(57)【要約】本発明はＴＡＢ分子及びＴＡＧ−７２に対するＡＤＥＰＴ構築物、並びにそれらを用いた治療方法に関する。【選択図】図１２
2008539237.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の酵素を抱合する抗体又は抗体フラグメントを含むＴＡＧ−２７を誘導するＴＡＢ分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＴＡＢ分子、ＴＧＡ−７２を誘導するＡＤＥＰＴ構築物及びそれらの治療における関係する。
【背景技術】
【０００２】
従来の非標的性治療物は循環系から消失するまで、自由に患者の体内を循環する。そのような非標的性分子は多くの細胞及び組織に無視できないほどの影響を与える。治療品が毒素である場合には、（例えば、「治療濃度域」である有効量と有害量と、又は致死量との差が小さいことを特徴とする化学療法薬において）、この問題は特に重要である。
【０００３】
研究者たちは特定の組織に対して特異性を有する治療品を開発する試みを行って来た。標的に選択的に結合することにより大部分の標的はこの組織に提示される。病理組織を標的とすることで、例えば、治療濃度域が低められ副作用が減る。
【０００４】
選択的結合は抗体を意図する酵素生産治療（（ＡＤＥＰＴ）、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１，  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７：３３１４−２４．；  Ｄｅｎｎｙ，  ２００１，  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．  ３６：５７７−９５参照）に用いられる。ＡＤＥＰＴにおいて、抗体又は抗体フラグメントは、不活性プロドラッグを活性細胞毒に転換する能力のある酵素に結合され、ＡＤＥＰＴ抱合体を生成する。抱合体は患者に投与され、抗原／抗体結合により標的細胞に局在する。不活性プロドラッグは続けて投与される。そして前記プロドラッグは患者の体内を循環する。しかしながら、前記プロドラッグは、組織の周辺においてのみ抱合により活性化されるまで、失活しているので、副作用が起きない。従って、前記毒の治療濃度域は所望の部位において増加し、体内を循環する活性ドラッグの割合低くなるので、標的組織の周辺において相対的に高い濃度の活性ドラッグが生産される。
【０００５】
ＡＤＥＰＴにおいて、プロパー抗原の選択は重要である（例えば、高い腫瘍／正常発現プロファイルを有する抗原）。特に興味の高い腫瘍抗原は、癌組織の細胞表面に顕著に見られる、ＴＡＧ−７２である。ＴＡＧ−７２は各種ヒトアデノカルシノマにおいて発現されるが、大部分の正常組織においても低い発現を示す、糖質エピトープである（Ｃａｏ，  Ｙ．，  Ｐ．  Ｓｔｏｓｉｅｋ，  Ｇ．  Ｆ．  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｕ．  Ｋａｒｓｔｅｎ  （１９９６）  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １０６，  １９７−２０７，  Ｔｈｏｍｓｅｎ−Ｆｒｉｅｄｅｎｒｅｉｃｈ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｉｓｓｕｅｓ：  ａ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｓｔｕｄｙ）。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明はＴＡＢ分子、ＴＡＧ−７２を誘導するＡＤＥＰＴ構築物及びそれらを用いた治療、特にプロドラッグを用いた治療に関する。本発明の分子は好ましくは最小化されておらず、免疫反応を誘発せず、高い収率で生産ことができる。第一の側面において、前記ＴＡＢ分子は抗体／酵素抱合体を含む。好ましい態様において前記ＴＡＢ分子はｓｃＦｖを含み、前記ｓｃＦｖは未修飾のアミノ酸配列を含む。前記アミノ酸配列は、配列番号２で定義される配列を含む。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子は配列番号２で定義されたアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有する。前記修飾は、ｈ８、ｈ５７、ｈ６２、ｈ８０、ｌ５、ｌ５３、ｌ７９及びｌ１０５からなる群より選択される少なくとも１つの位置を含む。各位置の前にある「ｈ」及び「ｌ」はそれぞれ重鎖及び軽鎖を示す。ここにおいて、ナンバリングはガバットシステム（Ｋａｂａｄ  ｓｙｓｔｅｍ）に基づく配列番号２で定義されたｓｃＦｖに基づくものである（例えば、Ｗｕ、Ｔ．Ｔ．及びＥ．Ａ．Ｋａｂａｔ（１９７０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２、２１１−２５０参照）。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子はｈ８０、ｌ５、ｌ５３、及びｌ７９の位置において修飾されている。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子はｈＶ８０Ｌ、ｌＳ５Ｔ、ｌＡ５３Ｔ、及びｌＫ７９Ｅにおける修飾を有する。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子はＴＡＢ２．４、ＴＡＢ２．５、又はＴＡＢ２．８分子を含む。前記ＴＡＢ２．４、ＴＡＢ２．５又はＴＡＢ２．８分子は配列番号２、配列番号２０、又は配列番号２２をそれぞれ含む。
【０００７】
好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子は更に酵素を含む。好ましい態様において、前記酵素はＢＬＡを含む。
【０００８】
好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子は完全長の抗体／酵素ＴＡＢ抱合体を含み、前記ｓｃＦｖは修飾されたアミノ酸配列を有する。前記アミノ酸配列は配列番号６、配列番号８、又は配列番号１２で定義される配列を含む。好ましい態様において前記ＴＡＢ分子は配列番号８で定義されたアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有し、前記修飾は、ｈ８、ｈ５７、ｈ６２、ｈ８０、ｌ５、ｌ５３、ｌ７９及びｌ１０５からなる群より選択される少なくとも１つの位置を含む。各位置の前にある「ｈ」及び「ｌ」はそれぞれ重鎖及び軽鎖を示す。ここにおいて、ナンバリングはガバットシステム（Ｋａｂａｄ  ｓｙｓｔｅｍ）に基づく配列番号２で定義されたｓｃＦｖに基づく（例えば、Ｗｕ、Ｔ．Ｔ．及びＥ．Ａ．Ｋａｂａｔ（１９７０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１３２、２１１−２５０参照）。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子はｈ８０、ｌ５、ｌ５３、及びｌ７９の位置において修飾されている。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子はｈＶ８０Ｌ、ｌＳ５Ｔ、ｌＡ５３Ｔ、及びｌＫ７９Ｅにおける修飾を有する。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子はＴＡＢ２．４、ＴＡＢ２．５又はＴＡＢ２．８分子を含む。前記ＴＡＢ２．４、ＴＡＢ２．５又はＴＡＢ２．８分子は配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１６をそれぞれ含む。
【０００９】
好ましい態様において、前記分子は配列番号１２を有するＴＡＢ２．６を含む。好ましい態様において、前記分子はクローンＭＥ３７４．４、ＭＥ３７５．１８、ＭＥ３７４．３１、ＭＥ３７４．６３、ＭＥ３７４．７３、又はＭＥ３７５．６９を含む。
【００１０】
第二の側面において、本発明は本明細書において提供される態様のほかに、第一の側面おけるいずれかの態様で定義されたＴＡＢ抱合体をコードする核酸に関する。好ましい態様において、前記分子は配列番号７、配列番号９、配列番号１１、又は配列番号１３のうちの一つを含む核酸である。
【００１１】
第三の側面において、本発明はＴＡＢ分子及びＴＡＢ分子の基質となるプロドラッグを必要とする個体に投与する工程を含む個体を処理する方法に関する。第四の側面において、本発明はＴＡＢ分子を含む医薬品組成物に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
違った方法で定義しない限り、全ての技術用語及び科学的用語は本発明の属する分野における当業者により理解されているのと同じ意味を有する。本明細書において説明された任意の方法及び物質と同等のものは本発明の実施及び試験に用いることができるが、本明細書においては、好ましい方法及び物質を説明する。本発明において以下で説明する以下の用語用いられる。
【００１３】
本明細書において、「抱合体」の語は所望の抗原に選択的に結合するＡＤＥＰＴ分子を意味する。抱合体の例は本明細書で説明するように、所望の酵素、例えばＢＬＡ、に結合する抗原又は抗体である。
【００１４】
本明細書において、「抗原」の語は、抗体（エピトープとも言う場合がある）により認識される化学構造を意味する。特に意図されるものは腫瘍関連抗原（ＴＡＡとも言われる）である。
【００１５】
本明細書において、「標的」の語は、細胞、組織、器官、癌細胞、又は癌組織の群を意味する。その意味で、標的は例えば、本明細書で説明するように、体の中にある化合物を届けたい領域を意味する。
【００１６】
「ＴＡＢ」分子はＴＡＧ−７２抗原（「ＴＡＧ−７２」）に結合する抱合体を意味する。ＴＡＢ分子は未修飾の配列又は修飾された配列を有する。前記未修飾配列は配列番号２で定義されるアミノ酸配列を含む。未修飾又は修飾された配列はＢＬＡを含んでいてもよい。
【００１７】
本明細書において、「未修飾」配列はｓｃＦｖ又は抱合体全体のいずれかを含む修飾されていない配列を意味する。
【００１８】
「修飾」は上で定義された未修飾配列の少なくとも１つの変異を含む配列を意味する。位置の番号付けは本明細書で説明する特定の態様において示す。例えば、ｓｃＦｖに関する相対的な位置番号は上で説明した配列番号２を参照して行う。同様に、例えば、完全抱合体に関する本明細書における相対的位置番号はしばしば配列番号８を参照して行われる。抗体又は抗体フラグメントにおける相対的アミノ酸位置又は変異位置の相対的位置はカバットナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ）において説明されている（Ｗｕ，  Ｔ．Ｔ．  ａｎｄ  Ｋａｂａｔ，  Ｅ．Ａ．  （１９７０）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２５０，  ７５３−７６０．，  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ａｍｐ−Ｃ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）。
【００１９】
本明細書において、「ＢＬＡ」はラクタム又はセファロスポリン構造を切断することができるタンパク質を意味する。意図するものはラクタム又はセファロスポリン構造を含むプロドラッグを活性化することができるＢＬＡである。意図するものは、例えば、エンテロバクタークロアカ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）からのＢＬＡ及びその相同物（例えば、  Ｇａｌｌｅｎｉ，  Ｍ．，  Ｌｉｎｄｂｅｒｇ，  Ｆ．，  Ｎｏｒｍａｒｋ  Ｓ．，  Ｃｏｌｅ．  Ｓ．，  Ｈｏｎｏｒｅ,  Ｎ．，  Ｊｏｒｉｓ，  Ｂ.  ａｎｄ  Ｆｒｅｒｅ，  Ｊ．Ｍ．  （１９８８），Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ  ａｍｐＣ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ２５０，  ７５３−７６０参照）、並びにＴＥＭ-４ラクタマーゼ（Ｓｉｒｏｔ，  Ｄ．  （１９９５）  Ｅｘｔｅｎｄｅｄ−ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｐｌａｓｍｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅｓ）及びＴＥＭ-４に相同な酵素である。
【００２０】
ＢＬＡは癌の医薬品に用いられている、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）  （Ｖｒｕｄｈｕｌａ，  Ｖ．  Ｍ．，  Ｈ.  Ｐ．  Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｄ．  Ｓｅｎｔｅｒ  （１９９５）  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ３８，  １３８０−５，  Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ａｓ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎ）  （Ｍｅｙｅｒ，  Ｄ．  Ｌ．，  Ｌ．  Ｎ．  Ｊｕｎｇｈｅｉｍ，  Ｋ．  Ｌ．  Ｌａｗ，  Ｓ．  Ｄ．  Ｍｉｋｏｌａｊｃｚｙｋ，  Ｔ．  Ａ．  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ，  Ｄ．  Ｇ．  Ｍａｃｋｅｎｓｅｎ，  Ｓ．  Ｌ．  Ｂｒｉｇｇｓ  ａｎｄ  Ｊ．  Ｊ．  Ｓｔａｒｌｉｎｇ  （１９９３）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３，  ３９５６−６３，  Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ：  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｇｒｏｗｔｈ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｍｏｄｅｌｓ）、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）  （Ｖｒｕｄｈｕｌａ，  Ｖ．  Ｍ．，  Ｄ．  Ｅ．  Ｋｅｒｒ，  Ｎ．  Ｏ．  Ｓｉｅｍｅｒｓ,  Ｇ．  Ｍ．  Ｄｕｂｏｗｃｈｉｋ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｄ．  Ｓｅｎｔｅｒ  （２００３）  Ｂｉｏｏｒｇ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｌｅｔｔ  １３，  ５３９−４２，  Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｌ−４９−ｓＦｖ−ｂｅｔａ−Ｌａｃｔａｍａｓｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、及びメルファラン（ｍｅｌｐｈａｌａｎ）  （Ｖｒｕｄｈｕｌａ，  Ｖ．  Ｍ．，  Ｐ．  Ｄ．  Ｓｅｎｔｅｒ，  Ｋ．  Ｊ．  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｍ．  Ｗａｌｌａｃｅ  （１９９３）  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  ３６，  ９１９−２３，  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ  ａｎｄ  ｍｅｌｐｈａｌａｎ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｇａｍｉｄａｓｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）等を放出する各種プロドラッグを活性化すると報告されている。
【００２１】
「結合部分」はＡＤＥＰＴ構築体、例えば、標的に結合するＴＡＢ分子の一部である。本発明において、ＴＡＢ分子の結合部分はＴＡＧ７２に結合する。結合部分はＴＡＢ分子の連続又は非連続のいずれかの１つ以上の領域を含む。
【００２２】
「活性部分」の語は、ＡＥＤＰＴ構築体、例えば、薬品（ａｇｅｎｔ）に機能性を付与するＴＡＢ分子、の一部である。活性部分は、例えばＴＡＢ分子の、連続又は非連続のいずれかの１つ以上の領域を含む。特に、活性部分はβ−ラクタマーゼ（ｂｅｔａ−ｌａｃｔａｍａｓｅ）等の酵素でもよい。
【００２３】
「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養」の語は、互換的に使用するとこができ、子孫全体を含む。全ての子孫は故意の、または偶然の突然変異のためＤＮＡ内容の点で全く同一でないかもしれない。形質転換された細胞をスクリーニングしたときに同じ機能を有する変異子孫は子孫又は形質転換体の定義に含まれる。この細胞は原核細胞でもよいし、真核細胞でもよい。
【００２４】
「オリゴヌクレオチド」の語は、２つ以上のデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドを含む分子であると定義される。正確なサイズは、多くの因子、言いかえれば、最終的な機能、又はそのオリゴヌクレオチドの用途に依存している。オリゴヌクレオチドは多くの好適な方法、例えば、クローニング、及び好適な配列の制限消化、及びＮａｒａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．６８：９０−９９のフォスフォトリエステル法；Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ６８：１０９−１５１のフォスフォジエステル法；Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．  ２２：１８５９−１８６２のジエチルフォスフォアミド法等による直接的な合成、及びＵ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ４，４５８，０６６の固体担持法により調製することができる。これらの文献を参照により本明細書に援用する。合成法に関する文献はＧｏｏｄｃｈｉｌｄ，  １９９０，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １（３）：１６５−１８７Ａであり、参照により本明細書に援用する。
【００２５】
本明細書で用いる「プライマー」の語はプライマー伸長生成物の合成が誘発されるような条件下において当該合成を開始させる働きをするオリゴヌクレオチドについて用いられる。核酸ストランドに相補的なプライマー伸張生成物の合成は好適温度において好適な緩衝液中に必要とされる４つの異なるヌクレオシド三リン酸及びＤＮＡポリメラーゼの存在下において開始される。
【００２６】
「緩衝液」は緩衝液、（２価の金属イオン等の）共同因子及び（好適なイオン強度を提供するための）塩を含み、所望のｐＨに調整される。
【００２７】
遺伝子配列の非コードストランド（非コードストランドの続きも同様に）にハイブリダイズするプライマーは本明細書において「上流」又は「前方向」プライマーと言う。遺伝子配列のコードストランドにハイブリダイズするプライマーは「下流」又は「後方向」プライマーと言う。
【００２８】
「タンパク質」の語は本明細書において「ペプチド」及び「ポリペプチド」と互換的に使用され、ペプチド結合により結合している２つ以上のアミノ酸残基を含む分子を意味する。似た側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが本分野において定義されている。これらのファミリーは塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非電荷極性側鎖（例えば、アスパラギン,  グルタミン,  セリン,  ストランドニン,  チロシン）、非極性側鎖（例えば、アラニン,  バリン,  ロイシン,  イソロイシン,  プロリン,  フェニルアラニン,  メチオニン,  トリプトファン,  システイン,  グリシン）、ベータ分岐側鎖（例えば、ストランドレオニン、バリン、イソロイシン）、及び  芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸を含む。標準的なアミノ酸の３文字表記又は１文字表記が本明細書において用いられる。等しい置換体も特許請求の範囲に含まれる。
【００２９】
本発明のペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質は、１つ以上の非分類的なアミノ酸を含むことができる。非分類的アミノ酸は、通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸（４−Ａｂｕ）、２−アミノ酪酸（２−Ａｂｕ）、６−アミノヘキサン酸（Ａｈｘ）、２−アミノイソ酪酸（２−Ａｉｂ）、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、β−メチルアミノ酸、Ｃａ−メチルアミノ酸、及びＮａ−メチルアミノ酸等のデザイナ−アミノ酸、並びに一般的なアミノ酸アナログを含むがこれらに限定されない。
【００３０】
「Ａｂ」又は「抗体」の語はポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、免役グロブリン又は標的抗原に結合する抗体の抗体又は機能フラグメントを意味する。そのような機能を有するものの例は、完全抗体分子、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、相補性決定領域（ＣＤＲｓ）、ＶＬ（軽鎖可変領域）、ＶＨ（重鎖可変領域）等の抗体フラグメント、並びにこれらの又は標的抗原に結合することができる免役グロブリンペプチドの他の機能部分の組合せを含む。これらのうちの特定の順所について本明細書において説明するが、列挙した全てのオーダーが本発明の範囲内である。例えば、ＴＡＢ２．５構築体はｖＨ−（ＧＧＧＧＳ）６−ｖＬのオーダーを有するが、この例は非限定的である。ｖＬ及びｖＨの全てのオーダーは特許請求の範囲である。
【００３１】
本明細書において、「リンカー」の語は、ＴＡＢ分子の２つのフラグメントに結合するアミノ酸の配列を意味する。このフラグメントは本明細書で説明するように、あらゆる順序で結合することができる。リンカーの長さは変化する。本明細書においてはリンカーの長さは３０アミノ酸である必要はない。これ以外の長さのリンカーも本発明の範囲内である（例えば、ＴＡＢ２．４分子は１５アミノ酸のリンカー長を有し、ＴＡＢ２．５及びＴＡＢ２．８は３０アミノ酸のリンカー長を有する）。
【００３２】
本明細書において、「リンカー構造」の語は２つのドラッグ部分を結合する構造を意味する。プロドラッグに関して言えば、例えば、リンカーは活性部分と非活性部分とを結合する。前記非活性部分は酵素を用いて、又は自然に除去される（例えば、不活性部分の切断又は除去について（例えば、Ｐａｐｏｔ，  Ｓ．  Ｔｒａｎｏｙ，  Ｉ．  Ｔｉｌｌｅｑｕｉｎ，  Ｆｌｏｒｅｎｔ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｇｅｓｓｏｎ，  Ｊ．Ｐ．  （２００２）  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ：  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  Ｃｕｒｒ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．  Ａｎｔｉ−Ｃａｎｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ２，  １５５−１８５参照）。
【００３３】
「プロドラッグ」の語は、１つ以上の酵素的触媒作用、又は生理学的触媒作用を介して高い薬物的活性を有する活性化合物へ転換される化合物を意味する。プロドラッグはプロパート（ｐｒｏｐａｒｔ）又は非活性部分、並びに活性ドラッグ部分又は検出部分を含む。任意に、プロドラッグはリンカー構造を含んでいてもよい。例えば、プロドラッグは酵素により切断されて活性ドラッグを放出する。代替的に、酵素は、例えば、診断において用いられる検出部分を放出するために変更することができる。より具体的な態様において、標的酵素を用いてプロドラッグを切断して、活性ドラッグを標的酵素への標的結合の周辺に放出する。「プロ−パート（Ｐｒｏ−ｐａｒｔ）」及び「不活性部分」はプロドラッグが転換された後の不活性部分を意味する。
【００３４】
本明細書において、「ＧＣ−Ｍｅｌ」は、例えば、Ｓｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７７３，４３５に記載の、プロドラッグ、グルタリル−セファロスポリンメルファラン（ｇｌｕｔａｒｙｌ−ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｎ−ｍｅｌｐｈａｌａｎ）を意味する。前記文献及び図表を参照により本明細書に援用する。
【００３５】
本明細書において、「Ｍｅｌ」はメルファラン（Ｍｅｌｐｈａｌａｎ）を意味する。Ｍｅｌの構造は当該分野において良く知られており、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７７３，４３５に記載されている。本文献及び図表を参照により本明細書に援用する。
【００３６】
プロドラッグはドキソルビシン、ビンブラスチン、パクリタキセル、デュオカルマイシン、カンプトセシン、アルキル化剤、トポイソメラーゼ、インヒビター、白金化合物、及び他の薬物を含む各種を放出できるように設計することができる。特に好ましいものはラクタマーゼにより活性化することができるものである（例えば、Ｓｅｎｔｅｒ，  Ｐ．Ｄ．，  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ＣＪ．  （２００１）  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｂｙ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｓ  ５３，  ２４７−２６４参照）。各種酵素により活性化されうる他のプロドラッグの例も知られている（Ｂａｇｓｈａｗｅ，  Ｋ．Ｄ．，  Ｓｈａｒｍａ，  Ｓ．Ｋ．，  Ｂｕｒｋｅ，  ＰＪ．，  Ｍｅｌｔｏｎ，  Ｒ．Ｇ．  ａｎｄ  Ｋｎｏｘ，  Ｊ．  （１９９９）  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ；  ａｌｓｏ  ｓｅｅ，  Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ，  Ｉ．，  Ｆｒｉｅｄｌｏｓ，  Ｄ．，  Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖｅｚ，  Ｄ．，  Ｄａｖｉｅｓ  Ｌ．  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，  ＣＪ．  （１９９９）  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｂｏｄｙ−ａｎｄ  ｇｅｎｅ-ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｐｒｏｄｒｕｇ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  （ＡＤＥＰＴ  ａｎｄ  ＧＤＥＰＴ）  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  １４，  ５１７−５３８参照）。
【００３７】
本明細書において、「医薬品上利用可能な担体」の語は医薬品の投与において好適な、任意の及び全ての溶媒、分散媒体、コート、抗菌性及び抗真菌性試薬、等圧及び吸収遅延剤等を含むことを意図する。そのような媒体及び試薬を医薬品として活性を有する基質に適用することは当分野において知られている。
【００３８】
本明細書において、「投与間隔」の語は、タンパク質の投与及びこれに続くプロドラッグの投与の間の間隔を意味する。
【００３９】
「配列相同性％」の語は、「相同性％」、「配列同一性％」及び「同一性％」と互換的に用いられる。配列アラインメントプログラムを用いて、２つ以上のペプチド配列の間のアミノ酸配列の同一性のレベルを意味する。例えば、本明細書において用いる８０％の相同性は、所定のアルゴリズムにより８０％の同一性があると決定されたものを意味し、従って所与の配列の相同性が所与の配列の長さ全体に渡って８０％より大きい同一性を有することを意味する。配列相同性の例示的なレベルは、所与の配列に対して６０、７０、８０、８５、９０、９５、９８又は９９％、あるいはこれ以上の同一性を含むがこれらに限定されない。
【００４０】
２つの配列の間の相同性を決定するのに用いることができるコンピュータープログラムの例は、当業者に良く知られている一連のＢＬＡＳＴプログラム、例えば、ＢＬＡＳＴＮ,  ＢＬＡＳＴＸ,  及び  ＴＢＬＡＳＴＸ,  ＢＬＡＳＴＰ、及びＴＢＬＡＳＴＮを含むがこれらに限定されない。Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：  ４０３−１０及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７，  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２５：３３８９−３４０２も参照のこと。配列検索は、通常、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）タンパク質配列及び他の公知のデータベース中のアミノ酸配列に対して所与のアミノ酸配列を評価する  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて行うことができる。前記ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）タンパク質配列及び他の公知のデータベース中のアミノ酸配列に対して全てのリーディングフレームが置換されているアミノ酸配列の検索に好適である。ＢＬＡＳＴＰ及びＢＬＡＳＴＸは、１１．０のオープンギャップペナルティー（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）及び１．０の伸長ギャップペナルティー（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）の規定パラメータ及びＢＬＯＳＵＭ−６２マトリックスを用いて行われる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ，  ｅｔ  ａｌ．，１９９７参照。
【００４１】
２つ以上の配列の間の「％相同性」を決定するために用いる好適なアラインメントの例は、タ１０のオープンギャップペナルティー（ｏｐｅｎ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）、０．１の伸長ギャップペナルティー（ｅｘｔｅｎｄｅｄ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｙ）の規定パラメータを含み、ＢＬＯＳＵＭ３０類似マトリックスを用いて操作するＭａｃＶｅｃｔｏｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ６．５のＣＬＵＳＴＡＬ−Ｗプログラムである。
【００４２】
本発明はＴＡＢ分子、ＴＡＧ−７２結合するＡＤＥＰＴ構築物、及びそれらの治療、特に本明細書で述べるプロドラッグを用いた治療に関係する。本発明の分子は好ましくは脱免疫され、免疫反応を誘発しない。
【００４３】
第一の側面において、前記ＴＡＢ分子は抗体／酵素抱合体を含む。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子はｓｃＦｖを含み、前記ｓｃＦｖは未修飾アミノ酸配列を含み、前記アミノ酸配列は配列番号２で定義されるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子は、配列番号２で定義されるアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有する。前記修飾は、ｈ８、ｈ５７、ｈ６２、ｈ８０、ｌ５、ｌ５３、ｌ７９及びｌ１０５からなる群より選択される少なくとも１つの位置を含み、各位置番号の前の「ｈ」及び「ｌ」は、それぞれ重鎖及び軽鎖を意味する。配列番号２で定義されるｓｃＦｖのついての番号付けは、カバットシステム（Ｋａｂａｔ  ｓｙｓｔｅｍ）  （例えば、Ｗｕ，  Ｔ．  Ｔ．  ａｎｄ  Ｅ．  Ａ．  Ｋａｂａｔ  （１９７０）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １３２，  ２１１−２５０参照）に基づいている。好ましい態様において、ＴＡＢ分子はｈ８、ｌ５、ｌ５３、及びｌ７９の位置で修飾されている。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子は、ｈＶ８０Ｌ、ｌＳ５Ｔ、ｌＡ５３Ｔ及びｌＫ７９Ｅの修飾を有する。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子はＴＡＢ２．４、ＴＡＢ２．５、又はＴＡＢ２．８分子を含む。前記  ＴＡＢ２．４、ＴＡＢ２．５、又はＴＡＢ２．８分子はそれぞれ、配列番号２、配列番号２０、又は配列番号２２を含む。
【００４４】
好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子は酵素を更に含む。好ましい態様において、前記酵素はＢＬＡを含む。好ましい態様において、前記ＢＬＡはＴＥＭ−４を含む。
【００４５】
好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子は完全長抗体／酵素ＴＡＢ抱合体を含み、前記ｓｃＦｖは未修飾アミノ酸配列を有する。前記アミノ酸配列は、配列番号２で定義される配列を含む。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子は配列番号８で定義されるアミノ酸配列を修飾したアミノ酸配列を有する。前記修飾は、ｈ８、ｈ５７、ｈ６２、ｈ８０、ｌ５、ｌ５３、ｌ７９、及びｌ１０５からなる群より選択される少なくとも１つの位置を含む。各位置番号の前の「ｈ」及び「ｌ」は、それぞれ重鎖及び軽鎖を意味する。配列番号２で定義されるｓｃＦｖのついての番号付けは、前記カバットシステム（Ｋａｂａｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）（基づいている。好ましい態様において、前記ＴＡＢ分子はｈ８０、ｌ５、ｌ５３及びｌ７９の位置において修飾される。好ましい態様においいて、前記ＴＡＢ分子はｈＶ８０Ｌ、ｌＳ５Ｔ、ｌＡ５３Ｔ及びｌＫ７９Ｅにおける修飾を有する。好ましい態様においいて、前記ＴＡＢ分子はＴＡＢ２．４、ＴＡＢ２．５又はＴＡＢ２．８分子を含む。前記ＴＡＢ２．４、ＴＡＢ２．５、又はＴＡＢ２．８分子はそれぞれ、配列番号２、配列番号２０、又は配列番号２２を含む。
【００４６】
好ましい態様において、前記分子は配列番号１２を有するＴＡＢ２．６を含む。好ましい態様において、前記分子はクローンＭＥ３７４．４、ＭＥ３７５．１８、ＭＥ３７４．３１、ＭＥ３７４．６３、ＭＥ３７４．７３又はＭＥ３７５．６９を含む。
【００４７】
他の態様において、前記ＴＡＢ分子は、２００２年６月１２日に提出されたＷＯ  ＵＳ０３／１８２００に記載の環境依存標的因子（ｍｉｌｉｅｕ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ａｇｅｎｔ）である。前記文献を参照により本明細書に援用する。  
本発明のＴＡＢ分子は標的及び非標的の間の異なる環境下において非標的と比較して標的に選択的に結合する。この結合の違いは、例えば標的及び非標的の間の、ｐＨ、酸素分圧、溶質又は検体（例えば、酪酸、糖、又は他の有機及び無機分子）の濃度、温度、光又はイオン強度における違いに起因している。本発明のＴＡＢ分子の選択的な結合は、一連の所望の条件下における標的の結合、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｓｉｔｕ、又はｉｎ  ｖｉｖｏ（例えば、個体の標的組織）での標的の確認、標的細胞又は組織を殺す、又はプロドラッグを標的組織において又はその近くで活性ドラッグに転換することに用いることができる。
【００４８】
１つの態様において、前記ＴＡＢ分子は例えば、２００２年、６月１２日に提出された国際公開公報ＵＳ０３／１８１８７に記載のような任意の抗体の親和性を増強させる方法を用いて、選択、作成、又は修飾される。前記文献を参照により本明細書に援用する。
【００４９】
他の態様において、前記ＴＡＢは、例えば、２００２年、６月１２日に提出された米国特許出願係属番号１０／１７０，３８７に記載のループ移植法を用いて選択、作成、又は修飾される。前記文献を参照により本明細書に援用する。
【００５０】
他の態様において、前記ＴＡＢは例えば、２００２年、６月１２日に提出された米国特許出願係属番号１０／１７０，７２９に記載されているような、多機能ポリペプチドである。前記文献を参照により本明細書に援用する。
【００５１】
他の態様において、本発明のＴＡＢ分子は、当該分野において良く知られている方法だけでなく、例えば、Ｕ．  Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，９７５，２７８に記載の診断又は治療用製品に用いられる。前記特許を参照により本明細書に援用する。前記活性部分は活性を有する任意の分子又は分子の一部分でよい。前記活性は任意の活性でよい。活性部分が有する活性タイプの例は、例えば、検出活性、酵素活性、治療活性、診断活性、毒活性、又は結合活性を含む。前記活性部分は、ＴＡＢ分子の個別部品であり、例えば、結合部分に融合又は抱合する酵素であることができ、あるいは、前記活性部分はＴＡＢの切断不可能な部分であり、例えば、標的にＴＡＢが結合したものであって、標的の活性を促進又は抑制する。
【００５２】
他の態様において、前記活性部分は酵素活性を有しており、酵素又は活性フラグメント又は酵素の誘導体である。特に好ましい活性部分は、治療において、プロドラッグを活性化するために用いることができる酵素である。触媒作用を有する多くの酵素がプロドラッグを活性化するために用いられている。例えば、Ｍｅｌｔｏｎ  ＆  Ｋｎｏｘ  Ｅｎｚｙｍｅ−ｐｒｏｄｒｕｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  （１９９９）及びＢａｇｓｈａｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １１：５７９  （１９９９）を参照。本発明の発明のＴＡＢを構築するのに用いることができる酵素の例は、プロテアーゼ、カルボキシペプチダーゼ、β−ラクタマーゼ、アスアラギナーゼ、オキシダーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、リパーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、アルドーラーゼ、フォスファターゼ、キナーゼ、トランスフェラーゼ、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、ヌクレオチダーゼ、ラッカーゼ、リダクターゼ等を含む（例えば、  参照により本明細書に援用される２００１年９月１２日に提出された米国係属出願Ｎｏ．  ０９／９５４，３８５参照）。そのようなものとして、本発明のＴＡＢは、例えば、プロテアーゼ活性、カルボキシペプチダーゼ活性、β−ラクタマーゼ活性、アスアラギナーゼ活性、オキシダーゼ活性、ヒドロラーゼ活性、リアーゼ活性、リパーゼ活性、セルラーゼ活性、アミラーゼ活性、アルドーラーゼ活性、フォスファターゼ活性、キナーゼ活性、トランスフェラーゼ活性、ポリメラーゼ活性、ヌクレアーゼ活性、ヌクレオチダーゼ活性、ラッカーゼ活性、リダクターゼ活性等を有する。用いることができる酵素の例は、以下で説明するプロドラッグを活性化することができるものであり、例えば、グルコースから過酸化水素の生成で例示されるような代謝物から毒物を生成することができるものである。Ｃｈｒｉｓｔｏｆｉｄｏｕ−Ｓｏｌｏｍｉｄｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌ  ＭｏＩ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２７８：Ｌ７９４参照。
【００５３】
１つの態様において、本発明はβ−ラクタマーゼ  （「ＢＬＡ」）を更に含むＴＡＢを提供する。例示的なＢＬＡ配列を図１に示す。
【００５４】
ＢＬＡ酵素はグラム陽性及びグラム陰性バクテリアの両方において幅広く分布している。ＢＬＡ配列は既知の配列である。ＢＬＡ配列の代表的な例は配列番号４である。ＢＬＡ酵素の特異性は様々であるが、共通してβ−ラクタマーゼを加水分解して置換されたβ−アミノ酸を生成する。従って、それらはβ−ラクタムを含む抗生物質に耐性を付与する。ＢＬＡ酵素は哺乳動物内には本来存在するものではないので、インヒビター、酵素基質、又は内性酵素システム（プロテアーゼ以外のもの）から最小抑制を受ける。このことにより、ＢＬＡ酵素は治療投与に好適なものになる。ＢＬＡ酵素は、サイズが小さく（Ｅ．クロナーゼ由来のＢＬＡは３９ｋＤのモノマーであり、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のＢＬＡは３０ｋＤのモノマーである。）それらの基質に対して高い活性を有しており、３７℃において最適な活性を示すことから、本発明の治療方法に更に好適である。Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）参照。
【００５５】
本発明のＴＡＢの生成に用いることができるＢＬＡの例は、クラスＡ、Ｂ、Ｃ、又はＤβ−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ、（Ｂｅｎｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｌｅｔｔ．  １２３：１０７  （１９９４）参照）、フィブロネクチン（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ）、グルコースオキシダーゼ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｎａｐｏｌｉｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ  ３：３５９  （１９９６）参照）、及び組織プラスミノーゲンアクティベーター（ｔｉｓｓｕｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２７０：３０４８６  （１９９５））を含むがこれらに限定されない。β−ラクタマーゼはそれらの配列に基づいて４つのクラスに分類される。Ｔｈｏｍｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００，  Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２：１２２５−３５参照。セリンβ−ラクタマーゼはＡ（ペニシリナーゼ）、Ｃ（セファロスポリナーゼ）、及びＤ（オキサシリナーゼ）を含む。クラスＢβ−ラクタマーゼは亜鉛含有又は金属β−ラクタマーゼである。あらゆるクラスのＢＬＡは本発明のＴＡＢを生成するために用いることができる。
【００５６】
１つの態様において、前記ＢＬＡは測定可能な特異的活性を有する。１つの態様において、前記ＢＬＡはＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｕｍｂｅｒ  １０／０２２，０９７に開示されているアッセイを用いて測定したときに、ニトロセフィン（ｎｉｔｒｏｃｅｆｉｎ）に対して約０．０１Ｕ／ｐｍｏｌより大きい活性を有する。他の態様において、特異活性は約０．１Ｕ／ｐｍｏｌより大きい。他の態様において、前記特異活性は約１Ｕ／ｐｍｏｌより大きい。これらの特異活性は標的に結合している場合のＢＬＡの特異活性を意味する。
【００５７】
１つの態様において、前記ＴＡＢの中のＢＡＬ酵素は、配列番号４で定義されるアミノ酸配列を含む。他の態様において、前記ＴＡＢの中のＢＡＬ酵素は、配列番号４に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、又は９９％あるいはこれより大きい配列相同性を有する。
【００５８】
ＴＡＢ又は１つ以上の結合部分により結合される標的は、ＴＡＧ−７２に結合するために生成される分子に対する任意の基質又は組成物であることができる。１つの態様において、標的は表面である。１つの態様において、前記表面は生物学的表面である。他の態様において、前記生物学的表面は器官の表面である。他の態様において前記生物学的表面は組織の表面である。他の態様において、前記生物学的表面は、細胞の表面である。他の態様において、前記生物学的表面は病気の器官、組織又は細胞の表面である。他の態様において、前記生物学的表面は正常又は健常な器官、組織、又は細胞の表面である。他の態様において、前記表面は組織の間質腔にある高分子である。他の態様において、前記生物学的表面はウイスル又は病原体の表面である。他の態様において、前記表面は非生物表面である。他の態様において、前記非生物表面は医療機器の表面である。他の態様において、前記医療機器は治療用機器である。他の態様において、前記治療用機器は移植された医療器具である。他の態様において、前記医療器具は診断器具である。他の態様において、前記診断器具はウェル又はトレイである。
【００５９】
組織は複合標的であり、単一の細胞タイプ、複数の細胞タイプの集合、又は特定の種類の細胞の集合体である。組織は未修飾でも修飾されていてもよい。ヒトにおいて、組織は、通常、表皮組織、結合組織、神経組織、及び筋肉組成物を含むがこれらに限定されないクラスに分類される。
【００６０】
他の態様において、前記標的は抗原ＴＡＧ−７２を発現する、又は標的自体に結合するＴＡＧ−７２を有する、又は標的の近辺に位置するＴＡＧ−７２を有する癌に関係する標的である。前記癌に関係する標的は、本発明の組成物が、例えば、癌細胞、癌組織、又は癌器官、癌細胞、癌組織、又は癌器官に関係する分子、あるいは、癌細胞、癌組織、又は癌器官に関係する分子、細胞、組織、又は器官（例えば、癌結合診断、個体に投与される治療分子、又は個体又は癌組織に関係する脈管構造等の健常組織からの生検）の診断、検出、又は処理の一部として、結合する、任意の標的である。
【００６１】
第二の側面において、本発明は本明細書において提供されるものの他に、前述の第一の側面において定義されたＴＡＢ抱合体をコードする核酸に関する。好ましい態様において、前記核酸は配列番号７、配列番号９、配列番号１５、又は配列番号１１の配列の少なくとも１つを含む。好ましい態様においいて、前記核酸は配列番号１３を含む。
【００６２】
前記核酸は、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡでもよい。本発明はＴＡＢの全部又は一部を含むポリペプチドをコードする核酸を含むプラスミドも提供する。前記プラスミドは、例えば、宿主細胞、器官、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて前記ポリペプチドを発現させる発現プラスミドである。前記発現ベクターは、例えば、バクテリア細胞の中で前記ポリペプチドを発現させることができる。前記バクテリア細胞は、例えば、バクテリア細胞内においてポリペプチドを発現させることができる。前記バクテリア細胞は、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞である。
【００６３】
遺伝子コードにおける冗長性のため、一般に、多くのＤＮＡ配列が所与のアミノ酸シーケンスをコードするので、この意味において等しいと言える。以下でのべるように、発現ベクターが挿入される宿主細胞に好適なコドンに基づいて、発現ベクターに用いる１つ又の等しいＤＮＡ配列を選択することが望ましい。本発明は所望のＴＡＢをコードする全てのＤＮＡ配列を包含することを意図する。
【００６４】
作動可能な発現クローンが用いられ、発現ベクター内の好適な調節配列に作動可能に結合するコード配列に置き換えることにより構築される。前記ベクターは宿主細胞内で独立して複製するように設計されているか、又は宿主細胞の染色体ＤＮＡに組み込まれるように設計されている。得られたクローンは好適な宿主細胞を形質転換するために用いられ、形質転換された宿主細胞はコード配列を発現させるために好適な条件下で培養される。発現されたＴＡＢは培地又は細胞から単離され、場合により、回収及び精製を行う。
【００６５】
コード配列及び好適な制御配列を含む好適なクローンの構築は、この分野においてよく知られている標準的なリゲーション、及び制限技術を用いる。通常、単離されたプラスミド、ＤＮＡ配列、又は合成されたオリゴヌクレオチドが切断され、修飾され、好適な形態に結合される。好適な制限部位は、もし通常利用可能でないならば、発現クローンの構築を促進するためにコード配列の末端に付加することができる。部位−特異的ＤＮＡ切断は、通常当該分野において知られている又は市販の制限酵素の製造元により特定されている条件下において、好適な制限酵素（又は酵素）を用いて処理することにより行う。例えば、アマシャム（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ）、ロシュ  モレキュラー  バイオケミカルズ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）及びニューイングランドバイオラボ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の製品カタログを参照のこと。所定の酵素に対する好適な温度において、約１乃至２時間のインキュベーション時間が通常用いられる。各インキュベーションの後、フェノール及びクロロホルムを用いた抽出によりタンパク質を除去する。この抽出の後に、エタノールを用いた沈降反応により水性分画からＤＮＡを抽出及び回収する。必要な場合には、機知の技術を用いてポリアクリルアミドゲル又はアガロースゲル電気泳動を行い、切断されたフラグメントのサイズ分離を行う。例えば、Ｍａｘａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５：４９９−５６０を参照。
【００６６】
リゲーションは、例えば、１５乃至３０μＬ容量において、以下の標準的な条件及び温度において行うことができる；２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０−５０ｍＭ  ＮａＣｌ、及び０℃において、４０μＭ  ＡＴＰと０．０１−０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（フラグメントのリゲーションのために相補的な一本鎖末端を用いる）、あるいは、１４℃において１ｍＭ  ＡＴＰ  及び０．３乃至０．６単位のＴ４ＤＮＡリガーゼ（ブルントエンド（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄリゲーション）のいずれかを用いる。相補的末端を用いたフラグメントの細胞内リゲーションは通常、３３−１００μｇ／ｍｌの総ＤＮＡ濃度（５−１００ｎＭの総末端濃度）において行われる。細胞内ブルントエンドリゲーション（通常、２０−３０リンカーの２０−３０倍のモル濃度を用いる）は１μＭの最終濃度で行われる。
【００６７】
プラスミドの構築のためリゲーションの正確さは当該分野においてよく知られている好適な方法を用いて確認することができる。例えば、プラスミド構築におけるリゲーションの正確さはリゲーション混合物をもちいて、Ｅ．ｃｏｌｉ株ＤＧ１０１（ＡＴＣＣ  ４７０４３）又はＥ．ｃｏｌｉ株ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ  ５３６０６）等の好適な宿主細胞の第一形質転換により確認することができる。形質転換が成功したかどうかは、アンピシリン、テトラサイクリン等の抗生物質耐性、あるいは感受性による選択、あるいは、当該分野において知られているプラスミド構築のモードに依存している他のマーカーを用いた選択により確認される。形質転換体由来のプラスミドはＣｌｅｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６２：１１５９に記載の方法により調製され、任意でその後にクロラムフェニコール増幅を行う。Ｃｌｅｗｅｌｌ，  １９７２，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．  １１０：６６７参照。代替的に、プラスミドＤＮＡは、「ｔｈｅ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｆｏｃｕｓ  ５  （２）」の１１ページに記載の「塩基―酸」抽出法を用いて調製することができ、ＤＮＡのＣｓＣｌ／エチジウムブロマイド超遠心分離法を用いた、前記プロトコルの工程１２乃至１７を繰り返すことにより、高度に精製されたプラスミドＤＮＡを得ることができる。代替法として、市販のプラスミドＤＮＡ単離キット、例えば、ＨＩＳＰＥＥＤ（ＴＭ）、ＱＩＡＦＩＬＴＥＲ（ＴＭ）、ＱＩＡＧＥＮ（登録商標）、プラスミドＤＮＡ単離キット（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア）を用いることができ、製品の仕様書に記載のプロトコルに従って行うことができる。単離されたＤＮＡは、例えば、制限酵素消化及び／又はＳａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７４：５４６３、更には  Ｍｅｓｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ９：３０９のジデオキシ法による配列決定、又はＭａｘａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ６５：４９９に記載の方法により解析される。制御配列、発現ベクター、及び形質転換方法は遺伝子を発現するために用いる宿主細胞のタイプに依存している。通常、原核生物、酵母、昆虫又は哺乳動物の細胞が宿主細胞として用いられる。原核宿主細胞は組み替えタンパク質を生成するのに一般的に最も有効であり、便利である。従って、タンパク質の発現に好んで用いられる。
【００６８】
組み換えタンパク質の発現に最も頻繁に用いられているのはＥ．ｃｏｌｉである。しかしながら、例えば、バチルススブチリシン（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、シュードモナス（ｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）及びサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及び他のバクテリア株等のＥ．ｃｏｌｉ以外の他の微生物株も用いることができる。そのような、原核システムにおいて、宿主細胞由来又は宿主細胞に適合性のある種由来の複製部位及び制御配列を含むプラスミドベクターが通常用いられる。
【００６９】
大部分のバクテリアプロモーターの制御下における構築物の発現のために、ｔｈｅ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｕｎｄｅｒ  ＧＣＳＣ  ＃６１３５由来のＥ．  ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＭＭ２９４を宿主細胞として用いる。ＰＬＮＲＢＳ又はＰＬＴ７ＲＢＳ制御配列を有するベクターの発現のために、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＭＣ１０００ラムダ溶原菌、Ｎ７Ｎ５３ｃＩ８５７  ＳｕｓＰ８０、ＡＴＣＣ  ３９５３１を用いる。１９８７年４月７日にＡＴＣＣに登録されたＥ．ｃｏｌｉ  ＤＧ１１６（ＡＴＣＣ  ５３６０６）及び１９８５年３月２９日にＡＴＣＣに登録されたＥ．ｃｏｌｉ  ＫＢ２（ＡＴＣＣ  ５３０７５）も宿主細胞として有用である。Ｍ１３ファージ組み換えには、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２株ＤＧ９８（ＡＴＣＣ  ３９７６８）等のファージ感染しやすいＥ．ｃｏｌｉ株を用いる。ＤＧ９８系統は１９８４年７月１３日にＡＴＣＣに登録された。
【００７０】
Ｅ．ｃｏｌｉは、通常、Ｂｏｌｉｖａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７，  Ｇｅｎｅ  ２：９５に記載のｐＢＲ３２２の誘導体を用いて形質転換される。プラスミドｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含む。これらの薬物耐性マーカーは、好ましいベクター構築物内で保持されるか又は破壊され、好ましい組み換え体を検出しやすくする。通常用いられる原核制御配列、すなわち、転写開始のためのプロモーター、任意でリボゾーム結合部位と共に用いられるオペレーターはβ−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）、ラクトース（ｌａｃ）プロモーターシステム（Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７，  Ｎａｔｕｒｅ  １９８：１０５６参照）、トリプトファンプロモーターシステム（Ｇｏｅｄｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ８：４０５７参照）、ラムダ由来ＰＬプロモーター（Ｓｈｉｍａｔａｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：１２８参照）、ジーンＮリボゾーム結合部位（ＮＲＢＳ）を含む。ポータブルコントロールシステムカセットはＵ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．  ４，７１１，８４５に定義されている。このカセットはＮＲＢＳに作動可能に結合している、言い換えると、ＮＲＢＳ配列の３’の６塩基以内を切断する少なくとも１つの制限部位を有する第三ＤＮＡ配列の上流に位置する、ＰＬプロモーターを含む。Ｃｈａｎｇらの１９８６年１０月８日に公表された欧州特許Ｎｏ．１９６，８６４に記載のフォスファターゼＡ（ＰｈｏＡ）システムも用いることができる。しかしながら、原核生物に適した任意の利用可能なプロモーターシステムを本発明の発現ベクターを構築するために用いることができる。
【００７１】
バクテリアに加えて、酵母等の真核微生物も組み替え宿主細胞として用いることができる。通常、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ベーカーズイースト（Ｂａｋｅｒ‘ｓ  ｙｅａｓｔ）のラボラトリーシステムを用いるが、他の多くの株も利用可能である。複製の２つの微生物源を用いたベクターが一般的である（Ｂｒｏａｃｈ，  １９８３，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  １０１：３０７）が、酵母の発現に好適な他のプラスミドベクターも知られている（例えば、Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｎａｔｕｒｅ  ２８２：３９；  Ｔｓｃｈｅｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｇｅｎｅ  １０：１５７；  及びＣｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚ．  １０１：３００参照）。
【００７２】
酵母ベクターの制御配列は糖分解酵素を合成するためのプロモーターを含む。Ｈｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９６８，  Ｊ．  Ａｄｖ．  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．  ７：１４９；  Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １７：４９００；  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．２５６：１３８５参照。
【００７３】
当分野において知られている他のプロモーターは３−フォスフォグリセレートキナーゼ（Ｈｉｔｚｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８０，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２５５：２０７３参照）、及びグリセルアルデヒド３−フォスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、フォスフォフルクトキナーゼ、グルコース−６フォスフェートイソメラーゼ、３−フォスフォグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースフォスフェートイソメラーゼ、フォスフォグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼ等の他の糖分解酵素のプロモーターを含む。育成条件により制御される転写の更なる利点を有する他のプロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロームＣ、酸性フォスファターゼ、窒素代謝に関する分解酵素、マルトース及びガラクトースの利用に反応する酵素に対するプロモーター領域である。
【００７４】
コード配列の３’末端に置かれたときに、ターミネータ配列も発現を高めるために用いられる。前記ターミネータ配列は酵母由来遺伝子におけるコード配列に続く３’非翻訳領域に見られる。酵母に適したプロモーター、複製の起源、及び他の制御配列を含む任意のベクターが酵母発現ベクターの構築に用いるのに適している。
【００７５】
コード配列は、多細胞生物由来の原核宿主細胞においても発現させることができる。Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｒｕｚ  ａｎｄ  Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ，  ｅｄｉｔｏｒｓ  （１９７３）参照。有用な宿主細胞はＣＯＳ−７、ＣＯＳ−Ａ２、ＣＶ−Ｉ、マウス骨髄腫細胞Ｎ５１、及びＶＥＲＯ等のマウス由来細胞、ＨｅＬａ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を含む。そのような細胞に対する発現ベクターは、例えば、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来の初期及び後期プロモーター（Ｆｉｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８，  Ｎａｔｕｒｅ  ２７３：１１３）、又はポリオーマ、アデノウイルス２、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）、又はトリ肉腫ウイルスに用いられる哺乳動物に適したプロモーター又は制御配列、あるいはイムノグロブリンプロモーター、及びヒートショックプロモーターを含む。
【００７６】
エンハンサー領域も好適な発現に重要である。これらは通常、プロモーター領域の上流に見られる。複製の起源は、必要であれば、ウイルス源から得ることができる。染色体への組み込みは真核生物におけるＤＮＡ複製のための共通のメカニズムである。
【００７７】
植物細胞も宿主細胞として用いることができる。ノパリンシンエターゼプロモーター及びポリアデニレーションシグナル配列（Ｄｅｐｉｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２，  Ｊ．  ＭｏＩ．  Ａｐｐｌ．  Ｇｅｎ．  １：５６１）等の植物細胞に適した制御配列が用いられる。バキュロウイルスにより提供される制御システムを利用した昆虫細胞を用いた発現システムも開示されている。Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  （１９８６），  Ｓｅｔｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，  Ｖｏｌ．  ８，  ｐｐ．２７７−９７参照。昆虫細胞を基にした発現はスポドプテラ・フルギペイダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｉｄａ）において行われる。これらのシステムは組み替え酵素の生成に有用である。
【００７８】
形質転換は、用いる宿主細胞に適した標準技術を用いて行う。Ｃｏｈｅｎ，  １９７２，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ６９：２１１０に記載の塩化カルシウムを用いたカルシウム処理法は、細胞壁バリアを有する真核及び他の細胞に用いる。アグロバクテリウムテゥメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いた感染（Ｓｈａｗ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３，  Ｇｅｎｅ  ２３：３１５参照）は特定の植物細胞に用いる。哺乳動物の細胞に対しては、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７８，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：５４６のリン酸カルシウム沈殿法が好ましい。酵母への形質転換はＳｏｌｉｎｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７７，  Ｊ．  Ｂａｃｔ．  １３０：９４６及びＨｓｉａｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７６：３８２９に記載の方法に従って行う。
【００７９】
本発明のＴＡＢの全部又は一部を含むポリペプチドをコードするＤＮＡの配列を修飾して、例えば、コードされるタンパク質のアミノ酸配列を修飾せずに宿主細胞のコドンより好適な配列を提供することが好ましい。始めの５−６コドンにおいてそのような修飾を行うと発現効率をすることができる。発現効率を改善するために修飾されたけれども、同様のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は等しいと定義され、本発明に包含される。
【００８０】
各種部位特異プライマー指令変異誘発法（ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｒｉｍｅｒ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ）は当分野においてよく知られている。例えば、参照により本明細書に援用されるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  １９８９  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ｃｈａｐｔｅｒ  １５．５１，「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ」参照。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）も部位指定変異誘発に用いることができる。当分野における他の標準的な技術において、突然変異をおこさせるプライマーの伸長生成物の構築のためのテンプレートとして提供されるｐＢＳＭ１３＋のような一本鎖ベクターに含まれる相補的な核酸配列を直接合成するプライマーとして、所望の変異をコードする合成オリゴヌクレオチドを用いる。変異されたＤＮＡは宿主微生物内で形質転換され、及び形質転換されたバクテリアの培養物は平板培養され、同定される。修飾されたベクターの同定は、選択された形質転換体のＤＮＡをニトロセルロース膜等の膜へ移し、修飾された配列に確実に適合するハイブリダイゼーションを行うが、オリジナルの未変異鎖へのハイブリダイゼーションを阻害する温度において、キナーゼ合成変異誘発プライマーを用いた「リフト（ｌｉｆｔｓ）」ハイブリダイゼーションを含む。プローブにハイブリダイズしたＤＮＡを含む形質転換体はその後、培養され（このＤＮＡ配列は、通常、配列解析される）、修飾ＤＮＡの貯蔵物として提供される。
【００８１】
一旦ポリペプチドが組み替え宿主細胞において発現されると、ポリペプチドの精製が行われる。各種精製方法を用いることができる。例示的な方法を実施例に記載する。タンパク質は、イオン交換クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、及び関連する技術等の各種クロマトグラフィー技術により精製することができる。更に、タンパク質は所望のタンパク質自身の沈殿、又は融解性に影響する塩又は他の試薬を用いたプロドラッグの不純物の選択的沈殿により精製することもできる。タンパク質は抽出により精製することもできる。
【００８２】
１つの態様において、ＴＡＢをコードしている核酸は高度に厳しい条件下において本明細書で開示する任意のアミノ酸配列をコードしている核酸に相補的な核酸にハイブリダイズする。高度に厳しい条件とは、例えば、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中、６５℃においてフィルター結合ＤＮＡにハイブリダイズし、６８℃において０．１ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中で洗浄を行う条件を言う（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ｅｄｓ．，  １９８９，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  Ｉ，  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  ｐ．２．１０．３）。他の高度に厳しい条件は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ａｔ  ｐａｇｅｓ  ２．１０．１−１６  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９，  ｐａｇｅｓ  ９．４７−５７に記載されている条件である。他の態様において、中程度に厳しい条件が用いられる。中程度に厳しい条件は、例えば、４２℃において０．２ＸＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中での洗浄を含む。他の中程度に厳しい条件は、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｖｏｌ．  Ｉ，  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  Ｉｎｃ．，  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．，  １９８９，  ｐａｇｅｓ  ２．１０．１−１６  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  ２ｄ  ｅｄ．，  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄｓ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９，  ｐａｇｅｓ  ９．４７−５７に記載のものを言う。
【００８３】
本発明の第三の側面において、本発明は必要に応じてＴＡＢを個体に投与する工程を含む個体を治療する方法及びＴＡＢの基質であるプロドラッグを提供する。他の態様において、本発明はＴＡＢ分子を個体に投与することによって個体を治療する方法及びＢＬＡを活性ドラッグ転換するプロドラッグを提供する。他の態様において、前記ＴＡＢは特に、ＴＡＢ２．４、ＴＡＢ２．５又はＴＡＢ２．８であり、それぞれ配列番号８、配列番号１０、又は配列番号１６で定義される。
【００８４】
メルファラン誘導体は本発明のこの態様におけるプロドラッグとして適している。酵素／プロドラッグ／活性ドラッグの組合せは、例えば、Ｓｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｐａｔｅｎｔ  ５，７７３，４３５に記載されている。本文献を参照により本明細書に援用する。この態様のための好適なプロドラッグの他の例は、例えば、Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）、Ｂａｇｓｈａｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １１：５７９−８３  （１９９９）、及びＫｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ９：２５５−５９  （１９９８）．  Ｗｉｌｍａｎ，  “Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  In  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，”  Ｂｉｏｃｌｗｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，  １４，  ｐｐ．  ３７５−８２  （６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，  Ｂｅｌｆａｓｔ  １９８６）  及びＶ．  Ｊ．  Ｓｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，  “Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：  Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，  Ｒ．  Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，  （ｅｄ），  ｐｐ．２４７−６７  （Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）に記載されている。
【００８５】
本発明のプロドラッグは、アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎｓ）、カンプトセシン（ｃａｍｐｔｏｔｈｅｃｉｎｓ）、リン酸含有プロドラッグ、チオリン酸含有プロドラッグ、硫黄含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、D-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化酵素、β−ラクタムプロドラッグ、β−ラクタム含有プロドラッグ、任意で置換されているフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ、又は任意で置換されているフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、抱合体の酵素により活性の高い細胞毒を含まないドラッグに転換されうる５−フルオロシトシン又は他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含むがこれらに限定されない。本発明に用いるためのプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞毒性ドラッグの例は、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テンポシド（ｔｅｍｐｏｓｉｄｅ）、アドリアマイシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ダウノマイシン（ｄａｕｎｏｍｙｃｉｎ）、カルミノマイシン（ｃａｒｍｉｎｏｍｙｃｉｎ）、アミノプテリン（ａｍｉｎｏｐｔｅｒｉｎ）、ダクチノマイシン（ｄａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｓ）、シス−プラチニウム及びシス−プラチニウムアナログ（ｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ及びｃｉｓ−ｐｌａｔｉｎｕｍ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ）、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｓ）、エスペラマイシン（ｅｓｐｅｒａｍｉｃｉｎｓ）（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．４，６７５，１８７参照）、５−フルオロウラシル、メルファラン、他の関係するナイトロジェンマスタード、他の関連するナイトロジェンマスタード誘導体を含むがこれらに限定されない。（例えば、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔ．  Ｎｏ．４，９７５，２７８参照）。
【００８６】
本発明の他の態様において、前記ＴＡＢは、エピポドフィルロトキシングルコシド（ｅｐｉｐｏｄｏｐｈｙｌ−ｌｏｔｏｘｉｎ  ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）の４’−リン酸誘導体を活性抗癌ドラッグに転換するアルカリ性フォスファターゼ（ＡＰ）を含む。そのような誘導体は、エトポシド−４’リン酸、エトポシド−４’−三リン酸、及びテニポシド−４’−リン酸を含む。本発明の他の態様は、リン酸部分がグルコシド上の他のヒドロキシ基で置換されているグルコシドのリン酸誘導体を含む。他の態様では、本発明においてリン酸誘導体として用いられるリン酸誘導体は、エトポシド−４‘−リン酸、又はエトポシド−４’−三リン酸である。標的とされたＡＰは、プロドラッグからリン酸基を除去し活性抗腫瘍因子を放出する。この態様のマイトマイシンリン酸化プロドラッグはマイトマイシンＣのＮ７−Ｃ１−８アルキルリン酸誘導体又はそれらの医薬品上許容可能な塩である。Ｎ７は親ドラッグのミトサン核の７位に付加されたナイトロジェン原子を意味する。他の態様において、用いられる誘導体は７−（２’−アミノエチルフォスフェート）マイトマイシン（ＭＯＰ）である。代替的に、前記ＭＯＰは、９−メトキシ−７−［［（フォス−フォノオキシ（ｐｈｏｎｏｏｘｙ））エチル］アミノ］マイトマイシン二ナトリウム塩でもよい。本発明の他の態様は、プロドラッグとしてＮ７−アルキルマイトマイシンフォスフォロチオ酸塩（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ）の使用を含む。
【００８７】
本発明の更なる態様において、前記ＴＡＢ分子は新規なアドリナマイシンプロドラッグを活性抗腫瘍ドラッグアドリナマイシンに転換するペニシリンアミラーゼ酵素を含む。他の態様において、前記ペニシリンアミダーゼはフェノキシアセチルアミド結合を加水分解するフサリウムオキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）から単離されたペニシリンＶアミダーゼ（ＰＶＡ）である。抗腫瘍活性を有する因子を放出するアミダーゼにより加水分解されるＮ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル）アドリナマイシン（ＡＰＯ）又はアドリナマイシンも用いることができる。
【００８８】
本発明は、例えば、アドリナマイシンプロドラッグ、Ｎ−（ｐ−ヒドロキシフェノキシアセチル）アドリナマイシン及び実質的に同様の方式で誘導体化されうる他の関連するアドリナマイシンプロドラッグの使用を含む。例えば、プロドラッグ、Ｎ−（フェノキシアセチル）アドリナマイシンの使用も本発明の範囲内である。更に、本発明のアドリナマイシンプロドラッグは、例えば、本明細書に開示されているヒドロキシ基以外のフェニル環上の置換を含むＮ−フェノキシアセチル誘導体のほかに、フェニル環の異なる位置における置換を含むアドリナマインの他のＮ−ヒドロキシフェノキシアセチル誘導体を含む。
【００８９】
更に、本発明は、ＴＡＢの一部として、プロドラッグを抗腫瘍活性を有する形態に誘導体化することができる特定のアミダーゼに対応する他のプロドラッグのほかにペニシリンＧアミダーゼ等の他のアミダーゼの使用を包含する。例えば、ＴＡＢ分子が更にペニシリンＧアミダーゼを含む場合、ペニシリンＧアミダーゼはこのタイプのアミド結合を加水分解することから、前記プロドラッグは（ＡＰＯのフェノキシアセチルアミド基とは対照的に）フェニルアセチルアミド基を含む（例えば、Ａ．  Ｌ．  Ｍａｒｇｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  ６１６，  ｐｐ．  ２８３−８９  （１９８０）参照）。従って、本発明のプロドラッグはＮ−（ｐ−ヒドロキシフェニルアセチルアドリナマイシン、Ｎ−（フェニルアセチル）アドリアマイシン、及びドリアマイシンを好適に置換した他のＮ−フェニルアセチル誘導体を含む。
【００９０】
本発明は、親ドラッグのアミン基と、フェノキシ酢酸、フェニル酢酸、又の関連する酸のカルボキシル基との反応により提供される任意のプロドラッグを含む。従って、本明細書で述べた、アドリナマイシンプロドラッグと実質的に同様の方式で誘導体化又は活性化することができるアドリアマイシン以外のアントラサイクリンのプロドラッグも本発明の範囲に包含される。例えば、本発明により生成され及び使用することができる他のプロドラッグは、ダウノマイシン、カルミノマイシン等のアントラサイクリンのヒドロキシフェノキシアセチルアミド誘導体、ヒドロキシフェニルアセチルアミド誘導体、フェノキシアセチルアミド誘導体、及びフェニルアセチルアミド誘導体を含む。メルファラン、マイトマイシン、アミノプテリン、及びダクチノマイシン等の他のアミン含有ドラッグも本発明のプロモーターを生産するために修飾され得る。
【００９１】
本発明の他の態様は、シトシンデアミナーゼ（ＣＤ）酵素のＴＡＢ形態を含む。前記デアミナーゼ酵素は、抗悪性化活性を欠く化合物である５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を、抗腫瘍活性を有するドラックである５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）に転換する。
【００９２】
１つの態様において、前記プロドラッグはペプチドである。プロドラッグとしてのペプチドの例は、Ｔｒｏｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７９：６２６  （１９８２）、及びＵｍｅｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ４３：６７１  （１９８９）に記載されている。これらの及び他の文献は、ペプチドが血液中で十分に安定であることを示している。ペプチド誘導体プロドラッグの利点は、半減期、組織分布、及び活性ドラッグに対して低い毒性等の好適な薬理学的性質を比較して選択することが可能なことである。ペプチド誘導体プロドラッグの大部分の文献は、例えば、リソソーム酵素によるプロドラッグの非特異的活性化に関係する。
【００９３】
前記プロドラッグは２つ以上の工程において活性ドラッグに転換されるプロドラッグである。例えば、前記プロドラッグはＴＡＢにより活性ドラッグの前駆体に転換することができる。前記前駆体は、例えば、１つ以上の追加的なＴＡＢの触媒活性、個体に投与された１つ以上の他の酵素の触媒活性、個体又は個体の標的部位に本来存在している１つ以上の酵素（例えば、プロテアーゼ、フォスファターゼ、キナーゼ又はポリメラーゼ）の触媒活性により、個体に投与されるドラッグにより、又は酵素学的触媒作用ではない化学プロセス（例えば、酸化、加水分解、異性化、又はエピ化）により活性ドラッグに転換される。
【００９４】
既存の薬物が問題であることが発見された後で、プロドラッグを含む対部分の研究がなされている。特に、抗癌ドラッグは低い治療指数により特徴付けられている。これらのドラッグを毒性の低いプロドラッグに転換し、その後、それらを選択的に病理組織中で活性化することにより、これらのドラッグの治療指数は有意に増加する。例えば、Ｍｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｚｙｍｅ−ｐｒｏｄｒｕｇ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  （１９９９）及びＮｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ  １４：５１７  （１９９９）参照。
【００９５】
この文献はタンパク質工学又は指向進化（ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）により酵素の基質特異性を変化させる多くの方法を開示している。従って、当業者は、自然発生酵素に対してプアな基質となると思われる構造にも適応させるように、酵素の特異性を向上させることができる。従って、プロドラッグは、ドラッグがプロドラッグストラテジーに適していなくても設計することができる。
【００９６】
本発明の他の態様は、いくつかのプロドラッグと単一のＴＡＢを用いた組合せ化学療法を提供することである。この態様において、同じＡＴＢに対する基質である多くのプロドラッグを用いる。従って、特定のＴＡＢが多くのプロドラッグを細胞毒形態に転換し、腫瘍部位において抗腫瘍活性を高める。
【００９７】
医薬用ペプチド、タンパク質、又は低分子の血液循環における半減期を引き伸ばすことが求められている。通常、短い半減期―数分乃至数時間は、あまり求められていない。しかし、高い初期投与ピークを生じる治療効果を生じるための高投与量は、副作用を引き起こす。そのような治療の半減期を引き伸ばすことは、低い投与量で、副作用の頻度を低め、それゆえ、安価で安全な投与を実現する。明らかに、研究者たちはタンパク質をＰＥＧへ共有結合させることにより、タンパク質の半減期を引き伸ばすことを行っている（Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  ５，７１１，９４４参照）。ヒト血清アルブミンについては、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７６６，８８３参照。ＦｃフラグメントについてはＷＯ  ００／２４７８２参照。更に、ヒト血清アルブミンに対するドラッグの非特異的ターゲティングはｉｎ  ｖｉｖｏにおける化学結合ドラックにより行うことができる（例えば、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，８４３，４４０参照）。更に、癌治療薬の場合、高い浸透及び滞留を利用して腫瘍中に高分子ドラッグを配置することが提案されている。それゆえ、ドラッグの治療効果を改善することは、ドラッグをタンパク質又の高分子量ポリマーに結合させることにより実現できる。
【００９８】
１つの態様において治療を必要とする個体は癌患者である。他の態様において、前記ＡＴＢはＴＡＧ−７２を発現している細胞、組織、腫瘍、又は器官を標的とする。他の態様において、前記プロドラッグはＴＡＢにより活性ドラッグに転換される。他の態様において、前記活性ドラッグは、アルキル化因子である。他の態様において、前記プロドラッグは抗腫瘍ナイトロジェンマスタードプロドラッグである。他の態様において、前記プロドラッグはグルタリル−Ｃ−Ｍｅｌ又はグルタリル−Ｃ−Ｍａｌ−Ｐｈｅ−ＮＨ２である（例えば、参照により本明細書に援用されるＳｅｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７７３，４３５及びＫｅｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｌｉｅｎｔ  ９：２５５−５９  （１９９８）参照）。他の態様において、前記プロドラッグはビンカ−セファロスポリン又はドキソルビシン−セファロスポリンである。Ｂａｇｓｈａｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１１：５７９−８３  （１９９９）参照。本発明に用いることができる他のプロドラッグ／酵素の組合せは、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，９７５，２７８及びＭｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｅｎｚｙｍｅ−Ｐｒｏｄｒｕｇ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９９）に記載されているものを含むがこれらに限定されない。
【００９９】
第四の側面において、本発明はＴＡＢ分子を含む医薬品組成物に関する。前記ＴＡＢ分子、これをコードする核酸、及び特定の態様においては、本明細書で説明するプロドラッグは投与に適した医薬品組成物に包含される。そのような組成物は、通常、活性化合物及び医薬品として許容されうる担体を含んでいる。前記活性化合物と適合性がない限り、既知のいかなる培地又は試薬が、前記組成物中に用いることができる。補足的な活性化合物も前記組成物中に用いることができる。
【０１００】
本発明は所望のＴＡＢ、プロドラッグ、又は核酸の発現又は活性を調節するための医薬品組成物の調製方法を含む。そのような方法は、所望の活性化合物の発現又は活性を調節する因子と医薬品として使用することができる担体とを製剤化する工程を含む。そのような組成物は更に、追加的な活性因子を含むことができる。従って、本発明は更に、医薬品として使用することができる担体を、所望のＴＡＢ、プロドラッグ、又は核酸の発現又は活性を調節する因子と１つ以上の追加的な活性化合物とを製剤化することにより医薬品組成物を調製するための方法を含む。
【０１０１】
本発明の医薬品組成物は意図される投与経路に適するように製剤化される。投与の例は、投与経路の例は、非経口、例えば静脈内、皮内、皮下、口頭（例えば吸入）、経皮的な（局所）経粘膜と直腸内適用を含む。経口、皮内、又は皮下適用のために用いる溶液又は懸濁液は、注射用水、生理食塩水、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又の合成溶媒；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌試薬；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸等のキレート成分、酢酸、クエン酸、又はリン酸等の緩衝成分；及び水酸化ナトリウム又はデキストロース等の浸透圧を調製する成分を含むことができる。ｐＨは塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基を用いて調整することができる。非経口製剤の調整は、ガラス又はプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジ、又は多剤投与バイアルに入れられる。
【０１０２】
注射用に好適な医薬品氏は滅菌水性溶液（水溶性）又は分散剤、及び滅菌注射用溶液又は分散剤を即座に調製することができる滅菌粉末を含む。静脈注射において、好適な担体はノーマルな生理食塩水、注射用水、５％デキストロース又はリン酸緩衝生理食塩水を含む（ＰＢＳ）。全てのケースにおいて、前記組成物は滅菌されており、注射器への出し入れが容易な溶液である。前記組成物は製造及び貯蔵条件下において安定であり、バクテリア及び糸状菌等の微生物の汚染作用に対して保存され得る。前記担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及びリピッドポリエチレングリコール等の）及びこれらの好適な混合物を含む溶媒又は分散培地である。好適な流動性は、分散の場合には必要とされる粒子サイズに維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用を避けることは、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロザール等の各種抗菌剤及び抗カビ剤により達成することができる。多くのケースにおいて、例えば、糖、マンニトール、ソルビトール、等のポリマーアルコール、塩化ナトリウム等のアイソトニック試薬を組成物中に含めることが好ましい。
【０１０３】
滅菌注射用溶液は上で列挙した成分の１つ以上の組合せを含む好適な溶媒中に必要量の活性化合物取り込み、その後にフィルター滅菌をすることにより調製することができる。通常、分散剤は活性化合物を、塩基性分散培地を含む滅菌媒体及び上で必要とされる成分中に取り込むことにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、調製の好適な方法は、活性成と任意の好適な成分を含むフィルター滅菌された溶液を凍結乾燥して、粉末を得る方法である。
【０１０４】
経口用組成物は通常不活性希釈剤、又は食用担体を含む。これらは通常、カプセ化されるか、又はタブレットに圧縮される。経口用投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤中に取り込まれ、タブレット、トローチ、又はカプセルに成形されて用いられる。
【０１０５】
医薬品として適合する結合試薬、及び／又はアジュバント物質は前記組成物の一部となりうる。タブレット、ピル、カプセル、トローチ等は同様な性質の、微結晶性セルロース、ガム、チラガカント又はゼラチン等の結合剤；スターチ、又はラクトース等の賦形剤；アルギニン酸、プリモゲル（Ｐｒｉｍｏｇｅｌ）、又はコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム又はＳｔｅｒｏｔｅｓ（ステロデス）等の滑剤；コロイド二酸化ケイ素等の流動促進剤；スクロース又はサッカリン等の甘味剤；又はペパーミント、メチルサリチル酸又は有機香料等の香料を含む。
【０１０６】
吸入による投与のために、前記組成物は、好適な推進体（例えば、二酸化炭素等の気体又は噴霧器）を含む高圧容器又はディスペンサーからのエアロゾルスプレーの形態で提供される。
【０１０７】
システマティック投与も経粘膜、又は経皮投与により行うことができる。経粘膜又は経皮投与のために、浸透させるバリアに好適な浸透剤を製剤中に用いる。そのような、浸透剤は通常当業者に知られており、例えば、経粘膜投与には界面活性剤、胆汁塩及びフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻腔内スプレー又は座薬を用いて行われる。経皮投与のために、活性化合物は、当該分野において一般的に知られている軟膏、ゲル、又はクリームに製剤化される。
【０１０８】
前記化合物は、座薬（例えば、ココアバター及び他のグリセリドに基づく従来の座薬）又は直腸への届けるための残留性浣腸剤の形態に調製することができる。
【０１０９】
他の態様において、前記活性化合物は、移植、及びマイクロカプセル化デリバリーシステムを含む放出制御された製剤のような、体内からの急速な消失を避けるための担体とともに製剤化される。エチレンビニルアセテート、高分子無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ酪酸等の生分解性、生物に好適なポリマーが用いられる。そのような製剤の調製方法は当業者によく知られている。材料はアルザコーポレーション（ＡｌｚａＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、及びノバファーマシューティカルインク（ＮｏｖａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ，  Ｉｎｃ．）から入手可能である。リポソーム懸濁液（各種抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的としたリポソーム）も医薬品に使用可能な担体として用いることができる。これらは、例えば、Ｕ．Ｓ．  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．４，５２２，８１１に記載されているような、当分野において既知の方法で調製することができる。
【０１１０】
１つの態様において、前記製剤は、例えば、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｐａｔｅｎｔ  ｎｕｍｂｅｒ  ６，２１６，３７５及びＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｐａｔｅｎｔ  ｎｕｍｂｅｒ  ６，５３７，９８８に記載されているように、スルフォブチルエーテル‐７−ベータシクロデキストリン及び２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンを含む。これらの文献を参照により本明細書に援用する。
【０１１１】
通常、個体に届けられるＴＡＢの量は、例えば、投与の経路、ＴＡＢの活性、個体において標的とされる所望の細胞、組織、又は器官の特異性の程度、個体から非特異的結合ＴＡＢを除去するのに必要とされる時間の長さ、所望の治療効果、個体の体積、個体の年齢、個体の健康状況、個体の性、個体の食事、個体のＴＡＢに対する免疫反応、個体にたいして投与される他の医薬品又は処置、疾病の程度、及び処置の現在の又は将来予想される経過を含む各種因子に依存する。プロドラッグを投与する例においても、治療効果を決定するのに影響する他の因子は、例えば、投与されるプロドラッグの量、ＴＡＢ及びプロドラッグの投与感覚、プロドラッグ及びこれに対応する活性ドラッグの活性、プロドラッグ及び活性ドラッグの副作用又は毒性を含む。
【０１１２】
ＴＡＢの量／個体の容量の範囲の例は、例えば、約０．００１乃至３０ｍｇ／ｋｇ体重、約０．０１乃至２５ｍｇ／ｋｇ体重、約０．１乃至２０ｍｇ／ｋｇ体重、及び約１乃至１０ｍｇ／ｋｇ、２乃至９ｍｇ／ｋｇ、３乃至８ｍｇ／ｋｇ、４乃至７ｍｇ／ｋｇ、又は５乃至６ｍｇ／ｋｇ体重を含む。
【０１１３】
特定の態様において、個体は約０．１乃至２０ｍｇ／ｋｇ体重の間の量のＴＡＢで、１週間に１度又は１乃至１０週間、好ましくは２乃至８週間、好ましくは約３乃至７週間及び好ましくは約４、５週間又は６週間に一度の頻度で処理される。ＴＡＢの効果的な量は処理法により増減し、望む結果がえられるまで、又の理由で処理を中止するまで、投与内容を変更したり、あるいは変更せずに、継続されるであろうことは理解されるであろう。投与の変更は本明細書で述べる診断の結果から得られ及び明らかである。
【０１１４】
プロドラッグの適切な投与は一般的な医者、獣医師、又は研究者が知りうる多くの因子に依存している。プロドラッグの投与量は、例えば、ＴＡＢの効果的な投与に影響する因子で述べたものと同様の因子に依存するだろう。典型的投与量は個体の体重又はサンプル重量１ｋｇあたりミリグラム乃至マイクログラムの投与量を含む（例えば、１キログラムあたり１マイクログラム乃至１キログラムあたり５００ミリグラム、１キログラムあたり約１００マイクログラム乃至１キログラムあたり約５ミリグラム、又は１キログラム当たり１マイクログラム乃至約１キログラム当たり５０マイクログラム）。プロドラッグの好適な投与量は治療効果を参考にしつつ、プロドラッグの能力に依存することも理解されるであろう。１つ以上のこれらのプロドラッグが動物（例えば、ヒト）に投与された場合、医師、獣医師、又は研究者は、例えば、相対的に低い投与量を始めに投与し、続いて、所望の反応が得られるまで投与量を高めることは、理解されるであろう。
【０１１５】
好ましくは、前記ＴＡＢは個体に投与され、その後プロドラッグが投与される。より好ましくは、ＴＡＢの投与及びプロドラッグの投与の間の時間は、その標的部位に結合させることによりその標的部位においてＴＡＢが蓄積し、及び個体の体の非標的部分から未結合ＴＡＢを除去するのに十分な時間である。最も好ましくは、未結合ＴＡＢに対する標的に結合したＴＡＢの割合は、プロドラッグが投与される時点において、最大かそれに近い値になっていることが最も好ましい。このような割合に到達するためのＴＡＢを投与した後に必要な時間はクリーニングタイムと言われている。このクリーニングタイムは、例えば、検出可能なＴＡＢ（例えば、放射線標識又は蛍光標識したＴＡＢ）を個体に投与し、当時に標的部位及び非標的部位の酵素の量を継時的に測定するような実験システムにより、決定又は見積もることができる。特に、カウンターパート活性ドラッグ毒性が高いいくつかのプロドラッグについては、個体システムにおいて未結合ＴＢＡのレベルを特定のスレッシュホールド以下にすることは重要である。このレベルも、上述のような実験で決定することができる。投与インターバルは約７２及び約９６時間が好ましい。
【０１１６】
１つの態様において、プロドラッグの投与は全身系である。他の態様において、プロドラッグの投与は標的中、又は標的の近くで行われる。
【０１１７】
前記医薬品組成物は容器、パック、ディスペンサー又はキット中に投与のための説明書とともに梱包される。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：ＴＡＢ２．１タンパク質を発現しているプラスミドｐＮＡ２２．７の構築
ＴＡＢ２．１分子のｓｃＦｖタンパク質のアミノ酸配列はネズミ科の抗ＴＡＧ−７２分子抗体（ｍＡｂ）ＣＣ４９配列（Ａｂｅｒｇｅｌ  ｅｔ．  ａｌ．，  （１９９３）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １７：４３８−４４３）より提供されたものである。この合成遺伝子の核酸配列はｖＨ−（ＧＧＧＧＳ）３−ｖＬの遺伝子構造を有するｖＨ及びｖＬドメインを含むＥ．ｃｏｌｉコドン使用プラス１５−ａａペプチドリンカーを基に設計された。設計された遺伝子を含む９３７ｂｐＤＮＡフラグメントを、フランキングＢｇＩＩ及びＥｃｏＲＶ制限酵素部位を用いてＭｃＬＡｂ（サウスサンフランシスコ、カルフォルニア）で合成し、プラスミドｐＰＣＲＩＩ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン、カールスバーグ、カルフォルニア）内でクローン化し、プラスミドｐＡＧを得た。
【０１１９】
プラスミドｐＭＥ２５．１をプラスミドｐＡＧ由来のＣＣ４９抗体の合成ｓｃＦｖタンパク質をクローンするのに用いた。ＢｇＩＩ及びＥｃｏＲＶ酵素を用いたプラスミドｐＡＧ及びｐＭＥ２５．１の消化において、０．８８ｋｂ挿入フラグメント及び４．３ｋｂのベクターフラグメントをそれぞれ、ゲル精製した。その後、これらを結合し、Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０（インビトロジェン、カールスバーグ、カルフォルニア州）ケミカルコンピテント細胞内で形質転換し、ＬＡ＋Ｃｍ５＋０．１ＣＴＸプレート上で選択した。１０の形質転換体から単離されたプラスミドＤＮＡをＰｖｕＩＩ酵素を用いて消化し、ＣＣ４９ｓｃＦフラグメントの適切なサイズ及び位置を確認した。予想される制限消化パターンが１０のクローン全てにおいて見られた。幾つかのクローンの発現及び結合について試験を行った後、プラスミドｐＮＡ２２．７を更なるエンジニアリングのために選択し、ＴＡＢ２．１と称した。
【０１２０】
実施例２：ＴＡＢ２．４タンパク質を発現しているプラスミドｐＳＷ２３９．１の構築
プラスミドｐＮＡ２２．７（ＴＡＢ２．１）を前述のクイックチェンジ変異誘発プロトコル（ストラタジェン、カリフィルニア）のＰＣＲプテンプレートとして用いる点を変更点として、プラスミドｐＳｗ２３９．１（ＴＡＢ２．４）を構築した（Ｗａｎｇ，  Ｗ．  ＆  Ｍａｌｃｏｌｍ，  Ｂ．Ａ．  ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２６：６８０−６８２  （１９９９））。この操作はＴＡＢ２．４タンパク質のｖＨ及びＬＶドメインの間のリンカーサイズを１５−ａａ［（ＧＧＧＧｓ）３］から３０−ａａ［（ＧＧＧＧｓ）６］に増やす。ヌクレオチド配列を大文字で示す１５−ａａ（ＧＧＧＧＳ）３シーケンスを挿入するためにプライマーＨＲ０６１ＦとＨＲ０６１Ｒ（ＨＲ０６１Ｆ：５’−ＡＣＣＧＴＴＡＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＴＴＣＧＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＧＧＧＣＴＣＴＧＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＴＴＣＣＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＴＧＧＣ−３’及びＨＲ０６１Ｒ：５’−ＡＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＣＡＧＡＧＣＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＣＧＡＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＧＣＴＧＣＴＡＡＣＧＧＴＣＡＣＧＣＴＧＧＴＣＣＣＴＴＧＡＣＣ−３’）を用いた。二段階の標準的クイックチャンジ変異誘発（ストラタジェン、カリフォルニア）ＰＣＲ反応を行い、その後にＤｐｍＩ酵素の消化を行う。５０μＬのＰＣＲ生成物のうちの２μＬをＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｅ、ケミカルコンピテントセル内で形質転換し、続いて、形質転換体をＬＡ+Ｃｍ１０１０．１ＣＴＸプレート上で選択した。１６クローンからのプラスミドＤＮＡをＴｅｍｐｌｉｐｈｉｎ−１００増幅キット（アマシャムバイオサイエンス）により増幅し、挿入位置が正確であるかを配列決定により確認した。１６クローンのうちの１１は所望の位置に挿入されていることを確認した。プラスミドｐＳＷ３２．９．１の融合遺伝子全体の全配列において、他の変異は生じていなかった。最終的にプラスミドｐＳＷ２３９．１を図１の配列番号を有するＴＡＢ２．４分子として選択した。ＴＡＢ２．４アミノ酸配列を図１に示す。
【０１２１】
実施例３：ＴＡＢ２．４の組合せコンセンサス変異誘発
ＴＡＢ２．４タンパク質の発現を改善するために、参照により本明細書に援用されるＷＯ  ＵＳ０４／３００８５に記載の組合せコンセンサス変異誘発を、ｐＳＷ２３９．１プラスミドをテンプレートとして用いてｖＨ及びｖＬドメインのフレームワーク領域中のアミノ酸残査のターゲッティングにより行った。これらの１２残査（ｖＨにおける８つの位置及びｖＬにおける４つの位置）は一般的なヒト抗体配列との比較により有意な違いがあると同定された（＜１０％  ａｂｕｎｄａｎｃｅ）。これらの１２部位の中から２１の変異体を作成し、これらのうちの幾つかは１つ以上の置換を有していた。前述の参照により本明細書に援用されるＷＯ  ＵＳ０４／３００８５に記載のマルチサイトクイックチェンジ変異誘発（Ｍｕｌｔｉ−ｓｉｔｅ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ストラタジェン、カリフィルニア）の変法を用いて、それぞれ０．４μＭ及び２μＭの濃度の組合せプライマーを用いてＭＥ３６７及びＭＥ３６８ＣＣＭライブラリーを表１に示す２１のリン酸化プライマーに用いて構築した。
【０１２２】
表１．ＴＡＢ２．４タンパク質の組合せコンセンサス変異誘発（ＣＣＭ）に用いた配列の組合せ。プライマーネームは、軽鎖（Ｌ）及び重鎖（Ｖ）において変異させるアミノ酸配列、その位置及び意図する変異（上のケースにおいて示す変異コドン）に対応する。従って、ＨＤ８Ｇは重鎖の８の位置でＧｌｙ（Ｇ）に変化させるＡｓｐ（Ｄ）に対応する。番号付けは軽鎖又は重鎖のカバット（Ｋａｂａｔ）システムに基づいている。全てのプライマーはセンス鎖に設計されている。
【表１】
2008539237.tif 000003
【０１２３】
変異及びＤｐｎＩ消化の後、２５μＬのＰＣＲ反応混合物のうちの１．５μＬをＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’細胞内へ形質転換し、その後ＬＡ＋Ｃｍ２０+０．１ＣＴＸプレート上で選択した。各ライブラリーからの９６クローンを以下で説明する９６ウェルマイクロタイタープレートにおける改善された発現のために初期スクリーニングした。活性に対する配列の統計的解析はライブラリーデザインに含まれる２１の変異体のうちの５つが結合により検出可能であることを示している。従って、新たなライブラリーはこれらの変異体（軽鎖Ｈ３２Ｍ、Ｈ３２Ｉ、Ａ３３Ｇ、Ａ３３Ｗ及びＡ３３Ｙ）をコードしているプライマーを用いずに設計された。これらの新たなライブラリーをＭＥ３７４、ＭＥ３７５、及びＭＥ３７７と名づけた。ＭＥ３７４は０．４μＭプライマー濃度において１６変異全てを含んでいた。ＭＥ３７５は０．１μＭのプライマー濃度において、１６変異体全てを含んでいた。ＭＥ３７７は軽鎖中に変異ＤＧ８、Ｎ４０Ａ，Ｎ４０Ｐ、Ｖ８０Ｌを、重鎖中にＡ３５Ｔを含んでいた。
【０１２４】
実施例４：ＣＣＭライブラリーの構築
ライブラリーｐＭ３６７及びｐＭ３６８は、ＢＬ培地及び５ｍｇ／Ｌクロラムフェニコール（ＣＭＰ）及び０．１ｍｇ／Ｌのセフォタタキム（ｃｅｐｈｏｔａｘｉｍｅ（ＣＴＸ，  シグマ））を含むアガープレート上で平板培養された。各ライブラリーからのコロニー（それぞれの親を含む９６クローン）を１００μＬのＬＢ及び５ｍｇ／ＬのＣＭＰを含む９６ウェルプレート内で形質転換した。プレートを振とうしながら高湿度のボックス内で７３℃、２４時間プレインキュベートした。スクリーニングの日に、１００μＬのＢ−Ｐｅｒ試薬（ＰＩＥＲＣＥ）を各ウェルに添加し、室温において３０分間振とうさせた。標的となるウシ顎下腺ムチン（「ＢＳＭ」シグマ）、はＢ７２．３及びＣＣ４９（Ｏ‘Ｂｏｙｌｅ，  ＫＰ.  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９６）．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １５，  ４０１−４０８）と確実に反応するＴＡＧ−７２エピトープを含むムチンである。ＰＢＳ中１００μＬの１０μｇ／ｍｌＢＳＭを添加することにより、高結合能を有する９６−ウェルポリスチレンプレート（Ｃｏｓｔａｒ＃９０１８）中にＢＳＭをコートし、このプレートを一晩４℃でインキュベートした。このプレートをＰＢＳＴ（ＰＢＳ+０．１％Ｔｗｅｅｎ２０）で洗浄し、１ウェル当たり２００μＬのＰＢＳＴで室温２時間インキュベーションした。このプレートをその後ＰＢＳＴで３回洗浄した。７μＬのＢ−Ｐｅｒ抽出ライブラリーサンプルを１ウェル当たり９３μＬのＰＢＳＴに添加した。このプレートを緩やかに振とうしながら室温で２時間インキュベートした。このプレートをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＰＢＳＯ（ＰＢＳＯ+０．１２５％オクチルグリコピラノシド）中２００μＬのＢＬＡ基質を各ウェルに添加し、結合ＢＬＡ活性を室温において４９０ｎｍ波長におけるニトロセフィンの加水分解をモニタリングしながら測定した（ｔ＝０）（図２参照。ニトロセフィンアッセイについては参照により本明細書に援用されるＷＯ０３／１０５７５７参照）。活性に対する配列の統計解析から、ライブラリーデザインに含まれる２１変異体のうちの５つがＢＳＭ結合において不利であることが分かった。ライブラリー中の各変異体について、この統計解析はこの実験データ決定されたパラメータを生じた。もし、変異体が発現、又はベースストック又は他の測定可能な変異のいずれかを改善するならば、このパラメータは陽性の値を示すであろう。もし、変異体が不利であるならはこのパラメータは陰性の値を示すであろう。このパラメータは、１のパラメータが〜１０倍の改善を示すような、対数の値である。このパラメータは変異体がライブラリー中に観察される回数に関して解析される。より多くの変異体が観察されると、パラメータ値の信頼性が高くなる。従って、新たなライブラリーは、これらの変異体をコードするプライマー（軽鎖についてＨ３２Ｍ、Ｈ３２Ｉ、Ａ３３Ｇ、及びＡ３３Ｙ）を用いずに設計された。各ライブラリー、ＭＥ７３４、ＭＥ３７５、及びＭＥ３７７の１つのプレートを、ＢＬ+１０ｍｇ／Ｌ  ＣＭＰを培地として用いた以外は、既に述べた方法と同じ用にスクリーニングした。総ＢＬＡ活性（発現）を、２０μＬサンプル希釈液を１８０μＬＰＢＳＯに添加し、室温において４９０ｎｍ波長におけるニトロセフィンの加水分解をモニタリングすることにより、ＰＢＳＯにおけるＢ−ｐｅｒ抽出物の１／１０希釈を測定した。
【０１２５】
最終的に、結合している組成物を以下のように決定した。ｔ＝０でＢＳＭに結合するＢＬＡ活性を測定したあと、このプレートを緩やかに振とうしながら、室温で１重量％間インキュベーションする。このプレートをその後、ＰＢＳＴで３回洗浄する。残りの結合ＢＬＡ活性（ｔ＝１）を測定する。ｔ＝０における結合ＢＬＡ活性に対する１時間インキュベーションした後のｔ＝１活性結合の割合がオフレートの比較の結果となる。図４はライブラリーＭＥ３７４、ＭＥ３５７、及びＭＥ３７７に対するスクリーニングデータを示す。多くの変異体はＴＡＢ２．４クローンよりも高い結合／インプット比を示す。
【０１２６】
図５において、スクリーニングデータに対する統計的解析は、幾つかの変異体がＴＡＢ２．４の高い発現において有利であることを示している。
【０１２７】
このスクリーニングから、２２クローンが更なる解析のために選択された。このクローンのグリセロールストック及び親ＴＡＢ２．４及び癌胎児性抗原（ＣＥＡ）に結合するが、ＴＡＧ−７２には結合しない対照ＣＡＢ１．２をＬＡ+５ｍｇ／Ｌ  ＣＭＯアガーゲル上に塗布した。各変異体からの４つのコロニーを９６ウェルプレート中１００μＬのＬＢ+１０ｍｇ／Ｌ  ＣＭＰに接種し、３７℃で一晩育成させた。このプレートを１００μＬのＬＢ+１０ｍｇ／Ｌ  ＣＭＰを含む３つの９６ウェルプレートで複製し、７３℃で４８時間した。３つのプレート（３回試験）のＢ−ｐｅｒ抽出物を上にのべたように調製した。ＢＬＡ活性、ＢＳＭへの結合、及びオフレートも上で述べたように測定した。サンプルをＰＢＳ中で１０倍希釈し、ＢＳＭ結合の試験に用いた。
【０１２８】
図６に示すデータは、幾つかのクローンが発現され、ＢＳＭに結合することを示している。しかしながら、配列の解析は幾つかのクローンがＶＬ及びＶＨの間のリンカー領域に変異を有することを示している。前記ＶＬ及びＶＨはＢ−ｐｅｒ抽出物中に存在するダイマー又はマルチマーの量に影響を及ぼし、その結果、結合データに影響する。リンカー変異を有するクローンは更なる解析には用いなかった。
【０１２９】
データ及び配列解析から選択された７つの最も良く発現／結合しているクローン、及びＴＡＢ２．４対照、を２ｍＬ  ＬＢ+１０ｍｇ／ＣＭＰを含むチューブ内で、３７℃で一晩育成した。その後、２００μＬの培地を３つの、２５ｍＬ+ＴＢ培地+１０ｍｇ／ｍＬＣＭＰに移し、３７℃で４８時間育成した。この培地の１ｍＬを平板培養し及び１ｍＬのＢ−ｐｅｒ試薬を添加し、振とうしながら６０分インキュベーションした。Ｂ−ｐｅｒ抽出物を延伸分離し、上清を新たなチューブに移した。各サンプルを、上で説明したＢＬＡ活性、ＢＳＭ結合（連続希釈）及びオフレートについて試験した。このサンプルを、融合タンパク質のインタクトネスについて抗−ＢＬＡウエスタンブロットにおいて比較した。このウエスタンブロットのために、各サンプルは、各ウェルにおいて５０ｎｇの融合タンパク質が付加されるように予め希釈された。この５０ｎｇの融合タンパク質は、６０μＬの各サンプルを３０μＬの４ＸＬＤＳサンプル緩衝液及びサンプル還元剤（インビトロジェン）に混合することにより２／３に希釈された。ゲルに付加されたサンプルは８５℃で５分間加熱された。１５μＬの各サンプルをゲルに付加した。このゲルはＮｕＰＡＧＥ４−１２％ＢＩｓ−Ｔｒｉｓゲルの分離されたウォール内で染色される。
【０１３０】
タンパク質を、その後、トランスファー緩衝液（インビトロジェン）を用いて、ＤＳＤ−ＰＡＧＥゲルからＰＶＤＦ膜上に移し、２５Ｖの定電圧で６０分間電気泳動した。２．５％ＢＳＡ溶液（０．１％のｔｗｅｅｎ−２０を含むトリトリス緩衝生理食塩水中ブロッカーＢＳＡ（ＴＢＳＴ）中にこの膜を浸し、６０分間振とうすることによりブロッキングを行った。膜を一次抗体溶液の中に浸し、６０分間振とうした（アブジェント（Ａｂｇｅｎｔ）マウス抗−ＢＬＡｍＡｂをＴＢＳＴ中で１：１０，０００希釈したもの）。この膜をＴＢＳＴで５分間３回洗浄した。この膜を第二抗体溶液（ヤギ抗−マウスＩｇＧ：ＨＲＰ（ピアス）をＴＢＳＴ中で１：２０，０００希釈したもの）に浸し、振とうしながら６０分洗浄した。この膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間、３回すすいだ。
【０１３１】
２ｍＬ  ＥＣＬプラス（アマシャムバイオサイエンス）検出溶液を５０μＬの溶液Ｂを２ｍの溶液Ａに添加することにより調整した。この検出液を膜の表面全体にピペッティングした。検出溶液で５分間インキュベーションした後、過剰の試薬を乾燥させ、この膜をタンパク質側をストームイメージスキャニングベッド（Ｓｔｏｒｍ  Ｉｍａｇｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｂｅｄ）に向けて置いた。ブルー蛍光／化学蛍光モードを用いてスキャンを行った。インタクトタンパク質のパーセンテージを決定するためにデンシトメトリーを用いた。このウエスタン膜はインタクト及び分解された物質の両方についてのバンドにおけるデンシトメトリーを行うためにイメージクアント（Ｉｍａｇｅ  Ｑｕａｎｔ）プログラムを用いたストームイメージャー（Ｓｔｏｒｍ  Ｉｍａｇｅｒ）を用いてスキャンした。断面線を濃度曲線下面積（ＡＵＣ）としてバンド強度を測定するために用い、インタクトのパーセント、ＢＬＡとして分解物のパーセント、並びにバンド強度の大きさを計算した。
【０１３２】
クローンｐＭＥ３７７．４は親ＴＡＢ２．４よりもより良い発現（３．５−４倍、図７参照）及びインタクトネス（〜９０％ｖｓ〜５０％、図８参照）を示し、コートされたＢＳＭに対して等しい結合及びオフレートを示した。このクローンを次世代として選択し、ＴＡＢ２．５と名づけた。ＴＡＢ２．５はＴＡＢ２．４と比較すると、ｓｃＦｖフラグメントのｖＨ領域にＶ８０Ｌの変異を含み、ｖＨ領域にＳ５Ｔ、Ａ５３Ｔ及びＫ７９Ｅ変異を含む。コートされたＢＳＭに対する結合曲線はこの試験されたクローンがＴＡＢ２．４よりも明らかに高い親和性を有することを示している（図９参照）。
【０１３３】
実施例５：ＴＡＢ２．４及びＴＡＢ２．５の発現及び精製
細胞をＢ−ｐｅｒ中で以下のように崩壊させる。凍結Ｅ．ｃｏｌｉ細胞ペースト１グラム当たり２．５ｍＬ  Ｂ−ｐｒｅ試薬（リン酸緩衝液中、ピアスバイオケミストリー社、カタログＮｏ．７８２６６）を添加した。ベンゾナーゼヌクレアーゼ（Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ  Ｎｕｃｌｅａｓｅ）（ノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）製品番号＃７０６６４−３）を１：１０００希釈になるように加水分解するＤＮＡに添加する。この混合物を激しく６０分間室温において撹拌する。崩壊した細胞を４℃、２０分、１２，０００ｒｐｍで遠心分離する。ペレットを廃棄する。
【０１３４】
融合タンパク質をＰＢＡ親和性クロマトグラフィーを介して捕捉する。粗タンパク質を付加する前に、５ｍＬＰＢＡカラム（アガロースゲル上にｍ−アミノフェニルボロン酸を固定化したもの。シグマ  製品番号＃Ａ−８３１２）を２５ｍｌＴＥＡ緩衝液（２０ｍＭトリエタノールアミン、ｐＨ７）で平衡化する。サンプル付加の後、このカラムを２５ｍＬＴＥＡで洗浄し、二回目に２５ｍＬＴＥＡ／ＮａＣｌ緩衝液（２０ｍＭ  トリエタノールアミン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ，ｐＨ７）で洗浄する。β−ラクタマーゼ融合タンパク質は２５ｍＬ  ホウ酸／ＮａＣｌ緩衝液（０，５Ｍホウ酸／０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７）で溶出させ、５ｍＬの分画に収集した。溶出された分画を上で説明した、ニトロフェリンピレートアッセイを用いてβ−ラクタマーゼ活性を測定した。
【０１３５】
サイズ排除クロマトグラフィーを用いて精製モノマーを得た。５ｍＬの濃度のＴＡＢタンパク質をＰＢＳで平衡化されているＳｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｒａｄｅ  ｃｏｌｕｍｎ  （Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，  製品番号＃  １７−１０７０−０１）に付加した。タンパク質を２ｍL／分の流量のＰＢＳで分離し、５ｍLの分画に収集した。
【０１３６】
エンドトキシンをＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（商標）を介して除去した。１−４ｍLの濃度のβ−ラクタマーゼ融合タンパク質をＰＢＳで平衡化されている１０ｍLのＤｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ（商標）（ｐｏｌｙｍｉｘｉｎ−Ｂに固定化されている、ピアス、製品＃２０３３９）カラム上に付加した。このサンプルをＰＢＳで溶出する前に２．５時間、樹脂に結合させた。１５１ｍＬの分画を収集した。溶出された分画の典型的なＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図１０に示す。個々の分画についてβ−ラクタマーゼ活性を、ニトロフェリンプレートアッセイを用いて測定し、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒＱＣＬ−１０００Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  Ｅｎｄｐｏｉｎｔ  ＬＡＬアッセイを用いてエンドトキシンを測定した。ＴＡＢタンパク質１ｍｇ当たりのエンドトキシン単位を計算した。ｉｎ  ｖｉｖｏでのマウスにおける最大濃度は５Ｕ／ｍｇであった。
【０１３７】
実施例６：ＴＡＧ−７２タンパク質に対するＴＡＢ２．４及びＴＡＢ２．５の結合
結合のための抗体を以下のようにコートした。全てのアッセイは高結合能９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ  ９０１８）を用いて行った。ＢＳＭ（シグマ）を室温で２時間、又は４℃で１６時間以上のいずれかの条件で、１００μＬＰＢＳ中１０μｇ／ウェルでコートした。腫瘍抽出物をＰＢＳ中１μＬ／ウェルでコートして、このプレートをインキュベーター内において２５℃で、Ｏ／Ｎを用いて乾燥した。腫瘍抽出物はいくつかのＬＳ１７４Ｔマウス由来異種移植片のプールから生成された。腫瘍プールはＴ−ｐｅｒ（ピアス、製品番号＃７８５１０）（腫瘍１００ｍｇ当たり１ｍＬ）を用いて処理し、Ｈａｌｔ  プロテアーゼインヒビター（ピアス、製品番号＃７８４１０、１００Ｘ）を１Ｘ濃度で添加し、腫瘍をホモジナイズした。このＴ−ｐｅｒ懸濁液を室温で２０分間振とうして、細胞を再懸濁し、１５分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離した。この懸濁液を腫瘍抽出物（ＴＥ）として収集し、分割して−８０℃で貯蔵した。細胞溶解物のタンパク質濃度を決定するためにＢＡＣ（バイオラド）アッセイを行った。市販のヒト由来液体（バイオプロセシング社、４３，５０４Ｕ／ｍＬストック）から精製されたＴＡＧ−７２から精製された抗原ＣＡ７２−４について、１／１０００希釈物の１００μＬを４℃で１６時間ＰＢＳ中でコートした。コートの後、ウェルをＰＢＳＴで３回洗浄し、２００μＬＰＢＳＴで２時間ブロッキングを行った。各種濃度のＴＡＢ分子をＰＢＳ中１００μＬの最終濃度になるように添加し、室温で振とうしながら、２時間インキュベーションした。未結合物質をＰＢＳＴで３回洗浄し、結合ＴＡＢを２００μＬのニトロセフィン溶液を添加することにより検出し、４９０ｎｍで１５分間検出した。
【０１３８】
ＴＡＢ２．５結合は、ＴＡＧ−７２抗原に対して全て試験した。抗原及びＣＡ７２−４抗原に依存して変化する結合シグナルはＢＳＭ及び腫瘍抽出物（ＴＥ）と比較して低い結合シグナルを呈した（図１１）。ＴＡＢ２．４及びＴＡＢ２．５は同様の親和性でコートされたＢＳＭに結合し（図１２）、同様のオフレートを呈した（図１３）。全てのケースにおいて、結合シグナルの飽和は試験されたＴＡＢの最高濃度においても見られなかった。
【０１３９】
競合アッセイも行った。ＢＳＭ又は腫瘍抽出物（ＴＥ）を上で説明したように９６ウェルプレートにコートした。このウェルを洗浄及びブロッキングした後、５０００ＵのＴＡＢをＰＢＳＴ中最終容量が１００μＬになるように各種濃度で添加した。用いたコンペティターはＢＳＭ（シグマ,  分子量１５０ＫＤａ）、ＳＴｎビオチン標識マルチマー（ＴＡＧ−７２,  グリコテック、製品番号  ＃０１−０５９）、ＬＳ１７４Ｔ細胞からの腫瘍抽出物  （ＴＥ）及びＣＡ７２-４（バイオプロセシング）であった。ビオチン標識されたＳＴｎマルチマーはＴＡＧ−７２の精製合成形態であり、ＴＡＢ抱合体により認識される。存在しているコンペティターの中のＴＡＢ２．５を撹拌しながら、室温で２時間インキュベーションし、未結合物質をＰＢＳＴで３回洗浄し、結合ＴＡＢ２．５に２００μＬのニトロセフィン溶液を添加し、４９０ｎｍのＯＤの動態を１５分間測定した。図１４及び１５はＢＳＭがＴＡＢ２．５の腫瘍抽出物への結合を抑制し、ＢＳＭが、それぞれ、〜３００ｎＭ及び〜２００ｎＭのＩＣ５０を有することを示している。ＢＳＭ又は腫瘍抽出物のいずれかへのＴＡＢ２．５の結合は、試験条件下において（腫瘍抽出物については１５０μＬ／ｍＬまで、ＣＡ７２−４については２２００Ｕ／ｍＬまで、及びＳＴｎについては８５０ｍＭまで）、腫瘍抽出物、ＣＡ７２−４、又はＳＴｎにより阻害されなかった。
【０１４０】
実施例７：チャージ変異体ライブラリーの構築
ＴＡＢ２．５タンパク質の薬理動態におけるタンパク質の正味電荷のインパクトを研究するために、ｓｃＦｖを基にして、又はβ−ラクタマーゼタンパク質を基にして、増加又は減少した正味電荷を有する４つのライブラリーを構築した。上で述べたマルチ部位クイックチェンジ変異誘発（ストラタジェン、カリフォルニア）プロトコルの変法（例えば、参照により本明細書に援用されるＷＯ０４／３００８５）を用いて、ｓｃＦｖに基づくライブラリーを用いて、ＴＡＢ２．５の正味電荷を増やした、又は減らしたライブラリー、及び２つのβ−ラクタマーゼに基づくライブラリーを構築した。ライブラリーＭＥ３８４は、アルギニン又はリジン残基を有する特定の非保存正電荷残基の置換により電荷を増やすためにβ−ラクタマーゼにおいて調製された。ＭＥ３８５はアスパラギン酸又はグルタミン酸の置換により、正味電荷を減らすために作成された。ライブラリーＭＥ３８６及びＭＥ３８７は、それぞれ、ｓｃＦｖと同じ方法で、それぞれ正味電荷を増やす又は減らすために調製された。ライブラリーＭＥ３８４及びＭＥ３８５は、表２に示すように、それぞれ、１７及び２０のリン酸化プライマーを用いて作成された。表３に示すように、それぞれ、１４及び１５のリン酸化プライマーを用いてライブラリーＭＥ３８６及びＭＥ３８７を作成した。全てのプライマーをＨＰＬＣで精製した。４つの個々の反応は、ｐＭＥ３７４．４をテンプレートとして０．４Ｍの組み合わせたプライマーの濃度で、構成した。変異誘発及びＤｐｎＩ消化の後、２５μＬのＰＣＲ反応混合物のうちの１．５μＬをＥ．ｃｏｌｉＴＯｐ１０Ｆ’細胞内へ移し、ＬＡ+２０ｍｇ／Ｌ  ＣＭＰ+０．１ＣＴＸプレート上で選択した。各ライブラリーの９６クローンを上で述べたように９６ウェルマイクロタイタープレートにおいて発現の改善についてスクリーニングした。
【０１４１】
表２．ＴＡＢ２．５タンパク質のベータラクタマーゼ変異誘発に用いたプライマーの配列。プライマーネームは変異させるアミノ酸、その位置、及び意図する変異誘発に対応している（上述の変異させたコドン）。β−ラクタマーゼ変異誘発に用いた全てのプライマーは名前の初めにＢがつく。従って、ＢＥ５ＲはＡｒｇ（Ｒ）に変異させるβ−ラクタマーゼの５の位置のＧｌｕ（Ｅ）に対応する。番号付けは、β−ラクタマーゼの第一残査に基づいている。全てのプライマーはセンス鎖に設計されている。
【表２】
2008539237.tif 000004
【０１４２】
2008539237.tif 000005
【０１４３】
ＴＡＢ２．５タンパク質のｓｃＦｖ変異誘発に用いたプライマーの配列。プライマーの名前は軽鎖（Ｌ）又は重鎖（Ｈ）において変異させるアミノ酸、その位置、及び意図する変異（上で説明する変異されたコドン）に対応する。従って、ＨＤ８ＲはＡｒｇ（Ｒ）に変異させる重鎖の８の位置のＡｓｐ（Ｄ）に対応する。軽鎖及び重鎖の両方における番号付けはカバット（Ｋａｂａｔ）システムに基づいている。全てのプライマーはセンス鎖に設計されている。
【表３】
2008539237.tif 000006
【０１４４】
2008539237.tif 000007
【０１４５】
実施例８：電荷変異体のライブラリーのスクリーニング
ライブラリーＭＥ３８４、ＭＥ３８５、ＭＥ３８６、ＭＥ３８７の各１つのプレートをＬＢ＋１０ｍｇ／Ｌ  ＣＭＰを育成培地として用いて、培養を３０℃、４８時間で行った点を除いて上で説明する方法と同様にスクリーニングした。総ＢＬＡ活性として測定される発現、ＢＳＭ結合、及びオフレートを全てのクローン及び親ＴＡＢ２．５について測定した。
【０１４６】
融合タンパク質及びＢＬＡタンパク質中に３までの電荷反転変異を含む多くの変異体が、ＴＡＢ２．５に似た形態で発現及び結合していることを確認した。これらの変異体は融合タンパク質のｓｃＦｖの部分に７つまでの電荷反転変異を含み、良好な発現を示し、親ＴＡＢ２．５に似た形態で、ＢＳＭに結合していることも確認された（図１６参照）。更なる解析のために、（親ＴＡＢ２．５に）似た結合を有し、発現が良好であり、正味電荷の範囲を含むクローンを選択した。これらのクローンに対するＢ−ｐｅｒ抽出物を、３０℃で４８時間９６ウェルプレートを用いて育成した後、（発現及びＢＳＭ結合について）４回試験した。更に、クローンを１１クローン及びテンプレートＴＡＢ２．５に選択した。このクローンの変異体、正味電荷、及び理論上のｐＩを表４に示す。ＴＢ培地を含む２５ｍＬ振とうフラスコ内で、３０℃、４８時間で、これらを育成した。発現（ＢＬＡ活性）、ＢＳＭ及び腫瘍抽出物（ＴＥ）結合、及びオフレート、ウエスタンブロットを用いたインタクトネスを測定し、野生型テンプレートＴＡＢ２．５と比較した。結果の概要を表５に示す。この結果は多くのクローンがＴＡＢ２．５と同様の特性を有することを示している。
【表４】
2008539237.tif 000008
【表５】
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【０１４７】
実施例９：ＴＡＢ２．６の構築及び試験
ＡｍｐＣ又はＴＡＢ２．５を約１００アミノ酸より小さく、血漿クリアランスに影響するＴＥＭ−β−ラクタマーゼで置換した。プラスミドｐＭＥ３８１．１０はＴＡＢ２．５及びβラクタマーゼを交換するのに適した制限部位を含む。ＴＥＭ−４は、セファロスポリンに対して高い活性を有するプラスミドであるｐＬＩＴＭＵＳ３９（ニューイングランドバイオラブ、ベバリー、マサチューセッツ）の変異体から、制限部位ＰｉｎＡＩ及びＮｏｔｌを含むプライマー、ＭＥ３６３Ｆ（５’−ＡＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＡＡＡＡＣＡＣＣＧＧＴＧＣＡＣＣＣＡＧＡＡＡＣＧＣＴＧＧＴＧＡＡＡＧ−３’）及びＭＥ３６３Ｒ（５’−ＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴＴＡＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＡＴＣＡＧＴＧＡＧＧ−３’）を用いて増幅した。このＰＣＲ生成物をクイックチェンジＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精製し、ｐＭＥ３８１．１０及びＰＣＲ生成物をＰｉｎＡＩ及びＮｏｔＩで消化した。約８５０ｂｐの挿入フラグメント及び４．１ｋｂのベクターフラグメントをゲル精製した。フラグメントをお互いに一晩かけて結合し、精製し、Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロジェン、カールスバーグ、カリフォルニア）内で形質転換し、ＬＡ+２０ｍｇ／Ｌ  ＣＭＰＣＴＸプレート上で選択した。２つのクローンを選択し、配列決定を行った。プラスミドｐＭＥ３８２．１をＴＡＢ２．６とした。ＴＡＢ２．６を発現させ、Ｂ−ｐｅｒ抽出物を上述のように調製した。ＢＬＡ活性及びＢＳＭへの結合を測定した。ＴＡＢ２．６は発現したが、観察されたＢＬＡ活性はＴＡＢ２．５と比較して低かった（１０倍未満、データ示さず）。
【０１４８】
実施例１０：ＴＡＢ２．７の構築及び試験
上述の試験において、ａｍｐＣの安定化バージョンであるａｍｐＣでβ−クタマーゼを置換した他のベクターを作成した（Ａｍｉｎ，  Ｎ．，  Ｌｉｕ，Ａ．Ｄ．，  Ｒａｍｅｒ，Ｓ．，  Ａｅｈｌｅ，Ｗ．，  Ｍｅｉｊｅｒ，Ｄ．，  Ｍｅｔｉｎ，Ｍ．，  Ｗｏｎｇ．Ｓ．，  Ｇｕａｌｆｅｔｔｉ，Ｐ．，  Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｖ．  （２００４）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，  Ｄｅｓｉｇｎ，  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，  １７，  ７８７−７９３参照）。プラスミドｐＭＥ３８１．１０はＴＡＢ２．５及びβ−ラクタマーゼを交換するのに適した制限部位を含む。我々の安定化したβ−ラクタマーゼを制限部位ＰｉｎＡＩ及びＮｏｔｌを含むプライマー、ＭＥ３６５Ｆ（５’−ＡＣＴＡＡＡＴＴＡＧＴＴＣＴＣＡＡＡＣＡＣＣＧＧＴＧＴＣＡＧＡＡＡＡＡＣＡＧＣＴＧ−３’）及びＭＥ３６５Ｒ（５’−ＣＧＴＴＴＧＡＴＣＴＣＧＡＧＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＡＧＣＴＴＧＴＣＧＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴＴＡＣＴＧＴＡＧＣＧＣＣＴＣＴＡＧＧＡＴＡＴＧＧ−３’）を用いて、プラスミドｐＮＡ０４．１７からＰＣＲ増幅した。このＰＣＲ生成物をクイックチェンジＰＣＲ精製キット（キアゲン）を用いて精製し、ｐＭＥ３８１．１０及びＰＣＲ生成物をＰｉｎＡＩ及びＮｏｔＩで消化した。約１．１ｋｂの挿入フラグメント及び４．１ｋｂのベクターフラグメントをゲル精製した。フラグメントをお互いに一晩かけて結合し、精製し、Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロジェン、カールスバーグ、カリフォルニア）内で形質転換し、ＬＡ+２０ｍｇ／Ｌ  ＣＭＰＣＴＸプレート上で選択した。２つのクローンを選択し、配列決定を行った。プラスミドｐＭＥ３８２．１をＴＡＢ２．７とした。
【０１４９】
ＴＡＢ２．５及びＴＡＢ２．７を２５ｍＬの振とうフラスコ培地で育成し、Ｂ−ｐｅｒ抽出物を調製した。ＴＡＢ２．７の発現はＴＡＢ２．５よりも５倍高かった。
【０１５０】
両分子のプロテアーゼ安定性を試験した。セルモリジンプロテアーゼをイミダゾール／ＨＣＬ緩衝液中で２．５ｍｇ／ｍＬの濃度になるように、ストック溶液を調製した。このストック溶液を５倍希釈し、５００μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ、２０μｇ／ｍＬ、及び４μｇ／ｍＬ、０μｇ／ｍＬの一連の濃度のセルモリジンプロテアーゼ溶液を調製した。８７μＬの各抽出物に各濃度のセルモリジンを含む８００μＬの緩衝液に添加し、ウォーターバス内で３７℃１時間インキュベーションした。
【０１５１】
このプロテアーゼをその後、２００μＬの１０ｍＭ  ＥＤＴＡで失活させた。全てのサンプルを、サンプル２０μＬのサンプルを１８０μＬのニトロセフィン基質に添加することにより残余ＢＬＡ活性を調べた。これらのプレートは５分間４９０ｎｍにおいてスキャンされ、活性挙動を調べた。これらのサンプルは、上で説明したように、残余ＢＳＭ結合活性と比較された。この分子のＢＡＬタンパク質はこのアッセイを行うには、不安定すぎるのでＢＳＭ結合はプロテアーゼ処理されたＴＡＢ２．５では測定されなかった。
【０１５２】
ＴＡＢ  ｓｃＦｖ上のプロテアーゼの効果を試験するために、ＴＡＢ２．５と同様のｓｃＦｖを有するけれども、より安定なＢＡＬを有するＴＡＢ２．７を試験した。図１７に示すように、ＴＡＢ２．７におけるＢＬＡの安定化バージョンは、説明したように、ＴＡＢ２．５のＢＬＡよりもよりプロテアーゼに対して安定である。ＴＡＢ２．７のＢＳＭに対する結合は、２．５ｍｇ／ｍＬの濃度のセルモリジンで試験を行うまで影響されなかった（図１８参照）。このデータはＴＡＢ２．７の他にＴＡＢ２．５のｓｃＦｖタンパク質が融合タンパク質のＢＬＡタンパク質よりもセルモリジン処理に対してより安定であることを示している。
【０１５３】
実施例１１：ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖の間のシステイン結合
ＴＡＢ２．７を安定化するために、我々は、軽鎖及び重鎖の各鎖のシステインを置換することにより、ｓｃＦｖの軽鎖及び重鎖の間にジスルフィド結合を作成した。ジスルフィド結合の位置は、タンパク質のモデリングにより決定した（例えば、Ｖ．Ｓ．  Ｄａｎｉ，  Ｃ．  Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａｎ  ａｎｄ  Ｒ．  Ｖａｒａｄａｒａｊａｎ  （２００３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １６，  １８７−１９３参照）。プラスミドｐＭＥ３８８．１（ＴＡＢ２．７）を前述のマルチ部位クイックチェンジ変異誘発（Ｍｕｌｔｉ−ｓｉｔｅ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ストラタジェン、カリフォルニア）の変法を用いて修飾した（例えば、参照により本明細書に援用される  WO  ＵＳ  ０４／３００８５参照）。ｐＭＥ３８８．１を用いて、それぞれ１００ｎｇの２つのリン酸化プライマーを用いて反応を設定した。軽鎖Ｌｅｕ４６をＣｙｓで置換するためのプライマーはＴＡＢＬＬ４６Ｃ；５’−［Ｐｈｏｓ］ＣＡＧＴＣＴＣＣＴＡＡＡＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＡＴＴＧＧＧＣＣＴＣＴＡＣ―３’であり、重鎖Ａｌａ１０１をＣｙｓで置換するためのプライマーはＴＡＢＨＡ１０１Ｃ；５’−［ＰｈＯＳ］ＡＧＣＣＴＴＡＡＣＡＴＧＴＧＣＴＡＴＴＧＧＧＧＴＣＡＡＧＧＧＡＣＣＡＧＣ−３’である。変異誘発及びＤｐｎＩ消化の後、２５μＬのＰＣＲ反応混合物のうちの１．５μＬをＥ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ’細胞内で形質転換し、ＬＡ+２０ｍｇ／Ｌ+０．１ｍｇ／Ｌ  ＣＴＸプレート上で選択した。３０クローンが得られ、そのうちの１２について配列決定を行った。これらのクローンの配列は、４つの変異を含むが（３  ｌＬ４６Ｃ、１  ｈＡ１０１Ｃ）、どの配列も両者を有してはいなかった。クローンｐＭＥ３９５．１（ｈＡ１０１Ｃ）を１００ｎｇのＴＡＢＬＬ４６Ｃのみを用いた新たな変異誘発のラウンドのために選択した。この反応を上せ説明したように行い、１２のクローンを得た。１２クローン全てを配列決定のために選択し、ｐＭＥ４０３．３が追加的なシステインを有することを確認した。この構築物を安定性及び発現のための更なる試験に用いた。
【０１５４】
上で説明するように、この変異体を発現させ、Ｂ−ｐｅｒ抽出物を調製した。ＢＬＡ活性及びＢＳＭに対する結合を測定した。ｐＭＥ４０３．３は良好に発現したが、ＴＡＢ２．７より〜３５％より低かった。Ｂ−ｐｅｒ抽出物は３５％のインタクトタンパク質を含んでいた。ＴＡＢ２．７では８５％であった（データ示さず）。コートされたＢＳＭに対す津結合親和性は〜４０倍まで低められていた（図１９参照）。従って、このデータはＩＬ４６及びｈＡ１０１残査をシステインに変異させることがタンパク質の安定性及び結合親和性に影響することを示している。このプロトコルに従って、より多くの変異体を設計し、試験することができるであろう。
【０１５５】
実施例１２：ＴＡＢ２変異体の熱安定性
ＤＳＣサーモグラフをマイクロキャル社のＶＰ  ＤＳＣを用いて収集した。緩衝液条件は、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４及びタンパク質濃度はＢＬＡ活性に基づいて〜０．７ｍｇ／ｍｌであった。データを、９０℃／時間のスキャン速度で、２５℃乃至９０℃の温度において収集した。ＴＡＢ２．５はＴＡＢ２．４よりもより安定であり（〜２℃）、凝集の傾向が少なかった（図２０参照）。熱転位はより広く、熱コーペラティブ（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ）はより少なかった。
【０１５６】
実施例１３：ＴＡＢ２．５の免役組織学的研究
ＴＡＢ２．５の免役組織学的研究をＡｃｃｕｍａｘ  Ａ３０１バージョンの癌アレイ及びＡ２０３台帳癌アレイ（ペンタゲン）上で以下の手順を用いて行った：
・ Ｈｉｓｔｏ−Ｃｌｅａｒ、２Ｘで５分間（ナショナルダイアグノスティック、製品番号＃ＨＳ−２００）を用いた脱パラフィン化（５分を２回）、
・ 一連の濃度の異なるエタノールを用いて脱水を行う（１００％、９５％、７５％、５０％、エタノール、脱イオン水にそれぞれ２分間浸す）、
・ 熱ベース抗原リトリバル（ｒｅｔｒｉｅｖａｌ）（３０分、１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８．０、９０℃）
・ １％ヤギ血清を含むＰＢＳで２０分間切片をインキュベーションする、
・ ＤＡＫＯ  ペルオキシダーゼブロッキング溶液を用いて内性ペルオキシダーゼをブロックする（１０分）、
・ スライドをＴＢＳ中で１分間洗浄
・ ＴＡＢ２．５で３０分間切片をインキュベートする（１０μｇ／ｍＬ、１％ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈）、
・ スライドをＴＢＳで５分間洗浄する、
・ ＲＯＰＯ２で切片を３０分間インキュベーションする（例えば、参照により本明細書に援用されるＵｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｓｅｒｉａｌ  ｎｕｍｂｅｒ  ６０／６３６，００２参照）（１％ヤギ血清を含むＰＢＳで希釈した０．１５μｇ／ｍＬ、抗−ＢＬＡラビットポリクローナル）
・ スライドをＴＢＳ中で５分間洗浄
・ ＤＡＫＯ抗ラビット抗体で３０分間切片をインキュベーションする（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ｒａｂｂｉｔ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎ＋Ｓｙｓｔｅｍ−ＨＲＰ，  ＤＡＢ，  ｃａｔａｌｏｇ  ＃  Ｋ４０１０）
・ スライドをＴＢＳで５分間洗浄
・ ＤＡＫＯ  ペルオキシド基質溶液中で切片を所望の染色状態になるまで、３−５分間インキュベーションする
・ 脱イオン水でスライドをすすぐ
・ ヘマトキシリン（ｈａｅｍｏｔｏｘｙｌｉｎ）で対比染色、ゴミとり、及びマウント。
【０１５７】
各種癌アレイを用いて、ＩＨＣによるＴＡＢ２．５組織結合の初期の評価において、１つの大腸癌に対して強力なシグナルが観察され、子宮癌及び胃癌切片に対して弱いシグナルが確認された。一方正常組織には結合しなかった（図２１参照）。大腸癌組織アレイにおいて、中程度から非常に強力な範囲の幾つかのヒト大腸癌の陽性ＴＡＢ２．５染色が観察された（図２２参照９）。大腸癌のサンプルの１つの拡大図を示す（図２３参照）。
【０１５８】
実施例１４：ヒト結腸直腸癌を異種移植したマウスモデルにおけるＴＡＢ２．４の薬理動態及び分布
１８−２２ｇ、約６―１０週齢のＮｃｒ胸腺欠損雌マウスの皮下に約２百万個のＬＳ１７４Ｔヒト結腸直腸癌細胞を移植した。ＬＳ１７４Ｔ細胞は、マウスを用いて生産され、再分離して生産され、ＡＴＣＣから入手した。腫瘍が約２００−３００ｍｍ３になった３０の動物に尻尾の静脈からＴＡＢ２．４（１ｍｇ／ｋｇ）を１回静脈注射を行った。投与前、投与後２分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間及び７２時間後にそれぞれ３匹のマウスを麻酔し、殺した。８時間、２４時間、４８時間及び７２時間の群の各マウスより腫瘍を採取し、液体窒素中で凍結し、解析に用いるまで約―７０℃で貯蔵した。血液を心臓採血により採取し、ＥＤＴＡをコートしたチューブに入れた。血液サンプルを遠心分離し、プラズマを分離し、プラズマを解析まで−７０℃で保存した。
【０１５９】
組織サンプルをＰＢＳ中１５μｇ／ｍＬアプロチニン（２ｍｌ緩衝液／グラム組織）を含むＰＢＳで氷上でホモジナイズした。ホモジネートをＴ−ｐｅｒ（１：１）（ピアス）で混合して、遠心分離した。組織上清中のＴＡＢ２．４濃度を、以下のように、捕捉ＢＬＡニトロセフィンアッセイを用いて、β−ラクタマーゼ活性（ＢＬＡ）を測定することにより、決定した：
1.  高結合容量（ＨＢＣ）プレート（Ｃｏｓｔａｒ  ＃９０１８）を５μｇ／ｍＬのチキンポリクローナル抗―ＢＬＡ抗体（ＰＡＳ  ３３１３／３３１４）、で１ウェル当たり１００μＬ、Ｏ／Ｎ４℃においてコートする；
2.  このプレートを１ＸＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳＴ）で３回洗浄する；
3.  このプレートを１ウェル当たり２５０μＬのＰＢＳ中のブロッカーカゼイン（Ｐｉｅｒｃｅ  ＃３７５２８）で、緩やかに振とうしながら室温において２時間、ブロッキングを行う；  
4.  このプレートをPBST  で３回洗浄する；  
5.  ２０μＬのプラズマサンプル又は組織サンプルを各ウェルに添加する、その後、１ウェル当たり８０μＬのブロッカーカゼインで希釈し、緩やかに振とうしながら、室温で２時間インキュベーションする；  
6.  ＰＢＳＴで６回洗浄する；  
7.  １ウェル当たり２００μＬのニトロセフィン基質溶液を添加する；
8.  １５分間４９０ｎｍで読み取る。
【０１６０】
この試験の結果は、ＴＡＢ２．４がプラズマ中から急速に消失し、ＴＬＳ１７４Ｔ腫瘍に位置することを示している（図２４参照）。ＴＡＢ２．４濃度の血液に対する腫瘍の高い割合が達成され維持されていた。
【０１６１】
実施例１５：非腫瘍スプラジードーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）雄ラットにおけるＴＡＢ２．５の薬理動態
３００−３５０ｇ、６―８週齢の３匹のスプラジードーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）雄ラットの大腿静脈にカテーテルを挿入し、ＴＡＢ２．５（１ｍｇ／ｋｇ）を１回の静脈注射により投与した。血液サンプルを、投与前、投与後２分、５分、１５分、３０分、１重量％間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間及び４８時間後に頚静脈カテーテルを介して収集してＥＤＴＡコートチューブに移し、遠心分離してプラズマを分離した。このプラズマを解析に用いるまで−７０℃で処理した。
【０１６２】
プラズマＴＡＢ２．５濃度を前述のＢＬＡニトロセフィンアッセイにより決定した。この試験から得られた結果は、静脈注射に続き、プラズマＴＡＢ２．５の分布は０．６３時間の急速分布ｔ１／２α、その後の６時間における緩やかな収束ｔ１／２βの２極性の分布有することを示す（図２５参照）。薬物暴露の５０％以上が１時間以内に起こっていた。薬物消去は０．２７ｍＬ／分であり、分布の容量（１６ｍＬ）はプラズマ容量と同様であった。
【０１６３】
実施例１６：ヒト結腸直腸癌を異種移植したマウスモデルにおけるＴＡＢ２．５の効果
１８−２２ｇ、約６−８週齢のＮｃｒ胸腺欠損ヌードマウスの皮下に、約５百万個のＬＳ１７４Ｔヒト結腸直腸癌細胞を移植した。ＬＳ１７４Ｔ細胞は、マウスを用いて生産され、再分離して生産され、ＡＴＣＣから入手した。腫瘍が約５０−１５０ｍｍ３になった動物は、腫瘍のサイズ有意差が生じないように無作為抽出して２つのグループに分けた。この動物に賦形剤（グループ１）又はＴＡＢ２．５（１ｍｇ／ｋｇ、グループ２）を投与した。２４時間後、ＴＡＢ２。５を投与した動物にＧＣ―Ｍｅｌを１５０ｍｇ／ｋｇ投与した。全ての薬物は尻尾の静脈を介して１回の静脈注射により投与した。腫瘍を２週間測定した。各グループの平均腫瘍容量を経時的にプロットした（図２６）。この図は、１５０ｍｇ／ｋｇのプロドラッグＧＣ−Ｍｅｌと組み合わせて投与した１ｍｇ／ｋｇのＴＡＢ２．５がヒト結腸直腸癌のマウスモデルにおいてＴＬＳ１７４Ｔ腫瘍細胞の成長抑制することを示した。
【０１６４】
実施例１７：ＴＡＢ２．８の構築
ＴＡＢ２．８はａｍｐＣ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）β−ラクタマーゼに融合しているｓｃＦｖを含む。このｓｃＦｖはＴＡＢ２．５ｓｃＦｖ（ｖＨ−リンカー−ＬＶ）に基づいているが、軽鎖及び重鎖が反転している（ＬＶ−リンカー−ｖＨ）。反転している鎖を含むｓｃＦｖはＤＮＡ２．０（Ｍｅｎｌｏ  ＰＡｒｋ）により合成され、それぞれの鎖の５’及び３’に隣接するＮｃｏＩ及びＰｉｎＡＩ制限部位も含む。ｐＭＥ３８１．１０（ＴＡＢ２．５クローンベクター）及び合成された遺伝子（ｐＧ００９３）をＮｃｏＩ及びＰｉｎＡＩで切断した。約７８４ｂｐの挿入フラグメント及び４．４ｋｂのベクターフラグメントをゲル精製した。これらのフラグメントをお互いに一晩かけて結合し、Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０Ｆ’（インビトロジェン、カールスバーグ、カリフォルニア）コンピテント細胞内で形質転換し、ＬＡ+Ｃｍ２０+０．１  ＣＴＸプレート上で選択した。２つのコロニーを選択し、配列決定を行い、プラスミドｐＭＥ４１１．１をＴＡＢ２．８と称した。
【０１６５】
ＴＯＰ１０Ｆ’中のＴＡＢ２．８及びＴＡＢ２．５を６００ｍｌのＴＢ−１０μｇ／ｍｌｃｍｐ中で３０℃で４８時間育成した。この培養物を１５分間、１０，０００ｒｐｍで遠心分離し、細胞溶解物を５０ｍｌＢ−ｐｅｒで、６０分間、室温で処理し、その後に１５分間遠心分離することにより回収した。ＴＡＢタンパク質を５ｍｌのＰＢＡカラムを用いて前述のように精製した。２０μＬ〜５ｍｇ／ｍＬのＰＢＡ精製物質を解析用サイズ排除カラム（ＳＥＣ，  Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｂｉｏｓｅｐ−ＳＥＣ−Ｓ  ３０００；  ６００ｘ７．８ｍｍ）に付加し、カラムを１ｍＬ／分のＰＢＳを流してモノマーを精製した。モノマーピークは自動的に１６．５分乃至１７．５分の溶出物の間に収集された。ＴＡＢ２．５及びＴＡＢ２．８のモノマーは上述のようにコートされたＢＳＭ及び腫瘍抽出物（ＴＥ）に対する結合アッセイにおいて比較された。
【０１６６】
実施例１８：ＴＡＢ２．８結合
結合ＢＬＡ活性は、図２７に示すようにＫＤを決定するために、ＴＡＢフリーの濃度に対してプロットされた。１つの部位への結合に対するＧｒａｐｉｔ  ｖｅｒ．３．０１カーブフィットツールソフトウェアを用いてＫＤを測定した。ＴＡＢ２．５及びＴＡＢ２．８はコートされたＢＳＭに対しては、それぞれ、４５及び９．９ｎＭ、及びＴＥに対してはそれぞれ１９及び４．１ｎＭのＫＤを有していた。両方のケースにおいて、ＴＡＢ２．８はＴＡＢ２．５よりも〜４倍よりよい結合を示した。このことは、ＴＡＢ２．８におけるＬＶ−ＶＨオリエンテーションがＴＡＢ２．５におけるＶＨ−ＬＶよりも良いことを示している。ＴＡＢ２．８の発現はＴＡＢ２．５に対して約２倍高かった。
【０１６７】
好適な態様を用いて本発明を説明してきたが、当業者は開示の態様の各種変更を容易にすることができ、そのような変更された発明も本発明の範囲内であることは明らかである。当業者は本明細書が、本発明の目的を達成するために適しており、最終製品及び利益を実行するのに充分に記載されていることを理解するだろう。分子複合体及び方法、手順、処理、分子及び特定の化合物は好適な態様の代表例である、例示であり、本発明をこれらに限定することは意図しない。様々な置換及び修飾は、本発明の精神及び範囲を逸脱せずに行われることは当業者に理解されるだろう。
【０１６８】
本明細書で言及する全ての特許及び刊行物は本発明が属する分野における当業者のレベルを示すために用いる。全ての特許及び刊行物は、明確に及び別個に参照により本明細書に援用される範囲において、参照により本明細書に援用される。
【０１６９】
本発明の好ましい態様を説明したけれども、当業者は開示された態様の明らかな各種変更をすることができ、そのような変更は本発明の範囲内であることは理解されるであろう。
【０１７０】
当業者は、本明細書において述べたほかに、言及した目的、結果及び利益を得るために本発明が適していることを理解する。本明細書で述べた組成物及び方法は、好適な態様であり、例示であり、本発明をこれらの態様に限定することを意図しない。当業者にとって、本発明の範囲の精神を逸せずに、本発明の各種置換及び変更をなし得ることは明らかである。
【０１７１】
例示的に本明細書において開示された本発明は、本明細書において特定されていない任意の構成要素又は限定がなくても実施することができる。用いた文言及び表現は、説明のための言葉であり、限定をするための言葉ではない。それらの特徴を示す、又は説明する又はその一部分に等しいものを含むそのような文言及び表現の使用を意図するものではない。しかし、特許請求の範囲内における可能な変更は意図される。したがって、本発明は好ましい態様により説明されるけれども、ここで開示されたコンセプトの任意の特徴、修飾、及び変更は当業者によりなされ、そのような修飾の変更は本明細書において開示する特許請求の範囲内であると考えられる。
【０１７２】
本発明は幅広く一般的に説明されている。包括的な開示の範囲内に当たる各下位概念も本発明の一部を形成する。このことは、削除された物質が本明細書に記載されているかどうかに関わらず、類概念から任意の主題を削除した条件付け又は負の限定を伴う、本発明の包括的な説明を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１７３】
【図１Ａ】図１ＡはＴＡＢ２．４（配列番号８）のアミノ酸配列を示す。ｖＨ及びｖＬ配列を下線、及びｖＨ及びｖＬの間のリンカーを太字で示す。
【図１Ｂ】図１ＢはＣＣ４９（配列番号３）のタンパク質配列を示す。
【図１Ｃ】図１ＣはＴＡＢ２のＢＬＡ分部分を定義する。
【図１Ｄ】図１ＤはＴＡＢ２．１（配列番号６）のアミノ酸配列を示す。
【図１Ｅ】図１ＥはＴＡＢ２．１（配列番号５）のＤＮＡ配列を示す。
【図１Ｆ】図１ＦはＴＡＢ２．４（配列番号８）のアミノ酸配列を定義する。
【図１Ｇ】図１ＧはＴＡＢ２．４（配列番号７）の核酸配列を定義する。
【図１Ｈ】図１ＨはＴＡＢ２．５（配列番号１０）のアミノ酸配列を定義する。
【図１Ｉ】図１ＩはＴＡＢ２．５（配列番号９）の核酸配列を定義する。
【図１Ｊ】図１ＪはＴＡＢ２．６（配列番号１２）のアミノ酸配列を定義する。
【図１Ｋ】図１ＫはＴＡＢ２．６（配列番号１１）の核酸配列を定義する。
【図１Ｌ】図１ＬはＴＡＢ２．７（配列番号１４）のアミノ酸配列を定義する。
【図１Ｍ】図１ＭはＴＡＢ２．７（配列番号１３）の核酸配列を定義する。
【図１Ｎ】図１ＮはｐＭＥ４０３．３タンパク質（配列番号１８）のアミノ酸配列を定義する。
【図１Ｏ】図１ＯはｐＭＥ４０３．３タンパク質（配列番号１７）の核酸配列を定義する。
【図１Ｐ】図１ＰはＴＡＢ２．８分子（配列番号１６）のアミノ酸配列を定義する。
【図１Ｑ】図１ＱはＴＡＢ２．８分子（配列番号１５）のアミノ酸配列を定義する。
【図２Ａ】図２ＡはコートされたＢＳＭへの結合に関するスクリーニングデータを示す。  このデータは実施例４で定義される、ライブラリーＭＥ３６７（上段）及びＭＥ３６８（下段）由来クローンの試験結果を示す。Ｘ軸はコロニー番号を示し、Ｙ軸はＢＬＡ結合を示す。
【図２Ｂ】図２ＢはコートされたＢＳＭへの結合に関するスクリーニングデータを示す。  このデータは実施例４に記載の、ライブラリーＭＥ３６７（上段）及びＭＥ３６８（下段）由来クローンの試験結果を示す。Ｘ軸はコロニー番号を示し、Ｙ軸はＢＬＡ結合を示す。
【図３】図３は実施例４に記載の、ライブラリーＭＥ３６７及びＭＥ３６８由来クローンの前記スクリーニングデータと配列決定の統計的解析を示す。
【図４】図４は実施例４に記載の、ライブラリーＭＥ３７４,  ＭＥ３７５及びＭＥ３７７由来クローンのＢＬＡ活性に対する結合のスクリーニングデータを示す。ライブラリー中の多くのクローンは野生型ＴＡＢ２．４であり、四角で示す。Ｘ軸は導入されたＢＬＡ活性を示す。Ｙ軸はＢＳＭ−抗原結合単位を示す。右に位置するクローンほどＢＬＡ活性が高く、平均ダイアゴナル（ｄｉａｇｏｎａｌ）より高い位置にあるクローンは、コートされたＢＳＭによく結合する傾向を示す。従って、ＢＬＡ活性のアウトプット／インプットの割合が平均より高くなる。差込み図は用いたクローンコードを示す。
【図５】図５は実施例４で説明する、ＭＥ３７４,  ＭＥ３７５  及びＭＥ３６８からのライブラリークローンのスクリーニングデータに対する配列決定の統計的解析を示す。Ｘ軸はクローンの番号を示す。Ｙ軸はパラメータを示す（統計アルゴリズムについては、  Ａｍｉｎ，  Ｎ．，  Ａ．  Ｄ．  Ｌｉｕ，  Ｓ．  Ｒａｍｅｒ,  Ｗ．  Ａｅｈｌｅ，  Ｄ．  Ｍｅｉｊｅｒ，  Ｍ．  Ｍｅｔｉｎ，  Ｓ．  Ｗｏｎｇ，  Ｐ．  Ｇｕａｌｆｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｖ．  Ｓｃｈｅｌｌｅｎｂｅｒｇｅｒ  （２００４）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  ＳｅＩ  １７，  ７８７−９３，  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔａｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ参照）。
【図６】図６は  実施例４で説明する、ＴＡＢ２．４コンセンサス組合せ変異誘発からの２２クローンのスクリーニングを示す。データは、ＴＡＢ２．４野生型に対する発現、ＢＳＭ結合、又はオフレートの比を示す。１より大きい値はクローンが親ＴＡＢ２．４よりもよりよい発現、ＢＭＳ結合を有することを示す。一方、１より小さい値は、クローンが、低い発現、ＢＳＮ結合又はオフレートを有することを示す。Ｘ軸はクローン番号を示す。Ｙ軸は、野生型に対してスクリーニングされた変異体を示す。
【図７】図７は実施例４で定義する、組合せ変異誘発ライブラリースクリーニングからの変異体クローンの２５ｍｌ振とうフラスコ内における発現を示す。Ｘ軸はクローン番号を示す。Ｙ軸はＢＬＡ活性を示す。
【図８】図８は実施例４で定義する、組合せコンセンサス変異誘発ライブラリーからの各種ＴＡＢ２．４変異体に対する抗ＢＬＡ抗体を用いたウエスタンブロットを示す。上方のパネルはウエスタンブロットを示す。下方のパネルは各クローン中に存在する突然変異を定義しているチャートを含む。
【図９】図９は実施例４で定義する、コートされたＢＳＭへの各種ＴＡＢ変異体の結合を説明する。Ｘ軸はＢＬＡ活性を単位で示す。Ｙ軸はＢＳＭ抗原結合単位を示す。差込み図は用いたクローンコードを示す。
【図１０】図１０は実施例５で定義するエンドトキシン除去後のＴＡＢ２．４の精製モノマーのＤＳＤ−ＡＰＧＥを示す。レーン１は分子量マーカー、レーン３−４は精製ＴＡＢ２．４を示す。
【図１１】図１１は実施例６で説明するコートされた各種ＴＡＧ−７２抗原に対するＴＡＢ２．５の結合を示す。ｘ軸は添加されたＢＬＡを単位で示す。ｙ軸は、結合したＢＬＡを示す。
【図１２】図１２は実施例６で説明するコートされたＢＳＭへの  ＴＡＢ２．４及びＴＡＢ２．５結合を示す。Ｘ軸は添加したＢＬＡを示す。Ｙ軸は結合ＢＬＡを示す。
【図１３】図１３は実施例６で説明するコートされたＢＳＭに対するＴＡＢ２．４及びＴＡＢ２．５のオフレートの測定結果を示す。Ｘ軸は時間を示す。Ｙ軸は結合フラクションを示す。
【図１４】図１４は実施例６で説明する、ＢＳＭ、ＴＥ、ＣＡ７２−４及びＴＡＧ−７２マルチマーにより、コートされた腫瘍抽出物（ＴＥ）に対するＴＡＢ２．５の競合結合を示す。Ｘ軸は個々のタンパク質を示す。Ｙ軸は結合パーセントを示す。
【図１５】図１５は実施例６で説明する、ＢＳＭ、ＴＥ、ＣＡ７２−４及びＴＡＧ−７２マルチマーを用いた、コートされたＢＳＭに対するＴＡＢ２．５の競合結合を示す。Ｘ軸は個々のタンパク質を示す。Ｙ軸は結合パーセントを示す。
【図１６】図１６は実施例８で説明する、ＭＥ３８４−ＭＥ３８７ライブラリー由来クローンの活性のインプットに対する結合のスクリーニングデータを示す。ライブラリー中の多くのクローンは親ＴＡＢ２．５クローンであり、黒四角で示す。ＴＡＢ２．５の平均にできるだけ近いクローンを選択した。Ｘ軸はＢＬＡインプットを示す、Ｙ軸はＢＳＭ結合を示す。差込み図は各クローンを示す。右側に位置するクローンはＢＡＬ活性の高いものを示し、平均ダイアゴナル（ｄｉａｇｏｎａｌ）よりも高いクローンは、コートされたＢＳＭによりよく結合する傾向がある。従って、ＢＬＡ活性のアウトプット／インプットが平均よりも高い。
【図１７】図１７は実施例１０で説明する、ＴＡＢ２．５及びＴＡＢ２．７のＢＬＡ活性における、３７℃、１時間のサーモリシン処理の影響を示す。Ｘ軸は添加したプロテアーゼを示す。Ｙ軸は残余ＢＬＡ活性のフラクションを示す。ＴＡＢ２．５は白丸で示す。ＴＡＢ２．７は黒丸で示す。差込み図は用いたクローンコードを示す。
【図１８】図１８は実施例１０で説明する、コートされたＢＳＭに対するＴＡＢ２．７の結合における３７℃、１時間のサーモリシン処理の影響を示す。Ｘ軸は添加したＢＬＡを示す。Ｙ軸は結合しているＴＡＢ２．７を示す。
【図１９】図１９は実施例１１で説明する、コートされたＢＳＭへのＴＡＢ2.7及びｐＭＥ４０３．３の結合を示す。Ｘ軸は添加されたＢＬＡを示す。Ｙ軸はＢＳＭ結合を示す。
【図２０】図２０は実施例１２で説明する、ＴＡＢ２．４及びＴＡＢ２．５の示差走査熱量測定（ＤＳＣ）のサーモグラムを説明する。Ｘ軸は温度を℃で示す。Ｙ軸はＣＰ（ｃａｌ／℃）を示す。
【図２１】図２１は実施例１３で説明するＡｃｃｕｍａｘ  Ａ３０１各種癌アレイ（Ｐｅｎｔａｇｅｎ）におけるＴＡＢ２．５の免役組織染色を示す。
【図２２】図２２は実施例１３で説明する、Ａｃｃｕｍａｘ  Ａ２０３大腸癌アレイ（Ｐｅｎｔａｇｅｎ）におけるＴＡＢ２．５の免役組織学染色を示す。
【図２３】図２３は実施例１３で説明する、Ａｃｃｕｍａｘ  Ａ２０３ヒト大腸癌アレイ（Ｐｅｎｔａｇｅｎ）におけるＴＡＢ２．５の免役組織染色の拡大図を示す。
【図２４】図２４は実施例１４で説明するマウスにおけるＴＡＢ２．４の濃度−時間プロファイルを示す。Ｘ軸は時間を示す。Ｙ軸はＴＡＢ２．４の濃度をμｇ／ｍｌで示す。
【図２５】図２５は実施例１５で定義するラットにおけるＴＡＢ２．５の結晶中濃度−時間プロファイルを示す。各ラットに投与した実際の濃度は、ラット１=０．８５  ｍｇ／ｋｇ、ラット２=０．８  ｍｇ／ｋｇ  及びラット３=０．４  ｍｇ／ｋｇである。Ｘ軸は時間を示す。Ｙ軸はＴＡＢ２．５の濃度をμｇ／ｍｌで示す。
【図２６】図２６は実施例１６で定義するＬＳ１７４Ｔ異種移植マウスモデルにおけるＴＡＢ２．５の効果を示す。Ｘ軸は時間を日で表す。Ｙ軸は腫瘍体積をｍｍ3で示す。
【図２７】図２７は実施例１８で示すＴＡＢ２８の結合を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図１Ｎ】
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【図１Ｏ】
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【図１Ｐ】
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【図１Ｑ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【国際調査報告】
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