(57)【要約】本発明は、新規な化学構造を有し、かつＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤としての優れた活性を保有する単離された因子を提供する。本発明は、さらに、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する方法を提供する。本発明は、さらに、本発明の標識された化合物、特に蛍光標識化合物を使用するアッセイ方法を提供する。本発明は、さらに、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する方法を提供する。該方法は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを有効量の該因子の１つと接触させることを含む。また、本発明は、細胞においてアポトーシスを促進するための、および低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる病態の重症度を低下させる方法も提供する。
2008537735.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＰＩ１５７７−１、ＴＰＩ１５７７−２、ＴＰＩ１５７７−３、ＴＰＩ１５６７−５、ＴＰＩ１５７７−６、ＴＰＩ１５７７−７、ＴＰＩ１５７７−８、ＴＰＩ１５６７−１１、ＴＰＩ１５６７−１２、ＴＰＩ１５６７−１３、ＴＰＩ１５６７−１４、ＴＰＩ１５７７−９、ＴＰＩ１５６７−２３、ＴＰＩ１５６７−２４、ＴＰＩ１５６７−１８、ＴＰＩ１５７２−８、ＴＰＩ１５７２−１５、ＴＰＩ１５７２−１６、ＴＰＩ１５７２−１０、ＴＰＩ１５７２−１１、ＴＰＩ１５７２−１４、ＴＰＩ１５７２−１７、ＴＰＩ１５７２−１８、ＴＰＩ１５７２−１９、ＴＰＩ１５７２−２０、ＴＰＩ１５７２−２１、ＴＰＩ１５７２−２２またはＴＰＩ１５７２−２３として本明細書中で同定された化合物の１つを含む、単離された因子。
【請求項２】
希釈剤と混合された請求項１記載の単離された因子を含む、組成物。
【請求項３】
請求項１または２記載の因子と、医薬上許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項４】
請求項１記載の化合物の１つよりなる群から選択される因子に結合したＩＡＰを含む、複合体。
【請求項５】
前記ＩＡＰが、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、ＮＩＡＰ、ＢＲＵＣＥ（Ａｐｐｏｌｌｏｎ）、ＭＬ−ＩＡＰ、ＩＬＰ２、ＤＩＡＰ−１、ＤＩＡＰ−２およびスルビビンよりなる群から選択される、請求項４記載の複合体。
【請求項６】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する方法であって、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するのに有効な量の因子と接触させることを含み、ここで、該因子は請求項１記載の因子の群から選択される、方法。
【請求項７】
前記ＩＡＰが、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、ＮＩＡＰ、ＢＲＵＣＥ（Ａｐｐｏｌｌｏｎ）、ＭＬ−ＩＡＰ、ＩＬＰ２、ＤＩＡＰ−１、ＤＩＡＰ−２およびスルビビンよりなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−９およびショウジョウバエカスパーゼＤＣＰ−１、ＤＲＩＣＥおよびＤＲＯＮＣよりなる群から選択される、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記接触がイン・ビトロで行われる、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
前記接触が細胞において起こる、請求項６記載の方法。
【請求項１１】
細胞においてアポトーシスを促進する方法であって、細胞を、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するのに有効な量の因子と接触させることを含み、該因子は請求項１記載の因子の群から選択される、方法。
【請求項１２】
前記細胞は真核生物細胞である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記ＩＡＰが、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、ＮＩＡＰ、ＢＲＵＣＥ（Ａｐｐｏｌｌｏｎ）、ＭＬ−ＩＡＰ、ＩＬＰ２、ＤＩＡＰ−１、ＤＩＡＰ−２およびスルビビンよりなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１４】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−９、ならびにショウジョウバエカスパーゼＤＣＰ−１、ＤＲＩＣＥおよびＤＲＯＮＣよりなる群から選択される、請求項１１記載の方法。
【請求項１５】
個体において病態の重症度を低下させる方法であって、病理学的に低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる病態を有する個体に、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するのに効果的な量の因子を投与することを含み、該因子は請求項１記載の因子の群から選択される、方法。
【請求項１６】
前記病態が癌である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記病態が、乾癬、過形成、自己免疫疾患および再狭窄よりなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記ＩＡＰが、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１、ｃ−ＩＡＰ−２、ＮＩＡＰ、ＢＲＵＣＥ（Ａｐｐｏｌｌｏｎ）、ＭＬ−ＩＡＰ、ＩＬＰ２、ＤＩＡＰ−１、ＤＩＡＰ−２およびスルビビンよりなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記カスパーゼが、カスパーゼ−３、カスパーゼ−７およびカスパーゼ−９ならびにショウジョウバエカスパーゼＤＣＰ−１、ＤＲＩＣＥおよびＤＲＯＮＣよりなる群から選択される、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
第二の治療剤を投与することをさらに含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法であって、
（ａ）標識された候補剤を供する工程であって、該標識された候補剤は標識に共有結合により連結された候補剤である、工程；
（ｂ）ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のいずれかのメンバーの非存在下で、該標識された候補剤についての非結合シグナルを検出する工程；
（ｃ）ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーの存在下で、該標識された候補剤についての結合シグナルを検出する工程；および
（ｄ）該非結合シグナルを該結合シグナルと比較する工程、
を含み、ここで、該結合シグナルと非結合シグナルとの間の差は、該ＩＡＰまたはＩＡＰ断片への該候補剤の結合を示し、それにより、ＩＡＰまたはＩＡＰ断片への候補剤の結合がＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として候補剤を同定する、方法。
【請求項２２】
前記ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーが、ＩＡＰである、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＡＰがＸＩＡＰである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーがＩＡＰ断片である、請求項２１記載の方法。
【請求項２５】
前記ＩＡＰ断片が、ＸＩＡＰのＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＢＩＲ１−２、またはＸＩＡＰのＢＩＲ１−２−３である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記ＩＡＰ断片が、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ―ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ２である、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記標識が蛍光標識である、請求項２１記載の方法。
【請求項２８】
前記標識がローダミンまたはフルオレセインであって、前記シグナルが蛍光偏光シグナルである、請求項２１記載の方法。
【請求項２９】
ＩＡＰに結合する因子を同定する方法であって、
（ａ）標識された候補剤を供する工程であって、該標識された候補剤は標識に共有結合により連結された候補剤である、工程；
（ｂ）ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のいずれかのメンバーの非存在下で、該標識された候補剤についての非結合シグナルを検出する工程；
（ｃ）ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーの存在下で、標識された候補剤についての結合シグナルを検出する工程；および
（ｄ）該非結合シグナルおよび該結合シグナルを比較する工程
を含み、ここで、該結合シグナルと非結合シグナルとの間の差はＩＡＰまたはＩＡＰ断片への候補化合物の結合を示し、それにより、ＩＡＰまたはＩＡＰデンペンへの候補剤の結合が、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として候補剤を同定する、方法。
【請求項３０】
前記ＩＡＰおよびＩＡＰ断片より成る群のメンバーがＩＡＰである、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記ＩＡＰがＸＩＡＰである、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーがＩＡＰ断片である、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
前記ＩＡＰ断片が、ＸＩＡＰのＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＢＩＲ１−２、またはＸＩＡＰのＢＩＲ２である、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記ＩＡＰ断片が、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ―ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ２である、請求項３４記載の方法。
【請求項３５】
前記標識が蛍光標識である、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
前記標識がローダミンまたはフルオレセインを含み、前記シグナルが蛍光偏光シグナルである、請求項２９記載の方法。
【請求項３７】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法であって、
（ａ）標識された候補剤を供する工程であって、該標識された候補剤が標識に共有結合により連結された候補剤である、工程；
（ｂ）公知のＩＡＰ−結合化合物を供する工程；
（ｃ）ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーの存在下で、該標識された候補剤についての結合シグナルを検出する工程；
（ｄ）該公知のＩＡＰ−結合化合物、ならびにＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群から選択される群のメンバーの存在下で、該標識された候補剤についての解離シグナルを検出する工程；ならびに
（ｅ）該結合シグナルと該解離シグナルとを比較する工程
を含み、ここで、該結合シグナルと解離シグナルとの間の差は、該公知のＩＡＰ−結合化合物の非存在下におけるＩＡＰまたはＩＡＰ断片への候補剤の結合を示し、それにより、該公知のＩＡＰ−結合化合物の非存在下におけるＩＡＰまたはＩＡＰ断片への候補剤の結合が、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤として候補剤を同定する、方法。
【請求項３８】
前記ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーがＩＡＰである、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
前記ＩＡＰがＸＩＡＰである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
前記ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーがＩＡＰ断片である、請求項３７記載の方法。
【請求項４１】
前記ＩＡＰ断片が、ＸＩＡＰのＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＢＩＲ１−２、またはＸＩＡＰのＢＩＲ１−２−３である、請求項３７記載の方法。
【請求項４２】
前記ＩＡＰ断片が、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ―ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ２である、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記標識が蛍光標識である、請求項３７記載の方法。
【請求項４４】
前記標識がローダミンまたはフルオレセインを含み、前記シグナルは蛍光偏光シグナルである、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
ＩＡＰに結合する因子を同定する方法であって、
（ａ）標識された候補剤を供する工程であって、該標識された候補剤は標識に共有結合により連結された候補剤である、工程；
（ｂ）公知のＩＡＰ−結合化合物を供する工程；
（ｃ）ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーの存在下で、該標識された候補剤についての結合シグナルを検出する工程；
（ｄ）該公知のＩＡＰ−結合化合物、ならびにＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーの存在下で、該標識された候補剤についての解離シグナルを検出する工程；ならびに、
（ｅ）該結合シグナルと該解離シグナルとを比較する工程
を含み、ここで、該結合シグナルと解離シグナルとの間の差は、該公知のＩＡＰ−結合化合物の非存在下におけるＩＡＰまたはＩＡＰ断片への候補剤の結合を示し、それにより、該公知のＩＡＰ−結合化合物の非存在下におけるＩＡＰまたはＩＡＰ断片への候補剤の結合が、ＩＡＰに結合する因子として候補剤を同定する、方法。
【請求項４６】
前記ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーがＩＡＰである、請求項４５記載の方法。
【請求項４７】
前記ＩＡＰがＸＩＡＰである、請求項４５記載の方法。
【請求項４８】
前記ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーはＩＡＰ断片である、請求項４５記載の方法。
【請求項４９】
前記ＩＡＰ断片が、ＸＩＡＰのＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＢＩＲ１−２−３、またはＸＩＡＰのＢＩＲ１−２である、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
前記ＩＡＰ断片が、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ―ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ２である、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記標識が蛍光標識である、請求項４５記載の方法。
【請求項５２】
前記標識がローダミンまたはフルオレセインを含み、前記シグナルが蛍光偏光シグナルである、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
ＩＡＰに結合する因子を同定する方法であって、
（ａ）ＩＡＰまたはＩＡＰの断片に連結されたシンチレーションビーズを供する工程；
（ｂ）標識された化合物を供する工程であって、該化合物は放射性標識で標識され、さらに、ＩＡＰまたはＩＡＰの断片に結合することが公知である、工程；
（ｃ）ＩＡＰまたはＩＡＰの断片に連結された該シンチレーションビーズを、候補化合物の存在下および非存在下において、該標識された化合物と接触させる工程；および
（ｄ）該候補化合物の存在下、および該候補化合物の非存在下において、該シンチレーションシグナルを測定する工程
を含み；ここで、該候補化合物の存在下におけるシンチレーションシグナルと、該候補化合物の非存在下におけるシンチレーションシグナルとの間の差は、該候補化合物がＩＡＰまたはＩＡＰの断片に結合することを示す、方法。
【請求項５４】
前記ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーがＩＡＰである、請求項５３記載の方法。
【請求項５５】
前記ＩＡＰがＸＩＡＰである、請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
前記ＩＡＰおよびＩＡＰ断片よりなる群のメンバーがＩＡＰ断片である、請求項５３記載の方法。
【請求項５７】
前記ＩＡＰまたはＩＡＰの断片が、ＸＩＡＰのＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＢＩＲ１−２、またはＸＩＡＰのＢＩＲ２である、請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
前記ＩＡＰまたはＩＡＰの断片が、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＧＳＴ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ―ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＴｈｉｏ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＢＯＰ−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ６−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ７−ＢＩＲ２、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ１−２−３、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ１−２、ＸＩＡＰのＨｉｓ８−ＢＩＲ２である、請求項６４記載の方法。
【請求項５９】
前記標識が蛍光標識である、請求項５３記載の方法。
【請求項６０】
前記標識がローダミンまたはフルオレセインを含み、前記シグナルが蛍光偏光シグナルでる、請求項５３記載の方法。
【請求項６１】
ＩＡＰに結合する因子を同定する方法であって、
（ａ）固定化されたＩＡＰまたはＩＡＰ断片を供する工程；
（ｂ）該固定化されたＩＡＰまたはＩＡＰ断片を標識された化合物と接触させる工程であって、該標識された化合物は適当な標識に連結された化合物であり、ＩＡＰまたはＩＡＰの断片に結合することが知られており、それにより、ＩＡＰまたはＩＡＰ断片および標識された化合物の結合複合体が形成される、工程；
（ｃ）該結合複合体を候補化合物に接触させる工程；ならびに
（ｄ）該候補化合物の存在下および非存在下において標識シグナルを測定することを含み、それにより、候補シグナルの存在下および非存在下における標識シグナルの差は、候補化合物がＩＡＰまたはＩＡＰの断片に結合することを示す、方法。
【請求項６２】
前記標識が蛍光標識である、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記標識がビオチンである、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
前記標識が放射性標識である、請求項６１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、一般には、分子医薬、さらに詳しくは、プログラムされた細胞死の調節に関与する分子相互作用を改変するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
身体中の正常な組織は、最終形に分化した状態に到達し、もはや分裂しない細胞によって、あるいは一定期間後に死滅し、分裂する細胞のプールから置き換えられた細胞によって形成される。例えば、神経組織は発生の初期に形成され、神経系の細胞は誕生後にまもなく最終形に分化した状態に到達する。対照的に、身体は、細胞の誕生および死滅のバランスされたフラックスを受ける皮膚、腸、骨髄および生殖器官のような多数の自己再生する組織を有する。平均的成人において一日当たり５００から７００億細胞の産生をもたらし、数年間にわたって全体重と同等な細胞の質量に達するこのフラックスは、等価な数の細胞の調節された根絶によってバランスされる。自己再生する組織において、根絶は、部分的には、一定期間の後に細胞が死滅するように遺伝子的に「プログラムされた」アポトーシスとして知られたプログラムされた細胞死のプロセスにより維持される。
【０００３】
アポトーシスは生物の発生の間に特に顕著であり、そこでは、一過的な機能を行う細胞は、それらの機能がもはや要求されないようになった後に死滅するようにプログラムされている。加えて、アポトーシスが、主な遺伝的改変を受ける細胞で起こり得、かくして、生物に、血管があり潜在的には癌を形成する細胞を除くための手段を与える。また、アポトーシスは、例えば、細菌トキシン、エタノールおよび紫外線照射を含めた種々の外的刺激への生物の暴露により誘導され得る。癌を治療するための化学療法剤もまたアポトーシスの優れたインデューサーである。
【０００４】
プログラムされた細胞死の調節は、多数の経路に関係する複雑なプロセスであり、場合により、プログラムされた細胞死の調節において欠陥が起こる。組織中の細胞の定常状態数を維持するにおける、または生物の発生の間において適切な細胞を維持するにおけるこのプロセスの臨界的な役割を仮定すると、プログラムされた細胞死における欠陥は、しばしば、病態に関連する。余りにも少ない、または余りにも多い細胞死のいずれかが、適切な療法が現在存在しない病気の半分を超えるものに関与すると見積もられている。
【０００５】
種々の病気状態は生物におけるプログラムされた細胞死の異常な調節により起こる。例えば、組織の定常状態を維持するのに必要とされる正常なレベルと比較して、組織において減少したレベルのアポトーシスをもたらす欠陥の結果、組織において細胞の増大がもたらされ得る。細胞数を増大させるそのようなメカニズムは種々の癌で同定されており、そこでは、腫瘍の形成は、癌細胞は、必ずしも、それらの正常なカウンターパートよりも迅速に分裂するからというのではなく、該正常な速度で死滅しないという理由で起こる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
かくして、プログラムされた細胞死滅経路を改変することができる因子、およびプログラムされた細胞死の異常な調節に関連する病気を患う個体を治療する方法に対して要望が存在する。本発明はこの要望を満足するものであり、同様にさらなる利点を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、構造ＴＰＩ  １５７７−１、ＴＰＩ  １５７７−２、１５７７−３、ＴＰＩ  １５７６−５、ＴＰＩ  １５７７−６、ＴＰＩ  １５７７−７、ＴＰＩ  １５７７−８、ＴＰＩ  １５７７−９、ＴＰＩ  １５６７−１１、ＴＰＩ  １５６７−１２、ＴＰＩ  １５６７−１３、ＴＰＩ  １５６７−１４、ＴＰＩ  １５６７−２３、ＴＰＩ  １５６７−２４、ＴＰＩ  １５６７−１８、ＴＰＩ  １５７２−８、ＴＰＩ  １５７２−１５、ＴＰＩ  １５７２−１６、１５７２−１０、１５７２−１１、１５７２−１４、１５７２−１７、１５７２−１８、１５７２−１９、ＴＰＩ  １５７２−２０、ＴＰＩ  １５７２−２１、ＴＰＩ  １５７２−２２またはＴＰＩ  １５７２−２３の１つを有する単離された因子を提供する。これらの化合物はＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤である。本発明は、さらに、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する方法を提供する。該方法は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを有効量の該因子の１つと接触させることを含む。また、本発明は、細胞においてアポトーシスを促進するための、および低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる病態の重症度を低下させる方法も提供する。
【０００８】
本発明は、さらに、ＩＡＰ−阻害カスパーゼ抑制解除剤を同定するためのアッセイ方法を提供する。１つの方法は、標識された候補剤を供し、ＩＡＰまたはＩＡＰの断片の存在下および非存在下において標識シグナルを測定することを含む。ＩＡＰまたはその断片の存在下または非存在下における標識シグナルの差は、ＩＡＰまたはその断片への候補剤における結合程度の尺度である。該方法は、所望により、結合曲線を作成し、結合したおよび結合していない標識シグナルの間の差に対してＩＡＰ（またはその断片）または候補剤いずれかの濃度をプロットすることを含んでもよい。
【０００９】
本発明は、さらに、ＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤を同定するためのもう１つのアッセイ方法を提供する。標識された候補剤をまず供する。標識シグナルを、ＩＡＰおよびその断片の非存在下において標識された候補剤について測定する。次いで、公知のＩＡＰ−結合剤およびＩＡＰまたはその断片の存在下において標識された候補剤について標識シグナルが得られる。第一および第二の標識シグナルの間の差は、ＩＡＰに対する候補剤の相対的親和性に対応し、かくして、候補剤のＩＡＰ阻害カスパーゼ抑制解除剤活性を示す。該方法は、所望により、結合曲線を作成し、結合したおよび結合していない標識シグナルの間の差に対してＩＡＰ（またはその断片）または候補剤いずれかの濃度をプロットすることを含む。
【００１０】
本発明は、コアペプチド４から３９および４２から５５よりなる群から選択されるコアペプチドを有する単離された因子を提供し、ここで、該因子はＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する。また、図５、９、１０、１４Ｂ、２１−２４、３４、３５および３６に示された構造のいずれかから選択されるコア構造を有する単離された因子が提供され、ここで、該因子はＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する。本発明は、さらに、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する方法を提供する。該方法はＩＡＰ−阻害カスパーゼを有効量の因子と接触させて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除することよりなり、該因子はコアペプチド４から３９および４２から５５に記載された配列を有するコアペプチドよりなる群から選択されるコアモチーフ；ＴＰＩ  ７５９、ＴＰＩ  ８８２、ＴＰＩ  ９１４またはＴＰＩ  ９２７よりなる群から選択されるコア構造；ＴＰＩ  １３９１，ＴＰＩ  １３４９、ＴＰＩ  １３９６、ＴＰＩ  １５０９、ＴＰＩ  １５４０、ＴＰＩ  １４００、ＴＰＩ  ７９２およびＴＰＩ  １３３２から選択されるコア構造を有する。また、本発明は、細胞においてアポトーシスを促進するための、および低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる病態の重症度を軽減するための方法も提供する。ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法がさらに提供される。
【００１１】
本発明は、さらに、ＩＡＰに結合する因子を同定する均一系ラジオアッセイ方法を提供する。該方法は、ＩＡＰまたはＩＡＰの断片およびＩＡＰまたはＩＡＰの断片に結合することが知られている化合物に連結されたシンチレーションリーズを供することを含む。公知のＩＡＰ結合化合物は、例えば、トリチウム標識で放射性標識される。次いで、候補化合物の存在下で、シンチレーションビーズを放射性標識ＩＡＰ結合化合物と接触させる。公知のＩＡＰ結合化合物の結合は、シンチレーション近似方法によるシンチレーションカウンティングによって測定される。候補化合物の存在下におけるシンチレーションカウントの減少は、候補化合物が公知のＩＡＰ結合化合物と競合することを示す。かくして、このアッセイにおいてシンチレーションカウントの減少を引き起こす候補化合物はＩＡＰ結合化合物として同定される。候補化合物の結合定数は、例えば、既知の濃度の公知のＩＡＰ結合化合物に対して候補化合物を滴定することによって調製することができる。
【００１２】
また、本発明は、ＩＡＰに結合する因子を同定するもう１つの方法を提供する。該方法は不均一競合アッセイであり、これは、商業的に入手可能な９６ウェルプレートのような支持体にＩＡＰまたはＩＡＰの断片を固定化することを含む。次いで、固定化されたＩＡＰ
またはＩＡＰの断片を、ＩＡＰに結合する公知の化合物と接触させる。公知の化合物は、蛍光標識、放射性標識、ビオチン、酵素などのような適当な標識で標識する。公知の化合物およびＩＡＰまたはＩＡＰの断片は結合した複合体を結成し、これは洗浄に際してさえ固定化されたままである。シグナルは結合した複合体から得ることができ、これは、陰性対照を表す。結合した複合体を候補剤と接触させる。もし候補剤がＩＡＰまたはＩＡＰの断片に競合して結合するならば、それは結合した複合体から標識された公知の化合物を置き換えるであろう。洗浄後、それは標識シグナルであり、次いで、複合体について測定する。陰性対照標識シグナルからの標識シグナルの減少は、候補化合物がＩＡＰまたはＩＡＰの断片に競合的に結合することを示す。かくして、標識シグナルの減少を引き起こす候補化合物はＩＡＰ結合化合物として同定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
（発明の詳細な説明）
本発明は、アポトーシス蛋白質の阻害剤（ＩＡＰ）がカスパーゼのプロテアーゼ活性を阻害するのを、またはカスパーゼに結合するのを抑制する因子を提供する。本発明の因子の利点は、それを用いて、アポトーシスがＩＡＰの調節活性によって妨げられる細胞においてアポトーシスが起こるようにすることができることである。従って、本発明は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を細胞に投与することによって、細胞の集団はイン・ビトロまたはエクス・ビボで生存する能力を低下させる方法を提供する。そのような方法における特定のＩＡＰ−誘導カスパーゼに対する特異性を有する因子の使用は、より大きな混合集団中細胞の亜集団を選択的に標的化し、殺傷することができる。また、個体に本発明の因子を投与することによって、癌または過形成のようなアポトーシスの生理学的に低下されたレベルによって特徴付けられる疾患を有する個体を治療する方法が提供され、ここで、該因子はＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し、それにより、アポトーシスのレベルを増大させる。
【００１４】
本発明は、さらに、アポトーシスの阻害剤を変調する因子を同定する方法を提供する。本発明の方法を用い、候補剤を、アポトーシス（ＩＡＰ蛋白質の阻害剤が、カスパーゼのプロテアーゼ活性を阻害するのを、またはカスパーゼへ結合するのを抑制する能力について測定することができる。抑制されていない場合のカスパーゼはアポトーシスを媒介する。かくして、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する方法によって決定された因子は、陰性調節化合物の存在下でアポトーシスが起こるのを可能とする因子として同定される。本発明の方法の利点は、それらが、候補剤の大きなライブラリーをＩＡＰ−阻害カスパーゼの種々の抑制解除の同定について効果的にスクリーニングすることができることである。
【００１５】
本明細書中で用いるように、用語「カスパーゼ」は、ポリペプチド中のアスパラギン酸残基に対してＣ−末端側を切断し、アポトーシスに導く細胞死滅経路に関与するシステインアスパルチル−特異的プロテアーゼのファミリーのメンバーを意味することを意図する。該用語は、例えば、Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，  Ｃｅｌｌ  ８２：３４９−３５２（１９９５）に記載されたように当該分野におけるその使用に合致することを意図する。カスパーゼ類は、以前は、ＩＬ−１βの不活性な３３キロダルトン（ｋＤａ）形態を活性な１７．５ｋＤａ形態に変換する、該ファミリーの最初に同定されたメンバーである、インタロイキン−１β（ＩＬ−１β）変換酵素（Ｉｃｅ）に対するそれらの相同性に基づいて「Ｉｃｅ」プロテアーゼといわれた。Ｉｃｅプロテアーゼは、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ発生の間においてアポトーシスに関与するＣａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ  ｃｅｄ−３遺伝子に対して相同であることが判明しており、トランスフェクション実験は、線維芽細胞におけるＩｃｅの発現が細胞においてアポトーシスを誘導したことを示した（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，  前述，１９９５参照）。従って、該用語はＩｃｅおよびｃｅｄ−３を含む。
【００１６】
Ｉｃｅおよびｃｅｄ−３に対する相同性を共有するさらなるポリペプチドが同定されており、カスパーゼといわれ、各カスパーゼは番号によって識別される。例えば、元来同定されたＩｃｅプロテアーゼは今日ではカスパーゼ−１といわれ、カスパーゼ−３と以前はいわれたプロテアーゼはＣＰＰ３２、ＹＡＭＡおよびアポパインとして種々に調べており、以前はカスパーゼ−９と命名された今日のプロテアーゼはＭｃｈ６またはＩＣＥ−ＩＡＰ６として知られていた。プロテアーゼのカスパーゼファミリーは、各々が、アスパラギン酸残基に対してＣ−末端側を切断するシステインプロテアーゼであり、各々はアミノ酸配列ＱＡＣＸＧ（配列番号：１）を一般に含む保存された活性部位システインを有し、ここで、Ｘはいずれのアミノ酸でもあり得るが、しばしばアルギニンである。カスパーゼは、カスパーゼ−３およびカスパーゼ−７を含めたＤＥＶＤ（配列番号：２）切断活性を有するもの、およびカスパーゼ−１を含めたＹＶＡＤ（配列番号：３）切断活性を有するものにさらに小分けされる（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，  前述，  １９９５）。
【００１７】
本明細書中で用いるように、用語「ＩＡＰ」または「アポトーシス蛋白質の阻害剤」は、カスパーゼの蛋白質分解活性を阻害する蛋白質を意味することを意図する。該用語は、カスパーゼに結合した場合に、カスパーゼの蛋白質分解活性を阻害する蛋白質を含むことができる。また、該用語は、カスパーゼの前駆体を加工して成熟形態とする上流カスパーゼの能力を阻害することによって下流カスパーゼの蛋白質分解活性を阻害する蛋白質を含むことができる。また、カスパーゼの普遍化および分解を誘導する蛋白質も該用語に含まれる。
【００１８】
抗アポトーシス蛋白質の蛋白質（ＩＡＰ）蛋白質ファミリーの阻害剤のメンバーは、脊椎動物および無脊椎動物動物種双方で見出されるホモログで進化を通じて保存されている。バキュロウィルスＩＡＰ、Ｃｐ−ＩＡＰおよびＯｐ−ＩＡＰは、細胞死滅阻害剤ｐ３５、カスパーゼに結合し、それを阻害するバキュロウィルス蛋白質において欠陥を機能的に補充するそれらの能力に基づいて同定されるプロファミリーの最初のメンバーであった。引き続いて、少なくとも７つのさらなるヒトホモログが同定されており、Ｘ染色体連結ＩＡＰ（ＸＩＡＰ、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｕ３２９７４）；細胞ＩＡＰ蛋白質、ｃ−ＩＡＰ−１／ＨＩＡＰ−２／ｈＭＩＨＢおよびｃ−ＩＡＰ−２／ＨＩＡＰ−１／ｈＭＩＨＣ  （Ｌｉｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：３４９−３５３（１９９６）；Ｒｏｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８３：１２４３−１２５２（１９９５））；ニューロンアポトーシス阻害蛋白質、ＮＡＩＰ（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  ８０：１６７−１７８（１９９５））；ＬＩＶＩＮともいわれるＭＬ−ＩＡＰ（Ｖｕｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒ．Ｂｉｏｌ．  １０：１３５９−１３６６（２０００）およびＫａｓｏｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７６：３２３８−３２４６（２００１））；Ａｐｏｌｌｏｎ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．  ２６４：８４７−８５４（１９９９））；およびスルビビン（Ａｍｂｒｏｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．  ３：９１７−９２１（１９９７））を含めた細胞死を阻害することが示されている。２つのＤｒｏｓｏｐｈｉｌａホモログ（ＤＩＡＰ１およびＤＩＡＰ２）もまた同定されており、細胞死を阻害することが示されている（Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３：２３９−２５２（１９９９））。Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａにおけるプログラムされた細胞死滅調節におけるＩＡＰ−ファミリー蛋白質についての中枢的役割は、ｒｅａｐｅｒ、ｈｉｄおよびｇｒｉｍを含めたハエにおけるいくつかのアポトーシス−誘導蛋白質がそれたの細胞傷害性メカニズムの一部としてＩＡＰに結合するという知見によって示唆された。他のＩＡＰ蛋白質は、ＣｉＩＡＰ、ＰｏＩＡＰ、ＣｐＩＡＰおよびＡＳＦＩＡＰ（Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  前述  （１９９９））のようなウィルスＩＡＰを含む。
【００１９】
本発明の因子によって標的とされるＩＡＰ蛋白質は、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７のようなエフェクターカスパーゼの活性を阻害するもの、およびカスパーゼ−９のようなイニシエーターカスパーゼを阻害するものを含む。ヒトＩＡＰ（ＸＩＡＰ、ｃＩＡＰ１、およびｃＩＡＰ２）は、カスパーゼ−３および−７を結合し、それを潜在的に阻害することが報告されており、Ｋｉは０．２から１０ｎＭの範囲である。これらのカスパーゼはアポトーシスプロテアーゼカスケードの末端側部分において働き、アポトーシスのイニシエーターよりはむしろエフェクターとして機能する。
【００２０】
全てのＩＡＰファミリーメンバーの普通の構造的特徴は、例えば、Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３：２３９−２５２（１９９９）に記載されたように１から３コピーで存在するバキュロウィルスＩＡＰリピート（ＢＩＲ）といわれる約７０アミノ酸モチーフである。ＢＩＲドメイン内で観察されるシステインおよびシスチジン残基の保存された存在および間隔は、該構造が亜鉛結合ドメインを表すことを示す。ＢＩＲドメインは区別される機能を呈することが示されている。例えば、ＸＩＡＰ（ＢＩＲ２）の第二のＢＩＲドメインはカスパーゼ―３についての優れた阻害剤であり、他方、ＸＩＡＰ（ＢＩＲ３）の第三のＢＩＲドメインはカスパーゼ−９を標的とする（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：１００８−１０１２（２０００）参照）。ＩＡＰのＮ−末端および中央部分に位置するＢＩＲモチーフに加えて、ＲＩＮＧフィンガードメインは、ＩＡＰ蛋白質ファミリーメンバーのＣ−末端部分に位置する（Ｂｉｒｎｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．  ６８：２５２１−２５２８（１９９４））。ＢＩＲドメインはコンセンサス配列：
【００２１】
【化１】
2008537735.tif 000003
（配列番号：１６）を有するアミノ酸配列に対応し、ここで、Ｘａａ１はいずれかのアミノ酸であり、Ｘａａ２はいずれかのアミノ酸であるか、または存在せず、Ｘａａ３は疎水性アミノ酸（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、またはＶａｌ）であり、Ｘａａ４はセリンまたはスレオニンであり、Ｘａａ５はフェニルアラニンまたはチロシンであり、Ｘａａ６はプロリンであるか、または存在せず、Ｘａａ７はアスパラギン酸またはグルタミン酸であり、およびＸａａ８は塩基性アミノ酸（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、またはＬｙｓ）である。
【００２２】
本明細書中で用いるように、用語「ＩＡＰ−阻害カスパーゼ」は、アポトーシス蛋白質の阻害剤の存在のため蛋白質分解活性が妨げられ、または抑制されるシステインアスパルチル−特異的プロテアーゼを意味することを意図する。該用語は、アポトーシス蛋白質の結合阻害剤による低下した活性を有するシステインアスパルチル−特異的プロテアーゼを含むことができる。該用語は、アポトーシス蛋白質の阻害剤の存在のため蛋白質分解活性が可能な成熟形態に加工されるのが妨げられ、または抑制されるシステインアスパルチル−特異的プロテアーゼも含むことができる。本発明でいうような加工されていからステインアスパルチル−特異的プロテアーゼの例は、付着されたプロ−ドメインを有するプロ−カスパーゼである。別法として本発明の組成物および方法、プロドメインを含有しない、またはプロカスパーゼではないＩＡＰ−阻害カスパーゼに向けることができる。
【００２３】
本明細書中で用いるように、用語「抑制解除する」は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼに言及して用いる場合、カスパーゼの蛋白質分解活性を阻害するＩＡＰの能力の低下、阻害または防止を意味することを意図する。従って、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤は、カスパーゼ蛋白質分解活性を阻害するＩＡＰの能力を阻害し、または妨げる分子である。該用語は、カスパーゼの普遍化および分解を誘導するＩＡＰの活性の阻害または防止を含むことができる。
【００２４】
本明細書中で用いるように、用語「因子」は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除することができる単純なまたは複雑な有機分子、ペプチド、ペプチドミメティック、蛋白質またはオリゴヌクレオチドのような合成または単離生物学的分子を意味する。
【００２５】
本明細書中で用いるように、用語「医薬上許容される担体」は、ヒトで用いられる十分な純度および品質を有する媒体を意味することを意図する。そのような媒体は水、リン酸ナトリウム緩衝液、リン酸緩衝化生理食塩水、ノーマルセーラインまたはリンゲル液もしくは他の生理学的に緩衝化された生理食塩水のようなヒト医薬グレードの滅菌媒体、あるいはグリコール、グリセロールのような他の溶媒またはビークル、オリーブ油のような油、または注射有機エステルであり得る。医薬上許容される媒体は汚染粒子および生物を実質的に含まない。
【００２６】
本明細書中で用いるように、用語「阻害する」は、蛋白質活性に言及して用いる場合、基質に対する蛋白質の親和性を減少させることによる、あるいは蛋白質が基質を産物に変換する触媒速度を減少することによる、活性の低下を意味することを意図する。該用語は、例えば、カスパーゼ基質に対するＩＡＰの親和性の減少、ポリペプチド基質に対するカスパーゼの親和性の減少、カスパーゼがアスパラギン酸残基のＣ−末端側でペプチドを切断する速度の減少、またはカスパーゼが普遍化し、または蛋白質分解により分解する速度の減少を含む。
【００２７】
本明細書中で用いるように、用語「単離された」は、因子に言及して用いる場合、該因子が１以上の試薬、前駆体または他の反応産物から分離されることを意味する。従って、単離された因子は、該因子を生じる合成反応または反応経路で見出される１以上の化合物を含むまない因子である。また、該用語には、天然で一緒に見出される１以上の化合物を含まない因子も含まれる。単離された因子は実質的に純粋な因子も含む。該用語は、コンビナトーリアル化学方法によって生じ、化学的精製によって、あるいは第二の分子とで共精製されるべき十分な安定性でもって第二の分子に結合することによって前駆体および他の産物から分離された分子を含むことができる。該用語は、生合成反応の産物のような天然に生じる因子、または天然に生じない因子を含むことができる。
【００２８】
本明細書中で用いるように、用語「ペプチド」とは、１つのアミノ酸のカルボキシルおよびもう１つのアミノ酸のアミノ基の間の共有結合によって連結された２以上のアミノ酸を含有する分子をいう。本発明のペプチドは、より大きなペプチド、蛋白質、蛋白質の断片、ペプトイド、ペプチドミメテックスなどのようなより大きな分子または因子に含め得る。ペプチドは、天然に生じないが、イン・ビトロ方法の結果として生じる天然に生じない分子であり得るか、あるいはｃＤＮＡライブラリーから発現された蛋白質またはその断片のような天然に生じる分子であり得る。ペプチドは線状、環状または多価のいずれかであり得、その立体配座は当該分野でよく知られた方法を用いて達成することができる。該用語は、天然に生じるプロテオ原性アミノ酸ならびにＤ−アミノ酸およびアミノ酸アナログのような天然に生じないアミノ酸を含み、そのいずれも当該分野で公知の方法を用いてペプチドに一体化させることができる。この定義に鑑みると、当業者であれば、本明細書中におけるアミノ酸への言及は、特に断りのない限り、例えば、天然に生じるプロテオ原性Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、アミノ酸アナログのような化学的修飾されたアミノ酸、ノルロイシンのような天然に生じる非プロテオ原性アミノ酸、および化学的に合成された因子を含む。本発明で有用な例示的なアミノ酸は以下にさらに記載する。
【００２９】
本明細書中で用いるように、用語「プロテオ原性」は、アミノ酸に言及して用いる場合には、アミノ酸をよく知られた代謝経路を介して細胞中の蛋白質に一体化できることを示す。アミノ酸はアルファ炭素における立体配置に言及する場合にＤまたはＬと命名される。立体配置に具体的に言及せずに本明細書中で言及されるアミノ酸は、アルファ炭素におけるＬ立体は位置を有すると理解される。プロテオ原性アミノ酸は、本明細書中においては、一文字または三文字暗号を用いて示され、例えば、Ｂｒａｎｄｅｎ  ａｎｄ  Ｔｏｏｚｅ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐｐ６−７（１９９１）に記載されたような当該分野で用いられる命名法に合致することを意図する。他のアミノ酸は当該分野で知られた命名法を用いて示され、例えば、ｐＣｌＰｈｅとはｐ−クロロ−フェニルアラニンをいい、ＴｈｉＡｌａとは２−チエニル−アラニンをいい、Ｎａｌとは３−（２−ナフチル）−アラニンをいい、３Ｉ−Ｔｙｒとは３−ヨード−チロシンをいい、Ｃｈａとはシクロヘキシルアラニンをいい、Ｌｙｓ−ｅ−Ｆｍｏｃとはリシン（ｅ−フルオレニルメトキシカルボニル）をいい、およびＯＥｔ−Ｔｙｒとはチロシン（Ｏ−エチル）をいう。
【００３０】
本明細書中で用いるように、用語「コア」とは、分子の化学的構造またはモチーフ、またはその部分を意味することを意図する。該化学構造またはモチーフは、例えば、ペプチドまたはペプチド含有分子のアミノ酸配列、または分子中の原子の共有結合を表す化学式であり得る。該用語に含まれる化学的構造またはモチーフは、さらに、キラルティに関して定義することができる。コアペプチドまたは他の化学的存在は分子の中央に位置する必要はない。
【００３１】
本発明は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する単離された因子を提供する。ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は：
（Ｌ−Ａｌａ）−Ｘ１−（Ｌ−Ｔｒｐ）−Ｘ２（コアペプチド４）
［式中、Ｘ１はＬ−ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐであって、Ｘ２はＬ−ＴｈｉＡｌａまたはＬ−ｐＣｌＰｈｅである］
に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有することができる。コアペプチド４に含まれる例示的なコアペプチドは、例えば：
（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）（コアペプチド５）、
（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ）（コアペプチド６）および
（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）（コアペプチド７）
を含む。
【００３２】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４（コアペプチド２３）
［式中、Ｘ１はＬ−Ａｌａ、Ｌ−Ｃｈａ、Ｌ−Ｎａｌ、Ｄ−ＴｒｐまたはＤ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）であり；Ｘ２はＤ−Ｎａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｌ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｄ−ＣｈａまたはＤ−ＴｈｉＡｌａであり；Ｘ３はＬ−Ｔｒｐ、Ｌ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）またはＤ−Ｐｈｅであり；およびＸ４はＬ−Ｎａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｒｐ（ＣＨＯ）、Ｌ−ＴｈｉＡｌａ、Ｌ−３Ｉ−ＴｙｒまたはＬ−ｐＣｌＰｈｅである］
に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有することができる。コアペプチド２３に含まれる例示的なコアペプチドは、例えば：
（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｄ−Ｎａｌ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｎａｌ）（コアペプチド２４）
（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｎａｌ）（コアペプチド２５）
（Ｌ−Ｃｈａ）−（Ｄ−Ｎａｌ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）（コアペプチド２６）
（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−３１−Ｔｙｒ）（コアペプチド２７）
（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）（コアペプチド２８）
（Ｌ−Ｃｈａ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ）（コアペプチド２９）
（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）（コアペプチド３０）
（Ｌ−Ａｌａ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）（コアペプチド３１）
（Ｌ−Ｎａｌ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）（コアペプチド３２）
（Ｌ−Ｎａｌ）−（Ｄ−Ｃｈａ）−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）（コアペプチド３３）
（Ｌ−Ｎａｌ）−（Ｄ−ＴｈｉＡｌａ）−（Ｄ−Ｐｈｅ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）（コアペプチド３４）を含む。
【００３３】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４（コアペプチド８）
［式中、Ｘ１はＤ−ＮａｌまたはＬ−ＴｈｉＡｌａであり；Ｘ２はＬｙｓ−εＦｍｏｃ、Ｄ−ｐＣｌＰｈｅまたはＬ−Ｎａｌであり；Ｘ３はＤ−Ｎａｌ、Ｌ−ｐＣｌＰｈｅまたはＤ−Ｌｙｓ（Ｆｍ）であり；およびＸ４はＬｙｓ−εＦｍｏｃまたはＤ−ｐＦＰｈｅである］
に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有することができる。コアペプチド８に含まれる例示的なコアペプチドは、例えば：
（Ｄ−Ｎａｌ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）−（Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）（コアペプチド９）
（Ｄ−Ｎａｌ）−（Ｄ−ＰＣｌＰｈｅ）−（Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）（コアペプチド１０）
（Ｄ−Ｎａｌ）−（Ｌ−Ｎａｌ）−（Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）（コアペプチド１１）
（Ｄ−Ｎａｌ）−（Ｌ−Ｎａｌ）−（Ｄ−Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）（コアペプチド１２）
（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）−（Ｄ−Ｎａｌ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）（コアペプチド１３）
（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）−（Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ）−（ｐＦ−Ｄ−Ｆ）（コアペプチド１４）
（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）−（Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ）−（Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）（コアペプチド１５）
（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）−（Ｌ−Ｎａｌ）−（Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）（コアペプチド１６）
（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）−（Ｌ−Ｎａｌ）−（Ｄ−Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）−（Ｌｙｓ−εＦｍｏｃ）（コアペプチド１７）
を含む。
【００３４】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４（コアペプチド３５）
［式中、Ｘ１はＬ−ＴｈｉＡｌａまたはＰｈｅであり；Ｘ２はＤ−ｐＣｌＰｈｅまたはＤ−ＯＥｔ−Ｔｙｒであり；Ｘ３はＤ−Ｎａｌ、またはＤ−ＯＥｔ−Ｔｙｒであり；およびＸ４はＤ−ｐＣｌＰｈｅまたはＤ−ｐＮＯ２Ｐｈｅである］
に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有することができる。コアペプチド３５に含まれる例示的なコアペプチドは、例えば：
（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）−（Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ）−（Ｄ−Ｎａｌ）−（Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ）（コアペプチド３６）
（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）−（Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ）−（Ｄ−Ｎａｌ）−（Ｄ−ｐＮＯ２Ｐｈｅ）（コアペプチド３７）
（Ｌ−ＴｈｉＡｌａ）−（Ｄ−ＯＥｔ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−ＯＥｔ−Ｔｙｒ）−（Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ）（コアペプチド３８）
（Ｐｈｅ）−（Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ）−（Ｄ−Ｎａｌ）−（Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ）（コアペプチド３９）
を含む。
【００３５】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は：
Ａ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（コアペプチド１８）
［式中、Ｘ１はＭｅｔ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、またはＴｈｉＡｌａであって、Ｘ２およびＸ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｎｌｅ、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｌ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｌ−ＰｙｒＡｌａ、Ｄ−ＰｙｒＡｌａ、Ｌ−ＴｈｉＡｌａ、Ｄ−ＴｈｉＡｌａ、Ｌ−Ｔｉｃ、Ｄ−Ｔｉｃ、Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ、Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ、Ｌ−ｐＩＰｈｅ、Ｄ−ｐＩＰｈｅ、Ｌ−ｐＮＯ２Ｐｈｅ、Ｄ−ｐＮＯ２Ｐｈｅ、Ｌ−Ｎａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、ベーターＡｌａ、ｅ−アミノカプロン酸、Ｌ−Ｍｅｔ［Ｏ２］、Ｌ−ｄｅｈｙｄＰｒｏ、またはＬ−３Ｉ−Ｔｙｒから選択される］
に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列を有することができる。
【００３６】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は：
Ｘ１−Ｘ２−（Ｌ−Ｔｒｐ）−（Ｄ−Ｔｒｐ）（コアペプチド１９）
［式中、Ｘ１およびＸ２はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｄ−Ａｌａ、Ｄ−Ａｓｐ、Ｄ−Ｇｌｕ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−Ｈｉｓ、Ｄ−Ｉｌｅ、Ｄ−Ｌｙｓ、Ｄ−Ｌｅｕ、Ｄ−Ｍｅｔ、Ｄ−Ａｓｎ、Ｄ−Ｐｒｏ、Ｄ−Ｇｌｎ、Ｄ−Ａｒｇ、Ｄ−Ｓｅｒ、Ｄ−Ｔｈｒ、Ｄ−Ｖａｌ、Ｄ−Ｔｒｐ、Ｄ−Ｔｙｒ、Ｌ−Ｎｌｅ、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｌ−Ｃｈａ、Ｄ−Ｃｈａ、Ｌ−ＰｙｒＡｌａ、Ｄ−ＰｙｒＡｌａ、Ｌ−ＴｈｉＡｌａ、Ｄ−ＴｈｉＡｌａ、Ｌ−Ｔｉｃ、Ｄ−Ｔｉｃ、Ｌ−ｐＣｌＰｈｅ、Ｄ−ｐＣｌＰｈｅ、Ｌ−ｐＩＰｈｅ、Ｄ−ｐＩＰｈｅ、Ｌ−ｐＮＯ２Ｐｈｅ、Ｄ−ｐＮＯ２Ｐｈｅ、Ｌ−Ｎａｌ、Ｄ−Ｎａｌ、ベーターＡｌａ、ｅ−アミノカプロン酸、Ｌ−Ｍｅｔ［Ｏ２］、Ｌ−ｄｅｈｙｄＰｒｏ、またはＬ−３Ｉ−Ｔｙｒから選択される］
に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有することができる。
【００３７】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は：
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｗ−Ｗ（コアペプチド５５）
［式中、Ｘ１、Ｘ２およびＸ３はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｒまたはＴｙｒ、から選択され、およびＸ４はＡｌａ，Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、ＴｈｒまたはＶａｌから選択される］
に対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有することができる。
【００３８】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は：
Ｘ１−Ｘ２−Ａ−Ａ−Ｗ−Ｗ（コアペプチド４３）、配列番号：７
Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ａ−Ｗ−Ｗ（コアペプチド４４）、配列番号：８
Ｘ１―Ｘ２−Ｒ−Ａ−Ｗ−Ｗ（コアペプチド４５）、配列番号：９
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ４−Ａ−Ｗ−Ｗ（コアペプチド４６）、
Ｘ１−Ｘ２−Ｃ−Ｋ−Ｗ−Ｗ（コアペプチド４７）、配列番号：１０
Ｘ１−Ｘ２−Ｌ−Ｘ３−Ｗ−Ｗ（コアペプチド２０）、
Ｘ１−Ｘ２−Ｒ−Ｘ３−Ｗ−Ｗ（コアペプチド２１）、
Ｘ１−Ｘ２−Ｇ−Ｘ３―Ｗ−Ｗ（コアペプチド２２）、
Ｘ１−Ｘ２−Ｔ−Ｘ３−Ｗ−Ｗ（コアペプチド４２）、
Ｘ１−Ｘ２−Ｖ−Ｘ３−Ｗ−Ｗ（コアペプチド４８）、
Ｘ１−Ｔ−Ｘ２−Ｘ３−Ｗ−Ｗ（コアペプチド４９）、
Ｘ１−Ｙ−Ｘ２−Ｘ３−Ｗ−Ｗ（コアペプチド５０）、
Ａ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｗ−Ｗ（コアペプチド５１）、
Ｃ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｗ−Ｗ（コアペプチド５２）、
Ｆ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｗ−Ｗ（コアペプチド５３）、または
Ｋ−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｗ−Ｗ（コアペプチド５４）、
［式中、Ｘ１、Ｘ２、およびＸ４はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＴｙｒから選択され、およびＸ３はＡｌａ、Ｌｙｓ、ＳｅｒまたはＴｈｒから選択される］
のいずれかに対応するコアペプチドまたはアミノ酸配列モチーフを有することができる。
【００３９】
本発明のコアペプチド配列は分子のそれら、または分子の部分であり得る。例えば、４つの位置を有する前記した配列はテトラペプチド分子であり得、４または６の位置を有する前記した配列はヘキサペプチド分子であり得る。本発明のコアペプチドは、例えば、少なくとも５のアミノ酸、少なくとも６のアミノ酸、少なくとも７のアミノ酸、少なくとも８のアミノ酸、少なくとも９のアミノ酸、少なくとも１０のアミノ酸、少なくとも２０のアミノ酸または少なくとも２５のアミノ酸を有する分子を含めたより大きな分子に含めることもできる。いくつかの具体例において、本発明のペプチドを含む分子のアミノ酸の長さは、当該ぺプチドがＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できる限りは、例えば、約４以下、約５以下、約６以下、約７以下、約８以下、約９以下、約１０以下、約２０以下、約２５以下、約５０以下、約１００以下、約１５０以下、約２００以下、またはそれ以上のアミノ酸の長さを含めた最大長さによって規定することができる。本発明のコアペプチドを有する分子もまた、前記した最小および最大の長さのいずれかの組合せによって限定されるサイズ範囲内で定義することもできる。
【００４０】
本発明は、さらに、非ペプチドベースのコア構造を有するＩＡＰ−阻害カスパーゼの効果的な抑制解除剤である因子を提供する。かくして、本発明は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除し、かつ図８に示されたＴＰＩ  ７５９のようなＮ−ベンジル−１，４，５−トリ置換−２，３−ジケトピペラジンに対応するコア構造を有する因子を提供する。ＴＰＩ  ７５９コア構造を有する因子は、例えば、図８に示されるように、ノルロイシン、ＮａｐＡｌａ、シクロへキシルアラニン、Ｌｙｓ、ノルバロイシンまたはバリンのアミノ酸側鎖基に由来する位置Ｒ１において；Ｌｅｕ、ＮａｐＡｌａ、Ｐｈｅ、ＩｌｅまたはＶａｌのアミノ酸側鎖基に由来するＲ２において；および４−イソブチル−アルファ−メチルフェニル酢酸、３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル酢酸、ヘプタン酸（アルファ−アルファ−アルファ−トリフルオロ−ｍ−トリル）酢酸、４−ｔｅｒｔ−ブチル−シクロヘキサンカルボン酸、ｍ−トリル酢酸、３，４−ジクロロフェニル酢酸、３，３−ジフェニルプロピオン酸、ジシクロヘキシル酢酸、シクロヘプタンカルボン酸、ｐ−トリル酢酸、またはシクロヘキサン酪酸に由来する官能基でＲ３において置換することができる。
【００４１】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、図７に示されるＴＰＩ  ８８２のようなＣ−６−アシルアミノ二環グアニジンに対応するコア構造を有することができる。ＴＰＩ  ８８２コア構造を有する因子は、例えば、図７に示すように、Ｌ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−２−クロロＰｈｅ、Ｏ−エチル−Ｄ−Ｔｙｒ、ｐ−ヨード−Ｌ−Ｐｈｅ、ｐ−ヨード−Ｄ−Ｐｈｅ、Ｄ−ホモ−Ｐｈｅ、Ｌ−ホモ−Ｐｈｅ、Ｌ−ナフチルＡｌａ、Ｄ−ナフチルＡｌａまたはＬ−４，４−ビフェニルアラニンのアミノ酸側鎖基に由来する位置Ｒ１において；２−フェニル酪酸、３−フェニル酪酸、ｍ−トリル酢酸、３−フルオロフェニル酢酸、ｐ−トリル酢酸、４−フルオロフェニル酢酸、３−メトキシフェニル酢酸、４−メトキシフェニル酢酸、４−エトキシフェニル酢酸、４−ビフェニル酢酸、フェニル酢酸、４−フェニル酪酸、ヘプタン酸、４−メチル吉草酸、ｔｅｒｔ−酪酸、シクロヘキシルカルボン酸、シクロヘキシル酢酸、シクロヘキシル酪酸、シクロヘプタンカルボン酸、シクロブタンカルボン酸、シクロペンチルカルボン酸、３−シクロペンチルプロピオン酸、シクロヘキシルプロピオン酸、４−メチル−１−シクロヘキシルカルボン酸、４−ｔ−ブチルシクロヘキシルカルボン酸、２−ノルボルナン酢酸、１−アダマンタン酢酸、２−エチル酪酸、３，３−ジフェニルプロピオン酸またはシクロペンチル酢酸に由来する官能基で位置Ｒ２おいて；および３−フルオロフェニル酢酸、４−エトキシフェニル酢酸、４−ビフェニル酢酸または３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル酢酸に由来する官能基で位置Ｒ３において置換することができる。ＴＰＩ  ８８２コア構造を有する因子は、図１０に示されるように、フェニル酢酸に由来する官能基でＲ２およびＲ３において、およびＬ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−シクロヘキシルアラニン、Ｄ−ｐ−クロロ−Ｐｈｅ、Ｄ−ｐ−フルオロ−Ｐｈｅ、Ｌ−ｐ−フルオロ−Ｐｈｅ、Ｄ−２−クロロ−Ｐｈｅ、Ｏ−エチル−Ｌ−Ｔｙｒ、Ｏ−エチル−Ｄ−Ｔｙｒ、Ｏ−メチル−Ｄ−Ｔｙｒ、３，５−ジヨード−ＴｙｒまたはＬ−ナフチルＡｌａのアミノ酸側鎖基に由来するＲ１において；Ｐｈｅのアミノ酸側鎖基でＲ１において；フェニル酢酸に由来する官能基でＲ３において、およびｐ−トリル酢酸、４−フルオロフェニル酢酸、３−メトキシフェニル酢酸、４−メトキシフェニル酢酸、４−エトキシフェニル酢酸、４−ビフェニル酢酸、フェニル酢酸、４−フェニル酪酸、ヘプタン酸、３−メチル吉草酸または４−メチル吉草酸に由来する官能基でＲ２において；あるいはＰｈｅのアミノ酸側鎖基でＲ１において；フェニル酢酸に由来する官能基でＲ２において；および４−ビフェニル酢酸、シクロヘキサンカルボン酸、シクロヘキシル酢酸、シクロヘキシル酪酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−シクロペンチルプロピオン酸または３，５−ビス（トリフルオロメチル）フェニル酢酸に由来する官能基でＲ３において置換できる。
【００４２】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、図６に示されるＴＰＩ  ９２７のようなフェニル尿素に対応するコア構造を有することができる。ＴＰＩ  ９２７コア構造を有する因子は、例えば、図６に示されるように、Ｄ−Ｌｙｓ（Ｍｅ）、Ｌ−３−（２Ｎａｐ）Ａｌａ、Ｄ−Ｃｈａｌａ、Ｌ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、ＬｅｕまたはＳｅｒのアミノ酸側鎖基に由来する位置Ｒ１において；ε―Ｌｙｓ、Ｌ−Ｎｌｅ、Ｄ−Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｄ−Ｏｒｎ（Ｍｅ）、Ｇｌｎ、Ｌ−３−（２−Ｎａｐ）ＡｌａまたはＤ−Ｔｈｒのアミノ酸側鎖基に由来する位置Ｒ２において；および４−メトキシフェニル酢酸、１−アダマンタン酢酸、シクロヘキサン酪酸、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキサンカルボン酸、シクロヘプタンカルボン酸、３−フルオロフェニル酢酸、３，３−ジフェニルプロピオン酸、４−エトキシフェニル酢酸、１−フェニル−１−シクロプロタンカルボン酸、１−ナフチル酢酸、またはシクロブタンカルボン酸に由来する官能基で位置Ｒ３において置換することができる。ＴＰＩ  ９２７コア構造を有する因子は、図９に示すように、Ｐｈｅのアミノ酸側鎖基でＲ１およびＲ２おいて、およびトリメチル酢酸、ヒドロシンナミン酸、４−ｔｅｒｔ−ブチルシクロヘキサンカルボン酸、４−メチル−１−シクロヘキサンカルボン酸、シクロペンチル酢酸、１−フェニル−１−シクロプロパンカルボン酸、シクロヘキサンカルボン酸、フェニル酢酸、シクロヘプタンカルボン酸、シクロブタンカルボン酸、シクロヘキサン酪酸、１−アダマンタン酢酸、シクロペンタンカルボン酸、イソ酪酸、シクロヘキシル酢酸；３−メトキシフェニル酢酸、酪酸、３−（３，４，５）−トリメトキシフェニルプロピオン酸；ヘプタン酸；２−ノルボルナン酢酸、シクロヘキサンプロピオン酸、ｔｅｒｔ−酪酸、４−エトキシフェニル酢酸、３，３−ジフェニルプロピオン酸、４−メトキシフェニル酢酸、酢酸、メチル吉草酸、ｐ−トリル酢酸または４−イソブチル−アルファ−メチルフェニル酢酸に由来する官能基でＲ３において置換することができる。
【００４３】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、図４に示されたＴＰＩ  ９１４のようなＬ−アシルトリアミンに対応するコア構造を有することができる。ＴＰＩ  ９１４コア構造を有する因子は、例えば、図４に示されるように、Ｎａｐ−Ａｌａまたは４−フルオロ−フェニルアラニンのアミノ酸側鎖基に由来する位置Ｒ１において；Ｌ−Ｔｒｐ、Ｎａｐ−Ａｌａ、Ｄ−Ｔｒｐ、４−クロロフェニルアラニン、Ｄ−シクロヘキシルアラニンまたはＴｙｒのアミノ酸側鎖基に由来する位置Ｒ２において；および４−ビニル安息香酸、４−エチル−４−ビフェニルカルボン酸、３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル酢酸、４−ビフェニルカルボン酸、４−ビフェニル酢酸または３，５−ビス−（トリフルオロメチル）−安息香酸に由来する官能基でＲ３において置換することができる。ＴＰＩ  ９１４コア構造を有する因子は、図５に各々示すように、Ｌｅｕのアミノ酸側鎖基に由来する官能基でＲ１において、Ｄ−Ｔｒｐのアミノ酸側鎖基に由来する官能基Ｒ２において、およびメチルでＲ３において；Ｌｅｕのアミノ酸側鎖基に由来する官能基でＲ１において、Ｐｈｅのアミノ酸側鎖基に由来する官能基でＲ２において、および３，５−ビス（トリフルオロメチル）−フェニル酢酸に由来する官能基でＲ３において；Ｌｅｕのアミノ酸側鎖基に由来する官能基でＲ１において、Ｐｈｅのアミノ酸側鎖基に由来する官能基でＲ２において、および４−ビニル安息香酸に由来する官能基でＲ３において；あるいはＬｅｕのアミノ酸側鎖基に由来する官能基でＲ１において、Ｐｈｅのアミノ酸側鎖基に由来する官能基でＲ２において、および４−エチル−４−ビフェニルカルボン酸に由来する官能基Ｒ３において置換することができる。
【００４４】
当業者であれば、ＴＰＩ  ９１４、ＴＰＩ  ９２７、ＴＰＩ  ７５９、ＴＰＩ  ８８２のコア構造を有するライブラリーは、１以上の位置においてコンビナトーリアル化することができるのを認識するであろう。コンビナトーリアル化位置とは、当該位置においてコンビナトーリアル化された分子のライブラリーが、その位置における化学構造が異なる分子の混合物であるような、異なる部位で種々に置換された位置をいう。そのようなライブラリーを用いて、例えば、実施例ＶＩに記載された位置スキャンニングを利用するスクリーニングにおおいてＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定することができる。かくして、位置Ｒ１、Ｒ２またはＲ３のいずれか１つを区別される部位に固定化して保持でき、他方、残りの２つの位置はコンビナトーリアル化し、それにより、いずれの位置が固定化されたかに基づいてサブライブラリーを生じさせることができる。さらに、１以上の他の位置をコンビナトーリアル化しつつ、コンビナトーリアル化できる、または一定に保持できるコア構造にさらなる位置を加えることができる。かくして、異なるまたはより多様なライブラリーを、特定のコア構造に基づいて、あるいはＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除することができるライブラリーから同定される種に基づいて作り出すことができる。
【００４５】
当業者であれば、ＴＰＩ  １３９６、ＴＰＩ  １３４９、ＴＰＩ  １３９１またはＴＰＩ  １４００シリーズの化合物のようなＴＰＩ  ９１４、ＴＰＩ  ９２７、ＴＰＩ  ７５９、ＴＰＩ  ８８２に対応するコア構造を有する本発明の因子は、さらに、ペプチド部位のような１以上の付加された部位を含むことができる。本発明の因子は残基したように多価とすることができ、その場合、付加された部位はＴＰＩ  ９１４、ＴＰＩ  ９２７、ＴＰＩ  ７５９、ＴＰＩ  ８８２に対応する１以上のコア構造、前記した配列を有するコアペプチド；またはこれらのコア構造およびコアペプチドの１以上の組合せであり得る。
【００４６】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できる因子は、ペプチドまたは非ペプチドコア構造に基づくか否かを問わず、生物学的蛋白質において天然で生じることが知られている部位を含むことができる。そのような部位は、蛋白質の一部である場合、共通してアミノ酸Ｒ−基という。これらのＲ基は種々の物理的または化学的特性によって特徴付けることができる。例として必須アミノ酸を取ると、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、またはＩｌｅで見出されるＲ基は非極性である特徴を有し；極性Ｒ基はＣｙｓのスルフヒドリル部位、Ｍｅｔのチオエステル、ＳｅｒおよびＴｈｒのヒドロキシル部位、およびＡｓｎおよびＧｌｎのアミド部位を含み；ＡｓｐおよびＧｌｕはカルボン酸部位の存在のため極性酸性基として特徴づけられ；極性塩基性Ｒ基は、アミノ部位を有するＬｙｓ、グアニジノ部位を有するＡｒｇ、および第二級アミンを持つイミダゾールを有するＨｉｓを含み；およびＰｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓはフェニルまたは複素環の存在による芳香族アミノ酸として特徴づけられる。本発明の因子はこれらの部位または特徴の１以上を含むことができ、それにより、該因子をＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できるようにする。
【００４７】
本発明の因子は、存在する場合、当該因子をＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できるようにする他の部位または部位の組合せに従って記載し、また特徴付けることもできる。本発明の因子に存在させることができる種々の部位についての定義は以下に記載する。
【００４８】
本明細書中で用いるように、用語「アルキル」は、単独で、または組み合わされて、１から１０、好ましくは１から６、より好ましくは１から４の炭素原子を含有する飽和直鎖または分岐鎖炭化水素基をいう。そのような基の例は、限定されるものではないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソ−プロピル、ｎ−ブチル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、イソ−アミル、へキシル、デシル等を含む。
【００４９】
用語「アルケン」とは、単独で、あるいは組み合わされて、合計２から１０、好ましくは２から６、より好ましくは２から４の炭素原子の、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素基をいう。そのような基の例は、限定されるものではないが、エチニル、Ｅ−およびＺ−プロペニル、イソプロペニル、Ｅ−およびＺ−ブテニル、Ｅ−およびＺ−イソブテニル、Ｅ−およびＺ−ペンテニル、デセニル、メチリデン（＝ＣＨ２）、エチリデン（―ＣＨ＝ＣＨ−）プロピリデン（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ−）等を含む。
【００５０】
用語「アルキン」とは、単独で、あるいは組み合わされて、合計２から１０、好ましくは２から６、より好ましくは２から４の炭素原子の少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する直鎖または分岐鎖炭化水素基をいう。そのような基の例は、限定されるものではないが、エチニル（アセチレニル）、プロピニル（プロパルギル）、ブチニル、ヘキシニル、デシニル等を含む。
【００５１】
用語「シクロアルキル」とは、単独で、あるいは組み合わされて、３から８、好ましくは３から６の炭素原子の炭素原子の飽和環状配置をいう。そのようなシクロアルキルキの例は、限定されるものではないが、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル等を含む。
【００５２】
用語「アリール」とは、フェニル、ナフチル、インデニル、インダニル、アズレニル、フルオレニルおよびアントラセニルよりなる群から選択される（全部が炭素および水素からなる）炭素環芳香族基；フリル、チエニル、ピリジル、ピロリル、オキサゾリル、チアゾリル、イミダゾリル、ピラゾリル、２−ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、１，２，３−オキサジアゾリル、１，２，３−トリアゾリル、１，３，４−チアジアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、１，３，５−トリアジニル、１，３，５−トリチアニル、インドリジニル、インドリル、イソインドリル、３Ｈ−インドリル、インドリニル、ベンゾ［ｂ］フラニル、２，３−ジヒドロベンゾフラニル、ベンゾ［ｂ］チオフェニル、１Ｈ−インダゾリル、ベンズイミダゾリル、ベンズチアゾリル、プリニル、４Ｈ−キノリジニル、キノリニル、イソキノリニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、キノキサリニル、１，８−ナフチリジニル、プテリジニル、カルバゾリル、アクリジニル、フェナジニル、フェノチアジニル、およびフェノキサジニルよりなる群から選択される複素環芳香族基をいう。
【００５３】
本出願において定義されるよに、「アリール」基は、独立して、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、シアノ、カルボキシ、カルボアルコキシ、１，２−ジオキシエチレン、アルコキシ、アルケノキシまたはアルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノ、アルキニルアミノ、脂肪族または芳香族アシル、アルコキシカルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、モルホリノカルボニルアミノ、チオモルホリノカルボニルアミノ、Ｎ−アルキルグアニジノ、アラルキルアミノスルホニル；アラルコキシアルキル；Ｎ−アラルコキシ尿素；Ｎ−ヒドロキシル尿素；Ｎ−アルケニル尿素；Ｎ，Ｎ−（アルキル，ヒドロキシル）尿素；ヘテロシクリル；チオアリールオキシ−置換アリール；Ｎ，Ｎ−（アリール，アルキル）ヒドラジノ；Ａｒ’−置換スルホニルヘテロシクリル；アラルキル−置換ヘテロシクリル；シクロアルキルおよびシクロアルケニル−置換ヘテロシクリル；シクロアルキル−縮合アリール；アリールオキシ−置換アルキル；ヘテロシクリルアミノ；脂肪族または芳香族アシルアミノカルボニル；脂肪族または芳香族アシル−置換アルケニル；Ａｒ’−置換アミノカルボニルオキシ；Ａｒ’，Ａｒ’−ジ置換アリール；脂肪族または芳香族アシル−置換アシル；シクロアルキルカルボニルアルキル；シクロアルキル−置換アミノ；アリールオキシカルボニルアルキル；ホスホロジアミジル酸またはエステルよりなる群から選択される１から４の置換基を独立して含有することができる。
【００５４】
「Ａｒ’」は、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、１，２−ジオキシメチレン、１，２−ジオキシエチレン、アルコキシ、アルケノキシ、アルキノキシ、アルキルアミノ、アルケニルアミノまたはアルキニルアミノ、アルキルカルボニルオキシ、脂肪族または芳香族アシル、アルキルカルボニルアミノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルキルスルホニルアミノ、Ｎ−アルキルまたはＮ，Ｎ−ジアルキル尿素よりなる群から選択される１から３の置換基を有する前記定義の炭素環または複素環アリール基である。
【００５５】
用語「アルコキシ」とは、単独で、あるいは組み合わされて、アルキルエーテル基をいい、ここで、用語「アルキル」は前記定義の通りである。適当なアルキルエーテル基の例は、限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソ−プロポキシ，ｎ−ブトキシ、イソ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ等を含む。
【００５６】
用語「アルケノキシ」とは、単独で、あるいは組み合わされて、式アルケニル−Ｏ−の基をいい、ここで、用語「アルケニル」は前記定義の通りである。適当なアルケノキシ基の例は、限定されるものではないが、アリルオキシ、Ｅ−およびＺ−３−メチル−２−プロペノキシ等を含む。
【００５７】
用語「チオアルコキシ」とは式アルキル−Ｓ−のチオエーテル基をいい、ここで、アルキルは前期定義の通りである。
【００５８】
用語「アルキルアミノ」とは、単独で、あるいは組み合わされて、モノ−ジ−アルキル−置換アミノ基（すなわち、式アルキル−ＮＨ−または（アルキル）２−Ｎ−の基）をいい、ここで、用語「アルキル」は前記定義の通りである。適当なアルキルアミノ基の例は、限定されるものではないが、メチルアミノ、エチルアミノ、プロピルアミノ、イソプロピルアミノ、ｔ−ブチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジエチルアミノ等を含む。
【００５９】
用語「アミド」とは、―Ｎ（Ｒ１）−Ｃ（＝Ｏ）−またはーＣ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒ１）−いずれかをいい、ここで、（Ｒ１）は本明細書中においては水素ならびに他の基を含むように定義される。用語「置換されたアミド」とは、（Ｒ１）が水素でない状況をいい、他方、用語「置換されていないアミド」とは（Ｒ１）が水素である状況をいう。
【００６０】
用語「アリルオキシ」とは、単独で、あるいは組み合わされて、式アリール−Ｏ−の基をいい、ここで、アリールは前記定義の通りである。アリルオキシ基の例は、限定されるものではないが、フェノキシ、ナフトキシ、ピリジルオキシ等を含む。
【００６１】
用語「アリールアミノ」とは、単独で、あるいは組み合わされて、式アリール−ＮＨ−の基をいい、ここで、アリールは前記定義の通りである。アリールアミノ基の例は、限定されるものではないが、フェニルアミノ（アニリド）、ナフチルアミノ、２−、３−および４−ピリジルアミノ等を含む。
【００６２】
用語「アリール−縮合シクロアルキル」とは、単独で、あるいは組み合わされて、アリール基と共に２つの隣接する原子を有するシクロアルキル基をいい、ここで、用語「シクロアルキル」および「アリール」は前記定義の通りである。アリール−縮合シクロアルキル基の例は、ベンゾ縮合シクロブチル基である。
【００６３】
用語「アルキルカルボニルアミノ」とは、単独で、あるいは組み合わされて、式アルキル−ＣＯＮＨの基をいい、ここで、用語「アルキル」は前記定義の通りである。
【００６４】
用語「アルコキシカルボニルアミノ」とは、単独で、または組み合わされて、式アルキル―ＯＣＯＮＨ−の基をいい、ここで、用語「アルキル」は前記定義の通りである。
【００６５】
用語「アルキルスルホニルアミノ」とは、単独で、あるいは組み合わされて、式アルキル―ＳＯ２ＮＨ−の基をいい、ここで、用語「アルキル」は前記定義の通りである。
【００６６】
用語「アリールスルホニルアミノ」とは、単独で、あるいは組み合わされて、式アリール−ＳＯ２ＮＨ−の基をいい、ここで、用語「アリール」は前記定義の通りである。
【００６７】
用語「Ｎ−アルキル尿素」とは、単独で、あるいは組み合わされて、式アルキル−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−の基をいい、ここで、用語「アルキル」は前記定義の通りである。
【００６８】
用語「Ｎ−アリール尿素」とは、単独で、あるいは組み合わされて、式アリール−ＮＨ−ＣＯ−ＮＨ−の基をいい、ここで、用語「アリール」は前記定義の通りである。
【００６９】
用語「ハロゲン」はフッ素、塩素、臭素およびヨウ素を意味する。
【００７０】
前記定義に鑑みると、本出願を通じて用いられるも他の化学用語は当業者によって容易に理解できる。用語は単独でまたは組み合わされて、認められた化学命名法に従って基の組合せを記載することができる。
【００７１】
本発明の因子は、予測可能な基または特徴を有する生成物を生じることがよく知られている試薬および条件を用いて合成することができる。例えば、ペプチドは比較的低コストにて多数合成することができ、それらは多様な特性を呈するように容易に修飾することができる（例えば、Ｒｅｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  （ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９９２）参照）。ＩＡＰ阻害カスパーゼのペプチド抑制解除剤は、固相ペプチド合成方法（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，  ８５：２１４９（１９６４）；  Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，１９８６年１２月２３日に発行された米国特許第４、６３１、２１１号）の修飾方法を用いて合成することができるか、当該分野で良く知られた標準的な溶液方法を用いて合成することができる（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，  Ｍ．，  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ２ｎｄ  ｅｄ．  （Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，  １９８８  ａｎｄ  １９９３，  前述．）参照）。Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの方法に調製されたペプチドは、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ−０１ペプチドシンセサイザー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）のような自動ペプチドシンセサイザーを用いて、あるいは手動ペプチド合成方法（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ，  前述，  １９８６）を用いて合成することができる。
【００７２】
さらに、以下に記載するもののようなコンビナトーリアル方法を用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を作成することができる。ライブラリーは、前記で定義され、または後に記載する実施例に記載されたもののような特定の基を持つ候補剤を有するように合成することができる。加えて、合成条件は、アミノ酸Ｒ基について前記した特徴のような本明細書中に記載された基の１以上に固有の特定の特徴を持つ候補化合物のライブラリーを生じさせるように選択することができる。例えば、ライブラリーは、ＳＭＡＣの天然に生じるＩＡＰ阻害剤の特徴を有するように合成することができる。ＳＭＡＣのＮ−末端領域は、ＩＡＰへの結合およびその阻害を媒介することが示されている（Ｓｒｉｎｉｖａｓｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１１２−１１６（２００１），  Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：１００８−１０１２（２０００），  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：１００４−１００８（２０００）参照）。従って、このＮ−末端ドメインを用いて、反応体および条件が同様な基および特徴をライブラリー中の候補剤に選択的に取り込まれるように選択されるように、ライブラリー合成をガイドすることができる。同様な戦略は、本明細書中に記載され、または本発明の方法によって同定される因子を用いて使用することができ、ここで、ライブラリーは、特定の因子に見出される、または複数の因子に共通する特徴または基を選択的に含有するようにされる。そのような設計戦略は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの効果的な抑制解除剤が同定される可能性を増加させる。
【００７３】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できる本発明の因子は、スクリーニングにおいて同定することができ、あるいはそうでなければ、本明細書中に記載された種々の機能的特定のいずれかにしたがって特徴付けることができる。１つの具体例において、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの阻害解除剤は、ＩＡＰの存在下でカスパーゼ活性を可能とするその能力に基づいて同定、あるいは特徴付けられる。例えば、本発明の化合物の有効性は、本発明の因子の存在および非存在下で、ＩＡＰ−阻害カスパーゼに対するカスパーゼ活性の比率に従って決定することができる。
【００７４】
カスパーゼ抑制解除アッセイを用い、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するいくつかの化合物が本明細書中に開示されてきた。例えば、本発明は、図２１から２４に示される構造のいずれかから選択されるコア構造を有する単離された因子を提供し、ここに該因子はＴＰＩ  １３４９−１から１３４９−３４；ＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−３６；ＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６；およびＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８から選択され、ここで、該因子はＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する。
【００７５】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する本発明の化合物は、ポリフェニル尿素、ジケトピペラジン、二環グアニジンン、Ｎ−アシルトリアミンまたはテトラペプチドのような開示された化合物クラスのメンバーであり得る。本明細書中に開示された化合物クラスについて観察された種々の活性のまとめを以下の表ＸＩＩに示す。この表は、カスパーゼ抑制解除アッセイ、ＳＭＡＣ競合アッセイおよびジャーカット細胞の細胞傷害性アッセイにおけるポリフェニル尿素、ジケドピペラジン、二環グアニジン、Ｎ−アシルトリアミンおよびテトラペプチドクラスからの代表的な化合物の平均的活性を示す。ポリフェニル尿素およびジケトピペラジンは、実施例ＶＩＩＩに記載されているように、全長ＸＩＡＰまたはＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインのいずれかの存在下において酵素抑制解除アッセイにおいて活性を有することが判明した。
【００７６】
【化２】
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ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する化合物を同定するための例示的なアッセイは実施例Ｉに供され、そのような抑制解除剤化合物を同定するためのアッセイの使用は実施例ＩからＶＩに示されている。実施例にて後に記載されるように、アッセイ条件に依存して、少なくとも約１．７であるＩＡＰ−阻害カスパーゼについての因子の存在下および非存在下におけるＶｍａｘの比率は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの効果的な抑制解除剤を示す。当業者であれば、有効性を示すこの比率の値は、用いる因子の濃度および因子のＩＣ５０に依存するであろうことを理解するであろう。従って、より高い濃度の因子を用いる場合、因子の存在および非存在下におけるＶｍａｘの比率についての閾値は少なくとも約２、少なくとも約２．５、少なくとも約３または少なくとも約４以上であり得る。より低い濃度の因子を用いる場合、この比率は少なくとも約１．５、少なくとも約１．３、少なくとも約１以下のように低くすることができる。かくして、例えば、ＩＡＰ当たり１モル当量の因子、ＩＡＰ当たり２モル当量の因子、ＩＡＰ当たり５モル当量の因子、ＩＡＰ当たり１０モル当量の因子、またはＩＡＰ当たり５０モル当量の因子またはそれ以上を含めた、アッセイに存在するＩＡＰに対する因子の相対的量と組み合わせて比率を表現するのが適切であり得る。
【００７７】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、例えば、結合アッセイにおいて、ＩＡＰまたはそのカスパーゼ−結合断片に対するその親和性によって同定することもできる。ＩＡＰの機能的断片、カスパーゼまたは双方を結合アッセイで用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤を同定することができると理解される。結合アッセイを用いて決定されたＩＡＰに対する因子の親和性は、所望であれば、平衡解離定数（Ｋｄ）または平衡会合定数（Ｋａ）によって定量することができる。ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、例えば、約１×１０−６Ｍ、１×１０−７Ｍ、または１×１０−８Ｍ未満を含めたマイクロモラー範囲にあるＫｄを有する因子として同定することができる。約１×１０−９Ｍ、１×１０−１０Ｍ、または１×１０−１１Ｍ未満のＫｄのようなナノモラー範囲親和性を有する因子を含めたより高い親和性の因子を同定することもできる。本発明の因子は、例えば、１×１０−１２Ｍ未満であるＫｄを含めたピコモラー親和性も有することができる。
【００７８】
別法として、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するにおける因子の有効性は、例えば、阻害結合アッセイにおいてＩＡＰおよびカスパーゼの間の会合の阻害に基づいて決定することができる。ＩＡＰ、カスパーゼまたは双方の機能的断片は阻害結合アッセイで用いることができると理解される。別法として、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤は、ＩＡＰ、およびＳＭＡＣのようなもう１つの阻害剤の間の結合を阻害するその能力に基づいて同定することができる。ＩＡＰのＳＭＡＣへの結合の阻害を測定するための例示的なアッセイは実施例ＶＩＩで供される。阻害は、所望であれば、Ｋｉのような平衡阻害定数によって定量することができる。Ｋｉについての値は、増大させる濃度の因子および固定された濃度の各結合パートナーにて、本明細書中に記載されたような抑止解除アッセイを行うことによって決定することができる。結合または阻害を分析して、Ｓｅｇｅｌ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９７５）に記載されたもののようなよく知られたキネッティック分析を用いて前記した平衡定数を決定することができる。ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、Ｋｄについて前期した範囲および値のようなマイクロモラー、ナノモラーまたはピコモラー範囲のＫｉを有するものとして同定することができる。
【００７９】
従って、本発明は、因子に結合したＩＡＰを有する複合体を提供し、該因子は、例えば、前記したコア構造を含めた本発明のコアペプチドまたはコア構造を有する。該複合体は、天然においてをＩＡＰと共に通常は生じる少なくとも１つの他の細胞成分から単離することができる。例えば、複合体は、天然においてＩＡＰと共に通常は生じる他の細胞成分を実質的に含まない精製された状態であり得る。該複合体は、ＩＡＰを通常は発現しない組換え細胞でも起こり得る。
【００８０】
本発明は、さらに、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制を解除する因子に連結された基を含めたコンジュゲートを提供する。本発明のコンジュゲートは、特定の細胞に対して因子を標的化するのに、あるいはＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子の安定性または生物学的半減期を増大させるのに、有用な基を含むことができる。例えば、基は、そこにおいて腫瘍細胞のようなアポトーシスを促進するのが望ましい特定の細胞に対する特異性を有する特定の抗体、その機能的断片、または他の結合ポリペプチドであり得る。ＩＡＰ−阻害カスパーゼがそこで抑制解除されるべき細胞に対して因子を標的化することができるいずれの基もコンジュゲートとして用いることができる。
【００８１】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子のコンジュゲートは、細胞のサイトゾルに対して因子を導入でき、またはそうでなければ因子を細胞膜を通して通過させるのを容易とすることができる基でもあり得る。因子は、例えば、異種標的化ドメインによって、または脂質ベースの担体を用いて細胞に導入することができる。かくして、本発明は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子のサイトゾル送達を提供する。
【００８２】
基は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子の投与で有利な安定性または特性を供するチャンバー付マイクロデバイス、細胞、リポソームまたはウィルスのような薬物送達ビークルでもありえる。一般に、そのようなマイクロデバイスは、非毒性であって、所望であれば、生体分解性とすべきである。因子を含有できるマクロカプセルを含めた種々の基、およびチャンバー付マイクロデバイスを含めた基を治療剤に連結するための方法は当該分野でよく知られており、商業的に入手可能である（例えば、”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”  １８ｔｈ  ｅｄ．  （Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．  １９９０），  ｃｈａｐｔｅｒｓ  ８９−９１；  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ  ，  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  １９８８）；また  Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，前述，１９９６参照）。
【００８３】
加えて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼ処方の抑制解除剤は生分解性ポリマーに取り込むことができ、化合物の徐放を可能とし、該ポリマーは薬物送達が望まれる近くにおいて、例えば、腫瘍の部位において移植し、または因子が経時的に全身放出されるように移植される。浸透圧ミニポンプを用いて、腫瘍成長へ、または腫瘍の血管供給へ直接的にのように、注目する部位へのカニューレを通しての、特定濃度のＩＡＰ−阻害カスパーゼ種の抑制解除剤および処方の制御された送達を供することもできる。生分解性ポリマーおよびそれらの使用は、例えば、Ｂｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．  ７４：４４１−４４６（１９９１）に詳細に記載されている。
【００８４】
本発明のコンジュゲートは標識である基を含むことができる。ＩＡＰおよび／またはカスパーゼに結合する標識化された因子を用いて、ＩＡＰおよび／またはカスパーゼの細胞下で局所化を同定し、あるいは従前は同定されていないＩＡＰまたはカスパーゼを同定することができる。ＩＡＰおよび／またはカスパーゼに結合する標識された因子を用いてＩＡＰおよび／またはカスパーゼに相互作用する他の分子を同定することもできる。後にさらに詳細に記載するように、そのような結合競合アッセイを用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定することができる。基として取り込むことができる標識は、例えば、フルオロフォア、クロモフォア、常磁性スピン標識、放射性核種、または検出することができるもう１つの分子に対する特異性を有する結合基を含む。
【００８５】
本発明の標識された因子は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼによってアポトーシスから阻害される組織内の細胞を同定するのに有用であり得る。かくして、標識された因子を診断方法で用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の投与がアポトーシスを進行させる細胞を同定することができる。該方法は、本発明の標識された因子を組織に投与し、標識された因子を取り込む１以上の細胞を同定する工程を含むことができる。標識された因子は、前記したようなイン・ビボ送達のための方法を用いて投与することができる。診断方法を種々の分解能で用いることができる。例えば、該方法を行って、因子によって標識された細胞を含有する組織を同定することができる。別法として、より高い分解能の方法を用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの存在下で標識される組織内の特定の細胞または細胞型を同定することができる。診断方法を用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼがアポトーシスを非標識細胞から進行させる細胞を区別することができるので、該方法は、本発明の治療方法で用いるための標的化または送達コンジュゲートの選択におけるガイドで有用であり得る。
【００８６】
診断方法をイン・ビトロで行うことができ、その場合、標識された因子を注射によってまたは組織を標識された因子を含有する溶液に浸漬することによって投与することができる。再度、該方法は、このようにしてアポトーシスから阻害されないものよりも、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを有する細胞を組織内で区別するのに十分な分解能で用いることができる。そのような分解能は、例えば、顕微鏡ベースの技術を用いることによって達成することができる。さらなる分解能は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの細胞下局所化を供することができる。細胞下局所化を用いて、適当なサイトゾル送達コンジュゲートを決定し、または実験中の特定の組織または細胞におけるアポトーシスの役割をさらに同定することができる。
【００８７】
また、本発明は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼおよび医薬担体の抑制解除剤を含有する医薬組成物を提供する。そのような組成物は、本発明のアポトーシス促進方法で用いて、アポトーシスの病理学的に低下したレベルによって特徴付けられる病態の重症度を阻害し、治療し、または低下させることができる。例えば、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制祖解除剤は、医薬上許容される媒体と共に溶液または懸濁液として投与することができる。
【００８８】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼ処方の抑制解除剤は、皮下、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮内、頭蓋内、気管内、および硬膜外投与のような非経口投与で適用可能なものを含む。ならびに経口、直腸、（硝子体内または前房内を含めた）眼、鼻、（頬および舌下を含めた）局所、子宮、または膣投与の処方で適用可能。ＩＡＰ−阻害カスパーゼ処方の抑制解除剤は単位投与形態で供することができ、当業者によく知られた医薬技術によって調製することができる。そのような技術は、有効成分および医薬担体または賦形剤を合わせる工程を含む。
【００８９】
非経口投与に適した処方は、前記した医薬上許容される媒体のような水性および非水性滅菌注射溶液を含む。溶液は、加えて、例えば、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤および処方を意図した需要者の血液と等張とする溶質を含有することができる。他の処方は、例えば、懸濁化剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液を含む。処方は、単位用量、または複数用量容器、例えば、密閉されたアンプルおよびバイヤル中で供することができ、例えば、使用直前に滅菌液体担体の添加を必要とする凍結乾燥された状態で貯蔵することができる。即席注射溶液および懸濁液は、先に記載した種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【００９０】
医薬上許容される媒体は、加えて、例えば、ＩＡＰ−阻害カスパーゼ剤の抑制解除剤を安定化させるように作用する生理学上許容される化合物を含有することができる。そのような生理学的に許容される化合物は、例えば、グルコース、スクロースまたはデキストロースのような炭水化物；アスコルビン酸またはグルタチオンのような抗酸化剤；微生物膜を破壊するＥＤＴＡのようなキレート化剤；カルシウムまたはマグネシウムのような二価金属イオン；低分子量蛋白質；脂質またはリポソーム；または他の安定化剤または賦形剤を含む。すでに記載したように、ＩＡＰ−阻害カスパーゼ処方の抑制解除剤は、生分解性ポリマーのような医薬上許容される媒体で処方することもできる。前記した医薬担体および媒体のすべては、それらはヒトで用いるための十分な純度および品質のものであり、研究グレード処方における匹敵する試薬から区別することができることを意味する医薬グレードにおいて言われるものとすることができる。
【００９１】
また、本発明は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤および治療活性を有する分子を組成物を提供する。本発明の抑制解除剤と共に含ませる分子は病理学的に低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる疾患に対する活性を有する化合物であり得る。例えば、該化合物は癌に対して活性を有することができる。前立腺癌に対して活性を有し、かつ本発明の活性解除剤化合物と組合わせて用いることができる例示的化合物はＶＰ−１６（エテポシド）である。実施例Ｘの結果によって示されるように、ＶＰ−１６とＴＰＩ  ７９２−３３またはＴＰＩ  ７９２−３５いずれかとの投与は、これらの化合物いずれかの単独よりも癌細胞殺傷に対してよりすぐれた効果を有した。
【００９２】
他の抗癌薬物もまたＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤と共に組成物で用いることができ、これは、限定されるものではないが、メクロレタミン、クロラムブシル、シクロフォスファミド、メルファラン、イフォスファミドのようなアルキル化剤；メトトレキセート６−メルカルトプリン、５−フルオロウラシルまたはシタラビンのような抗代謝産物；リツキ酸、ヘルセプチンまたはＭａｂ  Ｔｈｅｒａのような抗体；ビンブラスチンまてはビンクリスチンまたはエトポシドのような植物アルカロイド；ドキソルビシン、ダウノマイシン、ブレオマイシン、またはマイトマイシンのような抗生物質；カルムスチンまてたはロムスチンのようなニトロソ尿素；シスプラチンのような無機イオン；インターフェロンのような生物学的応答モディファイヤー；アスパリキナーゼのような酵素；またはタモキシフェンまたはフルタミドのようなホルモンを含む。もう１つの治療方法と組み合わせて本発明の治療方法を実行するに関して後に本明細書中で記載されるものを含めた、これらおよび他の抗癌化合物は当該分野で知られており、医薬用途に適した処方は、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  １６ｔｈ  Ｅｄ．，Ｍｅｒｃｋ  Ｒｅｓ．  Ｌａｂｓ．，  Ｒａｈｗａｙ  Ｎ．Ｊ．（１９９２）に記載されているように公知である。加えて、病理学的に低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる疾患を治療するためには、本発明の化合物を治療抗体と組み合わせて投与することができる。そのような治療抗体は、例えば、アポトーシス調節分子に結合し、その活性を変調することによるなど、アポトーシスを変調する抗体でありえる。非限定的例として、本発明の化合物は、カスパーゼ３、カスパーゼ７、Ｔｒａｉｌ  Ｒ−１またはＴｒａｉｌ  Ｒ−２を活性化する抗体と組み合わせて投与することができる。Ｔｒａｉｌ  Ｒ−１およびＴｒａｉｌ  Ｒ−２モノクローナル抗体の例はＨｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，  ＭＤから入手可能である。
【００９３】
本発明は、単独、または公知の抗癌剤と組み合わせて広い抗癌活性を示す化合物を提供する。例えば、ＴＰＩ  １３９６−３４、ＴＰＩ  １３９６−１２、ＴＰＩ  １３９６−２２およびＴＰＩ  １３９６−１１のような本発明のポリフェニル尿素化合物は、６０の異なる腫瘍細胞系の腫瘍細胞成長を有意に低下させる（実施例ＸＩＩＩおよび図２８および図２９参照）。細胞の５０％を殺傷するのに必要なポリフェニル尿素化合物の濃度（ＬＤ５０）は、公知の抗癌薬物のそれと匹敵するかまたは良好であった。腫瘍成長を阻害するのに効果的な用量のＴＰＩ  １３９６−１２で処理されたマウスの毒物学的分析は、白血球細胞カウント、赤血球細胞カウント、血小板カウント、ＢＵＮ、ビリルビン、ＡＬＴおよびＡＳＴを含めた種々のパラメータに対して毒性効果を示さなかった（図４１および実施例ＸＸＩＩＩ参照）。加えて、本明細書中で示されるように、正常な細胞は腫瘍細胞系と比較してポリフェニル尿素化合物に対して比較的抵抗性であった（図２８参照）。また、ポリフェニル尿素化合物は、患者から単離された慢性リンパ系白血病（ＣＬＬ）および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞のような非複製悪性細胞においてアポトーシスを誘導することが示された（図２８参照）。さらなる研究は、本発明のポリフェニル尿素化合物が抗原−特異的ＣＴＬの細胞傷害性を増強することができることを明らかにした（図３９参照）。
【００９４】
本明細書中でさらに開示されるように、ポリフェニル尿素化合物は、腫瘍細胞の殺傷を誘導するのに慣用的な抗癌薬物と共同して働くことができる。例えば、ＴＰＩ  １３９６−３４は、種々の癌細胞系において、エトポシド（ＶＰ１６）、ドキソルビシン（ＤＯＸ）またはパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）の用量−依存性細胞傷害性を有意に増加させる（実施例ＸＩＶおよび図３０および３１参照）。アポトーシスの誘導に対する同様の効果が、ポリフェニル尿素化合物、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーを含めた、アポトーシスである生物学的剤ＴＲＡＩＬを用いて観察された（図３０参照）。
【００９５】
また、本発明は、クローン原性生存アッセイにおいて、およびイン・ビボにて抗腫瘍活性を示す化合物を提供する。例えば、ポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−３４は、濃度を依存的に、種々の癌細胞系のクローン原性生存を減少させた（実施例ＸＶおよび図３２参照）。加えて、本明細書中に開示するように、ＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９６−２２のようなポリフェニル尿素化合物はイン・ビボにおいて抗腫瘍活性を有する。例えば、これらの化合物は、免疫寛容マウスにおいて成長させたヒト腫瘍異種移植片において腫瘍サイズおよび腫瘍重量を有意に低下させた（実施例ＸＶおよび図３２および３３参照）。追加の実験は、カスパーゼ活性を変調することによって、本発明のポリフェニル尿素化合物がイン・ビボにて機能し（図４０参照）、およびＸＩＡＰ蛋白質は、事実、イン・ビボにてこれらの化合物の標的であることが確認された（図３８）。
【００９６】
本発明は、さらに、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの阻害解除剤としての活性を有する本発明の少なくとも１つの化合物、および治療活性を有する第二の化合物を含むキットを提供する。キットに含めることができる本発明の化合物は、例えば、コアペプチド４から３９および４２から５５よりなる群から選択されるコアペプチドを有する、または図５、９、１０、１２、１４Ｂ、２１−２４、３４、３５、３６、３７および４３に示された構造のいずれから選択されるコア構造を有する化合物を含み、ここで、該化合物はＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する。そのようなキットは、例えば、病理学的に低下したレベルのアポとーシスによって特徴付けられる疾患で有用である。例えば、ＶＰ−１６と、ＴＰＩ  ７９２−３３またはＴＰＩ  ７９２−３５いずれかとを含むキットを用いて前立腺癌を治療することができる。
【００９７】
適当なキットは、当該化合物が各化合物の少なくとも１回の投与に続いて治療効果を有することが十分な量で供される限り、別々のパッケージされた処方として、または混合した処方にて化合物を含む。該処方は前記したもののいずれかであり得、あるいはそうでなければ、特定の化合物および投与の形態について適当であることが知られている。
【００９８】
本発明のキットの含量は、パッケージング材料または他の適当な物理的構造に収容して、好ましくは、滅菌、汚染物−フリー環境を提供する。加えて、パッケージング材料は、キット内の物質を、どのようにして、病理学的に低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる疾患の治療のために投与することができるかを示す指示書を含有する。使用についての指示書は、典型的には、投与の経路または、所望であれば、投与用の処方を調製するための方法を記載する触知可能な表現を含む。また、指示書は、キットの内容物の使用からの潜在的効果の同定、またはキットの内容物の不適切な使用に関する警告も含むことができる。
【００９９】
本発明は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法を提供する。該方法は、（ａ）ＩＡＰ、およびカスパーゼをＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除することができることが疑われる因子と接触させ、ここで、該カスパーゼはＩＡＰによって阻害されるＩＡＰ−阻害カスパーゼであり、ここで、該接触は、ＩＡＰの非存在下でカスパーゼ活性を可能とする条件下で起こり、（ｂ）ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除を検出する工程を含む。
【０１００】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除は、例えば、蛋白質分解活性を含めたＩＡＰ−阻害カスパーゼ活性の増加として検出することができる。
【０１０１】
蛋白質分解活性は特異的基質を用いてイン・ビトロアッセイで測定することができる。例えば、連続的フルオロメーターアッセイを用いて、Ｃ−末端アミノメチルクマリンで誘導体化されたＤＥＶＤ（配列番号：２）、Ｃ−末端アミノメチルクマリン（Ｔｙｒ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ａｓｐ−アミノメチルクマリン）で誘導体化されたＹＶＡＤ（配列番号：３）からの７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン（ＡＦＣ）、あるいはカルボベンゾキシ―Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−アミノメチルクマリンいずれかの以下の放出によって；または米国特許第６、２２８、６０３号Ｂ１に記載されたように、ｐＮＡで標識された同様なペプチドからのｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）の放出に従うことによって、加水分解速度を測定することができる。
【０１０２】
免疫ブロットまたは他のクロマトグラフィーベースのアッセイを用いて、基質と比較して生成物の改変された分子量に従ってカスパーゼによる基質の蛋白質分解を検出することができる。例えば、カスパーゼ−９のような上流イニシエーターカスパーゼの蛋白質分解活性は、米国特許第６，２２８，６０３号Ｂ１に記載された免疫ブロットアッセイにおいて、プロ−カスパーゼ−３のような下流エフェクタープロ−カスパーゼの成熟形態へのプロセッシングに基づいて測定することができる。本発明の因子の存在下および非存在下におけるＩＡＰ−阻害カスパーゼについてのそのようなアッセイの結果の比較を用いて、該因子の存在下におけるカスパーゼ活性の相対的増加に従ってＩＡＰ−阻害カスパーゼに抑制解除剤を同定することができる。
【０１０３】
また、アポトーシスに特徴的な細胞または細胞核における形態学的変化を同定することによって、カスパーゼの蛋白質分解活性を測定することもできる。アポトーシスの特徴であるそのような変化は、例えば、クロマチン凝縮、核断片化、細胞収縮、またはアポトーシス体と言われる小さな膜に囲まれた断片への結局の破壊に導く細胞ブレビングを含む。かくして、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤である因子は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼによるアポトーシスを受けるのが妨げられる細胞に加えた場合に特徴的なアポトーシスの変化を引き起こす能力に従って同定することができる。クロマチン凝縮または核断片化のようなアポトーシス変化が加えた因子の存在下および非存在下において区別できる限り、同様なアッセイをそのような細胞から誘導された細胞フリー抽出物で行うことができる。
【０１０４】
また、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除は、ＩＡＰ−カスパーゼ種の解離として検出することもできる。ＩＡＰ−阻害カスパーゼは、当該分野で公知の結合アッセイを用いて会合したＩＡＰを有するカスパーゼとして同定することができる。そのような複合体は、例えば、非変性ポリアクリルアミドゲル電気詠動、サイズ排除クロマトグラフィー、または分析遠心を用いて分子量またはサイズに従って同定することができる。また、ＩＡＰ−カスパーゼ複合体は、共沈殿技術を用いて同定することもできる。例えば、ＩＡＰ−カスパーゼ複合体は、一方または他方のパートナー単独と共にではなく双方のパートナーと共に共沈殿する抗体の能力により同定することができる。同様に、ＩＡＰまたはカスパーゼが、組換えＤＮＡ方法によって修飾されて、グルタチオンビーズと共に沈殿できるグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｍａｃｉａ；  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪ）；Ｎｉｃｋｅｌ  ＮＴＡセファロースと共に沈殿することができるポリヒスチジンタグ（Ｑｉａｇｅｎ；  Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ，  ＣＡ）；免疫沈澱できるフラグペプチド（Ｓｉｇｍａ；  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，  ＭＯ）のような抗体エピトープ；または他の公知のアフィニティータグのようなアフィニティータグを一体化させた場合に、技術を用いることができる。ＩＡＰ−カスパーゼ複合体形成を妨げ、あるいはそうでなければ、複合体の解離を引き起こす因子は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤としてそのようなアッセイで同定することができる。
【０１０５】
カスパーゼは、プロカスパーゼという前駆体ポリペプチドとして細胞に存在する。カスパーゼの活性化は、プロカスパーゼの蛋白質分解プロセッシングにより起こる。例えば、カスパーゼ−３は、３２ｋＤａポリペプチド前駆体、プロ−カスパーゼ−３の蛋白質分解によって形成されるほぼ１７−２０ｋＤａから１１ｋＤａポリペプチドから構成されるヘテロテトラマーである。プロ−カスパーゼ−３の切断は２工程で進む。最初の切断の結果、プロ−ドメイン、および約１１ｋＤａのより小さな十分にプロセッシングされたサブユニットを依然として含有する部分的にプロセッシングされた大きなサブユニット（２２から２４ｋＤａ）が生じる。第二の工程において、ブロ−ドメインは、恐らくは、自動触媒プロセスによって、部分的にプロセッシングされた大きなサブユニットから切断されて、カスパーゼ−３酵素の１７−２０ｋＤａの成熟した十分にプロセッシングされた大きなサブユニットを生じる。しかしながら、部分的にプロセッシングされたカスパーゼもやはりカスパーゼ活性を有するので、ブロードメインの除去はプロテアーゼの活性化に必要ではない。
【０１０６】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するための本発明の方法を用いて、ＩＡＰの存在のため、成熟した十分に蛋白質分解的に活性な形態へプロセッシングされるのを妨げられるカスパーゼを同定することができる。例えば、該方法を用いて、ＩＡＰが、カスパーゼへプロカスパーゼをプロセッシングするのを阻害するのを妨げ、または抑制する因子を同定することができる。プロカスパーゼのカスパーゼへのプロセッシングは、カスパーゼ蛋白質分解活性の増加に合致するので、蛋白質分解活性を測定するための前記した方法を、ＩＡＰが、カスパーゼへプロカスパーゼをプロセッシングするのを阻害するのを妨げ、または抑制する因子を同定する方法で用いることができる。同様に、前記したもののような結合アッセイを用いて、パートナーの合わされた分子量に従ってプロカスパーゼ−ＩＡＰ複合体を同定することができる。複合体形成を妨げ、あるいは複合体を解離させる因子は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤としてそのようなアッセイで同定することができる。ＩＡＰの存在のため、成熟した十分に蛋白質分解的に活性な形態にプロセッシングされるのが妨げられるカスパーゼもまた、成熟およびプロカスパーゼ形態の分子量またはサイズの差に従って同定することもできる。かくして、阻害性ＩＡＰの存在下でプロカスパーゼに接触すると、成熟形態を示す分子量またはサイズの変化を引き起こす因子を、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定することができる。
【０１０７】
本発明の方法を用いて、特定のＩＡＰまたはカスパーゼ、あるいはＩＡＰおよびカスパーゼの組合せに対して特定性を有するＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤を同定することができる。例えば、本発明は、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１またはｃ−ＩＡＰ−２のような真核生物ＩＡＰ、およびカスパーゼ−３、カスパーゼ−７またはカスパーゼ−９のようなカスパーゼの特異的結合を改変する因子を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。いずれの真核生物ＩＡＰも含めたいずれのＩＡＰも、適当なカスパーゼと組み合わせて本発明の方法で用いることができる。特定のカスパーゼを調節するに関与する他のＩＡＰ蛋白質を本明細書中で開示された方法を用いて同定することができる。従って、カスパーゼおよびＩＡＰの特定の組合せをスクリーニングアッセイで用いて、ＩＡＰによるカスパーゼ活性化の調節を変調する、あるいはＩＡＰおよびカスパーゼの特異的会合を改変する因子を同定することができる。
【０１０８】
本明細書中で開示するように、本発明のコアペプチドは、コアテトラペプチドおよびヘキサペプチド構造を有するコンビナトーリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定した。開示された方法に鑑みると、当業者であれば、６を超えるアミノ酸または４未満のアミノ酸を有するペプチドのコンビナトーリアルライブラリーを用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する他のコアペプチドを同定することもできることを認識するであろう。さらに、開示された方法を用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するコアペプチドを最初に同定できるが、当業者であれば、該方法を反復して用いて、後に記載するように、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するさらなるコアペプチドを最適化し、または同定することができることを知っているであろう。
【０１０９】
当業者であれば、迅速なスクリーニング方法とカップリングさせたコンビナトーリアル合成方法を用いて、ＩＡＰに対する増大した結合親和性、またはＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するにおける増大した活性を持ち、それにより、増強された治療能力を保有するさらなる抑制解除剤を最適化し、同定することができると期待される。
【０１１０】
反復アプローチは当該分野でよく知られており、一般にその双方をここに引用して援用する。Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５４，８４−８６（１９９１）；およびＤｏｏｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６，２０１９−２０２２（１９９４）に記載されている該反復アプローチにおいては、例えば、３つの可変基を有する分子のサブライブラリーが作成され、ここで、第一の変数は定義されている。定義された可変基を持つ化合物の各々は、他の２つの可変基において他の可能性の全てでもって反応する。これらのサブライブラリーを各々テストして、選択されたスクリーニングにおいて最高活性を有するサブライブラリー中の第二の変数の同一性を定義する。最初の２つの定義された可変位置を持つ新しいサブライブラリーは、再度、残りの定義されていない可変位置において他の可能性の全てをもって反応する。以前のように、最高活性を有するサブライブラリー中の第三の可変位置の同一性を決定する。もしより多くの変数が存在すれば、このプロセスを全ての変数について反復して、各変数がスクリーニングプロセスにおける最高の所望の活性に寄与する化合物を得る。次いで、このプロセスからの有望な化合物を、さらなる生物学的調査のために、伝統的な単一−化合物合成方法においてより大きな規模で合成することができる。
【０１１１】
位置−走査アプローチは、種々の有機ライブラリーのために、および種々のペプチドライブラリーのために記載されている（例えば、その双方をここに引用して援用するＲ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４および米国特許第５、５５６、７６２号参照）。位置−走査アプローチにおいて、サブライブラリーを作成し、サブライブラリーの各組での唯１つの変数を定義し、各単一変数が定義された（および他の可変位置の全てにおいて全ての他の可能性を持った）全ての可能なサブライブラリーを作成し、テストとする。本記載から、当業者であれば、２つの固定された位置が一度に定義されたライブラリーを合成することができよう。各単一−変数定義ライブラリーのテストから、その位置における最適置換基を決定し、所望の生物学的活性の最大を有する化合物の最適化または少なくとも１つのシリーズを指し示す。かくして、単一の位置が定義された化合物についてのサブライブラリーの数はその位置において望まれる異なる置換基の数である、各サブライブラリーにおける全ての化合物の数は、他の変数の各々におけるサブライブラリーの数の積であろう。
【０１１２】
ファージディスプレイ方法は、ランダムな、または選択的にランダム化されたペプチドの多様な集団を発現する手段を提供する。ファージディスプレイの種々の方法およびペプチドの多様な集団を生産するための方法は当該分野でよく知られている。例えば、Ｌａｄｎｅｒら（１９９３年６月２９日に発行された米国特許第５、２２３、４０９号）は、ファージの表面の結合ドメインの多様な集団を調製する方法を記載する。特に、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．は、ファージディスプレイライブラリーを生産するのに有用なファージベクター、ならびに潜在的結合ドメインを選択し、ランダムにまたは選択的に突然変異された結合ドメインを生産するための方法を記載する。
【０１１３】
ペプチド基を含有するＩＡＰ−阻害カスパーゼの本発明の抑制解除剤は、その活性基が、例えば、ｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）基またはフルオレニルメトキシカルボニル（ＦＭＯＣ）基を用いて要求されるように保護されたアミノ酸を用いて合成することができる。アミノ酸およびアミノ酸アナログは商業的に購入することができ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ；Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃ，  Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ  ＫＹ）、あるいは当該分野で公知の方法を用いて合成することができる。固相方法を用いて合成されたペプチド、例えば、その全てが商業的に入手可能である４−メチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨＡ）、４−（オキシメチル）−フェニルアセタミドメチルおよび４−（ヒドロキシメチル）フェノキシメチル−コポリ（スチレン−１％ジビニルベンゼン）（Ｗａｎｇ樹脂）を含めた種々の樹脂に、あるいはＤｅ  Ｇｒａｄｏ  ａｎｄ  Ｋａｉｓｅｒ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４７：３２５８（１９８２）によって記載されているように合成することができるｐ−ニトロベンゾフェノンオキシムポリマー（オキシム樹脂）に結合させることができる。
【０１１４】
本発明のペプチドに取り込まれたアミノ酸またはアミノ酸アナログの選択は、部分的には、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤に必要な特異的な物理的、化学的または生物学的特徴に依存するであろう。そのような特徴は、例えば、ペプチドが、イン・ビボまたはイン・ビトロで用いられるべきかおよび、イン・ビボで用いられる場合には、本発明のペプチドが投与される経路、またはそれが向けられる対象における位置によって決定される。例えば、本明細書中においえて例示されたＩＡＰ−阻害カスパーゼコアペプチドの抑制解除剤は、Ｌ−アミノ酸のみを用いて構成することができる。しかしながら、当業者であれば、本発明のペプチド中のアミノ酸のいずれかまたは全ては天然に生じるＬ−アミノ酸、天然に生じないＤ−アミノ酸またはアミノ酸アナログであり得るが、ペプチドはＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できるものとすることを知っているであろう。
【０１１５】
本発明のペプチドにＬ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸を含める選択は、部分的には、ペプチドの所望の特徴に依存する。例えば、１以上のＤ−アミノ酸の取り込みは、イン・ビトロまたはイン・ビボにてペプチドに対して増大した安定性を付与することができる。１以上のＤ−アミノ酸の取り込みは、例えば、実施例ＶＩＩにて記載されたアッセイ、または特定のペプチドの特定の蛋白質に対する結合親和性を測定するための他のよく知られた方法を用いて測定されるように、ペプチドのＩＡＰ結合親和性のような活性を増加または減少させることもできる。
【０１１６】
前記したように、本発明のペプチドは、線状、環状または多価いずれかであり得るが、その立体配座は当該分野で良く知られた方法を用いて達成することができる。本明細書中で用いるように、「環状」ペプチドとは、化学的に構造を環状形態へ変換することによって作成することができる合成線状ペプチドのアナログをいう。線状ペプチドの環化は、標的蛋白質への結合の能力を増加または減少させることによって生物活性を変調することができる（Ｐｅｌｔｏｎ，Ｊ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：２３６−２３９）線状ペプチドは非常にフレキシブルであって、溶液中で多くの異なる立体配座を取る傾向がある。環化は溶液中で利用可能な立体配座の数を制限するように作用し、かくして、ＩＡＰに対するより高い親和性、またはＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤としてのよる優れた活性を有する立体配座に好都合であり得る。
【０１１７】
線状ペプチドの環化は、遊離Ｎ−末端およびＣ−末端の間にペプチド結合を形成することによって（ホモデチックシクロペプチド）、あるいはアミノ酸骨格および／またはＮ−またはＣ−末端近くに位置する側鎖基の間に新しい共有結合を形成することによって（ヘテロデチックシクロペプチド）、達成される（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ，Ｎ．，１９８４，前述）。後者の環化は、共有結合、例えば、ジスルフィド、ラクトン、エーテルまたはチオエーテルを形成するために別の化学的戦略を用いる。本明細書中に記載されるように、５以上のアミノ酸残基の線状ペプチドは比較的容易に環化することができる。中央の４つの残基においてベーター−ターン立体配座を形成するペプチドの傾向は、ホモデチックおよびヘテロデチックシクロペプチド双方の形成を容易とする。Ｎ−またはＣ−末端におけるプロリンまたはグリシン残基の存在もまた、特に、長さが６残基よりも短い線状ペプチドからのシクロペプチドの形成を容易とする。
【０１１８】
本発明の因子は、抑制解除剤ＩＡＰ−阻害カスパーゼ配列または部位の分子当たりに存在する数に対して多価であり得る。多価剤に存在する配列または部位は同一または異なるのいずれかであり得る。例示的な多価ペプチドはよく知られた多重抗原ペプチド系（ＭＡＰＳ；例えば、Ｂｒｉａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．，１５６（２）：２５５−２６５；Ｓｃｈｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎ．，１７４（２）：１９９−２０９等参照）を用いて生成することができる。存在する抑制解除剤ＩＡＰ−阻害カスパーゼ配列または部位の数に対して多価である因子は、１を超えるＢＩＲドメインを有するＩＡＰと相互作用するのに有用であり得る。例えば、単一の因子を、同一ＩＡＰ上の別々のＢＩＲドメインと相互作用する２以上の配列または部位を含有するようにできる。多価剤およびＩＡＰにおける多重相互作用パートナーの存在は、相互作用の親和性または特異性を増加させることができる。
【０１１９】
いくつかの場合において、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤を、短期間の間のみ活性なままとするのは望ましくあり得る。それらの場合において、該因子への１以上のＬ−アミノ酸の取り込みは、例えば、対象における内因性ペプチダーゼがイン・ビボで該因子を消化するのを可能とすることができ、それにより、抑制解除剤への対象の暴露を制限する。１つの具体例において、該因子は、ペプチド骨格または他の構造に基づくかを問わず、Ｌ−アスパルテート部位または残基を通じるペプチド結合を含むことができる。それが抑制解除するカスパーゼによるＬ−アスパルテート含有剤の分解は、該因子によって許容されるアポトーシスの程度を最小化するフィードバック制御メカニズムを提供することができる。当業者であれば、例えば、対象の年齢および一般的な健康等を考慮することによって、本発明の因子に必要な望ましい特徴を決定することができる。例えば、対応するＬ−アミノ酸に代えて置換された１以上のＤ−アミノ酸を有するペプチドの対象における半減期は、薬理学の分野における当業者によく知られた方法を用いて決定することができる。
【０１２０】
ペプチドにおける反応性基の選択的修飾は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤に望ましい特徴を付与することもできる。本発明のペプチドは、依然として樹脂に結合させて、例えば、Ｎ−アセチル化ペプチドのようなＮ−末端修飾ペプチドを得つつ操作することができる。別法として、フッ素化水素または同等な切断試薬を用いてペプチドを樹脂から除去し、次いで、修飾することができる。Ｃ−末端カルボキシ基を含有する合成された因子（Ｗａｎｇ樹脂）は樹脂からの切断の後に、またはある場合には、液相合成に先立って修飾することができる。ペプチドのＮ−末端またはＣ−末端を修飾するための方法は当該分野でよく知られており、例えば、Ｎ−末端のアセチル化のための方法、およびＣ−末端のアミド化のための方法を含むことができる。
【０１２１】
また、本発明の範囲内にはペプチドアナログが含まれる。本明細書中で用いるように、用語「ペプチドアナログ」は、１以上の残基が機能的に同様な残基で保存的に置換されており、かつ本明細書中に記載されたような本発明のレクチン−結合ペプチドを機能的に模倣する能力を呈する、コアペプチド１から５５のような、ここに具体的に示された配列と実質的に同一のアミノ酸配列を有するいずれのペプチドも含む。保存的置換の例は、もう１つのものに代えてのイソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのような１つの非極性（疎水性）残基の置換、アルギニンおよびリシンの間、グルタミンおよびアスパラギンの間、グリシンおよびセリンの間のようなもう１つのものに代えての１つの極性（親水性）残基の置換、もう１つのものに代えてのリシン、アルギニンまたはヒスチジンのような１つの塩基性残基の置換、またはもう１つのものに代えてのアスパラギン酸またはグルタミン酸のような１つの酸性残基の置換を含む。
【０１２２】
本明細書中で用いるように、フレーズ「保存的置換」は、非誘導体化残基の代わりの化学的に誘導体化された残基の使用を含み、但し、そのようなペプチドは必要なＩＡＰ結合または阻害活性を呈するものとする。化学的誘導体は、例えば、遊離アミノ基が誘導体化されて、アミン塩酸塩、ｐ−トルエンスルホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブチルオキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成する分子を含むことができる。遊離カルボキシル基を誘導体化して、塩、メチルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステルあるいはヒドラジドを形成することができる。遊離ヒドロキシル基を誘導体化して、Ｏ−アシルまたはＯ−アルキル誘導体を形成することができる。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化して、Ｎ−ｉｍ−ベンジルヒスチジンを誘導体化することができる。また、化学的誘導体として、２０の標準的なアミノ酸の１以上の天然に生じるアミノ酸誘導体を含有するペプチドが含まれる。例えば：４−ヒドロキシプロリンをプロリンに代えて置換することができ；５−ヒドロキシリシンをリシンに代えて置換することができ；３−メチルヒスチジンをヒスチジンに代えて置換することができ；ホモセリンをセリンに代えて置換することができ；およびオルニチンをリシンに代えて置換することができる。本発明のペプチドは、必要なＩＡＰ結合または阻害活性が維持される限り、その配列を本明細書中で示したペプチドの配列に対して、残基の１以上の付加、欠失、あるいは付加および欠失の組合せを有するいずれのペプチドも含む。
【０１２３】
当業者であれば、本明細書中に提供されたガイダンスから、本発明の因子は、該因子がＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できる限り、アナログまたは誘導体で修飾し、誘導体化し、または置換したコアペプチドまたはコア構造を含むことができるのを認識するであろう。コアペプチドまたはコア構造におけるそのような改変は、本明細書中に記載されたもののようなよく知られた合成方法によって作成することができる。そのような改変された因子は、実施例Ｉに記載された抑制解除アッセイまたは実施例ＶＩＩに記載された偏光結合アッセイのような本明細書中に記載された方法を用いて活性をテストすることができる。
【０１２４】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定された因子は、例えば、前記したアッセイを含めた、該因子の存在下または非存在下におけるカスパーゼ蛋白質分解活性、またはＩＡＰおよびカスパーゼの結合を測定するためのアッセイを用いてテストすることができる。そのようなアッセイを用いてＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できるとして同定された因子は、前記した反復アプローチを用いて１以上の位置においてさらにコンビナトーリアル化することができる。別法として、同定された抑制解除剤、または複数の抑制解除剤を第二世代の因子の合理的設計のための基礎として用いることができる。例えば、複数の確証された因子の間の共通する構造的特徴を用いて、共有された特徴を取り込む一般化された構造の合成をガイドすることができる。因子に関する構造的情報は、ＩＡＰまたはカスパーゼに結合した場合、カスパーゼまたはＩＡＰとの不都合な相互作用に導く部位を除去しつつ、好都合な相互作用を供するとして同定された部位に対してそのままである、または改良する第二世代の因子を設計するのに用いることもできる。
【０１２５】
本発明は、最適化された第二世代の因子を設計するのに用いられるポリフェニル尿素化合物の構造的な活性関係（ＳＡＲ）情報を提供する（実施例ＸＶＩおよび表ＸおよびＸＩ参照）。図３４に示された一連の化合物（ＴＰＩ  １５０９）は、ＴＰＩ  １３９６ポリフェニル尿素化合物に基づいて合成された。これらの化合物の全てはＸＩＡＰ抑制解除アッセイで活性であった。従って、本発明は、該因子がＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する図３４に示された構造のいずれかから選択されたコア構造を有する単離された因子を提供する。加えて、ＴＰＩ  １５０９シリーズからの化合物のＲ基の修飾は、ここで、実施例ＸＶＩＩに提供される（図３５も参照）。当業者によって理解されるように、これらのタイプのＲ基修飾は、ＴＰＩ  １３９６ライブラリーにおけるもののような他のポリフェニル尿素化合物で用いることができる。
【０１２６】
本発明は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法を提供する。該方法は（ａ）ＩＡＰまたはカスパーゼに結合されたＩＡＰ−阻害カスパーゼの標識された抑制解除剤を検出し；（ｂ）結合したＩＡＰまたはカスパーゼを候補剤と接触させ、該因子はＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できることが疑われ；次いで、（ｃ）ＩＡＰまたはカスパーゼからのＩＡＰ−阻害カスパーゼの標識された抑制解除剤の解離を検出する工程を含み、それにより、該候補剤はＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子として同定される。該方法で用いられるＩＡＰ−阻害カスパーゼの標識された抑制解除剤は、コアペプチド４から３９および４２から５５のような本発明のコアペプチド、あるいはＴＰＩ  ７５９、  ＴＰＩ  ８８２、ＴＰＩ  ９１４、ＴＰＩ  ９２７から選択されたコア構造、またはＴＰＩ  １３９１、ＴＰＩ  １３４９、ＴＰＩ  １４００、ＴＰＩ  １３９６、ＴＰＩ  １５０９、ＴＰＩ  １５４０、ＴＰＩ  １５７７、ＴＰＩ  １５６７，ＴＰＩ  １５７２，ＴＰＩ  ７９２およびＴＰＩ  １３３２から選択される構造を有する化合物から選択されるコアモチーフを有することができる。該方法を用いて、前記した、および実施例に記載されたスクリーニング様式にてＩＡＰ−阻害カスパーゼの良好な抑制解除剤を同定することができる。
【０１２７】
また、本発明はＩＡＰ上の新規な負の調節結合部位も提供する。本明細書中で確認される新規な負の調節結合部位は（ＤＩＡＢＬＯとしても知られた）ＳＭＡＣペプチドに結合しない。ＳＭＡＣペプチドは、ＩＡＰのＢＩＲ３ドメインを通じてＸＩＡＰのようなＩＡＰに結合することが知られている（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：１００４−１００８（２０００））。図２６にてここに開示されたように、ＴＰＩ  １３９６−３４のような活性なポリフェニル尿素化合物は、ビオチン−ＳＭＡＣ  ７−量体ペプチドＡＶＰＩＡＱＫ（配列番号：５）とＸＩＡＰに対する結合について競合しない。実施例ＸＶＩＩおよび図３６にてここにさらに開示するように、ＴＰＩ  １３３２−６９またはＴＰＩ  １３３２−４のような活性なテトラペプチドは、ビオチン−ＳＭＡＣ  ７−量体ペプチドＡＶＰＩＡＱＫ（配列番号：５）とＸＩＡＰに対する結合について競合しない。従って、本明細書中で開示されるのは、非ＳＭＡＣ結合部位を介して、ＸＩＡＰのようなＩＡＰに作用する化合物である。本明細書中においてさらに開示されるように、ＸＩＡＰの非ＳＭＡＣ結合部位はＢＩＲ２ドメインであると同定されている。ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメイン−阻害カスパーゼを抑制解除する本発明のポリフェニル尿素化合物の能力は、例えば、図２１Ｃ、２２Ｅ、２３Ｅおよび２４Ｇにここに開示されている。加えて、ＢＩＲ２にん直接的に結合する本発明のポリフェニル尿素の化合物の能力は図４２に示され、実施例ＸＸＩＶに記載されている。
【０１２８】
これらの結果は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、ＩＡＰのＢＩＲドメインへ結合し、それにより、カスパーゼ−ＩＡＰ機能をブロックするＢＩＲドメインの能力を低下させることによって機能することができることを示す。従って、本発明は、（ａ）カスパーゼおよびＢＩＲドメインを、ＢＩＲドメインの非存在下でカスパーゼ活性を可能とする条件下で、候補剤と接触させ、ここで、ＢＩＲドメインはカスパーゼを阻害することができ、次いで、（ｂ）カスパーゼ活性を検出し、ここで、阻害されたカスパーゼの活性の増加は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する；ことを含む、ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法を提供する。
【０１２９】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するための本発明の方法は、カスパーゼを阻害することができるＢＩＲドメインと接触させることを含む。カスパーゼを阻害することができるいずれのＢＩＲドメインも本発明の方法で用いることができる。カスパーゼ活性を阻害するＢＩＲドメインの能力は、例えば、ＢＩＲドメインの非存在下における活性と比較して、ＢＩＲドメインの存在下におけるカスパーゼによる特異的基質のより低いレベルの加水分解を測定することによって、種々のよく知られた方法を用いて測定することができる。アポトーシスにおけるカスパーゼの役割を仮定すれば、カスパーゼ活性は、例えば、特異的基質の蛋白質分解（加水分解）を調べることによって直接的に、あるいは例えば、アポトーシスの細胞または細胞核特徴の形態学的変化を同定することによって間接的に同定することができるのは当業者に認識されるであろう。カスパーゼ活性を検出するための例示的なアッセイは前記にて、および実施例Ｉにおいて本明細書中で記載される。カスパーゼ−３を阻害できるＢＩＲドメインの例はＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインである（実施例ＶＩＩＩ参照）。
【０１３０】
本発明は、（ａ）ＩＡＰ上の非ＳＭＡＣ結合部位に結合したＩＡＰ−阻害カスパーゼの標識された抑制解除剤を検出し；（ｂ）該結合したＩＡＰまたはカスパーゼを候補剤と接触させ、該候補剤はＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除することができることが疑われ；次いで、（ｃ）ＩＡＰまたはカスパーゼからのＩＡＰ−阻害カスパーゼの標識された抑制解除剤の解離を検出し、それにより、候補剤はＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子として同定される；ことによって、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法をさらに提供する。１つの具体例において、標識された抑制解除剤、ＴＰＩ  １３３２またはＴＰＩ  １３９６ライブラリーからのコア構造に基づいている。もう１つの具体例において、ＩＡＰ上の非ＳＭＡＣ結合部位はＴＰＩ  １３３２−６９またはＴＰＩ  １３３２−４によって結合された部位である。
【０１３１】
さらなる具体例において、ＩＡＰ上の非ＳＭＡＣ結合はＢＩＲドメインである。従って、該方法は、（ａ）ＢＩＲドメイン−阻害カスパーゼの標識された抑制解除剤を検出し、該抑制解除剤はＢＩＲドメイン−カスパーゼ複合体のＢＩＲドメインに結合しており；（ｂ）該ＢＩＲドメイン−カスパーゼ複合体を候補剤と接触させ、該候補剤はＢＩＲドメイン−阻害カスパーゼを抑制解除することができることが疑われ、次いで、（ｃ）該複合体からのＢＩＲドメイン−阻害カスパーゼの標識された抑制解除剤の解離を検出することによって実施することができ、ここで、該抑制解除剤はＴＰＩ  １３９１、ＴＰＩ  １３４９、ＴＰＩ  １３９６、ＴＰＩ  １５０９、ＴＰＩ  １５４０、ＴＰＩ  １４００、ＴＰＩ  ７９２およびＴＰＩ  １３３２から選択されるコア構造を含む単離された因子から選択され、それにより、該候補剤は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子として同定される。
【０１３２】
実施例ＸＸＩＶに記載されているように、ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する本発明の化合物はＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインに直接的に結合することができる。ＢＩＲ２ドメインに結合する本発明の化合物と競合することができる因子もまた、抑制解除活性に重要な部位においてＢＩＲ２ドメインに結合するであろうことが認識される。従って、ＢＩＲ２ドメインへの結合について本発明の化合物と競合する当該因子の能力に基づいて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定する方法を提供する。該方法は、（ａ）ＢＩＲ２ドメインが抑制解除剤に結合する条件下で、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の存在下で、ＢＩＲ２ドメインを候補剤と接触させ、次いで、（ｂ）ＢＩＲ２ドメインからの抑制解除剤の解離を検出することを含み、ここで、該候補剤は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子として同定され、ここで、該抑制解除剤はＴＰＩ  １３９１、ＴＰＩ  １３４９、ＴＰＩ  １３９６、ＴＰＩ  １５０９、ＴＰＩ  １５４０、ＴＰＩ  １４００、ＴＰＩ  ７９２およびＴＰＩ  １３３２から選択されるコア構造を含む単離された因子から選択される。
【０１３３】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するのに用いることができる種々のアッセイが当該分野でよく知られている。そのような方法は、抑制解除剤、およびＸＩＡＰのようなＩＡＰを含有する複合体に候補剤が加えられる結合アッセイを含む。抑制解除剤またはＩＡＰは、例えば、ラテックスビーズまたはプレートに固定化することができ、あるいは溶液中に遊離させることができる。抑制解除剤、ＩＡＰまたは候補剤は、アルカリ性ホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはルシフェラーゼのような放射性標識、蛍光標識または酵素標識にコンジュゲートさせることができる。例えば、ＩＡＰおよび標識された抑制解除剤を含有する複合体に候補剤を加えることができ、例えば、ここで、ＩＡＰはラテックスビーズのような固体支持体に固定化される。次いで、候補剤によって置き換えられた標識された抑制解除剤の量を測定することができる。別法として、このアッセイを行うことができ、そこでは、ＩＡＰは固体支持体に結合されないが、溶液中に遊離される。加えて、蛍光標識候補化合物もまた、抑制解除剤およびＩＡＰを含有する複合体に加えることができ、標識された候補剤を含有する結合複合体を、例えば、蛍光偏光アッセイを用いて検出することができる（Ｄｅｇｔｅｒｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：１７３−１８２（２００１））。
【０１３４】
当業者であれば、種々のさらなる手段を用いて、候補剤がＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子であるか否か、あるいは候補剤がＩＡＰに結合した抑制解除剤を置き換えることができるか否かを決定することができる。例えば、シンチレーション近接アッセイ（Ａｌｏｕａｎｉ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３８：１３５−４１（２０００））を用いることができる。シンチレーション近接アッセイは、抗原が可逆的に選択的に結合するであろう抗体のような許容される分子で被覆されたフルオマイクロスフィアの使用を含む。例えば、ＩＡＰ−抑制解除剤複合体は、ＩＡＰに特異的に結合する抗体を用いてフルオマイクロスフィアに結合させ、３Ｈまたは１２５Ｉ標識ＦＰ候補剤と接触させることができる。もし標識された候補剤がＩＡＰに特異的に結合するならば、標識された候補剤からの放射エネルギーはフルオマイクロスフィアによって吸収され、それにより、容易に測定される光を生じる。
【０１３５】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するための、および抑制解除剤を置き換えた後にＸＩＡＰへの候補剤の特異的結合を測定するためのさらなるアッセイは、限定されるものではないが、ＵＶまたは化学架橋アッセイ（Ｆａｎｃｙ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．４：２８−３３（２０００））および生体分子相互作用分析（Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ  １：３９５−４１６（２０００））を含むことができる。ＩＡＰへの候補剤の特異的結合は、もしそれらが相互に接触しているならば、ＵＶまたは化学架橋剤を用いてこれらの２つの成分を架橋させることによって測定することができる。加えて、生体分子相互作用分析（ＢＩＡ）は、２つの成分が相互に接触しているか否かを検出することができる。そのようなアッセイにおいて、ＩＡＰ−抑制解除剤複合体のような１つの成分はＢＩＡチップに結合させ、候補剤のような第二の成分はチップを通過させる。もし候補剤が抑制解除剤を置き換え、かつＩＡＰに結合するならば、接触の結果電気信号が生じ、これは容易に検出される。
【０１３６】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するのに適したさらなるアッセイは、ＮＭＲ方法に基づくものを含む。そのような方法は、該因子および標的の間での複合体の形成に際して起こる、ＩＡＰまたはそのドメインのような、候補剤またはその標的のＮＭＲ−感受性パラメーターで観察することができる有意な乱れを利用する。これらの乱れを用いて、候補剤およびＩＡＰの間の結合を検出し、ならびに結合相互作用の強さを評価することができる。加えて、いくつかのＮＭＲ技術は、因子の結合部位、あるいは該因子のいずれの部分が標的と相互作用するのを担うかの同定を可能とする。ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するのに有用な例示的なＮＭＲ方法は、例えば、Ｓｈｕｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７４，１５３１−１５３４（１９９６）に記載された「ＮＭＲによるＳＡＲ」、およびその全ては、例えば、Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，  Ｖｏｌ．５，Ｎｏ．８（２００２）およびｉｎ  Ｈａｊｄｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３２（３）：２１１−２４０（１９９９）に記載されている、ＳＨＡＰＥＳスクリーニング、ＮＭＲを用いるリード最適化のための断片−ベースのアプローチ、およびフッ素−ＮＭＲ競合結合実験を含めた種々のＮＭＲ−ベースのスクリーニングアッセイを含む。
【０１３７】
蛍光−ベースのアッセイもまた、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するのに適している。ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子、およびＩＡＰまたはカスパーゼのようなその対応する標的の間の相互作用の測定に適用することができる蛍光方法の例は、因子および標的の間の相互作用の改変に由来する蛍光強度変化；因子および標的の間の距離に基づく蛍光強度の変化を測定するのに有用な蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）；もう１つの結合パートナーと会合し、またはそれから解離した場合に観察される結合パートナーのサイズの変化に由来する蛍光偏光変化；平行移動拡散、観察された結合パートナーのサイズに関連するパラメーターに基づく、蛍光寿命の変化、および蛍光修正スペクトロスコピーの観察を含む。そのような方法は蛍光標識剤または結合パートナーの使用を含むことができる。例えば、フルオロファは、フルオロファの励起または発光波長、フルオロファの蛍光偏光、またはフルオロファから発せられた蛍光の強度に基づいて検出することができる。別法として、検出は、結合したおよび結合していない状態についての標識の測定可能な特性の差に基づくことができる。例えば、実施例ＶＩＩに示されるように、結合していない基質と比較したＩＡＰに結合した基質のより遅い回転による蛍光偏光の差を用いて、会合を検出することができる。フルオロファ−標識剤とＩＡＰまたはカスパーゼとの会合を測定するのに用いることができる他の測定可能な差は、例えば、消光剤の存在または不存在による異なる発光強度、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）ドナーまたはアクセプターの存在または不存在による発光波長の差、またはフルオロファ立体配座または環境の差による発光波長の差を含む。本発明の方法で用いられるＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤は、例えば、前記したものを含めた種々の標識のいずれかで標識することができる。ＩＡＰまたはカスパーゼに結合した標識された抑制解除剤は、標識の公知の測定可能な特性に従って標識することができる。
【０１３８】
ＩＡＰまたはカスパーゼからのＩＡＰ−阻害カスパーゼの標識された抑制解除剤の解離は、競合結合候補剤の存在下におけるＩＡＰまたはカスパーゼからの標識の不存在、または該標識の量の低下として、あるいは競合結合候補剤の存在下で標識された因子とカスパーゼまたはＩＡＰとの解離に際して起こる変化の逆行として検出することができる。かくして、解離は、放射性核種標識抑制解除剤の存在下におけるＩＡＰまたはカスパーゼの放射能の低下または喪失、クロモフォア標識抑制解除剤の存在下におけるＩＡＰまたはカスパーゼについての特定の波長における電磁波吸収の低下または喪失、常磁性スピン標識抑制解除剤の存在下におけるＩＡＰまたはカスパーゼについての特定の場強度またはラジオ周波数における磁性シグナルの低下または喪失、あるいは二次的標識についての結合基で標識された抑制解除剤の存在下におけるＩＡＰまたはカスパーゼと会合した二次的標識の低下または喪失として、非標識候補剤の存在下で検出することができる。会合に際して起こる変化の逆行によって測定された解離の例は実施例ＶＩＩで供され、ここで、ＩＡＰ−結合基質と比較した、解離した基質のより速い回転による偏光の差を用いて解離を検出する。
【０１３９】
適切に標識された抑制解除剤およびＩＡＰまたはカスパーゼの会合または解離を測定するのに検出することができる標識の特性の他の変化は、例えば、熱の吸収および放出、電磁波放射の吸収および放出、受容体に対する親和性、分子量、密度、質量、電荷、導電性、核の磁気モーメント、電子のスピン状態、極性、分子の形状、または分子のサイズを含む。適切に標識された抑制解除剤およびＩＡＰまたはカスパーゼの会合または解離に際して変化することができる周囲の環境の特性は、例えば、周囲の溶媒の温度および屈折率を含む。ＩＡＰまたはカスパーゼからの抑制解除剤の会合および解離は、例えば、Ｓｅｇｅｌ，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９７５），およびＫｙｔｅ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂ．（１９９５）に記載された平衡結合分析、競合アッセイ、およびキネティック分析を含めた、よく知られた方法を用い、標識された抑制解除剤の、または抑制解除剤およびＩＡＰまたはカスパーゼの間の複合体の種々の特性のいずれかに基づいて測定することができる。
【０１４０】
加えて、実質的計算方法等を用いて、本発明のスクリーニング方法において、抑制解除剤を置き換えることができる化合物を同定することができる。例示的な実質的計算方法は、特定の結合を測定または予測するためのＩＡＰまたはＩＡＰ−抑制解除剤複合体構造の実質的表示への小−分子剤の実質的ドッキングを含む。例えば、Ｓｈｕｋｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，前述，１９９６；Ｌｅｎｇａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ６：４０２−４０６（１９９６）；Ｃｈｏｉｃｈｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２２１：３２７−３４６（１９９１）；Ｃｈｅｒｆｉｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １１：２７１−２８０（１９９１）；Ｐａｌｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ３９：３７２−３８４（２０００）；Ｅｃｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９９：１０３−１１５（１９９９）；Ｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｅｖ．１９：３０７−３１９（１９９９）；Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２０００）参照。
【０１４１】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を同定するための本発明の方法は、低スループットまたは高スループットアッセイ様式を用いて行うことができる。スクリーニングは、例えば、９６、３８４および１５３６ウェル様式を含めた全てのプレート様式で行うことができる。加えて、前記したもののようなアッセイをキネティック−ベースのまたは終点−ベースの標識で行うことができる。スクリーニングスルプットを増加させるためには、１を超える候補剤またはカスパーゼをアッセイ試料に存在させることができる。本発明の方法においてテストすべき異なる候補剤の数は該方法の適用に依存するであろう。例えば、手動スクリーニング手法を用い、あるいはいくつかの候補剤の間の効率を比較するのが望まれる場合、１つのまたは少数の候補剤をスクリーニングすることができる。しかしながら、候補剤の数がより大きければ、スクリーニングアッセイにおいて所望の活性を有する因子を同定する尤度はより大きくなると認識される。加えて、多数の候補剤を高−スループット自動スクリーニング方法で処理することができる。
【０１４２】
本発明は、データベースにおいてＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤を同定するための方法を提供する。ペプチドまたは小分子のような分子のデータベースは、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の構造を問い合わせて、問い合わせ構造と同一または同様な部位を有する候補剤を同定することができる。データーベースサーチで同定された候補剤は合成し、単離し、またはそうでなければ公知の方法を用いて得ることができ、次いで、先に、ぽよび実施例に記載されたアッセイを用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤としての活性のそのレベルについてテストすることができる。
【０１４３】
ペプチドベースの抑制解除剤については、アミノ酸配列（一次構造）または三次元構造（三次構造）またはその双方に基づいてデータベースに対して問い合わせを行って、同一または実質的に同様な構造を有するペプチドまたは蛋白質を同定することができる。２つの配列が実質的に同一であることを判断するのに用いることができる一次配列構造を比較するための方法は、例えば、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔおよびＧｅｎＰｅｐｔを含めたデータベースのように、当該分野でよく知られている。例えば、２つの配列が実質的に同一であるかを判断するための１つの方法は基本的な局所的整列サーチツールであるＢＬＡＳＴであり、これは、Ｔａｔｉａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０（１９９９）によって、またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブページに記載されたようにデフォルトパラメーターに従って用いることができる。ＢＬＡＳＴは、全ての利用可能な配列データベースを調べるのに設計された同様性サーチプログラムの組であり、アミノ酸または核酸配列における同様性についてサーチするように機能させることができる。ＢＬＡＳＴサーチは、よく規定された統計学的解釈を有するサーチスコアを提供する。さらに、ＢＬＡＳＴは局所的整列を求める発見的アルゴリズムを用い、従って、例えば、蛋白質ドメインを含めた同様性の単離された領域のみを共有する配列の間の関係を検出することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。
【０１４４】
元来記載されたＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，前述，１９９０）に加えて、アルゴニズムに対する修飾がなされている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））。１つの修飾はギャップドＢＬＡＳＴであり、これは挿入または欠失いずれかのギャップが整列に導入されることを可能とする。整列においてギャップを可能とすることは、バイオロジック関係をより親密に反映する傾向がある。例えば、ギャップドＢＬＡＳＴを用いて、２以上のポリペプチドの同様なドメイン内の配列同一性を同定することができる。第二の修飾はＰＳＩ−ＢＬＡＳＴであり、これは、配列ホモログについてサーチする感度の良好な方法である。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴは最初のギャップドＢＬＡＳＴサーチを行い、いずれかの有意な整列からの情報を用いて、位置−特異的スコアマトリックスを構築し、これは、データベースサーチングの次のラウンドのために問い合わせ配列を置き換える。ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴサーチは弱いが生物学的に重要な配列同様性に対してしばしばより感受性である。
【０１４５】
２つの配列は実質的に同一であるかを判断するのに用いることができる第二の源は、ＥｘＰＡＳｙにおいて世界的なウェブで入手可能なＰＲＯＳＩＴＥである。ＰＲＯＳＩＴＥは、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列から翻訳された特徴付けられていないポリペプチドの機能を決定するための方法である（Ｂａｉｒｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２１７−２２１（１９９７））。ＰＲＯＳＩＴＥは、ポリペプチドのいずれの公知のファミリーに、もしあれば、新しい配列が属するかを同定するのに用いることができる生物学的に重要な部位およびパターンのデータベースよりなる。この、または同様なアルゴリズムを用い、もう１つのポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドが、例えば、同様なドメインに見出されるものを含めた参照ポリペプチドにおけるアミノ酸残基の特定のクラスタと実質的に同一であるパターン、モチーフ、シグニシャーまたはフィンガープリントと呼ぶことができるアミノ酸残基の特定のクラスタのその配列における発生によって同定することができる。ＰＲＯＳＩＴＥはコンピュータアルゴリズムを用いて、ファミリーメンバーとしてのポリペプチドを同定するモチーフについてサーチする。また、ＰＲＯＳＩＴＥは、新しく同定されたポリペプチドが公知のファミリーのメンバーであるかを決定するのに用いることができる従前に同定されたモチーフの編集を維持する。
【０１４６】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の三次構造は、当該分野で知られたアルゴリズムを用いるａｂ  ｉｎｉｔｉｏ蛋白質折畳みのような理論的方法によって、またはＸ−線結晶学または核磁気共鳴ベースの構造決定のような経験的方法によって決定することがっできる。抑制解除剤の構造モデルは、例えば、Ｈａｄｌｅｙ  ａｎｄ  Ｊｏｎｅｓ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ７：１０９９−１１１２（１９９９）にレヴューされているＳＣＯＰ、ＣＡＴＨ、またはＦＳＳＰを含めたポリペプチド構造、および第二のポリペプチドに対する配列比較用の領域として用いられる特定の折りたたみまたは立体配座を有する領域を比較して、実質的に同様な領域を同定するアルゴリズムで用いることができる。
【０１４７】
同様なデータベースサーチング方法を非ペプチドベースの抑制解除剤のために、または構造に基づく非ペプチドベースの候補剤のデータベースを問い合わせるために用いることができる。データベースは、例えば、化学的特性情報または構造的情報に基づいて問い合わせることによってサーチすることができる。後者のアプローチにおいて、鋳型に対するマッチの発見に基づくアルゴリズムは、例えば、Ｍａｒｔｉｎ，“Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，”  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：２１４５−２１５４（１９９２）に記載されているように用いることができる。
【０１４８】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤は、問い合わせとしての位置スキャンニング合成コンビナトーリアルライブラリーの結果を用いてデータベースで同定することもできる。そのような結果はモチーフとして表すことができ、該モチーフを用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤につきデータベースをサーチすることができる。モチーフサーチは位置スキャンニング合成コンビナトーリアルライブラリーのスクリーニングの結果から生じ、各位置に含まれるのは、特定な値よりも大きな活性閾値を有する混合物に対応するアミノ酸である。活性閾値の例は、実施例Ｉに記載された候補剤の存在下および非存在下におけるカスパーゼ活性についてのＶｍａｘの比率である。モチーフベースのデータベースサーチングは、例えば、Ｈｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．５：１３７５−１３８２（１９９９），Ｈｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：１６５１−１６５９（１９９７）  ａｎｄ  Ｈｅｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １９：１６３−１６８（１９９８）に記載されているように当該分野において知られている。
【０１４９】
別法として、位置スキャンニング合成コンビナトーリアルライブラリーからの結果はスコアマトリックスとして表すことができ、該スコアマトリックスを用いて、配列データベースにおけるＩＡＰ−阻害カスパーゼの他の抑制解除剤について問い合わせることができる。データベースのスコア−マトリックスベースのサーチに基づいて候補ペプチドまたは蛋白質を同定するための方法は、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：２１３０−２１４１（２００１）に記載されている。簡単に述べれば、行は位置を表し、列は２０アミノ酸を表し、および各々はスコアに相関するマトリックスが構築される。特定の位置およびアミノ酸についてのスコアは、その位置において規定されたそのアミノ酸に対応する位置スキャンニング合成コンビナトーリアルライブラリーの混合物のためのアッセイ結果に基づく。例えば、各スコアは、特定の位置において規定されるアミノ酸に対応する混合物の存在下および非存在下においてカスパーゼ活性についてのＶｍａｘの比率に対応することができる。次いで、スコアリングマトリックスを用いて、データベースエントリーを横切ってスコアリングマトリックスを１アミノ酸増分にて移動させることによって、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの候補抑制解除剤についてサーチする。スコアはサーチされたデータベースエントリーについて計算され、各々をランク付けする。所定のカットオフを超えるスコアを有するものは、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの候補抑制解除剤として同定される。
【０１５０】
本発明は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを有効量の因子と接触させて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除することによってＩＡＰ−阻害カスパ−ゼを抑制解除する方法を提供し、害剤は、コアペプチド４から３９および４２から５５のような本発明のコアペプチド、またはＴＰＩ  ７５９、ＴＰＩ  ８８２、ＴＰＩ  ９１４またはＴＰＩ  ９２７のような本発明のコア構造から選択されるコアモチーフを有する。
【０１５１】
アポトーシス蛋白質の阻害剤（ＩＡＰ）のカスパーゼ阻害活性を阻害するためには、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを、ＩＡＰ―阻害カスパーゼを抑制解除するのに効果的な量の抑制解除剤と接触させる。かくして、該因子の有効量は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼについてのカスパーゼ活性と比較した、抑制解除されたＩＡＰ−阻害カスパーゼからのカスパーゼ蛋白質分解活性の増加を生じるのに十分な量である。抑制解除されたＩＡＰ−阻害カスパーゼからの蛋白質分解活性の増加は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤を同定するための方法を参照して、前記した方法のいずれかを用いて測定することができる。
【０１５２】
本発明の因子は、一旦、ＩＡＰがカスパーゼを阻害するのが阻害されれば、カスパーゼ活性が起こるのに適した条件下で、ＩＡＰ−阻害カスパーゼと接触させることができる。そのような条件は実施例Ｉに記載されたものを含む。ＩＡＰ−阻害カスパーゼと接触される因子は化合物の混合物に、単離された形態に、または実質的に純粋な形態に存在し得る。前記したように、化合物の混合物を、位置スキャンニングまたは反復を使用するスクリーニング方法においてＩＡＰ−阻害カスパーゼと接触させることができる。そのような混合物は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する能力を有するものとして同定することができる。該混合物は本発明の方法で用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制することができる。別法として、そのような活性を有する混合物における特定の種は、混合物中の個々の種を単離し、抑制解除アッセイを反復し、またはＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除のための第二のアッセイを行うことによってさらに規定することができる。ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子は、コンジュゲートとしての、または前記した処方における、実質的に純粋な形態のＩＡＰ−阻害カスパーゼと接触させることができる。
【０１５３】
本発明のさらなる具体例において、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを、細胞中にて、本発明の因子と接触させることができる。従って、本発明は、細胞を、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するのに有効な量の因子と接触させることによって、細胞中でアポトーシスを促進する方法を提供し、該因子は、コアペプチド４から３９および４２から５５のような本発明のコアペプチド、あるいはＴＰＩ  ７５９、ＴＰＩ  ８８２、ＴＰＩ  ９１４またはＴＰＩ  ９２７のような本発明のコアペプチドから選択されたコアモチーフを有する。
【０１５４】
コンジュゲートの部位の結合のような、ＩＡＰ−阻害カスパーゼのサイトゾル送達用の本明細書中に記載された方法を、細胞においてアポトーシスを促進する方法で用いることができる。該因子の有効量は、細胞中でアポトーシスが起こるのを可能とするのに十分な量と定義することができる。ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤を同定する関係で前記したもののような、アポトーシスの特徴である細胞または核における形態学的変化を測定する方法を用いて、細胞においてアポトーシスを促進する方法を行いつつ、アポトーシスをモニターすることができる。
【０１５５】
また、本発明は、エクス・ビボで生存する細胞の集団の能力を低下させる方法も提供する。該方法は細胞を本発明の因子と接触させる工程を含むことができ、ここで、該因子はＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する。該細胞は、細胞においてアポトーシスを促進するための前記した方法を用いて因子と接触させることができる。該方法を用いて、標的化部位の因子への結合のような、前記した標的化方法を用い、試料中の細胞の特定の亜集団を除去することができる。
【０１５６】
本発明の方法は、例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞、非ヒト−霊長類細胞、マウス細胞、ハムスター細胞、または他の動物細胞のような真核生物細胞；ハエまたは線虫細胞あるいは酵母細胞のような無脊椎動物細胞を含めた、ＩＡＰ−阻害カスパーゼが抑制解除される場合にアポトーシスが起こることができるいずれの生物からの細胞でも行うことができる。例えば、腫瘍細胞、幹細胞、神経細胞、脂肪細胞、造血細胞、肝細胞または筋肉細胞を含めた、種々の細胞タイプを本発明の方法で用いることができる。特に、該方法は、例えば、制御されない細胞増殖を呈する細胞、ならびに改変された増殖特徴または形態学的表現型に導く細胞周期の特定の相において機能不全を呈する細胞を含めた異常に調節された細胞においてアポトーシスを誘導するのに有用である。異常に調節される細胞タイプの具体的な例は、癌、および組織過形成の過形成細胞特徴のような新生物細胞を含む。もう１つの具体的な例は、異常に活性化されたようになる、または刺激に続いてダウンレギュレートしない免疫細胞を含む。自己免疫疾患はそのような異常に調節された免疫細胞によって媒介される。異常に調節された細胞は、生化学的にまたは生理学的に機能不全である細胞も含む。細胞機能または増殖の異常な調節の他のタイプは当業者に知られており、同様に、本発明の方法を用いるアポトーシス破壊に適用可能な本発明の標的細胞である。
【０１５７】
細胞のアポトーシスに関連する多数の特徴変化はカスパーゼの蛋白質分解活性によるものであるので、該方法を用いて、アポトーシスの特徴的変化を誘導することができる。例えば、クロマチンの核エンベロープへの付着に関与する、ラミンＢのカスパーゼ誘導蛋白質分解は、アポトーシスに関連するクロマチンの崩壊を担うことができる（Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎ，前述，１９９５）。ＤＮＡ断片化因子の４５ｋＤａサブユニット（ＤＦＦ−４５）のカスパーゼ誘導蛋白質分解は、ゲノムＤＮＡのヌクレオソーム断片への断片化に導く経路を活性化する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８９：１７５−１８４（１９９７））。加えて、ＰＡＲＰのカスパーゼ誘導蛋白質分解は、ＤＮＡ損傷を修復するＰＡＲＰの能力を妨げることができ、さらに、アポトーシスに関連する形態学的変化に寄与する。かくして、本発明の方法を用いて、クロマチンの崩壊、およびアポトーシスに関連するゲノムＤＮＡの断片化を誘導することができる。他のカスパーゼ標的蛋白質は、ステロール調節エレメント結合蛋白質；網膜芽細胞腫（ＲＢ）蛋白質；ＤＮＡ−依存性キナーゼ；Ｕ１  ７０−Ｋキナーゼ；およびＤＮＡ複製複合体の大サブユニット（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：１０１２−１０２０（１９９６）；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ  ９３：８３９５−８４００（１９９６）；Ｃａｓｃｉｏｌａ−Ｒｏｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：１９５７−１９６４（１９９６）；およびＵｂｅｄａ  ａｎｄ  Ｈａｂｅｎｅｒ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１９５６２−１９５６８（１９９７））を含み、その各々が、本発明の方法によって蛋白質分解することを誘導することができる。
【０１５８】
哺乳動物細胞において、カスパーゼの活性化は、区別されるカスパーゼによって開始されるが、共通の「イグゼキュショナー」カスパーゼの活性化をもたらす少なくとも２つの独立したメカニズムを通じて達成される。Ｆａｓ受容体へのリガンド結合によって開始されるアポトーシスは、１つのよく記載された細胞死滅経路である。この経路においては、リガンドのＦａｓへの結合は、Ｆａｓの細胞内ドメインを細胞内ＭＯＲＴＩ（ＦＡＤＤ）蛋白質に結合させ、該蛋白質は、今度はカスパーゼ−８に結合する（ＭＡＣＨ；ＦＬＩＣＥ；Ｍｃｈ５；Ｂｏｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８５：８０３−８１５（１９９６）；Ｍｕｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８５：８１７−８２７（１９９６）参照のこと）。これらの結果は、カスパーゼ−８を、Ｆａｓ細胞死滅経路に関与する上流カスパーゼと定義する。加えて、カスパーゼ−３はＦａｓ細胞死滅経路において活性化され、カスパーゼ−８またはカスパーゼ−８によって活性化されるプロテアーゼのような上流プロテアーゼがカスパーゼ−３の活性化に関与することを示唆する。従って、本発明の方法を用いて、ＩＡＰ阻害−カスパーゼ−８を直接的に抑制解除し、それにより、下流カスパーゼ−３プロテアーゼを効果的に抑制解除できる。
【０１５９】
カスパーゼ活性化はチトクロームｃも含むことができ、これは、哺乳動物細胞において、しばしば、ミトコンドリアからアポトーシスの間にサイトゾルに放出される（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ８６：１４７−１５７（１９９６）；Ｋｈａｒｂａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：６９３９−６９４２（１９９７）；Ｋｌｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１１３２−１１３６（１９９７）；ａｎｄ  Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５：１１２９−１１３２（１９９７））。サイトゾルに進入するに際して、チトクロームｃは蛋白質の複合体のＡＴＰ−またはｄＡＴＰ−依存性形成を誘導し、この結果、プロ−カスパーゼ−３の蛋白質分解活性化および核のアポトーシス破壊をもたらす（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，前述，１９９６）。この複合体のメンバーの中には、ＣＥＤ−４ホモログＡｐａｆ−１、およびカスパーゼ−９がある（Ａｐａｆ−３；Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，前述，１９９６；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９１：４７９−４８９（１９９７）；Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９０：４０５−４１３（１９９７））。ＸＩＡＰ，ｃ−ＩＡＰ−１およびｃ−ＩＡＰ−２は、ミトコンドリアからのチトクロームｃの放出を引き起こすことが知られている刺激によって誘導されたアポトーシスを抑制し、イン・ビトロにてチトクロームｃによって誘導されたカスパーゼ活性化を阻害することができる。かくして、本発明の因子および方法を用いて、ＸＩＡＰ、ｃ−ＩＡＰ−１またはｃ−ＩＡＰ−２によるカスパーゼの阻害を抑制することによって、ミトコンドリアからのチロクロームｃの放出に応答してアポトーシスをおこすことができる。
【０１６０】
本発明は、さらに、病理学的に低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる病態を有する個体に、有効量の因子を投与してＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除することによって、個体において病態の重症度を低下させる方法を提供する。本発明の方法において治療することができる病理学的に低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる疾患の例は、限定されるものではないが、再狭窄；狼瘡または慢性関節リウマチのような自己免疫疾患；同種異型移植片拒絶、湿疹のような皮膚の増殖性病巣；または良性前立腺肥大を含む。該因子は、コアペプチド４から３９および４２から５５のような本発明のコアペプチドまたはＴＰＩ  ７５９、ＴＰＩ  ８８２、ＴＰＩ  ９１４、ＴＰＩ  ９２７のような本発明のコア構造、またはＴＰＩ  １３９１、ＴＰＩ  １３４９、ＴＰＩ  １３９６、ＴＰＩ  １５０９、ＴＰＩ  １５４０、ＴＰＩ  １４００、ＴＰＩ  ７９２およびＴＰＩ  １３３２から選択させるコア構造を含む化合物から選択されるコアモチーフを有することができる。
【０１６１】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子の有効量は、病態を治療するのに用いた場合、個体に投与する場合にアポトーシスの増大を可能とするのに必要な量である。治療の有効量であることが要求される本発明の因子の用量は、例えば、治療すべき病態、投与の経路および形態、個体の体重および状態、および以前のまたは現在の療法に依存するであろう。該方法の特定の適用のための効果的な用量であると考えられる適当な量は、本明細書中に提供されるガイダンスを用いて当業者によって決定することができる。例えば、該量は、先に記載したようなイン・ビトロまたはイン・ビボアッセイから外挿することができる。当業者であれば、患者の状態は、治療のコースを通じてモニターすることができ、および投与される因子の量はそれに従って調整することができるのを認識するであろう。
【０１６２】
病態を治療し、またはその重症度を低下させるためには、有効量は、病理学的に低下されるアポトーシスを増大させることができる因子の有効量である。有効量は、治療養生法に応じて、例えば、約１０μｇ／ｋｇから５００ｍｇ／ｋｇ体重の間、例えば、約０．１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇの間、または好ましくは約１ｍｇ／ｋｇから５０ｍｇ／ｋｇの間とすることができる。例えば、もし因子または該因子を含有する処方を１日当たり１から数回投与するならば、もし処方を毎週または毎月またはそれよりも低い頻度で投与するよりもより低い用量を必要とするであろう。同様に、前記したもののような因子の適時の放出を可能とする処方は、単一ボーラス用量として投与されるであろうアポトーシスのより少ない量の抑制解除剤の連続的放出を供するであろう。例えば、本発明の因子は約１−５ｍｇ／ｋｇ／週の間で投与することができる。
【０１６３】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤、変種およびその組合せの処方もまた改変投与にて送達して、経時的にそれらのアポトーシス増大効果を組み合わせることができる。例えば、本発明のコアペプチドまたは構造を有する因子は単一ボーラス用量で投与し、続いて、単独で、あるいはそのような因子の異なる処方、または異なる因子の処方と組み合わせた、１以上のそのような因子種または変種を多数回投与することができる。因子の処方、変種またはその組合せの同時または改変送達であるかは問わず、投与の態様は前記した投与のタイプのいずれかとすることができ、特定の治療の必要性、および目的により選択されたＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の効率に依存するであろう。いずれの因子、処方、種および変種を一時的に投与される養生法にて組み合わせるかを決定するのは、治療すべき病態、および病気に罹った個体の特異的身体の特徴に依存するであろう。当業者であれば、特定の病態の分野内で知られた診断および臨床基準と共に、本明細書中に提供された教示およびガイダンスを用いて、特定の適用で効果的な投与の特異的養生法を知っているか、または決定できる。
【０１６４】
病理学的に低下したアポトーシスによって特徴付けられる病態を治療する方法は、加えて、他の療法と組み合わせて実行することができる。例えば、癌を治療するには、本発明の方法を、外科的処置、サイトカインおよび成長因子の投与を含めた化学療法、放射線または当該分野で公知の他の方法のような慣用的癌治療の前に、その間に、またはそれに引き続いて実行することができる。
【０１６５】
そのような治療は相乗的に作用することができ、慣用的療法によって引き起こされる腫瘍塊の低下が伴い、本発明の化合物の有効性を増大させ、その逆も成立する。本発明の化合物との共投与に適した抗癌薬物の非限定的例は癌療法の分野における当業者によく知られており、アミノグルテチミド、アモサクリン（ｍ−ＡＭＳＡ）アザシチジン、アスパラギナーゼ、ブレオマイシン、ブスルファン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、クロラムブシル、シスプラチン（ｃｉｓ−ＤＤＰ）、シクロフォスファミド、シタラビンＨＣｌ、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシンＨＣｌ、ドキソルビシンＨＣｌ、エリスロポエチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エトポシド（Ｖ１６−２１３）、フロキシウリジン、フルオロウラシル（５−ＦＵ）、フルタミド、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ）、ヒドロキシ尿素（ヒドロキシカルバミド）、イフォスファミド、インターフェロンアルファ、インターロイキン２、ロイプロリド酢酸（ＬＨＲＨ−放出因子アナログ）、ロムスチンン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミンＨＣｌ（ナイトロジェンマスタード）、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート（ＭＴＸ）、マイトグアゾン（メチル―ＧＡＧ、メチルグリオキサールビス−グアニルヒドラゾン、ＭＧＢＧ）、マイトマイシン、マイトタン（ｏ．ｐ’−ＤＤＤ）、マイトキサントロンＨＣｌ、オクトレオチド、ペントスタチン、プリカマイシン、プロカルバジンＨＣｌ、セムスチン（メチル―ＣＣＮＵ）、ストレプトゾシン、タモキシフェンクエン酸、テニポシド（ＶＭ−２６）、チオグアニン、チオテパ、ビンブラスチン硫酸、ビンクリスチン硫酸、ビンデシン硫酸、ハーセプチンおよびＭａｂＴｈｅｒａを含む。前記し、実施例Ｘの結果によって示されるように、ＴＰＩ  ７９２−３３またはＴＰＩ  ７９２−３５をＶＰ−１６と組み合わせて投与して、癌を治療することができる。同様に、実施例ＸＩＶの結果によって示されるように、ＴＰＩ  １３９６−３４を抗癌薬物と組み合わせて投与して、癌を治療することもできる。当業者であれば、本発明のいずれかの活性なポリフェニル尿素化合物について同様な効果が期待されることを認識するであろう。
【０１６６】
同様に、感染症を含む病態を治療するためには、本発明の方法を、感染症に対する抗生物質投与、または当該分野で知られた他の方法のような慣用的な治療に先立って、その間に、またはそれに引き続いて実行することができる。自己免疫障害の病態の治療は、特定の自己免疫疾患のための慣用的治療と、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するための本発明の方法と組み合わせることによって達成することもできる。慣用的な治療は、例えば、化学療法、ステロイド療法、インスリンおよび他の成長因子およびサイトカイン療法、受動免疫、Ｔ細胞受容体結合の阻害剤、およびＴ細胞受容体ワクチン接種を含む。本発明の方法は、慣用的治療の開始に先立って、その間に、またはそれに引き続いて、当該分野で知られたこれらのおよび他の方法と組み合わせて、かつ種々の時点に投与することができる。異常な細胞成長によって特徴付けられる病態についての治療の記載については、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ，（Ｂｅｒｋｏｗ，Ｒ．，Ｅｄｉｔｏｒ）Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２参照。例えば、組合せ組成物に関して前記したもののいずれかを含めた抗癌薬物を、治療の方法において、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の投与に先立って、その間に、または引き続いて投与することができる。
【０１６７】
前記したように、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子の処方の投与は、例えば、複数投与を含めた、慣用的療法と同時とすることができ、あるいはそれと共に別の投与で送達することができる。同時の投与は、例えば、ほぼ同時に、または順番として直ちに送達される同一処方または異なる処方において一緒にすることができる。代替投与は、例えば、時間的に別々の投与にて、本発明の因子および慣用的な治療的処置を送達することができる。先に記載したように、本発明の因子および慣用的療法の時間的に別々の投与は、同様に、送達および経路の異なる態様を用いることができる。
【０１６８】
本発明の因子および方法を用いて治療することができる病理学的に低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる疾患は、例えば、癌、過形成、自己免疫疾患および再狭窄を含む。増大する数のヒト病気が自己免疫として分類されてきており、例えば、慢性関節リウマチ、重症筋無力症、多発性硬化症、乾癬、全身エリテマトーデス、自己免疫甲状腺炎、グラーベ病、炎症性腸疾患、自己免疫ブドウ膜網膜炎、多発性筋炎、および糖尿病を含む。病理学的に低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられる多くの疾患についての動物モデルは開発されており、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する剤を使用する治療的処置の予測的評価で使用することができる。さらに、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の医薬組成物は、そのような動物モデルからのこれらの疾患の治療について信頼性よく外挿することができる。
【０１６９】
当業者であれば、関連する動物モデルにおけるルーチン的テストの結果に基づいて投与するために、どのようにして本発明の因子の有効性または量を決定するかを知っているであろう。投与すべき因子の量は、同様に、治療される個体における応答に基づいて臨床的状況で決定することができる。有効性の変調は、病態、およびアポトーシスの進行が治療で望まれる程度、または病態の重症度の低下に依存するであろう。変調は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除するのに用いられる特定の因子、処方、または投与戦略を調整することによって達成することができる。本明細書中で提供されるガイダンスに基づき、当業者であれば、治療すべき特定の疾患の重症度のよく知られたインジケーターに応答して有効性を変調することができるであろう。本明細書中に記載されたあるいはそうでなければ、病理学的に低下したレベルのアポトーシスによって特徴付けられることが知られた種々の病態についてのインジケーターの記載については、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄ，（Ｂｅｒｋｏｗ，Ｒ．，Ｅｄｉｔｏｒ）Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，１９９２参照。
【０１７０】
以下の実施例は、本発明を説明することを意図するものであるが、限定するものではない。
【０１７１】
（実施例Ｉ）
（ヘキサペプチドライブラリからのＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＩＡＰ抑制解除アッセイを示す。本実施例は、さらに、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できる因子の同定に対する位置−スキャンニングアプローチを示す。
【０１７２】
ヘキサペプチドの１２０混合物よりなるＤＣＲ３９０ライブラリーはＲ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８６９４および米国特許第５、５５６、７６２号に記載されたように当該分野で公知の方法を用いて合成した。各混合物は、その全てが、規定された位置に同一のアミノ酸、および残りの５つの位置における２０の必須アミノ酸のいずれかの組合せを有するヘキサペプチドの集団からなるものであった。各混合物は、規定されたアミノ酸が起こる位置番号（ヘキサペプチドのアミノ−末端からカルボキシ−末端へ１から６進むことからナンバリングされたもの）、および規定されたアミノ酸の同一性によって確認される。かくして、表Ｉの第一行に示されるように、位置１におけるトリプトファン、および位置２から５における２０のアミノ酸の全ての組合せを有する混合物は「位置１、Ｗ」として確認される。
【０１７３】
ＤＣＲ３９０ライブラリーは、後に記載されるアッセイを用いてスクリーニングした。ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除することができるものとしてＤＣＲ３９０ライブラリースクリーニングから確認される混合物に基づき、さらなる規定された位置をＴＰＩ  １２３９およびＴＰＩ  １３２８サブライブラリーに取り込み、同一アッセイを用いてサブライブラリーをスクリーニングした。
【０１７４】
カスパーゼ活性は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍａｘ３４０を用い、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ合成ペプチドからの７−アミノ−４−トリフルオロメチル−クマリン（ＡＦＣ）の放出によってアッセイしたＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：７７９７−７８００（１９７７）参照）。候補混合物は、該候補剤の存在下および非存在下において、精製された組換えカスパーゼ−３、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ、およびＧＳＴ−ＸＩＡＰを含有する混合物についてのＡＦＣ加水分解速度を測定することによって、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する能力についてスクリーニングした。候補混合物の存在下および非存在下における、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についてのＶｍａｘの比率を計算し、これを用いて、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する因子を含有するものを同定する。比率＝（候補混合物、カスパーゼ３およびＸＩＡＰが存在する場合のＶｍａｘ）／（カスパーゼ３およびＸＩＡＰが存在する場合のＶｍａｘ）。
【０１７５】
前記したアッセイを用いる、各々、ＤＣＲ３９０、ＴＰＩ  １２３９またはＴＰＩ  １３２８ライブラリーからの各混合物のスクリーニングを以下のように行った。各混合物を２５マイクロリットルの容量にて、かつ二連にて、９６ウェルマクロタイタープレートのウェルにアリコットした。二連ウェルの最初の組に、２５マイクロリットルのカスパーゼアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％スクロース、１０ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．１％  ＣＨＡＰＳ）を加え、ウェルの第二の組に、カスパーゼアッセイ緩衝液中の２５マイクロリットルの４０ｎＭ  ＸＩＡＰのストック溶液を加えた。各マイクロタイタープレートは以下の対照も有した：（１）２５マイクロリットルのカスパーゼアッセイ緩衝液および２５マイクロリットルのペプチド担体溶媒を加えた緩衝液ブランクウェル、（２）２５マイクロリットルのペプチド担体溶媒、およびカスパーゼアッセイ緩衝液中の２５マイクロリットルの４０ｎＭ  ＸＩＡＰのストック溶液を加えたＸＩＡＰ対照ウェル、および（３）カスパーゼアッセイ緩衝液中の２５マイクロリットルの４０ｎＭ  ＸＩＡＰのストック溶液、および２．５マイクロリットルの４μＭ  ＳＭＡＣペプチド（Ｈ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｇｌｎ−Ｌｙｓ−ＮＨ２、配列番号：５）を加えたＳＭＡＣ対照ウェル。試料および対照ウェルの各々に、２５マイクロリットルの０．６４ｎＭカスパーゼ−３溶液、引き続いて２５マイクロリットルの４００μＭ  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ基質を加えた。遊離されたＡＦＣの蛍光を３０秒間隔で３０分間、各ウェルから直ちに検出した。各ウェルからのＡＣ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についてのＶｍａｘは、ソフトマックススソフトウェアパッケージを用いて測定した。
【０１７６】
ＤＣＲ３９０ライブラリーについてのスクリーニングの結果を表Ｉに示す。異なる各アミノ酸で固定された同一の位置を有する混合物の組を、位置番号で確認される６つのセクションに配列する。６つのセクションの各々の中には、（１）固定されたアミノ酸の同一性、（２）候補混合物、カスパーゼ３およびＸＩＡＰが存在する場合の反応の見掛けの速度、および（３）候補混合物、およびカスパーゼ３が存在する場合の反応の見掛けの速度を示す３行がある。また、ＸＩＡＰ対照反応についての結果が各セクションに示される。各セクションにおける混合物は、第二行において見掛けの速度に従って減少する順番で配列される。ＸＩＡＰ対照反応と比較して有意により高い見掛けの速度を有する混合物を水平線の上方にリストし、それにより、ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除することができる因子を混合することが確認される。
【０１７７】
【化３】
2008537735.tif 000005
【０１７８】
【化４】
2008537735.tif 000006
【０１７９】
【化５】
2008537735.tif 000007
【０１８０】
【化６】
2008537735.tif 000008
【０１８１】
【化７】
2008537735.tif 000009
【０１８２】
【化８】
2008537735.tif 000010
ＤＣＲ３９０スクリーニングの結果に基づき、ＴＰＩ  １２３９ライブラリーを合成し、前記したカスパーゼアッセイを用いてスクリーニングした。特に、トリプトファンとして定義される位置５および６、種々に定義される位置３および／または４、および表ＩＩに記載される２０の必須アミノ酸でランダム化された残りの位置を有する混合物を合成した。表ＩＩに示されるように、ＸＩＡＰの非存在下においては、混合物はカスパーゼ活性に対して有意でない効果を有した。ＸＩＡＰの非存在下において、１．９またはそれよりも高い比率を有する混合物は、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できる因子を含有するものとして確認された。
【０１８３】
【化９】
2008537735.tif 000011
【０１８４】
【化１０】
2008537735.tif 000012
ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除できる因子を含有するとしてＴＰＩ  １２３９ライブラリーから同定される混合物を、さらに、用量応答について分析した。該用量応答データは、混合物がカスパーゼ活性に対して効果を有しないことを示す図１１に供される。ほとんどの活性な混合物は位置４においてアラニン、リシンまたはスレオニン、位置５および６においてトリプトファン、位置１から３において混合物を有することが判明した。
【０１８５】
ＤＣＲ３９０およびＴＰＩ  １２３９ライブラリースクリーニングの結果に基づき、ＴＰＩ  １３２８ライブラリーを合成し、前記したカスパーゼアッセイを用いてスクリーニングした。ＴＰＩ  １３２８ライブラリー中の各混合物については、３から４の位置が規定され、残りの位置は、Ａｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ，Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、Ｔｒｐ、ＣｙｓまたはＴｙｒを含めた必須アミノ酸の全ての２０コンビナトーリアル化された。位置４はＡｌａ、Ｌｙｓ、あるいはＡｌａ、ＬｙｓおよびＴｈｒの混合物で規定された（混合物は「３Ｘ」または「Ａ、Ｋ、Ｔ」という）。
【０１８６】
スクリーニングされた種々のＴＰＩ  １３２８サブライブラリー、および各混合物の存在下および非存在下におけるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についてのＶｍａｘの比率で得られた値を図１でプロットする。図１および表ＩＩＩにおいては、「Ｘ」は全ての２０の必須アミノ酸の混合物を表し、「Ｏ」は規定された位置のロケーションを表し、規定された位置におけるアミノ酸の同一性はｘ軸にプロットされる。１．７を超える比率を有する候補は、ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３の抑制解除剤であると定義された。ＴＰＩ  １３２８ライブラリから同定されたＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３の抑制解除剤のリストは表ＩＩＩに掲げる。
【０１８７】
【化１１】
2008537735.tif 000013
（実施例ＩＩ）
（ＴＰＩ  １３３２およびＴＰＩ  １３５２の個々のテトラペプチドライブラリーからのＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３を抑制解除できるＴＰＩ  １３３２およびＴＰＩ  １３５２テトラペプチドライブラリーからの因子の同定を示す。
【０１８８】
ＴＰＩ  １３３２およびＴＰＩ  １３５２テトラペプチドライブラリーは、トリプトファン上のホルミル保護基を異なる手法によって除去した以外は同一に合成された。ＴＰＩ  １３３２ライブラリーで用いた脱保護工程はより完全ではなく、スクリーニングで用いた候補化合物に存在するトリプトファン残基のいくつかがホルミル保護基を保持した可能性を残す。ＴＰＩ  １３５２ライブラリーで用いた脱保護化学は実質的に完全であったが、しかしながら、ライブラリー中の種のサブセットについてポリマー構造の形成がもたらされた。
【０１８９】
ＴＰＩ  １３３２およびＴＰＩ  １３５２ライブラリーからの候補を、実施例Ｉに記載された抑制解除アッセイを用いてスクリーニングした。ＴＰＩ  １３３２およびＴＰＩ  １３５２ライブラリーの各種の存在下および非存在下におけるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についてのＶｍａｘの比率を決定し、２．４よりも大きな値を有するものをＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤と定義した。
【０１９０】
ＴＰＩ  １３３２およびＴＰＩ  １３５２テトラペプチドライブラリーから同定されたＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３の抑制解除剤のリストを表ＩＶに掲げる。双方のライブラリーで同定された因子は「１３３２／１３５２」として示される。
【０１９１】
【化１２】
2008537735.tif 000014
ＴＰＩ  １３３２ライブラリー化合物の構造を図３６Ａに示し；ＴＰＩ  １４９５シリーズの関連化合物の構造を図３７に示す。
【０１９２】
（実施例ＩＩＩ）
（ＴＰＩ  ７９２ライブラリーからのＩＡＰ−阻害カスパーゼの個々のペプチド抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３を抑制解除できるＴＰＩ  ７９２ライブラリーからの因子の同定を示す。
【０１９３】
ＴＰＩ  ７９２ライブラリーはテトラペプチド骨格に基づく。ＴＰＩ  ７９２ライブラリーの種は、実施例Ｉに記載された抑制解除アッセイでスクリーニングした。ＴＰＩ  ７９２ライブラリーから同定されたＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３の抑制解除剤のリストを表Ｖに掲げる。テストされたＴＰＩ  ７９２コアペプチドについての構造は図２０に示される。
【０１９４】
【化１３】
2008537735.tif 000015
ＴＰＩ  ７９２ライブラリーから同定された因子の用量応答は、可変濃度の因子での抑制解除アッセイを反復することによって測定した。４つの濃度を選択した：ミリリットル当たり０．４、２、１０および５０マイクログラム。このデータより、抑制解除アッセイ（ＬＣ）において２またはそれよりも高い比率をもつ最低濃度を決定し、表Ｖに示す。ＴＰＩ  ７９２ライブラリーから決定された最低ＬＣ値は、ＴＰＩ  ７９２−３３についてミリリットル当たり０．４マイクログラムであった。
【０１９５】
（実施例ＩＶ）
（ＴＰＩ  １３１３ライブラリーからのＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３を抑制解除できるＴＰＩ  １３１３ライブラリーからの因子の同定を示す。
【０１９６】
ＴＰＩ  １３１３ライブラリーはテトラペプチド骨格に基づく。図２にリストされ、図３に示されたＴＰＩ  １３１３ライブラリーの種を、実施例Ｉに記載された抑制解除アッセイでスクリーニングした。ＴＰＩ  １３１３ライブラリーから同定されたＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３の抑制解除剤のリストを表ＶＩに掲げる。
【０１９７】
【化１４】
2008537735.tif 000016
ＴＰＩ  １３１３ライブラリーから同定された因子の用量応答は、可変濃度の因子で抑制解除アッセイを反復することによって測定した。４つの濃度を選択した：ミリリットル当たり０．４、２、１０および５０マイクログラム。このデータから見掛けのＩＣ５０を決定した。ＴＰＩ  １３１３ライブラリーから決定された最低ＩＣ５０値は、ＴＰＩ  １３１３−７については、ミリリットル当たり３．９から６．３マイクログラムの範囲である。
【０１９８】
（実施例Ｖ）
（ＴＰＩ  １３２５ライブラリーからのＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３を抑制解除できるＴＰＩ  １３２５ライブラリーからの因子の同定を示す。
【０１９９】
ＴＰＩ  １３２５ライブラリーを、実施例Ｉに記載された抑制解除アッセイでスクリーニングした。該アッセイについてアリコットされた各種については、（単一の公知のアミノ酸Ｒ基を有する）１位置を固定し、３つの位置をコンビナトーリアル化した。かくして、ＴＰＩ  １３２５ライブラリーから同定された各「混合物」は、化合物の混合物を表し、ここで、Ｘ１およびＸ２はＡｌａ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｐｈｅ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｓｎ、Ｐｒｏ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｖａｌ、ＴｒｐおよびＴｙｒから選択され、Ｘ３はＡｌａ、ＬｙｓおよびＴｈｒのいずれか１つを含む。
【０２００】
ＴＰＩ  １３２５ライブラリーから同定されたＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３の抑制解除剤のリストを表ＶＩＩに掲げる。
【０２０１】
【化１５】
2008537735.tif 000017
ＴＰＩ  １３２５ライブラリーから同定された因子の用量応答は、可変濃度の因子で抑制解除アッセイを反復することによって測定した。４つの濃度を選択した：ミリリットル当たり０．４、２、１０および５０マイクログラム。このデータより、見掛けのＩＣ５０を決定した。ＴＰＩ  １３２５ライブラリーから決定された最低ＩＣ５０値はＴＰＩ  １３２５−１５についてはミリリットル当たり１２マイクログラムであった。
【０２０２】
（実施例ＶＩ）
（ＴＰＩ  ９１４、ＴＰＩ  ９２７、ＴＰＩ  ７５９およびＴＰＩ  ８８２ライブラリーからのＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の同定）
本実施例は、ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼ−３を抑制解除できる、非ペプチドベースのライブラリーからの、因子の同定を示す。
【０２０３】
ＴＰＩ  ９１４、ＴＰＩ  ９２７、ＴＰＩ  ７５９およびＴＰＩ  ８８２ライブラリーは、実施例Ｉに記載された抑制解除アッセイと組み合わせて（米国特許第５、５５６、７６２号に記載された）位置スキャニングを用いてスクリーニングした。
【０２０４】
分析は、少なくとも１つの位置が定義されたコンビナトーリアルライブラリーで開始した。ヒトは、２よりも大きいかまたは等しい混合物／ＸＩＡＰ比率を生じる混合物として定義された。最初のライブラリーの分析に続き、増大する定義のライブラリーを、区別されるライブラリーが調製され、ここで、全ての位置が定義されるまでスクリーニングした。ついで、この定義されたライブラリーからのヒトを、後にリストするＩＣ５０値を生じた用量応答についてチェックした。
【０２０５】
ＴＰＩ  ９１４  Ｎ−アシルトリアミンライブラリーは、１２５，０００種の合計多様性につき、位置Ｒ１における５０のアミノ酸Ｒ基、位置Ｒ２における５０のアミノ酸Ｒ基、および位置Ｒ３における５０の酸誘導体を含んだ。Ｒ位置の１つにおいて定義された官能性を有し、抑制解除アッセイにおいてミリリットル当たり２５マイクログラムで存在させた場合に約１．８よりも大きな、またはそれと等しいペプチド／ＸＩＡＰ比率を有するとしてＴＰＩ  ９１４ライブラリーの位置スキャニングによって同定された混合物を同定し図４に示す。抑制解除アッセイにおいて、ミリリットル当たり６．２５マイクログラム、またはミリリットル当たり１２．５マイクログラムで存在する場合に、約１．８よりも大きな、またはそれと等しいペプチド／ＸＩＡＰ比率を有する対照剤を同定し、図５に示す。このスクリーニングに基づいて設計されたさらなる化合物を図２１ＡにてＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４として示す。これらの化合物の活性を図２１ＢからＤに示す。
【０２０６】
ＴＰＩ  ９２７ポリフェニル尿素ライブラリーは、８９，８５６種の合計多様性につき、位置Ｒ１における４８アミノ酸Ｒ基、位置Ｒ２における４８アミノ酸Ｒ基、および位置Ｒ３における３９酸誘導体を含んだ。Ｒ位置の１において規定された官能性を有し、抑制解除アッセイにおいて、ミリリットル当たり４マイクログラムで存在する場合に、約１．８よりも大きな、またはそれと等しいペプチド／ＸＩＡＰ比率を有するＴＰＩ  ９２７ライブラリーの位置スキャニングによって同定された混合物を同定し、図６に示す。抑制解除アッセイにおいて、ミリリットル当たり２５マイクログラムで存在する場合に、約１．８よりも大きな、またはそれと等しいペプチド／ＸＩＡＰ比率を有する因子を同定し、図９に示す。
【０２０７】
特に、図２５ａに示すように、前記したＴＰＩ  ９２７に基づくポリ−フェニル尿素の混合物−ベースのコンビナトーリアルライブラリーのアリコットを、ＸＩＡＰおよびカスパーゼ−３（黒色棒線）または、対照として、カスパーゼ−３単独（灰色棒線）を含有するマイクロタイタープレートに加えた。カスパーゼ−３活性は、前記したように、蛍光原性基質Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの切断をモニターすることによって測定した。簡単に述べれば、組換え蛋白質を、例えば、Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８８：３００−３０４（１９９７）に記載されているように細菌中で生産し、精製したＧＳＴ−ＸＩＡＰ（４６ｎＭ）を、１００μｌの５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１０％スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、および１０ｍＭ  ＤＴＴ中の活性なカスパーゼ−３−Ｈｉｓ６（０．３６ｎＭ）に加えて、プロテアーゼ活性のほぼ７５％阻害を達成した。カスパーゼ−３の活性は、１００μＭにおける蛍光原性テトラペプチド基質アセチル−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ（ＢＩＯＭＯＬ、Ｐｌｙｍｏｕｔｈ、ＰＡ）の切断をモニターすることによって測定した。蛍光原性ＡＦＣ（７−アミノ−４−トリフルオロメチルクマリン）産物の創製は、各々、４０５ｎｍおよび５１０ｎｍの励起および発光波長を用い、キネティックモードのスペクトロフルオロメトリックプレートリーダーで３７℃にて３０分間測定した。化学化合物を６．２５、１２．５および２５．０μｇ／ｍｌでスクリーニングして、Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣのカスパーゼ−３誘導切断を増加させる化合物を同定した。対照反応はＸＩＡＰを欠如し、全てのアッセイは基質加水分解の直線範囲で行って、基質枯渇人工物を回避した。
【０２０８】
位置スキャニングコンビナトーリアルライブラリー（最終濃度２５ｍｇ／ｍｌ）の代表的なスクリーニングを図２５ａに示す。図２５ａにおいて、ヒットは、カスパーゼ−３単独に影響することなく、ＸＩＡＰ−誘導反応において、カスパーゼ−３を二倍以上増大させた化合物と定義した。カスパーゼ活性は、化合物の添加後における酵素速度の増加倍数として表される。陽性化合物混合物は標準的な方法によってデコンボリュートし、後に記載されるのと同一のカスパーゼ抑制解除アッセイでスクリーニングされた３６の個々の化合物を生じた。
【０２０９】
３６の個々の化合物（ＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−３６）は、ポリフェニル尿素ライブラリーのデコンボリューションに基づいて合成した。個々の化合物は、位置スキャンニングコンビナトーリアルライブラリーの最も活性な混合物の規定された官能性の組合せに由来する。用いた官能性の数は、各々、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３において３、４および３であった。図２５ｂに示すように、３６の個々の化合物の各々は、陽性に対するカット−オフとしての酵素速度の２倍上昇を用い、ＸＩＡＰの存在下（黒色棒線）または非存在下（灰色棒線）においてカスパーゼ−３の活性を増加させるそれらの能力につき、カスパーゼ抑制解除アッセイを用いて２５ｍｇ／ｍｌでテストした。陽性に対する他のカット−オフは、例えば、１．５倍以上、または１．８倍以上を含むことができる。
【０２１０】
ＴＰＩ  ７５９  Ｎ−ベンジル−１，４，５−トリ置換−２，３−ジケトピペラジンライブラリーは、３１，３２０種の合計多様性について、位置Ｒ１における２９アミノ酸Ｒ基、位置Ｒ２における２７アミノ酸Ｒ基、および位置Ｒ３における４０酸誘導体を含んだ。Ｒ位置の１つにおける規定された官能性を有し、かつ抑制解除アッセイにおいて、ミリリットル当たり２５マイクログラムで存在した場合に、約２．０よりも大きな、またはそれと等しいペプチド／ＸＩＡＰ比率（Ｒ３が固定されたサブライブラリーの場合には、１．９またはそれよりも高い比率）を有するものとしてＴＰＩ  ７５９ライブラリーの位置スキャンニングによって同定された混合物を同定し、図８に示す。これらの官能性に基づいて設計されたさらなる化合物をＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６として図２３Ａに示す。これらの化合物の活性を図２３ＢからＦに示す。
【０２１１】
ＴＰＩ  ８８２  Ｃ−６−アシルアミノ二環グアニジンライブラリーは、７２，２８３種の合計多様性について、位置Ｒ１における４３アミノ酸Ｒ基、Ｒ２における４１酸誘導体およびＲ３における４１酸誘導体を含んだ。Ｒ位置の１つにおける規定された官能性を有し、かつ抑制解除アッセイにおいて、ミリリットル当たり５マイクログラムに存在させた場合に、約１．９よりも大きな、またはそれと等しいペプチド／ＸＩＡＰ比率を有するものとしてＴＰＩ  ８８２ライブラリーの位置スキャンニングによって同定された混合物を同定し、図７に示す。抑制解除アッセイにおいて、ミリリットル当たり８マイクログラムで存在させた場合に、約２．０よりも大きな、またはそれと等しいペプチド／ＸＩＡＰ比率を有する対照剤を同定し、図１０に示す。これらの官能性に基づいて設計されたさらなる化合物を、ＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８として図２４Ａに示す。これらの化合物の活性は図２４ＢからＨに示す。
【０２１２】
（実施例ＶＩＩ）
（ＳＭＡＣ競合アッセイ）
本実施例は、ＩＡＰについてのＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤、またはその機能的断片の結合親和性を測定するのに有用なアッセイを記載する。
【０２１３】
偏光ベースの結合アッセイを用いて、ローダミン標識ＳＭＡＣ（ローダミン−ＳＭＡＣ）およびＸＩＡＰ断片ＢＩＲ２またはＢＩＲ３ＲＩＮＧの間の結合を検出した。該アッセイは、遊離（未結合）ローダミン−ＳＭＡＣと比較した、結合したローダミン−ＳＭＡＣについての偏光の低下として検出される、ＸＩＡＰまたはその機能的断片に会合する場合にローダミン−ＳＭＡＣで起こる移動性の減少に基づく。
【０２１４】
グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ−ＢＩＲ２融合蛋白質（ＧＳＴ−ＢＩＲ２）またはＢＩＲ３ＲＩＮＧに対するローダミン−ＳＭＡＣの結合親和性を以下のように測定した。アッセイはｐＨ７．２／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１％ＢＳＡにおいて５０ｍＭトリス中で行った。ローダミン標識ＳＭＡＣは４００ｎＭで存在させた。ＧＳＴ−ＢＩＲ２は０．０５から２０μＭの範囲であり、他方、ＧＳＴ−ＢＩＲ３ＲＩＮＧは０．０２から６μＭの範囲であった。プレート（Ｐａｃｋａｒｄからのプロキシ（ｐｒｏｘｉ））は、５８１ｎｍの励起および５９５ｎｍにおける発光にて、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒからのＶｉｃｔｏｒで１時間後に２８℃にて蛍光偏光モードで読んだ。データは、ミリポラー−ｖｓ−蛋白質濃度の関数としてプロットした。ローダミン−ＳＭＡＣはＧＳＴ−ＢＩＲ２については２０μＭのＫｄ、およびＧＳＴ−ＢＩＲ３ＲＩＮＧについては２８０ｎＭのＫｄを有した。
【０２１５】
標識されていないＳＭＡＣは、４００ｎＭローダミン−ＳＭＡＣおよび１０μＭ  ＧＳＴ−ＢＩＲ２または１μＭ  ＧＳＴ−ＢＩＲ３ＲＩＮＧを含有する溶液に対して滴定した。プレート（Ｐａｃｋａｒｄからのプロキシ（ｐｒｏｘｉ））は、５３１ｎｍにおける励起および５９５ｎｍにおける発光にて、Ｐｅｒｋｉｎ−ＥｌｍｅｒからのＶｉｃｔｏｒで、１時間後に２８℃にて蛍光偏光モードで読んだ。標識されていないＳＭＡＣは０から５０μＭの範囲で滴定した。データはミリポラー−ｖｓ−ＳＭＡＣ濃度の関数としてプロットし、ＩＣ５０値を決定した。ＳＭＡＣ滴定のＩＣ５０値はＧＳＴ−ＢＩＲ３ＲＩＮＧについて２１μＭであった。標識されていないＳＭＡＣとの競合もまたＧＳＴ−ＢＩＲ２で観察されたが、ＩＣ５０の計算を行うには十分でなかった。
【０２１６】
ライブラリーからの候補剤を、４００ｎＭローダミン−ＳＭＡＣおよび１０μＭ  ＧＳＴ−ＢＩＲ２を含有する溶液に加える。蛍光偏光を各試料について測定し、４００ｎＭローダミン−ＳＭＡＣおよび１０μＭ  ＧＳＴ−ＢＩＲ２を含有する対照反応と比較して偏光の減少を示す候補を、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定する。対照として、蛍光偏光は、ＧＳＴ−ＢＩＲ２の非存在下においてライブラリー試料についても測定する。
【０２１７】
ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定される因子を、ローダミン−ＳＭＡＣおよびＧＳＴ−ＢＩＲ２の溶液に対して滴定する。偏光は、前記した因子の各濃度で測定する。データはミリポラー−ｖｓ−因子濃度の関数としてプロットし、結合定数はやはり前記したように決定する。
【０２１８】
（実施例ＶＩＩＩ）
（種々のライブラリーからの個々の化合物のスクリーニング）
本実施例は、ＴＰＩ  ９１４、ＴＰＩ  ９２７、ＴＰＩ  ７５９およびＴＰＩ  ８８２ライブラリーに由来する個々の因子のスクリーニング、およびＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除する個々の因子も同定を記載する。
【０２１９】
個々の因子は、実施例ＶＩで同定された活性な因子に基づいて合成した。図５に示されたＴＰＩ  ９１４抑制解除剤に基づく選択された因子を合成し、図２１においては因子ＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４として同定される。図９に示されたＴＰＩ  ９２７抑制解除剤に基づく選択された因子を合成し、図２２において、因子ＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５として確認される。図８に示されたＴＰＩ  ７５９抑制解除剤に基づく選択された因子を合成し、図２３において因子ＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６として確認される。図１０に示されたＴＰＩ  ８８２抑制解除剤に基づく選択された因子を合成し、図２４において、因子ＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８として確認される。
【０２２０】
カスパーゼ抑制解除アッセイを用いて、図２１から２４に示された因子を評価した。各化合物を、カスパーゼ−３活性を増加させるその能力につき、カスパーゼ抑制解除アッセイを用いてテストした。各分子量および質量と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を図２１Ａに示す。全長ＸＩＡＰを用いるカスパーゼ抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４の活性を図２１Ｂに示す。全長ＸＩＡＰおよびＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメイン双方を用いるＴＰＩ  １３４９−１、−３、−８、−１３、−２３、および−２８の活性を図２１Ｃに示す。ｃＩＡＰ−１  ＢＩＲ２ドメインを用いるＴＰＩ  １３４９−１、−３、−８、−１３、−２３、および−２８の活性を図２１Ｄに示す。これらのデータは、ＴＰＩ  １３４９化合物がＸＩＡＰまたはＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインいずれかによって阻害されるカスパーゼを抑制解除するにおいて活性であるが、カスパーゼ−３のｃＩＡＰ１−媒介抑制を克服しないことを示す。種々の化合物で観察される活性の欠如は、ｃＩＡＰ１よりも２倍過剰で存在する化合物の結果であり得ることを注目するのは重要である。
【０２２１】
各分子量および質量と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を図２２Ａに示す。全長ＸＩＡＰを用いるカスパーゼ抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−３６の活性を図２２Ｂに示す。全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３９６−３７からＴＰＩ  １３９６−６５の活性を図２２Ｃに示す。全長ＸＩＡＰおよびＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３９６−１１、−１２、−２２、−２８、および−３４の活性を示す表を図２２Ｄに示す。ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いる５０μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １３９６−１１、−１２、−２２、−２８、および−３４の活性を図２２Ｅに示す。全長ＸＩＡＰおよびカスパーゼ３または７を用いる１００μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １３９６−１１、−１２、−２２、−２８、および−３４の活性についてのさらなる代表的なデータを図２２Ｆに示す。ｃＩＡＰ−１  ＢＩＲ２ドメインを用いる１００μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １３９６−１１、−１２、−２２、−２８、および−３４の活性を図２２Ｇに示す。これらのデータは、ＴＰＩ  １３９６化合物が、ＸＩＡＰまたはＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインいずれかによって阻害されたカスパーゼを抑制解除するにおいて活性であるが、カスパーゼ−３のｃＩＡＰ１−媒介抑制を克服しないことを示す。種々の化合物で観察された活性の欠如は、ｃＩＡＰ１よりも２倍過剰に存在する化合物の結果であり得ることに注目するのは重要である。
【０２２２】
各分子量および質量と共にＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の構造を図２３Ａに示す。全長ＸＩＡＰを用いるカスパーゼ抑制解除アッセイにおける１００μｇ／ｍｌでのＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の活性を図２３Ｂに示す。全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおける２５μｇ／ｍｌでのＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の活性を図２３Ｃに示す。全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３９１−１、−４、−５、−７、−１７、−２１、−２５、−２８、−３４および−３５の活性を示す表を図２３Ｄに示す。全長ＸＩＡＰまたはＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３９１−１、−４、−５、−７、−１７、−２１、−２５、−２８、−３４および−３５の活性の比較を図２３Ｅに示す。ｃＩＡＰ−１  ＢＩＲ２ドメインを用いるＴＰＩ  １３９１−１、−４、−５、−７、−１７、−２１、−２５、−２８、−３４および−３５の活性を図２３Ｆに示す。これらのデータは、ＴＰＩ  １３９１化合物が、ＸＩＡＰまたはＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインいずれかによって阻害されたカスパーゼを抑制解除するにおいて活性であるが、カスパーゼ−３のｃＩＡＰ１−媒介抑制を克服しないことを示す。種々の化合物で観察された活性の欠如は、ｃＩＡＰ１よりも２倍過剰で存在する化合物の結果であり得ることに注目するのは重要である。
【０２２３】
各分子量および質量と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を図２４Ａに示す。全長ＸＩＡＰを用いるカスパーゼ抑制解除アッセイにおける２５μｇ／ｍｌでのＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−２８の活性を図２４Ｂに示す。全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおける１０μｇ／ｍｌでのＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−２８の活性を図２４Ｃに示す。全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおける２５μｇ／ｍｌでのＴＰＩ  １４００−２９からＴＰＩ  １４００−５８の活性を図２４Ｄに示す。全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおける１０μｇ／ｍｌでのＴＰＩ  １４００−２９からＴＰＩ  １４００−５８の活性を図２４Ｅに示す。全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １４００−６、−７、−１３、−１４、−３３、−３７、−４３、−４４の活性を示す表を図２４Ｆに示す。全長ＸＩＡＰまたはＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １４００−６、−７、−１３、−１４、−３３、−３７、−４３、−４４の活性の比較を図２４Ｇに示す。ｃＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いるＴＰＩ  １４００−６、−７、−１３、−１４、−３３、−３７、−４３、−４４の活性を図２４Ｈに示す。これらのデータは、ＴＰＩ  １４００化合物が、ＸＩＡＰまたはＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインいずれかによって阻害されたカスパーゼ抑制解除するにおいて活性が、カスパーゼ−３のｃＩＡＰ１−媒介抑制を克服しないことを示す。種々の化合物で観察された活性の欠如は、ｃＩＡＰ１よりも２倍過剰に存在する化合物の結果であり得ることに注目するのは重要である。
【０２２４】
（実施例ＩＸ）
ペプチジルおよび非ペプチジル化合物はイン・ビトロにてＩＡＰ−阻害カスパーゼのカスパーゼ活性を回復する。
【０２２５】
本実施例は、イン・ビトロにおけるＩＡＰ−阻害カスパーゼのペプチジルおよび非ペプチジル抑制解除剤の能力を測定するためのアッセイを示す。また、本実施例は、イン・ビトロにおいてＩＡＰ−阻害カスパーゼのカスパーゼ活性の回復するにおける能力を有するペプチジルおよび非ペプチジル化合物も確認する。
【０２２６】
カスパーゼ抑制解除アッセイを用いて、ＴＰＩ  ７９２ライブラリーのスクリーニングから同定されたペプチジルＩＡＰアンタゴニスト、およびＴＰＩ  １３９１およびＴＰＩ  １３９６ライブラリーのスクリーニングから同定された非ペプチジルＩＡＰアンタゴニストを評価した。各化合物を、実施例ＶＩＩに記載された条件下で、標識されたＳＭＡＣテトラペプチド、ＡＶＰＩ（配列番号：４）、および全長ＸＩＡＰの溶液に対して滴定した。偏光はＩＡＰアンタゴニストの各濃度で測定し、データはミリポラー−ｖｓ−化合物濃度の関数としてプロットし、ＥＣ５０結合定数をプロットから決定した。対照未標識ＳＭＡＣテトラペプチドとして、ＡＶＰＩ（配列番号：４）もアッセイした。
【０２２７】
ＴＰＩ  １３９６ライブラリー（ＴＰＩ  １３９６−１１、−１２、−２２、−２８、および−３４）のいくつかの化合物について、カスパーゼ−３またはカスパーゼ−７の存在下でカスパーゼ抑制解除アッセイを行った。図２２Ｆに示されたものからの代表的な結果であるこれらの結果はこれらの研究において、ポリフェニル尿素はカスパーゼ３および７のＸＩＡＰ−媒介抑制を逆行させた。これらの実験では、ＧＳＴ−ＸＩＡＰを１００μｌの緩衝液中の１００μＭ  ＤＥＶＤ−ＡＦＣと共に、活性なカスパーゼ−３（０．６９ｎＭ）またはカスパーゼ７（３．２ｎＭ）および７５μＭ化合物に加えた。ＡＦＣの創製は、４０５ｎｍ励起および５１０ｎｍ発光でのスペクトロフルオリメーターにて、３７℃で３０分間測定した。図２２Ｆで示されるデータは、ＸＩＡＰ−阻害反応（＝１．０）と比較したカスパーゼ活性を表し、３つの測定の平均±標準偏差である。対照未標識ＳＭＡＣヘプタペプチドとして、ＡＶＰＩＡＱＫもアッセイした。
【０２２８】
表ＶＩＩＩは、ＴＰＩ  ７９２、ＴＰＩ  １３９１およびＴＰＩ  １３９６ライブラリーから同定されたＩＡＰアンタゴニストについてのＳＭＡＣ競合アッセイの結果をまとめる。ＥＣ５０は、最大速度（Ｖｍａｘ）の５０％までカスパーゼ−３の活性を回復するのに必要な化合物の量を計算することによって決定された。最も優れたテトラマーペプチドのうちの２つはＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５であり、これらは、各々、ＳＭＡＣペプチドよりも５．２から２．５倍良好なイン・ビトロでの酵素抑制解除活性を呈した。最も優れたジケトピペラジンベースの化合物は、ＴＰＩ  １３９１−２１、ＴＰＩ  １３９１−２８およびＴＰＩ  １３９１−３４を含み、これらは、ＳＭＡＣペプチドよりも３．３から５．５倍より活性な能力を呈した。最も優れたフェニル−尿素化合物はＴＰＩ  １３９６−２２、ＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９６−２８を含み、これらは、ＳＭＡＣペプチドよりも１．６から２．８倍より活性な能力を呈した。
【０２２９】
カスパーゼ抑制解除アッセイを用いて、ｃＩＡＰ１  ＢＩＲ２ドメインの存在下において、ＴＰＩ  １３９６ライブラリーのスクリーニングから同定された非ペプチジルＩＡＰアンタゴニストを評価した。各化合物は、８．５ｎＭのカスパーゼ−３、３７μＭのｃＩＡＰ１  ＢＩＲ２、および１００μＭ  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣと共に１００μＭで存在させた。アッセイはＤＥＶＤ基質の添加に際して開始され、蛍光原性産物の放出はキメティックモードにて、３７℃にて３０分間追跡した。アッセイは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＦＭＡＸスペクトロフルオリメーターで行った。比率は、化合物の非存在下においてｃＩＡＰ  ＢＩＲ２でアッセイするのに対するものである。図２２Ｂおよび２２Ｃは、種々のＴＰＩ  １３９６ライブラリー化合物の存在下での相対的カスパーゼ活性を示す。図２２Ｇに示すように、ポリフェニル尿素化合物は、ｃＩＡＰ１  ＢＩＲ２ドメインを用いてアッセイされるように、ＸＩＡＰを阻害するが、ｃＩＡＰ１を阻害しない。化合物ＴＰＩ  １３９６−１１、ＴＰＩ  １３９６−１２、ＴＰＩ  １３９６−２２およびＴＰＩ  １３９６−３４は活性なＸＩＡＰ阻害剤を表し、他方、ＴＰＩ  １３９６−２８は不活性なアナログである。
【０２３０】
【化１６】
2008537735.tif 000018
これらの結果は、ペプチジル化合物ＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５；ジケトピペラジンベースの化合物ＴＰＩ  １３９１−２１、ＴＰＩ  １３９１−２８およびＴＰＩ  １３９１−３４；およびフェニル−尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−２２およびＴＰＩ  １３９６−３４がイン・ビトロにてＸＩＡＰ阻害カスパーゼを抑制解除し、ＳＭＡＣ  ＡＶＰＩテトラペプチド（配列番号：４）よりもより大きな効力でそうしたことを示す。
【０２３１】
（実施例Ｘ）
（ペプチジル化合物ＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５は腫瘍細胞を殺す）
本実施例は、細胞培養において、ＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の効力を測定するためのアッセイを示す。また、本実施例は、ＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５が培養中の腫瘍細胞の生存率を低下することも示す。
【０２３２】
ＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５化合物をアッセイして、腫瘍細胞生存率に対するそれらの効果を決定した。図１２に示すように、ＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５は、第３の位置においてそれらのアミノ酸配列が異なる非天然アミノ酸から構成されるテトラペプチドである。ＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５化合物は、共に、各々、位置１（Ｎ−末端）、２および４においてＬ−３−（２−チエニル）−アラニルＬ−（２−ナフチル）−アラニル、およびＬ−（ｅ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−リシン部位を有するが、ＴＰＩ  ７９２−３３がＬ−ｐ−クロロ−フェニルアラニルを有し、かつＴＰＩ  ７９２−３５がＤ−（ｅ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−リシル部位を有する位置３において異なる。
【０２３３】
前立腺癌細胞系からの細胞、ＡＬＶＡ３１はＸＩＡＰ、ならびに他のＩＡＰ−ファミリー蛋白質を発現する。ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除、およびＡＬＶＡ３１細胞の生存率に対する、個々の、あるいは細胞傷害性抗癌薬物ＶＰ−１６（エトポシド）と組み合わせた、ＴＰＩ  ７９２−３３またはＴＰＩ  ７９２−３５のイン・ビボ効果を以下のように測定した。ＡＬＶＡ３１前立腺癌細胞を、２．５％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含有する１００μＬ／ＲＰＭＩ中にて９６ウェルプレートに蒔いた（１０４細胞／ウェル）。２４時間後、ＩＡＰアンタゴニストＴＰＩ  ７９２−３３、ＴＰＩ  ７９２−３５またはＳＭＡＣ  ＡＶＰＩテトラペプチド（配列番号：４）を、ＶＰ−１６（１００μＭ最終濃度）の有りまたは無しにて、４０μＭの最終濃度で加えた。インキュベーションからさらに２４時間後、細胞生存率をＸＴＴ色素−低下アッセイ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ；Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，Ｉｎｄ．）およびトリパンブルー色素排除アッセイによって測定した。
【０２３４】
抗癌薬物ＶＰ−１６（エトポシド）は、単独でＡＬＶＡ３１細胞に投与した場合、ＸＴＴ色素−低下アッセイ（図１３）およびトリパンブルー色素排除アッセイにおいて、細胞の生存率に対して実質的に効果を有しなかった。ＳＭＡＣ  ＡＶＰＩテトラペプチド（配列番号：４）もまた、単独でＡＬＶＡ３１細胞に投与した場合、細胞生存率に対してやはり効果を有しなかった。対照的に、ＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５ペプチドは、殆ど半分だけこれらの前立腺癌細胞の生存率を低下させた。さらに、ＶＰ−１６とこれらのペプチドとの組合せの結果、ＶＰ−１６単独と比較してより優れた腫瘍細胞殺傷をもたらした。比較として、ＳＭＡＣペプチドは不活性であり、同一培養条件下で生きた腫瘍細胞の相対的数を有意に低下させなかった。
【０２３５】
これらの結果は、ＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５が、ＳＭＡＣ（配列番号：４）からの野生型ＡＶＰＩペプチドと比較して顕著に改良された細胞活性を呈することを示す。さらに、これらの結果は、ＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５が、ＩＡＰ−阻害カスパーゼを抑制解除することによって、腫瘍細胞におけるアポトーシスを増加させる効果を有することを示す。これらの結果は、ＴＰＩ  ７９２−３３およびＴＰＩ  ７９２−３５が前立腺癌細胞を抗癌薬物ＶＰ−１６に対して感受性とすることも示す。
【０２３６】
（実施例ＸＩ）
（非ペプチジル化合物ＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８は腫瘍細胞を殺す）
本実施例は、ＴＰＩ  １３９６ライブラリーから同定された（ポリフェニル尿素化合物とも呼ばれる）フェニル尿素化合物、およびＴＰＩ  １３９１ライブラリーから同定されたジケトピペラジン化合物が、培養中の腫瘍細胞の生存率を低下させることを示す。本実施例は、さらに、ＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８についての細胞殺傷活性が腫瘍細胞に対して特異的であることを示す。
【０２３７】
以下のアッセイを用いて、培養された腫瘍細胞系のアポトーシスを誘導するＴＰＩ  １３９６およびＴＰＩ  １３９１ライブラリーからの個々の化合物の能力をテストした。表ＩＸにリストされた化合物の各々を、種々の濃度にて２０時間、２．５％  ＦＢＳを含有するＲＰＭＩ中のジャーカット白血病細胞（６．２５×１０５細胞／ｍＬ）に個々に加えた。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ−コンジュゲーテッドアネキシンＶ抗体およびヨウ化プロピジウム（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ；Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で染色した。細胞を暗所で室温にて２０分間インキュベートし、蛍光をフローサイトメトリーによって測定した（ＦＡＣＳｃａｎ、イムノサイトメトリーシステム；Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ；Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）。アネキシンＶについて陽性である細胞染色を非生存とみなした。
【０２３８】
表ＩＸに示したように、これらの化合物は、細胞死を濃度依存的に誘導することができた。ＳＭＡＣは５０μＭで存在させた場合、細胞生存率を焼く１６％だけ低下させることができたが、いくつかのＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８化合物は細胞生存率を約８５から９４％だけ低下させる。かくして、ＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８ライブラリーから同定された化合物は、腫瘍細胞においてアポトーシルを誘導するのにＳＭＡＣよりも約５から６倍以上優れていた。さらなる化合物をテストするっ代表的な実験を図２７ａに示す。
【０２３９】
【化１７】
2008537735.tif 000019
【０２４０】
【化１８】
2008537735.tif 000020
ＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８化合物を後に記載するようにさらにテストした。図１４（パネルＢ）は、フェニル尿素ＴＰＩ  １３９６−３４およびジケトピペラジンＴＰＩ  １３９１−２８についての構造を示す。これらの化合物の双方は、化合物を０から２０μＭの範囲で加えた以外は、前記したアッセイを用い、培養した腫瘍細胞系おアポトーシスを濃度依存的に誘導することが示された。
【０２４１】
図１５に示すように、ＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８は、一日の暴露に続いて約６．５μＭのＥＣ５０値にてジャーカット白血病細胞を殺した。同一のコアファルマコフォア構造を有するが、ＸＩＡＰへの結合を妨げるＲ基における異なる置換基を持つ対照化合物が、アッセイ条件下でジャーカット白血病細胞の生存率を有意に低下させなかった。
【０２４２】
各対照化合物に対するＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８による細胞殺傷の比較を図１６に示す。５μＭまたは８μＭのＴＰＩ  １３９６−３４でのジャーカット白血病細胞の一日処理は、各々、細胞の約７５％および８５％を殺した。ジャーカット白血病細胞の５μＭまたは８μＭのＴＰＩ  １３９１−２８での一日処理は、各々、細胞の約４５％および８０％を殺した。対照的には、対照化合物は、未処理細胞と比較してこれらの白血病細胞の生存率に対して有意な効果を有さず、これは、これらの化合物の細胞傷害性活性が特異的であることを示す。同一アッセイ条件下で、５または８μＭのＳＭＡＣ  ＡＶＰＩテトラペプチド（配列番号：４）が、これらの白血病細胞の生存率に対して有意な効果を有さず、ＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８がＳＭＡＣよりもかなり大きな効力を有することが確認された。図２７ｂは、前記した代表的なアッセイを示し、そこでは、アネキシン−Ｖ染色によってパーセント細胞死を測定する前に種々の時間の間、ジャーカット細胞を１０μＭの１３９６−３４で培養した。図２７ｂで観察できるように、ＴＰＩ  １３９６−３４によるジャーカット細胞のアポトーシス誘導のキネティックスは迅速であり、半−最大殺傷はほぼ１２時間で達成され、最大殺傷は約２４時間で達成された。
【０２４３】
ジャーカット細胞は、８μＭの採集濃度の、ＴＰＩ  １３９６−３４、構造的に関連する加工物ＴＰＩ  １３９６−２８、またはＳＭＡＣ  ４量体ペプチドＡＶＰＩ（配列番号：４）で２０時間培養した。インキュベーションの後、細胞浸透性基質を用いてカスパーゼ−３およびカスパーゼ−７活性を全細胞で測定した。予測したように、ＴＰＩ  １３９６−３４はカスパーゼ活性化を誘導し、他方、ＴＰＩ  １３９６−２８（これは、Ｒ２においてののみＴＰＩ  １３９６−３４と異なる）は、カスパーゼ活性化を誘導しなかった（図２７ｃ参照）。
【０２４４】
加えて、ジャーカット細胞を、広域スペクトルカスパーゼ阻害剤である１００μＭ  ｚＶＡＤ−ｆｍｋの有りまたは無しにて、種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４で培養した。細胞死のパーセンテージは、アネキシン−Ｖ染色によって２０時間後に測定した。ＴＰＩ  １３９６−３４によって誘導されたアポトーシスは、細胞をｚＶＡＤ−ｆｍｋと共に共培養することによって抑制可能であった（図２７ｄ参照）。
【０２４５】
正常な骨髄細胞−ｖｓ−ジャーカット白血病細胞に対するＴＰＩ  １３９６−３４の効果の比較を以下のように行った。ＴＰＩ  １３９６−３４（５μＭ）を、ＲＰＭＩおよび２．５％のＦＢＳ中でジャーカット細胞または正常な骨髄細胞単核細胞（６．２５×１０５／ｍＬ）と共に２０時間インキュベートした。インキュベーションの後に細胞を洗浄し、ＦＩＴＣ−コンジュゲーテッドアネキシンＶ抗体およびヨウ化プロピジウムで染色し前記したようにフローサイトメトリーによって蛍光を測定した。
【０２４６】
図１７に示すように、白血病細胞の頑強な殺傷が観察された同一培養条件下で、ＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８は正常な骨髄細胞に対して傷害性をほとんど引き起こさなかった。これらの結果は、ＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８が、正常な細胞と比較して腫瘍細胞を選択的に殺傷することを示す。
【０２４７】
（実施例ＸＩＩ）
（ＴＰＩ  １３９６−３４による腫瘍細胞の殺傷はＸＩＡＰによって媒介される）
本実施例は、ＴＰＩ  １３９６−３４による腫瘍細胞殺傷に対する、過剰発現野生型および突然変異体ＸＩＡＰの効果を記載する。
【０２４８】
ＮＥＯ−対照プラスミド（Ｕ９３７−Ｎｅｏ細胞）またはＸＩＡＰをコードするプラスミド（Ｕ９３７−ＸＩＡＰ細胞）いずれかで安定にトランスフェクトされたＵ９３７白血病細胞（６．２５×１０５細胞／ｍＬ）を、ＲＰＭＩおよび２．５％  ＦＢＳ中の５または８μＭのＴＰＩ  １３９６−３４で２０時間処理した。インキュベーションの後、細胞を洗浄し、ＦＩＴＣコンジュゲーテッドアネキシンＶ抗体およびヨウ化プロピジウムで染色し実施例ＸＩに記載されたように蛍光をフローサイトメトリーによって測定した。
【０２４９】
図１８および図２７ｅに示すように、ＸＩＡＰの過剰発現はＵ９３７細胞をＴＰＩ  １３９６−３４に対して耐性とした。Ｕ９３７−ＮｅｏおよびＵ９３７−ＸＩＡＰ細胞に対するＴＰＩ  １３９６−３４の効果の比較は、ＸＩＡＰの過剰発現がこの因子によるアポトーシス誘導に対する耐性に相関することを示した。細胞がＸＩＡＰを過剰発現する場合の、ＴＰＩ  １３９６−３４のアポトーシス原性効果に対する腫瘍細胞の増大した耐性は、ＴＰＩ  １３９６−３４がＸＩＡＰへの結合によってアポトーシスを誘導することを示す。
【０２５０】
ベクタートランスフェクト対照細胞と比較したＵ９３７−ＸＩＡＰ細胞におけるＸＩＡＰの過剰発現は、免疫ブロッティングによって確認された（図１８、上方右側パネル）。Ｋ５６２細胞におけるＸＩＡＰの発現は、これらの細胞がＸＩＡＰを内因的に発現することが知られているので、対照として含めた。等量の蛋白質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＩＳＣ  ＢｉｏＥｘｐｒｅｓｓ，Ｋａｙｓｖｉｌｌｅ，ＵＴからの４から２０％グラジエントゲル）に付し、続いて、ニトロセルロース膜に移した。膜をモノクローナルマウス−抗ヒトＸＩＡＰ（０．２５ｍｇ／ｍＬ）（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ，ＫＹ）またはモノクローナルマウス−抗ｂ−アクチン（１：３０００ｖ／ｖ）（Ｓｉｇｍａ  Ｉｎｃ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）でプローブした。二次抗体は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲーテッドヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）よりなるものであった。検出は、増強されたケミルミネセンス（ＥＣＬ）方法によって行った。図２７ｅにおいて、ＸＩＡＰまたはネオマイシン対照トランスフェクタントを安定に過剰発現するＵ９３７細胞を、種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４で２０時間培養し、細胞の死滅のパーセンテージをアメキシン−Ｖ染色によって測定した。溶解物を細胞から調製し、全蛋白質含有量について正規化し、ＸＩＡＰ、カスパーゼ−３、およびβ−アクチンに対して特異的な抗体を用いるＳＤＳ−ＰＡＧＥ免疫ブロッティングによって分析した。
【０２５１】
全長ＸＩＡＰで細胞をトランスフェクトしたのに加え、種々のＸＩＡＰ突然変異体を過剰発現するプラスミドでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞で類似のアッセイを行った。ＨｅＬａ細胞を、ＢＩＲ２（カスパーゼ−３／７抑制）ドメイン、ＢＩＲ３（カスパーゼ−９抑制）ドメインのみを有する全長野生型ＸＩＡＰ−ｖｓ基質突然変異体、あるいはＢＩＲ２およびＢＩＲ３中の推定ＳＭＡＣ−結合ポケットの双方がもはやカスパーゼに結合しないように突然変異されている突然変異体をコードするプラスミドで一過的にトランスフェクトした。該突然変異体は、位置１４８、２１９、２２３、３１４および３２３をアラニンを含有するように修飾するための部位−特異的突然変異誘発によって表示させた。ＨｅＬａ細胞を、Ｂｃｌ−ＸＬ、カスパーゼの上流をミトコンドリアからのチトクロームＣ放出を抑制するように操作する抗アポトーシス蛋白質でやはり一過的にトランスフェクトした。ＨｅＬａ細胞（２．５×１０５）を、５％  ＦＢＳを含む２ｍＬのＤＭＥＭ  Ｈ２１中の６ウェルプレートに蒔いた。２４時間後に、細胞をプラスミドでトランスフェクトした（Ｇｅｎｅ  Ｐｏｒｔｅｒ）。トランスフェクションから４８時間後に、細胞を５μＭのＴＰＩ  １３９６−３４で２０時間処理した。次いで、浮遊および接着性細胞双方を培養から回収し、洗浄し、アポトーシスを、フローサイトメトリーを用いてアメキシンＶ染色によって測定した。
【０２５２】
図１９に示すように、ＴＰＩ  １３９６−３４は、対照ベクターでトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞においてアポトーシスを誘導した。ＴＰＩ  １３９６−３４によって誘導されたアポトーシスは、Ｂｃｌ−ＸＬを過剰発現することによってブロックされず、Ｂｃｌ−ＸＬはＸＩＡＰの上流を操作するという事実に合致する。対照的に、全長ＸＩＡＰを過剰発現するＨｅＬａ細胞をＴＰＩ  １３９６−３４から保護した。加えて、ＸＩＡＰのＳＭＡＣ−結合ポケットが突然変異されたＸＩＡＰの突然変異体を発現する細胞は化学化合物から保護されず、また、ＢＩＲ２ドメインのみから構成される突然変異体を発現する細胞も保護されなかった。ＢＩＲ３ドメインを発現する細胞は、ＴＰＩ  １３９６−３４のアポトーシス原性活性から保護された。一緒に考えるとこれらの結果が、ＴＰＩ  １３９６−３４は、ＸＩＡＰを標的化することによって培養中の腫瘍細胞系のアポトーシスを誘導することを示す。
【０２５３】
図２７ｆに示されるように、ＨｅＬａ細胞を、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−Ｘ、ＣｒｍＡをコードするプラスミド、または空のベクターでトランスフェクトした。トランスフェクションから２日後に、細胞をＴＰＩ  １３９６−３４（５μＭ）で２０時間処理し、死滅細胞のパーセンテージをアネキシン−Ｖ染色によって測定した。本明細書中に開示されたポリフェニル尿素化合物の標的を代表するＩＡＰと合致して、ＸＩＡＰの一過的または安定な過剰発現は、腫瘍細胞系を、活性な化合物によるアポトーシス誘導に対してより活性とし、用量−応答曲線を右側へシフトさせ、従って、より高い濃度の化合物を必要とした（図２７ｅおよび２７ｆ）。対照的に、抗アポトーシス蛋白質Ｂｃｌ−ＸＬまたはＣｒｍＡの過剰発現は腫瘍細胞系のＴＰＩ  １３９６−３４に対する感受性を改変せず、特異的効果を示す（図２７ｆ参照）。Ｂｃｌ−ＸＬ過剰発現はエトポシドおよびＣｒｍＡ（カスパーゼ−８阻害剤）のような伝統的な抗癌薬物に対する耐性を付与し、ＴＲＡＩＬによって誘導されるアポトーシスから細胞を保護し、これらの抗アポトーシス蛋白質はこれらの実験において機能的であったことが確認される。
【０２５４】
（実施例ＸＩＩＩ）
（形質転換された細胞に対するポリフェニル尿素化合物の広い活性）
本実施例は、ポリフェニル尿素化合物が、正常な細胞に対してほとんど効果を有しないが、多くの異なる腫瘍細胞系に対して活性を有することを示す。
【０２５５】
選択されたポリフェニル尿素化合物は、６０の腫瘍細胞系のＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）パネルについてテストした（図２８ａおよび図２９参照）。細胞を化合物と共に４８時間培養し、続いて、蛋白質−ベースの比色アッセイを用いて生きた細胞の相対的数を測定し、データを溶媒対照単独で処理された細胞に対するパーセント成長として表す。化合物ＴＰＩ  １３９６−１１、ＴＰＩ  １３９６−１２、ＴＰＩ  １３９６−２２、およびＴＰＩ  １３９６−３４は生きた細胞の数の低下を誘導し、６０の細胞系について平均ＬＤ５０（バックグラウンド細胞死について調整した後の、細胞の５０％を殺傷するのに必要な濃度）は、各々、１０＋／−２．８μＭ（中央値＝１７μＭ）、７．６＋／―１２μＭ（中央値＝６μＭ）、１１＋／−２．６μＭ（中央値＝２２μＭ）、および２２＋／−５μＭ（中央値＝２３μＭ）であった。さらに、ＬＤ５０は、活性な化合物で処理された腫瘍細胞の１／３を超えるものについて＜１０μＭであった。対照的に、ＬＤ５０は、７０μＭまでの構造的に関連する対照化合物ＴＰＩ  １３９６−２８での処理の後に、６０の腫瘍細胞系のいずれについても到達しなかった（図２８ａ参照）。比較によって、この同一のアッセイを用いる場合、６０の腫瘍細胞系のＮＣＩパネルにおける抗癌薬物エトポシドについての平均ＬＤ５０は２００＋／−２．５μＭであり、細胞のいずれもＬＤ５０＜１０μＭを有しなかった。
【０２５６】
腫瘍細胞系と比較して、正常な細胞はポリフェニル尿素化合物に対して比較的耐性であった。図２８ｂに示すように、ジャーカットおよびＨｅＬａ腫瘍細胞系、および正常な末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）骨髄単核細胞、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、またはヒト前立腺上皮細胞を含めた種々のタイプの細胞を種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４で培養した。２日後に、アネキシン−Ｖ染色によって細胞生存率を評価した。
【０２５７】
マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、ヒト前立腺上皮細胞、および末梢血液リンパ球（ＰＢＬ）のような正常な細胞を種々の濃度の活性なポリ−フェニル尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−３４で培養した場合、細胞の細胞傷害性曲線の傾きは腫瘍細胞系で観察されたよりもかなり平坦であった（図２８ｂ）。１０ｍＭの濃度において、例えば、パーセンテージ細胞死は、これらのタイプの正常な細胞についてのバックグラウンドを超えて一倍未満だけ増加し、他方、ジャーカットおよびＨｅＬａのような腫瘍系の殺傷は＞４倍だけ増加した。リンパ球を分裂レクチン、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）で活性化すると、ＸＩＡＰ−アンタゴニストに対する感受性を増加させなかった。正常なヒト骨髄単核細胞（ＢＭ）はより感受性となる傾向があった。しかしながら、これらの細胞についてさえ、ＬＤ５０は４０ｍＭまでの濃度で到達されなかった。比較として、ジャーカットおよびＨｅＬａ細胞のＬＤ５０は約５μＭの濃度において達成された（図２８ｂ）。
【０２５８】
多くの腫瘍および白血病細胞系は正常な細胞よりも速く増殖するので、ポリフェニル尿素化合物が非複製悪性細胞のアポトーシスを誘導出来るか否かを調べた。従って、５人の患者からの新たに単離された慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）Ｂ細胞、および急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を持つ５人の患者からの新たに単離された白血病芽細胞を、化合物ＴＰＩ  １３９６−１１、ＴＰＩ  １３９６−１２、またはＴＰＩ  １３９６−３４−ｖｓ−ＴＰＩ  １３９６−２８対照化合物またはＡＶＰＩペプチド（配列番号：４）でイン・ビトロにて２０から２４時間処理し、ＦＡＣＳ分析でのアネキシン−Ｖ／ヨウ化プロピジウム染色（図２８ｃ）またはアネキシン−Ｖ染色によって細胞死のパーセンテージを測定した。これらの白血病細胞試料は小さなパーセンテージの周期細胞のみを含有し、標準的な培養条件下では複製しなかった。図２８ｃおよび２８ｄで見られるように、活性なポリフェニル尿素化合物は、調べた５つのＣＬＬ検体のうち５つ（図２８ｃ）および５つのＡＭＬ検体のうち４つ（図２８ｄ）において初代−培養白血病細胞の用量−依存性細胞死を誘導し、培養における自然アポトーシスについての修正後にほぼ５μＭの容量においてＬＤ５０が達成された。対照的に、不活性な対照化合物ＴＰＩ  １３９６−２８およびＡＶＰＩペプチドはこれらの白血病細胞のアポトーシスを誘導しなかった。全ての試料はＴＰＩ  １３９６−３４、ＴＰＩ  １３９６−２８、ならびにＡＶＰＩペプチド双方で処理したが、完全なデータ組はＡＭＬ−１についてのみ示す。匹敵する結果が、他の白血病検体についての対照化合物で得られた。加えて、活性なポリフェニル尿素化合物もまたマウスからの形質転換された造血系細胞に対して活性であり、マウス７０Ｚ／３リンパ腫および不滅化３２Ｄミエロイド細胞の死滅を誘導し、ＥＣ５０バルブは８から１２μＭであった。かくして、細胞の複製は、開示されたポリ−フェニル尿素化合物に対する感受性で要求されない。
【０２５９】
（実施例ＸＩＶ）
（ポリフェニル尿素化合物は腫瘍細胞を抗癌薬物およびＴＲＡＩＬに対して感受性とする）
本実施例は、ポリフェニル尿素化合物が慣用的な抗癌薬物と共同して、腫瘍細胞の殺傷を誘導できることを示す。
【０２６０】
公知の抗癌薬剤と組み合わせたポリフェニル尿素化合物の効果をテストするために、Ｄｕ１４５前立腺癌細胞を、１０μＭ  ｔＰＩ  １３９６−３４の有りまたは無しにて、種々の濃度のエトポシド（ＶＰ１６）、ドキソルビシン（ＤＯＸ）、またはパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）で４８時間培養した。対照に対する生きた細胞のパーセンテージを、商業的に入手可能な（Ｓｉｇｍａ）ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾリル−２）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド）アッセイを用いて決定した。図３０ａは、ＴＰＩ  １３９６−３４が、Ｄｕ１４５前立腺癌細胞においてＶＰ１６、ＤＯＸ、およびＴＡＸＯＬの用量−依存性細胞傷害性を有意に増加させたことを示す代表的なデータを示す。種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４における結果を示すデータのより完全なバージョンを図３１ａに示す。同様な結果が、ＶＰ１６、ＤＯＸ、またはＴＡＸＯＬで処理されたＰＰＣ１（図３１ｂ）およびＰＣ３（図３１ｃ）前立腺癌細胞について、およびＶＰ１６またはＤＯＸで処理されたＨ４６０（図３１ｄ）肺癌細胞について得られた。不活性なポリ−フェニル尿素化合物は、腫瘍細胞を抗癌薬物に対して感受性としなかった。
【０２６１】
生物学的剤ＴＲＡＩＬによるアポトーシスに対するポリフェニル尿素化合物の効果、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのアポトーシス誘導数の同様なテストも行った。癌細胞系ＰＲＣ１、ＡＬＶＡ３１およびＤＵ１４５を、単独、あるいは１μＭの濃度のＴＰＩ  １３９６−３４と組み合わせた種々の濃度のＴＲＡＩＬで処理した。ＴＰＩ  １３９６−３４は、ＴＲＡＩＬ−誘導アポトーシスに対してＰＰＣ１、ＡＬＶＡ３１、ＤＵ１４５、およびＨｅＬａ細胞を感受性とした（図３０ｂ）。不活性な対照化合物はこの活性を呈しなかった。
【０２６２】
（実施例ＸＶ）
（ポリフェニル尿素化合物は、クローン原性生存アッセイおよび腫瘍異種移植片モデルにおいて抗腫瘍活性を示す）
本実施例は、癌細胞のクローン原性生存がポリフェニル尿素化合物によって低下されることを示す。加えて、選択されたポリフェニル尿素化合物は、免疫寛容マウスにおいて成長した、ヒト腫瘍異種移植片を用いるイン・ビボでの抗腫瘍活性を示した。
【０２６３】
短期間の細胞傷害性アッセイに加えて、選択されたポリフェニル尿素化合物を、抗癌活性のより厳密なテストと考えることができるコロニー形成アッセイにおいて癌細胞のクローン原性生存に対する効果についてテストした。２つの前立腺癌細胞系ＰＣ−３およびＬＮＣａＰをＴＰＩ  １３９６−３４で３日間培養し、次いで、培養基を変化させ、コロニーを１週間後にカウントした。図３２ａは、種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４および１つの濃度（１０μＭ）の対照化合物を用いて得られた結果を示す。図３２ａで分かるように、ＴＰＩ  １３９６−３４はこれらの癌細胞のクローン原性生存を濃度依存的に減少させ、平均ＥＣ５０用量は３μＭ＋０．５μＭ（平均＋標準誤差）であった。１０μＭの用量において、比較的効果をほとんど有しなかった不活性な対照化合物とは対照的に、コロニー形成は対照の＜５％まで低下した。
【０２６４】
選択されたポリフェニル尿素化合物を、免疫寛容マウスにおいて成長させたヒト腫瘍異種移植片を用い、イン・ビボにて抗腫瘍活性についてテストした。まず、いずれの用量のポリフェニル尿素化合物がマウスによって許容されるかを決定した。単一または分割用量として腹腔内送達された１００ｍｇ／ｋｇの結果、眼に見える傷害性はもたらされないことが判明した。腫瘍異種移植片実験では、ＰＰＣ１前立腺癌細胞（２５０万）をは８匹の雄Ｂａｌｂ／Ｃ  ｎｕ−／ｎｕ−マウスの脇腹に皮下注射した。動物の半分は７日および８日に３０ｍｇ／ｋｇのＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルモアミド）中のＴＰＩ  １３９６−３４の腹腔内注射を受け、他方、他の半分はＤＭＦ希釈剤単独を受けた。腫瘍の成長を外部キャリパーによって毎週少なくとも２回モニターした（図３２ｂ参照）。化合物の注射から２４日後に、マウスを犠牲にし、腫瘍を切り出し、重量を測った（図３２ｂ、インセット参照）。図３２ｂで分かるように、ＴＪＰＩ  １３９６−３４での処理の結果、ＤＭＦ対照と比較して低下した腫瘍サイズがもたらされた。
【０２６５】
同様なデータがＴＰＩ  １３９６−２２を用いて得られた（図３３ａおよび図３３ｂ参照）。これらの実験において、ＰＰＣ１前立腺癌細胞（２５０万）を雄Ｂａｌｂ／Ｃ  ｎｕ−／ｎｕ−マウスの脇腹に皮下注射した。５，６および７日に、腫瘍が約１２５ｍｍ３になると、マウスを３０ｍｇ／ｋｇのＴＰＩ  １３９６−２２または溶媒で腹腔内注射によって処理し、腫瘍容量を注射後１９日間、毎週少なくとも２回、キャリパーによって測定した。図３３ｂにおいては、マウスを１９日に犠牲にし、腫瘍を切り出し、重量を測定した。
【０２６６】
さらなる実験を、異なる腫瘍異種移植片モデルを用いて行った。ＨＣＴ−１１６結腸癌細胞（２５０万）を雌Ｂａｌｂ／Ｃ  ｎｕ−／ｎｕ−マウスの脇腹に注射した。６、７および８日において、腫瘍が約１２５ｍｍ３となると、マウスを腹腔内注射によって３０ｍｇ／ｋｇのＴＰＩ  １３９６−３４（ｎ＝１０）または溶媒対照（ｎ＝１９）で処理した。腫瘍容量を外部キャリパーによって毎週少なくとも２回１９日間測定した（図３２ｃ参照）。１９日において、マウスを犠牲にし、腫瘍を切り出し、体重を測定した。再度、腫瘍サイズは、溶媒対照と比較してＴＰＩ  １３９６−３４で処理したマウスにおいて低下した。
【０２６７】
まとめると、ＴＰＩ  １３９６−３４またはＴＰＩ  １３９６−２２を丁度２または３日間マウスに投与すると、ＰＰＣ１およびＨＣＴ１１６腫瘍の双方の成長速度を有意に遅らせ、かくして、これらの化学化合物のイン・ビボ抗腫瘍活性を示す。
【０２６８】
（実施例ＸＶＩ）
（個々のＴＰＩ  １３９６化合物の構造活性関係（ＳＡＲ）およびＴＰＩ  １５０９化合物の創製）
本実施例は、ＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−３６（これらの化合物の構造については図２２参照）に基づくＳＡＲ情報、およびＴＰＩ  １５０９化合物の構造を示す。ＴＰＩ  １５０９化合物はＴＰＩ  １３９６化合物に基づき、これは、今度は、ＴＰＩ  ９２７ライブラリーに基づく。個々化合物ＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−３６の活性スクリーニングによって示されるように、多数の異なる疎水性芳香族基が、Ｒ１およびＲ３位置における活性について許容される（表Ｘ参照）。表Ｘは、活性な化合物がＲ２位置におけるプロリンに由来し得ることも示す。
【０２６９】
【化１９】
2008537735.tif 000021
【０２７０】
【化２０】
2008537735.tif 000022
Ｒ２位置において異なる官能性を有する個々の化合物を調べると（表ＸＩ）、２つの第二級アミンおよび１つの第三級アミンを有するトリアミンに由来するジフェニル尿素はトリフェニル尿素よりも活性であることが分かる。これらのジフェニル尿素はプロリン−含有アシル化ジペプチドアミドの還元、続いて、フェニルイソシアネートでの処理から誘導した。
【０２７１】
【化２１】
2008537735.tif 000023
【０２７２】
【化２２】
2008537735.tif 000024
また、Ｌ−プロリンの代わりにＤ−プロリンを用いて構成した一連の化合物（ＴＰＩ  １５０９；図３４に示す）を活性についてテストした。図３４は、ＸＩＡＰ抑制解除アッセイにおけるこれらの化合物の名称、構造および活性を示す。これらの化合物の全ては２５ｍｇ／ｍｌにおいて活性であり、このアッセイにおいて最も活性化合物は、ＴＰＩ  １５０９−１、ＴＰＩ  １５０９−２、ＴＰＩ  １５０９−３、およびＴＰＩ  １５０９−６であった。
【０２７３】
（実施例ＸＶＩＩ）
（ポリフェニル尿素の構造活性関係（ＳＡＲ））
本実施例は、ポリ−フェニル尿素化合物の活性に対する主な足場および各Ｒ基の相対的重要性に取り組むのに用いることが出来る化合物を示す。図３５は、ＴＰＩ  １５０９−７のアナログである化合物を示し、ここで、Ｒ１、Ｒ２およびＲ３の特性は、それらの化学的性質、従って、それらの物理化学的特性を改変することによって別々に変化される。同様なシリーズの化合物をＴＰＩ  １３９６―３４に基づいて構成した。該化合物を活性についてアッセイし、もう１つのラウンドのＳＡＲを、所望により行って、化合物の構造をさらに最適化することが出来る。望ましい化合物は、例えば、現存する化合物よりも低い分子量および良好な薬理学的特性を持つ化合物であり得る。
【０２７４】
（実施例ＸＶＩＩＩ）
（ＴＰＩ  １３３２ペプチド化合物はＳＭＡＣ結合部位から区別されるＸＩＡＰにおける部位と相互作用する）
本実施例は、テトラペプチドのＴＰＩ  １３３２シリーズにおける化合物がＸＩＡＰ上のＳＭＡＣ結合部位と相互作用しないことを示す。
【０２７５】
７９２シリーズにおける非天然アミノ酸を含有するペプチド化合物、７９２−３３および７９２−３５（図１２および２０および実施例ＸＩ参照）、およびＴＰＩ  １３３２シリーズ、ＴＰＩ  １３３２−６９における活性化合物を、実施例Ｘにて前記したように、ＳＭＡＣ結合アッセイにおいて結合活性につきテストした。このアッセイでは、ビオチニル化ＳＭＡＣ７−量体ペプチド（５０ｎｇ）は、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％スクロース、０．１％  ＣＨＡＰＳ、１０ｍＭ  ＤＴＴのウェル当たり１００μｌ中１ｍｇ／ｍｌのＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）で被覆された９６ウェルプレートに結合させた。次いで、ＧＳＴ−ＸＩＡＰを、ＤＭＳＯ中の化合物の有りまたは無しにて、１００μｌ中０．１ｍｇ／ｍｌで加えた。室温での１時間のインキュベーションの後に、プレートを０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＰＢＳで洗浄し、結合したＧＳＴ−ＸＩＡＰを、マウス抗ＧＳＴモノクローナル抗体（１：２０００希釈）、続いて、抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲーテッドＩｇＧおよび３，３’，５，５’―テトラメチルベンジジン塩基（ＴＭＢ）基質の添加によって、プレートリーダーでの４５０ｎｍにおける検出にて、検出した。
【０２７６】
図３６ＡからＦおよび３７に示すように、ＴＰＩ  ７９２シリーズの活性な化合物およびそのアナログ、ならびにＴＰＩ  １３３２シリーズの化合物は、ＴＰＩ  １３３２−６９を例外として、ＳＭＡＣペプチドへのＸＩＡＰ結合と競合する。加えて、図３７に示すように、ＴＰＩ  １３３２−６９は抑制解除アッセイにおいて活性であるが、ＳＭＡＣペプチド結合部位について競合せず、ＴＰＩ  １４９５−５（位置４がＧであるＴＰＩ  １３３２−６９の置換アナログ）は抑制解除アッセイにおいて活性であって、ＳＭＡＣペプチド結合部位について競合する。予測されるように、７９２または１３３２シリーズにおける不活性な化合物は、ＳＭＡＣペプチドに対するＸＩＡＰ結合と競合しない。
【０２７７】
図３６ＣからＦに示すように、１３３２シリーズの多くの化合物はカスパーゼ３のＸＩＡＰ−媒介抑制を逆行させることができた。５０μｇ／ｍｌにおける活性な化合物（図３６Ｃ）は、ＴＰＩ  １３３２−１、−３、−４、−５、−１１、−１５、−３２、−３６、−３８、−４０、−４１、−４２、−４５、−４７、−６３から６９、−７１から７３、−７６、−７８、−８１から８５、−８７から９０および−９３を含んだ。また、ＴＰＩ  １３３２−１、−４、−４１、−５３、−６９、および−７７の活性は、図３６Ｅに示すように、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２ドメインを用いる抑制解除アッセイにおいて測定した。さらに、ｃＩＡＰ１  ＢＩＲ２ドメインを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３３２−１、−２、−４、−６、−４１、−４７、−５３、−５５、−６９、−７６、−７７および−８５の活性を図３６Ｆに示す。これらのデータは、ＴＰＩ  １３３２および関連化合物がＸＩＡＰまたはＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインによって阻害されたカスパーゼを抑制解除するのに活性であるが、カスパーゼ−３のｃＩＡＰ１−媒介抑制を克服しないことを示す。種々の化合物で観察された活性の欠如は、ｃＩＡＰ１の二倍過剰にて存在する化合物の結果であり得ることに注目するのは重要である。
【０２７８】
図３７に示すのは、ＴＰＩ  １４９５−１（ＴＰＩ  １３３２−６９）およびＴＰＩ  １４９５−２からＴＰＩ  １４９５−９といわれるＴＰＩ  １３３２−６９に由来する化合物の活性である。ＴＰＩ  １３３２−６９は、カスパーゼ抑制解除アッセイにおいて活性であるが、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいては不活性であり、他方、ＴＰＩ  １４９５−５はカスパーゼ抑制解除アッセイおよびＳＭＡＣ競合アッセイ双方において活性であった。これらのデータは、ＴＰＩ  １４９５−５が、ＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインおよびＳＭＡＣ結合ドメイン双方の機能に影響するＸＩＡＰ上の結合部位を有することを示す。
【０２７９】
図４３は、ＴＰＩ  １４５３シリーズといわれるＴＰＩ  ７９２−３３またはＴＰＩ  ７９２−３５に由来するいくつかの化合物を示す。示されるように、ＴＰＩ  １４５３−１はＴＰＩ  ７９２−３３と同一であり、ＴＰＩ  １４５３−２からＴＰＩ  １４５３−５は、種々の天然および非天然アミノ酸置換を含有するＴＰＩ  ７９２−３３の修飾であり；ＴＰＩ  １４５３−５はＴＰＩ  ７９２−３５と同一であり、ＴＰＩ  １４５３−６からＴＰＩ  １４５３−９は、種々の天然および非天然アミノ酸置換を含有するＴＰＩ  ７９２−３５の修飾である。化合物ＴＰＩ  １４５３−１、−２、−４、−６、−７、−８および−９は、カスパーゼ抑制解除アッセイおよびＳＭＡＣ競合アッセイ双方において活性を有すると判断された。
【０２８０】
これらのデータは、ＸＩＡＰ上の新規な負の調節部位、ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインがＳＭＡＣによって標的化されないことを示す。ＴＰＩ  １３３２−３６のようなこの新規な負の調節部位に結合する化合物、ならびにＳＭＡＣ結合部位およびＢＩＲ２ドメイン双方を変調する化合物をスクリーニングアッセイで用いて、この新規な部位に結合できる他の化合物を同定できる。
【０２８１】
（実施例ＸＩＸ）
（ＸＩＡＰ以外のＩＡＰを阻害する化合物の同定）
本実施例は、他のＩＡＰに対するＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤の効果を決定するのに用いることが出来るアッセイを記載する。
【０２８２】
前立腺癌の免疫組織化学分析は、ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２がこれらの腫瘍において共通して過剰発現されることを示す。ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２双方はカスパーゼ阻害剤であり（Ｒｏｙ，ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：６９１４−６９２５（１９９７））、それらは各々ＳＭＡＣに結合する（Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０２：３３−４２（２０００）；Ｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：８５５−８６２（２０００））。さらに、分子モデリング実験は、ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２のＢＩＲのいくつかが、ＸＩＡＰに対して大きな構造的同様性を有するＳＭＡＣに結合するようであることを示す。これらの観察は、ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤が、これらの他のＩＡＰによって阻害されるカスパーゼに対する活性を有することができることを示す。
【０２８３】
ＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤がこれらの他のＩＡＰによって阻害されるカスパーゼに対して活性を有することを確認するために、以下のアッセイを行う。ＸＩＡＰ上のＢＩＲに結合についての該化合物とＳＭＡＣペプチドとの競合をアッセイする。これを達成するためには、該化合物をＳＭＡＣ競合アッセイでテストし、そこでは、ＦＩＴＣ−コンジュゲーテッドＳＭＡＣテトラペプチドＡＶＰＩ（配列番号：４）またはＦＩＴＣ−コンジュゲーテッドＨｔｒＡ２テトラ−ペプチドＡＶＰＳ（配列番号：６）をＸＩＡＰからのＢＩＲに結合させる。全長ＸＩＡＰを発現するよりはむしろ、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：７７８７−７７９０（１９９８）  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７：２２１５−２２２３（１９９８）に記載されているように、ＢＩＲ２またはＢＩＲ３ドメインのみを含有するＸＩＡＰの断片を発現させる。これらのアッセイは、該化合物がＳＭＡＣ−ミミックとして機能するかを、また、該化合物がＢＩＲ２（カスパーゼ−３および−７を阻害するドメイン）、ＢＩＲ３（カスパーゼ−９を阻害するドメイン）、双方を標的化するか否か、またはこれらのドメインのいずれも標的化しないか否かを決定するであろう。
【０２８４】
加えて、ＢＩＲ２またはＢＩＲ３ドメインを用いて酵素抑制解除アッセイを行って、化合物によって標的化されるＸＩＡＰ中のドメインを突き止める。組換え精製ＢＩＲ２をカスパーゼ−３と混合し、ＢＩＲ３をカスパーゼ−９と混合し、次いで、該化合物がＢＩＲ２、ＢＩＲ３、双方を標的化するか否か、あるいはＸＩＡＰタンパク質中のこれらのドメインのいずれも標的化しないか否かを突き止める努力において、化合物の存在下および非存在下において、特異的蛍光原性基質ペプチド（カスパーゼ−３についてはＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣであるのに対し、カスパーゼ−９についてはＡｃ−ＬＥＨＤ−ＡＦＣ）に対してこれらのプロテアーゼの活性を測定する。これらの結果は、ＸＩＡＰ、ＢＩＲ２（Ｓｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０１：８１８−８２１（１９９９）  ａｎｄ  Ｒｉｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １０４：７９１−８００（２００１），ａｎｄ  ＢＩＲ３（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０８：１００４−１００８（２０００））の公表された構造の分子モデリングを用いる化合物の構造−ベースの最適化で用いることができる。
【０２８５】
ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２に関して、全長ｃＩＡＰ１およびｃＩＡＰ２、ならびに個々のＢＩＲドメインを含有する断片を用いて、同様な酵素抑制解除およびＳＭＡＣ競合アッセイを行い、かくして、化合物がＩＡＰ−ファミリーのこれらの他のメンバーを交差−阻害するか否かを決定する。
【０２８６】
もし化合物がｃＩＡＰ１、ｃＩＡＰ２、またはこれらの蛋白質の双方を阻害するならば、化合物の効力は医学的およびコンビナトーリアル化学を通じて改良することができる。アッセイを行って、細胞−ベースのアッセイにおける化合物の活性に関してイン・ビトロでのｃＩＡＰ１／ｃＩＡＰ２活性の保持−ｖｓ−喪失を対照させることができる。このタイプの構造活性関係実験は、最適な化合物がＸＩＡＰに対する選択的特異性−ｖｓ−いくつかのＩＡＰに対する汎用反応性を有するか否かを示す。これらの異なるプロフィール（選択的−ｖｓ−広域−スペクトル活性）をもつ化合物を傷害性論点に関して対照させて、効力および安全性の間の所望のバランスを持った化合物を得る。
【０２８７】
（実施例ＸＸ）
（ポリフェニル尿素化合物の作用のメカニズム）
ポリフェニル尿素化合物によるアポトーシス誘導が意図した作用メカニズムを通じて起こるか否かを判断するために、細胞ベースのアッセイにおいて、ＸＩＡＰノックアウトマウスから得られた細胞を用い、ＴＰＩ  １３９６−３４の傷害性をテストした。ＸＩＡＰ−／−マウスおよび形質転換された野生型（＋／＋）マウスからのマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）に対するＴＰＩ  １３９６−３４およびダウノルビシンのメカニズム−ベースの傷害性を測定した。細胞を低継代において（図３８ＡおよびＣ）直接的に、あるいはＳＶ４０大Ｔ抗原をコードするレトロウィルスでの注射による形質転換の後に（図３８ＢおよびＤ）テストした。細胞を種々の濃度の化合物ＴＰＩ  １３９６−３４（図３８ＡおよびＢ）で、またはダウノルビシン（図３８ＣおよびＤ）で１日培養した。細胞の生存率をＭＴＴアッセイによって測定し、対照の未処理細胞に対するパーセンテージとしてデータを表す。図３８ＡからＤに示されるデータは、三連測定の平均±標準偏差を表す。
【０２８８】
これらの結果は、ＸＩＡＰ−欠乏細胞は野生型ＭＥＦと比較してポリフェニル尿素化合物に対して感受性が低いことを示し、意図した標的（ＸＩＡＰ蛋白質）を欠如する細胞は感受性が低いので、化合物が意図した作用メカニズムを通じて機能するという証拠を提供する。対照的に、もし化合物が非特異的メカニズムを通じてアポトーシスを誘導したならば、ＸＩＡＰ−欠乏細胞は抗アポトーシス蛋白質の不存在のためより感受性であろうと予測される。これらの発見は、形質転換された細胞がＸＩＡＰアンタゴニストに対してより感受性であることを示すことによって形質転換されていない細胞を形質転換されている細胞と対照する。対照的に、ダウノルビシンのような慣用的な抗癌薬物は、これらのイン・ビボ細胞傷害性アッセイにおいて形質転換された細胞についての選択性を呈しない。
【０２８９】
（実施例ＸＸＩ）
（ポリフェニル尿素化合物は抗原−特異的ＣＴＬの細胞傷害性を増強する）
ポリフェニル尿素化合物がＣＴＬ−媒介細胞溶解に関連するアポトーシスメカニズムに対する抵抗性を低下させるかを判断するために、選択された化合物を、抗原−特異的ＣＴＬの細胞傷害性を増強するそれらの能力についてテストした。
【０２９０】
これらの実験については、腫瘍細胞に５１Ｃｒを負荷し、次いで、特異的抗原でパルスし、化合物の非存在下において（塗りつぶしていない丸印；ダッシュ線）、または１０μＭの不活性な対照化合物ＴＰＩ  １３９６−２８（四角）または活性な化合物ＴＰＩ  １３９６−３４（塗りつぶした丸印）いずれかの存在下で、５（図３９Ａ）または１０（図３９Ｂ）いずれかのエフェクター−標的比率にて抗原−特異的Ｔ細胞と共にインキュベートした。４時間後に、５１Ｃｒ放出を測定した。図３９に示されたデータは、洗剤溶解によって誘導された合計放出のパーセンテージとして表され、データは三連測定の平均±標準偏差を表す。
【０２９１】
図３９に示すように、ＴＰＩ  １３９６−３４は腫瘍細胞をＣＴＬ−媒介溶解に対して感受性とする。これらの結果は、ポリフェニル尿素化合物がＣＴＬエフェクター機能に対して有害ではない証拠を提供し、ＸＩＡＰの阻害が、ＣＴＬ−媒介細胞溶解に関連するアポトーシスメカニズムに対する抵抗性を低下させることを示す。
【０２９２】
（実施例ＸＸＩＩ）
（腫瘍におけるポリフェニル尿素化合物によるカスパーゼのイン・ビボ活性化）
ポリフェニル尿素化合物がイン・ビボで腫瘍においてカスパーゼ活性化を誘導するかを測定するために、ＴＰＩ  １３９６−１２をヒト腫瘍異種移植片マウスモデルでテストした。これらの実験では、８週齢の腫瘍−担持Ｂａｌｂ／ｃマウスを３０ｍｇ／ｋｇのポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−１２または等容量の希釈剤（ＣＮＴＬ）で３連続日腹腔内注射した。その結果を図４０Ａに示す腫瘍組織の免疫ブロット分析は、化合物または対照の最終注射から２４時間後に、切断されたカスパーゼ−３またはアクチンに特異的な抗体を用いて行った。これらの結果は、ポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−１２がイン・ビボで腫瘍においてカスパーゼ活性化を誘導することを示す。
【０２９３】
図４０Ｂは、Ｈ＆Ｅ染色セクション（ＢおよびＣ）；抗カスパーゼ−３抗体および抗ＰＣＮＡ抗体（暗色染色核；ＤおよびＥ）、抗カスパーゼ−６抗体（暗色染色；ＦおよびＧ）および抗ＤＦＦ４０抗体（暗色染色；ＨおよびＩ）を用いる腫瘍組織セクションの免疫組織化学を示す。代理マーカーＰＣＮＡの検出によって示されるように、ポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−１２は腫瘍増殖に対して効果を有しなかった。これらの結果は、ポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−１２がイン・ビボにてアポトーシスメカニズムを通じて機能するというさらなる証拠を提供する。
【０２９４】
（実施例ＸＸＩＩＩ）
（ポリフェニル尿素化合物のイン・ビボ毒性学分析）
ポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−１２のイン・ビボ安定性および毒性学を評価するために、腫瘍−担持マウスを、異種移植片モデルを用いてイン・ビボで抗腫瘍活性を達成するのに適していると従前に判断された複数用量の化合物で処理し、毒性学的分析を行った。これらの実験においては、Ｂａｌｂ／ｃマウス（８週齢）を処理しないか、３０ｍｇ／ｋｇのポリフェニル尿素化合物ＴＪＰＩ  １３９６−１２で、または等容量の希釈剤（１０％  ＤＭＳＯ、５％  ＴＷＥＥＮ  ８０を含有するＰＢＳ）で３連続日腹腔内注射した。最終注射から１２時間後に、マウスを犠牲にし、血液を、白血球細胞カウント（ＷＢＣ）、赤血球細胞カウント（ＲＢＣ）、および血小板カウント（ＰＬＴ）について分析した。血清はＢＵＮ、ビリルビン、ＡＬＴおよびＡＳＴについてアッセイした。図４１に示されるこれらのデータは、３匹のマウスについての平均±標準偏差を表す。これらのデータは統計学的有意性に到達しないが、それらは傾向を示す。
【０２９５】
図４１に示される毒性学的データはポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−１２が投与された用量においてはトキシンではないことを示す。加えて、組織の組織学的分析はこれらの結果を確認した。
【０２９６】
これらおよび関連する実験は、ポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−１２がマウスにおいて２００から４００ｍｇ／ｋｇよりも大きな最大許容用量（非致死）を有し；抗腫瘍活性が、２連続日の３０ｍｇ／ｋｇ腹腔内用量と少ない容量で示され；およびポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １３９６−１２が、４８時間を超えてヒト血清で安定であると予測されることを示した。
【０２９７】
（実施例ＸＸＩＶ）
（ポリフェニル尿素化合物はＢＩＲ２に選択的に結合する）
ポリフェニル尿素化合物がＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインに結合する直接的な証拠を得るために、ＮＭＲ実験を行った。これらの実験において、ポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １５４０−１４およびＴＰＩ  １５４０−１５はＢＩＲ２に選択的に結合することが示された。
【０２９８】
Ｔ１ｒ測定は、１０μＭ  ＧＳＴ−ＢＩＲ２の存在および非存在下、４００μＭポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １５４０−１４、−１５、または−２０にて２００ｍｓで形成した。活性化合物ＴＰＩ  １５４０−１４およびＴＰＩ  １５４０−１５の結合は、化学量論量下のＧＳＴ−ＢＩＲ２の存在下におけるシグナル強度の減少によって発現された。不活性な化合物ＴＰＩ  １５４０−１４はこの効果を示さなかった。対照として、内部参照化合物を、（図４２において＊でマークされた）ＴＰＩ  １５４０−１５を含有する化合物に加えた。ＧＳＴに結合する化合物に対する対照として、ＴＰＩ  １５４０−１５もまた、負の結果を生じたＧＳＴ−Ｂｃｌ−Ｂに対してテストした。ＴＰＩ  １５４０−１４およびＴＰＩ  １５４０−２０についての結果を図４２に示す。ＴＰＩ  １５４０−１５についての結果は、ＴＰＩ  １５４０−１４で観察されたのに同様であった。
【０２９９】
まとめると、本実施例は、ポリフェニル尿素化合物ＴＰＩ  １５４０−１４およびＴＰＩ  １５４０−１５がＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインに対して直接的に結合する証拠を提供する。
【０３００】
（実施例ＸＸＶ）
（ＴＰＩ  １５４０化合物の構造活性関係（ＳＡＲ））
本実施例は、個々のＴＰＩ  １５４０化合物ＴＰＩ  １５４０−６からＴＰＩ  １５４０−２３についてのＳＡＲ情報を示す。図３５Ｂに示されるように、ＸＩＡＰ抑制解除カッセイまたはジャーカット−アネキシンＶアッセイで観察されたＩＣ５０値によって示されるように、ＴＰＩ  １５０９−７またはＴＰＩ  １３９６−３４に対する比較において活性を改変することなく多数の異なる修飾をなすことができる。
【０３０１】
これらのＳＡＲデータは、ＴＰＩ  １３９６−３４のような活性化合物の構造が、イン・ビトロおよび細胞ベースのアッセイ双方において標的蛋白質に対する完全な活性を保持しつつ単純化することができることを示す。加えて、これらのデータは、ポリフェニル尿素化合物がリピンスキー（Ｌｉｐｉｎｓｋｙ）則に関して最適化することができ、従って、選択されたポリフェニル尿素化合物の薬理学的特性を最適化することができることを示す。
【０３０２】
（実施例ＸＸＶＩ）
（ビオチニル化ペプチドへのＢＩＤおよびＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインの結合）
本実施例は、ＴＰＩ  ７９２、ＴＰＩ  １３３２およびＴＰＩ  １４９５シリーズのビオチニル化ペプチドに結合するＸＩＡＰ−ＢＩＲ２についての競合アッセイを記載する。ビオチニル化ペプチドとはＴＰＩ  １５５４シリーズをいい、図４４に示すように、ＴＰＩ  １５５４−１からＴＰＩ  １５５４−８を含む。また、図４４の表には、元のテトラペプチド（非ビオチン合成＃）に対応するＴＰＩ  数、および分子量（ＭＷ）である。
【０３０３】
結合アッセイを行って、ビオチニル化ペプチドがＸＩＡＰのＢＩＲドメインに結合したか否かを判断した。ビオチニル化ペプチドをノルトラビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）−被覆プレートに吸着させ、ＧＳＴ−ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２またはＧＳＴ−ＢＩＤ（対照）を加えた。結合したＧＳＴポリペプチドを抗ＧＳＴ抗体で検出した。図４５ＡからＪは、ビオチニル化化合物ＴＰＩ  １４５３−１（ＴＰＩ  １５５４−１）（Ａ）；ＴＰＩ  １４５３−６（ＴＰＩ  １５５４−２）（Ｂ）；ＴＰＩ１３３２−４（ＴＰＩ  １５５４−３）（Ｃ）；ＴＰＩ  １３３２−４１（ＴＰＩ  １５５４−４）（Ｄ）；ＴＰＩ  １３３２−６９（ＴＰＩ  １５５４−５）（Ｅ）；ＴＰＩ  １３３２−７７（ＴＰＩ  １５５４−６）（Ｆ）；ＴＰＩ  １４９５−１９（ＴＰＩ  １５５４−７）（Ｇ）、およびＴＰＩ  １４９５−２０（ＴＰＩ  １５５４−８）（Ｈ）が、ＳＭＡＣペプチドＳＭＡＣ  ７−量体（Ｉ）およびＳＭＡＣ  ４量体（Ｊ）の結合と匹敵する程度までＸＩＡＰ−ＢＩＲ２への結合について競合したことを示す。
【０３０４】
図４６ＡからＣは、１．６μｇ／ｍｌ、０．４μｇ／ｍｌおよび０．１μｇ／ｍｌの濃度のビオチニル化ペプチドと共に１μｇ／ｍｌ  ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２（Ａ）；０．５μｇ／ｍｌ  ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２（Ｂ）、および０．２５μｇ／ｍｌ  ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２（Ｃ）を用いる、ビオチニル化テトラペプチドＴＰＩ  １５５４−１からＴＰＩ  １５５４−８へのＸＩＡＰ−ＢＩＲ２の結合を示す。ＴＰＩ  １５５４−３からＴＰＩ  １５５４−８は、ＴＰＩ  １５５４−１および−２と比較したＸＩＡＰ  ＢＩＲ２への結合のより大きな程度を有した。これらの結果は、ＸＩＡＰ  ＢＩＲドメインの、ビオチニル化テトラペプチドＴＰＩ  １５５４−３からＴＰＩ  １５５４−８への結合が、ＳＭＡＣペプチドの結合に匹敵することを示す。
【０３０５】
図４７は、非ＳＭＡＣミミックであるビオチニル化ペプチドＴＰＩ  １５５４−４（ＴＰＩ  １３３２−６９）（Ａ）；およびＳＭＡＣミミックであるビオチニル化ペプチドＴＰＩ  １５５４−３（ＴＰＩ  １３３２−４）（Ｂ）を用いる、ポリフェニル尿素化合物の存在および非存在下における、ビオチニル化テトラペプチドへのＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインの結合についての競合アッセイを示す。これらの実験からの結果は、ポリフェニル尿素が、テトラペプチドのいずれかと、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２ドメインの結合について競合しないことを示す。しかしながら、ＳＭＡＣミミックテトラペプチドＴＰＩ  １５５４−３が、ビオチニル化非ＳＭＡＣミミックテトラペプチドＴＰＩ  １５５４−５へのＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインの結合で競合する。ＴＰＩ  １５５４−３でのこの観察は、ＴＰＩ  １３３２−６９が、ＳＭＡＣおよびＢＩＲ２結合部位の間で重複するＸＩＡＰ上の部位に結合する実施例ＸＶＩＩＩにて記載した知見と合致する。
【０３０６】
（実施例ＸＸＶＩＩ）
（ローダミン−標識結合／競合結合アッセイ）
本実施例は、ＩＡＰについてのＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤、またはその機能的断片の結合親和性を測定するのに有用なアッセイを記載する。
【０３０７】
Ａ．結合アッセイ
偏光−ベースの結合アッセイを用いて、ＩＡＰ阻害カスパーゼのローダミン標識候補抑制解除剤（候補化合物）およびＸＩＡＰ断片Ｈｉｓ−ＢＩＲ２、Ｈｉｓ−ＢＩＲ１−２およびＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３の間の結合を検出した。該アッセイは、標的蛋白質への結合によるローダミン−標識候補化合物の偏光の増加として検出される、ＸＩＡＰまたはその機能的断片と会合した場合にローダミン標識候補化合物につき起こる移動性の減少に基づいている。
【０３０８】
第一のアッセイにおいて、ＩＡＰ阻害カスパーゼの候補抑制解除剤の結合は、蛍光偏光手法によって測定した。固定された量のローダミン−標識候補化合物を、種々の量のＩＡＰ断片化合物（ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２、Ｈｉｓ−Ｔｒａｆ２（陰性蛋白質対照）、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２、またはＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３）に対して滴定した。ＩＡＰ断片への抗化合物の結合は、候補化合物単独と比較した偏光の増加（ミリポラーまたはｍＰ）として検出される。というのは、結合したフルオロフォアは未結合フルオロフォアよりも大きな偏光効果を有するからである。ｍＰ−ｖｓ−ＩＡＰ断片のｌｏｇ濃度のプロットを用いて、ＩＡＰ断片についての候補化合物での結合定数を計算することができる。
【０３０９】
このアッセイの結果は、図４８、５０および５２に記載される。簡単に述べれば、マイクロモラー量の標識された候補化合物を、標準マイクロタイタープレートにおいて、種々の量のＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２、ＮＡＰのＢＩＲ１、およびＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２の存在下において緩衝化溶液中で調製した。（条件については表ＸＩＩ参照）。Ｈｉｓ−Ｔｒａｆ２は特異性について陰性対照として供した。ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２で観察されたのと同様な結果が、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３で観察された。プレートを室温にて１時間インキュベートし、その後、ローダミンの偏光を、５３０ｎｍにおける励起および５８０ｎｍにおける発光にてＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＨＴ（登録商標）マルチモードリーダーで読んだ。図４８、５０および５２は、マイクロポラー−ｖｓ−ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２、Ｈｉｓ−Ｔｒａｆ２、またはＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２のｌｏｇ濃度の関数としてプロットされた偏光値（ミリポラー、ｍＰ）を示す。Ｈｉｓ−Ｔｒａｆ２は陰性対照としてプロットした。ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２で観察されたのと同様な結果が、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３で見られる。
【０３１０】
ＴＰＩ  １３３２−４の構造を図３６Ａに示す。ＴＰＩ  １５４０−１４の構造を図３５Ａに記載する。
【０３１１】
【化２３】
2008537735.tif 000025
ＴＰＩ  １３３２−４の構造を図３６Ａに示す。ローダミン−標識ＴＰＩ  １３３２−４（ＴＰＩ  １５６６−１１）の構造を以下に示す。
【０３１２】
【化２４】
2008537735.tif 000026
ＴＰＩ  １５４０−１４の構造を図３５Ａに記載する。ローダミン−標識ＴＰＩ  １５４０−１４（ＴＰＩ  １５７６−３７ｐｋ１およびＴＰＩ  １５７６−３７ｐｋ２）の２つの種の構造を以下に示す。
【０３１３】
【化２５】
2008537735.tif 000027
Ｂ．競合結合アッセイ
第二のアッセイにおいて、ＩＡＰ阻害カスパーゼの候補抑制解除剤の競合結合は、蛍光偏光手法によって測定した。固定された量のローダミン−標識候補化合物およびＩＡＰ断片を、変化させる量の公知のＩＡＰ−結合化合物に対して滴定した。公知のＩＡＰ−結合化合物による候補化合物の置き換えは、偏光の減少として検出された。というのは、置き換えられた（未結合）候補化合物は、結合した候補化合物よりも低い偏光を有するだろうからである。偏光（ミリポラーまたはｍＰ）を、公知のＩＡＰ−結合化合物のｌｏｇ濃度（ｌｏｇ［  ］）に対してプロットした。次いで、ｍＰ−ｖｓ−ＩＡＰ−結合化合物のｌｏｇ濃度のプロットを用いて、候補化合物−ＩＡＰ断片対についての結合定数を計算した。
【０３１４】
このアッセイの結果を図４９、５１および５３に記載する。簡単に述べれば、マイクロモラー量の標識された候補化合物およびＩＡＰ断片を、標準９６−ウェルマイクロタイタープレートにおいて、種々の量のＩＡＰ−結合化合物ＴＰＩ−１３９６−１１の存在下で緩衝化溶液中で調製した。（条件については表ＸＩＩＩ参照）。プレートを室温にて１時間インキュベートし、その後、ローダミンの偏光を、５３０ｎｍの励起および５８０ｎｍの発光にてＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＨＴ（登録商標）マルチモードリーダーで読んだ。図４９、５１および５３はμｇ／ｍｌで表したＴＰＩ  １３９６−１１のｌｏｇ濃度の関数としてプロットした偏光値（ミリポラー、ｍＰ）を示す。図４９および５３は、標識された候補化合物のＩＣ５０も示す（ＴＰＩ  １３３２−４については１０μＭ、ＴＰＩ  １５４０−１４については３６μＭ）。
【０３１５】
【化２６】
2008537735.tif 000028
（実施例ＸＸＶＩＩＩ
（個々のＴＰＩ  １５７７、ＴＰＩ  １５６７およびＴＰＩ  １５７２の構造活性関係（ＳＡＲ））
本実施例は、ＴＰＩ  １５４０−１４に全て基づく、ＴＰＩ  １５７７、ＴＰＩ  １５６７およびＴＰＩ  １５７２に基づく構造およびＳＡＲ情報を示す。ＴＰＩ  １５７７、ＴＰＩ  １５６７およびＴＰＩ  １５７２ファミリーに属する個々の化合物の活性スクリーニングによって示されるように、多数の異なる疎水性基がＲ１、Ｒ３、Ｎ”位置における活性で許容できる（表ＸＩＶ参照）。
【０３１６】
【化２７】
2008537735.tif 000029
【０３１７】
【化２８】
2008537735.tif 000030
【０３１８】
【化２９】
2008537735.tif 000031
【０３１９】
【化３０】
2008537735.tif 000032
【０３２０】
【化３１】
2008537735.tif 000033
【０３２１】
【化３２】
2008537735.tif 000034
【０３２２】
【化３３】
2008537735.tif 000035
【０３２３】
【化３４】
2008537735.tif 000036
【０３２４】
【化３５】
2008537735.tif 000037
【０３２５】
【化３６】
2008537735.tif 000038
【０３２６】
実施例ＸＩの手法に従い、ＴＰＩ  １５４０−１４、ＴＰＩ  １５６７−１１、ＴＰＩ  １５６７−１２、ＴＰＩ  １５６７−１３、ＴＰＩ  １５６７−１４、ＴＰＩ  １５７７−９およびＴＰＩ  １５０９−７を、ジャーカット細胞においてアポトーシスを誘導するそれらの能力についてテストした。これらのテストの結果を図５４に示す。ＤＭＳＯ対照と比較して、テストされた化合物の各々は、マイクロモラー濃度においてテストした細胞系でアポトーシスを誘導できることが判明した。
【０３２７】
（実施例ＸＸＩＸ）
（シンチレーション近接アッセイ）
本実施例は、シンチレーション近接アッセイを記載する。この方法は、シンチレーション近接アッセイ（ＳＰＡ）において、トリチウムのような放射性方式で修飾されたＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤を用いる。均一アッセイにおいて、銅キレート（Ｈｉｓ―タグ）ＹＳｉＳＰＡＴＭシンチレーションビーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）をＨｉｓ−ＢＩＲ２、ＢＩＲ１−２またはＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３および放射性標識化合物と混合する。次いで、未標識競合化合物（候補化合物）を、回転させた９６ウェルプレート中にて種々の濃度で加え、ビーズ、付着されたＨｉｓ−蛋白質および結合放射性標識をペレット化する。次いで、プレートをシンチレーションカウンターで読む。結合した放射性標識の低下は、未標識候補化合物による競合を反映する。競合的に１以上の標識抑制解除剤を置き換える候補化合物を、リガンド、およびＩＡＰ阻害カスパーゼの潜在的抑制解除剤として同定する。Ａｌｄｅｒｔｏｎ，Ｗ．Ｋ．およびＰ．Ｎ．Ｌｏｗｅ，１９９９，Ｓｃｉｎｔｉｌｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  Ａｓｓａｙ  ｔｏ  Ｍｅａｓｕｒｅ  Ｎｉｔｒｏａｒｇｉｎｅ  ａｎｄ  Ｔｅｔｒａｈｙｄｒｂｉｏｐｅｒｉｎ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  Ｈｅｍｅ  Ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｎｉｔｒｉｃ  Ｏｘｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈａｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，３０１：１１４−１２５参照。
【０３２８】
（実施例ＸＸＸ）
（シンチレーション近接アッセイ）
本アッセイは、ＱｉａｇｅｎからのＮｉ−ＮＴＡ  Ｈｉ  Ｓｏｒｂ  ＰｌａｔｅｓＴＭを利用して、ＩＡＰ阻害カスパーゼの抑制解除剤である候補化合物を同定する。これは、何回かの洗浄工程を伴う不均一アッセイである。Ｈｉｓ−ＢＩＲ２、Ｈｉｓ−ＢＩＲ１−２またはＨｉｓ−ＢＩＲ１−２−３の１以上がプレートに結合する。種々の濃度の競合する未標識化合物（候補化合物）の存在下で、ビオチン−標識化合物、フルオロフォア標識化合物または放射性標識化合物を蛋白質に結合する。少なくとも１回の洗浄工程の後、結合した標識化合物を測定する。例えば、標識された化合物をビオチニル化する場合、読み出しは（共にＡｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａから入手可能）アルカリ性またはホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲーテッドストレプトアビジンを介するものであり、これは、眼に見える範囲の吸収を生じ、これは分光光度計で測定することができる。標識された化合物を放射性標識する場合、放射能の読み出しはシンチレーションカウンターで得られる。標識された化合物が蛍光標識されている場合、蛍光読み出しは蛍光分光光度計で得られる。競合する未標識化合物（候補化合物）の存在下での読み出しの増加は、未標識化合物による競合を反映する。競合的に標識された化合物を置き換えた候補化合物は、リガンドとして、およびＩＡＰ阻害カスパーゼの潜在的抑制解除剤として同定される。
【０３２９】
本出願を通じて、種々の刊行物が引用された。これらの刊行物のその全体の開示はここに引用して本出願に一体化させて、本発明が関する技術水準をより十分に記載する。
【０３３０】
本発明を先に提供した実施例を参照して記載してきたが、本発明の精神を逸脱することなく種々の修飾をなすことができるのは理解されるべきである。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０３３１】
【図１】図１は、ヘキサペプチドの混合物から構成されるＴＰＩ  １３２８ライブラリーの各種の存在下または非存在下におけるアセチル−ＤＥＶＤ−７−アミノ−４−トリフルオロメチル−クマリン（Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣ）の加水分解についてのＶｍａｘの比率で得られた値のプロットを示す（ここで、ＶｍａｘはＲＦＵ／分と等しい）。
【図２−１】図２は、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーの個々のテトラペプチド、および各ペプチド種の存在下および非存在下におけるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についての比率をリストする表を示す。該比率＝（ペプチド、カスパーゼ３およびＸＩＡＰが存在する場合のＶｍａｘ）／（カスパーゼ３およびＸＩＡＰが存在する場合のＶｍａｘ）。
【図２−２】図２は、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーの個々のテトラペプチド、および各ペプチド種の存在下および非存在下におけるＡｃ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についての比率をリストする表を示す。該比率＝（ペプチド、カスパーゼ３およびＸＩＡＰが存在する場合のＶｍａｘ）／（カスパーゼ３およびＸＩＡＰが存在する場合のＶｍａｘ）
【図３Ａ】図３Ａ−３Ｉは、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種についての構造を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ−３Ｉは、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種についての構造を示す。
【図３Ｃ】図３Ａ−３Ｉは、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種についての構造を示す。
【図３Ｄ】図３Ａ−３Ｉは、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種についての構造を示す。
【図３Ｅ】図３Ａ−３Ｉは、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種についての構造を示す。
【図３Ｆ】図３Ａ−３Ｉは、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種についての構造を示す。
【図３Ｇ】図３Ａ−３Ｉは、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種についての構造を示す。
【図３Ｈ】図３Ａ−３Ｉは、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種についての構造を示す。
【図３Ｉ】図３Ａ−３Ｉは、ＴＰＩ  １３１３ライブラリーにおけるテトラペプチドの個々の種についての構造を示す。
【図４】図４は、ＴＰＩ９１４Ｎ−アシルトリアミン位置走査コンビナトーリアルライブラリーにおいてＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制阻害剤であることが判明している混合物におけるはっきりとした機能の構造を示す。各ボックス下方にリストする化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。
【図５】図５は、ＴＰＩ９１４Ｎ−アシルトリアミンライブラリーにおけるＸＩＡＰ抑制解除剤であることが判明している個々の化合物についての構造を示す。各表エントリーにおいてリストされた化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。
【図６Ａ】図６Ａ−６Ｄは、ＴＰＩ９２７ポリフェニル尿素位置走査コンビナトーリアルライブラリーにおけるＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している混合物におけるはっきりとした機能の構造を示す。各ボックス中の化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。分子のコア構造が修飾された構造２５、７３、８６および８８については、得られた修飾されたコア構造およびＲ基が示される。
【図６Ｂ】図６Ａ−６Ｄは、ＴＰＩ９２７ポリフェニル尿素位置走査コンビナトーリアルライブラリーにおけるＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している混合物におけるはっきりとした機能の構造を示す。各ボックス中の化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。分子のコア構造が修飾された構造２５、７３、８６および８８については、得られた修飾されたコア構造およびＲ基が示される。
【図６Ｃ】図６Ａ−６Ｄは、ＴＰＩ９２７ポリフェニル尿素位置走査コンビナトーリアルライブラリーにおけるＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している混合物におけるはっきりとした機能の構造を示す。各ボックス中の化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。分子のコア構造が修飾された構造２５、７３、８６および８８については、得られた修飾されたコア構造およびＲ基が示される。
【図６Ｄ】図６Ａ−６Ｄは、ＴＰＩ９２７ポリフェニル尿素位置走査コンビナトーリアルライブラリーにおけるＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している混合物におけるはっきりとした機能の構造を示す。各ボックス中の化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。分子のコア構造が修飾された構造２５、７３、８６および８８については、得られた修飾されたコア構造およびＲ基が示される。
【図７】図７は、ＴＰＩ８８２  Ｃ−６−アシルアミノ二環グアニジンライブラリーにおけるＸＩＡＰ−誘導カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している混合物におけるはっきりとした機能の構造を示す。各ボックス中の化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。
【図８】図８は、ＴＰＩ７５９  Ｎ−ベンジル−１，４，５−トリ置換−２，３−ジケトピペラジン位置走査コンビナトーリアルライブラリーにおいてＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している混合物におけるはっきりとした機能の構造を示す。各ボックス下方にリストした化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。
【図９Ａ】図９Ａ−９Ｃは、ＴＰＩ９２７ポリフェニル尿素ライブラリーにおけるＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している個々の化合物についての構造を示す。各ボックス中の化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。
【図９Ｂ】図９Ａ−９Ｃは、ＴＰＩ９２７ポリフェニル尿素ライブラリーにおけるＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している個々の化合物についての構造を示す。各ボックス中の化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。
【図９Ｃ】図９Ａ−９Ｃは、ＴＰＩ９２７ポリフェニル尿素ライブラリーにおけるＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している個々の化合物についての構造を示す。各ボックス中の化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。
【図１０−１】図１０は、ＴＰＩ８８２  Ｃ−６−アシルアミノ二環グアニジンライブラリーにおいてＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している個々の化合物についての構造を示す。各ボックス中の化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。
【図１０−２】図１０は、ＴＰＩ８８２  Ｃ−６−アシルアミノ二環グアニジンライブラリーにおいてＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤であることが判明している個々の化合物についての構造を示す。各ボックス中の化学名称は、Ｒ基が由来する試薬である。各官能基は、それが由来する試薬と同一の立体化学を有する。
【図１１Ａ】図１１Ａ−１１Ｃは、ＴＰＩ  １２３９ライブラリーからのＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定された混合物の用量応答を示す。値は、各混合物の存在下および非存在下におけるＡＣ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についてのＶｍａｘの比率についてである。ＴＰＩ  １２３９混合物は各列の頂部にリストされた用量で存在した。
【図１１Ｂ】図１１Ａ−１１Ｃは、ＴＰＩ  １２３９ライブラリーからのＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定された混合物の用量応答を示す。値は、各混合物の存在下および非存在下におけるＡＣ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についてのＶｍａｘの比率についてである。ＴＰＩ  １２３９混合物は各列の頂部にリストされた用量で存在した。
【図１１Ｃ】図１１Ａ−１１Ｃは、ＴＰＩ  １２３９ライブラリーからのＸＩＡＰ−阻害カスパーゼの抑制解除剤として同定された混合物の用量応答を示す。値は、各混合物の存在下および非存在下におけるＡＣ−ＤＥＶＤ−ＡＦＣの加水分解についてのＶｍａｘの比率についてである。ＴＰＩ  １２３９混合物は各列の頂部にリストされた用量で存在した。
【図１２】図１２は、Ｌ−３−（２−チエニル）−アラニル−Ｌ−（２−ナフチル）−アラニル−Ｌ−ｐ−クロロ−フェニルアラニル−Ｌ−（ｅ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−リシン（ＴＰＩ７９２−３３；コアペプチド１６）およびＬ−３−（２−チエニル）−アラニル，Ｌ−（２−ナフチル）−アラニル−Ｄ−（ｅ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−リシル−Ｌ−（ｅ−フルオレニルメチルオキシカルボニル）−リシン（ＴＰＩ７９２−３５；コアペプチド１７）の構造を示す。
【図１３】図１３は、前立腺癌細胞生存率に対するＶＰ−１６（エトポシド）、ＴＰＩ７９２−３５、ＴＰＩ７９２−３３およびＳＭＡＣ  ＡＶＰＩテトラペプチド（配列番号：４）の効果を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａから１４Ｂは、ＴＰＩ  １３９６ライブラリーにおけるフェニル尿素化合物、およびＴＰＩ  １３９１ライブラリーにおけるジケトピペラジン化合物についての一般化された構造（パネルＡおよび化合物ＴＰＩ  １３９１−２８、ＴＰＩ  １３９１−２１、ＴＰＩ  １３９６−３４、ＴＰＩ  １３９６−２２、ＴＰＩ  １３９６−１１、ＴＰＩ  １３９６−１２についての構造（パネルＢ）を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａから１４Ｂは、ＴＰＩ  １３９６ライブラリーにおけるフェニル尿素化合物、およびＴＰＩ  １３９１ライブラリーにおけるジケトピペラジン化合物についての一般化された構造（パネルＡおよび化合物ＴＰＩ  １３９１−２８、ＴＰＩ  １３９１−２１、ＴＰＩ  １３９６−３４、ＴＰＩ  １３９６−２２、ＴＰＩ  １３９６−１１、ＴＰＩ  １３９６−１２についての構造（パネルＢ）を示す。
【図１５】図１５は、ＴＰＩ  １３９１−２８およびＴＰＩ  １３９６−３４によるジャーカット白血病細胞の濃度−依存性殺傷を示す。
【図１６】図１６は、各々、同様なコアファルマコフォアを有するが、異なるＲ基を有する対照化合物と比較した、ＴＰＩ  １３９１−２８およびＴＰＩ  １３９６−３４によるジャーカット白血病細胞の殺傷を示す。
【図１７】図１７は、正常な骨髄細胞−ｖｓ−ジャーカット白血病細胞に対するＴＰＩ  １３９６−３４およびＴＰＩ  １３９１−２８の効果の比較を示す。
【図１８】図１８は、ＴＰＩ  １３９６−３４のアポトーシス発生活性に対する野生型ＸＩＡＰの過剰発現の効果を示す。
【図１９】図１９は、ＴＰＩ  １３９６−３４のアポトーシス発生活性に対する野生型ＸＩＡＰの過剰発現の効果を示す。
【図２０】図２０Ａ−２０Ｂは、ＴＰＩ  ７９２−３、ＴＰＩ７９２−９、ＴＰＩ７９２−１５、ＴＰＩ７９２−１７、ＴＰＩ７９２−１９、ＴＰＩ７９２−２２、ＴＰＩ７９２−２７、ＴＰＩ７９２−３３およびＴＰＩ７９２−３５についての構造を示す。
【図２１−１】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−２】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−３】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−４】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−５】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−６】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−７】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−８】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−９】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−１０】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−１１】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−１２】図２１Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４についての構造を示す。
【図２１−１３】図２１Ｂは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３４９−１からＴＰＩ  １３４９−３４の活性を示す。
【図２１−１４】図２１Ｃは、全長ＸＩＡＰおよびＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメイン双方を用いるＴＰＩ  １３４９−１、−３、−８、−１３、−２３、および−２８の活性を示す。
【図２１−１５】図２１Ｄは、ｃＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いるＴＰＩ  １３４９−１、−３、−８、−１３、−２３および−２８の活性を示す。
【図２２−１】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−２】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−３】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−４】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−５】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−６】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−７】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−８】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−９】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−１０】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−１１】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−１２】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−１３】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−１４】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−１５】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−１６】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−１７】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−１８】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−１９】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−２０】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−２１】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−２２】図２２Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−６５の構造を示す。
【図２２−２３】図２２Ｂは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３９６−１からＴＰＩ  １３９６−３６の活性を示す。
【図２２−２４】図２２Ｃは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３９６−３７からＴＰＩ  １３９６−６５の活性を示す。
【図２２−２５】図２２Ｄは、全長ＸＩＡＰおよびＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３９６−１１、−１２、−２２、−２８、および−３４の活性を示す表を示す。
【図２２−２６】図２２Ｅは、ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いる５０μｇ／ｍｌでのＴＰＩ  １３９６−１１、−１２、−２２、−２８およびー３４の活性を示す。
【図２２−２７】図２２Ｆは、全長ＸＩＡＰおよびカスパーゼ３または７を用いる１００μｇ／ｍｌでのＴＰＩ  １３９６−１１、−１２、−２２、−２８および−３４の活性を示す。
【図２２−２８】図２２Ｇは、ｃＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いる１００μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １３９６−１１、−１２、−２２、−２８および−３４の活性を示す。
【図２３−１】図２３Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の構造を示す。
【図２３−２】図２３Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の構造を示す。
【図２３−３】図２３Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の構造を示す。
【図２３−４】図２３Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の構造を示す。
【図２３−５】図２３Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の構造を示す。
【図２３−６】図２３Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の構造を示す。
【図２３−７】図２３Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の構造を示す。
【図２３−８】図２３Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の構造を示す。
【図２３−９】図２３Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の構造を示す。
【図２３−１０】図２３Ｂは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおける１００μｇ／ｍｌでのＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の活性を示す。
【図２３−１１】図２３Ｃは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイでの２５μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １３９１−１からＴＰＩ  １３９１−３６の活性を示す。
【図２３−１２】図２３Ｄは、全長ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２を用いる抑制解除アッセイでのＴＰＩ  １３９１−１、−４、−５、−７、−１７、−２１、−２５、−２８、−３４および−３５の活性を示す表を示す。
【図２３−１３】図２３Ｅは、全長ＸＩＡＰまたはＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３９１−１、−４、−５、−７、−１７、−２１、−２５、−２８、−３４およびー３５の活性の比較を示す。
【図２３−１４】図２３Ｆは、ｃＩＡＰ、ＢＩＲ２ドメインを用いるＴＰＩ  １３９１−１、−４、−５、−７、−１７、−２１、−２５、−２８、−３４およびー３５の活性を示す。
【図２４−１】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−２】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−３】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−４】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−５】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−６】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−７】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−８】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−９】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−１０】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−１１】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−１２】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−１３】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−１４】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−１５】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−１６】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−１７】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−１８】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−１９】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−２０】図２４Ａは、ＳＭＡＣ競合アッセイにおいて１．８またはそれよりも高い比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共にＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−５８の構造を示す。
【図２４−２１】図２４Ｂは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイでの２５μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−２８の活性を示す。
【図２４−２２】図２４Ｃは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイでの１０μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １４００−１からＴＰＩ  １４００−２８の活性を示す。
【図２４−２３】図２４Ｄは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイでの２５μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １４００−２９ＴＰＩ  １４００−５８の活性を示す。
【図２４−２４】図２４Ｅは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイでの１０μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １４００−２９からＴＰＩ  １４００−５８の活性を示す。
【図２４−２５】図２４Ｆは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １４００−６、−７、１３、−１４、−３３、−３７、−４３、−４４の活性を示す表を示す。
【図２４−２６】図２４Ｇは、全長ＸＩＡＰまたはＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いる抑制解除アッセイでの２５μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １４００−６、−７、１３、−１４、−３３、−３７、−４３、−４４の活性の比較を示す。
【図２４−２７】図２４Ｈは、ｃＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いるＴＰＩ  １４００−６、−７、１３、−１４、−３３、−３７、−４３、−４４の活性を示す。
【図２５】図２５ａおよびｂは、カスパーゼ−３のＸＩＡＰ−媒介抑制を克服する化合物を同定するためのカスパーゼ抑制解除アッセイにおける小分子ポリ−フェニル尿素化合物のスクリーニングを示す。図２５ａは、ポリ−フェニル尿素ライブラリー混合物からのアリコットを用いる結果を示し、図２５ｂは、ポリ−フェニル尿素ライブラリーのデコンボリューションに基づく３６の個々の化合物についての結果を示す。
【図２６】図２６ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆは、ポリ−フェニル尿素化合物の生化学メカニズムの特徴を示す。図２６ａ、ｂ、ｃ、およびｄは、ＸＩＡＰおよびカスパーゼ−３（ａ）、ＸＩＡＰおよびカスパーゼ−９（ｂ）、ＢＩＲ−２およびカスパーゼ−３（ｃ）およびｐ３５およびカスパーゼ−３（ｄ）と共にポリ−フェニル尿素化合物を用いるカスパーゼ抑制解除アッセイの結果を示す。図２６ｅは、ビオチニル化ＳＭＡＣ（７−量体）をニュートラビジン−被覆プレートに吸着させ、次いで、ＧＳＴ−ＸＩＡＰを化合物と共にまたそれなしで加えた結合アッセイを示す。結合したＧＳＴ−ＸＩＡＰは、抗ＧＳＴ抗体で検出した。図２６ｆは、ＧＳＴ−ＸＩＡＰをプレートに吸着させ、次いで、化合物と共にまたはそれなくしてビオチニル化−ＳＭＡＣ（７−量体）と共にインキュベートした結合アッセイを示す。結合したビオチニル化−ＳＭＡＣペプチドは、ストレプトアビジン−ニューロピウム−ベースの蛍光方法によって検出した。
【図２７】図２７ａ、ｂ、ｃ、ｄ、ｅ、およびｆは、ポリ−フェニル尿素化合物の細胞活性に特徴付けを示す。図２７ａおよびｂは、種々のポリ−フェニル尿素化合物（ａ）またはＴＰＩ  １３９６−３４（ｂ）と共にジャーカット白血病細胞をインキュベーションした後における細胞死を示す。図２７ｃは、種々の化合物と共にジャーカット白血病細胞をインキュベーションした後におけるカスパーゼ３／７活性を示す。図２７ｄは、ｚＶＡＤ−ｆｉｎｋを含むまたは含まない種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４で培養したジャーカット細胞における細胞死を示す。図２７ｅは、ＴＰＩ  １３９６−３４と共に、ＸＩＡＰまたはネオマイシンを安定に過剰発現するＵ９３７のインキュベーション後における細胞死を示す。インセットは、Ｕ９３７細胞から調製した溶解物の免疫ブロット分析を示す。図２７ｆは、ＸＩＡＰ、Ｂｃｌ−ＸＬまたはＣｒｍＡでトランスフェクトし、ＴＰＩ  １３９６−３４と共にインキュベートしたＨｅＬａ細胞の細胞死を示す。図２７ｇは、対照、およびＴＰＩ  １３９６−３４で処理されたＳＶ４０−トランスフェクト細胞の生存率を示す。
【図２８】図２８ａ、ｂ、ｃおよびｄは、ＴＰＩ  １３９６−３４の広い抗腫瘍活性を示す。図２８ａは、溶媒単独で処理された細胞と比較した、ＴＰＩ  １３９６−３４またはＴＰＩ  １３９６−２８で培養した６０のヒト腫瘍細胞系の細胞成長の結果を示す。各系は腫瘍細胞系を表す。図２８ｂは、通常−ｖｓ−悪性細胞に対するＴＰＩ  １３９６−３４の効果を示す。図２８ｃは、種々のポリ−フェニル尿素化合物で培養した５人の患者からのＣＬＬＢ−細胞の平均（＋／−標準偏差）％アポトーシスを示す。図２８ｄは、５人の患者から単離され、種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４で培養されたＡＭＬ細胞の細胞死を示す。全ての試料は活性なＴＰＩ  １３９６−３４および不活性なＴＰＩ  １３９６−２８ならびにＡＶＰＩペプチドで処理したが、完全なデータ組はＡＭＬ−１についてのみ示される。匹敵する結果が他の試料で得られた。
【図２９】図２９は、溶媒希釈剤単独で培養された細胞と比較した、細胞培養についてのＮＣＩ−６０細胞パネルからの６０の腫瘍細胞系に対するＴＰＩ  １３９６−１２、ＴＰＩ  １３９６−２２、ＴＰＩ  １３９６−１１の効果を示す。
【図３０】図３０ａおよびｂは、ＴＰＩ  １３９６−３４が癌細胞を化学療法およびＴＲＡＩＬに対して感受性とすることを示す。図３０ａは、ＴＰＩ  １３９６−３４を含むまたは含まない、エトポシド（ＶＰ１６）、ドキソルビシン（ＤＯＸ）またはパクリタキセル（Ｔａｘ）で培養されたＤＵ１４５前立腺癌細胞の生存率を示す。図３０ｂは、単独で、またはＴＰＩ  １３９６−３４と組み合わせた種々の濃度のＴＲＡＩＬで処理された癌細胞系の生存率を示す。
【図３１Ａ】図３１ａ、ｂ、ｃおよびｄは、種々の腫瘍細胞系に対する、慣用的な化学療法剤とＴＰＩ  １３９６−３４との組合せの効果を示す。種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４および種々の濃度の化学療法薬物で培養されたＤＵ１４５（ａ）、ＰＰＣ１（ｂ）、ＰＣ３（ｃ）、およびＨ４６０（ｄ）細胞の生存率を示す。
【図３１Ｂ】図３１ａ、ｂ、ｃおよびｄは、種々の腫瘍細胞系に対する、慣用的な化学療法剤とＴＰＩ  １３９６−３４との組合せの効果を示す。種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４および種々の濃度の化学療法薬物で培養されたＤＵ１４５（ａ）、ＰＰＣ１（ｂ）、ＰＣ３（ｃ）、およびＨ４６０（ｄ）細胞の生存率を示す。
【図３１Ｃ】図３１ａ、ｂ、ｃおよびｄは、種々の腫瘍細胞系に対する、慣用的な化学療法剤とＴＰＩ  １３９６−３４との組合せの効果を示す。種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４および種々の濃度の化学療法薬物で培養されたＤＵ１４５（ａ）、ＰＰＣ１（ｂ）、ＰＣ３（ｃ）、およびＨ４６０（ｄ）細胞の生存率を示す。
【図３１Ｄ】図３１ａ、ｂ、ｃおよびｄは、種々の腫瘍細胞系に対する、慣用的な化学療法剤とＴＰＩ  １３９６−３４との組合せの効果を示す。種々の濃度のＴＰＩ  １３９６−３４および種々の濃度の化学療法薬物で培養されたＤＵ１４５（ａ）、ＰＰＣ１（ｂ）、ＰＣ３（ｃ）、およびＨ４６０（ｄ）細胞の生存率を示す。
【図３２】図３２ａ、ｂおよびｃは、クローン原性生存アッセイおよび腫瘍異種移植片実験におけるＴＰＩ  １３９６−３４の抗腫瘍活性を示す。図３２ａは、ＴＰＩ  １３９６−３４で培養された２つの前立腺癌細胞系、ＰＣ−３およびＬＮＣａＰのコロニー数を示す。対照化合物は棒線によって表され、１０μＭ用量結果のみを示す。図３２ｂは、ＴＰＩ  １３９６−３４での処理後におけるＰＰＣ１前立腺癌細胞を注射したＢａｌｂ／Ｃ  ｎｕ―／ｎｕ―マウスにおける腫瘍サイズを示す。インセットは、化合物注射から２４日後に犠牲にしたマウスにおける腫瘍重量を示す。図３２ｃは、ＨＣＴ１１６結腸癌細胞を注射したＢａｌｂ／Ｃ  ｎｕ―／ｎｕ―マウスにおける腫瘍容量および腫瘍重量を示す。６、７および８日において、マウスをＴＰＩ  １３９６−３４（Ｉ）または溶媒対照（Ｃ）で処理し、腫瘍容量を測定した。１９日に、マウスを犠牲にし、腫瘍の重量を測定した。棒線は中央値腫瘍サイズまたは重量を表す。
【図３３】図３３ａおよびｂは、腫瘍異種移植片モデルにおけるポリ−フェニル尿素化合物の抗腫瘍活性を示す。図３３ａは、ＴＰＩ  １３９６−２２、ＴＰＩ  １３９６−３４または溶媒対照で処理されたＰＰＣ−１前立腺癌細胞を注射したＢａｌｂ／Ｃ  ｎｕ―／ｎｕ―マウスの腫瘍容量を示す。図３３ｂは、１９日に犠牲にしたマウスの腫瘍重量を示す。棒線は中央値腫瘍サイズまたは重量を示す。
【図３４−１】図３４は、１．８の比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共に因子ＴＰＩ  １５０９−１からＴＰＩ  １５０９−９の構造を示す。
【図３４−２】図３４は、１．８の比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共に因子ＴＰＩ  １５０９−１からＴＰＩ  １５０９−９の構造を示す。
【図３４−３】図３４は、１．８の比率を有する各因子の各分子量、質量および最低濃度と共に因子ＴＰＩ  １５０９−１からＴＰＩ  １５０９−９の構造を示す。
【図３５−１】図３５Ａは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−２】図３５Ａは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−３】図３５Ａは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−４】図３５Ａは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−５】図３５Ａは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−６】図３５Ａは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−７】図３５Ａは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−８】図３５Ｂは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−９】図３５Ｂは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−１０】図３５Ｂは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−１１】図３５Ｂは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−１２】図３５Ｂは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−１３】図３５Ｂは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−１４】図３５Ｂは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３５−１５】図３５Ｂは、ポリ−フェニル尿素化合物についてのＳＡＲ実験の例としてのＴＰＩ  １５０９−７に基づくＲ基の化合物修飾を示す。
【図３６−１】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−２】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−３】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−４】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−５】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−６】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−７】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−８】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−９】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−１０】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−１１】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−１２】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−１３】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−１４】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−１５】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−１６】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−１７】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−１８】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−１９】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−２０】図３６Ａは、各分子量と共にＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の構造を示す。
【図３６−２１】図３６Ｂは、ＳＭＡＣペプチドへのＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメイン結合と競合するにおける、化合物の各分子量および活性と共に、ＴＰＩ  １３３２−４、ＴＰＩ  １３３２−２４、ＴＰＩ  １３３２−４１、ＴＰＩ  １３３２−６９、ＴＰＩ  １３３２−７６、およびＴＰＩ  １３３２−７７を含めた選択されたＴＰＩ  １３３２化合物の構造を示す。
【図３６−２２】図３６Ｃは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイでの５０  μｇ／ｍｌにおける１３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の活性を示す。
【図３６−２３】図３６Ｄは、全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイでの１６．７  μｇ／ｍｌにおけるＴＰＩ  １３３２−１からＴＰＩ  １３３２−９３の活性を示す。
【図３６−２４】図３６Ｅは、全長ＸＩＡＰおよびＸＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いる抑制解除アッセイにおけるＴＰＩ  １３３２−１、−４、−４１、−５３、−６９、および７７の活性を示す。
【図３６−２５】図３６Ｆは、ｃＩＡＰ  ＢＩＲ２ドメインを用いるＴＰＩ  １３３２−１、−２、−４、−６、−４１、−４７、−５３、−５５、−６９、−７６、−７７および−８５の活性を示す。
【図３７】図３７は、ＴＰＩ  １４９５−１、−２、−３、−４、−６、−７、−８または−９テトラペプチドシリーズのいずれもＳＭＡＣペプチドへのＸＩＡＰ結合に競合せず、他方、ＴＰＩ  １４９５−５はＳＭＡＣペプチドへのＸＩＡＰ結合に競合し；また、ＴＰＩ  １４９５−２、−３、−４、−６、−７、および−８は全長ＸＩＡＰを用いる抑制解除アッセイにおいて不活性であり、他方、ＴＰＩ  １４９５−１、−５、および−９は抑制解除アッセイにおいて活性であることも示される。
【図３８】図３８は、ＸＩＡＰ蛋白質を標的とすることによってＴＰＩ  １３９６−３４が機能することを示す。ＸＩＡＰノックアウトマウスまたは野生型マウスからの細胞をＴＰＩ  １３９６−３４またはダウノルビシンいずれかで処理し、％生存率を評価した。これらの実験で用いる細胞は、形質転換していない（図３８ＡおよびＣ）、あるいはＳＣ４０大Ｔ抗原をコードするレトロウィルスで形質転換された（図３８ＢおよびＤ）いずれかであった。
【図３９】図３９は、ＴＰＩ１３９６−３４が抗原−特異的ＣＴＬの細胞傷害性を促進することを示す。特異的抗原で処理された腫瘍細胞は、５（図３９Ｂ）または１０（図３９Ａ）のエフェクター：標的比率の抗原−特異的Ｔ細胞と共にインキュベートした。抗原濃度の関数としてのパーセント細胞溶解物を示す。
【図４０−１】図４０は、ＴＰＩ  １３９６−１２がカスパーゼのイン・ビボの活性化を行うことを示す。図４０Ａは、切断されたカスパーゼ−３またはアクチンに特異的な抗体を用いて行った、対照またはＴＰＩ  １３９６−１２で処理された動物からの腫瘍組織の免疫ブロットを示す。図４０Ｂは、ヘマトキシリンおよびエオジン（核染色）（ＡおよびＢ）；カスパーゼ−３抗体およびＰＣＮＡ抗体（ＣおよびＤ）；カスパーゼ−６抗体（ＥおよびＦ）およびＤＦＦ４０抗体（ＧおよびＨ）を用いて行った、対照またはＴＰＩ  １３９６−１２で処理された動物からの腫瘍組織の免疫組織化学を示す。
【図４０−２】図４０は、ＴＰＩ  １３９６−１２がカスパーゼのイン・ビボの活性化を行うことを示す。図４０Ａは、切断されたカスパーゼ−３またはアクチンに特異的な抗体を用いて行った、対照またはＴＰＩ  １３９６−１２で処理された動物からの腫瘍組織の免疫ブロットを示す。図４０Ｂは、ヘマトキシリンおよびエオジン（核染色）（ＡおよびＢ）；カスパーゼ−３抗体およびＰＣＮＡ抗体（ＣおよびＤ）；カスパーゼ−６抗体（ＥおよびＦ）およびＤＦＦ４０抗体（ＧおよびＨ）を用いて行った、対照またはＴＰＩ  １３９６−１２で処理された動物からの腫瘍組織の免疫組織化学を示す。
【図４１】図４１は、白血球細胞カウント（Ａ）；赤血球細胞カウント（Ｂ）；血小板カウント（Ｃ）；ＢＵＮ（Ｄ）；ビリルビン（Ｅ）；ＡＬＴ（Ｆ）；およびＡＳＴ（Ｇ）を含めた、ＴＰＩ  １３９６−１２の毒物学的分析を示す。
【図４２】図４２は、ＴＰＩ  １５４０−１４（ａ）およびＴＰＩ  １５４０−１５（ｂ）が共にＸＩＡＰのＢＩＲ２ドメインに選択的に結合し、他方、不活性な化合物ＴＰＩ  １５４０−２０が結合しない（ｃ）ことを示す。
【図４３】図４３は、全長ＸＩＡＰ（ＸＩＡＰ−ＦＬ抑制解除データ）を用いる抑制解除アッセイにおける、ならびにＳＭＡＣで競合アッセイ（競合結合アッセイ）における、（ＴＰＩ  ７９２−３３またはＴＰＩ  １４０８−３ともいわれる）ＴＰＩ  １４５３−１、ＴＰＩ  １４５３−２、ＴＰＩ  １４５３−３、ＴＰＩ  １４５３−４、ＴＰＩ  １４５３−５、（ＴＰＩ  ７９２−３５ともいわれる）ＴＰＩ  １４５３−６、ＴＰＩ  １４５３−７、ＴＰＩ  １４５３−８、およびＴＰＩ  １４５３−９の活性を示す。
【図４４】図４４は、ＴＰＩ  １５５４シリーズのビオチニル化テトラペプチドならびに元のテトラペプチドについての対応するペプチド数（非ビオチン合成＃）および分子量（ＭＷ）の表を示す。
【図４５】図４５ＡからＪは、以下のようにビオチニル化ペプチドへのＢＩＤおよびＸＩＡＰ−ＢＩＲ２の結合を示す：（Ａ）ＴＰＩ  １４５３−１（ＴＰＩ  １５５４−１）；（Ｂ）ＴＰＩ  １４５３−６（ＴＰＩ  １５５４−２）；（Ｃ）ＴＰＩ  １３３２−４（ＴＰＩ  １５５４−３）；（Ｄ）ＴＰＩ  １３３２−４１（ＴＰＩ  １５５４−４）；（Ｅ）ＴＰＩ  １３３２−６９（ＴＰＩ  １５５４−５）；（Ｆ）ＴＰＩ  １３３２−７７（ＴＰＩ  １５５４−６）；（Ｇ）ＴＰＩ  １４９５−１９（ＴＰＩ  １５５４−７）；（Ｈ）ＴＰＩ  １４９５−２０（ＴＰＩ  １５５４−８）；（Ｉ）ＳＭＡＣ  ７量体（ＴＰＩ  １４６５−１、−２）；および（Ｊ）ＳＭＡＣ  ４量体（ＴＰＩ  １４６５−３、−４）。
【図４６】図４６ＡからＣは、３つの濃度のＸＩＡＰ−ＢＩＲ２のビオチニル化テトラペプチドへの結合を示し、図４６Ａは、１μｇ／ｍｌ  ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２を用いる結果を示す；図４６Ｂは、０．５μｇ／ｍｌ  ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２を用いる結果を示し、および図４６Ｃは、０．２５μｇ／ｍｌ  ＸＩＡＰ  ＢＩＲ２を用いる結果を示す。
【図４７】図４７は、非ＳＭＡＣミミックである（Ａ）ビオチニル化ＴＰＩ  １３３２−６９；およびＳＭＡＣミミックであるビオチニル化ＴＰＩ  １３３２−４を用いる、ＸＩＡＰ−ＢＩＲ２との、ビオチニル化テトラペプチドの結合競合を示す。
【図４８】図４８は、ローダミン標識ＴＰＩ−１３３２−４（１５６６−１１）のＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２およびＨｉｓ−Ｔｒａｆ２（陰性蛋白質対照）への結合を示す。ローダミン標識ＴＰＩ  １３３２−４は、ｐＨ  ７．４／５０ｍＭ  ＮａＣｌの５０ｍＭ  Ｋｐｉ（リン酸カリウム）中で２．４μＭで存在させた。ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２およびＨｉｓ−Ｔｒａｆ２は０、０．１１、０．３３、０．９９、２．９６、８．８９、２６．６７および８０μＭで存在させた。プレートを室温にて１時間インキュベートし、ローダミンフィルター（励起５３０ｎｍ／発光５８０ｎｍ）および５６５ｎｍでのローダミン二色鏡をそなえた蛍光偏光モードにおいてＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＨＴにおいて読んだ。データは、可変傾きを持つシグモイド用量−応答曲線についての非線形回帰によってＰｒｉｓｍＴＭにおいてフィットした。
【図４９】図４９は、公知のＩＡＰ結合化合物ＴＰＩ  １３９６−１１の存在下における、ローダミン標識ＴＰＩ  １３３２−４（１５６６−１１）のＸＩＡＰのＨＩＳ−ＢＩＲ２への競合的結合を示す。ローダミン標識ＴＰＩ  １３３２−４は、ｐＨ７．４／５０ｍＭ  ＮａＣｌの５０ｍＭ  ＫＰｉ中で２．４μＭで存在させ、およびＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ２は７９μＭで存在させた。ＴＰＩ  １３９６−１１は０、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍｌにおけるものであった。プレートを室温にて１時間インキュベートし、ローダミンフィルター（励起５３０ｎｍ；発光５８０ｎｍ）および５６５ｎｍにおけるローダミン二色鏡を備えた蛍光偏光モードにてＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＨＴで読んだ。データは、可変傾きを持つシグモイド用量−応答曲線について非線形回帰によってＰｒｉｓｍＴＭにフィットした。
【図５０】図５０は、標識されたＴＰＩ  １５４０−１４（ＴＰＩ  １５７６−３７，ピーク１および２）のＨｉｓ−ＢＩＲ１−２、Ｈｉｓ−Ｔｒａｆ２（陰性蛋白質対照）およびＢＩＲ１への結合を示す。ローダミン標識ＴＰＩ  １５４０−１４（ＴＰＩ  １５７６−３７ｐｋ１またはＴＰＩ  １５７６−３７ｐｋ２）はｐＨ８．８／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１．２５ｍＭ  ＤＴＴの５０ｍＭトリス中で２．５μＭで存在させた。ＸＩＡＰのＢＩＲ１のＨｉｓ−ＢＩＲ１−２、Ｈｉｓ−Ｔｒａｆ２および、ＸＩＡＰのＢＩＲ１は０、０．１４、０．４１、１，２３、３，７０、１１．１１、３３，３３および１００μＭで存在させた。プレートを室温にて１時間インキュベートし、ローダミンフィルター（励起５３０ｎｍ；発光５８０ｎｍ）および５６５ｎｍにおけるローダミン二色鏡を備えた蛍光偏光モードでＬＩＪ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＨＴで読んだ。データは、可変傾きを持つシグモイド用量−応答曲線についての非線形回帰によってＰｒｉｓｍＴＭにフィットした。
【図５１】図５１は、標識されたＴＰＩ  １５４０−１４（ＴＰＩ  １５７６−３７，ピーク２）のＴＰＩ  １３９６−１１に対するＨｉｓ−ＢＩＲ１−２への競合的結合を示す。ＴＰＩ  １５７６−３７  ｐｋ２は、ｐＨ８．８／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１．２５ｍＭ  ＤＴＴの５０ｍＭトリス中で２．５μＭで存在させ、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２は５０μＭで存在させた。ＴＰＩ  １３９６−１１は０、１．５６、３．１３、６．２５、１２，５、２５、５０および１００μｇ／ｍｌにおけるものであった。プレートは室温にて１時間インキュベートし、ローダミンフィルター（励起５３０ｎｍ；発光５８０ｎｍ）および５６５ｎｍにおけるローダミン二色鏡を備えた蛍光偏光モードにてＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＨＴで読んだ。データは、可変傾きを持つシグモイド用量−応答曲線につき非線形回帰によってＰｒｉｓｍでフィットした。
【図５２】図５２は、標識されたＴＰＩ  １５４０（１５７６−４１，ピーク１および２）のＨｉｓ−ＢＩＲ１−２、Ｈｉｓ−Ｔｒａｆ２（陰性蛋白質対照）およびＢＩＲ１への結合を示す。ローダミン標識ＴＰＩ  １５４０−１４（ＴＰＩ  １５７６−４１ｐｋ１またはＴＰＩ  １５７６−４１ｐｋ２）はｐＨ８．８／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１．２５ｍＭ  ＤＴＴの５０ｍＭトリス中で２．５μＭで存在させた。ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２、Ｈｉｓ−Ｔｒａｆ２およびＸＩＡＰのＢｉｒ１は０、０．１４、０．４１、１．２３、３．７０、１１．１１、３３．３３および１００μＭで存在させた。プレートを室温にて１時間インキュベートし、ローダミンフィルター（励起５３０ｎｍ；発光５８０ｎｍ）および５６５ｎｍにおけるローダミン二色鏡を備えた蛍光偏光モードでＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＨＴで読んだ。データは、可変傾きを持つシグモイド用量−応答曲線についての非線形回帰によってＰｒｉｓｍにフィットした。
【図５３】図５３は、標識されたＴＰＩ  １５４０−１４（ＴＰＩ  １５７６−４１，ピーク２）の、ＴＰＩ  １３９６−１１に対するＨｉｓ−ＢＩＲ１−２への競合的結合を示す。ＴＰＩ  １５７６−４１ｐｋ２は、ｐＨ８．８／５０ｍＭ  ＮａＣｌ／１．２５ｍＭ  ＤＴＴの５０ｍＭトリス中で２．５μＭで存在させ、ＸＩＡＰのＨｉｓ−ＢＩＲ１−２は５０μＭで存在させた。ＴＰＩ  １３９６−１１は０、１．５６、３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０および１００μｇ／ｍｌにおけるものであった。プレートを室温にて１時間インキュベートし、ローダミンフィルター（励起５３０ｎｍ；発光５８０ｎｍ）および５６５ｎｍにおけるローダミン二色鏡を備えた蛍光偏光モードにてＬＪＬ  Ａｎａｌｙｓｔ  ＨＴで読んだ。データは、可変傾きを持つシグモイド用量−応答曲線につき非線形回帰によってＰｒｉｓｍにフィットした。
【図５４】図５４は、本発明のいくつかの化合物アポトーシス効果を示す。アポトーシス効果は、実施例ＸＸＶＩＩＩに記載したように決定された。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２１−４】
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【図２１−５】
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【図２１−６】
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【図２１−７】
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【図２１−８】
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【図２１−９】
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【図２１−１０】
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【図２１−１１】
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【図２１−１２】
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【図２１−１３】
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【図２１−１４】
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【図２１−１５】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２２−３】
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【図２２−４】
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【図２２−５】
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【図２２−６】
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【図２２−７】
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【図２２−８】
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【図２２−９】
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【図２２−１０】
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【図２２−１１】
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【図２２−１２】
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【図２２−１３】
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【図２２−１４】
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【図２２−１５】
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【図２２−１６】
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【図２２−１７】
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【図２２−１８】
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【図２２−１９】
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【図２２−２０】
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【図２２−２１】
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【図２２−２２】
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【図２２−２３】
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【図２２−２４】
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【図２２−２５】
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【図２２−２６】
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【図２２−２７】
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【図２２−２８】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２３−３】
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【図２３−４】
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【図２３−５】
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【図２３−６】
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【図２３−７】
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【図２３−８】
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【図２３−９】
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【図２３−１０】
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【図２３−１１】
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【図２３−１２】
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【図２３−１３】
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【図２３−１４】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２４−５】
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【図２４−６】
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【図２４−７】
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【図２４−８】
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【図２４−９】
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【図２４−１０】
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【図２４−１１】
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【図２４−１２】
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【図２４−１３】
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【図２４−１４】
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【図２４−１５】
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【図２４−１６】
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【図２４−１７】
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【図２４−１８】
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【図２４−１９】
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【図２４−２０】
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【図２４−２１】
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【図２４−２２】
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【図２４−２３】
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【図２４−２４】
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【図２４−２５】
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【図２４−２６】
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【図２４−２７】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３５−４】
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【図３５−５】
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【図３５−６】
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【図３５−７】
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【図３５−８】
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【図３５−９】
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【図３５−１０】
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【図３５−１１】
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【図３５−１２】
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【図３５−１３】
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【図３５−１４】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３６−３】
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【図３６−４】
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【図３６−５】
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【図３６−６】
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【図３６−７】
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【図３６−８】
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【図３６−９】
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【図３６−１０】
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【図３６−１１】
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【図３６−１２】
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【図３６−１３】
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【図３６−１４】
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【図３６−１５】
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【図３６−１６】
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【図３６−１７】
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【図３６−１８】
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【図３６−１９】
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【図３６−２０】
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【図３６−２１】
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【図３６−２２】
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【図３６−２３】
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【図３６−２４】
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【図３６−２５】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【配列表】
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