(57)【要約】本発明はＹＫＬ−４０が顕著な役割を果たす、例えば細胞とりわけ癌細胞の成長を阻害し、そして／またはアポトーシスを誘導する生物学的過程を変調することができる抗ヒトＹＫＬモノクローナル抗体に関する。本発明はまた該抗体を含む医薬組成物、ならびに細胞成長、細胞分化、細胞外マトリックスのリモデリング、転移の阻害および／またはアポトーシスによる細胞死の誘導が治癒成功の要件である疾患を処置するための該抗体に関し、そしておよび／または医薬組成物を使用する。本発明の抗体はＹＫＬ−４０上の特異的エピトープに結合することにより前記で述べた過程におけるＹＫＬ−４０の生物学的機能を阻害することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＫＬ−４０上のエピトープへの結合の際に細胞の成長、分化を阻害し、そして／またはアポトーシスを誘起することができる、ヒトＹＫＬ−４０（配列番号１）に特異的である抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
【請求項２】
前記抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質が、配列番号１として同定されるヒトＹＫＬ−４０の配列の残基８３〜９０、９６〜１０５、１３７〜１５０、２１０〜２２０、３０４〜３１４および／または３１８〜３２９を含むエピトープを特異的に認識し、そしてそれに結合することができる、請求項１に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
【請求項３】
前記抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質が、配列番号１の残基２１０〜２２０を含むエピトープを特異的に認識し、そしてそれに結合することができる、請求項２に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
【請求項４】
前記結合フラグメントまたはその組換えタンパク質が、配列番号１の残基２１０〜２２０のいずれかから選択される３から６個のアミノ酸残基からなるエピトープを特異的に認識し、そしてそれに結合することができる、請求項３に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
【請求項５】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体が抗体１１５Ｆ９、１１６Ｆ９または２０１Ｆ９からなる群から選択される、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が抗体２０１Ｆ９である、請求項７に記載の抗体。
【請求項９】
前記抗原結合フラグメントが、請求項２〜８のいずれかに記載の抗体から誘導される、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、またはＦｖである、請求項９に記載の抗体。
【請求項１１】
前記組換えタンパク質が、請求項２〜８のいずれかに記載の抗体の可変領域を含むｓＦｖ、ヒト抗体、ヒト化抗体または組換えタンパク質である、請求項１〜８に記載の抗体。
【請求項１２】
前記細胞が癌細胞である、請求項１に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
【請求項１３】
前記癌細胞が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部／頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の原発性癌のものである、請求項１２に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
【請求項１４】
癌細胞が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部／頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の転移性癌のものである、請求項１２に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
【請求項１５】
前記細胞が内皮細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、血管平滑筋細胞、単球／マクロファージおよびその他の血液細胞、肝星細胞から選択される、請求項１に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
【請求項１６】
配列番号１として同定されるヒトＹＫＬ−４０の配列の３〜８個のアミノ酸残基を本質的に含むエピトープであって、該アミノ酸残基が該配列の残基８３〜９０、９６〜１０５、１３７〜１５０、２１０〜２２０、３０４〜３１４および／または３１８〜３２９から選択される、エピトープ。
【請求項１７】
前記エピトープが配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６もしくは配列番号７として同定される配列または該配列のフラグメントもしくはバリアントから選択される配列を含む、請求項１６に記載のエピトープ。
【請求項１８】
前記エピトープが請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体により認識される、請求項１６および請求項１７に記載のエピトープ。
【請求項１９】
前記エピトープが配列番号２〜配列番号７のいずかの配列から選択される２つまたはそれより多い配列のアミノ酸残基を含む、請求項１８に記載のエピトープ。
【請求項２０】
前記エピトープが配列番号２〜配列番号７のいずれかの配列の１つもしくはそれより多いフラグメントを含む、請求項１９に記載のエピトープ。
【請求項２１】
前記エピトープがＹＫＬ−４０受容体に対するＹＫＬ−４０の結合部位、または該結合部位の一部であり、該結合部位が細胞成長、分化および／または細胞生存の刺激に依存するＹＫＬ−４０に関与する、請求項１６〜２０のいずれかに記載のエピトープ。
【請求項２２】
前記細胞が請求項１３〜１５で規定されるいずれかの細胞から選択される、請求項１９に記載のエピトープ。
【請求項２３】
前記エピトープがＹＫＬ−４０の配列（配列番号１）内に位置する、請求項１６〜２２のいずれかに記載のエピトープ。
【請求項２４】
ＹＫＬ−４０がスイスプロット受け入れ番号：Ｐ３６２２２で同定されるようなヒトＹＫＬ−４０である、請求項１６〜２３のいずれかに記載のエピトープ。
【請求項２５】
ヒトＹＫＬ−４０上のエピトープに結合することができる抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質であって、該エピトープが請求項２〜８のいずれかに記載の抗体により認識される、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
【請求項２６】
前記エピトープが請求項１５〜２４のいずれかに規定されるようなものである、請求項２５に記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質。
【請求項２７】
配列番号２〜配列番号７として同定されるいずれかの配列または該配列のフラグメントもしくはバリアントから選択される少なくとも１つの配列を含む、ペプチドフラグメント。
【請求項２８】
前記ペプチドフラグメントが配列番号２〜配列番号７として同定されるいずれかの配列または該配列のフラグメントもしくはバリアントから選択される少なくとも１つの配列からなる、請求項２７に記載のペプチドフラグメント。
【請求項２９】
前記ペプチドフラグメントが配列番号１として同定される配列の一部である、請求項２７または２８に記載のペプチドフラグメント。
【請求項３０】
前記ペプチドフラグメントが３〜２００個のアミノ酸残基からなる、請求項２７または２９に記載のペプチドフラグメント。
【請求項３１】
前記フラグメントが５〜６５個のアミノ酸残基からなる、請求項３０に記載のペプチドフラグメント。
【請求項３２】
前記フラグメントが８〜１５個のアミノ酸残基からなる、請求項２７−３１に記載のペプチドフラグメント。
【請求項３３】
前記フラグメントが抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質に結合することができ、該抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質が請求項１〜１１で規定される、請求項２７〜３２のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
【請求項３４】
前記フラグメントが細胞成長、分化および／または細胞生存に依存するＹＫＬ−４０の刺激に関与する結合部位でＹＫＬ−４０受容体に結合することができる、請求項２７〜３２に記載のペプチドフラグメント。
【請求項３５】
前記フラグメントが細胞成長、分化および／または細胞生存に依存するＹＫＬ−４０を刺激することができる、請求項３３または３４に記載のペプチドフラグメント。
【請求項３６】
前記フラグメントが細胞成長、分化および／または細胞生存に依存するＹＫＬ−４０を阻害することができる、請求項３３または３４に記載のペプチドフラグメント。
【請求項３７】
前記フラグメントが配列ＬＫＮＲＮＰＮＬ（配列番号２）からなる、請求項２８に記載のペプチドフラグメント。
【請求項３８】
前記フラグメントが配列ＶＧＧＷＮＦＧＳＱＲ（配列番号３）からなる、請求項２８に記載のペプチドフラグメント。
【請求項３９】
前記フラグメントが配列ＬＡＷＬＹＰＧＲＲＤＫＱＨＦ（配列番号４）からなる、請求項２８に記載のペプチドフラグメント。
【請求項４０】
前記フラグメントが配列ＧＡＷＲＧＴＴＧＨＨＳ（配列番号５）からなる、請求項２８に記載のペプチドフラグメント。
【請求項４１】
前記フラグメントが配列ＲＧＡＴＶＨＲＴＬＧＱ（配列番号６）からなる、請求項２８に記載のペプチドフラグメント。
【請求項４２】
前記フラグメントが配列ＹＡＴＫＧＮＱＷＶＧＹ（配列番号７）からなる、請求項２８に記載のペプチドフラグメント。
【請求項４３】
前記フラグメントが請求項１〜１１または２５〜２６で規定されるような抗体により認識できるエピトープを含有する免疫原性ペプチドフラグメントである、請求項２７〜４２のいずれかに記載のペプチドフラグメント。
【請求項４４】
請求項１〜１５および／または２４〜２５で規定される抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質が細胞成長、分化および／または細胞生存を阻害するためである、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
【請求項４５】
望ましくない細胞成長、細胞分化、細胞生存、細胞外マトリックスリモデリング、線維症、血管形成、炎症および転移の存在を特徴とする病理学的状態の進行の防止および／またはその状態の処置のための医薬の製造のための、請求項１〜１５および／または２４〜２５のいずれかに記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
【請求項４６】
前記病理学的状態が固形癌、もしくは血液学的悪性腫瘍、炎症性疾患または細胞外組織リモデリングの亢進および／もしくは線維症の発達に関連する疾患から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記腫瘍が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部／頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の原発性癌から選択される原発性癌である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４８】
前記腫瘍が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部／頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の転移性癌から選択される転移性癌である、請求項４６に記載の使用。
【請求項４９】
炎症性疾患が関節リウマチ、細菌感染、活動性炎症性腸疾患、炎症性疾患、肝臓線維症、器官線維症、組織線維症および皮膚線維症から選択される、請求項４６に記載の使用。
【請求項５０】
前記肝臓線維症がＢ型もしくはＣ型肝炎ウイルスまたはアルコール依存症に起因する、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
細胞成長、分化および／または生存を刺激または阻害するための、請求項２４〜３７のいずれかに記載のペプチドフラグメントの使用。
【請求項５２】
前記ペプチドフラグメントが細胞成長、分化および／または生存を刺激するために使用される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記ペプチドフラグメントが細胞成長、分化および／または生存を阻害するために使用される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５４】
請求項１〜１１および／または請求項２４〜２５に規定されるような抗体の生成のための、請求項２７〜３のいずれかに記載のペプチドフラグメントの使用。
【請求項５５】
望ましくない細胞成長、分化または強化された細胞生存の存在を特徴とする病理学的状態の処置のための医薬の製造のための、請求項２７〜４３のいずれかに記載のペプチドフラグメントの使用。
【請求項５６】
前記医薬が腫瘍、癌、血液学的悪性腫瘍、線維症および／または炎症性疾患の進行の防止および／または処置のためである、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
前記腫瘍が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部／頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の原発性癌から選択される原発性癌である、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
前記腫瘍が乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部／頸部の癌、悪性メラノーマ、その他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の原発性癌からのような任意の転移性癌から選択される転移性癌である、請求項５６に記載の使用
【請求項５９】
前記炎症性疾患が関節リウマチ、強直性脊椎炎、巨細胞性動脈炎、サルコイドーシス、細菌感染、活動性炎症性腸疾患、Ｂ型もしくはＣ型肝炎ウイルスまたはアルコール依存症により引き起こされる肝臓線維症または組織線維症および器官線維症から選択される、請求項５６に記載の使用。
【請求項６０】
細胞の成長、分化および／または生存の阻害が治癒に必要である病理学的状態の処置のための医薬の製造のための、請求項２７〜４３のいずれかに記載のペプチドフラグメントの使用。
【請求項６１】
前記細胞が内皮細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球／マクロファージもしくはその他の血液細胞または癌細胞から選択される、請求項６０に記載の使用。
【請求項６２】
抗体、抗原結合フラグメントもしくはその組換えタンパク質が、請求項１〜１１および／もしくは２４〜２５で規定され、そして／または請求項２４〜３７のいずれかに記載のペプチドフラグメントが非腫瘍細胞の増殖の阻害のためである、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
【請求項６３】
抗体、抗原結合フラグメントもしくはその組換えタンパク質が請求項１〜１４および／もしくは２２〜２３で規定され、そして／または請求項２７〜４３のいずれかに記載のペプチドフラグメントが血管形成の阻害のためである、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
【請求項６４】
抗体、抗原結合フラグメントもしくはその組換えタンパク質が請求項１〜１４および／もしくは２２〜２３で規定され、そして／または請求項２４〜３７のいずれかに記載のペプチドフラグメントが細胞外マトリックスリモデリングの阻害のためである、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
【請求項６５】
抗体、抗原結合フラグメントもしくはその組換えタンパク質が請求項１〜１４および／もしくは２２〜２３で定義され、そして／または請求項２７〜４３のいずれかに記載のペプチドフラグメントが線維症の阻害のためである、抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質の使用。
【請求項６６】
請求項１〜１１および／または請求項２４〜２５のいずれかに記載の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を含む医薬組成物。
【請求項６７】
請求項２７〜４３のいずれかに記載のペプチドフラグメントを含む医薬組成物。
【請求項６８】
請求項１〜１１および／もしくは２４〜２５のいずれかに記載の抗体、ならびに／または請求項２７〜４３のいずれかに記載のペプチドフラグメントまたは請求項６７に記載の医薬組成物を投与することを含む、癌ならびに／または炎症性疾患および線維性疾患を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は細胞とりわけ癌細胞の成長を阻害し、そして／またはアポトーシスを誘導することができる抗ヒトＹＫＬ−４０モノクローナル抗体、該抗体を含む医薬組成物、ならびに細胞成長、細胞分化、細胞外マトリックスのリモデリング、転移の阻害および／またはアポトーシスによる細胞死の誘導が治癒成功の要件である疾患を処置するための該抗体および／または医薬組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＹＫＬ−４０はインビトロでヒト骨肉腫細胞系ＭＧ６３により多量に分泌されるタンパク質として最初に同定され、そしてそのアミノ酸配列の最後の３個のＮ末端アミノ酸、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬｅｕ（Ｌ）により命名され、そして分子量およそ４０ｋＤａであった（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９９２）。
【０００３】
ＹＫＬ−４０のアミノ酸配列分析によりタンパク質がグリコシルヒドロラーゼファミリー１８に属することが示された（Ｈａｋａｌａら、１９９３）。ファミリーはキチナーゼを含む酵素およびまた酵素活性を有さないタンパク質からなる。ＹＫＬ−４０（ＣＨＩ３Ｌ１）に関する遺伝子は染色体１ｑ３１−１ｑ３２に位置し、そして１０個のエクソンからなり、そして約８ｋｂのゲノムＤＮＡにわたる（Ｒｅｈｌｉら、１９９７）。Ｓｐ１ファミリー転写因子はＹＫＬ−４０プロモーター活性の制御に主な役割を有しているようである（Ｒｅｈｌｉら、２００３）。ヒトＹＫＬ−４０の結晶学的構造が記載されている（Ｆｕｓｅｔｔｉら、２００３；Ｈｏｕｓｔｏｎら、２００３）。タンパク質は２個の球状ドメイン：トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＩＭ）バレルフォールドを有する（β／α）８ドメイン構造からなる大きなコアドメイン、およびβ鎖７とαらせん７との間のループに挿入された５個の逆平行β鎖および１個のαらせんからなる小型のα／βドメインを含有する。これはＹＫＬ−４０の活性部位に溝様の特徴を付与する。ＹＫＬ−４０の構造はいくつかのタンパク質、例えばヒトキトトリオシダーゼ（Ｆｕｓｅｔｔｉら、２００２）、マウスＹｍ１（Ｓｕｎら、２００１）、キイロショウジョウバエ成虫原基成長因子２（Ｖａｒｅｌａら、２００２）およびグリコシルヒドロラーゼファミリー１８のいくつかのその他の膜（Ｃｏｕｌｓｏｎ、１９９４）の構造にある程度類似するが、大きな相違もまた存在する。これらの相違の１つはキチナーゼ様触媒活性に必須の３個のアミノ酸（Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｐ）のうちの１個、主にＧｌｕ＞Ｌｅｕの変異であり、これはＹＫＬ−４０の糖分解酵素としての機能を完全に排除する。ＹＫＬ−４０はキチンに結合できるが、酵素活性を有さない（Ｒｅｎｋｅｍａら、１９９８）。ＹＫＬ−４０は糖タンパク質であり、そしてこれはまたその他の哺乳動物キチナーゼ様タンパク質と比較してＹＫＬ−４０の独特な特性である。
【０００４】
ＹＫＬ−４０はヘパリンに結合することができる。タンパク質のアミノ酸配列は表面ループに位置する１個のヘパリン結合モチーフ（１４３ＧＲＲＤＫＱＨ１４９）を含有する（Ｆｕｓｅｔｔｉら、２００３）。ＹＫＬ−４０はまたヒアルロナンに結合することもできる。折り畳まれたタンパク質は外面に２個の潜在的ヒアルロナン結合部位を含有する。ヒトＹＫＬ−４０はファミリー１８のキチナーゼと類似の様式で異なる長さのキチンに結合することができる。９個の糖結合サブサイトがＹＫＬ−４０の４３Åの溝で同定された（Ｆｕｓｅｔｔｉら、２００３）。短いまたは長いオリゴ糖のヒトＹＫＬ−４０への結合もまた可能である。長いおよび短いオリゴ糖に関して選択的親和性を有する２個の異なる結合部位の存在（その他の哺乳動物キチナーゼ様タンパク質では見出されていない）は、これらのオリゴ糖を担持する２個の標的間の架橋剤としてＹＫＬ−４０の機能的活性に関する重要性を有し得る。
【０００５】
ＹＫＬ−４０は多くの生物学的活性を有する。したがって、ヒトＹＫＬ−４０は軟骨細胞および滑膜細胞のような結合組織の細胞の成長因子として作用できることが示されている（Ｄｅ  Ｃｅｕｎｉｎｃｋら、２００１；Ｒｅｃｋｌｉｅｓら、２００２）。ＹＫＬ−４０はまたインスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）に類似する様式で線維芽細胞の成長を促進する（Ｒｅｃｋｌｉｅｓら、２００２）。線維芽細胞ではＹＫＬ−４０はＭＡＰキナーゼおよびＰＩ３Ｋシグナリングカスケードの活性化を惹起し、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＰＫ）−１／２ＭＡＰキナーゼおよびタンパク質キナーゼＢ（ＡＫＴ）の双方のリン酸化を導く。ＹＫＬ−４０による細胞質シグナル伝達経路の活性化は原形質膜の１つまたはそれより多い受容体分子を有するＹＫＬ−４０の相互作用を介して媒介されることが示唆されているが、ＹＫＬ−４０の生物学的効果を媒介する細胞受容体の同定に関しては現在のところわかっていない。
【０００６】
ＹＫＬ−４０が内皮細胞の化学誘引物質として作用し、そして塩基性繊維芽細胞成長因子による刺激に匹敵してこれらの細胞の遊走を刺激する（Ｍａｌｉｎｄａら、１９９９）。
【０００７】
ＹＫＬ−４０は枝分かれした細管の形成を促進することにより血管内皮細胞形態を変調するが、これはＹＫＬ−４０が遊走刺激および血管内皮細胞の再構築により血管形成において役割を果たし得ることを示している（Ｍａｌｉｎｄａら、１９９９）。ＹＫＬ−４０はまた血管平滑筋細胞の接着および遊走因子でもある（Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、２００３）。ＹＫＬ−４０は２つの独立したメカニズム：細胞外ヒアルロナンへの結合により、ならびに細胞によるヒアルロナンの合成および分泌との干渉により細胞付着に利用可能な局所細胞外ヒアルロナン濃度に影響し得ることが示唆されている。したがって、ＹＫＬ−４０は炎症、線維症、アテローム発生ならびに癌成長および癌転移の間に生じる組織リモデリング過程の間の細胞接着および遊走の程度に影響し得る。
【０００８】
マウスではＹＫＬ−４０は、そのタンパク質の発現が離乳の数日後に乳房上皮細胞において誘導されるので「乳房退行タンパク質（Ｂｒｐ−３９）」と称された。ＹＫＬ−４０が、どの細胞が退縮の間に生じる大幅な組織リモデリングを生き延びるべきかを決定する保護シグナリング因子として乳房退縮の間のプログラム細胞死の調節に関与することが提唱された（Ｍｏｈａｎｔｙら、２００３）。
【０００９】
ＹＫＬ−４０は様々な型の細胞によりインビトロおよびインビボで、とりわけ炎症、細胞外マトリックスの分解／リモデリングまたは進行中の線維形成を特徴とする組織において発現される。ＹＫＬ−４０は活性化された好中球により（Ｖｏｌｃｋら、１９９８）、分化の後期のマクロファージ（Ｋｉｒｃｋｐａｔｒｉｃｋら、１９９７；Ｋｒａｕｓｅら、１９９６；Ｒｅｈｌｉら、１９９７；Ｒｅｎｋｅｍａら、１９９８；Ｒｅｈｌｉら、２００３）、関節炎性軟骨細胞（Ｈａｋａｌａら、１９９３；Ｊｏｈａｎｓｅｎら、２００１；Ｖｏｌｃｋら、２００１）、分化型血管平滑筋細胞（Ｓｈａｃｋｅｌｔｏｎら、１９９５；Ｍａｌｉｎｄａら、１９９９；Ｎｉｓｈｉｋａｗａら、２００３）、および繊維芽細胞様滑膜細胞（Ｈａｋａｌａら、１９９３；Ｎｙｉｒｋｏｓら、１９９０；Ｄａｓｕｒｉら、２００４）により分泌される。ヒト胎児軟骨細胞におる研究によりＹＫＬ−４０が分化マーカーであることが示されている（Ｉｍａｂａｙａｓｈｉら、２００３）。炎症性滑膜（Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋら、１９９７；Ｂａｅｔｅｎら、２０００；Ｖｏｌｃｋら、２００１）、アテローム性プラーク（Ｂｏｏｔら、１９９９）、巨細胞性動脈炎を有する患者の動脈炎性血管（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９９９ａ）のマクロファージの亜集団により、および関節炎性軟骨細胞（Ｖｏｌｃｋら、２００１）によりインビボＹＫＬ−４０  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現が見出され、そして小細胞性肺癌からの生検の腫瘍周囲マクロファージはＹＫＬ−４０  ｍＲＮＡを発現する（Ｊｕｎｋｅｒら、２００５ｂ）。
【００１０】
ヒト肝臓におけるＹＫＬ−４０  ｍＲＮＡの強い発現が線維症の存在に関連することが示された。肝臓生検の免疫組織化学的研究により線維症を有する肝臓の部分におけるＹＫＬ−４０タンパク質発現が示されたが、肝細胞では発現は観察されなかった（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９９７；Ｊｏｈａｎｓｅｎら、２０００）。サプレッションサブトラクティブハイブリダイゼーション分析およびＲＴ−ＰＣＲにより、ＹＫＬ−４０はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）により引き起こされた硬変肝臓組織において最も過剰発現されるタンパク質の１つであることが実証された（Ｓｈａｃｋｅｌら、２００３）。
【００１１】
活動性関節リウマチ（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９９３；Ｈａｒｖｅｙら、１９９８；Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９９９ｂ；Ｖｏｌｃｋら、２００１）、重篤な細菌感染（Ｎｏｒｄｅｎｂａｅｋら、１９９９；Ｋｒｏｎｂｏｒｇら、２００２）、活動性炎症性腸疾患（Ｋｏｕｔｒｏｕｂａｋｉｓら、２００３；Ｖｉｎｄら、２００３）、および肝臓線維症（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９９７；Ｊｏｈａｎｓｅｎら、２０００；Ｔｒａｎら、２０００；ＮOｊｇａａｒｄら、２００３）のような炎症および線維症を特徴とする非悪性疾患を有する患者の血清ＹＫＬ−４０は上昇している。
【００１２】
ＹＫＬ−４０はいくつかの型のヒト癌腫（乳房、結腸、肺、腎臓、卵巣、前立腺、子宮、骨肉腫、乏突起膠腫、神経膠芽腫および胚細胞癌）（Ａ  ｓｅａｒｃｈ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＹＫＬ−４０  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｔｈｅ  ｄｂｅｓｔ  ｄａｔａｂａｓｅ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９９２；Ｊｕｎｋｅｒら、２００５ａ）により、およびｎｅｕ／ｒａｓ発癌遺伝子により惹起されるネズミ乳房腫瘍により発現および分泌される（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、１９９４）。マイクロアレイ遺伝子分析によりＹＫＬ−４０遺伝子は甲状腺乳頭癌（Ｈｕａｎｇら、２００１）、高悪性度神経膠腫（Ｔａｎｗａｒら、２００２）および細胞外粘液性軟骨肉腫（Ｓｊｏｇｒｅｎら、２００３）において最も過剰発現される遺伝子の１つとして同定された。ＹＫＬ−４０は骨肉腫細胞系ＭＧ６３、神経膠芽腫細胞および骨髄性白血病細胞系（Ｕ９３７、ＴＨＰ−１、ＨＬ−６０）によりインビトロで発現および分泌される（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９９２；Ｒｅｈｌｉら、２００３；Ｋｉｒｋｐａｔｒｉｃｋら、１９９５；Ｖｅｒｈｏｅｃｋｘら、２００４）。ＹＫＬ−４０は小細胞性肺癌細胞系ではインビトロでもインビボでも発現されないが、小細胞性肺癌生検における腫瘍関連マクロファージにより強く発現される（Ｊｕｎｋｅｒら、２００５ｂ）。
【００１３】
癌患者の血清におけるＹＫＬ−４０タンパク質のレベル上昇は今では多くの研究により報告されている（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９９５；Ｃｉｎｔｉｎら、１９９９；Ｃｉｎｔｉｎら、２００２；Ｔａｎｗａｒら、２００２；Ｂｒａｓｓｏら、２００３；Ｄｅｈｎら、２００３；Ｇｅｅｒｔｓｅｎら、２００３；ＨOｇｄａｌｌら、２００３；Ｊｅｎｓｅｎら、２００３；Ｊｏｈａｎｓｅｎら、２００３；Ｄｕｐｏｎｔら、２００４；Ｊｏｈａｎｓｅｎら、２００４）。いくつかの研究により乳房、結腸直腸、卵巣、腎臓、小細胞性肺および前立腺癌腫の患者でＹＫＬ−４０の血清濃度レベル上昇が、短期再発なし期間および短期全生存の独立した予後パラメーターであることが実証された。この観察は最初の癌診断時および再燃時に局所的なまたは進行した癌を有する患者において成された（Ｊｏｈａｎｓｅｎら、１９９５；Ｃｉｎｔｉｎら、１９９９；Ｃｉｎｔｉｎら、２００２；Ｂｒａｓｓｏら、２００３；Ｄｅｈｎら、２００３；Ｇｅｅｒｔｓｅｎら、２００３；ＨOｇｄａｌｌら、２００３；Ｊｅｎｓｅｎら、２００３；Ｊｏｈａｎｓｅｎら、２００３；Ｄｕｐｏｎｔら、２００４；Ｊｏｈａｎｓｅｎら、２００４）。これらのおよびその他の知見に基づいて、ＹＫＬ−４０は癌の存在または不在ならびに癌再発の予後および癌患者の生存に関する診断マーカーとして示唆され（特許文献１）、そして結合組織の分解のための、および記載された（特許文献２；特許文献３）結合組織の分解に関連する疾患（例えば癌）の同定のための方法において用いられるマーカーとして記載された。後者の方法の双方の群は患者由来の試料中のタンパク質を検出するための抗ＹＫＬ−４０抗体を用いることに基づく。
【００１４】
ＹＫＬ−４０に対する抗体は以前から知られており、例えば癌患者の血清／血漿中のＹＫＬ−４０のレベルの検出およびモニタリングのために用いられてきたが、ＹＫＬ−４０の機能を阻害することができる機能的抗ＹＫＬ−４０抗体は生成されておらず、また記載されていない。
【００１５】
参考文献
【００１６】
【表１】
2008531608.tif 000002
【００１７】
【表２】
2008531608.tif 000003
【００１８】
【表３】
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【００１９】
【表４】
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【００２０】
【表５】
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【００２１】
【表６】
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【００２２】
【表７】
2008531608.tif 000008
【００２３】
【表８】
2008531608.tif 000009
【特許文献１】国際公開第００／１９２０６号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９５／０１９９５号パンフレット
【特許文献３】米国特許第５，９３５，７９８号明細書
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２４】
発明の要旨
本発明はヒトＹＫＬ−４０に対するモノクローナル抗体が細胞成長、細胞分化、細胞生存および転移を有意に阻害することができるという知見に関する。
【００２５】
したがって、一態様では本発明は抗ヒトＹＫＬ−４０抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質に関し、該抗体、結合フラグメントまたはその組換えタンパク質は；
例えば内皮細胞、繊維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球／マクロファージもしくは癌細胞成長のような細胞成長を阻害する；および／または
例えば内皮細胞、繊維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球／マクロファージもしくは癌細胞死のような細胞死を誘導する；および／または
例えば内皮細胞、繊維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、肝星細胞、血管平滑筋細胞、単球／マクロファージもしくは癌細胞分化のような細胞分化を阻害する；および／または
癌細胞転移の可能性を阻害する；
ことができる。
【００２６】
本発明による抗ヒトＹＫＬ−４０モノクローナル抗体は細胞成長、分化、生存および細胞外組織リモデリングに関連するヒトＹＫＬ−４０の機能的活性を阻害することができる。とりわけ本発明は；
癌細胞成長の発達／進行、および／または
癌細胞転移の発達／進行、および／または
癌細胞分化の発達／進行、および／または
癌細胞生存の発達／進行、および／または
血管形成の発達／進行、および／または
細胞外マトリックスリモデリングの発達／進行、および／または
肝臓線維症の発達／進行、および／または
肺線維症の発達／進行、および／または
組織線維症の発達／進行、および／または
器官線維症の発達／進行、および／または
関節リウマチの発達／進行
におけるＹＫＬ−４０の生物学的活性を阻害することができる抗体に関する。
【００２７】
本発明はＹＫＬ−４０の特異的エピトープに結合したときに、前記で述べた過程におけるＹＫＬ−４０の生物学的機能を阻害することができる抗体を特色とする。
【００２８】
したがってさらなる態様では本発明は前記の抗体により認識され得るエピトープに関する。本発明のエピトープは、それが本明細書にて配列番号２、３、４、５、６もしくは７として同定されたいずれかの配列のアミノ酸残基を含むか、または該配列もしくはそのフラグメントの少なくとも１つからなる。本発明によれば該エピトープは結合部位であり、その受容体に対するＹＫＬ−４０の結合部位の一部を構成するか、またはいくつかのその他の分子、例えばヘパリン、ヘパラン硫酸プロテオグリカンもしくはヒアルロナンのような例えばＹＫＬ−４０リガンドと相互作用することによりＹＫＬ−４０による受容体の活性化の支援に関与する。前記で定義したエピトープを認識することができる抗体の；
ｉ）  細胞成長（癌を含む）を阻害する、および／または
ｉｉ）  細胞分化（癌を含む）を阻害する、および／または
ｉｉｉ）  細胞生存（癌を含む）を阻害する、および／または
ｖｉ）  細胞死（癌を含む）を誘導する、および／または
ｖ）  細胞外マトリックスリモデリングの発達／進行を阻害する、および／または
ｖｉ）  肝臓線維症の発達／進行を阻害する、および／または
ｖｉｉ）  関節リウマチの発達／進行を阻害する、および／または
ｖｉｉｉ）  器官線維症の発達／進行を阻害する、および／または
ｉｘ）  組織線維症の発達／進行を阻害する、および／または
ｘ）  血管形成の発達／進行を阻害する、および／または
ｘｉ）  転移を阻害する
ための使用もまた本発明の態様である。本発明はとりわけ癌ならびに／または例えば炎症性疾患および線維症に関連する疾患のような非悪性疾患の処置のための抗体の使用を特色とする。
【００２９】
本発明はまた前記の抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を含む医薬組成物にも関する。
【００３０】
本発明はまた
ｉ）  本発明の抗体の生成、ならびに／または
ｉｉ）  細胞増殖、分化および生存に関連するＹＫＬ−４０受容体の機能的活性を変調すること、ならびに／または
ｉｉｉ）  ＹＫＬ−４０の生物学的機能を変調すること、ならびに／または
ｖｉ）  医薬の製造
のためのエピトープを含むかまたはそれにより含まれるペプチド配列にも関する。
【００３１】
本発明は前記で定義したような抗体および／またはペプチド配列を含む医薬組成物にも関係する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
発明の詳細な説明
抗体
配列番号２−７から選択される少なくとも１つの配列を含むヒトＹＫＬ−４０上のエピトープを認識し、そして選択的に結合できる抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を提供し、そしてそれにより細胞成長、細胞分化、細胞生存および細胞外組織リモデリング過程に関連するＹＫＬ−４０の生物学的活性を阻害することは本発明の目的である。
【００３３】
抗体分子は免疫グロブリンと称される血漿タンパク質のファミリーに属し、その基本単位、免疫グロブリンフォールドまたはドメインは免疫系およびその他の生物学的認識系の多くの分子において種々の形態で用いられる。典型的な免疫グロブリンは可変領域として公知の抗原結合領域および定常領域として公知の不変化領域を含有する４個のポリペプチド鎖を有する。
【００３４】
元来の抗体および免疫グロブリンは通常約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２個の同一の軽（Ｌ）鎖および２個の同一の重（Ｈ）鎖からなる。各軽鎖は１個の共有結合性ジスルフィド結合により重鎖に連結されているが、ジスルフィド連結の数は様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重および軽鎖はまた規則的な間隔で鎖間ジスルフィド橋を有する。各重鎖は一方の末端で１つの可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続く多くの定常ドメインを有する。各軽鎖は一方の末端で１つの可変ドメイン（ＶＬ）およびその他方の末端で１個の定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の最初の定常ドメインと並び、そして軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並ぶ。特定のアミノ酸残基は軽および重鎖可変ドメインの間のインターフェースを形成すると考えられている（Ｎｏｖｏｔｎｙ  ＪおよびＨａｂｅｒ  Ｅ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．８２（１４）：４５９２−６，（１９８５））。
【００３５】
その重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。少なくとも５個の主要な免疫グロブリンのクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭがあり、そしてこれらのうちのいくつかをさらにサブクラス（アイソタイプ）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分けることができる。免疫グロブリンの様々なクラスに相当する重鎖定常ドメインをそれぞれアルファ（α）、デルダ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と称する。抗体の軽鎖をその定常ドメインのアミノ酸配列に基づいてカッパ（κ）およびラムダ（λ）と称される２個の明確に異なる型のうちの１つに割り当てることができる。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置が周知である。
【００３６】
抗体の可変ドメインの局面で「可変」なる用語は、可変ドメインの特定の部分が抗体間で配列が大きく異なるという事実を指す。可変ドメインは結合のためであり、そして各特定の抗体のその特定の抗原に関する特異性を決定する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様に分布されているものではない。それは軽鎖および重鎖可変ドメインの双方で超可変領域としても公知である相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３個のセグメントに集中する。
【００３７】
可変ドメインのさらに高度に保存された部分はフレームワーク（ＦＲ）と称される。元来の重および軽鎖各々の可変ドメインは、主にβシート立体配置をとり、ループ連結を形成する３個のＣＤＲにより連結され、そしてβシート構造の一部を形成している場合もある４個のＦＲ領域を含む。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域により一緒に近接しており、そしてその他の鎖のＣＤＲと共に抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。定常ドメインは抗体の抗原への結合に直接関与しないが、抗体依存性細胞毒性における抗体の関与のような種々のエフェクター機能を呈する。
【００３８】
したがって本発明における使用が企図される抗体は全免疫グロブリン、Ｆｖ、Ｆａｂおよび類似のフラグメントのような抗体フラグメント、可変ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一本鎖抗体等の形態を含む種々の形態のいずれかでよく、その全ては本明細書中で用いられる際には広義の用語「抗体」に入る。本発明は抗体、ポリクローナルまたはモノクローナルの任意の特異性の使用を企図し、そして具体的な抗原を認識およびそれと免疫反応する抗体に限定するものではない。好ましい実施態様では、以下に記載する治療方法およびスクリーニング方法の双方の局面で、本発明の抗原またはエピトープに免疫特異的である抗体またはそのフラグメントを使用する。
【００３９】
「抗体フラグメント」なる用語は全長抗体の一部、一般的には抗原結合または可変領域を指す。抗体フラグメントの実例にはＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントが挙げられる。抗体のパパイン消化によりＦａｂフラグメントと称され、各々が単一の抗原結合部位を有する２個の同一の抗原結合フラグメント、および容易に結晶化するその能力のためにそのように称される残りの「Ｆｃ」フラグメントが生成される。ペプシン処理により抗原を架橋することができる２個の抗原結合フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメント、および残りのその他のフラグメント（それはｐＦｃ’と称される）を生じる。さらなるフラグメントにはダイアボディー、直鎖抗体、一本鎖抗体分子および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体が含まれ得る。本明細書中で使用される際には抗体に関する「機能的フラグメント」とはＦｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２フラグメントを指す。
【００４０】
本明細書では「抗体フラグメント」なる用語は「抗原結合フラグメント」と互換的に使用される。
【００４１】
抗体フラグメントは約４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、９個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約１７個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸、またはそれより多いくらいの小型でよい。一般に本発明の抗体フラグメントはそれが、
配列番号１の８３−９０、９６−１０５、１３７−１５０、２１０−２２０、３０４−３１４および／もしくは３１８−３２９または本明細書で配列番号２−７として同定されたいずれかの配列から選択されるペプチド配列、または該配列のフラグメントを含むエピトープに対して特異性を有して結合する抗体に相対して類似のまたは免疫学的な特質を有する限り、任意のサイズ上限を有し得る。したがって本発明の局面では「抗体フラグメント」なる用語は「抗原結合フラグメント」なる用語と同一である。
【００４２】
抗体フラグメントはその抗原または受容体と選択的に結合するいくらかの能力を保持する。抗体フラグメントのいくつかの型を以下で定義する：
（１）Ｆａｂは抗体分子の一価の抗原結合フラグメントを含有するフラグメントである。Ｆａｂフラグメントは全抗体を酵素パパインで消化して無傷の軽鎖および１本の重鎖の一部を生じることにより生成することができる。
（２）Ｆａｂ’は全抗体をペプシンで処理し、続いて還元して無傷の軽鎖および１本の重鎖の一部を生じることにより得ることができる。抗体分子あたり２個のＦａｂ’フラグメントが得られる。
【００４３】
Ｆａｂ’フラグメントは抗体ヒンジ領域からの１個またはそれより多いシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端で数個の残基が加えられていることによりＦａｂフラグメントとは異なる。
（３）Ｆ（ａｂ’）２は全抗体を酵素ペプシンで処理するが続いて還元しないことにより得ることができる抗体のフラグメントである。
（４）Ｆ（ａｂ’）２は２個のジスルフィド結合により一緒になっている２個のＦａｂ’フラグメントの二量体である。
【００４４】
Ｆｖは完全抗原認識および結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。この領域は堅固な非共有結合的に会合した１個の重および１個の軽鎖可変ドメイン（ＶＨ−ＶＬ二量体）からなる。各可変ドメインの３個のＣＤＲが相互作用するこの立体配置でＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位が定義される。合計で６個のＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ抗原を認識しそして結合する能力を有するが、全結合部位よりも親和性は低い。
（５）一本鎖抗体（「ＳＣＡ」）は軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有し、遺伝子融合された一本鎖分子として適当なポリペプチドリンカーにより連結された、遺伝子操作された分子として定義される。かかる一本鎖抗体はまた「一本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントとも称される。一般的にＦｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが抗原結合に望ましい構造を形成することを可能にするＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの概説に関してはＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  １１３：２６９−３１５、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編、スプリンガー・ヴェルラグ、ニューヨーク州、１９９４年のＰｌｕｃｋｔｈｕｎを参照されたい。
【００４５】
「ダイアボディー」なる用語は２個の抗原結合部位を有する小型の抗体フラグメントを指し、そのフラグメントは同一のポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）で軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。短すぎて同一鎖で２個のドメイン間で対を為すことができないリンカーを使用することにより、ドメインは別の鎖の相補的ドメインと対を為さざるを得ず、そして２個の抗原結合部位を創成する。ダイアボディーは例えば欧州特許第４０４，０９７号；国際公開公報第９３／１１１６１号およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）においてさらに十分に記載されている。
【００４６】
本発明はヒトＹＫＬ−４０に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体の双方、抗原結合フラグメントならびに本発明による少なくとも１つの機能的活性を保持する組換えタンパク質を企図する。
【００４７】
ポリクローナル抗体の調製は当業者に周知である。例えばＩｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍａｎｓｏｎ編）、１−５頁（ヒューマンプレス）のＧｒｅｅｎら（１９９２）「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ」；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、セクション２．４．１のＣｏｌｉｇａｎら、「Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｓｅｒａ  ｉｎ  Ｒａｂｂｉｔｓ，Ｒａｔｓ，Ｍｉｃｅ  ａｎｄ  Ｈａｍｓｔｅｒｓ」（これらは出典明示により本明細書の一部とする）を参照されたい。
【００４８】
同様にモノクローナル抗体の調製は従来どおりである。例えばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−７（１９７５）；Ｃｏｌｉｇａｎら、セクション２．５．１−２．６．７；およびＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＭａｎｕａｌのＨａｒｌｏｗら、７２６頁、コールドスプリングハーバー出版（１９８８）参照。種々の十分に確立された技術によりモノクローナル抗体をハイブリドーマ培養から単離および精製することができる。かかる単離技術にはプロテインＡセファロースを用いるアフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィーおよびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：７９−１０４（１９９２）、ヒューマンプレス、ニューヨーク州のＣｏｌｉｇａｎら、セクション２．７．１−２．７．１２およびセクション２．９．１−２．９．３；Ｂａｒｎｅｓら、「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ（ＩｇＧ）」参照。
【００４９】
モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボ操作の方法は当業者に周知である。例えば本発明にしたがって用いられるモノクローナル抗体を、最初にＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−７（１９７５）により記載されたハイブリドーマ法により作ることができるか、または米国特許第４，８１６，５６７号に記載されるような組換え法により作ることができる。本発明で使用するためのモノクローナル抗体をＣｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓら、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載される技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。ヒト特異的および認識可能な配列を含有する抗体を作成するための別の方法は、組換え手段によりモノクローナル抗体をヒト化することを伴う。概説に関してはＨｏｌｍｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：２１９２−２２０１（１９９７）およびＶａｓｗａｎｉら、Ａｎｎａｌｓ  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８１：１０５−１１５（１９９８）を参照されたい。
【００５０】
本明細書で使用される際には「モノクローナル抗体」なる用語は実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち集団を含む個々の抗体は微量で存在し得る可能な天然発生変異を除けば同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対して指向する。さらに典型的には様々な決定基（エピトープ）に対して指向する様々な抗体を含む従来のポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一の決定基に対して指向する。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はその他の免疫グロブリンにより夾雑されることなくハイブリドーマ培養により合成される点で有利である。修飾語句「モノクローナル」は実質的に均質な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、そして任意の特定の方法による抗体の生成を必要とするとは解釈すべきでない。
【００５１】
本明細書のモノクローナル抗体は具体的には、重および／または軽鎖の一部が特定の種から誘導されたかまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるかまたは相同であるが、残りの（複数の）鎖は別の種から誘導されたかまたは別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、およびそれらが望ましい生物学的活性を呈する限りかかる抗体のフラグメントの対応する配列と同一であるかまたは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許第４，８１６，５６７号）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ８１：６８５１−６８５５（１９８４）。
【００５２】
抗体フラグメントを作成する方法もまた当分野において公知である（例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールドスプリングハーバーラボラトリー、ニューヨーク州、１９８８年（出典明示により本明細書の一部とする）参照）。本発明の抗体フラグメントを抗体のタンパク質溶解性加水分解により、またはそのフラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌における発現により調製することができる。従来の方法の全抗体のペプシンまたはパパイン消化により抗体フラグメントを得ることができる。例えばペプシンでの抗体の酵素的切断により抗体フラグメントを生成して、Ｆ（ａｂ‘）２と示される５Ｓフラグメントを提供することができる。チオール還元剤および場合によってはジスルフィド連結の切断の結果得られるスルフヒドリル基の遮断基を用いてこのフラグメントをさらに切断して３．５ＳＦａｂ’一価フラグメントを生成することができる。これに代えて、ペプシンを用いる酵素的切断により２個の一価Ｆａｂ’フラグメントおよびＦｃフラグメントを直接生成する。これらの方法は例えば米国特許第４，０３６，９４５号および米国特許第４，３３１，６４７号、ならびにそこに含まれる参照文献に記載されている。これらの特許はその全てを出典明示により本明細書の一部とする。
【００５３】
無傷の抗体により認識される抗原にフラグメントが結合する限り、一価軽重鎖フラグメントを形成するための重鎖の分離のような抗体の切断、さらにフラグメントの切断、またはその他の酵素的、化学的もしくは遺伝学的技術をも用いることができる。例えばＦｖフラグメントはＶＨおよびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は非共有結合的でよいか、または可変鎖は分子間ジスルフィド結合により連結されるか、またはグルタルアルデヒドのような化学物質により架橋され得る。好ましくは、Ｆｖフラグメントはペプチドリンカーにより連結されたＶＨおよびＶＬ鎖を含む。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドにより連結されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。構造遺伝子を発現ベクターに挿入し、それを続いて大腸菌のような宿主細胞に導入する。組換え宿主細胞は２個のＶドメインを橋渡しするリンカーペプチドを有する単一のポリペプチド鎖を合成する。ｓＦｖを生成するための方法は例えばＷｈｉｔｌｏｗら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：９７（１９９１）；Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）；米国特許第４，９４６，７７８号；およびＰａｃｋら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １１：１２７１−７７（１９９３）により記載されている。
【００５４】
抗体フラグメントの別の形態は単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識単位」）はしばしば抗原認識および結合に関与する。目的の抗体のＣＤＲをコードする遺伝子をクローニングまたは構築することによりＣＤＲペプチドを得ることができる。例えば抗体生成細胞のＲＮＡからの可変領域を合成するためのポリメラーゼ連鎖反応を用いることによりかかる遺伝子を調製する。例えばＬａｒｒｉｃｋら、Ｍｅｔｈｏｄｓ：ａ  Ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２：１０６（１９９１）参照。
【００５５】
本発明はヒトおよびヒト以外の（例えばネズミ抗体）のヒト化形態の抗体を企図する。かかるヒト化抗体は、エピトープ認識配列のようなヒト以外の免疫グロブリンから誘導された最小配列を含有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体のその他の抗原結合配列のような）である。大部分のヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、そこでレシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は望ましい特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのようなヒト以外の種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置き換えられる。本明細書に記載する（複数の）エピトープを認識する（複数の）配列のような本発明の（複数の）抗体の（複数の）最小配列を含有する（複数の）ヒト化抗体は本発明の好ましい実施態様である。とりわけ本発明はマウス抗ヒトＹＫＬ−４０モノクローナル抗体２０１Ｆ９および１１６Ｆ９のヒト化形態に関する。
【００５６】
ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は対応するヒト以外の残基により置き換えられる場合もある。さらにヒト化抗体はレシピエント抗体でも移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列でも見出されない残基を含み得る。抗体の性能をさらに精巧にし、そして最適化するためにこれらの修飾を行う。一般にヒト化抗体は少なくとも１個、および典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てを含み、そこでＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒト以外の免疫グロブリンのものに相当し、そしてＦＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体は最適には免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含む。さらに詳細にはＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）；Ｐｒｅｓｔａ、Ｃｕｒｒ  Ｏｐ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２：５９３−５９６（１９９２）；Ｈｏｌｍｅｓら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５８：２１９２−２２０１（１９９７）およびＶａｓｗａｎｉら、Ａｎｎａｌｓ  Ａｌｌｅｒｇｙ，  Ａｓｔｈｍａ  ＆  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８１：１０５−１１５（１９９８）を参照されたい。
【００５７】
天然または組換えヒトＹＫＬ−４０ポリペプチドまたはそのフラグメントを抗原として使用してポリクローナルおよびモノクローナル抗体を生成するための当分野で任意の標準的な方法により抗体の作成を達成することができる。好ましい実施態様ではかかる抗体は本明細書にて配列番号１として同定された、天然発生または組換え生成されたヒトＹＫＬ−４０（スイスプロット受け入れ番号：Ｐ３６２２２）またはそのバリアントもしくはフラグメントを用いて、さらに好ましい実施態様では該ポリペプチドのフラグメントを用いて作成され、該フラグメントは以下の基準の少なくとも２つに合致する免疫原性フラグメントである：
（ｉ）少なくとも５個のアミノ酸の隣接アミノ酸配列である；
（ｉｉ）配列番号１として同定された配列から誘導されたアミノ酸配列を含む；または
（ｉｉｉ）配列番号２−７で同定されたアミノ酸配列もしくはそのフラグメントを含む。
【００５８】
処置される抗体により、例えば本発明による免疫原性免疫原性フラグメントを該個体に投与することにより抗体をインビボで生成することもできる。したがって、本発明はさらに前記で記載した免疫原性フラグメントを含むワクチンに関する。
【００５９】
本出願はまた本発明の抗体を生成するための方法にも関し、該方法は本明細書で記載したＹＫＬ−４０またはＹＫＬ−４０の免疫原性フラグメントを提供する工程を含む。
【００６０】
本発明は細胞成長、分化、生存、転移可能性および例えば線維症の発達を伴う細胞外マトリックスリモデリングのような組織リモデリングに関連したＹＫＬ−４０の生物学的機能を阻害することができる抗体に関する。一実施態様ではかかる抗体は抗ヒトＹＫＬ−４０抗体もしくは抗体フラグメントまたはその組換えタンパク質でよく、それは配列番号１のアミノ酸残基８３−９０、９６−１０５、１３７−１５０、２１０−２２０、３０４−３１４および／もしくは３１８−３２９、または配列番号２−７から選択される配列、または該配列のフラグメントを含むエピトープに結合することができる。好ましくはエピトープは配列ＹＫＬ−４０（配列番号１）内に位置する。
【００６１】
別の実施態様では本発明は、抗ヒトＹＫＬ−４０抗体ではない抗体に関し、該抗体は前記の抗ヒトＹＫＬ−４０抗体により認識されるエピトープを認識し、そしてそれに結合することができる。
【００６２】
さらに別の実施態様では、本発明は本明細書に記載したエピトープに結合し、そしてそれにより
癌細胞成長の発達／進行、および／または
癌細胞分化の発達／進行、および／または
癌細胞生存の発達／進行、および／または
癌細胞転移の発達／進行、および／または
血管形成の発達／進行、および／または
細胞外マトリックスリモデリングの発達／進行、および／または
肝臓線維症の発達／進行、および／または
肺線維症の発達／進行、および／または
組織線維症の発達／進行、および／または
器官線維症の発達／進行、および／または
関節リウマチの発達
に関連するＹＫＬ−４０の機能を阻害することができる非抗体化合物に関する。
【００６３】
「エピトープ」なる用語は（抗原の）抗体（それにより免疫応答を引き起こす）により認識される（その抗原分子上の）特異的な原子の群を意味する。「エピトープ」なる用語は「抗原結合基」なる用語と等価である。エピトープは隣接アミノ酸配列内のように近接して位置するか、または抗原のアミノ酸配列の遠位部分に位置する例えば４、５、６、７、８個のアミノ酸残基のような３個またはそれより多いアミノ酸残基を含むことができるが、タンパク質フォールディングのために互いに接近している。
【００６４】
本発明は
１）配列番号１のアミノ酸残基８３−９０、９６−１０５、１３７−１５０、２１０−２２０、３０４−３１４および／もしくは３１８−３２９；
から選択され、
２）配列番号２−７もしくはそのフラグメントから選択される配列からなるか、または
３）配列番号２−７の配列のいずれかから誘導されたアミノ酸残基の組み合わせを含む、
少なくとも３個のアミノ酸残基を含むエピトープに関する。
【００６５】
好ましい実施態様では、エピトープはヒトＹＫＬ−４０に位置し、３から６個のアミノ酸残基のものであり、そしてＧ、Ａ、Ｗ、Ｓ、Ｒ、Ｔおよび／またはＫを含む。
【００６６】
好ましくは本発明は前記のエピトープを認識し、そしてそれに結合する能力を特徴とするヒトＹＫＬ−４０に対するモノクローナル抗体に関する。
【００６７】
さらにとりわけ本発明は好ましくはモノクローナル抗体１１５Ｆ９、１１６Ｆ９および２０１Ｆ９として同定される機能的に活性なマウス抗ヒトＹＫＬ−４０モノクローナル抗体の群に関する。
【００６８】
本発明によれば抗体１１５Ｆ９、１１６Ｆ９および２０１Ｆ９は前記で定義したようなエピトープに結合することができ、そしてそれにより本明細書に記載したＹＫＬ−４０タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を阻害することにより細胞成長および生存に関連するＹＫＬ−４０の機能を阻害する。
【００６９】
機能的に活性な抗体
したがって本発明は、配列番号２−７として同定された配列、そのフラグメントのいずれか、該抗体、ヒトＹＫＬ−４０もしくはＹＫＬ−４０機能的相同体の少なくとも１つの生物学的活性を変調することができる抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質、またはその機能的フラグメントから選択される配列を含むかまたはそれからなるエピトープを認識することができる抗体、抗原結合フラグメント、またはその組換えタンパク質に関し、該活性はｉ）細胞成長、ｉｉ）細胞生存、ｉｉｉ）細胞分化、ｖｉ）細胞外マトリックスリモデリング、ｖ）肝臓線維症の発達、ｖｉ）組織線維症の発達、ｖｉｉ）器官線維症の発達、ｖｉｉｉ）血管形成の発達、ｉｘ）関節リウマチの発達、ｘ）炎症の発達、および／またはｘｉ）転移の発達に関連している。
【００７０】
好ましい実施態様では抗体は抗ヒトＹＫＬ−４０モノクローナル抗体である。
【００７１】
「細胞成長」なる用語は本明細書では「細胞増殖」なる用語と互換的に用いられ、そして細胞分割により細胞数が大幅に増加する現象を指す。
【００７２】
「細胞生存」なる用語は、特に死にそうになるかまたは破壊されそうになった後に、または例えば細胞恒常性に影響してアポトーシスによる細胞自己破壊を誘導する因子でのような不適切に処置された後に、生存または存在し続ける細胞の現象を指す。「細胞生存の阻害／刺激」なる表現は本明細書では「アポトーシス／細胞死の刺激／阻害」なる表現と互換的に用いられる。
【００７３】
本内容では「ＹＫＬ−４０機能的相同体」なる表現は：
前記で定義されるヒトＹＫＬ−４０の免疫原性フラグメントの１つを含む；
細胞成長、生存、分化、アポトーシス、血管形成、細胞外マトリックスリモデリング、転移の発達、肝臓線維症の発達、組織線維症の発達、器官線維症の発達、関節リウマチの発達および／または炎症の発達に関連するＹＫＬ−４０生物学的活性の少なくとも１つが可能である；
本発明の抗体、好ましくはモノクローナル抗体１１５Ｆ９、１１６Ｆ９および／または２０１Ｆ９により認識され得る；
ポリペプチドを意味する。
【００７４】
本内容では「変調する」なる用語は抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質がヒトＹＫＬ−４０またはその機能的相同体またはその生物学的に活性なフラグメントの生物学的活性を増強または減少させることができることを意味する。好ましい実施態様では、本発明は細胞増殖、細胞成長、細胞分化、細胞生存の刺激、細胞の接着および／または運動性の変調のようなＹＫＬ−４０の少なくとも１つの生物学的活性を変調することができる抗体、抗原結合フラグメント、またはその組換えタンパク質を特性とする。好ましい実施態様では細胞は腫瘍細胞である。腫瘍細胞は好ましい実施態様では癌細胞または血液学的に悪性の細胞である。癌細胞は原発性または転移性のいずれかの癌に由来してよい。
【００７５】
「原発性癌」とは癌細胞の少なくとも１つの特徴的な特性を獲得しているが、未だ近隣組織に浸潤しておらず、そして原発巣の場所で局在する腫瘍に一緒にある腫瘍細胞の群を意味する。「転移性癌」とは原発性癌の細胞に由来し、該原発性癌を取り巻く組織に浸潤しており、身体中に散在し、新しい離れた場所で接着し、そして新しい腫瘍に成長した腫瘍細胞の群を意味する。
【００７６】
本発明の原発性および転移性癌の実例には、限定するものではないが乳房、結腸直腸、膵臓、胃、消化管間質性腫瘍（ＧＩＳＴ）、肝細胞、肺、小細胞性肺、卵巣、子宮、子宮頸、膀胱、腎臓、前立腺、精巣の癌腫、甲状腺癌、悪性メラノーマ、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、頭部／頸部その他の胃腸管系および胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍が挙げられる。
【００７７】
本発明による機能的抗体は増殖、分化を変調し、そして／または原発性および転移性癌細胞の双方の細胞生存に影響し、好ましくは該細胞の細胞成長／増殖／分化を阻害し、そして／または該細胞のアポトーシス／細胞死を誘導／刺激することができる。ヒトＹＫＬ−４０の生物学的活性は内皮細胞、線維芽細胞、滑膜細胞、軟骨細胞、血液細胞（例えば単球／マクロファージ、好中球および前駆細胞）、肝星細胞、血管平滑筋細胞、上皮細胞のような非癌細胞の増殖および生存の刺激において重要な役割を果たすことが以前から示されているので、その他の実施態様では本発明の機能的抗体はまたこれらの細胞の増殖を変調し、そして／または細胞生存に影響することができる。かかるＹＫＬ−４０生物学的活性の実例を、限定するものではないが、
ｉ）キチンの結合
ｉｉ）ヘパリンの結合
ｉｉｉ）硫酸ヘパランの結合
ｉｖ）ヒアルロナンの結合
ｖ）長いおよび／もしくは短いオリゴ糖の結合
ｖｉ）細胞成長因子としての役割
ｖｉｉ）細胞の化学誘引物質としての役割
ｖｉｉｉ）ヒアルロナンの合成との干渉
ｉｘ）細胞生存に関連するシグナル伝達経路の刺激
ｘ）分化の刺激
ｘｉ）血管形成の刺激
ｘｉｉ）線維形成の刺激
ｘｉｉｉ）細胞外マトリックスリモデリングの刺激ならびに／または
ｘｉｖ）炎症の刺激
のＹＫＬ−４０の能力から選択することができる。
【００７８】
したがって本明細書に記載する（複数の）エピトープを特異的に認識する本発明の機能的に活性な抗体、そのその抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質は前記のＹＫＬ−４０の生物学的活性のいずれか、好ましくは細胞増殖または生存に影響する過程に関連する任意の活性を変調することができる。
【００７９】
抗体１１５Ｆ９、１１６Ｆ９および２０１Ｆ９は、前記したＹＫＬ−４０活性のいずれか１つまたは活性の２つもしくはそれより多くを変調することができる本発明の好ましい機能的に活性な抗体である。
【００８０】
ペプチドフラグメント
本発明のエピトープを配列番号１の３から６個のアミノ酸残基により表すことができ、該アミノ酸残基は好ましくは配列番号１の配列によるアミノ酸残基８３−９０、９６−１０５、１３７−１５０、２１０−２２０、３０４−３１４および／または３１８−３２９を含むＹＫＬ−４０の部分に位置し、ここで好ましいアミノ酸残基はＧ、Ａ、Ｗ、Ｓ、Ｒ、Ｔおよび／またはＫである。またエピトープを配列番号２−７から選択される配列またはそのフラグメントのような配列番号１の配列から誘導された隣接アミノ酸配列により表すことができる。
【００８１】
したがって、本発明の一態様は以下：
【００８２】
【化１】
2008531608.tif 000010
またはそのフラグメントもしくはそのバリアント
の同定された配列の少なくとも１つを含むかまたはそれからなる（複数の）エピトープに関係する。
【００８３】
本発明による前記の配列はヒトＹＫＬ−４０の免疫原性フラグメントであり、そしてこれらの配列の少なくとも１つを含むかまたはそれからなるエピトープは前記の本発明の機能的抗体により認識される。したがって、一態様では前記で同定されたペプチドフラグメントを用いて本発明の機能的抗体を上昇させることができる。
【００８４】
本発明の別の態様ではペプチドフラグメントを、受容体の結合部位でＹＫＬ−４０タンパク質と競合することができるＹＫＬ−４０受容体の代替えリガンドとして用いることができる。ペプチドフラグメントのＹＫＬ−４０受容体に対する競合結合は、受容体結合および活性化により実行されるＹＫＬ−４０の機能を減弱させることができる。したがってペプチドフラグメントを、受容体結合により実行されるＹＫＬ−４０タンパク質の機能を阻害するための化合物として用いることができる。好ましくはペプチドフラグメントを用いて
ｉ）細胞成長の刺激
ｉｉ）細胞生存の刺激
ｉｉｉ）細胞増殖の刺激
ｉｖ）細胞分化の刺激
ｖ）細胞外マトリックスリモデリングの刺激
ｖｉ）肝臓線維症の発達の刺激
ｖｉｉ）器官線維症の発達の刺激
ｖｉｉｉ）組織線維症の発達の刺激
ｉｘ）関節リウマチの発達の刺激
ｘ）転移の発達の刺激
ｘｉ）血管形成の刺激
ｘｉｉ）炎症の刺激
の過程に関連するＹＫＬ−４０の機能を阻害できる。
【００８５】
本出願ではアミノ酸残基の標準的な一文字コードおよび標準的な三文字コードを適用する。アミノ酸の略語はＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  １８４：９−３７（１９８４）のＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ合同委員会での推奨に従う。記載および請求の範囲全体で天然アミノ酸に関して三文字コードまたは一文字コードのいずれかを用いる。ＬまたはＤ体が明記されていない場合、問題のアミノ酸は天然Ｌ体（Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．５６（５）５９５−６２４（１９８４）参照）、またはＤ体を有すると理解されるべきであり、それで形成されたペプチドはＬ体、Ｄ体またはＬ体およびＤ体が混合された配列から構成され得る。
【００８６】
明記されていない場合、本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸は遊離のカルボキシル酸として存在すると理解されるべきであり、これをまた「−ＯＨ」として明記することもできる。しかしながら本発明の化合物のＣ末端アミノ酸はアミド化誘導体でよく、それは「−ＮＨ２」として示される。他に記載されない場合、ポリペプチドのＮ末端アミノ酸は遊離アミノ基を含み、これはまた「Ｈ−」として明記され得る。
【００８７】
他に記載されない場合、アミノ酸は天然発生であってもなくても、アルファアミノ酸、ベータアミノ酸および／またはガンマアミノ酸のような任意のアミノ酸から選択され得る。したがってその群は限定するものではないが：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｌｂ、Ｎａｌ、Ｓａｒ、Ｏｒｎ、リジン類似体、ＤＡＰ、ＤＡＰＡおよび４Ｈｙｐを含む。
【００８８】
本発明によれば塩基性アミノ酸残基はアミノ酸Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓの残基により、酸性アミノ酸残基はアミノ酸ＧｌｕおよびＡｓｐの残基により表される。塩基性アミノ酸残基は荷電アミノ酸残基の群から構成される。疎水性アミノ酸残基の群はアミノ酸Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＭｅｔの残基により表される。
【００８９】
本発明によれば、例えばアミノ酸のグリコシル化および／またはアセチル化のようなペプチドの修飾を実施することができる。
【００９０】
一実施態様では、バリアントは、保存的置換を含む挿入、欠失および置換の数および範囲が増加するので、好ましい予め決定された配列から徐々に異なっているアミノ酸配列を呈するとして理解され得る。この差異は予め決定された配列とバリアントとの間の相同性の低下として測定される。
【００９１】
本発明によれば、ペプチド配列は５個またはそれより多いアミノ酸残基の長さを有し得る。６−８個のアミノ酸残基の長さが好ましく、本発明のエピトープ／免疫原性フラグメントは好ましくは６−８個のアミノ酸残基を含む。しかしながら例えば４、５または６個のような３から７個のアミノ酸残基からなる前記の配列の免疫原性フラグメントもまた本発明の範囲内である。
【００９２】
本発明のペプチドフラグメントのアミノ酸残基の数に関する上限は変化し得る。したがって本発明の免疫原性フラグメントを含むペプチドフラグメントは２５０個までのアミノ酸残基の長さを有し得る。例えばそれは５から１２５個のような５から１５０個のアミノ酸残基、例えば５から８０個のような５から１００個、例えば５から６５個、５から５０個、５から３０個または５から２０個を含み得る。
【００９３】
したがって本発明はまた８から２０個のような８から２５個、例えば８から１５のアミノ酸残基を含むかまたはそれからなるペプチドフラグメントを特性とする。その他の実施態様ではペプチドフラグメントの長さは１２から２５個のような１０から２５個、例えば１４から２５個でよいか、またはそれは１４から２０個もしくは１４から１８個のアミノ酸残基でよい。いくつかの実施態様では本発明の免疫原性配列（配列番号２−７）を含むペプチドフラグメントは２６から５０個のアミノ酸残基のような２５個を超えるアミノ酸残基、例えば２８−３０、３１−３５、３６−４０、４１−４５または４６−４９個のアミノ酸残基からなり得る。
【００９４】
全ての前記のペプチドフラグメントは配列番号２−７またはそのフラグメントもしくはバリアントから選択される配列の少なくとも１つを含むかまたはそれからなることは理解される。
【００９５】
本発明のペプチドフラグメントは一を超える配列番号２−７の免疫原性配列またはそのフラグメントもしくはバリアントを含むかまたはそれからなり得る。ペプチドフラグメントを単量体として処方することができる。これは、それらを免疫原性配列を含む個々のペプチド配列のシングルコピーとして表すことができることを意味する。ペプチドフラグメントはまた同一配列の一を超えるコピーを含むかまたはそれからなり得る。したがって本発明はまた前記の個々のペプチド配列の重合体にも関する。ペプチド配列の重合体を単一のペプチド鎖により表すことができ、ここで個々のペプチド配列は鎖内で２回またはそれより多く繰り返されるか、またはそれは分子でよく、ここで個々のペプチド配列のコピーはリンカー基を介して互いに連結されている。かかる重合体の非限定的な実例はデンドリマー重合体でよく、ここでペプチド配列の個々のコピーはリジンのようなコア分子に付着している。
【００９６】
化合物は２個またはそれより多い異なる本発明の免疫原性配列を含むかまたはそれからなり得る。
【００９７】
本発明の免疫原性配列を含むペプチドフラグメントは該配列のバリアントを含むかまたはそれからなり得る。
【００９８】
「ペプチド配列のバリアント」とは例えば１個またはそれより多いアミノ酸残基の置換によりペプチドを修飾することができることを意味する。Ｌアミノ酸およびＤアミノ酸の双方を用いることができる。その他の修飾はエステル、糖等のような誘導体を含み得る。実例はメチルおよびアセチルエステルである。反復配列のような重合化または種々キャリヤ、例えば４個のペプチド、８個のペプチド、１６個のペプチドもしくは３２個のペプチドを担持するリジンデンドリマーのようなリジンバックボーンへの付着は当分野において周知である。その他のキャリヤはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）または親油性デンドリマーまたは親油性誘導体により形成されたミセル様キャリヤまたはスターバースト（星状）炭素鎖重合体包合体またはジエチルアミノメタンの誘導体に基づくリガンド提示集合体（ＬＰＡ）のようなタンパク質部分でよい。
【００９９】
本発明によるペプチドフラグメントのバリアントは同一バリアントもしくはそのフラグメント内または異なるバリアントもしくはそのフラグメント間で、互いに独立して導入された複数の置換のような少なくとも１つの置換を含み得る。したがって複合体のバリアントまたはそのフラグメントは互いに独立した保存的置換を含み、ここで該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のグリシン（Ｇｌｙ）はＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のアラニン（Ａｌａ）がＧｌｙ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のバリン（Ｖａｌ）がＧｌｙ、Ａｌａ、ＬｅｕおよびＩｌｅからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のロイシン（Ｌｅｕ）がＧｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＩｌｅからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のイソロイシン（Ｉｌｅ）がＧｌｙ、Ａｌａ、ＶａｌおよびＬｅｕからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のアスパラギン酸（Ａｓｐ）がＧｌｕ、ＡｓｎおよびＧｌｎからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のアスパラギン（Ａｓｎ）がＡｓｐ、ＧｌｕおよびＧｌｎからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のグルタミン（Ｇｌｎ）がＡｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてここで該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のフェニルアラニン（Ｐｈｅ）がＴｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏからなるアミノ酸の群から選択され、そして好ましくはＴｙｒおよびＴｒｐからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のチロシン（Ｔｙｒ）がＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓ、Ｐｒｏからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸、好ましくはＰｈｅおよびＴｒｐからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該フラグメントの少なくとも１個のアルギニン（Ａｒｇ）がＬｙｓおよびＨｉｓからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のリジン（Ｌｙｓ）がＡｒｇおよびＨｉｓからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のプロリン（Ｐｒｏ）がＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＨｉｓからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換され、そしてそれとは独立してバリアントまたはそのフラグメントでは、該バリアントまたはそのフラグメントの少なくとも１個のシステイン（Ｃｙｓ）がＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＴｈｒおよびＴｙｒからなるアミノ酸の群から選択されるアミノ酸で置換される。
【０１００】
前記のことからペプチドフラグメントの同一機能等価物または該機能等価物のフラグメントは本明細書前記で定義したような保存アミノ酸の一を超える群からの一を超える保存アミノ酸置換を含み得る。「保存アミノ酸置換」なる用語は「相同アミノ酸置換」なる用語の同義語として用いられる。保存アミノ酸の群は以下のとおりである：
Ｐ、Ａ、Ｇ、Ｓ、Ｔ（中性、弱疎水性）
Ｑ、Ｎ、Ｅ、Ｄ、Ｂ、Ｚ（親水性、アミン酸）
Ｈ、Ｋ、Ｒ（親水性、塩基性）
Ｌ、Ｉ、Ｖ、Ｍ、Ｆ、Ｙ、Ｗ（疎水性、芳香族）
Ｃ（架橋形成）
保存的置換を本発明の好ましい予め決定されたペプチドまたはそのフラグメントの任意の位置に導入することができる。しかしながら非保存的置換、特に限定するものではないが任意の１つまたはそれより多い位置での非保存的置換を導入することも望ましいかもしれない。
【０１０１】
本発明のペプチドの機能等価フラグメントの形成に至る非保存的置換は、例えば極性、例えばＧｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、ＡｓｎもしくはＧｌｎのような極性側鎖を有する残基またはＡｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇもしくはＬｙｓのような荷電アミノ酸を置換した非極性側鎖（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＰｈｅまたはＭｅｔ）を有する残基、または非極性のものを荷電したもしくは極性の残基で置換することで実質的に異なり；および／またはｉｉ）ＰｒｏもしくはＧｌｙでの置換またはそれの別の残基での置換のようなペプチドバックボーン配向に及ぼすその影響で実質的に異なり；および／またはｉｉｉ）電荷、例えばＬｙｓ、ＨｉｓもしくはＡｒｇのような正に荷電した残基のＧｌｕもしくはＡｓｐのような負に荷電した残基での置換（およびその逆もまた同様）で実質的に異なり；および／またはｉｖ）立体構造の大きさ、例えば小さい側鎖、例えばＡｌａ、ＧｌｙもしくはＳｅｒを有するもののＨｉｓ、Ｔｒｐ、ＰｈｅもしくはＴｙｒのような大きな残基での置換（およびその逆もまた同様）で異なる。
【０１０２】
アミノ酸の置換は一実施態様ではその疎水性および親水性の値ならびに荷電、大きさ等を含むアミノ酸側鎖置換の相対的類似性に基づいて行われる。種々の前記の特徴を考慮に入れたアミノ酸置換の実例は当業者に周知であり、そして：アルギニンおよびリジン；グルタミン酸およびアスパラギン酸；セリンおよびスレオニン；グルタミンおよびアスパラギン；ならびにバリン、ロイシンおよびイソロイシンが含まれる。
【０１０３】
ｉ）細胞成長の刺激、および／または
ｉｉ）細胞増殖の刺激、および／または
ｉｉｉ）細胞生存の刺激、および／または
ｉｖ）細胞分化の刺激、および／または
ｖ）転移の発達の刺激、および／または
ｖｉ）細胞外マトリックスのリモデリングの刺激、および／または
ｖｉｉ）肝臓線維症の発達の刺激、および／または
ｖｉｉｉ）器官線維症の発達の刺激、および／または
ｉｘ）組織線維症の発達の刺激、および／または
ｘ）関節リウマチの発達の刺激、および／または
ｘｉ）血管形成の刺激、および／または
ｘｉｉ）炎症の刺激
の過程に関連するＹＫＬ−４０の機能は以下のＹＫＬ−４０の生物学的活性：
ｉ）キチンの結合、ならびに／または
ｉｉ）ヘパリンの結合、ならびに／または
ｉｉｉ）硫酸ヘパリンの結合、ならびに／または
ｉｖ）ヒアルロナンの結合、ならびに／または
ｖ）長いおよび／もしくは短いオリゴ糖の結合、ならびに／または
ｖｉ）細胞成長因子としての役割、ならびに／または
ｖｉｉ）細胞分化因子としての役割、ならびに／または
ｖｉｉｉ）細胞の化学誘引物質としての役割、ならびに／または
ｉｘ）ヒアルロナンの合成との干渉、ならびに／または
ｘ）細胞外マトリックスリモデリングとの干渉、ならびに／または
ｘｉ）細胞生存に関連するシグナル伝達経路の刺激、ならびに／または
ｘｉｉ）血管形成の刺激、ならびに／または
ｘｉｉｉ）炎症との干渉、ならびに／または
ｘｉｖ）線維形成の刺激、
から選択することができる。
【０１０４】
本発明によるこれらのＹＫＬ−４０の生物学的機能は以下の配列：
【０１０５】
【化２】
2008531608.tif 000011
の少なくとも１つを含むかまたはそれからなるタンパク質の構造部分を伴って実行される。
【０１０６】
本発明によれば、配列番号２−７全てまたはそれの少なくとも１つはＹＫＬ−４０上の受容体結合部位の形成に関与し、該部位は前記で同定されたＹＫＬ−４０の生物学的活性の少なくとも１つの実行に関与する。したがって本発明は、より長いペプチド配列での配列番号２−７の配列のいずれかの存在は（ｉ）ＹＫＬ−４０受容体への結合および／または（ｉｉ）本発明の機能的に活性な抗体への結合を競合する能力を保有するより長い該ペプチド配列に必須であると考えられる。したがって配列番号２−７の配列の少なくとも１つを含む配列はインビボおよびインビトロでヒトＹＫＬ−４０の生物学的活性のモジュレーターとして本発明と関係する。したがって、かかる配列が受容体結合に関してＹＫＬ−４０と競合する場合、配列はそれによりＹＫＬ−４０により誘起される細胞増殖、分化および／もしくは細胞生存の刺激の下方調節のようにＹＫＬ−４０の活性を減弱させることができるか、または抗体結合と競合する場合、配列は抗体の活性の阻害を減弱させ、そしてそれによりＹＫＬ−４０に依存する細胞増殖および／もしくは細胞生存を上方調節することができる。したがって配列番号２−７に選択された配列を含む８−２００個のアミノ酸長のペプチド配列またはそのフラグメントまたはそのバリアントはヒトＹＫＬ−４０の機能的相同体または配列番号２−７として同定されたいずれかの配列の機能的相同体であると考えられる。
【０１０７】
個々のペプチド配列の生成
任意の従来の合成方法、組換えＤＮＡテクノロジー、ペプチド配列が誘導される全長タンパク質の酵素的切断、または該方法の組み合わせにより本発明のペプチド配列を調製することができる。
【０１０８】
組換え調製
したがって一実施態様では本発明のペプチドを組換えＤＮＡテクノロジーを用いて生成する。
【０１０９】
ペプチドまたはそのペプチドが由来する対応する全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列を確立された標準的な方法、例えばＢｅａｕｃａｇｅおよびＣａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２２：１８５９−１８６９（１９８１）により記載されたホスホアミジン法またはＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．３：８０１−８０５（１９８４）により記載された方法により合成により調製することができる。ホスホアミジン法によればオリゴヌクレオチドを例えば自動ＤＮＡ合成器で合成し、精製し、アニーリングし、ライゲートし、そして適当なベクターでクローニングする。
【０１１０】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列をペプチド起源の対応する全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、標準的なプロトコール（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、ＣＳＨＬプレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９年）にしたがってＤＮＡアーゼＩを用いてフラグメント化することにより調製することもできる。本発明は前記で同定したタンパク質の群から選択される全長タンパク質に関する。これに代えて本発明の全長タンパク質をコードするＤＮＡを、特異的制限エンドヌクレアーゼを用いてフラグメント化することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、ＣＳＨＬプレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク州、１９８９年に記載される標準的な手順を用いてＤＮＡのフラグメントをさらに精製する。
【０１１１】
全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列はまた、例えば標準的な技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー、１９８９年参照）にしたがってゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーを調製し、そして合成オリゴヌクレオチドプローブを用いるハイブリダイゼーションにより全長タンパク質の全てまたは一部をコードするＤＮＡ配列に関してスクリーニングすることにより得られるゲノムまたはｃＤＮＡ起源のものでもよい。例えば米国特許第４，６８３，２０２号またはＳａｉｋｉら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７−４９１（１９８８）に記載されるように特異的プライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応によりＤＮＡ配列を調製することもできる。
【０１１２】
次いで組換えＤＮＡ手順に都合よく供することができる、任意のベクターでよい組換え発現ベクターにＤＮＡ配列を挿入する。ベクターの選択はしばしばそれを導入する宿主細胞に依存する。したがってベクターはその複製が染色体複製とは独立している自己複製ベクター、すなわち染色体外の実体として存在するベクター、例えばプラスミドでよい。これに代えてベクターは宿主細胞に導入される場合、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、そしてそれが組み込まれている（複数の）染色体と一緒に複製されるものでよい。
【０１１３】
ベクターではペプチドまたは全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列は適当なプロモーター配列に動作可能なように連結されているべきである。プロモーターは選択した宿主細胞において転写活性を示し、そして宿主細胞と同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導され得る任意のＤＮＡ配列でよい。哺乳動物細胞におけるコード化ＤＮＡ配列の転写を指示するための適当なプロモーターの実例はＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１：８５４−８６４（１９８１））、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２：８０９−８１４（１９８３））またはアデノウイルス２主要後期プロモーターである。昆虫細胞での使用に適当なプロモーターはポリヘドリンプロモーター（Ｖａｓｕｖｅｄａｎら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３１１：７−１１（１９９２））である。酵母宿主細胞で使用するのに適当なプロモーターには酵母糖分解遺伝子由来のプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１２０７３−１２０８０（１９８０）；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：４１９−４３４（１９８２））またはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒら編、プレナムプレス、ニューヨークのＹｏｕｎｇら（１９８２））またはＴＰＩ１（米国特許第４，５９９，３１１号）またはＡＤＨ２−４ｃ（Ｒｕｓｓｅｌｌら、Ｎａｔｕｒｅ  ３０４：６５２−６５４（１９８３））プロモーターが含まれる。糸状菌宿主細胞において使用するのに適当なプロモーターは例えばＡＤＨ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３−２０９９（１９８５））またはｔｐｉＡプロモーターである。
【０１１４】
コード化ＤＮＡ配列をヒト成長ホルモンターミネーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒら、前掲）または（真菌宿主用には）ＴＰＩ１（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ、前掲）またはＡＤＨ３（ＭｃＫｎｉｇｈｔら、前掲）プロモーターのような適当なターミネーターに動作可能なように連結させてもよい。ベクターはさらにポリアデニル化シグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５ＥＩｂ領域由来）、転写エンハンサー配列（例えばＳＶ４０エンハンサー）および翻訳エンハンサー配列（例えばアデノウイルスＶＡ  ＲＮＡをコードするもの）のようなエレメントを含むことができる。
【０１１５】
組換え発現ベクターはさらに問題の宿主細胞においてベクターの複製を可能にするＤＮＡ配列を含むことができる。かかる配列の実例は（宿主細胞が哺乳動物細胞である場合）ＳＶ４０の複製起点である。ベクターはまた選択マーカー、例えばジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子のようなその生成物が宿主細胞における欠損を補う遺伝子、または薬物、例えばネオマイシン、ヒドロマイシンもしくはメソトレキセートに対する抵抗性を付与するものをも含むことができる。
【０１１６】
ペプチドまたは全長タンパク質、プロモーターおよびターミネーターを各々コードするＤＮＡ配列をライゲートするため、ならびに複製に必要な情報を含有する適当なベクターにそれらを挿入するために用いられる手順は当業者に周知である（例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、前掲参照）。
【０１１７】
本発明の組換えペプチドを得るために、コード化ＤＮＡ配列を第２のペプチドコード化配列およびプロテアーゼ切断部位コード化配列と有効に融合して、融合タンパク質をコードするＤＮＡ構築物を提供することができ、ここでプロテアーゼ切断部位コード化配列はＨＢＰフラグメントと第２のペプチドコード化ＤＮＡとの間に位置し、組換え発現ベクターに挿入され、そして組換え宿主細胞において発現される。一実施態様では、該第２のペプチドは限定するものではないがグルタチオンＳリダクターゼ、仔ウシチモシン、細菌性チオレドキシンまたはヒトユビキチン天然もしくは合成バリアント、またはそのペプチドを含む群から選択される。別の実施態様ではプロテアーゼ切断部位を含むペプチド配列はアミノ酸配列ＩＥＧＲを有するＸａ因子、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫを有するエンテロキナーゼ、アミノ酸配列ＬＶＰＲ／ＧＳを有するスロンビンまたはアミノ酸配列ＸＫＸを有するアクロモバクター・リティカス切断部位でよい。
【０１１８】
発現ベクターを導入する宿主細胞はペプチドまたは全長タンパク質を発現することができる任意の細胞でよく、そして好ましくは無脊椎動物（昆虫）細胞または脊椎動物細胞のような真核細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞または哺乳動物細胞、特に昆虫および哺乳動物細胞である。適当な哺乳動物細胞系の実例はＨＥＫ２９３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５７３）、ＣＯＳ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５０）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６３２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１０）またはＣＨＯ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−６１）細胞系である。哺乳動物細胞をトランスフェクトし、そして細胞に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は例えばＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１（１９８２）；ＳｏｕｔｈｅｒｎおよびＢｅｒｇ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７−３４１（１９８２）；Ｌｏｙｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：４２２−４２６（１９８２）；Ｗｉｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ  １４：７２５（１９７８）；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３（１９８１）；Ｇｒａｈａｍおよびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ、Ｖｉｒｏｌ．５２：４５６（１９７３）；ならびにＮｅｕｍａｎｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１−８４５（１９８２）に記載されている。
【０１１９】
これに代えて真菌細胞（酵母細胞を含む）を宿主細胞として用いることができる。適当な酵母細胞の実例にはサッカロミセス種またはシゾサッカロミセス種、とりわけサッカロミセス・セレビシエの株が挙げられる。その他の真菌細胞の実例は糸状菌、例えばアスペルギルス種またはニューロスポラ種、とりわけコウジカビまたはクロカビの細胞である。タンパク質の発現のためのアスペルギルス種の使用は例えば欧州特許第２３８，０２３号に記載されている。
【０１２０】
細胞を培養するために用いる培地は適切な培養添加剤を含有する血清含有もしくは血清不含培地培地のような哺乳動物細胞の成長に適当な任意の従来の培地、または昆虫、酵母もしくは真菌細胞の成長に適当な培地でよい。適当な培地は商業的供給者から入手可能であるか、または公開されている（例えばアメリカンタイプカルチャーコレクションのカタログ中の）製法にしたがって調製することができる。
【０１２１】
次いで遠心または濾過による培地からの宿主細胞の分離、塩、例えば硫酸アンモニウムを用いる上澄みまたは濾液のタンパク質様構成成分の沈殿、種々のクロマトグラフィー手順、例えばＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等による精製を含む従来の手順により、細胞により組換えで生成されたペプチドまたは全長タンパク質を培養培地から回収することができる。
【０１２２】
合成による調製
ペプチドの合成による生成のための方法は当分野において周知である。合成ペプチドの生成のための詳細な記載および実践的な助言はＳｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ‘ｓ  Ｇｕｉｄｅ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）、Ｇｒａｎｔ  Ｇ．Ａ．編、オックスフォード大学出版局、２００２年またはＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ：Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ、ＦｒｏｋｊａｅｒおよびＨｏｖｇａａｒｄ編のＴａｙｌｏｒおよびＦｒａｎｃｉｓ、１９９９年に見出すことができる。
【０１２３】
例えばＦｍｏｃ化学を用いることにより、およびＡｃｍ保護システインでペプチドを合成することができる。逆相ＨＰＬＣによる精製の後、ペプチドをさらに加工して例えば環状またはＣもしくはＮ末端修飾アイソフォームを得ることができる。環化および末端修飾のための方法は当分野において周知であり、そして前記で引用した手引き書に詳記されている。
【０１２４】
好ましい実施態様では、本発明のペプチド配列を合成で、とりわけシークエンスアシステッドペプチド合成（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：ＳＡＰＳ）により生成する。
【０１２５】
ＳＡＰＳによりペプチドを、濾過用のポリプロピレンフィルターを装着したポリエチレン容器内でバッチ式で、または完全に自動化されたペプチド合成器でＮ−ａ−アミノ保護基として９−フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）もしくはｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏｃ）、および側鎖官能性に関する適当な一般的な保護基を用いてポリアミド固相法（Ｄｒｙｌａｎｄ，Ａ．およびＳｈｅｐｐａｒｄ，Ｒ．Ｃ．，  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ：１２５−１３７（１９８６））の連続フロー式でのいずれかで合成することができる。
【０１２６】
合成する場合、次いで個々のペプチド配列を当分野において周知の技術を用いて多量体として処方することができ、例えば国際公開公報第００／１８７９１号に記載されるＬＰＡ法により配列の二量体を得ることができ、ＭＡＰ合成によるデンドリマー重合体はＰＣＴ／ＵＳ９０／０２０３９に記載されている。
【０１２７】
医薬組成物
本発明の局面では、「医薬組成物」なる用語は「医薬」なる用語と同義語として用いられる。
【０１２８】
いくつかの実施態様では、本発明は前記で定義したようなエピトープを結合することができる抗体、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を含む医薬組成物に関する。好ましくは医薬組成物はモノクローナル抗体１１５Ｆ９、１１６Ｆ９および／もしくは２０１Ｆ９、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質、最も好ましくはモノクローナル抗体２０１Ｆ９、その抗原結合フラグメントまたは組換えタンパク質を含む。最も好ましくは本発明の医薬組成物は抗体１１５Ｆ９、１１６Ｆ９および／または２０１Ｆ９の（複数の）ヒト化形態を含むかまたは本質的に含む。
【０１２９】
その他の実施態様では、本発明はＹＫＬ−４０の免疫原性フラグメント、配列番号２−７として同定される配列の少なくとも１つを含む該フラグメントを含む医薬組成物に関する。
【０１３０】
一実施態様では、医薬組成物は配列番号２として同定されるペプチド配列またはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む。別の実施態様では、組成物は配列番号３として同定されるペプチド配列またはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む。さらに別の実施態様では、組成物は配列番号４として同定されるペプチド配列またはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む。なお別の実施態様では、組成物は配列番号５として同定されるペプチド配列またはそのフラグメントまたはそのバリアントを含む。なおさらに別の実施態様では、組成物は配列番号６として同定されるペプチド配列もしくはそのフラグメントもしくはそのバリアント、または配列番号６として同定されるペプチド配列もしくはそのフラグメントもしくはそのバリアントを含む。いくつかの実施態様では医薬組成物は配列番号２−７の配列の任意の組み合わせを含むことができる。
【０１３１】
組成物ではペプチド配列を単離された個々のフラグメントまたは前記で論じたようなその多量体もしくは二量体として処方することができる。
【０１３２】
例えば前記で記載した医薬組成物を用いてインビトロまたはインビボで癌細胞の死を促すことができる。
【０１３３】
組成物は対象にインビボで投与されるか、またはインビトロでの使用のために有効量の、前記で記載した１つもしくはそれより多い化合物を薬学的に許容される添加物と共に含有する。かかる医薬を経口、経皮、筋肉内、静脈内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、鼻腔内または肺投与に適当に処方することができる。
【０１３４】
本発明の化合物に基づく医薬および組成物の処方開発の計画は概して任意のその他のタンパク質基盤の薬物製剤に関する処方計画に相当する。可能性のある問題およびこれらの問題を打開するのに必要な手引きはいくつかの教本、例えばＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ａ．Ｋ．Ｂａｎｇａ編、テクノミック出版社、バーゼル、１９９５年で取り扱われている。
【０１３５】
注射用は通常液体溶液または懸濁液、注射前に液体に溶解または懸濁するのに適当な固体形態のいずれかとして調製される。調製物を乳化することもできる。活性成分はしばしば薬学的に許容され、そして活性成分と適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤は例えば水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等またはその組み合わせである。加えて所望により調製物は少量の湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤のような、または調製物の有効性もしくは輸送を強化する補助物質を含有することができる。
【０１３６】
本発明の化合物の処方を当業者に公知の技術により調製することができる。処方は薬学的に許容されるマイクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子等を含む担体および賦形剤を含有することができる。
【０１３７】
場合によっては活性成分がその効果を奏する部位で、注射により調製物を適当に投与することができる。その他の投与様式に適当であるさらなる処方には坐剤、鼻、肺および時には経口処方が含まれる。坐剤用では伝統的な結合剤および担体にはポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。０．５％から１０％、好ましくは１−２％の範囲で（複数の）活性成分を含有する混合物からかかる坐剤を処方することができる。経口処方には、例えば医薬用等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム等のような通常用いられる賦形剤が含まれる。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル、徐放処方または粉末の形態を取り、そして一般に１０−９５％、好ましくは２５−７０％の（複数の）活性成分を含有する。
【０１３８】
その他の処方は鼻および肺投与に適当なようなもの、例えば吸入器およびエアロゾルである。
【０１３９】
活性化合物を中性または塩形態に処方することができる。薬学的に許容される塩には酸付加塩（ペプチド化合物の遊離アミノ基で形成される）が含まれ、そしてそれは例えば塩酸もしくはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸で形成される。また遊離カルボキシル基で形成される塩を例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基から誘導することもできる。
【０１４０】
調製物を用量製剤に適合する様式で、および治療上有効であるような量で投与する。投与される量は、対象の体重および年齢を含む処置される対象、処置される疾患ならびに疾患の段階に依存する。適当な用量範囲は体重ｋｇあたり通常投与あたり活性成分数百μｇのオーダーで、好ましくは体重ｋｇあたり約０．１μｇから５０００μｇの範囲である。化合物の単量体形態を用いる場合、適当な投与量はしばしば体重ｋｇあたり約０．１μｇから３０００μｇの範囲、および特に体重ｋｇあたり約０．１μｇから１０００μｇの範囲のような体重ｋｇあたり０．１μｇから５０００μｇの範囲である。化合物の多量体形態を用いる場合、適当な投与量はしばしば体重ｋｇあたり約０．１μｇから７５０μｇの範囲のような体重ｋｇあたり０．１μｇから１０００μｇの範囲、および特に体重ｋｇあたり約０．１μｇから２５０μｇの範囲のような体重ｋｇあたり約０．１μｇから５００μｇの範囲である。とりわけ鼻に投与する場合、その他の経路により投与される場合よりも低用量が用いられる。投与を一回で実施することができるか、または次に投与を続けることができる。投与量は投与経路にも依存し、そして処置される対象の年齢および体重で変化する。多量体形態の好ましい投与量は体重７０ｋｇあたり１ｍｇから７０ｍｇの間である。
【０１４１】
局所適用または実質的に局所適用が好ましい適応症もある。
【０１４２】
本発明の化合物のいくつかは十分に活性であるが、その他のいくつかでは、調製物がさらに薬学的に許容される添加剤および／または担体を含む場合に効果が強化される。かかる添加剤および担体は当分野において公知である。活性物質のその標的への分配を促進する化合物を含むのが有利である場合もある。
【０１４３】
多くの場合、処方を多回投与することが必要である。投与は静脈内注入のような連続注入、または一日数回のようなより多い投与量で、毎日、週数回、毎週等の投与でよい。個体が細胞死に至り得る（複数の）因子に供されている前またはその直後に医薬の投与を開始するのが好ましい。好ましくは因子の出現から５時間内のような、因子の出現から８時間内に医薬を投与する。多くの化合物は長時間効果を呈し、それにより化合物の投与を１週または２週のような長い間隔で行うことができる。
【０１４４】
神経ガイドでの使用に関連して、投与は（複数の）活性化合物の放出制御に基づいて連続してまたは少量ずつでよい。さらに前駆体を用いて放出速度および／または放出部位を制御することができる。経口投与としてその他の種類のインプラントおよびウェルも同様に放出制御および／または前駆体の使用に基づいてよい。
【０１４５】
本発明はまた細胞死の誘導、細胞成長、肝臓線維症または関節リウマチの発達の阻害を必要とする個体の処置にも関する。処置は有効量の、前記で定義したような１つまたはそれより多い化合物を含む本発明の医薬組成物の投与を伴う。
【０１４６】
処置
前記で論じたように本明細書に記載する抗体およびペプチドフラグメントを以下に列挙するＹＫＬ−４０の生物学的活性：
ｉ）キチンの結合
ｉｉ）ヘパリンの結合
ｉｉｉ）硫酸ヘパランの結合
ｉｖ）ヒアルロナンの結合
ｖ）長いおよび／もしくは短いオリゴ糖の結合
ｖｉ）細胞成長因子としての役割
ｖｉｉ）分化因子としての役割
ｖｉｉｉ）細胞の化学誘引物質としての役割
ｉｘ）ヒアルロナンの合成との干渉
ｘ）細胞生存に関連するシグナル伝達経路の刺激
ｘｉ）血管形成の刺激
ｘｉｉ）線維形成の刺激
ｘｉｉｉ）細胞外マトリックスリモデリングとの干渉
ｘｉｖ）炎症との干渉ならびに／または
ｘｖ）転移の発達の刺激
の少なくとも１つを阻害または刺激のような変調のための使用することができる。
【０１４７】
前記のヒトＹＫＬ−４０の活性は細胞成長、増殖、分化および生存、細胞外マトリックスリモデリング、線維症ならびに血管形成を刺激するタンパク質の能力に関連している。したがって本発明の抗体およびペプチドフラグメントを細胞成長、増殖、分化および生存、転移および／または細胞外マトリックスリモデリングの発達、線維症、血管形成ならびに炎症を阻害するために使用することもできる。かかる抗体および／もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物の使用を含む、それを必要とする個体の処置が治癒の成功に至り得る多くの疾患および病理学的状態がある。「抗体」なる用語は本発明の局面では抗体、抗原結合フラグメントおよびその組換えタンパク質の双方を指す。
【０１４８】
したがって抗体および／もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物を用いて乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部／頸部の癌、悪性メラノーマおよびその他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の原発性癌を成功裏に処置することができる。
【０１４９】
または、抗体および／もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物を用いて乳癌、結腸直腸癌、膵臓癌、胃癌、肝細胞癌、その他の胃腸管系の癌、肺癌、小細胞性肺癌、卵巣癌、子宮癌、子宮頸癌、精巣癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓癌、甲状腺癌および頭部／頸部の癌、悪性メラノーマおよびその他の皮膚癌、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉種、グリア芽細胞種またはその他の脳腫瘍、胚細胞腫瘍、ならびに血液学的悪性腫瘍から選択される任意の転移性癌を処置することができる。
【０１５０】
さらに別の実施態様では抗体および／もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物を用いて例えば関節リウマチ、その他の炎症性関節疾患、細菌感染、活動性炎症性腸疾患または肝臓線維症（例えばＢ型もしくはＣ型肝炎ウイルスまたはアルコール依存症に引き起こされる）を処置することができる。
【０１５１】
なおその他の実施態様では、抗体および／もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物を用いて例えば関節リウマチ、巨細胞性動脈炎、強直性脊椎炎、結核、サルコイドーシス、強皮症、クローン病、潰瘍性大腸炎、アルコール性肝臓線維症、Ｃ型肝炎のような、該阻害が治癒に有利であり得る任意の病理学的状態で
任意の非腫瘍性細胞の増殖を阻害；
血管形成を阻害；
細胞外マトリックスリモデリングを阻害；
組織線維症を阻害；
することもできる。
【０１５２】
なおさらなる態様では本発明は、本発明の抗体および／もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物を投与することにより前記で論じたような疾患または状態を処置する方法に関する。
【０１５３】
加えて本発明はインビトロアッセイおよび方法における、例えば新しい抗癌性化合物をスクリーニングするためのアッセイにおける本発明の抗体および／もしくはペプチドフラグメント、またはそれを含む医薬組成物の使用に関する。
【実施例】
【０１５４】
１．抗ヒトＹＫＬ−４０モノクローナル抗体によるインビトロでの癌細胞成長および生存の阻害
ヒト悪性グリア芽腫Ｕ８７、ヒト骨肉腫ＭＧ６３およびＵ２ＯＳ、ならびにヒト悪性メラノーマＳＫ−ＭＥＬ２８の細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および抗生物質（ペニシリンおよびストレプトマイシン）を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ギブコ）中で培養を通常どおりに維持した。全ての細胞系をＡＴＴＣから入手した。
【０１５５】
抗ヒトＹＫＬ−４０抗体（Ａｂ）：
１１６Ｆ９（マウスモノクローナル；最高Ａｂ希釈１：１００はＡｂ濃度０．０６ｍｇ／ｍｌに等しい）
１１５Ｆ９（マウスモノクローナル；最高Ａｂ希釈１：５０はＡｂ濃度０．０３ｍｇ／ｍｌに等しい）
２０１Ｆ９（マウスモノクローナル；最高Ａｂ希釈１：２５０はＡｂ濃度０．０３ｍｇ／ｍｌに等しい）
Ｒ６６８（ウサギポリクローナル；最高Ａｂ希釈１：５０はＡｂ濃度０．００７５ｍｇ／ｍｌに等しい）
手順：
細胞を９６ウェルプレート（１２ウェル×８列）に培地２００μｌ中５０００セル／ウェルの密度で播種した。細胞を接着させ、そして一晩成長させた。翌日成長培地を捨て、そして細胞をリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で濯いだ。続いて以下に示すような様々の希釈の抗体を含有する新鮮培地２００μｌで細胞を処理した：
【０１５６】
【表９】
2008531608.tif 000012
各プレートで各列のウェル１から６を培地中１０％ＦＣＳの存在下でインキュベートし、ウェル７から１２を培地中ＦＣＳ不含で０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の存在下でインキュベートした。
【０１５７】
各抗体処理の１個のプレートを正常酸素圧状態でインキュベートし、そして別のプレートをＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウム、シグマ）での処置の７２時間前に低酸素（０．１％）状態でインキュベートした。
【０１５８】
ＭＴＴアッセイ：
Ｍｏｓｓｍａｎｎ  Ｔ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６５：５５−６３（１９８３）にしたがってＭＴＴアッセイ（培養中の生存および死亡細胞を区別することを可能にする）を実施した。
【０１５９】
ＭＴＴ４０μｌを各ウェル（２ｍｇ／ｍｌストック溶液）に加え、そしてプレートを正常酸素圧インキュベーター中３７℃で１時間インキュベートした。その後培地を捨て、そしてＤＭＳＯ１００μｌを各ウェルに加えた。プレートを１０秒間振盪し、そして５７０ｎｍ（６９０ｎｍでバックグラウンド補正）ＯＤ（光学密度）値を読んだ。結果を６ウェルのＯＤの平均＋／−標準偏差として示す。
【０１６０】
図１からわかるように、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）１１６Ｆ９および２０１Ｆ９は、培養培地中のＦＣＳの存在とは関係なく７２時間処理した後、対照ウェル（図１で「対照」および図２で「陰性」と記す抗体不含）と比較して処理ウェル（抗体を伴う）中の細胞数の減少により反映される、Ｕ８７グリア芽腫細胞の成長に及ぼす抑制効果を有する。モノクローナル抗体１１５Ｆ９およびポリクローナル抗体Ｒ６６７（示していない）は被験癌細胞の成長を阻害しなかった。モノクローナル抗体１１６Ｆ９をさらに２つのヒト骨肉腫細胞系ＭＧ６３およびＵ２ＯＳならびに１つのヒト悪性メラノーマ細胞系ＳＫ−ＭＥＬ２８培養下で試験した。
【０１６１】
図２で示す結果により、モノクローナル抗体１１６Ｆ９は双方の骨肉腫細胞において成長抑制効果を有するが、メラノーマＳＫ−ＭＥＬ２８細胞では有さないことが実証される。２つの被験骨肉腫細胞系はＹＫＬ−４０の高い発現レベルを特徴とするが、一方ＳＫ−ＭＥＬ２８細胞系の発現レベルはあったとしても非常に低い。
【０１６２】
これらの結果により、ＹＫＬ−４０に対するモノクローナル抗体（モノクローナル抗体１１６Ｆ９および２０１Ｆ９）はＹＫＬ−４０発現癌細胞において成長抑制効果を有する。その効果は細胞成長および生存の阻害もしくはアポトーシスの誘導によるか、またはその双方によるものであろう。
【０１６３】
実施例２．インビボでの抗ヒトＹＫＬ−４０モノクローナル抗体による癌細胞成長の阻害
ヒトグリア芽腫Ｕ８７細胞（４×１０６セル／腫瘍）をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が平均体積１０００ｍｍ３に達したときに、マウスを各群１０匹の３群に分けた。Ａ群は４０ｍｇ／ｋｇモノクローナル抗体２０１Ｆ９腹腔内投与で処置１日目から、およびその後週２回処置した。Ｂ群は２８ｍｇ／ｋｇモノクローナル抗体１１６Ｆ９腹腔内投与で処置１日目から、およびその後週２回処置した。Ｃ群（対照）にはＰＢＳ（リン酸塩緩衝ＮａＣｌ）を週２回腹腔内投与した。腫瘍サイズを毎日測定し、そして腫瘍サイズが体積１００ｍｍ３に達したときにマウスを屠殺した。６００ｍｍ３までの個々の腫瘍の成長に及ぼす処置の効果を図３（カプラン・マイヤー曲線）に示す。週２回のモノクローナル抗体２０１Ｆ９（４０ｍｇ／ｋｇ）の注射によりＰＢＳ処置動物の腫瘍と比較してＵ８７腫瘍の成長が低減されることを認めることができる（ログランク検定ｐ＜０．０５）。これは２つの異なる処置期間、腫瘍が体積６００ｍｍ３に達するまで、および体積９００ｍｍ３に達するまで（示していない）の日数の場合である。図３はモノクローナル抗体１１６Ｆ９がＰＢＳ処置ヌードマウスの腫瘍の成長と比較して、Ｕ８７腫瘍の成長に有意な阻害効果を有さなかったことを示している。しかしながら、１１６Ｆ９処置マウスは抗体２０１Ｆ９処置マウスと比較して低用量の抗体を投与され、そして高用量で投与された１１６Ｆ９は腫瘍成長に阻害効果を有し得ると推測することができる。
【０１６４】
別の実験では、ヒトグリア芽腫Ｕ８７細胞（８×１０６セル／腫瘍）をヌードマウスに皮下注射した。腫瘍が平均体積２００ｍｍ３に達したときに、マウスを各群１０匹の４群に分けた。Ａ群およびＣ群は処置１日に８Ｇｙの電離放射線（ＩＲ）を受けた。Ａ群およびＢ群は４０ｍｇ／ｋｇモノクローナル抗体２０１Ｆ９腹腔内投与で処置１日目から、およびその後週２回処置した。Ｄ群（対照）にはＰＢＳ（リン酸塩緩衝ＮａＣｌ）を週２回腹腔内投与した。腫瘍サイズを毎日測定し、そして腫瘍サイズが体積１０００ｍｍ３に達したときにマウスを屠殺した。６００ｍｍ３までの腫瘍の成長に及ぼす処置の効果を図４に示す。
【０１６５】
図４で実証される結果により、電離放射線（ＩＲ）もまた腫瘍に有意な成長低減効果を有することが示され、それはモノクローナル抗体２０１Ｆの効果に匹敵する。モノクローナル抗体２０１Ｆ９およびＩＲでの同時処置はモノクローナル抗体およびＩＲの相乗効果には至らない。ログランク検定のＰ値を以下の表１にまとめる。
【０１６６】
【表１０】
2008531608.tif 000013
Ｐ値はログランク検定である
ＩＲ−電離放射線
ＭＡｂ−モノクローナル抗体２０１Ｆ９
Ｔ６００−腫瘍体積が６００ｍｍ３まで成長するまでの時間
Ｔ９００−腫瘍体積が９００ｍｍ３まで成長するまでの時間。
【０１６７】
実施例３．モノクローナル抗体２０１Ｆ９に関するＹＫＬ−４０エピトープマッピング
抗体２０１Ｆ９のヒトＹＫＬ−４０（スイスプロット受け入れ番号：Ｐ３６２２２；配列番号１）のペプチドフラグメントに対する結合を分析することによりエピトープマッピングを実施した。ＹＫＬ−４０配列の（８−１４のアミノ酸残基の）３８１の重複ペプチドフラグメントのペプチドライブラリーを合成し、そしてペプスキャンシステムＢＶ（オランダ）により２０１Ｆ９抗体に対する結合能力に関してスクリーニングした。
【０１６８】
アミノ酸残基８１−１０５、１２７−１６５、２０３−２２３、２７９−２９２、３００−３１６および３１８−３３５を含むＹＫＬ−４０の部分に及ぶペプチドのいくつかの群が有意な結合を実証した。これらのデータおよびこれらのペプチドフラグメントを含むＹＫＬ−４０の構造部分の分析に基づいて、ペプチドの新しい群が設計され、合成され、そして抗体結合に関してスクリーニングされた。新しいペプチドはＹＫＬ−４０タンパク質のループ構造のペプチド配列の位置を考慮して望ましいように設計された。
【０１６９】
残基８３−９０（配列番号２）、９６−１０５（配列番号３）、１３７−１５０（配列番号４）、２１０−２２０（配列番号５）、３０４−３１４（配列番号６）および３１８−３２９（配列番号７）に及ぶ６個のペプチドが抗体２０１Ｆ９に関して可能な抗原性決定基／エピトープとして同定された。図５はＹＫＬ−４０の構造におけるペプチドの位置を実証する。ペプチドフラグメントの配列をアラインし、そして配列番号２、３、４、５、６および７の配列が相同性を共有すると思われた。表２（以下では）配列をアラインし、そしてアミノ酸残基の相同性を同一のアミノ酸残基を指す太字で、および相同アミノ酸残基に太線を付して示す。
【０１７０】
【表１１】
2008531608.tif 000014
表から残基Ｇ、Ａ、Ｗ、Ｒ、Ｔ、ＰおよびＳは最も好ましくは配列の抗原性特質を決定する残基であり、そしてＧＡＷＲＧＴＴＧＨＨＳ（配列番号５）は抗体２０１Ｆ９の主要なエピトープを含む配列である可能性がある。
【０１７１】
ＹＫＬ−４０の残基２１０−２２０（配列番号５）および１３７−１５０（配列番号４）に相当する配列内に位置するアミノ酸残基はＹＫＬ−４０リガンド／受容体結合に関与することが以前に示されている（Ｈｏｕｓｔｏｎら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３０２０６−３０２１２（２００３）およびＦｕｓｅｔｔｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３７７５３−３７７６０（２００３））。本データにより、配列は抗体２０１Ｆ９に関する抗原性決定基をも含むことが実証される。抗体によるこれらの残基の占有はＹＫＬ−４０の生物学的活性を阻害し、そしてしたがって癌細胞の成長の阻害に至る。
【図面の簡単な説明】
【０１７２】
【図１】図１は、インビトロ（ＭＴＴアッセイ）での悪性ヒト神経膠芽腫Ｕ８７細胞の細胞成長および生存に及ぼすヒトＹＫＬ−４０に対する様々なモノクローナル抗体（モノクローナル抗体１１５Ｆ９、１１６Ｆ９および２０１Ｆ９）の影響を示す。結果を６個の測定値の平均値＋／−標準偏差として示す。
【図２】図２は、インビトロ（ＭＴＴアッセイ）でのヒト骨肉腫細胞Ｕ２ＯＳおよびＭＧ−６３ならびにヒト悪性メラノーマ細胞ＳＫ−ＭＥＬ−２８の細胞成長および生存に及ぼすモノクローナル抗体１１６Ｆ９の阻害効果を実証する。結果を６個の測定値の平均値＋／−標準偏差として示す。
【図３】図３は、ヒト神経膠芽腫細胞Ｕ８７を注射し、そしてモノクローナル抗体（ＭＡｂ）２０１Ｆ９、１１６Ｆ９またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（対照）で処置したヌードマウスにおける個々の腫瘍の成長（腫瘍サイズ６００ｍｍ３までの日数）のカプラン・マイヤープロットを示す。
【図４】図４は、ヒト神経膠芽腫細胞Ｕ８７を注射し、そして電離放射線（ＩＲ）、モノクローナル抗体２０１Ｆ９（ＭＡｂ）、電離放射線およびモノクローナル抗体２０１Ｆ９を同時に（ＩＲ＋ＭＡｂ）またはリン酸塩緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（対照）で処置したヌードマウスにおける個々の腫瘍の成長（腫瘍サイズ６００ｍｍ３までの日数）のカプラン・マイヤープロットを表す。各群マウス１０匹。
【図５】図５は、ＹＫＬ−４０の３Ｄ構造でモノクローナル抗体２０１Ｆ９に関するエピトープ（配列番号２−７）を含むペプチド配列の局在を図式的に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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