(57)【要約】本発明は、少なくとも１つの非天然システインを含んでいる組換え技術で調製され操作されたタンパク質を選択的に還元および誘導体化するための方法であって、還元反応が酸化還元緩衝液の存在下で又はトリアリールホスフィン還元剤の存在下で実施される方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの非天然システインを活性コンホメーションにおいて含んでいる操作したタンパク質を選択的に還元するための方法であって、該タンパク質はジスルフィド架橋で低分子量チオール（RS-Cys）に結合された１以上のシステイン部分を具備し、該部分は該タンパク質がその活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していなく、低分子量チオール結合型タンパク質を酸化還元緩衝剤を含んでいる混合物と非変性条件下で反応させる工程を備える方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、前記酸化還元緩衝液が、(i)還元型および酸化型のグルタチオン, (ii)還元型および酸化型のγ-グルタミルシステイン, (iii)還元型および酸化型のシステイニルグリシン, (iv)還元型および酸化型のシステイン, および(v)還元型および酸化型のN-アセチルシステインから選択される酸化還元対などの低分子量のチオール/ジスルフィド酸化還元対を含む方法。
【請求項３】
請求項1〜2の何れか１項に記載の方法であって、前記酸化還元緩衝液は還元型および酸化型のグルタチオンの酸化還元対であり、前記還元型グルタチオンの濃度は0.01〜50 mMの範囲であり、前記酸化型グルタチオンの濃度は0.001〜2 mMの範囲である方法。
【請求項４】
請求項1〜3の何れか１項に記載の方法であって、前記混合物は、さらに大腸菌からのGrx1, Grx2 またはGrx3, 酵母からのGrx5p, ヒトからのGrx1およびGrx2, 並びにそのバリアントから選択されるグルタレドキシンなどのチオール/ジスルフィド酸化還元触媒を含む方法。
【請求項５】
請求項1〜4の何れか１項に記載の方法であって、前記酸化還元触媒（特に、グルタレドキシン）は、0.001〜20 μMの濃度で使用される方法。
【請求項６】
請求項1〜5の何れか１項に記載の方法であって、前記混合物は、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)を含まない方法。
【請求項７】
請求項1〜6の何れか１項に記載の方法であって、前記混合物は、さらに前記タンパク質のインヒビターを含む方法。
【請求項８】
請求項1〜7の何れか１項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、1以上の分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)を有する方法。
【請求項９】
請求項1〜8の何れか１項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、1以上の分子間のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)を別の操作されたタンパク質とで有する方法。
【請求項１０】
請求項1〜9の何れか１項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、不安定なジスルフィド結合を有するタンパク質である方法。
【請求項１１】
少なくとも１つの非天然システインを活性コンホメーションにおいて含んでいる操作したタンパク質を選択的に還元するための方法であって、該タンパク質はジスルフィド架橋で低分子量チオール（RS-Cys）に結合された１以上のシステイン部分を具備し、該部分は該タンパク質がその活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していなく、低分子量チオール結合型タンパク質をトリアリールホスフィン還元剤を含んでいる混合物と非変性条件下で反応させる工程を備える方法。
【請求項１２】
請求項11に記載の方法であって、前記トリアリールホスフィン還元剤が、以下の化合物9〜11から選択される方法：
【化１】
2008546670.tif 000010
【請求項１３】
請求項11〜12の何れか１項に記載の方法であって、前記トリアリールホスフィン還元剤が、0.01〜50 mMの濃度で使用される方法。
【請求項１４】
請求項11〜13の何れか１項に記載の方法であって、前記トリアリールホスフィン還元剤が、固体の支持体に固定化される方法。
【請求項１５】
請求項11〜14の何れか１項に記載の方法であって、前記混合物は、さらに前記タンパク質のインヒビターを含む方法。
【請求項１６】
請求項1〜15の何れか１項に記載の方法であって、前記タンパク質が、選択的な還元反応が行われる場合に活性型である方法。
【請求項１７】
請求項1〜16の何れか１項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、1以上の分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)を有する方法。
【請求項１８】
請求項1〜17の何れか１項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、1以上の分子間のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)を別の操作されたタンパク質とで有する方法。
【請求項１９】
請求項1〜18の何れか１項に記載の方法であって、前記操作されたタンパク質は、不安定なジスルフィド結合を有するタンパク質である方法。
【請求項２０】
請求項1〜19の何れか１項に記載の方法であって、前記タンパク質が、II因子ポリペプチド(FII/FIIa), VII因子ポリペプチド(FVII/FVIIa), VIII因子ポリペプチド(FVIII/FVIIIa), IX因子ポリペプチド(FIX/FIXa), Ｘ因子ポリペプチド(FX/FXa), XI因子ポリペプチド(FXI/FXIa), XIII因子ポリペプチド(FXIII/FXIIIa), およびプロテインＣポリペプチドから選択される方法。
【請求項２１】
請求項20に記載の方法であって、前記タンパク質がVII因子ポリペプチドである方法。
【請求項２２】
請求項1〜21の何れか１項に記載の方法であって、少なくとも１つの選択的に還元されたシステイン(HS-Cys)部分を化学基と結合させる同時の及び／又は引き続く工程を備える方法。
【請求項２３】
請求項22に記載の方法であって、前記化学基がポリエチレングリコール（PEG）から選択される方法。
【請求項２４】
請求項23に記載の方法であって、前記化学基は、ポリエチレングリコールであり、特に500〜100,000（例えば、1000〜75,000, または2,000〜60,000）の範囲の平均分子量を有しているものである方法。
【請求項２５】
ジスルフィド架橋で低分子量チオール（RS-Cys）に結合された1以上のシステイン部分を含んでいる活性コンホメーションのVII因子ポリペプチドを選択的に還元させるための方法であって、該部分は該VII因子ポリペプチドがその活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していなく、低分子量チオール結合型VII因子ポリペプチドと還元型および酸化型のグルタチオンおよびグルタレドキシンを含んでいる混合物とを反応させる工程と、同時に及び／又は引き続き少なくとも１つの選択的に還元されたシステイン(HS-Cys)部分を化学基と結合する工程とを備え、各工程は非変性条件下で行われる方法。
【請求項２６】
ジスルフィド架橋で低分子量チオール（RS-Cys）に結合された1以上のシステイン部分を含んでいる活性コンホメーションのVII因子ポリペプチドを選択的に還元させるための方法であって、該部分は該VII因子ポリペプチドがその活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していなく、低分子量チオール結合型VII因子ポリペプチドとトリアリールホスフィン-3,3',3''-トリスルホン酸化合物および活性部位インヒビターS1ポケットインヒビターを含んでいる混合物とを反応させる工程と、同時に及び／又は引き続き少なくとも１つの選択的に還元されたシステイン(HS-Cys)部分を化学基と結合する工程とを備え、各工程は非変性条件下で行われる方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、少なくとも１つの非天然システイン（non-native cysteine）を含んでいる組換え技術で調製され操作されたタンパク質（例えば、凝固因子またはトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質）を選択的に還元および誘導体化するための方法であって、還元反応が酸化還元緩衝液の存在下で又はトリアリールホスフィン還元剤の存在下で実施される方法に関する。
【０００２】
［発明の背景］
凝固因子VIIaは、止血の鍵となるイニシエーターである。これは、1〜3時間周辺に機能的な循環半減期を有する50-kDaの血漿タンパク質である。成熟タンパク質は、全体で12のジスルフィド結合対を形成する24のシステイン残基を含有する。これらのうち、前記プロテアーゼドメインにおけるCys340およびCys368を架橋しているジスルフィド結合は、高度に不安定であり、β-メルカプトエタノールなどの通常に使用される還元剤を低濃度で処理することでさえも容易に還元される〔Higashi(1997)を参照されたい〕。Cys340-Cys368(またはキモトリプシンナンバリングによるCys191-Cys220)は、凝固因子II, IX, X, XI およびプロテインＣを含んでいるトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼ中で高度に保存されている〔Wang(1997)を参照されたい〕。これはS1結合ポケットの壁の一部を形成し、FVIIaのジスルフィド結合の還元において、アミド溶解活性（amidolytic activity）の損失（loss）を生じる〔Higashi(1997)を参照されたい〕。
【０００３】
共有結合性の修飾（例えば、PEG化または脂質付着）は、彼等の薬物動態および薬力学的なプロファイルを改善するために、幾つかのタンパク質に基づく薬剤に適用されている。天然または操作されたシステインを介した結合によって、タンパク質（特に、細胞に分泌されるもの）の表面に本アミノ酸が稀であることと同様にチオール共役化学の高い選択性とにより部位特異的な修飾の魅力的な手段が提供される。
【０００４】
天然のVIIa因子には、２４のシステイン残基が含有される。また、ジスルフィド架橋は、以下のシステイン残基の間に樹立される：即ち、C17 およびC22, C50 およびC61, C55 およびC70, C72 およびC81, C91 およびC102, C98 およびC112, C114 およびC127, C135 およびC262, C159 およびC164, C178 およびC194, C310 およびC329, 並びにC340およびC368の間に樹立される。
【０００５】
天然のVIIa因子における自由チオール（free thiols）の欠失によって、次の提案が導かれた；その提案とは、循環半減期の延長が、修飾（例えば、溶媒に暴露されたシステインのＰＥＧ化）によって達成されえることである（例えば、WO 02/077218 A1およびWO 01/58935 A2を参照されたい）。
【０００６】
WO 01/58935 A2は、非ポリペプチド部分（non-polypeptide moieties）を有しているVII因子ポリペプチド及びその調製を開示する。とりわけ、非ポリペプチド部分が、システインを介してVII因子ポリペプチドに結合されることが示唆された。同様に、WO02/077218A1は、化学基（chemical groups）を有しているVII因子ポリペプチド結合体及びその調製を開示している。とりわけ、化学基が、システインを介してVII因子ポリペプチドに結合されることが示唆された。
【０００７】
しかしながら、実際には、このアプローチは、次の事実のために幾分複雑である；その事実とは、VII因子ポリペプチドの主な部分（predominant portions）に導入されたシステインは、前記ポリペプチドが組換え技術によって調製された場合に、グルタチオン(γ-グルタミルシステイニルグリシン), システイン, およびホモシステイン(図1を参照されたい)などの低分子量チオール化合物を有している混合ジスルフィド（mixed disulfides）として見出され、これによって前記システインのチオール基を介した引続く化学的な結合が阻止されることである。従って、係るシステインおよび低分子量チオールの混合ジスルフィドを、天然のジスルフィド結合を保存することで化学的に還元することができる方法の必要性が存在する。
【０００８】
SE 9501285Aは、タンパク質ジスルフィドオキシドレダクターゼ(例えば、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)), グルタレドキシン（glutaredoxin）および酸化還元緩衝剤の混合物を用いて適切に折りたたまれた生物学的に活性なジスルフィド架橋されたタンパク質のインビトロ産生のための方法を開示している。前記文献は、分子内のジスルフィド結合に関与するシステインに注目している。
【０００９】
［発明の簡単な説明］
組換え技術で調製されたタンパク質の分子内ジスルフィド結合に関与しないシステインのチオール基を介した化学的な結合に関する上記の障害に関して、本発明は規定の酸化還元緩衝液（例えば、チオール-ジスルフィド酸化還元触媒との組み合わせ）またはトリアリールホスフィンを、低分子量チオールおよび少なくとも１つの非天然システイン（例えば、凝固因子またはトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質）を含んでいる操作されたタンパク質の間の混合ジスルフィド結合を係る操作された又は天然のシステインで選択的に還元するために使用することをはじめて提供する。混合ジスルフィドの選択的な還元に続いて、自由システインを次に前記タンパク質において当業者に既知のチオール共役化学を用いる結合で修飾することができる。
【００１０】
操作された又は天然のシステインを介した化学的な結合によって、単一の均質な産物を産出するタンパク質の目標を定めた修飾（targeted modification）の選択肢が提供される。しかしながら、システインが低分子量チオールに結合される場合において、タンパク質は不安定な分子内ジスルフィド結合を含有し、この戦略は実行可能（feasible）ではない。本発明によって、引続く化学的な修飾のための解放されたシステイン（liberated cysteine）を調製する低分子量チオール部分の選択的な除去が可能となる。
【００１１】
本発明の１つの側面は、少なくとも１つの非天然システインを活性コンホメーション（active conformation）において含んでいる操作したタンパク質（例えば、凝固因子またはトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質）を選択的に還元するための方法に関し；該タンパク質はジスルフィド架橋で低分子量チオール（RS-Cys）に結合された１以上のシステイン部分を具備し；該部分は、該タンパク質がその活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していなく；該方法は、低分子量チオール結合型タンパク質が酸化還元緩衝液を含んでいる混合物と非変性条件下で反応することを許容する工程を備える。
【００１２】
本発明の別の側面は、少なくとも１つの非天然システインを活性コンホメーションにおいて含んでいる操作したタンパク質（例えば、凝固因子またはトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質）を選択的に還元するための方法に関し；該タンパク質はジスルフィド架橋で低分子量チオール（RS-Cys）に結合された１以上のシステイン部分を具備し；該部分は、該タンパク質がその活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していなく；該方法は、低分子量チオール結合型タンパク質がトリアリールホスフィン還元剤を含んでいる混合物と非変性条件下で反応することを許容する工程を備える。
【００１３】
「選択的に還元された（selectively reduced）」の用語は、次の事実を意味する；その事実とは、ジスルフィド架橋で低分子量チオールに結合されたシステイン部分の主な部分（例えば、60%以上、または80%以上、例えば、90%以上の割合）が還元されて、他の基との結合が可能なチオール基を有しているシステイン部分を解放し、他方で他のジスルフィド結合（典型的には、分子内のジスルフィド結合）の主な部分（例えば、60%以上、または80%以上、例えば、90%以上）が、操作されたタンパク質の生物学的な活性が実質的に保存されるように保存される。一態様において、生物学的な活性が実質的に保存（例えば、60%以上、例えば、80%以上、例えば、90%以上の活性が、非還元のタンパク質の活性と比較して保存される）される間に、前記タンパク質において１以上の非天然システイン部分が還元される場合に、前記タンパク質は「選択的に還元された」といえる。
【００１４】
［発明の詳細な記述］
(A)酸化還元緩衝剤
上記のとおり、本発明は、少なくとも１つの非天然システインを活性コンホメーションにおいて含んでいる操作したタンパク質（例えば、凝固因子またはトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質）を選択的に還元するための方法を提供する。問題のタンパク質には、ジスルフィド架橋で低分子量チオール(RS-Cys)に結合された1以上のシステイン部分が含まれ；この部分は、前記タンパク質が活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与しなく；前記方法には、低分子量チオール結合タンパク質を還元して非変性条件下で酸化還元緩衝剤を含んでいる混合物と反応させることを備える。
【００１５】
本明細書中に使用される場合、「酸化還元緩衝剤（redox buffer）」の用語は、次の比率で存在するチオール/ジスルフィド酸化還元対を意味する；その比率とは、タンパク質-低分子量チオール混合ジスルフィド(RS-Cys)を十分に還元して分裂させ、同時に前記タンパク質における天然のジスルフィド結合の統合性（integrity）を十分に酸化して保存する比率である。
【００１６】
好ましくは、前記酸化還元緩衝剤は、低分子量のチオール/ジスルフィド酸化還元対を含む。「低分子量（low molecular weight）」の用語は、チオール型の酸化還元対が多くとも500 g/モルの分子量を有することを意味する。係る酸化還元対（redox pairs）の例は、(i)還元型および酸化型のグルタチオンおよび(ii)還元型および酸化型のγ-グルタミルシステイン, (iii)還元型および酸化型のシステイニルグリシン, (iv)還元型および酸化型のシステイン, (v)還元型および酸化型のN-アセチルシステイン, (vi)システアミン, および(vii)ジヒドロリポアミド/リポアミドから選択されるものである, 好ましくは(i)還元型および酸化型のグルタチオンから選択されるものである。
【００１７】
至適な酸化還元条件は、当業者に周知の及び図2, 3, および 4で実施したタンパク質の酸化還元滴定（redox titration）を行うことによって決定することができる〔Gilbert (1995)をも参照されたい〕。
【００１８】
一態様において、酸化還元緩衝剤は、還元型および酸化型のグルタチオンの酸化還元対である。また、還元型グルタチオンの濃度は、0〜100 mMの範囲である。また、還元型グルタチオンおよび酸化型グルタチオンの間の比は、2〜200の範囲にある。
【００１９】
別の態様において、操作されたタンパク質は、不安定なジスルフィド結合を有するタンパク質である。
【００２０】
本明細書中に使用される「不安定なジスルフィド結合を有するタンパク質（protein with labile disulfide bonds）」という表現は、25度付近で非変性条件で約中性のpHで5 mM ジチオスレイトール(DTT)の存在下でインキュベーションする場合に、生物活性の進行性の損失（例えば、2 hrs以内の最初の生物活性と比して50%）を呈しているタンパク質を意味する。
【００２１】
別の態様において、酸化還元緩衝剤は、還元型および酸化型のグルタチオンの酸化還元対である。また、還元型グルタチオンの濃度は、0〜100 mMの範囲（例えば、0.01〜50mM）である。また、酸化型グルタチオンの濃度は、0〜5mMの範囲（例えば、0.001〜5mM）にある。VII因子ポリペプチド関して、還元型グルタチオンの濃度は、好ましくは0〜5 mMの範囲（例えば、0.01〜2mM）、酸化型のグルタチオンの濃度は、0.001〜2 mMの範囲（例えば、0.001〜0.200 mM）である。
グルタチオンおよび他の低分子量チオールは一般に反応速度論的に貧弱（poor）な還元剤（reductants）/酸化剤（oxidants）であるので、最も好ましくはチオール/ジスルフィド酸化還元触媒を反応の速度を増強するための酸化還元緩衝剤の混合物に含ませる。
【００２２】
前記混合物に含まれる適切なチオール/ジスルフィド酸化還元触媒には、ジチオール型およびモノチオール型のグルタレドキシンが含まれる。グルタレドキシン及びその機能は、一般にFernandes等〔Fernandes et al.(2004)〕に記載されている。グルタレドキシンの有用な例は、大腸菌（Escherichia coli）からのGrx1, Grx2 or Grx3(Holmgren et al., 1995), 酵母（Saccharomyces cerevisiae）からのGrx1p, Grx2p, Grx3p, Grx4p, およびGrx5p(Luikenhuis et al. 1998; Rodriguez-Manzaneque et al., 1999; Grant, 2001), ヒトからのGrx1およびGrx2(Padilla et al. 1995; Lundberg et al., 2001), 並びにそのバリアントから選択されるものである。バリアントには、CXXCモチーフ中のＣ末端システインが別のアミノ酸（典型的にはセリンまたはアラニン）で置換されたジチオール型のグルタレドキシンが含まれるが、これに限定されない（Yang など, 1998を参照されたい）。
【００２３】
酸化還元触媒（特に、グルタレドキシン）は、好ましくは0.001〜20 μMの濃度で使用される。
【００２４】
前記混合物がタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ(PDI)を含まないことが好適である。
【００２５】
酸化還元緩衝剤は、さらに他の成分（例えば、塩、pH、緩衝液など）を含んでもよい。また、本発明の方法は、問題のタンパク質に適切な任意の温度（例えば、-5゜C〜50゜Cの範囲、例えば、0゜C〜25゜Cの範囲）で実施してもよい（もちろん、所与の条件下においてタンパク質の安定性に依存する）。
【００２６】
この方法が変性剤のない条件を意味している天然の条件下で実施され、タンパク質がその天然の活性コンホメーションを保持することが理解されるべきである。
【００２７】
(B)トリアリールホスフィン還元剤
上記のとおり、本発明は、少なくとも１つの非天然システインを活性コンホメーションにおいて含んでいる操作したタンパク質（例えば、凝固因子またはトリプシンファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質）を選択的に還元するための方法も提供する。問題のタンパク質には、ジスルフィド架橋で低分子量チオール(RS-Cys)に結合された1以上のシステイン部分が含まれ；この部分は、前記タンパク質が活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与しなく；前記方法は、低分子量チオール結合タンパク質を還元して非変性条件下でトリアリールホスフィン還元剤と反応させることを備える。
【００２８】
「トリアリールホスフィン還元剤（triarylphosphine reducing agent）」の用語は、任意で１以上の置換基で置換されたトリアリールホスフィンを意味する。
【００２９】
トリアリールホスフィン還元剤のアリール基は、好ましくはフェニル, ナフチル, 1,2,3,4-テトラヒドロナフチル, アントラシル, フェナントラシル（phenanthracyl）, ピレニル, ベンゾピレニル（benzopyrenyl）, フルオレニルおよびキサンテニル（特にフェニル）から選択される。また、現在選択された態様において、アリール基は、好ましくは同一である。現在最も興味深い態様において、全て３つのアリール基は、フェニルである。アリール基（特に、フェニル基）に存在してもよい置換基の例は、典型的にはスルホン酸, カルボン酸, C1-6-アルキル, C1-6-アルコキシ, および C1-6-アルコキシ-C1-6-アルキル, またはC3-6-アルキレン（２つの隣接するアリール炭素原子を有している環を示している）またはC2-6-アルキレンオキシ（２つの隣接するアリール炭素原子を有している環を示している）またはC1-4-アルキレン-オキシ-C1-4-アルキレン（２つの隣接するアリール炭素原子を有している環を示している）から選択されるものである。
【００３０】
現在最も興味深い態様において、少なくとも１つのアリール(例えば、フェニル)は、スルホン酸およびカルボン酸（特に、スルホン酸）から選択される少なくとも１つの置換基を有する；係る置換基は、好ましくはリン原子への結合に対しメタ位に配置されている。
【００３１】
好ましくは、全ての３つのアリール基は、スルホン酸置換基を有する。例えば、全ての３つのアリール基は、スルホン酸置換基および少なくとも１つの更なる置換基を有する（特に、リン原子への結合に対しパラ位に少なくとも１つの置換基、特にこのパラ位における酸素置換基）。
【００３２】
好適な還元剤のアリール基は、リン原子への結合に対しオルト位に置換基を有しないことが現在信じられている。
【００３３】
「C1-6-アルキル」の用語は、1〜6の炭素原子を有している直鎖状または分枝状の飽和の炭化水素残基を包含する。特定の例は、メチル, エチル, n-プロピル, イソプロピル, n-ブチル, イソブチル, sec-ブチル, tert-ブチル, n-ペンチル, イソペンチル, n-ヘキシル, などである。同様に、「C1-4-アルキル」の用語は、1〜4の炭素原子を有している直鎖状または分枝状の飽和の炭化水素残基を包含する。「C1-6-アルキレン」, 「C2-6-アルキレン」などの用語は、それぞれ「C1-6-アルキル」, 「C2-6-アルキル」に対応するビラジカルを表す。
【００３４】
適切なトリアリールホスフィン還元剤は、還元電位および立体障害（steric hinderance）の間の有用なバランスを有しているものである。トリアリールホスフィン還元剤の化学的な性質は、タンパク質における天然のジスルフィド結合の統合性を保存している間に、タンパク質-低分子量チオール混合ジスルフィド(RS-Cys)を切断する能力によって決定（dictated）される。現在の非常に興味深い化合物は、トリアリールホスフィントリスルホン酸、例えば、トリフェニルホスフィン-3,3',3''-トリスルホン酸及びそのアナログである。その例は、トリフェニルホスフィン-3,3',3''-トリスルホン酸及びそのアナログから選択されるトリアリールホスフィン還元剤である（例えば、以下の化合物9〜11から選択されるものの１つである）：
【化１】
2008546670.tif 000002
トリアリールホスフィン還元剤は、好ましくは0.001〜100 mM（例えば、 0.01〜50 mM または0.1〜25 mM）の濃度で使用される。
【００３５】
１つの興味深い態様において、トリアリールホスフィン還元剤は、固体の支持体に固定化される。これによって、還元剤をタンパク質から容易に分離することが促進される。通常は、トリアリールホスフィン還元剤（例えば、化合物9〜11）は、当業者に既知の手段によって（例えば、リンカー基をアリール基の１つに導入することによって）固定化されてもよい。トリアリールホスフィン試薬12は、上記1の連結可能なバリアントの例である。
【化２】
2008546670.tif 000003
反応は、典型的には0〜40゜Cの範囲の温度（例えば、外界温度）で、場合に応じて、5秒から数日の期間で実施される。反応に続いて、転換を確認するためにHPLCを行ってもよい。溶媒は、好ましくは水性の緩衝剤（任意でDMSOまたはDMFなどの共溶媒を含んでいる）である。また、溶媒は、塩（例えば、カルシウム塩）を含んでもよい。
【００３６】
１つのバリアントにおいて、トリアリールホスフィン還元剤は、タンパク質に対するインヒビター（例えば、活性部位S1ポケットのインヒビター）との組み合わせで使用される（さらに以下の記載を参照されたい）。
【００３７】
タンパク質
一般に、上記の酸化還元緩衝剤を用いる選択的な還元の戦略は、タンパク質が活性形態である場合に、少なくとも１つの非天然システインを含んでいる操作されたタンパク質〔特に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していない操作されたシステインを有しているタンパク質〕に適用可能であると信じられており、それゆえ潜在的に低分子量チオール結合型(RS-Cys)の形態である。
【００３８】
「低分子量チオール結合型(RS-Cys)の形態」の用語及び類似する用語は、次の事項を意味する；その事項とは、問題のタンパク質のシステインのチオール基が、チオール基を有している化合物（該化合物は500 Da未満の分子量を有する）に結合されることである。係る化合物の例は、グルタチオン, ガンマ-グルタミルシステイン, システイニルグリシン, システイン, N-アセチルシステイン, システアミン, などである。
【００３９】
「活性形態（active form）」の用語は、触媒(酵素)、酵素前駆体、またはコファクターなどの望ましい作用を行う能力のあるタンパク質の形態を意味する。「活性形態」は、時々は「正しくフォールドされた形態」と称される。
【００４０】
1つの興味深い態様において、タンパク質の多くの部分（即ち、少なくとも50%）が、選択的な還元反応が行われる場合に活性型である。
【００４１】
係るタンパク質（「タンパク質工学」による非天然システインの導入に供試されている）の重要なクラスには、特にII因子ポリペプチド(FII/FIIa), VII因子ポリペプチド(FVII/FVIIa), VIII因子ポリペプチド(FVIII/FVIIIa), IX因子ポリペプチド(FIX/FIXa), Ｘ因子ポリペプチド(FX/FXa), XI因子ポリペプチド(FXI/FXIa), XIII因子ポリペプチド(FXIII/FXIIIa), およびプロテインＣポリペプチドから選択される凝固因子ポリペプチドが含まれ、その中でもVII因子ポリペプチドが特に重要である。
【００４２】
「操作された（engineered）」タンパク質の別の非常に重要なクラスには、特にII因子ポリペプチド(FII/FIIa), VII因子ポリペプチド(FVII/FVIIa), IX因子ポリペプチド(FIX/FIXa), Ｘ因子ポリペプチド(FX/FXa), XI因子ポリペプチド(FXI/FXIa), およびプロテインＣポリペプチドから選択されるトリプシン-ファミリーのセリンプロテアーゼのタンパク質に対応しているポリペプチドが含まれ、その中でもVII因子ポリペプチドが特に重要である。
【００４３】
「操作された」タンパク質の別の非常に重要なクラスには、抗体が含まれる。
【００４４】
本明細書中に使用される「抗体」の用語は、抗原に特異的に結合する能力を有している免疫グロブリン分子及びその断片を意味する。
【００４５】
「抗体」の用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片（ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨIドメインからなる一価の断片）；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ）２およびＦ（ａｂ’）２断片（ヒンジ領域でのジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含んでいる二価の断片）；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の一つのアームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；並びに（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン（ＶＬおよびＶＨ）は別々の遺伝子によってコードされているが、これらを組換え手法を使用して連結することが可能であり、この連結は、これらを単一のタンパク質鎖（ＶＬおよびＶＨ領域がペアで一価の分子を形成する、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られるもの）として作出しえる合成リンカーによってなされる；〔例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426: and Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい〕。かかる単鎖抗体も、「抗体」の用語に含まれることを意図している。単鎖抗体の他の形態、例えば、ディアボディー（diabodies）も含まれる。ディアボディーは、二価であり、ＶＨおよびＶＬドメインが単一のポリペプチド鎖上に発現している二重特異性（bispecific）の抗体であり、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを許容するために短いリンカーを用いることにより、前記ドメインを別の鎖の相補的なドメインとペアにし、そして２つの抗原結合部位を作出するものである（例えば、Hol-liger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123を参照されたい）。
【００４６】
前記タンパク質は、一般に未変性タンパク質と比較して、少なくとも１つの非天然システインを含む「操作された」ポリペプチドである。係る「操作された」ポリペプチドは、好ましくは当業者には明らかな組換え技術で調製される（WO02/077218 A1およびWO 01/58935A2をも参照されたい）。
【００４７】
上述したように、特に興味深いタンパク質は、VII因子ポリペプチドである。
【００４８】
本明細書中に使用される「非変性条件（non-denaturing conditions）」は、次の条件を意味する；つまり、前記タンパク質が原型（intact）のコンホメーションを実質的に保持し、生物活性が開始産物の活性と比較して実質的に保存（例えば、活性の60%以上, または80%以上, 例えば、90%以上）される条件を意味する。
【００４９】
本明細書に使用される「VII因子ポリペプチド」、「FVIIポリペプチド」などの用語は、野生型ヒトVIIa因子のアミノ酸配列1〜406(即ち、米国特許第4,784,950号に開示されたアミノ酸配列を有しているポリペプチド)を含んでいる任意のタンパク質、そのバリアント、同様に、VII因子関連ポリペプチド、VII因子誘導体およびVII因子結合体を意味する（ここで、少なくとも１つのアミノ酸が、システインで置換されている）。これには、野生型ヒトVIIa因子と比較して実質的に同じか又は改善された生物活性を呈している、FVIIバリアント（FVII variants）、VII因子関連ポリペプチド（Factor VII-related polypeptides）、およびVII因子誘導体が含まれる。
【００５０】
「VII因子（Factor VII）」または「FVII」の用語は、VII因子ポリペプチドの未切断（酵素前駆体）の形態、並びにタンパク質分解性にプロセスされてこれらのそれぞれの生理活性な形態に産生された、VIIa因子と称されるものを含むことが意図される。典型的には、VII因子は、残基152および153の間で切断されてVIIa因子を産出する。VII因子の係るバリアントは、ヒトVII因子と比較して、安定度、リン脂質結合、変更された比活性などを含む異なる特性を示してもよい。
【００５１】
本明細書中に使用される、「VII因子関連ポリペプチド（Factor VII-related polypeptides）」は、野生型VIIa因子の活性と比較して、還元型または短縮型（truncated）など（例えば、Glaドメインのないバリアント）の実質的に修飾されたVIIa因子生物活性を有するバリアントを含むポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドには、特定のアミノ酸配列の変更を導入して、ポリペプチドの生理活性を修飾または崩壊（disrupt）させたVII因子またはVIIa因子が限定されることなく含まれる（少なくとも１つの係る修飾は導入されたシステインである）。
【００５２】
本明細書中に使用される「VII因子誘導体（Factor VII derivative）」の用語は、野生型VII因子と比べて実質的に同じか又は改善された生物活性を呈しているFVIIポリペプチドを意味することを意図しており、ここで親ペプチドの1以上のアミノ酸は、例えば、アルキル化、グリコシル化、脱グリコシル（deglycosylation）、PEG化（PEGylation）、アシル化、エステル形成またはアミド形成などによって遺伝的および／または化学的および／または酵素的に修飾されている。これにはPEG化VIIa因子、システイン―PEG化ヒトVIIa因子及びそのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【００５３】
「PEG化VIIa因子（PEGylated Factor VIIa）」などの用語は、PEG分子を有しているVII因子ポリペプチド結合体を意味する。前記PEG分子は、VII因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基または炭水化物部分を含むVII因子ポリペプチドの任意の部分に付着しえることが理解される。「システイン―PEG化VII因子（cysteine-PEGylated Factor VII）」の用語は、VII因子ポリペプチドの非天然システインのスルフヒドリル基に結合させたPEG分子を有しているVII因子ポリペプチドを意味する。
【００５４】
VII因子誘導体の非限定的な例には、WO03/31464および米国特許出願US 20040043446, US 20040063911, US 20040142856, US 20040137557, および US 20040132640 (Neose Technologies, Inc.)に開示された糖PEG化（GlycoPegylated）FVII誘導体；WO 01/04287, 米国特許出願20030165996, WO 01/58935, WO 03/93465 (Maxygen ApS)およびWO 02/02764, 米国特許出願20030211094(ミネソタ大学)に開示されたFVII結合体が含まれる。
【００５５】
「改善された生物活性（improved biological activity）」の用語は、i)組換え型の野生型ヒトVIIa因子と比較して実質的に同じか又は増加したタンパク分解活性を有するFVIIポリペプチドを、又はii)組換え型の野生型ヒトVIIa因子と比較して実質的に同じか又は増加したTF結合活性を有するFVIIポリペプチドを、又はiii)組換え型の野生型ヒトVIIa因子と比較して実質的に同じか又は増加した血漿中の半減期を有するFVIIポリペプチドを意味する。「PEG化ヒトVIIa因子（PEGylated human Factor VIIa）」の用語は、ヒトVIIa因子ポリペプチドに結合されたPEG分子を有しているヒトVIIa因子を意味する。前記PEG分子は、VIIa因子ポリペプチドの任意のアミノ酸残基または炭水化物部分を含むVIIa因子ポリペプチドの任意の部分に付着しえることが理解される。「システイン―PEG化ヒトVIIa因子（cysteine-PEGylated human Factor VIIa）」の用語は、ヒトVIIa因子に導入されたシステインのスルフヒドリル基に結合させたPEG分子を有しているVIIa因子を意味する。
【００５６】
組換え型の野生型ヒトVIIa因子と比較して、実質的に同じ又は増加したタンパク分解活性を有しているVII因子バリアントの非限定の例には、S52A-FVIIa, S60A-FVIIa (  Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998)；米国特許第5,580,560号に開示された増加したタンパク分解の安定性を呈しているFVIIaバリアント；残基290および291の間または残基315および316の間でタンパク質分解性に切断されているVIIa因子(Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995)；VIIa因子の酸化型(Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)；PCT/DK02/00189(WO02/077218に対応する)に開示されたFVIIバリアント；およびWO02/38162（Scripps Research Institute）に開示された増加したタンパク分解の安定性を呈しているFVIIバリアント；WO99/20767, 米国特許US6017882およびUS6747003, 米国特許出願第20030100506(ミネソタ大学)およびWO00/66753, 米国特許出願第US20010018414, US 2004220106, およびUS 200131005, 米国特許US6762286およびUS6693075(ミネソタ大学)に開示された修飾型Glaドメインを有している及び増強した膜結合を呈しているFVIIバリアント；およびWO01/58935, US特許US6806063, US特許出願20030096338 (Maxygen ApS), WO03/93465 (Maxygen ApS), WO04/029091(Maxygen ApS), WO04/083361(Maxygen ApS), およびWO04/111242(Maxygen ApS), 同様にWO04/108763(Canadian Blood Services)に開示されたFVIIバリアントが含まれる。
【００５７】
野生型FVIIaと比較して増加した生物活性を有しているFVIIバリアントの限定されることのない例には、WO 01/83725, WO 02/22776, WO 02/077218, PCT/DK02/00635 (WO 03/027147に対応する), デンマーク国特許出願PA 2002 01423 (WO 04/029090に対応する), デンマーク国特許出願PA2001 01627 (WO 03/027147に対応する); WO 02/38162 (Scripps Research Institute)に開示されたFVIIバリアント；およびJP2001061479(Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示された増強活性を有するFVIIaバリアントが含まれる。
【００５８】
興味深い「操作された」VII因子ポリペプチドの具体的な例は、WO02/077218A1(Novo Nordisk A/S)およびWO 01/58935A2(Maxygen ApS)の21-24ページに開示されたものである。
【００５９】
システイン残基を導入しえるポジションの例には、タンパク分解性のデグラデーション部位の近傍（vicinity）のポジションが含まれるが、これらに限定されない。従って、本発明の興味深い態様において、導入される（好ましくは置換によって）システイン残基は、I30C, K32C, D33C, A34C, T37C, K38C, W41C, Y44C, S45C, D46C, L141C, E142C, K143C, R144C, L288C, D289C, R290C, G291C, A292C, S314C, R315C, K316C, V317C, L390C, M391C, R392C, S393C, E394C, P395C, R396C, P397C, G398C, V399C, L401C, R402C, A403C, P404C及びその組合せからなる群から選択される（特に、K32C, Y44C, K143C, R290C, R315C, K341C, R392C, R396C, R402C及びその組合せからなる群から選択される）。本発明の興味深い態様において、前記システイン残基は、次のポジションに導入される；つまり、野生型のFVIIが、表面に暴露された側鎖の少なくとも25%を有しているスレオニンまたはセリン残基によって占められるポジションに導入される。一例を挙げると、VII因子ポリペプチドにおいて、システイン残基は、S12, S23, S43, S45, S52, S53, S60, S67, T83, S103, T106, T108, S111, S119, S126, T128, T130, S147, T185, S214, S222, S232, T233, T238, T239, T255, T267, T293, T307, S320, T324, S333, S336, T370およびS393からなる群から選択される少なくとも１つのポジションに好ましくは置換によって導入される。さらに好ましくは、システイン残基は、少なくとも１つのS残基を含んでいるFVIIのポジションに導入される（前記ポジションは、S12, S23, S43, S45, S52, S53, S60, S67, S103, S111, S119, S126, S147, S214, S222, S232, S320, S333, S336 および S393からなる群から選択される）。更なる態様において、システイン残基は、次のポジションに導入される；つまり、野生型のFVIIが、表面に暴露された側鎖の少なくとも50%を有しているスレオニンまたはセリン残基によって占められるポジションに導入される。一例を挙げると、FVIIポリペプチドにおいて、システイン残基は、S23, S43, S52, S53, S60, S67, T106, T108, S111, S119, S147, S214, T238, T267 およびT293からなる群から選択される少なくとも１つのポジション（さらに好ましくはS23, S43, S52, S53, S60, S67, S111, S119, S147 およびS214からなる群から選択されるポジション）に好ましくは置換によって導入される。なお更なる態様において、システイン残基は、活性部位領域に局在しない任意の前述のポジションから選択される少なくとも１つのポジションに導入される。好ましくは、前記ポジションは、TまたはS残基で占められる。例として、VII因子ポリペプチドは、S12, S23, S43, S45, S52, S53, S60, S67, T83, S103, T106, T108, S111, S119, S126, T128, T130, S147, T185, S214, S222, T255, T267, T307, S320, S333, S336, T370 およびS393（表面に暴露されたその側鎖の25%以上を有している）からなる群から選択される少なくとも１つのポジションに導入されたシステイン残基を含む；これは、特にS12, S23, S43, S45, S52, S53, S60, S67, S103, S111, S119, S 126, S147, S214, S222, S320, S333, S336 およびS393（S残基によって占められる）からなる群から、より好ましくはS23, S43, S52, S53, S60, S67, T106, T108, S111, S119, S147, S214 およびT267（表面に暴露されたその側鎖の50%以上を有している）から、特にS23, S43, S52, S53, S60, S67, S111, S119, S147 およびS214（S残基によって占められる）からなる群から選択される。なお更なる態様において、システイン残基は、組織因子結合部位領域に局在しない任意の前述のリストから選択される少なくとも１つのポジションに導入される。好まし���は、前記ポジションは、TまたはS残基で占められる。例として、VII因子ポリペプチドは、S12, S23, S45, S52, S53, S67, T83, S103, T106, T108, S111, S119, S126, T128, T130, S147, T185, S214, S222, S232, T233, T238, T239, T255, T267, T293, S320, T324, S333, S336, T370 およびS393（表面に暴露されたその側鎖の25%以上を有している）からなる群から選択される少なくとも１つのポジションに導入されたシステイン残基を含む；これは、特にS12, S23, S45, S52, S53, S67, S103, S111, S119, S126, S147, S214, S222, S232, S320, S333, S336 およびS393（S残基によって占められる）からなる群から、より好ましくはS23, S52, S53, S67, T106, T108, S111, S119, S147, S214, T238, T267 およびT293（表面に暴露されたその側鎖の50%以上を有している）から、特にS23, S52, S53, S67, S111, S119, S147 およびS214（S残基によって占められる）からなる群から選択される。なお更なる態様において、システイン残基は、組織因子結合部位領域にも活性部位領域にも局在しない任意の前述のリストから選択される少なくとも１つのポジションに導入される。好ましくは、前記ポジションは、TまたはS残基で占められる。例として、VII因子ポリペプチドは、S12, S23, S45, S52, S53, S67, T83, S103, T106, T108, S111, S119, S126, T128, T130, S147, T185, S214, S222, T255, T267, S320, S333, S336, T370 およびS393（表面に暴露されたその側鎖の25%以上を有している）からなる群から選択される少なくとも１つのポジションに導入されたシステイン残基を含む；これは、特にS12, S23, S45, S52, S53, S67, S103, S111, S119, S126, S147, S214, S222, S320, S333, S336 およびS393（S残基によって占められる）からなる群から、より好ましくはS23, S52, S53, S67, T106, T108, S111, S119, S147, S214 およびT267（表面に暴露されたその側鎖の50%以上を有している）から、特にS23, S52, S53, S67, S111, S119, S147 およびS214（S残基によって占められる）からなる群から選択される。
【００６０】
VII因子ポリペプチドの他の有用な例には、247〜260, 393〜405または406（特にR396, Q250 またはP406, またはK157, V158, M298, L305, D334, S336, K337 またはF374）から選択されるポジションでのアミノ酸がシステインで置換されている或いはシステインが末端に導入されているものが含まれる（例えば、VIIa因子  407C）。
【００６１】
タンパク質インヒビター
１つの重要な態様において、混合物は、さらにタンパク質のインヒビターを含む。混合物中にインヒビターを含めることによって、タンパク質のコンホメーションが幾分か安定化され、それによって分子内のジスルフィド結合が酸化還元緩衝剤で還元される傾向が低いことが信じられている。好ましくは、タンパク質のインヒビターは、活性部位インヒビターである。
【００６２】
タンパク質がVII因子ポリペプチドである場合において、S1結合ポケットへと伸展する活性部位インヒビターの存在が、活性部位領域中の内部のジスルフィド結合を還元から防御するための選択的な還元反応の間に必要とされるだろう。この目的に有用なインヒビターには、ベンズアミジン（例えば、4-アミノベンザミジン）、アルギニン、および他のより強力なアナログが含まれる；例えば、WO 05/016365 A3に開示されたもの及びアベンティスによってEP1162194A1（特に、請求項1〜6に及び[0009]〜[0052]規定されたもの）に開示されたもの、およびEP1270551A1（特に、請求項1および2および[0010]〜[0032]）に開示されたものを参照されたい。
【００６３】
結合
上記の選択的な還元の１つの重要な目的は、化学基（例えば、非ポリペプチド部分）の付着(結合)に使用できるシステイン基を解放（liberate）させることである。
【００６４】
それ故、1つの重要な態様において、前記方法は、さらに少なくとも１つの選択的に還元されたシステイン(HS-Cys)部分を化学基と結合させる同時の及び／又は引き続く工程を備える。
【００６５】
少なくとも１つの選択的に還元されたシステイン部分と化学基との結合を、同時（即ち、酸化還元緩衝剤を含んでいる混合物への結合を導く1以上の試薬の付加によって）に或いは選択的に還元されたタンパク質の精製および／または単離の後などに行われる引き続く工程で行いえることを理解すべきである。
【００６６】
一態様において、前記化学基は遅延基（protractor group）である；つまり、該基は、タンパク質(例えば、VII因子ポリペプチド)への結合に際し、該タンパク質またはポリペプチドの循環半減期（circulation half-life）を非修飾型のタンパク質またはポリペプチドと比較して増加させるものである。遅延効果の背景に存在する固有の原理（specific principle）は、サイズの増加、ペプチダーゼまたは抗体によって認識されえるペプチド配列の遮蔽、または肝臓またはマクロファージなどに存在しているグリカン特異的レセプターによって認識されない様式でのグリカンのマスキング、クリアランスの防止または減少によって生じるものであってもよい。遅延基の遅延効果は、血液成分（例えば、アルブミン）への結合または脈管組織（vascular tissue）への非特異的な付着などによっても生じえる。結合された糖タンパク質は、その生物活性が実質的に保存されるべきである。
【００６７】
本発明の一態様において、遅延基は、以下のものからなる群から選択される：
(a)  1以上のカルボン酸、アミンスルホン酸（amines sulfonic acids）、ホスホン酸、又はその組み合わせを含みえる低分子の有機の荷電したラジカル(15〜1,000 Da)
(b)  低分子(15〜1,000 Da)の中性で親水性の分子；例えば、シクロデキストリン、またはポリエチレン鎖（任意に分枝状であってもよい）
(c)  低分子(15〜1,000 Da)の疎水性の分子；例えば、脂肪酸又はコール酸又はその誘導体
(d)  2,000〜60,000 Daの平均分子量を有しているポリエチレングリコール
(e)  明確な規定の精密ポリマー（well defined precision polymer）；例えば、700〜20,000 Da、または好ましくは700〜10,000 Daの間の分子量を有しているデンドリマー
(f)  実質的に非免疫原性のポリペプチド；例えば、アルブミンまたは抗体または抗体の一部（任意でFcドメインを含んでいる）
(g)  高分子量の有機のポリマー；例えば、デキストラン。
【００６８】
本発明の別の態様において、遅延基は、デンドリマー、ポリアルキレン酸化物(PAO)、ポリアルキレングリコール(PAG)、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)およびポリプロピレングリコール(PPG)、分枝状のPEGs、ポリビニルアルコール(PVA)、ポリカルボキシレート、ポリビニルピロリドン（poly-vinylpyrolidone）、ポリエチレン-コマレイン酸無水物（polyethylene-co-maleic acid anhydride）、ポリスチレン-コマレイン酸無水物（polystyrene-co-maleic acid anhydride）、およびデキストラン、カルボキシメチル-デキストランからなる群から選択される。本発明の１つの重要な態様において、遅延基は、PEG基である。
【００６９】
「分枝状ポリマー（branched polymer）」、または「樹状ポリマー（dendritic polymer）」、「デンドリマー（dendrimer）」または「樹状構造（dendritic structure）」の用語は、幾つかのものが分枝を含んでいるモノマー構成要素（monomer building blocks）の選択物から組立てられる有機ポリマー（organic polymer）を意味する。
【００７０】
本発明の一態様において、遅延基は、血清タンパク質結合リガンド（serum protein binding-ligands）からなる群から選択され、例えば、脂肪酸、C5〜C24脂肪酸、脂肪族の二酸(例えば、C5〜C24)のようなアルブミンに結合する化合物である。遅延基の他の例には、生理学的条件下で電荷特性を変化させる部分を含んでいる小さい有機分子が含まれ、例えば、カルボン酸またはアミン、またはグリカン特異的な認識を阻止する中性の置換基〔例えば、小さいアルキル置換基(例えば、C1〜C5アルキル)〕である。本発明の一態様において、遅延基は、アルブミンである。
【００７１】
一態様において、化学基は、非ポリペプチド（non-polypeptide）である。
【００７２】
１つの重要な態様において、化学基は、ポリエチレングリコール(PEG)であり、特に500〜100,000（例えば、1,000〜75,000, または2,000〜60,000）の範囲の平均分子量を有しているものである。
【００７３】
結合（Conjugation）は、WO02/077218A1およびWO01/58935A2に開示されたとおり行うことができる。
【００７４】
特に重要なものは、PEGを化学基としてタンパク質との結合に使用することである。「ポリエチレングリコール」または「PEG」の用語は、カップリング剤（coupling agents）、カップリングする若しくは活性化する部分〔例えば、チオール、トリフレート、トレシレート（tresylate）、アジルジン（azirdine）、オキシラン、ピリジルジチオ（pyridyldithio）、ビニルスルホン（vinysulfone）、ハロアセタート（haloacetate）、または好ましくはマレイミド部分〕を有する又は有さないポリエチレングリコール化合物又はその誘導体を意味する。マレイミドモノメトキシPEG（maleimido monomethoxy PEG）などの化合物は、本発明の活性化PEG化合物の例示である。
【００７５】
PEGは、適切なポリマー分子である。というのも、ポリサッカライド（例えば、デキストラン）と比較して、架橋する能力のある反応基を少数有するからである。特に、単官能基のPEG〔例えば、メトキシポリエチレングリコール(mPEG)〕が、重要である。というのも、カップリング化学が相対的に単純だからである（僅か１つのに反応基が、ポリペプチドの付着基との結合に利用可能である）。結果的に、架橋の危険性が排除され、ポリペプチド結合体がより均質で、ポリマー分子とポリペプチドとの反応がコントロールしやすくなる。
【００７６】
ポリマー分子とポリペプチドとの共有結合性の付着を行うために、ポリマー分子のヒドロキシル末端基（hydroxyl end groups）が活性型（反応性の官能基を伴う）で提供される。適切な活性化されたポリマー分子は、商業的に利用可能である（例えば、Shearwater Corp., Huntsville, Ala., USA, or from PolyMASC Pharmaceuticals plc, UKから）。或いは、ポリマー分子は、当該技術分野において既知の従来の方法によって活性化することができる（例えば、WO90/13540に開示されたもの）。本発明に使用するための活性化された直鎖状または分枝状のポリマー分子の具体的な例は、Shearwater Corp.の1997および2000のカタログ(研究および薬物に使用される機能化された生体適合性のポリマー、ポリエチレングリコールおよび誘導体、本明細書中に参照によって援用される)に記載されている。活性化されたPEGポリマーの具体的な例には、次の直鎖状PEGs、即ち：NHS-PEG(例えば、SPA-PEG, SSPA-PEG, SBA-PEG, SS-PEG, SSA-PEG, SC-PEG, SG-PEG, およびSCM-PEG), およびNOR-PEG), BTC-PEG, EPOX-PEG, NCO-PEG, NPC-PEG, CDI-PEG, ALD-PEG, TRES-PEG, VS-PEG, IODO-PEG, およびMAL-PEG, および分枝状のPEGs（例えば、PEG2-NHSおよび米国特許第5,932,462および米国特許第5,643,575号に開示されたもの、両方の文献は本明細書中に参照によって援用される）が含まれる。さらに、米国特許第. 5,824,778, 米国特許第5,476,653, WO 97/32607, EP 229,108, EP 402,378, 米国特許第4,902,502号, 米国特許第5,281,698号, 米国特許第5,122,614号, 米国特許第5,219,564号, WO 92/16555, WO 94/04193, WO 94/14758, WO 94/17039, WO 94/18247, WO 94/28024, WO 95/00162, WO 95/11924, WO 95/13090, WO 95/33490, WO 96/00080, WO 97/18832, WO 98/41562, WO 98/48837, WO 99/32134, WO 99/32139, WO 99/32140, WO 96/40791, WO 98/32466, WO 95/06058, EP 439 508, WO 97/03106, WO 96/21469, WO 95/13312, EP 921 131, 米国特許第5,736,625号, WO 98/05363, EP 809 996, 米国特許第5,629,384号, WO 96/41813, WO 96/07670, 米国特許第5,473,034号, 米国特許第5,516,673号, EP 605 963, 米国特許第5,382,657号, EP 510 356, EP 400 472, EP 183 503 および EP 154 316（本明細書中に参照によって援用される）は、有用なポリマー分子および／またはPEG化の化学を開示している。
【００７７】
ポリペプチドおよび活性化されたポリマー分子の結合は、従来の方法を使用することによって実施される；例えば、文献〔R. F. Taylor, (1991), "Protein immobilisation. Fundamental and applications", Marcel Dekker, N.Y.; S. S. Wong, (1992), "Chemistry of Protein Conjugation and Crosslinking", CRC Press, Boca Raton; G. T. Hermanson et al., (1993), "Immobilized Affinity Ligand Techniques", Academic Press, N.Y.〕（これらの文献はポリマー分子の活性化に適切な方法をも記載する）に記載のとおり実施される。当業者は、次の事項に気づくだろう；その事項とは、使用される活性化法および／または結合化学は、ポリペプチドの付着基（この例は、上記の記載でさらに記載されている）に及びポリマーの官能基〔例えば、アミン, ヒドロキシル, カルボキシル, アルデヒド, スルフィドリル（sulfydryl）, スクシンイミジル, マレイミド, ビニルスルホンまたはハロアセタート〕に依存することである。PEG化を、ポリペプチドにおける全ての利用可能な付着基（即ち、ポリペプチドの表面に暴露される付着基）への結合に実施してもよい、或いは1以上の特定の付着基〔例えば、Ｎ末端アミノ基(米国特許第5,985,265)〕への結合に実施してもよい。さらにまた、結合を、一段階または段階的な様式で樹立してもよい（例えば、WO99/55377に記載のとおり）。
【００７８】
付着したPEG分子の数、係る分子のサイズおよび形態（例えば、直鎖状または分枝状であるかどうか）、および係る分子が付着したポリペプチド中の場所に関して至適な分子を産生するために、PEG化が設計される。使用されるポリマーの分子量は、達成すべき所望の効果を考慮して選択される。一例を挙げると、結合の主な目的が高分子量および大きいサイズを有している結合体を達成するためである場合（例えば、腎クリアランスを減少させるため）、所望の効果を得るために１若しくは数個の高分子量ポリマー分子又はより少ない分子量を有している多数（a number of）のポリマー分子数を選択しえる。
【００７９】
さらに、少なくとも本発明の結合体の主要な部分の見かけ上のサイズ(「見かけ上の分子量（apparent molecular weight）」または「見かけ上の質量（apparent mass）」とも称される)が、少なくとも約50 kDa、例えば、少なくとも約55 kDa、例えば、少なくとも約60 kDa、例えば、少なくとも約66 kDaである場合に、有利な結果を得られることが発見された。この事項は次の事実に起因することが信じられている；その事実とは、腎クリアランスが、十分に大きい見かけ上のサイズを有している結合体に関して実質的に排除されることである。この関連において、タンパク質結合体またはVII因子ポリペプチドの「見かけ上のサイズ」は、SDS-PAGE法によって決定される。
【００８０】
さらにまた、過剰なポリマー結合によって、化学基(例えば、非ポリペプチド部分)が結合されたタンパク質（例えば、VII因子ポリペプチド）の活性の損失を誘導できることが報告されている（さらに以下の記載を参照されたい）。この問題は、例えば、機能的な部位に配置された付着基の除去によって又は結合前に機能的な部位を可逆的にブロックすること（従って、タンパク質の機能的な部位が、結合の間にブロックされる）によって排除することができる。具体的には、タンパク質および化学基(例えば、非ポリペプチド部分)の間の結合は、前記タンパク質の機能的な部位がヘルパー分子（例えば、前記タンパク質の機能的な部位に結合する能力のある組織因子またはセリンプロテアーゼインヒビター）によってブロックされる条件下で実施しえる。好ましくは、ヘルパー分子は、タンパク質の機能的な部位を特異的に認識するもの（例えば、レセプター）である、特に組織因子であって、組織因子の全長もしくは適切には切断型である組織因子または１つは組織因子であり他が結合するペプチドまたはペプチドインヒビターである２分子の組織因子であり、それゆえ触媒トライアッド（catalytic triad）の周囲の領域（好ましくは、触媒トライアッド中の任意の原子の10Å内のアミノ酸残基と規定される）が防御されるものである。
【００８１】
或いは、ヘルパー分子は、抗体であってもよく、特にタンパク質(例えば、VII因子ポリペプチド)を認識するモノクローナル抗体であってもよい。特に、ヘルパー分子は、中和モノクローナル抗体（neutralizing monoclonal antibody）であってもよい。
【００８２】
前記タンパク質は、好ましくは結合する前に、ヘルパー分子と相互作用する。〔しばしば、同じヘルパー分子(例えば、インヒビター)を、混合ジスルフィドが還元される工程に使用することが有利である〕。これによって、次の事項が保証される；その事項とは、タンパク質(例えば、VII因子ポリペプチド)の機能的な部位が遮蔽され又は防御され、結果的に化学基(例えば、非ポリペプチド部分)でのポリマーなどとしての誘導体化が無効（unavailable）であることである。
【００８３】
ヘルパー分子からの溶出に続いて、化学基およびタンパク質の結合体を、少なくとも部分的に保存された機能的な部位で回収することができる。
【００８４】
好適な態様
本発明の好適な態様において、本発明は、ジスルフィド架橋で低分子量チオール（RS-Cys）に結合された1以上のシステイン部分を含んでいる活性コンホメーションのVII因子ポリペプチドを選択的に還元させるための方法に関する；該部分は、該VII因子ポリペプチドがその活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していなく；該方法は、低分子量チオール結合型FVIIポリペプチドと還元型および酸化型のグルタチオンおよびグルタレドキシンを含んでいる混合物とを反応させる工程と、同時および／または引き続き少なくとも１つの選択的に還元されたシステイン(HS-Cys)部分を化学基と結合する工程とを備える（各工程は非変性条件下）。
【００８５】
別の好適な態様において、本発明は、ジスルフィド架橋で低分子量チオール（RS-Cys）に結合された1以上のシステイン部分を含んでいる活性コンホメーションのVII因子ポリペプチドを選択的に還元させるための方法に関する；該部分は、該VII因子ポリペプチドがその活性形態で存在する場合に、分子内のS-Sブリッジ(Cys-S-S-Cys)に関与していなく；該方法は、低分子量チオール結合型VII因子ポリペプチドとトリアリールホスフィン-3,3',3''-トリスルホン酸化合物および活性部位インヒビターS1ポケットインヒビターを含んでいる混合物とを反応させる工程と、同時に及び／又は引き続いて少なくとも１つの選択的に還元されたシステイン(HS-Cys)部分を化学基と結合する工程とを備える（各工程は非変性条件下）。
【００８６】
実験
材料および方法
材料：  DL-ジチオスレイトール(DTT)を、Sigmaから購入した。還元型の及び酸化型のグルタチオン(それぞれGSHおよびGSSG), システイン (Cys), DL-ホモシステイン(hCy), システイニルグリシン(CG), およびγ-グルタミルシステイン(γ-GC)を、Sigmaから購入した。システアミン(Cya)および7-フルオロベンゾフラザン-4-スルホン酸アンモニウム塩(SBD-f)を、Flukaから購入した。トリス(2-カルボキシルエチル)ホスフィン(TCEP)を、Calbiochem(Merck KGaA, Darmstadt, Germany)から購入した。ヨードアセトアミドを、Sigmaから購入した。色素生産性S-2288基質を、Chromogenix (Milano, イタリア)から購入した。PEG5k-マレイミド(2E2M0H01), PEG20k-マレイミド(2E2M0P01), PEG40k-マレイミド(2D3Y0T01), およびマレイミド-PEG3.4k-マレイミド(2E2E0F02)を、Nektar Therapeutics(Huntsville, AL)から購入した。d-Phe-Phe-Arg-クロロメチルケトンを、Bachemから購入した。トリフェニルホスフィン-3,3',3'' トリスルホン酸を、Aldrichから購入した。ヒト血漿由来のFXおよびFXaを、Enzyme Research Laboratories Inc.(South Bend, IN)から購入した。可溶性の組織因子1-219(sTF)を、公開された処置（Freskgard et al., 1996）にしたがって調製した。組換え型のFVIIaの発現および精製を、以前の記載（Thim など, 1988; Persson および Nielsen, 1996）のとおり実施した。全ての他の化学物質は、分析用グレード以上のものを使用した。
【００８７】
濃度決定：  保存液中のGSSGの濃度を、381 M-1cm-1の吸光係数（extinction coefficient）を用いて248nmの吸光から決定した。GSH, DTT, および他の低分子量チオールの濃度を、Ellman’s試薬（5,5’-ジチオビス(2-ニトロ安息香酸)）および412nmでの2-ニトロ-5-チオ安息香酸の分子吸光係数として14150 M-1cm-1を用いて決定した。
【００８８】
HPLCによるGSSGの決定を、基本的に他の記載（TakahashiおよびCreighton, 1996）のとおり実施した。要約すると、50 μlの酸で停止させたサンプルを、30゜Cに維持されたC18逆相カラム(Luna C18(2) 100 Å, 3μm粒径, 4.6x50mm; Phenomenex Inc., Torrance, CA)に負荷した。5 minで100%溶出剤A(0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸(TFA)の水溶液)を定組成（isocratic）で行なった後に、GSSGを、0-5%の溶出剤B(0.085%(v/v)TFAをアセトニトリル中に含有するもの)でのリニアグラジエントを5minで流速1ml/minで行い溶出し、214nmでの吸光で検出した。GSSGの濃度を、算出されたピーク領域(Millenium32 v4.0 ソフトウェア, ウォーターズ)を既知量のGSSGで作成した標準曲線と比較することによって決定した。直線性は、2-25nmolのGSSGの範囲で観察された。
【００８９】
チオール修飾型のFVIIa 407CのHPLCでの分析：  自由な及びチオール修飾型のFVIIa 407C種を、45゜Cに維持されたC3逆相カラム(Zorbax 300SB-C3, 2.1x150mm, 5-μm粒径; Agilent Technologies, Denmark)を用いるHPLCで分析した。流速は、0.5 ml/minであった。また、移動相は、0.1%(v/v)のTFA水溶液(溶出剤A)および0.085%(v/v)のTFAアセトニトリル溶液(溶出剤B)からなるものであった。25μlの酸で停止したサンプルを注入した後に、系を定組成の30%溶出剤Bで5min、38-41.5%溶出剤Bを20minおよび41.5-55%溶出剤Bを20minのリニアグラジエントで処理した。溶出液を、蛍光(それぞれ280および348nmの励起および発光波長)でモニターした。
【００９０】
［例］
FVIIaは不安定な分子内ジスルフィド結合を含有する（DTTの存在下でインキュベーションすることによって証明された）：  FVIIa中に不安定な分子内ジスルフィド結合が存在することが、0, 0.5, 1, または5mMのジスルフィド還元剤DTTの存在下でインキュベーション後に触媒活性が損失することから決定された。反応を、300μMのFVIIa, およびDTTを含有している反応緩衝剤(50mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.01%Tween80, pH7.0)中で室温で実施した。時間を合わせたインターバルで（At timed intervals）、20μlの反応物を、10mMのヨードアセトアミドを含有している160μlの反応緩衝液に移して、自由チオールを急速にアルキル化し、反応を停止させた。引き続いて、残留しているアミド溶解活性を、ポリスチレンマイクロタイタープレート(Nunc, Denmark)中で、20μlのS-2288色素生産性基質を終濃度1mMで添加し、SpectraMaxTM 340 ミクロプレート分光光度計にSOFTmax PROソフトウェア(v2.2; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)を備えた装置において、吸光度を405nmで連続的に10minモニターすることによって測定した。アミド溶解活性は、ゼロ時間（time zero）でＤＴＴが存在しない傾きと比較して、リニアプログレス曲線（linear progress curves）の傾きとして報告された。表3を参照されたい。
【表１】
2008546670.tif 000004
【００９１】
FVII 407C変異体をコード化しているDNA構築物：  FVIIa 407Cをコード化しているDNA構築物を、WO02/077218A1に記載のとおり構築した。
【００９２】
FVII Q250C変異体をコード化しているDNA構築物：  FVIIa Q250Cをコード化しているDNA構築物を、WO02/077218A1に記載のとおり構築した。
【００９３】
FVII R396C変異体をコード化しているDNA構築物：  FVIIa R396Cをコード化しているDNA構築物を、WO02/077218A1に記載のとおり構築した。
【００９４】
FVII 407Cの発現および精製：  BHK細胞を、基本的に以前の記載（Thim et al., 1988; Persson and Nielsen, 1996）のとおりにトランスフェクションして、FVIIa 407Cバリアントの発現を得た。前記VII因子ポリペプチドを、以下の通り精製した:
条件培地（Conditioned medium）を、25mlカラムのＱセファロース・ファースト・フロー(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に、5ｍＭ ＥＤＴＡ、0.1%トリトンX-100、および10ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨの調製を8.0および伝導率の調整を水を添加することにより10〜11mS/cmにしたものを添加した後に、ロードした。前記タンパク質の溶出は、10mM Ｔｒｉｓ、50mM塩化ナトリウム、0.1% トリトンX-100、ｐＨ8.0から10mM Ｔｒｉｓ、50mM塩化ナトリウム、25mM CaCl2、0.1%トリトンX-100、pH7.5へのグラジエントで達成された。FVIIa 407Cを含有している分画を、プールし、そしてモノクローナル抗体  F1A2(Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark)をＣＮＢｒ-活性化セファロース4B(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に連結したものを含んでいる25-ｍｌカラムに適用した。前記カラムを、50mM HEPES、ｐＨ7.5（10mM CaCl2、100mM塩化ナトリウム、および0.02%トリトンX-100を含んでいる）で平衡化した。平衡化緩衝液および2M NaClを含有している平衡化緩衝液で洗浄した後、結合した物質は、CaCl2の代わりに10mM EDTAを含有している平衡化緩衝液で溶出された。貯蔵の前に、FVIIa 407Cを50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 緩衝剤へと透析で移行させた。各工程の収率をVII因子のELISA測定に続いて測定し、精製タンパク質をSDS-PAGEで分析した。
【００９５】
FVII Q250Cの発現および精製：  BHK細胞を、基本的に以前の記載（Thim et al., 1988; Persson and Nielsen, 1996）のとおりにトランスフェクションして、FVIIa Q250Cバリアントの発現を得た。前記VII因子ポリペプチドを、以下の通り精製した:
条件培地（Conditioned medium）を、25mlカラムのＱセファロース・ファースト・フロー(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に、5ｍＭ ＥＤＴＡ、0.1%トリトンX-100、および10ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨの調製を8.0および伝導率の調整を水を添加することにより10〜11mS/cmにしたものを添加した後に、ロードした。前記タンパク質の溶出は、10mM Ｔｒｉｓ、50mM塩化ナトリウム、0.1% トリトンX-100、ｐＨ8.0から10mM Ｔｒｉｓ、50mM塩化ナトリウム、25mM CaCl2、0.1%トリトンX-100、pH7.5へのグラジエントで達成された。FVIIa 407Cを含有している分画を、プールし、そしてモノクローナル抗体  F1A2(Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark)をＣＮＢｒ-活性化セファロース4B(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に連結したものを含んでいる25-ｍｌカラムに適用した。前記カラムを、50mM HEPES、ｐＨ7.5（10mM CaCl2、100mM塩化ナトリウム、および0.02%トリトンX-100を含んでいる）で平衡化した。平衡化緩衝液および2M NaClを含有している平衡化緩衝液で洗浄した後、結合した物質は、CaCl2の代わりに10mM EDTAを含有している平衡化緩衝液で溶出された。貯蔵の前に、FVIIa Q250Cを50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0 緩衝剤へと透析で移行させた。各工程の収率をVII因子のELISA測定に続いて測定し、精製タンパク質をSDS-PAGEで分析した。
【００９６】
FVII R396Cの発現および精製：  FVIIa R396Cの発現および精製を、WO02/077218A1に記載のとおり実施した。
【００９７】
グルタレドキシンのクローニングおよび発現：  大腸菌（Escherichia coli）グルタレドキシン2(Grx2)および酵母（Saccharomyces cerevisiae）グルタレドキシン1(yGrx1p)を、それぞれ製造者の推奨にしたがってExpand High Fidelity PCR(Roche Diagnostics Corporation, Indianapolis, IN)、プライマーペア  oHOJ98-f/oHOJ98-rおよびoHOJ11-f/oHOJ11-rを用いるPCRによって増幅し、隣接するNdeIおよびXhoI制限部位が導入された(プライマー配列は、表1にリストされる)。
【表２】
2008546670.tif 000005
【００９８】
PCR反応のためのゲノムの鋳型DNAを、公開された処置（Grimberg et al., 1989; Hoffman and Winston, 1987）にしたがって大腸菌および酵母から調製した。精製されたPCR産物をNdeIおよびXhoIで切断し、pET-24a(+) (Novagen)の対応している部位に連結し、それぞれpHOJ294およびpHOJ210を作出した。停止コドンはベクターによって提供され、２つの遺伝子にはＣ末端のLEHHHHHH親和性タグをコード化している３’ベクター由来の拡張が付与された。yGrx1p Cys30→Ser(yGrx1p C30S)をコード化しているプラスミドpHOJ286を、製造者の説明書（Stratagene, La Jolla, CA）にしたがって、プライマーoHOJ88-f/oHOJ88-rおよびpHOJ210を鋳型として用いてQuickChange（登録商標）部位特異的突然変異誘発で構築した。全てのクローン化された配列の正しい身元（identity）を、DNAシークエンシングで確認した。
【００９９】
発現に関して、pHOJ210, 286, および294プラスミドを、化学的にコンピテントとしたBL21(DE3)細胞(ストラタジーン, La Jolla, CA)に導入した。新鮮な一晩培養した形質転換体（Fresh overnight transformants）を、500mlのテリフィックブロス((Sambrook など, 1989))および30μg/mlのカナマイシンに、0.02の開始OD600まで播種した。培養物を、37゜Cでバッフルフラスコ（baffled flask）で230rpmで中間対数期(OD600 3-4)まで成長させた〔この時間に温度を25゜Cに低下させ、タンパク質発現を0.1mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド(ITPG)で誘導した〕。一晩の発現後に、細胞を、遠心分離で収穫し、50mlの溶解緩衝液(50mM リン酸カリウム, 300mM NaCl, pH8.0)に再懸濁し、3回の凍結融解サイクルで溶解した。透明化ライセート（cleared lysate）を、溶解緩衝剤を流速5ml/minで平衡化した20mlのNi-NTA Superflow(Qiagen GmbH, Hilden, ドイツ)カラムに負荷した。溶解緩衝剤で洗浄した後に、結合したタンパク質を、溶出緩衝液中に溶解させた0-200mMのイミダゾールのリニアグラジエントで溶出した。ピークフラクションを、プールし、20mMのジチオスレイトールで20minで処理し、50 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA, pH 8.0に対して透析した。タンパク質は、-80゜Cで貯蔵され、SDS-PAGEで>90%純粋であると判定された。5240M-1cm-1(yGrx1pおよびyGrx1p  C30S)および21740M-1cm-1(Grx2)のモル吸光係数を用い、280nmの吸光度で濃度を測定した。
【０１００】
FVIIa 407Cとの混合ジスルフィドに導入している低分子量チオールの同定：  蛍光 SBD-誘導化低分子量チオール（fluorescent SBD-derivatized low-molecular weight thiols）のHPLC検出を、Oe等(1998)を若干修正した方法で実施した。要約すると、ジスルフィド還元および引き続く解放されたチオールの誘導体化を、25μlの10μMのFVIIa 407C(または野生型FVIIa)を160mM Tris-HCl, 8mM EDTA, pH9.6の緩衝剤中に含むものと、5μlの14mM TCEP（水溶液）および10μlの0.3% SBD-f（水溶液）とを60゜Cで60minインキュベートすることによって行った。引き続いて、誘導体化（derivatization）を2μlの5M HClの添加で停止し、サンプルを更に分析するまで4゜Cで静置した（24hr以内）。HPLC分析を、サンプルの25μlのアリコット（aliquots）を逆相C18(2)カラム(Luna, 100Å, 3.5μm粒径, 150ｘ4.6mm; Phenomenex Inc., Torrance, CA)に注入して、流速1ml/minで行った。カラム温度を、30゜Cに維持した。SBD-誘導化チオールを、75mM Naクエン酸塩, pH2.90および2%メタノールからなる移動相を用いた定組成溶出（isocratic elution）で分離し、386nmでの励起で516nmで放射された蛍光によって検出した。ピークの同定は、保持時間を、FVIIa 407Cに関して上記で記載された処置にしたがって調製された一連の既知の低分子量チオール化合物のものと比較することで行った。GSH, γ-GC, GC, Cys, Hcy, およびCyaを定量するためのキャリブレーション曲線を、各チオールの濃度を0.4〜3.5μMに最終的な反応混合物において変化させることによって得た。
【０１０１】
この分析から、次の事項を結論付けることができる；その事項とは、FVIIa 407Cに結合された主要な低分子量チオールが、グルタチオン, システイン, およびホモシステインであるとのことである。結果を図1に示す。
【０１０２】
FVIIaの酸化還元滴定：  FVIIa Cys突然変異体の選択的な還元に適切な条件を同定するために、FVIIaの構造上の安定性を、基本的に(Loferer et al., 1995)に記載のとおりにGSHおよびGSSGの濃度を変化させることによって得られる規定の酸化還元電位を有している緩衝液中で評価した。FVIIaにおける最も不安定なジスルフィド結合の還元がアミド溶解活性およびsTF 結合の欠損と関連していることが示されたので（Higashi等, 1997）、FVIIaの構造上の統合性を色素生産性基質S-2288をsTFの存在下で加水分解する能力によってモニターした。
【０１０３】
FVIIa(1μM)の酸化還元滴定を、50μMのGSSGおよび様々な濃度のGSH(0〜34mM)を含んでいる50mM HEPES, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, pH7.0の緩衝液(徹底的に窒素でパージする)中で行った。加えて、一連のサンプルは、25mMのp-アミノベンザミジン（S1ポケットを占有するFVIIaの活性部位インヒビター）を含有していた（Sichler 等, 2002; Persson 等, 2004）。平衡に達するまでに必要とされる時間を減らすために、反応を酸化還元触媒として作用する1μMのyGrx1pの存在下で行った（Ostergaard 等, 2004）。窒素大気下で3.5時間30゜Cでサンプルを平衡化した後、残留するアミド溶解活性を以下に記載のとおり決定した。同じ時間に、反応混合物のアリコートを、等容量の100mM HClで停止した。GSSGの平衡濃度を、材料および方法に記載のとおりHPLCで決定した。
【０１０４】
残留するアミド溶解活性を測定するために、20μlの平衡化されたサンプルを、10 mM ヨードアセトアミドを含んでいる緩衝液(50mM HEPES, 100mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.01% Tween80, pH 7.4)で20倍希釈して、自由チオールを急速にアルキル化し、引き続くチオール酸化を阻止した。活性アッセイを、ポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc, Denmark）で、最終容量200μlの80nM sTFを含んでいる緩衝液中で行い、サンプルを停止して終濃度10nM FVIIaとした。15minのプレインキュベーションを室温で行った後に、1mMの色素生産性基質S-2288を添加し、吸光度をSpectraMaxTM 340ミクロプレート分光光度計にSOFTmax PROソフトウェア(v2.2; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)を備えた装置において、405nmで連続的に20minモニターすることによって測定した。アミド溶解活性を、ブランクの値を減算した後にリニアプログレス曲線（linear progress curves）の傾きとして報告した。
【０１０５】
データを、次の反応(Eq.1)で分析した。この反応でFVIIaは、不活性のFVIIa（FVIIaiと称される）へと単一の分子内ジスルフィド結合の可逆的な還元によって転換される：
Eq.1          FVIIa + 2GSH  ⇔  FVIIai + GSSG
逆反応(Kox)の見かけ上の平衡定数を、次の類縁関係(Eq.2)から推測できる：
Eq.2          f=amax/(1+[GSH]2/([GSSG] Kox)) 
式中のfは所与の[GSH]2/[GSSG]での残留アミド溶解活性（residual amidolytic activity）であり、amaxは低い[GSH]2/[GSSG]での限定アミド溶解活性（limiting amidolytic activity）である。
【０１０６】
酸化還元滴定のデータをEq.2とKaleidagraphソフトウェア(v3.6, Synergy software)を用いた非線形最小二乗回帰分析（non-linear least squares regression）でフィッティングして、それぞれ25mM p-アミノベンザミジンの非存在下または存在下で93±6mMおよび166±16mMの見かけ上の Kox’sを得た（図2）。
【０１０７】
FVIIa 407C-グルタチオン混合ジスルフィドの酸化還元滴定：  グルタチオンおよびCys407の間の混合ジスルフィドの安定性を、13μMのFVIIa 407Cを0.5mM GSHおよび様々な濃度のGSSG(5〜500μM)を含有している50mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM CaCl2, pH7.0中でインキュベーションすることによって測定した。加えて、全サンプルには、反応を触媒する10μM Grx2を含有させた。5時間の平衡化を30゜Cで行った後に、50μlのアリコートを、100mM HClで停止した。GSSGの平衡濃度を、材料および方法に記載のとおりHPLCで決定した。脱グルタチオニルされたFVIIa 407Cの相対量を測定するために、20μlの各サンプルを15μlの1.6mM PEG5kマレイミドと混合することによって自由チオールをPEG5kで標識した。18minのインキュベーションを室温で行い、N-エチルマレイミドを終濃度25mMで添加して、引き続く処理の間のタンパク質のさらなる（非特異的な）PEG化を競合的に抑制した。各サンプルにおけるPEG5k-修飾型FVIIa 407Cを、材料および方法に記載のとおりHPLCで検出および定量した。
【０１０８】
データを、次の反応(Eq.3)により分析した。この反応でグルタチオニル化されたFVIIa 407C(FVIIa 407C-GSH)は、GSHと反応して、自由なFVIIa 407CおよびGSSGを生じる：
Eq.3          FVIIa 407C-GSH+GSH  ⇔  FVIIa 407C+GSSG
逆反応の見かけ上の平衡定数（Kscoxと称される）を、次の類縁関係(Eq.4)から推測できる：
Eq.4          A407C-PEG5k =Amax([GSH]/[GSSG])/([GSH]/[GSSG]+Kscox)
式中のA407C-PEG5kは所与の[GSH]/[GSSG]比での5k-PEG化FVIIa 407Cのピーク領域であり、Amaxは高い[GSH]/[GSSG]での限定ピーク領域（limiting peak area）である。
【０１０９】
測定されたピーク領域  対  [GSH]/[GSSG]比（平衡状態）のプロットを、図3に示す。Eq.4をデータとKaleidagraphソフトウェア(v3.6, Synergy software)を用いた非線形最小二乗回帰分析でフィッティングして、見かけ上のKscox  1.0を得た〔この値は同類の他のグルタチオニル化されたタンパク質（a range of other glutathionylated proteins）に関して測定されたものと非常に類似している（Gilbert, 1995）〕。
【０１１０】
至適な還元条件（FVIIa 407Cの選択的な還元を支持している至適なグルタチオン酸化還元条件）の同定：  混合ジスルフィドを、以下のパラメータを[GSSG]との関数としたプロットから同定した：(1)Eq.2および推定Kox値を用いたp-アミノベンザミジンの存在下または非存在下での残留アミド溶解活性、および(2)Eq.4およびKscoxからの選択的に還元されたタンパク質の分数（fraction）。実際上の理由から、GSHの濃度を、0.5 mMにセットした。図4に示されるとおり、0.5mM GSHの存在下で大まかに15および60μMの間のGSSGの濃度では、>90%の残効性（residual activity）および>90%の自由なCys407を生じる。[GSSG]の至適な常用範囲は幾つかのパラメータに依存し、これにはGSHの濃度（図3〜5に例示される）、KoxおよびKscoxの値（示さず）、および還元反応の間のアミド溶解活性の許容される損失が含まれる。
【０１１１】
FVIIa 407Cの選択的な還元およびPEG5k, PEG20k, およびPEG40k修飾：  FVIIa 407Cのチオール修飾は、３つの連続的な工程に分けることができる、つまり：(A)グルタレドキシン触媒性の還元反応, (B)チオール特異的なアルキル化, および(C)精製である。各工程の終わりに、反応混合物の小さいアリコートを、10%(v/v)ギ酸で停止し、材料および方法における記載および図7での例示のとおりHPLCで分析した。
【０１１２】
(A)  FVIIa 407C(4.8mg)を、0.5mM GSH, 15μM GSSG, 25mM p-アミノベンザミジン, および10μM Grx2を含んでいる総容積が4.4mlで50mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM CaCl2, pH7.0の緩衝液中で、4.5時間30゜Cでインキュベーションした。GSSGの初濃度は、反応の間のGSSGの形成を補償するために至適な常用範囲の下端値（lower end）であった（図4において網掛けの領域）。(B)  引き続いて、自由チオールを、PEG5k-マレイミド, PEG20k-マレイミド, またはPEG40k-マレイミド(水に溶解)を終濃度0.8mMで添加することによって修飾した。チオールアルキル化を認容し、0.5mMシステインでの停止に際して、15min室温で進めた。(C)  EDTAをカルシウム過剰(20mM終濃度)に添加し、全内容物を緩衝剤A(50mM HEPES, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH7.0)で平衡化された1mlのHiTrapQ  FFカラム(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に負荷し、FVIIa 407Cを捕獲した。緩衝剤Aで洗浄後に、結合したタンパク質の一段階の溶出を、前記HiTrapカラムの前に設置されたHiLoad Superdex200 16/60pgカラム（Amersham Biosciences）に直接的に緩衝剤B(10mM GlyGly, 150mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.01%Tween80, pH7.0)を適用して行った。PEG化および非PEG化の種を、流速1ml/minで分離し、280nmでの吸光で検出した。
【０１１３】
FVIIa 407Cの選択的な還元およびPEG3.4-架橋：  (A)FVIIa 407C(4.8mg)を、0.5mM GSH, 10 μM GSSG, 25mM p-アミノベンザミジン, および10μM Grx2を含んでいる総容積が4.4mlで50mM HEPES, 100mM NaCl, 10mM CaCl2, pH7.0の緩衝液中で、4.5時間30゜Cでインキュベーションした。GSSGの初濃度は、反応の間のGSSGの形成を補償するために至適な常用範囲の下端値であった（図4において網掛けの領域）。(B)  EDTAをカルシウム過剰(20mM終濃度)に添加し、全内容物を緩衝剤A(50mM HEPES, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH7.0)で平衡化された1mlのHiTrapQ  FFカラム(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に負荷し、FVIIa 407Cを捕獲した。非結合性のグルタチオン緩衝剤およびGrx2pを除去するために緩衝剤Aで洗浄した後に、FVIIa 407Cを緩衝剤B(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, pH 7.0)で一段階で溶出した。溶出液中のFVIIa 407Cの濃度を、62・103 M-1cm-1の吸光係数を用いて280 nmでの吸光度で測定した。架橋を、約 0.6のマレイミドの均等物-PEG3.4k-マレイミドの存在下で1.5 時間室温で行った。(C)  EDTAをカルシウム過剰(20mM終濃度)に添加し、全内容物を緩衝剤A(50mM HEPES, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH7.0)で平衡化された1mlのHiTrapQ  FFカラム(Amersham Biosciences, GE Healthcare)に負荷（loaded）し、FVIIa 407Cを捕獲した。緩衝剤Aで洗浄後に、結合したタンパク質の一段階の溶出を、HiLoad Superdex200 16/60pgカラム（Amersham Biosciences）に直接的に緩衝剤B(10mM GlyGly, 150mM NaCl, 10mM CaCl2, 0.01%Tween80, pH7.0)を適用して行い、PEG化および非PEG化の種を分離した。流速を1 ml/minで行った。タンパク質を、280nmでの吸光で検出した。
【０１１４】
FVIIa 407C, FVIIa 407C-PEG5k, FVIIa 407C-PEG20k, FVIIa 407C-PEG40k, およびFVIIa 407C-PEG3.4k-FVIIa 407CのSDS-PAGE分析：  FVIIa 407Cおよび5k, 20k, 40k, および3.4k-PEG化化合物(それぞれ約 1.5 μg)を、還元性および非還元性のSDS-PAGEで分析した。このSDS-PAGEは製造者の推奨にしたがって4〜12%のBis-Tris NuPAGE（登録商標）ゲル(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を200Vで35 minでMES緩衝剤(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)で泳動して行った。ゲルを、製造者の推奨にしたがって、水で洗浄し、Simply BlueTM SafeStain(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)で染色した。ゲルを図8に示す。
【０１１５】
FVIIa 407C, FVIIa 407C-PEG5k, FVIIa 407C-PEG20k, FVIIa 407C-PEG40k, および FVIIa 407C-PEG3.4k-FVIIa 407Cの活性部位の滴定：  FVIIa 407CおよびPEG化化合物の活性部位の濃度を、基本的に他の記載(Bock, 1992)のとおり不足当量レベル（sub-stoichiometric levels）のd-Phe-Phe-Arg-クロロメチルケトン(FFR-cmk)で滴定した際のアミド溶解活性の不可逆的な損失から決定した。簡単に説明すると、各タンパク質を、280 nmでの62・103 M-1cm-1の吸光係数を用いて、50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.01% Tween 80, pH 7.0の緩衝液で300 nMの近似濃度に希釈した。次に、希釈したタンパク質(20 μl)を、20 μlの1.5 μM sTFおよび20 μlの0〜1.2 μMのFFR-cmk（DMSOに溶解したFFR-cmk貯蔵物から緩衝液中に新たに調製し、-80゜Cで貯蔵した）と混合した。室温で一晩インキュベーションした後に、残留するアミド溶解活性を測定した。
【０１１６】
活性アッセイを、ポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc, Denmark）で、最終容量200μlの50 nM sTFおよび約 10 nMのFVIIa（サンプルの10倍希釈に対応している）を含んでいる緩衝液(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 0.01% Tween 80, pH 7.4)中で行った。15minのプレインキュベーションを室温で行った後に、1mMの色素生産性基質S-2288を添加し、吸光度をSpectraMaxTM 340ミクロプレート分光光度計にSOFTmax PROソフトウェア(v2.2; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)を備えた装置において、405nmで連続的に20minモニターすることによって測定した。アミド溶解活性を、ブランクの値を減算した後にリニアプログレス曲線（linear progress curves）の傾きとして報告した。活性部位濃度は、アミド溶解活性を完全に無効化（abolishing）しているFFR-cmkの最小濃度を外挿することによって決定された。
【０１１７】
表2には、280 nmでのタンパク質の吸光度に対する活性部位濃度の測定が示されている。値は、FVIIa 407Cに対して100%に標準化された。
【表３】
2008546670.tif 000006
【０１１８】
トリフェニルホスフィン-3,3',3''トリスルホン酸を用いたFVIIa R396C-混合ジスルフィドの還元：  トリフェニルホスフィン-3,3',3''トリスルホン酸(PPh3S3)を用いたFVIIa R396C-混合ジスルフィドの小スケールの還元を、以下の通り行った；つまり、FVIIa R396C(4.4 μM)を、総容量50 μlの50 mM p-アミノベンザミジンを含有している反応緩衝液(50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.05% Tween 20, pH 7.0)中で2.5または5.0 mM PPh3S3の何れかで処理して行った。室温で16.3 時間インキュベーションした後、反応混合物(30 μl)を、過剰な還元剤を除去するために製造者の説明書にしたがって反応緩衝液で再水和（rehydrated）したPro・スピンTM Spinカラム（Princeton Separations, Adelphia, New Jersey）で脱塩した。引き続いて、自由チオールを、0.2 mMのPEG5k-マレイミドで10 min、室温でアルキル化した。PEG化および非PEG化型のFVIIa R396Cを、還元性のSDS-PAGEで分析した。このSDS-PAGEは製造者の推奨にしたがって4〜12%のBis-Trisゲル(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)を200Vで35 minでMES緩衝剤で泳動して行った。Simply BlueTM SafeStain(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA)でのゲル染色を、製造者の説明書にしたがって行った。ゲルを図9Aに示す。
【０１１９】
PPh3S3でのインキュベーションの前後のFVIIa R396Cのアミド溶解活性を、反応混合物を200 μl(総容積)の50 mM sTFを含有している50 mM HEPES, 100 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 1 mg/ml BSA, pH7.4の緩衝液に320倍希釈して測定した。15minのプレインキュベーションを室温で行った後に、1mMの色素生産性基質S-2288を添加し、吸光度をSpectraMaxTM 340ミクロプレート分光光度計にSOFTmax PROソフトウェア(v2.2; Molecular Devices Corp., Sunnyvale, CA)を備えた装置を用いてポリスチレンマイクロタイタープレート（Nunc, Denmark）中で405nmで連続的に20minモニターすることによって測定した。アミド溶解活性を、ブランクの値を減算した後にリニアプログレス曲線（linear progress curves）の傾きとして報告した。結果を図9Bに示す。
【０１２０】
VII因子ポリペプチドにおける暴露されたジスルフィドの選択的な還元：  商業的に利用可能なトリアリールホスフィン1(トリフェニルホスフィン-3,3',3''-トリスルホン酸のリン酸三ナトリウム塩、Aldrich)は、約 5%の対応する3,3’-bis-スルホン酸2を含有する。上記１を標準的な逆相ＨＰＬＣで精製し、0.1%トリフルオロ酢酸の存在下でアセトニトリル水溶液のグラジエントで溶出した。
【化３】
2008546670.tif 000007
トリフェニルホスフィン-3,3',3''-トリスルホン酸(2.5 mM)を、活性部位インヒビターの4-アミノベンザミジンとともに使用して、グルタチオンおよびFVIIa R396C（基本的にアミド溶解活性を損失している）の間の暴露されたジスルフィド結合を還元できることが示されている。混合ジスルフィド結合の還元的な切断を、解放されたシステインをPEG5k-マレイミドで引き続き修飾することによって実証した。
【０１２１】
トリアリールホスフィンの上記1〜3(10 mM)を、rFVIIaで1 h室温で個々にインキュベーションした。上記1の存在下で、rFVIIaは、その活性の殆どを保持した。対照的に、3,3’-bis-スルホン酸2によって、酵素のアミド溶解活性の急速な減少が生じた、類似の4,4’-bis-スルホン酸3(二カリウム塩、Aldrich)も同様である（従って、rFVIIaの還元に至適であるとは考えられなかった）。
【０１２２】
さらにまた、前記1を、シスチンジメチルエステル5を還元する能力に関して試験した。反応を、室温で前記1を15 mMの水溶液濃度で行った。基質を、5 mMの濃度で存在させた。前記5のジスルフィド結合が所与の条件下で還元されることがLC-MS分析で実証された。
【化４】
2008546670.tif 000008
より立体的に障害されたトリアリールホスフィン4（三ナトリウム塩、Strem）は、rfVIIaに対してほとんど非反応性であることが発見され、より選択的な還元剤が開発される可能性を示唆している。化合物9〜11は、選択的なジスルフィド還元剤であることが期待されるトリアリールホスフィンの非限定的な例を表す。
【化５】
2008546670.tif 000009
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【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図1は、FVIIa 407Cとの混合ジスルフィドに導入された低分子量チオールの同定を表す。タンパク質を、TCEPおよびSBD-fの存在下でインキュベーションして、FVIIa 407Cの調製において操作されたCys407に付着したチオールを解放し、誘導体化した。SBD-誘導化チオールを、逆相HPLCで分離し、蛍光（それぞれ386および516 nmの励起および発光波長）で検出した。野生型のFVIIaおよび一連の低分子量チオール化合物（各10ピコモル；  標準と称される）のHPLCのトレースを、比較のために示す。アステリスクでマークしたピークは、商業的に利用可能なシステアミン中の不純物から生じた。２つのアステリスクは、FVIIa 407CのHPLCトレース中の身元が未知のピークを指し示す。各ピークの上のパーセンテージは、分析されたFVIIa 407Cの量と比較した所与のチオール種（その保持時間から同定された）の量を示す。保持時間に基づいて、FVIIa 407Cに結合された主要なチオールが、グルタチオン, システイン, およびホモシステインであるとのことを結論付けることができる。略語：  GSH(グルタチオン), γ-GC(γ-グルタミルシステイン), CG(システイニルグリシン), Cys(システイン), Hcy(ホモシステイン)およびCya(システアミン)。
【図２】図2は、様々な濃度の還元型および酸化型のグルタチオン([GSH]2/[GSSG]の比で示される), 1 μMの酵母グルタレドキシン1(yGrx1p)の存在下で、25 mMのp-アミノベンザミジンの非存在下（オープンサークル）または存在下（オープンスクエア）の何れかでpH7でインキュベーションしたFVIIaの残留するアミド溶解活性を示す。アミド溶解活性を測定する前に、全サンプルを3.5 hrs、30゜Cで平衡化させた。アミドリティック活性は、完全に活性なFVIIaに関する１に対し標準化された。
【図３】図3は、FVIIa Cys407およびグルタチオンの間の混合ジスルフィドの酸化還元滴定を示す。FVIIa 407Cを、様々な比率の還元型および酸化型のグルタチオン([GSH]/[GSSG]比で示される)および10 μMの大腸菌のグルタレドキシン2(Grx2)を含んでいるpH 7の緩衝液中で平衡化させた。5 hrs、30゜Cでの平衡化に続いて、PEG5k-マレイミドでのアルキル化の後に、自由なFVIIa 407Cを検出し、HPLCで定量した。ピーク領域は、完全な5k-PEG化FVIIaに関する１に対して標準化された。
【図４】図4は、0.5 mM GSH, 様々な濃度のGSSG, および25 mM p-アミノベンザミジン(+PABA)または無し(-PABA)からなる酸化還元緩衝剤で平衡化した残留アミド溶解活性（点線）および自由なCys407チオール基を有しているFVIIa 407Cの分画(実線)を示す。曲線を、Eq.2および4, 93(-PABA)および166 mM(+PABA)のKox値, および1.02のKscox値を用いて表した。網掛けの領域は、>90%の残効性および>90%の自由な407Cチオールを生じるGSSGの濃度範囲を示す。
【図５】図4と同様であるが、0.25 mM GSHを代わりに用いた図を示す。網掛けの領域は、>90%の残効性および>90%の自由なFVIIa 407Cチオールを生じるGSSGの濃度範囲を示す。
【図６】図4と同様であるが、1.0 mM GSHを代わりに用いた図を示す。網掛けの領域は、>90%の残効性および>90%の自由なFVIIa 407Cチオールを生じるGSSGの濃度範囲を示す。
【図７】図7は、選択的な還元の前（点線）および後（一点鎖線）、およびPEG20k-マレイミドでの修飾後のFVIIa 407CのHPLC分析を表す。407C, 407C-SR, および 407C-PEG20kは、それぞれ自由な, 低分子量チオール結合型の, および20k-PEG化FVIIa 407Cを示している。アステリスクは身元が未知のピークを指し示しており、おそらく過度にPEG化された種が示されている。ピークの統合によって、還元工程の終了時に89%の自由なFVIIa 407Cが産生されたのに対し、無処置の材料では11%であった。チオールアルキル化の後、FVIIa 407Cの85%がモノPEG化種（mono-PEGylated species）に転換される。
【図８】図8は、FVIIa 407C(レーンA), FVIIa 407C-PEG5k(レーンB), FVIIa 407C-PEG20k(レーンC), FVIIa 407C-PEG40k(レーンD), およびFVIIa 407C-PEG3.4k-FVIIa 407C(レーンE)の還元性(右のパネル)および非還元性(左の パネル)のSDS-PAGE分析を表す。
【図９】図9は、(A)2.5(レーンA)または5.0 mM(レーンB)のトリフェニルホスフィン-3,3',3''トリスルホン酸(PPh3S3)を16.3 hrs、室温で処理し、PEG20k-マレイミドで標識したFVIIa R396Cの還元性のSDS-PAGE分析を表す。レーンCは、無処置のFVIIaを参照として含有する。(B)PPh3S3での16.3 hrsのインキュベーションの前（100%活性）および後のFVIIa R396Cの相対アミドリティック活性を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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