(57)【要約】式（Ｉ）によって表される化合物であって、同式において、Ｒは、スルフォニウム中心に対しβ−位置において、炭素−炭素二重結合、炭素−酸素二重結合、炭素−硫黄二重結合、炭素−窒素二重結合、炭素−炭素三重結合、炭素−窒素三重結合、または、芳香族炭素環またはヘテロ環システムを含み；Ｘ-は、１個以上の負電荷を持つ有機または無機の陰イオンであり；Ｚは、−ＣＲ1Ｒ2−、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲ3−であり；および、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、Ｈ、Ｄ、およびＣ1−Ｃ12アルキルから独立に選ばれる。
2008539166.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2008539166.tif 000022
によって表される化合物であって、
上式において、
Ｒは、スルフォニウム中心に対しβ−位置において、炭素−炭素二重結合、炭素−酸素二重結合、炭素−硫黄二重結合、炭素−窒素二重結合、炭素−炭素三重結合、炭素−窒素三重結合、または、芳香族炭素環またはヘテロ環システムを含み；
Ｘ-は、１個以上の負電荷を持つ有機または無機の陰イオンであり；
Ｚは、−ＣＲ1Ｒ2−、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲ3−であり；および、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、Ｈ、Ｄ、およびＣ1−Ｃ12アルキルから独立に選ばれる、
ことを特徴とする、前記化合物。
【請求項２】
Ｚが−ＣＲ1Ｒ2−であることを特徴とする、請求項１による化合物。
【請求項３】
Ｒ1およびＲ2がＨおよびＤから独立に選ばれることを特徴とする、請求項２による化合物。
【請求項４】
Ｒが、スルフォニウム中心に対するβ位置に−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、またはフェニル基を含むことを特徴とする、請求項１による化合物。
【請求項５】
前記有機または無機の陰イオンが、トリフルオロ酢酸塩、ギ酸塩、ハロゲン化物、およびスルフォン酸塩から選ばれることを特徴とする、請求項１から４のいずれか１項による化合物。
【請求項６】
Ｒが、官能基、Ｘ線回折データの位相角分析に好適な重原子または重原子クラスター、放射性同位元素または安定な希少同位元素、および、蛍光発色団、消光剤、アフィニティタグ、架橋剤、核酸切断試薬、スピンラベル、発色団、任意に修飾が可能なタンパク、ペプチドまたはアミノ酸、任意に修飾が可能なヌクレオチド、ヌクレオシド、または核酸、炭水化物、脂質、トランスフェクション試薬、挿入剤、ナノ粒子、およびビーズから選ばれるメンバーの残基から選ばれる少なくとも一員をさらに含むことを特徴とする、請求項１から５のいずれか１項による化合物。
【請求項７】
前記官能基が、アミノ基、チオール基、１，２−ジオール基、ヒドラジノ基、ヒドロキシアミノ基、ハロアセタミド基、マレイミド基、アルデヒド基、ケトン基、１，２−アミノチオール基、アジド基、アルキン基、１，３−ジエン官能基、ジエノフィル官能基、ハロゲン化アリール基、末端アルキン基、アリールボロン酸基、末端ハロアルキン基、末端シリルアルキン基、および、保護されたアミノ、チオール、１，２−ジオール、ヒドラジノ、ヒドロキシアミノ、アルデヒド、ケトン、および１，２−アミノチオール基から選ばれることを特徴とする、請求項６による化合物。
【請求項８】
前記発色団が、Ａｌｅｘａ、ＢＯＤＩＰＹ、ｂｉｍａｎｅ、クマリン、Ｃａｓｃａｄｅブルー、ダンシル、ダポキシル、フルオレセイン、マンシル、ＭＡＮＴ、Ｏｒｅｇｏｎグリーン、ピレン、ローダミン、Ｔｅｘａｓレッド、ＴＮＳ、蛍光ナノ結晶（量子ドット）、シアニン蛍光発色団およびその誘導体から選ばれることを特徴とする、請求項６による化合物。
【請求項９】
前記蛍光消光剤が、ダブシル、ＱＳＹ、およびＢＨＱから選ばれることを特徴とする、請求項６による化合物。
【請求項１０】
前記アフィニティタグが、ペプチドタグ、金属キレート群、同位元素コード標識アフィニティタグ、ビオチン、マルトース、マンノース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ジゴキシゲニン、およびジニトロフェノールから選ばれることを特徴とする、請求項６による化合物。
【請求項１１】
前記ペプチドタグが、ｈｉｓ−タグ、金属キレート性を有するタグ、ストレップ−タグ、フラッグ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、エピトープ、およびグルタチオンから選ばれることを特徴とする、請求項１０による化合物。
【請求項１２】
前記金属キレート群が、ニトリロトリ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１，１０−フェナントロリン、クラウンエーテル、およびＨｉｓ4-8ペプチドであることを特徴とする、請求項１０による化合物。
【請求項１３】
前記架橋剤が、一、または二官能白金（ＩＩ）複合体、マレイミド、イオドアセタミド、アルデヒド、および光架橋剤から選ばれる選ばれることを特徴とする、請求項６による化合物。
【請求項１４】
前記光架橋剤が、アリールアジド、ジアゾ化合物、２−ニトロフェニル化合物、プソラレン、およびベンゾフェノン化合物から選ばれることを特徴とする、請求項１３による化合物。
【請求項１５】
前記重原子、または重原子クラスターが、Ｘ線回折データを位相角分析するのに好適な、銅、亜鉛、セレン、臭素、ヨウ素、ルテニウム、パラジウム、カドミウム、タングステン、白金、金、水銀、ビスマス、サマリウム、ユーロピウム、テルビウム、ウラニウム、Ｔａ6Ｂｒ14、Ｆｅ4Ｓ4、またはＰ2Ｗ18Ｏ62から選ばれることを特徴とする、請求項６による化合物。
【請求項１６】
前記核酸切断試薬は、鉄−エチレンジアミンテトラ酢酸（鉄−ＥＤＴＡ）、銅−１，１０−フェナントロリン、アクリジンまたはその誘導体、エンジン化合物、およびロジウム複合体から選ばれることを特徴とする、請求項６による化合物。
【請求項１７】
請求項１から１６のいずれか１項による化合物、および、通常Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭまたはＡｄｏＭｅｔ）を補因子として用いるメチルトランスフェラーゼの複合体。
【請求項１８】
前記メチルトランスフェラーゼが、通常、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭまたはＡｄｏＭｅｔ）のメチル残基を、核酸分子、ポリペプチド、炭水化物、または小型分子に転移することを特徴とする、請求項１７による複合体。
【請求項１９】
前記メチルトランスフェラーゼが、孤立ＤＮＡメチルトランスフェラーゼであるか、または、細菌の制限修飾システムの一部であることを特徴とする、請求項１８による複合体。
【請求項２０】
前記メチルトランスフェラーゼが、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼのＭ．Ｔａｑｌ、Ｍ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＢｃｎＩＢ（Ｍ２．ＢｃｎＩ）、Ｍ．ＳｓｓＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩ、Ｍ．ＲｓｒＩ、Ｍ２．ＢｆｉＩ（Ｍ．ＢｆｉＣ２）、Ｍ２．Ｅｃｏ３１Ｉまたはその誘導体から成るグループから選ばれることを特徴とする請求項１９による複合体。
【請求項２１】
請求項１から１６のいずれか１項による化合物を含むキット。
【請求項２２】
請求項１７から２０のいずれか１項に定義されるものと同じメチルトランスフェラーゼをさらに含むことを特徴とする、請求項２１によるキット。
【請求項２３】
請求項１７から２０のいずれか１項による複合体を含むキット。
【請求項２４】
請求項１から１６のいずれか１項による化合物、または請求項１７から２０のいずれか１項による複合体、および、要すれば任意に製薬学的に受容可能な担体を含む製薬組成物。
【請求項２５】
請求項１から１６のいずれか１項による化合物、または請求項１７から２０のいずれか１項による複合体を含む診断組成物。
【請求項２６】
請求項１から１６のいずれか１項による化合物、またはその混合物の、標的分子を修飾するための使用。
【請求項２７】
標的分子の修飾が、請求項１から１６のいずれか１項による化合物またはその混合物を、該化合物の一部を標的分子に転移するメチルトランスフェラーゼの補因子として使用することによって実現されることを特徴とする、請求項２６による使用。
【請求項２８】
標的分子が、核酸分子、ポリペプチド、炭水化物、または小型分子であることを特徴とする、請求項２６または２７による使用。
【請求項２９】
核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドであることを特徴とする、請求項２８による使用。
【請求項３０】
小型分子が、リン脂質、アミノ酸、ホルモン、ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびそれらの誘導体から選ばれることを特徴とする、請求項２８による使用。
【請求項３１】
メチルトランスフェラーゼが、請求項１７から２０のいずれか１項に定義されるメチルトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項２７から２９のいずれか１項による使用。
【請求項３２】
修飾された標的分子の調製法であって、請求項１から１６のいずれか１項による化合物と、該化合物を補因子として使用することが可能なメチルトランスフェラーゼの存在下に、該化合物の一部を標的分子に転移することを可能とする条件下に、標的分子をインキュベートすることを含む前記調製法。
【請求項３３】
メチルトランスフェラーゼが、請求項１７から２０のいずれか１項に定義されるものと同じメチルトランスフェラーゼであることを特徴とする、請求項３２による方法。
【請求項３４】
標的分子が、核酸分子、ポリペプチド、炭水化物、小型分子、またはそれらの間の複合体であることを特徴とする、請求項３２または３３による方法。
【請求項３５】
核酸分子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドであることを特徴とする、請求項３４による方法。
【請求項３６】
前記ＤＮＡまたはＲＮＡ分子が、配列特異的やり方で修飾されることを特徴とする、請求項３５による方法。
【請求項３７】
ポリペプチドが、配列特異的やり方で修飾されることを特徴とする、請求項３４による方法。
【請求項３８】
小型分子が、リン脂質、アミノ酸、ホルモン、ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびそれらの誘導体から選ばれることを特徴とする、請求項３４による方法。
【請求項３９】
修飾が、標識として好適な基を標的分子に転移し、他の未標識分子の間において標識された該分子の特定を可能とすることによって実現されることを特徴とする、請求項３６または３８による方法。
【請求項４０】
標識が、蛍光発色団、蛍光消光剤、アフィニティタグ、スピンラベル、放射性または安定な希少同位元素、発色団、および検出可能なナノ粒子から選ばれることを特徴とする、請求項３９による方法。
【請求項４１】
生体分子における配列特異的メチル化を検出する方法であって、
（ａ）前記メチルトランスフェラーゼの検出可能な補因子の存在下に、生体分子をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼに接触させること；および、
（ｂ）前記メチルトランスフェラーゼの認識部位が、補因子またはその誘導体によって修飾されたかどうかを検出することを含み、
前記メチルトランスフェラーゼの認識部位の修飾は、前記認識部位におけるメチル化の不在を示し；
前記補因子は、請求項１から１６のいずれか１項による化合物であることを特徴とする、前記方法。
【請求項４２】
前記生体分子が、核酸分子、または（ポリ）ペプチドであることを特徴とする、請求項４１による方法。
【請求項４３】
工程（ａ）が、インビトロか、細胞抽出物についてか、またはインビボで実行されることを特徴とする、請求項４１または４２による方法。
【請求項４４】
前記核酸分子がＤＮＡであることを特徴とする、請求項４２または４３による方法。
【請求項４５】
工程（ａ）の前に、制限酵素でＤＮＡを処理する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項４４による方法。
【請求項４６】
前記ＤＮＡが、固相支持体の上に固定されることを特徴とする、請求項４４または４５による方法。
【請求項４７】
前記ＤＮＡ分子が、固相支持体に、該固相支持体に付着するオリゴヌクレオチドに該ＤＮＡ分子をハイブリダイズすることによって付着されることを特徴とする、請求項４６による方法。
【請求項４８】
前記メチルトランスフェラーゼが、孤立ＤＮＡメチルトランスフェラーゼであるか、または、細菌の制限修飾システムの一部であることを特徴とする、請求項４１から４７のいずれか１項による方法。
【請求項４９】
細菌の制限修飾システムから得られる前記メチルトランスフェラーゼが、Ｍ．Ｔａｑｌ、Ｍ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＢｃｎＩＢ（Ｍ２．ＢｃｎＩ）、Ｍ．ＳｓｓＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩ、Ｍ．ＲｓｒＩ、Ｍ２．ＢｆｉＩ（Ｍ．ＢｆｉＣ２）、およびＭ２．Ｅｃｏ３１Ｉまたはその誘導体から選ばれることを特徴とする請求項４８による方法。
【請求項５０】
（ａ）前記補因子が、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの認識部位における、または認識部位近傍における、制限酵素の切断を阻止し；かつ、
（ｂ）メチル化が、補因子誘導体によるＤＮＡの修飾が、前記認識部位において、またはその近傍において、制限酵素によって仲介される切断を阻止するかどうかを試験することによって検出されることを特徴とする、請求項４１から４９のいずれか１項による方法。
【請求項５１】
（ａ）補因子が、メチルトランスフェラーゼの認識部位において核酸増幅を妨げ；かつ、
（ｂ）メチル化が、核酸の増幅が、メチルトランスフェラーゼの認識部位において遅れるかどうかを試験することによって検出されることを特徴とする、請求項４１から４９のいずれか１項による方法。
【請求項５２】
（ａ）補因子が蛍光標識を含み；かつ、
（ｂ）メチル化が、前記核酸分子における蛍光の存在、または量を測定することによって検出されることを特徴とする、請求項４１から５１のいずれか１項による方法。
【請求項５３】
（ａ）メチルトランスフェラーゼの認識配列において修飾された核酸分子が、アフィニティ精製によって精製され；かつ、
（ｂ）補因子がアフィニティタグを含むことを特徴とする、請求項４１から５２のいずれか１項による方法。
【請求項５４】
補因子が、ＤＮＡのシトシン残基には付加されるが、５−メチルシトシン残基に対しては付加させることができないことを特徴とする、請求項４１から５３のいずれか１項による方法。
【請求項５５】
工程（ａ）の後に、ＤＮＡ分子の配列を決定する追加工程を含むことを特徴とする、請求項４１から５４のいずれか１項による方法。
【請求項５６】
前記検出可能な補因子の標識は、（ａ）前記検出可能な補因子の標識に特異的に結合する抗体によって、あるいは、（ｂ）前記検出可能な補因子に特異的に結合するアビジンまたはストレプトアビジンによって検出されることを特徴とする、請求項４１から５５のいずれか１項による方法。
【請求項５７】
前記ＤＮＡ分子の配列が、ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーション、Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆ分析、または、酵素断片化およびクロマトグラフィーによるヌクレオシド組成の分析によって決定されることを特徴とする、請求項４１から５５のいずれか１項による方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、式（Ｉ）：
【０００２】
【化１】
2008539166.tif 000003
によって表される化合物に関する。
【０００３】
上式において、Ｒは、スルフォニウム中心に対してβ−位置に存在する、炭素−炭素二重結合、炭素−酸素二重結合、炭素−硫黄二重結合、炭素−窒素二重結合、炭素−炭素三重結合、炭素−窒素三重結合、または、芳香族炭素環またはヘテロ環システムを含み；Ｘ-は、１個以上の負電荷を持つ有機または無機の陰イオンであり；Ｚは、−ＣＲ1Ｒ2−、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲ3−であり；および、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、Ｈ、Ｄ、およびＣ1−Ｃ12アルキルから独立に選ばれる。本発明はまた、本発明の化合物と、通常、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ、またはＡｄｏＭｅｔ）を補因子として用いるメチルトランスフェラーゼとの複合体にも関する。さらに本発明は、本発明の化合物を含む製薬および診断組成物にも関する。最後に、本発明は、メチルトランスフェラーゼの存在下に、本発明の化合物と標的分子をインキュベートすることを含む、修飾された標的分子の調製法に関する。その際、メチルトランスフェラーゼは、標的分子に対し該化合物の一部の転移を可能とする条件下に、該化合物を補因子として使用することが可能である。
【０００４】
本明細書の本文を通じていくつかの文書が引用される。本明細書に引用される文書の開示内容（メーカーの仕様、案内等を含む）を、参照することにより本明細書に含める。本明細書を通じて言及され、インビトロで実行される工程については、どのような組み合わせも（単一工程のみを含む）、細胞抽出物でも、またはインビボでも実行することが可能である。
【０００５】
本発明は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＴアーゼ）を用いて例示される。しかしながら、本発明は、ＲＮＡおよびタンパクメチルトランスフェラーゼにも、他の生体分子に作用するメチルトランスフェラーゼにも使用が可能である。
【背景技術】
【０００６】
ＤＮＡメチル化は、ほとんど全ての生物に認められる（Ｊｅｌｔｓｃｈ、（２００２）  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ３、２７５−２９３）。ＤＮＡは、シトシン、アデニン、チミン、およびグアニンの外に、メチル化された核酸塩基、５−メチルシトシン（５−ｍＣｙｔ）、Ｎ４−メチルシトシン（４−ｍＣｙｔ）、またはＮ６−メチルアデニン（６−ｍＡｄｅ）を含むことが可能である。これらのメチル化核酸塩基は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＭＴアーゼ）によって形成される。この酵素は、そのＤＮＡ認識配列内部のシトシンのＣ５炭素、シトシンのＮ４窒素、またはアデニンのＮ６窒素に対する、補因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）からの活性化メチル基の転移を触媒する（Ｃｈｅｎｇ、（１９９５）  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．  ２４、２９３−３１８）。ある特定のヌクレオチド配列が、メチル化または非メチル化形として存在することが可能なのであるから、ＤＮＡメチル化は、多種多様な生物機能に与るＤＮＡの情報内容の増加と見なすことも可能である。前核細胞では、ＤＮＡメチル化は、内因性制限エンドヌクレアーゼ、ＤＮＡミスマッチ修復、遺伝子発現調節、およびＤＮＡ複製から宿主のゲノムを守る、ゲノム保護に与る。真核細胞では、ＤＮＡメチル化は、重要な調節過程、例えば、遺伝子沈黙化（Ｂｉｒｄ、（２００２）  Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  １６、６−２１）、ゲノムインプリンティング（Ｆｅｉｌ  ａｎｄ  Ｋｈｏｓｌａ、（１９９９）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １５、４３１−４３５）、Ｘ−染色体の不活性化（Ｐａｎｎｉｎｇ  ａｎｄ  Ｊａｅｎｉｓｃｈ、（１９９８）  Ｃｅｌｌ  ９３、３０５−３０８）、ゲノム内寄生生物の沈黙化（Ｙｏｄｅｒ、（１９９７）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １３、３３５−３４０）、および、発癌（Ｂａｙｌｉｎ、（１９９８）  Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ７２、１４１−１９６；  Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｉｒｄ、（１９９９）  Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．  ２１、１６３−１６７）の一端を担っている。
【０００７】
最近、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ由来のＤＮＡアデニン−６メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．Ｔａｑｌ）に対する、新規設計の蛍光補因子が提示された（Ｐｌｊｅｖａｌｉｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、（２００３）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １２５、３４８６−３４９２）。もちろん、Ｍ．Ｔａｑｌは、２本鎖の５′−ＴＣＧＡ−３′パリンドローム配列内のアデニンの環外アミノ基の、補因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ、またはＡｄｏＭｅｔ）のメチル基に対する求核性攻撃を触媒し、これが、配列−および塩基−特異的メチル基転移をもたらす。他のメチルトランスフェラーゼ同様、Ｍ．Ｔａｑｌも、各標的塩基に対し１個のメチル基を転移することができるだけで、完全にメチル化された認識配列を有するＤＮＡはそれ以上修飾されない。天然の補因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭまたはＡｄｏＭｅｔ）のメチオニン側鎖の、アジリジニル残基による置換は、ＤＮＡの標的アデニンに対する、全体ヌクレオシドの、Ｍ．Ｔａｑｌ触媒による求核性環解放および結合をもたらす。アデノシル成分は、補因子結合のための分子アンカーとなる。蛍光発色団の、屈曲性リンカーを介する、アデノシル成分の８位置に対する付着は、補因子の結合を妨げない。この補因子、８−アミノ［１”−（Ｎ”−ダンシル）−４”−アミノブチル］−５’−（１−アジリジニル）−５’−デオキシアデノシンを用いて、Ｍ．Ｔａｑｌ触媒反応においてＤＮＡを配列特異的に標識することが可能である（Ｐｌｊｅｖａｌｊｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、（２００３）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １２５、３４８６−３４９２）。
【０００８】
従来技術には、前述のＮ−アデノシルアジリジン誘導体の外に、８−アミノ［１”−（Ｎ”−ビオチニル）−４”−アミノブチル］−５’−（１−アジリジニル）−５’−デオキシアデノシン（Ｐｌｊｅｖａｌｊｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、（２００４）  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．  ２８３、１４５−１６１）が記載される。これも生体分子を標識するのに使用が可能である（Ｐｌｊｅｖａｌｊｃｉｃ  ｅｔ  ａｌ．、（２００４）  ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ５、２６５−２６９）。標識化は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼを用いることによって実行される。これらの酵素は、当然のことながら、補因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（１、ＳＡＭ、またはＡｄｏＭｅｔ）の活性化されたメチル基の、各種基質、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク、およびその他の生体分子内の定められた求核位置に対する転移を触媒する。これによって、メチル化生体分子と、脱メチル化補因子Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）が生成される（スキーム１）。このように、メチルトランスフェラーゼが、生体高分子の、配列特異的、共有結合修飾を触媒することが可能であるということは、これらメチルトランスフェラーゼをバイオテクノロジー全体における興味ある道具とするものであるが、メチル基の外に、もっと大きな化学的実体を転移し、それと共に標的生体分子に対し新たな機能を付加することができるならば、それは望ましいことであろう。原理的には、このことは、前述のＮ−アデノシルアジリジン誘導体を用いて実現することが可能である。しかしながら、アジリジン補因子は、メチルトランスフェラーゼに対し自殺基質として作用するという欠点を持つ。アジリジン補因子が標的生体分子に結合した後、メチルトランスフェラーゼは簡単に解離することができず、その結合産物に結合し続ける。このため、このメチルトランスフェラーゼは、真の触媒として作用しないので、標的分子に対し化学量論的量として用いなければならない。原理的には、この制限は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（１、ＳＡＭ、またはＡｄｏＭｅｔ）のメチル基を、より大きい脂肪族基によって置換することで克服することが可能である。Ｓｃｈｌｅｎｋ（Ｓｃｈｌｅｎｋ  ａｎｄ  Ｄａｉｎｋｏ、（１９７５）  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ．Ａｃｔａ  ３８５、３１２−３２３；  Ｓｃｈｌｅｎｋ、（１９７７）  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ａｄｅｎｏｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ（ｅｄｓ．Ｓａｌｖａｄｏｒｅ、Ｂｏｒｅｋ  ａｎｄ  Ｚａｐｐｉａ）、Ｃｏｌｕｍｂｉａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、３−１７）による研究は、比較的大型の化学基、例えば、エチルおよびプロピルが、メチルトランスフェラーゼによって、Ｓ−アデノシル−Ｌ−エチオニン（３）およびＳ−アデノシル−Ｌ−プロピオニン（４）から転移が可能であることを示した（スキーム１）。しかしながら、同時に、酵素によるアルキル転移速度は、転移可能基のサイズの増加と共に急激に増す（メチル＞＞エチル＞ｎ−プロピル基）ことが認められた。この一般的傾向は、様々なＤＮＡメチルトランスフェラーゼについても確かめられた（実施例３）。
【０００９】
【化２】
2008539166.tif 000004
【００１０】
スキーム１
メチルトランスフェラーゼは、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（１）、および延長型飽和側鎖を持つ類縁体のスルフォニウム中心に隣接する、求電子性炭素原子に対する、各種生体分子の求核攻撃を触媒する。
【００１１】
長さを増しながら転移可能基を用いると転移速度が急激に低下する（上記参照）ため、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン誘導体は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−トランスフェラーゼ依存性メチルトランスフェラーゼの効果的な補因子としての使用が妨げられる。Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン誘導体は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼの天然の基質と緊密に関連するのであるから、スルフォニウム結合側鎖について転移速度が改善されたＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン系誘導体を開発することができたならば、それは望ましいと考えられる。上記に鑑みて、本発明の教示をもたらすきっかけとなった技術的問題は、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン−依存性メチルトランスフェラーゼのための、さらに別のＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン系補因子を提供することである。
【発明の開示】
【００１２】
この技術的問題に対する解答は、特許請求の範囲に詳述される実施態様を提供することによって実現される。
【００１３】
従って、本発明は、式（Ｉ）：
【化３】
2008539166.tif 000005
【００１４】
上式において、Ｒは、スルフォニウム中心に対してβ−位置において、炭素−炭素二重結合、炭素−酸素二重結合、炭素−硫黄二重結合、炭素−窒素二重結合、炭素−炭素三重結合、炭素−窒素三重結合、または芳香族炭素環またはヘテロ環システムを含み；
Ｘ-は、１個以上の負電荷を持つ有機または無機の陰イオンであり；
Ｚは、−ＣＲ1Ｒ2−、−Ｏ−、−Ｓ−、または−ＮＲ3−であり；および、
Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、Ｈ、Ｄ、およびＣ1−Ｃ12アルキルから独立に選ばれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
本出願の教示は、従来技術において記載された所見、すなわち、酵素によるアルキル転移速度は、転移可能基のサイズの増加と共に急激に低下する（メチル＞＞エチル＞ｎ−プロピル基）という所見を確認した。この所見の理由は従来技術で解明されていない。本発明において提示される実験データに基づくと、この効果には、立体的要因の外に、電子的要因が関与しているらしいことが予想された。本発明の教示によれば、転移可能基の長さの増加に伴う転移速度の低下は、スルフォニウム中心に対するβ−位置に二重結合、三重結合、芳香族または複素環芳香族成分を導入することによって克服が可能であること；スルフォニウム中心の、この置換基の適切な例は、アリル、プロパルジル、およびベンジル置換基であることが予測された。実際、新規ＡｄｏＭｅｔ類縁体５から９は、すなわち、プロプ−２−エニルを有するもの（−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2；すなわち、Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−ＣＨ＝ＣＨ2である式Ｉの化合物；補因子５）、プロプ−２−イニル（−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ；すなわち、Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡ＣＨである式Ｉの化合物；補因子６）、ブト−２−イニル（−ＣＨ2Ｃ≡Ｃ−ＣＨ3；すなわち、Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡ＣＣＨ3である式Ｉの化合物；補因子７）、ペント−２−イニル（−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＣＨ3；すなわち、Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡ＣＣＨ2ＣＨ3である式Ｉの化合物；補因子８）、またはベンジル基（すなわち、Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−フェニルである式Ｉの化合物；補因子９）を、活性化スルフォニウム中心に有する類縁体は、各種ＤＮＡメチルトランスフェラーゼに対し、優れたものから極めて優れたものに至る補因子として作動する（実施例３）。従って、延長型飽和アルキル基をスルフォニウム中心に持つＡｄｏＭｅｔ類縁体の貧弱な反応性は、転移可能基のスルフォニウム中心に対するβ位置に導入された、二重結合、三重結合、または芳香族置換基による活性化によって克服することが可能である。このような補因子は、適切なメチルトランスフェラーゼを触媒に用いて、ＤＮＡ、ＲＮＡ、およびタンパクのような各種生体分子に対し、反応基または他の化学的実体を配列特異的に転移するのに有用であると思われる。
【００１６】
生体高分子の配列特異的標識化は、二つの方法で実現することが可能である。先ず、例えば、補因子５、６、または９のアリル、プロパルジル、またはベンジルシステムを、化学的反応基によって延長し、次に、適切な反応性標識によって共有的に修飾する（２工程標識化）。第二に、適切な標識によってアリル、プロパルジル、またはベンジル置換された補因子を調製し、次に、この標識を、適切なメチルトランスフェラーゼによって標的分子に直接転移する（１工程標識化）
【００１７】
例として、補因子５の誘導体、基質としてＤＮＡ、およびアデニン特異的ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＭ．Ｔｒａｑｌを用いた、これら二つの戦略をスキーム２に示す。Ｍ．Ｔａｑｌは、２本鎖ＤＮＡ配列５′−ＴＣＧＡ−３′を認識し、当然のことながらＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（１、ＳＡＭ、またはＡｄｏＭｅｔ）のメチル基を、アデノシン残基のアミノ基に転移する。補因子５の場合、アリル基が、配列−および塩基−特異的に転移される（実施例２Ａ．３）。スペーサを介してアリルシステムに化学的反応基Ｙを付着させることによって、この反応基は効率的にＤＮＡに転移され、次に、適切な反応基Ｖを含む標識によって修飾される（スキーム２Ａ）。それとは別に、共有的に付着した標識を含む補因子５の誘導体を、ＹとＶを反応させることによって合成することが可能である。次に、標識を含むこの活性化基が、Ｍ．Ｔａｑｌによって、ＤＮＡに直接配列特異的に転移される（スキーム２Ｂ）。本発明による他の化合物、例えば、プロパルジル活性化基を含む補因子６、およびベンジル活性化基を含む補因子９の誘導体についても同様の戦略を企図することが可能である。
【００１８】
【化４】
2008539166.tif 000006
【００１９】
スキーム２
補因子５、基質としてＤＮＡ、およびアデニン特異的ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＭ．Ｔａｑｌによって示される２工程標識化（Ａ）、および１工程標識化（Ｂ）。ＹおよびＶは、相互に反応性を持つ基であり、Ｌは、基ＹおよびＶの反応によってもたらされた化学結合を表し、黒塗り球は標識を表す記号である。
【００２０】
水溶液において、この修飾された生体分子に標識を付着させるために、反応基ＹおよびＶ、および結合Ｌを定める、たくさんの化学選択的連結の利用が可能である。古典的連結（Ｇａｒｍａｎ、（１９９７）  「非放射性標識化：実技入門（Ｎｏｎ−ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ：  Ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）は、アミン反応基、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステル、アシルアジド、アシルニトリル、アシルクロリド、ペンタフルオロフェニルエステル、チオエステル、スルフォニルクロリド、イソチオシアネート、イミドエステル、アルデヒド、またはケトンと反応し、安定なアミド類、スルフォナミド類、チオウレア類、イミテード類またはイミン類をもたらすことが可能な一次アミノ基の使用を含み、次に、これらアミド類、スルフォナミド類、チオウレア類、イミテード類またはイミン類を還元して安定な二次アミンをもたらすことが可能である。チオールは、ハロアセタミド、マレイミド、アジリジン、または他のチオール類と特異的に反応し、チオエステルまたはジスルフィド結合をもたらすが、１，２−ジオールは、アリールボロン酸によって修飾することが可能である。ヒドラジンまたはヒドロキシルアミンは、アルデヒドまたはケトンによって縮合されて、ヒドラゾンまたはオキシムを形成する。さらに、これらの古典的な連結の外に、それに代わる、いくつかの、水溶液において十分に進行する結合法が近年出現した。１，２−アミノチオールは、アルデヒドまたはチオエステルと選択的に反応してチアゾリジン（例えば、「ポリペプチドのＮ−末端システイン残基（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、Ｌｉｕ  ａｎｄ  Ｔａｍ、（１９９４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１、６５８４−６５８８）、または、安定なアミド結合（例えば、ポリペプチドのＮ−末端システイン残基、未修飾の、化学的ペプチド結合（Ｎ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ、ｎａｔｉｖｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｇａｔｉｏｎ））、Ｄａｗｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６、７７６−７７９）を形成する。さらに、アジドは、アルキンと（「Ｈｕｉｓｇｅｎ  １，３−双極子環付加反応（Ｈｕｉｓｇｅｎ  １，３−ｄｉｐｏｌａｒ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ）」、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ４１、１０５３−１０５７）、または、フォスファンエステルと（「Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ連結（Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ）」、Ｓａｘｏｎ  ａｎｄ  Ｂｅｒｔｏｚｚｉ、（２０００）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７、２００７−２０１０）反応して、１，２，３−トリアゾールまたはアミドを形成することが可能である。さらに、活性化ジエンおよびジエノフィルの間におけるＤｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ環付加反応（例えば、「フランおよびマレイミド（ｆｕｒａｎｅｓ  ａｎｄ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅｓ）」、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．、（２００２）  Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．  ４７８５−４７８８）は、水性溶液において実行が可能である。他の、現代的な白金触媒架橋反応、例えば、アリールアルキンまたはビアリールを生成する、ハロゲン化アリールおよび末端アルキンの間（「Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ結合（Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）」、Ｃａｓａｌｎｕｏｖａ  ａｎｄ  Ｃａｌａｂｒｅｓｅ、（１９９０）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １１２、４３２４−４３３０；  Ｄｉｂｒｏｗｓｋｉ  ａｎｄ  Ｓｃｈｍｉｄｔｃｈｅｎ、（１９９８）  Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．  Ｅｄ．  ３７、４７６−４７８；  Ｂｏｎｇ  ａｎｄ  Ｇｈａｄｅｒｉ、（２００１）  Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．  ３、２５０９−２５１１）、または、ハロゲン化アリールおよびアリールボロン酸の間（「Ｓｕｚｕｋｉ結合（Ｓｕｚｕｋｉ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ）」、Ｃａｓａｌｎｕｏｖａ  ａｎｄ  Ｃａｌｂｒｅｓｅ、（１９９０）  Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．  １１２、４３２４−４３３０；  ＤｅＶａｓｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（２００４）  Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．  ６９、７９１９−７９２７）の反応も、使おうと思えば、使用することが可能であろう。さらに、末端ハロアルキンと、末端アルキンまたは末端シリルアルキンとの間の、銅触媒アルキン結合反応は、ジイン接合体をもたらすが、この反応も水溶液の中で実行することが可能である。最後に、フッ素性誘導体形成試薬、例えば、４−ハロ−７−ニトロベンゾフラン、Ｎ−メチルイサト酸無水物、または活性化ビマンを用い、転移チオール、アミノ、またはヒドロキシル基を直接標識することも可能である。
【００２１】
核酸は一般に、求核性または求電子性の高い中心を持たない。従って、相互交換可能な基ＹおよびＶを含む、求核分子および求電子分子の間のパラジウム触媒架橋反応、または銅触媒アルキン結合反応は、環付加の外に、核酸の配列特異的２工程標識化に使用することが可能である（表１）。補因子６の場合、末端アルキン基はＤＮＡに転移され、ＤＮＡは直接、アジド（１，３−双極子環付加反応）、ハロゲン化アリール（Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ結合）、または末端ハロアルキン（アルキン結合）と結合することが可能となる。
【００２２】
【表１】
2008539166.tif 000007
【００２３】
ポリペプチドの２工程配列特異的標識化には、利用可能な化学選択的連結は、核酸の場合よりも数少ない。これはポリペプチドは一般に求核中心（アミノ基および、程度は低いがチオール基も）を含むからである。実行可能な反応のリストを表２に示す。この場合も、例えば、補因子６によって転移される末端アルキン基は、アジド（１，３−双極子環付加反応）、ハロゲン化アリール（Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ結合反応）、または末端アルキン（アルキン結合反応）と直接結合することが可能である。
【００２４】
【表２】
2008539166.tif 000008
【００２５】
１工程標識化（スキーム２Ｂ）のためには、アリル、プロパルジル、またはベンジルシステムを有する標識補因子（Ｉ）を先ず調製する必要がある。原理的には、これは、二つの方法で実行することが可能であり、スキーム３においてアリル補因子５の標識誘導体について図示される。例えば、反応基Ｖを含む標識を、反応基Ｙを含むアリルアルコールに付着させることが可能である。その後、アルコールを活性化し（例えば、Ｘ＝ハロゲン化物またはスルフォネート）、Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）と反応させて、所望の標識補因子を得る（スキーム３、左側）。標識の共有結合付着は水性または有機溶媒において実行することが可能であるから、活性化基ＹおよびＶについては様々な組み合わせが実行可能である（表３）。もちろん、この反応スキームは、標識そのものが、標識付着、活性化、およびＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）との反応の条件に向けて安定であることを要求する。
【００２６】
【化５】
2008539166.tif 000009
【００２７】
スキーム３
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）から、標識されたアリル補因子へ至る二つの合成ルート。ＹおよびＶは、相互に反応する基であり、Ｌは化学結合を表し、Ｘはハロゲン化物またはスルフォネートであり、黒塗り円は標識を表す。
【００２８】
【表３】
2008539166.tif 000010
2008539166.tif 000011
【００２９】
それとは別に、標識は、反応基Ｙを含む、アリル、プロパルジル、およびベンジルシステムによって補因子（Ｉ）の中に導入することが可能である。これを、アリル補因子５の標識誘導体を例として用いてスキーム３（右）に示す。塩基条件下におけるＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（１）の不安定性を考えると、この合成ルートによる標識補因子の合成は、水溶液におけるやや酸性条件下で進行する化学選択的連結反応が有利であろう。可能な連結反応を表４に挙げる。補因子６の場合、連結後、プロパルジルシステムをそのまま脱離するハロゲン化アリール（Ｓｏｎｏｇａｓｈｉｒａ結合）と直接結合が可能な末端アルキレン基は既に存在する。
【００３０】
【表４】
2008539166.tif 000012
【００３１】
本発明のある好ましい実施態様では、ＺはＣＲ1Ｒ2であり、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立にＨ、Ｄ、およびＣ1−Ｃ12アルキルから選ばれる。
【００３２】
本発明のより好ましい実施態様では、Ｚは−ＣＲ1Ｒ2であり、Ｒ1、Ｒ2はそれぞれ独立にＨおよびＤから選ばれる。
【００３３】
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、Ｒは、スルフォニウム中心に対するβ位置に−ＣＨ＝ＣＨ−、−Ｃ≡Ｃ−、またはフェニル基を含む。本発明の教示に一致するこのような化合物の例は、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）、または（ＩＶ）によって表される。
【００３４】
【化６】
2008539166.tif 000013
【００３５】
上式において、Ｘ-は、１個以上の負の電荷を担持する有機または無機の分子である。
【００３６】
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、前記有機または無機の陰イオンは、トリフルオロ酢酸塩、ギ酸塩、ハロゲン化物、およびスルフォン酸塩から選ばれる。
【００３７】
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、Ｒは、官能基、Ｘ線回折データの位相角分析に好適な重原子または重原子クラスター、放射性同位元素または安定な希少同位元素、および、蛍光発色団、消光剤、アフィニティタグ、架橋剤、核酸切断試薬、スピンラベル、発色団、任意に修飾が可能なタンパク、ペプチドまたはアミノ酸、任意に修飾が可能なヌクレオチド、ヌクレオシド、または核酸、炭水化物、脂質、トランスフェクション試薬、挿入剤、ナノ粒子、およびビーズから選ばれるメンバーの残基から選ばれる少なくとも一員をさらに含む。
【００３８】
好ましい、放射性の、または安定な希少同位元素は、3Ｈ（Ｔ）、14Ｃ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、125Ｉ、131Ｉ、2Ｈ（Ｄ）、13Ｃ、15Ｎ、17Ｏ、および18Ｏから成るグループから選ばれる。さらに、好ましい安定な同位元素は、19Ｆおよび127Ｉから成るグループから選ばれる。
【００３９】
安定な常磁性基（通常、ニトリル根）である好ましいスピンラベルは、２，２，６，６−テトラメチル−ピペリジン−１−オキシル、および２，２，５，５−テトラメチル−ピロリジン−１−オキシルから成るグループから選ばれる。
【００４０】
好ましいアミノ酸修飾体は、β−およびγ−アミノ酸から成るグループから選ばれ、好ましいペプチド修飾体は、デプシペプチド、ビニル性ペプチド、過メチル化ペプチド、ペプトイド、アザペプチド（アザチド）、オリゴカルバメート、オリゴ尿素、オリゴスルフォン、オリゴスルフォンアミド、オリゴスルフィンアミド、ピロール−イミダゾール−ヒドロキシピロールポリアミド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）から成るグループから選ばれ、より好ましくは前記ペプチド修飾体は、ピロール−イミダゾール−ヒドロキシピロールおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）である。
【００４１】
好ましい核酸修飾体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックされた核酸（ＬＮＡ）、およびフォスフォロチオエート修飾核酸から成るグループから選ばれる。
【００４２】
好ましいトランスフェクション試薬は、陽イオン性脂質（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、米国から市販されるリポフェクタミンおよび誘導体）、陽イオン性ポリマー（例えば、Ｓｉｇｍａから市販されるポリエチレンイミン（ＰＥＩ））およびポリ陽イオン性デンドリマーから成るグループから選ばれる。
【００４３】
好ましい挿入剤は、通常、二重鎖核酸における隣接塩基間を結合する、平坦であるか、または平坦に近い芳香環システムであるが、これは、エチジウム、チアゾールオレンジ、アクリジンまたはその誘導体、およびピレンから成るグループから選ばれる。
【００４４】
好ましいナノ粒子は、金および銀クラスターから成るグループから選ばれる。
【００４５】
好ましいビーズは、シリカビーズ、磁気ビーズ、およびポリスチレン微小球（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州、米国から市販されている）から成るグループから選ばれる。
【００４６】
本発明の一つの実施態様では、前記官能基は、アミノ基、チオール基、１，２−ジオール基、ヒドラジノ基、ヒドロキシアミノ基、ハロアセタミド基、マレイミド基、アルデヒド基、ケトン基、１，２−アミノチオール基、アジド基、アルキン基、１，３−ジエン官能基、ジエノフィル官能基（例えば、活性化炭素−炭素二重結合）、ハロゲン化アリール基、末端アルキン基、アリールボロン酸基、末端ハロアルキン基、末端シリルアルキン基、および、保護されたアミノ、チオール、１，２−ジオール、ヒドラジノ、ヒドロキシアミノ、アルデヒド、ケトン、および１，２−アミノチオール基から選ばれる。
【００４７】
本発明のもう一つの実施態様では、前記発色団は、Ａｌｅｘａ、ＢＯＤＩＰＹ、ｂｉｍａｎｅ、クマリン、Ｃａｓｃａｄｅブルー、ダンシル、ダポキシル、フルオレセイン、マンシル、ＭＡＮＴ、Ｏｒｅｇｏｎグリーン、ピレン、ローダミン、Ｔｅｘａｓレッド、ＴＮＳ、蛍光ナノ結晶（量子ドット）、シアニン蛍光発色団およびその誘導体から選ばれる。
【００４８】
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、前記蛍光消光剤は、ダブシル、ＱＳＹ、およびＢＨＱから選ばれる。
【００４９】
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、前記アフィニティタグは、ペプチドタグ、金属キレート群、同位元素コード標識アフィニティタグ、ビオチン、マルトース、マンノース、グルコース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ジゴキシゲニン、およびジニトロフェノールから選ばれる。
【００５０】
本発明のもう一つの実施態様では、前記ペプチドタグは、ｈｉｓ−タグ、金属キレート性を有するタグ、ストレップ−タグ、フラッグ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、エピトープ、およびグルタチオンから選ばれる。
【００５１】
本明細書で用いる「アフィニティタグ」という用語は、特に、例えば、アフィニティ精製に使用することが可能な標識に関する。従来技術において、本発明に一致するいくつかのタグがよく知られる。このようなタグは、例えば、金属キレート性を持ち、メチルトランスフェラーゼ触媒による生体分子への転移前に、または転移後に、固定化金属イオンアフィニティクロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）で使用される基質に対する、本発明の補因子（Ｉ）の側鎖−Ｚ−Ｒの結合を可能としてもよい。Ｐｏｒａｔｈ等（Ｐｏｒａｔｈ  ｅｔ  ａｌ．、（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５８、５９８−５９９）によって開発されたＩＭＡＣ技術は、いくつかのタンパク表層残基（ヒスチジン、システイン、および低級トリプトファン）と、ポリカルボン酸リガンドとキレートを形成する遷移金属由来の陽イオンとの間に生ずる相互作用に基づく。典型的条件は、従来技術に記述されており、当業者には既知である（Ｐｏｒａｔｈ、（１９９２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３、２６３−２８１；  Ｈｅｍｄａｎ  ａｎｄ  Ｐｏｒａｔｈ、（１９８５）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ３２３、２５５−２６４；  Ｐｏｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｅｎ、（１９９１）  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ５５０、７５１−７６４）。
【００５２】
その他の好ましいタグとしては、８アミノ酸ストレプトアビジンに関する「ストレップ−タグ」が挙げられる。この配列は、最適アフィニティタグ性を持つペプチド結合配列を特定するために、ランダムペプチドライブラリーを体系的にスクリーニングすることによって特定された（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ａｎｄ  Ｓｋｅｒｒａ、（１９９３）  Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ６、１０９−１２２）。本発明の補因子（Ｉ）の側鎖−Ｚ−Ｒに付着させると、修飾された核酸分子、または（ポリ）ペプチドは、例えば、ＳｔｒｅｐＴａｃｔｉｎ、ストレプトアビジン、アビジン等を含む基質を備える重力流カラムを用いることによって、アフィニティ精製することが可能となる。このような基質は市販されており、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ／Ｔｈｅ  Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ（テキサス州、米国）、またはＩＢＡ／ゲッチンゲン（ドイツ）から購入することが可能である。
【００５３】
その他の好ましいタグとしては、「フラッグ−タグ」が挙げられる。これは、抗フラッグ抗体に結合する８アミノ酸ペプチドに関する。本発明の補因子（Ｉ）の側鎖−Ｚ−Ｒに付着させると、修飾された核酸分子、または（ポリ）ペプチドは、例えば、固定された抗フラッグ抗体を含む基質を備える重力流カラムを用いることによって、アフィニティ精製することが可能となる。このような基質は市販されており、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入することが可能である。
【００５４】
その他の好ましいタグとしては「ｃ−ｍｙｃ−タグ」が挙げられる。これは、抗−ｃ−ｍｙｃ抗体に結合する１０アミノ酸ペプチドに関する。本発明の補因子（Ｉ）の側鎖−Ｚ−Ｒに付着させると、修飾された核酸分子、または（ポリ）ペプチドは、例えば、固定された抗−ｃ−ｍｙｃ抗体を含む基質を備える重力流カラムを用いることによって、アフィニティ精製することが可能となる。このような基質は市販されており、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（イリノイ州、米国）から購入することが可能である。
【００５５】
その他の好ましいタグとしては「ＨＡ−タグ」が挙げられる。これは、インフルエンザウィルスの表面血球凝集素から得られ、抗ＨＡ抗体に結合する９アミノ酸ペプチドに関する。本発明の補因子（Ｉ）の側鎖−Ｚ−Ｒに付着させると、修飾された核酸分子、または（ポリ）ペプチドは、例えば、固定された抗ＨＡ抗体を含む基質を備える重力流カラムを用いることによって、アフィニティ精製することが可能となる。
【００５６】
本発明のもう一つの実施態様では、前記金属キレート群は、ニトリロトリ酢酸、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、１，１０−フェナントロリン、クラウンエーテル、およびＨｉｓ4-8ペプチドである。
【００５７】
前記架橋剤は、一、または二官能白金（ＩＩ）複合体、マレイミド、イオドアセタミド、アルデヒド、および光架橋剤、例えば、アリールアジド、ジアゾ化合物、２−ニトロフェニル化合物、プソラレンおよびベンゾフェノン化合物から選ばれる。
【００５８】
本発明のもう一つの実施態様では、前記重原子、または重原子クラスターは、Ｘ線回折データを位相角分析するのに好適な、銅、亜鉛、セレン、臭素、ヨウ素、ルテニウム、パラジウム、カドミウム、タングステン、白金、金、水銀、ビスマス、サマリウム、ユーロピウム、テルビウム、ウラニウム、Ｔａ6Ｂｒ14、Ｆｅ4Ｓ4、およびＰ2Ｗ18Ｏ62から選ばれることが好ましい。
【００５９】
好ましい核酸切断試薬は、鉄−ＥＤＴＡ、銅−１，１０−フェナントロリン、アクリジンまたはその誘導体、エンジン化合物、およびロジウム複合体から成るグループから選ばれ、より好ましくは、前記核酸切断試薬は、鉄−ＥＤＴＡ、銅１，１０−フェナントロリン、およびロジウム複合体から選ばれる。
【００６０】
本発明はまた、本発明の化合物（Ｉ）の複合体、および、通常Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭまたはＡｄｏＭｅｔ）を補因子として用いるメチルトランスフェラーゼに関する。
【００６１】
本発明のある好ましい実施態様では、前記メチルトランスフェラーゼは、通常、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭまたはＡｄｏＭｅｔ）のメチル残基を、核酸分子、ポリペプチド、炭水化物、または小型分子に転移する。ＳＡＭ（ＡｄｏＭｅｔ）−依存性メチルトランスフェラーゼに関しては、その総説が、例えば、Ｋａｇａｎ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ、（１９９４）  Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ３１０、４１７−４２７に提示される。この論文はまた、例えば、カテコールＯ−メチルトランスフェラーゼおよびグリシンＮ−メチルトランスフェラーゼを含む、Ｏ−メチルトランスフェラーゼおよび小型分子Ｎ−メチルトランスフェラーゼのリストを示す。
【００６２】
「核酸分子」、「ポリペプチド」、「炭水化物」、または「小型分子」という用語は、場合によって「生体分子」とも呼ばれる。生体分子は、全く天然である、すなわち、未修飾であってもよく、あるいは、合成または修飾されていてもよく、かつ、複合体として存在してもよい。従って、例えば、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子の外に、修飾されたＤＮＡおよびＲＮＡ分子も含む。ＤＮＡは、例えば、ｃＤＮＡ、またはゲノムＤＮＡであってもよい。ＲＮＡは、例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、スプライスされたＲＮＡでも、スプライスされていないＲＮＡであってもよい。本明細書においてポリペプチドという用語が用いられる場合は必ず、それは、タンパク、ペプチド、およびポリペプチドを含むものと理解しなければならない。ペプチドは、例えば、長さが１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６残基ほどの短いものであってもよい。
【００６３】
本発明のより好ましい実施態様では、前記メチルトランスフェラーゼは、孤立ＤＮＡメチルトランスフェラーゼであるか、または、細菌の制限修飾システムの一部である。
【００６４】
前記ＤＮＡメチルトランスフェラーゼは、Ｍ．ＡａｃＤａｍ、Ｍ．ＡａｔＩＩ、Ｍ．ＡｂａＯＲＦＤＰ、Ｍ．ＡｂａＯＲＦＫＰ、Ｍ．ＡｂｒＩ、Ｍ．ＡｃｃＩ、Ｍ．ＡｃｃＩＩＩ、Ｍ．ＡｃｉＩ、Ｍ．ＡｃｌＩ、Ｍ．ＡｃｕＩ、Ｍ．Ａｆａ２２ＭＩ、Ｍ．ＡｆｌＩＩ、Ｍ．ＡｆｌＩＩＩ、Ｍ．ＡｇｅＩ、Ｍ．ＡｈｄＩ、Ｍ．ＡｈｙＢＰ、Ｍ．ＡｌａＫ２Ｉ、Ｍ．ＡｌｕＩ、Ｍ．ＡｌｗＩ、Ｍ．Ａｌｗ２６Ｉ、Ｍ．ＡｐａＩ、Ｍ．ＡｐａＬＩ、Ｍ．ＡｐｅＫＩ、Ｍ．ＡｐｏＩ、Ｍ．ＡｑｕＩ、Ｍ．ＡｓｃＩ、Ｍ．ＡｓｅＩ、Ｍ．ＡｓｅＩＩ、Ｍ．ＡｓｉＳＩ、Ｍ．ＡｓｐＣＮＩ、Ｍ．ＡｔｕＣＩ、Ｍ．ＡｔｕＣＯＲＦ１９９７Ｐ、Ｍ．ＡｔｕＤＯＲＦ７９４Ｐ、Ｍ．ＡｔｕＤＯＲＦ３８３９Ｐ、Ｍ．ＡｖａＩ、Ｍ．ＡｖａＩＩ、Ｍ．ＡｖａＩＩＩ、Ｍ．ＡｖａＩＶＰ、Ｍ．ＡｖａＶ、Ｍ．ＡｖａＶＩ、Ｍ．ＡｖａＶＩＩ、Ｍ．ＡｖａＶＩＩＩ、Ｍ．ＡｖａＩＸ、Ｍ．ＡｖａＯＲＦ３７００Ｐ、Ｍ．ＡｖａＯＲＦ７２７０Ｐ、Ｍ．ＡｖｒＩ、Ｍ．ＡｖｒＩＩ、Ｍ．ＢａｂＩ、Ｍ．ＢａｅＩ、Ｍ．ＢａｌＩ、Ｍ．ＢａｍＨＩ、Ｍ．ＢａｍＨＩＩ、Ｍ．ＢａｎＩ、Ｍ．ＢａｎＩＩ、Ｍ．ＢａｎＩＩＩ、Ｍ．ＢａｔＡＯＲＦ３８１４Ｐ、Ｍ．ＢａｔＡ５８１ＯＲＦ３８４６Ｐ、Ｍ．Ｂｂｕ２９７Ｉ、Ｍ．ＢｂｖＩ、Ｍ１．ＢｂｖＣＩ、Ｍ２．ＢｂｖＣＩ、Ｍ．ＢｂｖＳＩ、Ｍ１．ＢｃｃＩ、Ｍ２．ＢｃｃＩ、Ｍ．Ｂｃｅ１２４７Ｉ、Ｍ１．ＢｃｅＡＩ、Ｍ２．ＢｃｅＡＩ、Ｍ．Ｂｃｅ１４５７９ＯＲＦ９３９Ｐ、Ｍ．ＢｃｅＳＯＲＦ３６５Ｐ、Ｍ．ＢｃｅＳＯＲＦ４６０５Ｐ、Ｍ１．ＢｃｅＳＯＲＦ５６０６Ｐ、Ｍ２．ＢｃｅＳＯＲＦ５６０６Ｐ、Ｍ．Ｂｃｅｐ１Ｐ、Ｍ．Ｂｃｅｐ４３ＯＲＦＡＰ、Ｍ．ＢｃｈＩ、Ｍ．ＢｃｌＩ、Ｍ１．ＢｃｎＩ、Ｍ２．ＢｃｎＩ（Ｍ．ＢｃｎＩＢ）、Ｍ１．ＢｃｏＫＩ、Ｍ２．ＢｃｏＫＩ、Ｍ．Ｂｃｓ１３９Ｐ、Ｍ．ＢｄｉＩ、Ｍ．ＢｅｐＩ、Ｍ１．ＢｆａＩ、Ｍ２．ＢｆａＩ、Ｍ．ＢｆａＯＲＦＣ１５７Ｐ、Ｍ２．ＢｆｉＩ（Ｍ．ＢｆｉＣ２）、Ｍ１．ＢｆｕＡＩ、Ｍ２．ＢｆｕＡＩ、Ｍ．ＢｇｌＩ、Ｍ．ＢｇｌＩＩ、Ｍ１．ＢｈａＩ、Ｍ２．ＢｈａＩ、Ｍ．ＢｈａＩＩ、Ｍ．ＢｊａＯＲＦ２５０９Ｐ、Ｍ．ＢｌｏＮＯＲＦ５６４Ｐ、Ｍ．ＢｌｏＮＯＲＦ１４７３Ｐ、Ｍ．ＢｌｐＩ、Ｍ．ＢｍａＩ、Ｍ．ＢｍａＰｈｉＥ１２５ＯＲＦ５６Ｐ、Ｍ．Ｂｍｅ２１６Ｉ、Ｍ．ＢｍｅＬＯＲＦ１４４４Ｐ、Ｍ．ＢｍｅＴＩ、Ｍ１．ＢｍｒＩ、Ｍ２．ＢｍｒＩ、Ｍ．ＢｎａＩ、Ｍ．ＢｐｍＩ、Ｍ１．Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｍ２．Ｂｐｕ１０Ｉ、Ｍ１．ＢｓａＩ、Ｍ２．ＢｓａＩ、Ｍ．ＢｓａＡＩ、Ｍ．ＢｓａＪＩ、Ｍ．ＢｓａＷＩ、Ｍ１．ＢｓｃＧＩ、Ｍ２．ＢｓｃＧＩ、Ｍ．Ｂｓｅ６３４Ｉ、Ｍ．ＢｓｅＣＩ、Ｍ．ＢｓｅＤＩ、ＢｓｅＭＩＩ、ＢｓｅＲＩ、Ｍ．ＢｓｅＲＩ、Ｍ．ＢｓｅＹＩ、ＢｓｇＩ、Ｍ．ＢｓｇＩ、Ｍ．ＢｓｉＷＩ、Ｍ．ＢｓｌＩ、Ｍ１．ＢｓｍＩ、Ｍ２．ＢｓｍＩ、Ｍ．ＢｓｍＡＩ、Ｍ．ＢｓｍＢＩ、Ｍ．ＢｓｏＢＩ、Ｍ．ＢｓｐＩ、Ｍ．Ｂｓｐ６Ｉ、Ｍ．Ｂｓｐ５０Ｉ、Ｍ．Ｂｓｐ９８Ｉ、Ｍ．Ｂｓｐ１０６Ｉ、Ｍ．Ｂｓｐ１４３ＩＩ、ＢｓｐＣＮＩ、Ｍ．ＢｓｐＣＮＩ、Ｍ．ＢｓｐＥＩ、Ｍ．ＢｓｐＨＩ、Ｍ．ＢｓｐＩＳ４Ｉ、Ｍ．ＢｓｐＫＴ６Ｉ、ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ、Ｍ１．ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ、Ｍ２．ＢｓｐＬＵ１１ＩＩＩ、Ｍ１．ＢｓｐＭＩ、Ｍ２．ＢｓｐＭＩ、Ｍ．ＢｓｐＭＩＩ、Ｍ．ＢｓｐＲＩ、Ｍ．ＢｓｐＳＴ５Ｉ、Ｍ１．ＢｓｒＩ、Ｍ２．ＢｓｒＩ、Ｍ１．ＢｓｒＢＩ、Ｍ２．ＢｓｒＢＩ、Ｍ．ＢｓｒＦＩ、Ｍ．ＢｓｓＨＩ、Ｍ．ＢｓｓＨＩＩ、Ｍ．ＢｓｓＳＩ、Ｍ．ＢｓｔＩ、Ｍ．ＢｓｔＥＩＩ、Ｍ．ＢｓｔＥＩＩＩ、Ｍ１．ＢｓｔＦ５Ｉ、Ｍ２．ＢｓｔＦ５Ｉ、Ｍ３．ＢｓｔＦ５Ｉ、Ｍ４．ＢｓｔＦ５Ｉ、Ｍ．ＢｓｔＧＩＩ、Ｍ．ＢｓｔＬＶＩ、Ｍ．ＢｓｔＮＩ、Ｍ．ＢｓｔＮＢＩ、Ｍ．ＢｓｔＶＩ、Ｍ．ＢｓｔＸＩ、Ｍ．ＢｓｔＹＩ、Ｍ．Ｂｓｕ１５Ｉ、Ｍ．Ｂｓｕ３６Ｉ、Ｍ．Ｂｓｕ６６３３Ｉ、Ｍ．ＢｓｕＢＩ、Ｍ．ＢｓｕＥＩＩ、Ｍ．ＢｓｕＦＩ、Ｍ．Ｂｓｕ１３３０ＯＲＦ４９１Ｐ、Ｍ．ＢｓｕＲＩ、Ｍ．ＢｔｈＩＰＳ７８、Ｍ．ＢｔｈＶＯＲＦ４６２５Ｐ、Ｍ．ＢｕｓＬＢＯＲＦＣ７４７Ｐ； 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【００６５】
本発明のより好ましい実施態様では、メチルトランスフェラーゼは、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼＭ．Ｔａｑｌ、Ｍ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＢｃｎＩＢ（Ｍ２．ＢｃｎＩ）、Ｍ．ＳｓｓＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩ、Ｍ．ＲｓｒＩ、Ｍ２．ＢｆｉＩ（Ｍ．ＢｆｉＣ２）、Ｍ２．Ｅｃｏ３１Ｉまたはその誘導体から成るグループから選ばれる。
【００６６】
本発明はさらに、本発明の化合物（Ｉ）を含むキットに関する。このキットの各種成分は、保存のために要すれば任意に適切なバッファーに溶解されて、１個以上の容器にパックされてもよい。使用案内を載せたリーフレットを加えてもよい。
【００６７】
本発明のある好ましい実施態様では、本発明のキットはさらに、本発明で定義されるものと同じメチルトランスフェラーゼを含む。
【００６８】
本発明はさらに、本発明の複合体を含むキットに関する。
【００６９】
本発明はさらに、本発明の化合物（Ｉ）または本発明の複合体、および、要すれば任意に製薬学的に受容可能な担体を含む製薬組成物に関する。
【００７０】
本発明はさらに、本発明の化合物（Ｉ）、または本発明の複合体を含む診断組成物に関する。一実施態様によれば、診断組成物は、液体組成物である。この診断組成物の好ましい溶媒は水性である。さらに、組成物は、処方のｐＨ、浸透圧、粘度、色、滅菌性、安定性、溶解速度、または臭気を修飾または維持するための、他の成分または担体を含んでもよい。同様に、組成物は、その診断組成物の安定性、溶解速度、放出、または吸収を修飾または維持するために、さらに別の製薬学的に受容可能な成分を含んでもよい。一旦診断組成物が処方されたならば、これを、溶液、縣濁液、ゲル、乳液、固体、脱水または凍結粉末として、滅菌バイアルの中に貯蔵してもよい。このような処方は、すぐに使用できる形として、または、使用の直前に再構成を必要とする形として保存されてよい。
【００７１】
本発明はさらに、本発明の化合物（Ｉ）、またはその混合物の、標的分子を修飾するための使用に関する。典型的使用は、本発明の教示による方法、例えば、本明細書に記載される方法である。
【００７２】
本発明の好ましい実施態様では、標的分子の修飾は、本発明の化合物（Ｉ）またはその混合物を、該化合物の一部を標的分子に転移するメチルトランスフェラーゼの補因子として使用することによって実現される。
【００７３】
本発明の好ましい実施態様では、標的分子は、核酸分子、要すれば任意に配列特異的なやり方で修飾されたポリペプチド、炭水化物、または小型分子である。
【００７４】
本発明の好ましい実施態様では、核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドであり、より好ましくは、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子は、配列特異的やり方で修飾される。
【００７５】
本発明の、もう一つのより好ましい実施態様では、小型分子は、リン脂質、アミノ酸、ホルモン、ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびそれらの誘導体から選ばれる。
【００７６】
本発明の、もう一つのより好ましい実施態様では、メチルトランスフェラーゼは、上に定義したＤＮＡメチルトランスフェラーゼである。
【００７７】
本発明はさらに、修飾された標的分子の調製法であって、本発明の化合物（Ｉ）と、該化合物を補因子として使用することが可能なメチルトランスフェラーゼの存在下に、該化合物の一部を標的分子に転移することを可能とする条件下に、標的分子をインキュベートすることを含む方法に関する。
【００７８】
本発明のある好ましい実施態様では、標的分子は、核酸分子、ポリペプチド、炭水化物、または小型分子、またはそれらの間の複合体である。
【００７９】
本発明のより好ましい実施態様では、小型分子は、リン脂質、アミノ酸、ホルモン、ヌクレオチド、ヌクレオシド、およびそれらの誘導体である。
【００８０】
本発明のより好ましい実施態様では、ポリペプチドは配列特異的やり方で修飾される。
【００８１】
本発明のより好ましい実施態様では、ＤＮＡ、またはＲＮＡ分子は配列特異的やり方で修飾される。
【００８２】
本発明のもう一つのより好ましい実施態様では、修飾は、標識として好適な基を標的分子に転移し、他の未標識分子の間において標識された該分子の特定を可能とすることによって実現される。最後に、本発明のより好ましい実施態様では、標識は、蛍光発色団、蛍光消光剤、アフィニティタグ、スピンラベル、質量タグ、放射性または安定な希少同位元素、発色団、および検出可能なナノ粒子から選ばれる。
【００８３】
本発明はまた、生体分子における配列特異的メチル化を検出する方法であって、（ａ）前記メチルトランスフェラーゼの検出可能な補因子の存在下に、生体分子をＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン依存性メチルトランスフェラーゼに接触させること；および、（ｂ）前記メチルトランスフェラーゼの認識部位が、補因子またはその誘導体によって修飾されたかどうかを検出することを含み、前記メチルトランスフェラーゼの認識部位の修飾は、前記認識部位におけるメチル化の不在を示し、前記補因子は、上に詳述した本発明の、式（Ｉ）の化合物、またはその誘導体であることを特徴とする、方法に関する。
【００８４】
「生体分子」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または（ポリ）ペプチドを意味する。「（ポリ）ペプチド」という用語は、ペプチド、またはポリペプチドを交互に指す。通常、ペプチドは、最大３０個の残基から成る共有的に結合されるアミノ酸であるが、一方ポリペプチドは（「タンパク」とも呼ばれる）３１個以上のアミノ酸残基を含む。生体分子は、染色体またはゲノムＤＮＡであることが好ましい。
【００８５】
「生体分子をメチルトランスフェラーゼに接触させる」という用語は、メチルトランスフェラーゼと生体分子とを接触させることを意味する。一般に、このことは、生体分子を含むサンプルにメチルトランスフェラーゼを加えることによって実現される。それとは別に、生体分子を含むサンプルを、メチルトランスフェラーゼを含む溶液に加えてもよい。当業者には、最適な酵素活性を実現するのに必要な特定のバッファー条件は既知である。このような条件は、当業者には既知であるか、あるいは、様々なアッセイ条件下で酵素活性を調べることによって獲得することが可能である。
【００８６】
通常、生体分子は、メチルトランスフェラーゼ補因子の存在下にメチルトランスフェラーゼと接触させられる。前記補因子は、上に詳述された、式（Ｉ）の化合物、またはその誘導体であることが好ましい。
【００８７】
「メチルトランスフェラーゼ」という用語は、通常、活性化メチルを、Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＡｄｏＭｅｔ）からその基質へ転移する酵素を指す。メチルトランスフェラーゼは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または（ポリ）ペプチドをメチル化することが可能な酵素であることが好ましい。より好ましくは、メチルトランスフェラーゼは、Ｍ．ＴａｑＩ、Ｍ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＢｃｎＩＢ（Ｍ２．ＢｃｎＩ）、Ｍ．ＳｓｓＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩ、Ｍ．ＲｓｒＩ、Ｍ２．ＢｆｉＩ（Ｍ．ＢｆｉＣ２）、Ｍ２．Ｅｃｏ３１Ｉ、またはそれらの誘導体から選ばれるＤＮＡメチルトランスフェラーゼであることが好ましい。
【００８８】
「前記メチルトランスフェラーゼの認識部位が、補因子またはその誘導体によって修飾されたかどうかを検出すること」という用語は、式（Ｉ）の補因子またはその誘導体が生体分子に付着したかどうかを評価することを意味する。好ましくは、検出法は、メチルトランスフェラーゼの認識配列の中に、前記補因子またはその誘導体によって修飾された特定の残基を特定することを含む。前記誘導体は、式（Ｉ）の化合物またはその誘導体と、生体分子との間の反応から生じる任意の化合物であってよい。
【００８９】
「認識配列」という用語は、生体分子において、メチルトランスフェラーゼによって認識される特定の配列を指す。メチルトランスフェラーゼがＤＮＡメチルトランスフェラーゼである場合、認識配列は、２、３、４、５、６、または８個または対のヌクレオチドまたはヌクレオチドペアを含んでもよい。本明細書で用いる認識配列は、通常、本発明の、式（Ｉ）の化合物、またはその誘導体に対するアクセプター部位を含む。本発明の教示は、メチルトランスフェラーゼ依存性に配列特異的標識付着を可能とする。いわゆるＣｐＧ島に配されるシトシン残基のＤＮＡ標識は、本発明の特異的局面である。なぜなら、これによって、ヒトの染色体ＤＮＡのメチル化状態を評価することが可能となるからである。従って、本発明の方法は、染色体ＤＮＡのメチル化状態の変化と関連する疾病を診断するのに特に有用であるが、ただし本発明が有用であるのはこれに限定されない。本発明の方法は、他の供給源から得られたＤＮＡのメチル化状態ばかりでなく、ＲＮＡまたは（ポリ）ペプチドのメチル化状態を評価するのにも有用である筈である。さらに、メチルトランスフェラーゼと複合体を形成する式（Ｉ）の補因子またはその誘導体は、生化学、分子生物学、遺伝子治療、およびナノ生物工学における種々の応用にも有用となる筈である。さらに、式（Ｉ）の補因子またはその誘導体は、メチルトランスフェラーゼの、新たなメチル化標的を見出すのに使用することが可能である。
【００９０】
本発明の好ましい実施態様では、前記生体分子は、核酸分子か、または（ポリ）ペプチドである。核酸分子は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含むものと理解しなければならない。好ましくは、ＤＮＡは、染色体またはゲノムＤＮＡである。生体分子は任意の長さを持っていてよい。「染色体ＤＮＡ」という用語はまた、染色体の断片を含む。前記断片は、最大５００ヌクレオチド（ｎｔ）、１キロベース（ｋｂ）、２ｋｂ、３ｋｂ、４ｋｂ、５ｋｂ、６ｋｂ、７ｋｂ、８ｋｂ、９ｋｂ、１０ｋｂまたはそれ以上の長さを持つ。一方、染色体ＤＮＡによって包括されるものは、最大５ｎｔ、１０ｎｔ、１５ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、１００ｎｔ、２００ｎｔ、３００ｎｔ、４００ｎｔ、５００ｎｔの長さを持つ短い断片である。
【００９１】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施態様では、前記（ａ）工程は、インビトロか、細胞抽出物か、またはインビボで実行される。一般に、制限酵素およびＤＮＡトランスフェラーゼによる処理にとって好適な反応条件は、当業者には既知であり、例えば、分子生物学の標準的教科書に記録される（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」；  ＩＳＢＮ：  ０８７９６９５７６５、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、２００１を参照されたい）。Ｍ．Ｓｓｓｌの変種Ｑ１４２Ａによって仲介される補因子標識化の適正条件は、バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ塩酸、５０ｍＭ塩化ナトリウム、１ｍＭジチオスレイトール、ｐＨ７．９）に溶解した、式（Ｉ）の化合物３００μＭ、Ｍ．Ｓｓｓｌ変種Ｑ１４２Ａ  ７３ｐｍｏｌである。インキュベーションは、３７℃４時間でよい。本発明の方法をインビトロで実行する場合、分析の前に個体から生物サンプルを分離する。この「生物サンプル」という用語は、個体から取り出された標本に関する。前記標本は、毛髪、皮膚、粘膜表面、体液、例えば、血液、血漿、血清、尿、唾液、喀痰、涙液、脳脊髄液、精液、滑液、羊水、乳汁、リンパ液、肺喀痰、気管支分泌液を含む体液、または大便から採取されるのが好ましい。
【００９２】
個体は、ヒトまたは動物であってよい。個体は、七面鳥またはニワトリを含む家禽であるか、あるいは、個体は、哺乳類、例えば、ヒト、霊長類、ラット、マウス、モルモット、ブタ、ウシ、ネコ、またはウサギを含む哺乳類であることが好ましい。
【００９３】
本発明のより好ましい実施態様では、前記核酸分子はＤＮＡである。前記ＤＮＡは染色体ＤＮＡであることが好ましい。
【００９４】
本発明の、もう一つのより好ましい実施態様では、本法は、工程（ａ）の前に、制限酵素でＤＮＡを処理する工程をさらに含む。制限酵素は、Ｒ．ＡａｔＩＩ、Ｒ．ＡｃｃＩ、Ｒ．Ａｃｃ６５Ｉ、Ｒ．ＡｃｉＩ、Ｒ．ＡｃｌＩ、Ｒ．ＡｆｅＩ、Ｒ．ＡｆｌＩＩ、Ｒ．ＡｆｌＩＩＩ、Ｒ．ＡｇｅＩ、Ｒ．ＡｈｄＩ、Ｒ．ＡｌｕＩ、Ｒ．ＡｌｗＩ、Ｒ．ＡｌｗＮＩ、Ｒ．ＡｐａＩ、Ｒ．ＡｐａＬＩ、Ｒ．ＡｐｏＩ、Ｒ．ＡｓｃＩ、Ｒ．ＡｓｅＩ、Ｒ．ＡｓｉＳＩ、Ｒ．ＡｖａＩ、Ｒ．ＡｖａＩＩ、Ｒ．ＡｖｒＩＩ、Ｒ．ＢａｅＩ、Ｒ．ＢａｍＨＩ、Ｒ．ＢａｎＩ、Ｒ．ＢａｎＩＩ、Ｒ．ＢｂｓＩ、Ｒ．ＢｂｖＩ、Ｒ．ＢｂｖＣＩ、Ｒ．ＢｃｅＡＩ、Ｒ．ＢｃｇＩ、Ｒ．ＢｃｉＶＩ、Ｒ．ＢｃｌＩ、Ｒ．ＢｆａＩ、Ｒ．ＢｆｒＢＩ、Ｒ．ＢｆｕＡＩ、Ｒ．ＢｇｌＩ、Ｒ．ＢｇｌＩＩ、Ｒ．ＢｌｐＩ、Ｒ．Ｂｍｅ１５８０Ｉ、Ｒ．ＢｍｇＢＩ、Ｒ．ＢｍｒＩ、Ｒ．ＢｐｍＩ、Ｒ．ＢｓａＩ、Ｒ．ＢｓａＡＩ、Ｒ．ＢｓａＢＩ、Ｒ．ＢｓａＨＩ、Ｒ．ＢｓａＪＩ、Ｒ．ＢｓａＷＩ、Ｒ．ＢｓａＸＩ、Ｒ．ＢｓｅＲＩ、Ｒ．ＢｓｇＩ、Ｒ．ＢｓｉＥＩ、Ｒ．ＢｓｉＨＫＡＩ、Ｒ．ＢｓｉＷＩ、Ｒ．ＢｓｌＩ、Ｒ．ＢｓｍＩ、Ｒ．ＢｓｍＡＩ、Ｒ．ＢｓｍＢＩ、Ｒ．ＢｓｍＦＩ、Ｒ．ＢｓｏＢＩ、Ｒ．Ｂｓｐ１２８６Ｉ、Ｒ．ＢｓｐＣＮＩ、Ｒ．ＢｓｐＤＩ、Ｒ．ＢｓｐＥＩ、Ｒ．ＢｓｐＨＩ、Ｒ．ＢｓｐＭＩ、Ｒ．ＢｓｒＩ、Ｒ．ＢｓｒＢＩ、Ｒ．ＢｓｒＤＩ、Ｒ．ＢｓｒＦＩ、Ｒ．ＢｓｒＧＩ、Ｒ．ＢｓｓＨＩＩ、Ｒ．ＢｓｓＫＩ、Ｒ．ＢｓｓＳＩ、Ｒ．ＢｓｔＡＰＩ、Ｒ．ＢｓｔＢＩ、Ｒ．ＢｓｔＥＩＩ、Ｒ．ＢｓｔＦ５Ｉ、Ｒ．ＢｓｔＮＩ、Ｒ．ＢｓｔＵＩ、Ｒ．ＢｓｔＸＩ、Ｒ．ＢｓｔＹＩ、Ｒ．ＢｓｔＺ１７Ｉ、Ｒ．Ｂｓｕ３６Ｉ、Ｒ．ＢｔｇＩ、Ｒ．ＢｔｒＩ、Ｒ．ＢｔｓＩ、Ｒ．Ｃａｃ８Ｉ、Ｒ．ＣｌａＩ、Ｒ．ＤｄｅＩ、Ｒ．ＤｐｎＩ、Ｒ．ＤｐｎＩＩ、Ｒ．ＤｒａＩ、Ｒ．ＤｒａＩＩＩ、Ｒ．ＤｒｄＩ、Ｒ．ＥａｅＩ、Ｒ．ＥａｇＩ、Ｒ．ＥａｒＩ、Ｒ．ＥｃｉＩ、Ｒ．ＥｃｏＮＩ、Ｒ．ＥｃｏＯ１０９Ｉ、Ｒ．ＥｃｏＲＩ、Ｒ．ＥｃｏＲＶ、Ｒ．ＦａｕＩ、Ｒ．Ｆｎｕ４ＨＩ、Ｒ．ＦｏｋＩ、Ｒ．ＦｓｅＩ、Ｒ．ＦｓｐＩ、Ｒ．ＨａｅＩＩ、Ｒ．ＨａｅＩＩＩ、Ｒ．ＨｇａＩ、Ｒ．ＨｈａＩ、Ｒ．ＨｉｎＰ１Ｉ、Ｒ．ＨｉｎｃＩＩ、Ｒ．ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｒ．ＨｉｎｆＩ、Ｒ．ＨｐａＩ、Ｒ．ＨｐａＩＩ、Ｒ．ＨｐｈＩ、Ｒ．Ｈｐｙ９９Ｉ、Ｒ．Ｈｐｙ１８８Ｉ、Ｒ．Ｈｐｙ１８８ＩＩＩ、Ｒ．ＨｐｙＣＨ４ＩＩＩ、Ｒ．ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、Ｒ．ＨｐｙＣＨ４Ｖ、Ｒ．ＫａｓＩ、Ｒ．ＫｐｎＩ、Ｒ．ＭｂｏＩ、Ｒ．ＭｂｏＩＩ、Ｒ．ＭｆｅＩ、Ｒ．ＭｌｕＩ、Ｒ．ＭｌｙＩ、Ｒ．ＭｎｌＩ、Ｒ．ＭｓｃＩ、Ｒ．ＭｓｅＩ、Ｒ．ＭｓｌＩ、Ｒ．ＭｓｐＩ、Ｒ．ＭｓｐＡ１Ｉ、Ｒ．ＭｗｏＩ、Ｒ．ＮａｅＩ、Ｒ．ＮａｒＩ、Ｒ．ＮｃｉＩ、Ｒ．ＮｃｏＩ、Ｒ．ＮｄｅＩ、Ｒ．ＮｇｏＭＩＶ、Ｒ．ＮｈｅＩ、Ｒ．ＮｌａＩＩＩ、Ｒ．ＮｌａＩＶ、Ｒ．ＮｏｔＩ、Ｒ．ＮｒｕＩ、Ｒ．ＮｓｉＩ、Ｒ．ＮｓｐＩ、Ｒ．ＰａｃＩ、Ｒ．ＰａｅＲ７Ｉ、Ｒ．ＰｃｉＩ、Ｒ．ＰｆｌＦＩ、Ｒ．ＰｆｌＭＩ、Ｒ．ＰｌｅＩ、Ｒ．ＰｍｅＩ、Ｒ．ＰｍｌＩ、Ｒ．ＰｐｕＭＩ、Ｒ．ＰｓｈＡＩ、Ｒ．ＰｓｉＩ、Ｒ．ＰｓｐＧＩ、Ｒ．ＰｓｐＯＭＩ、Ｒ．ＰｓｔＩ、Ｒ．ＰｖｕＩ、Ｒ．ＰｖｕＩＩ、Ｒ．ＲｓａＩ、Ｒ．ＲｓｒＩＩ、Ｒ．ＳａｃＩ、Ｒ．ＳａｃＩＩ、Ｒ．ＳａｌＩ、Ｒ．ＳａｐＩ、Ｒ．Ｓａｕ９６Ｉ、Ｒ．Ｓａｕ３ＡＩ、Ｒ．ＳｂｆＩ、Ｒ．ＳｃａＩ、Ｒ．ＳｃｒＦＩ、Ｒ．ＳｅｘＡＩ、Ｒ．ＳｆａＮＩ、Ｒ．ＳｆｃＩ、Ｒ．ＳｆｉＩ、Ｒ．ＳｆｏＩ、Ｒ．ＳｇｒＡＩ、Ｒ．ＳｍａＩ、Ｒ．ＳｍｌＩ、Ｒ．ＳｎａＢＩ、Ｒ．ＳｐｅＩ、Ｒ．ＳｐｈＩ、Ｒ．ＳｓｐＩ、Ｒ．ＳｔｕＩ、Ｒ．ＳｔｙＩ、Ｒ．ＳｗａＩ、Ｒ．ＴａｑＩ、Ｒ．ＴｆｉＩ、Ｒ．ＴｌｉＩ、Ｒ．ＴｓｅＩ、Ｒ．Ｔｓｐ４５Ｉ、Ｒ．Ｔｓｐ５０９Ｉ、Ｒ．ＴｓｐＲＩ、Ｒ．Ｔｔｈ１１１Ｉ、Ｒ．ＸｂａＩ、Ｒ．ＸｃｍＩ、Ｒ．ＸｈｏＩ、Ｒ．ＸｍａＩ、およびＲ．ＸｍｎＩから成るグループから選ばれてもよい。
【００９５】
本発明のさらにもう一つのより好ましい実施態様では、前記ＤＮＡは、固相支持体の上に固定される。本発明に従って用いられる固相支持体は、フィルター材料、チップ、ウェイファー、マイクロタイタープレートを含む。固相支持体に対する固定は、種々の手段、例えば、活性化表面に対する共有結合、または、核酸分子に対するハイブリダイゼーションを含む各種手段によって実現してよい。
【００９６】
本発明のもう一つのより好ましい実施態様では、前記ＤＮＡ分子は、固相支持体に、この固相支持体に付着するオリゴヌクレオチドに該ＤＮＡ分子をハイブリダイズすることによって付着する。ハイブリダイゼーション条件は、低度、中等度、または高度の厳格度であってよい。本明細書で用いる「厳格条件」という用語は、当業者にはよく知られているが、高度の厳格度条件に一致する。各配列に対する適切な厳格度のハイブリダイゼーション条件は、当業者であれば、温度、核酸分子の組成、塩条件等のパラメータを修飾することによって定めることが可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，「分子クローニング、実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」；  ＩＳＢＮ：  ０８７９６９５７６５、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、２００１、またはＨｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｓ（ｅｄｓ．），「核酸ハイブリダイゼーション、実技入門（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ）」、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  １９８５、特に、「ハイブリダイゼーション戦略（Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ）」の章、Ｂｒｉｔｔｅｎ  ＆  Ｄａｖｉｄｓｏｎ著、３から５を参照されたい。厳格ハイブリダイゼーション条件とは、例えば、５０％フォルムアミド、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ液、１０％硫酸デキストラン、および、２０μｇ／ｍＬの変性、せん断鮭精子ＤＮＡを含む溶液において４２℃で一晩インキュベーション、その後、約６５℃において０．１ｘＳＳＣにおいてフィルター洗浄を含む条件である。他の厳格ハイブリダイゼーション条件は、例えば、６５℃における０．２ｘＳＳＣ（３０ｍＭ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸三ナトリウム、ｐＨ７）である。さらにより低い厳格度を実現するために、厳格ハイブリダイゼーションの後に実行される洗浄を、より高い塩濃度（例えば、５ｘＳＳＣ）で行ってもよい。ハイブリダイゼーション実験における背景雑音を抑制するために使用されるブロッキング試薬を含めるか、および／または置換することによって、前述の条件に変動をもたらすことが可能であることに注意しなければならない。典型的ブロッキング試薬としては、Ｄｅｎｈａｒｄｔ試薬、ＢＬＯＴＴＯ、ヘパリン、変性鮭精子ＤＮＡ、および市販の私企業専売処方が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。特定のブロッキング試薬の導入は、適合性問題のために、前述のハイブリダイゼーション条件の修正を要求する場合がある。比較的低い厳格度を持つハイブリダイゼーション条件も考慮の対象となる。ハイブリダイゼーションおよび信号検出の厳格度の変更は、例えば、フォルムアミド濃度（フォルムアミドのパーセンテージが低いと厳格度は低くなる）、塩条件、または温度を操作することによって実現される。例えば、比較的低い厳格度条件は、６ｘＳＳＰＥ（２０ｘＳＳＰＥ＝３Ｍ  ＮａＣｌ、０．２Ｍ  ＮａＨ2ＰＯ4、０．０２Ｍ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４）、０．５％ＳＤＳ、３０％フ���ルムアミド、１００μｇ／ｍＬの変性鮭精子ＤＮＡを含む溶液において３７℃で一晩インキュベーション、その後、５０℃において１ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳにおいて洗浄を含む。さらに低い厳格度を実現するためには、厳格ハイブリダイゼーション後に実行される洗浄を、より高い塩濃度（例えば、５ｘＳＳＣ）において行ってもよい。
【００９７】
本発明のもう一つのより好ましい実施態様では、メチルトランスフェラーゼは、孤立ＤＮＡトランスフェラーゼであるか、または細菌制限修飾システムの一部である。
【００９８】
本発明のさらにもう一つの好ましい実施態様では、前記メチルトランスフェラーゼは、Ｍ．ＴａｑＩ、Ｍ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＢｃｎＩＢ（Ｍ２．ＢｃｎＩ）、Ｍ．ＳｓｓＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩ、Ｍ．ＲｓｒＩ、Ｍ２．ＢｆｉＩ（Ｍ．ＢｆｉＣ２）、およびＭ２．Ｅｃｏ３１Ｉ、またはその誘導体から選ばれる。用語”Ｍ．ＨｈａＩ”は、アクセス番号Ｐ０５１０２の下にＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに保管されるＤＮＡメチルトランスフェラーゼを指す。用語”Ｍ．ＴａｑＩ”は、アクセス番号Ｐ１４３８５の下にＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに保管されるＤＮＡメチルトランスフェラーゼを指す。用語”Ｍ．ＢｓｅＣＩ”は、アクセス番号Ｐ４３４２３の下にＳｗｉｓｓｐｒｏｔデータベースに保管されるＤＮＡメチルトランスフェラーゼを指す。しかしながら、Ｍ．ＴａｑＩ、Ｍ．ＨｈａＩ、Ｍ．ＢｃｎＩＢ（Ｍ２．ＢｃｎＩ）、Ｍ．ＳｓｓＩ、Ｍ．ＢｓｅＣＩ、Ｍ．ＲｓｒＩ、Ｍ２．ＢｆｉＩ（Ｍ．ＢｆｉＣ２）およびＭ２．Ｅｃｏ３１Ｉと同じ配列特異性を持つものであれば、すなわち、同じ認識配列を持つか、または、低い配列特異性を持つものでも該認識配列の一部だけを含んでいれば、他の任意のメチルトランスフェラーゼも、本発明の方法にとって有用である可能性がある。
【００９９】
本発明のもう一つのより好ましい実施態様では、（ａ）本発明の式（Ｉ）の化合物、またはその誘導体は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの認識部位における、または認識部位近傍における、制限酵素の切断を阻止し；かつ、（ｂ）メチル化は、前記化合物によるＤＮＡの修飾が、前記認識部位において、またはその近傍において、制限酵素による切断を阻止するかどうかを試験することによって検出される。
【０１００】
本発明の発明人は、認識配列のアクセプター部位における、本発明の式（Ｉ）の化合物の存在が、重複するか、または同じ認識配列を持つ制限酵素によるＤＮＡ切断を阻止することを観察した。本明細書で用いる制限酵素切断の阻止とは、制限酵素が、ＤＮＡ鎖を切断することを防止することを意味する。理論に縛られる心算はないが、立体的障碍が、認識配列への接触を阻止するため、制限酵素が生産的な形でその標的配列に結合できなくなると仮定される。この所見は、本発明の化合物による最初の標識化工程、および、制限酵素によるその後の切断工程を含むアッセイに利用することが可能である。もちろん、制限酵素の選択は、標識工程で用いられる特定のＤＮＡトランスフェラーゼに依存する。一般的ガイドラインとして、制限酵素の認識配列は、修飾された塩基の近傍になければならない。制限酵素の認識配列は、修飾された塩基を含むことが好ましい。ＤＮＡトランスフェラーゼの認識配列と、制限酵素の認識配列とが同じであることがより好ましい。制限酵素およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼの特定の組み合わせの選択は、当業者には明らかであり、これ以上の説明を必要としない。さらに、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによって実行される標識化反応、および制限酵素切断は、標準条件下で実行されてよい。
【０１０１】
本発明のもう一つのより好ましい実施態様では、（ａ）本発明の式（Ｉ）の化合物、またはその誘導体は、メチルトランスフェラーゼの認識部位において核酸増幅を妨げ；かつ、（ｂ）メチル化は、核酸の増幅が、メチルトランスフェラーゼの認識部位において遅れるかどうかを試験することによって検出される。増幅遅延は、増幅反応時においてプライマー結合または鎖伸長を妨げることによって実現されると考えられる。
【０１０２】
「増幅」または「増幅する」という用語は、コピー数の増加を意味する。当業者であれば、核酸分子を増幅するための様々な方法を存知しているであろうが、これらの方法は、本発明の診断法においても使用が可能である。増幅法としては、例えば、「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）、「リガーゼ連鎖反応」（ＬＣＲ、ＥＰＡ３２０３０８）、「周期的プローブ反応」（ＣＰＲ）、「鎖移動増幅」（ＳＤＡ、Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．  ７、１６９１−１６９６）、「転写依存増幅システム」（ＴＡＳ、Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８６、１１７３；  Ｇｉｎｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．、ＰＣＴ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ＷＯ  ８８／１０３１５）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。ＤＮＡの増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて実行することが好ましい［Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｖｏｌ．２２６（Ｂａｒｌｅｔｔ  ａｎｄ  Ｓｔｉｒｌｉｎｇ、ｅｄｓ．）：  ＰＣＲ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ；  ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｅｈｒｌｉｃｈ、ｅｄ．）、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９９２；  ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．、ｅｄｓ．）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  １９９０］。サンプルがごく微量の核酸しか含んでいない場合には、核酸増幅法が特に便利な場合がある。前記核酸がＲＮＡである場合、ＲＴ−ＰＣＲを実行してもよい。その後、ＰＣＲを含むもう一つの増幅工程を実行してもよい。それとは別に、同じサンプルに含まれる前記核酸がＤＮＡである場合、ＰＣＲを実行してよい。
【０１０３】
一般に、ＰＣＲは、（ａ）ＤＮＡ分子の二つの鎖を溶解する、変性工程；（ｂ）ＤＮＡ分子の溶解鎖にプライマーを特異的にアニールさせることを目的とするアニーリング工程；および、（ｃ）鋳型鎖によって供給される情報を用いてアニールしたプライマーを伸長させる伸長工程から成るサイクルの、数多くの繰り返しから成る。一般に、ＰＣＲは、５μＬの１０ｘＰＣＲバッファーを、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、各デオキシヌクレオシド三リン酸２００μＭ、各プライマー０．５μＬ（１０μＭ）、約１０から１００ｎｇの鋳型ＤＮＡ、および、１から２．５単位のＴａｑ  ＤＮＡと共に含む５０μＬの反応混合液において実行される。増幅用プライマーは、標識されてもよいし、未標識であってもよい。ＤＮＡ増幅は、例えば、モデル２４００熱サイクラー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）使用：９４℃で２分、次いでアニーリング（５０℃で３０秒）、伸長（７２℃で１分）、変性（９４℃で１０秒）から成るサイクルを３５サイクル、および最終アニーリング工程５５℃で１分および最終伸長工程７２℃で５分、によって実行することが可能である。しかしながら、当業者であれば、特定の核酸分子の増幅のためにこれらの条件をどう最適化したらよいか、または、反応混合物容量をどのように縮小、または拡大したらよいかを承知している。
【０１０４】
核酸増幅のもう一つの方法は、「逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）」である。この方法は、増幅される核酸がＲＮＡから成る場合に用いられる。「逆転写酵素」という用語は、リボ核酸鋳型に対して相補的なプライマー伸長産物を形成する、デオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒する酵素を指す。この酵素は、プライマーの３′末端において合成を開始し、鋳型の５′末端に向かって進み、５′末端に達したところで合成が止む。ＲＮＡ標的配列を、相補的なコピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列に変換するのに好適な重合剤の例として、ニワトリ骨髄芽細胞症ウィルス逆転写酵素およびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒによって市販される、逆転写酵素活性を持つ熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがある。通常、ゲノムＲＮＡ／ｃＤＮＡ二重鎖鋳型は、最初の逆転写工程後の初回の変性工程時に熱変性されてＤＮＡ鎖を離脱させ、これが、増幅用鋳型として利用される。ＤＮＡ鋳型と共に使用するのに好適なポリメラーゼとしては、例えば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩまたはそのクレノウ断片、Ｔ．ｓｕｂ．４  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｔｈポリメラーゼ、および、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓから単離され、Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅによって開発・製造され、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒによって市販される、熱安定ＤＮＡポリメラーゼであるＴａｑポリメラーゼが挙げられる。この後者の酵素は、核酸の増幅および配列決定に広く使用される。Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを使用するための反応条件は従来技術において既知であり、かつ、例えば、「ＰＣＲ技術（ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」、Ｅｈｒｌｉｃｈ（１９８９、Ｓｔｏｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；  Ｉｎｎｉｓ、Ｇｅｌｆａｎｄ、Ｓｎｉｎｓｋｙ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｅ．  １９９０、「ＰＣＲプロトコール：方法および応用ガイド（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載される。高温ＲＴによって、より高いプライマー特異性および効率が実現される。１９９１年８月１５日出願の、係属中の米国特許出願第０７／７４６，１２１号は「相同性ＲＴ−ＰＣＲ」を記載する。このＰＣＲでは、逆転写とＰＣＲ増幅の両工程において同じプライマーおよびポリメラーゼで十分であり、二つの反応が試薬の交代無しに行われるように反応条件が最適化される。Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素としても機能することが可能な熱安定ＤＮＡポリメラーゼであるが、これは、鋳型によらず、全てのプライマー伸長工程において使用することが可能である。両工程は、試薬を変える、または加えるためにチューブを開くことを要することなく実行することが可能である。ただ温度プロフィールだけは、第１サイクル（ＲＮＡ鋳型）と残りの増幅サイクル（ＤＮＡ鋳型）の間で調整する。ＲＴ反応は、例えば、５ｘＡＮＶ−ＲＴバッファー４μＬ、２μＬのオリゴｄＴ（１００μｇ／ｍＬ）、１０ｍＭ  ｄＮＴＰ  ２μＬ、全体ＲＮＡ  １μＬ、１０単位のＡＭＶ逆転写酵素、およびＨ2Ｏを加えて２０μＬの最終容量としたものを含む２０μＬの反応混合液において実行される。反応は、例えば、下記の条件を用いて実行してもよい。反応は、逆転写を可能とするために１５分７０℃に維持される。次に、反応温度を９５℃に１分上げて、ＲＮＡ−ｃＤＮＡ二重鎖を変性する。次に、反応温度を９５℃で１５秒および６０℃で２０秒から成る２サイクル、その後、９０℃で１５秒および６０℃で２０秒から成る３８サイクルを経過させる。最後に、反応温度を、最終伸長工程のために６０℃で４分維持し、１５℃に冷却し、増幅サンプルのその後の処理までその温度に維持する。
【０１０５】
本発明を通じて使用される「プライマー」または「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然であると合成であるとを問わず、鋳型核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長産物が誘発される条件下で、すなわち、適切な温度に維持された、適切なバッファーに溶解した４種類の異なるヌクレオシド三リン酸またはその類縁体、および重合剤（すなわち、ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素）の存在下において、核酸合成の起点として作動することが可能な、約８から約３０、最終的には約５０ヌクレオチド長の、短い核酸分子を指す。プライマーは、１本鎖オリゴデオキシリボヌクレオチドであることが好ましい。プライマーの適切な長さは、そのプライマーの意図される用途に依存するが、通常、ＰＣＲプライマーおよび配列決定反応に使用されるプライマーとしては、１０から２５ヌクレオチドの範囲を持つ。短いプライマーは、一般に、鋳型に対し十分安定なハイブリッド複合体を形成するにはより低い温度を必要とする。プライマーは、鋳型の正確な配列を反映する必要はなく、その増幅仲介能力が侵されない限り、鋳型に特異的にハイブリダイズするのに十分なほど相補的であればよい。「ハイブリダイズする」とは、２本の１本鎖核酸同士が、相補的塩基の対合を介して、すなわち、Ａ対Ｔ（ＲＮＡではＵ）、Ｇ対Ｃの対合を介して結合することを指す。「プライマーペア」という用語は、２本鎖核酸分子の、それぞれ、プラスおよびマイナス鎖にハイブリダイズし、例えば、ＰＣＲ反応において、例えば、ＤＮＡ断片の増幅を可能とする二つのプライマーを指す。要すれば、プライマーは、分光光度計、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的手段によって検出が可能な化合物を取り込ませることによって標識することが可能である。例えば、有用な標識としては、蛍光染料、高電子密度試薬、ビオチン、または、抗血清またはモノクロナール抗体が利用可能な小型分子が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。標識はまた、増幅された核酸またはその断片の選択をやり易くするために、プライマーを「捕捉する」ためにも用いられる。カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）は、好ましい標識である。他の好ましい標識としては、フルオロクローム、例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓレッド、フィコエリスリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレセイン（ＪＯＥ）、５−カルボキシフルオレセイン（５−ＦＡＭ）、または、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射性標識、例えば、32Ｐ、35Ｓ、3Ｈが挙げられる。
【０１０６】
標識も２段階システムであってもよい。すなわち、プライマーが、高度の親和性を持つ結合パートナー、例えば、アビジン、特異的抗体等を持つ、ビオチン、ハプテン等に接合され、該結合パートナーは、検出可能な標識に接合されるシステムである。標識は、プライマーの片方だけ、または両方に接合されてよい。
【０１０７】
前記診断法において、核酸の配列決定工程を実行してもよい。配列決定のためには、従来技術で既知の任意の方法を用いてよい。核酸配列は、ＳａｎｇｅｒまたはＭａｘａｍ／Ｇｉｌｂｅｒｔの配列決定技術（例えば、「分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｖｏｌ．  １６７（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ、ｅｄｓ．）：  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１；  Ｇａｌａｓ  ａｎｄ  ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，「ゲノム技術、現在と未来（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：  Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ）」、Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ、ＵＫ、２００２を参照）に基づく方法によって決められるのが好ましい。
【０１０８】
本発明のある好ましい実施態様では、ＰＣＲはリアルタイムＰＣＲである。本発明のもう一つの好ましい実施態様では、核酸増幅は、リアルタイムＰＣＲによって実行される。
【０１０９】
本発明のもう一つのより好ましい実施態様では、（ａ）本発明の式（Ｉ）の化合物、またはその誘導体は、蛍光標識を含み；かつ、（ｂ）メチル化が、前記核酸分子における蛍光の存在、または量を測定することによって検出される。本発明の式（Ｉ）の前記化合物、またはその誘導体は、本発明において前述した蛍光標識、または、当業者に既知のものの内の任意のものによって標識してよい。本発明によれば、Ａｌｅｘａ、ＢＯＤＩＰＹ、ｂｉｍａｎｅ、クマリン、Ｃａｓｃａｄｅブルー、ダンシル、ダポキシル、フルオレセイン、マンシル、ＭＡＮＴ、Ｏｒｅｇｏｎグリーン、ピレン、ローダミン、Ｔｅｘａｓレッド、ＴＮＳ、蛍光ナノ結晶（量子ドット）、シアニン蛍光発色団、およびそれらの誘導体が特に好ましい標識である。
【０１１０】
「蛍光の存在または量を測定する」とは、蛍光分光光度計測によって蛍光が検出されるかどうか、あるいは、どの程度の蛍光が検出されるかを意味する。
【０１１１】
本発明のもう一つのより好ましい実施態様では、（ａ）メチルトランスフェラーゼの認識配列において修飾された核酸分子がアフィニティ精製によって精製され；かつ、（ｂ）本発明の式（Ｉ）の化合物、またはその誘導体はアフィニティタグを含む。
【０１１２】
核酸分子は、本発明の式（Ｉ）の化合物、またはその誘導体の標識に特異的に結合することが可能な化合物を用いて精製してもよい。その場合、標識は、アフィニティタグに一致するか、アフィニティタグを含む。標識またはアフィニティタグに結合することが可能な化合物は、化合物の結合が特異的である、抗体、タンパク、ペプチド、またはアプタマーである。アフィニティタグは、エピトープ、例えば、フラッグ−タグ、ｃ−ｍｙｃ−タグ、ＨＡ−タグ、ジゴキシゲニン、またはジニトロフェノールである。それとは別に、アフィニティタグは、人工ペプチド、例えば、Ｈｉｓタグであってもよい。「Ｈｉｓタグ」は、Ｈｉｓ4、Ｈｉｓ5、Ｈｉｓ6、Ｈｉｓ7、Ｈｉｓ8、Ｈｉｓ9、Ｈｉｓ10、Ｈｉｓ11、Ｈｉｓ12、Ｈｉｓ13、Ｈｉｓ14、Ｈｉｓ15から選ばれてもよい。さらに、アフィニティタグは、ビオチン、ストレップ−タグ、グルタチオン、ニッケル−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、またはマルトースであってもよい。アフィニティタグが「Ｈｉｓタグ」である場合、固相支持体に結合したニッケルを精製のために用いてもよい。アフィニティタグがエピトープである場合、精製には、固相支持体に結合した抗体−アフィニティを用いることが可能である。アフィニティタグがビオチンまたはストレップ−タグである場合には、固相支持体に結合させたアビジンまたはストレプトアビジンを精製のために用いてもよい。アフィニティタグがグルタチオンの場合、固相支持体に結合させたグルタチオントランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を精製のために用いてよい。アフィニティタグがマルトースである場合、固相支持体に結合させたマルトース結合タンパクを精製のために用いてよい。アフィニティタグがニッケル−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）である場合には、固相支持体に結合させた、いくつかのヒスチジン残基含有ペプチドを精製のために用いてよい。
【０１１３】
アフィニティ精製は、一般に、静止材料（固相）に固定されたリガンドとの結合性相互作用における差に基づいて、溶液（移動相）における分子を分離することを含む。アフィニティ精製における支持体または基質は、リガンドが共有的に付着されるものであれば、任意の材料であってよい。典型的には、アフィニティ基質として使用される材料は、標的分子が存在するシステムに対し不溶である。通常、ただし必ずしもそうとは限らないが、不溶の基質は固体である。有用なアフィニティ支持体は、高い、表面積対容量比を持ち、リガンドの共有的付着のために簡単に修飾される化学基を有し、非特異的結合性が極めて小さく、流動性が良く、かつ、機械的および化学的安定性を持つものである。好ましい固相支持体は、アガロース、セファロース、およびポリスチレンビーズである。
【０１１４】
アフィニティ精製は、本発明の式（Ｉ）の化合物、またはその誘導体のアフィニティタグとしてビオチン、ジゴキシゲニン、グルタチオン、またはニッケル−ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）を用いることによって実行するのが好ましい。
【０１１５】
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、本発明の式（Ｉ）の化合物、またはその誘導体は、ＤＮＡのシトシン残基には付加されるが、５−メチルシトシン残基に対しては付加させることができないことが好ましい。
【０１１６】
本発明の好ましい実施態様では、方法は、工程（ａ）の後に、ＤＮＡ分子の配列を決定する追加工程を含む。配列決定のためには、従来技術で既知の任意の方法を用いてよい。核酸配列は、ＳａｎｇｅｒまたはＭａｘａｍ／Ｇｉｌｂｅｒｔの配列決定技術（例えば、「分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｖｏｌ．１６７（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｈｉｌｌ、ｅｄｓ．）：  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、２００１；  Ｇａｌａｓ  ａｎｄ  ＭｃＣｏｒｍａｃｋ，「ゲノム技術、現在と未来（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ：  Ｐｒｅｓｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ）」、Ｃａｉｓｔｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗｙｍｏｎｄｈａｍ、ＵＫ、２００２を参照）に基づく方法によって決められるのが好ましい。
【０１１７】
本発明のもう一つの好ましい実施態様では、前記検出可能な補因子の標識は、（ａ）前記検出可能な補因子の標識に特異的に結合する抗体によって、あるいは、（ｂ）前記検出可能な補因子に特異的に結合するアビジンまたはストレプトアビジンによって検出される。
【０１１８】
本発明を通じて使用される「抗体」という用語は、モノクロナール抗体、ポリクロナール抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、またはその断片を指す。抗体は、エピトープに対して特異的であることが好ましい。抗体は、ヒト化抗体、合成抗体、抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ断片等、または、これらの内の任意のものの化学的に修飾された誘導体であってもよい。モノクロナール抗体は、例えば、最初にＫｏｅｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、（１９７５）  Ｎａｔｕｒｅ  ２５６、４９５、ａｎｄ  Ｇａｌｆｒｅ、（１９８１）  Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ７３、３に記載されたものと同じ技術によって調製される。この技術は、マウス骨髄腫細胞を、免疫化哺乳動物由来の脾臓細胞と融合させることを含むが、従来技術によって開発された修正を伴う。さらに、抗体、またはその断片は、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ「抗体、実験室マニュアル（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、ＣＳＨ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、１９９８に記載される方法を用いることによって獲得される。前記抗体の誘導体がファージディスプレイ技術によって獲得される場合、分析されるエピトープに結合するファージ抗体の効率を増すために、ビアコアシステムに用いられる表面プラスモン共鳴を用いることが可能である（Ｓｃｈｉｅｒ、（１９９６）  Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７、９７−１０５；  Ｍａｌｍｂｏｒｇ、（１９９５）  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３、７−１３）。キメラ抗体の製造は、例えば、ＷＯ８９／０９６２２に記載される。
【０１１９】
抗体は標識してもよく、その際、標識は、本発明において述べた標識の内の任意のものであってよい。
【０１２０】
最後に、本発明のもう一つの好ましい実施態様では、前記ＤＮＡ分子の配列が、ＤＮＡ配列決定、ハイブリダイゼーション、Ｍａｌｄｉ−Ｔｏｆ分析、または、酵素断片化およびクロマトグラフィーによるヌクレオシド組成の分析によって決定される。
【０１２１】
本発明はさらに、下記の実施例によって、ただしこれらの実施例によって限定されることなく具体的に説明される。
【実施例】
【０１２２】
［実施例１］
補因子３−９の合成
補因子３−９の合成をスキーム１に示すとおりに実行した。
【０１２３】
【化７】
2008539166.tif 000014
【０１２４】
スキーム４
補因子類縁体３−９の化学的合成、補因子類縁体５から９は本発明によるもので、補因子３および４は比較のためにのみ提示する。
【０１２５】
補因子類縁体３−９合成のための一般的手順
ギ酸および酢酸（１：１混合物）に溶解したＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に、０℃でアリキルトリフレートまたは臭化アルキルをゆっくり加えた。この溶液を放置して室温に温め、室温で振とうしながらインキュベートした。補因子３−６に至る反応の進行を、分析的陽イオン交換ＨＰＬＣ（ＥＣ  ２５０／４  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００−５  ＳＡ、ＣＣ  ８／４  Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ  １００−５  ＳＡプレカラム装備、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ、Ｄｕｅｒｅｎ、ドイツ）によって分析した。化合物は、アジ化ナトリウム（１ｍＭ）を含む、酢酸トリエチルアンモニウムバッファー（１００ｍＭ、ｐＨ４．０）によって１ｍＬ／分の流速においてイソクラティックに溶出した。化合物は、２６０ｎｍおよび２７８ｎｍにおいて検出した。補因子７および８は、分析的逆相ＨＰＬＣ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８  １５０ｘ２．１ｍｍ、５μｍ、Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８  ２０ｘ２．１ｍ、５μｍプレカラム装備、Ｓｕｐｅｌｃｏ、ドイツ）、およびそれに結合される質量分析検出器（ＨＰ  １１００  ｓｅｒｉｅｓ  ＥＳＩ−ＭＳ、単一四重極装備）によって分析した。化合物は、ギ酸アンモニウム水溶液（２０ｍＭ、ｐＨ３．５）に溶解したメタノール（０％で６分、その後直線勾配で１００％まで６分、１００％で４分）によって０．３ｍＬ／分の流速において溶出した。ＭＳ検出の効率を上げるために、ポストカラム移動相修飾（メタノールに溶解した１％ＣＦ3ＣＯＯＨの等量共同流）を用いた。さらに、化合物を、２１０ｎｍ、２６０ｎｍ、および２８０ｎｍにおいて検出した。
【０１２６】
水を加えて反応を停止させ（補因子３−６および９のためには３０ｍＬ、補因子７および８のためには２０ｍＬ）、水相をジエチルエーテルで抽出した（補因子３−６では３ｘ５ｍＬ、補因子７，８では３ｘ２０ｍＬ、補因子９では３ｘ１５ｍＬ）。補因子３−６および９を含む水相を凍結によって濃縮し、得られた淡褐色油を０．０１％のトリフルオロ酢酸を含む水（５ｍＬ）に溶解した。硫黄中心における補因子エピマーの精製および分離は（補因子９では、エピマーの分離は実現されなかった）、予備的逆相ＨＰＬＣ（Ｐｒｏｎｔｏｓｉｌ−ＯＤＳ  ５μｍ、１２０Å、３０ｘ２０ｍｍプレカラム、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ、Ｌｅｏｎｂｅｒｇ、ドイツ）によって実行した。化合物は、トリフルオロ酢酸水溶液に溶解した（０．０１％）アセトニトリル（補因子３−６：直線勾配で１０％まで１５分、７０％まで５分；補因子９：１４％から直線勾配で４２％まで１０分、７０％まで５分）によって１０ｍＬ／分の流速において溶出した。化合物は、２６０ｎｍおよび２７８ｎｍにおいて検出した。補因子７および８は、予備的逆相ＨＰＬＣ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８  ２５０ｘ１０ｍｍ、５μｍ、Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８  ２０ｘ２．１  ｍ、５μｍプレカラム装備、Ｓｕｐｅｌｃｏ、ドイツ）によって分析した。化合物は、ギ酸アンモニウム水溶液（２０ｍＭ、ｐＨ３．５）に溶解したメタノール（直線勾配で１００％まで１２分）によって２０℃で４．５ｍＬ／分の流速において溶出した。化合物を、２１０ｎｍ、２６０ｎｍ、および２８０ｎｍにおいて検出した。分画を含む産物を収集し、溶媒を凍結によって除去した。収率は、補因子のアデニン発色団の、２６０ｎｍにおける吸光係数１５４００Ｌｍｏｌ-1ｃｍ-1を用いＵＶ分光光度計測によって定量した。
【０１２７】
Ａ．  ５’−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］エチルスルフォニオ］−５’−デオキシアデノシン（Ｓ−アデノシル−Ｌ−エチオニン）、補因子３（比較例）
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）（２０ｍｇ、５２μｍｏｌ）を、ギ酸と酢酸の１：１混合液（３ｍＬ）に溶解し、エチルトリフルオロメチルスルフォネート（１．２１ｍＬ、９．３６ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。反応は、一般的手順において記載したとおりに実行し、２時間後に完了した。予備的逆相ＨＰＬＣによる精製によって、３（保持時間７．５分、１０．９μｍｏｌ、２１％）およびそのエピマー（保持時間７．８分、６．０μｍｏｌ、１２％）が白色固体として得られた。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：  ４１３．２（２）［Ｍ］+、３３４．２（５）［５’−エチルチオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｎａ］+、２５０．１（８８）［Ｍ−エチオニン］+、１３６．２（１００）［アデニン＋Ｈ］+．
【０１２８】
Ｂ．  ５’−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］プロピルスルフォニオ］−５’−デオキシアデノシン（Ｓ−アデノシル−Ｌ−エチオニン）、補因子４（比較例）
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）（２０ｍｇ、５２μｍｏｌ）を、ギ酸と酢酸の１：１混合液（３ｍＬ）に溶解し、プロピルトリフルオロメチルスルフォネート（１．８ｇ、９．３６ｍｍｏｌ、Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、（２０００）  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １、５７１−５７４による方法に従って調製）を加えた。反応は、一般的手順において記載したとおりに実行し、２．５時間後に完了した。予備的逆相ＨＰＬＣによる精製によって、４（保持時間１６．６分、１０．５μｍｏｌ、２１％）およびそのエピマー（保持時間１６．９分、８．３μｍｏｌ、１６％）が白色固体として得られた。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：  ３４８．０（１７）［５’−プロピルチオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｎａ］+、３２６．０（１００）［５’−プロピルチオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｈ］+．
【０１２９】
Ｃ．  ５’−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］プロプ−２−エニルスルフォニオ］−５’−デオキシアデノシン、補因子５
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）（２０ｍｇ、５２μｍｏｌ）を、ギ酸と酢酸の１：１混合液（３ｍＬ）に溶解し、臭化アリル（２６４μＬ、３．１２ｍｍｏｌ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。反応は、一般的手順において記載したとおりに実行し、４時間後に完了した。予備的逆相ＨＰＬＣによる精製によって、５（保持時間１７．１分、７．２μｍｏｌ、１４％）およびそのエピマー（保持時間１７．９分、１１．６μｍｏｌ、２２％）が白色固体として得られた。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：  ３４６．０（３０）［５’−（プロプ−２−エニル）チオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｎａ］+、３２４．０（１００）［５’−（プロプ−２−エニル）チオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｈ］+．
【０１３０】
Ｄ．  ５’−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］プロプ−２−イニルスルフォニオ］−５’−デオキシアデノシン、補因子６
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）（２０ｍｇ、５２μｍｏｌ）を、ギ酸と酢酸の１：１混合液（３ｍＬ）に溶解し、プロパルギルトリフルオロメチルスルフォネート（１．７６ｇ、９．３６ｍｍｏｌ、Ｒｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．、（２０００）  Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  １、５７１−５７４による方法に従って調製）を加えた。反応は、一般的手順において記載したとおりに実行し、３０分後に完了した。予備的逆相ＨＰＬＣによる精製によって、６（保持時間８．８分、１０．８μｍｏｌ、２１％）およびそのエピマー（保持時間９．５分、７．７μｍｏｌ、１５％）が白色固体として得られた。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：  ３４４．０（２６）［５’−（プロプ−２−イニル）チオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｎａ］+、３２２．０（１００）［５’−（プロプ−２−イニル）チオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｈ］+、１３６．０（８）［アデニニン＋Ｈ］+．
【０１３１】
Ｅ．  ５’−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］ブト−２−イニルスルフォニオ］−５’−デオキシアデノシン、補因子７
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）（２０ｍｇ、５２μｍｏｌ）を、ギ酸と酢酸の１：１混合液（１ｍＬ）に溶解し、ブト−２−イニルトリフルオロメチルスルフォネート（２００当量）を加えた。反応は、一般的手順において記載したとおりに実行し、２時間後に完了した。分析的逆相ＨＰＬＣの際１３．４分の保持時間で溶出した産物を、予備的逆相ＨＰＬＣにて精製した。補因子７（２．６μｍｏｌ、５％）が、硫黄中心におけるエピマーの混合物として得られた。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：  ４３７．１（１００）［Ｍ］+、３３６．１（２）［５’−（ブト−２−イニル）チオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｈ］+、２５０．１（８８）［５′−デオキシアデノシン］+．
【０１３２】
Ｆ．  ５’−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］ペント−２−イニルスルフォニオ］−５’−デオキシアデノシン、補因子８
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）（１０ｍｇ、２６μｍｏｌ）を、ギ酸と酢酸の１：１混合液（０．５ｍＬ）に溶解し、ペント−２−イニルトリフルオロメチルスルフォネート（２００当量）を加えた。反応は、一般的手順において記載したとおりに実行し、２時間後に完了した。分析的逆相ＨＰＬＣの際１６．０分および１５．８分の保持時間で溶出した産物とそのエピマーを、予備的逆相ＨＰＬＣにて精製した。補因子８（１．８μｍｏｌ、７．０％）とそのエピマー（２．０μｍｏｌ、７．７％）が、白色固体として得られた。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：  ４５１．１（１００）［Ｍ］+、３５０．１（１０）［５’−（ペント−２−イニル）チオ−５’−デオキシアデノシン）＋Ｈ］+、２５０．１（２０）［５′−デオキシアデノシン］+．
【０１３３】
Ｇ．  ５’−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］ベンジルスルフォニオ］−５’−デオキシアデノシン、補因子９
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）（２０ｍｇ、５２μｍｏｌ）を、ギ酸と酢酸の１：１混合液（１ｍＬ）に溶解し、臭化ベンジル（１．１ｍＬ、９．４ｍｍｏｌ）を加えた。反応は、一般的手順において記載したとおりに実行し、５時間後に完了した。予備的逆相ＨＰＬＣによる精製によって、補因子９（保持時間９．０分、２４．７μｍｏｌ、４７．５％）が、硫黄中心におけるエピマーの混合物として白色固体として得られた。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：  ４７５．２（１００）［Ｍ］+．  ＥＳＩ−ＭＳ−ＭＳ（４７５．２）ｍ／ｚ（相対強度）：  ３７４．０（８８．５）［５′−ベンジルチオ−５′−デオキシアデノシン＋Ｈ］+、３４０．０（５９．５）［Ｍ−アデニン］+、２５０．２（８６．１）［５′−デオキシアデノシン］+、２２６．２（１００）［Ｓ−ベンジル−ホモシステイン＋Ｈ］+．
【０１３４】
［実施例２］
種々のクラスの補因子３−９およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる、短い二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの配列特異的修飾
ＤＮＡアデニン−Ｎ６メチルトランスフェラーゼＭ．Ｔａｑｌ、ＤＮＡシトシン−Ｃ５メチルトランスフェラーゼＭ．ＨｈａＩの変種Ｑ８２Ａ、またはＤＮＡシトシン−Ｎ４メチルトランスフェラーゼＭ．ＢｃｎＩＢによる、補因子３−９からの、活性化エチル（ＣＨ2ＣＨ3）、プロピル（ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）、プロプ−２−エニル（ＣＨ2ＣＨＣＨ2）、プロプ−２−イニル基（ＣＨ2ＣＣＨ）、ブト−２−イニル（ＣＨ2ＣＣＣＨ3）、ペント−２−イニル（ＣＨ2ＣＣＣＨ2ＣＨ3）、またはベンジル基（ＣＨ2Ｃ6Ｈ5）の、ＤＮＡへの転移は、先ず、基質として短い二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドを用いて調べた。酵素転移の後、この二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドを酵素的に断片化し、修飾されたヌクレオシドを、ＥＳＩ−ＭＳ結合の逆相ＨＰＬＣによって分析した。
【０１３５】
Ａ．  Ｍ．Ｔａｑｌによる二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド内のアデニン−Ｎ６の修飾
【０１３６】
【化８】
2008539166.tif 000015
【０１３７】
スキーム５
ＤＮＡアデニン−Ｎ６メチルトランスフェラーゼＭ．ＴａｑＩによる、半メチル化二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ．ＩＩの配列特異的修飾。Ｍ．Ｔａｑｌの５’−ＴＣＧＡ−３’ＤＮＡ認識部位（太字）は、上方鎖Ｉに配される、ただ一つの修飾可能な標的アデニンしか含まないことに注意。下方鎖ＩＩの、他方の標的アデニンは、メチル化（ＡMe＝Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン）によってブロックされている。従って、認識鎖の修飾は、上方鎖Ｉのみに起こることが可能である。
【０１３８】
この半メチル化二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ．ＩＩは、バッファー（１５０μＬ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩、５０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのジチオスレイトール、０．０１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ７．９）に溶解した、等量（１５ｎｍｏｌ）の、相補的な１本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ（５’−ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＴＧＣＣＧ−３’）およびＩＩ（５’−ＣＧＧＣＡＴＣＧＡMeＧＣＧＧＣ−３’、ＡMe＝Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン）を混ぜ合わせ、９５℃で５分加熱し、室温にゆっくりと冷却することによって生産される。酵素による修飾は、バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩、５０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのジチオスレイトール、０．０１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ７．９）において、二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ．ＩＩ（２０μＭ）を、補因子３−９（３−６では４００μＭ、７−８では２００μＭ、および９では３００μＭ）、およびＭ．ＴａｑＩ（２２μＭ、Ｇｏｅｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ８、１２１−１２５の記載の通りに製造）と共に３７℃で一晩インキュベーションすることによって実行した。Ｍ．ＴａｑＩは、９５℃で１０分加熱することによって変性し、遠心（１３２００  ｒｐｍ／分、２分）によって除去した。修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩは、ゲルろ過（ＮＡＰ−５カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、フライブルグ、ドイツ）によって脱塩し、水（１ｍＬ）で溶出し、凍結した。
【０１３９】
修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩを、ヌクレア−ゼＰ１（１５００ｕ、Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）、および仔ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（３０ｕ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍａｎｔａｓ、Ｓｔ．Ｌｅｏｎ−Ｒｏｔ、ドイツ）を含むバッファー（１００μＬ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１ｍＭの酢酸亜鉛、ｐＨ７．５）に溶解し、３７℃で４時間インキュベートした。ヌクレオシドを、逆相ＨＰＬＣ（シンメトリ−Ｃ18  ５μｍ、１００A、２５０ｘ４．６ｍｍ、シンメトリ−Ｃ18  ５μｍ装備、１００A、２０ｘ４．６ｍｍプレカラム、Ｗａｔｅｒｓ、Ｅｓｃｈｂｏｒｎ，ドイツ）によって分析した。化合物は、トリエチルアンモニウムアセテートバッファー（１０ｍＭ、ｐＨ７．０）に溶解したアセトニトリル（５％で７分、その後直線勾配で６％まで１５分、３５％まで８分、および７０％まで２分）で流速１ｍＬ／分で溶出し、２５４ｎｍで検出した。
【０１４０】
ＨＰＬＣ−結合ＥＳＩ−ＭＳ測定のために、化合物を、ギ酸アンモニウムバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ３．５）に溶解したメタノール（０％で３分、次いで直線勾配で１００％まで２２分）で溶出した。ポストカラム移動相修飾（９６％メタノール、４％ギ酸との等量共同流）を用い、２’−デオキシアデノシンおよびその誘導体の検出効率を上げた。質量スペクトラムを、２００−３７０ｍ／ｚ範囲で記録した。
【０１４１】
Ａ．１  補因子３（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ3）およびＭ．ＴａｑＩによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析（比較例）
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ3による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩの断片化（図１のトレースａ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＡ、およびｄＡMeの外に、ｄＡMeよりも長い保持時間（３０．５分）を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：２８０．１  ［Ｍ］+）は、Ｎ６−エチル−２’−デオキシアデノシン（ｄＡEthyl）と一致した。この修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの、実験的に求められたヌクレオチド組成は、理論的ヌクレオチド組成（括弧の中に示す）とよく一致することが認められた。ｄＣ  １１．４（１１）、ｄＧ  １０．６（１１）、ｄＴ  ３．０（３）、ｄＡ  ０．９（１）、ｄＡMe  １．０（１）  ｄＡEthyl  １．０（１）。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体３は、Ｍ．ＴａｑＩの補因子として機能する。
【０１４２】
Ａ．２  補因子４（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）およびＭ．ＴａｑＩによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析（比較例）
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩの断片化（図１のトレースｂ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＡ、およびｄＡMeの外に、ｄＡMeよりも長い保持時間（３２．０分）を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：２９４．２  ［Ｍ］+）は、Ｎ６−プロピル−２’−デオキシアデノシン（ｄＡPropyl）と一致した。この修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの、実験的に求められたヌクレオチド組成は、理論的ヌクレオチド組成（括弧の中に示す）とよく一致することが認められた。ｄＣ  １１．４（１１）、ｄＧ  １０．７（１１）、ｄＴ  ２．９（３）、ｄＡ  １．０（１）、ｄＡMe  １．０（１）  ｄＡPropyl  １．０（１）。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体４は、Ｍ．ＴａｑＩの補因子として機能する。
【０１４３】
Ａ．３  補因子５（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）およびＭ．ＴａｑＩによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩの断片化（図１のトレースｃ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＡ、およびｄＡMeの外に、ｄＡMeよりも長い保持時間（３１．５分）を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：２９２．２  ［Ｍ］+）は、Ｎ６−プロペニル−２’−デオキシアデノシン（ｄＡPropenyl）と一致した。この修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの、実験的に求められたヌクレオチド組成は、理論的ヌクレオチド組成（括弧の中に示す）とよく一致することが認められた。ｄＣ  １１．４（１１）、ｄＧ  １０．７（１１）、ｄＴ  ３．０（３）、ｄＡ  ０．９（１）、ｄＡMe  １．０（１）  ｄＡPropenyl  １．１（１）。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体５は、Ｍ．ＴａｑＩの補因子として機能する。
【０１４４】
Ａ．４  補因子６（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ）およびＭ．ＴａｑＩによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨによる、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩの断片化（図１のトレースｄ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＡ、およびｄＡMeの外に、ｄＡMeよりも長い保持時間（３０．５分）を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：２９０．２  ［Ｍ］+）は、Ｎ６−プロピニル−２’−デオキシアデノシン（ｄＡPropynyl）と一致した。この修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの、実験的に求められたヌクレオチド組成は、理論的ヌクレオチド組成（括弧の中に示す）とよく一致することが認められた。ｄＣ  １１．４（１１）、ｄＧ  １１．１（１１）、ｄＴ  ２．７（３）、ｄＡ  ０．９（１）、ｄＡMe  １．０（１）  ｄＡPropynyl  ０．９（１）。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体６は、Ｍ．ＴａｑＩの補因子として機能する。
【０１４５】
Ａ．５  補因子７（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ3）およびＭ．ＴａｑＩによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ3による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩの断片化（図１のトレースｅ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＡ、およびｄＡMeの外に、ｄＡMeよりも長い保持時間（３１．９分）を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：３０４．２  ［Ｍ］+）は、Ｎ６−ブト−２−イニル−２’−デオキシアデノシン（ｄＡBut-2-ynyl）と一致した。この修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの、実験的に求められたヌクレオチド組成は、理論的ヌクレオチド組成（括弧の中に示す）とよく一致することが認められた。ｄＣ  １１．２（１１）、ｄＧ  １０．９（１１）、ｄＴ  ２．８（３）、ｄＡ  ０．９（１）、ｄＡMe  １．０（１）  ｄＡBut-2-ynyl  １．０（１）。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体７は、Ｍ．ＴａｑＩの補因子として機能する。
【０１４６】
Ａ．６  補因子８（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＣＨ3）およびＭ．ＴａｑＩによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＣＨ3による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩの断片化（図１のトレースｆ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＡ、およびｄＡMeの外に、ｄＡMeよりも長い保持時間（３３．５分）を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：３１８．２  ［Ｍ］+）は、Ｎ６−ペント−２−イニル−２’−デオキシアデノシン（ｄＡPent-2-ynyl）と一致した。この修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの、実験的に求められたヌクレオチド組成は、理論的ヌクレオチド組成（括弧の中に示す）とよく一致することが認められた。ｄＣ  １１．２（１１）、ｄＧ  １０．９（１１）、ｄＴ  ２．８（３）、ｄＡ  ０．９（１）、ｄＡMe  １．０（１）  ｄＡPent-2-ynyl  １．０（１）。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体８は、Ｍ．ＴａｑＩの補因子として機能する。
【０１４７】
Ａ．７  補因子９（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5）およびＭ．ＴａｑＩによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩの断片化（図１のトレースｇ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、ｄＡ、およびｄＡMeの外に、ｄＡMeよりも長い保持時間（３４．３分）を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：３４１  ［Ｍ］+）は、Ｎ６−ベンジル−２’−デオキシアデノシン（ｄＡBenzyl）と一致した。この修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの、実験的に求められたヌクレオチド組成は、理論的ヌクレオチド組成（括弧の中に示す）とよく一致することが認められた。ｄＣ  １１．３（１１）、ｄＧ  １１．０（１１）、ｄＴ  ３．０（３）、ｄＡ  ０．８（１）、ｄＡMe  １．０（１）  ｄＡBenzyl  ０．９（１）。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体９は、Ｍ．ＴａｑＩの補因子として機能する。
【０１４８】
Ｂ．  Ｍ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａによる二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドにおけるシトシン−Ｃ５の修飾
【０１４９】
【化９】
2008539166.tif 000016
【０１５０】
スキーム６
ＤＮＡシトシン−Ｃ５メチルトランスフェラーゼＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａによる、二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩＩＩ．ＩＶの配列特異的修飾。二重鎖５’−ＧＣＧＣ−３’  ＤＮＡ認識配列（太字）は、２本の修飾可能標的シトシンを含み、この認識配列内の第２シトシン残基の修飾は、上方鎖ＩＩＩにおいて起こるか（図示）、または下方鎖ＩＶにおいて起こる（図示せず）。
【０１５１】
ＤＮＡ、および天然補因子ＡｄｏＭｅｔ  １（ＰＤＢ同上：６ＭＨＴ；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５、２７７３−２７８３）と複合体を形成するＭ．ＨｈａＩの三次元構造は、Ｑ８２が、延長したメチル基置換体を含む補因子類縁体と相互作用を持つには立体的に不都合である可能性を示唆した。従って、Ｑ８２のコドンを、標準的Ｋｕｎｋｅｌ突然変異発生法（Ｋｕｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８２、４８８−４９２）によってアラニンに対するコドンに変更したところ、完全な遺伝子の適正なＤＮＡ配列が、ＤＮＡ配列決定によって確かめられた。Ｑ８２Ａ変種の発現および精製を、野生型酵素について記載されるものと同じやり方（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１、８６４８−８６５３；  Ｋｉｍａｓａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７、３１７−３２４）で実行した。
【０１５２】
二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩＩＩ．ＩＶは、水に溶解した、等モル量（２．５ｎｍｏｌ）の、相補的な１本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩＩＩ（５’−ＣＡＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＴＡＴ−３’）およびＩＶ（５’−ＡＴＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＡＴＧ−３’）を混ぜ合わせ、８５℃で５分加熱し、室温にゆっくりと冷却することによって生産された。酵素による修飾は、二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩＩＩ．ＩＶ（１２．５μＭ）を、バッファー（補因子３−５、７、および８では、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸、１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４であり；補因子６では、２５ｍＭの３−モルフォリノ−プロパンスルフォン酸、２５ｍＭの２−モルフォリノ−エタンスルフォン酸、１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、ｐＨ６．０）に溶解した、補因子３−８（３００μＭ）、およびＭ．ＨｈａＩ（１５μＭ）と共に３７℃で一晩インキュベーションすることによって調べた。Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａは、８０℃で１０分加熱し、プロテイナーゼＫと５５℃で１０分インキュベーションすることによって変性した。加水分解産物は、ゲルろ過によって除去した（Ｇ−２５カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１５３】
得られた二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド液を、ヌクレア−ゼＰ１（１５００ｕ、Ｓｉｇｍａ）、および仔ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（３０ｕ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍａｎｔａｓ）を含むバッファー（１／１０容量、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの酢酸亜鉛、ｐＨ７．５）で処理し、３７℃で４時間インキュベートした。ヌクレオシドを、逆相ＨＰＬＣ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−Ｃ１８  １５０ｘ２．１ｍｍ、５μｍ、付属装備Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８  ２０ｘ２．１ｍｍ、５μｍ、プレカラム、Ｓｕｐｅｌｃｏ，ドイツ）−質量分析検出器（ＨＰ１１００シリーズＥＳＩ−ＭＳ、単一四重極装備）によって分析した。化合物は、ギ酸アンモニウムバッファー（２０ｍＭ、補因子３、４、６にはｐＨ７．０、補因子５、７、８にはｐＨ３．５）に溶解したメタノール（０％で６分、その後直線勾配で５６％まで１５分、８０％まで１分）で流速０．３ｍＬ／分で溶出し、２８０ｎｍで検出した。オンライン質量分析検出のために、ポストカラム移動相修飾（９６％メタノール、４％ギ酸、および１ｍＭの水酸化ナトリウムとの等量共同流）を用い、２’−デオキシシチジンおよびその誘導体の検出効率を上げた。質量スペクトラムを、５０−６００ｍ／ｚ範囲で記録した。
【０１５４】
Ｂ．１  補因子３（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ3）およびＭ．ＨｈａＩ−ＱＡ２Ａによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析（比較例）
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ3による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＩＩ．ＩＶ）Z-Rの断片化（図２のトレースａ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡの外に、１６．５分の保持時間を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：２７８  ［Ｍ＋Ｎａ］+、１６２［Ｃ５−エチル−シトシン＋Ｎａ］+は、Ｃ５−エチル−２’−デオキシシチジン（ｄＣC5-Ethyl）と一致した。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体３は、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａの補因子として機能する。
【０１５５】
Ｂ．２  補因子４（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）およびＭ．ＨｈａＩ−ＱＡ２Ａによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析（比較例）
二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの断片化（図２のトレースｂ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡのみが明らかにされた。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体４は、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａの補因子として機能しない。
【０１５６】
Ｂ．３  補因子５（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）およびＭ．ＨｈａＩ−ＱＡ２Ａによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＩＩ．ＩＶ）Z-Rの断片化（図２のトレースｃ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡの外に、１５．９分の保持時間を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：２９０  ［Ｍ＋Ｎａ］+、１７４［Ｃ５−プロペニル−シトシン＋Ｎａ］+は、Ｃ５−プロペニル−２’−デオキシシチジン（ｄＣC5-Propenyl）と一致した。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体５は、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａの補因子として機能する。
【０１５７】
Ｂ．４  補因子６（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ）およびＭ．ＨｈａＩ−ＱＡ２Ａによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨによる、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＩＩ．ＩＶ）Z-Rの断片化（図２のトレースｄ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡの外に、１５．７分の保持時間を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：２８８  ［Ｍ＋Ｎａ］+、１７２［Ｃ５−プロピニル−シトシン＋Ｎａ］+は、Ｃ５−プロピニル−２’−デオキシシチジン（ｄＣC5-Propynyl）と一致した。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体６は、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａの補因子として機能する。
【０１５８】
Ｂ．５  補因子７（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ3）およびＭ．ＨｈａＩ−ＱＡ２Ａによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ3による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＩＩ．ＩＶ）Z-Rの断片化（図２のトレースｅ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡの外に、１７．８分の保持時間を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：３０２  ［Ｍ＋Ｎａ］+、１８６［Ｃ５−ブト−２−イニル−２’−シトシン＋Ｎａ］+は、Ｃ５−ブト−２−イニル−２’−デオキシシチジン（ｄＣC5-But-2-ynyl）と一致した。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体７は、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａの補因子として機能する。
【０１５９】
Ｂ．６  補因子８（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＣＨ3）およびＭ．ＨｈａＩ−ＱＡ２Ａによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＣＨ3による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＩＩ．ＩＶ）Z-Rの断片化（図２のトレースｆ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡの外に、２０．３分の保持時間を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：３１６  ［Ｍ＋Ｎａ］+、２００［Ｃ５−ペント−２−イニル−シトシン＋Ｎａ］+は、Ｃ５−ペント−２−イニル−２’−デオキシシチジン（ｄＣC5-Pent-2-ynyl）と一致した。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体８は、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａの補因子として機能する。
【０１６０】
Ｃ．  Ｍ．ＢｃｎＩＢによる二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドにおけるシトシン−Ｎ４の修飾
【０１６１】
【化１０】
2008539166.tif 000017
【０１６２】
スキーム７
ＤＮＡシトシン−Ｎ４メチルトランスフェラーゼＭ．ＢｃｎＩＢによる、二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＶ．ＶＩの配列特異的修飾。二重鎖内の５’−ＣＣＧＧＧ−３’  ＤＮＡ認識配列（太字）は、２本の修飾可能標的シトシンを含み、この認識配列内の第２シトシン残基の修飾は、上方鎖Ｖにおいて起こるか（図示）、または下方鎖ＶＩにおいて起こる（図示せず）。
【０１６３】
二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＶ．ＶＩは、水に溶解した、等モル量（２．５ｎｍｏｌ）の、相補的な１本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＶ（５’−ＣＡＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＴＡＴ−３’）およびＶＩ（５’−ＡＴＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＡＴＧ−３’）を混ぜ合わせ、８５℃で５分加熱し、室温にゆっくりと冷却することによって生産された。酵素による修飾（スキーム７）は、二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＶ．ＶＩ（１２．５μＭ）を、バッファー（補因子３−５では、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸、１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４であり；補因子６では、２５ｍＭの３−モルフォリノ−プロパンスルフォン酸、２５ｍＭの２−モルフォリノ−エタンスルフォン酸、１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、ｐＨ６．０）に溶解した、補因子３−６（３００μＭ）、およびＭ．ＢｃｎＩＢ（１５μＭ）と共に３７℃で一晩インキュベーションすることによって調べた。Ｍ．ＢｃｎＩＢは、８０℃で１０分加熱し、プロテイナーゼＫと５５℃で１時間インキュベーションすることによって変性した。加水分解産物は、ゲルろ過によって除去した（Ｇ−２５カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。
【０１６４】
得られた二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド液を、ヌクレア−ゼＰ１（１５００ｕ、Ｓｉｇｍａ）、および仔ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（３０ｕ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍａｎｔａｓ）を含むバッファー（１／１０容量、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの酢酸亜鉛、ｐＨ７．５）で処理し、３７℃で４時間インキュベートした。ヌクレオシドを、逆相ＨＰＬＣ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ−Ｃ１８  １５０ｘ２．１ｍｍ、５μｍ、付属装備Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８  ２０ｘ２．１ｍｍ、５μｍ、プレカラム、Ｓｕｐｅｌｃｏ，ドイツ）−質量分析検出器（ＨＰ１１００シリーズＥＳＩ−ＭＳ、単一四重極装備）によって分析した。化合物は、ギ酸アンモニウムバッファー（２０ｍＭ、補因子３、４、６にはｐＨ７．０、補因子５にはｐＨ３．５）に溶解したメタノール（０％で６分、その後直線勾配で５６％まで１５分、８０％まで１分）で流速０．３ｍＬ／分で溶出し、２８０ｎｍで検出した。オンライン質量分析検出のために、ポストカラム移動相修飾（９６％メタノール、４％ギ酸、および１ｍＭの水酸化ナトリウムとの等量共同流）を用い、２’−デオキシシチジンおよびその誘導体の検出効率を上げた。質量スペクトラムを、５０−６００ｍ／ｚ範囲で記録した。
【０１６５】
Ｃ．１  補因子３（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ3）およびＭ．ＢｃｎＩＢによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析（比較例）
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ3による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＩＩ．ＩＶ）Z-Rの断片化（図３のトレースａ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡの外に、１６．９分の保持時間を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：２７８  ［Ｍ＋Ｎａ］+、１６２［Ｎ４−エチル−シトシン＋Ｎａ］+は、Ｎ４−エチル−２’−デオキシシチジン（ｄＣN4-Ethyl）と一致した。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体３は、Ｍ．ＢｃｎＩＢの補因子として機能する。
【０１６６】
Ｃ．２  補因子４（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）およびＭ．ＢｃｎＩＢによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析（比較例）
二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの断片化（図３のトレースｂ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡのみが明らかにされた。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体４は、Ｍ．ＢｃｎＩＢの補因子として機能しない。
【０１６７】
Ｃ．３  補因子５（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）およびＭ．ＢｃｎＩＢによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＩＩ．ＩＶ）Z-Rの断片化（図３のトレースｃ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡの外に、１６．２分の保持時間を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：２９０  ［Ｍ＋Ｎａ］+、１７４［Ｎ４−プロペニル−シトシン＋Ｎａ］+は、Ｎ４−プロペニル−２’−デオキシシチジン（ｄＣN4-Propenyl）と一致した。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体５は、Ｍ．ＢｃｎＩＢの補因子として機能する。
【０１６８】
Ｃ．４  補因子６（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ）およびＭ．ＢｃｎＩＢによる処理後の二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド分析
二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの断片化（図３のトレースｄ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡのみが明らかにされた。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体６は、Ｍ．ＢｃｎＩＢの補因子として機能しない。
【０１６９】
［実施例３］
種々のクラスの補因子３−９およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる、長いＤＮＡの配列特異的修飾
ＤＮＡアデニン−Ｎ６メチルトランスフェラーゼＭ．Ｔａｑｌおよびその変種Ｖ２１Ｇ、ＤＮＡシトシン−Ｃ５メチルトランスフェラーゼＭ．ＨｈａＩおよびその変種Ｑ８２Ａ、ＤＮＡシトシン−Ｎ４メチルトランスフェラーゼＭ．ＢｃｎＩＢ、およびＤＮＡシトシン−Ｃ５メチルトランスフェラーゼＭ．ＳｓｓＩの変種Ｑ１４２Ａによる、補因子３−９からの、活性化エチル（−ＣＨ2ＣＨ3）、プロピル（−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ3）、プロプ−２−エニル（−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨ2）、プロプ−２−イニル基（−ＣＨ2Ｃ≡ＣＨ）、ブト−２−イニル（−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ3）、ペント−２−イニル（−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＣＨ3）、およびベンジル基（−ＣＨ2Ｃ6Ｈ5）の、ファージラムダＤＮＡ（４８５０２塩基対）への転移動態を、ＤＮＡ保護アッセイによって調べた。このアッセイでは、制限エンドヌクレアーゼの認識部位内の核酸塩基の、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ触媒修飾は、これらの酵素による断片化からそのＤＮＡを保護することが可能であるという事実を利用する。ＤＮＡ保護アッセイの原理を、ＤＮＡアデニン−Ｎ６メチルトランスフェラーゼＭ．ＴａｑＩおよび制限エンドヌクレアーゼＲ．ＴａｑＩを例として用いてスキーム８に図示する。５’−ＴＣＧＡ−３’認識配列を含む、未修飾ＤＮＡは、Ｒ．ＴａｑＩによって容易に断片化される。補因子の存在下Ｍ．ＴａｑＩによってＤＮＡ修飾されると、活性基Ｚ−Ｒ修飾５’−ＴＣＧＡZ-R−３’配列が形成され、その結果、Ｒ．ＴａｑＩは、この修飾されたＤＮＡを断片化することができない。次に、断片化の出現をアガロースゲル電気泳動によって分析する。
【０１７０】
【化１１】
2008539166.tif 000018
【０１７１】
スキーム８
天然補因子１および補因子類縁体３−９と共に用いられる各種ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの酵素活性を定量するために使用されるＤＮＡ保護アッセイの原理。ＤＮＡアデニン−Ｎ６メチルトランスフェラーゼＭ．ＴａｑＩに関する結合酵素アッセイが、５’−ＴＣＧＡ−３’配列におけるＤＮＡ修飾を分析するために制限エンドヌクレアーゼＲ．ＴａｑＩを用いて図示される（Ｍ．ＴａｑＩおよびＲ．ＴａｑＩの認識配列５’−ＴＣＧＡ−３’は、黒塗り四角で示される）。
【０１７２】
ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの量を変えることによって、このアッセイを用い、補因子３−９と組み合わせた各種ＤＮＡメチルトランスフェラーゼの酵素活性を調べ、その結果を、天然補因子１と組み合わせた場合の酵素活性と比較することが可能となる。与えられた実験条件下で、制限エンドヌクレアーゼによる断片化から、１μｇのファージＤＮＡを完全に保護するのに必要な、最小量のＤＮＡメチルトランスフェラーゼを、１酵素単位（ｕ）と定義する。
【０１７３】
Ａ．１  各種補因子１および３−９と組み合わせたＭ．ＴａｑＩ（野生型酵素）の酵素活性
ウシ血清アルブミン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、ファージラムダＤＮＡ（１μｇ、３１．３ｆｍｏｌ、１２１  ５’−ＴＣＧＡ−３’認識配列、３．７８ｐｍｏｌ認識配列、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、および天然補因子１（３００μＭ）、または補因子類縁体３−９（３００μＭ）を含む、バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩、５０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのジチオスレイトール、および０．０１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ７．９）に溶解したＭ．ＴａｑＩ（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ８、１２１−１２５に記載される通りに調製）の２倍連続希釈液（２００ｎｇ、４．１８ｐｍｏｌから開始）（２０μＬ）を６０℃で４時間インキュベートした。その後、Ｒ．ＴａｑＩ制限エンドヌクレアーゼ（４０ｕ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ウシ血清アルブミン（０．１６６ｍｇ／ｍＬ）、およびバッファー（１６．６ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩、１６６ｍＭの塩化ナトリウム、８．３ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ８．０）を含む溶液（３０μＬ）を、各希釈液に加え、６０−６５℃でのインキュベーションを１５分続けた。各サンプルに負荷バッファー（１０μＬ、０．２５％ブロムフェノール青、３０％グリセロール）を加え、分液（１２μＬ）を、保護の程度について、アガロースゲル（１％）電気泳動によって分析した。並行的なコントロール実験を、Ｍ．ＴａｑＩの不在下、およびＭ．ＴａｑＩの存在下（２００ｎｇ）におけるファージラムダＤＮＡについて実行した。
【０１７４】
与えられた実験条件下において、天然補因子１または補因子類縁体３−９と組み合わせたＭ．ＴａｑＩについて下記の特異的活性が観察された（図４）、すなわち、１：４０９６０ｕ／μｇ；３：１０ｕ／μｇ；４：＜５ｕ／μｇ；５：８０ｕ／μｇ；６：１０ｕ／μｇ；７：１２８０ｕ／μｇ；８：６４０ｕ／μｇ；９：６４０ｕ／μｇである。これらの結果は、メチルよりも大きな化学基であっても、スルフォニウム中心直近の炭素が、隣接する炭素−炭素二重結合（アリルシステム）、隣接炭素−炭素三重結合（プロパルジルシステム）、または隣接芳香環（ベンジルシステム）によってさらに活性化されると、相当の活性をもってＭ．ＴａｑＩによって転移が可能であることを示す。
【０１７５】
Ａ．２  各種補因子１および３−９と組み合わせたＭ．ＴａｑＩ変種Ｖ２１Ｇの酵素活性
ＤＮＡおよび非反応性補因子類縁体（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ８、１２１−１２５）と複合体を形成するＭ．ＴａｑＩの三次元構造、および、天然補因子１（Ｌａｂａｈｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９４）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１、１０９５７−１０９６１）と複合体を形成するＭ．ＴａｑＩの三次元構造の比較から、Ｖ２１は、延長したメチル基置換体を含む補因子類縁体と相互作用を持つには立体的に不利となることが示唆された。従って、Ｖ２１のコドンを、標準的ＰＣＲ突然変異発生法（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）  Ｇｅｎｅ  ７７、５１−５９）によってグリシンに対するコドンに変更したところ、完全な遺伝子の適正なＤＮＡ配列が、ＤＮＡ配列決定によって確かめられた。Ｖ２１Ｇ変種の発現および精製を、野生型酵素について記載されるものと同じやり方（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９８）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２６、１０７６−１０８３；  Ｇｏｅｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ８、１２１−１２５）で実行した。Ｖ２１Ｇ変種に関するＤＮＡ保護アッセイは、野生型について記載される通りに行った（実施例３Ａ．１）。
【０１７６】
天然補因子１または補因子類縁体３−９と組み合わせたＭ．ＴａｑＩ−Ｖ２１Ｇについて下記の特異的活性が観察された（図５）、すなわち、１：３２０ｕ／μｇ；３：５ｕ／μｇ；４：＜５ｕ／μｇ；５：６４０ｕ／μｇ；６：２０ｕ／μｇ；７：８０ｕ／μｇ；８：８０ｕ／μｇ；および９：２５６０ｕ／μｇである。Ｍ．ＴａｑＩのＶ２１Ｇ変種は、補因子５および９において、天然補因子１よりも活性が高い。さらに、Ｖ２１Ｇ変種は、補因子５、６、および９において、野生型酵素よりもはっきりと高い活性を持つ。
【０１７７】
Ｂ．１  各種補因子１および３−８と組み合わせたＭ．ＨｈａＩ（野生型酵素）の酵素活性
ウシ血清アルブミン（０．２ｍｇ／ｍＬ）、ファージラムダＤＮＡ（１．１６μｇ、３６．３ｆｍｏｌ、２１５  ５’−ＧＣＧＣ−３’認識配列、７．８ｐｍｏｌ認識配列、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、および天然補因子１（３００μＭ）、または補因子類縁体３−８（３００μＭ）を含む、バッファー（補因子３−５、７および８では、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸、１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．４であり；補因子６では、２５ｍＭの３−モルフォリノ−プロパンスルフォン酸、２５ｍＭの２−モルフォリノ−エタンスルフォン酸、１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ６．０）に溶解したＭ．ＨｈａＩ（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１、８６４８−８６５３  ａｎｄ  Ｋｌｉｍａｓａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７、３１７−３２４に記載される通りに調製）の２倍連続希釈液（２７８ｎｇ、７．５ｐｍｏｌから開始）（１５μＬ）を３７℃で４時間インキュベートした。その後、８０℃で１０分加熱して反応を停止させた。Ｒ．Ｈｉｎ６Ｉ（Ｍ．ＨｈａＩと同じ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼであるが、修飾されたＤＮＡは切断しない）（１２ｕ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ウシ血清アルブミン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、およびバッファー（３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩、６６ｍＭの酢酸カリウム、２６．５ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．９）を含む溶液（１０μＬ）を、各希釈液に加え、３７℃でのインキュベーションを１時間続けた。各サンプルに橙色負荷染料液（５μＬ、０．２％オレンジＧ、０．０５％キシレンシアノールＦＦ、６０ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、６０％グリセロール、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を加え、分液（１５μＬ）を、保護の程度について、アガロースゲル（１％）電気泳動によって分析した。並行的なコントロール実験を、Ｍ．ＨｈａＩの不在下、およびＭ．ＨｈａＩの存在下（２７８ｎｇ）におけるファージラムダＤＮＡについて実行した。
【０１７８】
与えられた実験条件下において、天然補因子１または補因子類縁体３−８と組み合わせたＭ．ＨｈａＩについて下記の特異的活性が観察された（図６）、すなわち、１：４６０ｕ／μｇ；３：＜４ｕ／μｇ；４：０ｕ／μｇ；５：７ｕ／μｇ；６：＜４ｕ／μｇ；７：２９ｕ／μｇ；および８：＜４ｕ／μｇである。これらの結果は、メチルよりも大きな化学基であっても、スルフォニウム中心直近の炭素が、隣接する炭素−炭素二重結合（アリルシステム）、または、隣接炭素−炭素三重結合（プロパルジルシステム）によってさらに活性化されると、相当の活性をもってＭ．ＨｈａＩによって転移が可能であることを示す。
【０１７９】
Ｂ．２  各種補因子１および３−８と組み合わせたＭ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａの酵素活性
Ｍ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａ（実施例２Ｂ参照）に関するＤＮＡ保護アッセイは、野生型について記載される通りに行った（実施例３Ｂ．１）。
【０１８０】
天然補因子１または補因子類縁体３−８と組み合わせたＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａについて下記の特異的活性が観察された（図７）、すなわち、１：１１５ｕ／μｇ；３：７ｕ／μｇ；４：０ｕ／μｇ；５：２９ｕ／μｇ；６：＜４ｕ／μｇ；７：５８ｕ／μｇ；および８：＜４ｕ／μｇである。Ｑ８２Ａ変種は、大型の、メチル基置換体を担持する補因子においても（補因子４を例外として）、野生型Ｍ．ＨｈａＩと比べより高い活性を有する。
【０１８１】
Ｃ  各種補因子１および３−８と組み合わせたＭ．ＢｃｎＩＢ（野生型酵素）の酵素活性
ウシ血清アルブミン（０．２ｍｇ／ｍＬ）、ファージラムダＤＮＡ（１．１０μｇ、３４．４ｐｍｏｌ、１１４  ５’−ＣＣＳＧＧ−３’認識配列、Ｓ＝ＣまたはＧ、３．９ｐｍｏｌ認識配列、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、および天然補因子１（３００μＭ）、または補因子類縁体３−８（３００μＭ）を含む、バッファー（補因子３−５、７および８では、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸、１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．４であり；補因子６では、２５ｍＭの３−モルフォリノ−プロパンスルフォン酸、２５ｍＭの２−モルフォリノ−エタンスルフォン酸、１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ６．０）に溶解したＭ．ＢｃｎＩＢの２倍連続希釈液（１４４ｎｇ、３．８ｐｍｏｌから開始）（１５μＬ）を３７℃で４時間インキュベートした。その後、８０℃で１０分加熱して反応を停止させた。Ｒ．ＢｃｎＩ（１２ｕ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ウシ血清アルブミン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、およびバッファー（３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩、６６ｍＭの酢酸カリウム、２６．５ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．９）を含む溶液（１０μＬ）を、各希釈液に加え、３７℃でのインキュベーションを１時間続けた。各サンプルに橙色負荷染料液（５μＬ、０．２％オレンジＧ、０．０５％キシレンシアノールＦＦ、６０ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、６０％グリセロール、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を加え、分液（１５μＬ）を、保護の程度について、アガロースゲル（１％）電気泳動によって分析した。並行的なコントロール実験を、Ｍ．ＢｃｎＩＢの不在下、およびＭ．ＢｃｎＩＢの存在下（１４４ｎｇ）におけるファージラムダＤＮＡについて実行した。
【０１８２】
与えられた実験条件下において、天然補因子１または補因子類縁体３−８と組み合わせたＭ．ＢｃｎＩＢについて下記の特異的活性が観察された（図８）、すなわち、１：４４４ｕ／μｇ；３：＜７ｕ／μｇ；４：＜７ｕ／μｇ；５：＜７ｕ／μｇ；６：０ｕ／μｇ；７：２８ｕ／μｇ；および８：１４ｕ／μｇである。これらの結果は、メチルよりも大きな化学基であっても、スルフォニウム中心直近の炭素が、隣接炭素−炭素三重結合（プロパルジルシステム）によってさらに活性化されると、相当の活性をもってＭ．ＢｃｎＩによって転移が可能であることを示す。
【０１８３】
Ｄ．  各種補因子１、５、および７と組み合わせたＭ．ＳｓｓＩ変種Ｑ１４２Ａの酵素活性
Ｍ．ＳｓｓＩは、ＤＮＡシトシン−Ｃ５メチルトランスフェラーゼであり、短い２本鎖５’−ＣＧ−３’  ＤＮＡ配列を認識する。野生型酵素は、補因子３−６とはほとんど何も酵素活性を示さない。しかしながら、Ｍ．ＳｓｓＩの三次元構造モデル（Ｋｏｕｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．、（２００４）  Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．  ２２、３３９−３４６）から、Ｑ１４２（Ｍ．ＨｈａＩにおけるＱ８２と相同である）は、延長したメチル基置換体を含む補因子類縁体と相互作用を持つには立体的に不利となることが示唆された。従って、Ｑ１４２のコドンを、標準的ＰＣＲ突然変異発生法（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８９）  Ｇｅｎｅ  ７７、５１−５９）によってアラニンに対するコドンに変更したところ、完全な遺伝子の適正なＤＮＡ配列が、ＤＮＡ配列決定によって確かめられた。
【０１８４】
ファージラムダＤＮＡ（１μｇ、３１．３ｆｍｏｌ、３１１３  ５’−ＣＧ−３’認識配列、９７ｐｍｏｌ認識配列、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、および天然補因子１（３００μＭ）、または補因子類縁体５および７（３００μＭ）を含む、バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸、５０ｍＭの塩化ナトリウム、１ｍＭのジチオスレイトール、ｐＨ７．９）に溶解したＭ．ＳｓｓＩ−Ｑ１４２Ａの２倍連続希釈液（３３００ｎｇ、７３ｐｍｏｌから開始）（２０μＬ）を３７℃で４時間インキュベートした。その後、６５℃で２０分加熱して反応を停止させた。塩化マグネシウム（１μＬ、２００ｍＭ）、およびＲ．ＢｓｔＵＩ制限エンドヌクレアーゼ（１μＬ、１０ｕ、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を含む溶液を、各希釈液に加え、６０℃でのインキュベーションを１時間続けた。各サンプルに負荷バッファー（１０μＬ、０．２５％ブロムフェノール青、３０％グリセロール）を加え、分液（１５μＬ）を、保護の程度について、アガロースゲル（１％）電気泳動によって分析した。補因子無添加の下で実行した並行的コントロール実験は、ファージラムダＤＮＡの完全な保護をもたらさなかった。
【０１８５】
与えられた実験条件下において、天然補因子１または補因子類縁体５および７と組み合わせたＭ．ＳｓｓＩ−Ｑ１４２Ａについて下記の特異的活性が観察された（図９）、すなわち、１：２０ｕ／μｇ；５：１．２ｕ／μｇ；および７：０．６ｕ／μｇである。これらの結果は、メチルよりも大きな化学基であっても、スルフォニウム中心直近の炭素が、隣接炭素−炭素三重結合（プロパルジルシステム）によってさらに活性化されると、相当の活性を持つＭ．ＳｓｓＩのＱ１４２Ａ変種によって転移が可能であることを示す。
【０１８６】
［実施例４］
配列特異的２工程ＤＮＡ標識化
一次アミノ基（補因子類縁体１０）を含む活性化側鎖を、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ触媒によって転移し、次いで、アミン反応性蛍光標識による化学選択的修飾によって配列特異的ＤＮＡ標識化を実現した（２工程標識化）。
【０１８７】
Ａ．  補因子類縁体１０の合成
側鎖に一次アミノ基を有する補因子１０（Ｚ＝−ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2−ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）の化学的合成を、スキーム９に示すように実行した。
【０１８８】
【化１２】
2008539166.tif 000019
【０１８９】
スキーム９
本発明による補因子１０の化学合成
【０１９０】
Ａ．１  ４−アミノブト−２−イン−１−オル塩酸、化合物１１
メタノール（１５０ｍＬ）に溶解した、４−フタルイミドブト−２−イン−１−オル（７．６６ｇ、３５．６ｍｍｏｌ、Ｔｈｏｍｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．、（２００３）  Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．  ３３、３６３１−３６４１に従って調製）に、ヒドラジン水化物（３．４６ｍＬ、７１．２ｍｍｏｌ）を加えた。この反応混合液を還流しながら２時間加熱し、室温に冷却後、溶媒を減圧留去した。水とエタノール（１００ｍＬ、１：１混合物）および濃塩酸（１００ｍＬ）を残留物に加えた。この混合物を還流しながら２０分加熱し、沈殿をろ過によって除去した。ろ液を減圧下に濃縮し、得られた残留物をメタノールから再結晶させたところ、化合物１１が、白色固体として得られた（３．５７ｇ、８２％）。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：  δ＝３．７７（ｔ、4Ｊ＝２．０Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2）、４．１８（ｔ、4Ｊ＝２．０、２Ｈ、ＣＨ2）；  13Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、Ｄ2Ｏ）：  δ＝３２．０９、５２．２３、７９．１５、８７．９６．
【０１９１】
Ａ．２  ４−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタンアミド］ブト−２−イン−１−オール、化合物１２
４−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］ブタン酸（５．２０ｇ、２５．６ｍｍｏｌ、Ｈｏｕｓｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．、（１９８８）  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ３、２５９−２６１の同様にして調製）を、無水テトラヒドロフラン（２０ｍＬ）に溶解し、カルボキシジイミダゾール（ＣＤＩ）（４．５６ｇ、２８．１ｍｍｏｌ）を加えた。得られた透明溶液を室温で２時間攪拌した。次に、一次アミン１１（３．１１ｇ、２５．６ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（７．１０ｍＬ、５０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で２時間攪拌を続けた。溶媒を減圧留去し、未精製産物をカラムクロマトグラフィー（シリカゲル、４０ｇ、クロロフォルム／酢酸エチル  １：１）で精製したところ、化合物１２が淡黄色油状物（３．５９ｇ、５２％）として得られた（Ｒf  ０．３、クロロフォルム／酢酸エチル  １：１）。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：  δ＝１．４１（ｓ、９Ｈ、ＣＨ3）、１．７８（ｑｕｉｎｔ、3Ｊ＝６．８Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2）、２．２２（ｔ、3Ｊ＝７．１Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2）、３．１３（ｑ、3Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2）、４．０３−４．０９（ｍ、２Ｈ、ＣＨ2）、４．０９−４．１４（ｍ、２Ｈ、ＣＨ2）、４．８４（ｂｒ．ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、６．６７（ｂｒ．ｓ、１Ｈ、ＮＨ）；  13Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：  δ＝２６．３８、２８．６４、２９．６２、３３．５２、４０．０５、５０．７４、７９．６３、８１．２２、８１．８６、１５３．８７、１７１．５３．
【０１９２】
Ａ．３  ４−［（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ブタンアミド］ブト−２−イニル、化合物１３
塩化メチレン（１５ｍＬ）に溶解したアルコール１２（１．０ｇ、３．７ｍｍｏｌ）の溶液に、４−ニトロベンゼンスルフォニルクロリド（０．９０ｇ、４．０７ｍｍｏｌ）および水酸化ナトリウム（０．７４ｇ、１８．５ｍｍｏｌ）を０℃で加えた。得られた溶液を室温で３時間攪拌した。次に、冷水（２０ｍＬ）を加え、反応混合液を塩化メチレン（３ｘ１０ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層を硫酸ナトリウムの上で乾燥させた。ろ過後、溶媒を減圧留去したところ、化合物１３（０．９３ｇ、５５％）が、淡黄色固体として得られた。
1Ｈ−ＮＭＲ（３００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：  δ＝１．４３（ｓ、９Ｈ、ＣＨ3）、１．７６（ｑｕｉｎｔ、3Ｊ＝６．６Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2）、２．１９（ｔ、3Ｊ＝７．１、２Ｈ、ＣＨ2）、３．１３（ｑ、3Ｊ＝６．４Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2）、３．９２（ｄｔ、4Ｊ＝１．８Ｈｚ、3Ｊ＝５．３Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2）、４．７４（ｂｒ．ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、４．８３（ｔ、4Ｊ＝１．８Ｈｚ、２Ｈ、ＣＨ2）、６．６１（ｂｒ．ｓ、１Ｈ、ＮＨ）、８．０９−８．１７（ｍ、２Ｈ、ａｒｏｍ．  Ｈ）、８．３８−８．４５（ｍ、２Ｈ、ａｒｏｍ．  Ｈ）；  13Ｃ−ＮＭＲ（７５ＭＨｚ、ＣＤＣｌ3）：  δ＝２６．９６、２８．６４、２９．２６、３３．３７、３９．６６、５９．３３、７４．１９、７９．８９、８７．０８、１２４．６９、１２９．７４、１４２．３６、１５１．２０、１６２．７６、１７２．６４．
【０１９３】
Ａ．４  ５’−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］−４−［４−（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニルアミノ）−ブタンアミド］ブト−２−イニルスルフォニオ］−５’−デオキシアデノシン、化合物１４
Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（２）（２０ｍｇ、５２μｍｏｌ）を、ギ酸および酢酸の１：１混合液（０．４ｍＬ）に溶解し、スルフォン酸塩１３（１６当量）を０℃で加えた。溶液を放置して室温に温め、振とうしながら室温でインキュベートした。補因子７および８に関し、反応の進行を、実施例１に記載する通りに分析的逆相ＨＰＬＣによって分析した。ただし、化合物は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＳ  Ｃ１８逆相カラム（７５ｘ２．１ｍｍ、３μｍ、Ｓｕｐｅｌｃｏ、ドイツ）、Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＳ  Ｃ１８プレカラム（２０ｘ２．１ｍｍ、５μｍ）装備を用い、３０℃でメタノール勾配（８０％まで５分、次に８０％で３分）で溶出した。
【０１９４】
８時間後、水（４ｍＬ）を加えて反応を停止させ、水相をジエチルエーテル（３ｘ４ｍＬ）で抽出した。化合物１４を含む水相を減圧留去し、得られた淡褐色油をギ酸アンモニウムバッファー（１０ｍＬ、２０ｍＭ、ｐＨ３．５）に溶解した。精製は、予備的逆相ＨＰＬＣ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＳ  Ｃ１８  １５０ｘ１０ｍｍ、５μｍで、Ｓｕｐｅｌｇｕａｒｄ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＳ  Ｃ１８、１８ｘ１０ｍｍ、５μｍプレカラム装備、Ｓｕｐｅｌｃｏ，ドイツ）によって実行した。化合物は、ギ酸アンモニウム水溶液（２０ｍＭ、ｐＨ３．５）に溶解したメタノール（直線勾配で１０％から１３．２％まで９分、８０％まで２分、次に８０％で２分）によって３０℃、４．０ｍＬ／分の流速において溶出し、２１０ｎｍ、２６０ｎｍおよび２８０ｎｍにおいて検出した。産物１４、および硫黄におけるそのエピマーは、それぞれ、９．３分および８．８分の保持時間で溶出した。分画を含む産物を収集し、溶媒を手早く減圧留去した。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：  ６３７．３（１００）［Ｍ］+、５３６．２（１５）［５’−（４−（４−（ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニルアミノ）ブタンアミド）ブト−２−イニル）チオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｈ］+、５５８．２（１２）［５’−（４−（４−（ｔｅｒｔ．−ブトキシカルボニルアミノ）ブタンアミド）ブト−２−イニル）チオ−５’−デオキシ−アデノシン＋Ｎａ］+、２５０．１（１０）［５′−デオキシアデノシン］+．
【０１９５】
Ａ．５  ５’−［（Ｓ）−［（３Ｓ）−３−アミノ−３−カルボキシプロピル］−４−［４−アミノブタンアミド］ブト−２−イニルスルフォニオ］−５’−デオキシアデノシン、補因子１０
化合物１４を水に溶解し、２容量のトリフルオロ酢酸を加えて脱保護を実行した。反応の進行を分析的逆相ＨＰＬＣ（実施例４Ａ．４を参照）にて分析したところ、補因子１０は、３．２分の保持時間で溶出した。室温で１時間インキュベーション後、溶媒を減圧留去し、残留物を、ギ酸アンモニウム水溶液（２０ｍＭ、ｐＨ３．５）に溶解した。
【０１９６】
逆相カラムクロマトグラフィー（逆相シリカゲル１００  Ｃ１８、Ｆｌｕｋａ）によって精製を実行し、化合物を、５％アセトニトリルを含むギ酸アンモニウムバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ３．５）によって溶出した。分画を含む産物を収集し、溶媒を減圧留去し、残留物を水に溶解した。産物１０の量（２．５μｍｏｌ、最後の２工程では５％）は、アデニン発色団の２６０ｎｍにおける消滅係数１５４００Ｌｍｏｌ-1ｃｍ-1を用いＵＶ分光光度計測によって定量した。
ＥＳＩ−ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度）：  ５３７．３（２５）［Ｍ］+、４５８．１（３３）［５’−（４−（４−アミノブタンアミド）ブト−２−イニル）チオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｎａ］+、４３６．２（１００）［５’−（４−（４−アミノブタンアミド）ブト−２−イニル）チオ−５’−デオキシアデノシン＋Ｈ］+．
【０１９７】
Ｂ．  種々のクラスの補因子１０およびＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる、短い二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドの配列特異的修飾
ＤＮＡアデニン−Ｎ６メチルトランスフェラーゼＭ．Ｔａｑｌ、およびＤＮＡシトシン−Ｃ５メチルトランスフェラーゼＭ．ＨｈａＩの変種Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａによる、補因子１０からの、活性化４−（４−アミノブタンアミド）ブト−２−イニル基（Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）の転移は、先ず、基質として短い二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドを用いて調べた。酵素転移の後、この二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドを酵素的に断片化し、得られた修飾ヌクレオシドを、ＥＳＩ−ＭＳ結合の逆相ＨＰＬＣによって分析した。
【０１９８】
Ｂ．１  Ｍ．ＴａｑＩによる、二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド内のアデニン−Ｎ６の修飾
半メチル化二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ．ＩＩ（実施例２Ａのスキーム５を参照）は、水に溶解した、等モル量の、相補的な１本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ（５’−ＧＣＣＧＣＴＣＧＡＴＧＣＣＧ−３’）およびＩＩ（５’−ＣＧＧＣＡＴＣＧＡMeＧＣＧＧＣ−３’、ＡMe＝Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン）を混ぜ合わせ、８５℃で５分加熱し、室温にゆっくりと冷却することによって生産した。酵素による修飾は、バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩、５０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのジチオスレイトール、０．０１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ７．９）において、二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ．ＩＩ（１０μＭ）を、補因子１０（３００μＭ）、およびＭ．ＴａｑＩ（１２．５μＭ、Ｇｏｅｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ８、１２１−１２５の記載の通りに製造）と共に３７℃で一晩インキュベーションすることによって実行した。溶液を９５℃で１０分加熱し、プロテイナーゼＫを添加し、５５℃で１０分インキュベートした。加水分解産物をゲルろ過（Ｇ−２５カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によって除去した。
【０１９９】
得られた溶液を、ヌクレア−ゼＰ１（１．１４ｕ、Ｓｉｇｍａ、Ｔａｕｋｉｒｃｈｅｎ、ドイツ）、および仔ウシ小腸アルカリフォスファターゼ（１８ｕ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍａｎｔａｓ）を含むバッファー（１／１０容量、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸、１００ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの酢酸亜鉛、ｐＨ７．５）に溶解し、４２℃で４時間インキュベートし、Ｍｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ−３スピンカラム（Ａｍｉｃｏｎ）に通過させた。ヌクレオシドを、逆相ＨＰＬＣ（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ＨＳ  Ｃ１８  ２０ｘ２．１ｍｍ、５μｍ、プレカラム、Ｓｕｐｅｌｃｏ，ドイツ）−質量分析検出器（ＨＰ  １１００シリーズＥＳＩ−ＭＳ、単一四重極装備）によって分析した。化合物は、ギ酸アンモニウムバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ３．５）に溶解したエタノール（０％で３分、その後直線勾配で２０％まで１５分、８０％まで２分）で流速０．３ｍＬ／分で溶出した。オンライン質量分析検出のために、ポストカラム移動相修飾（９６％メタノール、４％ギ酸、および１ｍＭの水酸化ナトリウムとの等量共同流）を用い、２’−デオキシアデノシン、２’−デオキシシチジンおよびその誘導体の検出効率を上げた。質量スペクトラムを、５０−６００ｍ／ｚ範囲で記録した。
【０２００】
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-RＩＩの断片化（図１０、上段のトレースａ）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡMeの外に、ｄＡMeよりも長い（１９．１分）の保持時間を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：４２６  ［Ｍ＋Ｎａ］+、３１０［Ｎ６−（４−（４−アミノブタンアミド）ブト−２−イニル）アデニン＋Ｎａ］+）は、Ｎ６−［４−（４−アミノブタンアミド）ブト−２−イニル］−２’−デオキシアデノシン（ｄＡ4-(4-Aminobutanamido)but-2-ynylと一致した。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体３は、Ｍ．ＢｃｎＩＢの補因子として機能する。この修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-RＩＩの、実験的に求められたヌクレオチド組成は、理論的ヌクレオチド組成（括弧の中に示す）とよく一致することが認められた。ｄＣ  １０．２（１１）、ｄＧ  １１．８（１１）、ｄＴ  ３．０（３）、ｄＡ  １．０（１）、ｄＡMe  １．０（１）  ｄＡ4-(4-Aminobutanamido)but-2-ynyl１．１（１）。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体１０は、Ｍ．ＴａｑＩの補因子として機能する。
【０２０１】
Ｂ．２  Ｍ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａによる、二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド内のシトシン−Ｃ５の修飾
ＤＮＡ、および天然補因子ＡｄｏＭｅｔ  １（ＰＤＢ同上：６ＭＨＴ；Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５、２７７３−２７８３）と複合体を形成するＭ．ＨｈａＩの三次元構造は、Ｎ３０４（Ｑ８２に加えて）が、延長したメチル基置換体を含む補因子類縁体と相互作用を持つには立体的に不都合である可能性を示唆した。従って、Ｎ３０４のコドンを、標準的メガプライマーＰＣＲ突然変異発生法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、（２００１）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１３．３１−１３．３５）によってアラニンに対するコドンに変更し、この突然変異を含む断片を、Ｑ８２Ａ突然変異を含むプラスミドでクローンした（実施例２Ｂ、実施例３Ｂ．２）。完全な遺伝子の適正なＤＮＡ配列が、ＤＮＡ配列決定によって確かめられた。Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａ変種の発現および精製を、野生型酵素について記載されるものと同じやり方（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９２）  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３１、８６４８−８６５３；  Ｋｉｍａｓａｕｓｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．、（１９９８）  ＥＭＢＯ  Ｊ．  １７、３１７−３２４）で実行した。アミノ酸置換の存在は、精製Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａの質量分析によって確かめられた。
【０２０２】
二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩＩＩ．ＩＶは、水に溶解した、等モル量（２．５ｎｍｏｌ）の、相補的な１本鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩＩＩ（５’−ＣＡＴＴＡＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＣＣＴＧＧＣＴＡＴ−３’）およびＩＶ（５’−ＡＴＡＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＧＧＣＧＣＧＴＡＡＴＧ−３’）を混ぜ合わせ、８５℃で５分加熱し、室温にゆっくりと冷却することによって生産された。酵素による修飾は、二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩＩＩ．ＩＶ（１２．５μＭ）を、バッファー（補因子３−５、７、および８では、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸、１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、ｐＨ７．４であり；補因子６では、２５ｍＭの３−モルフォリノ−プロパンスルフォン酸、２５ｍＭの２−モルフォリノ−エタンスルフォン酸、１０ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、０．２ｍｇ／ｍＬのウシ血清アルブミン、ｐＨ６．０）に溶解した、補因子３−８（３００μＭ）、およびＭ．ＨｈａＩ（１５μＭ）と共に３７℃で一晩インキュベーションすることによって調べた。Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａは、８０℃で１０分加熱し、プロテイナーゼＫを加え、５５℃で２時間インキュベーションした。加水分解産物は、ゲルろ過によって除去した（Ｇ−２５カラム、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）。酵素断片化および、得られたヌクレオシドのＥＳＩ−ＭＳ−結合逆相ＨＰＬＣ分析は、実施例４Ｂ．１に記載する通りに実行した。
【０２０３】
−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2による、修飾された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＩＩ．ＩＶ）Z-Rの断片化（図１０の曲線ａ、下段）から、天然のヌクレオシドｄＣ、ｄＧ、ｄＴ、およびｄＡの外に、１１．５分の保持時間を持つ新規化合物のあることが明らかにされた。この新規化合物を、結合ＥＳＩ−ＭＳによって分析したところ、観察された質量（ｍ／ｚ：４０２  ［Ｍ＋Ｎａ］+、２８６［Ｃ５−（４−（４−アミノブタン−アミド）ブト−２−イニル）シトシン＋Ｎａ］+は、Ｃ５−［４−（４−アミノブタン−アミド）ブト−２−イニル］２’−デオキシシチジン（ｄＣC5-[4-(4-Aminobutanamido)but-2-ynyl）と一致した。従って、ＡｄｏＭｅｔ類縁体１０は、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａの補因子として機能する。
【０２０４】
Ｃ．  補因子１０および種々のクラスのＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる、長いＤＮＡの配列特異的修飾
補因子１０と組み合わせた、ＤＮＡアデニン−Ｎ６メチルトランスフェラーゼＭ．ＴａｑＩ、およびＤＮＡシトシン−Ｃ５メチルトランスセラーゼＭ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａの酵素活性を、ＤＮＡ保護アッセイ（実施例３、スキーム８を参照）を用いて調べた。
【０２０５】
Ｃ．１  補因子１０と組み合わせたＭ．ＴａｑＩ（野生型酵素）の酵素活性
ファージラムダＤＮＡ（１．０３μｇ、３２．３ｆｍｏｌ、１２１  ５’−ＴＣＧＡ−３’認識配列、３．９１ｐｍｏｌ認識配列、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、および補因子類縁体１０（３００μＭ）を含む、バッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩、５０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのジチオスレイトール、および０．０１％のトリトンＸ−１００、ｐＨ７．９）に溶解したＭ．ＴａｑＩ（Ｇｏｅｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ８、１２１−１２５に記載される通りに調製）の２倍連続希釈液（１８０ｎｇ、３．７５ｐｍｏｌから開始）（１５μＬ）を６０℃で１時間インキュベートした。その後、Ｒ．ＴａｑＩ制限エンドヌクレアーゼ（１０ｕ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ウシ血清アルブミン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、およびバッファー（３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩、６６ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、ｐＨ７．９）を含む溶液（１０μＬ）を、各希釈液に加え、６５℃でのインキュベーションを１時間続けた。各サンプルに橙色負荷染料液（５μＬ、０．２％オレンジＧ、０．０５％キシレンシアノールＦＦ、６０ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、６０％グリセロール、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を加え、分液（１５μＬ）を、保護の程度について、アガロースゲル（１％）電気泳動によって分析した。並行的なコントロール実験を、Ｍ．ＴａｑＩの不在下、およびＭ．ＴａｑＩの存在下（１８０ｎｇ）におけるファージラムダＤＮＡについて実行した。
【０２０６】
与えられた実験条件下において、補因子類縁体１０（図１１、左）と組み合わせたＭ．ＴａｑＩの特異的活性は、１１ｕ／μｇであった。実施例３Ａ．１に示す補因子１、３−９について得られたＭ．ＴａｑＩの特異的活性と比較する場合、この数字に４という倍数を掛けなければならない。なぜなら、Ｍ．Ｔａｑとのインキュベーションは１時間しかなく、実施例３Ａ．１で用いた４時間ではなかったからである。この得られた結果は、延長し、アミノ官能基を持つ側鎖であっても、スルフォニウム中心直近の炭素が、隣接炭素−炭素三重結合（プロパルジルシステム）によってさらに活性化されると、相当の活性をもってＭ．ＴａｑＩによって転移が可能であることを示す。
【０２０７】
Ｃ．２  補因子１０と組み合わせたＭ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａの酵素活性
ウシ血清アルブミン（０．２ｍｇ／ｍＬ）、ファージラムダＤＮＡ（１．１６μｇ、３６．３ｆｍｏｌ、２１５  ５’−ＧＣＧＣ−３’認識配列、７．８ｐｍｏｌ認識配列、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、および補因子類縁体１０（３００μＭ）を含む、バッファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−塩酸、１５ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．４）に溶解したＭ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａ（実施例４Ｂ．２に記載される通りに調製）の２倍連続希釈液（１１００ｎｇ、３０ｐｍｏｌから開始）（１５μＬ）を３７℃で１時間インキュベートした。その後、８０℃で１０分加熱して反応を停止させた。Ｒ．Ｈｉｎ６Ｉ（Ｍ．ＨｈａＩと同じ配列を認識する制限エンドヌクレアーゼであるが、修飾されたＤＮＡは切断しない）（１２ｕ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、ウシ血清アルブミン（０．１ｍｇ／ｍＬ）、およびバッファー（３３ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸塩、６６ｍＭの酢酸カリウム、２６．５ｍＭの塩化マグネシウム、ｐＨ７．９）を含む溶液（１０μＬ）を、各希釈液に加え、３７℃でのインキュベーションを１時間続けた。各サンプルに橙色負荷染料液（５μＬ、０．２％オレンジＧ、０．０５％キシレンシアノールＦＦ、６０ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、６０％グリセロール、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を加え、分液（１５μＬ）を、保護の程度について、アガロースゲル（１％）電気泳動によって分析した。並行的なコントロール実験を、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａの不在下、およびＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａの存在下（１１００ｎｇ）におけるファージラムダＤＮＡについて実行した。
【０２０８】
補因子１０と組み合わせたＭ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａ（図１１右側）は、ほぼ完全にファージラムダＤＮＡを保護した。この結果は、延長し、アミノ官能基付き側鎖であっても、スルフォニウム中心直近の炭素が、隣接炭素−炭素三重結合（プロパルジルシステム）によってさらに活性化されると、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａによって転移が可能であることを示す。
【０２０９】
Ｄ．  補因子１０および異なるクラスのＤＮＡメチルトランスフェラーゼによる、ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの配列特異的２工程標識化
ＤＮＡアデニン−Ｎ６メチルトランスフェラーゼＭ．ＴａｑＩ、およびＤＮＡシトシン−Ｃ５メチルトランスフェラーゼＭ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａを触媒として用い、補因子１０から、活性化４−（４−アミノブタンアミド）ブト−２−イニル基（−Ｚ−Ｒ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2）の第１の配列特異的転移を行い、次に、６−（フルオレセイン−５（および−６）カルボキサミド）ヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルを、配列特異的に修飾されたｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの一次アミノ基と第２反応させることによって長いプラスミドＤＮＡの配列特異的標識化を実行した（スキーム１０）。ＤＮＡ標識化の配列特異性は、標識されたｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを各種制限エンドヌクレアーゼによって断片化し、得られたＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動によって分離し、そのアガロースゲルを蛍光画像記録することによって確かめた（図１２）。
【０２１０】
【化１３】
2008539166.tif 000020
【０２１１】
スキーム１０
本発明による、ＤＮＡの、配列特異的２工程蛍光標識表示
【０２１２】
Ｄ１．  ＤＮＡアデニン−Ｎ６メチルトランスフェラーゼＭ．ＴａｑＩによる、ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの５’−ＴＣＧＡ−３’  ＤＮＡに対する、補因子１０からの配列特異的転移
ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（２０．４μｇ、７．１４ｐｍｏｌ、７  ５’−ＴＣＧＡ−３’  認識配列、５０ｐｍｏｌ認識配列、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、Ｍ．ＴａｑＩ（２．３９μｇ、５０ｐｍｏｌ、Ｇｏｅｄｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．、（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．  ８、１２１−１２５の記載の通りに調製）、および補因子類縁体１０（３００μＭ）を、バッファー（１００μＬ、２０ｍＭのＴｒｉｓ酢酸塩、５０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、１ｍＭのジチオスレイトール、および０．０１％  還元済みＴｒｉｔｏｎＸ−１００、ｐＨ７．９）において６０℃で４時間インキュベートした。その後、この反応混合液から、フェノール液、クロロフォルム、およびイソアミルアルコール（１ｘ１００μＬ）の２５：２４：１混合液を有するフェノール液（１ｘ１００μＬ）、およびクロロフォルム（３ｘ１００μＬ）で抽出した。水相に、酢酸ナトリウム（１０μＬ、３Ｍ、ｐＨ７．０）およびイソプロパノール（８０μＬ）を加えた。沈殿を、１５０００ｇにおいて室温で１５分の遠心によって収集した。上清を除去し、ペレットを、エタノール水溶液（１００μＬ、７５％）で洗浄した。ペレットを乾燥し、水に溶解した（１００μＬ）。
【０２１３】
Ｄ２．  ＤＮＡシトシン−Ｃ５メチルトランスフェラーゼＭ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａによる、ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの５’−ＧＣＧＣ−３’  ＤＮＡに対する、補因子１０からの配列特異的転移
ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（２３．１μｇ、８．０６ｐｍｏｌ、３１  ５’−ＧＣＧＣ−３’  認識配列、２５０ｐｍｏｌ認識配列、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）、Ｍ．ＨｈａＩ  変種Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａ（９．２５μｇ、２５０ｐｍｏｌ、実施例４Ｂ．２の記載の通りに調製）、および補因子類縁体１０（３００μＭ）を、ウシ血清アルブミン（０．２ｍｇ／ｍＬ）を含むバッファー（１００μＬ、５０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸、１５ｍＭの塩化ナトリウム、０．５ｍＭのエチレンジアミンテトラ酢酸、２ｍＭの２−メルカプトエタノール、ｐＨ７．４）において３７℃で４時間インキュベートした。その後、この反応混合液から、フェノール液、クロロフォルム、およびイソアミルアルコール（１ｘ１００μＬ）の２５：２４：１混合液を有するフェノール液（１ｘ１００μＬ）、およびクロロフォルム（３ｘ１００μＬ）で抽出した。水相に、酢酸ナトリウム（１０μＬ、３Ｍ、ｐＨ７．０）およびイソプロパノール（８０μＬ）を加えた。沈殿を、１５０００ｇで室温において１５分の遠心によって収集した。上清を除去し、ペレットを、エタノール水溶液（１００μＬ、７５％）で洗浄した。ペレットを乾燥し、水に溶解した（１００μＬ）。
【０２１４】
Ｄ３．  Ｍ．ＴａｑＩ−およびＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａ修飾ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの蛍光標識化
実施例４Ｄ．１または４Ｄ．２において得られた、修飾されたｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ、６−（フルオレセイン−５（および−６）−カルボキサミド）ヘキサン酸Ｎ−ヒドロキシ−スクシニミジルエステル（２２２μｇ、３６８ｎｍｏｌ、あらかじめジメチルスルフォキシドに溶解させたもの）、および、炭酸水素ナトリウム（０．１５Ｍ、ｐＨ９．０）を含む溶液（９０μＬ）を、暗黒で室温で１時間インキュベートした。その後、この反応混合液を、ＮＡＰ５カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を通過させ、イソプロパノール（４／５容量）を加えてプラスミドＤＮＡを沈殿させた。沈殿を、１５０００ｇで室温において１５分の遠心によって収集した。上清を除去し、ペレットを、エタノール水溶液（２ｘ１００μＬ、７５％）で洗浄した。ペレットを乾燥し、水に溶解した（４０μＬ）。
【０２１５】
Ｄ．４  蛍光標識ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの分析
実施例４Ｄ．３において得られた修飾されたｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡ（３μＬ）を、メーカーの指示に従って、各種制限エンドヌクレアーゼ、または制限エンドヌクレアーゼの組み合わせ（Ｒ．Ｘｃｅｌ、Ｒ．ＭｂｉＩ＋Ｒ．Ｅｃｏ８８Ｉ、Ｒ．ＢｐｉＩ＋Ｒ．ＢｓｅＳＩ、Ｒ．ＢｐｉＩ＋Ｒ．ＰｖｕｌＩ、およびＲ．ＧｓｕＩ、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）によって断片化した。その後、プロテイキナーゼＫ（２ｍｇ／ｍＬ）、およびドデシル硫酸ナトリウム（１％）の溶液（１／５容量）を各断片化反応液に加え、サンプルを５５℃で３０分インキュベートした。各サンプルに橙色負荷染料液（１／６容量、０．２％オレンジＧ、０．０５％キシレンシアノールＦＦ、６０ｍＭエチレンジアミンテトラ酢酸、６０％グリセロール、ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を加え、ＤＮＡ断片を、臭化エチジウム無添加下、アガロースゲル（１．５％）電気泳動（１０Ｖ／ｃｍ）によって分離した。アガロースゲルは、４７３ｎｍレーザーおよびＬＰＢフィルターセット使用によるＦｕｊｉゲル画像化システムＦＬＡ−５１００によって走査した（図１２上段）。その後、アガロースゲルを臭化エチジウムで染色し、比較のために再び走査した（図１２上段）。
【０２１６】
Ｍ．ＴａｑＩによるｐＢＲ３２２修飾体から得られたもので、Ｍ．ＴａｑＩ認識配列を全く含まないＤＮＡ断片は、臭化エチジウム染色不在下では視認されなかった（図１２、白楕円で示す）。さらに、個別のＤＮＡ断片の蛍光強度は、これらの断片におけるＭ．ＴａｑＩまたはＭ．ＨｈａＩ認識配列の数とよく相関していた（表５）。これらの結果は、ＡｄｏＭｅｔ類縁体１０の存在下にＭ．ＴａｑＩまたはＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａによってアミノ修飾されたＤＮＡは、Ｎ−ヒドロキシスクシニミジルエステルによって標識されること、および、標識化は配列特異的であることを示す。
【０２１７】
【表５】
2008539166.tif 000021
【図面の簡単な説明】
【０２１８】
【図１】図１は、補因子３−９およびＭ．ＴａｑＩ（ｄＡMe＝Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン）による処理後に得られる、酵素的に断片化された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩのＨＰＬＣ分析である。ｄＡZ-Rでは、化学基Ｚ−Ｒが、ｄＡのＮ６位置に付着する。曲線（ａ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−ＣＨ3を有する補因子３；曲線（ｂ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−ＣＨ2ＣＨ3を有する補因子４；曲線（ｃ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−ＣＨ＝ＣＨ2を有する補因子５；曲線（ｄ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡ＣＨを有する補因子６；曲線（ｅ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡ＣＣＨ3を有する補因子７；曲線（ｆ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2ＣＨ3を有する補因子８；および、曲線（ｇ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ6Ｈ5を有する補因子９。
【図２】図２は、補因子３−９およびＭ．ＨｈａＩ−Ｑ２３Ａによる処理後に得られる、酵素的に断片化された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ＩＩＩ．ＩＶ）Z-RのＨＰＬＣ分析である。ｄＣZ-Rでは、化学基Ｚ−Ｒが、ｄＣのＣ５位置に付着する。曲線（ａ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−ＣＨ3を有する補因子３；曲線（ｂ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−ＣＨ2ＣＨ3を有する補因子４；曲線（ｃ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−ＣＨ＝ＣＨ2を有する補因子５；曲線（ｄ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡ＣＨを有する補因子６；曲線（ｅ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡ＣＣＨ3を有する補因子７；および、曲線（ｆ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2ＣＨ3を有する補因子８。
【図３】図３は、補因子３−６およびＭ．ＢｃｎＩＢによる処理後に得られる、酵素的に断片化された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチド（Ｖ．ＶＩ）Z-RのＨＰＬＣ分析である。ｄＣZ-Rでは、化学基Ｚ−Ｒが、ｄＣのＮ４位置に付着する。曲線（ａ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−ＣＨ3を有する補因子３；曲線（ｂ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−ＣＨ2ＣＨ3を有する補因子４；曲線（ｃ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−ＣＨ＝ＣＨ2を有する補因子５；および、曲線（ｄ）：Ｚ＝ＣＨ2およびＲ＝−Ｃ≡ＣＨを有する補因子６。
【図４】図４は、天然補因子１、または補因子類縁体３−９から、ファージラムダＤＮＡに向かう、各種化学基Ｚ−Ｒの、Ｍ．ＴａｑＩ触媒による転移に関するＤＮＡ保護アッセイを示す。ＤＮＡ（１μｇ）および補因子（３００μＭ）を、先ず、様々な量のＭ．ＴａｑＩ（レーン１において２００ｎｇで開始し、レーン１から１９において２倍連続希釈）と４時間インキュベートし、次に、Ｒ．ＴａｑＩによる断片化を経過させた。ファージラムダＤＮＡによる並行的コントロール実験を、Ｍ．ＴａｑＩおよび補因子無添加（Ｃ１はＲ．ＴａｑＩ無添加、およびＣ４はＲ．ＴａｑＩ添加）、および、Ｍ．ＴａｑＩ添加（Ｃ２はＲ．ＴａｑＩ無添加、およびＣ３はＲ．ＴａｑＩ添加）の下におこなった。Ｒ．ＴａｑＩによる、ファージラムダＤＮＡの完全な断片化は、Ｍ．ＴａｑＩ無添加条件下において全ての補因子ついて観察された（データ図示せず）。
【図５】図５は、天然補因子１、および補因子類縁体３−９から、ファージラムダＤＮＡに向かう、各種化学基Ｚ−Ｒの、Ｍ．ＴａｑＩ変種Ｖ２１Ｇ−触媒による転移に関するＤＮＡ保護アッセイを示す。ＤＮＡ（１μｇ）および補因子（３００μＭ）を、先ず、様々な量のＭ．ＴａｑＩ−Ｖ２１Ｇ（レーン１において２００ｎｇで開始し、レーン１から２１において２倍連続希釈）と４時間インキュベートし、次に、Ｒ．ＴａｑＩによる断片化を経過させた。ファージラムダＤＮＡによる並行的コントロール実験を、Ｍ．ＴａｑＩ−Ｖ２１Ｇおよび補因子無添加（Ｃ１はＲ．ＴａｑＩ無添加、およびＣ４はＲ．ＴａｑＩ添加）、および、Ｍ．ＴａｑＩ−Ｖ２１Ｇ添加（Ｃ２はＲ．ＴａｑＩ無添加、およびＣ３はＲ．ＴａｑＩ添加）の下におこなった。Ｒ．ＴａｑＩによる、ファージラムダＤＮＡの完全な断片化は、Ｍ．ＴａｑＩ−Ｖ２１Ｇ無添加条件下において全ての補因子ついて観察された（データ図示せず）。
【図６】図６は、天然補因子１、または補因子類縁体３−８から、ファージラムダＤＮＡに向かう、各種化学基Ｚ−Ｒの、Ｍ．ＨｈａＩ触媒による転移に関するＤＮＡ保護アッセイを示す。ＤＮＡ（１．１６μｇ）および補因子（３００μＭ）を、先ず、様々な量のＭ．ＨｈａＩ（レーン１において２７８ｎｇで開始し、レーン１から２０において２倍連続希釈；レーン０ではＭ．ＨｈａＩ無添加）と４時間インキュベートし、次に、Ｒ．Ｈｉｎ６Ｉによる断片化を経過させた。ファージラムダＤＮＡによる並行的コントロール実験を、Ｍ．ＨｈａＩおよび補因子無添加（Ｃ１はＲ．Ｈｉｎ６Ｉ無添加、およびＣ２はＲ．Ｈｉｎ６Ｉ添加）、および、Ｍ．ＨｈａＩ添加（Ｃ３はＲ．Ｈｉｎ６Ｉ添加）の下におこなった。
【図７】図７は、天然補因子１、または補因子類縁体３−８から、ファージラムダＤＮＡに向かう、各種化学基Ｚ−Ｒの、Ｍ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａ触媒による転移に関するＤＮＡ保護アッセイを示す。ＤＮＡ（１．１６μｇ）および補因子（３００μＭ）を、先ず、様々な量のＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ（レーン１において２７８ｎｇで開始し、レーン１から２０において２倍連続希釈；レーン０ではＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ無添加）と４時間インキュベートし、次に、Ｒ．Ｈｉｎ６Ｉによる断片化を経過させた。ファージラムダＤＮＡによる並行的コントロール実験を、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａおよび補因子無添加（Ｃ１はＲ．Ｈｉｎ６Ｉ無添加、およびＣ２はＲ．Ｈｉｎ６Ｉ添加）、および、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ添加（Ｃ３はＲ．Ｈｉｎ６Ｉ添加）の下におこなった。
【図８】図８は、天然補因子１、または補因子類縁体３−８から、ファージラムダＤＮＡに向かう、各種化学基Ｚ−Ｒの、Ｍ．ＢｃｎＩＢ触媒による転移に関するＤＮＡ保護アッセイを示す。ＤＮＡ（１．１μｇ）および補因子（３００μＭ）を、先ず、様々な量のＭ．ＢｃｎＩＢ（レーン１において１４４ｎｇで開始し、レーン１から２０において２倍連続希釈；レーン０ではＭ．ＢｃｎＩＢ無添加）と４時間インキュベートし、次に、Ｒ．ＢｃｎＩによる断片化を経過させた。ファージラムダＤＮＡによる並行的コントロール実験を、Ｍ．ＢｃｎＩＢおよび補因子無添加（Ｃ１はＲ．ＢｃｎＩ無添加、およびＣ２はＲ．ＢｃｎＩ添加）、および、Ｍ．ＢｃｎＩＢ添加（Ｃ３はＲ．ＢｃｎＩ添加）の下におこなった。
【図９】図９は、天然補因子１、および補因子類縁体５および７から、ファージラムダＤＮＡに向かう、各種化学基Ｚ−Ｒの、Ｍ．ＳｓｓＩ変種Ｑ１４２Ａ触媒による転移に関するＤＮＡ保護アッセイを示す。ＤＮＡ（１μｇ）および補因子（３００μＭ）を、先ず、様々な量のＭ．ＳｓｓＩ−Ｑ１４２Ａ（レーン１において３３００ｎｇで開始し、レーン１から１４において２倍連続希釈；レーン０ではＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ無添加）とインキュベートし、次に、Ｒ．ＢｓｔＵＩによる断片化を経過させた。ファージラムダＤＮＡによる並行的コントロール実験を、補因子無添加の下におこなった。
【図１０】図１０は、補因子１０と組み合わせたＤＮＡメチルトランスフェラーゼ触媒修飾後に得られる、酵素的に断片化された二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドのＨＰＬＣ分析である。上段：Ｍ．ＴａｑＩおよび補因子１０による処理後に得られた二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩの断片化（曲線ａ）、および、コントロールとして補因子１０無添加においてＭ．ＴａｑＩとインキュベートした二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ．ＩＩの断片化（曲線ｂ）。ｄＡZ-Rでは、化学基Ｚ−Ｒが、ｄＡのＮ６位置に付着し、Ｚ＝ＣＨ2、およびＲ＝−ＣＨ2Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2（ｄＡMe  ＝Ｎ６−メチル−２’−デオキシアデノシン）である。下段：Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａおよび補因子１０による処理後に得られた二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩZ-R．ＩＩの断片化（曲線ａ）、および、コントロールとして補因子１０無添加においてＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａとインキュベートした二重鎖オリゴデオキシヌクレオチドＩ．ＩＩの断片化（曲線ｂ）。ｄＣZ-Rでは、化学基Ｚ−Ｒが、ｄＣのＣ５位置に付着し、Ｚ＝ＣＨ2、およびＲ＝−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2である。
【図１１】図１１は、補因子類縁体１０から、ファージラムダＤＮＡに向かう、化学基Ｚ−Ｒの、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ触媒による転移に関するＤＮＡ保護アッセイを示す。ここに、Ｚ＝ＣＨ2、およびＲ＝−Ｃ≡ＣＣＨ2ＮＨＣＯＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＮＨ2である。左：ＤＮＡ（１．０３μｇ）および補因子１０（３００μＭ）を、先ず、様々な量のＭ．ＴａｑＩ（レーン１において１８０ｎｇで開始し、レーン１から９において２倍連続希釈、レーン０ではＭ．ＴａｑＩ無添加）と１時間インキュベートし、次に、Ｒ．ＴａｑＩによる断片化を経過させた。ファージラムダＤＮＡによる並行的コントロール実験を、Ｍ．ＴａｑＩおよび補因子１０無添加（Ｃ１はＲ．ＴａｑＩ無添加、およびＣ２はＲ．ＴａｑＩ添加）、および、Ｍ．ＴａｑＩ添加（Ｃ３はＲ．ＴａｑＩ添加）の下におこなった。右：ＤＮＡ（１．１６μｇ）および補因子１０（３００μＭ）を、先ず、様々な量のＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａ（レーン１において１１００ｎｇで開始し、レーン１から９において２倍連続希釈、レーン０ではＭ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａ無添加）と１時間インキュベートし、次に、Ｒ．Ｈｉｎ６Ｉによる断片化を経過させた。ファージラムダＤＮＡによる並行的コントロール実験を、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａおよび補因子１０無添加（Ｃ１はＲ．Ｈｉｎ６Ｉ無添加、およびＣ２はＲ．Ｈｉｎ６Ｉ添加）、および、Ｍ．ＨｈａＩ−Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａ添加（Ｃ３はＲ．Ｈｉｎ６Ｉ添加）の下におこなった。
【図１２】図１２は、本発明による、ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡの、配列特異的２工程蛍光標識表示を示す。ｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを、ＡｄｏＭｅｔ類縁体１０の存在下に、Ｍ．ＴａｑＩまたはＭ．ＨｈａＩ変種Ｑ８２Ａ／Ｎ３０４Ａ（Ｍ．ＨｈａＩ＊で表示）によってアミノ修飾し、フルオレセインＮ−ヒドロキシ−スクシニミジルエステル（スキーム１０）と反応させた。標識化プラスミドＤＮＡを、各種制限エンドヌクレアーゼ、または制限エンドヌクレアーゼの組み合わせ（表示）によって断片化し、ＤＮＡ断片を、アガロースゲル電気泳動によって分離した。臭化エチジウム無添加の状態（上段）、および添加の状態（下段、コントロールとして）で蛍光画像記録を実施した。Ｍ．ＴａｑＩによるｐＢＲ３２２修飾体から得られ、Ｍ．ＴａｑＩ認識配列を全く含まないＤＮＡ断片は、臭化エチジウム染色の不在下では視認されない（白楕円で示す）。コントロールは、未修飾のｐＢＲ３２２プラスミドＤＮＡを、フルオレセインＮ−ヒドロキシスクシニミジルエステルによって処理し、次いで、制限エンドヌクレアーゼ断片化を行って実施した（Ｍ＝ＤＮＡマーカー）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
2008539166.tif 000035