(57)【要約】一つは5'エキソヌクレアーゼ活性が減少しており、一つは5'エキソヌクレアーゼ活性を有している、少なくとも二つのDNAポリメラーゼを含む、熱安定性DNAポリメラーゼ組成物。このポリメラーゼは、核酸合成、DNA配列決定、核酸増幅、およびcDNA合成を含むが、これに限定されない方法に使用することができる。2008546422.tif 000012
2008546422.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
D144A点変異を有するテルムス・フィリフォルミス(Thermus filiformis)(Tfi)DNAポリメラーゼをコードする単離された組換え核酸分子であって、該点変異は該ポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少させる、単離された組換え核酸分子。
【請求項２】
E437D点変異をさらに含む、請求項1記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項1または2記載の核酸分子から産生される、単離された突然変異型Tfi DNAポリメラーゼ。
【請求項４】
D144A点変異を有する、単離された突然変異型Tfi DNAポリメラーゼ。
【請求項５】
D144AおよびE437Dの点変異を有する、単離された突然変異型Tfi DNAポリメラーゼ。
【請求項６】
少なくとも二つの熱安定性DNAポリメラーゼを含む組成物であって、該ポリメラーゼの少なくとも一つは5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少しており(エキソ−)、該ポリメラーゼの少なくとも一つは5'エキソヌクレアーゼ活性を有している(エキソ＋)、組成物。
【請求項７】
前記ポリメラーゼが同種の高温性細菌由来である、請求項6記載の組成物。
【請求項８】
前記5'エキソ−および5'エキソ＋ポリメラーゼが、9：1〜1：9(エキソ−：エキソ＋)の比率で組み合わされている、請求項6記載の組成物。
【請求項９】
比率が7：3(エキソ−：エキソ＋)である、請求項8記載の組成物。
【請求項１０】
請求項1記載の単離された核酸分子を含むベクター。
【請求項１１】
前記核酸分子がプロモーターに機能的に連結されている、請求項10記載のベクター。
【請求項１２】
請求項11記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
洗浄剤、緩衝塩、デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)、およびジデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)からなる群より選択される少なくとも二つの成分をさらに含む、請求項6記載の組成物。
【請求項１４】
前記成分が洗浄剤、緩衝塩、およびdNTPである、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
（a）第一DNA分子にプライマーをハイブリダイズさせる工程、ならびに
（b）該第一DNA分子の全部または一部と相補的な第二DNA分子を合成するのに十分な条件の下、一つ以上のデオキシまたはジデオキシヌクレオシド三リン酸および請求項6記載の組成物の存在下で、(a)記載のDNA分子をインキュベートする工程
含む、二本鎖DNAを合成する方法。
【請求項１６】
（a）第一プライマーがDNA分子の第一鎖の3'末端またはその近くの配列に相補的であり、第二プライマーが該DNA分子の第二鎖の3'末端またはその近くの配列に相補的である、第一および第二プライマーを提供する工程、
（b）第一鎖に相補的な第三鎖および第二鎖に相補的な第四鎖が合成されるような条件の下、請求項6記載の組成物の存在下で、第一プライマーを第一鎖に、第二プライマーを第二鎖にハイブリダイズさせる工程、
（c）第一および第三鎖、ならびに第二および第四鎖を変性させる工程、ならびに
（d）(a)から(c)の工程を一度またはそれ以上反復する工程、
含む、二本鎖DNA分子を増幅する方法。
【請求項１７】
（a）請求項6記載の組成物を含む第一容器、
（b）ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸を一つ以上含む第二容器、および
（c）デオキシリボヌクレオシド三リン酸を一つ以上含む第三容器
を含む、DNA分子の配列を決定するためのキット。
【請求項１８】
（a）請求項6記載の組成物を含む第一容器、および
（b）デオキシリボヌクレオシド三リン酸を一つ以上含む第二容器
を含む、DNA分子を増幅するためのキット。
【請求項１９】
（a）mRNAにオリゴ(dT)プライマーまたは他の相補的なプライマーを接触させ、ハイブリッドを形成する工程、ならびに
（b）(a)で形成したハイブリッドに請求項6記載の組成物、dATP、dCTP、dGTP、およびdTTPを接触させ、それによってcDNA-RNAハイブリッドを得る工程
を含む、mRNAからcDNAを調製する方法。
【請求項２０】
（a）mRNAにオリゴ(dT)プライマーまたは他の相補的なプライマーを接触させ、ハイブリッドを形成する工程、ならびに
（b）(a)で形成したハイブリッドに請求項6記載の組成物、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、および第一鎖cDNAに相補的なオリゴヌクレオチドまたはプライマーを接触させ、それによってdsDNAを得る工程
を含む、mRNAからdsDNAを調製する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、DNAポリメラーゼおよび突然変異型DNAポリメラーゼに関する。特に、5'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼおよび5'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少させたDNAポリメラーゼの組み合わせに関するものである。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
DNAポリメラーゼは、核酸テンプレートの全部または一部に相補的なDNA分子を合成する。ポリメラーゼは、プライマーを一本鎖のテンプレートにハイブリダイズさせることにより5'から3'の方向へDNAを合成する、すなわち成長していく鎖の3'水酸基へ連続的にヌクレオチドを付け加えていく。従って、例えば、デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)およびプライマーの存在下で、一本鎖の核酸テンプレートに相補的な新しいDNA分子が合成できる。通常、相補的なDNA分子を合成するのに、RNAまたはDNAテンプレートが使用される。しかし、キメラ型テンプレートや修正核酸テンプレートなどのテンプレートも、重合核酸の相補分子を合成するのに使用できる。DNA依存性のDNAポリメラーゼはDNAテンプレートを使い、テンプレートの少なくとも一部に相補的なDNA分子を生成する。RNA依存性のDNAポリメラーゼ、すなわち逆転写酵素は、RNAテンプレートを利用し、テンプレートの少なくとも一部に相補的なDNA鎖すなわちcDNAを生成する。逆転写酵素は一般的に、mRNAをcDNAへ転写するのに使用される。DNAポリメラーゼの中には、DNA依存性のDNAポリメラーゼ活性とRNA依存性のDNAポリメラーゼ活性の両方を有しているのがある。
【０００３】
DNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ活性以外に、触媒活性をさらに一つ以上有している場合がある。通常、DNAポリメラーゼは、3'-5'エクソヌクレアーゼ(「プルーフリーディング」)および5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有している場合がある。各活性は、タンパク質の特定の部位またはドメインに局在している。例えば、大腸菌のポリメラーゼI(pol I)をサブチリシンで二つの断片に分割すると、大きい方の断片(「クレノウ」)は3'-5'エクソヌクレアーゼ活性およびDNAポリメラーゼ活性を有し、小さい方の断片は5'-3'エクソヌクレアーゼ活性を有している。
【０００４】
DNAポリメラーゼは、種々の中温性および高温性の有機体から単離される。高温性の有機体から単離されるDNAポリメラーゼは、通常、中温性の有機体から単離される酵素よりも重合活性の最適温度が高い。熱安定性のDNAポリメラーゼが多数の高温性細菌種から発見されており、その中には、テルムス・アクアティクス(Thermus aquaticus)(Taq)、テルムス・フィリフォルミス(Thermus filiformis)(Tfi)、テルムス・テルモフィラス(Thermus thermophilus)(Tth)、および桿菌属、テルモコッカス属、スルフォロブス属およびピロコッカス属の種も含まれるが、これに限定されるものではない。更に、他の種々の高温細菌から単離された熱安定性のDNAポリメラーゼがPCT国際公開公報第03/025132号(特許文献1)に記載されており、その内容全体は参照により本明細書に組み入れられる。熱安定性のDNAポリメラーゼは、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を含めて、数多くの適用に利用されている。
【０００５】
PCRは標的核酸の増幅に利用される。つまり標的DNAを変性させ、オリゴヌクレオチドプライマーを標的DNA分子の反対鎖の特定配列にハイブリダイズさせ、このプライマーをDNAポリメラーゼ(通常、熱安定性のDNAポリメラーゼ)で延長することにより、二つの新しいDNA鎖を生成し、これをさらに次のハイブリダイゼーションのテンプレートとして利用する。ポリメラーゼが熱安定性ならば、熱はポリメラーゼ活性を破壊しないので、変性段階ごとに新鮮なポリメラーゼを追加する必要はない。RT-PCRでは、DNAプライマーは標的RNA分子の鎖にハイブリダイズし、このプライマーを逆転写酵素で延長させると、新しいDNA鎖(すなわちcDNA)が生成され、これがPCRのテンプレートとして用いられる。
【０００６】
テルムス・アクアティクス(Taq)から得られる熱安定性のDNAポリメラーゼはPCRを可能なものとした。異なる性質(例えば高いまたは低い適合度(fidelity)；追加の、向上した、少ないまたは減少した触媒活性；変更された基質の使用または選好性(preference)；あるいは異なる補助因子要求)を有し、特定の適用に適した熱安定性ポリメラーゼが、他の有機体から、および/または組換えDNA技術を用いて単離されている。
【０００７】
【特許文献１】国際公開公報第03/025132号
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明の一実施態様は、D144A点変異を有するテルムス・フィリフォルミス(Tfi)DNAポリメラーゼをコードする単離された組換え核酸分子であり、ここで該点変異は該ポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少させる。単離された核酸分子は、さらにE437D点変異を含む場合がある。本実施態様の一局面として、上述の核酸分子の一つから突然変異型Tfi DNAポリメラーゼが産生される。
【０００９】
別の実施態様では、D144A点変異を有する単離された突然変異型Tfi DNAポリメラーゼが提供される。本発明は、D144AおよびE437D点変異を有する単離された突然変異型Tfi DNAポリメラーゼも提供する。別の実施態様は、少なくとも二つの熱安定性DNAポリメラーゼを含む組成物であり、該ポリメラーゼの少なくとも一つは5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少しており(エキソ−)、該ポリメラーゼの少なくとも一つは5'エキソヌクレアーゼ活性を有している(エキソ＋)組成物である。ポリメラーゼは同じ種の高温細菌から得られる場合もある。この組成物は、洗浄剤、緩衝塩、デオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)およびジデオキシヌクレオシド三リン酸(dNTP)のうち少なくとも二つを含む場合もある。別の実施態様では、組成物は洗浄剤、緩衝塩およびdNTPを含む。別の実施態様では、5'エキソ−および5'エキソ＋ポリメラーゼは、9：1〜1：9(エキソ−：エキソ＋)の比率で組み合わされている。一つの実施態様では、比率は7：3(エキソ−：エキソ＋)である。本発明は、上述の単離された核酸分子のいずれかを含有するベクターおよびベクターを含有する宿主細胞も提供する。核酸分子はプロモーターと機能的に連結されている場合もある。
【００１０】
本発明は二本鎖DNAを合成する方法も提供し、それには第一DNA分子にプライマーをハイブリダイズさせる工程、および該第一DNA分子の全部または一部と相補的な第二DNA分子を合成するのに十分な条件の下、一つ以上のデオキシまたはジデオキシヌクレオシド三リン酸および上述のDNAポリメラーゼ/組成物のいずれかの存在下で、DNA分子をインキュベーションする工程が含まれる。
【００１１】
別の実施態様は二本鎖DNA分子を増幅する方法であり、それには第一プライマーがDNAの第一鎖の3'末端またはその近くの配列に相補的であり、第二プライマーがDNAの第二鎖の3'末端またはその近くの配列に相補的である第一および第二プライマーを提供する工程、第一鎖に相補的な第三鎖および第二鎖に相補的な第四鎖が合成されるような条件の下、上述のDNAポリメラーゼ/組成物のいずれかの存在下で、第一プライマーを第一鎖に、第二プライマーを第二鎖にハイブリダイズさせる工程、第一および第三鎖ならびに第二および第四鎖を変性させる工程、ならびにこれらの工程を一度またはそれ以上反復する工程が含まれる。
【００１２】
DNA分子の配列を決定するキットも提供される。これには上述のDNAポリメラーゼ/組成物のいずれかを含む第一容器、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸を一つ以上含む第二容器、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を一つ以上含む第三容器が含まれる。
【００１３】
本発明はDNA分子を増幅するためのキットも提供する。これには上述のDNAポリメラーゼ/組成物のいずれかを含む第一容器、およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を一つ以上含む第二容器が含まれる。
【００１４】
別の実施態様はmRNAからcDNAを調製する方法であり、これにはmRNAにオリゴ(dT)プライマーまたは他の相補的なプライマーを接触させ、ハイブリッドを形成する工程、ならびにハイブリッドに上述のDNAポリメラーゼ/組成物のいずれか、およびdATP、dCTP、dGTP、およびdTTPを接触させ、cDNA-RNAハイブリッドを得る工程が含まれる。
【００１５】
本発明はmRNAからdsDNAを調製する方法も提供する。これにはmRNAにオリゴ(dT)プライマーまたは他の相補的なプライマーを接触させ、ハイブリッドを形成する工程、上述のDNAポリメラーゼ/組成物のいずれか、およびdATP、dCTP、dGTP、dTTP、および第一鎖cDNAに相補的なオリゴヌクレオチドまたはプライマーを接触させ、dsDNAを得る工程が含まれる。
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、熱安定性のDNAポリメラーゼブレンド、および5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少している突然変異型DNAポリメラーゼに関する。これらのポリメラーゼブレンドおよびポリメラーゼは、5'エキソヌクレアーゼ活性を調整してPCRの性能を向上させる。本明細書で使用される場合、「ブレンド」という用語は、少なくとも二つのDNAポリメラーゼを意味し、その少なくとも一つは5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少(以後「エキソ−」と呼ぶ)しており、その少なくとも一つは5'エキソヌクレアーゼ活性を有している(以後「エキソ＋」と呼ぶ)。エキソ−とエキソ＋は同じ場合もあれば、異なっている場合もある。例えば、ブレンドはエキソ−Tfiポリメラーゼとエキソ＋Tfiポリメラーゼの組み合わせであっても良いし、エキソ−Tfiポリメラーゼとエキソ＋Taq DNAポリメラーゼの組み合わせであってもよい。アミノ酸レベルで見ると、TfiとTaqは約78％同一で86％は類似である。TfiおよびTaq DNAポリメラーゼは両方とも5'から3'へのエキソヌクレアーゼ活性および5'から3'へのポリメラーゼ活性を有しているが、3'から5'へのエキソヌクレアーゼ活性は欠如している。エキソ−/エキソ＋ブレンドのエキソ−ポリメラーゼは5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少している。エキソ＋/エキソ−ブレンドに加えて、特にTfiポリメラーゼの5'エキソ活性が減少している、または実質的に減少している熱安定性のエキソ−DNAポリメラーゼも本明細書に記載されている。組成物、反応混合物およびDNAポリメラーゼブレンドやエキソ−DNAポリメラーゼなどを含むキットも、そういうポリメラーゼを用いた核酸合成、配列決定および増幅の方法として、本明細書に記載されている。以下の用語は、分子生物学の当業者により一般的に使用されている。
【００１７】
クローニングベクター：
宿主細胞内で自動的に複製できる核酸分子、例えばプラスミド、コスミドまたはファージDNA、または他のDNA分子のこと。クローニングベクターは、生物学的に必須の機能を失うことなく、そういうDNAの配列を決定可能な方法で操作でき、複製やクローニングを行なわせるために目的の核酸断片を挿入することのできる一つまたは少数の認識部位(例えば、組換え部位、制限部位、トポイソメラーゼ部位など)を有している場合がある。クローニングベクターは、そのクローニングベクターによって形質転換される細胞を同定するのに適したマーカーを含んでいる場合もある。マーカーは例えば、テトラサイクリン耐性、アンピシリン耐性、カナマイシン耐性などの抗生物質耐性遺伝子である場合もある。当技術分野で公知の他のマーカー配列を使用してもよい。
【００１８】
発現ベクター：
クローニングベクターに似たベクターであるが、宿主に形質移入後、クローン化された遺伝子の発現を向上させる能力を持ったベクターのこと。クローン化遺伝子は、通常、プロモーターまたはエンハンサー配列のような何らかの制御配列のコントロール下に置かれる(つまり機能的な状態に連結される)。
【００１９】
宿主/組換え宿主：
複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたは宿主ゲノムDNAに組込まれる場合もそうでない場合もある他の非相同核酸分子の受容体である原核生物細胞、真核生物細胞または微生物のこと。核酸分子は、構造遺伝子またはその一部、プロモーターおよび/または複製開始点を含む場合もある。「宿主」または「組換え宿主」という用語は、宿主染色体またはゲノムの一部として非相同核酸配列を含有するように遺伝子工学的に処理された宿主細胞も含むように解釈される。
【００２０】
プロモーター：
核酸配列の転写開始部位で転写を開始できるように、適切な補助因子の存在下、RNAポリメラーゼが結合するDNA配列のこと。プロモーターには、転写部位と転写開始部位の間に存在する5'非コード領域を含めてもよい。プロモーターには、エンハンサーや転写因子と相互作用できる他のヌクレオチド配列など、シス作動性転写制御要素を含めてもよい。
【００２１】
機能的に連結された：
本明細書で使用する場合は、シス状態で関係している核酸配列の転写を制御、またはそれに影響を及ぼす位置にあるプロモーターまたはエンハンサーなどの他の制御配列を意味する。
【００２２】
発現：
発現は核酸からポリペプチドが産生されるプロセスを言う。遺伝子からmRNAへの転写およびmRNAからポリペプチドへの翻訳を含めてもよい。
【００２３】
実質的に純粋：
「実質的に純粋」というのは、本明細書で使用する場合、天然状態で所望のタンパク質と関係しており、その機能を損なうまたは向上させる場合がある細胞の汚染物質が、本質的に存在しないタンパク質を意味する。そういう汚染物質には、ホスファターゼ、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたは望ましくないDNAポリメラーゼも含まれるが、これだけに限定されるものではない。実質的に純粋なポリペプチドには、25％以下、15％以下、10％以下、5％以下または1％以下の汚染細胞成分が含まれる。200DNAポリメラーゼユニットをタンパク質ゲル(すなわちSDS-PAGE)にかけ、クマシーブルーで染色した場合に、実質的に純粋なDNAポリメラーゼが、検出可能なタンパク質汚染物を全く含まない場合もある。
【００２４】
実質的に単離された：
「実質的に単離された」というのは、本明細書で使用する場合、天然状態で関係している汚染タンパク質および/または組換え宿主の中に存在する汚染タンパク質が本質的に存在しないポリペプチドを意味する。実質的に単離されたペプチドには、25％以下、15％以下、10％以下、5％以下または1％以下の汚染タンパク質が含まれる。ある場合には、実質的に単離されたペプチドは、試料のタンパク質の75％、85％、90％、95％、98％または99％を表す。汚染タンパク質および/または試料中の目的タンパク質の割合は、当技術分野で公知の技術(例えばSDS-PAGE)を使って決定してよい。ポリペプチドを含む0.5μgの試料をSDS-PAGEで分析したとき、検出可能なタンパク質汚染物が全く存在しない場合もある。
【００２５】
実質的に減少した：
酵素活性が「実質的に減少した」組換え酵素とは、対応する(例えば非改良野生型)酵素の活性の約30％未満、約20％未満、約15％未満、約10％未満、約7.5％未満、約5％未満、約2％未満または約1％未満を有することを意味する。
【００２６】
プライマー：
「プライマー」とは、本明細書で使用する場合、核酸分子の重合または増幅の際に、ヌクレオチドモノマーの共有結合により延長される一本鎖のオリゴヌクレオチドを言う。
【００２７】
テンプレート：
「テンプレート」とは、本明細書で使用する場合、増幅、合成、配列決定またはコピー化に利用される核酸ポリメラーゼの二本鎖または一本鎖DNAまたはRNA基質を意味する。二本鎖DNAの場合は、鎖の変性による第一および第二鎖の形成は、増幅、合成または配列決定の前に通常行なわれる。テンプレートの一部に相補的なプライマーが適切な条件下でテンプレートにハイブリダイズし、本明細書に記載のポリペプチドがテンプレートまたはその一部に相補的なDNA分子を合成する。新規合成DNA分子の合成または延長の際にミスマッチな組込みが行なわれれば、一つまたはある数のミスマッチ塩基対が生じる場合がある。従って、合成DNA分子は、テンプレートに正確に相補的でなければならない。RNAテンプレートの場合は、DNAプライマーがテンプレートRNAの一本鎖にハイブリダイズし、逆転写酵素活性を有するポリペプチドが相補的なDNAの合成に利用される。
【００２８】
組込み：
「組込み」と言う用語は、核酸分子またはプライマーの一部になることを意味する。
【００２９】
増幅：
本明細書で使用する場合、「増幅」とは、DNAポリメラーゼを用いてヌクレオチド配列のコピー数を増やすインビトロの方法を意味する。核酸を増幅すれば、テンプレートに相補的なDNA分子にヌクレオチドが組込まれる。追加の核酸分子を合成するテンプレートとして、以前のDNA分子およびそのテンプレートが利用できる。本明細書で使用する場合、一つの増幅反応はDNA複製を何度も反復してよい。DNA増幅反応には、例えばPCRが含まれる。一回のPCR反応は、DNA分子の変性および合成を一度またはそれ以上、例えば、2、3、4、5、10、15、20、25、30、50、60、70、80、90、100またはそれ以上の「サイクル」で行なってもよい。
【００３０】
オリゴヌクレオチド：
「オリゴヌクレオチド」とは、共有結合した一連のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含む合成または天然の分子を意味する。こういうヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体は、5炭糖の3'の位置と隣接ヌクレオチドの5炭糖の5'の位置の間で、リン酸ジエステル結合によって結合されていてもよい。一つ以上のインターヌクレオチドホスフェート基を別の種類の基、例えばペプチド結合、ホスホロチオアート基またはメチレン基で置換した分子もこの中に含まれる。オリゴヌクレオチドは、当技術分野で公知の手順を使って、合成調製してもよい。
【００３１】
ヌクレオチド：
本明細書で使用する場合、「ヌクレオチド」とは、塩基、糖、リン酸塩の組み合わせを意味する。ヌクレオチドは核酸分子(DNAおよびRNA)のモノマーユニットである。ヌクレオチドと言う用語には、dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP、またはそれらの誘導体などのデオキシリボヌクレオシド三リン酸も含まれる。そういう誘導体には、例えば、[α-S]dATP、7-デアザ-dGTPおよび7-デアザ-dATPなどが含まれる。ヌクレオチドと言う用語は、本明細書で使用する場合、ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITPおよびddTTPなどのddNTP)およびその誘導体も意味する。ヌクレオチドは非標識でもよいし、公知の技術で検出可能な標識を付していてもよい。検出可能な標識には、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識などが含まれる。ヌクレオチドは、一つ以上の反応性官能基を含んでいてもよい。標識は、核酸合成、配列決定または増幅反応において、ヌクレオチドの使用前、使用中および/または使用後に、官能基に付加してもよい。
【００３２】
ヌクレオチドは非標識でもよいし、公知の技術で検出可能な標識を付してもよい。検出可能な標識には、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光標識、化学発光標識、酵素標識なども含まれる。ヌクレオチドの蛍光標識には、フルオレセイン、5-カルボキシフルオレセイン(FAM)、2'7'-ジメトキシ-4'5-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン(JOE)、ローダミン、6-カルボキシローダミン(R6G)、N,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA)、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、4-(4'ジメチルアミノフェニルアゾ)安息香酸(DABCYL)、カスケードブルー、オレゴングリーン、テキサスレッド、シアニン、5-(2'-アミノエチル)アミノナフタレン-1-スルホン酸(EDANS)などが含まれる。蛍光標識したヌクレオチドの具体例としては、カリフォルニア州フォースターシティのパーキンエルマー社から入手可能な[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTPおよび[dROX]ddTTP、イリノイ州アーリントンハイツのアマシャム社から入手可能なフルオロリンクデオキシヌクレオチド、フルオロリンクCy3-dCTP、フルオロリンクCy5-dCTP、フルオロリンクFluorX-dCTP、フルオロリンクCy3-dUTPおよびフルオロリンクCy5-dUTP、インディアナ州インディアナポリスのベーリンガーマンハイム社から入手可能なフルオレセイン-15-dATP、フルオレセイン-12-dUTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、IR770-9-dATP、フルオレセイン-12-ddUTP、フルオレセイン-12-UTPおよびフルオレセイン-15-2'-dATP、オレゴン州ユージーンのモレキュラープローブ社から入手可能なクロマタイドラベルドヌクレオタイズ、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、カスケードブルー-7-UTP、カスケードブルー-7-dUTP、フルオレセイン-12-UTP、フルオレセイン-12-dUTP、オレゴングリーン488-5-dUTP、ローダミングリーン-5-UTP、ローダミングリーン-5-dUTP、テトラメチルローダミン-6-UTP、テトラメチルローダミン-6-dUTP、テキサスレッド-5-UTP、テキサスレッド-5-dUTPおよびテキサスレッド-12-dUTPなどが挙げられる。
【００３３】
熱安定性：
本明細書で使用する場合、「熱安定性」と言うのは、熱による不活性化に耐性の分子活性を意味する。例えば、DNAポリメラーゼは、5'から3'の方向にプライマーを延長することにより、一本鎖DNAテンプレートに相補的なDNA分子を合成する。中温性DNAポリメラーゼの活性は、熱処理により不活性化できる。例えば、T5DNAポリメラーゼは、摂氏90度に30秒間晒すことにより、完全に不活性化される。熱安定性の活性は、対応する中温性の活性よりも熱不活性に耐性である。熱安定性のポリメラーゼは熱に比較的安定であり、核酸テンプレートからDNAまたはRNAを形成する際に、触媒として機能できる。熱安定性のDNAポリメラーゼは、熱不活性に完全に耐性である必要はなく、熱処理の結果、活性が減少するだけでよい。熱安定性のDNAポリメラーゼは、通常、一般的な中温性DNAポリメラーゼよりも高い最適温度も有している。
【００３４】
例えば摂氏95度で30分間加熱した後、活性の少なくとも5％、少なくとも10％、少なくとも15％、少なくとも20％、少なくとも25％、少なくとも30％、少なくとも35％、少なくとも40％、少なくとも45％、少なくとも50％、少なくとも55％、少なくとも60％、少なくとも65％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％または少なくとも95％が維持されていれば、そのポリメラーゼは特に熱安定性であると見なされる。
【００３５】
適合度：
適合度とは、核酸重合の正確性あるいはテンプレートに相補的な核酸分子を合成する際に、核酸ポリメラーゼが正確な基質を不正確な基質と区別する能力を意味する。ポリメラーゼの適合度が高ければ高いほど、核酸合成の際に成長していく鎖にポリメラーゼがヌクレオチドを間違って組込む回数が少なくなる。適合度を増大または向上させれば、エラーの回数が少ない(すなわち間違って組込む率が低い)忠実なポリメラーゼが得られる。
【００３６】
ハイブリダイゼーション：
「ハイブリダイゼーション」および「ハイブリダイズ」という用語は、核酸分子(RNAおよび/またはDNA)の二つの相補的な一本鎖部分が二本鎖を形成することを意味する。本明細書で使用する場合、塩基対が完全に相補的でなくても、核酸分子の二つの部分がハイブリダイズする場合がある。従って、当技術分野で公知の適切なハイブリダイゼーションとストリンジェント条件が使用されれば、塩基がミスマッチであっても、核酸分子の二つの部分のハイブリダイゼーションが妨げられることはない。
【００３７】
二つのヌクレオチド配列が互いにハイブリダイズできる能力は、二つのヌクレオチド配列の相補性の度合次第、つまりマッチする相補的なヌクレオチド対の割合次第である。ある配列のヌクレオチドが別の配列に相補的であればあるほど、ハイブリダイゼーションの度合は高くなる。ハイブリダイゼーションの度合は、温度、溶媒の割合、塩の濃度などのストリンジェント条件によっても変化する。
【００３８】
「選択的ハイブリダイゼーション」と言うのは、ポリヌクレオチドと標的とのハイブリダイゼーションの度合が、完全または完全に近い相補性を必要とする条件に関係している。すなわちハイブリダイゼーション媒体に存在する他の核酸との結合と比べ、ポリヌクレオチドが標的に特異的に結合するのに十分な相補性の度合を言う。
【００３９】
5'-3'エキソヌクレアーゼ活性：
「5'-3'エキソヌクレアーゼ活性」は、大腸菌のDNA polIおよびpolIIIなどのDNAポリメラーゼにしばしば関係している酵素活性である。既知の多くのポリメラーゼのうち、5'-3'エキソヌクレアーゼ活性はポリメラーゼのN末端領域に存在する(Ollis等, Nature 313：762-766, 1985、Freemont等, Proteins 1：66-73, 1986、Joyce, Curr. Opin. Struct. Biol. 1：123-129, 1991)。5'-3'エキソヌクレアーゼ活性のアミノ酸決定因子は定義されている(例えば大腸菌のDNAポリメラーゼI)(Gutman等, Nucl. Acids Res. 21：4406-4407, 1993)。5'エキソヌクレアーゼドメインは、例えば大腸菌のポリメラーゼIのクレノウ断片に示されるように、ポリメラーゼ活性にとっては重要ではない。クレノウ断片は、5'エキソヌクレアーゼ活性の欠如した天然のタンパク質分解断片である(Joyce等, J. Biol. Chem. 257：1958-1964, 1990)。この活性が欠如しているポリメラーゼは、DNA配列決定の際に特に役立つ。
【００４０】
5'-3'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少したDNAポリメラーゼは、(1)対応する野生型酵素の5'-3'エキソヌクレアーゼ活性の約10％以下または約1％以下の活性を有する突然変異型DNAポリメラーゼ、あるいは(2)約1ユニット/mgタンパク質、好ましくは約0.1ユニット/mgタンパク質未満の5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼである。
【００４１】
5'-3'エキソヌクレアーゼ活性は配列ゲルで観察可能である。5'-3'エキソヌクレアーゼ活性は、配列ゲル中の放射標識付プライマーの分解に基づいて測定可能である。従って、この活性の相対量、すなわち野生型のポリメラーゼと突然変異型のポリメラーゼの比較は、ルーチンの実験で決定するしかない。
【００４２】
オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発は、突然変異型DNAポリメラーゼの生成に利用できる。この技術を用いれば、コードするDNA分子の特定部位で、塩基対をいくらでも変更可能である。この技術は、一般的に、関心対象の天然DNAポリメラーゼをコードする一本鎖ヌクレオチド配列に相補的な(一つ以上の所望のミスマッチを除く)オリゴヌクレオチドのアニーリングにも関係している。ミスマッチのオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼにより延長されることにより、一方の鎖の配列に所望の変更を含んでいる二本鎖DNA分子を生成する。勿論、配列の変更は、アミノ酸の欠損、置換および/または挿入を導く。変更された鎖は、二本鎖ポリヌクレオチドを形成するテンプレートとして用いられる。この二本鎖ポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入すれば、突然変異型ポリペプチドが生成できる。上述のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発は、当業者に公知の技術、例えばPCRを用いて実行できる。一つの実施態様によれば、エキソヌクレアーゼ活性を変更するようにデザインされる突然変異はポリメラーゼ活性に悪い影響を及ぼさない。
【００４３】
DNAポリメラーゼブレンド
DNAポリメラーゼブレンドは少なくとも二つの熱安定性DNAポリメラーゼを含有しており、その少なくとも一つは5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少しており、少なくとも一つは5'エキソヌクレアーゼ活性を有している。「エキソ＋」はDNAポリメラーゼが5'エキソヌクレアーゼ活性を有していることを意味しており、「エキソ−」はDNAポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼ活性が減少している、または実質的に減少していることを意味している。DNAポリメラーゼブレンドの最適5'エキソヌクレアーゼ活性は、エキソ−およびエキソ＋DNAポリメラーゼの比率を変えることによって得られる。最適比率は使用される特定のポリメラーゼブレンド次第であり、当業者ならば本明細書記載の方法を用いて容易に決定できる。
【００４４】
エキソ−突然変異株は、挿入、欠損、フレームシフト変異、点変異のうち少なくとも一つを含んでいる。欠損変異はN末端、C末端および/または内部に生じる。一つの実施態様では、一つ以上の点変異、ひいては一つ以上のアミノ酸置換が、5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少しているポリメラーゼを生成するのに用いられる。そういう突然変異は当業者に周知の数多くの方法によって実行できる。それには部位特異的突然変異誘発も含まれるが、これだけに限定されるものではない。部位特異的突然変異誘発を用いれば、コードするDNA分子の特定部位で、塩基対をいくらでも変更可能である。この技術は、一般的に、関心対象のDNAポリメラーゼをコードする一本鎖ヌクレオチド配列に相補的な(一つ以上の所望のミスマッチを除く)オリゴヌクレオチドのアニーリングにも関係している。ミスマッチのオリゴヌクレオチドは、DNAポリメラーゼにより延長されることにより、一方の鎖の配列に所望の変更を含んでいる二本鎖DNA分子を生成する。配列の変更は、アミノ酸の欠損、置換および/または挿入を導く。この二本鎖ポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入すれば、突然変異型ポリペプチドが生成される。この手順はPCRを用いて行なってもよい。
【００４５】
上述した通り、エキソ−およびエキソ＋DNAポリメラーゼは同じポリメラーゼ(例えば両方ともTfiポリメラーゼ)であってもよいし、あるいは異なるポリメラーゼ(例えばTfiおよびTziポリメラーゼ)であってもよい。一つの実施態様では、点変異を有しており、従って5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少しているTfiポリメラーゼが用いられる。別の実施態様では、Tfiエキソ−ポリメラーゼはasp144からala144(D144A)の点変異を有している。別の実施態様では、ポリメラーゼはasp121からala121(D121A)の点変異を有している。本明細書では例として、D144A 5'エキソヌクレアーゼ突然変異体が用いられるが、DNAポリメラーゼの成分として5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少している突然変異型DNAポリメラーゼであればどれを用いても、本発明の範囲に含まれる。
【００４６】
DNAポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少している一つ以上の突然変異体に加えて、ポリメラーゼは熱安定性を増大させる一つ以上の突然変異体を含む場合もある。例えば、Tfiは、5'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に減少させる点変異に加えて、熱安定性を増大させる一つ以上の突然変異体を含む場合もある。そういう突然変異体の一つはglu437からasp437(E437D)である。一つの実施態様では、Tfi DNAポリメラーゼは二つの点変異(D144AおよびE437D)を有している。このポリメラーゼは、エキソ−活性が実質的に減少しており、しかも熱安定性が向上している。本明細書ではD144A/E437Dの二重突然変異体を例として挙げているが、DNAポリメラーゼブレンドの成分として、5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少しており、しかも熱安定性が向上している突然変異型DNAポリメラーゼ(例えば5'エキソ活性が実質的に減少し、熱安定性が向上する結果をもたらす二つの点変異を有するもの)であればどれを使用しても、本発明の範囲に含まれる。突然変異型ポリメラーゼの5'エキソヌクレアーゼ活性および熱安定性は、当技術分野で公知の方法および本明細書記載の方法で決定できる。本明細書記載のエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドは、エキソ−対エキソ＋の比率が約9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8または1：9のものを使用できる。一つの実施態様では、エキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドは、エキソ−対エキソ＋の比率が約7：3のものが使用される。
【００４７】
本明細書記載の組成物および方法に使用される熱安定性のDNAポリメラーゼは、テルムス・テルモフィラス(Tth)DNAポリメラーゼ、テルムス・アクアティクス(Taq)DNAポリメラーゼ、テルモコッカス・ジリジ(Tzi)DNAポリメラーゼ、テルモトガ・ネオポリタナ(Tne)DNAポリメラーゼ、テルモトガ・マリチマ(Tma)DNAポリメラーゼ、テルムス・フィリフォルミス(Tfi)DNAポリメラーゼ、シュトッフェル断片、テルモスクリプト(Thermoscript)(登録商標)、スーパースクリプトI(SuperscriptI)(登録商標)、スーパースクリプトII(SuperscriptII)(登録商標)、スーパースクリプトIII(SuperscriptIII)(登録商標)、テルモコッカス・リトラリス(TliまたはVENT(商標))DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・フリオサス(Pfu)DNAポリメラーゼ、DEEPVENT(商標)DNAポリメラーゼ、ピロコッカス・ウーシイ(Pwo)DNAポリメラーゼ、ピロコッカス属の種KOD2(KOD)DNAポリメラーゼ、バチルス・ステアロテルモフィラス(Bst)DNAポリメラーゼ、バチルス・カルドフィラス(Bca)DNAポリメラーゼ、スルフォロブス・アシドカルダリウス(Sac)DNAポリメラーゼ、テルモプラズマ・アシドフィラム(Tac)DNAポリメラーゼ、テルモス・フラブス(Tfl/Tub)DNAポリメラーゼ、テルムス・ルーバー(Tru)DNAポリメラーゼ、テルムス・ブロッキアヌス(DYNAZYME(商標))DNAポリメラーゼ、メタノバクテリウム・テルモオートトロフィカム(Mth)DNAポリメラーゼ、マイコバクテリウムDNAポリメラーゼ(例えばMtb、Mlep)、および一般的にPol IおよびPol IIIタイプのポリメラーゼおよびそれらの突然変異体または変異株を含むが、これだけに限定されるものではない。
【００４８】
こういうポリメラーゼは、例えば、米国特許第5,436,149号、米国特許第4,889,818号、米国特許第4,965,188号、米国特許第5,079,352号、米国特許第5,614,365号、米国特許第5,374,553号、米国特許第5,270,179号、米国特許第5,047,342号、米国特許第5,512,462号、国際公開公報第92/06188号、国際公開公報第92/06200号、国際公開公報第96/10640号、国際公開公報第97/09451号、Barnes, W.M. Gene 112：29-35(1992)、Lawyer, F.C.等, PCR Meth. Appl. 2：275-287, 1993、Flaman, J.-M.等, Nucl. Acids Res. 22：3259-3260, 1994、および米国特許出願第10/244,081号(2002年9月16日出願)などに記載されている。Tzi DNAポリメラーゼは、同時係属中の米国特許出願第60/647,408号(2005年1月28日出願)に記載されており、これらは、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４９】
野生型Tfi DNAポリメラーゼ(テルムスRt41A DNAポリメラーゼとしても知られる)の全ヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：1および2として本明細書に記載され、参照により本明細書に組み入れられるPCT国際公開公報第03/025132号ではそれぞれ表15および16に記載されている。
【００５０】
配列番号：1：
2008546422.tif 000003
【００５１】
配列番号：2：
2008546422.tif 000004
【００５２】
突然変異型核酸ポリメラーゼ
本明細書には、5'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に減少しているが、ポリメラーゼ活性の実質的なレベルを保持しているポリメラーゼをコードする単離核酸も記載されている(例えば、野生型Tfi DNAポリメラーゼをコードする配列番号：1の配列を有する単離核酸の点変異)。「実質的なレベル」と言うのは、対応する野生型ポリメラーゼのポリメラーゼ活性の少なくとも約25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％または100％を意味する。一つの実施態様では、突然変異型ポリメラーゼをコードする核酸は、以下に記載するように、プロモーターに機能的に連結されている、および/またはベクター(例えば発現ベクター)に挿入されている。一つの実施態様では、核酸は、配列番号：2(野生型Tfi DNAポリメラーゼ)のアミノ酸配列を有するDNAポリメラーゼをコードする。
【００５３】
クローニングおよびDNAポリメラーゼの発現
DNAポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングするには、適切な細胞タイプから得られる関心対象のポリメラーゼ遺伝子を含む単離DNA(例えばcDNA)を用いて、分子生物学の技術分野で公知の通常の方法(例えば、Molecular Cloning, a Laboratory Manual (2nd ed.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)により、ベクターに組換えDNAライブラリーを構築する。野生型または突然変異型DNAポリメラーゼをクローニングするには、組換えDNAライブラリーを形質転換させる宿主と適合するならば、当技術分野で公知のどのベクターを使用しても構わない。
【００５４】
本明細書記載のポリメラーゼの発現を最適化するには、当技術分野で公知の誘発可能なプロモーターまたは構成プロモーターを用いて、組換え宿主内で、高レベルのポリメラーゼ構造遺伝子を発現させてもよい。同様に、高レベルの発現を達成するには、高コピー数のベクターを用いてもよい。誘発可能な高コピー数を有するベクターも、組換え宿主内でポリメラーゼの発現を向上させるのに有効である。
【００５５】
プラスミドライブラリーを構築するための原核生物ベクターには、大腸菌で複製可能なプラスミドも含まれる。例えば、pBR322、pET-26b(+)、ColE1、pSC101、pUCベクター(pUC18、pUC19等、Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)などであるが、これだけに限定されるものではない。バチルスプラスミドにはpC194、pC221、pC217等が含まれる(Glyczan, Molecualr Biology Bacilli, Academic Press, New York, pp307-329, 1982)。適切なストレプトミセスプラスミドにはpIJ101が含まれる(Kendall等, J. Bacteriol. 169：4177-4183, 1987)。シュードモナスプラスミドはJohn等(Rad. Insec. Dis. 8：693-704, 1986)およびIgaki(Jpn. J. Bacteriol. 33：729-742, 1978)によって総説されている。広範な宿主範囲のプラスミドまたはコスミド、例えばpCP13(Darzins等, J. Bacteriol. 159：9-18, 1984)も本発明には使用可能である。
【００５６】
野生型または突然変異型のDNAポリメラーゼ遺伝子は、大腸菌または他の細菌種、例えばエシェリキア、シュードモナス、セラチア、プロテウス等を含むがこれに限定されない原生生物の宿主でクローニングしてもよい。真核生物の宿主も、野生型または突然変異型ポリメラーゼのクローニングおよび発現に利用できる。こういう宿主には、酵母、真菌および哺乳動物の細胞も含まれる。こういう真核生物の細胞で所望のDNAポリメラーゼを発現させるには、真核生物のプロモーターを含む真核生物の調節領域の利用が関係する場合もある。真核生物の細胞で野生型または突然変異型ポリメラーゼ遺伝子をクローニングおよび発現させるのは、公知の真核生物ベクターシステムを用いた公知の技術によって行なってもよい。
【００５７】
宿主は通常の公知の技術で形質転換できる。一つの実施態様では、形質転換した大腸菌のコロニーは、ニトロセルロース膜に移し、培養し、熱安定性のDNAポリメラーゼの発現をスクリーニングする。形質転換した細胞がニトロセルロース上で成長したら、標準の技術を使ってその細胞を溶解し、膜を摂氏95度で5分間処理し、内因性の大腸菌酵素を不活性化する。使用する宿主およびクローニングするDNAポリメラーゼの温度安定性次第では、他の温度で宿主のポリメラーゼを不活性化してもよい。安定したDNAポリメラーゼ活性は、公知の技術(すなわち、Sanger等, Gene 97：119-123, 1991)を用いて、DNAポリメラーゼの活性をアッセイすることにより検出する。
【００５８】
そういう核酸分子を含む宿主細胞、およびそういう核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞も、本明細書に記載されている。ポリペプチドを生成する方法(例えば、そういう核酸分子を使ってポリペプチドを生成する方法)も含まれている。特定の実施態様では、ポリペプチドは(1)単離、(2)実質的に純粋および/または(3)本質的に純粋な形で提供される。その他、一つ以上のポリペプチドおよび/または本明細書記載のポリヌクレオチドを含む組成物および混合物(例えば反応混合物)も含まれる。
【００５９】
野生型または突然変異型のDNAポリメラーゼの発現を最適化するには、誘発可能なプロモーターまたは構成プロモーターが良く知られており、組換え宿主内で、高レベルのポリメラーゼ構造遺伝子を発現させるのにそういうプロモーターを用いてもよい。同様に、当技術分野で公知の高コピー数のベクターを用いて、組換え宿主内でDNAポリメラーゼの発現を達成または向上させてもよい。
【００６０】
原核生物の細胞(例えば、大腸菌、枯草菌、シュードモナス等)で所望の構造遺伝子を発現させるには、遺伝子は機能性の原核生物プロモーターに機能的に連結されていてもよい。しかし、天然のプロモーターが原核生物の宿主で機能し、ポリメラーゼ遺伝子を発現させる場合もある。従って、天然のプロモーターまたは他のプロモーターが、DNAポリメラーゼ遺伝子の発現に利用できる。そういう他のプロモーターは発現を向上させるために使用してもよいし、構成プロモーターか調節可能(すなわち誘発可能または抑制解除可能)プロモーターであってもよい。構成プロモーターには、バクテリオファージλのintプロモーターおよびpBR322のβ-ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーターが含まれる。誘発可能な原核生物のプロモーターには、バクテリオファージλの主要左右プロモーター(PRおよびPL)、大腸菌のtrp、recA、lacZ、lacI、tet、gal、trcおよびtacプロモーターが含まれる。枯草菌のプロモーターには、α-アミラーゼ(Ulmanen等, J. Bacteiol 162：176-182(1985))およびバチルスバクテリオファージプロモーター(Gryczan, T., 前出)が含まれる。ストレプトミセスプロモーターはWard等, Mol. Gen. Genet. 203：468-478, 1986により記載されている。原核生物のプロモーターはGlick, J. Ind. Microbiol. 1：277-282, 1987、Cenatiempto, Y., Biochimie 68：505-516, 1986およびGottesman, Ann. Rev. Genet. 18：415-442(1984)により総説されている。原核生物の細胞での発現には、配列をコードする遺伝子の上流にリボソーム結合部位が存在する必要がある。そういうリボソーム結合部位は、例えば、Gold等, Ann. Rev. Microbiol. 35：365-404(1981)により開示されている。
【００６１】
一つの実施態様では、本明細書記載のDNAポリメラーゼは、クローニングしたポリメラーゼ遺伝子を含有しそれを発現する組換え宿主を発酵させることにより生成される。目的の好温菌またはクローニングしたDNAポリメラーゼ遺伝子を含む宿主が同化し得る栄養素であれば、何でも、培地に加えてよい。最適培養条件は、使用する菌株および培地の組成によって、ケースバイケースで選択すべきである。所望の遺伝子を含むベクターDNAの発現を維持するため、抗生物質を増殖培地に添加してもよい。
【００６２】
本発明のDNAポリメラーゼを生成する組換え宿主細胞は、例えば遠心分離によって培養液から分離できる。一般的に、集めた微生物細胞は適切な緩衝液に分散し、超音波処理または他の公知の手順に従ってそれを分解し、緩衝液が酵素を抽出しやすくする。超遠心分離または遠心分離によって細胞残屑を除去した後、DNAポリメラーゼは、抽出、沈殿、クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、電気泳動など、標準のタンパク質精製技術を使って精製する。DNAポリメラーゼの存在を精製中に検出するアッセイは当技術分野では公知であり、通常の生化学的精製方法を使用しながら、そういう酵素の存在の決定に利用可能である。
【００６３】
エキソ−/エキソ＋ポリメラーゼブレンドおよび突然変異型ポリメラーゼ
本明細書記載のエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドまたは突然変異型ポリメラーゼは、公知のDNA配列決定、DNA標識化、DNA増幅またはcDNA合成反応に利用してよい。ポリメラーゼブレンドおよびポリメラーゼは、多型DNA断片の分析および/または分類に用いてもよい。DNAは以下に記載する所望の源から自由に入手可能である。
【００６４】
DNA源
適切なDNA源は、種々の細胞、組織、器官または有機体も含めて、多くの商業的源から入手可能である(例えば、American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Md.；Jackson Laboratories, Bar Harbor, Me.；Cell Systems, Inc., Kirkland, Wash.；Advanced Tissue Sciences, La Jolla, Calif.)。一つの実施態様では、ゲノムDNA調製の出発材料として用いられる細胞は、真核生物(例えば、真菌または酵母、原生動物および他の寄生虫、ヒトおよび他の哺乳類を含む動物など)である。哺乳動物の細胞はすべてDNAの調製に使用可能であり、例えば、血液細胞(赤血球および白血球)、内皮細胞、上皮細胞、神経細胞(中枢神経または末梢神経系由来)、筋肉細胞(骨格菌、平滑筋または心筋由来の筋細胞および筋芽細胞を含む)、結合組織細胞(線維芽細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、軟骨芽細胞、骨細胞および骨芽細胞を含む)、他の間質細胞(マクロファージ、樹状突起細胞、シュワン細胞)などである。上記の体細胞を与える前駆体、前駆細胞および幹細胞などの他の細胞も同様に適切である。同様にDNAの調製に適しているのは、脳、腎臓、肝臓、膵臓、血液、骨髄、筋肉、神経、皮膚、尿生殖器系、循環器系、リンパ系、消化器系および結合組織源の哺乳動物の組織または器官、ならびに哺乳動物(ヒトも含む)の胚または胎児由来の組織または器官である。こういう細胞、組織および器官は正常なものであっても良いし、病的なものであっても良い。
【００６５】
DNA配列決定
周知のように、配列決定反応(恒温DNA配列決定およびDNAのサイクル配列決定)にはDNAポリメラーゼの使用が要求される。ジデオキシ仲介の配列決定には、DNAポリメラーゼを用いた延長工程に特定のポリマーを使用する連鎖停止技術、塩基特異的な連鎖停止剤、および最初のDNA分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように、新たに合成された連鎖停止DNA分子を大きさごとに分離するためのポリアクリルアミドゲルの使用が関係する。特に、DNA分子の配列決定は、塩基特異的な停止剤を含有するそれぞれ異なる四つのDNA配列決定反応を用いて行なわれる。例えば、第一の反応はG特異的な停止剤を含んでおり、第二の反応はT特異的な停止剤を含んでおり、第三の反応はA特異的な停止剤を含んでおり、第四の反応はC特異的な停止剤を含んでいる。好ましい停止剤ヌクレオチドの一つは、ddATP、ddTTP、ddGTP、ddITP、ddCTPなどのジデオキシリボヌクレオシド三リン酸(ddNTP)である。ジデオキシリボヌクレオシド三リン酸の類似体は当技術分野では公知であり、それも使用可能である。
【００６６】
DNA分子の配列決定を行なう場合、ddNTPはデオキシリボース塩基の3'の位置の水酸基残基が欠如しているので、DNAポリメラーゼによって成長するDNA鎖に取り込まれるけれども、3'水酸基残基の欠如のゆえに、次のリン酸ジエステル結合の形成が妨げられ、その結果、DNA分子の延長が停止する。従って、一種類のddNTPを少量、配列決定反応混合物の中に添加しておけば、鎖の延長と塩基特異的な停止との間に競合が生じ、その結果、配列決定対象のDNAテンプレートよりも短い合成DNA分子の集団が得られる。四つの異なる酵素反応に四つの異なるddNTPを用いれば、合成されたDNA分子の集団は大きさにより分離されるので、最初のDNA分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部が決定される。ジデオキシヌクレオチドによるDNA配列決定は良く知られており、前出のSambrook等により記載されている。勿論、本明細書に記載のエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドおよび突然変異型DNAポリメラーゼは、こういう配列決定反応に使用できる。
【００６７】
周知のように、配列決定反応には、検出可能に標識されたヌクレオチドが通常用いられる。標識ヌクレオチドはいくらでも配列決定(または標識)反応に使用可能である。それには、ラジオアイソトープ、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識などが含まれるが、それだけに限定されるものではない。
【００６８】
ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)
良く知られているDNA増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、DNAポリメラーゼとデオキシリボヌクレオシド三リン酸を用いて標的DNAテンプレートを増幅する工程である。そういうPCR反応では、増幅対象の第一のDNA分子鎖の3'末端(または3'末端の近く)に相補的なプラマーと、増幅対象の第二のDNA分子鎖の3'末端(または3'末端の近く)に相補的な第二プラマーが、それぞれのDNA鎖にハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下、DNAポリメラーゼによって、第一鎖に相補的な第三DNA分子および増幅対象のDNA分子の第二鎖に相補的な第四DNA分子が合成される。この合成により、二つの二本鎖DNA分子が得られる。こういう二本鎖DNA分子は、次に、DNAポリメラーゼ、プライマーおよびデオキシリボヌクレオシド三リン酸を供給することにより、さらにDNA分子合成のDNAテンプレートとして用いられる。周知の通り、追加の合成は、最初の反応を(過剰のプライマーとデオキシリボヌクレオシド三リン酸を添加することにより)「サイクリング」し、複数の変性と合成工程を経て行なわれる。通常、二本鎖DNAを一本鎖DNAテンプレートに変性させるのは、高温で行なわれる。本明細書記載のエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドおよび突然変異型DNAポリメラーゼは熱安定性であるので、DNA増幅反応中のそういう熱サイクルでは破壊されない。要するに、こういうDNAポリメラーゼブレンドおよび突然変異型DNAポリメラーゼはPCR反応に理想的に適している。特に、増幅中DNA分子の変性に高温が使用される場合に適している。本明細書記載のエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドおよび突然変異型DNAポリメラーゼは当業者に公知のあらゆるPCR法、例えば、エンドポイントPCR、リアルタイムqPCR(米国特許第6,569,627号、米国特許第5,994,056号、米国特許第5,210,015号、米国特許第5,487,972号、米国特許第5,804,375号、米国特許第5,994,076号、これらの内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる)、対立遺伝子特異的増幅、リニアPCR、ワンステップ逆転写酵素(RT)-PCR、2ステップRT-PCR、突然変異誘発性PCR、マルチプレックスPCR、同時係属中の米国特許出願第09/599,594号(内容はその全体が参照により本明細書に組み入れられる)記載のPCR法などに用いることができる。
【００６９】
cDNAの調製
本明細書記載のエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドおよび突然変異型DNAポリメラーゼは、mRNAテンプレートからcDNAを調製する際にも利用できる。例えば、米国特許第5,405,776号および同第5,244,797号(これらの開示は参照により本明細書に組み入れられる)を参照のこと。従って、本発明はmRNAからcDNAを調製する方法にも関係しており、(a)mRNAをオリゴ(dT)プライマーまたは他の相補プライマーに接触させてハイブリッドを作成する工程、および(b)工程(a)で作成されたハイブリッドに本発明のDNAポリメラーゼブレンドまたは突然変異型ポリメラーゼおよび四種類のdNTPを接触させてcDNA-RNAハイブリッドを得る工程がそれに含まれる。工程(b)の反応混合物が、生成されるcDNAに相補的な適切なオリゴヌクレオチドを更に含んでいる場合は、第一鎖合成後にdsDNAを得ることも可能である。要するに、本発明は、本明細書記載のエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドおよびポリメラーゼを用いてdsDNAを調製する方法にも関係している。
【００７０】
別の実施態様は、エキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドおよび突然変異型DNAポリメラーゼを含む核酸合成、配列決定または増幅のための組成物および反応に関する。こういう混合物には、ポリメラーゼブレンドまたは突然変異型ポリメラーゼ、一つ以上のdNTP(dATP、dTTP、dGTP、dCTP)、核酸テンプレート、オリゴヌクレオチドプライマー、マグネシウム、緩衝塩などが含まれる。あるいは他の成分(例えば非イオン性洗浄剤)を含んでいてもよい。配列決定反応の場合は、一つ以上のddNTPを含んでいてもよい。dNTPまたはddNTPは、非標識であってもよいし、蛍光、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識または放射性標識で標識してもよい。ある実施態様では、DNAポリメラーゼブレンドまたは突然変異型DNAポリメラーゼを含む組成物は、参照により内容全体が本明細書に組み入れられるPCT国際公開公報第98/06736号に記載の方法で配合してもよい。
【００７１】
ある実施態様では、キットが提供される(例えば、本明細書記載の方法を実施するために使用するキット)。そういうキットには、エキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドおよび突然変異型DNAポリメラーゼに加えて、一つ以上の抗DNAポリメラーゼ抗体、一つ以上の宿主細胞(好ましくは核酸分子を摂取する能力のある宿主細胞)、一つ以上の核酸(例えば、核酸テンプレート)、一つ以上のヌクレオチド、一つ以上の核酸プライマー、一つ以上のベクター、一つ以上のリガーゼ、一つ以上のトポイソメラーゼおよび一つ以上の緩衝液または緩衝塩からなる群より選択される一つ以上の成分を含んでいてもよい。
【００７２】
多型DNA断片の分析および分類
一つの実施態様では、第一の個人と第二の個人の関係は、ミニサテライトまたはマイクロサテライトDNA配列のような特定の多型DNA断片を分析および分類することにより決定される。こういう方法では、各個人の増幅断片が比較され、類似性と相違性が決定される。そういう分析では、例えば、各個人の増幅断片の大きさ、あるいは各個人の増幅断片の配列が比較される。本発明の別の実施態様では、遺伝的同一性が決定できる。そういう同一性試験は、例えば、親子鑑定や法医学分析などで重要である。こういう本発明の実施態様では、DNAを含む試料を分析し、それが一人以上の個人から得た試料と比較される。このような本発明の一つの実施態様では、一つのDNA試料が第一の個人から得られ、別の試料が第一の個人との関係が不明な第二の個人から得られる。第一の個人と第二の個人から得られるこれらの試料を本発明の方法を用いて比較することにより、遺伝的同一性または第一の個人と第二の個人の関係が決定できる。特に好ましい実施態様では、第一のDNA試料は既知の個人から得られる既知の試料であり、第二のDNA試料は、例えば、犯行現場の物質から得られる未知の試料である。本発明の別の実施態様では、一つのDNA試料が第一の個人から得られ、別の試料が第一の個人と関係している第二の個人から得られる。本発明の方法を用いて第一の個人と第二の個人から得られるこれらの試料を比較することにより、例えば、多型、ミニサテライト、マイクロサテライトまたはSTR DNA断片のメンデル遺伝の調査が可能となり、第一の個人と第二の個人の遺伝学的血縁関係が決定できる。
【００７３】
本発明の別の実施態様では、関心対象の遺伝子をコードする遺伝マーカーとして重要なDNA断片が同定および単離できる。例えば、異なる源からの試料を比較することにより、感染症(細菌、真菌、寄生虫またはウイルス起源)、癌、遺伝病などの病気の原因に関係しているDNA断片の同定および特徴付けが可能となる。本発明のこの実施態様では、正常な細胞または組織から得られるDNA試料と病気の細胞または組織から得られるDNA試料が比較される。本発明に従って比較することにより、一つのDNA試料には含まれているが片方のDNA試料には存在しない一つ以上のユニークな多型断片が同定および分離できる。そういうユニークな多型断片を同定することにより、発病に関連または関係している配列の同定が可能となる。
【００７４】
ゲル電気泳動は、通常、濃度3〜12％(例えば8％)のポリアクリルアミドおよび濃度約4〜12M(例えば8M)の尿素を含むゲルを用いる標準の手順に従って、アガロースまたはポリアクリルアミド配列決定ゲル上で行なわれる。試料はゲルに負荷されるが、その後の比較を簡便化するため、異なるゲノムDNA源から調製される増幅DNA断片を含む試料を隣のレーンにも負荷する。試料の比較を容易にするため、既知の大きさの基準マーカーが用いられる。電気泳動により分離されたDNA断片は、オートラジオグラフィーなどの当業者には公知の種々の技術を用いて視覚化および同定される。オートラジオグラフフィルムを調べることにより、多型断片パターンの違い(「分類」)、あるいはゲルの一つのレーンに一つ以上のユニークなバンドが存在するかどうか(「識別」)が判明する。他のレーンには観察されないバンドが一つのレーン(単一の試料、細胞または組織タイプに対応)に存在する場合、それはそのユニークなバンドを含むDNA断片が源特異的であり、多型DNA断片である可能性が高いことを示している。
【００７５】
キット
本明細書記載のエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドおよび突然変異型ポリメラーゼは、キットの調製に適している。こういうポリメラーゼブレンドまたはポリメラーゼを含むキットは、キットの内容次第であるが、公知の技術を用いて、検出可能なDNA分子の標識化、DNA配列決定、DNA分子の増幅、あるいはcDNA合成に利用できる(その開示が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,962,020号、米国特許第5,173,411号、米国特許第4,795,699号、米国特許第5,498,523号、米国特許第5,405,776号、米国特許第5,244,797号を参照)。こういうキットは、バイアルや試験管など一つ以上の容器手段をぴったりと収容するように分画された支持手段を備えていてもよい。こういう容器手段のそれぞれには、DNA配列決定、DNA標識化、DNA増幅またはcDNA合成を行なうのに必要な成分または成分の混合物が含まれる。
【００７６】
そういうキットには、エキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドおよび突然変異型DNAポリメラーゼに加えて、一つ以上の抗DNAポリメラーゼ抗体、一つ以上の宿主細胞(好ましくは核酸分子を摂取する能力のある宿主細胞)、一つ以上の核酸(例えば、核酸テンプレート)、一つ以上のヌクレオチド、一つ以上の核酸プライマー、一つ以上のベクター、一つ以上のリガーゼ、一つ以上のトポイソメラーゼおよび一つ以上の緩衝液または緩衝塩からなる群より選択される一つ以上の成分を含んでいてもよい。
【００７７】
キットの構成要素は、通常、個別の容器または一緒の容器(例えば、バイアル、チューブ、アンプル、瓶など)に入れて提供される。キットには、通常、核酸の合成、増幅、配列決定方法などを記載した説明書などの梱包材が含まれている。第一の容器には、例えば、実質的に精製された各ポリメラーゼの試料が含まれている。第二の容器には、例えば、DNAテンプレートに相補的なDNA分子を合成するのに必要な一種類以上のヌクレオチドが含まれている。第三の容器には、一種類以上のジデオキシヌクレオシド三リン酸が含まれる。第四の容器には、ピロホスファターゼが含まれる。キットには、上述の容器に加えて、一種類以上のDNAプライマーを含む容器も含まれている場合がある。DNAを増幅するのに使用されるキットには、例えば、本明細書記載の実質的に純粋なエキソ−およびエキソ＋DNAポリメラーゼまたは実質的に純粋なエキソ−DNAポリメラーゼを含む第一の容器、および一種類のヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物を含む一つ以上の容器が含まれる。キットには、DNAを増幅するための種々のプライマーが含まれる場合もあれば、含まれていない場合もある。種々のキット構成要素が別々の容器に提供されるのではなく、同じ容器に種々の組み合わせで提供される場合もある。例えば、エキソ−/エキソ＋ポリメラーゼおよびヌクレオチドが同じ容器に入って提供される場合もあれば、エキソ−、エキソ＋およびヌクレオチドが別々の容器に入って提供される場合もある。
【００７８】
cDNA合成用のキットには、エキソ−/エキソ＋ポリメラーゼブレンドを含む第一の容器、四種類のdNTPを含む第二の容器およびオリゴ(dT)プライマーを含む第三の容器が含まれる(その開示が参照として本明細書に組み入れられる米国特許第5,405,776号、米国特許第5,244,797号を参照)。本発明のエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドおよびエキソ−DNAポリメラーゼはdsDNAの調製にも使用可能なので、第四の容器は第一鎖cDNAに相補的な適切なプライマーを含んでいる場合もある。勿論こういう試薬を一つ以上組み合わせ、それを単一のチューブに入れて提供することも可能である。本発明のキットには、必要ならば、DNA分子の合成または配列決定中に使用される検出可能に標識されたヌクレオチドを含む容器を加えてもよい。いくつかの標識のうち一つをそういうヌクレオチドを検出するのに用いてもよい。標識としては、例えば、ラジオアイソトープ、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識、酵素標識などが含まれるが、これだけに限定されるものではない。
【００７９】
以上、実施態様について一般的な説明を行なったが、以下に実施例を挙げてより詳細に説明したい。但し、実施例はあくまでも例として挙げたものであり、本発明を限定するものではない。
【００８０】
実施例
実施例1
Tfi遺伝子の合成
Tfi遺伝子は、PCRベースの遺伝子構築(Young等, Nucl. Acids Res., 2004)により136のヌクレオチドから合成した。このオリゴヌクレオチドはプログラムDNA Works 2.0(Hoover等, 2002)を用いて設計した。Tfiのタンパク質配列をDNA Worksにインプットし、パラメーターを大腸菌での発現を最適化するように、そして合成遺伝子のGC含量を最少にするように調整した。突然変異E437D(GAA→GAT)を含む完全合成の遺伝子製品は配列決定で確認し、pTTQのNdeI/HindIII制限部位にサブクローニングした。これをTfi 5'エキソ＋(またはエキソ＋)と呼ぶ。Tfi 5'エキソ−(またはエキソ−)は5'→3'エキソヌクレアーゼのドメインに別の突然変異、D144A(GAT→GAA)を含んでおり、製造元の指示に従って、Quikchange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を用いて、Tfiエキソ＋に導入した。TfiのオープンリーディングフレームのDNA配列は配列番号：1に示してあり、野生型のTfiタンパク質配列は配列番号：2に示してある。
【００８１】
実施例2
Tfi細胞培養
6リットルの調製物を得るため、6つの1リットルTfi培養物をLBアンピシリン(LB-amp)(100μg/ml)を含む3リットルのシェーカーフラスコで増殖した。培養物は、250rpmで常時攪拌しながら摂氏37度でインキュベートした。使用した二種類の菌株は以下の通りである。
Tfiエキソ＋株：DH10b中のpTTQ-Tfi-E437D
Tfiエキソ−株：DH10b中のpTTQ-Tfi-E437D/D144A
【００８２】
一日目、初期培地を作成し、200mlのLB-amp(100μg/ml)をDH10b(pTTQ-sRT41a-E437D/D144A)のグリセロールストックと一緒に接種した。細胞は摂氏37度、250rpmで一晩増殖させた。二日目、希釈した初期培地を30倍に希釈し、6つの1リットルLB-amp(100μg/ml)シェーカーフラスコに入れ、OD600が約1.0になるまで摂氏37度、250rpmで6〜8時間攪拌した。タンパク質発現は1mMのIPTGで誘発し、摂氏37度、250rpmで一晩(14〜16時間)継続した。細胞は遠心分離し、上澄み液は廃棄した。細胞ペレットは摂氏マイナス80度で凍結するか、実施例2に記載の方法で処理した。活性なポリメラーゼは凍結および新鮮な細胞ペーストから調製した。比活性に識別可能な違いは見られなかった。細胞重量は、培地1リットルあたり細胞ペースト約4gであった。
【００８３】
実施例3
Tfi DNAポリメラーゼ(エキソ＋およびエキソ−)の精製
細胞は溶解緩衝液(50mMトリスHCl、pH7.5、10mM KCl、1mM EDTA、6％グリセロール、1ml/20g細胞ペーストプロテアーゼ阻害剤カクテルおよび5mMの2-メルカプトエタノール)に懸濁し、フレンチプレスを通過させると、約85％の細胞溶解が行なわれた。試料は遠心分離し、溶解産物にBig ChapsおよびCHAPSOを添加した。濃度はそれぞれ0.001％および0.0001％とした。次に溶解産物は摂氏75度で20分加熱し、10分間混合した。その結果得られた溶解産物は、5M NaClをCf＝0.2Mに添加し、次に攪拌しながら10％ポリエチレンイミン(Polymin P)を摂氏4度でCf＝0.4％に添加することにより、Polymin Pで沈殿させた。試料は15〜20分間攪拌し、15,000rpmで15分間遠心分離した。その結果得られた溶解産物は、固体硫酸アンモニウムを45％(258g/1L)に添加し、次に摂氏4度で30分間攪拌することにより、硫酸アンモニウムで沈殿させた。試料は摂氏4度、15,000rpmで20分間遠心分離した。硫酸アンモニウムペレットを12ml緩衝液B(25mM Kpi、pH6.6、50mM KCl、0.1mM EDTA、8％グリセロール、5mM 2-メルカプトエタノール、0.001％Big CHAPS、0.0001％CHAPSO)に再懸濁し、それから1Lの緩衝液Bで一晩透析した。
【００８４】
次に、得られた試料は緩衝液Bで平衡化した床体積5.0mlのカラム(EM Science、カタログ番号116882-7)を用いて、EMD-SO4カラムクロマトグラフィに供した。ポンプAが緩衝液Bをポンプ輸送し、ポンプBが緩衝液C(25mM Kpi、pH6.6、700mM KCl、0.1mM EDTA、8％グリセロール、5mM 2-メルカプトエタノール、0.001％Big CHAPS、0.0001％CHAPSO)をポンプ輸送した。12mlの試料は0.45μmのシリンジフィルターで濾過し、流速1ml/分、0〜70％緩衝液Bのグラジエントで15カラム体積に適用した。フラクションサイズは2mlであった。画分にTfi DNAが存在することは、4〜20％トリスグリシンゲルを用いたドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS-PAGE)およびTfi DNAポリメラーゼの分子量とほぼ同じである94kDaバンドを視覚化することにより確認した。ポリメラーゼを含むピーク画分を集め、1Lの緩衝液D(25mMトリスCl、pH8.0、50mM KCl、0.1mM EDTA、8％グリセロール、5mM 2-メルカプトエタノール、0.001％Big CHAPS、0.0001％CHAPSO)で一晩透析した。
【００８５】
得られた試料は、直径2.0cm、床体積5mlのSource 30Qカラムクロマトグラフィ(Amersham)にかけた。カラムは緩衝液Dで平衡化した。ポンプAは緩衝液Dをポンプ輸送し、ポンプBは緩衝液E(25mMトリスHCl、pH8.0、500mM KCl、0.1mM EDTA、8％グリセロール、5mM 2-メルカプトエタノール、0.001％Big CHAPS、0.0001％CHAPSO)をポンプ輸送した。20mlの試料は0.45μmのシリンジフィルターで濾過し、流速1ml/分、0〜100％緩衝液Bのグラジエントで15カラム体積に適用した。フラクションサイズは2mlであった。ピーク画分は集め、Tfi貯蔵緩衝液(20mMトリスHCl、pH8.0、0.1mM EDTA、50％グリセロール、1mM DTT、0.1％Big CHAPS、0.01％CHAPSO)で一晩透析した。
【００８６】
実施例4
PCR最適化
PCR最適化用の開始点としてTaq 10X PCR緩衝液を使用した。最終5X Tfi緩衝液は、250mMトリスHCl、pH8.4、75mM (NH4)2SO4、25mM KCl、10％グリセロール、0.5％Big CHAPS、0.05％CHAPSO、1mM DTTであった。Tfi PCR反応物は、0.2μMのプライマー、200μMの各dNTP、1X Tfi PCR緩衝液、1.5mMのMgCl2、20〜200ngのテンプレートDNA、1〜5ユニットのTfi DNAポリメラーゼ(全量＝50μl)で構成された。サイクリング条件は、35サイクルを摂氏94度で15〜30秒、摂氏55度〜摂氏64度で30秒、そして摂氏70度で1分/kb行なった。PCR反応物10μlを0.4ug/mlの臭化エチジウム(EtBr)を含有するアガロースゲルで分析した。
【００８７】
実施例5
適合度判定
ポリメラーゼの適合度は、BRCA1エキソン11PCR増幅およびdHPLC分析を用いて判定した。増幅反応は、異なるDNAポリメラーゼを用いて行なった。要約すると、100ng K562ゲノムDNA、0.2μMの各プライマー、1X PCR反応緩衝液、1.5mMのMg2＋、200μMの各dNTPおよび水(最終容量50μl)からなる反応物中で、437塩基対の断片を増幅した。順方向プライマーは
2008546422.tif 000005
および逆方向プライマーは
2008546422.tif 000006
であった。サイクリング条件は、摂氏94度で2分、35サイクルを摂氏94度で15秒、摂氏58度で30秒、摂氏68度で45秒、摂氏68度で7分、そして摂氏4度で行なった。PCRサイクリングの後、5μlの反応混合物をWAVEシステムに直接負荷した。溶媒グラジエントは、WAVE Optimized(商標)緩衝液A(0.1M ETAA、pH7.0)とWAVE Optimized(商標)緩衝液B(0.1M ETAA、25％アセトニトリル、pH7.0)を混合し、60〜66％の緩衝液Bを摂氏56度で4.5分リニアグラジエントすることにより行なった。各分析後、DNASep(商標)Cartridgeを100％WAVE Optimized緩衝液Bを用いて0.5分間洗浄し、54％緩衝液Bで2分間平衡化し、次の試料注入の準備とした。ヘテロ二本鎖DNAを形成するPCRの割合(PCR誘引エラーの存在を示す)を決定するため、ホモ二本鎖ピークとヘテロ二本鎖ピークのピーク面積を計算した。
【００８８】
代表的なクロマトグラムを図1に示す。各ピークの割合も図に示してある。Tfiエキソ−/エキソ＋(比率7対3)、Taq(Invitrogen)およびTaq(Promega)の主要ホモ二本鎖ピークは、それぞれ約72％、65％および65％であった。
【００８９】
実施例6
Tfiエキソ−/エキソ＋ブレンドを用いたPCR
ヒトK562細胞ゲノムテンプレートDNAについてPCRを行い、1.5kbの標的(Rhod 1495)を増幅した。各反応は、50mMトリスHCl、pH8.4、15mM (NH4)2SO4、5mM KCl、2％グリセロール、0.2mMの各dNTP、1.5mMのMgCl2、0.02％Big Chap、0.002％Chapso、0.2mM DTT、0.2μMの各プライマーおよび100ngのK562ゲノムDNAの反応緩衝液で行なった。Rhod 1459の順方向プライマーは
2008546422.tif 000007
および逆方向プライマーは
2008546422.tif 000008
であった。PCR反応には、Tfiエキソ−(D144A/E437D)とTfiエキソ＋(E437D)DNAポリメラーゼの二つの酵素を使用した。Tfi DNAポリメラーゼのポリメラーゼおよびアミノ酸配列は、同時係属中の米国特許出願第10/244,081号(内容全体が参照により本明細書に組み入れられる)に記載してある。反応ごとに、5ユニットのポリメラーゼを異なるエキソ−/エキソ＋比率、すなわちエキソ−のみ、9：1、8：2、7：3、6：4、5：5、4：6、3：7、2：8、1：9、およびエキソ＋(エキソ−対エキソ＋の比率として表す)で、反応混合物に添加した。サイクリング条件(Perkin Elmer 9600サーマルサイクラー)は、1サイクルを摂氏94度で30秒、35サイクルを摂氏94度で30秒、35サイクルを摂氏94度で15秒、摂氏60度で30秒、摂氏68度で1.5分、そして1サイクルを摂氏68度で10分行なった。10μlのPCR反応産物は、0.4μg/ml臭化エチジウムを含有するアガロースゲルで分析した。その結果は図2に示してある。エキソ−TfiポリメラーゼはPCR産物の収率を向上させた。
【００９０】
実施例7
リアルタイムPCR
リアルタイムPCRは、TaqMan(登録商標)ヒトβ-アクチン標的を増幅するために用いた。各Tfi DNAポリメラーゼ反応は、50mMトリスHCl、pH8.4、15mM (NH4)2SO4、2％グリセロール、5mM KCl、0.02％Big Chap、0.002％Chapso、0.2mM DTT、3mMのMgCl2、0.5mMの各dNTP、0.2μMの各β-アクチンプライマー(以下を参照)、1X ROX参照染料、3.5ユニットのTfiエキソ−、1.5ユニットのTfiエキソ＋およびテンプレートとして用いるコピー数の異なるプラスミドDNAを含有する反応緩衝液で行なった。
【００９１】
各Taq DNAポリメラーゼ反応は、20mMトリスHCl、pH8.4、50mM KCl、3mMのMgCl2、0.5mMの各dNTP、0.2μMの各β-アクチンプライマー(以下を参照)、0.1μMのβ-アクチンプローブ(以下を参照)、1X ROX参照染料、1ユニットのTaq DNAポリメラーゼ、およびテンプレートとして用いるコピー数の異なるプラスミドDNAを含有する反応緩衝液で行なった。使用したβ-アクチンプライマーおよびプローブ配列は以下であった。
2008546422.tif 000009
【００９２】
サイクリング条件は、摂氏50度で2分、摂氏95度で2分、50サイクルを摂氏95度で15秒、摂氏60度で30秒行なった。結果は表1(Taq DNAポリメラーゼ)および表2(Tfiエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼ)に示してある。各表の最上段に示す数値は、PCRテンプレートとして用いたプラスミドDNAのコピー数である。NTCは未処理の対照を示す。
【００９３】
【表１】
2008546422.tif 000010
【００９４】
【表２】
2008546422.tif 000011
【００９５】
106〜100コピーにおいて、TfiおよびTaqの勾配はそれぞれ-3.39および-3.30であった。TfiおよびTaqの相関係数(R2)は、それぞれ0.995および0.986であった。この結果は、リアルタイムPCRにおいて、Tfiエキソ−/エキソ＋DNAポリメラーゼブレンドはTaq DNAポリメラーゼ同様に有効であることを示している。
【００９６】
実施例8
Tfiエキソ−/エキソ＋PCR反応における非イオン性洗浄剤
Tfiエキソ−/エキソ＋PCR反応との適合性について、100種類以上の非イオン性洗浄剤を調べた。適切な洗浄剤には、NP-40、トリトンX-100、Chaps、Chapso、N-ドデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド、Big CHAPS(N,N-ビス-(3-D-グルコンアミドプロピル)コラミド)、N-テトラデシル-N,N-ジメチルアミン-N-オキシド、N-デシル-β-D-マルトシド、N-ウンデシル-β-D-マルトシド、N-ドデシル-β-D-マルトシド、ジギトニン、J1、n-ドデシル-α-マルトシド、n-テトラデシル-β-D-マルトシド、1-S-デシル-β-D-チオマルトシド、1-S-ドデシル-β-D-チオマルトシド、メガ9、メガ10などが含まれる。これらの非イオン性洗浄剤は、糖類、N-オキシド、およびステロイドの三つのクラスに分類される。n-テトラデシル-β-D-マルトシド、n-ドデシル-α-マルトシド、n-ドデシル-β-マルトシドおよびジギトニンは、3kb標的の増幅が良好であった。二種類の良好な洗浄剤の組み合わせを種々試験して見た。その結果、0.1％Big Chapおよび0.01％Chapso、ならびに0.05％Big Chapおよび0.005％テトラデシル-β-D-マルトシドの組み合わせは、特にPCRで有効に機能した。
【００９７】
実施例9
Tfiエキソ−/エキソ＋感度
プラスミドおよびゲノムDNAの増幅に関して、Tfiエキソ−/エキソ＋(比率7：3)ブレンドの感度をTaqと比較した。ある範囲のDNAテンプレート濃度を用いて、約1,000bpの断片を増幅した。プラスミドDNAに関しては、1fgおよび100pgのpBR322を用いた。ゲノムDNA(Rhod 1033)に関しては、1pgから100ngを用いた。PCRでは、摂氏60度で30秒35サイクル、アニーリングを行い、摂氏72度で1分30秒延長を行なった。0.8％アガロースゲル電気泳動法により、最終産物の20％を160ボルトの設定で65分間分析した。結果(図3)は、TfiブレンドがTaqよりも感度が良いことを示している。
【００９８】
以上、明確化および理解のために、図および実施例を用いて本発明を詳細に記載したが、条件、フォーミュレーション、その他のパラメーターの広範かつ等価な範囲内で、本発明またはそのいかなる特定の実施態様の範囲に影響を与えることなく、本発明を部分修正または変更できること、さらにそういう部分修正または変更が添付の特許請求の範囲内にあることは、当業者にとって明らかである。
【００９９】
本明細書記載の出版物、特許および特許出願は、管轄権で認められていることを条件として、そういう個別の出版物、特許または特許出願が、まるで具体的/個別的に参照として編入されるよう指示されているかのように、すべて参照により本明細書に組み入れられる。2005年6月28日に出願された米国特許出願第11/170,762号(発明の名称「DNAポリメラーゼブレンドおよび突然変異型DNAポリメラーゼ(DNA Polymerase Blends and Mutant DNA Polymerases)」)は、管轄権で認められていることを条件として、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図1は、三種類のDNAポリメラーゼ、すなわちTfiエキソ−/エキソ＋ブレンド(比率7：3)(上)、Taq (Invitrogen)(中)およびTaq (Promega)(下)を用いたBRCAエキソン11 437bp増幅製品を示す代表的なクロマトグラムである。主要ピークはホモ二本鎖ピークで、PCR誘引のエラーの存在を示している。
【図２】図2は、異なる比率の5'(エキソ＋)および5'(エキソ−)Tfi DNAポリメラーゼを用いたRhod 1495遺伝子のPCR増幅製品を示すアガロースゲルの写真である。各反応には、異なるエキソ−：エキソ＋の比率を有する5ユニットの酵素が添加されている。ゲルの上部にエキソ−：エキソ＋の比率が示してある。各反応の10μlを臭化エチジウム含有のアガロースゲルで分析した。
【図３】図3は、Tfiエキソ−/エキソ＋ブレンド(比率7：3)とTaq DNAポリメラーゼ(Invitrogen)の感受性を比較するゲルの写真である。異なる量のプラスミドpBR322または約1,000 bpのゲノムK562細胞DNA断片を増幅し、アガロースゲル電気泳動で分析したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年8月27日(2008.8.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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