(57)【要約】  ペプチドの固相合成のための新規の方法が開示される。当該方法は、αヘリックス二次構造成分を形成する強い傾向を有するペプチドまたはペプチドセグメントに特に有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチドを製造する方法であって、個々に保護されたおよび／または保護されていないアミノ酸側鎖を有してよい前記ペプチドが、両親媒性ＰＥＧ樹脂である固相に結合されて作製され、および、ここにおいて前記ペプチドが、少なくとも４つの保護されたまたは保護されていないヘリックス形成アミノ酸残基を含む一連の６つの隣接したアミノ酸残基から成る、プロリンを含まないヘリックス形成セグメントを含むことを特徴とするペプチドを製造する方法。
【請求項２】
前記ＰＥＧ樹脂の充填容量が少なくとも０．５ ｍｍｏｌ／ｇであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｆｍｏｃ合成であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ヘリックス形成セグメントが、少なくとも１０、より好ましくは少なくとも１２残基長であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、官能基のリンカーまたはハンドルを介して前記固相につなげられることを特徴とする請求項１から請求項４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記リンカーがアミド産生リンカー、好ましくはＳｉｅｂｅｒまたはＲｉｎｋアミドリンカーであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＥＧ樹脂が、アミノ−アルキル官能化ＰＥＧ樹脂であって、そのアミノ官能基に前記ペプチドが結合して、Ｃα−末端ペプチジル−カルボキサミドを形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記樹脂が、ポリスチレン−ＰＥＧの混合またはコポリマーまたはブロックコポリマーではないＰＥＧ樹脂であり、好ましくは前記樹脂が実質的に純粋なＰＥＧ樹脂であることを特徴とする請求項２または請求項５に記載の方法。
【請求項９】
請求項１による、ペプチド−ＰＥＧ樹脂コンジュゲート。
【請求項１０】
前記ペプチド成分が、Ｒ１−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列を有し、ここにおいてＲ１が、Ｈ、アセチル−または除去可能な保護基であって、最も好ましくはＲ１がアセチルであり、および、ここにおいて個々のアミノ酸が、さらに側鎖保護基を含んでよいことを特徴とする請求項９に記載のペプチド−ＰＥＧ樹脂コンジュゲート。
【請求項１１】
前記ペプチドが、アミノ酸配列Ｒ１−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅであり、ここにおいてＲ１が、Ｈ、アセチル−または除去可能な保護基であって、および、ここにおいてさらに前記ペプチドが樹脂から切断され脱保護されることを特徴とする請求項１または請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
前記切断が１段階の切断および脱保護であることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本発明は、固相上にて特定のタイプのペプチドを合成する方法、および各々のペプチド固相コンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）に関する。
【０００２】
ＨＩＶ感染といった幅広いヒトウイルス性疾病の阻害剤として作用する、優良なペプチド薬剤は、Ｔ−２０（ＤＰ−１７８とも呼ばれる）であり、これは、Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２で表される。このペプチド配列は、α−ヘリックス状の融合（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）配列セグメント、いわゆる「７アミノ酸繰り返し（ｈｅｐｔａｄ ｒｅｐｅａｔ）」から取得され、これは、ＨＩＶ−１由来の膜貫通受容体タンパク質ｇｐ４１のアミノ酸６３８−６７３に相当する。ｇｐ４１は、細胞のウイルス感染の仲介に重要である。
【０００３】
従って、大きなスケールでの効率的な生成方法が必要であるが、今までに、固相におけるＴ−２０のセグメントの部分的な合成の組み合わせ、続く、典型的に液相におけるセグメントの濃縮によってのみでしか達成されていない（ＷＯ ９９／４８５１３参照）。固相における効率的な全長合成はこれまでに実証されておらず、そのような方法は、典型的に、適切な生成物を無駄な副産物より多く生成することができず、不純物の精製にはさらなる問題が生じ、いっそう最終的な収量が減少してしまっていた。
【０００４】
Ｔａｍ， Ｊ．ら（Ｄｅｐ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ； Ｏｒｇａｎｉｃ Ｌｅｔｔｅｒｓ ，２００２， Ｖｏｌ．４： ４１６７−４１７０）は、特に、３つのヘリックスの束（ｔｈｒｅｅ−ｈｅｌｉｘ ｂｕｎｄｌｅｓ）を作製する目的で、ＤＰ−１７８および関係する３０−ｍｅｒのペプチドの作製について記載している。著者らはただ、カップリング剤および樹脂切断（ｒｅｓｉｎ ｃｌｅａｖａｇｅ）の条件を使用して、一般的なＦＭＯＣ合成方法を適用したことを述べている。用いた樹脂のタイプおよび／または樹脂ハンドル（ｒｅｓｉｎ ｈａｎｄｌｅ）、ならびに使用する薬剤の過剰量について何も記載されていない。クロマトグラムは示されておらず、精製の詳細または最終的な精製度も示されていない。得られた収率の表示もなく、結果に対して疑いを残している。研究は、研究室のスケールでの実験にのみ適したものであったため、効率的な合成工程を発明する明らかな必要性は検討されていなかった。
【０００５】
本発明の目的は、そのようなα−ヘリックス状タンパク質および特にＴ−２０の、改良され効率的な合成方法を発明することである。この目的は、本発明による方法によって解決される。
【０００６】
本発明によるペプチドの作製のための方法によると、これは、当該ペプチド（保護されたおよび／または保護されていないアミノ酸側鎖を有してよい）を、固相に結合させる工程を含み、前記固相は、両親媒性ＰＥＧ樹脂であり、前記ペプチドは、プロリンを含まないヘリックス形成セグメント（ｈｅｌｉｘ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｓｅｇｍｅｎｔ）を含み、前記ヘリックス形成セグメントは、少なくとも４つの保護されたまたは保護されていないヘリックス形成アミノ酸残基を含む一連の６つの隣接したアミノ酸残基から成る。
【０００７】
図１には、ＨＰＬＣクロマトグラムが示されており、この方法で合成した生成物から得られた不純物が低レベルであり、高い収率での合成が可能であることが示されている。ＰＥＧ樹脂は、種々の会社から提供されており、例えば、カナダ、ケベックのＭａｔｒｉｘ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．（「ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ」ブランド）、またはデンマークのＶｅｒｓａｍａｔｒｉｘ Ａ．Ｓ．から提供されている。そのような樹脂は、例えばＵＳ２００３０７８３７２ Ａ１に記載されており、ＰＥＧ樹脂の好ましいタイプに関しては、ＷＯ ０２／４０５５９に記載されている。ペプチドの結合のために、そのようなＰＥＧ樹脂は、末端の「本来的な（ｎａｔｉｖｅ）」ヒドロキシメチル遊離基、または、例えば、それから誘導される「半本来的な（ｑｕａｓｉ−ｎａｔｉｖｅ）」アミノメチル、カルボキシルもしくはブロモメチルまたはヨードメチル遊離基を含んでよい。または、固相結合のための、既知の複合または移植リンカーまたはハンドル（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｏｒ ｇｒａｆｔｅｄ ｌｉｎｋｅｒｓ ｏｒ ｈａｎｄｌｅｓ）によって誘導体化してよく、例えば、Ｗａｎｇ樹脂、４ヒドロキシメチル安息香酸（後者は、ｐ−ジメチルアミノピリジン触媒によるエステル化による、第１のアミノ酸の結合を要する、Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｊ． Ｃｈｅｍ． ｃｏｓ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ｐ．３３６ｆｆ参照）、２−クロロ−トリチル−クロリド(ＣＴＣ)および関連する、好ましくはアルコキシル化された、トリチルハロゲン化物樹脂、Ｂａｙｅｒの４−カルボキシトリチル樹脂、４−メチルベンジルヒドリルアミノレジンであってよい。または、例えば、Ｆｍｏｃ化学において使用されるような、アミド産生ＰＡＬまたはＲｉｎｋまたはＳｉｅｂｅｒアミドリンカー、またはＢｏｃ化学が使用されるべきもの、例えばＰａｍハンドルまたはアミド産生ＢＨＡハンドルであってよい。
【０００８】
好ましくは、本発明に使用されるＰＥＧ樹脂は、樹脂からのペプチドの切断において酸アミドを産出する活性ＮＨ遊離基を含むリンカーを含む。これは、ペプチドのＣ末端アミノ酸残基のＣα−カルボン酸官能基とそのようなリンカーとの最初の結合の後である。または、これは、アスパラギン酸またはグルタミン酸のω−カルボン酸側鎖官能基由来であり、ペプチドのＣ末端の最初の側鎖の固着（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ）および保護の後の切断においてアスパラギンまたはグルタミンを産出する。この状況において、そのようなリンカーは、アミド産生リンカー（ａｍｉｄｅ−ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｌｉｎｋｅｒｓ）と名付けられる。より好ましくは、およびＴ２０の合成のために好ましくは、そのようなアミド産生リンカーは、ＰＡＬ（Ａｌｂｅｒｉｃｉｏらによる、１９８７， Ｉｎｔ． Ｊ． Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ３０， ２０６−２１６）、Ｓｉｅｂｅｒ（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． １９８７， ２８， ２１０７−２１１０）または同様の９−アミノ−キサンテニル−型樹脂リンカー、またはＲｉｎｋアミド（４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ；Ｒｉｎｋらによる、１９８７， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔ． ２８，３７８７ ｆｆ）リンカーである。
【０００９】
そのようなＰＥＧ樹脂はまた、例えば、ＫｅｍｐｅらによるＪ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １９９６， １１８， ７０８３および ＵＳ５，９１０，５５４に記載されるような、混合型ポリエーテル−ポリエステルまたはポリエーテル−ポリアミド樹脂であってよい可能性もある。
【００１０】
好ましくは、ＰＥＧ樹脂は、実質的に純粋なＰＥＧ樹脂であって、最終的に、明確な構造的成分としてのさらなる置換ポリスチレン成分を欠くＰＥＧ樹脂であり、および、より好ましくは、さらにまた、何れかの内部エステル（ｉｎｔｅｒｎａｌ ｅｓｔｅｒ）またはアミド官能基を含まないが、ポリエーテル官能基のみを含む。特に、後者の定義において、直接またはハンドルを介して樹脂をペプチドに架橋する末端エステルまたはアミド結合は考慮されない。というのは、それらは、内部構造的、架橋的な特徴ではなく、このことに関して「純粋なＰＥＧ」の定義に影響しないためである。
【００１１】
ＰＥＧ樹脂は、通常のＦｍｏｃ合成の際に、良い互換性および標準的溶媒の取り扱いの容易さとともに、最適な化学的安定性を提供する。本発明によると、それらは、例えば格別な収率および純度でのＴ−２０の合成を可能とする。
【００１２】
ヘリックス形成セグメントは、上述したようなヘリックス形成アミノ酸残基を含む；この状況におけるそれらの意味において、ヘリックス形成セグメントは、強力なヘリックス形成体となるものであり、すなわち、ＣｈｏｕおよびＦａｓｍａｎによるＡｎｎ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ４７， ２５８ （１９７８）によるヘリックス傾向注釈および予測スキーム（ｔｈｅ ｈｅｌｉｘ ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ ｓｃｈｅｍｅ）においてＨαまたはｈα−タイプアミノ酸として注記されるものである。そのような強力なヘリックス形成体は、単純に、経験的に１を越える定量されるヘリックス傾向を有しており、このことは、強力なヘリックス形成アミノ酸残基が、Ｘ線タンパク質構造でのαヘリックスにおける平均頻度よりも高い頻度で存在することを意味する。天然の２０のアミノ酸のそれぞれについて、数値による経験的な傾向値を、上述したＣｈｏｕの文献において、一覧としてみることができる。強力なヘリックス形成体は、従って、Ａｌａ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＶａｌである。対照的に、Ｈｉｓ、ＡｒｇおよびＡｓｐは、統計学的な頻度、すなわち約１の傾向で存在するが、αヘリックスにおいて、Ａｓｎは、ヘリックス形成に対して真にネガティブな影響を有することがわかっており、すなわち、わずか０．６７の傾向を有している。ヘリックス状またはヘリックス形成ペプチドセグメントの予測において、比較的単純ではあるが信頼できる予測アルゴリズムがＣｈｏｕら（１９７８）により定義された。：６つの連続したアミノ酸残基中において、２つのＨｉｓおよび／またはＡｓｐが１つの強力なヘリックス形成残基を埋め合わせるという例外的規則の下、４つの強力なヘリックス形成アミノ酸残基のクラスターがヘリックスの核を成すと考えられる。そのようなヘリックスセグメントの全てのオーバーラップするテトラペプチドセグメントに対する平均ヘリックス傾向を算出すると、そのようなヘリックスは、末端のテトラペプチドセグメントの平均した傾向が１．００未満に落ちるまで、両方向に伸びることが予想されてよい。プロリンは、ヘリックスを壊す存在であり、ヘリックスの末端にのみ存在してよい。好ましくは、従って、予測されるヘリックス形成セグメントは、上述したＣｈｏｕの文献による同様に予測可能な平均ベータシート傾向値よりも大きな平均ヘリックス傾向を有している。しばしば、ペプチド合成の分野において、内部鎖結合（ｉｎｔｅｒ−ｃｈａｉｎ ｂｏｎｄｉｎｇ）により隣接したペプチド鎖の凝集をもたらすベータシート構造は、合成中のカップリング反応および合成後の脱保護反応にネガティブな影響を与える可能性があると考えられる一方で、内部鎖ヘリックス形成は、リニア固相合成（ｌｉｎｅａｒ ｓｏｌｉｄ−ｐｈａｓｅ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）にとって障害となる見込みがあるとは認知されなかった。
【００１３】
カップリング反応、使用するカップリング剤および樹脂からの切断／側鎖の保護は、例えばＢｏｃ、または、好ましくは、Ｆｍｏｃ化学を用いて、標準的固相合成プロトコールによって行われるだろう。特に、それぞれのカップリング工程後のカップリング効率は、合成の間、例えばニンヒドリン試験によって調節されるべきであり、予期しない低いカップリング効率を示す個々のカップリングは、脱保護およびカップリングのさらなるサイクルを続ける前に、再度行うべきである；特に、重要なカップリング工程の後、まだ反応していないＮα−官能基の先行するキャッピングは、都合よく、次の合成サイクルの前に行うことが可能である。
【００１４】
特にＴ−２０の場合、樹脂上の合成後、一般に無水酢酸を用いたＮ末端アセチル化または同様の修飾を行ってよい。通常、ＰＥＧ樹脂からの１段階の全体的な切断、および側鎖に対して、特別で、直交する（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）保護基を用いない脱保護の後、ペプチドは回収されおよび単離されまたはさらに従来の方法によって処理される。
【００１５】
好ましくは、合成されるペプチドはＴ−２０である。しかしながら、ヘリックス形成セグメントを含むその他のペプチドも本発明による方法によって得ることができる。Ｔ−２０とは別に、そのようなヘリックス形成セグメントを有する同様のペプチドのさらなる例は、１５−４０アミノ酸残基を有する前記ｇｐ４１ ７アミノ酸繰り返しドメインと、オーバーラップしまたは関連するが、同一ではないペプチドであり、およびＴ−２０と少なくとも１０アミノ酸残基がオーバーラップする。
【００１６】
好ましくは、ヘリックス状ペプチドセグメントを含むという要求に加えて、合成すべきペプチドであって、特定される前記ヘリックス状ペプチドセグメントの前に含まれるペプチドの全長は、少なくとも１５アミノ酸であり、より好ましくは、少なくとも２４アミノ酸であり、最も好ましくは少なくとも３０アミノ酸の長さである。
【００１７】
好ましくは、合成されるペプチドは、以下の配列を有するチモシンα１であり、
１−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｎ−２８
ここにおいて、個々のアミノ酸鎖は、保護されておらずまたは適切に保護されており、必要に応じて、当該分野において一般的な知識によって、所定の個々のアミノ酸残基のためであってよい（例えば、以下のＢｏｄａｎｓｋｙを参照）。より好ましくは、そのようなペプチドは、リニア合成（ｌｉｎｅａｒ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）に続く工程であって、しかし樹脂からの切断の前においてＮ末端アセチル化される。医薬品としても使用される天然のサイマルファシン（ｔｙｍａｌｆａｓｉｎ）は、Ｎ末端アセチル化される。
【００１８】
特に、本発明者らは、側鎖の欠失によって多くの不純物をもたらし、それゆえリニア相合成の際に得られる最終生成物の収率が減少するのは、主にサイマルファシンペプチドのＣ末端側の半分であり、１９−２８残基についてであることを発見した。ペプチドのこの部分は、合成が非常に難しいことがわかった。
【００１９】
反対に、リニア合成の際、Ｗｏｅｈｒらによるそのようなオキサゾリジンジペプチドも使用可能である（Ｗｏｅｈｒ ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ． １１８， ９２１８）。
【実施例】
【００２０】
Ｔ−２０の固相合成
一般的方法。Ｍａｔｒｉｘ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎ （ケベック、カナダ）によるＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ樹脂、Ｌｕｘｅｍｂｏｕｒｇ Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ Ｌｔｄ．（テルアビブ、イスラエル）によるＨＣＴＵ、ＩＲＩＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ（マルクトレドヴィッツ、ドイツ）による保護Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体およびＲｉｎｋハンドル。
【００２１】
手動の固相合成は、ポリエチレン多孔ディスクを装着したポリプロピレンシリンジ（１０ｍＬ）において行った。溶媒および可溶性薬剤は、吸引により除去した。Ｆｍｏｃ基の除去は、ピペリジン−ＤＭＦ（２：８， ｖ／ｖ） （１ ｘ ２ 分， ２ ｘ １０ 分）によって行った。脱保護、カップリング、および再び脱保護の工程の間の洗浄は、それぞれ１０ｍＬ溶媒／ｇ樹脂で用いて、ＤＭＦ（５ｘ０．５分）およびＣＨ２Ｃｌ２（５ｘ０．５分）によって行った。ペプチド合成変換および洗浄は２５℃で行った。
【００２２】
自動固相合成は、０．１０ｍｍｏｌの樹脂を用いるＦａｓｔＭｏｃプログラムを用いて、ＡＢＩ ４３３Ａペプチド合成機によって行った。
【００２３】
Ｆｍｏｃの除去は、２２％ペペリジンの入ったＤＭＦによって、２＋７．６分間行った。樹脂は、ＤＣＭ（０．５分を６回）およびＤＭＦ（４回）で洗浄した。
【００２４】
カップリング。カートリッジ中で、Ｆｍｏｃ−アミノ酸（０．９ｍｍｏｌ、１０当量）をＤＭＦに溶解し、ＤＭＦに溶解した０．９ｍｍｏｌの０．４５Ｍ ＨＣＴＵをカートリッジに添加した。そして、ＮＭＰに溶解した１ｍＬの２Ｍ ＤＩＥＡを添加し、溶液を反応容器に移した。カップリングを３０分間行い、樹脂はＤＭＦで洗浄する（６回）。
【００２５】
ＨＰＬＣ逆相カラムＳｙｍｍｅｔｒｙ（商標）Ｃ１８ ４，６ｘ１５０ｍｍ，５μｍ（カラムＡ）は、Ｗａｔｅｒｓ（アイルランド）から得た。分析用ＨＰＬＣは、２つの溶媒送達ポンプ（Ｗａｔｅｒｓ １５２５）、自動注入器（Ｗａｔｅｒｓ ７１７オートサンプラー）、二重波長検出器（Ｗａｔｅｒｓ ２４８７）、およびシステムコントローラー（Ｂｒｅｅｚｅ Ｖ３．２０）を含むＷａｔｅｒｓ装置によって行った。ＵＶ検出器は２２０ｎｍとし、Ｈ２Ｏ (＋０．０４５％ ＴＦＡ)に対するＣＨ３ＣＮ (＋０．０３６％ ＴＦＡ)の直線的勾配は、１５分間で３０％から７０％とした。
【００２６】
ペプチドサンプルのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦおよびＥＳ−ＭＳ分析は、ＡＣＨマトリックスを用いて、ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｖｏｙａｇｅｒ ＤＥ ＲＰにて行った。図１は、ａ）においてＨＰＬＣクロマトグラムによる、およびｂ、ｃ）においてＭＳスペクトルによる生成物の純度および収率を示している。純粋な生成物（ＲＴ ７，０７８）の収率は、ＨＰＬＣ分析において、不純物に対して５０％であった。
【００２７】
実施例１
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２ （Ｔ−２０）
工程１
Ｆｍｏｃ−Ｒｉｎｋ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ−樹脂
ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ−樹脂（０．１ ｍｍｏｌ， ０．４５ ｍｍｏｌ／ｇ）をポリプロピレンシリンジに入れた。続いて、樹脂に、ＣＨ２Ｃｌ２ (３ ｘ ０．５分)、ＤＭＦ (３ ｘ ０．５分)、およびＤＭＦ (５ ｘ ０．５分)による洗浄／処理を施した。その後、ＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解したＦｍｏｃ−Ｒｉｎｋハンドル（３当量）およびＤＩＥＡ (６当量)を添加し、続いて、ＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解したＰｙＢＯＰ (３当量)およびＨＯＡｔ (３当量)を添加した。混合物を機械的に２時間撹拌し続け、樹脂をＤＭＦで洗浄し（３ｘ０．５分）した。ニンヒドリン試験は陰性であった。
【００２８】
工程２
Ｈ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−ＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ−樹脂
Ｆｍｏｃ基を除去し、Ｆｍｏｃ−ａａ−ＯＨ’ｓ）を、上述したＡＢＩ自動合成器４３３Ａにて、上記のペプチジル−樹脂（工程１）に連続的に添加した。
【００２９】
工程３
Ａｃ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）−Ｐｈｅ−ＮＨ−Ｒｉｎｋ−ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ−樹脂
最終的なアセチル化を、ＤＭＦ (５ ｍＬ)にＡｃ２Ｏ−ＤＩＥＡ−ＤＭＦ (１０：５：８５)を加えた溶液にて、１５分間散発的に手動で撹拌しておこなった。ニンヒドリンは陰性であった。
【００３０】
工程４
Ａｃ−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ２ （Ｔ−２０）
ペプチド−樹脂を、ＴＦＡ−ｉＰｒ３ＳｉＨ−Ｈ２Ｏ （９５：２．５：２．５）に懸濁し、混合液を２時間撹拌した。その後、エーテル／ヘキサンを添加し、ペプチドを沈殿させ、遠心分離後溶媒を除去し、余分にエーテル／ヘキサンを添加し、遠心分離後除去した。この操作を、複数回繰り返した。最終的に、Ｈ２Ｏ（５ｍＬ）を添加し、凍結乾燥させた。ＥＩ−ＭＳ， ｃａｌｃｄ． ４４８９． Ｆｏｕｎｄ： ｍ／ｚ   ［Ｍ＋２Ｈ］２＋／２ ２２４８。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１ａ】図１は、ａ）においてＨＰＬＣクロマトグラムによる、およびｂ、ｃ）においてＭＳスペクトルによる生成物の純度および収率を示している。
【図１ｂ】図１は、ａ）においてＨＰＬＣクロマトグラムによる、およびｂ、ｃ）においてＭＳスペクトルによる生成物の純度および収率を示している。
【図１ｃ】図１は、ａ）においてＨＰＬＣクロマトグラムによる、およびｂ、ｃ）においてＭＳスペクトルによる生成物の純度および収率を示している。
【図１ａ】
2008534639.tif 000002
【図１ｂ】
2008534639.tif 000003
【図１ｃ】
2008534639.tif 000004
【配列表】
2008534639000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月14日(2007.6.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００７】
図１には、ＨＰＬＣクロマトグラムが示されており、この方法で合成した生成物から得られた不純物が低レベルであり、高い収率での合成が可能であることが示されている。ＰＥＧ樹脂は、種々の会社から提供されており、例えば、カナダ、ケベックのＭａｔｒｉｘ Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ Ｉｎｃ．（「ＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ」ブランド）、またはデンマークのＶｅｒｓａｍａｔｒｉｘ Ａ．Ｓ．から提供されている。ＰＥＧ樹脂の好ましいタイプは、ＷＯ ０２／４０５５９に記載されている。ペプチドの結合のために、そのようなＰＥＧ樹脂は、末端の「本来的な（ｎａｔｉｖｅ）」ヒドロキシメチル遊離基、または、例えば、それから誘導される「半本来的な（ｑｕａｓｉ−ｎａｔｉｖｅ）」アミノメチル、カルボキシルもしくはブロモメチルまたはヨードメチル遊離基を含んでよい。または、固相結合のための、既知の複合または移植リンカーまたはハンドル（ｉｎｔｅｇｒａｌ ｏｒ ｇｒａｆｔｅｄ ｌｉｎｋｅｒｓ ｏｒ ｈａｎｄｌｅｓ）によって誘導体化してよく、例えば、Ｗａｎｇ樹脂、４ヒドロキシメチル安息香酸（後者は、ｐ−ジメチルアミノピリジン触媒によるエステル化による、第１のアミノ酸の結合を要する、Ａｔｈｅｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８１， Ｊ． Ｃｈｅｍ． ｃｏｓ． Ｃｈｅｍ． Ｃｏｍｍｕｎ．， ｐ．３３６ｆｆ参照）、２−クロロ−トリチル−クロリド(ＣＴＣ)および関連する、好ましくはアルコキシル化された、トリチルハロゲン化物樹脂、Ｂａｙｅｒの４−カルボキシトリチル樹脂、４−メチルベンジルヒドリルアミノレジンであってよい。または、例えば、Ｆｍｏｃ化学において使用されるような、アミド産生ＰＡＬまたはＲｉｎｋまたはＳｉｅｂｅｒアミドリンカー、またはＢｏｃ化学が使用されるべきもの、例えばＰａｍハンドルまたはアミド産生ＢＨＡハンドルであってよい。
【手続補正２】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも２４アミノ酸残基長でありおよび個々に保護されたおよび／または保護されていないアミノ酸側鎖を有してよいペプチドを固相上で製造する方法であって、前記ペプチドが、内部架橋、構造的要素としてポリエーテル官能基のみを有する、両親媒性で、実質的に純粋なＰＥＧ樹脂である固相に結合されて作製され、および、ここにおいて前記ペプチドが、少なくとも１２残基長の、プロリンを含まないヘリックス形成セグメントを含むことを特徴とする方法。
【請求項２】
前記ＰＥＧ樹脂の充填容量が少なくとも０．５ ｍｍｏｌ／ｇであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
合成するペプチドの全長であって、当該ヘリックス状ペプチドセグメントの前に含まれるペプチドの全長が、少なくとも３０アミノ酸であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ペプチドが、Ｔ−２０、Ｎ末端アセチル化Ｔ−２０、チモシン−α１であり、または、少なくとも１０残基でＴ−２０とオーバーラップする、α−ヘリックス状、融合（ｆｕｓｏｇｅｎｉｃ）配列要素を有する１５−４０アミノ酸残基の7アミノ酸繰り返しペプチドであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ペプチドが、官能基のリンカーまたはハンドルを介して前記固相につなげられることを特徴とする請求項１から請求項４の何れか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記リンカーがアミド産生リンカー、好ましくはＳｉｅｂｅｒまたはＲｉｎｋアミドリンカーであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＥＧ樹脂が、アミノ−アルキル官能化ＰＥＧ樹脂であって、そのアミノ官能基に前記ペプチドが結合して、Ｃα−末端ペプチジル−カルボキサミドを形成することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記樹脂が、ポリスチレン−ＰＥＧの混合またはコポリマーまたはブロックコポリマーではないＰＥＧ樹脂であり、好ましくは前記樹脂が実質的に純粋なＰＥＧ樹脂であることを特徴とする請求項２または請求項５に記載の方法。
【請求項９】
少なくとも２４アミノ酸残基のペプチドと、実質的に純粋なＰＥＧ樹脂固相とのコンジュゲートであって、前記樹脂が、内部架橋、構造的要素としてポリエーテル官能基のみを有する、両親媒性で、実質的に純粋なＰＥＧ樹脂であり、および、前記ペプチドが、少なくとも１２残基長の、プロリンを含まないヘリックス形成セグメントを含むコンジュゲート。
【請求項１０】
前記ペプチド成分が、Ｒ１−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅであるアミノ酸配列を有し、ここにおいてＲ１が、Ｈ、アセチル−または除去可能な保護基であって、最も好ましくはＲ１がアセチルであり、および、ここにおいて個々のアミノ酸が、さらに側鎖保護基を含んでよいことを特徴とする請求項９に記載のペプチド−ＰＥＧ樹脂コンジュゲート。
【請求項１１】
前記ペプチド成分がチモシン−α１であることを特徴とする請求項９に記載のペプチド−ＰＥＧ樹脂コンジュゲート。
【国際調査報告】
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