(57)【要約】  本発明は、心臓の弁および血管の移植片などの埋入可能な医療用デバイスのインビボ再細胞化のためのホーミング因子を含むマトリックスに関する。
2008518606.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造マトリックスを含む構造骨格において、該マトリックスが１種類以上のホーミング因子でコートされていることを特徴とする構造骨格。
【請求項２】
前記構造骨格が血管または心臓の弁の構造骨格である、請求項１に記載の構造骨格。
【請求項３】
前記ホーミング因子が、前駆細胞または幹細胞を該マトリックスに結合させることができる、請求項１または２に記載の構造骨格。
【請求項４】
構造マトリックスが非生分解性である、請求項１〜３いずれか１項に記載の構造骨格。
【請求項５】
前記ホーミング因子が、レセプタのリガンド、または該レセプタへの結合ドメインを含むその断片、または該レセプタに結合するペプチドである、請求項１〜４いずれか１項に記載の構造骨格。
【請求項６】
前記レセプタが幹細胞または前駆細胞上に発現される、請求項５に記載の構造骨格。
【請求項７】
前記ホーミング因子が、間質由来因子１、幹細胞因子、ＶＣＡＭ−１、フィブリノゲンのＰ１領域およびフィブリノゲンのＰ２領域からなる群より選択される、請求項１〜６いずれか１項に記載の構造骨格。
【請求項８】
前記ホーミング因子が間質由来因子１またはＳＣＦである、請求項１〜７いずれか１項に記載の構造骨格。
【請求項９】
化学誘引物質因子または動員因子を含まない、請求項１〜８いずれか１項に記載の構造骨格。
【請求項１０】
化学誘引物質因子および／または動員因子をさらに含む、請求項１〜８いずれか１項に記載の構造骨格。
【請求項１１】
ホーミング因子と構造マトリックス間の相互作用を助長する１種類以上のタンパク質でさらにコートされた、請求項１〜１０いずれか１項に記載の構造骨格。
【請求項１２】
該助長タンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲンおよびフィブリノゲンからなる群より選択される、請求項１１に記載の構造骨格。
【請求項１３】
前記ホーミング因子が前記構造マトリックスにリンカーアームによってコートされる、請求項１〜１２いずれか１項に記載の構造骨格。
【請求項１４】
リンカーアームが生分解性である、請求項１３に記載の構造骨格。
【請求項１５】
ホーミング因子と構造マトリックスへの結合を助長するタンパク質とをマトリックスに融合タンパク質として結合させる、請求項１１に記載の構造骨格。
【請求項１６】
構造マトリックスが、非架橋プロテーゼまたは無細胞化大動脈根である、請求項１〜１５いずれか１項に記載の構造骨格。
【請求項１７】
マトリックスをホーミング因子でコートする工程を含む、構造骨格の作製方法。
【請求項１８】
構造骨格が心臓の弁または血管構造骨格である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
構造骨格のマトリックスが、ホーミング因子と構造マトリックス間の相互作用を助長する１種類以上のタンパク質で予備コートされる、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
ホーミング因子が構造マトリックスに化学的に架橋される、請求項１７〜１９いずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記コートが、前記ホーミング因子を含む溶液を前記マトリックスに含浸させることにより行なわれる、請求項１７〜２０いずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
移植片用の構造マトリックスおよび１種類以上のホーミング因子を含むキット。
【請求項２３】
移植片が血管または心臓の弁の形態である、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
前記ホーミング因子が、幹細胞および／または前駆細胞に特異的なレセプタのリガンドである、請求項２２または２３に記載のキット。
【請求項２５】
ホーミング因子が、間質由来因子１、幹細胞因子、ＶＣＡＭ−１、フィブリノゲンのＰ１領域およびフィブリノゲンのＰ２領域またはそのレセプタ結合能力を保持しているその断片もしくは誘導体からなる群より選択される、請求項２２〜２４いずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
間質由来因子と構造マトリックス間の相互作用を助長するタンパク質をさらに含む、請求項２２〜２５いずれか１項に記載のキット。
【請求項２７】
ホーミング因子と構造マトリックス間の相互作用を助長するタンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲンおよびフィブリノゲンからなる群より選択される、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
埋入可能なデバイスを作製するためのホーミング因子の使用。
【請求項２９】
デバイスが心臓弁または血管移植片である、請求項２８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、組織工学、および埋入可能なデバイスの構造骨格（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の細胞播種に関する。さらに、本発明は、マトリックスへの細胞のインビトロおよび／またはインビボ播種を確実にする分子に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
プロテーゼ心臓弁は、血栓症、心内膜炎、機械的機能不全、組織分解、石灰化などの合併症のおそれを有する。このような問題およびこのようなプロテーゼが小児患者において成長およびリモデリングの可能性を欠くという事実が、心臓弁の組織工学の動機付けである。
【０００３】
組織工学の主な目的は、患者内に組み込まれる生体要素の送達による機能の回復である。組織工学は、本質的に３つの要素：
−生体成分を提示する細胞
−３次元支持体構造を提供するマトリックス
−遺伝子発現および細胞外マトリックス堆積に影響を与えるシグナル分子
を基本とする。
【０００４】
組織工学は、細胞と新しい組織を構築するための構造骨格とを組み合わせるものである。マトリックスの細胞播種には、２つの選択肢、すなわちインビトロ播種のための培養自己細胞、および自己細胞のインビボでの誘引が、現在研究されている。
【０００５】
種々のマトリックスが、組織工学に関して検討されている（図１参照）。マトリックスは、合成ポリマーまたはコラーゲンもしくはフィブリンの成形された構造骨格であり得る。構造骨格は、天然のもの（例えば、無細胞根（ａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｏｏｔ））であり得るか、または架橋プロテーゼであり得る。
【０００６】
また、生存可能な組織工学的心臓弁を得るために種々の方法が考案されている。完全（ｃｏｍｐｌｅｔｅ）パラダイムには、細胞および構造骨格をインビトロで組み合わせた後、バイオリアクタ内での構築物のインビトロ成熟による弁の構築が記載されている（図２）。次いで、成熟構築物を患者内に埋入すると、おそらくインビボリモデリングが行なわれ得る（Ｒａｂｋｉｎ  ＆  Ｓｃｈｏｅｎ（２００２）Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐａｔｈｏｌ．１１，３０５−３１７に概説）。最も徹底的に研究された構築物は、Ｈｏｅｒｓｔｕｐらにより創製された弁である（（２００２）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １０６，ｌ１４３−ｌ１５０））。彼らは、バイオリアクタとともに完全パラダイムを用い、生存可能なリモデリングされたヒツジ肺動脈弁を得ることに成功した。
【０００７】
Ｃａｍｐｂｅｌｌら（（１９９９）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８５，１１７３−１１７８）は、既知の防御機構（すなわち異物反応）を利用する血管の組織工学において構造骨格を播種することを示唆している。成熟異物反応は、マクロファージ層、線維芽細胞の数個の層および中皮外層から構成される（Ｂｕｔｌｅｒら（２００１ａ）Ｂｉｏｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｉｎｓｔｒｕｍ．３７，１９−２４．；Ｂｕｔｌｅｒら（２００１ｂ）Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ
Ｓｕｒｇ．１４，１３９−１５２）。Ｃａｍｐｂｅｌｌら（１９９９，前掲）は、線維芽細胞が、交差分化（ｔｒａｎｓ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）マクロファージに由来すると主張しているが、決定的な証拠は未だ公表されていない。
【０００８】
これらの方法が成功するためには、いくつかの調節上の課題（例えば、最適な機能および耐久性）を満たさなければならない。組織工学的弁のコスト高を正当化するためには、これらは、既存の弁よりも優れた品質を有することが示されなければならない。さらに、上記の手法はすべて、生体安全性の課題を克服するものでなければならない。生体安全性の問題およびそれに関するＦＤＡのガイドラインは、文書により十分示されている（“Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｏｎ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ  ｏｆ  ｌｉｖｉｎｇ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｃｅｌｌｓ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｅｄ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｎｄｅｄ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｒｅｐａｉｒ  ｏｒ  ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ”．９５Ｎ−０２００（１９９６）；“Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｔｉｓｓｕｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ−Ｔｈｅ  ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ”．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｔｈｅｒａｐｙ  ６：１９５−２１２（１９９７）；“Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｓｔｒｙ−Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ”．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ
Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１５１３−１５２４（１９９８）；  “ＰＨＳ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ  ｏｎ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  ｘｅｎｏｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”（２００１）；  “Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ  ａｄｖｉｓｏｒｙ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇ”（２００１））。
【０００９】
インビトロ培養細胞の使用、または回収した細胞の使用でさえ、特定の問題点を有する。図３に示すように、細胞の回収および培養は、ともに、遺伝的不安定性または変異誘発を誘導し得る。これは、異なる因子に起因し得る。回収および培養はともに、一般的に、外来タンパク質の使用を必要とする。異種起源のタンパク質溶解性酵素または血清は、種間病原体汚染の潜在的な根源である。かかる汚染は、未検出であっても、培養物自体だけでなく、レシピエントをも危険にさらす。ある種のウイルスの増殖機構は、そのゲノムの宿主ゲノム内への挿入を許容し得、これは、挿入部位によっては有害な突然変異を引きこし得る。ある種のウイルスの遺伝子はまた、癌遺伝子として作用し得る。生体安全性の問題は、異種材料の使用にも等しく当てはまる。ウイルス感染のリスクに加え、細胞の培養はまた、細胞を非生理学的条件（例えば、増大した酸素張力）に曝露する。平均すると、哺乳動物組織は２〜８％の範囲の酸素張力に曝露されているが、一般的に、インキュベータでは２１％酸素張力の圧縮空気が使用される。マウス始原線維芽細胞は、老化および自発的不死化をもたらすＤＮＡ損傷を極めて受けやすいことが示されている。これらの実験において、ヒト線維芽細胞はずっと影響されにくかったという事実にもかかわらず、他の研究では、ヒト細胞は、酸化的ストレスに対して鈍感ではないことが示されている。例えば、ヒト関節軟骨の軟骨細胞は、酸化的ストレスに敏感であることが示されている。細胞株を用いて、酸素は、主に、急速に増殖中の細胞においてゲノム再編成を誘導することが示されている。またさらに、ヒト線維芽細胞は酸化的ストレスに応答して老化し、これは、酸化的ストレスに依存性の速度でテロメアの短小化およびテロメアＤＮＡにおける単鎖破断を引き起こし得ることが示されている。線維芽細胞培養物では、酸素張力を減少させると、２倍の増大が得られた。別の注目すべき観察結果は、老化が８個の遺伝子、中でもフィブロネクチン、オステオネクチンおよびα１−プロコラーゲンを上方調節することである。
【００１０】
生体安全性は、インビトロ細胞播種心臓弁の調節上の課題における非常に重要な側面であり、レシピエント内への埋入前での個々の各弁プロテーゼの厳しい品質管理の開発を課する。調節上の課題の増加はまた、かかるプロテーゼのコストを著しく増大させ、それにより、その使用は特定の患者群に限定される。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
当該技術分野において、生存可能な組織工学的心臓弁および他の埋入可能なデバイスを得るための方法の必要性が存在する。より詳しくは、細胞播種、特にインビボ細胞播種、最も詳しくは細胞播種を増大した剪断応力の条件下で行なう必要がある場合に適した構造骨格、例えば、心臓弁および血管の構造骨格の必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
発明の概要
本発明は、一般的に、動物またはヒトの身体内への埋入のために用いられる組織および器官の構造骨格の作製におけるホーミング因子の使用に関する。特定の一態様によれば、本発明は、身体内への埋入時の高剪断応力に影響されやすい構造骨格の作製におけるホーミング因子の使用に関する。最も詳しくは、本発明は、心血管系、リンパ系または他の管（例えば、尿道）における使用のための構造骨格に関する。本発明の具体的な一実施形態は、１種類以上のホーミング因子でコートされた構造マトリックスを含む構造骨格に関する。より詳しくは、本発明のホーミング因子は、幹細胞または前駆細胞に結合することができる因子である。
【００１３】
本発明の特定の一態様は、長期使用および身体内での機能が意図される埋入可能なデバイスの構造骨格に関する。すなわち、耐久性があり生体適合性だが非生分解性のマトリックスに基づく。具体的な一実施形態によれば、構造マトリックスは、非架橋プロテーゼまたは無細胞化大動脈根である。
【００１４】
本発明のさらなる特定の態様は、１種類以上のホーミング因子を含む構造骨格であって、該ホーミング因子がレセプタのリガンド、または該レセプタへの結合ドメインを含むその断片、または該レセプタに結合するペプチドである構造骨格に関する。最も詳しくは、該レセプタは、幹細胞または前駆細胞上に発現されるレセプタである。
【００１５】
本発明に関連して用いるホーミング因子またはホーミングタンパク質の特定の実施形態は、間質由来因子１、幹細胞因子、ＶＣＡＭ−１、フィブリノゲンのＰ１領域およびフィブリノゲンのＰ２領域であり、より詳しくは、間質由来因子１（ＳＤＦ−１）もしくは幹細胞因子（ＳＣＦ）またはその断片もしくは誘導体である。
【００１６】
特定の一実施形態では、構造骨格マトリックスは、１種類以上のホーミング因子でコートされ、細胞と構造骨格のマトリックス間の相互作用を助長するタンパク質である。かかるタンパク質は、限定されないが、フィブロネクチン、コラーゲンまたはフィブリノゲンであり得る。ホーミングタンパク質がＶＣＡＭ−１である特定の一実施形態では、ＶＣＡＭ−１と細胞上のそのレセプタ間の相互作用は、任意選択で多面発現性プロテアーゼインヒビターα２−マクログロブリンの添加によってさらに増強され得る。
【００１７】
本発明の特定の一実施形態では、ホーミング因子（１種類または複数種類）は、リンカーアームによって構造マトリックスに化学的に架橋されている。ここで、リンカーアームは、ホーミング因子と構造マトリックス間の空間を占める。ホーミング因子とマトリックス間の結合は、不可逆的（永続的）または生分解性であり得る。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態によれば、本発明のホーミング因子（１種類または複数種類）は、構造マトリックスへの結合を助長するタンパク質との融合タンパク質の形態であり得る（すなわち、２つのタンパク質が１つの連続したポリペプチド鎖を形成する）。
【００１９】
特定の一実施形態では、本発明の構造骨格の構造マトリックスは、架橋ウシ心膜またはブタ大動脈根などの生物学的材料である。
【００２０】
またさらなる実施形態では、ホーミング因子は、本発明の構造骨格のマトリックスに化学的に架橋される。
【００２１】
本発明はまた、構造骨格のマトリックスが１種類以上のホーミング因子でコートされる本発明の構造骨格の作製方法に関する。特定の一実施形態によれば、コーティングは、含浸によって、すなわち、上記のホーミング因子の１種類以上を適切な含浸バッファー（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）中に含む溶液中でのマトリックスの定温放置によって保証される。この方法の特定の実施形態は、ホーミング因子と構造マトリックス間の相互作用を助長する１種類以上のタンパク質での予備コーティング工程を含む。
【００２２】
特定の一実施形態によれば、本発明の構造骨格は、化学誘引物質因子または動員因子を含まない。あるいはまた、本発明の構造骨格は、１種類以上の本発明のホーミング因子を、１種類以上の化学誘引物質因子および／または動員因子との組み合わせで含む。
【００２３】
したがって、本発明は、任意選択で埋入可能なデバイス、例えば限定されないが、血管または心臓の弁などの形態の構造マトリックス、および１種類以上のホーミング因子を含むキットを提供する。
【００２４】
したがって、本発明は、障害または疾患状態の組織または器官との置換に適した構造骨格でのインビボ播種を増強するためのホーミング因子の使用に関する。ホーミング因子の使用は、高剪断応力下にある位置に埋入するための構造骨格、例えば、心血管系（例えば、心臓弁または血管移植片など）における使用のための構造骨格の作製において特別な利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
発明の詳細な説明
本発明では、構造骨格を開示し、より詳しくは、１種類以上のホーミング因子の存在によって、適切な細胞への結合が確実になるマトリックスを含む埋入可能なデバイス用の構造骨格を開示する。「構造骨格」は、本明細書で用いる場合、患者の身体内の疾患状態、損傷状態、欠失あるいは欠陥（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）組織または器官の組織修復、回復、増大もしくは再生または置換のための埋入可能な医療用デバイスに関する。「埋入可能な医療用デバイス」は、本明細書で用いる場合、ヒト身体内に導入されるか、任意選択で埋入されることが意図される任意のデバイスをいい、管、管路または身体の器官内への埋入のために用いられるデバイス（例えば、ステント、カテーテル、カニューレ、脈管または動脈の移植片シースなど）、食道、気管、結腸、胆管、尿路内への埋入のためのデバイス、整形外科用デバイスなどが挙げられる。
【００２６】
本発明に関連する範囲で特に重要なのは、剪断応力がマトリックスへの適切な細胞の自然な付着に抗して作用する位置への配置が意図される構造骨格である。したがって、本発明に関連して特に重要なのは、高剪断応力に影響されやすい組織（例えば、血管または心臓弁、尿管、胆管、膵管、胆嚢管、肝管、または総胆管など）の置換および／または回復における使用のための構造骨格である。
【００２７】
かかる構造骨格の播種は、インビボ、インサイチュ（すなわち、疾患または損傷状態の動脈の部位への埋入時）インビボ、エクスサイチュ（ｅｘ  ｓｉｔｕ）（すなわち、身体内の別の部位内への埋入）またはインビトロ（例えば、バイオリアクタ内）で確実になされ得る。
【００２８】
ホーミングタンパク質またはホーミング因子は、１種類以上の特定の細胞型と相互作用し、したがって、マトリックスに結合したとき、マトリックス上での該細胞型の富化を可能にするドッキング分子と定義する。かかるドッキング分子は、細胞の表面（例えば、別のタンパク質または炭水化物構造、本明細書において細胞標的分子ともいう）でのマトリックスと該分子間の相互作用を確実にする。本発明の特定の一実施形態によれば、ホーミング因子は、マトリックスと１種類以上の特定の細胞型間の特定の相互作用（これは、本質的に、１種類以上の特定の細胞型の表面上でのみ起こる分子へのホーミング因子の結合によって、または１種類以上の特定の細胞型の細胞標的分子にのみ結合するようにホーミング因子を調節することによって確実となり得る）を確実にする分子である。
【００２９】
典型的には、ホーミング因子と細胞の間の相互作用は、リガンド−レセプタ相互作用である。したがって、本発明の特定の一実施形態は、ある種の細胞型、より詳しくは、本明細書において以下に記載する細胞型に結合するレセプタの１種類以上のリガンドを含む構造骨格に関する。
【００３０】
別の実施形態によれば、ホーミング因子は、最も詳しくは、幹細胞または前駆細胞上で特異的に発現される炭水化物構造に特異的に結合する分子である。糖結合特性を保持しているこれらの炭水化物結合タンパク質の一部分は、ホーミング因子としての機能に同程度に好適である。
【００３１】
本発明の構造骨格および方法に好適なホーミング因子は、それが細胞標的分子に結合する能力を保持している限り、切断型タンパク質および／または誘導体、例えば、変異タンパク質などであってもよい。ホーミングタンパク質の最小結合領域は、切断性欠失をマッピングすることによって規定され得る。本発明の特定の一実施形態によれば、細胞標的分子がレセプタであり、ホーミング因子が、そのリガンドの断片（例えば、そのレセプタ結合断片）である。典型的には、タンパク質リガンドの誘導体もしくは変異型形態またはその断片であるホーミング因子は、天然のリガンドまたはその断片と、少なくとも８０％、特には少なくとも９０％、最も特別には少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性を有するとともに、細胞標的分子に対する結合能力を保持している。
【００３２】
本発明のホーミング因子は、種々の条件下でマトリックスに対する細胞の付着を確実にし、および／または増大させる。本発明のホーミング因子による細胞の結合は、高剪断応力の条件において、組織の構造骨格の播種に特別な利点を提供する。
【００３３】
本発明のホーミング因子により捕捉される細胞は、適切な構造骨格の生成において重要な細胞、すなわち、置き換えられる組織または器官と同様に機能し得る構造骨格である。本発明の特定の一実施形態によれば、ホーミング因子は、幹細胞または前駆細胞（すなわち、未分化であるが、１種類以上の細胞系統に委任（ｃｏｍｍｉｔ）される）、より詳しくは造血前駆細胞に結合することができるタンパク質である。
【００３４】
本発明の特定の一実施形態によれば、ホーミング因子は、間葉または造血幹細胞を結合することができる分子である。本発明では、マトリックス上での幹細胞および／または前駆細胞のホーミングにより、特に筋線維芽細胞に分化する細胞がシードされたマトリックス構造骨格が確保されることが示されている。
【００３５】
特に好適なホーミング分子は、フィブリノゲン、幹細胞因子（ＳＣＦ）、間質由来因子１（ＳＤＦ−１）、フィブロネクチン（ＦＮ）および血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）（図４）のＰ１およびＰ２エピトープからなる群のもの、最も特別には、そのレセプタ結合親和性を保持しているＳＤＦ−１もしくはＳＣＦまたはその断片もしくは誘導体で
ある。
【００３６】
本発明の特定の実施形態は、マトリックスの播種のためのホーミングタンパク質としてのＳＤＦ−１の使用に関する。ＳＤＦ−１（間質細胞由来因子１）は、プレＢ細胞成長刺激因子（ＰＢＳＦ）として、またはケモカインｃｘｃモチーフリガンド１２（ＣＸＣＬ１２）としても知られている。ＳＤＦ−１  ｃＤＮＡおよびタンパク質の配列は、それぞれ、Ｇｅｎｂａｎｋの受託番号Ｅ０９６６８およびＮＰ＿００１０２９０５８に存在する。ＳＤＦ−１は、それぞれ６８個のアミノ酸（α）および７２個のアミノ酸（β）の２つの異なる形態で存在し、ここで、β形態は、α形態と比べると４個のさらなるアミノ酸をカルボキシ末端に有する。ＳＤＦ−１は、ＣＸＣＲ４レセプタのリガンドである（Ｂｌｅｕｅｌら（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８２，８２９−８３３）。レセプタ結合のためのＳＤＦ１のインタクトなＮ末端の重要性は、文献で示されている［例えば、Ｓａｄｉｒ  Ｊ
Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００４  ２７９，４３８５４−４３８６０］。したがって、本発明では、ＳＤＦ−１の断片は、該タンパク質のアミノ末端を保持している断片である。特定の一実施形態によれば、ＳＤＦ−１の断片または誘導体は、その上にアミノ末端領域（アミノ酸１〜１４）および中央のβシート（アミノ酸１５〜５４）を含有するが、カルボキシ末端領域（それぞれ、αおよびβ形態のアミノ酸５５〜６８および５５〜７２）で１種類以上のアミノ酸を欠くものである。かかる断片のレセプタ結合活性は、Ｓａｄｉｒら（前掲）に記載のようにして評価され得る。
【００３７】
本発明のまた別の実施形態によれば、ＳＣＦは、マトリックス内でホーミングタンパク質として使用される。ＳＣＦは、骨髄間葉幹細胞（ＭＳＣ）によって、マウスではそのプロテインチロシンキナーゼレセプタ（ｃ−キット）により、ヒトではＣＤ１１７によって認識され（Ｊｉａｎｇら（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１８，４１−４９；Ｎａｋａｍｕｒａら（２００４）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３２，３９０−３９６）、したがって、ＭＳＣのホーミングを確実にし得る。さらに、ＣＤ１１７は、造血前駆細胞の発生において不可欠な因子である（Ａｇｉｓら（１９９３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５１，４２２１−４２２７）。ＳＣＦ（幹細胞因子）は、ＫＩＴリガンド（ＫＩＴＬＧ）、マスト細胞成長因子（ＭＧＦ）およびスチールファクター（Ｓｔｅｅｌ  Ｆａｃｔｏｒ）（ＳＦ）のホモログとしても知られている。ＳＣＦのｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに受託番号Ｍ５９９６４で寄託されている。ＳＣＦは、ＫＩＴチロシンキナーゼレセプタのリガンドである。ＳＣＦは、天然には、選択的ＲＮＡスプライシングおよびタンパク質溶解性プロセッシングの結果として、膜固定状態で、または可溶性アイソフォームとして存在する。本発明の特定の一実施形態によれば、ＳＣＦの断片または誘導体は、ＳＣＦの細胞外ドメインを含有する１８９個のアミノ酸（ａｍｉｎｏ）のアミノ末端断片を含む。あるいはまた、ＳＣＦの断片または誘導体は、ＳＣＦの１６５個のアミノ酸のアミノ末端を含有する天然に存在する可溶性形態を含む。また別の特定の一実施形態によれば、ＳＣＦの断片または誘導体は、ＳＣＦのレセプタ結合コアを含有する１４１残基のアミノ末端を含む。これらの断片の番号付けは、リーダー配列の切断後に放出される２４８個のアミノ酸のタンパク質配列を指す。ＳＣＦの上記の断片およびそのレセプタ結合能力は、Ｌａｎｇｌｅｙら（１９９４）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．３１１，５５−６１に記載されている。本発明のＳＣＦまたはＳＣＦの断片もしくは誘導体は、単量体または二量体であり得る。二量体の断片は、二量体の結合に関与するシステイン残基を酸化または架橋することにより得られ得る。あるいはまた、ＳＣＦまたはその断片は組換えによりタンデムに発現させ、それらの間にスペーサーペプチドを有する。
【００３８】
本発明のさらに特定の実施形態は、ホーミングタンパク質としてのＶＣＡＭ−１の使用に関する。ＶＣＡＭ−１のｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに受託番号Ｍ６０３３５で寄託されている。
【００３９】
本発明のさらに特定の実施形態は、ホーミング因子と、ホーミング分子およびその細胞標的分子（本明細書において助長タンパク質ともいう、下記参照）間の相互作用に影響を及ぼす分子との併用に関する。一実施形態によれば、ＶＣＡＭ−１はマトリックスに、α２−マクログロブリンとの組み合わせで添加される（図７）。それは、この多面発現性プロテアーゼインヒビターが、ＶＣＡＭ−１とＶＬＡ４間の結合を安定化し得るからである。この機能は、ＶＣＡＭ−１タンパク質を分解する多面発現性プロテアーゼの阻害の結果である（Ｌｅｖｅｓｑｕｅら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８，１２８９−１２９７）。α２−マクログロブリンのｃＤＮＡおよびタンパク質配列は、Ｇｅｎｂａｎｋに受託番号ＮＭ＿００００１４で寄託されている。
【００４０】
別の特定の一実施形態によれば、フィブリノゲンのＰ１およびＰ２エピトープが、ホーミングタンパク質として使用される。Ｐ１およびＰ２には、マクロファージ（ＭＦ）のｍａｃ１−インテグリンが結合する。異物反応は、外来表面へのフィブリノゲンの吸着によって開始されることが示された。これにより、分子の立体構造の変化が誘導され、２つのエピトープＰ１およびＰ２の露出がもたらされる（Ｈｕら（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８，１２３１−１２３８）。次いで、結合したマクロファージは、「標準的な」異物反応の場合と同様に幹細胞を誘引する。本発明の一実施形態は、内在性幹細胞を誘引するためのＰ１およびＰ２エピトープを含む好適な、欠陥、疾患または障害状態の心臓弁との直接置換に適したマトリックスである。Ｐ１およびＰ２エピトープはマトリックスに連結され得る。また、本発明は、埋入後に内在性幹細胞を誘引するために構造骨格をＰ１およびＰ２エピトープでコートするためのＰ１およびＰ２エピトープの使用に関連する。Ｈｕら（２００１，前掲）に記載のように、Ｐ１エピトープは、フィブリノゲンγのアミノ酸１９０〜２０２を指し、一方、Ｐ２エピトープは、フィブリノゲンγのアミノ酸３７７〜３９５を指す。
【００４１】
本発明のまた別の実施形態によれば、マトリックスは、ＶＬＡ４またはＶＬＡ−５を発現する前駆細胞をホーミングさせるフィブロネクチンを含む。ヒトフィブロネクチン（ＦＮ１）の種々のスプライスバリアントが、ＮＩＨヌクレオチドデータベースに受託番号ＮＭ＿２１２４８２（バリアント１）、ＮＭ＿２１２４７５（バリアント２）、ＮＭ＿００２０２６（バリアント３）、ＮＭ＿２１２４７８（バリアント４）、ＮＭ＿２１２４７６（バリアント５）、ＮＭ＿２１２４７４（バリアント６）およびＮＭ＿０５４０３４（バリアント７）で示されている。
【００４２】
本発明の構造骨格における使用のために特に好適なのは、フィブロネクチンおよび／またはＶＣＡＭ−１を含み、フィブロネクチンおよび／またはＶＣＡＭ−１と相乗的に作用するＳＤＦ−１をさらに含むマトリックスまたは構造骨格である。
【００４３】
上記で特徴付けしたホーミングタンパク質である間質由来因子１、幹細胞因子、ＶＣＡＭ−１、フィブリノゲンのＰ１領域またはフィブリノゲンのＰ２領域の使用、および心臓弁または血管用の構造骨格のホーミング剤として、現在の当該技術分野のものか、または当業者に利用可能な任意のその機能性ホモログまたは誘導体を使用することは、本発明の一部である。
【００４４】
理論的には、本発明のホーミング因子は、構造骨格のレシピエントから得られ得るが、実用目的のためには、ホーミング因子が合成または組換えにより得られる（原核生物または真核生物のいずれかにより）ことが多いと思われる。上記のホーミングタンパク質はすべて市販されている。組換えヒトＳＤＦ−１および組換えヒトＳＣＦ（大腸菌）は、種々の企業（Ｓｉｇｍａ  ＲＢＩ、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ＣａｍｐｒｏおよびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ）から入手することができる。組換えヒトＶＣＡＭ−１（マウス骨髄腫細胞株）は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓから入手され得る。ヒト線維芽細胞由来の天然フィブロネ
クチンは、Ｓｉｇｍａ  ＲＢＩおよびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手され得る。ヒト血漿由来の天然フィブリノゲンは、Ｓｉｇｍａ  ＲＢＩおよびＣａｌｂｉｏｃｈｅｍから入手され得る。
【００４５】
フィブリノゲンのＰ１およびＰ２エピトープに関して、該エピトープは、天然タンパク質のタンパク質溶解性切断、またはより好ましくは、Ｈｕら（前掲）に記載のタンパク質配列に従うインビトロ生合成のいずれかによって、天然フィブリノゲンから誘導され得る。
【００４６】
本発明の一態様によれば、１種類以上のホーミング因子の存在により、マトリックスに対する１種類以上の特定の細胞型の結合が確実となる。したがって、組織工学、より詳しくは、マトリックスが絶えず血液またはリンパ液などの体液およびそれに存在する細胞と接触している血管もしくはリンパ系器官または他の管（例えば、尿道など）の組織工学との関連において、ホーミング剤単独の存在は、マトリックスと適切な細胞との集団を確保するのに充分であり得る。本発明では、ホーミング因子が、選択したマトリックスに適切な細胞を物理的および特異的に連結させるために使用され得ることを示す（図５）。したがって、本発明の特定の一実施形態は、ホーミング因子を含む構造骨格に関する。最も詳しくは、本発明は、その表面上に１種類以上のホーミング因子のみを含み、化学誘引、動員などに関与する他のタンパク質は含まない構造骨格に関する。ホーミング因子が、関連する細胞のマトリックスへの結合を充分確実にするだけでなく、細胞の誘引および／または動員に影響を及ぼす他の分子の非存在が、潜在的に重要な負の副作用（例えば、移植片の血管新生など）を回避する。
【００４７】
しかしながら、本発明において、ホーミング因子と他の生物活性分子との組み合わせを、本発明の構造骨格を構成するマトリックスのコーティングに用いることもまた想定される。
【００４８】
したがって、本発明のさらなる実施形態によれば、マトリックスは、１種類以上のホーミング因子に加え、マトリックスへの適切な細胞の結合を助長する１種類以上の他の因子をさらに含む。かかる他の因子としては、動員剤、化学誘引剤および助長因子が挙げられる。
【００４９】
「動員剤」は、本発明との関連において、幹細胞などの細胞を、身体内のその起源の場所から動員する薬剤である。より詳しくは、動員剤は、血液中の幹細胞の量を増加させるために使用される。動員剤の特定の一例は、顆粒球コロニー刺激因子またはＧ−ＣＳＦである。天然に存在するこの因子は、他の造血成長因子と組み合わせたとき、低い毒性および相乗効果を有する。他の動員剤は、アデノシン、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ１）、ＩＬ３、ＩＬ７、ＩＬ１１およびＩＬ１２である（Ｆｕ  ＆  Ｌｉｅｓｖｅｌｄ（２０００）Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ．１４，２０５−２１８）。本発明によるホーミング因子に加えて動員因子を使用することは、インビボでのマトリックスの播種が想定されるツールおよび方法において特に重要である。動員剤は任意選択でマトリックスに含めるが、構造骨格の埋入前に身体に投与してもよい。
【００５０】
あるいは、またはさらに、本発明では、ホーミング因子（１種類または複数種類）および任意選択の上記の動員剤（１種類または複数種類）とともに、１種類以上の化学誘引因子の使用を想定する。本明細書で用いる「化学誘引」または「化学走性化合物」は、細胞を誘引することができる化合物である。一般に、これらは、勾配的に存在する場合、細胞に対して効果を有する。幹細胞に対して考えられ得る化学誘引剤は、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）である（Ｙｏｕｎｇら（１９９９）Ｃ
ｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  １７，８８１−８８８）。
【００５１】
あるいは、またはさらに、本発明では、ホーミング因子（１種類または複数種類）および任意選択の上記のさらなる因子とともに、１種類以上の助長剤の使用を想定する。「助長因子」は、本発明のホーミングタンパク質または因子への細胞の結合を助長または強化する因子である。かかる助長タンパク質の例としては、可溶性コラーゲン、アルブミン、フィブリノゲンまたはフィブロネクチンが挙げられる。助長タンパク質は、ホーミング因子とともにマトリックス上にコートしてもよく、別個の層としてコートしてもよい。
【００５２】
したがって、本発明は、１種類以上のホーミング因子を伴うマトリックスを含む、管または他の埋入可能な構造骨格（例えば、血管または心臓弁）の組織工学における使用のためのマトリックスに関する。より詳しくは、本発明は、欠陥、疾患または障害状態の心臓弁と置換するため、およびインビボ再細胞化（ｒｅｃｅｌｌｕｌａｒｉｓａｔｉｏｎ）のために設計されるＳＤＦ−１および／またはＳＣＦを含むマトリックスに関する。ＳＤＦ−１負荷マトリックスまたは構造骨格は、さらなるホーミング剤を含むものであり得、さらにまた、１種類以上の動員剤、例えば、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、アデノシン、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、インターロイキン−１（ＩＬ１）、ＩＬ３、ＩＬ７、ＩＬ１１およびＩＬ１２またはその組み合わせからなる群より選択される動員剤を含むものであり得る。マトリックスは、１種類以上の化学誘引剤、例えば、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）；胎盤成長因子（ＰＬＧＦ）またはその組み合わせからなる群より選択される化学誘引剤をさらに含むものであり得る。
【００５３】
一実施形態によれば、本発明の細胞化パラダイムは、３つの工程を含む（図２）。任意選択で、最初の幹細胞動員工程、次に、ホーミング因子でコートされた構造骨格（例えば、管または弁）の埋入および、任意選択で、構造骨格による化学誘引剤の放出である。特定の一実施形態によれば、かかる構造骨格は、心血管系における使用のための管または弁である。しかしながら、この実施形態では、弁または血管の移植片が疾患状態の弁または血管の位置内に埋入されるため、血液と直接接触し、したがって、マトリックスをホーミング因子とともに、任意選択で化学誘引剤との組み合わせで埋入することで充分である。
【００５４】
本発明による内在性細胞の付着のために作製される心臓弁構築物は、標準的な埋入手順、例えば限定されないが、以下に記載するものなどによって埋入され得る。心臓弁は、同所性または異所性の位置に、本来の弁の完全または部分除去を伴って、または伴わずに埋入される。古典的な埋入手法が、本明細書に記載のようにして使用されるか、または埋入は、最小限の侵襲性、血管内または経皮的（下記参照）アプローチを伴うものであり得る。血管移植片の埋入方法も同様に当該技術分野において知られている。
【００５５】
本発明の手法はまた、文献（例えば、限定されないが、ＥＰ  １１５２７８０Ａ１およびＷＯ  ００４５８７４Ａ１など）に記載の方法によって経皮的に埋入可能な弁プロテーゼに適用され得る。これらの特許出願書類には、経皮的経路による心臓弁の埋入のためのデバイスであって、末梢膨張（ｄｅｐｌｏｙｍｅｎｔ）バルーンおよび腋窩（ｃｅｎｔｒａｌ  ａｘｉａｌ）血流ポンプから構成され、インビトロ播種または成熟を必要としない移植片に特に適したデバイスが記載されている。
【００５６】
したがって、本発明は、器官または組織の構造骨格、より詳しくは剪断応力を受ける器官および／または組織の構造骨格、例えば、心血管もしくはリンパ系の構造骨格または尿路の構造骨格などの工学技術における使用のためのマトリックスに関する。最も詳しくは、本発明は、心臓弁および血管組織の構造骨格に関する。本発明の特定の一実施形態によれば、マトリックスを本発明によるホーミング因子（１種類または複数種類）とともに含
む構造骨格が、使用される埋入可能なデバイスの形状に倣って作られ、したがって、予め作製された器官、弁または管に対応する。構造骨格は、生体適合性であり、外科的または経皮的に埋入可能のいずれかである必要がある。本発明では、ステントありおよびステントなしの両方の構造骨格が想定される。
【００５７】
本発明との関連における使用に適当なマトリックスの例としては、人工的に作製および成形された構造骨格（これらは、合成ポリマーまたは生物学的材料のもの、例えば、コラーゲンもしくはフィブリンなどであり得る）および天然の構造骨格（例えば、無細胞根材料または架橋天然材料、例えば心膜など）が挙げられる（図１）。生物学的マトリックスとしては、生物学的材料（例えば、ヒトフィブリンゲルなど）から新たに得られるマトリックスならびに起源（例えば限定されないが、無細胞化大動脈根など）の構造を保持しているマトリックスが挙げられる。生物学的材料は、自系（デバイスが埋入される患者由来）、同種（例えば、埋入物をヒト内に埋入する場合は、ヒト材料由来）または異種の起源（例えば、ヒト埋入物の場合は、ウシ、ブタもしくはヒツジ）のものであり得る。生物学的マトリックスは、そのままのもの（ｆｒｅｓｈ）またはマトリックスの表面上での細胞の成長もしくはマトリックスの柔軟性（例えば、低温保存、ＵＶ照射、光酸化）に欠陥をもたらさないように処理したもののいずれかである。合成移植片は、ポリエステル、発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）および当該技術分野において知られた他の複合材料などの材料で構成され得る。特に、本発明によれば、合成マトリックスは、生体適合性で生分解性の材料、例えば、ポリグリコール酸メッシュおよびポリヒドロキシアルカノエート、細菌由来熱可塑性ポリエステルなどである。あるいはまた、合成デバイスは、ポリエステル、発泡ポリテトラフルオロエチレン（ｅＰＴＦＥ）および当該技術分野において知られた他の複合材料などの材料で構成されたものであり得る。
【００５８】
本発明の特定の一実施形態によれば、マトリックスは非生分解性であり、したがって耐久性があり、身体内での長期間の存在および機能発揮を可能にする。細胞が取り出されたウシ心膜に由来するマトリックス（例えば、Ｖｅｒｉｔａｓ∞  Ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＭａｔｒｉｘまたはＳｙｎｅｒＧｒａｆｔ∞など）が、本発明との関連において想定される。
【００５９】
本発明によるマトリックス上のホーミング因子（１種類または複数種類）の「コーティング」は、種々の様式で行なわれ得る。コーティング手順のうち、３つのコーティング方法が、自然状態でマトリックスに結合するホーミング因子に特に好適であり、含浸手順が使用され得る。この結合は、ホーミング因子およびマトリックスの両方に依存性である。含浸は、ホーミング因子を含む適切な溶媒（例えば限定されないが、リン酸緩衝生理食塩水など）で構成される溶液中でのマトリックスの定温放置を伴う。この溶液は、予備コートされたデバイスおよび手術室内での予備埋入コーティングを可能にするコーティングキットの両方に適用可能である。
【００６０】
あるいはまた、本発明によれば、可溶性コラーゲン、アルブミン、フィブリノゲンまたはフィブロネクチンのいずれかとの同時コーティングが行なわれる。これは、これらのタンパク質と相互作用するホーミング因子を用いる場合、特に好適である。この方法は、細胞外マトリックスタンパク質で予備コーティングすることを含む。この予備コーティングは、マトリックス中の架橋天然タンパク質とその天然対応物との相互作用に基づくものである。次いで、第２段階では、ホーミング因子は、これらの添加された細胞外マトリックスタンパク質に結合する。この場合も、この手順は、埋入可能なデバイスならびにＯＲ内でのコーティングを可能にするキット構成の搬送前に適用してもよい。
【００６１】
あるいはまた、スペーサー分子を伴うか、または伴わない化学的架橋を、マトリックスとホーミング因子との間に確保してもよい。いったん細胞が付着したら、ホーミング因子の存在はあまり重要でなくなるため、スペーサーは永続的なリンカーであっても生分解性
のリンカーであってもよい。該因子は、機能性を維持していれば、マトリックスに直接架橋されていてもよい。別の実施形態は、空間を占めるリンカーアームとの生化学的架橋を伴う。このリンカーアームの具体的な構造は、架橋の生分解性、したがって添加されたホーミング因子の薬物動態の制御を可能にするものである。この架橋のための種々の方法が当該技術分野において記載されている。特に有用なパラダイムは、ＥＰ  ０８２０４８３Ｂ１に記載のような光化学的架橋の使用であるが、異なる架橋方法も想定される（例えば、特許出願公開公報ＥＰ０９９１９４４Ｂ１、ＥＰ１０３５８７９Ｂ１およびＷＯ０１５９４５５Ａ２に記載の方法）。
【００６２】
本発明の特定の一実施形態によれば、１種類以上のホーミング因子および／または化学誘引物質ならびに動員因子がマトリックス上に、融合タンパク質の形態で存在する。融合タンパク質は組換え技術によって得られ得る。次いで、融合タンパク質を、マトリックスとの相互作用に関して特定的に選択し、したがって、融合タンパク質は、ホーミング部分ならびにマトリックス相互作用部分を含む。一般的に、融合タンパク質は、各々が特定のタンパク質をコードする２つの遺伝子の組み合わせで構成される遺伝子の挿入によって遺伝的に改変された宿主生物体によって産生される。これにより、任意の上記のホーミング因子と、架橋マトリックスと相互作用するタンパク質との組み合わせが可能になる。この場合もまた、融合タンパク質構築物中の後者のタンパク質は、限定されないがコラーゲン、フィブリノゲンまたはフィブロネクチンなどの分子の完全または部分ポリペプチドであり得る。融合タンパク質は、一般に、その特異的細胞ホーミングおよびマトリックス結合特性に関して選択される。融合タンパク質は埋入可能なデバイスに、搬送前、またはレシピエントへの埋入の直前にキット構成内でのいずれかで適用され得る。
【００６３】
弁の任意の後続の処理（すなわち、滅菌）によるタンパク質の不活化を回避するために注意を払う必要がある。動員剤、化学誘引剤またはホーミング剤の生物活性を有意に改変しない滅菌手法が好ましい。動員剤、化学誘引剤またはホーミング剤の生物学的活性を保存し得る適切な滅菌条件が当該技術分野において存在し、例えば、負荷したマトリックスの例えば低線量γ照射またはエチレンオキシドでの滅菌などである。特に好適な滅菌方法は、３７〜６３℃の範囲内から選択される温度のエチレンオキシドまたは約１〜約３ｍＲａｄのγ照射または電子ビーム照射である。生物活性剤がタンパク質またはペプチドである場合、生物学的活性は、製剤中に、１）外来タンパク質、例えば、アルブミンまたはゼラチン；および２）フリーラジカルスカベンジャー（抗酸化剤）、例えば、没食子酸プロピル、３−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）またはアスコルビン酸を、生物学的に活性なペプチドの照射誘導分解を遅滞させるのに有効な量で含めることによりγ照射滅菌中に最適化され得る。滅菌は、好ましくは低温（例えば、−７０℃）で行なう。
【００６４】
別の態様によれば、本発明は、疾患または損傷状態の組織、管または器官、例えば限定されないが、疾患または損傷状態の血管または心臓弁を有する患者の処置方法であって、前記患者に、１種類以上のホーミング因子でコートされた本発明の構造骨格を埋入することを含む方法に関する。
【００６５】
特定の一実施形態によれば、構造骨格は、インビボでの播種のために埋入される。しかしながら、あるいはまた、インビトロでの播種も想定される。インビトロ播種は、バイオリアクタ内で起こり得る。本発明に関連して好適なバイオリアクタは当該技術分野において知られており、Ｈｏｅｒｓｔｒｕｐら（２００２，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８（５）：８６３−８７０）によって記載されたものが挙げられる。
【００６６】
本発明に従って使用されるホーミング因子およびこれが結合する細胞の特定の実施形態を図４に示す。当業者には、ホーミング因子の種々の組み合わせがなされ得ることが自明
であろう。さらにまた、本発明の構造骨格の製造および使用ならびに該系の構築および方法における種々の修正および変形もまた想定される。
【００６７】
本発明の構造骨格は、図３に示すような多くのリスクを伴う従来技術の構造骨格と比べて、特別な利点を提供する。第１のリスクは、異種病原体（例えば、プリオン、ウイルスなど）に対する患者の細胞の曝露である。付随的な薬剤リスクがタンパク質溶解酵素または培養培地のいずれかにより導入される。これらの因子は、心臓弁組織工学インビトロ段階に典型的であるが、該リスクは、これらの感染経路に限定的でない。他の感染経路は、異種マトリックス材料または同じ施設内で処置した場合の患者の細胞間の交差感染である。ウイルス感染は、いくつかの特定のリスクを提示し、その多くは、感染の系統（ｓｔｒａｉｎ）（例えば、埋入後患者感染、ウイルスＤＮＡのゲノム挿入による変異誘発、およびおそらく不死化を誘導するウイルスタンパク質のプロト癌遺伝子機能）に依存性である。リスクの第２のファミリーは、細胞がインビトロ条件下で曝露される非生理学的細胞環境要因である。一例は、非生理学的酸素張力、例えば酸化的ストレスによって誘導される潜在的なＤＮＡ損傷である。結論は、該細胞が「自己」であり、その潜在的誘導損傷とは無関係に患者の免疫系に受容されるため、これらの要因の各々を試験する必要があるということである。
【００６８】
以下の図は、本発明を例示するが、本発明を本明細書に記載の具体的な実施形態に限定すると解釈されるべきでない。
【００６９】
実施例
実施例１：構造骨格のＩＰ埋入による弁の工学
適切な細胞の接着に関与する重要な因子を同定するためのシードマトリックスを得るため、未成熟異物反応を用いて、架橋生物学的マトリックス、すなわち光酸化ウシ心膜を再構築（ｒｅｐｏｐｕｌａｔｅ）した。かかる型のマトリックスは、それ自体が耐久性を確保する。ヒツジでは、３日間腹腔内（ＩＰ）埋入した構造骨格またはパッチが、間葉起源で未成熟分化を伴う、筋線維芽細胞表現型に分化し得た（通常、分化する）芽様細胞で覆われる。より詳しくは、これらの細胞は、ビメンチンに関して陽性であるが、Δ平滑筋アクチンおよび重鎖ミオシンに関して陰性であることがわかった（表１参照）。
【００７０】
【表１】
2008518606.tif 000003
【００７１】
数日以内に異なる表現型に分化する耐久性が証明された安定なマトリックスが得られ得ることがわかった。
【００７２】
弁はヒツジＩＰ成熟材料から構築し、ヒツジの肺動脈内に埋入し、機能性について評価した。２４個の弁を埋入した（１２個の未シード対照および１２個の腹腔内シード弁）。２つの群の各々において、肺動脈内への埋入後の２つの時間点を１週間（ｎ＝６／群）および１ヶ月（ｎ＝６／群）試験した。弁機能は、心エコー検査によって評価した。異常は観察されなかった。
【００７３】
腹腔内シード移植片では大きな血栓形成は見られなかったが、対照群では１つ見られた。
【００７４】
【表２】
2008518606.tif 000004
【００７５】
組織学的染色を用いると、対照と腹腔内シード弁構築物間で細胞化において著しい差があることがわかった。対照とは対比的に、細胞の有意な堆積および新しいマトリックスが、腹腔内シード弁上に観察され、これはまた、元のマトリックスの再構築を明白に示した（図６および図７参照）。外植弁および対照試料の７μｍ凍結切片を、ＣＤ４４（クローンＢＡＴ  ３１Ａ、ＶＭＲＤ  Ｉｎｃ．）、ＣＤ４５（クローン１．１１．３２、Ｓｅｒｏｔｅｃ）、ＣＤ１７２ａ（クローンＤＨ５９Ｂ、ＶＭＲＤ  Ｉｎｃ．）、ビメンチン（クローンＶ９、ＤＡＫＯ）、ＡＳＭＡ（クローン１Ａ４、ＤＡＫＯ）、ＳＭＭＳ−１（クローンＳＭＭＳ−１、ＤＡＫＯ）、リン酸化ヒストンＨ３（ポリクローナル、ＣＡＭＰＲＯ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＣＤ１１７（ポリクローナル、ＡＢＣＡＭ）、ｅｃＮＯＳ（クローン３、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＭＨＣ−Ｉ（クローンＨ５８Ａ、ＶＭＲＤ，Ｉｎｃ）、ＭＨＣ−ＩＩ（クローンＴＨ１４Ｂ、ＶＭＲＤ，ＩｎｃおよびＣＤ３４（クローンＱＢＥｎｄ  １０、ＤＡＫＯ）について免疫蛍光法により染色した。
【００７６】
［ＣＤ４４：Ｈ−ＣＡＭ、細胞表面分子結合ヒアルロン酸；ＣＤ４５：白血球共通抗原；ＣＤ１７２ａは、単球および幹細胞のマーカである；ビメンチンは、間葉細胞のマーカである；α平滑筋アクチン（ＡＳＭＡ）は、筋線維芽細胞および平滑筋細胞のマーカである；重鎖ミオシン（ＳＭＭＳ−１）は、平滑筋細胞のマーカである；リン酸化ヒストンＨ
３は、有糸分裂のマーカである；ＣＤ１１７は、幹細胞のマーカである；ｅｃＮＯＳは、内皮のマーカである；ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩは、免疫応答のマーカである；ＣＤ３４は、前駆細胞のマーカである］
埋入したマトリックス材料内および該材料上に存在する細胞を、完全葉状構造（ｌｅａｆｌｅｔ）の一切片において計測した。自発的シード対照は、肺内の位置に埋入後１週間および１ヶ月で、それぞれ、３７５３［９９５，１７２５４］および３３４５［１５６２，４２９８］細胞／切片を有した。他方において、ＩＰ予備シード弁は、１週間および１ヶ月で、それぞれ、１２１２６［４５７１，２８２１６］および２０４０４［４７２３，３２０８４］細胞／切片を有した。自発弁とＩＰ予備シード弁間のこの４〜７倍の細胞計測数の増加は有意であった。
【００７７】
弁切片で見られた陽性細胞の割合を図８の表にまとめる。すべての群および染色のデータをメジアン値および９５％信頼区間として示す。これらはパーセンテージであるため、陽性細胞の割合のみが示されており、観察した全細胞での大きな差、細胞型絶対計測数での大きな差は明白であることに留意されたい。
【００７８】
これらの所見は、これらの細胞が、筋線維芽細胞を有する安定化された生物学的マトリックスを再生させる潜在性を明白に示す。さらにまた、１ヶ月埋入物は、すでに、自発的内皮再生の徴候を示した。再細胞化のプロセスは、新たに堆積される材料の量が連続増加性でなく、内皮によって覆われているため、自己制御型のようである。これにより、新しい細胞が付着し、再細胞化プロセスに寄与することが抑制される。
【００７９】
安定化した生物学的マトリックスを使用したが、腹腔内播種によって得られる細胞は、このマトリックスを修飾することができるとともに、自身を堆積させることができる。
【００８０】
異種マトリックス材料および自己細胞から構築されたこのバイオハイブリッド弁は、マトリックスの信頼性を細胞の生存能と組み合わせる。細胞は間葉起源のものであり、細胞再構築のために適切な表現型、筋線維芽細胞に分化し得る。本試験は、再構築は、マクロファージによって媒介または開始されるが、（造血）幹細胞由来であることを示す。
【００８１】
実施例２：腹腔内マトリックスへの幹細胞誘引
マトリックス材料をラットの腹腔内に導入し、誘引された細胞の型を調べた。
【００８２】
動物
雄Ｗｉｓｔａｒラット（ｎ＝３６；３８０〜４００ｇ）を選択した。食餌に対する接近は随意とした。動物はすべて、「Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ」（ＮＩＨ出版物８５−２３、１９８５年改定）に従って飼育した。試験は、地元の倫理委員会によって承認されたものであった。
【００８３】
手順
およそ２０分を要した外科的処置中、麻酔を１００％酸素中４％イソフルレンを１ｌ／分で５分間で導入し、１００％酸素中２％イソフルレンを０．５ｌ／分で維持した。剃毛および消毒後、皮膚、腹筋および腹膜を通しておよそ１．５ｃｍの傍腹直筋切開を行なった。マトリックス材料を含むステンレス鋼ケージを腹腔内に挿入し、経腹縫合（Ｔｉｃｒｏｎ  ３−０）により腹壁に固定した。腹膜および腹筋を連続（ｒｕｎｎｉｎｇ）縫合（Ｔｉｃｒｏｎ  ３−０）により閉鎖し、身づくろい動作による創傷の開口を回避するため、皮膚を皮内縫合した（Ｔｉｃｒｏｎ  ３−０）。外科的処置後、麻酔を中止した。およそ５分後、動物は意識を回復し、個々のケージに入れられた。
【００８４】
条件
マトリックス材料の回収を種々の時間点に行なった。種々の回収時間は、動物が割り当てられた群に応じて、埋入後６時間、１、２、３、５および７日間とした。この目的のため、動物を再度麻酔し、創傷を再度開口し、ケージを取り出した。
【００８５】
材料
回収したマトリックス材料を、Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ培地（Ｌｅｉｃａ−Ｖａｎ  Ｈｏｐｐｌｙｎｕｓ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ブリュッセル，ベルギー）中に包埋し、液体窒素中でスナップ凍結し、−８０℃で保存した。凍結切片の薄片化をＭｉｃｒｏｍ  ＨＭ５００  ＯＭクリオスタット（Ｐｒｏｓａｎ，メーレルベーク，ベルギー）において行なった。７μｍ切片を、ポリ−Ｌ−リシンコートしたスライド上に置き、染色まで−２０℃で保存した。
【００８６】
染色の前に、材料を氷冷アセトン中に１０分間固定した。続いて、マトリックス切片を抗体で免疫組織化学的に染色した。一次抗体を、ＦＩＴＣコンジュゲート二次抗体で検出した。Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｃａｍ  ＭＲｃ５カメラを備えたＡｘｉｏｐｌａｎ  ２イメージング顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ；ザヴェンテム，ベルギー）を用い、室温で写真を撮影した。用いた対物レンズは、Ｐｌａｎ−ＮＥＯＦＬＵＡＲ  １×／０．０２５，Ｐｌａｎ−ＡＰＯＣＨＲＯＭＡＴ  １０×／０．４５および２０×／０．７５であった。Ａｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｌ．４．４を用いて画像解析を行なった。
【００８７】
細胞の表現型を詳細に試験するため（免疫組織化学）、これらを、機能または特異性に従って分類する。細胞密度および増殖を腹腔内埋入後６つの時間点（ｎ＝６／時間点）で試験した。
【００８８】
【表３】
2008518606.tif 000005
【００８９】
データを平均±標準偏差として示す。ａは６時間との有意差（ｐ＜０．０５）；ｂは５日との有意差（ｐ＜０．０５）；ｃは３日との有意差（ｐ＜０．０５）。
【００９０】
表３は、腹腔内埋入を進行させてから６時間後に細胞が完全に無細胞埋入材料上に存在することを示す。埋入物内においては、一般的に経時的な細胞数の増加が見られ得、進行させてから第１日に有意となる。埋入後７日間で、４倍より多くの細胞数の増加が観察される。インサイチュ細胞増殖を評価するために用いたマーカであるリン酸化ヒストンＨ３（ＰＰＨ−Ｈ３）は、埋入後第３日にインサイチュ細胞増殖においておよそ５％の有意なピークを示す。第３日の細胞増殖におけるピークの存在を除き、これらのデータは、細胞
分裂ではなく細胞流入による組織の新生を支持する。細胞増殖が細胞性（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）の増加に寄与していると思われるのは第３日のみである。
【００９１】
細胞結合およびホーミング能力を、ＶＬＡ−４（ＣＤ４９ｄ）、ＣＤ４４およびＣＤ１７２ａまたはシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）に対する抗体を用いて評価した。図９は、ＶＬＡ４＋細胞が細胞集団のほぼ２０％を含むＦＢＲの第１段階に明白に存在すること、およびこの割合が腹腔内埋入の５日後にほぼ非存在となるまで有意に減少することを示す。ＣＤ４４＋細胞は、６時間での測定値と比べ、同様の開始存在度を示し、第２、５および７日に有意に減少するが、その存在は、第７日まで約１０％に維持される。ＣＤ１７２ａデータは、その減少が有意に存在しないこと、および少量だが統計学的に有意なピーク第３日に存在することを除き、ＣＤ４４データと同じ次数（ｏｒｄｅｒ）の大きさ以内で存在するこれらの細胞の同様の存在パターンを示す。Ｔ細胞、Ｂ細胞、胸腺細胞、ＣＤ３４＋造血幹細胞および内皮細胞上に見られるＶＬＡ−４（ＣＤ４９ｄ）は、骨髄基質上の血管細胞接着分子−１（ＶＣＡＭ−１）に結合するインテグリン分子であり、骨髄基質への幹細胞および前駆細胞のホーミングに関与する（Ｋｒａｕｓｅら（１９９６）Ｂｌｏｏｄ  ８７，１−１３）。ＶＬＡ−４はまた、フィブロネクチンへの造血前駆細胞の付着を媒介する（Ｌｅｖｅｓｑｕｅ  ＆（１９９９）Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２７，５７９−５８６）。白血球、造血前駆細胞（Ｎｅｔｅｌｅｎｂｏｓら（２００２）Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．７２，３５３−３６２）および間葉幹細胞（Ｒｏｍｂｏｕｔｓ  ＆  Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ（２００３）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １７，１６０−１７０）上の接着分子であるＣＤ４４は、細胞−細胞および細胞−ＥＣＭ相互作用を媒介すること、炎症部位への白血球輸送においてある役割を果たすこと、およびリンパ球活性化および組織浸潤を同時刺激することが示されている（Ｗｕら（２００５）Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．１５，４８３−４９４）。さらにまた、細胞表面プロテオグリカンＣＤ４４と細胞外マトリックスグリコサミノグリカンヒアルロナン（ＨＡ）との相互作用は、炎症における重要な事象である（Ｌｅｖｅｓｑｕｅら，前掲）。埋入直後のＶＬＡ−４＋およびＣＤ４４＋の両方の細胞の割合のレベルの上昇は、細胞が分化し始める後期段階中に有意に減少する（これは、絶対細胞数においても観察される）これらの分子によって媒介される細胞結合およびホーミング能力の増加を明白に示す。
【００９２】
最も重要なことに、幹／前駆細胞によって主に発現される４つのマーカ：ＣＤ１３３、幹細胞抗原−１（Ｓｃａ−１）、ＣＤ３４およびＣＤ１１７（ｃ−キット）を試験した（図１０参照）。試験したうちで最も原始的な幹細胞であるＣＤ１３３＋細胞の割合（Ｇｅｈｌｉｎｇら（２０００）Ｂｌｏｏｄ  ９５，３１０６−３１１２）は、非常に少なく、埋入３日後に１例のラットにおいてその最大２．３％に達した。Ｓｃａ−１は、原始造血細胞および間葉幹細胞によって提示されることが知られている。腹腔内埋入の初期段階の間、これらの細胞がおよそ７％見られた。ＣＤ３４およびｃ−キット（ＣＤ１１７）はともに、循環造血幹細胞および前駆細胞のマーカである（Ｏｋａｍｏｔｏら（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５，２７５７−２７６３）。Ｃ−キットはまた、間葉幹細胞上にも発現される。ＣＤ３４＋細胞の時間的プロフィールは、埋入物材料上に見られるこれらの細胞の割合の漸増を示し、第２および３日に有意なピーク値約５〜８％に達する。注目すべきは、ＣＤ３４＋細胞の低レベルへの非常に急速な戻りが既に第５日に明白であり、その後、第７日に向かって再度有意な増加がみられることである。ｃ−キットのパターンは、第２および３日におよそ２％の有意なレベル上昇を示す。膜貫通細胞表面抗原であるＣＤ１３３の発現は、ＣＤ３４＋幹細胞および前駆細胞のサブセット（Ｂｕｈｒｉｎｇら（１９９９）Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７２，２５−３８）および内皮前駆細胞（Ｇｅｈｌｉｎｇら，２０００，前掲）に限定的である。さらに、これは、少数割合（およそ０．２％）のＣＤ３４−細胞によって発現される（Ｇａｌｌａｃｈｅｒら，前掲）。ＣＤ３４＋ＣＤ１３３＋細胞は原始細胞および骨髄性前駆細胞において富化されているが、ＣＤ３４＋ＣＤ１３３−細胞は、主に、Ｂ細胞および後期赤血球前駆細胞からなる（Ｂｕｈ
ｒｉｎｇら，１９９９，前掲）。ＣＤ１３３抗原は、埋入されるパッチ内に散発的に存在し、これは、ＦＢＲでの新しい組織の形成において、これらの原始細胞の非常に限定的な寄与を示す。Ｓｃａ−１は、骨髄および末梢血中の多能性原始造血幹細胞上、ならびに間葉幹細胞上に発現される。Ｓｃａ−１＋細胞は、Ｓｃａ−１−細胞よりも原始的であり、造血因子の組み合わせ（例えば、ＳＣＦおよび間質細胞）に対してより良好に応答する（Ｏｋａｄａら（１９９２）Ｂｌｏｏｄ  ８０，３０４４−３０５０；ＲｏｍｂｏｕｔｓおよびＰｌｏｅｍａｃｈｅｒ  前掲；Ｓｐａｎｇｒｕｄｅら（１９９１）Ｂｌｏｏｄ  ７８，１３９５−１４０２）。興味深いことに、埋入直後にこれらの細胞がかなり多くの割合で観察され、後期段階で漸減した。絶対細胞数のピークが埋入２日後に観察された。総合すると、これらの所見は、これらの細胞が、ＦＢＲ反応に対する主要な初期の寄与物質であることを明白に示す。
【００９３】
ＣＤ３４およびＣＤ１１７の両方を、ＣＤ１３３およびＳｃａ−１と比べてより委任性の幹細胞および前駆細胞のマーカとして用いた。マーカＣＤ３４は、単鎖の膜タンパク質であり、造血幹／前駆細胞、内皮前駆細胞および毛細血管内皮細胞の存在を示す。Ｃ−キット（ＣＤ１１７）は、レセプタチロシンキナーゼファミリーの一構成員であって、幹細胞因子（ＳＣＦ）のレセプタであり、造血原始幹細胞および委任前駆細胞上（Ｏｋａｄａら，前掲）、循環未成熟細胞上（Ｔａｇｕｃｈｉら（２００４）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ
１０９，２９７２−２９７５）および間葉幹細胞上（Ｒｏｍｂｏｕｔｓ  ａｎｄ  Ｐｌｏｅｍａｃｈｅｒ  前掲）に発現される。これらの結果は、２および３日間の埋入でＣＤ３４＋およびｃ−キット＋細胞の両方の一時的なレベル上昇を示し、これは、ＣＤ３４＋細胞の割合に特に顕著であった。これらの細胞は、第３日に明白なピークを示し、初期のＳｃａ−１＋細胞の割合に近かった。これらの所見は、より委任性のｃ−キット＋へのＳｃａ−１＋細胞の分化、または初期ＦＢＲに存在する他の細胞（おそらくマクロファージ）から放出されたシグナル伝達因子による血流からのこれらの細胞型の一時的な漸増によるＣＤ３４＋細胞のいずれかによって説明され得る。ＣＤ３４＋細胞のそのピーク時の絶対数は、Ｓｃａ−１の絶対細胞計測数を大きく超えるため、後者の説明が、より容認され得る。
【００９４】
本発明により、驚くべきことに、ラット腹腔内埋入モデルにおいて、未成熟異物反応中、幹細胞および前駆細胞が組織に誘引され、（筋）線維芽細胞を伴うマトリックスの再構築に積極的に関与することがわかった。
【００９５】
実施例３：組織新生における特異的遺伝子発現
前述のように、組織新生は、心臓弁などの血管構造と類似する細胞成分を伴う層状組織をもたらすことができるため（Ｂｕｔｌｅｒら，２００１ａ  前掲；Ｂｕｔｌｅｒら，２００１ｂ  前掲）、成体動物モデルにおけるＦＢＲで起こるため、これを試験した。残念ながら、成熟組織は、弁の品質が変動しやすい方法である手術室における弁プロテーゼの構築を必要とし得るため、理想的な解決手段ではない（Ｇｒａｂｅｎｗｏｇｅｒら（２０００）Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ  Ｄｉｓ  ９，１０４−１０９）。それにもかかわらず、組織新生それ自体は、新しい組織の構築に必要なあらゆる成分、すなわち、細胞（実施例２）、新しい細胞外マトリックス、シグナル伝達分子およびホーミングタンパク質を含むため、興味深い特徴である。細胞外マトリックスへの細胞の物理的連結を担う分子であるホーミングタンパク質が同定された。
【００９６】
実施例２と同様に、完全に無細胞で架橋マトリックスである光酸化ウシ心膜をステンレス鋼ケージ中に懸濁し、Ｗｉｓｔａｒラットの腹腔内に埋入した。２つの異なる埋入期間（１．５日間および３日間）を各群２匹のラットで試験した。埋入物を、動物が割り当てられた群に応じて１．５日または３日後に回収した。この目的のため、動物を再度麻酔し、創傷を再度開口し、ケージを取り出した。回収したら、マトリックスパッチを直ちに、
ＲＮＡ抽出までＲＮＡｌａｔｅｒ  ＲＮＡ  Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ試薬（Ｑｉａｇｅｎ）中に入れた。
【００９７】
バックグラウンド遺伝子発現、すなわちマクロファージの遺伝子発現を、３匹のラット由来のチオグリコレート−（２ｍｌ  ３％チオグリコレート含有滅菌生理食塩水、濾過滅菌済み）誘導腹腔内マクロファージから得た。
【００９８】
全ＲＮＡを、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて抽出した後、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎ  Ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてさらに精製した。全ＲＮＡを、それぞれ、Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｌｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）およびＮａｎｏｄｒｏｐ分光測光器を、ＶＩＢ（Ｆｌｅｍｉｓｈ  Ｉｎｔｅｒｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｒｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで用いて、その完全性について制御および精製した。プローブを５μｇの全ＲＮＡから調製したところ、アフィメトリクスのガイドラインによると、分解または不純物の兆候は示されなかった（２６０／２８０および２６０／２３０＞１．８）。簡単には、全ＲＮＡから、ポリｄＴ−Ｔ７プライマーを用いてポリ−Ａ  ＲＮＡを逆転写し、Ｔ７インビトロ転写反応中、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＩＶＴ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（カタログ番号９００４４９，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ハイウィカム，ＵＫ）を用いて標識した。プローブを精製し（ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｃｌｅａｎｕｐ  Ｍｏｄｕｌｅ，カタログ番号Ｐ／Ｎ  ９００３７１，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＵＫ）、再度、収量について解析し（３０〜ｌ２０μｇ）、精製した（２６０／２８０および２６０／２３０  ＞１．８）。２０μｇをアルカリ加水分解で断片化した。断片化したａＲＮＡを、対照スパイク（ｓｐｉｋｅ）含有３００μｌハイブリダイゼーションバッファー（Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｋｉｔ，カタログ番号９００２９９，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ハイウィカム，ＵＫ）で再懸濁し、２００μｌのプローブを４５℃の回転式（ｒｏｔｉｓｓｅｒｉｅ）の炉内でハイブリダイズさせた。遺伝子チップ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｒａｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  ２３０  ２．０  Ａｒｒａｙ，Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＵＫ）を洗浄し、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ
４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＵＫ）中で、ＥｕｋＧＥ−ＷＳ２ｖ４プロトコルを用いて染色し、続いて、ＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｓｃａｎｎｅｒ  ３０００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，ＵＫ）でスキャンした。画像解析をＧＣＯＳにて行なった。
【００９９】
実験は、種々の動物から得た非プール試料を用いて３連で行なった。画像解析をＧＣＯＳにて行なった。有意性ｐ＜０．０５でバックグラウンドレベル超に達するプローブ強度値を、プレゼントコール（ｐｒｅｓｅｎｔ  ｃａｌｌｓ）とみなした。マイクロアレイデータの機能分析を、遺伝子をＧｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙカテゴリーに従って分類するＯｎｔｏ−Ｅｘｐｒｅｓｓを用いて行なった［Ｄｒａｇｈｉｃｉら（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１，３７７５−３３８１］。
【０１００】
実施例３に示すように、一次反応が起こった後、細胞外マトリックス分子およびホーミングタンパク質の構築が起こり、第３日に細胞付着部位が提供される。
【０１０１】
マイクロアレイチップ上に存在するすべての遺伝子（±３１０００）を解析に考慮した。ベン図（図１１）に、遺伝子発現所見の概要を示す。ＦＢＲおよびＩＰの発現プロフィールを比較すると、３８６８  ＦＢＲ３および２９５７  ＦＢＲ１．５特異的遺伝子（非マクロファージ起源）が見出された。主要な遺伝子は、細胞外マトリックスタンパク質および幹細胞の誘引およびホーミングを可能にするシグナル伝達タンパク質をコードし、これは、未成熟ＦＢＲに関与することが示されている。有意なシグナルが、ＦＢＲ１．５およびＦＢＲ３の両方の種々のコラーゲンおよびラミニンの構造分子について見られたが、
ＧＯによって分類されるこれらの分子の一般的な発現は、後者の群でのみ有意であることが示された。これは、ＦＢＲ１．５群の一部の構造分子の発現とは無関係に、該遺伝子の有意な寄与はＦＢＲ３群において見られること、すなわちポスト細胞（ｐｏｓｔ  ｃｅｌｌ）ホーミングを意味する。ＦＢＲ３およびＦＢＲ１．５では、それぞれ８５個および１１６個の遺伝子が、造血幹細胞に結合する分子であり、したがって、生物学的マトリックスへの組込みの興味深い候補である間質細胞由来因子１γ（ＳＤＦ−１）のシグナル伝達体活性（ＧＯに関して）に帰属した。
【０１０２】
これらの結果から、ＳＤＦ−１およびＳＣＦの両方がこの成体組織新生に存在し、両方が、血管／弁プロテーゼへのインビボ幹／前駆細胞ホーミングの研究対象となる候補ホーミングタンパク質と思われる。
【０１０３】
実施例４：ラットにおける頚動脈移植片
ナノコート材料の再播種の可能性を、小径（ｃａｌｉｂｒｅ）血管移植片を総頚動脈内に挿入物として移植することにより評価した。移植片は光酸化心膜から、ＳＤＦ−１またはＳＣＦのいずれかをフィブロネクチンでのウシ心膜の前コーティングありまたはなしで、１μｇ／管１つ（３０μｌのＰＢＳ中）で用いて手作業で作製した。移植片を所定の位置に、細胞接着を達成するのに充分だが、該細胞の分化（これは、その幹細胞の特性の低下をもたらし得る）をもたらすのには充分でない２４時間だけ維持した。ラット頚動脈の内径に近い内径を有するウシ心膜の管を作製した。移植片は、光酸化の小パッチを小ゲージプラスチック製カニューレの周りに回転させ、マイクロ手術の技術を用いて縦方向の両端を縫合することにより製作した。移植片の長さはおよそ５ｍｍであり、内径は１０倍小さい。移植片の内径を総頚動脈の内径と比較すると、移植片の直径がおよそ２０％大きくなっていることが明らかになった。この直径の増大は、予備埋入物が数週間、特許（ｐａｔｅｎｔ）に維持されたため、選択された。
【０１０４】
埋入プロトコルは、Ｂｏｅｃｋｘ（１９９７）Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．６３，Ｓ１２８−Ｓ１３４）によって公表されたウサギ用のプロトコルを適合させたものである。３８０〜４００ｇの雄Ｗｉｓｔａｒラット（各材料群でｎ＝６）を、イソフルレン（導入：４％；術中：２％）で麻酔した。剃毛およびヨード（ｊｏｄｉｕｍ）アルコールでの消毒後、総頚動脈を切開して周辺組織を除き、Ａｃｌａｎｄ型マイクロクランプ内にマウントした。次いで、動脈を横に切開し、移植片構築物の近位および遠位の両方を１０／０モノフィラメントナイロンにより、９〜１２針縫合を必要とする７時縫合（７  ｏ’ｃｌｏｃｋ  ｓｔｉｔｃｈ）手法（Ｋｉｒｓｃｈら（１９９２）Ａｍ．Ｓｕｒｇ．５８，７２２−７２７）を用いて縫合した。針は、管壁の厚み全体に通した（ｃａｔｃｈ）。針が動脈の脈管内膜に触れないことにだけ注意を払った。全手順は、鎮痙剤（例えば、パパベリン）および抗凝血剤（例えば、ヘパリン）なしで行なった。最後の一針の縫合後、二重Ａｃｌａｎｄ型マイクロクランプを取り出した。数分して完全な止血を確認した後、皮膚を閉鎖した。麻酔を中止して、およそ５分後に動物が覚醒し、個々のケージに移された。
【０１０５】
２４時間後、創傷を再度開口し、移植片を取り出し（ｐｒｅｌｅｖａｔｅｄ）、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄した。移植片および各吻合部において、小部分の天然頚動脈を切除した。内腔をリン酸緩衝生理食塩水で穏やかにフラッシュ洗浄し、続いて、Ｔｉｓｓｕｅ
Ｆｒｅｅｚｉｎｇ培地を充填した。同じ培地中に包埋した後、試料を液体窒素中にスナップ凍結し、−８０℃で保存した。切片化を、Ｍｉｃｒｏｍ  ＨＭ５００  ＯＭ  クリオスタット（Ｐｒｏｓａｎ，メーレルベーク，ベルギー）において行なった。７μｍの縦長切片を、ポリ−Ｌ−リシンコートされたスライド上に置き、染色まで−２０℃で保存した。
【０１０６】
幹細胞誘引に重点を置くため、試料を、４つのマーカ：ＣＤ３（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎ
ｇｅｎ；クローンＧ４．１８）、ｃ−キット（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；クローンＨ−３００）、ＣＤ３４（ＤＡＫＯ；クローンＱＢＥｎｄ  １０）、Ｓｃａ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ；ヤギポリクローナル）について免疫組織化学的に染色した。以下の表は、各抗体によって染色された細胞型を示す。
【０１０７】
【表４】
2008518606.tif 000006
【０１０８】
すべての一次抗体を、フルオロクロームであるＦＩＴＣまたはテキサスレッドコンジュゲート抗体により検出した。画像解析を、Ａｘｉｏｐｌａｎ  ２イメージング顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ，ザヴェンテム，ベルギー）およびＡｘｉｏｖｉｓｉｏｎ  ４．４ソフトウエアパッケージ（Ｚｅｉｓｓ，ザヴェンテム，ベルギー）を用いて行なった。細胞の表現型分類のため、合計２５０個の細胞を各長さ方向の断面について評価し、その結果を、パーセントで示した。偏りを回避するため、数枚の写真を撮影し、無作為リストに従って４分割して計測した。
【０１０９】
全体的に、定量的細胞接着において差は見られなかった（表５）。
【０１１０】
【表５】
2008518606.tif 000007
【０１１１】
ＣＤ３４陽性細胞は、２つの群に見られた。これらの細胞は、ラットの血管内への埋入後に自発的播種に供しただけの対照に存在した（１．８５［０．００，７．２１］％）。さらにまた、これらは、ＳＣＦ含浸光酸化ウシ心膜（３．８４［０．００，１１．０８］％）内に存在することが示され、数値の増加が見られたが、これは、個体間で大きくばらつくため、有意でないことがわかった。残りの３つの群は、ＣＤ３４＋細胞を含まなかった。
【０１１２】
ＣＤ１１７免疫染色の結果を図１２（Ａ）に示す。光酸化心膜から構成される対照試料は、ラットの頚動脈に埋入した後、４．７０［２．１４，１２．１７］％のメジアン存在度のＣＤ１１７＋細胞を示した。同じマトリックス材料にＳＣＦまたはＳＤＦ−１のいずれかを含浸すると、埋入物の管腔側面内および該側面上のＣＤ１１７＋細胞の割合が有意に増加した。ＳＣＦおよびＳＤＦ−１について、それぞれ、１５．７８［１０．０４，４７．９０］％および３４．０２［２６．３２，３７．３９］％の割合が見られた。フィブロネクチンの同時含浸は、ＣＤ３４＋およびＳｃａ−１＋細胞の存在に対して効果を有しなかったが、ＣＤ１１７＋細胞のホーミングにおいて明白な増加が見られた。フィブロネクチンおよびＳＣＦの同時含浸は、４７．８４［４１．１０，６６．００］％のＣＤ１１７＋細胞割合をもたらした。数値が大きく増大したが、これは、ＳＣＦ群においてＣＤ１１７＋割合が大きくばらつくため、有意でないことがわかった。他方において、フィブロネクチンおよびＳＤＦ−１同時含浸群においてＣＤ１１７＋割合に見られた増加（４８．９０［４２．３２，５４．０８］％）は、ＳＤＦ−１群と比べ、有意に増加していることがわかった。一般に、すべての含浸プロトコルによってＣＤ１１７陽性細胞のホーミングの増強が誘導されること、および特に、ＳＣＦまたはＳＤＦ−１のいずれかとフィブロネクチンとの組み合わせにより、このマーカに陽性である細胞が約５０％もたらされることがわかった。
【０１１３】
最後に、フィブロネクチンでの予備コーティングありまたはなしで、ＳＤＦ−１またはＳＣＦでコートした光酸化ウシ心膜へのＳｃａ−１＋幹細胞の誘引を調べた（図１２ｂ参照）。対照では、いくらかのＳｃａ−１陽性細胞が、６つの埋入物のうち２つに見られた。同じマトリックス材料を含浸させると、これは、ａｌ埋入物においてＳｃａ−１陽性細胞接着をもたらすともに、Ｓｃａ−１陽性細胞の割合の有意な増加をもたらした。Ｓｃａ−１陽性細胞は、幹細胞群またはＴ−細胞のサブセットのいずれかに帰属し得る。Ｔ−細胞に関する染色（抗ＣＤ３免疫組織化学）は、すべての埋入物で陰性であることが示され、それにより、含浸させた材料へのＳｃａ−１陽性幹細胞の特異的ホーミングが確認された。
【０１１４】
実施例５：ヒツジの頚動脈内に埋入されたパッチ
ＳＣＦおよびＳＤＦ−１を含浸させたウシ心膜パッチを、ヒツジの頚動脈内に埋入した。両タンパク質は、フィブロネクチンでのマトリックス材料の前コーティングありまたはなしで使用した。４つのパッチを、各（左および右）頚動脈内に埋入した。各側で、対照、１μｇ、３μｇおよび１０μｇ／ｃｍ２コートパッチを埋入した。対照は、下流に埋入し、続いて、１、３および１０μｇ／ｃｍ２パッチを、１０μｇ／ｃｍ２パッチを一番上流位置にして埋入した。図１３は、いくらかのＣＤ３４＋細胞（造血幹／前駆細胞）が見られたことを示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１５】
【図１】図１は、本発明の特定の一実施形態による構造骨格の選択肢の一般的概要を示す概略図である。第１の群は、成形された構造骨格である。これらには、弁の構造骨格を創製するために生物学的または非生物学的熱可塑性物質のいずれかが用いられている。一般に、これは、熱可塑性の硬化を許容する鋳型を用いて、またはエレクトロスピニング（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｉｎｎｉｎｇ）として知られる方法によってなされる。別の選択肢は、かかる弁を創製するのにコラーゲンまたはフィブリンなどのタンパク質を用いることである。このような構築物は、例えば患者から得られる天然のタンパク質から作製され、同種もしくは異種起源または組み換えられたものである。これらのタンパク質を、次いで、弁の鋳型内で互いに相互作用させる。第２の群は天然の構造骨格、すなわち、同種または異種の生物学的弁である。２つの主要なクラス（１）無細胞化大動脈根および（２）架橋プロテーゼに識別され得る。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に従う心臓弁組織工学において実施される完全組織工学パラダイムを示す概念図である。弁構築物は、適切に選択した構造骨格上での適切な細胞の播種によって作製される。これらの細胞は、内皮細胞、線維芽細胞または弁間質細胞であり得る。次いで、インビトロで創製した弁構築物をバイオリアクタ内に一定期間入れて、該細胞を漸増する流れおよび圧力に慣らしつつ構築物を熟成させる。次いで、成熟構築物を、一般的には数週間後にレシピエント内に埋入し、インビボリモデリングに供することができる。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に従う心臓弁組織工学における完全パラダイムのリスクを示す概略図である。
【図４】図４は、ホーミングタンパク質および本発明の一実施形態による特定の細胞型上に存在するそれぞれのレセプタを示す概略図である。フィブリノゲンのＰ１またはＰ２エピトープは、マクロファージによって発現されるｍａｃ１インテグリンと相互作用する。幹細胞因子（ＳＣＦ）は、「間葉」幹細胞（ＭＳＣ）のプロテインチロシンキナーゼレセプタ（ｃ−キットまたはＣＤ１１７）に結合する。造血幹細胞（ＨＳＣ）のホーミングは、種々の相互作用によってなされ得る。これは、間質由来因子１（ＳＤＦ−１）がそのレセプタＣＸＣＲ４に結合することによって優先的になされる。ＨＳＣはまた、後期（ｖｅｒｙ  ｌａｔｅ）抗原（ＶＬＡ）４または５によってフィブロネクチン（ＦＮ）に結合し、さらに、ＶＬＡ−４もまた、血管細胞接着分子１またはＶＣＡＭ−１に結合する。後者の結合は、多面発現性プロテアーゼインヒビターα２−マクログロブリン（α２−ＭＧ）によって増強され得る。
【図５】図５は、本発明の一態様による細胞播種後の本発明の構造骨格の概略的立体構造である。マトリックス上のホーミングタンパク質は、誘引された細胞のレセプタと相互作用する。細胞結合の特異性は、ホーミングタンパク質の適切な選択肢によって決定される。
【図６】図６は、本発明の一態様による自発的シード葉状構造（Ａ）および予備シードされたＩＰ（Ｂ）の例である。パネルＣは、１週間および１ヶ月での自発的シード葉状構造およびＩＰ予備シード葉状構造の両方の再細胞化（全細胞計測数／葉状構造長）を示す。＊：ｐ＜０．０５。
【図７】図７は、組織学である。グラフＡ：１週間および１ヶ月での自発的シード葉状構造およびＩＰ予備シード葉状構造の両方の過剰成長の中央値。グラフＢ：ウシ光酸化心膜上に新たに堆積したマトリックスのメジアン表面。グラフＣ：表面から先端まで測定した葉状構造長のメジアン値。＊：ｐ＜０．０５
【図８】図８は、本明細書の実施例１に記載の細胞マーカに対する抗体を用いた埋入弁のキャラクタライゼーションである。データをメジアン［９５％Ｃｌ］として示す。＊は、１週間群間有意差を示す。†は、両対照群間または両ＩＰシード群間のいずれかの有意差を示す。‡は、両１ヶ月群間の差を示す。§は、ＩＰ試験試料と有意に異なることを示し、ｅは、ｎ＜６のため、統計学的解析を行ない得なかったことを示す。
【図９】図９は、ＦＢＲの種々の段階時に該材料中に存在する（Ａ）ＶＬＡ−４＋（Ｂ）ＣＤ４４＋および（Ｃ）ＣＤ１７２ａ＋細胞の割合である。ドットおよびエラーバーは、平均±標準偏差を表す。ａ）６時間と有意に異なる（ｐ＜０．０５）；ｂ）６時間、１、２および３日間と有意に異なる（ｐ＜０．０５）；ｃ）３日間と有意に異なる（ｐ＜０．０５）；ｄ）２日間と有意に異なる（ｐ＜０．０５）。ＣＤ１７２ａでは、２例のラットデータ不明のため、６時間データを統計学的解析から除外する。細胞結合およびホーミング能力は、埋入直後に高く、一般的に、その後は、第３日のＣＤ１７２ａ＋細胞の有意なピークを除いて減少する。
【図１０】図１０は、ＦＢＲの種々の段階時に該材料中に存在する（Ａ）ＣＤ１３３＋および（Ｂ）Ｓｃａ−１＋原始幹細胞の割合、ならびに（Ｃ）ＣＤ３４＋および（Ｄ）ＣＤ１１７＋前駆細胞の割合である。ドットおよびエラーバーは、平均±標準偏差を表す。ａ）５日間と有意に異なる（ｐ＜０．０５）；ｂ）３、５および７日間と有意に異なる（ｐ＜０．０５）；ｃ）３日間と有意に異なる（ｐ＜０．０５）；ｄ）２日間と有意に異なる（ｐ＜０．０５）。見てわかるように、Ｓｃａ−１＋原始幹細胞は、その存在下で埋入後６時間にピークを有するが、ＣＤ３４＋およびＣＤ１１７＋前駆細胞は、その存在下で埋入後２および３日間にピークを有する。
【図１１】図１１は、１．５および３日後の腹腔内埋入物ならびに本発明の一態様による腹腔内マクロファージ（ＩＰ）マイクロアレイ評価した遺伝子発現プロフィールから得られた結果である。
【図１２Ａ】図１２Ａは、対照ならびにＳＤＦ−１およびＳＣＦ含浸（ＦＮ予備コーティングありまたはなし）頚動脈移植片上に存在するＣＤ１１７（ａ）陽性細胞の割合の結果である。アスタリスクは、対照との有意差を示し（各群においてｎ＝６）、＃は、ＳＤＦ群との差を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、対照ならびにＳＤＦ−１およびＳＣＦ含浸（ＦＮ予備コーティングありまたはなし）頚動脈移植片上に存在するＳｃａ−１（ｂ）陽性細胞の割合の結果である。アスタリスクは、対照との有意差を示し（各群においてｎ＝６）、＃は、ＳＤＦ群との差を示す。
【図１３】図１３は、ヒツジ動脈内に埋入したパッチ上のＣＤ３４＋細胞（造血幹／前駆細胞）の存在を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月10日(2007.7.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造マトリックスを、幹細胞または前駆細胞上に発現されるレセプタである該レセプタのリガンドまたは該レセプタへの結合ドメインを含むその断片でコートする工程を含む、インビボ埋入用構造骨格の作製方法において、該構造骨格にインビトロで細胞を播種しないことをさらに特徴とする、インビボ埋入用構造骨格の作製方法。
【請求項２】
構造骨格が心臓の弁または血管構造骨格である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
構造マトリックスが生分解性である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記リガンドが、間質由来因子１、幹細胞因子、ＶＣＡＭ−１、フィブリノゲンのＰ１領域およびフィブリノゲンのＰ２領域からなる群より選択される、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
構造マトリックスを化学誘引物質因子または動員因子でコートする工程を含まない、請求項１〜４いずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
構造マトリックスを１種類以上の化学誘引物質因子および／または動員因子でコートする工程をさらに含む、請求項１〜５いずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
構造骨格のマトリックスを、該リガンドまたはその断片と構造マトリックス間の相互作用を助長する１種類以上のタンパク質で予備コートする工程をさらに含む、請求項１〜６いずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
該リガンドまたはその断片と、構造マトリックスとの相互作用を助長するタンパク質と
をマトリックス上に融合タンパク質としてコートする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
該助長タンパク質が、フィブロネクチン、コラーゲンおよびフィブリノゲンからなる群より選択される、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
該リガンドまたはその断片が前記構造マトリックスにリンカーアームによってコートされる、請求項１〜９いずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
構造マトリックスが、非架橋プロテーゼまたは無細胞化大動脈根である、請求項１〜１０いずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
構造マトリックスを該リガンドまたはその断片でコートする工程が、化学的架橋によって、または該リガンドまたはその断片を含む溶液を該マトリックスに含浸させることにより行なわれる、請求項１〜１１いずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
構造マトリックスを、幹細胞または前駆細胞上に発現されるレセプタである該レセプタのリガンドまたは該レセプタへの結合ドメインを含むその断片でコートする工程から本質的になる、インビボ埋入用無細胞構造骨格の作製方法。
【請求項１４】
構造マトリックスを含む事前のインビトロ播種を伴わないインビボ埋入用無細胞構造骨格において、前記マトリックスが、幹細胞または前駆細胞上に発現されるレセプタである１種類以上の該レセプタのリガンドまたは該レセプタへの結合ドメインを含むその断片でコートされることを特徴とするインビボ埋入用無細胞構造骨格。
【請求項１５】
前記構造骨格が血管または心臓の弁の構造骨格である、請求項１４に記載の無細胞構造骨格。
【請求項１６】
前記リガンドが、間質由来因子１、幹細胞因子、ＶＣＡＭ−１、フィブリノゲンのＰ１領域およびフィブリノゲンのＰ２領域からなる群より選択される、請求項１４または１５に記載の無細胞構造骨格。
【請求項１７】
化学誘引物質因子および／または動員因子をさらに含む、請求項１４〜１６いずれか１項に記載の無細胞構造骨格。
【請求項１８】
該リガンドまたはその断片と構造マトリックス間の相互作用を助長する１種類以上のタンパク質でさらにコートされた、請求項１４〜１７いずれか１項に記載の無細胞構造骨格。
【請求項１９】
構造マトリックスが、非架橋プロテーゼまたは無細胞化大動脈根である、請求項１４〜１８いずれか１項に記載の無細胞構造骨格。
【請求項２０】
該リガンドまたはその断片が構造マトリックスに化学的に架橋される、請求項１４〜１９いずれか１項に記載の無細胞構造骨格。
【請求項２１】
移植片用の構造マトリックスと、幹細胞または前駆細胞上に発現されるレセプタである１種類以上の該リガンドまたは該レセプタへの結合ドメインを含むその断片とを含む、インビトロで播種しない無細胞構造骨格の発達のためのキット。
【請求項２２】
移植片が血管または心臓の弁の形態である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
リガンドが、間質由来因子１、幹細胞因子、ＶＣＡＭ−１、フィブリノゲンのＰ１領域およびフィブリノゲンのＰ２領域からなる群より選択される、請求項２１または２２に記載のキット。
【請求項２４】
幹細胞または前駆細胞上に発現されるレセプタである該レセプタのリガンドまたは該レセプタへの結合ドメインを含むその断片の、埋入可能な無細胞デバイスの作製のための使用。
【請求項２５】
デバイスが心臓弁または血管移植片である、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
ａ）構造骨格を動物またはヒトの身体内に埋入する工程、
ｂ）前記構造骨格への細胞の付着を可能にする工程、
ｃ）前記動物またはヒトから前記構造骨格を回収する工程、および
ｄ）前記構造骨格から幹細胞または前駆細胞を単離する工程
を含む、幹細胞および／または前駆細胞の富化および単離のための方法。
【請求項２７】
幹細胞または前駆細胞上に発現されるレセプタである該レセプタのリガンドまたは該レセプタへの結合ドメインを含むその断片の、心臓弁または血管移植片としての使用のための埋入可能な無細胞デバイスの製造のための使用。
【国際調査報告】
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2008518606.tif 000024