(57)【要約】  本発明は、７〜２０アミノ酸残基の配列を有するポリペプチドでウイルスタンパク質または断片の相同的配列が置き換えられるとそれが発現される宿主に対する、ウイルスタンパク質またはその断片の免疫抑制特性をモデュレーションすることができる、７〜２０アミノ酸残基の配列を有するポリペプチド（免疫抑制モデュレートリー配列）に関し、該ポリペプチドは、以下の最小共通アミノ酸配列：Ｘ１Ｙ９Ｙ１０Ｙ１１ＣＹ１２Ｘ２（ここで、Ｘ１およびＸ２は、該免疫抑制特性に影響を及ぼすように選択され、Ｙ９〜Ｙ１２は可変アミノ酸残基を示す）を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
７〜２０アミノ酸残基の配列を有するポリペプチドで、ウイルスタンパク質または断片の相同的な配列が置き換えられるとそれが発現される宿主に対する、ウイルスタンパク質またはその断片の免疫抑制特性をモデュレーションすることができる、７〜２０アミノ酸残基の配列を有するポリペプチド（免疫抑制モデュレートリー配列）であって、前記ポリペプチドは、
以下の最小共通アミノ酸配列：
【表１】
2008506357.tif 000043
（式中、
Ｘ１およびＸ２は、前記の免疫抑制特性に影響を及ぼすように選択され、Ｙ９〜Ｙ１２は、可変アミノ酸残基を示す）
を含む、前記ポリペプチド。
【請求項２】
Ｘ１およびＸ２が、
ａ．Ｘ１は、Ｅ、Ｋ、またはＱであり、Ｘ２はＡである
ｂ．Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＦである
からなる群より選択される、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ウイルス遺伝子に由来する核酸によりコードされている、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ウイルスｅｎｖ遺伝子に由来する核酸によりコードされている、請求項１〜３のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
レトロウイルスｅｎｖ遺伝子に由来する核酸によりコードされている、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記レトロウイルスが、ＭｏＭＬＶ、フレンドレトロウイルス、ＦｅＬＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＳＴＬＶ−１、およびＭＰＭＶからなる群より選択される、請求項５に記載のポリペプチド。
【請求項７】
【表２】
2008506357.tif 000044
からなる群より選択される配列を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
【表３】
2008506357.tif 000045
（式中、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、免疫抑制特性を与える）
あるいは
【表４】
2008506357.tif 000046
（式中、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、低い免疫抑制特性を与える）
あるいは
【表５】
2008506357.tif 000047
（式中、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、実質的に全く免疫抑制特性を与えない）
からなる群より選択される以上の配列を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
以下の共通配列：
【表６】
2008506357.tif 000048
（式中、
Ｘ１およびＸ２は、請求項１に定義された通りであり、Ｙ１〜Ｙ１４は、任意のアミノ酸を示す）
を有する、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
【表７】
2008506357.tif 000049
（式中、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、免疫抑制特性を与える）
あるいは
【表８】
2008506357.tif 000050
（式中、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、低い免疫抑制特性を与える）
あるいは
【表９】
2008506357.tif 000051
（式中、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、実質的に全く免疫抑制特性を与えない）
からなる群より選択される配列を有する、請求項１〜９のいずれか１項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
野生型ＥＮＶタンパク質に対して改変された免疫抑制活性を有する変異ＥＮＶタンパク質を製造するための、以下の配列：
【表１０】
2008506357.tif 000052
（式中、
変異されるべき第一のアミノ酸はＸ１であり、変異されるべき第二のアミノ酸はＸ２であり、Ｙ１〜Ｙ１２は任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む野生型ウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質における、第一のアミノ酸の第一の変異および場合により第二のアミノ酸の第二の変異の使用。
【請求項１２】
前記変異ＥＮＶタンパク質の抗原性に関与する構造が、実質的に保存されている、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
野生型ＥＮＶタンパク質に対して低下した免疫抑制活性を有する変異ＥＮＶタンパク質を製造するための、以下の配列：
【表１１】
2008506357.tif 000053
（式中、
変異されるべき第一のアミノ酸はＸ１であり、変異されるべき第二のアミノ酸はＸ２であり、Ｙ１〜Ｙ１２は任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む、野生型ウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質における、第一のアミノ酸の第一の変異および場合により第二のアミノ酸の第二の変異の、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１４】
野生型ＥＮＶタンパク質に対して低下した免疫抑制活性を有する変異ＥＮＶタンパク質を製造するための、以下の配列：
【表１２】
2008506357.tif 000054
（式中、
変異されるべき第一のアミノ酸はＸ１であり、変異されるべき第二のアミノ酸はＸ２であり、Ｙ１〜Ｙ１２は任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む、野生型ウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質における、第一のアミノ酸の第一の変異および第二のアミノ酸の第二の変異の、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１５】
野生型ＥＮＶタンパク質に対して上昇した免疫抑制活性を有する変異ＥＮＶタンパク質を製造するための、以下の配列：
【表１３】
2008506357.tif 000055
（式中、
変異されるべき第一のアミノ酸はＸ１であり、変異されるべき第二のアミノ酸はＸ２であり、Ｙ１〜Ｙ１２は任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む、野生型ウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質における、第一のアミノ酸の第一の変異および場合により第二のアミノ酸の第二の変異の、請求項１１または１２に記載の使用。
【請求項１６】
以下の配列
【表１４】
2008506357.tif 000056
（式中、
アミノ酸Ｘ１および場合によりアミノ酸Ｘ２は変異しており、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に有する、野生型ＥＮＶタンパク質の変異から得られた変異ＥＮＶタンパク質（ただし、前記変異ＥＮＶタンパク質は、野生型ＥＮＶタンパク質に対して改変された免疫抑制活性を有する）、
あるいは、その断片（ただし、前記断片は、変異アミノ酸Ｘ１および場合によりＸ２を有し、前記変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、前記変異ＥＮＶタンパク質において採用されている構造と実質的に類似している）、
あるいは、少なくとも１アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、前記変異ＥＮＶタンパク質またはその断片から得られたタンパク質（ただし、前記の得られたタンパク質は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、前記変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、前記変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の構造と実質的に類似している）。
【請求項１７】
前記の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の抗原性に関与する構造が、野生型ＥＮＶタンパク質に対して実質的に保存されている、請求項１６に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載の以下の配列： 
【表１５】
2008506357.tif 000057
（式中、
アミノ酸Ｘ１および場合によりアミノ酸Ｘ２は変異しており、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む、野生型ＥＮＶタンパク質の変異から得られた変異ＥＮＶタンパク質（ただし、前記変異ＥＮＶタンパク質は、野生型ＥＮＶタンパク質に対して低下した免疫抑制活性を有する）、
あるいは、その断片（ただし、前記断片は、変異アミノ酸Ｘ１および場合によりＸ２を有し、前記変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、前記変異ＥＮＶタンパク質において採用されている構造と実質的に類似している）、
あるいは、少なくとも１アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、前記変異ＥＮＶタンパク質またはその断片から得られたタンパク質（ただし、前記の得られたタンパク質は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、前記変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、前記変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の構造と実質的に類似している）。
【請求項１９】
請求項１６または１７に記載の以下の配列：
【表１６】
2008506357.tif 000058
（式中、
アミノ酸Ｘ１および場合によりアミノ酸Ｘ２は変異しており、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む、野生型ＥＮＶタンパク質の変異から得られた変異ＥＮＶタンパク質（ただし、前記変異ＥＮＶタンパク質は、野生型ＥＮＶタンパク質に対して低下した免疫抑制活性を有する）、
あるいは、その断片（ただし、前記断片は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、前記変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、前記変異ＥＮＶタンパク質において採用されている構造と実質的に類似している）、
あるいは、少なくとも１アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、前記変異ＥＮＶタンパク質またはその断片から得られたタンパク質（ただし、前記の得られたタンパク質は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、前記変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、前記変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の構造と実質的に類似している）。
【請求項２０】
前記変異が置換である、請求項１６〜１９のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項２１】
Ｘ１がＲまたはＨにより置換されている、請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項２２】
Ｘ２が、Ｆ、Ｍ、Ｙ、またはＷにより置換されている、請求項１６〜２１のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項２３】
Ｘ１が、Ｅ、Ｋ、またはＱであり、ＲまたはＨにより置換されている、請求項１６〜２２のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項２４】
Ｘ２が、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＫであり、Ｆ、Ｍ、Ｙ、またはＷにより置換されている、請求項１６〜２３のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項２５】
前記ＥＮＶタンパク質が、ＨＥＲＶ  ＥＮＶ、特に
ＨＥＲＶ−ＦＲＤ  ＥＮＶ（配列番号８２）（ここで、Ｘ１はＱ４２７であり、Ｘ２はＡ４３３である）、または
ＨＥＲＶ−Ｔ  ＥＮＶ（配列番号８４）（ここで、Ｘ１はＱ５１６であり、Ｘ２はＡ５２２である）、または
ＨＥＲＶ−Ｒ  ＥＮＶ（配列番号８６）（ここで、Ｘ１はＥ５６１であり、Ｘ２はＫ５６７である）、または
ＨＥＲＶ−Ｖ  ＥＮＶ（配列番号８８）（ここで、Ｘ１はＱ３８１であり、Ｘ２はＶ３８７である）、または
ＨＥＲＶ−Ｒ（ｂ）ＥＮＶ（配列番号９０）（ここで、Ｘ１はＥ３９１であり、Ｘ２はＬ３９７である）
から選択される、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項２６】
前記ＥＮＶタンパク質がＨＥＲＶ−ＦＲＤ  ＥＮＶであり、前記変異ＥＮＶタンパク質の配列が、
配列番号１２０、
配列番号１２２
から選択される、請求項２５に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項２７】
前記ＥＮＶタンパク質がＨＥＲＶ−Ｖ  ＥＮＶであり、前記変異ＥＮＶタンパク質の配列が、
配列番号１２４、
配列番号１２６
から選択される、請求項２５に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項２８】
前記ＥＮＶタンパク質がＨＥＲＶ−Ｔ  ＥＮＶであり、前記変異ＥＮＶタンパク質の配列が、
配列番号１２８、
配列番号１３０
から選択される、請求項２５に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項２９】
前記ＥＮＶタンパク質がＨＥＲＶ−Ｒ  ＥＮＶであり、前記変異ＥＮＶタンパク質の配列が、
配列番号１４６、
配列番号１４８
から選択される、請求項２５に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項３０】
前記ＥＮＶタンパク質が、
ＨＴＬＶ−１ＥＮＶ（配列番号９２）（ここで、Ｘ１はＱ３８９であり、Ｘ２はＡ３９５である）、または
ＨＴＬＶ−２ＥＮＶ（配列番号９４）（ここで、Ｘ１はＱ３８５であり、Ｘ２はＡ３９１である）、または
ＦｅＬＶ  ＥＮＶ（配列番号９６）（ここで、Ｘ１はＥ５２７であり、Ｘ２はＡ５３３である）、または
ＰＥＲＶ  ＥＮＶ（配列番号９８）（ここで、Ｘ１はＥ５４５であり、Ｘ２はＡ５５１である）、または
ＳＴＬＶ−１ＥＮＶ（配列番号１００）（ここで、Ｘ１はＱ３８９であり、Ｘ２はＡ３９５である）、または
ＭｏＭＬＶ  ＥＮＶ（配列番号７０）（ここで、Ｘ１はＥ５５１であり、Ｘ２はＡ５５７である）、または
ＭＰＭＶ  ＥＮＶ（配列番号７２）（ここで、Ｘ１はＱ４７１であり、Ｘ２はＡ４７７である）、または
ＦＶ  ＥＮＶ（配列番号１０２）（ここで、Ｘ１はＥ５６１であり、Ｘ２はＡ５６７である）
から選択される、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項３１】
前記ＥＮＶタンパク質がＦｅＬＶ  ＥＮＶであり、前記変異ＥＮＶタンパク質の配列が、
配列番号１０４、
配列番号１０６
から選択される、請求項３０に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項３２】
前記ＥＮＶタンパク質がＨＴＬＶ−１ＥＮＶであり、前記変異ＥＮＶタンパク質の配列が、
配列番号１０８、
配列番号１１０
から選択される、請求項３０に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項３３】
前記ＥＮＶタンパク質がＨＴＬＶ−２ＥＮＶであり、前記変異ＥＮＶタンパク質の配列が、
配列番号１１２、
配列番号１１４
から選択される、請求項３０に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項３４】
前記ＥＮＶタンパク質がＰＥＲＶ  ＥＮＶであり、前記変異ＥＮＶタンパク質の配列が、
配列番号１５０、
配列番号１５２
から選択される、請求項３０に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項３５】
請求項１６または１７に記載の以下の配列：
【表１７】
2008506357.tif 000059
（式中、
アミノ酸Ｘ１および場合によりアミノ酸Ｘ２は変異しており、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む、野生型ＥＮＶタンパク質の変異から得られた変異ＥＮＶタンパク質（ただし、前記変異ＥＮＶタンパク質は、野生型ＥＮＶタンパク質に対して上昇した免疫抑制活性を有する）、
あるいは、その断片（ただし、前記断片は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、前記変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、前記変異ＥＮＶタンパク質において採用されている構造と実質的に類似している）、
あるいは、少なくとも１アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、前記変異ＥＮＶタンパク質またはその断片から得られたタンパク質（ただし、前記の得られたタンパク質は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、前記変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、前記変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の構造と実質的に類似している）。
【請求項３６】
前記変異が置換である、請求項３５に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項３７】
Ｘ１が、ＥまたはＱにより置換され、Ｘ２がＡにより置換されている、請求項３５または２２に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項３８】
前記ＥＮＶタンパク質が、ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶ、例えば配列番号７４により示される配列であり、変異ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶの配列が、
配列番号１１６、
配列番号１１８
から選択される、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片。
【請求項３９】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１種類のポリペプチドまたは請求項１６〜３８のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の変異ＥＮＶタンパク質もしくはその断片を含むことを特徴とするタンパク質であって、ただし、前記ポリペプチドが野生型ＥＮＶタンパク質に由来する場合、前記ポリペプチドを含む前記タンパク質は、前記の野生型ＥＮＶタンパク質とは異なっている、前記タンパク質。
【請求項４０】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチド、請求項１６〜３８のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質または請求項３９に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項４１】
配列番号１０３、
配列番号１０５、
配列番号１０７、
配列番号１０９、
配列番号１１１、
配列番号１１３、
配列番号１１５、
配列番号１１７、
配列番号１１９、
配列番号１２１、
配列番号１２３、
配列番号１２５、
配列番号１２７、
配列番号１２９、
配列番号１４５、
配列番号１４７、
配列番号１４９、および
配列番号１５１
を含むリストから選択される配列により示されることを特徴とする、請求項４０に記載の核酸。
【請求項４２】
請求項４０または４１に記載の核酸並びに前記核酸の発現に必要なエレメントを含むことを特徴とする、真核または原核発現ベクター。
【請求項４３】
前記ベクターが、ウイルスベクター、特にポックスベクター、例えば鶏痘、カナリア痘、もしくはＭＶＡ（改変されたワクシニアウイルスアンカラ）ベクター、アデノウイルスベクター、麻疹ベクター、またはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ベクターである、請求項４２に記載の真核または原核発現ベクター。
【請求項４４】
前記ベクターが、請求項４０または４１に記載の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片をコードする核酸配列、特に、変異ＦｅＬＶ  ＥＮＶ、例えば配列番号１０３または配列番号１０５により示される配列、並びに、場合により、前記の変異ＥＮＶと同じウイルスを起源とするＧＡＧタンパク質をコードする核酸を含む、ウイルスベクター、特にカナリア痘ベクターである、請求項４２または４３に記載の真核または原核発現ベクター。
【請求項４５】
請求項４０もしくは４１に記載の核酸、または、請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の真核もしくは原核発現ベクターを含むことを特徴とする、組換え細胞。
【請求項４６】
活性物質として、
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１種類のポリペプチド、または
請求項１６〜３９のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の変異ＥＮＶタンパク質もしくはその断片、または
請求項４０もしくは４１に記載の少なくとも１種類の核酸、または
請求項４２〜４４のいずれか１項に記載の少なくとも１種類の原核もしくは真核発現ベクター、または
請求項４５に記載の少なくとも１種類の組換え細胞を、
薬学的に許容されうる担体と共に含む、医薬またはワクチン組成物。
【請求項４７】
ＨＴＬＶまたはＦｅＬＶ感染などのウイルス疾患の予防および／または処置を目的とした医薬またはワクチンの製造のための、請求項１６〜３４のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質もしくはその断片を含むもしくはから構成される少なくとも１種類のタンパク質、または、前記タンパク質をコードする核酸の使用。
【請求項４８】
癌の予防および／または処置を目的とした医薬またはワクチンの製造のための、請求項２５〜２９のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質もしくはその断片を含むもしくはから構成される少なくとも１種類のタンパク質、または、前記タンパク質をコードする核酸の使用。
【請求項４９】
自己免疫疾患、アレルギー、または移植片拒絶などの免疫系の阻害を必要とする病態の予防および／または処置を目的とした医薬またはワクチンの製造のための、請求項３５〜３８のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質もしくはその断片を含むもしくはから構成される少なくとも１種類のタンパク質、または、前記タンパク質をコードする核酸の使用。
【請求項５０】
癌、ウイルス疾患、または自己免疫疾患、アレルギー、もしくは移植片拒絶などの免疫系の阻害を必要とする病態の予防および／または処置を目的とした医薬の製造のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の少なくとも１種類のポリペプチド、または請求項３９に記載の前記ポリペプチドを含むタンパク質、または前記ポリペプチドもしくは前記タンパク質をコードする核酸の使用。
【請求項５１】
癌、ウイルス疾患、または自己免疫疾患、アレルギー、もしくは移植片拒絶などの免疫系の阻害を必要とする病態の予防および／または処置を目的とした医薬またはワクチンの製造のための、少なくとも１種類のタンパク質または前記タンパク質をコードする核酸の使用であって、前記タンパク質は、
−以下の配列：
【表１８】
2008506357.tif 000060
（式中、
アミノ酸Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示し、アミノ酸Ｘ１は、Ｅ、Ｋ、またはＱを示し、場合によりアミノ酸Ｘ２はＡを示す）
を実質的に含む免疫抑制性ＥＮＶタンパク質、
−あるいは、その断片（ただし、前記断片は、アミノ酸Ｘ１および場合によりＸ２を有し、前記ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有する）、
−あるいは、少なくとも１アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、前記ＥＮＶタンパク質またはその断片から得られたタンパク質（ただし、前記の得られたタンパク質は、アミノ酸Ｘ１および場合によりＸ２を有し、前記変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有する）
を含むまたはから構成される、前記使用。
【請求項５２】
前記ＥＮＶタンパク質は、
ＨＥＲＶ−Ｔ  ＥＮＶ、例えば配列番号８４により示される配列、または
ＨＥＲＶ−Ｒ  ＥＮＶ、例えば配列番号８６により示される配列、または
ＨＥＲＶ−Ｖ  ＥＮＶ、例えば配列番号８８により示される配列、または
ＨＥＲＶ−Ｒ（ｂ）ＥＮＶ、例えば配列番号９０により示される配列、または
ＨＴＬＶ−１ＥＮＶ、例えば配列番号９２により示される配列、または
ＨＴＬＶ−２ＥＮＶ、例えば配列番号９４により示される配列、または
ＦｅＬＶ  ＥＮＶ、例えば配列番号９６により示される配列、または
ＰＥＲＶ  ＥＮＶ、例えば配列番号９８により示される配列、または
ＳＴＬＶ−１ＥＮＶ、例えば配列番号１００により示される配列、または
ＦＶ  ＥＮＶ、例えば配列番号１０２により示される配列
から選択される、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
−ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、またはそれらの断片、例えばＦａｂもしくはＦ（ａｂ）２’断片、
−ｓｃＦｖポリペプチド、
−アプタマー、
−結合ペプチド
から選択される、ＥＮＶタンパク質のリガンドの調製のための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１６〜３９のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項５４】
請求項１６〜３８のいずれか１項に記載の変異ＥＮＶタンパク質、または、請求項３９に記載のそれらを含むタンパク質もしくはポリペプチドに指向された、抗体もしくはその断片、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマー、または結合ペプチドであって、ただし、前記抗体もしくはその断片、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマー、または結合ペプチドは、対応する野生型ＥＮＶタンパク質には結合しない、前記抗体もしくはその断片、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマー、または結合ペプチド。
【請求項５５】
ウイルスまたは腫瘍細胞の免疫抑制活性をモデュレーションしやすい化合物をスクリーニングするための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のポリペプチドまたは請求項１６〜３９のいずれか１項に記載のタンパク質の使用。
【請求項５６】
ウイルスまたは腫瘍細胞の免疫抑制活性をモデュレーションしやすい化合物をスクリーニングするための、請求項５３または５４に記載の抗体もしくはその断片、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマー、または結合ペプチドの使用。
【請求項５７】
スクリーニングすべき化合物が、ペプチド、特に５〜３０アミノ酸を含むペプチド、例えば、コンビナトリアルペプチドライブラリーを起源とするペプチドである、請求項５５または５６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、タンパク質、特に抗原性タンパク質の免疫抑制特性をモデュレーションする（modulate）ことができるアミノ酸配列に関する。本発明はまた、抗原性特性は実質的に保持しつつ、このポリペプチドの由来のタンパク質に対して、獲得されモデュレーションされた免疫抑制特性を有する、抗原性で免疫抑制性のタンパク質から得られたポリペプチドを提供する。
【０００２】
本発明は、特に、ウイルスまたはレトロウイルス感染の分野（内因性レトロウイルスの分野を含む）に関し、このようなウイルスまたはレトロウイルスに感受性の宿主（動物またはヒト宿主を含む）の予防および／または処置のための物質を設計するための手段を提供する。
【０００３】
本発明のポリペプチドは、特に、ウイルス感染もしくはその有害な結果の予防および／または処置、あるいは、内因性レトロウイルス（ＥＲＶ）発現誘導の有害な結果の予防および／または処置の方法に使用するための、免疫原性組成物の作成、並びに、弱毒ウイルスの産生に使用できる。
【０００４】
発明の背景
ウイルスなどの感染性物質は、その宿主に侵入し、その免疫応答を回避するための機序および戦略を進化させている。様々な刊行物により、ウイルス：エプスタイン・バーヒトヘルペスウイルス４型（Suzukiら、1995、Exp.Med.182、477-486；Qinら、1996、J.Immunol.156、2316-2323）、Mason-Pfizerサルウイルス（Blaiseら、2001、J.Gen.Virol.、82、1597-1600）、モロニーネズミ白血病ウイルス（MangeneyおよびHeidmann、1998、Proc.Natl.Sci.USA、95、14920-14925）およびその他（Alcamiら、2002 EMBO reports、3(10)、927-932の論評を参照）によりコードされるタンパク質の免疫抑制特性が実証されている。これは、レトロウイルス感染が、宿主の免疫系の機能不全を伴うことが多いという事実により確認され得る。
【０００５】
これらの免疫抑制作用には、インターロイキン−２依存性リンパ球増殖の阻害、ヒトナチュラルキラー細胞の細胞溶解活性の阻害、および、単球により仲介される腫瘍細胞殺滅の阻害、並びに、サイトカイン合成のモデュレーション（modulation）が挙げられる。
【０００６】
インビボでの試験により、不活性化ウイルス、並びに、レトロウイルスエンベロープタンパク質に類似した合成ペプチドが、免疫抑制特性を有することが実証された（Oostendorpら、1993、Crit.Rev.Oncol.Hematol.14、189-206；Haraguchiら、1997、J.Leukocyte Biol.61、654-666）。より最近では、Mangeneyら（1998、Proc.Natl.Sci.USA.95、14920-14925）により、レトロウイルスエンベロープタンパク質を発現しているＣ５７ＢＬ／６株由来のネズミ腫瘍細胞は、Ｂａｌｂ／ｃマウス（同種移植片）に注入されると、腫瘍を形成し、一方、レトロウイルスエンベロープタンパク質を発現していない同じ細胞は拒絶されることが示された。エンベロープタンパク質中で様々な箇所を欠失させることにより、ＩＳＵ（「免疫抑制（immunosuppressive）」）ドメインと呼ばれる免疫抑制機能に関与するドメインが同定された。
【０００７】
ＩＳＵドメインは、初めて、エンベロープ糖タンパク質の膜貫通部分において同定された。レトロウイルスのｅｎｖ（エンベロープ（envelope））遺伝子は、前駆体ポリペプチドをコードしており、これはその後、２つのタンパク質（表面糖タンパク質（ＳＵ）および膜貫通サブユニット（ＴＭ））へと切断される。ＳＵタンパク質は、認識およびウイルスの細胞受容体への結合に関与している。ＴＭ部分は、エンベロープ複合体（ＳＵおよびＴＭ）を標的細胞膜にアンカーするのに関与し、細胞膜融合およびウイルス侵入に直接的に関与する。
【０００８】
多くのウイルス、特に、モロニーネズミ白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭｕＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）およびヒトＴ細胞白血病ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）のＴＭサブユニット構造が解明されている。エンベロープタンパク質中の高度に保存されている組織はまた、非レトロウイルスタンパク質、例えばインフルエンザウイルスおよびエボラウイルスにも見出されている。
【０００９】
免疫抑制作用はまた、ＥＲＶ、特にＨＥＲＶ（ヒト内因性レトロウイルス）で特徴づけられている別のクラスのタンパク質にも発見されている。ＨＥＲＶは、ヒトゲノムに広がっているレトロウイルス起源の配列であるエレメントを含み、祖先の感染のプロウイルス残遺物を示す。それ故、ＨＥＲＶとレトロウイルスの間には強い類似性があると推論できる。これらの中のいくつかのＨＥＲＶエレメントは依然として機能し、活性タンパク質、すなわち、ウイルス様タンパク質をコードする可能性があるが、それらの大半は、蓄積された変異、欠失および／または切断短縮（truncation）を有する。
【００１０】
これらの機能的なＨＥＲＶの役割が提唱されており、これには、レトロウイルス感染に対する防御（Bestら、1997 Trends Microbiol.5、313-318）または免疫抑制作用を介した母体免疫系からの胎児の防御（Ciancioloら、1985、Science 230、453-455；MangeneyおよびHeidmann 1998 Proc.Natl.Sci.USA.95、14920-14925）が挙げられる。免疫抑制特性を有するエンベロープタンパク質をコードするＨＥＲＶは、Mangeneyら（2001 J.Gen.Virology 82、2515-2518）により同定された。この刊行物には、ＨＥＲＶ−Ｈによりコードされるタンパク質は、エンベロープを発現する細胞が免疫応答を回避し増殖することを可能としたが、空ベクターでトランスフェクトされた同細胞は移植マウスにより普通に拒絶されたと報告されている。
【００１１】
融合性特性を有する、すなわち、インビトロで合胞体（多核細胞）を形成できる、機能的エンベロープタンパク質をコードする他のＥＲＶ、特にＨＥＲＶが同定された：それらには、ＨＥＲＶ−ＦＲＤおよびＨＥＲＶ−Ｗが挙げられる（Blondら、2000、J.Virol.74、3321-3329；Blaiseら、2003、Proc.Natl.Acad.Sci.22、13013-13018）。さらに、インビボでの実験により、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質を、それ自体のエンベロープタンパク質の産生が欠損しているＭｏＭＬＶウイルス粒子と同時発現させると、機能的ウイルス粒子を形成でき、ヒト細胞を感染させることができることが示された（Patienceら、1998、J.Virol.72、2671-2676）。結論としては、ＨＥＲＶ−Ｗには、その融合性特性および感染性特性が保存されている。類似の融合性特性および感染性特性が、ＨＥＲＶ−ＦＲＤに関しても観察されている。
【００１２】
観察された免疫抑制作用は、内容に応じて、哺乳動物、特にヒトにおいて、一方では病原性ウイルス感染に、他方では腫瘍細胞の活発な増殖に関連している可能性がある。腫瘍細胞の活発な増殖は、特に、ＥＲＶウイルス様タンパク質の発現の結果である。しかし、免疫抑制の機序を完全に解明するにはより深い洞察が必要とされ、これらの免疫抑制タンパク質の同定は、ウイルス感染に対する、または内因性レトロウイルス発現誘導に対する、または宿主におけるその有害な結果に対する、治療戦略（ワクチン戦略を含む）の新しい展望を開拓する。
【００１３】
現在使用されているワクチンは、特に、以下のように分類できる：
−弱毒化または衰弱化した改変病原体に存する弱毒生ワクチン（細菌性またはウイルス性ワクチン）。宿主への投与後、改変された病原性生物は、宿主内で複製し、免疫応答を刺激する。このタイプのワクチンは、一般的に、１回量の投与により長期に持続する免疫をもたらすが、副作用、すなわち、該病原体により引き起こされる軽度の病気の症例を引き起こす可能性があり、したがって、免疫系の弱まったヒトには投与すべきではない。
−特に熱処理および／または化学的処理の結果として死滅または不活性化された病原体に存する、不活性化または死菌ワクチン（生物完全体）。このように処理された病原体は複製できず、通常引き起こす疾病を引き起こすことはできない。それ故、それらは安全であり、免疫系が弱まった宿主にさえ投与できる。しかし、それらは、通常、生ワクチンほど効果的ではなく、それ故、複数回の用量の投与が必要である。
−抗原をコードする遺伝子の発現の結果として組換え技術により特に得られた、タンパク質全体またはその抗原性決定基を含む、病原体微生物の抗原性画分に存するワクチン。発現されたタンパク質を患者に投与しても、または、タンパク質をコードする核酸を発現ベクターに挿入し、これを宿主に投与してもよい。しかし、このようなワクチンは、通常、生ワクチンほど効果的ではなく、それ故、複数回量が必要である。
【００１４】
ウイルス、細菌、またはその他を含む病原体に起因する感染から宿主を防御するために、宿主において免疫応答を誘起できるワクチン調製物に適した化合物の設計に適用される原理は、免疫療法による、確立された感染の処置に適した化合物の設計に置き換えられる。しかし、このような化合物の効力は、特に抗ウイルスまたは抗ウイルス様の予防または免疫療法の分野では十分ではないことが判明している。さらに、該化合物の使用には、安全性に関する多くの問題が依然として生じる。
【００１５】
ワクチン成分としての免疫化のためのまたは免疫療法のための、いくつかのレトロウイルスエンベロープタンパク質の使用に観察される１つの欠点は、宿主の免疫応答の有効性を妨害または影響を及ぼす可能性のある、その免疫抑制特性に存する。結果として、これらのタンパク質は、免疫応答を阻害する可能性があるため、その天然形態では患者に投与できない。したがって、偉大なる挑戦とは、これらのタンパク質の抗原性特性および／または宿主細胞感染に関連するその特性を変化させることなく、これらのタンパク質の免疫抑制特性を抑制またはモデュレーションすることである。しかし、エンベロープタンパク質複合体を変異させる試みは、その融合機能および感染機能を非常に変化させ、それ故、免疫応答を発生させる活性本質としてのその対象も非常に変化した（Delamarreら、1997 J.Virol.71(1)、259-266；Rosenbergら、1999、J.Cell.Biol.145、57-68）。
【００１６】
本発明の目的は、該タンパク質の免疫抑制特性の決定基を同定することであり、これには、該免疫抑制タンパク質のその抗原性特性を実質的に保持している、タンパク質、特にウイルスまたはウイルス様タンパク質の免疫抑制特性のモデュレーションに関与するポリペプチド配列およびアミノ酸残基を同定することが含まれる。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、該タンパク質の免疫抑制特性のこのような決定基を同定し、そして、改変された、すなわち、モデュレーションされた免疫抑制特性を有するポリペプチドの設計のためにそれを使用することである。
【００１８】
本発明の別の目的は、抗原性で免疫抑制性のタンパク質から得られたこのようなポリペプチドを提供することであり、該ポリペプチドは、元来のタンパク質の抗原性特性を保持しつつモデュレーションされた免疫抑制特性を特徴としている。
【００１９】
病原生物に対する、特にウイルスに対する効果的な免疫応答、すなわち、細胞性および／または体液性免疫応答を促進するための手段を提供することも本発明の目的であり、これは、免疫系を変化させるリスクが低く、病原生物、特にウイルスによる感染に対して防御的、または、宿主におけるその有害な作用に対して防御的、または、宿主における内因性レトロウイルス発現の有害な結果に対して防御的であるだろう。本発明はまた、ウイルスを含む病原生物に感染した患者の免疫療法による処置に、または、悪性作用を含むその有害な作用の処置に、または、宿主においては通常沈黙している内因性ウイルス発現誘導に関連した病態に罹患した患者の処置に適した手段を提供する。
【００２０】
発明の概要
１つの態様において、本発明は、ポリペプチドでウイルスタンパク質または断片の相同的配列が置き換えられると該ポリペプチドが発現される宿主に対する、ウイルスタンパク質またはその断片の免疫抑制特性をモデュレーションすることができる該ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、以下の最小共通アミノ酸配列：
【表１９】
2008506357.tif 000002
（式中、
Ｘ１およびＸ２は、該免疫抑制特性に影響を及ぼすように選択され、Ｙは、可変アミノ酸残基を示し、３および１は、Ｘ１とＣの間およびＣとＸ２の間の可変アミノ酸残基の数をそれぞれ示す）
を有する。
【００２１】
該最小共通配列は、「免疫抑制モデュレートリー配列（immunosupprssion-modulatory sequence）」と呼ばれる。
【００２２】
１つの実施形態において、免疫抑制モデュレートリー配列を含む、先の定義に該当するペプチドは、ウイルスから得られ、これには、ウイルス様タンパク質から、特にレトロウイルスタンパク質から、特にウイルスもしくはレトロウイルスエンベロープタンパク質から、または、内因性レトロウイルス由来のエンベロープタンパク質から、特にヒト内因性レトロウイルス（ＨＥＲＶ）から得られることも含まれる。
【００２３】
ウイルス（ＥＲＶを含む）の数個のエンベロープタンパク質のアミノ酸配列は、Benitら（J Virol.2001年12月、p.11707-11719）の図３に開示されている。
【００２４】
所定のタンパク質に関する免疫抑制特性に影響を及ぼす特定のアミノ酸残基対が特徴づけられ、これにより、所望の「免疫抑制モデュレートリー」特性を有する配列が同定され、これは、
ａ）タンパク質（この中に以下の配列が存在する）の免疫抑制特性の発生に関与する配列は：
【表２０】
2008506357.tif 000003
を含む
および、ｂ）その中に存在すると免疫抑制タンパク質の免疫抑制特性を変化、例えば低下または抑制する配列は
【表２１】
2008506357.tif 000004
を含む
からなる群より選択できる。
【００２５】
別の態様において、本発明は、所定の抗原性で免疫抑制性のタンパク質から得られたポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２により示されるアミノ酸配列（いわゆる、免疫抑制モデュレートリー配列）を含み、ここで該ポリペプチドにおいて、Ｙは、可変アミノ酸残基を示し、３および１は、Ｘ１とＣの間およびＣとＸ２の間の可変アミノ酸残基Ｙの数をそれぞれ示し、Ｘ１およびＸ２は、該ポリペプチドに、所定の該タンパク質の免疫抑制特性に対して変化した免疫抑制特性を付与するように選択される。
【００２６】
特定の実施形態において、抗原性で免疫抑制性の特性を有するタンパク質は、ウイルス由来の遺伝子、特にレトロウイルス由来のｅｎｖ遺伝子によりコードされている。
【００２７】
このようなタンパク質は、以下の共通配列：Ｅ／Ｑ−Ｇ−Ｇ−Ｌ／Ｔ／Ｉ−Ｃ−Ａ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｖ／Ｉ−Ａを有する免疫抑制配列決定基を含む。Ｘ１（Ｅ／Ｑ）および場合によりＸ２（Ａ）残基が置き換えられている同じタンパク質は、免疫抑制特性は欠失している可能性があるが、その抗原性特性は保持している。改変された免疫抑制モデュレートリー配列の一例は、Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｌ／Ｔ／Ｉ−Ｃ−Ａ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｖ／Ｉ−Ｆであり、これは免疫抑制特性を変化させ、特に、該配列を含む非免疫抑制ポリペプチドを生じることができる。具体的な改変された免疫抑制モデュレートリー配列は、
【表２２】
2008506357.tif 000005
の群より選択される。
【００２８】
特定の実施形態において、該タンパク質はさらに、感染性特性および／または融合性特性を有する。免疫抑制モデュレートリー配列の、例えば、Ｘ１および場合によりＸ２アミノ酸残基の置換による改変は、有利には、これらの一方または両方の補助特性に影響を及ぼさない方法で行なってもよい。
【００２９】
別の態様において、本発明は、このようなポリペプチドまたはこれらのポリペプチドを発現している組換えウイルス粒子を含む組成物に関する。このような組成物または粒子は、それらを注入した宿主における免疫応答の誘出による、ウイルス感染の予防または処置、例えば、その有害作用の予防または処置、あるいは、宿主における内因性ウイルス、特にＨＥＲＶの発現の結果の予防または処置に使用できる。
【００３０】
別の態様において、本発明は、免疫抑制モデュレートリー配列のアミノ酸組成を改変することにより、該タンパク質の免疫抑制特性をモデュレーションする方法に関する。
【００３１】
詳細な説明
本発明は、７〜２０アミノ酸残基の配列を有するポリペプチドでウイルスタンパク質またはその断片の相同的配列が置き換えられると該ポリペプチドが発現される宿主に対する、該ウイルスタンパク質またはその断片の免疫抑制特性をモデュレーションすることができる、該ポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、以下の最小共通アミノ酸配列：
【表２３】
2008506357.tif 000006
（式中、
Ｘ１およびＸ２は、該免疫抑制特性に対して影響を及ぼすように選択され、Ｙは、可変アミノ酸残基を示し、３および１は、それぞれ、Ｘ１とＣおよびＣとＸ２の間の可変アミノ酸残基Ｙの数を示す）
を含む。
【００３２】
本発明の全ての配列において、１文字アミノ酸コードが使用される。ＸおよびＹは、可変アミノ酸残基を示すために使用され、Ｘは、所定のタンパク質の免疫抑制特性に影響を及ぼすように決定された。
【００３３】
Ｙは、様々なポリペプチドに応じて、１つの所定のポリペプチド内で変化し得るアミノ酸残基を示す。「（Ｙ）３」は、３個のアミノ酸残基が、Ｘ１残基とシステイン残基（Ｃ）の間に存在することを示す。３個のアミノ酸残基は異なっていても同じでもよく、互いに独立して選択できる。先の配列中のシステインのような、配列中の特定のアミノ酸残基の指定は、このアミノ酸残基が不変であること、すなわち、該配列中に一定の位置を有することを意味する。
【００３４】
場合により、共通配列はまた、以下：
【表２４】
2008506357.tif 000007
（式中、
Ｘ１はＸ１を示し、Ｘ２はＸ２を示し、Ｙ９〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
のように記載することもできる。本明細書に示したアミノ酸Ｙ９〜Ｙ１２は同一または異なる。
【００３５】
本発明において、「ウイルス」または「ウイルス性」なる表現は、特に断りない限り、外来性もしくは内因性ウイルスの両方またはその成分に適用される。それ故、「ウイルス性タンパク質」は、「ウイルス様タンパク質」も包含し、これはまた、内因性ウイルスの発現産物を記載する場合には、特にＥＲＶ、特にＨＥＲＶとも呼ばれてもよい。
【００３６】
本発明に記載のポリペプチドの先の共通配列は、「免疫抑制モデュレートリー配列」と呼ばれ、これが、７〜２０アミノ酸残基を有するポリペプチドに存在する場合には、このような免疫抑制特性を有するとして、または、配列Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２を有するペプチドモチーフを含むという事実にも関わらずこのような特性が欠失しているとして、同定されたタンパク質の免疫抑制特性をモデュレーションするために該ポリペプチドを使用できることを意味する。
【００３７】
より特定すると、Ｘは、先の共通配列を含むタンパク質の免疫抑制特性のモデュレーションにおいて、個々にまたは一緒に直接的に関与している、両方のアミノ酸残基（Ｘ１およびＸ２）を示す。それらは、７アミノ酸残基を有する最小ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端にそれぞれ位置する。
【００３８】
タンパク質は、宿主により通常は拒絶されるであろう宿主に移植された腫瘍細胞において発現されるこのタンパク質が、それとは反対に、これらの腫瘍細胞の増殖および宿主による免疫拒絶の回避を可能とする場合に、免疫抑制特性を有すると言われる。
【００３９】
タンパク質の免疫抑制活性をアッセイするインビボでの手順は、Mangeney M.およびHeidmann T.、1998 PNASあるいは図５に示されるBlaiseら、2001により使用されているものである。試験すべきタンパク質を発現している野生型または改変核酸を、既知のトランスフェクション法により、ＭＣＡ２０５またはＣｌ８．１細胞株などの腫瘍細胞株にトランスフェクトする。その後、試験すべきタンパク質を発現している腫瘍細胞を、宿主、一般的にはマウスに注入、特に皮下注入する。該注入の後、腫瘍の確立またはその反対のその拒絶を判定し、腫瘍面積を測定する。インビトロでのアッセイも、高用量の合成ペプチドを使用して行なうことができるが、間接的で信頼性が低い。なぜなら、完全な免疫系を有する動物に適用する場合に「免疫抑制」なる表現が妥当であるが、細胞株に適用する場合には妥当ではないからである。
【００４０】
本明細書で使用した「改変核酸」なる表現は、コードされたポリペプチドまたはタンパク質のアミノ酸組成を変化させる、ヌクレオチドの置換、欠失、または挿入などの任意の遺伝子変化を意味する。したがって、アミノ酸配列は、元来のタンパク質に存在する相同的配列を置き換える、すなわち置換することができる。
【００４１】
免疫抑制特性のモデュレーションに関して試験されるタンパク質中の「相同的配列」なる語句は、アッセイのためにそれを置換（すなわち置き換え）した配列とＸ１およびＸ２残基を除いて同じアミノ酸配列を有する配列、すなわちＸ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２を意味し；そのＸ１およびＸ２残基の少なくとも一方およびおそらく両方が、元来の配列中のその対応するアミノ酸残基とは異なるように選択される。したがって、Ｙアミノ酸残基は、改変すべきタンパク質の相同的配列と、先に定義された７〜２０アミノ酸残基を有するポリペプチド配列との間に保存されている。
【００４２】
様々なウイルスに関するこのような相同的配列が、図９に開示されており、Benit L.ら（J.Virol.Vol.75、No.23、2001年12月、p.11709-11719）の図３にいくつかのウイルスの様々なエンベロープのＴＭサブユニットの内容が示されている。
【００４３】
Ｘ１およびＸ２アミノ酸残基は、元来のウイルスタンパク質の免疫抑制特性をモデュレーションするように選択される。本明細書に使用した「モデュレーションする」なる語句は、同条件で試験した場合の、元来の（すなわち非改変）タンパク質の免疫抑制活性に対して、改変タンパク質の免疫抑制活性の上昇または低下を意味する。
【００４４】
本発明は、特に、元来の免疫抑制タンパク質に対して、改変タンパク質の免疫抑制特性を低下させることのできる「免疫抑制モデュレートリー配列」に関する。モデュレーションは、好ましくは有意であり、これは、宿主の免疫応答が検出可能となり、有利には、病原体物質を排除するに十分となるか、あるいは、宿主における該病原体による感染の有害な結果、または、宿主における内因性ウイルス、特に正常なサイレントＥＲＶ、特にＨＥＲＶの発現の有害な結果を停止、安定化、もしくは逆転させるに十分となることを意味する。
【００４５】
特定の実施形態において、モデュレーションにより、元来のタンパク質の免疫抑制特性が低下する。
【００４６】
特定の実施形態において、それは、改変タンパク質、すなわち得られたタンパク質の免疫抑制特性は、元来タンパク質の免疫抑制特性に対して少なくとも２倍低下することに相当する。
【００４７】
７〜２０アミノ酸残基を有し、配列Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２を含む本発明の先に定義されたポリペプチドは、Ｘ１および／またはＸ２が、タンパク質の免疫抑制特性をモデュレーションするように選択されたものであり、したがって：
本発明の特定の実施形態において、Ｘ１は、アルカリ性アミノ酸残基であり、Ｘ２は芳香族残基であるか、あるいはその逆である。
【００４８】
本明細書で示した「アルカリ性」は、塩基性アミノ酸に関する。
【００４９】
本発明の別の特定の実施形態において、Ｘ１は、アルカリ性残基であるか、またはＸ２は芳香族残基であり、あるいはその逆である。
【００５０】
本発明者らは、免疫抑制タンパク質に対するＸ１およびＸ２のモデュレーション効果は、元来の免疫抑制タンパク質中のＸ１またはＸ２残基の一方のみが改変された場合には、より低いことを観察した。
【００５１】
それ故、免疫抑制モデュレートリー配列中のＸ１およびＸ２の両方の改変が有利と捉えられることができる。
【００５２】
本発明の別の特定の実施形態において、Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２として示されるアミノ酸配列中に位置するＸ１またはＸ２残基は、以下のように選択される：
ここで、Ｘ１は、Ｒ、Ｈ、およびＫから選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＨから選択されるか、あるいは、Ｘ１は、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＨから選択され、Ｘ２は、Ｒ、Ｈ、およびＫから選択される。
【００５３】
本発明のさらなる実施形態において、Ｘ１は、Ｒ、Ｈ、またはＫであり、Ｘ２は、Ｆであるか、あるいはその逆である。
【００５４】
本発明のさらなる実施形態において、Ｘ１はＲであり、Ｘ２は、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＨである。
【００５５】
本発明の別のさらなる実施形態において、Ｘ１およびＸ２は、以下からなる群より選択される：
ａ．Ｘ１は、Ｅ、Ｋ、またはＱであり、Ｘ２はＡである
ｂ．Ｘ１はＷであり、Ｘ２はＩまたはＶである
ｃ．Ｘ１はＲであり、Ｘ２はＦである
ｄ．Ｘ１はＫであり、Ｘ２はＦである。
【００５６】
本発明者らは、ウイルスエンベロープタンパク質の免疫抑制特性のモデュレーションに対する、免疫抑制モデュレートリー配列中の、特定のＸ１およびＸ２残基の効果を同定した。
【００５７】
本発明者らの観察により、Ｘ１がグルタミン酸（Ｅ）またはグルタミン（Ｑ）であり、Ｘ２がアラニン（Ａ）である可能性がある場合、本発明の共通配列を含む得られるウイルスエンベロープタンパク質は、免疫抑制特性を有すると考えることができる。逆に、Ｘ１がアルギニン（Ｒ）であり、Ｘ２がフェニルアラニン（Ｆ）である場合、本発明の共通配列を含む得られるウイルスエンベロープタンパク質は、免疫抑制特性が低いか、または全く有さない。興味深いことに、ファンデルワールス相互作用がＥ／Ａ対で疑われる場合、アルギニンの正に荷電した側鎖とフェニルアラニンのパイ電子（陰極）の間のＲ／Ｆ対に静電気相互作用が起こる可能性がある。
【００５８】
したがって、本発明の特定の実施形態において、７〜２０アミノ酸残基を有するポリペプチドは、タンパク質に低い免疫抑制特性を付与するかまたは全く付与しないに適した免疫抑制モデュレートリー配列Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２を有し、ここでのＸ１はＲであり、および／またはＸ２はＦである。
【００５９】
別の実施形態において、タンパク質に低い免疫抑制特性を付与するかまたは全く付与しないようにするために、Ｘ１はＫであり、Ｘ２はＦである。特に、このようなタンパク質は、低い免疫抑制特性を有する。
【００６０】
免疫抑制特性は、先に定義され実施例に示される試験でアッセイされることが想起される。
【００６１】
共通配列Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２は、ウイルスタンパク質、特にウイルスエンベロープタンパク質において同定することができる。具体的なエンベロープタンパク質は、２個のサブユニット（ＳＵおよびＴＭサブユニット）を含むレトロウイルスのものである。このような共通配列は、ＭｏＭＬＶ、フレンドレトロウイルス、ＦｅＬＶ、ＨＴＶＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、ＳＴＬＶ−１、ＧＬＶ−Ｘ、ポックスウイルス、ＭＰＭＶ、またはＳＳＡＶ、またはエボラもしくはマールブルグウイルス、または内因性レトロウイルス、例えばＦＲＤ、ＰｙＥＲＶ、ＰＥＲＶ、もしくはＨＥＲＶ−Ｔに見出される。
【００６２】
様々なタンパク質においてこのように同定されたＹアミノ酸残基は、Ｅ／Ｑ−Ｇ−Ｇ−Ｌ／Ｔ／Ｉ−Ｃ−Ａ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｖ／Ｉ−ＡまたはＲ−Ｇ−Ｇ−Ｌ／Ｔ／Ｉ−Ｃ−Ａ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｖ／Ｉ−Ｆなどの本発明の特定の配列を決定することを可能とする。「／」は、この配列の位置が、提供される指示にしたがって、いくつかの種類のアミノ酸残基を受け入れることを示す。
【００６３】
それ故、本発明の先に定義されたポリペプチドは、特定の実施形態において、
【表２５】
2008506357.tif 000008
（ここで、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、免疫抑制特性を与える）、あるいは
【表２６】
2008506357.tif 000009
（ここで、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、低い免疫抑制特性を与えるか、または全く与えない）
からなる群より選択できる最小配列を含む。
【００６４】
より特定すると、本発明の先に定義されたポリペプチドは、別の実施形態において、
【表２７】
2008506357.tif 000010
（ここで、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、免疫抑制特性を与える）、あるいは
【表２８】
2008506357.tif 000011
（ここで、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、低い免疫抑制特性を与える）、あるいは
【表２９】
2008506357.tif 000012
（ここで、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、実質的に全く免疫抑制特性を与えない）
からなる群より選択できる最小配列を含む。
【００６５】
本明細書で意図する「低い免疫抑制特性」は、それを含むタンパク質に、配列番号１７〜２２により示されるポリペプチドよりも低い免疫抑制特性を与えるが、それを含むタンパク質に、配列番号２３〜２７〜３２により示されるポリペプチドよりも高い免疫抑制特性を与えるポリペプチドに関する。特に、低い免疫抑制特性を与えるポリペプチドを含むタンパク質は、例えば配列番号１１８により示されるようなＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶ  Ｒ３９３Ｑ  Ｆ３９９Ａ二重変異体よりも免疫抑制の程度が低い。より特定すると、低い免疫抑制特性を与えるポリペプチドを含むタンパク質の免疫抑制指数は正であるが、該ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶ  Ｒ３９３Ｑ  Ｆ３９９Ａ二重変異体の免疫抑制指数よりも低く、好ましくは、該ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶ  Ｒ３９３Ｑ  Ｆ３９９Ａ二重変異体の免疫抑制指数の５０％未満である。
【００６６】
本発明の全てのポリペプチドが、宿主細胞、特に原核細胞または真核細胞において該ポリペプチドの発現を可能とするあらゆる既知の方法により得ることのできる核酸によりコードされている。例として、核酸は、適切なプローブおよび増幅技術を使用して、ウイルスを発現している試料から単離できる。それらはまた、化学合成しても、既存のプラスミドまたは本発明のプラスミドから酵素による消化により得てもよい。
【００６７】
さらに、本発明のポリペプチドはまた、十分に確立された手順にしたがって、化学合成しても、または、半合成してもよい。
【００６８】
特定の２０アミノ酸ポリペプチドは、以下の共通配列：
【表３０】
2008506357.tif 000013
を有する。
【００６９】
先に説明したように、Ｘ１およびＸ２は、該ポリペプチドが挿入されている、試験される、すなわち元来のウイルス免疫抑制タンパク質の免疫抑制特性に影響を及ぼすように選択され（先に定義された相同配列中のＸ１およびＸ２残基の置換を含む）、ここで、Ｙは、可変アミノ酸残基を示し、３および１は、それぞれ、Ｘ１とＣおよびＣとＸ２の間の可変アミノ酸Ｙ残基の数を示し、１３は、該ポリペプチドのＮ末端部分のアミノ酸残基の数を示す。配列中のＹ残基は、独立して、同じであっても異なっていてもよい。
【００７０】
様々なタンパク質配列中の不変アミノ酸残基の同定により、特定の配列：（Ｙ）２−Ｎ−（Ｙ）３−Ｌ−（Ｙ）２−Ｌ−（Ｙ）３−Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２、すなわち、Ｎ末端からＣ末端の順に、２個の可変アミノ酸残基、アスパラギン（Ｎ）、３個の可変アミノ酸残基、ロイシン（Ｌ）、２個の可変アミノ酸残基、ロイシン（Ｌ）、３個の可変アミノ酸残基、Ｘ１残基、３個の可変アミノ酸残基、システイン（Ｃ）、１個の可変アミノ酸残基、およびＸ２残基の画定が可能となる。
【００７１】
場合により、先の共通配列は、以下：
Ｙ１３Ｙ１４ＮＹ１Ｙ２Ｙ３ＬＹ４Ｙ５ＬＹ６Ｙ７Ｙ８Ｘ１Ｙ９Ｙ１０Ｙ１１ＣＹ１２Ｘ２
（式中、
Ｘ１およびＸ２は、それぞれ、Ｘ１およびＸ２に同一であり、Ｙ１〜Ｙ１４は、任意のアミノ酸を示す）
のように記載できる。本明細書で示されるアミノ酸Ｙ１〜Ｙ１４は、同じであっても異なっていてもよい。
【００７２】
先に開示された試験において、ウイルス免疫抑制タンパク質の免疫抑制特性をモデュレーションする能力を呈する特定のアミノ酸配列は、
【表３１】
2008506357.tif 000014
（ここで、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、免疫抑制特性を与える）、あるいは
【表３２】
2008506357.tif 000015
（ここで、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、低い免疫抑制特性を与えるか、または全く与えない）
からなる群より選択できる。
【００７３】
好ましい実施形態によれば、先に開示された試験において、ウイルス免疫抑制タンパク質の免疫抑制特性をモデュレーションする能力を呈する特定のアミノ酸配列は、
【表３３】
2008506357.tif 000016
（ここで、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、免疫抑制特性を与える）、あるいは
【表３４】
2008506357.tif 000017
（ここで、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、低い免疫抑制特性を与える）、あるいは
【表３５】
2008506357.tif 000018
（ここで、これらの免疫抑制モデュレートリー配列は、それらを含むタンパク質に、実質的に全く免疫抑制特性を与えない）
からなる群より選択できる。
【００７４】
本発明はまた、野生型ＥＮＶタンパク質に対して、改変された免疫抑制活性を有する変異ＥＮＶタンパク質を製造するための、以下の配列：
【表３６】
2008506357.tif 000019
（ここで、
変異すべき第一アミノ酸はＸ１であり、変異すべき第二アミノ酸はＸ２であり、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む、野生型ウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質における、第一アミノ酸の第一変異および場合により第二アミノ酸の第二変異の使用に関する。
【００７５】
「野生型ウイルスエンベロープタンパク質」なる表現は、アミノ酸Ｘ１が変異していないエンベロープタンパク質に関する。特に、他の変異または改変がエンベロープタンパク質になされたものも除外されない。
【００７６】
「実質的に含む」なる表現は、先の配列中の４個の一定のアミノ酸（太文字で示される）の少なくとも２個が、該野生型ウイルスエンベロープに存在することを意味する。エンベロープ配列中のＸ１およびＸ２の位置を明確に決定するには、２個のアミノ酸で十分である。有利には、先の配列は、通常、膜貫通（ＴＭ）サブユニット、より特定するとＴＭサブユニットのエクトドメインに局在する。
【００７７】
本明細書で意図するアミノ酸Ｙ１〜Ｙ１２は、互いに独立して、異なるかまたは同じである。
【００７８】
本明細書で意図する変異ＥＮＶタンパク質は、実質的に、以下の配列：
【表３７】
2008506357.tif 000020
（式中、Ｘ’１は、変異Ｘ１に相当し、Ｘ’２は変異Ｘ２に相当する）
を有する。
【００７９】
「改変された免疫抑制活性」なる表現は、変異ＥＮＶタンパク質が、対応する野生型ＥＮＶタンパク質に対して、低下または上昇した免疫抑制活性を有することを意味する。特に、変異ＥＮＶタンパク質は、実質的に、あらゆる残留の免疫抑制活性がなくなっていてもよい。別の場合において、変異ＥＮＶタンパク質は免疫抑制活性を有する可能性があるが、一方、対応する野生型ＥＮＶタンパク質は、実質的に免疫抑制活性がない。免疫抑制活性は、例えば、免疫抑制指数法を使用することにより、前記および実施例に記載のように測定することができる。
【００８０】
有利には、改変された免疫抑制活性を有する変異ＥＮＶタンパク質は、多くの適用、特に治療適用を有し、これは本明細書で以後に記載されている。
【００８１】
先に定義した使用の好ましい実施形態において、変異ＥＮＶタンパク質の抗原性に関与する構造は、実質的に保存されている。
【００８２】
本明細書で意図する「抗原性に関与する構造」なる表現は、抗体、または免疫細胞、特にＴ細胞の膜受容体などの免疫系の成分と相互作用しやすいタンパク質の構造に関する。
【００８３】
本発明によれば、変異ＥＮＶタンパク質におけるこれらの構造の少なくとも１個以上が、対応する野生型ＥＮＶタンパク質と同じコンフォメーションを提示する。有利には、これは、変異ＥＮＶタンパク質に対して誘起される免疫反応はまた、対応する野生型ＥＮＶタンパク質に対しても指向されるであろうことを意味する。
【００８４】
好ましい実施形態によれば、本発明はまた、野生型ＥＮＶタンパク質に対して低下した免疫抑制活性を有する変異ＥＮＶタンパク質を製造するための、以下の配列：
【表３８】
2008506357.tif 000021
（式中、
変異すべき第一アミノ酸はＸ１であり、変異すべき第二アミノ酸はＸ２であり、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む野生型ウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質における、第一アミノ酸の第一の変異および場合により第二アミノ酸の第二の変異の先に定義した使用にも関する。
【００８５】
最も好ましい実施形態において、免疫抑制活性の低下は、変異ＥＮＶタンパク質において殆ど残留活性が認められない程度である。
【００８６】
好ましい実施形態によれば、本発明はまた、野生型ＥＮＶタンパク質に対して低下した免疫抑制活性を有する変異ＥＮＶタンパク質を製造するための、以下の配列：
【表３９】
2008506357.tif 000022
（式中、
変異すべき第一アミノ酸はＸ１であり、変異すべき第二アミノ酸はＸ２であり、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む野生型ウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質における、第一アミノ酸の第一の変異および第二のアミノ酸の第二の変異の先に定義した使用に関する。
【００８７】
対応する野生型ＥＮＶに対して変異ＥＮＶタンパク質の免疫抑制活性を改変するのに、Ｘ１のみの変異で十分である。しかし、変異ＥＮＶタンパク質の構造は、実質的に、対応する野生型ＥＮＶタンパク質に対して確実に保存されているので、Ｘ２も変異させることが有利である。
【００８８】
先に定義した使用の好ましい実施形態において、該変異は置換である。
【００８９】
先に定義した使用の別の好ましい実施形態において、Ｘ１は、ＲまたはＨにより置換されている。
【００９０】
先に定義した使用の別の好ましい実施形態において、Ｘ２は、Ｆ、Ｍ、Ｙ、またはＷにより置換されている。
【００９１】
先に定義した使用のさらなる好ましい実施形態において、Ｘ１は、Ｅ、Ｋ、またはＱであり、ＲまたはＨにより置換されている。
【００９２】
先に定義した使用のさらなる好ましい実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＨＥＲＶ−Ｈ  ＥＮＶであり、Ｘ１はＫである。
【００９３】
先の定義した使用のさらなる好ましい実施形態において、Ｘ２は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＫであり、Ｆ、Ｍ、Ｙ、またはＷにより置換されている。
【００９４】
先に定義した使用の特に好ましい実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＨＥＲＶ  ＥＮＶであり、特に、
ＨＥＲＶ−ＦＲＤ  ＥＮＶ（配列番号８２）（ここで、Ｘ１はＱ４２７であり、Ｘ２はＡ４３３である）、または
ＨＥＲＶ−Ｔ  ＥＮＶ（配列番号８４）（ここで、Ｘ１はＱ５１６であり、Ｘ２はＡ５２２である）、または
ＨＥＲＶ−Ｒ  ＥＮＶ（配列番号８６）（ここで、Ｘ１はＥ５６１であり、Ｘ２はＫ５６７である）、または
ＨＥＲＶ−Ｖ  ＥＮＶ（配列番号８８）（ここで、Ｘ１はＱ３８１であり、Ｘ２はＶ３８７である）、または
ＨＥＲＶ−Ｒ（ｂ）ＥＮＶ（配列番号９０）（ここで、Ｘ１はＥ３９１であり、Ｘ２はＬ３９７である）
から選択される。
【００９５】
ＨＥＲＶは、以前に記載されたヒト内因性レトロウイルスに関する。ＨＥＲＶ  ＥＮＶタンパク質は、癌細胞において発現されることが判明している。先に列挙したＨＥＲＶ  ＥＮＶは免疫抑制活性を提示し、それらを有する癌細胞が、免疫応答を回避するのを手助けする可能性がある。これらのＨＥＲＶは当業者には公知であり、特に、Benitら、J.Virol.2001、75:11709-11719に考察されている。以後に明らかとなるように、免疫抑制活性の低下したＨＥＲＶ  ＥＮＶタンパク質は、癌細胞により発現される野生型ＥＮＶタンパク質の活性を阻害するワクチンの調製に有利である。
【００９６】
先に定義した使用の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質はＨＥＲＶ−ＦＲＤ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１２０、
配列番号１２２
から選択される。配列番号１２０は、変異Ｑ４２７Ｒを有する。配列番号１２２は、変異Ｑ４２７Ｒ＋Ａ４３３Ｆを有する。配列番号１２０または１２２により示される変異ＨＥＲＶ−ＦＲＥ  ＥＮＶは、対応する野生型ＨＥＲＶ−ＦＲＤ  ＥＮＶに対して、低下した免疫抑制活性を提示する。
【００９７】
先に定義した使用の別の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質はＨＥＲＶ−Ｖ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１２４、
配列番号１２６
から選択される。配列番号１２４は、変異Ｑ３８１Ｒを有する。配列番号１２６は、変異Ｑ３８１Ｒ＋Ｖ３８７Ｆを有する。
【００９８】
配列番号１２４または１２６により示される変異ＨＥＲＶ−Ｖ  ＥＮＶは、対応する野生型ＨＥＲＶ−Ｖ  ＥＮＶに対して、低下した免疫抑制活性を提示する。
【００９９】
先に定義した使用の別の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質はＨＥＲＶ−Ｔ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１２８、
配列番号１３０
から選択される。配列番号１２８は、変異Ｑ５１６Ｒを有する。配列番号１３０は、変異Ｑ５１６Ｒ＋Ａ５２２Ｆを有する。
【０１００】
配列番号１２８または１３０により示される変異ＨＥＲＶ−Ｔ  ＥＮＶは、対応する野生型ＨＥＲＶ−Ｔ  ＥＮＶに対して、低下した免疫抑制活性を提示する。
【０１０１】
先に定義した使用の別の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質はＨＥＲＶ−Ｒ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１４６、
配列番号１４８
から選択される。配列番号１４６は、変異Ｅ５６１Ｒを有する。配列番号１４８は、変異Ｅ５６１Ｒ＋Ｋ５６７Ｆを有する。
【０１０２】
配列番号１２８または１３０により示される変異ＨＥＲＶ−Ｒ  ＥＮＶは、対応する野生型ＨＥＲＶ−Ｒ  ＥＮＶに対して、低下した免疫抑制活性を提示する。
【０１０３】
先に定義した使用の別の特に好ましい実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、
ＨＴＬＶ−１ＥＮＶ（配列番号９２）（ここで、Ｘ１はＱ３８９であり、Ｘ２はＡ３９５である）、または
ＨＴＬＶ−２ＥＮＶ（配列番号９４）（ここで、Ｘ１はＱ３８５であり、Ｘ２はＡ３９１である）、または
ＦｅＬＶ  ＥＮＶ（配列番号９６）（ここで、Ｘ１はＥ５２７であり、Ｘ２はＡ５３３である）、または
ＰＥＲＶ  ＥＮＶ（配列番号９８）（ここで、Ｘ１はＥ５４５であり、Ｘ２はＡ５５１である）、または
ＳＴＬＶ−１ＥＮＶ（配列番号１００）（ここで、Ｘ１はＱ３８９であり、Ｘ２はＡ３９５である）、または
ＭｏＭＬＶ  ＥＮＶ（配列番号７０）（ここで、Ｘ１はＥ５５１であり、Ｘ２はＡ５５７である）、または
ＭＰＭＶ  ＥＮＶ（配列番号７２）（ここで、Ｘ１はＱ４７１であり、Ｘ２はＡ４７７である）、または
ＦＶ  ＥＮＶ（配列番号１０２）（ここで、Ｘ１はＥ５６１であり、Ｘ２はＡ５６７である）
から選択される。
【０１０４】
ＨＴＬＶ−１および２は、ヒトＴ細胞白血病ウイルス１型および２型に関する。
ＦｅＬＶは、ネコ白血病ウイルスに関する。
ＰＥＲＶは、ブタ内因性レトロウイルスに関する。
ＳＴＬＶ−１は、サルＴ細胞白血病ウイルス１型に関する。
ＭｏＭＬＶは、モロニーネズミ白血病ウイルスに関する。
ＭＰＭＶは、Mason-Pfizerサルウイルスに関する。
ＦＶは、マウスフレンドウイルスに関する。
【０１０５】
これらのウイルスは、当業者には公知であり、Benitら、J.Virol.2001、75:11709-11719に特に記載されている。これらのウイルスの増殖は、ウイルスが免疫応答を回避するのを手助けする免疫抑制ＥＮＶタンパク質の存在により特に促進される。以後に明らかとなるように、免疫抑制活性の低下したウイルスＥＮＶタンパク質は、ウイルスにより発現される野生型ＥＮＶタンパク質の活性を阻害するのに有利である。
【０１０６】
先に定義した使用の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質はＦｅＬＶ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１０４、
配列番号１０６
から選択される。配列番号１０４は、変異Ｅ５２７Ｒを有する。配列番号１０６は、変異Ｅ５２７Ｒ＋Ａ５３３Ｆを有する。
【０１０７】
配列番号１０４または１０６により示される変異ＦｅＬＶ  ＥＮＶは、対応する野生型ＦｅＬＶ  ＥＮＶに対して低下した免疫抑制活性を提示する。
【０１０８】
先に定義した使用の別の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質はＨＴＬＶ−１ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１０８、
配列番号１１０
から選択される。配列番号１０８は、変異Ｑ３８９Ｒを有する。配列番号１１０は、変異Ｑ３８９Ｒ＋Ａ３９５Ｆを有する。
【０１０９】
配列番号１０８または１１０により示される変異ＨＴＬＶ−１ＥＮＶは、対応する野生型ＨＴＬＶ−１ＥＮＶに対して低下した免疫抑制活性を提示する。
【０１１０】
先に定義した使用の別の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質はＨＴＬＶ−２ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１１２、
配列番号１１４
から選択される。配列番号１１２は、変異Ｑ３８５Ｒを有する。配列番号１１４は、Ｑ３８５Ｒ＋Ａ３９１Ｆを有する。
【０１１１】
配列番号１１２または１１４により示される変異ＨＴＬＶ−２ＥＮＶは、対応する野生型ＨＴＬＶ−２ＥＮＶに対して低下した免疫抑制活性を提示する。
【０１１２】
先に定義した使用の別の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質はＰＥＲＶ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１５０、
配列番号１５２
から選択される。配列番号１５０は、変異Ｅ５４５Ｒを有する。配列番号１５２は、変異Ｅ５４５Ｒ＋Ａ５５１Ｆを有する。
【０１１３】
配列番号１５０または１５２により示される変異ＰＥＲＶ  ＥＮＶは、対応する野生型ＰＥＲＶに対して低下した免疫抑制活性を提示する。
【０１１４】
本発明はまた、野生型ＥＮＶタンパク質に対して上昇した免疫抑制活性を有する変異ＥＮＶタンパク質を製造するための、以下の配列：
【表４０】
2008506357.tif 000023
（式中、
変異すべき第一アミノ酸はＸ１であり、変異すべき第二アミノ酸はＸ２であり、Ｙ１〜Ｙ１２は任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む野生型ウイルスエンベロープ（ＥＮＶ）タンパク質における第一アミノ酸の第一の変異および場合により第二アミノ酸の第二の変異の先の使用に関する。
【０１１５】
対応する野生型ＥＮＶに対して変異ＥＮＶタンパク質の免疫抑制活性を上昇させるのに、Ｘ１のみの変異で十分である。しかし、変異ＥＮＶタンパク質の構造は、対応する野生型ＥＮＶタンパク質に対して実質的に確実に保存されているので、Ｘ２も変異させることが有利である。
【０１１６】
有利には、本発明によれば、免疫抑制活性を有する変異ＥＮＶタンパク質（対応する野生型ＥＮＶタンパク質は実質的にそのような活性はない）を得ることが可能である。このような免疫抑制活性の上昇した変異ＥＮＶタンパク質は、例えば移植片拒絶または自己免疫疾患などにおいて、免疫系を阻害するのに有用である。
【０１１７】
免疫抑制活性の上昇した変異ＥＮＶタンパク質の製造のための先に述べた使用の好ましい実施形態において、該変異は置換である。
【０１１８】
免疫抑制活性の上昇した変異ＥＮＶタンパク質を製造するための先に述べた使用の別の好ましい実施形態において、Ｘ１は、Ｅ、Ｋ、またはＱにより置換され、Ｘ２はＡにより置換されている。
【０１１９】
免疫抑制活性の上昇した変異ＥＮＶタンパク質を製造するための先に述べた使用の別の好ましい実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、配列番号７４により示されるようなＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶであり、該変異ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶの配列は、好ましくは、
配列番号１１６、
配列番号１１８
から選択される。配列番号１１６は、変異Ｒ３９３Ｅ／Ｑを有する。配列番号１１８は、変異Ｒ３９３Ｅ／Ｑ＋Ｆ３９９Ａを有する。
【０１２０】
配列番号１１６または１１８により示される変異ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶは、免疫抑制活性が実質的にない対応する野生型ＨＥＲＶ−Ｗに対して上昇した免疫抑制活性を提示する。
【０１２１】
本発明はまた、所定の抗原性で免疫抑制性のタンパク質から得られるポリペプチドを提供し、該ポリペプチドは、Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２により示されるアミノ酸配列（いわゆる「免疫抑制モデュレートリー配列」）を含み、ここで該ポリペプチド中のＹは、可変アミノ酸残基を示し、３および１は、それぞれＸ１とＣおよびＣとＸ２の間の可変アミノ酸Ｙ残基の数を示し、Ｘ１およびＸ２は、該ポリペプチドに、所定の該ポリペプチドの免疫抑制特性に対して変化した免疫抑制特性を付与するように選択される。
【０１２２】
本明細書で使用した「得られた」なる語句は、ポリペプチド中のアミノ酸配列、特に免疫抑制モデュレートリー配列が、所定のタンパク質の配列に対して改変されていることを示す。したがって、「所定の」該タンパク質は、その免疫抑制特性をモデュレーションするために改変が必要とされる元来のタンパク質である。本発明に記載のポリペプチドは、１個または数個のアミノ酸残基または配列の置換、欠失、付加、組換え、または挿入により所定のタンパク質から生物学的または化学的に得ることができ、ただし、本発明の共通配列は、Ｘ１およびＸ２が出発点の所定のタンパク質の免疫抑制特性をモデュレーションするように選択されたものであり、それ故、Ｘ１および／またはＸ２は、所定の該免疫抑制タンパク質中のその元来の対応する残基に対して置換により変異している。配列の挿入の場合、免疫抑制モデュレートリー配列は、所定のタンパク質に存在する相同配列を置き換えても、あるいは、挿入配列と同じ免疫抑制特性のモデュレーション機能に関与していることが知られているかまたは関与していそうである配列を置き換えても、あるいは、出発点のアミノ酸配列内に挿入されてもよい。全ての場合において、挿入部位（ポリペプチドのＣ末端部分）後のアミノ酸配列のオープンリーディングフレームは保存されている。
【０１２３】
明らかに、本発明は、本発明のポリペプチドを得るために、所定の該タンパク質を実際に出発点としてもまたは出発点とせずに行なってもよい。したがって、所定の該タンパク質は、生物学的または化学的観点から必要な出発物質ではなく、得られるポリペプチドの設計のための参照物質である。
【０１２４】
本発明の特定の実施形態において、得られたポリペプチドは、所定の出発点の該ポリペプチドよりも低い免疫抑制特性を有し、有利には、実質的に該免疫抑制特性を欠失しており、例えば、免疫抑制特性を全く有していない。
【０１２５】
本発明を通じて「ポリペプチド」および「タンパク質」なる表現は、アミノ酸配列を含む任意の長さ（本記載において特に断りない限り）の分子を定義する。
【０１２６】
特定の実施形態において、該ポリペプチドまたはタンパク質は、多量体、特に三量体である。
【０１２７】
本明細書で使用した「所定の」は、出発点のタンパク質（これから本発明のポリペプチドが設計される、すなわち、モデュレーションされた免疫抑制特性を有するように誘導される）を意味する。このタンパク質は、野生型タンパク質（例えば、ウイルス、特にレトロウイルス株から単離）でも、または以前に改変されたタンパク質（例えば宿主においてベクターから発現）であってもよい。このようなタンパク質は、抗原性および免疫抑制特性を有するものの中から選択される。
【０１２８】
所定のタンパク質は、先に定義された免疫抑制特性を有し：この所定のタンパク質が、移植宿主により通常は拒絶される腫瘍細胞において発現されると、これらの腫瘍細胞の増殖が可能となり、免疫拒絶を回避することが可能となる。
【０１２９】
第二に、それは抗原性タンパク質であり、すなわち、それが投与された宿主において形成される抗体により認識されることができる。有利には、適切な既知の条件でそれが投与された宿主において免疫応答を誘導することができ、したがって、該抗原性タンパク質は、有利には、免疫原性タンパク質である。これは、該宿主が、該タンパク質のエピトープに対する抗体を産生することに関与する。
【０１３０】
該タンパク質のこれらの所望の特性が抗原性、特に免疫原性であるという点から、そして、得られるポリペプチドに必要とされる特性が、これらの抗原性、特に免疫原性特性を実質的に保持しているということである点から、本発明のポリペプチドを得るために使用される所定のタンパク質は、天然もしくは天然に存在するタンパク質または抗原性、特に免疫原性のその断片を包含し、ただし、該断片は、さらに、免疫抑制特性を有する。それはまた、天然または天然に存在するタンパク質に対して改変されたタンパク質を包含し、ただし、改変されたタンパク質は、抗原性および免疫抑制特性を有する。
【０１３１】
本発明のポリペプチドを得るために参照として使用される所定のタンパク質は、ウイルスタンパク質、すなわち、ウイルスのような感染性物質の核酸によりコードされるウイルスタンパク質であっても、または内因性レトロウイルス、特にＨＥＲＶのウイルス起源の核酸によりコードされるタンパク質であってもよい。特定のタンパク質は、ウイルスの亜クラスであるレトロウイルスを起源とするタンパク質である。特定の実施形態において、所定のタンパク質は、エンベロープタンパク質、すなわちｅｎｖ遺伝子の発現産物である。
【０１３２】
本明細書で使用した「核酸」は、ゲノムＤＮＡコード配列、相補的ＤＮＡコード配列などの細胞性核酸を含む、ＤＮＡまたはＲＮＡ形態のウイルス核酸を意味する。本出願に引用される全ての核酸は、一本鎖でも二本鎖でもよい。
【０１３３】
Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２モチーフのＸ１およびＸ２アミノ酸残基は、先に記載したように選択される。
【０１３４】
抗原性および免疫原性タンパク質から得られ、配列Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２を含む、本発明の先に定義されたポリペプチドは、以下のように定義できる：
本発明の特定の実施形態において、Ｘ１はアルカリ性アミノ酸残基であり、Ｘ２は、芳香族残基であり、あるいはその逆である。
【０１３５】
本発明の別の特定の実施形態において、Ｘ１はアルカリ性残基であるか、またはＸ２は芳香族残基であるか、あるいはその逆である。
【０１３６】
本発明者らは、タンパク質の免疫抑制特性に対するＸ１およびＸ２のモデュレーション効果は、通常、元来の免疫抑制タンパク質中のＸ１またはＸ２残基の一方のみを改変した場合、より低いことを観察した。
【０１３７】
それ故、免疫抑制モデュレートリー配列中のＸ１およびＸ２の両方の改変を有利と捉えることができる。
【０１３８】
本発明の別の特定の実施形態において、Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２として示されるアミノ酸配列中に位置するＸ１またはＸ２残基は、以下のように選択される：
ここで、Ｘ１は、Ｒ、Ｈ、またはＫから選択され、Ｘ２は、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＨから選択されるか、あるいは、Ｘ１は、Ｆ、Ｗ、Ｙ、およびＨから選択され、Ｘ２は、Ｒ、Ｈ、およびＫから選択される。
【０１３９】
本発明のさらなる実施形態において、Ｘ１は、Ｒ、Ｈ、またはＫであり、Ｘ２は、Ｆであるか、あるいはその逆である。
【０１４０】
本発明のさらなる実施形態において、Ｘ１はＲであり、Ｘ２は、Ｆ、Ｗ、Ｙ、またはＨである。
【０１４１】
本発明者らは、特に、抗原性で免疫抑制性のタンパク質から得られるポリペプチドが、特定の興味深いＸ１およびＸ２残基がそれぞれＲとＦまたはＫとＦである場合、該ポリペプチドが由来するタンパク質の免疫抑制特性に対して変化した免疫抑制特性を有することを同定した。
【０１４２】
所定のタンパク質は、有利には、抗原性および免疫抑制特性を有する、ウイルスタンパク質、特にレトロウイルスタンパク質またはウイルス起源のタンパク質（例えばＨＥＲＶの１つ）であってもよい。
【０１４３】
したがって、既知の天然に存在する免疫抑制特性の低いまたは全くないＨＥＲＶ−Ｗ、Ｈ１、Ｆ（ｃ）１、またはＦ（ｃ）２のエンベロープタンパク質は、本発明の目的ではない。
【０１４４】
本発明の特定の実施形態において、抗原性タンパク質から得られたポリペプチドは、その抗原性特性を保持しつつ、変化した免疫抑制特性、特に低下した免疫抑制特性を有する。
【０１４５】
別の特定の実施形態において、これらのタンパク質は、さらに、抗原性および免疫抑制特性、感染性特性および／または融合性特性を有する。
【０１４６】
所定の出発点のタンパク質がさらに、ウイルスエンベロープタンパク質で同定された特性のような、融合性特性および感染性特性を有する場合、これらの一方または両方の特性を、得られたポリペプチドにおいて保持できるが、必要ではない。
【０１４７】
元来の所定のタンパク質のこれらの特性が、本発明の得られたポリペプチドにおいて維持されているかどうかを判定するための、融合性特性および／または感染性特性の評価または測定は、得られたポリペプチドが、実質的に、元来の所定のタンパク質の構造、特に抗原性構造、例えば免疫原性決定基を保持しているかどうかに関する有用な指標を提供できる。
【０１４８】
タンパク質は、該タンパク質をコードする核酸でトランスフェクトされた細胞が、同じタンパク質をおそらく発現していない他の細胞と合胞体（多核細胞）を形成できる場合、融合性特性を有していると言われる。実際に、融合性特性を有するタンパク質の強力な発現は、融合事象に関与する該タンパク質の受容体の発現を遮断することが疑われる。それ故、融合能は、融合性特性を有する該タンパク質を発現している細胞と、その受容体を発現している細胞との間の合胞体の形成により画定できる。細胞は、リン酸カルシウム沈降法またはリポフェクタミン（登録商標）などのリポソームを用いるなどの、様々な既知の方法によりトランスフェクトすることができる。
【０１４９】
タンパク質は、このタンパク質で覆膜された偽型が細胞を感染できる場合、感染性特性を有すると言われる。本明細書で使用した「偽型」は、異なる株のＥＮＶタンパク質が取り込まれているウイルス粒子を意味する。ＭＬＶコア粒子が現在使用されている。偽型は、感染性タンパク質をコードするベクターを、別のウイルス株のＧＡＧおよびＰＯＬタンパク質をコードする１種または数種のベクターを用いて同時トランスフェクトされた、細胞株（例えば２９３Ｔ細胞）で産生される。
【０１５０】
記載の特性を有する特定のポリペプチドは、ウイルスエンベロープタンパク質（ＥＮＶ）、特にレトロウイルスエンベロープタンパク質から得られる。このようなレトロウイルスＥＮＶは、ＭｏＭＬＶ、フレンドレトロウイルス、ＦｅＬＶ、ＨＴＬＶ−１、ＳＴＬＶ−１およびＭＰＭＶからなるレトロウイルス群より選択できる。他の興味深いポリペプチドは、ＨＥＲＶなどのウイルス起源の核酸によりコードされるものである。ウイルスが関与する限り、エボラおよびマールブルグウイルスは、本発明のポリペプチドを得ることができるＥＮＶタンパク質を有する。
【０１５１】
該エンベロープタンパク質は、抗原性、特に免疫原性特性、および免疫抑制特性が関与する限り、天然もしくは天然に存在するタンパク質の全てまたは一部であってもよく、あるいは、その抗原性、特に免疫原性の変種（その断片を含む）、すなわち、天然に存在するウイルスエンベロープタンパク質の類似体に由来してもよい。
【０１５２】
先に記載の所定のタンパク質のアミノ酸配列内で、本発明者らは、免疫抑制の調節に関与する特定の残基を同定した。免疫抑制特性をタンパク質に付与する免疫抑制モデュレートリー配列と呼ばれるこのような配列は、以下：Ｅ／Ｑ−Ｇ−Ｇ−Ｌ／Ｔ／Ｉ−Ｃ−Ａ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｖ／Ｉ−Ａであり、ここで、「／」は、この配列位置が、数種類のアミノ酸残基を受け入れることを示す。したがって、
【表４１】
2008506357.tif 000024
からなる群より選択される免疫抑制モデュレートリー配列を含むタンパク質は、免疫抑制特性を有する特に所定のタンパク質であり、これから、本発明の共通配列のＸ１およびＸ２位置を表す末端Ｅ／ＱおよびまたはＡ残基を改変することにより本発明のポリペプチドを得ることができる。
【０１５３】
先に記載したように、本明細書で使用した「得られた」なる語句は、該ポリペプチドのアミノ酸配列、特に免疫抑制モデュレートリー配列が、免疫抑制特性に影響を及ぼすように、特に該特性を低下させるように、所定のタンパク質の配列に対して改変されていることを示す。これらの変化した免疫抑制特性は、先に記載したアミノ酸特徴による、Ｘ１およびＸ２残基の置換の結果であり得る。
【０１５４】
これらの変化した免疫抑制特性はまた、選択されたタンパク質の許容部位への、Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２配列を含むポリペプチドの挿入の結果であり得、ここで、Ｘ１およびＸ２は、免疫抑制特性を変化させるように選択される。
【０１５５】
本明細書で使用した「許容部位」は、タンパク質の抗原性特性を実質的に変化させない部位を意味する。
【０１５６】
挿入により、免疫抑制に関与する相同的配列または配列を置き換えることができる。本発明に記載の７〜２０アミノ酸残基のポリペプチドもまた、所定のタンパク質からアミノ酸残基を欠失させることなく、挿入することができる。
【０１５７】
先に記載の所定のタンパク質から得られ、変化した免疫抑制特性を有するポリペプチドは、以下の配列Ｒ−Ｇ−Ｇ−Ｌ／Ｔ／Ｉ−Ｃ−Ａ／Ｋ／Ｌ／Ｍ／Ｖ／Ｉ−Ｆを有する配列、特に、
【表４２】
2008506357.tif 000025
からなる群より選択される配列を含む。
【０１５８】
先に示した配列は、同定された天然に存在するレトロウイルスＥＮＶタンパク質における該Ｘ１およびＸ２残基の変異により得られた。
【０１５９】
同じ戦略を、Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ−（Ｙ）１−Ｘ２に類似した配列を提示するタンパク質を発現するウイルスに適用できる。特に、Ｙ残基は、先に記載（Benitら、2001）したものとは異なるアミノ酸残基であってもよい。
【０１６０】
さらに、本出願の所定のＥＮＶタンパク質の構造、例えばその３次元構造は、アミノ酸配列が異なるにも関わらず、他のウイルス、特に他のレトロウイルスと類似した構造特徴を共有することが示された。したがって、高度に保存されたＴＭ構造の組織は、融合過程およびウイルス進入を引き起こす一般的な機序に関連している可能性が最も高い、エボラもしくはマールブルグウイルスのタンパク質に見出されている。結果的に、同じアプローチを適用して、このようなウイルスの免疫抑制モデュレーションに関与する特定の配列を同定することができる。
【０１６１】
本発明はまた、以下の配列：
【表４３】
2008506357.tif 000026
（ここで、アミノ酸Ｘ１および場合によりアミノ酸Ｘ２は変異しており、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に有する、野生型ＥＮＶタンパク質の変異から得られる変異ＥＮＶタンパク質（ここで、該変異ＥＮＶタンパク質は、野生型ＥＮＶタンパク質に対して改変された免疫抑制活性を有する）、
あるいは、その断片（ただし、該断片は、変異アミノ酸Ｘ１および場合によりＸ２を有し、該変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、該変異ＥＮＶタンパク質で採用されている構造と実質的に類似している）、
あるいは、少なくとも１アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、該変異ＥＮＶタンパク質から得られるタンパク質またはその断片（ただし、得られた該タンパク質は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、該変異ＥＮＶタンパク質の免疫抑制活性に類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片と実質的に類似している）
に関する。
【０１６２】
本明細書で意図する変異ＥＮＶタンパク質は、以下の配列：
【表４４】
2008506357.tif 000027
（式中、Ｘ’１は変異Ｘ１に対応し、Ｘ’２は変異Ｘ２に対応する）
を実質的に有する。
【０１６３】
本明細書で意図する本発明に記載の変異ＥＮＶタンパク質の断片は、特に、少なくとも７アミノ酸長であり、変異アミノ酸Ｘ１を含む。場合により、該断片は、少なくとも７アミノ酸長であり、Ｘ１およびＸ２の両方を含む。本発明に記載の好ましい変異ＥＮＶタンパク質断片は、特に、ＴＭサブユニットまたはＴＭサブユニットのエクトドメインから構成される。
【０１６４】
本発明の好ましい実施形態において、変異ＥＮＶタンパク質から得られた先に述べたタンパク質は、該変異ＥＮＶタンパク質と少なくとも８０％の配列同一性、特に少なくとも９０％の配列同一性を提示する。
【０１６５】
先の定義した変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の好ましい実施形態において、該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の抗原性に関与する構造は、野生型ＥＮＶタンパク質に対して実質的に保存されている。
【０１６６】
好ましい実施形態によれば、本発明は、以下の配列：
【表４５】
2008506357.tif 000028
（式中、
アミノ酸Ｘ１および場合によりアミノ酸Ｘ２は変異しており、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む、野生型ＥＮＶタンパク質の変異から得られた先に定義した変異ＥＮＶタンパク質（ここで、該変異ＥＮＶタンパク質は、野生型ＥＮＶタンパク質に対して低下した免疫抑制活性を有する）、
あるいは、その断片（ただし、該断片は、変異アミノ酸Ｘ１および場合によりＸ２を有し、該変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、該変異ＥＮＶタンパク質に採用されている構造と実質的に類似している）、
あるいは、少なくとも１アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片から得られたタンパク質（ただし、得られた該タンパク質は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、該変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片と実質的に類似している）
に関する。
【０１６７】
好ましい実施形態によれば、本発明は、以下の配列：
【表４６】
2008506357.tif 000029
（式中、
アミノ酸Ｘ１およびアミノ酸Ｘ２は変異しており、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む、野生型ＥＮＶタンパク質の変異から得られた先に定義した変異ＥＮＶタンパク質（ここで、該変異ＥＮＶタンパク質は、野生型ＥＮＶタンパク質に対して低下した免疫抑制活性を有する）、
あるいは、その断片（ただし、該断片は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、該変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、該変異ＥＮＶタンパク質に採用されている構造と実質的に類似している）、
あるいは、少なくとも１アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片から得られたタンパク質（ただし、得られた該タンパク質は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、該変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片と実質的に類似している）
に関する。
【０１６８】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の好ましい実施形態において、該変異は置換である。
【０１６９】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の別の好ましい実施形態において、Ｘ１は、ＲまたはＨにより置換されている。
【０１７０】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の別の好ましい実施形態において、Ｘ２は、Ｆ、Ｍ、Ｙ、またはＷにより置換されている。
【０１７１】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の別の好ましい実施形態において、Ｘ１は、Ｅ、Ｋ、またはＱであり、ＲまたはＨにより置換されている。
【０１７２】
好ましい実施形態において、先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片は、ＨＥＲＶ−Ｈ  ＥＮＶ（ここで、Ｘ１はＫである）である。
【０１７３】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の別の好ましい実施形態において、Ｘ２は、Ａ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、またはＫであり、Ｆ、Ｍ、Ｙ、またはＷにより置換されている。
【０１７４】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の特に好ましい実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＨＥＲＶ  ＥＮＶ、特に：
ＨＥＲＶ−ＦＲＤ  ＥＮＶ（配列番号８２）（ここで、Ｘ１はＱ４２７であり、Ｘ２はＡ４３３である）、または
ＨＥＲＶ−Ｔ  ＥＮＶ（配列番号８４）（ここで、Ｘ１はＱ５１６であり、Ｘ２はＡ５２２である）、または
ＨＥＲＶ−Ｒ  ＥＮＶ（配列番号８６）（ここで、Ｘ１はＥ５６１であり、Ｘ２はＫ５６７である）、または
ＨＥＲＶ−Ｖ  ＥＮＶ（配列番号８８）（ここで、Ｘ１はＱ３８１であり、Ｘ２はＶ３８７である）、または
ＨＥＲＶ−Ｒ（ｂ）ＥＮＶ（配列番号９０）（ここで、Ｘ１はＥ３９１であり、Ｘ２はＬ３９７である）
から選択される。
【０１７５】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＨＥＲＶ−ＦＲＤ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１２０、
配列番号１２２
から選択される。
【０１７６】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＨＥＲＶ−Ｖ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１２４、
配列番号１２６
から選択される。
【０１７７】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＨＥＲＶ−Ｔ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は：
配列番号１２８、
配列番号１３０
から選択される。
【０１７８】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＨＥＲＶ−Ｒ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は：
配列番号１４６、
配列番号１４８
から選択される。
【０１７９】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の特に好ましい実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、
ＨＴＬＶ−１ＥＮＶ（配列番号９２）（ここで、Ｘ１はＱ３８９であり、Ｘ２はＡ３９５である）、または
ＨＴＬＶ−２ＥＮＶ（配列番号９４）（ここで、Ｘ１はＱ３８５であり、Ｘ２はＡ３９１である）、または
ＦｅＬＶ  ＥＮＶ（配列番号９６）（ここで、Ｘ１はＥ５２７であり、Ｘ２はＡ５３３である）、または
ＰＥＲＶ  ＥＮＶ（配列番号９８）（ここで、Ｘ１はＥ５４５であり、Ｘ２はＡ５５１である）、または
ＳＴＬＶ−１ＥＮＶ（配列番号１００）（ここで、Ｘ１はＱ３８９であり、Ｘ２はＡ３９５である）、または
ＭｏＭＬＶ  ＥＮＶ（配列番号７０）（ここで、Ｘ１はＥ５５１であり、Ｘ２はＡ５５７である）、または
ＭＰＭＶ  ＥＮＶ（配列番号７２）（ここで、Ｘ１はＱ４７１であり、Ｘ２はＡ４７７である）、または
ＦＶ  ＥＮＶ（配列番号１０２）（ここで、Ｘ１はＱ５６１であり、Ｘ２はＡ５６７である）
から選択される。
【０１８０】
先に定義した該ＥＮＶタンパク質またはその断片の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＦｅＬＶ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１０４、
配列番号１０６
から選択される。
【０１８１】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＨＴＬＶ−１ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１０８、
配列番号１１０
から選択される。
【０１８２】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＨＴＬＶ−２ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１１２、
配列番号１１４
から選択される。
【０１８３】
先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の有利な実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、ＰＥＲＶ  ＥＮＶであり、該変異ＥＮＶタンパク質の配列は、
配列番号１５０、
配列番号１５２
から選択される。
【０１８４】
好ましい実施形態によれば、本発明は、以下の配列：
【表４７】
2008506357.tif 000030
（式中、
アミノ酸Ｘ１および場合によりＸ２は変異しており、Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示す）
を実質的に含む、野生型ＥＮＶタンパク質の変異から得られた先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質（ここで、該変異ＥＮＶタンパク質は、野生型ＥＮＶタンパク質に対して上昇した免疫抑制活性を有する）、
あるいは、その断片（ただし、該断片は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、該変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、該変異ＥＮＶタンパク質で採用されている構造と実質的に類似している）、
あるいは、少なくとも１アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片から得られたタンパク質（ただし、得られた該タンパク質は、変異アミノ酸Ｘ１およびＸ２を有し、該変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有し、場合により、その抗原性構造は、該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片と実質的に類似している）
に関する。
【０１８５】
免疫抑制活性の上昇した先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の好ましい実施形態において、該変異は置換である。
【０１８６】
免疫抑制活性の上昇した先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の好ましい実施形態において、Ｘ１は、Ｅ、Ｋ、またはＱにより置換され、Ｘ２は、Ａにより置換されている。
【０１８７】
免疫抑制活性の上昇した先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片の好ましい実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、配列番号７４により示されるような、ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶであり、該変異ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶの配列は、
配列番号１１６、
配列番号１１８
から選択される。
【０１８８】
本発明はまた、先に定義した少なくとも１個のポリペプチド、または先に定義した少なくとも１個の変異ＥＮＶタンパク質もしくはその断片を含むことを特徴とするタンパク質に関し、ただし、該ポリペプチドが、野生型ＥＮＶタンパク質を起源とする場合、該ポリペプチドを含む該タンパク質は、野生型ＥＮＶタンパク質とは異なる。
【０１８９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする、核酸、特にポリヌクレオチドに関する。特定の実施形態において、これらの核酸はベクターに挿入される。組換えベクターは、プラスミド、細菌導入のためのファージ、酵母を形質転換できるＹＡＣ、または任意の発現ベクターであってもよい。
【０１９０】
さらに、該組換えベクターは、制御下での核酸の誘導性発現または条件的発現、あるいは適宜、構成的発現を可能とする転写調節領域（プロモーターを含む）を含む。また、組織特異的転写領域も使用できる。さらに、該組換えベクターは、複製起点および／またはマーカー遺伝子を含む。
【０１９１】
本発明の特定の実施形態において、該ベクターはまた、ウイルスＧＡＧおよび／またはＰＯＬタンパク質または機能的ウイルスタンパク質を発現するに十分なその断片をコードする核酸を含む。場合により、該ベクターは、ＮＥＦ、ＴＡＴのようなウイルス補助タンパク質またはその断片をコードする核酸を含んでいてもよい。
【０１９２】
または、ＧＡＧおよびＰＯＬコード配列は、ＥＮＶ発現ベクターとは異なるベクターを含む、別々のベクターに挿入してもよい。
【０１９３】
本発明の特定の実施形態において、プロウイルスゲノムは、抗原性特性を有するが、所定のタンパク質に対して変化した免疫抑制特性を有する本発明のポリペプチドをコードする核酸、あるいは、感染性、融合性、および抗原性特性を有するが、所定のタンパク質に対して変化した免疫抑制特性を有する本発明のポリペプチドをコードする核酸を用いて改変されている。
【０１９４】
本発明はまた、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む細胞に関する。
【０１９５】
特定の実施形態において、相同的細胞配列を用いての組換えまたは細胞ゲノムへの挿入により、ポリヌクレオチドが細胞ゲノムに取り込まれるように、細胞を本発明のポリヌクレオチドで形質転換する。細胞はまた、本発明のベクターを用いて、当業者の公知の方法によりトランスフェクトさせてもよい。トランスフェクションまたは感染は、生体外で、すなわち、生きた生物の体外の人工的環境において行なうことができる。
【０１９６】
別の実施形態において、本発明に記載のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターは、他のベクターに含まれている、特にウイルスＧＡＧタンパク質および／またはＰＯＬタンパク質をコードする他の核酸の導入により補完される。
【０１９７】
これらの細胞株は、組換えウイルス粒子の産生に有用である。特定の実施形態において、ＧＡＧおよびＰＯＬポリペプチドは、ＥＮＶタンパク質と同じウイルス株を起源とする。別の実施形態において、ＧＡＧおよびＰＯＬポリペプチドは、ＥＮＶタンパク質とは異なる株を起源とする。
【０１９８】
産生される組換えウイルス粒子は、機能的ＰＯＬタンパク質をコードする核酸、機能的ＧＡＧタンパク質をコードする核酸、および本発明のポリペプチドをコードする核酸を含む。
【０１９９】
さらに、ＥＮＶタンパク質は、宿主に応じた両種指向性ウイルスＥＮＶタンパク質（すなわち、ウイルスの起源ではない種の細胞を感染できる）または宿主に応じた同種指向性ウイルスＥＮＶタンパク質（すなわち、ウイルスの起源である種の細胞のみにおいてしか複製できない）から選択できる。
【０２００】
組換えウイルス粒子が感染性であり複製性であることを確実にするために、該ベクターは、転写、発現、およびキャプシド形成シグナル、例えばＬＴＲ、ｃＰＰＴ、ＰＰＴ３’、ＣＴＳ、ＳＡ、ＳＤ、ｐｓｉ配列、およびＲＲＥから選択された様々な核酸配列を含む。しかし、このようなエレメントを欠失させて、非複製ウイルス粒子を産生することもできる。さらに、プロウイルスゲノムは、補助タンパク質をコードする核酸を含む。
【０２０１】
場合により、該粒子を調製して、宿主に医学適用するに有用なさらに他の化合物を発現させることもできる。
【０２０２】
本発明はまた、先に定義した該ポリペプチド、先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質、または先に定義した該タンパク質をコードする核酸に関する。
【０２０３】
好ましい実施形態において、先に定義した該核酸は、
配列番号１０３、
配列番号１０５、
配列番号１０７、
配列番号１０９、
配列番号１１１、
配列番号１１３、
配列番号１１５、
配列番号１１７、
配列番号１１９、
配列番号１２１、
配列番号１２３、
配列番号１２５、
配列番号１２７、
配列番号１２９、
配列番号１４５、
配列番号１４７、
配列番号１４９、および
配列番号１５１
を含むリストから選択される配列により示されることを特徴とする。
【０２０４】
先に述べた配列番号１０３〜１２９および配列番号１４７〜１５１（奇数）は、それぞれ、配列番号１０４〜１３０および配列番号１４６〜１５２（偶数）をコードする。
【０２０５】
本発明はまた、先に定義した該核酸並びに該核酸の発現に必要なエレメントを含むことを特徴とする、真核または原核発現ベクターに関する。
【０２０６】
好ましい実施形態において、先に定義した該真核または原核発現ベクターは、ウイルスベクター、特にポックスベクター、例えば鶏痘、カナリア痘、もしくはＭＶＡ（改変されたワクシニアウイルスアンカラ）ベクター、アデノウイルスベクター、麻疹ベクター、またはＣＭＶ（サイトメガロウイルス）ベクターである。
【０２０７】
さらに好ましい実施形態において、先に定義した該真核または原核発現ベクターは、先に定義した該変異ＥＮＶタンパク質またはその断片、特に変異ＦｅＬＶ  ＥＮＶ、例えば配列番号１０３または配列番号１０５により示される配列をコードする核酸配列、並びに、場合により、該変異ＥＮＶと同じウイルスを起源とするＧＡＧタンパク質をコードする核酸を含む、ウイルスベクター、特にカナリア痘ベクターである。
【０２０８】
本発明はまた、先に定義した該核酸、または先に定義した該真核もしくは原核発現ベクターを含むことを特徴とする、組換え細胞に関する。
【０２０９】
本発明はまた、所定のタンパク質に対して変化した免疫抑制特性を有する本発明のポリペプチド、特に、該ポリペプチドの由来するタンパク質の抗原性特性、特に免疫原性特性を実質的に保持しているポリペプチドを含む組成物に関する。
【０２１０】
本発明の特定の組成物は、出発点の所定のタンパク質に対して低い免疫抑制特性を有するか、またはさらには、実質的に全く免疫抑制特性を有さない。
【０２１１】
他の組成物は、ポリヌクレオチド、または、本発明のポリペプチドをコードする核酸を含むベクターを含む。この場合、組織特異的プロモーターは、該組成物が投与（例えば注射）される器官に応じて、必要とされる発現強度に応じて選択できる。
【０２１２】
本発明の他の組成物は本発明のポリペプチドを有し、場合により、宿主において医学的関心の高いさらに他の化合物を発現する組換えウイルス粒子またはウイルスも含む。
【０２１３】
本発明のポリペプチドおよび組成物は、薬物の活性成分の設計に有用であり、したがって、感染、特にウイルス感染の予防およびまたは処置のための、あるいは、ウイルス感染から生じた有害な結果、特に、悪性状態（腫瘍を含む）の処置のための、あるいは、宿主において通常は沈黙している内因性ウイルス、特にＨＥＲＶの発現に関連した腫瘍を含む有害な結果、特に悪性状態の予防および／または処置のための、興味深い特性を有する。「処置」なる表現は、本発明のポリペプチドおよび組成物を用いて達成される治癒効果、並びにまた、患者において観察される症状の寛解、あるいは、患者の容態の改善を包含する。
【０２１４】
特定の実施形態において、本発明の組成物はさらに、感染、特にウイルス感染、特にレトロウイルス感染の予防または処置に有用な（サイトカインを含む）、あるいは、通常は沈黙しているＥＲＶの発現から生じる結果の処置に有用な、追加の活性化合物を含む。
【０２１５】
特に注射による全身または局所投与の投与に使用する場合、該組成物は、さらに、薬学的に適した賦形剤または担体および／またはビヒクルを含む。
【０２１６】
数種類の組成物を使用して、本発明の抗原性ポリペプチドに対する免疫応答を誘起することができる。
【０２１７】
第一に、核酸を含む組成物を宿主に投与、例えば注射し（ＤＮＡワクチン接種として知られる）、該核酸は、インビボにおいて、本発明に記載のポリペプチドを発現する。ＤＮＡワクチンは、通常、真核プロモーター、クローニングサイト、ポリアデニル化配列、選択マーカー、および細菌複製起点を含む、プラスミドベクターからなる。これらの全てのエレメントは、当業者に公知である。裸ＤＮＡの送達は有効性が低いことが示されており、細胞へのＤＮＡの送達を向上するためにはいくつかの担体が必要とされる。２種類の担体が開発されている：ウイルス担体（アデノウイルス、レンチウイルス）もしくは非ウイルス担体、例えばポリマー（および特にカチオン性ポリマー）、封入されたＤＮＡ（リポソーム）または金ミクロ粒子に連結させたＤＮＡ。
【０２１８】
別の種類の組成物は、所定のタンパク質に対して変化した免疫抑制特性を有し、抗原性特性を有する、本発明のポリペプチドを含む。このような組成物は免疫原性である可能性があり、すなわち、該組成物はそれが投与された宿主において免疫応答を誘起できる。しかし、該タンパク質は時に非免疫原性であるか、または免疫原性が低いことがあるので、免疫応答を誘起または向上するために、該ポリペプチドと共にアジュバントを投与してもよい。アジュバントは、該アジュバントと混合された抗原の免疫原性を増強する任意の物質として定義される。水酸化アルミニウムゲル、水中油滴型エマルション、または免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）などのいくつかのアジュバントは、可溶性抗原を、小粒子へと変換する。別のクラスのアジュバントには、細菌の滅菌構成成分、例えば細胞壁または多糖、フロイントアジュバントなどが挙げられる。
【０２１９】
それ故、抗原性特性を有するが、所定のタンパク質に対して変化した免疫抑制特性を有するポリペプチドを含む組成物は、それが投与された宿主における免疫応答の誘起に、および、体液性および／または細胞性免疫応答の発生において興味深い。
【０２２０】
実際に、宿主の免疫系は完全に機能しているので、非免疫抑制特性を有するポリペプチドの投与（例えば注射）は、所定のタンパク質（免疫抑制特性を有する）の投与よりも効果的な免疫反応を与える。
【０２２１】
特定の実施形態において、本発明に記載のポリペプチドは、抗原性特性、融合性特性、および感染性特性を有するが、所定の免疫抑制タンパク質に対して変化した免疫抑制特性を有する。
【０２２２】
本発明に記載の変化した免疫抑制特性は、有利には、元来の出発点のタンパク質に対して低下した免疫抑制特性に相当する。
【０２２３】
先に記載した該特性を有するポリペプチドで覆膜されたウイルス粒子は、ｇａｇ−ｐｏｌベクター、および、該ポリペプチドをコードする核酸を含むベクターでトランスフェクトされた組換え細胞株において作成できる。
【０２２４】
場合により、これらのウイルス粒子はまた、治療または予防目的の他の化合物も発現する。
【０２２５】
興味深いことに、このようなウイルス粒子は、宿主の細胞を感染し融合させることができ、非免疫抑制エンベロープタンパク質を取り込むことができる。このようなウイルス粒子を含む組成物は、免疫抑制特性を有する所定のタンパク質を取り込んだウイルス粒子よりも良好な効果的な免疫反応を誘起する。実際に、該エンベロープタンパク質は、その宿主を免疫抑制できず、その結果、最適な免疫反応が得られる。別の結果は、ＥＮＶ遺伝子の関与しない組換え事象に因り複製能を有するウイルス粒子は、組換えウイルス粒子は免疫応答を避けることができないので、限られた宿主においてその増殖を行なうというものである。
【０２２６】
融合性特性および感染性特性を有する抗原性エンベロープタンパク質で覆膜されたウイルス粒子を含む組成物は、効果的で安全なワクチンのようである。
【０２２７】
興味深いことに、このようなウイルス粒子は、複製性（機能的）でも、または非複製性であってもよい。これは、一旦宿主に投与された粒子の滞留時間に対して、および、免疫応答の品質に対して結果を及ぼす可能性がある。
【０２２８】
先に引用した全ての組成物は、皮下（s.c.）、皮内（i.d.）、筋肉内（i.m.）、または静脈内（i.v.）注射、経口投与、および鼻腔投与、または吸入などの様々な経路を介して、宿主に注射できる。
【０２２９】
本発明はまた、活性物質として、
先に定義した少なくとも１種類のポリペプチド、または
先に定義した少なくとも１種類の変異ＥＮＶタンパク質またはその断片、または
先に定義した少なくとも１種類の核酸、または
先に定義した少なくとも１種類の原核もしくは真核発現ベクター、または
先に定義した少なくとも１種類の組換え細胞、を薬学的に許容されうる担体と共に含む、医薬またはワクチン組成物に関する。
【０２３０】
本明細書において以後に記載したように、これらの医薬組成物は、特に、癌、免疫疾患、またはウイルス疾患の処置に有用である。
【０２３１】
本発明はまた、ウイルス疾患、例えばＨＴＬＶまたはＦｅＬＶ感染などの予防および／または処置を目的とした医薬またはワクチンの製造のための、先に定義した免疫抑制活性の低下した変異ＥＮＶタンパク質もしくはその断片を含むもしくはから構成される少なくとも１種類のタンパク質、または、該タンパク質をコードする核酸の使用に関する。
【０２３２】
個体への免疫抑制活性の低下した変異ＥＮＶタンパク質の投与は、該個体を、対応するウイルスによる感染から防御しやすい。実際に、該変異ＥＮＶタンパク質に対して誘起される免疫応答はまた、対応する野生型ＥＮＶタンパク質に対しても指向される。本明細書で実証されているように、この免疫応答は、効果的に、野生型ＥＮＶタンパク質の免疫抑制活性を遮断し、ウイルスの免疫回避を妨げる。
【０２３３】
さらに、該変異ＥＮＶタンパク質はまた、ウイルスの野生型ＥＮＶとその天然受容体に関して競合し、これにより、該野生型ＥＮＶの活性を阻害する、分子デコイとしても作用しやすい。
【０２３４】
本発明はまた、癌の予防および／または処置を目的とした医薬またはワクチンの製造のための、先に定義した変異ＨＥＲＶ  ＥＮＶタンパク質もしくはその断片を含むもしくはから構成される少なくとも１種類のタンパク質、または、該タンパク質をコードする核酸の使用に関する。
【０２３５】
本明細書で実証されているように、癌細胞により発現されるＨＥＲＶ  ＥＮＶタンパク質の活性を遮断することにより、これらの細胞の免疫回避は妨げられる。したがって、免疫抑制活性の低下した変異ＨＥＲＶ  ＥＮＶタンパク質に対して効果的に誘起される免疫応答は、癌細胞により発現される野生型ＨＥＲＶ  ＥＮＶに対しても指向され、したがって、これらの癌細胞は免疫回避できなくなる。
【０２３６】
さらに、変異ＥＮＶタンパク質は、癌細胞により発現される野生型ＥＮＶと、その天然受容体への結合に関して競合し、したがって、該野生型ＥＮＶの活性を阻害する、分子デコイとしても作用しやすい。
【０２３７】
本発明はまた、免疫系の阻害を必要とする病態、例えば自己免疫疾患、アレルギー、または移植片拒絶などの予防および／または処置を目的とした医薬またはワクチンの製造のための、先に定義した免疫抑制活性の上昇した変異ＥＮＶタンパク質もしくはその断片を含むもしくはから構成される少なくとも１種類のタンパク質、または、該タンパク質をコードする核酸の使用に関する。
【０２３８】
本明細書で意図する移植片拒絶は、移植片対宿主疾患（ＧＶＨＤ）も包含する。
【０２３９】
本発明はまた、癌、ウイルス疾患、または免疫系の阻害を必要とする疾患、例えば自己免疫疾患、アレルギー、もしくは移植片拒絶の予防および／または処置を目的とした医薬の製造のための、先に定義した少なくとも１種類のポリペプチド、または、先に定義した該ポリペプチドを含むタンパク質、または、該ポリペプチドもしくは該タンパク質をコードする核酸の使用に関する。
【０２４０】
先に定義したポリペプチドおよびそれらを含むタンパク質は、いくつかの適用を有する可能性がある。野生型免疫抑制ＥＮＶタンパク質を起源とする場合、それらを直接使用して、免疫系を阻害できる。さもなければ、免疫抑制ＥＮＶタンパク質を起源とする場合であれ非免疫抑制ＥＮＶタンパク質を起源とする場合であれ、それらは、野生型ＥＮＶタンパク質の活性を妨げる、癌細胞またはウイルスにより発現される対応する野生型ＥＮＶタンパク質の天然受容体に結合させるためのデコイとして使用できる。
【０２４１】
本発明はまた、癌、ウイルス疾患、または免疫系の阻害を必要とする病態、例えば自己免疫疾患、アレルギー、もしくは移植片拒絶の予防および／または処置を目的とした医薬またはワクチンの製造のための、少なくとも１種類のタンパク質または該タンパク質をコードする核酸の使用に関し、該タンパク質は、
−以下の配列：
【表４８】
2008506357.tif 000031
（式中、
アミノ酸Ｙ１〜Ｙ１２は、任意のアミノ酸を示し、アミノ酸Ｘ１は、Ｅ、Ｋ、またはＱを示し、場合によりアミノ酸Ｘ２はＡを示す）
を実質的に含む免疫抑制ＥＮＶタンパク質、
−あるいは、その断片（ただし、該断片は、アミノ酸Ｘ１および場合によりＸ２を有し、該ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有する）、
−あるいは、少なくとも１アミノ酸の挿入、欠失、または置換により、該ＥＮＶタンパク質またはその断片から得られるタンパク質（ただし、得られた該タンパク質は、アミノ酸Ｘ１および場合によりＸ２を有し、該変異ＥＮＶタンパク質と類似した免疫抑制活性を有する）
を含むまたはから構成される。
【０２４２】
癌、ウイルス疾患、または免疫系の阻害を必要とする病態、例えば自己免疫疾患、アレルギー、もしくは移植片拒絶の予防および／または処置を目的とした医薬またはワクチンの製造のための、以下の配列：
【表４９】
2008506357.tif 000032
を実質的に含む免疫抑制ＥＮＶタンパク質を含むまたはから構成される少なくとも１種類のタンパク質の先に定義した使用の好ましい実施形態において、該ＥＮＶタンパク質は、
ＨＥＲＶ−Ｔ  ＥＮＶ、例えば配列番号８４により示される配列、または
ＨＥＲＶ−Ｒ  ＥＮＶ、例えば配列番号８６により示される配列、または
ＨＥＲＶ−Ｖ  ＥＮＶ、例えば配列番号８８により示される配列、または
ＨＥＲＶ−Ｒ（ｂ）ＥＮＶ、例えば配列番号９０により示される配列、または
ＨＴＬＶ−１ＥＮＶ、例えば配列番号９２により示される配列、または
ＨＴＬＶ−２ＥＮＶ、例えば配列番号９４により示される配列、または
ＦｅＬＶ  ＥＮＶ、例えば配列番号９６により示される配列、または
ＰＥＲＶ  ＥＮＶ、例えば配列番号９８により示される配列、または
ＳＴＬＶ−１ＥＮＶ、例えば配列番号１００により示される配列、または
ＦＶ  ＥＮＶ、例えば配列番号１０２により示される配列
から選択される。
【０２４３】
先に述べたポリペプチドと同様に、これらのタンパク質およびその断片もいくつかの適用を有する可能性がある。それらは、免疫系を直接阻害するために使用しても、または、癌細胞もしくはウイルスにより発現され対応する野生型ＥＮＶタンパク質の天然受容体に結合させるためのデコイとして使用してもよい。
【０２４４】
本発明はまた、
ａ．免疫抑制効果はモデュレーションするが、融合性特性、感染性特性、および免疫抑制特性は保持するように、ヌクレオチド免疫抑制モデュレートリー配列を改変すること、
ｂ．改変遺伝子を発現させること、
ｃ．改変ポリペプチドを精製すること、
ｄ．改変ポリペプチドを動物に注射し、免疫応答を誘導すること、
ｅ．改変ポリペプチドに対して産生された抗体を精製すること
を含む、抗体の産生法に関する。
【０２４５】
本発明はまた、
ａ．該抗原性および免疫抑制特性をコードする核酸配列中の、先に定義した共通アミノ酸配列をコードする免疫抑制モデュレートリー配列をコードする核酸配列を同定すること、
ｂ．先に定義した配列Ｘ１−（Ｙ）３−Ｃ（Ｙ）１−Ｘ２中の、免疫抑制特性に影響を及ぼすアミノ酸Ｘ１およびＸ２をコードするコドンを同定すること、
ｃ．得られるタンパク質が、その抗原性特性は保持するが、改変された免疫抑制特性を有するように、両方の該アミノ酸をコードするコドンを改変すること、
ｄ．改変された免疫抑制特性を有する該抗原性タンパク質をコードする得られた改変核酸配列を発現させること
を含む、抗原性で免疫抑制性のタンパク質の抗原性特性は保持しつつ、その免疫抑制特性をモデュレーションする方法も提供する。
【０２４６】
その融合性特性、感染性特性および抗原性特性は保持しつつ、さらなる感染性特性および融合性特性を有する抗原性で免疫抑制性のタンパク質の免疫抑制特性をモデュレーションする具体的な方法は、
ａ．先に定義したものと類似したアミノ酸配列をコードするｅｎｖ遺伝子の免疫抑制モデュレートリー配列を同定すること、
ｂ．得られたタンパク質が、その融合性特性、感染性特性および抗原性特性は保持するが、その免疫抑制特性が改変されているような、免疫抑制特性に影響を及ぼすアミノ酸をコードするコドンを改変すること
を含む。
【０２４７】
本発明はまた、
ａ．抗原性で免疫抑制性のタンパク質の免疫抑制特性はモデュレーションするが、その抗原性特性は保持するように、抗原性で免疫抑制性のタンパク質をコードする遺伝子を改変すること、
ｂ．組換え細胞株において改変遺伝子を発現させ、改変プロウイルスゲノムを取り込んだ弱毒組換えウイルス粒子を産生すること
を含む、弱毒ウイルスの調製法を提供する。
【０２４８】
本発明はまた、
ａ．抗原性で免疫抑制性のＥＮＶタンパク質の免疫抑制特性はモデュレーションするが、その融合性特性、感染性特性および抗原性特性は保持するように、さらなる融合性特性および感染性特性を有するウイルスの抗原性で免疫抑制性のＥＮＶタンパク質をコードする遺伝子を改変すること、
ｂ．組換え細胞株において改変遺伝子を発現させ、改変プロウイルスゲノムを取り込んだ弱毒組換えウイルス粒子を産生すること
を含む、弱毒ウイルスの調製法に関する。
【０２４９】
本発明はまた、より一般的には、ウイルス疾患または悪性状態または腫瘍疾患の予防または処置に適した免疫原性組成物の調製のための、非免疫抑制性または低免疫抑制性のポリペプチドの使用に関する。したがって、免疫抑制特性を全く有さないかまたは免疫抑制特性の低い天然に存在するタンパク質を使用でき；それらは、ＨＥＲＶ−ＷまたはＨＥＲＶ−Ｈを包含する。
【０２５０】
本発明はまた、
−ポリクローナルもしくはモノクローナル抗体、またはその断片、例えばＦａｂもしくはＦ（ａｂ）’２断片、
−ｓｃＦｖポリペプチド、
−アプタマー、
−結合ペプチド
から選択される、ＥＮＶタンパク質のリガンドの調製のための、先に定義したポリペプチドまたは先に定義した変異タンパク質もしくはタンパク質の使用に関する。
【０２５１】
このようなリガンドおよびそれらの調製法は、当業者には公知である。
【０２５２】
本発明はまた、先に定義した変異ＥＮＶタンパク質または先に定義したそれらを含むタンパク質もしくはポリペプチドに対して指向される、抗体もしくはその断片、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマー、または結合ペプチドに関し、ただし、該抗体もしくはその断片、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマー、または結合ペプチドは、対応する野生型ＥＮＶタンパク質には結合しない。
【０２５３】
本発明はまた、ウイルスまたは腫瘍細胞の免疫抑制活性をモデュレーションしやすい化合物をスクリーニングするための、先に定義したポリペプチド、または先に定義したタンパク質の使用に関する。
【０２５４】
本発明はまた、ウイルスまたは腫瘍細胞の免疫抑制活性をモデュレーションしやすい化合物をスクリーニングするための、先に定義した抗体もしくはその断片、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマー、または結合ペプチドの使用に関する。
【０２５５】
先に定義したポリペプチド、先に定義したタンパク質、あるいは先に定義した抗体もしくはその断片、ｓｃＦｖポリペプチド、アプタマー、または結合ペプチドの先に定義した使用の好ましい実施形態において、スクリーニングすべき化合物は、ペプチド、特に、５〜３０アミノ酸を含むペプチド、例えばコンビナトリアルペプチドライブラリーを起源とするペプチドである。
【０２５６】
実施例
実施例１
方法：
マウスおよび細胞株
これらの試験で使用される細胞株は：
−２９３Ｔ、胚腎細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１１２６８）、
−ＨｅＬａ、ヒト類上皮癌細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、
−ＭＣＡ２０５、メチルコラントレンにより誘導されたネズミ線維肉腫細胞（ShuおよびRosenberg、1985）、
−ＮＩＨ  ３Ｔ３、マウス線維芽細胞であった。細胞を、１０％ウシ胎児血清、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）、およびペニシリン（１００単位／ｍｌ）の補充されたＤＭＥＭ中で培養した。
【０２５７】
改変タンパク質の免疫抑制効果を試験するために、Janvier（Laval、フランス）から入手した８〜１２週令のＣ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスを使用した。
【０２５８】
作製
ＨＥＲＶ−ＷおよびＨＥＲＶ−Ｔのエンベロープを発現しているベクター（ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＷおよびｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＴ）は以前に記載されている（Blaiseら、2003）。簡潔に言うと、それらは、プロモーター（ヒトサイトメガロウイルス初期プロモーター）、ウサギβ−グロビンイントロン、およびポリアデニル化配列を含む。ＨＥＲＶ−Ｗ  ｅｎｖのｃＤＮＡを、ベクターのＥｃｏＲＩ部位間に挿入した（図３Ａ）。
【０２５９】
ＭＰＭＶのエンベロープ遺伝子は、ＸｈｏＩおよびＭｌｕＩ（下線）で消化した以下のプライマー：
【表５０】
2008506357.tif 000033
を使用してＰＣＲによりｐＴＭＯベクターから回収し、同じ酵素で消化したｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＴにクローニングした。ＭＰＭＶのエンベロープ遺伝子を含み発現しているｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＭＰＭＶ発現ベクターが得られた（図２Ａ）。これらのベクターは、細胞間融合アッセイに、および、偽型の産生に使用された。
【０２６０】
以下の構造物の記載の中のアミノ酸位置＊は、鋳型としてのスイスモデルソフトウェアにより作成したＨＥＲＶ−ＷのＴＭサブユニットのモデル構造（図８）（http://swissmodel.expasy.org/)、および、モロニーネズミ白血病ウイルスＴＭサブユニットの構造（プロテインデータバンクＩＤ：１ＭＯＦ（１）、http://www.resb.org/pdf/）にしたがって番号を付した。それ故、ＮＣＢＩ配列アクセッション番号に開示された対応するエンベロープのＳＵ−ＴＭ前駆体で同定された場合、このナンバリングスキームに従う位置４４および５０は以下の位置を示す：
【表５１】
2008506357.tif 000034
【０２６１】
ＮＣＢＩ  ＵＲＬ：http://www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez/
（１）Fass D、Harrison SC、Kim PS、Nat Struct Biol.1996年5月;3(5):465-9。
（２）Blond,J.L.、Beseme,F.、Duret,L、Bouton,O.、Bedin,F.、Perron,H.、Mandrand,B.、およびMallet,F.J.、Virol.73(2)、1175-1185(1999)。
（３）Petropoulos,C.J.、付録2：レトロウイルス分類学、タンパク質構造、配列、および遺伝子マップ、PETROVIRUSES:757、Coffin,J.M.（編）；コールドスプリングハーバーラボラトリープレス、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、NY州、米国（1997）。
【０２６２】
ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＷの部位特異的変異誘発は、鋳型としての一本鎖ウラシル付加ＤＮＡおよび変異原性オリゴヌクレオチド（変異は太字）を使用して、以前に記載（Kunkelら、1987）された通りに行ない、該変異原性オリゴヌクレオチドには、スクリーニングをより容易にするために制限酵素部位（下線）も沈黙的に導入された：
【表５２】
2008506357.tif 000035
【０２６３】
ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＭＰＭＶの部位特異的変異誘発は、合成オリゴヌクレオチドの代わりに、沈黙的にＸｈｏＩを導入するアンチセンスプライマー
【表５３】
2008506357.tif 000036
を、変異原性プライマーサイレント：
【表５４】
2008506357.tif 000037
に連結させたＰＣＲ断片を使用することを除き同じ方法により行なった。
【０２６４】
ｐＤＦＧ−ｅｎｖＷの変異誘導体を、ｐＤＦＧ−ｅｎｖＷのＢｓｔＢＩ−ＢｓｒＧＩおよびＢｓｒＧＩ−ＢｓｔＥＩＩ断片と、ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＷのＢｓｔＥＩＩ−ＢｓｔＢＩ断片との３重ライゲーションにより作成した。
【０２６５】
ｐＤＦＧ−ｅｎｖＭＰＭＶおよびその変異誘導体（図２Ｂ）は、ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＭＰＭＶのＡｇｅＩ−ＭｌｕＩ断片を、同酵素で消化されたｐＤＦＧ−ＭｏＴＭＴａｇベクターにライゲーションすることにより作成した。ｐＤＦＧプラスミドは、ＬＴＲ、スプライス部位（ＳＤおよびＳＡ）、ｐｓｉ配列、およびＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）エレメント、並びに選択遺伝子（抗生物質耐性遺伝子）を含む、エンベロープ発現ベクターである。これらのベクター（図１Ｂ、２Ｂおよび３Ｂ）は、エンベロープ発現腫瘍細胞およびインビボアッセイにおいて使用された。
【０２６６】
融合性特性：細胞間融合アッセイ
ＨｅＬａ細胞を、リポフェクタミン（インビトロジェン製、５×１０５個の細胞あたり２μｇのＤＮＡ）を使用してトランスフェクトした。エンベロープ糖タンパク質の融合活性を、対応する発現ベクターによるトランスフェクションの２４時間後に測定した（図１Ａ、２Ａ、および３Ａ）。合胞体を可視化するために、細胞をメタノール中で固定し、製造業者の指示にしたがって、メイグリュンワルドおよびギームザ溶液（シグマ製）を添加することにより染色した。細胞個体群中の融合事象の比率を示す融合指数は、［（Ｎ−Ｓ）／Ｔ］×１００（ここで、Ｎは、合胞体中の核の数であり、Ｓは、合胞体の数であり、Ｔは、計測された核の総数である）として定義された（図４）。エンベロープタンパク質を発現していないｐｈＣＭＶベクターを、陰性対照として使用した。
【０２６７】
感染性特性：感染性アッセイ
エンベロープ糖タンパク質（野生型または変異型）を発現している７．５×１０５個の２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウム法を使用して、１．７５μｇのＣＭＶ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ＭｏＭＬＶ、１．７５μｇのＭＦＧ−ｎｌｓ−ｌａｃＺ、および０．５５μｇのｐｈＣＭＶベクターと共に同時トランスフェクトした。ＭＦＧ−ｎｌｓ−ｌａｃＺベクターは、ＭｏＭＬＶ  ＬＴＲ、ｐｓｉ配列、ＮＬＳ（核内移行シグナル）、およびＬａｃＺ遺伝子を含んでいた。偽型（別のウイルス株由来のエンベロープタンパク質を有するＭｏＭＬＶのウイルス体）を含む上清を２日後に回収し、ろ過し、培養培地中に連続希釈し、４μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で９６ウェル培養プレート中の４×１０３個のＨｅＬａ細胞の感染に使用した。プレートを２日後に固定し、Ｘ−ｇａｌで１時間着色させ、β−ガラクトシダーゼを発現する感染細胞の斑点を計測して、偽型力価を判定した（上清１ｍｌあたりの感染性粒子の数）。エンベロープタンパク質を発現していないｐｈＣＭＶベクターを、陰性対照として使用した。
【０２６８】
免疫抑制特性：エンベロープ発現腫瘍細胞の確立およびインビボアッセイ
リン酸カルシウム法を使用して、１．７５μｇのＣＭＶ−ｇａｇ−ｐｏｌ−ＭｏＭＬＶおよび０．５５μｇのＣＭＶ−ｅｎｖＡｍｐｈｏと共に、７．５×１０５個の２９３Ｔ細胞に一過性に同時トランスフェクトすることにより、ｐＤＦＧレトロウイルス発現ベクター（１．７５μｇ）をパッケージングした。上清を２日後に回収し、ろ過し、Mangeney & Heidmann、1998に記載されているように、４μｇ／ｍｌのポリブレンの存在下で、５×１０５個のＭＣＡ２０５腫瘍細胞の感染に使用した。細胞を、選択培地（４００単位／ｍＬのヒグロマイシン）中で２週間維持した。インビボアッセイのために、腫瘍細胞をトリプシン処理し、遠心分離にかけ、１×１０７個の細胞／ｍＬの濃度でＰＢＳ中に再懸濁した。１００μＬの各懸濁液を、３匹のＣ５７／ＢＬ６および８〜１０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスの剃った右側腹部に皮下注射した。腫瘍確立は、触診により判定し、腫瘍面積（ｍｍ２）は、垂直の腫瘍直径の測定により判定した（図５）。免疫抑制指数は、ｉ＝（Ｓｅｎｖ−Ｓなし）／Ｓなし（ここで、Ｓｅｎｖは、エンベロープタンパク質を発現している腫瘍により到達される最大面積であり、Ｓなしは、エンベロープタンパク質を発現していない腫瘍（陰性対照）により到達される最大面積である）として定義される。
【０２６９】
結果
１．様々な野生型エンベロープタンパク質の感染性特性の判定
エンベロープタンパク質の感染性を、ＮＩＨ３Ｔ３細胞（ＭｏＭＬＶ）またはＨｅＬａ細胞（ＨＥＲＶ−ＷおよびＭＰＭＶ）において試験した。図６は、３種の野生型エンベロープタンパク質（１、５、および９列）が感染を持続できたことを示す。
【０２７０】
様々な野生型エンベロープタンパク質の免疫抑制作用の判定
ＭＰＭＶレトロウイルスおよびＨＥＲＶ−Ｗの免疫抑制作用を、同種ｂａｌｂ／ｃまたは同系Ｃ５７ＢＩ／６マウスに注射されたＭＣＡ２００５細胞で試験した。図７は、ＭＰＭＶを発現している腫瘍（黒棒）は、ＨＥＲＶ−Ｗを発現している腫瘍（白棒）に対して大きかったことを示す。本発明者らは、ＭＰＭＶエンベロープの免疫抑制作用を確認する一方で、ＨＥＲＶ−Ｗは、同種宿主を免疫抑制できなかったことを示した。
【０２７１】
結論すると、ＭＰＭＶおよびＨＥＲＶ−Ｗのエンベロープタンパク質は、融合性および感染性の点で同じ特性を有しているが、その免疫抑制特性に関しては異なっていた。
【０２７２】
３．免疫抑制特性の変化したエンベロープタンパク質を同定するための戦略
ＨＥＲＶ−ＷおよびＭＰＭＶの異なる特性に基づいて、本発明者らは、免疫抑制のモデュレーションに関与している可能性のある、アミノ酸配列中のドメインを同定することを試みた。
【０２７３】
ＭｏＭＬＶの結晶化サブドメインであるＴＭドメインのアミノ酸３０からアミノ酸４７の間の推定１７アミノ酸免疫抑制ドメイン（ＩＳＵ）、それぞれの２個のロイシン（Ｌ）が、以前に、いくつかの刊行物において特徴づけられた（Blaiseら、2001 J Virol.82、1597-1600）。
【０２７４】
２ステップの戦略を適用した：最初のステップは、得られるタンパク質（すなわち改変タンパク質）が、対応する非改変タンパク質の融合性特性および感染性特性を保持するように、エンベロープタンパク質を改変することであった。一旦このような改変エンベロープタンパク質が同定されると、その免疫抑制作用を試験し、非改変タンパク質の免疫抑制作用と比較した。
【０２７５】
４．改変ＨＥＲＶ−Ｗの研究
１つ難しい点は、ＴＭサブユニットのアミノ酸組成を改変する以前の試みにより、ＳＵ−ＴＭが会合しなくなり、感染性が変化したという事実である。例えば、ＭＰＭＶ免疫抑制ドメインのロイシン３０からトレオニン４０までの欠失により、エンベロープタンパク質の感染性は完全に抑止された（Brodyら、1992 J.Virol 66、3466-3475；Brodyら、1994、Virology 202、673-683）。
【０２７６】
これらの不成功な試みにも関わらず、本発明者らは、ＩＳＵドメインのアミノ酸組成、および、ドメイン構造に対する該組成の可能性ある影響を研究し、インビボで観察される免疫抑制特性に関与する該ＩＳＵドメインの新しい定義に到達した。本発明者らはさらに、タンパク質のアミノ酸配列中のいくつかの位置は、これらの位置におけるアミノ酸残基の性質と共に、免疫抑制作用にとって重要であると判断した。
【０２７７】
本発明者らは特に、例えばＭＰＭＶの対応する残基による所定の残基の置換を使用して、免疫抑制とさせる、非免疫抑制性エンベロープタンパク質、すなわちＨＥＲＶ−ＷＥｎｖタンパク質のアミノ酸配列中のいくつかの改変を設計した。
【０２７８】
ａ．感染性特性
ＨＥＲＶ−ＷエンベロープのＡ３６ＧおよびＴ４７Ｉ置換は、エンベロープタンパク質の感染性、融合性および免疫抑制作用を改変しなかった（表１）。これらの２個のアミノ酸は、これらの機能に関する決定基ではないようであった。逆に、Ｒ４４ＱまたはＦ５０Ａ置換は、エンベロープタンパク質の感染性特性および融合性特性の両方を強く変化させた（表１、図６の２および３列）。
【０２７９】
Ｒ４４ＱおよびＦ５０Ａ置換の両方を含む二重変異体を作成した。驚くべきことに、二重変異体は、野生型ポリペプチドと類似した融合性特性および感染性特性を保持していた（表１および図６の４列）。
【０２８０】
この結果およびＭｏＭＬＶのエンベロープに見られるいくつかの相同的位置（図８）を使用したこの改変エンベロープタンパク質の設計により、これらの２個のアミノ酸は、該エンベロープタンパク質のＴＭ単位構造におけるそのそれぞれの位置およびその性質の両方のために、共に相互作用する可能性があることが示唆された。この相互作用の可能性は、この変異対の補完的な挙動を説明し得る。これは、以前の試みではこのようなアミノ酸を同定できなかったので意外であった。
【０２８１】
ｂ．免疫抑制特性
先に述べたのと同じくらい驚くべき別の結果が、免疫抑制作用の研究から得られた。実際に、野生型ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質は、腫瘍のサイズから見て免疫抑制性ではなかったが、ＨＥＲＶ−Ｗ二重変異体は、野生型ＭＰＭＶエンベロープタンパク質よりも免疫抑制性の程度が高かった（表１および図７、白棒）。
【０２８２】
さらに、本発明者らは、配列中の２個のアミノ酸の位置を同定し、その一方は、以前には、ＩＳＵドメインの一部を形成するとは報告されておらず（位置５０）、これらは共に、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質の免疫抑制作用のモデュレーションに関与していることが判明した。
【０２８３】
【表５５】
2008506357.tif 000038
【０２８４】
５．改変レトロウイルスエンベロープタンパク質の研究
これらのアミノ酸残基は、免疫抑制決定基に属するという事実を確認するために、位置４４（ＥまたはＱ）および５０（Ｆ）に類似のアミノ酸を含む他のレトロウイルスをスクリーニングした。これらの中のいくつかのレトロウイルスが同定され、図９に開示された：モロニーネズミ白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、フレンドウイルス、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス１型（ＨＴＬＶ−１）およびサルＴ細胞リンパ向性ウイルス１型（ＳＴＬＶ−１）。
【０２８５】
それらの中の２個のＭＰＭＶおよびＭｏＭＬＶウイルスにおいて、アミノ酸残基４４および５０を、ＨＥＲＶ−Ｗに見られる対応するアミノ酸により置き換えた。以下の構造物を作成した：Ｅ４４Ｒ、Ａ５０Ｆ、およびＥ４４Ｒ／Ａ５０Ｆ（ＭｏＭＬＶ）、並びに、Ｑ４４Ｒ、Ａ５０Ｆ、およびＱ４４Ｒ／Ａ５０Ｆ（ＭＰＭＶ）。
【０２８６】
ａ．感染性特性
興味深いことに、ＭｏＭＬＶでは、一重変異体はその感染性特性を失い（表２および図６の６および７列）、一方、二重変異体は、野生型タンパク質と同じ特性を有していた（表２および図６の８列）。
【０２８７】
ＭＰＭＶでは、変異体と野生型の間に僅かな差異が観察されたが、二重変異体のみが、野生型タンパク質と厳密に同一である特性を提示した（表３および図６の１０〜１２列）。
【０２８８】
ｂ．免疫抑制特性
ＭｏＭＬＶでは、インビボにおいて、Ｅ４４Ｒ置換または二重変異体（Ｅ４４Ｒ＋Ａ５０Ｆ）を有するタンパク質の両方の、その免疫抑制特性が低下していた（表２）。
【０２８９】
ＭＰＭＶでは、インビボにおいて、Ｑ４４Ｒ置換または二重変異体（Ｑ４４Ｒ＋Ａ５０Ｆ）を有するタンパク質の両方の、その免疫抑制特性が低下していた（表３）。
【０２９０】
【表５６】
2008506357.tif 000039
【０２９１】
【表５７】
2008506357.tif 000040
【０２９２】
合わせて考えると、これらの全ての結果により、以下の結論を引き出すことができた：
【０２９３】
第一に、レトロウイルス免疫抑制エンベロープタンパク質の免疫抑制特性を改変するには単一変異で十分であるようであった。実際に、４４位のグルタミンまたはグルタミン酸を、アルギニンで置き換えると、変異体の免疫抑制挙動は低下した。しかし、融合性特性および感染性特性も、消失しないまでも、強く低下した（ＭＰＭＶ）。
【０２９４】
第二に、二重変異体（４４および５０位）は、対応する野生型エンベロープタンパク質に対して免疫抑制特性が低下していた。興味深いことに、ＭＰＭＶ二重変異体は、野生型タンパク質と同程度効率的な融合性特性、および、高い感染性特性を有していた。ウイルス粒子および生ワクチンの製造におけるこのようなタンパク質に対する関心は有望であった。
【０２９５】
実施例２
方法
マウスおよび細胞株：１０週令のスイスマウス（ＦＶ許容）を、Janvier（Laval、フランス）から入手した。細胞株２９３Ｔ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１１２６８）、ＨｅＬａ（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、ＮＩＨ／３Ｔ３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５８）およびＭＣＡ２０５（ＲＥＦ）を、１０％ウシ胎児血清、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）およびペニシリン（１００単位／ｍｌ）の補充されたＤＭＥＭ中で培養した。
【０２９６】
作成：プラスミドｐ５７（Oliffら、J.Virol 33、475-86(1980)）およびｐＥＴ２８（＋）ｂ（ノバゲン製）を使用した。
ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＦＶを、ＰＣＲ鋳型としてのｐ５７並びにプライマー１６および１７を使用して、ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＭＰＭＶ（実施例１）と同様に作成した。ＣｌａＩ／ＡｖｒＩＩ開裂ベクターに、２種のＰＣＲ産物（第一のものはＣｌａＩで消化、第二のものはＡｖｒＩＩで消化）を挿入することにより、変異誘導体を作成した。これらの断片を、Ｅ１４Ｒ変異（これは、全長ＥＮＶのＥ５６１変異に相当する）に関してはリン酸化プライマー対１−２および３−４、Ａ２０Ｆ変異（これは全長ＥＮＶのＡ５６７Ｆ変異に相当する）に関しては１−５および３−６、並びにＥ１４Ｒ＋Ａ２０Ｆ変異に関しては１−２および４−６を用いて作成した。ｐＤＦＧ−ｅｎｖＦＶおよびその変異誘導体は、ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＦＶのＡｇｅＩ／ＭｌｕＩ断片を、同酵素で消化されたｐＤＦＧ−ＭｏＴＭＴａｇに挿入することにより作成した。二重変異体ｐ５７は、二重変異体ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＦＶのＢｓｔＺ１１Ｉ／ＢｓｍＩ断片を、同酵素で消化されたｐ５７に挿入することにより作成した。
【０２９７】
ＦＶエンベロープタンパク質のＳＵサブユニットのための細菌発現ベクターは、鋳型としてのｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＦＶおよびプライマー対７−８を用いて作成され、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化されたＰＣＲ断片を、同酵素で消化されたｐＥＴ２８（＋）ｂに挿入することにより作成した。
【０２９８】
ＦＶエンベロープタンパク質のＳＵおよびＴＭサブユニットのための細菌発現ベクターは、鋳型としての野生型もしくは二重変異体ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＦＶおよびプライマー対７−８もしくは９−１０を用いて作成され、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩで消化されたＰＣＲ断片を、同酵素で消化されたｐＥＴ２８（＋）ｂに挿入することにより作成した。
【０２９９】
【表５８】
2008506357.tif 000041
【０３００】
ウイルスの産生、定量、および不活性化：７．５×１０５個の２９３Ｔ細胞を、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（インビトロジェン製）を使用して、４μｇのｐ５７ＤＮＡを用いてトランスフェクトした。４８時間後、細胞懸濁液を使用して、４μｇ／ｍＬのポリブレンの存在下で５×１０５個のＮＩＨ／３Ｔ３細胞を感染させ、感染細胞を、さらに４日間培養した。ウイルス粒子を細胞上清から回収し、超遠心分離により濃縮し、ＰＢＳ中に再懸濁し、凍結させた。ＰＢＳ中のウイルス懸濁液を、０．５ｍＷ／ｃｍ２でＵＶ光に３０分間さらすことにより不活性化した。
【０３０１】
免疫抑制アッセイ：ＭＣＡ２０５細胞を、エンベロープ遺伝子発現ベクターまたは空ベクターを用いて形質導入し、同種マウスに移植し、そこで実施例１に記載のように、一過性腫瘍を確立した。免疫抑制指数は、（Ａｅｎｖ−Ａなし）／Ａなし（ここで、ＡｅｎｖおよびＡなしは、エンベロープ遺伝子および空カセットをそれぞれ発現している細胞を用いて得られた平均腫瘍面積である）として計算された。
【０３０２】
細胞間融合および感染性アッセイを、実施例１に記載したように、エンベロープ発現ベクターとしてｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＦＶおよびその変異誘導体を用いて行なった。
【０３０３】
ウイルス負荷アッセイ：２μｌの濃縮ウイルスまたは２０μｌの細胞上清もしくは血清から、ＲＮＡを、ＲＮＡイージーミクロキット（キアゲン製）を使用して抽出し、ＭｏＭｕＬＶ逆転写キット（アプライド製）およびプライマーとしてのランダムヘキサマーを使用して逆転写し、プラチナＳＹＢＲグリーンｑＰＣＲキット（インビトロジェン製）およびプライマー
【表５９】
2008506357.tif 000042
を使用して、リアルタイムＰＣＲによりｃＤＮＡを定量した。
【０３０４】
組換えタンパク質：組換えタンパク質を、発現ベクターとしてｐＥＴ２８（＋）ｂ（ノバゲン製）を使用して、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ストラタジーン）において産生した。ＳＵサブユニットは封入体として産生され、野生型および変異型ＴＭサブユニットは可溶性物質として産生された。それらを、製造業者の指示にしたがって、ハイトラップキレーティングＨＰカラム（アマシャム製）で精製した。ＴＭサブユニットを、スーパーデックス７５ＨＲ１０／３０カラム（アマシャム製）でさらに精製し、主要な三量体形態を単離し、そのＬＰＳ含量を、ＬＡＬ  ＱＣＬ−１０００キット（カンブレックス製）を使用して定量し、Ｅ．ｃｏｌｉＬＰＳ（０１１１：Ｂ４株、シグマ製）の添加により５μｇ／ｍｇに調整した。
【０３０５】
マウス免疫化：マウスに、１００μｇの組換えＴＭサブユニットまたは１．５×１０１０個のＲＮＡコピーの無傷もしくはＵＶで不活性化されたＦＶウイルス粒子を１週間間隔で３回注射した。１００μｇのＣｐＧ（ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド  ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＣＧＴＴ（配列番号１４４））が、アジュバントとして系統的に添加された。血清を最後の免疫化から４日後に回収した。不活性化ウイルス粒子で免疫化されたマウスに、１０６個のＲＮＡコピーの野生型ＦＶで攻撃し、攻撃後の血清を５日後に回収した。
【０３０６】
免疫学的ＦＶ検出：組換えＳＵサブユニットが、発現ベクターとしてｐＥＴ２８（＋）ｂ（ノバゲン製）を使用して、ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（ストラタジーン製）において封入体として産生され、製造業者の指示にしたがってハイトラップキレーティングＨＰカラム（アマシャム製）で精製され、これを使用して２μｇ／ｍｌの濃度でMaxiSorpマイクロプレート（Nunc製）を覆った。連続希釈血清中のＩｇＧ水準を、ＨＲＰ（アマシャム製）にコンジュゲートさせた抗マウスＩｇＧ抗体、および、色素生産性試薬としてのＯＰＤ（シグマ製）を使用して定量した。
【０３０７】
結果
１．エンベロープタンパク質により誘導される免疫抑制の消失により、感染性レトロウイルスの完全な免疫拒絶がなされた：実施例１で例証された免疫抑制と感染性の間の遺伝子的な二重変異により生じる分離により、そのエンベロープタンパク質の免疫抑制活性は欠いているが、依然として複製性であり感染性である完全なレトロウイルスを作成する可能性が開拓された。
【０３０８】
フレンドネズミ白血病ウイルス（ＦＶ）がモデルとして選択された。なぜなら、このマウスゲノムは、インビボでの検出を損なう関連する内因性レトロウイルスを含まないからである。
【０３０９】
ＦＶエンベロープの重要な残基を、シンシチン−１（ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶ）の残基と置き換え、そして、ＭＰＭＶエンベロープと同様に、二重変異Ｅ１４Ｒ＋Ａ２０Ｆ（これは、全長ＥＮＶのＥ５６１Ｒ＋Ａ５６７Ｆ変異に相当する）が、感染性を変化させることなく、免疫抑制を復帰させることを確認した（図１１Ａおよび１１Ｂ）。ＦＶ分子クローン５７において、野生型エンベロープ遺伝子を、その非免疫抑制変異体に置き換え、各種類のレトロウイルス粒子がインビトロで産生された。ウイルス収量は、細胞上清中のウイルスＲＮＡの定量的ＲＴ−ＰＣＲアッセイにより測定したところ類似していた。
【０３１０】
期待されたとおり、両方のウイルスタイプが、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞でのインビトロ感染アッセイにおいて同じ増殖反応速度を示し（図１１Ｃ）、インビボで５グレイで照射された免疫低下マウスに注射した場合も同様に示した（図１２Ａ）。
【０３１１】
正常なマウスでは、野生型ＦＶは、最初に、感染前期中に全てのマウスにおいて高度なウイルス血症を確立した（ウイルス注射の７日後、図１２Ａ〜１２Ｂ）。この期間の後に持続的な感染が確立され、マウスは、非類遺伝子性の非近交系マウスで期待された通りに、様々な程度でウイルス複製を制御できた。４ヵ月後、感染マウスの８０％が、赤白血病症候群を呈し、ヘマトクリット水準は３５％未満であった。
【０３１２】
これに対し、変異非免疫抑制ＦＶは、非常に高用量のウイルスコピー（１０６個のＲＮＡコピー、１０２のＩＤ５０）の注射から１４日後という早い時期においても検出不可能であり、病態の根拠は認められなかった。特筆すべきことには、ＦＶエンベロープタンパク質に対して指向されるＩｇＧは、野生型ＦＶに感染させたマウスにおいては持続的に検出されたが、二重変異体ＦＶに感染させたマウスにおいては一過性にしか検出されず（図１３）、このことは、変異ウイルスが完全に排除されたことを示す。
【０３１３】
結論すると、本実験は、エンベロープにより駆動される免疫抑制が存在しないことにより、進入ウイルスの完全な免疫拒絶がもたらされたので、エンベロープにより駆動される免疫抑制は、ＦＶ感染に不可欠であることを実証した。
【０３１４】
２．免疫抑制陰性組換えエンベロープタンパク質および不活性化ウイルス粒子の免疫原性の上昇：標的細胞へのウイルスの進入において重要な要素として、レトロウイルスエンベロープタンパク質は、組換えタンパク質として、その断片として、または欠陥ウイルスベクターの有する遺伝子として、あらゆるワクチン製剤に系統的に含まれる。エンベロープタンパク質により仲介される免疫抑制は、ＩＳＵを含む免疫原に対して高まる応答を阻害する可能性があり、したがって、そのワクチン効力は低下する可能性があったと疑われる。
【０３１５】
この仮説を試験するために、２種類のＩＳＵ含有免疫原を作成した：１）精製時に同一の挙動を示す可溶性（したがって正しく折りたたまれている）で三量体の形態として、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて産生される、野生型もしくは変異型ＦＶエンベロープタンパク質のＴＭサブユニットのエクトドメインに相当する組換えタンパク質；２）そのエンベロープタンパク質の天然構造を保存するために、無傷であるかまたはＵＶ光にさらされることにより不活性化された、野生型および変異型ＦＶ粒子。
【０３１６】
図１４Ａに示されるように、変異非免疫抑制エンベロープタンパク質のみが、ＩｇＧ水準の高いこのような応答を生じた。どの場合においても、野生型または変異型ＴＭサブユニットで覆膜されたプレートで得られたシグナルは、定量的に同じであり、このことは、マウス血清中の抗ＴＭ抗体は、優先的に、ＩＳＵそれ自体に指向されるのではなく、むしろ、ＴＭサブユニット内の他のエピトープに対して指向されることが示された。
【０３１７】
したがって、ＦＶエンベロープタンパク質に導入された二重変異体は、そのＩＳＵを高度に効果的なエピトープへと変換させなかった。さらに、野生型エンベロープタンパク質により生じたＩｇＭ水準は、その非免疫抑制変異体対応物により生じたその水準よりもはるかに高かった。これらの結果により、ＦＶエンベロープタンパク質の免疫抑制ドメインは、免疫系を直接阻害し、この作用は、標的細胞におけるウイルスの進入および複製も必要とせず、またさらには、ＴＭサブユニットのみ以外の他のウイルス成分さえも必要としないことが示唆された。
【０３１８】
図１４Ｂは、ＭｏＭＬＶ  ＥＮＶおよびＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶを用いてこれらの結果を確認した。ＭｏＭＬＶ  ＥＮＶの野生型組換えＴＭサブユニットに対してほぼ全くＩｇＧ応答は誘起されず、一方、非免疫抑制二重変異体（実施例１参照）は、強いＩｇＧ応答を示した。さらに、期待された通り、免疫抑制活性が天然的に欠けているＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶのＴＭサブユニットに対するＩｇＧ応答は見られたが、一方、免疫抑制二重変異体（実施例１参照）は、ほんの僅かなＩｇＧ応答しか誘起しなかった。
【０３１９】
３．エンベロープタンパク質により誘導される免疫抑制の消失は、不活性化ウイルス粒子のワクチン効力を向上させた：このＩＳＵの抗原性を阻害する作用は、免疫抑制エンベロープタンパク質を含むあらゆるワクチン製剤の効力を低下させる可能性があるのではないか、そしてこれにより、二重変異により誘導されるこの作用の特異的破壊は、ワクチン効力を向上させる可能性があるのではないかと疑われる。
【０３２０】
この仮説を試験するために、野生型および二重変異不活性化ウイルス粒子で、または、無傷二重変異ウイルス粒子で免疫化されたマウスに、無傷野生型ＦＶで攻撃した。その後、血清ウイルス負荷量を、攻撃の５日後の極大ウイルス血症時にアッセイした（図１５）。
【０３２１】
ウイルスは、野生型不活性化ＦＶで免疫化された全てのマウスにおいて検出可能であったが、幾何学的平均ウイルス負荷量は、アジュバントのみで免疫化された対照マウスよりも５０倍低く、このことから、野生型粒子での免疫化により有意ではあるが不完全な防御が付与されたことが示された。これに対し、非免疫抑制不活性化二重変異体ＦＶで免疫化された１４中６匹のマウスのウイルス負荷量は、アッセイの検出閾値未満であり、幾何学的平均ウイルス負荷量は、アジュバントのみで免疫化されたマウスに対して７５００倍低かった。さらに、無傷非免疫抑制二重変異体ＦＶで免疫化された１４中１２匹のマウスのウイルス負荷量は、検出閾値未満であり、幾何学的平均ウイルス負荷量も、検出閾値未満であった。
【０３２２】
これらの結果により、エンベロープタンパク質の正統的な機能（したがって構造）を保存している変異による免疫抑制の破壊は、このようなタンパク質に基づいたワクチン製剤の効力を向上させることが示された。
【０３２３】
実施例３
方法
マウスおよび細胞株：８〜１２週令のＣ５７ＢＬ／６およびＳＣＩＤマウスを、Janvier（フランス）から入手した。Ｂ１６（Ｃ５７ＢＬ／６起源のネズミメラノーマ細胞株、ＥＡＣＣ  ９４０４２２５４）および２９３Ｔ（ヒト胚腎細胞、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１１２６８）を、熱で不活性化された１０％ウシ胎児血清および抗生物質の補充されたＤＭＥＭ中で維持した。
【０３２４】
作成：ｐｌｎｃｘ由来のｐｌｎｃｘＨ１発現ベクター（MillerおよびRosman Biotechniques 1989;7:989-90）およびｐＳＵＰＥＲ（Brummelkampら、Science 2002;296:550-3）ベクターを作成し、ＭｅｌＡＲＶ（開始コドンから１２２０〜１２３８のｎｔ位置のｇａｇ配列内のゲノム転写物に標的化）に対して、または対照としての緑色蛍光タンパク質転写物（開始コドンから２１５〜２３３のｎｔ位置）に対して指向される短い転写物を作成した。それらは、最初に、アニーリングした６４ｍｅｒのオリゴヌクレオチド（図１Ｂの配列）を、ＢｇｌＩＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位で開裂したｐＳＵＰＥＲに挿入し、その後、これらの構造物に由来するＢａｍＨＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片を、対応する部位で開裂したｐｌｎｃｘに導入することにより得られた。ＭｅｌＡＲＶウイルスＲＮＡから作成したＲＴ−ＰＣＲ産物を、エンベロープ５’末端においてＡｇｅＩ含有プライマーおよびエンベロープ３’末端においてＸｈｏＩ含有プライマーを使用して、同部位で開裂したヒグロマイシン含有ｐＤＦＧベクター（MangeneyおよびHeidmann Proc Natl Acad Sci USA 1998:95:14920-14925）に導入する（または導入しない）ことにより、ＭｅｌＡＲＶエンベロープ（ｐＤＦＧ  ＭｅｌＡＲＶｅｎｖ）および対照（ｐＤＦＧ  なし）用の発現ベクターを作成した。
【０３２５】
ＥＲＶＫＤＢ１６腫瘍細胞の確立：７．５×１０５個の２９３Ｔ細胞を、ｐｌｎｃｘＨ１ベクター（１．７５μｇ）およびＭＬＶタンパク質用の発現ベクター（両種指向性ＭＬＶエンベロープベクターに関しては０．５５μｇ、ＭＬＶ  ｇａｇおよびｐｏｌベクターに関しては１．７５μｇ、Blaiseら、J Virol 2004;78:1050-1054参照）を用いて同時トランスフェクトした。トランスフェクションから３６時間後、ウイルス上清を、Ｂ１６腫瘍細胞の感染のために回収した（５×１０５個の細胞あたり２．５ｍｌの上清、８μｇ／ｍｌのポリブレンを含む）。細胞を、選択培地（１ｍｇ／ｍｌのネオマイシン）に３週間維持した。いくつかの実験において、ｐＤＦＧ  ＭｅｌＡＲＶｅｎｖ発現ベクター（または対照ｐＤＦＧ  なし）を、同じプロトコルを使用して細胞に追加的に導入し、感染細胞を、３００単位／ｍｌのヒグロマイシンで選択した。
【０３２６】
ＭｅｌＡＲＶタンパク質の発現：ＭｅｌＡＲＶ発現の解析は、ウェスタンブロット解析により行なった。１０７個の細胞の上清を回収し、１００×ｇで１０分間かけて遠心分離にかけ、ろ過し、ＳＷ４１ベックマンローター（１５０，０００×ｇ、１時間、４℃）での超遠心分離により濃縮した。ペレットを、溶解緩衝液に再懸濁し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにかけ、ブロットし、抗Ｅｎｖ  ｍＡｂ（Ciancoloら、J Exp Med 1984;159:964-969）および抗Ｇａｇヤギ血清（Viromed Biosafety Labs）を用いて判別した。
【０３２７】
インビトロでの形質転換アッセイ：対照Ｂ１６細胞およびＥＲＶＫＤ−Ｂ１６細胞の両方を、軟寒天に蒔き、足場依存的増殖の効率を判定した。細胞（２×１０３または２×１０４）を、１０％ウシ胎児血清の補充されたＤＭＥＭ中０．５％寒天の固層上に重層された、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ中０．３３％の寒天５ｍｌに蒔いた。培養を、４週間維持し、コロニーをＩＮＴ溶液（シグマ・アルドリッチ製）で染色し、その後、計測した。
【０３２８】
インビボでの腫瘍進行：インビボでのアッセイのために、腫瘍細胞を、３回ＰＢＳで洗浄し、トリプシン処理をせずに剥がし、マウスの右側腹部の剃られた領域に皮下接種した。腫瘍確立は、触診により判定し、垂直の腫瘍直径を測定することにより腫瘍面積を判定した。
【０３２９】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の精製および同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスへの養子移入：ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、１７日前に２×１０５個のＢ１６細胞の移植されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾臓から新しく単離した。細胞を、ＭＡＣＳ磁気ビーズ（マウス調節Ｔ細胞単離キット、Miltenyi Biotech）を使用して、製造業者の指示にしたがって、陰性および陽性選択の２ステップ手順により精製した。５万個の精製リンパ球を、未処置Ｃ５７ＢＬ／６マウスの静脈内に導入した。レシピエントマウスの右側腹部に、同じ日に、２×１０５個の対照Ｂ１６細胞またはＥＲＶＫＤＢ１６細胞で攻撃した。
【０３３０】
結果
１．ＥＲＶのノックダウンにより、Ｂ１６メラノーマ細胞の形質転換された表現型は改変されなかった。
ＭｅｌＡＲＶエレメントのウイルスゲノムおよび対照としての関係ないｇｆｐ遺伝子に対して指向される短い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を産生する安定なベクターに基づく、ＲＮＡ干渉アプローチを使用した。使用されたプラスミドの手順および構造の原理は、図１６Ａ〜１６Ｂに示した。図１６Ｃにより、ＥＲＶ特異的ｄｓＲＮＡベクターは、形質導入Ｂ１６細胞（ＥＲＶＫＤＢ１６細胞）におけるＥＲＶ発現をほぼ完全に消失させ、対照の形質導入細胞（対照Ｂ１６細胞）に対して、ＥｎｖおよびＧａｇウイルスタンパク質の両方の量の１０倍を超える低下をもたらしたことが明確に示された。次のステップとして、ＥＲＶＫＤＢ１６細胞および対照Ｂ１６細胞の形質転換表現型を、インビトロおよびインビボの両方でアッセイした。インビトロでの足場依存的増殖速度を、半固体培地に撒いた後に測定した（軟寒天アッセイ）。図１７Ａに示されているように、ＥＲＶＫＤＢ１６細胞株は、対照Ｂ１６細胞と類似したコロニー数を生じた。インビボでの２個の細胞個体群の増殖速度を、Ｘ線照射マウスまたはＳＣＩＤマウスに移植した後に解析した。図１７Ｂに示されているように、両方の細胞個体群が、類似の増殖速度を有する形質転換表現型を有していた。共に、これらの結果により、ＭｅｌＡＲＶ内因性レトロウイルスのノックダウンは、メラノーマ細胞の形質転換状態に対して全く効果を及ぼさないことが示された。
【０３３１】
２．ＥＲＶのノックダウンは、インビボでＢ１６腫瘍細胞の増殖を阻害し、免疫応答性を有する宿主の生存率を高めた。
腫瘍細胞が、インビボで、ＥＲＶ依存的機序を通じた抗腫瘍応答を圧倒する可能性があるかどうかについて調べるために、本発明者らは、Ｃ５７ＢＬ／６免疫応答性マウスに対照Ｂ１６細胞およびＥＲＶＫＤＢ１６細胞を注射することにより、腫瘍進行に対する、ＭｅｌＡＲＶのノックダウンの影響を探索した。図１８Ａに示されているように、期待された通り、対照Ｂ１６細胞の増殖により、大半の動物において大きな腫瘍がもたらされ、一方、ＥＲＶＫＤＢ１６細胞により、小さなサイズの腫瘍が、少数の移植マウスだけに生じた。腫瘍細胞の増殖の差異はまた、動物生存率の程度によっても明確に実証され（図１８Ｂ）：早くも７０日後に、対照Ｂ１６細胞の移植されたマウスの９０％がその腫瘍により死滅し、一方、ＥＲＶＫＤＢ１６細胞の移植されたマウスの８０％が生存し腫瘍を有していなかった（依然として１３０日後までそうであった）。観察された効果に関与するＭｅｌＡＲＶ遺伝子を同定する試みにおいて、ＭｅｌＡＲＶｅｎｖ遺伝子のみのための発現ベクター（ｄｓＲＮＡ標的化配列を欠失）を、ＥＲＶＫＤＢ１６細胞に戻して導入した。その後、得られた二重形質導入ＥＲＶＫＤ＋ｅｎｖ（または対照）Ｂ１６細胞を、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに移植した。図１８Ｃに示されているように、これによりノックダウン効果は部分的に復帰し、Ｅｎｖ発現細胞の移植されたマウスの５０％がすでに７０日後に死滅していた。この復帰により、ｅｎｖ遺伝子が、少なくとも部分的に、腫瘍免疫回避に関与していることが示された。復帰の一部の効果は、外因性ベクターにより発現された場合のＥｎｖタンパク質の発現の低さにより説明される可能性が最も高かった（図１９）。
【０３３２】
この方向に沿って、ＭｅｌＡＲＶに標的化され、免疫応答性を有するマウスにＢ１６細胞が移植された１２日後に腹腔内注射された、合成ｓｉＲＮＡを使用した最初のシリーズの実験により、実際に、対照ｓｉＲＮＡを注射されたマウスに対して、腫瘍増殖が１／３阻害され（図２０Ａ）、補足図２０Ｂで示されているように、再現的に生存延命率が増加したことは興味深い。
【０３３３】
本データにより、腫瘍は、ＥＲＶのエンベロープを発現することにより免疫系を圧倒し、ＥＲＶ発現を遮断することにより腫瘍拒絶が増強されることが実証された。
【０３３４】
ヒトにおいて、主に胎盤および精巣の正常組織に限定されるＥＲＶｅｎｖ遺伝子の発現は、精上皮腫およびメラノーマなどの数種類の腫瘍においても観察できることが特筆される。このようなＨＥＲＶ  ＥＮＶタンパク質は、免疫抑制性であることが示されている。それ故、これらのＥＮＶタンパク質の発現または活性を阻害することは、ＥＮＶ発現腫瘍に対する免疫応答を増強するための見込みあるアプローチである。このような腫瘍ＥＮＶタンパク質活性の阻害は、例えば、本発明に記載の免疫抑制活性の欠失した変異ＥＮＶタンパク質を用いた予防的もしくは治療的ワクチン接種により誘起される免疫応答により、または、腫瘍ＥＮＶタンパク質に直接結合する化合物により行なうことができる。
【図面の簡単な説明】
【０３３５】
【図１Ａ】ＭｏＭＬＶのｅｎｖ核酸を含むベクターまたはそれから得られるポリペプチドの図。これらのベクターに含まれる核酸は、ＭｏＭＬＶの野生型エンベロープタンパク質（ｅｎｖＭｏＭＬＶ）またはＸ１および／またはＸ２をコードするコドンの置換によりそれから得られた本発明のポリペプチドをコードしている。図１Ａは、ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＭＯＭＬＶベクターを示す。図１Ｂは、ｐＤＦＧ−ｅｎｖＭｏＭＬＶ−ｉｒｅｓＨｙｇｒｏベクターを示す。
【図１Ｂ】ＭｏＭＬＶのｅｎｖ核酸を含むベクターまたはそれから得られるポリペプチドの図。これらのベクターに含まれる核酸は、ＭｏＭＬＶの野生型エンベロープタンパク質（ｅｎｖＭｏＭＬＶ）またはＸ１および／またはＸ２をコードするコドンの置換によりそれから得られた本発明のポリペプチドをコードしている。図１Ａは、ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＭＯＭＬＶベクターを示す。図１Ｂは、ｐＤＦＧ−ｅｎｖＭｏＭＬＶ−ｉｒｅｓＨｙｇｒｏベクターを示す。
【図２Ａ】ＭＰＭＶのｅｎｖ核酸を含むベクターまたはそれから得られるポリペプチドの図。これらのベクターに含まれる核酸は、ＭＰＭＶの野生型エンベロープタンパク質（ｅｎｖＭＰＭＶ）またはＸ１および／またはＸ２をコードするコドンの置換によりそれから得られた本発明のポリペプチドをコードしている。図２Ａは、ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＭＰＭＶベクターを示す。図２Ｂは、ｐＤＦＧ−ｅｎｖＭＰＭＧ−ｉｒｅｓＨｙｇｒｏベクターを示す。
【図２Ｂ】ＭＰＭＶのｅｎｖ核酸を含むベクターまたはそれから得られるポリペプチドの図。これらのベクターに含まれる核酸は、ＭＰＭＶの野生型エンベロープタンパク質（ｅｎｖＭＰＭＶ）またはＸ１および／またはＸ２をコードするコドンの置換によりそれから得られた本発明のポリペプチドをコードしている。図２Ａは、ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＭＰＭＶベクターを示す。図２Ｂは、ｐＤＦＧ−ｅｎｖＭＰＭＧ−ｉｒｅｓＨｙｇｒｏベクターを示す。
【図３Ａ】ＨＥＲＶ−ＷのＨＥＲＶ−Ｗ核酸を含むベクターまたはそれから得られたポリペプチドの図。これらのベクターに含まれる核酸は、野生型エンベロープタンパク質Ｗ（ｅｎｖＷ）またはＸ１および／またはＸ２をコードするコドンの置換によりそれから得られる本発明のポリペプチドをコードしている。図３Ａは、ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＷベクターを示す。図３Ｂは、ｐＤＦＧ−ｅｎｖＷ−ｉｒｅｓＨｙｇｒｏベクターを示す。
【図３Ｂ】ＨＥＲＶ−ＷのＨＥＲＶ−Ｗ核酸を含むベクターまたはそれから得られたポリペプチドの図。これらのベクターに含まれる核酸は、野生型エンベロープタンパク質Ｗ（ｅｎｖＷ）またはＸ１および／またはＸ２をコードするコドンの置換によりそれから得られる本発明のポリペプチドをコードしている。図３Ａは、ｐｈＣＭＶ−ｅｎｖＷベクターを示す。図３Ｂは、ｐＤＦＧ−ｅｎｖＷ−ｉｒｅｓＨｙｇｒｏベクターを示す。
【図４】細胞間融合アッセイの図。使用されるベクターは、対象のエンベロープタンパク質（ＳＵおよびＴＭサブユニット）をコードする核酸、ＣＭＶプロモーター、およびポリＡヌクレオチドエレメント（ｐＡ）を含む。
【図５】エンベロープを発現する腫瘍細胞の確立およびインビボアッセイの図。使用されるベクターは、対象のエンベロープタンパク質をコードする核酸（ｅｎｖ）、ヒグロマイシン遺伝子（ｈｙｇｒｏ）、およびＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を含む。白いボックスは、ＬＴＲを示し、矢印は、転写開始を示す。
【図６】感染性特性アッセイの結果１〜１２の数字は、本明細書に使用される株を意味する。この図は、野生型（ｗｔ）または本発明に記載の変異エンベロープタンパク質の感染の結果を示す。
【図７】免疫抑制特性アッセイの結果この図は、同種ｂａｌｂ／ｃマウスに注入された場合の、エンベロープを発現しているＭＣＡ２０５細胞の免疫抑制特性アッセイの結果を示す。挿入図には、同系Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに注入された、エンベロープタンパク質を発現しているＭＣＡ２０５細胞の結果が示されている。黒棒は、ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質を示し、一方、白棒は、ＭＰＭＶエンベロープタンパク質を示し、陰影のついた棒は、二重変異体（Ｒ４４Ｑ＋Ｆ５０Ａ）ＨＥＲＶ−Ｗエンベロープタンパク質を示す。
【図８】ＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶタンパク質のＴＭサブユニットの構造設計図この構造設計図は、免疫抑制モデュレートリー配列のアルギニン（Ｘ１）およびフェニルアラニン（Ｘ２）アミノ酸残基、並びに、このような特性に関与していない２個のアミノ酸残基（アラニンおよびトレオニン）の位置を示す。
【図９】様々なウイルスおよびＨＥＲＶの免疫抑制モデュレートリー配列の例最初の列は、ウイルスまたはＨＥＲＶの一般名を示し、第二列は、ウイルスまたはＨＥＲＶの起源を示し、第三列は、同定された免疫抑制モデュレートリー配列のヌクレオチド配列（１文字アミノ酸を使用）を示し、最後の列は、エンベロープタンパク質のアクセッション番号を示す。Ｘ１およびＸ２アミノ酸残基は、太文字で示されている。
【図１０】野生型エンベロープタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列。アミノ酸配列中の、Ｘ１およびＸ２の位置に下線を付けている。ＡおよびＢは、ＭｏＭＬＶのエンベロープタンパク質のヌクレオチドおよびタンパク質配列を示し、ＣおよびＤは、ＭＰＭＶのエンベロープタンパク質のヌクレオチドおよびタンパク質配列を示し、ＥおよびＦは、ＨＥＲＶ−Ｗのエンベロープタンパク質（ｅｎｖＷ）のヌクレオチドおよびタンパク質配列を示す。ヌクレオチド配列（Ａ、Ｃ、およびＥ）は、エンベロープタンパク質のコード配列であり、最初のコドン（ＡＴＧ）は、転写の最初のコドンであり、最後のコドン（ＴＡＧ）は終止コドンである。タンパク質配列（Ｂ、Ｄ、およびＦ）では、最初のアミノ酸文字コードが使用されている。最初のＭは、タンパク質の最初のメチオニンを示し、記号「＊」は、終止コドンを示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃ：免疫抑制欠陥ＦＶエンベロープタンパク質のインビトロでの特性。図１１Ａ、標的としてＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した、ＭＬＶウイルス偽型の表面上に発現された、ＦＶ野生型（ｗｔ）エンベロープタンパク質、Ｅ１４Ｒ変異エンベロープタンパク質、Ａ２０Ｆ変異エンベロープタンパク質、およびＥ１４Ｒ＋Ａ２０Ｆ二重変異（ＤＭ）エンベロープタンパク質の感染性。縦軸は、感染性を示す（ｆｆｕ／ｍｌ）。図１１Ｂ、野生型（ｗｔ）および二重変異（ＤＭ）ＦＶエンベロープタンパク質のインビボでの免疫抑制活性（横軸、免疫抑制指数）。図１１Ｃ、インビトロでの、標的としてＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を使用した、野生型（黒丸）ＦＶビリオンと免疫抑制欠陥（灰色の丸）ＦＶビリオンの増殖速度の比較。細胞上清のウイルス負荷量（縦軸、ＲＮＡコピー数／ｍＬ）が、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりアッセイされている。横軸は、感染後の日数を示す。白丸は、対照を示す。
【図１１Ｂ】図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃ：免疫抑制欠陥ＦＶエンベロープタンパク質のインビトロでの特性。図１１Ａ、標的としてＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した、ＭＬＶウイルス偽型の表面上に発現された、ＦＶ野生型（ｗｔ）エンベロープタンパク質、Ｅ１４Ｒ変異エンベロープタンパク質、Ａ２０Ｆ変異エンベロープタンパク質、およびＥ１４Ｒ＋Ａ２０Ｆ二重変異（ＤＭ）エンベロープタンパク質の感染性。縦軸は、感染性を示す（ｆｆｕ／ｍｌ）。図１１Ｂ、野生型（ｗｔ）および二重変異（ＤＭ）ＦＶエンベロープタンパク質のインビボでの免疫抑制活性（横軸、免疫抑制指数）。図１１Ｃ、インビトロでの、標的としてＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を使用した、野生型（黒丸）ＦＶビリオンと免疫抑制欠陥（灰色の丸）ＦＶビリオンの増殖速度の比較。細胞上清のウイルス負荷量（縦軸、ＲＮＡコピー数／ｍＬ）が、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりアッセイされている。横軸は、感染後の日数を示す。白丸は、対照を示す。
【図１１Ｃ】図１１Ａ、図１１Ｂ、および図１１Ｃ：免疫抑制欠陥ＦＶエンベロープタンパク質のインビトロでの特性。図１１Ａ、標的としてＮＩＨ３Ｔ３細胞を使用した、ＭＬＶウイルス偽型の表面上に発現された、ＦＶ野生型（ｗｔ）エンベロープタンパク質、Ｅ１４Ｒ変異エンベロープタンパク質、Ａ２０Ｆ変異エンベロープタンパク質、およびＥ１４Ｒ＋Ａ２０Ｆ二重変異（ＤＭ）エンベロープタンパク質の感染性。縦軸は、感染性を示す（ｆｆｕ／ｍｌ）。図１１Ｂ、野生型（ｗｔ）および二重変異（ＤＭ）ＦＶエンベロープタンパク質のインビボでの免疫抑制活性（横軸、免疫抑制指数）。図１１Ｃ、インビトロでの、標的としてＮＩＨ  ３Ｔ３細胞を使用した、野生型（黒丸）ＦＶビリオンと免疫抑制欠陥（灰色の丸）ＦＶビリオンの増殖速度の比較。細胞上清のウイルス負荷量（縦軸、ＲＮＡコピー数／ｍＬ）が、定量的ＲＴ−ＰＣＲによりアッセイされている。横軸は、感染後の日数を示す。白丸は、対照を示す。
【図１２Ａ】図１２Ａおよび図１２Ｂ：インビボでのＦＶ感染時におけるエンベロープにより駆動される免疫抑制の消失の効果。野生型ＦＶ（黒丸）または非免疫抑制変異体ＦＶ（灰色の丸）の注入後の照射（図１２Ａ）および非照射（図１２Ｂ）スイスマウスの血清ウイルス負荷量（縦軸、ＲＮＡコピー数／ｍＬ）。ＰＢＳ注入マウスのシグナルは、検出閾値より低かった（白丸）。横軸は、注入後の日数を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａおよび図１２Ｂ：インビボでのＦＶ感染時におけるエンベロープにより駆動される免疫抑制の消失の効果。野生型ＦＶ（黒丸）または非免疫抑制変異体ＦＶ（灰色の丸）の注入後の照射（図１２Ａ）および非照射（図１２Ｂ）スイスマウスの血清ウイルス負荷量（縦軸、ＲＮＡコピー数／ｍＬ）。ＰＢＳ注入マウスのシグナルは、検出閾値より低かった（白丸）。横軸は、注入後の日数を示す。
【図１３】感染マウスにおけるＦＶの免疫学的検出。野生型ＦＶ（黒丸および黒線）、非免疫抑制変異体ＦＶ（灰色の丸および灰色の線）またはＰＢＳ（白丸および点線）の注入されたマウスの血清中の、ＦＶエンベロープタンパク質のＳＵサブユニットに対して指向されるＩｇＧを定量した（縦軸、任意の単位）。線は、ＩｇＧ水準の幾何学的平均を示す。横軸は、注入後の日数を示す。
【図１４Ａ】図１４Ａおよび図１４Ｂ：野生型および非免疫抑制変異体ＦＶエンベロープタンパク質の抗原性。図１４Ａ、ＦＶエンベロープタンパク質の組換えＴＭサブユニット（左）またはＵＶで不活性化されたＦＶウイルス粒子（右）を注入されたマウスの血清中の、ＦＶエンベロープタンパク質のＴＭサブユニットに指向されるＩｇＭおよびＩｇＧを定量した。黒：野生型ＦＶ；灰色：非免疫抑制変異体ＦＶ；白：アジュバントのみ。５（左）または１４（右）匹のスイスマウスの平均±標準偏差。縦軸は、任意の単位（ａ．ｕ．）の抗ＴＭ  ＥＬＩＳＡシグナルを示す。図１４Ｂ、実施例１に記載のようなＭｏＭＬＶ（左）およびＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶ（右）の野生型（ｗｔ）または二重変異体（ｄｍ）組換えＴＭサブユニットを注入されたマウスを用いて図１４Ａと同様。縦軸は、ＩｇＧ水準（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
【図１４Ｂ】図１４Ａおよび図１４Ｂ：野生型および非免疫抑制変異体ＦＶエンベロープタンパク質の抗原性。図１４Ａ、ＦＶエンベロープタンパク質の組換えＴＭサブユニット（左）またはＵＶで不活性化されたＦＶウイルス粒子（右）を注入されたマウスの血清中の、ＦＶエンベロープタンパク質のＴＭサブユニットに指向されるＩｇＭおよびＩｇＧを定量した。黒：野生型ＦＶ；灰色：非免疫抑制変異体ＦＶ；白：アジュバントのみ。５（左）または１４（右）匹のスイスマウスの平均±標準偏差。縦軸は、任意の単位（ａ．ｕ．）の抗ＴＭ  ＥＬＩＳＡシグナルを示す。図１４Ｂ、実施例１に記載のようなＭｏＭＬＶ（左）およびＨＥＲＶ−Ｗ  ＥＮＶ（右）の野生型（ｗｔ）または二重変異体（ｄｍ）組換えＴＭサブユニットを注入されたマウスを用いて図１４Ａと同様。縦軸は、ＩｇＧ水準（ｎｇ／ｍＬ）を示す。
【図１５】ワクチン接種アッセイ。図１５は、ＵＶで不活性化された野生型または非免疫抑制二重変異体フレンドウイルス（ＦＶ）を、あるいは、無傷の非免疫抑制二重変異体フレンドウイルス（ＦＶ）を、あるいは、ＣｐＧアジュバントのみを用いて免疫化され、野生型ＦＶで攻撃されたマウスのウイルス負荷量（縦軸、血清１ｍＬあたりのＲＮＡコピー数）を示す。免疫化は、攻撃の、１日前、７日前、１４日前、および２１日前に行ない、対応するウイルス負荷量は、灰色の点で示される。攻撃５日後のウイルス負荷量は、黒い点として示される。検出閾値は、２×１０３個のＲＮＡコピー／ｍＬの横線として示される。グラフの上には、攻撃５日後の検出水準未満のウイルス負荷量を有するマウスの数および比率が示されている。横棒は、ウイルス負荷量の幾何学的平均を示す。
【図１６Ａ】図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃ：アッセイのノックダウン手順および理論。図１６Ａは、ＥＲＶ発現をノックダウンする手順を示し、ｐＳＵＰＥＲベクターを使用してｐｌｎｃｖに由来するベクターを作成し、Ｈ１−ＲＮＡプロモーターの制御下で、ＲＮＡ干渉のための短い二本鎖転写物を産生した。Ｂ１６細胞を、これらの発現ベクターを用いて形質導入し、Ｇ４１８選択にかけ、得られたＥＲＶＫＤおよび対照Ｂ１６細胞を、マウスの側腹部に皮下注射し、その腫瘍増殖をモニタリングした。図１６Ｂ、ＥＲＶおよび対照（ｇｆｐ）ベクターにより生じるｄｓＲＮＡの予測される構造；数字は、それぞれの標的化配列内のｎｔ位置を意味する（方法を参照）。図１６Ｃ、ＥＲＶノックダウン（ＥＲＶＫＤ）および対照細胞の上清中のＧａｇ（抗Ｇａｇ）およびＥｎｖ（抗Ｅｎｖ）発現のウェスタンブロット解析。分子量が、図の両側に示されている。
【図１６Ｂ】図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃ：アッセイのノックダウン手順および理論。図１６Ａは、ＥＲＶ発現をノックダウンする手順を示し、ｐＳＵＰＥＲベクターを使用してｐｌｎｃｖに由来するベクターを作成し、Ｈ１−ＲＮＡプロモーターの制御下で、ＲＮＡ干渉のための短い二本鎖転写物を産生した。Ｂ１６細胞を、これらの発現ベクターを用いて形質導入し、Ｇ４１８選択にかけ、得られたＥＲＶＫＤおよび対照Ｂ１６細胞を、マウスの側腹部に皮下注射し、その腫瘍増殖をモニタリングした。図１６Ｂ、ＥＲＶおよび対照（ｇｆｐ）ベクターにより生じるｄｓＲＮＡの予測される構造；数字は、それぞれの標的化配列内のｎｔ位置を意味する（方法を参照）。図１６Ｃ、ＥＲＶノックダウン（ＥＲＶＫＤ）および対照細胞の上清中のＧａｇ（抗Ｇａｇ）およびＥｎｖ（抗Ｅｎｖ）発現のウェスタンブロット解析。分子量が、図の両側に示されている。
【図１６Ｃ】図１６Ａ、図１６Ｂ、および図１６Ｃ：アッセイのノックダウン手順および理論。図１６Ａは、ＥＲＶ発現をノックダウンする手順を示し、ｐＳＵＰＥＲベクターを使用してｐｌｎｃｖに由来するベクターを作成し、Ｈ１−ＲＮＡプロモーターの制御下で、ＲＮＡ干渉のための短い二本鎖転写物を産生した。Ｂ１６細胞を、これらの発現ベクターを用いて形質導入し、Ｇ４１８選択にかけ、得られたＥＲＶＫＤおよび対照Ｂ１６細胞を、マウスの側腹部に皮下注射し、その腫瘍増殖をモニタリングした。図１６Ｂ、ＥＲＶおよび対照（ｇｆｐ）ベクターにより生じるｄｓＲＮＡの予測される構造；数字は、それぞれの標的化配列内のｎｔ位置を意味する（方法を参照）。図１６Ｃ、ＥＲＶノックダウン（ＥＲＶＫＤ）および対照細胞の上清中のＧａｇ（抗Ｇａｇ）およびＥｎｖ（抗Ｅｎｖ）発現のウェスタンブロット解析。分子量が、図の両側に示されている。
【図１７Ａ】図１７Ａおよび図１７Ｂ：ノックダウン細胞は、形質転換された表現型を保存している。図１７Ａ、軟寒天アッセイを使用した形質転換された表現型のインビトロでの解析。左パネル、ＥＲＶＫＤ（右のプレート）および対照Ｂ１６（左のプレート）細胞（２×１０３または２×１０４）を、４週間、半固体層に蒔き、その後、コロニーの数を計測した（右パネル）。図１７Ｂ、インビボでの、免疫不適格マウスを使用した、形質転換された表現型のアッセイ。ＥＲＶＫＤおよび対照Ｂ１６細胞（２×１０５）を、Ｘ線照射（５Ｇｙ）Ｃ５７Ｂｌ／６（左パネル）またはＳＣＩＤマウス（右パネル）の側腹部に皮下注射し（１群あたり５匹のマウスを用いて２〜５回の独立した実験）、腫瘍増殖を、腫瘍面積を測定することにより時間（横軸、注射後の日数）の関数として判定した。
【図１７Ｂ】図１７Ａおよび図１７Ｂ：ノックダウン細胞は、形質転換された表現型を保存している。図１７Ａ、軟寒天アッセイを使用した形質転換された表現型のインビトロでの解析。左パネル、ＥＲＶＫＤ（右のプレート）および対照Ｂ１６（左のプレート）細胞（２×１０３または２×１０４）を、４週間、半固体層に蒔き、その後、コロニーの数を計測した（右パネル）。図１７Ｂ、インビボでの、免疫不適格マウスを使用した、形質転換された表現型のアッセイ。ＥＲＶＫＤおよび対照Ｂ１６細胞（２×１０５）を、Ｘ線照射（５Ｇｙ）Ｃ５７Ｂｌ／６（左パネル）またはＳＣＩＤマウス（右パネル）の側腹部に皮下注射し（１群あたり５匹のマウスを用いて２〜５回の独立した実験）、腫瘍増殖を、腫瘍面積を測定することにより時間（横軸、注射後の日数）の関数として判定した。
【図１８Ａ】図１８Ａ、図１８Ｂ、および図１８Ｃ：ＥＲＶノックダウン時の腫瘍細胞増殖の阻害およびマウス生存率の上昇。図１８Ａ、免疫適格性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに移植された、対照Ｂ１６細胞（黒点）およびＥＲＶＫＤＢ１６細胞（白点）の腫瘍細胞増殖（１群あたり２２匹のマウス；図１７Ｂと同じ実験条件）。腫瘍面積（縦軸、ｍｍ２）は、時間の関数（横軸、注射後の日数）として測定される。図１８Ｂ、時間（横軸、注射後の日数）の関数としての、対照（黒点）およびＥＲＶＫＤＢ１６細胞（白点）を移植されたマウス（１群あたり１０匹）の中の生存動物の比率（縦軸）。図１８Ｃ、時間（横軸、注射後の日数）の関数としての、ＭｅｌＡＲＶ  ｅｎｖ形質導入ＥＲＶＫＤＢ１６細胞（灰色の点）およびＥＲＶＫＤＢ１６細胞（白点）を移植されたマウス間の生存動物（１群あたり１０匹）の比率（縦軸）。
【図１８Ｂ】図１８Ａ、図１８Ｂ、および図１８Ｃ：ＥＲＶノックダウン時の腫瘍細胞増殖の阻害およびマウス生存率の上昇。図１８Ａ、免疫適格性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに移植された、対照Ｂ１６細胞（黒点）およびＥＲＶＫＤＢ１６細胞（白点）の腫瘍細胞増殖（１群あたり２２匹のマウス；図１７Ｂと同じ実験条件）。腫瘍面積（縦軸、ｍｍ２）は、時間の関数（横軸、注射後の日数）として測定される。図１８Ｂ、時間（横軸、注射後の日数）の関数としての、対照（黒点）およびＥＲＶＫＤＢ１６細胞（白点）を移植されたマウス（１群あたり１０匹）の中の生存動物の比率（縦軸）。図１８Ｃ、時間（横軸、注射後の日数）の関数としての、ＭｅｌＡＲＶ  ｅｎｖ形質導入ＥＲＶＫＤＢ１６細胞（灰色の点）およびＥＲＶＫＤＢ１６細胞（白点）を移植されたマウス間の生存動物（１群あたり１０匹）の比率（縦軸）。
【図１８Ｃ】図１８Ａ、図１８Ｂ、および図１８Ｃ：ＥＲＶノックダウン時の腫瘍細胞増殖の阻害およびマウス生存率の上昇。図１８Ａ、免疫適格性Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに移植された、対照Ｂ１６細胞（黒点）およびＥＲＶＫＤＢ１６細胞（白点）の腫瘍細胞増殖（１群あたり２２匹のマウス；図１７Ｂと同じ実験条件）。腫瘍面積（縦軸、ｍｍ２）は、時間の関数（横軸、注射後の日数）として測定される。図１８Ｂ、時間（横軸、注射後の日数）の関数としての、対照（黒点）およびＥＲＶＫＤＢ１６細胞（白点）を移植されたマウス（１群あたり１０匹）の中の生存動物の比率（縦軸）。図１８Ｃ、時間（横軸、注射後の日数）の関数としての、ＭｅｌＡＲＶ  ｅｎｖ形質導入ＥＲＶＫＤＢ１６細胞（灰色の点）およびＥＲＶＫＤＢ１６細胞（白点）を移植されたマウス間の生存動物（１群あたり１０匹）の比率（縦軸）。
【図１９】ＥＲＶエンベロープタンパク質検出のための免疫染色。対照、ＥＲＶＫＤ、およびＥＲＶＫＤ＋ｅｎｖＢ１６細胞を、ヤギ抗マウスＦＩＴＣ抗体により明らかとなる９Ｂ６抗体（ＭｅｌＡＲＶエンベロープタンパク質に対して指向；E.Gorelikより贈呈、Cancer Res 1988;48;4954-4958）で標識した（Caltag、Burlingame、米国）。フローサイトメトリー解析を、Facscalibur血球計数器を使用して行なった。計数（縦軸）が、ＥＲＶエンベロープ発現（横軸）の関数として示されている。
【図２０Ａ】図２０Ａおよび図２０Ｂ：インビボでのｓｉＲＮＡの全身投与は、腫瘍細胞の進行を低下させる。図１６Ｂで言及されている、１９ｎｔＥＲＶ（白点）および対照（ｇｆｐ）（黒点）配列に標的化された合成ｓｉＲＮＡは、MWG Biotechから購入した。それらを、２×１０５個のＢ１６細胞の移植された１２日後にマウスの右側腹部に腹腔内注射した（５０μｌのＰＢＳ中に３μｇのｓｉＲＮＡ）。図２０Ａ、腫瘍面積（縦軸、ｍｍ２）は、時間の関数（横軸、腫瘍注入後の日数）として測定され、ｓｉＲＮＡ注入は矢印として示される。図２０Ｂ、生存動物の比率（縦軸）は、時間の関数（横軸、腫瘍注入後の日数）としてモニタリングした（２回の独立した実験において１群あたり５匹のマウス）。
【図２０Ｂ】図２０Ａおよび図２０Ｂ：インビボでのｓｉＲＮＡの全身投与は、腫瘍細胞の進行を低下させる。図１６Ｂで言及されている、１９ｎｔＥＲＶ（白点）および対照（ｇｆｐ）（黒点）配列に標的化された合成ｓｉＲＮＡは、MWG Biotechから購入した。それらを、２×１０５個のＢ１６細胞の移植された１２日後にマウスの右側腹部に腹腔内注射した（５０μｌのＰＢＳ中に３μｇのｓｉＲＮＡ）。図２０Ａ、腫瘍面積（縦軸、ｍｍ２）は、時間の関数（横軸、腫瘍注入後の日数）として測定され、ｓｉＲＮＡ注入は矢印として示される。図２０Ｂ、生存動物の比率（縦軸）は、時間の関数（横軸、腫瘍注入後の日数）としてモニタリングした（２回の独立した実験において１群あたり５匹のマウス）。
【図１Ａ】
2008506357.tif 000061
【図１Ｂ】
2008506357.tif 000062
【図２Ａ】
2008506357.tif 000063
【図２Ｂ】
2008506357.tif 000064
【図３Ａ】
2008506357.tif 000065
【図３Ｂ】
2008506357.tif 000066
【図４】
2008506357.tif 000067
【図５】
2008506357.tif 000068
【図６】
2008506357.tif 000069
【図７】
2008506357.tif 000070
【図８】
2008506357.tif 000071
【図９】
2008506357.tif 000072
【図１０−１】
2008506357.tif 000073
【図１０−２】
2008506357.tif 000074
【図１０−３】
2008506357.tif 000075
【図１０−４】
2008506357.tif 000076
【図１１Ａ】
2008506357.tif 000077
【図１１Ｂ】
2008506357.tif 000078
【図１１Ｃ】
2008506357.tif 000079
【図１２Ａ】
2008506357.tif 000080
【図１２Ｂ】
2008506357.tif 000081
【図１３】
2008506357.tif 000082
【図１４Ａ】
2008506357.tif 000083
【図１４Ｂ】
2008506357.tif 000084
【図１５】
2008506357.tif 000085
【図１６Ａ】
2008506357.tif 000086
【図１６Ｂ】
2008506357.tif 000087
【図１６Ｃ】
2008506357.tif 000088
【図１７Ａ】
2008506357.tif 000089
【図１７Ｂ】
2008506357.tif 000090
【図１８Ａ】
2008506357.tif 000091
【図１８Ｂ】
2008506357.tif 000092
【図１８Ｃ】
2008506357.tif 000093
【図１９】
2008506357.tif 000094
【図２０Ａ】
2008506357.tif 000095
【図２０Ｂ】
2008506357.tif 000096
【配列表】
2008506357000001.app
【国際調査報告】
2008506357.tif 000097
2008506357.tif 000098
2008506357.tif 000099
2008506357.tif 000100