(57)【要約】  改良された水溶性を有するGnRHの拮抗性ペプチドが開示される。これらのペプチドは、0.5 ng/ml以下の化学的去勢レベルまで、in vivoでの血清テストステロンレベルを抑制することができる。少なくとも、典型的には、持続放出製剤中で用いられるレベルのGnRHアンタゴニストを含む、安定な、濾過滅菌可能な、ゲル化しない溶液も開示され、同時に、分散相への酸の添加を含む、該分散相を含むポリマー中での、GnRHアンタゴニストの溶解性を増加させる方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Pro9, DAla10 NH2を有する性腺刺激ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト。
【請求項２】
式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有する性腺刺激ホルモン放出ホルモンアンタゴニスト。
【請求項３】
請求項２に記載のアンタゴニストと、製薬上許容される担体または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項４】
未処理の哺乳動物と比較して、哺乳動物におけるテストステロンレベルの抑制を達成するのに十分な量の請求項１〜３のいずれか1項に記載のアンタゴニストまたは組成物を、該哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物におけるテストステロンレベルを抑制する方法。
【請求項５】
前記アンタゴニストまたは組成物を皮下投与する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
性腺刺激ホルモン放出ホルモンに関連する障害に罹患する哺乳動物において該ホルモンを拮抗させる方法であって、AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2であるGnRHアンタゴニストを含む組成物の有効量を該哺乳動物に投与することを含む、前記方法。
【請求項８】
前記障害が、テストステロン依存的障害、良性の前立腺肥大または前立腺癌である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物を皮下投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記哺乳動物がヒトである、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物に対するGnRHアンタゴニストを含む組成物の有効量で雄を処理することを含む、雄の生殖能力を可逆的に抑制する方法であって、該アンタゴニストがAcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2であり、雄の生殖能力が、該アンタゴニストを用いた処理の停止後に回復する、前記方法。
【請求項１２】
前記組成物中のアンタゴニストの量が、1日あたり約0.09〜2.5 mg/kg体重である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物中のアンタゴニストの量が、1日あたり約0.09 mg/kg体重である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有する性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)アンタゴニストおよび酸付加物を含む分散相製剤のための組成物。
【請求項１５】
GnRH類似体が凍結乾燥されたGnRHアンタゴニストである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記酸付加物が有機もしくは無機酸付加物またはその組合せである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１７】
前記有機または無機酸付加物が5.0以下のpKaを有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記有機酸付加物が、氷酢酸、乳酸、グリコール酸、グリセリン酸、安息香酸、プロパン酸、メタンスルホン酸、およびメシチリン酸またはこれらの酸の組合せからなる群より選択される、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
前記無機酸付加物がHClである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記組成物が生体適合性であり、かつ生分解性のポリマーをさらに含む、請求項１４に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ポリマーが乳酸のホモポリマーまたは乳酸とグリコール酸のコポリマーである、請求項１４に記載の分散相製剤。
【請求項２２】
分散相を含むポリマー中での、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有する性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)アンタゴニストの溶解性を増加させる方法であって、
容器中に前記GnRHアンタゴニストを分散させること；
第1の有機溶媒を前記GnRHアンタゴニストに添加して、第1の有機混合物を形成させること；
第2の有機溶媒中に一定量のポリマーを溶解して、第2の有機混合物を形成させること；ならびに
前記第1および第2の有機混合物を混合して、分散相を形成させること、
を含む、前記方法。
【請求項２３】
前記GnRHアンタゴニストが凍結乾燥される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記分散相を40℃、または該分散相のゲル化を防止するのに十分な温度に加熱することをさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記第1の有機溶媒がメタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、塩化エチレン、四塩化炭素、クロロホルム、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、アセトン、乳酸エチル、または酢酸エチルである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記分散相に一定量の酸付加物を添加する工程をさらに含み、該分散相中の酸付加物の量が、そこから調製される任意のミクロスフェアの放出特性に影響することなく、該分散相中でのGnRHアンタゴニストの溶解性を増加させるのに十分なものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
ポリマー、および式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Pro9, DAla10 NH2を有する性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)アンタゴニストを含むミクロスフェア組成物。
【請求項２８】
前記ポリマーが10〜40の酸数を有する、請求項２７に記載のミクロスフェア組成物。
【請求項２９】
前記ポリマーが少なくとも50％のラクチドから構成される、請求項２７に記載のミクロスフェア組成物。
【請求項３０】
前記ポリマーが100％のラクチドから構成される、請求項２７に記載のミクロスフェア組成物。
【請求項３１】
前記性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)アンタゴニストが、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有する、請求項２７に記載のミクロスフェア組成物。
【請求項３２】
有機酸をさらに含む、請求項２７に記載のミクロスフェア組成物。
【請求項３３】
前記有機酸が、酢酸、乳酸、グリコール酸、酪酸、吉草酸、デカン酸、ステアリン酸またはクエン酸である、請求項３２に記載のミクロスフェア組成物。
【請求項３４】
前記有機酸が、約5重量％〜約50重量％のレベルで存在する、請求項３２に記載のミクロスフェア組成物。
【請求項３５】
前記酸数が少なくとも5であり、前記ポリマーが100％のラクチドから構成される、請求項２７に記載のミクロスフェア組成物。
【請求項３６】
前記酸数が少なくとも15であり、前記ポリマーが50％のラクチドおよび50％のグリコリドから構成される、請求項２７に記載のミクロスフェア組成物。
【請求項３７】
前記アンタゴニストが、ポリマーマトリックスに対して40重量％未満の量で存在する、請求項２７に記載のミクロスフェア組成物。
【請求項３８】
ミクロスフェアを調製する方法であって、
(a)下記のもの：
(i)一定量のポリマーを一定量の第1の有機溶媒に溶解することにより形成され、該第1の有機溶媒が水と混和しないものである、第1の有機溶液；
(ii)前記第1の有機溶媒と混和性である一定量の第2の有機溶媒を、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有する性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)アンタゴニストに、または十分な量の酸付加物中にGnRHの該アンタゴニストを溶解し、必要に応じて、一定量の前記第1の有機溶媒を添加することにより形成された溶液に添加することにより形成された第2の有機溶液；
を混合することにより形成された分散相を提供すること；ならびに
(b)該分散相が乳濁液を形成する連続相を提供すること；
(c)該連続相中で該分散相を乳化して、ミクロスフェアを形成させること；
(d)工程(c)後に形成されるミクロスフェアから、前記第1および第2の有機溶媒を除去すること；ならびに
(e)前記溶媒を実質的に含まないミクロスフェアを回収すること、
を含む、前記方法。
【請求項３９】
前記GnRHアンタゴニストが凍結乾燥される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第1の有機溶媒が、ジクロロメタンまたはクロロホルムである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第2の有機溶媒が、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、N-メチルピロリドン、塩化エチレン、四塩化炭素、クロロホルム、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、アセトン、乳酸エチルおよび酢酸エチルからなる群より選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４２】
前記酸付加物が、有機酸もしくは無機酸またはその組合せである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４３】
前記酸付加物が、5.0以下のpKaを有し、氷酢酸、乳酸、グリコール酸、グリセリン酸、安息香酸、プロパン酸、メタンスルホン酸、メシチリン酸およびHClまたはこれらの酸の組合せからなる群より選択されるものである、請求項３８に記載の方法。
【請求項４４】
分散相を含むポリマー中での、凍結乾燥された式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有する性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)アンタゴニストの溶解性を増加させる方法であって、
凍結乾燥されたGnRHのアンタゴニストを十分量の酸付加物に溶解して、溶液を形成させること；
一定量の有機溶媒を該溶液に添加して、第1の有機溶液を形成させること；
一定量のポリマーを一定量の該有機溶媒中に溶解して、第2の有機溶液を形成させること；ならびに
前記第1および第2の有機溶液を混合して、分散相を形成させること、
を含む、前記方法。
【請求項４５】
前記方法が、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、N-メチルピロリドン、塩化エチレン、四塩化炭素、クロロホルム、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、アセトン、乳酸エチル、または酢酸エチルを、前記溶液に添加する任意的工程の後に、前記有機溶媒を添加する工程を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記有機溶媒が、ジクロロメタンである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記酸付加物が、有機酸もしくは無機酸またはその組合せである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記酸付加物が、5.0以下のpKaを有する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記酸付加物が、氷酢酸、乳酸、グリコール酸、グリセリン酸、安息香酸、プロパン酸、メタンスルホン酸、メシチリン酸もしくはHClまたはこれらの酸の組合せである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記酸付加物が、氷酢酸である、請求項４９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2004年7月16日に提出された米国特許仮出願第60/588,826号の利益を請求するものであり、この出願の本文はその全体が参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【０００２】
本発明は、哺乳動物におけるホルモン依存的な生理学的および病理学的症状における適用のための抗性腺刺激ホルモン剤に関する。特に、本発明は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)のアンタゴニストである合成ペプチドに関する。本発明はまた、性腺刺激ホルモンにより刺激されたステロイドの過剰分泌から生じる症状を治療するための方法における、GnRHアンタゴニストを含む医薬組成物の使用にも関する。
【背景技術】
【０００３】
性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)は、視床下部で合成されるペプチドホルモンであり、下垂体により産生される性ホルモンの調節において重要な役割を果たしている。構造的には、GnRHはアミノ酸配列Pyro-Glu1-His2-Trp3-Ser4-Tyr5-Gly6-Leu7-Arg8-Pro9-Gly10-NH2を有するデカペプチドである。また、それは黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)としても当業界で公知である。
【０００４】
一度、GnRHが視床下部から放出されれば、それは下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞の表面受容体と相互作用する。一度、この表面受容体が刺激されれば、性腺刺激ホルモン産生細胞はいわゆる性腺刺激ホルモン、黄体形成ホルモン(LH)および卵胞刺激ホルモン(FSH)を合成、放出する。ヒトの生殖におけるこれらのホルモンの重要性は公知である。例えば、FSHは雄性体における精子形成および雌性体における卵胞の発達を調節し、ならびにLHはテストステロンなどの性腺ステロイド産生を調節する。かくして、視床下部によるGnRHデカペプチドの放出の前に、下垂体によるホルモン放出が必要であると考えられる。これらの知見以来、ヒトなどの哺乳動物における性腺刺激ホルモンの分泌を抑制するために、GnRHアンタゴニストとしても知られる、GnRHデカペプチドの正常な機能に対して拮抗するGnRH類似体が用いられてきた。本質的には、GnRHアンタゴニストは、FSHおよびLHの循環レベルを低下させるように働く。
【０００５】
近年、テストステロンの分泌または排卵活動を制御するため、ならびに前立腺癌および子宮内膜症などの様々な他のホルモン感受的なヒトの症状を治療するための薬剤としての臨床的使用のために、いくつかのGnRHアンタゴニストが開発されてきた。また、このアンタゴニストは、他の婦人科学的目的、特に、補助妊娠におけるLHの急上昇を抑制するためにも用いられる。作用の点で、GnRHアンタゴニストは、GnRH受容体への天然のGnRHペプチドの接近を遮断し、かくして、性腺刺激ホルモン産生を抑制すると報告されている。
【０００６】
改良されたGnRHアンタゴニストの探索においては、ヒスタミン放出の可能性の減少、性腺刺激ホルモン抑制の効力の維持または増加および水溶性の増加に焦点が当てられてきた。例えば、米国特許第5,656,727号、5,516,887号、5,506,207号、5,480,969号および5,296,468号は、いくつかのGnRHアンタゴニストの設計および合成を開示している。上記特許に記載されたいくつかのGnRHアンタゴニストの魅力的な特性にも拘らず、さらに改良されたGnRHアンタゴニストのための探索が続けられている。GnRHのアンタゴニストである、オルンチド(orntide)(DNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, PicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 -NH2) (米国特許第5,480,969号および5,656,727号；Janeckaら、J.Med.Chem., 1994, 37:2238-2241)は、現在までに開発された最も有効なGnRHアンタゴニストの1つであると報告されている(Jiangら、Intl. J. Pharmaceutics, 2002, 233:19-27)。それは高い抗性腺刺激ホルモン効力および低いヒスタミン放出および比較的好ましい水溶性を有すると報告されている。よりさらに改良されたGnRHアンタゴニスト、特に、約5〜約7の範囲のpH、より好ましくはpH 7.4を有する製剤中で、オルンチドよりも高い水溶性を示し、かつ好ましい生物学的有効性を有するものが望ましい。
【発明の開示】
【０００７】
本発明においては、ユニークで好ましい薬理学的特性を有するGnRHアンタゴニストを見出した。これらの特性により、それらのGnRHアンタゴニストは性ステロイド依存的な病状、特に、性腺刺激ホルモン軸の長期間の抑制を必要とする病状の管理のための理想的な候補となる。例えば、本発明においては、オルンチド、特に、位置5における残基に対する特定の改変により、通常の生理学的pHでオルンチドよりも高い水溶性を示すが、抗性腺刺激ホルモン効力などの他の好ましい特性を有するGnRHアンタゴニストが得られる。本発明の一般的な態様においては、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Pro9, DAla10 NH2を有するGnRHアンタゴニスト、その密接に関連する類似体およびその製薬上許容される塩が、改良された水溶性および他の好ましい製薬特性を有することが見出される。
【０００８】
本発明の一態様においては、哺乳動物において性腺刺激ホルモンレベルを制御する方法を提供する。この方法は、哺乳動物において内因性の性腺刺激ホルモンレベルを実質的に抑制するのに有効な量および頻度で、GnRHアンタゴニストを送達すること、またはこれを投与することを含む。あるいは、または上記に加えて、この方法は、哺乳動物において内因性の性腺刺激ホルモンレベルを実質的に抑制するのに有効な頻度(例えば、1日2回以上)でGnRHアンタゴニストを投与することを含む。性腺刺激ホルモンの過剰分泌を罹患する哺乳動物においては、本発明のGnRHアンタゴニストを、これらの哺乳動物において性腺刺激ホルモンを所望のレベルに維持するのに有効な量および頻度で投与する。この方法は、前立腺および卵巣の障害もしくは雌性体におけるアンドロゲンの過剰産生、または異常に高いレベルのLHもしくはFSHを、正常な、もしくはほぼ正常なレベルまで低下させることが望ましい、そのような高いレベル、などの性腺刺激ホルモンに関連する障害を罹患する哺乳動物を治療するのに特に有用である。本発明の方法を実施することにより、哺乳動物における性腺刺激ホルモンまたはステロイドのレベルを、哺乳動物中、所定の治療期間、所望のレベルに維持し、この治療の停止後、正常なレベルまで戻すことができる。
【０００９】
本発明の別の態様においては、所定の治療期間、ヒトなどの哺乳動物におけるテストステロンレベルを抑制する方法を提供する。この方法においては、有効量の本発明のGnRHアンタゴニスト(例えば、AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2またはAcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Val7, IprLys8(もしくはArg8), Pro9, DAla10 NH2)および好適な担体または希釈剤を含む一定量の医薬組成物を投与する。投与される医薬組成物の量は、それがテストステロンレベルの実質的な低下をもたらすようなものである。
【００１０】
本発明のさらに別の態様においては、直接的もしくは間接的にGnRHにより誘導される、腫瘍細胞増殖および／または過剰のホルモン分泌などの症状を診断する方法を提供する。この方法においては、本発明のGnRHアンタゴニストを、好適なin vitroでの細胞培養物に、もしくはin vivoで投与し、ホルモン分泌、ステロイドレベルおよび／または腫瘍細胞増殖を様々な間隔でモニターする。
【００１１】
本発明はまた、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Pro9, DAla10 NH2を有する性腺刺激ホルモン放出ホルモンアンタゴニストを含む分散相製剤またはミクロスフェアのための組成物に関連する他の態様も開示する。一実施形態においては、分散相製剤のための組成物は、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有する性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)アンタゴニストおよび酸付加物を含むか、またはこれから本質的になる。GnRH類似体は、好ましくは凍結乾燥されたGnRHアンタゴニストであり、酸付加物は有機酸もしくは無機酸の付加物または有機酸および無機酸の両方である。有機酸または無機酸の付加物は5.0以下のpKaを有するのが好ましい。有機酸付加物は、氷酢酸、乳酸、グリコール酸、グリセリン酸、安息香酸、プロパン酸、メタンスルホン酸、およびメシチリン酸(mesitylic acid)のうちの少なくとも1種であってもよい。好ましい無機酸付加物はHClであるが、望ましいpKa値を有する他の無機酸を用いてもよい。前記組成物は必要に応じて、例えば、乳酸のホモポリマーまたは乳酸とグリコール酸のコポリマーなどの、生体適合性で生体分解性のポリマーを有する。
【００１２】
ミクロスフェアのための好ましい組成物は、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Pro9, DAla10 NH2を有するか、または本質的にこれからなるGnRHアンタゴニストを含むものである。さらに、このミクロスフェア組成物は所与の酸の数を有するポリマーを有し、ここで、その数は、ポリマーが100％のラクチドから構成される場合、少なくとも5であるか、もしくはポリマーが50％のラクチドおよび50％のグリコリドから構成される場合、少なくとも15であるか、または10〜40の間であるのが好ましい。このポリマーは少なくとも50％のラクチドまたは100％のラクチドを含んでもよい。ミクロスフェア組成物は必要に応じて、該組成物に付加された、例えば、酢酸、乳酸、グリコール酸、酪酸、吉草酸、デカン酸、ステアリン酸またはクエン酸などの1種以上の有機酸を有してもよい。該組成物中の前記アンタゴニストの量は、ポリマーマトリックスに対して40重量％以下である。付加される有機酸の量は、それが約5重量％〜約50重量％のレベルで存在するようなものである。
【００１３】
ミクロスフェアの調製は、分散相および連続相の使用を含む。選択された連続相は、分散相が乳濁液を形成するものである。分散相を、第1の有機溶液と第2の有機溶液を混合することにより形成させる。第1の有機溶液は、一定量のポリマーを一定量の第1の有機溶媒(例えば、ジクロロメタンまたはクロロホルム)に溶解することにより形成されたものであるが、この第1の有機溶媒は水と混和しない。第2の有機溶液は、第1の有機溶媒が混和する、一定量の第2の有機溶媒を、本発明のGnRHアンタゴニスト、例えば、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有するアンタゴニストに、またはGnRHのアンタゴニストを十分な量の酸付加物に溶解することにより形成された溶液に添加し、必要に応じて、一定量の第1の有機溶媒を添加することにより形成されたものである。酸付加物は任意の有機酸もしくは無機酸またはそれらの組合せであってよいが、選択された酸または組合せ物は5.0以下のpKaを有するのが好ましい。例えば、選択された酸は氷酢酸、乳酸、グリコール酸、グリセリン酸、安息香酸、プロパン酸、メタンスルホン酸、メシチリン酸およびHClのうちの少なくとも1種であってよい。次いで、分散相を連続相中で乳化して、ミクロスフェアを形成させる。そのように形成されたミクロスフェアから、第1および第2の有機溶媒を除去して、有機溶媒を完全にではなくても、実質的に含まないミクロスフェアを回収する。このミクロスフェア中で用いられるGnRHアンタゴニストは凍結乾燥されたものであってよい。
【００１４】
本発明はまた、分散相を含むポリマー中での、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Pro9, DAla10 NH2を有するGnRHアンタゴニストの溶解性を増加させる方法も開示する。本発明の一実施形態においては、分散相を含むポリマー中での、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有するGnRHアンタゴニストの溶解性を増加させる方法は、以下の種々の工程の全部またはいくつかを含む：容器中にGnRHアンタゴニスト(凍結乾燥されたものであっても、またはそうでなくても)を分散させること、第1の有機溶媒をGnRHアンタゴニストに添加して、第1の有機混合物を形成させること、一定量のポリマーを第2の有機溶媒に溶解して、第2の有機混合物を形成させること；ならびに第1および第2の有機混合物を混合して、分散相を形成させること。この方法はさらに、必要に応じて、40℃または分散相のゲル化を防止するのに十分な温度まで、該分散相を加熱することを含んでもよい。必要に応じて、この方法は、一定量の酸付加物を分散相に添加する工程を含んでもよい。分散相中の酸付加物の量は、それが、そこから調製される任意のミクロスフェアの放出特性に影響することなく、該分散相中でのGnRHアンタゴニストの溶解性を増加させるのに十分なものであるようなものであってよい。第1の有機溶媒は、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、N-メチルピロリドン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、塩化メチレン、塩化エチレン、四塩化炭素、クロロホルム、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、アセトン、乳酸エチル、もしくは酢酸エチルのうちのいずれか、またはそのうちの少なくとも1種であってよい。
【００１５】
本発明の別の実施形態においては、分散相を含むポリマー中での、式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有するGnRHアンタゴニスト(凍結乾燥されたもの)の溶解性を増加させる方法は、以下の種々の工程の全部またはいくつかを含む：GnRHの凍結乾燥されたアンタゴニストを十分な量の酸付加物に溶解して、溶液を形成させること、一定量の有機溶媒を該溶液に添加して、第1の有機溶液を形成させること、一定量のポリマーを一定量の有機溶媒に溶解して、第2の有機溶液を形成させること、ならびに第1および第2の有機溶液を混合して、分散相を形成させること。この方法は、必要に応じて、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、N-メチルピロリドン、塩化エチレン、四塩化炭素、クロロホルム、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、アセトン、乳酸エチル、または酢酸エチルのうちの少なくとも1種を、前記溶液に添加した後、該有機溶媒を添加する工程を含む。
【００１６】
本発明の選択された性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)の溶解性を増加させる方法において用いられる酸付加物(好ましくは、5.0以下のpKaを有する)は、氷酢酸、乳酸、グリコール酸、グリセリン酸、安息香酸、プロパン酸、メタンスルホン酸、メシチリン酸およびHClのうちの少なくとも1種であってよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
本発明の新規な製薬上活性な化合物は、性腺刺激ホルモン放出ホルモン(GnRH)に拮抗する類似体(GnRHアンタゴニスト)である。これらの拮抗類似体は、動物における内部テストステロンレベルの調節および種々のホルモン感受性ヒト疾患状態の治療において有効であると考えられる。このアンタゴニストはペプチド性化合物であり、10個のアミノ酸からなるのが好ましい。アンタゴニストのNおよびC末端の両方を、それらが遊離の酸としても塩基としてでもなく存在するように、酵素分解からブロックまたは保護するのが好ましい。N末端での改変としては、N-アシル化、N-ホルミル化、またはピログルタミン酸などの環状アミノ酸の使用が挙げられる。C末端を、カルボン酸の代わりにアミドまたはエチルアミドを用いることにより保護することができる。このアミノ酸も改変されていてもよく、すなわち、天然のL-アミノ酸の代わりにD-アミノ酸を用いるのが好ましい。
【００１８】
本発明のGnRHアンタゴニストは、一般式AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Pro9, DAla10 NH2を有する。一般式中の-NH2は、C末端が遊離のカルボン酸よりもむしろアミドであることを示している。一般式中の10個のアミノ酸のうち、位置7および8のアミノ酸が示されていないが、これはこれらの2つの位置では、様々な等価なアミノ酸残基を用いることができるからである。具体的には、位置7ではLeuまたはValのいずれかを用いることができるが、Leuが好ましいアミノ酸である。位置8においてはIprLysまたはArgを用いることができるが、IprLysが好ましいアミノ酸である。位置7および8でのそのような等価な残基の置換は、本発明のGnRHアンタゴニストの生物活性を有意に変化させないと考えられる。
【００１９】
本発明の好ましい実施形態においては、下記式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2を有するGnRHアンタゴニストを用いる。本発明のさらに好ましい実施形態においては、本質的に下記式：AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2からなるGnRHアンタゴニストを用いる。このGnRHアンタゴニストは、位置5に改変されたリジン残基を有する点を除いて、従来技術により公知のオルンチドと構造的に類似している。オルンチドは位置5にピコリノイルリジンを有する。本発明のアンタゴニストは位置5のリジン上にニコチノイル置換を有する。この改変により、GnRHアンタゴニストはより極性が高くなり、かくしてオルンチドのものと比較して水への溶解性が増加する。溶解性の決定は当業者の技術の範囲内にある。例えば、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)中の保持時間を測定することによるか、またはオクタノール-水分配試験を介してこれを行うことができる。さらに、この改変は、テストステロン抑制の持続期間またはGnRHアンタゴニストによるヒスタミン放出の可能性を有意に変化させないと考えられる。
【００２０】
皮下沈着物を調製するための所与のペプチド性GnRHアンタゴニストの選択は、ゲルを形成するその傾向に依存し、この傾向は皮下環境においてより高いものであってよい。従来技術は、ゲル形成が所与のペプチド性GnRHアンタゴニストの濃度および／または水溶性に依存し、特定の点を越えて該アンタゴニストの濃度を増加させることは、ゲル形成に起因するその生体利用率に影響し得ることを報告している。ペプチド性GnRHアンタゴニストである、従来技術により公知の酢酸オルンチドの場合、例えば、本発明者らは、それが5以下のpHでも、5 mg/mL未満の濃度でのみ水性培地に溶解し得ることを見出した。さらに、それはその低い濃度でもゲル化する傾向を有するが、ミクロスフェアのための製剤中のオルンチドの望ましい濃度は少なくとも100 mg/mLである。また、それが1日に100μg/kg体重の用量を超えるレベルでの注入の時点で濃度依存的ゲル化を示すことが報告されている(Jiangら、2002, Intl J of Pharmaceutics, 233: 19-27)。
【００２１】
本発明のアンタゴニストを用いることにより、これらのアンタゴニストの改良された水溶性のため、皮下注入の際のゲル化または沈降化の危険性を低下させることができる。さらに、この有利な特性の結果として、図1に示されるものなどのGnRHアンタゴニストの日用量は、望ましいものであるべきである酢酸オルンチドのものよりも数倍多いものであってよいことが今や期待される。さらに、本明細書に開示されるGnRHアンタゴニストを、長期間に渡って所与のGnRHアンタゴニストを投与することが望ましい状況で有利に用いることもできる。例えば、前立腺癌の治療には、テストステロンを、数週間から1年間の長期間に渡って、去勢レベル(すなわち、≦0.5 ng/ml)まで抑制する必要がある場合がある。本発明のGnRHアンタゴニストのより優れた溶解性のため、皮下沈着物からのそれらの生体利用率は、限定された水溶性を有する従来技術により公知のGnRHアンタゴニストの生体利用率よりも濃度依存性が低い。結果として、所望のLHおよびテストステロン抑制を達成するためには、1回または数回の本発明のGnRHアンタゴニストの注入で十分である。必要に応じて、本明細書に開示されるアンタゴニストの用量および濃度を、LHおよびテストステロン抑制の期間の顕著な増加を実現するように増加させることができる。これらの、および他の特性により、本発明のGnRHアンタゴニストは、一般的に比較可能な生物学的有効性のオルンチドまたは他の従来技術により公知のGnRHアンタゴニストと比較して、皮下注入による投与のための治療的または保護的な医薬組成物を作製するのに特に好適になる。
【００２２】
従って、別の態様においては、本発明は、製薬上許容される担体および／または希釈剤と共に、有効量の本発明のGnRHアンタゴニストを投与することにより、哺乳動物における性腺刺激ホルモンまたはステロイドの分泌を抑制する方法を提供する。それは、ホルモンに関連するか、またはステロイドに依存的な病状の治療のための方法を含む。
【００２３】
広範な研究およびいくつかのGnRH類似体(例えば、GanirelixおよびCetrorelix)に関して既に作製された臨床試験データの結果として、本発明の化合物を、例えば、テストステロン抑制剤または排卵抑制剤として使用する方法を決定することは当業者の技術の範囲内である。一般的には、本発明のGnRHアンタゴニストを用いるヒトなどの患者の治療を、公知の臨床治療手順を用いる同じ様式で実施することができると考えられる。一般的には、このGnRHアンタゴニストを好適な担体中で提供し、該患者における性腺刺激ホルモンレベルまたはステロイドを抑制するのに有効な用量で投与する。種々のGnRHアンタゴニスト調製物および用量をさらに本明細書に記載する。また、米国特許第5,480,969号および5,656,727号；Moralesら、2002, Biology of Reproduction 67: 1360-1365; Mannら、1998, Journal of Endocrinology 156: 493-501; Kostanskiら、2000, AAPS PharmSciTech, 1(4) 論文27(これらの内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする)も参照されたい。
【００２４】
本発明のGnRHアンタゴニストを、製薬上許容される非毒性塩の形態で投与できることが多いが、酢酸塩が好ましい塩の形態である。前記医薬組成物は、従来の製薬上許容される担体と共に、有効量の所与のGnRHアンタゴニストを含んでもよい。この組成物は等張性溶液の形態にあってもよい。酢酸、クエン酸またはリン酸バッファーなどの好適なバッファー溶液を用いることができる。
【００２５】
一般的には、前記組成物中のGnRHアンタゴニストの量を、公知の製薬原理に従って選択することができる。薬剤成分としての有効量のGnRHアンタゴニストが特に包含される。用語「有効量」により、例えば、薬剤に関して、「製薬上有効量」が包含されることが理解される。「製薬上有効量」は、必要とされるか、もしくは所望の治療応答を引き出すのに十分である薬剤もしくは製薬上活性な物質の量(amount)もしくは量(quantity)であるか、または患者に投与した場合に好適な生物応答を引き出すのに十分な量である。
【００２６】
本発明のGnRHアンタゴニストを含む組成物を、皮下、筋肉内、静脈内、鼻腔内、膣内もしくは直腸内的に哺乳動物に投与して、生殖腺活性の可逆的な抑制、特に、テストステロンの可逆的な抑制を要求する用途などの所望の効果を達成することができる。有効量は投与の形態および治療しようとする特定種の哺乳動物に応じて変化し得る。従来技術により公知の酢酸オルンチドはpH 5で低い水溶性(5 mg/mL未満の濃度)を有するが、本発明のGnRHアンタゴニストは5 mg/mL、10 mg/mL、20 mg/mL、30 mg/mLおよび50 mg/mLの高さでさえ、ならびに約4.0〜5.4のpHで良好な溶解性を有する。かくして、本発明のGnRHアンタゴニストを、約5のpHの1〜50 mg/mLの溶液として好適に用いることができる。これらのGnRHアンタゴニストはin vivoでよく寛容される。
【００２７】
通常、用量は、皮下的に与えられる場合、動物宿主の体重1キログラムあたり、約90μg〜約2.5 mgのGnRHアンタゴニストであってよい。1つの典型的な剤形の例は、GnRHアンタゴニストを含む滅菌水または約5のpHのバッファー溶液であり、この溶液を皮下投与して、1日あたり約0.09〜2.5 mg/kg体重の範囲の用量を提供する。
【００２８】
本発明の別の態様においては、本発明の様々なGnRHアンタゴニストのための送達ビヒクルとして様々な天然および合成のポリマーおよび樹脂から形成された、持続放出製剤、ミクロスフェアおよびマイクロカプセル製剤が包含される。ミクロスフェアおよびマイクロカプセル剤は両方とも、薬剤を分散、捕捉、またはカプセル封入するマトリックス(例えば、ポリマーマトリックス)を含む。ミクロスフェアは、一般的には、薬剤を分散、捕捉、またはカプセル封入する固体ポリマー球体である。マイクロカプセル剤は、活性薬剤、この場合、本発明のGnRHアンタゴニストのコアの周囲の外側のポリマー殻を有するものである。最も広い可能性のある意味での持続放出製剤とは、持続もしくは延長された期間、または少なくとも、GnRHアンタゴニストがマトリックスを用いない従来の形態、すなわち、製剤化されていない状態でin vivoで利用可能となった場合よりも長い期間、GnRHアンタゴニストの放出をもたらす、本発明のGnRHアンタゴニストの製剤を意味する。必要に応じて、これらの製剤からのGnRHアンタゴニストの放出は、一定の速度および／または所与の期間、連続的濃度で生じる。好適な持続放出製剤は、1日放出製剤から6ヶ月放出製剤以上の範囲であってよく、臨床適用の型に応じて当業者により決定することができる。好ましい放出製剤は1ヶ月、3ヶ月および6ヶ月放出製剤である。当業者であれば、前記マトリックス組成物を操作することにより、様々な放出形態を調製する方法を知っているであろう。
【００２９】
本質的には、活性薬剤をマトリックス、典型的には、ポリマーマトリックス中に分散、捕捉またはカプセル封入する場合、ミクロスフェアは、薬剤の持続放出または遅延放出を提供するその能力のため、魅力的な送達ビヒクルである。そのような製剤は通常、少量の水またはいくらかの他の好適な溶媒中に、高レベルの類似体を溶解することを必要とする。典型的には、持続放出製剤において用いられるGnRH類似体のレベルは50 mg/mL〜100 mg/mL以上の範囲である。従来技術のGnRH類似体の比較的低い溶解性および水性または他の溶媒中でゲルを形成するその濃度依存的傾向により、ミクロスフェア製剤におけるその使用は大きく制限される。さらに、ゲル化する溶液はミクロスフェア製剤の無菌製造のための滅菌濾過に関する問題を提起する。その点において、本発明のGnRHアンタゴニストは、持続放出製剤における使用にとって、特に、熱、蒸気およびγ照射などの他の魅力の乏しい滅菌技術に対する手段よりもむしろ、該アンタゴニストおよびポリマーマトリックスの溶液を濾過滅菌することにより滅菌された持続放出製剤を調製する(別々に、または混合した溶液として)のに特に好適である。分散相製剤およびミクロスフェアを調製する方法は当業界で公知である。例えば、米国特許第5,945,126号；6,361,798号；6,270,802号；および4,818,542号(その内容は参照により本明細書に組み入れられるものとする)を参照されたい。
【００３０】
本発明に従って調製されるポリマー溶液または分散相製剤は、当業者には公知の技術により、インプラントもしくはミクロスフェアもしくは微粒子もしくはその他のものなどの様々な持続放出剤形を作製するのに好適である。これらのものとしては、噴霧乾燥、減圧乾燥、乳濁液の形成および溶媒蒸発または溶媒抽出および噴霧凍結が挙げられる。かくして、本明細書を通した用語「分散相」の使用にも拘らず、前記製剤の好適性は、いかなる意味においても別の相中での分散にのみ限定されるわけではない。
【００３１】
乳化プロセスにより、ミクロスフェアを調製する方法は、典型的には、少なくとも1つの分散相および連続相の調製物を含む。例えば、米国特許第5,945,126号を参照されたい。この分散相は、典型的には、溶媒中に溶解された前記活性薬剤およびポリマー材料を含む。連続相への添加に際して、分散相は乳化プロセスにおいてミクロスフェアを形成する。前記製剤中のポリマーは、典型的には活性薬剤(例えば、本発明のGnRHアンタゴニスト)のためのマトリックスとして働き、生分解性であり生体適合性であるのが好ましい。ポリマーマトリックス材料の好ましい例は、ポリ(グリコール酸)、ポリ(d,l-乳酸)、ポリ(l-乳酸)、ポリ(l-ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ(dl-ラクチド-コ-グリコリド)、ポリ(l-ラクチド-コ-dl-ラクチド)、グリコール酸および乳酸の他のホモポリマーまたはコポリマーなどのラクチドおよびグリコリドである。様々なポリマーがミクロスフェア製剤中で用いられてきた。例えば、米国特許第6,361,798号、5,945,126号および4,818,542号を参照されたい。
【００３２】
典型的な実務においては、前記ポリマー、選択されたGnRHアンタゴニストおよび溶媒を混合して、分散相を形成させる。分散相は真の均質な溶液であるのが好ましく、前記ポリマー、溶媒および選択されたGnRHアンタゴニストを一緒に混合して溶液を形成させることにより調製することができる。あるいは、ポリマーおよび選択されたGnRHアンタゴニストの別々の溶液を、それぞれそれ自身の溶媒中で調製し、続いて混合して、分散相溶液を形成させることができる。好ましいポリ(乳酸)またはポリ(ラクチド-コ-グリコリド)ポリマーにとって好適な溶媒としては、塩化メチレン、クロロホルム、酢酸エチル、置換ピロリドンなどが挙げられる。ポリマー溶液を調製するのに用いられる溶媒の種類は、GnRHアンタゴニスト溶液を調製するのに用いられるものと同じであっても異なっていてもよい。
【００３３】
いくつかの実施形態においては、分散相を乳濁液として形成させることができる。例えば、所与のGnRHアンタゴニストを好適な溶媒に溶解する場合、得られる溶液はポリマーの溶液および特定のポリマー溶媒と完全に混和しないものであってよい。GnRHアンタゴニストおよびポリマーが比較的均一に分散された比較的均質な分散相を提供するためには、GnRHアンタゴニストおよびその溶媒を、ポリマーおよびポリマー溶媒と共に乳化して、公知の界面活性剤を用いて分散相乳濁液を形成させることができる。分散相を連続相に導入する際には、水-油-水(W/O/W)乳濁液を形成させる。さらに他の系においては、ポリマー溶液中のGnRHアンタゴニストの直接懸濁液を形成させることにより、分散相を調製することができる。
【００３４】
ポリマーおよび／またはGnRH類似体を溶解するための溶媒は、分散相製剤を調製するのに典型的に用いられるものと同じであっても異なっていてもよい。典型的な溶媒としては、限定されるものではないが、水、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、塩化メチレン、塩化エチレン、四塩化炭素、クロロホルム、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、アセトンまたは酢酸エチルが挙げられる。
【００３５】
いくつかの実施形態においては、本発明によるミクロスフェア製剤は、所望のレベルの1種以上の本発明のGnRHアンタゴニストを含んでもよい。ミクロスフェアのための製剤中のGnRHアンタゴニストの所望の濃度またはレベルは、少なくとも約25 mg/mL、より好ましくは、少なくとも約50 mg/mL、さらにより好ましくは、少なくとも約100 mg/mLであってよい。本発明のGnRHアンタゴニストの溶解性が高ければ、関連する溶解性および／またはゲル化の問題を含まず、持続放出製剤において少なくとも典型的に用いられるレベルの該アンタゴニストを含む安定な溶液を取得することが可能であるべきである。ポリマーマトリックスと比較した本発明のGnRHアンタゴニストの量は、約1〜40重量％、好ましくは約5〜20重量％であってよい。
【００３６】
例示的な実施形態においては、図1に示される化学構造を有するGnRHアンタゴニストを含むミクロスフェアを、以下のような乳濁液および溶媒抽出プロセスにより調製することができる：約200 mgのGnRHアンタゴニストを2.0 gのメタノールに溶解するか、または約3.0 gのポリマー(例えば、Boehringer Ingelheim社製のRG503H、ロット番号290103)を約10 gのジクロロメタンに溶解する。2つの溶液を混合して、GnRHアンタゴニストを含むポリマー溶液を形成させる。次いで、Silverson Homogenizer (Silverson Machines, Waterside UK)などのホモジェナイザーを約5000 RPMで用いて、好適な連続相(例えば、0.35％(wt/vol.)のポリビニルアルコールを含む水溶液)中に前記ポリマー溶液を分散させることにより、ミクロスフェア懸濁液を形成させる。かくして形成されたミクロスフェア懸濁液を溶媒除去容器に移して、該懸濁液から有機溶媒を完全に、または実質的に除去する。次いで、懸濁液を濾過、洗浄および周囲温度で一晩乾燥させる。乳濁液および溶媒抽出プロセスによるミクロスフェアの調製は当業者には公知である。
【００３７】
所望の濃度を達成するGnRHアンタゴニストの量が、液体組成物もしくは分散相を調製するのに用いられる溶媒中にもう溶解しないか、または得られる溶液が該溶液中に存在するアンタゴニストのレベルに起因して不安定であり、ゲル化する場合、本発明はそのような問題に対処するためのユニークな手法を包含する。本明細書に開示されるユニークな手法を用いて、所望の溶解性ならびにゲル化に対する安定性を達成することができる。例えば、1つの手法は、分散相の調製において凍結乾燥されたGnRHアンタゴニストおよび酸でない有機溶媒の溶液を使用することである。凍結乾燥されたGnRHアンタゴニストに、少量の有機または無機酸を添加した後、酸でない有機溶媒を添加することにより、ゲル化に対する安定性を改善することもできる。
【００３８】
より具体的には、一実施形態において、本発明はゲル化に対する耐性を示し、濾過滅菌可能であるGnRHアンタゴニスト組成物を提供する。この組成物は、典型的には、ミクロスフェアを製造するのに有用な分散相製剤である。この組成物は、好ましくはGnRHアンタゴニストおよび少なくとも1種の有機溶媒から作製された溶液から得られる凍結乾燥されたGnRHアンタゴニストを含む。好ましい溶媒は、メタノール、エタノール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、塩化メチレン、塩化エチレン、四塩化炭素、クロロホルム、ジエチルエーテル、メチルエチルエーテル、ヘキサン、シクロヘキサン、ベンゼン、アセトンおよび酢酸エチルからなる群より選択される。凍結乾燥されたGnRHアンタゴニストに加えて、前記組成物は有機または無機酸を含んでもよい。通常の凍結乾燥サイクル下で凍結乾燥することができる有機溶媒の例は、tert-ブタノール(TBA)およびシクロヘキサンである。例えば、前記アンタゴニストの200 mg/mLの溶液を、TBA-水混合物(例えば、34％のTBAおよび66％の水)中で作製することができる。このサンプルに対して、十分量の氷酢酸(約3％)を添加してもよい。次いで、この溶液を凍結乾燥する。凍結化を、例えば、-50℃で約2時間行う。乾燥サイクルの例は、20時間以上に渡って-50℃〜10℃まで増加させた後、20時間以上に渡って10℃〜25℃まで増加させた後、約10時間、25℃にて最後の乾燥を行うものであってよい。
【００３９】
本発明の別の態様においては、分散相を含むポリマー中での所望のレベルのGnRHアンタゴニストの溶解性を増加させる方法を提供する。この方法は、有効量の好適な有機溶媒を、所望の量の凍結乾燥されたGnRHアンタゴニストに加えて、類似体を完全に、またはできるだけ溶解することを含む。これとは別に、別の有機溶媒中に一定量のポリマーを溶解した後、アンタゴニストを含む部分を、ポリマーを含む部分と混合して分散相を形成させる。必要に応じて、有効量の好適な酸付加物を分散相に添加して、必要に応じて、溶解性を増加させることができる。分散相中の酸付加物の量は、分散相中での所望の量のGnRHアンタゴニストの溶解性を増加させるのにちょうど十分なものである。好ましい実施形態においては、酸の量は溶解性を達成するのに十分高いものであるべきであり、かつミクロスフェアをO/W(水中油)またはO/O(油中油)プロセスにより形成できないほど高いものであるべきではない。1つの好ましい実施形態においては、分散相(DP)中の酸の量は50重量％以下であってよい。
【００４０】
分散相を含むポリマー中での大量の凍結乾燥されたGnRHのアンタゴニストの溶解性を増加させる別の方法も提供される。この方法に従って、所望の量の凍結乾燥されたGnRHのアンタゴニストを、十分量の酸付加物に溶解して溶液を形成させた後、1種以上の溶媒を添加する。例えば、好適な溶媒は、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド、ジメチルアセトアミド、ジオキサン、テトラヒドロフラン(THF)、塩化メチレン、塩化エチレン、四塩化炭素、クロロホルム、酢酸エチル、アセトン、エチルメチルケトンなどのポリマーのための溶媒またはメタノール、エタノール、シクロヘキサンなどのポリマーのための非溶媒であってもよい。添加される溶媒がポリマーのための非溶媒である場合、添加される溶媒は、該ポリマーが最終的な分散相中、溶液中に滞留するような量に制限される。
【００４１】
かくして、ゲル化に対する、アンタゴニストを含むDPの安定性を、有効量の酸もしくは酸の組合せ(酸もしくは酸の組合せを本明細書においては酸付加物とも呼ぶ)を添加することにより、および／または分散相を含むポリマー中の凍結乾燥されたGnRHのアンタゴニストを使用することにより改善することができる。酸または酸付加物は有機酸であっても無機酸であってもよい。酸付加物は、5.0以下のpKaを有するのが好ましい。好適な酸付加物の例としては、限定されるものではないが、氷酢酸、乳酸、グリコール酸、グリセリン酸、安息香酸、プロパン酸、メタンスルホン酸、メシチリン酸およびHCl、またはこれらの酸の組合せが挙げられる。例えば、DPに有効量の氷酢酸を添加することにより、安定性を改善することができる。乳酸を、氷酢酸の代わりに用いることができる。乳酸は吸湿性であり、水中で85〜90％の溶液として入手可能である。大量の酸における水含量は相の分離を引き起こし得ることに留意すべきである。従って、無水の酸または5％未満の水を含む酸が好ましい。
【００４２】
必要とされる酸の量は、ある程度まで、前記アンタゴニストが凍結乾燥されたものであるか否かに依存する。凍結乾燥されていないGnRHアンタゴニストを含む安定な分散相製剤を調製するためには、分散相の総重量に基づいて、例えば、20重量％を越える、増加した量の酸付加物が必要となることがある。かくして得られた分散相組成物は、低いMWポリマーを含み、O/Wプロセスによる所望の放出特性を有し、かつミクロスフェアを作製する好ましい方法がO/Oプロセスによるものである状況下で、ミクロスフェアをもたらさなくてもよい。一方、前記アンタゴニストを凍結乾燥することにより、有機溶媒中に該アンタゴニストを溶解するのに必要とされる酸の量を有意に最小化することができる。かくして得られた分散相組成物は所望の放出特性を有するミクロスフェアをもたらすことができる。
【００４３】
分散相に加えて前記アンタゴニストを含む種々の成分に関する添加プロトコルの順序に従うことにより、透明な分散相を達成することもできる。種々の成分を添加する1つの好ましい順序は以下の通りである：第1に、氷酢酸または他の好適な酸を前記アンタゴニストに添加して、溶液を形成させる。この溶液に、メタノールまたはいくつかの他の好適な溶媒を添加する。典型的には、GnRHアンタゴニストを溶解するのに用いられる溶媒または該アンタゴニストおよびポリマーの両方が可溶性である溶媒部分(例えば、DCM)を添加して、溶液を形成させた後、この溶液に任意の他の成分を添加する。次いで、前記組成物に前記ポリマーを溶解するのに用いられるDCMまたは他の溶媒の一部を添加する。この様式での前記アンタゴニストの調製は、40℃に加熱するか、または加温して透明な溶液を達成することを必要とせず、また、それは最初のゲル化を防止する。次いで、この溶液をポリマー(例えば、PLGAまたはPLA)溶液に添加し、よく混合する。あるいは、好適な溶媒中のポリマー溶液を、酸中の前記アンタゴニスト溶液に添加することができる。このように、透明で、安定で、ゲル化せず、かつ濾過可能なDPを取得することができる。他の溶媒を前記アンタゴニストに添加した後、該アンタゴニストを酸中に添加し、溶解する場合、得られる溶液はゲルを形成する傾向を示すことがある。
【００４４】
一例として、前記組成物、0.984 gのRG503H、0.22 gの新規GnRHアンタゴニスト、0.85 gの氷酢酸、5.0 gのDCMおよび0.74 gのメタノールを有する分散相製剤を形成させるのに必要とされる本発明のGnRHアンタゴニストおよび他の成分を以下のように調製することができる：第1に、凍結乾燥されたアンタゴニストを、5.0以下のpKaを有する酸(例えば、酢酸)の限定量(例えば、アンタゴニストの重量の約3倍)に溶解する。その後、メタノールおよび／またはジクロロメタン(DCM)の一部、好ましくは、半分を、アンタゴニスト-酸溶液に添加する。残りのDCMを用いて、ポリマー、PLGAまたはPLAを溶解させる。粘性のポリマー溶液およびアンタゴニストを含む溶液を一緒に混合して、DPを形成させる。そのように形成されたDPは、酸をDPに添加する場合よりも、ゲル化に対するより良い濾過可能性および安定性を示し得る。かくして、透明な溶液と形成するために、酢酸を最初に添加する。次いで、メタノールおよび／またはDCMの半分(2.5 g)を添加することにより、それは粘性が低く、透明な溶液に形成することができる。次いで、この溶液を前記ポリマー溶液と混合することができる。酢酸中の本発明のGnRHアンタゴニストの溶液を、ポリマー溶液と直接的に混合することもできる。例示的な組成物においては、重量％に基づく該組成物中の各成分の量は以下の通りであってよい：約12.6％のRG503H、約2.8％の本発明のGnRHアンタゴニスト、約10.9％の氷酢酸、約64.15％のDCMおよび約9.49％のメタノール。
【００４５】
好適な順序で前記成分を添加することは、安定性およびゲル化の問題を回避するための最も好ましい手法である。上記のように、順序の一部として、前記アンタゴニストを最初に酸に溶解した後、メタノールなどの他の成分を添加して分散相製剤を調製しなければならない。この様式では、前記アンタゴニストの溶解を、最初のゲル化を全く起こすことなく迅速に達成することができる。それにより、0.2μ以下のフィルター(0.1μ、0.05μなど)を通して容易に濾過することができる非常に安定な溶液を得ることもできる。かくして、溶解性およびゲル化の問題を、DPへの酸の添加により、および／またはDPを作製するための成分の適切な順序での添加により回避することができる。
【００４６】
一般的には、本発明のアンタゴニストは、例えば、低いpHバッファーレベルで改良された溶解性を有する。良好な薬剤の取り込み効率を達成するために、連続相(CP)を、例えば、pH 7-9に緩衝化することができる。CPの緩衝能力は、pHを、好ましくは6.8以下、特に、6以下に落とさずに、DP製剤に添加された酸を中和するのに十分高いものであるべきである。これを、ミクロスフェア中へのカプセル封入効率を増加させる一般的方法として行うことができる。特に、分散相中で酸付加物を用いるか、または用いないオルンチドの溶解性および溶解性を増加させる方法を開示する、米国特許出願公開第20050042294号は参照により本明細書に組み入れられるものとする。
【００４７】
従って、本発明の態様を実施することにより、当業者は製剤中での高レベルのGnRHアンタゴニストの使用に関連する問題を克服することができる。そのような製剤を用いて、一貫性のある放出特性を有するミクロスフェアを製造することができる。さらに、そのような製剤を、微小フィルターを用いて濾過することができ、また当業者であれば、ミクロスフェアの製造における使用のための濾過滅菌可能なGnRHアンタゴニストを含む製剤を取得することができるであろう。例えば、本発明に従って調製された溶液を、0.2μのフィルターを用いて濾過することができる。PLAまたはPLGAミクロスフェアの両方を調製して、3ヶ月、6ヶ月または1年間の放出製剤を達成することができる。
【００４８】
本発明の別の態様においては、GnRHアンタゴニストペプチドを診断目的で用いることもできる。in vitro試験を実施して、特定の腫瘍細胞がGnRHに対して感受的であるかどうかを決定することができる。例えば、in vitroアッセイにおいては、腫瘍細胞培養物を、所与のGnRHアンタゴニストで処理した後、この培養物をホルモン分泌および細胞増殖についてモニターする。同様に、これらのペプチドをin vivoで注入して、性腺刺激ホルモンまたはステロイドの分泌に対するその効果を決定することができる。例えば、患者の血液サンプルをアッセイして、ホルモン分泌、例えば、LHの分泌の減少の程度を決定する。
【００４９】
本発明のGnRHアンタゴニストを、当業界で公知のペプチド合成方法により大量に合成することができる。
【実施例】
【００５０】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するものであるが、勿論、いかなる意味においてもその範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。以下の実施例は、特に詳細に記載しない限り、当業者には公知で日常的である従来の技術を用いて実施されたものである。図1に示される化学構造を有するGnRHアンタゴニストは、本明細書においては「新規GnRHアンタゴニスト」とも呼ばれるが、これを以下に記載の実施例において用いた。
【００５１】
1. 図1に示される化学構造を有するGnRHアンタゴニストの水溶性
新規GnRHアンタゴニストは、Bachem California, Inc., Torrence, CAにより合成されたものである。該化合物のこの酢酸塩は、98％を超えるペプチド純度を有する白色粉末の酢酸塩であり、位置5にピコリノイルリジンの代わりにニコチノイルリジンを有することにより、酢酸オルンチドとは異なる。
【００５２】
新規GnRHアンタゴニストの溶解性を、室温にて酢酸オルンチドのものと比較した。この実験においては、50 mgの新規GnRHアンタゴニストを小さいガラス容器中に量り取り、2 mLの精製水をそれに加えた。比較的緩やかに混合したところ、30秒以内に溶解することが見出された。さらに3 mLの水を添加し、溶液を混合し、pHを決定したところ、5.4であった。同じ手順を用いて、酢酸オルンチド(オルニレリックス(ornirelix)として当業界で公知である)の溶解性を試験した。10 mg/mLの最終濃度は、本発明者らが酢酸オルンチドについて達成することができたものの約2倍であることが見出された。
【００５３】
それとは別に、別の50 mgのアリコートを量り取り、1 mlの水を添加した。これも溶解した。これは50 mg/mLの濃度であり、これは酢酸オルンチドを用いて溶解することができるものの10倍である。かくして、新規GnRHアンタゴニストの水溶性は驚くほど良好であることが見出された。
【００５４】
2. 本発明のGnRHアンタゴニストの一実施形態のin vivoにおける投与
in vivoでテストステロンを抑制する新規GnRHアンタゴニストの薬理学的効力を証明するために、当業界に認知された標準的な実験的ラットモデルを用いた。簡単に述べると、体重約300 gの雄のSprague DawleyラットをHarlan(Indianapolis, IN)から購入し、University of Kentucky Animal Research Facilityに認可されたプロトコルにより要求される検疫期間の直後に用いた。
【００５５】
評価を2群のラットにおいて行った。群1は新規GnRHアンタゴニストを投与される6匹のラットを含んでいた。他方の群は2匹のラットからなる対照群であった。新規GnRHアンタゴニストを皮下投与した(肩甲骨)。テストステロンレベルの測定のために、血液サンプル(1 mL)を0、1、3、6、12、24、および48時間で尾静脈から採取した。血清を2000 rpmで15分間の遠心分離により抽出し、テストステロン／LHレベルの測定まで-20℃で保存した。ラット血漿テストステロンを、Diagnostic Systems, Inc. Webster, TXから購入したActive(商標)Teststeron RIA DSL-4000キットを用いて測定した。十分な洗い流し期間を達成するために、前記用量を1週間間隔で投与した。表1は、注入スケジュール、ペプチド質量および希釈要件、ならびに新規GnRHアンタゴニスト投与のための注入容量を示す。
【００５６】
表1は、新規GnRHアンタゴニスト投与のためのプロトコルを示す。合計6匹のラットを、試験した各用量について用いた。第1週においては、各ラットは15μgの単回投与を受けた。第2週においては、用量を30μgに増加させた。次に、第3週においては、各ラットは60μgの単回投与を受けた。表2はビヒクルのみを受けた合計2匹のラットを含む対照ラット群である。
【表１】
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【００５７】
【表２】
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【００５８】
図2A-2Cは、新規GnRHアンタゴニスト投与の最初の3週間に関する結果を示す。図2Aに示されるように、ラットに、1匹あたり15μgの新規GnRHアンタゴニストを投与した場合、6時間で抑制が認められ、テストステロンレベルは0.2 ng/mL(平均±SD)に達した。テストステロンの化学的去勢(すなわち、0.5 ng/ml以下)は、テストステロンレベルが1.5 ng/mlに上昇し始めた後、約12時間持続した。
【００５９】
ラットに、1匹あたり30μgの新規GnRHアンタゴニストを投与した場合、抑制は少なくとも12時間持続し、24時間までに、テストステロンレベルは0.5 ng/mLを超えた。図2Bを参照されたい。図2Cに示されるように、60μgの用量から得られたデータは、30μgの用量を用いた場合に認められたものと類似する結果を示している。
【００６０】
好ましい実施形態のこれまでの記載は、当業者が本発明を作製し、使用することができるようにするために提供されたものである。これらの実施形態に対する様々な変更が当業者にとっては容易に明らかとなるであろうし、本明細書に定義される一般的な原理を、本発明の能力を用いずに他の実施形態に適用することができる。かくして、本発明は、本明細書に示される実施形態に限定されることを意図されないが、本明細書に開示される原理および新規特徴と一致する最も広い範囲に従うべきである。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図1は、本発明のGnRHアンタゴニスト類似体の一実施形態の構造を示す。
【図２】図2は、3週間に渡るGnRHアンタゴニスト(AcDNal1, DpCIPhe2, D3Pal3, Ser4, NicLys5, D(6ANic)Orn6, Leu7, IprLys8, Pro9, DAla10 NH2)の投与後のラットにおける平均血清テストステロンレベルを示す。第1週における15μg／ラット(2A)、第2週における30μg／ラット(2B)および第3週における60μg／ラット(2C)の用量での、図1に示される化学構造を有する類似体の投与後のテストステロンレベルを示す。
【図２Ａ】図2Aは、第1週における15μg／ラットの用量での、図1に示される化学構造を有する類似体の投与後のテストステロンレベルを示す。
【図２Ｂ】図2Bは、第2週における30μg／ラットの用量での、図1に示される化学構造を有する類似体の投与後のテストステロンレベルを示す。
【図２Ｃ】図2Cは、第3週における60μg／ラットの用量での、図1に示される化学構造を有する類似体の投与後のテストステロンレベルを示す。
【図３Ａ】図3Aは、3週間に渡る、対照ラット(すなわち、ビヒクルのみの投与後)における平均血清テストステロンレベルを示す。第1週における0.3 ml／ラットの用量での、注入用水(WFI)の投与後のテストステロンレベルを示す。
【図３Ｂ】図3Bは、3週間に渡る、対照ラット(すなわち、ビヒクルのみの投与後)における平均血清テストステロンレベルを示す。第2週における0.3 ml／ラットの用量での、注入用水(WFI)の投与後のテストステロンレベルを示す。
【図３Ｃ】図3Cは、3週間に渡る、対照ラット(すなわち、ビヒクルのみの投与後)における平均血清テストステロンレベルを示す。第3週における0.3 ml／ラットの用量での、注入用水(WFI)の投与後のテストステロンレベルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【国際調査報告】
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