施態様では、本願発明の方法、組成物、およびデバイスは、血栓症の予防または治療に用いることができる。ある実施態様では、前記ポリペプチドでコーティングされたデバイスは、非血栓形成性であってよい。その他の実施態様では、前記ポリペプチドでコーティングされたデバイスは、抗血栓形成性であってよい。さらにその他の実施態様では、前記ポリペプチドでコーティングされたデバイスは、同様のコーティングされていないデバイスよりも実質的に血栓形成性が低いだろう。あるコーティングされたデバイスが抗血栓形成性を有するかどうか、または単純に非血栓形成であるかどうかにかかわらず、本願発明にしたがってコーティングされたデバイスは、代替的な介入療法と比較して血栓形成を低減または予防する。
【００４３】
本願発明の実施には、他に指示のない限り、当業の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、組換え生物学、微生物学、ウイルス学、組換えDNA、および免疫学従来の技術を用いるだろう。そのような技術は、文献に記載されている。たとえば、Molecular Cloning:A Laboratory Manual, 3rd Ed., ed. by Sambrook and Russell
(Cold Spring Harbor Laboratory Press:2001)、the treatise,
Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.)、Using Antibodies, Second Edition by Harlow and Lane, Cold Spring Harbor
Press, New York, 1999、Current Protocols in Cell
Biology, ed. by Bonifacino, Dasso, Lippincott-Schwartz, Harford, and Yamada,
John Wiley and Sons, Inc., New York, 1999を参照のこと。
【００４４】
本願発明のその他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００４５】
発明の詳細な説明
(i)  概要
エラスチンおよびエラスチンシグナル伝達経路の生物学的特性は、その内容全体を援用をもって本願明細書に引用するLi et al.(1998) Journal of Clinical
Investigation 102:1783-1787、Li
et al.(1998) Nature 393:276-280、Karnik
et al.(2003) Matrix Biology 22:409-425、Karnik
et al.(2003) Development 130:411-423、およびBrooke et al.(2003) Trends in Cardiovascular Medicine 13:176-181に提供される。簡単に説明すると、これらおよびその他の参考文献は、エラスチンシグナル伝達を調節すると、平滑筋細胞および血管平滑筋細胞に効果を与えることを実証した。しかし、これまで、内皮細胞の接着および遊走の調節のための、トロポエラスチンおよびその生物活性断片の用途は、認識されていなかった。  
【００４６】
本願明細書に開示された発見に基づいて、トロポエラスチンおよびその生物活性断片は、内皮細胞の接着および／または遊走を促進するために用いることができる。この発見は、トロポエラスチンまたはその生物活性断片を、単体で、またはデバイスと合わせて用いるin vitroの方法を開発することを可能にする。例示的なin vitroの使用には、未変性（たとえば完全長）トロポエラスチンの1つ以上の機能活性を保持するトロポエラスチンまたはペプチド模倣体の断片を同定および／または特徴付けするためのスクリーニングアッセイが含まれる。  
【００４７】
この発見は、トロポエラスチンまたはその生物活性断片のin vivoにおける使用方法の開発も可能にする。例示的なin vivoの使用は、トロポエラスチンまたはその生物活性断片を共有結合させたデバイスへの、内皮細胞の接着の促進である。in vivoにおける文脈において、移植可能なデバイスの内皮化（たとえば患者への配置の前後）は、再狭窄および／または血栓症の予防または低減を助けることができる。移植可能なデバイスの内皮化を促進する能力は、多数の介入アプローチのいずれかの有効性を増強するであろう重要な進歩である。現在使用され意図される移植可能なデバイスおよび介入アプローチが、血栓および／または再狭窄の著しいリスクをもたらすとすると、本願発明の方法および組成物は、これらの処置に関与するリスクを実質的に低減し、それによってその安全性と有効性を増加させるだろう。  
【００４８】
(ii)  定義
便宜上、本願明細書、実施例、および添付される特許請求の範囲に用いられる特定の用語をここにまとめる。他に定義のない限り、本願明細書に用いられたすべての技術および科学用語は、本願発明が属する当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００４９】
本願明細書で用いられる冠詞「a」および「an」は、その冠詞の文法上の物体1つまたは1つより多い（すなわち少なくとも1つ）を意味する。例として、「an element」は1つの要素または1つより多い要素を意味する。  
【００５０】
本願明細書に記載の「タンパク質」は、基本的に20個のアミノ酸のいずれかからなるポリマーである。「ポリペプチド」は比較的大きいポリペプチドに関して用いられる場合が多く、「ペプチド」は小さいポリペプチドに関して用いられることが多く、当業におけるこれらの用語の用途は重複し変化する。
【００５１】
「ペプチド」、「タンパク質」、および「ポリペプチド」という用語は、本願明細書では同義的に用いられる。
【００５２】
「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」という用語も、本願明細書では同義的に用いられる。
【００５３】
本願明細書に記載の「組換え」は、タンパク質が原核細胞または真核細胞発現系に由来するということを意味する。
【００５４】
「野生種」という用語は、通常、in vivoに存在する、タンパク質もしくはその部分、またはタンパク質配列もしくはその部分をそれぞれコードする天然のポリヌクレオチド配列を意味する。
【００５５】
「突然変異体」という用語は、生物の遺伝物質のいずれかの変化、特に野生種のポリヌクレオチド配列の変化（つまり欠失、置換、付加、もしくは変性）、または野生種タンパク質のいずれかの変化を意味する。「変異体」という用語は「突然変異体」と同義的に用いられる。遺伝物質の変化がタンパク質の機能の変化を生じると推測される場合が多いが、「突然変異体」および「変異体」という用語は、野生種タンパク質の配列の変化であって、その変化がタンパク質の機能を変化させる（たとえば新しい機能を増加、減少障害する）かどうか、またはその変化がタンパク質の機能に影響しないかどうかに無関係の変化を意味する。  
【００５６】
本願明細書に記載の「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）、および適宜、リボ核酸（RNA）などのポリヌクレオチドを意味する。この用語はまた、ヌクレオチド類似体から作製されたRNAまたはDNAのいずれかの等価物、類似物、ならびに本願明細書に記載の実施態様に適用されるとおり、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドが含まれることも理解されるべきである。
【００５７】
本願明細書に記載の「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、エキソンおよび（任意で）イントロン配列の両方を含む、ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む、核酸を意味する。  
【００５８】
本願明細書に記載の「ベクタ」という用語は、結合している別の核酸を輸送する能力がある核酸分子を意味する。好ましいベクタは、結合している核酸の自己複製および／または発現の能力があるものである。動作可能に結合した遺伝子の発現を方向付ける能力があるベクタを、本願明細書では「発現ベクタ」とよぶ。 
【００５９】
発現制御配列がポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御および調節するばあい、ポリヌクレオチド配列（DNA、RNA）は発現制御配列に「動作可能に結合」している。「動作可能に結合した」という用語には、発現されるポリヌクレオチド配列の前にある適切な開始シグナル（たとえばATG）があること、および発現制御配列の制御下においてポリヌクレオチド配列の発現と、ポリヌクレオチド配列によってコードされた所望のポリペプチドの産生を可能にする、正しいリーディングフレームを維持することが含まれる。
【００６０】
「転写制御配列」は、本願明細書全体において、動作可能に結合されたタンパク質コード配列の転写を誘導または制御する、開始シグナル、エンハンサ、およびプロモータなどの核酸配列を意味するために用いられる総称である。ある例では、組換え遺伝子の転写は、発現外とされる細胞種のにおける組換え遺伝子の発現を制御する、プロモータ配列（またはその他の転写制御配列）の制御下にある。組換え遺伝子が、天然型のタンパク質の転写を制御する配列と同一の、または異なる、転写制御配列の制御下にあってよいことも、理解されるだろう。
【００６１】
本願明細書に記載の「組織特異的プロモータ」という用語は、プロモータとして働く、つまりプロモータに動作可能に結合した特定の核酸配列の発現を制御し、たとえば神経細胞など神経由来の細胞など、組織の特定の細胞の特定の核酸配列の発現に作用する、核酸配列を意味する。当該用語は、ある組織に主に存在する特定の核酸の発現を調節するが、その他の組織における発現も引き起こす、いわゆる「漏出」プロモータも網羅する。
【００６２】
「同一性」とは、2つのペプチド間、または2つの核酸分子間の配列の類似性を意味する。同一性は、比較の目的のために整列させることができる各配列の位置を比較することによって決定することができる。比較された配列のある位置が同一の塩基またはアミノ酸によって占められていれば、その分子はその位置において同一である。配列間の同一性の程度は、配列が共有するマッチング位置の数の関数である。  
【００６３】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、ポリペプチドをコードする第1のアミノ酸配列と、第1のポリペプチドのいずれかのドメインに対して異質であり実質的に相同ではないドメイン（たとえばポリペプチド部分）を決定する第2のアミノ酸配列の融合体である。キメラタンパク質は、（異なるタンパク質であっても）第1のタンパク質も発現する生物において認められる外来性ドメインを提示してもよく、または異なる種の生物によって発現されたタンパク質構造の「種間」、「遺伝子間」等の融合体であってもよい。
【００６４】
本願発明の「非ヒト動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、非ヒト霊長類などの哺乳類が含まれる。 
【００６５】
DNAまたはRNAなどの核酸に関して本願明細書に用いられる「単離された」という用語は、高分子の天然供給源に存在する、それぞれその他のDNAまたはRNAから分離された分子を意味する。本願明細書に記載の「単離された」という用語は、組換えDNA技術によって生成した場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まない、または化学的に合成された場合には化学前駆体またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸またはペプチドも意味する。さらに、「単離された核酸」には、断片として天然に存在せず、天然の状態で発見されることがない核酸断片を含むことが意図される。
【００６６】
本願明細書に記載の「増殖する」および「増殖」は、細胞が細胞分裂することを意味する。  
【００６７】
本願明細書に記載の「非経口投与」および「経口的に投与された」という文言は、経腸および局所投与をのぞく投与形態で通常は注射による投与を意味し、静脈内、血管内、筋肉内、動脈内、鞘内、心室内、眼窩内、嚢内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜内、クモ膜下、脊髄内、および胸骨内注射および輸液が、それらに限定されずに含まれる。 
【００６８】
本願明細書に用いられる「全身投与」、「全身に投与した」、「末梢投与」および「末梢に投与した」という文言は、中枢神経への直接投与ではない、化合物、薬物、またはそのほかの物質の投与方法であって、その化合物、薬物、またはそのほかの物質が動物の全身に入り、代謝およびたとえば皮下投与などそのほかの同様のプロセスを経るような投与を意味する。 
【００６９】
本願明細書に記載の「有効量」という用語は、被験体における望ましい作用の一部を生じるのに有効な、1つ以上の薬剤、物質、または本願明細書に記載の1つ以上の薬剤を含む組成物の量を意味する。  
【００７０】
「薬学的に許容な」という文言は、本願明細書では、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症のない、妥当なベネフィット／リスク比に見合った、ヒトおよび動物の組織との接触に用いるのに好適な、化合物、物質、組成物および／または投与剤形を意味するために用いられる。 
【００７１】
本願明細書に用いられる「薬学的に許容な担体」という文言は、当該薬剤をある器官または体の部分から別の器官または体の部分へと運搬または輸送することに関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入物質などの、薬学的に許容な物質、組成物または賦形剤を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があるという意味において「許容」でなければならない。  
【００７２】
ポリペプチド、ポリペプチド断片、または変異ポリペプチドの機能的等価物は、未変性または天然のポリペプチドの生物学的および／または免疫学的活性を保持するポリペプチドである。免疫学的活性とは、未変性ポリペプチドが有する抗原性エピトープに対する抗体の産生を誘導する能力を意味し、生物学的活性とは、免疫学的活性を除外する、特定の未変性ポリペプチドによって引き起こされる阻害性または刺激性の機能を意味する。本願発明の文脈において、例示的な生物活性には、(i)  in vitroにおける内皮細胞の接着の促進、(ii)  in vivoにおける内皮細胞の接着の促進、(iii)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の接着の促進、(iv)  in vitroにおけるヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）の接着の促進、(v)  in vitroにおける内皮細胞の遊走の促進、(vi)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の遊走の促進、(vii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の接着の促進、(viii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の遊走の促進、(ix)  in vitroにおけるヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）の接着の促進が、それらに限定されずに含まれる。さらなる例示的な生物学的活性には、あるレセプタに結合する能力、ある遺伝子の転写を活性化させる能力、ある遺伝子の転写を阻害する能力、ある共因子と結合する（たとえば直接的にまたは間接的に結合する）能力、あるシグナル伝達経路を経たシグナル伝達を促進する能力、および別のあるシグナル伝達経路を経たシグナル伝達を阻害する能力が含まれる。
【００７３】
変異核酸またはアミノ酸配列は、完全長または完全長以外であってよい。本願発明の核酸またはタンパク質の変異体には、本願発明の核酸またはタンパク質に同一の領域を含む分子が、それらに限定されずに含まれる。各種実施態様において、前記変異体は、同一サイズの、または当業に知られるコンピュータ相同性プログラムによってアラインメントが行われた整列配列と比較した場合の、またはコードされた核酸が厳密な、中程度に厳密な、もしくは厳密性の低い条件下において前記タンパク質をコードする配列の補体にハイブリダイズすることができる、核酸またはアミノ酸配列に少なくとも約60%、65%、70%、75%、80%、83%、85%、90%、95%、97%、98%、または99%以上同一である。変異体は、ポリペプチド間で異なる残基数に関して記述することもできる。たとえば、変異体は、6アミノ酸残基の1つ、6アミノ酸残基の2つ、または6アミノ酸残基の3つにおいて、特定のポリペプチド配列から異なる場合もある。
【００７４】
「相同的な核酸配列」または「相同的なアミノ酸配列」、またはその変異種とは、上述のヌクレオチドレベルまたはアミノ酸レベルにおける同一性の程度によって特徴付けられた配列を意味する。相同的なヌクレオチド配列は、ある配列のイソ型をコードする配列をコードする。イソ型は、たとえばRNAの選択的スプライシングの結果、同じ生物の異なる組織に発現させることができる。代替的には、異なる遺伝子がイソ型をコードすることができる。相同的なヌクレオチド配列には、脊椎動物に限定されないが含まれるその他の種のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が含まれ、したがって、たとえばヒト、カエル、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、およびその他の生物が含まれてもよい。相同的なヌクレオチド配列には、本願明細書に記載のヌクレオチド配列の天然の対立遺伝子変異種および突然変異体も、それらに限定されずに含まれる。しかし、相同的なヌクレオチド配列には、あるタンパク質をコードする正確なヌクレオチド配列が含まれる。相同的な核酸配列には、保存的アミノ酸置換体をコードする核酸配列が含まれる（後述）。
【００７５】
本願明細書に記載のとおり、ある例示的な組成物は、トロポエラスチンアミノ酸または核酸配列の全体または一部分を含むか、それらから構成されるか、または基本的にそれらから構成される。本願明細書に記載の通り、「トロポエラスチン」はエラスチン遺伝子の全体または一部分によってコード可能なタンパク質の全体または一部分を意味する。この用語は、エラスチン遺伝子のスプライスおよびタンパク質分解産生物も意味する。この用語は、合成的に生成したか、天然のエラスチンのヒトまたは動物供給源から精製したエラスチン遺伝子によってコードされた、トロポエラスチンタンパク質およびタンパク質断片も意味する。トロポエラスチンまたはその生物活性断片という文言は、本願明細書全体において、前述のエラスチンを用いた組成物のいずれかを意味するように用いられるだろう。ヒトトロポエラスチンの例示的な核酸配列は配列番号1に示され、アミノ酸配列は配列番号2に示されている。さらに例示的なトロポエラスチンアミノ酸配列は、配列番号3および4に示される。トロポエラスチンはエラスチンシグナル伝達を刺激することができ、エラスチンシグナル伝達の刺激は、以下の機能的重要性の1つ以上を有している。その機能的重要性には、(i)  in vitroにおける内皮細胞の接着の促進、(ii)  in vivoにおける内皮細胞の接着の促進、(iii)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の接着の促進、(iv)  in vitroにおけるヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）の接着の促進、(v)  in vitroにおける内皮細胞の遊走の促進、(vi)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の遊走の促進、(vii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の接着の促進、(viii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の遊走の促進、(ix)  in vitroにおけるヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）の接着の促進が、それらに限定されずに含まれる。本願発明の方法およびデバイスに用いられるトロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、未変性トロポエラスチンの前述の機能的活性を1つ以上有している。ある実施態様では、トロポエラスチンまたは生物活性断片によって促進される接着は、インテグリンαvβ3に（全体的にまたは部分的に）依存する。  
【００７６】
完全長トロポエラスチンに加えて、トロポエラスチンの生物活性断片もエラスチンシグナル伝達を刺激することができる。生物活性断片は、タンパク質のある部分が、完全長タンパク質の機能的特質を1つ以上維持することを意味する。本願発明の文脈において、トロポエラスチンの生物活性断片は、エラスチンシグナル伝達を促進する能力のすべてまたは一部分を保持し、その結果、(i)  in vitroにおける内皮細胞の接着の促進、(ii)  in vivoにおける内皮細胞の接着の促進、(iii)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の接着の促進、(iv)  in vitroにおけるヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）の接着の促進、(v)  in vitroにおける内皮細胞の遊走の促進、(vi)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の遊走の促進、(vii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の接着の促進、(viii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の遊走の促進、(ix)  in vitroにおけるヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）の接着の促進をそれらに限定せずに含む、エラスチンシグナル伝達の1つ以上の機能的な結果を生じる。トロポエラスチンの例示的な生物活性断片は、配列番号5に提供される。トロポエラスチンの別の例示的な生物活性断片は、配列番号6に提供される。断片は、合成方法を含むいずれかの方法によってつくることができる。本願方法は、トロポエラスチンの生物活性ペプチド断片だけでなく、ペプチド模倣体（修飾断片）の使用も意図する。トロポエラスチンの例示的なペプチド模倣体は、配列番号5番、または配列番号6番のペプチド模倣体である。ある実施態様では、トロポエラスチンまたは生物活性断片によって促進される接着は、インテグリンαvβ3に（全体的にまたは部分的に）依存する。
【００７７】
「抗増殖剤」および「抗増殖化合物」という用語は、本願明細書全体において同義的に用いられ、増殖を阻害するペプチドまたは非ペプチドのいずれかを意味する。本願発明は、本願発明の組成物およびデバイスが、治療される特定の適応症に適切な治療法の部分として、その他の薬剤と同時にまたはそれを併用して投与してよい場合もあることを意図する。そのようなあるクラスの薬剤は、抗増殖剤を含む。例示的な抗増殖剤には、ハロゲン化プリンまたはピリミジン類似体（たとえばフッ素化類似体）、マクロイド、細胞骨格／微小管不安定化剤、および放射能などが、それらに限定されずに含まれる。抗増殖剤のさらなる制限のない例には、5-フルオロウラシル（5-FU）、5’-デオキシ-5-フルオロウリジン、5-フルオロウリジン、2’-デオキシ-5-フルオロウリジン、フルオロシトシン、5-トリフルオロメチル-2’-デオキシウリジン、アリトレチノイン（9-シス-レチノイン酸）、アミホスチン、ベキサロテン（4-[1-(5,6,7,8-テトラヒドロ-3,5,5,8,8-ペンタメチル-2-ナフタレニル)エテニル]安息香酸）、ブレオマイシン、カペシタビン（5’-デオキシ-5-フルオロ-シチジン）、クロラムブシル、クラドリビン、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン（6-メチレンアンドロスタ-1,4-ジエン-3,17-ジオン）、フルダラビン、5-フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イリノテカン、メルファラン、メトトレキセート、ミトキサントロン、パクリタキセル、ペントスタチン、プレドニムスチン、ストレプトゾシン、テモゾールアミド、テニポシド、トムデクス、トポテカン、バルルビシン（N-トリフルオロアセチルアドリアマイシン14-バレレート）、ビノレルビン、およびそれらの塩が含まれる。さらなる例には、アクチノマイシンD、シトカラシンD、デキサメタゾン、エベロリムス、シロリムス、タクロリムス、ラトルンクリンA、ラパマイシンおよびABT-578などのその類似体、、カルベジロール、FK506、タキソール、シクロスポリン、カンプトテシン、カルビシン、クロロゾトシン、クロモマイシンA3を含むクロモマイシン、クラドリビン、コルチシン、コンブレタスタチン、デメコルシン、デノプテリン、ドキソルビシン、ドロモスタノロン、エダトレキセート、エノシタビン、エピチオスタノール、フォルメスタン、レンチナン、ロニダミン、メレンゲストロール、メノガリル、ノガラマイシン、ノルジヒドログアイアレト酸、オリボマイシンAなどのオリボマイシン、ピラルビシン、プリカマイシン、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、プロマイシン、ラニムスチン、リストセチンAなどのリストセチン、テガフール、ビンブラスチン、ビンデシン、およびゾルビシンが含まれる。前述の抗増殖剤のいずれにおいても、本願発明は、前記抗増殖剤の活性全体またはその一部分を保持する、薬学的に許容な塩、エステル、プロドラッグ、類似体およびその保護型の使用を、同様に意図する。別のクラスの薬剤には、栄養補助食品も含まれる。さらに別のクラスの薬剤には、βブロッカー、およびその他の高血圧媒介体が含まれる。本願発明は、本願発明の組成物とデバイスを両方含むコンビナトリアル療法と、治療される特定の��状に特有のその他の治療法を意図する。しかし、ある実施態様では、本願発明の組成物およびデバイスを使用すると、従来推奨された、または処方された治療法の全体または一部分の必要性が回避される。   
【００７８】
「付加された」という用語は、アミノ酸残基への1つ以上の部分の付加を意味する。この用語は、制限されることなく、いずれかのアミノ酸残基へのいずれかの部分の付加を意味する。この用語には、共有的または非共有的相互作用を介した、部分の結合が含まれる。
【００７９】
「N末端アミノ酸残基」という用語は、ポリペプチドまたはペプチドの第1のアミノ酸残基（アミノ酸番号1）を意味する。
【００８０】
「C末端アミノ酸残基」という用語は、ポリペプチドまたはペプチドの最後のアミノ酸残基（アミノ酸番号nであって、nはペプチドまたはポリペプチドの残基の合計数）を意味する。 
【００８１】
「アミノ酸側鎖」という用語は、K. D. Kopple, "Peptides and
Amino Acids", W. A. Benjamin Inc., New York
and Amsterdam,
1966, p2 および33に記載のような、CH(NH2)COOH 部分以外のアミノ酸部分であって、一般的なアミノ酸のそのような側鎖の例は、-CH2CH2SCH3 (メチオニンの側鎖)、-CH2(CH3)-CH2CH3 (イソロイシンの側鎖)、-CH2CH(CH3)2 (ロイシンの側鎖)またはH-(グリシンの側鎖)である。  
【００８２】
ある実施態様では、本願発明の用途に用いられるアミノ酸は、タンパク質に認められる天然にのアミノ酸、またはアミノ基およびカルボキシル基を含むそのようなアミノ酸の天然の同化もしくは異化産生物である。特に好適なアミノ酸側鎖には、以下のアミノ酸、グリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンのものから選択された側鎖が含まれる。
【００８３】
「アミノ酸残基」という用語にはさらに、本願明細書に記載の任意のアミノ酸の類似体、誘導体、および同属種、ならびにC末端またはN末端保護アミノ酸（たとえばN末端またはC末端保護基で修飾された）誘導体が含まれる。たとえば、本願発明は、側鎖が伸長または短縮されている一方で、カルボキシ基、アミノ基、または環化のためのその他の反応性前駆官能基を提供しているアミノ酸類似体、および適切な官能基を有する変異側鎖を有するアミノ酸類似体の使用を意図する。たとえば、当該化合物には、たとえばシアノアラニン、カナバニン、ジエンコル酸、ノルロイシン、3ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、5ヒドロキシトリプトファン、1メチルヒスチジン、3メチルヒスチジン、ジアミノピメリン酸、オルニチン、またはジアミノブチル酸が含まれてよい。本願明細書において好適な側鎖を有するその他の天然のアミノ酸代謝物または前駆体は、当業に認識されるであろうし、本願発明の範囲内に含まれる。  
【００８４】
さらに、アミノ酸の構造が立体異性型を許容する場合、そのようなアミノ酸の(D)および(L)立体異性体も含まれる。本願明細書のアミノ酸およびアミノ酸残基の立体配置は適切な記号(d)、(l)または(dl)によって指定され、立体配置が指定されていない場合、アミノ酸または残基は(d)、(l)または(dl)を有することができる。本願発明の化合物の一部の構造には非対称炭素原子が含まれるという点には留意すべきだろう。そのような非対称性から生じる異性体が本願発明の範囲内に含まれることは、適宜に理解される。そのような異性体は、従来の分離技術、および立体的に制御された合成によって、実質的に純粋な形で得ることができる。この用途の目的のために、他に明らかに記載のない限り、指定されたアミノ酸は(d) または(l)立体異性体の両方を含むよう解釈されるべきである。
【００８５】
本願明細書に開示された「逆」または「レトロ」ペプチド配列は、共有結合したアミノ酸残基（またはその類似体もしくは模倣体）の完全配列の部分において、アミノ酸骨格におけるペプチドの結合形成のカルボキシル基からアミノ基への正常な方向が、従来通り左から右への方向に読むと、ペプチド結合のアミノ部分がカルボキシ部分の前に来る（後ろに来るのではなく）ように逆転していることを意味する。総合的には、Goodman, M. and Chorev, M. Accounts of Chem. Res. 1979, 12, 423を参照。
【００８６】
本願明細書に記載の逆配置ペプチドには、(a)  1つ以上のアミノ末端残基が逆（"rev"）配置に転換したもの（したがって、この分子の最も左側に第2の「カルボキシル末端」が生じる）、および(b)  1つ以上のカルボキシル末端残基が逆（"rev"）配置に転換したもの（この分子の最も右側に第2の「アミノ末端」が生じる）、が含まれる。ペプチド（アミド）結合は、正常配置の残基と逆配置の残基の間の接合部分には、形成することができない。
【００８７】
したがって、本願発明のある逆ペプチド化合物は、逆ペプチド（逆アミド）結合を用いて上述の配列の隣接する2つの部分を連結するために、適切なアミノ酸模倣部分を用いてつくることができる。上述の(a)の場合、ジケト化合物の中央の残基を便利に用いて、2つのアミド結合で構造を連結させ、ペプチド模倣体構造を完成させることもできる。上述の(b)の場合、ジアミノ化合物の中央の残基を同様に用いて、2つのアミド結合で構造を連結させ、ペプチド模倣体構造をつくり出すこともできる。
【００８８】
そのような化合物の逆方向の結合は、一般に、さらに、逆向きでないペプチドの空間配置に似た側鎖の空間配置を維持するために、逆アミノ酸残基の鏡像異性立体配置の反転を必要とするだろう。ペプチドの逆部分のアミノ酸の立体配置は、好ましくは(D)であり、非逆部分の立体配置は好ましくは(L)である。結合活性を最適化するのに適切な場合、反対向きまたは混合の立体配置が許容可能となる。
【００８９】
本願発明のある化合物は、特定の幾何学的形状または立体異性形状で存在していてよい。本願発明は、シス-およびトランス-異性体、R-およびS-鏡像異性体、ジアステレオマー、(D)-異性体、(L)-異性体、それらのラセミ混合物、およびその他のそれらの混合物を含むすべての化合物が、本願発明の範囲内に入ることを意図する。アルキル基などの置換基には、さらなる非対称炭素原子が存在する。そのようなすべての異性体、およびその混合物は本願発明に含まれることを意図する。
【００９０】
たとえば、本願明細書の化合物のある鏡像異性体が望ましい場合、非対称合成、またはキラル補助基を用いた誘導によって調製してもよく、その場合、得られたジアステレオマー混合物を分離して補助基を切断し、純粋な望ましい鏡像異性体を得る。代替的には、分子がアミノ基などの塩基性官能基、またはカルボキシル基などの酸性官能基を含む場合、適切な光学活性酸または塩基を用いてジアステレオマー塩を形成し、その後、当業に公知の分別再結晶法またはクロマトグラフィ法によって形成されたジアステレオマを分解してから、純粋な鏡像異性体を回収する。  
【００９１】
本願発明の目的のために、化学元素はPeriodic Table of the Elements,
CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed., 1986-87の内表紙に従って同定される。さらに本願発明の目的のために、「炭化水素」という用語は、少なくとも1つの水素および1つの炭素原子を有するすべての許容しうる化合物を含むことを意図する。広い局面では、前記の許容しうる炭化水素には、非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環およびヘテロ環、芳香族および非芳香族の、置換または非置換であってよい有機化合物が含まれる。
【００９２】
(iii)  例示的なエラスチンベースの組成物および方法
本願発明は、内皮細胞の接着および／または遊走を促進するために使用することができる組成物、方法およびデバイスを提供する。特に、本願発明は、トロポエラスチンまたはその生物活性断片を含むか、またはそれらから基本的に構成される組成物およびデバイスを提供する。本願発明の方法、組成物、およびデバイスに用いられるトロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片は、未変性トロポエラスチンの機能的／生物学的活性を1つ以上有している。例示的な生物学的活性には、以下の生物学的活性、(i)  in vitroにおける内皮細胞の接着の促進、(ii)  in vivoにおける内皮細胞の接着の促進、(iii)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の接着の促進、(iv)  in vitroにおけるヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）の接着の促進、(v)  in vitroにおける内皮細胞の遊走の促進、(vi)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の遊走の促進、(vii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の接着の促進、(viii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の遊走の促進、(ix)  in vitroにおけるヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）の接着の促進の1つ以上が、それらに限定されずに含まれる。  
【００９３】
ポリペプチドおよびペプチド断片：  本願発明は、トロポエラスチンポリペプチドまたはその生物活性断片を含むか、またはそれら基本的に構成される組成物およびデバイスを提供する。そのような組成物およびデバイスは、本願発明のin vivoまたはin vitroの方法に用いることができる。  
【００９４】
ある実施態様では、その組成物またはデバイスは、トロポエラスチンポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片を含む。そのようなポリペプチドまたは断片は、野生種ペプチド配列または変異配列のいずれかを含んでよく、変異配列は容易に作製でき、その変異配列が未変性ポリペプチドの生物学的活性の1つ以上を保持することを確認するために試験することができる。当業者は、少なくとも60%、70%、75%、80%、83%、85%、90%、95%、98% または99%、あるポリペプチドと同一であるアミノ酸配列を含む変異体を容易に作ることができ、エラスチンシグナル伝達を活性化させて未変性トロポエラスチンの生物学的活性を1つ以上保持させることができる。さらに具体的に説明するために、本願発明はトロポエラスチンポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片（たとえば配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6）に少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%、99%、または100%同一のアミノ酸配列を含む変異ポリペプチドを意図する。  
【００９５】
トロポエラスチンの生物活性断片の変異体は、対応する未変性トポエラスチンの断片に、少なくとも60%、70%、75%、80%、83%、85%、90%、95%、98%、または99% 同一であるアミノ酸配列を含む。そのような生物活性断片は、完全長トロポエラスチンの1つ以上の生物学的活性を有する。    
【００９６】
さらに、ある生物活性断片は、未変性トロポエラスチンタンパク質の文脈の範囲内で複数回繰り返す。たとえば、配列番号5番に示された6量体配列は、前記の未変性タンパク質の文脈内において複数回反復している。したがって、本願発明は、ある生物活性断片の1回以上の反復を含むか、またはそれらから基本的に構成される組成物およびデバイスを意図する。たとえば、本願発明は、配列番号5に示される6量体配列の1、2、3、4、5、6または7回の反復を含むか、またはそれらから基本的に構成される組成物を意図する。さらに、前記未変性タンパク質の文脈においてC末端断片には反復がないが、本願発明は、配列番号6に示される配列の1、2、3、4、5、6または7回の反復を含むか、またはそれらから基本的に構成される組成物を意図する。当業者は過度の実験をすることなくある断片の複数の反復を含む組成物を容易に作製し試験することができるという点を、指摘する。   
【００９７】
上に詳述のポリペプチドおよび断片に加えて、本願発明は、前記ポリペプチドおよび断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸にも関連する。本願明細書に記載の核酸という用語には、由来する完全長核酸配列と実質的に同一の機能を有する断片が、等価物として含まれることを意図する。等価のヌクレオチド配列には、対立遺伝子多型などのヌクレオチド置換、付加または欠失が1つ以上異なる配列が含まれ、したがって、たとえば野生種トロポエラスチン（配列番号1）のヌクレオチドと異なる配列を含むだろう。等価の配列には、遺伝子コードの縮重による既知の野生種または変異配列とは異なるものも含まれる。等価の配列には、ストリンジェントな条件下（つまり、約1Mの塩の中で形成されたDNA2本鎖の融点（Tm）よりも約20乃至27℃下に等しい）で、エラスチンベースの組成物のヌクレオチド配列にハイブリダイズさせた核酸配列も含むことができる。ストリンジェントなハイブリダイゼーションの条件のさらなる例には、65℃における0.2X SSC の洗浄ステップが含まれる。
【００９８】
ある実施態様では、本願発明は、65℃、0.2XSSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1番に示される核酸配列とハイブリダイズした核酸配列によってコードされる、またはコードすることができる組成物を意図する。
【００９９】
本願明細書に記載の方法に用いるための等価のヌクレオチド配列には、あるヌクレオチド配列に少なくとも60%同一の配列も含まれる。別の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、エラスチンベースの組成物をコードする未変性配列のヌクレオチド配列に少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95 、98%、99%、または100%同一であり、未変性トロポエラスチンの1つ以上の生物活性を保持する。
【０１００】
遺伝子コードの縮重に起因する、あるエラスチンベースの組成物をコードするヌクレオチド配列とは異なる配列を有する核酸も、本願発明の範囲内である。そのような核酸は、機能的に等価なペプチドをコードするが、その配列は、遺伝子コードの縮重に起因する当業に既知の野生種配列とは異なる。たとえば、たくさんのアミノ酸が2つ以上のトリプレットによって指定されている。同一のアミノ酸を特定するコドンまたはシノニム（たとえば、CAUとCACはどちらもヒスチジンをコードする）によって、アミノ酸配列に作用しない「サイレント」な突然変異が生じることがある。しかし、アミノ酸配列に変化を生じないDNA配列多型も存在することは予期される。当業者には、未変性トロポエラスチンの1つ以上の生物活性を有するポリペプチドをコードする核酸の1つ以上のヌクレオチド（ヌクレオチドの最高約3乃至5%）におけるこの変異は、未変性対立遺伝子多型に由来する、ある種の個体に存在してもよいということは、理解されよう。   
【０１０１】
ペプチド模倣体：  その他の実施態様では、本願発明は、前記組成物がペプチド模倣体（本願明細書では、エラスチンベースの組成物の模倣体を同義的に意味する）を含むことを意図する。好ましいペプチド模倣体は、未変性トロポエラスチンの1つ以上の生物学的活性を有する。ペプチド模倣体はペプチドおよびタンパク質に基づいた、または誘導された化合物である。本願発明のペプチド模倣体は、非天然アミノ酸、立体的な制約、および等比体積置換などを用いた、既知のエラスチンベースの組成物のアミノ酸配列の構造修飾によって得ることができる。当該ペプチド模倣体は、ペプチドと非ペプチドの合成構造の間の構造空間の連続を構成する。  
【０１０２】
例示的なペプチド模倣体は、非加水分解性（たとえばプロテアーゼ、または対応するペプチドを分解するその他の生理学的条件に対する高い安定性）の、高い特異性および／または有効性を有し、および前記ペプチド模倣体の細胞内局在性のための高い細胞透過性を有する特質を有してよい。具体化の目的のために、本願発明のペプチド類似体は、たとえば、ベンゾジアゼピン(たとえば Freidinger
et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher:
Leiden, Netherlands, 1988参照)、置換ガンマラクタム環(Garvey
et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM
Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, p123)、C-7模倣体(Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biologyy, G.R. Marshall
ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, p.105)、ケトメチレン擬ペプチド(Ewenson et al. (1986) J
Med Chem 29: 295; and Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function
(Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co.
Rockland, IL, 1985)、βターンジペプチド核(Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett
26: 647; and Sato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231)、βアミノアルコール(Gordon
et al.(1985) Biochem Biophys Res Commun126:419; and Dann et al.(1986) Biochem
Biophys Res Commun 134:71), diaminoketones (Natarajan et al.(1984) Biochem
Biophys Res Commun 124:141)、およびメチレンアミノ修飾(Roark et al. in Peptides:Chemistry
and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988,
p134)を用いて生成することができる。また、一般的にはPeptides: Chemistry and Biology, G.R.Marshall ed., ESCOM Publisher:Leiden,
Netherlands, 1988}の中の例示的実施態様の分析および合成方法を参照。
【０１０３】
当該ペプチド模倣体を作製するための行うことができる各種の側鎖置換に加えて、本願発明は特に、ペプチドの2次構造の立体は位置的に制限された模倣体の使用を意図する。ペプチドのアミド結合用のサロゲートが、多数開発されている。よく使われているアミド結合のサロゲートには、(i)  トランスオレフィン、(ii)  フルオロアルケン、(iii)  メチレンアミノ、(iv)  ホスホンアミド、および(v)  スルホンアミドが含まれる。
【０１０４】
【化１】
2008532942.tif 000002
【０１０５】
サロゲートの例
【０１０６】
【化２】
2008532942.tif 000003
【０１０７】
さらに、ペプチドの骨格のより多くの実質的な修飾に基づいたペプチド模倣体も用いることができる。このカテゴリに分類されるペプチド模倣体には、(i)  レトロ-インベルソ類似体、および(ii)  N-アルキルグリシン類似体（いわゆるペプトイド）が含まれる。
【０１０８】
【化３】
2008532942.tif 000004
【０１０９】
類似体の例
【０１１０】
【化４】
2008532942.tif 000005
【０１１１】
さらに、たとえばPCT公報WO 99/48897号など、新規のペプチド模倣体の開発を目指して、コンビナトリアル化学の方法が行われている。たとえば、いわゆる「ペプチドモーフィング」戦略のある実施例は、多様なペプチド結合置換基を含むペプチド類似体のライブラリのランダム作製に焦点を当てている。
【０１１２】
【化５】
2008532942.tif 000006
【０１１３】
例示的な実施態様では、前記ペプチド模倣体は、ペプチドのレトロ-インベルソ類似体として誘導することができる。レトロ-インベルソ類似体は、米国特許第4,522,752号Sisto et al. などにより記述されたとおり、当業に知られる方法に従って作製することができる。一般的な指針として、タンパク質分解に最も感受性がある部位を、模倣スイッチに最適な感受性の低いアミド結合と交換する。最終生成物、またはその中間体は、HPLCで精製することができる。
【０１１４】
別の具体的な実施態様では、ペプチド模倣体は、例示的なVal Gly Val Ala Pro Gly ペプチドを誘導する例示的なレトロ-エナチオペプチド類似体などの、ペプチドのレトロ-エナチオ類似体として誘導することができる。
【０１１５】
NH2-(d)Gly-(d)Pro-(d)Ala-(d)Val-(d)Gly-(d)Val-COOH
【０１１６】
このようなレトロエナンチオ類似体は、市販のD-アミノ酸（またはその類似体）、および標準の固相または液相ペプチド合成技術を用いて合成することができる。たとえば、好ましい固相合成法では、好適なアミノ保護（t-ブチルオキシカルボニル、Boc）残基（またはその類似体）は、クロロメチル樹脂などの固体支持体に共有結合させる。その樹脂を、ジクロロメタン（DCM）で洗浄し、BOC保護基をTFAのDCM溶液で処理することによって取り除く。その樹脂を洗浄して中和し、次のBoc保護D-アミノ酸を、ジイソプロピルカルボジイミドと結合させて導入する。その樹脂を再び洗浄し、このサイクルを、残りのアミノ酸についても順次繰り返す。保護されたレトロエナンチオペプチドの合成が完了したら、そのペプチドを、保護基を取り除いて、フッ酸／アニソール／ジメチルスルフィド／チオアニソールで処理することによって固体支持体から切り離す。最終生成物をHPLCで精製し、純粋なレトロ-エナンチオ類似体を得る。
【０１１７】
さらに別の具体的な実施態様では、トランスオレフィン誘導体を当該ポリペプチドのいずれかのために作製することができる。トランスオレフィン類似体は、Y.K. Shue et al.(1987) Tetrahedron Letters
28:3225に記載の方法によって、および当業に知られるその他の方法によって、合成することができる。引用した方法またはその他の入手可能な方法における変更は、使用した試薬の性質によって必要になる場合もある。
【０１１８】
さらに、上述の方法によって合成する疑似ジペプチドに他の疑似ジペプチドを結合させ、アミド官能性のかわりに数種類のオレフィン官能性を有するペプチド類似体をつくることもできる。  
【０１１９】
ペプチド模倣体誘導体のさらに別の種類には、ホスホン酸誘導体が含まれる。そのようなホスホン酸誘導体の合成は、既知の合成スキームから作りかえることができる。たとえば、Loots et al. in Peptides:Chemistry and Biology, (Escom
Science Publishers, Leiden, 1988, p. 118)、Petrillo et al. in Peptides:Structure
and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium, Pierce
Chemical Co. Rockland, IL, 1985)を参照。
【０１２０】
その他の多くのペプチド模倣体構造が当業に知られており、エラスチンベース組成物のペプチド模倣体のデザインに用いるために容易に変更することができる。具体的には、そのペプチド模倣体には、1-アザビシクロ[4.3.0]ノナンサロゲート（Kim et al.(1997) J. Org. Chem. 62:2847参照）、またはN-アセチルピペラジン酸（Xi et al.(1998) J. Am. Chem. Soc. 120:80参照）、または制約されたアミノ酸類似体としての2-置換ピペラジン部分（Williams
et al.(1996) J. Med. Chem. 39:1345-1348参照）を組み込んでもよい。さらに他の実施態様では、あるアミノ酸残基は、たとえば単環式または二環式芳香族またはヘテロ芳香族核、または二芳香族、芳香族、ヘテロ芳香族、または二ヘテロ芳香族核などのアリールおよび二アリールで置換することができる。
【０１２１】
当該ペプチド模倣体は、たとえばハイスループットスクリーニング技術と合わせたコンビナトリアル合成技術などによって最適化することができ、さらに、そのペプチド模倣体が、確実に未変性トロポエラスチンの生物活性を1つ以上保持していることを確認するためにテストすることができる。
【０１２２】
本願発明は、内皮細胞の接着および／または遊走を促進する方法、組成物およびデバイスを意図する。本願発明は、単一のエラスチン組成物（たとえばトロポエラスチンポリペプチド、単一の生物活性断片、単一のペプチド模倣体など）の使用、および同時にまたは連続して使用される2つ以上のエラスチン組成物の使用を意図する。したがって、本願発明は、トロポエラスチンポリペプチドおよび1つ以上のトロポエラスチン断片またはペプチド模倣体が、同時にまたは連続して使用される実施態様を意図する。本願発明は、2つ以上のトロポエラスチン断片またはペプチド模倣体を使用する実施態様を意図する。 
【０１２３】
本願発明は、内皮細胞の接着および／または遊走を促進する方法、組成物およびデバイスを提供する。トロポエラスチンまたは1つ以上のその生物活性断片は、内皮細胞の接着および／または遊走を促進するために、用いることもできる。ある実施態様では、トロポエラスチンまたはその生物活性断片はデバイスに共有的に結合し、そのトロポエラスチンの生物活性断片は前記金属デバイスへの内皮細胞の接着を促進する。本願発明は、以下の、トロポエラスチン、その生物活性断片、ペプチド模倣体、2つ以上のその生物活性断片、2つ以上のペプチド模倣体、または完全長トロポエラスチンと1つ以上のその生物活性断片もしくはペプチド模倣体の組み合わせの、いずれかを用いて、内皮細胞接着を促進する方法を意図する。  
【０１２４】
本願発明は、内皮細胞の接着および／または遊走を促進する方法、組成物およびデバイスを提供する。例示的な内皮細胞には、内皮幹細胞がそれに限定されずに含まれる。本願発明の方法、組成物およびデバイスは、in vivoまたはin vitroにおいて用いることができる。デバイスの配置後、in vivoにおいてデバイスの内皮化が生じうる。In vivoにおける内皮化は、内在的な内皮細胞がデバイスに接着するにしたがって生じる。デバイスの内皮化は、デバイスの配置前にもin vitroにおいて生じさせることができる。つまり、デバイスは、配置前に、たとえば患者に由来する内皮細胞などの内皮細胞を、予め播種することができる。さらなる内皮化が、デバイス配置後に生じることもある。
【０１２５】
内皮細胞の遊走および増殖へのエラスチンの作用は、冠動脈ステントなどの血管内デバイスの配置に伴う合併症の一部を予防するための、ユニークな治療上の利点を提供する。最近配置される冠動脈ステントはin situの血栓症の高発症率を伴うが、血栓症の発症率は、ステントの金属支柱が内皮化されると劇的に低下する。これには、そのような内皮化が生じるまで、アスピリンとクロピドグレルなどの複数の高血小板剤を使用する必要がある。通常は耐容性が良好だが、外科手術が必要な場合、または患者がビタミンK依存性凝固因子の阻害など、その他の抗凝固の方法を要する心房性細動などの疾患を有する場合、そのような高血漿剤の使用によって、治療上のジレンマが生じることがある。血管内デバイスの、より迅速な血管内内皮化を促進する物質は、in situにおける血栓症の発生率を低下させるだけでなく、二重の血小板療法を必要とする時間を短縮できる可能性もある。  
【０１２６】
したがって、本願発明は血栓症を低減する方法を提供する。本願発明はさらに、抗血小板療法に必要な治療時間を短縮する方法を提供する。  
【０１２７】
冠動脈ステント配置のさらなる合併症は、特に糖尿病など高リスクの個体における、平滑筋細胞過剰増殖とステント内再狭窄の後発のリスクである。薬物溶出性ステントプラットホームは、この再狭窄との闘いの試みの中で開発された。細胞毒性剤の溶出によって、薬物溶出性ステントは再狭窄の問題を大幅に克服し、インターベンション心臓学の到達範囲を、広げて従来は心臓胸郭部手術の領域内のみであった高リスク病変を含むようになった。しかし、薬物溶出性ステントは、薬物溶出性ステント（DES）配置から1年を超えて生じる場合があるステント内血栓症の場合でも、おそらく、in situ血栓症が生じるかもしれない時間枠を増加してきた。これは、細胞毒性剤の持続性溶出にともなって生じる内皮化の遅延によって生じる可能性が高い。
【０１２８】
トロポエラスチンまたはその生物活性断片の使用は、これら両方の限界を克服する機会を提供する場合もある。本願明細書では、本願発明者らはエラスチンが内皮遊走を促進することを実証する。そのような増強された遊走は、周囲の内皮による遊走／浸潤によって、より迅速なデバイス内皮化を生じることもある。さらに、本願発明者らは、エラスチンを共有結合させたステンレス鋼表面が、同様のはだかの金属表面よりも、顕著に高い内皮細胞および内皮前駆細胞の接着を有することを実証する。さらに、接着性の内皮細胞は、無傷の内部弾性版への接着後にスプレッド細胞質を有する。トロポエラスチン、およびその生物活性断片の、内皮細胞の接着および／または遊走を促進する能力を考えると、これらのペプチドは血栓症および再狭窄を減少させるための方法およびデバイスに使用することができる。そのポリペプチドは単体で使用することもでき、またはその他のデバイスまたは治療法と合わせて用いることもできる。     
【０１２９】
ある実施態様では、本願発明はトロポエラスチン（または断片）と接着を促進する1種類以上のその他の薬剤を併用した内皮細胞接着を促進する方法を提供する。たとえば、トロポエラスチン（または断片）は、抗CD34抗体を同時または連続的に併用することができる。ある実施態様では、本願発明はエラスチンベースの組成物および抗CD34抗体の両方を用いた方法およびデバイスを提供する。
【０１３０】
以前、本願発明者らは、平滑筋遊走および分化へのエラスチンの作用を記述し、ステント内膜過形成を低減するためのエラスチン外筒の能力を実証した。エラスチンでコーティングしたステンレス鋼デバイスは、急速な内皮化だけでなく、引き続く内膜過形成の低下のさらなる利益を有する可能性もある。  
【０１３１】
ステント配置後の血管内血栓症の前の記述は、体内または血管腔内へのいずれかのデバイスの配置に関連する一般的な問題を説明する例を提供する。血栓症は、ステント、カテーテル、ワイヤ、シャント、およびその他の腔内デバイスに関連する問題であって、そのデイバイスが配置されるのが血管内であるかまたは別種類の管であるかには関係ない。さらに、血栓症は、心徐細動機、ペースメーカ、胸腔チューブ、心室補助装置、人工呼吸器、および卵円孔開存閉鎖装置などを含む、大型デバイスの配置に関連する問題でもある。血栓症のリスクは、抗血小板または抗凝固管理を必要とすることが多く、これらの手術の全体的なリスクを上昇させる。全体として、血栓症に関連するリスクは、心血管症状をそれに限定せずに含む、広範囲の疾患および症状の介入治療に、大きく影響する。  
【０１３２】
ある実施態様では、内皮細胞の接着を促進するのに有効なトロポエラスチンまたはその生物活性断片の量は、流速および圧の生理学的に関連する条件下において、内皮細胞の接着を促進および維持するために十分な量である。そのような生理学的に関連する条件は、動脈または静脈内での流速および圧の条件、または別の体内の管での流速および圧の条件である。動脈および／または静脈の血流および圧、または別の体内の管内での液体の流れおよび圧の生理学的条件下における、接着を維持するのに有効なトロポエラスチンまたはその生物活性断片の量の使用は、トロポエラスチン組成物に付属する、トロポエラスチン組成物およびデバイスのin vivoにおける有効な使用において、重要なステップである。  
【０１３３】
ある実施態様では、内皮細胞の接着を促進するために用いられるトロポエラスチンまたは生物活性断片の量は、生理学的に関連する条件下において、内皮細胞の接着を促進および維持するために効果的な量である。たとえば、デバイスに共有結合させるトロポエラスチンまたは生物活性断片の量は、生理学的に関連する条件下において、内皮細胞の接着を促進および維持するために効果的な量を含む。例示的な有効量は、デバイスの面積に対して、少なくとも約100 ng/cm2、少なくとも約150 ng/cm2、または少なくとも約200 ng/cm2である。さらに例示的な有効量は、少なくとも約250 ng/cm2、少なくとも約275 ng/cm2、または少なくとも約300 ng/cm2である。さらなる例示的な有効量は、少なくとも約310 ng/cm2、少なくとも約325 ng/cm2、少なくとも約350 ng/cm2、少なくとも約375 ng/cm2、または少なくとも約400 ng/cm2である。さらなる例示的な有効量は、少なくとも約450 ng/cm2、少なくとも約500 ng/cm2、少なくとも約550 ng/cm2、少なくとも約600 ng/cm2、少なくとも約625 ng/cm2、少なくとも約650 ng/cm2、または少なくとも約700 ng/cm2である。本願発明は、生理学的に関連する条件下における接着の促進および維持に有効な量は、デバイスが配置される管、および患者の基礎疾患の状態または生理学によって変化することがあることを認識し意図する。さらに、有効な量はデバイスの材料によっても変化する場合がある。なぜなら、一部の材料は他の材料よりも血栓形成性が高いからである。たとえば、金属はとくに血栓形成性であって、金属デバイスの配置後の血栓形成のリスクは、他の材料でつくられたデバイスの配置後の血栓形成のリスクよりも大きい。当業者は、特定の患者の治療に最適な条件を決定することができる。
【０１３４】
例示的なデバイスは、多数の物質のいずれかでつくられるかまたはコーティングされてよい。本願明細書全体に詳述の通り、本願発明は、トロポエラスチンまたはその生物活性断片を、ヒトまたは動物体内の管に配置する、使用中の任意のデバイスに実質的に結合させるステップを意図する。例示的な物質は、医療機器の製造に典型的に用いられる生体適合性の物質である。例として、デバイスは、金属、プラスチック、シリコーン、ダクロン、PTFE、またはその誘導体もしくは合金からつくられるか、またはそれらでコーティングされる。当該ポリペプチドは、デバイス表面に共有結合するか、または架橋結合することができる。固体表面へのポリペプチドの共有結合の方法は、当業に公知である。一例を本願明細書に提供する。しかし、当業に知られる表面にポリペプチドを結合するその他の方法も同様に意図され、容易に用いることができる。当業者は、結合させるタンパク質の濃度、および結合が望ましいデバイス表面の性質に依存した、さまざまな結合化学および方法の中から選択することができる。             
【０１３５】
(iv)  スクリーニングの方法
本願明細書は、トロポエラスチンまたはその生物活性断片を含む組成物を用いて、内皮細胞および内皮前駆細胞の接着および遊走を促進するための方法および組成物を説明する。再狭窄および血栓症を予防および／または減少させるために有効なデバイス、方法、および組成物を提供する重要性を鑑み、本願発明はトロポエラスチン変異ポリペプチド、トロポエラスチンの生物活性断片、ならびに内皮細胞の接着および／または遊走を促進するのに有用であると考えられるペプチド模倣体を同定するためのスクリーニングの有用性を認識する。本願発明の方法によって同定および／または特徴付けされる例示的な断片、変異体、およびペプチド模倣体は、未変性トロポエラスチンの以下の機能的活性を1つ以上有している。それは、(i)  in vitroにおける内皮細胞の接着の促進、(ii)  in vivoにおける内皮細胞の接着の促進、(iii)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の接着の促進、(iv)  in vitroにおけるヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）の接着の促進、(v)  in vitroにおける内皮細胞の遊走の促進、(vi)  in vitroにおけるヒト動脈内被細胞（HuAEC）の遊走の促進、(vii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の接着の促進、(viii)  in vitroにおけるA2058ヒト黒色腫細胞の遊走の促進、(ix)  in vitroにおけるヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）の接着の促進である。本願発明のスクリーニングの方法によって同定された変異体、断片、およびペプチド模倣体は、in vivoにおける再狭窄および／または血栓症の治療または予防のために有用であるかどうかを決定するためにさらに分析することができる。      
【０１３６】
意図されるスクリーニングの方法には、単一のポリペプチド候補、およびポリペプチドのライブラリをスクリーニングするステップが含まれる。さらに、スクリーニングの方法は、ハイスループットアッセイとして実施することもできる。 
【０１３７】
本願発明の文脈において、細胞ベースのスクリーニングを、培養液中の内皮細胞または内皮細胞株において実施することができる。例示的な内皮細胞または細胞株は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類などがそれらに限定されずに含まれるいずれかの種に由来してよい。さらに、例示的な内皮細胞には、内皮前駆細胞または形質転換内皮細胞株が含まれる。制限されない例として、そのスクリーニングは、ヒト動脈内皮細胞（HuAEC）、またはヒト微小管内皮細胞（HMVEC）の培養物で行うことができる。  
【０１３８】
使用される細胞種に関係なく、細胞の培養物を1種類以上の候補ポリペプチドに接触させて、細胞接着および／または細胞遊走についてアッセイすることができる。対象として、候補ポリペプチドの作用を、ポリペプチドの欠如下、またはBSAなどの担体の存在下における細胞のふるまいと比較することができる。本方法を使用して、有用である可能性のあるポリペプチド変異体、断片、またはペプチド模倣体を同定および／または特徴付けすることができる。特に、ポリペプチドの欠如下、または担体のみの存在下における細胞のふるまいと比較している、内皮細胞の接着および／または遊走を促進するポリペプチドは、本願発明の方法において有用かもしれないポリペプチドである。そのようなポリペプチドは、さらなるin vitroまたはin vivoアッセイに用いてさらに分析することができる。  
【０１３９】
トロポエラスチンポリペプチド変異体、断片、またはペプチド模倣体を同定および／または特徴付けするために用いる方法論に関係なく、in vitroにおいて内皮接着および／または遊走を促進すると同定されたポリペプチドは、さまざまなin vitroまたはin vivoの用途を有する。したがって、本願発明はさらに、本願発明のスクリーニング方法によって同定されるポリペプチドの使用を意図する。同定されたエラスチンベースの組成物は、単体で用いてもよく、もしくはその他の薬剤と併用してもよく、または薬学的に許容な担体に調合してもよい。
【０１４０】
本願発明は、トロポエラスチンまたはペプチド断片が結合したさまざまなデバイスの有効性を試験する様々な方法も意図する。たとえば、さまざまな物質（たとえばプラスチック、金属、PTFE、シリコーンなど）でつくられたデバイスは、架橋または共有結合によって、有効量のトロポエラスチンまたは生物活性断片でコーティングすることができる。コーティングされたデバイスは、動物モデルの管の中に挿入することができる。たとえば、ブタは心血管適応症の動物モデルとしてよく用いられる。コーティングされたデバイスは、ブタの動脈または静脈中に配置することができる。移植されたデバイスの血栓形成作用を、対照動物の動物または静脈に配置されたはだかの貴族デバイスの血栓形成作用と比較することができる。金属は典型的にはデバイス物質の中で最も血管形成性が高く、はだか金属対照は、最大レベルのデバイスの血管形成性を示す。  
【０１４１】
移植したデバイスを見るためにイメージング法を用いることができる。実験後のある時点で、デバイスを取り除き、はだか金属デバイスと比較した各種コーティングデバイスの相対的内皮化を評価するためにイメージングすることができる。  
【０１４２】
同様の実験を、他の管および他の動物モデルを用いて実施することができる。さらに、損傷または罹患動物を用いて、実験を行うこともできる。医療デバイスを罹患または損傷患者に埋め込む場合、罹患動物は血栓形成プロセスのより正確なモデルとなる場合もある。  
【０１４３】
(v)  核酸、タンパク質、化学化合物、および薬剤の薬学的組成物の投与の方法
本願発明はさらに、トロポエラスチンポリペプチド、およびその生物活性断片を含む薬学的組成物を意図する。ある実施態様では、その薬学的組成物は、従来の製薬技術にしたがって調剤された、トロポエラスチンポリペプチド、およびその生物活性断片を含む。たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing
Co., Easton, PA)を参照。本願発明の薬学的製剤は、活性作用物質、または活性作用物質の薬学的に許容な塩を含んでよい。これらの組成物には、活性作用物質に加えて、当業に公知の薬学的に許容な賦形剤、担体、バッファ、安定剤、またはその他の物質が含まれてよい。そのような物質は無毒性であって、その活性作用物質の有効性を阻害してはならない。好ましい薬学的組成物は、非発熱性である。さらなる好ましい薬学的組成物は、非抗原性である。その担体は、たとえば、静脈、筋肉内、経口、くも膜下腔、神経鞘または非経口、経皮、経肺など、投与経路によってさまざまな形状をとってよい。さらに、その担体は、トロポエラスチンポリペプチド、またはその生物活性断片の金属デバイスへの共有結合に適している。
【０１４４】
好適な担体の具体例は、水、食塩水、デキストロース溶液、フルクトース溶液、エタノール、または動物、植物もしくは合成由来の油である。その担体は、たとえば保存剤、懸濁剤、可溶化剤、およびバッファなど、その他の成分も含んでよい。
【０１４５】
本願発明による薬学的組成物には、デバイスも含まれる。そのようなデバイスは、トロポエラスチンポリペプチド、またはその生物活性な断片を含む組成物と共有結合する。トロポエラスチン組成物は、デバイス表面に架橋結合することもできる。コーティングされたデバイスは、ヒトまたは動物体内への投与に適している（たとえば挿入、移植、送達など）。コーティングされたデバイスは、任意に、1つ以上の適応症についてFDAに認可されている。  
【０１４６】
例示的なデバイスは、実質的に特定の適応症に適するいずれかの形状またはサイズの金属デバイスである。例示的な金属は、当業者によって選択されるが、ステンレス鋼、外科用鋼、チタン、金、銀、プラチナ、ニチノール、アルミニウム、ニッケル、およびその他の金属、ならびにヒトまたは動物体内への異色に適する金属合金が、それらに制限されずに含まれる。さらに例示的なデバイスは、プラスチック、シリコーン、ダクロン、PTFE、またはその誘導体または組み合わせからつくられるかまたはコーティングされる。
【０１４７】
例示的なデバイスには、ステント、カテーテル、ワイヤ、およびその他の腔内デバイスが、それらに限定されずに含まれる。さらに例示的なデバイスには、シャント、胸腔チューブ、卵円孔開存閉鎖装置、心徐細動器、ペースメーカ、血管内移植物、人工心臓、人工心臓弁、心室補助装置、および人工呼吸器が含まれる。そのようなデバイスは、静脈内、脈管内、動脈内、経口、直腸、外科的、尿道、またはあるデバイスを適切に送達させるための当業に知られるその他の方法によって、送達することができる。   
【０１４８】
当業者は、血栓症および再狭窄は心血管疾患の治療に伴うだけでなく、その他の閉塞性脈管疾患および障害において直面する問題であることは、容易に理解するだろう。さらに、血栓症は、医療デバイスが治療を構成する個別の徴候にかかわらず、いずれの医療デバイスの移植にも関連する潜在的な問題である。したがって、本願発明は、さまざまな体内の脈管に用いられ、さまざまな疾患の徴候に関連する方法およびデバイスを意図する。例として、例示的な体内脈管には、動脈、静脈、総胆管、膵管、腎管、食道、気管、尿道、膀胱、尿道、卵管、ファローピウス管、輸精管、前立腺管、またはリンパ管が含まれる。非心血管性の徴候に適切なさらなる特異的なデバイスには、胆嚢ステント、気管内ステント、膀胱ドレナージカテーテル、脳-腹膜シャントカテーテル、透析カテーテル、および腹膜透析用移植片またはカテーテルなどが、それらに限定されずに含まれる。つまり、本願発明は、デバイスを一時的または永久に人または動物体内に配置することに関与する実質的にすべての介入が血栓症のリスクを生じることへの認識および理解に基づく。したがって、本願発明は、実質的に血栓症のリスクを低下させるそのような医療介入のいずれかの一部として用いることができる方法および組成物を提供する。
【０１４９】
本願発明は、本願発明の薬学的組成物、デバイス、および関連キットを含む製造品も提供する。本願発明は、本願発明の薬学的組成物を含むいずれかの種類の用品を包含するが、製造品は、典型的には容器であって、好ましくはそこに収容された組成物を特定するラベルと、その組成物および／またはデバイスの使用指示書を有する容器である。
【０１５０】
上述のいずれかの別の実施態様では、本願発明は、トロポエラスチンまたはその生物活性断片でコーティングされたデバイスを、さらに内皮細胞で予めコーティング（ヒトまたは非ヒト患者に移植する前にコーティング）することができる。そのような実施態様では、内皮細胞または内皮前駆細胞（たとえば、患者本人、または血縁もしくは非血縁ドナーのいずれかから採取した）を、トロポエラスチンでコーティングされたデバイスに、ex vivoにて接着させる。その後、これらのデバイスを患者に移植する。理論に束縛されることなく、体内に移植されたら、患者自身の細胞がそのデバイスにさらに接着する場合もある。しかし、さらなる内皮接着がin vivoで生じるかどうかにかかわらず、そのデバイスは、すでに内皮細胞または内皮前駆細胞でコーティングされており、再狭窄または血栓症を減少または予防するだろう。
【０１５１】
当業者は、患者本人以外の供給源に由来する内皮細胞を、ex vivoにてそのデバイスに播種すると、移植後に免疫応答を誘発することがあることを認識するだろう。したがって、ある実施態様では、本願発明は拒絶反応抑制剤の併用投与を意図する。
【０１５２】
本願発明には、医療用デバイスの移植を要する心血管またはその他のいずれかの障害の治療を伴う、再狭窄または血栓症の予防または治療の方法が含まれる。例示的な障害には、心血管疾患、および閉塞性血管疾患などが含まれる。例として、本願発明は、アテローム性動脈硬化症、再狭窄、血管バイパス移植片狭窄、移植性動脈症、動脈瘤、および解離の治療後の、再狭窄または血栓症の予防または治療の方法を意図する。さらに、本願発明は、総胆管、膵管、食道、気管、尿道、膀胱、尿道、卵管、ファローピウス管、輸精管、前立腺管、涙管、およびリンパ管から選択される脈管の治療後の再狭窄または血栓症の予防または治療の方法を意図する。さらに、本願発明は、患者には、広範囲の疾患および症状のいずれかの治療の一部として、デバイスの配置が必要である場合が多いということを認識する。例として、疾患、損傷、または症状のいずれかを実質的に罹患する患者には、人工呼吸器を配置する必要がある場合がある。一部の患者の場合、人工呼吸器の配置は、治療の長期を占める一部の場合もある。たとえば、特に高度な脊髄に生じるALSまたは重篤な脊髄損傷の患者は、人工呼吸器による長期間の維持を要する場合がある。さらなる例として、透析患者は腹膜カテーテルを長期間使用する必要がある場合もある。本願発明は、いずれかの疾患、症状、または損傷の治療に伴うデバイスの配置の後に生じる血栓症の減少または予防のための方法、組成物、およびデバイスを意図する。          
【０１５３】
本願発明の組成物がin vitroまたはin vivoのいずれに使用されるかには関係なく、およびそれらがデバイスに共有結合されているかどうかに関係なく、本願発明は、本願発明の組成物が、水、緩衝食塩水、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）またはそれらの好適な混合物などの生物学的に許容な媒体とともに投与するために、都合よく調剤することができることを意図する。  
【０１５４】
選択した媒体における活性成分の最適な濃度は、医化学者に公知の方法にしたがって、経験的に決定することができる。本願明細書に記載の通り、「生物学的に許容な媒体」には、1種類以上の薬剤の望ましい投与経路に適すると考えられる、溶媒、および分散媒などが含まれる。薬学的に活性な物質へのそのような媒体の使用は、当業に知られる。任意の従来の媒体または作用物質が作用物質または作用物質の組み合わせの活性と適合性がない場合以外は、本願発明の薬学的調製物へのその使用が意図される。その他のタンパク質を含む好ましい賦形剤およびその調製物は、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical Sciences.
Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)などに記載される。これらの賦形剤には、注射可能な「沈殿製剤」が含まれる。  
【０１５５】
導入方法は、生体適合性デバイスによる送達によって提供することもできる。当該薬剤の送達に好適な生体適合性デバイスには、ステント、ワイヤ、カテーテル、およびシースなどの腔内デバイスが含まれる。しかし、投与は、生体適合性デバイスによる送達に限定されない。本願明細書に詳述の通り、本願発明は、多数の投与経路および送達の方法のいずれかを意図する。
【０１５６】
有効な量または用量レベルは、本願発明に用いられる特定の1つ以上の薬剤の活性、投与経路、投与時間、使用された特定の化合物の排出速度、治療の持続時間、特定の薬剤と併用したほかの薬物、化合物、および／または物質、動物の年齢、性別、体重、症状、健康状態、および既往歴を含む各種要因、ならびに医療関連業者に公知の因子によって変化するだろう。  
【０１５７】
薬剤は担体で投与することができ、または薬学製剤（組成物）として投与することもできる。前記薬剤は、ヒトまたは獣医学での使用に便利な投与のために調製することもできる。ある実施態様では、薬学的調製物に含まれる薬剤は、それ自体が活性であってもよく、または、たとえば生理学的背景において活性化合物に転換できるプロドラッグであってもよい。 
【０１５８】
このような組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含んでよい。微生物の活動を確実に防ぐために、たとえばパラベン、クロロブタノール、およびフェノールソルビン酸などの各種抗菌剤および抗真菌剤を含んでもよい。さらに、糖、および塩化ナトリウムなどの等張剤を前記組成物に含ませることが望ましい。さらに、注射可能な剤形の吸収を持続させるために、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を含んでもよい。 
【実施例】
【０１５９】
本願発明はここまでは一般的に記述されているが、以下の例を参照することによってより容易に理解されるであろう。以下の例は、本願発明のある局面および実施態様を説明する目的のためだけに含まれているものであり、本願発明を制限することは意図しない。
【０１６０】
例1：トロポエラスチンは内皮細胞の接着を促進する
図１は、CHO細胞、ヒト胚腎細胞（HEK 293）、ヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）、およびヒト動脈内皮細胞（HuAEC）の接着への、フィブロネクチンおよびトロポエラスチンの作用を示す。0.1% BSA（対照）、10 ug/ml フィブロネクチン（FN）、または10 ug/ml組換えトロポエラスチンのいずれかでコーティングされた培養プレートに細胞を播種し、コーティングされた基質への接着を調べた。
【０１６１】
調べた4種類すべての細胞種が、フィブロネクチンに接着した。これに対し、HuAECと、程度は低いがHuAoSMCが、トロポエラスチンに接着した。しかし、CHO細胞もHEK 293 細胞も、いずれもトロポエラスチンには接着しなかった。これらの結果から、内皮細胞と平滑筋細胞がトロポエラスチンに接着することが実証された。しかし、フィブロネクチンへの細胞の結合と異なり、トロポエラスチンへの細胞の結合には、いくらかの細胞種の特異性がある。たとえば、図1は、フィブロネクチンに接着するCHO細胞およびHEK 293細胞は、トロポエラスチンに接着しないことを示す。これらの実験を通して使用した完全長組換えトロポエラスチンは、配列番号4に示される。特に、これらの実験は、未変性シグナル配列を欠失した組換えヒトトロポエラスチンで行った。さらに、タンパク質を、N末端と、次いで第Xa因子切断部位に10X Hisタグを有するように操作した。これらの実験に用いたヒトトロポエラスチンタンパク質の完全長は、706アミノ酸残基だった。
【０１６２】
図１に示した結果を、図2にグラフで示す。図２は、トロポエラスチンがHuAECの接着を促進することを示す。この細胞接着を1ウェルあたりの細胞結合数によって計数すると、フィブロネクチンまたはコラーゲンで認められたものと同程度である。
【０１６３】
インテグリンのそれぞれの組み合わせが、フィブロネクチン、コラーゲン、またはトロポエラスチンでコーティングされたウェルへの細胞の接着に関与したかどうかを決定するために、内皮細胞を、免疫グロブリンG（IgG、対照）25μg/ml、または抗αVβ3もしくは抗α2β1 25μg/mlでインキュベートしてから、その細胞をコーティング表面に接触させた。抗αVβ3 または抗α2β1での予インキュベートでは、フィブロネクチンまたはコラーゲンでコーティングした表面への内皮細胞の接着が有意に低下しなかった。しかし、トロポエラスチンでコーティングしたウェルへの内皮接着は、抗αVβ3 遮断抗体による細胞のインキュベーションによって、50%超、遮断された。これにより、インテグリンαVβ3 へのトロポエラスチンの結合が、トロポエラスチンコーティング表面への内皮接着への重要な寄与因子であることが示された。
【０１６４】
例2：トロポエラスチンおよびその生物活性断片は、内皮細胞の遊走を促進する
図３では、トロポエラスチンが内皮細胞の遊走を促進したことを実証する結果をグラフにまとめる。HuAECのBSA、フィブロネクチン、および組換えトロポエラスチンへの遊走を測定した。組換えトロポエラスチンは内皮細胞遊走を促進した。さらに、トロポエラスチンは、フィブロネクチンと同程度、細胞遊走を促進した。  
【０１６５】
本願発明者らはさらに、内皮細胞遊走を促進するトロポエラスチンの2つの生物活性断片の能力を評価した。これらの結果も図3にまとめる。本願発明者らは6量体VGVAPGをアッセイした。この6量体配列は、完全長トロポエラスチンタンパク質の範囲内で複数回反復する。さらに、6量体の1回反復、および6量体の複数回反復は、完全長トロポエラスチンタンパク質の生物活性の少なくとも一部を保持することが示されている。本願発明者らはさらに、トロポエラスチンタンパク質の17残基C末端断片をアッセイした。この17アミノ酸残基を、配列番号6（IFPGGACLGKACGRKRK）に示す。  
【０１６６】
図３にまとめたとおり、6量体配列とC末端17アミノ酸残基断片の両方が、内皮細胞の遊走を促進した。このアッセイでは、その断片は等しく良好に機能した。さらに、その断片は、完全長トロポエラスチンタンパク質と少なくとも同程度、もしかしたらそれよりも良好に、内皮細胞遊走を促進した。  
【０１６７】
図3：トロポエラスチンおよびその生物活性断片は、A2058ヒトメラノーマ細胞の接着および遊走を促進する   
図4は、A2058ヒトメラノーマ細胞の接着への、フィブロネクチン、トロポエラスチン、およびトロポエラスチンの生物活性断片の作用を示す。A2058細胞は、BSA（対照）、フィブロネクチン、トロポエラスチン、または6量体配列VGVAPGの1回反復に相当するトロポエラスチンの生物活性断片でコーティングされた基質への接着についてアッセイした。BSAへの接着と比較して、A2058細胞は、フィブロネクチン、トロポエラスチン、またはトロポエラスチンの生物活性断片でコーティングされた基質に接着した。特に、トロポエラスチンへの接着は用量依存性で、細胞は、フィブロネクチン10 ug/ml と同様にトロポエラスチン50
ug/ml に接着した。さらに、10 μM の6量体配列VGVAPG（たとえばトロポエラスチンの生物活性断片）の1回反復は、BSAと同等に、および完全長トロポエラスチン10 ug/ml と同等のレベルで、A2058細胞の接着を促進した。  
【０１６８】
図5は、A2058ヒトメラノーマ細胞の遊走への、フィブロネクチン、トロポエラスチン、およびトロポエラスチンの2種類の異なる生物活性断片の作用を示す。A2058細胞は、フィブロネクチン、トロポエラスチン、6量体配列VGVAPGの1回反復（たとえばトロポエラスチンの生物活性断片）、およびトロポエラスチンのC末端断片（配列番号6に示されるC末端断片）に応じて遊走した。完全長トロポエラスチン、VGVAPGの1回反復、および配列番号6に示されるC末端断片すべてが、同程度にA2058細胞の遊走を促進した。  
【０１６９】
例4：内皮細胞はコーティングされたステンレス鋼デバイスに接着する
本願発明は、トロポエラスチンおよびその生物活性断片が、内皮細胞の接着および遊走を促進するという発見に基づいている。この発見により、ヒトまたは非ヒト動物に移植される、またはすることができるデバイスへの内皮細胞の接着を促進する方法および組成物のデザインが可能になる。本出願全体に詳述するように、内皮細胞によるデバイスのコーティング（たとえば体内へのまたはin vivoにおける配置のいずれかの前）は、再狭窄および血栓症の予防を助ける。    
【０１７０】
本願発明の重要な局面が再狭窄および血栓症の予防であることを考えて、本願発明者らは内皮細胞がトロポエラスチンでコーティングされた金属デバイスに接着するかどうかを解決する実験を行った。簡単に説明すると、トロポエラスチンを、直径約6mmのステンレス鋼ディスクに共有結合させた。トロポエラスチンを、中間多糖分子を用いてディスク表面に結合させた。トロポエラスチンのディスク表面に共有結合させるための例示的なプロセス、および本願明細書に用いられたプロセスは、Genous Bio-Engineered R ステントの製造に用いられる。これらのディスクは、顕微鏡イメージングのための十分な表面積を提供した。抗CD34抗体および多糖賦形剤のみでも同様にディスクをコーティングした。同様のプロセスを用いて抗CD34抗体でコーティングしたステント（Genous Bio-Engineered R ステント）が、現在ヒトにおける臨床試験中であり、循環内皮細胞および内皮前駆細胞の捕捉を促進し、内皮化を加速することが期待されている。 
【０１７１】
ヒト微小管内皮細胞（HMVEC）を、これらのコーティングされたディスクで培養し、コーティングされたディスクへの細胞の接着をアッセイした。これらの実験の結果を図6にまとめる。トロポエラスチンは、内皮細胞の金属デバイスへの接着を促進した。            
【０１７２】
例5：  内皮細胞はコーティングされたステンレス鋼デバイスの表面全体に接着して広がる
血栓症および再狭窄を予防または治療するために、本願発明は、内皮細胞の接着および／または遊走を促進する方法およびデバイスを提供する。ある実施態様では、内皮細胞は移植可能な医療用デバイスに結合し、それによって血栓症または再狭窄を低減または予防する。本願発明は、デバイスを内皮細胞（たとえば、患者自身の内皮細胞か、または別のヒトまたは動物に由来する内皮細胞のいずれかなど）でコーティングできることを意図する。代替的には、本願発明は、患者にデバイスを移植した後、患者自身の内皮細胞（たとえば内皮細胞または内皮前駆細胞）が移植デバイスに接着することを意図する。理論に束縛されることなく、細胞でデバイスの全体または一部分をコーティングし、血栓症および／または再狭窄の予防または低減を助けることができる。
【０１７３】
本願発明者らは、トロポエラスチンが内皮前駆細胞の接着を促進するかどうかを評価する実験を行った。トロポエラスチンを、直径約6mmのステンレス鋼ディスクに共有結合させた。対照として、抗CD34抗体（内皮細胞接着を促進することが知られている）を同様のステンレス鋼ディスクに共有結合させた。  内皮前駆細胞を、これらのコーティングされたディスクで培養し、コーティングされたディスクへの細胞の接着をアッセイした。これらの実験の結果を図7にまとめる。トロポエラスチンは、内皮細胞の金属デバイスへの接着を促進した。   
【０１７４】
本願発明者らは、接着性内皮細胞の外観も検討した。本願発明者らは、トロポエラスチンが金属デバイスへの細胞の接着を促進するだけでなく、さらに、デバイスの表面全体への接着性細胞の広がりも促進することを認めた。この細胞の広がりは、トロポエラスチンでコーティングされたデバイスに固有で、抗CD34抗体でコーティングされたデバイスには認められなかった。    
【０１７５】
細胞の広がりは、トリトンX-100でコーティングした金属表面に接着した内皮細胞を透過させ、ファロイジンで染色してアクチン細胞骨格とDAPIで細胞核をマークすることによって観察した。上述のとおり、抗CD34抗体か、またはトロポエラスチンのいずれかで金属ディスクをコーティングしたところ、多糖コーティング対照ディスクまたははだか金属ディスクと比較して、細胞接着が顕著に増加した。トロポエラスチンでコーティングされたディスクに接着している内皮細胞は、十分に広がった細胞質と組織化されたアクチン細胞骨格を有した。したがって、血管内に配置された場合、トロポエラスチンまたは抗CD34抗体のいずれかでコーティングされたステンレス鋼表面は、同様のはだか金属表面よりも、迅速に内皮化するようだ。
【０１７６】
本願発明は、金属デバイスへの内皮細胞の接着を促進するトロポエラスチンまたはその生物学活性断片でコーティングした金属デバイスの使用を意図する。本願発明は、トロポエラスチンまたはその生物活性断片と、抗CD34抗体の両方でコーティングした金属デバイスの使用も意図する。内皮細胞の接着を促進する両方の薬剤の能力を考えると、2種類でコーティングしたデバイスは有利な場合もある。
前述の実験では、以下の方法を用いた。
【０１７７】
細胞接着アッセイ
96穴プレートを一晩4℃で2回、10μg/mlのコラーゲン、フィブロネクチン、トロポエラスチン、または0.1%ウシ血清アルブミン（BSA）でコーティングした。細胞を、0.25%トリプシン/1mM EDTAで収集し、接着バッファ（基礎培地で0.5%BSA）の中で3回洗浄し、接着バッファに作業密度5 x 105/ml で懸濁し、37℃で1時間（5%CO2）かけて回収した。インテグリン阻害アッセイのために、25μ/ml抗インテグリン抗体（ケミコン社、カリフォルニア州テメキュラ）、または対照IgG（ジャクソン・イムノリサーチラボラトリーズ社、ペンシルバニア州ウェストグローブ）を、回収期間中に細胞懸濁液に加えた。細胞の回収中、コーティングした96穴プレートをdPBS中で2回洗浄し、25℃、5.0% BSA
(dPBS)で1時間ブロッキングした。ブロッキング溶液を取り除き、ウェルをdPBS中で2回洗浄した。回収した細胞を、1ウェルにつき100μlの容量のコーティングされたウェルに加え、37℃で30分（5% CO2）放置した。このインキュベーション後、アッセイプレートを裏返して、アッセイウェルを100μlのdPBSで2回洗浄し、非特異性の接着細胞を取り除いた。その後、そのウェルをザンボニ固定液に固定し、ギル1ヘマトキシリンで染色し、80%グリセロールで覆った。このアッセイは、拡大率100倍で画像化し、ツァイス社製アキシオカムデジタルカメラを搭載したツァイス社製アキシオバート 200倒立顕微鏡で3ヶ所の無作為の視野／ウェルを捕捉した。目盛りの読みは、1ウェルあたりの接着細胞の数を表す（高性能100倍視野6ヶ所の平均で、2つの別々のウェルから3ヶ所とった）。 
【０１７８】
ステンレス鋼ディスク上の接着アッセイ
予め抗CD34抗体、トロポエラスチン、コーティング賦形剤でコーティングするか、またはコーティングしていない金属6mmステンレス鋼ディスク（Orbus Medical Technologies社、フロリダ州フォートローダーデール）での接着アッセイを、上述に同様の方法で行った。ただし、以下の変更を加えた。48穴プレートを用いて、アッセイ時間中にディスクの操作を容易にするためにディスクを支え、細胞懸濁液の体積を2倍（200μl/ウェル）用いた。それぞれのディスクに共有結合させた例示的な総タンパク量は、約100μgだった。接着後、非特異的に接着した細胞を取り除くために、そのウェルをdPBS中で渦運動を用いて2回洗浄した。ウェルは、4%中性緩衝ホルマリンの中で25℃で10分間固定し、dPBS中で3回洗浄し、0.5%トリトンX-100（dPBS）中を透過させて、5%無脂肪乳（dPBS）でブロッキングし、オレゴングリーン488を結合させたファロイジン（モレキュラー・プローブス／インビトロジェン社、カリフォルニア州カールスバッド）でアクチン線維集合体を染色した。そのディスクを、ベクタシールド取り付け媒体+ DAPI（ベクター・ラボラトリーズ社、カリフォルニア州バーリンゲーム）を有する改良顕微鏡スライドにのせ、水銀ランプの下、ツァイス社製アキシカムデジタルカメラを装着したツァイス社製アキシオプラン顕微鏡で画像化した。
【０１７９】
遊走アッセイ
簡単に説明すると、アッセイの16時間前に、集密性が70%のヒトメラノーマA2058細胞（ATCC、3乃至12代）、またはヒト動脈内皮細胞（HAEC、カンブレックス社、4-7代）の75cm2フラスコを、基本培地（それぞれdMEM + 0.1%BSA、またはEBM-2 + 0.1%FCS）に保持した。細胞を、0.25%トリプシン/1mM EDTAで取り出し、.5% BSA (dMEM) で希釈して、基礎培地で（dMEM + 0.5%BSA）または（EBM-2 +
0.1%FCS）の中で3回洗浄し、作業密度（A2058では2 x 106/ml 、または HAECでは1.5x106 HAEC）の懸濁液で37℃で1時間（5%CO2）かけて回収した。遊走阻害アッセイのために、その細胞を、25μ/ml抗インテグリン抗体（ケミコン社、カリフォルニア州テメキュラ）、または対照IgG（ジャクソン・イムノリサーチラボラトリーズ社、ペンシルバニア州ウェストグローブ）の中で、回収期間中30分間、プレインキュベートした。すべての遊走アッセイは、48穴ボイデンチャンバー装置（ニューロプローブ社、メリーランド州キャビンジョン）で3回行った。回収した細胞を、30μlの下部チャンバーに加えた。そのウェルを8μm孔ポリカーボネート膜（ニューロプローブ社、メリーランド州キャビンジョン）で覆い、A2058細胞については100μg/mlラットテールコラーゲン（トレビジェン社、メリーランド州ガイザーズバーグ）で、HAECについてはブタ皮膚由来のアセチル化1%ゼラチン（シグマ社、ミズーリ州セントルイス）でコーティングした。この装置は、37℃（5%CO2）で組み立てて、2時間の接着時間、逆転させて保存した。この装置を再び逆転させて、走化性因子52μl、10mg/mlのフィブロネクチン、200ng/mlのトロポエラスチン、10μMのエラスチン由来ペプチド、VGVAPGおよびIFPGGACLGKACGRKRK（C末端ペプチド）、または0.1%BSA/dMEM （希釈、無作為遊走対照）を上部チャンバに加え、37℃（5%CO2）で加湿したインキュベータの中で2時間遊走させた。膜を取り除き、メタノールで固定して、ヘマ3染色セット（フィッシャーサイエンティフィック社、ペンシルバニア州ピッツバーグ）で染色して、50 x 75mm のスライドガラスに遊走側を下にして載せた。90%封入剤（キシレン溶液）を適用する前に、湿らせた綿棒で、膜の遊走していない暴露面から遊走していない細胞を取り除いた。目盛りの読みは、膜全体を遊走する細胞の数を示す（2つの高性能 X 20視野／ウェルの合計、それぞれ6ウェルセットの平均）。
【０１８０】
CD34+細胞の精製
アフェレーシス法によって収集した末梢血単核細胞調製物から、ヒトCD34+細胞を精製した。収集手順を行う前の4日間、ドナーを10μg/kg 顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）で動態化した。この操作は、ユタ大学学内倫理委員会に認証されたとおりである。CD34+の精製は、自動化細胞選択装置CliniMACS（ミルテニー・バイオテック社、カリフォルニア州オーバーン）を用いて、密封および滅菌システム中で行われた。標的細胞を、酸化鉄とマウスCD34モノクローナル抗体に結合させデキストランを含む超常磁性粒子で標識した。標識後、その細胞を、高勾配磁気分離カラムを用いて分離した。磁気的に標識した細胞は、帯磁したカラムの中に留まるが、未標識の細胞は通過した。カラムから磁場を取り除いてCD34+細胞を回収し、その細胞を洗浄して収集バッグに入れた。
【０１８１】
CD34+濃縮度および純度の解析は、FACSan分析器（ベクトンディキンソン社、カリフォルニア州サンホセ）を用いて、フローサイトメトリによって行った。細胞は、生存率プローブ7-アミノアクチノマイシン-D（シグマ・アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）に加えて、モノクローナル抗体CD45-FITCおよびCD34-PE（ベクトンディキンソン社、カリフォルニア州サンホセ）で染色した。簡単に説明すると、データ解析を、すべての白血球（CD45陽性細胞）およびすべての生存細胞（7-AAD 陰性）のゲーティングによって行い、CD34-PE発現をイソタイプ（IgG2a-PE）対照と比較して調べた。少なくとも100,000個の生存白血球を解析して、CD34陽性細胞の割合を決定した。実験に用いられる細胞は、98% CD34+細胞だった。
【０１８２】
組換えヒトトロポエラスチン
内因性シグナル配列を除去し、10Xヒスチジンタグで置換した。このcDNAは、イソプロピル-β-D-チオガラクトシド（IPTG）誘導性作製物（pETシステム、ノバジェン／EMDバイオサイエンシズ社、カリフォルニア州サンディエゴ）にクローニングし、大腸菌宿主株Rosetta-2 (DE3) pLysS （ノバジェン社）で発現させた。50 μg/ml アンピシリンおよび3450 μg/ml クロラムフェニコールを含有するLB成長培地に、組換えトロポエラスチンプラスミドを含有するRosetta-2 (DE3) pLysS バクテリアを播種し、その培養物を、600nmの光学密度が0.4乃至0.6になるまで、37℃で増殖させた。誘導は、IPTGを最終濃度1mMになるまで加えて行い、培養物は37℃で4時間インキュベートした。バクテリアペレットを、16,000 x gで4℃で20分間遠心分離して収集した。そのペレットを、Bugbuster HT ＋ リソザイムの中に再懸濁させ、脱イオン化H2Oで1:10で希釈したBugbusterで洗浄（合計4回）してから40乃至5,000 x gで遠心分離して、封入体を精製した。最後の洗浄後、その封入体を、16,000 x gで4℃で15分間、遠心分離して収集した。封入体を、pH7.9に調整された（尿素の添加後）6M尿素を含有する1Xバインドバッファ（500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、5 mM イミダゾール）に再懸濁させた。ペレットを、4℃で一晩溶解させた。それから、不溶性物質を、16,000 x gで30分間遠心分離して除去した。その上清を0.45μmシリンジフィルタでろ過した。それから、その試料を、6M尿素で1Xバインドバッファに予め平衡化させたHis-Mag ビーズ（ノバジェン社）に加えて、5分間、ロッカーに置いた。Magnatight
stand （ノバジェン社）を用いてビーズを収集し、6M尿素（pH7.9に調整）を含有する1X洗浄バッファ（500 mM NaCl、60 mM イミダゾール、20 mM Tris-HCl）で4回洗浄した。最後の洗浄後、タンパク質を、500 mM イミダゾール、500 mM NaCl、20 mM Tris-HCl、6M 尿素、 pH 7.9で、ビーズから溶出させた。その後、その試料を、10,000 MWCO を有するSlide-A-Lyzer 透析カセット（ピアース社）を用いて、HBSSに対して透析した。得られたタンパク質を、標準技術によるSDS-PAGE 分析によって分析し、-80℃で保存した。
【０１８３】
その他の試薬
接着実験用に、ヒトコラーゲンIおよびフィブロネクチンを、バイオメディカルテクノロジーズ社（マサチューセッツ州ストートン）から購入した。エラスチン由来のペプチドを、ユタ大学DNA/ペプチド施設で合成した。
【０１８４】
参考文献
WO00/50068
Olson et al. (1995) Hum
Mol Genet. 4(9): 1677-9.
Curran
et al. (1993) Cell 73: 159-168.
Ewart et al. (1993) Nat Genet. 5: 11-16.
Li
et al. (1997) Hum. Mol. Genet. 6:
1021-1028.
Dietz
and Mecham (2000) Matrix Biol. 19: 481-486.
Li
et al. (1998) Nature 393: 276-280.
Li
et al. (1998) J. Clin. Invest. 102:
1783-1787.
Karnik et al. (2003) Matrix Biology
22: 409-425
Karnik
et al. (2003) Development 130: 411-423
Brooke et al. (2003) Trends in Cardiovascular Medicine 13:
176-181  
【０１８５】
本願明細書に記載のすべての公表物、特許、および特許出願は、各公表物、特許、または特許出願が特異的および個別にその全体を引用により援用されることを示唆されるのと同程度に、本願明細書にその全体を引用により援用される。
【０１８６】
等価物
当業者であれば、ごく普通の実験を用いるのみで、ここに説明した本願発明の特定の実施態様の等価物を数多く認識し、または確認できることであろう。このような等価物は、添付の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
【図１】CHO細胞、ヒト胚腎細胞（HEK 293）、ヒト動脈平滑筋細胞（HuAoSMC）、およびヒト動脈内皮細胞（HuAEC）の接着への、フィブロネクチンおよびトロポエラスチンの作用を示す。各細胞種について、細胞接着は、フィブロネクチンまたは組換えヒトトロポエラスチンのいずれかでコーティングされた培養皿の中で測定された。内皮細胞と、程度はより小さいが平滑筋細胞は、トロポエラスチンでコーティングされた培養皿に接着させることに留意されたい。それに対して、CHO 細胞およびHEK 293は、フィブロネクチンでコーティングされた培養皿に接着するが、トロポエラスチンでコーティングされた培養皿には接着しない。
【図２】各種タンパク質でコーティングされた培養皿への内皮細胞の接着をグラフにまとめる。トロポエラスチンのHuAECへの接着は、フィブロネクチンおよびコラーゲンで認められたものと同等である。
【図３】内皮細胞遊走へのトロポエラスチンまたはトロポエラスチンの各種の生物活性断片の作用を示す。トロポエラスチン、およびトロポエラスチンの2つの異なる生物活性断片は、内皮細胞の遊走を促進する。内皮細胞遊走へのトロポエラスチンおよび各種生物活性断片の作用は、フィブロネクチンの内皮細胞遊走への作用と同等である。
【図４】トロポエラスチン、およびトロポエラスチンの生物活性断片が、A2058ヒトメラノーマ細胞の接着を促進することを示す。
【図５】トロポエラスチン、およびトロポエラスチンの各種生物活性断片が、A2058ヒトメラノーマ細胞の遊走を促進することを示す。
【図６】別のヒト内皮細胞種（ヒト微小管内皮細胞-HMVEC）が、トロポエラスチンが共有結合しているステンレス鋼ディスクに接着したことを示す。トロポエラスチンでコーティングされたステンレス鋼ディスクへのHMVECの接着は、抗CD34抗体でコーティングされたステンレス鋼ディスクへのHMVECの接着と同程度であった。
【図７】内皮前駆細胞が、抗CD34抗体またはトロポエラスチンのいずれかでコーティングされたステンレス鋼ディスクに接着することを示す。しかし、ステンレス鋼ディスクに結合した後の細胞の試験では、トロポエラスチンへの接着がディスク表面全体に広がる細胞に関連していることを示した。これに対して、本願発明者らは、抗CD34抗体でコーティングしたステンレス鋼ディスクで培養した内皮細胞の広がりではなく接着を認めた。
【図１】
2008532942.tif 000007
【図２】
2008532942.tif 000008
【図３】
2008532942.tif 000009
【図４】
2008532942.tif 000010
【図５】
2008532942.tif 000011
【図６】
2008532942.tif 000012
【図７】
2008532942.tif 000013
【配列表】
2008532942000001.xml
【国際調査報告】
2008532942.tif 000021
2008532942.tif 000022
2008532942.tif 000023
2008532942.tif 000024