(57)【要約】  本発明は、ヒト凝固因子VIIポリペプチド、ならびに該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物、ポリヌクレオチドを含みかつ発現するベクターおよび宿主細胞、因子VIIポリペプチドを含む薬学的組成物、治療のための使用および方法；およびこれらに関する全ての追加的な発明の特徴に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列に関して少なくとも一つの配列の変更を含む変異体因子VIIポリペプチドであって、前記少なくとも一つの変更が、以下のものからなる群から選択されるポリペプチド：
(i) Aを除く任意の他のアミノ酸でのN145の置換；
(ii) AまたはDを除く任意の他のアミノ酸でのN322の置換；および
(iii) Aを除く任意の他のアミノ酸でのN145の置換およびAまたはDを除く任意の他のアミノ酸でのN322の非依存的置換；
(iv) 任意の他のアミノ酸でのN145の置換およびAまたはDを除く任意のアミノ酸でのN322の非依存的置換；および
(v) Aを除く任意のアミノ酸でのN145の置換および任意の他のアミノ酸でのN322の非依存的置換。
(vi) 配列番号１の配列に関する任意の位置での置換であって、前記配列の変更が、N145、N322、またはN145およびN322の両方でのN結合型グリコシル化の分裂をもたらし、かつ前記配列の変更が位置145または322ではない。
【請求項２】
前記N結合型グリコシル化の分裂をもたらす変更が、N145Q、N322Q、またはN145QおよびN322Qを含む請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記N結合型グリコシル化の分裂をもたらす変更が、配列番号１の配列に関して位置146、323、または146および323の両方である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記N結合型グリコシル化の分裂をもたらす変更が、配列番号１の配列に関して位置147、324、または327および324の両方である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記N結合型グリコシル化の分裂をもたらす変更が、配列番号１の配列に関して位置148、325、または148および325の両方である請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記N結合型グリコシル化の分裂をもたらす変更が、K143N/N145TおよびK143N/N145T/R315N/V317Tから選択される請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチドであって、以下のものからなる群から選択された配列の変更をさらに含むポリペプチド：R152E; S344A; L305V; L305V/M306D/D309S; L305I、L305T、F374P、V158T/M298Q、V158D/E296V/M298Q、K337A、M298Q、V158D/M298Q、L305V/K337A、V158D/E296V/M298Q/L305V、V158D/E296V/M298Q/K337A、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A、K157A、E296V、E296V/M298Q、V158D/E296V、V158D/M298K、およびS336G、L305V/K337A、L305V/V158D、L305V/E296V、L305V/M298Q、L305V/V158T、L305V/K337A/V158T、L305V/K337A/M298Q、L305V/K337A/E296V、L305V/K337A/V158D、L305V/V158D/M298Q、L305V/V158D/E296V、L305V/V158T/M298Q、L305V/V158T/E296V、L305V/E296V/M298Q、L305V/V158D/E296V/M298Q、L305V/V158T/E296V/M298Q、L305V/V158T/K337A/M298Q、L305V/V158T/E296V/K337A、L305V/V158D/K337A/M298Q、L305V/V158D/E296V/K337A‐FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、S314E/K316H、S314E/K316Q、S314E/L305V、S314E/K337A、S314E/V158D、S314E/E296V、S314E/M298Q、S314E/V158T、K316H/L305V、K316H/K337A、K316H/V158D、K316H/E296V、K316H/M298Q、K316H/V158T、K316Q/L305V、K316Q/K337A、K316Q/V158D、K316Q/E296V、K316Q/M298Q、K316Q/V158T、S314E/
L305V/K337A、S314E/L305V/V158D、S314E/L305V/E296V、S314E/L305V/M298Q、S314E/L305V/V158T、S314E/L305V/K337A/V158T、S314E/L305V/K337A/M298Q、S314E/L305V/K337A/E296V、S314E/L305V/K337A/V158D、S314E/L305V/V158D/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V、S314E/L305V/V158T/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V、S314E/L305V/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、K316H/L305V/K337A、K316H/L305V/V158D、K316H/L305V/E296V、K316H/L305V/M298Q、K316H/L305V/V158T、K316H/L305V/K337A/V158T、K316H/L305V/K337A/M298Q、K316H/L305V/K337A/E296V、K316H/L305V/K337A/V158D、K316H/L305V/V158D/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V、K316H/L305V/V158T/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V、K316H/L305V/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、K316Q/L305V/K337A、K316Q/L305V/V158D、K316Q/L305V/E296V、K316Q/L305V/M298Q、K316Q/L305V/V158T、K316Q/L305V/K337A/V158T、K316Q/L305V/K337A/M298Q、K316Q/L305V/K337A/E296V、K316Q/L305V/K337A/V158D、K316Q/L305V/V158D/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V、K316Q/L305V/V158T/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V、K316Q/L305V/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、F374Y/K337A、F374Y/V158D、F374Y/E296V、F374Y/M298Q、F374Y/V158T、F374Y/S314E、F374Y/L305V、F374Y/L305V/K337A、F374Y/L305V/V158D、F374Y/L305V/E296V、F374Y/L305V/M298Q、F374Y/L305V/V158T、F374Y/L305V/S314E、F374Y/K337A/S314E、F374Y/K337A/V158T、F374Y/K337A/M298Q、F374Y/K337A/E296V、F374Y/K337A/V158D、F374Y/V158D/S314E、F374Y/V158D/M298Q、F374Y/V158D/E296V、F374Y/V158T/S314E、F374Y/V158T/M298Q、F374Y/V158T/E296V、F374Y/E296V/S314E、F374Y/S314E/M298Q、F374Y/E296V/M298Q、F374Y/L305V/K337A/V158D、F374Y/L305V/K337A/E296V、F374Y/L305V/K337A/M298Q、F374Y/L305V/K337A/V158T、F374Y/L305V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V、F374Y/L305V/V158D/M298Q、F374Y/L305V/V158D/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q、F374Y/L305V/E296V/V158T、F374Y/L305V/E296V/S314E、F374Y/L305V/M298Q/V158T、F374Y/L305V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/S314E、F374Y/K337A/S314E/V158T、F374Y/K337A/S314E/M298Q、F374Y/K337A/S314E/E296V、F374Y/K337A/S314E/V158D、F374Y/K337A/V158T/M298Q、F374Y/K337A/V158T/E296V、F374Y/K337A/M298Q/E296V、F374Y/K337A/M298Q/V158D、F374Y/K337A/E296V/V158D、F374Y/V158D/S314E/M298Q、F374Y/V158D/S314E/E296V、F374Y/V158D/M298Q/E296V、F374Y/V158T/S314E/E296V、F374Y/V158T/S314E/M298Q、F374Y/V158T/M298Q/E296V、F374Y/E296V/S314E/M298Q、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E; R152E、S344A; P11Q/K33E、T106N、V253N、R290N/A292T、G291N、R315N/V317T、およびK143N/R315N/V317T。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、野生型ヒトFVIIaと比較して減少した半減期を示す請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的処方。
【請求項１０】
因子VII-反応性症候群を治療する方法であって、該治療を必要とする患者に請求項９に記載の治療学的有効量の処方を投与することを含む方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載の治療学的有効量のポリペプチドを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、ヒト凝固因子VIIポリペプチド、ならびに該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構造体、該ポリヌクレオチドを含みかつ発現するベクターおよび宿主細胞、因子VIIポリペプチドを含む薬学的組成物、治療のための該組成物の使用および方法；およびこれらに関連したその他の本発明の特徴に関する。
【発明の背景】
【０００２】
血液凝固は、繊維素塊を最終的に生じさせる、様々な血液成分(または因子)の複雑な相互作用からなるプロセスである。一般に、凝固カスケードと呼ばれる一連の反応に参加する血液成分は、酵素的に不活性なタンパク質（プロ酵素または酵素前駆体)であり、アクチベータ(それ自体も活性化された凝固因子)の作用によってタンパク分解酵素に転換される。このような転換を受けた凝固因子は一般に「活性因子」と呼ばれ、凝固因子の名前に文字「ａ］を追加することよって示される(例えば、因子VIIa)。
【０００３】
止血プロセスの開始は、血管壁への外傷の結果として露出された、組織因子と因子VIIa間の複合体の形成によって媒介される。この複合体は、因子IXおよびXを活性形態に転換させる。因子Xaは、組織因子を有する細胞上において制限された量のプロトロンビンをトロンビンへ転換させる。トロンビンは、血小板を活性化させ、かつ因子VおよびVIIIを因子VaおよびVIIIaに活性化させ、両補因子は下流のプロセスにおいて十分なトロンビン発生を導く。このプロセスは、因子IXa(因子VIIIaと複合体を形成)による因子Xaの生成を含み、かつ活性化された血小板の表面上で起こる。トロンビンは最終的にはフィブリノーゲンをフィブリンに転換させ、線維素塊を形成させる。
【０００４】
因子VIIは、単鎖酵素前駆体として血液中で循環する微量血漿糖タンパク質である。酵素前駆体は触媒作用的に不活性である。単鎖因子VIIは、インビボで因子Xa、因子XIIa、因子IXa、因子VIIaまたはトロンビンによって二鎖因子VIIaに転換され得る。因子Xaは、因子VIIの主要な生理学的アクチベータになると考えられる。酵素前駆体因子VIIの活性化された二鎖分子への転換は、内部Arg152-Ile153ペプチド結合の開裂によって生じる。
【０００５】
患者の凝集カスケードを刺激することはしばしば望ましい。因子VIIaは、例えば凝固因子の欠乏(例えば、血友病AおよびBまたは凝固因子XIまたはVIIの欠乏)または凝固因子阻害物質の存在によって引き起こされた出血性疾患を制御するために使用されてきた。因子VIIaはまた、正常に機能する血液凝固カスケード(凝固因子の欠失または任意の凝固因子に対する阻害物質がない)をもつ患者において生じる過度の出血を制御するためにも使用されてきた。このような出血は、例えば、不完全な血小板機能、血小板減少症またはフォン・ヴィレブランド病によって引き起こされ得る。出血はまた、外科手術および他の態様の組織損傷または外傷に関連して大きな問題である。
【０００６】
修飾された薬物動態学的性質を有する因子VIIポリペプチドについての当業者の要求がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、野生型因子VII中に存在する2つのN結合型グリコシル化部位の少なくとも1つが分裂した変異体因子VIIポリペプチドを提供する。
【０００８】
一側面において、本発明は、配列番号１の配列に関して少なくとも一つの配列の変更を含む変異体因子VIIポリペプチドであって、
前記変更が、以下のものからなる群から選択されるポリペプチドに関する：
(i) Aを除く任意の他のアミノ酸でのN145の置換；
(ii) AまたはDを除く任意の他のアミノ酸でのN322の置換；および
(iii) Aを除く任意の他のアミノ酸でのN145の置換およびAまたはDを除く任意の他のアミノ酸でのN322の非依存的置換；
(iv) 任意の他のアミノ酸でのN145の置換およびAまたはDを除く任意のアミノ酸でのN322の非依存的置換；および
(v) Aを除く任意のアミノ酸でのN145の置換および任意の他のアミノ酸でのN322の非依存的置換。
【０００９】
(vi) 配列番号１の配列に関する任意の位置での置換であって、前記配列の変更が、N145、N322、またはN145およびN322の両方でのN結合型グリコシル化の分裂をもたらし、かつ前記配列の変更が位置145または322ではない。
【００１０】
実施態様の一系列において、変異体には、配列番号１の配列に関して少なくとも一つの配列の変更が含まれる。前記配列の変更には、(i) Aを除く任意の他のアミノ酸でのN145の置換；(ii) AまたはDを除く任意の他のアミノ酸でのN322の置換；または(iii) 前記の組み合わせが含まれる。このような変更の制限のない例には、N145Q; N322Q; および N145Q/N322Qが含まれる。
【００１１】
実施態様の一系列において、変異体には、配列番号１の配列に関して少なくとも一つの配列の変更が含まれる。前記配列の変更は、直接的には位置145または322のいずれにも関与しないが、N145、N322、またはN145およびN322の両方でのN連結型グリコシル化の分裂をもたらす。このような変更の制限のない例には、(i) T147を任意の他のアミノ酸に変化させること；S324を任意の他のアミノ酸に変化させること；またはT147およびS324の両方を任意の他のアミノ酸に非依存的に変化させることと、(ii) A146、I323またはその両方をPに変化させることと、(iii) K148、E325またはその両方をP（または同じ部位でのグリコシル化の分裂をもたらすであろう任意の他のアミノ酸）に変化させることと、(iv) N145-T147の間および／またはN322-S324の間の一以上のアミノ酸の挿入または欠失（このような挿入または欠失が同一部位でのグリコシル化の分裂をもたらすとき）とが含まれる。
【００１２】
一側面において、本発明は、グリコシル化分裂型因子VIIa変異体ポリペプチドおよび薬学的に許容可能なキャリアまたは賦形剤を含む薬学的処方を提供する。
【００１３】
一側面において、本発明は、因子VIIa反応性症候群を治療するための方法を提供し、治療学的有効量のグリコシル化分裂型因子VIIa変異体ポリペプチドを、このような治療を必要とする患者に投与することによって行われる方法を提供する。
【００１４】
他の側面において、本発明は、治療学的有効量のグリコシル化分裂型因子VIIa変異体ポリペプチドを含む、因子VIIa反応性症候群を治療するために使用され得るキットを提供する。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
本発明は、グリコシル化分裂型因子VIIポリペプチド（すなわち、野生型因子VII中に存在する一方または両方のN結合型オリゴ糖類を欠く因子VIIポリペプチド) に関する。本発明者らは、驚くべきことに、正常なN結合型オリゴ糖基の一方または両方を欠く因子VIIaポリペプチドが、増強された因子VIIaの生物学的活性を示すことを見出した。本発明の因子VIIポリペプチドは、 凝血促進性治療および他の用途のための野生型因子VIIaの代替物を提供する。
【００１６】
また、これらのグリコシル化分裂型因子VIIポリペプチドのより速いクリアランスは、幾つかの治療学的適用において有利である。
【００１７】
さらに、それらは、例えば、それらが生成され得る発現系の拡大された範囲の使用を可能にすることによって、野生型グリコシル化因子VIIaに対する優位性を与える。
【００１８】
野生型因子VIIとは、米国特許第4,784,950号（配列番号１）に開示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。用語「因子VII」には、その未開裂な形態（酵素前駆体）における因子VIIポリペプチドが含まれ、かつ因子VIIaと命名され得るタンパク分解的に加工されて各生物活性形態を与えるものが含まれる。典型的には、因子VIIは残基152と153との間で開裂し因子VIIaを産生する。
【００１９】
因子VII変異体は、一以上のアミノ酸の置換、欠失、および／または挿入によって、配列番号１から誘導された配列を有するポリペプチドである。挿入は、N終端、C終端、および／またはその内部で起こり得る。アミノ酸の置換を表わす場合、最初の文字はヒト野生型FVIIのある位置に天然に存在するアミノ酸を表わす。次の数は、ヒト野生型FVIIにおけるその位置を表わす。二番目の文字は天然のアミノ酸を置換するアミノ酸を表わす。
【００２０】
本発明は、N145またはN322のいずれか、またはN145およびN322の両方にグリコシル化分裂置換体を有する因子VII変異体を提供する。実施態様の一系列において、N145が、アラニン(A)を除いた任意のアミノ酸（天然に生じるかまたは天然に生じないアミノ酸）によって置換される。実施態様の他の系列において、N322が、Aまたはアルパラギン酸（D）を除いた任意のアミノ酸（天然に生じるかまたは天然には生じないアミノ酸）によって置換される。実施態様の他の系列において、N145がAを除いた任意のアミノ酸によって置換され、かつN322がAまたはDを除いた任意のアミノ酸によって置換される。実施態様の他の系列において、N145が任意のアミノ酸（天然に生じるかまたは天然には存在しないアミノ酸）で置換され、かつN322がAまたはDを除いた任意のアミノ酸によって置換される。実施態様の他の系列において、N145がAlaを除いた任意のアミノ酸で置換され、かつN322が任意のアミノ酸で置換される。実施態様の他の系列において、N145およびN322は、各々独立して任意のアミノ酸で置換される。
【００２１】
実施態様の一系列において、本発明には、N145QもしくはN322Qまたは組合せN145Q/N322Q を含む因子VII変異体が含まれる。本発明にはまた、任意の残基145-147および／または残基322-324が除去された（すなわち、任意の他のアミノ酸が欠失し、かつ置換されていない）因子VII変異体が含まれる。
【００２２】
実施態様の一系列において、本発明には、少なくとも一つの配列の変更を含む因子VII変異体が含まれ、N結合型グリコシル化の分裂をもたらす前記変更は、配列番号１の配列に関して位置146、323または146および323の両方に存在する。
【００２３】
実施態様の一系列において、本発明には、少なくとも一つの配列の変更を含む因子VII変異体が含まれ、N結合型グリコシル化の分裂をもたらす前記変更は、配列番号１の配列に関して位置147、324または147および324の両方に存在する。
【００２４】
実施態様の一系列において、本発明には、少なくとも一つの配列の変更を含む因子VII変異体が含まれ、N結合型グリコシル化の分裂をもたらす前記変更は、配列番号１の配列に関して位置148、325または148および325の両方に存在する。
【００２５】
実施態様の一系列において、本発明には、少なくとも一つの配列の変更を含む変異体因子VIIポリペプチドであって、N結合型グリコシル化の分裂をもたらす前記変更が、K143N/N145T および K143N/N145T/R315N/V317Tから選択される変異体因子VIIポリペプチドが含まれる。
【００２６】
実施態様の一系列において、本発明には、N結合型グリコシル化の分裂をもたらす少なくとも一つの配列の変更を含む因子VII変異体であって、前記配列の変更が以下のものからなる群から選択される因子VII変異体が含まれる：R152E; S344A; L305V; L305V/M306D/D309S; L305I、L305T、F374P、V158T/M298Q、V158D/E296V/M298Q、K337A、M298Q、V158D/M298Q、L305V/K337A、V158D/E296V/M298Q/L305V、V158D/E296V/M298Q/K337A、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A、K157A、E296V、E296V/M298Q、V158D/E296V、V158D/M298K、およびS336G、L305V/K337A、L305V/V158D、L305V/E296V、L305V/M298Q、L305V/V158T、L305V/K337A/V158T、L305V/K337A/M298Q、L305V/K337A/E296V、L305V/K337A/V158D、L305V/V158D/M298Q、L305V/V158D/E296V、L305V/V158T/M298Q、L305V/V158T/E296V、L305V/E296V/M298Q、L305V/V158D/E296V/M298Q、L305V/V158T/E296V/M298Q、L305V/V158T/K337A/M298Q、L305V/V158T/E296V/K337A、L305V/V158D/K337A/M298Q、L305V/V158D/E296V/K337A‐FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、S314E/K316H、S314E/K316Q、S314E/L305V、S314E/K337A、S314E/V158D、S314E/E296V、S314E/M298Q、S314E/V158T、K316H/L305V、K316H/K337A、K316H/V158D、K316H/E296V、K316H/M298Q、K316H/V158T、K316Q/L305V、K316Q/K337A、K316Q/V158D、
K316Q/E296V、K316Q/M298Q、K316Q/V158T、S314E/L305V/K337A、S314E/L305V/V158D、S314E/L305V/E296V、S314E/L305V/M298Q、S314E/L305V/V158T、S314E/L305V/K337A/V158T、S314E/L305V/K337A/M298Q、S314E/L305V/K337A/E296V、S314E/L305V/K337A/V158D、S314E/L305V/V158D/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V、S314E/L305V/V158T/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V、S314E/L305V/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、K316H/L305V/K337A、K316H/L305V/V158D、K316H/L305V/E296V、K316H/L305V/M298Q、K316H/L305V/V158T、K316H/L305V/K337A/V158T、K316H/L305V/K337A/M298Q、K316H/L305V/K337A/E296V、K316H/L305V/K337A/V158D、K316H/L305V/V158D/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V、K316H/L305V/V158T/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V、K316H/L305V/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、K316Q/L305V/K337A、K316Q/L305V/V158D、K316Q/L305V/E296V、K316Q/L305V/M298Q、K316Q/L305V/V158T、K316Q/L305V/K337A/V158T、K316Q/L305V/K337A/M298Q、K316Q/L305V/K337A/E296V、K316Q/L305V/K337A/V158D、K316Q/L305V/V158D/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V、K316Q/L305V/V158T/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V、K316Q/L305V/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、F374Y/K337A、F374Y/V158D、F374Y/E296V、F374Y/M298Q、F374Y/V158T、F374Y/S314E、F374Y/L305V、F374Y/L305V/K337A、F374Y/L305V/V158D、F374Y/L305V/E296V、F374Y/L305V/M298Q、F374Y/L305V/V158T、F374Y/L305V/S314E、F374Y/K337A/S314E、F374Y/K337A/V158T、F374Y/K337A/M298Q、F374Y/K337A/E296V、F374Y/K337A/V158D、F374Y/V158D/S314E、F374Y/V158D/M298Q、F374Y/V158D/E296V、F374Y/V158T/S314E、F374Y/V158T/M298Q、F374Y/V158T/E296V、F374Y/E296V/S314E、F374Y/S314E/M298Q、F374Y/E296V/M298Q、F374Y/L305V/K337A/V158D、F374Y/L305V/K337A/E296V、F374Y/L305V/K337A/M298Q、F374Y/L305V/K337A/V158T、F374Y/L305V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V、F374Y/L305V/V158D/M298Q、F374Y/L305V/V158D/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q、F374Y/L305V/E296V/V158T、F374Y/L305V/E296V/S314E、F374Y/L305V/M298Q/V158T、F374Y/L305V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/S314E、F374Y/K337A/S314E/V158T、F374Y/K337A/S314E/M298Q、F374Y/K337A/S314E/E296V、F374Y/K337A/S314E/V158D、F374Y/K337A/V158T/M298Q、F374Y/K337A/V158T/E296V、F374Y/K337A/M298Q/E296V、F374Y/K337A/M298Q/V158D、F374Y/K337A/E296V/V158D、F374Y/V158D/S314E/M298Q、F374Y/V158D/S314E/E296V、F374Y/V158D/M298Q/E296V、F374Y/V158T/S314E/E296V、F374Y/V158T/S314E/M298Q、F374Y/V158T/M298Q/E296V、F374Y/E296V/S314E/M298Q、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E; R152E、S344A; P11Q/K33E、T106N、V253N、R290N/A292T、G291N、R315N/V317T、およびK143N/R315N/V317T。
【００２７】
実施態様の一系列において、本発明には、変異体因子VIIポリペプチドであって、野生型ヒトFVIIaと比較して減少した半減期を示す変異体因子VIIポリペプチドが含まれる。
【００２８】
いくつかの実施態様において、本発明の因子VII変異体は、ヒト血漿において測定されたとき野生型因子VIIの半減期と比較して、少なくとも約0.25時間、少なくとも約0.5時間、少なくとも約1時間、少なくとも約2時間に半減期の減少を示す。
【００２９】
いくつかの実施態様において、変異体因子VIIポリペプチドは、ヒト血漿中において測定されたときに約2時間未満、例えば、約1.5時間未満、約1時間未満、30分未満の半減期を示す。
【００３０】
以下の表は、さらに本発明の異なる制限のない実施態様を例証する。
【表１】
2008503541.tif 000002
【００３１】
N145について上述に挙げた任意の置換基は、N322について上述に挙げた任意の置換基と組み合わされ得ることが理解され得る。
【００３２】
本発明にはまた、N＋1、N＋2、またはN＋3残基の置換によるN145および／またはN322でのグリコシル化の分裂が包含される。すなわち、S147のT以外の任意の残基への置換および／またはT324のS以外の任意の残基への置換を有するポリペプチド、ならびにA146、K148、I323、およびE325の一以上がグリコシル化分裂型アミノ酸（プロリン(P)によって例証されるがこれに限定されない）によって置換されたポリペプチドがまた、本発明によって包含される。
【００３３】
本発明はまた、配列番号１のN145とA146の間; A146とS147の間; N322とI323の間; またはI323とT324の間に一以上のアミノ酸の挿入されたポリペプチドが包含される。このような挿入は、N145またはN322でのグリコシル化の分裂を適用可能にもたらす。
【００３４】
グリコシル化がN145およびN322の両方で分裂する因子VII変異体において、上記に開示されたものの任意の組み合わせが使用され得る（例えば、T324の置換と組み合わされたN145の置換、または任意の他の有用な組み合わせ）。
【００３５】
実施態様の一系列において、N145、N322、またはその両方でグリコシル化を分裂させる因子VIIaのアミノ酸配列の修飾が、一以上の追加の配列の変更によって因子VII配列内に含まれる。
【００３６】
追加の修飾の制限のない例には、S52A-FVIIa、S60A-FVIIa ( Lino et al., Arch. Biochem. Biophys. 352: 182-192, 1998); 米国特許第5,580,560号に開示された増加したタンパク分解安定性を示すFVIIa変異体 ; 残基290と291の間または残基315と316の間でタンパク質分解的に開裂された因子VIIa (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995);酸化された形態の因子VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999); PCT/DK02/00189 (WO 02/077218に対応) に開示されたFVII変異体; およびWO 02/38162 (Scripps Research Institute)に開示された増加したタンパク質分解安定性を示すFVII変異体; 修飾されたGla-ドメインを有し、かつWO 99/20767、米国特許第6017882号および第6747003号、米国特許出願第20030100506号(University of Minnesota) および WO 00/66753、米国特許出願第20010018414号、第2004220106号、および第200131005号、米国特許第6762286号および第6693075号 (University of Minnesota)に開示された増強された膜結合を示すFVII変異体; および WO 01/58935、米国特許第6806063号、米国特許出願第20030096338号 (Maxygen ApS)、WO 03/93465 (Maxygen ApS)、WO 04/029091 (Maxygen ApS)、WO 04/083361 (Maxygen ApS)、およびWO 04/111242 (Maxygen ApS)、およびWO 04/108763 (Canadian Blood Services)に開示されたFVII変異体が含まれる。
【００３７】
野生型FVIIaと比較して増加した生物学的活性を有するFVII変異体の制限のない例には、WO 01/83725、WO 02/22776、WO 02/077218、PCT/DK02/00635 (WO 03/027147に相当)、デンマーク特許出願第2002 01423号 (WO 04/029090に相当)、デンマーク特許出願第2001 01627号 (WO 03/027147に相当); WO 02/38162 (Scripps Research Institute)に開示されたFVII変異体; および日本特許出願第2001061479号 (Chemo-Sero-Therapeutic Res Inst.)に開示された増強された活性を有するFVIIa 変異体が含まれる。
【００３８】
追加の修飾のさらなる制限のない例には、以下のものが含まれる: R152E; S344A; L305V; L305V/M306D/D309S; L305I、L305T、F374P、V158T/M298Q、V158D/E296V/M298Q、K337A、M298Q、V158D/M298Q、L305V/K337A、V158D/E296V/M298Q/L305V、V158D/E296V/M298Q/K337A、V158D/E296V/M298Q/L305V/K337A、K157A、E296V、E296V/M298Q、V158D/E296V、V158D/M298K、およびS336G、L305V/K337A、L305V/V158D、L305V/E296V、L305V/M298Q、L305V/V158T、L305V/K337A/V158T、L305V/K337A/M298Q、L305V/K337A/E296V、L305V/K337A/V158D、L305V/V158D/M298Q、L305V/V158D/E296V、L305V/V158T/M298Q、L305V/V158T/E296V、L305V/E296V/M298Q、L305V/V158D/E296V/M298Q、L305V/V158T/E296V/M298Q、L305V/V158T/K337A/M298Q、L305V/V158T/E296V/K337A、L305V/V158D/K337A/M298Q、L305V/V158D/E296V/K337A‐FVII、L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、S314E/K316H、S314E/K316Q、S314E/L305V、S314E/K337A、S314E/V158D、S314E/E296V、S314E/M298Q、S314E/V158T、K316H/L305V、K316H/K337A、K316H/V158D、K316H/E296V、K316H/M298Q、K316H/V158T、K316Q/L305V、K316Q/K337A、K316Q/V158D、K316Q/E296V、K316Q/M298Q、K316Q/V158T、S314E/L305V/K337A、S314E/L305V/V158D、S3
14E/L305V/E296V、S314E/L305V/M298Q、S314E/L305V/V158T、S314E/L305V/K337A/V158T、S314E/L305V/K337A/M298Q、S314E/L305V/K337A/E296V、S314E/L305V/K337A/V158D、S314E/L305V/V158D/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V、S314E/L305V/V158T/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V、S314E/L305V/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q、S314E/L305V/V158T/K337A/M298Q、S314E/L305V/V158T/E296V/K337A、S314E/L305V/V158D/K337A/M298Q、S314E/L305V/V158D/E296V/K337A、S314E/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、S314E/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、K316H/L305V/K337A、K316H/L305V/V158D、K316H/L305V/E296V、K316H/L305V/M298Q、K316H/L305V/V158T、K316H/L305V/K337A/V158T、K316H/L305V/K337A/M298Q、K316H/L305V/K337A/E296V、K316H/L305V/K337A/V158D、K316H/L305V/V158D/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V、K316H/L305V/V158T/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V、K316H/L305V/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q、K316H/L305V/V158T/K337A/M298Q、K316H/L305V/V158T/E296V/K337A、K316H/L305V/V158D/K337A/M298Q、K316H/L305V/V158D/E296V/K337A、K316H/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、K316H/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、K316Q/L305V/K337A、K316Q/L305V/V158D、K316Q/L305V/E296V、K316Q/L305V/M298Q、K316Q/L305V/V158T、K316Q/L305V/K337A/V158T、K316Q/L305V/K337A/M298Q、K316Q/L305V/K337A/E296V、K316Q/L305V/K337A/V158D、K316Q/L305V/V158D/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V、K316Q/L305V/V158T/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V、K316Q/L305V/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q、K316Q/L305V/V158T/K337A/M298Q、K316Q/L305V/V158T/E296V/K337A、K316Q/L305V/V158D/K337A/M298Q、K316Q/L305V/V158D/E296V/K337A、K316Q/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、K316Q/L305V/V158T/E296V/M298Q/K337A、F374Y/K337A、F374Y/V158D、F374Y/E296V、F374Y/M298Q、F374Y/V158T、F374Y/S314E、F374Y/L305V、F374Y/L305V/K337A、F374Y/L305V/V158D、F374Y/L305V/E296V、F374Y/L305V/M298Q、F374Y/L305V/V158T、F374Y/L305V/S314E、F374Y/K337A/S314E、F374Y/K337A/V158T、F374Y/K337A/M298Q、F374Y/K337A/E296V、F374Y/K337A/V158D、F374Y/V158D/S314E、F374Y/V158D/M298Q、F374Y/V158D/E296V、F374Y/V158T/S314E、F374Y/V158T/M298Q、F374Y/V158T/E296V、F374Y/E296V/S314E、F374Y/S314E/M298Q、F374Y/E296V/M298Q、F374Y/L305V/K337A/V158D、F374Y/L305V/K337A/E296V、F374Y/L305V/K337A/M298Q、F374Y/L305V/K337A/V158T、F374Y/L305V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V、F374Y/L305V/V158D/M298Q、F374Y/L305V/V158D/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q、F374Y/L305V/E296V/V158T、F374Y/L305V/E296V/S314E、F374Y/L305V/M298Q/V158T、F374Y/L305V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/S314E、F374Y/K337A/S314E/V158T、F374Y/K337A/S314E/M298Q、F374Y/K337A/S314E/E296V、F374Y/K337A/S314E/V158D、F374Y/K337A/V158T/M298Q、F374Y/K337A/V158T/E296V、F374Y/K337A/M298Q/E296V、F374Y/K337A/M298Q/V158D、F374Y/K337A/E296V/V158D、F374Y/V158D/S314E/M298Q、F374Y/V158D/S314E/E296V、F374Y/V158D/M298Q/E296V、F374Y/V158T/S314E/E296V、F374Y/V158T/S314E/M298Q、F374Y/V158T/M298Q/E296V、F374Y/E296V/S314E/M298Q、F374Y/L305V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/K337A/S314E、F374Y/E296V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A、F374Y/L305V/E296V/M298Q/S314E、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A、F374Y/V158D/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158D/K337A/S314E、F374Y/V158D/M298Q/K337A/S314E、F374Y/V158D/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A、F374Y/L305V/V158D/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/S314E、F374Y/V158T/E296V/M298Q/K337A、F374Y/V158T/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/K337A/S314E、F374Y/V158T/M298Q/K337A/S314E、F374Y/V158T/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158T/E296V/M298Q、F374Y/L305V/V158T/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158T/E296V/K337A、F374Y/L305V/V158T/M298Q/S314E、F374Y/L305V/V158T/E296V/S314E、F374Y/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/V158T/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T、F374Y/L305V/E296V/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A、F374Y/L305V/V158D/E296V/K337A/S314E、F374Y/L305V/V158D/M298Q/K337A/S314E、F374Y/L305V/E296V/M298Q/K337A/V158T/S314E、F374Y/L305V/V158D/E296V/M298Q/K337A/S314E、R152E、S344A; P11Q/K33E、T106N、V253N、R290N/A292T、G291N、R315N/V317T、K143N/R315N/V317T; およびT233〜N240のアミノ酸配列中に置換、付加または欠失を有するFVII、およびR304〜C329（上記に特定された322-324以外）のアミノ酸配列中に置換、付加または欠失を有するFVII。実施態様の一系列において、本発明の変異体にはK143N/N145Tが含まれ; 幾つかの実施態様において、本発明の変異体にはK143N/N145T/R315N/V317Tが含まれる。
【００３９】
本発明にはまた、残基145、322またはその両方を含む因子VIIの断片中において、グリコシル化分裂型の変更が導入された因子VIIの断片が包含される。例えば、融合タンパク質(すなわち他の非因子VII配列と組み合わされた)の一部よりなるペプチドが挙げられる。いくつかの実施態様において、因子VIIから誘導された断片は、因子VII生物活性を有する。いくつかの実施態様において、因子VIIから誘導された断片は、因子VIIの宿主依存性の免疫原性／抗原性を保持または欠く。
【００４０】
本発明にはまた、因子VIIポリペプチドであって、因子VIIポリペプチド中において、N145、N322、またはその両方でグリコシル化を分裂させる因子VIIaのアミノ酸配列の修飾が、ポリペプチドのアミノ酸の一以上の化学的修飾（例えば、アルキル化、PEG化、アシル化、エステル形成、アミド形成、またはこれらに類する化学的修飾）によって行われる因子VIIポリペプチドが包含される。このような因子VII誘導体の制限のない例には、PEG化因子VIIa、システイン-PEG化因子VIIa、およびその変異体が含まれる。
【００４１】
これには、PEG化ヒト因子VIIa、システイン-PEG化ヒト因子VIIaおよびその変異体が含まれるがこれらに限定されない。因子VII誘導体の制限のない例には、WO 03/31464および米国特許出願第20040043446号、第20040063911号、第20040142856号、第20040137557号、および第20040132640号 (Neose Technologies, Inc.)に開示された糖PEG化された(GlycoPegylated)FVII誘導体; WO 01/04287、米国特許出願第20030165996号、WO 01/58935、WO 03/93465 (Maxygen ApS) および WO 02/02764、米国特許出願第20030211094号 (University of Minnesota) に開示されたFVII結合体が含まれる。
【００４２】
PEG化とは、因子VIIaポリペプチドの任意の部位（任意のアミノ酸残基または糖質基を含むがこれらに限定されない）とのPEG分子の結合をいう。用語「システイン-PEG化ヒト因子VIIa」とは、因子VIIaに導入されたシステインのスルフヒドリル基と結合したPEG分子を有する因子VIIaをいう。修飾された因子VIIaの他の制限のない例には、残基290と291の間または残基315と316との間でタンパク質分解的に開裂した因子VIIa (Mollerup et al., Biotechnol. Bioeng. 48:501-505, 1995); および酸化された形態の因子VIIa (Kornfelt et al., Arch. Biochem. Biophys. 363:43-54, 1999)が含まれる。
【００４３】
本発明にはまた、有用な因子VIIのグリコシル化分裂型変異体を同定するための方法が包含される。これらの方法は、以下の工程によって行われる。
【００４４】
(a) 活性化された形態の発現産物を生成する条件下において、因子VIIの異なるグリコシル化分裂型変異体（例えば、N145、N322、またはその両方でグリコシル化が分裂された変異体）をコードする複数のDNA化学種の発現産物を得る工程と、
(b) 因子VIIa生物学的活性; 生物学的利用能; 貯蔵安定性; および免疫原性の一以上について発現産物を試験する工程（以下を参照されたい）。
【００４５】
いくつかの実施態様において、工程(b)の前に、発現産物が本発明による化学的修飾を受けてもよい（例えば、さらなるタンパク質分解性開裂、PEG化、およりこれらに類する修飾）。
【００４６】
いくつかの実施態様において、N145でグリコシル化を分裂させる特定の配列の修飾は、N322でグリコシル化を分裂させる他の配列の修飾と組み合わされ得る。本発明にはさらに、生物学的活性、生物学的利用能、および／または貯蔵安定性の所望のプロフィールが達成されるまで(a)および(b)を繰り返すことが含まれ得る。
【００４７】
因子VIIaの性質
いくつかの実施態様において、本発明の因子VII/VIIaのグリコシル化分裂型変異体は、未修飾の(野生型)因子VII/因子VIIaと比較して向上した生物学的活性、薬物動態学的性質および／または貯蔵安定性を示す。本発明の目的のために、因子VIIaの生物学的活性は、例えば米国特許第5,997,864において記載されるような、因子VII欠乏性血漿およびトロンボプラスチンを使用して血液凝固を促進する製剤の能力を測定することによって定量化され得る。この分析において、生物学的活性は、対照試料と比較した凝固時間における減少として表わされ、1単位/mlの因子VII活性を含む貯留されたヒト血清標準と比較することによって「因子VII単位」に転換される。代わりに、血餅溶解時間および凝血強度は、例えば Vig et al.(2001) Blood coagulation & fibrinolysis, Vol. 12 (7) pp. 555-561 および Sorensen (2003) Throm Haemost 1:551-558 によって記載されたようなトロンボエラストグラピー(thromboelastograpy)によって測定され得る。代わりに、凝血強度は 、Carr et al, (1991), Am. J. Med. Sci. 302: 13-8によって記載されたように分析され得る。トロンボエラストグラピーによって測定される因子VIIaの凝血活性を反映する一つのパラメーターは、「全体的凝血度(overall clot quality)」(OCQ)である。いったん凝血形成が開始されたとき(t=0)、時間の関数としての凝血の強度の測定は、凝血塊形成の最大速度(max vel)と最大速度に到達するのに必要な時間（ｔmax vel)を明らかにする。続いて、組織プラスミノーゲン活性化因子(TPA)の追加は、線維素溶解の測定、および線維素溶解の最大速度に達するのに必要な時間(t min vel)の導出を可能にする。OCQは次のように計算される:
【数１】
2008503541.tif 000003
【００４８】
因子VIIa生物学的活性はまた、(i)因子VIIaが脂質薄膜中に埋め込まれたTFを含む系において因子Xaを生成する因子VIIaの能力を測定し(Persson et al., J. Biol. Chem. 272:19919-19924, 1997)；(ii) 水性系において因子Xの加水分解を測定し； (iii) 表面プラズモン共鳴に基づいた装置を使用してTFに対するその物理的結合を測定し (Persson, FEBS Letts. 413:359-363, 1997)、 (iv)合成基質の加水分解を測定し; および／または (v) インビトロ系でのTF非依存性のトロンビンの生成を測定することによって定量化され得る。
【００４９】
野生型因子VIIaに関する向上したまたは増強した生物学的活性を有する因子VII変異体には、上述された一以上の凝血試験、タンパク質分解試験、またはTF結合試験において試験されたとき、同じ細胞タイプにおいて生成された野生型因子VIIaの特異的活性の少なくとも約125%、少なくとも約150%、少なくとも約175%、少なくとも約200%を示すものが包含される。
【００５０】
特定の対象の因子VIIa変異体は、変異体の活性と野生型因子VIIの活性との間の比が、1.0超、例えば少なくとも約1.25、例えば、少なくとも約1.5、1.75、2.0、2.5、または3.0になる変異体である。
【００５１】
生物利用能とは、投与後の所定時間に血漿中において検出され得る因子VII変異体ポリペプチドの投与量の割合を意味する。典型的には、生物利用能は、試験動物において、約25〜250g/kgの製剤を投与し; 投与後の所定時間に血漿サンプルを得; および一以上の凝固試験（または任意の生物試験）、免疫試験、またはこれらに等価な試験を使用してサンプル中の因子VII変異体の含量を決定することによって測定される。データは、[因子VII] 対 時間として典型的にはグラフ化されて表示され、かつ生物学的利用能は、曲線下面積(AUC）として表わされる。因子VII変異体の相対的な生物学的利用能とは、変異体のAUCと野生型因子VIIのAUCとの間の比をいう。
【００５２】
いくつかの実施態様において、本発明の因子VII変異体は、野生型の因子VIIの生物学的利用能の少なくとも約110%、少なくとも約120%、少なくとも約130%、少なくとも約140% の相対的な生物学的利用能を示す。生物学的利用能は、任意の哺乳類生物種、例えばイヌにおいて測定され得、およびAUCを算出するために使用される所定時間には、10分〜8時間の異なる間隔が包含され得る。
【００５３】
「半減期」とは、因子VII変異体ポリペプチドの血漿濃度について、ある特定の値からその値の半分の値まで減少させるために必要な時間をいう。半減期は、生物学的利用能についての手順と同じ手順を使用して決定され得る。
【００５４】
実施態様の一系列において、本発明は、様々な因子VIIポリペプチドを包含し、前記ポリペプチドは野生型ヒトFVIIaと比較して減少した半減期を有する。
【００５５】
いくつかの実施態様において、本発明の因子VII変異体は、野生型ヒト因子VIIの半減期と比較してヒト血漿中において測定されたとき、少なくとも約0.25時間、少なくとも約0.5時間、少なくとも約1時間、または少なくとも約2時間の半減期における増加を示す。
【００５６】
製剤の免疫原性とは、ヒトに投与されたときに有害な免疫反応（体液性免疫、細胞性免疫またはその両方）を誘発する製剤の能力をいう。免疫原性は、当該技術において知られた従来の方法を使用して、ある感受性個体における抗因子VII抗体および／または因子VII反応性T細胞の存在を定量することによって測定され得る。いくつかの実施態様において、本発明の因子VII変異体は、外因的に投与された野生型の因子VIIのある感受性個体についての免疫原生と比較して、少なくとも約10％、少なくとも約25％、少なくとも約40％、または少なくとも約50％の感受性個体における免疫原性の減少を示す。
【００５７】
因子VII製剤の貯蔵安定性は、25℃で乾燥粉末として貯蔵されたときに減衰する製剤の20％の生物学的活性について必要とされる時間(a)および／または製剤中の因子VIIa凝集塊の割合における倍加について必要とされる時間(b)を測定することによって評価され得る。
【００５８】
いくつの実施態様において、本発明の因子VII変異体は、減衰する20％の生物学的活性に必要な時間において、野生型因子VIIで同じ現象について必要とされる時間と比較して少なくとも約30％、少なくとも約60％、少なくとも約100％の増加を示す（両製剤とも乾燥粉末として25℃で貯蔵されるとき）。
【００５９】
いくつかの実施態様において、本発明の因子VII変異体は、凝集塊の倍加に必要とされる時間において、野生型因子VIIと比較して少なくとも約30％、少なくとも約60％、少なくとも約100％の増加を示す（両製剤とも乾燥粉末として25℃で貯蔵されるとき）。凝集塊の含量は、Protein Pak 300 SW カラム (7.5 x 300 mm) (Waters, 80013)上のゲル浸透HPLCによって次のように決定される。カラムは溶出剤A（0.2M硫酸アンモニウム、5％イソプロパノール、リン酸で2.5に調整されたpH、およびその後にpHはトリエチルアミンで7.0に調整される）で平衡化され、その後に25μgのサンプルが該カラムに適用される。溶出は溶出剤Aを使用して0.5ml/分の流速で30分間にわたって行われる。そして、検出は、215 nmでの吸光度を測定することによって達成される。凝集塊の含量は、因子VII凝集塊のピーク面積／因子VIIピークの総面積（モノマーおよび凝集塊）として算出される。
【００６０】
DNA構築物、ベクター、および組換え宿主細胞におけるグリコシル化分裂型因子VII変異体の発現
本発明は、本明細書中に開示されたグリコシル化分裂型因子VII変異体をコードするポリヌクレオチド構築物; 該構築物を含むベクター、およびその変異体が発現され得る該ベクターを含む宿主細胞を提供する。該変異体は、任意の従来方法を使用して野生型因子VIIをコードするDNAから構築され得る。因子VIIaポリペプチド変異体の発現に使用される発現ベクターには、クローン化された遺伝子またはcDNAの転写を導くことができるプロモーターが含まれるであろう。プロモーターは、選択された宿主細胞において転写活性を示す任意のDNA配列であり、かつ宿主細胞と同族または異種であるタンパク質をコードする遺伝子から誘導され得る。
【００６１】
本発明の因子VII変異体を宿主細胞の分泌経路に導くために、分泌シグナル配列 (リーダー配列または前配列としても知られる) が、組換えベクター中に提供され得る。分泌シグナル配列は、正確な読み取り枠内においてヒト因子VIIポリペプチド変異体をコードするDNA配列に結合する。分泌シグナル配列は、一般に該ペプチドをコードするDNA配列の5'側に位置する。分泌シグナル配列は通常は該タンパク質に付随するものであっても、他の分泌タンパク質をコードする遺伝子に由来するものであっても、あるいは合成ペプチドであってもよい。
【００６２】
酵母細胞からの分泌については、適切なシグナルペプチドには、α-因子シグナルペプチド(米国特許第4,870,008号を参照)、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチド(O. Hagenbuchle et al., Nature 289, 1981, pp. 643-646を参照)、修飾されたカルボキシペプチダーゼシグナルペプチド(L.A. Valls et al., Cell 48, 1987, pp. 887-897を参照)、酵母BAR1シグナルペプチド(WO 87/02670を参照)、または酵母アスパラギン酸プロテアーゼ3(YAP3)シグナルペプチド (M. Egel-Mitani et al., Yeast 6, 1990, pp. 127-137を参照) が含まれるがこれらに限定されない。さらに、リーダーペプチドをコードする配列はまた、シグナル配列の下流およびヒト因子VII変異体をコードするDNA配列の上流に挿入され得る。リーダーペプチドの機能は、発現ペプチドを小胞体からゴルジ装置に導くことを可能にし、さらに培養液中への分泌のために分泌小胞に導く（すなわち、細胞壁を通したヒト因子VIIポリペプチド変異体の輸出または少なくとも細胞膜を通した酵母細胞の細胞膜周辺腔への輸出）。一実施態様において、リーダーペプチドは、酵母α因子リーダーである（その使用は、例えばUS 4,546,082, US 4,870,008, EP 16 201, EP 123 294, EP 123 544 および EP 163 529)。代わりに、リーダーペプチドは、合成リーダーペプチド、すなわち、天然において見出されないリーダーペプチドであってもよい。合成リーダーペプチドは、例えば、WO 89/02463またはWO 92/11378に記載されたように行われ得る。
【００６３】
因子VII変異体、プロモーターおよび任意的には分泌シグナル配列および／または終結因子それぞれをコードするDNA配列をライゲートするために使用される手順ならびにこれらを複製のために必要な情報を含む適切なベクターに挿入する手順は、当業者に周知である（例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New Yorkを参照されたい）。
【００６４】
本発明による因子VII変異体は、任意の適切な宿主細胞を使用して生産され得る。幾つかの実施態様において、異種性宿主細胞は、組換え遺伝子から特定の変異因子VIIを発現するようプログラムされている。宿主細胞は、脊椎動物、昆虫、真菌または細菌性細胞であってもよい。因子VII変異体はまた、遺伝子導入動物または植物中において生産され得る。
【００６５】
本発明における使用のための哺乳類細胞系統の例は、COS-1(ATCC CRL 1650)、幼少ハムスター腎臓 (BHK) および293 (ATCC CRL 1573; Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977)細胞系統である。好ましいBHK細胞系統は、tk-ts13 BHK細胞系統 (Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:1106-1110, 1982  参照によって本明細書中に組み込まれる) である（以後、BHK 570細胞という）。BHK 570細胞系統は、ATCC受諾番号CRL 10314のもとAmerican Type Culture Collection, 12301 Parklawn Dr., Rockville, Md. 20852に寄託されている。tk-ts 13 BHK 細胞系統はまた、ATCCから受託番号CRL 1632のもと利用可能である。さらに、以下の多数の他の細胞系統が、本発明の範囲内で使用され得る：Rat Hep I (Rat hepatoma; ATCC CRL 1600)、Rat Hep II (Rat hepatoma; ATCC CRL 1548)、TCMK (ATCC CCL 139)、Human lung (ATCC HB 8065)、NCTC 1469 (ATCC CCL 9.1)、CHO (ATCC CCL 61)、DUKX 細胞 (Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4216-4220, 1980) および CHO-DG44 細胞 (Urlaub et al. Cell33: 405-412, 1983)。
【００６６】
適切な酵母細胞の例には、Saccharomyces spp.またはSchizosaccharomyces spp.の細胞、特にSaccharomyces cerevisiae または Saccharomyces kluyveriの細胞株が含まれる。異種DNAで酵母細胞を形質転換するための方法およびそこから異種ポリペプチドを生産する方法が、例えば、米国特許第4,599,311号、米国特許第4,931,373号、米国特許第4,870,008号、米国特許第5,037,743号および米国特許第4,845,075号において記載されている（これらの全てが参照によって本明細書中に組み込まれる）。形質転換された細胞は、典型的には選択可能なマーカー、共通の薬剤耐性または特定の栄養素、例えばロイシンの欠損下で生育する能力によって決定された表現型によって選択される。酵母における使用のための好ましいベクターは、米国特許4,931,373において開示されたPOT1ベクターである。因子VII変異体をコードするDNA配列は、上述したようにシグナル配列および任意的にはリーダー配列によって先行され得る。適切な酵母細胞のさらなる例には、K. lactis, HansenulaのようなKluyveromycesの細胞株、例えば H. polymorpha または Pichia 例えば P. pastoris がある (Gleeson et al., J. Gen. Microbiol. 132, 1986, pp. 3459-3465; 米国特許第4,882,279号を参照されたい)。
【００６７】
他の真菌細胞の例には、線維状真菌の細胞、例えばAspergillus spp., Neurospora spp., Fusarium spp. または Trichoderma spp., 特にA. oryzae, A nidulans または A. niger の細胞株がある。タンパク質の発現のためのAspergillus spp.の使用は、例えば、欧州特許第272 277号、欧州特許第238 023号、欧州特許第184 438号に記載される。F. oxysporum の形質転換は、例えば、Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156によって記載されたように行われ得る。Trichoderma spp.の形質転換は、例えば欧州特許第244 234号に記載されたように行われ得る。
【００６８】
本発明は、本発明によるグリコシル化分裂型因子VII変異体を生成する方法を包含する。これらの方法は、以下の工程によって行われる：
（ａ）グリコシル化分裂型因子VII変異体を発現する細胞を培養する工程と、
（ｂ）前記培養物から因子VII変異体を回収し、ポリペプチドを含む製剤を得る工程。
【００６９】
前記方法にはさらに、因子VII変異体の精製および／または活性化が含まれる。
【００７０】
これらの細胞の起源からの因子VII変異体ポリペプチドの分離は、付着性細胞培養物から所望の生成物を含む細胞培養液の分離；非付着性細胞を除去するための遠心分離またはろ過；およびこれらに類するものを含むがこれらに限定されない当該技術分野において既知の任意の方法によって達成され得る。
【００７１】
任意的には、因子VIIポリペプチドはさらに精製され得る。精製は、アフィニィティークロマトグラフィー、例えば抗因子VII抗体カラム上での処理（例えば、Wakabayashi et al., J. Biol. Chem. 261:11097, 1986; and Thim et al., Biochem. 27:7785, 1988 を参照されたい) ; 疎水性相互作用クロマトグラフィー；イオン交換クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー；電気泳動処理（例えば、調製等電点電気泳動(IEF)）、溶解度分離(例えば、硫安沈澱)、または抽出およびこれらに類するものを含むがこれらに限定されない当該技術において既知の任意の方法を使用して達成され得る。一般的には、Scopes, Protein Purification, Springer-Verlag, New York, 1982; および Protein Purification, J.-C. Janson および Lars Ryden, editors, VCH Publishers, New York, 1989 を参照されたい。精製後、製剤には好ましくは、宿主細胞から誘導された非因子VIIタンパク質の少なくとも約10重量％、より好ましくは約5重量％、および最も好ましくは約1重量％が含まれる。
【００７２】
因子VIIおよび因子VII変異体ポリペプチドは、トリプシン様特異性を有する因子VIIaまたは他のプロテアーゼ（例えば、因子IXa、カリクレイン、因子Xa、およびトロンビン）を使用して、タンパク質分解性開裂によって活性化され得る。例えば、Osterud et al., Biochem. 11:2853 (1972); Thomas, U.S. Patent No. 4,456,591; および Hedner et al., J. Clin. Invest. 71:1836 (1983) を参照されたい。代わりに、因子VIIは、イオン交換クロマトグラフィーカラム、例えばMono Q (登録商標)（Pharmacia）またはこれに類するものを通して因子VIIを通過させることによって活性化され得る。得られた活性化された因子VIIはまた、以下に記載されたように処方および投与され得る。
【００７３】
薬学的組成物およびその使用の方法
本発明の因子VII変異体ポリペプチドはまた、任意の因子VII反応性症候群、例えば凝固因子欠失 ( 例えば、血友病AおよびBまたは凝固因子XIまたはVIIの欠失 ); 血小板減少症またはフォン・ヴィレブランド病、または凝固因子阻害物質、または任意の原因からの過度の出血によって引き起こされる疾患を含むがこれらに限定されない出血性疾患を治療するために使用され得る。
【００７４】
本発明による因子VII変異体を含む薬学的組成物は、予防学的および／または治療学的処理のための非経口的投与を主に目指す。好ましくは、薬学的組成物は、非経口的、すなわち、静脈内、皮下内、または筋肉内に投与される。これらは連続的または拍動的な注入によって投与され得る。
【００７５】
薬学的組成物または処方には、薬学的に許容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアまたは希釈液と組み合わされた（好ましくはこの中に溶解された）、本発明による製剤が含まれる。様々な水性キャリア、例えば水、希釈された水、0.4％生理食塩水、0.3％グリシンおよびこれらに類するものが使用され得る。本発明の因子VII変異体はまた、傷害部位への送達またはターゲティングのためのリポソーム製剤に処方され得る。リポソーム製剤はまた、一般的には例えば、米国特許第4,837,028号、第4,501,728号および第4,975,282号に記載されている。該組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。得られた水溶性溶液はまた、使用のためにパッケージングされ得、または無菌条件下および凍結乾燥下でろ過され得る。凍結乾燥された製剤は投与の前に無菌水溶液と混合される。
【００７６】
組成物には、pH調節剤および緩衝剤および／または等張性調節剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどを含むがこれらに限定されない薬学的に許容可能な補助物質またはアジュバントが含まれ得る。
【００７７】
これらの処方中の因子VII変異体ポリペプチドの濃度は幅広く変化し得（すなわち、約0.5重量％未満、一般的にはまたは少なくとも約1重量％〜15または20重量％）、かつ選択された投与の特定の態様に従って、液体容積、粘度等によって主に選択されるであろう。
【００７８】
従って、静脈注射のための典型的な薬学的組成物にはまた、250mlの無菌リンガー溶液および10mgの因子VII変異体ポリペプチドが含まれ得る。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実際の方法は、当業者に周知または自明であり、その詳細は、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990) に記載されている。
【００７９】
本発明の因子VII変異体を含む組成物は、予防的および／または治療学的処理のために投与され得る。治療学的適用において、組成物は、疾患およびその合併症を治癒、緩和または部分的に抑止するのに十分な量で、上述したような疾患に既に罹患している患者に投与される。これを達成するのに十分な量が、「治療学的有効量」として定義される。各目的についての有効量は、疾患または傷害の重症度および患者の重量および通常状態に依存するであろう。しかしながら一般には、有効量は、70kgの患者について一日当り約0.05mg〜約500mgの製剤の範囲内にあり、一日当り約1.0mg〜約200mgの製剤の投与量が一般に共通して使用される。適切な投与を決定することは、日常的な実験を使用して、基質の値を構築しかつマトリックスの異なる地点を試験することによって達成され得ることが理解されるであろう。
【００８０】
本発明の製剤の局所的送達、例えば、局所的適用は、噴霧、灌流、二重バルーンカテーテル、ステント（血管移植片またはステント内部に組み込まれた）、被覆バルーンカテーテルに使用されたヒドロゲル、または他の十分に確立された方法によって行われ得る。いずれにしても、薬学的組成物は、患者を効果的に治療するのに十分な製剤の量を提供すべきである。
【００８１】
本発明は、因子VIIaまたは因子VIIa等価物に合わせてさらなる薬剤の組み合わせ投与を含む。いくつかの実施態様において、さらなる薬剤には、血液凝固剤が含まれる。血液凝固剤には、例えば因子VIII、因子IX（例えば、WO 02/062376を参照)、因子V (例えば、PCT/DK02/00736を参照)、因子XI、因子XIII (例えばWO 01/85198を参照); プロトロンビン、またはトロンビン; または線維素溶解性系の阻害剤、例えばPAI-1 (例えば、PCT/DK02/00735を参照)、アプロチニン、ε-アミノカプロン酸（例えばPCT/DK02/00752を参照) またはトラネキサム酸 (例えば、PCT/DK02/00751を参照) が含まれる。また、組織因子経路阻害剤（TFPI阻害剤）（例えば、WO 01/85199を参照）; トロンビン活性化可能な繊維素溶解阻害剤（TAFI）（例えば、PCT/DK02/00734を参照）; タンパク質C阻害剤 (例えば、PCT/DK02/00737を参照); トロンボモジュリン(例えば、PCT/DK02/00738を参照); タンパク質S阻害剤 (例えばPCT/DK02/00739を参照); 組織プラスミノゲン活性化因子阻害剤 (例えば、PCT/DK02/00740を参照); α2-抗プラスミン (例えば、PCT/DK02/00741を参照); アプロチニン (例えば、PCT/DK02/00742を参照); およびフィブリノーゲンが含まれる。
【００８２】
因子VIIaと他の薬剤との組み合わせの投与を含む実施態様において、因子VIIaまたは因子VIIa等価物の投与はそのままで有効な量を含み、かつ追加の薬剤が患者に対する治療学的利益を増大させ得る。代わりに、因子VIIaまたはその等価物と第二の薬剤との組み合わせはともに、外傷と関連した遅延性合併症を予防するのに有効量な量を含み得る。また、有効量が、特定の治療措置の内容（例えば、投与の時期および回数、投与の態様、処方の態様など）において定義され得ることが理解されるであろう。
【００８３】
次の例は、本発明の制限のない例として意図される。
【例】
【００８４】
例１：因子VIIの生物学的活性についての試験：
以下の実験は、本発明による因子VII変異体の生物学的活性を試験するために行われる。
【００８５】
インビトロでの加水分解試験
野生型因子VIIaおよび因子VIIa変異体（以下、ともに「因子VIIa」として言及される）は、その生物学的性質を直接的に比較するために並行して試験に供される。該試験は、マイクロタイタープレート (MaxiSorp, Nunc, Denmark) 中で行われる。色素生産性基質 D-Ile-Pro-Arg-p-ニトロアニリド (S-2288, Chromogenix, Sweden)（最終濃度1 mM）が、0.1 M NaCl、5 mM CaCl2 および 1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含む50 mM Hepes, pH 7.4中において、因子VIIa（最終濃度100 nM）に添加される。405 nmでの吸光度は、SpectraMax（商標） 340 プレートリーダー (Molecular Devices, USA) において連続的に測定される。20分間のインキュベーションの間に展開された吸光度が、酵素を含まないブランクウェル中の吸光度を減算した後、以下の式を使用して変異体の活性と野生型因子VIIaの活性との間の比を計算する。
【数２】
2008503541.tif 000004
【００８６】
上記式に基づいて、天然の因子VIIaに匹敵するかまたはより高い活性を有する因子VIIa変異体が同定され得る（例えば、変異体の活性と天然の因子VII（野生型FVII）の活性との間の比が1.0を超える変異体）。
【００８７】
因子VIIaまたは因子VIIa変異体の活性はまた、因子Xのような生理学的基質（適切には100〜1000 nMの濃度）を使用して測定され得、生成された因子Xa が、適切な色素生産性基質(例えば S-2765)を追加した後に測定される（「インビトロでのタンパク質分解試験」。さらに、活性試験が生理学的温度で行われ得る。
【００８８】
インビトロでのタンパク質分解試験
野生型因子VIIaおよび因子VIIa変異体（以下、ともに「因子VIIa」として言及される）は、その生物学的性質を直接的に比較するために並行して試験に供される。該試験は、マイクロタイタープレート (MaxiSorp, Nunc, Denmark) 中で行われる。0.1 M NaCl、5 mM CaCl2 および 1 mg/ml ウシ血清アルブミンを含む100μL 50 mM Hepes, pH 7.4中の因子VIIa (10 nM) および 因子X (0.8 μM) が15分間にわたってインキュベートされる。因子Xの開裂はその後、0.1 M NaCl、20 mM EDTAおよび1mg/ml ウシ血清アルブミンを含む50μL 50mM Hepes, pH7.4の追加によって停止される。生成された因子Xaの量は、色素生産性基質 Z-D-Arg-Gly-Arg-p-ニトロアニリド (S-2765, Chromogenix, Sweden)（最終濃度 0.5 mM）の追加によって測定される。405 nmでの吸光度が、SpectraMax（商標）340プレートリーダー (Molecular Devices, USA) において連続的に測定される。10分間にわたって展開された吸光度が、FVIIa を含まないブランクウェル中の吸光度を減算した後、以下の式を使用して変異体のタンパク質分解活性と野生型因子VIIaのタンパク質分解活性との間の比を計算する。
【数３】
2008503541.tif 000005
【００８９】
トロンビン生成試験：
トロンビンを生成する因子VIIもしくは因子VII関連ポリペプチドまたは因子VIIIもしくは因子VIII関連ポリペプチド（例えば変異体）の能力は、全ての関連のある血液凝固因子および生理学的濃度の阻害物質および活性化された血小板を含む試験系において測定され得る(p.543 in Monroe et al. (1997) Brit. J. Haematol. 99, 542-547に記載；参照によって本明細書中に組み込まれる)。
【００９０】
凝血試験：
因子VIIポリペプチドの活性はまた、WO 92/15686 または 米国特許第5,997,864号に記載されたような一段階凝血試験（試験４）を使用して本質的に測定され得る。簡潔には、試験対象のサンプルが、50 mM Tris (pH 7.5)中に希釈され、0.1% BSAおよび100μLが、10 mM Ca2+を含む100μLの因子VII欠乏性血漿および200μLのトロンボプラスチンCでインキュベートされる。凝血時間が測定され、参照標準または連続的な希釈液中のクエン酸塩が加えられた正常ヒト血漿の貯留液を使用して標準曲線と比較される。
【００９１】
例２：グリコシル化分裂型因子VII変異体の構築および発現
以下の実験は、グリコシル化分裂型因子VII変異体を生成するために行われた。
【００９２】
１．ヒト因子VIIまたはグリコシル化分裂型因子VII変異体をコードする発現プラスミドの構築：  Hagen et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83, 2412-2416, 1986) [受託番号M13232]によって生成されたλHVII565クローンに由来する全長ヒト因子VII cDNAは、pcDN3.1+ (Invitrogen) のBamH I/EcoR I 部位に挿入され、pTS8 プラスミドが作製された。分裂型因子VII変異体をコードする構築物は、製造業者によって推奨されたQuickChangeキット(Stratagene)を使用してpTS8の指向性突然変異によって生成された。N145Q変異は5’-TTCTAGAAAAAAGACAAGCCAGCAAACCCCAAGG-3’ (配列番号2)フォアードプライマー(下線部分が変異)および相補的なリバースプライマーで導入され、かつ、N322Q変異は5’-GTGGGAGACTCCCCACAAATCACGGAGTACATG-3’ (配列番号3) フォアードプライマーおよび相補的リバースプライマーで導入された。野生型因子VIIcDNAは、pMPSVHE (Artelt et al., Gene, 68, 213-219, 1988)のHind III/EcoR I部位にpTS8からサブクローニングされ、pTS39プラスミドが作製された。同様に、一重または二重N-グリコシル化部位ノックアウト変異をコードする変異型因子VIIcDNAは、pMPSVHEのMlu I/EcoR I部位に挿入され、N145Q変異を有する因子VII（FVII−N145Q）をコードするpCK711プラスミド、FVII-N322QをコードするpCK711プラスミド、およびFVII-N145/322QをコードするpCK713が作製された。挿入された因子VII遺伝子は、DNAシークエンシングによって確認された。
【００９３】
２．ヒト因子VIIまたはグリコシル化分裂型因子VII変異体を生成する安定な細胞系統の生成：  チャイニーズハムスター卵巣細胞（CHO−K1）は、リポフェクタミン(Invitrogen)を使用してpTS39、pCK711、pCK712またはpCK713と組み合わされたネオマイシン耐性遺伝子を含むpSV2-neoでコトンラスフェクトされた。因子VIIタンパク質を発現するクローン安定性は、450 μg/ml G418で選択された。耐性クローンは、ELISAによって因子VIIについての細胞培養を試験することによってスクリーニングされた。このようにして野生型ヒト因子VII、FVII-N322Q、FVII-N145Q、またはFVII-N145/322Qを発現する細胞系統が確立された。
【００９４】
３．ウェスタンブロットによる野生型因子VIIとグリコシル化分裂型因子VII変異体との比較：  野生型ヒト因子VII、FVII-N322Q、FVII-N145Q、またはFVII-N145/322Qを発現するCHO-K1誘導型細胞系統からの培養液を、SDS-PAGEゲル上に載せて電気泳動した。ゲル内のタンパク質は、電気ブロッティングによってPVDF膜に移された。膜上の因子VIIは、マウス抗FVIIモノクローナル抗体（クローンFVII-4F9, Novo Nordisk)およびHRP-結合型ウサギ抗マウスIgG抗体（DAKO）とともに膜の経時的インキュベーションと、ECLウェスタンブロッティング検出試薬(Amersham Biosciences)でのインキュベーションによって可視化された。読み取りは、Las-1000ルミネセンスイメージアナライザー(Fujifilm)で行われた。野生型因子VIIおよび三つのグリコシル化分裂型因子VII変異体が、異なるバンドとして検出され、三つのグリコシル化分裂型因子VII変異体全ての有効な分泌が実証された（図１）。各N-グリコシル化ノックアウト変異は、因子VII変異体の電気泳動の移動度を増加させた（図１）。この結果は、因子VII変異体のN-グリコシル化部位が意図したとおり実際に分裂したことを確証させる。
【００９５】
例３：グリコシル化分裂型因子VIIaの生物活性
以下の例は、グリコシル化分裂型因子VIIaポリペプチドの生物活性を試験するために行われた。
【００９６】
培養液は、野生型ヒト因子VIIの遺伝子または本明細書中の例２に記載された一つまたは二つのNグリコシル化ノックアウト変異をもつヒト因子VIIの遺伝子を含む発現プラスミドでトランスフェクトされたCHO-K1誘導型の安定化クローン株から回収された。該培養液は、酵素連結型免疫吸着試験（ELISA）によって因子VII含量について分析され、かつ凝血試験によって因子VII活性について分析された。凝血試験について、培養液および50 mM Pipes pH 7.2、100 mM NaCl、2 mM EDTA、および1 % BSA中に希釈された因子VII標準体が、等しい容積の因子VII欠乏培地で混合された。各サンプルの凝血時間は、12.5 mM CaCl2中のウサギトロンボプラスチンの等しい量の追加によってACL 300R (Instrumentation Laboratory)凝血装置において決定された。因子VIIユニットと凝血時間との関係は標準曲線で決定され、各培養液中の単位の量が凝血時間から計算された。組み換え野生型および変異体因子VIIのFVII活性は、ELISAおよび凝血試験データを組み合わせることによって計算された。結果を以下の表に示す：
【表２】
2008503541.tif 000006
【００９７】
これらの結果は、グリコシル化分裂型ヒト因子VIIが野生型ヒト因子VIIと比較して増加した活性を示すことを実証した。
【００９８】
例４：グリコシル化分裂型因子VIIのインビボ反応速度と野生型FVIIのインビボ反応速度との比較
以下の実験は、グリコシル化分裂型因子VIIaのインビボでのクリアランスと野生型因子VIIaのインビボでのクリアランスとを比較して行われた。
【００９９】
約30g体重のオスのNMRIマウスの尻尾の静脈に1mg/kgの精製されたFVIIa-N145/322Qまたは野生型のFVIIaを注射した。二つの化合物の各々は、一度の大量注射で13匹または9匹のマウスに与えた。各化合物について、血液サンプルが、注射後0.08時間、0.17時間、0.33時間、0.67時間、1時間、2時間、4時間、6時間、および8時間経過した2〜3匹の麻酔されたマウスの眼から回収された。血液は安定化され、二つの化合物の各々についての特異的な標準曲線を使用してELISAによってFVIIaについて試験を行った。二つの化合物のクリアランスを表わすパラメーターは、2つの化合物の濃度-時間のプロフィールから計算された。キーとなるパラメーターは以下の表に示された。グリコシル化分裂型因子VIIaが野生型因子VIIaよりも速いことは明らかである。
【表３】
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【０１００】
本明細書中に引用された出版物、特許出願および特許を含む全ての参考資料は、各資料が個々におよび具体的に参照によって組み込まれて示され、かつその全体が明細書中に示されるのと同じ範囲で(法によって認められた最大の範囲まで）、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０１０１】
全ての見出しおよび副見出しは、単なる便宜のために本明細書中で使用されているに過ぎず、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１０２】
本明細書中において別の方法が示されるかまたは文脈に明らかに矛盾しない限りにおいて、全ての可能な変形における上述した要素の全ての組み合わせが、本発明によって包含される。
【０１０３】
本明細書中において別の方法が示されるかまたは文脈に明らかに矛盾しない限りにおいて、本発明を説明する文脈（特に、クレームの文脈）における用語「a」および「an」および「the」および類似の冠詞の使用は、単数および複数の両方を意味するものとして解釈されるべきである。
【０１０４】
本明細書中の数値の範囲のレシテーションは、本明細書中において別の意図が無い限り、範囲内にある離れた数値に個別に言及する速記方法として役立たせることを単に意図しているに過ぎない。他の状態がない限り、本明細書中に提供された全ての正確な値は、対応する近似の値の代表値である（例えば、特定の因子または測定値に関して提供された全ての正確な模範的な数値がまた、「約」によって修飾された、対応する近似の測定値を提供することを意味する）。
【０１０５】
本明細書中に記載された全ての方法は、本明細書中において別の方法が示されるかまたは文脈に明らかに矛盾しない限りにおいて、任意の適切な手順において行われ得る。
【０１０６】
本明細書中に提供された任意のおよび全ての例、または例示的な言語（例えば「such as」）の使用は、本発明をよりよく照らすことを意味しているに過ぎず、特に言及がない限り本発明の範囲の限定をもたらすものではない。明細書中の言語は、本発明の実施に対する要素として任意の非権利要求的要素を示すものとして解釈されるべきではない。
【０１０７】
本明細書中の特許文書の引用および組み込みは、便宜のために行われているに過ぎず、このような特許文書の正当性、特許性および／または実効性を反映しません。
【０１０８】
本明細書中において別の方法が示されるかまたは文脈に明らかに矛盾しない限りにおいて、ある特定の要素を「具備する」、「有する」、「包含する」または「含む」といった用語を使用する本発明の側面または実施態様の明細書中の記載は、その特定の要素「からなる」、「から主としてなる」、「を実質的に含む」本発明の側面または実施態様についてのサポートを提供することを意味する。
【０１０９】
本発明には、適用可能な法によって認められた本明細書に添付されたクレーム中に列挙された主題の全ての修飾物および等価物が含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、野生型因子VIIとグリコシル化分裂型因子VII変異体とを比較するウェスタンブロットである。実験の詳細は、例3.2において記載された通りである。左側は分子量マーカーであり、0、1または2N結合型核オリゴ糖鎖を含む因子VIIポリペプチドの移動の指標である。
【図２−１】図２は、天然の（野生型）ヒト血液凝固因子VIIの全アミノ酸配列（配列番号:1）を示す。
【図２−２】図２は、天然の（野生型）ヒト血液凝固因子VIIの全アミノ酸配列（配列番号:1）を示す。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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