(57)【要約】  リボスイッチおよびリボスイッチの改変型を、特異的エフェクター化合物により制御されるデザイナー遺伝スイッチとして使用できる。リボスイッチを活性化するこのようなエフェクター化合物を、本明細書においてトリガー分子と称する。天然スイッチは、抗生物質およびその他の小分子療法の標的である。さらに、リボスイッチの構造は、天然スイッチの実際の断片が、新たな非免疫原性遺伝的制御エレメントの構築に使用される事を可能にする。例えば、新たな認識ドメインが、ユーザーの規定したエフェクター化合物によって遺伝調節を惹起するよう、アプタマー(分子認識)ドメインを他の非天然アプタマーに交換（またはそれ以外の態様で修飾）することができる。変化したスイッチは治療計画の一部となり、蛋白合成を始動、停止または調節する。新たに構築された遺伝調節ネットワークは、生体バイオセンサー、生物の代謝改変のような領域に、そして遺伝子治療処置の先進形態に応用できる。化合物は、リボスイッチを刺激、活性化、阻害、および／または不活性化するのに利用できる。リボスイッチの原子構造は、リボスイッチを刺激、活性化、阻害、および／または不活性化する新たな化合物の設計に利用できる。
2008518630.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
図6に示した原子構造を含む天然グアニン応答性リボスイッチの原子構造。
【請求項２】
原子構造の原子座標が、図6に記載の原子について表6に列挙した原子座標を含む、請求項1に記載の原子構造。
【請求項３】
原子構造の原子座標が表6に列挙した原子座標を含む、請求項1に記載の原子構造。
【請求項４】
(a) 被検化合物を伴う請求項1の原子構造をモデル作製し；そして
(b) その被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定する、
事を含む、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法。
【請求項５】
被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかの決定が、リボスイッチのモデル中の被検化合物について予測された最小相互作用エネルギー、予測された結合定数、予測された解離定数、または組み合わせを決定することを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかの決定が、被検化合物とリボスイッチとの、1もしくはそれ以上の予測された結合、1もしくはそれ以上の予測された相互作用、または組み合わせを決定することを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項７】
リボスイッチがグアニンリボスイッチである、請求項4に記載の方法。
【請求項８】
グアニンリボスイッチが表5のリボスイッチである、請求項7に記載の方法。
【請求項９】
原子の接触を工程(b)で決定し、それにより、被検化合物とリボスイッチの相互作用を決定する、請求項4に記載の方法。
【請求項１０】
(c) 被検化合物の類似体を特定し；
(d) 被検化合物の類似体がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定する、
という工程をさらに含む、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
化合物がヒポキサンチンである、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
細菌を、請求項10に記載の方法により特定した類似体と接触させることを含む、細菌を殺滅する方法。
【請求項１３】
細菌を、請求項4に記載の方法により特定した類似体と接触させることを含む、細菌を殺滅する方法。
【請求項１４】
被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定するためにゲル型検定を利用する、請求項4に記載の方法。
【請求項１５】
被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定するためにチップ型検定を利用する、請求項4に記載の方法。
【請求項１６】
被検化合物が、ファン・デル・ワールス相互作用、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用、または組み合わせによって相互作用する、請求項4に記載の方法。
【請求項１７】
リボスイッチがRNA開裂性リボザイムを含む、請求項4に記載の方法。
【請求項１８】
消光部分を含む核酸が開裂する時に蛍光シグナルが生成する、請求項4に記載の方法。
【請求項１９】
蛍光シグナルの生成に分子ビーコン技術を利用する、請求項4に記載の方法。
【請求項２０】
該方法を高スループットスクリーニングを用いて実施する、請求項4に記載の方法。
【請求項２１】
リボスイッチを被検化合物と接触させる［ここで、リボスイッチが被検化合物と相互作用する時、蛍光シグナルが生成する］事を含む、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法。
【請求項２２】
(a) リボスイッチの結晶構造を特定し：
(b) 被検化合物を伴うそのリボスイッチのモデル作製を行い；そして、
(c) 被検化合物がそのリボスイッチと相互作用するかどうかを決定する、
事を含む、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法。
【請求項２３】
リボスイッチがグアニンリボスイッチである、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
グアニンリボスイッチが表5のリボスイッチである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
コード領域と機能的に結合したリボスイッチを含むRNAをコードしている核酸分子を含む、調節可能な遺伝子発現構築物であって、このリボスイッチが表5のリボスイッチであり、このリボスイッチが該RNAの発現を調節し、このリボスイッチおよびコード領域が異種である、構築物。
【請求項２６】
リボスイッチがトリガー分子によって活性化され、トリガー分子により活性化される時このリボスイッチがシグナルを生成する、請求項25に記載の遺伝子発現構築物。
【請求項２７】
試料およびリボスイッチを接触させる事を含む、目的化合物を検出する方法であって、リボスイッチは表5のリボスイッチであり、リボスイッチは目的化合物により活性化され、リボスイッチは目的化合物により活性化された時にシグナルを生成し、リボスイッチは試料が目的化合物を含有する時にシグナルを生成する、方法。
【請求項２８】
目的化合物により活性化された時にリボスイッチがコンホメーションを変化させ、そのコンホメーションの変化がコンホメーション依存性標識を介してシグナルを生成する、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
目的化合物により活性化された時にリボスイッチがコンホメーションを変化させ、そのコンホメーションの変化が、リボスイッチに結合したRNAの発現に変化を惹起し、その発現の変化がシグナルを生成する、請求項27に記載の方法。
【請求項３０】
シグナルが、リボスイッチに結合したRNAから発現されるレポーター蛋白により生成される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
(a) 化合物および細胞を接触させるステップ、
を含む方法であって、
(b) 該化合物は、式I：
【化１】
2008518630.tif 000088
で示される構造を有し、
この化合物がグアニン応答性リボスイッチと結合する時、R1およびR2は水素結合ドナーとして働き、R7は水素結合アクセプターとして働き、R9は水素結合ドナーとして働き、R10は水素結合アクセプターとして働き、
【化２】
2008518630.tif 000089
は、各々独立して単結合または二重結合を表し、
この化合物はグアニン、ヒポキサンチンまたはキサンチンではなく、
細胞は、グアニン応答性リボスイッチを含むRNAをコードしている遺伝子を含み、
ここで、この化合物は、グアニン応答性リボスイッチと結合することにより該遺伝子の発現を阻害する、
ことを含む、遺伝子発現を阻害する方法。
【請求項３２】
R3が水素結合アクセプターである、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
R1、R2、R9または組み合わせが、独立して、-NR11-、-CHR11-、=CR11-、および-C(=NR11)- ［式中、R11は-H、-NH2、-OH、 -SH、-CO2H、置換または非置換アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、またはベンジルオキシ、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、-NHC(O)NH2、-NH-NH2、-NH-NHアルキル、-NH-NHアルコキシ、-NH-SO2アルキル、-NH-SO2-R12、NHCO2CH2-R12、-NH-OR12、-N+H2-R12、-NH-NH-R12、および-NH-NH-CH2-R12［式中、R12 は、
【化３】
2008518630.tif 000090
［式中、nは1ないし5であり、そしてR13は、-H、-NH2、-OH、アルコキシ、-N-モルホリノまたはハライドのうち1またはそれ以上である］
である］
である］
である、請求項31に記載の方法。
【請求項３４】
R8およびR7が合してCH=N-、-CH2-O-、-CH2-S-、または-CH2SO2-を表し得る、請求項31に記載の方法。
【請求項３５】
R10が、-OH、-SH、-NH2、-CO2H、-アルコキシ、-アリールオキシ、-ベンジルオキシ、-ハライド、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、-NHCO2CH2-R12、-NHC(O)NH2、-NH-NH2、-NH-NHアルキル、-NH-NHアルコキシ、-SO2アルキル、-SO2アリール、-NH-SO2アルキル、-NH-SO2-R12、-NH-OR12、-NH-R12、-NH-NH-R12、-NH-NH-CH2-R12、または-NH-CH2-R12［式中、R12 は、
【化４】
2008518630.tif 000091
［式中、nは1ないし5であり、そしてR13は、-H、-NH2、-OH、アルコキシ、-N-モルホリノまたはハライドのうち1またはそれ以上である］
である］
である、請求項31に記載の方法。
【請求項３６】
R10が、NR14［式中、R14は、-H、-NH2、-OH、-SH、-CO2H、- CO2アルキル、-CO2アリール、-C(O)NH2、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、アルコキシ、アリールオキシ、またはベンジルオキシ、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、-NHC(O)NH2、-SO2アルキル、-SO2アリール、-NH-SO2アルキル、-NH-SO2-R12、-NH-OR12、-NH-R12、または-NH-CH2-R12
［式中、R12 は、
【化５】
2008518630.tif 000092
［式中、nは1ないし5であり、そしてR13は、-H、-NH2、-OH、アルコキシ、-N-モルホリノまたはハライドのうち1またはそれ以上である］
である］
である］
である、請求項31に記載の方法。
【請求項３７】
化合物が式II：
【化６】
2008518630.tif 000093
［式中、
R7は、NまたはCHであり；
R10は、=O、=S、=NH、=NOH、=Nアルキル、=Nアルコキシル、=N-アリール、=Nアリールオキシ、=N-ベンジル、-Nベンジルオキシ、=N-NH2、=N-NHOH、=N-NHアルキル、=N-NHアルコキシ、=N-NHアリール、=N-NHアリールオキシ、=N-NHベンジル、=N-NHベンジルオキシ、=N-NH-(p-アミノ-フェニル)、=N-NH- (p-メトキシフェニル)、=N-NH-(p-N-モルホリノ-フェニル)であり；そして、
R2は、=CR15-［式中、R15は、-NH2、-NHNH2、-NHOH、-NHアルキル、-NHアルコキシ、- NHアリール、-NHアリールオキシ、-NHベンジル、-NHベンジルオキシ、-N+H2アリール、-N+H2-(p-N-モルホリノ-フェニル)、-N+H2-(p-アミノフェニル)、-N+H2-(p-メトキシフェニル)、-NHCO2アルキル、- NHCO2ベンジル、-NHNHアルキル、-NHNHアリール、-NHNHベンジル、または-NHC(O)アルキルである］
で示される構造を有する、請求項31に記載の方法。
【請求項３８】
化合物が式III：
【化７】
2008518630.tif 000094
［式中、
R7は、NまたはCHであり；
R10は、-H、-OH、-SH、-アルコキシ、ハライド、-NH2、-NHOH、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHアリール、-NHアリールオキシ、-NHベンジル、-NHベンジルオキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、NHCO2ベンジル、-NHNH2、-NHNHアルキル、-NHNHアリール、または-NHNHベンジルであり；そして、
R2は、=CR15-［式中、R15は、-NH2、-NHNH2、-NHOH、-NHアルキル、-NHアルコキシ、- NHアリール、-NHアリールオキシ、-NHベンジル、-NHベンジルオキシ、-N+H2アリール、-N+H2-(p-N-モルホリノ-フェニル)、-N+H2-(p-アミノフェニル)、-N+H2-(p-メトキシフェニル)、-NHCO2アルキル、- NHCO2ベンジル、-NHNHアルキル、-NHNHアリール、-NHNHベンジル、または-NHC(O)アルキルである］
である］
で示される構造を有する、請求項31に記載の方法。
【請求項３９】
(a) リボスイッチを含むRNAをコードしている遺伝子の発現の阻害について或る化合物を試験し［ここで、リボスイッチは表5のリボスイッチであり、その阻害はリボスイッチを介している］、(b) 細胞と、工程(a)で遺伝子発現を阻害した化合物を接触させることにより遺伝子発現を阻害する
［ここで、その細胞は、リボスイッチを含むRNAをコードしている遺伝子を含み、その化合物は、リボスイッチに結合することにより遺伝子の発現を阻害する］、
ステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対するクロスリファレンス
本出願は、2004年11月8日出願の米国仮出願第60/625864号の利益を請求するものである。2004年11月8日出願の米国仮出願第60/625864号を、引用によりその全体を本明細書の一部とする。
【０００２】
連邦政府の後援による研究に関する陳述
本発明は、National Institutes of Healthにより授与されたGrant NIH GM068819-2およびDefense Advanced Research Projects Agencyにより授与されたGrant DARPA W911NF-04-1-0416に基づく政府の支援を受けてなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
ここに開示する発明は一般に、遺伝子発現の分野、特に遺伝子発現の調節の領域に属する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
細胞は、遺伝的発現パターンを変えることにより、数多くの生化学的シグナルおよび環境上のきっかけに応答せねばならないため、正確な遺伝学的調節は生態系の本質的な特徴であるである。知られている殆どの遺伝調節メカニズムは、化学的または物理的刺激を感知し次いで関連するDNAまたはメッセンジャーRNA配列と選択的相互作用を行うことにより遺伝子発現を調節する、蛋白因子の使用を含んでいる。蛋白は複雑な形状をとり、生態系に化学的および物理的環境を正確に感知させる多彩な機能を遂行できる。代謝産物に応答する蛋白因子は、典型的には、転写開始を調節するためにDNAと結合することにより（例えば、lacリプレッサー蛋白；Matthews, K.S., and Nichols, J.C., 1998, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 58, 127-164）、または転写終結（例えば、PyrR蛋白；Switzer, K.L., et al., 1999, Prog. Nucleic Acids Res. Mol. Biol. 62, 329-367）もしくは翻訳（例えば、TRAP蛋白；Babitzke, P., and Gollnick, P., 2001, J. Bacteriol. 183, 5795-5802）のいずれかを制御するためにRNAと結合することにより、作用する。蛋白因子は、アロステリック調節または翻訳後修飾といった種々のメカニズムによって環境刺激に応答し、これらのメカニズムを巧みに操って、高応答性の遺伝スイッチとして働く（例えば、Ptashne, M., and Gann, A.(2002) 「遺伝子およびシグナル」Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY）。
【０００５】
遺伝調節における蛋白因子の広範な参加に加えて、RNAが遺伝的調整に積極的な役割を担い得ることもまた知られている。近年の研究は、小さな非コードRNAがmRNAを選択的に標的化して分解に向かわせ、それが遺伝子発現のダウンレギュレーションをもたらすという実質的な役割を明らかにしつつある（例えば、Hannon, G.J. 2002, Nature 418, 244-251およびその参考文献を参照されたい）。このRNA干渉のプロセスは、短RNAがワトソン-クリック塩基相補性によって、意図するmRNA標的を選択的に認識する能力を利用しており、その後、結合したmRNAは蛋白の作用により分解される。RNAは、この系において分子認識のための理想的な物質である。何故なら、新規な高特異性RNA結合部位を持つ蛋白因子を作り出すよりも、進化のプロセスによって新しい標的特異的RNA因子を作り出す方が遙かに容易であるためである。
【０００６】
蛋白は、生物学が酵素、レセプターおよび構造機能のために有する殆どの要件を満たすが、RNAもまたこれらの能力を有し得る。例えば、RNAは、相当な酵素力および正確な分子認識を示す、数多くのリボザイムドメイン （Cech & Golden, 「RNAのみを用いた触媒活性部位の構築」The RNA World, R. F. Gesteland, T.R. Cech, J. F. Atkins eds., pp.321-350(1998)；Breaker, 「触媒性ポリヌクレオチドのインビトロ選択」Chem. Rev. 97, 371-390(1997)）およびレセプタードメイン（Osborne & Ellington, 「核酸選択および組み合わせ化学の課題」Chem. Rev. 97, 349-370(1997)；Hermann & Patel,「 核酸アプタマーによる適応認識」Science 287, 820-825(2000)）を形成するに充分な構造上の可塑性を持っている。さらに、これらの活性が組み合わされて、エフェクター分子により選択的に調節されるアロステリックリボザイムが創成され得る（Soukup & Breaker, 「精密RNA分子スイッチの設計」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 3584-3589(1999)；Seetharaman et al., 「複雑な化学的および生物学的混合物の分析のための固定化リボスイッチ」Nature Biotechnol. 19, 336-341(2001)）。
【０００７】
RNAのこれらの性質は、或る種のRNAが、特定代謝産物の存在に対する遺伝的調節応答を行うためにアロステリックメカニズムを使っているかも知れない、という推測に合致する（Gold et al., 「オリゴヌクレオチドの形状からゲノムSELEXまで: 新規な生物学的調節ループ」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94, 59-64 (1997)；Gold et al.,「SELEXおよびゲノムの進化」Curr. Opin. Gen. Dev. 7, 848-851 (1997)；Nou & Kadner,「アデノシルコバラミンはbtuB RNAに対するリボソームの結合を阻害する」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 7190-7195 (2000)；Gelfand et al.,「細菌リボフラビン合成遺伝子の調節に関与する保存されたRNA構造要素」Trends Gen. 15, 439-442 (1999)；Miranda-Rios et al.,「保存されたRNA構造(thiボックス)が細菌のチアミン生合成遺伝子発現の調節に関与している」Proc. Natl. Acad. ScL USA 98, 9736-9741 (2001)；Stormo & Ji,「mRNAは小分子の発現を制御するそれらの直接センサーとして働くのか？」Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98, 9465-9467 (2001)）。チアミンピロ燐酸(TPP)依存性センサー／調節蛋白がチアミン生合成遺伝子の制御に参加していることが提唱された（(Webb & Downs,「Salmonella typhimurium における、チアミン一燐酸キナーゼをコードしているthiLの特性解明」 J. Biol. Chem. 272, 15702-15707 (1997)）が、そのような蛋白因子が存在することは示されていない。
【０００８】
高濃度リジンによってB. subtilisのlysC遺伝子の転写が抑制される（Kochhar, S., and Paulus, H. 1996, Microbiol. 142:1635-1639；Maeder, U., et al., 2002, J. Bacteriol. 184:4288-4295；Patte, J.C. 1996 「リジンおよびスレオニンの生合成」Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, F.C. Neidhardt, et al., eds., Vol. 1, pp. 528-541. ASM Press, Washington, DC；Patte, J.-C, et al., 1998, FEMS Microbiol. Lett. 169:165-170）が、遺伝的調節因子の役割を示す蛋白因子は特定されなかった（Liao, H.-H., and Hseu, T.-H. 1998, FEMS Microbiol. Lett. 168:31-36）。lysC遺伝子はアスパルトキナーゼIIをコードしており、これはL-アスパラギン酸をL-リジンに変換する代謝経路の第一工程を触媒する（Belitsky, B.R. 2002「グルタミン酸塩およびアスパラギン酸塩ファミリーのアミノ酸、アラニン、ならびにポリアミンの生合成」Bacillus subtilis and its Closest Relatives: from Genes to Cells. A.L. Sonenshein, J.A. Hoch, and R. Losick, eds., ASM Press, Washington, D.C.）。
【発明の開示】
【０００９】
発明の簡単な要約
或る種の天然mRNAが代謝産物感受性遺伝スイッチとして働き、その際そのRNAが小さな有機分子と直接結合することが発見された。この結合プロセスはこのmRNAのコンホメーションを変化させ、それが種々の異なるメカニズムによって遺伝子発現の変化を惹起する。これらの天然「リボスイッチ」の改変型（様々な核酸工学的戦略を用いて創成される）は、特異的エフェクター化合物により制御されるデザイナー遺伝スイッチとして利用できる。リボスイッチを活性化するこのようなエフェクター化合物を本明細書においてトリガー分子と称する。天然スイッチは、抗生物質およびその他の小分子療法の標的である。さらに、リボスイッチの構造は、天然スイッチの実際の断片を、新たな非免疫原性遺伝調節エレメントの構築に使用することを可能にする。例えば、新たな認識ドメインがユーザーの規定したエフェクター化合物による遺伝的調節を惹起するよう、アプタマー（分子認識）ドメインを他の非天然アプタマーに交換（またはこれ以外の態様で修飾）することができる。変化したスイッチは治療計画の一部となり、蛋白合成を始動させたり、停止させたり、調節したりする。新たに構築された遺伝調節ネットワークは、生体バイオセンサー、生物の代謝改変のような領域に、そして遺伝子治療処置の先進形態に応用できる。
【００１０】
単離され組換えられたリボスイッチ、係るリボスイッチを含む組換え構築物、係るリボスイッチに機能的に結合した異種配列、ならびに係るリボスイッチ、リボスイッチ組換え構築物、および異種配列に機能的に結合したリボスイッチを担持する、細胞およびトランスジェニック生物を開示する。異種配列は、例えば、レポーター蛋白またはペプチドを包含する、目的の蛋白またはペプチドをコードしている配列であってよい。好ましいリボスイッチは、天然に存在するリボスイッチであるか、またはそれから誘導されるものである。
【００１１】
リボスイッチの結晶原子構造もまた開示する。これらの構造は、リボスイッチと結合リガンドの相互作用の評価およびモデル作製に有用である。これらはさらに、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法にも有用である。
【００１２】
異種アプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むキメラリボスイッチもまた開示する。即ち、或る原料由来のアプタマードメインおよび別の原料由来の発現プラットフォームドメインから成るキメラリボスイッチが作製される。この異種原料は、例えば異なる特定リボスイッチまたは異なるクラスのリボスイッチに由来するものであってよい。異種アプタマーは非リボスイッチアプタマーに由来するものであってもよい。異種発現プラットフォームドメインもまた非リボスイッチ原料に由来するものであってよい。
【００１３】
リボスイッチを活性化、不活性化または遮断できる化合物を選択および特定するための組成物および方法もまた開示する。リボスイッチの活性化とは、トリガー分子との結合時にリボスイッチの状態が変化することを指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物によっても、そしてトリガー分子との結合以外の方法でも活性化され得る。本明細書においてトリガー分子という語は、リボスイッチを活性化できる分子および化合物を指すのに使用する。これは、リボスイッチのための天然または正常なトリガー分子およびリボスイッチを活性化できるその他の化合物を包含する。天然または正常なトリガー分子は、所定の天然リボスイッチのためのトリガー分子であり、または、幾つかの非天然リボスイッチの場合には、そのためにリボスイッチが設計されたトリガー分子、または、それを用いてリボスイッチが選択されたトリガー分子である（例えば、インビトロ選択またはインビトロ進化技術の場合のように）。非天然トリガー分子は非天然トリガー分子と称することができる。
【００１４】
リボスイッチの不活性化とは、トリガー分子が結合していない場合のリボスイッチの状態の変化を指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物の結合によっても、そしてトリガー分子の除去以外の方法でも不活性化され得る。リボスイッチの遮断とは、トリガー分子の存在がリボスイッチを活性化しない、リボスイッチの条件または状態を指す。
【００１５】
被検化合物を伴うリボスイッチの原子構造をモデル作製し、被検化合物がそのリボスイッチと相互作用するかどうかを判定することを含む、リボスイッチと相互作用する化合物の特定方法もまた開示する。これは、リボスイッチおよび被検化合物の原子接触を決定することによって実現できる。さらに、この原子接触を分析することにより、リボスイッチと相互作用することがわかっている化合物の類似体を作製し、次いでその類似体の原子構造を、相互作用が最大となるように最適化することができる。これらの方法を高スループットスクリーニングと共に利用できる。
【００１６】
さらに、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断できる化合物、および係る化合物を含有する組成物を開示する。さらに、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断するための組成物および方法を開示する。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を制御するよう機能する。リボスイッチを活性化、不活性化または遮断するための化合物が使用できる。リボスイッチのためのトリガー分子(ならびにその他の活性化化合物)を使用してリボスイッチを活性化することができる。トリガー分子以外の化合物は一般に、リボスイッチの不活性化または遮断に使用できる。リボスイッチはまた、例えばリボスイッチからトリガー分子を除去することによって不活性化され得る。リボスイッチは、例えばリボスイッチを活性化しないトリガー分子の類似体との結合によって遮断され得る。
【００１７】
或る化合物をRNA分子と接触させることにより、そのRNA分子、またはRNA分子をコードしている遺伝子の発現を変化させる組成物および方法を開示する［ここでこのRNA分子はリボスイッチを包含する］。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を制御するよう機能する。したがって、リボスイッチを包含する目的RNA分子を、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断するような条件下におくことを利用して、そのRNAの発現を変化させることができる。例えば転写終結またはそのRNAへのリボソーム結合の遮断の結果として、発現が変化し得る。リボスイッチの性質にもよるが、トリガー分子の結合は、そのRNA分子の発現を低減または妨害するか、またはそのRNA分子の発現を促進または増大させ得る。
【００１８】
さらに、リボスイッチをRNA分子に機能的に結合させることによりそのRNA分子またはRNA分子をコードしている遺伝子の発現を調節するための組成物および方法を開示する。例えばリボスイッチをRNA分子と物理的に結合させる、またはRNA分子をコードしている核酸をリボスイッチが含まれそれがコードされるように改変して、その改変された核酸から産生されたRNAが該RNA分子と機能的に結合したリボスイッチを持つようにする、といった事を包含する任意の適当な方法で、リボスイッチをRNA分子と機能的に結合させることができる。目的RNA分子に機能的に結合したリボスイッチを、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断するような条件下におくことを利用して、そのRNAの発現を変化させることができる。
【００１９】
さらに、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断することによりリボスイッチを含む天然遺伝子またはRNAの発現を調節するための組成物および方法を開示する。もしその遺伝子が、それを担持している細胞または生物の生存に必須であるならば、リボスイッチの活性化、不活性化または遮断は、その細胞または生物の死、静止または衰弱をもたらし得る。例えば、微生物の生存に必須の天然遺伝子における天然リボスイッチの活性化は、その微生物の死をもたらし得る（もしリボスイッチの活性化が発現を停止または抑制するならば）。これが、抗菌作用および抗生物作用に本開示化合物および方法を使用する一つの根拠である。
【００２０】
さらに、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断することにより、リボスイッチを含む単離された、改変された、または組み換えられた遺伝子もしくはRNAの発現を調整するための組成物および方法を開示する。遺伝子またはRNAは任意の方法で改変または組換えを行うことができる。例えば、リボスイッチおよび該RNAのコード領域は異種のものであってよく、リボスイッチは組換えもしくはキメラ、または両者であってよい。もしこの遺伝子が所望の発現生成物をコードしているならば、リボスイッチの活性化または不活性化を用いて該遺伝子の発現を誘導し、そのようにして発現生成物の産生をもたらすことができる。もしこの遺伝子が遺伝子発現または別の細胞プロセスのインデューサーまたはリプレッサーをコードしているならば、リボスイッチの活性化、不活性化または遮断は、他の、調節された遺伝子または細胞プロセスの誘導、抑制または脱抑制をもたらすことができる。このような多くの二次調節作用が知られており、それらをリボスイッチとの使用に適合させることができる。このような調節のための一次制御としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小さい非抗原性分子であり得ることである。
【００２１】
アプタマードメインをリボスイッチの発現プラットフォームドメインと機能的に結合させる（これはキメラリボスイッチである）ことによりリボスイッチの調節を変えるための組成物および方法を開示する。するとこのアプタマードメインは、例えばこのアプタマードメインのためのトリガー分子の作用を介してリボスイッチの調節を仲介できる。アプタマードメインは、例えばリボスイッチの正常または天然アプタマードメインを新たなアプタマードメインに置き換えることを包含する任意の適当な方法でリボスイッチの発現プラットフォームドメインと機能的に結合できる。一般に、アプタマードメインがそこから誘導されているリボスイッチを活性化、不活性化または遮断できる任意の化合物または条件を使用して、キメラリボスイッチを活性化、不活性化または遮断することができる。
【００２２】
リボスイッチを共有結合で変化させることにより（例えば、リボスイッチの一部を架橋、または或る化合物をリボスイッチに結合させることによって）リボスイッチを不活性化するための組成物および方法を開示する。このような方法によるリボスイッチの不活性化は、例えばそのリボスイッチのためのトリガー分子が結合することを防ぐ、またはトリガー分子の結合時にリボスイッチの状態が変化することを防ぐ、またはリボスイッチの発現プラットフォームドメインがトリガー分子の結合時に発現に影響を及ぼすことを防ぐという変化に起因し得る。
【００２３】
さらに、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する化合物を特定する方法を開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物は、被検化合物とリボスイッチを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価することによって特定できる。リボスイッチが活性化するならば、その被検化合物はリボスイッチを活性化する化合物として特定される。リボスイッチの活性化は任意の適当な方法で評価できる。例えば、リボスイッチをレポーターRNAと結合させ、レポーターRNAの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、被検化合物の存在下および不在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、そこからのシグナルがリボスイッチの活性化状態に応じて変化する、コンホメーション依存性標識を含むことができる。このようなリボスイッチは、好ましくは天然に存在するリボスイッチ由来の、またはそれから誘導されるアプタマードメインを使用する。理解できるように、リボスイッチの活性化の評価は、対照検定もしくは測定を使用して、または対照検定もしくは測定を使用せずに実施できる。リボスイッチを不活性化する化合物を特定する方法も同様にして実施できる。
【００２４】
リボスイッチを遮断する化合物の特定は任意の適当な方法で達成できる。例えば、リボスイッチを活性化または不活性化することがわかっている化合物の存在下で、且つ被検化合物の存在下でリボスイッチの活性化または不活性化を評価する検定を実施できる。活性化または不活性化が、被検化合物不在時に観察されるようには観察されない場合、その被検化合物をリボスイッチの活性化または不活性化を遮断する化合物であると特定する。
【００２５】
バイオセンサーリボスイッチもまた開示する。バイオセンサーリボスイッチは、同族トリガー分子の存在下で検出可能シグナルを生成する、改変されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値レベルで、またはそれ以上で反応を誘発できる。バイオセンサーリボスイッチは、インビボまたはインビトロ使用のために設計できる。例えば、シグナルとしての役割を有する、またはシグナル産生に関与する蛋白をコードしているレポーターRNAと機能的に結合したバイオセンサーリボスイッチは、そのリボスイッチ／レポーターRNAをコードしている核酸構築物を担持する細胞または生物を改変することによってインビボ使用できる。インビトロ使用のためのバイオセンサーリボスイッチの例は、そこからのシグナルがリボスイッチの活性化状態に応じて変化する、コンホメーション依存性標識を含むリボスイッチである。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは天然に存在するリボスイッチ由来の、またはそこから誘導されたアプタマードメインを使用する。バイオセンサーリボスイッチを使用して化合物を検出する方法もまた開示する。この方法は、被検試料とバイオセンサーリボスイッチを接触させ、そのバイオセンサーリボスイッチの活性化を評価することを包含する。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、被検試料中にバイオセンサーリボスイッチのためのトリガー分子が存在することを示す。
【００２６】
リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する化合物を特定し、特定された化合物を製造することによって作製される化合物もまた開示する。これは例えば、本明細書の他所に開示する化合物特定方法を、特定された化合物を製造する方法と結びつけることによって達成できる。例えば、被検化合物とリボスイッチを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価し、もしリボスイッチが被検化合物によって活性化されるならば、リボスイッチを活性化する被検化合物を当該化合物として製造することによって化合物が作製できる。
【００２７】
或る化合物によるリボスイッチの活性化、不活性化または遮断を調査し、調査した化合物を製造することによって作製された化合物もまた開示する。これは例えば、本明細書の他所に開示する化合物活性化、不活性化または遮断評価方法を、調査された化合物を製造する方法と結びつけることによって達成できる。例えば、被検化合物とリボスイッチを接触させ、リボスイッチの活性化を評価し、もしリボスイッチが被検化合物によって活性化されるならば、リボスイッチを活性化する被検化合物を当該化合物として製造することによって化合物が作製できる。リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する能力について化合物を調査することとは、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断することが過去に知られていなかった化合物を特定すること、および、或る化合物がリボスイッチを活性化、不活性化または遮断する能力を評価すること［ここで、その化合物はリボスイッチを活性化、不活性化または遮断することが既にわかっている］の両方を指す。
【００２８】
新たなトリガー分子を認識する新たなリボスイッチおよび／または新たなアプタマーを選択、設計または誘導する方法もまた開示する。このような方法は、リボスイッチ中にアプタマー変異体の集合を作製し、目的化合物の存在下におけるその変異体リボスイッチの活性化を評価し、活性化された変異体リボスイッチ （または、例えば最も高度にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ） を選択し、そして、所望の活性、特異性、活性および特異性の組み合わせ、またはその他の性質の組み合わせを有する変異体リボスイッチが生成するまでこれらの工程を反復する事を含む。これらの方法により製造されたリボスイッチおよびアプタマードメインもまた開示する。
【００２９】
誘導体および組換え形態を包含する、開示したリボスイッチは、一般に、天然に存在するリボスイッチおよびde novo設計されたリボスイッチを包含する任意の供給源に由来するものであってよい。このような任意のリボスイッチを、開示した方法において、または開示した方法と共に使用することができる。しかしながら、種々のタイプのリボスイッチを定義することができ、そのようなサブタイプの幾つかが、特定の方法において、またはその方法と共に使用できる（一般的に本明細書の他所に記載する）。リボスイッチのタイプは、例えば天然に存在するリボスイッチ、天然に存在するリボスイッチの誘導体および修飾形態、キメラリボスイッチ、ならびに組換えリボスイッチを包含する。天然に存在するリボスイッチは、自然界に見いだされるリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。このような天然に存在するリボスイッチは、自然界に存在する天然リボスイッチの単離または組換え形態であってよい。即ち、このリボスイッチは、同じ一次構造を有するが、新たな遺伝的または核酸状況で単離または改変されている。キメラリボスイッチは、例えば、任意または特定のクラスまたはタイプのリボスイッチの一部分と、同じまたは異なるクラスまたはタイプの別のリボスイッチの一部；任意または特定のクラスまたはタイプのリボスイッチの一部と、任意の非リボスイッチ配列もしくは成分で構成されている。組換えリボスイッチは、新たな遺伝的または核酸状況で単離または改変されたリボスイッチである。
【００３０】
異なるクラスのリボスイッチとは、同じもしくは類似のトリガー分子を有するリボスイッチ、または、同じもしくは類似の全体構造（予測された、決定された、または組み合わせ）を有するリボスイッチを指す。同じクラスのリボスイッチは一般に、同じまたは類似のトリガー分子および同じまたは類似の全体構造の両者を有するが、そうである必要がある訳ではない。リボスイッチのクラスは、グリシン応答性リボスイッチ、グアニン応答性リボスイッチ、アデニン応答性リボスイッチ、リジン応答性リボスイッチ、チアミンピロ燐酸応答性リボスイッチ、アデノシルコバラミン応答性リボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド応答性リボスイッチ、およびS-アデノシルメチオニン応答性リボスイッチ、を包含する。
【００３１】
開示した方法および組成物のさらなる利点は、一部は以下の説明に開示し、一部はその説明から理解できるであろうし、または開示した方法および組成物の実施により習得できるであろう。開示した方法および組成物の利点は、付記した請求項に具体的に指摘した要素および組み合わせによって実現および達成できるであろう。前記の一般的説明および以下の詳細な説明は共に例示的および説明的であるに過ぎず、特許請求した本発明を限定するものでないことは明白である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
開示した方法および組成物は、以下に述べる具体的な態様の詳細な説明およびそこに含まれる実施例ならびに図面およびそれらの前および後の説明を参照することによって、より容易に理解できる。
【００３３】
或る種の天然mRNAは代謝産物感受性の遺伝スイッチとして働き、その場合、RNAは小有機分子に直接結合する。この結合プロセスはこのmRNAのコンホメーションを変化させ、それが種々の異なるメカニズムによって遺伝子発現の変化を惹起する。これらの天然「リボスイッチ」の改変型（様々な核酸工学的戦略を用いて創成される）は、特異的エフェクター化合物（本明細書ではトリガー分子と称する）により制御されるデザイナー遺伝スイッチとして利用できる。天然のスイッチは、抗生物質およびその他の小分子療法の標的である。さらに、リボスイッチの構造は、天然スイッチの実際の断片が、新たな非免疫原性遺伝調節エレメントの構築に使用されることを可能にする。例えば、新たな認識ドメインがユーザーの規定したエフェクター化合物によって遺伝的調節を惹起するよう、アプタマー（分子認識）ドメインを他の非天然アプタマーに交換（またはそれ以外の態様で修飾）することができる。変化したスイッチは治療計画の一部となり、蛋白合成を始動させたり、停止させたり、調節したりする。新たに構築された遺伝的調節ネットワークは、生体バイオセンサー、生物の代謝改変のような領域に、そして遺伝子治療処置の先進形態に応用できる。
【００３４】
典型的にはメッセンジャーRNAは、翻訳プロセス中に、蛋白-または小RNA-調節因子およびリボソームによって作用する遺伝情報の受動的担体であると考えられる。或る種のmRNAが天然アプターマードメインを持つこと、そしてこれらのRNAドメインへの、特定代謝産物の直接結合が、遺伝子発現の調節を導くことが発見された。天然リボスイッチは、通常天然RNAには随伴しない、二つの驚くべき機能を示す。第一に、このmRNAエレメントは、一つの構造が、その標的代謝産物のための正確な結合ポケットの働きをする、特異な構造状態をとることができる。第二に、代謝産物により誘発される、構造状態間のアロステリック相互変換は、幾つかの特異なメカニズムの一つにより遺伝子発現レベルの変化を惹起する。リボスイッチは典型的には二つの別々なドメインに分けられる：標的と選択的に結合するドメイン(アプタマードメイン)と、遺伝調節に影響を及ぼすドメイン(発現プラットフォーム)である。これら二つのドメイン間の活発な相互作用が、遺伝子発現の代謝産物依存性アロステリック調節を引き起こす。
【００３５】
リボスイッチの特異なクラスが特定されており、それらは活性化させる化合物（本明細書ではトリガー分子と称する）を選択的に認識することが示されている。例えば、補酵素B12、グリシン、チアミンピロ燐酸(TPP)、およびフラビンモノヌクレオチド(FMN)は、これらの化合物の代謝経路または輸送経路中の重要酵素をコードしている遺伝子に存在するリボスイッチを活性化する。各リボスイッチクラスのアプタマードメインは、高度に保存されたコンセンサス配列および構造に従う。したがって、配列相同性の探索を利用して、関連するリボスイッチドメインを特定できる。リボスイッチドメインは、細菌、古細菌、および真核生物由来の様々な生物で発見されている。
【００３６】
グアニンを認識し、これを他のプリン類似体の殆どに対して識別する、一つのクラスのリボスイッチが発見されている。グアニンリボスイッチのコンセンサス配列および構造特徴を有する代表的RNAは、原核生物の数多くの遺伝子の5’-非翻訳領域(UTR)に位置し、ここでプリンのサルベージおよび生合成に関わる蛋白の発現を制御する。この系統発生学的収集物のうち代表的な3つが、グアニンより数倍良好な解離定数(見掛けのKD)値を持つアデニンと結合する。このアデニンに対する選択性は、リボスイッチのコアにある一ヌクレオチド置換に起因し、その場合各々の代表物は、ワトソン／クリック塩基対を形成することによってその対応リガンドを認識する可能性が最も高い。さらに、Bacillus subtilisのydhL遺伝子に関連するアデニン特異的リボスイッチは、遺伝的「オン」スイッチとして機能し、その場合、アデニンの結合が、固有の転写ターミネーターステムの形成を不可能にする構造的再編成を惹起する。グアニン感知リボスイッチは、この化合物の濃度変化に応答して遺伝子発現を調節する、RNA遺伝調節エレメントの1クラスである。
【００３７】
Escherichia coli btuB mRNAの5’-非翻訳配列は、代謝監視および遺伝調節において、より積極的な役割を担う。このmRNAは、蛋白を必要とせずに補酵素B12と選択的に結合することにより、代謝を感知する遺伝スイッチとして働く。この結合事象は、リボソーム結合の阻害およびそれによって起こるコバラミン輸送蛋白BtuBの合成低下に寄与しているようである。この発見は、本明細書に記載の関連する知見と共に、RNA-代謝産物相互作用を介する代謝監視が遺伝調節の広範囲に及ぶメカニズムであるとの仮説を支持するものである。
【００３８】
チアミンピロ燐酸(TPP)リボスイッチが、その標的化合物のアロステリックセンサーとして働き、その際、アプタマードメインによるTPPの結合が、アプタマー内部および翻訳を妨げる近傍の発現プラットフォーム内部のコンホメーション状態を安定化することを、RNAの構造調査データが示している。発現プラットフォームの多様性は広範であるように見受けられる。thiM RNAは、シャイン・ダルガーノ(SD)-遮断メカニズムを利用して翻訳を制御する。これに対してthiC RNAは転写および翻訳の両方で遺伝子発現を制御し、故に、TPP結合事象を転写終結事象および完成したmRNAの翻訳阻害に変換する、幾分複雑な発現プラットフォームを利用しているのかも知れない。
【００３９】
グリシン感知リボスイッチおよびそれらの構成成分とのキメラリボスイッチと共にまたはその一部として利用できるその他のリボスイッチが多数知られている。そのようなリボスイッチの例およびそれらの用途は米国出願公開第2005-0053951号に記載されており、引用によりその全内容、特に特定リボスイッチの構造および動作の説明を本明細書の一部とする。
【００４０】
A. リボスイッチRNAの一般的機構
細菌のリボスイッチRNAは主として、特定mRNAの中心的コード領域の5’-非翻訳領域(5’-UTR)内に位置している。構造調査研究（下記に詳説する）により、リボスイッチエレメントが一般に二つのドメイン：リガンド結合ドメインとして働く天然アプタマー（T. Hermann, D. J. Patel, Science 2000, 287, 820；L.Gold, et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763）、および、遺伝子発現に関与するRNAエレメント （例えば、シャイン・ダルガーノ(SD)エレメント；転写ターミネーターステム） と連動する「発現プラットフォーム」、で構成されることが明らかになっている。これらの結論は、インビトロ合成されたアプタマードメインが発現プラットフォームの不在下で適当なリガンドに結合するという観察から導き出される（米国出願公開第2005-0053951号の実施例2、3および6を参照されたい)。さらに、構造調査研究は、殆どのリボスイッチのアプタマードメインは、個別に調べると、特定の二次および三次構造の折りたたみを採用し、それは5’リーダーRNA全体で調べると、そのアプタマー構造と本質的に同一であることを示唆している。この事は、多くの場合、アプタマードメインが、発現プラットフォームとは独立して折りたたまれる1個のモジュラー単位であることを意味している（米国出願公開第2005-0053951号の実施例2、3および6を参照されたい）。
【００４１】
最終的に、アプタマードメインのリガンド結合状態または非結合状態は、遺伝子発現への影響行使に関与する、発現プラットフォームによって説明できる。リボスイッチがモジュラーエレメントであるという見解は、アプタマードメインは様々な生物の間で（TPPリボスイッチについて観察されるように、界の間においてさえ）高度に保存されている（N. Sudarsan, et al., RNA 2003, 9, 644）が、これに対して発現プラットフォームは、配列、構造、および付加されたオープンリーディングフレームの発現が制御されるメカニズムの点で相違しているという事実によってさらに支持される。例えば、B. subtilisのtenA mRNAのTPPリボスイッチとのリガンド結合は、転写終結を引き起こす（A. S. Mironov, et al., Cell 2002, 111, 747）。この発現プラットフォームは、E. coli由来のthiM mRNA中のTPPリボスイッチの発現プラットフォーム（ここではTPP結合は、SD遮断メカニズムによって翻訳阻害を引き起こす）に比較して配列および構造が異なっている （米国出願公開第2005-0053951号の実施例2を参照されたい）。TPPアプタマードメインは容易に認識され、これら二つの転写ユニット間で殆ど同一の機能上の性質を持っているが、遺伝調節メカニズムおよびそれを実行する発現プラットフォームは非常に相違している。
【００４２】
リボスイッチRNAのアプタマードメインは、典型的には~70ないし170nt長の範囲である（米国出願公開第2005-0053951号の図11）。この知見は、インビトロ進化実験が、かなり短く構造的複雑性の低い、多岐にわたる小分子結合アプタマーを特定したことを考えると、幾分意外なものであった（T. Hermann, D. J. Patel, Science 2000, 287, 820；L. Gold, et al., Annual Review of Biochemistry 1995, 64, 763；M. Famulok, Current Opinion in Structural Biology 1999, 9, 324）。人工的アプタマーに比して天然アプタマー配列の複雑性および情報内容が実質的に増えている理由は依然として解明されていないが、この複雑性は、高い親和性および選択性をもって機能するRNAレセプターの形成に必要であると考えられる。リガンド-リボスイッチ複合体の見掛けのKD値は、低ナノモルないし低マイクロモルの範囲である。幾つかのアプタマードメインは、付属する発現プラットフォームから単離されると、標的リガンドについて、無傷のリボスイッチよりも改善された親和性（〜10ないし100倍）を示すということも、注目する価値がある（米国出願公開第2005-0053951号の実施例2を参照されたい）。恐らくは、全く無傷のリボスイッチRNAが要求する複数の異なったRNAコンホメーションのサンプリングにはエネルギーコストがかかり、それがリガンド親和性の喪失に反映されているのであろう。アプタマードメインは分子スイッチとして働かねばならないため、このこともまた天然アプタマーに対する機能的要求を増大させる可能性があり、それらのより精密化された構造を正当化するのに役立ち得るかも知れない。
【００４３】
B. 細菌における転写終結のリボスイッチ調節
細菌は、転写終結のために主として二つの方法を利用する。或る種の遺伝子は、Rho蛋白に依存性の終結シグナルを組み込んでおり（J. P. Richardson, Biochimica et Biophysica Acta 2002, 1577, 251）、一方、別の遺伝子は、転写延長複合体を不安定化させるためにRho-非依存性ターミネーター（固有ターミネーター）を利用する（I. Gusarov, E. Nudler, Molecular Cell 1999, 3, 495；E. Nudler, M. E. Gottesman, Genes to Cells 2002, 7, 755）。後者のRNAエレメントは、GCリッチステムループとこれに続く6-9個のウリジル残基のつながりで構成される。固有ターミネーターは細菌ゲノム全体に拡がっており（F. Lillo, et al., 2002, 18, 971）、典型的には遺伝子またはオペロンの3’末端に位置している。興味深いことに、5’-UTR内部に位置する固有ターミネーターについて観察された例数が増加しつつある。
【００４４】
細菌が利用している多種多様の遺伝調節戦略の中で、RNAポリメラーゼが5’-UTR内部の終結シグナルに、調節された方法で応答する例が増加しつつある（T. M. Henkin, Current Opinion in Microbiology 2000, 3, 149）。或る状態の間、このRNAポリメラーゼ複合体は、外部シグナルによって終結シグナルを認識するか無視するか、いずれかの指令を受ける。 転写開始は調節なしでも起こり得るが、mRNA合成（および遺伝子発現）に対する制御は、最終的には固有ターミネーターの調節によって指令される。恐らくは、少なくとも二つの相互に排他的なmRNAコンホメーションのうち一方が、転写終結のシグナルを送るRNA構造の形成または破壊をもたらすのであろう。幾つかの例ではRNAであり（F. J. Grundy, et al. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 2002, 99, 11121；T. M. Henkin, C. Yanofsky, Bioessays 2002, 24, 700）、また他の例では蛋白である（J. Stulke, Archives of Microbiology 2002, 177, 433）、トランス作動因子は、一般に、特定の細胞内シグナルの受け取りおよびそれに続く一方のRNAコンホメーションの安定化に必要とされる。リボスイッチは、RNA構造調節と、遺伝調節機構によって解釈される代謝シグナルとの間の直接的つながりを提供する。B. subtilis mRNA由来のFMNリボスイッチの簡単な概説を、このメカニズムを説明するために以下に供する。
【００４５】
xpt-pbuXオペロン（Christiansen, L.C., et al., 1997, J. Bacteriol. 179, 2540- 2550）は、グアニンに対して高親和性および高選択性を示すリボスイッチによって制御される。このクラスのリボスイッチは、12-遺伝子purオペロンのそれを包含する、B. subtilisの5個の転写ユニットの5’-非翻訳領域(5’-UTR)に存在する。mRNAによるグアニンの直接結合は、或る種の細菌において、プリン代謝の代謝ホメオスタシスの、重要な決定要素の役割を有する。さらに、7個の特異な標的分子に応答する、この発見されたリボスイッチのクラスは、中心的代謝経路にとって基本的な重要性を持つ、Bacillus subtilis中の少なくとも68個の遺伝子を制御する。
【００４６】
B. subtilis中に特定されたグアニンリボスイッチもまた開示する。細菌のプリンサルベージ経路中の一般的代謝産物であるヒポキサンチンに結合した、B. subtilisのxpt-pbuXオペロン由来のグアニンリボスイッチのプリン結合ドメインの、1.95Å分解能での結晶構造が明らかにされた。この構造は、リガンドをほぼ完全に包み込む結合ポケットを創成する、幾つかの系統発生的に保存されたヌクレオチドを含む複雑なRNA折り畳みを示す。ヒポキサンチンは、この構造を安定化して、下流の転写終結エレメントの形成を促すよう機能し、それによって、代謝産物の細胞内濃度増大に応答して遺伝子発現を直接抑制するメカニズムを提供する。
【００４７】
チアミン生合成に関わる或る種のmRNAは、蛋白因子が参加することなしに、チアミン(ビタミンB1)またはその生物活性ピロ燐酸誘導体(TPP)に結合する。このmRNA-エフェクター複合体は、リボソーム結合部位を隔離し遺伝子発現の低下を導く特異な構造を採用している。この代謝産物感知mRNA系は、その起源が蛋白の進化上の出現以前にさかのぼる、遺伝的「リボスイッチ」（本明細書ではリボスイッチと称する）の例を提供する。Escherichia coliのbtuB遺伝子のmRNAリーダー配列が選択的に補酵素B12と結合できる事、そして、この結合事象が遺伝調節にとって重要なRNA中の構造変化を引き起こすことが発見された（米国出願公開第2005-0053951号の実施例1を参照されたい）。さらに、チアミン生合成蛋白をコードしているmRNAもまたリボスイッチメカニズムを利用することが発見された（米国出願公開第2005-0053951号の実施例2を参照されたい）。
【００４８】
グリシンによって選択的に始動するリボスイッチのクラスが細菌中で発見された。Bacillus subtilis由来のこれらグリシン感知RNAの代表例は、gcνTオペロン（これはグリシン開裂系を形成する蛋白をコードしている）のためのまれな遺伝的オンスイッチとして作用する。大抵のグリシンリボスイッチは、 協力的に機能する2個のリガンド結合ドメインを統合して、二状態の遺伝スイッチにより近づくようにする。リボスイッチのこの進歩した形態は、過剰のグリシンを効率的に使用してクエン酸サイクルを介した炭素流入を提供し、蛋白合成に充分な量のアミノ酸を維持する事を確実とするために進化したのかも知れない。このように、リボスイッチは重要な調節的役割を演じ、かつて蛋白因子のみに観察されていた複雑な挙動特性を示す。
【００４９】
本明細書に開示した特定の天然リボスイッチは、代謝産物の結合によって遺伝子発現を制御するmRNAの最初の例であるが、この遺伝調節戦略は生物界に広く行き渡っていると予想される。TPP、補酵素B12およびFMNは、RNA世界の間に生物学的補助因子として出現した（Joyce,「RNAに基づく進化の古代」Nature 418, 214-221 (2002)）という事が示唆されている（White III,「初期代謝状態の化石としての補酵素」J. MoL Evol. 7, 101-104 (1976)；White III,「ピリジンヌクレオチド補酵素」Acad. Press, NY pp. 1-17 (1982)；Benner et al.,「RNA世界のパリンプセストとしての近代的代謝」Proc. Natl. Acad. ScL USA 86, 7054-7058 (1989)）。もしこれらの代謝産物が蛋白の出現前に生合成され使用されたとすれば、或る種のリボスイッチは、最も古代の遺伝調節形態の現代例ということになるかも知れない。ゲノム配列データベースの検索によって、TPPアプタマーに対応する配列が、細菌、古細菌および真核生物由来の生物に、概して大きな変化無しに存在することが明らかとなった。新たな代謝産物結合mRNAが進化に伴って出現する可能性はあるが、既知のリボスイッチはRNA世界からの分子化石であるという事もあり得る。
【００５０】
当然の事ながら、別途記載のない限り、開示した方法および組成物は、特定の合成法、特定の分析技術、または特定の試薬に限定されず、したがって変わり得る。本明細書で使用する用語は特定の態様のみを説明する目的のためのものであり、限定を意図するものでないこともまた明らかである。
【００５１】
材料
開示した方法および組成物のために使用できる、またはそれらと組み合わせて使用できる、またはそれらの製造に使用できる、またはそれらの生成物である、材料、組成物、および構成成分を開示する。これらのおよびその他の材料を本明細書に開示する。そして、これらの化合物の様々な個別的および集合的組み合わせならびに順列の具体的な一つ一つを明確に開示することはできないが、これらの材料の組み合わせ、部分集合、相互作用、群などを開示する時、それぞれが本明細書中で具体的に意図され説明されている事が理解できる。例えば、リボスイッチまたはアプタマードメインが開示および議論されており、且つそのリボスイッチまたはアプタマードメインを包含する幾つかの分子に対して施され得る幾つかの修飾が論じられているならば、リボスイッチまたはアプタマードメインの組み合わせおよび順列の各々および全て、ならびに可能な修飾は、これに反する具体的な指摘がない限り、個別的に企図されている。したがって、分子A、B、およびCのクラスならびに分子D、E、およびFのクラスが開示され、且つ組み合わせ分子A-Dの例が開示されているならば、各々が個別に列挙されていなくとも、それぞれが個別的および集合的に企図されている。即ち、この例では、A、B、およびC；D、E、およびF；ならびに組み合わせ例A-Dの開示から、組み合わせA-E、A-F、B-D、B-E、B-F、C-D、C-E、およびC-Fが個別的に企図され、開示されているものと考えるべきである。同様に、これらの任意の部分集合または組み合わせもまた個別的に企図され開示されている。したがって、A、B、およびC；D、E、およびF；ならびに組み合わせ例A-Dの開示から、例えばサブグループA-E、B-F、およびC-Eが個別的に企図され開示されていると考えるべきである。この概念を、開示した組成物を製造および使用する方法の工程を包含する（但しこれらに限定される訳ではない）、本出願の全ての側面に適用する。したがって、実施できる様々なさらなる工程がある時、これらさらなる工程の各々は、開示した方法の任意の特定の態様または態様の組み合わせを用いて実施でき、そして、このような組み合わせの各々が、個別的に企図され開示されていると考えるべきであることが理解できる。
【００５２】
A. リボスイッチ
リボスイッチは、発現されるべきRNA分子の一部であり、トリガー分子と結合した時に状態が変化する、発現調節エレメントである。リボスイッチは、典型的には二つの別々なドメインに分けられる：標的と選択的に結合するドメイン(アプタマードメイン)と、遺伝調節に影響を及ぼすドメイン(発現プラットフォームドメイン)である。遺伝子発現の代謝産物依存性アロステリック調節をもたらすのは、これら二つのドメイン間の活発な相互作用である。単離された組換えリボスイッチ、係るリボスイッチを含む組換え構築物、係るリボスイッチと機能的に結合した異種配列、および係るリボスイッチを担持する細胞およびトランスジェニック生物、リボスイッチ組換え構築物、ならびに異種配列と機能的に結合したリボスイッチを開示する。この異種配列は例えば、レポーター蛋白またはペプチドを包含する、目的蛋白またはペプチドをコードしている配列であってよい。好ましいリボスイッチは天然に存在するリボスイッチまたはそこから誘導されるリボスイッチである。
【００５３】
誘導体および組換え型を包含する、開示したリボスイッチは、一般に、天然に存在するリボスイッチおよびde novo設計されたリボスイッチを包含する任意の供給源由来のものであってよい。このような任意のリボスイッチを、開示した方法において、または該方法と共に使用できる。しかしながら、種々のタイプのリボスイッチを定義することができ、そのようなサブタイプの幾つかが、特定の方法において、またはその方法と共に使用できる（一般的に本明細書の他所に記載する）。リボスイッチのタイプは、例えば天然に存在するリボスイッチ、天然に存在するリボスイッチの誘導体および修飾形態、キメラリボスイッチ、ならびに組換えリボスイッチを包含する。天然に存在するリボスイッチとは、自然界に見いだされるリボスイッチの配列を有するリボスイッチである。このような天然に存在するリボスイッチは、自然界に存在する天然リボスイッチの単離または組換え形態であってよい。即ち、このリボスイッチは、同じ一次構造を有するが、新たな遺伝的または核酸状況で単離または改変されている。キメラリボスイッチは、例えば、任意または特定のクラスまたはタイプのリボスイッチの一部分と、同じまたは異なるクラスまたはタイプの別のリボスイッチの一部；任意または特定のクラスまたはタイプのリボスイッチの一部と、任意の非リボスイッチ配列もしくは成分で構成することができる。組換えリボスイッチは、新たな遺伝的または核酸状況で単離または改変されたリボスイッチである。
【００５４】
リボスイッチは、1個のまたは複数のアプタマードメインを有し得る。複数のアプタマードメインを持つリボスイッチ中のアプタマードメインは、トリガー分子の協力的結合を示すか、または、トリガー分子の協力的結合を示さない（即ち、そのアプタマーは協力的結合を示す必要がない）。後者の場合、アプタマードメインは独立結合体であると言うことができる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、1または複数の発現プラットフォームドメインを有し得る。例えば、トリガー分子の協力的結合を示す2個のアプタマードメインを有するリボスイッチは、両方のアプタマードメインによって調節される1個の発現プラットフォームドメインに結合できる。複数のアプタマーを有するリボスイッチは、リンカーを介して連結した1またはそれ以上のアプタマーを持つことができる。このようなアプタマーがトリガー分子に協力的結合を行う時、そのリンカーは協力的リンカーであってよい。
【００５５】
アプタマードメインがxおよびx−1［ここで、xは、協力的結合について分析されるアプタマードメインの数（またはアプタマードメイン上の結合部位の数）である］の間のヒル定数nを有する時、このアプタマードメインは協力的結合を示すと言える。したがって例えば、2個のアプタマードメインを持つリボスイッチ（例えばグリシン応答性リボスイッチ）は、そのリボスイッチが2および1の間のヒル定数を持つならば、協力的結合を示すと言える。使用する値xは、協力的結合について分析されるアプタマードメインの数に依存し、必ずしもそのリボスイッチ中に存在するアプタマーの数に依存する訳ではないことを理解すべきである。この事は、リボスイッチが複数のアプタマードメインを持ち、その幾つかだけが協力的結合を示す事があるため、意味をなす。
【００５６】
異なるクラスのリボスイッチとは、同じもしくは類似のトリガー分子を有するリボスイッチ、または、同じもしくは類似の全体構造（予測された、決定された、または組み合わせ）を有するリボスイッチを指す。同じクラスのリボスイッチは一般に、同じまたは類似のトリガー分子および同じまたは類似の全体構造の両者を有するが、そうである必要がある訳ではない。リボスイッチのクラスは、グリシン応答性リボスイッチ、グアニン応答性リボスイッチ、アデニン応答性リボスイッチ、リジン応答性リボスイッチ、チアミンピロ燐酸応答性リボスイッチ、アデノシルコバラミン応答性リボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド応答性リボスイッチ、およびS-アデノシルメチオニン応答性リボスイッチ、を包含する。
【００５７】
異種のアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインを含むキメラリボスイッチもまた開示する。即ち、キメラリボスイッチは、或る原料に由来するアプタマードメインおよび別の原料に由来する発現プラットフォームドメインで構成されている。この異種原料は、例えば異なる特定リボスイッチ、異なるタイプのリボスイッチ、または異なるクラスのリボスイッチに由来するものであってよい。異種アプタマーは非リボスイッチアプタマーに由来するものであってもよい。異種発現プラットフォームドメインもまた非リボスイッチ原料に由来するものであってよい。
【００５８】
リボスイッチは、その他の既知の、開発された、または天然に存在するリボスイッチから修飾することができる。例えば、スイッチドメイン部分は、そのリボスイッチの、既知のまたは予想される二次、三次、または二次および三次両構造を維持しつつ、1またはそれ以上のヌクレオチドを変化させることによって修飾できる。例えば、塩基対中の両方のヌクレオチドを、やはり塩基対を形成するヌクレオチドに変えることができる。塩基対合の保持を可能にする変化を、本明細書では塩基対保存的変化と称する。
【００５９】
インビトロ選択および進化技術を用いて、修飾されたまたは誘導体リボスイッチを作製することもできる。一般に、リボスイッチに適用されるインビトロ進化技術は、リボスイッチ配列の或る部分(群)は変化しているが、そのリボスイッチの別の部分は一定に保たれている、変異体リボスイッチの集合の作製を含む。次いで、この変異体リボスイッチの組の活性化、不活性化または遮断（またはその他の機能的または構造的基準）を評価し、目的とする基準に合致する変異体リボスイッチを、使用のためまたはさらなる回の進化のために選択する。変異体生成に有用なベースリボスイッチは、本明細書に記載の特定且つコンセンサスなリボスイッチである。コンセンサスリボスイッチを利用して、インビトロ選択および進化のために、リボスイッチのどの部分が変化するかという情報を得ることができる。
【００６０】
変化した調節を行う修飾リボスイッチもまた開示する。リボスイッチの調節は、アプタマードメインをリボスイッチの発現プラットフォームに機能的に結合させることによって変化させることができる（これはキメラリボスイッチである）。するとこのアプタマードメインは、例えばそのアプタマードメインに対するトリガー分子の作用によって、リボスイッチの調節を仲介できる。例えばリボスイッチの正常または天然アプタマードメインを新たなアプタマードメインに置き換えることを包含する任意の適当な方法で、アプタマードメインを、リボスイッチの発現プラットフォームドメインと機能的に結合させることができる。一般に、そのアプタマードメインが誘導されたリボスイッチを活性化、不活性化または遮断できる任意の化合物または条件を使用して、キメラリボスイッチを活性化、不活性化または遮断することができる。
【００６１】
不活性化されたリボスイッチもまた開示する。リボスイッチは、そのリボスイッチを共有結合的に変化させることによって不活性化できる（例えば、リボスイッチの一部を架橋することによって、またはリボスイッチに化合物を結合させることによって）。このような方法によるリボスイッチの不活性化は、例えばそのリボスイッチのためのトリガー分子の結合を妨げる、またはトリガー分子の結合時にリボスイッチの状態が変化するのを妨げる、またはトリガー分子の結合時にそのリボスイッチの発現プラットフォームドメインが発現に影響を及ぼすことを妨げる、といった変化から引き起こされ得る。
【００６２】
バイオセンサーリボスイッチもまた開示する。バイオセンサーリボスイッチは、同族トリガー分子の存在下で検出可能シグナルを生成する、人為的に改変されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値で、またはそれ以上のレベルで反応を誘発できる。バイオセンサーリボスイッチは、インビボまたはインビトロ使用のために設計できる。例えば、細胞または生物を、そのリボスイッチ／レポーターRNAをコードしている核酸構築物を担持するよう改変することによって、シグナルとしての役割を有する、またはシグナル産生に関与する蛋白をコードしているレポーターRNAと機能的に結合したバイオセンサーリボスイッチをインビボ使用できる。インビトロ使用のためのバイオセンサーリボスイッチの例は、そこからのシグナルがリボスイッチの活性化状態に応じて変化する、コンホメーション依存性標識を含むリボスイッチである。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは天然に存在するリボスイッチ由来の、またはそこから誘導されたアプタマードメインを使用する。バイオセンサーリボスイッチは様々な状況およびプラットフォームで使用できる。例えば、バイオセンサーリボスイッチは固体支持体、例えばプレート、チップ、ストリップおよびウェルと共に使用できる。
【００６３】
新たなトリガー分子を認識する、修飾されたまたは誘導体リボスイッチもまた開示する。新たなトリガー分子を認識する新たなリボスイッチおよび／または新たなアプタマーを、既知リボスイッチのために選択し、または設計し、またはそこから誘導することができる。これは、リボスイッチ中にアプタマー変異体の集合を製造し、目的化合物の存在下におけるその変異体リボスイッチの活性化を評価し、活性化された変異体リボスイッチ （または、例えば最も高度にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ） を選択し、そして、所望の活性、特異性、活性および特異性の組み合わせ、またはその他の性質の組み合わせを有する変異体リボスイッチが生成するまでこれらの工程を反復する事を含む。
【００６４】
特に有用なアプタマードメインは、本明細書でP1ステム構造（または単にP1）と呼ばれるステム構造を形成できる。種々のリボスイッチのP1ステムが、米国出願公開第2005-0053951号の図11に示されている。P1ステム構造中のハイブリダイズしている鎖をアプタマー鎖（P1a鎖とも言う）および対照鎖（P1b鎖とも言う）と称する。対照鎖は、アプタマー鎖および、調節鎖と呼ばれる連結した発現プラットフォーム中の配列（P1c鎖とも言う）の両者とステム構造を形成できる。したがって、対照鎖(P1b)は、アプタマー鎖(P1a)および調節鎖(P1c)と択一的ステム構造を形成できる。リボスイッチの活性化および不活性化は、ステム構造のうちの１つから別のステム構造へのシフトを産む（P1a/P1bからP1b/P1cへ、またはその逆）。P1b/P1cステム構造の形成は、リボスイッチを含むRNA分子の発現に影響を及ぼす。この制御メカニズムによって働くリボスイッチを、本明細書では代替ステム構造リボスイッチ（または択一的ステムリボスイッチ）と称する。2個のアプタマーを有する幾つかのグリシン応答性リボスイッチは、第二アプタマー中のP1ステムを用いるこのメカニズムを利用する。
【００６５】
一般に、発現プラットフォームドメイン中の調節鎖をアプタマードメインの対照鎖に相補的になるように設計または適合させる事によって、任意のアプタマードメインを任意の発現プラットフォームドメインとの使用に適合させることができる。或いは、アプタマーの配列およびアプタマードメインの対照鎖を、対照鎖が発現プラットフォーム中の機能的に重要な配列に相補的となるよう適合させる事ができる。例えば、対照鎖は或るRNAのシャイン・ダルガーノ配列に相補的となるよう適合させる事ができ、その結果、対照鎖とSD配列の間にステム構造が形成される時、SD配列はリボソームにアクセスできなくなり、したがって翻訳開始が低下または妨害される。アプタマー鎖は、そのアプタマードメインにおいてP1ステムを形成させる事に対応する、配列変化を有するであろう事に留意されたい。協同的結合を示す複数のアプタマーを有するリボスイッチの場合、活性化アプタマー（発現プラットフォームドメインと相互作用するアプタマー）のP1ステムのうち1個は、SD配列とステム構造を形成するよう設計する必要がある。
【００６６】
別の例として、RNA分子（そのRNAの非翻訳領域が最も好都合である）に転写ターミネーターを付加することができ、その場合、転写ターミネーターの配列の一部は、アプタマードメインの対照鎖に相補的である（その配列は調節鎖である）。このことによってアプタマードメインの対照配列が、アプタマー鎖および調節鎖と択一的ステム構造を形成することが可能となり、このようにして、そのリボスイッチの活性化または不活性化の際に転写ターミネーターが形成または破壊されることになる。同じような設計の択一的ステム構造により、他の任意の発現エレメントをリボスイッチの制御下におくことができる。
リボスイッチにより制御される転写ターミネーターに関して、転写速度およびリボスイッチと発現プラットフォームエレメントの間隔が、適正な制御のために重要である。転写速度は、例えば、転写を休止させリボスイッチにトリガー分子を形成および感知させるポリメラーゼ休止エレメント（例えば一連のウリジン残基）によって調整され得る。例えば、FMNリボスイッチがある場合、FMNがアプタマードメインと結合すると、抗ターミネーター配列が隔離され、抗ターミネーター構造の形成のために利用できない（米国出願公開第2005-0053951号の図12）。ところがFMNが無い場合には、抗ターミネーターは、いったんそのヌクレオチドがポリメラーゼから出現したならば、形成され得る。次いでRNAPが休止部位から自由になるが、結局は別のU-ストレッチに到達し、再度休止する。次いで、ターミネーターヌクレオチドが抗ターミネーターに拘束されていない場合にのみ、転写ターミネーターが形成される。
【００６７】
コード領域と機能的に結合したリボスイッチを含むRNAをコードしている核酸分子を含む、調節可能な遺伝子発現構築物［ここで、このリボスイッチは当該RNAの発現を調節し、リボスイッチおよびコード領域は異種である］を開示する。このリボスイッチは1個のアプタマードメインおよび1個の発現プラットフォームドメインを含むことができ、そのアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは異種である。このリボスイッチは1個のアプタマードメインおよび1個の発現プラットフォームドメインを含むことができ、そのアプタマードメインはP1ステムを含み、P1ステムはアプタマー鎖および対照鎖を含み、発現プラットフォームドメインは調節鎖を含み、調節鎖、対照鎖、またはその両方がステム構造を形成するように設計されていた。このリボスイッチは、2またはそれ以上のアプタマードメインおよび1個の発現プラットフォームドメインを含むことができ、そのアプタマードメインの少なくとも1個と発現プラットフォームドメインは異種である。このリボスイッチは、2またはそれ以上のアプタマードメインおよび1個の発現プラットフォームドメインを含むことができ、そのアプタマードメインの少なくとも1個はP1ステムを含み、P1ステムはアプタマー鎖および対照鎖を含み、発現プラットフォームドメインは調節鎖を含み、調節鎖、対照鎖、またはその両方がステム構造を形成するように設計されていた。
【００６８】
天然に存在するリボスイッチの非天然誘導体であるリボスイッチを開示する。このリボスイッチは1個のアプタマードメインおよび1個の発現プラットフォームドメインを含むことができ、そのアプタマードメインおよび発現プラットフォームドメインは異種である。このリボスイッチは、天然に存在するグアニン応答性リボスイッチ、アデニン応答性リボスイッチ、リジン応答性リボスイッチ、チアミンピロ燐酸応答性リボスイッチ、アデノシルコバラミン応答性リボスイッチ、フラビンモノヌクレオチド応答性リボスイッチ、グリシン応答性リボスイッチ、またはS-アデノシルメチオニン応答性リボスイッチから誘導できる。このリボスイッチはトリガー分子によって活性化される［ここで当該リボスイッチは、トリガー分子により活性化される時、シグナルを生成する］。
【００６９】
表5は、種々のグアニンリボスイッチの例を開示するものである。表5にある配列のアラインメントは、INFERNALソフトウェアパッケージのcmalignプログラムによる出力のストックホルムフォーマットによる。表5中の最後の二つの項目は、Eddy, S. R.(2003). INFERNAL. Version 0.55に記載のコンピューターアルゴリズムが反映されたモチーフのコンセンサス配列および構造を反映している。著者により配布。Dept. of Genetics, Washington University School of Medicine. St. Louis, Missouri。米国出願公開第2005-0053951号の図41は、コンセンサスリボスイッチ配列、天然リボスイッチ配列、およびリボスイッチ配列アラインメントを記載している。アデニンリボスイッチRNAに結合した種々の核酸塩基の熱力学的パラメータを表7に示す。グアニンリボスイッチRNAに結合した種々の核酸塩基の熱力学的パラメータを表8に示す。
【００７０】
数多くのリボスイッチおよびリボスイッチ構築物を本明細書に記載し言及する。いかなる特定のリボスイッチもしくはリボスイッチ構築物またはリボスイッチもしくはリボスイッチ構築物の群も、本明細書に開示する発明の幾つかの態様から除外できる。例えば、xpt-pbuXリボスイッチとレポーター遺伝子の融合を、レポーター遺伝子に融合したリボスイッチの集合から除外することができる。別の例としては、表5に列挙したリボスイッチの任意の組み合わせを、開示した方法および組成物の任意の態様に個別的に包含させ、またはそれらから個別的に除外することができる。
【００７１】
1. アプタマードメイン
アプタマーは、特定の化合物およびクラスの化合物と選択的に結合できる、核酸セグメントおよび構造である。リボスイッチは、トリガー分子との結合時にそのリボスイッチの状態または構造の変化をもたらす、アプタマードメインを持っている。機能的リボスイッチにおいては、トリガー分子がアプタマードメインに結合する時、そのアプタマードメインに結合した発現プラットフォームドメインの状態または構造が変化する。リボスイッチのアプタマードメインは、例えばリボスイッチの天然アプタマードメイン、人工的アプタマー、改変された、選択された、進化したまたは誘導されたアプタマーもしくはアプタマードメインを包含する任意の供給源から誘導できる。リボスイッチ中のアプタマーは一般に、例えばステム構造を形成することによって、連結した発現プラットフォームドメインの一部と相互作用する部分を少なくとも1個持っている。このステム構造は、トリガー分子と結合する時に形成されるか、または破壊される。
【００７２】
種々の天然リボスイッチのコンセンサスアプタマードメインが、米国出願公開第2005-0053951号の図11および本明細書の他所に示されている。これらのアプタマードメイン（そこに具体化されている全ての直接変異体を包含する）をリボスイッチに使用できる。コンセンサス配列および構造とは、配列および構造の変異を示す。示された変異の範囲内のアプタマードメインを、本明細書において直接変異体と称する。これらのアプタマードメインを修飾して、修飾または変異体アプタマードメインを作ることができる。保存的修飾は、その対にあるヌクレオチドが相補性を維持しているような、塩基対形成しているヌクレオチドの任意の変化を包含する。中等度修飾は、指示された長さの範囲の20%またはそれ以下である、ステムまたはループ（それについて長さまたは長さの範囲が示されている）の長さの変化を包含する。それについてコンセンサス構造が、特定の長さを持つステムまたはループを示している場合、または一定範囲の長さを列挙もしくは述べている場合二、ループおよびステム長が「指示されている」と考える。中等度修飾は、指示された長さ範囲の40%またはそれ以下である、ステムまたはループ（それについて長さまたは長さの範囲が示されている）の長さの変化を包含する。中等度修飾はさらに、アプタマードメインの非特定部分の機能的変異体を包含する。アプタマードメインの非特定部分は、米国出願公開第2005-0053951号の図11に実線で示されている。
【００７３】
発現プラットフォームおよびRNA分子と共に使用するためにアプタマードメインを適合させる際に、P1ステムおよびその構成鎖を修飾することができる。伸張的であることもあるこのような修飾は、本明細書ではP1修飾と称する。P1修飾は、アプタマードメインのP1ステムの配列および／または長さに対する変更を包含する。
【００７４】
米国出願公開第2005-0053951号の図11に示されているアプタマードメイン（任意の直接変異体を包含する）は、インビトロ選択またはインビトロ進化技術によって誘導されるアプタマードメインを作製するための出発配列として特に有用である。
【００７５】
開示したリボスイッチのアプタマードメインはさらに、他の任意の目的のために、そして他の任意の状況で、アプタマーとして利用できる。例えば、リボザイム、他の分子スイッチ、および構造変化がRNAの機能に影響を及ぼし得る任意のRNA分子を制御するために、アプタマーを利用することができる。
【００７６】
2. 発現プラットフォームドメイン
発現プラットフォームドメインは、そのリボスイッチを含むRNA分子の発現に影響を及ぼす、リボスイッチの一部分である。発現プラットフォームドメインは一般に、例えばステム構造を形成することにより、連結したアプタマードメインの一部と相互作用できる部分を少なくとも1個持っている。このステム構造は、トリガー分子と結合する時に形成されるか、または破壊される。ステム構造は一般に、発現調節構造であるか、または発現調節構造の形成を妨げる。発現調節構造は、その構造を含むRNA分子の発現を可能にする、妨げる、増強する、または阻害する構造である。例としてシャイン・ダルガーノ配列、開始コドン、転写ターミネーター、ならびに安定性およびプロセシングシグナルがある。
【００７７】
B. トリガー分子
トリガー分子は、リボスイッチを活性化できる分子および化合物である。これには、リボスイッチのための天然または正常なトリガー分子およびリボスイッチを活性化できるその他の化合物がある。天然または正常トリガー分子とは、自然界にある、与えられたリボスイッチのためのトリガー分子であるか、または、幾つかの非天然リボスイッチの場合には、リボスイッチをそれに対して設計した、またはリボスイッチをそれを用いて選択した、トリガー分子である（例えばインビトロ選択またはインビトロ進化技術のように）。
【００７８】
C. 化合物
リボスイッチを活性化、不活性化または遮断できる化合物、および係る化合物を含有する組成物もまた開示する。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を制御するよう機能する。リボスイッチを活性化、不活性化または遮断するために化合物が使用できる。リボスイッチのトリガー分子（およびその他の活性化化合物）を使用してリボスイッチを活性化できる。トリガー分子以外の化合物は一般に、リボスイッチの不活性化または遮断に使用できる。さらに、例えばトリガー分子をリボスイッチから除去することによってリボスイッチを不活性化することができる。例えばリボスイッチを活性化しないトリガー分子の類似体と結合させることにより、リボスイッチを遮断することができる。
【００７９】
RNA分子またはRNA分子をコードしている遺伝子の発現を変えるための化合物もまた開示する［ここで、RNA分子はリボスイッチを包含する］。これは、化合物をRNA分子と接触させる事により達成できる。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を制御するよう機能する。したがって、リボスイッチを含む目的RNA分子を、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する条件におくことを利用して、そのRNAの発現を変えることができる。例えば転写の終結またはRNAに対するリボソーム結合遮断の結果、発現が変わり得る。トリガー分子の結合は、リボスイッチの性質に応じて、RNA分子の発現を低下もしくは防止、またはRNA分子の発現を促進もしくは増大させ得る。
【００８０】
RNA分子またはRNA分子をコードしている遺伝子の発現を調節する化合物もまた開示する。リボスイッチを含む、天然に存在する遺伝子またはRNAの発現を、そのリボスイッチを活性化、不活性化または遮断することによって調節する化合物もまた開示する。遺伝子が、それを担持している細胞または生物の生存に必須である場合、そのリボスイッチの活性化、不活性化または遮断は、その細胞または生物の死、静止または衰弱をもたらす。
【００８１】
リボスイッチを含む、単離され、改変されまたは組み換えられた遺伝子もしくはRNAの発現を、そのリボスイッチを活性化、不活性化または遮断することによって調節する化合物もまた開示する。遺伝子が所望の発現生成物をコードしているならば、そのリボスイッチの活性化または不活性化を利用して、当該遺伝子の発現を誘起し、そのようにして発現生成物の生成をもたらすことができる。遺伝子が遺伝子発現または別の細胞プロセスのインデューサーまたはリプレッサーをコードしているならば、リボスイッチの活性化、不活性化または遮断は、別の、調節された遺伝子または細胞プロセスの誘導、抑制または脱抑制をもたらし得る。このような二次調節効果が多数知られており、それらをリボスイッチとの使用に適合させることができる。このような調節のための一次制御としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小さな非抗原性分子であることである。
【００８２】
リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する化合物を特定する方法もまた開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物は、被検化合物およびリボスイッチを接触させ、リボスイッチの活性化を評価することによって特定できる。もしリボスイッチが活性化されたならば、被検化合物はリボスイッチを活性化する化合物と特定される。リボスイッチの活性化は任意の適当な方法で評価できる。例えば、リボスイッチをレポーターRNAに結合させ、そのレポーターRNAの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、被検化合物の存在下または不在下で測定できる。もう一つの例として、リボスイッチは、そこからのシグナルがリボスイッチの活性化状態に応じて変化するコンホメーション依存性標識を含むことができる。このようなリボスイッチは、好ましくは天然に存在するリボスイッチに由来する、またはそれから誘導されるアプタマードメインを利用する。以上のように、リボスイッチの活性化の評価は、対照検定もしくは測定を利用して、または対照検定もしくは測定を利用せずに実施できる。リボスイッチを不活性化する化合物を特定する方法も同様にして達成できる。
【００８３】
リボスイッチを遮断する化合物の特定は任意の適当な方法で達成できる。例えば、リボスイッチを活性化または不活性化することがわかっている化合物の存在下で、且つ被検化合物の存在下で、リボスイッチの活性化または不活性化を評価するための検定を実施できる。もし、被検化合物の不在下で観察されるように活性化または不活性化が観察されなかったならば、その化合物を、リボスイッチの活性化または不活性化を遮断する化合物と特定する。
【００８４】
リボスイッチの原子結晶構造を用いて化合物を特定することもできる。天然グアニン応答性リボスイッチのこうした結晶原子構造の例を、図5に見いだすことができる。この原子構造の原子座標を表6に列挙する。図5に、ヒポキサンチンに結合したリボスイッチを示す。この例では、細菌のプリンサルベージ経路中の一般的代謝産物であるヒポキサンチンに結合した、B. subtilisのxpt-pbuXオペロン由来のグアニンリボスイッチのプリン結合ドメインの、1.95Å分解能での結晶構造を示す。この構造は、リガンドを殆ど完全に包み込む結合ポケットを創成する、幾つかの系統発生的に保存されたヌクレオチドを含む複雑なRNA折り畳みを明らかにしている。ヒポキサンチンは、この構造を安定化し下流の転写ターミネーターエレメントの形成を促すよう機能し、それによって代謝産物の細胞内濃度の増大に応答して遺伝子発現を直接抑制するメカニズムを提供する。
【００８５】
例えば、被検化合物を伴うリボスイッチの原子構造をモデル作製し、被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかを判定することにより、リボスイッチの結晶構造を用いて化合物を特定することができる。これは、リボスイッチのモデル中の被検化合物について、予測された最小相互作用エネルギー、予測された結合定数、予測された解離定数、または組み合わせを利用することによって実施できる。例えば、リボスイッチとリボスイッチに結合することがわかっている化合物（例えばトリガー分子）の間のフィットを評価し、化合物の結合時に明らかな副作用無しに、または殆ど無しにその化合物が変化を受け得る部位を特定し、そして、新たな化合物を作製するためにそのような変化を1またはそれ以上組み込む事により、化合物を特定することもできる。リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法は、そのように特定された化合物の作製をも含み得る。
【００８６】
典型的には、この方法は最初に、化合物（「既知化合物」または「既知標的」とも言う）を伴うリボスイッチの三次元構造を利用する。本明細書に開示する任意のトリガー分子および化合物を、そのような既知化合物として利用できる。リボスイッチの構造は、任意の既知手段、例えば結晶学または溶液NMR分光法を用いて決定できる。その構造は、コンピューター分子モデル作製シミュレーションプログラム、例えばAutoDockによって取得することもできる。この方法は、リボスイッチおよびそのリボスイッチのための可能性ある化合物の間の結合量、例えば結合エネルギーを決定する事を含み得る。活性化合物とは、リボスイッチに対して何らかの活性を有する化合物、例えばリボスイッチの活性を阻害またはリボスイッチの活性を増強する化合物である。さらに、この、可能性ある化合物は、該分子のための既知化合物と何らかの構造関係を有する類似体であるかも知れない。トリガー分子、既知化合物、および本明細書に開示の化合物のうちいかなるものも、可能性ある化合物の基礎として、またはこれを誘導するために利用することができる。
【００８７】
既知化合物および可能性ある化合物の構造、性質、相互作用または結合パラメータなどの一致または関係を、幾つかの方法で表示することができる。例えば、構造モデルを用いて測定または評価できる任意の測定値または相互作用パラメータ、ならびに、既知化合物および可能性ある化合物について得られるこのような測定値およびパラメータを比較できる。既知化合物および可能性ある化合物の全体としての一致を観察できることがある。また、可能性ある化合物、例えば類似体と、既知化合物が、その可能性ある化合物がリボスイッチと相互作用するドメインのみで一致することを観察できる場合もある。また、可能性ある化合物および既知化合物の、サブドメインレベルでの一致、例えば、既知化合物においてリボスイッチと接触している部分または原子の7Å、6Å、5Å、4Å、3Å、または2Å以内にある、可能性ある化合物中の部分または原子のみでの一致が観察されることもある。一般に、サブドメインが特異的であればあるほど、可能性ある化合物の部分および既知化合物の部分の一致は高まる。例えば、全体としての既知化合物および可能性ある化合物の間には、30%またはそれ以上、35%またはそれ以上、40%またはそれ以上、45%またはそれ以上、50%またはそれ以上、55%またはそれ以上、60%またはそれ以上、65%またはそれ以上、70%またはそれ以上、75%またはそれ以上、80%またはそれ以上、85%またはそれ以上、90%またはそれ以上、95%またはそれ以上の一致が存在し得、既知化合物および可能性ある化合物の結合ドメインの間には、50%またはそれ以上、55%またはそれ以上、60%またはそれ以上、65%またはそれ以上、70%またはそれ以上、75%またはそれ以上、80%またはそれ以上、85%またはそれ以上、90%またはそれ以上、95%またはそれ以上の一致が存在し得、そして、リボスイッチと相互作用する部分または原子の5Å以内にある既知化合物の部分または原子に対応する、可能性ある化合物の部分または原子の間には、70%またはそれ以上、75%またはそれ以上、80%またはそれ以上、85%またはそれ以上、90%またはそれ以上、95%またはそれ以上の一致が存在し得る。もう一つのサブドメインは、リボスイッチと実際に接触する部分または原子のサブドメインである。この場合、一致は、例えば50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、またはそれ以上となり得る。
【００８８】
典型的には、可能性ある化合物は、可能性ある化合物のファミリー、即ち類似体の集合内に存在し、それらは全てそのリボスイッチのための既知化合物に対し何らかの構造的関係を有する。いかなる数の成員で構成されるファミリーもスクリーニングできる。ファミリー成員の最大数は、所望の時間で各成員をスクリーニングするのに利用できるコンピューターの性能にのみ制限を受ける。その方法は、少なくとも1個の、リボスイッチの鋳型構造、および標的（これはしばしば既知の標的である）を含み得る。この構造が実在する必要はない。何故ならこれは、幾つかの場合には開示の方法の際、標準的構造決定技術を用いて作製できるためである。この方法を使用する時点で実際の構造が存在することが好ましい。
【００８９】
この方法はさらに、既知化合物の構造からの情報を利用して、可能性ある化合物の構造をモデル作製することを含み得る。このモデル作製は本明細書に記載のように任意の方法で実施できる。
【００９０】
可能性ある化合物のコンホメーションおよび位置は、計算の間固定しておくことができる。即ち、リボスイッチは、既知化合物に対するのと全く同じ向きで、可能性ある化合物に結合するとみなす。
【００９１】
次に、リボスイッチおよび可能性ある化合物の間の結合エネルギー（またはその他の性質もしくはパラメータ）が決定でき、そして、その結合エネルギー（またはその他の性質もしくはパラメータ）が或る基準に合致するならば、その可能性ある化合物を現実の化合物、即ちリボスイッチと相互作用しそうな化合物であると決定できる。以下に結合エネルギーの使用に言及するが、化合物とリボスイッチの相互作用またはモデル作製に関連する任意の性質またはパラメータを利用できることを理解すべきである。基準は、リボスイッチと可能性ある化合物との、コンピューター計算された結合エネルギーが、同じリボスイッチと既知化合物のコンピューター計算された結合エネルギーと同様であるか、またはより好ましい値であることであってよい。例えば、実際の化合物は、本明細書に記載のコンピューター計算された結合エネルギーが、既知化合物の結合エネルギーの、例えば少なくとも60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%、101%、102%、103%、104%、105%、106%、107%、108%、109%、110%、120%、130%、140%、150%、200%、250%、300%、350%、400%、450%、500%、600%、700%、800%、900%、1000%、またはそれ以上である化合物であってよい。実際の化合物はさらに、可能性ある全化合物をそれらの結合エネルギーの強さの順に並べた時、例えば可能性ある化合物の集合中の［ここでこの集合は、少なくとも、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、350、400、500、700、または1000の可能性ある化合物である］コンピューター計算された結合強度について上位20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1% の化合物であってよい。
【００９２】
本明細書に開示のように、いったん可能性ある化合物が特定されたならば、従来の試験および分析、例えばリボスイッチと相互作用するおよび／またはリボスイッチを調節する、実際の化合物の能力をさらに特定するために、リボスイッチおよび実際の化合物を用いる生物検定が実施できる。開示した方法は、リボスイッチおよび化合物の活性を検定する工程、および、例えばリボスイッチに基づくライブラリーを用いて組み合わせ化学研究を実施する工程を包含し得る。
【００９３】
エネルギー計算は、例えば分子または量子力学を基礎とすることができる。分子力学は、結合伸縮、ファン・デル・ワールス力、または静電相互作用のような総エネルギーの成分を表す一連の経験的関数を合計することにより、系のエネルギーを近似する。量子力学法は、様々な程度の近似を用いてシュレディンガー等式を解くために様々な近似度を使用する。これらの方法は電子構造を取り扱い、化学反応の特性解明を可能にする。
【００９４】
リボスイッチの可能性ある化合物を特定できる。これは、既知化合物に対して所定の類似性を有する、可能性ある化合物を選択することによって達成できる。例えば、既知化合物と同じファミリーの化合物を選択できる。
【００９５】
計算のための各リボスイッチを製造するために、解明されていないまたは可能性ある化合物の結晶構造に無い原子を組み込むことができる。これは、例えばPRODRGウェブサーバーhttp://www.davapc1.bioch.dundee.ac.uk./programs/prodrg、または、InsightII、Quanta（共にwww.accelrys.com）、CNS（Brunger et al.,「 結晶学およびNMRシステム：高分子構造決定のための新たな一組のソフトウェア」Acta Crystallogr. D 54, 905-921(1998)）のような標準分子モデル作製プログラム、または、リボスイッチ構造を製造できるその他任意の分子モデル作製系を用いて実施できる。
【００９６】
次いで、可能性ある化合物およびリボスイッチの結合エネルギー（またはその他の性質もしくはパラメータ）を計算する。これを実施するために、多数の手段がある。例えば、可能性ある化合物-分子のエネルギーを、モデル内部の全ての原子対の間の静電およびファン・デル・ワールス相互作用の総和としてモデル作製する、経験的関数を用いて、側鎖位置のサンプリングおよび結合熱力学のコンピューター計算が遂行できる。可能性ある化合物とリボスイッチの結合エネルギーを採点するための、その他任意のコンピューター方法が利用できる（H. Gohlke, & G. Klebe. 「高分子レセプターに対する小分子リガンドの結合親和性の説明および予測へのアプローチ」Angew. Chem. Int. Ed. 41, 2644-4676 (2002)）。このような採点方法の例には、AutoDock（G. M. Morris et al. 「ラマルク遺伝アルゴリズムおよび経験的結合自由エネルギー関数を用いた自動ドッキング」J. Comput. Chem. 19, 1639-1662 (1998)）、Gold （G. Jones et al.「脱溶媒和の説明を伴う遺伝アルゴリズムを用いたレセプター部位の分子認識」J. Mol. Biol. 245, 43-53 (1995)）、Chem-Score （M. D. Eldridge et al. J. Comput-Aided Mol. Des. 11, 425-445 (1997)）およびDrug-Score （H. Gohlke et al.「蛋白-リガンド相互作用を予測する、知識に基づく採点関数」 J Mol. Biol. 295, 337-356 (2000)）といったプログラムで遂行される方法が包含されるが、これらに限定される訳ではない。
【００９７】
回転異性体ライブラリーは当業者に公知であり、インターネットを包含する様々な供給源から取得できる。回転異性体は、低エネルギー側鎖コンホメーションである。回転異性体ライブラリーの使用は、最も可能性の高い側鎖コンホメーションを試行するための構造のモデル作製、時間の節約、および、より正しそうな構造の作製を可能にする。回転異性体ライブラリーの使用は、可能性ある化合物の所定領域内、例えば結合部位、または該化合物の定められた距離内にある残基に限定され得る。後者の距離は任意の所望の長さに設定でき、例えば、可能性ある化合物は、その分子の任意の原子から2、3、4、5、6、7、8、または9Åにあってよい。
【００９８】
あらゆる原子対の間の静電相互作用は、例えば式：
Eelec ＝ 332.08 q1q2 /εг
［式中、q1およびq2は、部分原子電荷であり、rはそれらの間の距離であり、そしてεは誘電率である］
を有するクーロンモデルを用いて算出できる。
【００９９】
部分原子電荷は、分子の電荷分布を説明するために考案された既存のパラメータの集合から取得できる。パラメータ集合の例は、PARSE （D. A. Sitkoff et al. 「巨視的溶媒モデルを用いた水和自由エネルギーの精密な計算」J. Phys. Chem. 98, 1978-1988 (1994)）、CHARMM（(MacKerell et al. 「蛋白の分子モデル作製および力学的研究のための全原子経験ポテンシャル」 J. Phys. Chem. B 102, 3586-3616, 1998） およびAMBER （W. D. Cornell et al. 「蛋白、核酸、および有機分子のシミュレーションのための第二世代力場」 J. Am. Chem. Soc. 117. 5179-5195 (1995)）を包含するが、これらに限定されない。原子の部分電荷を、類似官能基から類推することによって、またはPRODRGサーバー（D. M. F. van Aalten et al. 「PRODRG。小分子の座標から分子トポロジーおよび独自の分子記述子を作成するためのプログラム」J. Comput.-Aided Mol. Design 10, 255-262 (1996)）で遂行されるような実験的帰属法によって、または標準量子力学計算法（例えば、C. I. Bayly et al.「原子電荷誘導に電荷制限を使用する、良好にふるまう静電ポテンシャルに基づく方法 − RESPモデル」J. Phys. Chem. 91, 10269-10280, (1993)）の使用によって帰属させることができる。
【０１００】
静電相互作用は、静電的脱溶媒和効果を取り入れた、より精緻な方法で計算することもできる。これは、陽的溶媒および陰的溶媒モデルを包含する。前者では水分子が計算に直接含まれ、一方後者では、水の効果を誘電連続体アプローチによって説明する。静電相互作用を計算するための陰的溶媒法の具体例は、Poisson-Boltzmannに基づく方法およびGeneralized Born法（M. Feig & C. L. Brooks「生体分子のシミュレーションにおける陰的溶媒モデルの開発および応用における最近の進歩」Curr. Opin. Struct. Biol. 14, 217-224 (2004)）を包含するが、これらに限定される訳ではない。
【０１０１】
原子対（ここで、両原子は硫黄または炭素のいずれかである）の間のファン・デル・ワールスおよび疎水性相互作用は、簡単なレナード・ジョーンズ形式を用いて以下の等式で計算できる：
Evdw = E｛σatt12/r12 − σatt6/r6｝
［式中、Eはエネルギーであり、rは2個の原子の距離であり、そしてσattは相互作用のエネルギーが0である距離である］。
【０１０２】
原子対（ここで、一方または両方の原子は硫黄でもなく炭素でもない）の間のファン・デル・ワールス相互作用は、単純な反発エネルギー項：
Evdw = E｛σrep12/r12｝
［式中、Eはエネルギーであり、rは2個の原子の距離であり、そしてσrepは反発相互作用がEに等しい距離を決定する］
を用いて計算できる。
【０１０３】
原子間の疎水性相互作用もまた、当業者の知悉するその他様々な方法を用いて計算できる。例えば、複合体が形成される時に埋没するリガンドおよびレセプターの溶媒アクセス可能表面積に比例するとして、エネルギー寄与が計算できる。このような寄与は、例えばStreet & Mayoの提唱した方法（A. G. Street & S. L. Mayo「蛋白溶媒アクセス可能表面積の対計算」Folding & Design 3, 253-258 (1998))）で、原子対間の相互作用の観点から表現できる。疎水性またはファン・デル・ワールスまたはその他のエネルギー寄与のための、他の任意の形式の実施を計算に含めることができる。
【０１０４】
各々の可能性ある化合物-リボスイッチ相互作用について結合エネルギーを計算できる。例えば、モンテ・カルロサンプリングをリボスイッチの存在下および不在下で遂行し、各シミュレーションにおける平均エネルギーを算出できる。次いでリボスイッチと可能性ある化合物の結合エネルギーを、算出された二つの平均エネルギーの差異として計算できる。
【０１０５】
可能性ある化合物とリボスイッチの、コンピューター計算された結合エネルギーを、既知化合物とリボスイッチのコンピューター計算された結合エネルギーと比較して、可能性ある化合物が実際の化合物でありそうかどうかを判定することができる。次にこれらの結果を、リボスイッチおよび化合物間の実際の相互作用を測定した実験データを用いて確認する。リボスイッチと化合物の間の実際の相互作用を決定するのに使用できる方法の例は、平衡透析測定（リボスイッチに対する放射性形態の化合物の結合を検出する）、酵素阻害検定（該化合物の存在下および不在下でリボスイッチの活性を監視できる）、および化学シフト摂動測定（可能性ある化合物に対するリボスイッチの結合を、原子のNMR化学シフトの変化を観察することによって監視する）を包含するがこれらに限定されない。
【０１０６】
上に開示の方法において、リボスイッチは例えばグアニンリボスイッチであってよい。このリボスイッチは、例えば表5のリボスイッチから選択できる。
リボスイッチの原子結晶構造を、可能性ある化合物を用いてモデル作製した後、リボスイッチと該化合物の間の実際の相互作用を決定するためにさらなる試験を実施できる。例えば、ゲル型およびチップ型検出法を用いるアロステリックリボザイム検定、ならびにインラインプロービング検定を包含する、数多くの異なるアプローチを利用して、結合RNAを検出できる。高スループット試験もまた、例えば蛍光検出法を利用して実施できる。例えば、RNA開裂性リボザイムを活性化することにより遺伝子発現を制御する、グルコサミン-6-燐酸感知リボスイッチの天然触媒活性を利用できる。このリボザイムを再構成して、複数の代謝回転速度を持つ別々の基質分子を開裂させることができる。故に、或る化合物がリボザイム機能の引き金を引くと、消光基の近傍に保持された蛍光基は解放される（したがって、より蛍光性となる）。第二に、分子ビーコン技術を使用できる。これは、ビーコンがリボスイッチRNAとドッキングするのを或る化合物が妨げる時に、蛍光を抑制するような系を作り出す。いずれのアプローチも、本明細書に記載のRNA設計戦略を用いることにより任意のリボスイッチクラスに応用できる。
【０１０７】
本明細書に開示したグアニンリボスイッチと相互作用する類似体も、本明細書に開示する。このような類似体の例は図12Bに見いだすことができる。合成され試験された26の化合物の多くが、グアニンと同じまたはより良好な定数でグアニンリボスイッチに結合する(-5nM)。極めて可変性の化学組成物への付加物が機能を発現するという事実は、これらの化学的スカホールドの変形物を数多く作製して、その機能をインビトロおよび細胞内で試験できることを示している。特に、これらの化合物のさらなる修飾版は、RNA構造内の他の官能基に新たに接触することにより、グアニンリボスイッチとの結合を改善できる。さらに、バイオアベイラビリティー、毒性、および合成容易性(数ある性質の中で特に)の調節が、これら二つのスカホールド領域に修飾を施すことによって調節可能であるが、それは、これらの部位において多くの修飾が可能である事を、リボスイッチの構造モデルが示しているためである。
【０１０８】
高スループットスクリーニングを利用して、標準的または非標準的いずれかの様式の分子認識で、やはりリボスイッチRNAに結合する全く新しい化学的スカホールドを明らかにすることもできる。リボスイッチは発見された最初の天然代謝産物結合RNAの主たる形態であることから、高スループットスクリーニングに適合できる結合検定を創成する努力はかつて殆どなされてこなかった。ゲル型およびチップ型検出法を用いるアロステリックリボザイム検定、ならびにインラインプロービング検定を包含する、数多くの異なるアプローチを利用して、代謝産物結合RNAを検出できる。リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する化合物を特定し、その特定された化合物を製造することにより生成される化合物もまた開示する。これは、本明細書の他所に開示した化合物特定法を、特定された化合物を製造する方法と組み合わせることによって達成できる。例えば、被検化合物およびリボスイッチを接触させ、リボスイッチの活性化を評価し、そして、もしリボスイッチが被検化合物によって活性化されたならば、リボスイッチを活性化するその被検化合物を当該化合物として製造することによって、化合物を生成できる。
【０１０９】
或る化合物によるリボスイッチの活性化、不活性化、または遮断を調べ、その調べた化合物を製造することによって生成される化合物も開示する。これは、例えば、本明細書の他所に開示した化合物の活性化、不活性化または遮断評価法を、調べた化合物を製造する方法と組み合わせることによって達成できる。例えば、被検化合物およびリボスイッチを接触させ、リボスイッチの活性化を評価し、そして、もしリボスイッチが被検化合物によって活性化されたならば、リボスイッチを活性化するその被検化合物を当該化合物として製造することによって、化合物を生成できる。リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する能力について化合物を調べるという事は、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断することがかつて知られていなかった化合物を特定する事、および、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する化合物（ここで、その化合物はリボスイッチを活性化、不活性化または遮断することが既にわかっている）の能力を評価する事の両方を指す。
【０１１０】
本明細書で使用する「置換された」という語は、全ての許容可能な有機化合物の置換基の包含を意図している。広範な態様では、この許容可能な置換基は、有機化合物の、非環式および環式、分枝および非分枝、炭素環式およびヘテロ環式、ならびに芳香族および非芳香族置換基を包含する。置換基の例は、例えば下記のものを包含する。許容可能な置換基は、適当な有機化合物に対して1またはそれ以上、そして同じまたは異なっていてよい。本内容の目的のため、窒素のようなヘテロ原子は、そのヘテロ原子の原子価を満足する、水素置換基および／または本明細書に記載の有機化合物の、許容可能な任意の置換基を有することができる。この内容は、いかなる方法によっても有機化合物の許容可能な置換基によって制限を受けることを意図していない。また、「置換」または「で置換された」という語は、そのような置換が、置換された原子および置換基の許容された原子価に一致するという、そして、その置換が安定な化合物、例えば、転位、環化、脱離などによる自動的な変化を受けない化合物を産むという、暗黙の条件を包含する但し書きを包含する。
【０１１１】
「A1」、「A2」、「A3」、および「A4」を、種々の具体的置換基を表すため、本明細書で一般記号として使用する。これらの記号は本明細書に開示するものに限らず任意の置換基であってよく、一つの例においてそれらが或る置換基に定義されている場合、別の例では他の何らかの置換基として定義されていてもよい。
【０１１２】
本明細書で使用する「アルキル」という語は、1ないし24個の炭素原子を有する分枝または非分枝飽和炭化水素基、例えばメチル、エチル、n-プロピル、イソプロピル、n-ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、エイコシル、テトラコシル等である。アルキル基は置換されていても置換されていなくてもよい。アルキル基は、下記のように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）1またはそれ以上の基で置換されていてよい。「低級アルキル」という語は、6またはそれ以下の炭素原子を有するアルキル基、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、sec-ブチル、iso-ブチル、tert-ブチル、ペンチル、ヘキシル等である。
【０１１３】
本明細書全編において、「アルキル」は、非置換アルキル基および置換アルキル基の両者を指すのに使用する。しかしながら置換アルキル基は、アルキル基上の具体的置換基を特定することにより、本明細書中で具体的にも言及する。例えば、「ハロゲン化アルキル」という語は、1またはそれ以上のハライド、例えば弗素、塩素、臭素、または沃素で置換されているアルキル基を特に指す。「アルコキシアルキル」という語は、1またはそれ以上の下記のようなアルコキシ基で置換されているアルキル基を特に指す。「アルキルアミノ」という語は、1またはそれ以上の下記のようなアミノ基で置換されているアルキル基を特に指す。一つの例で「アルキル」が使われ、別の例で「ハロゲン化アルキル」のような特定の用語が使われている場合、「アルキル」という語が「ハロゲン化アルキル」などのような特定用語を意味しないということを意図している訳ではない。
【０１１４】
この慣行は本明細書に記載の他の基に対しても利用される。即ち、「シクロアルキル」といった語は、非置換および置換シクロアルキル部分の両者を指し、それに加えて、置換された部分を本明細書で具体的に特定することもでき、例えば、或る特定の置換シクロアルキルを、例えば「アルキルシクロアルキル」と称することもできる。同様に、置換アルコキシを例えば「ハロゲン化アルコキシ」、特定の置換アルケニルを例えば「アルケニルアルコール」等と具体的に称することができる。さらに、「シクロアルキル」のような一般名および「アルキルシクロアルキル」のような特定名を使用する慣行は、一般名が特定名を包含しないという事を意味している訳ではない。
【０１１５】
本明細書で使用する「アルコキシ」という語は、1個の末端エーテル結合によって結合したアルキル基であり、即ち、「アルコキシ」基はOA1［式中、A2は上記定義によるアルキルである］で定義できる。
【０１１６】
本明細書で使用する「アルケニル」という語は、少なくとも1個の炭素-炭素二重結合を含む構造式を有する、2ないし24個の炭素原子を有する炭化水素基である。(A1A2)C=C(A3A4) のような非対称構造は、EおよびZ異性体の両者を含むことを意図している。この事は、非対称アルケンが存在する、本明細書に記載の構造式で推定できるか、または結合記号C=Cにより明確に示され得る。アルケニル基は、下記のように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）1またはそれ以上の基で置換されていてよい。
【０１１７】
本明細書で使用する「アルキニル」という語は、少なくとも1個の炭素-炭素三重結合を含む構造式を有する、2ないし24個の炭素原子を有する炭化水素基である。アルキニル基は、下記のように、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを包含する（但しこれらに限定される訳ではない）1またはそれ以上の基で置換されていてよい。
【０１１８】
本明細書で使用する「アリール」という語は、ベンゼン、ナフタレン、フェニル、ビフェニル、フェノキシベンゼンなどを包含する（但しこれらに限定されない）、炭素を基礎とする任意の芳香族基を含む基である。「アリール」という語はさらに「ヘテロアリール」を包含し、これは、芳香族基の環内に少なくとも1個のヘテロ原子が組み込まれた芳香族基を含む基として定義される。ヘテロ原子の例には、窒素、酸素、硫黄、および燐があるがこれらに限定されない。同様に、やはり「アリール」という語に包含される「非ヘテロアリール」という語は、ヘテロ原子を含まない芳香族基を含む基を定義している。アリール基は置換されていても置換されていなくてもよい。アリール基は、本明細書に記載のようなアルキル、ハロゲン化アルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを包含する（但しこれらに限定されない）1またはそれ以上の基で置換されていてよい。「ビアリール」という語は、アリール基の特別なタイプであって、アリールの定義に包含される。ビアリールは、ナフタレンのように、融合環構造を介して結合した、またはビフェニルのように1またはそれ以上の炭素-炭素結合を介して結合した、2個のアリール基を指す。
【０１１９】
本明細書で使用する「シクロアルキル」という語は、少なくとも3個の炭素原子で構成される非芳香族炭素に基づく環である。シクロアルキル基の例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等である。「ヘテロシクロアルキル」という語は、その環の炭素原子のうち少なくとも1個が、窒素、酸素、硫黄、または燐のようなヘテロ原子（但しこれらに限定されない）で置換されている、上記定義によるシクロアルキル基である。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、置換されていても置換されていなくてもよい。シクロアルキル基およびヘテロシクロアルキル基は、本明細書に記載のようなアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを包含する（但しこれらに限定されない）1またはそれ以上の基で置換されていてよい。
【０１２０】
本明細書に記載の「シクロアルケニル」という語は、少なくとも3個の炭素原子で構成され、少なくとも1個の二重結合、即ちC=Cを含む、非芳香族炭素に基づく環である。シクロアルケニル基の例は、シクロプロペニル、シクロブテニル、シクロペンテニル、シクロペンタジエニル、シクロへキセニル、シクロヘキサジエニル等を包含するがこれらに限定されない。「ヘテロシクロアルケニル」という語は、上記定義によるシクロアルケニル基の一タイプであって「シクロアルケニル」という語の意義に包含され、ここで、この環の炭素原子のうち少なくとも1個が、例えば窒素、酸素、硫黄、または燐のような（但しこれらに限定されない）ヘテロ原子で置換されている。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は置換されていても置換されていなくてもよい。シクロアルケニル基およびヘテロシクロアルケニル基は、本明細書に記載のようにアルキル、アルコキシ、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、アルデヒド、アミノ、カルボン酸、エステル、エーテル、ハライド、ヒドロキシ、ケトン、スルホ-オキソ、スルホニル、スルホン、スルホキシド、またはチオールを包含する（但しこれらに限定されない）1またはそれ以上の基で置換されていてよい。
【０１２１】
「環式基」という語は、本明細書においてアリール基、非アリール基（即ち、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル、およびヘテロシクロアルケニル基）のいずれか、またはその両者を指す。環式基は、置換されていても置換されていなくてもよい1またはそれ以上の環系を有する。環式基は、1もしくはそれ以上のアリール基、1もしくはそれ以上の非アリール基、または1もしくはそれ以上のアリール基および1もしくはそれ以上の非アリール基を含み得る。
【０１２２】
本明細書で使用する「アルデヒド」という語は、式：-C(O)Hで示される。本明細書全編を通じて、「C(O)」は、C=Oの簡略表記である。
本明細書で使用する「アミン」または「アミノ」という語は、式：NA1A2A3［式中、A1、A2、およびA3は独立して、上記の水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい］で表される。
【０１２３】
本明細書で使用する「カルボン酸」という語は、式：-C(O)OHで表される。本明細書で使用する「カルボキシラート」は、式：-C(O)O-で表される。
【０１２４】
本明細書で使用する「エステル」という語は、式：-OC(O)A1または-C(O)OA1［式中、A1は、上記のようなアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい］で表される。
【０１２５】
本明細書で使用する「エーテル」という語は、式：A1OA2［式中、A1およびA2は、独立して、上記のようなアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい］で表される。
【０１２６】
本明細書で使用する「ケトン」という語は、式：A1C(O)A2［式中、A1およびA2は、独立して、上記のようなアルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい］で表される。
本明細書で使用する「ハライド」という語は、ハロゲン弗素、塩素、臭素、および沃素を指す。
【０１２７】
本明細書で使用する「ヒドロキシ」という語は、式：-OHで表される。
本明細書で使用する「スルホ-オキソ」という語は、式：-S(O)A1（即ち「スルホニル」）、A1S(O)A2（即ち「スルホキシド」）、-S(O)2A1、A1SO2A2（即ち「スルホン」）、-OS(O)2A1、または-OS(O)2OA1［式中、A1およびA2は、上記のような水素、アルキル、ハロゲン化アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、シクロアルケニル、ヘテロシクロアルキル、またはヘテロシクロアルケニル基であってよい］で表される。本明細書全編を通じて、「S(O)」は、S=Oの簡略表記である。
【０１２８】
本明細書で使用する「スルホニルアミノ」または「スルホンアミド」という語は、式：-S(O)2NH-で表される。
本明細書で使用する「チオール」という語は、式：-SHで表される。
本明細書で使用する「Rn」［式中、nは何らかの整数である］は、独立して、上に列挙した1またはそれ以上の基を有する。例えば、R10がアリール基を含む場合、このアリール基の水素原子のうち1個は、所望によりヒドロキシ基、アルコキシ基、アミン基、アルキル基、ハライドなどで置換されていてもよい。選択された基に応じて、第一の基が第二の基の内部に組み込まれたり、或いは第一の基が第二の基に懸架(即ち付着)していてよい。例えば、「アミノ基を含むアルキル基」という句では、アミノ基がアルキル基のバックボーンに組み込まれていてよい。或いは、アミノ基は、アルキル基のバックボーンに付着していてもよい。選択される基(群)の性質が、第一の基が第二の基に包埋されるのかまたは付着するのかを決定する。
【０１２９】
別途記載のない限り、実線のみで示され楔形または点線で示されていない化学結合を持つ式は、可能性のある各異性体、例えば各々のエナンチオマーおよびジアステレオマー、ならびに異性体混合物、例えばラセミまたはスカレミック混合物を意図している。
【０１３０】
本明細書に開示する或る種の材料、化合物、組成物および成分は、商業的に入手できるか、または当業者に一般的に知られる技術を用いて容易に合成できる。例えば、開示した化合物および組成物の製造に使用する出発材料および試薬は、Aldrich Chemical Co., (Milwaukee, Wis.)、Acros Organics (Morris Plains, NJ.)、Fisher Scientific (Pittsburgh, Pa.)、もしくはSigma (St. Louis, Mo.)といった商業的供給業者から入手できるか、または、Fieser and Fieser's Reagents for Organic Synthesis, Volumes 1-17 (John Wiley and Sons, 1991)；Rodd's Chemistry of Carbon Compounds, Volumes 1-5 and Supplementals (Elsevier Science Publishers, 1989)；Organic Reactions, Volumes 1- 40 (John Wiley and Sons, 1991)；March's Advanced Organic Chemistry, (John Wiley and Sons, 4th Edition)；および Larock's Comprehensive Organic Transformations (VCH Publishers Inc., 1989)のような文献に開示の方法に従い、当業者の知悉する方法によって製造する。
【０１３１】
グアニン応答性リボスイッチ（およびグアニン応答性リボスイッチから誘導されるリボスイッチ）と共に有用に使用できる化合物は、式I：
【化１】
2008518630.tif 000003
［ここで、この化合物はグアニン応答性リボスイッチまたはその誘導体に結合でき、この化合物がグアニン応答性リボスイッチまたは誘導体に結合する時、R1およびR2は水素結合ドナーとして働き、R7は水素結合アクセプターとして働き、R9は水素結合ドナーとして働き、R10は水素結合アクセプターとして働く。式中、
【化２】
2008518630.tif 000004
は、各々独立して単結合または二重結合を表す］
で示される化合物を包含する。他の幾つかの例では、R3は水素結合アクセプターであってよい。
【０１３２】
特定の部分または基を本明細書中で水素結合ドナーまたはアクセプターと称することがあるが、この術語は当然の事ながら、単に参照を容易にするために様々な置換基を分類するために使用するに過ぎない。このような言葉遣いは、特定部分が実際にリボスイッチまたは他の何らかの化合物との水素結合に参加している事を意味すると解釈してはならない。例えば、本明細書で水素結合アクセプター(またはドナー)として言及される部分は、リボスイッチまたはその他の化合物との疎水性、イオン性、ファン・デル・ワールス、またはその他のタイプの相互作用に単独でまたは追加的に関わるということがあり得る。
【０１３３】
本明細書に開示した或る種の基は、水素結合アクセプターおよび水素結合ドナーの両方として言及され得るということも理解できる。例えば、-OHは水素原子を供与することにより水素結合ドナーとなり得；-OHはまた、酸素原子上の1またはそれ以上の非結合電子対を介して水素結合アクセプターともなり得る。このように本明細書全編を通じて、様々な部分が水素結合ドナーおよびアクセプターとなり得、そのように言及され得る。
【０１３４】
例えばR1、R2、およびR9のうちの1またはそれ以上のように、開示した化合物に存在し得る好適な水素結合ドナーは、極性水素結合を含む部分であり、それは例えば水素原子がC、N、O、またはSといった、より電気陰性である原子に結合している場合である。R1、R2、およびR9のための好適な水素結合ドナーの例は、以下の部分を包含するが、これらに限定されない：-NR11-、-CHR11-、=CR11-、および-C(=NR11)- ［式中、R11は-H、-NH2、-OH、 -SH、-CO2H、置換または非置換アルキル、アルコキシ、アリール、アリールオキシ、またはベンジルオキシ、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、-NHC(O)NH2、-NH-NH2、-NH-NHアルキル、-NH-NHアルコキシ、-NH-SO2アルキル、-NH-SO2-R12-、NHCO2CH2-R12、-NH-OR12、-N+H2-R12、-NH-NH-R12、および-NH-NH-CH2-R12［式中、R12 は、
【化３】
2008518630.tif 000005
［式中、nは1ないし5であり、そしてR13は、-H、-NH2、-OH、アルコキシ、-N-モルホリノまたはハライドのうち1またはそれ以上であってよい］
である］
である］。
【０１３５】
開示した化合物中に存在し得る、例えばR3、R7、およびR10のうち1またはそれ以上のような好適な水素結合アクセプターは、非結合電子対を含む部分である。非結合電子対は、典型的にはN、O、S、およびハロゲン原子上に存在する。R3、R7のための好適な水素結合アクセプターの例は、N、O、S、およびSO2を包含するがこれらに限定されない。例えば、基R8およびR7は合して-CH=N-、-CH2-O-、-CH2-S-、または-CH2SO2-として表される。R3は、N、O、またはSであってよく、これらは式Iについて言えば、それぞれ-N=R2、-O-R2、および-S-R2部分［式中、R2は前記と同意義である］を形成する。
【０１３６】
R10部分については、好適な水素結合アクセプターは、例えばO=R6または S=R6［式中、R6はCである］におけるOまたはSであってよい。 R10のための水素結合アクセプターのさらなる例は、-OH、-SH、-NH2、-CO2H、-アルコキシ、-アリールオキシ、-ベンジルオキシ、-ハライド、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、-NHCO2CH2-R12、-NHC(O)NH2、-NH-NH2、-NH-NHアルキル、-NH-NHアルコキシ、-SO2アルキル、-SO2アリール、-NH-SO2アルキル、-NH-SO2-R12、-NH-OR12、-NH-R12、-NH-NH-R12、-NH-NH-CH2-R12、または-NH-CH2-R12［式中、R12 は前記と同意義である］を包含するが、これらに限定されない。
【０１３７】
R10 のための好適な水素結合アクセプターの、さらに別の例は、例えばR14N=R6［式中、R6はCである］におけるNR14である。これらの例においてR14は、-H、-NH2、-OH、-SH、-CO2H、- CO2アルキル、-CO2アリール、-C(O)NH2、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシ、アルコキシ、アリールオキシ、またはベンジルオキシ、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、- NHC(O)NH2、-SO2アルキル、-SO2アリール、-NH-SO2アルキル、-NH-SO2-R12、-NH-OR12、-NH-R12、または-NH-CH2-R12［式中、R12 は前記と同意義である］であってよい。
【０１３８】
本明細書に開示する幾つかの具体的化合物は、式II：
【化４】
2008518630.tif 000006
［式中、
R7は、NまたはCHであり；
R10は、=O、=S、=NH、=NOH、=Nアルキル、=Nアルコキシル、=N-アリール、=Nアリールオキシ、=N-ベンジル、-Nベンジルオキシ、=N-NH2、=N-NHOH、=N-NHアルキル、=N-NHアルコキシ、=N-NHアリール、=N-NHアリールオキシ、=N-NHベンジル、=N-NHベンジルオキシ、=N-NH-(p-アミノ-フェニル)、=N-NH-(p-メトキシフェニル)、=N-NH-(p-N-モルホリノ-フェニル)であり；そして、
R2は、=CR15-［式中、R15は、-NH2、-NHNH2、-NHOH、-NHアルキル、-NHアルコキシ、- NHアリール、-NHアリールオキシ、-NHベンジル、-NHベンジルオキシ、-N+H2アリール、-N+H2-(p-N-モルホリノ-フェニル)、-N+H2-(p-アミノフェニル)、-N+H2-(p-メトキシフェニル)、-NHCO2アルキル、- NHCO2ベンジル、-NHNHアルキル、-NHNHアリール、-NHNHベンジル、または-NHC(O)アルキルである］である］
で表すことができる。
【０１３９】
別の化合物は、式III：
【化５】
2008518630.tif 000007
［式中、
R10は、-H、-OH、-SH、-アルコキシ、ハライド、-NH2、-NHOH、-NHアルキル、-NHアルコキシ、-NHアリール、-NHアリールオキシ、-NHベンジル、-NHベンジルオキシ、-NHC(O)アルキル、-NHCO2アルキル、NHCO2ベンジル、-NHNH2、-NHNHアルキル、-NHNHアリール、または-NHNHベンジルであり；R2およびR7は前記と同意義である］
で表すことができる。
【０１４０】
化合物のさらなる具体例は、図12Bに示す。
グアニン応答性リボスイッチ（およびグアニン応答性リボスイッチから誘導されるリボスイッチ）と共に有用に使用できるさらなる化合物は、式：
【化６】
2008518630.tif 000008
［ここで、この化合物はグアニン応答性リボスイッチまたはその誘導体に結合でき、この化合物がグアニン応答性リボスイッチまたは誘導体に結合する時、R7は水素結合アクセプターとして働き、R10は水素結合ドナーとして働き、R11は水素結合アクセプターとして働き、R12は水素結合ドナーとして働く。式中、R13は、H、H2であるかまたは存在せず、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、およびR9は各々独立してC、N、O、またはSであり、そして、
【化７】
2008518630.tif 000009
は各々独立して単結合または二重結合を表す］
を有する化合物を包含する。
【０１４１】
上の定義内のあらゆる化合物が、本明細書に具体的に開示されていることを意図し、そしてそう考えられるべきである。さらに、上の定義内に特定され得るあらゆる亜群が、本明細書に具体的に開示されていることを意図し、そしてそう考えられるべきである。その結果、任意の化合物、または化合物の亜群が、個別的に使用に包含されもしくはそこから除外され、または化合物のリストに包含されもしくはそこから除外され得るという事が企図される。例えば一つの選択枝として、各化合物が、上に定義のとおりではあるが、グアニン、ヒポキサンチン、キサンチン、またはN2-メチルグアニンではない、一群の化合物が企図される。別の例として、各化合物が、上に定義のとおりであり、且つグアニン応答性リボスイッチを活性化できる、一群の化合物が企図される。
【０１４２】
リボスイッチと相互作用する化合物に対して本明細書に記載した、特定の接触および相互作用（例えば水素結合供与または受容）が好ましいが、それが化合物とリボスイッチの相互作用に必須である訳ではないという事を理解すべきである。例えば、化合物は、開示した接触および相互作用を行う化合物よりも低い親和性および／または特異性でリボスイッチと相互作用することがある。さらに、該化合物上の異なったまたはさらなる官能基が、リボスイッチとの新たな、異なる、そして／または代償的接触を導入することがある。例えば、グアニンリボスイッチについて、例えばR10およびR2に大きな官能基を使用できる。このような官能基は、そのリボスイッチの他の部分と接触および相互作用を起こすことができ、そして起こすよう設計され得る。このような接触および相互作用は、トリガー分子およびコア構造の接触および相互作用を代償することができる。
【０１４３】
アデニン応答性リボスイッチ（およびアデニン応答性リボスイッチから誘導されるリボスイッチ）と共に有用に使用できる化合物は、式：
【化８】
2008518630.tif 000010
［ここで、この化合物はアデニン応答性リボスイッチまたはその誘導体に結合でき、この化合物がアデニン応答性リボスイッチまたは誘導体に結合する時、R1、R3およびR7は水素結合アクセプターとして働き、そしてR10およびR11は水素結合水素結合ドナーとして働く。式中、R12は、H、H2であるかまたは存在せず、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R8、およびR9は各々独立してC、N、O、またはSであり、そして、
【化９】
2008518630.tif 000011
は、各々独立して単結合または二重結合を表す］
を有する化合物を包含する。
【０１４４】
上の定義内のあらゆる化合物が、本明細書に具体的に開示されていることを意図し、そしてそう考えられるべきである。さらに、上の定義内に特定され得るあらゆる亜群が、本明細書に具体的に開示されていることを意図し、そしてそう考えられるべきである。その結果、任意の化合物、または化合物の亜群が、個別的に使用に包含されもしくはそこから除外され、または化合物のリストに包含されもしくはそこから除外され得るという事が企図される。例えば一つの選択枝として、各化合物が、上に定義のとおりではあるが、アデニン、2,6-ジアミノプリン、または2-アミノプリンではない、一群の化合物が企図される。別の例として、各化合物が、上に定義のとおりであり、且つアデニン応答性リボスイッチを活性化できる、一群の化合物が企図される。
【０１４５】
リジン応答性リボスイッチ（およびリジン応答性リボスイッチから誘導されるリボスイッチ）と共に有用に使用できる化合物は、式：
【化１０】
2008518630.tif 000012
［ここで、この化合物はリジン応答性リボスイッチまたはその誘導体に結合できる。式中、R2およびR3は各々正に荷電しており、R1は負に荷電しており、R4は、C、N、O、またはSであり、そして、
【化１１】
2008518630.tif 000013
は、各々独立して単結合または二重結合を表す］
を有する化合物を包含する。R2およびR3が各々NH3+であり、R1がO-である、上記定義による化合物もまた企図される。
【０１４６】
上の定義内のあらゆる化合物が、本明細書に具体的に開示されていることを意図し、そしてそう考えられるべきである。さらに、上の定義内に特定され得るあらゆる亜群が、本明細書に具体的に開示されていることを意図し、そしてそう考えられるべきである。その結果、任意の化合物、または化合物の亜群が、個別的に使用に包含されもしくはそこから除外され、または化合物のリストに個別的に包含されもしくはそこから除外され得るという事が企図される。例えば一つの選択枝として、各化合物が、上に定義のとおりではあるが、リジンではない、一群の化合物が企図される。別の例として、各化合物が、上に定義のとおりであり、且つリジン応答性リボスイッチを活性化できる、一群の化合物が企図される。
【０１４７】
TPP応答性リボスイッチ（およびリジン応答性リボスイッチから誘導されるリボスイッチ）と共に有用に使用できる化合物は、式：
【化１２】
2008518630.tif 000014
［ここで、この化合物はTPP応答性リボスイッチまたはその誘導体に結合できる。式中、R1は正に荷電しており、R2およびR3は各々独立してC、O、またはSであり、R4は、CH3、NH2、OH、SH、Hであるかまたは存在せず、R5は、CH3、NH2、OH、SH、またはHであり、R6は、CまたはNであり、そして、
【化１３】
2008518630.tif 000015
は、各々独立して単結合または二重結合を表す］
を有する化合物を包含する。R1が燐酸、二燐酸または三燐酸である、上記定義による化合物もまた企図される。
【０１４８】
上の定義内のあらゆる化合物が、本明細書に具体的に開示されていることを意図し、そしてそう考えられるべきである。さらに、上の定義内に特定され得るあらゆる亜群が、本明細書に具体的に開示されていることを意図し、そしてそう考えられるべきである。その結果、任意の化合物、または化合物の亜群が、個別的に使用に包含されもしくはそこから除外され、または化合物のリストに包含されもしくはそこから除外され得るという事が企図される。例えば一つの選択枝として、各化合物が、上に定義のとおりではあるが、TPP、TPまたはチアミンではない、一群の化合物が企図される。別の例として、各化合物が、上に定義のとおりであり、且つTPP応答性リボスイッチを活性化できる、一群の化合物が企図される。
【０１４９】
D. 構築物、ベクターおよび発現系
開示したリボスイッチは、任意の適当な発現系と共に使用できる。組換え発現は、ベクター、例えばプラスミドを用いて効果的に達成する。ベクターは、リボスイッチをコードしている配列と機能的に結合したプロモーターおよび発現しようとするRNA(例えば、蛋白をコードしているRNA)を含む。このベクターはさらに、転写および翻訳に必要な他の要素を含み得る。本明細書で使用するベクターとは、外因性DNAを含む任意の担体を指す。したがって、ベクターとは、外因性核酸を、分解せずに細胞内に運搬する物体であり、そこへとデリバリーされる細胞内の核酸の発現を産むプロモーターを含む。ベクターには、ウイルス核酸、ウイルス、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体があるが、これらに限定される訳ではない。リボスイッチで調節される構築物の担持に好適な、様々な原核生物および真核生物発現ベクターが製造できる。そのような発現ベクターは、例えばpET、pET3d、pCR2.1、pBAD、pUC、および酵母ベクターを包含する。ベクターは、例えば様々なインビボおよびインビトロ状況で使用できる。
【０１５０】
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、AIDSウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビスおよびその他のRNAウイルス（HIVバックボーンを有するこれらのウイルスを包含する）が包含される。ベクターとしての使用を好適とする、これらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーもまた有用である。Verma(1985)に記載されているレトロウイルスは、マウスモロニー白血病ウイルス、MMLV、およびベクターとしてのMMLVの望ましい性質を発現するレトロウイルスを包含する。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、RNAポリメラーゼIII転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含む。ベクターとして設計する場合、ウイルスは典型的には1またはそれ以上の初期遺伝子を取り除き、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットを、除去したウイルスDNAの代わりにウイルスゲノム中に挿入する。
【０１５１】
「プロモーター」とは、一般に転写開始部位に関して相対的に固定された位置にある時に機能する、DNAの配列または配列群である。「プロモーター」は、RNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
【０１５２】
「エンハンサー」とは一般に、転写開始部位から不定の距離で機能し、転写ユニットに対して5’（Laimins, 1981）または3’（Lusky et al., 1983）のいずれかにあるDNA配列を指す。さらにエンハンサーは、コード配列自身の内部にある（Osborne et al., 1984）と同時にイントロン内部にあってよい（Banerji et al., 1983）。これらは通常10および300bp長の間であり、シスで機能する。エンハンサーは近傍のプロモーターからの転写を増大させるよう機能する。プロモーターと同様エンハンサーはしばしば、転写調節を仲介する応答エレメントをも含む。エンハンサーはしばしば発現の調節を決定する。
【０１５３】
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）で使用される発現ベクターは、mRNAの発現に影響を及ぼし得る転写終結に必要な配列をも含む。これらの領域は組織因子蛋白をコードしているmRNAの非翻訳部分にあるポリアデニル化セグメントとして転写される。3’非翻訳領域はさらに転写終結部位を含む。転写ユニットはポリアデニル化領域をも含むのが好ましい。この領域の一つの利点は、転写された単位がmRNAのようにプロセシングおよび輸送される傾向を増大させる事である。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの特定および用途は、充分確立されている。相同的ポリアデニル化シグナルがトランスジーン構築物で利用されるのが好ましい。
【０１５４】
ベクターは、マーカー生成物をコードしている核酸配列を含み得る。このマーカー生成物を使用して、遺伝子が細胞にデリバリーされたかどうか、そしてデリバリーされたならば発現されているかどうかを決定する。好ましいマーカー遺伝子は、β-ガラクトシダーゼをコードしているE. Coli lacZ遺伝子および緑色蛍光蛋白である。
【０１５５】
幾つかの態様では、マーカーは選択可能なマーカーであってよい。このような選択可能なマーターが宿主細胞中にうまく移行すると、形質転換された宿主細胞は、選択圧の下におかれた時に生き残ることができる。広く利用される、二つの明確な選択方法のカテゴリーがある。第一のカテゴリーは、細胞の代謝、および、添加培地に拘束されずに増殖する能力を欠失する突然変異セルラインの使用に基づく。第二のカテゴリーは優性選択であるがこれは、いかなる細胞型でも使用できる選択スキームを意味し、突然変異セルラインの使用を必要としない。これらのスキームは典型的には、宿主細胞の増殖を停止させるために薬物を使用する。新規な遺伝子を有する細胞は、薬物耐性を運搬する蛋白を発現し、選択下に生き残る。係る優性選択の例は、薬物ネオマイシン(Southern and Berg, 1982)、ミコフェノール酸(Mulligan and Berg, 1980)またはハイグロマイシン(Sugden et al., 1985)を使用する。
【０１５６】
遺伝子の移動は、プラスミド、ウイルスベクター、ウイルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミド、および人工染色体への、遺伝材料の直接移動を利用して、または、細胞もしくは担体、例えば陽イオン性リポソームへの遺伝材料の移動を介して達成できる。このような方法は当分野において周知であり、本明細書に記載の方法での使用に、容易に適合させることができる。移動ベクターは、遺伝子を細胞内にデリバリーするのに用いられる任意のヌクレオチド構築物(例えばプラスミド)であってよく、または、遺伝子をデリバリーする一般戦略の一部、例えば組換えレトロウイルスもしくはアデノウイルスの一部(Ram et al., Cancer Res. 53:83-88(1993))であってよい。ウイルスベクター、化学的形質転換体、または物理的機械的方法、例えばエレクトロポレーションおよびDNAの直接拡散を包含するトランスフェクションのための適当な手段が、例えばWolff, J. A., et al., Science, 247, 1465-1468(1990)；およびWolff, J. A. Nature, 352, 815-818(1991)に記載されている。
【０１５７】
1. ウイルスベクター
好ましいウイルスベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、AIDSウイルス、神経栄養ウイルス、シンドビスおよびその他のRNAウイルス（HIVバックボーンを有するこれらのウイルスを包含する）である。ベクターとしての使用を好適とする、これらのウイルスの性質を共有する任意のウイルスファミリーもまた好ましい。好ましいレトロウイルスは、マウスモロニー白血病ウイルス、MMLV、およびベクターとしてのMMLVの望ましい性質を発現するレトロウイルスを包含する。レトロウイルスベクターは、他のウイルスベクターよりも大きな遺伝的ペイロード、即ちトランスジーンまたはマーカー遺伝子を持つことができ、この理由で広く使用されるベクターである。しかしながらこれは、非増殖細胞には有用でない。アデノウイルスベクターは比較的安定であり、働かせ易く、高い力価を有し、そしてエアロゾル製剤でデリバリーでき、そして非分割細胞にトランスフェクトすることができる。ポックスウイルスベクターは大きく、遺伝子を挿入するための部位を数カ所持ち、熱安定性で室温保存できる。好ましい態様は、宿主生物の免疫反応を抑制するよう設計され、ウイルス抗原によって誘導されるウイルスベクターである。好ましいこのタイプのベクターは、インターロイキン8または10のコード領域を担持する。
【０１５８】
ウイルスベクターは、遺伝子を細胞中に導入するための殆どの化学的および物理的方法よりも高い処理能力(遺伝子を導入する能力)を有する。典型的には、ウイルスベクターは、非構造初期遺伝子、構造後期遺伝子、RNAポリメラーゼIII転写物、複製およびキャプシド形成に必要な逆末端反復、ならびにウイルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含む。ベクターとして設計する場合、ウイルスは典型的には1またはそれ以上の初期遺伝子を取り除き、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットを、除去したウイルスDNAの代わりにウイルスゲノム中に挿入する。このタイプの構築物は、約8kbまでの外来遺伝材料を担持できる。取り除かれた初期遺伝子の必要機能は、典型的には、その初期遺伝子の遺伝子産物をトランスに発現するよう設計されたセルラインによって供給される。
【０１５９】
i. レトロウイルスベクター
レトロウイルスは、任意のタイプ、サブファミリー、族、または指向性を包含する、Retroviridaeウイルス科に属する動物ウイルスである。レトロウイルスベクターは、一般的にVerma, I. M., 「遺伝子移動のためのレトロウイルスベクター」Microbiology - 1985, American Society for Microbiology, pp. 229-232, Washington, (1985)に記載されており、これを引用により本明細書の一部とする。レトロウイルスベクターを遺伝子治療に使用する方法の例は、米国特許第4868116および4980286号；PCT出願WO 90/02806およびWO 89/07136；ならびにMulligan (Science 260:926-932 (1993))に記載されており、これらの教示を引用により本明細書の一部とする。
【０１６０】
レトロウイルスは、本質的には、その中に核酸という積み荷を詰め込んだパッケージである。この核酸の積み荷は、パッケージングシグナルを持ち、それが、複製された娘分子がパッケージ被覆内に効率的にパッケージングされることを保証する。パッケージングシグナルに加えて、複製および複製されたウイルスのパッケージングにシスで必要な幾つかの分子がある。典型的には、レトロウイルスゲノムは、蛋白被殻の作製に関わるgag、pol、およびenv遺伝子を含む。標的細胞へと移動されるべき外来DNAによって典型的に置換されるのは、gag、pol、およびenv遺伝子である。レトロウイスルベクターは典型的には、パッケージ被覆中への取り込みのためのパッケージングシグナル、gag転写ユニットの開始をシグナル伝達する配列、逆転写に必要なエレメント（逆転写のtRNAプライマーに結合するプライマー結合部位を含む）、DNA合成中にRNA鎖のスイッチを導く末端反復配列、DNA合成の第二鎖の合成のためのプライミング部位として働く、5’ないし3’LTRにあるプリンリッチ配列、および、宿主ゲノムへの挿入のため、DNA状態のレトロウイルス挿入を可能にする、LTRの末端近くの特異的配列を含む。gag、pol、およびenv遺伝子の除去は、そのウイルスゲノム中に約8kbの外来配列を挿入し、逆転写状態となり、そして複製時に新たなレトロウイルス粒子中にパッケージングされることを可能にする。この量の核酸は、各転写物のサイズに応じて、1個ないし多数の遺伝子のデリバリーに充分なものである。挿入物には他の遺伝子と共に、正または負いずれかの選択マーカーをを含むことが好ましい。
【０１６１】
殆どのレトロウイルスベクター中の複製機構およびパッケージング蛋白は除去されている(gag、pol、およびenv)ので、典型的にはそれらをパッケージングセルライン中に入れることによって、ベクターが生成する。パッケージングセルラインは、複製およびパッケージング機構を含むがパッケージングシグナルを欠失するレトロウイルスによってトランスフェクトまたは形質転換されたセルラインである。選ばれたDNAを担持するベクターをこれらのセルライン中にトランスフェクトさせる時、ヘルパー細胞によりシスで供給された機構により、目的遺伝子を含むベクターが複製され新たなレトロウイスル粒子内に複製される。この機構のためのゲノムは、必要なシグナルを欠失するため、パッケージングされない。
【０１６２】
ii. アデノウイルスベクター
複製欠損アデノウイルスの構築が記載されている（Berkner et al., J. Virology 61:1213-1220 (1987)； Massie et al., Mol. Cell. Biol. 6:2872-2883 (1986)；Haj-Ahmad et al., J. Virology 57:267-274 (1986)；Davidson et al., J. Virology 61:1226-1239 (1987)；Zhang 「リポソーム仲介トランスフェクションおよびPCR分析による組換えアデノウイルスの製造および同定」BioTechniques 15:868-872 (1993)）。これらのウイルスをベクターとして使用することの利点は、これらは最初に感染した細胞の内部では複製できるが、新たな感染性ウイルス粒子を形成することができないため、他の細胞型に広がる範囲が限られているという事である。組換えアデノウイルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、CNS実質およびその他幾つかの組織部位への直接的インビボデリバリー後に、高効率の遺伝子移動を達成することが示されている（Morsy, J. Clin. Invest. 92:1580-1586 (1993)；Kirshenbaum, J. Clin. Invest. 92:381-387 (1993)；Roessler, J. Clin. Invest. 92:1085-1092 (1993)；Moullier, Nature Genetics 4:154-159 (1993)；La Salle, Science 259:988-990 (1993)；Gomez-Foix, J. Biol. Chem. 267:25129-25134 (1992)；Rich, Human Gene Therapy 4:461-476 (1993)；Zabner, Nature Genetics 6:75-83 (1994)；Guzman, Circulation Research 73:1201-1207 (1993)；Bout, Human Gene Therapy 5:3- 10 (1994)；Zabner, Cell 75:207-216 (1993)；Caillaud, Eur. J. Neuroscience 5:1287-1291 (1993)；およびRagot, J. Gen. Virology 74:501-507 (1993)）。組換えアデノウイルスは、特異的な細胞表面レセプターに結合することによって遺伝子の形質導入を達成し、その後、野生型または複製欠損アデノウイルスと同じ方法で、レセプター仲介型エンドサイトーシスによりインターナライズされる（Chardonnet and Dales, Virology 40:462-477 (1970)；Brown and Burlingham, J. Virology 12:386-396 (1973)；Svensson and Persson, J. Virology 55:442-449 (1985)；Seth, et al., J. Virol. 51:650-655 (1984)；Seth, et al., Mol. Cell. Biol. 4:1528-1533 (1984)；Varga et al., J. Virology 65:6061-6070 (1991)；Wickham et al., Cell 73:309-319 (1993)）。
【０１６３】
好ましいウイルスベクターは、E1遺伝子が取り除かれたアデノウイルスに基づくベクターであり、これらのビリオンがヒト293セルラインのようなセルラインで生成される。もう一つの好ましい態様では、E1およびE3遺伝子の両者がアデノウイルスゲノムから除去される。
【０１６４】
もう一つの型のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス(AAV)に基づいている。この欠損パルボウイルスは、多くの細胞型に感染できヒトに対して非病原性であるため、好ましいベクターである。AAV型ベクターは約4ないし5kbを輸送でき、野生型AAVは第19染色体中に安定的に挿入されることがわかっている。この、部位特異的組み込み性質を有するベクターが好ましい。この型のベクターで特に好ましい態様は、Avigen, San Francisco, CAにより製造されたP4.1 Cベクターであり、これは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子、HSV-tk、および／またはマーカー遺伝子、例えば緑色蛍光蛋白、GFPをコードしている遺伝子を含むことができる。
【０１６５】
ウイルスおよびレトロウイルスに挿入された遺伝子は、望む遺伝子産物の発現を制御する助けとなる、プロモーター、および／またはエンハンサーを通常含む。プロモーターは一般に、転写開始部位に関して相対的に固定された位置にある時に機能するDNA配列または配列群である。プロモーターは、RNAポリメラーゼおよび転写因子の基本的相互作用に必要なコアエレメントを含み、上流エレメントおよび応答エレメントを含み得る。
【０１６６】
2. ウイルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物宿主細胞においてベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、様々な供給源、例えばポリオーマ、シミアンウイルス40(SV40)、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、および最も好ましいサイトメガロウイルスのようなウイルスゲノムから、または、異種哺乳動物プロモーター、例えばβアクチンプロモーターから取得できる。SV40ウイルスの初期および後期プロモーターは、SV40ウイルス複製起点をも含むSV40制限フラグメントとして簡便に取得できる（Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)）。ヒトサイトメガロウイルスの即時初期プロモーターは、HindIII E制限フラグメントとして簡便に取得できる（Greenway, PJ. et al., Gene 18: 355-360 (1982)）。無論、宿主細胞または関連種由来のプロモーターもまたここでは有用である。
【０１６７】
エンハンサーとは一般に、転写開始部位から不定の距離で機能するDNA配列を指し、転写ユニットに対して5’ （Laimins, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 993 (1981)）であっても3’ （Lusky, M.L., et al., Mol. Cell Bio. 3: 1108 (1983)）であってもよい。さらにエンハンサーは、イントロンの内部にあってよく（Banerji, J.L. et al., Cell 33: 729 (1983)）、また、コード配列自身の内部にあってよい（Osborne, T.F., et al., Mol. Cell Bio. 4: 1293 (1984)）。これらは通常10および300bp長の間であり、シスで機能する。エンハンサーは、近傍のプロモーターからの転写を増大させるよう機能する。エンハンサーはまた、しばしば転写調節を仲介する応答エレメントを含む。プロモーターもまた、転写調節を仲介する応答エレメントを含み得る。エンハンサーはしばしば遺伝子の発現調節を決定する。現在、哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテインおよびインスリン）が知られており、典型的には真核生物細胞ウイルス由来のエンハンサーを使用する。好ましい例は、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(bp100-270)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーである。
【０１６８】
プロモーターおよび／またはエンハンサーは、光、またはそれらの機能を始動させる特別な化学事象によって特異的に活性化され得る。テトラサイクリンおよびデキサメタゾンのような試薬によって系は調節され得る。照射、例えばガンマ線照射、またはアルキル化化学療法薬への暴露によってウイルスベクター遺伝子の発現を増強させる方法もある。
【０１６９】
プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、全ての真核生物細胞型で活性であるのが好ましい。この型の好ましいプロモーターはCMVプロモーター(650塩基)である。別の好ましいプロモーターは、SV40プロモーター、サイトメガロウイルス(全長プロモーター)、およびレトロウイルスベクターLTFである。
【０１７０】
全ての特異的調節エレメントは、クローニングでき、メラノーマ細胞のような特定の細胞型で選択的に発現される発現ベクターを構築するのに利用できることが示されている。グリア線維酸性蛋白(GFAP)プロモーターは、グリア起源の細胞において選択的に遺伝子を発現させるために利用されている。
【０１７１】
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞)に用いられる発現ベクターは、mRNA発現に影響を及ぼす、転写終結に必要な配列をも含み得る。これらの領域は、組織因子蛋白をコードしているmRNAの非翻訳部分においてポリアデニル化セグメントとして転写される。3’非翻訳領域は転写終結部位をも含んでいる。この転写ユニットはポリアデニル化領域をも含むのが好ましい。この領域の一つの利点は、これは、転写ユニットがプロセシングを受けてmRNAのように輸送される傾向を高めるという事である。発現構築物中のポリアデニル化シグナルの特定および使用は、充分に確立されている。相同的なポリアデニル化シグナルをトランスジーン構築物中で使用するのが好ましい。転写ユニットの好ましい態様では、ポリアデニル化領域はSV40初期ポリアデニル化シグナルから誘導され、約400塩基から成る。転写されたユニットが、その構築物からの発現またはその構築物の安定性を改善するために、単独で、または上記配列と組み合わせて、他の標準的配列を含むこともまた好ましい。
【０１７２】
3. マーカー
ベクターは、マーカー生成物をコードしている核酸配列を含み得る。このマーカー生成物は、その遺伝子が細胞にデリバリーされたかどうか、そしてデリバリーされたならば発現されたかどうかを判定するのに使用される。好ましいマーカー遺伝子はβ-ガラクトシダーゼをコードしているE. Coli lacZ遺伝子および緑色蛍光蛋白である。
【０１７３】
幾つかの態様では、マーカーは選択可能なマーカーであってよい。哺乳動物細胞のための好適な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類似体G418、ハイドロマイシン、およびピューロマイシンである。このような選択可能なマーカーが哺乳動物宿主細胞中にうまく移行すると、形質転換された哺乳動物宿主細胞は、選択圧の下におかれた場合に生き残ることができる。広く利用される、二つの明確な選択方法のカテゴリーがある。第一のカテゴリーは、細胞の代謝、および、添加培地に拘束されずに増殖する能力を欠失する突然変異セルラインの使用に基づく。二つの例は、CHO DHFR-細胞およびマウスLTK-細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンのような栄養素の添加無しに増殖する能力を欠失する。これらの細胞は、完全なヌクレオチド合成経路に必要な或る種の遺伝子を欠失するため、失われているヌクレオチドを添加培地に供給しないと生存できない。培地への添加に代わる方法は、それぞれの遺伝子を欠失する細胞内に無傷のDHFRまたはTK遺伝子を導入し、それらの増殖要件を変える事である。DHFRまたはTK遺伝子で形質転換されなかった個々の細胞は、非添加培地で生存できないであろう。
【０１７４】
第二のカテゴリーは優性選択であるがこれは、いかなる細胞型でも使用できる選択スキームを意味し、突然変異セルラインの使用を必要としない。これらのスキームは典型的には、薬物を使用して宿主細胞の増殖を停止させる。薬物耐性を運搬する蛋白を発現する細胞は、選択下に生き残る。係る優性選択の例は、薬物ネオマイシン（Southern P. and Berg, P., J. Molec. Appl. Genet. 1: 327 (1982)）、ミコフェノール酸（Mulligan, R.C. and Berg, P. Science 209: 1422 (1980)）またはハイグロマイシン（Sugden, B. et al., Mol. Cell. Biol. 5: 410-413 (1985)）を使用する。これら三例では、それぞれ適切な薬物G418もしくはネオマイシン(ゲネチシン)、xgpt(ミコフェノール酸)またはハイグロマイシンに対する耐性を運搬するために、真核生物制御下の細菌遺伝子を使用する。ネオマイシン類似体G418およびピューロマイシンを含むものもある。
【０１７５】
E. バイオセンサーリボスイッチ
バイオセンサーリボスイッチもまた開示する。バイオセンサーリボスイッチは、同族トリガー分子の存在下で検出可能シグナルを生成する、改変されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値レベルで、またはそれ以上で反応が誘発され得る。バイオセンサーリボスイッチは、インビボまたはインビトロ使用のために設計できる。例えば、細胞または生物を、そのリボスイッチ／レポーターRNAをコードしている核酸構築物を担持するよう改変することによって、シグナルとしての役割を有する、またはシグナル産生に関与する蛋白をコードしているレポーターRNAと機能的に結合したバイオセンサーリボスイッチをインビボ使用できる。インビトロ使用のためのバイオセンサーリボスイッチの例は、そこからのシグナルがリボスイッチの活性化状態に応じて変化する、コンホメーション依存性標識を含むリボスイッチである。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは天然に存在するリボスイッチ由来の、またはそこから誘導されたアプタマードメインを使用する。
【０１７６】
F. レポーター蛋白およびペプチド
リボスイッチの活性化を評価するために、またはバイオセンサーリボスイッチのために、レポーター蛋白もしくはペプチドを利用できる。レポーター蛋白またはペプチドは、その発現がリボスイッチによって調節されるRNAによってコードされ得る。実施例に幾つかの特別なレポーター蛋白の使用を説明する。レポーター蛋白およびペプチドの使用は周知であり、リボスイッチと共に使用するために容易に適合させることができる。レポーター蛋白は、検出され得るまたは検出可能シグナルを生成する、任意の蛋白もしくはペプチドであってよい。好ましくは、この蛋白またはペプチドの存在を、標準技術（例えば、ラジオイムノアッセイ、放射標識、イムノアッセイ、酵素活性に対する検定、吸光度、蛍光、ルミネセンス、およびウェスタンブロット）を用いて検出できる。レポーター蛋白のレベルは、低レベルであっても標準技術を用いて容易に定量可能であるのが、より好ましい。有用なレポーター蛋白は、ルシフェラーゼ、緑色蛍光蛋白およびそれらの誘導体、例えばPhotinus pyralis由来の蛍ルシフェラーゼ(FL)、およびRenilla reniformis由来のRenillaルシフェラーゼ(RL)を包含する。
【０１７７】
G. コンホメーション依存性標識
コンホメーション依存性標識とは、その標識が関係する分子または化合物(例えばリボスイッチ)の形態またはコンホメーションの変化に基づいて蛍光強度または波長の変化を産む全ての標識を指す。プローブおよびプライマーの文脈で使用されるコンホメーション依存性標識の例は、分子ビーコン、Amplifluor、FRETプローブ、開裂可能なFRETプローブ、TaqManプローブ、scorpionプライマー、蛍光性トリプレックスオリゴ（トリプレックス分子ビーコンまたはトリプレックスFRETプローブを包含するがこれらに限定されない）、蛍光性水溶性コンジュゲート化ポリマー、PNAプローブおよびQPNAプローブを包含する。このような標識を、そして特にそれらの機能原理を、リボスイッチと共に使用するために適合させることができる。幾つかのタイプのコンホメーション依存性標識が、Schweitzer and Kingsmore, Curr. Opin. Biotech. 12:21-27(2001)に論評されている。
【０１７８】
コンホメーション依存性標識の一形態であるステム消光標識とは、ステム構造が形成された時に消光部分が近傍にもたらされ、その結果その標識からの蛍光が消光するように、核酸上に位置させた蛍光標識である。ステムが崩壊する（例えばその標識を含むリボスイッチが活性化された時）と、消光部分はもはやその蛍光標識の近傍にないので、蛍光が増大する。この効果の例を、分子ビーコン、蛍光トリプレックスオリゴ、トリプレックス分子ビーコン、トリプレックスFRETプローブ、およびQPNAプローブに見いだすことができ、これらの操作原理をリボスイッチと共に使用するために適合させることができる。
【０１７９】
コンホメーション依存性標識の一形態であるステム活性化標識とは、ステム構造の形成によって蛍光が増大または変化する、標識または標識のペアである。ステム活性化標識はアクセプター蛍光標識およびドナー部分を含み、その結果、アクセプターおよびドナーが近傍にある時（その標識を含む核酸鎖がステム構造を形成している時）、ドナーからアクセプターへの蛍光共鳴エネルギー移動がアクセプターに蛍光を惹起する。ステム活性化標識は典型的には、ステム構造がその核酸分子中に形成される時、アクセプターおよびドナーが近傍にもたらされるような、核酸分子（例えばリボスイッチ）上の位置にある標識のペアである。ステム活性化標識のドナー部分が自身蛍光標識であるならば、アクセプターの近傍にない時（即ち、ステロ構造が形成されていない的）にエネルギーを蛍光として放出する（典型的にはアクセプターの蛍光とは異なる波長において）。ステム構造が形成される時、全体としての効果は、ドナー蛍光の低下およびアクセプター蛍光の増大となるであろう。FRETプローブはステム活性化標識の使用例であって、その操作原理をリボスイッチと共に使用するために適合させることができる。
【０１８０】
H. 検出標識
リボスイッチの活性化、不活性化もしくは遮断、またはリボスイッチの活性化、不活性化もしくは遮断時に産生される核酸または蛋白の発現の検出および定量を助けるため、検出標識を、検出プローブもしくは検出分子中に組み込む、または発現される核酸もしくは蛋白に直接組み込むことができる。本明細書で使用する検出標識とは、直接的または間接的に核酸または蛋白に関与することができ、直接的または間接的に測定可能且つ検出可能なシグナルを生成する任意の分子である。このような標識が多数当業者に知られている。開示した方法での使用に好適な検出標識の例は、放射性同位元素、蛍光分子、燐光分子、酵素、抗体、およびリガンドである。
【０１８１】
好適な蛍光標識の例は、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)、 5,6-カルボキシメチルフルオレセイン、テキサスレッド、ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル(NBD)、クマリン、ダンシルクロリド、ローダミン、アミノメチルクマリン(AMCA)、エオシン、エリスロシン、BODIPY（登録商標）、カスケードブルー（登録商標）、オレゴングリーン（登録商標）、ピレン、リサミン、キサンテン、アクリジン、オキサジン、フィコエリスリン、ランタニドイオンの大環状キレート、例えばquantum dye（登録商標）、蛍光エネルギー移動色素、例えばチアゾールオレンジ-エチジウムヘテロ二量体、ならびにシアニン色素Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy7を包含する。その他の具体的な蛍光標識の例は、3-ヒドロキシピレン 5,8,10-トリスルホン酸、5-ヒドロキシトリプタミン(5-HT)、酸性フクシン、アリザリンコンプレクソン、アリザリンレッド、アロフィコシアニン、アミノクマリン、ステアリン酸アントロイル、アストラゾンブリリアントレッド4G、アストラゾンオレンジR、アストラゾンレッド6B、アストラゾンイエロー7 GLL、アタブリン、オーラミン、オーロホスフィン、オーロホスフィンG、BAO9(ビスアミノフェニルオキサジアゾール)、BCECF、ベルベリンスルファート、ビスベンズアミド、Blancophor FFG溶液、Blancophor SV、Bodipy Fl、ブリリアントスルホフラビンFF、Calcien Blue、カルシウムグリーン、Calcofluor RW溶液、Calcofluor White、Calcophor White ABT溶液、 Calcophor White標準溶液、Carbostyryl、カスケードイエロー、カテコールアミン、キナクリン、コリホスフィンO、クマリン-ファロイジン、CY3.1 8、CY5.1 8、CY7、Dans (1-ジメチルアミノナファリン5スルホン酸)、Dansa (ジアミノナフチルスルホン酸)、Dansyl NH-CH3、ジアミノフェニルオキシジアゾール(DAO)、ジメチルアミノ-5-スルホン酸、ジピロメテンボロンジフルオリド、ジフェニルブリリアントフラビン7GFF、ドパミン、エリスロシンITC、Euchrysin、FIF (ホルムアルデヒド誘導蛍光)、Flazo Orange、Fluo 3、 フルオレサミン、Fura-2、Genacryl Brilliant Red B、Genacryl Brilliant Yellow 10GF、Genacryl Pink 3G、Genacryl Yellow 5GF、Gloxalic Acid、Granular Blue、ヘマトポルフィリン、Indo-1、イントラホワイトCf液、Leucophor PAF、Leucophor SF、Leucophor WS、リサミンローダミンB200 (RD200)、ルシファーイエローCH、ルシファーイエロー VS、マグダラレッド、マリナブルー、マキシロンブリリアントフラビン10 GFF、マキシロンブリリアントフラビン8 GFF、MPS (メチルグリーンピロニンスチルベン)、ミトラマイシン、NBDアミン、ニトロベンズオキサジドール、ノルアドレナリン、ヌクレアーファストレッド、ヌクレアーイエロー、ナイロサンブリリアントフラビンE8G、オキサジアゾール、パシフィックブルー、パラロサニリン(Feulgen)、Phorwite AR溶液、Phorwite BKL、Phorwite Rev、Phorwite RPA、Phosphine 3R、フタロシアニン、フィコエリスリンR、ポリアザインダセンポントクロームブルーブラック、ポルフィリン、プリムリン、プロシオンイエロー、ピロニン、ピロニンB、ピロザールブリリアントフラビン7GF、キナクリンマスタード、ローダミン123、ローダミン5 GLD、ローダミン6G、ローダミンB、ローダミンB 200、ローダミンBエキストラ、ローダミンBB、ローダミンBG、ローダミンWT、セロトニン、セブロンブリリアントレッド2B、セブロンブリリアントレッド4G、セブロンブリリアントレ��ドB、セブロンオレンジ、セブロンイエローL、SITS (プリムリン)、SITS(スチルベンイソチオスルホン酸)、スチルベン、スナーフ1、スルホローダミンB Can C、スルホローダミンGエキストラ、テトラサイクリン、チアジンレッドR、チオフラビンS、チオフラビンTCN、チオフラビン5、チオライト、チオゾールオレンジ、チノポールCBS、トゥルーブルー、ウルトラライト、ウラニンB、ユビテックスSFC、キシレンオレンジ、およびXRITCを包含する。
【０１８２】
有用な蛍光標識は、フルオレセイン(5-カルボキシフルオレセイン-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル)、ローダミン(5,6-テトラメチルローダミン)、およびシアニン色素Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5およびCy7である。これらの蛍光色素の吸収および発光極大はそれぞれ、FITC (490 nm; 520 nm)、Cy3 (554 nm; 568 nm)、Cy3.5 (581 nm; 588 nm)、Cy5 (652 nm; 672 nm)、Cy5.5 (682 nm; 703 nm) およびCy7 (755 nm; 778 nm)であり、したがってこれらの同時検出が可能である。その他の蛍光色素の例には、6-カルボキシフルオレセイン(6-FAM)、2',4',1,4,-テトラクロロフルオレセイン(TET)、2’,4’,5’,7’,l,4-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、2’,7’-ジメトキシ-4’,5’-ジクロロ-6-カルボキシローダミン(JOE)、2’-クロロ-5’-フルオロ-7’,8’-融合フェニル-1,4-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン (NED)、および2’-クロロ-7’-フェニル-1,4-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(VIC)がある。蛍光標識は、Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ；Molecular Probes, Eugene, OR；およびResearch Organics, Cleveland, Ohioを包含する様々な商業的供給源から入手できる。
【０１８３】
さらなる興味深い標識は、それらが関係するプローブが標的分子に特異結合している時にのみシグナルを発生する標識であり、このような標識は、Tyagi & Kramer, Nature Biotechnology (1996) 14:303およびEP 0070685 Blに記載の「分子ビーコン」を包含する。
標識されたヌクレオチドは、合成中に発現された核酸へと直接取り込まれるのに役立つ検出標識の一形態である。核酸中に取り込まれ得る検出標識の例は、BrdUrd（5-ブロモデオキシウリジン。Hoy and Schimke, Mutation Research 290:217-230 (1993)）、アミノアリルデオキシウリジン（Henegariu et al:, Nature Biotechnology 18:345-348 (2000)）、 5-メチルシトシン(Sano et al., Biochim. Biophys. Acta 951:157-165 (1988))、ブロモウリジン（Wansick et al, J. Cell Biology 122:283-293 (1993)）、およびビオチン修飾されたヌクレオチド（Langer et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:6633 (1981)）またはジゴキシゲニンのような適当なハプテンで修飾されたヌクレオチド（Kerkhof, Anal. Biochem. 205:359-364 (1992)）、といったヌクレオチド類似体を包含する。好適な蛍光標識ヌクレオチドは、フルオレセイン-イソチオシアナート-dUTP、シアニン-3-dUTPおよびシアニン-5-dUTP（Yu et al, Nucleic Acids Res., 22:3226-3232 (1994)）である。DNAのための好ましいヌクレオチド類似体検出標識は、BrdUrd （ブロモデオキシウリジン、BrdUrd、BrdU、BUdR。Sigma-Aldrich Co）である。検出標識をDNA中に取り込むための、その他の有用なヌクレオチド類似体は、AA-dUTP（アミノアリル-デオキシウリジン三燐酸。Sigma-Aldrich Co.）、および5-メチル-dCTP （Roche Molecular Biochemicals）である。検出標識をRNA中に取り込むための有用なヌクレオチド類似体は、ビオチン-16-UTP（ビオチン-16-ウリジン-5'-三燐酸。Roche Molecular Biochemicals）である。フルオレセイン、Cy3、およびCy5は、直接標識のためにdUTPに結合させることができる。Cy3.5およびCy7は、ビオチン-またはジゴキシゲニン-標識されたプローブの二次検出のため、アビジンまたは抗ジゴキシゲニンコンジュゲートとして利用可能である。
【０１８４】
核酸中に組み込まれている検出標識、例えばビオチンを、続いて当分野で周知の鋭敏な方法を用いて検出することができる。例えば、ビオチンはストレプトアビジン-アルカリホスファターゼコンジュゲート（Tropix, Inc.）を用いて検出できるが、これをビオチンに結合させ、その後適当な基質（例えば、化学ルミネセンス基質CSPD：3-(4-メトキシスピロ-[1,2,-ジオキセタン-3-2'-(5'-クロロ)トリクロロ[3.3.1.13,7]デカン]-4-イル)フェニル燐酸；Tropix, Inc.）の化学ルミネセンスにより検出する。標識はまた、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、大豆ペルオキシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびポリメラーゼであってもよく、これらは例えば、化学的シグナル増幅を用いて、または光もしくは蛍光シグナルを発生する酵素に対する基質（例えば化学ルミネセンス性1,2-ジオキセタン基質）を使用することによって検出できる。
【０１８５】
これらの検出標識のうち2またはそれ以上を組み合わせた分子もまた検出標識として考えられる。既知の任意の検出標識を、開示したプローブ、タグ、分子および方法と共に使用して、開示した方法で産生されたリボスイッチまたは核酸または蛋白の活性化または不活性化を標識および検出することができる。検出標識により発生したシグナルを検出および測定する方法もまた当業者に周知である。例えば、放射性同位元素はシンチレーション計数または直接的視覚化により検出でき；蛍光分子は蛍光分光光度計で検出でき；燐光分子は分光光度計またはカメラによる直接的視覚化で検出でき；酵素は、その酵素で触媒される反応生成物の検出または視覚化によって検出でき；抗体は、その抗体に結合させた二次検出標識を検出することにより検出できる。本明細書で使用する検出分子とは、検出しようとする化合物または組成物と相互作用して、そこに1またはそれ以上の検出標識が結合する分子である。
【０１８６】
I. 配列類似性
本明細書に記載のように、相同性および一致という語の使用は類似性と同じ事を意味すると理解できる。したがって例えば、相同性という語が二つの配列（例えば、非天然配列）の間で使用される場合、これは、必ずしもこれら二つの配列間の進化上の関係を指している訳ではなく、それらの核酸配列間の類似性または関連に注目しているものと理解できる。進化上関連のある2つの分子の相同性を決定する方法の多くは、それらが進化上関連を有するか否かに拘わらず、配列類似性を測定する目的で、任意の2またはそれ以上の核酸または蛋白に、常套的に適用できる。
【０１８７】
一般に、本明細書に開示するリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子および蛋白の、任意の既知変異体および誘導体または生成するかも知れないそれらのものを規定する一つの方法は、特定の既知配列に対する相同性に関してその変異体および誘導体を定義することによる事が理解できる。本明細書に開示する特定配列の、この一致は、本明細書の他所にも記載する。一般に、本明細書に開示するリボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォーム、遺伝子および蛋白は、典型的には、定められた配列または天然配列に対して少なくとも約70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、または99パーセントの相同性を有する。当業者には、如何にして二つの蛋白または核酸、例えば遺伝子の相同性を決定するかが容易に理解できる。例えば、相同性が最高レベルとなるように二つの配列をアラインした後、相同性を計算することができる。
【０１８８】
相同性を計算するもう一つの方法は、公開されているアルゴリズムにより実施できる。比較のために最適な配列アラインメントを、Smith and Waterman Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)のローカル相同性アルゴリズムによって、またはNeedleman and Wunsch, J. MoL Biol. 48: 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって、またはPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444 (1988)の相同性検索法によって、またはこれらのアルゴリズムのコンピューター制御された遂行によって（GAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA。Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI）、または視察によって、実施できる。
【０１８９】
同じタイプの相同性が、例えばZuker, M. Science 244:48-52, 1989、Jaeger et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:7706-7710, 1989、Jaeger et al. Methods Enzymol. 183:281-306, 1989に開示されたアルゴリズムにより、核酸について取得でき、これらを、少なくとも核酸アラインメントに関連する材料について、引用により本明細書の一部とする。通常、これら任意の方法を利用できるという事、そして、幾つかの例では、これら様々な方法の結果が相違することがあるという事は当然である。しかしながら当業者には、これらの方法のうち少なくとも一つによって一致が見いだされたならば、その配列は、述べられた一致を有すると言える事が理解できる。
【０１９０】
例えば、本明細書で、別の配列に対して或る一定の相同性パーセントを有すると述べられた配列とは、上記の計算方法のうち1またはそれ以上によって計算する時に記載の相同性を有する配列を指す。例えば、第一の配列が第二の配列に対してZuker計算法を用いて80パーセントの相同性を持つと計算されたならば、他の何らかの計算法で計算した時に第一の配列が第二の配列に対して80パーセントの相同性を持たなくても、その第一の配列は第二の配列に対して80パーセントの相同性（本明細書の定義による）を持つ。もう一つの例として、第一の配列が第二の配列に対してZuker計算法およびPearson and Lipman計算法の両者を用いて80パーセントの相同性を持つと計算されたならば、Smith and Waterman計算法、Needleman and Wunsch計算法、Jaeger計算法、または他の任意の計算法で計算した時に第一の配列が第二の配列に対して80パーセントの相同性を持たなくても、その第一の配列は第二の配列に対して80パーセントの相同性（本明細書の定義による）を持つ。さらに別の例として、第一の配列が第二の配列に対してそれぞれの計算法を用いて80パーセントの相同性を持つと計算されたならば、その第一の配列は第二の配列に対して80パーセントの相同性（本明細書の定義による）を持つ（とは言え実際には、異なる計算法ではしばしば異なる相同性パーセントの計算結果となる）。
【０１９１】
J. ハイブリダイゼーションおよび選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションという語は典型的には、少なくとも二つの核酸分子、例えばプライマーまたはプローブおよびリボスイッチまたは遺伝子の間の、配列が誘導する相互作用を意味する。配列が誘導する相互作用とは、ヌクレオチド特異的方法で二つのヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体またはヌクレオチド誘導体の間に起こる相互作用を意味する。例えば、GがCと相互作用する事またはAがTと相互作用する事は、配列が誘導する相互作用である。典型的には、配列が誘導する相互作用は、ヌクレオチドのワトソン-クリック面またはフーグスティーン面で起こる。二つの核酸のハイブリダイゼーションは、当業者の知悉する幾つかの条件およびパラメータにより影響を受ける。例えば、塩濃度、pH、および反応温度の全てが、二つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響する。
【０１９２】
二つの核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションのパラメータは当業者に周知である。例えば幾つかの態様では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、ストリンジェントハイブリダイゼーション条件として定義できる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、そのハイブリダイゼーションおよび洗浄工程のいずれかまたは両方の温度および塩濃度の両者によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するハイブリダイゼーション条件は、Tm(当該分子の半分がそれらのハイブリダイゼーション相手から解離する融解温度)より約12-25℃低い温度と高イオン強度溶液(6X SSCまたは6X SSPE)中でのハイブリダイゼーションおよびそれに続く、洗浄温度がTmより約5℃ないし20℃低くなるよう選択された温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄を包含できる。温度および塩濃度は予備実験で容易に実験的決定ができ、その予備実験では、フィルターに固定化されたレファランスDNAの試料を標識された目的核酸とハイブリダイズし、次いで異なるストリンジェンシーの条件下に洗浄する。ハイブリダイゼーション温度は、典型的にはDNA-RNAおよびRNA-RNAハイブリダイゼーションではより高い。条件を、ストリンジェンシーを達成するため上記のように利用、または当分野で知られているように利用できる（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989；Kunkel et al. Methods Enzymol. 1987:154:367, 1987。これらを、少なくとも核酸ハイブリダイゼーションに関係する材料について、引用により本明細書の一部とする）。DNA-DNAハイブリダイゼーションのための好ましいストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、6X SSCまたは6X SSPE中約68℃(水溶液)およびこれに続く68℃での洗浄であってよい。所望によりハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーを、所望の相補性の程度が低下するに応じて、そしてさらに変異度を探索する領域のG-CまたはA-T豊富度に応じて下げることができる。同様に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーを、所望の相同性が増大するに応じて、そしてさらに高い相同性が望まれる領域のG-CまたはA-T豊富度に応じて上げることができる（これらは全て当分野で周知である）。
【０１９３】
選択的ハイブリダイゼーションを定義するもう一つの方法は、別の核酸に結合した核酸のうち一個の量(パーセンテージ)に注目することによる。例えば幾つかの態様では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、限定的核酸のうち少なくとも約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100パーセントが非限定的核酸に結合している事である。典型的には、この非限定的核酸は、例えば10または100または1000倍過剰である。このタイプの検定は、限定的および非限定的核酸の両者が、例えばそれらのkdの10倍もしくは100倍もしくは1000倍低い、または核酸分子の一方だけが10倍もしくは100倍もしくは1000倍であり、または一方もしくは両方の核酸分子がそれらのkd以上であるという条件下で実施できる。
【０１９４】
選択的ハイブリダイゼーションを定義するもう一つの方法は、所望の酵素的操作の推進にハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で、その酵素的操作を受ける核酸のパーセンテージに注目することである。例えば幾つかの態様では、選択的ハイブリダイゼーション条件は、核酸のうち少なくとも約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100パーセントが、その酵素的操作を推進する条件下で酵素的操作を受ける事であり、例えば、酵素的操作がDNA伸張である場合、核酸分子のうち少なくとも約60、65、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100パーセントが伸張される時が、選択的ハイブリダイゼーション条件である。好ましい条件はさらに、その酵素が操作を遂行するのに適切であるとして製造者が推奨する、または当分野で指示される条件を包含する。
【０１９５】
相同性と同様に、二つの核酸分子間のハイブリダイゼーションレベルを決定するための様々な方法が本明細書に開示されている事が理解できる。これらの方法および条件は、二つの核酸分子の間に種々のハイブリダイゼーションパーセンテージを与え得るが、別途記載のない限り、いかなる方法のパラメータへの適合も満足できるものであるという事が理解できる。例えば、80%ハイブリダイゼーションが求められており、且つハイブリダイゼーションが、これらの方法のうち任意の一つにおいて必要とされるパラメータの範囲内で起こるならば、それは本明細書に開示されていると考える。
【０１９６】
当業者は、或る組成物または方法が、集合的にまたは単独でハイブリダイゼーションを決定するための基準のいずれか一つに適合するならば、それは本明細書に開示の組成物または方法であるという事が理解できる。
【０１９７】
K. 核酸
例えばリボスイッチ、アプタマー、ならびにリボスイッチおよびアプタマーをコードしている核酸を包含する、核酸を基礎とする様々な分子を本明細書に開示する。開示した核酸は、例えばヌクレオチド、ヌクレオチド類似体、またはヌクレオチド代替物で構成され得る。これらのおよびその他の分子の非限定的例を本明細書に論ずる。例えば、ベクターが細胞で発現される時、発現されるmRNAは典型的にはA、C、G、およびUで構成されることが理解できる。同様に、核酸分子が例えば外因性デリバリーによって細胞または細胞環境内に導入される場合、その核酸分子は、細胞環境において当該核酸分子の分解を減少させるヌクレオチド類似体で構成されていることが有利であるという事が理解できる。
【０１９８】
それらの関連する機能が維持される限り、リボスイッチ、アプタマー、発現プラットフォームおよびその他任意のオリゴヌクレオチドおよび核酸は、修飾ヌクレオチド(ヌクレオチド類似体)で構成される、またはそれらを包含することができる。多数の修飾ヌクレオチドが知られており、オリゴヌクレオチドおよび核酸に使用することができる。ヌクレオチド類似体は、塩基、糖、または燐酸部分のいずれかに何らかのタイプの修飾を含むヌクレオチドである。塩基部分への修飾は、A、C、G、およびT/Uの天然および合成的修飾、ならびに種々のプリンまたはピリミジン塩基、例えばウラシル-5-イル、ヒポキサンチン-9-イル(I)、および2-アミノアデニン-9-イルを包含する。修飾塩基は、5-メチルシトシン(5-me-C)、5-ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、2-アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの6-メチルおよびその他のアルキル誘導体、アデニンおよびグアニンの2-プロピルおよびその他のアルキル誘導体、2-チオウラシル、2-チオチミンおよび2-チオシトシン、5-ハロウラシルおよびシトシン、5-プロピニルウラシルおよびシトシン、6-アゾウラシル、シトシンおよびチミン、5-ウラシル(シュードウラシル)、4-チオウラシル、8-ハロ、8-アミノ、8-チオール、8-チオアルキル、8-ヒドロキシおよびその他の8-置換アデニンおよびグアニン、5-ハロ、特に5-ブロモ、5-トリフルオロメチルおよびその他の5-置換ウラシルおよびシトシン、7-メチルグアニンおよび7-メチルアデニン、8-アザグアニンおよび8-アザアデニン、7-デアザグアニンおよび7-デアザアデニンならびに3-デアザグアニンおよび3-デアザアデニンを包含するがこれらに限定される訳ではない。さらなる塩基修飾が、例えば米国特許第3687808号、Englisch et al., Angewandte Chemie, International Edition, 1991, 30, 613、およびSanghvi, Y. S., Chapter 15, Antisense Research and Applications, pages 289-302, Crooke, S. T. and Lebleu, B. ed., CRC Press, 1993に見いだせる。幾つかのヌクレオチド類似体、例えば5-置換ピリミジン、6-アザピリミジンならびにN-2、N-6およびO-6置換プリン（2-アミノプロピルアデニン、5-プロピニルウラシルおよび5-プロピニルシトシンを包含する）。5-メチルシトシンは二本鎖形成の安定性を増大させることができる。その他の修飾塩基は、普遍的塩基として機能する塩基である。普遍的塩基は3-ニトロピロールおよび5-ニトロインドールを包含する。普遍的塩基は、通常の塩基に置き換わるが塩基対に偏りを持たない。即ち、普遍的塩基は他の任意の塩基と塩基対を形成できる。塩基修飾はしばしば、例えば2’-O-メトキシエチルのような糖修飾と組み合わされて、二本鎖安定性増大といった独特の性質を達成できる。様々な塩基修飾を説明および詳述する、数多くの米国特許、例えば4845205；5130302；5134066；5175273；5367066；5432272；5457187；5459255；5484908；5502177；5525711；5552540；5587469；5594121；5596091；5614617；および5681941がある。これらの特許の各々を引用によりその全内容、特に塩基修飾、それらの合成、使用、ならびにオリゴヌクレオチドおよび核酸へのそれらの組み込みについての説明を本明細書の一部とする。
【０１９９】
ヌクレオチド類似体は、糖部分の修飾をも包含する。糖部分への修飾は、リボースおよびデオキシリボースの天然の修飾ならびに合成による修飾を包含する。糖の修飾は、2’位における以下の修飾：OH；F；O-、S-、もしくはN-アルキル；O-、S-、もしくはN-アルケニル；O-、S-、もしくはN-アルキニル；またはO-アルキル-O-アルキル［ここで、アルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換または非置換C1ないしC10、アルキルまたはC2ないしC10アルケニルおよびアルキニルであってよい］を包含するがこれらに限定される訳ではない。2’糖修飾はさらに、-O[(CH2)nO]mCH3、-O(CH2)nOCH3、-O(CH2)nNH2、-O(CH2)nCH3、-O(CH2)n-ONH2、および-O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2［式中、nおよびmは1ないし約10である］を包含するがこれらに限定されない。
【０２００】
2’位におけるその他の修飾は、C1ないしC10低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリル、アラルキル、O-アルカリルもしくはO-アラルキル、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、SO2CH3、ONO2、NO2、N3、NH2、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、RNA開裂基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改善する基、および類似の性質を持つその他の置換基を包含するがこれらに限定されない。同様の修飾をその糖の他の位置、特に3’末端ヌクレオチドまたは2’-5’結合オリゴヌクレオチドの3’位の糖、および5’末端ヌクレオチドの5’位に施すこともできる。修飾糖はまた、架橋している環上酸素、例えばCH2およびSに修飾を含むものを包含する。ヌクレオチド糖類似体はさらに、ペントフラノシル糖に代わるシクロブチル部分のような糖模倣物を有することもある。このような修飾糖構造の製造を教示する、多数の米国特許、例えば4981957；5118800；5319080；5359044；5393878；5446137；5466786；5514785；5519134；5567811；5576427；5591722；5597909；5610300；5627053；5639873；5646265；5658873；5670633；および5700920があり、これらの各々を引用によりその全内容、特にそれらの修飾糖構造、それらの合成、使用、ならびにヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸へのそれらの組み込みについての説明を本明細書の一部とする。
【０２０１】
ヌクレオチド類似体はさらに、燐酸部分での修飾を包含する。修飾燐酸部分は、二つのヌクレオチド間の結合がホスホロチオアート、キラルホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチルおよびその他のアルキルホスホナート(3’-アルキレンホスホナートおよびキラルホスホナートを包含する)、ホスフィナート、ホスホロアミダート(3’-アミノホスホロアミダートおよびアミノアルキルホスホロアミダートを包含する)、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホナート、チオノアルキルホスホトリエステル、ならびにボラノ燐酸を含むよう修飾され得るものを包含するがこれらに限定されない。二つのヌクレオチド間のこれらの燐酸または修飾燐酸結合は3’-5’結合または2’-5’結合によるものであってよく、その結合は3’-5’から5’-3’へ、または2’-5’から5’-2’へといったような逆転した極性を含むことがあると理解できる。様々な塩、混合塩および遊離酸の形態もまた包含される。多数の米国特許が、修飾燐酸を含むヌクレオチドの製造および使用方法を教示しており、それらは、3687808；4469863；4476301；5023243；5177196；5188897；5264423；5276019；5278302；5286717；5321131；5399676；5405939；5453496；5455233；5466677；5476925；5519126；5536821；5541306；5550111；5563253；5571799；5587361；および5625050を包含し(但しこれらに限定されない)、これらの各々を引用によりその全内容、特に修飾燐酸、それらの合成、使用、ならびにヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸へのそれらの組み込みについての説明を本明細書の一部とする。
【０２０２】
ヌクレオチド類似体は一つの修飾だけを含む必要はなく、1個の部分または異なる部分の間に複数の修飾を含み得るということが理解できる。
【０２０３】
ヌクレオチド代替物とは、ペプチド核酸(PNA)のように、ヌクレオチドと類似の機能上の性質を持つが燐酸部分を含まない分子である。ヌクレオチド代替物は、ワトソン-クリックまたはフーグスティーン方式で相補的核酸を認識しそれとハイブリダイズ(塩基対形成)するが、燐酸部分以外の部分によって結合する分子である。ヌクレオチド代替物は適当な標的核酸と相互作用する時、二重螺旋型構造をとることができる。
【０２０４】
ヌクレオチド代替物は、燐酸部分および／または糖部分が置き換えられてしまったヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体である。ヌクレオチド代替物は標準的な燐酸原子を含まない。燐酸に代わる代替物は、例えば短鎖アルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子およびアルキルまたはシクロアルキルヌクレオシド間結合、または1もしくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子によるもしくはヘテロ環によるヌクレオシド間結合であってよい。これらには、モルホリノ結合（部分的に、ヌクレオシドの糖部分から形成されている）；シロキサンバックボーン；スルフィド、スルホキシドおよびスルホンバックボーン；ホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；メチレンホルムアセチルおよびチオホルムアセチルバックボーン；アルケン含有バックボーン；スルファミン酸バックボーン；メチレンイミノおよびメチレンヒドラジノバックボーン；スルホン酸およびスルホンアミドバックボーン；アミドバックボーンを有するもの；ならびに混合N、O、SおよびCH2要素部分を有するものが包含される。多数の米国特許が、このようなタイプの燐酸置換の製造および使用方法を開示しており、それらは、5034506；5166315；5185444；5214134；5216141；5235033；5264562；5264564；5405,938；5434257；5466677；5470967；5489677；5541307；5561225；5596086；5602240；5610289；5602240；5608046；5610289；5618704；5623070；5663312；5633360；5677437；および5677439を包含し(但しこれらに限定されない)、これらの各々を引用によりその全内容、特に燐酸置換、それらの合成、使用、ならびにヌクレオチド、オリゴヌクレオチドおよび核酸へのそれらの組み込みについての説明を本明細書の一部とする。
【０２０５】
ヌクレオチド代替物において、ヌクレオチドの糖および燐酸部分の両方が、例えばアミド型の結合(アミノエチルグリシン)によって置き換えられていることがあると理解できる(PNA)。米国特許第5539082；5714331；および5719262号はPNA分子の製造および使用方法を教示しており、これらの各々を引用により本明細書の一部とする（Nielsen et al., Science 254:1497-1500(1991)をも参照されたい）。
【０２０６】
オリゴヌクレオチドおよび核酸はヌクレオチドで構成され、異なるタイプのヌクレオチドで構成されてもよいし同じタイプのヌクレオチドで構成されてもよい。例えば、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドのうち1またはそれ以上が、リボヌクレオチド、2’-O-メチルリボヌクレオチド、もしくはリボヌクレオチドおよび2’-O-メチルリボヌクレオチドの混合物であってよく；ヌクレオチドの約10%ないし約50%が、リボヌクレオチド、2’-O-メチルリボヌクレオチド、もしくはリボヌクレオチドおよび2’-O-メチルリボヌクレオチドの混合物であってよく；ヌクレオチドの約50%またはそれ以上が、リボヌクレオチド、2’-O-メチルリボヌクレオチド、もしくはリボヌクレオチドおよび2’-O-メチルリボヌクレオチドの混合物であってよく；または、ヌクレオチドの全てが、リボヌクレオチド、2’-O-メチルリボヌクレオチド、もしくはリボヌクレオチドおよび2’-O-メチルリボヌクレオチドの混合物であってよい。このようなオリゴヌクレオチドおよび核酸を、キメラオリゴヌクレオチドおよびキメラ核酸と称することができる。
【０２０７】
L. 固体支持体
固体支持体とは、分子（例えばトリガー分子）およびリボスイッチ（または開示した本方法で使用される、または本方法により製造されるその他の成分）を結びつけることのできる、固体状態の基質または支持体である。リボスイッチおよびその他の分子を固体支持体に直接または間接的に結合させることができる。例えば、被検体（例えば、トリガー分子、被検化合物）を、固体支持体の表面に結合させ、または固体支持体上に固定化した捕捉剤（例えば、被検体に結合する化合物または分子）に関与させることができる。別の例として、リボスイッチを固体支持体表面に結合させ、または固体支持体に固定化したプローブに関与させることができる。アレーとは、それに、多数のリボスイッチ、プローブまたはその他の分子が、アレー、グリッドまたはその他の統制のとれたパターンで関与している固体支持体である。
【０２０８】
固体支持体で使用するための固体状態の基質は、成分がそれと直接または間接的に関与する任意の固体材料を包含できる。これは、アクリルアミド、アガロース、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、金、ポリスチレン、ポリエチレンビニルアセタート、ポリプロピレン、ポリメタクリラート、ポリエチレン、ポリエチレンオキシド、ポリシリケート、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フルオロカーボン、ナイロン、シリコンゴム、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリアクチン酸、ポリオルトエステル、官能性シラン、ポリプロピルフメラート、コラーゲン、グリコサミノグリカン、およびポリアミノ酸といった材料を包含する。固体状態基質は薄膜、メンブレン、瓶、皿、繊維、織物、成型ポリマー、粒子、ビーズ、微粒子、または組み合わせを包含する任意の有用な形態を持つことができる。固体状態基質および固体支持体は多孔性または非多孔性であってよい。チップは、長方形または正方形の小さな材料片である。固体状態基質の好ましい形態は、薄膜、ビーズまたはチップである。固体状態基質の有用な形態は微量定量皿である。幾つかの態様では、マルチウェルガラススライドを使用できる。
【０２０９】
アレーは、複数のリボスイッチ、トリガー分子、その他の分子、固体支持体上の特定されたもしくは所定の位置に固定化された化合物またはプローブを含み得る。この固体支持体上の所定位置の各々には一般に一つのタイプの成分がある（即ち、その位置にある全ての成分は同じである）。或いは、多くのタイプの成分を、固体支持体上の同じ所定位置に固定化することもできる。各々の位置に、与えられた成分のコピーが複数あるであろう。固体支持体上で異なる成分を空間的に分離することにより、検出および同定を分離することができる。
【０２１０】
固体支持体を単一のユニットまたは構造にすることは、有用ではあるが必要である訳ではない。リボスイッチ、トリガー分子、その他の分子、化合物および／またはプローブの集合を、幾つもの数の固体支持体上に分布させることができる。例えば極端な場合には、各成分を別々の反応管もしくは容器中に、または別々のビーズもしくは微粒子上に固定化することができる。
【０２１１】
オリゴヌクレオチドを固体状態の基質に固定化する方法は、充分に確立されている。アドレスプローブおよび検出プローブを含むオリゴヌクレオチドを、確立された結合法を用いて基質に結合させることができる。例えば、好適な結合法が、Pease et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(11):5022-5026 (1994)、およびKhrapko et al., Mol Biol (Mosk) (USSR) 25:718-730 (1991)に記載されている。カゼイン被覆スライド上への3’-アミノオリゴヌクレオチドの固定化法が、Stimpson et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6379-6383 (1995)に記載されている。固体状態基質にオリゴヌクレオチドを結合させる有用な方法が、Guo et al, Nucleic Acids Res. 22:5456-5465 (1994)に記載されている。
【０２１２】
固体支持体上に固定化した各成分（例えば、リボスイッチ、トリガー分子、またはその他の分子）は、その固体支持体の異なる所定領域に位置させることができる。異なる位置とは、異なる反応チェンバーであってよい。異なる所定領域の各々は、他の異なる領域から物理的に分離していてよい。固体支持体の異なる所定領域間の距離は、固定されていても可変性であってもよい。例えばアレーでは、成分の各々が相互に一定距離に配置され、一方、ビーズに結びついた成分は固定された空間的関係にはない。特に、多数の固体支持体ユニット（例えば、多数のビーズ）を使用すると、可変性の距離となるであろう。
【０２１３】
成分は、任意の密度で固体支持体に関係または固定化することができる。1立方センチメートルあたり400を超える密度で異なる成分を固体支持体に固定化することができる。成分のアレーは幾つもの成分を有し得る。例えば、1個のアレーは少なくとも1000個、スク何クトも10000個、少なくとも100000個、または少なくとも1000000個の異なる成分を固体支持体上に固定化させることができる。
【０２１４】
M. キット
上記の材料およびその他の材料を、開示した方法の実施に、または実施を助けるのに役立つキットとして、任意の適当な組み合わせで同梱できる。与えられたキット内の構成成分を、開示した方法と共に使用するために設計し適合させることは有用である。例えば、化合物を検出するためのキットを開示するが、そのキットは1またはそれ以上のバイオセンサーリボスイッチを含む。このキットはさらに、リボスイッチの活性化を検出する試薬および標識を含むことができる。
【０２１５】
N. 混合物
開示した方法を実施することにより、または実施の準備をすることにより形成される混合物を開示する。
その方法が、組成物または成分または試薬を混合または接触に至らせることを含む時は常に、その方法の実施は幾つかの異なる混合物を作り出す。例えば、その方法が3つの混合工程を包含する場合、もし工程が別々に実施されるならばこれらの工程のそれぞれの後に固有の混合物が形成される。さらに、その工程が実施される方法に拘わらず、全工程の完了後に一つの混合物が形成される。本明細書の内容は、開示した方法を実施することにより得られるこれらの混合物、および、例えば本明細書に開示した任意の試薬、組成物、または成分を含有する混合物を企図するものである。
【０２１６】
O. 系
開示した方法の実施に、または実施を助けるのに役立つ系を開示する。系は一般に、構造、機械、装置などおよび組成物、化合物、材料などといった製造品の組み合わせを含む。本明細書に開示される、またはその内容から明らかである組み合わせが企図される。例えば、バイオセンサーリボスイッチ、固体支持体およびシグナル読み取り装置を含む系が開示され企図される。
【０２１７】
P. データ構造およびコンピューター制御
開示した方法で使用される、またはそれにより生成される、またはそこから生成されるデータ構造を開示する。データ構造は一般に、組成物または媒質中に収集された、統制された、保存された、そして／または具体化された、任意の形態のデータ、情報、および／または対象である。電子的形態、例えばRAMまたは保存ディスク中に保存されたリボスイッチ構造および活性化測定値は、データ構造の1タイプである。
【０２１８】
開示した方法、またはその任意の部分またはそのための準備を、コンピューター制御によって制御、管理、またはその他の方法で補助することができる。このようなコンピューター制御は、コンピューター制御されたプロセスまたは方法によって達成でき、そしてデータ構造を使用および／または生成でき、そしてコンピュータープログラムを使用することができる。このようなコンピューター制御、コンピューター制御されたプロセス、データ構造、およびコンピュータープログラムが企図され、本明細書に開示されていると理解すべきである。
【０２１９】
方法
リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する方法を開示する。このような方法は、例えばリボスイッチと、化合物、またはリボスイッチを活性化、不活性化もしくは遮断できるトリガー分子を接触させることを含み得る。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去を介して遺伝子発現を制御するよう機能する。化合物は、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断するために使用できる。リボスイッチのためのトリガー分子（およびその他の活性化化合物）は、リボスイッチを活性化するために使用できる。トリガー分子以外の化合物は一般に、リボスイッチを不活性化または遮断するために使用できる。リボスイッチは、例えばリボスイッチからトリガー分子を除去することによって不活性化され得る。したがって、リボスイッチを不活性化する、開示の方法は、例えばリボスイッチからトリガー分子(またはその他の活性化化合物)を除去、またはリボスイッチと接触しているトリガー分子を除去することを含む。例えばリボスイッチを活性化しないトリガー分子類似体の結合によって、リボスイッチを遮断することができる。
【０２２０】
或る化合物をRNA分子と接触させることによって、そのRNA分子またはRNA分子をコードしている遺伝子（ここで、このRNA分子はリボスイッチを含む）の発現を変化させる方法もまた開示する。リボスイッチは、トリガー分子の結合または除去によって遺伝子発現を制御するよう機能する。したがって、リボスイッチを含む目的RNA分子を、そのリボスイッチを活性化、不活性化または遮断する状態におくことを利用して、そのRNAの発現を変化させることができる。例えば当該RNAへの転写の終止または当該RNAへのリボソーム結合の遮断の結果、発現が変化を受け得る。リボスイッチの性質に応じて、トリガー分子の結合が、当該RNA分子の発現を低減もしくは阻止、または当該RNA分子の発現を促進もしくは増大させ得る。
【０２２１】
リボスイッチをRNA分子に機能的に結合させることによって、そのRNA分子またはRNA分子をコードしている遺伝子の発現を調節する方法もまた開示する。例えば、リボスイッチをRNA分子と物理的に連結することによって、または、RNA分子をコードしている核酸を、リボスイッチを含み且つコードしているよう改変し、その結果、改変された核酸から生成したRNAが、そのRNA分子と機能的に結合したリボスイッチを有するようにすることによって、といったような方法を包含する任意の適当な方法によって、リボスイッチをRNA分子と機能的に結合させることができる。目的とするRNA分子と機能的に結合したリボスイッチを、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する条件におくことを利用して、そのRNAの発現を変化させることができる。
【０２２２】
リボスイッチを活性化、不活性化または遮断することによって、リボスイッチを含む天然の遺伝子またはRNAの発現を調整する方法もまた開示する。もしその遺伝子が、それを担持する細胞または生物の生存に必須であるならば、リボスイッチの活性化、不活性化または遮断は、その細胞または生物の死、静止または衰弱をもたらし得る。例えば、微生物の生存に必須の天然遺伝子における天然リボスイッチの活性化は、その微生物の死をもたらし得る（もしリボスイッチの活性化が発現を停止または抑制するならば）。これが、抗菌作用および抗生物作用を目的として本開示化合物および方法を使用する一つの根拠である。
【０２２３】
リボスイッチを活性化、不活性化または遮断することにより、リボスイッチを含む単離された、改変された、または組み換えられた遺伝子もしくはRNAの発現を調整するための方法もまた開示する。この遺伝子またはRNAは任意の方法で改変または組換えを行うことができる。例えば、リボスイッチおよび該RNAのコード領域は異種のものであってよく、リボスイッチは組換えもしくはキメラ、または両者であってよい。もしこの遺伝子が所望の発現生成物をコードしているならば、リボスイッチの活性化または不活性化を用いて該遺伝子の発現を誘導し、そのようにして発現生成物の産生をもたらすことができる。もしこの遺伝子が遺伝子発現または別の細胞プロセスのインデューサーまたはリプレッサーをコードしているならば、リボスイッチの活性化、不活性化または遮断は、他の、調整された遺伝子または細胞プロセスの誘導、抑制または脱抑制をもたらすことができる。このような多くの二次調節作用が知られており、それらをリボスイッチとの使用に適合させることができる。このような調節のための一次制御としてのリボスイッチの利点は、リボスイッチトリガー分子が小さい非抗原性分子であり得ることである。
【０２２４】
アプタマードメインをリボスイッチの発現プラットフォームドメインと機能的に結合させる（これはキメラリボスイッチである）ことにより、リボスイッチの調節を変える方法もまた開示する。するとこのアプタマードメインは、例えばこのアプタマードメインのためのトリガー分子の作用を介してリボスイッチの調節を仲介できる。アプタマードメインは、例えばリボスイッチの正常または天然のアプタマードメインを新たなアプタマードメインに置き換えることを包含する任意の適当な方法でリボスイッチの発現プラットフォームドメインと機能的に結合できる。一般に、アプタマードメインがそこから誘導されているリボスイッチを活性化、不活性化または遮断できる任意の化合物または条件を使用して、キメラリボスイッチを活性化、不活性化または遮断することができる。
【０２２５】
リボスイッチを共有結合で変化させることにより（例えば、リボスイッチの一部を架橋、または或る化合物をリボスイッチに結合させることによって）、リボスイッチを不活性化する方法もまた開示する。このような方法によるリボスイッチの不活性化は、例えばそのリボスイッチのためのトリガー分子が結合することを妨げる、またはトリガー分子の結合時にリボスイッチの状態が変化することを妨げる、またはリボスイッチの発現プラットフォームドメインがトリガー分子の結合時に発現に影響を及ぼすことを妨げるという変化に起因し得る。
【０２２６】
新たなトリガー分子を認識する新たなリボスイッチおよび／または新たなアプタマーを選択、設計または誘導する方法もまた開示する。このような方法は、リボスイッチ中にアプタマー変異体の集合を作り出し、目的化合物の存在下でその変異体リボスイッチの活性化を評価し、活性化された変異体リボスイッチ （または、例えば最も高度にまたは最も選択的に活性化されたリボスイッチ） を選択し、そして、所望の活性、特異性、活性および特異性の組み合わせ、またはその他の性質の組み合わせを有する変異体リボスイッチが生成するまでこれらの工程を反復する事を含む。これらの方法により製造されたリボスイッチおよびアプタマードメインもまた開示する。
【０２２７】
機能的核酸分子のインビトロ選択およびインビトロ進化のための技術は既知であり、リボスイッチおよびそれらの成分と共に使用するために適合させることができる。有用な技術は、例えばA. Roth and R. R. Breaker (2003) 「アロステリックリボザイムのインビトロ選択」Methods in Molecular Biology Series - Catalytic Nucleic Acid Protocols (Sioud, M., ed.), Humana, Totowa, NJ；R. R. Breaker (2002)「バイオセンサー構成成分としての改変されたアロステリックリボザイム」Curr. Opin. Biotechnol. 13:31-39；G. M. Emilsson and R. R. Breaker (2002) 「デオキシリボザイム：新たな活性および新たな応用」Cell. Mol. Life Sci. 59:596- 607；Y. Li, R. R. Breaker (2001)「キナーゼおよびリガーゼデオキシリボザイムのインビトロ選択」Methods 23:179-190；G. A. Soukup, R. R. Breaker (2000)「アロステリックリボザイム」Ribozymes: Biology and Biotechnology. R. K. Gaur and G. Krupp eds. Eaton Publishing；G. A. Soukup, R. R. Breaker (2000)「アロステリック核酸触媒」Curr. Opin. Struct. Biol. 10:318-325；G. A. Soukup, R. R. Breaker (1999)「核酸分子スイッチ」Trends Biotechnol. 17:469-476；R. R. Breaker (1999)「自己開裂リボザイムおよびデオキシリボザイムのインビトロ選択」Intracellular Ribozyme Applications: Principles and Protocols. L. Couture, J. Rossi eds. Horizon Scientific Press, Norfolk, England；R. R. Breaker (1997)「触媒性ポリヌクレオチドのインビトロ選択」Chem. Rev. 97:371-390；およびこれらに引用されている参考文献に記載されており、これらの刊行物は引用により、インビトロ選択および進化技術に関するそれらの説明を、個別的に本明細書の一部とする。
【０２２８】
さらに、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する化合物を選択および特定する方法もまた開示する。リボスイッチの活性化とは、トリガー分子との結合時のリボスイッチの状態の変化を指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物によっても、そしてトリガー分子の結合以外の方法でも活性化され得る。本明細書で使用するトリガー分子という語は、リボスイッチを活性化できる分子および化合物を指す。これは、そのリボスイッチのための天然または正常トリガー分子、および、リボスイッチを活性化できるその他の分子を包含する。天然または正常トリガー分子は、自然界にある与えられたリボスイッチのためのトリガー分子であるか、または、幾つかの非天然リボスイッチの場合には、そのためにリボスイッチが設計された、またはそれによってリボスイッチが選択されたトリガー分子である（例えば、インビトロ選択またはインビトロ進化技術の場合のように）。非天然のトリガー分子は非天然トリガー分子と呼ぶことができる。
【０２２９】
被検化合物を伴うリボスイッチの原子構造をモデル作製し、被検化合物がそのリボスイッチと相互作用するかどうかを判定することを含む、リボスイッチと相互作用する化合物の特定方法もまた本明細書に開示する。被検化合物がそのリボスイッチと相互作用するかどうかの判定は、本明細書の他所に記載のように、例えば、リボスイッチのモデルにおける被検化合物の予測最小相互作用エネルギー、予測結合定数、予測解離定数、または組み合わせを決定することによって達成できる。被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかの判定は、例えば、被検化合物とリボスイッチモデルとの、1またはそれ以上の予測された結合、1またはそれ以上の予測相互作用、または組み合わせを決定することによって達成できる。予測相互作用は、上記のように、例えばファン・デル・ワールス相互作用、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用、または組み合わせより成る群から選択できる。一例では、リボスイッチはグアニンリボスイッチである。
【０２３０】
リボスイッチとの相互作用が決定された時に原子接触が決定され、それにより被検化合物とリボスイッチの相互作用が決定される。被検化合物の類似体を特定でき、その被検化合物の類似体がリボスイッチと相互作用するかどうかが決定できる。
【０２３１】
細菌を、本明細書に開示する化合物または本明細書に開示の方法によって特定された化合物と接触させる事を含む、細菌を殺滅または阻害する方法もまた開示する。
【０２３２】
リボスイッチの結晶構造を特定し、被検化合物を伴うリボスイッチをモデル作製し、そして被検化合物がそのリボスイッチと相互作用するかどうかを決定することを含む、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法もまた開示する。リボスイッチの不活性化とは、トリガー分子が結合していない時のリボスイッチの状態の変化を指す。リボスイッチは、トリガー分子以外の化合物の結合によっても、そしてトリガー分子の除去以外の方法でも不活性化され得る。リボスイッチの遮断とは、トリガー分子の存在がリボスイッチを活性化しない、リボスイッチの条件または状態を指す。
【０２３３】
リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する化合物を特定する方法もまた開示する。例えば、リボスイッチを活性化する化合物は、被検化合物とリボスイッチを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価することによって特定できる。リボスイッチが活性化するならば、その被検化合物はリボスイッチを活性化する化合物として特定される。リボスイッチの活性化は任意の適当な方法で評価できる。例えば、リボスイッチをレポーターRNAと結合させ、そのレポーターRNAの発現、発現レベル、または発現レベルの変化を、被検化合物の存在下および不在下で測定することができる。別の例として、リボスイッチは、そこからのシグナルがリボスイッチの活性化状態に応じて変化する、コンホメーション依存性標識を含むことができる。このようなリボスイッチは、好ましくは天然に存在するリボスイッチ由来の、またはそれから誘導されるアプタマードメインを利用する。理解できるように、リボスイッチの活性化の評価は、対照検定もしくは測定を使用して、または対照検定もしくは測定を使用せずに実施できる。リボスイッチを不活性化する化合物を特定する方法も同様にして実施できる。
【０２３４】
本明細書の他所に開示する方法に加えて、リボスイッチを遮断する化合物の特定を、任意の適当な方法で達成することができる。例えば、リボスイッチを活性化または不活性化することがわかっている化合物の存在下で、且つ被検化合物の存在下で、そのリボスイッチの活性化または不活性化を評価する検定を実施できる。活性化または不活性化が、被検化合物不在時に観察されるようには観察されない場合、その被検化合物をリボスイッチの活性化または不活性化を遮断する化合物であると特定する。
【０２３５】
バイオセンサーリボスイッチを用いて化合物を検出する方法もまた開示する。この方法は、被検化合物とバイオセンサーリボスイッチを接触させ、そのバイオセンサーリボスイッチの活性化を評価することを包含する。バイオセンサーリボスイッチの活性化は、被検化合物中にバイオセンサーリボスイッチのためのトリガー分子が存在することを示す。バイオセンサーリボスイッチは、同族トリガー分子の存在下で検出可能シグナルを生成する、改変されたリボスイッチである。有用なバイオセンサーリボスイッチは、トリガー分子の閾値レベルで、またはそれ以上で反応が誘発され得る。バイオセンサーリボスイッチは、インビボまたはインビトロ使用のために設計できる。例えば、シグナルとしての役割を有する、またはシグナル産生に関与する蛋白をコードしているレポーターRNAと機能的に結合したバイオセンサーリボスイッチを、そのリボスイッチ／レポーターRNAをコードしている核酸構築物を担持する細胞または生物を改変することによってインビボで使用できる。インビトロ使用のためのバイオセンサーリボスイッチの例は、そこからのシグナルがリボスイッチの活性化状態に応じて変化する、コンホメーション依存性標識を含むリボスイッチである。このようなバイオセンサーリボスイッチは、好ましくは天然に存在するリボスイッチ由来の、またはそこから誘導されたアプタマードメインを使用する。
【０２３６】
トリガー分子の濃度が低下する時リボスイッチの活性化は逆転し、シグナルもまたトリガー分子の濃度が変化するにつれて変化することから、バイオセンサーリボスイッチを使用して、変化しつつある状態を監視することができる。そのトリガー分子に対して異なる解離定数を持つリボスイッチを作り出すことによって、検出できるトリガー分子の濃度範囲を変えることができる。これは、例えばトリガー分子に対して高い親和性を持つリボスイッチの感受性を「低下させる」ことによって容易に達成できる。同じセンサーまたは検定において、異なる感受性を有する多数のバイオセンサーリボスイッチを使用することにより、様々な濃度を監視できる。
【０２３７】
リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する化合物を特定し、特定された化合物を製造することにより生成される化合物もまた開示する。これは、例えば本明細書の他所に開示した化合物特定方法を、特定された化合物を製造する方法と結びつけることによって達成できる。例えば、被検化合物とリボスイッチを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価し、そしてもしリボスイッチが被検化合物によって活性化されたならば、リボスイッチを活性化する被検化合物を、当該化合物として製造することによって、化合物を生成できる。
【０２３８】
或る化合物によるリボスイッチの活性化、不活性化または遮断を調査し、調査された化合物を製造することによって生成される化合物もまた開示する。これは、例えば本明細書の他所に開示した化合物活性化、不活性化または遮断評価法を、調査された化合物の製造方法と結びつけることによって達成できる。例えば、被検化合物とリボスイッチを接触させ、そのリボスイッチの活性化を評価し、そしてもしリボスイッチが被検化合物によって活性化されたならば、リボスイッチを活性化する被検化合物を、当該化合物として製造することによって、化合物を生成できる。リボスイッチを活性化、不活性化または遮断する化合物の能力について調査することは、リボスイッチを活性化、不活性化または遮断することが過去に知られていなかった化合物の特定、および、或る化合物がリボスイッチを活性化、不活性化または遮断することが既にわかっている場合にリボスイッチを活性化、不活性化または遮断するその化合物の能力を評価する事の両方を指す。
【０２３９】
目的とする化合物を検出する方法を開示するが、その方法は、試料およびリボスイッチを接触させる事を含む［ここで、リボスイッチは目的化合物によって活性化され、リボスイッチは、目的化合物により活性化された時にシグナルを生成し、リボスイッチは試料が目的化合物を含む時シグナルを生成する］。リボスイッチは、目的化合物によって活性化された時にコンホメーションを変化させ得る［ここで、このコンホメーションの変化が、コンホメーション依存性標識を介してシグナルを生成する］。リボスイッチは、目的化合物によって活性化された時にコンホメーションを変化させ得る［ここで、このコンホメーションの変化が、リボスイッチに結合したRNAの発現の変化を惹起し、発現の変化はシグナルを生成する］。このシグナルは、リボスイッチに結合したRNAから発現されるレポーター蛋白によって生成され得る。
【０２４０】
(a) リボスイッチを含むRNAをコードしている遺伝子の発現の阻害について或る化合物を試験し［ここで、その阻害はリボスイッチを介している］、そして、(b) 細胞と、工程(a)で遺伝子発現を阻害した化合物を接触させることにより遺伝子発現を阻害する［ここで、その細胞は、リボスイッチを含むRNAをコードしている遺伝子を含み、その化合物は、リボスイッチに結合することにより遺伝子の発現を阻害する］事を含む方法を開示する。
【０２４１】
リボスイッチを特定する方法をも開示するが、その方法は、或る化合物の存在下および不在下でRNA分子のインライン自然開裂を評価することを含む［ここで、RNA分子は該化合物により調節される遺伝子によりコードされており、RNA分子のインライン自然開裂のパターンの変化がリボスイッチを示す］。
【０２４２】
A. 抗菌性化合物の特定
リボスイッチは、有機小分子に結合させる目的のために導き出された構造化RNAの新しいクラスである。リボスイッチの天然結合ポケットは、代謝産物類似体を用いて、または天然代謝産物の形状-空間を模倣した化合物によって標的化され得る。リボスイッチは、(1) Bacillus anthracisを包含する多数のグラム陽性およびグラム陰性細菌中に見いだされ、(2) これらの細菌における遺伝子発現の基本的な調節物質であり、(3) 同時耐性を生じる可能性の低い、多数のコピー中に存在し、そして、(4) ヒトに存在するとの証明は未だなされていない。この特徴の組み合わせが、リボスイッチを新たな抗菌性化合物のための魅力的な標的としている。さらに、リボスイッチの小分子リガンドは、薬物候補物質を生成するための有用な誘導体化部位を提供する。幾つかのリボスイッチの分布は、米国出願公開第2005-0053951号の表1に示されている。
【０２４３】
或るクラスのリボスイッチが特定され、薬物標的としてのその可能性が評価されたならば（例えば、標的生物において幾つの遺伝子がそのクラスのリボスイッチによって調節されているかを決定することによる）、候補分子を特定することができる。
長年にわたり細菌を殺すことが知られていた二つの化合物が、リボスイッチに結合することによって機能するということが断定された。特に、化合物アミノエチルシステイン(リジンの類似体)は細菌のリジンリボスイッチに結合し、リジン生合成に必要な遺伝子の発現を妨げる。同様に、化合物ピリチアミン(チアミンの類似体)は細菌細胞により二燐酸化されてピリチアミンピロ燐酸を生成する。この後者の化合物はチアミンピロ燐酸(TPP)に類似し、TPPリボスイッチに結合することから、細菌にとって毒性である。故に、現代の薬物発見戦略を応用してリボスイッチを標的とすることは、新たなクラスの抗生物化合物の発見に繋がり得る。構造に基づく薬剤設計法を本明細書に開示のように利用して、リボスイッチに結合しそのアロステリック作用を始動させる代謝産物類似体を生成することができる。
【０２４４】
細菌の薬剤耐性菌株の出現により、新しいクラスの抗生物質を特定する必要性が注目されている。抗リボスイッチ薬物は、抗菌作用の一形態を示し、それは以下の理由でかなり興味深い。リボスイッチは、基本的代謝プロセスに必須な遺伝子の発現を制御する。故に、薬物によるこれらの遺伝子制御要素の操作が、新たな抗生物質を産む。リボスイッチはさらに、代謝産物と選択的に結合するよう進化したRNA構造を担持し、それ故これらのRNAレセプターは、蛋白酵素およびレセプターと同じくらい良好な薬物標的となる。さらに、二つの抗菌性化合物(上記)が、RNA標的の突然変異の過程で出現する抗生物質耐性を不活性化することによって細菌を殺滅することが示されている。多数の細菌中に、良く保存されたリボスイッチが少なくとも11クラス存在し、これらが数多くの薬物標的を提供している。
【０２４５】
グラム陽性およびグラム陰性系統の多くの生物が、多数のクラスのリボスイッチを有する（米国出願公開第2005-0053951号を参照されたい）。Staphylococcusのような主たる病原性生物およびBacillus anthracisのような主たるバイオテロ関連生物は、共にリボスイッチに富む。本明細書に開示のとおり、グアニンリボスイッチの原子分解構造が解明されており、それが、リボスイッチ結合化合物の創成のために構造に基づく設計法を利用することを可能にしている。特に、グアニンリボスイッチの結合部位のモデルは、リガンド修飾を可能にするであろう二つのチャネルが存在することを示している(図12A)。N2またはO6位のいずれかに化学修飾を有する26個のグアニン類似体が作り出されており、これまでに試験された殆ど全てがナノモル以下の解離定数でリボスイッチに結合する。図12Bは、修飾されたN2およびO6位を持つ、合成されたグアニン類似体の構造を示す。これらの化合物の殆どは、結合部位モデル中の分子認識の「盲点」を利用しているか、またはアプタマードメインがB. subtilisグアニンリボスイッチを形成している。良好な化合物は足場として利用でき、その足場の上にさらなる化学的変化を導入して、非毒性の、生物利用可能な、高親和性の、抗リボスイッチ化合物を創成することができる。
【０２４６】
以下に、SAMリボスイッチを用いたその説明を供する（米国出願公開第2005-0053951号の実施例7を参照されたい）。反応性メチルおよびスルホニウムイオン中心を安定な硫黄型結合に置換したSAM類似体(YBD-2およびYBD3)は、充分な親和性’(低ないし中等度ナノモル範囲) をもってリボスイッチに認識され、さらなるSAM類似体合成の基本骨格として役立つ。加えて、より広範囲の結合類似体(N-およびC-型結合)を合成および試験して最適な基本骨格を得、それに基づきアミノ酸およびヌクレオシド誘導体を製造することができる。
【０２４７】
SAMのスルホキシドおよびスルホン誘導体を用いて類似体を作り出すことができる。例えば、Ronald T. Borchardt and Yih Shiong Wu「S-アデノシルメチオニン依存性メチルトランスフェラーゼの、可能性あるインヒビター。1. S-アデノシルホモシステインのアミノ酸部分の修飾」J. Med. Chem. 17, 862-868, 1974に記載の確立された合成プロトコルを利用できる。これらのおよびその他の類似体を合成し、連続的にまたは小グループで結合について検定することができる。各ラウンドで確立される認識決定基に基づく化合物特定の進行中に、さらなるSAM類似体を設計できる。本明細書の他所に記載のように、B. subtilisおよびB. anthracisのリボスイッチRNAについて単純な結合検定を実施できる。より高度な検定もまた利用できる。
【０２４８】
最も有望なSAM類似体先導化合物は、代謝的不活性を維持しつつ、細菌細胞内に進入しリボスイッチに結合しなければならない。加えて、有用なSAM類似体は、リボスイッチにより強固に拘束されるが、蛋白酵素の活性部位でSAMに関して競合してはならず、さもなければ患者の細胞で望ましくない毒性作用を産む危険性がある。これらの問題の予備的評価として、B. subtilisの増殖を阻止しE. coli培養（これはSAMを利用するがSAMリボスイッチを欠失する）に影響を及ぼさない能力について化合物を試験できる。先導化合物の候補物質についてスクリーニングするため、平行細菌培養を以下のように生育させることができる：
1. 外部から供給されるSAM類似体の不在下で、B. subtilisをグルコース最少培地で培養する。
2. 外部から供給されるSAM類似体の存在下で、B. subtilisをグルコース最少培地で培養する（高用量が選択でき、推定薬物化合物の濃度範囲を調べるために設計された反復実験がこれに続く）。
3. 外部から供給されるSAM類似体の存在下で、E. coliをグルコース最少培地で培養する（高用量を選択し、推定薬物化合物の濃度範囲を調べるために設計された反復実験がこれに続く）。
【０２４９】
細胞倍増時間を測定することにより、様々な培養のフィットを比較できる。様々な濃度の薬化合物を微量定量プレート中で増殖させた培養を用いて試験し、別の研究室からの微量定量プレート読み取り機を用いて分析することができる。培養1は良好に増殖すると予想される。培養2を阻害する薬物は、培養3の増殖を阻害するかも知れないし阻害しないかも知れない。広範囲の薬物濃度に暴露する時に培養2および培養3の両者を同じように阻害する薬物は、この外因性化合物により誘発される一般毒性を反映し得る（即ち、リボスイッチ阻害に代わって、またはこれに加えて、多くの異なる細胞プロセスを阻害する）。このスクリーニングで特定された有望な薬物候補物質は、仮に阻害するとしても極めて高用量でのみE. coliを阻害し、それより遙かに低い（＞10倍）濃度でB. subtilisを阻害する。
【０２５０】
SAMのderivization pointsが特定されると、先導薬化合物の効率的な特定には、適切なSAM類似体または一般的化学ライブラリーの大規模スクリーニングが必要である。核酸工学の原則を用いる1または2の異なる方法により、高スループットスクリーニングを創出できる。高スループットスクリーニング検定に適合するフォーマットに、下に概説する両方の蛍光センサーの設計を適合させることは、固定化法または溶液法を利用することにより、受け入れられる。
【０２５１】
レポーターを創出する一つの方法は、リボスイッチドメインへのSAMの結合時に蛍光タグの解放を触媒するドメインを付加することによって、リボスイッチに第三の機能を加えることである。最後のレポーター構築物では、蛍光シグナル生成のための触媒ドメインの適正な折り畳みをさせることにより、リガンド結合事象を中継するコミュニケーションモジュールを介して、この触媒ドメインがyitJSAMリボスイッチに結合できる。これは下に概説するように達成され得る。
【０２５２】
SAM RiboReporter Pool Design：RNAへのインビトロ転写のためのDNA鋳型を、適当なDNA鋳型およびプライマー配列を用いてPCR増幅により構築した。この構築物において、ハンマーヘッドのステムII（SAMアプタマーのステムP1）を無作為化して2億5千万以上の可能性ある配列組み合わせを存在させるが、ここで、幾つかは、SAMまたは関連する高親和性類似体によってアプタマーが占有される時にのみ、不可避的にリボザイムの機能が発揮される。構築物集団中の各分子は、ランダムドメインを除いて同一配列であり、このランダムドメインでは、可能性あるあらゆる配列の組み合わせが、その集団中に多コピーで提示される。
【０２５３】
SAM RiboReporter Selection：このインビトロ選択プロトコルは、以下の工程の反復であってよい：
1. 標準法によりインビトロでRNAを転写する。RNA全体に放射性を取り込ませるため、[α-32P]を含む。
2. 標準法により、変性PAGE上で全長RNAを精製する。
3. 触媒活性にとって充分なマグネシウム(20mM)を含有しSAMを含まない負の選択緩衝液中で、全長RNA(〜100pmole)をインキュベートする。利己的分子の出現を排除するため、必要に応じてアルカリ変性または熱循環を行いつつ、室温(〜23℃)で4時間インキュベートする。
4. 変性PAGE上で全長RNAを精製し、SAMの不在下で反応するRNAを廃棄する。
5. 20mM Mg2+およびSAMを含有する正の選択緩衝液(pH7.5、23℃)中でインキュベートする。室温で20分間インキュベート。
6. 開裂したRNAを変性PAGE上で精製し、SAMに結合したスイッチを回収し、RNAの自己開裂をさせる。
7. RNAをDNAに逆転写させる。
8. RNAの開裂部分を再導入したプライマーを用いてDNAをPCR増幅する。
【０２５４】
工程4のSAM濃度は、最初100μMで、選択が進行するにつれて低下させる。良好なコミュニケーションモジュール回収の進行は、工程6における精製ゲル上に観察される開裂の量によって評価できる。選択の終点は、この集団が10nM SAM中で100%開裂に近づく時（親リボザイムおよびリボスイッチの最大活性のための条件）、またはこの集団が複数ラウンドにわたって改善のない、活性のプラトーに近づく時のいずれかである。次いでこの最終集団の配列決定を行う。個々のコミュニケーションモジュールクローンを、SAMの存在下に、スクリーニング構築物中での蛍光シグナル生成について検定することができる。
【０２５５】
蛍光シグナルはさらに、リボスイッチの仲介する分子ビーコンの反応誘発によっても生成し得る。この設計では、リボスイッチのコンホメーション変化が、発蛍光団および消光剤の両者で標識した折りたたまれた分子ビーコンのアンフォールドを惹起し、そしてリボスイッチとのヘリックス形成により、その発蛍光団を消光剤から放逐する。このメカニズムは既存のリボスイッチに容易に適合させ得るが、それは、この方法が、転写制御に関与するターミネーターおよび抗ターミネーターステムのリガンド仲介形成を利用できるためである。
【０２５６】
分子ビーコンに結合することによりリガンド結合を報告するリボスイッチを使用するために、適当な構築物を実験的に決定せねばならない。分子ビーコンの最適な長さおよびヌクレオチド組成ならびにリボスイッチ上の結合部位を系統的に調べ、最大のシグナル対ノイズ比を得る。この検定の正当性は、分子ビーコンに結合したリボスイッチに対する種々のSAM類似体の見掛けの相対的結合親和性（蛍光シグナル生成比率によって決定）を、標準インラインプロービングにより決定した結合定数と比較することによって決定できる。
【０２５７】
具体的態様
図6に示した原子構造を含む天然グアニン応答性リボスイッチの原子構造を開示する。この原子構造の原子座標は、図6に示した原子に関して表6に列挙した原子座標を含み得る。この原子構造の原子座標は、表6に列挙した原子座標を含み得る。
【０２５８】
(a) 被検化合物を伴う請求項1に記載の原子構造をモデル作製し；そして(b) 被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定する、事を含む、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法もまた開示する。
さらに、リボスイッチを被検化合物と接触させる事を含む［ここで、リボスイッチと被検化合物の相互作用の際、蛍光シグナルが生成する］、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法を開示する。
【０２５９】
さらに、細菌を、リボスイッチと相互作用する化合物の類似体と接触させる事を含む、細菌を殺滅する方法を開示する。
さらに、細菌を、リボスイッチと相互作用する化合物と接触させる事を含む、細菌を殺滅する方法を開示する。
【０２６０】
さらに、(a) リボスイッチの結晶構造を特定し；(b)被検化合物を伴うリボスイッチをモデル作製し；そして、(c) その被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定する、事を含む、リボスイッチと相互作用する化合物を特定する方法を開示する。
さらに、コード領域と機能的に結合したリボスイッチを含むRNAをコードしている核酸分子を含む、調節可能な遺伝子発現構築物［ここで、このリボスイッチは、表5のリボスイッチであり、このリボスイッチは当該RNAの発現を調節し、このリボスイッチおよびコード領域は異種である］を開示する。
【０２６１】
さらに、試料およびリボスイッチを接触させる事を含む、目的化合物を検出する方法［ここで、このリボスイッチは表5のリボスイッチであり、このリボスイッチは目的化合物により活性化され、このリボスイッチは目的化合物により活性化された時にシグナルを生成し、このリボスイッチは試料が目的化合物を含有する時にシグナルを生成する］を開示する。
【０２６２】
さらに、(a) リボスイッチを含むRNAをコードしている遺伝子の発現阻害について化合物を試験し［ここで、このリボスイッチは表5のリボスイッチであり、阻害はこのリボスイッチを介してなされる］、そして、(b) 細胞と、工程(a)で遺伝子発現を阻害した化合物を接触させる事によって遺伝子発現を阻害する［ここで、この細胞はリボスイッチを含むRNAをコードしている遺伝子を含み、この化合物はリボスイッチに結合することにより該遺伝子の発現を阻害する］事を含む方法を開示する。
【０２６３】
被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかの決定は、リボスイッチモデルにおける被検化合物の、推定最小相互作用エネルギー、推定結合定数、推定解離定数、またはその組み合わせを決定することを含み得る。被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかの決定は、被検化合物とリボスイッチモデルとの、1もしくはそれ以上の推定された結合、1もしくはそれ以上の推定された相互作用、またはその組み合わせを決定することを含む。リボスイッチはグアニンリボスイッチであってよい。グアニンリボスイッチは、表5のリボスイッチであってよい。被検化合物を伴うリボスイッチをモデル作製することにより原子の接触を決定し、それにより被検化合物とリボスイッチの相互作用を決定することができる。
【０２６４】
この方法はさらに、(c) 被検化合物の類似体を特定し；(d) 被検化合物の類似体がリボスイッチと相互作用するかどうかを決定する、という工程を含む。この化合物はヒポキサンチンであってよい。被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかの決定には、ゲル型検定が利用できる。被検化合物がリボスイッチと相互作用するかどうかの決定には、チップ型検定が利用できる。
【０２６５】
被検化合物は、ファン・デル・ワールス相互作用、水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用、またはこれらの組み合わせにより相互作用できる。リボスイッチはRNA開裂性リボザイムを含み得る。消光部分を含む核酸が開裂する際、蛍光シグナルが生成し得る。分子ビーコン技術を利用して蛍光シグナルを生成させることができる。この方法は高スループットスクリーニングを用いて実施できる。
【０２６６】
リボスイッチはグアニンリボスイッチであってよい。グアニンリボスイッチは、表5のリボスイッチであってよい。リボスイッチはトリガー分子によって活性化される［ここでこのリボスイッチは、トリガー分子により活性化された時にシグナルを生成する］。リボスイッチは目的化合物により活性化された時にコンホメーションが変化する［ここで、このコンホメーション変化が、コンホメーション依存性標識を介してシグナルを生成する］。リボスイッチは目的化合物により活性化された時にコンホメーションが変化する［ここで、このコンホメーション変化が、リボスイッチに結合したRNAの発現の変化を惹起し、この発現の変化がシグナルを生成する］。このシグナルは、リボスイッチに結合したRNAから発現されるレポーター蛋白により生成され得る。
【実施例】
【０２６７】
実施例
A. 実施例1：代謝産物ヒポキサンチンと複合体形成した天然グアニン応答性リボスイッチの構造
天然バイオセンサーが如何に機能するかを理解するため、グアニン応答性リボスイッチの生物学的関連リガンド、ヒポキサンチンに結合したグアニン結合ドメインの構造を、X線結晶学で解析した（表2および図12A）。ヒポキサンチンに結合した状態では、このRNAは三次元折り畳み構造をとり、末端ループ（L2およびL3）が一連の相互連結した水素結合（図5の対形成図式を参照されたい）を形成して、P2およびP3ヘリックスを相互に平行な状態に至らせる（図5C）。リボース-燐酸バックボーン領域の並置の結果である、好ましくない静電相互作用は、この二つのバックボーン間にある幾つかのカチオンの結合により中和される（図10）RNAの大域的らせん配置を固定しているのは、三方向接合点周囲の数多くの三次接触であって、これは、結合しているヒポキサンチンと相互作用するJ2/3ループ(図5A)、P1ヘリックス、ならびにJ1/2およびJ3/1ループに支配されている。
【０２６８】
プリン結合ポケットは、この三方向分岐点要素またはその周囲にある、保存されたヌクレオチドによって創出される。これらのヌクレオチドは、上方および下方に二組の三重塩基が形成されることでプリン結合ポケットを規定するのを助ける（図5A）。ポケットの3’側には、水で仲介されるU22-A52A73三重塩基およびA23G46-C53三重塩基が隣接しており；いずれの場合にも、アデノシンのワトソン・クリック面が、ワトソン・クリックペアの副溝と相互作用する（図6A）。他の側は、それぞれヘリックスP1の頂点にある保存されたワトソン・クリックペア（U20-A76およびA21-U75）ならびにU49およびC50のワトソン・クリック面の間の連続する三重塩基（これがJ2/3ループをP1ヘリックスに繋ぎ止める）によって創出される。リガンド結合部位を創出するための、この広範な三重塩基の使用は、テオフィリン（Zimmermann, G. R., Jenison, R. D., Wick, C. L., Simmorre, J.-P. & Pardi, A.「連結構造モチーフはテオフィリン結合RNAによる分子識別を仲介する」Nature Struct. Biol. 4, 644-649 (1997)）、FMN（Fan, P., Suri, A. K., Fiala, R., Live, D. & Patel, D. J. 「FMN-RNAアプタマー複合体における分子認識」J. Mol. Biol. 258, 480-500 (1996)）およびマラカイトグリーン（Baugh, C, Grate, D. & Wilson, C.「マラカイトグリーンアプタマーの2.8Å結晶構造」J. Mol. Biol. 301, 117-128 (2000)）バインダーの構造に例示されるような、平面状環系を認識するインビトロ選択されたRNAアプタマーに非常によく似ている。このように、人為的に選択されたRNAは、小分子リガンド結合部位を創出するため、それらの天然対応物と同じ原則を幾つか利用する。
【０２６９】
ヒポキサンチンは、多数の水素結合によってヌクレオチドU22、U47、U51およびC74と結合し（図6B）、P1ヘリックス上に直接積み上がる四重塩基を形成する。この構造は、mRNAがリガンド中の全官能基と接触することを明瞭に示し、それにより生化学的研究において観察されるヒポキサンチンに対する特異性を説明できる（Mandal, M. & Breaker, R. R.「リボスイッチによる遺伝子調節」Nature Rev. Mol. Cell. Biol. 5, 451-463 (2004)）。加えて、この結合には、結合したプリンの2位に環外アミンを収容する余地があることから、グアニン結合は容易に理論的説明ができる。このさらなる官能基はC74およびU51の2位のカルボニル酸素と水素結合を形成でき、この事はグアニンに対するこのリボスイッチの親和性がヒポキサンチンに比して10倍高いことと整合性がある。
【０２７０】
最も顕著な特徴の一つは、リガンドがRNAによって殆ど完全に包み込まれる方法である（図6C）：ヒポキサンチン表面の97.8%は、複合体中のバルク溶媒にとってアクセス不能である。固体支持体上へのリガンドの固定化を含まない選択戦略（Koizumi, M., Soukup, G. A., Kerr, J. N. & Breaker, R. R.「第二メッセンジャーcGMPおよびcAMPに応答するリボザイムのアロステリック選択」Nature Struct. Biol. 6, 1062-1071 (1999)）は、同程度にリガンドを埋没させ得るRNAの開発に有望であるものの、RNAによる認識のためにリガンドを殆ど完全に利用することは、構造的特性解明がなされたアプタマーの中では前例がない。この発見はまた、局所結合部位はリガンド結合時に実質的なコンホメーション変化を受けなければならないことをも意味する。何故なら、多くのRNA-リガンド相互作用に共通する特徴である、既に形成された結合部位へのアクセスを達成することは、ヒポキサンチンにはできないためである（Leulliot, N. & Varani, G.「RNA-蛋白認識における最新の話題：誘導されたフィットおよびコンホメーションの捕捉による、特異性および生物学的機能の制御」Biochemistry 40, 7947-7956 (2001)；Williamson, J. R.「RNA-蛋白認識における誘導されたフィット」Nature Struct. Biol. 7, 834-837 (2000)）。最後に、この方式のプリン認識は、ヌクレオチド74におけるシトシンからウラシルへの単一点突然変異により、グアニンからアデニンへと特異性を変化させる能力を容易に説明する（Mandal, M. & Breaker, R. R.「転写ターミネーターの崩壊によるアデニンリボスイッチおよび遺伝子活性化」Nature Struct. Mol. Biol. 11, 29-35 (2004)）。ワトソン・クリックペア形成の優先傾向はグアニンからアデニンへと変化するが、プリンおよびRNA間の他の相互作用は変化しない。
【０２７１】
三次構造は、ヘリックスP2およびP3をキャッピングしているユニークなループ-ループ相互作用（これは過去に観察されていないタイプの、2個の四重塩基によって規定される）によって安定化される。各々の四重塩基は、副溝中にドッキングした非標準ペアを伴うワトソン・クリックペアを含む（それぞれA33A66およびU34A65ペアと相互作用するG38-C60およびG37-C61；図7A）。この配置は、一般的に見いだされるタイプI/II A-マイナートリプルモチーフ中でA型ヘリックス中にアデノシンが詰め込まれる態様と極めて類似している（Doherty, E. A., Batey, R. T., Masquida, B. & Doudna, J. A. 「RNAにおけるヘリックス詰め込みの普遍的様式」Nature Struct. Biol. 8, 339-343 (2001)；Nissen, P., Ippolito, J. A., Ban, N., Moore, P. B. & Steitz, T. A.「大きなリボソームサブユニット：AマイナーモチーフにおけるRNA三次相互作用」Proc. Natl Acad. Sci. USA 98, 4899-4903 (2001)）。これら8個のヌクレオチドのうちどの1個が突然変異しても、ループ-ループ相互作用のコアを固定している複雑な水素結合ネットワークが崩壊するが、それは、厳格な系統発生学的保存を説明するものである。A-プラットフォームモチーフ（Gate, J. H. et al.「アデノシンプラットフォームによるRNA三次構造仲介」Science 273, 1696-1699 (1996)）および膨張したGモチーフ（Correll, C. C, Beneken, J., Plantinga, M. J., Lubbers, M. & Chan, Y. L.「1.04Å分解能RNA構造に基づく膨張したGモチーフの共通した且つ明瞭な特徴」Nucleic Acids Res. 31 , 6806-6818 (2003)）と同族のG62およびU63間の並列相互作用を含む2個の非標準的なペアが、これらの四重塩基上に積み重なっている（図7B)。G62U63ペアは、反対側のループのバックボーンに対する水素結合によってさらに安定化される。
【０２７２】
2個の末端ループ間の相互作用は、グアニンリボスイッチによるリガンド結合に必須である。インラインプロービング実験での測定によると、グアニンの存在時および不在時のRNA安定性の相違は、RNA三次構造のこの要素がグアニンまたはヒポキサンチンとは独立して形成される事を示す。野生型ループを安定なUUCGテトラループに置き換えると（Molinaro, M. & Tinoco, I. Jr「RNA構造を折りたたむ超安定UNCGテトラループヘアピンの使用：熱力学的および分光学的応用」Nucleic Acids Res. 23, 3056-3063 (1995)；図11）（これにより三次相互作用が排除される）、リボスイッチがヒポキサンチンを認識する能力が廃絶され、この事は、それが高親和性相互作用の推進に決定的であることを示す（図8）。このように、この三次相互作用はリガンドを直接接触させる訳ではないが、プリン認識のためのリボスイッチの全体的組織化に重要である。同様に、種々のハンマーヘッドリボザイムの天然配列は、生理的条件下でのそれらの開裂速度を著明に加速するループ-ループ相互作用を含む（De Ia Pena, M., Gago, S. & Flores, R. 「天然ハンマーヘッドリボザイムの周辺領域はそれらの自己開裂活性を非常に増大させる」EMBO J. 22, 5561-5570 (2003)；Khvorova, A., Lescoute, A., Westhof, E. & Jayasena, S. D. 「ハンマーヘッドリボザイムの触媒コア外部の配列要素は細胞内活性を有効にする」Nature Struct. Biol. 10, 708-712 (2003)）。それぞれにおいて三次相互作用は、機能部位を含む三方向接合点が生理的濃度のリガンドまたはMg2+イオンに応答できるような方法で、RNAを拘束する。
【０２７３】
高いMg2+イオン濃度（20mM MgC12）においてグアニンリボスイッチは、グアニンおよびヒポキサンチンに対して極めて高い親和性を有する（実測解離定数(Kd)はそれぞれ5nMおよび50nM）。しかしながらEscherichia coliにおいては、purRリプレッサーによるxpt-pbuXオペロンの転写抑制が、1-10μM濃度のプリンに反応して起こる。リボスイッチが同様な濃度（恐らくは生理的レベルを反映する）のプリンに応答するかどうかを判定するため、ヒポキサンチンに対する親和性を、種々のイオン条件の等温滴定熱量測定によって決定した（表1）。より生理的なイオン強度（0.25-1 mM Mg2+）において、RNAは、purRリプレッサー蛋白（E. coli変異体についての実測Kd=9μM）と同様のヒポキサンチンに対する親和性（実測Kd=3-4μM）を示した（Choi, K. Y. & Zalkin, H.「Escherichia coliプリンリプレッサーの構造特性解明およびコリプレッサー結合」J. Bacteriol. 174, 6207-6214 (1992)）。このように、RNAおよび蛋白に基づく調節メカニズムはいずれも同じような細胞内代謝産物濃度に応答するよう調整されるように思われる。
【０２７４】
【表１】
2008518630.tif 000016
【０２７５】
この構造はさらに、如何にしてRNAが、提唱されたRho-独立性転写調節メカニズムを介して細胞内代謝産物濃度を遺伝子発現の変化に直接変換するのかを示す（Mandal, M., Boese, B., Barrick, J. E., Winkler, W. C. & Breaker, R. R.「リボスイッチはBacillus subtilisおよびその他の細菌において基本的な生化学的経路を制御する」Cell 113, 577-586 (2003)；Johansen, L. E., Nygaard, P., Lassen, C, Agerso, Y. & Saxild, H. H.「pbuG、 nupG(yxj A)、およびpbuE (ydhL)に加えてpurおよびxpt-pbuXオペロンを含む第二のBacillus subtilis purレギュロンの定義」J. Bacteriol. 185, 5200-5209 (2003)）。最初の90ヌクレオチドの転写は、RNAの三次構造の形成を開始するために相互作用するL2およびL3ループと共に、グアニン結合ドメインの形成をもたらす（図5B）。これにより、有効なリガンド結合のための三方向接合点モチーフが部分的に組織化されるが、この接合点は、プリンを結合ポケットにアクセスさせるため、ある程度は非構造化されていなければならない。充分高濃度のグアニンまたはヒポキサンチンの下では、核酸塩基はこのポケットに結合し、積層相互作用およびJ2/3を伴う三重塩基によって短P1ヘリックスを安定化し、そしてP1ヌクレオチドが抗ターミネーター要素に組み込まれるのを防ぐ。次いでこのmRNAが古典的なRho-独立性ターミネーターステムループを形成することができ、転写が停止する。対照的に、低い細胞内濃度のグアニンまたはヒポキサンチンの下では、孤立したP1ヘリックスの3’側が容易に動員されて安定な抗ターミネーター要素を形成し、転写の継続を促す。このように、ヒポキサンチンはリボスイッチの根本要素であり、或るコンホメーションを別のコンホメーションよりも安定化させるリボスイッチの能力により、二つの異なる経路に沿ってリボスイッチがmRNAの折り畳みを指令できるようにさせ、結果として細胞内グアニン、ヒポキサンチンおよびキサンチン濃度の有効なバイオセンサーをもたらす。
【０２７６】
1. 方法
結晶：RNAを、天然アフィニティ-タグ精製法（Kieft, J. S. & Batey, R. T.「RNAの迅速且つ非変性的精製のための一般法」RNA 10, 988-995 (2004)）によって合成および精製し、これを10mM K+-HEPES(pH7.5)および1mMヒポキサンチンを含有する緩衝液に交換した。この溶液を母液（25% PEG 3000(w/v)、200mM酢酸アンモニウムおよび10mMコバルトヘキサミンを含有）で1:1比に混合し、室温で2-3週間インキュベートすることにより結晶を成長させた。
【０２７７】
データの収集および加工：  25% 2-メチル-2,4-ペンタンジオールを加えた母液中で凍結防止した結晶に、CuKα波長で単波長異常回折実験を行い、少なくとも1.8Å分解能まで明瞭な回折が観察された。このデータをインデックス化し、積分し、そしてD*TREK（Pflugrath, J. W.「X線回折データ収集におけるより精密化された事柄」Acta Crystallogr. D 55, 1718-1725 (1999)）を用いてスケール調節し、SOLVE（Terwilliger, T.「SOLVEおよびRESOLVE：自動化された構造解法、密度改変およびモデル構築」J. Synchrotron Radiat. 11, 49-52 (2004)）で重原子部位を特定し、そしてCNS（Brunger, A. T. et al.「結晶学およびNMR系：高分子の構造決定のための新たな一組のソフトウェア」Acta Crystallogr. D 54, 905-921 (1998)）で精密化を行い、最終的に各々17.8%および22.8%というRxtalおよびRfree値を持つモデルを得た。このモデルは、電子密度が測定できなかったA82を除く全てのRNA原子を、ヒポキサンチンリガンドと共に含む。
【０２７８】
RNAの合成および精製：  B. subtilisのpbuX-xptオペロンのグアニンリボスイッチの配列を含む68ヌクレオチド構築物を、部分重複DNAオリゴヌクレオチド（Integrated DNA Technologies）および標準PCR法を用いて構築した。Eco RIおよびNgoMIV制限部位を5’および3’末端にそれぞれ含む、得られたDNAフラグメントを、RNAの天然精製のために設計されたプラスミドベクターpRAV12にライゲーションし（Kieft, J. S. & Batey, R. T.「RNAの迅速且つ非変性的精製のための一般法」RNA 10, 988-995 (2004)）、得られたベクターの配列を検証した。得られたベクターからPCRにより、インビトロ転写用DNA鋳型を、精製アファニティタグの5’末端および3’側に、T7 RNAポリメラーゼプロモーターに対するプライマーを用いて作製した（5', GCGCGCGAATTCTAATACGACTCACTATAG (配列番号10; 3', GGATCCTGCCCAGGGCTG; 配列番号11)。30mM Tris-HCl (pH8.0)、10mM DTT、0.1% Triton X-100、0.1mMスペルミジン-HCl、8mM 各NTP、40mM MgCl2、50μg/mL T7 RNAポリメラーゼ、および1mLの~0.5μM鋳型を含有する反応混合物12.5mL（Doudna, J. A.「結晶化のためのホモジニアスリボザイムRNAの製造」Methods Mol Biol 74, 365-70 (1997)）に、不溶性のピロ燐酸マグネシウムの形成を抑制するために1単位/mLの無機ピロホスファターゼを添加して、RNAを転写した。反応混合物を37℃で1.5時間インキュベートした。RNAの天然精製を記載のように実施した。アフィニティカラムからRNAが溶出した後、これを直ちに10000 MWCO遠心フィルター装置（Amicon, Ultra-15）を用いて濃縮した。全てのRNAが〜500μLに濃縮された後、これを遠心濃縮器を使用して、10mM K+-HEPES(pH7.5)および1mMヒポキサンチンを含有する緩衝液の15mLアリコート3個に交換した。最終的なRNAを450μMに濃縮したが、これは260nmの吸光度およびその塩基組成に基づいて算出した吸光係数によって判断した。
【０２７９】
RNA結晶化：  RNA溶液を、10mMコバルトヘキサミン、200mM酢酸アンモニウムおよび25% PEG 2Kを含有するリザーバー溶液で1:1比に混合する、ハンギングドロップ法を用いてグアニンリボスイッチの結晶を得た。この結晶化トレーを室温(23℃)でインキュベートすると、7-14日間で最大サイズ(0.05 x 0.05 x 0.2 mm)の結晶が得られた。25% (v/v) 2-メチル-2,4 ペンタンジオール(MPD) を加えた母液を含む溶液30μLを5分間添加することにより結晶の凍結防止を行い、液体窒素中で急速冷凍した。CuKα照射を用いるホームX線源(Rigaku MSC) で回折データを収集し、逆ビーム実験によって異常データの収集を達成した。このデータをインデックス化し、積分し、そしてCrystalClear （Rigaku MSC）およびD*TREK（Pflugrath, J. W.「X線回折データ収集におけるより精密化された事柄」Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 55, 1718-1725 (1999)）を用いてスケール調節した。この結晶はC2空間群（a = 132.30Å、b = 35.25Å、c = 42.23Å、d= 90.95°）に属し、非対称ユニットあたり1個の分子を含んでいる（全ての結晶学的統計については表2を参照されたい）。その後の位相決定および精密化に用いたデータは全て或る1個の結晶から収集した。
【０２８０】
位相決定および構造決定。単波長異常回折(SAD)実験（Dauter, Z., Dauter, M. & Dodson, E.「素晴らしいSAD」Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 58, 494-506 (2002)；Rice, L. M., Earnest, T. N. & Brunger, A. T.「単波長異常回折位相決定再訪」Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56 ( Pt 11), 1413-20 (2000)）および1.95Å分解能まで拡大する回折データを用いて位相を決定した。この実験では、コバルトを重原子誘導体として扱ったが、この重原子誘導体はCuKα波長で弱い異常シグナルを有する（f’ = −2.464、f" = 3.608）。SOLVE（Terwilliger, T.「SOLVEおよびRESOLVE：自動化された構造解法、密度改変およびモデル構築」J. Synchrotron Radiat. 11, 49-52 (2004)）を用いて10の重原子溶液を見いだし、figure of meritは0.38、評点は40.9であった。CNS（Brunger, A. T. et al.「結晶学およびNMR系：高分子構造決定のための新たな一連のソフトウェア」Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 54 ( Pt 5), 905-21 (1998)）を用いて、この重原子モデルおよびその鏡像を使用して位相を決定し、密度修飾を伴う改善を施した。この重原子モデルのうちただ一つが、明確なバックボーン接続性および塩基積層のある電子密度地図をもたらし、この地図は充分明瞭であったので、RNAの大部分を追跡できた。O（Jones, T. A., Zou, J. Y., Cowan, S. W. & Kjeldgaard「電子密度地図における蛋白モデル構築のための改良法およびこれらのモデル中の誤りの位置」Acta Crystallogr A 47 ( Pt 2), 110-9 (1991)）におけるモデル構築およびCNSでの精密化の反復ラウンドを実施し、一方で、Rfreeを監視してこれが各ラウンド後に改善されていることを確認した。3’末端A82を除くこのRNA中の全ヌクレオチドを構築した後、このモデル中に挿入した合計332個の水分子を使用し、各溶媒が、別の原子との水素結合の距離内にあり且つ80未満のBファクターを持たねばならないという制約を用いて、water pickingを2ラウンド実施した。モデル構築のこの相の実施中に、明らかな八面体配位構造を伴う内圏原子を有する事に基づいて12個のコバルトヘキサミンイオンを同定し、それらの位置を異常回折地図によって検証した。この時点で、1個のスペルミジンおよび酢酸イオンもこのモデル内に入れた。糖のひだ構造は、C2’-endoに拘束された残基22、34、35、47、49および62を除いてC3’-endoに拘束されていた。
【０２８１】
等温滴定熱量測定。等温滴定熱量測定(ITC)（Leavitt, S. & Freire, E.「等温滴定熱量測定による蛋白結合エネルギーの直接測定」Curr Opin Struct Biol 11, 560-6 (2001)；Pierce, M., Raman, C. S. & Nall, B. T.「蛋白-蛋白相互作用の等温滴定熱量測定」Methods 19, 213-21 (1999)）のためのRNAを転写し、上記のように精製し、10 mM K+-HEPES(pH7.5)、100mM KClおよび種々の濃度のMgCl2を含有する緩衝液に対して4℃で24-48時間、徹底透析した。透析後、この緩衝液を使用して、RNAのおよそ10倍高い濃度のヒポキサンチン溶液を調製した（典型的にはそれぞれ約120□Mおよび12□M）。実験は全てMicrocal MCS ITC装置で30℃で実施した。RNAおよびヒポキサンチン溶液の脱気後、RNA試料中への29注入のヒポキサンチン10μLの滴定を、ヒポキサンチン：RNAの最終モル比が2:1ないし3:1となるように実施した（Recht, M. I. & Williamson, J. R.「中央ドメインの組み立て：S15-RNA複合体へのS6およびS18結合の熱力学および反応速度論」J Mol Biol 313, 35-48 (2001)）。滴定データをOrigin ITCソフトウェア(Microcal Software Inc.)を用いて解析し、一部位結合モデルに当てはめた。
【０２８２】
表2：  結晶学の統計
データ収集
空間群：                                           C2
a, b, c                                         132.30、35.25、42.23 Å
β                                              90.95°
分解能a：                                          20 -1.95Å (2.02 - 1.95 Å)
波長：                                             1.5418
完全性% ：                                         92.9 % (85.3 %)
測定された反射：                                   76950
ユニークな反射：                                   25789
平均冗長性：                                       2.9 (2.45)
I/σ：                                             21.5 (6.3)
Rsymb：                                            3.7% (13.5 %)
位相決定
Phasing Powerc：                                   1.62 (0.95)
Rcullis d：                                        0.67
Figure of Merit
SOLVE：                                            0.38
CNS（密度改良後）：                                0.86
精密化
分解能：                                           20 - 1.95Å (2.02 - 1.95Å)
反射数：
Working：                                        23356 (84.1%)
Test set：                                       2430 (8.8 %)
Rxtale：                                           17.8 (24.8)
Rfree：                                            22.8 (31.8) 
r.m.s.d.結合：                                     0.0095Å
r.m.s.d.角度：                                     1.70°
クロスバリデーションしたLuzzati coordinate error： 0.25Å
クロスバリデーションしたSigma-a coordinate error： 0.23Å
平均Bファクター：                                  22.4 Å2
【０２８３】
a. 括弧内の数は最高分解能シェルに対応する。
b. Rmerge = Σ|I−＜I＞|/ΣI ［式中、Iは測定強度であり、＜I＞は複数の対称関連反射測定値の平均強度である］。
c. Phasing power =〈|FH|〉/〈||FP+FH|−|FPH||〉（全ての反射について報告された）。
d. Rcullis = Σ||FPH±FP|−FH(calc)|/Σ|FPH| （全ての反射について報告された）。
e. Rxtal = Σ|Fo−|Fc||/Σ|Fo| （Rxtalはworking setに由来し、Rfreeはtest setに由来する）。
【０２８４】
B. 実施例2：  抗菌剤としてのリボスイッチ類似体の使用
グアニンリボスイッチアプタマーおよびアデニンについての関連アプタマーの両者のために原子分解モデルを作製した（Serganov A, Yuan YR, Pikovskaya O, Polonskaia A, Malinina L, Phan AT, Hobartner C, Micura R, Breaker RR, Patel DJ. (2004)「アデニンおよびグアニン感知mRNAによる遺伝子発現の差別的調節のための構造基盤」Chem. Biol. 11:1729-1741）。これらのモデルはBatey等（Batey, R.T., Gilbert, S.D., Montange, R.K. (2004) 「代謝産物ヒポキサンチンと複合体形成した天然グアニン応答性リボスイッチの構造」18:432:411-415）の提唱したモデルと本質的に同一であり、故に、図12Bに示される化合物の設計に用いた構造モデルが正確であることを示している。さらに、グアニンおよびアデニンリボスイッチアプタマーの類似性は、グアニン類似体の設計に用いた同じアプローチを、同様に設計したアデニン類似体によるアデニンリボスイッチの阻害に使用できるという事を明確に示している。
【０２８５】
図12Bに示したグアニン類似体がグアニンリボスイッチにインビトロで結合する能力を調べ、Bacillus subtilisに対するそれらの抗菌活性もまた調べた。これらの類似体のうち6個が、グアニンを欠く培地におけるB. subtilisの増殖を阻害する（表3）。これらのうちの一つである化合物G-014を、富化培地におけるB. subtilisに対する阻害活性について、そして幾つかの臨床に関連する病原体に対する阻害活性について調べた（表4）。重要なことに、G-104は、Bacillus anthracisおよびメチシリン耐性Staphylococcus aureusを包含するこれらの病原体の殆どを、バンコマイシンと同様の有効性で阻害する。
【０２８６】
これらのグアニン類似体の抗菌メカニズムをより完全に精査するため、二つの遺伝子レポーター系を開発した。一方の系では、高濃度のグアニンまたはリボスイッチ結合グアニン類似体がGFPの発現を阻害するよう、グアニンリボスイッチを緑色蛍光蛋白(GFP)に融合させた（図14）。即ち、GFP蛍光レベルの低下が、細菌内部のグアニンリボスイッチとの結合およびその調節を示す。同様の系を、β-ガラクトシダーゼ上流のグアニンリボスイッチと共に構築した。これもまた、β-ガラクトシダーゼ活性レベルの低下が、化合物がグアニンリボスイッチをインビボで抑制することを示す。表3に、各グアニン類似体に関するこれらの検定結果を要約する。細胞を殺滅する化合物および遺伝子発現を制御する化合物の相関もまた確立した。任意の適当なレポーター遺伝子、例えば適当なレポーター蛋白または適当なレポーターRNAをコードしている遺伝子を含む類似の系を利用することができる（例えばリボザイム）。
【０２８７】
G-014がBacillus subtilisに対して抗菌性であることもまた確定された。直接比較では、G-014はカルベニシリンと同じ比率で生存コロニー形成単位(「CFU」)数を低下させる（図15）。
【０２８８】
【表２】
2008518630.tif 000017
【０２８９】
【表３】
2008518630.tif 000018
【０２９０】
【表４】
2008518630.tif 000019
【０２９１】
【表５】
2008518630.tif 000020
【０２９２】
【表６】
2008518630.tif 000021
【０２９３】
【表７】
2008518630.tif 000022
【０２９４】
【表８】
2008518630.tif 000023
【０２９５】
【表９】
2008518630.tif 000024
【０２９６】
【表１０】
2008518630.tif 000025
【０２９７】
【表１１】
2008518630.tif 000026
【０２９８】
【表１２】
2008518630.tif 000027
【０２９９】
【表１３】
2008518630.tif 000028
【０３００】
【表１４】
2008518630.tif 000029
【０３０１】
【表１５】
2008518630.tif 000030
【０３０２】
【表１６】
2008518630.tif 000031
【０３０３】
【表１７】
2008518630.tif 000032
【０３０４】
【表１８】
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【０３０５】
【表１９】
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【０３０６】
【表２０】
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【０３０７】
【表２１】
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【０３０８】
【表２２】
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【０３０９】
【表２３】
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【０３１０】
【表２４】
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【０３１１】
【表２５】
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【０３１２】
【表２６】
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【０３１３】
【表２７】
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【０３１４】
【表２８】
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【０３１５】
【表２９】
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【０３１６】
【表３０】
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【０３１７】
【表３１】
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【０３１８】
【表３２】
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【０３１９】
【表３３】
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【０３２０】
【表３４】
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【０３２１】
【表３５】
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【０３２２】
【表３６】
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【０３２３】
【表３７】
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【０３２４】
【表３８】
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【０３２５】
【表３９】
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【０３２６】
【表４０】
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【０３２７】
【表４１】
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【０３２８】
【表４２】
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【０３２９】
【表４３】
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【０３３０】
【表４４】
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【０３３１】
【表４５】
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【０３３２】
【表４６】
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【０３３３】
【表４７】
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【０３３４】
【表４８】
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【０３３５】
【表４９】
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【０３３６】
【表５０】
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【０３３７】
【表５１】
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【０３３８】
【表５２】
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【０３３９】
【表５３】
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【０３４０】
【表５４】
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【０３４１】
【表５５】
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【０３４２】
【表５６】
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【０３４３】
【表５７】
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【０３４４】
【表５８】
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【０３４５】
【表５９】
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【０３４６】
【表６０】
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【０３４７】
【表６１】
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【０３４８】
【表６２】
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【０３４９】
【表６３】
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【０３５０】
【表６４】
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【０３５１】
【表６５】
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【０３５２】
【表６６】
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【０３５３】
【表６７】
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【０３５４】
【表６８】
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【０３５５】
【表６９】
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【０３５６】
【表７０】
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【０３５７】
【表７１】
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【０３５８】
【表７２】
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【０３５９】
開示した方法および組成物は変更し得るため、記載した特定の方法論、プロトコル、および試薬に限定されないという事が理解できる。さらに、本明細書で使用する用語は特定の態様を説明する事のみを目的とするものであって、本発明の範囲を限定するものと解してはならず、本発明は付記した請求項によってのみ制限を受けるという事が理解できる。
本明細書および付記した請求項で使用する場合、単数形「a」、「an」および「the」は、文脈が明らかにそれに反する旨を述べていない限り、複数形を包含することに留意すべきである。したがって、例えば「a riboswitch」という呼称は複数の係るリボスイッチを包含し、「the riboswitch」という呼称は1またはそれ以上のリボスイッチおよび当業者の知悉するそれらの等価物に対する呼称、等々である。
【０３６０】
「所望による」または「所望により」とは、その後に記載された事象、状況または物質が、起こっても起こらなくてもよい、または存在しても存在しなくてもよいという事、そしてその記載が、その事象、状況、または物質が起こるまたは存在する例と、それが起こらないまたは存在しない例を包含する事を意味する。
【０３６１】
本明細書において範囲は、「約」或る特定値から、そして／または「約」別の特定値まで、というように表現され得る。このような範囲が表現されている場合、文脈が特にそれに反する旨を述べていない限り、或る特定の値および／または別の特定の値の範囲が具体的に企図され、そして開示されていると考えられる。同様に、数値が先行詞「約」の使用により近似値として記載されている場合、その特定値が、文脈が特にそれに反する旨を述べていない限り、開示されていると考えるべき別の具体的に企図された態様を形成する事が理解できるであろう。さらに、それぞれの範囲の終点は、文脈が特にそれに反する旨を述べていない限り、他の終点に関連して、且つ他の終点に独立して、有意であることが理解できるであろう。最後に、明記された範囲内に含まれる全ての個別的な数値および小範囲もまた、文脈が特にそれに反する旨を述べていない限り、個別的に企図され開示されていると考えるべきであることを理解せねばならない。具体的事例においてこれらの態様の幾つかが明確に開示されているか、全てが明確に開示されているかに拘わらず、前記の内容が適用される。
【０３６２】
それに反する定義がなされていない限り、本明細書で使用する技術的および科学的用語は、開示された方法および組成物の属する分野において通常の知識を有する者により、一般に理解されているのと同じ意義を有する。本明細書に記載されたものと類似または等価の方法および物質は全て、本発明に係る方法および組成物の実施または試験に使用でき、特に有用な方法、装置、および物質は記載のとおりである。本明細書に引用した刊行物およびそのために頭蓋冠鉤物が引用された物質は、引用により特に本明細書の一部とする。本明細書中のいかなる記載も、先行発明であるという理由で本発明がそのような内容に先行する権利が与えられない事の承認であると解してはならない。いかなる参考文献も先行技術を構成するとの了解をしている訳ではない。参考文献の考察は、それらの著者が主張していることを述べており、出願人は、引用された文書の正確性および妥当性に異議を唱える権利を留保する。本明細書には幾つかの刊行物が引用されているが、このような引用文献は、これらの文書のうち任意のものが当分野の一般知識の一部を形成しているとの了解を構成するものでないことは明確に理解できるであろう。
【０３６３】
本明細書の説明および請求項全編にわたり、「comprise」という語およびこの言葉の変形、例えば「comprising」および「comprises」は、「包含するがそれに限定されない」を意味し、例えば他の添加物、成分、整数または工程の排除を意図するものではない。
当業者は、単なる常套的実験法を利用して、本明細書に記載の方法および組成物の特定態様に対する多くの等価物を認識または確認することができるであろう。そのような等価物は以下の請求項に包含されることを意図している。
【０３６４】
本明細書に組み入れその一部を構成する添付図面は、開示した方法および組成物についての幾つかの態様を例示し、説明と共に、開示した方法および組成物の原理を説明する役割を有する。
【図面の簡単な説明】
【０３６５】
【図１Ａ】図1A、1Bおよび1Cは、B. subtilis中のxpt-pbuX mRNAのGボックスRNAがグアニンに対してアロステリックに応答することを示している。図1Aは、主としてプリン代謝に関わる遺伝子の5’UTRに存在するGボックスRNAドメインについてのコンセンサス配列および二次モデルを示す(配列番号1)。系統発生分析は、三ステム(P1からP3まで)接合点の形成と矛盾しない。小文字および大文字で示された描かれているヌクレオチドは、調査された代表の、それぞれ90%以上および80%以上存在する。丸で囲んだヌクレオチドは塩基相補性を示し、これはシュードノットの形成を示しているかも知れない。
【図１Ｂ】図1Bは、xpt-pbuX転写ユニットの5’-UTRの配列およびリガンド誘導性構造変化を示す(配列番号2)。推定的な抗ターミネーター相互作用を囲みで示す。インラインプロービング(Cから)で決定した構造変化を受けるヌクレオチドを正方形を記して特定する。201 xpt RNAの93 xptフラグメント(囲み付き)はグアニン結合機能を保持している。星印はインビトロ転写(5’末端)を促進する、または制限部位(3’末端)を生むRNA配列への変化を示す。ヌクレオチド番号は、天然の転写開始部位の第一ヌクレオチドから始まる。翻訳開始コドンは186位から始まる。
【図１Ｃ】図1Cは、グアニンおよび関連するプリンが93 xpt mRNAフラグメントの構造的調節を選択的に誘導することを示す。各々G、H、XおよびAで示されるグアニン、ヒポキサンチン、キサンチンおよびアデニンの不在下(−)または存在下で40時間インキュベートすることにより、前駆体RNA（Pre；5’ 32P標識した）をインラインプロービングに付した。NR、T1および-OHと標記したレーンはそれぞれ、反応しなかったRNA、RNアーゼT1による部分消化に付したRNA（G特異的開裂）、または部分的アルカリ消化に付したRNAを含む。G特異的開裂に対応する選択されたバンドを示す。領域1ないし4は、自発的RNA開裂のリガンド誘導性調節を受けた主たる部位を示す。
【図２Ａ】図2A、2Bおよび2Cは、xpt-pbuX mRNAのグアニン結合アプタマーによる分子識別を示す。図2Aは、グアニン、ヒポキサンチンおよびキサンチン（B. subtilisにおけるxpt-pbuX遺伝子発現の活性な天然調節物質）についての化学構造および見掛けのKD値 対アデニン(不活性)の化学構造および見かけのKD値を示す。グアニンと比較した化学構造の相違を丸で囲んである。KD値は図2に示すように201 xpt RNAで樹立した。グアニン上の番号は環上窒素原子の位置を表す。
【図２Ｂ】図2Bは、グアニンの様々な類似体についての化学構造およびKD値が、このプリンの変化が全て結合親和性の喪失を惹起することを明らかにしていることを示す。白抜きの丸は、示された値より著しく高くなりそうなKD値を示している。何故なら500μMより高い濃度の類似体はこの分析では調査しなかったからである。表示したG、H、XおよびAの見かけのKD値を比較のために三角形でプロットする。
【図２Ｃ】図2Cは、201 xpt中のグアニンアプタマーの分子認識特徴の模式的表示である。グアノシン(KD＞100μM)およびイノシン(KD＞100μM)（これらは各々グアニンおよびヒポキサンチンの9-リボシル誘導体である）は測定可能な結合を示さないため、グアニンの9位に水素結合の形成が予想される。
【図３Ａ】図3A、3Bおよび3Cは、グアニン-およびアデニン-特異的リボスイッチを示す。図3Aは、この研究で調査した2つのグアニン特異的(purEおよびxpt)および3つのアデニン特異的アプタマードメイン、BS2-puuE、BS3-xpt、BS5-ydhL、CP4-add、VV1-addの配列および構造的特徴を示し、これらを各々配列番号3-7で表す。P1ないしP3は、アプタマードメインの二次構造を含む3塩基対ステムを示す。小文字のヌクレオチドは、塩基が系統発生の代表の90%以上で保存されている位置を示している。矢印は、リガンド特異性の決定要素である、アプタマーの保存的コア内部のヌクレオチドを示す。BS、CPおよびVVは、各々B. subtilis、Clostridium perfringensおよびVibrio vulnificusを示す。
【図３Ｂ】図3Bは、xptおよびydhLアプタマーの配列および二次構造を示す(配列番号8)。丸で囲んだヌクレオチドは、xptアプタマーとは異なるydhLアプタマー内の位置を示す。
【図３Ｃ】図3Cに開示する配列は配列番号9である。xpt内のヌクレオチドは、米国出願公開第2005-0053951号の実施例9に記載のとおり番号を付してある。他の表記法はAに記載のとおりである。
【図４Ａ】図4Aおよび4Bは、ydhL由来のアデニンアプタマーによる分子認識の特異性を示す。図4a上部：80 ydhL RNAとの測定可能な結合を示す、アデニン、グアニンおよびその他のプリン類似体の化学構造。最も強固に結合する化合物である2,6-DAPと比較した化学的変化を丸で囲んである。下部左：種々のプリンについての見掛けのKD値のプロット。下部右：ydhLに対する分子認識接触の役割を有するアデニンに関する化学的特徴のモデル。N7およびN9の重要性が決定されていないことに留意されたい。丸で囲んだ矢印は、もし水素結合ドナーがC2に付加されれば接触が存在し得ることを示している。
【図４Ｂ】図4Bは、80 ydhL RNAによって拘束されない種々のプリンの化学構造を示す（300μMより低いKD値）。
【図５】図5A、5B、5Cおよび5Dは、グアニンリボスイッチ-ヒポキサンチン複合体の二次および三次構造を示す。図5Aは、左：B. subtilisのグアニンリボスイッチのxpt-pbuXグアニン結合ドメインの二次構造を示す(配列番号213)。既知のグアニンリボスイッチの90%以上で保存されているヌクレオチドを赤色で示し；番号付けは全長mRNAと一致させてある。彩色した囲みは図6および7に示した構造特徴に対応する。右：ヒポキサンチン結合型の三次構造。ループ間の最重要三次相互作用を太破線で示し；水が仲介する三重鎖を丸で囲んだ「w」で示す。図5Bは、mRNAの5’非翻訳領域中のグアニンリボスイッチによる遺伝子抑制を示す(配列番号214)。初期の転写が結合ドメインを生み、これが、もしグアニンが充分高濃度であるならば、グアニン(G)と速やかに結合し始める。ヒポキサンチン(HX、上部右)はグアニン結合ドメイン、特にP1ヘリックスを安定化し、mRNAがターミネーターエレメント（転写を休止させる)を形成するようにさせる。リガンド不在下では(下部右)、抗ターミネーターが形成され、転写の継続を促す。図5Cは、RNA-ヒポキサンチン複合体の三次元構造のリボン表示を示す。ヒポキサンチンリガンドを赤色で示し、その表面を点で表す。図5Dは、P2およびP3ヘリックスの最密充填を強調する、この複合体の平面図を示す。
【図６】図6A、6Bおよび6Cは、グアニン結合ドメインによるヒポキサンチン(HX)の認識を示す。図6A：三方向接合点にあるヒポキサンチン結合ポケットの立体図。図6B ：ヒポキサンチンおよびRNAの間の水素結合相互作用（灰色の破線）。最後のモデル（スティック表示で示す）を、シミュレーションしたアニーリング2Fo-Fc省略地図（橙色のかご）上に重ね合わせるが、ここでは、示された原子が地図の計算から除外された。図6C：テオフィリンに結合したテオフィリン結合アプタマー(中央)およびヒポキサンチンに結合したE. coli purRリプレッサー(右)と比較した、ヒポキサンチンに結合したグアニンリボスイッチの結合ポケットの分子表面の表示(左)。
【図７】図7A、7Bおよび7Cは、三次構造の安定化を示す。図7A：ループ-ループ接触の核を形成する、二つの塩基四つ組のうちの一方。図5と同様に炭素原子を彩色してある。図7B：塩基対および四つ組の配置を強調した、ループ-ループ相互作用の側面図。方向表示のために示したA65およびU34の間の水素結合と共に、Aに示した四つ組の塩基を青色に彩色した。U34の2’-ヒドロキシ基との相互作用を強化する水素結合と共に、A35A64ペアを黄色で示した。キャッピングしているG62U63ペアを赤色で示す。
【図８】図8Aおよび8Bは、ヒポキサンチンに対するリボスイッチの親和性の推定を示す。10mM K+-HEPES(pH7.5)、100mM KClおよび5mM MgCl2を含有する緩衝液中、30℃での、野生型グアニン結合ドメイン(図8A)の、およびヒポキサンチンとの三次相互作用を欠失するグアニン結合ドメイン(図8B)の、等温滴定熱量測定曲線を示す。
【図９】図9Aおよび9Bは、高スループットスクリーニングと共に使用できる二つのタイプのリボスイッチ結合検定の模式的表示である。図9A：自己開裂リボザイムの固有作用を利用する、リボザイムに基づく検定が使用できる。Xは被検化合物を表し、GlcN6Pはグルコサミン-6-燐酸である。FおよびQは、各々発蛍光団および消光剤部分を表す（例えば、TAMRAおよびCY3）。図9B：グアニン結合RNAのような非リボザイムリボスイッチのために分子ビーコン検定を使用できる。表記法はAに記載する。
【０３６６】
【図１０】図10は、グアニンリボスイッチに結合したコバルトヘキサミンイオンを示す。左のRNA(灰色)は図5Bと同じ透視図法で示してあり、結合したヒポキサンチンを赤色で、そしてCo(NH3)63+を緑および青色で示してある。右側のRNAは左の図を180°回転させてある。
【図１１】図11は、RNA GR-ミニマルの二次構造を示す(配列番号215)。このRNAは、リガンド結合の際、ループL2およびL3により形成される三次相互作用の効果を調べるために設計された。この構築物において、L2およびL3ループはP2およびP3の一部と共に除去され、極めて安定なUUCGテトラループに置き換えられた。
【図１２Ａ】図12Aおよび12Bは、抗リボスイッチ化合物の、構造に基づく設計を示す。図12A：グアニン類似体ヒポキサンチン(HX)に結合したグアニンリボスイッチの原子分解モデル。グアニン結合は、プリン環の環外アミン位置2ならびにC60およびU37の酸素原子の間に形成される、2個のさらなる接触を含み得る。青色の陰影は、存在するチャネルを示し、これがグアニン環の修飾を可能にする。これらのチャネルに沿って、そしてこれらの末端付近に、アプタマーおよび特異的グアニン誘導体の間に形成される新たな接触の機会がある。
【図１２Ｂ】図12B：グアニンリボスイッチ構造中のチャネルを利用するため、グアニン類似体の代表例（合計26；G-001ないしG-26と命名した）を合成した。このコレクション中、殆どの化合物は、1ナノモル未満の解離定数でリボスイッチと結合する。当該化合物およびチャネル付近の官能基の間に新たな接触を獲得するため、これらの化合物をさらに修飾することができる。
【図１３】図13は、種々の類似体によるグアニンアプタマーのアロステリック調節を明らかにするインラインプロービング研究の代表的ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析を示す。NR、T1およびOHは、それぞれ、反応無し、ヌクレアーゼT1部分消化、およびアルカリ部分消化を示す。インラインプロービング検定を〜1日間実施し、J1/2、J2/3およびJ3/1領域における自発的RNA開裂生成物バンドの減弱がリガンド結合を表す。この減弱は、1nMの化合物を加えた時でも起こり、この事は、解離定数がこの値に等しいか、またはより良好であることを示す。
【図１４】図14は、グアニンリボスイッチ機能のためのインビボGFPレポーター検定を示す。グアニン不在下では、全長mRNAが転写されGFPが発現される。高濃度グアニンまたは活性グアニン類似体の存在下では、転写ターミネーターが形成され、GFPの発現が抑制される。β-ガラクトシダーゼ遺伝子がリボスイッチの制御下にある、同様のシステムが創成された。
【図１５】図15は、G-014に対するタイム-キル検定を示す。G-014は、カルベニシリンと等しい比率で長時間B. subtilis生存細胞数を減少させる。
【図１Ａ】
2008518630.tif 000095
【図１Ｂ】
2008518630.tif 000096
【図１Ｃ】
2008518630.tif 000097
【図２Ａ】
2008518630.tif 000098
【図２Ｂ】
2008518630.tif 000099
【図２Ｃ】
2008518630.tif 000100
【図３Ａ】
2008518630.tif 000101
【図３Ｂ】
2008518630.tif 000102
【図３Ｃ】
2008518630.tif 000103
【図４Ａ】
2008518630.tif 000104
【図４Ｂ】
2008518630.tif 000105
【図５】
2008518630.tif 000106
【図６】
2008518630.tif 000107
【図７】
2008518630.tif 000108
【図８】
2008518630.tif 000109
【図９】
2008518630.tif 000110
【図１０】
2008518630.tif 000111
【図１１】
2008518630.tif 000112
【図１２Ａ】
2008518630.tif 000113
【図１２Ｂ】
2008518630.tif 000114
【図１３】
2008518630.tif 000115
【図１４】
2008518630.tif 000116
【図１５】
2008518630.tif 000117
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月18日(2007.7.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８４】
リボスイッチの原子結晶構造を用いて化合物を特定することもできる。天然グアニン応答性リボスイッチのこうした結晶原子構造の原子座標の例を、表6に列挙する。リボスイッチは、ヒポキサンチンに結合している。この例は、結晶構造は、細菌のプリンサルベージ経路中の一般的代謝産物であるヒポキサンチンに結合した、B. subtilisのxpt-pbuXオペロン由来のグアニンリボスイッチのプリン結合ドメインの、1.95Å分解能でのものである。この構造は、リガンドを殆ど完全に包み込む結合ポケットを創成する、幾つかの系統発生的に保存されたヌクレオチドを含む複雑なRNA折り畳みを明らかにしている。ヒポキサンチンは、この構造を安定化し下流の転写ターミネーターエレメントの形成を促すよう機能し、それによって代謝産物の細胞内濃度の増大に応答して遺伝子発現を直接抑制するメカニズムを提供する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６７】
実施例
A. 実施例1：代謝産物ヒポキサンチンと複合体形成した天然グアニン応答性リボスイッチの構造
削除された文は全て、（本願明細書とともに提出されなかった）対応の図面中に示される情報のみに関するものであり、当該図面の不存在下では有用な情報を提出しない。残りの文は、当該図面に関する記載を除去し、そして削除された文から自明な主題（すなわち、グアニン・リボスイッチ）を確定するためにのみ変更されている。グアニンリボスイッチ(配列番号214)の初期の転写が結合ドメインを生み、これが、もしグアニンが充分高濃度であるならば、グアニン(G)と速やかに結合し始める。ヒポキサンチンはグアニン結合ドメイン、特にP1ヘリックスを安定化し、mRNAがターミネーターエレメント（転写を休止させる)を形成するようにさせる。
リガンド不在下では、抗ターミネーターが形成され、転写の継続を促す。
天然バイオセンサーが如何に機能するかを理解するため、グアニン応答性リボスイッチの生物学的関連リガンド、ヒポキサンチンに結合したグアニン結合ドメインの構造を、X線結晶学で解析した（表2および図12A）。ヒポキサンチンに結合した状態では、このRNAは三次元折り畳み構造をとり、末端ループ（L2およびL3）が一連の相互連結した水素結合を形成して、P2およびP3ヘリックスを相互に平行な状態に至らせる。リボース-燐酸バックボーン領域の並置の結果である、好ましくない静電相互作用は、この二つのバックボーン間にある幾つかのカチオンの結合により中和される（図10）RNAの大域的らせん配置を固定しているのは、三方向接合点周囲の数多くの三次接触であって、これは、結合しているヒポキサンチンと相互作用するJ2/3ループ、P1ヘリックス、ならびにJ1/2およびJ3/1ループに支配されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２６８】
プリン結合ポケットは、この三方向分岐点要素またはその周囲にある、保存されたヌクレオチドによって創出される。これらのヌクレオチドは、上方および下方に二組の三重塩基が形成されることでプリン結合ポケットを規定するのを助ける。ポケットの3’側には、水で仲介されるU22-A52A73三重塩基およびA23G46-C53三重塩基が隣接しており；いずれの場合にも、アデノシンのワトソン・クリック面が、ワトソン・クリックペアの副溝と相互作用する（図6A）。他の側は、それぞれヘリックスP1の頂点にある保存されたワトソン・クリックペア（U20-A76およびA21-U75）ならびにU49およびC50のワトソン・クリック面の間の連続する三重塩基（これがJ2/3ループをP1ヘリックスに繋ぎ止める）によって創出される。リガンド結合部位を創出するための、この広範な三重塩基の使用は、テオフィリン（Zimmermann, G. R., Jenison, R. D., Wick, C. L., Simmorre, J.-P. & Pardi, A.「連結構造モチーフはテオフィリン結合RNAによる分子識別を仲介する」Nature Struct. Biol. 4, 644-649 (1997)）、FMN（Fan, P., Suri, A. K., Fiala, R., Live, D. & Patel, D. J. 「FMN-RNAアプタマー複合体における分子認識」J. Mol. Biol. 258, 480-500 (1996)）およびマラカイトグリーン（Baugh, C, Grate, D. & Wilson, C.「マラカイトグリーンアプタマーの2.8Å結晶構造」J. Mol. Biol. 301, 117-128 (2000)）バインダーの構造に例示されるような、平面状環系を認識するインビトロ選択されたRNAアプタマーに非常によく似ている。このように、人為的に選択されたRNAは、小分子リガンド結合部位を創出するため、それらの天然対応物と同じ原則を幾つか利用する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７５】
この構造はさらに、如何にしてRNAが、提唱されたRho-独立性転写調節メカニズムを介して細胞内代謝産物濃度を遺伝子発現の変化に直接変換するのかを示す（Mandal, M., Boese, B., Barrick, J. E., Winkler, W. C. & Breaker, R. R.「リボスイッチはBacillus subtilisおよびその他の細菌において基本的な生化学的経路を制御する」Cell 113, 577-586 (2003)；Johansen, L. E., Nygaard, P., Lassen, C, Agerso, Y. & Saxild, H. H.「pbuG、 nupG(yxj A)、およびpbuE (ydhL)に加えてpurおよびxpt-pbuXオペロンを含む第二のBacillus subtilis purレギュロンの定義」J. Bacteriol. 185, 5200-5209 (2003)）。最初の90ヌクレオチドの転写は、RNAの三次構造の形成を開始するために相互作用するL2およびL3ループと共に、グアニン結合ドメインの形成をもたらす。これにより、有効なリガンド結合のための三方向接合点モチーフが部分的に組織化されるが、この接合点は、プリンを結合ポケットにアクセスさせるため、ある程度は非構造化されていなければならない。充分高濃度のグアニンまたはヒポキサンチンの下では、核酸塩基はこのポケットに結合し、積層相互作用およびJ2/3を伴う三重塩基によって短P1ヘリックスを安定化し、そしてP1ヌクレオチドが抗ターミネーター要素に組み込まれるのを防ぐ。次いでこのmRNAが古典的なRho-独立性ターミネーターステムループを形成することができ、転写が停止する。対照的に、低い細胞内濃度のグアニンまたはヒポキサンチンの下では、孤立したP1ヘリックスの3’側が容易に動員されて安定な抗ターミネーター要素を形成し、転写の継続を促す。このように、ヒポキサンチンはリボスイッチの根本要素であり、或るコンホメーションを別のコンホメーションよりも安定化させるリボスイッチの能力により、二つの異なる経路に沿ってリボスイッチがmRNAの折り畳みを指令できるようにさせ、結果として細胞内グアニン、ヒポキサンチンおよびキサンチン濃度の有効なバイオセンサーをもたらす。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６５】
【図１Ａ】図1A、1Bおよび1Cは、B. subtilis中のxpt-pbuX mRNAのGボックスRNAがグアニンに対してアロステリックに応答することを示している。図1Aは、主としてプリン代謝に関わる遺伝子の5’UTRに存在するGボックスRNAドメインについてのコンセンサス配列および二次モデルを示す(配列番号1)。系統発生分析は、三ステム(P1からP3まで)接合点の形成と矛盾しない。小文字および大文字で示された描かれているヌクレオチドは、調査された代表の、それぞれ90%以上および80%以上存在する。丸で囲んだヌクレオチドは塩基相補性を示し、これはシュードノットの形成を示しているかも知れない。
【図１Ｂ】図1Bは、xpt-pbuX転写ユニットの5’-UTRの配列およびリガンド誘導性構造変化を示す(配列番号2)。推定的な抗ターミネーター相互作用を囲みで示す。インラインプロービング(Cから)で決定した構造変化を受けるヌクレオチドを正方形を記して特定する。201 xpt RNAの93 xptフラグメント(囲み付き)はグアニン結合機能を保持している。星印はインビトロ転写(5’末端)を促進する、または制限部位(3’末端)を生むRNA配列への変化を示す。ヌクレオチド番号は、天然の転写開始部位の第一ヌクレオチドから始まる。翻訳開始コドンは186位から始まる。
【図１Ｃ】図1Cは、グアニンおよび関連するプリンが93 xpt mRNAフラグメントの構造的調節を選択的に誘導することを示す。各々G、H、XおよびAで示されるグアニン、ヒポキサンチン、キサンチンおよびアデニンの不在下(−)または存在下で40時間インキュベートすることにより、前駆体RNA（Pre；5’ 32P標識した）をインラインプロービングに付した。NR、T1および-OHと標記したレーンはそれぞれ、反応しなかったRNA、RNアーゼT1による部分消化に付したRNA（G特異的開裂）、または部分的アルカリ消化に付したRNAを含む。G特異的開裂に対応する選択されたバンドを示す。領域1ないし4は、自発的RNA開裂のリガンド誘導性調節を受けた主たる部位を示す。
【図２Ａ】図2A、2Bおよび2Cは、xpt-pbuX mRNAのグアニン結合アプタマーによる分子識別を示す。図2Aは、グアニン、ヒポキサンチンおよびキサンチン（B. subtilisにおけるxpt-pbuX遺伝子発現の活性な天然調節物質）についての化学構造および見掛けのKD値 対アデニン(不活性)の化学構造および見かけのKD値を示す。グアニンと比較した化学構造の相違を丸で囲んである。KD値は図2に示すように201 xpt RNAで樹立した。グアニン上の番号は環上窒素原子の位置を表す。
【図２Ｂ】図2Bは、グアニンの様々な類似体についての化学構造およびKD値が、このプリンの変化が全て結合親和性の喪失を惹起することを明らかにしていることを示す。白抜きの丸は、示された値より著しく高くなりそうなKD値を示している。何故なら500μMより高い濃度の類似体はこの分析では調査しなかったからである。表示したG、H、XおよびAの見かけのKD値を比較のために三角形でプロットする。
【図２Ｃ】図2Cは、201 xpt中のグアニンアプタマーの分子認識特徴の模式的表示である。グアノシン(KD＞100μM)およびイノシン(KD＞100μM)（これらは各々グアニンおよびヒポキサンチンの9-リボシル誘導体である）は測定可能な結合を示さないため、グアニンの9位に水素結合の形成が予想される。
【図３Ａ】図3A、3Bおよび3Cは、グアニン-およびアデニン-特異的リボスイッチを示す。図3Aは、この研究で調査した2つのグアニン特異的(purEおよびxpt)および3つのアデニン特異的アプタマードメイン、BS2-puuE、BS3-xpt、BS5-ydhL、CP4-add、VV1-addの配列および構造的特徴を示し、これらを各々配列番号3-7で表す。P1ないしP3は、アプタマードメインの二次構造を含む3塩基対ステムを示す。小文字のヌクレオチドは、塩基が系統発生の代表の90%以上で保存されている位置を示している。矢印は、リガンド特異性の決定要素である、アプタマーの保存的コア内部のヌクレオチドを示す。BS、CPおよびVVは、各々B. subtilis、Clostridium perfringensおよびVibrio vulnificusを示す。
【図３Ｂ】図3Bは、xptおよびydhLアプタマーの配列および二次構造を示す(配列番号8)。丸で囲んだヌクレオチドは、xptアプタマーとは異なるydhLアプタマー内の位置を示す。
【図３Ｃ】図3Cに開示する配列は配列番号9である。xpt内のヌクレオチドは、米国出願公開第2005-0053951号の実施例9に記載のとおり番号を付してある。他の表記法はAに記載のとおりである。
【図４Ａ】図4Aおよび4Bは、ydhL由来のアデニンアプタマーによる分子認識の特異性を示す。図4a上部：80 ydhL RNAとの測定可能な結合を示す、アデニン、グアニンおよびその他のプリン類似体の化学構造。最も強固に結合する化合物である2,6-DAPと比較した化学的変化を丸で囲んである。下部左：種々のプリンについての見掛けのKD値のプロット。下部右：ydhLに対する分子認識接触の役割を有するアデニンに関する化学的特徴のモデル。N7およびN9の重要性が決定されていないことに留意されたい。丸で囲んだ矢印は、もし水素結合ドナーがC2に付加されれば接触が存在し得ることを示している。
【図４Ｂ】図4Bは、80 ydhL RNAによって拘束されない種々のプリンの化学構造を示す（300μMより低いKD値）。
【図５】図5A、5B、5C、5D、5E、及び5Fは、リボスイッチの野生型及び５つの突然変異についての、AdoCb1の存在下及び不在下でのcpm比(a/b)及びMiller Clnits数を示す。
【図６】図6A、6Bおよび6Cは、グアニン結合ドメインによるヒポキサンチン(HX)の認識を示す。図6A：三方向接合点にあるヒポキサンチン結合ポケットの立体図。図6B ：ヒポキサンチンおよびRNAの間の水素結合相互作用（灰色の破線）。最後のモデル（スティック表示で示す）を、シミュレーションしたアニーリング2Fo-Fc省略地図（橙色のかご）上に重ね合わせるが、ここでは、示された原子が地図の計算から除外された。図6C：テオフィリンに結合したテオフィリン結合アプタマー(中央)およびヒポキサンチンに結合したE. coli purRリプレッサー(右)と比較した、ヒポキサンチンに結合したグアニンリボスイッチの結合ポケットの分子表面の表示(左)。
【図７】図7A、7Bおよび7Cは、三次構造の安定化を示す。図7A：ループ-ループ接触の核を形成する、二つの塩基四つ組のうちの一方。図5と同様に炭素原子を彩色してある。図7B：塩基対および四つ組の配置を強調した、ループ-ループ相互作用の側面図。方向表示のために示したA65およびU34の間の水素結合と共に、Aに示した四つ組の塩基を青色に彩色した。U34の2’-ヒドロキシ基との相互作用を強化する水素結合と共に、A35A64ペアを黄色で示した。キャッピングしているG62U63ペアを赤色で示す。
【図８】図8Aおよび8Bは、ヒポキサンチンに対するリボスイッチの親和性の推定を示す。10mM K+-HEPES(pH7.5)、100mM KClおよび5mM MgCl2を含有する緩衝液中、30℃での、野生型グアニン結合ドメイン(図8A)の、およびヒポキサンチンとの三次相互作用を欠失するグアニン結合ドメイン(図8B)の、等温滴定熱量測定曲線を示す。
【図９】図9Aおよび9Bは、高スループットスクリーニングと共に使用できる二つのタイプのリボスイッチ結合検定の模式的表示である。図9A：自己開裂リボザイムの固有作用を利用する、リボザイムに基づく検定が使用できる。Xは被検化合物を表し、GlcN6Pはグルコサミン-6-燐酸である。FおよびQは、各々発蛍光団および消光剤部分を表す（例えば、TAMRAおよびCY3）。図9B：グアニン結合RNAのような非リボザイムリボスイッチのために分子ビーコン検定を使用できる。表記法はAに記載する。
【国際調査報告】
2008518630.tif 000118
2008518630.tif 000119