(57)【要約】  本発明は、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法に関する。ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、好ましくは酢酸グラチラマーである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって：
(ｉ)  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸およびそれらの混合物からなる群から選択される)；そして
(ii)  工程(ｉ)で形成された保護されたポリペプチドに酸を添加し、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる(ここで、該酸はγ−ｐ−メトキシベンジル基をグルタミン酸部分から、そしてＮ−ｔ−ブトキシカルボニル基をリシン部分から開裂させる)
工程を含む、方法。
【請求項２】
酢酸グラチラマーの製造法であって：
(ａ)  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたグラチラマーを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸、およびそれらの混合物から成る群から選択される)；
(ｂ)  工程(ａ)で形成された保護されたグラチラマーに酸を添加して、グラチラマーを形成させ(ここで、該酸はγ−ｐ−メトキシベンジル基をグルタミン酸部分から、そしてＮ−ｔ−ブトキシカルボニル基をリシン部分から開裂させる)；そして
(ｃ)  工程(ｂ)で形成されたグラチラマーを酢酸で処理して、酢酸グラチラマーを形成させる
工程を含む、方法。
【請求項３】
酸が酢酸、塩酸、臭化水素、フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、硫酸およびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
酸が酢酸と塩酸の混合物である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
酸が酢酸と臭化水素の混合物である、請求項３記載の方法。
【請求項６】
酸が酢酸と硫酸の混合物である、請求項３記載の方法。
【請求項７】
酸がトリフルオロ酢酸である、請求項３記載の方法。
【請求項８】
酢酸グラチラマーが約２kDa〜約３０kDaの重量平均分子量を有する、請求項２記載の方法。
【請求項９】
酢酸グラチラマーが約４.７kDa〜約１１kDaの重量平均分子量を有する、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
酢酸グラチラマーが約７kDa〜約１０kDaの重量平均分子量を有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ポリペプチドが約４０kDaより大きい分子量を有するポリペプチドフラグメントを実質的に含まない、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
ポリペプチドが約２kDa未満の分子量を有するポリペプチドフラグメントを実質的に含まない、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
工程(ii)が約１０℃〜約４０℃の温度で行われる、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
工程(ii)が約１５℃〜約３０℃の温度で行われる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
工程(ii)が約２２℃〜約２５℃の温度で行われる、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
イニシエーターがジエチルアミンである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
極性非プロトン性溶媒がテトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルフラン、ジメチルホルムアミド、１,４−ジオキサン、ジメトキシエタン、１,２−ジクロロエチレン、ジメチルスルホキシド、ジクロロメタンおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
極性非プロトン性溶媒が１,４−ジオキサンである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
極性非プロトン性溶媒がテトラヒドロフランである、請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
酸がポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の総重量に基づいて約０.１重量％(wt.％)〜約１００wt.％の量で存在する、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
酸がポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の総重量に基づいて約１wt.％〜約１０wt.％の量で存在する、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
酸がポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の総重量に基づいて約２wt.％〜約６wt.％の量で存在する、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
(ｉ)  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸およびそれらの混合物から成る群から選択される)；そして
(ii)  工程(ｉ)で形成された保護されたポリペプチドに酸を添加し、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる(ここで、該酸はγ−ｐ−メトキシベンジル基をグルタミン酸部分から、そしてＮ−ｔ−ブトキシカルボニル基をリシン部分から開裂させる)
工程を含む方法により製造された、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項２４】
(ａ)  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたグラチラマーを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸、およびそれらの混合物から成る群から選択される)；
(ｂ)  工程(ａ)で形成された保護されたグラチラマーに酸を添加して、グラチラマーを形成させ(ここで、該酸はγ−ｐ−メトキシベンジル基をグルタミン酸部分から、そしてＮ−ｔ−ブトキシカルボニル基をリシン部分から開裂させる)；そして
(ｃ)  工程(ｂ)で形成されたグラチラマーを酢酸で処理して、酢酸グラチラマーを形成させる
工程を含む方法により製造された、酢酸グラチラマー。
【請求項２５】
２kDa未満の重量平均分子量を有するグラチラマーが工程(ｃ)の前に除去されている、請求項２４に記載の方法により製造された酢酸グラチラマー。
【請求項２６】
２kDa未満の重量平均分子量を有するグラチラマーが透析およびダイアフィルトレーションから成る群から選択される方法により除去されている、請求項２５記載の酢酸グラチラマー。
【請求項２７】
透析を最初に水中で行い、酢酸水溶液中の透析が続く、請求項２６記載の酢酸グラチラマー。
【請求項２８】
グラチラマーを酢酸で処理した後に凍結乾燥工程をさらに含む、請求項２４記載の方法により製造された酢酸グラチラマー。
【請求項２９】
炎症性、非自己免疫性中枢神経系疾患を有する患者を処置するまたはこのような疾患の症状を軽減する方法であって、請求項１記載の方法により製造されたポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を炎症性、非自己免疫性中枢神経系疾患の処置に十分な量かつ期間患者に投与することを含む、方法。
【請求項３０】
炎症性、非自己免疫性中枢神経系疾患を有する患者を処置するまたはこのような疾患の症状を軽減する方法であって、請求項２記載の方法により製造された酢酸グラチラマーを炎症性、非自己免疫性中枢神経系疾患の処置に十分な量かつ期間患者に投与することを含む、方法。
【請求項３１】
非自己免疫性中枢神経系疾患が多発性硬化症である、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
保護されたポリペプチドをアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液で処理し、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させることを含む、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法。
【請求項３３】
Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって：
(ａ)１  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；そして
(ｂ)１  工程(ａ)１で形成された保護されたポリペプチドにアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液を添加して、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる
工程を含む、方法。
【請求項３４】
酢酸グラチラマーの製造法であって：
(ａ)１'  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合化させて、保護されたグラチラマーを形成させ；
(ｂ)１'  工程(ａ)１'で形成された保護されたグラチラマーにアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液を添加して、グラチラマーを形成させ；そして
(ｃ)１'  グラチラマーを酢酸で処理して、酢酸グラチラマーを形成させる
工程を含む、方法。
【請求項３５】
工程(ｂ)１が約−７８℃〜約４０℃の温度で行われる、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
工程(ｂ)１が約−２５℃〜約３０℃の温度で行われる、請求項３５記載の方法。
【請求項３７】
工程(ｂ)１が約−１０℃〜約１０℃の温度で行われる、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
工程(ｂ)１が約０℃の温度で行われる、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
ｐＨが約１３〜約１４である、請求項３２記載の方法。
【請求項４０】
さらに緩衝液を含む、請求項３２記載の方法。
【請求項４１】
緩衝液が酢酸緩衝液であり、ｐＨが約８〜約１２である、請求項３２記載の方法。
【請求項４２】
アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物が水酸化カルシウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化ナトリウムおよびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項３２記載の方法。
【請求項４３】
アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物が水酸化ナトリウムである、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物がポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の総重量に基づいて約０.１wt.％〜約４００wt.％の量で存在する、請求項３２記載の方法。
【請求項４５】
アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物がポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の総重量に基づいて約１０wt.％〜約３００wt.％の量で存在する、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物がポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の総重量に基づいて約１４０wt.％〜約２６０wt.％の量で存在する、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
保護されたポリペプチドをアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液で処理して、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる工程を含む方法により製造された、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩(ここで、該ポリペプチドはＬ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含む)。
【請求項４８】
(ａ)１  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；そして
(ｂ)１  工程(ａ)１で形成された保護されたポリペプチドにアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液を添加して、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる
工程を含む方法により製造された、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項４９】
(ａ)１'  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸Ｌ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合化させて、保護されたグラチラマーを形成させ；
(ｂ)１'  工程(ａ)１'で形成された保護されたグラチラマーにアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液を添加して、グラチラマーを形成させ；そして
(ｃ)１'  工程(ｂ)１'で形成されたグラチラマーを酢酸で処理して、酢酸グラチラマーを形成させる
工程を含む方法により製造された、酢酸グラチラマー。
【請求項５０】
Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって：
(ａ)２  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；
(ｂ)２  酸と工程(ａ)２で形成された保護されたポリペプチドおよび溶媒を混合して生成物を形成させ；そして
(ｃ)２  ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニア、およびそれらの混合物から成る群から選択される物質と工程(ｂ)２で形成された生成物、および水または溶媒と水の混合物と混合して、脱保護されたポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる
工程を含む、方法。
【請求項５１】
Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって：
(ａ)２  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；
(ｂ)２  酸と工程(ａ)２で形成された保護されたポリペプチドおよび溶媒を含む溶液または懸濁液を混合して、生成物を形成させ；そして
(ｃ)２  ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニア、およびそれらの混合物から成る群から選択される物質と工程(ｂ)２で形成された生成物、および水または溶媒と水の混合物を混合して、脱保護されたポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる
工程を含む、方法。
【請求項５２】
保護されたＬ−リシンがＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンである、請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
保護されたＬ−グルタミン酸がγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸およびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
保護されたＬ−グルタミン酸がγ−ベンジルＬ−グルタミン酸である、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
酢酸グラチラマーの製造法であって：
(ａ)２'  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたグラチラマーを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸およびそれらの混合物から成る群から選択される)；
(ｂ)２'  酸と工程(ａ)２'で形成された保護されたグラチラマーおよび溶媒を混合して、生成物を形成させ；
(ｃ)２'  ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニア、およびそれらの混合物から成る群から選択される物質と工程(ｂ)２'で形成された生成物、および水または溶媒と水の混合物を混合して、脱保護されたグラチラマーを形成させ；そして
(ｄ)２'  工程(ｃ)２'で形成された脱保護されたグラチラマーを酢酸で処理して、酢酸グラチラマーを形成させる
工程を含む、方法。
【請求項５６】
工程(ｂ)２で使用する溶媒が極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒およびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項５０記載の方法。
【請求項５７】
溶媒が酢酸、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルフラン、ジメチルホルムアミド、１,４−ジオキサン、ジメトキシエタン、１,２−ジクロロエチレン、ジメチルスルホキシドおよびジクロロメタンから成る群から選択される、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
溶媒がテトラヒドロフランである、請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
溶媒が酢酸である、請求項５７記載の方法。
【請求項６０】
ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質が、工程(ｃ)２に使用する工程(ｂ)２の生成物の総重量に基づいて、約１倍(wt.)〜約１,０００倍(wt.)の量で存在する、請求項５０記載の方法。
【請求項６１】
ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質が約１０倍(wt.)〜約５００倍(wt.)の量で存在する、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質が約５０倍(wt.)〜約１５０倍(wt.)の量で存在する、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって：
(ａ)３  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；
(ｂ)３  酸と工程(ａ)３で形成された保護されたポリペプチドおよび溶媒を混合して、生成物を形成させ；そして
(ｃ)３  アルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質と工程(ｂ)３で形成された生成物、および溶媒または溶媒と水の混合物を混合して、脱保護されたポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩。
【請求項６４】
Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって：
(ａ)３  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；
(ｂ)３  酸と工程(ａ)３で形成された保護されたポリペプチドおよび溶媒の混合物を混合して、生成物を形成させ；そして
(ｃ)３  アルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質と、工程(ｂ)３で形成された生成物および溶媒または溶媒と水の混合物を混合して、脱保護されたポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる
工程を含む、方法。
【請求項６５】
保護されたＬ−リシンがＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンである、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
保護されたＬ−グルタミン酸がγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸およびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項６３記載の方法。
【請求項６７】
酢酸グラチラマーの製造法であって：
(ａ)３'  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたグラチラマーを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸およびそれらの混合物から成る群から選択される)；
(ｂ)３'  酸と工程(ａ)３'で形成された保護されたグラチラマーおよび溶媒を含む混合物を混合して、生成物を形成させ；
(ｃ)３'  アルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質と、工程(ｂ)３'で形成された生成物および溶媒または溶媒と水の混合物を含む混合物を混合して、脱保護されたグラチラマーを形成させ；そして
(ｄ)３'  工程(ｃ)３'で形成された脱保護されたグラチラマーを酢酸で処理して、酢酸グラチラマーを形成させる
工程を含む、方法。
【請求項６８】
工程(ｂ)３で使用する溶媒が極性プロトン性溶媒、極性非プロトン性溶媒およびそれらの混合物から成る群から選択される、請求項６３記載の方法。
【請求項６９】
溶媒が酢酸、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルフラン、ジメチルホルムアミド、１,４−ジオキサン、ジメトキシエタン、１,２−ジクロロエチレン、ジメチルスルホキシドおよびジクロロメタンから成る群から選択される、請求項６８記載の方法。
【請求項７０】
溶媒がテトラヒドロフランである、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
溶媒が酢酸である、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
アルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質が、工程(ｃ)３において使用する溶媒または溶媒と水の混合物の総重量に基づいて約０.１wt.％〜約１０wt.％の量で存在する、請求項６３記載の方法。
【請求項７３】
アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質が、工程(ｃ)３において使用する溶媒または溶媒と水の混合物の総重量に基づいて約０.１wt.％〜約５wt.％の量で存在する、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
工程(ｃ)３において使用する溶媒または溶媒と水の混合物が、工程(ｃ)３において使用する工程(ｂ)３の生成物の総重量に基づいて、約１倍(wt.)〜約１０００倍(wt.)の量で存在する、請求項６３記載の方法。
【請求項７５】
工程(ｃ)３において使用する溶媒または溶媒と水の混合物が、工程(ｃ)３において使用する工程(ｂ)３の生成物の総重量に基づいて、約１０倍(wt.)〜約５００倍(wt.)の量で存在する、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質が、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸リチウム、炭酸マグネシウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カルシウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素ナトリウムから成る群から選択される、請求項６３記載の方法。
【請求項７７】
物質が水酸化ナトリウム、水酸化リチウムおよび水酸化カリウムから成る群から選択される、請求項７６記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法を提供する。より具体的に、本発明は酢酸グラチラマーの製造法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
COPAXONE(登録商標)は、多発性硬化症の処置のためのＦＤＡが認可した薬剤である酢酸グラチラマーの商品名である。COPAXONE(登録商標)はまたコポリマー−１としても既知である。COPAXONE(登録商標)のラベルは、COPAXONE(登録商標)が、各々０.１４１、０.４２７、０.０９５および０.３３８の平均モル分率で４種の天然に存在するアミノ酸：Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシンおよびＬ−リシンを含み、４.７−１１.０キロダルトン(kDa)の重量平均分子量を有する合成ポリペプチドの酢酸塩であることを記載している。COPAXONE(登録商標)は、異なる分子量および配列を有するポリペプチドの混合物である。COPAXONE(登録商標)の構造式は：
(Ｇｌｕ, Ａｌａ, Ｌｙｓ, Ｔｙｒ)ｘ・ｘＣＨ３ＣＯＯＨ
(Ｃ５Ｈ９ＮＯ４・Ｃ３Ｈ７ＮＯ２・Ｃ６Ｈ１４Ｎ２Ｏ２・Ｃ９Ｈ１１ＮＯ３)ｘ・ｘＣ２Ｈ４Ｏ２
である。
【０００３】
COPAXONE(登録商標)は、２０mgの酢酸グラチラマーおよび４０mgのマンニトールを含む、白色ないしオフホワイト色の、滅菌、凍結乾燥粉末である。それは、滅菌水で再構成後に皮下投与するための、一回使い切りバイアルとして供給される。
【０００４】
コポリマー−１または酢酸グラチラマーの製造法は、米国特許３,８４９,５５０；５,８００,８０８；５,９８１,５８９；６,０４８,８９８；６,０５４,４３０；６,３４２,４７６；および６,３６２,１６１に記載されている。酢酸グラチラマーの製造法は、保護されたポリペプチドを形成させるための、チロシン、アラニン、γ−ベンジルグルタミン酸およびＮε−トリフルオロアセチルリシンのＮ−カルボキシ無水物の、無水ジオキサン中、室温での、イニシエーターとしてジエチルアミンを使用した重合を基礎とする。γ−ベンジル基の非ブロック化(最初の脱保護)は、保護されたポリペプチドを臭化水素／酢酸中、室温で撹拌することにより達成される。これらの条件はまたコポリマーの開裂も促進する。次工程は１Ｍ  ピペリジンでの処理による、コポリマーのＮε−トリフルオロアセチル基の除去(第二の脱保護)である。最終工程において、コポリマーを透析を介して精製し、その後酢酸で処理して酢酸塩を形成させ、そして水に対して透析してもう一回精製することにより、酢酸グラチラマーを得る。故に、これらの先行文献は、４種のＮ−カルボキシ無水物の重合、２回の脱保護工程、２回の精製工程および１回の酢酸塩形成工程を含む。
【０００５】
米国特許６,６２０,８４７は、トリフルオロアセチルコポリマー−１を水性ピペリジンで処理して、コポリマー−１の溶液を形成させ、コポリマー−１を精製すること含む、コポリマー−１の製造法を記載する。
【０００６】
米国特許出願公開２００４／００９１９５６は、酢酸グラチラマーの製造のための３工程法を記載する。該方法は、Ｌ−アラニン、Ｌ−チロシン、保護されたＬ−グルタミン酸および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を重合して、保護されたポリペプチドまたはその塩を得て；そして保護されたポリペプチドまたはその塩を、水素圧下のパラジウム触媒移動水素化またはパラジウム触媒水素化のいずれかにより脱保護する工程を含む。
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
本発明はＬ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって：
(ｉ)Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物；保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物；およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸およびそれらの混合物から成る群から選択される)；そして
(ii)工程(ｉ)で形成された保護されたポリペプチドに酸を添加して、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる(ここで、該酸はγ−ｐ−メトキシベンジル基をグルタミン酸部分から、そしてＮ−ｔ−ブトキシカルボニル基をリシン部分から開裂させる)
工程を含む、方法を提供する。
【０００８】
本発明は、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって、該保護されたポリペプチドをアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液で処理して、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる工程を含む、方法を提供する。
【０００９】
本発明はＬ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって：
(ａ)２  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；
(ｂ)２  酸と工程(ａ)２で形成された保護されたポリペプチドおよび溶媒を混合して、生成物を形成させ；そして
(ｃ)２  ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質を、工程(ｂ)２で形成された生成物および水または溶媒と水の混合物と混合して、脱保護されたポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる
工程を含む、方法を提供する。
【００１０】
本発明は、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって：
(ａ)３  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；
(ｂ)３  酸と、工程(ａ)３で形成された保護されたポリペプチドおよび溶媒を混合して、生成物を形成させ；そして
(ｃ)３  アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質と、工程(ｂ)３で形成された生成物および溶媒または溶媒と水の混合物を混合して、脱保護されたポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる
工程を含む、方法を提供する。
【００１１】
発明の記載
本発明は、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法に関する。本ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、好ましくは酢酸グラチラマーである。
【００１２】
Ｉ. 酸加水分解法。
本発明の一つの態様において、本方法は下記を含む：
(ｉ)  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸およびそれらの混合物から成る群から選択される)；そして
(ii)  工程(ｉ)で形成された保護されたポリペプチドに酸を添加して、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる(ここで、該酸はγ−ｐ−メトキシベンジル基をグルタミン酸部分から、そしてＮ−ｔ−ブトキシカルボニル基をリシン部分から開裂させる)。
【００１３】
本発明の一つの態様において、本方法は下記を含む：
(ａ)  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたグラチラマーを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸、およびそれらの混合物から成る群から選択される)；
(ｂ)  工程(ａ)で形成された保護されたグラチラマーに酸を添加してグラチラマーを形成させ(ここで、該酸はγ−ｐ−メトキシベンジル基をグルタミン酸部分から、そしてＮ−ｔ−ブトキシカルボニル基をリシン部分から開裂させる)；そして
(ｃ)  工程(ｂ)で形成されたグラチラマーを酢酸で処理して、酢酸グラチラマーを形成させる。
【００１４】
本発明の方法の重合工程、工程(ｉ)、工程(ａ)、工程(ａ)１、工程(ａ)１'、工程(ａ)２、工程(ａ)２'、工程(ａ)３および工程(ａ)３'において、Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、好ましくは約１０℃〜約４０℃、より好ましくは約２０℃〜約３０℃の温度で重合させる。本重合反応は、好ましくは約２時間〜約８０時間、より好ましくは約２０時間〜約５０時間の期間行う。最も好ましくは、本重合反応約２４時間、約２５℃の温度で行う。
【００１５】
本極性非プロトン性溶媒は、好ましくはテトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルフラン、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、ジメトキシエタン、１,２−ジクロロエチレン、ジメチルスルホキシドおよびジクロロメタンから選択される。最も好ましくは、本極性非プロトン性溶媒は１,４−ジオキサンである。極性非プロトン性溶媒の混合物もまた使用できる。
【００１６】
本発明の方法の工程(ｉ)、工程(ａ)、工程(ａ)１、工程(ａ)１'、工程(ａ)２、工程(ａ)２'、工程(ａ)３および工程(ａ)３'で使用するイニシエーターは、ジアルキルまたはトリアルキルアミンのような任意のアルキルアミンイニシエーターであり得る。本アルキル基のそれぞれは、好ましくは１−６個の炭素原子を有する。好ましいアルキルアミンイニシエーターはジエチルアミンである。好ましくは、本ジエチルアミンは、Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物の重量に基づいて、約０.００１重量％(wt.％)〜約２wt.％、より好ましくは約０.０１wt.％〜約０.０２wt.％の量で存在する。
【００１７】
本発明の一つの態様において、水を、本重合混合物に重合後に添加する。水の添加は、保護されたポリペプチドの沈殿をもたらす。水を、好ましくは水および保護されたポリペプチドを含む混合物から真空濾過により除去し、回収された保護されたポリペプチドを乾燥させる。乾燥法は、真空乾燥のように、当業者に既知である。
【００１８】
本発明の方法の脱保護工程、工程(ii)において、酸を、工程(ｉ)で形成された保護されたポリペプチドに添加し、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる。本酸は、γ−ｐ−メトキシベンジル基またはγ−ベンジル基をグルタミン酸部分から、そしてＮ−ｔ−ブトキシカルボニル基をリシン部分から開裂させる。加えて、本酸は、異種ポリペプチドフラグメントを形成するポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩のアミド結合を開裂させる。
【００１９】
本発明の方法の脱保護工程、工程(ｂ)において、酸を工程(ａ)で形成された保護されたグラチラマーに添加し、グラチラマーを形成させる。本酸は、γ−ｐ−メトキシベンジル基またはγ−ベンジル基をグルタミン酸部分から、そしてＮ−ｔ−ブトキシカルボニル基をリシン部分から開裂させる。加えて、本酸は、異種グラチラマーフラグメントを形成するグラチラマーのアミド結合を開裂させる。
【００２０】
適当な酸は、酢酸、塩酸、臭化水素、フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、リン酸、トリフルオロ酢酸および硫酸を含むが、これらに限定されない。酸の混合物もまた使用できる。好ましい酸はトリフルオロ酢酸、酢酸と塩酸の混合物、酢酸と臭化水素の混合物および酢酸と硫酸の混合物から選択される。本酸は水溶液の形で添加できる。
【００２１】
本酸は、好ましくは、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーの重量に基づいて約０.１wt.％〜約１００wt.％、より好ましくは約１wt.％〜約１０wt.％の量で存在する。最も好ましくは、本酸は、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーの重量に基づいて、約２wt.％〜約６wt.％の量で存在する。
【００２２】
酸添加中の反応媒体の温度は、好ましくは約１０℃〜約４０℃、より好ましくは１５℃〜約３０℃である。本酸は、好ましくは約１時間〜約３０時間の期間にわたり、撹拌しながら添加する。最も好ましくは、本酸を、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーに、約２５℃の温度で、約１時間〜約８時間の期間、撹拌しながら添加する。
【００２３】
過剰な酸を、好ましくは本反応混合物から、本反応混合物の窒素でのパージ、凍結乾燥、または脱保護されたポリペプチドを固体形態で得るための真空下のロータリーエバポレーターの手段により除去する。しかしながら、当業者に既知の他の分離法もまた使用できる。
【００２４】
遊離塩基または酸付加塩の形の脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを、好ましくは水または酢酸水溶液に溶解する。望まない低分子量、すなわち、約２kDa未満のポリペプチドまたはグラチラマーフラグメント、および高分子量、すなわち、約４０kDaを超えるポリペプチドまたはグラチラマーフラグメントを、好ましくは透析またはダイアフィルトレーションのような方法で除去する。好ましい膜は、Medicell International Ltd.から入手可能な１２−１４kDaの分子量カットオフを有するサイズ６膜のようなVisking一部透過性セルロース膜、およびMilliporeから入手可能なPellicon XL PLCCC 10(５０cm２)またはPLCCC 5(５０cm２)のような接線流濾過(ＴＦＦ)膜を含む。本発明の好ましい態様において、本脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを水に溶解し、透析に付し、続いて酢酸水溶液中で透析する。
【００２５】
本発明者らは、望む分子量のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、工程(ii)または工程(ｂ)で添加する酸の希釈、濃縮および／または時間により制御できることを決定している。
【００２６】
本発明の一つの態様において、水を、本脱保護されたポリペプチドから除去する。好ましい除去法は凍結乾燥である。凍結乾燥において、溶液を凍結させ、真空下に置き、水(氷)が融解せずに真空で気化(昇華)し、非水成分(脱保護されたポリペプチドおよび残存塩)がダメージを受けていない状態で、すなわち、化学分解なしに残る。凍結乾燥の乾燥生成物は、脱保護されたポリペプチドおよび残存塩を含む。
【００２７】
本発明の一つの態様において、本脱保護されたポリペプチドを氷酢酸で処理して、酢酸グラチラマー塩を形成させる。本酢酸グラチラマー塩を、好ましくは凍結乾燥により乾燥させて、酢酸グラチラマー塩生成物を得る。
【００２８】
II. 相間移動法。
本発明の一つの態様において、Ｌ−チロシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−グルタミン酸およびＬ−リシンを含むポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の製造法であって、保護されたポリペプチドをアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液で処理して、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる工程を含む方法を提供する。
【００２９】
本発明の一つの態様において、本方法は下記を含む：
(ａ)１  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；そして
(ｂ)１  アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液を工程(ａ)１で形成された保護されたポリペプチドに添加し、ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる。
【００３０】
本発明の一つの態様において、本方法は下記を含む：
(ａ)１'  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸Ｌ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたグラチラマーを形成させ；
(ｂ)１'  アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液を工程(ａ)１'で形成された保護されたグラチラマーに添加して、グラチラマーを形成させ；そして
(ｃ)１'  グラチラマーを酢酸で処理して、酢酸グラチラマーを形成させる。
【００３１】
本発明の方法の脱保護工程、工程(ｂ)１および工程(ｂ)１'において、アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液を、工程(ａ)１で形成された保護されたポリペプチドまたは工程(ａ)１'で形成された保護されたグラチラマーに添加する。工程(ｂ)１および工程(ｂ)１'において、グルタミン酸部分上の保護基、すなわちγ−ベンジル基、およびリシン部分上の保護基、すなわちＮε−トリフルオロアセチル基を除去する。加えて、本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物は、異種ポリペプチドまたはグラチラマーフラグメントを形成するポリペプチドまたはグラチラマーのアミド結合を開裂させる。
【００３２】
何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーからの保護基の除去が、本脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーの有機相から水相への相間移動をもたらすと考える。
【００３３】
工程(ｂ)１または工程(ｂ)１'における緩衝液の非存在下で、工程(ｂ)１および工程(ｂ)１'中のｐＨは、アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液の添加後一般に約１３〜約１４である。工程(ｂ)１または工程(ｂ)１'における緩衝液存在下で、ｐＨは一般に約８〜約１２である。本緩衝液は添加してよく、またはその場で形成してよい。好ましい緩衝液は、酢酸ナトリウムのような酢酸緩衝液である。
【００３４】
本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物は、好ましくは水酸化カルシウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化カリウムおよび水酸化ナトリウムから選択される。より好ましくは、本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物は水酸化ナトリウムである。アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の組合せもまた使用できる。
【００３５】
本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物は、好ましくは、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーの重量に基づいて約０.１wt.％〜約４００wt.％、より好ましくは約１０wt.％〜約３００wt.％の量で存在する。最も好ましくは、本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物は、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーの重量に基づいて約１４０wt.％〜約２６０wt.％の量で存在する。
【００３６】
アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液は、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーに、好ましくは約−７８℃〜約４０℃、より好ましくは−２５℃〜約３０℃の温度で、好ましくは約１時間〜約３０時間の期間添加する。最も好ましくは、アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液を、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーに、約−１０℃〜約１０℃、例えば、０℃の温度で、約１時間〜約８時間の期間、撹拌しながら添加する。アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の水溶液のこの添加は、有機相および水相が形成される相分離をもたらす。
【００３７】
本有機相は、実質的に極性非プロトン性溶媒および保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーを含む。本水相は、実質的に水、アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、および遊離塩基の形態の脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを含む。本水相と有機相を、好ましくは遠心分離を使用して分離し、有機相をデカントする。
【００３８】
本発明の方法のさらなる利点は、アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の添加が、脱保護されたポリペプチドを形成させるための保護されたポリペプチドの脱保護、または脱保護されたグラチラマーを形成させるための保護されたグラチラマーの脱保護をもたらすことである。加えて、本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物が、ポリペプチドまたはグラチラマーフラグメントを形成させるための、脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーのアミド結合の開裂をもたらす。
【００３９】
本水相を、好ましくは有機酸または鉱酸で処理して、約７〜約８のｐＨを達成する。ｐＨを調節するためのこのような有機酸または鉱酸は、当業者に既知であり、酢酸、ギ酸、シュウ酸および塩酸を含むが、これらに限定されない。希塩酸が好ましい。使用する有機酸または鉱酸の量は、好ましくは工程(ｂ)１または工程(ｂ)１'中に添加するアルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物の量に基づいて当量であり、これは約７〜約８のｐＨを産生するのに十分である。
【００４０】
望まない低分子量、すなわち約２kDa未満のポリペプチドまたはグラチラマーフラグメント、および高分子量、すなわち約４０kDaより大きいポリペプチドまたはグラチラマーフラグメントを、好ましくは透析またはダイアフィルトレーションのような方法で除去する。好ましい膜は、好ましい膜は、Medicell International Ltd.から入手可能な１２−１４kDaの分子量カットオフを有するサイズ６膜のようなVisking一部透過性セルロース膜、およびMilliporeから入手可能なPellicon XL PLCCC 10(５０cm２)またはPLCCC 5(５０cm２)のような接線流濾過(ＴＦＦ)膜を含む。本発明の好ましい態様において、本脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを水中の透析に付し、続いて酢酸水溶液中で透析する。
【００４１】
III. アミンまたはアンモニアの使用法。
本発明の一つの態様において、本方法は下記を含む：
(ａ)２  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；
(ｂ)２  酸と、工程(ａ)２で形成された保護されたポリペプチドおよび溶媒を混合して、生成物を形成させ、好ましくは、本酸を保護されたポリペプチドおよび溶媒を含む溶液または懸濁液と混合し；そして
(ｃ)２  ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニア、およびそれらの混合物から成る群から選択される物質と、工程(ｂ)２において形成された生成物および水または溶媒と水の混合物を混合して、脱保護されたポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる。
【００４２】
本発明の一つの態様において、本方法は下記を含む：
(ａ)２'  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたグラチラマーを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸およびそれらの混合物から成る群から選択される)；
(ｂ)２'  酸と工程(ａ２')で形成された保護されたグラチラマーおよび溶媒を混合して、生成物を形成させ；
(ｃ)２'  ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質と、工程(ｂ)２で形成された生成物、および水または溶媒と水の混合物を混合して、脱保護されたグラチラマーを形成させ；そして
(ｄ)２'  工程(ｃ)２'で形成された脱保護されたグラチラマーを酢酸で処理して、酢酸グラチラマーを形成させる。
【００４３】
本発明の方法の最初の脱保護工程、工程(ｂ)２および工程(ｂ)２'において、酸を、工程(ａ)２で形成された保護されたポリペプチドまたは工程(ａ)２'で形成された保護されたグラチラマー、および溶媒と混合して、生成物を形成させる。好ましくは、本酸を混合物、すなわち、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーおよび溶媒を含む溶液または懸濁液に添加する。工程(ｂ)２および工程(ｂ)２'において、グルタミン酸部分上の保護基、すなわち、γ−ｐ−メトキシベンジル基および／またはγ−ベンジル基を除去する。何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、本酸がまた異種ポリペプチドまたはグラチラマーフラグメントを形成する保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーのアミド結合を開裂させると考える。
【００４４】
適当な酸は、酢酸、塩酸、臭化水素、フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、リン酸、トリフルオロ酢酸および硫酸を含むが、これらに限定されない。酸の混合物もまた使用できる。好ましい酸はトリフルオロ酢酸、酢酸と塩酸の混合物、酢酸と臭化水素の混合物および酢酸と硫酸の混合物から選択される。本酸は、水溶液の形態で添加できる。
【００４５】
本酸は、好ましくは、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーの重量に基づいて約０.１wt.％〜約１００wt.％、より好ましくは約１wt.％〜約１０wt.％の量で存在する。最も好ましくは、本酸は、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーの重量に基づいて約２wt.％〜約６wt.％の量で存在する。
【００４６】
酸添加中の反応媒体の温度は、好ましくは約１０℃〜約４０℃、より好ましくは１５℃〜約３０℃である。本酸は、好ましくは約１時間〜約３０時間の期間にわたり、撹拌しながら添加する。最も好ましくは、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーに、約２５℃の温度で、約１時間〜約８時間の期間、撹拌しながら添加する。
【００４７】
最初の脱保護工程、工程(ｂ)２および工程(ｂ)２'で使用する溶媒は、極性プロトン性溶媒および極性非プロトン性溶媒から選択される。好ましくは、工程(ｂ)２および工程(ｂ)２'で使用する溶媒は、酢酸、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルフラン、ジメチルホルムアミド、１,４−ジオキサン、ジメトキシエタン、１,２−ジクロロエチレン、ジメチルスルホキシドおよびジクロロメタンから選択される。溶媒の混合物もまた使用できる。最も好ましくは、工程(ｂ)２および工程(ｂ)２'で使用する溶媒はテトラヒドロフランまたは酢酸である。
【００４８】
工程(ｂ)２および工程(ｂ)２'で使用する溶媒の量は、工程(ｂ)２または工程(ｂ)２'において使用する保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーの量に基づいて、好ましくは約１倍(wt.)〜約１,０００倍(wt.)、より好ましくは約１０倍(wt.)〜約５００倍(wt.)である。
【００４９】
本発明の方法の第二の脱保護工程、工程(ｃ)２および工程(ｃ)２'において、ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質を、工程(ｂ)２または工程(ｂ)２'において形成された生成物および水または溶媒と水の混合物と混合し、脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを形成させる。
【００５０】
好ましくは、ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質を、混合物、すなわち、工程(ｂ)２または工程(ｂ)２'で形成された生成物および水または溶媒と水の混合物を含む溶液または懸濁液に添加する。アンモニアはＮＨ３(水性)またはＮＨ３(ガス)の形態である。好ましくは約７〜約１４のｐＨを有するアンモニア水溶液を使用する。ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質の、工程(ｂ)２または工程(ｂ)２'において形成された生成物への添加は、好ましくはリシン部分のＮε−トリフルオロアセチル基のような保護基を除去する。好ましくは、本脱保護されたポリペプチドは、遊離塩基の形態の脱保護されたグラチラマーである。
【００５１】
ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質は、工程(ｃ)２または工程(ｃ)２'において使用される工程(ｂ)２または工程(ｂ)２'の生成物の総重量に基づいて、好ましくは約１倍(wt.)〜約１,０００倍(wt.)、より好ましくは約１０倍(wt.)〜約５００倍(wt.)である。最も好ましくは、ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質は、約５０倍(wt.)〜約１５０倍(wt.)の量で存在する。
【００５２】
ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質は、好ましくは工程(ｂ)２または工程(ｂ)２'において形成された生成物および水または溶媒と水の混合物を含む溶液または懸濁液と、約１０℃〜約６０℃、より好ましくは１５℃〜約４０℃の温度で、好ましくは約１分〜約６０時間の期間混合し、脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを形成させる。適当な溶媒は、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルフラン、ジメチルホルムアミド、１,４−ジオキサン、ジメトキシエタン、１,２−ジクロロエチレン、ジメチルスルホキシドおよびジクロロメタンを含むが、これらに限定されない。好ましい溶媒はテトラヒドロフランである。
【００５３】
より好ましくは、ジイソプロピルアミン、イソプロピルアミン、アンモニアおよびそれらの混合物から成る群から選択される物質を、工程(ｂ)２または工程(ｂ)２'において形成された生成物および水または溶媒と水の混合物を含む溶液または懸濁液と、約２０℃〜約３０℃の温度で、約１時間〜約３０時間の期間混合し、脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを形成させる。未反応のジイソプロピルアミンまたはアンモニア、または何らかの溶媒または水を、好ましくは蒸発または真空蒸留により除去する。
【００５４】
望まない低分子量、すなわち約２kDa未満のポリペプチドまたはグラチラマーフラグメント、および高分子量、すなわち約４０kDaより大きいポリペプチドまたはグラチラマーフラグメントを、好ましくは透析またはダイアフィルトレーションのような方法で除去する。好ましい膜は、Medicell International Ltd.から入手可能な１２−１４kDaの分子量カットオフを有するサイズ６膜のようなVisking一部透過性セルロース膜、およびMilliporeから入手可能なPellicon XL PLCCC 10(５０cm２)またはPLCCC 5(５０cm２)のような接線流濾過(ＴＦＦ)膜を含む。本発明の好ましい態様において、本脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを水中の透析に付し、続いて酢酸水溶液中で透析する。
【００５５】
IV. アルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩または炭酸水素塩の使用法。
本発明の一つの態様において、本方法は下記を含む：
(ａ)３  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物および保護されたＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたポリペプチドを形成させ；
(ｂ)３  酸と工程(ａ)３で形成された保護されたポリペプチドおよび溶媒を混合して、生成物を形成させ、好ましくは、本酸を、保護されたポリペプチドおよび溶媒を含む溶液または懸濁液と混合し；そして
(ｃ)３  アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質と、工程(ｂ)３で形成された生成物および溶媒または溶媒と水の混合物を混合して、脱保護されたポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を形成させる。
【００５６】
本発明の一つの態様において、本方法は下記を含む：
(ａ)３'  Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物、保護されたＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物およびＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物の混合物を、極性非プロトン性溶媒中、イニシエーター存在下で重合させて、保護されたグラチラマーを形成させ(ここで、該保護されたＬ−グルタミン酸はγ−ｐ−メトキシベンジルＬ−グルタミン酸、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸およびそれらの混合物から成る群から選択される)；
(ｂ)３'  酸と工程(ａ)３'で形成された保護されたグラチラマーおよび溶媒を含む混合物を混合して、生成物を形成させ；
(ｃ)３'  アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質と、工程(ｂ)３'で形成された生成物および溶媒または溶媒と水の混合物を含む混合物を混合して、脱保護されたグラチラマーを形成させ；そして
(ｄ)３'  工程(ｃ)３'で形成された脱保護されたグラチラマーを酢酸で処理して、酢酸グラチラマーを形成させる。
【００５７】
本発明の方法の最初の脱保護工程、工程(ｂ)３および工程(ｂ)３'において、酸を、工程(ａ)３で形成された保護されたポリペプチドまたは工程(ａ)３'で形成された保護されたグラチラマーおよび溶媒と混合して、生成物を形成させる。好ましくは、本酸を混合物、すなわち、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーおよび溶媒を含む溶液または懸濁液に添加する。工程(ｂ)３および工程(ｂ)３'において、グルタミン酸部分上の保護基、すなわち、γ−ｐ−メトキシベンジル基および／またはγ−ベンジル基を除去する。何らかの特定の理論に縛られることを望まないが、本発明者らは、本酸がまた異種ポリペプチドフラグメントを形成する保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーのアミド結合を開裂させると考える。
【００５８】
適当な酸は、酢酸、塩酸、臭化水素、フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、リン酸、トリフルオロ酢酸および硫酸を含むが、これらに限定されない。酸の混合物もまた使用できる。好ましい酸はトリフルオロ酢酸、酢酸と塩酸の混合物、酢酸と臭化水素の混合物および酢酸と硫酸の混合物から選択される。本酸は、水溶液の形態で添加できる。
【００５９】
本酸は、好ましくは、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーの重量に基づいて約０.１wt.％〜約１００wt.％、より好ましくは約１wt.％〜約１０wt.％の量で存在する。最も好ましくは、本酸は、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーの重量に基づいて約２wt.％〜約６wt.％の量で存在する。
【００６０】
酸添加中の反応媒体の温度は、好ましくは約１０℃〜約４０℃、より好ましくは１５℃〜約３０℃である。本酸は、好ましくは約１時間〜約３０時間の期間にわたり、撹拌しながら添加する。最も好ましくは、保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーに、約２５℃の温度で、約１時間〜約８時間の期間、撹拌しながら添加する。
【００６１】
最初の脱保護工程、工程(ｂ)３および工程(ｂ)３'において使用する溶媒は、極性プロトン性溶媒および極性非プロトン性溶媒から選択される。好ましくは、工程(ｂ)３および工程(ｂ)３'で使用する溶媒は、酢酸、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルフラン、ジメチルホルムアミド、１,４−ジオキサン、ジメトキシエタン、１,２−ジクロロエチレン、ジメチルスルホキシドおよびジクロロメタンから選択される。溶媒の混合物もまた使用できる。最も好ましくは、工程(ｂ)３および工程(ｂ)３'で使用する溶媒は、テトラヒドロフランまたは酢酸である。
【００６２】
工程(ｂ)３および工程(ｂ)３'で使用する溶媒の量は、工程(ｂ)３または工程(ｂ)３'において使用する保護されたポリペプチドまたは保護されたグラチラマーの量に基づいて、好ましくは約１倍(wt.)〜約１,０００倍(wt.)、より好ましくは約１０倍(wt.)〜約５００倍(wt.)である。
【００６３】
本発明の方法の第二の脱保護工程、工程(ｃ)３および工程(ｃ)３'において、アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質を、工程(ｂ)３または工程(ｂ)３'において形成された生成物および水または溶媒と水の混合物と混合して、脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを形成させる。
【００６４】
好ましくは、本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質を、混合物、すなわち、工程(ｂ)３または工程(ｂ)３'において形成された生成物および水または溶媒と水の混合物を含む溶液または懸濁液に添加する。アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質の、工程(ｂ)３または工程(ｂ)３'における生成物への添加は、好ましくはリシン部分のＮε−トリフルオロアセチル基を除去する。好ましくは本脱保護されたポリペプチドは、遊離塩基形態の脱保護されたグラチラマーである。
【００６５】
アルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩および炭酸水素塩から選択される物質は、水酸化カルシウム、水酸化リチウム、水酸化マグネシウム、水酸化カリウム、水酸化バリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カルシウム、炭酸リチウム、炭酸マグネシウム、炭酸カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素カルシウム、炭酸水素リチウム、炭酸水素マグネシウム、炭酸水素カリウムおよび炭酸水素ナトリウムから成る群から選択される。より好ましくは、工程(ｃ)３または工程(ｃ)３'において使用する物質は、水酸化ナトリウム、水酸化リチウムおよび水酸化カリウムから成る群から選択される。
【００６６】
本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質は、工程(ｃ)３または工程(ｃ)３'に使用する工程(ｂ)３または工程(ｂ)３'の生成物の総重量に基づいて、好ましくは約１倍(wt.)〜約１,０００倍(wt.)、より好ましくは約１０倍(wt.)〜約５００倍(wt.)の量で存在する。最も好ましくは、本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質は、約５０倍(wt.)〜約１５０倍(wt.)の量で存在する。
【００６７】
本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質は、好ましくは工程(ｂ)３または工程(ｂ)３'において形成された生成物および水または溶媒と水の混合物を含む溶液または懸濁液と、約１０℃〜約６０℃、より好ましくは１５℃〜約４０℃の温度で、好ましくは約１分〜約６０時間の期間混合し、脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを形成させる。適当な溶媒は、テトラヒドロフラン、酢酸エチル、ジメチルフラン、ジメチルホルムアミド、１,４−ジオキサン、ジメトキシエタン、１,２−ジクロロエチレン、ジメチルスルホキシドおよびジクロロメタンを含むが、これらに限定されない。好ましい溶媒はテトラヒドロフランである。
【００６８】
より好ましくは、本アルカリもしくはアルカリ土類金属水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩およびそれらの混合物から成る群から選択される物質を、工程(ｂ)３または工程(ｂ)３'において形成された生成物および水または溶媒と水の混合物を含む溶液または懸濁液と、約２０℃〜約３０℃の温度で、約１時間〜約３０時間の期間混合し、脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを形成させる。未反応のアルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩または何らかの溶媒または水を、好ましくは蒸発または真空蒸留により除去する。
【００６９】
工程(ｃ)３または工程(ｃ)３'において使用する溶媒または溶媒と水の混合物の量は、工程(ｃ)３または工程(ｃ)３'に使用する工程(ｂ)３または工程(ｂ)３'の生成物の総重量に基づいて、好ましくは約１倍(wt.)〜約１,０００倍(wt.)、より好ましくは約１０倍(wt.)〜約５００倍(wt.)である。
【００７０】
第二の脱保護工程、工程(ｃ)３および工程(ｃ)３'の後、全ての相を好ましくは分液漏斗で分離するか、または溶媒を好ましくは蒸発または真空蒸留により除去する。本脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーは、好ましくは水溶液として得る。
【００７１】
望まない低分子量、すなわち約２kDa未満のポリペプチドまたはグラチラマーフラグメントおよび高分子量、すなわち約４０kDaより大きいポリペプチドまたはグラチラマーフラグメントを、好ましくは透析またはダイアフィルトレーションのような方法で除去する。好ましい膜は、Medicell International Ltd.から入手可能な１２−１４kDaの分子量カットオフを有するサイズ６膜のようなVisking一部透過性セルロース膜、およびMilliporeから入手可能なPellicon XL PLCCC 10(５０cm２)またはPLCCC 5(５０cm２)のような接線流濾過(ＴＦＦ)膜を含む。本発明の好ましい態様において、本脱保護されたポリペプチドまたは脱保護されたグラチラマーを水中の透析に付し、続いて酢酸水溶液中で透析する。
【００７２】
本発明の方法で製造したポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩の重量平均分子量は、ガス浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)で決定して、好ましくは約２kDa〜約３０kDa、より好ましくは約４.７kDa〜約１１kDa、および最も好ましくは約７kDa〜約１０kDaである。好ましくは、本ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、約４０kDaより大きい分子量を有するポリペプチドフラグメントを実質的に含まない。好ましくは、本ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩は、約２kDa未満の分子量を有するポリペプチドフラグメントを実質的に含まない。ここで使用する“実質的に含まない”は、本発明の方法で製造したポリペプチドの約５重量％未満、より好ましくは約２.５重量％未満を意味する。
【００７３】
本発明の方法により製造したポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩、好ましくは酢酸グラチラマーは、当分野で既知の慣用法により製剤できる。
【００７４】
本発明の一つの態様において、本発明の方法により製造したポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、水のような許容される医薬用(pharmaceutical)液体媒体に溶解し、その溶液または懸濁液を体内に注射する。
【００７５】
本発明の一つの態様において、本酢酸グラチラマー塩を、水およびマンニトールを含む混合物に溶解し、その溶液を体内に注射する。
【００７６】
典型的に、本ポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩を、多発性硬化症を有する患者に、毎日、例えば、２０mgの酢酸グラチラマーの用量で投与する。
【００７７】
下記の非限定的実施例は、本発明のさらなる局面を説明する。
実施例１−７は、酢酸グラチラマーを製造するための酸加水分解法に関する。
【実施例】
【００７８】
実施例１
保護されたポリペプチドの製造。
Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物(８６０mg、７.５mmol)、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物(６００mg、２.３mmol)、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物(１４１０mg、５.２mmol)およびＬ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物(３００mg、１.４mmol)を三首フラスコに入れる。蒸留した無水ジオキサン(５７mL)を添加する。ジエチルアミン(３.４μL)を添加する。得られた混合物を、２４時間、約２２−２５℃の温度で機械的に撹拌する。混合物を１００mL  脱イオン水にゆっくり注ぎ、真空下濾過する。固体を真空下１２時間置く。
【００７９】
実施例２
保護されたポリペプチドの製造。
Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物(４３０mg、３.７５mmol)、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物(３００mg、１.１５mmol)、Ｎ−ｔ−ブトキシカルボニルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物(７０５mg、２.６mmol)およびＬ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物(１５０mg、０.７mmol)を三首フラスコに入れる。蒸留した無水ジオキサン(２８.５mL)を添加する。ジエチルアミン(１.７μL)を添加する。得られた混合物を、２４時間、約２２−２５℃の温度で機械的に撹拌する。混合物を１００mL  脱イオン水にゆっくり注ぎ、真空下濾過する。固体を真空下１２時間置く。
【００８０】
実施例３
実施例１で製造した保護されたポリペプチドのＨＢｒ／酢酸での脱保護。
実施例１で製造した保護されたポリペプチド(２００mg)を、７mLの３３％臭化水素の酢酸溶液に懸濁する。出発物質はゆっくり溶解し、赤褐色溶液を形成する。混合物を、１７時間、約２２℃の温度で撹拌する。ＨＢｒ／酢酸の溶液を、ロータリーエバポレーターを使用して減圧下蒸発乾固する。この残渣に、１００mLの水を添加して固体を溶解させる。溶液を、サイズ６のチューブの形であり、１２−１４kDaの分子量カットオフを有するVisking一部透過性セルロース膜に置く。サイズ６チューブは、２７／３２インチ、２１.５mmの直径、および３２−３４mmの幅を有する。チューブはMedicell International Ltd.から入手可能である。溶液を含むチューブを、水のビーカー中で撹拌する。約２kDa未満の分子量を有するポリペプチドフラグメントを、透析チューブから浸透により除去する。チューブを水から除去し、０.３％酢酸水溶液を含むビーカー中で撹拌する。得られた生成物をチューブから除去し、凍結乾燥して、純粋白色固体として酢酸グラチラマーを得る。
【００８１】
実施例４
実施例１で製造した保護されたポリペプチドのＨＣｌ／酢酸での脱保護。
実施例１で製造した保護されたポリペプチド(２００mg)を、氷酢酸で２０mLに調整した９.４mL  濃塩酸から調製した２０mLの混合物に懸濁する。出発物質はゆっくり溶解し、わずかに濁った溶液を形成する。混合物を、１７時間、約２２℃の温度で撹拌する。ＨＣｌ／酢酸の溶液を、ロータリーエバポレーターを使用して減圧下蒸発乾固する。この残渣に、１００mLの水を添加して固体を溶解させる。溶液を、サイズ６のチューブの形であり、１２−１４kDaの分子量カットオフを有するVisking一部透過性セルロース膜に置く。サイズ６チューブは、２７／３２インチ、２１.５mmの直径、および３２−３４mmの幅を有する。チューブはMedicell International Ltd.から入手可能である。溶液を含むチューブを、水のビーカー中で撹拌する。約２kDa未満の分子量を有するポリペプチドフラグメントを、透析チューブから浸透により除去する。チューブを水から除去し、０.３％酢酸水溶液を含むビーカー中で撹拌する。得られた生成物をチューブから除去し、凍結乾燥して、純粋白色固体として酢酸グラチラマーを得る。
【００８２】
実施例５
実施例２で製造した保護されたポリペプチドのＨＣｌ／酢酸での脱保護。
実施例２で製造した保護されたポリペプチド(２００mg)を、氷酢酸で２０mLに調整した９.４mL  濃塩酸から調製した２０mLの混合物に懸濁する。出発物質はゆっくり溶解し、わずかに濁った溶液を形成する。混合物を、１７時間、約２２℃の温度で撹拌する。ＨＣｌ／酢酸の溶液を、ロータリーエバポレーターを使用して減圧下蒸発乾固する。この残渣に、１００mLの水を添加して固体を溶解させる。溶液をサイズ６のチューブの形であり、１２−１４kDaの分子量カットオフを有するVisking一部透過性セルロース膜に置く。サイズ６チューブは、２７／３２インチ、２１.５mmの直径、および３２−３４mmの幅を有する。チューブはMedicell International Ltd.から入手可能である。溶液を含むチューブを、水のビーカー中で撹拌する。約２kDa未満の分子量を有するポリペプチドフラグメントを、透析チューブから浸透により除去する。チューブを水から除去し、０.３％酢酸水溶液を含むビーカー中で撹拌する。得られた生成物をチューブから除去し、凍結乾燥して、純粋白色固体として酢酸グラチラマーを得る。
【００８３】
実施例６
ＵＶディテクターを使用したＧＰＣによる相対的分子量決定。
【表１】
2008518930.tif 000002
ＧＰＣの試験結果を表Ｉに要約する。
【００８４】
【表２】
2008518930.tif 000003
表Ｉの試験結果は、本発明の方法により製造した酢酸グラチラマー、サンプルＡおよびＢの重量平均分子量が各々８.５５１kDaおよび７.６８９kDaであり、そしてCOPAXONE(登録商標)の重量平均分子量は、ロット番号に依存して７.９２３kDaおよび９.５２４kDaであることを明らかに示す。
【００８５】
実施例７
屈折率ディテクターを使用したゲル浸透クロマトグラフィー(ＧＰＣ)による相対的分子量決定。
【表３】
2008518930.tif 000004
ＲＩディテクターでのＧＰＣの試験結果を表IIに要約する。
【００８６】
【表４】
2008518930.tif 000005
表IIの試験結果は、本発明の方法により製造した酢酸グラチラマー、サンプルＡおよびＢの重量平均分子量が各々９.５８１kDaおよび８.２２４kDaであり、COPAXONE(登録商標)の重量平均分子量は、ロット番号に依存して８.６６３kDaおよび９.６４１kDaであることを明らかに示す。
【００８７】
実施例８−１７は、酢酸グラチラマーの製造のための相間移動法に関する。
本発明者らは、グラチラマー形成におけるアルカリ化合物(水酸化ナトリウム)の影響を定量するために、１(低)から５(高)のスケールを確立している。試験結果を表IIIに要約する。
【００８８】
【表５】
2008518930.tif 000006
【００８９】
表IIIの結果は、０.１−１.０Ｎ  水酸化ナトリウム溶液を、本発明のポリペプチドまたはその薬学的に許容される塩生成物の製造に使用できることを明らかに示す。表IIIの結果はまた、少なくとも０.２５Ｎ濃度の水酸化ナトリウムが、有機相と水相の相分離を促進するために好ましいことも示す。
【００９０】
実施例８
重合工程(ａ)。
チロシンのＮ−カルボキシ無水物(３０mg、０.０１０mm)、アラニンのＮ−カルボキシ無水物(６２mg、０.０５４mm)、γ−ベンジルグルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物(４２mg、０.０１６mm)およびＥ−Ｎ−トリフルオロアセチルリシンのＮ−カルボキシ無水物(１００mg、０.０３７mm)を、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコに入れる。この混合物に、２０mLの乾燥テトラヒドロフランを添加する。透明溶液が得られる。ジエチルアミン(１０μL)を添加する。得られた混合物を４８時間撹拌する。テトラヒドロフランを蒸発により除去する。水(１５０mL)をを残渣に添加し、撹拌を続ける。白色固体が得られる。固体を濾過し、真空下、デシケーターで乾燥させる。
収量は１５４mgであると決定される。
【００９１】
実施例９
脱保護工程(ｂ)。
実施例８で製造した保護された酢酸グラチラマー、７５mgを、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコに移す。テトラヒドロフラン(１５mL)をフラスコに添加して、撹拌する。透明溶液が得られる。０.５Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液(８mL)を添加する。水酸化ナトリウム溶液添加の結果、その混合物は濁る。混合物を、１時間、２４−２６℃で撹拌する。２相の形成が観察される。底層を分離し、希１Ｎ  ＨＣｌ水溶液を使用して、撹拌しながらｐＨ＝６.０まで酸性化する。粗グラチラマー遊離塩基溶液を、ナイロンフィルター(０.２ミクロンNylon Acrodisk）を使用して濾過する。
【００９２】
実施例１０
実施例８で製造した保護された酢酸グラチラマー、７５mgを、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコに移す。テトラヒドロフラン(１５mL)をフラスコに添加して、撹拌する。透明溶液が得られる。０.２５Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液(１０mL)を添加する。水酸化ナトリウム溶液添加の結果、その混合物は濁る。混合物を１６時間、２５−２６℃で撹拌する。反応混合物を１５分遠心分離する。２相の形成が観察される。底層を分離し、希ＨＣｌ水溶液を使用して、撹拌しながらｐＨ＝７−７.５まで酸性化する。撹拌をさらに３０分続け、ｐＨはｐＨ＝８.０であると決定される。粗グラチラマー遊離塩基溶液を濾過する。
【００９３】
実施例１１
重合工程。
チロシンのＮ−カルボキシ無水物(３０mg、０.０１０mm)、アラニンのＮ−カルボキシ無水物(６２mg、０.０５４mm)、γ−ベンジルグルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物(４２mg、０.０１６mm)およびＥ−Ｎ−トリフルオロアセチルリシンのＮ−カルボキシ無水物(１００mg、０.０３７mm)を、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコに入れる。この混合物に、２０mLの乾燥ジオキサンを添加する。透明溶液が得られる。ジエチルアミン(１０μL)を添加する。得られた混合物を４８時間撹拌する。これに、水(１５０mL)を撹拌しながらゆっくり添加する。白色固体が得られる。固体を濾過し、真空下、デシケーターで乾燥させる。
収量は１７０mgであると決定される。
【００９４】
実施例１２
脱保護工程。
実施例１１で製造した保護された酢酸グラチラマー、７５mgを、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコに移す。ジオキサン(１５mL)をフラスコに添加して、撹拌する。透明溶液が得られる。０.５Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液(１０mL)を添加する。水酸化ナトリウム溶液添加の結果、その混合物は濁る。混合物を、１６時間、２５−２６℃で撹拌する。反応混合物を１５分遠心分離する。２相の形成が観察される。底層を分離し、希ＨＣｌ水溶液を使用して、撹拌しながらｐＨ＝７−７.５まで酸性化する。撹拌をさらに３０分続け、ｐＨはｐＨ＝８.０であると決定される。粗グラチラマー遊離塩基溶液を濾過する。
【００９５】
実施例１３
低温で行う脱保護工程。
実施例１２で製造した保護された酢酸グラチラマー、７５mgを、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコに移す。テトラヒドロフラン(１５mL)をフラスコに添加し、溶液の温度を０℃まで下げる。０.５Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液(１０mL)を温度を０℃に維持しながら、溶液に添加する。水酸化ナトリウム添加の結果、その混合物は濁る。溶液を、３時間、０℃で撹拌する。２相の形成が観察される。底層を分離し、０℃で希ＨＣｌ水溶液を使用して、撹拌しながらｐＨ＝７−７.５まで酸性化する。撹拌をさらに３０分続け、ｐＨは約ｐＨ＝８.０であると決定される。粗グラチラマー遊離塩基溶液を濾過する。
【００９６】
実施例１４
酢酸緩衝液での脱保護工程。
実施例１２で製造された保護された酢酸グラチラマー、７５mgを、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコに移す。テトラヒドロフラン(１５mL)をフラスコに添加し、溶液の温度を０℃まで下げる。０.５Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液(１０mL)、および酢酸(２mL)を温度を０℃におよびｐＨ＝１２に維持しながら、溶液に添加する。水酸化ナトリウムおよび酢酸添加の結果、その混合物は濁る。溶液を、３時間、０℃で撹拌する。２相の形成が観察される。底層を分離し、０℃で希ＨＣｌ水溶液を使用して、撹拌しながらｐＨ＝７−７.５まで酸性化する。撹拌をさらに３０分続け、ｐＨは約ｐＨ＝８.０であると決定される。粗グラチラマー遊離塩基溶液を濾過する。
【００９７】
実施例１５
実施例８で製造した保護された酢酸グラチラマー、７５mgを、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコに移す。ジオキサン(１５mL)をフラスコに添加して、撹拌する。透明溶液が得られる。０.２５Ｎ  水酸化ナトリウム水溶液(１０mL)を添加する。水酸化ナトリウム溶液添加の結果、その混合物は濁る。混合物を、１６時間、２５−２６℃で撹拌する。反応混合物を１５分遠心分離する。２相の形成が観察される。底層を分離し、希ＨＣｌ水溶液を使用して、撹拌しながらｐＨ＝７−７.５まで酸性化する。撹拌をさらに３０分続け、ｐＨはｐＨ＝８.０であると決定される。粗グラチラマー遊離塩基溶液を濾過する。
【００９８】
実施例１６
ダイアフィルトレーション(接線流濾過)。
実施例９で製造した粗グラチラマー遊離塩基溶液を、水で１２０に希釈する。希釈溶液を、最初にMilliporeから入手可能な１０Ｋダイアフィルトレーション膜、Pellicon XL、PLCCC 10(５０cm２)を通して濾過し、次いで、Milliporeから入手可能な１０Ｋダイアフィルトレーション膜、Pellicon XL、PLCCC 5(５０cm２)を通して濾過する。得られた濃縮溶液を凍結乾燥する。白色粉末が得られる。
【００９９】
実施例１７
酢酸グラチラマーの精製のクロマトグラフ法。
実施例９で製造した粗グラチラマー遊離塩基溶液を、クロマトグラフ分離に付す。ゲル濾過用カラム、FRACTOGEL TSK HW55(６００×２６mm)を、Superformance 26 Merckカートリッジ中に製造業者の指示に従い調製する。カラムを０.２Ｍ  アンモニウム酢酸緩衝液ｐＨ５.０で平衡化し、３０mLのグラチラマー遊離塩基溶液サンプル(２０mg／mL、０.２Ｍ  酢酸アンモニウムｐＨ５.０中)をカラムに載せ、フラクションを１０分毎に回収する。７−８KDaの平均分子量を有するフラクションを単離する。
【０１００】
実施例１８−２５は、アルカリもしくはアルカリ土類金属の水酸化物、炭酸塩、または炭酸水素塩を使用した酢酸グラチラマーの製造法に関する。
【０１０１】
実施例１８
保護されたポリペプチドの製造。
Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物(２０７.１９mg、１.０mM)、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物(６２０mg、５.４mM)、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物(４３０mg、１.６mM)およびＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物(１.０１ｇ、３.７３mM)を、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコ(１００mL)に入れる。この混合物に４０mLのテトラヒドロフランを添加する。ジエチルアミン(１０μL)を添加する。得られた混合物を、２４時間、約２５℃の温度で撹拌する。混合物を、撹拌しながら１００mL  水にゆっくり注ぐ。固体が沈殿する。固体を２時間撹拌後に濾過し、水で洗浄する。固体を１００mL  水に再懸濁し、濾過する。固体を、真空下約１２時間静置する。
【０１０２】
実施例１９
保護されたポリペプチドの製造。
Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物(２０７.１９mg、１.０mM)、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物(６２０mg、５.４mM)、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物(４３０mg、１.６mM)およびＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物(１.０１ｇ、３.７３mM)を、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコ(１００mL)に入れる。この混合物に４０mLのジオキサンを添加する。ジエチルアミン(１０μL)を添加する。得られた混合物を４８時間約２５℃の温度で撹拌する。混合物を、撹拌しながら１００mL  水にゆっくり注ぐ。固体が沈殿する。固体を濾過し、水で洗浄する。固体を１００mL  水に再懸濁し、濾過する。固体を、真空下約１２時間静置する。
【０１０３】
実施例２０
実施例２で製造したポリペプチドからのγ−ベンジル部分の開裂。
実施例１９で製造した保護されたポリペプチド、１００mgをテトラヒドロフラン(２０mL)に懸濁し、氷水浴で冷却する。濃硫酸、４mLを添加する。得られた透明溶液を、２０時間、約２５℃の温度で撹拌する。溶媒、テトラヒドロフランを２５℃で蒸発により除去し、粘性液体を形成させる。水、５０mLを撹拌しながら粘性液体に添加する。白色沈殿が形成され、それを真空下濾過し、五酸化リンで、真空化、２５℃で約１２時間暗所で乾燥させる。白色固体が得られる。固体を濾過し、真空下、デシケーターで乾燥させる。収量は７５mgであると決定される。
【０１０４】
実施例２１
実施例２０で製造したポリペプチドからのＮε−トリフルオロアセチル部分の開裂。
実施例２０で製造した保護されたポリペプチド、７５mgを１２mLのテトラヒドロフランに分配し、４mLの０.５Ｍ  水性水酸化ナトリウムを撹拌しながら添加する。混合物を３時間、環境温度(約２２℃)で撹拌する。低水層を分離し、酢酸でｐＨ＝６.０に酸性化する。
【０１０５】
実施例２２
実施例１９で製造したポリペプチドからのγ−ベンジル部分の開裂。
実施例１９で製造した保護されたポリペプチド、１ｇを、氷酢酸で１００mLに調整した４７mL  濃ＨＣｌから調製した５０mLの混合物に懸濁させる。出発物質はゆっくり溶解し、わずかに濁った溶液を形成する。混合物を、１８時間、約２２℃の温度で撹拌する。溶液を、１,０００mLの撹拌している水に注ぐ。白色沈殿が形成される。懸濁液をさらに３時間撹拌し、次いで濾過する。生成物を水で洗浄し、真空下、５０℃で約１７時間乾燥させる。
【０１０６】
実施例２３
実施例２２で製造したポリペプチドからのＮε−トリフルオロアセチル部分の開裂。
実施例２２で製造した保護されたポリペプチド、３００mgを、４５mLのテトラヒドロフランに分散させ、２５mLの０.５Ｍ  水性水酸化ナトリウムを撹拌しながら添加する。混合物を３時間、環境温度(約２２℃)で撹拌する。透明、２相液体系が形成される。低水層を分離し、酢酸でｐＨ＝６.０に酸性化する。透明、無色溶液を、透析袋に入れ、環境温度で一度０.３％水性酢酸に対して、次いで水に対して５.５のｐＨが達成されるまで透析する。この溶液を濾過し、凍結乾燥して、酢酸グラチラマーを白色固体として得る。
【０１０７】
実施例２４
ダイアフィルトレーション(接線流濾過)。
実施例２１で製造した酢酸グラチラマー溶液を、水で１２０mLに調整し、酢酸グラチラマーの濃度を０.５−０.６mg／mLとする。希釈溶液を、最初にMilliporeから入手可能な３０Ｋダイアフィルトレーション膜、Pellicon XL、PLCCC 10(５０cm２)を通して濾過し、次いで、Milliporeから入手可能な３Ｋダイアフィルトレーション膜、Pellicon XL、PLCCC 5(５０cm２)を通して濾過する。得られた濃縮溶液を、凍結乾燥して固体形態の酢酸グラチラマーを得る。
【０１０８】
実施例２５
酢酸グラチラマーの精製のクロマトグラフ法。
実施例２３で製造した、ｐＨ＝６の抽出物としてのグラチラマーを、真空で濃縮乾固し、クロマトグラフ分離に付す。ゲル濾過用カラム、FRACTOGEL TSK HW55(６００×２６mm)を、Superformance 26 Merckカートリッジ中に製造業者の指示に従い調製する。カラムを０.２Ｍ  アンモニウム酢酸緩衝液ｐＨ５.０で平衡化し、３０mLのグラチラマー遊離塩基溶液サンプル(２０mg／mL、０.２Ｍ  酢酸アンモニウムｐＨ５.０中)をカラムに載せ、フラクションを回収する。７−１０kDaの平均分子量を有するフラクションを単離する。
【０１０９】
実施例２６−３３は、アミンまたはアンモニアを使用した酢酸グラチラマーの製造法に関する。
【０１１０】
実施例２６
保護されたポリペプチドの製造。
Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物(２０７.１９mg、１.０mM)、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物(６２０mg、５.４mM)、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物(４３０mg、１.６mM)およびＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物(１.０１ｇ、３.７３mM)を、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコ(１００mL)に入れる。この混合物に４０mLのテトラヒドロフランを添加する。ジエチルアミン(１０μL)を添加する。得られた混合物を２４時間、約２５℃の温度で撹拌する。混合物を、撹拌しながら１００mL  水にゆっくり注ぐ。固体が沈殿する。固体を２時間撹拌後に濾過し、水で洗浄する。固体を１００mL  水に再懸濁し、濾過する。固体を、真空下約１２時間静置する。
【０１１１】
実施例２７
保護されたポリペプチドの製造。
Ｌ−チロシンのＮ−カルボキシ無水物(２０７.１９mg、１.０mM)、Ｌ−アラニンのＮ−カルボキシ無水物(６２０mg、５.４mM)、γ−ベンジルＬ−グルタミン酸のＮ−カルボキシ無水物(４３０mg、１.６mM)およびＮε−トリフルオロアセチルＬ−リシンのＮ−カルボキシ無水物(１.０１ｇ、３.７３mM)を、マグネティックスターラーを備えた一首フラスコ(１００mL)に入れる。この混合物に４０mLのジオキサンを添加する。ジエチルアミン(１０μL)を添加する。得られた混合物を４８時間約２５℃の温度で撹拌する。混合物を、撹拌しながら１００mL  水にゆっくり注ぐ。固体が沈殿する。固体を濾過し、水で洗浄する。固体を１００mL  水に再懸濁し、濾過する。固体を、真空下約１２時間静置する。
【０１１２】
実施例２８
実施例２７で製造したポリペプチドからのγ−ベンジル部分の開裂。
実施例２７で製造した保護されたポリペプチド、１００mgを、テトラヒドロフラン(２０mL)に懸濁し、氷水浴で冷却する。濃硫酸、４mLを添加する。得られた透明溶液を、２０時間、約２５℃の温度で撹拌する。溶媒、テトラヒドロフランを２５℃で蒸発により除去し、粘性液体を形成させる。水、５０mLを撹拌しながら粘性液体に添加する。白色沈殿が形成され、それを真空下濾過し、五酸化リンで、真空化、２５℃で約１２時間暗所で乾燥させる。白色固体が得られる。固体を濾過し、真空下、デシケーターで乾燥させる。収量は７５mgであると決定される。
【０１１３】
実施例２９
実施例２７で製造したポリペプチドからのγ−ベンジル部分の除去。
実施例２７で製造した保護されたポリペプチド、１ｇを、氷酢酸で１００mLに調整した４７mL  濃ＨＣｌから調製した５０mLの混合物に懸濁させる。出発物質はゆっくり溶解し、わずかに濁った溶液を形成する。混合物を、１８時間、約２２℃の温度で撹拌する。溶液を、１,０００mLの撹拌している水に注ぐ。白色沈殿が形成される。懸濁液をさらに３時間撹拌し、次いで濾過する。生成物を水で洗浄し、真空下、５０℃で約１７時間乾燥させる。
【０１１４】
実施例３０
実施例２８で製造したポリペプチドからのＮε−トリフルオロアセチル部分の開裂に使用すべきアミンの評価。
実施例２８で製造したポリペプチド、７５mgを１５mLの水に懸濁させる。アミン、７mLを懸濁液に添加して、アミン濃度を３Ｍとする。アミンのリストを表IVに提供する。脱保護されたポリペプチドが水に可溶性であるため、この反応を、溶液の透明度によりモニターする。各アミンの結果を、表IVに要約する。
【０１１５】
【表６】
2008518930.tif 000007
【０１１６】
表IVの結果は、実施例２８で製造したポリペプチドの遊離塩基形態が、ジイソプロピルアミンまたはイソプロピルアミンの添加でのみ形成されることを明らかに示す。表IVの結果はまたジプロピルアミン、モルホリン、Ｎ−メチル−ピペラジン、ジシクロヘキシルアミン、ジ−ｓｅｃ−ブチルアミン、ピロリジン、およびメチルアミンが、ポリペプチドの遊離塩基形態の産生に失敗したことを示す。
【０１１７】
故に、出願人は、本発明の方法の第二の脱保護工程、工程(ｂ)において、ジイソプロピルアミンおよびイソプロピルアミンだけが、リシン部分のＮε−トリフルオロアセチル基を十分に除去できたアミンであることを、予期外に決定した。
【０１１８】
実施例３１
実施例２８で製造したポリペプチドからのＮε−トリフルオロアセチル部分の開裂。
実施例２８で製造したポリペプチド、７５mgを、１５mLの水に懸濁する。ジイソプロピルアミン、７mLを懸濁液に添加して、アミン濃度を３Ｍとする。乳白色−白色溶液が約１時間で透明になり、透明溶液を２５℃で２０時間撹拌する。反応混合物を約２５℃で蒸発させ、粘性液体の形態の粗グラチラマー遊離塩基を形成させる。五十パーセント(５０％)酢酸(１５mL)を混合物に添加し、３０分撹拌して、酢酸グラチラマー溶液を形成させる。
【０１１９】
実施例３２
ダイアフィルトレーション(接線流濾過)。
実施例３１で製造した酢酸グラチラマー溶液を、水で１２０mLに希釈する。希釈溶液を、最初にMilliporeから入手可能な３０Ｋダイアフィルトレーション膜、Pellicon XL、PLCCC 10(５０cm２)を通して濾過し、次いで、Milliporeから入手可能な３Ｋダイアフィルトレーション膜、Pellicon XL、PLCCC 5(５０cm２)を通して濾過する。得られた濃縮溶液を、凍結乾燥して固体形態の酢酸グラチラマーを得る。
【０１２０】
実施例３３
酢酸グラチラマーの精製のクロマトグラフ法。
実施例３１で製造した酢酸グラチラマー溶液を、真空で濃縮乾固し、クロマトグラフ分離に付す。ゲル濾過用カラム、FRACTOGEL TSK HW55(６００×２６mm)を、Superformance 26 Merckカートリッジ中に製造業者の指示に従い調製する。カラムを０.２Ｍ  アンモニウム酢酸緩衝液ｐＨ５.０で平衡化し、３０mLのグラチラマー遊離塩基溶液サンプル(２０mg／mL、０.２Ｍ  酢酸アンモニウムｐＨ５.０中)をカラムに載せ、フラクションを回収する。７−１０kDaの平均分子量を有するフラクションを単離する。
【０１２１】
本発明は、ある態様を特に参照して記載しているが、変化および修飾が、添付の特許請求の範囲の範囲および精神の範囲内で当業者により為し得ることは、理解されるべきである。
【国際調査報告】
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2008518930.tif 000009