(57)【要約】本発明は、免疫刺激性の抗体を用いた疾患の治療におけるサイトカインの非特異的な放出に起因する望ましくない副作用を低減または除去する薬剤の製造のためのグルココルチコイドの使用に関するものであり、また、少なくとも一の免疫刺激性の抗体および少なくとも一のグルココルチコイドを含んでいる薬学的組成物に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一またはそれ以上の免疫刺激性の抗体、特に三官能性の抗体（ｔｒＡＢ）を用いた疾患の治療における非特異的なサイトカインの放出を低減させるための薬剤を製造するための、一またはそれ以上のグルココルチコイドの使用。
【請求項２】
上記グルココルチコイドが合成グルココルチコイドであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記合成グルココルチコイドが、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、酢酸コリチゾン、プレドニリデン、デフラザコート、クロプレドノール、フルオコルトロン、およびブデノシドからなる群より選択されることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
上記疾患が癌性の疾患および腫瘍性の疾患からなる群より選択されることを特徴とする請求項１〜３の何れか一項に記載の使用。
【請求項５】
上記癌性の疾患が胃癌、腺癌、悪性黒色腫、結腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、肝細胞癌、全組織型の気管支癌、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、および消化器間質腫瘍（ＧＩＳＴ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項４に記載の使用。
【請求項６】
上記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、および／または多官能性の抗体であることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の使用。
【請求項７】
上記抗体は、二重特異性であり、個々が、腫瘍抗原およびＣＤマーカーに対して少なくとも一の特異性を示すことを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
上記ＣＤマーカーがＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２８およびＣＤ４４からなる群より選択されることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
上記腫瘍抗原が、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｎｅｕ、Ｇ２５０、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ、ＶＥＧＦ、ＧＤ３、ＥＧＦＲ、αＶβ３−インテグリン、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＡＳＣ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ５２、ｃ−ｅｒｂ−２、ＣＡＬＬＡ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１１７、ｐ９７、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、Ｃ２１５、９．２．２７抗体の抗原、ＮＥ１５０抗体の抗原、およびＣＡ１２５抗体の抗原からなる群より選択されることを特徴とする請求項７または８に記載の使用。
【請求項１０】
上記抗体が抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３、または抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性の抗体であることを特徴とする請求項７〜９の何れか一項に記載の使用。
【請求項１１】
上記抗体および／または上記グルココルチコイドが、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、または所定の組織に選択的に投与されることを特徴とする請求項１〜１０の何れか一項に記載の使用。
【請求項１２】
上記所定の組織への選択的な投与が、組織の供給血管へのカテーテルを介して行われることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
肝臓への上記投与が、肝動脈へのカテーテルを介して行われることを特徴とする請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
上記グルココルチコイドおよび上記抗体が同時に投与されることを特徴とする請求項１〜１３の何れか一項に記載の使用。
【請求項１５】
少なくとも一の免疫刺激性の抗体と、
少なくとも一のグルココルチコイドと、
任意に一またはそれ以上の薬学的に適合可能な担体および／または補助薬を含んでいる、薬学的組成物。
【請求項１６】
上記グルココルチコイドが合成グルココルチコイドであることを特徴とする請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
上記合成グルココルチコイドが、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、酢酸コリチゾン、プレドニリデン、デフラザコート、クロプレドノール、フルオコルトロン、およびブデノシドからなる群より選択されることを特徴とする請求項１６に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
上記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、および／または多官能性の抗体であることを特徴とする請求項１５〜１７の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
上記抗体は、二重特異性であり、個々が、腫瘍抗原およびＣＤマーカーに対して少なくとも一の特異性を示すことを特徴とする請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
上記ＣＤマーカーがＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２８およびＣＤ４４からなる群より選択されることを特徴とする請求項１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
上記腫瘍抗原が、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｎｅｕ、Ｇ２５０、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ、ＶＥＧＦ、ＧＤ３、ＥＧＦＲ、αＶβ３−インテグリン、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＡＳＣ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ５２、ｃ−ｅｒｂ−２、ＣＡＬＬＡ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１１７、ｐ９７、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、Ｃ２１５、９．２．２７抗体の抗原、ＮＥ１５０抗体の抗原、およびＣＡ１２５抗体の抗原からなる群より選択されることを特徴とする請求項１９または２０に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
上記抗体が、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３、または抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性の抗体であることを特徴とする請求項１９〜２１の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
上記疾患が癌性の疾患および腫瘍性の疾患からなる群より選択されることを特徴とする請求項１５〜２２の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２４】
上記癌性の疾患が胃癌、腺癌、悪性黒色腫、結腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、肝細胞癌、全組織型の気管支癌、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、および消化器間質腫瘍（ＧＩＳＴ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項２３に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、免疫刺激性の抗体を用いた疾患の治療におけるサイトカインの非特異的な放出に起因する望ましくない副作用を低減または除去する薬剤の製造のためのグルココルチコイドの使用に関するものであり、また、少なくとも一の免疫刺激性の抗体および少なくとも一のグルココルチコイドを含んでいる薬学的組成物に関するものである。
【０００２】
免疫療法処置は、これまでのところ、困難を伴ってしか、または不十分にしか制御することができないが、疾患、特に癌および感染症の治療において増大する役割を果たしている。これに関し、免疫刺激性の薬剤としての抗体の使用が好んでなされている（Glennie and Johnson (2000) Immunology Today 21(8): 403-410を参照されたい）。このようなタイプの免疫刺激性の抗体の有効性は、特に、所定の抗原との特異的な結合の可能性次第である。しかしながら、従来の免疫刺激性の抗体を用いた癌および感染症のような疾患の治療に関する大きな問題は、そのようなタイプの抗体の使用によって引き起こされる深刻な副作用である。上記に関して、深い倦怠感、嘔吐、アレルギー反応、低血圧、頻脈、高熱および致命的な循環障害または臓器不全さえもが、特に、主にＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）に起因して観察されている。
【０００３】
これらの免疫刺激性の抗体の激しい副作用は、多くの場合において、該抗体によって引き起こされるサイトカインの非特異的な放出に関係しており、それは、報告されている臨床上の副作用の大きい部分についての原因となっている。サイトカインの放出の程度は、免疫刺激性の抗体の使用量および使用速度に依存しており、それぞれの免疫刺激性の抗体の臨床上の許容量を制限する。
【０００４】
グルココルチコイドは、古くから、高い効果を有する抗炎症性および免疫抑制作用性の物質として知られている。グルココルチコイドの免疫抑制作用における一つの機構は、そのサイトカインの転写を弱める働きである（例えば、Blotta et al. (1997) J. Immunol. 158: 5589 to 5595; Ballow and Nelson (1997) JAMA 278 (22), Chapter 24: 2008 to 2017を参照されたい）。近年では、グルココルチコイドの免疫抑制作用の研究が、特に、Ｔ細胞の形成およびその機能について、さらなる進展がなされている（現在の概略は、例えば、Ashwell and Vacchio (2000) Annu. Rev. Immunol. 18: 309 to 345）。効果的な免疫抑制療法の開発において、特に（急性の）移植の拒絶反応を防ぐことに関して、グルココルチコイドの、さらなる免疫抑制剤との組み合わせての使用が、好んでなされている。例えば、ハーベリンら（Herbelin et al.、Transplantation (2000) 68 (5): 616 to 622）らは、グルココルチコイドの事前投与を伴っており、該グルココルチコイドによってＴＮＦ−α、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γの産生が低減することに起因する、抗ＣＤ３抗体ＯＫＴ３を用いた急性免疫抑制療法の改善を報告している。しかしながら、現在の技術水準において、抗体療法、例えば、三官能性の抗体（ｔｒＡＢ）を用いた療法により、患者の免疫系を刺激することに関して、グルココルチコイドを使用することは、まったく知られていない。さらに言えば、従来、グルココルチコイドが用いられているのは、免疫抑制が治療上の目的である場合である。
【０００５】
したがって、本発明の基本的な目的は、免疫系を刺激するように働く抗体の副作用を最も広範囲に有効に緩和するための新規システムを提供することである。
【０００６】
上記目的は、請求項において特徴付けられた本発明の実施形態によって達成される。
【０００７】
特に、本発明によって、一またはそれ以上のグルココルチコイドの使用が、一またはそれ以上の抗体を用いた疾患の治療におけるサイトカインの非特異的な放出を低減させるための薬剤の製造のために提供される。
【０００８】
疾患、特に癌の症例における、免疫刺激のための抗体療法に関しての、グルココルチコイドの今までにない適用は、所定の特異性を有する免疫刺激性の抗体とグルココルチコイドとの組み合わせが、該所定の抗原をターゲットにした該免疫刺激性の抗体の作用が損なわれることなしに、免疫学的な細胞による非特異的なサイトカインの放出の低減をもたらすという驚くべき事実に基づくものである。特に、免疫刺激（例えば、腫瘍細胞に対するもの）のための抗体の使用に関して、抗体とグルココルチコイドとの組み合わせは、結果的な免疫作用の調節をもたらす；すなわち、所定の抗原をターゲットとする抗体の作用は、概ね変化せず、一方、上述の非特異的なサイトカインの放出のような、上記ターゲットとする抗原への結合とは無関係な免疫刺激性の抗体の使用において生じる、非特異的な効果は顕著に低減される。
【０００９】
グルココルチコイド（すなわち、一またはそれ以上の）と、一またはそれ以上の免疫刺激性の抗体の組み合わせによれば、技術水準において知られている免疫刺激療法に比べて、免疫療法のための抗体の可能性、特に、臨床への適用性を大幅に広げるいくつかの利点が現れる：
１．サイトカインの上記放出を低減することにより、同じ投与量において、特異的な作用（すなわち、ターゲットとする抗原に対するもの）を概ね変化させなくとも、望ましくない副作用（上に列挙したような）は非常にわずかに生じるのみである。
【００１０】
２．上記望ましくない副作用を低減することにより、使用されるべき上記抗体の投与量を増加させることができる。その結果として、グルココルチコイドとの組み合わせによれば、上記抗体の投与量を増加させることにより、作用の多大な増強が可能である。
【００１１】
３．驚くべきことに、本発明に従って使用されるグルココルチコイドは、サイトカインの非特異的な（全身的な）放出のみを低減させ、ターゲットとなる抗原への結合とは無関係である。したがって、サイトカインの放出は、抗原結合部位（例えば、腫瘍細胞の結合および意図的な破壊の部位）においてのみ生じる。したがって、上述の、新たに可能となったより多くの投与量に加えて、この効果により、全身的に放出されたサイトカインの影響を受けることなしに、免疫刺激性の抗体の作用が、上記抗原結合部位に集中する。
【００１２】
本発明の意義において、用語「抗体」は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体を含んでおり、結合型または可溶型として存在し得、また、これらの抗体の断片も含まれる。また、本発明に係る抗体の断片に加えて、本発明に係る抗体はまた、他の（タンパク質）構成要素との融合タンパク質のような組換え体として存在し得る。そのような断片、または融合タンパク質の構成要素としての本発明に係る抗体の断片は、典型的には、酵素による切断の方法、タンパク質合成の方法、または当業者に慣用されている組換え技術によって、生産される。本発明に係る最も好適な抗体は、三官能性の抗体（ｔｒＡＢ）である。
【００１３】
本発明に係るキメラ抗体は、さまざまな動物種由来の、さまざまな構成要素を含んでいる分子である（例えば、マウスモノクローナル抗体由来の可変領域、およびヒト免疫グロブリン由来の定常領域を示している抗体）。キメラ抗体は、一方では、使用の際の免疫原性を低減させるために、他方では、生産時の収量を高めるために好適に使用される；例えば、マウスモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ細胞株から高収量に生産されるが、ヒトにおいて、高い免疫原性を招く。そのため、ヒト／マウスキメラ抗体が好適に使用される。マウスモノクローナル抗体の超可変相補性決定領域（ＣＤＲ）が、ヒト抗体の残りの部分とともに自抗体中に組合されているモノクローナル抗体は、さらに好適である。キメラ抗体およびその製造方法は公知である（Cabilly et al., Proc. Natl. Sci. USA 81: 3273-3277 (1984); Morrison et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 81:6851-6855 (1984); Boulianne et al. Nature 312: 643-646 (1984); Cabilly et al., EP-A-125 023; Neuberger et al., Nature 314: 268-270 (1985); Taniguchi et al., EP-A-171 496; Morrion et al., EP-A-173 494; Neuberger et al., WO 86/01533; Kudo et al., EP-A-184 187; Sahagan et al., J. Immunol. 137: 1066-1074 (1986); Robinson et al., WO 87/02671; Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 84: 214218 (1987); Better et al., Science 240: 1041-1043 (1988) and Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, supra.）。これらの引用された参照文献は、開示の補助として、本発明に組み込まれる。
【００１４】
本発明の意義において、表現「免疫刺激性の抗体」または「免疫治療用の抗体」は、それぞれの抗体が、その抗原特異性によって、それぞれの疾患の治療の範囲において望まれる、患者の免疫系の刺激（賦活）を引き起こす、または補助することを意味する。
【００１５】
とりわけ、本発明の意義において、免疫刺激性の抗体は、Ｔ細胞の活性化を誘導する。このことに関する特に有利な点は、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ、細胞傷害性Ｔリンパ球、いわゆるキラーＴ細胞）の活性化である。しかし、免疫刺激性の抗体は、例えば、ヘルパーＴ細胞、補助細胞（マクロファージ）、樹状細胞、Ｂ細胞、またはナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）を介して生じる抗体媒介効果もまた包含している。
【００１６】
特に好適な免疫刺激性の抗体は、多重特異性、特に二重特異性、および／または多官能性、特に三官能性である。特に、二重特異性抗体について、例えば、ｓｃＦｖ分子（いわゆる単鎖抗体）、二量体等の、組換え技術により生産された、組換え抗体分子が後述される。二重特異性抗体および免疫複合体が、例えば、van Spriel et al. (2000) Immunol. Today 21: 391-397に示されている。二重特異性抗体は、当然、公知のハイブリドーマ技術によってもまた生産され得る。多価の二重特異性抗体の断片を製造するための方法は、当業者において知られており、例えば、Tomlinson and Holliger (2000) Meth. Enzymol. 326: 461ffに記載されている。特に好適な二重特異性抗体の例は、そのＦｃ部位、すなわち、抗原への結合に直接的に関与しない抗体の部位に、免疫補助細胞が結合し得る、三官能性の二重特異性抗体である。
【００１７】
本発明に係る好適な免疫刺激性の二重特異性抗体は、例えば腫瘍細胞のような傷害すべき細胞上の抗原に対する少なくとも一の特異性と、ＣＤマーカーに対する少なくとも一の特異性を示すものである。そのようなタイプの免疫刺激性の二重特異性抗体のＣＤマーカーは、好ましくはＴリンパ球上に発現され、したがって、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２８およびＣＤ４４からなる群より選択される。上記二重特異性抗体のＴ細胞への特異性は、結果的に、一方では、特異的な様式で、Ｔ細胞を集める。免疫刺激性の活性な抗体の、好適な第２の特異性は、免疫系によって排除されるべき細胞上に、可能な限り特異的に発現している抗原に対するものである。癌細胞の場合、それはいわゆる腫瘍抗原、すなわち腫瘍細胞の表面に発現しているペプチドまたはポリペプチドである。癌細胞に対して免疫刺激性の様式で活性である抗体の好ましい腫瘍抗原は、例えば、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｎｅｕ、Ｇ２５０、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ、ＶＥＧＦ、ＧＤ３、ＥＧＦＲ、αＶβ３−インテグリン、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＡＳＣ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ５２、ｃ−ｅｒｂ−２、ＣＡＬＬＡ（ＣＤ１０）、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１１７、ｐ９７、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、Ｃ２１５、９．２．２７抗体の抗原、ＮＥ１５０抗体の抗原、およびＣＡ１２５抗体の抗原である（Jager (2001) J. Clin. Pathol. 54(9): 669-674; Jager (2002) Curr. Opin. Immunol. 14(2): 178-182も参照されたい）。
【００１８】
この文脈において得に好ましいのは、上述したように、一またはそれ以上の補助細胞への結合部位をＦｃ部位に有する、二重特異性抗体の変異体である。このタイプの抗体は、例えば腫瘍細胞のような除去すべき細胞、およびＴ細胞を集めるだけではなく、同時に、単球またはマクロファージのような補助細胞も集めて、これにより、「三細胞の複合体」を形成する。第３の細胞結合の相手を集めることにより、除去すべき細胞の食細胞が開始される。またこれは、ひいては、除去すべき細胞上に発現している単離された抗原だけではなく、患者の体内において、可能な限りの変異を伴って存在している除去すべき細胞、特に腫瘍細胞に対して該患者を免疫する結果としてのポリクローナルな免疫反応の発生に必要である。特に、本発明に従った免疫刺激の様式において活性な三官能性の二重特異性抗体の好適な特に実施形態が、例えば、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３、または抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ３の特異性を伴って与えられる。
【００１９】
本発明に従って使用されるグルココルチコイドは、特に限定されるものではなく、天然に生成したもの、例えばハイドロコルチゾン（コルチゾル）もしくはコルチゾン、または合成されたものであり得る。生物学的な半減期（短期間活性である、中期間活性である、および長期間活性である）についての選択にかんしても何の制限も存在しない。本発明に従って使用される合成グルココルチコイドは、例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、酢酸コリチゾン、プレドニリデン、デフラザコート、クロプレドノール、フルオコルトロン、およびブデノシド（budenoside)であるが、これらに限られない。
【００２０】
本発明に係る特に好適なグルココルチコイドは、グルココルチコイドデキサメタゾンである。デキサメタゾンは、合成グルココルチコイドであり、その半減期は３６時間から５４時間に達し、これは長期間活性なグルココルチコイドに属する。従って、継続的なグルココルチコイドの作用が必須な処置のために特に好適である。デキサメタゾンは、投与されると、７０〜８０％の割合でアルブミンに結合する。そのため、遊離した活性のグルココルチコイドの割合は２０〜３０％である。デキサメタゾンは、天然の副腎皮質ホルモンコルチゾンの約３０倍強力な作用を有しており、わずかに鉱質コルチコイド作用作用を有しており、わずかな保水作用および保塩作用を有している。他の多くの適用のなかでも、心不全または心臓肥大を伴う患者への適用が特に好適である。さらに治療上重要なことは、デキサメタゾンの強力な消炎作用および免疫抑制（抗アレルギー）作用である。また、静脈注射後数分の内に、最大の血漿中濃度が得られるという事実も利点である。
【００２１】
グルココルチコイド（または数種のグルココルチコイド）とともに用いられる本発明に係る免疫治療用の抗体（または数種の抗体）を用いて治療され得る癌性の疾患の例として、胃癌、腺癌、悪性黒色腫、結腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、肝細胞癌、気管支癌（全組織型）、リンパ腫、肉腫、非小細胞肺癌、芽細胞腫、消化器間質腫瘍（ＧＩＳＴ）等を挙げることができる。
【００２２】
本発明に従った、免疫刺激性の抗体およびグルココルチコイドの投与方法については、何の制約もない。したがって、上記グルココルチコイドおよび上記抗体は、腹腔内に、全身的に（静脈内に、または動脈内に）、筋肉内に、皮内に、皮下に、腫瘍内に、または所定の組織に、もしくは所定の組織を介して選択的に、投与され得る。また当然、グルココルチコイドは、特に、経口で投与され得、軟膏、ジェル、またはその他の投与に好適な形態であり得る。投与は、皮膚上への投与であってもよい。所定の組織への、もしくは所定の組織を介しての選択的な投与の例としては、（免疫学的組織としての）骨髄を介しての投与、またはそれぞれの組織に供給を行う血管（動脈）への超選択的カテーテルを介しての投与を挙げることができる。カテーテルによるそのようなタイプの投与の具体的な例としては、肝臓への選択的な投与、または肝臓を介しての全身的な投与のための肝動脈（A.hepatica）へのカテーテル手段が挙げられる。組織特異的な投与のさらなる例としては、門脈を介した肝臓への投与、腎動脈を介した腎臓への投与、脳腫瘍の場合のくも膜下構内への投与、腸間膜を介した結腸領域への投与、腹腔動脈および上腸間膜動脈を介しての膵臓への投与、および対応する動脈を介しての手足の腫瘍への投与がある。その上さらに、腫瘍への直接的な投与も効果的であり得る。もちろん、本発明に係る、免疫刺激性の抗体、およびグルココルチコイドの使用に当たっては、これらの活性の組成物の投与は、同様の方法で、または異なった方法で実施される；例えば、抗体は選択的に肝臓へ、グルココルチコイドは、例えば静脈内投与により全身的に行うことができる。
【００２３】
グルココルチコイドは、例えば、免疫刺激剤として働く抗体に対して、同時に、別個に、または時期をずらして投与され得る。したがって、グルココルチコイドは、上記抗体に対して、時間的に前、後、または同時に投与され得る。特に好適な実施形態によれば、グルココルチコイドおよび免疫刺激性の抗体は、おおよそ同時に投与される。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、癌性の疾患、腫瘍性の疾患の治療または予防に関する、少なくとも一の、上述したような免疫刺激性の、または免疫治療用の抗体、および少なくとも一の、上述したようなグルココルチコイドを、同時に、別個に、または時期をずらして投与されるために組合わせて調製された形態に含んでいる製品である。癌性の疾患は、例えば、胃癌、腺癌、悪性黒色腫、結腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、肝細胞癌、全組織型の気管支癌、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、および／または消化器間質腫瘍（ＧＩＳＴ）を含んでいる。
【００２５】
本発明に係る製品の成分である、少なくとも一の、上述したような免疫刺激性の、または免疫治療用の抗体（第１成分）、および少なくとも一の、上述したようなグルココルチコイド（第２成分）は、それらの目標とする使用のために機能的に統合されている。上記製品の成分は、互いに独立には、上述したような、本発明に係る有利な作用を生み出し得ない。したがって、第１成分および第２成分（同時に、別個に、または時期をずらした投与）の空間的な分離にもかかわらず、本発明の実施は、新規な組み合わせの形態として得られるものであり、技術水準において記載されたものではない。
【００２６】
本発明に係る製品は、方法、治療法、疾患の治療および／もしくは予防方法、または本発明に係る混合された治療法において採用し得るすべての成分、物質、および実施形態を含むものである。
【００２７】
本発明のさらなる目的は、少なくとも一の、上述したような免疫刺激性の、または免疫治療用の抗体、および少なくとも一の、上述したようなグルココルチコイドを含んでいる薬学的組成物に関するものである。本発明に係る薬学的組成物は、特に、上に列挙したような疾患を治療するために好適である。本発明に係る薬学的組成物の薬学的に活性な成分は、詳細に後述するような、一またはそれ以上の担体および／または補助物質を結合されて存在していてもよい。
【００２８】
本発明に係る薬学的組成物、またはグルココルチコイドの本発明に係る使用において、グルココルチコイドおよび抗体は、好適な処方により有利に作られる。そのようなタイプの処方は、当業者に知られており、治療または免疫刺激の態様で働く物質に加えて、一またはそれ以上の薬学的に適合可能な担体および／または薬学的に適合可能な賦形剤を含んでいる。好適な処方、およびそのようなタイプの処方の製造のための適切な方法は、たとえば、文献”Remington's Pharmaceutical Sciences”（Mack Pub. Co., Easton, PA, 1980）に開示されており、該文献の全内容は、本発明の開示の一部分として組み込まれる。非経口での投与のために、滅菌水、滅菌された食塩水、ポリアルキレングリコール、水和ナフタリン、および特に、生体適合性のラクチド高分子、例えば、ラクチド／グリコリド共重合体、またはポリオキシエチレン／ポリオキシプロピレン共重合体が担体物質として考慮される。本発明に係る薬学的組成物は、金属イオンとの複合化、または、例えばポリ乳酸塩、ポリグリコール酸、ハイドロジェルのような高分子化合物の特定の調製物の中もしくは上に、もしくはリポソーム、マイクロエマルジョン、ミセル、単層小胞、多層小胞、赤血球断片、芽球上に物質を含ませるために、充填物質、ラクトース、マンニトールのような物質、例えばポリエチレングリコールのような高分子と、本発明に係る免疫刺激性の抗体との共有結合のための物質を含み得る。上記薬学的組成物のそれぞれの実施形態は、例えば、可溶性、安定性、生物学的利用性、または分解性のような物理的特性に従って選択される。本発明に係る活性物質成分の制御されたまたは定常な放出は、親油性の沈殿（例えば、脂肪酸、ろう、または油脂）を主とする処方を含んでいる。本発明の範囲には、本発明に係る薬学的組成物または薬剤の被覆は、薬学的に活性な物質を含む。つまり、高分子によって被覆することがまた開示されている（例えば、ポリオキサマー、またはポリオキサミン）。その上、本発明に係る薬学的に活性な物質または組成物は、例えば、プロテアーゼ阻害剤、または浸透性増強剤のような保護被覆を有し得る。好適な担体は、典型的には、水性の担体物質であり、注射用水（ＷＦＩ）、またはリン酸塩、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ，または酢酸等によって緩衝された水であり、ｐＨは、典型的には５．０〜８．０（好ましくは６．５〜７．５）に調整される。上記担体または上記賦形剤は、付加的に、選択的に、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、または他の例えば溶液を等張性にする物質のような塩成分を含んでいる。上記担体または上記賦形剤はさらに、上述した成分に加えて、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ポリソルベート５０、砂糖、またはアミノ酸等の付加的な成分を含み得る。
【００２９】
本発明に係る薬剤、製品、または薬学的組成物の投与方法は、対処すべき疾患のタイプ、適切な時期、制御すべき抗原、ならびに、患者の体重、年齢、および性別に依存する。
【００３０】
本発明に係る処方の活性成分の濃度は、広い範囲に変化し得る。抗体の本発明に係る投与量は、約１μｇから約１ｍｇまで変動する。一方、グルココルチコイドは、一般に、約１ｍｇから約１０００ｍｇの範囲で投与され、特に約１ｍｇから約１００ｍｇの範囲で投与される。
【００３１】
本発明よれば、さらに、上述したような免疫刺激性の抗体および少なくとも一のグルココルチコイドを患者、特に人間の患者に投与することを含む、上述した疾患の治療方法が提供される。これに関して、免疫刺激性の抗体より前の、または同時の、グルココルチコイドの事前投与または同時投与が好ましい。当然、本発明によれば、いくつかの免疫刺激性の抗体およびいくつかのグルココルチコイドが任意の組合わせて用いられ得る。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、すくなくとも一の上述したような免疫刺激性または免疫治療用の抗体、および少なくとも一の上述したようなグルココルチコイドを含んでおり、該すくなくとも一の上述したような免疫刺激性または免疫治療用の抗体、および該少なくとも一の上述したようなグルココルチコイドは、互いに分離されているキットに関するものである。
【００３３】
本発明の好適な実施形態は、癌性の疾患、腫瘍性の疾患の治療または予防のためのキットの使用に関する。癌性の疾患は、例えば、胃癌、腺癌、悪性黒色腫、結腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、肝細胞癌、全組織型の気管支癌、リンパ腫、肉腫、非小細胞肺癌、芽細胞腫、および／または消化器間質腫瘍を含んでいる。
【００３４】
図面は以下の通りである：
図１は、ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）を用いて刺激を行った後、およびＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）を用いずに刺激を行った後における、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（濃度１０６細胞／ｍｌ）によるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出を示すグラフである。
【００３５】
図１Ａのｙ軸は、濃度単位ｐｇ／ｍｌのＩＬ−６の放出を示しており、ｘ軸は、ＰＢＭＣの各刺激を示している。刺激されないＰＢＭＣ（「ＰＢＭＣ」バー）は、コントロールを示す。このグラフにおいて、Ｅはそれぞれ、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する、１００μｇ／ｍｌの三官能性二重特異性抗体（trifuntional bispecific antibody）を示している。特定の濃度μｇ／ｍｌを有するデキサメタゾンは、「Ｄｅｘａ」と示されている。図１Ａによる実験では、ＰＢＭＣからのＩＬ−６の放出は、ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（＝標的細胞）と接触させずに刺激を行った後に調査した。ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞を用いずに行う刺激は、抗原結合に非依存的なサイトカインの非特異的な放出に対応している。放出は、ＰＢＭＣの全身性（totality）により、全身的に生じる。図１Ａに示されているように、デキサメタゾンは、ＩＬ−６の放出を濃度依存的に低下させる。濃度１μｇ／ｍｌの場合、ＩＬ−６の放出はほぼ完全に抑制される。従って、全身的なＩＬ−６の放出によって生じる副作用は、十分に高容量のデキサメタゾンを投与することによって、ほぼ完全に抑制されるはずである。
【００３６】
図１Ｂは、図１Ａと対応する図であって、ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（ＨＣＴ８の濃度は、５×１０４細胞／ｍｌ）と接触させて刺激を行った後における、ＰＢＭＣからのＩＬ−６の放出を示している。ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞を用いた刺激の手順は、ＰＢＭＣの抗原結合部位からのＩＬ−６の放出状況と対応している。従って、この実験的な構成において測定されるＩＬ−６は、望ましくない副作用を後に引き起こすことのない、今回用いられている抗体の特異的（すなわち標的）作用と対応している。ＩＬ−６は、特異的な免疫反応に直接関連する免疫細胞のみから放出される。従って、絶対的に高い放出（図１Ｂのｙ軸の目盛り、および図１Ａのｙ軸の目盛りを参照されたい）は、高度な副作用の兆候として評価されるべきではないが、抗原結合部位における特異的な免疫学的作用として説明される。免疫刺激性の抗体（immunostimulating antibody）をグルココルチコイドと共に臨床的に用いた場合、特異的な作用に直接関連する少量のＰＢＭＣから、多量のＩＬ−６が放出される。しかし、ＰＢＭＣの全身性によるインターロイキンの非特異的放出によって（図１Ａ参照）、副作用が生じる。図１Ｂから明らかであるように、デキサメタゾンの濃度が１μｇ／ｍｌである場合、ＩＬ−６の放出は確かに低下するが、デキサメタゾンを投与せずに、ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞を用いずに抗体刺激を行った場合に観察される全身的な放出を遥かに上回る（図１Ａ参照）。従って、免疫刺激性の抗体とデキサメタゾンとを組み合わせて投与した場合、非特異的なＩＬ−６の放出が大幅に抑制されるが、免疫刺激性の抗体の標的とする作用（targeted action）は顕著なままである。
【００３７】
図１Ｃは、上述の図１Ａおよび図１Ｂに従って、ＨＣＴ８細胞（標的細胞）を用いて刺激を行った後と、ＨＣＴ８細胞（標的細胞）を用いずに刺激を行った後とにおけるＩＬ−６の放出をパーセンテージ比較した図を示している。ｙ軸には、デキサメタゾンを同時使用しない場合の値（＝１００ ％）に対する、ＩＬ−６の放出が示されている。左手のバーはそれぞれ、ＨＣＴ８を用いずに刺激を行った場合の値を示しており、右手のバーはそれぞれ、ＨＣＴ８細胞を用いて刺激を行った後の結果を示している。デキサメタゾンの投与量が０．１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまでの間において、ＨＣＴ８細胞の非存在下においてＰＢＭＣを刺激した後のＩＬ−６分泌が、ＨＣＴ８細胞の存在化における刺激したときに対して乖離する：１μｇ／ｍｌのデキサメタゾンを投与して刺激を行った場合、特異的（すなわちＥｐＣＡＭ陽性癌細胞の結合によって生じる）作用に関連したＩＬ−６の放出が維持される。これとは対照的に、抗原結合（この場合は、ＨＣＴ８細胞におけるＥｐＣＡＭ結合）に非依存的なＩＬ−６の非特異的分泌が大幅に低下、あるいは消失する。
【００３８】
図２は、ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞を用いずに、およびＥｐＣＡＭ陽性癌細胞の存在下において、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性の三官能性の二重特異性抗体を用いて刺激を行った後における、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）の放出結果を示している。
【００３９】
図２Ａは、上述の図１Ａ（ＩＬ−６の放出を示す）と同様の方法によって、ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞と接触させずに刺激を行った後における、ＰＢＭＣからのＴＮＦ−αの放出を示している。ＴＮＦ−α濃度は、ｙ軸においてｐｇ／ｍｌで示されている。この標的細胞を用いない刺激は、図１Ａに照らして既に説明したように、抗体／抗原間の相互作用とは非依存的に生ずるサイトカインの全身的かつ非特異的放出と対応している。この全身的なＴＮＦ−αの放出は、ＰＢＭＣ集団（PBMC population）によってもたらされる。デキサメタゾンは、ＴＮＦ−αの放出を濃度依存的に低下させる。既に濃度０．１μｇ／ｍｌにおいて、ＴＮＦ−αの大幅な放出が生じている。この低下は、グルココルチコイドを投与せずに抗体刺激を行った場合におけるＴＮＦ−α放出の約５分の１に達する。グルココルチコイド濃度が１μｇ／ｍｌおよびこれ以上である場合、ＴＮＦ−αの放出が完全に抑制される。
【００４０】
図２Ｂは、図１Ｂと同様の図であって、ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞と接触させた抗体を用いて刺激を行った後における、ＰＢＭＣからのＴＮＦ−αの放出を示している。この図でもまた、ＴＮＦ−α濃度は、ｙ軸においてｐｇ／ｍｌで示されている。残りの目盛りは、図１Ｂと同様である。ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞を標的細胞として用いて行う刺激は、この実験的な構成において行われたものだが、抗原結合部位におけるＰＢＭＣからのＴＮＦ−α放出の状況と対応している。従って、この実験において測定されるＴＮＦ−α濃度は、大部分が、抗体の特異的（標的）作用に帰するものであり、望ましくない副作用を結果的に引き起こすことがない。ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞に接触させて刺激を行った場合は、標的細胞に接触させずに刺激を行った場合と比較して、絶対的に高いＴＮＦ−αの放出値が測定される。しかしこの原因は、図１Ｂに示すＩＬ−６の放出に関連して既に説明したように、抗体／抗原間の相互作用部位における特異的な免疫学的作用にある。また、この場合において、１μｇ／ｍｌまたはこれ以上の濃度のグルココルチコイドデキサメタゾンを投与してＴＮＦ−αの放出を調査すると、特異的ＴＮＦ−αの放出量の明確な低下が観察されるが、しかし放出量はまだ顕著である。
【００４１】
図２Ｃは、図１Ｃと同様の図であって、ＨＣＴ８標的細胞を用いずに刺激を行った後におけるＴＮＦ−αの放出（それぞれ左側のバー）と、ＨＣＴ８標的細胞を用いて刺激を行った後におけるＴＮＦ−αの放出（それぞれ右側のバー）とのパーセンテージ比較を示している。１００ ％値は、デキサメタゾンを同時投与しない場合のＴＮＦ−αの放出と対応している。アプリケーション（application）については、図１Ｃを参照されたい。ＴＮＦ−αに関しては、デキサメタゾン投与量が０．１μｇ／ｍｌから１μｇ／ｍｌまでの間において、標的細胞による刺激が行われていないサイトカイン分泌の、標的細胞と接触させて刺激を行った場合に対する乖離が観察される。デキサメタゾン濃度が１μｇ／ｍｌである場合、（ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞の結合により）特異的な作用に関連したＴＮＦ−αの放出が維持される（グルココルチコイドを同時添加しない場合の抗体刺激に対して、サイトカインの放出が６０ ％以上）。これとは対照的に、デキサメタゾンを０．１μｇ／ｍｌ添加した場合、抗原結合（ＨＣＴ８細胞におけるＥｐＣＡＭ結合）に非依存的に生じるＴＮＦ−αの非特異的な分泌が、デキサメタゾンを添加せずに抗体刺激を行った場合に測定された値の少なくとも２０％まで低下する。１ｍｇ／ｍｌのデキサメタゾンを投与した場合、ＴＮＦ−αの非特異的放出は完全に消失する。
【００４２】
図３は、上述の図１および図２と対応するさらなる図であって、標的細胞（ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞）と接触させていない二重特異性抗体（抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３）を用いて刺激を行った後におけるＰＢＭＣからのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の放出と、標的細胞（ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞）と接触させた二重特異性抗体（抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３）を用いて刺激を行った後におけるＰＢＭＣからのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の放出とに関する結果を示している。ＩＦＮ−γは、（ＴＮＦ−αと同様に）ＴＨ１１−特異的（Ｔヘルパー細胞１型特異的）サイトカインであって、さらにＴ細胞媒介抗原特異的な標的細胞破壊のマーカーである。ＩＦＮ−γは、抗原に対して刺激を行った後、活性化された特異的Ｔ−リンパ球によって分泌される。従ってＩＦＮ−γは、標的細胞と同時接触させていない抗体を用いて刺激を行った場合は発生しない。なぜなら、この場合、標的とされる抗原／抗体間の相互作用に基づいて刺激が行われないからである。
【００４３】
図３Ａは、図１Ａおよび図２Ａ（ｙ軸は、濃度単位ｐｇ／ｍｌのＩＦＮ−γを示す）と同様の図であって、上述の期待を確認するものである。刺激が行われない場合、ＩＦＮ−γの放出はＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（ＨＣＴ８）との接触なしに起こる。
【００４４】
図３Ｂは、ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（ＨＣＴ８）と接触させた抗体を用いて刺激を行った後における、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γの放出を示している。標的細胞（ＨＴＣ８）と接触させた二重特異性抗体を用いてＰＢＭＣを刺激した場合、ＩＦＮ−γが顕著に放出される。このＩＦＮ−γの顕著な放出は、グルココルチコイドを添加しなかった場合は、６０００ｐｇ／ｍｌ以上に達する。デキサメタゾンを０．０１μｇ／ｍｌの同時投与した場合、ＩＦＮ−γの放出はやや増加する（７０００ｐｇ／ｍｌ以上）。デキサメタゾン濃度が０．１μｇ／ｍｌの場合、ＩＦＮ−γの放出は３０００ｐｇ／ｍｌ未満に低下するが、それでもやはり顕著である。
【００４５】
図３Ｃは、図１Ｃおよび図２Ｃと同様の方法によって、ＨＣＴ８標的細胞と接触させた抗体を用いて刺激を行った後におけるサイトカインの放出（ここではＩＦＮ−γ）と、ＨＣＴ８標的細胞と接触させていない抗体を用いて刺激を行った後におけるサイトカインの放出とのパーセンテージ比較を示している。
【００４６】
図４は、濃度０．０１、０．１、１および１μｇ／ｍｌのデキサメタソンの同時投与の影響下での、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性二重特異性抗体（濃度１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）によるＴ細胞活性化に関する実験の結果を示したグラフである。
図４Ａ〜図４Ｅの各例において、ｙ軸には、活性マーカー（図４Ａおよび４ＣではＣＤ２５、図４Ｂでおよび４ＤではＣＤ６９、図４ＥではＨＬＡ−ＤＲ）の発現したＣＤ３／ＣＤ４陽性Ｔリンパ球（ヘルパーＴ細胞）またはＣＤ３／ＣＤ８陽性Ｔリンパ球（キラーＴ細胞）の割合比をプロットしている。測定はＦＡＣＳ解析により行った。図４Ａ〜Ｅにおける左側のバーは、ぞれぞれ、ＨＣＴ８標的細胞（濃度５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）に接触しない刺激の結果を示しており、右側のバーは、ぞれぞれ、ＨＣＴ８標的細胞に接触する場合の測定値を示している。三官能性二重特異性抗体の刺激がＨＣＴ８標的細胞への接触による場合、すなわち標的抗原の結合に特異的な刺激と一致する場合、図４Ａ〜４Ｅにおいて変化することのない高い測定値が示すように、Ｔ細胞活性はデキサメタソンによる影響を受けない。
【００４７】
図５は、特異的な細胞傷害性のパーセンテージの測定結果を示す図であり、蛍光標識したＨＣＴ８腫瘍細胞を用いた２時間の細胞傷害性試験により測定した。図５Ａ〜５Ｄにおいて、ＨＣＴ８に対する特異的な細胞傷害性のパーセンテージは標的細胞に対するエフェクター細胞（Ｅ／Ｔ）の比率としてプロットされており、上記細胞傷害性試験は、標的細胞に対するエフェクター細胞の比率が４０：１、２０：１、１０：１、５：１および２．５：１の場合を各例として実施している。各試験において、ＨＣＴ８細胞なしの抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する１００μｇ／ｍｌの三官能性二重特異性抗体（Ｅ）を用いた刺激は、ＨＣＴ８細胞の存在下でも行われ（Ｅ＋ＨＣＴ８）、また、デキサメタソン（濃度０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌ、または１０．０μｇ／ｍｌ）の付加的な投与を、ＨＣＴ８細胞に接触しない状態（Ｅ＋μｇ／ｍｌ  Ｄｅｘａ）、およびＨＣＴ８細胞に接触する状態（Ｅ＋μｇ／ｍｌ  ｄｅｘａ＋ＨＣＴ８）において受けた。
【００４８】
図５Ａは、特異的な細胞傷害性のパーセンテージにおける濃度０．０１ｍｇ／ｍｌのデキサメタソンの影響を示している。デキサメタソンなしのＰＢＭＣと比べて、同図では、グルココルチコイドのおかげで、特異的な細胞傷害性のパーセンテージに抑制が生じていない。
【００４９】
図５Ｂは、濃度０．１μｇ／ｍｌのデキサメタソンの影響に関する対応する測定の結果を示している。このデキサメタソン濃度では、特異的な細胞傷害性のパーセンテージの抑制に約５０ポイントの差異が生じている。この点について、ＨＣＴ８細胞が存在している場合と、存在していない場合との刺激には明確な差異が生じていない。
【００５０】
図５Ｃは、濃度１μｇ／ｍｌのデキサメタソンを用いた比較測定の結果を示している。図５Ｃの例においてもまた、特異的な細胞傷害性のパーセンテージに明確な差異が生じている。ＰＢＭＣがＨＣＴ８細胞の存在に影響されている場合、グルココルチコイドの濃度が０．１μｇ／ｍｌ（図５Ｂ参照）の場合において立証されたものとほぼ同じレベルである。標的細胞に対するエフェクター細胞の比率が２０：１の場合には、ＨＣＴ８のない場合においてＰＢＭＣの特異的な細胞傷害性のパーセンテージの抑制がより一層大きくなっている。
【００５１】
図５Ｄは、濃度１０μｇ／ｍｌのデキサメタソンの場合の対応する測定の結果を示している。ＨＣＴ８細胞の存在するＰＢＭＣの刺激の場合において、このデキサメタソン濃度における特異的な細胞傷害性のパーセンテージは、デキサメタソン濃度が０．１μｇ／ｍｌおよび１μｇ／ｍｌ（図５Ｂおよび５Ｃ参照）の場合に確立した値とほぼ一致している。標的細胞に対するエフェクター細胞の比率が２０：１の場合には、３０％の細胞傷害性が生じており、標的細胞に対するエフェクター細胞の比率が２倍になると細胞傷害性は、６０％となる。その一方で、ＨＣＴ８の存在しないＰＢＭＣの刺激の場合においては、より低いデキサメタソンの濃度に対して細胞傷害性の値がさらに減少する。
【００５２】
図５Ａ〜５Ｄに示した結果に関して、デキサメタソンは、０．０１μｇ／ｍｌの濃度では、刺激されたＰＢＭＣの細胞傷害性について影響を与えていない。刺激中におけるＨＣＴ８の存在の有無に関わらず、０．１μｇ／ｍｌの濃度から細胞傷害性がはっきりと減少する。デキサメタソンの濃度を上記の３つの範囲（０．１μｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）とし、標的細胞に対するエフェクター細胞の比率が４０：１であり、ＨＣＴ８が存在する条件における刺激の場合には、具体的な細胞傷害性の割合はデキサメタソンなしで測定した細胞傷害性の４０％〜６０％のレベルを維持する。したがって、標的細胞（Ｔ）に対するエフェクター細胞（Ｅ）の比率が一致する場合、広い濃度範囲内におけるグルココルチコイドの添加において、ＨＣＴ８細胞の存在下において刺激したＰＢＭＣの細胞傷害性の差異は、一定に維持される。一方で、細胞傷害性は、ＨＣＴ８の存在しないＰＢＭＣの刺激の後、デキサメタソン濃度に依存してさらに減少する。
【００５３】
図６は、化学療法抵抗性の胃癌の患者の治療における免疫学的なパラメータの検査値を示す図である。本発明に基づけば、免疫活性化剤として、三官能性であり、腫瘍細胞に対して二重特異性を有する抗体（抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３）を用い、免疫療法による副作用の抑制のためにグルココルチコイド（デキサメタソン）を用いる。図６Ａ〜６Ｅのｙ軸におおける測定値は、それぞれ特殊化したユニットにおける各例としてプロットされている。経過日における治療作用はｘ軸に示されている。この点について、Ｅは上記の免疫活性化抗体の投与を投与量（μｇ）腹腔内と併せて示している。また、Ｄｅｘは投与されるデキサメタソンの投与量（ｍｇ）皮下を示している。
【００５４】
図６Ａは、白血球濃度（ｇ／ｌ）（黒いひし形）および血清ＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）（黒い四角形）の曲線を示す図である。ｄａｙ０およびｄａｙ４におけるはじめの２回の抗体投与は、グルココルチコイドを添加投与することなく行われている。この治療条件において、特に「急性期タンパク」ＣＲＰの血清濃度が４０ｍｇ／ｄｌに上昇している。抗体の投与量を５００μｇに上昇するとともに、デキサメタソンを添加投与する治療のさらなる作用において、ＣＲＰ血清レベルは通常値に戻る。本発明に係る組み合わせ治療における白血球濃度もまた、２０ｇ／ｌ以下を維持する。健康な成人の通常値は、４ｇ／ｌから１１ｇ／ｌの間を変動している。白血球数の増加の観測もまた、所望の免疫活性の発現である。
【００５５】
図６Ｂは、特異の血球数中におけるリンパ球の割合比の曲線を示す図である。治療の初期段階での抗体のみの治療の場合、および免疫治療用の抗体の投与量をさらに増加すると共にデキサメタソンを添加投与する場合の双方において観測した変動は、期待通りである。特に、本発明において、抗体とグルココルチコイドとの組み合わせ投与の終了に向かうにつれて、測定値は、ほぼ健康な成人の通常値（２０％〜３０％がリンパ球）の範囲内の状態となっている。
【００５６】
図６Ｃは、ＩＬ−２受容体の血清濃度の曲線を示している。当初は免疫活性化抗体の投与量腹腔内を１００μｇにまで増加し、デキサメタソンの添加投与量を約５．５ｎｇ／ｍｌとしているため、値は治療の開始時点において、約１ｎｇ／ｍｌから約２ｎｇ／ｍｌに上昇している。しかし、三官能性であり、二重特異性抗体の投与量をさらに増加させ、同時にグルココルチコイドの同時投与する投与量を１０ｍｇ皮下としているにもかからわず、ＩＬ−２受容体の濃度は治療の終了時点に向かって再度低下し、１ｎｇ／ｍｌ以下となる。
【００５７】
図６Ｄは、胃癌の患者において測定した血清中ＴＮＦ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）の曲線を示している。ＴＮＦ−αは、細胞免疫活性の発現と同様に、免疫療法の抗体の投与量を１０μｇから５００μｇに増加する治療により上昇している。抗体のみを少量投与した場合には５０ｐｇ／ｍｌ以下の値であるが、２００μｇまたは５００μｇ腹腔内の二重特異性抗体に加えて１０ｍｇ皮下のデキサメタソンを投与した場合には、いずれの例においても約２００ｐｇ／ｍｌとなる。したがって、グルココルチコイドを投与することにより、副作用を抑制し、免疫療法の抗体の投与量をより一層増加することができる。本発明において、優れた細胞特異性免疫活性は、治療またはグルココルチコイドの使用の過程において観測される。
【００５８】
図６Ｅは、治療をｘ軸にプロットした場合の胃癌患者の血清中ＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ）の曲線を示している。デキサメタソンを同時に投与しない免疫活性化抗体の１回目および２回目の投与（ｄａｙ０およびｄａｙ４）後、ＩＬ−６濃度は、それぞれ、約３００ｐｇ／ｍｌおよびほぼ１０００ｐｇ／ｍｌ弱にまで明らかに増加する。抗体およびグルココルチコイドの１回目の混合投与（ｄａｙ９における抗体１００μｇ腹腔内＋デキサメタソン４０ｍｇ皮下）の後でもまた、ＩＬ−６濃度は、最大値である約１２００ｐｇ／ｍｌにまで急速に上昇している。しかし、ＩＬ濃度は、瞬時に元の値に戻る。そして、抗体を５００μｇ腹腔内（同時にデキサメタソン１０ｍｇ皮下を投与）に増加したとしても低い値を維持し続ける。
【００５９】
胃癌患者において立証された免疫学的なパラメータの値は、ＴＮＦ−α濃度の上昇が示すように、特異的な抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の三官能性二重特異性抗体にデキサメタソンを足した組み合わせ治療によって、細胞特異性免疫活性が明らかに生じることを示している。その他のパラメータはすべて、グルココルチコイドの投与によって、抗体の投与量の著しい増加の下でも概ね一定となっている。この点について、測定した免疫学的パラメータは、ＴＮＦ−αを除いていずれも腫瘍細胞における抗体性作用を示していないが、免疫学的な副作用となるということも注意すべきである。特に、抗体の投与量を非常に増加しているにもかかわらず、デキサメタソンを同時に投与することによって、ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群）の兆候はみられない。ＳＩＲＳは、高い投与量での抗体治療、特に免疫活性化治療におけるサイトカインの激しい全身からの放出により引き起こされる炎症性の症候群であり、臓器不全を引き起こす可能性があり、致命的な結果となることさえある。本発明に係る組み合わせ治療によって、化学療法抵抗性胃癌の患者において観測した免疫学的なパラメータは、いかなるタイプの深刻な副作用のいずれの兆候も示していない。
【００６０】
図７は、すい臓値および肝臓値における、化学療法抵抗性胃癌患者の治療の上述した副作用の存在を示す図である。
【００６１】
図７Ａは、すい臓特異性酵素であるα−アミラーゼ（黒いひし形）およびリパーゼ（黒い四角形）の血清濃度（Ｕ／ｌ）曲線を示している。本発明に係る組み合わせ治療において、免疫活性化抗体の投与量を非常に増加させているにもかかわらず、好ましくない副作用の兆候として生じるすい臓パラメータの異常な増加はみられない（健康な成人の通常値は、α−アミラーゼ＜１２０Ｕ／ｌであり、リパーゼ＜１９０Ｕ／ｌである）。
【００６２】
図７Ｂは、上述した胃癌患者の治療の下での肝臓特異性酵素であるアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ；黒いひし形）、γ−グルタミル転移酵素（γ−ＧＴ；黒い四角形）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ；黒い三角形）、およびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ；ｘ）の血清濃度（Ｕ／ｌ）に対応する曲線である。測定した酵素の血清濃度のレファレンスレンジ（reference range）は、それぞれ以下の通りである：ＡＰは４０〜１９０Ｕ／ｌ、γ−ＧＴは４〜１８Ｕ／ｌ、ＧＯＴは５〜１５Ｕ／ｌ、ＧＰＴは５〜１９Ｕ／ｌ。抗体／グルココルチコイド組み合わせ治療の開始時点（ｄａｙ１０からｄａｙ１３）では、肝臓酵素の血清濃度の単純増加が生じている（特には、ＡＰ）。しかし、短時間で通常値に戻る。したがって、肝臓特異性酵素の濃度の場合においてもまた、デキサメタソンを同時に投与することによって、免疫活性化抗体の投与の増加と一致する、好ましくない副作用の兆候として生じる増加はみられない。
【００６３】
図７Ｃは、胃癌患者の治療の過程における作用としてさらなる肝臓パラメータであるビリルビンの合計濃度（ｍｇ／ｄｌ）を示す図である。３０μｇから１００μｇまで免疫活性化抗体の投与量を増加した後のビリルビンの急速な増加は別として、投与量のさらなる増加を行った場合であっても、この肝臓パラメータは１ｍｇ／ｄｌ以下のレファレンスレンジに位置している。したがって、デキサメタソンを投与した場合において二重特異性抗体の投与量を非常に多量としているにもかかわらず、ビリルビンには好ましくない副作用を示すことを立証する増加がみられない。これに関連して、デキサメタソンと免疫活性抗体とを同時に投与する治療において、患者がどのような深刻な臨床副作用も示さないことが立証される。
【００６４】
抗体（特異性抗Ｅｐ−ＣＡＭ×抗ＣＤ３である三官能性二重特異性抗体）およびデキサメタソンを用いた本発明に係る免疫治療のために、さらなる患者を従事させた。腺癌および肝臓に転移した女性患者の事象である。抗体の投与は、肝動脈（A.heptatica dextra）における選択カテーテルを通して行われた。図８は、治療の作用として免疫学的なパラメータの資料を再度示す図である。パラメータの図解は、上記の図６に関する説明おいてなされている。
【００６５】
図８Ａは、白血球数およびＣＲＰ血清濃度の曲線を示しており、図８Ｂは、治療過程の作用における特異の血球数中のリンパ球の割合比を示している。図８Ｃは、ＩＬ−２受容体濃度の曲線であり、図８Ｄは、ＴＮＦ受容体ｐ７５およびＴＮＦ受容体ｐ５５をプロットしたものであり、そして図８Ｅは、本発明に係る組み合わせ治療の下でのＩＬ−６濃度の曲線を示している。治療によって、デキサメタソンの投与にもかからわらず、可溶ＩＬ−２受容体（図８Ｃ）ならびにＴＮＦ受容体ｐ７５およびｐ５５（図８Ｄ）において全体的な上昇が生じており、腫瘍細胞に対する所望の免疫活性が示されている。同時に、抗体の投与量を１μｇから４０μｇに増加することによって、例えば４０まで増加した場合には、白血球、血清ＣＲＰ、リンパ球の割合比において深刻な増加が生じておらず、またＩＬ−６の全身からの放出の深刻な増加についても生じていない（図８Ａ、８Ｂおよび８Ｅ参照）。
【００６６】
すい臓特異的および肝臓特異的な実験値もまた、本発明に係る上記した免疫活性化抗体とともにグルココルチコイドを投与する治療を受けた肝臓に転移した腺癌に苦しむ女性患者において決定された。研究の結果を図９に示す。プロットは、上記の胃癌患者の場合における図７に関する説明おいてなされている。
【００６７】
図９Ａは、すい臓特異性酵素であるα−アミラーゼおよびリパーゼの血清濃度（Ｕ／ｌ）曲線を再度示している。ｘ軸には、治療の作用を示している。すい臓値は、治療全体においてレファレンスレンジの範囲内であった。
【００６８】
図９Ｂは、肝臓特異性酵素であるＡＰ、γ−ＧＴ、ＧＯＴ、およびＧＰＴ（同様にＵ／ｌ）に一致するプロットを示している。抗体の投与量を５μｇから４０μｇに増加された場合におけるＡＰの上昇は、２００Ｕ／ｌから始まり、約７００Ｕ／ｌであることを確かに示している。同様に、γ−ＧＴおよびＧＰＴの濃度は投与量の増加によって、それぞれ、１００以下から４００Ｕ／ｌ弱および１５０Ｕ／ｌ弱にまで上昇している。しかし、この肝臓特性酵素の濃度の上昇は、心配されている副作用を示すものではなく、治療の終了まで増加は、完全に反対となる。そして、どのようなときも患者において臨床問題は生じていない。ところで、これはビリルビン濃度の曲線もまた適用される。図９Ｃには、治療過程の作用およびさらなる肝臓特異性実験パラメータが示されている。５μｇの抗体投与の場合における０．５ｍｇ／ｄｌから、４０μｇの抗体投与の場合における３〜３．５ｍｇ／ｄｌまで、ビリルビンの合計濃度の上昇は、患者の肝臓において治療による深刻な副作用を示していない。この点において、患者の肝臓値、特には肝臓特異性酵素が既存の肝臓の転移によって上昇していることを同じく心に留めておく必要がある。
【００６９】
図１０は、細胞傷害性試験における、蛍光標識されたＨＣＴ８腫瘍細胞を用いた特異的な細胞傷害性のパーセンテージの測定の結果を表すグラフを示す。図１０Ａから図１０Ｃは、３人の健康な被験者それぞれに対して行われた測定結果の平均値を表す。一方、図１０Ｄは、６人の胃癌患者それぞれに対して行われた測定結果の平均値を表す。上記試験では、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、および１０００ｎｇ／ｍｌの各種の濃度において、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性二重特異性抗体によって刺激がなされた。用いられたそれぞれの抗体の濃度は、図１０Ａおよび図１０Ｂにおいて特定されている。ＰＢＭＣの濃度は、１０６細胞／ｍｌとなる。ＨＣＴ８細胞の濃度は、５×１０４細胞／ｍｌとなる。各試験では、刺激は、抗体を用いて、ＨＣＴ８なしで（ＰＢＭＣ＋ＡＫ）、ＨＣＴ８細胞の存在下で（ＰＢＭＣ＋ＡＫ＋ＨＣＴ８）、および濃度０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、１．０μｇ／ｍｌのデキサメタソンの付加的な投与を受けて（それぞれＰＢＭＣ＋ＡＫ＋０．０１、０．１、および１）行われた。ｙ軸は、細胞傷害性のパーセンテージを示しており、ｘ軸は、それぞれのＰＢＭＣの試験を示している。刺激されていないＰＢＭＣはコントロールを示す（ＰＢＭＣ）。
【００７０】
図１０Ａは、濃度１０ｎｇ／ｍｌの抗体の場合の対応する測定の結果を示す。ＨＣＴ８と接触され、デキサメタゾンを投与された、刺激されたＰＢＭＣの場合、特異的な細胞傷害性のパーセンテージの抑制は、約１５ポイント生じた（約５５％から４１％へ）。この抑制は、デキサメタゾンの濃度の上昇に伴い増加する。上記パーセンテージの抑制は、ＨＣＴ８との接触がある場合の方が、ＨＣＴ８との接触がない試験に比べてより明確に示された。そこでは、抑制はたった５ポイントしか生じなかった。
【００７１】
図１０Ｂは、濃度１００ｎｇ／ｍｌの抗体の場合の測定結果を示す。ＨＣＴ８標的細胞との接触を伴う刺激されたＰＢＭＣの場合、デキサメタゾンの付加的な投与がなされた場合、特異的な細胞傷害性のパーセンテージの明らかな抑制が３０ポイントに達するまで生じた（約７８％から５０％へ）。この抑制は、デキサメタゾンの濃度の上昇に伴い増加する。これに対して、ＨＣＴ８との接触を伴わない、デキサメタゾンが投与された刺激されたＰＢＣＭの場合は、細胞傷害性について、約１０ポイントの、わずかな抑制しか生じなかった。この抑制も同様に、デキサメタゾンの濃度の上昇に伴い増加する。
【００７２】
図１０Ｃは、濃度１０００ｎｇ／ｍｌの抗体の場合の対応する測定結果を示す。細胞傷害性の抑制は、デキサメタゾンにより起こるが、これは、濃度１００ｎｇ／ｍｌの抗体を用いた場合（図１０Ｂ）に比べて、全体を通して小さいことが判明した。ＨＣＴ８標的細胞との接触を伴う刺激されたＰＢＭＣの場合、デキサメタゾンの付加的な投与がなされた場合、特異的な細胞傷害性のパーセンテージの明らかな抑制が２０ポイントに達するまで生じた（約８５％から６７％へ）。この抑制は、デキサメタゾンの濃度の上昇に伴い増加する。ＨＣＴ８との接触を伴わない、デキサメタゾンが投与された刺激されたＰＢＣＭの試験では、約２ポイントの、最小限の抑制しか生じなかった。この抑制も同様に、デキサメタゾンの濃度の上昇に伴い増加する。
【００７３】
図１０Ｄは、胃癌を有する腫瘍患者の場合の対応する平均値の測定を示す。これらの測定は、濃度１００ｎｇ／ｍｌの抗体により実施された。同様に、デキサメタゾンの投与下において、細胞傷害性のパーセンテージの明らかな抑制が約２７ポイント生じた（約７８％から５１％へ）。ＨＣＴ８細胞との接触とともに刺激された場合、上記抑制は大きくなることが明らかとなった。この結果は、図１０Ｂ（健康な被験者）に示されるような抗体の濃度の観点に匹敵する。このような比較から、健康な被験者および腫瘍患者の両方において、グルココルチコイドデキサメタゾンの投与により、特異的な細胞傷害性のパーセンテージの明確な抑制が生じる。
【００７４】
図１１〜１３は、健康な被験者における、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞（ＨＣＴ８）（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）なし、または存在下で、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性の三官能性二重特異性抗体（ＡＫ）（濃度１ｍｇ／ｍｌ）による刺激後の、ＰＢＭＣ（濃度１０６細胞／ｍｌ）からのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフである。ｙ軸には、各サイトカインのｐｇ／ｍｌでの濃度が示されており、ｘ軸には、ＰＢＭＣのそれぞれの刺激試験が示されている。添加されたデキサメタゾンのそれぞれの濃度は、μｇ／ｍｌで、”０．０１”、”０．１”および”１”と記載されている。刺激されていないＰＢＭＣの値がコントロールとして同様に示されている（”ＰＢＭＣ”）。
【００７５】
ＥｐＣＡＭ陽性細胞との接触なしでのＰＢＭＣの刺激は、抗原との結合（抗体／抗原相互作用）に無関係な、サイトカインの非特異的な放出に対応する（図１〜３も同様）。各サイトカインの放出は、ＰＢＭＣによって全身的に行われる。ＥｐＣＡＭ陽性細胞との接触ありでのＰＢＭＣの刺激は、抗原結合部位でのＰＢＭＣの直接的なそれぞれのサイトカインの放出に対応する。各サイトカインの放出は、ラストネーム付きの実験的な試験によって測定された。したがって、望ましくない副作用（全身性の放出）を構成せずに使用し得る抗体の特異的な（標的の）作用に対応する。各サイトカインは、この場合、特異的な免疫反応に直接的に関与する免疫細胞からのみ放出される。
【００７６】
図１１は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の放出の結果を示す。ＩＬ−１０については、免疫抑制性のサイトカインの問題があった。抗体による刺激およびデキサメタゾンの投与の場合、ＩＬ−１０の放出が減少することが認識された。デキサメタゾンの濃度がより高まると、上記減少がより大きくなる。
【００７７】
図１２は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出の結果を示す。抗体による刺激およびデキサメタゾンの投与の場合、炎症性サイトカインＩＬ−６の放出は減少する。デキサメタゾンの濃度がより高まると、上記減少がより大きくなる。ＩＬ−６の放出の明確な減少は、ＨＣＴ８との同時刺激がない場合、より大きくなる。また、ＨＣＴ８と接触する場合のサイトカインの絶対的に高い放出は、高められた副作用（全身性のサイトカインの放出）の兆候ではなく、抗原結合部位における特異的な免疫反応によって生じる。したがって、ＨＣＴとの接触なし（副作用）でのＩＬ−６の放出は、本発明に適合するように、ＨＣＴ８との接触あり（特異的作用）の場合に比べて、デキサメタゾンの濃度が上昇するに伴い、より大きく顕著に減少する。すなわち、とても強い特異的作用が存在している（抗原結合部位におけるサイトカインの放出）。
【００７８】
図１３は、ＴＮＦ−αの放出の結果を示す。ＴＮＦ−αは、ＩＦＮ−γと同様に、細胞性免疫のサイトカインである。抗体による刺激およびデキサメタゾンの投与の場合、ＴＮＦ−αの放出は減少する。デキサメタゾンの濃度がより高まると、上記減少がより大きくなる。ＴＮＦ−αの放出の減少は、予測されるように、ＨＣＴ８との同時刺激がない場合、より大きくなる。ＨＣＴ８との同時接触がないとき（全身性放出、副作用）、デキサメタゾンの濃度が０．１μｇ／ｍｌから、ＴＮＦ−αの放出が、ＨＣＴ８との接触あり（特異的作用）に比べてより大きく減少した。また、ＨＣＴ８と接触する場合のＴＮＦ−αの絶対的に高い放出は、高められた副作用（全身性のサイトカインの放出）の兆候ではなく、抗原結合部位における特異的な免疫反応によって生じる。したがって、本発明に適合するように、副作用は、特異的な作用に比べて、より大きく減少する。
【００７９】
図１４〜１６は、腫瘍患者における、ＰＢＭＣからのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフである。実験的な試験（濃度、物質、および使用細胞）は、図１１〜１３に示される試験に対応する。同じサイトカインの放出が同様に測定された。これにより、健康な被験者の結果（図１１〜１３）が、腫瘍患者の結果（図１４〜１６）と比較され得る。同様に、グラフのｙ軸およびｘ軸は、図１１〜１３に対応する。また、ＨＣＴ８との接触なし（図１〜３；１１〜１３）でのＰＢＭＣの刺激は、抗原との結合に無関係な、サイトカインの非特異的な放出に対応する。各サイトカインの放出は、ＰＢＭＣによって全身的に行われる。ＨＣＴ８との接触ありでのＰＢＭＣの刺激は、抗原結合部位でのＰＢＭＣの直接的なそれぞれのサイトカインの放出に対応する。各サイトカインの放出は、ラストネーム付きの実験的な試験によって測定された。したがって、望ましくない副作用（全身性の放出）を構成せずに使用し得る抗体の特異的な（標的の）作用に対応する。各サイトカインは、この場合、特異的な免疫反応に直接的に関与する免疫細胞からのみ放出される。
【００８０】
図１４は、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の放出の結果を示す。抗体による刺激およびデキサメタゾンの投与の場合、ＩＬ−１０の放出は減少する。デキサメタゾンの濃度がより高まると、上記減少がより大きくなる。ＩＬ−１０の放出の減少は、ＨＣＴ８との同時刺激がない場合、より穏やかになる。また、ＨＣＴ８と接触する場合のサイトカインの絶対的に高い放出は、高められた副作用（全身性のサイトカインの放出）の兆候ではなく、抗原結合部位における特異的な免疫反応によって生じる。したがって、ＨＣＴとの接触なし（副作用）でのＩＬ−１０の放出は、ＨＣＴ８との接触あり（特異的作用）の場合に比べて、デキサメタゾンの濃度が上昇するに伴い、より大きく顕著に減少する。すなわち、とても強い特異的作用が存在している（抗原結合部位におけるサイトカインの放出）。
【００８１】
図１５は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出の結果を示す。図１４と同様に、抗体による刺激およびデキサメタゾンの投与の場合、ＩＬ−６の放出は減少する。デキサメタゾンの濃度がより高まると、上記減少がより大きくなる。ＩＬ−６の放出の急峻な減少は、ＨＣＴ８との同時刺激がない場合、より大きくなる。また、ＨＣＴ８と接触する場合のサイトカインの絶対的に高い放出は、高められた副作用（全身性のサイトカインの放出）の兆候ではなく、抗原結合部位における特異的な免疫反応によって生じる。したがって、ＨＣＴとの接触なし（副作用）でのＩＬ−６の放出は、本発明に適合するように、ＨＣＴ８との接触あり（特異的作用）の場合に比べて、デキサメタゾンの濃度が上昇するに伴い、より大きく顕著に減少する。すなわち、とても強い特異的作用が存在している（抗原結合部位におけるサイトカインの放出）。
【００８２】
図１６は、ＴＮＦ−αの放出の結果を示す。抗体による刺激およびデキサメタゾンの投与の場合、ＴＮＦ−αの放出は減少する。デキサメタゾンの濃度がより高まると、上記減少がより大きくなる。ＴＮＦ−αの放出の減少は、予測されるように、ＨＣＴ８との同時刺激がない場合、より大きくなる。また、ＨＣＴ８と接触する場合のサイトカインの絶対的に高い放出は、高められた副作用（全身性のサイトカインの放出）の兆候ではなく、抗原結合部位における特異的な免疫反応によって生じる。したがって、ＨＣＴとの接触なし（副作用）でのＴＮＦ−αの放出は、ＨＣＴ８との接触あり（特異的作用）の場合に比べて、デキサメタゾンの濃度が上昇するに伴い、より大きく顕著に減少する。すなわち、とても強い特異的作用が存在している（抗原結合部位におけるサイトカインの放出）。
【００８３】
一方では、健康な被験者を用い（図１１〜１３）、他方では腫瘍患者を用いた（図１４〜１６）抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の三官能性二重特異性抗体によりなされたサイトカインの放出の結果の考察において、健康な被験者に対する場合に対応する腫瘍患者の場合において、グルココルチコイドデキサメタゾンは、非特異的な全身性のサイトカインの放出（副作用；ＨＣＴ８との接触なし）に対して、特異的な作用（ＥｐＣＡＭおよびＣＤ−３に対する）よりも、本発明に適合するように、大きな効果を有していた。その結果として、本発明に適合するように、副作用は大幅に低減された。
【００８４】
図１７〜１８は、健康な被験者における、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍細胞（ＨＣＴ８）（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）なし、または存在下で、モノクローナルな単特異性抗体ハーセプチン（ＡＫ）（濃度１ｍｇ／ｍｌ）による刺激後の、ＰＢＭＣ（濃度１０６細胞／ｍｌ）からのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフである。ｙ軸には、各サイトカインのｐｇ／ｍｌでの濃度が示されており、ｘ軸には、ＰＢＭＣのそれぞれの刺激試験が示されている。添加されたデキサメタゾンのそれぞれの濃度は、μｇ／ｍｌで、”０．０１”、”０．１”および”１”と記載されている。刺激されていないＰＢＭＣの値がコントロールとして同様に示されている（”ＰＢＭＣ”）。
【００８５】
図１７は、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出の結果を示す。抗体による刺激およびデキサメタゾンの投与の場合、ＩＬ−６の放出は減少する。デキサメタゾンの濃度がより高まると、上記減少がより大きくなる。ＩＬ−６の放出の急激な減少は、ＨＣＴ８との同時刺激がない場合、さらに大きくなる。また、ＨＣＴ８と接触する場合のサイトカインの絶対的に高い放出は、高められた副作用（全身性のサイトカインの放出）の兆候ではなく、抗原結合部位における特異的な免疫反応によって生じる。したがって、ＨＣＴとの接触なし（副作用）でのＩＬ−６の放出は、ＨＣＴ８との接触あり（特異的作用）の場合に比べて、デキサメタゾンの濃度が上昇するに伴い、より大きく顕著に減少する。すなわち、とても強い特異的作用が存在している（抗原結合部位におけるサイトカインの放出）。
【００８６】
図１８は、ＴＮＦ−αの放出の結果を示す。抗体による刺激およびデキサメタゾンの投与の場合、ＴＮＦ−αの放出は減少する。デキサメタゾンの濃度がより高まると、上記減少がより大きくなる。ＴＮＦ−αの放出の急激な減少は、ＨＣＴ８との同時刺激がない場合、さらに大きくなる。また、ＨＣＴ８と接触する場合のサイトカインの絶対的に高い放出は、高められた副作用（全身性のサイトカインの放出）の兆候ではなく、抗原結合部位における特異的な免疫反応によって生じる。したがって、ＨＣＴとの接触なし（副作用）でのＴＮＦ−αの放出は、ＨＣＴ８との接触あり（特異的作用）の場合に比べて、デキサメタゾンの濃度が上昇するに伴い、より大きく顕著に減少する。すなわち、とても強い特異的作用が存在している（抗原結合部位におけるサイトカインの放出）。
【００８７】
さまざまな抗体によるＰＢＭＣの刺激における様々なサイトカインの放出の結果の考察において、
（ｉ）図１１〜１６の実験的試験：抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性二重特異性抗体による刺激；
（ｉｉ）図１７〜１８の実験的試験：単特異性モノクローナル抗体ハーセプチンによる刺激
上記両抗体は、それらの異なる作用機構にもかかわらず、さまざまなサイトカインの放出について、健康な披験者および腫瘍の患者の両方に対して、実質的に同様の効果を示したことに留意されたい。
【００８８】
図１９は、デキサメタソン（濃度０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、および１．０μｇ／ｍｌ）の同時投与の影響下での、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性二重特異性抗体を用いた１０６細胞／ｍｌでのＴ細胞活性化に関する測定結果を示すグラフである。ヘルパーＴ細胞上の表面マーカーＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ２５およびＣＤ３／ＣＤ８／ＨＬＡＤＲの測定が表されている。これに関し、ＣＤ３／ＣＤ３は、ヘルパーＴリンパ球を示し、ＣＤ２５との組合わせで、それらの細胞の活性マーカーとなる。ＣＤ３／ＣＤ８は細胞傷害性Ｔリンパ球を示し、ＨＬＡＤＲとの組合わせで、それらの細胞の活性マーカーとなる。ｙ軸は、活性マーカー（ＣＤ２５およびＨＬＡＤＲ）が発現しているＣＤ３／ＣＤ４（ヘルパーＴ細胞）およびＣＤ３／ＣＤ８（キラーＴ細胞）陽性Ｔリンパ球のパーセンテージ分画を示している。ｘ軸は、それぞれのＰＢＭＣ刺激試験を、ＨＣＴ８標的細胞（５×１０４細胞／ｍｌ）との接触を伴うか否か、デキサメタゾンのさまざまな濃度での投与を伴うか否かとともに、左半分のコラムには、ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ２５の測定に関して、右半分のコラムには、ＣＤ３／ＣＤ８／ＨＬＡＤＲの測定に関して、示されている。上記測定はＦＡＣＳ解析により行われた。図１９の下表には、それぞれの刺激試験の測定値（パーセンテージ）が記載されている。ＨＣＴ８標的細胞との接触を受けた三官能性二重特異性による刺激（この刺激は、標的抗原と結合した特異的な刺激に対応する）の場合、デキサメタゾンは、Ｔ細胞活性化に影響しないことが認識される。これは、図１９の下表における変化しない高い値により立証される。
【００８９】
下記の実施例は、本発明を制限することなく、さらに詳述するものである。
【００９０】
（実施例１）
（末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の抽出）
フィコール（比重１．０６８ｇ／ｃｍ３）上での遠心分離により、健康なボランティアの末梢血から単核球を抽出した。この目的のために、ヘパリン処理された静脈血を、フィコール上に層形成して、２０００ｒｐｍで２０分間の遠心分離を行った。遠心分離後、フィコール層の上にある単核球の層をピペットで回収し、ＰＢＳで洗浄した。
【００９１】
（ＰＢＭＣの刺激）
刺激を行うために、上記ＰＢＭＣが１×１０６／ｍｌ濃度で用いられた。ＰＢＭＣの上記刺激は、特異性が抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３で１００μｇ／ｍｌ濃度の、または特異性が抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ３で１ｍｇ／ｍｌ濃度の、インタクトな三官能性二重特異性抗体(trifunctional bispecific antibody)を用いてなされた。上記刺激は、３７℃で２４時間行われた。上記刺激は、それぞれのサンプルについて、腫瘍細胞が存在しない状態、または１ｍｌ当たり５×１０４のＨＣＴ８腫瘍細胞（ＡＴＣＣ由来；ＥｐＣＡＭ陽性）の存在下で行った。合成グルココルチコイドのデキサメサソン（Ｊｅｎａｐｈａｒｍより取得）について、グルココルチコイドなしでの刺激試験、ならびに、グルココルチコイドを０．０１、０．１、１および１０μｇ／ｍｌ用いた試験が行われた。
【００９２】
（サイトカインの定量）
上記刺激後、上清中のサイトカインＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、およびＩＦＮ−γ濃度の定量が、２４穴プレート上においてＥＬＩＳＡ法によって各々測定された。各々に対して、測定を２回行った。ＥＬＩＳＡ法は、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍ製造のスタンダードキットを用いて、取扱説明書通りに行った。
【００９３】
（結果）
（ＩＬ−６の放出）
ＩＬ−６は、免疫反応が生じると直接的に免疫学的エフェクター細胞及び抗原提示細胞から分泌されるサイトカインである。血清中におけるサイトカインとしてのＩＬ−６の臨床的意義は、炎症または免疫反応が生じた後、数時間分泌され、また、該免疫反応の程度と、その分泌量とには関連性がある。本実施例において、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞（ＨＣＴ８）を接触させ、同時に０．０１〜１０μｇ／ｍｌのデキサメサソンを添加した場合、図１Ｂに示すように、上清内に、５０００ｐｇ／ｍｌを上回る量のＩＬ−６の放出が確認された。この放出は、ＥｐＣＡＭ特異的抗体の免疫反応に関係するとともに、所望の免疫反応を示すものである。このようなＩＬ−６の多量放出は、特異的な抗原抗体反応に直接的に寄与したわずかな免疫細胞によるものである。
【００９４】
対照として、抗体をＨＣＴ８腫瘍細胞と接触させなかった場合のＰＢＭＣの刺激をみてみると、９０００ｐｇ／ｍｌを上回る量のＩＬ−６の放出が認められた（図１Ａ）。この放出は、所望の特異的反応とは無関係な多数のＰＢＭＣによる、全身的な免疫促進抗体の臨床的応用の場合に生じるものである。この全身的なＩＬ−６の放出により、体内に非常に多量のＩＬ−６が生成されることになり、結局、ＳＩＲＳにも至る副作用をもたらすことになる。
【００９５】
本発明は、グルココルチコイド（本実施例ではデキサメサソン）と抗体との組み合わせにより、デキサメサソンが、免疫刺激性の抗体に起因する、臨床的な副作用を引き起こす非特異的放出ＩＬ−６を、完全に抑制することを見出した。また、同時に、本発明によれば、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞を用いた刺激後にみられ、ひいては免疫刺激性の抗体の所望の特異的反応と関連する、ＩＬ−６の放出を維持することができる。
【００９６】
（ＴＮＦ−αの放出）
ＴＮＦ−αは、標的細胞（ここではＨＣＴ８腫瘍細胞）の免疫的破壊が起きた場合に免疫学的エフェクター細胞（ここではＰＢＭＣ）によって分泌されるＴＨ１サイトカインである。腫瘍細胞を用いない場合の非特異的刺激と比較すれば、本実施例の場合は、特定の抗原（ＥｐＣＡＭ）を有した腫瘍細胞の存在下において三官能性二重特異性抗体によって刺激した後に測定したところ、ＴＮＦ−α量がおおよそ３倍増加した（図２Ａ及び図２Ｂ）。ＴＮＦ−α濃度における上記した明確な増加は、腫瘍細胞の免疫的破壊の過程における、ＰＢＭＣによる、腫瘍細胞依存性の放出に起因している。仮に、本発明に沿って、三官能性二重特異性抗体がグルココルチコイド（本実施例ではデキサメサソン）と組み合わされたら、非特異的な影響によるＴＮＦ−α放出を低減させることができ、もし、グルココルチコイド濃度が比較的高ければ、ＴＮＦ−α放出を完全に抑制することができる。このように、本発明によれば、グルココルチコイドを用いることにより、ＴＮＦ−αの非特異的放出に起因する臨床的な副作用を大幅に抑制もしくは完全に無くすことが可能となる。サイトカインの非特異的放出と比較すれば、デキサメサソンを添加することによって、抗原依存の、標的細胞特異的なＴＮＦ−αの放出は、完全が維持することが可能となる。
【００９７】
（ＩＦＮ−γの放出）
ＩＦＮ−γもまた、ＴＨ１サイトカインである。更には、ＩＦＮ−γは、抗原に対しての刺激後の活性化された特異的Ｔリンパ球によって分泌されるものであり、Ｔ細胞介在型の抗原特異的な標的細胞破壊のためのマーカーとして用いられる。従って、ＩＦＮ−γは、ＨＣＴ８標的細胞の非存在下での三官能性二重特異性抗体を用いたＰＢＭＣの刺激後に分泌されるわけではない。なぜなら、この場合は非特異的な刺激のみが起こり、抗原に対して直接的なものではないからである（図３Ａ）。ＨＣＴ８細胞の存在下での刺激の過程では、抗体による、ＥｐＣＡＭに対する刺激によって、ＩＦＮ−γの有意な放出がみられた。本実施例では、グルココルチコイド濃度が１μｇ／ｍｌを下回っている場合は、この標的細胞に特異的なＩＦＮ−γ放出が、実質的に維持される。
【００９８】
（実施例２）
抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の三官能性二重特異性抗体を用いて刺激を行うＴ細胞活性化におけるグルココルチコイドの影響を調べるために、実施例１で説明した刺激実験を行った。そして、Ｔ細胞特異的活性マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、ＨＬＡ−ＤＲをそれぞれ、ＣＤ３＋／ＣＤ４＋、ＣＤ３＋／ＣＤ８＋、Ｔリンパ球の場合に用いて測定した。
【００９９】
（ＦＡＣＳ解析）
ＦＡＣＳ解析は、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製のＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒを用いることによって行った。必須特異性であるＦＩＴＣ−、ＰＥ−、ＡＰＣ−標識化抗体によって適切に刺激されたＰＢＭＣは、標識化される。
【０１００】
（結果）
図４Ａ〜図４Ｅからわかるように、二重特異性の三官能性抗体による刺激の場合は、グルココルチコイドであるデキサメサソンによる、Ｔ細胞の活性化への影響は無いと言える。
【０１０１】
（実施例３）
次に、Ｔ細胞毒性に関するグルココルチコイドの影響について、細胞傷害性試験を用いて調べた。ＰＢＭＣ抽出物およびそれらの刺激されたものを用いて、実施例１で説明した試験が行われた。
【０１０２】
（細胞傷害性試験）
ＣＥＣＦ−ＡＭ色素を使用した蛍光テストによって、細胞傷害性を調べた。テストは、Kolber et al. (1988) J.Immunol.Meth. 108:255-264に記載の２時間リリース術を用いて行った。
【０１０３】
（結果）
図５Ａ及び図５Ｂからわかるように、三官能性二重特異性抗体によって生じる、刺激されたＰＢＭＣの細胞傷害性に関するデキサメサソンの影響は、以下のようにまとめることができる。デキサメサソンが０．０１ｍｇ／ｍｌである場合は、促進ＰＢＭＣの細胞傷害性に関して、デキサメサソンの影響は無いといえる。刺激中にＨＣＴ８腫瘍細胞が有るか無いかに関わらず、濃度０．１μｇ／ｍｌから細胞傷害性の顕著な低下がみられた。ＨＣＴ８存在下での刺激の場合は、効果細胞と標的細胞とが４０：１で、デキサメサソンの濃度が０．１μg／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌであると、細胞毒性の割合は、高いレベルで一定に維持される。ＰＢＭＣの刺激中に標的細胞が存在しない場合は、デキサメサソンの濃度に応じて、細胞傷害性の割合は更に減少する。
【０１０４】
実施例１〜３のインビトロデータによれば、次のようにまとめることができる。それは、グルココルチコイドと免疫刺激性の抗体との組み合わせを通じて、所望の抗原特異的免疫反応（実施例１）や、Ｔ細胞活性化（実施例２）や、刺激された細胞の細胞傷害性（実施例３）を低減させることなく、サイトカインの非特異的な放出を低減させることができる。デキサメサソンの濃度が０．１μｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌの間では、非特異的な放出を大幅に削減、もしくは完全に無くすことができる。比較として、このデキサメサソンの濃度範囲内での、インビトロの、腫瘍細胞抗原ＥｐＣＡＭに対する直接的な免疫活性は、大きくは影響しない。
【０１０５】
（実施例４）
胃癌（腹膜癌症；ｐＴ３  ｐＮ２  Ｍ１）の患者（４６歳男性）に対して、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の三官能性二重特異性抗体と、グルココルチコイドとを用いた本発明の免疫治療を施した。治療は、西暦２０００年の胃切除術後、腫瘍に対して行われた数々の効果の無い化学治療の後に行われた。患者は、腹水の症状を示していた。腹水内の腫瘍細胞の検査を行った結果、強いＥｐＣＡＭ発現（ＥｐＣＡＭ＋＋＋）が得られた。抗体は腹腔内(i.p.)に投与され、毎回、６時間から１０時間かけて投与された。
【０１０６】
まず、治療の初期では、抗体を、グルココルチコイドと組み合わせることなく、比較的少量、患者に投与した。これらの２つの単独療法実験後、抗体の量を明らかに増やして、これと同時にデキサメサソンを投与した。下記の表は、治療の経過をまとめたものであり、副作用についても示している。
【０１０７】
【表１】
2008539177.tif 000002
【０１０８】
表１からわかるように、免疫促進抗体を用いた単独治療の過程において１０ｍｇ〜３０ｍｇの量の場合は、患者は強い副作用に悩まされた。具体的には、嘔吐、腹痛、倦怠感、高熱である。しかしながら、抗体が、デキサメサソンと共に用いられた場合は、その量を５００ｍｇ腹腔内に増やしても、発熱や他の副作用は現れなかった。また、免疫的検査パラメータは、腫瘍細胞に特異的で直接的な抗体の強い免疫促進反応を示していた（図６）。本発明に係る組み合わせ治療下においては、肝臓の値及び膵臓の値に特に目立ったものはなかった（図７）。本発明に係る治療を終えた後、腹水内から悪性腫瘍細胞を完全に消滅させることができた。
【０１０９】
（実施例５）
次に、腺癌（シグマｐＴ３  ｐＮ２  Ｍ１）で、汎発性の肝転移(diffuse hepatic metastasis)である女性患者（６８歳）に対して、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の三官能性二重特異性抗体と、グルココルチコイドのデキサメサソンとを用いた免疫治療を施した。肝転移細胞の８０％がＥｐＣＡＭ陽性であった。本発明の治療の過程で、抗体の投与は、組織（本実施例の場合は肝臓内）へ選択的に投与することができたり、または（肝臓への散布の後）全身に投与できる一例である肝動脈（A. hepatica dextra）を経由した選択的なカテーテルを経由して行われた。デキサメサソンの投与は、免疫促進抗体の投与に先駆けて、前投与として行われた。
【０１１０】
上記した治療過程について、表２にまとめた。
【０１１１】
【表２】
2008539177.tif 000003
【０１１２】
本発明のように、三官能性二重特異性抗体とグルココルチコイドとを組み合わせることによって、一時的に発熱があった。しかしながら、最高温度から遅くとも１０時間以内で平熱に戻った。治療の間に、抗体の量を４０倍（１μｇから４０μｇ）も増やしたにもかかわらず、量を増やしたことに対する免疫促進抗体の副作用の増大はみられず、これは、デキサメサソンの投与によるものであるといえる。デキサメサソンの投与による抗体の免疫促進反応への目立った悪影響はなかった。これは、全身を介した可溶性ＩＬ−２レセプターや、ＴＮＦレセプターｐ５５・ｐ７５の上昇によって実証されている（図８）。比較として、抗体に対して、デキサメサソンの量を４０倍にしても、目立った副作用はみられなかった。このことは、膵臓や肝臓に特異的な検査パラメータによっても確認された。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１Ａ】ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）を用いずに刺激を行った後における、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（濃度１０６細胞／ｍｌ）によるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出を示すグラフである。
【図１Ｂ】ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）を用いて刺激を行った後における、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（濃度１０６細胞／ｍｌ）によるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出を示すグラフである。
【図１Ｃ】ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）を用いて刺激を行った後、およびＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）を用いずに刺激を行った後における、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）（濃度１０６細胞／ｍｌ）によるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出を示すグラフである。
【図２Ａ】ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞と接触させずに刺激を行った後における、ＰＢＭＣからのＴＮＦ−αの放出を示している。
【図２Ｂ】ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞と接触させた抗体を用いて刺激を行った後における、ＰＢＭＣからのＴＮＦ−αの放出を示している。
【図２Ｃ】ＨＣＴ８標的細胞を用いずに刺激を行った後におけるＴＮＦ−αの放出（それぞれ左側のバー）と、ＨＣＴ８標的細胞を用いて刺激を行った後におけるＴＮＦ−αの放出（それぞれ右側のバー）とのパーセンテージ比較を示している。
【図３Ａ】標的細胞（ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞）と接触させていない二重特異性抗体（抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３）を用いて刺激を行った後におけるＰＢＭＣからのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の放出を示している。
【図３Ｂ】ＥｐＣＡＭ陽性癌細胞（ＨＣＴ８）と接触させた抗体を用いて刺激を行った後における、ＰＢＭＣからのＩＦＮ−γの放出を示している。
【図３Ｃ】ＨＣＴ８標的細胞と接触させた抗体を用いて刺激を行った後におけるサイトカインの放出（ここではＩＦＮ−γ）と、ＨＣＴ８標的細胞と接触させていない抗体を用いて刺激を行った後におけるサイトカインの放出とのパーセンテージ比較を示している。
【図４Ａ】濃度０．０１、０．１、１および１μｇ／ｍｌのデキサメタソンの同時投与の影響下での、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性二重特異性抗体（濃度１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）によるＴ細胞活性化に関する実験の結果を示したグラフである。
【図４Ｂ】濃度０．０１、０．１、１および１μｇ／ｍｌのデキサメタソンの同時投与の影響下での、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性二重特異性抗体（濃度１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）によるＴ細胞活性化に関する実験の結果を示したグラフである。
【図４Ｃ】濃度０．０１、０．１、１および１μｇ／ｍｌのデキサメタソンの同時投与の影響下での、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性二重特異性抗体（濃度１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）によるＴ細胞活性化に関する実験の結果を示したグラフである。
【図４Ｄ】濃度０．０１、０．１、１および１μｇ／ｍｌのデキサメタソンの同時投与の影響下での、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性二重特異性抗体（濃度１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）によるＴ細胞活性化に関する実験の結果を示したグラフである。
【図４Ｅ】濃度０．０１、０．１、１および１μｇ／ｍｌのデキサメタソンの同時投与の影響下での、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性二重特異性抗体（濃度１０６ｃｅｌｌｓ／ｍｌ）によるＴ細胞活性化に関する実験の結果を示したグラフである。
【図５Ａ】特異的な細胞傷害性のパーセンテージにおける濃度０．０１ｍｇ／ｍｌのデキサメタソンの影響を示している。
【図５Ｂ】濃度０．１μｇ／ｍｌのデキサメタソンの影響に関する対応する測定の結果を示している。
【図５Ｃ】濃度１μｇ／ｍｌのデキサメタソンを用いた比較測定の結果を示している。
【図５Ｄ】濃度１０μｇ／ｍｌのデキサメタソンの場合の対応する測定の結果を示している。
【図６Ａ】白血球濃度（ｇ／ｌ）（黒いひし形）および血清ＣＲＰ濃度（ｍｇ／ｄｌ）（黒い四角形）の曲線を示す図である。
【図６Ｂ】特異の血球数中におけるリンパ球の割合比の曲線を示す図である。
【図６Ｃ】ＩＬ−２受容体の血清濃度の曲線を示している。
【図６Ｄ】胃癌の患者において測定した血清中ＴＮＦ−α濃度（ｐｇ／ｍｌ）の曲線を示している。
【図６Ｅ】治療をｘ軸にプロットした場合の胃癌患者の血清中ＩＬ−６濃度（ｐｇ／ｍｌ）の曲線を示している。
【図７Ａ】すい臓特異性酵素であるα−アミラーゼ（黒いひし形）およびリパーゼ（黒い四角形）の血清濃度（Ｕ／ｌ）曲線を示している。
【図７Ｂ】胃癌患者の治療の下での肝臓特異性酵素であるアルカリ性ホスファターゼ（ＡＰ；黒いひし形）、γ−グルタミル転移酵素（γ−ＧＴ；黒い四角形）、グルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ（ＧＯＴ；黒い三角形）、およびグルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ（ＧＰＴ；ｘ）の血清濃度（Ｕ／ｌ）に対応する曲線である。
【図７Ｃ】胃癌患者の治療の過程における作用としてさらなる肝臓パラメータであるビリルビンの合計濃度（ｍｇ／ｄｌ）を示す図である。
【図８Ａ】白血球数およびＣＲＰ血清濃度の曲線を示している。
【図８Ｂ】治療過程の作用における特異の血球数中のリンパ球の割合比を示している。
【図８Ｃ】ＩＬ−２受容体濃度の曲線である。
【図８Ｄ】ＴＮＦ受容体ｐ７５およびＴＮＦ受容体ｐ５５をプロットしたものである。
【図８Ｅ】本発明に係る組み合わせ治療の下でのＩＬ−６濃度の曲線を示している。
【図９Ａ】すい臓特異性酵素であるα−アミラーゼおよびリパーゼの血清濃度（Ｕ／ｌ）曲線を再度示している。
【図９Ｂ】肝臓特異性酵素であるＡＰ、γ−ＧＴ、ＧＯＴ、およびＧＰＴ（同様にＵ／ｌ）に一致するプロットを示している。
【図９Ｃ】治療過程の作用およびさらなる肝臓特異性実験パラメータが示されている。
【図１０Ａ】細胞傷害性試験における、蛍光標識されたＨＣＴ８腫瘍細胞を用いた特異的な細胞傷害性のパーセンテージの測定の結果を表すグラフを示し、３人の健康な被験者それぞれに対して行われた測定結果の平均値を表す。なお、濃度１０ｎｇ／ｍｌの抗体の場合の対応する測定の結果を示す。
【図１０Ｂ】細胞傷害性試験における、蛍光標識されたＨＣＴ８腫瘍細胞を用いた特異的な細胞傷害性のパーセンテージの測定の結果を表すグラフを示し、３人の健康な被験者それぞれに対して行われた測定結果の平均値を表す。なお、濃度１００ｎｇ／ｍｌの抗体の場合の測定結果を示す。
【図１０Ｃ】細胞傷害性試験における、蛍光標識されたＨＣＴ８腫瘍細胞を用いた特異的な細胞傷害性のパーセンテージの測定の結果を表すグラフを示し、３人の健康な被験者それぞれに対して行われた測定結果の平均値を表す。なお、濃度１０００ｎｇ／ｍｌの抗体の場合の対応する測定結果を示す。
【図１０Ｄ】細胞傷害性試験における、蛍光標識されたＨＣＴ８腫瘍細胞を用いた特異的な細胞傷害性のパーセンテージの測定の結果を表すグラフを示し、６人の胃癌患者それぞれに対して行われた測定結果の平均値を表す。なお、濃度１００ｎｇ／ｍｌの抗体の場合に対応する測定結果を示す。
【図１１】健康な被験者における、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞（ＨＣＴ８）（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）なし、または存在下で、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性の三官能性二重特異性抗体（ＡＫ）（濃度１ｍｇ／ｍｌ）による刺激後の、ＰＢＭＣ（濃度１０６細胞／ｍｌ）からのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフであり、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の放出の結果を示す。
【図１２】健康な被験者における、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞（ＨＣＴ８）（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）なし、または存在下で、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性の三官能性二重特異性抗体（ＡＫ）（濃度１ｍｇ／ｍｌ）による刺激後の、ＰＢＭＣ（濃度１０６細胞／ｍｌ）からのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフであり、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出の結果を示す。
【図１３】健康な被験者における、ＥｐＣＡＭ陽性腫瘍細胞（ＨＣＴ８）（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）なし、または存在下で、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性の三官能性二重特異性抗体（ＡＫ）（濃度１ｍｇ／ｍｌ）による刺激後の、ＰＢＭＣ（濃度１０６細胞／ｍｌ）からのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフであり、ＴＮＦ−αの放出の結果を示す。
【図１４】腫瘍患者における、ＰＢＭＣからのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフであり、インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）の放出の結果を示す。
【図１５】腫瘍患者における、ＰＢＭＣからのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフであり、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出の結果を示す。
【図１６】腫瘍患者における、ＰＢＭＣからのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフであり、ＴＮＦ−αの放出の結果を示す。
【図１７】健康な被験者における、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍細胞（ＨＣＴ８）（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）なし、または存在下で、モノクローナルな単特異性抗体ハーセプチン（ＡＫ）（濃度１ｍｇ／ｍｌ）による刺激後の、ＰＢＭＣ（濃度１０６細胞／ｍｌ）からのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフであり、インターロイキン−６（ＩＬ−６）の放出の結果を示す。
【図１８】健康な被験者における、ＨＥＲ２／ｎｅｕ陽性腫瘍細胞（ＨＣＴ８）（濃度５×１０４細胞／ｍｌ）なし、または存在下で、モノクローナルな単特異性抗体ハーセプチン（ＡＫ）（濃度１ｍｇ／ｍｌ）による刺激後の、ＰＢＭＣ（濃度１０６細胞／ｍｌ）からのさまざまなサイトカインの放出の結果を示すグラフであり、ＴＮＦ−αの放出の結果を示す。
【図１９】デキサメタソン（濃度０．０１μｇ／ｍｌ、０．１μｇ／ｍｌ、および１．０μｇ／ｍｌ）の同時投与の影響下での、抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性二重特異性抗体を用いた１０６細胞／ｍｌでのＴ細胞活性化に関する測定結果を示すグラフである。
【図１Ａ】
2008539177.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
2008539177.tif 000006
【図２Ａ】
2008539177.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
2008539177.tif 000009
【図３Ａ】
2008539177.tif 000010
【図３Ｂ】
2008539177.tif 000011
【図３Ｃ】
2008539177.tif 000012
【図４Ａ】
2008539177.tif 000013
【図４Ｂ】
2008539177.tif 000014
【図４Ｃ】
2008539177.tif 000015
【図４Ｄ】
2008539177.tif 000016
【図４Ｅ】
2008539177.tif 000017
【図５Ａ】
2008539177.tif 000018
【図５Ｂ】
2008539177.tif 000019
【図５Ｃ】
2008539177.tif 000020
【図５Ｄ】
2008539177.tif 000021
【図６Ａ】
2008539177.tif 000022
【図６Ｂ】
2008539177.tif 000023
【図６Ｃ】
2008539177.tif 000024
【図６Ｄ】
2008539177.tif 000025
【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
2008539177.tif 000027
【図７Ｂ】
2008539177.tif 000028
【図７Ｃ】
2008539177.tif 000029
【図８Ａ】
2008539177.tif 000030
【図８Ｂ】
2008539177.tif 000031
【図８Ｃ】
2008539177.tif 000032
【図８Ｄ】
2008539177.tif 000033
【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
2008539177.tif 000035
【図９Ｂ】
2008539177.tif 000036
【図９Ｃ】
2008539177.tif 000037
【図１０Ａ】
2008539177.tif 000038
【図１０Ｂ】
2008539177.tif 000039
【図１０Ｃ】
2008539177.tif 000040
【図１０Ｄ】
2008539177.tif 000041
【図１１】
2008539177.tif 000042
【図１２】
2008539177.tif 000043
【図１３】
2008539177.tif 000044
【図１４】
2008539177.tif 000045
【図１５】
2008539177.tif 000046
【図１６】
2008539177.tif 000047
【図１７】
2008539177.tif 000048
【図１８】
2008539177.tif 000049
【図１９】
2008539177.tif 000050
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月26日(2007.2.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一またはそれ以上の免疫刺激性の三官能性の二重特異性抗体（ｔｒＡＢ）を用いた癌性の疾患および腫瘍性の疾患からなる群より選択される疾患の治療における非特異的なサイトカインの放出を低減させるための薬剤を製造するための、一またはそれ以上のグルココルチコイドの使用。
【請求項２】
上記グルココルチコイドが合成グルココルチコイドであることを特徴とする請求項１に記載の使用。
【請求項３】
上記合成グルココルチコイドが、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、酢酸コリチゾン、プレドニリデン、デフラザコート、クロプレドノール、フルオコルトロン、およびブデノシドからなる群より選択されることを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
上記癌性の疾患が胃癌、腺癌、悪性黒色腫、結腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、肝細胞癌、全組織型の気管支癌、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、および消化器間質腫瘍（ＧＩＳＴ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
上記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および／またはヒト化抗体であることを特徴とする請求項１〜４の何れか一項に記載の使用。
【請求項６】
上記抗体は、個々が、腫瘍抗原およびＣＤマーカーに対して少なくとも一の特異性を示すことを特徴とする請求項１〜５の何れか一項に記載の使用。
【請求項７】
上記ＣＤマーカーがＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２８およびＣＤ４４からなる群より選択されることを特徴とする請求項６に記載の使用。
【請求項８】
上記腫瘍抗原が、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｎｅｕ、Ｇ２５０、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ、ＶＥＧＦ、ＧＤ３、ＥＧＦＲ、αＶβ３−インテグリン、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＡＳＣ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ５２、ｃ−ｅｒｂ−２、ＣＡＬＬＡ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１１７、ｐ９７、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、Ｃ２１５、９．２．２７抗体の抗原、ＮＥ１５０抗体の抗原、およびＣＡ１２５抗体の抗原からなる群より選択されることを特徴とする請求項６または７に記載の使用。
【請求項９】
上記抗体が抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３、または抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性の抗体であることを特徴とする請求項６〜８の何れか一項に記載の使用。
【請求項１０】
上記抗体および／または上記グルココルチコイドが、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腫瘍内、または所定の組織に選択的に投与されることを特徴とする請求項１〜９の何れか一項に記載の使用。
【請求項１１】
上記所定の組織への選択的な投与が、組織の供給血管へのカテーテルを介して行われることを特徴とする請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
肝臓への上記投与が、肝動脈へのカテーテルを介して行われることを特徴とする請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
上記グルココルチコイドおよび上記抗体が同時に投与されることを特徴とする請求項１〜１２の何れか一項に記載の使用。
【請求項１４】
少なくとも一の免疫刺激性の三官能性の二重特異性抗体と、
少なくとも一のグルココルチコイドと、
任意に一またはそれ以上の薬学的に適合可能な担体および／または補助薬を含んでいる、薬学的組成物。
【請求項１５】
上記グルココルチコイドが合成グルココルチコイドであることを特徴とする請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
上記合成グルココルチコイドが、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、ベタメタゾン、デキサメタゾン、酢酸コリチゾン、プレドニリデン、デフラザコート、クロプレドノール、フルオコルトロン、およびブデノシドからなる群より選択されることを特徴とする請求項１５に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
上記抗体が、モノクローナル抗体、キメラ抗体、および／またはヒト化抗体であることを特徴とする請求項１４〜１６の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
上記抗体は、個々が、腫瘍抗原およびＣＤマーカーに対して少なくとも一の特異性を示すことを特徴とする請求項１４〜１７の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
上記ＣＤマーカーがＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ２８およびＣＤ４４からなる群より選択されることを特徴とする請求項１８に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
上記腫瘍抗原が、ＥｐＣＡＭ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３／ｎｅｕ、Ｇ２５０、ＣＥＡ、ＭＡＧＥ、ＶＥＧＦ、ＧＤ３、ＥＧＦＲ、αＶβ３−インテグリン、ＨＬＡ、ＨＬＡ−ＤＲ、ＡＳＣ、ＣＤ１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３３、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ５２、ｃ−ｅｒｂ−２、ＣＡＬＬＡ、ＭＨＣＩＩ、ＣＤ４４ｖ３、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ１１７、ｐ９７、ガングリオシドＧＤ２、ＧＤ３、Ｃ２１５、９．２．２７抗体の抗原、ＮＥ１５０抗体の抗原、およびＣＡ１２５抗体の抗原からなる群より選択されることを特徴とする請求項１８または１９に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
上記抗体が抗ＥｐＣＡＭ×抗ＣＤ３、または抗ＨＥＲ２／ｎｅｕ×抗ＣＤ３の特異性を有する三官能性の抗体であることを特徴とする請求項１８〜２０の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
上記疾患が癌性の疾患および腫瘍性の疾患からなる群より選択されることを特徴とする請求項１４〜２１の何れか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
上記癌性の疾患が胃癌、腺癌、悪性黒色腫、結腸癌、膵癌、卵巣癌、子宮癌、肝細胞癌、全組織型の気管支癌、リンパ腫、肉腫、芽細胞腫、および消化器間質腫瘍（ＧＩＳＴ）からなる群より選択されることを特徴とする請求項２２に記載の薬学的組成物。
【国際調査報告】
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