(57)【要約】【課題】デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、ジストロフィン遺伝子の重篤な欠陥により引き起こされる進行性筋疾患であり、３０歳までに患者が死亡する結果となる。【解決手段】本発明は、ＤＭＤに対して適切なヒトモデルとして二重変異体マウス（ＤＭ）を利用する。これらのマウスは、ジストロフィン及びユートロフィン（mdxl+，utrn -/-）の両方を欠損し、３ヵ月で死亡し、重い筋肉衰弱、顕著な成長遅延、脊柱後彎、減量、緩い姿勢（slack posture）及び不動性状態を患うからである。新規なヒト網膜ジストロフィンＤｐ２６０のトランスジーンからの発現は、早死を防ぎ、重篤な筋ジストロフィーを緩い臨床的筋疾患に弱めることを明らかにした。筋電図、組織学、ラジオグラフィー、磁気共鳴イメージング、及び行動研究は、ＤＭトランスジェニックマウスが、正常に成育し、正常な背骨の彎曲及び運動性を持ち、筋疾患を弱めたと結論した。トランスジェニックＤＭマウスによるＥＭＧ及び組織学的なデータは、異常性を緩やかな筋疾患に典型的なレベルまで弱めることを明らかにしたが、一方、ＤＭマウスは、ヒトジストロフィン異常症に共通して見られる著しい異常性が見られた。また、トランスジェニックＤＭマウスは、何も処理をしていないｍｄｘマウス及びコントロールと同等の測定可能な運動レベルも有した。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジストロフィンタンパク質をコードする核酸配列よりなる形質転換ベクターであって、
前記核酸配列は、形質転換に先立って、前記ベクターに含まれない形質転換ベクター。
【請求項２】
前記形質転換ベクターがさらに、プロモーター、エンハンサ、及びポリＡシグナル部位からなる群から選択される少なくとも１つの制御エレメントを含む請求項１に記載の形質転換ベクター。
【請求項３】
前記核酸配列が、前記ジストロフィンタンパク質を発現できるトランスジーンである請求項１に記載の形質転換ベクター。
【請求項４】
前記核酸配列が配列番号１０と少なくとも８０％配列同一性をもつ請求項１に記載の形質転換ベクター。
【請求項５】
前記形質転換ベクターがプラスミド及びウィルスベクターからなる群から選択される請求項１に記載の形質転換ベクター。
【請求項６】
前記ジストロフィンタンパク質が網膜ジストロフィンタンパク質である請求項１に記載の形質転換ベクター。
【請求項７】
核酸配列が細胞のゲノムへ組み込まれ、それによって、細胞が形質転換され、細胞、核酸配列は、前記ジストロフィンタンパク質をコードする細胞。
【請求項８】
前記核酸配列が配列番号１０と少なくとも８０％配列同一性をもつ請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記核酸配列がさらに、プロモーター、エンハンサ、及びポリＡ部位からなる群から選択される少なくとも１つの制御エレメントを含む請求項７に記載の細胞。
【請求項１０】
前記細胞が、筋原細胞、骨髄細胞、及びＳＰ骨髄細胞からなる群から選択される請求項７に記載の細胞。
【請求項１１】
前記ジストロフィンタンパク質が、網膜ジストロフィンタンパク質である請求項７に記載の細胞。
【請求項１２】
そのゲノムへ安定に導入される外来核酸配列をもち、
前記核酸配列は、ジストロフィンをコードする、トランスジェニック動物。
【請求項１３】
前記動物が、マウス、ヒト、イヌ、及びウマからなる群から選択される請求項１２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１４】
前記核酸配列が配列番号１０と少なくとも８０％配列同一性をもつ請求項１２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１５】
前記核酸配列がさらに、プロモーター、エンハンサ、及びポリＡ部位からなる群から選択される少なくとも１つの制御エレメントを含む請求項１２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１６】
前記ジストロフィンタンパク質が網膜ジストロフィンタンパク質である請求項１２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項１７】
請求項１に記載のベクターをそのなかにもつ形質転換細胞。
【請求項１８】
動物のデュシェンヌ型筋ジストロフィーの臨床的症状を少なくとも１つ軽減する方法であり、前記方法は下記ステップよりなる：
ゲノムインサートを前記動物のゲノムへ導入し、前記インサートは、ジストロフィンタンパク質をコードする。
【請求項１９】
前記インサートが配列番号１０と少なくとも８０％配列同一性を持つ核酸配列である請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記インサートがさらに、プロモーター、エンハンサ、及びポリＡシグナル部位からなる群から選択される少なくとも１つの制御エレメントを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記ジストロフィンタンパク質が網膜ジストロフィンである請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
前記導入ステップが、
安定にベクターを前記ゲノムにトランスフェクションし、
前記ベクターが前記ゲノムインサートを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記ベクターがプラスミド及びウィルスベクターからなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記臨床症状が、複合反復放電、脊柱後彎、ネクローシス、緩い姿勢（slack posture）、顕著な成長遅延、及び重い筋肉衰弱からなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
前記動物が、ヒト、マウス、ウマ、及びイヌからなる群から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
動物のデュシェンヌ型筋ジストロフィーの臨床症状を少なくとも１つ軽減する方法であり、前記方法は下記ステップよりなる：
細胞を前記動物へ投与し、
前記細胞がジストロフィンをコードしたゲノムインサートがトランスフェクトされたものである。
【請求項２７】
前記方法はさらに、前記投与ステップに先立って、前記動物から細胞を受け取り、前記細胞へ前記遺伝子インサートをトランスフェンクトするステップを含む請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記トランスフェクトステップが、ベクターを通して起こるまたは裸ＤＮＡのエレクトロポレーションを通して起こる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ジストロフィンが網膜ジストロフィンである請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記ゲノムインサートが配列番号１０と少なくとも８０％配列同一性がある請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞が、筋原細胞、骨髄細胞及びＳＰ骨髄細胞からなる群から選択される請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
ジストロフィンタンパク質を発現する核酸配列を含むトランスジーン。
【請求項３３】
前記ジストロフィンが網膜ジストロフィンである請求項３２に記載のトランスジーン。
【請求項３４】
前記核酸配列が配列番号１０と少なくとも８０％配列同一性をもつ請求項３２に記載のトランスジーン。
【請求項３５】
前記核酸配列がＡＴＣＣクローン５７６７０，５７６７２，５７６７４，及び５７６７６に由来する請求項３２に記載のトランスジーン。
【請求項３６】
前記核酸配列が前記ジストロフィンの選択的スプライシングの結果生じるアイソホームに由来する請求項３２に記載のトランスジーン。
【請求項３７】
さらに、プロモーター、エンハンサ、及びポリＡシグナル部位からなる群から選択される少なくとも１つの制御エレメントを含む請求項３２に記載のトランスジーン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連した出願
本願は、次の出願の優先権主張をする。シリアルナンバー：６０／５８８，７００；出願：２００４年６月１６日；シリアルナンバー６０／６０８，２５２；出願：２００４年９月９日；及びシリアルナンバー６０／６１３，０２６；出願：２００４年９月２４日，これらの教示及び内容は、参照により、ここに含まれる。
【０００２】
本発明は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）に関する。より詳細には、本発明は、ＤＭＤのための新しいモデル並びに、ＤＭＤのための治療に関する。さらにより詳細には、本発明は、新しいトランスジーン、前記トランスジーンを組込むベクター、及びジストロフィンの発現が起こるように、前記トランスジーンを動物ＤＮＡへの組込む方法に関する。さらにより詳細には、本発明は、生体内において、前記新しいトランスジーンを使用するＤＭＤの治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
先行技術の開示
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）は、よくある男児の神経筋疾患である。
これは、進行性の筋変性を特徴とする劣性Ｘ連鎖型疾患であり、２０代において重い障害及び２０代半ば早期に心不全または呼吸不全を引き起こす。
現在、延命または前記疾患の臨床経過を大きく変えるような治療方法はない。標準的な治療は、主に、患者の一般的な健康や彼らの生活の質を改善することに集中する。
グルココルチコイド（例えば、プレドニゾロン）は、複数の研究において、筋力低下を緩和するための結果が認められたが、それらの効果はかなり短く（１８−３６ヶ月）、前記疾患の臨床経過を変えない。
【０００４】
ジストロフィン遺伝子の突然変異は、ＤＭＤの原因となるジストロフィン発現の欠失をもたらす。ジストロフィンの４２７ｋＤａアイソホームは、内在性膜タンパク質をアクチン細胞骨格に連結し、筋肉活性中、筋細胞膜を安定にすると考えられる。ジストロフィンがなければ、膜は、カルシウムイオンの流入を可能にする機能的な安定性を失い、最後には、筋繊維のネクローシスを引き起こす。
【０００５】
ジストロフィンは、Ｎ末端アクチン結合ドメイン、２４スペクトリン類似リピートからなるロッドドメイン、システィンに富むドメイン及びＣ末端ドメインからなるマルチドメインタンパク質である。
２つの後者のドメインは、ＤＡＰ（ジストロフィン関連タンパク質）複合体のタンパク質とシントロフィンに結合している。
ジストロフィン遺伝子の７９のエクソンの選択的スプライシングは、７１ｋＤａから全長４２７ｋＤａの範囲である、いくつかのジストロフィン アイソホームを生産する。
少なくとも７つの独立したプロモーターが、細胞特異的な方法で発現される７つの異なるジストロフィン アイソホームの転写を制御する。
【０００６】
ｍｄｘマウスは、ヒトＤＭＤの遺伝子モデルとして利用されている。ｍｄｘマウスは、生後はじめの６週間、筋ジストロフィーの兆候が見られるが、ヒトＤＭＤとは異なって、それらのその後の病気の経過は、緩やかである。
成熟ｍｄｘマウスの肢筋は、重い衰弱またはヒトＤＭＤに見られる重い進行性の変性が見られない。
ｍｄｘマウスの横隔膜には、ヒトＤＭＤ筋に相当する変性や繊維化が見られるが、マウスは、呼吸器障害を患うこともなく、それらは通常の寿命を持つ。
【０００７】
ユートロフィン（ｕｔｒｎ）は、ジストロフィン関連タンパク質と相互作用し、ｍｄｘマウスの筋ジストロフィンの欠損を代償するジストロフィンの常染色体のホモローグである。
ユートロフィンの最大のアップレギュレーションで筋肉は、最小の病理上の変化を示す。
しかしながら、この補充となる代替は、ヒトでは起こらず、これが、ｍｄｘマウスとヒトＤＭＤ間における表現型の違いとおそらく説明されるだろう。
【０００８】
従って、当技術に必要とされるのは、ヒトＤＭＤで示されるのと同じ表現型の特徴及び臨床所見を有するヒトＤＭＤ遺伝子モデルである。
さらに、当技術で必要とされるものとしては、ジストロフィンまたはそれらのホモローグを発現する遺伝子である。
また、さらに、当技術で必要とされるものとしては、ジストロフィンを発現する遺伝子、またはそれらのホモローグを含むベクターであり、そのベクターはジストロフィン遺伝子、またはそれらのホモローグのような動物ゲノムをトランスフェクトでき、それは発現され、それによって、筋ジストロフィンの欠損を補充する。
さらに必要とされるのは、ジストロフィンまたはそれらのホモローグを発現するＤＮＡをトランスフェクトされた細胞を利用するＤＭＤの治療方法である。
また、さらに必要とされるのは、ジストロフィンまたはそれらのホモローグを発現する遺伝子によって発現された単離タンパク質を利用してＤＭＤを治療する方法がある。
最終的に、必要とされるのは、冒された動物のゲノムへトランスフェクトされ、ジストロフィン、またはそれらのホモローグを発現し、筋ジストロフィンの欠損を補充する、ベクターを利用してＤＭＤを治療する方法である。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、先行技術固有の諸問題を解決し、当技術において、明確な進歩を提供する。大まかに言うと、本発明のひとつの態様としては、ヒト網膜ジストロフィンのアイソホーム，Ｄｐ２６０と称される，及び適切な制御エレメントを含む単離されたトランスジーンを含む。
本発明のもうひとつの態様として、このＤｐ２６０トランスジーンを動物のゲノムへ挿入するためのベクターに組込みまたは挿入し、それによって網膜ジストロフィンタンパク質を発現させる方法が提供される。
好ましくは、動物は、哺乳類からなる群から選択され、より好ましくは、ヒト、マウス、イヌ及びウマからなる群から選択され、特に好ましくは、動物は、ヒトである。
本発明に関する態様としては、Ｄｐ２６０トランスジーンを含む動物が供給される。本発明のもうひとつの態様としては、Ｄｐ２６０トランスジーンは、動物の筋ジストロフィーのための遺伝子治療に使用するために、骨髄細胞及び筋原細胞を形質転換するために使用することができる。
好ましい動物は、哺乳類である。より好ましくは、動物は、マウス、イヌ、ウマ、及びヒトからなる群から選択される。
本発明のもうひとつの態様としては、Ｄｐ２６０トランスジーンは、他の適切なベクター中で使用されたり、または、他の適切なトランスフェクション方法で，例えば、リポフェクションのような，筋ジストロフィーのための遺伝子治療の他の方法，に使用される。
本発明のもうひとつの態様としては、Ｄｐ２６０により発現されるタンパク質は、それを必要とする動物へ投与される。
【００１０】
本発明のひとつの実施形態は、ヒトＤｐ２６０のＤＮＡ配列から構築される。ヒトＤｐ２６０は、ジストロフィンのアイソホームであり、ジストロフィン遺伝子の独特なはじめのエクソンＲ１からエクソン３０の選択的スプライシングにより生産される。
ヒト網膜ジストロフィンは、ジストロフィンに見られるシスティンに富むドメイン、Ｃ末端ドメイン、及び多くのロッド類似ドメインを含むが、ジストロフィンのＮ末端アクチン結合ドメインを欠いている。
加えて、第二アクチン結合ドメインは、ヒトＤｐ２６０のスペクトリンリピートに位置している。ヒトＤｐ２６０は、通常、網膜で発現され、アクチンと他のジストロフィン関連タンパク質とともに局在している。それはまた、多くのジストロフィン機能を共有している。
本実施形態において、トランスジーンは、ヒト網膜ジストロフィン及び適切な制御エレメントから構築される。
適切なヒトＤｐ２６０配列は、ＡＴＣＣクローン５７６７０、５７６７２、５７６７４、及び５７６７６から由来されるものでもよく、当業者であればよく知られている技術を使用して、直接的にプラスミド中へクローンすることができる。
本発明の目的において、トランスジーンに使用される好ましいＤＮＡ配列は、ヒトＤｐ２６０と同じ機能を持つべきであり、より好ましくは、トランスジーンのＤｐ２６０部分のＤＮＡ配列が少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、さらにより好ましくは、少なくとも９５％、さらにより好ましくは、少なくとも９７％、及び特に好ましくは、９９−１００％、ヒトＤｐ２６０と同一配列を持つ。
本発明のトランスジーン配列は、また、ジストロフィンの選択的スプライシングの結果からなるアイソホームでもあってもよい。
本発明の目的のために利用されるジストロフィンのそのような選択的スプライシングされた形態（spliced form）のひとつは、ジストロフィンエクソン７１を含む。
好ましい形態は、最終的に得られたトランスジーンもまた、トランスジーンの発現を容易にするために、Ｄｐ２６０配列の上流にプロモーター及びエンハンサ配列を含む。
好ましい制御エレメントは、マウス筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター及びエンハンサ，及び制御エレメントとしてマウスＭＣＫエクソン１及び２を含む。
トランスジーンの発現は、トランスジーンを細胞系統へ安定にトランスフェクションし、その後、そのタンパク質産物の配列分析によりテストされる。
スプライシングのエラーは、正しいスプライス部位のエクソン受容体の刻み目（score）を改良するために、公知部位定方向突然変異誘発によって、修復される。
その他の好ましい形態としては、トランスジーンは、その結果である転写の適切な安定性を確実にするために追加的な制御部位を含む。
そのような制御部位のひとつは、適切なポリアデニル化を確実にするために、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナル配列を構造体の３’末端に付加する。
【００１１】
もう一つの実施形態としては、本発明は、先述したような、Ｄｐ２６０トランスジーン及びそれに関係する制御エレメントを、他の細胞をトランスフェクトするのに適切であるベクター中に含む。
そのようなベクターとして、好ましくは、ジストロフィンの機能と同様の機能を持つタンパク質を発現するＤＮＡ配列を含む。
好ましくは、そのようなベクターに使われるＤＮＡ配列としては、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、特により好ましくは、少なくとも９７％、最も好ましくは、９９〜１００％、ヒトＤｐ２６０と同一性がある。
より好ましい形態としては、前記ベクターもまた、ヒトジストロフィンエクソン７１を含むヒトＤｐ２６０の形態を含む。
より好ましい形態としては、前記ベクターもまた、先述したような、プロモーター、エンハンサ、及びポリＡシグナル部位のような制御エレメントを含む。
本ベクターは、種々の市販のプラスミド、アデノウィルス、またはレンチウィルスであってもよい。
【００１２】
もう一つの実施態様としては、本発明は、Ｄｐ２６０トランスジーンをトランスフェクトされた動物を含む。
好ましい形態としては、トランスフェクションのために使用されるＤｐ２６０は、ジストロフィンと同様の機能を持つタンパク質を発現し、好ましくは、Ｄｐ２６０はヒトＤｐ２６０である。
そのような動物のゲノムは、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、特により好ましくは少なくとも９７％、最も好ましくは９９〜１００％、ヒトＤｐ２６０と配列相同性があるＤＮＡ配列のコピーを少なくとも１つ含むことが望ましい。
ある形態としては、動物は、それらのゲノムに配置される、ジストロフィンエクソン７１を含むＤｐ２６０の配列のコピーを少なくとも１つ含む。
好ましくは、動物は、哺乳類、及びより好ましくは、動物は、ヒト、マウス、ウマ、及びイヌからなる群から選択される。
【００１３】
本発明のもう一つの好ましい実施形態としては、Ｄｐ２６０トランスジーンは、制限消化により、そのプラスミドからトランスジーンを放出し、それを直接的に卵母細胞へ挿入するマイクロインジェクション工程により、動物ゲノムへ挿入される。
トランスジーンをそれらのゲノムへ組み込まれた動物は、シークエンシング及びＰＣＲ反応を含む適当な公知の方法によって識別される。
好ましくは、これらの動物は、それらの筋細胞でＤｐ２６０を発現し、その特性は、ＰＣＲ及びウェスタンブロッティングのような公知の技術を使用してテストされることができる。
そのような実施形態で恩恵を受ける動物としては、ヒト、マウス、イヌ、及びウマが含まれる。
この実施態様のある例としては、好ましいヒトＤｐ２６０トランスジーンは、Ｄｐ２６０トランスジーンをＤＭマウス卵母細胞へ挿入することにより二重変異体（ＤＭ）マウスのゲノムへ挿入され、続いて、ｍｄｘとユートロフィンノックアウトマウスとの一連の交雑を行った。
当然、マウスもまた、裸ＤＮＡのエレクトロポレーションだけでなく、アデノウィルスまたはレンチウィルスのような他のベクターの使用を含む、いずれかの公知の方法によりトランスフェクトされうる。
トランスフェクトされていないＤＭマウスは、ヒトの筋ジストロフィーに似た身体的症状が現れ、ジストロフィンだけでなく、そのマウスの類似体、ユートロフィンも生産されなかった。
その上、ＤＭマウスは、短い生存率をもち、それらの筋肉の高いレベルのネクローシスをもつ致命的な表現型が見られ、それらの年齢に応じて、複合反復放電（ＣＲＤｓ）発生率の増加、筋ジストロフィーの特徴を示した。
対照的に、Ｄｐ２６０トランスジーンを発現するＤＭマウス（ＤＭ／Ｔｇ＋）は、緩やかなミオパシーのみの症状が表れ、通常の生存率をもつ。
その上、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスは、ＤＭマウスに見られる致命的な背骨の彎曲（脊柱後彎）または肢筋の衰弱が見られなかった。
それらはまた、それらの年齢に応じて、ネクローシスのレベルがより低く、またＣＲＤの発生もより低くあらわれる。
ＤＭマウス及びＤＭＤを患うヒト固体間の類似性によると、ＤＭマウスは、その疾患の理想的なモデルのようである。
【００１４】
本発明のさらにもう一つの実施形態としては、Ｄｐ２６０トランスジーンは、マウス、イヌ、ウマ及びヒトから取り出された細胞へ安定にトランスフェクトするのに使用される。
これは、選択的マーカー（例えば、ネオマイシン抵抗性）を含むレンチウィルスベクターの使用により実行される。
好ましくは、トランスフェクトされる細胞は、筋原細胞がよい。そのような細胞は、筋細胞へ分化するからである。
より好ましくは、トランスフェクトされる細胞は、骨髄細胞がよく、さらに好ましくは、トランスフェクトされる細胞は、ＳＰ骨髄細胞(side population bone marrow cell)さらに好ましくは、トランスフェクトされる細胞は、Ｌｉｎ−，Ｓｃａ＋及びＫｉｔ＋細胞表面マーカーをもつＳＰ細胞(side population cell)である。
これらのトランスフェクト細胞は、螢光励起細胞分離捕集装置（ＦＡＣＳ）のようなよく知られている方法により確認可能である。
それらは、さらに、ヘキスト染色を除去するそれらの能力によって定義される。
さらに、これらのトランスフェクト細胞は、筋細胞への分化が増加する可能性をみせる。
これらの細胞を形質転換するための方法は、プラスミド、アデノウィルス、レンチウィルスのようなベクターの使用、及び好ましくは、裸ＤＮＡのエレクトロポレーションの使用が含まれる。
Ｄｐ２６０の安定な発現は、ＰＣＲ及びウェスタンブロッティング試験の利用により検出される。
【００１５】
本発明のまたさらにもう一つの実施態様としては、遺伝子治療の利用により、動物にＤｐ２６０を与える方法を供給する。
好ましくは、動物は、哺乳類であり、またさらに好ましくは、ヒト、マウス、イヌ及びウマからなる群から選択される。
そのような治療の終着点は、筋ジストロフィー症状の緩和である。
本実施形態のある好ましい形態としては、細胞は、患者から取り出され、またトランスジーンを安定にトランスフェクトされる。前記トランスジーンは、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは、少なくとも８５％、さらにより好ましくは、少なくとも９０％、よりさらに好ましくは、少なくとも９５％、特により好ましくは、少なくとも９７％、最も好ましくは９９〜１００％、ヒトＤｐ２６０配列同一性のあるＤＮＡ配列を含む。
この方法のさらに好ましい形態としては、そのような細胞は、ヒトジストロフィンエクソン７１を含むＤｐ２６０の形態を含むＤＮＡ配列がトランスフェクトされる。
本発明の好ましいトランスジーンは、また、Ｄｐ２６０の安定な発現のために適切な制御エレメントを含んでもよい。
好ましくは、トランスフェクトされる細胞は、筋原細胞または骨髄細胞である。
さらにより好ましくは、これらの細胞は、先述したような、ＳＰ骨髄細胞であり、先述したような細胞表面マーカーを伴い、そのような細胞は、特に筋細胞へ分化する可能性のある細胞である。
より好ましくは、これらの細胞は、患者受取治療（patient receiving therapy）から取得され、体外でＤｐ２６０トランスジーンがトランスフェクトされ、自家移植で同じ患者へ返還される。
そのような自家移植は、トランスフェクトされる細胞が患者自身のものであるため、免疫応答が発生する可能性を減らし、さらに、免疫抑制剤の必要性をなくす。
トランスフェクトされる細胞の自家骨髄移植は、疾患の工程中の様々なポイントに間に合って使用されうる。
骨髄細胞は、より損傷した細胞により強くひきつけられる。従って、この工程を長い間、筋ジストロフィーを患っている年齢が高い患者に適切である。
また、この工程は、患者の生存中、何回か行うことができる。そのような自家骨髄移植の効果は、付加的であり、それによって、健康、機能的な筋肉の重量が増加するからである。
【００１６】
重要なことに、本発明は、免疫学的意義において有利である。
一般的に、遺伝子治療の何れの型でも障害となるのは、トランスジーン産物の免疫遺伝性である。
全長のジストロフィンは、トランスジーン（１）の発現を欠失した結果を来すことができる免疫遺伝応答を誘導することができる。
Ｄｐ２６０トランスジーンの特異的な性質は、ヒトジストロフィンの自動的に生じるアイソホームを発現する。
Ｄｐ２６０タンパク質は、網膜で主に発現し、その他組織で少量発現する。
従って、網膜ジストロフィンは、自動的なアイソホーム（natural isoform）である。
トランスジーンによるＤｐ２６０の挿入は、Ｄｐ２６０の発現に影響を及ぼさないエクソン３０の上流の欠失をもつ患者に特に免疫遺伝性の応答を誘導しない。
これは、全ジストロフィントランスジーン並びに大部分のスペクトリンドメインコード領域が取り去るまたは取り除かれたマイクロジストロフィントランスジーンよりも明らかに優位にある。
マイクロジストロフィンもまた、そのタンパク質が新生抗原（マイクロジストロフィンタンパク質は、ディシェンヌ型筋ジストロフィーによる患者とは無関係である配列を含む）と考えられるので、免疫性の応答を強力に誘導するであろう。
本発明のＤｐ２６０トランスジーンは、正常な遺伝子治療のためのこの重要な障害を克服する。
【００１７】
ここで使われているように、下記定義が適用される：当業者であればよく知られている“配列同一性”は、２またはより多いポリペプチド配列または２またはより多いポリヌクレオチド配列，すなわち参照配列と、参照配列と比較するために与えられた配列との間の関係を指す。
配列同一性は、そのような配列間の一致によって決定されるように、配列類似性の最高度を示すように、配列が最適に整列させられた後、与えられた配列と参照配列を比較することによって決定される。
そのような整列において、配列同一性は、位置対位置を基礎として確かめられ、例えば、配列は、特定の位置で、もしその位置で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であれば“同一”である。
このような位置同一性の合計数は、その後、参照配列の全ヌクレオチドまたはアミノ酸で配分され、％配列同一性として与えられる。
【００１８】
配列同一性は、公知の方法により、直ちに計算することができる。
上記公知の方法とは、コンピューテーショナル  モレキュラー  バイオロジー（Computational Molecular Biology），Lesk,A.N.,オックスフォード  ユニバーシティー  プレス（Oxford University Press）,ニューヨーク(１９８８),バイオコンピューティング：インフォマティクス  アンド  ゲノム  プロジェクト（Biocomputing：Informatics and Genome Projects）,Smith,D.W.編，アカデミック  プレス（Academic Press）,ニューヨーク（１９９３）；コンピューター  アナライシス  オブ  シーケンス  データ，パートI（Computer Analysis of Sequence Data,Part I）Griffin,A.M.,及びGriffin,H.G編，ヒューマーナ  プレス（Humana Press），ニュージャージー（１９９４）；シーケンス  アナライシス  イン  モレキュラー  バイオロジー（Sequence Analysis in Molecular Biology），von Heinge G.,アカデミック  プレス（Academic Press）（１９８７）；シーケンス  アナライシス  プライマー（Sequence Analysis Primer）,Gribskov,M.及びDevereux.J.編，M ストクックトン  プレス（M.Stockton Press）,ニューヨーク（１９９１）；及びCarillo,H.,及びLipman,D.,SIAM J．アプライド  マス（Applied Mass）.,４８：１０７３(１９８８)，に記載されている内容を含むが、これに限定されない。
【００１９】
配列同一性を決定するより好ましい方法は、テストされる配列間で大きな一致を与えるように設計することである。
配列同一性を決定する方法は、与えられた配列間で配列同一性を決定するために公共で利用されているコンピュータープログラムにまとめられている。
そのようなプログラムを含む例としては、ＧＣＧプログラムパッケージ（the GCG program package）(Devereux,J等.,ヌクレイック  エシドズ  リサーチ，１２（１）：３８７（１９８４）)，BLASTP,BLASTN及びFASTA（Altschul,S.F等，J.Molec.Biol.,２１５：４０３−４１０(１９９０)．BLASTXプログラムは、公共に利用されているNCBI及びその他のソース（BLASTマニュアル，Altschul,S等.,NCVINLM NIH Bethesda,MD20894,Altschul,S.F等., J.Molec.Bio.,２１５：４０３−４１０（１９９０），ここで参照された内容は、本願明細書にすべて含まれる））が含まれるが、これらに限定されない。
これらのプログラムは、与えられた配列及び参照配列間で高度の配列同一性を出すために、デフォルトギャップウェイト（default gap weight）を使って、最適に位置あわせをする。
説明すれば、参照配列に対して、少なくとも、例えば、９５％“配列同一性”を有するヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドとは、与えられたポリヌクレオチドのヌクレオチド配列は、参照ヌクレオチド配列の各１００ヌクレオチドに対して、５つまでの変異を含むであろう、与えられたポリヌクレオチド配列を除いた参照配列と同一であることを意味する。
別の言葉で言い換えれば、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも９５％同一性を持つヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド中には、参照配列中の合計ヌクレオチドの５％までのヌクレオチドが、欠失または他のヌクレオチドに置換され、または参照配列中の５％までのヌクレオチド数が参照配列中に組み込まれている。
参照配列のこれら変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端部位またはそれらの末端部位間の何れかでおこり、参照配列中に個別か、または参照配列内の一つまたはそれ以上の連続群としてヌクレオチド間に散在する。
同様に、参照アミノ酸配列に対して、少なくとも、例えば、９５％配列同一性をもつ与えられたアミノ酸配列をもつポリペプチドとは、ポリペプチドの与えられたアミノ酸配列は、参照アミノ酸配列の各１００アミノ酸に対して、５アミノ酸までの変異を含む、与えられたポリペプチド配列以外は、参照配列と同一であることを意味する。
言い換えれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性を有するポリペプチド配列を得るために、参照配列中の５％までのアミノ酸残基を欠失、または他アミノ酸に置換、または参照配列中のアミノ酸残基の合計の５％以上のアミノ酸数を参照配列へ組み込めばよい。
参照配列の改変は、参照アミノ酸配列のアミノ基末端部位またはカルボキシル基末端部位、またはこれら末端間のいずれかでおこり、参照配列中の残基間で、個別か、参照配列内の一つかまたはそれ以上の連続群に散在している。
好ましくは、同一でない残基部位は、保存アミノ酸置換によって異なっている。
しかしながら、保存置換は、配列同一性を決定する時、一致するものとして含まれない。
個別のタンパク質をコードするＤＮＡは、コードの縮重により、ヌクレオチド配列は異なるが、また、同じタンパク質を発現またはコードする。
そのようなわずかなＤＮＡコードの改変は、当業者によりよく知られていて、本発明に含まれる。
【００２０】
ここで使われるような“トランスフェクション”という用語は、例えば、発現ベクターから、レシピエント細胞へ核酸媒介遺伝子の伝達による、核酸の導入を意味する。
ここで使われるような“形質転換”は、外来ＤＮＡまたはＲＮＡの細胞内への取り込み、例えば、形質転換された細胞が、ジストロフィンタンパク質の組換え形態を発現する、または、伝達された遺伝子からのアンチセンス発現の場合、ジストロフィンタンパク質の自然発生形態が阻害される、結果、細胞の遺伝子型が、変化するプロセスを指す。
【００２１】
ここで使われるような“トランスジーン”という用語は、核酸配列（例えば、ジストロフィンタンパク質をコードする、またはそこへアンチセンス転写する），トランスジェニック動物またはそれが導入される細胞に対して、一部または全部が異種、つまり外来、である、または、トランスジェニック動物またはそれが導入される細胞の外来遺伝子と相同性であるが、導入されるために設計され、または、挿入される細胞のゲノムをかえる（例えば、通常の遺伝子の導入とその導入がノックアウトの結果であるのと異なる位置に導入される）を意味する。
トランスジーンは、一つまたはそれ以上の制御配列及び、選択された核酸の最適な発現のために必要であるイントロンのようないくつかの核酸を含む。
【００２２】
“ベクター”という用語は、それに連結されている核酸分子を輸送することができる核酸分子をさす。
好ましいベクターは、それらが結合されるために、自立的増殖および／連結された核酸の発現ができるものである。
【００２３】
“トランスジェニック”動物は、マイクロインジェクション、あるいはベクターを介した組換えウィルスによる感染、あるいは裸ＤＮＡのエレクトロポレーションなどによるサブセル・レベルでの人為的遺伝子操作により、直接的または間接的に、受け取った遺伝子情報を有する動物である。
本明細書中における“トランスジェニック”は、古典的な交配または体外受精を含まず、どちらかといえば、一つまたはそれ以上の細胞が、組換えＤＮＡ分子を収納した動物をさす。
この分子が動物の染色体中に統合されることが、極めて好ましいものの、本発明は、酵母人工染色体の中に設計されるような、染色体外の複製するＤＮＡ配列の使用も含んでいる。
好ましくは、本発明のトランスジェニック動物は、遺伝情報が取り込まれ、さらには生殖細胞に組み込まれ、その結果として、子孫に情報を伝えることができる能力を与えるトランスジェニック動物を示す“生殖細胞系列トランスジェニック動物”を含む。
そのような子孫が、実際に、その情報の一部あるいは全部を持っているのであれば、その情報の一部あるいは全部を持っているとすれば、その時には、それらもまたトランスジェニック動物である。
【００２４】
ここで使われるように、“核酸”という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、及び、適切なところでは、リボ核酸（ＲＮＡ）に該当するようなポリヌクレオチドをさす。
この用語は、ヌクレオチドアナログ由来のＲＮＡまたはＤＮＡを等価物として、また、１本鎖（センスまたはアンチセンス）及び２本鎖ポリヌクレオチドで記載されている実施態様にも適用できることとして、含むと理解されるべきである。
【００２５】
“安定したトランスフェクション”または“安定にトランスフェクトされた”という用語は、トランスフェクトされた細胞のゲノムへ外来ＤＮＡの導入と組込みをさす。
“安定したトランスフェクタント”という用語は、外来ＤＮＡをゲノムＤＮＡへ安定に組み込んだ細胞をさす。
【発明の詳細な説明】
【００２６】
下記実施例は、本発明に従って好ましい方法を示した。しかし、これら実施例は、説明の手段として提供されるが、本発明の全領域の限定として受け取られるべきものではない。
【００２７】
［実施例１］
ヒトＤｐ２６０トランスジーン構造体の準備及び分析
マウス筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター及びエンハンサ（配列番号１）が、ＭＣＫエクソン１（配列番号２）、イントロン１（配列番号３）、及びエクソン２の５’非翻訳部位を含むエクソン２（配列番号４）の一部に加えて、最終トランスジーンを作製するのに使用された。
ＭＣＫの制御エレメントは、最初のエクソン及びはじめのイントロン（配列番号５）の一部とともに、pBluescript II ＳＫベクター（ストラータジーン，ラホーヤ，ＣＡ）へ直接クローンされた。
ＭＣＫのＡＴＧ 開始コドンまでの、ＭＣＫイントロン１の残りの部分及びエクソン２からなる、１番目のＰＣＲアンプリコン（配列番号６）は、ＮｄｅＩ制限サイトを作るために、ＰＣＲによって増幅された。
これによって、ヒトのゲノム ＰＣＲアンプリコンのＮｄｅＩ制限サイトへのライゲーションが可能になった。
２番目のＰＣＲアンプリコン（配列番号７）は、ＭＣＫ開始コドンが通常位置するまさにその場所に位置する、網膜ジストロフィンに特異な最初のエクソンＲ１のＡＴＧ開始コドンから始まり、イントロンＲ１に続き、そしてエクソン３０で終了した。
２番目のＰＣＲアンプリコン（配列番号７）は、また、組み込まれたＦｓｐＩサイトを含んだ。
３番目のＰＣＲ産物は、ヒト ジストロフィン ｃＤＮＡ クローン ｃＤＮＤ４−５ａ（ＡＴＣＣ番号 ５７６７０）を使って増幅された。
この産物は、その５’末端でＦｓｐＩ制限サイトを含み、その３’末端で自動的に生じるＡａｔII部位を含むように設計され、構造体に添加された。
ヒトジストロフィンをコードする配列の残りの部分は、３つのヒトジストロフィンｃＤＮＡクローン，ｃＤＭＤ ５ｂ−７，８，及び９−１４（ＡＴＣＣ番号 ５７６７２，５７６７４，及び５７６７６），自動的に生じる制限サイトを利用して構造体にライゲートすることにより作製された。
ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナル配列（配列番号８）（インビトロゲン，カールズバッド，ＣＡ）は、転写産物の適度な安定性及びポリアデニル化を保証するために、構造体の３’末端が添加された。
このシグナル配列は、Invitrogen.comウェブサイトから、ＰＣＤＮＡ３．１Ｈｙｇｒｏプラスミドプライマーを利用したＰＣＲ産物から作製された。
このプライマー配列は、個々に、配列番号２１及び２２として、この明細書中に含まれる。
配列番号２１は、ＢＧＨ−Ａｆ１の中にＡｆ１III制限サイトを含み、下流プライマーである。配列番号２２は、ＢＧＨ−Ｎｏｔの中にＮｏｔＩ制限サイトを含み、上流プライマーである。
この結果、作製に使用された全制限サイトとともに示される、図１（配列番号９）に示す構造体が得られた。
【００２８】
ＡＢＩ３７７自動シーケンサー（アプライド バイオシステム、フォスターシティ、ＣＡ）が、Ｄｐ２６０トランスジーン（配列番号１０）の全コード領域の配列の精密度を確認するために使用された。
野生型アミノ酸配列を保有する２つのサイレント変異が発見された。他の２つの変異が配列中に発見されたが、それらは製造元のプロトコール（クイックチェンジ 部位特異的突然変異キット、ストラータジーン）に従って、部位特異的突然変異により野生型配列へ復帰させられた。
塩基配列決定は、また、その構造体がエクソン７１（配列番号１１）を欠くことも明らかにした。
これは、ヒト及びマウス遺伝子の正常なスプライスバリアントによるものであり、シントロフィン結合部位は、このエクソンの下流である。
ヒトＤｐ２６０トランスジーン転写の発現及びタンパク質産物は、ＭＭ１４筋原細胞系統（ハウシュカ，ワシントン大学）、つまり分化した筋細胞由来の系統において、Jaynesらのモレキュラー  セル  バイオロジー（Mol Cell.Biol）6:2855-2865（1986）に記載の方法に従った、安定したトランスフェクションにより試験された。
なお、上記文献に記載された技術及び内容は、ここに引用され、本発明に含まれる。
【００２９】
ＭＭ１４筋原細胞系統へのトランスジーンの安定なトランスフェクションを確立した後、ｃＤＮＡ ＰＣＲ産物分析及びシークエンシングの結果、トランスジェニック mＲＮＡのほとんどが、ＭＣＫ エクソン２／エクソンＲ１セグメント（配列番号１２）を除去しＭＣＫエクソン１から、直接ジストロフィン エクソン３０へスプライシングされることが示された。
情報量分析により、ＭＣＫエクソン２受容体サイトのかなり弱い６．２ビットスコアと比較して、１２．１ビットの強いエクソン３０受容体サイトのスコアが示された。
ＭＣＫイントロン１の３’領域の３つのヌクレオチドは、部位特異的突然変異誘発（クイック チェンジ 部位特異的突然変異誘発キット、ストラータジーン）によって変換され、エクソン２受容体のビットスコアを１２．４ビットに増加し、より強いスプライス受容サイトにした。
続いて行ったトランスフェクション実験により、ＲＮＡ産物の正しいスプライシングが確認された。
変異したヌクレオチドは、配列番号５の６３６３，６３６４及び６３６８の位置（図１０のアスターリスクでマークされた）に発見され、全て“ｇ”から“ｔ”へ突然変異されていた。
発現したタンパク質（配列番号１３）は、トランスフェクトされた筋原細胞から調整されたタンパク質試料のウェスタンブロットを使って分析された。
ウェスタンブロットは、Ｄｐ４２７（図２ａ）と比較すると、トランスフェクトされた細胞のＤｐ２６０の強い発現を示した。
インサートのないＭＣＫプラスミドを使ったコントロールトランスフェクションは、Ｄｐ２６０を発現しなかったが、Ｄｐ４２７筋ジストロフィンの発現を示した。
【００３０】
［実施例２］
ＤＭヒトＤｐ２６０トランスジェニックマウスの生産
ヒトＤｐ２６０トランスジーン構造体は、エンドー フリー プラスミドキット（キアゲン、バレンシア、ＣＡ）を用いて抽出され、卵母細胞注入に先立って、NotＩによる制限消化よって、プラスミドベクターからリリースされた。
構造体は、２００個の卵へ注入され、それを擬似妊娠した雌に移植し、出産し、離乳した。
Ｄｐ２６０トランスジーンに対する遺伝子型判別は、ヒトＤｐ２６０トランスジーンを組み込んだ２匹のマウスを識別した。
遺伝子型判別は、ＭＣＫ特異的フォーワードプライマー（配列番号１４）およびジストロフィン ヒト エクソン３０特異的リバースプライマー（配列番号１５）を使ったＰＣＲ反応により実行され、これにより、４００ｂｐ未満のトランスジーン特異的産物（配列番号１６）が増幅された。
両系統のマウスはトランスジーンの強い発現を示し、ゲノムへの挿入位置、及びマウスゲノムに挿入されたトランスジーンのコピー数によって相違しているのだろう。
トランスジェニックマウスは、このように、Ｔｇ＋動物として以下に記載されているＴｇＮ（ＤＭＤ２６０）１ Ｒａｗ トランスジーンをもつことによって識別される。
【００３１】
ユートロフィンノックアウトutrn-/- マウス(ステファン ハウシュッカ  ワシントン大学)は、ユートロフィン遺伝子のエクソン６４の中に挿入されたネオマイシン（neo）耐性遺伝子の存在または欠損に基づくＰＣＲ反応を使って識別された。
３１２塩基対のアンプリコン遺伝子（配列番号１７）は、挿入されたｎｅｏ遺伝子（配列番号１８）及びユートロフィン遺伝子のエクソン６４の３’末端の塩基配列（配列番号１９）から開発されたプライマーを使い、作製された。
野生型アレルは、追加のフォーワードプライマー（配列番号２０）をｕｔｒｎノックアウトマウスでは欠損している５’末端に、使用することで識別された。
ｕｔｒｎノックアウト及びＴｇ+マウスに対するコンジェニックＣ５７ＢＬ/６Ｊ系統は、Ｃ５７ＢＬ/６Ｊマウスを１０世代と戻し交配することにより作製された。
【００３２】
ＤＭ（ｕｔｒｎ-/- , ｍｄｘ）雄は、トランスジーンを持つ持たないにかかわらず、ｕｔｒｎ ノックアウトマウス、Ｔｇ＋マウス、およびｍｄｘマウス（ジャクソン研究所から取得、バーハーバー、ＭＥ）を使った交配系列から作製された。
ｍｄｘ変異を持っているマウスは、以前、Amalfitano ＆ Chamberlain in Muscle ＆ Nerve 19 ; 1549-1553 (1996)に記載されたＡＲＭＳ ＰＣＲアッセイを利用して識別された。
最初にｍｄｘ雌をｕｔｒｎ-/-雄と交配することによって、引き続いてＤｐ２６０ Ｔｇ+雄に交配される雌が生産された。
これで、ヒトＤｐ２６０トランスジーンを有するまたは有さないＤＭ雄（ＸｍｄｘＹ，ｕｔｒｎ-/-）を生産するための、同型接合の ｕｔｒｎ-/-雄に交配される雌キャリア（Ｘｍｄｘ，Ｘ＋，ｕｔｒｎ-/-，Ｔｇ＋）を産生した。
これらの交配は、４８匹のＤＭマウスと４８匹のＤＭ／Ｔｇ＋マウスの結果を生じた。
【００３３】
［実施例３］
ウェスタンブロッティング
ヒトＭＣＫ／Ｄｐ２６０ ＴｇあるいはＭＣＫプラスミドのみのいずれかが安定にトランスフェクトされ、分化したＭＭ１４筋原細胞の培養物が採取された。
タンパク質は、ダンス型ホモジナイザーの中で、１ｍＬホモジナイズ緩衝液(50ｍＭ Tris pH8,150ｍＭ NaCl,1mM EDTA,0.04mg/mL アプロチニン,0.0025 mg/ mL ぺプスタチンＡ,0.025 ロイペプチン,１ｍＭ フェニルメチルスルホニルフルオライド, 0.1% Triton X100)でホモジナイズすることにより、３百万個の細胞から抽出された。
筋肉組織は、またＤＭ／Ｔｇ＋及びＤＭマウスの後肢から採取された（１００ｍｇ）。
前記組織は、凍結され、１ｍＬホモジナイズ緩衝液中、冷却した乳鉢及び乳棒を使用してホモジナイズされた。
ホモジネートは、細胞の破片を沈殿させるために、１０分間、１３，０００ｒｐｍ、４℃で遠心分離された。
【００３４】
４Ｘローディングバッファー（インビトロゲン）が、上清に添加され、タンパク質は、１０分間、７０℃で熱変性された。
２４ｍＬの分取は、ＮｕＰＡＧＥ トリス−アセテート ＳＤＳゲルシステム（インビトロゲン）を使用した４−８％アクリルアミドゲルで分析された。
タンパク質は、ノベックスチェンバー（インビトロゲン）で、ハイボンド−Ｃスーパー膜（アマシャム バイオサイエンス，ピスカタウェー，ＮＪ）へトランスファーされた。
膜は、非特異的な結合をさけるために、４％ミルクを含むトリス−ＮａＣｌ−Ｔｗｅｅｎ ｂｕｆｆｅｒ（ＴＮＴ）で４℃、一晩ブロックされた。
膜は、その後、一次抗体とともに室温で２時間インキュベートされた。
筋原細胞のウェスタンブロットについては、一次抗体（ＶＩＡ４-２ Ａ３,アップステートバイオテクノロジー，レークプレーシド，ＮＹ）は、ジストロフィンのカルボキシ末端の最後の１７アミノ酸に対して生じるマウスモノクローナルＩｇＭであった。
肢筋のウエスタンブロットについては、一次抗体は、ジストロフィンＣ末端特異的ＩｇＧ（ＭＡＮＤＲＡ−１，シグマ）であった。
【００３５】
筋原細胞の試料のために、膜は、ＴＮＴ緩衝液を使って何回か洗浄にかけられた。
二次抗体（抗マウスＩｇＭ，ペルオキシダーゼ，シグマ）は、室温で１時間または４℃で一晩でアプライされた。
追加の洗浄後、膜は、ＥＣＬ（enhanced chemilluminescence）検出液（アマシャム バイオサイエンス，ピスカタウェイ，ＮＪ）に暴露され、続いて、Ｘ線フィルムへ露光された。
後肢筋のウェスタンブロットのために、アルカリホスファターゼを結合した抗マウスＩｇＧ（シグマ）は、ジストロフィンタンパク質バンドの比色可視化するために、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム塩化物）キット（ＫＰＬ，ゲーサーズバーグ，ＭＤ）が使用された。
【００３６】
マウス後肢筋のウェスタンブロット分析は、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスおける、Ｄｐ２６０の強い発現を示唆したが、一方、ＤＭマウス由来の後肢筋のウェスタンブロット分析は、Ｄｐ２６０発現を示さなかった。
【００３７】
［実施例４］
免疫細胞化学的組織学的研究
殺してすぐの動物からの後肢は、皮を剥がれ、２％パラホルムアルデヒドを含むｐＨ７．４ リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に４〜６時間浸漬された。
１本の後肢から、ヒラメ筋及び長指伸（ＥＤＬ）筋が解剖して取り出され、４℃で２４〜４８時間固定され、その後、パラフィンに埋め込まれた。
それらは、その後、切片化され、標準的な組織学的な方法を使って、トルイジンブルーで染色された。
反対側の肢の筋肉は、１〜２ｍｍ３の塊へ分解され、Histochem J.21:163-171(1989)のトクヤスの方法に従い、スクロース及びポリビニルピロリドンの混合物で凍結保護され、液体窒素中で、急速凍結された。
１．５μＬ厚の横断切片は、ＦＣＳアタッチメントのついたレイヒェルトウルトラカットS ミクロトームを使って、得られた。
【００３８】
凍結切片は、０．２％ゼラチン及び０．５％脱脂粉乳を含むＴＢＳ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，０．００１％ＮａＮ３，ｐＨ７．６）中で、４℃で一晩ブロックされた。
切片は、室温下、５分間、ＴＢＳで洗浄され、その後、ブロック液で希釈された一次抗体中で、９０分間、インキュベートされた。
使用された抗体は、１：２５で希釈されたＣ末端特異的モノクローナル抗ジストロフィン（ＭＡＮＤＲＡ−１）（シグマ），または１：２００で希釈されたウサギポリクローナル抗ラミニン（シグマ）であった。
切片は、５分間、ＰＢＳ中で２回リンスされ、３０分間、５％ヤギ血清を含むＴＢＳ中でブロックされ、ＴＢＳで２回リンスされた。
それらは、６０分間、アレクサ４８８が結合した，種特異的な二次抗体（モレキュラープローブ、ユージーン、ＯＲ）とともにインキュベートされ、その後、リンスされ、観察するためにマウントされた。
ラミニンラベルされたスライドは、核を見えるように、１０分間０．２ｍｇ／ｍＬヨウ化プロピジウムで対比染色され、その後、再度リンス及びマウントされた。
画像は、ＣＣＤカメラを装備したオリンパスＢＸ−５０エピ螢光顕微鏡を使用して記録された。
【００３９】
組織学的切片の定量分析のために、クロスセッション領域は、パブリックドメインのＮＩＨ画像プログラムを使用し、マッキントッシュコンピューター上でデジタイズされた。
値は、全筋肉のクロスセッション領域あたりの、ネクローシス／再生のパーセンテージとして示された。
非末梢核を有する筋繊維のパーセンテージは、ヨウ化プロピジウム及び抗ラミニンでラベルされた凍結断面のデジタル画像を使って決定された。
平均間の相違は、スチューデントのｔ検定を使って分析された。
【００４０】
免疫細胞化学の結果は、Ｄｐ２６０，Ｔｇ＋マウスにおいて、Ｄｐ２６０タンパク質は、筋繊維膜に局在化することを示した。
ＤＭマウスは、ジストロフィンを持っておらず、局在化も見られなかった（図３ｂ）。
８週齢ＤＭ／Ｔｇ＋マウスでは、図３ａが示されるように、蛍光強度は、細胞間で変化したが、図３ｃに示されるように、１６週では、より均一で、細胞膜に局在化するように見られた。
【００４１】
筋肉の組織学的分析において、Ｄｐ２６０トランスジーンをもたないＤＭマウス（図６ｂ）は、筋繊維変性、繊維化、及び食細胞による浸潤が広領域で見られ、このことは筋肉組織の大規模なネクローシス及び炎症を示す。
この病変は、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスＤｐ２６０トランスジーンの発現により、完全には除去されないが、冒された領域は、ＤＭマウスで見られるよりも、ずっと集中化し、限局的である。
ＤＭ／Ｔｇ＋マウスのヒラメ筋の外見は、野生型同齢コントロール動物のヒラメ筋の形態にかなり類似していた（図６ｃ）。
定量分析は、両タイプのネクローシス領域のパーセンテージは、年齢とともに減少したが、１６週まで、ＤＭマウスは、死亡するまで、進行的により多くの筋肉のネクローシスが起こるのに対し、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスはＥＤＬ及びヒラメ筋においてネクローシスがほとんど起こらないことを示している。
中心核を有する筋繊維のパーセンテージは、骨格筋の慢性変性及び再生の指標である。
それは、ＤＭ及びＤＭ／Ｔｇ＋両マウスにおいて、年齢とともに増加したが、ヒラメ筋及びＥＤＬ筋の両方において、ＤＭ／Ｔｇ＋の平均は、同齢の平均よりも有意に低かった（ｐ＜０．０５）。
【００４２】
［実施例５］
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）及びラジオグラフィー
サジタルＭＲＩは、ＤＭ、及びＤＭ／Ｔｇ＋マウスについて、水平ボア９．４Ｔ バリアン社製システム上でマウスボリュームコイル及び、次に示すパラメーター、すなわち、ＴＲ／ＴＥ＝２０００／１４ｍｓ；視界＝６０×３０ｍｍ；イメージマトリクス＝２５６×２５６ピクセル；スライス厚＝１ｍｍ；及び平均数＝２でスピン−エコーイメージングシーケンスを使用して、実施された。
ＭＲＩは、ＤＭマウスに見られる極度な外観の変形が（図４ｅ）、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスには存在しないことを示した（図４ｄ）。
ＤＭマウスは、また、野生型の動物（図４ｆ）と比較して、脊柱傍の筋束及び心筋の両方の厚さが明らかに減少していることを示した。
ＤＭ／Ｔｇ＋動物のこれらの特徴は、ＭＲＩによっては、野生型動物と区別がつかなかった。
ＤＭ／Ｔｇ＋マウスの心筋の幅は、ＤＭマウスのそれよりも厚いようにみえ、正常なコントロールマウスのそれとかなり類似しているように見える。
【００４３】
脊柱後弯は，ＤＭＤに見られる脊柱側弯の四足動物版であり、重症なジストロフィンＤＭマウスの特徴である。
３匹のＤＭおよび３匹のＤＭ／Ｔｇ＋マウスについて、通常の方法で実施したラジオグラフィーは、マウスにおける脊柱後弯に対するヒトＤｐ２６０発現の効果を示す。
図４ｂに示されるＸ線画像は、ＤＭマウスの重症な脊柱後弯の背骨、つまり、ゴニオメーター分析により１２０°と測定する弯曲を示す。
それに対して、ＤＭ／ＴＭ＋マウスは、図４に見られるように、正常マウスに類似した、５６°の背骨の湾曲を示す。
【００４４】
［実施例６］
筋電図（ＥＭＧ）研究
針電極の挿入に対する反応に対する節電図の応答は、カーター等、Am.J.Phys.Med.Rehabil.71:2-5(1992)及びドゥミトル、Electrodiagnostic Medicine 第2版，276-277による以前記載された方法を使い、ＤＭ／Ｔｇ＋マウス及びＤＭマウスからとった四肢筋肉について記録された。
ＥＭＧ研究は、ニューロマックスＥＭＧシステム（ＸＬ Ｔｅｋ,オンタリオ，カナダ）を使い、前脛骨筋について実施された。
セッティングは、ノッチフィルタ及び適応フィルターの両方を６０Ｈｚに、低周波フィルターを３０Ｈｚに、高周波フィルターを１０，０００Ｈｚに、ゲインを２００／ｄｉｖに、１０ｍｓ／ｄｉｖに、及び負のトリガースロープに標準化された。
接地及び参照電極は、０．２５ｍｍ２記録面（ＴＥＣＡ社，オンタリオ，カナダ）をもつ単極針電極である、皮下に設置されたＥＥＧ皮下記録針（ニコレット０１９−４０９７００，ニコレットバイオメディカル，マディソン，ＷＩ）であった。
全マウスは、０．６ｍｇ／ｇ重量のアベルチン（トリブロモエタノール，シグマ）により、麻酔をかけられた。重量は、各ＥＭＧテストのたびに取得された。
【００４５】
ＥＭＧテストにおけるＣＲＤの存在は、筋肉膜の不安定性及び筋肉病変を示す。
ＣＲＤを測定するために、腹筋を４区画に等分割し、４週間隔で、いくつの４分区画にＣＲＤを存在したか、及び、（挿入活性をもつ）ＣＲＤが合計でいくつあったのかを記録した。
ＥＭＧ活動は、約０．５ｍｍ増分で中心から放射状に飛び出す針穿刺により４点で記録された。
各四分画分で、４つの穿刺が行われ、各象限で作られ、研究される動物の側面は、外傷によるアーチファクトを最小化するために、４週間の間隔で変更された。
ＣＲＤをもつ４画分は０から４のスコアがつけられ，ＣＲＤ総数は、０から１６のスコアがつけられた。
【００４６】
筋電図は、筋肉膜安定性及びＤＭ及びＤＭ／Ｔｇ＋マウスの筋肉病変直接的に評価する。
より高齢のＤＭ／Ｔｇマウスは、個々の運動単位が興奮し、正常なＥＭＧパターンを表す（図５ａ）。
ＤＭマウスは、ジストロフィン異常症の異常の特徴を表すＣＲＤパターンを表す。
ＣＲＤは、筋肉神経支配除去及び筋障害性の状態と相関関係がある神経障害的状態で共通に見られる。
電気生理学的反応は、時間中ずっと、２つのマウス群について収集され、それらの臨床学的所見に相関していた。
４週齢マウスにおいて、ＤＭ及びＤＭ／Ｔｇ＋群のマウスの間で、ＣＲＤを有する四分画分数または合計ＣＲＤの罹患率はほとんど違いがなかった（図５ｃ及び５ｄ）。
マウスが老化するにつれて、ＤＭマウスは、ＣＲＤを有するより大きな四分画分数及びより大きな合計ＣＲＤ数を持つようになるが、それに対してＤＭ／Ｔｇ＋マウスは、各々がより少さくなった（図５ｃ及び５ｄ）。
８週目では、ＣＲＤを有する四分画分数（ｐ＝０．００２）（図５ｃ）及びＣＲＤを有する四分画分数の合計数（ｐ＜０．００１）（図５ｃ）の両方において、違いは、有意に大きくなった。
ＣＲＤは、ＤＭマウスの４つ全ての四分画分に認められるが、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスの象限が認められるＣＲＤはより少数であった。
ＤＭマウスは、８から１２週の間に死亡したが、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスは生き残り、２４週まで研究された。
それらのＥＭＧ研究は、ＣＲＤを有する四分画分の数及びＣＲＤの総数が軽度の筋障害に典型的な水準にまで減少したことを示した。
【００４７】
［実施例７］
運動性研究
運動活性データは、シングルフォースプレートアクトメーター（スティーブ  ファウラーから入手）で記録された。フォースプレートアクトメーターは、１２ｃｍ×１２ｃｍの感知領域を使用した。
空間解像度は、１ｍｍであり、時間解像度は、０．０２秒であった。
マウスは、目の細かいサンドペーパーで粗くしたアクリルプラスチック板で動き、記録セッションが、暗く、音響減衰した部屋で１５分間続けられた。
スティーブ  ファウラーにより書かれたソフトウェアが、データを記録し分析するために使われたが、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスに対する平均的な９５％信頼区間を見つけることによって、データが分析された。
【００４８】
フォースプレートアクトメーターは、マウスの運動性をそれらの移動距離によって測定した。
６週で、ＤＭマウスは、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスほど動かず（図９）、ＤＭ群データは、マージナルな有意性（ｐ＝０．０７）を表すｔ検定で、９５％の信頼区間の丁度外側に出た。
１０週で、ＤＭマウスは、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスに比較して重大な障害をもった（ｐ＝０．００２）。
ＤＭ／Ｔｇ＋マウスは、何も処理されていないｍｄｘマウス及びＣ５７ＢＬ／６Ｊコントロールマウスと同等のレベルで動き、これは、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスの、９５％信頼区間内に十分に入った。
ＤＭ／Ｔｇ＋マウスは、また正常に動き、概して健康的に見え、さらに、ＤＭマウスに典型的な、活動性減少、異常なよたよた歩行、制約され動きの悪い四肢を示さなかった。
【００４９】
［実施例８］
ＤＭ／Ｔｇ＋マウスにおける重大な筋ジストロフィー表現型の減少
ＤＭ／Ｔｇ＋マウスは正常に成長しＤＭマウスよりも長生きするので、ＤＭマウスに見られる重大な筋ジストロフィーの表現型は、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスにおいて、改善された。
ＤＭマウスは、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスが正常に成長するのに対して、小型であった（図４）。臨床的な健康状態は、筋肉の質量及び強さと相関関係があるため、体重によって評価された。
４週間で、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスの平均体重［１８．１±０．７ｇ（ｎ＝１４）］は、ＤＭマウスの平均体重［１４．１±０．６ｇ（ｎ＝７）］よりも有意に大きい（ｐ＝０．００１）。
８週までに、わずかＤＭ／Ｔｇ＋マウスは、２６．９±０．７ｇ（ｎ＝１２）に成長し、１６週までに、３０．８±１．２ｇ（ｎ＝６）に成長した。
８週までに、ＤＭマウスは、１７．９±１．３ｇ（ｎ＝６）に成長し、その後、まもなく死亡した。
【００５０】
一般的には、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスは、月齢に応じて正常なレベルまで体重が増加したが、一方、ＤＭマウスは、体重増加が最小限にとどまり、早死した。
寿命研究のために生産された全２８匹のＤＭ／Ｔｇ＋マウスは、３０匹のＤＭマウスの平均寿命（２．９±０．３月）より長く生存した。
２３匹のＤＭ／Ｔｇ＋マウスは６月齢以上生存し、それらのうちの６匹のみ死亡した。
この２１％割合の減少は、実験マウスでは正常である。７匹のＤＭ／Ｔｇ＋マウスは、１年齢またはそれ以上の年齢に届いた。
【００５１】
［実施例９］
細胞採取、トランスフェクション、及び投与によるＤＭＤ治療
マウス、イヌ、ウマ及びヒト由来の細胞は、常法を使い、また、先に記載があるように、動物から採取され、網膜ジストロフィンタンパク質をコードするように遺伝子インサートに、安定にトランスフェクトされた。
安定にトランスフェクトされた細胞は、それから、少なくともひとつのＤＭＤの臨床症状の苦しみを減らすために、動物へ投与される。
好ましくは、細胞は、自家移植となるように、同一固体の動物から採取され、投与する。そのような措置は、各固体動物の生涯を通して必要程度で、繰り返される。
より具体的には、骨髄細胞は、幹細胞可塑性を保持する条件下で単離され、培養されてもよい。
それらは、その後、選択的なマーカー遺伝子，例えば、ネオマイシン抵抗性、をもつＤｐ２６０トランスジーンを含むレンチウィルスによってトランスフェクトされる。
また、別の方法として、エレクトロポレーションがトランスジーンを骨髄細胞に導入するための方法として使用されてもよい。これは、選択的な遺伝子マーカー：ネオマイシン抵抗性遺伝子を含む２番目のプラスミドを伴うコトランスフェクションで行うことができる。
これは選択的な遺伝子、すなわち、ネオマイシン抵抗性遺伝子をもつ２つ目のプラスミド、を含むコトランスフェクションによって行われてもよい。
ネオマイシンにより細胞が選択されたあと、それらは、レシピエントに移植されてもよい。
【００５２】
特許または出願ファイルは、カラーで実行された図または写真が少なくとも一つ含まれる。
カラー図または写真があるこの特許または特許出願明細書のコピーは、官公庁への請求及び必要な手数料の支払いにより提供される。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】図１は、トランスジーンの構造体に利用した全制限サイトを表示したヒトＤｐ２６０トランスジーン構造体の概略図である。
【図２ａ】図２ａは、ＭＣＫプラスミドのみでトランスフェクトした筋原細胞と比較したＤｐ２６０トランスジーン構造体でトランスフェクトした筋原細胞のウエスタンブロットゲル分析である。
【図２ｂ】図２ｂは、ＤＭ/Ｔｇ+及びＤＭマウスの後肢のウエスタンブロットゲル分析である。
【図３ａ】図３ａは、モノクローナルのＣ末端特異的な抗ジストロフィンで免疫し、二次抗体を結合させたＡｌｅｘａ−４８８で検出した８週齢ＤＭ／Ｔｇ＋マウスのヒラメ筋の横断図の写真である。
【図３ｂ】図３ｂは、モノクローナルＣ末端特異的抗ジストロフィンで免疫ラベルし、Ａｌｅｘａ−４８８結合二次抗体で検出した８週齢ＤＭマウスのヒラメ筋の横断切片の写真である。
【図３ｃ】図３ｃは、モノクローナルＣ末端特異的抗ジストロフィンで免疫ラベルし、Ａｌｅｘａ−４８８結合二次抗体で検出した１６週齢ＤＭ／Ｔｇ＋マウスのヒラメ筋の横断切片の写真である。
【図４ａ】図４ａは、ＤＭ／Ｔｇ＋及びＤＭマウスの相対的な大きさ及び表現を比較する写真である。
【図４ｂ】図４ｂは、背骨の湾曲をゴニオメーター分析により測定した、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスのラジオグラフィーＸ線画像である。
【図４ｃ】図４ｃは、背骨の湾曲をゴニオメーター分析により測定した、ＤＭマウスのラジオグラフィーＸ線画像である。
【図４ｄ】図４ｄは、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスの磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）研究である。
【図４ｅ】図４ｅは、ＤＭマウスのＭＲＩ研究である。
【図４ｆ】図４ｆは、正常なコントロールマウスのＭＲＩ研究である。
【図５ａ】図５ａは、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスからの筋電図（ＥＭＧ）記録である。
【図５ｂ】図５ｂは、ＤＭマウスによるＥＭＧ記録である。
【図５ｃ】図５ｃは、ＤＭ及びＤＭ／Ｔｇ＋マウス齢による複合反復放電（ＣＲＤｓ）を示す筋腹四分画分の平均数のグラフである。
【図５ｄ】図５ｄは、ＤＭ及びＤＭ／Ｔｇ＋マウス齢によるＣＲＤｓの平均総数を表すグラフである。
【図６ａ】図６ａは、８週齢におけるＤＭ／Ｔｇ＋マウスのヒラメ筋のトルイジンブルー染色された横断切片の写真である。
【図６ｂ】図６ｂは、８週齢おけるＤＭマウスのヒラメ筋のトルイジンブルー染色された横断切片の写真である。
【図６ｃ】図６ｃは、８週齢における野生型マウスのヒラメ筋のトルイジンブルー染色された横断切片の写真である。
【図７ａ】図７ａは、年齢に応じて、ＤＭ及びＤＭ／Ｔｇ＋マウスの長指伸筋における壊死領域をパーセンテージで定量化したグラフである。
【図７ｂ】図７ｂは、年齢に応じて、ＤＭ及びＤＭ／Ｔｇ＋マウスのヒラメ筋における壊死領域をパーセンテージで定量化したグラフである。
【図８ａ】図８ａは、年齢に応じて、ＤＭ及びＤＭ／Ｔｇ＋マウスの長指伸筋の中心核を表す筋繊維をパーセンテージで定量化したグラフである。
【図８ｂ】図８ｂは、年齢に応じて、ＤＭ及びＤＭ／Ｔｇ＋マウスのヒラメ筋の中心核を表す筋繊維をパーセンテージで定量化したグラフである。
【図９】図９は、各エラーバーの範囲は、平均の±１標準誤差を表示し、水平に引かれた線は、ＤＭ／Ｔｇ＋マウスにより試験された３つの歩行活動のセッションに対し９５％信頼区間を表すことを特徴とする、ＤＭ，ＤＭ／Ｔｇ＋，成熟ｍｄｘ及び成熟Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスのフォースプレートアクトメーター（force plate actometer）を使用して決定された運動活性の棒グラフである。
【図１０】図１０は、すべての制限サイト及び興味を引く注釈付きの領域を伴うＤｐ２６０トランスジーンの表記である。
【００５４】
＜配列表＞
本出願は、機械読み取りフォーマット及び紙の両方にリストされた配列を含む。機械読み取りフォーマットは、３４４４４．ｔｘｔコピー１及び３４４４４．ｔｘｔコピー２としてラベルされた。
これらのコピーは、相互に同一であり、ここに含まれる配列リストの紙コピーと同一である。
これら各配列リストは、参照によって本出願に明確に含まれる。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図３ｃ】
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【図４ａ】
2008506394.tif 000008
【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図４ｄ】
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【図４ｅ】
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【図４ｆ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図５ｃ】
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【図５ｄ】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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