(57)【要約】本発明は４０歳以下または５５歳以上の被検者の乳ガン診断方法を提供する。該方法は、被検者から核酸を得て、前記核酸中の多型部位のヌクレオチドを決定する段階を含む。また、乳ガンに特異的なポリヌクレオチド、該ポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ及び診断キットを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
４１歳未満の検体から核酸を得て、かつ前記核酸の中の多型部位のヌクレオチドを決定し、さらに前記多型部位は、表１に列挙された多型配列：配列番号２、４−６、９−１０、１２−１５、１７−３３及び３６から選択された多型配列の１０１番の位置に対応することを特徴とする４１歳未満の検体の乳ガン診断方法。
【請求項２】
多重座マーカに対する核酸中に存在する遺伝子型パターンを決定することをさらに含み、前記多重座マーカは、表２に列挙された多重座マーカから選択されることを特徴とする請求項１に記載の乳ガン診断方法。
【請求項３】
前記遺伝子型パターンを決定することは、前記多重座マーカを含む各多型部位で核酸中に存在するヌクレオチドを決定することを含むことを特徴とする請求項２に記載の乳ガン診断方法。
【請求項４】
前記多型部位に存在する前記ヌクレオチドを決定することは、検体から得られた前記核酸をマイクロアレイでハイブリダイズするものであり、前記マイクロアレイは、配列番号２、４−６、９−１０、１２−１５、１７−３３及び３６から選択された多型配列の１０１位置に該当する多型部位のヌクレオチドを決定するためのプローブポリヌクレオチド、またはその相補体を含むものであり、さらに  前記ハイブリダイゼーションの結果を検出することを含むことを特徴とする請求項１に記載の乳ガン診断方法。
【請求項５】
前記核酸中に存在するとして決定された遺伝子型パターンが表２に示された多重座マーカの遺伝子型と同一である場合、前記検体は、乳ガン患者であると診断されるか、または乳ガンにかかる危険が高いと判断することを特徴とする請求項２に記載の乳ガン診断方法。
【請求項６】
５４歳以上の検体から核酸を得ることと、
前記核酸の多型部位に存在するヌクレオチドを決定することを含み、前記多型部位は、表３の多型配列：配列番号１−１９、２１−２４、２６−２８及び３０−３７から選択された多型配列の１０１番目の位置に対応する多型部位であることを特徴とする乳ガン診断方法。
【請求項７】
多重座マーカの核酸中に存在する遺伝子型パターンを決定することをさらに含み、前記多重座マーカは、表４に列挙された多重座マーカから選択されることを特徴とする請求項６に記載の乳ガン診断方法。
【請求項８】
前記多型部位でヌクレオチドを決定することは、
検体から得られた前記核酸をマイクロアレイにハイブリダイズするものであって、前記マイクロアレイが配列番号１−１９、２１−２４、２６−２８及び３０−３７から選択された多型配列の１０１番目の位置に対応する多型部位のヌクレオチドを決定するためのプローブポリヌクレオチド、またはその相補体を含む段階と、
前記ハイブリダイゼーションの結果を検出することを含むことを特徴とする請求項６に記載の乳ガン診断方法。
【請求項９】
前記遺伝子型を決定することは、前記多重座マーカを含む各多型部位で核酸中に存在する前記ヌクレオチドを決定する段階を含むことを特徴とする請求項７に記載の乳ガン診断方法。
【請求項１０】
前記核酸中に存在するとして決定された遺伝子型パターンが、表４に示された多重座マーカの遺伝子型パターンと同一である場合、前記検体は、乳ガン患者であると診断されるか、または乳ガンにかかる危険が高いと判断することを特徴とする請求項７に記載の乳ガン診断方法。
【請求項１１】
配列番号１ないし３７からなる群から選択された多型配列の全部または連続的な部分を有するポリヌクレオチドであって、前記多型配列の前記連続的な部分は、前記多型配列の１０１番位置を含むことを特徴とするポリヌクレオチド、またはその相補的なポリヌクレオチド。
【請求項１２】
多重座マーカポリヌクレオチドのセットであって、前記多重座マーカは、表２及び表４に記載の多重座マーカから選択され、表２または表４の多重座マーカから選択された全部または連続した一部分を有することを特徴とする多重座マーカポリヌクレオチドのセット。
【請求項１３】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１４】
請求項１２に記載の多重座ポリヌクレオチドのセットを含むことを特徴とするマイクロアレイ。
【請求項１５】
請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴とする乳ガンの診断用診断キット。
【請求項１６】
請求項１２に記載の多重座マーカポリヌクレオチドのセットを含むことを特徴とする乳ガンの診断用診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、乳ガン特異的な多型配列を利用した乳ガン診断方法、乳ガン特異的なポリヌクレオチド、及び該ポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ及び診断キットに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
あらゆる生物のゲノムは、自然発生的突然変異を経験しており、継続的進化の過程で祖先の核酸配列の変異形態を発生させる。先祖の核酸配列の変異形態は、先祖の形態に比べて進化的に利益または不利益を与えたり、またはその中性の場合もありうる。ある場合は、変異形態が致死的な不利益を与えて、子孫に受け継がれない。他の場合では、変異形態が種に進化上の利益を与え、ついには、その種のほとんどの個体のＤＮＡに変異形態が組み込まれ、有利な先祖形態となる。多くの場合、この先祖形態及び変異形態は共に生き残り、種の集団の中で共存することになる。複数形態の配列の共存により、多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が発生する。集団内に共存するＤＮＡ配列の差を多型という。かかる多型の例には、制限断片長さ多形（ＲＦＬＰ：Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ    Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ｌｅｎｇｔｈ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）、マイクロサテライトＳＴＲ（Ｓｈｏｒｔ  Ｔａｎｄｅｍ  Ｒｅｐｅａｔｓ）、一塩基多型（ＳＮＰ：Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）が含まれる。かような配列差が発見されるＤＮＡ配列内の位置を多型位置（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｉｔｅ）という。
【０００３】
ＳＮＰは、単一ヌクレオチドがＤＮＡ配列内で異なる多型である。ＳＮＰが遺伝子内のコーディング領域の配列中に発生すると、多型形態のいずれによっても、非同義のコドン変化を引き起こし、変異された特性を有する変異蛋白質の発現を引き起こすことがある。一方、前記ＳＮＰが遺伝子の非コーディング領域の配列中で発生する場合にも、例えば、欠陥あるスプライシングの結果として変異された蛋白質の発現を招くことがある。しかし、多くのＳＮＰは、表現型に何らの影響を及ぼさないものもある。
【０００４】
ＳＮＰは、人間の場合、約１，０００ｂｐごとに１回の頻度で発生することが知られている。それらＳＮＰが疾病の有無のような表現型に影響を及ぼす場合、前記ＳＮＰの対立因子を含むポリヌクレオチドは、かかる疾病を診断するのにおいて、プライマーまたはプローブとして利用できる。前記ＳＮＰの対立因子に特異的に結合するモノクローナル抗体もまた、疾病の診断に利用できる。現在、さまざまな研究機関でヌクレオチド配列及びＳＮＰ機能に関する研究が行われている。このようにして発見されたＳＮＰの塩基配列及びその他の実験結果がデータベース化して公開されており、だれでもアクセスして研究に利用できる。
【０００５】
しかし、かかるＳＮＰのほとんどは、単純に人間のゲノムまたはｃＤＮＡ上のＳＮＰが存在するということを発見しただけであり、ほとんどのＳＮＰの表現型に及ぼす効果はいまだに知られていない。
【０００６】
乳ガンは、従来技術においては、Ｘ線、超音波診断、生化学的及び分子生物学的方法によって診断可能である。このうち、分子生物学的方法は、早期診断の目的で利用できていない。現在、ミリアッド（Ｍｙｒｉａｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ）社により、ＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ２との遺伝子における乳ガンと関連した約３ないし３０個のＳＮＰ部位が確認されている。
【０００７】
しかしながら、従来知られていた乳ガン診断方法は、いずれも単一ＳＮＰマーカを利用するものであり、個別ＳＮＰマーカの組合わせである多重座マーカ（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｍａｒｋｅｒ）が乳ガンと関連があるか否かということと、それを利用して乳ガンを診断する方法は、明らかにされていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の開示
発明が解決しようとする課題
本発明の目的は、乳ガン特異性の多型配列を利用して４１歳以下または５４歳以上の検体において、乳ガンを診断する方法を提供することである。
【０００９】
本発明の他の目的は、４１未満歳または５４歳以上の検体において、乳ガン特異性のポリヌクレオチドを提供することである。
【００１０】
本発明のさらに他の目的は、乳ガン特異性のポリヌクレオチドを含むマイクロアレイ及び診断キットを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
課題を解決するための手段
用語「ａ」及び「ａｎ」は、量を限定する意味ではなく、一つ以上の参照された事項が存在するということを示す。用語「ｏｒ」は、「ａｎｄ／ｏｒ」を意味する。用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」、「ｈａｖｉｎｇ」及び「ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ」は、開放された用語として解釈されるものである（すなわち、含むが、ここに限定されるものではないという意味である）。
【００１２】
値の範囲を引用することは、単に取り立てて言及がなければ、前記範囲内に該当する各個別の値を個別に参照する短縮表記方法として役割を果たすということを意図したものであり、前記各個別の値は、明細書に個別に引用されているように、明細書に含まれるものである。あらゆる範囲の末端値は、前記範囲内に含まれて独立的に組合わせ可能である。
【００１３】
本明細書に記述されたあらゆる方法は、明細書に取り立てて言及がないか、または文脈によって明確に反駁されていなければ、適した順序で行われるものである。任意及びあらゆる例の使用、または例示的言語（例えば、「ｓｕｃｈ  ａｓ」）は、単に発明をさらに良好に示すためのものと解釈されねばならず、取り立てて請求されないならば、発明の範囲を限定するものではない。明細書内のいなかる言語も、本明細書に使われているような発明の実施に必須な請求されていない任意の要素を示すものと解釈されてはならない。取り立てて定義されていなければ、本明細書に使われた技術的及び科学的用語は、本発明に属する技術分野の当業者によって一般的に履行されるところと同じ意味を有するものとして使われる。
【００１４】
本発明は、４０歳以下の被検者から核酸を分離し、前記核酸中の多型部位の塩基配列を決定する段階を含む、４０歳以下の被検者の乳ガンを診断する方法を提供する。多型部位のヌクレオチドを決定することは、下記表１に表した多型配列から選択された一つ以上の多型配列の多型部位（１０１番目）でのヌクレオチドの遺伝子型を決定する段階を含むことができる。
【００１５】
【表１】
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【００１６】
表１において、名称と表示されたカラムは、多型配列（「ＳＮＰマーカ」ともいう）を含む多型配列の名称を示す。本明細書で「多型配列」とは、ＳＮＰが存在する多型部位を含むヌクレオチド配列を示す。前記「多型部位」とは、ＳＮＰが存在する多型配列の位置を示す。ｒｓ番号で表示されたカラムは、ＮＣＢＩ  ＧｅｎｂａｎｋのｄｂＳＮＰデータベースのＳＮＰのＳＮＰ確認番号（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｎｕｍｂｅｒ）を示す。前記データベースは、一般に開放されているために、当業者ならばだれでもアクセス可能である。本発明において、ｒｓ番号は、ＮＣＢＩ  ｂｕｉｌｄ  １２３に基づいたものである。配列番号と表示したカラムは、核酸内のＳＮＰの確認のための２０１ｂｐ標準配列に対する配列確認番号を示す。Ａ１及びＡ２と表示したカラムは、それら標準配列のそれぞれの多型部位、１０１番位置に存在する２個の対立因子を示す。多型部位を有した前記標準配列が多型部位以外の配列で一部の変形があったとしても、本発明の範囲に含まれるものと解釈されねばならない。
【００１７】
本発明の方法の一具体例によれば、前記多型部位のヌクレオチドを決定する段階は、下記表２に示された多重座マーカから選択された一つ以上の多重座マーカでの遺伝子型を決定する段階を含む。本明細書において、「多重座マーカ」とは、乳ガンと関連した多重多型部位の組合わせで示す遺伝子型パターンを示す。
【００１８】
【表２】
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【００１９】
表２で、名称は、多重座マーカ（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｍａｒｋｅｒ）の名称を示し、遺伝子型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｐａｔｔｅｒｎ）は、多重座マーカの遺伝子型を示し、＝の左側の括弧の中に表示された３桁数字は、表１に表示された多型配列を確認するために使われたＳＭＢＣ＿数字のうち、「数字」の部分を示したものであり、＝の右側の括弧の中に表示された各一桁数字は、＝の左側の括弧の中に表示されたそれぞれ対応する３桁数字に該当する表１の多型配列の多型部位の遺伝子型を示し、０はＡ１Ａ１、１はＡ１Ａ２、２はＡ２Ａ２、０−はＡ１Ａ２またはＡ２Ａ２、及び２−はＡ１Ａ１またはＡ１Ａ２遺伝子型を示し、前記Ａ１またはＡ２対立因子（ａｌｌｅｌｅ）は、表１に表した各多型配列の多型部位でのヌクレオチド対立因子を示すものである。各ＳＮＰは、２個の可能な対立因子であるために、ＳＮＰの遺伝子型は、個体内で同型接合子（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）（例、Ａ１Ａ１）または異型接合子（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）（Ａ１Ａ２）の形態で存在しうる。
【００２０】
本発明はまた、５４歳以上の検体から核酸を分離し、前記核酸中の多型部位の塩基配列を決定するものであり、下記表３に表した一つ以上の多型配列での多型部位（１０１番目ヌクレオチド）のヌクレオチドを決定することを含む、乳ガン診断方法を提供する。
【００２１】
【表３−１】
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【００２２】
【表３−２】
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【００２３】
表３の名称、ｒｓ番号、配列番号、Ａ１及びＡ２は、前記表１で説明通りである。
【００２４】
本発明の方法の一具体例で、前記核酸中の多型部位の塩基配列を決定する段階は、下記表４に示された多重座マーカから選択された一つ以上の多重座マーカでの遺伝子型パターンを決定することを含む。
【００２５】
【表４】
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【００２６】
表４で、名称は多重座マーカ（ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｍａｒｋｅｒ）の名称を示し、遺伝子型パターン（ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ｐａｔｔｅｒｎ）は多型マーカの遺伝子型を示し、＝の左側の括弧の中に表した各三桁数字は、表３の前記多型配列を確認するために使われたＳＭＢＣ＿数字のうち、「数字」部分を示したものであり、＝の右側の括弧の中に表示された各一桁数字は、＝の左側の括弧の中に表したそれぞれ対応する三桁数字に該当する表３の多型配列の多型部位で遺伝子型を示し、０はＡ１Ａ１、１はＡ１Ａ２、２はＡ２Ａ２、０−はＡ１Ａ２またはＡ２Ａ２、及び２−はＡ１Ａ１またはＡ１Ａ２遺伝子型を示し、前記Ａ１またはＡ２対立因子（ａｌｌｅｌｅ）は、表３の各多型配列の多型部位でのヌクレオチド対立因子を示すものである。
【００２７】
本発明において、検体は、多様な人種に属する個体であるが、望ましくは、黄色人種、さらに望ましくは、韓国人女性である。
【００２８】
本発明の方法において、核酸とはヌクレオチドの連続体であり、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びそれらの誘導体が含まれる。ＤＮＡには、生物学的由来のＤＮＡ、合成または半合成ＤＮＡ及びｍＲＮＡから合成されるｃＤＮＡを含む意味である。
【００２９】
本発明において、検体から核酸を分離する方法は、当業者に公知の任意の方法を介してなされる。例えば、組織または細胞から核酸を直接的に精製したり、またはＰＣＲ（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）のような増幅方法を使用して特定の領域を特異的に増幅し、これを分離することによってなされる。ＰＣＲ増幅法以外に、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（Ｗｕ及びＷａｌｌａｃｅ，  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４，５６０（１９８９）；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，  １０７７（１９８８））、転写増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（Ｋｗｏｈら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６，  １１７３（１９８９））及び自家維持配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７，  １８７４（１９９０））及び核酸配列に基づいた増幅（ＮＡＳＢＡ）が使われることができる。
【００３０】
分離された核酸の塩基配列の決定は、当業者に公知の多様な方法によってなされる。例えば、ジデオキシ法によって直接的な核酸のヌクレオチド配列の決定を介してなされるか、または多型部位の配列を含むプローブ、またはそれに相補的なプローブを前記核酸と混成化させ、それから得られる混成化程度を測定することにより、多型部位のヌクレオチド配列を決定する方法などが利用される。ハイブリダイゼーションの程度は、例えば、検出可能な標識を標的核酸に表示し、混成化された標的核酸だけを特異的に検出することによってなされるが、それ以外の電気的信号検出方法などが使われることが可能である。
【００３１】
本発明の一具体例において、前記多型部位での塩基配列の決定は、前記表１または表３に表したＳＮＰマーカの多型部位のヌクレオチドを含むポリヌクレオチドまたはその相補的ポリヌクレオチドがプローブとして基板に固定化されているマイクロアレイに、前記検体から由来した核酸の断片をハイブリダイゼーションすることと、前記ハイブリダイゼーションする程度を測定することを含む方法によってなされるのである。前記マイクロアレイは、基板上に固定化された、表１または３のＳＮＰマーカの多型部位の一つ以上のヌクレオチドを含むプローブポリヌクレオチド、またはその相補的ポリヌクレオチドを含む。
【００３２】
マイクロアレイとは、標的核酸に特異的に結合できるプローブが基板の特定の領域に固定化されている基板であり、早く多様な生物学的分析を行うのに広く使われている。プローブの長さは、特別に限定されないが、望ましくは、１０ないし１００ｂｐのものである。ポリヌクレオチドマイクロアレイを製造する方法は、当業界に公知であり、本発明の方法も、それら公知の任意のマイクロアレイ製造方法によって製造されるものを利用できる。また、マイクロアレイ上での核酸のハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーションの結果の検出は、当業界に公知である。前記検出は、例えば、核酸試料を蛍光物質、例えばＣｙ３及びＣｙ５のような物質を含む検出可能な信号を発生させることができる標識物質で標識した後でマイクロアレイ上に混成化し、前記標識物質から発生する信号を検出することによって混成化結果を検出できる。
【００３３】
塩基配列の分析結果、検体から分離された核酸中に危険対立因子（ｒｉｓｋ  ａｌｌｅｌｅ）が一つ以上存在する場合、被検者が乳ガン患者であるか、または乳ガンにかかる危険が高いと決定できる。本発明の一具体例は、塩基配列の分析結果、被検者から分離された核酸中に表２及び表４に示された一つ以上の多重座マーカが存在する場合、被検者が乳ガン患者であるか、または乳ガンにかかる危険が高いと決定する段階を含む。
【００３４】
本発明はまた、表１または表３の多型配列からなる群から選択された一つ以上の多型配列の全体または部分を有するポリヌクレオチドであって、前記多型配列の前記部分は、前記選択された多型配列の多型部位（１０１番目位置）のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、またはその相補的なポリヌクレオチドを提供する。前記ポリヌクレオチドの長さは、特別に限定されるものではないが、１０ないし２０１ｂｐ、望ましくは、１０ないし１００ｂｐでありうる。
【００３５】
本発明の前記一つ以上のポリヌクレオチドは、４１歳未満または５４歳以上の女性の検体において乳ガンと特異的に関連している。従って、前記ポリヌクレオチドは、乳ガンを診断または治療するのに有用に使われることが可能である。ここで、「多重座マーカポリヌクレオチドのセット」とは、４１歳未満の検体で、乳ガンと特異的な関連がある表２に示された各多重座マーカ、または５４歳以上の検体で、乳ガンと特異的な関連がある表４の多重座マーカから選択された多重座マーカの２以上の各ＳＮＰマーカそれぞれに係るポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドセットをいう。それらポリヌクレオチドは、プライマー及びプローブとして使われることが可能であるが、それらの例に限定されるものではない。プローブとして使われる場合、溶液中で使われるか、または固体基板上に固定されて使われることが可能である。固体基板上に固定化されて使われる前記プローブは、微細な特定の領域にアレイ状に配列されている形態、すなわち、マイクロアレイ形態で使われることが可能である。
【００３６】
従って、本発明はまた、前記表１または表３の多型配列からなる群から選択された多型配列の全部または一部を有するポリヌクレオチドであって、前記多型配列の前記部分は、前記選択された多型配列の多型部位（１０１番目）のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、またはその相補的なポリヌクレオチドが固体基板上に固定化されているマイクロアレイを提供する。前記マイクロアレイは、表２または表４の一つ以上の多重座マーカに係る多重座マーカポリヌクレオチドセットを含むことができる。前記ポリヌクレオチドの長さは、特別に限定されるものではないが、１０ないし２０１ｂｐ、望ましくは、１０ないし１００ｂｐでありうる。
【００３７】
マイクロアレイについては当業者にとって公知であり、当業者ならば容易に前記ポリヌクレオチドを利用してマイクロアレイを製作できる。
【００３８】
本発明はまた、表１または表３の多型配列からなる群から選択された多型配列の全部または一部を有するポリヌクレオチドであって、前記多型配列の前記部分は、前記選択された多型配列の多型部位（１０１番目）のヌクレオチドを含むポリヌクレオチド、またはその相補的なポリヌクレオチド、及び使用指針書が含まれた乳ガン診断用キットを提供する。前記キットは、表２または表４の一つ以上の多重座マーカポリヌクレオチドに係る多重座マーカポリヌクレオチドセットを含むことができる。前記ポリヌクレオチドの長さは、特別に限定されるものではないが、１０ないし２０１ｂｐ、望ましくは、１０ないし１００ｂｐでありうる。
【００３９】
本発明のキットにおいて、キットに含まれたポリヌクレオチドについては、前記の通りである。また、使用指針書は、使用目的によって当業者が理解することができるように、使用過程及び成分などが記載されているものである。前記キットは、例えば、被検体から分離された核酸試料に前記ポリヌクレオチドをプローブとして混成化させ、それから発生する信号を利用して混成化程度を測定することにより、多型部位に特定の対立因子の有無を判別するのに使われることが可能である。前記特定の対立因子の有無または遺伝子型の有無に基づいて、被検体が乳ガンにかかる危険性または乳ガン患者であるかを判別できる。
【００４０】
本発明において、表１及び３に示された各多型配列（ＳＮＰマーカ）及びそれらの２以上の組合わせは、乳ガンと関連性があるのである。特に、前記表２と４の多重座マーカは、乳ガンと関連性がある。これは、乳ガン患者と正常人から収集された血液から得られたＤＮＡを配列分析した結果を介して確認することができた。従来、乳ガンは、女性の閉経期を経たか否かによって発病率が異なって現れると知られているために、各個体の多重座における遺伝子型パターンの分析は、閉経期年齢を前後として３つの年齢群に分けて分析した。韓国人女性において、平均的閉経年齢は４７．６歳であり、月経の履行期は約４年であると知られているために、年齢区分は、４０歳以下の若い年齢グループ、４１歳以上５４歳以下の中年年齢グループ、５４歳以上の老年年齢グループに区分した。分析に使われた各年齢群別個体の数は、次の表５の通りである。
【００４１】
【表５】
2008531041.tif 000008
【００４２】
分析結果、患者群及び正常群での各多重座マーカに対する出現頻度及びオッズ率（ｏｄｄｓ  ｒａｔｉｏ）及び９５％信頼区間は、次の表６と表７の通りである。
【００４３】
表６は、４０歳以下の若い年齢グループについての結果を示す。表６に示されているように、多重座マーカＹ０１ないしＹ１６の遺伝子型パターンは、患者群で特異的に示され、前記多重座マーカＹ０１ないしＹ１６のオッズ率は、３８より大きい。これらの結果は、前記多重座マーカＹ０１ないしＹ１６が乳ガンと陽性的に関連するということを示す。
【００４４】
【表６】
2008531041.tif 000009
【００４５】
表６で、名称及び遺伝子型パターンは前記表２に示された通りである。＃ｃａｓｅ及び＃ｃｏｎｔｒｏｌは、それぞれ患者群及び正常群での出現頻度を示す。ＯＲ及び９５％ＣＩは、オッズ率及び９５％信頼区間を示す。表６の患者群で、Ｙ０１ないしＹ１６の多重座マーカのうちいずれか一つを満足させる患者の数は、調査された総８７人のうち７３人であった（７３／８７＝８４％）。
【００４６】
下記表７は、５５歳以上の年齢群での結果を示すものであり、多重座マーカＯ０１ないしＯ２４の遺伝子型パターンは、患者群でのみ特異的に出現し、前記多重座マーカＯ０１ないしＯ２４のオッズ率がいずれも２６以上であった。それらの結果は、前記多重座マーカＯ０１ないしＯ２４が乳ガンと陽性的（ｐｏｓｉｔｉｅ）関連性があるということを示す。
【００４７】
【表７−１】
2008531041.tif 000010
【００４８】
【表７−２】
2008531041.tif 000011
【００４９】
表７のうち、名称、遺伝子型、ＯＲ及び９５％ＣＩは、前記の表６の通りである。表７での患者群で、Ｏ０１ないしＯ２４の多重座マーカのうちいずれか一つを満足させる患者の数は、調査された総９６人のうち９１人であった（９１／９６＝９４％）。
【００５０】
本発明において、前記３つの年齢群の各年齢群において、前記多重座マーカＹ０１ないしＹ１６及びＯ０１ないしＯ２４のそれぞれの遺伝子型パターンを満足させる個体の数は、次の表８の通りである。
【００５１】
【表８−１】
2008531041.tif 000012
【００５２】
【表８−２】
2008531041.tif 000013
【００５３】
前記表８で、若年、中年及び老齢は、それぞれ４０歳以下、４１歳以上５４歳以下、及び５５歳以上の年齢群から由来した試料を示し、ＯＲはオッズ率を示し、＃ｃａｓｅ及び＃ｃｏｎｔｒｏｌは、それぞれ患者群及び正常群に該当する個体の数を示す。図１は、前記表８に表した各年齢群で、特定の多重座マーカに対するオッズ率をグラフで表したものである。図１に示されているように、Ｙ０１ないしＹ１６多重座マーカは、４０歳以下の年齢群で乳ガンと関連した特異的マーカであり、Ｏ０１ないしＯ２４は、５５歳以上の年齢群で乳ガンと関連した特異的マーカであることが分かる。
【００５４】
下記表９は、４０歳以下の若い年齢群で、前記Ｙ０１ないしＹ１６多重座マーカに含まれた各ＳＮＰマーカについてカイ自乗値及びオッズ率を分析した結果を表したものである。
【００５５】
【表９】
2008531041.tif 000014
【００５６】
前記表９に示されているように、各ＳＮＰ形成マーカは、乳ガンと関連性があるということが分かる。表９での名称は、ＳＮＰ形成マーカの名称であり、Ｄｅｌｔａは疾病群での対立因子の頻度と正常群での対立因子の頻度のとの差の絶対値を示し、正常群でのＡ２対立因子の頻度は（正常群でのＡ２Ａ２遺伝子型の頻度ｘ２＋正常群でのＡ１Ａ２遺伝子型の頻度）／（正常群でのサンプル数ｘ２）である。Ｃｈｉ＿ｅｘａｃｔ＿ｐＶａｌｕｅは、ｐ−ｖａｌｕｅ  ｏｆ  Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔ  ｏｆ  ｃｈｉ−ｓｑｕａｒｅ  ｔｅｓｔを使用して決定されたｐ−値を示し、遺伝子型の数の値が５より小さな値が含まれる場合、一般のカイ二乗検定結果が不正確でありえるので、さらに正確なＦｉｓｈｅｒ’ｓ  ｅｘａｃｔ  ｔｅｓｔを介して統計的有意性（ｐ−ｖａｌｕｅ）を検定することが望ましい。本発明では、ｐ−ｖａｌｕｅが０．０５以下である場合、疾病群と正常群との遺伝子型が同じではない。すなわち、患者群と正常群との間に有意な差があると判断した。表６−９において、ＯＲ（オッズ率）は、正常群のうちから危険対立因子を有する確率に係る疾病群のうちから危険対立因子を有する確率の比率を示す。本発明では、Ｍａｎｔｅｌ−Ｈａｅｎｓｚｅｌオッズ率方法を使用した。ＣＩ（ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｒａｌ）は、オッズ率の９５％信頼区間を示し、（下限信頼区間、上限信頼区間）を示す。１が信頼区間に含まれる場合には、疾病と危険対立因子との有意ではない関連性があると判断される。ＨＷＥ状態は、ハーディー・ワインバーグ平衡（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）の状態を示す。メンデルの遺伝法則及びハーディー・ワインバーグ法則によれば、集団をなす対立因子の遺伝子構成（ｍａｋｅｕｐ）は、一定の頻度で維持される。前記遺伝的構成が統計的に有意である場合、生物学的に有意であると考慮できる。ここで、ｃｏｎ＿ＨＷＥは、正常群でハーディー・ワインバーグ平衡からの偏差の程度を示すものである。カイ二乗（ｄｆ＝１）検定で、ｃｈｉ−ｖａｌｕｅ＝６．６３（ｐ−ｖａｌｕｅ＝０．０１、ｄｆ＝１）を基準で、６．６３より大きい場合には、ハーディー・ワインバーグ非平衡ＨＷＤ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）で、６．６３より小さな場合には、ハーディー・ワインバーグ平衡ＨＷＥ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ）と判断した。
【００５７】
下記表１０は、５５歳以上の年齢群で、前記Ｏ０１ないしＯ２４多重座マーカに含まれた各ＳＮＰマーカについて、カイ二乗値及びオッズ率を分析した結果を表したものである。
【００５８】
【表１０−１】
2008531041.tif 000015
【００５９】
【表１０−２】
2008531041.tif 000016
【００６０】
前記表１０に示されているように、各ＳＮＰ形成マーカは、乳ガンと関連性があるということが分かる。カラム表示は、表９に示された通りである。
【００６１】
下記表１１は、本発明のＹ０１ないしＹ１６及びＯ０１ないしＯ２４多重座マーカに含まれた各ＳＮＰマーカについての情報を表したものである。
【００６２】
【表１１−１】
2008531041.tif 000017
【００６３】
【表１１−２】
2008531041.tif 000018
【００６４】
表１１で、「ｂａｎｄ」は、前記ＳＮＰの染色体番号を示し、ここで「ｐ」は、動原体からの染色体の短いアームを示し、「ｑ」は、動原体からの染色体の長いアームを示し、前記数字はバンド数を示す。例えば、ＩＤ：ＳＭＢＣ＿００１内に位置したＳＮＰの数字が１９ｐ１３．３である場合、前記ＳＮＰは、１９番目の染色体の短いアーム（ｐ）に位置してバンド１３．３領域内に位置する。「Ｇｅｎｅ」は、前記ＳＮＰを含む遺伝子を示す。「ｆｘｎ  ｃｌａｓｓ」は、前記遺伝子内での前記ＳＮＰの役割を示す。「ａａ＿ｒｅｓｉｄｕｅ」は、前記ＳＮＰのアミノ酸を示す。「ａａ＿ｐｏｓｉｔｉｏｎ」は、前記遺伝子から生産された蛋白質内のアミノ酸の位置を示す。
【発明の効果】
【００６５】
発明の効果
本発明の方法によれば、４０歳以下または５４歳以上の被検者に対し、乳ガンの存在または危険の存在いかんを容易に決定できる。
【００６６】
本発明のポリヌクレオチド、マイクロアレイ及び診断キットによれば、４１歳未満または５４歳以上の被検者に対し、乳ガンの存在または危険の存在いかんを分析するにあたって有用に使用可能である。
【００６７】
図面の簡単な説明
図１は、本願の前記の内容及び他の特徴及び長所は、添付された図面を参照してその例示的具体例をさらに詳細に記述することによってさらに明確になる。
【００６８】
図１は、表８に表した各年齢群において特定の多重座マーカに対するオッズ率をグラフで表したものである。
【００６９】
発明を実施するための最良の形態
【実施例】
【００７０】
実施例
本実施例では、韓国人女性において、平均的閉経年齢は４７．６歳であり、月経の履行期は約４年であると知られているために、年齢区分は、４０歳以下の若い年齢グループ、４１歳以上５４歳以下の中年年齢グループ、５５歳以上の老年年齢グループの３つに区分して各検体の血液からＤＮＡを分離し、ＳＮＰの出現頻度を分析した。分析に使われた各年齢群別個体の数は、前記表５に表した通りである。
【００７１】
患者群は、乳ガン患者と判明されて治療中である検体であり、正常人は、同一年齢帯に該当しつつ、まだ乳ガンの症状のない個体である。本実施例に選択されたＳＮＰは、公開されたデータベース（ＮＣＢＩ  ｄｂＳＮＰ：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＳＮＰ／）から選択されたものである（表１及び表３参照）。分析は、選択されたＳＮＰ周辺の配列を利用したプライマーを利用し、試料中の一塩基配列を分析した。
【００７２】
１．ＤＮＡ試料の準備
乳ガン患者及び正常人から収集した血液からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ抽出は、公知の抽出方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ｐ３９２，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  ２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９）と、商業用キット（Ｇｅｎｔｒａ  ｓｙｓｔｅｍ）の説明書とによってなされた。抽出されたＤＮＡのうち、純度（A２６０／A２８０ｎｍ）が最低１．７以上になるもののみを選別して使用した。
【００７３】
２．標的ＤＮＡの増幅
分析しようとするＳＮＰの含まれた一定のＤＮＡ領域である標的ＤＮＡをＰＣＲを利用して増幅した。ＰＣＲ法は、一般的な方法によって進め、その条件は、次のようであった。まず、標的ゲノムＤＮＡを、２．５ｎｇ／ｍｌで準備した。次に、下記のＰＣＲ反応液を準備した。
【００７４】
水（ＨＰＬＣクラス）  ２．２４μｌ
１０ｘバッファ（１５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２含有）  ０．５μｌ
ｄＮＴＰミックス（ＧＩＢＣＯ）（２５ｍＭ／各）  ０．０４μｌ
Ｔａｑ  ｐｏｌ（ＨｏｔＳｔａｒ）（５Ｕ／μｌ）  ０．０２μｌ
フォワード／リバースプライマーミックス（１μＭ／各）  ０．０２μｌ
ＤＮＡ  １．００μｌ
総反応体積  ５．００μｌ
ここで、前記フォワード及びリバースプライマーは、公知のデータベースのＳＮＰの上流と下流とから、適当な位置で選択した。前記プライマーを表１２に整理した。
【００７５】
熱循環反応は、９５℃で１５分間維持し、９５℃で３０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１分を４５回反復し、７２℃で３分間維持した後、４℃に保管した。
【００７６】
３．増幅された標的ＤＮＡ中のＳＮＰの分析
標的ＤＮＡ断片中のＳＮＰの分析は、シーケノム（Ｓｅｑｕｅｎｏｍ）社の均質的ＭａｓｓＥｘｔｅｎｓｉｏｎ（ｈｏｍｏｇｅｎｅｏｕｓ  ＭａｓｓＥｘｔｅｎｓｉｏｎ：以下、ｈＭＥともいう）技法を利用した。前記ＭａｓｓＥｘｔｅｎｓｉｏｎ技法の原理は、次の通りである。まず、標的ＤＮＡ断片中のＳＮＰの直前までの塩基に、相補的なプライマー（延長用プライマー（ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｒｉｍｅｒ）ともいう）を製作する。次に、前記プライマーを標的ＤＮＡ断片に混成化させ、ＤＮＡ重合反応を起こす。このとき、反応液中の対象ＳＮＰ対立因子のうち、第１対立因子塩基（例えば、Ａ対立因子）に相補的である塩基が添加された後で反応を止める試薬（例えば、ｄｄＴＴＰ）を含める。その結果、標的ＤＮＡ断片に第１対立因子（例えば、Ａ対立因子）が存在する場合には、前記第１対立因子に相補的である塩基（例えば、Ｔ）一つだけが添加された産物が得られる。一方、標的ＤＮＡ断片に第２対立因子（例えば、Ｇ対立因子）が存在する場合には、前記第２対立因子に相補的な塩基（例えば、Ｃ）が添加された最も近接した第１対立因子塩基（例えば、Ａ）まで延びた産物を得ることになる。このように得られた前記プライマーから延びた産物の長さを質量分析を介して決定することにより、標的ＤＮＡに存在する対立因子の種類を決定できる。具体的な実験条件は、次の通りであった。
【００７７】
まず、前記ＰＣＲ産物から結合されないｄＮＴＰを除去した。すなわち、純水１．５３μｌ、ＨＭＥバッファ０．１７μｌ、ＳＡＰ（Ｓｈｒｉｍｐ  Ａｌｋａｌｉｎｅ  Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）０．３０μｌを１．５ｍｌチューブに入れて混合し、ＳＡＰ酵素溶液を準備した。次いで、前記チューブを５，０００ｒｐｍで１０秒間遠心分離した。その後、ＰＣＲ産物を前記ＳＡＰ溶液チューブに入れ、密封した後で３７℃で２０分、８５℃で５分間維持した後、４℃で保管した。
【００７８】
次に、前記標的ＤＮＡ産物をテンプレートとして均質的延長反応を実施した。反応液は、次の通りあった。
【００７９】
水（脱イオン水）  １．７２８μｌ
ｈＭＥ延長ミックス（２．２５ｍＭｄ／ｄｄＮＴＰｓを含む１０ｘバッファ）  ０．２００μｌ
延長プライマー（各１００μＭ）  ０．０５４μｌ
Ｔｈｅｒｍｏｓｅｑｕｅｎａｓｅ（３２Ｕ／μｌ）  ０．０１８μｌ
総体積２．００μｌ
前記反応液をよく混合した後、スピンダウン遠心分離を行った。前記反応液の入ったチューブまたはプレートをよく密封した後、９４℃で２分間維持した後、９４℃で５秒、５２℃で５秒、７２℃で５秒を４０回反復した後、４℃で保管した。このように得られた均質的延長反応産物をレジン（ＳｐｅｃｔｒｏＣＬＥＡＮ）を使用して洗浄した。
【００８０】
得られた延長反応産物を質量分析方法のうちＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ）を利用して多型部位の配列を分析した。前記ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦは、分析しようとする物質がレーザビームを受ければ、イオン化されたマトリックス（ｍａｔｒｉｘ）と共に飛行し、真空状態で反対側にある検出器まで飛んで行くのにかかった時間を計算して質量を分析する原理によって作動する。質量が小さな物質は、検出器に速く達するが、このように得られる質量の差と、公知のＳＮＰの配列とを根拠とし、標的ＤＮＡのＳＮＰの配列を決定できるのである。標的配列の増幅及び延長反応に使われたプライマーは、下記表１２に示された通りである。
【００８１】
【表１２−１】
2008531041.tif 000019
【００８２】
【表１２−２】
2008531041.tif 000020
【００８３】
前記のようなＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを使用した標的ＤＮＡの多型部位の配列を決定した結果、及びその正常人並びに乳ガン患者での出現頻度分析の結果は、表６ないし１１に表した。このとき、各対立因子は、各個体において同型接合子（ｈｏｍｏｚｙｇｏｔｅ）または異型接合子（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｔｅ）の形態で存在しうる。メンデルの遺伝法則とハーディー−ワインバーグ（Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ）法則によれば、集団を構成する対立因子の組成は、一定の頻度に維持され、統計的に有意である場合、生物学的機能上の意味を付与できる。
【００８４】
本発明によって乳ガンと関連性があると確認されたＳＮＰマーカ及び多重ＳＮＰマーカは、個体が乳ガンにかかる確率が高いか、あるいは低いかを決定するのに使われることが可能である。また、個体が前記ＳＮＰマーカ及び多重マーカを含んでいるか否かによって個体をいくつかのサブタイプに分類し、各サブタイプによる乳ガン治療または予防薬品の敏感度を研究するのに利用できる。それ以外に前記ＳＮＰマーカ及び多重マーカは、乳ガン予後予測及び検証、乳ガン予防薬及び治療薬の開発などに活用できる。
【００８５】
あらゆる可能な変異により、前記の要素の任意の組合わせは、本明細書に特別に言及がないか、または明白に文脈によって反駁されていなければ、本発明に含まれるものである。
【産業上の利用可能性】
【００８６】
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、４０歳以下または５４歳以上の被検者に対し、乳ガンの存在または危険の存在いかんを容易に決定できる。
【００８７】
本発明のポリヌクレオチド、マイクロアレイ及び診断キットによれば、４０歳以下または５４歳以上の被検者に対し、乳ガンの存在または危険の存在いかんを分析するにあたって有用に使われることが可能である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】表８に表した各年齢群において特定の多重座マーカに対するオッズ率をグラフで表したものである。
【図１】
2008531041.tif 000021
【配列表】
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【国際調査報告】
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