(57)【要約】  ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６に４０％より大きなＤＮＡ配列相同性を持つビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を含んでいる共生組成物であって、ここで、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６は、コテクシオン  ナシオナール  ドゥ  キュルテュール  ドゥ  ミクロオルガニスム（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、ＣＮＣＭ、パスツール研究所）に、２００４年１２月９日に寄託されたものであり、寄託番号ＣＮＣＭ１−３３４２を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、パストゥール研究所）において２００４年１２月９日寄託番号ＣＮＣＭ１−３３４２をもって寄託されたビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６、またはこれの、相同体、子孫、あるいは突然変異体。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６に対する４０％よりも大きいＤＮＡ配列相同性を持ち、ここでビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６がＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、パストゥール研究所）において２００４年１２月９日寄託番号ＣＮＣＭ１−３３４２をもって寄託された、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株。
【請求項３】
請求項１もしくは請求項２において定義されたとおりのビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と１種以上の許容可能な賦形剤とを含んでいる、共生組成物。
【請求項４】
前記組成物が、食品製品である、請求項３において定義されたとおりの共生組成物。
【請求項５】
前記食品製品が、発酵乳、植物乳、豆乳、バター、チーズ、およびヨーグルトから選択された、酪農主体の製品である、請求項４において定義されたとおりの共生組成物。
【請求項６】
請求項１もしくは請求項２において定義されたとおりの、治療物質としての使用用の、特に、消化管疾患（例えば下痢）、癌、コレステロール過剰、アレルギー、および感染の処置および／または予防における、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株。
【請求項７】
請求項１もしくは請求項２において定義されたとおりのビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の、前記疾患の処置および／または予防用の医薬品の調製における使用。
【請求項８】
請求項１もしくは請求項２において定義されたとおりのビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を、更なる治療剤（１種もしくは複数種）と一緒に含んでいる組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属しているバクテリウム、該バクテリウムを含んでいる共生組成物、特に食品製品、および、消化管疾患処置におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ビフィドバクテリア（もしくはビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属に属しているバクテリア）が、ヒトおよび動物の糞叢の最も重要な集団の１つを構成する。一般的に、これらのバクテリアが高い割合において糞叢中において存在している場合、良好な健康の指標であると考えられている。この理由により、これらは、共生バクテリアとして知られている（生きて摂取された場合、腸叢の天然のバランスを向上させる有益微生物）。既知のビフィドバクテリアの例は、Ｂ．アドレセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）、Ｂ．アニマリス（Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ）、Ｂ．ビフィドゥム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）、Ｂ．ブレベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）、Ｂ．カテヌラトゥム（Ｂ．ｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）、およびＢ．ロングム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）を包含し、これらのバクテリアは、有益な、技術（テクノロジー）面での、官能特性、および共生効果を持つと示されている。
【０００３】
ビフィドバクテリアは、発酵乳（”生きているビフィズス菌”入りヨーグルト）における添加剤として最もよく見出されており、これゆえ、経済的に重要な商品を構成する。ミルク産業により選ばれた株は、製造プロセスに対する耐性、および、食品内での生存のような数多くの厳しい要求に見合わなければならない。フランスにおける最も汎用された種は、Ｂ．ａｎｉｍａｌｉｓ亜種ラクティス（ｌａｃｔｉｓ）およびＢ．ａｎｉｍａｌｉｓ亜種ａｎｉｍａｌｉｓであり、これらは、動物起源からの亜種であり、決してヒトから単離されなかった。ビフィドバクテリアの重要さの観点において、食品産業の要求に最適の特性を持っている新種をこの属内で同定する大きな必要性がある。例えば、２００４年、ある１グループが、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  プシュクレロフィルム（ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）を豚盲腸から、同定単離した（Ｓｉｍｐｓｏｎ，ＰＪ．ら、（２００４）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ５４：４０１〜６）。以前に知られたビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種は、２０℃と４６〜４９．５℃との間の温度でだけ成長できていた（Ｂｉａｖａｔｉ，Ｂ．ら、（２０００）、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ５０：１１７〜１３１；Ｄｏｎｇら、（２０００）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ５０Ｐｔ１：１１９〜２５）が、このバクテリアは、全ての以前の種を凌駕する利点を、４〜１０℃において成長していくことにより、実証した。これは、共生組成物には有益であり、これらバクテリアが、その保蔵低温をより生き延びやすく、これゆえ、保蔵寿命を引き延ばすからである。これゆえ、更なるビフィドバクテリア種の同定を求める大きな必要性があり、これらは、独特の（ユニークな）利点を保有するだけでなく、以前に同定されたビフィドバクテリア種の有益さも保持する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
これゆえ、本発明の第１の態様によれば、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、パストゥール研究所）において２００４年１２月９日、寄託番号ＣＮＣＭ１−３３４２をもって寄託されたビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６、またはこれの、相同体、子孫、もしくは突然変異体が提供される。
【０００５】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６の相同体が、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、パストゥール研究所）において２００４年１２月９日、寄託番号ＣＮＣＭ１−３３４２をもって寄託されたビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６（本明細書において以降’ＧＣ５６’と言われる）との４０％よりも大きいＤＮＡ配列相同性を持っているいずれのビフィドバクテリア株を言うと理解されることが、認められる。好ましくは、ＧＣ５６相同体が、ＧＣ５６との５０％よりも大きい相同性を持っているものであり、より好ましくは６０％よりも大きく、最も好ましくは７０％よりも大きく、特に好ましくは８０％よりも大きく、または、最も特に好ましくは９０％よりも大きい（あるいは、上の値のいずれかの間のいずれかの範囲）。配列の相同性が、ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合実験に関して本明細書において記載されたとおりテストされ得ることも、認められる。このような実験は、１６ＳｒＤＮＡもしくはｈｓｐ６０遺伝子の特定の配列の検出を包含することがあり、これらの配列および繋がったエンドヌクレアーゼ制限部位が、ＧＣ５６の検出を可能とする。他の実験が、ＧＣ５６を同定することもあるが、ＥＬＩＳＡ−ＰＣＲおよびＰＣＲ−ＲＦＬＰを包含する。
【０００６】
ＧＣ５６は、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  クルディラクティス（ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ）と呼ばれる新種のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を代表する。これら用語、ＧＣ５６、ＧＣ５６群（グループ）、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＣ５６、およびＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓが、互換的に使用されており、この新種のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）を言う。
【０００７】
本明細書において論じられるＧＣ５６株の例は、ＦＲ６２／ｂ／３、ＦＲ５９／ｂ／２、およびＦＲ４７／３を包含する。これらの株の１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列が、ＧｅｎＢａｎｋにおいて寄託されており、寄託番号：
ＡＹ９５２４４９（配列ＩＤ  Ｎｏ：３）、ＡＹ９５２４４８（配列ＩＤ  Ｎｏ：４）、およびＡＹ９５２４５０（配列ＩＤ  Ｎｏ：２）
をそれぞれ持つ。ＧｅｎＢａｎｋにおいて寄託されたＡＹ９５２４４８に関する１６ＳｒＤＮＡ遺伝子配列は、本願出願日において、エラーを持つ。本発明者らは、該配列における該エラーを訂正する適用を行った。
【０００８】
ＧＣ５６は、”Ｌ’ｅｔｏｉｌｅ  ｄｕ  Ｖｅｒｃｏｒｓ”のチーズ作りの間に同定され、これは、伝統的で手作りのプロセスである。ＧＣ５６は、チーズ生産プロセスの間中存在しており（つまり、生乳からその熟成の終わりまで）、統計的に有意の増加を、該プロセス間に伴う。これらのバクテリアは、天然微生物集団に属し、これは、末端製品の官能特性の開発に参画する。
【０００９】
ＧＣ５６は、食品生産プロセスから単離された最初のビフィドバクテリア種であるとの鍵（キー）である利点を持ち、一方、以前のビフィドバクテリアは、ヒトもしくは動物の消化管から抽出されており、これゆえ、ＧＣ５６は、他のビフィドバクテリアよりも、製造プロセス中に統合するによりたやすく、食品および発酵製品における安定化にもよりたやすい。
【００１０】
ＧＣ５６は、好冷であり、１０〜１２℃程度の低温、”Ｌ’ｅｔｏｉｌｅ  ｄｕ  Ｖｅｒｃｏｒｓ”プロセスの熟成温度において成長できるとも見出されており、一方、他の殆どが、２０℃よりも高温を必要とする。ＧＣ５６は、Ｌ’ｅｔｏｉｌｅ  ｄｕ  Ｖｅｒｃｏｒｓのプロセス（ミルク４℃、２日の型からの除去まで２２℃に温め、次いで、８日の熟成から２８日まで１２℃において維持した）の低温により選択された、ミルク亜優占種集団を構成すると考えられている。低温での成長の鍵である利点は、ＧＣ５６バクテリアが、他の殆どの共生バクテイア組成物よりも、低い保管温度をより生き延び易いことであり、これゆえ、その保蔵寿命を引き延ばす。
【００１１】
ＧＣ５６の更なる利点は、空気（エア）寛容であることであり、一方、他の殆どが、複製し生き延びるのに厳しい嫌気条件を必要とする。
【００１２】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＣ５６の更なる利点は、これらが、良好な発酵乳（単独でもしくは混合物で）、末端製品における良好な乳酸耐性（１０６ｃｆｕ／ｇよりも多い）、充分な成長速度、良好な、胃酸、胆汁、および消化管酵素耐性を与え、ならびに、成長因子（イースト抽出物、加水分解蛋白、ビタミン、および他の元素）を求める必要性がより低いことである。
【００１３】
本発明の第２の態様として、本明細書において前に定義されたＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＣ５６と、１種以上の許容可能な賦形剤とを含んでいる共生組成物が与えられている。
【００１４】
許容可能な賦形剤が、当業者に、共生組成物調製品についてよく知られていると認められていると思われる。
このような許容可能な賦形剤の例は：
蔗糖（スクロース）、異性化糖、葡萄糖（グルコース）、果糖（フルクトース）、パラチノース、トレハロース、乳糖（ラクトース）、およびキシロースのような糖；ソルビトール、キシリトール、エリトリトール（エリスリトール）、ラクチトール、パラチノール、還元餅状澱粉シロップ、および還元餅状麦芽糖（マルトース）シロップのような糖アルコール；スクロース脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、およびレシチンのような乳化剤；カラギーナン、キサンタンゴム、グアーゴム、ペクチン、およびローカストビーンゴムのような増粘剤（安定化剤）；クエン酸、乳酸、および林檎酸のような酸性化剤；レモン果汁（ジュース）、オレンジ果汁、およびベリー果汁のような果汁；ビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、およびビタミンＥのようなビタミン；ならびに、カルシウム、鉄、マンガン、および亜鉛のようなミネラル
を包含する。
【００１５】
本発明の組成物は、添加混合していって調製されてよく、適切には常温および大気圧において、通常では口腔投与用に適合される。このような組成物は、錠剤（タブレット）、カプセル、口腔用液体調製品、従来の食品製品、粉末、顆粒、ロゼンジ、再形成可能な粉末、もしくは懸濁の形であってよい。
【００１６】
口腔投与用錠剤（タブレット）およびカプセルは、単位（ユニット）用量の形であってよく、結合剤、充填剤（フィラー）、錠剤用潤滑剤、崩壊剤、および許容可能な湿潤剤のような１種以上の従来の賦形剤を含有してよい。これら錠剤は、医薬の実際においてよく知られた方法に従い、コーティングされてよい。
【００１７】
口腔用液体調製品は、例えば、水性もしくは油性懸濁、溶液、エマルション、シロップ、またはエリキシルの形であってよく、あるいは、水もしくは他の適切なビヒクルを用いる使用前再構成用乾燥製品の形であってよい。このような液体調製品は、懸濁剤、乳化剤、非水性ビヒクル（食用油を包含してよい）、保存料、もし望まれれば、従来の香料および着色料のような従来の添加剤を含有してよい。
【００１８】
１つの好ましい実施形態において、本発明の組成物は、従来の食品製品、より好ましくは、酪農主体の製品（例えば、発酵乳、植物乳、豆乳、バター、チーズ、もしくはヨーグルト）または果汁として処方される。本組成物は好ましくは、大人および小人ヒトおよび動物用食品もしくは飲料として処方される。代わりの好ましい実施形態において、本組成物は、凍結乾燥されたかもしくは噴霧乾燥された粉末として処方される。
【００１９】
共生効果を呈している（つまり、腸叢バランスを維持している）と同時に、ビフィドバクテリアは一般的に、消化管疾患（例えば下痢）、癌、コレステロール過剰、アレルギー、および感染のような種々の疾患の処置および／または予防において、潜在的に有用であるとも信じられている。
【００２０】
これゆえ、本発明の更なる態様として、治療物質としての、特に上の疾患の処置および／または予防における使用用ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）ＧＣ５６が与えられている。
【００２１】
本発明は更に、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＣ５６の、上の疾患の処置および／または予防用医薬品調製における使用を提供する。
【００２２】
本発明は更に、上の疾患の、ヒトもしくは動物の被験体における処置および／または予防方法を提供し、該被験体に、治療有効量のＢｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＣ５６を投与していくことを含む。
【００２３】
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＣ５６が、他の治療剤と組み合わせて使用されてよく、例えば、消化管疾患（例えば下痢）、癌、コレステロール過剰、アレルギー、および感染の処置および／または予防において有用であると知られた他の医薬品である。
【００２４】
これゆえ、本発明の更なる態様として、ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）ＧＣ５６を更なる治療剤（１種もしくは複数種）と共に含んでいる組み合わせが与えられている。
【００２５】
上に言及された組み合わせは簡便に、共生組成物、これゆえ、上で定義されたとおりの組み合わせを１種以上の賦形剤と共に含んでいる共生組成物の形での使用に与えられてよく、本発明の更なる態様を含む。このような組み合わせの個々の成分が、連続してもしくは同時に、別々のもしくは組み合わされた共生組成物において投与されてよい。
【００２６】
好ましい実施形態において、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＣ５６が、他のビフィドバクテリアもしくは：
ラクトバチルス  アキドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、ラクトバチルス  ガッセーリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトバチルス  プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ラクトバチルス  ブクネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、ラクトバチルス  カゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス  ジョンソニイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｊｏｈｎｓｏｎｉｉ）、ラクトバチルス  ガッリナルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｌｌｉｎａｒｕｍ）、ラクトバチルス  （アミロボルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｖｏｒｕｓ）、ラクトバチルス  ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、ラクトバチルス  ラムノスス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトバチルス  ケフィル（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチルス  パラカゼイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｃａｓｅｉ）、ラクトバチルス  クリスパトゥス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｒｉｓｐａｔｕｓ）、ラクトバチルス  デルブルウェキイ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）亜種ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ亜種ブルガリクル（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｌ）、ラクトバチルス  ヘルウェティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、ラクトバチルス  ゼエ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｚｅａｅ）、およびラクトバチルス  サリバリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｌｉｕｓ）のようなＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ属に属しているバクテリア；ストレプトコッカス  テルモフィルス（サーモフィルス）（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のようなＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属しているバクテリア；ラクトコッカス  ラクティス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）亜種クレモリス（ｃｒｅｍｏｒｉｓ）およびＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ亜種ｌａｃｔｉｓのようなＬａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ属に属しているバクテリア；バチルス  スブティリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）のようなＢａｃｉｌｌｕｓ属に属しているバクテリア；ならびに、サッカロミセス  ケレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、トルラスポラ  デルブルウェキイ（Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、およびカンディダ  ケフィル（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｅｆｙｒ）のような、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｏｒｕｌａｓｐｏｒａ、およびＣａｎｄｉｄａ属に属しているイースト
のような他の共生バクテリアと組み合わされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明の好ましい実施形態が今、添付の図面に言及しながら、例としてだけ記載される。
【００２８】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）ＧＣ５６の単離
ＧＣ５６が、産業における生乳チーズ加工品”Ｌ’ｅｔｏｉｌｅ  ｄｕ  Ｖｅｒｃｏｒｓ”（フランス）から、単離された。培養方法（Ｄｅｌｃｅｎｓｅｒｉｅら、（２００５）Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ６１：  ５５−６７）が、特に分子レベルでの方法が、これらのバクテリアの、その産物の産物鎖、および、その末端産物組成のチェックを通しての検出を可能とした。９５株が、３１／３１の研究されたチーズ”Ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ  ｄｕ  Ｖｅｒｃｏｒｓ”から、異なる生産段階において単離され、内３／７のチーズは商品生乳チーズからであり、これら以外は”Ｌ’Ｅｔｏｉｌｅ  ｄｕ  Ｖｅｒｃｏｒｓ”からであり、生乳サンプル中であった。Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ＧＣ５６株ＦＲ６２／ｂ／３（＝ＣＵＥＴＭ０４／３）が、Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、パストゥール研究所）において、２００４年１２月９日、寄託番号ＣＮＣＭ１−３３４２と共に寄託されており、その配列が、Ｇｅｎｂａｎｋ上、寄託番号ＡＹ９５２４４９と共に寄託されている。
【００２９】
ＰＣＲによるビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）ＧＣ５６の検出
１．ＤＮＡ標的の調製
ＤＮＡ抽出（Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ゲノムＤＮＡ精製キット、Ｐｒｏｍｅｇａから）：
１ｍｌの肉汁が、２分間１３，０００ｇにおいて遠心された。このペレットが、４８０μｌのＥＤＴＡ、６０μｌのリゾチーム、および１２０μｌの細胞溶解溶液に懸濁され、４５分間３７℃においてインキュベートされた。遠心後、６００μｌの核溶解溶液が、該ペレットに加えられ、次いで、５分間８０℃においてインキュベートした。冷やされたら、２００μｌの蛋白溶解溶液が加えられ、その後、ボルテックスミキサーに付した。この結果得られてくる懸濁が次いで５分間、氷上でインキュベートされ、５分間１３，０００ｇにおいて遠心された。上清が、６００μｌのイソプロパノールを含有しているきれいなチューブ（管）に移され、該管が次いで、遠心された。上清がデカンテーションされ、６００μｌの７０％エタノールが加えられ、該管が遠心された。エタノールがアスピレーションされ、ペレットが１０分間風乾された。仕上げに、該ＤＮＡペレットが再度、１００μｌの再水和溶液中において、終夜４℃において水和された。
【００３０】
２．ＰＣＲプロトコル
ＧＣ５６が、複合微生物集団内において、ｈｓｐ６０遺伝子主体の２種類のＰＣＲ方法論を使用して、検出され得る。
【００３１】
（ａ）種特異的プライマーを使用してのＰＣＲ
４μｌのＤＮＡ（５０〜１００ｎｇ）、０．２μｌ（４００ｐｍｏｌ／ｌ）の上流プライマー（５’−ＡＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：４４）；表１）および０．２μｌ（４００ｐｍｏｌ／ｌ）の下流プライマー（５’−ＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：４５）；表１）、０．２ｍｏｌ／ｌのｄＮＴＰ、０．２μｌ（ＩＵ）のＴａｑポリメラーゼ酵素、２μｌの酵素用バッファー、１．６μｌのＭｇＣｌ２、ならびに、１１．０μｌの超純水が混合され、合計体積２０μｌに達した。
【００３２】
本熱サイクラーは、以降とおり、プログラムされた。
１回の１０分のサイクルを９５℃において
次いで、９５℃３０秒、６４．２℃（アニール化温度）３０秒、および７２℃３０秒から構成された３０回のサイクル
７２℃５分により終了
【００３３】
２０μｌの各ＰＣＲ産物が、２μｌの着色剤に加えられ、２％アガロース寒天ゲルのウェルに移された。そのサイズの評価が、Ｓｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ（登録商標）を使用して、調製された。該寒天は、ＴＡＥ  ＩＸ緩衝液に浸され、移動条件は、６０分１２０Ｖ４００ｍＡであった。移動後、その寒天が１０分間、臭化エチジウム中においてインキュベートされ、１０分間、水洗された。増幅生成物が、紫外線透過発光下に観察された。ｈｓｐｏ’Ｏｇｅｎｅ配列が、その位置をＳｍａｒｔ  Ｌａｄｄｅｒ（登録商標）と相関させていくことにより、同定された。ブランクのコントロールのウェルも調製され、各ＰＣＲにおける混入を評価した。
【００３４】
（ｂ）種特異的プローブを使用してのリアルタイムＰＣＲ
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属（表１）に特異的な１対の変性プライマーが、ｈｓｐｏ’Ｏｇｅｎｅに関するＰＣＲ用に使用された。１プローブが、４株のＧＣ５６グループ（ＦＲ５１／ｈ／１、ＦＲ４７／３ｂ、ＦＲ５９／ｂ／２、ＦＲ５４／ｅ／１）のＤＮＡ配列後、ＧＣ５６グループ（表１）のｈｓｐｏ’Ｏ配列から選ばれた。これらビフィドバクテリアの配列が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを使用して、並べられた。これら並びが、ＧＣ５６グループに特異的な配列を明らかとした。
【００３５】
これらの配列から、これらプライマー、および、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）により提供されたプローブ設計（デザイン）ガイドラインを使用して、プローブが誘導された。特異性をチェックするために、選択されたプローブが、利用可能な全ｈｓｐｏ’Ｏｇｅｎｅ配列に比較され、ＢＬＡＳＴデータベースサーチプログラムを使用した。ＧＣ５６プローブが、ＦＡＭ（レポーター色素）およびＤＱを用いて標識（ラベル）された。
【００３６】
【表１】
2008539776.tif 000002
【００３７】
これらアッセイの感受性および特異性
本プローブの特異性をチェックするために、ＰＣＲが、１３種の異なるビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種に属している５５株、ならびに、ＧＣ５６グループに属している９種のビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株に関して実施された。ＧＣ５６プローブを用いて観察された結果は、特異性９８％（１種のＢ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ株（５０３Ｉｅ）だけ、陽性であった）および感受性１００％（テストされたＧＣ５６グループからの９株が、陽性であった）を明らかにした。
【００３８】
リアルタイムＰＣＲ条件
増幅反応混合物は、１０〜５０ｎｇのＤＮＡ、１２．５μｌのｑＰＣＲｔｍＭａｓｔｅｒｍｉｘ（Ｅｕｒｏｇｅｎｔｅｃ、Ｓｅｒａｉｎｇ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）、９６０ｎＭの各プライマー、５０〜１５０ｎＭのフッ素系プローブ、および、５ｍＭのＭｇＣｌ２を、合計容積２５μｌに含有した。各マイクロウェルプレートにおいて、１ウェルが鋳型を持たないコントロールとして使用されたが、該ＤＮＡサンプル以外の全試薬を含有した。該増幅は、５０℃２分間、９５℃１０分間、次いで、４０サイクルの２温度ＰＣＲ（９５℃３０秒間および６０℃９０秒間）であり、検出は、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７０００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  ｃｉｔｙ、ＵＳＡ）上で実施された。これらサンプルに関するＰＣＲの結果が、ΔＲｎ（相対感度）蛍光シグナルとして表現された。
【００３９】
Ｃｔ値が、５００よりも高い相対蛍光値に関して２５よりも低かった場合、サンプルは陽性と見なされた。
【００４０】
多重ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲのような他の種々のこれらの方法が、ハイブリダイゼーション手法、ドットブロットハイブリダイゼーション、ｉｎ  ｓｉｔｕ蛍光ハイブリダイゼーション、コロニーハイブリダイゼーション、拘束フラグメント長多型解析のような他の手法同様、使用され得た。
【００４１】
ビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）ＧＣ５６の特徴化
（ａ）温度
暫定的な研究において、株ＦＲ６２／ｂ／３、ＧＣ５６が、１０ｍｌの全乳クリーム、粉乳を有する全乳クリーム（乾燥状態において１５％蛋白に到達するよう）、半脱脂粉乳、粉乳を有する半脱脂粉乳、および甘味濃縮乳（Ｎｅｓｔｌｅ（登録商標））中において、インキュベートされた。ＵＨＴ乳およびＮｅｓｔｌｅ（登録商標）粉乳が、使用された。接種された乳サンプルが、嫌気的な瓶中において、３０および３７℃において、７２時間インキュベートされ、バクテリアが次いで、カウントされた。成育速度が、３７℃におけるよりも、３０℃においてより良好であると見出されたので、３０℃が、更なる研究用に選ばれた。
【００４２】
（ｂ）成育
Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉａが、ＢＨＩ（倍の濃度）肉汁において、３０℃３日間、嫌気的条件下に継代培養された。肉汁中初期濃度は、１０７ｃｆｕ／ｍｌであった。該肉汁は、ペプトン−生理食塩水中に１０から１０まで稀釈された。１００μｌの肉汁、ならびに、稀釈物−２、−４、−６、および−８が回収され、１０ｍｌの全乳クリーム、もしくは、粉乳を有する全乳クリームに懸濁された（乾燥状態において１５％蛋白に到達するよう）。これら乳は、嫌気的瓶中において、６、１２、２４、および４８時間、３０℃においてインキュベートされた。
【００４３】
各インキュベート時刻において、ｐＨが測定され、バクテリアが螺旋接種を用いてカウントされた。
【００４４】
結果は、より良好な成育を、補完乳において示した。バクテリア濃度は、初期接種１０５、１０３、および１０１ｃｆｕ／ｍｌを用いると、１０１０ｃｆｕ／ｍｌに４８時間後上昇したが、初期接種１０−１ｃｆｕ／ｍｌを用いると、１０９であった。ｐＨ値は、４．６〜５．３に、全ての補完乳において、傾いた。
【００４５】
全乳クリームにおいて、１０９ｃｆｕ／ｍｌだけが、初期速度１０５ｃｆｕ／ｍｌから生産され、１０６が、１０３ｃｆｕ／ｍｌから生産された。ｐＨ低下は、５．７〜６．４に到達した。
【００４６】
この暫定的な研究の狙いは、必要とされる初期濃度を知ること、および、発酵過程の伸展を研究することであった。
【００４７】
次いで、接種株ＦＲ６２／ｂ／３（乳主体培地から９．５  ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍｌ）が、３０℃において２４時間、乳主体培地（０．３％ペプトン−カゼイン、０．５％イースト抽出物、および８％脱脂粉乳）含有２０Ｌ発酵槽において、培養された。５０ｍｌの８サンプルが、以降の時刻において、回収された。
接種時刻、および、２、４、６、８、１０、１２、および２４時間のインキュベート後
螺旋状に接種していったのが、各サンプルに関し、真っ直ぐとされた。ｐＨが自動的に、発酵槽中において、追跡された。
【００４８】
これら結果は、８．４  ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍｌ（接種時刻）から９．２までの成育を６時間後示し、この速度は、２４時間まで維持された。
【００４９】
Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ株を用いて接種した場合、ＦＲ６２／ｂ／３株が、８．１  ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍｌ（接種時刻）から９．２まで、１０時間後成育し、我々は、速度８．９  ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍｌを２４時間後観察したが、ｐＨは、単独であった場合よりも低下した（下のセクション（ｃ）参照）。
【００５０】
ＧＣ５６は、ＴＰＹ肉汁において（ｂａｉｎ−ｍａｒｉｅにおいて）も、最高温度４１．５℃まで、および、最低温度７℃で増殖可能であり、成長のための至適温度は、３９℃である。ＴＰＹにおいて、成長のための最小初期ｐＨは、４．７である。ＧＣ５６は、ＴＰＹ寒天上でも、好気条件下に、３７℃および３９℃において、増殖可能である。
【００５１】
ＴＰＹ寒天上のＧＣ５６のコロニーは、３９℃嫌気的条件下に、クリーム色で、円く、全体の縁が凸である。これらは、直径１ｍｍにまで届く。これらは、好気的条件下では、抑えられた直径（１ｍｍ未満）に届く。
【００５２】
（ｃ）ｐＨ
乳培地のｐＨは当初、６．６であった。
発酵槽中において単独で培養された場合、ＧＣ５６の株ＦＲ６２／ｂ／３がｐＨの低下を生み出し、５．９から（播種時間において）、６時間後５．０に、１２時間後４．２に、２４時間後３．９に低下した。
【００５３】
更に培地を酸性化させるアシドフィルス菌（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）株存在下に、ｐＨ値が５．９から、６時間後４．４に、１２時間後３．８に、２４時間後３．５に下がった。これら２種のバクテリア計数は、２４時間後８ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬに増加した。
【００５４】
（ｄ）生存率
発酵槽中におけるインキュベート後、冷蔵条件（好気的条件、温度４〜８℃）における生存率が、研究された。
【００５５】
初期速度９．２ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬから、ＧＣ５６の株ＦＲ６２／ｂ／３は、１８日後８．５ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬに、２９日後７．３ｌｏｇ  ｃｆｕ／ｍＬに届いた。文献によれば、製品における１０６もしくは１０７ｃｆｕ／ｍＬもしくは／ｇより大きい速度の共生が必要とされ、陽性の効果の観察を可能とする。
【００５６】
（ｅ）生化学分析
ＧＣ５６グループは、数量解析により、よく系統的に個別化されている（ウェイトを加味しなかった平均連関およびＨａｒｔｉｇａｎクラスター化法に基づいた分類）。ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のもう１種別の種に属している型も対照株も、該グループに参加しない。
【００５７】
生乳において、および、生乳チーズにおいて、最も頻繁に単離される種であるＧＣ５６グループおよび種Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｌｏｎｇｕｍを差別化する生化学的特徴が、下の表２において提示されており、ある特定の特徴に関する陽性の％を示す。
【００５８】
【表２】
2008539776.tif 000003
【００５９】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓの単離新株を、最も近い系統種であるＢ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍから差別化する表現型の特徴が、表３において提示されている。表３におけるデータは、Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓの単離された異なる１４１種に基づいている。これらの結果は、単離されたこれら１４１種、ＦＲ６２／ｂ／３Ｔ（Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓのある１株）、およびＢ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍＬＭＧ２１７７５Ｔにおいて観察された陽性応答の％として与えられている。
【００６０】
【表３】
2008539776.tif 000004
【００６１】
Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ全株（該株の≧９８％）が、ガラクトース、グルコース、フルクトース、マルトース、ラクトース、メリビオース、スクロース、ラフィノース、およびＤ−トゥラノースを発酵させる。いずれも（該株の≦２％）、グリセロール、エリスリトール、Ｄ−アラビノース、Ｌ−アラビノース、Ｌ−キシロース、アドニトール、β−メチルキシロシド、Ｌ−ソルボース、ラムノース、ドゥルシトール、イノシトール、マンニトール、ソルビトール、α−メチル−Ｄ−グルコシド、Ｎ−アセチルグルコサミン、アルブチン、トレハロース、イヌリン、メレジトース、澱粉（スターチ）、グリコーゲン、キシリトール、Ｄ−リキソース、Ｄ−タガトース、Ｄ−フコース、Ｌ−フコース、Ｄ−アラビトール、Ｌ−アラビトール、グルコネート、２−ケト−グルコネート、５−ケト−グルコネートを発酵させない。全株（該株の≧９８％）が、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルコシダーゼ、アルギニンアリールアミダーゼ、プロリンアリールアミダーゼ、フェニルアラニンアリールアミダーゼ、ロイシンアリールアミダーゼ、およびヒスチジンアリールアミダーゼに関して陽性であった。全て（該株の≦２％）、ウレアーゼ、インドール産生、硝酸塩還元、アルギニンジヒドロラーゼ、β−ガラクトシダーゼ−６−ホスフェート、α−アラビノシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、グルタミン酸脱炭酸酵素、α−フコシダーゼ、ピログルタミン酸アリールアミダーゼ、グルタミルアリールアミダーゼに関して陰性であった。
【００６２】
（ｆ）Ｇ＋Ｃ含量
ＧＣ５６のＦＲ６２／ｂ／３株の平均ＧＣ含量（Ｔｍ方法）は５６％であり、このグループのうち９株が５５．２％である（ＳＤ＝０．８３）。
【００６３】
（ｇ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション
ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合レベルが、全ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種およびアエリスカルドヴィア・アエリフィラ（Ａｅｒｉｓｃａｒｄｏｖｉａ  ａｅｒｉｐｈｉｌａ）のタイプの株を用いると、４〜３６％であったが、結果が下の表４において示され、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６グループ（１３実験）内では、７６〜１００％であった。Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍとＧＣ５６対照群株（ＦＲ６２／ｂ／３）との間でのＤＮＡ−ＤＮＡ相同性は、３１％（２回測定）に等しく、ＧＣ５６群が、そのような種に属さないことを確認している（バクテリア種の定義の閾値７０％以上；ＧｏｅｂｅｌおよびＳｔａｃｋｅｂｒａｎｄｔ、（１９９４）、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６０：  １６１４〜１６２１；Ｒｏｓｓｅｌｌｏ−ＭｏｒａおよびＡｍａｎｎ（２００１）、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ、２５：  ３９〜６７）。
【００６４】
ＤＮＡ−ＤＮＡ再会合レベルが、Ｄｅ  Ｌｅｙらにより記述された復元速度からの分光学的方法を使用して求められ（Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９７０）１２、１３３〜１４２）、僅かにハイブリダイゼーション温度を修飾した（Ｇａｖｉｎｉら、Ｅｃｏｌｏｇｙ  ｉｎ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｄｉｓｅａｓｅ（２００１）１３、４０〜４５）。これら決定は、６７．３℃（株ＦＲ６２／ｂ／３のＧ＋Ｃ含量に従い、Ｔｍ−２５℃）において実施され、温度コントローラー（Ｐｅｌｔｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｖａｒｉａｎ）付きの分光計Ｃａｒｙ  １００（Ｖａｒｉａｎ）を使用した。
【００６５】
【表４】
2008539776.tif 000005
【００６６】
表４は、ＦＲ６２／ｂ／３（ＧＣ５６グループ）からのＤＮＡの、Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓおよびＡｅｒｉｓｃａｒｄｏｖｉａ  ａｅｒｉｐｈｉｌａの株を包含して、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属のタイプの株からのＤＮＡとのＤＮＡ−ＤＮＡ再会合を示す。
【００６７】
Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ  ＦＲ６２／ｂ／３（ＧＣ５６）、Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ  ＦＲ５５／ｄ／２、ＦＲ５９／ｂ／２、ＦＲ９８／ａ／１１、Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ  ＦＲ５０／ｆ／４、Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ  Ｂｒｉｅ／９、Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ  ＰｉｃＶ／１０、Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ  ＦＲ３５／５、およびＢ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ  Ｒｅｂ／１３は全て、Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ株であり、Ｂ．ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ  ＦＲ６２／ｂ／３と８０％より多いＤＮＡ相同性を持つ。
【００６８】
（ｈ）１６ＳｒＲＮＡ配列化
１６ＳｒＤＮＡ（約１４００ｂｐ）の配列化が、ＧＣ５６グループの３種の代表的な株（ＦＲ／６２／ｂ／３、ＦＲ／４７／ｂ／３、ＦＲ／５９／ｂ／２株）上で実現されており、Ｇｅｎｂａｎｋ上で利用できる他の近いビフィドバクテリア（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）配列と比較された（図１）。このグループが、ＦＲ／６２／ｂ／３、ＦＲ／５９／ｂ／２、およびＦＲ／４７／ｂ／３株を考慮すると、好冷細菌（Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）と９９．８％の類似（３つの違い）を表示したように見えた。
【００６９】
３種のＧＣ５６株の１６ＳｒＤＮＡ配列が、好冷細菌（Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）を用いて、実施された。特異的な制限酵素領域（エリア）が、ＡＩｕＩおよびＴａｑｌを使用して、同定された（図２）。制限断片長の多型が使用でき、このグループをサンプル中において検出もしくは同定した。好冷細菌（Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）との違いは、観察されなかった。しかしながら、好冷細菌（Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）をこれらの種類のサンプル中において見出す低い可能性がある。
【００７０】
（ｉ）ｈｓｐｏ’Ｏ遺伝子一部配列化
図３は、ＧＣ５６群（グループ）（ＦＲ４７／３、ＦＲ５１／ｈ／ｌ、ＦＲ５４／ｅ／ｌ、５９／ｂ／２）の幾つかの株のｈｓｐｏ’Ｏ遺伝子配列を、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＰｕｂＭｅｄ−ＢＬＡＳＴ）上で見出された近いと同定された配列と共に示す。これらＧＣ５６グループ株間で違いは観察されなかった一方で、他のビフィドバクテリア種との違いが観察された。これらの違いは、リアルタイムＰＣＲ用に選ばれた特異的なＰＣＲプライマーおよび特異的なプローブに使用された（表１）。
【００７１】
（ｊ）外観
ＧＣ５６細胞は、グラム陽性であり、胞子非形成桿菌であり、不規則に形作られた桿体である。ＦＲ６２／ｂ／３株の形態が、図４において示されている。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの１６ＳｒＤＮＡの配列（１４１９ヌクレオチド）の系統樹を示し、ＦＲ６２／ｂ／３株（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＹ９５２４４９）、ＦＲ４７／３株（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＹ９５２４５０）、ＦＲ５９／ｂ／２株（Ｇｅｎｂａｎｋ寄託番号ＡＹ９５２４４８）を包含している。ＦＲ６２／ｂ／３、ＦＲ４７／３、およびＦＲ５９／ｂ／２は全て、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｃｒｕｄｉｌａｃｔｉｓ株である。これら配列が、ＣｌｕｓｔａｌＸを用いて整列された。該系統樹は、Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｂｏｖｉｓを根とし、近接アルゴリズムを使用しながら構築された。ブートストラップの（自己完結した）値は、１０００本の木から計算されたが、各節において与えられている。括弧中の数は、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号に対応する。
【図２−１】ＧＣ５６  ＦＲ６２／ｂ／３、Ｆｒ４７／３、およびＦｒ５９／ｂ／２株の１６ＳｒＤＮＡの、Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍとの、配列の整列を示す。これら配列が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを使用しながら整列された。配列１（配列ＩＤ番号：１）は、Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＹ１７４１０８）であり、配列２（配列ＩＤ番号：２）は、ＧＣ５６ＦＲ４７／３（ＡＹ９５２４５０）であり、配列３（配列ＩＤ番号：３）は、ＧＣ５６ＦＲ６２／ｂ／３（ＡＹ９５２４４９）であり、配列４（配列ＩＤ番号：４）は、ＧＣ５６ＦＲ５９／ｂ／２（ＡＹ９５２４４８）である。配列Ｃが、コンセンサス配列である。該コンセンサス配列において、以降の象徴が使用されている。    ．          もし主要な特徴が、当該配列において、≧２０％の表示を持つ場合。    ：          もし主要な特徴が、当該配列において、≧４０％の表示を持つ場合。    ＋          もし主要な特徴が、当該配列において、≧６０％の表示を持つ場合。    ＊          もし主要な特徴が、当該配列において、≧８０％の表示を持つ場合。    特徴自体    もしこれが、全配列において、存在している場合。１６ＳｒＤＮＡ上流（５’−ａａｔａｇｃｔｃｃｔｇｇａａａｃｇｇｇｔ−３’（配列ＩＤ番号：５））〜１６ＳｒＤＮＡ下流（５’−ｃｇｔａａｇｇｇｇｃａｔｇａｔｇａｔｃｔ−３’（配列ＩＤ番号：６））の制限マップは、ＡＩｕＩ：ＡＧＣＴ切断位置５、１００、４１１、６９６、９０２（下線部）およびＴａｑｌ：ＴＣＧＡ切断位置１３２、７９６（イタリック）を包含する。
【図２−２】ＧＣ５６  ＦＲ６２／ｂ／３、Ｆｒ４７／３、およびＦｒ５９／ｂ／２株の１６ＳｒＤＮＡの、Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍとの、配列の整列を示す。これら配列が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを使用しながら整列された。配列１（配列ＩＤ番号：１）は、Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＹ１７４１０８）であり、配列２（配列ＩＤ番号：２）は、ＧＣ５６ＦＲ４７／３（ＡＹ９５２４５０）であり、配列３（配列ＩＤ番号：３）は、ＧＣ５６ＦＲ６２／ｂ／３（ＡＹ９５２４４９）であり、配列４（配列ＩＤ番号：４）は、ＧＣ５６ＦＲ５９／ｂ／２（ＡＹ９５２４４８）である。配列Ｃが、コンセンサス配列である。該コンセンサス配列において、以降の象徴が使用されている。    ．          もし主要な特徴が、当該配列において、≧２０％の表示を持つ場合。    ：          もし主要な特徴が、当該配列において、≧４０％の表示を持つ場合。    ＋          もし主要な特徴が、当該配列において、≧６０％の表示を持つ場合。    ＊          もし主要な特徴が、当該配列において、≧８０％の表示を持つ場合。    特徴自体    もしこれが、全配列において、存在している場合。１６ＳｒＤＮＡ上流（５’−ａａｔａｇｃｔｃｃｔｇｇａａａｃｇｇｇｔ−３’（配列ＩＤ番号：５））〜１６ＳｒＤＮＡ下流（５’−ｃｇｔａａｇｇｇｇｃａｔｇａｔｇａｔｃｔ−３’（配列ＩＤ番号：６））の制限マップは、ＡＩｕＩ：ＡＧＣＴ切断位置５、１００、４１１、６９６、９０２（下線部）およびＴａｑｌ：ＴＣＧＡ切断位置１３２、７９６（イタリック）を包含する。
【図２−３】ＧＣ５６  ＦＲ６２／ｂ／３、Ｆｒ４７／３、およびＦｒ５９／ｂ／２株の１６ＳｒＤＮＡの、Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍとの、配列の整列を示す。これら配列が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを使用しながら整列された。配列１（配列ＩＤ番号：１）は、Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＹ１７４１０８）であり、配列２（配列ＩＤ番号：２）は、ＧＣ５６ＦＲ４７／３（ＡＹ９５２４５０）であり、配列３（配列ＩＤ番号：３）は、ＧＣ５６ＦＲ６２／ｂ／３（ＡＹ９５２４４９）であり、配列４（配列ＩＤ番号：４）は、ＧＣ５６ＦＲ５９／ｂ／２（ＡＹ９５２４４８）である。配列Ｃが、コンセンサス配列である。該コンセンサス配列において、以降の象徴が使用されている。    ．          もし主要な特徴が、当該配列において、≧２０％の表示を持つ場合。    ：          もし主要な特徴が、当該配列において、≧４０％の表示を持つ場合。    ＋          もし主要な特徴が、当該配列において、≧６０％の表示を持つ場合。    ＊          もし主要な特徴が、当該配列において、≧８０％の表示を持つ場合。    特徴自体    もしこれが、全配列において、存在している場合。１６ＳｒＤＮＡ上流（５’−ａａｔａｇｃｔｃｃｔｇｇａａａｃｇｇｇｔ−３’（配列ＩＤ番号：５））〜１６ＳｒＤＮＡ下流（５’−ｃｇｔａａｇｇｇｇｃａｔｇａｔｇａｔｃｔ−３’（配列ＩＤ番号：６））の制限マップは、ＡＩｕＩ：ＡＧＣＴ切断位置５、１００、４１１、６９６、９０２（下線部）およびＴａｑｌ：ＴＣＧＡ切断位置１３２、７９６（イタリック）を包含する。
【図２−４】ＧＣ５６  ＦＲ６２／ｂ／３、Ｆｒ４７／３、およびＦｒ５９／ｂ／２株の１６ＳｒＤＮＡの、Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍとの、配列の整列を示す。これら配列が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを使用しながら整列された。配列１（配列ＩＤ番号：１）は、Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＹ１７４１０８）であり、配列２（配列ＩＤ番号：２）は、ＧＣ５６ＦＲ４７／３（ＡＹ９５２４５０）であり、配列３（配列ＩＤ番号：３）は、ＧＣ５６ＦＲ６２／ｂ／３（ＡＹ９５２４４９）であり、配列４（配列ＩＤ番号：４）は、ＧＣ５６ＦＲ５９／ｂ／２（ＡＹ９５２４４８）である。配列Ｃが、コンセンサス配列である。該コンセンサス配列において、以降の象徴が使用されている。    ．          もし主要な特徴が、当該配列において、≧２０％の表示を持つ場合。    ：          もし主要な特徴が、当該配列において、≧４０％の表示を持つ場合。    ＋          もし主要な特徴が、当該配列において、≧６０％の表示を持つ場合。    ＊          もし主要な特徴が、当該配列において、≧８０％の表示を持つ場合。    特徴自体    もしこれが、全配列において、存在している場合。１６ＳｒＤＮＡ上流（５’−ａａｔａｇｃｔｃｃｔｇｇａａａｃｇｇｇｔ−３’（配列ＩＤ番号：５））〜１６ＳｒＤＮＡ下流（５’−ｃｇｔａａｇｇｇｇｃａｔｇａｔｇａｔｃｔ−３’（配列ＩＤ番号：６））の制限マップは、ＡＩｕＩ：ＡＧＣＴ切断位置５、１００、４１１、６９６、９０２（下線部）およびＴａｑｌ：ＴＣＧＡ切断位置１３２、７９６（イタリック）を包含する。
【図２−５】ＧＣ５６  ＦＲ６２／ｂ／３、Ｆｒ４７／３、およびＦｒ５９／ｂ／２株の１６ＳｒＤＮＡの、Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍとの、配列の整列を示す。これら配列が、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅからのプログラムＣｌｕｓｔａｌＷを使用しながら整列された。配列１（配列ＩＤ番号：１）は、Ｂ．ｐｓｙｃｈｒａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ（ＡＹ１７４１０８）であり、配列２（配列ＩＤ番号：２）は、ＧＣ５６ＦＲ４７／３（ＡＹ９５２４５０）であり、配列３（配列ＩＤ番号：３）は、ＧＣ５６ＦＲ６２／ｂ／３（ＡＹ９５２４４９）であり、配列４（配列ＩＤ番号：４）は、ＧＣ５６ＦＲ５９／ｂ／２（ＡＹ９５２４４８）である。配列Ｃが、コンセンサス配列である。該コンセンサス配列において、以降の象徴が使用されている。    ．          もし主要な特徴が、当該配列において、≧２０％の表示を持つ場合。    ：          もし主要な特徴が、当該配列において、≧４０％の表示を持つ場合。    ＋          もし主要な特徴が、当該配列において、≧６０％の表示を持つ場合。    ＊          もし主要な特徴が、当該配列において、≧８０％の表示を持つ場合。    特徴自体    もしこれが、全配列において、存在している場合。１６ＳｒＤＮＡ上流（５’−ａａｔａｇｃｔｃｃｔｇｇａａａｃｇｇｇｔ−３’（配列ＩＤ番号：５））〜１６ＳｒＤＮＡ下流（５’−ｃｇｔａａｇｇｇｇｃａｔｇａｔｇａｔｃｔ−３’（配列ＩＤ番号：６））の制限マップは、ＡＩｕＩ：ＡＧＣＴ切断位置５、１００、４１１、６９６、９０２（下線部）およびＴａｑｌ：ＴＣＧＡ切断位置１３２、７９６（イタリック）を包含する。
【図３】ＧＣ５６グループの幾つかの株のｈｓｐｏ’Ｏ遺伝子配列の整列を、近く同定された配列と共に示す。より具体的には、図３は、ＧＣ５６グループの４種（ＦＲ４７／３、ＦＲ５１／ｈ／１、ＦＲ５４／ｅ／１、５９／ｂ／２）のｈｓｐ６０遺伝子の一部配列の整列を、Ｇｅｎｂａｎｋ（ＰｕｂＭｅｄ−ＢＬＡＳＴ）上で見出された近く同定された配列、つまり：Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ（ＡＹ００４２７４）、Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ（ＡＦ２１０３１９）、Ｂ．ｒｕｍｉｎａｎｔｉｕｍ（ＡＦ２４０５７１）、Ｂ．ｍｅｒｙｃｉｃｕｍ（ＡＹ００４２７７）、Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｕｍ（ＡＦ２４０５６８）と共に示す。ＦＡＭ−ＡＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＧＴＴＧＡ−ＤＱ（配列ＩＤ番号：４３）が、ｈｓｐ６０遺伝子を標的化するのに使用されたプローブであり、ＧＣ５６グループ特異的である。５’−ＡＴＴＴＣＣＧＣＡＧＣＣＡＡＧＧＡＣＧＴ−３’（配列ＩＤ番号：４４）および５’ＴＣＣＡＧＡＧＣＴＴＣＧＧＣＧＡＴＣＴＴＣ−３’（配列ＩＤ番号：４５）が、ＧＣ５６グループに特異的な前向きおよび逆向きのプライマーであり、ｈｓｐｏ’Ｏ遺伝子を標的化するのに使用された。
【図４】ＧＣ５６の形態学的外観を示す。
【図１】
2008539776.tif 000006
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２−５】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
2008539776000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月17日(2008.1.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、パストゥール研究所）において２００４年１２月９日寄託番号ＣＮＣＭ１−３３４２をもって寄託されたビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６。
【請求項２】
ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６に対する４０％よりも大きいＤＮＡ配列相同性を持ち、ここでビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＧＣ５６がＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  Ｍｉｃｒｏ−ｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ（ＣＮＣＭ、パストゥール研究所）において２００４年１２月９日寄託番号ＣＮＣＭ１−３３４２をもって寄託された、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株。
【請求項３】
請求項１もしくは請求項２において定義されたとおりのビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株と１種以上の許容可能な賦形剤とを含んでいる、共生組成物。
【請求項４】
前記組成物が、食品製品である、請求項３において定義されたとおりの共生組成物。
【請求項５】
前記食品製品が、発酵乳、植物乳、豆乳、バター、チーズ、およびヨーグルトから選択された、酪農主体の製品である、請求項４において定義されたとおりの共生組成物。
【請求項６】
請求項１もしくは請求項２において定義されたとおりの、治療物質としての使用用の、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株。
【請求項７】
消化管疾患、下痢、癌、コレステロール過剰、アレルギー、および感染の処置および／または予防における使用用の、請求項１もしくは請求項２において定義されたとおりの、ビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株。
【請求項８】
請求項１もしくは請求項２において定義されたとおりのビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株の、消化管疾患、下痢、癌、コレステロール過剰、アレルギー、および感染の処置および／または予防用の医薬品の調製における使用。
【請求項９】
請求項１もしくは請求項２において定義されたとおりのビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）株を、更なる治療剤（１種もしくは複数種）と一緒に含んでいる組み合わせ。
【国際調査報告】
2008539776.tif 000025