(57)【要約】  本発明は、新規ポリペプチド、及び哺乳動物、例えば、ヒトにおける新生物の診断、検出、モニタリング及び治療において、これらのポリペプチドを使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
新生物細胞又は前癌病変の細胞に特異的に結合するが、正常細胞には特異的に結合しない、単離されたポリペプチドであって、配列番号２７の配列のアミノ酸２８〜３２、５１〜５３及び９０〜１００を含み、そしてここにおいて、正常細胞は、副腎の球状、束状帯の細胞及び腎臓の集合管の上皮細胞ではない、前記単離されたポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドがさらに配列番号２６の配列のアミノ酸１１〜１８、３６〜４３及び８２〜１０４を含む、請求項１に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項３】
新生物細胞又は前癌病変の細胞へ特異的に結合するが、正常細胞には特異的に結合しない、単離されたポリペプチドであって、配列番号２の配列のアミノ酸１１〜１５、３０〜４６及び７９〜８８を含むが、配列番号２の完全長配列は含まず、そしてここにおいて、正常細胞は、副腎の球状、束状帯の細胞及び腎臓の集合管の上皮細胞ではない、前記単離されたポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドがさらに配列番号４の配列のアミノ酸１７〜３２、４８〜５４及び８７〜９５を含むが、配列番号４の完全長配列は含まない、請求項３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、前記新生物細胞又は前記前癌病変の細胞のアポトーシスを誘発できるが、前記正常細胞のアポトーシスは誘発しない、請求項１又は３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項６】
前記新生物細胞が、バレット腫瘍及び食道、胃、腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、気管支、乳腺、頚部、前立腺、心臓、卵巣及び子宮の腫瘍から成る群より選択される、請求項１又は３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項７】
前記前癌病変が、胃粘膜の異形成、胃の間質性化生、細菌ヘリコバクター・ピロリに付随する胃粘膜の炎症、胃の管状及び乳頭状腺腫、結腸の管状腺腫、結腸の絨毛腺腫、潰瘍性結腸炎における異形成、バレット異形成、食道のバレット化生、頚部上皮内新形成Ｉ、頚部上皮内新形成ＩＩ、頚部上皮内新形成ＩＩＩ、扁平上皮化生、気管支の扁平上皮異形成、ローグレード及びハイグレード前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（Ｄ−ＣＩＳ）及び非浸潤性乳小葉癌（Ｌ−ＣＩＳ）から成る群より選択される、請求項１又は３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、ＶＬ、ＶＨ、ＦＶ、ＦＣ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２から成る群より選択される、抗体の機能性断片である、請求項１又は３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、配列番号６の配列を含んでいるポリペプチドへ特異的に結合する、請求項１又は３に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
配列番号２８の配列の核酸３１〜５４、１０６〜１２９及び２４４〜３１２、及び／又は配列番号２９の配列の８２〜９６、１５１〜１５９及び／又は２６８〜３００を含んでいる、単離された核酸分子。
【請求項１１】
配列番号１の配列の核酸３１〜４５、８８〜１３８及び２３５〜２６４、及び／又は配列番号３の配列の核酸４９〜９６、１４２〜１６２及び２５９〜２８５を含んでいる、単離された核酸分子であって、配列番号１又は配列番号３の完全長配列を含んでいない、前記核酸分子。
【請求項１２】
配列番号５の配列を含んでいる、単離された核酸分子。
【請求項１３】
配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２８又は配列番号２９の核酸配列を含んでいる、ベクター。
【請求項１４】
請求項１３のベクターを含んでいる、単離された細胞。
【請求項１５】
請求項１又は３のポリペプチドを発現する、単離された細胞。
【請求項１６】
前記単離された細胞が哺乳動物細胞である、請求項１５に記載の単離された細胞。
【請求項１７】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１６に記載の単離された細胞。
【請求項１８】
前記方法が、細胞と、配列番号２９を含んでいるベクターを接触させ、そして前記ベクターにより発現されるポリペプチドを単離することを含んでいる、請求項１の精製されたポリペプチドを産生する方法。
【請求項１９】
前記ベクターが、配列番号２８の配列をさらに含んでいる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
哺乳動物における新生物又は前癌病変を診断する方法であって、（ａ）前記哺乳動物に由来する細胞又は組織試料と、請求項１又は３の精製されたポリペプチドを接触させ、そして（ｂ）前記精製されたポリペプチドが、前記細胞又は組織試料に特異的に結合するかどうかを検出する工程を含み、ここにおいて、前記精製されたポリペプチドの前記細胞又は組織試料への特異的結合が、前記哺乳動物が新生物又は前癌病変を有していることを示している、前記方法。
【請求項２１】
前記細胞又は組織試料が、バレット腫瘍、食道、胃、腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、気管支、乳腺、頚部、前立腺、心臓、卵巣及び子宮の腫瘍、胃粘膜の異形成、胃の間質性化生、細菌ヘリコバクター・ピロリに付随する胃粘膜の炎症、胃の管状及び乳頭状腺腫、結腸の管状腺腫、結腸の絨毛腺腫、潰瘍性結腸炎における異形成、バレット異形成、食道のバレット化生、頚部上皮内新形成Ｉ、頚部上皮内新形成ＩＩ、頚部上皮内新形成ＩＩＩ、扁平上皮化生、気管支の扁平上皮異形成、ローグレード及びハイグレード前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（Ｄ−ＣＩＳ）及び非浸潤性乳小葉癌（Ｌ−ＣＩＳ）から成る群より選択される組織に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、放射性核種、蛍光マーカー、酵素、細胞毒素、サイトカイン及び増殖阻害剤から成る群より選択される検出可能な作用剤にコンジュゲートされている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記検出可能な作用剤が、前記細胞のアポトーシスを誘発することができる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、タンパク質精製タグにコンジュゲートされている、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記タンパク質精製タグが切断可能である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリペプチドがマウス抗体５８／４７−６９である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
哺乳動物における増殖性障害を治療する方法であって、細胞と請求項１又は３の精製されたポリペプチドを接触させる工程を含み、ここにおいて、前記精製されたポリペプチドの前記細胞への結合が、前記細胞のアポトーシスの誘発を生じる、前記方法。
【請求項３０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが抗体である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記抗体がマウス抗体５８／４７−である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、放射性核種、蛍光マーカー、酵素、細胞毒素、サイトカイン及び増殖阻害剤から成る群より選択される検出可能な作用剤にコンジュゲートされている、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポリペプチドが、タンパク質精製タグにコンジュゲートされている、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記タンパク質精製タグが切断可能である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
薬学的に許容できる坦体中に、請求項１の単離されたポリペプチドを含んでいる、薬学的組成物。
【請求項３８】
請求項１又は３の単離されたポリペプチドを含んでいる、診断剤。
【請求項３９】
前記ポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８から成るアミノ酸配列を含み、そして前記ポリペプチドが、配列番号６の完全長配列を含んでいない、単離されたポリペプチド。
【請求項４０】
前記ポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８から成るアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４１】
前記ポリペプチドが、配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８から成るアミノ酸配列を含む、請求項３９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４２】
前記ポリペプチドが、少なくとも９５％の純度である、請求項３９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４３】
前記ポリペプチドが、マウス抗体５８／４７−６９により特異的に結合される、請求項３９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４４】
前記ポリペプチドが、腫瘍特異的糖構造を含む、請求項３９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４５】
前記ポリペプチドが、胃粘膜の異形成、胃の間質性化生、細菌ヘリコバクター・ピロリに付随する胃粘膜の炎症、胃の管状及び乳頭状腺腫、結腸の管状腺腫、結腸の絨毛腺腫、潰瘍性結腸炎における異形成、バレット異形成、食道のバレット化生、頚部上皮内新形成Ｉ、頚部上皮内新形成ＩＩ、頚部上皮内新形成ＩＩＩ、扁平上皮化生、気管支の扁平上皮異形成、ローグレード及びハイグレード前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（Ｄ−ＣＩＳ）及び非浸潤性乳小葉癌（Ｌ−ＣＩＳ）から成る群より選択される前癌病変により発現され、そして同一組織型の正常細胞によっては発現されない、請求項３９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが、バレット腫瘍及び食道、胃、腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、気管支、乳腺、頚部、前立腺、心臓、卵巣及び子宮の腫瘍から成る群より選択される腫瘍により発現され、そして同一組織型の正常細胞によっては発現されない、請求項３９に記載の単離されたポリペプチド。
【請求項４７】
請求項３９に記載の単離されたポリペプチドを含んでいる、診断剤。
【請求項４８】
哺乳動物において腫瘍特異的免疫応答を誘発する方法であって、前記哺乳動物と、配列番号６の配列を含んでいる単離されたポリペプチド、又は配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含んでいる断片を接触させる工程を含み、ここにおいて、前記接触が、前記哺乳動物における腫瘍特異的免疫応答を誘発する、前記方法。
【請求項４９】
前記腫瘍特異的免疫応答が、抗体の産生を含み、前記抗体は、それが特異的に結合された細胞のアポトーシスを誘発する、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記断片が、配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８及び配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含み、そして配列番号６の完全長配列を含んでいない、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
配列番号６の配列を含んでいる単離されたポリペプチド、又は配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含んでいるその断片を産生する方法であって、（ａ）細胞と、配列番号５と実質的に同一である核酸配列を含んでいるベクターを接触させ、そして（ｂ）前記細胞により発現されたポリペプチドを単離する、工程を含んでいる、前記方法。
【請求項５２】
候補療法化合物を同定する方法であって、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含んでいるポリペプチド、又は配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含んでいるその断片を発現している細胞と、試験化合物を接触させ、そして（ｂ）前記試験化合物が、前記細胞のアポトーシスを誘発し、そして前記試験化合物と接触させた対照細胞のアポトーシスを誘発しないかどうかを決定する、工程を含み、ここにおいて、前記細胞のアポトーシスは誘発するが、前記対照細胞のアポトーシスは誘発しない試験化合物が、候補療法化合物である、前記方法。
【請求項５３】
前記断片が、配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８及び配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含み、そして配列番号６の完全長配列を含んでいない、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞が、腺癌細胞株２３１３２（ＤＳＭＺ受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２０１）である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
新生物細胞に特異的に結合する抗体を産生する方法であって、（ａ）請求項３９の精製されたポリペプチドを哺乳動物に投与し、そして（ｂ）前記ポリペプチドに特異的に結合する抗体を、前記哺乳動物から単離することを含んでいる、前記方法。
【請求項５６】
前記ポリペプチドが、腺癌細胞株２３１３２（ＤＳＭＺ受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ２０１）から精製される、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記方法がさらに、前記哺乳動物から、前記抗体を発現している細胞を単離することを含んでいる、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌診断及び治療の分野、そしてより具体的には、ポリペプチド、及び哺乳動物、例えば、ヒトにおける新生物の診断、検出、モニタリング及び治療において、これらのポリペプチドを使用する方法に関する。
【０００２】
米国において、毎年百万をはるかに超える個体が癌と診断されている。医学分野における最近の進歩は、癌患者の生存の比率を著しく改良しているが、多数の癌関連死をさらに、腫瘍の早期診断により防ぐことができるであろう。従って、最初の診断時に、憂慮すべき数の患者が、すでに疾患の後期段階に到達している。明らかに、新生物（例えば、胃腺癌、結腸直腸腺癌、肺腺癌、膵臓の腺癌）の早期そして改良された検出及び治療が必要であり、このことは新生物を治療する機会を増加させ、それにより長期生存のための改善された予後を導くであろう。
【０００３】
Ｂ細胞ハイブリドーマから産生されたヒトモノクローナル抗体は、腫瘍、ウイルス及び微生物感染、減少した抗体産生を伴うＢ細胞免疫不全、及び免疫系の他の機能障害の治療において使用することができる。胃癌腫は、世界中で最も頻繁に発生する、癌の型の一つであり、組織学的にびまん型（ｄｉｆｆｕｓｅ）腺癌及び腸型（ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ）腺癌に分けられる。腸型胃癌種は、しばしば慢性型Ｂ胃炎、そして特に、異形成変化及び胃癌腫の前駆型であると考えられている腸化生を伴う。胃癌腫のこれら二型間の相違はまた、びらん型の癌腫を有する患者は、しばしば血液型Ａに属しており、それから癌リスクにおける遺伝因子の影響を結論付けることができ、一方、環境因子（例えば、ヘリコバクター・ピロリ感染）が、腸型の癌腫の出現には可能性として意味がある。
【０００４】
胃癌の発生は、多工程及び多因子プロセスである（Correa, Cancer Res. 52:6735-6740 (1992) ）。分子機構についてはほとんど知られていないが、高い塩摂取、アルコール、ニトロソアミン、及び細菌ヘリコバクター・ピロリ（Ｈ．ピロリ）の感染のような因子が、胃発癌の開始に関与していると、明瞭に証明されている。Ｈ．ピロリ感染と、胃炎の出現、異形成及び胃癌の発生間の強い相関のため、ＷＨＯにより、本細菌はクラスＩ発癌物質として分類された。Ｈ．ピロリは、粘膜環境における重大な前癌性細胞変化を直接誘発し、それはまた、しばしば、胃炎及び胃癌患者で観察されている、自己抗体の増加の原因でもある（Negrini et al, Gastroenterol. 111:655-665 (1996) ）。これらの抗体は、胃病変及び胃上皮細胞のアポトーシスを誘発することができる（Steiniger et al, Virchows Arch. 433:13-18 (1998) ）。例えば、胃Ｈ＋／Ｋ（＋）−ＡＴＰａｓｅ（Claeys et al, Gastroenterology 115:340-347 (1998) ）、インターロイキン−８（Crabtree et al, Scand. J. Immunol. 37:65-70 (1993); Ma et al, Scand. J. Gastroenterol. 29:961-965 (1994) ）及びルイス式血液型抗原（Appelmelk et al, Trends. Microbiol. 5:70-73 (1997) ）に対する抗体が、胃粘膜又は胃癌においてしばしば観察されている。
【０００５】
胃癌を治療するための治療法は、現在、胃切除及びリンパ節切除に限定されている。これらの方法に付随する予後不良のため、代替の又は追加の治療及び診断法が必要とされている。
【０００６】
発明の要旨
本発明は、新生物細胞ならびに前癌病変の細胞上で発現されるが、正常細胞上では発現されない、ＣＦＲ−１の新規アイソフォームを特異的に結合する、ポリペプチド及びポリペプチド断片を特色とする。これらのポリペプチドは、インビトロ及びインビボの両方で、腫瘍のみならず前癌構造の療法及び診断に使用することができる。ＣＦＲ−１の新規アイソフォーム、この新規アイソフォームの断片、及びこの新規アイソフォームをコードする核酸は、新生物細胞に対する免疫応答を誘発する方法において、この新規アイソフォーム又はこの新規アイソフォームの断片に特異的に結合する抗体を産生する方法において、及び追加の療法化合物を同定するためのスクリーニング法において、使用することができる。
【０００７】
従って、本発明の第１の側面は、新生物細胞又は前癌病変の細胞へ特異的に結合するが、正常細胞には特異的に結合しない、単離されたポリペプチドを特色とし、ここで、正常細胞は、副腎の球状（ｇｌｏｍｅｒｕｌａｒ）、束状（ｆａｓｃｉｃｕｌａｒ）帯の細胞又は腎臓の集合管（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｔｕｂｅ）の上皮細胞ではない。この単離されたポリペプチドは、配列番号２７の配列のアミノ酸２８〜３２、５１〜５３及び／又は９０〜１００を含むことができる。本発明の第一の側面の望ましい態様において、単離されたポリペプチドはまた、配列番号２６の配列のアミノ酸１１〜１８、３６〜４３及び／又は８２〜１０４を含む。関連する側面において、本発明は、配列番号２の配列のアミノ酸１１〜１５、３０〜４６及び／又は７９〜８８、及び／又は配列番号４の配列のアミノ酸１７〜３２、４８〜５４及び／又は８７〜９５を含むが、配列番号２又は配列番号４の完全長配列を含まず、そして新生物細胞又は前癌病変の細胞へ特異的に結合するが、正常細胞には特異的に結合しない、単離されたポリペプチドを特色とし、ここで、正常細胞は、副腎の球状、束状帯の細胞又は腎臓の集合管の上皮細胞ではない。
【０００８】
別の望ましい態様において、ポリペプチドは、配列番号２６のアミノ酸１１〜１８、３６〜４３及び／又は８２〜１０４又は配列番号２７のアミノ酸２８〜３２、５１〜５３及び／又は９０〜１００を含むが、配列番号２６又は配列番号２７の完全長アミノ酸配列を含まない。
【０００９】
本発明の第１の側面のさらに望ましい態様において、ポリペプチドは、新生物細胞又は前癌病変の細胞のアポトーシスを誘発することが可能であるが、正常細胞のアポトーシスは誘発しない。加えて、新生物性は、バレット（Ｂａｒｒｅｔｔ）腫瘍細胞又は食道、胃、腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、気管支、乳腺、頚部、前立腺、心臓、卵巣あるいは子宮の腫瘍細胞であることができる。さらに、前癌病変は、胃粘膜の異形成（ｄｙｓｐｌａｓｉａ）、胃の間質性化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）、細菌ヘリコバクター・ピロリに付随する胃粘膜の炎症、胃の管状及び乳頭状腺腫、結腸の管状腺腫、結腸の絨毛腺腫、潰瘍性結腸炎における異形成、バレット異形成、食道のバレット化生、頚部上皮内新形成Ｉ、頚部上皮内新形成ＩＩ、頚部上皮内新形成ＩＩＩ、扁平上皮化生、気管支の扁平上皮異形成、ローグレード（ｌｏｗ  ｇｒａｄｅ）及びハイグレード（ｈｉｇｈ  ｇｒａｄｅ）前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（Ｄ−ＣＩＳ）又は非浸潤性乳小葉癌（Ｌ−ＣＩＳ）、であることができる。
【００１０】
第１の側面の別の望ましい態様において、ポリペプチドは、抗体の機能性断片、例えば、ＶＬ、ＶＨ、ＦＶ、ＦＣ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２抗体断片である。加えて、ポリペプチドは、配列番号６を含んでいるポリペプチド又はその断片へ、特異的に結合することができる。
【００１１】
第２の側面において、本発明は、核酸、配列番号２８の配列の３１〜５４、１０６〜１２９及び／又は２４４〜３１２、及び／又は配列番号２９の配列の８２〜９６、１５１〜１５９及び／又は２６８〜３００を含んでいる、単離された核酸分子を特色とする。この側面の望ましい態様において、単離された核酸分子は、配列番号２８及び／又は配列番号２９の完全長配列を含んでいない。関連する側面において、本発明は、配列番号１の核酸３１〜４５、８８〜１３８及び／又は２３５〜２６４を含んでいる、単離された核酸分子を特色とする。望ましくは、この核酸分子は配列番号１の完全長配列を含んでいない。第３の側面において、本発明は、配列番号３の核酸４９〜９６、１４２〜１６２及び／又は２５９〜２８５を含んでいる、単離された核酸分子を特色とする。本発明の第３の側面の望ましい態様において、核酸分子は配列番号３の完全長配列を含んでいない。
【００１２】
第４の側面において、本発明は、配列番号５の配列を含んでいる、単離された核酸分子を特色とし、そして第５の側面において、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２８及び／又は配列番号２９の核酸配列を含有するベクターを特色とする。
【００１３】
第６の側面において、本発明は、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２８及び／又は配列番号２９の核酸配列を含むベクターを含有する、単離された細胞、例えば、哺乳動物細胞を特色とする。
【００１４】
第７の側面において、本発明は、本発明の第１の側面のポリペプチドを発現する、単離された細胞、例えば、哺乳動物細胞を特色とする。望ましくは、本発明の第７の側面の細胞は、ヒト細胞である。
【００１５】
第８の側面において、本発明は、本発明の第１の側面の精製されたポリペプチドを産生する方法を特色とする。この方法は、細胞と、配列番号１、配列番号３、配列番号５、配列番号２８及び／又は配列番号２９を含むベクターを接触させ、そしてベクターにより発現されたポリペプチドを単離する、ことを含んでいる。
【００１６】
本発明の第９の側面は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける、新生物又は前癌病状を診断する方法を特色とする。この方法は、（ａ）哺乳動物に由来する細胞又は組織試料を、本発明の第１の側面の精製されたポリペプチドと接触させ、そして（ｂ）精製されたポリペプチドが、細胞又は組織試料へ特異的に結合するかどうかを決定する、工程を含んでおり、ここで、細胞又は組織試料への、精製されたポリペプチドの特異的結合は、新生物又は前癌病状を有している哺乳動物を示している。本発明のこの側面の望ましい態様において、細胞又は組織試料は、バレット腫瘍、食道、胃、腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、気管支、乳腺、頚部、前立腺、心臓、卵巣あるいは子宮の腫瘍、胃粘膜の異形成、胃の間質性化生、細菌ヘリコバクター・ピロリに付随する胃粘膜の炎症、胃の管状及び乳頭状腺腫、結腸の管状腺腫、結腸の絨毛腺腫、潰瘍性結腸炎における異形成、バレット異形成、食道のバレット化生、頚部上皮内新形成Ｉ、頚部上皮内新形成ＩＩ、頚部上皮内新形成ＩＩＩ、扁平上皮化生、気管支の扁平上皮異形成、ローグレード及びハイグレード前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（Ｄ−ＣＩＳ）又は非浸潤性乳小葉癌（Ｌ−ＣＩＳ）であることができる。本発明の第９の側面の他の望ましい態様において、ポリペプチドは、マウス抗体５８／４７−６９のような抗体である。
【００１７】
第９の側面のさらに望ましい態様において、ポリペプチドは検出可能な作用剤にコンジュゲートされる。この検出可能な作用剤は、放射性核種、蛍光マーカー、酵素、細胞毒素、サイトカイン又は増殖阻害剤であることができ、そして検出可能な作用剤はまた、細胞のアポトーシスを誘発することが可能であってもよい。加えて、第９の側面のポリペプチドは、タンパク質精製タグ、例えば、切断可能タンパク質精製タグへコンジュゲートすることができる。
【００１８】
本発明の第１０の側面は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける増殖性障害を治療する方法を特色とする。この方法は、細胞と第１の側面の精製されたポリペプチドを接触させる工程を含んでおり、ここで、細胞への精製されたポリペプチドの結合は、細胞のアポトーシスの誘発を生じる。この側面の望ましい態様において、ポリペプチドは抗体、例えば、ヒト化抗体、キメラ抗体（即ち、一つより多くの種に由来するアミノ酸配列を含んでいるもの）又はマウス抗体５８／４７−６９である。加えて、本発明の第１０の側面のポリペプチドは、検出可能な作用剤へコンジュゲートすることができる。この検出可能な作用剤は、放射性核種、蛍光マーカー、酵素、細胞毒素、サイトカイン又は増殖阻害剤であることができる。ポリペプチドはまた、切断可能タンパク質精製タグのようなタンパク質精製タグへコンジュゲートすることもできる。
【００１９】
第１１の側面において、本発明は、薬学的に許容できる坦体中に、第１の側面の単離されたポリペプチドを含む薬学的組成物を特色とし、そして第１２の側面において、本発明は、本発明の第１の側面の単離されたポリペプチドを含有する診断剤を特色とする。
【００２０】
第１３の側面において、本発明は、配列番号６の配列のアミノ酸４６９〜５１８及び／又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含む、単離されたポリペプチド、例えば、９０％、９５％又は９９％純度であるもの、を特色とする。第１３の側面の望ましい態様において、ポリペプチドは、配列番号６の完全長配列を含んでいない。別の望ましい態様において、第１３の側面のポリペプチドは、配列番号５の核酸配列によりコードされている。
【００２１】
第１３の側面のさらに望ましい態様において、ポリペプチドは、マウス抗体５８／４７−６９により特異的に結合され、及び／又は腫瘍特異的糖構造を含む。加えて、ポリペプチドは、ポリアクリルアミドゲル上で、およそ１３０ｋＤの見掛けの分子量を有することができ、そして腺癌細胞株２３１３２により発現されるポリペプチドであることができる。
【００２２】
本発明の第１３の側面の他の望ましい態様において、ポリペプチドは前癌病変により発現されるが、同一組織型の正常細胞によっては発現されない。この前癌病変は、胃粘膜の異形成、胃の間質性化生、細菌ヘリコバクター・ピロリに付随する胃粘膜の炎症、胃の管状及び乳頭状腺腫、結腸の管状腺腫、結腸の絨毛腺腫、潰瘍性結腸炎における異形成、バレット異形成、食道のバレット化生、頚部上皮内新形成Ｉ、頚部上皮内新形成ＩＩ、頚部上皮内新形成ＩＩＩ、扁平上皮化生、気管支の扁平上皮異形成、ローグレード及びハイグレード前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（Ｄ−ＣＩＳ）又は非浸潤性乳小葉癌（Ｌ−ＣＩＳ）であることができる。さらに、本発明の第１３の側面のポリペプチドは、バレット腫瘍、又は食道、胃、腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、気管支、乳腺、頚部、前立腺、心臓、卵巣あるいは子宮の腫瘍により発現されることができるが、同一組織型の正常組織では発現されない。
【００２３】
本発明の第１４の側面は、薬学的に許容できる坦体中に、第１３の側面のポリペプチドを含む薬学的組成物を特色とし、そして第１５の側面は、第１３の側面の単離されたポリペプチドを包含する診断剤を特色とする。
【００２４】
本発明の第１６の側面は、哺乳動物における腫瘍特異的免疫応答を誘発する方法を特色とする。この方法は、哺乳動物、例えば、ヒトと、配列番号６の配列を含有する単離されたポリペプチド、又は配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含むが、配列番号６の完全長配列は含んでいない、単離されたポリペプチドを接触させる工程を含んでおり、ここで、接触させることは、哺乳動物における腫瘍特異的免疫応答を誘発する。望ましくは、腫瘍特異的免疫応答は、抗体の産生を包含し、その抗体は、抗体が特異的に結合された細胞のアポトーシスを誘発する。
【００２５】
この側面のさらに望ましい態様において、本発明は、配列番号６をコードするヌクレオチド配列、又はその断片を包含する、プラスミドベクター又はウイルスベクターを含んでいるＤＮＡワクチンを特色とし、ここで、患者に投与することにより、患者、例えば、ヒト患者に腫瘍特異的免疫応答が誘発される。この免疫応答は、例えば、新生物又は前癌病変に特異的に結合する抗体の形成を生じる。
【００２６】
第１７の態様において、本発明は、配列番号６の配列、又は配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含むが、配列番号６の完全長配列は含んでいないその断片、を含有する単離されたポリペプチドを産生する方法を特色とする。この方法は、（ａ）細胞と、配列番号５又はその断片と実質的に同一である、又は同一である核酸配列を含有するベクターを接触させ、そして（ｂ）細胞により発現されるポリペプチドを単離する、工程を含んでいる。望ましい態様において、断片は、配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８及び配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含むが、配列番号６の完全長配列は含んでいない。
【００２７】
本発明の第１８の側面は、候補療法化合物を同定する方法を特色とする。この方法は、（ａ）配列番号６のアミノ酸配列を含有するポリペプチドを発現している細胞、例えば、腺癌細胞株２３１３２（ＤＳＭＺ受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２０１）と、試験化合物を接触させ、そして（ｂ）試験化合物が細胞のアポトーシスを誘発し、そして試験化合物と接触させた対照細胞ではアポトーシスを誘発しないかどうかを決定する、工程を含み、ここで、細胞のアポトーシスを誘発し、対照細胞のアポトーシスを誘発しない試験化合物は、候補療法化合物である。この方法の望ましい態様において、配列番号６の断片、例えば、配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含むが、配列番号６の完全長配列は含んでいないものを、使用することができる。
【００２８】
別の側面において、本発明は、新生物性細胞へ特異的に結合する抗体を産生する方法を特色とする。この方法は、（ａ）配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８及び／又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を有しているが、配列番号６の完全長配列は含んでいない、精製されたポリペプチドを哺乳動物に投与し、そして（ｂ）哺乳動物から、配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８及び／又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を有しているポリペプチドへ特異的に結合する抗体を単離する、ことを含んでいる。もしくは、哺乳動物へ投与される精製されたポリペプチドは、配列番号６の完全長配列を含んでいてもよい。本発明のこの側面の望ましい態様において、ポリペプチドは、腺癌細胞株２３１３２（ＤＳＭＺ受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２０１）から精製する。別の望ましい態様において、配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８及び／又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を有しているポリペプチドは、腫瘍特異的糖構造を含む。この側面の別の望ましい態様において、方法は又、哺乳動物から抗体を発現している細胞を単離することを含む。
【００２９】
定義
「新規ＣＦＲ−１アイソフォーム」及び「ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォーム」とは、配列番号６のアミノ酸４６９〜５１８及び／又は配列番号６のアミノ酸７３９〜７４８を含み、新生物性細胞及び前癌病変の細胞により発現されるが、正常細胞によっては発現されない、ＣＦＲ−１のアイソフォームを意味しており、ここで、副腎の球状、束状帯の細胞又は腎臓の集合管の上皮細胞は、正常細胞の群から除外する。望ましくは、新規ＣＦＲ−１アイソフォームは、配列番号６の完全長アミノ酸配列を含んでいない。さらに望ましい態様において、新規ＣＦＲ−１アイソフォームは、ヒトモノクローナル抗体１０３／５１及び／又はマウス抗体５８／４７−６９により特異的に結合され、そしておよそ１３０ｋＤの分子量を有する。用語「およそ」の使用は、これらの型のサイズ決定が、分子サイズ決定方法の変化又は変動により（例えば、ゲル電気泳動条件）影響されることを、当業者が認識するであろうことを反映している。加えて、新規ＣＦＲ−１アイソフォームは、腺癌細胞株２３１３２（ＤＳＭＺ受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２０１）上に存在するポリペプチドである。
【００３０】
別の望ましい態様において、新規ＣＦＲ−１アイソフォームは、以下の型の前癌病変の細胞により発現されるが、正常細胞では発現されない：ヘリコバクター・ピロリ誘発胃炎、胃の腸型化生及び異形成、結腸の潰瘍性結腸炎関連異形成及び腺腫、食道のバレット化生及び異形成、肺の扁平上皮細胞化生及び異形成、頚部上皮内新形成、ローグレード及びハイグレード前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（Ｄ−ＣＩＳ）又は非浸潤性乳小葉癌（Ｌ−ＣＩＳ）。
【００３１】
さらに望ましい態様において、新規ＣＦＲ−１アイソフォームは、以下の組織の癌腫により発現されるが、同一組織の正常細胞では発現されない：食道、胃、結腸、肝臓、膵臓、肺、乳腺、卵巣、子宮、頚部及び前立腺。
【００３２】
「ＰＡＭ−１抗体」とは、配列番号６のアミノ酸配列を含み、及び２３１３２細胞により発現される、ＣＦＲ−１のアイソフォームへ特異的に結合するポリペプチドを意味する。望ましい態様において、ＰＡＭ−１抗体は、配列番号６のアミノ酸配列を有しているＣＦＲ−１アイソフォームの腫瘍特異的糖構造を結合する。例えば、ＰＡＭ−１抗体は、配列番号２及び／又は４のすべての又は一部の配列を含有する、ヒトモノクローナル抗体１０３／５１、マウス抗体５８−４９／６９、又はヒト化又はキメラ抗体であることができる。さらに望ましい態様において、ＰＡＭ−１抗体は、新生物性細胞又は前癌病変の細胞において、アポトーシスを誘発するか又は増殖を変化させる、又は両方をすることが可能であるが、正常細胞では不可能である。追加の望ましい態様において、ＰＡＭ−１抗体は、配列番号２及び／又は配列番号４のアミノ酸配列を含むか、又は、一部、配列番号１及び／又は配列番号３の核酸配列によりコードされている。さらに望ましい態様において、ＰＡＭ−１抗体は、配列番号２６のアミノ酸１１〜１８、３６〜４３及び／又は８２〜１０４、及び／又は配列番号２７のアミノ酸２８〜３２、５１〜５３及び／又は９０〜１００を含むことができる。
【００３３】
ポリペプチドに関して本明細書において使用される「機能性断片」又は「ＰＡＭ−１抗体の断片」とは、完全長ポリペプチドの少なくとも一つの生物学的活性を保持する断片を意味する。こうした生物学的活性の例は、抗原を特異的に結合する、アポトーシスを誘発する、及び／又は細胞増殖を抑制する能力である。機能性断片の生物学的活性は、例えば、本明細書に記載したアッセイのいずれか一つを使用して決定することができる。
【００３４】
抗体の機能性断片の例は、当業者には周知である、ＶＬ、ＶＨ、ＦＶ、ＦＣ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２断片である（例えば、Huston et al., Cell Biophys. 22:189-224, 1993 ；及びHarlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 1999 を参照されたい）。望ましくは、「機能性断片」は配列番号２、配列番号４、配列番号２６又は配列番号２７のアミノ酸配列の断片、例えば、３、４、５、１０、１５、２０、１５、３０、５０、７５又は１００の連続したアミノ酸と実質的に同一である、アミノ酸配列を有する。より望ましい態様において、「機能性断片」は配列番号２、配列番号４、配列番号２６又は配列番号２７のアミノ酸配列の断片と同一である。こうした「機能性断片」は、配列番号２、配列番号４、配列番号２６又は配列番号２７の３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、１５、３０、５０、７５又は１００の連続したアミノ酸を含んでいてもよいし、又は配列番号２、配列番号４、配列番号２６又は配列番号２７の全アミノ酸配列であってもよい。望ましい態様において、こうした断片は、マウスＰＡＭ−１抗体５８−４９／６９又はヒトＰＡＭ−１抗体１０３／５１のＶＨ又はＶＬ領域の一つまたはそれより多くの相補性決定領域（ＣＤＲ）を包含する。例えば、機能性断片は、配列番号２のアミノ酸１１〜１５、３０〜４６及び／又は７９〜８８；及び／又は配列番号４のアミノ酸１７〜３２、４８〜５４及び／又は８７〜９５を包含することができる。機能性断片の他の例は、配列番号２６のアミノ酸１１〜１８、３６〜４３及び／又は８２〜１０４、及び／又は配列番号２７のアミノ酸２８〜３２、５１〜５３及び／又は９０〜１００を含む。
【００３５】
「検出可能な作用剤」とは、検出を容易にするため、診断剤へ連結されている化合物を意味する。こうした「検出可能な作用剤」は、診断剤へ共有結合で又は非共有結合で連結することができる。加えて、連結は直接でもあるいは間接であってもよい。「検出可能な作用剤」の例には、タンパク質精製タグ、細胞毒素、酵素、常磁性標識、酵素基質、補因子、酵素阻害剤、色素、放射性核種、化学発光標識、蛍光マーカー、増殖阻害剤、サイトカイン、抗体及びビオチンが含まれる。
【００３６】
「診断剤」とは、本明細書記載のアッセイのいずれか一つ、ならびに当該技術分野で標準である任意の他の方法を用いることにより、新生物細胞を検出するために使用することができる化合物を意味する。診断剤は、例えば、細胞株２３１３２（ＤＳＭＺ受入番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２０１）へ特異的に結合するが、正常細胞とは結合しない、抗体を含むことができる。加えて、診断剤は、ヘリコバクター・ピロリ誘発胃炎、胃の腸型化生及び異形成、結腸の潰瘍性結腸炎関連異形成及び腺腫、食道のバレット化生及び異形成、肺の扁平上皮細胞化生及び異形成、頚部上皮内新形成、ローグレード及びハイグレード前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（Ｄ−ＣＩＳ）又は非浸潤性乳小葉癌（Ｌ−ＣＩＳ）、を示しているもののような、前癌病変の細胞に特異的に結合することができる。診断剤は又、食道、胃、結腸、肝臓、膵臓、肺、乳腺、卵巣、子宮、頚部及び前立腺の癌腫と特異的に結合できるが、同一組織型の非新生物性細胞へは結合しない。さらに、「診断剤」は、新生物性細胞又は前癌病変の細胞へ結合された時にのみ、細胞増殖を改変する、アポトーシスを誘発する、又はその両方を行うことができるが、正常細胞へは結合しない。さらに、「診断剤」は、例えば、ペプチド、ポリペプチド、合成有機分子、天然に存在する有機分子、核酸分子そしてこれらの成分、ならびに診断剤に共有結合で又は非共有結合で連結された一つまたはそれより多くの検出可能な作用剤を含むことができる。
【００３７】
「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件」とは、例えば、約５０％ホルムアミド、０．１ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ、１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、２ＸＳＳＣ（クエン酸ナトリウム緩衝液）、１０％硫酸デキストラン中、およそ４２℃でのハイブリダイゼーション、約２ＸＳＳＣ、１％ＳＤＳ中、およそ６５℃での最初の洗浄、続いての約０．１ＸＳＳＣ中、およそ６５℃での二回目の洗浄、を意味する。もしくは、「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件」は、約５０％ホルムアミド、０．１ｍｇ／ｍｌ剪断サケ精子ＤＮＡ、０．５％ＳＤＳ、５ＸＳＳＰＥ，１Ｘデンハート中、およそ４２℃でのハイブリダイゼーション、続いての２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、室温での２回の洗浄、そして０．２ＸＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、５５〜６０℃間での２回の洗浄を含むことができる。
【００３８】
本明細書において使用される「細胞増殖を改変する」とは、同一条件下、その型の細胞の細胞分裂の正常速度と比較して、細胞の細胞分裂の速度における減少又は増加を指す。細胞増殖は、当該技術分野で標準的な多くの方法、例えば、本明細書に記載されているＭＴＴ細胞増殖アッセイ、ＢｒｄＵ取り込み、そして３Ｈチミジン取り込み、を使用してアッセイすることができる。こうしたアッセイは、例えば、Ausubel et al, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001 ；及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., 2001 、に記載されている。望ましくは、細胞増殖の増加又は減少は２０％、４０％、５０％又は７５％である。望ましい態様において、細胞増殖の増加又は減少は８０％、９０％、９５％である。別の望ましい態様において、細胞増殖は完全に抑制される。
【００３９】
本明細書において使用される「アポトーシスを誘発する」とは、当該技術分野で詳細に明らかにされている細胞中での特性の出現を指す（例えば、Wyllie et al., Br. J. Cancer 80 Suppl. 1:34-37, 1999; Kerr et al., Br. J. Cancer 26:239-257, 1972 、を参照されたい）。これらの特性には、膜小泡形成、ＤＮＡ凝縮のような形態学的特性、ならびにＦ−アクチン含有物、ミトコンドリア塊そして膜電位における変化を包含する。アポトーシスの誘発は、当該技術分野では標準の多くの方法、例えば、細胞死ＥＬＩＳＡ、ＴＵＮＥＬ染色、ＤＮＡ染色（例えば、Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８）そして、アクリジンオレンジ、Ｍｉｔｏ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｒｅｄ（登録商標）染色（Molecular Probes,Eugene,OR) 及びＡｎｎｅｘｉｎ  Ｖ（登録商標）染色(Becton Dickinson,NJ) のような多様な生体色素による染色、を使用してアッセイすることができる。本明細書において使用される「アポトーシスを誘発する」とは、同一条件下、対照細胞集団と比較した場合の、アポトーシスを起こしている細胞数の増加を指す。例えば、アポトーシスの増加は１０％、２０％、４０％、５０％又は７５％であることができる。望ましい態様において、アポトーシスの誘発は、対照細胞集団で見られるものの２倍、３倍、１０倍あるいは１００倍を超えることさえある、アポトーシスの増加を生じる。
【００４０】
本明細書において使用される「ヒト化抗体」とは、最小の非ヒト、例えば、マウス抗体配列が、ヒト抗体配列と組み合わされ、そして、それにもかかわらず、本来の非ヒト抗体の結合特異性を維持している、遺伝子工学的に処理された抗体である。望ましい態様において、ヒト化抗体は、１５％、２０％、２５％、３０％又は４０％の非ヒト配列を含有する。より望ましい態様において、ヒト化抗体は、５％又は１０％の非ヒト配列を含有する。加えて、ヒト化抗体は、望ましくは、ヒト免疫応答を誘発しないか又は最小のヒト免疫応答のみを誘発する。
【００４１】
本明細書において使用される「新生物細胞」とは、不適切な条件下、細胞分割を起こしている、アポトーシスを起こしていない、又はその両方である細胞を指す。例えば、「新生物細胞」は、対応する正常細胞が細胞分割を起こさない時に細胞分割を起こすことができ、又は、もしくは、「新生物細胞」は正常細胞周期チェックポイント制御へ応答することができない。
【００４２】
「前癌病変の細胞」とは、不適切な条件下、細胞分割を起こしている、アポトーシスを起こしていない、又はその両方であるが、癌性腫瘍へは発達していない細胞を意味する。例えば、前癌病変の細胞は、対応する正常細胞が細胞分割を起こさない時に細胞分割を起こすことができ、又は、もしくは、前癌病変の細胞は、正常細胞周期チェックポイント制御へ応答することができない。前癌病変の細胞の例には、Ｈ．ピロリ誘発胃炎、胃の腸型化生及び異形成、結腸の潰瘍性結腸炎関連異形成及び腺腫、食道のバレット化生及び異形成、肺の扁平上皮細胞化生及び異形成、頚部上皮内新形成、ローグレード及びハイグレード前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（Ｄ−ＣＩＳ）又は非浸潤性乳小葉癌（Ｌ−ＣＩＳ）、が含まれる。
【００４３】
本明細書において使用される「正常細胞」とは、新生物細胞でも前癌病変の細胞でもない細胞を意味する。
【００４４】
本明細書において使用される「増殖性疾患」とは、細胞の異常増殖を生じる何らかの障害を指す。増殖性疾患の具体的例は、胃腺癌、結腸直腸腺癌、肺腺癌及び膵臓の腺癌のような、新生物の多様な型である。しかしながら、増殖性疾患はまた、トランスフォーミングウイルスに感染される細胞の結果であってもよい。
【００４５】
本明細書において使用される「タンパク質精製タグ」とは、タンパク質の精製を助けるためにタンパク質へ共有結合で、あるいは非共有結合で加えられているペプチド、例えば、エピトープタグである。望ましくは、こうしたペプチドは、抗体又はビオチン又はアビジンのような別のペプチドへ高い親和性で結合する。市販品として入手可能なエピトープタグの例には、Ｈｉｓ−タグ、ＨＡ−タグ、ＦＬＡＧ（登録商標）−タグ及びｃ−Ｍｙｃ−タグが含まれる。しかしながら、抗体により認識されるいずれのエピトープもまたタンパク質精製タグとして使用することができる。例えば、Ausubel et ah, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001 ；及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2001 、を参照されたい。タンパク質精製タグは、例えば、酵素（例えば、トロンビン）あるいは化学物質（例えば、ブロモシアン）を使用することにより、タンパク質から切断することができる。
【００４６】
ポリペプチド、例えば、抗体に関して、本明細書において使用される「特異的に結合する」そして「特異的に認識する」とは、等量の任意の他のタンパク質と比較して、特定のタンパク質、例えば、抗原に対するポリペプチドの増加した親和性を意味する。例えば、抗体、例えば、２３１３２細胞へ特異的に結合する、ヒト又はマウスＰＡＭ−１抗体は、望ましくは、等量の関連抗原を含む任意の他の抗原に対するよりも、少なくとも２倍、５倍、１０倍、３０倍あるいは１００倍を超えるその抗原に対する親和性を有している。別のポリペプチドへのポリペプチドの結合は、本明細書に記載されているように、あるいは当該技術分野におけるかなり多数の標準法、例えば、ウェスタン分析、ＥＬＩＳＡ又は共免疫沈降により決定することができる。
【００４７】
「実質的に同一」とは、参照アミノ酸（例えば、配列番号２、４、６、２６又は２７の配列）又は核酸配列（例えば、配列番号１、３、５、２８又は２９の配列）又はそれらの断片と、少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％同一性を示すポリペプチド又は核酸を意味する。望ましい態様において、ポリペプチド又は核酸配列は、参照アミノ酸又は核酸配列と少なくとも９８％、９９％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％又は１００％までも同一である。ポリペプチドについては、比較配列の長さは一般に少なくとも３、４、５、６、８、１０又は１５アミノ酸であり、そして望ましくは少なくとも２０又は２５の連続アミノ酸であろう。より望ましい態様において、比較配列の長さは少なくとも３０、５０、７５、９０又は９５の連続アミノ酸、又は完全長アミノ酸配列でさえある。核酸については、比較配列の長さは一般に少なくとも９、１０、１２、１５、１８、２０、２４又は２５の連続ヌクレオチドであり、そして望ましくは少なくとも３０の連続ヌクレオチドであろう。より望ましい態様において、比較配列の長さは少なくとも５０、７５、１５０、２２５、２７０、２８０、２８５又は２９０連続ヌクレオチド、又は完全長ヌクレオチド配列でさえある。
【００４８】
配列同一性は、デフォルト設定された配列分析ソフトウェアーを使用して測定することができる（例えば、Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705 の配列分析ソフトウェアーパッケージ）。こうしたソフトウェアーは、多様な置換、欠失そして他の修飾への相同性の程度を割り当てることにより、類似配列を一致させることができる。保存的置換は典型的には、以下のグループ内の置換を含んでいる：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；そしてフェニルアラニン、チロシン。
【００４９】
複数の配列もまた、ペアワイズアライメントモードを「ｓｌｏｗ」に設定し、ペアワイズアライメントパラメーターを１０．０のオープンギャップペナルティー（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）及び０．１のエックステンドギャップペナルティー（ｅｘｔｅｎｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）を含むように、ならびに類似性マトリックスを「ｂｌｏｓｕｍ」に設定することにより、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．４）プログラム（European Molecular Biology Laboratory, Germany のJulie D. Thompson and Toby Gibson 、及びEuropean Bioinformatics Institute, Cambridge, UK,のDesmond Higgins 、により作製された）を使用して整列させることができる。加えて、マルチプルアライメントパラメーターは、１０．０のオープンギャップペナルティーそして０．１のエックステンドギャップペナルティーを含むことができ、ならびに類似性マトリックスを「ｂｌｏｓｕｍ」に、ディレイダイバージェント（ｄｅｌａｙ  ｄｉｖｅｒｇｅｎｔ）を４０％に、そしてギャップディスタンス（ｇａｐ  ｄｉｓｔａｎｃｅ）を８に設定する。
【００５０】
「精製された」又は「単離された」とは、それに天然に付随する他の成分から分離されたことを意味する。典型的には、天然に付随しているタンパク質、抗体及び天然に存在する有機分子を含まずに、重量で少なくとも５０％である場合、あるいは核酸分子に関しては、生物体のゲノムにおける核酸分子の配列に天然に隣接する核酸配列を含んでいない場合、因子は「精製され」又は「単離され」ている。望ましくは、因子は重量で、少なくとも７５％、より望ましくは、少なくとも９０％又は９５％、最も望ましくは、少なくとも９９％純粋である。実質的に純粋な因子は、化学合成、天然源からの因子の分離、あるいは天然には因子を産生しない組換え宿主細胞における因子の産生により得ることができる。タンパク質、小胞及び細胞小器官は、Ausubel et at.（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001 ）により記載されているような標準技術を使用して、当業者は精製することができる。因子は、望ましくは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、光学密度、ＨＰＬＣ分析又はウェスタン分析を使用して測定された場合（Ausubel et ah, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001 ）、出発材料の少なくとも２、５又は１０倍は純粋である。望ましい精製法には、免疫沈降、イムノアフィニティークロマトグラフィー及びニッケルアフィニティーカラムのようなカラムクロマトグラフィー、磁気ビーズイムノアフィニティー精製、そしてプレート結合抗体によるパニングが含まれる。
【００５１】
「腫瘍特異的糖構造」とは、新生物細胞又は前癌病変細胞上に存在するが、同一細胞型の正常細胞上には存在しない、ポリペプチド上の糖構造を意味する。
【００５２】
「ベクター」又は「発現ベクター」とは、発現系、ウイルスベクター、核酸に基づいたシャトルビヒクル、核酸搬送に適応した核酸分子、又は自律性自己複製環状ＤＮＡ（例えば、プラスミド）を意味する。ベクターが宿主細胞中に維持されている場合、ベクターは自律性構造として、宿主細胞のゲノム内に組み込まれて、又は宿主細胞の核又は細胞質中に維持されて、有糸分裂の間に細胞により安定して複製されることが可能である。
【００５３】
利点
本明細書に記載したＣＤＲ−１アイソフォーム、ならびにこのアイソフォームを結合する抗体は、以前に記載されている増殖マーカー、例えば、Ｋｉ６７とは異なり、正常及び新生物細胞間を区別するために使用することができる。加えて、本発明のポリペプチドは、前癌病変の細胞のような、腫瘍を生じるであろう細胞を同定するために使用することが可能である。
【００５４】
本発明の他の特色及び利点は、以下の詳細な説明、図及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００５５】
詳細な説明
本発明は新規ポリペプチド、及び哺乳動物、例えば、ヒトにおける新生物の診断、検出、モニタリング及び治療において、これらのポリペプチドを使用する方法を特色とする。特に、本明細書に記載されたＣＦＲ−１のアイソフォーム、及びヒトモノクローナル抗体１０３／５１及びマウス抗体５８−４９／６９のような、この抗原を結合するポリペプチドは、インビトロ及びインビボの両方で、腫瘍のみでなく、前癌構造の治療及び診断を可能にする。さらに、新規ＣＦＲ−１のアイソフォームは、追加の療法化合物を同定するためのスクリーニング法で使用することができる。
【００５６】
免疫学的研究は、免疫系が悪性細胞と有効に戦うことができない場合、細胞性及び体液性活性は測定可能ではあるが、腫瘍細胞を破壊するには十分ではないことを示した。現在、免疫応答の有効性を増加させるための有効なアプローチは、患者の免疫応答により生じる抗体を単離し、適した方法でそれらを再生産し、そしてそれらを療法的に使用する。それ故、例えば、肺、食道及び結腸癌を有している患者起源の抗体を単離することができ、それらから、例えば、腫瘍細胞の分化及び増殖に直接的に影響する、ヒトモノクローナル抗体を誘導することができる。
【００５７】
我々は、びまん型腺癌を有する胃癌患者から単離されたヒト抗体１０３／５１（ヒトＰＡＭ−１）が、Ｈ．ピロリ誘発胃炎に存在する細胞及び胃癌細胞と交差反応することを記載した。抗体可変遺伝子領域の配列決定は、ヒトＰＡＭ−１抗体（１０３／５１）を自己反応性抗体であると同定した。低用量においては、ＰＡＭ−１抗体（ヒト及びマウスの両方）は、インビトロで、胃癌細胞の有糸分裂効果を有しており、それらは１３０ｋＤ膜受容体に結合した。
【００５８】
モノクローナル抗体１０３／５１の細胞性受容体は、以前は知られていなかった。本発明を導く実験の過程において、この細胞性受容体を同定することができた。モノクローナル抗体１０３／５１は、非常に特異的なストリンジェンシー条件下のみで、ウェスタンブロット分析の間にその受容体と反応し、変性人為産物により起こされる、さらなるタンパク質のアレイとの非特異的反応が観察される。
【００５９】
配列決定分析は、ＰＡＭ−１により認識される抗原はＣＦＲ−１タンパク質と相同的であるが、このタンパク質と同一ではないことを示した。このＣＦＲ−１のアイソフォームは、ヒトＰＡＭ−１抗体（１０３／５１）及び／又はマウスＰＡＭ−１抗体（５８／４７−６９）により、特異的に結合される。本明細書に記載したＣＦＲ−１のアイソフォームは、腫瘍細胞、特に胃癌腫細胞に特異的であり、正常胃組織によっては発現されない。
【００６０】
我々はこのＣＦＲ−１のアイソフォームをさらに特徴付け、Ｎ−結合を経て、タンパク質主鎖へ連結されている特別の糖構造を含んでいることを決定した。加えて、ヒトＰＡＭ−１抗体１０３／５１に対する特異性を、免疫組織化学的染色、及びＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１アイソフォームを発現しない二つの細胞株のＭＴＴアッセイを通して、同一の反応及び機能を有している精製された分子から、マウス抗体を製造することにより確認した。ヒト及びマウス抗体の両方で検出された、ＣＦＲ−１分子のアイソフォームは、上皮細胞の細胞膜中に局在化しており、野生型ＣＤＲ−１について以前に記載されているものとは異なった発現パターンを有している（Burrus et al, 1992, MoI. Cell. Biol. 12:5600-5609 ）。
【００６１】
ＣＦＲ−１
ニワトリ線維芽細胞から、高親和性ＦＧＦ結合タンパク質として単離された、野生型ＣＦＲ−１（Burrus et al, 1992, MoI. Cell. Biol. 12:5600-5609 ）は、多数のＦＧＦへ結合し、細胞増殖の調節において役割を果たすことができる。チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）において、ＣＦＲ−１は、ゴルジ装置においてのみ発現されていることが観察されているが（Burrus et al, 1992, MoI. Cell. Biol. 12:5600-5609 ）、それはまた突然変異形で分泌されることが可能である（Zuber et al, 1997, J. Cell Physiol. 170:217-227 ）。生物体に依存し、二つのＣＦＲ−１の検出された変異体、ＥＳＬ−１及びＭＧ−１６０は、８０％から９５％の間の配列相同性を共有し（Burrus et al, 1992, MoI. Cell. Biol. 12:5600-5609; Stieber et al, 1995, Exp. Cell Res. 219:562-570; Steegmaier et al, 1995, Nature 373:615-620; Mourelatos et al, 1996, DNA Cell Biol. 15:1121- 1128 ）、他の既知のタンパク質とはいかなる相同性も共有していないようである。ＣＦＲ−１、及びＥＳＬ−１及びＭＧ−１６０の機能及び細胞分布は、比較的未決定でありそして矛盾している。内側ゴルジシアロ糖タンパク質であり、そしてラット脳から精製された、ＭＧ−１６０は、細胞内ＦＧＦ輸送において役割を果たしている（Zuber et al, 1997, J. Cell Physiol. 170:217-227 ）。
【００６２】
最近の発見は、このタンパク質の局在化はゴルジ装置に限定されないことを示した。しかしながら、もしｃ末端で切り詰められていると、タンパク質は、原形質膜及びフィロポディア（ｆｉｌｏｐｏｄｉａ）に局在化することが可能である（Gonatas et al, 1998, J. Cell Sci. Ill :249-260 ）。このことは、マウス好中球前駆細胞（３２Ｄｃｌ３）から単離された、第三の相同体、ＥＳＬ−１が、ゴルジ装置ならびに微絨毛の細胞表面上に位置していることと一致している（Steegmaier et al, 1997, J. Cell Sci. 110:687-694, Gonatas et al, 1998, J.Cell Sci. 111:249-260 ）。ＥＳＬ−１は、好中球においてＥ−セレクチンのためのリガンドとして同定され、およそ１５０ｋＤの分子量を有する。ＥＳＬ−１抗体による免疫沈降は、このタンパク質の非定義アイソフォームを、いくつかの癌性細胞株を含む、多様な細胞から沈降できたことを示した（Steegmaier et al, 1995, Nature 373:615-620 ）。
【００６３】
組織分布は、抗体Ｋｉ６７での染色により実証されるように、本明細書に記載したＣＦＲ−１の腫瘍−及び前癌病変−特異的アイソフォームが、細胞活性化及び増殖に相関していることを示した（Ramires et al, 1997, J. Pathol. 182:62-67 ）。タンパク質の多様な細胞分布は、周知の現象である（Smalheiser, 1996, MoI. Biol. Cell 7:1003-1014 ）。改変された分布は、原形質膜への輸送を導くことができる、悪性細胞における異なったグリコシル化により起こされるのであろう。正常胃粘膜は、この受容体を測定可能な量では発現しないが、Ｈ．ピロリ感染上皮及び形成異常上皮は、この抗原を発現する。両方の組織とも増殖し、そして胃癌の前駆型であることができる。
【００６４】
正常細胞で観察される、ＣＦＲ−１の従来記載されている構造とは対照的に、本明細書に記載したＣＦＲ−１のアイソフォームは、正常細胞では観察されず、成長及び対応する前駆型段階で観察される腫瘍細胞のような、悪性腫瘍に関連した増殖性細胞上では排他的である。従って、本明細書に記載したＣＦＲ−１アイソフォームは、胃癌腫の診断及び治療のみならず、すべての上皮性腫瘍に対して使用することができる。胃腫瘍のほかにも、これらの受容体の存在が、以下の腫瘍の癌性組織で証明されている：食道、胃、腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、気管支、乳腺、頚部、前立腺、心臓、バレット、卵巣及び／又は子宮。本明細書に記載したＣＦＲ−１のアイソフォームへ結合する抗体、例えば、ＰＡＭ−１抗体はそれ故、癌性又は前癌性（及び正常ではない）細胞に対して標的化された活性を有する。
【００６５】
抗体及びポリペプチド
抗体は個体の健康を維持することにおいて必須の役割を果たしている。特に、抗体は血清に提示され、そして細菌、ウイルス及び毒素のような多様な病原体へ結合しそして除去することを助けている。抗体は２つの重鎖及び２つの軽鎖から構築されたＹ形状タンパク質構造から成っている。各鎖はモジュラー構成を有している：各軽鎖は２つのドメインから成っており、そして各重鎖は少なくとも４つのドメインを有している。抗原結合部位は、重鎖からの１つのドメイン（ＶＨドメイン）及び軽鎖からの１つのドメイン（ＶＬドメイン）から作り上げられている。実際、これらの２つのドメインを非共有結合か又はジスルフィド結合又はペプチドリンカーを経た共有結合で結合させて連結することにより、小さな抗原結合断片を調製することが可能である。抗原結合ドメインは、抗体の他のドメインよりもアミノ酸配列が可変性であり、そしてそれ故、定常（Ｃ）ドメインと対照的に、可変（Ｖ）ドメインと称される。抗体の定常ドメインは、補体溶解及び細胞媒介死滅のような、抗体エフェクター機構の引き金を引くことに寄与する。
【００６６】
抗体は、遺伝子再構成を含むプロセスにおいてＢリンパ球により作製される。これらの細胞の発育の間、可変ドメインをコードする遺伝子が遺伝子要素から組み立てられる。ＶＨドメインの場合においては、３つの要素、未再構成ＶＨ遺伝子、Ｄセグメント及びＪＨセグメントが存在する。ＶＬドメインの場合においては、２つの要素、未再構成ＶＬ（Ｖラムダ又はＶカッパ）遺伝子及びＪＬ（Ｊラムダ又はＪカッパ）セグメントが存在する。これらの遺伝子セグメントの無作為な組み合わせ、そして再構成されたＶＨ及びＶＬドメインの無作為な組み合わせは、非常に多くの同等に多様な抗原へ結合することが可能な抗体の広範なレパートリーを発生する。さらに、ＶＨ及びＶＬ領域は各々、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）及び４つのフレームワーク領域（ＦＲ）を有する。ＦＲは抗体の中軸であり、そしてＣＤＲは抗原へ結合する、抗体の一部である。当業者は、同一種で産生された、多数の抗体のアミノ酸配列を比較することにより、抗体のＦＲ及びＣＤＲ領域を決定することが可能である（例えば、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997 ；及びKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services, 1991 、を参照されたい）。
【００６７】
新生物特異的ポリペプチドの産生
ＰＡＭ−１抗体又はその断片は、ハイブリドーマにおける、又は組換え的に、大腸菌又は酵母（例えば、Ｓ．セレビジエ）、又は哺乳動物細胞株のような宿主細胞における発現によって産生することができる。ポリペプチドの機能性断片もまた、例えば、組換え法を使用する直接合成により産生させることができる。これらの方法は当該技術分野において標準である。例えば、核酸配列はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用して増幅することができる。ＰＣＲ技術は当該技術分野において周知であり、例えば、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されている。標準法そして本明細書において記載したように、ハイブリドーマ又はトリオーマにより発現されたモノクローナル抗体の配列を得ることができ、そして抗体の機能性断片を増幅することができる。例えば、全ＲＮＡを、腫瘍特異的モノクローナル抗体を発現しているハイブリドーマから単離することができる。次ぎにｃＤＮＡは逆転写酵素を使用してＲＮＡから産生させることができ、そして重および軽鎖の可変領域の機能性断片を含有するｃＤＮＡは、ＰＣＲを使用して増幅することができる。ＰＣＲ生成物は次ぎに、精製しそして発現ベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクター内へクローン化することができる。多くの標準ベクターが入手可能であり、適切なベクターの選択は、例えば、ベクター内へ挿入されるＤＮＡのサイズ及びベクターでトランスフェクトされる宿主細胞に依存するであろう。
【００６８】
本発明の方法を使用して同定された核酸分子は、多様な標準ベクター及び宿主細胞で発現させることができる。宿主細胞中で活性である任意のプロモーターを、核酸分子を発現させるために使用することができる。それにもかかわらず、哺乳動物細胞における抗体又は抗体の断片の発現のためには、免疫グロブリン遺伝子プロモーターの使用が望ましい。宿主細胞内へベクターを導入する方法は、当該技術分野において標準であり、電気穿孔、合成脂質ポリマー（例えば、リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）（商標））の使用、塩化カルシウムの使用、そしてＤＥＡＥデキストランの使用が含まれる。こうした方法はまた、例えば、Ausubel et ah, Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience, New York, 2001 ；及びSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y., 2001 、にも記載されている。
【００６９】
加えて、抗体により認識される精製された抗原（例えば、ヒトＰＡＭ−１抗体１０３／５１により認識されるＣＦＲ−１の新規アイソフォーム）、又はその断片は、同一抗原を特異的に認識する、追加の抗体を発生させるために使用することができる。こうした方法は、当該技術分野では標準であり、そして哺乳動物において抗原に対する免疫応答を惹起するため、マウス、ラット、ウサギ、ヤギ又はウマのような哺乳動物を、精製された抗原で免疫することを一般に含む。この免疫化に応答して、哺乳動物により産生された抗体は、哺乳動物から得られた血液から精製し、結合特異性及び機能を特徴付けることができ、あるいは、哺乳動物から抗体産生リンパ球又は脾臓細胞を得、抗体産生ハイブリドーマ細胞株を産生させるために使用することができる。これらのハイブリドーマ細胞株により産生された抗体は次ぎに、本明細書で記載した標準アッセイを使用して、結合特異性及び機能を特徴付ける。
【００７０】
ＰＡＭ−１抗体のアミノ酸変異体の単離
ＰＡＭ−１抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードするＤＮＡ内へ適切なヌクレオチド変化を導入するか、又は所望のポリペプチドのインビトロ合成により調製することが可能である。こうした変異体は、例えば、ＰＡＭ−１抗体のアミノ酸配列内残基の、欠失、挿入又は置換を包含する。もし、最終構築物が所望の特性、例えば、新生物細胞のアポトーシスを誘発するが、非新生物細胞では誘発しない能力、又は細胞の増殖を抑制する能力、を所有するとすれば、最終構築物へ到達するために、欠失、挿入又は置換の任意の組み合わせを作ることが可能である。アミノ酸変化はまた、糖鎖形成部位の数又は位置を変化させる、膜繋留特性を改変する、又はタンパク分解性切断に対する感受性を修飾するような、抗体の翻訳後プロセスを改変することもできる。
【００７１】
抗体のような、ポリペプチドのアミノ酸配列変異体の設計においては、変異部位の位置及び変異の性質は、修飾されるべき特性（単数又は複数種類）に依存するであろう。変異のための部位は、個々に又は連続して、例えば、最初に保存的アミノ酸選択物で置換し、そして次ぎに達成された結果に依存してより過激な選択をするか、又は標的残基を欠失させることにより、修飾することが可能である。
【００７２】
ポリペプチド中の変異誘発のための、特定の残基又は領域の同定に有用な方法は「アラニンスキャニング変異誘発」と称され、例えば、Cunningham and Wells (Science 244:1081-1085, 1989) に記載されている。ここでは、標的残基の残基又はグループを同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕのような荷電残基）、中性又は陰性に荷電したアミノ酸（最も望ましくはアラニン又はフェニルアラニン）で置き換えて、アミノ酸と細胞内又は外部の周囲水性環境との相互作用に影響を及ぼす。次ぎに、置換部位に、又は置換部位の代わりにさらなる又は他の変異を導入することにより、置換に対して機能的感受性を示しているドメインをさらに正確にする。従って、アミノ酸配列変異を導入するための部位が前もって決定されている限り、変異の性質は前もって決定される必要はない。例えば、既定の部位での変異の遂行を最適にするため、アラニンスキャニング又は無作為変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現された変異体を、例えば、新生物細胞のアポトーシスを誘発し、そして非新生物細胞では誘発しない、又は新生物細胞の増殖を抑制し、そして非新生物細胞では抑制しない能力でスクリーニングする。
【００７３】
置換的変異誘発に最も重要な部位には、ポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼすと同定された部位が含まれる。これらの部位、特に、少なくとも３つの他の全く同じに保存された部位の配列内に位置する部位、を比較的保存的様式で置換することができる。例えば、ａｌａはｖａｌ、ｌｅｕ又はｉｌｅで置換できる；ａｒｇはｌｙｓ、ｇｌｎ又はａｓｎで置換できる；ａｓｎはｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ又はａｒｇで置換できる；ａｓｐはｇｌｕで置換できる；ｃｙｓはｓｅｒで置換できる；ｇｌｎはａｓｎで置換できる；ｇｌｕはａｓｐで置換できる；ｇｌｙはｐｒｏで置換できる；ｈｉｓはａｓｎ，ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｒｇで置換できる；ｉｌｅはｌｅｕ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ又はｐｈｅで置換できる；ｌｅｕはｉｌｅ、ｖａｌ、ｍｅｔ、ａｌａ又はｐｈｅで置換できる；ｌｙｓはａｒｇ、ｇｌｎ又はａｓｎで置換できる；ｍｅｔはｌｅｕ、ｐｈｅ又はｉｌｅで置換できる；ｐｈｅはｌｅｕ、ｖａｌ、ｉｌｅ又はａｌａで置換できる；ｐｒｏはｇｌｙで置換できる；ｓｅｒはｔｈｒで置換できる；ｔｈｒはｓｅｒで置換できる；ｔｒｐはｔｙｒで置換できる；ｔｙｒはｔｒｐ、ｐｈｅ、ｔｈｒ又はｓｅｒで置換できる；そしてｖａｌはｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ又はｐｈｅで置換できる。
【００７４】
ポリペプチドと検出可能な作用剤とのコンジュゲーション
もし望むなら、ＰＡＭ−１抗体、その断片、又は本明細書に記載した新規ＣＦＲ−１アイソフォームは、ポリペプチドの精製、ならびにそれを必要とする哺乳動物における新生物又は前癌病変の診断、モニタリング又は治療を容易にするため、検出可能な作用剤へ連結することができる。適した検出可能な作用剤の選択は、ポリペプチドの意図された使用に依存し、そして当業者には明らかであろう。本発明に従った検出可能な作用剤には、例えば、タンパク質精製タグ、細胞毒素、酵素、常磁性標識、酵素基質、補因子、酵素阻害剤、色素、放射性核種、化学発光標識、蛍光マーカー、増殖阻害剤及びビオチンが含まれる。
【００７５】
タンパク質精製タグは、ポリペプチドの単離を容易にするため、ＰＡＭ−１抗体、その断片、又は本明細書に記載した新規ＣＦＲ−１アイソフォームへコンジュゲートすることができる。使用することが可能なタグの例には、Ｈｉｓ−タグ、ＨＡ−タグ、ＦＬＡＧ（登録商標）−タグそしてｃ−Ｍｙｃ−タグが含まれる。タグを精製後に除去することが可能なように、酵素的又は化学的切断部位をポリペプチド及びタグ部分の間に工学処理することができる。適した毒素には、ジフテリア毒素、シュードモナス内毒素Ａ、リシン及びコレラ毒素が含まれる。適した酵素標識の例には、リンゴ酸ヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、デルタ−５−ステロイドイソメラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アルファ−グリセロールリン酸デヒドロゲナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ及びアセチルコリンエステラーゼが含まれる。適した放射性同位元素標識の例には、３Ｈ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３５Ｓ及び１４Ｃが含まれる。望ましくは、放射性同位元素は１０〜５，０００ｋｅｖ範囲、より望ましくは、１００〜５００ｋｅｖで放射するであろう。常磁性同位元素もまたポリペプチドへコンジュゲートし、癌の診断及び治療のためにインビボで使用することができる。こうしたコンジュゲートされた抗体の使用は、インビボ核磁気共鳴イメージングのためであってもよい。こうした方法は当該技術分野で周知である（例えば、Schaefer et al., JACC 14:472-480, 1989; Shreve et al., Magn. Reson. Med. 3:336-340, 1986; Wolf, Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16:93-95, 1984; Wesbey et al., Physiol. Chem. Phys. Med. NMR 16:145-155, 1984; およびRunge et al., Invest. Radiol. 19:408-415, 1984 、を参照されたい）。もしくは、放射性標識ポリペプチドはまた、標識抗体が結合しているいずれかの組織の外科的除去を含む、放射性免疫ガイド手術（ＲＩＧＳ）にも使用することができる。従って、標識ポリペプチドは非新生物組織から新生物組織を区別することにより、新生物組織へ外科医を導く。腫瘍イメージングに有用な放射性標識は、好ましくは短寿命放射性同位元素である。スカンジウム−４７（３．４日）、ガリウム−６７（２．８日）、ガリウム−６８（６８分）、テクネチウム−９９ｍ（６時間）、インジウム−１１１（３．２日）及びラジウム−２２３（１１．４日）のような１時間から１１．４日の範囲の半減期を有する多様な放射活性金属が、抗体とのコンジュゲーションに利用可能であり、その中で、ガリウム−６７、テクネチウム−９９ｍ及びインジウム−１１１はガンマカメライメージングに好ましく、ガリウム−６８はポジトロン放出断層撮影に好ましく、そしてスカンジウム−４７及びラジウム−２２３（及び他のアルファ放出放射性核種）は腫瘍療法に好ましい。
【００７６】
適した蛍光マーカーの例には、フルオレセイン、イソチオシアレート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、オフタルデヒド及びフルオレスカミンが含まれる。化学発光マーカーの例には、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識及びエクオリン標識が含まれる。当業者は、本発明に従って用いることができる、他の適した標識を承知しているであろう。ＰＡＭ−１抗体、その断片、又は本明細書に記載した新規ＣＦＲ−１アイソフォームのような、本明細書に記載したポリペプチドへの、これらの検出可能な作用剤のコンジュゲーションは、当該技術分野において周知の標準技術を使用して達成することが可能である。典型的な抗体コンジュゲーション技術は、Kennedy et al. (Clin. Chim. Acta 70, 1-31, 1976) 及びSchurs et al. (Clin. Chim. Acta 81, 1-40 , 1977) に記載されており、例えば、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法が含まれる。抗体は、例えば、米国特許第４，４４４，７４４号に記載されている、当該技術分野において周知の、いくつかの技術のいずれかにより放射性標識することができる。全てのこれらの方法は、本明細書において援用される。
【００７７】
本発明の治療の全ての方法において、同一又は異なった腫瘍又は腫瘍細胞型に付随する、異なった抗原又は同一の抗原の異なったエピトープに特異的な、異なった又は同一の標識抗体の混合物を使用することができることが理解できる。こうした組み合わせは、特定の場合に検出、位置限定及び／又は療法を増強することができ、そしてまた、一つ以上の新生物又は新生物の型のための、広範なスクリーニングの範囲も増加させることが可能である。
【００７８】
抗腫瘍剤へコンジュゲートされたポリペプチド
ＰＡＭ−１抗体又はその断片は、新生物細胞のアポトーシスを誘発し、新生物細胞の細胞増殖を抑制し、又はその両方を行うことができるが、ポリペプチドをさらに新生物細胞を殺す、又はそれらの増殖を抑制する剤へコンジュゲートすることができる。ＰＡＭ−１抗体又はその断片の標的化能力は、腫瘍への細胞毒性又は抗増殖剤の搬送を生じ、腫瘍の破壊を増強する。それ故、ポリペプチドはまた、ヒト患者のような哺乳動物において、新生物又は前癌病変の治療及び予防のために使用することができる。ポリペプチドへ連結された細胞毒性剤は、ポリペプチドが結合した腫瘍細胞又は腫瘍を破壊する又は損傷する、いずれかの剤であることができる。こうした剤の例には、化学療法剤又は放射性同位元素、プロドラッグを活性化する酵素、又はサイトカインが含まれる。
【００７９】
適した化学療法剤は当業者には周知であり、例えば、タキソール、ミトラマイシン、デオキシコ−ホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ−アルファ）、エトプシド、テニポシド、アントラサイクリン（例えば、ダウノマイシン及びドキソルビシン）、メトトレキセート、ビンデシン、ネオカルジノスタチン、シス−プラチン、クロラムブシル、シトシンアラビノシド、５−フルオロウリジン、メルファラン、リシン及びカリチェアミシンが含まれる。化学療法剤は、当該技術分野において周知の慣用法を使用して抗体へコンジュゲートすることができる。
【００８０】
細胞毒性剤としての使用に適した放射性同位元素もまた当業者には周知であり、例えば、１３１Ｉ又は２１１Ａｔのようなアスタチンが含まれる。これらの同位元素は、当該技術分野において周知の慣用技術を使用して、共有結合か又は非共有結合で、ポリペプチドへ結合させることができる。
【００８１】
もしくは、細胞毒性剤はまた、プロドラッグを活性化させる、酵素であってもよい。このことは、腫瘍部位で、不活性プロドラッグをその活性な細胞毒性形への変換を可能にし、「抗体指示酵素プロドラッグ療法」（ＡＤＥＰＴ）と称されている。従って、ポリペプチド−酵素コンジュゲートを患者に投与し、そして治療されるべき腫瘍の領域での位置限定を可能にすることができる。次ぎに、細胞毒性薬剤への変換が、位置限定した酵素の影響下、治療されるべき腫瘍の領域に位置限定するように、患者へプロドラッグを投与する。酵素の例は細菌カルボキシペプチダーゼＧ２（ＣＰＧ２）であり、その使用は例えば、ＷＯ８８／０７３７８に記載されている。もし望むなら、ポリペプチド−酵素コンジュゲートを、新生物の近傍ではない体の領域からのクリアランスを促進するように、ＷＯ８９／００４２７の教示に従って修飾することができる。ポリペプチド−酵素コンジュゲートはまた、例えば、腫瘍の近傍ではない体の領域に、酵素を不活性化する追加の成分を提供することにより、ＷＯ８９／００４２７に従って使用することもできる。
【００８２】
別の代替物として、ＰＡＭ−１抗体又はその断片へコンジュゲートされた細胞毒性剤はまた、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）又は腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−アルファ）のようなサイトカインであってもよい。サイトカインが、他の組織に影響することなく、腫瘍を損傷させることを又は腫瘍の破壊を仲介するように、ポリペプチドはサイトカインを腫瘍へ標的化する。サイトカインは、慣用組換えＤＮＡ技術を使用して、ＤＮＡレベルでポリペプチドへ融合させることができる。
【００８３】
加えて、細胞増殖のいずれかの抑制剤、例えば、ゲニステイン、タモキシフェン又はシクロホスファミド、を本発明に記載されたポリペプチドとコンジュゲートすることができる。
【００８４】
用量
本発明の療法的方法に関し、本発明のポリペプチドの患者への投与が、特定の投与様式、用量又は投与の頻度に限定されることは意図されない；本発明は、筋肉内、静脈内、腹腔内、小胞内、関節内、病巣内、皮下、又は新生物細胞のアポトーシスを誘発することにより、腫瘍細胞の増殖を抑制することにより、又はその両方により、新生物細胞の数を減少させるのに適切な用量を提供するために十分な何れかの他の経路を含む、全ての投与様式を企図する。化合物（単数又は複数種類）は、単回用量又は複数回用量で患者に投与することができる。複数回用量が投与される場合、用量を、例えば、１日、２日、１週、２週又は１ヶ月ずつ、互いに分割することができる。例えば、ポリペプチド（例えば、ＰＡＭ−１抗体、その断片、本明細書に記載した新規ＣＦＲ−１アイソフォーム）、又はこのＣＦＲ−１の新規アイソフォームをコードする核酸分子を含んでいるベクターを、週に１回、例えば、２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０又はそれより多くの週の間、投与することができる。いずれの特定の対象に対しても、個々の必要性及び組成物を投与している又は投与を監督している人の専門的判断に従って、特定の投与計画を、期間を通して調節しなければならないことを理解すべきである。正確な量は、使用されたポリペプチド又はベクター、ポリペプチドが結合するリガンドの腫瘍表面上の密度、そしてポリペプチドのクリアランスの速度に依存して変化するであろう。例えば、もし、より低い用量が十分な抗新生物活性を提供しないならば、ＰＡＭ−１抗体又は本明細書に記載したＣＦＲ−１の新規アイソフォームの投薬量を増加させることが可能である。逆に、もし、新生物が患者から除去されたら、ＰＡＭ−１抗体又は本明細書に記載したＣＦＲ−１の新規アイソフォームの投薬量を減少させることが可能である。
【００８５】
主治医が最終的に適切な量及び投与計画を決定するであろうが、モノクローナル抗体又はそれらの断片のようなポリペプチドの治療的に有効量は、例えば、約０．１ｍｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ体重／日又は０．７０ｍｇ〜３５０ｍｇ／ｋｇ体重／週、の範囲であることができる。望ましくは、療法的有効量は、約０．５０ｍｇ〜２０．０ｍｇ／ｋｇの範囲、より望ましくは、約０．５０ｍｇ〜１５．０ｍｇ／ｋｇの範囲であり、例えば、約０．２、０．３、０．５、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、７．０、８．０、８．５、９．０、１０．０、１１．０、１２．０、１３．０、１４．０又は１５．０ｍｇ／ｋｇ体重を、毎日、１日おき、又は週に２回投与する。
【００８６】
例えば、適した用量とは、上記のように投与された場合、ポリペプチドがアポトーシスを誘発することが可能であり、そしてそれが基礎（即ち、未治療）レベルより少なくとも２０％は超えている量である。一般に、適切な投薬量及び治療計画は、療法的及び／又は予防的利点を提供するのに十分な量で活性化合物（単数又は複数種類）を提供する。こうした応答は非治療患者と比較して、治療患者における改良された臨床的結果（例えば、より頻繁な寛解、完全に又は部分的に、又はより長い疾患のない生存）を確立することによりモニターすることが可能である。この発明に従うと、ポリペプチドの投与は、当該技術分野において周知のいずれかの標準アッセイにより測定されるように、未治療対照のアポトーシスと比較して、少なくとも２０％、４０％、５０％あるいは７５％以上も、新生物細胞アポトーシスを誘発することが可能である。より望ましくは、アポトーシスは、非治療対照のアポトーシスよりも８０％、９０％、９５％あるいは１００％以上でさえも誘発される。もしくは、ポリペプチドの投与は、当該技術分野において周知のいずれかの標準アッセイにより測定されるように、未治療対照の増殖と比較して、少なくとも２０％、４０％、５０％あるいは７５％以下に新生物細胞増殖を抑制することが可能である。より望ましくは、増殖は、非治療対照の増殖よりも少なくとも８０％、９０％、９５％あるいは１００％以下でさえも抑制される。最も望ましくは、ポリペプチドは、非治療対照細胞と比較して、同時に新生物細胞の増殖を抑制しそしてアポトーシスを誘発することが可能である。こうした応答は、本明細書記載されている技術を含む、当該技術分野において周知のいずれかの標準技術によりモニターすることが可能である。一般に、薬学的組成物のため、用量中に存在する抗体の量は、宿主のｋｇ当たり約２５μｇ〜５ｍｇの範囲である。適した用量サイズは患者のサイズで変化するであろうが、典型的には約０．１ｍＬ〜約５ｍＬの範囲であろう。
【００８７】
加えて、配列番号６又はその断片をコードするヌクレオチド配列を含む、プラスミドベクター又はウイルスベクターを含んでいるＤＮＡワクチンを、患者の腫瘍特異的免疫応答を誘発するために使用することができる。この免疫応答は、例えば、新生物又は前癌病変へ特異的に結合する抗体の形成を生じる。一般に、約１ｎｇ〜５ｍｇ、１００ｎｇ〜２．５ｍｇ、１μｇ〜７５０μｇ、そして好ましくは約１０μｇ〜３００μｇのＤＮＡを、筋肉組織内に直接投与する。皮下注射、皮内導入、皮膚を通した圧入、及び腹腔内、静脈内又は吸入搬送のような他の様式もまた適する。加えて、ブースターワクチン接種を提供することができる。
【００８８】
薬学的組成物の製剤
ＰＡＭ−１抗体、その断片、または本明細書に記載した新規ＣＦＲ−１アイソフォームは、標的領域へ到達した時に抗新生物特性を有する濃度を生じる、いずれかの適した手段により投与することができる。ポリペプチドは、適切な量で、いずれかの適した坦体物質に含ませることができ、一般的には、組成物の総重量の１〜９５重量％の量で存在する。組成物は、非経口（例えば、皮下、静脈内、筋肉内又は腹腔内）投与経路に適している剤形で提供することができる。薬学的組成物は、慣用薬務に従って製剤することができる（例えばRemington: The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000 及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York 、を参照されたい）。
【００８９】
薬学的組成物は、慣用的な、無毒の薬学的に許容できる坦体及び補助剤を含有する、剤形、製剤中で、又は適した搬送装置又は移植物を経て、注射、注入又は移植（皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内など）により非経口的に投与することができる。もし新生物細胞が血液と直接接触していれば（例えば、白血病）、又はもし腫瘍が血流からのみ到達可能であるとすれば、静脈内（Ｉ．Ｖ．）経路を使用することができる。腫瘍が、胸膜腔又は腹腔のような限定された空間で成長している場合、ポリペプチドは血流内よりむしろ腔内へ直接投与することができる。こうした組成物の製剤及び調製は、薬学的製剤の当業者にはよく知られている。製剤は、例えば、Remington (The Science and Practice of Pharmacy (20th ed.), ed. A.R. Gennaro, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000 及びEncyclopedia of Pharmaceutical Technology, eds. J. Swarbrick and J. C. Boylan, 1988-1999, Marcel Dekker, New York) に見出すことが可能である。
【００９０】
癌進行の診断及びモニタリング
上に議論したように、本発明の側面は、哺乳動物、好ましくはヒト患者において、新生物を検出する又は診断する方法に関する。典型的には、ＰＡＭ−１抗体又はその断片により特異的に結合されるいずれの新生物も、本発明の方法に従って、インビトロかまたはインビボで検出することができる。こうした新生物は、ＰＡＭ−１抗体により結合されるＣＦＲ−１のアイソフォームを発現するものであろう。さらに、本明細書に記載したＣＦＲ−１のアイソフォームを発現する細胞は、新生物細胞または前癌病変中の細胞である可能性がある。それ故、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームは、患者が新生物を有しているか、または新生物を発生させる可能性があるかどうかを検出するためのマーカーとして使用することができる。
【００９１】
ＰＡＭ−１抗体及びその断片は、新生物、前癌病変中の細胞、ならびに増殖している悪性細胞へ特異的に結合するが、正常細胞及び正常に増殖している細胞または組織へは結合しないので特に有用である。従って、こうしたポリペプチドは腫瘍内の新生物細胞へは結合できるが、正常な周囲組織へは結合せず、それ故、哺乳動物中の新生物の検出、治療又はその両方を可能にしている。例えば、患者中にポリペプチドにより結合される細胞が残存していないことを検証することにより、あるいは、患者から除去された腫瘍が、ポリペプチドにより結合されない細胞により完全に囲まれていることを検証することにより、バイオプシーが全腫瘍を除去したかどうかを決定するため、ＰＡＭ−１抗体及びその断片を使用することができる。
【００９２】
検出の感度を改良するため、複数の新生物マーカーを既定の試料又は個体内でアッセイすることができる。従って、異なった抗原に特異的な抗体又は機能性断片のようなポリペプチドを、単一アッセイ内に、又は複数アッセイに組み合わせることができる。さらに、新生物に特異的な複数のプライマー又はプローブを同時に使用することができる。マーカーの選択は、最適感度を生じる組み合わせを決定するための日常的な実験に基づくことができる。
【００９３】
新生物のインビトロ検出
一般に、哺乳動物における新生物の診断は、哺乳動物（例えば、ヒト患者）から生物学的試料を得、こうした試料とＰＡＭ−１抗体またはその断片を接触させ、試験試料中の、癌と診断されている哺乳動物からの又は新生物を有しないことが知られている別の患者からの健康な組織に由来する非新生物細胞に対応する対照試料と比較した、新生物細胞に対するポリペプチドの反応性又は結合のレベルを検出することを含んでいる。それ故、本明細書に記載したＣＦＲ−１の新規アイソフォーム、ならびに本発明のＰＡＭ−１抗体は、さもないと検出不能である、初期段階腫瘍又は転移の検出に特に有用である。従って、患者の新生物を診断することに加え、本発明の方法はまた、哺乳動物の新生物の進行をモニターするためにも使用することができる。それ故、本明細書に記載したポリペプチドは、新生物進行のためのマーカーとして使用することができる。この目的には、新生物の診断のために使用される下記のアッセイを、時間を通して実施することができ、反応性ポリペプチド（単数又は複数種類）のレベルの変化を評価する。例えば、アッセイを２４〜７２時間毎に、６ヶ月〜１年の期間にわたって実施し、そしてその後必要に応じて実施することができる。一般に、検出された結合ＰＡＭ−１抗体のレベルが時間を通して増加している、又は本明細書に記載したＣＦＲ−１の新規アイソフォームの発現が時間を通して増加している患者においては、新生物が進行している。対照的に、結合されたＰＡＭ−１抗体のレベルが一定に維持されるか又は時間とともに減少する時、又は本明細書に記載したＣＦＲ−１の新規アイソフォームの発現が時間を通して減少している場合、新生物は進行していない。もしくは、上で指摘したように、本明細書に記載したＣＦＲ−１アイソフォーム及びＰＡＭ−１抗体はまた、腫瘍が哺乳動物から完全に除去されたかどうかを決定するため、外科的介入による腫瘍切除後に、哺乳動物における腫瘍細胞の存在を決定するためにも使用することができる。
【００９４】
望ましくは、ポリペプチドを、ポリペプチド反応性の検出又は測定を容易にする検出可能な作用剤へ連結する。生物学的試料は、新生物細胞又は増殖している細胞を含有することができる任意の生物学的材料であり、例えば、血液、唾液、組織、血清、粘液、痰、尿又は涙が含まれる。生物学的試料はまた組織切片（それは固定された組織であってもよい）、新鮮な組織、又は凍結組織であってもよい。対照試料よりも、生物学的試料とＰＡＭ−１抗体又はその断片の反応性のレベルにおける増加、又は本明細書に記載したＣＦＲ−１アイソフォームの増加した発現があるならば、試料が得られた哺乳動物において新生物が検出される又は診断される。こうした増加は、対照レベルを超えること少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％あるいは５０％以上である。結合又は反応性のレベルは、当該技術分野において周知のいずれかの方法により決定することが可能であり、それは以下により詳細に記載されている。
【００９５】
インビトロ診断アッセイ
本発明のポリペプチドを使用する新生物又は前癌病変の診断は、試料中のポリペプチドマーカー、例えば、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームを検出するための結合剤を使用する、当業者には周知の任意の方法により実施することができる。例えば、Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, N. Y., 1999 、を参照されたい。例えば、ポリペプチドは酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウェスタンブロッティング、又は組織試料中の腫瘍細胞のインサイツ検出に使用することができる。例えば、ＥＬＩＳＡアッセイは典型的には、生物学的試料中の腫瘍細胞へ結合するための、固体支持体上に固定された、抗体のようなポリペプチドの使用を含んでいる。結合された腫瘍細胞は次ぎに、レポーター基を含みそして抗体／腫瘍細胞複合体へ特異的に結合する検出試薬を使用して検出することができる。こうした検出試薬には、例えば、抗免疫グロブリン、プロテインＧ、プロテインＡ又はレクチンのような、ＰＡＭ−１抗体又はその断片へ特異的に結合する任意の結合剤を包含する。もしくは、競合アッセイを利用することができ、ここで、ポリペプチドはＰＡＭ−１抗体であり、そしてここで、抗体が特異的である抗原をレポーター基で標識し、そして、抗体と生物学的試料とのインキュベーション後に、固定化された抗体へ結合させる。試料の成分が、抗体への標識抗原の結合を阻害する程度は、試料と固定化抗体の反応性の指標である。患者の新生物の診断、又は患者の前癌病変の同定はまた、二抗体サンドイッチアッセイによっても決定することができる。このアッセイは、試料中のポリペプチドが固定化抗体へ結合されるように、最初に固体支持体（通常マイクロタイタープレートのウェル）上に固定化されている抗体と試料を接触させる。次ぎに未結合試料を固定化ポリペプチド−抗体複合体から除去し、レポーター基を含有する検出試薬（好ましくは、ポリペプチド上の異なった部位へ結合可能な第二抗体）を加える。次ぎに固体支持体上に結合されて残った検出試薬の量を、具体的レポーター基に適した方法を使用して決定する。例えば、胃腺癌のような新生物の存在又は不存在を決定するには、固体支持体に結合されて残ったレポーター基から検出された信号を、前もって決定されたカットオフ値に対応する信号と一般に比較する。新生物の検出のためのカットオフ値とは、抗体と、新生物を有しない患者からの試料をインキュベートした場合に得られた信号の平均値である。
【００９６】
レポーター基の検出のために用いる方法は、レポーター基の性質に依存する。放射活性基に対しては、シンチレーション計数又はオートラジオグラフィー法を使用することができる。分光学的方法は、色素、化学発光及び蛍光基を検出するために使用することができる。ビオチンは、異なったレポーター基（通常、放射活性又は蛍光基、又は酵素）と共役されたアビジンを使用して検出することができる。酵素レポーター基は一般に、基質の添加（一般に、規定された一定期間）、続いての、反応生成物の分光学的又は他の分析により検出することができる。
【００９７】
ＰＡＭ−１抗体及びその断片はまた、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡による、腫瘍細胞のインサイツ検出又は定量的決定のため、組織学的にも用いることができる。インサイツ検出又は決定は、患者から組織検体を取りだし、そして検体中の任意の腫瘍細胞へ標識抗体を結合させることにより達成する。こうした手法の使用は、試料中の新生物又は前癌病変の検出を可能にするのみでなく、またそれらの空間的分布の決定も可能にする。別の例として、生物学的試料は、スライド上に新生物細胞を含む生物学的材料の塗抹であることも可能であり、生物学的材料中の新生物細胞の検出は、顕微鏡で塗抹を試験することにより、又はフルオサイトメトリーにより達成する。
【００９８】
新生物のインビボ検出
もしくは、ＰＡＭ−１抗体はまた、新生物又は前癌病変を検出するそして位置限定するために、インビボで使用することもできる。こうした方法は、検出可能な作用剤で標識されているＰＡＭ−１抗体又はその断片を、哺乳動物、望ましくはヒトに非経口的に注射することを含むことができ、そしてそれは、例えば、米国特許第４，４４４，７４４号に記載されている。例えば、抗体又は抗体断片は、薬学的に不活性な放射性同位元素で放射性標識し、そして患者へ投与することが可能である。放射性同位元素の活性は、フォトスキャニング装置を使用して哺乳動物中で検出することが可能であり、対照と比較した活性の増加は、新生物の検出及び位置限定を反映する。
【００９９】
治療
哺乳動物における新生物の診断及びモニタリングに加え、本発明はまた、哺乳動物、望ましくはヒト患者において新生物を治療するための方法も特色とする。本方法は一般に、ポリペプチド、例えば、本明細書に記載したＣＦＲ−１のアイソフォーム、又はＰＡＭ−１抗体又はその断片の生物学的有効量を患者へ投与することを含んでいる。ポリペプチドは典型的には、クモ膜下腔内、皮下、粘膜下又は腔内注射による、ならびに静脈内又は動脈内注射のためのような、いずれかの投与経路を使用する注射手段により、哺乳動物へ投与する。従って、ポリペプチドを、例えば、患者の血流内へのポリペプチドの静脈内注射により、全身的に注射することができ、又はもしくは、ポリペプチドを、新生物の部位へ又は新生物細胞の近傍の位置へ直接注射することも可能である。
【０１００】
例えば、本明細書に記載したＣＦＲ−１アイソフォームの全て又は一部に対応する精製されたポリペプチドは、抗体形成を強化する及び増幅するために使用することができ、ゆえに、腫瘍細胞の、上昇したアポトーシスを誘発するため、又は補体仲介溶解のために使用することができる。さらに、栄養取り込みにおけるＣＦＲ−１のありそうな機能を仮定すると、受容体を阻止することは、成長の停止を導くので、この腫瘍特異的ＣＦＲ−１のアイソフォームを発現している細胞を「餓死させる」であろう。
【０１０１】
その組織分布の点から見て、本明細書に記載したＣＦＲ−１のアイソフォームは、以下の腫瘍及び前癌病変を治療するために特に適している：胃粘膜の異形成、胃の間質性化生、細菌ヘリコバクター・ピロリに付随する胃粘膜の炎症、胃の管状及び乳頭状腺腫、結腸の管状腺腫、結腸の絨毛腺腫、潰瘍性結腸炎における異形成、バレット異形成、食道のバレット化生、頚部上皮内新形成Ｉ、頚部上皮内新形成ＩＩ、頚部上皮内新形成ＩＩＩ、扁平上皮化生、気管支の扁平上皮異形成、ローグレード及びハイグレード前立腺上皮内新形成（ＰＩＮ）、非浸潤性乳管癌（Ｄ−ＣＩＳ）、非浸潤性乳小葉癌（Ｌ−ＣＩＳ）、バレット腫瘍、及び食道、胃、腸、直腸、肝臓、胆嚢、膵臓、肺、気管支、乳腺、頚部、前立腺、心臓、卵巣及び子宮の腫瘍。
【０１０２】
さらに、ＰＡＭ−１抗体及びその断片は、新生物を治療するため、又は前癌病変の細胞を殺すための方法でも使用することができる。上で議論したように、新生物又は前癌病変の細胞へのＰＡＭ−１抗体又はその断片の結合は、対照細胞と比較して、アポトーシスの誘発、細胞増殖の減少、又はその両方を生じる。もしくは、抗体はまた、補体経路も活性化することができ、それは最終的に細胞膜内へ穿刺される孔の原因となり、細胞死を生じる。
【０１０３】
もし望むなら、ＰＡＭ−１抗体又はその断片はまた、上記のように薬剤又は毒素へコンジュゲートすることもできる。一度細胞表面へ結合されたら、コンジュゲートは細胞原形質内へ貪食され、そこで細胞酵素が切断し、そして、それ故、コンジュゲートから薬剤又は毒素が活性化又は遊離される。一度放出されたら、薬剤又は毒素は細胞を損傷し、そして不可逆的に細胞死を誘発する。放射性標識抗体に関しては、新生物細胞又は前癌病変の細胞への結合、そして結果として起こる、細胞ＤＮＡから短距離での放射線の放出は、ＤＮＡに損傷を生成し、それ故次の複製ラウンドで細胞死を誘発する。例えば、新生物が対象において検出されそして位置限定された後、より高い用量の標識抗体、７０ｋｇの患者体重に基づくと、一般に１３１Ｉについて２５〜２５０ｍＣｉ、好ましくは用量当たり５０ｎＣｉ〜１５０ｍＣｉ、を注射する。注射は、静脈内、動脈内、リンパ管内、クモ膜下腔内又は腔内であることができ、そして一回より多く反復することができる。いくつかの療法のためには、放射性標識ポリペプチド又はポリペプチド混合物の分割用量を、例えば、２０〜１２０ｍＣｉ（７０ｋｇ患者）の範囲で、複数回投与するのが有利であり、従って、通常、正常組織への照射の比例した増加をもたらすことなく、新生物へより高い細胞殺傷用量を提供している。
【０１０４】
標識ポリペプチドを使用する療法は、第一の療法処置として有利に使用されるが、また他の抗新生物療法と組み合わせて（例えば、放射線及び化学療法）、そして外科手術の補助として使用することもできる。こうしたコンジュゲートされたポリペプチドの投与は、小さな転移が外科的に除去不可能である場合に特に有用である。
【０１０５】
ポリペプチドと他の抗新生物療法の組み合わせ
化学療法剤及び／又は放射線及び／又は新生物の外科的除去は、随意に本発明のいずれかの方法と組み合わせることが可能である。化学療法剤として使用可能な化合物のクラスには：アルキル化剤、代謝拮抗剤、天然物及びそれらの誘導体、ホルモン及びステロイド（合成類似体を含んで）、及び合成品が含まれる。アルキル化剤（例えば、ナイトロジェンマスタード、エチレンイミン誘導体、アルキルスルホネート、ニトロソ尿素及びトリアゼン）の例には、ウラシルマスタード、クロルメチン、シクロホスファミド（シトキサン（登録商標））、イフォスファミド、メルファレン、クロランブシル、ピポブロマン、トリエチレン−メラミン、トリエチレンチオホスホラミン、ブスルファン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン、ダカルバジン及びテモゾロミドが含まれる。代謝拮抗剤（葉酸アンタゴニスト、ピリミジン類似体、プリン類似体及びアデノシンデアミナーゼ阻害剤を含んで）は、例えば、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビンリン酸、ペントスタチン及びゲムシタビンを含むことができる。天然物及びそれらの誘導体（ビンカアルカロイド、抗腫瘍抗生物質、酵素、リンホカイン及びエピポドフィロトキシンを含んで）もまた使用することができ、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、パクリタクセル（パクリタクセルはタキソール（登録商標）として商業的に入手可能である）、ミトラマイシン、デオキシコ−フォルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特にＩＦＮ−アルファ）、エトポシド及びテニポシドが含まれる。ホルモン及びステロイド（合成類似体を含んで）には、例えば、１７−アルファ−エチニルエストラジオール、ジエチルスチルベステロール、テストステロン、プレドニソン、フルオキシメステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、テストラクトン、酢酸メゲストロール、タモキシフェン、メチルプレドニソロン、メチルテストステロン、プレドニゾロン、トリアムシノロン、クロロトリアニセン、ヒドロキシプロゲステロン、アミノグルテチミド、エストラムスチン、酢酸メドロキシプロゲステロン、ロイプロリド、フルタミド、トレミフェン又はゾラデックスが含まれる。合成品（白金配位化合物のような無機の複合体を含んで)の例には、シスプラチン、カルボプラチン、ヒドロキシ尿素、アムサクリン、プロカルバジン、ミトタン、ミトキサントロン、レバミソール及びヘキサメチルメラミンが含まれる。
【０１０６】
これら化学療法剤のほとんどの、安全で有効な投与のための方法及び用量は当業者には周知である。加えて、これらの投与は標準文献に記載されている。例えば、化学療法剤の多くの投与は、その開示が本明細書において援用される“Physicians' Desk Reference” (PDR), 例えば１９９６年版(Medical Economics Company, Montvale, NJ. 07645-1742, USA) 、に記載されている。
【０１０７】
療法化合物の同定
本明細書に記載したＣＦＲ−１の新規アイソフォーム又はその断片は、抗新生物又は抗増殖剤を製造するために使用することができ、ここにおいては、腫瘍に対して有効である可能性を有する化合物を、本明細書に記載した新規ＣＦＲ−１アイソフォームへ特異的に結合するその能力でアッセイする。陽性結果が得られたら、即ち、結合が生じたら、この化合物を、本明細書に記載した方法を使用し、新生物細胞又は前癌病変の細胞においてアポトーシスを誘発するその能力で、又はこうした細胞の増殖速度を改変するその能力でアッセイすることができる。こうした化合物が特徴付けられたら、それを新生物性疾患の治療のための薬学的組成物に含ませることができる。
【０１０８】
試験抽出物及び化合物
一般に、本明細書に記載したＣＦＲ−１の新規アイソフォームの生物学的活性を変化させる化合物は、当該技術分野では周知の方法に従って、天然産物、合成（又は半合成）抽出物両方の大きなライブラリー、又は化学ライブラリーから同定した。例えば、こうした化合物は、ヒト抗体、マウス抗体、いずれか任意の種のヒト化抗体、ならびに、抗体のタンパク分解切断により得られた、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２及び／又はＦａｂ’断片のような抗体断片であることができる。これらにはまた、一本鎖抗体及び／又は四量体及び／又は二量体抗体形及び／又は二特異性抗体が含まれる。
【０１０９】
当業者は、試験抽出物又は化合物の正確な起源は、本発明のスクリーニング法（単数又は複数種類）には決定的ではないことを理解するであろう。従って、実質的にかなり多数の化学抽出物又は化合物を、本明細書に記載した例示の方法を使用してスクリーニングすることが可能である。こうした抽出物又は化合物の例には、限定されるわけではないが、植物、真菌、原核生物又は動物に基づいた抽出物、発酵ブロス及び合成化合物、ならびに、存在する化合物の修飾物が含まれる。限定されるわけではないが、糖類、脂質、ペプチド及び核酸に基づいた化合物を含む、任意の数の化学化合物の無作為又は方向付けられた合成（半合成又は全合成）を起こすための多数の方法も利用可能である。合成化合物ライブラリーは、例えば、Brandon Associates (Merrimack, NH) 及びAldrich Chemical (Milwaukee, WT) から商業的に入手可能である。
【０１１０】
もしくは、細菌、真菌、植物及び動物抽出物の形の天然化合物のライブラリーは、限定されるわけではないが、Biotics (Sussex,UK) 、 Xenova (Slough, UK) 、Harbor Branch Oceangraphics Institute (Ft. Pierce, FL) 及び PharmaMar, U.S.A. (Cambridge, MA) を含む多数の供給元から商業的に入手可能である。加えて、もし望むなら、当該技術分野で周知の方法に従って（例えば、コンビナトリアル化学法又は標準抽出及び分画法）、天然及び合成的に製造されたライブラリーを製造する。さらに、もし望むなら、いずれのライブラリー又は化合物も、標準化学的、物理的又は生化学的方法を使用して、容易に修飾することができる。
【０１１１】
加えて、当業者は、重複排除（ｄｅｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ）（例えば、分類学的重複排除、生物学的重複排除及び化学的重複排除、又はこれらのいずれかの組み合わせ）、又はＣＦＲ−１に対するその効果がすでに既知である物質の複製又は反復の除去、のための方法を可能な限り用いるべきであることを、容易に理解するであろう。
【０１１２】
粗抽出物が、本明細書に記載した新規ＣＦＲ−１アイソフォームの生物学的活性を変化させることを観察した場合、観察された効果の原因となる化学構成物を単離するため、陽性リード（ｌｅａｄ）抽出物のさらなる分画が必要である。それ故、抽出、分画及び精製過程のゴールは、本明細書に記載した新規ＣＦＲ−１アイソフォームの生物学的活性を変化させる活性を有する、粗抽出物内の化学実体の注意深い特徴付け及び同定である。化合物の混合物における活性の検出のために本明細書で記載したものと同一のインビボ及びインビトロアッセイを、活性成分を精製するために又はそれらの誘導体を試験するために使用することが可能である。こうした不均一抽出物の分画及び精製の方法は、当該技術分野で既知である。
【０１１３】
以下の実施例は、本発明を例示する目的で提供されており、制限と解釈してはならない。
【実施例】
【０１１４】
実施例１
材料及び方法
細胞培養及び抗体精製
全てのアッセイにおいて、DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH, Mascheronder Weg Ib, 38124 Braunschweig, Germany にＡＣＣ２０１の番号で寄託されている、既知の胃腺癌細胞株２３１３２を使用した。細胞は、１０％ＦＣＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン（両方とも１％）を補給したＲＰＭＩ−１６４０ (PAA, Vienna, Austria) 中で、８０％コンフルエントまで増殖させた。記載したアッセイのためには、使用前に、細胞をトリプシン／ＥＤＴＡで引き離し、リン酸緩衝液（ＰＢS）で２回洗浄した。ＰＡＭ−１抗体産生ヒトハイブリドーマ細胞株１０３／５１は、無血清ＡＩＭ（登録商標）Ｖ培地(Life Technologies, Karlsruhe, Germany) 中、細胞培養フラスコ（１７５ｃｍ２）で増殖させた。細胞培養上清を集め、ＩｇＭ抗体ＰＡＭ−１を、ＦＰＬＣシステムを使用し、ＨｉＴｒａｐ（商標）  ＩｇＭアフィニティーカラム(Amersham Pharmacia Biotech, Freiburg, Germany) で精製した。抗体を２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．５、３０％イソプロパノール中、で溶離した。ＰＢＳとの緩衝液交換は、ＮＡＰ（商標）−１０カラム(Amersham Pharmacia Biotech) を使用して実行した。純度は、ＳＤＳゲル電気泳動及びウェスタンブロッティングにより決定した。
【０１１５】
膜抽出物の調製
腫瘍細胞からの膜タンパク質の単離は、細胞株２３１３２を使用し、Hensel et al. (Int. J. Cancer 81:229-235 (1999)) により記載されたように実行した。要約すれば、コンフルエント腫瘍細胞をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）で２回洗浄し、細胞スクレーパーで収集し、遠心分離し、そして低浸透圧性緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、３ｍＭ  ＫＣｌ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）に再懸濁した。氷上で１５分インキュベーション後、続いて５分超音波処理し、１０，０００ｇで１０分の遠心分離により核をペレット化した。膜をペレット化するため、上清をスウィング−アウトローター中、１０，０００ｇで３０分遠心分離した。ペレットを低浸透圧性緩衝液で洗浄した後、膜溶解緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ  ７．４、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール及び１％  ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００）に再懸濁した。プロテアーゼ阻害剤(Boehringer, Mannheim, Germany) を全ての溶液に加えた。
【０１１６】
ウェスタンブロッティング
例えば、Hensel et al. (Int. J. Cancer 81:229-235 (1999)) により記載されているような標準プロトコールを使用し、タンパク質の１０％還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動）ゲル及びウェスタンブロッティングを実施した。要約すれば、ブロットしたニトロセルロース膜を、２％低脂肪ミルク粉末を含有するＰＢＳでブロックし、続けて、１０μｇ／ｍｌ精製一次抗体（例えば、１０３／５１）又は対照抗体（無傷の又は断片化した）と１時間インキュベートした。二次抗体（ペルオキシダーゼ−結合ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体(Dianova, Hamburg, Germany) ) を、Pierce (KMF, St. Augustin, Germany) からのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ化学発光キットで検出した。ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄後、ブロットを二次抗体（ペルオキシダーゼ−結合ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体(Dianova, Hamburg, Germany) )とインキュベートした。反応を、Pierce (KMF, St. Augustin, Germany) からのＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ化学発光キットの助けをかりて検出した。
【０１１７】
抗原１０３／５１の精製
抗原の精製は、Pharmacia (Freiburg, Germany) ＦＰＬＣユニットを使用するカラムクロマトグラフィーにより実施した。サイズ排除クロマトグラフィーについては、Pharmacia ＳＵＰＥＲＤＥＸ  ２００カラム (XKl6/60) に５ｍｇの膜調製物を充填し、緩衝液Ａ（１００ｍＭトリス／Ｃｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）で溶離した。次ぎに、溶離液を分画し、抗体１０３／５１との反応についてのウェスタンブロット分析で試験した。陽性分画を、緩衝液Ａを使用してＭＯＮＯＱ（５／５）精製カラムに充填した。結合したタンパク質を、緩衝液Ｂ（１００ｍＭトリス／Ｃｌ、ｐＨ７．５、１Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）を使用する直線濃度勾配で溶離し、分画し、そしてクーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロット分析で試験した。陽性バンドをゲルから切り出し、配列決定するか又はマウスの免疫化に使用した。
【０１１８】
ＭＡＬＤＩペプチドマッピング
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから目的のバンドを切り出し、約１ｍｍｘ１ｍｍの小片に切断した。例えば、Shevchenko et al. (Anal.Chem. 68:850-858 1996)) に記載されているように、ゲル小片を洗浄し、ＤＴＴ（ジチオスレイトール）で還元し、ヨードアセトアミドでＳ−アルキル化し、トリプシン（非修飾、配列決定用、Boehringer ）でゲル内消化した。３７℃で３時間の消化後、０．３μｌの消化溶液を除去し、遅延抽出を備えたＢｒｕｋｅｒ  Ｒｅｆｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ(Bruker-Franzen, Bremen, Germany) でのＭＡＬＤＩペプチド質量マッピングにかけた。試料調製には、薄層技術を適用した(Jensen et al, Rapid.Commun.Mass.Spectrom. 10:1371-1378 (1996)) 。トリプシンペプチド質量を、社内で開発したＰｅｐｔｉｄｅＳｅａｒｃｈソフトウェアープログラムによる、非重複性タンパク質配列データベースを探索するために使用した。
【０１１９】
ＣＦＲ−１アンチセンスベクターのクローニング及びトランスフェクション
ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲは、例えば、Hensel et al. (Int.J.Cancer 81:229-235 (1999)) に記載されているような標準法を使用して実施した。要約すれば、塩基対８０２から１６９９の範囲の８９７ｂｐ断片のＰＣＲ増幅にためには、以下のプライマーを使用した：CFR-For 5' GCTTGGAGAAAGGCCTGGTGAA 3' （配列番号９）、CFR-Rev 5' TGGCACTTGCGGTACAGGACAG 3' （配列番号１０）。増幅は以下のサイクルプロフィールを使用して実施した：９５℃、２分、続いて、９４℃、３０秒、；６０℃、３０秒；７２℃、６０秒を３５サイクル、そして７２℃で４分の最終伸長。ｐＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ  Ａｍｐ  ＳＫ（＋）ベクター内へのクローニング及びＤＮＡ配列決定は、Hensel et al. (Int. J. Cancer 81:229- 235 (1999)) に記載されているように実施した。挿入物をｐＨｏｏｋ−２ベクター(Invitrogen, Leek, Netherlands) 内へサブクローン化し、クローニングの正確さは、配列決定により検証した。
【０１２０】
ｐＨＯＯＫ２−抗ＣＦＲ−１による細胞株２３１３２のトランスフェクションは、供給元のマニュアルに従って、ＰＲＩＭＥＦＥＣＴＯＲ試薬(PQLab, Erlangen, Germany) により達成した。要約すれば、プラスミドＤＮＡを１０μｇ／ｍｌに希釈し、無血清増殖培地に対して１：１０の比でＰＲＩＭＥＦＥＣＴＯＲ試薬を加えた。希釈プラスミドＤＮＡ（４５０μｌ）、希釈ＰＲＩＭＥＦＥＣＴＯＲ試薬（９０μｌ）及び無血清培地（４６０μｌ）を混合し、室温（ＲＴ）でインキュベートした。６０ミリリットル細胞培養プレート（７０％コンフルエント）を無血清培地で２回洗浄し、次ぎにＰＲＩＭＥＦＥＣＴＯＲ／ＤＮＡ混合物を滴加した。細胞を、３７℃及び７％ＣＯ２で、１８時間インキュベートし、次ぎに無血清増殖培地を、１０％ＦＣＳ含有増殖培地で置き換え、細胞をさらに２４時間インキュベートした後、ＣＦＲ−１発現を検討した。
【０１２１】
フローサイトメトリー
トランスフェクション４８時間後、トリプシン／ＥＤＴＡにより、細胞株２３１３２を培養プレートから引き離し、洗浄し、引き続いて氷上で、抗体１０３／５１及びヒトアイソタイプ一致対照抗体（Chromopure ヒトＩｇＭ）と１５分インキュベートし、続いて、氷上で１５分、ＦＩＴＣ−標識ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体(Dianova) とインキュベートした。抗体を、０．０１％アジ化ナトリウム含有ＰＢＳ中に最適に希釈した。細胞を、フローサイトメトリー(FACScan; Becton Dickinson, USA) により分析した。
【０１２２】
グリコシダーゼアッセイ
引き離し、そして洗浄した細胞を、１０％ＦＣＳ含有ＲＰＭＩ−１６４０に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートし、次ぎに計数し、サイトスピンを調製した。風乾後、サイトスピン調製物をアセトン固定し（１０分）、洗浄し、そして２０μＵ／ｍｌのＯ−グリコシダーゼ又は５ｍＵ／ｍｌのＮ−グリコシダーゼ(Boehringer) と、３７℃で４時間インキュベートした。スライドを次ぎに洗浄し、免疫組織化学的に染色した。
【０１２３】
膜性タンパク質の脱グリコシルのため、膜抽出物を、脱グリコシル化緩衝液（５０ｍＭ  ＰＯ４−緩衝液、ｐＨ７．４）に希釈した１ｍＵ／ｍｌのＮ−グリコシダーゼと、３７℃で１６時間インキュベートした。対照として、抽出物を脱グリコシル化緩衝液のみとインキュベートした。抽出物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、上記のようにウェスタンブロットを実施した。
【０１２４】
マウスモノクローナル抗体の産生
ＢＡＬＢ／ｃマウスを、１７日以内に２回、５μｇの抗体１０３／５１の精製抗原で免疫し、２回目の免疫化の４日後に殺した。脾臓を機械的に破壊し、Vollmers et al. (Cell 40:547-557 (1985)) に記載されているように、１ｘ１０７ＮＳ０細胞と融合した。抗体産生ハイブリドーマを、免疫組織化学的染色及びウェスタンブロット分析における反応を通して試験した。陽性反応性を有するクローン５８／４７−６９を、さらなる実験に使用した。
【０１２５】
パラフィン切片の免疫組織化学的染色
パラフィン包埋ヒト胃粘膜及び腫瘍を切片となし（５μｍ）、除パラフィンし、ＰＢＳに希釈したＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）（１５ｍｇ／ｍｌ）で３０分ブロックした。切片を、ハイブリドーマ１０３／５１の上清又はＢＳＡ／ＰＢＳ(Dako, Hamburg, Germany) で１：１５に希釈した５８／４７−６９、Ｋｉ６７(Loxo, Dossenhein, Germany) 又はマウス抗サイトケラチン８抗体と、加湿インキュベーター中、２〜２．５時間インキュベートした。切片を、トリス／ＮａＣｌで３回洗浄し、続いて、ウサギ血清含有ＰＢＳ（抗体１０３／５１に対して）又はヒトＡＢ血漿含有ＰＢＳ（抗体５８／４７−６９及び抗サイトケラチンに対して）で１：５０に希釈した、ペルオキシダーゼ標識ウサギ抗ヒト又はウサギ抗マウスコンジュゲート(Dako) とインキュベートした。トリス／ＮａＣｌでの３回の洗浄及びＰＢＳ中での１０分のインキュベーション後、ジアミノベンジジン（０．０５％）−過酸化水素（０．０２％）を用いる、ＲＴで１０分の染色を実施した。反応を流水道水で停止し、切片をヘマトキシリンで対比染色した。
【０１２６】
生きている及びアセトン固定細胞の免疫組織化学的染色
生細胞染色については、細胞を引き離し、洗浄し、そして１ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈した。１ｍｌの細胞懸濁液を１，５００ｇで５分、遠心分離した。完全ＲＰＭＩで４０μｇ／ｍｌに希釈した抗体を、１ｍｌの最終容量まで加え、そして９０分、氷上でインキュベートした。細胞は次ぎに、１，５００ｇで５分、ペレット化し、５００μｌのＲＰＭＩで再懸濁した。２００μｌの細胞懸濁液で、サイトスピン調製試料を調製し、３０分風乾した。細胞をアセトンで３０分固定し、トリス／ＮａＣｌで３回洗浄した。ＨＲＰ−結合ウサギ抗ヒトＩｇＭ抗体(DAKO) をＰＢＳ／ＢＳＡ（０．１％）で１：５０に希釈し、ＲＴで３０分インキュベートした。３回の洗浄後、上記のように染色を実施した。
【０１２７】
アセトン固定細胞の染色については、上記のように、サイトスピンを調製し、ＲＴで風乾し、アセトンで固定した。サイトスピンを、ＰＢＳ／ＢＳＡ（０．１％）で１５分ブロックし、１０μｇ／ｍｌの一次抗体と３０分インキュベートし、続いて３回洗浄した。二次抗体とのインキュベーション及び染色は、上記のように実施した。
【０１２８】
ＭＴＴ増殖アッセイ
確立された細胞株２３１３２のＭＴＴアッセイは、Vollmers et al. (Cancer 74:1525-1532 (1994)) に記載されているように実施した。要約すれば、トリプシン処理細胞を、完全増殖培地中に１ｘ１０６細胞／ｍｌに希釈し、５０μｌの細胞懸濁液を、９６ウェルプレートの各ウェルに加えた。完全増殖培地で指示された濃度に希釈した、５０μｌの抗体をウェルに加え、プレートを、加湿インキュベーター中、３７℃で１又は２日インキュベートした。分析のため、５０μｌのＭＴＴ（３（４，５−ジメチルチアゾール）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）溶液（５ｍｇ／ｍｌ）を各ウェルに加え、プレートを３０分インキュベートした。インキュベーション後、プレートを８００ｇで５分遠心分離し、ＭＴＴ溶液を除去し、染色された細胞ペレットを１５０μｌのジメチルスルホキシドに溶解し、そして吸収を、５４０ｎｍ及び６９０ｎｍの波長で測定した。
【０１２９】
細胞死ＥＬＩＳＡ
腫瘍細胞株２３１３２／８７に対する抗体誘発アポトーシスの程度を、Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳキット(Roche, Mannheim, Germany) により分析した。このアッセイのためには、１ｘ１０４腫瘍細胞を９６ウェルプレートに蒔き、断片化ＰＡＭ−１抗体の存在下、加湿ＣＯ２インキュベーター中、３７℃及び７％ＣＯ２で、２４時間インキュベートした。正常増殖を示すため、細胞に完全増殖培地を補充した（対照１）。無関係断片化ＩｇＭは、陰性対照として働いた（対照２）。インキュベーション後、細胞を２００ｇで１０分遠心分離し、上清を除去し、続いて溶解緩衝液と、ＲＴで３０分インキュベートした。遠心分離後、上清をストレプトアビジン被覆マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）内へ移し、免疫試薬（１０％抗ヒストン−ビオチン、１０％抗ＤＮＡ−ペルオキシダーゼ（抗ＤＮＡ  ＰＯＤ）及び８０％インキュベーション緩衝液の混合物）を加え、２５０ｒｐｍでのＭＴＰ振盪機上、ＲＴで２時間インキュベートした。インキュベーションに続いて、非結合成分を、インキュベーション緩衝液で洗浄することにより除去した。ペルオキシダーゼは、基質としてＡＢＴＳ（商標）（５ｍｌの基質緩衝液中に、ＡＢＴＳ（商標）（２，２’−アジノ−ジ［３−エチル−ベンゾ−チアゾリン−スルホネート］）１錠）を用いて測光法で決定した。抗体誘発アポトーシスは、ブランクとしてのＡＢＴＳ溶液に対して、４０５ｎｍで測定した（参照波長およそ４９０ｎｍ）。
【０１３０】
インビボ実験
インビボでの腫瘍細胞増殖に対する断片化ＰＡＭ−１の影響を決定するため、ヌードマウス−ヒト胃癌腫細胞システムを使用した（例えば、Vollmers et al., Oncology Reports 5:35-40 (1998) を参照されたい）。簡単には、２ｘ１０６胃癌腫細胞（２３１３２／８７）を、８週齢のＮＭＲＩｎｕ／ｎｕマウス(Harlan Winkelmami GmbH, Borchen, Germany) にｉ．ｐ．で注射し、続いて、癌腫細胞注射４日後に、断片化ＰＡＭ−１抗体を注射した。対照マウスには、同一濃度で無関係断片化ヒトＩｇＭを注射した。目に見える腫瘍増殖を、実験の間、顕微鏡で測定した。実験は、腫瘍が最大許容サイズに到達した時に終了し、その上に、マウスを殺し、各々、腫瘍サイズ、腫瘍重量を決定し、そして腫瘍の転移及び他の変化について器官及び組織を点検した。
【０１３１】
ＦｒａｇＥｌ−クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）アポトーシスアッセイ
マウスにおいて誘発された腫瘍がアポトーシスを起こしているかどうかを調べるため、免疫組織化学を使用して、ＤＮＡ断片化を測定した。アポトーシスに特異的であり、当該技術分野では標準である、クレノウアッセイを、Vollmers et al. (Oncology Reports 5:549-552 (1998)) に記載されているように実施した。簡単には、ＰＡＭ−１処理マウス及び対照群において増殖したマウス腫瘍を、３％ホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。切片は次ぎに、アポトーシス特異的ＦｒａｇＥＬ−クレノウＤＮＡ断片化キット(Calbiochem- Novabiochem, Bad Soden, Germany) を使用し、製造元の説明書に従って処理した。
【０１３２】
ＣＦＲ−１の新規アイソフォームの配列を決定する方法
ｃＤＮＡ合成のため、Quiagen からのＲＮＥＡＳＹキットの助けをかりて、ＲＮＡ
を調製した。このＲＮＡ調製にためには、１ｘ１０６細胞を氷冷ＰＢＳで２回洗浄し、１０００ｘｇ、５分でペレット化し、ＲＮＡを製造元の記載に従って調製した。５μｇＲＮＡ（１〜５μｌ溶液）を１μｌのオリゴ−ｄＴ１５（１μｇ／μｌ）及び２μｌのランダムプライマー（４０μＭ）と混合し、Ｈ２Ｏを使用して８μｌの総容量とした。ＲＮＡを、６５℃で１０分変性させ、試料は続いて氷上で冷却した。５．２μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏ、５μｌの５ｘ逆転写酵素緩衝液、２．５μｌのｄＮＴＰ（１０ｍＭ当たり）、２．５μｌのＤＴＴ（２５０ｍＭ）、０．８μｌのＲＮａｓｉｎ（４００Ｕ）及び１μｌのＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（２００Ｕ）から成る、１７μｌのＭａｓｔｅｒｍｉｘをＲＮＡに加えた。ｃＤＮＡの合成は、３７℃で７０分実施し、続いて９５℃に５分加熱することにより終結させた。１〜５μｌのｃＤＮＡをＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘと混合し、Ｈ２Ｏを使用して２５μｌの総容量とした。ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒｍｉｘは、２．５μｌの１０ｘＴａｑ−ポリメラーゼ緩衝液、０．５μｌの１０ｍＭ  ＮＴＰ、１．５〜２μｌの２５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５μｌの各２０ｐＭの３’及び５’プライマー及び０．２μｌのＴａｑポリメラーゼ（１Ｕ）から成っていた。種々のＰＣＲ産物のための増幅条件は、種々のｃＤＮＡを増幅するために使用した下記のＰＣＲプログラムの概要に示されている。
【０１３３】
【表１】
2008506352.tif 000002
【０１３４】
プライマー配列
ＰＣＲに使用した、オリゴヌクレオチドの配列は以下に示されている
ＣＦＲ
CFR-For 1 5' OGC AGC TTC AGC AGC AAC AGC A 3' （配列番号１１）
CFR-Rev 1 5' CAG CTC AGC CAC CCG GAG AAT G 3' （配列番号１２）
CFR-For 2 5' GCT TGG AGA AAG GCC TGG TGA A 3' （配列番号１３）
CFR-Rev 2 5' TGG CAC TTG CGG TAC AGG ACA G 3' （配列番号１４）
CFR-For 3 5' GAA CAC CGT CTC TTA GAG CTG C 3' （配列番号１５）
CFR-Rev 3 5' GCT TCC TGC AGA GTG TCA TTG C 3' （配列番号１６）
CFR-For 4 5' GGA GGA CGT GTT GAA GCT TTG C 3' （配列番号１７）
CFR-Rev 4 5' CCA GGG CAC AAG CAG TAT GAA G 3' （配列番号１８）
CFR-For 5 5' CAA CAG CAG ACA GGT CAG GTG G 3' （配列番号１９）
CFR-Rev 5 5' CCG GAA GTT CTG TTG GTA TGA G 3' （配列番号２０）。
【０１３５】
配列決定はApplied Biosystems からのシクエンサーを使用して実施した。以下のオリゴヌクレオチドを、クローン化ＰＣＲ産物の配列決定に使用した：
T3 5' ATTTAACCCTCACTAAAGGG 3' （配列番号２１）
T7 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3' （配列番号２２）。
３μｌのプラスミドＤＮＡを、１μｌのプライマー（３．２ｐＭ）、１１μｌのＨ２Ｏ、及び５μｌのＡＢＩＰＲＩＳＭ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔの反応混合物と混合し、以下のパラメーターを使用する２５サイクルの間、サーモサイクラー中でインキュベートした：
【０１３６】
【表２】
2008506352.tif 000003
【０１３７】
オリゴヌクレオチド及びｄＮＴＰを除去するため、反応混合物をＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−５０を満たした精製カラムで精製した。この目的のため、１００μｌピペットチップに上端までカラム材料を充填し、２０００ｘｇで３分遠心分離した。続いて、試料を注ぎ、そして小カラムを再び遠心分離した。ＤＮＡを次ぎに、２μｌの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２）及び５０μｌの１００％エタノールにより沈殿させ、１３，０００ｘｇで１５分遠心分離することによりペレット化した。乾燥後、ＤＮＡに３μｌのホルムアミド／２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（５：）を加え、シクエンサーで分析した。
【０１３８】
配列分析
各クローニング反応から、少なくとも５クローンを配列決定した。Ｔａｑ−ポリメラーゼを使用する増幅及び／又は配列決定の間に生じる誤差の可能性を同定するため、クローン化ＰＣＲ断片の配列を、ウィンドウソフトウェアーのためのＤＮＡｓｉｓの助けをかりてお互いに比較し、両方の読み取り方向から、全てのクローンの共通配列を確立した。ＤＮＡ配列をアミノ酸配列に書き直すことにより、サイレント変異及びアミノ酸置換変異を決定した。ＭＧ１６０及びＣＦＲ−１の配列は、ＮＣＢＩデータバンクから引き出し、ウィンドウソフトウェアーのためのＤＮＡｓｉｓを使用して、ＰＣＲ産物の配列と比較した。これらの配列のアラインメントは、図１６に示されている。
【０１３９】
ＲＮＡ単離
胃の正常及び癌性胃組織からのＲＮＡは、ＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬(Invitrogen) によるフェノール−グアニジン−イソチオシアネート法を使用して単離した。簡単には、凍結正常及び腫瘍組織を、凍結マイクロトーム上で連続的な５μｍ切片に切断した。組織試料に１ｍｌのＴＲＩＺＯＬ（登録商標）試薬を加え、溶液を続いて均質化した。均質化後、不溶性物質を、４℃、１２，０００ｘｇで１０分の遠心分離によりホモジネートから除去した。２００μｌのクロロホルムを、ＲＮＡ含有上清に加え、そして、混合後、溶液をＲＴで３分インキュベートした。４℃、１２，０００ｘｇで１５分の遠心分離後、水相を、５００μｌのイソプロパノールと３０秒混合することにより沈殿を生じさせ、ＲＴで１０分インキュベートし、４℃、１２，０００ｘｇで１０分遠心分離した。生じたＲＮＡペレットを、１ｍｌの７５％エタノールで洗浄し、そして４℃、７，５００ｘｇで５分遠心分離した。ＲＮＡペレットを風乾し、８０μｌのＤＥＰＣ処理水に再懸濁した。精製された全ＲＮＡの完全性及び質を１％アガロースゲル電気泳動で管理し、濃度を分光学的に評価した。
【０１４０】
半定量的逆転写−ＰＣＲ
ｍＲＮＡレベルを、半定量的逆転写−ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）法を使用して試験した。正常及び癌性胃組織からの第一鎖ｃＤＮＡの合成は、供給元からのマニュアルに従って、モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素(M-MLV RT, Invitrogen GmbH, Karlsruhe, Germany) 及びオリゴ−ｄＴプライマーを使用し、５μｇの全ＲＮＡで実施した。ＰＣＲ産物の配列法を、ＣＦＲ−１  ｍＲＮＡを検出するために使用した。ＰＣＲ反応は、２ｎＭ  ＭｇＣｌ２、０，４ｐＭプライマー、２００μｍの各ｄＮＴＰ及び１単位のＴａｑポリメラーゼ（ＭＢＩ）を含む２５μｌ容量で実施した。ＣＦＲ−１  ｍＲＮＡの発現を、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルへ基準化した。ＣＦＲ−１及びＧＡＰＤＨに対して特異的なプライマーは、その報告されている配列に基づいて設計され、MWG-BIOTECH AG (Ebersberg, Germany) により商業的に合成された。これらのオリゴヌクレオチドの配列は、ＣＦＲ−１について、5' CAAGAGCAGACAG-GTCAGGTGG 3' （配列番号２２）及び5' CCGGAAGTTCTGTTG-GTATGAG 3' （配列番号２３）、及びＧＡＰＤＨについて5' GTGGAAGGACTCATGACCACAGTC 3' （配列番号２４）及び5' CATGTGGGCCATGAGGTCCACCAC 3' （配列番号２５）である。期待される増幅産物のサイズは、ＣＦＲ−１について７５０ｂｐ及びＧＡＰＤＨについて４８２ｂｐである。ＣＦＲ−１は、９４℃で４分、そして９４℃（３０ｓ）、５５℃（３０ｓ）及び７２℃（３０ｓ）で４０サイクル、７２℃（４分）での最終伸長工程により増幅した。陰性対照としての各ＰＣＲ実験は、ｃＤＮＡなしのＰＣＲ緩衝液含有資料を含んでいた。ＰＣＲ産物は、トリス−酢酸−ＥＤＴＡ緩衝液中のアガロースゲル電気泳動（２％）及びエチジウムブロミド染色により同定した。
【０１４１】
ペプシン切断
ＰＡＭ−１抗体のペプシン消化のため、ＮＡＰ（商標）−１０カラム(Amersham Pharmacia Biotech) を使用する、１００ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．５）による緩衝液交換を使用した。さらに、適した陰性対照を得るため、無関係ヒトＩｇＭ抗体(Chrompure IgM, Dianova, Hamburg, Germany) で、ペプシン消化を実施した。各ミリグラムの抗体について、５μｇのペプシン(Sigma Aldrich, Taufkirchen, Germany) を加え、続いて３７℃水浴中で、１０〜１５分インキュベートした。１／１０容量の３．０Ｍトリス（ｐＨ８．８）を加えることにより反応を停止させ、続いて１０，０００ｇで３０分遠心分離した。実験での使用に先立って、断片化ＰＡＭ−１抗体及び断片化ヒト対照ＩｇＭを、ＰＢＳに対して透析した。ペプシン切断の成功は、ＳＤＳゲル電気泳動及びウェスタンブロットにより試験した。
【０１４２】
以下の実験は、上記材料及び方法を使用して実施した。
【０１４３】
実施例２
ＰＡＭ−１抗体により認識された抗原の同定及び特徴付け
抗原１０３／５１の精製及び同定
抗体１０３／５１が、胃癌細胞上のおよそ１３０ｋＤ膜タンパク質へ結合することを示すため、ウェスタンブロット分析を使用した。我々は、このタンパク質を、連続的サイズ排除及びアニオン交換クロマトグラフィーにより前精製した（図１Ａ）。タンパク質を、クーマシー染色分取ＳＤＳ−ＰＡＧＥから切り出し、一部をマウスモノクローナル抗体の産生のために使用し（下記参照）、そして一部を、Shevchenko et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93:14440-14445 (1996)) のような、当該技術分野では標準の方法を使用して、タンパク質を同定するために使用した。トリプシンによる３時間のゲル内消化後、全消化容量の約１％をとり、高質量精度ＭＡＬＤＩペプチド質量マッピングにかけた（ＭＡＬＤＩ  ＭＳが決定的な同定を導かない場合のため、消化物の残りをナノエレクトロンスプレー分析のために取っておく）。ＭＡＬＤＩ分析には、タンパク質消化物のフェムトモル量しか消費しないにもかかわらず、データベース探索は、５０ｐｐｍ以内の質量精度で、ＣＦＲ−１配列に３５ペプチドが一致した。これらのペプチドはＣＦＲ−１配列の２９％をカバーし、それ故、タンパク質をＣＦＲ−１相同体であると決定的に同定している。ＣＦＲ−１はおよそ１３４ｋＤの計算分子量を有している(Burrus et at, 1992, MoI. Cell Biol. 12:5600-5609) （図１Ｂ）。この新規ＣＦＲ−１相同体の核酸（配列番号５）及びアミノ酸（配列番号６）配列は図１０−１から１０−５に示されている。
【０１４４】
抗体１０３／５１の結合及び生細胞染色に対する、ＣＦＲ−１アンチセンスベクターによる細胞株２３１３２の過渡的トランスフェクションの影響
免疫組織化学及びフローサイトメトリーを使用し、胃癌腫細胞株２３１３２のアンチセンストランスフェクションの影響を調べた。このため、塩基対８０２及び１６９９間の領域に隣接する、ＣＦＲ−１の８９７ｂｐＰＣＲ断片を、ｐＨＯＯＫ−２ベクター内に、ＣＭＶプロモーターに関してアンチセンス方向でクローン化した。洗浄した細胞を、ｐＨＯＯＫ−ＣＦＲアンチセンスベクター、ｐＨＯＯＫ−ｌａｃＺ及びｐＨＯＯＫベクターで、中間工程でトランスフェクトした。トランスフェクションは、β−ガラクトシダーゼアッセイで管理した（データは示されていない）。トランスフェクション４８時間後、サイトスピン調製物を調製し、抗体１０３／５１、及び対照として抗サイトケラチン１８で染色した（データは示されていない）。
【０１４５】
免疫組織化学は、偽トランスフェクト細胞と比較した場合、ｐＨＯＯＫ−ＣＦＲアンチセンスベクターでトランスフェクトした細胞における、明瞭な染色の減少を示した（図２Ａ及び２Ｂ）。このことにより、ＣＦＲ−１に対する抗体１０３／５１の結合が確認された。両方の染色で見られるわずかな細胞質染色は、アセトン固定細胞に対するヒトＩｇＭ抗体の染色でしばしば観察される非特異的結合によるものであろう。膜発現及びトランスフェクションの影響もまた、フローサイトメトリーにより試験した（図２Ｇ〜２Ｉ）。データは、ＣＦＲ−１アンチセンスベクターでの細胞トランスフェクション後の、抗体１０３／５１の結合の減少を示している。しかしながら、未処理細胞又は対照ベクターｐＨＯＯＫ−２でトランスフェクトした細胞は、細胞株２３１３２への明瞭な結合を示し、細胞膜上でのＣＦＲ−１アイソフォームの発現を示している。
【０１４６】
ＣＦＲ−１アイソフォームの特異的膜分布を探求するため、細胞株２３１３２及びいくつかの非胃癌細胞株で、生細胞染色を実施した。細胞株２３１３２について、明瞭な染色を見出したが（図２Ｃ及び２Ｄ）、一方、ヒト肺腺癌細胞株Ｃｏｌｏ−６９９（図２Ｅ及び２Ｆ）及びヒト類表皮肺癌細胞株ＥＰＬＣ−２７２Ｈ（データは示されていない）は明瞭に陰性であった。これらのデータは、記載されたＣＦＲ−１アイソフォームは全ての癌細胞株では発現されていないことを示しており、そして２３１３２細胞の排他的膜染色は、ＣＦＲ−１アイソフォームは、ＣＦＲ−１についてこれまで記載されている分布とは異なった分布を有していることを示している。
【０１４７】
グリコシダーゼアッセイ
ＣＦＲ−１は５つの可能なＮ−グリコシル化部位を有するシアロ糖タンパク質であり、グリコシダーゼＦでの処理により、本分子はこれらの部位でグリコシル化されることが示されている(Steegmaier et al, Nature 373:615-620 (1995)) 。腫瘍反応性抗体は、しばしば炭水化物残基と反応するので、抗体１０３／５１がそうであるかどうかを調べた。細胞株２３１３２のサイトスピン調製物を、Ｏ−及びＮ−グリコシダーゼと４時間インキュベートし、次ぎに、抗体１０３／５１での免疫組織化学的染色にかけた。Ｎ−グリコシダーゼでの細胞の処理は、１０３／５１染色における劇的な減少を導いたが（図３Ｂ）、一方、脱リン酸化緩衝液（図３Ａ）又はＯ−グリコシダーゼ（データは示されていない）での消化は、抗体１０３／５１の結合には何の効果も有していなかった。このことは、抗体１０３／５１の結合の特異性は、Ｎ−連結糖残基に位置しているに違いなく、一次タンパク質配列には位置していないことを示している。
【０１４８】
この効果をさらに照らし合わせるため、細胞株２３１３２の膜抽出物を１６時間脱グリコシル化し、ウェスタンブロットを調製し、抗体１０３／５１で染色した。対照溶解物と比較した場合、Ｎ−グリコシダーゼとインキュベートした溶解物で反応の減少を見出した（図３Ｃ）。
【０１４９】
マウス抗体の産生及び胃腺癌のパラフィン切片の免疫組織化学的染色
ＣＦＲ−１を特異的に認識する商業的抗体は入手可能ではない。それ故、特異性を強化し、そしてＣＦＲ−１発現をさらに特徴付けるモノクローナル抗体の産生のため、クーマシー染色ＳＤＳゲルから溶離した精製タンパク質でマウスを免疫した。脾臓細胞は、ヘテロミエローマＮＳ０と融合することにより不死化した。１５０クローンを免疫組織化学的染色で試験した。陽性クローンを再クローン化し、クローン５８／４７−４９（ＩｇＭ）をさらなる特徴付けに使用した。ヒト抗体１０３／５１及びマウス抗体５８／４７−６９の結合特性を調べるため、１５の異なった胃腺癌及び１つの腺腫のパラフィン切片を染色した。正常上皮組織の腺性細胞の同一の染色及び癌腫細胞の強い染色を見出した（図４Ａ〜４Ｄ）。要約すれば、初期癌腫（ｎ＝２）は両方の抗体で染色された。間質型癌腫に対しては、両方の抗体は５例の内４を染色し、びらん型癌腫に対しては、すべての例（ｎ＝４）が染色され、そして中間型は、両方の抗体で５０％（ｎ＝４）で陽性であった。これらの結果は、胃癌腫のほとんどの例での、本明細書に記載したＣＦＲ−１アイソフォームの高い発現を示している。調べられた腺腫は異なる染色パターンを示し、陽性細胞は、正常から形質転換細胞への移行においてのみであった。
【０１５０】
マウス抗体５８−４９／６９の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）が、図８Ａ及び８Ｂに示されている。図８Ｂに示したように、５８−４９／６９可変領域重鎖のＣＤＲ１は、アミノ酸１１〜１５をコードする、ヌクレオチド３１〜４５にまたがり、ＣＤＲ２は、アミノ酸３０〜４６をコードするヌクレオチド８８〜１３８にまたがり、そしてＣＤＲ３は、アミノ酸７９〜８８をコードするヌクレオチド２３５〜２６４にまたがっている。加えて、Ｄ−遺伝子は、ヌクレオチド２３５〜２４３にまたがり、そしてＪ−遺伝子は、ヌクレオチド２４３〜２８８にまたがっている。
【０１５１】
マウス抗体５８−４９／６９の軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号３）及びアミノ酸配列（配列番号４）が、図９Ａ及び９Ｂに示されている。図９Ｂに示したように、５８−４９／６９可変領域軽鎖のＣＤＲ１は、アミノ酸１７〜３２をコードする、ヌクレオチド４９〜９６にまたがり、ＣＤＲ２は、アミノ酸４８〜５４をコードするヌクレオチド１４２〜１６２にまたがり、そしてＣＤＲ３は、アミノ酸８７〜９５をコードするヌクレオチド２５９〜２８５にまたがっている。
【０１５２】
ヒト抗体１０３／５１の重鎖可変領域の核酸配列（配列番号２８）及びアミノ酸配列（配列番号２６）が、図１７に示されている。１０３／５１可変領域重鎖のＣＤＲ１は、アミノ酸１１〜１８をコードする、ヌクレオチド３１〜５４にまたがり、ＣＤＲ２は、アミノ酸３６〜４３をコードするヌクレオチド１０６〜１２９にまたがり、そしてＣＤＲ３は、アミノ酸８２〜１０４をコードするヌクレオチド２４４〜３１２にまたがっている。
【０１５３】
ヒト抗体１０３／５１の軽鎖可変領域の核酸配列（配列番号２９）及びアミノ酸配列（配列番号２７）が、図１８に示されている。１０３／５１可変領域軽鎖のＣＤＲ１は、アミノ酸２８〜３２をコードする、ヌクレオチド８２〜９６にまたがり、ＣＤＲ２は、アミノ酸５１〜５３をコードするヌクレオチド１５１〜１５９にまたがり、そしてＣＤＲ３は、アミノ酸９０〜１００をコードするヌクレオチド２６８〜３００にまたがっている。
【０１５４】
胃粘膜に対する抗体１０３／５１による免疫組織化学的染色
胃粘膜に対する抗体１０３／５１の反応パターンをより詳細に調べるため、炎症のない胃組織、Ｈ．ピロリ付随慢性活性胃炎、ハイグレード異形成及び胃腺癌に対して、免疫組織化学的染色を実施した（図５Ａ〜５Ｄ）。非炎症胃組織については、反応は観察されなかった。しかしながら、Ｈ．ピロリ胃炎を有する患者の粘膜においては、主として小窩細胞の基底帯で染色を見出した。抗体１０３／５１の染色パターンは、Ｋｉ６７染色により示された活性化パターン(Ramires et al, 1997, J. Pathol. 182:62-67) と強い相関を示す。抗体１０３／５１のより強い染色は、胃異形成の増殖帯域で見られ、Ｋｉ６７染色とまた相関していた。最も強い染色は、胃癌腫の増殖帯域で見出された。
【０１５５】
異なった組織に対する抗体１０３／５１及び５８／４７−６９の免疫組織化学的染色
抗体１０３／５１及び５８／４７−６９を用いた、パラフィン切片の免疫組織化学的染色により、他の癌性及び正常組織における、本明細書に記載したＣＦＲ−１アイソフォームの発現を調べた。１５の癌性組織（胃癌腫以外）の内、抗体１０３／５１は１３の例で染色を示した（図６Ａ〜６Ｆ、表１Ａ）。陰性染色は、肺の未分化細胞で観察され、細胞株Ｃｏｌｏ−６９９及びＥＰＬＣ−２７２Ｈでの免疫組織化学的染色及びＭＴＴアッセイからの結果を確認している。これらのデータは、悪性形質転換細胞における、本明細書に記載したＣＦＲ−１アイソフォームの過剰発現及び細胞膜への分布を示している。
【０１５６】
【表３】
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【０１５７】
【表４】
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【０１５８】
表１Ａ及び１Ｂについて、抗体染色は以下のように記録された：「−」＝染色なし；「＋」＝中程度の染色；「＋＋」＝強い染色。ＨＣＣ＝肝細胞性癌腫、１増殖性帯域、腺性小窩、２球状、束状帯（膜性染色）、３小胞体の集合管。
【０１５９】
試験された２８の正常及び前癌病変に対して、３つの腸型器官でのみの限定された発現を見出した（表１Ｂ）。膜染色は、胃の腺性小窩及び副腎の球状及び束状帯で観察され、一方、ゴルジ装置の染色は、腎臓の集合管で観察された（図５）。ゴルジ特異性染色は、Burrus et al. (MoI. Cell Biol. 12:5600-5609 (1992)) により以前に記載されている、ＣＦＲ−１と相同的な抗原の特徴付けをさらに立証した。
【０１６０】
ヒト及びマウスモノクローナル抗体による刺激
抗体１０３／５１は、インビトロで細胞株２３１３２の刺激を導く。抗体１０３／５１のこの刺激を、増殖の標準アッセイである、ミトコンドリアヒドロキシラーゼアッセイ（ＭＴＴ）を使用して測定した(Carmichael et al, Cancer Res. 47:936-942 (1987)) 。抗体１０３／５１の刺激特性をさらに調べるため、細胞株２３１３２と、種々の濃度の精製抗体とインキュベートした。４μｇ／ｍｌで最も高い活性を示す、濃度依存性刺激を見出した（図７Ａ）。より高い濃度は、刺激のわずかな減少を示した。
【０１６１】
細胞増殖に対する同一の効果をマウス抗体５８／４７−６９が有しているかを試験するため、匹敵する量で精製抗体を用いるＭＴＴ刺激アッセイを実施した。図７Ｂに見ることができるように、両方の抗体が、インビトロでの細胞株２３１３２の刺激を導いた。このことは、両抗体の同一の特異性を立証している。
【０１６２】
抗体１０３／５１及びマウス抗体５８／４７−６９の刺激が、本明細書に記載したＣＦＲ−１アイソフォームへの結合により仲介されることを確認するため、細胞を対照ベクターｐＨＯＯＫ−２及びＣＦＲ−１アンチセンスベクターでトランスフェクトし、ＭＴＴアッセイにおいてトランスフェクトした細胞を試験した。トランスフェクションの陽性対照として、細胞をまた、ｐＨＯＯＫ−２−ｌａｃＺベクターでもトランスフェクトし、続いてβ−ガラクトシダーゼ染色した（データは示されていない）。非トランスフェクト細胞及び対照ベクターｐＨＯＯＫ−２でトランスフェクトした細胞において、匹敵する刺激が観察されると仮定すれば、トランスフェクション手法による両抗体の刺激効果の減少を排除することが可能である。対照的に、ＣＦＲ−１アンチセンスベクターでトランスフェクトした細胞は減少した刺激を明らかに示した（図７Ｃ）。
【０１６３】
最後に、抗体１０３／５１による刺激が、本明細書に記載したＣＦＲ−１アイソフォーム以外の受容体によっては仲介されないことを示すため、細胞株２３１３２でＭＴＴ刺激アッセイを実施し、それを、このアイソフォームを発現しない肺癌腫細胞株Ｃｏｌｏ−６９９及びＥＰＬＣ−２７２Ｈと比較した。細胞株２３１３２は上に記載したように刺激されるが、２つの肺癌腫細胞株は抗体１０３／５１によるいかなる刺激も示さず（図７Ｄ）、免疫組織化学的で観察された結果を立証している。
【０１６４】
実施例３
ＰＡＭ−１により認識される抗原は、癌性及び前癌性細胞上で特異的に発現される
悪性組織上での、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１アイソフォームの高度に特異的な発現をさらに研究する及び例示するため、最も頻繁に発生する癌腫の５〜１３の異なったケースについて、免疫組織化学的に試験した。ＰＡＭ−１の反応性を、すべての増殖している細胞の核に局在する、Ｋｉ６７タンパク質の発現と比較した。このタンパク質の機能はまだ知られていないが(Endl and Gerdes, Exp. Cell Res. 257:231-237 (2000)) 、それは増殖研究のための標準マーカーとして最も広範に使用されている(Scholzen and Gerdes, J. Cell. Physiol. 182:311-322 (2000); 及びBrown and Gatter, Histopathology 40:2-11 (2002)) 。染色結果は表２に要約されている。
【０１６５】
【表５】
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【０１６６】
ひとまとめにして考えると、ＰＡＭ−１は、全ての癌腫に対して広範で、強くそして均質な染色を示すが、Ｋｉ６７は全ての癌腫では見いだせず、ほとんどのケースで弱い発現のみを示し、ＰＡＭ−１とは対照的に、非均質に分布していた（表２）。肝臓（ＨＣＣ）の腺癌は全て陰性であり、前立腺、肺及び乳房の浸潤性小葉癌腫の、いくつかのケースでのみ、Ｋｉ６７に対して陽性である。これらのデータはまた、ＰＡＭ−１により認識されるＣＦＲ−１アイソフォームが、ほとんどの試験された癌腫上で特異的に発現されていることを立証している。
【０１６７】
正常及び腫瘍組織におけるＣＦＲ−１の遺伝子発現
ＰＡＭ−１抗体は、悪性細胞上に特異的に見いだされる、本明細書に記載したＣＦＲ−１のアイソフォーム上のＮ−連結炭水化物残基と反応する。非悪性細胞に対するＰＡＭ−１結合の欠如は、それ故、正常細胞上の受容体の非発現かまたは、悪性細胞上に見いだされるものとは異なっているＣＦＲ−１の翻訳後修飾、の結果であることが可能である。我々は、このことを分子レベルで調べた。非悪性及び癌性胃組織のＣＦＲ−１  ｍＲＮＡを、半定量的ＲＴ−ＰＣＲを使用して試験した。ＲＴ−ＰＣＲ法は、内部対照として、構成的に発現される「ハウスキーピング遺伝子」ＧＡＰＤＨを使用することにより、規格化した。正常胃組織と比較して、ＣＦＲ−１の増加した発現レベルが胃腫瘍組織で検出できた。このことは、悪性細胞上の抗体ＰＡＭ−１により検出されたＣＦＲ−１は、特異的過剰発現そしておそらくＣＦＲ−１の転写後に修飾されたアイソフォームであろうことを示している。
【０１６８】
前悪性組織上のＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１アイソフォームの発現
ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１アイソフォームは、Ｈ．ピロリ誘発胃炎及び胃異形成のような胃癌前駆型病変で発現され、発現のレベルは悪性度の増大とともに増加するようである。この観察を明らかにする及び改善するため、及び増殖マーカーＫｉ６７との比較を得るため、多様な他の前駆型病変で、追加の免疫組織化学的実験を実施した。以下に記載した、結腸、食道、頚部及び気管支癌腫及び対応する増殖帯域からの前駆型病変の実例は、ＰＡＭ−１抗原の特異的発現を示した。データは表３に要約されている。
【０１６９】
【表６】
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【０１７０】
腺腫−癌腫続発（ｓｅｑｕｅｎｃｅ）
頻繁に発生する新生物に属する、結腸の悪性変化及び結果として生じる癌腫は、しばしば高い死亡率が付随する。結腸癌腫の形成は多工程プロセスであり、それはいわゆる腺腫−癌腫続発をさかのぼって調べることができる。全ての腺腫性病変は、上皮増殖性変化の結果として生じ、そして腺腫が浸潤性結腸直腸腺癌の前駆型病変であるという強い証拠がある(Cummings, Semin. Gastrointest. Dis. 11:229-237 (2000); Scheiden et al., Int. J. Colorectal Dis. 15:29-34 (2000); 及び Wehrmann and Fruhmorgen, MMW Fortschr. Med. 142:26-29 (2000)) 。結腸直腸発癌は、それ自体、前癌性病変におけるＰＡＭ−１抗体の反応パターンをより詳細に調べるための理想的な機会を提供する。それ故、追加の免疫組織化学的染色を、異なった型の粘膜及び上皮に対して実施した。上で指摘したように、ＰＡＭ−１抗体は、Ｈ．ピロリ関連慢性活性胃炎、ハイグレード異形成及び胃腺癌と反応する。我々はまた、ＰＡＭ−１抗体が、胃発癌における前癌性段階である、萎縮性胃炎及び腸型化生を染色することを決定した。非炎症性結腸粘膜は、反応を示さなかった。ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームの増加した発現が、腺癌へ変性するより高い危険性を有する、結腸の腺腫に見出された。ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームの発現が、管状及び絨毛状腺腫の両方、特に増殖帯域で見られた。
【０１７１】
上皮細胞の非定型変化から成る、潰瘍性結腸炎−関連異形成もまた、結腸直腸腺癌の発生に関与することが認識されている(Wong et al., Histopathology 37:108-114 (2000)) 。このハイグレード異形成、特に非定型上皮細胞において、ＰＡＭ−１抗体による明瞭な染色が観察された。
【０１７２】
最も強い染色は、胃粘膜のケースで得られた結果に続いて、結腸直腸腺癌で見出された。ここで、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームの発現は、Ｋｉ６７のパターンと相関した。
【０１７３】
バレット発癌
バレット食道は、長期にわたる胃食道逆流の合併症である。遠位扁平上皮性粘膜は、遷延性損傷への応答として、化生円柱上皮により置き換えられている。食道腺癌の発癌は、バレット化生からバレット異形成へと起こる(Spechler, Semin. Gastrointest. Dis. 7:51-60 (1996); Haggitt, Hum. Pathol. 25:982-933 (1994); Devesa et al, Cancer 83:2049-2053 (1998); 及び Spechler, Am. J. Med. 111 Suppl 8A:130-136 (2001)) 。
【０１７４】
バレット癌腫の増加する発生のため、バレット上皮上のＣＦＲ−１の発現を、ＰＡＭ−１抗体による免疫組織化学的染色を使用して調べた。ＰＡＭ−１による染色は、バレット化生の異形成円柱上皮における、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームの増加した発現を明らかにした。加えて、強い染色パターンが、バレット異形成、特に構築的及び細胞学的異常を有する細胞で観察された。後者は、食道の浸潤性腺癌（バレット癌腫）の前駆型とみなされており(Spechler, Am. J. Med. 11 Suppl 8 A: 130-136 (2001)) 、そしてＫｉ６７の発現と相関した。最も強い染色は、バレット癌腫で見出された。ＰＡＭ−１抗体は、噴門（中心）の癌腫に対する強い染色パターンを示したが、Ｋｉ６７は匹敵する様式では発現されていなかった。
【０１７５】
頚部新生物
構築的異常を有する頚部上皮で、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームの増加した発現も観察された。頚部扁平上皮細胞癌腫の前駆型は、頚部上皮内新生物グレードＩ、ＩＩ及びＩＩＩとして分類されている。穏和な異形成は、ＣＩＮ  Ｉから非浸潤性癌病変ＣＩＮ  ＩＩＩまで名付けられている(Arends et al., J. Clin. Pathol. 51:96-103 (1998)) 。頚部の前駆型病変（ＣＩＮ  Ｉ〜ＩＩＩ）及び浸潤性悪性腫瘍、扁平上皮細胞癌腫が、この研究に含まれている。
【０１７６】
正常上皮細胞は、ＰＡＭ−１抗体との反応を示さないが、一方、頚部新生物の異なった型について、ＰＡＭ−１抗体での増加した染色が注目された。染色パターンは、異なった細胞層における非定型細胞の出現及び基礎増殖帯域の広範化に従った。Ｋｉ６７の反応は、一般に、ＰＡＭ−１抗体の染色パターンと相関したが、染色はより弱かった。
【０１７７】
気管支発癌
肺の癌腫は、世界中で最も頻繁に発生している癌腫の一つである。最も共通の型は、扁平上皮細胞癌腫であり、それは喫煙の履歴と密接に相関している。喫煙者の気道において、扁平上皮化生及び異形成が普通に存在する。扁平上皮化生において、正常気管支線毛性上皮は、扁平上皮により置き換えられている。細胞学的攪乱及び重度の非定型性の発生により、扁平上皮異形成として知られている病変になる(Colby et al, Adv. Anat. Pathol. 5:205-212 (1998); 及び Franklin, J. Thorac. Imaging 15:3-12 (2000)) 。
【０１７８】
正常線毛性上皮では、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームの発現はないが、一方、ＰＡＭ−１抗体は気管支上皮の化生及び異形成と反応する。気管支の扁平上皮細胞化生は、発癌の最初の段階を表し、異形成と比較して、より低い強度の染色を示す。癌の予備的段階である異形成については、より強い染色が観察された。最も強い染色は再び、扁平上皮細胞癌腫で観察された。この研究における３つのケースの各々において、ＰＡＭ−１の染色は、Ｋｉ６７の反応パターンと相関した。
【０１７９】
増殖帯域
ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームの発現が、悪性増殖に特異的であり、そして正常増殖過程（例えば、組織の再生）には関与していないかどうかを調べるため、健康及び前悪性組織の異なった増殖領域を、ＰＡＭ−１及びＫｉ６７抗体で染色した。正常結腸粘膜の増殖帯域は、Ｋｉ６７については陽性であるが、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームの発現については陰性であることを観察した。同一の結果が正常頚部組織で見られた。ここで再び、Ｋｉ６７は増殖帯域の陽性染色を示し、一方、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームは発現されていない。対照的に、食道の腺癌についてのバレット食道前悪性型病変を定義する、非異形成腸型バレット化生は、Ｋｉ６７及びＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームの陽性発現を示す。このことは、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームは、健康な増殖細胞では発現されないことを明瞭に示している。
【０１８０】
前悪性型病変における、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームの発現についての要旨
前癌性病変についての免疫組織化学的データは、表３（前記）に要約されている。各入手可能な前駆型病変型の３から１５の異なったケースを試験した。一般に、抗体ＰＡＭ−１は、ほとんど全ての異なった前駆型に対して、明瞭な陽性及び均質な染色、そして加えて、悪性型のグレードで増加した発現レベルを示した。対照的に、増殖マーカーＫｉ６７は、癌腫（例えば、萎縮性胃炎、胃の管状腺癌及び気管支の扁平上皮化生）に対して類似の非均質発現を示し、そして健康な及び悪性組織の両方で発現されている。加えて、健康な組織の増殖帯域は、Ｋｉ６７については明瞭に陽性であるが、ＰＡＭ−１抗体により認識されるＣＦＲ−１のアイソフォームについては陰性であり、このＣＦＲ−１のアイソフォームと悪性型の関連を支持している。
【０１８１】
実施例４
断片化ＰＡＭ−１  ＩｇＭ抗体及び組換えＰＡＭ−１  ＩｇＧはアポトーシスを誘発する
アポトーシスは、ＤＮＡの断片化、細胞の縮み、及び小胞体の膨張、続いての細胞の細分化及び膜結合小胞及びアポトーシス小体の形成を通した、プログラムされた細胞死、細胞の自殺である。細胞死の生理学的形であるアポトーシスは、壊死の場合のように、炎症過程又は組織外傷の引き金を引くことなく、不必要な細胞の迅速でそしてきれいな除去を保証する。病理学的条件下、それはまた、癌前駆型細胞のような悪性細胞を除去するために使用される。細胞毒性Ｔリンパ球又はサイトカインのような、腫瘍壊死因子、グルココルチコイド及び抗体のような、非常に多様な刺激を通して引き金を引くことができる。それは、真核生物細胞の死の最も頻度の高い原因であり、胚発生、変態及び組織萎縮において発生する。ＮＧＦ／ＴＮＦファミリーのもののような、細胞表面上のアポトーシス性受容体は、主としてリンパ球上で発現されるが、多様な他の細胞型でも見出され、それ故にそれらは癌療法のためには適していない。特に、これらの受容体のリガンド及び抗体は、インビボ試験において肝臓損傷を導いた。それ故、アポトーシス性機能を有している腫瘍特異性受容体は特に重要である。
【０１８２】
ＰＡＭ−１切断
無傷の５量体ＰＡＭ−１抗体をＩｇＭ抗体断片へ切断するために、ペプシン消化を使用した。切断後、生じた断片を、非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングにより分析した。ブロッティング後、無傷の抗体は、無傷の抗体（単量体形及び軽鎖）に対応する特徴的なバンドを示した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥでは、約９００ｋＤａの無傷の５量体ＩｇＭは、スタッキングゲル内へ移動することは不可能であった。１０〜１５分のペプシンでの処理後、５量体形は単量体、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ及び軽鎖断片へ完全に消化され、それらは分子量により明瞭に同定できた（図１１Ａ及び１１Ｂ）。消化後は、ＰＡＭ−１の５量体形は残っていなかった。同一の実験を無関係ヒトＩｇＭ抗体で行うと、類似の結果を導いた（データは示されていない）。無関係断片化ヒトＩｇＭは、以下の実験において、陰性対照として使用した。
【０１８３】
断片化ＰＡＭ−１抗体は、ヒト胃癌腫及び前駆体のパラフィン切片に対する腫瘍結合について試験し、無傷のＰＡＭ−１と比較した。図１２Ａ及び１２Ｂに図示したように、両方の抗体とも、腫瘍及び前駆型細胞に対して類似の結合パターンを所有する。
【０１８４】
ＰＡＭ−１インビトロ活性
断片化ＰＡＭ−１のインビトロ活性を定義するため、比色ミトコンドリアヒドロキシラーゼアッセイ（ＭＴＴ）を使用した。細胞株２３１３２／８７と、種々の濃度の断片化ＰＡＭ−１をインキュベートし、断片化ＰＡＭ−１抗体が、濃度依存性様式で細胞増殖を阻害することを見出した（図１３Ａ）。対照的に、異なった濃度の無関係断片化ＩｇＭで処理された細胞の増殖は影響されない。
【０１８５】
腫瘍細胞増殖に対する、断片化ＰＡＭ−１抗体の阻害効果をさらに調べるため、アポトーシス特異的Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳ  Ｋｉｔを使用した。図１３Ｂに図示されている実験は、断片化ＰＡＭ−１抗体が、インビトロで、胃癌腫細胞におけるアポトーシスを誘発することにより細胞増殖を阻害することを明らかに示している。
【０１８６】
断片化ＰＡＭ−１インビボアッセイ
インビボにおいて、腫瘍細胞増殖に対する断片化ＰＡＭ−１の効果を決定するため、ヌードマウス−ヒト胃癌腫細胞システムを使用した。ヒト胃癌腫細胞株２３１３２に由来する、２ｘ１０６細胞の濃度を、ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスに、腹腔内（ｉ．ｐ．）で注射した。腫瘍細胞の接種４日後、ＰＢＳに希釈した２００μｇの断片化ＰＡＭ−１抗体をｉ．ｐ．で注射した。対照マウスには、同量の無関係断片化ヒトＩｇＭを与えた。研究継続の間、腫瘍増殖を顕微鏡的に管理した。２３日後、マウスを殺した。対照マウスはｉ．ｐ．第５日目から測定可能な腫瘍を発生させた。第２３日目まで腫瘍サイズの急な増加が観察された。比較して、断片化ＰＡＭ−１抗体で処理したマウスは、第１０日目の前には検出可能な腫瘍を発生しなかった。さらに、実験過程の間に発生した腫瘍は、増殖及びサイズにおいて著しい減少を示した（図１４Ａ）。
【０１８７】
研究はまた、腫瘍の隠れた広がり及び他の変化についての、マウスの器官及び組織の点検も含んでいた。二つの追加の実験において、マウスにｉ．ｐ．で胃癌を接種し、断片化ＰＡＭ−１又は対照抗体を与えた。２３日後、マウスの腫瘍増殖を点検した。対照群は、腹膜、隔膜、腎臓、胃、腸、肝臓および脾臓（脾臓は全てのケースにおいて肥大していた）内へ広がった、拡大腫瘍を示した。対照的に、断片化ＰＡＭ−１抗体で処理したマウスは、減少した腫瘍の拡大を示し、加えて、肥大した脾臓は観察できなかった。両方の実験において、腫瘍塊の総重量は、ＰＡＭ−１抗体により著しく減少した（図１４Ｂ及び１４Ｃ）。
【０１８８】
腫瘍の形態学的分析は、断片化ＰＡＭ−１抗体で処理したマウスからの腫瘍が、減少したサイズのみでなく、腫瘍退行、浸潤及び高い数の核濃縮細胞のような増殖パターンにおける退行性変化も示したことを明らかにした（図１５Ａ及び１５Ｄ）。アポトーシス活性についての腫瘍のインサイツ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）染色は、断片化ＰＡＭ−１抗体で処理したマウスからの腫瘍が、対照マウスと比較して、有意により高い数のアポトーシスを起こしている腫瘍細胞を有していることを示した（図１５Ｃ及び１５Ｆ）。図１５Ｂ及び１５Ｅは、アポトーシス陽性対照により免疫ペルオキシダーゼ染色を示しており、そこでは全ての細胞核が染色されている。
【０１８９】
組換えＰＡＭ−１インビボ活性
インビボでの、腫瘍細胞増殖に対する、組換えＰＡＭ−１  ＩｇＧ抗体の効果を決定するため、マウス−ヒト胃癌腫及びマウス−ヒト膵臓癌腫細胞システムを使用した。各システムにおいて、第０日目に、６〜８週齢のＣＢ−１７／ＩｃｒＨａｎＨｓｄ−ｓｃｉｄマウスに癌腫細胞を注射した（群当たりｎ＝１０）。胃癌腫細胞の場合、２．０ｘ１０６  ２３１３２／８７細胞を第０日目に皮下（ｓ．ｃ．）で注射し、膵臓癌腫細胞の場合、１．５ｘ１０６  ＢＸＰＣ−３細胞を第０日目にｓ．ｃ．で注射した。各々の試験及び対照群の各マウスには、２００μｇのＰＡＭ−１  ＩｇＧ抗体又は対照ＩｇＧ抗体（Ｃｈｒｏｍｐｕｒｅ  ヒトＩｇＧ）を、第１、３、５、７及び９日目に注射した。
【０１９０】
胃癌に対するＰＡＭ−１  ＩｇＧ抗体の活性を試験するため、マウスを第１４日目に殺し、対照及び試験群間の腫瘍重量及び容量を比較した。図１９Ａ及び１９Ｂから明らかなように、ＰＡＭ−１  ＩｇＧ抗体の投与は、対照群と比較した場合、胃癌腫瘍容量（ｐ＝０．０００７）及び腫瘍重量（ｐ＝０．００３６）の有意な減少を生じた。
【０１９１】
同様に、膵臓癌に対するＰＡＭ−１  ＩｇＧ抗体の活性を試験するため、マウスを第２７日目に殺し、対照及び試験群間の腫瘍重量及び容量を比較した。図２０Ａ及び２０Ｂから明らかなように、ＰＡＭ−１  ＩｇＧ抗体の投与は、対照群と比較した場合、膵臓癌腫瘍容量（ｐ＝０．０２９６）及び腫瘍重量（ｐ＝０．１５４）の有意な減少を生じた。ＰＡＭ−１誘発腫瘍退行もまた、膵臓癌細胞、及びＰＡＭ−１か又は対照ＩｇＧ抗体を注射したマウスから得られた組織を、ケラチンについて又はヘマトキシリン−エオシンで染色することにより検証した。対照（図２１Ａ）と比較した場合に図２１Ｃで見られたケラチン染色における減少は、ＰＡＭ−１抗体を受けたマウスにおける腫瘍細胞死を示しており、同様に、ＰＡＭ−１  ＩｇＧ抗体を受けたマウスから得られた腫瘍組織にはアポトーシス性細胞が存在するが（図２１Ｄにおいて矢印により示されている）、対照組織（図２１Ｂ）には存在しない。
【０１９２】
実施例５
新生物のインビボイメージング
胃癌のような新生物を有していると疑われた患者に、本明細書に記載した方法を使用して、放射性ヨウ素化ＰＡＭ−１抗体又はその断片、又は別の腫瘍特異的ポリペプチド、及び放射性標識非特異的抗体を投与することができる。イメージングのための腫瘍の位置限定はGoldenberg et al. (N. Engl. J. Med., 298:1384, 1978) の方法に従って達成することができる。Ｉ．Ｖ．により、１３１Ｉ−ＰＡＭ−１抗体、及びＴｃ−９９ｍ−標識非特異的抗体の溶液の等量注入液を患者に投与することができる。試薬Ｉ．Ｖ．の投与に先立って、患者は典型的には、抗体調製液（非標識）に対する又は抗体調製液のような同一種の抗体に対する過敏性を前もって試験する。１３１Ｉの甲状腺取り込みを阻止するため、放射性ヨウ素化抗体の注射１日前又はそれ以前の日から開始し、１日２又は３回、５滴の用量でルゴール液を経口で投与する。多様な体の領域の画像及び投影図を、標識された調製液を注射して４、８及び２４時間後に撮ることができる。もし存在するならば、新生物（例えば、胃腺癌）が、DeLand et al. (Cancer Res. 40:3046, 1980) により、１３１Ｉ標識抗ＣＥＡ抗体及びＴｃ−９９ｍ−標識ヒト血清アルブミンのために記載されているように、１３１ＩのカウントからＴｃ−９９ｍのカウントを差し引いた、ガンマカメライメージングにより検出される。注射８時間後、イメージングを通常クリアーし、２４時間のスキャンに至るまで時間とともに向上させる。
【０１９３】
実施例６
標識抗体混合物を使用する新生物の治療
新生物を有すると診断された患者、例えば、胃腺癌を有すると診断された患者は、以下のようにＰＡＭ−１抗体又はその断片で治療することができる。ルゴール溶液を、例えば、１日３回７滴、患者に投与することができる。続いて、１３１Ｉ−ＰＡＭ−１抗体の治療量を患者に投与することができる。例えば、５０ｍＣｉの１３１Ｉ用量を、３週間にわたって毎週与えることができ、血液学的毒性により治療を中断するまで、個体に基づいて調節された間隔（例えば、３ヶ月毎）で繰り返す。正確な治療計画は一般に主治医又は治療を監督する人が決定する。放射性ヨウ素化抗体は、５０ｍｌの無菌生理学的食塩水中、ゆっくりしたＩ．Ｖ．注入で投与することができる。３回目の注射投与量の後、原発性腫瘍のサイズの減少及び転移に注目する（特に、第二の治療サイクル後、又は治療開始から１０週後）。
【０１９４】
実施例７
コンジュゲートした抗体を使用する治療
新生物を有すると診断された患者、例えば、転移した胃癌を有する患者は、１３１Ｉ−ＰＡＭ−１、１０Ｂ−ＰＡＭ−１、及びＴｃ−９９ｍ標識非特異的抗体の溶液で治療することができる。７０ｋｇ患者体重に基づいた１００ｍＣｉの１３１Ｉ活性を提供するのに十分な量の１３１Ｉ−ＰＡＭ−１抗体（５０ｍｌの無菌生理学的食塩水中）を患者に投与することができる。この投与量は、抗体分子当たり、４０〜８０ホウ素原子及び８〜１６ホウ素−１０原子を有する３．３ｍｇの抗体に等しい。新生物は最初に、実施例５の手法を使用して正確に位置限定する。加えて、前の実施例におけるように、ルゴール溶液を患者へ連続的に投与せねばならない。熱中性子のよく平行化されたビームは、決められた腫瘍位置に焦点を当てることができる。８〜２０分の時間に搬送される、４００〜８００ラドの熱中性子ビーム線量での照射が各腫瘍部位にもたらされ、同時外部照射療法が指示されていない限り、個体に基づいて調節された間隔で、腫瘍位置発見抗体の投与（放射性標識と又はなしで）とともに随意に繰り返すが、通常３２００ラドの総線量は超えないようにする。もし望むなら、この治療に加えて、化学療法剤のような抗腫瘍剤もまた、患者へ投与することができる。
【０１９５】
他の態様
本発明を、その特定の態様に関連して記載してきたが、さらなる修飾が可能であり、そして本出願は本発明の原理に一般に従う本発明のいずれもの変形、使用又は適用に及ぶことが意図されており、そして本発明が関与する当該技術分野内の、周知の又は慣用的な実施の範囲内にある本開示からのこうした離脱を含み、そして先に示した必須の特色へ適用することができることが理解されるであろう。
【０１９６】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＩＢ０３／０１３３５及びＰＣＴ／ＩＢ０３／０３４８７号、米国特許出願第１０／７６４，７３０号、米国特許第５，３６７，０６０、５，６４１，８６９、６，２０７，６４６、６，３８４，０１８号、及び本明細書で引用した全ての他の参照文献、特許及び特許出願は、その全体が本明細書において援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１９７】
【図１】図１Ａは、タンパク質ゲルの画像であり、抗体１０３／５１により認識される抗原を示している。胃癌腫細胞株２３１３２からの膜分画を、クロマトグラフィー的手法で精製し、全膜分画（レーン２）又は精製タンパク質（レーン３）をクーマシーで染色した（レーン１：１０ｋＤａラダー）。細胞株２３１３２の膜分画に対する抗体１０３／５１でのウェスタンブロット分析は、およそ１３０ｋＤの分子質量を有するタンパク質との一つの反応を示した（レーン４）。処理された膜抽出物の特異性は、１０３／５１によるウェスタンブロッティングにより点検した（レーン５）。矢印により指し示されているタンパク質バンドを分取用ゲルから切り出し、ＭＡＬＤＩ質量マッピング及びマウスの免疫化に使用した。
【０１９８】
図１Ｂは、高分解能ＭＡＬＤＩペプチド質量マッピングによる、１３０ｋＤａゲル分離タンパク質の同定のスペクトログラムである。「＊」で表示したピークは、５０ｐｐｍより良好な質量精度で、Ｕ２８８１１ヒトシステイン−リッチ線維芽細胞増殖因子受容体（ＣＦＲ−１）のトリプシンペプチドの計算質量と一致した。「Ｔ」で表示したピークは、トリプシン自己分解生成物に相当している。挿入図は、ｍ／ｚ１７０７．８１８のピークの質量分解能（ｍ／Δｍ＝９０００）を示している。
【図２】図２Ａ〜２Ｆは、抗体１０３／５１染色及び生細胞染色に対する、ＣＦＲ−１アンチセンストランスフェクションの影響を示している画像である（倍率２００ｘ）。図２Ａは、対照ベクターで過渡的にトランスフェクトした細胞株２３１３２を示しており、アセトン固定後、抗体１０３／５１による強い染色を示している。図２Ｂは、ＣＦＲ−１アンチセンスベクターで過渡的にトランスフェクトした細胞における、減少した染色を示している。免疫組織化学的染色におけるバックグラウンド染色を減少させるため、生細胞染色を、細胞株２３１３２で実施した。明瞭な膜染色が見られる（図２Ｃ）。図２Ｄは、二次抗体のみを使用する、細胞株２３１３２に対する対照生細胞染色を示している。図２Ｅは、抗体１０３／５１による、細胞株Ｃｏｌｏ−６９９に対する生細胞染色の欠如を示しており、それはこの細胞株がＣＦＲ−１の発現について陰性であることを指摘している。図２Ｆは、細胞株Ｃｏｌｏ−６９９に対して、二次抗体のみを使用する、対照生細胞染色を示している。
【０１９９】
図２Ｇは、抗体ＣｈｒｏｍｏｐｕｒｅヒトＩｇＭ（灰色）及び１０３／５１による、細胞株２３１３２のフローサイトメトリー結果のグラフである。
【０２００】
図２Ｈは、対照ベクターｐＨＯＯＫ−２でトランスフェクトした細胞の、トランスフェクション４８時間後のフローサイトメトリーによる分析のグラフである。
【０２０１】
図２Ｉは、ＣＦＲ−１アンチセンスベクターでトランスフェクトした細胞のグラフであり、抗体１０３／５１の結合の明瞭な減少を示している。
【図３】図３Ａ及び３Ｂは、抗体１０３／５１での染色に対する、脱グリコシル化の影響を示している画像である。図３Ａは、脱グリコシル化緩衝液でインキュベートした２３１３２細胞を示しており、アセトン固定したものは抗体１０３／５１で強い染色を示し、そして図３Ｂは、Ｎ−グリコシダーゼで処理し、続いてアセトン固定した２３１３２細胞を示している。Ｎ−グリコシダーゼ処理の結果として、染色の減少が明白である。
【０２０２】
図３Ｃは、抗体１０３／５１との反応について、細胞株２３１３２の膜抽出物の脱グリコシル化の影響を示しているウェスタンブロットである。脱グリコシル化緩衝液（緩衝液）と１６時間インキュベートした抽出物は、非処理抽出物（対照）と比較して、染色においては相違を示さなかった。対照的に、Ｎ−グリコシダーゼとのインキュベーションは、染色における明瞭な減少を導いた（Ｎ−グリコ）。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、胃腺癌細胞に対する、マウス抗体５８／４７−６９及び１０３／５１での免疫組織化学的染色を示している一連の画像である。抗体１０３／５１及びマウス抗体５８／４７−６９の同一特異性を示すため、びらん型胃腺癌を、ヘマトキシリン−エオシン（図４Ａ）、抗体１０３／５１（図４Ｂ）及び５８／４７−６９（図４Ｃ）、及び陽性対照として抗サイトケラチン１８で染色した。図４Ｃ及び図４Ｄにおける同一の染色は、同一の特異性を指摘している（矢印は腫瘍細胞を指している）。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、異なった胃組織に対する、抗体１０３／５１の免疫組織化学的染色を示している一連の画像である。胃組織の凍結切片を、ヘマトキシリン−エオシン（「ＨＥ］）、抗体Ｋｉ６７（増殖している細胞を示すため）及び抗体１０３／５１で染色した。倍率は１００ｘである。図５Ａは、炎症を有する胃組織を示している。図５Ｂは、Ｈ．ピロリ誘発胃炎（挿入図は印を付けた腺のより高い倍率の像を示している）を示している。図５Ｃは異形成を示し、図５Ｄは胃癌細胞を示している。
【図６】図６Ａ〜６Ｆは、異なった癌性及び正常組織に対する、抗体１０３／５１での免疫組織化学的染色を示している一連の画像である。以下の組織に対する抗体１０３／５１の染色が示されている：ファーター膨大部の癌腫（図６Ａ）、乳癌浸潤性小葉（図６Ｂ）、結腸の腺癌及び結腸の正常杯細胞上皮細胞の無染色（図６Ｃ）、肝細胞癌腫（図６Ｄ）、副腎の球状及び束状帯（図６Ｅ）、腎臓の集合管−ゴルジ装置（矢印）の特異的染色（図６Ｆ）。図６Ａ〜６Ｄ中の矢印は、腫瘍細胞を指し示し、図６Ｃ中の矢印は杯細胞を指しており、図６Ｆ中の矢印はゴルジ装置を指し示している（倍率４００ｘ（図６Ａ〜６Ｅ）及び２００ｘ（図６Ｆ））。
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、比色ＭＴＴアッセイにより決定された、抗体１０３／５１及び５８／４７−６９による細胞株の刺激を示している、一連のグラフである。図７Ａは、精製抗体１０３／５１での滴定のグラフであり、４μｇ／ｍｌまでの刺激の増加を示している。より高い濃度は、より高い刺激を導かなかった（ｃ＝対照、抗体が加えられていない）。図７Ｂは、等濃度（４μｇ／ｍｌ）の精製抗体１０３／５１及び５８／４７−６９でのＭＴＴアッセイの結果のグラフであり、接種１又は２日後の、腫瘍細胞２３１３２の匹敵する刺激を示している（対照１＝ＣｈｒｏｍｏｐｕｒｅヒトＩｇＭ、対照２＝無関係マウスＩｇＭ）。図７Ｃは、細胞株２３１３２を対照ベクターｐＨＯＯＫ−２又はＣＦＲ−１アンチセンスベクターで過渡的にトランスフェクトし、２４時間インキュベートし、４μｇ／ｍｌの精製抗体１０３／５１で刺激して２４時間後、ＭＴＴアッセイで試験した実験の結果のグラフである。未トランスフェクト細胞もまた、対照としてインキュベートした（対照、無関係ヒトＩｇＭ）。図７Ｄは、異なった上皮腫瘍細胞株に対する、等濃度（４μｇ／ｍｌ）の抗体１０３／５１を用いたＭＴＴアッセイの結果のグラフである。このグラフは、抗体添加後２４時間の細胞２３１３２のみにおける刺激を示す。ＰＡＭ−１抗体により認識される抗原を発現していない細胞株（Ｃｏｌｏ−６９９及びＥＰＬＣ−２７２Ｈ）は、抗体１０３／５１によるいかなる刺激も示さない。
【図８Ａ】図８Ａ及び８Ｂは、マウス抗体ＮＭ５８−４９／６９の重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）である。Ｊ−遺伝子及びＤ−遺伝子、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が、図８Ｂに示されている。
【図８Ｂ】図８Ａ及び８Ｂは、マウス抗体ＮＭ５８−４９／６９の重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号１）及びアミノ酸配列（配列番号２）である。Ｊ−遺伝子及びＤ−遺伝子、ならびに相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が、図８Ｂに示されている。
【図９Ａ】図９Ａ及び９Ｂは、マウス抗体ＮＭ５８−４９／６９の軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号３）及びアミノ酸配列（配列番号４）である。相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が、図９Ｂに示されている。
【図９Ｂ】図９Ａ及び９Ｂは、マウス抗体ＮＭ５８−４９／６９の軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号３）及びアミノ酸配列（配列番号４）である。相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が、図９Ｂに示されている。
【図１０】図１０−１〜１０−５は、細胞株２３１３２により発現された、ＣＦＲ−１の新規アイソフォームの核酸配列（配列番号５）及びアミノ酸配列（配列番号６）である。
【図１１】図１１Ａ及び１１Ｂは、抗体ＰＡＭ−１の断片を示している、一連のクーマシーブルー染色ＳＤＳゲル及びウェスタンブロットである。抗体断片を得るため、無傷のＰＡＭ−１抗体をペプシンで消化した。ＰＡＭ−１抗体をペプシンで消化すると、抗体断片を得た。図１１Ａは、無傷のＰＡＭ−１抗体（レーン１）及びペプシン処理１０分（レーン２）及び１５分（レーン３）後の断片化抗体の、クーマシーブルー染色ＳＤＳゲルを示している。図１１Ｂは、無傷（レーン１）及び断片化（レーン２及び３）ＰＡＭ−１抗体の特異的タンパク質バンドを示している。
【図１２】図１２Ａ及び１２Ｂは、前悪性及び悪性組織に対する、無傷の及び断片化ＰＡＭ−１抗体の免疫組織化学的染色を示している一連の画像である。パラフィン切片を、陽性対照（抗サイトケラチン８）、陰性対照として無関係断片化ＩｇＭ、無傷のＰＡＭ−１抗体又は断片化ＰＡＭ−１抗体で染色した。図１２Ａは、結腸の絨毛腺腫（結腸癌腫の前駆型病変）を示し；図１２Ｂは、胃腺癌を示している。本来の倍率は１００ｘであった。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、インビトロにおける、断片化ＰＡＭ−１抗体の機能性分析を示しているグラフである。胃癌細胞株２３１３２／８７の増殖に対する、断片化ＰＡＭ−１抗体処理の結果を、ＭＴＴ増殖アッセイ（図１３Ａ）及びＣｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ＥＬＩＳＡＰＬＵＳアポトーシスアッセイ（図１３Ｂ）により測定した。図１３Ａは、断片化ＰＡＭ−１抗体による、細胞増殖の濃度依存性阻害を示している。図１３Ｂは、ＰＡＭ−１の断片化形による、処理２４時間後の抗体誘発アポトーシスを示している（対照１：抗体を加えていない；対照２：無関係断片化ＩｇＭを同様な濃度で加えた）。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、ＮＭＲＩｎｕ／ｎｕマウスにおいて、断片化ＰＡＭ−１抗体で処理したヒト癌腫細胞のインビボ実験の結果を示している一連のグラフである。図１４Ａは、２３日の期間にわたって、ＰＡＭ−１抗体の断片化形又は無関係断片化ＩｇＭ（対照群）で処理されたマウスの、腫瘍サイズ発育を示している。図１４Ｂ及び１４Ｃは、２３日後、断片化ＰＡＭ−１抗体で処理されたマウスにおいては、抗体減少腫瘍質量が測定可能であることを示している。無関係断片化ＩｇＭで処理されたマウスの群が、全ての実験において対照として働いた。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｆは、アポトーシスのためのクレノウＦｒａｇＥＬ  ＤＮＡ断片化キットによる、パラフィン包埋腫瘍切片の免疫ペルオキシダーゼ染色を示している一連の画像である。切片は、無関係断片化ＩｇＭ（図１５Ａ〜１５Ｃ）か又は断片化ＰＡＭ−１抗体（図１５Ｄ〜Ｆ）で処理したマウスから得られた。図１５Ａ及び１５Ｄは、ＨＥ染色を示し；図１５Ｂ及び１５Ｅは、アポトーシス陽性対照による免疫ペルオキシダーゼ染色を示し、全ての細胞核が染色される；そして図１５Ｃ及び１５Ｆは、ＤＮＡ断片化キットによる免疫ペルオキシダーゼ染色を示し、アポトーシス性細胞の核のみが染色される（本来の倍率、ｘ１００／ｘ２００）。
【図１６】図１６は、細胞株２３１３２から得られたＣＦＲ−１のアミノ酸配列（配列番号６）とＣＦＲ−１及びＭＧ１６０の公開されている配列（配列番号７及び８）の比較である。これらの実験的比較は、細胞株２３１３２から得られたＣＦＲ−１タンパク質は、以前に知られていたＣＦＲ−１配列とは同一ではないが、それらの新規アイソフォームを表すことを主として示している。配列間の相違には下線が引かれている。
【図１７】図１７は、ヒトＰＡＭ−１抗体（クローン１０３／５１）の重鎖の可変領域の核酸配列（配列番号２６）及びアミノ酸配列（配列番号２８）である。相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が指し示されている。
【図１８】図１８は、ヒトＰＡＭ−１抗体（クローン１０３／５１）の軽鎖の可変領域の核酸配列（配列番号２７）及びアミノ酸配列（配列番号２９）である。相補性決定領域（ＣＤＲ）１〜３が指し示されている。
【図１９】図１９Ａ及び１９Ｂは、ＰＡＭ−１組換えＩｇＧ抗体が、マウスモデルを使用するインビボにおいて、胃癌の腫瘍容量（図１９Ａ）及び腫瘍重量（図１９Ｂ）の両方の減少を誘発することを示している、一連のグラフである。対照ＩｇＧ抗体（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅヒトＩｇＧ；「ＣＰ  ＩｇＧ」）を受けているマウスは、黒丸により指し示されており、ＰＡＭ−１  Ａｂを受けているマウスは、白丸により指し示されている。
【図２０】図２０Ａ及び２０Ｂは、ＰＡＭ−１組換えＩｇＧ抗体が、マウスモデルを使用するインビボにおいて、膵臓癌の腫瘍容量（図２０Ａ）及び腫瘍重量（図２０Ｂ）の両方の減少を誘発することを示している、一連のグラフである。対照ＩｇＧ抗体（ＣｈｒｏｍｐｕｒｅヒトＩｇＧ；「ＣＰ  ＩｇＧ」）を受けているマウスは、黒丸により指し示されており、ＰＡＭ−１  Ａｂを受けているマウスは、白丸により指し示されている。
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｄは、対照ＩｇＧ抗体（図２１Ａ及び２１Ｂ）かまたはＰＡＭ−１  ＩｇＧ（図２１Ｃ及び２１Ｄ）を注射したマウスにおける膵臓癌のケラチン染色（図２１Ａ及び２１Ｃ）及びヘマトキシリン−エオシン（「Ｈ＆Ｅ」）染色（図２１Ｂ及び２１Ｄ）を示している画像である。図２１Ｃにおけるケラチン染色の減少は、腫瘍細胞死を指摘しており、そしてアポトーシス性細胞は、図２１Ｄにおいて矢印で指し示されている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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