(57)【要約】本発明は、（１）セレコキシブのようなＣＯＸ−２選択的阻害剤、（２）ゲルダナマイシン、またはゲルダナマイシン誘導体またはアナログのようなＨｓｐ９０阻害剤、（３）癌の治療用のビタミンＥ化合物、（４）ＴＮＦ−アルファのようなＴＮＦ、（５）ＶＥＧＦ阻害剤、または（６）ＩＬ−ＩＯの阻害剤いずれかと組み合わされた、ＭＤＡ−７蛋白質またはＭＤＡ−７をコードする核酸を含む方法および組成物に関する。ある例において、乳癌のための治療が提供される。他の例において、肺癌のための治療が提供される。そのような例は、いくつかの場合、ＭＤＡ−７蛋白質を発現するアデノウィルスベクターを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において癌を治療する方法であって、ＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤を該患者に提供することを含む、方法。
【請求項２】
前記ＭＤＡ−７が、ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む組成物を前記患者に投与することによって該患者に供され、ここで、該ＭＤＡ−７ポリペプチドは該患者において発現される、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記組成物が医薬上許容される組成物である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸がベクター中に存在する、請求項２記載の方法。
【請求項５】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
約１０９ないし約１０１３ウィルス粒子が前記患者／投与に投与される、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項５記載の方法。
【請求項８】
アデノウィルスベクターがプロタミンと共に処方される、請求項７記載の方法
【請求項９】
前記ＭＤＡ−７核酸組成物が前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項２記載の方法。
【請求項１０】
前記ＭＤＡ−７核酸組成物が１以上の脂質を含む、請求項２記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物がＤＯＴＡＰおよびコレステロールまたはその誘導体を含む、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記ＭＤＡ−７が、精製されたＭＤＡ−７蛋白質を含む組成物を前記患者に投与することによって該患者に提供される、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
前記精製されたＭＤＡ−７蛋白質組成物は前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記患者に、ＣＯＸ−２阻害剤と、ｉ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはｉｉ）ＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸いずれかとを含む組成物が提供される、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
前記患者に、前記ＣＯＸ−２阻害剤が提提供されてから２４時間以内に前記ＭＤＡ−７が提供される、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
前記患者に、前記ＣＯＸ−２阻害剤が提供されてから２時間以内に前記ＭＤＡ−７が提供される、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記患者に、前記ＣＯＸ−２阻害剤が提供されるのに先立って前記ＭＤＡ−７が提供される、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記患者に、前記ＭＤＡ−７が提供されるのに先立って前記ＣＯＸ−２が提供される、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記患者に、前記ＣＯＸ−２阻害剤を該患者に投与することによってＣＯＸ−２阻害剤が提供される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ブミラコキシブ、またはエトリコキシブ、またはその組合せである、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記患者に、ＣＯＸ−２阻害剤プロドラッグを患者に投与することによって前記ＣＯＸ−２阻害剤が提供される、請求項１記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＯＸ−２阻害剤またはＣＯＸ−２阻害剤プロドラッグが、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項１９または２１記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、メラノーマ、非−小細胞肺、小細胞肺、肺、肝臓癌腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、首部、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部、胃腸、リンパ腫、脳、結腸または膀胱である、請求項１記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が上皮癌細胞を含む、請求項１記載の方法。
【請求項２５】
さらに、前記患者を放射線療法および／または化学療法に供することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項２６】
前記患者が放射線療法に提供される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
ＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤が各々少なくとも１回供された後に、前記患者が放射線療法に供される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記患者が致死未満用量の放射線療法に供される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
さらに、前記患者から腫瘍の全てまたは一部を切除することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３０】
ＭＤＡ−７および／またはＣＯＸ−２阻害剤が腫瘍切除の後に前記患者に提供される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
少なくとも、生じた腫瘍床に組成物を投与することによって、前記患者にＭＤＡ−７および／またはＣＯＸ−２阻害剤が提供される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記患者にＭＤＡ−７および／またはＣＯＸ−２阻害剤が１回を超えて提供される、請求項１記載の方法。
【請求項３３】
患者において乳癌を治療する方法であって、該患者に、ｉ）前記患者において発現できるプロモーターの制御下にある、ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を含む、アデノウィルスベクター；およびｉｉ）ＣＯＸ−２阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項３４】
前記患者がＨＥＲ−２／ｎｅｕ陰性である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
さらに、前記患者から１以上の腫瘍の全てまたは一部を切除することを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項３６】
前記アデノウィルスベクターおよびＣＯＸ−２阻害剤が医薬上許容される組成物中に存在する、請求項３３記載の方法。
【請求項３７】
約１０９ないし約１０１３の間のウィルス粒子が前記患者／投与に投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項３８】
アデノウィルスベクターがプロタミンと共に処方される、請求項３３記載の方法。
【請求項３９】
前記アデノウィルスベクターおよび／またはＣＯＸ−２阻害剤が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が投与されてから２４時間以内に、前記患者に前記アデノウィルスベクターが投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項４１】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が投与されてから２時間以内に、前記患者に前記アデノウィルスベクターが投与される、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が投与されるに先立って、前記患者に前記アデノウィルスベクターが投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項４３】
前記アデノウィルスベクターが投与されるに先立って、前記患者に前記ＣＯＸ−２が提供される、請求項３３記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＯＸ−２阻害剤が、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブ、またはエトリコキシブ、またはその組合せである、請求項３３記載の方法。
【請求項４５】
さらに、前記患者を放射線療法、化学療法、および／または免疫療法に供することを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４６】
さらに、前記患者から腫瘍の全部または一部を切除することを含む、請求項３３記載の方法。
【請求項４７】
腫瘍切除の後に、ＭＤＡ−７および／またはＣＯＸ−２阻害剤が提供される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記患者に前記アデノウィルスが投与され、かつ／または前記ＣＯＸ−２阻害剤が生じた腫瘍床に投与される、請求項３０記載の方法。
【請求項４９】
前記患者に前記アデノウィルスおよび／または前記ＣＯＸ−２阻害剤が１回を超えて投与される、請求項３３記載の方法。
【請求項５０】
癌細胞を放射線感受性化する方法であって、該癌細胞に一定量のＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤を提供することを含む、方法。
【請求項５１】
さらに、前記癌細胞を放射線に供することを含む、請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記癌細胞が致死未満用量の放射線に供される、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
ａ）ＣＯＸ−２阻害剤またはＣＯＸ−２阻害剤プロドラッグ；および
ｂ）精製された活性なＭＤＡ−７蛋白質、またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸；
を含む、医薬組成物。
【請求項５４】
前記組成物がＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む、請求項５３記載の医薬組成物。
【請求項５５】
前記核酸がアデノウィルスベクターである、請求項５４記載の医薬組成物。
【請求項５６】
前記医薬組成物がＣＯＸ−２阻害剤を含む、請求項５４記載の医薬組成物。
【請求項５７】
前記ＣＯＸ−２阻害剤がセレコキシブである、請求項５６記載の医薬組成物。
【請求項５８】
ｉ）プロモーターに操作可能に連結されている、ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を有する、アデノウィルスベクター；およびｉｉ）ＣＯＸ−２阻害剤、
を含む、医薬組成物。
【請求項５９】
ＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤を患者に提供することを含む、乳癌細胞を治療する方法。
【請求項６０】
ＭＤＡ−７およびＨｓｐ９０阻害剤を患者に提供することを含む、患者において癌を治療する方法。
【請求項６１】
前記ＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸を含む組成物を前記患者に投与することによって、該ＭＤＡ−７が該患者に提供され、ここで、該ＭＤＡ−７ポリペプチドが該患者において発現される、請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記組成物が医薬上許容される組成物である、請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
前記核酸がベクター中に存在する、請求項６１記載の方法。
【請求項６４】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
約１０９ないし約１０１３のウィルス粒子が前記患者／投与に投与される、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項６４記載の方法。
【請求項６７】
前記アデノウィルスベクターがプロタミンと共に処方される、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記ＭＤＡ−７核酸組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項６１記載の方法。
【請求項６９】
前記ＭＤＡ−７核酸組成物が１以上の脂質を含む、請求項６１記載の方法。
【請求項７０】
前記組成物がＤＯＴＡＰおよびコレステロール、またはその誘導体を含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
精製されたＭＤＡ−７蛋白質を含む組成物を前記患者に投与することによって、前記ＭＤＡ−７が該患者に提供される、請求項６０記載の方法。
【請求項７２】
前記精製されたＭＤＡ−７蛋白質組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項７１記載の方法。
【請求項７３】
前記患者に、前記Ｈｓｐ９０阻害剤と、ｉ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはｉｉ）ＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸いずれかとを含む組成物が提供される、請求項６０記載の方法。
【請求項７４】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤が提供されてから２４時間以内に、前記ＭＤＡ−７が前記患者に提供される、請求項６０記載の方法。
【請求項７５】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤が提供されてから２時間以内に前記ＭＤＡ−７が前記患者に提供される、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤が提供されるに先立って前記ＭＤＡ−７が前記患者に提供される、請求項７４記載の方法。
【請求項７７】
前記ＭＤＡ−７が提供されるに先立って、前記Ｈｓｐ９０阻害剤が前記患者に提供される、請求項７４記載の方法。
【請求項７８】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤を前記患者に投与することによって、該患者に前記Ｈｓｐ９０阻害剤が提供される、請求項６０記載の方法。
【請求項７９】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤が、ゲルダナマイシン、またはその誘導体、またはアナログ、またはその組み合わせである、請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤がゲルダナマイシンアナログである、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記ゲルダナマイシンアナログが１７−ＡＡＧである、請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
前記患者にＨｓｐ９０阻害剤プロドラッグを投与することによって、該患者にＨｓｐ９０阻害剤が提供される、請求項６０記載の方法。
【請求項８３】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤またはＨｓｐ９０阻害剤プロドラッグが、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項７８記載の方法。
【請求項８４】
前記癌が、メラノーマ、非−小細胞肺、小細胞肺、肺、肝臓癌腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、首部、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部、胃腸、リンパ腫、脳、結腸または膀胱のものである、請求項６０記載の方法。
【請求項８５】
前記癌が上皮癌細胞を含む、請求項６０記載の方法。
【請求項８６】
さらに、前記患者を放射線療法および／または化学療法に供することを含む、請求項６０記載の方法。
【請求項８７】
さらに、前記患者から腫瘍の全部または一部を切除することを含む、請求項６０記載の方法。
【請求項８８】
ＭＤＡ−７および／またはＨｓｐ９０阻害剤が、腫瘍の切除の後に前記患者に提供される、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
少なくとも、組成物を生じた腫瘍床に投与することによって、患者にＭＤＡ−７および／またはＨｓｐ９０阻害剤が提供される、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
前記患者に、ＭＤＡ−７および／またはＨｓｐ９０阻害剤が１回を超えて提供される、請求項６０記載の方法。
【請求項９１】
患者において肺癌を治療する方法であって、該患者に、ｉ）該患者において発現できるプロモーターの制御下にある、ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を含む、アデノウィルスベクター；およびｉｉ）Ｈｓｐ９０阻害剤を投与することを含む、方法。
【請求項９２】
さらに、前記患者から１以上の腫瘍の全部または一部を切除することを含む、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
前記アデノウィルスベクターおよびＨｓｐ９０阻害剤が医薬上許容される組成物中に存在する、請求項９１記載の方法。
【請求項９４】
約１０９ないし約１０１３の間のウィルス粒子が前記患者／投与に投与される、請求項９１記載の方法。
【請求項９５】
前記アデノウィルスベクターがプロタミンと共に処方される、請求項９１記載の方法。
【請求項９６】
前記アデノウィルスベクターおよび／またはＨｓｐ９０阻害剤が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項９１記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤が投与されてから２４時間以内に、前記患者に前記アデノウィルスベクターが投与される、請求項９１記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤が投与されてから２時間以内に、前記患者に前記アデノウィルスベクターが投与される、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤が投与されるに先立って、前記患者に前記アデノウィルスベクターが投与される、請求項９１記載の方法。
【請求項１００】
前記アデノウィルスベクターが投与されるに先立って、前記患者に前記Ｈｓｐ９０阻害剤が提供される、請求項９１記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤がゲルダナマイシン、またはその誘導体またはアナログ、またはその組合せである、請求項９１記載の方法。
【請求項１０２】
さらに、前記患者を、放射線療法、化学療法、および／または免疫療法に供することを含む、請求項９１記載の方法。
【請求項１０３】
さらに、前記患者から腫瘍の全部または一部を切除することを含む、請求項９１記載の方法。
【請求項１０４】
ＭＤＡ−７および／またはＨｓｐ９０阻害剤は、腫瘍切除の後に前記患者に提供される請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
前記患者に前記アデノウィルスが投与され、かつ／または前記Ｈｓｐ９０阻害剤が生じた腫瘍床に投与される、請求項８８記載の方法。
【請求項１０６】
前記患者に前記アデノウィルスおよび／または前記Ｈｓｐ９０阻害剤が１回を超えて投与される、請求項９１記載の方法。
【請求項１０７】
ａ）Ｈｓｐ９０阻害剤またはＨｓｐ９０阻害剤プロドラッグ；および
ｂ）精製された活性なＭＤＡ−７蛋白質、またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸；
を含む、医薬組成物。
【請求項１０８】
前記組成物がＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む、請求項１０７記載の医薬組成物。
【請求項１０９】
前記核酸がアデノウィルスベクターである、請求項１０８記載の医薬組成物。
【請求項１１０】
前記医薬組成物がＨｓｐ９０阻害剤を含む、請求項１０８記載の医薬組成物。
【請求項１１１】
前記Ｈｓｐ９０阻害剤がゲルダナマイシンまたは１７−ＧＡＡである、請求項１１０記載の医薬組成物。
【請求項１１２】
ｉ）プロモーターに操作可能に連結されている、ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を有する、アデノウィルスベクター；およびｉｉ）Ｈｓｐ９０阻害剤、を含む、医薬組成物。
【請求項１１３】
肺癌細胞を治療する方法であって、ＭＤＡ−７およびＨｓｐ９０阻害剤を患者に提供することを含む、方法。
【請求項１１４】
患者において癌細胞を治療する方法であって、該患者にＭＤＡ−７およびＭＤＡ−７結合剤を提供することを含む、方法。
【請求項１１５】
前記結合剤がＣＯＸ−２阻害剤である、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１６】
前記結合剤がＨｓｐ９０阻害剤である、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１７】
前記結合剤がビタミンＥ化合物である、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１８】
患者において癌を治療する方法であって、ＭＤＡ−７およびビタミンＥ化合物を該患者に提供することを含む、方法。
【請求項１１９】
ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む組成物を前記患者に投与することによって、前記ＭＤＡ−７が該患者に供され、ここで、該ＭＤＡ−７ポリペプチドは該患者において発現される、請求項１１８記載の方法。
【請求項１２０】
前記組成物が医薬上許容される組成物である、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２１】
前記核酸がベクター中に存在する、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２２】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項１２１記載の方法。
【請求項１２３】
約１０９ないし約１０１３ウィルス粒子が前記患者／投与に投与される、請求項１２２記載の方法。
【請求項１２４】
前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項１２２記載の方法
【請求項１２５】
アデノウィルスベクターがプロタミンと共に処方される、請求項１２４記載の方法。
【請求項１２６】
前記ＭＤＡ−７核酸組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２７】
前記ＭＤＡ−７核酸組成物が１以上の脂質を含む、請求項１１９記載の方法。
【請求項１２８】
前記組成物がＤＯＴＡＰおよびコレステロール、またはその誘導体を含む、請求項１２７記載の方法。
【請求項１２９】
精製されたＭＤＡ−７蛋白質を含む組成物が前記患者に投与されることによって、前記ＭＤＡ−７が患者に提供される、請求項１１８記載の方法。
【請求項１３０】
前記精製されたＭＤＡ−７蛋白質組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項１２９記載の方法。
【請求項１３１】
前記患者に、各治療用の約５ｍｇと約５００ｍｇとの間のビタミンＥ化合物が提供される、請求項１１８記載の方法。
【請求項１３２】
前記ビタミンＥ化合物が固体または乾燥粉末として前記患者に提供される、請求項１１８記載の方法。
【請求項１３３】
前記ビタミンＥ化合物が、１以上のリポソームを含む組成物中で前記患者に提供される、請求項１１８記載の方法。
【請求項１３４】
トコフェロールまたはそのセステル化形態を含む組成物を前記患者に投与することによって、前記ビタミンＥ化合物が患者に提供される、請求項１１８記載の方法。
【請求項１３５】
前記トコフェロールがアルファ−トコフェロールである、請求項１３４記載の方法。
【請求項１３６】
前記エステル化形態がトコフェロールアセテートまたはトコフェロールスクシネートである、請求項１３４記載の方法。
【請求項１３７】
前記組成物がアルファ−トコフェリルスクシネートを含む、請求項１３６記載の方法。
【請求項１３８】
前記患者に、前記ビタミンＥ化合物またはそのエステル化形態と、ｉ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはｉｉ）ＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸いずれかとを含む組成物が提供される、請求項１１８記載の方法。
【請求項１３９】
前記ビタミンＥ化合物が提供されてから２４時間以内に、前記患者に前記ＭＤＡ−７が提供される、請求項１１８記載の方法。
【請求項１４０】
前記ビタミンＥ化合物が提供されてから２時間以内に、前記患者に前記ＭＤＡ−７が提供される、請求項１３９記載の方法。
【請求項１４１】
前記ビタミンＥ化合物が提供されるに先立って、前記患者に前記ＭＤＡ−７が提供される、請求項１３９記載の方法。
【請求項１４２】
前記ＭＤＡ−７が提供されるに先立って、前記患者に前記ビタミンＥ化合物が提供される、請求項１３９記載の方法。
【請求項１４３】
前記ビタミンＥ化合物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項１３４記載の方法。
【請求項１４４】
前記癌が、メラノーマ、非−小細胞肺、小細胞肺、肺、肝臓癌腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、首部、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部、胃腸、リンパ腫、脳、結腸または膀胱のものある、請求項１１８記載の方法。
【請求項１４５】
前記癌が上皮癌細胞を含む、請求項１１８記載の方法。
【請求項１４６】
さらに、前記患者を放射線療法および／または化学療法に供することを含む、請求項１１８記載の方法。
【請求項１４７】
さらに、前記患者から腫瘍の全部または一部を切除することを含む、請求項１１８記載の方法。
【請求項１４８】
ＭＤＡ−７および／またはビタミンＥ化合物が腫瘍切除の後に、前記患者に提供される、請求項１４７記載の方法。
【請求項１４９】
少なくとも組成物を生じた腫瘍床に投与することによって、前記患者に、ＭＤＡ−７および／またはビタミンＥ化合物が提供される、請求項１４８記載の方法。
【請求項１５０】
前記患者にＭＤＡ−７および／またはビタミンＥ化合物が１回を超えて提供される、請求項１１８記載の方法。
【請求項１５１】
患者において癌を治療する方法であって、該患者に、ｉ）該患者において発現できるプロモーターの制御下にある、ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を含む、アデノウィルスベクター；およびｉｉ）アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェロールのエステル化形態、を投与することを含む、方法。
【請求項１５２】
前記患者にアルファトコフェロールスクシネートまたはアルファトコフェロールアセテートが投与される、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５３】
さらに、前記患者から１以上の腫瘍の全てまたは一部を切除することを含む、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５４】
前記アデノウィルスベクターおよび前記アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェロールのエステル化形態が、医薬上許容される組成物中に存在する、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５５】
約１０９ないし約１０１３の間のウィルス粒子が前記患者／投与に投与される、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５６】
アデノウィルスベクターがプロタミンと共に処方される、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５７】
前記アデノウィルスベクターおよび／または前記アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェロールのエステル化形態が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５８】
前記アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェロールのエステル化形態が投与されてから２４時間以内に、前記患者に前記アデノウィルスベクターが投与される、請求項１５１記載の方法。
【請求項１５９】
前記アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェロールのエステル化形態が投与されてから２時間以内に、前記患者に前記アデノウィルスベクターが投与される、請求項１５８記載の方法。
【請求項１６０】
前記アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェロールのエステル化形態が投与されるに先立って、前記患者に前記アデノウィルスベクターが投与される、請求項１５１記載の方法。
【請求項１６１】
前記アデノウィルスベクターが投与されるに先立って、前記患者に前記アルファートコフェロール、またはアルファ−トコフェロールのエステル化形態が提供される、請求項１５１記載の方法。
【請求項１６２】
さらに、前記患者を、放射線療法、化学療法、および／または免疫療法に供することを含む、請求項１５１記載の方法。
【請求項１６３】
さらに、前記患者から腫瘍の全部または一部を切除することを含む、請求項１５１記載の方法。
【請求項１６４】
ＭＤＡ−７および／または前記アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェロールのエステル化形態が、腫瘍切除の後に患者に提供される、請求項１６３記載の方法。
【請求項１６５】
前記患者に前記アデノウィルスが投与され、かつ／または前記アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェロールのエステル化形態が生じた腫瘍床に投与される、請求項１４８記載の方法。
【請求項１６６】
前記患者に前記アデノウィルスおよび／または前記アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェロールのエステル化形態が、１回を超えて投与される、請求項１５１記載の方法。
【請求項１６７】
ａ）ビタミンＥ化合物；および
ｂ）精製された活性なＭＤＡ−７蛋白質、またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸；
を含む、医薬組成物。
【請求項１６８】
前記組成物がＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む、請求項１６７記載の医薬組成物。
【請求項１６９】
前記核酸がアデノウィルスベクターである、請求項１６８記載の医薬組成物。
【請求項１７０】
前記医薬組成物が、アルファ−トコフェロールまたはそのエステル化形態であるビタミンＥ化合物を含む、請求項１６８記載の医薬組成物。
【請求項１７１】
前記アルファ−トコフェロールがアルファ−トコフェリルスクシネートである、請求項１７０記載の医薬組成物。
【請求項１７２】
ｉ）プロモーターに操作可能に連結された、ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を有する、アデノウィルスベクター；およびｉｉ）アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェリルスクシネート、を含む、医薬組成物。
【請求項１７３】
ａ）精製された活性なＭＤＡ−７蛋白質、またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸、および
ｂ）ＭＤＡ−７結合剤；
を含む、医薬組成物。
【請求項１７４】
患者において肺癌を治療または予防する方法であって、ＭＤＡ−７蛋白質をコードするポリヌクレオチド、ＤＯＴＡＰ、およびコレステロールを含む医薬上許容される組成物を該患者に投与することを含む、方法。
【請求項１７５】
ＭＤＡ−７蛋白質をコードする前記ポリヌクレオチドが発現構築体を含む、請求項１７４記載の方法。
【請求項１７６】
前記組成物がリポソームを含む、請求項１７４記載の方法。
【請求項１７７】
前記リポソームがＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子である、請求項１７６記載の方法。
【請求項１７８】
前記肺癌が非−小細胞肺癌、小細胞肺癌、または転移性肺癌である、請求項１７４記載の方法。
【請求項１７９】
前記方法が、前記患者において転移性肺癌を治療する方法である、請求項１７４記載の方法。
【請求項１８０】
前記組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項１７４記載の方法。
【請求項１８１】
患者において癌を治療する方法であって、ＭＤＡ−７および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を該患者に提供することを含む、方法。
【請求項１８２】
前記ＴＮＦが、ＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＴＮＦ−ガンマ、ＴＮＦ−デルタ、またはＴＮＦ−イプシロンである、請求項１８１記載の方法。
【請求項１８３】
前記ＴＮＦがＴＮＦ−アルファである、請求項１８２記載の方法。
【請求項１８４】
ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む組成物を前記患者に投与することによって、前記ＭＤＡ−７が該患者に供され、ここで、該ＭＤＡ−７ポリペプチドは該患者において発現される、請求項１８１記載の方法。
【請求項１８５】
前記組成物が医薬上許容される組成物である、請求項１８４記載の方法。
【請求項１８６】
前記核酸がベクター中に存在する、請求項１８４記載の方法。
【請求項１８７】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項１８６記載の方法。
【請求項１８８】
約１０９ないし約１０１３ウィルス粒子が患者／投与に投与される、請求項１８７記載の方法。
【請求項１８９】
前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項１８６記載の方法。
【請求項１９０】
アデノウィルスベクターがプロタミンと共に処方される、請求項１８９記載の方法。
【請求項１９１】
前記ＭＤＡ−７核酸組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項１８４記載の方法。
【請求項１９２】
前記ＭＤＡ−７核酸組成物が１以上の脂質を含む、請求項１８４記載の方法。
【請求項１９３】
前記組成物がＤＯＴＡＰおよびコレステロールまたはその誘導体を含む、請求項１９２記載の方法。
【請求項１９４】
前記ＭＤＡ−７が、精製されたＭＤＡ−７蛋白質を含む組成物を前記患者に投与することによって該患者に提供される、請求項１８１記載の方法。
【請求項１９５】
前記精製されたＭＤＡ−７蛋白質組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項１９４記載の方法。
【請求項１９６】
ＴＮＦをコードする配列を有する核酸を含む組成物を前記患者に投与することによって、前記ＴＮＦが該患者に供され、ここで、該ＴＮＦは該患者において発現される、請求項１８１記載の方法。
【請求項１９７】
前記組成物が医薬上許容される組成物である、請求項１９６記載の方法。
【請求項１９８】
前記核酸がベクター中に存在する、請求項１９６記載の方法。
【請求項１９９】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項１９８記載の方法。
【請求項２００】
約１０９ないし約１０１３のウィルス粒子が前記患者／投与に投与される、請求項１９９記載の方法。
【請求項２０１】
前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項１９９記載の方法。
【請求項２０２】
アデノウィルスベクターがプロタミンと共に処方される、請求項２０１記載の方法。
【請求項２０３】
前記ＴＮＦ核酸組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項１９６記載の方法。
【請求項２０４】
前記ＴＮＦ核酸組成物が１以上の脂質を含む、請求項１９６記載の方法。
【請求項２０５】
前記組成物がＤＯＴＡＰおよびコレステロール、またはその誘導体を含む、請求項２０４記載の方法。
【請求項２０６】
精製されたＴＮＦを含む組成物を前記患者に投与することによって、前記ＴＮＦが該患者に提供される、請求項１９６記載の方法。
【請求項２０７】
前記精製されたＴＮＦ組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項２０６記載の方法。
【請求項２０８】
ａ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質、またはＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸；およびｂ）精製されたＴＮＦ、またはＴＮＦをコードする配列を有する核酸を含む組成物を、前記患者に提供する、請求項１８１記載の方法。
【請求項２０９】
ＴＮＦと、ｉ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはｉｉ）ＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸いずれかとを含む組成物が、前記患者に提供される、請求項２０８記載の方法。
【請求項２１０】
前記ＴＮＦがＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＴＮＦ−ガンマ、ＴＮＦ−デルタ、またはＴＮＦ−イプシロンである、請求項２０９記載の方法。
【請求項２１１】
前記ＴＮＦがＴＮＦ−アルファである、請求項２１０記載の方法。
【請求項２１２】
ＴＮＦが提供されてから２４時間以内に、前記患者にＭＤＡ−７が提供される請求項１８１記載の方法。
【請求項２１３】
ＴＮＦが提供されてから２時間以内に、前記患者に前記ＭＤＡ−７が提供される請求項２１２記載の方法。
【請求項２１４】
ＴＮＦが提供されるに先立って、前記患者に前記ＭＤＡ−７が提供される請求項２１２記載の方法。
【請求項２１５】
前記ＭＤＡ−７が提供されるに先立って、前記患者にＴＮＦが提供される、請求項２１２記載の方法。
【請求項２１６】
前記癌が、メラノーマ、非−小細胞肺、小細胞肺、肺、肝臓癌腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、首部、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部、胃腸、リンパ腫、脳、結腸または膀胱のものである、請求項１８１記載の方法。
【請求項２１７】
前記癌が上皮癌細胞を含む、請求項１８１記載の方法。
【請求項２１８】
さらに、前記患者を放射線療法および／または化学療法に供することを含む、請求項１８１記載の方法。
【請求項２１９】
前記患者が放射線療法に供される、請求項２１８記載の方法。
【請求項２２０】
ＭＤＡ−７およびＴＮＦが各々少なくとも１回供された後に、前記患者が放射線療法に供される、請求項２１８記載の方法。
【請求項２２１】
前記患者が致死未満用量の放射線療法に供される、請求項２２０記載の方法。
【請求項２２２】
さらに、前記患者から腫瘍の全てまたは一部を切除することを含む、請求項１８１記載の方法。
【請求項２２３】
ＭＤＡ−７および／またはＴＮＦが腫瘍切除の後に患者に提供される、請求項２２２記載の方法。
【請求項２２４】
少なくとも、組成物を生じた腫瘍床に投与することによって、前記患者にＭＤＡ−７および／またはＴＮＦが提供される、請求項２２３記載の方法。
【請求項２２５】
前記患者にＭＤＡ−７および／またはＴＮＦが１回を超えて提供される、請求項１８１記載の方法。
【請求項２２６】
ａ）精製された活性なＴＮＦ、またはＴＮＦをコードする配列を有する核酸；および
ｂ）精製された活性なＭＤＡ−７蛋白質、またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸；
を含む、医薬組成物。
【請求項２２７】
前記ＴＮＦがＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＴＮＦ−ガンマ、ＴＮＦ−デルタ、またはＴＮＦ−イプシロンである、請求項２２６記載の医薬組成物。
【請求項２２８】
前記ＴＮＦがＴＮＦ−アルファである、請求項２２７記載の医薬組成物。
【請求項２２９】
前記組成物がＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む、医薬組成物。
【請求項２３０】
ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸がアデノウィルスベクターである、請求項２２９記載の医薬組成物。
【請求項２３１】
前記組成物がＴＮＦをコードする配列を有する核酸を含む、請求項２２６記載の医薬組成物。
【請求項２３２】
ＴＮＦをコードする配列を有する前記核酸がアデノウィルスベクターである、請求項２３１記載の医薬組成物。
【請求項２３３】
ｉ）第一のプロモーターに操作可能に連結されている、ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を有する、第一のアデノウィルスベクター；およびｉｉ）第二のプロモーターに操作可能に連結されている、ＴＮＦをコードする配列を有する、第二のアデノウィルスベクター；を含む、医薬組成物。
【請求項２３４】
前記ＴＮＦがＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＴＮＦ−ガンマ、ＴＮＦ−デルタ、またはＴＮＦ−イプシロンである、請求項２３３記載の医薬組成物。
【請求項２３５】
前記ＴＮＦがＴＮＦ−アルファである、請求項２３４記載の医薬組成物。
【請求項２３６】
ＭＤＡ−７をコードする第一の核酸配列を有するアデノウィルスベクター、およびＴＮＦをコードする第二の核酸配列を含む、医薬組成物。
【請求項２３７】
前記ＴＮＦがＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＴＮＦ−ガンマ、ＴＮＦ−デルタ、またはＴＮＦ−イプシロンである、請求項２３６記載の医薬組成物。
【請求項２３８】
前記ＴＮＦがＴＮＦ−アルファである、請求項２３７記載の医薬組成物。
【請求項２３９】
前記第一の核酸配列および第二の核酸配列がプロモーターに操作可能に連結されている、請求項２３６記載の医薬組成物。
【請求項２４０】
前記第一の核酸配列が前記第一のプロモーターに操作可能に結合されており、かつ前記第二の核酸配列が前記第二のプロモーターに操作可能に結合されている、請求項２３６記載の医薬組成物。
【請求項２４１】
ＭＤＡ−７および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤を提供することを含む、患者において癌を治療する方法。
【請求項２４２】
前記阻害剤がＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に特異的に結合する、請求項２４１記載の方法。
【請求項２４３】
前記ＶＥＧＦ阻害剤がＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、または低分子である、請求項２４２記載の方法。
【請求項２４４】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が抗体である、請求項２４２記載の方法。
【請求項２４５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２４４記載の方法。
【請求項２４６】
前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するモノクローナル抗体である、請求項２４５記載の方法。
【請求項２４７】
前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体である、請求項２４６記載の方法。
【請求項２４８】
前記モノクローナル抗体がベバシズマブである、請求項２４６記載の方法。
【請求項２４９】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が低分子である、請求項２４３記載の方法。
【請求項２５０】
前記低分子がＶＥＧＦのチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項２４９記載の方法。
【請求項２５１】
前記ＶＥＧＦの阻害剤がリボザイムである、請求項２４３記載の方法。
【請求項２５２】
前記リボザイムが、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡを特異的に標的化するリボザイムである、請求項２５１記載の方法。
【請求項２５３】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が可溶性ＶＥＧＦ受容体である、請求項２４３記載の方法。
【請求項２５４】
ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む組成物を患者に投与することによって、前記ＭＤＡ−７が前記患者に提供され、ここで、該ＭＤＡ−７ポリペプチドは該患者において発現される、請求項２４１記載の方法。
【請求項２５５】
前記組成物が医薬上許容される組成物である、請求項２５４記載の方法。
【請求項２５６】
前記核酸がベクター中に存在する、請求項２５４記載の方法。
【請求項２５７】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項２５６記載の方法。
【請求項２５８】
約１０９ないし約１０１３ウィルス粒子が前記患者／投与に投与される、請求項２５７記載の方法。
【請求項２５９】
前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項２５７記載の方法。
【請求項２６０】
アデノウィルスベクターがプロタミンと共に処方される、請求項２５９記載の方法。
【請求項２６１】
前記ＭＤＡ−７核酸組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項２５４記載の方法。
【請求項２６２】
前記ＭＤＡ−７核酸組成物が１以上の脂質を含む、請求項２５４記載の方法。
【請求項２６３】
前記組成物がＤＯＴＡＰおよびコレステロール、またはその誘導体を含む、請求項２６２記載の方法。
【請求項２６４】
精製されたＭＤＡ−７蛋白質を含む組成物を前記患者に投与することによって、ＭＤＡ−７が該患者に提供される、請求項２４１記載の方法。
【請求項２６５】
前記精製されたＭＤＡ−７蛋白質組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項２６４記載の方法。
【請求項２６６】
前記ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列を有する核酸を含む組成物を前記患者に投与することによって、該ＶＥＧＦ阻害剤が該患者に供され、ここで、該ＶＥＧＦ阻害剤は患者において発現される、請求項２４１記載の方法。
【請求項２６７】
前記ＶＥＧＦ阻害剤がＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、または低分子である、請求項２６６記載の方法。
【請求項２６８】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が抗体である、請求項２６７記載の方法。
【請求項２６９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２６８記載の方法。
【請求項２７０】
前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するモノクローナル抗体である、請求項２６９記載の方法。
【請求項２７１】
前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体である、請求項２７０記載の方法。
【請求項２７２】
前記モノクローナル抗体がベバシズマブである、請求項２７１記載の方法。
【請求項２７３】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が低分子である、請求項２６７記載の方法。
【請求項２７４】
前記低分子がＶＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項２７３記載の方法。
【請求項２７５】
前記ＶＥＧＦの阻害剤がリボザイムである、請求項２６７記載の方法。
【請求項２７６】
前記リボザイムが、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡを特異的に標的化するリボザイムである、請求項２７４記載の方法。
【請求項２７７】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が可溶性ＶＥＧＦ受容体である、請求項２７６記載の方法。
【請求項２７８】
前記組成物が医薬上許容される組成物である、請求項２６６記載の方法。
【請求項２７９】
前記核酸がベクター中に存在する、請求項２６６記載の方法。
【請求項２８０】
前記ベクターがウィルスベクターである、請求項２７９記載の方法。
【請求項２８１】
約１０９ないし約１０１３ウィルス粒子が前記患者／投与に投与される、請求項２８０記載の方法。
【請求項２８２】
前記ベクターがアデノウィルスベクターである、請求項２８０記載の方法。
【請求項２８３】
アデノウィルスベクターがプロタミンと共に処方される、請求項２８２記載の方法。
【請求項２８４】
前記組成物が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項２６６記載の方法。
【請求項２８５】
前記組成物が１以上の脂質を含む、請求項２６６記載の方法。
【請求項２８６】
前記組成物がＤＯＴＡＰおよびコレステロール、またはその誘導体を含む、請求項２８５記載の方法。
【請求項２８７】
成長因子該阻害剤が、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞により直接的に、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与される、請求項２４１記載の方法。
【請求項２８８】
前記患者に少なくとも以下：
ａ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質、またはＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸；および
ｂ）ＶＥＧＦに特異的に結合するモノクローナル抗体；
が提供される、請求項２４１記載の方法。
【請求項２８９】
前記モノクローナル抗体がベバシズマブである、請求項２８８記載の方法。
【請求項２９０】
ベバシズマブが提供されてから２４時間以内に、前記患者にＭＤＡ−７が提供される、請求項２８９記載の方法。
【請求項２９１】
ベバシズマブが提供されてから２時間以内に、前記患者に前記ＭＤＡ−７が提供される、請求項２９０記載の方法。
【請求項２９２】
ベバシズマブが提供されるに先立って、前記患者に前記ＭＤＡ−７が提供される、請求項２９０記載の方法。
【請求項２９３】
前記ＭＤＡ−７が提供されるに先立って、前記患者にベバシズマブが提供される、請求項２８９記載の方法。
【請求項２９４】
前記癌が、メラノーマ、非−小細胞肺、小細胞肺、肺、肝臓癌腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、首部、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部、胃腸、リンパ腫、脳、結腸または膀胱のものである、請求項２４１記載の方法。
【請求項２９５】
前記癌が上皮癌細胞を含む、請求項２４１記載の方法。
【請求項２９６】
さらに、前記患者を放射線療法および／または化学療法に供することを含む、請求項２４１記載の方法。
【請求項２９７】
前記患者が放射線療法に供される、請求項２９６記載の方法。
【請求項２９８】
ＭＤＡ−７およびメバシズマブが各々少なくとも１回供された後に、前記患者が放射線療法に供される、請求項２９７記載の方法。
【請求項２９９】
前記患者が致死未満用量の放射線療法に供される、請求項２９７記載の方法。
【請求項３００】
さらに、前記患者から腫瘍の全てまたは一部を切除することを含む、請求項２４１記載の方法。
【請求項３０１】
腫瘍切除の後に、ＭＤＡ−７および／または成長因子の阻害剤が前記患者に提供される、請求項３００記載の方法。
【請求項３０２】
少なくとも、組成物を生じた腫瘍床に投与することによって、前記患者にＭＤＡ−７および／または成長因子の阻害剤が提供される、請求項３００記載の方法。
【請求項３０３】
前記患者にＭＤＡ−７および／またはベバシズマブが一回を超えて提供される、請求項２４１記載の方法。
【請求項３０４】
ａ）ＶＥＧＦ阻害剤、またはＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列を有する核酸；および
ｂ）精製された活性なＭＤＡ−７蛋白質、またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸；
を含む、医薬組成物。
【請求項３０５】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、蛋白質、ポリペプチド、ペプチドまたは低分子である、請求項３０４記載の医薬組成物。
【請求項３０６】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が抗体である、請求項３０５記載の医薬組成物。
【請求項３０７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項３０６記載の医薬組成物。
【請求項３０８】
前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対するモノクローナル抗体である、請求項３０７記載の医薬組成物。
【請求項３０９】
前記モノクローナル抗体がＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体である、請求項３０８記載の医薬組成物。
【請求項３１０】
前記モノクローナル抗体がベバシズマブである、請求項３０９記載の医薬組成物。
【請求項３１１】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が低分子である、請求項３０５記載の医薬組成物。
【請求項３１２】
前記低分子がＶＥＧＦ受容体のチロシンキナーゼ阻害剤である、請求項３１１記載の医薬組成物。
【請求項３１３】
前記ＶＥＧＦの該阻害剤がリボザイムである、請求項３０５記載の医薬組成物。
【請求項３１４】
前記リボザイムが、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡを特異的に標的化するリボザイムである、請求項３１３記載の医薬組成物。
【請求項３１５】
前記ＶＥＧＦで阻害剤が可溶性ＶＥＧＦ受容体である、請求項３０５記載の医薬組成物。
【請求項３１６】
前記組成物がＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む、請求項３０４記載の医薬組成物。
【請求項３１７】
ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する前記核酸がアデノウィルスベクターである、請求項３０４記載の医薬組成物。
【請求項３１８】
前記組成物がＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列を有する核酸を含む、請求項３０４記載の医薬組成物。
【請求項３１９】
ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列を有する前記核酸がアデノウィルスベクターである、請求項３０４記載の医薬組成物。
【請求項３２０】
ａ）ベバシズマブ、および
ｂ）精製された活性なＭＤＡ−７蛋白質、またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸；
を含む、医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年２月８日に出願された米国仮特許出願第６０／６５０，８０７号、２００５年３月１４日に出願された米国仮特許出願第６０／６６１，６７９号、２００５年４月２９日に出願された米国仮特許出願第６０／６７６，０９６号、および２００５年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／７４９，３７２号に関連する。これらの各々は、その全体が、本明細書中に参考として援用される。
【０００２】
政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからのグラント番号ＣＡ１６６７２、ＣＡ７８７７８、およびＣＡ１０２７１６に従って、本発明における権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、一般には、分子生物学および腫瘍学の分野に関する。更に詳しくは、本発明は、ＭＤＡ−７のような腫瘍サプレッサー、および１以上のＣＯＸ−２阻害剤を含む癌を治療するための方法および組成物に関する。この治療の組合せは、各成分単独よりも効果的であって、それらの予測される相加的効果よりも大きい。他のある具体例において、本発明は、ＭＤＡ−７のような腫瘍サプレッサー、およびゲルダナマイシンおよびそのアナログおよび誘導体のようなＨｓｐ９０阻害剤を用いる癌を治療するための方法および組成物に関する。さらなる具体例において、本発明は、ＭＤＡ−７およびビタミンＥ化合物を含む癌を治療するための方法および組成物に関する。また、本発明は、ＭＤＡ−７のような腫瘍サプレッサー、および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）を含む癌を治療するための方法および組成物に関する。さらなる具体例において、本発明は、ＭＤＡ−７およびＶＥＧＦ阻害剤を含む癌を治療するための方法および組成物に関する。また、本発明は、ＭＤＡ−７およびＩＬ−１０阻害剤を含む癌を治療するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００４】
（関連する分野の詳述）
１．ＭＤＡ−７
メラノーマ分化―関連遺伝子７（ｍｄａ−７）は２４ｋＤＡ蛋白質をコードし、正常な細胞を害することなく、選択的に癌細胞において細胞死滅およびアポトーシスを誘導する最近記載されている腫瘍サプレッサー遺伝子である（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１；  Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３；  Ｐａｔａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
【０００５】
ＭＤＡ−７のアデノウィルスの過剰発現は、結直腸（Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、乳房（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３），前立腺（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１），および肺癌種（Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）を含めた種々の腫瘍タイプにおける腫瘍選択的成長抑制およびアポトーシス誘導に導く。
【０００６】
最近、ｍｄａ−７（Ａｄ−ｍｄａ７）およびトラスツマブのアデノウィルス媒介送達の組合せが、Ａｋｔおよびβ―カテニンのリン酸化を減少させることによってＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ｃ−ｅｒｂＢ２）過剰発現乳癌細胞において抗―腫瘍活性を増大させたことが示されている（非特許文献１）
また、ｍｄａ−７のアデノウィルス―媒介過剰発現は、ヒト肺癌細胞において、引き続いてのｅＩＦ−２アルファ、他のＰＫＲ標的基質のリン酸化、およびアポトーシス誘導と共にＰＫＲの迅速な誘導に導くことも示された（Ｐａｔａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。
【０００７】
ＰＫＲはインターフェロンで誘導される二本鎖ＲＮＡ活性化プロテインキナーゼである。インターフェロン（ＩＦＮ）の抗ウィルスおよび抗増殖効果を媒介するにおけるその機能については最良に特徴付けられているが、ＰＫＲは転写調節、細胞分化、シグナル変換および腫瘍抑制にも関係付けられている（Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。ＰＫＲはアポトーシス、細胞―増殖、シグナル変換、および分化の調節に関与するのは明らかである（Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  ２００１；  Ｂａｒｂｅｒ，２００１；  Ｊａｇｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。また、ＰＫＲは熱ショック蛋白質９０（Ｈｓｐ９０）分子シャペロン複合体によって調節されることも示されている（Ｄｏｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。Ｈｓｐ９０およびそのコ―シャペロンｐ２３はＮ−末端二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡ結合領域を介して、並びにそのキナーゼドメインを介してＰＫＲに結合する（Ｄｏｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００１）。ｄｓＲＮＡおよびゲルダナマイシン（以後、ＧＡという）は、共に、成熟ＰＫＲからのＨｓｐ９０およびＰ２３の迅速な解離を誘導し；イン・ビボおよびイン・ビトロ双方においてＰＫＲを活性化する（非特許文献２）。Ｈｓｐ９０は、環境ストレスに暴露された細胞中の蛋白質の再折り畳みに、およびいくつかの鍵となる調節蛋白質の立体配座に必要なシャペロンである（Ｍａｌｏｎｅｙ  ａｎｄ  Ｗｏｒｋｍａｎ，  ２００２）。
【０００８】
２．ＮＳＡＩＤ
アスピリン、およびいくつかの他の非―ステロイド系抗―炎症薬物（ＮＳＡＩＤ）は結直腸癌に対して化学予防作用を発揮し、恐らくは胃、食道（Ｔｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）および膀胱（Ｅａｒｎｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２）癌に対してさえも発揮することを示唆する益々増大する量の実験および疫学的データがある。アスピリン、イプブロフェン、ピロキシカム（Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０；  Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）、インドメタシン（Ｎａｒｉｓａｗａ，  １９８１）、およびスリンダック（Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７；  Ｒａｏ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９５）は、ＡＯＭ−処理ラットモデルにおいて結腸癌形成を効果的に阻害し、フルルビプロフェンはＡＰＣ（Ｍｉｎ）＋マウスモデルにおいて抗−腫瘍効果を示した（Ｗｅｃｈｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７）。ＮＳＡＩＤは、活性化されたＫｉ−ｒａｓを保有する腫瘍の発生を阻害する（Ｓｉｎｇｈ  ａｎｄ  Ｒｅｄｄｙ，  １９９５）。
【０００９】
ＮＳＡＩＤは腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導を介して癌形成を阻害するように見える（Ｂｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｌｕｐｕｌｅｓｃｕ，  １９９６；  Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７ｂ）。多数の研究は、アポトーシスの誘導を含めた、ＮＳＡＩＤの化学予防特性はプロスタグランジン合成を阻害するそれらの能力の関数であることを示唆する（ＤｕＢｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｌｕｐｕｌｅｓｃｕ，  １９９６；  Ｖａｎｅ  ａｎｄ  Ｂｏｔｔｉｎｇ，  １９９７にレビューされている）。これは、プロ炎症性プロスタグランジンの合成を抑制するシクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）活性の阻害によって行うことができると仮定されている（Ｈｉｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。疫学的および実験室的研究は、結腸癌形成は、少なくとも部分的には、ＣＯＸイソ酵素（ＣＯＸ−１および―２）によるプロスタグランジン生産の変調を介して媒介されることを示唆する（Ｋａｗａｍｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。しかしながら、最近の研究は、ＮＳＡＩＤがプロスタグランジン―依存性および―非依存性メカニズム双方を介して癌形成を阻害できることを示す（Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７ａ；  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｈａｎｉｆ，  １９９６）。スリンダックスルホン、ＮＳＡＩＤスリンダックの代謝産物は、ＣＯＸ−阻害活性を欠如するが、腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導し（Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９７ｂ）、いくつかの癌形成のげっ歯類モデルにおける腫瘍発生を阻害する（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｐｉａｚｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５，  １９９７ａ）。スリンダック活性の潜在的メカニズムは、他のＮＳＡＩＤ剤のＣＯＸを阻害よりはむしろ、チロシンキナーゼの直接的または間接的阻害であろうと仮定されている（Ｗｉｎｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。
【００１０】
いくつかのＮＳＡＩＤはヒト臨床試験においてその効果について調べられている。イブプロフェンの相ＩＩａ試験（一ヶ月）は完了しており、３００ｍｇ／日の用量においてさえ、平坦な粘膜におけるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）レベルの有意な減少が観察された。イブプロフェンの３００ｍｇの用量は非常に低く（１２００ないし３０００ｍｇ／日以上の治療用量範囲）、毒性は長時間にわたってさえ見られないようである。しかしながら、動物の化学予防モデルにおいて、イブプロフェンは他のＮＳＡＩＤよりも効率は低い。研究は、結腸癌の発生に対するＮＳＡＩＤ、アスピリンの有益な効果を示唆しており、効果は１０００ｍｇ以上の毎週の合計用量においてのみ明らかである（Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）。しかしながら、３つの大きなコホールト研究は、アスピリンの有益な効果についての相反する報告を作成している（Ｇａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｇｉｏｖａｎｎｕｃｃｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６；  Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３）。研究者の１つのグループは、最近、ＰＧＥ２αが８０ｍｇ／日と１６０ｍｇ／日との間の用量で減少させることができることを示している。対照的に、研究者のもう１つのグループは、アスピリンのこれらの低い用量において結腸粘膜プロスタグランジンに対してそのような効果を示していないが、上部胃腸粘膜におけるプロスタグランジンの実質的教育が示された。これらの研究の結果は、８０ｍｇのアスピリンの用量が結腸粘膜に対してこの剤の効果の閾値におけるものであることを示す。かくして、アスピリンは、長期アスピリン使用に関連する深刻な脳血管および胃腸の有害効果の有意な危険性と結合されたその効率に関する問題のため、一般的な集団における結直腸癌の主な化学予防については一般的には推奨されない（Ｓｉｎｇｈ，  １９９８）。
【００１１】
ＮＳＡＩＤプロキシカムは動物モデルにおいて最も効果的な化学予防剤である（Ｐｏｌｌａｒｄ  ａｎｄ  Ｌｕｃｋｅｒｔ，  １９８９；  Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７；  Ｒｉｔｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｎｄｌｅｒ，  １９９９）が、それは最近のＩＩｂ試験において副作用を示した。ＮＳＡＩＤの副作用の大きな包括的分析もまた、ピロキシカムが他のＮＳＡＩＤよりも大きな副作用を有することを示す（Ｌａｎｚａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。加えて、少なくとも１つの研究において、上部胃腸管の腫瘍はピロキシカム処置に対して感受性であるが、十二指腸および結腸のそれは比較的耐性であることが示唆されている（Ｒｉｔｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｅｎｄｌｅｒ，  １９９９）。スリンダックは家族性腺腫ポリポーシス（ＦＡＰ）患者においてアデノーマの退行を生じることが示されている（Ｍｕｓｃａｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）が、散在性アデノーマにおける少なくとも１つの研究はそのような効果を示していない（Ｌａｄｅｎｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５）。
【００１２】
新規な分子技術の発達の迅速なペース、およびヒトゲノムプロジェクトの完了のため、新しい治療標的が癌シグナリング経路に対して開発されつつある。最近の合理的に設計された薬物はセレコキシブ―選択的シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）阻害剤であり、これは抗−炎症剤として（Ｇａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）、および化学予防状況において（Ｋｉｓｍｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）活性を示している。シクロオキシゲナーゼ２（従前は、プロスタグランジンエンドペルオキシドＨシンターゼと言われていた）は、シクロオキシゲナーゼのふたつのイソ形態のうちの１つである。構成的に発現されるシクロオキシゲナーゼ１とは異なり、ＣＯＸ−２は誘導性酵素であって、結腸、乳房、肺および胃癌を含めた多くの腫瘍タイプにおいてかなり増大した発現を示し、癌形成においてＣＯＸ−２について原因となる役割を示唆する（Ｋｏｅｈｎｅ  ａｎｄ  Ｄｕｂｏｉｓ，  ２００４；  Ｈｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）。最近、セレコキシブは成長阻止を促進し、プロ生存シグナリングキナーゼ、プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）／Ａｋｔをダウンレギュレートすることによって、乳癌を含めた種々の癌においてアポトーシスを誘導することが示されている（Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；  Ｋｕｌｐ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４；Ｅｌ−Ｒａｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｌｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【００１３】
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ過剰発現は攻撃的な侵入性乳癌のホールマークである（Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。最近の研究は、ＣＯＸ−２過剰発現が攻撃的乳癌に対する予後マーカーである可能性があり、貧弱な生存に相関するように見えることも示唆している（Ｄｅｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。高レベルのＣＯＸ−２がＨＥＲ−２／ｎｅｕ陽性腫瘍で見出されており、陽性フィードバックループがこれらのマーカーの間に存在することが提案されている（Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。ＣＯＸ−２発現はＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子の転写を増大させ、ＣＯＸ−２の阻害の結果、減少したＨＥＲ−２／ｎｅｕレベルがもたらされる。ＨＥＲ−２／ｎｅｕの増大した発現の結果、Ａｋｅｔ／プロテインキナーゼＢ（ＰＫＢ）に対するホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）を介する構成的シグナリングをもたらす（Ｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）。これらのセリン／スレオニンキナーゼの活性化の結果、細胞の増殖および生存シグナルがもたらされる（Ｃｒａｖｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。Ａｄ―ｍｄａ７は乳癌細胞においてＡｋｔ生存経路を負に調節することが従前に示されている（非特許文献１）。
【００１４】
３．Ｈｓｐ９０阻害剤
ゲルデニミシン（ＧＡ）および１７−アリル−アミノ―ゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）はＨｓｐ９０のＮＨ２―末端部分におけるＡＴＰ−結合部位に特異的に結合することができ、その機能を阻害することができる。Ｈｓｐ９０機能の阻害は、ステロイド受容体、ＨＥＲ２、およびＲａｆ、ＰＤＫ１、Ａｋｔおよびｃｄｋ４キナーゼを含めたそのクライアント蛋白質の分解に導く（Ｓａｕｓｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）。対照的に、従前の研究は、ＧＡがＨｓｐ９０およびｐ２３の成熟ＰＫＲからの迅速な解離を誘導し、イン・ビボおよびイン・ビトロ双方においてＰＫＲを活性化することができるのを示した（Ｄｏｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。ゲルダナマイシン（ＧＡ）は、有意な抗癌特性を有する天然に生じるアナサマイシン抗生物質である。１７−アリルアミノ，１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）、ゲルダナマイシン誘導体は前臨床モデルにおいて良好な活性および癌選択性を示し、今日では、刺激される初期の結果を伴う癌患者における相Ｉ、相ＩＩ臨床試験まで進んでいる（非特許文献３）。１７ＡＡＧおよび急性照射での組合せ治療は、ヒト前立腺癌腫において超相加的成長抑制を生じる（Ｅｎｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。低レベルの１７ＡＡＧを用いる組合せ療法は、ＨＥＲ−２過剰発現乳癌細胞系に対するタキソールおよびドキソルビシンの効果を高めることが見出されている（非特許文献４）。従前の研究は乳癌細胞におけるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の１７ＡＡＧ破壊を示し、ＡＫＴのダウンレギュレーションは、ブチレート―誘導アポトーシスに対する結腸腫瘍細胞の増大した感受性に関連付けられている（Ｒａｈｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３）。
【００１５】
４．ビタミンＥ化合物
ビタミンＥスクシネート（ＶＥＳ）の抗−腫瘍活性を記載する研究が公表されている（Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８２）。最近の研究は、腹腔内投与されたＶＥＳが動物異種移植片および同種異系移植片モデルにおいて抗−腫瘍活性を有することを示している（Ｍａｌａｆａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００；Ｍａｌａｆａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。調査は、ＶＥＳが、ＤＮＡ合成をブロックすることによって癌細胞成長の濃度―および時間―依存性阻害を誘導し、細胞の分化を誘導し、およびアポトーシスを誘導することを示している（Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；Ｎｅｕｚｉｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１；Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ，  ２００２；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。
【００１６】
５．癌
全ての男性のほぼ半分、および全ての婦人の１／３を超える者が彼らの生涯にわたって癌に罹るであろう。百万人を超える人々が毎年癌と診断される。癌での死亡の率は一般に減少しているが、多くの人々はいくつかの形態の癌により毎年死亡し続けている。肺、結腸／直腸、前立腺、および乳房はほとんどの死亡を引き起こす癌である。
【００１７】
婦人の健康を脅かす種々の癌のうち、米国女性のなかでは、乳癌は癌―関連死亡の二番目に最も頻度の高い原因である。全ての癌による死亡のほぼ１５％が乳癌による婦人の病気で報告されており、その発生率はわずかに肺癌の後にある（Ｊｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００２）。更に、乳癌は世界中を通じて開発国および後進国のほとんどにおいて癌死亡率の主な原因の１つである（Ｐｉｓａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９）。新しい薬物および治療様式の開発を通じてかなりの進歩が達成されてきたが、治療―関連毒性を低下させつつ治療結果を改善する緊急の要望が依然として存在する（Ｐｅｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。これは同様に他の癌についても当てはまる。
【００１８】
本発明は癌のための新しくかつ改良された治療に対する要望に取り組む。
【非特許文献１】ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ，１３６：４３７−４４２（２００４）
【非特許文献２】Ｄｏｎｚｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，２０：３７７１−３７８０（２００１）
【非特許文献３】Ｋａｍａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．，４０７−４１０（２００３）
【非特許文献４】Ｓｏｌｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，６３：２１３９２１−２１３９４４（２００３）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１９】
（発明の要旨）
本発明は、一般に、１以上のさらなる治療剤と組み合わせてＭＤＡ―７を用いて癌を治療する方法および組成物を提供する。さらなる治療剤はＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ阻害剤またはＩＬ−１０阻害剤を含む。
【００２０】
いくつかの具体例において、本発明はＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤の組合せを用いて癌を治療する方法および組成物を提供する。また、本発明はＭＤＡ−７およびＨｓｐ９０阻害剤の組合せを用いて癌を治療する方法および組成物も提供する。さらなる具体例において、本発明は、ＭＤＡ−７およびビタミンＥ化合物の組合せを用いて癌を治療する方法および組成物に関する。なお、さらなる具体例において、本発明は、ＭＤＡ−７および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）の組合せを用いて癌を治療する方法および組成物に関する。また、本発明は、ＭＤＡ−７および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）阻害剤の組合せを用いて癌を治療する方法および組成物にも関する。なおさらなる具体例において、本発明は、ＭＤＡ−７およびＩＬ−１０阻害剤を用いて癌を治療する方法および組成物に関する。
【００２１】
本発明の方法は、具体的には、（ｉ）ＣＯＸ−２阻害剤、（ｉｉ）Ｈｓｐ９０阻害剤；（ｉｉｉ）ビタミンＥ化合物；（ｉｖ）ＴＮＦ；（ｖ）ＶＥＧＦ阻害剤；（ｖｉ）ＩＬ−１０阻害剤：または（ｖｉｉ）ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、およびｖｉ）の１以上の組合せと組み合わせてＭＤＡ−７を患者に提供することを含む患者において癌を治療する方法を含む。これらの化合物ｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、またはｖｉ）をＭＤＡ−７の関係で用いる場合、それらは集合的に「ＭＤＡ−７結合剤」ということができ、ＭＤＡ−７およびｉ）、ｉｉ）、ｉｉｉ）、ｉｖ）、ｖ）、またはｖｉ）とのいずれの組合せ療法も「ＭＤＡ−７結合療法」ということができる。提供される量はある具体例においては「有効量」と考えることができる。
【００２２】
ある具体例においては、ＭＤＡ−７は、次いで、細胞においてＭＤＡ−７を発現するＭＤＡ−７をコードする発現構築体を細胞に投与することによって細胞に提供される。特別な具体例において、発現構築体はウィルスベクターである。さらなる具体例において、ウィルスベクターは、ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を含有するアデノウィルスベクターである。
【００２３】
ある具体例において、ＭＤＡ−７核酸組成物は１以上の脂質を含む。例えば、組成物はＤＯＴＡＰおよびコレステロールまたはその誘導体を含むことができる。いくつかの具体例において、抗−炎症剤はＭＤＡ−７の投与の前に、間に、またはその後に投与される。
【００２４】
ＭＤＡ−７は、精製されたＭＤＡ−７蛋白質を含む組成物を患者に投与することによって患者に提供することができる。ある具体例において、該方法は、放射線療法、化学療法、および／またはプレ悪性または悪性病巣の外科的切開に患者を供することを含む。
【００２５】
ある具体例において、それは、ＭＤＡ−７およびＭＤＡ−７連結剤を細胞に提供することによって乳癌細胞を治療する方法および組成物にも関する。特別な具体例において、ＭＤＡ−７結合剤は細胞に対するＣＯＸ−２阻害剤である。
【００２６】
いくつかの具体例は、ＭＤＡ−７およびＭＤＡ−７結合剤を細胞に提供することを含む、患者において癌細胞を放射線感受性化する方法に関する。用語「放射線感受性化」は、細胞が放射線の損傷効果に対してより感受性とされることを意味する。
【００２７】
「有効量」は、患者に１）ＭＤＡ−７および２）ｉ）ＣＯＸ−２阻害剤、ｉｉ）Ｈｓｐ９０阻害剤、ｉｉｉ）ビタミンＥ化合物、ｉｖ）ＴＮＦ、ｖ）ＶＥＧＦ阻害剤、またはＩＬ−１０阻害剤、またはＭＤＡ−７療法で用いられる他の剤の双方が治療的利点に導く量または複数の量で提供されることを意味する。患者にはＭＤＡ−７のある量、およびｉ）ＣＯＸ−２阻害剤、ｉｉ）Ｈｓｐ９０阻害剤、ｉｉｉ）ビタミンＥ化合物、ｉｖ）ＴＮＦ、ｖ）ＶＥＧＦ阻害剤、またはＩＬ−１０阻害剤のある量が与えられ、その量の双方は治療的利点に寄与すると考えられることは理解されるであろう。ビタミンＥ化合物の組合せ、またはビタミンＥ化合物およびＣＯＸ−２阻害剤の組合せのような２を超える異なる化合物がＭＤＡ−７と共に提供される具体例において、用語「有効量」は、患者に提供される物質の組合せの量の結果として治療的利点を提供する量が患者に提供されることを意味すると理解される。
【００２８】
ある具体例においては、組成物はＭＤＡ−７ポリペプチドおよびＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物のようなもう１つの抗癌剤、またはＶＥＧＦ阻害剤、ＴＮＦ、またはＩＬ−１０阻害剤のような他のＭＤＡ−７連結剤を含有する。従って、本発明のいくつかの方法においては、患者には、精製されたＭＤＡ−７蛋白質を含む組成物が投与される。用語「精製された」は、ＭＤＡ−７蛋白質が他の蛋白質から従前に単離されていること、および該蛋白質は組成物に処方されるに先立って少なくとも約９５％純粋であることを意味する。ある具体例において、精製されたＭＤＡ−７蛋白質は約９５、９６、９７、９８、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５％純度以上であるか、あるいは少なくとも約９５、９６、９７、９８、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５％純度以上であるか、あるいはその中で誘導可能ないずれかの範囲である。更に、精製されたＭＤＡ−７蛋白質は活性であると考えられ、それはアポトーシスを誘導することができることを意味する。精製されたＭＤＡ−７蛋白質は、それが、（組換え手段によって調製されるように）精製されていないＭＤＡ−７の同等な量として（アポトーシス活性によって測定して）活性であるとして約、少なくとも約、またはせいぜい約５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５％以上（またはそのなかで誘導可能ないずれかの範囲）であるように、活性の点で資格があり得る。
【００２９】
もう１つの具体例において、それは、患者において、または患者の細胞において、ＭＤＡ−７ポリペプチド、ＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ、ＶＥＧＦ阻害剤、ＴＮＦポリペプチド、またはＩＬ−１０阻害剤に導くことができる化合物を含有する。
【００３０】
患者は、治療を受ける癌を持ついずれかの動物である。本発明の多くの具体例において、患者は哺乳動物、特にヒトである。
【００３１】
癌はいずれのタイプの癌でもあり得る。例えば、癌はメラノーマ、非−小細胞肺、小細胞肺、肺、肝、癌腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、首部、胸、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部、胃腸、リンパ腫、脳、結腸または膀胱であってよい。ある具体例において、癌は上皮癌細胞を含む。ある具体例において、癌は乳癌、肺癌、または前立腺癌である。
【００３２】
対象は、関連する予防剤が投与される時点において特定の病気または健康−関連疾患が無いことが知られている、またはそれが疑われる対象であり得る。対象は、例えば、知られた病気または健康−関連疾患を持たない対象であり得る（すなわち、健康な対象）。いくつかの具体例において、対象は特定の病気または健康−関連疾患を発症する危険性がある対象である。例えば、対象は、癌の再発を発症する危険性のある過去に治療されたことがある癌の病歴を有していてもよい。対象は、遺伝的素因のためまたは過去の化学療法の結果として再発癌を発症する危険性がある対象であってもよい。あるいは、対象は、現在病気が無いが、第２の原発性腫瘍を発症する危険性がある、首尾よく治療された癌の病歴を持つ対象であってよい。例えば、該危険性は、最初の原発性腫瘍の治療として適用された過去の放射線療法または化学療法の結果であって良い。いくつかの具体例において、対象は、第２の病気または健康−関連疾患の発症の危険性がある。最初の病気または健康−関連疾患を持つ対象であって良い。
【００３３】
「治療」および「治療する」とは、対象への剤、薬物または治療剤の投与または適用、あるいは病気または健康−関連疾患の治療的利点を得る目的でも対象に対する手法または様式の実行をいう。
【００３４】
「病気」または「健康−関連疾患」は、感染、遺伝的欠陥、および／または環境ストレスのようないずれかの原因に由来する身体の一部、器官、または系のいずれかの病理学的状態であり得る。原因は知られていても、知られていなくても良い。そのような疾患の例は、限定されるものではないが、プレ悪性状態、形成異常、癌、および他の過剰増殖性病を含む。癌は、例えば、再発癌、あるいは慣用的な治療方法および標準的な療法に対して抵抗性であることが知られている、またはそうであることが疑われる癌であってよい。
【００３５】
本明細書を通じて用いられる用語「治療的利点」とは、限定されるものではないが、プレ−癌、形成異常、癌、および他の過剰増殖性病を含む、自己の疾患の医学的処置に関連する対象の状態改善を促進し、または高めるいずれかのものをいう。治療的利点の非限定的例のリストはいずれかの期間による対象の寿命の延長、病気の新形成発生の減少または遅延、過剰増殖の減少、腫瘍成長の低下、転移の遅延または転移の数の低下、癌細胞または腫瘍細胞の増殖速度の低下、プレ悪性状態からの新形成発生の進行の減少または遅延および対象の状態に帰すことができる対象に対する痛みの減少を含む。
【００３６】
「予防」および「予防する」は、その通常のかつ簡明な意味に従って用いて、「前もって行為を行う」または「そのような行為」を意味する。特定の病気または健康−関連疾患の関係においては、それらの用語は剤、薬物または治療剤の対象への投与または適用、あるいは病気または健康−関連疾患の開始を阻止する目的での対象に対する手法または様式の実行をいう。本発明のある具体例において、該方法は、ＭＤＡ−７蛋白質、または該蛋白質をコードする核酸を送達して、対象において病気または健康−関連疾患を予防することを含む。病気または疾患を予防するのに適した医薬組成物の量は、病気または健康−関連疾患の開始を阻止することが知られている、またはそれが疑われる量である。本発明では、ＭＤＡ−７は、ＣＯＸ−２阻害剤またはいずれかの他のＭＤＡ−７結合剤のような少なくとも１つの他の剤に加えて対象に提供することができる。
【００３７】
本発明のさらなる具体例において、該方法は、治療を必要とする患者を同定することを含む。患者は、例えば、患者が癌または腫瘍を有すると判断がなされる１以上のテストを有し、患者に対して手術し、またはバイオプシーが採取される、患者の病歴の採取に基づいて同定することができる。
【００３８】
従って、ある具体例において、ＭＤＡ−７は、ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む組成物を患者に投与することによって患者に供され、ここに、該ＭＤＡ−７ポリペプチドは患者において発現される。ＭＤＡ−７コーディング核酸配列は、患者において発現を提供することができるプロモーターの制御下にいると考えられる。プロモーターは構成的組織−特異的抑制性、または誘導性とすることができる。ある具体例において、プロモーターはＣＭＶ  ＩＥプロモーターである。さらなる具体例において、エンハンサーを含める。発現構築体を含むベクターを本発明の方法で使用して、ＭＤＡ−７を患者に提供することができる。ある具体例において、ベクターはウィルスベクターである。もしウィルスベクターを用いるならば、いくつかの具体例において、ベクターはプロタミンと共に処方される。ある具体例において、ベクターは１以上の脂質で処方される。いくつかの具体例において、脂質処方はＤＯＴＡＰ：コレステロール（またはその誘導体）（ＢＯＴＡＰ：ｃｈｏｌ）処方である。
【００３９】
患者に投与される組成物は医薬上許容される処方であってよいと考えられる。
【００４０】
用いることができるウィルスベクターはアデノウィルス、アデノ−関連ウィルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス、およびワクシニアウイルスである。特別な具体例においては、ベクターは、複製−欠陥であり得るアデノウィルスベクターである。この場合、約１０９ないし約１０１３ウィルス粒子（ｃｐ）またはプラーク形成単位（ｐｆｕ）が投与あたり（患者／投与）または１日当たり（平均日用量）いずれかで患者に投与される。そのような用量は約、少なくても約、またはせいぜい約１０９、１０１０、１０１１、１０１２または１０１３ｖｐまたはｐｆｕ（またはその中で誘導できるいずれかの範囲）を含み、これは、投与当たり、または１日当たり、または治療サイクル当たりに与えられる量であってよい。
【００４１】
事実、本発明の具体例は、ＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤の組合せが、癌細胞におけるアポトーシスの促進に関して相乗的な治療効果を提供することを記載する。また、本発明の具体例は、ＭＤＡ−７およびＴＮＦ−アルファの組合せが、腫瘍細胞増殖の阻害に関して相乗的な治療効果を提供することを記載する。本発明の他の具体例において、方法は、癌細胞におけるアポトーシスの促進に関して相乗的な治療効果を提供する、ＭＤＡ−７およびＨｓｐ９０阻害剤の組合せに関する。本発明のさらなる具体例は、ＭＤＡ−７および１以上のビタミンＥ化合物の組合せが、癌細胞の阻害の促進に関して相乗的な治療効果を提供することを記載する。本発明のなおさらなる具体例は、ＭＤＡ−７およびＶＥＧＦ阻害剤の組み合わせが腫瘍成長の阻害に関して相乗的な治療効果を提供することを記載する。本発明の具体例は、ＭＤＡ−７およびＴＮＦポリペプチドの組合せが、癌療法に関して相乗的な治療効果を提供することを記載する。加えて、いくつかの具体例において、ＭＤＡ−７およびＩＬ−１０阻害剤の組合せは癌療法に関して相乗的な治療効果を提供する。「相乗的な」は、治療効果が、単一療法として適用された各剤の効果を加えることに基づいて予測されたよりも大きいことを示す。
【００４２】
患者には、本発明の方法においてＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤の双方が提供される。他の方法においては、患者にはＭＤＡ−７およびＨｓｐ９０阻害剤の双方が提供される。なおさらなる方法において、患者にはＭＤＡ−７および少なくとも１つのビタミンＥ化合物の双方が提供される。さらなる具体例において、患者にはＭＤＡ−７およびＶＥＧＦ阻害剤が提供される。もう１つの具体例において、患者にはＭＤＡ−７およびＴＮＦポリペプチドが提供される。他の具体例において、患者にはＭＤＡ−７およびＩＬ−１０阻害剤の双方が提供される。用語「提供する」はその通常かつ簡明な意味：「用いるために与えるまたは供給すること」（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌｉｓｈ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ）に従って用いる。患者の癌細胞、または患者の癌細胞に隣接する細胞は、本発明の方法においてはＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物、ＶＥＧＦ阻害剤、および／またはＴＮＦに曝露されると考えられる。ＭＤＡ−７は局外者効果を発揮し、その結果、癌細胞に隣接する細胞はＭＤＡ−７を発現し、それを癌細胞に提供することができる。本発明の具体例において、ＭＤＡ−７および／またはＣＯＸ−２阻害剤を患者に提供するように、組成物が患者に投与される。他の具体例において、ＭＤＡ−７および／またはＨｓｐ９０阻害剤を患者に提供するように、組成物は患者に投与される。なおさらなる具体例において、ＭＤＡ−７および／または１以上のビタミンＥ化合物を患者に提供するように、組成物が患者に投与される。特に、ビタミンＥ化合物のエステル化形態を組成物に含めることができると考えられる。さらに、いくつかの具体例において、ＭＤＡ−７および／またはＶＥＧＦ阻害剤を患者に提供するように、組成物が患者に投与される。なおさらなる具体例において、ＭＤＡ−７および／またはＴＮＦポリペプチドを患者に提供するように、組成物は患者に投与される。加えて、ＭＤＡ−７および／またはＩＬ−１０阻害剤を患者に提供するように、組成物が患者に投与される。
【００４３】
化合物および組成物は、患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、心臓周囲内、臍帯内、眼内、経口、局所的、局所、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、局所化灌流浴標的細胞に直接的にカテーテルを介して、または洗浄を介して投与することができる。投与経路の組み合わせを用いることができると考えられる。例えば、ＭＤＡ−７は１つの経路によって提供することができ、他方、ＭＤＡ−７結合剤はもう１つの経路によって提供される。別法として、ａ）ＭＤＡ−７またはｂ）ＣＯＸ−２、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物、ＶＥＧＦ阻害剤、ＴＮＦ、またはＩＬ−１０阻害剤（ＭＤＡ−７結合剤）いずれかの１つの用量を患者に投与し、他方、もう１つの用量を異なる方法で患者に投与することが考えられる。
【００４４】
ある具体例においては、化合物または組成物は腫瘍中にまたは腫瘍に直接的に注射される。別法として、または加えて、化合物または組成物は残存する腫瘍床（ｔｕｍｏｒ  ｂｅｄ）に適応され、または投与される。さらに、特別な具体例において、ＣＯＸ−２阻害剤は患者によって経口服用され、または患者に静脈内投与される。他の具体例において、Ｈｓｐ９０阻害剤は経口服用され、または注入または注射によって患者に提供される。特定の具体例において、ビタミンＥ化合物は経口服用され、または静脈内または腹腔内投与される。ある具体例において、ＶＥＧＦ阻害剤またはＩＬ−１０阻害剤は、静脈内のように注入によって投与される。特定の具体例において、ＴＮＦは腫瘍中に、または腫瘍に、直接的に投与される。特に、いずれのＭＤＡ−７結合剤も同様に腫瘍内に与えることができると考えられる。
【００４５】
ＭＤＡ−７、ＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物、ＶＥＧＦ阻害剤、ＴＮＦまたはＩＬ−１０阻害剤は、療法の一部として、以下の回数または少なくとも以下の回数：１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０回以上患者に提供することができる。特に患者には、ＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤を患者のがん治療の一部として１回を超えて提供すると考えられる。また、特に、他の具体例において、患者にはＭＤＡ−７およびＨｓｐ９０阻害剤を患者の癌治療の一部として１回を超えて提供されると考えられる。なおさらなる具体例において、患者にはＭＤＡ−７およびビタミンＥ化合物を患者の癌治療の一部として１回を超えて提供する。さらに、記載された療法のコースがあり得、および該コースは必要であれば反復することができると考えられる。これは同様にいずれの他のＭＤＡ−７結合剤での療法にも適応される。
【００４６】
ＭＤＡ−７は、ＭＤＡ−７結合剤の投与に先立って、同時にまたは後にのいずれかで患者に投与することができる。当業者は１を超える治療剤の投与のための治療方法に精通しているであろう。例えば、患者には、ＭＤＡ−７結合剤を供してから２４時間以内にＭＤＡ−７を提供することができる。いくつかの具体例において、患者には、ＭＤＡ−７結合剤を供してから２時間以内にＭＤＡ−７を提供する。さらなる具体例において、患者には、ＭＤＡ−７結合剤を提供するに先立って、ＭＤＡ−７を提供する。さらなる具体例において、患者にはＭＤＡ−７を提供するに先立ってＭＤＡ−７結合剤を提供する。
【００４７】
本発明を用いて細胞においてアポトーシスを誘導することができる。これは癌を治療するための方法および組成物で使用できると考えられる。癌は以下のタイプのいずれともすることができる：メラノーマ、非−小細胞肺、小細胞肺、肺、肝、癌腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、首部、胸、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部、胃腸、リンパ腫、脳、結腸または膀胱。ある具体例において、癌は上皮癌細胞を含む特別な具体例において、癌は乳癌である。乳癌の場合には、患者はＨＥＲ−２／ｎｅｕ陰性であり得、または患者はＨＥＲ−２／ｎｅｕ陽性であり得る。かくして、治療は患者のＨＥＲ−２／ｎｅｕ状態とは独立できる。
【００４８】
さらに、本発明を用いて、化生、形成異常および過形成を含めた、癌を治療し、またはプレ−癌またはプレ−悪性細胞を治療することができる。また、それを用いて、扁平化生、形成異常、良性前立腺過形成細胞、過形成病巣等のような、望ましくないが、良性の細胞を阻害することもできる。癌への、または癌のより重症の形態への進行は、本明細書中で議論するＭＤＡ−７結合療法を含む本発明の方法によって停止し、破壊し、または遅延させることができる。
【００４９】
さらに、癌は切除できないまたは切除可能腫瘍を含んでも良い。いくつかの具体例において、癌は、（ＭＤＡ−７結合療法と比較して）単一療法としてを除いて、放射線療法、化学療法、および／または（トラスツズマブのような）免疫療法に対して、または本明細書中で議論する剤のいずれかに対して抵抗性に見える。さらに、癌は転移したまたは第２の腫瘍を含むことができるが、いくつかの具体例において、それは１以上の原発性腫瘍のみに関する。さらに、本発明の方法および組成物は、腫瘍の転移を阻害するために、または腫瘍のさらなる成長を予防するために、ならびに腫瘍または癌を低下させ、または排除するために実行することができると考えられる。
【００５０】
特別な具体例において、本発明は、癌を治療する方法に関し、そこでは、癌を持つ患者にＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤が提供される。本発明の他の方法は、ｉ）ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を含むアデノウィルスベクター、ここに、該核酸配列は患者で発現され得るプロモーターの制御下にある；およびｉｉ）ＣＯＸ−２阻害剤を患者に投与することを含む、患者において乳癌を治療することを含む。
【００５１】
本発明のいくつかの具体例において、患者にはＣＯＸ−２阻害剤を直接的に患者に投与することによってＣＯＸ−２阻害剤を提供すると考えられる。他の具体例において、ＣＯＸ−２阻害剤のプロドラッグを患者に投与し、患者の体内で１回、それはＣＯＸ−２阻害剤の活性な形態に変換される。本発明では、ＣＯＸ−２阻害剤はセレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブおよびエトリコキシブよりなる群から選択されると考えられる。さらに、２、３または４のそのような阻害剤（および／またはそれらの関連プロドラッグ）の組合せのような１を超えるＣＯＸ−２阻害剤を使用することができる。
【００５２】
より特別な具体例において、ＭＤＡ−７結合剤はＣＯＸ−２阻害剤である。ＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤での放射線感受性化は、細胞周期の放射線感受性Ｇ２／Ｍ期において腫瘍細胞を阻止することによって起こる。かくして、癌細胞は定期的には暴露される放射線の量または複数量は放射線感受性化の後には降下され、または低下され得ると考えられる。別法として、放射線セッションの数またはセッションの長さは低下させることができる。ある具体例において、いずれかの単一量、合計量、セッションの数、またはセッションの長さの低下は、約、少なくても約、またはせいぜい約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、６００、７００、８００、９００、１０００％以上、またはその中で誘導可能ないずれかの範囲だけである。
【００５３】
また、本発明は癌を治療する方法に関し、そこでは、癌患者にＭＤＡ−７およびＨｓｐ９０阻害剤が提供される。ある具体例において、該方法は、ｉ）ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を含むアデノウィルスベクター、ここに、該核酸配列は患者において発現され得るプロモーターの制御下にある；およびｉｉ）Ｈｓｐ−９０阻害剤を提供することによって癌を治療することを含む。用語「Ｈｓｐ−９０阻害剤」とはＨｓｐ９０機能を特異的かつ直接的に阻害する物質をいう。ある具体例において、Ｈｓｐ−９０阻害剤はＨｓｐ９０ポリペプチドに結合する。
【００５４】
ある具体例において、方法は、ｉ）ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を含むアデノウィルスベクター、ここに、該核酸配列は患者において発現され得るプロモーターの制御下にある；およびｉｉ）Ｈｓｐ９０阻害剤を提供することによって癌を治療することを含む。
【００５５】
本発明のいくつかの具体例において、患者には、Ｈｓｐ９０阻害剤を患者に直接的に投与することによってＨｓｐ９０が提供される。他の具体例において、Ｈｓｐ９０阻害剤のプロドラッグを患者に投与し、患者の体内で一旦、それはＨｓｐ９０阻害剤の活性な形態に変換される。本発明では、Ｈｓｐ９０阻害剤は、いくつかの具体例において、ゲルダナマイシン、またはゲルダナマイシンの誘導体またはアナログであると考えられる。用語「誘導体」とは、直接的に、あるいは修飾または部分的置換によってもう１つの物質から生じた物質をいう。用語「アナログ」とは、もう１つの分子と構造的に同様であり、またはもう１つの分子と同様または対応する属性を有する物質をいう（例えば、Ｈｓｐ９０に特異的に結合することができることができるゲルダナマイシン変種）。さらに、２、３または４のそのような阻害剤（および／またはその関連プロドラッグ）の組合せのような１を超えるＨｓｐ９０阻害剤を使用することができる。
【００５６】
ある具体例において、本発明は癌を治療する方法に関し、そこでは、癌患者にＭＤＡ−７およびビタミンＥ化合物が提供される。用語「ビタミンＥ化合物」とは、トコフェロールおよびトコトリエノールサブファミリーにおける脂質−可溶性抗酸化剤化合物である天然および合成物質、ならびにそのような物質のエステル化形態、およびコンジュゲーテッド形態をいう。トコフェロールおよびトコトリエノールファミリーは、各々、メンバーとしてアルファ（α）、ベータ（β）、ガンマ（γ）およびデルタ（δ）ビタミンを有する。エステル化形態はアセテートおよびスクシネート形態を含む。ある具体例において、ビタミンＥ化合物は合成のものであり、他方、他の具体例において、それは特定のビタマーの天然に生じるバージョンである。特別な具体例において、ビタミンＥ化合物は、α−トコフェリルスクシネートとしても知られたビタミンＥスクシネート（ＶＥＳ）である。
【００５７】
本発明のいくつかの具体例において、ビタミンＥを患者に投与することによって、患者にビタミンＥを提供すると考えられる。用語「Ｅ」は、８つの脂質−可溶性の抗酸化剤トコフェロールおよびトコトリエノール化合物のいずれかであると理解される。他の具体例において、ビタミンＥのプロドラッグを患者に投与し、一旦患者の身体内に入るとそれはビタミンＥの活性な形態に変換される。ある具体例において、プロドラッグは、アセテートまたはスクシネート形態のようなビタミンＥのエステル化形態である。本発明では、ビタミンＥ化合物は、いくつかの具体例において、アルファ−トコフェロールあるいはアルファ−トコフェリルスクシネートまたはアルファ−トコフェロールアセテートのようなアルファ−トコフェロールのエステル化形態である。用語「エステル化形態」とは、エステル基を持つ物質の形態をいう。ある他の具体例において、ビタミンＥ化合物のアナログをビタミンＥ化合物の代わりに本発明の方法および組成物で使用する。用語「アナログ」とは、もう１つの分子と構造的に同様であり、またはそれと同様なまたは対応する属性を共有する物質をいう（例えば、Ｔｒｏｌｏｘ  Ｃ）。さらなる具体例において、ビタミンＥコンジュゲートを本発明の方法および組成物で使用する。さらに、２、３または４のそのようなビタマーおよび／またはエステル化形態の組合せのような１を超えるビタミンＥ化合物を使用することができる。
【００５８】
また、本発明は、ＭＤＡ−７およびＴＮＦを患者に提供することを含む、患者において癌を治療する方法に関する。該ＴＮＦはＴＮＦ−アルファ、ＴＮＦ−ベータ、ＴＮＦ−ガンマ、ＴＮＦ−デルタ、またはＴＮＦ−イプシロンのようないずれのＴＮＦであってもよい。本発明の特別な具体例において、ＴＮＦはＴＮＦ−アルファである。部分的長さの配列がＴＮＦとして機能することができる限り、ＴＮＦは全長アミノ酸配列、または部分的長さの配列いずれも含むことができる。また、ＴＮＦの定義には、ＴＮＦの全長および部分的長さの配列のアミノ酸配列の変種が、これらの配列変種がＴＮＦとして機能することができる限り含まれる。
【００５９】
加えて、本発明は、ＭＤＡ−７およびＶＥＧＦ阻害剤を患者に提供することを含む、患者において癌を治療する方法を含む。癌治療の関係では、抗−血管形成因子は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）およびその受容体の間の相互作用の阻害に依拠することができる。腫瘍ＶＥＧＦ発現は、臨床的には、ある範囲の悪性疾患における病気の進行と関連付けられてきた。そのような関連は、内皮細胞の化学走性および有糸分裂誘発を刺激し、ならびに内皮細胞−関連プロテアーゼ活性を増大させ、および微小血管細胞におけるインテグリン発現を上昇させて、細胞外マトリックス相互作用を増加させることによって、腫瘍血管形成を誘導するＶＥＧＦの能力に帰属されると考えられる。関連するチロシンキナーゼ活性をもつＶＥＧＦに対する２つの高−親和性受容体が、ヒト血管内皮で同定されている：Ｆｌｔ−１およびＫＤＲ。これらの受容体に結合するＶＥＧＦは、受容体チロシンキナーゼドメインの二量体化および引き続いての活性化を引き起こすと考えられる。ＶＥＧＦ阻害剤は当業者に知られたいずれのＶＥＧＦ阻害剤であってもよい。例えば、阻害剤はＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、リボザイム、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、オリゴ糖または低分子であってよい。特別な具体例において、ＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に対して向けられた抗体のような抗体である。より特別な具体例において、抗体は、ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体のようなモノクローナル抗体である。より特別な具体例において、ＶＥＧＦ阻害剤はベバシズマブ（アバスチン）である。いくつかの具体例において、ＶＥＧＦ阻害剤は低分子である。そのような低分子の例はＶＥＧＦ受容体の低分子チロシンキナーゼ阻害剤を含む。特別な具体例において、ＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡまたはＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡを特異的に標的とするリボザイムのようなリボザイムである。さらなる特別な具体例において、ＶＥＧＦ阻害剤は可溶性ＶＥＧＦ受容体である。
【００６０】
本発明のいくつかの具体例において、ＶＥＧＦシグナリングを阻害する分子が考えられる。ある具体例において、ＶＥＧＦシグナリングの阻害は受容体チロシンキナーゼ阻害剤を介するものであろう。考えられる受容体チロシンキナーゼ阻害剤は、限定されるものではないが、ＺＤ４１９０、ＺＤ６４７４、およびＡＺＤ２１７１（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）ＣＥＰ−７０５５（Ｃｅｐｈａｌｏｎ  Ｆｒａｚｅｒ，ＰＡ）ＰＴＫ７８７（Ｎｏｖａｒｔｉｓ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）およびＳＵ５４１６（Ｓｕｇｅｎ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｓｉｓｃｏ，ＣＡ）を含む。
【００６１】
また、本発明は、ＭＤＡ−７およびＩＬ−１０阻害剤を患者に提供することによって患者において癌を治療する方法に関する。ＩＬ−１０の阻害剤は当業者に知られたいずれのＩＬ−１０阻害剤であってもよい。例えば、該阻害剤はＤＮＡ、ＲＮＡ、リボザイム、オリゴヌクレオチド、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、抗体または低分子であり得る。特別な具体例において、ＩＬ−１０阻害剤はＩＬ−１０に対して向けられた抗体のような抗体である。いくつかの具体例において、抗体はモノクローナル抗体である。
【００６２】
前記したように、ＭＤＡ−７は、ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む組成物を患者に投与することによって患者に提供することができ、ここに、該ＭＤＡ−７ポリペプチドは患者において発現される。特別な具体例において、該組成物は医薬上許容される組成物である。別法として、前記したように、ＭＤＡ−７は、精製されたＭＤＡ−７蛋白質組成物を患者に投与することによって患者に提供することができる。ある特別な具体例において、組成物は医薬上許容される組成物である。
【００６３】
ＭＤＡ−７およびＴＮＦを提供することに関する本発明の方法において、ＴＮＦをコードする配列を有する核酸を含む組成物を患者に投与することによってＴＮＦは患者に提供することができ、ここに、該ＴＮＦポリペプチドは患者において発現される。ＭＤＡ−７およびＶＥＧＦ阻害剤を提供することに関する本発明の方法において、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列を有する核酸を含む組成物を患者に投与することによってＶＥＧＦ阻害剤を患者に提供することができ、ここに、ＶＥＧＦ阻害剤は患者において発現される。ＭＤＡ−７およびＩＬ−１０阻害剤を投与することを含む本発明の方法において、ＶＥＧＦ阻害剤をコードする配列を有する核酸を含む組成物を患者に投与することによってＩＬ−１０阻害剤を患者に提供することができる。
【００６４】
患者には、ある具体例においては、単一組成物にてＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤を提供すると考えられる。患者に投与すべき組成物は、本明細書中で開示された本発明の組成物を含む。さらに、いくつかの具体例において、患者には、ＣＯＸ−２阻害剤、およびｉ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはｉｉ）ＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸いずれかを含む組成物が提供される。別法として、ＣＯＸ−２阻害剤の代わりに組成物はＣＯＸ−２阻害剤プロドラッグを含むことができる。
【００６５】
本発明の他の方法において、いくつかの具体例において、患者には単一の組成物の投与にてＭＤＡ−７およびＨｓｐ９０阻害剤が提供される。患者に投与すべき組成物は本明細書中に開示された本発明の組成物を含む。さらに、いくつかの具体例において、患者には、Ｈｓｐ９０阻害剤、およびｉ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはｉｉ）ＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸いずれかを含む組成物が提供される。別法として、Ｈｓｐ９０阻害剤の代わりに、組成物はＨｓｐ９０阻害剤プロドラッグを含むことができる。
【００６６】
いくつかの具体例において、患者には単一組成物にてＭＤＡ−７およびビタミンＥ化合物が提供されると考えられる。患者に投与すべき組成物は、本明細書中に開示された本発明の組成物を含む。さらに、いくつかの具体例において、患者にはＣＯＸ−２阻害剤およびｉ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはｉｉ）ＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸いずれかを含む組成物が提供される。別法として、ビタミンＥの代わりに組成物はビタミンＥのエステル化形態、ビタミンＥアナログ、またはビタミンＥコンジュゲートを含むことができる。
【００６７】
また、単一組成物に関して前記した具体例は、ＶＥＧＦ阻害剤、ＴＮＦ、またはＩＬ−１０阻害剤のような、他のＭＤＡ−７結合剤に同様に適応されると考えられる。
【００６８】
他の具体例において、ＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤または他のＭＤＡ−７結合剤は患者に別々に提供される。同様に、ある具体例においては、ＭＤＡ−７およびＨｓｐ９０阻害剤は患者に別々に提供される。さらに、さらなる具体例において、ＭＤＡ−７および１以上のビタミンＥ化合物は患者に別々に提供される。それらの場合において、患者には１つの剤が供され、他の剤は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、および／または１、２、３、４、５、６、７日および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週内に、またはその中で誘導可能ないずれかの範囲に供され、または投与される。ある具体例において、患者には、ＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤またはビタミンＥ化合物、または他のＭＤＡ−７結合剤が提供されて２４時間以内にＭＤＡ−７が提供される。他の具体例において、患者には、ＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物、または他のＭＤＡ−７結合剤が提供されてから２時間以内にＭＤＡ−７が提供される。いくつかの具体例において、患者には、ＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物、または他のＭＤＡ−７結合剤が提供されるに先立ってＭＤＡ−７が供され、他方、他の場合には、患者にはＭＤＡ−７が提供されるに先立って、該剤が提供される。さらに、患者は、ＭＤＡ−７での治療のコースの全体にわたってＭＤＡ−７結合剤を摂取し、またはそれが投与され得ると考えられる。例えば、患者はＭＤＡ−７療法を６週間の間受けることができると考えられる。その時間の間、患者は、例えば、少なくとも日または週ベースのような６週間を通じてＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、またはビタミンＥ化合物を摂取することができる。従って、患者は、ＭＤＡ−７が提供されてから２４時間以内に（または前記で特定したいずれかの時間以内に）ＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物、または他のＭＤＡ−７結合剤を摂取することができ、またはそれを提供することができ、およびＭＤＡ−７は一回を超えて提供することができると考えられる。従って、患者は、ＭＤＡ−７が（蛋白質または該蛋白質をコードする核酸いずれかとして）患者に供された各時点から２４時間以内にＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物、ＶＥＧＦ阻害剤、ＴＮＦ、またはＩＬ−１０阻害剤が摂取されており、または提供されているであろう。さらに、前記特定のいずれかの時間以内にＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、またはビタミンＥ化合物または他のＭＤＡ−７結合剤は複数回摂取され、または提供することができると考えられる。例えば、患者は、ＭＤＡ−７が提供されてから２４時間以内に３つの用量のＣＯＸ−２阻害剤を摂取することができる。結果として、患者は、ＭＤＡ−７が提供されてから特定時間内にＭＤＡ−７結合剤を１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０以上の個々の回数を摂取することができ、または供され得る。別法として、ＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物、または他のＭＤＡ−７結合剤はＭＤＡ−７での治療の間にまたはそれを通じて全身的に提供することができる。
【００６９】
いくつかの具体例において、患者は、ＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤（または他のＭＤＡ−７結合剤）が各々少なくとも１回供された後に、放射線療法に供される。さらなる具体例において、患者は致死未満用量の放射線療法に供される。用語「致死未満用量」とは、放射線に暴露された患者の細胞について致死量（すなわち、細胞を死滅させる量）未満の単一セッションにおいて患者に与えられる放射線の量をいう。致死未満用量は、最初に放射線感受性化処理が供されなかった、同様な特徴（例えば、癌のステージ、腫瘍のサイズ、予後等をいう）を持つ癌患者に現在与えられる用量未満であると考えられる。放射線感受性化処理は、約、少なくても約、またはせいぜい約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０分、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、および／または１、２、３、４、５、６、７日以上、またはその中で誘導できるいずれかの範囲までに放射線に対する暴露に先行できると考えられる。
【００７０】
本発明のある具体例において、方法は、患者を放射線療法および／または化学療法に供することも含む。他の具体例において、患者は免疫療法に供される。他の特別な具体例において、方法は、患者から腫瘍の全部または一部を切除することも含む。複数の腫瘍を除去することができると考えられる（全部または一部）。これらの場合の各々において、他の癌療法の前に、間にまたは後に、ＭＤＡ−７および／またはＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、ビタミンＥ化合物、ＶＥＧＦ阻害剤、ＴＮＦおよび／またはＩＬ−１０阻害剤を提供することができる。ある具体例において、１または複数の剤と共に組成物を少なくとも生じた腫瘍床に投与することなどして、腫瘍切除の後に、ＭＤＡ−７および／またはＭＤＡ−７結合剤を患者に提供することができる。
【００７１】
他の具体例において、患者は患者からの腫瘍の全部または一部の切除に供される。ＭＤＡ−７およびＭＤＡ−７結合剤は、患者からの腫瘍の全部または一部の切除前に、間または後に投与することができる。いくつかの具体例において、ＭＤＡ−７およびＭＤＡ−７結合剤は、患者からの腫瘍の全部または一部の切除の後に提供される。いくつかの具体例において、少なくとも、組成物を生じた腫瘍床に投与することによって、患者にＭＤＡ−７およびＭＤＡ−７結合剤を提供する。
【００７２】
ＭＤＡ−７およびＭＤＡ−７結合剤は一回、または一回を超えて投与することができる。ＭＤＡ−７またはＭＤＡ−７結合剤いずれかがアデノウィルスベクターである特別な具体例において、患者にはアデノウィルスベクターを１回または１回を超えて投与することができる。
【００７３】
本発明の他の具体例は、本発明の具体例におけるＭＤＡ−７の代わりに異なる腫瘍サプレッサーを提供することを含む。他の腫瘍はサプレッサーは、それに限定されるものではないが、ｐ５３、ＦＵＳＩ、Ｃ−ＣＡＭ、ＦＨＩＴ、ＤＣＣ、Ｒｂ、およびＰＴＥＮを含む。それ自体、該蛋白質または該腫瘍サプレッサーをコードする核酸を前記したように使用することができる。
【００７４】
また、本発明は医薬組成物に関する。いくつかの具体例において、ａ）ＣＯＸ−２阻害剤またはＣＯＸ−２阻害剤プロドラッグ；およびｂ）精製されかつ活性なＭＤＡ−７蛋白質またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む医薬組成物がある。ＭＤＡ−７をコードする核酸を含む具体例においては、核酸はアデノウィルスベクターであってよいと考えられる。医薬組成物は、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブ、およびエトリコキシブのうちの１以上を含有することができる。ある具体例において、それはセレコキシブを含有する。
【００７５】
他の医薬組成物はａ）Ｈｓｐ９０阻害剤またはＨｓｐ９０阻害剤プロドラッグ；およびｂ）精製されかつ活性なＭＤＡ−７蛋白質またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む。ＭＤＡ−７をコードする核酸を含む具体例において、該核酸はアデノウィルスベクターであってよいと考えられる。特別な具体例において、組成物はＧＡまたは１７−ＧＡＡを含む。なおさらなる具体例において、医薬組成物はゲルダナマイシンまたはゲルダナマイシン誘導体またはアナログまたはそのプロドラッグを含有する。
【００７６】
また、本発明は、ａ）少なくとも１つのビタミンＥ化合物；およびｂ）精製されかつ活性なＭＤＡ−７蛋白質、またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む医薬組成物に関する。ＭＤＡ−７をコードする核酸を含む具体例において、該核酸はアデノウィルスベクターであってよいと考えられる。特別な具体例において、組成物はＶＥＳを含む。
【００７７】
いくつかの具体例において、精製されたＴＮＦを含む組成物を患者に投与することができることによってＴＮＦは患者に提供される。前記したように、その配列がいくらかのレベルの生物学的活性を維持する限り、これは全長ＴＮＦアミノ酸配列、またはＴＮＦとしての生物学的機能を維持する部分的長さの配列、または全長または部分的長さのＴＮＦの配列変種であってよい。同様に、ＭＤＡ−７およびＶＥＧＦ阻害剤の投与に関する具体例において、ＶＥＧＦ阻害剤は蛋白質である場合、精製された蛋白質として投与することができる。同様に、ＭＤＡ−７およびＩＬ−１０阻害剤の投与に関する具体例において、ＩＬ−１０阻害剤は、アミノ酸配列である場合、精製された蛋白質を含む組成物にて患者に提供することができる。
【００７８】
特別な具体例において、患者には、精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸、および精製されたＴＮＦアミノ酸配列を含む組成物が提供される。さらなる特別な具体例において、患者には、ＴＮＦ、および精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸いずれかを含む組成物が提供される。より特別な具体例において、ＴＮＦ蛋白質はＴＮＦ−アルファ蛋白質である。
【００７９】
さらなる具体例において、患者には少なくとも以下の：（ａ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはＭＤＡ−７蛋白質をコードする配列を有する核酸；および（ｂ）ＶＥＧＦに特異的に結合するモノクローナル抗体が提供される。ある特別な具体例において、モノクローナル抗体はベバシズマブである。
【００８０】
なおさらなる具体例において、患者には：（ａ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはＭＤＡ−７蛋白質をコードする配列を有する核酸；および（ｂ）ＩＬ−１０、またはＩＬ−１０に特異的に結合するコードする配列を有する核酸に特異的に結合する抗体を含む組成物が提供される。ある特別な具体例において、モノクローナル抗体はベバシズマブである。
【００８１】
また、本発明は、一般には、（ａ）精製され活性なＴＮＦまたはＴＮＦをコードする配列を有する核酸；および（ｂ）精製され活性なＭＤＡ−７蛋白質またはＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む医薬組成物に関する。特別な具体例において、精製され活性なＴＮＦは精製され活性なＴＮＦ−アルファである。さらなる特別な具体例において、ＴＮＦをコードする配列を有する核酸は、ＴＮＦ−アルファポリペプチドをコードする配列を有する核酸である。
【００８２】
ある具体例において、医薬組成物はＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む。特別な具体例において、ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする核酸はアデノウィルスベクターである。医薬組成物は、ＴＮＦ−アルファポリペプチドのようなＴＮＦポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含むことができる。ＴＮＦポリペプチドをコードする核酸がアデノウィルスベクターであってよい。特別な具体例において、医薬組成物は、（ａ）ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を有する第一のアデノウィルスベクター、ここに、該核酸配列は第一のプロモーター配列に操作可能に結合されており；および（ｂ）ＴＮＦポリペプチドをコードする配列を有する第２のアデノウィルスベクター、ここに、ＴＮＦポリペプチドをコードする核酸配列は第２のプロモーターに操作可能に連結されている；を含む。ＴＮＦポリペプチドは、例えば、ＴＮＦ−アルファポリペプチドであってよい。
【００８３】
いくつかの具体例において、医薬組成物は、ＭＤＡ−７をコードする第一の核酸配列、およびＴＮＦポリペプチドをコードする第二の核酸配列を有するアデノウィルスベクターを含む。より特別な具体例において、ＴＮＦポリペプチドをコードする第二の核酸配列は、ＴＮＦ−アルファポリペプチドをコードする核酸配列である。第一の核酸配列および第二の核酸配列は１以上の共通するプロモーターに操作可能に連結されていてもいなくてもよい。
【００８４】
また、本発明は、ＭＤＡ−７蛋白質をコードするポリヌクレオチドおよび脂質を含む医薬上許容される組成物を患者に投与することを含む。患者において癌を治療または予防する方法に関する。癌は前記した癌のいずれかであり得る。ある具体例において、患者は肺癌をもつ患者である。例えば、肺癌は非−小細胞肺、小細胞肺、または転移性肺癌（肺の境界の外に拡大した癌）であってよい。肺癌からの二次的腫瘍の治療に加えて、原発性肺癌の治療を行うことができる。さらなる具体例において、該方法は、患者において転移性肺癌を治療する方法としてさらに規定される。
【００８５】
医薬組成物に適したいずれの脂質も本発明によって考えられる。ある具体例において、組成物はリポソームを含むものとして、さらに規定される。医薬投与に適したいずれのリポソームも本発明の方法で含めることが考えられる。ある具体例において、リポソームはＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子である。リポソームおよびナノ粒子は後に本発明中においてより詳しく議論する。投与の方法／経路は静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻腔内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、血管内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、心臓周囲内、臍帯内、眼内、経口、局所的、吸入、注射、注入、連続的注入、局所化された灌流浴標的細胞により直接的にカテーテルを介して、および／または洗浄を介してのように、当業者に知られたいずれかの方法であり得る。
【００８６】
本発明の他の具体例は、ＭＤＡ−７およびタキソテール（ドセタキソール）を患者に提供することを含む、患者において癌を治療する方法に関する。ＭＤＡ−７は、当業者に知られたいずれかの方法によって患者に提供することができる。例えば、ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む組成物を患者に投与することによってＭＤＡ−７を患者に提供することができ、ここに、ＭＤＡ−７ポリペプチドは患者において発現される。
【００８７】
いくつかの具体例において、精製されたＭＤＡ−７蛋白質を含む組成物を患者に投与することによって、ＭＤＡ−７が患者に提供される。該組成物は、他の化学療法剤またはＭＤＡ−７結合剤のような１以上のさらなる抗癌剤を含むことができる。例示的な化学療法剤は後に明細書中に記載する。さらなる具体例において、患者は１以上のさらなる抗癌療法で治療されているものである。そのような療法の例は放射線療法、さらなる化学療法、免疫療法、遺伝子治療の他の形態および外科的療法を含む。
【００８８】
ある具体例において、患者には、タキソテール、およびｉ）精製されたＭＤＡ−７蛋白質またはｉｉ）ＭＤＡ−７をコードする配列を有する核酸いずれかを含む組成物が提供される。ＭＤＡ−７はタキソテールの投与に先立って、間にまたは後に提供することができる。いくつかの具体例において、例えば、患者には、タキソテールが提供されてから２４時間以内にＭＤＡ−７が提供される。より特別には、患者には、タキソテールが提供されてから２時間以内にＭＤＡ−７を提供することができる。患者には、タキソテールを提供するに先立って、ＭＤＡ−７を提供することができ、あるいは患者には、ＭＤＡ−７が提供されるに先立ってタキソテールを提供することができる。ある具体例において、患者には、タキソテールを患者に投与することによってタキソテールが提供される。
【００８９】
癌は前記した癌のいずれかにあり得る。ある特別な具体例において、癌は乳癌である。いくつかの具体例において、該方法は、さらに、患者を放射線療法および／または化学療法に供することを含む。例えば、ＭＤＡ−７およびタキソテールが各々少なくとも１回供された後に、患者を放射線療法に供することができる。いくつかの具体例において、患者を致死未満用量の放射線療法に供する。いくつかの具体例において、患者を、腫瘍の全てまたは一部の患者からの切除に供する。タキソテールは腫瘍切除の前、間、または後に提供することができる。いくつかの具体例において、少なくとも、組成物を生じた腫瘍床に投与することによって、患者にはＭＤＡ−７および／またはタキソテールが提供される。タキソテールは１回、または１回を超えて投与することができる。
【００９０】
組成物が核酸を含む具体例において、核酸はベクター中に入れてよい。例えば、ベクターはウィルスベクターであってよい。特別な具体例において、ウィルスベクターはアデノウィルスベクターである。いくつかの具体例において、アデノウィルスはプロタミンと共に処方される。いずれかの数のウィルス粒子を投与当たり患者に投与することができる。ある具体例において、約１０９ないし約１０１３ウィルス粒子を患者／投与に投与する。
【００９１】
核酸組成物が投与される本発明の具体例のいくつかにおいて、核酸組成物は１以上の脂質を含むことができる。前記した脂質のいずれかをこれらの脂質−核酸組成物に含めることができる。そのような脂質の例は、ＤＯＴＡＰおよびコレステロール、またはその誘導体を含む。
【００９２】
また、本発明は、一般には、（ａ）患者からの細胞を含む試料をＩＬ−１０発現のレベルについてアッセイし、次いで、（ｂ）ＩＬ−１０発現のレベルがＭＤＡ−７抵抗性細胞、またはＭＤＡ感受性細胞に相関するか否かに応じてＭＤＡ−７癌療法を投与し、または投与しないことを含む。対象においてＭＤＡ−７癌療法の効率を予測する方法に関する方法。
【００９３】
いくつかの具体例において、対象は、化学療法、放射線療法、または抗−癌療法のいくつかの他の形態で既に治療されてきた対象である。当業者に知られたいずれかの方法を用いて、ＩＬ−１０発現のレベルについて生物学的試料をアッセイすることができる。例えば、いくつかの具体例において、ＩＬ−１０発現のレベルは、ＩＬ−１０を特異的に認識する抗体を用いてアッセイされる。他の具体例において、ＩＬ−１０発現のレベルは、ＩＬ−１０転写体に相補的なまたはそれと同一な核酸プライマーまたはプローブを用いてアッセイされる。
【００９４】
癌細胞を含む生物学的試料は、それが１以上の癌細胞を含有する限り、いずれのタイプの生物学的試料でもあり得る。例えば、生物学的試料は、血漿試料、血清試料、血液試料、脳脊髄液試料、または尿試料のような体液試料であってよい。特別な具体例において、生物学的試料は対象からの腫瘍組織の試料のような組織試料である。
【００９５】
さらなる具体例において、対象におけるＭＤＡ−７癌療法の効率を予測する方法は、もし対象がＭＤＡ−７抵抗性細胞に相関するＩＬ−１０のレベルを発現するならば対象にＩＬ−１０阻害剤を提供することを含む。前記した方法のいずれかを、ＩＬ−１０阻害剤の投与において対象に適用することができる。さらに、本明細書中に記載された教示に基づき、当業者であれば対象によって発現されたＩＬ−１０のレベルがＭＤＡ−７抵抗性細胞に相関するか否かを決定することができよう。
【００９６】
また、本発明は、一般に、ＭＤＡ−７を患者に提供することを含む、患者において、病気または健康−関連疾患を予防する方法に向けられ、ここに、ＭＤＡ−７が対象において癌を予防するのに十分なものである。該病気または健康−関連疾患は、例えば、プレ悪性病巣または癌であってよい。癌は、前記した癌のいずれであってもよい。前記したように、対象は、癌を発症する危険性がある対象であってよい。例えば、対照が遺伝的素因を有することができ、あるいは首尾よく治療される癌の病歴を有してもよい。
【００９７】
病気または健康−関連疾患の予防のためにＭＤＡ−７を対象に提供する方法は前記した方法のいずれも含む。ある具体例において、ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む組成物を対象に投与することによって、ＭＤＡ−７が患者に供され、ここに、ＭＤＡ−７ポリペプチドは患者において発現される。組成物は医薬上許容される組成物である。前記したように、その理論を本セクションに一体化させ、核酸はウィルスベクターのようなベクター中に入れることができる。投与は、前記した方法のいずれかのような当業者に知られたいずれかの方法によることができる。
【００９８】
また、本発明は、ＭＤＡ−７をコードする核酸配列を含むアデノウィルスベクターを患者に投与することを含む、患者において癌を予防する方法に関し、ここに、核酸配列は患者で発現され得るプロモーターの制御下にある。アデノウィルスベクターは前記で詳細に議論し、その議論を本セクションに一体化させる。投与は当業者に知られたいずれの方法によることもでき、前記した方法を含む。
【００９９】
いくつかの具体例において、患者は化学療法、放射線療法、化学療法、免疫療法および／または遺伝子治療で首尾よく治療された癌の病歴を有する。いくつかのより特別な具体例において、患者を放射線療法に供する。例えば、ＭＤＡ−７およびＭＤＡ−７結合剤を少なくとも１回供した後に、患者を放射線療法に提供することができる。放射線療法の用量は当業者に知られたいずれの用量であってもよい。例えば、いくつかの具体例において、該用量は放射線療法の致死未満用量である。
【０１００】
また、本発明は一般に、ＭＤＡ−７を患者に提供することを含む患者においてプレ悪性病巣を治療する方法に関する。ＭＤＡ−７を提供するのは、ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸を含む組成物を患者に投与するなどのような当業者に知られたいずれの方法によることもでき、ここに、ＭＤＡ−７ポリペプチドは、患者で発現される。該組成物は先に議論したように医薬上許容される組成物であってよい。ある具体例において、核酸はベクター中に入れる。ベクターは先に議論した通りであり、その議論を本セクションに一体化させる。
【０１０１】
組成物は、組成物の経口、静脈内、および直接的な注射を含めた本明細書中で議論した投与用に処方することができる。
【０１０２】
本発明の１つの態様に関して議論したいずれの具体例も同様に本発明の他の態様に適用される。例えば、１つのＭＤＡ−７結合剤の関係で議論したいずれの具体例も、いずれかの他のＭＤＡ−７結合剤に適用することができる。
【０１０３】
実施例セクションにおける具体例は、本発明の全ての態様に適用することができる本発明の具体例であると理解される。
【０１０４】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、明示的に示されなければ代替物のみをいうように「および／または」を意味するように用いられ、あるいは該代替物は相互に排他的であるが、開示は代替物のみおよび「および／または」をいう定義を支持する。
【０１０５】
本明細書を通じて、用語「約」は、値が、該値を決定するのに使用されるデバイスまたは方法についての誤差の標準偏差を含むことを示すように用いる。
【０１０６】
長く継続する特許法に従い、用語「ある」は、特許請求の範囲または明細書において用語「を含む」と共に用いられる場合、特に言及されなければ１以上を示す。
【０１０７】
本発明の他の目的、特徴および利点は以下の詳細な記載から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な記載および具体的な例は本発明の特別な具体例を示しつつ、説明のみのため掲げられることを理解すべきである。というのは、本発明の精神および範囲内の種々の変形および修飾はこの詳細な記載から明らかになるであろうからである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１０８】
（発明の詳細な説明）
Ａ．ＭＤＡ−７組成物
本発明の組成物および方法は、ＭＤＡ−７ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドをコードする核酸を使用する。ＭＤＡ−７は、ｐ５３−野生型、ｐ５３−ナルおよびｐ５３−突然変異体である癌細胞の成長を抑制することが示されている腫瘍サプレッサーである。また、ｐ−５３ナル細胞におけるアポトーシス−関連Ｂ遺伝子の観察されたアップレギュレーションはＭＤＡ−７がｐ５３−非依存性メカニズムを用いて癌細胞の破壊を誘導することができることを示す。
【０１０９】
Ｂ．ＭＤＡ−７
ＭＤＡ−７  ｍＲＮＡはヒトＰＢＭＣで同定されており（Ｅｋｍｅｋｃｉｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）、ヒトＭＤＡ−７蛋白質のサイトカイン機能は報告されなかった。遺伝子および蛋白質配列特徴に基づいて、ＭＤＡ−７はＩＬ−２４と命名されてきた（ＮＣＤＩデータベースアクセションＸＭ ００１４０５）。ネズミＭＤＡ−７蛋白質ホモログＦＩＳＰ（ＩＬ−４−誘導分泌蛋白質）はＴｈ２特異的サイトカインとして報告された（Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１）。ＦＩＳＰの転写は、ノックアウト実験によって示されるように、ＴＣＲおよびＩＬ−４受容体係合および引き続いてのＰＫＣおよびＳＴＡＴ６活性化によって誘導される。ＦＩＳＰの発現は特徴付けられたが、機能は未だこの推定サイトカインに帰属されていない（Ｄｅｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００４）。ラットＭＤＡ−７ホモログＣ４９ａ（Ｍｏｂ−５）はｍｄａ−７遺伝子に対して７８％相同であり、創傷治癒に関連付けられている（Ｓｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９９；  Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。Ｍｏｂ−５もまた分泌蛋白質であることが示されており、推定細胞表面受容体はｒａｓ形質転換細胞で同定された（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０００）。ＭＤＡ−７遺伝子のホモログおよび分泌されたＭＤＡ−７蛋白質は種々の種において発現され、分泌される。しかしながら、サイトカイン活性を有するＭＤＡ−７を示すデータは出現していない。そのような活性は、抗原の免疫原性を増強させることによって、広く種々の病気および感染の治療のための結果を有する。
【０１１０】
ヒトｍｄａ−７  ｃＤＮＡ（配列番号：１）は、２３．８ｋＤａの予測されるサイズを持つ２０６アミノ酸（配列番号：２）の進化的に保存された蛋白質をコードする。推定アミノ酸配列は、シグナル配列の特徴を有する約アミノ酸２６ないし４５の疎水性ストレッチを含有する。構造データ、公知のサイトカインに対する相同性、染色体局所化、予測されるＮ−末端分泌シグナルペプチド、サイトカイン分泌のその調節の証明の組合せは、全て、ＩＬ−１０ファミリーサイトカインとしてのＭＤＡ−７／ＩＬ−２４の分類を支持する（Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４レビュー参照）。４９アミノ酸リーダー配列はそれを分泌された蛋白質として同定する；最近の研究はこれを確認し、Ａｄ−ｍｄａ７形質導入細胞が、ヘテロダイマー受容体ＩＬ−２０Ｒ１／ＩＬ−２０Ｒ２およびＩＬ−２２Ｒ２／ＩＬ−２０Ｒ１に結合することができるＭＤＡ−７蛋白質の高レベルの４０ｋＤａ形態を放出することを報告している。該蛋白質の細胞内形態（２３ないし３０ｋＤａ）は切断され、細胞外区画へのその放出の前に（主としてグリコシル化によって）かなり修飾される（ここに引用して援用する、Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４レビュー参照）。
【０１１１】
ＭＤＡ−７の発現は、原発性および転移性メラノーマと比較した正常なメラノサイトにおける増大したｍＲＮＡレベル、ならびにヌードマウスにおける増強された腫瘍形成について選択された初期の垂直成長相メラノーマ細胞における減少したＭＤＡ−７発現によって示されるように、メラノーマの進行に逆に関連する。報告は、ＭＤＡ−７が腫瘍細胞アポトーシス活性を持つＩＬ−１０ファミリーサイトカインであり、それが誘導する細胞傷害性効果は腫瘍細胞に対して特異的であることを示す（Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４レビュー）。いくつかの研究は、ｍｄａ−７のアポトーシスを、活性を媒介するシグナル変換経路を調べた。これらは多数で細胞タイプ特異性であるように見え、該蛋白質の細胞内形態によって、および分泌された形態によって誘導される効果を含む（傍観者効果）（ここに引用して援用するＵＳＮ１０／７９１，６９２参照）。ＭＤＡ−７に関するさらなる情報およびデータは、その出願の全てをここに引用してその全体を援用する。米国特許出願第０９／６１５，１５４号、第１０／０１７，４７２号、第１０／３７８，５９０号および第１０／７９１，６９２号に見出すことができる。
【０１１２】
さらなる研究は、ＭＤＡ−７の上昇したレベルがイン・ビトロにて癌細胞の成長を抑制し、ヒト乳癌細胞におけるアポトーシスならびにヌードマウスにおける腫瘍増殖の阻害を選択的に誘導したことを示した（Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６  および  Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８）。Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）は、ＭＤＡ−７が、乳房、中枢神経系、頸部、結腸、前立腺、および結合組織を含めた多様な起源の癌細胞においてすぐれた成長抑制遺伝子であるという発見を報告する。コロニー阻害アッセイを用いて、ＭＤＡ−７の上昇した発現が、ヒト頸部癌腫（ＨｅＬａ）、ヒト乳房癌腫（ＭＣＦ−７  および  Ｔ４７Ｄ）、結腸癌腫（ＬＳ１７４Ｔ  および  ＳＷ４８０）、鼻咽頭癌腫（ＨＯＮＥ−１）、前立腺癌腫（ＤＵ−１４５）、メラノーマ（ＨＯ−１  および  Ｃ８１６１）、多形神経膠芽細胞腫（ＧＢＭ−１８  および  Ｔ９８Ｇ）、および骨肉腫（Ｓａｏｓ−２）における成長阻害を増強したことを示した。正常な細胞（ＨＭＥＣ、ＨＢＬ−１００、およびＣＲＥＦ−Ｔｒａｎｓ６）におけるＭＤＡ−７過剰発現は限定された成長阻害を示し、これは、ｍｄａ−７導入遺伝子効果が正常な細胞では発現されないことを示す。考え合わせると、データは、ＭＤＡ−７の上昇した発現による成長阻害が正常な細胞におけるよりも癌細胞においてイン・ビトロでより効果的であることを示す。
【０１１３】
Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）は、ＭＤＡ−７が癌細胞成長を抑制するメカニズムについての洞察を報告した。該研究は、乳癌細胞系ＭＣＦ−７およびＴ４７ＤにおけるＭＤＡ−７の異所性発現が、正常なＨＢＬ１００細胞に対する効果なくして、細胞周期分析およびＴＵＮＥＬアッセイによって検出されるようにアポトーシスを誘導したと報告した。アデノウィルスｍｄａ−７（「Ａｄ−ｍｄａ７」）で感染させた細胞からの細胞溶解物のウェスタンブロット分析は、アポトーシス刺激蛋白質ＢＡＸのアップレギュレーションを示した。Ａｄ−ｍｄａ７感染は、ＭＣＦ−７およびＴ４７Ｄ細胞においてのみＢＡＸ蛋白質のレベルを上昇させ、正常なＨＢＬ−１００またはＨＭＥＣ細胞においては上昇させなかった。これらのデータは、ＭＣＦ−７腫瘍細胞の異種移植片腫瘍形成に対するエクス・ビボＡｄ−ｍｄａ７形質導入の効果を評価する調査に導く。エクス・ビボ形質導入の結果、腫瘍異種移植片モデルにおいて腫瘍形成および進行の阻害がもたらされた。
【０１１４】
遺伝子治療を用いる癌の治療のための主な様式はアポトーシスの誘導である。これは、癌細胞を他の剤に対して感受性とし、あるいは細胞内経路を直接的に刺激することによってアポトーシスを誘導することによってのいずれかにより達成することができる。他の癌療法は、血管形成を誘導して、成長する腫瘍に必要な栄養を供給する腫瘍に対する必要性を利用する。エンドスタチンおよびアンジオスタチンは２つのそのような療法の例である（ＷＯ  ００／０５３５６およびＷＯ  ００／２６３６８）。
【０１１５】
これらの構築体の使用可能性に関する特別な理論に固執するものではないが、受容体結合に関連するＣ−末端に位置するＤ−螺旋領域における種を横切ってのＩＬ−１０に対するｍｄａ−７の顕著なアミノ酸相同性がある。かくして、３０ないし３５アミノ酸領域を好ましくは含有する分子は特に好ましい。
【０１１６】
かくして、本発明の１つの具体例において、血管形成−関連病の治療は治療ペプチドまたはポリペプチドの投与を含む。もう１つの具体例において、治療は、病気細胞または内皮細胞を含む標的へｍｄａ−７をコードする核酸発現構築体の投与を含む。標的細胞は構築体を取り込み、核酸によってコードされた治療ペプチドを発現し、それにより、標的細胞における分化を阻害すると考えられる。ＭＤＡ−７を発現する細胞は、今度は、発現構築体によって形質導入されず、または感染されない隣接細胞と相互作用できる蛋白質を分泌することができる。このようにして、腫瘍のための新しい血管系を確立するのに必要な複雑な相互作用は阻害され、腫瘍の治療が達成される。
【０１１７】
本発明のもう１つの具体例において、血管形成−関連病はＭＤＡ−７、またはそれを発現する構築体で治療することができると考えられる。本発明において治療で考えられる血管形成−関連病のいくつかは乾癬、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、骨関節炎（ＯＡ）および肺におけるプレ−新形成病巣である。
【０１１８】
なおもう１つの具体例において、広く種々の癌状態の治療は本発明の範囲内である。例えば、メラノーマ、非−小細胞肺、小細胞肺、肺、肺癌腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、白血病、神経芽細胞腫、頭部、首部、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部、胃腸、リンパ腫、脳、結腸または膀胱。なおより好ましい具体例において、該血管形成−関連病は慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、骨関節炎、平滑筋腫、アデノーマ、脂肪腫、血管腫、線維腫、血管閉塞、再狭窄、アテローム性動脈硬化症、プレ−新形成病巣、イン・サイチュ癌腫、口腔毛様、白斑症または乾癬は治療の対象となり得る。特別な具体例において、癌は切除可能であり得る、またはそうでない腫瘍を含む。さらに、癌は転移性腫瘍、または恐らくは転移が可能である腫瘍を含むことができる。
【０１１９】
本発明の方法および組成物によって治療することができる癌細胞は膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、胃腸、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、首部、卵巣、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌または子宮からの細胞も含む。加えて、これらに限定するものではないが、癌は具体的には以下の組織学的タイプであってよい：新生物、悪性；癌腫；癌腫、未分化；巨細胞および紡錘細胞癌腫；小細胞癌腫；乳頭癌腫；扁平細胞癌腫；リンパ系上皮癌腫；基底細胞癌腫；毛質性上皮癌腫；移行細胞癌腫；乳頭移行細胞癌腫；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌腫；組み合わされた肝細胞癌腫および胆管癌；小柱腺癌；腺様嚢胞性癌腫；腺腫様ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性結腸ポリポーシス；固体癌腫；類癌腫、悪性；気管支−肺胞腺癌；乳頭腺癌；色素嫌性癌腫；好酸性癌腫；酸親和性腺癌；好中性癌腫；明細胞腺癌；顆粒細胞癌腫；小胞腺癌；乳頭および小胞腺癌；非カプセル化硬化性癌腫；副腎皮質癌腫；類内膜癌腫；皮膚付属器官癌腫；アポクリン腺癌；皮脂性腺癌；耳垢腺癌；粘膜表皮癌腫；嚢胞腺癌；乳頭嚢胞腺癌；乳頭重症嚢胞腺癌；ムチン嚢胞腺癌；ムチン腺癌；印環細胞癌腫；浸潤性管癌腫；髄質癌腫；小葉癌腫；炎症性癌腫；パジェット病、乳房；腺房細胞癌腫；腺鱗状癌腫；腺癌ｗ／扁平化成；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；キョウ膜、悪性；顆粒膜細胞腫瘍、悪性；男性ホルモン産生細胞腫、悪性；セルトリ細胞癌腫；ライディッヒ細胞腫瘍；悪性脂質細胞腫瘍、悪性；パラガングリオーマ、悪性；過剰−乳房パラガングリオーマ、悪性；クロム親和性細胞腫；クロムス血管肉腫；悪性メラノーマ；メラニン欠乏メラノーマ；表層展延メラノーマ；巨大色素性母斑における悪性メラノーマ；類上皮細胞メラノーマ；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；繊維状組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胚性横紋筋肉腫；肺胞横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー混合腫瘍；腎芽細胞腫；肝芽細胞腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレンナー腫、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；未分化胚細胞腫；胚性癌腫；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポシ肉腫；血管周囲細胞腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；皮質近傍肉腫；軟骨肉腫；軟骨芽細胞腫、悪性；間葉軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯牙発生腫瘍、悪性；エナメル芽細胞骨肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠細胞腫、悪性；脳室上衣芽細胞腫；神経膠星状細胞腫；原形質神経膠星状細胞腫；原線維神経膠星状細胞腫；神経膠星状芽細胞腫；神経膠芽細胞腫；稀突起神経膠腫；稀突起神経膠芽細胞腫；原始的神経外胚葉；小脳肉腫；神経節神経芽細胞腫；神経芽細胞腫；網膜芽細胞腫；嗅覚神経腹性腫瘍；骨髄腫、悪性；神経線維肉腫；神経髄腫、悪性；顆粒細胞腫瘍、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン；パラ肉芽腫；悪性リンパ腫、小リンパ球性；悪性リンパ腫；大細胞、散漫；悪性リンパ腫、小胞；ポリープ状真菌症；他の特別な非−ホジキンリンパ腫；悪性組織球増殖症；多発性ミエローマ；肥満細胞肉腫；免疫増殖性小腸病；白血病；リンパ系白血病；プラズマ細胞白血病；赤血球白血病；リンパ系肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基性白血病；好酸性白血病；単球白血病；肥満細胞白血病；巨核芽細胞白血病；骨髄性肉腫；および毛様細胞白血病。
【０１２０】
本発明のある具体例において、ｍｄａ−７はＭＤＡ−７ポリペプチドを発現する核酸として提供される。特別な具体例において、核酸はウィルスベクターであり、ここに、ウィルスベクターの用量は１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、または少なくとも１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５またはそれより高いｐｆｕまたはウィルス粒子である。ある具体例において、ウィルスベクターはアデノウィルスベクター、レトロウィルスベクター、ワクシニアウィルスベクター、アデノ−関連ウィルスベクター、ポリオーマーウィルスベクター、アルファウィルスベクター、ラブドウィルスベクター、またはヘルペスウィルスベクターである。最も好ましくは、ウィルスベクターはアデノウィルスベクターである。他の特別な具体例において、核酸は非−ウィルスベクターである。
【０１２１】
ある具体例において、ポリペプチドを発現する核酸はプロモーターに操作可能に連結されている。本発明で適するプロモーターの非限定的例はＣＭＶ  ＩＥ、デクチン−１、デクチン−２、ヒトＣＤ１１ｃ、Ｆ４／８０、ＳＭ２２  または  ＭＨＣクラスＩＩプロモーターを含み、しかしながら、本明細書中に記載したような、本発明のｍｄａ−７遺伝子または免疫遺伝子の発現を駆動するのに有用ないずれの他のプロモーターも本発明の実施に適用できると考えられる。
【０１２２】
好ましくは、本発明の核酸は注射によって投与される。他の具体例は複数注射による核酸の投与を含む。ある具体例において、注射は病気または腫瘍部位に対して局所、領域的または末端である。いくつかの具体例において、核酸の投与は連続的注入、腫瘍内注射、腹腔内または静脈内注射を介する。他の具体例において、核酸は腫瘍の切除に先立って、または後に；または先立っておよび後の双方にて腫瘍床に投与される。別法として、核酸は化学療法、生物療法、免疫療法、外科的または放射線療法の前、間、または後に患者に投与される。好ましくは、患者はヒトである。他の具体例において、患者は癌患者である。
【０１２３】
Ｃ．核酸、ベクターおよび調節シグナル
本発明は、ｍｄａ−７遺伝子およびその遺伝子産物ＭＤＡ−７に関連するポリヌクレオチドまたは核酸分子に関する。加えて、本発明は、免疫原性分子に関するポリヌクレオチドまたは核酸分子に向けられる。これらのポリヌクレオチドまたは核酸分子は哺乳動物細胞から単離可能であり、精製可能である。ｍｄａ−７遺伝子産物に関連する核酸分子である、分泌または全長バージョンいずれかである、単離され精製されたＭＤＡ−７核酸分子はＲＮＡまたはＤＮＡの形態を取ることができる。本明細書中で用いるように、用語「ＲＮＡ転写体」とは、ＤＮＡ核酸分子からの転写の産物であるＲＮＡ分子をいう。そのような転写体は１以上のポリペプチドをコードすることができる。
【０１２４】
本出願で用いるように、用語「ポリヌクレオチド」とは、全ゲノム核酸から遊離させて単離された核酸分子、ＲＮＡまたはＤＮＡをいう。従って、「ＭＤＡ−７をコードするポリヌクレオチド」とは、ＭＤＡ−７をコードする配列を含有し、全ゲノムＤＮＡおよび蛋白質から離されて単離され、または精製され、それを含まない核酸セグメントをいう。本出願がＭＤＡ−７−コーディングポリヌクレオチドまたは核酸の機能または活性をいう場合、該ポリヌクレオチドは癌細胞のアポトーシスを誘導する能力を有する分子をコードすることを意味する。
【０１２５】
用語「ｃＤＮＡ」は、鋳型としてＲＮＡを用いて調製されたＤＮＡをいうことを意図する。ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ転写体とは反対に、ｃＤＮＡを使用する利点は、安定性、および組換えＤＮＡ技術を用いて配列を操作する能力である（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，１９９６）。全長または部分的ゲノム配列がいくらかである場合、時間があり得る。別法として、ｃＤＮＡは有利であろう。なぜならば、それはポリペプチドのコーディング領域を表し、イントロンおよび他の調節領域を排除するからである。
【０１２６】
また、与えられた細胞からの与えられたＭＤＡ−７−コーディング核酸またはｍｄａ−７遺伝子は、わずかに異なる核酸配列を有するが、それにも拘わらず、ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする天然変種または株によって表されえると考えられる。特別な場合において、ヒトＭＤＡ−７ポリペプチドは特別な具体例である。その結果、本発明は、最小アミノ酸変化を持つが、同一活性を保有するＭＤＡ−７も含む。
【０１２７】
用語「遺伝子」は、機能的蛋白質、ポリペプチド、またはペプチド−コーディング核酸ユニットをいうために感銘性のために用いる。当業者によって理解されるように、この機能的用語は、蛋白質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合蛋白質および突然変異体を発現する、または発現するように適合させることができるゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、およびより小さな作製された遺伝子セグメントを含む。ＭＤＡ−７をコードする核酸分子は以下の長さまたは少なくとも以下の長さの連続核酸配列：
【０１２８】
【化１】
2008531481.tif 000002
またはヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基対を含むことができる。そのような配列は配列番号：１（ＭＤＡ−７コーディング配列）と同一またはそれに対して相補的であり得る。
【０１２９】
「他のコーディング配列から実質的に離れて単離された」は、注目する遺伝子が核酸セグメントのコーディング配列の一部を形成し、該セグメントは大きな染色体断片または他の機能的遺伝子またはｃＤＮＡコーディング領域のような天然に生じるコーディング核酸の大きな部分を含有しないことを意味する。勿論、これは元来単離された核酸セグメントをいい、ヒトの操作によって該セグメントに後に加えられた遺伝子またはコーディング領域を排除しない。
【０１３０】
特別な具体例において、本発明は、「ヒトＭＤＡ−７」または「ＭＤＡ−７ポリペプチド」と命名されるＭＤＡ−７に対応する、配列番号：２に従って、またはそれに実質的に記載された連続アミノ酸配列をそのアミノ酸配列内に含むＭＤＡ−７蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ配列を取り込んだ単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。
【０１３１】
用語「配列番号：２に実質的に記載された配列」とは、該配列が配列番号：２の部分に実質的に対応し、配列番号：２のアミノ酸と同一であるか、またはその生物学的機能同等体である少なくとも少数のアミノ酸を有することを意味する。
【０１３２】
用語「生物学的機能的同等体」は、当該分野でよく理解されており、本明細書中においてさらに詳細に定義される。従って、配列番号：２のアミノ酸と同一であるか、または機能的に同等であるアミノ酸の約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％、および例えば、約７０％ないし約８０％、より好ましくは約８１％および約９０％；またはなおより好ましくは約９１％と約９９％との間を有する配列は「配列番号：２に実質的に記載された」配列であり、但し、当該蛋白質の生物学的活性はアポトーシスを誘導することに関して維持されているものとする。特別な具体例において、ＭＤＡ−７蛋白質、ポリペプチドまたはペプチド、または生物学的機能的同等体の生物学的活性は免疫応答の増強を含む。ある他の具体例において、本発明は、配列番号：１に実質的に記載されたアミノ酸配列をその配列内に含む単離されたＤＮＡセグメントおよび組換えベクターに関する。用語「配列番号：１に実質的に記載された」は前記と同一の意味で用いられ、核酸配列が配列番号：１の部分に実質的に対応し、配列番号：２のコドンと同一、または機能的に同等でない比較的少数のコドンを有することを意味する。再度、ＭＤＡ−７活性を呈する蛋白質、ポリペプチド、またはペプチドをコードするＤＮＡセグメントは本発明の具体例で使用されるであろう。
【０１３３】
特別な具体例において、本発明は、ＭＤＡ−７ポリペプチドに従った、または実質的に対応する連続アミノ酸配列をそのアミノ酸配列内に含むＤＮＡ−７ポリペプチドまたはペプチドをコードするＤＮＡ配列を取り込む単離された核酸セグメントおよび組換えベクターに関する。
【０１３４】
本発明のベクターは、主として、真核生物プロモーター（すなわち構成的、誘導性、抑制性、組織特異的）の制御下にある治療ｍｄａ−７遺伝子またはＭＤＡ−７コーディング核酸配列で細胞を形質転換するように設計される。また、該ベクターは、もし他の理由がなくても、イン・ビトロでその操作を容易にするための選択マーカーを含有することができる。しかしながら、選択マーカーは組換え細胞を生産するにおいて重要な役割を演じることができる。
【０１３５】
以下の表１および２は、本発明に従って用いられる種々の調節シグナルをリストする。
【０１３６】
【表１】
2008531481.tif 000003
【０１３７】
【表２−１】
2008531481.tif 000004
【０１３８】
【表２−２】
2008531481.tif 000005
【０１３９】
【表２−３】
2008531481.tif 000006
真核生物細胞において蛋白質コーディング遺伝子の転写を制御するプロモーターおよびエンハンサーは多数の遺伝子エレメントから構成される。細胞マシーナリーは各エレメントによって運ばれる調節情報を集め、統合することができ、異なる遺伝子が転写調節の区別されるしばしば複雑なパターンを発生させるのを可能とする。
【０１４０】
用語「プロモーター」は、本明細書中においては、ＲＮＡポリメラーゼＩＩについての開始部位の周りにクラスター化される転写制御モジュールの群をいうように用いられる。どのようにしてプロモーターが組織化されるかについての考えの多くは、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ｔｋ）およびＳＶ４０初期転写ユニットについてのそれを含めたいくつかのウィルスプロモーターの分析に由来する。より最近の研究によって増大したこれらの研究は、プロモーターが、区別される機能的モジュールから構成され、各々はほぼ７ないし２０ｂｐのＤＮＡからなり、かつ転写アクチベーター蛋白質についての１以上の認識部位を含有することを示した。
【０１４１】
各プロモーター中の少なくとも１つのモジュールは、ＲＮＡ合成についての開始部位を位置決定するように機能する。これの最良な公知の例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子についてのプロモーターおよびＳＶ４０後期遺伝子についてのプロモーターのようなＴＡＴＡボックスを欠如するいくつかのプロモーターにおいては、開始部位に重複する区別されるエレメントそれ自体は開始の場所を固定するのを助ける。
【０１４２】
さらなるプロモーターエレメントは転写開始の頻度を調節する。典型的には、多数のプロモーターが最近、同様に開始部位の下流に機能的エレメントを含有することが示されているが、これらは開始部位から３０ないし１１０ｂｐ上流の領域に位置する。エレメントの間の間隔は固定可能であり、したがって、エレメントが相互に逆転され、または相互に対して移動された場合にプロモーター機能が維持される。ｔｋプロモーターにおいては、エレメントの間の間隔は活性が減少し始める前に５０ｂｐ離れるまで増大させることができる。プロモーターに依存して、個々のエレメントは協調的にまたは独立して機能して、転写を活性化することができる。
【０１４３】
エンハンサーは、ＤＮＡの同一分子上の離れた位置に位置するプロモーターからの転写を増大させた遺伝子エレメントとして元来は検出された。大きな距離にわたって作用するこの能力は、原核生物転写調節の古典的研究においてはほとんど前例を有しない。引き続いての研究は、エンハンサー活性を持つＤＮＡの領域はかなりプロモーターのように組織化されることを示した。すなわち、それらは多くの個々のエレメントから構成され、その各々は１以上の転写蛋白質に結合する。
【０１４４】
エンハンサーおよびプロモーターの間の基本的な区別は操作可能である。全体としてのエンハンサー領域は一定の距離をおいて転写を刺激できなければならない；これはプロモーター領域またはその成分エレメントでは当てはまる必要はない。他方、プロモーターは特定の部位においておよび特定の向きにおいてＲＮＡ合成の開始を指令する１以上のエレメントを有さなければならず、他方、エンハンサーはこれらの特異性を欠如する。この操作区別とは別に、エンハンサーおよびプロモーターは非常に似た存在である。
【０１４５】
プロモーターおよびエンハンサーは細胞において転写を活性化する同一の一般的機能を有する。それらはしばしば重複しかつ連続し、しばしば、非常に似ているモジュール組織化を有するように見える。考え合わせると、これらの考慮は、エンハンサーおよびプロモーターは相応する存在であり、これらの配列に結合した転写アクチベーター蛋白質が基本的には同一の方法で細胞転写マシーナリーと相互作用できることを示唆する。
【０１４６】
いくつかの具体例において、本発明で用いられるプロモーターはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、即時型（ＩＥ）プロモーターである。このプロモーターは、本発明で用いられるいくつかであるベクターｐｃＤＮＡＩＩＩにおいて、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから商業的に入手可能である。また、本発明において有用であると考えられるのはデクチン−１およびデクチン−２プロモーターである。以下に示すのは、本発明で組み合わせて用いることができるさらなるウィルスプロモーター、細胞プロモーター／エンハンサーおよび誘導性プロモーター／エンハンサーのリストである。また、加えて、いずれかのプロモーター／エンハンサー組み合わせ（それ自体、真核生物プロモーターデータベースＥＰＤＢ）を用いて、オリゴ糖プロセッシング酵素、蛋白質折り畳みアクセサリー蛋白質選択マーカー蛋白質または異種蛋白質をコードする構造遺伝子の発現を駆動することができよう。
【０１４７】
有用であることが判明するであろうもう１つのシグナルはポリアデニル化シグナルである。そのようなシグナルはヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子、またはＳＶ４０から得ることができる。
【０１４８】
内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用を用いて、マルチジーン、またはポリシストロニックメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントは、５−メチル化キャップ−依存性翻訳のリボソームスキャニングモデルを回避し、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウイルスファミリーの２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）からのＩＲＥＳエレメントは記載されており（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳは記載されている（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，１９９１）。ＩＲＥＳエレメントは異種オープンリーディングフレームに連結させることができる。多数のオープンリーディングフレームを一緒に転写させることができ、各々はＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロニックメッセージを生じる。ＩＲＥＳエレメントによって、各オープンリーディングフレームは効率的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。多数の遺伝子は、単一のプロモーター／エンハンサーを用いて効率的に発現させて、単一のメッセージを転写することができる。
【０１４９】
いずれにせよ、プロモーターは、遺伝子の上流に機能的に位置した場合に、その遺伝子の発現に導くＤＮＡエレメントであることが理解されよう。本発明のほとんどの導入遺伝子構築体はプロモーターエレメントから機能的に下流に位置する。
【０１５０】
本発明の組成物および方法は、本発明の組成物を患者に投与するために提供される。
【０１５１】
Ｄ．ベクター
ＭＤＡ−７ポリペプチドは、ベクターに含まれる核酸分子によってコードされ得る。このようにして、ＭＤＡ−７ポリペプチドは、該ポリペプチドは患者で発現される限り、そのようなベクターの投与を介して患者に提供することができる。
【０１５２】
用語「ベクター」は、その中で核酸配列を、そこで細胞が複製できる該細胞への導入のために挿入することができるキャリアー核酸分子をいうのに用いられる。核酸配列は「外因性」でありえるが、これは、それが、ベクターが導入される細胞に対して外来性であること、または該配列が、配列が通常は見出されない宿主細胞核酸内の位置におけるを除いて細胞中の配列に対して相応であることを意味する。ベクターはプラスミド、コスミド、ウィルス（バクテリオファージ、動物ウィルス、植物ウィルス）および人工染色体（例えば、ＹＡＣ）を含む。当業者であれば、双方をここに引用して援用するＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９６に記載されている標準的な組換え技術を介してベクターを構築するのに精通しているであろう。修飾されたゲノロニンのような修飾されたポリペプチドをコードするのに加えてベクターはタグまたは標的化分子のような非−修飾ポリペプチドをコードすることができる。そのような融合蛋白質をコードする有用なベクターは、後の精製および分離または切断用のグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）可溶性融合蛋白質で用いるための、ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５）、ヒスチジンのストレッチをコードするベクター、およびｐＧＥＸベクターを含む。標的化分子は、対象の身体における特定の器官、組織、細胞、または他の位置へ修飾されたポリペプチドを向けるものである。
【０１５３】
用語「発現ベクター」とは、転写され得る遺伝子産物の少なくとも一部をコードする核酸配列を含有するベクターをいう。いくつかの場合において、次いで、ＲＮＡ分子を蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドに翻訳する。発現ベクターは、特定の宿主生物における操作可能に連結したコーディング配列の転写および、恐らくは、翻訳に必要な核酸配列をいう種々の「対照配列」を含有することができる。転写および翻訳を支配する対照配列に加えて、ベクターおよび発現ベクターは、同様に他の機能を発揮し、かつ先に記載された核酸配列を含有することができる。
【０１５４】
１．ウィルスベクター
ａ．アデノウィルス感染
組換えＤＮＡの送達のための１つの方法は、アデノウィルス発現ベクターの使用を含む。アデノウィルスベクターはゲノムＤＮＡへの組込みについて低い能力を有することが知られているが、この特徴は、これらのベクターによって提供される遺伝子導入の高い効率によって逆バランスされている。「アデノウィルス発現ベクター」は、（ａ）構築体のパッケージングを支持し、および（ｂ）その中にクローン化されている組換え遺伝子構築体を最終的に発現するのに十分なアデノウィルス配列を含有する構築体を含むことを意味する。
【０１５５】
アデノウィルスベクターは複製欠陥、少なくとも条件付欠陥であり得、アデノウィルスベクターの性質は本発明の成功した実施に対して非常に重要であると考えられない。アデノウィルスは、４２の異なる公知の血清型またはサブグループＡないしＦのうちのいずれであってもよい。サブグループＣのアデノウイルスタイプ５は、本発明で用いられる条件付き複製−欠陥アデノウィルスベクターを得るためのいくつかの出発材料である。これは、アデノウイルスタイプ５が、多量の生化学的および遺伝子情報がそれについて知られているヒトアデノウイルスであり、それは、歴史的には、ベクターとしてアデノウィルスを使用するほとんどの構築で用いられてきた。
【０１５６】
前記したように、本発明による典型的なベクターは、複製欠陥であり、アデノウィルスＥ１領域を有しないであろう。かくして、形質転換構築体を、そこからＥ１−コーディング配列が除去された位置に導入するのが最も便宜であろう。しかしながら、アデノウィルス配列内への構築体への挿入の位置は本発明にとって非常に重要ではない。注目する遺伝子をコードするポリヌクレオチドもまた、Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）によって記載されたＥ３置換ベクターにおける欠失されたＥ３領域の代わりに、またはヘルパー細胞系またはヘルパーウイルスがＥ４欠陥を補充するＥ４領域において挿入することもできる。
【０１５７】
アデノウィルスの成長および操作は当業者に知られており、イン・ビトロおよびイン・ビボにて広い宿主範囲を呈する。ウィルスのこの群は高い力価、例えば、ｍｌ当たり１０９−１０１１プラーク−形成単位で得ることができ、それらは高度に感染性である。アデノウィルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノムへの取込を必要としない。アデノウィルスベクターによって送達される外来性遺伝子はエピソームのものであり、従って、宿主細胞に対して低い遺伝子傷害性を有する。
【０１５８】
ｂ．レトロウイルス感染
レトロウイルスは、逆−転写のプロセスによって感染した細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力によって特徴付けられる一本鎖ＲＮＡウィルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。次いで、得られたＤＮＡをプロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込み、ウィルス蛋白質の合成を指令する。該組込の結果、受容体細胞およびその子孫においてウィルス遺伝子配列が保持される。
【０１５９】
レトロウィルスベクターを構築するためには、注目する遺伝子をコードする核酸をあるウィルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製−欠陥であるウィルスを得る。ビリオンを生産するためには、ＬＴＲおよびパッケージングが無い以外はｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含有するパッケージング細胞系を構築する（Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３）。ｃＤＮＡを含有する組換えプラスミドを、レトロウイルスＬＴＲおよびパッケージング配列と共に（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）この細胞系に導入すると、パッケージング配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写体がウィルス粒子にパッケージされるのを可能とし、次いで、これを培養基に分泌させる（Ｎｉｃｏｌａｓ  ａｎｄ  Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ、  １９８８；  Ｔｅｍｉｎ、  １９８６；  Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８３）。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を集め、所望により、濃縮し、遺伝子導入のために用いる。レトロウィルスベクターは広く種々の細胞型に感染することができる。しかしながら、組込みおよび安定な発現は宿主細胞の分裂を必要とする（Ｐａｓｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７５）。
【０１６０】
ｃ．ＡＡＶ感染
アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）は、本発明で用いるための魅力的なベクター系である。というのは、それは組込の高い頻度を有し、それは非分裂性細胞に感染することができ、かくして、それを、組織培養における哺乳動物細胞への遺伝子の送達で有用とする（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）。ＡＡＶは感染性について広い宿主範囲を有し（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８４；  Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６；  Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）、これは、それが本発明で用いるのに適用できることを意味する。ｒＡＡＶベクターの作成および使用に関する詳細は、各々を引用して援用する米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号に記載されている。
【０１６１】
遺伝子送達におけるＡＡＶの使用を示す研究はＬａＦａｃｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９８８）；  Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）；  Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）；  および  Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）を含む。組換えＡＡＶベクターは、（Ｋａｐｌｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８；  Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９；  Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  および  Ｓｍｉｔｈ、  １９９４；  Ｙｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｈｅｒｍｏｎａｔ  および  Ｍｕｚｙｃｚｋａ、  １９８４；  Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８５；  ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８８）およびヒト病気に関与する遺伝子（Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９２；  Ｏｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０；  Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４；  Ｗｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４）のイン・ビトロおよびイン・ビボ形質導入で首尾よく用いられてきた。最近、ＡＡＶベクターは嚢胞性線維症の治療のためにＩ相ヒト試験で認可された。
【０１６２】
典型的には、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウィルスは、２つのＡＡＶターミナルリピートが近接する注目する遺伝子を含有するプラスミド（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９８；  Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９；各々ここに引用して援用する）およびターミナルリピートを含まない野生型ＡＡＶコーディング配列を含有する発現プラスミド、例えば、ｐＩＭ４５（ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１；ここに引用して援用する）を共トランスフェクトすることによって作成される。細胞は、ＡＡＶヘルパー機能に必要なアデノウィルス遺伝子を運ぶアデノウィルスまたはプラスミドで感染させ、またはトランスフェクトもされる。そのようにして作成されたｒＡＡＶウイルスストックは、（例えば、塩化セシウム密度遠心によって）ｒＡＡＶ粒子から物理的に分離されなければならないアデノウィルスで汚染される。別法として、ＡＡＶコーディング領域を含有するアデノウィルスベクターまたはＡＡＶコーディング領域およびアデノウイルスヘルパー遺伝子のいくつかまたは全てを含有する細胞系を用いることができよう（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９４ａ；  Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，  １９９５）。ｒＡＡＶ  ＤＮＡを組み込まれたプロウイルスとして運ぶ細胞系も用いることができる（Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５）。
【０１６３】
ｄ．プロタミン
プロタミンを用いて、発現構築体との複合体を形成することもできる。次いで、そのような複合体を細胞への投与について前記した脂質組成物で処方することができる。プロタミンはＤＮＡに関連する小さなコードに塩基性のヌクレオ蛋白質である。核酸の送達におけるそれらの使用は、ここに引用して援用する米国特許第５，１８７，２６０号に記載されている。ウィルスベクターをプロタミン分子と複合体化させることによってウィルスベクターの形質導入効率を増大させるための方法および組成物に関する（２００３年３月２４日に出願された）米国特許出願第１０／３９１，０６８号をここに引用して具体的に一体化させる。
【０１６４】
２．非−ウィルス送達
ＭＤＡ−７蛋白質をコードする核酸のウィルス送達に加えて、以下のものは与えられた宿主細胞への組換え遺伝子送達のさらなる方法であり、かくして、本発明で考えられる。
【０１６５】
ａ．脂質媒介形質転換
本発明のさらなる具体例において、発現ベクターをリポソームまたは脂質処方で捕獲することができる。リポソームは、リン脂質二層膜および内部水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。マルチラメラリポソームは、水性媒体によって分離される多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質を過剰の水性溶液に懸濁させる場合に自然に形成される。脂質成分が、閉じた構造の形成前に自己−再編成を受け、脂質二層の間に水および溶解された溶質を捕獲する（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。また、リポフェクタミンで複合体化した遺伝子構築体が考えられる（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）。
【０１６６】
脂質形成における最近の進歩はイン・ビボでの遺伝子導入の効率を改良した（Ｓｍｙｔｈ−Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；ＷＯ  ９８／０７４０８）。等モル比率の１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアミノ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロールから合成される新規な脂質形成は、系統的イン・ビボ遺伝子導入をほぼ１５０倍有意に増強させる。ＤＯＴＡＰ：コレステロール脂質形成は、「サンドイッチリポソーム」といわれるユニークな構造を形成するといわれる。この処方は、嵌入した二層または「花瓶」構造の間にＤＮＡを「サンドイッチ」にすると報告されている。これらの脂質構造の有利な特徴はコレステロールによる陽性コロイド安定化、二次元ＤＮＡパッキングおよび増大した血清安定性を含む。
【０１６７】
癌の治療のためのそのような処方の製造および使用は、ここに引用して援用する０９／第５７５，４７３号に提供される。
【０１６８】
さらなる具体例において、リポソームはナノ粒子としてさらに定義される。「ナノ粒子」は、本明細書中においては、サブミクロン粒子をいうと定義される。サブミクロン粒子はいずれのサイズとすることもできる。例えば、ナノ粒子は約０．１、１、１０、１００、３００、５００、７００、１０００ナノメートル以上の直径を有することができる。対象に投与されるナノ粒子は１を超えるサイズとすることができる。
【０１６９】
当業者に公知のいずれの方法も、ナノ粒子を製造するのに用いることができる。いくつかの具体例において、ナノ粒子は生産プロセスの間に押し出される。ナノ粒子の製造に関する例示的な情報は、その各々をここに具体的に引用して本セクションに一体化される、米国特許出願公開番号２００５０１４３３３６、米国特許出願公開番号２００３０２２３９３８、米国特許出願公開番号２００３０１４７９６６、およびＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６０／６６１，６８０に見出すことができる。
【０１７０】
ある具体例において、抗−炎症剤は脂質と共に投与して、脂質：核酸複合体の投与に対して二次的な炎症を予防し、または低下させる。例えば、抗−炎症剤は非−ステロイド抗−炎症剤、サリシレート、抗−リウマチ剤、ステロイド、または免疫抑制剤であってよい。脂質−核酸複合体と組み合わせた抗−炎症剤の投与に関する情報は、ここに具体的に引用して援用する米国特許出願公開番号２００５０１４３３３６に見出すことができる。
【０１７１】
ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌナノ粒子の合成は、当業者に知られたいずれかの方法によるものである。例えば、該方法は、その双方を具体的にここに引用して援用するＣｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００３または  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９７に記載されたものに従うことができる。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡ複合体はマウスへの注射に２ないし３時間先立って新たに調製した。
【０１７２】
当業者であれば、核酸配列を捕獲するためのリポソームまたは脂質処方の使用に精通しているであろう。リポソームは、リン脂質二層膜および内部水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。マルチラメラリポソームは、水性媒体によって分離された多数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水性溶液に懸濁された場合に自然に形成される。脂質成分が閉じた構造の形成の前に自己−再編成を受け、脂質二層の間に水および溶解された溶質を捕獲する（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。また、リポフェクタミンと複合体化された遺伝子構築体が考えられる（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）。
【０１７３】
脂質−媒介核酸送達およびイン・ビトロでの外来性ＤＮＡの発現は非常に成功した（Ｎｉｃｏｌａｕ  および  Ｓｅｎｅ、  １９８２；  Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９７９；  Ｎｉｃｏｌａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）。Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）は、培養されたニワトリ胚、ＨｅＬａおよび肝臓腫における脂質−媒介送達および外来性ＤＮＡの発現の可能性を示した。
【０１７４】
脂質ベースの非−ウィルス処方はアデノウィルス遺伝子療法に対する代替法を提供する。多くの細胞培養研究は脂質ベースの非−ウィルス遺伝子導入を記載してきたが、脂質ベースの処方を介する系統的遺伝子送達が制限された。非−ウィルス脂質ベースの遺伝子送達の主な制限は、非−ウィルス送達ビヒクルを含むカチオン性脂質の毒性である。リポソームのイン・ビボ毒性は、イン・ビトロおよびイン・ビボ遺伝子導入結果の間の矛盾を部分的に説明する。この矛盾するデータに寄与するもう１つの因子は、血清蛋白質の存在下および不存在下におけるリポソーム安定性の差である。リポソームおよび血清蛋白質の間の相互作用はリポソームの安定性特徴に対する劇的なインパクトを有する（Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，１９９７）。カチオン性リポソームは負に荷電した血清蛋白質を引き付け、それに結合する。血清蛋白質によって被覆されたリポソームは溶解され、またはマクロファージによって取り込まれ、環境からのそれらの除去に導かれる。現在のイン・ビボリポソーム送達方法は皮下、皮内、腫瘍内または頭蓋内注射を用いて、循環におけるカチオン性脂質に伴う毒性および安定性の問題を回避する。リポソームおよび血漿蛋白質の相互作用は、イン・ビトロの効率（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７）およびイン・ビボ遺伝子導入（Ｚｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９３；  Ｓｏｌｏｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｔｈｉｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ｔｓｕｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９５；  Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９６）の間の食い違いの原因である。
【０１７５】
リポソーム処方における最近の進歩はイン・ビボでの遺伝子導入の効率を改良した（ＷＯ  ９８／０７４０８）。等モル比率の１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロールから構成される新規なリポソーヌ処方は、系統的にイン・ビボ遺伝子導入をほぼ１５０倍有意に増強する。ＤＯＴＡＰ：コレステロール脂質処方は、「サンドイッチリポソーム」といわれるユニークな構造を形成するといわれている。この処方は、嵌入した二層または「花瓶」構造の間にＤＮＡを「サンドイッチ」すると報告されている。これらのリポソームの有利な特徴はコレステロールによるコロイド安定化、二次元ＤＮＡパッキングおよび増大した血清安定性を含む。
【０１７６】
脂質処方の製造は、しばしば、（Ｉ）逆相蒸発、（ＩＩ）脱水−再水和、（ＩＩＩ）洗剤透析および（ＩＶ）薄いフイルム水和後のリポソーム混合物の音波処理または系列的押出しによって達成される。一旦製造されれば、脂質構造を用いて、循環に入った場合に毒性（化学療法剤）または不安定（核酸）である化合物をカプセル化することができる。リポソームカプセル化の結果、そのような化合物についてのより低い毒性およびより長い血清半減期をもたらした（Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９０）。多数の病気処理は脂質ベースの遺伝子導入戦略を用いて、慣用的な療法を増強させ、または新規な療法、特に、過剰増殖性病を治療するための療法を確立している。
【０１７７】
リポソームは血球凝集素ウイルス（ＨＶＪ）と複合体化することができる。これは、細胞膜との融合を促進し、リポソーム−カプセル化ＤＮＡの細胞エントリーを促進することが示されている（Ｋａｎｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８９）。他の具体例において、リポソームは、核非−ヒストン染色体蛋白質（ＨＭＧ−１）と組み合わせて複合体化し、または使用することができる（Ｋａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。なおさらなる具体例において、リポソームはＨＶＪおよびＨＭＧ−１と組み合わせて複合体化し、または使用することができる。
【０１７８】
非ウィルス送達のための核酸はポリアクリルアミドゲル、塩化セシウム遠心グラジエント、カラムクロマトグラフィーによって、あるいは当業者に知られたいずれかの他の手段によって精製することができる（例えば、ここに引用して援用するＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１参照）。ある態様において、本発明は単離された核酸である核酸に関する。本明細書中で用いるように、用語「単離された核酸」とは、細胞成分またはイン・ビトロ反応成分のバルク、および／または１以上の細胞の全ゲノムおよび転写された核酸のバルクから遊離させて単離された、またはそうでなければそれを含まない核酸分子（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）をいう。核酸を単離するための方法（例えば、平衡密度遠心、電気泳動分離、カラムクロマトグラフィー）は当業者に良く知られている。
【０１７９】
Ｅ．蛋白質、ペプチドおよびポリペプチド
本発明は、ＭＤＡ−７ポリペプチドの方法および組成物に向けられる。ある具体例において、ＭＤＡ−ポリペプチドは癌の治療で用いる。ある具体例において、ＭＤＡ−７ポリペプチドは直接的に提供される。用語「蛋白質」および「ポリペプチド」は本明細書中においては相互交換的に用いる。
【０１８０】
本発明のさらなる具体例は、ＭＤＡ−７蛋白質、およびその内因性シグナル配列を欠如するＭＤＡ−７の切形バージョン、または異種シグナル配列を持つＭＤＡ−７ポリペプチドを含む精製された蛋白質組成物の使用を含む。ＭＤＡ−７の切形された分子は、例えば、保護ＭＤＡ−７アミノ酸残基４６ないし４９およびさらにＮ−末端切形で始まる分子を含む。具体的に考えられるのは残基
【０１８１】
【化２】
2008531481.tif 000007
および１８２で開始し、残基２０６で終了する分子である。さらなる具体例において、残基
【０１８２】
【化３】
2008531481.tif 000008
および４８は、配列番号：２に示すように、ＭＤＡ−７の他の連続残基と共に含まれる。
【０１８３】
また、本発明は、以下の：（ａ）ＴＮＦ、（ｂ）ＶＥＧＦ阻害剤、または（ｃ）ＩＬ−１０阻害剤のうちの１以上と組み合わせた、ＭＤＡ−７またはＭＤＡ−７をコードする核酸の方法および組成物に向けられる。本発明のある具体例において、ＴＮＦ、ＶＥＧＦ阻害剤、またはＩＬ−１０阻害剤は蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドである。
【０１８４】
当業者によって理解されるように、修飾または変形を、ＭＤＡ−７ポリペプチドまたはペプチド、ＴＮＦポリペプチドまたはペプチド、ＶＥＧＦ阻害剤ポリペプチドまたはペプチド、またはＩＬ−１０阻害剤の構造で成すことができ、依然として、同様なまたはそうでなければ望ましい特徴を有する分子を生産するであろう。例えば、あるアミノ酸は他のアミノ酸で置き換えることができ、構造との相互作用的結合能力の認識可能な喪失なくしての蛋白質配列における欠失、置換または切形を含む。その蛋白質の生物学的機能活性を規定するのは蛋白質の相互作用的能力および性質であるので、あるアミノ酸配列置換を蛋白質配列（または、勿論、その基礎となるＤＮＡコーディング配列）でなすことができ、それにも拘わらず、同様な腫瘍抑制、アポトーシス−誘導、血管形成またはサイトカイン特性を持つ蛋白質を得ることができる。かくして、本発明によって、それの生物学的利用性または活性の認識可能な喪失なくして、ＭＤＡ−７ポリペプチドまたはペプチド（または基礎となるＤＮＡ）の配列において種々の変化をなすことができると考えられる。ＴＮＦ−アルファの全長アミノ酸および核酸配列は、ここに、各々、配列番号：３および配列番号：４として添付する。ＴＮＦ−ベータの全長アミノ酸および核酸配列は、各々、配列番号：５および配列番号：６として本明細書に添付する。
【０１８５】
ＶＥＧＦ−Ａは交互スプライシングによって単一遺伝子から誘導されたいくつかのイソ形態に存在する。ＶＥＧＦ−Ａのイソ形態１２１の全長アミノ酸配列および核酸配列は、各々、本明細書中においては、配列番号：７および配列番号：８として記載される。ＶＥＧＦ−Ａのイソ形態１６５の全長アミノ酸配列および核酸配列は、各々、本明細書中においては、配列番号：９および配列番号：１０として記載される。ＶＥＧＦ−Ａのイソ形態１８９の全長アミノ酸配列および核酸配列は、各々、配列番号：１１および配列番号：１２として本明細書中では記載される。ＶＥＧＦ−Ａのイソ形態２６０の全長アミノ酸配列および核酸配列は、各々、配列番号：１３および配列番号：１４としてここでは記載される。ＶＥＧＦ−Ｂの全長アミノ酸配列および核酸配列は、各々、配列番号：１５および配列番号：１６としてここでは記載される。ＶＥＧＦ−Ｃの全長アミノ酸配列および核酸配列は、各々、配列番号：１７および配列番号：１８としてここでは記載される。ＶＥＧＦ−Ｄの全長アミノ酸配列および核酸配列は、各々、配列番号：１９および配列番号：２０としてここでは記載される。胎盤成長因子、ＶＥＧＦファミリーのメンバーの全長アミノ酸配列および核酸配列は、各々、配列番号：２１および配列番号：２２としてここでは記載される。
【０１８６】
機能的同等体の用語において、当業者であれば、生物学的に機能的に同等な蛋白質またはペプチドの定義において固有なのは、許容できるレベルの同等な生物学的活性を持つ分子を依然としてもたらす分子の規定された部分内でなすことができる変化の数に対する限定の概念であるのは当業者によってやはりよく理解されることも理解する。生物学的に機能的に同等なペプチドは、かくして、アミノ酸のほとんどまたは全てではないがあるものを置き換えることができるペプチドとここでは定義される。特に、小さなペプチドに関する場合、より少数のアミノ酸を変化させることができる。勿論、異なる置換を持つ複数の区別される蛋白質／ペプチドは本発明に従って容易に作成し、用いることができる。
【０１８７】
ある残基が蛋白質またはペプチドの生物学的または構造的特性に特に重要であることが示された場合、（例えば、酵素の活性部位における、またはＲＮＡポリメラーゼＩＩ結合領域における残基）、そのような残基は一般には交換しなくても良い。
【０１８８】
アミノ酸置換は、一般には、アミノ酸側鎖置換基の相対的類似性、例えば、それらの疎水性、親水性、電荷、サイズ等に基づく。アミノ酸側鎖置換基のサイズ、形状およびタイプの分析は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンは全て正に荷電された残基であり；アラニン、グリシンおよびセリンは全て同様なサイズであり；およびフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは全て一般に同様な形状を有することを明らかにしている。従って、これらの考慮に基づいて、以下のサブセットは生物学的に機能的同等体とここでは定義される：アルギニン、リシン、およびヒスチジン；アラニン、グリシンおよびセリン；およびフェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン。
【０１８９】
より定量的な変化を行うには、アミノ酸のヒドロパシック指標を考慮することができる。各アミノ酸には、それらの疎水性および電荷の特徴に基づいてヒドロパシック指標が割り当てられており、これらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタメート（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパルテート（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）である。
【０１９０】
蛋白質に相互作用的生物学的機能を付与するにおけるヒドロパシックアミノ酸指標の重要性は、一般には、当該分野において理解されている（ここに引用して援用する、Ｋｙｔｅ  ＆  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８２）。ある種のアミノ酸は、同様なヒドロパシック指標またはスコアを有する他のアミノ酸で置換することができ、依然として、同様な生物学的活性を保有するのは知られている。ヒドロパシック指標に基づいて変化を行うには、そのヒドロパシック指標が±２内にあるアミノ酸の置換が好ましく、±１内であるものが特に好ましく、±０．５内にあるいくつか、およびそのようなものはなおより特に好ましい。
【０１９１】
また、アミノ酸の置換は、特に、それにより作成される生物学的機能的同等な蛋白質またはポリペプチドがこの場合に当てはまるように免疫学的具体例で用いることを意図する場合、親水性に基づいて効果的になすことができるのは当該分野で理解されている。ここに引用して援用する米国特許第４，５５４，１０１号は、その隣接するアミノ酸の親水性によって支配される蛋白質の最大局所平均親水性が、その免疫原性および抗原性と、すなわち、蛋白質の生物学的特性と相関すると述べている。
【０１９２】
米国特許第４，５５４，１０１号に詳細に記載されているように、以下の親水性値がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（＋３．０）；アスパルテート（＋３．０±１）；グルタメート（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；チロシン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−０．１）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【０１９３】
同様な親水性の値に基づいて変化をなすにおいて、その親水性値が±２内にあるアミノ酸の置換が好ましく、±１内にあるものが特に好ましく、±０．５内にあるものがなおより特に好ましい。
【０１９４】
議論をアミノ酸変化に生起する機能的に同等なポリペプチドに焦点を当ててきたが、これらの変化は、遺伝子暗号が縮重しており、また２以上のコドンが同一アミノ酸をコードできることも考慮して、コーディングＤＮＡの改変によって行うことができるのが認識されよう。
【０１９５】
１．イン・ビトロ蛋白質の生産
実施例に掲げる精製方法に加えて、イン・ビトロ蛋白質生産のための一般的手法を議論する。本発明のいくつかの具体例に従うウィルスベクターでの形質導入に従い、一次哺乳動物細胞培養を種々の方法で調製することができる。発現構築体とイン・ビトロおよび発現構築体との接触を行いつつ、細胞を生きて維持させるためには、細胞が正しい比率の酸素および二酸化炭素ならびに栄養素との接触を維持するが、微生物汚染から保護されることを確保するのが必要である。細胞培養技術はよく記載されており、ここに引用して開示する（Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９９２）。
【０１９６】
前記の１つの具体例は、蛋白質の生産および提示ために細胞を不滅化するための遺伝子導入の使用を含む。注目する蛋白質についての遺伝子を前記したように適当な宿主細胞に導入し、続いて、適当な条件下で細胞を培養する。実質的にいずれのポリペプチドについての遺伝子もこのようにして使用することができる。組換え発現ベクター、およびその中に含まれるエレメントの作成は先に議論した。別法として、生産すべき蛋白質は、問題とする細胞によって通常に合成される内因性蛋白質であってよい。
【０１９７】
本発明のもう１つの具体例はオートロガスＢリンパ球細胞系を用い、これは、免疫遺伝子産物、より具体的には免疫原性活性を有する蛋白質を発現するウィルスベクターでトランスフェクトされる。哺乳動物宿主細胞系の他の例はＶｅｒｏおよびＨｅＬａ細胞、ＣＥＭのような他のＢ−およびＴ−細胞系、７２１．２２１、Ｈ９、Ｊｕｒｋａｔ、Ｒａｊｉ等、ならびにチャイニーズハムスター卵巣、Ｗ１３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、２９３、ＨｅｐＧ２、３Ｔ３、ＲＩＮおよびＭＤＣＫ細胞のような細胞系を含む。加えて、挿入された配列の発現を変調し、または望まれる方法で遺伝子産物を修飾し、プロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。蛋白質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）蛋白質の機能で重要であろう。異なる宿主細胞は蛋白質の翻訳後プロセッシングおよび修飾についての特徴および具体的メカニズムを有する。適当な細胞系または宿主系は、発現される外来性蛋白質の正しい修飾およびプロセッシングを確実とするように選択することができる。
【０１９８】
限定されるものではないが、各々、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒｔ−細胞における、ＨＳＶチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン―グアニンホスホービボシルトランスフェラーゼおよびアデニンホスホーリボシルトランスフェラーゼ遺伝子を含めた多数の選択系を用いることができる。また、抗―代謝産物抵抗性を選択の基礎として用いることができきる：抵抗性を付与するｄｈｆｒ；ミコフェノール酸に対して抵抗性を付与するｇｐｔ−アミノグリコシドＧ４１８に対して抵抗性を付与するｎｅｏ―ヒグロマイシンに対する抵抗性を付与するｈｙｇｒｏ。
【０１９９】
動物細胞を２つの態様において：培養のバルク全体で懸濁液中で成長する非―足場―依存性細胞として、またはそれらの増殖用の固体基質への付着を必要とする足場―依存性細胞として（すなわち、細胞増殖の単相タイプ）イン・ビトロ増殖させることができる。
【０２００】
連続的樹立された細胞系からの非―足場依存性または懸濁液培養が、細胞および細胞産物の大規模生産の最も広く用いられる手段である。しかしながら、懸濁培養細胞は腫瘍形成能力、および接着性細胞よりも低い蛋白質成産を有する。
【０２０１】
２．ＥＲ−標的化配列
本発明のポリペプチドは１以上の小胞体標的化配列を含む。細胞内の蛋白質の最終的な位置は、蛋白質の配列内にコードされる標的化配列に依存する。最も単純な場合には、シグナルの欠如は、蛋白質を、細胞質である欠陥経路へ向ける。ＥＲ中に保持される運命にある蛋白質は、ＥＲ中に蛋白質を保持するためのある種のシグナルペプチドを有しなければならない。本発明のポリペプチドは、Ｎ−末端またはＣ−末端においてさらなるアミノ酸残基を含んでも含まなくてもよい。
【０２０２】
ＥＲは、細胞質を通じて核膜から延びる膜に包まれた微小管および嚢（槽）のネットワークである。蛋白質の分泌経路は以下の通りである：粗いＥＲ→ゴルジ→分泌小胞→細胞外部。
【０２０３】
蛋白質が分泌されるためには、蛋白質は、一般には、ＥＲからゴルジへ移動しなければならない。ＢｉＰ、シグナルペプチダーゼ、プロテインジスルフィドイソメラーゼのような、ＥＲ内に維持されなければならないある種の蛋白質がある。特異的な局所化シグナルは蛋白質をＥＲに標的化する。
【０２０４】
ある種の蛋白質は、それらのカルボキシ末端におけるＥＲ標的化配列Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ（一文字暗号ではＫＤＥＬ）の存在の結果としてＥＲルーメンに保持される。もしこの配列が該蛋白質の一部でなければ、該蛋白質は、その代わり、ゴルジに輸送され、細胞から分泌される。カルボキシ末端におけるＫＤＥＬ配列またはＫＫＸＸ配列（ＫＫＸＸ配列）の存在の結果、ＥＲに蛋白質が滞留する。これらの配列の存在の結果、これらの区画の膜中の特異的リサイクリング受容体へ蛋白質が結合し、次いで、ＥＲへ選択的に逆輸送される。
【０２０５】
ＥＲからの蛋白質の輸出は、バルク流によるのみならず、蛋白質のゴルジ装置への選択的輸送を媒介する標的化シグナルを特異的に認識する調節された経路によって起こる。１６−ないし３０−残基ＥＲシグナル配列の存在はリボソームをＥＲ膜に向け、ＥＲ膜を横切っての蛋白質の輸送を開始する。
【０２０６】
ＥＲシグナル配列は、通常、蛋白質のＮ−端に位置する。これらの標的化配列は、頻繁には、１以上の正に荷電したアミノ酸、続いての、６ないし１２の疎水性残基の連続的ストレッチを含有する。腫愚なる配列は、通常、それが依然としてリボソーム上で成長しつつある間に蛋白質から切断される。シグナル配列からの疎水性アミノ酸のいくつかの特異的欠失、またはそれらの１つの荷電したアミノ酸への突然変異の結果、蛋白質がＥＲ膜をルーメンへと通過するのを失敗する。ランダムなＮ−末端アミノ酸配列の付加は、再度ゾル蛋白質がＥＲルーメンに移動するのを引き起こし、これは、疎水性残基がＥＲ標的化に対して臨界的な結合部位を形成することを示す。
【０２０７】
小胞体標的化配列は、いずれかの数のアミノ酸残基を、これらのアミノ酸残基がポリペプチドの小胞体への運命を標的化する限りは含むことができる。本発明のポリペプチドは単一のＥＲ標的化配列、または１を超えるＥＲ標的化配列を含むことができる。ＥＲ標的化シグナルに関するさらなる情報は、ここに引用してその全体を援用する、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／  ｐｓｈｏｏｔｅｒ＿ｐｅｆ＿ｍａｎ．ｐｄｆにおけるインターネットでのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号Ｖ８９０−２０、Ｖ８９１−２０、Ｖ８９２−２０およびＶ８９３−２０、「ｐＳｈｏｏｔｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｍａｎｕａｌ  Ｉ（ｐＥＦ／ｍｙｃ  ｖｅｃｔｏｒｓ）」に見出すことができる。シグナル配列の認識およびＥＲに対して標的化される蛋白質のレビューは、やはり、具体的にここに引用して援用する、ＷａｌｔｅｒおよびＪｏｈｎｓｏｎ、１９９４；  Ｋｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３；およびＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．、１９８７、に見出すことができる。
【０２０８】
３．ＭＤＡ−７精製の方法
本発明は、本発明のいくつかの具体例において、精製されたＭＤＡ−７を使用する。当業者に知られた以下の方法および同様な方法を用いて、本明細書中に開示されたＭＤＡ−７の精製の方法を実行することができる。そのような方法はここに引用して援用する１０／７９１、６９２に開示されている。この開示の一部を以下に掲げる（図面なし）。
【０２０９】
Ｆ．抗体の生産
１．ＭＤＡ−７に結合する抗体
組換えｈｉｓ−タグドＭＤＡ−７蛋白質はＥ．ｃｏｌｉにおいて生産され、ニッケルＮＴＡアガロースカラムで精製した。該物質は４５分間でバッチモードでカラム樹脂に結合し、次いで、カラムに注ぎ、溶出物をカラムベッドを通して流した。該物質を、０．５％ｃｈａｐｓを含有する１０ｍＭトリスｐＨ８．０で洗浄し、最後に、１０ｍＭトリスｐＨ８．０＋４００ｍＭイミダゾールでカラムから溶出させた。溶出したＭＤＡ−７を１０ｍＭトリスｐＨ８．０に対して透析した。最後の産物はほぼ２３ｋＤａの分子量を持つ単一のバンドであることが示された。アミノ末端蛋白質配列は正しいことが示され、純度は９０％よりも大であると見積もられた。
【０２１０】
この物質を以下のプロトコルを用いてウサギに注射した：ＩＦＡおよび１００ｍｇのＭＤＰと共に４００ｍｇのＭＤＡ−７蛋白質を皮下注射し、３週間後に、ＩＦＡと共に２００μｇのＭＤＡ−７蛋白質を注射し、その３週間後に、さらに１００ｍｇのＭＤＡ−７蛋白質を静脈内注射した。抗血清の力価は、ＥＬＩＳＡアッセイに基づいて１／１００、０００よりも大であることが示された。必要であれば、動物にブースター注射を行った。
【０２１１】
ＭＤＡ−７蛋白質をスルフヒドリル結合を介して固体支持体樹脂に結合させた。樹脂および結合した蛋白質を徹底的に洗浄した。この洗浄された物質を用いて、抗体精製のためのＭＤＡ−７カラムを作成した。ウサギポリクローナル血清を２０ｍＭのトリス緩衝液ｐＨ８．０で１：１希釈し、０．２−ミクロンのフィルターを通して濾過し、その後、ＭＤＡ−７カラムへポンプで送った。次いで、吸光度がベースラインに戻るまで、カラムを同一の２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．０で洗浄した。抗体を０．１Ｍ酢酸でカラムから溶出させた。抗体を含有する溶出物を直ちにｐＨ８．０へ逆調整した。次いで、このアフィニティー−精製抗体を、１０ｍＭトリスｐＨ８．０に対して透析し、濃縮した。
【０２１２】
２．ＩＬ−１０およびＶＥＧＦに結合する抗体
本発明のいくつかの具体例はＩＬ−１０の阻害剤と組み合わせたＭＤＡ−７を含む方法および組成物に関し、ここに、該阻害剤は抗体である。また、本発明は、ＶＥＧＦ−阻害剤と組み合わせたＭＤＡ−７を含む方法および組成物に関し、ここに、ＶＥＧＦ阻害剤はＶＥＦに結合する抗体である。
【０２１３】
ＩＬ−１０のような免疫モジュレーターに結合する抗体に関する情報は米国特許第６、１６８、７９１号に見出すことができ、ここにそれを具体的に引用して援用する。米国特許第６、１６８、７９１号は、ＩＬ−１０またはＩＬ−１０のアゴニストのような免疫モジュレーターに結合する抗体の生産のための抗体および方法を教示する。ＩＬ−１０抗体生産に関するさらなる情報は、その各々をここに具体的に引用して援用する、米国特許第６、４０７、２１８号および米国特許出願２００５０１０１７７０に見出すことができる。さらに、ＭＤＡ−７精製のための抗体に関する以下の議論はＶＥＧＦまたはＩＬ−１０−特異的抗体の関係で実施することができる。
【０２１４】
ＩＬ−１０抗体配列の例は、ＣＤＲ１（配列番号：２３）、ＣＤＲ２における配列番号：２４、およびＣＤＲ３における配列番号：２５よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む少なくとも１つの抗体軽鎖可変領域、またはその結合断片；およびフレームワーク領域、ここに、フレームワーク領域のアミノ酸配列はヒト免疫グロブリンアミノ酸配列の全てまたは実質的に全てであり；および相補性決定領域１（ＣＤＲ１）における配列番号：２６、ＣＤＲ２における配列番号：２７、およびＣＤＲ３における配列番号：２８よりなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む少なくとも１つの抗体重鎖可変領域、またはその結合断片：およびフレームワーク領域、ここに、フレームワーク領域のアミノ酸配列はヒト免疫グロブリンアミノ酸配列の全てまたは実質的に全てである；を含めた、ＩＬ−１０に結合する抗体分子、またはその結合断片を含む。抗体は、さらに、重鎖定常領域を含むことができ、ここに、重鎖定常領域はガンマ−１、ガンマ−２、ガンマ−３またはガンマ−４ヒト重差定常領域またはその変種を含む。抗体は、さらに、軽鎖定常領域を含むことができ、ここに、軽鎖定常領域はラムダまたはカッパヒト軽鎖定常領域を含む。
【０２１５】
抗−ヒト−ＩＬ−１０抗体に関するさらなる情報は、ここに引用して援用する、ｓｉｇｍａａｌｄｒｉｃｈ．ｃｏｍ／ｓｉｇｍａ／ｄａｔａｓｈｅｅｔ／ｉ５０２０ｄａｔ．ｐｄｆにおける世界的ウェブに見出すことができる。
【０２１６】
本明細書中で用いるように、用語「抗体」とは、抗体のいずれかの形態、または所望の生物学的活性を呈するその断片をいう。かくして、それは最も広い意味で用いられ、具体的には、（全長モノクローナル抗体を含めた）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）、および抗体断片を、それらが所望生物学的活性を呈する限りはカバーする。
【０２１７】
ＩＬ−１０に結合する抗体の定義内には、ＩＬ−１０抗体結合断片が含まれる。本明細書中で用いるように、用語「ＩＬ−１０結合断片」または「その結合断片」は、依然として、ＩＬ−１０活性を阻害するその生物学的活性を実質的に保有する抗体の断片または誘導体を含む。従って、用語「抗体断片」またはＩＬ−１０結合断片とは、全長断片の一部、一般的には、抗原結合またはその可変領域をいう。抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイヤボディー；線状抗体；単一鎖抗体分子、例えば、ｓｃ−Ｆｖ；および抗体断片から形成された多特異的抗体を含む。典型的には、結合断片または誘導体はそのＩＬ−１０阻害活性の少なくとも５０％を保有する。好ましくは、結合断片または誘導体はそのＩＬ−１０阻害活性の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９９％、または１００％を保有する。また、ＩＬ−１０結合断片は、そのバイオロジック活性を実質的に改変しない保存的アミノ酸置換を含むことができることも意図する。
【０２１８】
本明細書中で用いるように、用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、微量に存在できる可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原性エピトープに対して向けられる。対照的に、慣用的な（ポリクローナル）超生物は、典型的には、異なるエピトープに対して向けられた（またはそれに対して特異的な）抗体の多数を含む。修飾語「モノクローナル」は、抗体の実質的に均質な集団から得られた抗体の特性を示し、いずれかの特定の方法による抗体の生産を要求するものと解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って用いるべきモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作成することができ、あるいは組換えＤＮＡ方法によって作成することができる（例えば、米国特許第４、８１６、５６７号参照）。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ｍｏｎ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【０２１９】
本明細書中で用いるように、用語「ヒト化抗体」とは、非−ヒト（例えば、ネズミ）抗体ならびにヒト抗体からの配列を含有する抗体の形態をいう。そのような抗体は、非−ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。一般に、ヒト化抗体は少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここに、超可変ループの全てまたは実質的に全ては非−ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てはヒト免疫グロブリンの配列のそれである。ヒト化抗体は、所望により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれも含むであろう。
【０２２０】
モノクローナル抗体を作成するためのいずれの適当な用法も用いることができる。例えば、受容者をＩＬ−１０またはその断片で免疫化することができる。免疫化のいずれの適当な方法も用いることができる。そのような方法はアジュバント、他の免疫刺激体、反復されたブースター免疫化、および１以上の免疫化経路の使用を含むことができる。
【０２２１】
ＩＬ−１０またはＶＥＧＦのいずれの適当な源も、本明細書中に開示された組成物および方法の非−ヒト抗体の作成のための免疫原として用いることができる。そのような形態は、限定されるものではないが、当該分野で公知の組換え、合成、化学または酵素分解手段を通じて作成された、全蛋白質、ペプチド、およびエピトープを含む。
【０２２２】
抗原のいずれの形態を用いて、生物学的に活性な抗体を作成するのに十分な抗体を作成することもできる。かくして、誘導抗原は、単独、あるいは当該分野で公知の１以上の免疫原性増強剤と組み合わせた、単一エピトープ、多数エピトープ、または全蛋白質であってよい。誘導抗原は単離された全長蛋白質、（例えば、抗原の少なくとも一部でトランスフェクトされた細胞で免疫化する）細胞表面蛋白質、（例えば、蛋白質の細胞外ドメイン部分のみで免疫化する）可溶性蛋白質であってよい。抗原は、遺伝子的に修飾された細胞において生産することができる。抗原をコードするＤＮＡはゲノムまたは非−ゲノム（例えば、ｃＤＮＡ）であってよく、細胞外ドメインの少なくとも一部をコードする。本明細書中で用いるように、用語「部分」とは、適切には、注目する抗原の免疫原性エピトープを構成するための最小数のアミノ酸または核酸をいう。注目する細胞の形質転換に適したいずれの遺伝子ベクターも使用することができ、限定されるものではないが、カチオン性脂質のような、アデノウィルスベクター、プラスミド、および非−ウィルスベクターを含む。
【０２２３】
Ｄ．ポリクローナル抗体を用いる分泌されたＭＤＡ−７の精製および特徴付け
１．アフィニティーカラム生産
ウサギ血清からのヒトＭＤＡ−７に対する異なるポリクローナル抗体をまず精製した。凍結されたウサギ血清試料を解凍し、滅菌１×  ＰＢＳ緩衝液で１：１希釈した。希釈された試料を、２ｍｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ）に対して温和に揺すりつつ、浴方法にて個々に４℃にて１晩暴露した。４つの異なるカラムを作成した。樹脂を１０カラム容量の２０ｍＭ二塩基性リン酸ナトリウム（６１ｍｌ）で洗浄して、ｐＨを７．０とする。カラムを３アリコットにて３カラム容量の０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（ｐＨ３．０）で溶出させ、０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳで中和した。Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、溶出された抗体を定量した。次いで、抗体を、１０、０００ＭＷＣＯ透析カセット中で１晩透析することによって、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ８．３）に交換した。
【０２２４】
乾燥されたＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを活性化するために１グラムを１ｍＭ冷ＨＣｌを含む１０ないし１５カラム容量で洗浄した。５ｍｌの系列容量を用いて、源の除去を確実とした。次いで、活性化されたＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを、１カラム容量の系列的洗浄によって１０カラム容量で洗浄して、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３に交換した。各場合においてほぼ８０ないし９０ミリグラムの抗体を精製および緩衝液交換の後に回収した。次いで、５ｍｌの膨潤した活性化ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを０．１ＭＣＯ３、ｐＨ８．３中の８０ないし９０ミリグラムの精製された抗体と共に、温和に回転しつつ、室温にて４時間インキュベートした。
【０２２５】
抗体結合効率をＢｒａｄｆｏｒｄ蛋白質アッセイによって測定し、各場合において、活性化されたＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合した抗体の９５％よりも大であった。結合の後に、０．１Ｍトリス、ｐＨ８．０中の２５ないし３０カラム容量によって、非−反応基をブロックした。次いで、カラムを、０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０、０．５ｍ  ＮａＣｌと交互に、０．１Ｍトリス、ｐＨ８．０、０．５ｍ  ＮａＣｌの系列的洗浄、５×カラム容量で５回洗浄した。蛋白質刺激は洗浄で行い、蛋白質は検出されなかった。
【０２２６】
２．アフィニティークロマトグラフィー精製
可溶性グリコシル化ＭＤＡ−７を分泌する安定にトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞が得られ、１：１００Ｌ−グルタミン、１：１００ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよび１：１００  ＨＥＰＥＳを含む５％胎児子ウシ血清を含有するＲＰＭＩ中で高い密集にて維持した。細胞を２ないし３日毎に分裂させ、１：１０００希釈ヒグロマイシン（２０ｍｇ／ｍｌストック）中の維持の７日毎に改変した。次いで、４００ｍｌの上清を２ないし３日毎に収穫し、１０，０００分子量カットオフ膜にてＡＭＩＣＯＮ攪拌細胞と共に濃縮した。５０ｍｌの濃縮された上清をバッチ方法にて、温和に揺れさせつつ、５ｍｌのベッド容量抗体−ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アフィニティー樹脂）へ４℃にて２日間暴露した。次いで、アフィニティー樹脂をＰｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ２６カラム中に入れ、上清を３回通して、抗体に対する抗原の最大結合を確実とした。アフィニティー樹脂を、重力流動によって、５×２０ｍｌの０．１ＭトリスｐＨ８．０で洗浄した。ＭＤＡ−７を３×５ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させ、０．５ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で直ちに中和した。溶出および中和後直ちに、２ｍｇのヒトアルブミンを加えて、蛋白質送出に対して保護した。次いで、溶出された蛋白質を１０，０００分子量カットオフスピンカラム（ＡＭＩＣＯＮ）で濃縮し、滅菌１×  ＰＢＳに交換した。次いで、１ないし１．５ｍｌの１×  ＰＢＳ交換アフィニティー精製蛋白質を２００ミリリットルの３×洗浄されたプロテイン−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＳＩＧＭＡ）に回転しつつ室温で２時間、あるいは回転しつつ４℃にて１晩暴露した。プロテインＡ暴露は、溶出画分に浸出する抗体を吸収する。
【０２２７】
その生産を本明細書中に記載する４つの異なるポリクローナル抗体をアフィニティー精製でテストした。サイズ分解精製（サイズ排除参照）を使用して、アフィニティー精製に先立って上清からかなりの汚染蛋白質を除去し、その最も豊富なのはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）であった。しかしながら、このようにして単離されたＭＤＡ−７の暴露は、カラム上の抗体がＭＤＡ−７を保持するのを可能としなかった。これは、おそらくは、ＢＳＡの不存在下でＭＤＡ−７を保持することができたＢＳＡブロッキング非−特異的結合部位のためであった。ＭＤＡ−７は高度にグリコシル化された蛋白質であり、それは、プラスチックおよび他の表面に非常に固着できると考えられる。
【０２２８】
ＭＤＡ−７含有上清からのＢＳＡの除去は、アフィニティークロマトグラフィーによるＭＤＡ−７の精製を阻害する。ほとんどの蛋白質は、フロースルーに存在した。溶出するまでＭＤＡ−７蛋白質はアフィニティーカラムに保持されない。有意な量のＢＳＡ（銀染色によると２ないし３ｍｇ／ｍｌ）を含有するアフィニティー精製は、精製よりも長い間生物学的機能を保持し、ここに、ＢＳＡ汚染は有意に低かった。ＢＳＡの存在下におけるアフィニティー精製は、高モルのＮａＣｌおよび低ｐＨでの溶出まで、アフィニティーカラムでのＭＤＡ−７の滞留を可能とする。ポリクローナルアフィニティー樹脂によるアフィニティー精製の結果、比較的同様な量のＭＤＡ−７を含む多数のロッドがもたらされた。クーマシー分析は、比較的少量の汚染蛋白質を示した。約２０％よりも大の均一性ＭＤＡ−７の精製が観察された。
【０２２９】
アフィニティー精製は反復可能であり、１２％ポリアクリルアミドゲルのクーマシー染色分析によるとＭＤＡ−７を相対的純度まで豊富化した。ウェスタンブロッド上で検出されるバンドの強度によって、より多くのＭＤＡ−７は、抗原のアフィニティー樹脂へのより長い暴露で保持された。透析カセットおよびスピンカラムを比較すると、１×  ＰＢＳへの交換の方法の間にほとんど差はなかった。
【０２３０】
３．アニオン交換精製
２ないし３ロッドのアフィニティー精製ＭＤＡ−７をプールし、１０，０００  ＭＷＣＯ透析カセット中の５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．０に室温にて２ないし１２時間で交換した。次いで、蛋白質を、１ｍｌ／分の流速の５ｍｌベッド容量アニオン交換カラムに負荷した。１０ｍｌのフロースルーが得られ、結合した蛋白質を、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．０中での１Ｍ  ＮａＣｌの段階グラジエントで溶出した。溶出プログラムは、２ｍｌ／分の流速にて、５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ５．０の１０ｍｌ洗浄で開始した。最初の段階溶出は５分における０Ｍないし０．２５Ｍ  ＮａＣｌであり、５０ｍＭ  ＭＥＳ、０．２５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．０における５分の洗浄を伴った。第２のグラジエント段階は５分での０．２５Ｍ  ＮａＣｌないし０．５Ｍ  ＮａＣｌ、続いての、５分の洗浄であった。最終溶出は０．５Ｍ  ＮａＣｌないし１Ｍ  ＮａＣｌであった。０．９ないし１．０Ｍ  ＮａＣｌでの溶出までＭＤＡ−７はカラムに保持され；ＭＤＡ−７は約９０％ないし９５％均一性まで精製された。
【０２３１】
１８ＫＤａの未グリコシル化蛋白質は、ｐＨ５．０においてアニオン交換カラムに結合しなかった。ＭＤＡ−７のポスト−アフィニティーアニオン交換からの画分の銀染色分析は、ＭＤＡ−７の未グリコシル化形態は供−精製グリコシル化蛋白質を伴わなかった。天然ＭＤＡ−７複合体は、分子量３１、２８および２７／２６の少なくとも３つの蛋白質を含有するように見える。以前は、１工程アニオン交換精製を利用してＭＤＡ−７を精製する試みがなされ、そこでは、ＭＤＡ−７を含有する上清が５０ｍＭ  ＭＥＳ、ｐＨ６．０に交換された。１工程アニオン交換精製は、アニオン交換カラムからの各ピークがウェスタンブロット上のポリクローナル抗−ＭＤＡ−７によって検出されたＭＤＡ−７を含有することを示した。この方法による精製は、ＭＤＡ−７が使用したＮａＣｌの全てのモル濃度においてカラムから分離されるにつれて、この方法による精製はいずれかの範囲のイオン強度においてＭＤＡ−７を有意に豊富化しなかった。
【０２３２】
４．サイズ排除クロマトグラフィー
ＸＫ２６  １メートルのカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注がれたＳ２００  Ｓｅｐｈａｄｅｘ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を利用して、２００ｍｌベッド容量のサイズ排除クロマトグラフィーカラムを作成した。該カラムは重力により沈降させ、次いで、ＢｉｏＲａｄ  ＢｉｏＬｏｇｉｃ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎで３．５ｍｌ／分でパッキングした。
【０２３３】
２９３ｔ細胞によって分泌されたＭＤＡ−７の見掛けの分子量を測定するために、蛋白質分子量標準（マウスＩｇＧ  ５ｍｇ、アルカリ性ホスファターゼ  ３ｍｇ、ＢＳＡ  １０ｍｇ、およびヒトベータ２ミクログロブリン  ３ｍｇ）を組み合わせて、相対的保持時間を測定した。分子量に対する精製された蛋白質の溶出時間をプロットし、０．９７のＲ２値を導いた。２００ｍｌの、ＭＤＡ−７を含有する２９３ｔ上清をＡＭＩＣＯＮ攪拌細胞中の１０，０００  ＭＷＣＯフィルターで１０ｍｌまで濃縮し、サイズ分解カラムに１×  ＰＢＳ中で２ｍｌ／分で負荷した。画分を５ｍｌ毎に採取した。相対的保持時間を順次の試料のウェスタンブロット分析によって決定し、公知の標準から誘導された系と比較した。８０ないし１００ｋＤａの見掛けの分子量が関連するＭＤＡ−７に割当られた。存在する合計ＭＤＡ−７の０．１％未満はナノメートル３１ｋＤａ形態であることが判明した。図１５は、分子量に対する保持時間の比較を示す。ＭＤＡ−７複合体は約８５ないし９５ｋＤａの分子量の間で溶出した。
【０２３４】
５．サイズ、アニオン、およびレクチン精製
コンカナバリンＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムでのレクチン精製を、ＭＤＡ−７を精製する試みで使用した。しかしながら、相対的純度の正味の増加は達成されなかった。サイズ排除、アニオン、およびレクチン精製方法を全ての組合せで利用して、ＭＤＡ−７について豊富化したコンビナトーリアル精製。しかしながら、これらの方法の組合せは、アフィニティークロマトグラフィー、続いてのアニオンクロマトグラフィーよりも大きなＭＤＡ−７の精製を提供した。これらの結果は、アフィニティーおよびアニオン交換クロマトグラフィーによってＭＤＡ−７を少なくとも９０ないし９５％均一性まで精製することができることを示す。
【０２３５】
Ｈ．モノクローナル抗体を用いる分泌されたＭＤＡ−７の精製および特徴付け
１．抗体の生産
７Ｇ１１Ｆ．２（モノクローナル抗体）と命名されたハイブリドーマークローンは、Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａで処理されている安定にトランスフェクトされた２９３ｔ細胞の細胞内ＦＡＣＳ分析によってＩＬ−２４／ｍｄａ−７陽性細胞を検出するにおいて最も効果的であった抗体を生産すると判断された。これらの予備的なデータに基づき、このクローンを利用して、５リットルの上清を生産した。簡単に述べると、細胞（７Ｇ１１Ｆ．２）を、１：１００  Ｌ−グルタミン、１：１００ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよび１：１００  ＨＥＰＥＳを含む１０％胎児子ウシ血清を含有する補足された５０ｍｌのＤＭＥＭ中の１ｘ１０６細胞／ｍｌで蒔いた。細胞を蒔き、１０日間成長させ、次いで、上清を収穫させた。
【０２３６】
２．抗体の精製
２０００ｒｐｍにおける１０分間の遠心によって上清を細胞から清澄化し、デカントした。次いで、清澄化された上清を０．２２ミクロンセルロースアセテートフィルターで滅菌濾過し、窒素下でＹＭＣＯ  ３０ｋＤａ膜にわたってＡｍｉｃｏｎ攪拌細胞で５０ｍｌまで濃縮した。濃縮された上清を、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）に架橋されたｒプロテインＧに４℃にてｏ／ｍ暴露した。抗体を１Ｍ  ＮａＣｌ  ｐＨ３．０、３アリコットでの３カラム容量で抗体を溶出させ、０．５Ｍ  ＨＥＰＥＳで中和した。汚染ウシＩｇＧを除去するために、得られた溶出物を、透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ／Ｅｎｄｏｇｅｎ、ＹＭＣＯ  ３０  ｋＤａ）を介して、０．４Ｍ  ＮａＣｌ（合計）を含有する１×  ＰＢＳに交換した。蛋白質をＳｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）に架橋されたｒプロテインＡに４℃にてｏ／ｎ暴露した。プロテインＡはマウスＩｇＧ１ａよりも高い親和性にてウシＩｇＧに結合するので、カラムからのフロースルーを採取した。相対的純度をＳＤＳ  ＰＡＧＥでの分析によって測定し、９０％純度であり（７Ｇ１１Ｆ．２）、汚染蛋白質は全部でウシＩｇＧを含んだ。Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を用いて、溶出された抗体を定量した。次いで、１０，０００ＭＷＣＯ透析カセット中で一晩透析することによって、抗体を、０．５Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３に交換した。
【０２３７】
３．アフィニティーカラム作成
乾燥したＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを活性化するために、１グラムを１０ないし１５カラム容量の１ｍＭ冷ＨＣｌで洗浄した。５ｍｌの系列的容量を用いて、スクロースの除去を確実とした。次いで、活性化されたＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを１カラム容量の系列的洗浄による１０カラム容量で洗浄して、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３に交換した。２５ｍｇの抗体（７Ｇ１１Ｆ．２）を精製および緩衝液交換の後に回収した。２ｍｌの膨潤した活性化ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅを０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ８．３中の精製された抗体と共に、温和に回転させつつ、室温にて４時間インキュベートした。
【０２３８】
抗体結合効率は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ蛋白質アッセイによって測定し；９５％を超える抗体が活性化されたＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅに結合した。
【０２３９】
結合の後、０．１ＭトリスｐＨ８．０中の２５ないし３０カラム容量で洗浄することによって非−反応基をブロックした。最後に、カラムを、０．１Ｍ酢酸緩衝液、ｐＨ４．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌと交互に、０．１ＭトリスｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、５×カラム容量の系列的洗浄で５回洗浄した。蛋白質見積もりは洗浄で行い、蛋白質は検出されなかった。
【０２４０】
４．アフィニティー精製
可溶性グリコシル化ＩＬ−２４を分泌する安定にトランスフェクトされた２９３ｔ細胞はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．から得られ、１：１００  Ｌ−グルタミン、１：１００  ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐおよび１：１００  ＨＥＰＥＳを含む５％胎児コウシ血清を含有するＲＰＭＩ中で高い密集度で維持した。細胞を２ないし３日毎に分裂させ、１：１０００希釈ヒグロマイシン（２０ｍｇ／ｍｌストック）中での維持の７日毎に改変した。４０ｍｌの上清を２ないし３日毎に収穫し、１０，０００分子量カットオフ膜にわたってＡｍｉｃｏｎ攪拌細胞で濃縮した。５０ｍｌの濃縮された上清を、バッチ方法にて、５ｍｌベッド容量の抗体−ＣＮＢｒ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（アフィニティー樹脂）に、温和に揺り動かしつつ、４℃にて２日間暴露した。アフィニティー樹脂をＰｈａｒｍａｃｉａ  ＸＫ２６カラム中に入れ、上清を３回通して、抗体に対する抗原の最大結合を確実とした。アフィニティー樹脂を重力流動によって５×２０ｍｌの０．１ＭトリスｐＨ８．０で洗浄した。ＩＬ−２４を３×５ｍｌの１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１Ｍグリシン、ｐＨ３．０で溶出させ、０．５ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液で中和した。溶出および中和後直ちに、２ｍｇのヒトアルブミンを加えて、蛋白質の喪失に対して保護した。次いで、溶出された蛋白質を１０，０００分子量カットオフスピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ）で濃縮し、滅菌１Ｘ  ＰＢＳに交換した。１ないし１．５ｍｌの１×  ＰＢＳ交換アフィニティー精製蛋白質を２００マイクロリットルの３×洗浄ｒプロテイン−Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ）に、回転しつつ、室温にて２時間、あるいは回転しつつ４℃にて一晩暴露した。プロテインＡ暴露は、溶出に浸出した抗体を吸収し、その除去はＩＬ−２４機能を維持するのに臨界的である。
【０２４１】
該７Ｇ１１Ｆ．２モノクローナル抗体カラムは、先のセクションにおけるポリクローナルカラムとして同様な量のＩＬ−２４／ｍｄａ―７を保持した。
【０２４２】
以下の一般的技術もまたよく知られており、それを用いて、精製方法を実行した。
【０２４３】
ａ．ゲル電気泳動
ゲル電気泳動は、精製手法で用いることができるよく知られた技術である。標準的な方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）を用いるアガロース、アガロース−アクリルアミドまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動は精製プロセスで利用することができる。
【０２４４】
ｂ．クロマトグラフィー技術
別法として、クロマトグラフィー技術を使用して、ＭＤＡ−７の単離および精製を行うことができる。本発明で用いることができる多くの種類のクロマトグラフィーがある：吸着、アフィニティー、分配、イオン−交換およびモレキュラーシーブ、およびカラム、ペーパー、薄層およびガスクロマトグラフィーを含めたそれらを用いるための多くの特殊化された技術（Ｆｒｅｉｆｅｌｄｅｒ、１９８２）。
【０２４５】
ｃ．免疫学的試薬
特許請求した発明のある態様は免疫学的試薬の使用を含む。特許請求した発明のある具体例において、免疫学的試薬はＭＤＡ−７の調製物の精製で用いる。精製方法で用いるための抗体が考えられる。そのような抗体は容易に作成し、および／または容易に入手可能である。
【０２４６】
本明細書中で用いるように、用語「抗体」は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥのような免疫学的結合剤を広くいうことを意図する。一般には、ＩｇＧおよび／またはＩｇＭが好ましい。というのは、それらは生理学的状況において最も普通の抗体であるからであり、かつなぜならばそれらは実験室設定において最も容易に成されるからである。
【０２４７】
用語「抗体」を用いて、抗原結合領域を有するいずれの抗体−様分子をいい、これは、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、単一ドメイン抗体（ＤＡＢ）、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、（単一鎖Ｆｖ）等のような抗体断片を含む。種々の抗体−べースの構築体および断片を調製し、用いる技術は当該分野で良く知られている。抗体を調製し、特徴づけるための手段もまた当該分野で良く知られている（例えば、ここに引用して援用する、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８参照）。
【０２４８】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、ある種の利点、例えば、再現性および大規模生産を有することが認められており、それらの使用は一般的に好ましい。本発明は、かくして、ヒト、ネズミ、サル、ラット、ハムスター、ウサギおよびニワトリ起源さえのモノクローナル抗体を提供する。試薬の調製の容易性および容易な入手可能性のため、ネズミモノクローナル抗体がしばしば好ましいであろう。
【０２４９】
しかしながら、ヒト定常および／または可変領域ドメインを担持するマウス、ラット、または他の種からのキメラ抗体、二特異的抗体、組換えおよび作成抗体およびその断片がそうであるように、「ヒト化」抗体もまた考えられる。患者の葉の病気に「慣用的に仕立てられた」抗体の開発のための方法は同様に知られており、そのように慣用的に仕立てられた抗体も考えられる。
【０２５０】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）を作成するための方法は、当業者によく知られている。
【０２５１】
ｉ．ＮＳＡＩＤおよびＣＯＸ−２阻害剤
ＮＳＡＩＤはステロイドでない抗−炎症剤である。抗−炎症作用に加えて、それらは鎮痛、解熱、および血小板−阻害作用を有する。それらは、主として、慢性関節疾患、および疼痛および炎症を伴うある種の柔軟組織障害の治療で用いられる。それらが、アラキドン酸を環状エンドペルオキサイド、プロスタグランジンの前駆体へ変換するシクロオキシゲナーゼを阻害することによりプロスタグランジンの合成をブロックすることによって作用する。本発明では、酵素ＣＯＸ−２を選択的に阻害するＮＳＡＩＤの使用が考えられる。
【０２５２】
ＮＳＡＩＤは結腸腫瘍細胞系および動物組織の双方におけるアポトーシスを誘導し、腫瘍においてＫｉ−ｒａｓ活性化を阻害するように見える；しかしながら、Ｋｉ−ｒａｓの活性化は、未だ、ＮＳＡＩＤ媒介細胞傷害性のメカニズムとして調査されたことはなかった。また、そのような細胞傷害性がＮＳＡＩＤの抗−炎症特性に依存するかも知られていない。やはりＫｉ−ｒａｓ活性化を阻害するＮＳＡＩＤスリンダックは、２つの異なる分子に代謝され、それらはＣＯＸを阻害するそれらの能力において異なり、しかし、双方はアポトーシスの誘導を介して化学予防効果を発揮することができる。しかしながら、スリンダックスルホンはＣＯＸ−阻害活性を欠如し、それは、プロスタグランジン合成から独立してアポトーシスの誘導を促進するようである。再度、本発明は、シクロオキシゲナーゼを特異的かつ直接的に阻害する化合物または剤というＣＯＸ−２選択的阻害剤を含む。
【０２５３】
ＣＯＸ−２選択的阻害剤はセレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸＴＭ）、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸＴＭ）、バルデコキシブ（ＢＥＸＴＲＡＴＭ）、ブミラコキシブ（ＰＲＥＸＩＧＥＴＭ）、またはエトリコキシブ（ＡＲＣＯＸＩＡＴＭ）を含む。セレコキシブおよびロフェコキシブの商業的バージョンは、心血管系に対するそれらの効果、および心血管病の認められた増大した危険性に関する関心のため最近撤退された。ＰＲＥＸＩＧＥおよびＡＲＣＯＸＩＡは合衆国においての使用についてＦＤＡによって未だ認可されていないが、それらは他の国においては認可されている。
【０２５４】
１．セレコキシブ
ある具体例において、本発明はＣＯＸ−２阻害剤セレコキシブに関する。商品名ＣＥＬＥＢＲＥＸＴＭ下でＳｅａｒｌｅによって販売されるセレコキシブは、化学的には、４−［５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）−１Ｈ−フィラゾール−１−イル］ベンゼンスルホンアミドと命名される。実験式はＣ１７Ｈ１４Ｆ３Ｎ３Ｏ２Ｓである。分子量は３８１．３８である。ＣＥＬＥＢＲＥＸＴＭは１００または２００ｍｇ経口カプセルで市販されている。
【０２５５】
セレコキシブは動物モデルにおいて抗−炎症、鎮痛および解熱活性を呈する。作用メカニズムは、プロスタブランジン合成の阻害の結果であると考えられている。酵素シクロオキシゲナーゼ−２または「ＣＯＸ−２」はこの経路における重要な酵素である。ＣＯＸ−２の選択的阻害（関連酵素ＣＯＸ−１は阻害されない）はセレコキシブの特徴であり、ＣＯＸ−１の阻害に関連する潜在的胃腸毒性を低下させると考えられている。
【０２５６】
ａ．ファーマコキネティックス
セレコキシブのピーク血漿レベルは経口投与後ほぼ３時間である。高脂肪食事と共に摂取すると血漿レベルは約１ないし２時間遅れ、合計して１０ないし２０％の吸収増加が伴う。アルミニウムまたはマグネシウム含有制酸剤の結果、結晶濃度が減少する。セレコキシブは臨床的用量範囲で高度に結合した蛋白質であり、イン・ビトロ実験は、アルブミンおよびアルファ１−酸高蛋白質が主な結合種であることを示している。チトクロームＰ４５０  ２Ｃ９はセレコキシブの主な代謝酵素である。３つの一次的代謝産物はアルコール、対応するカルボン酸およびそのグルクロナイドコンジュゲートであり；これらの代謝産物はＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２阻害剤として不活性である。単一用量に続き、用量の５７％は糞中に排出され、２７％は尿中に排出される。有効半減期は絶食状態下でほぼ１１時間である。
【０２５７】
ｂ．患者集団
老人患者は高い最大血清濃度を有し、同齢の男性は同齢の女性よりも高い濃度を有した。５０ｋｇ未満の同齢の患者では、より低い用量を最初に用いるべきである。黒人は白人よりも高い血清濃度を示す。肝臓不全は血清濃度を増大させ、他方、腎臓不全は濃度を減少させる。
【０２５８】
ｃ．薬物相互作用
患者は、チトクロームＰ４５０  ２Ｃ９を阻害する薬物の使用に関して質問されるべきである。特異的潜在的薬物相互作用はフルコナゾールおよびリチウムおよび、恐らくは、フロセミドおよびＡＣＥ阻害剤を含む。
【０２５９】
ｄ．副作用および禁忌
ＮＳＡＩＤについての副作用は典型的には、胃十二指腸および胃腸刺激を含む。しかしながら、セレコキシブは他のＮＳＡＩＤよりもかなり低いこれらの効果を示す。他の可能な副作用はアナフィラキシー様作用を含むが、いずれもセレコキシブについては報告されていない。また、それは進行した腎臓病を持つ患者および妊娠した母親については回避されるべきである。
【０２６０】
ｅ．ＮＳＡＩＤの組合せ
種々のＣＯＸ−２阻害剤の組合せもまた本発明に従って使用できる。例えば、より低い用量の複数のＣＯＸ−２阻害剤およびＭＤＡ−７を用いることによって個々の化合物のより高い用量に伴う副作用または毒性を低下させるのが可能である。本明細書中で概説した目的では特に、セレコキシブはこのようにして他のＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせて用いることができる。
【０２６１】
２．ＶＩＯＸＸＴＭ
ある具体例において、本発明はＣＯＸ−２阻害剤ロフェコキシブに関する。商品名ＶＩＯＸＸＴＭ下でＭｅｒｃｋによって販売されるロフェコキシブは、化学的には４−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−３−フェニル−２−（５Ｈ）フラノンと命名される。実験式はＣ１７Ｈ１４Ｏ４Ｓであって、分子量は３１４．３６である。ＶＩＯＸＸＴＭは１２．５、２５、または５０ｍｇ経口カプセルにて、または１２．５または２５ｍｇ／５ｍｌの濃度を持つ経口懸濁液として市販されている。
【０２６２】
セレコキシブは動物モデルにおいて抗−炎症鎮痛および解熱活性を呈する。作用メカニズムは、（ＣＯＸ−１ではなく）ＣＯＸ−２を選択的に阻害することによるプロスタグランジンの合成の阻害の結果であると考えられる。
【０２６３】
ａ．ファーマコキネティックス
ロフェコキシブのピーク血漿レベルは経口投与後に２ないし３時間である。高脂肪食事から１ないし２時間後にピークレベルが遅れた以外は、食物は血漿レベルに影響しなかった。それは、主として、サイトゾル酵素による低下を通じて代謝される。
【０２６４】
ｂ．薬物相互作用
具体的な潜在的薬物相互作用はリファムピン、テオフィリンおよびワルファリンを含む。
【０２６５】
ｃ．副作用および禁忌
決定された深刻な心血管血栓症のより高い発生率が患者で観察されてきた。
【０２６６】
３．バルデコキシブ
ある具体例において、本発明はＣＯＸ−２阻害剤バルデコキシブに関連する。商品名ＢＥＸＴＲＡ下でＰｆｉｚｅｒによって販売されるセレコキシブは化学てきには４−（５−メチル−３−フェニル−４−イソキサゾリル）ベンゼンスルホンアミドと命名される。実験式はＣ１６Ｈ１４Ｎ２Ｏ３Ｓであって、分子量は３１４．３６である。ＢＥＸＴＲＡは１０または２０ｍｇ経口カプセルで市販されている。
【０２６７】
セレコキシブは抗−炎症、鎮痛および解熱活性を有する。それは血漿中で見出される量においてＣＯＸ−１ではなくＣＯＸ−２を選択的に阻害すると考えられる。
【０２６８】
ａ．ファーマコキネティックス
バルデコキシブのピーク血漿レベルは約３時間後に達成される。食物によって引き起こされる有意な効果はないが、高脂肪食事と共に摂取した場合には、血漿レベルは約１ないし２時間遅延した。
【０２６９】
バルデコキシブはＰ４５０イソ酵素３Ａ４および２Ｃ９、ならびにグルクロニド化を介する非−Ｐ４５０酵素によって代謝される。フルコナゾールおよびエトコナゾールのような３Ａ４および／または２Ｃ９を阻害する薬物は血漿濃度を増大させることができる。
【０２７０】
ｂ．患者の集団
差は同定されておらず、また調べられてもいない。
【０２７１】
ｃ．薬物相互作用
患者は、チトクロームＰ４５０  ２Ｃ９および３Ａ４を阻害する薬物の使用に関して質問されるべきである。具体的な潜在的薬物相互作用はフルコナゾールおよびケトコナゾールを含む。しかしながら、バルデコキシブのそれの約１０％の濃度においてヒト血漿中でバルデコキシブの活性な代謝産物がある。
【０２７２】
ｄ．副作用および禁忌
深刻な皮膚反応が示されている。また、胃腸毒性が観察されている。
【０２７３】
Ｊ．Ｈｓｐ９０阻害剤
本発明は、Ｈｓｐ９０に直接的に結合し、抗−腫瘍活性を有する化合物をいうＨｓｐ９０阻害剤に関する。Ｈｓｐ９０は、腫瘍細胞の成長および／または生存を促進する種々の突然変異下および過剰発現されたシグナリング蛋白質の折り畳み、組立および活性に対して臨界的である分子シャペロンである。Ｈｓｐ９０クライアント蛋白質は突然変異したｐ５３、Ｒａｆ−１、Ａｋｔ、ＥｒｂＢ２および低酸素症−誘導性因子１α（ＨＩＦ−１α）（Ｎｅｃｋｅｒｓ、２００２）を含む。
【０２７４】
ある具体例において、化合物はベンゾキノンアンサマイシンおよびそれらのアナログのような天然および合成低分子である。特別な具体例において、Ｈｓｐ９０阻害剤はゲルダナマイシンおよびそのアナログおよび誘導体である。
【０２７５】
ゲルダナマイシン（ＧＡ）はＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓによって生産されるベンゾキノンアンサマイシン抗生物質である。それは抗特性を有することが示されており、それは、熱ショック蛋白質Ｈｓｐ９０に特異的に結合し、そのクライアント蛋白質の脱安定化および分解を引き起こすその能力によって引き起こされると考えられている（Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４；Ｎｅｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９９）。
【０２７６】
臨床試験におけるＧＡのアナログは１７−アリルアミノ−１７−デメトキシゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）であり、これはゲルダナマイシン（ＧＡ）の毒性が低いかつより安定なアナログである（Ｓｃｈｕｌｔｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。Ｈｓｐ９０への１７ＡＡＧ結合はＧＡよりも弱いが、１７ＡＡＧはＧＡと同様な抗腫瘍効果を呈し、良好な毒性プロフィールを有する。Ｉ相臨床試験からの情報は、１７ＡＡＧが、最大許容用量未満の濃度において達成される抗腫瘍活性を有することを示す（Ａｇｎｅｗ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。
【０２７７】
本発明には、ＧＡの標的化バージョンが含まれる。例えば、固体腫瘍の療法で認可された最初のｍＡＢであるフェルセプチンはＨｅｒ２を標的化し、ＧＡをＨｅｒ２−過剰発現腫瘍に標的化するように選択された。ＮＣＩは、そのようなコンジュゲートがヘルセプチン単独よりも優れた選択的細胞傷害性インパクトを送達することを報告した。そのようなコンジュゲートを調製するためには、ＧＡを修飾して、潜在的第１級アミンを導入する（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。脱保護後に、この第１級アミンは、蛋白質への結合を可能とするマレイミド基の導入用の部位を提供する（Ｍａｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。ＩｎｖｉｖｏＧｅｎと呼ばれる会社はゲルダナマイシンの誘導体、１７−（３−（４−マレイミドブチルカルボキサミド）プロピル−アミド）ゲルダナマイシン（ＧＭＢ−ＡＰＡ−ＧＡ）を作り出し、これは、ヘルセプチンまたは他のｍＡＢと容易にコンジュゲートすることができる。他の具体例の関係において本出願で記載したように、他の抗生物質が本発明での使用で考えられる。
【０２７８】
ゲルダナマイシンアナログおよび誘導体は、限定されるものではないが、１７ＡＡＧ、ＮＳＣ  ２５５１１０、ＮＳＣ  ６８２３００、ＮＳＣ  ６８３６６１、ＮＳＣ  ６８３６６３、１７ＤＭＡＧ、１５−ヒドロキシゲルダナマイシン、三環ゲルダナマイシンアナログ（ＫＯＳＮ−１６３３）、メチル−ゲルダナマイシネート、１７−ホルミル−１７−デメトキシ−１８−Ｏ、−２１−Ｏ−ジヒドロゲルダナマイシンおよび１７−ヒドロキシメチル−１７−デメトキシゲルダナマイシンを含む。ここに引用して援用する、Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）、Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）；Ｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）；Ｌｅ  Ｂｒａｚａｄｅｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）参照。
【０２７９】
ある具体例において、ＧＡあるいはＧＡの誘導体またはアナログは、２６Ｓプロテアソームのキモトリプシン−様活性の可逆的阻害剤であるボルテゾミブでの治療養生法の一部として与えられる。用量は約、少なくとも約、またはせいぜい約
【０２８０】
【化４】
2008531481.tif 000009
ｍｇ／ｍ２（腫瘍サイズに関する）またはｍｇ／日、あるいはその中で誘導可能ないずれかの範囲である。特別な具体例において、ベルテゾミルは静脈内投与される。
【０２８１】
ある具体例において、患者はＧＡまたはアナログもしくは誘導体を、２８日サイクルの日１、８および１５における３００ｍｇ／ｍ２の用量での静脈内注入として受ける。必要であれば、療法の複数のサイクルが考えられる。
【０２８２】
Ｋ．ビタミンＥ化合物
用語「ビタミンＥ」とは、８つの関連する脂質−溶解性の抗酸化剤化合物（アルファ（α）−トコフェロール、ベータ（β）−トコフェロール、ガンマ（γ）−トコフェロール、デルタ（δ）−トコフェロール、α−トコトリエノール、β−トコトリエノール、γ−トコトリエノール、およびδ−トコトリエノール）のファミリーをいう。トコフェロールおよびトコトリエノールサブファミリーは各々、ユニークな生物学的活性を有するアルファ、ベータ、ガンマおよびデルタビタマーよりなる。トコフェロールは、それらが不飽和イソプレミル側鎖よりはむしろ飽和フィチル側鎖を有する点でトコトリエノールとは異なる。
【０２８３】
アルファ−トコフェロールは、ヒト身体に能動的に維持されるビタミンＥの唯一の形態であり、かくして、血液および組織で見出されるビタミンＥの最も豊富な形態である（Ｔｒａｂｅｒ、１９９９）。ヒトにおけるアルファ−トコフェノールの主な機能は、抗酸化剤として作用するその能力であるように見える（ｌｐｉ．ｏｒｅｇｏｎｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／ｉｎｆｏｃｅｎｔｅｒ／ｖｉｔａｍｉｎｓ／ｖｉｔａｍｉｎＥ）における世界的ウェブ参照）。ビタミンＥの合成バージョンは入手可能である（１２．５％真性ＲＲＲ−α−トコフェロールおよび８７．５％立体異性体よりなる化学的混合物；すなわち、同一順番で連結されたＲＲＲ−α−トコフェロールに見出される原子の同一数およびタイプを有するが、それらの空間的配置が異なる、製造プロセスの間に生産された７つの分子）（“Ｄｉｅｔａｒｙ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ  Ｉｎｔａｋｅｓ  ｆｏｒ  Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｃ、Ｖｉｔａｍｉｎ  Ｅ、  Ｓｅｌｅｎｉｕｍ、ａｎｄ  Ｃａｒｏｔｅｎｏｉｄｓ”、２０００、およびＫｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。かくして、（ＲＲＲ−α−トコフェロールまたはｄ−α−トコフェロールといわれる）天然真性ビタミンＥおよび（ａｌｌ−ｒａｃ［ｅｍｉｃ］−α−トコフェロールまたはｄｌ−α−トコフェロール）は化学的に同等ではない。
【０２８４】
真性ＲＲＲ−α−トコフェロールおよび合成ビタミンＥは、共に、アセテートまたはスクシネート誘導体として購入することができる。ＲＲＲ−α−トコフェロールのクロマンヘッドに対するこれらの修飾を行って、空気に曝露され、抗酸化剤の能力を回復するために除去されなければならない場合に、Ｃ−６位置のヒドロキシル部位を酸化から保護する（Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。α−ＴＥＡといわれるＲＲＲ−α−トコフェロールの非加水分解性エーテルアナログは同定されている（Ｌａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。特に、α−ＴＥＡはビタミンＥアナログとして本発明の方法および組成物で用いることができると考えられる。Ｂｉｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の論文はビタミンＥアナログを議論しており、ここに引用して援用する（Ｂｉｒｒｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。
【０２８５】
ビタミンＥ化合物は、α−トコフェリル酢酸またはα−トコフェリルコハク酸としてのエステル形態で通常は生産され入手可能である。これらの形態のいずれも、腸中でアセテートまたはスクシネート部位の除去によって身体中でアルファ−トコフェロールに変換されるまでいずれの抗酸化剤も有しない。エステル化形態は、非エステル化形態よりも、貯蔵時間および温度に関して酸化に対してより抵抗性であり、およびかなり安定である。スクシネート形態の活性化はアセテート形態よりも遅いが、スクシネート形態は他の形態では利用できない組織の領域にアクセスし、利益を与えるように見える。
【０２８６】
ビタミンＥは身体中で１を越えるメカニズムを有する。それはフリーラジカルを破壊し抗酸化剤の機能膜を安定化し、プロスタグランジンの合成を阻害し、および血小板凝集を妨げ、いくつかの癌細胞において細胞分化を誘導し（イン・ビトロにおいてメラノーマ細胞）、およびいくつかの腫瘍細胞（ネズミ神経芽細胞腫、ラット神経膠細胞腫およびヒト前立腺）の成長を阻害する。その癌と戦う能力は、プロスタグランジン合成のその阻害に関連するであろう。なぜならば、過剰のプロスタグランジンが免疫系を抑制できるからである（ｓｐｒｉｎｇｂｏａｒｄ４ｈｅａｌｔｈ．ｃｏｍ／ｎｏｔｅｂｏｏｋ／ｖ＿ｅ．ｈｔｍｌにおける世界的ウェブ参照）。
【０２８７】
いくつかの研究はＲＲＲ−α−トコフェリルスクシネート（ビタミンＥスクシネート；ＶＥＳ）ＲＲＲ−α−トコフェロールの加水分解可能なエステル誘導体の優れた抗−腫瘍活性を記載している。ＰｒａｓａｄおよびＥｄｗａｒｄｓ−Ｐｒａｓａｄは、マウスメラノーマＢ−１６細胞の形態学的改変および成長阻害を誘導するビタミンＥの他の形態ではなくビタミンＥスクシネートの能力を最初に記載し、それは、ビタミンＥスクシネートが有用な腫瘍治療剤であろうことを示唆する（Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９８２）。さらなる研究は、ビタミンＥスクシネートが、乳房、前立腺、肺および結腸を含めた広く種々の上皮癌細胞タイプ；ならびにイン・ビトロでの造血系−リンパ系白血病およびリンパ腫細胞の優れた成長阻害剤であることを示している（Ｆａｒｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４；Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｎｅｕｚｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９２）。最近の研究は、ビタミンＥスクシネートが、腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与された場合に動物異種移植片および同種異系移植片モデルにおいて抗−腫瘍活性を有することを示しており（Ｍａｌａｆａ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｍａｌａｆａ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ｎｅｕｚｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）、これは、潜在的治療能力を示唆する。ｉ．ｐ．または蛍光（ｐ．ｏ．）投与されたビタミンＥスクシネートもまた、マウスにおける発癌物質［ベンゾ（ａ）ピレン］−誘導前胃癌形成に対する阻害効果を有することも示されており、抗−癌形成剤としての能力を示唆する（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。研究は、ビタミンＥスクシネートが、ＤＮＡ合成遮断、細胞分化の誘導、およびアポトーシスの誘導を介する癌細胞成長の濃度−および時間−依存性阻害を誘導することを示している（Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｎｅｕｚｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｙｏｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。
【０２８８】
ビタミンＥスクシネートは、価値あることには、腫瘍細胞に対する成長阻害効果のその誘導のみならず、正常な細胞および組織に向けての毒性のその欠如のためである（Ｆａｒｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４；Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｋｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｎｅｕｚｉｌ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｐｒａｓａｄ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２；Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２；Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。非−加水分解性ビタミンＥスクシネート誘導体の使用は、それが無傷化合物であって、その切断産物（すなわち、ＲＲＲ−α−トコフェロールまたはコハク酸）のいずれかではなく、抗−増殖効果を担うことを示した（Ｆａｒｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９４）。かくして、このビタミンＥ誘導体の抗−増殖作用は、非−抗酸化剤特性によるものであると考えられる。ＲＲＲ−α−トコフェリルスクシネート（ＶＥＳ）は、クロマンヘッドの６−位置のヒドロキル部位の代わりにスクシニル部位を含有させるためにエステル結合を介して構造的に修飾されているＲＲＲ−α−トコフェロールの誘導体である。ＲＲＲ−α−トコフェロールのこのエステル結合スクシネート部位は、アポトーシスをトリガーし、ＤＮＡ構成を阻害する生物学的作用に影響するビタミンＥの最も優れた形態であった。ビタミンＥのこの形態は、腫瘍細胞が、正常な細胞に対してアポトーシス誘導効果を有さずして、アポトーシスを受けるよう誘導する。ビタミンＥのスクシネート化形態は無傷剤と同程度に抗癌剤として効果的であり；しかしながら、細胞および組織エステラーゼは、スクシネート部位を切断することができ、それにより、ＲＲＲ−α−トコフェロールのスクシネート形態を遊離ＲＲＲ−α−トコフェロールに変換し、この化合物を抗癌剤として効果的でなくすることができる。ＲＲＲ−α−トコフェロールは、上皮または免疫起源の細胞において抗増殖またはプロアポトーシス生物学的活性を呈しない。
【０２８９】
ビタミンＥは植物で通常見出され、種子でより豊富であり、それから、天然状態のトコフェロールがヒトおよび動物（野生および家畜）において容易に吸収され利用される。例えば、ここに引用して援用する、米国特許第５、１７９、１２２号参照。長期間の貯蔵のための産業による食品および試料の加工は、ビタミンＥ含有量の加速された劣化を促進する。食物源からの天然ビタミンＥの喪失を補うためには、天然または合成ビタミンＥの栄養補充物を注射によってまたは経口投与する。トコフェロールは不安定な分子であることが知られている。トコフェロール安定性を改良するためには、製造プロセスは、一般には、アセテートまたはスクシネート基をトコフェロールに付着させ、ビタミンＥアセテートまたはスクシネート（ｄ−またはｄｌ−アルファ−トコフェリルアセテートまたはスクシネート）を作製する。水性ビタミンＥ溶液の親水性性質の効率、およびビタミンＥの腸吸収に際しての分散は、正常なおよび危うい腸による親水性ビタミンＥの増大した吸収によって示すことができるのはよく知られている。当該分野においては、天然または合成のビタミンＥの源もまた生物学的利用性に影響することが知られている。危うい腸においては、ビタミンＥ吸収を、胆汁鬱滞肝臓、および嚢胞性線維症のような脂質吸収不良症候群を持つ患者で調べられた。そのような患者はビタミンＥまたは他のダイエット脂質を吸収することができない。ビタミンＥの水溶性形態（ｄ−アルファ−トコフェリルポリエチレングリコール１０００スクシネートまたは「ＴＰＧＳ」）をそのような患者に経口投与した場合、血中トコフェロールの上昇は１週間以内に観察された。同一患者に植物油中のトコフェロールを投与した場合、血液中にトコフェロールの有意な増大はなかった（Ｔｒａｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９８８）。かくして、天然または合成のトコフェロールのタイプ、およびＴＰＧＳの親水性は、ヒトおよび動物におけるビタミンＥの吸収および生物学的利用性を決定するにおいて重要であり得る。水−分散性処方でビタミンＥを投与する利点はヒト臨床試験においてＢａｔｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）によって示されており、そこでは、ビタミンＡ、Ｅ、ＢおよびＢ２が液体ビヒクル（Ａｑｕａ  Ｂｉｏｓｏｒｂ）に処方され、不ソフトゼラチンカプセルにカプセル化され、これが経口投与された。該処方においては、Ｂ２は≦１００ｎｍの粒子直径を持つ懸濁液としての処方に取り込まれた。柔軟な弾性ゼラチンカプセルは２０％のポリソルベート８０、１％モノオレイン酸ソルビタンおよび７９％の蒸留されたモノグリセリドを水分散性基剤として含有した。Ｂａｔｅｍａｎは、彼の投与処方における脂質可溶性ビタミンＡおよびＥに加えて、水溶性ビタミンＢ２の親水性は増強された吸収を示すことを示した。ビタミンＥのこれらのバージョンのいずれも本発明の一部としての使用が考えられる。
【０２９０】
ビタミンＥコンジュゲートは、限定されるものではないが、ビタミンＥコハク酸（ＶＥＳＡ）プログルタメートコンジュゲート、ビタミンＥコハク酸（ＶＥＳＡ）ポリエチレングリコールアミンピログルタメートコンジュゲート、ビタミンＥアミンピログルタメートコンジュゲートを含めたビタミンＡピログルタミン酸（ピログルタメート）コンジュゲート；ビタミンＥコハク酸（ＶＥＳＡ）ピロリジノンコンジュゲートを含めたビタミンＥピロリジノンコンジュゲート；ビタミンＥゲンチシン酸コンジュゲートを含めたビタミンＥゲンチシン酸コンジュゲートを含む。ここに引用して援用する米国特許第６、８５８、２２７号。
【０２９１】
Ｌ．血管内皮成長因子阻害剤
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、血管内皮細胞についての高度に特異的なマイトジェンである。５つのＶＥＧＦイソ形態が、単一のＶＥＧＦ遺伝子からのオールタネイティブスプライシングの結果として生じる。これらのイソ形態は、それらの分子量、および細胞−表面ヘパラン−硫酸プロテオグリカンに結合するそれらの能力のような、生物学的毒性が異なる。ＶＥＧＦの発現は活性化された癌遺伝子によっておよび種々のサイトカインによって低酸素症に応答して増強される。ＶＥＧＦは内皮細胞増殖を誘導し、細胞移動を促進し、およびアポトーシスを阻害する。イン・ビボＶＥＧＦは血管形成ならびに血管の浸透化を誘導し、血管形成の調節において中枢的な役割を演じる。脱調節化ＶＥＧＦ発現は、腫瘍血管形成を促進することによって固体腫瘍の発生に、および異常な血管形成によって特徴づけられるいくつかのさらなる病気の病因に寄与する。結果として、ＶＥＧＦシグナリングの阻害は広く種々の腫瘍の発生をなくする。
【０２９２】
ＶＥＧＦ阻害剤は、当該分子の不存在下でのＶＥＧＦの活性と比較してＶＥＧＦの活性をブロックし、または減少させる、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、ペプチドまたは低分子のようないずれかの分子である。当業者に知られたいずれのアッセイを用いて、ＶＥＧＦ活性を評価し、および分子の存在下および不存在下におけるＶＥＧＦの活性を測定することができる。ＶＥＧＦ阻害剤の例は本明細書中において他の箇所において長く議論する。
【０２９３】
ＶＥＧＦ阻害剤の用量は当業者に知られたいずれの用量でもあり得る。例えば、もしＶＥＧＦ阻害剤がベバシズマブであれば、用量は静脈内注入によって約０．１ないし約１０ｍｇ／ｋｇ以上であり得る。該用量は、副作用、および療法に対する応答のような臨床に応じてしつらえることができる。ベバシズマブは、胃腸穿孔、医療的介入を必要とする創傷裂開、深刻な出血、ネフローゼ症候群または高血圧危険性を発生した患者では永久に中断すべきである。
【０２９４】
Ｍ．ＩＬ−１０阻害剤
インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）は、ネズミおよびヒト生物の双方で同定された、最近記載された天然内因性免疫抑制サイトカインである。ネズミインターロイキン−１０（ｍＩＬ−１０）は、元来、ＴヘルパーＴ細胞クローンから放出されたサイトカイン合成阻害因子として記載されたが、それは、ＣＤ４−、８＋ネズミ脾臓Ｔ細胞のクローニング効果に対する増強効果を含めた、リンパ球の種々のサブセットに対して増殖効果を運ぶ。ヒトインターロイキン１０（ｈＩＬ−１０）は、最近配列決定され、ＤＮＡ配列レベルにおいて、ならびにアミノ酸レベルにおいてｍＩＬ１０に対して高い相同性を有することが明らかとされている。さらに、ブタインターロイキン１０は、最近配列決定され、ＤＮＡ配列レベルにおいて、並びにアミノ酸レベルにおいてヒトＩＬ−１０に対して高い相同性を有することが明らかとされている。また、ｈＩＬ−１０はエプスタイン−バールウィルスゲノム中のオープンリーディングフレームに対して高い相同性を有し、ＢＣＲＦ１およびウィルスＩＬ−１０はｈＩＬ−１０と同様ないくらかの活性を示す。
【０２９５】
ヒトＩＬ−１０は活性化されたＴ細胞クローンおよび不滅化Ｂ細胞によって生産され、そのサイトカイン合成阻害因子（ＣＳＩＦ）活性、いくつかのプロ−炎症サイトカインおよびコロニー−刺激因子の生産の阻害に加えて、それは、単核細胞による天然インターロイキン−１受容体アンタゴニスト蛋白質／ペプチド（ＩＲＡＰ）の生産を誘導し、それにより、ＩＬ−１活性を間接的に阻害する。また、ＩＬ−１０は、単球によってそれ自身の生産をダウンレギュレートし、クラスＩＩ  ＭＨＣ発現の発現を阻害する。
【０２９６】
ＩＬ−１０阻害剤は、当該分子の不存在下におけるＩＬ−１０の活性と比較してＩＬ−１０の活性をブロックし、または減少させるＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、蛋白質、ポリヌクレオチド、ペプチドまたは低分子のようないずれの分子でもある。特異的ＩＬ−１０阻害剤についての情報は本明細書中において他の箇所に記載されている。当業者に知られたいずれのアッセイを用いて、ＩＬ−１０活性を評価し、分子の存在下および存在下においてＩＬ−１０の活性を測定することもできる。
【０２９７】
Ｉｌ−１０阻害剤の用量は当業者に知られたいずれの用量でもあり得る。例えば、該用量は静脈内注入により約０．１ないし約１０ｍｇ／ｋｇ以上であってよい。用量は副作用、および療法に対する応答のような臨床的基準に応じてしたてることができる。
【０２９８】
Ｎ．ＴＮＦ
ＴＮＦは急性相反応をすべて刺激する他のサイトカインの群のメンバーである。ＴＮＦ−アルファおよびＴＮＦ−ベータのようなこのファミリーにおける種々のメンバーがある。ＴＮＦ−アルファはマクロファージの表面の２１２アミノ酸長プロペプチドから切断された１８５アミノ酸糖蛋白質ペプチドホルモンである。いくつかの細胞はより短いまたはより長いイソ形態を分泌する。ＴＮＦαは、例えば、注入によって、損傷の間に白血球細胞内皮およびいくつかの他の組織によって放出される。その放出はインターロイキン１および細菌エンドトキシンのようないくつかの他のメディエーターによって刺激される。それは、一般には、インターロイキン１および６とで、種々の器官系に対して多数の作用を有する。
【０２９９】
ＴＮＦの用量は当業者に知られたいずれの用量でもあり得る。例えば、該用量は静脈内注入による約０．１ないし約１０ｍｇ／ｋｇ以上であってよい。該用量は副作用、および療法に対する応答のような臨床的基準に応じてしたてることができる。
【０３００】
Ｏ．タキソテール
ドセタキソール（タキソテール；Ａｖｅｎｔｉｓによって製造）は、抗新形成化学療法剤である。タキソテールは、先の化学療法の失敗の後に、局所的に進行した、または転移性の乳癌を持つ患者の治療で示される。タキソテールの用量は当業者に知られたいずれの用量でもあり得る。例えば、該用量は約１ｍｇ／ｍ２ないし約１，５００ｍｇ／ｍ２以上ｄあり得る。
【０３０１】
Ｐ．医薬処方および送達
本発明のある具体例において、ＭＤＡ−７蛋白質をコードする発現構築体の送達を含む方法が考えられる。いくつかの具体例において、該方法は免疫原をコードする発現構築体の送達に向けられる。別法として、発現構築体はＭＤＡ−７ポリペプチドおよび免疫原双方をコードする配列を含む。免疫応答を含む病気および疾患の例は、ワクチンで予防または治療される病気を含む。肺癌、頭部および首部癌、乳癌、膵臓癌、前立腺癌、腎臓癌、骨癌、精巣癌、頸部癌、胃腸癌、リンパ腫、肺におけるプレ−新形成病巣、結腸癌、乳癌、膀胱癌およびＭＤＡ−７ポリ蛋白質を投与して誘導された免疫応答を誘導することによって治療することができる免疫応答に関連するいずれかの他の病気または疾患を含む。
【０３０２】
１．有効量
医薬組成物（有効量）は、一般には、述べられた所望の結果を検出可能にかつ反復可能に達成し、例えば、病気の程度またはその兆候を軽減、低下、最小化または制限するのに十分な量と定義される。より厳しい定義を適用することができ、病気の排除、根絶または治癒を含む。
【０３０３】
２．投与
ある特別な具体例において、本発明の方法および組成物を用い、細胞を殺し、細胞成長を阻害し、転移を阻害し、腫瘍または組織サイズを減少させ、そうでなければ、腫瘍細胞の悪性表現型を逆行させまたは低下し、免疫応答を誘導し、または血管形成を阻害するのが望まれる。投与の経路は、自然には、標的化すべき病巣または部位の位置および性質に伴って変化することができ、例えば、皮内、皮下、領域的、非経口、静脈内、筋肉内、鼻内、全身、および経口投与および処方を含む。
【０３０４】
腫瘍血管系への直接的注射、腫瘍内注射または注射が、区別される固体接近可能腫瘍または他の接近可能標的領域で具体的に考えられる。局所的、領域的または全身投与もまた適切であろう。＞４ｃｍの腫瘍については、投与すべき容量は約４ないし１０ｍｌ（好ましくは１０ｍｌ）であり、他方、＜４ｃｍの腫瘍では、約１ないし３ｍｌの容量が用いられるであろう（好ましくは３ｍｌ）。
【０３０５】
単一用量として送達される多数の注射は約０．１ないし約０．５ｍｌの容量を含む。ウィルス粒子は有意には、多数の注射をほぼ１ｃｍ間隔を設けた腫瘍または標的化部位に投与することによって接触させることができる。
【０３０６】
外科的介入の場合には、本発明は手術前に用いて、手術できない腫瘍を切除に付せるようにすることができる。別法として、本発明を外科的処置の時点でおよび／またはその後に用いて、残存するまたは転移性病気を治療することができる。例えば、切除された腫瘍床に、免疫原性分子と共に、またはその不存在下に、ＭＤＡ−７またはＭＤＡ−７−コーディング構築体を含む処方を注射し、または灌流することができる。該灌流は、例えば、外科的処置の部位に移植されたカテーテルを残すことによって切除後に継続することができる。周期的な外科的処置後処理も考えられる。
【０３０７】
発現構築体またはウィルス構築体の連続的灌流も考えられる。連続的灌流で送達される構築体またはペプチドの量は、望ましい摂取の量によって決定することができる。
【０３０８】
連続的投与は、適切な場合、例えば、腫瘍または他の望ましくない侵された領域を切除し、腫瘍床または標的化部位を処理して残存する微視的病気を排除する。シリンジまたはカテーテル化を介する送達がいくらかある。そのような連続的灌流は、治療の開始後に、約１ないし２時間から、約２ないし６時間、約６ないし１２時間、約１２ないし２４時間、約１ないし２日、約１ないし２週間またはそれ以上の期間を要するであろう。一般に、連続的灌流を介する治療組成物の容量は、灌流が行われる間の期間にわたって調整された、単一または複数注射によって与えられるものと同等であろう。
【０３０９】
治療養生法は同様に変化させることができ、しばしば、腫瘍タイプ、腫瘍の位置、免疫状態、標的部位、病気進行、および患者の健康および年齢に依存する。明らかに、腫瘍のある種のタイプはより攻撃的な治療を必要とし、他方、同時に、ある種の患者はよりやっかいなプロトコルを許容できない。臨床家は、治療処方の公知の有効性および（もしあれば）毒性に基づいてそのような決定をなすのに最も適している。
【０３１０】
いくつかの具体例において、治療すべき腫瘍または冒された領域は少なくとも最初は切除可能ではないであろう。治療ウィルス構築体での治療は、境界における収縮のため、またはある特に侵入性部分の排除によって腫瘍の切除性を増大させることができる。治療に続き、切除が可能であろう。切除に引き続いてのさらなる治療は、腫瘍または標的化部位における微視的残存病を排除するように提供される。
【０３１１】
原発性腫瘍または切除後腫瘍床については治療の典型的なコースは多数の容量を含むであろう。典型的な原発性腫瘍の治療は２週間に渡る６用量適用を含む。２週間の養生法は１回、２回、３回、４回、５回、６回以上反復することができる。治療のコースの間に、計画された投与を完了する必要性を再度評価することができる。
【０３１２】
治療は種々の「単位用量」を含むことができる。単位用量は治療組成物の所定量を含有すると定義される。投与すべき量、ならびに特定の経路および処方は臨床分野における当業者の技量内におけるものである。単位用量は単一の注射として投与される必要はないが、設定された時間にわたる連続的注入を含むことができる。本発明の単位用量は、便宜には、プラーク形成単位「ＰＦＵ」またはウィルス構築体についてのウィルス粒子換算で記載することができる。単位用量は１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３ＰＦＵまたはウィルス粒子（ＶＰ）およびそれ以上の範囲である。別法として、特定の量は平均日用量、平均週用量、または平気月用量として投与される量であってよい。
【０３１３】
蛋白質は約、または少なくとも約
【０３１４】
【化５】
2008531481.tif 000010
またはそれ以上のｎｇ／ｍｌあるいはその中で誘導可能ないずれかの範囲の用量にて患者に投与することができる。別法として、本明細書中で特定されたいずれの量も平均日用量、平均週用量、または平均月用量として投与される量であってよい。
【０３１５】
ＣＯＸ−２阻害剤は、約、または少なくとも約
【０３１６】
【化６】
2008531481.tif 000011
ｍｇまたはそれ以上、あるいはその中で誘導可能ないずれかの範囲の用量または複数用量にて患者に投与することができる。別法として、特定の用量は平均日用量、平均週用量、または平均月用量として投与される量であってよく、あるいはそれはｍｇ／ｋｇの換算で表すことができ、ここに、ｋｇとは患者の体重をいい、およびｍｇは前記で特定した。他の具体例において、特定の量は先に議論したいずれの数でもあるが、（腫瘍のサイズまたは患者の表面積に関して）ｍｇ／ｍ２として表される。
【０３１７】
ＧＡまたはそのアナログ誘導体の濃度は約、少なくとも約、またはせいぜい約
【０３１８】
【化７】
2008531481.tif 000012
またはそれ以上のｍｇまたはｍｇ／ｍ２（腫瘍サイズまたは患者の表面積に関して）、あるいはその中で誘導可能ないずれかの範囲の用量とすることができる。別法として、特定の量は平均日用量、平均週用量、または平均月用量として投与される量であってよく、あるいはそれはｍｇ／ｋｇの換算で表すことができ、ここに、ｋｇとは患者の体重をいい、およびｍｇは先に特定した。
【０３１９】
ビタミンＥ化合物またはそのアナログの濃度は約、少なくとも約、またはせいぜい約
【０３２０】
【化８】
2008531481.tif 000013
またはそれ以上のｍｇ、μｇ／ｍｌ、ｍｇ／ｋｇ（患者体重に関して）、またはｍｇ／ｍ２（腫瘍サイズまたは患者の表面積に関して）、あるいはその中で誘導できるいずれかの範囲の用量とすることができる。別法として、ビタミンＥ化合物またはアナログの量はＩ．Ｕ．（国際単位）の換算で表すことができる。ある具体例において、ビタミンＥ化合物の量は約、少なくとも約、またはせいぜい約
【０３２１】
【化９】
2008531481.tif 000014
またはそれ以上のＩ．Ｕ．、あるいはその中で誘導可能ないずれかの範囲である。
【０３２２】
３．注射組成物および処方
いくつかの具体例において、免疫原性分子、ＭＤＡ−７蛋白質をコードする発現構築体、ＭＤＡ−７蛋白質、および／または免疫原の送達のための方法は全身投与を介するものである。しかしながら、本明細書中に開示された医薬組成物は、別法として、（各々、ここに具体的に引用してその全体を援用する）米国特許第５、５４３、１５８号；米国特許第５、６４１、５１５号および米国特許第５、３９９、３６３号に記載されたように非経口、皮下、直接的に、器官内、静脈内、皮内、筋肉内、または腹腔内でさえ投与することができる。
【０３２３】
発現構築体が注射に必要な針の特定のゲージを通過することができる限り、核酸構築体の注射は、溶液の注射で用いられるシリンジまたはいずれかの他の方法によって送達することができる。溶液を保持するためのアンプルチャンバー、および溶液をノズルから送達の部位へと押し出すためのエネルギーデバイスを規定するノズルを有する新規なニードレス注射系が最近記載されている（米国特許第５、８４６、２３３号）。シリンジ系もまた、正確にいずれかの深さでの溶液の所定量の複数の注射を可能とする遺伝子治療で用いるのに記載されている（米国特許第５、８４６、２２５号）。
【０３２４】
遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合された水中で調製することができる。グリセロール、液状ポリエチレングリコール、およびその混合物中で、油中で、分散液を調製することもできる。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの調製物は微生物の成長を妨げるための保存剤を含有する。注射用途に適した医薬形態は、滅菌水性溶液または分散液、および滅菌注射溶液または分散液の即席製剤用の滅菌粉末を用いる（ここに具体的に引用してその全体を援用する米国特許第５、４６６、４６８号）。全ての場合において、形態は滅菌されていなければならず、容易なシリンジ性が存在する程度まで流体でなければならない。それは、製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌ようのような微生物の汚染作用に対して保持されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適当な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングを用いることによって、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持することによって、および界面活性剤を用いることによって維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラペン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロザルなどによって実現することができる。多くの場合には、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むのが好ましいであろう。注射組成物の延長された吸収は、吸収を遅延する剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物で用いることによって実現することができる。
【０３２５】
ある処方においては、水−ベースの処方を使用し、他方、他の場合には、それは脂質−ベースとすることができる。本発明の特別な具体例において、ＭＤＡ−７（またはコーディング核酸）および／またはＭＤＡ−７結合剤を含む組成物は水−ベースの組成物におけるものである。他の具体例において、処方は液体ベースである。ビタミンＥ化合物は水−または液体−ベースの処方とすることができるのが特に考えられる。
【０３２６】
水性溶液での非経口投与では、例えば、溶液は、必要であれば、適切に緩衝化すべきである。液体希釈剤はまず十分な生理食塩水またはグルコースで等張とすべきである。これらの特別な水性溶液は静脈内、筋肉内、皮下、腫瘍内および腹腔内投与に特に適している。この関係で、使用できる滅菌水性媒体は本開示に徴して当業者に知られているであろう。例えば、１つの用量は１ｍｌの等張ＮａＣｌ溶液に溶解させ、１０００ｍｌの皮下注入流体にくわえるか、あるいは提案された注入部位に注射することができる（例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”第１５版、１０３５−１０３８および１４７０−１５８０頁参照）。用量におけるいくらかの変形は、治療すべき対象の状態において必然的に起こるであろう。投与を担う個人は、結局は個々の対象についての適切な用量を決定するであろう。さらに、ヒト投与では、製剤は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ標準によって必要とされる滅菌性、発熱性、一般的安全性および純度の標準を満たすべきである。
【０３２７】
滅菌注射溶液は、必要な量の活性化合物を前記例示の種々の他の成分と共に適当な溶媒に配合し、必要であれば、続いて濾過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、種々の滅菌された有効成分を、基本的分散媒体、および前記リストのものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクルに配合することによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合には、調製のいくつかの方法は真空−乾燥および凍結乾燥技術であり、これは、その先に滅菌濾過した溶液から有効成分＋いずれかのさらなる所望の成分の粉末を生じる。
【０３２８】
本明細書中に開示された組成物は中性または塩形態で処方できる。医薬上許容される塩は（蛋白質の遊離アミノ基とで形成され）および、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸とで形成された酸付加塩を含む。遊離カルボキシル基とで形成された塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来し得る。処方に際して、溶液は投与処方に適合した様式で、かつ治療的に効果的であるような量で投与されるであろう。処方は注射溶液、薬物放出カプセルなどのような種々の投与形態で容易に投与される。
【０３２９】
本明細書中で用いるように、「担体」はいずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、ビヒクル、コーディング、希釈剤、抗菌剤、および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤、緩衝液、担体溶液、懸濁液、コロイドなどを含む。医薬活性物質のためのそのような媒体および剤の使用は当該分野でよく知られている。いずれかの慣用的な媒体または剤は有効成分に不適合である限りを除いて、治療組成物におけるその使用が考えられる。補充的有効成分は組成物に配合することもできる。
【０３３０】
フレーズ「医薬上許容される」とは、ヒトに投与された場合に、アレルギー性または同様な望まない作用を生じない分子存在および組成物をいう。蛋白質を有効成分として含有する水性組成物の調製は当該分野でよく理解されている。典型的には、そのような組成物は注射剤として、液状溶液または懸濁液いずれかとして調製され；注射に先立って、液体中の溶液または懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。
【０３３１】
化合物および剤は注射によって、例えば、皮下または筋肉内注射によって、慣用的には非経口投与することができる。投与の他の態様に適したさらなる処方は坐薬およびある場合には、経口処方を含む。坐薬では伝統的なバインダーおよび担体は、例えば、ポリアルカレングリコールおよびトリグリセリドを含むことができ；そのような坐薬は約０．５％から約１０％、好ましくは約１％から約２％の範囲の有効成分を含有する混合物から形成することができる。経口処方は、例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、維持放出処方または粉末の形態をとり、約１０％から約９５％、好ましくは約２５％から約７０％の有効成分を含有する。
【０３３２】
ＭＤＡ−７蛋白質（またはその断片）あるいはＭＤＡ−７の全てまたは一部をコードする核酸は中性または塩形態で処方することができる。医薬上許容される塩は（ペプチドの遊離アミノ基とで形成された酸付加塩、および、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などのような有機酸とで形成されたものを含む。また、遊離カルボキシル基とで形成された塩は、例えば、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来することもできる。
【０３３３】
ある処方においては、ＭＤＡ−７結合剤は乾燥粉末として処方される。当該プロセスについて、純粋な炭水化物の代わりに酪農副産物の形態である接近可能な安価な原料を容易に用いることができるのは本発明のさらなる目的である。これらの目的は、蛋白質コロイドおよび二糖を含有するビタミンＥ乾燥粉末の調製用のプロセスによって達成できることが判明し、ここに、引用して援用する米国特許第４、２６２、０１７号に記載されているように、ビタミンＥエステルを、カゼイネートの残存液体の固体含有量に基づいて、２ないし３０重量％の存在下で、ラクトースの生産からの、アルカリ土類金属イオンが被覆、ラクトースが豊富な残存液体に分散させ、該分散液を噴霧乾燥する。該プロセスは、良好なフレーバーを有し、食品および動物試料用の添加剤として使用できる自由−流動ビタミンＥ乾燥粉末を与える。乾燥粉末は、さらに、良好な錠剤化特徴を有する。適当なビタミンＥエステルはｄ−およびｄ、ｌ−α−トコフェロールの慣用的エステルである。具体的な例はビタミンＥアセテート、ビタミンＥスクシネート、ビタミンＥパルミテートおよびビタミンＥニコチネートである。これらの中で、アセテートが好ましい。
【０３３４】
蛋白質、核酸、またはＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、またはビタミンＥ化合物を投与処方に適合した様式で、かつ治療的に効果的である量で投与される。投与すべき量は、例えば、癌の攻撃性、いずれかの腫瘍のサイズ、治療の以前のまたは他のコースを含めた治療すべき対象に依存する。投与するのに必要な有効成分の正確な量は実施者の判断に依存する。初期投与および引き続いての投与に適した養生法もまた可変的であるが、典型的には、初期投与、続いての他の投与である。そのような投与は、時間スパンニング１０、２０、３０、４０、５０、６０分、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４またはそれ以上の時間、および／または１、２、３、４、５、６、７日またはそれ以上の期間にわたって連続的に、単一用量としての全身投与であり得る。さらに、投与は、処方および／または投与の態様によって実施される時間放出または維持放出メカニズムを介するのであって良い。
【０３３５】
適用の方法は広く変化させることができる。投与のための慣用的方法のいずれも適用することができる。これらは、個体生理学的に許容される基剤上での経口適用、または注射による非経口の生理学的に許容される分散液中での適用を含むと考えられる。用量は投与の経路に依存し、宿主のサイズに従って変化するであろう。
【０３３６】
多くの場合において、治療剤（ＭＤＡ−７およびＣＯＸ−２阻害剤、Ｈｓｐ９０阻害剤、またはビタミンＥ化合物）の双方の各々の複数投与を有するのが望ましいであろう。
【０３３７】
Ｑ．組合せ治療
ある具体例において、本発明の組成物および方法は、ＭＤＡ−７の効果を増強させるための、あるいはＭＤＡ−７が使用されるいずれかの治療、診断または予後効果を増加させるための、ＭＤＡ−７結合剤または組成物を含めた他の剤と組み合わせた、ＭＤＡ−７ポリペプチド、またはそれをコードする発現構築体、およびＣＯＸ−２阻害剤またはＨｓｐ９０阻害剤いずれかを含む。これらの組成物は、所望の効果、例えば、癌細胞の殺傷および／または血管形成の阻害を達成するのに有効な組合せ量で提供されるであろう。このプロセスは、細胞を同時に発現構築体および該剤または複数因子と接触させることを含むことができる。これは、同時に、細胞を、双方のまたは全ての剤を含む単一組成物または薬理学的処方と接触させることによって、あるいは細胞を２以上の区別される組成物または処方と接触させることによって達成することができ、ここに、１つの組成物は１）（蛋白質または核酸いずれかとしての）ＭＤＡ−７；および／または２）ＣＯＸ−２阻害剤またはＨｓｐ９０阻害剤（または他のＭＤＡ−７結合剤）のいずれか；および／または３）第３の剤を提供する。
【０３３８】
本発明の具体例において、ｍｄａ−７遺伝子（またはｃＤＮＡ）または蛋白質療法は、第二のまたは他の抗癌剤または療法に加えて、（「ＭＤＡ−７／ＣＯＸ−２阻害剤療法」といわれる）ＣＯＸ−２阻害剤と組み合わせて用いることが考えられる。他の具体例において、ｍｄａ−７遺伝子（またはｃＤＮＡ）または蛋白質療法は、第二のまたは他の抗癌剤または療法に加えて、（「ＭＤＡ−７／Ｈｓｐ９０療法」といわれる）Ｈｓｐ９０阻害剤と組み合わせて用いることが考えられる。別法として、ＭＤＡ−７／ＣＯＸ−２阻害剤療法またはＭＤＡ−７／Ｈｓｐ９０阻害剤療法は、数分ないし数週間の範囲の間隔だけ他の抗癌治療に先行し、またはその後にすることができる。ＭＤＡ遺伝子または蛋白質療法を、ＣＯＸ−２阻害剤またはＨｓｐ９０阻害剤から別々に患者に提供する具体例において、一般には、２つの化合物が依然として患者に対して有利に組み合わせた効果を発揮できるように、有意な時間が各送達の時間の間に過ぎないことを確実とする；別法として、ＭＤＡ−７／ＣＯＸ−２阻害剤療法またはＭＤＡ−７／Ｈｓｐ９０阻害剤療法が第二の抗癌療法とは別々に患者に提供される具体例において、一般には、２つの療法が、依然として、患者に対して有利に組み合わせられた効果を発揮できるように、有意な時間が各療法の時間の間に過ぎないことを確実とする。そのような例においては、患者に、相互から約１２ないし２４時間以内に、より好ましくは相互から約６ないし１２時間以内に１）ＭＤＡ−７／ＣＯＸ−２阻害剤療法または２）ＭＤＡ−７／Ｈｓｐ９０阻害剤療法および第二の抗癌療法いずれかを提供することができる。いくつかの状況においては、治療のための時間を有意に延長するのが望ましいであろう、しかしながら、数日（２、３、４、５、６または７）ないし数週間（１、２、３、４、５、６、７または８）が各投与の間に経過する。ＣＯＸ−３阻害剤またはＨｓｐ−９０阻害剤の代わりに、本発明はもう１つのＭＤＡ−７結合剤の関係で実施することができる。
【０３３９】
ある具体例においては、治療のコースは
【０３４０】
【化１０】
2008531481.tif 000015
日またはそれ以上継続するであろう。１つの剤は日
【０３４１】
【化１１】
2008531481.tif 000016
および／または９０、そのいずれかの組合せにて投与することができ、もう１つの剤は日
【０３４２】
【化１２】
2008531481.tif 000017
および／または９０、またはそのいずれかの組合せにて投与されると考えられる。１日（２４時間）内に、患者は１または複数の剤の投与を受けることができる。さらに、治療のコースの後に、抗癌治療を投与しない時点があると考えられる。この時点は、その予後、強さ、健康等のような患者の状態に依存して、１、２、３、４、５、６、７日および／または１、２、３、４、５週間、および／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日またはそれ以上継続することができる。
【０３４３】
種々の組合せを使用することができ、例えば、ＭＤＡ遺伝子または蛋白質療法は「Ａ」であって、ＭＤＡ−７結合剤は「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ｂ    Ｂ／Ｂ／Ａ    Ａ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ｂ／Ｂ    Ｂ／Ａ／Ａ    Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ    Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ    Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ    Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ    Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ    Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ    Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ    Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ    Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ。
【０３４４】
別法として、「Ａ」はＭＤＡ−７／結合剤療法の投与であり得、「Ｂ」は第二の抗癌療法の投与であり得る。他の具体例において、ＭＤＡ−７遺伝子または蛋白質療法は「Ａ」であって、ＭＤＡ−７結合剤は「Ｂ」である；あるいは「Ａ」はＭＤＡ−７／ＭＤＡ−７結合剤療法の投与であり得、「Ｂ」は第二の抗癌療法の投与であり得る。
【０３４５】
患者への本発明のいずれかの化合物または療法の投与は、もしあれば、ベクターまたはいずれかの蛋白質または他の剤の毒性を考慮し、そのような化合物の投与についての一般的なプロトコルに従うであろう。従って、いくつかの具体例において、ＣＤＡ−７および／またはＭＤＡ−７結合剤に帰属できる毒性をモニターする工程がある。治療サイクルは必要であれば反復されると予測される。また、種々の標準的療法、ならびに外科的介入は、記載された療法と組み合わせて適用することができると考えられる。
【０３４６】
特別な具体例において、化学療法、放射線療法、免疫療法または他の遺伝子治療のような第二の抗癌療法を、例えば、本明細書中に記載された、ＭＤＡ−７／ＣＯＸ−２阻害剤療法またはＭＤＡ−７／Ｈｓｐ９０阻害剤療法またはいずれかの他のＭＤＡ−７結合療法と組み合わせて使用すると考えられる。
【０３４７】
１．化学療法
癌療法は化学および放射線ベースの治療双方との種々の組合せ療法も含む。組合せ療法は、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロデタミン、シクロフォスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルフォアラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシル−蛋白質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセート、あるいは前記のいずれかのアナログまたは誘導体変種を含む。
【０３４８】
２．放射線療法
マイクロ波、プロトンビーム照射（米国特許第５、７６０、３９５号および米国特許第４、８７０、２８７号）およびＵＶ−照射のような、ＤＮＡ損傷を引き起こし、広く用いられてきた他の因子は、腫瘍細胞へのγ−線、Ｘ−線および／または放射性同位体の指向性送達として通常知られているものである。ＤＮＡ損傷因子の他の形態も考えられる。最もありそうには、これらの因子の全てはＤＮＡに対する、ＤＮＡの前駆体に対する、ＤＮＡの複製および修復に対する、および染色体の組立および維持に対する広い範囲の損傷を行う。Ｘ−線についての用量範囲は長時間の（３ないし４週間の）５０ないし２００レントゲンの日用量、ないし２０００ないし６０００レントゲンの単一用量の範囲である。放射性同位体についての用量範囲は広く変化し、同位体の半減期、発せられる放射線の強度およびタイプ、および新形成細胞による取込に依存する。
【０３４９】
用語「接触された」および「暴露された」は、細胞に適用される場合、本明細書においては治療構築体および化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達され、標的細胞に直接近接するように置かれるプロセスを記載するのに用いる。細胞殺傷を達成するためには、例えば、双方の剤を、細胞を殺傷し、またはそれが分裂するのを妨げるのに有効な組合せ療法にて細胞に送達される。
【０３５０】
３．免疫療法
癌治療の関係では、免疫療法剤は、一般には、癌細胞を標的化し、それを破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。トラスツズマブ（ＨｅｒｃｅｐｔｉｎＴＭ）はそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体は単独で療法のエフェクターとして働くことができるか、あるいはそれは他の細胞を動員して、細胞殺傷を現実に行うことができる。抗体は薬物またはトキシン（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラトキシン、１００日咳トキシン等）にコンジュゲートさせ、単に標的化剤として提供することができる。別法として、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的にまたは間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってヨい。種々のエフェクター細胞は細胞傷害性Ｔ細胞およびＭＫ細胞を含む。治療様式の組合せ、すなわち、直接的細胞傷害性活性およびＥｒｂＢ２の阻害または低下は、ＥｒｂＢ２過剰発現癌の治療において治療的利点を提供するであろう。
【０３５１】
もう１つの免疫療法もまた、ＭＤＡ−７／ＣＯＸ−２阻害剤療法ＭＤＡ−７／Ｈｓｐ９０阻害剤療法との組合せ療法の一部として用いることもできる。組合せ療法のための一般的アプローチは後に議論する。免疫療法の１つの態様において、腫瘍細胞は、標的化できる、すなわち、他の細胞の大部分に存在しないいくつかのマーカーを担わなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかは本発明の関係で標的化に適しているであろう。通常の腫瘍マーカーは癌胚性抗原、前立腺特異的抗原、子宮腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、Ｓｉａｌｙｌ  Ｌｅｗｉｓ  Ａｎｔｉｇｅｎ、  ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５を含む。免疫療法の代替態様は、抗癌効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ガンマ−ＩＦＮのようなサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８のようなケモカイン、およびＦＬＴ３リガンドのような成長因子を含めた、免疫刺激因子も存在する。ＭＤＡ−７のような腫瘍サプレッサーと組み合わせた、蛋白質としての、または遺伝子送達を用いる、免疫刺激分子の組合せは、抗−腫瘍効果を増強することが示されている（Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。
【０３５２】
しかしながら、これらの化合物のいずれかに対する抗体を用いて、ここに議論する抗癌剤を標的化することができる。
【０３５３】
先に議論したように、現在調査中であるか、または用いられている免疫療法の例は免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、ジニトロクロロベンゼンおよび芳香族化合物（米国特許第５、８０１、００５号；米国特許第５、７３９、１６９号；  ＨｕｉおよびＨａｓｈｉｍｏｔｏ、１９９８；Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）、サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、βおよびγ；ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ（Ｂｕｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｈｅｌｌｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９８）、遺伝子治療、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ｐ５３（Ｑｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ａｕｓｔｉｎ−ＷａｒｄおよびＶｉｌｌａｓｅｃａ、１９９８；米国特許第５、８３０、８８０号および米国特許第５、８４６、９４５号）およびモノクローナル抗体、例えば、抗−ガングリオシドＧＭ２、抗−ＨＥＲ−２、抗−ｐ１８５；Ｐｉｅｔｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｈａｎｉｂｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；米国特許第５、８２４、３１１号）である。ヘルセプチン（トラスツズマブ）は、ＨＥＲ２−ｎｅｕ受容体をブロックするキメラ（マウス−ヒト）モノクローナル抗体である。それは抗−腫瘍活性を保有し、悪性腫瘍の治療で用いるのに認可されてきた（Ｄｉｌｌｍａｎ、  １９９９）。１以上の抗癌療法を本明細書中で記載されたＭＤＡ−７療法と共に使用することができると考えられる。
【０３５４】
癌の受動的免疫療法のための多数の異なるアプローチが存在する。それらは広く以下のようにカテゴリーに分けることができる：抗体単独の注射；トキシンまたは化学療法剤に結合された抗体の注射；放射性同位体に結合された抗体の注射；抗−イディオタイプ抗体の注射；および、最後に、骨髄における腫瘍細胞のパージング。
【０３５５】
４．遺伝子治療
なおもう１つの具体例において、組合せ療法は遺伝子治療を含み、そこでは、治療剤ポリヌクレオチドがＭＤＡ−７ポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸の前に、後に、またはそれと同時に投与される。もう１つの遺伝子産物をコードするベクターと組み合わせた、ＭＤＡ−７ポリペプチドまたはコーディング核酸の送達は、標的組織に対して組み合わせ療法効果を有することができる。
【０３５６】
５．外科的処置
癌を持つ個人のほぼ６０％がいくつかのタイプの外科的処置を受け、これは、予防的、診断的またはステージング、治癒的および軽減的外科的処置を含む。治癒的外科的処置は癌治療であり、これは、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法のような他の療法と組み合わせて用いることができる。
【０３５７】
治癒的外科的処置は切除を含み、そこでは、癌性組織の全てまたは一部が物理的に除去され、切り出され、および／または破壊される。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去をいう。腫瘍切除に加えて、外科的処置による治療はレーザー外科的処置、低温外科的処置、電子外科的処置および微視的に制御された外科的処置（Ｍｏｈｓの外科的処置）を含む。さらに、本発明は、表層癌、正常組織のプレ癌または発生量の除去と組み合わせて用いることができると考えられる。
【０３５８】
癌性細胞、組織または腫瘍の全ての一部の切り出しに際して、キャビティーを身体中に形成することができる。治療は、当該領域のさらなる抗癌療法での灌流、直接的注射または局所的適用によって達成することができる。そのような治療は、例えば、１、２、３、４、５、６、７日毎に、または１、２、３、４および５週間毎に、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１または１２ヶ月毎に反復することができる。これらの治療は同様に変化させる容量のものとすることができる。
【０３５９】
６．ホルモン療法
また、ホルモン療法を本発明と組み合わせて、あるいは先に記載されたいずれかの他の癌療法と組み合わせて用いることができる。ホルモンの使用は、乳房、前立腺、卵巣または頸部癌のようなある種の癌の治療で使用して、テストステロンまたはエストロゲンのようなある種のホルモンのレベルを降下させ、またはその効果をブロックすることができる。この治療は、しばしば、治療オプションとしての、または転移の危険性を低下させるための、少なくとも１つの他の癌療法と組み合わせて用いる。
【実施例】
【０３６０】
Ｒ．実施例
以下の実施例は本発明の好ましい具体例を示すために含める。以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施においてよく機能させるための本発明者らによって発見された技術を表し、かくしてその実施のための好ましい態様を構成すると考えることができるのは当業者によって認識されるべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示に徴して、本発明の精神および範囲を逸脱することなく、多くの変形を開示された特別な具体例でなして、依然として、類似のまたは同様の結果を得ることができるのを認識すべきである。
【０３６１】
実施例１
セレコキシブおよびＡＤ−ＭＤＡ７での相乗的殺腫瘍効果
Ａ．材料および方法
１．細胞系
上昇したレベルのＨＥＲ−２／ｎｅｕ（ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８細胞）を発現するように作成されたエストロゲン受容体陽性ＭＣＦ７細胞はＭｉｅｎ−Ｃｈｉｅ  Ｈｕｎｇ博士からの贈物であった。エストロゲン受容体陰性およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ−非過剰発現ＭＤＡ−ＭＢ−４３６ヒト乳癌細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、  Ｍａｎａｓｓａｓ、  Ｖｅｒｇｉｎｉａ）から入手した。細胞は、湿潤化３７℃、５％ＣＯ２雰囲気中で、１０ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、  Ｇｒａｎｄ  ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を含む１０％胎児ウシ血清を補足した高グルコースＤＭＥＭ／Ｆ−１２培地中に維持した。
【０３６２】
２．アデノウィルス形質導入およびセレコキシブ治療
ｍｄａ−７遺伝子（Ａｄ−ｍｄａ７）およびルシフェラーゼレポーター遺伝子（ＡＤ−ｌｕｃ）はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）から入手した。１００−ＭＭ培養プレート中の１ｘ１０６細胞を、各々、ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８およびＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞系について細胞当たり２０００または１０００ウィルス粒子（ｖｐ）（１００または５０プラーク−形成単位／細胞）のＭＯＩにてＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃで形質導入した。セレコキシブをＤＭＳＯに溶解させ、（細胞生存に影響しないように）０．１％未満の最終濃度にて細胞培養基に加え−次いで、各々、ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８およびＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞について２０または５０μＭの用量にて培養に導入した。ベクターおよびセレコキシブの用量は５０％未満の毒性を確保して、Ａｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブのコンビナトーリアル効果を比較した。
【０３６３】
３．細胞増殖アッセイ
ヒト乳癌細胞増殖に対するセレコキシブおよびＡｄ−ｍｄａ７の効果は、トリパンブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏ．、  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）排除およびＭＴＴ（臭化３−［４、５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２、５−ジフェニルテトラゾリウム）（Ｓｉｇｍａ、  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）アッセイの後に、細胞カウンティングによって決定した。簡単に述べれば、細胞を６０−ｍｍ培養プレート当たり６×１０５細胞の密度にて蒔いた。２４時間後に、培地を除去し、セレコキシブを含むまたは含まない培養基を計画通り加え、記載したようにウィルス形質導入を行った。７２時間のインキュベーション後に、浮遊するおよび接着性細胞を収穫し、ヘモサイトメーターを用いて組み合わされた細胞集団をカウントした。細胞生存率はトリパンブルー排除染色によって測定した。ＭＴＴアッセイでは、１，０００細胞を９６−ウェルプレートに三連で蒔き、７２時間後にアッセイした。インキュベーションの後に、細胞をＤＭＳＯで固定し、ＭＴＴ溶液（５ｍｇ／ｍｌ）で染色した。吸光度を自動分光光度計ミニプレートリーダー（ＥＬ８０８  Ｕｌｔｒａｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ、  Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、  Ｉｎｃ．、  Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、  ＶＴ）で５７０ｎｍにおいて読んだ。値を正規化し、対象細胞と比較してパーセンテージ変化としてプロットした（平均値±Ｓ．Ｅ．Ｍ．）。
【０３６４】
４．細胞周期およびアポトーシスアッセイ
全ての培養は収穫の時点において密集下であった。収穫された細胞を氷冷８０％エタノールで固定し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（Ｓｉｇｍａ、  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、  ＭＯ）で染色し、従前に記載したように、フローサイトメーター（ＦＣＭ）（ＥＰＩＣＳ  ＸＬ−ＭＣＬ、Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｍｉａｍｉ、ＦＬ）を用いて分析した。培地中に浮遊する細胞、およびトリプシン処理した接着性細胞を収穫し、ペレット化した。集めた細胞を洗浄し、次いで、アネキシンＶ／ＦＩＴＣアポトーシス検出キット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ、ＮＪ）を用い、アネキシンＶ−フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）／ＰＩで染色した。製造業者のプロトコルに従い、ＢｒｄＵ（５−ブロモ−２−デオキシウリジン）／ターミナルでオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）−媒介２’−デオキシウリジン５’−３リン酸（ｄＵＴＰ）−ビオチンニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイ（ＡＰＯ−Ｄｉｒｅｃｔ、  ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、  Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅ、  ＮＪ）を行った。簡単に述べれば、パラホルムアルデヒド−固定細胞を洗浄し、染色溶液（１０μｌのＴｄＴ反応緩衝液、０．７５μｌのＴｄＴ酵素、および８μｌのＦＩＴＣ−ｄＵＴＰ）と共に一晩インキュベートした。翌日、細胞を濯ぎ、１ｍｌのＰＩ／ＲＮａｓｅ溶液に再懸濁させた。室温での３０分間の暗所でのインキュベーションに続き、フローサイトメトリーを行って、アポトーシス細胞のパーセンテージを得た。細胞周期を、ＦＣＭ（Ｍｕｌｔｉｃｙｃｌｅ、  Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｆｌｏｗ  Ｓｙｓｔｅｍ、  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  ＣＡ）と組み合わせたプログラムで解析した。
【０３６５】
５．プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）測定
ＰＧＥ２の濃度を測定するために、細胞を１×１０６細胞／１００−ｍｍプレートの密度にて蒔き、セレコキシブ、Ａｄ−ｍｄａ７、または双方の剤の組合せで処理した。７２時間のインキュベーションの後、３μｌのアラキドン酸（１ｍＭ）を培養基に加えて、ＰＧＥ２生産を３０分間増強させた。上清を集め、製造業者のマニュアルに従い、酵素−結合免疫アッセイキット（Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、  ＭＩ）を用いてＰＧＥ２濃度を測定するまで−８０℃で貯蔵した。三連値からの最終結果をｐｇ／ｍｌとして表した。
【０３６６】
６．ウェスタンブロッティング
ＢｉｏＲａｄアッセイ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、  ＣＡ）を用い、細胞を溶解させ、蛋白質濃度を測定した。１０％ＳＤＳゲルを用いるウェスタンブロット分析によって、溶解物を分析した。レーンに５０μｇの蛋白質を負荷し、９０Ｖにおいて２時間電気泳動を行った。細胞をニトロセルロース膜に移し、これを５％無脂肪乾燥乳でブロックし、一次抗体（ＣＯＸ−２  （Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、  Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、  ＭＩ）、β−カテニン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．、  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、  ＣＡ）、Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、  Ｂｅｖｅｒｌｙ、  ＭＡ）およびｐ−Ａｋｔ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、  Ｂｅｖｅｒｌｙ、  ＭＡ））と共に４℃にて一晩インキュベートした。膜を洗浄し、二次抗体と共に室温にて１時間インキュベートした。次いで、膜を発色させ、増強されたケミルミネセンス（ＥＣＬ）ウェスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、  Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、  ＵＫ）を用いて蛋白質シグナルを検出した。膜をβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、  ＣＡ）に対する抗体と共にインキュベートして、同等な蛋白質負荷を評価した。結果をデンシトメトリーに付した。
【０３６７】
７．統計学的解析
統計学的解析を対照および処理群の間、および異なる実験群の間で行った。平均の比較はスチューデントのｔ検定を用いて行った。ウェスタンブロットのデンシトメトリーは、スチューデントのｔ検定によって優位性について分析した。ｐ＜０．０５の値を持つ差は統計学的に有意であると考えた。
【０３６８】
Ｂ．結果
１．Ａｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブ共処理は乳癌細胞の成長を阻害する。
【０３６９】
Ａｄ−ｍｄａ７および／またはセレコキシブで処理した後、トリパンブルー排除およびＭＴＴアッセイを用いて細胞生存率を評価した。ＭＴＴアッセイを用いる図１に示すように、組合せ治療群は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕの発現状態にかかわらず、対照と比較して、４８時間および７２時間のインキュベーションの後に有意に減少した細胞生存率を示した。
ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（＋）細胞は、２４時間処理後におけるＡｄ−ｍｄａ７および組合せ治療の間の生細胞の数の差（ｐ＝０．０４）、４８時間の処理後における対照と比較した組合せ群における生存率の有意な減少（ｐ＝０．０４５）を示し、全ての処理群は対照と比較して生存の統計学的に有意な減少を示した（セレコキシブについてｐ＝０．００２、Ａｄ−ｍｄａ７についてｐ＝０．０２、および組合せについてのｐ＝０．００９）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（−）細胞は２４時間後に群の間で差を示さなかったが、組合せは対照と比較して差を示し始めた（ｐ＝０．０４９）。組合せ治療およびＡｄ−ｍｄａ７治療はセレコキシブよりもＨＥＲ２／ｎｅｕ（−）細胞を殺傷するにおいてより効果的なように見え（各々、ｐ＝０．０３およびｐ＝０．０２）、組合せは２日において腫瘍細胞殺傷でＡｄ−ｍｄａ７よりも優れていた（ｐ＝０．０２）。
【０３７０】
７２時間の処理の後に、Ａｄ−ｍｄａ７は対照よりも効果的であり（ｐ＝０．０２）、組合せは細胞傷害性においてセレコキシブよりも優れていた（ｐ＝０．０１）。トリパンブルー排除を用いる図２に示すように、セレコキシブおよび組合せ治療は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（＋）細胞における対照と比較して腫瘍細胞殺傷数においてより大きな効率を示した（各々、ｐ＝０．０４およびｐ＝０．０１）。ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８細胞における３つの処理群の間で、セレコキシブまたはＡｄ−ｍｄａ７はいずれも組合せと比較して増大した細胞傷害性を示した（ｐ＝０．０１）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞において、組合せ処理は対照、Ａｄ−ｍｄａ７、またはセレコキシブと比較して最も効果的な処理アームであった（各々、ｐ＝０．０１、０．０１および０．０１）。ＰＧＥ２生産に対する組合せの治療効果もまたそれらの細胞において測定した（表４）。再現性良く、組合せは対照と比較してＰＧＥ２生産のより大きな阻害を示した（ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（＋）についてはｐ＝０．０１、およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ（−）細胞についてはｐ＝０．０４９）。ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞における単一療法Ａｄ−ｍｄａ７での治療は、ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８細胞で見出される顕著な減少（ｐ＝０．０４）と比較して、生じたＰＧＥ２の量において有意な減少を示さなかった（ｐ＝０．０６）。セレコキシブは双方の細胞系においてＰＥＧ２生産を低下させた（ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８についてはｐ＝０．０３、およびＭＤＡ−ＭＢ−４３６）についてはｐ＝０．０４９）。
【０３７１】
【表４】
2008531481.tif 000018
２．Ａｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブ組合せは個々の処理と比較してアポトーシスを増大させる。
【０３７２】
腫瘍細胞系を用いる従前の研究は、Ａｄ−ＭＤＡ７がＧ２／Ｍ細胞周期阻止を誘導し、他方、セレコキシブがＧ１ブロックを誘導することを示した。Ａｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブ組合せは細胞周期のＧ１期においてＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８細胞をブロックし（ｐ＝０．０３）、セレコキシブ単独によって媒介されるＧ１ブロックよりも有意により顕著であった。ＨＥＲ２／ｍｅｕ−細胞において、組合せ治療の結果、セレコキシブまたはＡｄ−ｍｄａ７と比較してＳ−相における細胞の増大をもたらした（図３）。ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８およびＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞において、セレコキシブはＡｄ−ＭＤＡ７よりもＧ１チェックポイントにおいてより多くの細胞をブロックし（ｐ＝０．０２）、他方、Ａｄ−ｍｄａ７単一療法の結果、Ｇ２／Ｍブロックをもたらした（図３）。
【０３７３】
初期および後期アポトーシス事象はアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＴＵＮＥＬアッセイを用いて評価し（図４）；双方のアッセイは、単独療法または対照と比較して、組合せ治療によって誘導されるアポトーシスの有意な増加を示した。さらに、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現状態にかかわらず増大したアポトーシスが観察された（ｐ＜０．０５）。セレコキシブおよびＡｄ−ｍｄａ７はアネキシンＶ／ＦＩＴＣアッセイによって双方の細胞系においてアポトーシスを促進した（ｐ＜０．０５）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕ（＋）細胞におけるＴＵＮＥＬと比較した増大したアネキシンＶ染色は、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６と比較してＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８細胞におけるアポトーシスのより迅速なキネティックスを反映するようである。
【０３７４】
３．Ａｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブ組合せはＣＯＸ−２、Ａｋｔおよびｐ−Ａｋｔの発現を減少させる。
【０３７５】
Ａｄ−ｍｄａ７処理はＡｋｔおよびｐ−Ａｋｔの発現を負に調節することが知られている（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．）。同様な効果は、Ａｄ−ｍｄａ７形質導入後にβ−カテニン発現で観察された。Ａｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブの組合せ後における代表的なプロ生存マーカーの発現に対するＡｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブの役割を解明するために、ウェスタンブロットを行って、ＣＯＸ−２、Ａｋｔ、ｐ−Ａｋｔ、およびβ−カテニンの定常状態レベルを分析した。
【０３７６】
Ａｋｔおよびｐ−Ａｋｔのレベルはウェスタンブロッティング分析およびデンシトメトリーによって測定した。ＨＥＲ２−（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６）およびＨＥＲ２＋（ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８）細胞は、対照（ＰＢＳ）と比較して、組合せ処理後においてＡｋｔおよびｐ−Ａｋｔの有意に減少した発現を示した。ＨＥＲ２＋細胞におけるＡｋｔについての相対的デンシトメトリー数はセレコキシブ（１．０１）、Ａｄ−ｍｄａ７（０．９９）および双方（０．５３＊）（＊ｐ＜０．０５）であった。ＨＥＲ２＋細胞におけるｐＡｋｔについての相対的デンシトメトリー数はセレコキシブ（０．６１＊）、Ａｄ−ＭＤＡ７（１．８５）および双方（０．３６＊）（＊ｐ＜０．０５）であった。ＨＥＲ２−細胞におけるＡｋｔについての相対的デンシトメトリー数はセレコキシブ（０．７２）、Ａｄ−ｍｄａ７（１．００）および双方（０．４４＊）（＊ｐ＜０．０５）であった。ＨＥＲ２−細胞におけるｐＡｋｔについての相対的デンシトメトリー数はセレコキシブ（０．６７）、Ａｄ−ｍｄａ７（１．６１）および双方（０．３７＊）（＊ｐ＜０．０５）であった。
【０３７７】
ＣＯＸ−２の相対的レベルはウェスタンブロッティング分析およびデンシトメトリーによって測定した。ＨＥＲ２−（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６）およびＨＥＲ２＋（ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８）細胞は、対照（ＰＢＳ）と比較して、組合せ処理後にＣＯＸ−２の有意に減少した発現を示した。ＨＥＲ２＋細胞におけるＣＯＸ−２についての相対的デンシトメトリー数はセレコキシブ（０．５３）、Ａｄ−ｍｄａ７（０．７８）および双方（０．５３＊）（＊ｐ＜０．０５）であった。ＨＥＲ２−細胞におけるＣＯＸ−２についての相対的デンシトメトリー数はセレコキシブ（０．７４）、Ａｄ−ｍｄａ７（０．７８）および双方（０．４５＊）（＊ｐ＜０．０５）であった。
【０３７８】
β−カテニンの相対的レベルはウェスタンブロッティング分析およびデンシトメトリーによって測定した。ＨＥＲ２−（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６）およびＨＥＲ２＋（ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８）細胞はβ−カテニンの発現において有意な差を示さなかった。ＨＥＲ２＋細胞におけるβ−カテニンについての相対的デンシトメトリー数はセレコキシブ（０．７８）、Ａｄ−ｍｄａ７（０．６４）および双方（０．８５）であった。ＨＥＲ２−細胞におけるβ−カテニンについての相対的デンシトメトリー数はセレコキシブ（０．８２）、Ａｄ−ｍｄａ７（０．９７）および双方（０．６１）であった。
【０３７９】
Ａｋｔ、ｐ−ＡｋｔおよびＣＯＸ−２の有意に減少したレベルは、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ発現にかかわらず、処理に続いて認められた（ｐ＜０．０５）。組合せ処理に続いて、セレコキシブは、ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８細胞における対照よりもＡｋｔのリン酸化を阻害するより優れた能力を示した（ｐ＝０．０４）。Ａｋｔの発現は、幾分、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞における対照と比較してセレコキシブによって抑制された（ｐ＝０．０５４）。Ａｄ−ｍｄａ７は双方の細胞系においてｐ−Ａｋｔを減少させたが、増加もまたＡｄ−ｌｕｃで観察され、これは、該効果がＭＤＡ−７蛋白質依存性でなかったことを示唆する。Ａｄ−ＭＤＡ７およびセレコキシブの組合せは対照と比較して＞７０％だけ、セレコキシブ単一療法と比較してほぼ５０％だけｐ−Ａｋｔを低下させた。Ａｄ−ＭＤＡ７およびセレコキシブは共にＣＯＸ−２発現を低下させ、さらなるＣＯＸ−２阻害がＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞における組合せによって見られた。Ａｄ−ＭＤＡ７およびセレコキシブは共にＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８細胞においてβ−カテニンを低下させ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３６細胞においてはβ−カテニンレベルをわずかに低下させたに過ぎなかった。該組み合わせは双方の細胞系においてβ−カテニンレベルを低下させ、しかしながら、ダウンレギュレーションは統計学的に有意でなかった。
【０３８０】
Ｃ．考察
Ａｄ−ｍｄａ７のユニークな特性は、癌細胞成長の阻害、および正常な細胞に影響することのないアポトーシスの誘導である（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３；  Ｐａｔａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００２；  Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９６；  Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０００）。腫瘍細胞殺傷を担うらしい癌細胞における他の作用メカニズムは、プロ生存メディエーターＡｋｔおよびリン酸化Ａｋｔのダウンレギュレーションである（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３；  ＭｃＫｅｎｚｉｅ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００４）。シクロオキシゲナーゼ２（ＣＯＸ−２）は、種々の種類のプロスタグランジンの生産のためのアラキドン酸を代謝することが必要な酵素の１つである。カスケードにおける他の酵素であるシクロオキシゲナーゼ１は細胞において構成的に発現されるが、ＣＯＸ−２は、それがしばしば腫瘍細胞において誘導され、またはアップレギュレートされる点で区別される。最近、種々の種類のヒト癌におけるＣＯＸ−２の増強された発現が認識されており、癌を予防しまたは治療するための選択的または非特異的ＣＯＸ−２阻害剤の役割を調べるための多くの調査に導く。アスピリンおよび他の非ステロイド抗−炎症薬物は多くの癌、特に結腸癌において化学予防の使用で有効性を示した（Ｓｔｅｉｎｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０００；  Ｔｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９１）。より最近、乳癌を含めた種々の癌を予防し、治療するにおいて、セレコキシブを含めた、選択的ＣＯＸ−２阻害剤の潜在的適用を調べる益々増大する数の報告があった（Ｂａｓｕ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００４；  Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３；  Ｈｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００２）。
【０３８１】
複雑なシグナル変換の中では、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔはアポトーシスおよび生存経路の調節におけるその役割についてかなりの注目を受けている（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３）。レトロウイルス癌遺伝子として最初に単離され、ＰＩ３Ｋはいくつかのヒト癌においてプロ生存経路を駆動する（Ｆｒｙ、２００１）。リン脂質の細胞内レベルによって調節されたセリン−スレオニンプロテインキナーゼであるＰＫＢ／Ａｋｔは、癌形成において鍵となる役割を演じるように見える（Ｋｎｕｅｆｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３）。セリン−スレオニンプロテインキナーゼであるＰＫＢ／ＡｋｔはＰＩ３Ｋの下流標的であるので、それは、種々のヒト癌においてＴｈｒ３０８およびＳｅｒ４７３におけるリン酸化によって増幅され、または活性化される（Ｍａｒｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｗｎｗａｒｄ、  １９９７）。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ生存経路は、ＮＦ−カッパＢ（ＮＦ−κＢ）シグナリング経路を調節し、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−誘導アポトーシスの誘導を抑制することが示されている（Ｂｕｒｏｗ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０００）。ＨＥＲ−２／ｎｅｕはＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ経路の活性化を促進し、次いで、それはＮＦ−κＢを活性化し、アポトーシスの阻害に至る。加えて、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔシグナリング経路は、トランスフォーミング成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）によって媒介される癌細胞移動を惹起することができる（Ｂａｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０００）。かくして、最近の調査は、種々の癌の治療におけるＡｋｔ活性の調節または阻害に焦点を当てている。優れたかつ選択的ＣＯＸ−２阻害剤の１つであるセレコキシブは、Ａｋｔ活性化の阻害を通じてイン・ビトロにて癌細胞においてアポトーシスを誘導したことが最近報告されている（Ｈｓｕ  ｅｔ  ａｌ．、  ２０００）。アデノウィルスベクターは、イン・ビトロおよびイン・ビボにて治療遺伝子を導入するのに首尾よく広く用いられてきた。
【０３８２】
Ａｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブの組合せはＡｋｔのリン酸化を減少させ、増強された殺腫瘍効果は、ＰＧＥ２およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ受容体発現の間の正のフィードバックループのためＨＥＲ−２／ｎｅｕ−過剰発現細胞においてより顕著であろうと予測されるであろう（Ｂｅｎｏｉｔ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００４）。事実、これらの実験は、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ−陽性およびＨＥＲ−２／ｎｅｕ−陰性乳癌細胞双方においてセレコキシブおよびＡｄ−ｍｄａ７を組み合わせることによって増強された抗−腫瘍活性を首尾よく示した。これはＣＯＸ−２発現の直接的阻害を介して、およびＰＩ３Ｋ／Ａｋｔプロ生存経路のダウンレギュレーションを通じて起こった。組合せにおけるＡｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブの使用は、いくつかの利点を提供することができ、これは、単一療法として効果的であるためにいずれかの剤で必要とされるものよりも低い用量においてアポトーシスおよび腫瘍細胞成長の阻害を増強させることを含む。
【０３８３】
実施例２
ＭＤＡ７およびセレコキシブでの放射線感受性化
Ａ．材料および方法
ＭＤＡ−ＭＢ−４３６およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８ヒト乳癌細胞（実施例１参照）を、Ａｄ−ＭＤＡ７単独、セレコキシブ単独、または双方の組合せでの予備処理と共に、またはそれなくして、照射に先立って３日間異なる用量の放射線に暴露した。細胞をクローン原性生存についてアッセイして、３つの異なる処理アームの放射線感受性化効果を比較した。フローサイトメトリーおよび細胞周期分析を行って、細胞周期の変化およびアポトーシスの誘導にアクセスした。統計学的解明はスチューデントのｔ−検定によって行った。
【０３８４】
Ｂ．結果
クローン原性生存アッセイは、Ａｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブの組合せは双方の乳癌細胞系において腫瘍細胞放射線感受性化を有意に増強させたことを示した。致死未満用量、セレコキシブ（ＭＢ４３６については５０μＭ、およびＭＢ４６８については３０μＭ）およびＡｄ−ｍｄａ７（ＭＢ４３６については１，０００およびＭＢ４６８については２、０００の感染多重度（ＭＯＩ））において、該組合せは双方の細胞系の有意に増強された放射線感受性を示した（ｐ＜０．０５）。対照と比較して組合せ療法群においてアポトーシス細胞の増大したパーセンテージがあるが、これは統計学的に有意ではなかった。細胞周期の分析は、対照と比較して組合せ群においてＧ２／Ｍ細胞周期の増加を示した。
【０３８５】
実施例３
ゲルダナマイシンおよびそのアナログでのＡｄ−ＭＤＡ７細胞殺傷の増強
Ａ．材料および方法
１．細胞系および試薬
Ａ５４９およびＨ４６０ヒト肺癌細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手した。全ての細胞は、３７℃の５％ＣＯ２雰囲気中で、１０％胎児ウシ血清、１０ｍＭグルタミン、１００単位／ｍＬペニシリン１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０中に維持した。ゲルダナマイシン（ＧＡ）はＣａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  ＣＡ）から入手した。１７−アリル−アミノゲルダナマイシン（１７ＡＡＧ）は親切にもＮｇｕｙｅｎ  Ｄａｏ博士（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、  Ｂｅｔｈｅｓｄａ、  ＭＤ）から供給された。１７ＡＡＧは１０−ｍＭストック溶液としてＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、  ＭＯ）中で処方Ｃ、−２０℃で貯蔵した。最終の作動溶液を培地中に希釈して、＜０．０１％のＤＭＳＯを含有させた。この化合物を用いる全ての実験は、和らげた照明条件下で行った。
【０３８６】
２．アデノウィルス生産
Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ＬａｃＺおよびＡｄ−Ｌｕｃベクターの構築は従前に報告されている（Ｐａｔａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００２）Ａ５４９およびＨ４６０癌細胞系におけるアデノウィルスベクターの変換効率は、細胞をＡｄ−ＬａｃＺで感染させ、次いで、細胞の少なくとも７０％変換するのに必要な力価を測定することによって決定した。
【０３８７】
３．フローサイトメトリー分析
細胞のアポトーシスは、ヨウ化プロピジウム染色およびＦＡＣＳ分析によって測定した。細胞を収穫し、遠心によってペレット化し、５０μｇ／ｍＬヨウ化プロピジウム、０．１％トリトンＸ１００、および０．１％クエン酸ナトリウムを含有するリン酸―緩衝化生理食塩水に再懸濁し、ＦＡＣＳ分析先立って渦巻かせた（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、  ＣＡ；  ＦＬ−３  ｃｈａｎｎｅｌ）。
【０３８８】
４．ウェスタンブロッド分析
トランスフェクションから４８時間後に、細胞抽出物を調製し、イムノブロピトアッセイを従前に記載されているように行った（Ｐａｔａｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００２）以下の抗体を用いた：ＰＫＲ（Ｋ−１７）、ＨＳＰ９０、β―カテニン、Ｅ−カドヘリン、Ｒａｆ−１、およびβ―アクチン抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎａｔａ  Ｃｒｕｚ、  ＣＡ）から購入した。ホスホ−ＰＫＲ［ｐＴ４５１］およびホスホ−ｅＩＦ−２α［ｐＳ５１］抗体はＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｉｔｏｎａｌ（ＢｉｏＳｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｉｔｏｎａｌ、  Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、  ＣＡ）から購入した。Ａｋｔおよびホスホ−Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）はＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ；  Ｂｅｖｅｒｌｙ、  ＭＡ）から購入した。ＭＤＡ−７に対するポリクローナルまたはモノクローナル抗体はＩｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ（Ｈｏｕｓｔｏｎ、  ＴＸ）から入手した。
【０３８９】
５．免疫蛍光分析
Ａ５４９細胞（５×１０４細胞／ウェル）を７０％密集までチャンバースライド上で成長させ、次いで、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、ＧＡ、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＧＡまたはＡｄ−ｌｕｃ＋ＧＡで処理した。４８時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、新たに作成した４％パラホルムアルデヒド／ＰＢＳで１５分間固定した。次いで、細胞を０．２％トリトンＸ−１００で４℃にて２０分間浸透させ、１％の正常なヤギ血清で１時間ブロックした。ヤギポリクローナル抗―ベータ−カテニンを４℃にて一晩インキュベートし、ローダミン二次抗体で３７℃にて３０分間発色させた。次いで、細胞を蛍光顕微鏡（Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５０蛍光顕微鏡）下で可視化した（Ｖｏｒｂｕｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（２００２））。
【０３９０】
６．免疫沈澱分析
細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＧＡまたはＧＡ単独で４８時間処理し、次いで、ＲＩＰＡ緩衝液（１×ＰＢＳ、１％Ｎｏｍｉｄｅｔ  Ｐ−４０、０．５％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％ＳＤＳ）中で溶解させた。５００μｌ（５００μｌ）の細胞溶解物を一次抗体と共に４℃にて一晩インキュベートした。プロテインＡ−Ｇアガロースをミックスに加え、４時間インキュベートした。ビーズを２５００ｒｐｍの遠心によって４℃にて５分間ペレット化した。ペレットを１ｍＬのＲＩＰＡ緩衝液で４回洗浄した。最後の洗浄の後、５０μｌの１×  ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液をビーズに加え、次いで、それを渦巻かせ、５分間煮沸した。次いで、上清をゲルに負荷する前に１分間に、２５００ｒｐｍで遠心した。
【０３９１】
７．移動性アッセイ
培地（０．７ｍｌ）を２４−ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルに加えた。細胞培養インサート（Ｆｉｓｈｅｒ；  ８  μｍ  ポアサイズ、  Ｆａｌｃｏｎ  ３０９７）を各ウェルに入れた。Ａ５４９およびＨ４６０細胞を５×１０５細胞／ｍｌの濃度に調整し、５００μｌの細胞を各インサートに入れた。細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、ＧＡ、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＧＡおよびＡｄ−ｌｕｃ＋ＧＡと共に３６時間インキュベートした。３６時間後に、ウェルの底部に接着した細胞の数をカウントした。移動度が、３６時間後にウェルに接着する薬物―フリーのウェル中の細胞の数のパーセンテージとして表す。
【０３９２】
８．統計学的分析
報告されたデータは、３以上の独立した実験の平均を表し、棒線は標準偏差（ＳＤ）を示す。ＡＮＯＢＡおよび両側スチューデントｔ検定を、各々、複数の群の統計学的分析および対、様式比較のために用い、Ｐは＜０．０５有意と考えられた。
【０３９３】
Ｂ．結果
１．ゲルダナマイシン（ＧＡ）は、ヒト肺癌細胞においてアデノウィルスｍｄａ―７媒介細胞殺傷を増強させる。
【０３９４】
多くの研究者らは、ゲルダナマイシン（ＧＡ）は乳癌および結腸癌細胞での細胞死滅を誘導できることを示した。ＧＡがヒト肺癌Ａ５４９およびＨ４６０細胞においてアポトーシスを誘導できるが否かを調べた。フローサイトメトリー分析は異なる用量のＧＡでの暴露から４８時間後にＡ５４９およびＨ４６０細胞系で行った。図５Ａは、ＧＡでの肺癌細胞の処理の結果、双方の細胞系において細胞死滅の高いパーセンテージが得られた。細胞死滅はこれらの癌細胞系においてＧＡによって誘導され用量−依存性であった。４８時間の５０ｎｍおよび１５０ｎｍ用量のＧＡと組み合わせたＡｄ−ｍｄａ７の効果をＡ５４９およびＨ４６０細胞系双方で調べた。フローサイトメトリー分析は、Ａｄ−ｍｄａ７単独の結果、各々、Ａ５４９およびＨ４６０細胞においてアポトーシスの１５および１２パーセンテージがもたらされた。５０ｎｍにおけるＧＡ単独の結果、４８時間において、各々、Ａ５４９およびＨ４６０細胞においてアポトーシスの６．３および５．７パーセンテージがもたらされた。１５０ｎｍにおけるＧＡ単独の結果、４８時間において、各々、Ａ５４９およびＨ４６０細胞においてアポトーシスの２３．６および２１パーセンテージがもたらされた。ＧＡおよびＡｄ−ｍｄａ７の組合せの結果、Ａ５４９（２５．３および４４％）およびＨ４６０（２１．７および３７．５％）細胞双方においてアポトーシス細胞の実質的増強がもたらされた（図５Ｂ）。アポトーシス効果のこの増強は、これらの癌細胞においてＧＡおよびＡｄ−ｌｕｃ組み合わせでは出現しない（図５Ｂ）。さらに、組合せ効果は各剤の加えられた効果よりも大きかった。
【０３９５】
２．Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡ組み合わせ処理はＰＫＲの発現を増加させない。
【０３９６】
本発明者らは、Ａｄ−ｍｄａ７がｄｓ−ＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）を誘導し、それを活性化することを従前に報告し、これは、肺癌細胞におけるｅＩＦ−２アルファのリン酸化およびアポトーシスの誘導に導く。従って、Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡ組み合わせ処理がＰＫＲの発現レベルおよびリン酸化状態を増大させるかをテストした。Ａｄ−ｍｄａ７で処理されたＡ５４９およびＨ４６０細胞は、ＰＫＲおよびリン酸化ＰＫＲの量の増加を呈した。対照的に、ＰＢＳ、ＧＡまたはＡｄ−ｌｕｃ処理の結果、ＰＫＲの、またはＰＫＲのリン酸化の増大はもたらされなかった。Ａｄ−ｍｄａ７とＧＡとの組合せは、Ａ５４９およびＨ４６０細胞双方においてＰＫＲレベルまたはそのリン酸化状態を増加させなかった。対照的に、これらの癌細胞のＧＡでの処理は立体配座成熟のためにＨｓｐ９０を必要とするＡＫＴ、Ｐ−ＡＫＴ、Ｒａｆ標的の分解を引き起こした。興味深いことには、Ａｄ−ｍｄａ７はＡＫＴを分解したが、同時に、Ａ５４９およびＨ４６０細胞双方においてＡＫＴのリン酸化状態を増大させた。Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡ共処理は、これらの癌細胞においてリン酸化ＡＫＴを有意に分解した。これらの結果は、ＡＫＴのＡｄ−ｍｄａ７媒介活性化の阻害が、部分的には、Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡの相乗効果に帰すことができることを示唆する。
【０３９７】
３．Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡの組合せは、肺癌細胞において、表面Ｅ−カドヘリンをアップレギュレートし、β−カテニン／Ｅ−カドヘリンの会合を増加させる。
【０３９８】
従前の報告は、Ａｄ−ｍｄａ７はヒト胚癌細胞においてＥ−カドヘリンをアップレギュレートできることを示した（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３）。本発明者らは、Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡの組合せがヒト肺癌細胞においてＥ−カドヘリンのアップレギュレーションを増強するか否かを調べた。図６Ａに示すように、Ａｄ−ｍｄａ７単独、およびＧＡ単独は、各々、抗−Ｅ−カドヘリンモノクローナル抗体を用いる表面染色およびフローサイトメトリーによって測定されるように、Ａ５４９およびＨ４６０細胞においてＥ−カドヘリンレベルを増大させる。ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、ＧＡ単独またはＡｄ−ｌｕｃ＋ＧＡ処理と比較して、Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡ（５０ｎｍ）組合せ処理は、これらの細胞においてＥ−カドヘリンのレベルをさらに増大させた。免疫蛍光染色は、Ａｄ−ｍｄａ７単独、およびＧＡ単独は、各々、Ａ５４９細胞においてβ−カテニンレベルを増大させることを示した。染色実験もまた、Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡ組合せがこれらの細胞においてβ−カテニンを顕著に増大させたことを示した。
【０３９９】
従前の研究もまた、ゲルダナマイシンがβ−カテニンのチロシン脱リン酸化を刺激でき、β−カテニン／Ｅ−カドヘリンの会合を増大させ、その結果、細胞移動度が実質的に減少したことを示した（Ｂｏｎｖｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００１）。従って、Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡの組合せがβ−カテニン／Ｅ−カドヘリンの会合を増大できるか否かを調べた。ＰＢＳ−、Ａｄ−ｍｄａ７−、ＧＡ−または組合せ−処理細胞は、まず、抗−Ｅ−カドヘリン抗体で免疫沈澱され、次いで、β−カテニン−特異的抗体で免疫ブロットされた。これは、Ｅ−カドヘリンで共沈殿されたβ−カテニンの量が、ＰＢＳ、Ａｄ−ｍｄａ７またはＧＡ単独で処理されたＡ５４９およびＨ４６０の両細胞において観察されたレベルと比較して、ＭＤＡ−７およびＧＡの組合せで処理された細胞において劇的に増大したことを示した。また、免疫沈澱を双方の細胞系において抗−Ｅ−カドヘリン抗体でイムノブロットした場合に、Ｅ−カドヘリンの同一レベルを検出することができた。
【０４００】
膜−会合β−カテニン−Ｅ−カドヘリン複合体の豊富性は細胞移動度に逆に関係するので、Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡの組合せがＡ５４９およびＨ４６０細胞の移動度を低下させることができたか否かをイン・ビトロで調べた。３６時間のイン・ビトロ移動度アッセイに加えると、Ａｄ−ｍｄａ７またはＧＡ（５０ｎＭ）単独は、トリパンブルー染色によって評価されるように、細胞生存率に影響することなく双方の細胞系において移動度を低下させた（図６Ｂ）。Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡの共処理の結果、Ａ５４９およびＨ４６０細胞双方において実質的に減少した細胞移動度がもたらされた（図６Ｂ）。この結果は、双方の細胞系においてＡｄ−ｌｕｃおよびＧＡで共処理した場合に出現しなかった（図６Ｂ）。
【０４０１】
次に、１７ＡＡＧ−ＧＡアナログが、ＭＤＡ−７で処理されたヒト胚癌細胞に対して同一効果を有することができるか否かを調べた。２つの異なる用量の１７ＡＡＧでの暴露から４８時間後に、フローサイトメトリー分析をＡ５４９およびＨ４６０細胞系で行った。図７は、１７ＡＡＧまたはＡｄ−ｍｄａ７単独での肺癌細胞の処理の結果、双方の細胞系で細胞死滅がもたらされた。Ａｄ−ｌｕｃおよび１７ＡＡＧの組合せと比較して、１７ＡＡＧおよびＡｄ−ｍｄａ７の組合せの結果、Ａ５４９およびＨ４６０細胞双方においてアポトーシスの有意な増強がもたらされた（図７）。
【０４０２】
実施例４
ビタミンＥスクシネート（ＶＥＳ）との組合せにおけるＡＤ−ＭＤＡ７成長阻害効果の増強
Ａ．材料および方法
１．細胞系および試薬
ヒト卵巣癌細胞ＭＤＡＨ２７７４は、ＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  ＣｅｎｔｅｒのＪｕｄｉｔｈ  Ｗｏｌｆ博士から入手した。正常な線維芽細胞の細胞系ＭＲＣ−９はＡＴＣＣから入手した。Ａｄ−ルシフェラーゼおよびＡｄ−ＭＤＡ７ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから得た（例えば、ここに引用して援用するＭｈａｓｉｈｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００１参照）。ビタミンＥスクシネートはＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、  ＭＯから入手した。
【０４０３】
２．成長阻害についてのアッセイ
ヒト卵巣癌細胞（ＭＤＡＨ２７７４）または正常なヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−９）をＡｄ−ｌｕｃ（ベクター対照）、トコフェロール（ビタミンＥスクシネート、８μｇ／ｍｌ）、Ａｄ−ｍｄａ７（２０００ｖｐ／細胞）またはその組合せで７２時間（３日）処理した。
【０４０４】
細胞を無血清培地中でＡｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で３時間感染させた。３時間のインキュベーションの後、細胞に完全培地を補充した。この時点において、ＤＭＳＯに溶解させたトコフェロールを８μｇ／ｍｌの最終濃度まで細胞に加えた。７２時間のインキュベーションの後、細胞を収穫し、トリパン排除方法によってパーセント成長阻害を測定した。
【０４０５】
３．ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析では、細胞溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５；１０ｍＭ  ＫＣＩ、１ｍＭ  ＭｇＣ１２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、２５０ｍＭスクロースおよび１×プロテアーゼ阻害剤）を加えることによってＡｄ−ｌｕｃ（ベクター対照）、トコフェロール（ビタミンＥスクシネート、８μｇ／ｍｌ）、Ａｄ−ｍｄａ７（２０００ｖｐ／細胞）またはその組合せによって処理されたＭＤＡＨ  ２７７４細胞から全蛋白質を単離した。蛋白質をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ナイロン膜上に固定化した。膜をカスパーゼ−９（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、  Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）、およびカスパーゼ３、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼＰＡＲＰ、Ｂｉｄ、およびカスパーゼ−８（ＢＤ−Ｐｈａｒｎｉｎｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  ＣＡ）；ＦａｓおよびＭＤＡ−７（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）；チトクロームＣ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、  ＣＡ）；およびβ−アクチンに対する一次抗体でプローブした。蛋白質の発現を、適当なホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−コンジュゲーテッド二次抗体を用いることによって測定し、Ａｍｅｒｓｈａｍの増強されたケミルミネセンスウェスタンブロッティング検出システムの適用によって、増強されたケミルミネセンスフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ、Ａｍｅｒｓｈａｍ）上で可視化した。
【０４０６】
４．細胞分画
従前に記載されているように、チトクロームＣ放出の検出のために、細胞を細胞質およびミトコンドリア画分に分画した（Ｇｅｗｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、  ６０：２１６３−２１６８、  ２０００）。簡単に述べれば、腫瘍細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、トコフェロール、またはその組合せで７２時間処理した。処理から７２時間後に、細胞をＰＢＳで洗浄し、掻き落としによって細胞を中部に集め、１００μｌの氷冷緩衝液Ｍ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  （ｐＨ７．５）、  １０ｍＭ  ＫＣＩ、  １．５ｍＭ  ＭｇＣ１２、  １ｍＭ  ＥＧＴＡ、  １ｍＭ  ＥＤＴＡ、  １ｍＭ  ＤＴＴ、  ２５０ｍＭ  Ｓｕｃｒｏｓｅ、  ０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、  ２μｇ／ｍｌ  ｐｅｐｓｔａｔｉｎ、  ２μｇ／ｍｌロイペプチン、および２μｇ／ｍｌアクロチニン）中で、テフロン（登録商標）ペッスル（氷上５０ストローク）を備えた小さなガラスホモゲナイザーでホモゲナイズした。ホモゲネートを１６，０００×ｇにて４℃で２０分間回転させ、上清（ミトコンドリア画分）および細胞ペレット（細胞質画分）を、ウェスタンブロット分析によってチトクロームｃを検出するために用いた。
【０４０７】
Ｂ．結果
１．卵巣癌細胞の成長阻害は、ビタミンＥ（トコフェロール）と組み合わせたＡｄ−ｍｄａ７での処理によって増強される。
【０４０８】
Ａｄ−ｍｄａ７成長阻害効果がビタミンＥによって増強できるか否かを判断するために、細胞をＡｄ−ｌｕｃ（ベクター対照）、トコフェロール（ビタミンＥスクシネート）、Ａｄ−ｍｄａ７またはその組合せで処理した。図８Ａに示すように、Ａｄ−ｍｄａ７とビタミンＥスクシネートとの組合せは、Ａｄ−ｍｄａ７またはビタミンＥスクシネート単独での処理と比較して、成長阻害を改良した。図８Ｂは、正常な線維芽細胞のＡｄ−ｍｄａ７およびビタミンＥでの処理が、Ａｄ−ｍｄａ７単独での処理の後に観察されたのを超えて成長阻害を増加させないことを示す。
【０４０９】
２．アポトーシスがＡｄ−ｍｄａ７およびビタミンＥ（トコフェロール）で処理された卵巣癌細胞において増加される指摘
ビタミンＥスクシネートと組み合わせたＡｄ−ｍｄａ７の改良された成長阻害効果がアポトーシスに帰することができるかを判断するために、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、ビタミンＥスクシネートまたはその組合せで処理されたヒト卵巣癌細胞においてウェスタンブロット分析を行った。この分析は、ＭＤＡ−７蛋白質の生産がビタミンＥスクシネートの存在下で大いに増強されることを明らかにした。ＭＤＡ−７蛋白質の増大した生産と合致して、ウェスタンブロット分析もまた、ビタミンＥスクシネートと組み合わせてＡｄ−ｍｄａ７で処理された癌細胞におけるアポトーシスのホールマークの増強された観察を明らかにした。具体的には、カスパーゼ−３、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、ＰＡＲＰ、およびＢｉｄの切断は、いずれかの試薬単独で処理された細胞と比較した場合、Ａｄ−ｍｄａ７およびビタミンＥスクシネートで処理された癌細胞においてかなりの程度観察された。加えて、減少されたチトクロームＣ蛋白質発現によって示されるミトコンドリアからのチトクロームＣの増強された放出もまた、Ａｄ−ｍｄａ７およびビタミンＥスクシネートで処理された細胞におけるアポトーシスの増大を示した。最後に、アポトーシス−関連Ｆａｓ蛋白質はいずれかの試薬単独よりもＡｄ−ｍｄａ７およびビタミンＥスクシネートで処理された癌細胞においてより容易に検出された（図９）。
【０４１０】
実施例５
リポソーム媒介ｍｄａ−７／ＩＬ−２４遺伝子送達後の肺腫瘍細胞成長の局所的および  系統的阻害
Ａ．材料および方法
１．材料
全ての脂質（ＤＯＴＡＰ、コレステロール）はＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ脂質（Ａｌｂａｓｔｅｒ、  ＡＬ）から購入した。ハム／Ｆ１２培地および胎児ウシ血清（ＦＤＳ）はＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ−Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、  ＮＹ）から購入した。ポリクローナルウサギ抗−ヒトＭＤＡ−７抗体はＩｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，  Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ、  ＴＸ）から入手し、抗−マウスＣＤ３１はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｉｎｃ．  （Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、  ＣＡ）から入手した。
【０４１１】
２．細胞系および動物
ヒト非−小細胞肺癌腫細胞系Ａ５４９はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、１０％ＦＢＳ、１％グルタメート、および抗生物質を補足したハム−Ｆ１２培地中に維持した。ネズミＵＶ２２３７Ｍ細胞はＩｓａｉａｈ  Ｊ．  Ｆｉｄｌｅｒ博士（Ｍ．Ｄ．  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）から入手し、他の文献に記載されたように維持した（Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。細胞を規則的に継代し、マイコプラズマの存在についてテストした。実験で用いた４ないし６週齢雌ＢＡＬＢ／ｃヌード（ｎｕ／ｎｕ）マウス（Ｈａｒｌａｎ−Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  Ｉｎｃ．、  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、  ＩＮ）およびＣ３Ｈ／Ｎｃｒマウス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、  Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋｓｂｕｒｇ、  ＭＤ）を病原体−フリー環境に維持し、動物のケアおよび使用について確立された制度ガイドラインに従って取り扱った。
【０４１２】
３．プラスミドの精製
実験で用いたプラスミドをｐＶａｘプラスミドベクター（Ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ、  Ｃａｒｌｓｂａｄ、  ＣＡ）にクローン化し、他の文献に記載されたように精製した（Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９７；  Ｇａｅｎｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９９）。簡単に述べれば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下にある細菌β−ガラクトシダーゼ（Ｌａｃ−Ｚ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、またはヒトｍｄａ−７  ｃＤＮＡを運ぶプラスミドを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ宿主株ＤＨ５αにおいてカナマイシン選択下で成長させた。精製されたプラスミドのエンドトキシンレベルは、発色カブトガニアメーバー様細胞溶解物キネティックアッセイキット（Ｋｉｎｅｔｉｃ−ＱＣＬ；  Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ、  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、  ＭＤ）を用いることによって測定した。精製されたプラスミドＤＮＡの濃度および純度はＯＤ２６０／２８０比率によって測定した。
【０４１３】
４．ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームの合成およびＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡ混合物の調製
他の文献に記載されているように、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームを合成し、減少させるサイズ１．０、０．４５、０．２、および０．１μｍのＷｈａｔｍａｎフィルター（Ｋｅｎｔ、ＵＫ）を通して押し出した（Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３；  Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、  １９９７）。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｉ−ＤＮＡ複合体は、マウスへの注射に２ないし３時間先立って新たに調製した。
【０４１４】
５．粒子サイズ分析
新たに調製されたＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＤＮＡ複合体を、Ｎ４粒子サイズアナライザー（Ｃｏｕｌｔｅｒ、  Ｍｉａｍｉ、  ＦＬ）を用いることによって平均粒子サイズについて分析した。リポソーム−ＤＮＡ複合体の平均粒子サイズは３００ｎｍと３２５ｎｍとの間の範囲であった。
【０４１５】
６．皮下腫瘍異種移植片に対するＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ７複合体の効果
全ての実験において、１００μｌの滅菌リン酸−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させた５×１０６腫瘍細胞（Ａ５４９）を右背面側腹部に注射した。腫瘍が４ないし５ｍｍ２のサイズに到達すれば、動物を群にランダム化し、処理を開始した。腫瘍−担持動物を６匹の動物の４つの群に分けた。群１は処理を受けず、群２はＰＢＳを受け、群３はＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＬａｃＺ複合体（５０μｇ／用量）を受け、群４はＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体（５０μｇ／用量）を受け；全ての処理は腫瘍内投与し、合計６用量にて毎日与えた。制度ガイドラインについての腫瘍内注射のために、動物をメトキシフルラン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ、  Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、  ＮＪ）で麻酔した。腫瘍測定は処理群の知識なくして観察者によって１日置に記録され、腫瘍容量は式Ｖ（ｍｍ３）＝ａｘｂ２／２を用いることによって計算し、ここに、「ａ」は最大寸法であり、「ｂ」は垂直方向直径である（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；  Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。抗腫瘍効率データは、各群における全ての動物においての累積腫瘍容量として表して、腫瘍のサイズおよび数双方を説明する。全ての実験において、腫瘍サイズの変化の統計学的有意性はＡＮＯＶＡによって２１および２４日に測定した。
【０４１６】
マウス腫瘍細胞に対するｍｄａ−７の効果をテストするために、我々は同系腫瘍モデルを利用した。この目的で、Ｃ３ＨマウスにネズミＵＶ２２３７ｍ線維肉腫細胞（１ｘ１０６）を皮下注射し、３つの群に分けた（ｎ＝８／群）。腫瘍のサイズが４ないし５ｍｍ２に到達すれば、動物は以下のように腫瘍内処理を受けた：処理無し（対照）、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体またはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体。処理スケジュールおよび治療効果の分析はＡ５４９腫瘍モデルについて既に述べたのと同一であった。統計学的分析およびＡＮＯＶＡによって２１日および２３日に計算された有意性のために、実験を２回反復した。
【０４１７】
７．ＭＤＡ−７、アポトーシスおよびＣＤ３１の測定
各々、ｎｕ／ｎｕまたはＣ３Ｈマウスにおいて樹立された皮下Ａ５４９またはＵＶ２２３７ｍ腫瘍を収穫し、４％緩衝化ホルマリン中で固定し、パラフィンに包埋し、４−μｍセクションに切断した。他の文献に記載されているように、組織セクションをＭＤＡ−７導入遺伝子発現について免疫染色した（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００２；  Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３）。ＭＤＡ−７に対して陽性である腫瘍細胞染色は明るい視野の顕微鏡下で分析し、処理群の知識がない観察者によって定量された。検体当たり少なくとも５つの視野を分析した。処理に続いての腫瘍細胞の運命を判断するために、腫瘍のセクションを、ターミナルデオキシヌクレオチドトランスフェラーゼ（Ｔｄｔ）キット（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ、  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、  ＩＮ）でアポトーシス細胞死滅について染色し、既に記載されたように、メチレンブルーまたはメチルグリーンで逆染色した（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００２；  Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００１）。全ての染色手法において、適当な陰性対照を含めた。
【０４１８】
ＣＤ−３１染色については、従前に記載されているように、組織を抗−ＣＤ３１抗体で染色し、（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００２；  Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、  ２００３）、盲検にて顕微鏡下で観察した。微小血管密度（ＭＶＤ）は、高出力倍率（Ｘ４００）下で腫瘍組織当たり５つのランダムに選択された視野においてＣＤ３１陽性染色血管の数をカウントすることによって半定量的に測定した。処理群当たりの３腫瘍組織を表す合計１５の視野を調べ、定量し、結果を視野当たりの血管の平均数として表した。
【０４１９】
８．処理後における腫瘍の特徴付け
ｍｄａ−７遺伝子の治療効果を測定するために、最後の処理後にマウスから腫瘍を収穫し、組織病理学的調査に付した。分析は、処理群の予めの知識がない病理学者によってなされた。
【０４２０】
９．実験的肺転移に対するＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ７複合体の効果
肺転移に対するＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体の効果をテストするために、雌ヌードマウスに、１００μｌの滅菌ＰＢＳに懸濁させた１０６Ａ５４９腫瘍細胞を尾静脈を介して注射した。６日後に、マウスを３つの群に分け、以下のように処理した：処理なし（群１）、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体（群２）、およびＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体（群３）。各群において８匹のマウスがいた。全ての処理は５０μｇリポソーム−ＤＮＡ複合体からなり、合計６の用量にて２７−ゲージニードルを用いて毎日尾静脈を介して投与した。最後の用量から３週間後に、ＣＯ２吸入によって動物を安楽死させた。各マウスの肺にＩｎｄｉａｎａインクを器官内注射し、Ｆｅｋｅｔｅｓ溶液（Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）中で固定した。全身ＭＤＡ−７遺伝子処理の治療効果は、処理群の知識がない観察者により、切開顕微鏡下で各肺における転移腫瘍の数をカウントすることによって決定した。データを分析し、群間の差は、もしＰ値がＭａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙランク−合計テストによって＜０．０５であれば統計学的に有意であると解釈した。
【０４２１】
同系肺腫瘍モデルとして、マウスＵＶ２２３７ｍ線維肉腫細胞（１ｘ１０６）でＣ３Ｈマウスを注射し、３つの群に分けた（ｎ＝７／群）。注射から６日後に、動物を以下のように処理した：処理無しＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体、またはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体。処理スケジュールおよび治療効果の分析は、Ａ５４９モデルについて既に記載したのと同一であった。実験は統計学的有意性のために二回行った。
【０４２２】
Ｂ．結果
１．ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体での腫瘍細胞のイン・ビトロトランスフェクション
ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４蛋白質をコードする発現プラスミドを用いることによってヒト（Ａ５４９）およびマウス（ＵＶ２２３７ｍ）腫瘍細胞へプラスミドＤＮＡを送達するＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームの能力を評価した。ｍｄａ−７プラスミドＤＮＡと複合体化したＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームでのトランスフェクションの結果、２４および４８時間において、Ａ５４９およびＵＶ２２３７ｍ腫瘍細胞双方において外因性ＭＤＡ−７蛋白質が発現された。ＭＤＡ−７発現はＰＢＳ処理対照細胞では観察されなかった。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７でトランスフェクトされたＡ５４９およびＵＶ２２３７ｍ細胞からの組織培養上清の分析は、４８時間において分泌されたＭＤＡ−７蛋白質を示したが、２４時間においては示さなかった。４８時間における分泌されたＭＤＡ−７蛋白質の検出は、分泌されたＭＤＡ−７蛋白質が２４時間において検出可能であったＡｄ−ｍｄａ７処理細胞において観察されたものとは異なる（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。これは、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームを用いて達成されたトランスジェニックＭＤＡ−７発現がＡｄ−ｍｄａ７で得られたものよりも低いことを示唆する。分泌されたＭＤＡ−７蛋白質はＰＢＳ処理細胞においては観察されなかった。かくして、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌリポソームは、ｍｄａ−７  ＤＮＡを腫瘍細胞に効果的に送達することができ、その結果、Ａｄ−ｍｄａ７よりは低いにもかかわらず、細胞内および分泌されたトランスジェニックＭＤＡ−７生産がもたらされた。
【０４２３】
２．ＭＤＡ−７は皮下腫瘍成長を阻害する。
【０４２４】
ｎｕ／ｎｕマウスにおいてＡ５４９ヒト肺皮下腫瘍の成長を抑制するＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体の能力を評価した。腫瘍−担持マウスの、腫瘍内経路を介するＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体での処理は、ＰＢＳで処理されていない、処理された、またはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＬａｃＺ複合体で処理された動物における腫瘍成長と比較して、腫瘍成長を有意に阻害した（Ｐ＝０．００１）（図１０Ａ）。腫瘍の組織病理学的分析は、種々の処理群の間で腫瘍浸潤細胞の有意な変化を明らかにしなかった。
【０４２５】
Ｃ３Ｈマウスにおける皮下ネズミ腫瘍に対するｍｄａ−７遺伝子の治療効果を次に評価した。ＵＶ２２３Ｍ腫瘍を担うマウスを３つの群に分け、１つは処理無しを受け、第２のマウスはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体での処理を受け、および第３のマウスはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体での処理を受けた。ＵＶ２２３７ｍ腫瘍の成長は、２つの対照群における腫瘍成長と比較すると、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体の腫瘍内投与で処理されたマウスにおいて１９日から出発して阻害された（図１０Ｂ）。しかしながら、有意な腫瘍阻害は２３日に観察された（Ｐ＝０．０１）。腫瘍阻害（Ｐ＝０．２４）もまた、未処理対照マウスと比較してＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体で処理したマウスにおいて観察された。しかしながら、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体処理マウスで観察された阻害効果は非−特異的効果に帰され、我々の従前の研究と合致する（Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。
【０４２６】
観察された腫瘍−抑制効果がｍｄａ−７遺伝子発現によるものであることを示すために、注射から４８時間後に得られた皮下Ａ５４９およびＵＶ２２３７ｍ腫瘍を、ＭＤＡ−７蛋白質発現についての免疫組織化学分析に付した。ＭＤＡ−７蛋白質の発現は、各々、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体で処理されたＡ５４９およびＵＶ２２３ｍ腫瘍の１８％および１３％で観察され（Ｐ＝０．００１；図１０Ｃ）、処理されなかった、ＰＢＳで処理された、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ  ＬａｃＺで処理された、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体で処理された動物におけるよりも有意により高い数であった。非−特異的染色のあるレベルが、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体で処理されたＡ５４９腫瘍で観察された。ＭＤＡ−７発現のパターンの分析は、細胞外であるように見えたより散漫な染色パターンに加えて、強い細胞内染色を明らかにした。染色のこのパターンはヒト腫瘍異種移植片およびネズミ同系腫瘍の双方で観察された。
【０４２７】
３．ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ７複合体で処理された肺腫瘍におけるアポトーシス細胞死滅
ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体での処理の後の腫瘍細胞の運命を判断するために、ｎｕ／ｎｕマウスおよびＣ３およびＨマウスからの皮下腫瘍（Ａ５４９、ＵＶ２２３７ｍ）を、従前に記載されているようにアポトーシス細胞死滅について分析した（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。アポトーシス細胞死滅を示す有意な（Ｐ＝０．００１レベルのＴＵＮＥＬ陽性細胞（１３％  Ａ５４９、および９％  ＵＶ２３３７ｍ）が、処理されていない、ＰＢＳで処理された、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴで処理された、またはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＬａｃＺで処理された対照動物からの腫瘍と比較して、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７で処理された腫瘍で観察された（図１１）。
【０４２８】
４．ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体で処理された肺腫瘍における低下したＣＤ３１−陽性染色
腫瘍血管形成に対するｍｄａ−７処理の効果を測定するために、従前に記載されているように、腫瘍組織をＣＤ３１染色に付した（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。ＣＤ３１−陽性染色のレベルは、未処理、ＰＢＳ−処理、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＬａｃＺ複合体処理、およびＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ−処理マウスから得られた腫瘍組織と比較して、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ７処理Ａ５４９（１０％）およびＵＶ２２３７ｍ（５．８％）腫瘍組織において有意に（Ｐ＝０．０１）低下した（図１２）。低下したＣＤ３１染色は低下した血管形成を示す。
【０４２９】
５．ＭＤＡ−７は実験的肺転移を阻害する。
【０４３０】
次に、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体の活性を、ヒトＡ５４９肺癌細胞またはマウスＵＶ２２７ｍ細胞を用いて実験的肺転移モデルにおいて調べた。腫瘍細胞の静脈内送達の結果、肺の迅速な腫瘍シーディングがもたらされ、３０日後には動物は圧倒的な肺腫瘍負荷に屈する。Ａ５４９およびＵＶ２２３７ｍ肺腫瘍−担持ヌードまたはＣ３ＨマウスのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体での系列的処理の結果、ＰＢＳまたはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体での処理よりも肺転移の有意に（Ｐ＜０．０５）低い数をもたらした（図１３）。ＵＶ２２３７ｍマウスにおいて、ＤＯＴＡＰ：Ｃほｌ−ＣＡＴ複合体での処理の結果、ＰＢＳで処理したものと比較した場合に、腫瘍節の数の有意な低下がもたらされ、これは、いくらかの非特異的抗腫瘍活性を示唆する（図１３）。さらに、処理は、罹患率および死亡率の欠如によって証明されるように、観察された腫瘍関連毒性無しによく許容した。
【０４３１】
実施例６
Ａｄ−ｍｄａ７は卵巣癌細胞の化学感受性化を誘導する。
【０４３２】
６−ウェル培養プレートに蒔いたＭＤＡＨ  ２７７４卵巣癌細胞（５ｘ１０５／ウエル）をタキソール（０．５ｎｍ）、Ａｄ−ｌｕｃ（５００ｖｐ／細胞）、Ａｄ−ｌｕｃおよびタキソールまたはＡｄ−ｍｄａ７およびタキソールで処理した。処理から７２時間後に細胞を収穫し、トリパンブルー排除アッセイによって細胞生存率について分析した。未処理細胞を対照として供した。Ａｄ−ｌｕｃおよびタキソールまたはＡｄ−ｍｄａ７およびタキソールで処理された細胞は、他の処理群と比較して成長阻害を示した（図１４）。しかしながら、相加的ないし相乗的である有意な成長阻害は、Ａｄ−ｍｄａ７およびタキソールで処理された細胞においてのみ観察された（Ｐ＝＜０．０５）（図１４）。実験は三連ウェルで行い、結果は２つの別々の平均として表した。
【０４３３】
実施例７
ｍｄａ−７遺伝子導入は乳癌腫細胞を化学療法、生物学的療法および放射線療法に対して感受性とする：ｂｌｃ−２ファミリーメンバーの発現との相関
Ａ．材料および方法
１．細胞および試薬
全ての細胞系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、  ＭＤ）から入手した。評価した乳癌細胞系はＴ４７Ｄ、  ＭＣＦ−７、  ＭＤＡ−ＭＢ−４５３、  ＳＫＢｒ３、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、  ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、  ＭＤＡ−ＭＢ−３６１、  ＨＢＬ−１００およびＢＴ−２０であった。初代ヒト乳頭上皮細胞（ＨＭＥＣ）、ヒト血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）およびＭＪ−９０ヒト線維芽細胞はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  ＣＡ）から入手した。細胞をＤＭＥＭ培地（ＧＩＢＣＯ、  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、  ＮＹ）および胎児ウシ血清（各細胞系に従って、５ないし１０％）中で成長させ、マイコプラズマについてルーチン的にテストした。ヘルセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）、タキソテール（Ａｖｅｎｔｉｓ−ＲＰＲ、  Ｃｏｌｌｅｇｅｖｉｌｌｅ、  ＰＡ）、タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、  Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、  ＭＯ）、およびアドリアマイシン（Ａｄｒｉａ  Ｌａｂｓ、  Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ）はＭＤ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ薬局から入手した）。
【０４３４】
２．組換えアデノウィルス
ｍｄａ−７遺伝子（Ａｄ−ｍｄａ７）、ルシフェラーゼレポーター遺伝子（Ａｄ−ｌｕｃ）または空ベクター（Ａｄ−ＣＭＶｐ（Ａ））を含有する複製−血管ヒトタイプ５アデノウイルス（Ａｄ５）の生産は従前に報告されている（Ｍｈａｓｉｈｌｋａｒ、２００１）。Ａｄ−ｍｄａ７の構築は、ｍｄａ−７  ｃＤＮＡをＣＭＶ−ＩＥプロモーター、続いて、ＳＶ４０ポリアデニル化［ｐ（Ａ）］配列に連結することを含んだ；この発現カセットをＡｄ５のＥ１領域に入れた。ＰＣＲＴＭ、制限エンドヌクレアーゼ消化、およびＤＮＡ配列決定分析を用いてウイルスストックを確認した。
【０４３５】
ウェスタンブロット分析；細胞溶解物を１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動に付し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｐｉｅｒｃｅ、  Ｉｎｃ．）に対するＳｕｐｅｒ−Ｓｉｇｎａｌ基質を用いるウェスタンブロットによって分析した。ＮＤＡ−７に対するポリクローナルおよびモノクローナル抗体はＩｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓによって生じさせた。実験で用いた他のモノクローナル抗体はＰＫＲ、ｐ５３、ＢＣＬ−２、  ＢＣＬ−ＸＬ、  ＢＡＸ、α−チューブリンおよびβ−アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を認識した。二次抗体はＳａｎｔａ−Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から、およびＡｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。
【０４３６】
３．形質導入および薬物処理
細胞を、示した薬物（タモキシフェン１−１０μｇ／ｍｌ；タキソテール１−１０ｎｇ／ｍｌ；アドリアマイシン１−１０μｇ／ｍｌおよびヘルセプチン１μｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下で、増大させる感染多重度（ＭＯＩ）にてＡｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−空またはＡｄ−ｌｕｃで形質導入した。細胞を、３Ｈ−チミジン取込−アッセイのために９６−ウェル様式にて５００ないし２０００細胞／ウェルにて、あるいは蛋白質発現、トリパンブルー生存率またはアポトーシスアッセイのために、６−ウェルプレートにて１０５−１０６細胞／ウェルにて平板培養した。薬物組み合わせ実験において、ベクターの添加に先立って、薬物を１回加え、細胞を連続的に剤に暴露した。
【０４３７】
４．細胞増殖分析
細胞の成長阻害は、活動的に複製する細胞のＤＮＡへの３Ｈ−チミジン取込によって測定した。３Ｈ−チミジンを細胞に加え（１μＣｉ／ｍｌ）、受容体細胞からの上清の除去によって反応を１５時間後に提示させた。トリプシンＥＤＴＡ（ＧＩＢＣＯ）を用いて細胞を収穫し、Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆｉｌｔｅｒｍａｔｅ細胞ハーベスターを用いてフィルター上に集め、製造業者のプロトコルに従って、脱イオン水およびメタノール中で洗浄した。フィルターを乾燥し、Ｍａｔｒｉｘ９６００（Ｐａｃｋａｒｄ）を用いて分析した。
【０４３８】
５．アポトーシスおよび細胞生存率アッセイ
アポトーシスは、ＴＵＮＥＬおよびアネキシンＶアッセイによって測定した。ＴＵＮＥＬアッセイでは、製造業者のプロトコルに従い（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）、発色性ＴＵＮＥＬ−ＰＯＤ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）アッセイを用いて腫瘍セクションをアポトーシスについて分析し、ＴＵＮＥＬ陽性細胞をそれらの暗茶色染色によって同定した。アネキシンＶアッセイはＡｐｏＡｌｅｒｔアネキシンＶ−ＦＩＴＣキット（ＣＬＯＮＴＥＣＨ、  Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、  ＣＡ）を用いて行った（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。細胞生存率はトリパン−ブルー排除アッセイによって測定した。
【０４３９】
ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色での細胞周期分析。細胞−周期の進行は、細胞ＤＮＡのＰＩ染色によって測定した。細胞を１ないし２ｘ１０６細胞／ｍＬのＰＢＳの単一細胞懸濁液として調製し、冷７０％エタノールで２時間固定し、遠心した。固定剤をデカントし、細胞をＰＢＳ中で洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ、５０μｇ／ｍｌ）およびＲＮＡｓｅ（ＰＢＳ中２０μｇ／ｍｌ）で染色した。処理された細胞をＦＡＣＳ分析によって評価した。
【０４４０】
クローン原性生存アッセイ。クローン原性生存アッセイは、ＸＲＴ（０、２または４Ｇｙ）と組み合わせてＡｄ−ＭＤＡ７およびＡｄ−ＣＭＶｐ（Ａ）（ＭＯＩ  ２０００ウィルス粒子／細胞）を用いて行った。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞を、空のアデノウィルスベクター（Ａｄ−ＣＭＶｐ（Ａ））またはＡｄ−ｍｄａ７と共に１ｘ１０５細胞にて２日間培養し、次いで、放射線療法（ＸＲＴ）で処理した。細胞を２．５ｘ１０５細胞の密度で再度蒔いた。クローン原性生存を３週間後に評価し；コロニーを固定し、ギムザで染色し、カウントした（Ｎｉｓｈｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。
【０４４１】
６．動物実験および免疫組織化学分析
Ｂａｌｂ  Ｃ  ｎｕ／ｎｕマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ、ＭＡ）から入手した。６週齢雌マウスの右後足に乳癌細胞を注射し、腫瘍の成長について観察した。全ての実験において、１００μｌの滅菌リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）に懸濁させた腫瘍細胞（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１；ＭＣＦ−７またはＭＤＡ−ＭＢ−４６８）を右背面側腹部に注射し、ほぼ１００ｍｍ３まで成長させた。次いで、動物を群にランダム化し（ｎ＝５ないし１０動物／群）、以下のように処理を開始した：群１はＰＢＳを受け、群２はＡｄ−ｌｕｃを受け、群３はＡｄ−ｍｄａ７を受けた。投与スケジュールは異なるモデルで変化させた：ＭＢ−３６１異種移植片モデルにおいては、腫瘍が１３０ｍｍ３に到達すると、群当たり１０匹のマウスに、合計３用量にて１日置きに、１ｘ１０１０ｖｐの用量にてＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７を注射した。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８モデルにおいて、各々が１３０ｍｍ３の腫瘍を持つ５匹の動物に、合計３つの注射にて、１日毎に２ｘ１０１０ｖｐの用量でＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７を注射した。ＭＣＦ−７異種移植片モデルにおいては、群当たり１０匹の動物に、６つの注射のために１日置きに、１ｘ１０１０、３ｘ１０１０または１ｘ１０１１ｖｐのＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｓまたはＡｄ−ｍｄａ７を、腫瘍が８５ｍｍ３に到達すれば、注射した。
【０４４２】
放射線療法組合せの評価のために、マウスを６つの処理群に分けた（群当たりｎ＝５）：リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｂ−ｌｕｃ＋ＸＲＴ、ＸＲＴ単独、Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＸＲＴ。１、３および５日に、２ｘ１０１０ｖｐ／ｍｌの用量のＰＢＳまたはアデノウィルスベクターでの直接的注射によって腫瘍を処理した。６日に、動物を、放射線（５Ｇｙ）の後足への単一適用で処理した。腫瘍測定を１日置に取り、用量を計算した。腫瘍は選択されたマウスから収穫し、動物を犠牲にした直後にパラフィンに包埋した。試料を、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、  ＣＡ）を用いる免疫組織化学によって、ＭＤＡ７およびＰＫＲ発現について分析した。腫瘍内注射を、制度ガイドラインに従い、メトキシフルラン（Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｐｌｏｕｇｈ、  Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、  ＮＪ）を用いて麻酔下に行った。腫瘍測定は処理群の知識なくして１日置きに記録し、式Ｖ（ｍｍ３）＝ａｘｂ２／２を用いて用量を計算し、ここに、「ａ」は最大寸法であって、「ｂ」は垂直直径（１５，２３）である。腫瘍がサイズが１．５ｃｍに到達すると、マウスを安楽死させた。
【０４４３】
７．統計学的解析
実験結果の統計学的有意性は、腫瘍測定についてスチューデントのｔ−検定を用いて計算した。ＡＮＯＶＡおよび両側スチューデントｔ−検定を、各々、複数群の統計学的解析および対様式比較のために用い、ｐ＜０．０５が有意と考えた。
【０４４４】
Ｂ．結果
１．ＭＤＡ−７は、Ａｄ−ｍｄａ７での処理の後に乳癌細胞において過剰発現される。
【０４４５】
９つの乳癌細胞系のパネルを用いた；親腫瘍タイプおよびｐ５３突然変異状態を図１５にまとめる。２つの代表的な乳癌腫系：ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（突然変異体ｐ５３）およびＭＣＦ−７（野生型ｐ５３）のウェスタンブロット分析は、ｐ５３の状態にかかわらず、Ａｄ−ｍｄａ７形質導入の後にＭＤＡ−７蛋白質は顕著に過剰発現することを示す（図１６Ａ）；ＭＤＡ−７蛋白質はＡｄ−ｌｕｃまたはＰＢＳ処理細胞の溶解物において明らかでなかった。β−アクチンを内部対照として用いて、同等な蛋白質負荷を確実とした。結果は、ＭＤＡ−７の異所性発現が高レベルのｄｓ  ＲＮＡ活性化ｓｅｒ／ｔｈｒキナーゼＰＫＲを誘導し、他方、Ａｄ−ｌｕｃで形質導入した細胞は誘導しなかった。さらなる乳癌細胞（Ｔ４７Ｄ：ＭＢ−２３１；ＭＢ−３６１；ＭＢ−４６８；ＳＫＢｒ３；ＢＴ−２０；ＨＢＬ−１００）からの溶解物のウェスタンブロット分析もまた、Ａｄ−ｍｄａ７処理細胞においてＭＤＡ−７の高い発現を示した。
【０４４６】
２．Ａｄ−ｍｄａ７はイン・ビトロにて乳癌細胞において細胞死滅を誘導する。
【０４４７】
乳癌細胞系：ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＳＫＢｒ３、ＨＢＬ−１００、ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＤＡ−ＭＢ−３６１、および３つの正常な細胞型：ＨＭＥＣ（乳頭上皮）；ＭＪ９０（線維芽細胞）およびＨＵＶＥＣ（内皮細胞）を増大させる用量のＡｄ−ｍｄａ７または対照ベクター−Ａｄ−ルシフェラーゼ（Ａｄ−ｌｕｃ）またはＡｄ−ＣＭＶｐ（Ａ）（Ａｄ−空）で処理し、成長阻害について評価した。５０％（ＩＣ５０）分の成長阻害に必要なベクターの濃度を各細胞系について計算し、図１５にリストする。Ａｄ−ｍｄａ７による成長阻害についてのＩＣ５０値を、対照ベクターについて得られたＩＣ５０値で割って、選択性指標（Ｓ．Ｉ．）を得た。該ＳＩは、対照Ａｄベクターと比較したＡｄ−ｍｄａ７による細胞成長阻害についての相対的能力を示す。正常な細胞のＳＩ値は全て１に等しいが；乳腫瘍細胞のそれは、Ａｄ−ｍｄａ７が対照よりも＞２ないし＞３０倍（平均＞８）大きい細胞傷害性であることを示す（図１５）。Ｓ．Ｉ．値は大きな範囲にわたるが、それらは、ｍｄａ−７活性が形質転換された細胞に対して選択的であって、ＭＤＡ−７蛋白質の発現は正常な細胞において毒性を誘導しないことを示す。Ａｄ−ｍｄａ７の腫瘍−細胞選択的効果のもう１つの例は３Ｈ−チミジン取込アッセイから来る（図１６Ａ）；我々の結果は、Ａｄ−ｍｄａ７で形質導入されたＴ４７Ｄ、ＢＴ−２０、ＭＤＡ−ＭＢ−３６１およびＭＣＦ−７乳癌細胞において有意な用量−依存性成長阻害を示す（ｐ＜０．００１）。ＭＤＡ−７発現は９６％までだけ細胞増殖を阻害し、他方、Ａｄ−ｌｕｃ−形質導入細胞の成長は最小限改変された。これらの結果は、Ａｄ−ｍｄａ７が細胞周期阻止を誘導することを示唆し、かくして、我々は、未処理、Ａｄ−ｌｕｃおよびＡｄ−ｍｄａ７形質導入ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＣＦ−７細胞の細胞周期分析（ＰＩ染色）を行った。図１６Ｃに示すように、Ａｄ−ｍｄａ７で形質導入された細胞は細胞周期ブロック、および未処理またはＡｄ−ｌｕｃ処理細胞と比較してＧ２／Ｍ細胞の分立の２ないし３倍増加を受ける。
【０４４８】
細胞死滅のキネティックスおよび用量−依存性を評価し、代表的なデータをＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞について示す（図１６Ｄ）：低いＡｄ−ｍｄａ７用量（１０００ｖｐ／細胞：５０ｐｆｕ／細胞）において、有意な細胞死滅（ｐ＜０．００１）が処理から２日後に観察された；より高い用量においては、有意な殺傷が１日に観察され、経時的に増大した。まとめると、ＭＤＡ−７発現は時間―および用量―依存的に双方の様式で乳癌細胞を殺し、他方、Ａｄ−ｌｕｃはわずかな効果を示したに過ぎない（図１６Ｄ）。対照的に、対応する正常な細胞、ヒト乳頭上皮細胞（ＨＭＥＣ）は、より長い時点においてさえＡｄ−ｌｕｃおよびＡｄ−ｍｄａ７からの有意な毒性を示さない（図１６Ｅ）正常な線維芽細胞および初代内皮細胞を用いるさらなる実験は、正常な細胞に対する細胞傷害性の欠如を確認した（図１５）。
【０４４９】
３．Ａｄ−ｍｄａ７によるアポトーシスの誘導
腫瘍細胞におけるＭＤＡ−７の発現は、細胞成長の阻害に関連するもの以外のシグナルに影響でき、種々の癌細胞タイプにおいてアポトーシス経路を活性化することが報告されている（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８；Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。これらの知見に合致して、Ａｄ−ｍｄａ７での形質導入は、Ｔ４７Ｄ、ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞系においてアポトーシスをトリガーすることが観察された（各々、４１、５２、４３および３２％）（図１７Ａ）。対照的に、これらの系を対照Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−空で形質導入すると、アポトーシスを受けている細胞の数はビヒクル処理細胞で観察されたのと匹敵した。これらの細胞系についてのさらなるアッセイによって、Ａｄ−ｍｄａ７が、Ｔ４７Ｄ乳癌細胞において、用量―依存的にアポトーシスを誘導し、ＢＡＸをアップレギュレートすることが確認された（図１７Ｂ）。汎−カスパーゼ阻害剤ＺＶＡＤでの処理は、４０％だけアポトーシスを低下させた：しかしながら、ＢＡＸのＭＤＡ−７誘導は低下されなかった。Ａｄ−ｌｕｃでの処理はＢＡＸまたはアポトーシスを活性化しなかった（図１７Ｂ）。アポトーシス誘導のメカニズムを次に評価した。Ａｄ−ｍｄａ７はカスパーゼ３およびＰＡＲＰの切断を誘導し、ミトコンドリア媒介アポトーシス誘導に合致する（図１７Ｃ）。
【０４５０】
４．イン・ビボにて、ｍｄａ−７の発現は腫瘍の成長を低下させる。
【０４５１】
Ａｄ−ｍｄａ７によって誘導された乳癌細胞のイン・ビトロ成長阻害がイン・ビボで腫瘍成長に対する同様な効果に翻訳されるかを判断するために、我々は、ヌードマウスモデルにおいてＭＤＡ−ＭＢ−３６１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８およびＭＣＦ−７細胞を用いて生じさせた異種移植片腫瘍を評価した。腫瘍はほぼ１００ｍｍ３に到達すると、動物を処理群に分け（群当たりｎ＝５ないし１０動物）、ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で処理した。図１８ＡないしＤに示すように、Ａｄ−ｍｄａ７での腫瘍の直接的注射は、全ての３つの異種移植片モデルでの、１０日までに明らかな、腫瘍容量の有意な低下を誘導した（ｐ＝０．００２−０．００４）。２０日までに、Ａｄ−ｌｕｃまたはＰＢＳで処理した対照腫瘍は容量の４倍ないし８倍増加を受け、８００ｍｍ３よりも大きな最大に到達した。対照的に、Ａｄ−ｍｄａ７処理腫瘍はいずれかのわずかな腫瘍成長を示し（ＭＤＡ−ＭＢ−３６１およびＭＤＡ−ＭＢ−４６８）、あるいはそれらの最初の容量のほぼ３倍まで成長した（ＭＣＦ−７）。Ａｄ−ｌｕｃは腫瘍成長に対して可変効果を誘導し、最大効果はＭＢ−３６１モデルにおけるものであった；しかしながら、Ａｄ−ｍｄａ７はかなり頑強かつ安定な成長阻害を終始誘導し、その結果、全ての３つのモデルにおいて延長された主要成長対照がもたらされた。ｐ５３について突然変異体および野生型である双方の腫瘍細胞において有意な成長阻害が明らかであった（図１９参照）。容量―上昇実験をｐ５３野生型ＭＣＦ−７腫瘍で行い、そこでは、低い容量は腫瘍成長をブロックするのに効果的でないことが判明し、他方、３倍高い用量はいくらか腫瘍成長阻害を生じ（ｐ＝０．０８）、より高い用量の対数はこの攻撃的な腫瘍の頑強な腫瘍成長阻害を生じた（ｐ＝０．００２）（図１９および図１８Ａ−Ｄ）。これらの腫瘍がサイズが２倍になるのに必要な時間に反映されているように（図１９）、腫瘍成長の速度はＡｄ−ｍｄａ７処理によって有意に低下した（図１８Ｃ参照）。ｐ５３野生型およびｐ５３突然変異体乳癌細胞双方において、ｍｄａ−７，これらの結果は、発現が、イン・ビトロおよびイン・ビボ双方において抗―増殖活性を有することを示す。また、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８異種移植片をＭＤＡ−７発現およびアポトーシス誘導について分析した。強いＭＤＡ−７免疫染色が処理されたＡｄ−ＭＤＡ７で観察されたが、ＰＢＳまたはＡｄ−ｌｕｃ処理腫瘍においては観察されなかった（図１８Ｄ）。ＴＵＮＥＬ分析は、ＭＤＡ−７蛋白質発現がアポトーシスに相関することを示した。ＭＤＡ−７発現腫瘍は、イン・ビトロで観察されたのと同様に（図１６Ａ）、ＰＫＲ蛋白質の高い発現を示した（図１８Ｄ）。
【０４５２】
５．タモキシフェン。タキソテールまたはアドリアマイシン処理とＡｄ−ｍｄａ７形質導入との組合せは、乳癌細胞を示すに対して相加的な効果を有する。
【０４５３】
先に示したように、Ａｄ−ｍｄａ７／での単一剤療法は、乳癌細胞に対して有望な抗―腫瘍活性を呈する。しかしながら、乳癌に対する現在の治療は、細胞傷害性化学療法、放射線療法、ホルモン療法、およびヘルセプチンのような新しいバイオロジック療法を組み合わせるマルチ―様式治療アプローチを使用する（Ｗｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７；Ａｍａｔ  ｅｔ  ａｌ．、２００３；Ｂｏｎｎａｄｏｎａ、１９８９；Ｔａｎｔｉｖｅｊｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００３；Ｐｅｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。Ａｄ−ｍｄａ７と化学療法剤との組合せが細胞傷害性を増強できるか否かを調べるために、乳癌細胞系をＡｄ−ｍｄａ７＋一連の化学療法剤で治療し、細胞増殖および細胞生存性アッセイを用いて分析した。これらの細胞を、まず、エストロゲンアンタゴニストのタモキシフェン、標的組織におけるその受容体の結合に対してエストロゲンと競合することによって作用する非−ステロイド剤で処理した（Ｗｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７）コンビナトーリアル薬物相互作用の評価を容易とするために、各剤の治療下用量を用いた。
【０４５４】
Ａｄ−ｍｄａ７およびタモキシフェンの間の用量―応答（図２０Ａ）をまず確立した。低い用量のＡｄ−空（０ないし１０００ｖｐ／細胞）またはタモキシフェン（２μｇ／ｍｌまで）は、Ｔ４７Ｄ細胞において２０％未満だけ細胞増殖を低下させた。非常に低い用量（１００ｖｐ／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７の添加は細胞増殖に影響せず、他方、５００ｖｐ／細胞および１０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｍｄａ７の結果、タモキシフェンと組み合わせた場合に用量―依存性成長阻害がもたらされた（各々、６０％および８０％阻害）。図２０Ｂ（頂部パネル）に示すように、ＭＣＦ−７細胞はタモキシフェン（１μｇ／ｍＬ）およびＡｄ−ｍｄａ７（１０００ｖｐ／細胞）単独に対してわずかな応答（＜１５％）を示したが、双方の剤の組合せでの処理は相乗的な効果を有し、６０％を超えて細胞増殖を低下させた（ｐ＜０．００１）。更なる実験を行って、ｐ５３突然変異体Ｔ４７Ｄ細胞を評価した：この場合には、単一剤としてのＡｄ−ｍｄａ７での処理は成長を有意に低下させた。しかしながら、ｐ５３野生型ＭＣＦ−７細胞の場合のように、２つの組合せで療法の効果は相乗的であり、８０％だけチミジンカウントを低下させた（ｐ＜０．０１）。Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−空での腫瘍細胞の形質導入は≦１５％だけ成長を低下させた。同様な相乗的相互作用がＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞でやはり観察された。
【０４５５】
Ａｄ―ｍｄａ７がタキサンファミリーに属する剤の効果を増強できるかを調べるために、乳癌細胞をタキソテール（ドセタキソール、０．５−２ｎｇ／ｍｌ）で処理した。タキソテールは、微小管ネットワークを破壊する抗神経性薬物であり、細胞が有糸分裂および間期を完了するのを妨げる（Ｗｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｆｉｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９７；Ａｍａｔ  ｗｔ  ａｌ．、２００３）。細胞増殖アッセイを、チミジン取込のほぼ４０％阻害をもたらすタキソテールの用量にてＴ４７ＤおよびＭＣＦ−７で行った（図２１ＡないしＢ）。該細胞はＡｄ−ｍｄａ７に対して感受性であったが、Ａｄ−ｌｕｃに対しては感受性でなかった；Ａｄ−ｍｄａ７をタキソテールと組み合わせると、増強された感受性が双方の細胞系で観察された。同一の結果がＭＤＡ−ＭＢ−３６１細胞で得られた。次いで、その効果がそのヌクレオチド塩基インタカレーションおよび細胞膜脂質結合活性によって媒介されると考えられる細胞傷害性アントラサイクリン抗生物質であるアドリアマイシン（ドキソルビシン）をテストした（Ｗｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、２０００；Ｔａｎｔｉｖｅｊｋｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。ＤＮＡ−切断可能複合体を形成する、この剤と修復構想トポイソメラーゼＩＩとの直接的相互作用は、その薬物の傷害性において役割を演じると考えられる。Ｔ４７ＤまたはＭＤＦ−７細胞の、単一剤として用いられるＡｄ−ｍｄａ７（２００ないし２５００ｖｐ／細胞）での、またはアドリアマイシン（１ｎｇ／ｍＬ）での処理は細胞増殖を現象させた；他方、Ａｄ−ｍｄａ７およびアドリアマイシンの組合せでの処理は超相加的（相乗的）効果を示した（図２２ＡないしＢ）。相乗的活性は低い薬物濃度において明らかであった。Ｔ４７Ｄ細胞においては、２００ｖｐ／細胞Ａｄ−ｍｄａ７または１ｎｇ／ｍｌアドリアマイシンの結果、細胞成長のわずかな１７ないし２３％）の低下がもたらされたが、双方の剤の組合せの結果、有意により大きな（＞６０％）成長阻害がもたらされた（ｐ＜０．０１）。
【０４５６】
次いで、タキソテール、アドリアマイシン、タモキシフェンおよびヘルセプチン（図１５Ｃおよび図１６）と組み合わせたＡｄ−ｍｄａ７で処理された乳癌細胞におけるアポトーシスシグナリング（ｐ５３；ＢＣＬ−ＸＬ；ＢＣＬ−２およびＢＡＸ）を評価した。乳癌細胞の単一剤Ａｄ−ｍｄａ７処理はｐ５３またはＢＣＬ−ＸＬの定常状態レベルを実質的に変更せず、他方、Ｔ４７Ｄ細胞で観察された効果と同様に、ＢＣＬ−２の発現を低下させ、ＢＡＸをアップレギュレートした（図２２Ｃ）。タキソテール、アドリアマイシンまたはヘルセプチンで処理された細胞において、ｐ５３およびＢＣＬ−ＸＬにおける有意な改変はＡｄ−ｍｄａ７処理ののちに認められなかった（図２３）。ＢＣＬ−２およびＢＣＬ−ＸＬの定常状態レベルは双方の化学療法で処理された細胞において低下した。Ａｄ−ｍｄａ７はタキソテール、アドリアマイシンで処理された細胞においてＢＡＸのアップレギュレーションを誘導し、他方、ヘルセプチンと組み合わせた場合に、ＭＤＡ−７発現はＢＣＬ−２の減少を引き起こした（図２２Ｃ）。ｐ５３およびＢＣＬ−２ファミリーメンバーにおける分子の変化を図２３にまとめる。これらのアポトーシスメディエーターは、用いる薬物およびベクターに基づいて異なる調節を示す。単一療法として、または化学療法と組み合わせて送達された場合、Ａｄ−ｍｄａ７は乳癌細胞においてＢＡＸを終始アップレギュレートした。
【０４５７】
ヘルセプチンは、ヒト表皮成長因子受容体―２（ＨＥＲ−２）に対するアンタゴニストとして開発されたヒト化抗体である（Ｐｅｒｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。この実験においては、実験を行って、Ａｄ−ｍｄａ７の発現によって増強されたＭＤＡ−ＭＢ−４５３（ＨＥＲ２過剰発現）およびＭＣＦ−７（ＨＥＲ２陰性）細胞に対するヘルセプチンの細胞傷害性を評価した（図２２Ｄ）。事実、ヘルセプチンと組み合わせたＡｄ−ｍｄａ７で細胞を形質導入した場合、未処理対照と比較してＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞の細胞死滅の相乗的＞５倍増加が観察された（ｐ＜０．００１）。対照的に、Ｈｅｒ−２受容体発現のそれらの欠如によって予測されるように、ＭＣＦ−７細胞はヘルセプチンに対して抵抗性であった。Ａｄ−ｍｄａ７はＭＣＦ−７細胞において死滅を誘導し；しかしながら、Ａｄ−ｍｄａ７／ヘルセプチンの組合せは増強された活性を示さなかった。単一剤としての、またはヘルセプチンと組み合わせた、Ａｄ−ｌｕｃでの処理は、前記と同様な条件下で、観察された細胞死滅のパーセンテージを有意に増加させなかった。これらの結果は、Ａｄ−ｍｄａ７および化学療法剤、ホルモンまたはバイオロジック剤の組合せ使用が、単一療法処理と比較して、腫瘍細胞死滅に必要な処理濃度を低下させることができ、かくして、関連する毒性を潜在的に低下させることができることを示す。
【０４５８】
６．Ａｄ−ｍｄａ７と放射線療法との組合せは、乳癌細胞クローン原性生存および腫瘍成長に対して相乗効果を有する。
【０４５９】
次いで、実験を行って、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞に対するＡｄ−ｍｄａ７およびＸＲＴ組合せ療法のインパクトを調べた。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞を空のアデノウィルスベクター（Ａｄ−ｐ（Ａ））またはＡｄ−ｍｄａ７（共に、２０００ｖｐ／細胞のＭＯＩ）で処理し、照射した。抗―腫瘍活性を、コロニー形成アッセイを用いて評価した。図２４Ａに示すように、ＸＲＴまたはＡｄ−ｐ（Ａ）と比較したＡｄ−ｍｄａ７＋ＸＲＴ処理細胞の生存における有意な減少が観察された。腫瘍細胞殺傷のＭＤＡ−７媒介増強が２および４Ｇｙ  ＸＲＴ双方において観察された（図２４Ａ）。これらの結果は、Ａｄ−ｍｄａ７＋放射線療法の組合せが、イン・ビトロにて、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞においてコロニー形成を超相加的様式で阻害することを示す。
【０４６０】
組み合わせたＡｄ−ｍｄａ７およびＸＲＴ療法のイン・ビボでの効果を調べるために、我々は、大きな（＞１３０ｍｍ３）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌異種移植片腫瘍を、個々に、またはＸＲＴ（５Ｇｙ）と組み合わせたＡｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃまたはＰＢＳで処理した。動物を６つの処理群に分け（各群においてｎ＝５）、ＰＢＳ、ＡＤ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｌｕｃ＋ＸＲＴ、ＸＲＴ、Ａｄ−ｍｄａ−７またはＡｄ−ｍｄａ７＋ＸＲＴで処理した。処理群の間における腫瘍サイズの顕著な差が、処理中止後１週間以内に明らかであった。ＸＲＴ単独、Ａｄ−ｍｄａ７単独、およびＡｄ−ｌｕｃおよびＸＲＴの組合せでの処理の結果、全て、腫瘍成長の有意な減少がもたらされた（ｐ＜０．０５）。しかしながら、最も顕著な変化は、ＸＲＴおよびＡｄ−ｍｄａ７の組合せを受けた動物で観察された。図２４Ｂで示されるように、Ａｄ−ｍｄａ７―処理動物における腫瘍進行の実質的阻害が観察された。しかしながら、Ａｄ−ｍｄａ７およびＸＲＴを組み合わせて用いた場合、腫瘍成長の退行が観察された（ｐ＝０．００１７）。Ａｄ−ｍｄａ７／ＸＲＴ処理動物からの腫瘍はほぼ５０％だけサイズが最初に増加したが、引き続いて、８０％まで退行した。Ａｄ−ｍｄａ７／ＸＲＴ群における動物の全ては退行を受け、腫瘍測定は＜４２ｍｍ３最下点に到達した。対照腫瘍は５００％を超えてサイズが増大し、他方、ＸＲＴ処理腫瘍は＞３５０％だけ増加した。Ａｄ−ｍｄａ７／ＸＲＴ群における腫瘍は延長された安定化を呈し、他方、ＸＲＴ、Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｌｕｃ／ＸＲＴ腫瘍は徐々により大きく成長した。腫瘍がサイズが倍になる時間を評価すると、ＰＢＳおよびＡｄ−ｌｕｃ処理動物は、おのおの、１０日および１１日までにこのサイズに到達した；ＸＲＴおよびＡｄ−ｌｕｃ／ＸＲＴ群双方における動物は１６日を必要とし、他方、Ａｄ−ｍｄａ７処理腫瘍は２５日を必要とした。Ａｄ−ｍｄａ７／ＸＲＴ処理動物からの腫瘍は＞３０日までにサイズが倍にならず、平均して、それらの出発サイズよりも２５％小さかった。トランスジェニックＭＤＡ−７蛋白質の上昇した発現はＡｄ−ｍｄａ７処理腫瘍においてのみ観察されたが、ＰＢＳ−またはＡｄ−ｌｕｃ−処理腫瘍においては観察されなかった（図１８Ｄ）。
【０４６１】
実施例８
ヒトインターロイキン２４（ＩＬ−２４）蛋白質はＩＬ−２０受容体を介して乳癌細胞を殺傷し、ＩＬ−１０によって拮抗される。
【０４６２】
Ａ．材料および方法
１．細胞培養および試薬
ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３乳癌系はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｏｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ，Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手し、１０％胎児ウシ血清（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、１００単位／ｍｌペニシリン１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭＬグルタミンおよびＨＥＰＥＳ緩衝液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を補足したＤＭＥＭ（Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｉｎｃ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）中に維持した。細胞をルーチン的にスクリーニングして、マイコプラズマ汚染の欠如を確認し、成長の対数期で用いた。モノクローナル抗―ＩＬ―２４抗体は従前に記載されているように調製した（Ｃａｕｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。ウサギホスホ―Ｓｔａｔ３（Ｔｙｒ７０５）抗体はＣｅｌｌ  Ｓｉｎｇａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）から購入し、β―アクチンモノクローナル抗体およびターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ―媒介ｄＵＴＰ−リオチンニック―末端標識（ＴＵＮＥＬ）キットはＯｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、  ＣＡ）から購入し、および他の一次および二次抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）から購入した。細胞生存率はトリパンブルー排除アッセイによって分析した。細胞をトリプシン処理し、アリコットを０．４％トリパンブルーと共に１：１で容量懸濁した。合計細胞数および細胞生存率カウントを光学顕微鏡によってヘモサイトメーターを用いて評価した（Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。
【０４６３】
２．ヒトＩＬ−２４での精製および処理
全長ｍｄａ−７  ｃＤＮＡを、ＣＭＶプロモーターを含有するｐＣＥＰ４  ＦＬＡＧベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）にクローン化した。プラスミドをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、安定なサブ−クローンをヒグロマイシン（０．４μｇ／ｍｌ）を用いて単離した。２９３−ＩＬ２４細胞からの上清を濃縮し、記載されているようにアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した（Ｃａｕｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）。細胞を０ないし３０ｎｇ／ｍｌの精製されたＩＬ−２４蛋白質で処理するか、あるいはトランスウェルシステム（Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）を用いて２９３−ＩＬ２４プロデューサー細胞と共に共培養した。
【０４６４】
３．遺伝子導入
ｍｄａ−７遺伝子を運ぶ複製―欠陥ヒトタイプ５アデノウイルス（Ａｄ５）は従前に記載されている（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）ｍｄａ−７遺伝子を内部ＣＭＶ−ＩＥプロモーター続いてＳＶ４０ポリアデニル化配列に連結させた。ルシフェラーゼの発現のための配列を含有する同一アデノウイルスベクター（Ａｄ−ｌｕｃ）を対照ウィルスとして用いた。細胞を感染から１日前に平板培養した。細胞当たり６２５ないし１０，０００ウィルス粒子を用い（３３ないし５００ｐｆｕ／細胞）、標的細胞をアデノウィルスベクター（Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃ）で感染させた。実験条件を最適化して、免疫組織化学染色の結果に基づいて、細胞の＞７０％においてＩＬ−２４蛋白質発現を達成した。
【０４６５】
４．免疫ブロッティング
種々の抗体および標準的な手法を用いる免疫ブロッティングを従前に記載されているように行った（Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。テストした一次抗体は：ｐ−ＳＴＡＴ３、カスパーゼ―３、ｐ−ｃｄｃ２（ｔｙｒ−１５）、ｐ−ｃｄｃ２５（ｓｅｒ−２１６）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、  Ｂｅｖｅｒｌｙ、  ＭＡ）、抗−ｐ２７ウサギポリクローナル、抗−β―カテニンモノクローナル、抗−ｐ−Ａｋｔ抗−Ａｋｔ、β―アクチン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  ＣＡ）または抗−ＩＬ−２４抗体（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、  Ｈｏｕｓｔｏｎ、  ＴＸ）であった。増強されたケミルミネセンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｉｅｓ）を用いて蛋白質を可視化した。ＳＴＡＴ−３の活性化は、ホスホ―ＳＴＡＴ３−特異的抗体を用いて免疫蛍光アッセイによって測定した（Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００５）。染色から１ないし２時間後に蛍光顕微鏡を用いて写真を撮った。
【０４６６】
５．ＦＡＣＳ分析
細胞表面受容体サブユニットＩＬ−２０Ｒ１およびＩＬ−２２Ｒ１を、プロサイトメトリーによって調べた。簡単に述べれば、０．２％ＥＤＴＡ／ＰＢＳを加えることによって単層細胞を脱着させ、氷冷ＰＢＳで１回洗浄し、ペレット化し、ＰＢＳ中０．１ｍｌの１％ＦＢＳに再懸濁させ、抗−ＩＬ−２０Ｒ１抗−ＩＬ−２２Ｒ１または正常なＩｇＧ対照抗体いずれかと共に室温にて６０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、氷上で、ＰＢＳ中の１％ＦＢＳ中のＦＩＴＣ−コンジュゲーテッド二次抗体と共に３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳ中の０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で３回洗浄し、ペレット化し、５００μｌの１％パラホルムアルデヒド中に再懸濁させ、データを獲得し、分析した。製造業者のプロトコルに従って行ったアネキシンＶアッセイによって、アポトーシスをＦＡＣＳ分析を介して測定した。ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡ）にて、細胞をフローサイトメトリー分析によって分析した。１０，０００細胞の試料集団を分析のために用いた。
【０４６７】
６．免疫蛍光アッセイ
チャンバースライド中で成長する細胞を種々の濃度（０ないし２０ｎｇ／ｍｌ）のヒトＩＬ−２４蛋白質で３０分間処理した。細胞をエタノール：酢酸（９．５：０．５）で固定し、次いで、ホスホ―Ｓｔａｔ３一次抗体およびＦＩＴＣ−標識二次抗体で染色した。Ｎｉｋｏｎ蛍光顕微鏡を用いてスライドを分析した。
【０４６８】
７．統計学的解析
実験結果の統計学的有意性は、スチューデントｔ−検定を用いて評価した。有意性はｐ＜０．０５に設定した。
【０４６９】
Ｂ．結果
１．Ａｄ−ｍｄａ７ベクターは乳癌細胞において高レベルのＩＬ−２４発現および細胞殺傷を誘導する。
【０４７０】
この実験においては、２つのよく樹立された乳癌細胞系モデル、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３を評価した。これらの乳癌細胞を種々の用量（細胞当たり０ないし１０，０００ウィルス粒子；０ないし５００ｐｆｕ／細胞）のＡｄ−ｍｄａ７で形質導入し、７２時間後に、上清および細胞溶解物を集め、ＩＬ−２４蛋白質発現のためにウェスタンブロッティングによってプローブした。双方の細胞系はＩＬ−２４の高レベル発現および分泌を示し、これはＡｄ−ｍｄａ７の用量に相関して増大した。複数のバンドがブロットで観察され、ＩＬ−２４のその成熟グリコシル化形態へのプロセッシングを反映する。ＩＬ−２４発現は遺伝子送達の直接的結果である。というのは、未処理細胞、またはルシフェラーゼ遺伝子（Ａｄ−ｌｕｃ）を運ぶ対照ベクターで処理された細胞はＩＬ−２４発現を示さなかったからである。
【０４７１】
また、３日後に、トリパンブルー排除分析によって、細胞培養を生存率についてモニターした。ルシフェラーゼ対照ベクターでの形質導入は、未処理細胞と比較してわずかな殺傷を引き起こしたに過ぎず、他方、Ａｄ−ｍｄａ７は用量−依存的に有意により大きな（ｐ＜０．００１）殺傷を誘導した（図２５）。細胞殺傷はＡｄ−ｍｄａ７によって媒介される分泌されたＩＬ−２４の発現に強く相関し、相関係数は、各々、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３について０．９８および０．９３であった（表５）。
【０４７２】
【表５】
2008531481.tif 000019
これらのデータは、観察された細胞殺傷効果が増大するレベルのＩＬ−２４蛋白質発現の結果であることを示唆する。
【０４７３】
２．Ａｄ−ｍｄａ７は細胞周期の進行をブロックし、乳癌細胞においてアポトーシスを誘導する。
【０４７４】
乳癌細胞においてＡｄ−ｍｄａ７によって誘導された細胞死滅のメカニズムを理解するために、ＰＩ染色およびフローサイトメトリーによる細胞周期分析を行った。Ａｄ−ｍｄａ７形質導入細胞における細胞周期の分析は、未処理対照またはＡｄ−ｌｕｃ形質導入細胞と比較して、Ｇ２／Ｍ集団において有意な増加（ｐ＜０．０５）を示し、これは、この相における細胞周期阻止を示す（図２６Ａ）。細胞周期進行をブロックするＡｄ−ｍｄａ７についての更なる裏付けは、細胞周期蛋白質の分析によって得られた。Ａｄ−ｍｄａ７での処理の結果、ＣＤＣ−２５の増大したリン酸化および合計ｐ２７レベルの増加がもたらされた。ＣＤＣ−２５は、Ｓｅｒ２１６のリン酸化によって不活化されるＧ２からＭへの細胞周期進行に関与するホスファターゼである。ＣＤＣ−２５の不活化は、それが、細胞周期進行を可能とするその下流の標的を脱リン酸化するのを妨げる。ｐ２７は、そのレベルが休止細胞において増大するもう１つの臨界的な細胞周期調節蛋白質である。増大した細胞周期のブロックは、ＣＤＣ−２の減少したリン酸化に相関した。未処理細胞、およびＡｄ−Ｌｕｃ対照ベクターで形質導入された細胞は、ｐ２７またはｐ−ＣＤＣ−２５またはｐ−ｃｄｃ２レベルの変化を示さなかった。
【０４７５】
プログラムされた細胞死滅経路の活性化におけるＡｄ−ｍｄａ７の役割を評価するために、アネキシンＶアッセイを行って、初期のアポトーシス事象を分析した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３の双方の細胞のＡｄ−ｍｄａ７での処理の結果、アネキシンＶ要請細胞が有意に増加し（ｐ＜０．０１）これは、Ａｄ−ｌｕｃ処理対照と比較してアポトーシスのより高い分率を示す（図２６Ｂ）。ウェスタン分析は、Ａｄ−ｍｄａ７処理のちにおける乳癌細胞でのカスパーゼ―３用量―依存性切断および活性化を示した。ＰＩ３Ｋ生存経路は、胸腫瘍形成および化学抵抗性に関連付けられており；かくして、ＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞におけるＰＩ３ＫおよびＷｎｔ生存シグナリング経路での蛋白質発現の調節を調べた（ＮｉｃｈｏｌｓｏｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ、２００２；Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００４；Ｓｉｍｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。ウェスタンブロット分析は、増大するレベルのＭＤＡ−７／ＩＬ−２４発現が、細胞生存経路に関する蛋白質の阻害に相関したことを示した。ＩＬ−２４のレベルが細胞内で増大するにつれて、ＡｋｔＰ−Ａｋｔおよびβ―カテニンの同時減少が観察された。
【０４７６】
３．内因性ＩＬ−２４蛋白質はＳＴＡＴ３を活性化し、乳癌細胞を殺傷する。
【０４７７】
ＩＬ―２４蛋白質はＡｄ−ｍｄａ７形質導入細胞の上清および細胞内区画双方に存在するので、乳癌細胞の成長阻害における細胞内  ｖｓ  細胞外ＩＬ−２４の機能を調べた。ＭｅＷＯメラノーマ細胞を陽性対照細胞系として供した。というのは、ＩＬ―２４はリガンド―受容体係合を介してメラノーマ細胞を効果的に殺傷すると報告されているからである（Ｃｈａｄａ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。増大させる濃度の抗−ＭＤＡ７中和抗体をＡｄ−ｍｄａ７形質導入細胞の培養に加えた。乳房およびメラノーマ細胞系において、ＩＬ−２４の中和は、非特異的ＩｇＧ抗体の添加と比較して細胞殺傷を有意に減少させ（ｐ＜０．０１）（図２７）、これは、該効果がＩＬ−２４特異的であることを示す。抗−ＩＬ−２４が細胞殺傷を十分に妨げることができず、Ａｄ−ｍｄａ７が細胞内および細胞外メカニズムの双方によって乳癌細胞を殺傷することを示唆することに注意されたし。
【０４７８】
ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４を含めた全てのＩＬ−１０サイトカインファミリーメンバーは、受容体−陽性細胞系においてＳＴＡＴ３の活性化を誘導することが示されている（Ｐｅｓｔｋａ  ｅｔ  ａｌ．，２００４）。従って、ＩＬ−２４受容体係合を、乳癌細胞におけるＳＴＡＴ３リン酸化および核への移動をテストすることによって評価した。ＩＬ−２４に対する受容体は、タイプ１のＩＬ−２０Ｒ（ＩＬ−２０Ｒ１／ＩＬ−２０Ｒ２）およびタイプ２のＩＬ−２０Ｒ（ＩＬ−２２Ｒ１／ＩＬ−２０Ｒ２）と言われるヘテロダイマーサイトカイン受容体である。ホスホ―ＳＴＡＴ３に対して向けられた抗体を用いる免疫蛍光顕微鏡は、ＩＬ−２４およびＩＬ−１０の双方が乳癌細胞系の双方においてＳＴＡＴ３活性化できることを示す。
【０４７９】
４．ＩＬ―２４は、アポトーシスを誘導するのにそのＩＬ−２０受容体への結合を必要とする。
【０４８０】
ＩＬ−２４およびＩＬ−１０は共に関連受容体に結合し、ＳＴＡＴ３を活性化するが、ＩＬ−２４のみが細胞を殺傷する能力を有するので、実験を行って、いずれの受容体がＩＬ−２４による細胞死滅を媒介するかを同定した。ＭＤＡ−ＭＢ４５３およびＭＤＡ−ＭＢ２３１細胞を、ＩＬ−２４、ＩＬ−２０Ｒ１、またはＩＬ−２２Ｒ１に対する中和抗体で処理し、次いで、ＩＬ−２４に暴露し、トリパンブルー染色を用いて細胞死滅についてモニターした。抗−ＩＬ−２４はＩＬ−２４媒介細胞殺傷を≧８０％だけ有意に阻害することができた（ｐ＜０．０１）。抗−ＩＬ−２２Ｒ１は中程度の低下を示し（ＭＢ２３１では１６％、およびＭＢ４３では２２％）、他方、抗−ＩＬ−２０Ｒ１は双方の細胞系において≧６０％だけ殺傷を有意に低下させた（ｐ＜０．０１）（図２８Ａ）。双方の受容体中和抗体を組み合わせると、殺傷を有意に対照に匹敵するレベルまでさらに低下させた。
【０４８１】
実験を行って、これらの受容体に対する特異的抗体およびＦＡＣＳ分析を用いてＩＬ−２０Ｒ１およびＩＬ−２２Ｒ１の細胞表面発現を調べた。結果は、ＩＬ−２０Ｒ１染色はＩＬ−２２Ｒ１染色よりもほぼ４倍高いことを示し、ＩＬ−２０Ｒ１が細胞表面でかなり豊富であり、あるいは抗−ＩＬ−２２Ｒ１抗体が抗−ＩＬ−２０Ｒ１よりも低い結合親和性を有することを示唆する（表６）。
【０４８２】
【表６】
2008531481.tif 000020
陽性対照ＭｅＷｏメラノーマ細胞系は高レベルの療細胞表面ＩＬ−２０Ｒ１およびＩＬ−２２Ｒ１受容体サブユニットを発現し、他方、これらの受容体のレベルはＡ５４９細胞（肺がん細胞）非常に低かった。
【０４８３】
５．ＩＬ―２４は乳癌細胞において用量―依存性アポトーシスを誘導するが、他のＩＬ−１０ファミリーメンバーは誘導しない。
【０４８４】
ＩＬ―２４蛋白質によって媒介される細胞死滅のメカニズムを評価するために、アネキシンＶアッセイを用いて、ＩＬ−２４蛋白質への暴露の後に乳癌細胞においてアポトーシスを評価した。ウェスタンブロッティングによって、並行培養上清を定常状態ＩＬ−２４蛋白質レベルについて分析した。乳癌系のＩＬ−２４蛋白質での処理の結果、有意な細胞死滅が誘導され、増大するレベルのアポトーシスはＩＬ−２４の用量と直接的に相関した（図２８Ｂ）。この結果は、他のＩＬ−１０ファミリーサイトカインでは観察されなかった。ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２２を乳癌細胞に対する細胞傷害性について評価したが、これらのいずれもバックグラウンドレベルを超えて細胞死滅を誘導しなかった（図２９Ａ）。乳癌細胞においては、ＩＬ−１０および全ての他のファミリーメンバーはＳＴＡＴ３を活性化することができるが、ＩＬ−２４は直接的細胞傷害性特性を持つ唯一のファミリーメンバーである。
【０４８５】
６．ＩＬ―１０はＩＬ―２４蛋白質によって媒介される殺傷に拮抗する。
【０４８６】
従前の研究は、ＩＬ−１０が、ＩＬ−６、インターフェロン―γ、ＴＮＦ−α、およびＰＢＭＣにおいてＩＬ−２４によって誘導される他のサイトカインの発現をブロックしたことを示したので（Ｃａｕｄｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、２００２）、実験を行って、ＩＬ−１０およびＩＬ−２４がシグナル変換および細胞増殖において相互に対して拮抗するか否かを評価した。ＩＬ−１０がＩＬ−２４に誘導成長阻害を調節できるか否かを判断するために、ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を共に同一量のＩＬ−２４蛋白質および増大させる量の組換えＩＬ−１０で処理した。結果は、ＩＬ−１０がＩＬ−２４−蛋白質―誘導殺傷を用量−依存的に有意に阻害したことを示す（図２９Ｂ）。ＩＬ―１０単独は、乳癌細胞系の細胞増殖または殺傷を刺激しなかった（図２９Ａ）。特異性についての更なる対照として、ＩＬ−１０を煮沸して、その機能をブロックした。ＩＬ−１０の煮沸は、ＩＬ−２４によって媒介される殺傷を阻害するその能力をなくした（図２９Ｂ）。
【０４８７】
実施例９
ベバシズマブは、肺癌細胞に対するＡｄ−ｍｄａ７−媒介抗−腫瘍活性を増強する。
【０４８８】
Ａ．材料および方法
１．組換えアデノウィルスベクター
従前に報告されているように、Ａｄ−ｍｄａ７およびＡｄ−ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ベクターを構築し、精製した（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。細胞系についての形質導入効率は、ＧＦＰを運ぶアデノウイルスベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）で測定した。形質導入効率は、３０００ｖｐ／細胞で感染させた場合、各細胞系で８０よりも大きかった。細胞を適当なウィルス粒子で処理した。
【０４８９】
２．細胞培養および試薬
非小細胞肺がん細胞系Ｈ１２９９およびＡ５４９を従前に記載されているように培養した（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。ＨＵＶＥＣはｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から購入し、５％胎児ウシ血清および製造業者によってアブレット（ａｂｕｌｌｅｔ）キットとして提供される更なる試薬を含む内皮細胞基礎培地中で成長させた。内皮細胞を継代３ないし８において用いた。
【０４９０】
３．細胞増殖アッセイ
非−細胞傷害性用量を決定するために、用量―力価測定実験を行った。このパイロット実験に従うと、１０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｍｄａ７は４日までは肺癌細胞に対して細胞傷害性ではなく、他方、２０００および３０００ｖｐ／細胞の用量は細胞傷害性であった。これらの結果に基づくと、前記した全ての引き続いてのアッセイを１０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７を用いて行った。
【０４９１】
腫瘍細胞（Ｈ１２９９およびＡ５４９）を６つのウェルプレートに蒔き、（２ｘ１０５細胞／ウェル）、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（Ａｄ−ｌｕｃ）またはＡｄ−ｍｄａ７を発現するアデノウィルスベクターで処理した（１０００ウィルス粒子［ｖｐ］／細胞））。ＰＢＳで処理した細胞を対照として供した。細胞を図面にリストした種々の時点で収穫し、従前に記載されているように細胞生存率アッセイに付した（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。
【０４９２】
内皮細胞増殖に対するＡｄ−ｍｄａ７−処理Ｈ１２９９からの条件培地の効果の分析のために、ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を６つのウェルプレートに蒔いた（３×１０５細胞／ウェル）。インキュベーション後２４時間において、培養基を、ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で処理した腫瘍細胞から調製された条件培地で置き換えた。ＨＵＶＥＣをさらに３日間インキュベートし、その後、収穫し、細胞生存率アッセイに付した（Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００３；Ｍｈａｓｅｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）。
【０４９３】
実験の別の組において、ＨＵＶＥＣを、組み換えヒトＶＥＧＦ１６５または抗−ＭＤＡ−７抗体（１０μｇ／ｍｌ；Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、Ｈｏｕｓｔｏｎ、ＴＸ）含有するＡｄ−ｍｄａ７−処理細胞からの条件培地で処理し、細胞生存率を前記したように測定した。
【０４９４】
４．ウェスタンブロッティング
ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、またはＡｄ−ｍｄａ７で処理された腫瘍細胞を、処理後の指定された時点において収穫した。従前に記載されているように、細胞溶解物を集め、ウェスタンブロッティングによって分析した（Ｍｈａｓｈｉｌｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．、２００１；Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２０００）。以下の抗−ヒト一次抗体を検出で用いた：ＶＥＧＦＲ２（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）、リン酸化ＶＥＧＦＲ２（ｐＶＥＧＦＲ２、Ｙ１２１４；Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｃａｍａｒｉｌｌｏ、ＣＡ）、ＶＥＧＦ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）；ベータ―アクチン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、  ＭＯ）；ＡＫＴ、リン酸化ＡＫＴ（ｐＡＫＴ）、カスパーゼ―３（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＣＡ）；およびＭＤＡ−７（Ｉｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）。
【０４９５】
５．酵素―結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）
腫瘍細胞を６つのウェルプレートに蒔き、ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で処理した（１０００ｖｐ／細胞）。条件培地を処理から４８時間および７２時間後に集め、１３，０００ｒｐｍの遠心に１５分間付して細胞をデブリスを除去した。商業的に入手可能なＥＬＩＳＡキット（ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅヒトＶＥＤＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用い、上清をヒトＶＥＧＦについて三連で分析した。製造業者のプロトコルに従ってアッセイを行い、ＶＥＧＦ濃度を測定した。Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７処理細胞の条件培地中のＶＥＧＦ濃度は、ＰＢＳ−処理細胞の培地中でのＶＥＧＦ濃度に対するパーセンテージ阻害として表した。実験を３回行い、結果を３つの別々の実験の平均として表した。
【０４９６】
６．Ｓｒｃキナーゼアッセイ
Ｓｒｃキナーゼアッセイを従前に記載されているように行った（Ｂｏｙｄ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。簡単に述べれば、ＰＢＳ−、Ａｄ−ｌｕｃ−、およびＡｄ−ｍｄａ７−処理腫瘍細胞からの細胞溶解物を放射性免疫沈澱アッセイ緩衝液中に調製し、抗−ｃ−Ｓｒｃモノクローナル抗体３２７と反応させた（Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）。免疫複合体を、ウサギ抗マウスＩｇＧおよびホルマルリン−固定パンドルジン（Ｐａｎｄｏｒｄｉｎ）とで形成した。２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中の１０μＣｉの［γ―３２Ｐ］ＡＴＰ、１０ｍＭ  Ｍｇ２＋、１０μｇのウサギ筋肉エノラーゼ（Ｓｉｇｍａ）、および１００μＭオルトバナジン酸ナトリウムを加えることによって、キナーゼ反応を開始した。反応はドデシル硫酸ナトリウムで停止させた。放射性標識蛋白質産物を８％ポリアクリルアミドゲル中で分離し、オートラジオグラフィーに付した。ブロットを、デンシトメーターを用いる半定量的分析に付し、値をＰＢＳに対するパーセント阻害として表した。
【０４９７】
７．ＶＥＧＦ受容体活性化アッセイ
ＨＵＶＥＣを６−ウエルプレート（５ｘ１０５／ウエル）に蒔き、成長因子フリー培地含有１％ＰＢＳを一晩飢餓させた。翌日、培地を、ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｍｄａ７＋抗−ＭＤＡ７抗体、Ａｄ−ｍｄａ７＋組換えヒトＶＥＧＦ（ｒｈＶＥＧＦ）で処理された腫瘍細胞から収集された条件培地で置き換えた。実験の異なる組において、細胞を、やはり、アバスチン、アバスチン＋Ａｄ−ｌｕｃおよびアバスチン＋Ａｄ−ｍｄａ７で処理された条件培地で処理した。条件培地を加えなかったＨＵＶＥＣを対照として供した。条件培地の添加から５、１０および６０分後に細胞を収穫し、細胞溶解物を調製し、ウェスタンブロッティングによってＶＥＧＦ受容体のリン酸化、およびＡＫＴのリン酸化、ＶＥＧＦ受容体の下流標的について分析した。
【０４９８】
８．イン・ビボ分析
Ａｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブ組合せがイン・ビボにて腫瘍の腫瘍成長阻害を増強するかを判断するために、Ｈ１２９９腫瘍細胞（５ｘ１０６）を無胸腺ＢＡＬＢ／ｃ雌ヌードマウス（ｎ＝５０）の下方右側腹部に皮下注射した。マウスを群に分け、腫瘍のサイズが５０ないし１００ｍｍ３に到達すれば、以下のように処理した：ＰＢＳ（ｎ＝８）、Ａｄ−ｌｕｃ（ｎ＝８）、Ａｄ−ｍｄａ７（ｎ＝８）、ビバシズマブ（ｎ＝９）、Ａｄ−ｌｕｃ＋ビバシズマブ（ｎ＝８）、Ａｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブ（ｎ＝９）。マウスをＡｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で１週間につき２回腫瘍内処理した（１ｘ１０１０ｖｐ／用量）。ビバシズマブ（１００ｕｇ／身体）は１週間につき２回腹腔内投与した。動物を毎週体重を計り、従前に記載されているように、腫瘍成長を１週間につき３回測定した（Ｓａｅｋｉ  ｅｔ  ａｌ．、２００２；Ｒａｍｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．、２００３）。最初の処理から２８日後に、全ての動物をＣＯ２で吸入を介して殺し、組織病理学的調査およびウェスタンブロット分析のために腫瘍を収集した。実験の２つの異なる組を行った。
【０４９９】
９．統計学的解析
全ての実験は３回行い、スチューデントのｔ−検定および偏差の解析を用いて、実験結果の統計学的有意性を計算した。有意性レベルはＰ＜０．０５に設定した。
【０５００】
Ｂ．結果
１．Ａｄ−ｍｄａ７はその殺傷効果とは独立してＮＳＣＬＣにおけるＶＥＧＦを抑制した。
【０５０１】
Ｈ１２９９およびＡ５４９を６−ウェル組織培養プレート中で成長させ（２ｘ１０５）、１０００ＶＰ／細胞のＡｄ−ｍｄａ７で処理した。細胞をＰＢＳおよびＡｄ−ｌｕｃ（１０００ｖｐ／細胞）で処理し、対照として供した。細胞抽出物および培養上清を処理から４８時間および７２時間後に集めた。Ａｄ−ｍｄａ７は、ＰＢＳおよびＡｄ−ｌｕｃと比較して、双方のＮＳＣＬＣにおけるＶＥＧＦ発現を顕著に減少させた（図３０Ａ）。および、ＭＤＡ−７蛋白質発現は時間依存性であるように観察された。細胞生存率アッセイは、１０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｍｄａ７は、処理後７２時間まで、双方の肺がん細胞系に対するいずれの殺傷効果も示さなかった（図３１ＡないしＢ）。細胞上清中のＶＥＧＦの分析は、Ａｄ−ｍｄａ７が、Ａｄ−ｌｕｃと比較して双方のＮＳＣＬＣにおいてＶＥＧＦを有意に抑制したことを示した（図３０Ｂ、図３１Ｂ）。これらのデータは、Ａｄ−ｍｄａ７が腫瘍細胞に対するその毒性効果から独立して、ＮＳＣＬＣにおけるＶＥＧＦ発現を阻害することを示唆する。
【０５０２】
２．Ａｄ−ｍｄａ７はＮＳＣＬＣにおいてＳｒｃ活性化をダウンレギュレートした。
【０５０３】
従前のいくつかの研究は、ｃ−Ｓｒｃ、非受容体キナーゼがＶＥＧＦ発現を調節するにおいて役割を演じることを示しており、Ｓｒｃの高発現は増加したＶＥＧＦ発現に関連すると報告されている（Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．、２００５；ＩｒｂｙおよびＹｅａｔｍａｎ、２０００；Ｂｒｏｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．、２００４）。これらの報告に基づいて、我々は、Ａｄ−ｍｄａ７−媒介ＶＥＧＦ阻害がＮＳＣＬＣにおけるｃ−Ｓｒｃに関連するか否かをＳｒｃキナーゼアッセイによって調べた。
【０５０４】
Ｈ１２９９およびＡ５４９細胞を６−ウェルプレートに蒔き、ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃおよびＡｄ−ｍｄａ７での処理から４８時間後に溶解物を収集した。キナーゼアッセイキットを用いてＳｒｃ活性を分析した。Ａｄ−ｍｄａ７は双方のＮＳＣＬＣにおけるＳｒｃ活性を有意に減少させた（図３２）。これらのデータは、Ａｄ−ｍｄａ７によるＳｒｃ活性の阻害が、肺癌細胞においてＶＥＧＦのダウンレギュレーションを引き起こすことを示唆する。
【０５０５】
３．肺癌細胞におけるＭＤＡ−７−媒介ＶＥＧＦ阻害が、内皮細胞増殖およびＶＥＧＦ受容体シグナリングに影響する。
【０５０６】
ＶＥＧＦは、内皮細胞増殖および生存についての鍵となる成長因子であることが示されている（Ｇｅｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、１９９８）。従って、ＶＥＧＦの阻害は内皮細胞死滅を提供するはずである。腫瘍細胞による減少したＶＥＧＦ生産が内皮細胞増殖およびシグナリングに影響したか否かを調べるために、細胞生存率アッセイおよびＨＵＶＥＣに対するＶＥＧＦ受容体シグナリングについてのウェスタンブロット分析を行った。
【０５０７】
Ａｄ−ｍｄａ７−処理腫瘍細胞から収集した条件培地でのＨＵＶＥＣの処理は、Ａｄ−ｌｕｃ−処理腫瘍細胞からの条件培地での処理と比較して、細胞増殖の有意な阻害を示し（図３３Ａ）、その際、データはＰＢＳ群に対するパーセント阻害によって示した（図３３Ａ）。ＨＵＶＥＣ増殖の阻害が低下したＶＥＧＦによるものか否かをさらに評価するために、血清−飢餓ＨＵＶＥＣを前記したように処理し、ＶＥＧＦ受容体シグナリングについて分析した。加えて、過剰容量の抗−ＭＤＡ７中和抗体を加えて、ＭＤＡ−７蛋白質の分泌された形態がＨＵＶＥＣ増殖に影響するかもしれない可能性を排除した。ＨＵＶＥＣをＰＢＳおよびＡｄ−ｌｕｃ処理腫瘍細胞からの条件培地で処理すると、ＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴ、ＶＥＧＦＲ２シグナリング経路についての下流標的をリン酸化した。ＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴ活性化は、抗−ＭＤＡ７中和抗体の存在下または不存在下において、Ａｄ−ｍｄａ７−処理細胞からの条件培地で処理されたＨＵＶＥＣにおいて常に観察されなかった。Ａｄ−ｍｄａ７−処理細胞からの条件培地へのｒｈＶＥＧＦ１６５への添加は、ＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴ活性化を回復した（図３３Ｂ）。
【０５０８】
４．Ａｄ−ｍｄａ７はＨＵＶＥＣに対するいずれの殺傷効果も示さず、アバスチンはＨＵＶＥＣ細胞増殖を阻害したが、Ｈ１２９９細胞増殖に影響しなかった。
【０５０９】
実験を行って、Ａｄ−ｍｄａ７およびビバシズマブの組合せが肺癌に対して効果的か否かを調べた。腫瘍細胞および内皮細胞に対するＡｄ−ｍｄａ７およびビバコズマブ双方の毒性を評価するために細胞生存率アッセイを行った。Ｈ１２９９細胞（２ｘ１０５／ウェル）およびＨＵＶＥＣ（３ｘ１０５／ウェル）を６−ウェルプレートに蒔いた。翌日、細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ（１０００ｖｐ／細胞）、Ａｄ−ｍｄａ７（１０００ｖｐ／細胞）およびビバシズマブ（０．７８ｕｇ／ｍｌ、１．５６ｕｇ／ｍｌ、３，１２５ｕｇ／ｍｌ）、Ａｄ−ｌｕｃ＋ビバシズマブおよびＡｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブで各々処理した。処理から４８時間および７３時間後に、細胞をトリプシン処理し、トリパンブルー細胞排除アッセイで分析した。従前のデータに合致して、１０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｍａｄ７はＨ１２９９およびＨＵＶＥＣ双方に対していずれの毒性も示さなかった。ビバシズマブはＨＵＶＥＣ生存率を阻害したが、ベバシズマブはＨ１２９９に対して有害な効果を示さなかった（図３４）。
【０５１０】
５．ＭＤＡ−７およびアバスチンによる肺癌細胞におけるＶＥＧＦ阻害は内皮細胞の増殖に影響する。
【０５１１】
Ａｄ−ｍｄａ７−処理腫瘍細胞から収集した条件培地でのＨＵＶＥＣの処理は、Ａｄ−ｌｕｃ−処理腫瘍細胞からの条件培地での処理と比較して、細胞増殖の有意な阻害を示し（Ｐ＝＜０．０５；図３４）、その際、データはＰＢＳ群に対するパーセント阻害によって示した（図３５）。
【０５１２】
６．ＨＵＶＥＣに対するＶＥＧＦＲ２シグナリングのブロックは、Ａｄ−ｍｄａ７をビバシズマブと組み合わせた場合に、有意に増強された。
【０５１３】
ビバシズマブと共にＡｄ−ｍｄａ７が、ＨＵＶＥＣに対するＶＥＧＦＲ２シグナリング経路の抑制効果を増強するか否かを評価するために、Ａｄ−ｍｄａ７をビバシズマブと組み合わせた以外は、前記したのと同一の実験の組を行った。再度、ＰＢＳおよびＡｄ−ｌｕｃ処理腫瘍細胞からの条件培地はＶＥＧＦＲ２シグナリングを活性化した。より少ないＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴ活性が、Ａｄ−ｍｄａ７−処理細胞およびビバシズマブ−処理細胞からの条件培地で処理したＨＵＶＥＣで観察された。さらに、ビバシズマブ−処理上清によるＨＵＶＥＣに対対するＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴ活性化の阻害効果は、Ａｄ−ｍｄａ７−処理、およびＡｄ−ｌｕｃ＋ビバシズマブ−処理上清のそれと同様であった。ＨＵＶＥＣを、Ａｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブで処理した培養上清によって処理した場合、ＶＥＧＦＲ２シグナリングの活性化が顕著に低下した（図３６）。
【０５１４】
７．Ａｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブ組合せは、イン・ビボにて腫瘍成長抑制を増強する。
【０５１５】
Ａｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブ組合せ処理が腫瘍成長抑制を増強するか否かを調べるために、異種移植片モデルを用いてイン・ビボ実験を行った。Ａｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブで処理したマウスは、ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、ビバシズマブまたはＡｄ−ｌｕｃ＋ビバシズマブで処理したマウスと比較して、腫瘍成長を有意に抑制した。さらに、体重喪失、罹患率または死亡のような、各剤または組合せに関連する有害効果は観察されず、全ての処理が許容できることを示唆する。
【０５１６】
腫瘍阻害の分子メカニズムを調べるために、最後の処理から２４時間後に動物を安楽死させ、腫瘍試料を収集し、スナップ凍結させ、またはホルマリン中で固定した。全蛋白質をスナップ凍結腫瘍組織から抽出し、ＶＥＧＦ、ＭＤＡ−７、およびカスパーゼ−３についてウェスタンブロット分析によって分析した。ｍｄａ−７遺伝子は腫瘍細胞に首尾よくトランスフェクトされた。腫瘍試料中のＶＥＧＦはＡｄ−ｍｄａ７処理によって抑制され、他方、ＰＢＳおよびＡｄ−ｌｕｃは阻害しなかった（図３７）。腫瘍をＡｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブによって処理した場合、ＶＥＧＦ発現は有意に低下した。さらに、切断されたカスパーゼ−３が、Ａｄ−ｍｄａ７で処理した腫瘍で観察された。興味深いことには、腫瘍をＡｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブによって処理した場合、より多くのカスパーゼ−３切断が観察された。
【０５１７】
ＭＤＡ−７、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１およびＴＵＮＥＬについての腫瘍組織の免疫組織化学分析が、ＡＤ−ｍｄａ７およびビバシズマブで処理されたマウスからの腫瘍は、全ての他の処理群と比較して、ＶＥＧＦ、ＣＤ３１の有意な低下、および増大したＴＵＮＥＬ陽性染色を示すことを示した。加えて、観察された効果はＭＤＡ−７蛋白質発現に相関していた。
【０５１８】
まとめると、Ａｄ−ｍｄａ７はＳｒｃキナーゼ活性の阻害を通じてＮＳＣＬＣにおいてＶＥＧＦを抑制する。Ａｄ−ｍｄａ７をビバシズマブと組み合わせた場合、ＨＵＶＥＣに対するＶＥＧＦＲ２シグナリングのブロックは有意に増強された。肺癌細胞におけるＭＤＡ−７−媒介ＶＥＧＦ阻害は、内皮細胞増殖およびＶＥＧＦ受容体シグナリングに影響する。Ａｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブ組合せはイン・ビボにて腫瘍成長抑制を増強する。Ａｄ−ｍｄａ７＋ビバシズマブ組合せは、イン・ビボにてＶＥＧＦの阻害効果、および腫瘍アポトーシスを増強させる。
【０５１９】
実施例１０
Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ処理は前立腺腫瘍細胞の殺傷を増強させる。
【０５２０】
Ｅ．材料および方法
１．組換えアデノウィルスベクター
Ａｄ−ｍｄａ７およびＡｄ−ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）ベクターを構築し、精製し、およびＩｎｔｒｏｇｅｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓによって供給された。
【０５２１】
２．形質導入の効率
前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰについての形質導入効率を、ＧＦＰを運ぶアデノウィルスベクター（Ａｄ−ＧＦＰ）で測定した。細胞を６−ウェルプレートに蒔き、異なる容量のＡｄ−ＧＦＰ（１００、３００、６００、および１２００ｖｐ／細胞）で処理した。Ａｄ−ＧＦＰ処理細胞は引き続いて処理しないか、または組換えヒトＴＮＦ−アルファ蛋白質（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理した。トリプシン処理によるＴＮＦ−アルファ処理から２４時間後に細胞を収穫し、ＰＢＳで３回洗浄し、ＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳ分析に付した。ＰＢＳで処理した細胞を対照として供した。
【０５２２】
３．細胞培養および試薬
前立腺癌細胞系ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５をＡＴＣＣによって推奨されるように培養した。
【０５２３】
４．細胞増殖アッセイ
腫瘍細胞（ＬＮＣａＰ）を６−ウェル（５ｘ１０４）または９６−ウエルプレート（２ｘ１０３細胞／ウエル）に蒔き、単独で、あるいはＴＮＦ−アルファ（５ｎｇ／ｍｌ）と組み合わせた、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（Ａｄ−ｌｕｃ）またはＡｄ−ｍｄａ７（１５００−２０００ウィルス粒子［ｖｐ］／細胞）を発現するアデノウィルスベクターで処理した。ＰＢＳで処理した細胞を対照として供した。従前に記載されたＸＴＴ方法を用いる処理から４８時間および７２時間後に、細胞を細胞生存率アッセイに付した。
【０５２４】
５．ウェスタンブロッティング
処理から２４時間後に、Ａｄ−ｍｄａ７で（１０００−２０００ｖｐ／細胞）、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ（１０−２０ｎｇ／ｍｌ）またはＡｄ−ｍｄａ７＋抗−ＴＮＦ−アルファ抗体（０．５−ｕｇ／ｍｌ）で処理された腫瘍細胞を収穫した。細胞溶解物を収集し、ウェスタンブロッティングによってＭＤＡ−７蛋白質発現について分析した。
【０５２５】
６．細胞周期
腫瘍細胞（ＬＮＣａＰ）を６−ウェルプレートに蒔き、Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃ（１５００ｖｐ／細胞）、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｄ−ｍｄａ７＋抗−ＴＮＦ抗体（１ｕｇ／ｍｌ）、Ａｄ−ｌｕｃ＋ＴＮＦアルファまたはＡｄ−ｌｕｃ＋抗−ＴＮＦ抗体で処理した。処理から４８時間後に細胞を収穫し、フローサイトメトリーによってサブＧ０／Ｇ１期にある細胞の数について分析した。ＰＢＳで処理した細胞を対照として供した。
【０５２６】
Ｂ．結果
１．Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ処理は前立腺腫瘍細胞殺傷を増強させる。
【０５２７】
前立腺腫瘍（ＬＮＣａＰ）細胞をＰＢＳ、ＴＮＦ−アルファ、Ａｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃ＋ＴＮＦ、またはＡｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦで処理した。ウィルス処理は２０００ｖｐ／細胞におけるものであり、ＴＮＦ処理は５ｎｇ／ｍｌにおけるものであった。処理から４８時間後に、細胞を明るい視野の顕微鏡下で可視化した。Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦで処理された細胞は、他の処理群と比較して、細胞増殖の有意な阻害を示した。
【０５２８】
２．Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ処理は腫瘍細胞増殖を阻害する。
【０５２９】
前立腺腫瘍（ＬＮＣａＰ）細胞をＰＢＳ、ＴＮＦ−アルファ、Ａｄ−Ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃ＋ＴＮＦ、またはＡｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦで処理した。ウィルス処理は１５００ｖｐ／細胞におけるものであり、ＴＮＦ処理は５ｎｇ／ｍｌにおけるものであった。処理から４８時間および７２時間後に、細胞をＸＴＴアッセイに付して、細胞生存率を測定した。Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦで処理した細胞は、他の処理群と比較して、有意な成長阻害を示した（図３７）。阻害効果は相乗的であった。
【０５３０】
３．Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ処理は外因性ＭＤＡ−７蛋白質発現を増加させる。
【０５３１】
６−ウェルプレートに蒔いた前立腺腫瘍細胞（ＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５）をＡｄ−ｍｄａ７（１０００−２０００ｖｐ／細胞）、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ（１０−２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＡｄ−ｍｄａ７＋抗−ＴＮＦ抗体（０．５−１ｕｇ／ｍｌ）で処理した。細胞を処理から２４時間後に収穫し、ウェスタンブロッティングによってＭＤＡ−７蛋白質発現について分析した。Ａｄ−ｍｄａ７（２０００ｖｐ／細胞）で処理されたＬＮＣａＰ細胞はＭＤＡ−７発現を示した。しかしながら、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ（２０ｎｇ／ｍｌ）で処理された細胞は、抗−ＴＮＦ抗体（０．５ｕｇ／ｍｌ）の存在下で阻害された外因性ＭＤＡ−７蛋白質発現の顕著な増加を示した。Ａｄ−ｍｄａ７（１５００ｖｐ／細胞）で処理されたＬＮＣａＰおよびＤＵ１４５細胞はＭＤＡ−７発現を示した。しかしながら、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理された細胞は、抗−ＴＮＦ抗体（１．０ｕｇ／ｍｌ）の存在下で減少した外因性ＭＤＡ−７蛋白質発現の顕著な増加を示した。
【０５３２】
４．ＴＮＦ−アルファは形質導入効率を増加させる。
【０５３３】
腫瘍（ＬＮＣａＰ）細胞を１００、３００、６００および１２００ｖｐ／細胞のＡｄ−ＧＦＰで、ＴＮＦアルファ（１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下で処理した。処理を受けなかった細胞を対照として供した。ＴＮＦ−アルファ処理から２４時間後に、細胞を収穫し、ＰＢＳで３回洗浄し、５００ｕｌのＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳ分析に付した。Ａｄ−ＧＦＰ単独で処理された細胞は、１００ｖｐ／細胞のＡｄ−ＧＦＰについての７３．５％で出発して、形質導入効率の用量−依存的増加を示した（図３８）。しかしながら、ＴＮＦ−アルファの存在下では、形質導入効率は増加し、１００ｖｐ／細胞のＡｄ−ＧＦＰについて９２．８％であることが観察された。形質導入の増加は、ＴＮＦ−アルファの存在下で３００ｖｐ／細胞のＡｄ−ＧＦＰから飽和したように見えた。
【０５３４】
５．Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ処理の結果、サブＧ０／Ｇ１期にある細胞の増大した数をもたらした。
【０５３５】
腫瘍（ＬＮＣａＰ）細胞をＰＢＳ、ＴＮＦ−アルファ（１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｄ−Ｌｕｃ（１５００ｖｐ／細胞）、Ａｄ−ｍｄａ７（１５００ｖｐ／細胞）、Ａｄ−ｌｕｃ＋ＴＮＦ、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ、Ａｄ−ｌｕｃ＋抗−ＴＮＦ抗体（１ｕｇ／ｍｌ）またはＡｄ−ｍｄａ７＋抗−ＴＮＦ抗体で処理した。処理から４８時間後に、細胞を収穫し、ＰＢＳで３回洗浄し、ヨウ化プロピジウム（０．５ｕｇ／ｍｌ）を含有する５００ｕｌのＰＢＳに再懸濁させた。細胞をＦＡＣＳ分析に付した。Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦで処理された細胞の有意な数がサブＧ０／Ｇ１期で観察され、（７０％）、これは、０．４５％ないし２６．３％の範囲である他の処理群と比較してアポトーシス細胞を示した。
【０５３６】
本明細書中に開示し、特許請求する組成物および方法の全ては、本開示に徴して過度な実験なくして作成し、実施することができる。本発明の組成物および方法を好ましい具体例により記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、本明細書中に開示された組成物および方法、および方法の工程または工程の配列に変形を加えることができるのは当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的にかつ生理学的に関連するある種の剤は、同一または類似の結果を達成しつつ、本明細書中に記載された剤の代わりに置き換えることができるのは明らかであろう。当業者に明らかなすべてのそのような同様な置換および修飾は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０５３７】
参考文献
本明細書中に記載されたものの補充的な例示の手順または他の詳細を提供する範囲において、以下の参考文献は、本明細書中に参考として具体的に援用される。
【０５３８】
【表７】
2008531481.tif 000021
【０５３９】
【表８】
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【０５４０】
【表９】
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【０５４１】
【表１０】
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【０５４２】
【表１１】
2008531481.tif 000025
【０５４３】
【表１２】
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【０５４４】
【表１３】
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【０５４５】
【表１４】
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【０５４６】
【表１５】
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【０５４７】
【表１６】
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【０５４８】
【表１７】
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【０５４９】
【表１８】
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【０５５０】
【表１９】
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【０５５１】
【表２０】
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【０５５２】
【表２１】
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【図面の簡単な説明】
【０５５３】
以下の図面は本明細書の一部を掲載し、本発明のある態様をさらに示すために含まれる。本発明は、ここに提示される特別な具体例の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することによって良好に理解されるであろう。
【図１Ａ】図１Ａ。７２時間のセレコキシブ、Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｍｄａ７＋セレコキシブ処理後における細胞生存率。ＨＥＲ２−（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６）（ａ）およびＨＥＲ２＋（ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８）（ｂ）乳癌細胞を対照としてのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、レポーターとしてのＡｄ−ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、Ａｄ−ｍｄａ７、セレコキシブおよびＡｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブ（Ｍ＋Ｃ）の組合せで処理した。該組合せは、対照（ＰＢＳ）と比較して最も有意に減少した生存分率を示した。生存率はＭＴＴアッセイによって測定した。吸光度は対照に対するパーセンテージ生存率としてプロットする。（＊ｐ＜０．０５）
【図１Ｂ】図１Ｂ。７２時間のセレコキシブ、Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｍｄａ７＋セレコキシブ処理後における細胞生存率。ＨＥＲ２−（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６）（ａ）およびＨＥＲ２＋（ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８）（ｂ）乳癌細胞を対照としてのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）、レポーターとしてのＡｄ−ｌｕｃ（ルシフェラーゼ）、Ａｄ−ｍｄａ７、セレコキシブおよびＡｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブ（Ｍ＋Ｃ）の組合せで処理した。該組合せは、対照（ＰＢＳ）と比較して最も有意に減少した生存分率を示した。生存率はＭＴＴアッセイによって測定した。吸光度は対照に対するパーセンテージ生存率としてプロットする。（＊ｐ＜０．０５）
【図２】７２時間の処理後におけるトリパンブルー排除による細胞死滅の測定。Ｈｅｒ２−（ＭＤＡ）−ＭＢ−４３６）およびＨｅｒ２＋（ＭＣＡ７／Ｈｅｒ１８）乳癌細胞をＡｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃ、セレコキシブ、またはＡｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブの組合せ（Ｍ＋Ｃ）で３日間処理し、細胞生存率をトリパンブルー排除によってアッセイした。双方の細胞系は、対照（ＰＢＳ）と比較して、組合せ群（Ｍ＋Ｃ）においてかなり増大した死滅細胞集団を示した。データは％細胞死滅  ｖｓ  処理としてプロットする。（＊ｐ＜０．０５）
【図３Ａ】図３Ａ。７２時間処理後における細胞周期分析。Ｈｅｒ２−（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６）（ａ）およびＨｅｒ２＋（ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８）（ｂ）乳癌細胞をＡｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃ、セレコキシブ、またはＡｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブの組合せで３日間処理し、次いで浮遊するおよび接着性細胞を細胞周期分析のため集めた。ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８細胞は対照（ＰＢＳ）と比較して組合せ（Ｍ＋Ｃ）において細胞周期のＧ１期を有意に増大させた。
【図３Ｂ】図３Ｂ。７２時間処理後における細胞周期分析。Ｈｅｒ２−（ＭＤＡ−ＭＢ−４３６）（ａ）およびＨｅｒ２＋（ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８）（ｂ）乳癌細胞をＡｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃ、セレコキシブ、またはＡｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブの組合せで３日間処理し、次いで浮遊するおよび接着性細胞を細胞周期分析のため集めた。ＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８細胞は対照（ＰＢＳ）と比較して組合せ（Ｍ＋Ｃ）において細胞周期のＧ１期を有意に増大させた。
【図４Ａ】図４Ａ。アネキシンＶ／ＦＩＴＣおよびＴＵＮＥＬアッセイによるフローサイトメトリー。ＭＤＡ―ＭＢ−４３６（ａ）およびＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８（ｂ）細胞を７２時間の処理の後に収穫し、次いで、製造業者のプロトコルに従って染色した。アネキシンＶ／ＦＩＴＣアッセイによってセレコキシブおよびｍｄａ７処理は増大したアポトーシスを示し（ｐ＜０．０５）、Ａｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブの組合せ処理（Ｍ＋Ｃ）は全ての群に対してアポトーシスの最も増大したパーセンテージを示した（ｐ＜０．０５）。ＴＵＮＥＬアッセイによって組み合わせたおよびセレコキシブ処理は対照（ＰＢＳ）と比較してアポトーシスの有意な増加を示した（ｐ＜０．０５）（＊ｐ＜０．０５）。
【図４Ｂ】図４Ｂ。アネキシンＶ／ＦＩＴＣおよびＴＵＮＥＬアッセイによるフローサイトメトリー。ＭＤＡ―ＭＢ−４３６（ａ）およびＭＣＦ７／Ｈｅｒ１８（ｂ）細胞を７２時間の処理の後に収穫し、次いで、製造業者のプロトコルに従って染色した。アネキシンＶ／ＦＩＴＣアッセイによってセレコキシブおよびｍｄａ７処理は増大したアポトーシスを示し（ｐ＜０．０５）、Ａｄ−ｍｄａ７およびセレコキシブの組合せ処理（Ｍ＋Ｃ）は全ての群に対してアポトーシスの最も増大したパーセンテージを示した（ｐ＜０．０５）。ＴＵＮＥＬアッセイによって組み合わせたおよびセレコキシブ処理は対照（ＰＢＳ）と比較してアポトーシスの有意な増加を示した（ｐ＜０．０５）（＊ｐ＜０．０５）。
【図５Ａ】図５Ａ。ヒト肺癌細胞におけるゲルダナマイシン（ＧＡ）によるアデノウィルスｍｄａ−７媒介細胞殺傷の増強。（Ａ）異なる用量のゲルダナマイシンでの処理に続いてのＡ５４９およびＨ４６０細胞における細胞死滅のパーセンテージ。細胞は、処理から４８時間後にフローサイトメトリーによって分析した。三連実験を各細胞系で行った。（Ｂ）Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃ、ＧＡ、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＧＡおよびＡｄ−ｌｕｃ＋ＧＡ処理後におけるＡ５４９およびＨ４６０細胞におけるアポトーシスのフローサイトメトリー分析。三連実験を各細胞系で行った。
【図５Ｂ】図５Ｂ。ヒト肺癌細胞におけるゲルダナマイシン（ＧＡ）によるアデノウィルスｍｄａ−７媒介細胞殺傷の増強。（Ａ）異なる用量のゲルダナマイシンでの処理に続いてのＡ５４９およびＨ４６０細胞における細胞死滅のパーセンテージ。細胞は、処理から４８時間後にフローサイトメトリーによって分析した。三連実験を各細胞系で行った。（Ｂ）Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃ、ＧＡ、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＧＡおよびＡｄ−ｌｕｃ＋ＧＡ処理後におけるＡ５４９およびＨ４６０細胞におけるアポトーシスのフローサイトメトリー分析。三連実験を各細胞系で行った。
【図６Ａ】図６Ａ。Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡは肺癌細胞移動性を阻害する。（Ａ）ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＧＡ、Ａｄ−ｌｕｃ＋ＧＡおよびＧＡで処理した後のＡ５４９およびＨ４６０細胞における表面Ｅ−カドヘリンレベルのフローサイトメトリー分析。三連の実験を各細胞系で行った。（Ｂ）肺癌細胞移動性は、「材料および方法」に記載したように測定した。Ａｄ−ｍｄａ７＋ＧＡはＡ５４９およびＨ４６０肺癌細胞の移動性を顕著に低下させた。示されたデータは３つの独立した実験の代表である。
【図６Ｂ】図６Ｂ。Ａｄ−ｍｄａ７およびＧＡは肺癌細胞移動性を阻害する。（Ａ）ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＧＡ、Ａｄ−ｌｕｃ＋ＧＡおよびＧＡで処理した後のＡ５４９およびＨ４６０細胞における表面Ｅ−カドヘリンレベルのフローサイトメトリー分析。三連の実験を各細胞系で行った。（Ｂ）肺癌細胞移動性は、「材料および方法」に記載したように測定した。Ａｄ−ｍｄａ７＋ＧＡはＡ５４９およびＨ４６０肺癌細胞の移動性を顕著に低下させた。示されたデータは３つの独立した実験の代表である。
【図７】１７ＡＡＧは、ヒト肺癌細胞においてアデノウィルスｍｄａ−７媒介細胞殺傷を増強する。Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃ、１７ＡＡＧ、Ａｄ−ｍｄａ７＋１７ＡＡＧおよびＡｄ−ｌｕｃ＋１７ＡＡＧ処理後における、Ａ５４９およびＨ４６０細胞でのアポトーシスのフローサイトメトリー分析。三連実験を各細胞系について行った。
【図８Ａ】図８Ａ。ビタミンＥスクシネートと組み合わせたＡｄ−ｍｄａ７処理は、ヒト卵巣癌細胞の成長を阻害するが、正常な細胞の成長を阻害しない。（Ａ）ヒト卵巣癌細胞（ＭＤＡＨ  ２７７０）または（Ｂ）正常なヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−９）をＡｄ−ｌｕｃ（ベクター対照）、トコフェロール（ビタミンＥスクシネート、８μｇ／ｍｌ）、Ａｄ−ｍｄａ７（２０００ｖｐ／細胞）またはその組合せで処理した。
【図８Ｂ】図８Ｂ。ビタミンＥスクシネートと組み合わせたＡｄ−ｍｄａ７処理は、ヒト卵巣癌細胞の成長を阻害するが、正常な細胞の成長を阻害しない。（Ａ）ヒト卵巣癌細胞（ＭＤＡＨ  ２７７０）または（Ｂ）正常なヒト線維芽細胞（ＭＲＣ−９）をＡｄ−ｌｕｃ（ベクター対照）、トコフェロール（ビタミンＥスクシネート、８μｇ／ｍｌ）、Ａｄ−ｍｄａ７（２０００ｖｐ／細胞）またはその組合せで処理した。
【図９】Ｆａｂに対する抗体を用いるウェスタンブロット分析をＭＤＡＨ  ２７７４細胞で行い、Ａｄ−ｌｕｃ（ベクター対照）、トコフェロール（ビタミンＥスクシネート、８μｇ／ｍｌ）、Ａｄ−ｍｄａ７（１０００ｖｐ／細胞）またはその組合せで処理した。各処理条件下で存在するＦａｓ蛋白質のレベルを、未処理細胞と比較したＦａｓ蛋白質のパーセンテージ増加としてＹ軸に定量的にプロットした。
【図１０Ａ】図１０Ａ。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体は、皮下腫瘍の成長を抑制する。皮下腫瘍−担持（Ａ５４９またはＵＶ２２３ｍ）ヌードマウスおよびＣ３Ｈマウスを群に分け、以下のように、合計６の用量（５０μｇ／用量）について毎日処理した：処理無し、ＰＢＳ、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＬａｃＺ複合体またはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体および、ＤＯＰＡＴ：Ｃｈｏｌ−ｍｄｅ−７複合体。（Ａ）Ａ５４９。（Ｂ）ＵＶ２２３７ｍ。各時点は各群についての平均腫瘍容量を表す。（Ｃ）処理から４８時間後に皮下腫瘍を収穫し、ＭＤＡ−７蛋白質発現について分析した。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体で処理した腫瘍において、Ａ５４９腫瘍細胞のうちの１８％およびＵＶ２２３７ｍ腫瘍のうちの１３％はＭＤＡ−７蛋白質を生じ、他方、対照腫瘍はＭＤＡ−７蛋白質を生じなかった。
【図１０Ｂ】図１０Ｂ。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体は、皮下腫瘍の成長を抑制する。皮下腫瘍−担持（Ａ５４９またはＵＶ２２３ｍ）ヌードマウスおよびＣ３Ｈマウスを群に分け、以下のように、合計６の用量（５０μｇ／用量）について毎日処理した：処理無し、ＰＢＳ、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＬａｃＺ複合体またはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体および、ＤＯＰＡＴ：Ｃｈｏｌ−ｍｄｅ−７複合体。（Ａ）Ａ５４９。（Ｂ）ＵＶ２２３７ｍ。各時点は各群についての平均腫瘍容量を表す。（Ｃ）処理から４８時間後に皮下腫瘍を収穫し、ＭＤＡ−７蛋白質発現について分析した。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体で処理した腫瘍において、Ａ５４９腫瘍細胞のうちの１８％およびＵＶ２２３７ｍ腫瘍のうちの１３％はＭＤＡ−７蛋白質を生じ、他方、対照腫瘍はＭＤＡ−７蛋白質を生じなかった。
【図１０Ｃ】図１０Ｃ。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体は、皮下腫瘍の成長を抑制する。皮下腫瘍−担持（Ａ５４９またはＵＶ２２３ｍ）ヌードマウスおよびＣ３Ｈマウスを群に分け、以下のように、合計６の用量（５０μｇ／用量）について毎日処理した：処理無し、ＰＢＳ、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＬａｃＺ複合体またはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体および、ＤＯＰＡＴ：Ｃｈｏｌ−ｍｄｅ−７複合体。（Ａ）Ａ５４９。（Ｂ）ＵＶ２２３７ｍ。各時点は各群についての平均腫瘍容量を表す。（Ｃ）処理から４８時間後に皮下腫瘍を収穫し、ＭＤＡ−７蛋白質発現について分析した。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体で処理した腫瘍において、Ａ５４９腫瘍細胞のうちの１８％およびＵＶ２２３７ｍ腫瘍のうちの１３％はＭＤＡ−７蛋白質を生じ、他方、対照腫瘍はＭＤＡ−７蛋白質を生じなかった。
【図１１】ＭＤＡ−７は、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体での処理に続いてアポトーシス細胞死滅を誘導する。処理無し、ＰＢＳ、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＬａｃＺまたはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体、またはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体を受けた動物からの皮下腫瘍（Ａ５４９、およびＵＶ２２３７ｍ）を収穫し、ＴＵＮＥＬ染色によってアポトーシス細胞死滅について分析した。ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体で処理した腫瘍においてアポトーシス細胞死滅を受けている細胞のパーセンテージ（Ａ５４９については１３％およびＵＶ２２３７ｍについては９％）は他の処理群におけるよりも有意に高かった（Ｐ＝０．００１）。棒線は標準偏差を示す。
【図１２】ＤＯＰＡＴ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体は腫瘍血管形成を阻害する。ＰＢＳ、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＬａｃＺまたはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体、またはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体で処理していない、または処理したいずれかである皮下腫瘍（Ａ５４９、およびＵＶ２２３７ｍ）をＣＤ３１に対して染色し、半定量的分析に付した。ＣＤ３１−陽性内皮染色は、他の処理群の腫瘍におけるよりもＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ７−処理腫瘍で有意に低かった（Ｐ＝０．０１）。棒線は標準偏差を示す。
【図１３】ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体は実験的肺転移を阻害する。肺腫瘍（Ａ５４９、ＵＶ２２３７ｍ）−担持ｎｕ／ｎｕまたはＣ３Ｈマウスを、ＰＢＳ、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ＣＡＴ複合体またはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体で合計６用量（５０μｇ／用量）について毎日処理した。転移性腫瘍成長は、２つの対照群におけるのと比較して、ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ−ｍｄａ−７複合体で処理したヌードマウス、およびＣ３Ｈマウス双方において有意に阻害された（Ｐ＝＜０．０５）。棒線は標準偏差を示す。
【図１４】卵巣癌細胞の化学感受性化Ａｄ−ｌｕｃおよびタキソールまたはＡｄ−ｍｄａ７およびタキソールで処理した細胞は、他の処理群と比較して成長阻害を示した。しかしながら、相加的ないし相乗的である有意な成長阻害は、Ａｄ−ｍｄａ７およびタキソールで処理した細胞においてのみ観察された（Ｐ＝＜０．０５）。実験は三連ウェルで行い、結果は２つの別々の実験の平均として表す。棒線は標準偏差を示す。
【図１５】Ａｄ−ｍｄａ７は乳癌腫瘍細胞の成長を選択的に阻害するが、正常な細胞を阻害しない。細胞系、ｐ５３突然変異状態（ｍ：突然変異した；ｗｔ：野生型）およびＩＣ５０（トリチウム化チミジンアッセイによる５０％成長阻害に必要なベクターの濃度）値のまとめを、対照ベクター（＊：Ａｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−空）と比較してＡｄ−ｍｄａ７について示す。＃：Ａｄ−ｍｄａ７についてのＩＣ５０をＡｄ−対照についてのＩＣ５０で割った比率として評価する選択性指標（Ｓ．Ｉ）。
【図１６】図１６ＡないしＥ。ＭＤＡ−７はＰＫＲを誘導し、腫瘍細胞に対して細胞傷害性である。（Ａ）２０００ｖｐ／細胞のＭＯＩにおいてＡｄ−ｍｄａ（ｍｄａ−７）またはＡｄ−ｌｕｃ（ｌｕｃ）で処理したＭＣＦ−７およびＭＤＡ−ＭＤ−４５３細胞のウェスタンブロット分析。ＭＤＡ−７蛋白質はＡｄ−ｍｄａ７−処理細胞に存在したが、対照−処理細胞には存在しなかった。ＰＫＲ蛋白質はＭＤＡ−７によって誘導される。β−アクチンは同等な蛋白質負荷を示す対照である。（Ｂ）乳癌腫細胞のＡｄ−ｍｄａ７での処理はイン・ビトロにて腫瘍細胞の成長を阻害する。トリチウム化チミジンアッセイをＴ４７Ｄ；ＭＤＡ−ＭＢ−３６１；ＭＣＦ−７；ＢＴ−２０で行い；細胞をＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃ（０ないし１０，０００ｖｐ／細胞；０ないし５００ｐｆｕ／細胞）で４日間処理し、３Ｈ−チミジン取込によって成長をモニターした。データは平均＋ＳＤとして示す。（Ｃ）ＭＤＡ−７はＧ２／Ｍ細胞阻止を誘導する（矢印）。Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃ、またはビヒクル対照で形質導入された腫瘍細胞を、ＰＩおよびフローサイトメトリーを用いて細胞周期について分析した。（Ｄ）Ａｄ−ｍｄａ７は用量−および時間−依存的に腫瘍細胞の死滅を誘導する。Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃで形質導入され、形質導入から２４ないし７２時間後にトリパンブルー染色によって分析されたＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞。結果をパーセント細胞死滅  ｖｓ  ベクター用量および時間として示す。データは平均＋ＳＤとしてプロットする。（Ｅ）Ａｄ−ｍｄａ７はＨＭＥＣ細胞において細胞死滅を誘導しない。細胞をＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃで形質導入し、４日後にトリパンブルー染色によって分析した。結果を、パーセント細胞死滅  ｖｓ  用量（０ないし１０，０００ｖｐ／細胞）として表す。データは平均＋ＳＤとしてプロットする。
【図１７】図１７ＡないしＣ。Ａｄ−ｍｄａ７は乳癌細胞においてアポトーシスを誘導する。（Ａ）Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃで３日間処理された乳癌系、およびアネキシンＶを用いて分析したアポトーシス。＊ｐ＜０．０１。データは平均＋ＳＤとしてプロットする。（Ｂ）ＭＤＡ−７はＴ４７Ｄ細胞においてＢＡＸを誘導する。Ｔ４７Ｄ細胞を２０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で処理し、溶解物をＭＤＡ−７およびＢＡＸ発現について評価した。ＺＶＡＤでの処理はアポトーシスを低下させたが、ＭＤＡ−７またはＢＡＸでの処理は低下させなかった。（Ｃ）ＭＤＡ−７は乳癌腫細胞においてアポトーシス−関連蛋白質を誘導する。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８細胞をＡｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃで処理し、または処理しなかった（ＵＴ）。細胞溶解物を、カスパーゼ３、ＰＡＲＰ、およびＭＤＡ−７に対する抗体でプローブした。ベータクチン（β−アクチン）を内部対照として用いて、同等な蛋白質負荷を示す。
【図１８】図１８ＡないしＤ。Ａｄ−ｍｄａ７は乳癌異種移植片の成長を阻害する。乳癌細胞：ＭＣＦ−７（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ−４６８（Ｂ）、およびＭＤＡ−ＭＢ−３６１（Ｃ）を用いて、ヌードマウスにおける腫瘍形成を誘導した。次いで、腫瘍にＡｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃまたはＰＢＳを注射し、それらの成長を追跡した。結果は（ｍｍ３で表した）腫瘍容量  ｖｓ  （日で表した）時間として示す。＊ＭＣＦ−７およびＭＢ−３６１についてはｐ＜０．００２；ＭＢ−４６８についてはｐ＜０．００４。（Ｄ）Ａｄ−ｍｄａ７はＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌異種移植片においてアポトーシスを誘導する。腫瘍をヌードマウスにおいて樹立し、ＰＢＳ、Ａｄ−ＬｕｓまたはＡｄ−ｍｄａ７を注射し、２４時間後に収穫し、ホルマリン中で固定した。パラフィン包埋セクションを、ＭＤＡ−７蛋白質またはＰＫＲ蛋白質に対する抗体での免疫組織化学分析に付した。Ａｄ−ｍｄａ７処理腫瘍において、ＭＤＡ−７およびＰＫＲ発現の有意な増加（青色染色細胞）が観察された。Ａｄ−ｍｄａ７処理腫瘍もまた高レベルのＴＵＮＥＬシグナルを示した（矢印）。対照腫瘍はＭＤＡ−７発現、ＰＫＲ誘導またはアポトーシスを示さなかった。
【図１９】Ａｄ−ｍｄａ７は複数モデルにおいて乳癌成長を有意に阻害する。腫瘍モデルおよびｐ５３状態を示す。
【図２０】図２０ＡないしＢ。タモキシフェンンと組み合わせた場合に、Ａｄ−ｍｄａ７は相乗的である。（Ａ）タモキシフェンと組み合わせてＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−空で処理したＴ４７Ｄ細胞の成長阻害。Ａｄベクター（０ないし１０００ｖｐ／細胞）および増大する用量のタモキシフェン（０ないし２μｇ／ｍｌ）で３日間処理し、細胞増殖について分析した細胞。（Ｂ）単一療法として、または１μｇ／ｍｌタモキシフェンと組み合わせてＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃで処理したＭＣＦ−７およびＴ４７Ｄ細胞。データは平均＋ＳＤとして示される。
【図２１】図２１ＡないしＢ。タキソテールおよびＡｄ−ｍｄａ７での組合せ処理は乳癌細胞の成長を阻害する。乳癌細胞系（Ａ）Ｔ４７Ｄおよび（Ｂ）ＭＣＦ−７を、示したように、Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃ（０ないし２０００ｖｐ／細胞）およびタキソテール（０ないし２ｎｇ／ｍｌ）で処理した。３日後、３Ｈ−チミジン取込を用いて増殖をアッセイした。データは平均＋ＳＤとして示す。
【図２２】図２２ＡないしＤ。Ａｄ−ｍｄａ７とアドリアマイシンまたはヘルセプチンとの組合せ処理は腫瘍細胞の増殖を阻害する。示したように、Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃおよびアドリアマイシン（０ないし１ｎｇ／ｍｌ）で処理された（Ａ）Ｔ４７Ｄおよび（Ｂ）ＭＣＦ−７乳癌腫細胞系。３日後に、３Ｈ−チミジン取込を用いて増殖をアッセイした。データは平均＋ＳＤとして表す。単一療法（対照）としての、またはタキソテール、アドリアマイシンまたはヘルセプチンと組み合わせた、（Ｃ）Ａｄ−ｍｄａ７（Ｍ）またはＡｄ−ｌｕｃ（Ｌ）で処理されたＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞からの溶解物のウェスタン分析。ｐ５３およびＢＣＬ−２ファミリーメンバーに対する抗体を用いてブロットをプローブした。チューブリン染色を用いて、同等な負荷を確認した。（Ｄ）Ａｄ−ｍｄａ７はＨｅｒ２＋細胞においてヘルセプチンとで相乗作用を示す。示したように、対照（ＵＴ）；１μｇ／ｍｌヘルセプチン（Ｈ）；２０００ｖｐ／細胞Ａｄ−ｌｕｃ（Ｌ）；Ａｄ−ｍｄａ７（Ｍ）または組合せでの処理から３日後において、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３（Ｈｅｒ２＋）およびＭＣＦ−７（Ｈｅｒ２−）乳癌細胞において、細胞死滅をトリパンブルー染色によって測定した。データは平均＋ＳＤとして示す。
【図２３】化学療法と組み合わせた場合、Ａｄ−ｍｄａ７は異なるアポトーシスレギュレーターを変調する。示された治療剤と組み合わせた、Ａｄ−ｍｄａ７、Ａｄ−ｌｕｃ（２０００ｖｐ／細胞）またはベクターで処理されたＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞。ｐ５３；ＢＣＬ−２；ＢＣＬ−ＸＬ；ＢＡＸに対する抗体を用いて細胞溶解物を免疫ブロットし、チューブリンを用いて正規化した。Ａｄ−ｍｄａ７溶解物を対応するＡｄ−ｌｕｃ処理と比較した。↓：Ａｄ−ｌｕｃ対照と比較して減少した発現；↑：Ａｄ−ｌｕｃ対照と比較して増大した発現；−：Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃの間で変化無し；ｎ．ｓ．：シグナル無し。
【図２４】図２４ＡないしＢ。Ａｂ−ｍｄａ７および放射線療法での組合せ実験。（Ａ）Ａｄ−ｍｄａ７＋放射線（ＲＴ）の組合せはクローン原性アッセイにおいて細胞の生存を減少させる。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌細胞を２０００ｖｐ／細胞にてＲＴ、Ａｄ−空またはＡｄ−ｍｄａ７で処理した；感染から４８時間後に、細胞を照射し（０、２または４Ｇｙ）、クローン原性アッセイによって評価した。Ａｄ−ｍｄａ７＋放射線療法の組合せは、対照処理と比較して、乳癌細胞において相乗的にクローン形成を阻害した。（Ｂ）放射線療法（ＲＴ）およびＡｄ−ｍｄａ７の組合せはイン・ビボにて乳癌成長を顕著に減少させる。ＭＤＡ−ＭＢ−４６８乳癌腫瘍がほぼ１００ｍｍ３に到達すると、動物を６つの処理群に分けた（各群においてｎ＝５動物）；ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｌｕｃ＋ＲＴ、ＲＴ，Ａｄ−ｍｄａ７およびＡｄ−ｍｄａ７＋ＲＴ。組換えアデノウィルスを、合計３回の注射のために１日おきに２×１０１０ｖｐ／ｍｌの用量にて腫瘍内注射によって送達した。第三の注射から２４時間後に、５Ｇｙの単一用量を後足に送達した。腫瘍を二次元における測定によって増殖について評価し、腫瘍容量を記録した。処理群の間において腫瘍サイズに顕著な差があった。Ａｄ−ｍｄａ７単一療法はＲＴ単独またはＡｄ−ｌｕｃ／ＲＴよりも大きな腫瘍成長阻害を生じた。最も顕著な成長抑制は、ＸＲＴおよびＡｄ−ｍｄａ７の組み合わせを受けた動物で観察された。＊：ｐ＜０．００２
【図２５】Ａｄ−ｍｄａ７ベクター感染乳癌細胞はＩＬ−２４蛋白質を発現し、その結果、細胞死滅がもたらされる。ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３を、示したように種々の量のＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃで７２時間形質導入した。トリパンブルー排除アッセイによる細胞カウンティングの結果は、三連試料を用いる２つの独立した実験の平均＋ＳＤとしてプロットする。＊＊Ａｄ−ｌｕｃと比較してｐ＜０．０１．
【図２６Ａ】Ａｄ−ｍｄａ７は細胞周期阻止およびアポトーシスを誘導する。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を示したようにＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃで形質導入した。７２時間のインキュベーションに続いて、ＦＡＣＳアッセイによって細胞を分析した。図面はＰＩ染色細胞分布を示した。矢印は、対照またはＡｄ−ｌｕｃ処理細胞よりも有意に高かったＧ２／Ｍ細胞集団を示す（ｐ＜０．０５）。結果は、２つの独立した実験の平均＋ＳＤとしてプロットする。（Ｂ）５０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃを３日間でＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞に加え、アポトーシス細胞パーセンテージをアネキシンＶ分析によって定量した。＊は、対照よりも有意に高かったアポトーシス細胞集団を示す（ｐ＜０．０５）。結果は、３つの独立した実験の平均＋ＳＤとしてプロットする。
【図２６Ｂ】Ａｄ−ｍｄａ７は細胞周期阻止およびアポトーシスを誘導する。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を示したようにＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃで形質導入した。７２時間のインキュベーションに続いて、ＦＡＣＳアッセイによって細胞を分析した。図面はＰＩ染色細胞分布を示した。矢印は、対照またはＡｄ−ｌｕｃ処理細胞よりも有意に高かったＧ２／Ｍ細胞集団を示す（ｐ＜０．０５）。結果は、２つの独立した実験の平均＋ＳＤとしてプロットする。（Ｂ）５０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃを３日間でＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞に加え、アポトーシス細胞パーセンテージをアネキシンＶ分析によって定量した。＊は、対照よりも有意に高かったアポトーシス細胞集団を示す（ｐ＜０．０５）。結果は、３つの独立した実験の平均＋ＳＤとしてプロットする。
【図２７】ＩＬ−２４蛋白質はホスホ−ＳＴＡＴ３を活性化し、乳癌細胞において細胞殺傷を誘導した。ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３乳癌細胞およびＭｅＷｏメラノーマ細胞（陽性対照）を、示した濃度において、３０００ｖｐ／細胞のＡｄ−ｍｄａ７＋正常マウスＩｇＧまたは抗−ＩＬ２４モノクローナル抗体で処理した。３日間のインキュベーションの後に、細胞死滅を処理に対してプロットした。データは三連試料を用いる２つの独立した実験の平均＋Ｓｄとしてプロットする。＊Ａｄ−ｍｄａ７媒介殺傷と比較してｐ＜０．０１。
【図２８Ａ】図２８Ａ。乳癌細胞のＩＬ−２４媒介殺傷はＩＬ−２０Ｒ１を介して起こる。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を、単独での、または５００ｎｇ／ｍｌの示した抗体（抗−ＭＤＡ７、抗−ＩＬ−２０Ｒ１、抗−ＩＬ−２２Ｒ１または正常なマウスＩｇＧ）と組み合わせた３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２４で９６時間処理した。＊ＩＬ−２４媒介殺傷と比較してｐ＜０．０１。データは三連試料の平均＋ＳＤとして示す。（Ｂ）ＩＬ−２４蛋白質はＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞においてアポトーシスを誘導する。種々の希釈におけるヒトＩＬ−２４蛋白質をＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞培養基に加えた。ＩＬ−２４のウェスタンブロットを上方パネルに示す。９６時間の処理の後、細胞を集め、ＴＵＮＥＬ染色を用いて、アポトーシス細胞集団を測定した。
【図２８Ｂ】図２８Ｂ。乳癌細胞のＩＬ−２４媒介殺傷はＩＬ−２０Ｒ１を介して起こる。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を、単独での、または５００ｎｇ／ｍｌの示した抗体（抗−ＭＤＡ７、抗−ＩＬ−２０Ｒ１、抗−ＩＬ−２２Ｒ１または正常なマウスＩｇＧ）と組み合わせた３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２４で９６時間処理した。＊ＩＬ−２４媒介殺傷と比較してｐ＜０．０１。データは三連試料の平均＋ＳＤとして示す。（Ｂ）ＩＬ−２４蛋白質はＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞においてアポトーシスを誘導する。種々の希釈におけるヒトＩＬ−２４蛋白質をＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞培養基に加えた。ＩＬ−２４のウェスタンブロットを上方パネルに示す。９６時間の処理の後、細胞を集め、ＴＵＮＥＬ染色を用いて、アポトーシス細胞集団を測定した。
【図２９Ａ】ＩＬ−１０はＩＬ−２４の殺傷活性をブロックした。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２またはＩＬ−２４で９６時間処理した。トリパンブルー排除アッセイによる細胞カウンティングの結果を、三連試料を用いる２つの独立した実験の平均＋ＳＤとしてプロットする。＊ＩＬ−１０と比較してｐ＜０．０１。（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を、３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２４、または増大させる濃度のＩＬ−１０（０ないし３００ｎｇ／ｍｌ）と共に、ＩＬ−２４で、または変性した煮沸ＩＬ−１０で処理した。＊ｐ＜０．０５は、ＩＬ−２４単独と比較した細胞死滅の有意な阻害を示す。データは、三連試料を用いる２つの独立した実験の平均＋ＳＤとして示す。
【図２９Ｂ】ＩＬ−１０はＩＬ−２４の殺傷活性をブロックした。（Ａ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２２またはＩＬ−２４で９６時間処理した。トリパンブルー排除アッセイによる細胞カウンティングの結果を、三連試料を用いる２つの独立した実験の平均＋ＳＤとしてプロットする。＊ＩＬ−１０と比較してｐ＜０．０１。（Ｂ）ＭＤＡ−ＭＢ２３１およびＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞を、３０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−２４、または増大させる濃度のＩＬ−１０（０ないし３００ｎｇ／ｍｌ）と共に、ＩＬ−２４で、または変性した煮沸ＩＬ−１０で処理した。＊ｐ＜０．０５は、ＩＬ−２４単独と比較した細胞死滅の有意な阻害を示す。データは、三連試料を用いる２つの独立した実験の平均＋ＳＤとして示す。
【図３０Ａ】図３０Ａ。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４は肺腫瘍細胞においてＶＥＧＦを阻害する。肺腫瘍細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ＬｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で処理した。細胞および培養上清を処理から７２時間後に集め、外因性ＭＤＡ−７蛋白質発現について、およびウェスタンブロッティングによって細胞溶解物からのＶＥＧＦについて、およびＥＬＩＳＡによって上清中のＶＥＧＦについて分析した。（Ａ）ＭＤＡ−７およびＶＥＧＦ発現ＰＢＳ−Ａｄ−ｌｕｃ−およびＡｄ−ｍｄａ７−処理細胞。β−アクチンを内部負荷対照として用いた。（Ｂ）ＶＥＧＦ発現をＥＬＩＳＡによって測定し、ＰＢＳに対するパーセント阻害として表す。
【図３０Ｂ】図３０Ｂ。ＭＤＡ−７／ＩＬ−２４は肺腫瘍細胞においてＶＥＧＦを阻害する。肺腫瘍細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ＬｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で処理した。細胞および培養上清を処理から７２時間後に集め、外因性ＭＤＡ−７蛋白質発現について、およびウェスタンブロッティングによって細胞溶解物からのＶＥＧＦについて、およびＥＬＩＳＡによって上清中のＶＥＧＦについて分析した。（Ａ）ＭＤＡ−７およびＶＥＧＦ発現ＰＢＳ−Ａｄ−ｌｕｃ−およびＡｄ−ｍｄａ７−処理細胞。β−アクチンを内部負荷対照として用いた。（Ｂ）ＶＥＧＦ発現をＥＬＩＳＡによって測定し、ＰＢＳに対するパーセント阻害として表す。
【図３１Ａ】図３１Ａ。ＭＤＡ−７−媒介ＶＥＧＦ阻害は腫瘍細胞殺傷とは独立している。腫瘍細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ＬｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７（１０００ｖｐ／細胞）で処理した。（Ａ）細胞を処理後に種々の時点で収穫し、細胞の生存率を測定した。２４時間ないし７２時間の３つの処理群の中で、有意な腫瘍細胞阻害は観察されなかった。（Ｂ）処理から４８時間および７２時間後の培養上清の分析は、Ａｄ−ｌｕｃ処理と比較してＡｄ−ｍｄａ７−処理上清において減少したＶＥＧＦレベルを示した。Ａｄ−ｍｄａ７によるＶＥＧＦの阻害は、細胞生存率アッセイにおいて観察されるように、細胞殺傷とは独立しているように観察された。
【図３１Ｂ】図３１Ｂ。ＭＤＡ−７−媒介ＶＥＧＦ阻害は腫瘍細胞殺傷とは独立している。腫瘍細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ＬｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７（１０００ｖｐ／細胞）で処理した。（Ａ）細胞を処理後に種々の時点で収穫し、細胞の生存率を測定した。２４時間ないし７２時間の３つの処理群の中で、有意な腫瘍細胞阻害は観察されなかった。（Ｂ）処理から４８時間および７２時間後の培養上清の分析は、Ａｄ−ｌｕｃ処理と比較してＡｄ−ｍｄａ７−処理上清において減少したＶＥＧＦレベルを示した。Ａｄ−ｍｄａ７によるＶＥＧＦの阻害は、細胞生存率アッセイにおいて観察されるように、細胞殺傷とは独立しているように観察された。
【図３２】ＭＤＡ−７−媒介ＶＥＧＦ阻害はＳｒｃを阻害することによって起こる。腫瘍細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ＬｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で処理し、収穫し、実施例８に記載したように、Ｓｒｃキナーゼ活性の発現について分析した。Ａｄ−ｍｄａ７によるＳｒｃキナーゼの阻害は、ＰＢＳおよびＡｄ−ｌｕｃ処理細胞におけるＳｒｃ活性と比較して顕著に減少した。
【図３３Ａ】腫瘍細胞におけるＭＤＡ−７−媒介ＶＥＧＦ阻害は内皮細胞増殖および細胞シグナリングに影響する。（Ａ）ＰＢＳ、Ａｂ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で処理したＨ１２９９細胞からの条件培地を処理から４８時間後に集め、過剰な抗−ＭＤＡ７中和抗体（１０μｇ／ｍｌ）、または組換えヒトＶＥＧＦ１６５蛋白質（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下でＨＵＶＥＣに加えた。実施例８に記載したように、細胞をトリパンブルーアッセイによって細胞増殖について、およびウェスタンブロッティングによってＶＥＧＦＲ２シグナリングについて分析した。Ａｄ−ｍｄａ７−処理Ｈ１２９９細胞からの条件培地は、ＰＢＳ−およびＡｄ−ｌｕｃ処理細胞からの条件培地と比較してＨＵＶＥＣ増殖を有意に阻害した。（Ｂ）５、１０および６０分におけるＨＵＶＥＣでのＶＥＧＦＲ２およびｐＡＫＴ，ＶＥＧＦ受容体シグナリングの下流標的についての分析は、ＰＢＳ−およびＡｄ−ｌｕｃ−処理腫瘍細胞からの条件培地で処理したＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴの活性化を示した。しかしながら、抗−ＭＤＡ７中和抗体の存在下または不存在下において、Ａｄ−ｍｄａ７−処理腫瘍細胞からの培地で処理されたＨＵＶＥＣにおいて、ＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴ活性化は観察されなかった。ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴ活性化は、ｒｈＶＥＧＦ蛋白質をＡｄ−ｍｄａ７−処理腫瘍細胞からの条件培地に加えた場合に回復された。
【図３３Ｂ】腫瘍細胞におけるＭＤＡ−７−媒介ＶＥＧＦ阻害は内皮細胞増殖および細胞シグナリングに影響する。（Ａ）ＰＢＳ、Ａｂ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７で処理したＨ１２９９細胞からの条件培地を処理から４８時間後に集め、過剰な抗−ＭＤＡ７中和抗体（１０μｇ／ｍｌ）、または組換えヒトＶＥＧＦ１６５蛋白質（５０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下でＨＵＶＥＣに加えた。実施例８に記載したように、細胞をトリパンブルーアッセイによって細胞増殖について、およびウェスタンブロッティングによってＶＥＧＦＲ２シグナリングについて分析した。Ａｄ−ｍｄａ７−処理Ｈ１２９９細胞からの条件培地は、ＰＢＳ−およびＡｄ−ｌｕｃ処理細胞からの条件培地と比較してＨＵＶＥＣ増殖を有意に阻害した。（Ｂ）５、１０および６０分におけるＨＵＶＥＣでのＶＥＧＦＲ２およびｐＡＫＴ，ＶＥＧＦ受容体シグナリングの下流標的についての分析は、ＰＢＳ−およびＡｄ−ｌｕｃ−処理腫瘍細胞からの条件培地で処理したＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴの活性化を示した。しかしながら、抗−ＭＤＡ７中和抗体の存在下または不存在下において、Ａｄ−ｍｄａ７−処理腫瘍細胞からの培地で処理されたＨＵＶＥＣにおいて、ＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴ活性化は観察されなかった。ＨＵＶＥＣにおけるＶＥＧＦＲ２およびＡＫＴ活性化は、ｒｈＶＥＧＦ蛋白質をＡｄ−ｍｄａ７−処理腫瘍細胞からの条件培地に加えた場合に回復された。
【図３４】ＭＤＡ−７ではなくベビシズマブは内皮細胞増殖を阻害する。腫瘍（Ｈ１２９９）細胞および内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞をＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、アバスチン、Ａｄ−ｌｕｃ＋アバスチンまたはＡｄ−ｍｄａ７＋アバスチンで処理した。３つの異なる濃度のアバスチンをＡｄ−ｌｕｃまたはＡｄ−ｍｄａ７と組み合わせてテストした。細胞を処理から４８時間および７２時間後に修飾し、トリパンブルー排除アッセイによって細胞生存率に付した。腫瘍細胞において、処理群のいずれかにおいて観察された有意な阻害はなかった。しかしながら、内皮細胞において、有意な阻害が、アバスチン、Ａｄ−ｌｕｃ＋アバスチンおよびＡｄ−ｍｄａ７＋アバスチンで処理された細胞で観察された。しかしながら、最も有意な阻害は、内皮細胞をＡｄ−ｍｄａ７およびアバスチンで内皮細胞を処理した場合に用量−依存的に観察された。
【図３５】腫瘍細胞におけるＭＤＡ−７およびアバスチンの組合せによるＶＥＧＦ阻害は内皮細胞増殖に影響する。ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、アバスチン、Ａｄ−ｌｕｃ＋アバスチンまたはＡｄ−ｍｄａ７＋アバスチンで処理されたＨ１２９９細胞からの条件培地を処理から４８時間後に集め、ＨＵＶＥＣに加えた。細胞を「材料および方法」におけるトリパンブルーアッセイによって細胞増殖について分析した。Ａｄ−ｍｄａ７−、アバスチン−、Ａｄ−ｌｕｃ＋アバスチン−およびＡｄ−ｍｄａ７＋アバスチン処理Ｈ１２９９細胞からの条件培地は、ＰＢＳ−およびＡｄ−ｌｕｃ処理細胞からの条件培地と比較してＨＵＶＥＣ増殖を有意に阻害した。しかしながら、阻害効果は、ＨＵＶＥＣをＡｄ−ｍｄａ７＋アバスチン処理腫瘍細胞からの条件培地で処理した場合に最も有意であった。
【図３６】Ａｄ−ｍｄａ７＋アバスチンはイン・ビボにてＶＥＧＦを有意に低下させた。
【図３７】ＭＤＡ−７＋アバスチンはイン・ビボにて腫瘍増殖を阻害する。Ｈ１２９９使用細胞（５×１０６）を注射することによって、皮下Ｈ１２９９腫瘍細胞をヌードマウスにおいて樹立した。動物を群（ｎ＝８／群）に分け、以下のように処理した：ＰＢＳ、Ａｄ−ｌｕｃ、Ａｄ−ｍｄａ７、アバスチン、Ａｄ−ｌｕｃ＋アバスチン、およびＡｄ−ｍｄａ７＋アバスチン。Ａｄ−ｍｄａ７またはＡｄ−ｌｕｃ（１×１０１０ｖｐ／注射）を腫瘍内注射し、アバスチン（５ｍｇ／Ｋｇ）を腹腔内注射した。処理を１週間につき２回４週間与え、腫瘍のサイズを１週間につき３回測定した。実験の最後に、動物を安楽死させ、腫瘍を単離し、免疫組織化学分析およびウェスタンブロッティングに付した。有意な腫瘍成長阻害が、他の処理群と比較して、Ａｄ−ｍｄａ７＋アバスチンで処理されたマウスで観察された。腫瘍成長の有意な阻害は、ＰＢＳまたはＡｄ−ｌｕｃで処理されたマウスからの腫瘍と比較して、Ａｂ−ｍｄａ７−、アバスチン−およびＡｄ−ｌｕｃ＋アバスチン−処理マウスでも観察された。体重の有意な低下は処理群のいずれにおいても観察されなかった（２８日まで測定）。
【図３８】Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ処理は腫瘍細胞増殖を阻害する。前立腺腫瘍（ＬＮＣａＰ）腫瘍細胞をＰＢＳ（Ｐ）、ＴＮＦ−アルファ（Ｔ）、Ａｄ−Ｌｕｃ（Ｌ）、Ａｄ−ｍｄａ７（Ｍ）、Ａｄ−ｌｕｃ＋ＴＮＦ（Ｌ＋Ｔ）またはＡｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ（Ｍ＋Ｔ）で処理した。ウィルス処理は１５００ｖｐ／細胞におけるものであり、ＴＮＦ処理は５ｎｇ／ｍｌにおけるものであった。処理から４８時間および７２時間後に、細胞をＸＴＴアッセイに付して、細胞生存率を測定した。Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦで処理した細胞は、他の処理群と比較して有意な増殖阻害を示した。
【図３９】ＴＮＦ−アルファは形質導入効率を増大させる。腫瘍（ＬＮＣａＰ）細胞を、ＴＮＦ−アルファ（１０μｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下で１００、３００、６００および１２００ｖｐ／細胞のＡｄ−ＧＦＰで処理した。処理を受けなかった細胞を対照として供した。ＴＮＦ−アルファ処理から２４時間後に、細胞を収穫し、ＰＢＳで３回洗浄し、５００ｕｌのＰＢＳに再懸濁させ、ＦＡＣＳ分析に付した。Ａｄ−ＧＦＰ単独で処理した細胞は、１００ｖｐ／細胞のＡｄ−ＧＦＰについての７３．５％で出発して形質導入効率において用量−依存的増加を示した。しかしながら、ＴＮＦ−アルファの存在下で、形質導入効率は増大し、１００ｖｐ／細胞のＡｄ−ＧＦＰについて９２．８％であると観察された。形質導入の増加は、ＴＮＦ−アルファの存在下で３００ｖｐ／細胞のＡｄ−ＧＦＰから飽和したように見えた。
【図４０】Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ−アルファ処理の結果、ＳｕｂＧ０／Ｇ１期における細胞の数が増大する。腫瘍（ＬＮＣａＰ）細胞をＰＢＳ（Ｐ）、ＴＮＦ−アルファ（Ｔ；１０ｎｇ／ｍｌ）、Ａｄ−Ｌｕｃ（Ｌ；１５００ｖｐ／細胞）、Ａｄ−ｍｄａ７（Ｍ；１５００ｖｐ／細胞）、Ａｄ−ｌｕｃ＋ＴＮＦ（Ｌ＋Ｔ）、Ａｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦ（Ｍ＋Ｔ）、Ａｄ−ｌｕｃ＋抗−ＴＮＦ抗体（Ｌ＋Ａ；１μｇ／ｍｌ）またはＡｄ−ｍｄａ７＋抗−ＴＮＦ抗体（Ｍ＋Ａ）で処理した。処理から４８時間後、細胞を収穫し、ＰＢＳで３回洗浄し、ヨウ化プロピジウム（０．５μｇ／ｍｌ）を含有する５００ｕｌのＰＢＳに再懸濁させた。細胞をＦＡＣＳ分析に付した。ＳｕｂＧ０／Ｇ１期で観察されたＡｄ−ｍｄａ７＋ＴＮＦで処理された有意な数の細胞（７０％）は、０．４５％ないし２６．３％の範囲である他の処理群と比較してアポトーシス細胞を示した。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月24日(2007.10.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者における癌を処置するための組成物であって、該組成物はＭＤＡ−７およびＭＤＡ−７連結剤を含み、該患者への投与に適しており、該連結剤は、ＶＥＧＦ阻害剤、選択的ＣＯＸ−２阻害剤、ＣＯＸ−２阻害剤プロドラッグ、１７−ＧＡＡ、ビタミンＥ化合物、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ−γ、ＴＮＦ−δ、またはＴＮＦ−εであり、該ＶＥＧＦ阻害剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを特異的に標的とするリボザイム、ＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡを特異的に標的とするリボザイム、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチドまたは低分子である、組成物。
【請求項２】
前記ＭＤＡ−７連結剤は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡを特異的に標的とするリボザイム、ＶＥＧＦ受容体ｍＲＮＡを特異的に標的とするリボザイム、蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、オリゴヌクレオチドまたは低分子であるＶＥＧＦ阻害剤である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＶＥＧＦ阻害剤は、ＶＥＧＦに対する抗体、またはＶＥＧＦ受容体に対する抗体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記モノクローナル抗体はベバシズマブである、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ＶＥＧＦ阻害剤はさらに、ＶＥＧＦシグナル伝達を阻害する分子と定義される、請求項２に記載の組成物。
【請求項７】
ＶＥＧＦシグナル伝達を阻害する前記分子は、受容体チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記受容体チロシンキナーゼ阻害剤は、ＺＤ４１９０、ＺＤ６４７４、、ＡＺＤ２１７１、ＣＥＰ−７０５５、ＰＴＫ７８７またはＳＵ５４１６である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＶＥＧＦ阻害剤は低分子であり、該低分子は、ＶＥＧＦ受容体の低分子チロシンキナーゼ阻害剤である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＶＥＧＦ阻害剤は蛋白質であり、該蛋白質は、可溶性ＶＥＧＦ受容体である、請求項２に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＭＤＡ−７連結剤は選択的ＣＯＸ−２阻害剤であり、該選択的ＣＯＸ−２阻害剤は、セレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、ルミラコキシブ、またはエトリコキシブである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＭＤＡ−７連結剤は、ＣＯＸ−２阻害剤プロドラッグである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記ＭＤＡ−７連結剤は、１７−ＧＡＡである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＭＤＡ−７連結剤はビタミンＥ化合物であり、該ビタミンＥ化合物は、アルファ−トコフェロールまたはアルファ−トコフェロールのエステル化形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記ＭＤＡ−７は、ＭＤＡ−７ポリペプチドをコードする配列を有する核酸の形態であり、該ＭＤＡ−７は前記患者において発現される、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記核酸はウイルスベクター中に存在する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ウイルスベクターは、アデノウイルスベクターである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物は１以上の脂質を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記組成物は、ＤＯＴＡＰおよびコレステロールまたはそれらの誘導体を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
前記ＭＤＡ−７は、ＭＤＡ−７蛋白質の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＭＤＡ−７は、前記患者に、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜、心臓周内、臍滞内、眼内、経口、局所、局所的、吸入により、注射により、注入により、連続的注入により、標的細胞に直接浴びさせる局所的灌流により、カテーテルを介して、または洗浄を介して投与されるのに適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記癌が、メラノーマ、非−小細胞肺、小細胞肺、肺、肝臓癌腫、網膜芽細胞腫、神経膠星状細胞腫、神経膠芽細胞腫、歯肉、舌、白血病、神経芽細胞腫、頭部、首部、乳房、膵臓、前立腺、腎臓、骨、精巣、卵巣、中皮腫、頸部、胃腸、リンパ腫、脳、結腸または膀胱のものである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
放射線療法および／または化学療法と組み合わせて使用されるのに適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
放射線療法と組み合わせて使用されるのに適している、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
化学療法と組み合わせて使用されるのに適している、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ＭＤＡ−７は、前記ＭＤＡ−７連結剤に先立って投与されるのに適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ＭＤＡ−７は、前記ＭＤＡ−７連結剤よりも後に投与されるのに適している、請求項１に記載の組成物。
【請求項２８】
前記ＭＤＡ−７は、前記ＭＤＡ−７連結剤と同時に投与されるのに適している、請求項１に記載の組成物。
【国際調査報告】
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