(57)【要約】免疫反応を調節調節するためのオリゴヌクレオチドが開示される。本発明のオリゴヌクレオチドは、免疫機能を刺激、多様な免疫疾患およびアトピー性皮膚疾患を治療、または正常免疫細胞を保護するために有用である。【選択図】図６
2008501787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式で表わされる、免疫反応（ａｄｊｕｖａｎｔ）を刺激するための、または免疫疾患を治療するためのオリゴデオキシヌクレオチド：
［一般式］：ＨＫＣＧＴＴＣＲＴＧＴＣＳＧＭ（配列番号１）
ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＳはＣまたはＧであり、ＨはＡ、ＴまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、そしてＭはＣまたはＡである。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、下記一般式で表わされる、５個のヌクレオチドを５’側と３’側にさらに含む、請求項１に記載の免疫反応を刺激するための、または免疫疾患を治療するためのオリゴデオキシヌクレオチド：
［一般式］：ＤＫＭＨＫＣＧＴＴＣＲＴＧＴＣＳＧＭＹＫ（配列番号２）
ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＳはＣまたはＧであり、ＨはＡ、ＴまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、ＤはＡ、ＧまたはＴであり、ＭはＣまたはＡであり、ＭはＣまたはＡであり、そしてＹはＣまたはＴである。
【請求項３】
前記オリゴデオキシヌクレオチドが、放射線治療を適用する際に正常免疫細胞を保護する、請求項１および２のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴデオキシヌクレオチドが、皮膚疾患を治療または予防する、請求項１および２のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項５】
前記オリゴデオキシヌクレオチドが、多様なＴｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスを維持する、請求項１および２のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項６】
前記オリゴデオキシヌクレオチドが、前記ヌクレオチド間にホスホジエステル結合またはホスホロチオエート結合を有する、請求項１および２のいずれかに記載のオリゴデオキシヌクレオチド。
【請求項７】
前記オリゴヌクレオチドは、５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＧＣＣＴ−３’（配列番号３）、５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＴ−３’  （配列番号４）、５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＡＴＧＴＣＧＧＣＣＴ−３’（配列番号５）、５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣＣＴ−３’（配列番号６）、５’−ＧＴＡＴＴＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＴＣＣＴ−３’（配列番号７）、および  ５’−ＴＧＡＣＴＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＡＴＧ−３’（配列番号８）からなる群より選択される、請求項１および２のいずれかに記載のデオキシオリゴヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫反応を刺激しそして免疫反応のバランス維持に使用することができ、そして治療学的用途の点からみてアトピー性皮膚炎など様々な免疫疾患に効果がある、マイコバクテリア（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来オリゴヌクレオチドに関し、さらに詳しくは、ＤＮＡ配列の修飾により変化する効果を有し、ホスホジエステル形態のオリゴデオキシヌクレオチドによる免疫反応（アジュバント）を刺激し、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスを維持することによる多様な免疫疾患治療およびアトピー性皮膚炎の治療に使用することが可能であり、そしてまた並びに放射線照射の治療に対する細胞の生存を増加させる効果を持つ、免疫反応を刺激することに関与する三つのＣｐＧモチーフを有するオリゴヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
一般に先天性免疫体系によって生ずる免疫システムは、バランスを保ちながら精巧に調節されなければならない。すなわち、免疫性（ｉｍｍｕｎｉｔｙ）と耐性（ｔｏｌｅｒａｎｃｅ）間のバランス、Ｔｈ１（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １）とＴｈ２（Ｔ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  ２）免疫性のバランス、炎症（ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ）と抗体産生不全症（ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ）のバランスを精巧に調節することが必須的である。ところが、残念ながらこれまで開発された多くの免疫疾患治療剤は、免疫体系の適切に調節することができず、自己免疫疾患、アレルギー性疾患、慢性炎症などが広まった。ところが、先天性免疫体系は、病原菌侵入の際に外部物質の構造的な差異点（Ｐａｔｈｏｇｅｎ−Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｔｔｅｒｎ、ＰＡＭＰ）を免疫細胞が認識して活性化され、続いて信号が伝達されて、病原体の破壊をもたらす免疫体系のカスケード反応を開始する機序である。したがって、先天性免疫体系を用いたＧｏｏｄ＆Ｅｖｉｌメカニズムを正確に理解して、Ｅｖｉｌメカニズムを最小化する免疫疾患治療剤の開発が要求されている。
【０００３】
１８９０年代、Ｗｉｌｌｉａｍ  Ｂ．Ｃｏｌｅｙは、病原性微生物の感染が癌患者の抗癌効果を誘導できるという特異な現象を観察し、この修正バクテリア療法（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｙ）を約９００名の癌患者に適用して約４０％の効能を有することを発見した。１９８０年代、日本の研究者らは、異なった新しい視角からコリー毒素（Ｃｏｌｅｙ’ｓ  ｔｏｘｉｎ）の有用性を認識して、カルメットゲラン菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ、ＢＣＧ）の活性分画が抗癌効果を示すこと立証し、ＢＣＧの抗癌活性がそのＤＮＡ配列の固有の特性から由来したことを確認した。１９９５年、Ｋｒｅｉｇらは、Ｂ細胞遺伝子を抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドの研究過程で、メチル化されていないシトシンとグアニンからなる特定ＤＮＡ配列の合成オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）が免疫細胞の活性化を誘導するという事実を立証した。Ｋｒｅｉｇの観点からみて、既存の日本の研究者らにより立証されたＢＣＧの抗癌効果は、メチル化されていないＢＣＧ  ＤＮＡの特性に起因したものであり、そしてこのようなバクテリアＤＮＡによる免疫活性化は、脊椎動物の免疫システムが自己（ｓｅｌｆ）のＤＮＡと非自己（ｎｏｎ−ｓｅｌｆ）のＤＮＡを区分することができるということを新たにを提示した。
【０００４】
バクテリアの免疫活性化およびその調節に関する初期研究は、抗体の生成を誘発するコリー毒素などのタンパク質抗原に焦点をあてた。ところが、いろいろの発表から、微生物構成物質の中により強力な免疫活性化誘導体が存在することが報告された。そして、バクテリアのＤＮＡは、強力な免疫活性化、およびそれぞれの抗原に対するいくつかの免疫反応を誘導する傾向があることも立証された（６、７）。２つの核酸塩基配列からなるＣｐＧジヌクレオチドが免疫活性化およびその調節の要点であり、最近の研究から、脊椎動物もまた自己のＤＮＡとバクテリアＤＮＡを区別して、免疫細胞を活性化させることが明らかとなった。このようなＣｐＧモチーフ（ＣｐＧ  ｍｏｔｉｆｓ）は、バクテリアでは非常に有り触れたものであるが、哺乳動物ではそうではない。ＣｐＧモチーフを含むオリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ−ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、ＣｐＧ−ＯＤＮ）は、先天的免疫反応および獲得された免疫反応を含む種々の宿主の防御機序を活性化させる（Ａｋｄｉｓ，  ＣＡ．  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：６４１−６４６，  ２０００）。
【０００５】
最近は、ＣｐＧ−ＯＤＮの有用性を高めるために骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）を修飾したＣｐＧ−ＯＤＮが開発された。ＤＮＡの基本骨格であるホスホジエステル骨格のＣｐＧ−ＯＤＮは、ヌクレアーゼに対して敏感であって、体内で容易に分解される。したがって、ＣｐＧ−ＯＤＮが、生体内で毒性を誘発する危険が少ない。しかしながら、ホスホジエステル骨格のＣｐＧ−ＯＤＮは、他の骨格のＣｐＧ−ＯＤＮよりも低い活性を有することが明らかとなっている（Ｋｗｏｎ，  ＨＪ．ら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ｒｅｓ．  Ｃｏｍｍｕｎ．，  ３１１：１２９−１３８，  ２００３）。これに対し、ホスホロチオエート骨格（ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）のＣｐＧ−ＯＤＮは、インビボでヌクレアーゼによって分解されないように構造を修飾して人為的に作られたものである。ホスホロチオエート骨格のＣｐＧ−ＯＤＮは、ホスホジエステル骨格のＣｐＧ−ＯＤＮに比べて有効なインビボでの安定性、および優れたＢ細胞を活性化する能力を有する。したがって、現在、ホスホロチオエート骨格に修飾したＣｐＧ−ＯＤＮが最も広く用いられている。ところが、このようなホスホロチオエート骨格のＣｐＧ−ＯＤＮは、数多いタンパク質への非特異的なＯＤＮの結合を増加させ、そして体内で容易に分解されないために、毒性を誘導する。また、ホスホロチオエート骨格のＣｐＧ−ＯＤＮは、関節炎を誘発し、そしてその症状を悪化させ（Ｄｅｎｇ  ＧＭら．，  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ＆  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ，  ４３  （２）：  ３５６−３６４，  ２０００）、ＳＬＥ（全身性エリトマトーデス）などの自己免疫疾患を起こすことが報告された  （Ｔａｎａｋａ，  Ｔ．ら．，  Ｊ  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １７５：５９７−６０７，  １９９２）。
【０００６】
今世紀以来、製剤は、様々な物質を免疫補助剤（アジュバント）としてワクチンに添加することにより作成され、このような製剤はワクチンの効果を最大化するために設計されてきた。ところが、現在、アルミニウム塩（ミョウバン、Ａｌ２Ｏ３）が、ワクチン中で投与できるように承認された唯一のアジュバントである。最近の研究によれば、組み換え肝炎表面抗原（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｓｕｒｆａｃｅ  ａｎｔｉｇｅｎ）をミョウバンおよびＣｐＧ−ＯＤＮと混合してマウスに注射した場合、ミョウバンのみを免疫補助剤として使用した場合より一層高いワクチン効果を得ることができた（Ｄａｖｉｓ  Ｈ  Ｌ．ら，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １６０：  ８７０−８７６，  １９９８）。ミョウバンは、Ｔｈ２免疫反応を誘導して細胞性免疫（ｃｅｌｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ）を弱く誘導し、一方、ＣｐＧ−ＯＤＮは、Ｔｈ１サイトカインの発現を誘導して体液性および細胞性免疫を強く誘導する。ところが、このときに使用したＣｐＧ−ＯＤＮは、ホスホロチオエート骨格を持つため副作用を誘発する可能性が存在する。
【０００７】
一方、皮膚疾患とは、ヒトを含む動物の皮膚に現れる全ての異常所見をいう。その中でも、アトピー性皮膚炎は、激しい掻痒症、乾燥した皮膚および湿疹性皮膚炎から選択される慢性／炎症性皮膚疾患のような特徴的主症状を有する（Ｒｕｄｉｋｏｆｆ，  Ｄ．ら．，  Ｌａｎｃｅｔ．  ３５１：１７１５−１７２１，  １９９８）。アトピー性皮膚炎は、一般に遺伝的傾向があり、個人によってアレルギー喘息、アレルギー鼻炎、アレルギー結膜炎およびじんま疹（ｕｒｔｉｃａｒｉａ）を伴う。アトピー性皮膚炎患者から報告された一連の免疫学的異常所見としては、ＩｇＥ生成の増加、ＣＤ８＋抑制／細胞毒性Ｔリンパ球（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ／ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の数減少および機能低下、ＩＦＮ−γを分泌するＴｈ１（Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  １）リンパ球の数減少などがある。また、アトピー性皮膚炎の皮膚病変では、組織学的にＣＤ４＋表現型を有するＴリンパ球、単核球／マクロファージの浸潤、肥満細胞および好酸球が増加しており、樹状細胞（ＤＣ）と表皮のランゲルハンス細胞も増加している（Ｉｍｏｋａｗａ，  Ｇ．，ら．，  Ｊ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  Ｄｅｒｍａｔｏｌ．，  ９６：５２３−５２６，  １９９１）。
【０００８】
多くの研究者らは、Ｘ線を用いて癌細胞を死滅させて癌を治療する方法を開発してきた。ところが、放射線による抗癌治療の際、放射線により、癌組織およびその周囲にある免疫細胞が不可避的に傷害され免疫機能の低下をもたらす。放射線照射によってＢ細胞（Ａｓｈｗｅｌｌ  ＪＤら．，  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １３６：３６４９−３６５６，  １９８６）、Ｔ細胞（Ｐｒｏｓｓｅｒ  ＪＳ  Ｉｎｔ．  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ．  Ｂｉｏｌ．  Ｒｅｌａｔ．  Ｓｔｕｄ．  Ｐｈｙｓ．  Ｃｈｅｍ．  Ｍｅｄ．  ３０：４５９−４６５，  １９７６）、マクロファージ（Ｙｏｓｈｉｈｉｓａ  Ｋら．，  Ｊ．  Ｒａｄｉａｔ  Ｒｅｓ．  ４５：２０５−２１１，  ２００４）などの免疫細胞が死滅する（アポトーシス）という報告がある。したがって、癌などの疾患を治療するための放射線治療法において、癌細胞以外の正常免疫細胞を生存させて免疫反応を正常に維持させる方法が求められる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、免疫反応（アジュバント）を刺激し及び免疫反応のバランスを維持することによる多様な免疫疾患治療に使用することができ、アトピー性皮膚炎に効果があり、そして放射線照射に対する細胞の生存を増加させる効果がある、マイコバクテリウムボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）由来免疫反応調節用オリゴヌクレオチドに関する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
そこで、本発明は、下記一般式で表示され、少なくとも２つの非メチル化ＣｐＧモチーフを含むＤＮＡ配列からなる、マイコバクテリウムボビスＢＣＧから単離されたＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを提供し、ここでＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、免疫反応（アジュバント）を刺激し、多様な免疫疾患治療のためのＴｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスを維持し、癌などの難治性疾患を放射線療法を使用して治療するの際に、正常免疫細胞を保護するために使用可能であり、そして皮膚疾患の治療または予防方法もまた提供する。
【００１１】
［一般式］：ＨＫＣＧＴＴＣＲＴＧＴＣＳＧＭ（配列番号１）
ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＳはＣまたはＧであり、ＨはＡ、ＴまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、ＭはＣまたはＡである。
【００１２】
本発明において、前記オリゴヌクレオチドは、好ましくは、下記一般式で表示された５つのヌクレオチドを５’側と３’側にさらに含む。
【００１３】
［一般式］：ＤＫＭＨＫＣＧＴＴＣＲＴＧＴＣＳＧＭＹＫ（配列番号２）
ここで、ＲはＡまたはＧであり、ＳはＣまたはＧであり、ＨはＡ、ＴまたはＣであり、ＫはＧまたはＴであり、ＤはＡ、ＧまたはＴであり、ＭはＣまたはＡであり、ＹはＣまたはＴである。
【００１４】
本発明において、「ＣｐＧモチーフ（ｍｏｔｉｆ）」とは、ホスホジエステル結合（リン酸結合）で連結された非メチル化シトシン−グアニンジヌクレオチド（非メチル化シトシン−リン酸（フォスフェイト）−グアニンジヌクレオチドともいう）を含有し、免疫反応を活性化させるＤＮＡ配列をいう。また、「ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド（以下、「ＣｐＧ−ＯＤＮ」という）とは、ＣｐＧモチーフを少なくとも２つ含むオリゴデオキシヌクレオチドをいう。
【００１５】
また、本発明において、「個体（ｓｕｂｊｅｃｔ）」とは、哺乳動物、特にヒトを含む動物を意味する。前記個体は、治療が必要な患者であってもよい。
本発明において、前記オリゴヌクレオチドは、５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＧＣＣＴ−３’  （配列番号３）、５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＴ−３’  （配列番号４）、５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＡＴＧＴＣＧＧＣＣＴ−３’（配列番号５）、５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣＣＴ−３’（配列番号６）、５’−ＧＴＡＴＴＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＴＣＣＴ−３’（配列番号７）および５’−ＴＧＡＣＴＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧＣＡＴＧ−３’  （配列番号８）からなる群より選択されることが好ましい。
【００１６】
本発明のＭＢ−ＯＤＮは、天然供給源（例えば、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡ）に由来してもよく、または化学的に合成されるか、若しくは組み換え的に製造されてもよい。本発明のＭＢ−ＯＤＮは、当業界に公知になっている様々な核酸合成技術及び機械を用いて合成できる（Ａｕｓｕｂｅｌら．，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｈｓ  ２．  ａｎｄ  ４  （Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，  １９８９）；  Ｍａｎｉａｔｉｓ，ら．，  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂ．，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８２）；  ａｎｄ  米国特許４，４５８，０６６号）。
【００１７】
本発明のＭＢ−ＯＤＮは、好ましくはホスホジエステル骨格を有する。ＤＮＡの基本骨格であるホスホジエステル骨格は、インビボでヌクレアーゼによって容易に分解されるため、毒性を誘導するおそれが少ない。本発明のＭＢ−ＯＤＮは、ホスホジエステル骨格を持っても、従来の他のＣｐＧ−ＯＤＮとは異なり、インビトロおよびインビボで優れた免疫活性を有することが特徴である。また、本発明のＭＢ−ＯＤＮは、修飾骨格（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）を含むことができる。オリゴヌクレオチド骨格の修飾は、インビボにＣｐＧ−ＯＤＮが投与されるとき、ＣｐＧ−ＯＤＮの活性および／または安定性を強化させることができるということが明らかとなっている。本発明のＭＢ−ＯＤＮにおいて好ましい骨格の変形としては、分解に耐性を持たせるホスホロチオエート修飾を含む。ホスホロチオエート修飾は、末端で発生することが可能であり、例えば最後の２つおよび３つの５’または３’ヌクレオチドがホスホロチオエート結合によって連結可能である。また、本発明のＭＢ−ＯＤＮは、分解に耐性を持たせる２次構造（例えばステムループ構造）を有するように修飾可能である。好ましくは、本発明のＭＢ−ＯＤＮは修飾され、部分的にホスホロチオエート修飾骨格を有することが可能である。ホスホロチオエートは、ホスホロアミダートまたはＨ−ホスホネート化学を用いて自動化技術によって合成できる（Ｓ．  Ｅ．  Ｂｅａｕｃａｇｅら．，  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，  ２２：１８５９，  １９８１；  Ｆｒｏｅｈｌｅｒら．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄ．  Ｒｅｓ．，  １４：５３９９−５４０７）。別の修飾例として、アリール−およびアルキル−ホスホネートは、例えば米国特許第４，４６９，８６３号に記載されているように合成でき、そしてアルキルホスホトリエステル（荷電された酸素残基が米国特許第５，０２３，２４３号およびヨーロッパー特許第０９２，５７４号に記載されているようにアルキル化される）は、市販試薬を用いて、自動化された固相合成によって製造できる。また、分解にさらに少なく敏感化させる別の修飾例は、アデノシン、シトシン、グアニン、チミン及びウリジンのアセチル−、チオ−およびこれと類似の修飾、並びにイノシンおよびキシン（ｑｕｅｓｉｎｅ）などの非定型塩基を含む。テトラエチルグリコールまたはヘキサエチレングリコールなどのジオールを末端に有するＣｐＧ−ＯＤＮも分解にさらに耐性的である。この他にも、ホスホジエステルとホスホロチオエートの組み合わせ、ホスホトリエステル、ホスホロアミダート、メチルホスホネート、メチルホスホロチオネート、ホスホロジチロエートおよびこれらの組み合わせが含まれる（Ｋｈｏｒａｎａら．，  Ｊ．  Ｍｏｌｅｃ．  Ｂｉｏｌ．，  ７２：２０９，  １９７２；  Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ，  Ｊ．  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．，  ４：１６５，  １９９０）。このように骨格が修飾されたＣｐＧ−ＯＤＮは、増大したヌクレアーゼ抵抗性（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ）、増加した細胞吸収（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ）、増加したタンパク質取込み（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｕｐｔａｋｅ）お��び／または変更された細胞内局在（ａｌｔｅｒｅｄ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）などによって強力な免疫効果を示すことができる。
【００１８】
本発明のＭＢ−ＯＤＮの好ましい骨格は、ホスホジエステル（以下「Ｏ型」という）またはホスホロチオエート（以下「Ｓ型」という）骨格であり、最も好ましい骨格は、インビボで容易に分解されて副作用を誘発しないＯ型骨格である。
【００１９】
本発明に係るＭＢ−ＯＤＮは、Ｔｈ１サイトカインの発現を誘導して体液性免疫反応を強く誘導することを示しており、ワクチンの効果を改善するアジュバント活性を持つ。その具体的な生理的活性は、次のとおりである：
１）マウスおよびマウス脾臓の免疫細胞においてＩＬ−１２の生産を増加させる。
２）樹状細胞を活性化させてＩＬ−１２の発現を誘導させる。
３）ＨＥＬを抗原として用い、ＭＢ−ＯＤＮをアジュバントとして用いたとき、抗体の生産が増加する。この際、ＣＦＡを抗原として用いたとき、Ｔｈ１免疫反応の結果として、ＩｇＧ２ａの生産がより増加した。
【００２０】
前述したような活性により、本発明に係るＭＢ−ＯＤＮは、ワクチンの効能を改善する効果を有する。従来知られているＣｐＧ−ＯＤＮとは異なり、本発明のＭＢ−ＯＤＮは、骨格の形態を問わずに、ほぼ同一の活性を示すという点に特徴がある。本発明では、Ｏ型骨格に修飾した本発明のＣｐＧ−ＯＤＮがＳ型骨格に修飾した場合とほぼ同等に活性を示すことを明らかにした。また、Ｔｈ１サイトカインの発現を誘導して体液性免疫反応を強く誘導することを明らかにしたので、本発明のＣｐＧ−ＯＤＮはワクチンのアジュバントとして効果的に使用できる。
【００２１】
本発明に係るＭＢ−ＯＤＮは、Ｔｈ２サイトカイン（例えばＩＬ−４）を抑制し、および／またはＴｈ１サイトカイン（例えばＩＬ−１２）を誘導することにより、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスを調節する生理的活性を持つ。その具体的な生理的活性は、次のとおりである。１）マクロファージを活性化させてＩＬ−１２のプロモータを活性化させる。２）樹状細胞を活性化させてＩＬ−１２の発現を誘導させる。３）マウスにおけるＩＬ−１２の生産を増加させる。４）マウス脾臓の免疫細胞におけるＩＬ−１２の生産を増加させる。５）Ｔｈ２−リンパ球によって仲介されるサイトカイン（ＩＬ−４およびＩＬ−１０）の発現を阻害させる。６）アトピー性皮膚炎病変部位でＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の細胞数を減少させる。７）血清内ＩｇＥ水準を減少させる。
【００２２】
前述したような活性により、本発明に係るＭＢ−ＯＤＮは、皮膚疾患の治療または症状改善の効果を有する。従来知られているＣｐＰ  ＯＤＮとは異なり、本発明のＣｐＧ−ＯＤＮは、骨格の形態を問わずに、ほぼ同一の活性を示すという点に特徴がある。本発明では、Ｏ型骨格に修飾した本発明のＣｐＧ−ＯＤＮがＳ型骨格に修飾したＣｐＧ−ＯＤＮと同等またはより優れた活性を示すことを明らかにした。したがって、本発明のＭＢ−ＯＤＮは、全ての皮膚疾患の治療または予防に効果的に使用できる。また、本発明のＣｐＧ−ＯＤＮは、Ｔｈ１サイトカインの発現を誘導して、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のバランスを保たせるので、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のアンバランスから発生する免疫疾患（例えば、喘息）の治療剤として効果的に適用できる。
【００２３】
本発明に係るＭＢ−ＯＤＮは、免疫細胞の生存を増加させる機能を持つ。ＭＢ−ＯＤＮは、マクロファージを刺激してＢｃｌ−ｘｓ／Ｌの発現を増加させ、そして放射線照射によるアポトーシスを阻害する効果を有する。また次いで、ＭＢ−ＯＤＮは、Ｂ細胞の放射線照射によるアポトーシスを阻害する効果を有する。したがって、ＭＢ−ＯＤＮは、放射線照射による癌などの難治性疾患治療の際、正常の免疫細胞の生存率を高めて免疫機能を正常化させることに効果的に適用することができる。ＭＢ−ＯＤＮの具体的な生理的活性は、次の通りである。１）マクロファージのＢｃｌ−ｘｓ／Ｌの発現を増加させる。２）放射線照射によるマクロファージの生存率を増加させる。３）放射線照射によるＢ細胞の生存率を増加させる。
【実施例】
【００２４】
以下、本発明の好ましい態様を、付随する図面に関連して詳細に記載される出あろう。
したがって、下記実施例は、本発明を例示するもので、本発明の内容を限定するものではない。
【００２５】
＜実施例１＞  
Ｅ．ｃｏｌｉとＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡのＤＮＡ塩基配列の分析
＜１−１＞Ｅ．ｃｏｌｉとＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡにおけるＣｐＧモチーフのＤＮＡ塩基配列の分析
本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉとＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡ配列をコンピュータプログラムを用いて分析した。Ｅ．ｃｏｌｉとＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡ内に存在する６ヌクレオチドからなるＤＮＡ配列の頻度をコンピュータプログラムを用いて計算した。染色体上のＤＮＡ配列ＸＸＣＧＸＸの確率は、理論的に１／４６であるが、実際、Ｅ．ｃｏｌｉとＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡ上のＤＮＡ配列ＸＸＣＧＸＸの確率は一層高い。また、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡにおけるＸＸＣＧＸＸの頻度は、でＥ．ｃｏｌｉより高いことを確認した（図１）。
【００２６】
＜１−２＞  Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡにおけるＣｐＧ−ＯＤＮ塩基配列の分析
Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡを無作為に２０個の塩基配列を選択し、そして次いで、その中から、３つのＸＸＣＧＸＸモチーフが含まれるオリゴヌクレオチドを選別した。
例えば：ＧＡＣＧＴＴＧＡＧＴＣＧＴＴＡＡＣＧＡＧ  ＣとＣ間に４および５塩基のギャップを有するオリゴヌクレオチド（−ＣＧＸＸＣＧＸＸＸＣＧ−、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５、図２ａ）、並びにＣとＣ間の各５塩基のギャップを有するオリゴヌクレオチド（−ＣＧＸＸＸＣＧＸＸＸＣＧ−、ＭＢ−ＯＤＮ  ５／５、図２ｂ）を分析した結果は、図２のとおりである。Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡ中に、３９５の−ＣＧＸＸＣＧＸＸＸＣＧ−形態のオリゴヌクレオチド、３５４の−ＣＧＸＸＸＣＧＸＸＸＣＧ−形態のオリゴヌクレオチドが存在することを示している。図１において示されるように、頻度の高いモチーフＸＸＣＧＸＸを含むオリゴヌクレオチドに高い点数を与える優先順位で２０個の塩基配列を記載した。オリゴヌクレオチドの２０個の塩基対の５’−または３’−末端にＣＧが存在するオリゴヌクレオチド配列を排除し、候補免疫反応調節用オリゴヌクレオチドを７１個選定して合成し、候補物質の検出に利用した。
【００２７】
＜実施例２＞
免疫活性を有するＭＢ−ＯＤＮの検出
＜２−１＞合成した候補ＭＢ−ＯＤＮの免疫反応
前記実施例＜１−２＞で製造されたＭＢ−ＯＤＮおよびその多様な置換体がマクロファージのＩＬ−８およびＩＬ−１２のプロモータを活性化可能か否かを調査した。
【００２８】
ａ）マウスマクロファージの培養
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ、ヴァージニア州マナッサス）を、１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞培養を３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター（Ｆｏｒｍａ）中で行った。
【００２９】
ｂ）ＩＬ−８およびＩＬ−１２プロモータ−Ｌｕｃレポータプラスミドの設計
ＩＬ−８プロモータ領域（−１３５ｂｐから＋４６ｂｐまで）を増幅するために、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、次のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。
【００３０】
【化１】
2008501787.tif 000003
【００３１】
前記増幅されたＩＬ−８プロモータ領域の断片を制限酵素ＢｇｌIIおよびＨｉｎｄIIIで消化されたｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入した。こうしてＩＬ−８プロモータ−Ｌｕｃレポータプラスミドを構築した（Ｗｕ  Ｇ．  Ｄ．ら．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２：２３９６−２４０３，  １９９７）。
【００３２】
一方、ＩＬ−１２プロモータ領域（−３７３ｂｐから＋５２ｂｐまで）を増幅するために、ヒトゲノムＤＮＡを鋳型とし、次のプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。
【００３３】
【化２】
2008501787.tif 000004
【００３４】
増幅されたＩＬ−１２プロモータ領域の断片を制限酵素ＳａｃＩおよびＸｈｏＩで消化されたｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）に挿入した。こうしてＩＬ−１２プロモータ−Ｌｕｃレポータプラスミドを構築した（Ｗｕ  Ｇ．  Ｄ．ら．，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２７２：２３９６−２４０３，  １９９７）。
【００３５】
ｃ）プロモータ活性化分析：ルシフェラーゼ活性アッセイ
ＲＡＷ２６４．７細胞（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅｒ、ＭＩＤ）を５×１０４細胞／ウェルの濃度で１２ウェルプレートに分注して３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。前記細胞を、前記ｂ）で構築したＩＬ−８プロモータ−ＬｕｃレポータプラスミドまたはＩＬ−１２プロモータ−ＬｕｃレポータプラスミドとｐＲＬ−ｎｕｌｌプラスミド（Ｐｒｏｇｅｍａ）で共トランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）した。その後、共トランスフェクションした細胞を３７℃で、５％ＣＯ２インキュベーターで２４時間培養した。図３に記載のＭＢ−ＯＤＮｓ（１０μｇ／ウェル）で各ウェルを処理し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで６時間または１２時間培養した。この際、対照群をＰＢＳで処理した。その後、デュアル−ルシフェラーゼレポータアッセイシステム（Ｄｕａｌ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ａｓｓａｙ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｐｒｏｍｅｇａ）のＰＬＢ（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を１００μＬ／ｗｅｌｌの濃度で各ウェルに添加して細胞を均質化した。細胞溶解液を遠心分離し、得られた上澄み液（１５μＬ）を用いてルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼの活性は、ＴＤ−２０／２０（Ｔｕｒｎｅｒ  ｄｅｓｉｇｎｓ）ルミノメータ（ｌｕｍｉｎｏｍｅｔｅｒ）を用いて測定した。ＭＢ−ＯＤＮの処理による各プロモータの活性は、対照群に対する相対的な活性として測定した。すなわち、対照群の活性を「１」として、実験群はこれに対する活性化倍数（ｆｏｌｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ）で表わした。
【００３６】
その結果、図４に示すように、ＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１の塩基配列がＩＬ−８プロモータを活性化させるものと確認された。
【００３７】
＜２−２＞ＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１類似オリゴヌクレオチドによるＩＬ−８プロモータの活性化
前記実施例＜２−１＞でＩＬ−８プロモータの活性化に効果があるＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の塩基配列のうちＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧ配列は同一であり、その他の塩基配列は異なるＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１と類似のＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡに存在する２０個の塩基配列を分析した。その結果、図５ａに示すように、１７個のＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１類似オリゴヌクレオチドが存在することが分かった。その後、前記実施例＜２−１＞と同様の方法を繰り返し、ＩＬ−８プロモータの活性を測定した。
【００３８】
その結果、図５ｂに示すように、塩基配列によってＩＬ−８プロモータを活性化させる能力が異なることが分かった。本発明に係るＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１に加えて、ＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１．１４も高い活性を示した。
【００３９】
＜実施例３＞
ＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列の修飾および免疫反応
＜３−１＞ＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列の修飾
ＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１オリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列を図６ａのように修飾して、ＤＮＡ配列を合成した。ＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１のＣＧ配列をＧＣ配列にそれぞれ変えた（＃３１−ＣＧ−１、＃３１−ＣＧ−２、＃３１−ＣＧ−３）。また、１番目のＣＧと２番目のＣＧをＧＣ配列に変え（＃３１−ＣＧ−４）、２番目のＣＧと３番目のＣＧをＧＣ配列に変え（＃３１−ＣＧ−５）、１番目のＣＧと３番目のＣＧをＧＣ配列に変えた（＃３１−ＣＧ−５）。図６ａに示すようにＣＧ配列のＧをＡ、Ｔ、Ｃに図６ａのようにそれぞれ変えた。また、１番目と２番目のＣＧをＣＡに、２番目と３番目のＣＧをＣＡに、１番目と３番目のＣＧをＣＡに変えた。
【００４０】
＜３−２＞オリゴヌクレオチド修飾されたＭＢ−ＯＤＮ４／５＃３１オリゴヌクレオチドの免疫反応の測定
１２ウェルプレートにＲＡＷ２６４．７細胞を５×１０４細胞／ウェルで敷き、２４時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。ＩＬ−８プロモータレポータプラスミドとｐＲＬ−ｎｕｌｌプラスミドを共トランスフェクションさせた後、２４時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。１０μｇ／ウェルの合成オリゴヌクレオチドで各ウェルを処理し、６時間３７℃、ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。その後、前記実施例＜２−１＞と同様の方法を繰り返し、ＩＬ−８プロモータ活性を測定した。
【００４１】
いずれかの修飾されたＤＮＡ配列を有する合成オリゴヌクレオチドがマクロファージのＩＬ−８プロモータをどの程度活性化させるかをルシフェラーゼアッセイを使用して測定した。結果として、オリゴヌクレオチド５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＴＧＣＧＣＣＴ−３’、５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＡＴＧＴＣＧＧＣＣＴ−３’、５’−ＡＧＣＡＧＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＣＧＣＣＴ−３により高くＩＬ−８プロモータは活性化された（図６ｂ）。他の合成オリゴヌクレオチドは、対照群より低いＩＬ−８プロモータ活性を示した。ＩＬ−８プロモータを活性化するオリゴヌクレオチドにおいて、ＣｐＧモチーフではなく、２番目のＣｐＧモチーフＴＴＣＧＴＧの変異体である「ＴＴＣＡＴＧ」を有するオリゴヌクレオチドによってもＩＬ−８プロモータの活性化が測定された。３番目のＣｐＧモチーフである「ＧＴＣＧＧＣ」を修飾したとき、ＣｐＧモチーフ中に再び現れる配列ＧＴＧＣＧＣおよびＧＴＣＣＧＣが、ＩＬ−８プロモータを活性化可能であることが明らかとなった（図６）。
【００４２】
＜実施例４＞
ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１およびＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４オリゴヌクレオチドの骨格修飾による免疫反応調査
＜４−１＞ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１およびＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４の骨格修飾によるＲＡＷ２６４．７細胞の活性化
ＲＡＷ２６４．７細胞に、前記実施例＜２−１＞のｂ）で構築したＩＬ−８−ＬｕｃプロモータレポータベクターまたはＩＬ−１２−ＬｕｃプロモータレポータベクターとｐＲＬ−ｎｕｌｌプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）で共トランスフェクションさせた。前記トランスフェクションされた細胞にＯ型（ホスホジエステル骨格）並びにＳ型（ホスホロチオエート骨格）ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１およびＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４（０または１０μｇ／ｍＬ）でそれぞれ処理し、８時間インキュベートした。その後、前記実施例＜２−１＞と同様の方法を繰り返し、ＩＬ−８プロモータおよびＩＬ−１２プロモータの活性を測定した。その結果、図７に示すように、本発明に係るＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１とＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４は、骨格の形態を問わずに（Ｏ型およびＳ型の両方とも）最も高い活性を示した。
【００４３】
＜４−２＞ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１およびＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４の骨格修飾によるＮＦ−ｋＢ活性化
２４ウェルプレートにカバーガラスを入れ、ＲＡＷ２６４．７細胞を５×１０５細胞／ｍＬずつ入れて３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間インキュベートした。各ウェルをＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１およびＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４をそれぞれ５μｇ／ウェルの量で処理した。３０分経過後、３．７％のホルムアルデヒドで細胞を固定させた後、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００を含むＰＢＳで浸透可能に（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚｅ）した。０．２％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ（ＰＢＳＴ）に１％ドンキー血清（ｄｏｎｋｅｙ  ｓｅｒｕｍ）を入れた溶液で３０分間ブロッキングした後、ＰＢＳＴにマウス抗−ｐ６５（力価１：５００）抗体を０．５μＬ／ウェルの濃度で入れて２時間常温に放置した。ＰＢＳＴで洗浄した後、細胞をドンキー−抗−マウス−ＩｇＧ−ＦＩＴＣ（力価１：２５０）抗体で２時間処理した。共焦点顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）を用いてＮＦ−ｋＢの核への移動を観察した（Ｌｅｅ，  Ｙ．，  ｅｔ．  ａｌ．，  （２００２）  Ｂｌｏｏｄ  ９９，  ４３０７−４３１７）。
【００４４】
図８ａは、ＮＦ−ｋＢを免疫染色法で染色し、共焦点顕微鏡を用いてＮＦ−ｋＢの核への移動現象を観察した図である。何にも処理していない対照群またはＣｐＧモチーフのない対照群（ｎｏｎ−ＣｐＧ−ＯＤＮ  ２０４１）では、ＮＦ−ｋＢが細胞質に位置した。マクロファージをＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１およびＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４で処理した場合に、ＮＦ−ｋＢが核に移動した。本発明に係るＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１とＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４は、骨格の形態を問わずに（Ｏ型およびＳ型の両方とも）ＮＦ−ｋＢが核に移動した。
【００４５】
図８ｂは、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１およびＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４で処理したＲＡＷ２６４．７細胞株中でＮＦ−ｋＢが活性化されることをＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  ｍｏｂｉｌｉｔｙ  ｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙ）で確認した実験である。各６ウェルプレートにＲＡＷ２６４．７細胞を５×１０５細胞／ｍＬずつ入れて、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２４時間インキュベートした。ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１およびＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４で各細胞を５μｇ／ウェルずつで処理した。３０分経過後、細胞を核抽出バッファ（ｎｕｃｌｅａｒ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）中で反応させた後、遠心分離して核タンパク質を得てＥＭＳＡを行った。ＥＭＳＡのためにＮＦ−ｋＢ結合部位を有するプローブ（５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’）（配列番号１３）を３２Ｐで標識した。３２-Ｐで標識されたプローブと２０μｇの核タンパク質を緩衝溶液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、６５ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ジチオスレイトール、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＮＰ−４０、５０ｍｇ／ｍＬ  ポリ（ｄＩｄＣ）：ｐｏｌｙ（ｄＩｄＣ）および８％グリセロール）中で混合した後、常温で３０分間反応させた。反応液を０．５×ＴＢＥ（１×ＴＢＥは８９ｍＭ  Ｔｒｉｓホウ酸塩および１ｍＭ  ＥＤＴＡである。ｐＨ８．０）および２．５％グリセロールを含有する４％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動した。ＮＦ−ｋＢ競合剤（ｃｏｍｐｅｔｉｔｏｒ）としては、プローブ５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ−３’（配列番号１３）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．，  カルフォルニア州サンタクルズ）を使用し、ＥＭＳＡを行うために細胞を５０回前処理した。ＮＦ−ｋＢ抗体スーパーシフトアッセイ（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｓｕｐｅｒｓｈｉｆｔ  ａｓｓａｙｓ）を、４℃で３０分間１μｇのＮＦ−ｋＢ抗体で前処理した細胞を反応することにより行い、そして次いでＥＭＳＡを行った。図８において、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１およびＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４によってＲＡＷ２６４．７細胞中でＮＦ−ｋＢが活性化されることがＥＭＳＡから示される。本発明に係るＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１とＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１．１４は、骨格の形態を問わずに（Ｏ型およびＳ型の両方とも）ＮＦ−ｋＢを活性化させることをＥＭＳＡによって確認することができた。
【００４６】
＜実施例５＞
ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の体液性免疫反応誘導
＜５−１＞免疫化（Ｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）
４週齢のＢａｌｂ／ｃマウスに鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ、５０ｍｇ／匹）とＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１（１００μｇ／匹）の混合物を腹腔内投与した。１週経過後、同量のＨＥＬとＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の混合物を再び投与した。１週経過後、ハートパンチング（ｈｅａｒｔ  ｐｕｎｃｈｉｎｇ）方法で血液を採取し、遠心分離して血球を沈澱させ、血清を獲得した。獲得した血清から抗−ＨＥＬ抗体（総ＩｇＧ、Ｉｇ  Ｇ１、Ｉｇ  Ｇ２ａ）の力価を測定するためにＥＬＩＳＡを行った。
【００４７】
＜５−２＞ＥＬＩＳＡ
獲得した血清にＰＢＳ／０．２％アジ化ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ）を用いて１：１０で希釈（ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して−２０℃に保管した。９６ウェル免疫プレート（Ｎｕｎｃ）にＨＥＬ（１０μｇ／ｍＬ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６）を入れて４℃で１６時間放置してプレート底にＨＥＬを固定した。ＰＢＳＴ（ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を用いてプレートを洗浄し、細胞をブロッキングするために、１％牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を入れて室温で１時間放置した。血清をＰＢＳを用いて１：３で連続希釈してプレートに順次添加し、４℃で１６時間放置した後、ＰＢＳＴで洗浄した。アルカリホスファダーゼ−共役検出（Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｅｔｅｃｔｉｎｇ）抗体をＰＢＳＴに混ぜてプレートに添加し、室温で２時間放置した。総Ｉｇを検出するために、１：２，０００ヤギ抗−マウスＩｇ（Ｈ＋Ｌ）（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）抗体を使用した。発色のために１−ＳｔｅｐＴＭ  ＡＢＴＳ（ＰＩＥＲＣＥ）を入れ、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて４０５ｎｍで吸光を測定した（Ｃｈｕ，  Ｒ．  Ｓ．，  ｅｔ．  ａｌ．，  （１９９７）  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８６，  １６２３−１６３１）。
【００４８】
ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１をＢａｌｂ／ｃマウス腹腔内に鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）と共に投与して、体液性免疫反応を調査した。ＨＥＬのみを単独で投与したマウスに比べ、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１と共にＨＥＬを投与したマウスにおいて、抗体のレベルがより増加したので、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１断片が体液性免疫でアジュバントの効果があることを確認した（図９）。マイコバクテリアの抽出物を、パラフィン油と混合した薬剤であるフロインドアジュバント（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）は、約６０年間使用されている代表的なアジュバントの一つである。ところが、アジュバントは、細胞仲介刺激効果を示さず、ヒトに使用できないという問題を有する。ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１は、体液性免疫を刺激するアジュバントとして作用し、そして免疫細胞を刺激して細胞仲介免疫反応もまた誘導するため、新しいアジュバントとしての使用が可能であるという結果を得た。また、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１は、Ｔｈ１免疫反応特異的なＩｇＧ２ａの抗体生産に有効に使用されたことを示している。
【００４９】
＜実施例６＞
ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１のサイトカイン生産誘導
＜６−１＞樹状細胞におけるサイトカイン発現
ａ）樹状細胞の分離およびＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１での処理
４週齢のＢａｌｂ／ｃマウスの大腿部の骨髄から前駆細胞を分離した。分離された前駆細胞をＲＢＣ溶解溶液（１５０ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、１０ｍＭ  炭酸カリウム、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ｐＨ７．４）と反応させた後、細胞を回収した。前記細胞を６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に２×１０６ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で分注した。骨髄の前駆細胞を樹状細胞に分化させるために、ＩＬ−４とＧＭ−ＣＳＦ（ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）をそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬの濃度で添加した１０％ＦＢＳ含有ＲＰＭＩ培地を各ウェルに加えた（Ｇｈｏｓｈ，  Ｍ．，  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７０：  ５６２５−５６２９，  ２００３）。細胞を３７℃で５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。細胞は、２日毎に使用した培地を新鮮な培地に交替しながら６日間インキュベートした。その後、細胞を、本発明に係るＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１、ＣｐＧ−ＯＤＮ  １８２６およびｎｏｎ−ＣｐＧ−ＯＤＮ２０４１と１０μｇ／ｍＬのレベルで処理した。
【００５０】
ｂ）樹状細胞におけるＩＬ−１２発現
本発明に係るＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１で処理した樹状細胞におけるＩＬ−１２の発現レベルを測定するためにＲＴ−ＰＣＲを行った。
【００５１】
まず、前記実施例＜６−１ａ＞でＢａｌｂ／ｃマウスから分離された樹状細胞をＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１で時間別（０、０．５、１、２、４および８時間）に処理した。対照群はＯ型１８２６ＣｐＧ−ＯＤＮと２０４１ｎｏｎ−ＣｐＧ−ＯＤＮでそれぞれ処理した。
【００５２】
その後、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて樹状細胞から総ＲＮＡを単離した。次に、総ＲＮＡ（５μｇ）をＭ−ＭＬＶ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で処理してｃＤＮＡを構築した。このように構築したｃＤＮＡを鋳型として使用し、次の特異的なプライマーセットを用いてＰＣＲを行った。
【００５３】
【化３】
2008501787.tif 000005
【００５４】
ＰＣＲ増幅は、９５℃で３０秒間のＤＮＡ変性、５７℃で４０秒間のプライマーアニーリング、７２℃で１分間のその延長を２５サイクル繰り返すことにより行った。ＰＣＲ増幅が完了した後、１％アガロースゲルで増幅されたＰＣＲ産物を確認した。その結果、図１０に示すように、本発明に係るＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１によってのみ、ＩＬ−１２の発現が誘導されたことが明らかとなった。一方、Ｓ型の１８２６ＣｐＧ  ＯＤＮがＩＬ−１２の発現を高い水準で誘導すると報告されたこととは異なり（Ｌｅｅ，  ＫＷ．ら．，  Ｍｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ４１：９５５−９６４，  ２００４）、Ｓ型の１８２６ＣｐＧ  ＯＤＮによってはＩＬ−１２の発現が誘導されなかった。
【００５５】
＜６−２＞ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１によるマウスにおけるＩＬ−１２発現
本発明に係るＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１で処理したマウスにおいてＩＬ−１２ｐ４０の発現レベルを測定するために免疫化した後、ＥＬＩＳＡを行った。
【００５６】
ａ）免疫化
４週齢のＢａｌｂ／ｃマウスにＯ型とＳ型のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１、およびｎｏｎ−ＣｐＧ−ＯＤＮ２０４１（１００μｇ／匹）それぞれを腹腔内投与した。２４時間経過後、ハートパンチング方法で血液を採取し、遠心分離して血球を沈澱させ、血清を獲得した。
【００５７】
ｂ）ＥＬＩＳＡ
まず、前記実施例＜５−２＞と同様に、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１で免疫化したＢａｌｂ／ｃマウスから単離された血清中で抗−ＩＬ−１２ｐ４０および抗−ＩＬ−４抗体の力価を測定するためにＥＬＩＳＡを行った。
【００５８】
ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１をＢａｌｂ／ｃマウス腹腔内に投与してＩＬ−１２ｐ４０とＩＬ−４の生産レベルを比較した。その結果、図１１ａに示すように、本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１はＩＬ−１２ｐ４０の生産を誘導したが、ＩＬ−４の生産レベルには影響しなかった。Ｓ型のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１がＩＬ−１２  ｐ４０の生産をさらに高い水準に増加させた。したがって、本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１が、ＩＬ−１２ｐ４０の生産を増加させてＴｈ１免疫反応性を改善させる効果があることが示される。
【００５９】
＜６−３＞ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１によるマウス脾臓免疫細胞におけるＩＬ−１２発現
マウスの脾臓から免疫細胞を収集し、これを５×１０５ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌの密度で各ウェルに分注した。その後、各ウェルをＯ型またはＳ型のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１、およびｎｏｎ−ＣｐＧ−ＯＤＮ  ２０４１（０または１０μｇ／ｍＬ）で処理し、２４時間インキュベートした。培養が完了した後、細胞培養液を分離した。その後、細胞培養液内サイトカインのレベルを測定するために、各商用化された抗−ＩＬ−１２  ｐ４０およびＩＬ−４抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネソタ州ミネアポリス）を用いて、前記実施例＜５−２＞と同様にサンドイッチＥＬＩＳＡをそれぞれ行った。
【００６０】
その結果、図１１ｂに示すように、本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１は、骨格の形態を問わずに、脾臓免疫細胞におけるＩＬ−１２  ｐ４０の発現レベルを高い水準に増加させた。ところが、本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１は、ＩＬ−４の生産には影響を及ぼさなかった。特に、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫反応のＴｈ１免疫反応を誘導する代表的なサイトカインであるＩＬ−１２は、本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１によって誘導され、そして本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１がＴｈ１免疫反応を誘導し得ることを確認することができた。
【００６１】
＜実施例７＞
アトピー性皮膚炎を治療する能力を調査するためのインビボ分析
＜７−１＞本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１含有軟膏剤の塗布
ＮＣ／Ｎｇａマウス６匹を２つの群に分けた：ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１処理群および無処理群。製造したＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１を含有する軟膏剤（０．２ｍｇ／ｈｅａｄ）を処理群のマウスの背にあるアトピー性皮膚炎病変部位に５日に１回ずつ２週間（総４回）塗布した。本発明のＣｐＧ  ＯＤＮが添加されていないペトロラタムを、無処理群のマウスに同一の条件で塗布した。
【００６２】
＜７−２＞病変の観察
本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１含有軟膏剤の塗布後５日目または７日目にアトピー性皮膚炎の病変部位を肉眼で観察した。その結果、図１２ａに示すように、無処理群のマウスと比較するとき、Ｏ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１を塗布したマウスの背において皮膚病変の消失が観察された。また、マウスの背から皮膚を摘出してＨ＆Ｅ染色法によってアトピー性皮膚炎の治療効果を調査した。その結果、図１２ｂに示すように、本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１を塗布したマウスの病変では、過角化症（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）とアカントシース（ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ）が著しく減少し、真皮内リンパ球の浸潤も減少して、アトピー性皮膚炎がマウスの病変部位で治療されることを確認した。
【００６３】
＜７−３＞組織学的分析
ａ）サイトカインの発現
本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１含有軟膏剤の塗布後５日目、７日目および１４日目に１．５×１．５ｃｍ２の皮膚を摘出した。その後、４％ホルマリン溶液で少なくとも１日固定した。固定された皮膚組織をパラフィンで処理して５μｍの厚さに切った。パラフィンを除去した後、以下のようにＬＳＡＢ＋ｋｉｔ（ＤＡＫＯ、デンマーク）のマニュアルに従って実験を行った。上記皮膚組織を３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処理した。その後、皮膚組織を０．１％ＢＳＡを含有するＴＢＳ（Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ、ｐＨ７．４）で希釈した１０％正常ヤギ血清を添加してブロッキングした。次いで、皮膚組織を、１次抗体、例えばヤギ抗マウスＩＬ−１０抗体、ヤギ抗マウスＩＬ−４抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＵＳＡ）、ラット抗マウスＩＦＮ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ、ＵＳＡ）で処理し、４℃で少なくとも１２時間反応させた。その後、皮膚組織をビオチン標識２次抗体を室温で少なくとも３０分間反応させた後、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンをそこへ添加して常温で約３０分間反応させた。ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ、デンマーク）を用いて皮膚組織を染色した後、染色した皮膚組織を顕微鏡によって観察した。
【００６４】
その結果、図１３に示すように、本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１含有軟膏剤の塗布後５日目に、マウスの表皮では、ＩＬ−４の発現は減少したが、ＩＦＮ−γの発現は増加したことを確認した。したがって、本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１が、アトピー性皮膚炎で特異的に高いＴｈ２表現型Ｔリンパ球によって仲介されるサイトカインＩＬ−４の生成を抑制するが、本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１が、Ｔｈ１表現型Ｔリンパ球によって仲介されるサイトカインＩＦＮ−γの生成を増加させることにより、アトピー性皮膚炎の状態を改善しそして治療することが示される。
【００６５】
ｂ）ＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の細胞数の測定
本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１含有軟膏剤の塗布後５日目、７日目および１４日目に１．５×１．５ｃｍ２の皮膚を摘出した。摘出された皮膚組織を液体窒素で冷凍した。その後、ティッシュテック（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）ＯＣＴ化合物（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ  ＵＳＡ、ＩＮＣ．）を用いて皮膚組織を試料ブロックに挿入し、低温保持装置（ｃｒｙｏｓｔａｔ）を用いて５μｍの厚さに切断した。切断された皮膚組織を１次抗体、例えばラット抗マウスＣＤ４ｍＡｂ（ＢＤ  ｐｈａｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）またはラット抗ＣＤ８ｍＡｂ（Ｓｅｒｏｔｅｃ、ＵＫ）を４℃で１２時間反応させた。次いで、上記皮膚組織をビオチン標識２次抗体で常温で少なくとも３０分間反応させ、次いで、ペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジンをそこに添加して常温で約３０分間反応させた。ＤＡＢ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ｃｈｒｏｍｏｇｅｎ  ｓｙｓｔｅｍ（ＤＡＫＯ、デンマーク）を用いて皮膚組織を染色した後、染色した皮膚組織を顕微鏡によって観察した。写真は全て１００倍で撮った。
【００６６】
その結果、図１４に示すように、本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１を塗布したマウスの皮膚でＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球細胞が減少することが明らかになった。アトピー性皮膚炎の病変におけるＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の減少は、アトピー性皮膚炎の治療に非常に効果的である（Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  Ｖ．，ら．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．  １０４：１０９７−１１０５，  １９９９）。
【００６７】
＜７−４＞血清内ＩｇＥ水準の分析
各群のマウスから血漿を収得し、使用する前まで−２０℃で保管した。総ＩｇＥ水準は、マウスＩｇＥ  ＢＤ  ＯｐｔＥＩＡ  Ｋｉｔ（ＢＤ  ｐｈａｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて測定した。その後、血漿内ＩｇＥ抗体（ＢＤ  ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）レベルを調査するために、商用化されたビオチン標識ＩｇＥ抗体（ＢＤ  ｐｈａｍｉｎｇｅｎ、ＵＳＡ）を用いて前記実施例＜５−２＞と同様にサンドイッチＥＬＩＳＡをそれぞれ行った。
【００６８】
その結果、図１５に示すように、本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１含有軟膏剤を塗布したマウスでは、血清内ＩｇＥレベルが著しく減少した。
これらの結果より、本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１がＴｈ１−リンパ球によって仲介されるサイトカインの発現を増加させるが、Ｔｈ２リンパ球によって仲介されるサイトカインの発現を抑制し、血清内ＩｇＥ水準を減少させることにより、アトピー性皮膚炎の治療に非常に優れた効果を示すことを確認することができた。
【００６９】
＜実施例８＞
放射線照射の際に免疫細胞の生存率に及ぼすＭＤ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の効果
＜８−１＞ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１処理によるＢｃｌ−ｘｓ／Ｌの発現
６ウェルプレートにＲＡＷ２６４．７細胞を１×１０５細胞／ウェルで敷き、２４時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。各細胞を、１０μｇ／ウェルの密度で合成オリゴヌクレオチドと処理し、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で６時間インキュベートした。溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）を１００μＬ／ウェルずつ入れ、ＲＡＷ２６４．７細胞を均質化した。細胞溶解液を遠心分離して上澄み液（１５μＬ）を得て、これを用いてウェスタンブロットを行った。生じた上澄み液を、抗体−ヤギ抗マウスＢｃｌ−ｘｓ／Ｌで処理し、ペルオキシダーゼ標識２次抗体と反応させた後、エンハンストケミルミネサンス試薬（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅａｇｅｎｔ）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州ピスカタウェイ、ＵＳＡ）を用いてＢｃｌ−ｘｓ／Ｌを観察した。
【００７０】
その結果、図１６に示すように、本発明に係るＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１は、ＲＡＷ２６４．７細胞においてＢｃｌ−ｘｓ／Ｌの発現を刺激することにより細胞の生存率を増加させる効果があることが示された。
【００７１】
＜８−２＞ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１処理によるマクロファージの生存率増加の観察
４ウェルチャンバースライド（Ｌａｂ−ＴＥＫ  Ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ、Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ）にＲＡＷ２６４．７細胞を３×１０４細胞／ウェルで敷き、２４時間３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中でインキュベートした。各ウェルを、１０μｇ／ウェルの密度で合成オリゴヌクレオチドと６時間処理し、γ−照射器で１０Ｇｙ放射線を照射した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間インキュベートした。培養したＲＡＷ２６４．７細胞の培地に３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）溶液（５×、２μｇ／ｍＬ）を直接添加し（０．４μｇ／ｍＬとなるように）、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で４時間反応させた。各ウェルの培地を完全にに除去し、ＤＭＳＯ０．５ｍＬを添加した後、３７℃で１０分間反応させ、生成されたホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）結晶を溶かした。反応液１００μＬを取って、５７０ｎｍで吸光度を測定するために使用した。
【００７２】
その結果、図１７に示すように、本発明に係るＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の処理が、ＲＡＷ２６４．７細胞が放射線照射によって死滅することを阻害する効果を持つことが分かった。骨格の形態に関連しては、Ｏ型がさらに高い活性を示した。
【００７３】
＜８−３＞ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１処理によるＢ細胞の生存率増加の観察
６ウェルプレートにＲＰＭＩ８２２６細胞を１×１０５細胞／ウェルで敷き、１０μｇ／ウェルの密度で合成オリゴヌクレオチドと６時間処理し、γ−照射器で１０Ｇｙ放射線を照射した後、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で４８時間インキュベートした。インキュベートした細胞にヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ）を５０μｇ／ｍＬで添加して、１０分間氷浴で反応させた後、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）でＰＩでの細胞染色のレベルを確認した。
【００７４】
また、インキュベートした細胞を冷たいＰＢＳで２回洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＰＥ５μＬを添加した後、１５分間室温で反応させた。ここにアネキシンＶ結合緩衝液（Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）０．４ｍＬを加えた後、フローサイトメトリーでアネキシンＶに結合した細胞のレベルを測定した。
【００７５】
その結果、図１８および図１９に示すように、本発明に係るＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の処理が、ＲＰＭＩ８２２６細胞が放射線照射によって死滅することを阻害する効果を持つことが分かった。
【００７６】
これらの結果より、本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１が、癌などの難治性疾患を放射線照射により治療する際、正常免疫細胞の生存率を高めて免疫機能を正常化させるのに非常に優れた効果を示すことを確認することができた。
【産業上の利用可能性】
【００７７】
上述したように、本発明に係るマイコバクテリウムボビスＢＣＧ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧ）由来オリゴヌクレオチド部分は、ＨＥＬ抗体を形成するためのアジュバントとしての役割を行って体液性免疫に関与し、マクロファージのＩＬ−８およびＩＬ−１２プロモータの活性化カスケードにおいてＩＬ−８プロモータを活性化することにより先天性免疫細胞の活性化に関与することが分かった。また、本発明のオリゴヌクレオチドは、体液性免疫を刺激するためのアジュバントとして作用し、そして免疫細胞を刺激して細胞仲介性免疫反応を誘導するため、新しいアジュバントとして使用可能であることが確認された。また、本発明のＭＢ−ＯＤＮは、アトピー性皮膚炎動物モデルであるＮＣ／Ｎｇａマウスにおいて、Ｔｈ１−リンパ球によって仲介されるサイトカインの発現を増加させるが、Ｔｈ２−リンパ球によって仲介されるサイトカインの発現は抑制し、血清内ＩｇＥレベルを減少させることにより、アトピー性皮膚炎の治療に非常に優れた効果を示すことが明らかになった。
【００７８】
本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１が、癌などの難治性疾患を放射線照射により治療するの際に、正常免疫細胞の生存率を高めて免疫機能を正常化させるのに非常に優れた効果を示すことを確認することができた。
【図面の簡単な説明】
【００７９】
これら、並びに本発明の好ましい態様の他の特徴、側面および利点は、参照により完全に本明細書に援用される図面を付随する以下の詳細な説明において、より完全に記載されるであろう。図面においては：
【図１】図１は、Ｅ．ｃｏｌｉとＭ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡ配列をコンピュータプログラムを用いて分析した結果である。２塩基が、ＣＧジヌクレオチドの両末端に存在する全てのＤＮＡ配列（ＣｐＧモチーフ）を分析した。結果として、図１に示すように、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡに一層多いＣｐＧモチーフが存在することを確認した。
【図２】図２は、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡに存在するＤＮＡ配列中に、３つのＣｐＧモチーフが２０塩基対上に存在するＤＮＡ配列を分析した結果である。ＣｐＧモチーフにおいて、オリゴヌクレオチドは、塩基ＣとＣ間に４および５塩基のギャップを有し（−ＣＧＸＸＣＧＸＸＸＣＧ−、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５）、そして塩基ＣとＣ間の各５塩基のギャップを有する  （−ＣＧＸＸＸＣＧＸＸＸＣＧ−、ＭＢ−ＯＤＮ  ５／５）。Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡに存在する−ＣＧＸＸＣＧＸＸＸＣＧ−形態のオリゴヌクレオチドは３９５個、−ＣＧＸＸＸＣＧＸＸＸＣＧ−形態のオリゴヌクレオチドは３５４個存在することを示す。
【図３】図３は、候補免疫反応調節用オリゴヌクレオチドを７１個選定して合成し、候補配列の検出に利用した。
【図４】図４は、図３に示すように、ホスホジエステル結合の形態で合成した免疫反応調節用オリゴヌクレオチド７１個で処理したＲＡＷ２６４．７細胞における、ＩＬ−８およびＩＬ−１２プロモータの活性化を示す図である。図４ａは、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５形態の合成した３５個のオリゴヌクレオチドが、マクロファージのＩＬ−８プロモータを活性化させる程度を比較した結果を示す図であり、図４ｂは、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５形態の合成した３５個のオリゴヌクレオチドが、マクロファージのＩＬ−１２プロモータを活性化させる程度を比較した結果を示す図であり、図４ｃは、ＭＢ−ＯＤＮ  ５／５形態の合成した３５個のオリゴヌクレオチドが、マクロファージのＩＬ−８プロモータを活性化させる程度を比較した結果を示す図である。
【図５】図５は、Ｍ．ｂｏｖｉｓ  ＢＣＧの染色体ＤＮＡに存在するＤＮＡ配列の中の、２０塩基対上に存在するＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１のＣＧＴＴＣＧＴＧＴＣＧコアの、それぞれ５’側および３’側に５つの異なるＤＮＡ配列を有する１７個のオリゴヌクレオチドを選択した結果を示す図であり（図５ａ）、ホスホジエステル骨格のオリゴヌクレオチドを合成して、１７個のオリゴヌクレオチドがマクロファージのＩＬ−８プロモータを活性化する程度を比較した結果を示す図（図５ｂ）である。
【図６】図６は、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の塩基数を１５塩基対に減らしたオリゴヌクレオチドＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１（Ｍ）、ＣＧ配列をＧＣ配列で置換した＃３１−ＣＧ、およびＣＧ配列のＧをＡ、ＴまたはＣで独立して置換した＃３１−Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄが（図６ａ）マクロファージのＩＬ−８プロモータを活性化させる程度を比較した結果を示す図である（図６ｂ）。
【図７】図７は、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１および３１．１４の骨格をホスホジエステルおよびホスホロチオエートの形態で合成して、ＩＬ−８およびＩＬ−１２プロモータの活性化に及ぼす影響を、マウスマクロファージ細胞株であるＲＡＷ２６４．７細胞で比較した図である。図７ａと図７ｂは、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の骨格をホスホジエステルおよびホスホロチオエートの形態で合成して、濃度依存的にＩＬ−８プロモータを活性化させることを示す図である。図７ｃと図７ｄは、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１および＃３１．１４の骨格をホスホジエステルおよびホスホロチオエートの形態で合成してＩＬ−８およびＩＬ−１２プロモータの活性化に及ぼす影響を示す図である。
【図８】図８は、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１のホスホジエステルおよびホスホロチオエート骨格の形態でＲＡＷ  ２６４．７細胞株を刺激したとき、ＮＦ−ｋＢを活性化させることを示す図である。図８ａはＲＡＷ２６４．７細胞をＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１（１０μｇ／ｍＬ）で３０分間処理し、固定し、その後ＮＦ−ｋＢ  ｐ６５−特異的抗血清を用いて間接免疫蛍光法を行ってＮＦ−ｋＢの局在を確認した図である。図８ｂは、ＲＡＷ２６４．７細胞をＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１（１０μｇ／ｍＬ）で３０分間処理した後、核タンパク質を分離してＮＦ−ｋＢコンセンサス結合部位（ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）に結合するＮＦ−ｋＢを確認するＥＭＳＡ（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ  Ｍｏｂｉｌｉｔｙ  Ｓｈｉｆｔ  Ａｓｓａｙ）の結果である。
【図９】図９は、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の骨格をホスホジエステルおよびホスホロチオエートの形態で合成し、鶏卵リゾチーム（ＨＥＬ）（ｈｅｎ  ｅｇｇ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ）によって腹腔免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスの体液性免疫への影響の比較を示す図である。
【図１０】図１０は、樹状細胞におけるＩＬ−１２の発現について、本発明のＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の効果を、従来の１８２６ＣｐＧ−ＯＤＮおよび非−ＣｐＧ−ＯＤＮ（２０４１）と比較したことを示す電気泳動図である。
【図１１ａ】図１１は、ＩＬ−１２  ｐ４０の生産について、本発明に係るＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の修飾骨格の効果を、従来の１８２６  ＣｐＧ−ＯＤＮおよび非−ＣｐＧ−ＯＤＮ（２０４１）と比較したことを示す図である。図１１ａは、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１でＢａｌｂ／ｃマウスを腹腔免疫化した後、血清中でどの程度ＩＬ−１２  ｐ４０が産生されたかを確認した図である。
【図１１ｂ】図１１ｂはＢａｌｂ／ｃマウスらの脾臓免疫細胞を分離してＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１で処理したとき、ＩＬ−１２  ｐ４０の産生を確認した図である。
【図１２ａ】図１２は、動物モデルを用いて本発明に係るＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１の投与によってアトピー性皮膚炎が治療されることを確認した結果である。図１２ａは、本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１をＮＣ／Ｎｇａマウスの背にあるアトピー性皮膚炎の病変に塗布した後５日目および７日目に肉眼で観察した写真である。
【図１２ｂ】図１２ｂは、アトピー性皮膚炎が発生したＮＣ／Ｎｇａマウスの背皮膚にＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１を塗布し、皮膚を摘出してＨ＆Ｅ染色したことを示す写真である。図１２において、「←→はアカントシース（ａｃａｎｔｈｏｓｉｓ）の病変部位、→は過角化症（ｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｓｉｓ）の病変部位を示す。
【図１３】図１３は、本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１を投与したＮＣ／Ｎｇａマウスの背皮膚でサイトカイン（ＩＬ−４およびＩＦＮ−γ）発現のレベルを観察した組織化学的分析の結果を示す図である。図中、矢印はサイトカインの発現部位を示す。
【図１４】図１４は、本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１を投与したＮＣ／Ｎｇａマウスの背皮膚でＣＤ４＋およびＣＤ８＋リンパ球の細胞数を観察した組織化学的分析の結果を示す顕微鏡写真である。
【図１５】図１５は、本発明のＯ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１を投与したＮＣ／Ｎｇａマウスの血清内ＩｇＥレベル示す図である。図中、ＡＤは、無処理群を示す。
【図１６】図１６は、Ｏ型ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１でマクロファージ細胞株ＲＡＷ２６４．７を処理したときの、Ｂｃｌ−ｘｓ／Ｌの発現が増加することを示すウエスタンブロットを用いた図である。
【図１７】図１７は、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１でＲＡＷ２６４．７細胞を前処理した後、ＲＡＷ２６４．７細胞を放射線照射したとき、ＲＡＷ２６４．７細胞の生存率が増加したことを、ＭＴＴアッセイを用いて示す図である。
【図１８】図１８は、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１でＢ細胞株ＲＰＭＩ８２２６を前処理した後、ＲＰＭＩ８２２６細胞を放射線照射したとき、ＲＰＭＩ８２２６細胞の生存率が増加したことを、ＰＩ染色後、フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を用いて示す図である。
【図１９】図１９は、ＭＢ−ＯＤＮ  ４／５＃３１でＢ細胞株ＲＰＭＩ８２２６を前処理した後、ＲＰＭＩ８２２６細胞を放射線照射したとき、ＲＰＭＩ８２２６細胞の生存率が増加したことを、アネキシンＶ染色後、フローサイトメトリーを用いて示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図９】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図１０】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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