(57)【要約】本発明は、核酸脂質粒子を細胞に送達する、例えば導入するための脂質をベースとした調合物、およびこのような脂質ベースの調合物の送達効率を最適化するためのアッセイを目的とする。核酸脂質粒子は、干渉RNA分子、1カ所以上の不飽和部位を有する、約10〜約20個の炭素原子のアルキル側鎖を持つカチオン性脂質、非カチオン性脂質、およびポリエチレングリコール(PEG)脂質複合体またはポリアミド(ATTA)複合体などの、粒子の凝集を阻止する複合体脂質を含む。2008501730.tif 000036
2008501730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記を含む、核酸脂質粒子：
(a)干渉RNA；
(b)式Iの、かつ次の構造を有するカチオン性脂質：
2008501730.tif 000033
式中：
R1およびR2は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より独立に選択され；
R3およびR4は、約10〜約20個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より独立に選択され、ここで、R3およびR4の少なくとも一つが不飽和部位を少なくとも2カ所含み；
(c)非カチオン性脂質；および
(d)粒子の凝集を阻止する複合体脂質。
【請求項２】
カチオン性脂質が、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)および1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)からなる群より選択される、請求項1記載の核酸脂質粒子。
【請求項３】
核酸脂質粒子中の干渉RNAが、水溶液中においてヌクレアーゼによる分解に対し耐性である、請求項1記載の核酸脂質粒子。
【請求項４】
粒子が約150nm未満の中央直径を有する、請求項1記載の核酸脂質粒子。
【請求項５】
干渉RNAが低分子干渉RNA(siRNA)を含む、請求項1記載の核酸脂質粒子。
【請求項６】
siRNAが15〜60(二重鎖)ヌクレオチドを含む、請求項5記載の核酸脂質粒子。
【請求項７】
干渉RNAがプラスミドから転写される、請求項1記載の核酸脂質粒子。
【請求項８】
干渉RNAが二本鎖RNA(dsRNA)を含む、請求項1記載の核酸脂質粒子。
【請求項９】
非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロールおよびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の核酸脂質粒子。
【請求項１０】
粒子の凝集を阻止する複合体脂質がポリエチレングリコール(PEG)脂質複合体、ポリアミド(ATTA)脂質複合体およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の核酸脂質粒子。
【請求項１１】
粒子の凝集を阻止する複合体脂質がポリエチレングリコール脂質を含み、かつPEG脂質が、PEGジアシルグリセロール(DAG)、PEGジアルキルオキシプロピル、PEGリン脂質、PEGセラミドおよびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項1記載の核酸脂質粒子。
【請求項１２】
粒子の凝集を阻止する複合体脂質が、ポリエチレングリコール(PEG)ジアルキルオキシプロピル複合体を含む、請求項11記載の核酸脂質粒子。
【請求項１３】
PEGジアルキルオキシプロピル複合体が、PEG-ジラウリルオキシプロピル(C12)、PEGジミリスチルオキシプロピル(C14)、PEGジパルミチルオキシプロピル(C16)およびPEGジステアリルオキシプロピル(C18)からなる群より選択されるメンバーである、請求項12記載の核酸脂質粒子。
【請求項１４】
粒子の凝集を阻止する複合体脂質が下記式を有する、請求項1記載の核酸脂質粒子：
A-W-Y(式II)
式中、
Aは脂質成分であり；
Wは親水性ポリマーであり；かつ
Yはポリカチオン性成分である。
【請求項１５】
Wが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーおよびそれらの組み合わせからなる群より選択されるポリマーであり、該ポリマーが約250〜約7000ダルトンの分子量を有する、請求項14記載の核酸脂質粒子組成物。
【請求項１６】
選択されたpHにおいてYが少なくとも4つの正電荷を有する、請求項14記載の核酸脂質粒子組成物。 
【請求項１７】
Yが、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、それらの誘導体およびそれらの組み合わせからなる群より選択されるメンバーである、請求項14記載の核酸脂質粒子組成物。
【請求項１８】
細胞を下記を含む核酸脂質粒子と接触させることを含む、該細胞内に干渉RNAを導入する方法：
(a)該干渉RNA；
(b)式Iの、かつ下記の構造を有するカチオン性脂質：
2008501730.tif 000034
式中：
R1およびR2は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より独立に選択され；かつ
R3およびR4は、約10〜約20個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より独立に選択され、ここで、R3およびR4の少なくとも一つが不飽和部位を少なくとも2カ所含み；
(c)非カチオン性脂質；および
(d)粒子の凝集を阻止する複合体脂質。
【請求項１９】
核酸脂質粒子内の干渉RNAが水溶液中においてヌクレアーゼによる分解に対し耐性である、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
粒子が約150nm未満の中央直径を有する、請求項18記載の方法。
【請求項２１】
干渉RNAが低分子干渉RNA(siRNA)を含む、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
干渉RNAがプラスミドから転写される、請求項18記載の方法。
【請求項２３】
非カチオン性脂質が、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、パルミトイルオレヨールホスファチジルグリセロール(POPG)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、16-O-モノメチルPE、16-O-ジメチルPE、18-1-トランスPE、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE)、コレステロールおよびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項18記載の方法。
【請求項２４】
粒子の凝集を阻止する複合体脂質が、ポリエチレングリコール(PEG)脂質複合体、ポリアミド(ATTA)脂質複合体およびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項18記載の方法。
【請求項２５】
粒子の凝集を阻止する複合体脂質が、ポリエチレングリコール(PEG)脂質である、請求項18記載の方法。
【請求項２６】
PEG脂質が、PEG-ジアシルグリセロール、PEGジアルキルオキシプロピル、PEGリン脂質、PEG-セラミドおよびそれらの混合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
粒子の凝集を阻止する複合脂質が、ポリエチレングリコール(PEG)-ジアルキルオキシプロピル複合体である、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
PEG-ジアルキルオキシプロピル複合体がPEG-ジミリスチルオキシプロピル(C14)である、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
細胞が哺乳動物内にある、請求項18記載の方法。
【請求項３０】
哺乳動物がヒトである、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
投与部位に対し遠位部位にある干渉RNAの存在が、粒子投与後少なくとも48時間検出可能である、請求項29記載の方法。
【請求項３２】
投与部位に対し遠位部位にある干渉RNAの存在が、粒子投与後少なくとも24時間検出可能である、請求項29記載の方法。
【請求項３３】
下記を含む核酸脂質粒子を哺乳動物被検体に投与することを含む、干渉RNAのインビボ送達法：
(a)該干渉RNA；
(b)式Iの、かつ次の構造を有するカチオン性脂質：
2008501730.tif 000035
式中：
R1およびR2は、HおよびC1〜C3アルキルからなる群より独立に選択され；かつ
R3およびR4は、約10〜約20個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より独立に選択され、ここで、R3およびR4の少なくとも一つが不飽和部位を少なくとも2カ所含み；
(c)非カチオン性脂質；および
(d)粒子の凝集を阻止する複合体脂質。
【請求項３４】
哺乳動物がヒトである、請求項33記載の方法。
【請求項３５】
ヒトが遺伝子の発現に関連する疾患または障害を有し、かつ該遺伝子の発現が干渉RNAによって減じられる、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
疾患または障害が遺伝子の過剰発現に関連している、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
静脈内投与である、請求項33記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、核酸を封入する血清安定な脂質送達ビークルを含む、細胞または哺乳動物に有効なRNA干渉(RNAi)を提供するための、核酸の治療的送達のための組成物および方法に関する。より具体的には、本発明は、全身送達に適した小直径を有する、血清安定粒子中に封入された低分子干渉RNA(siRNA)を用いることを目的とする。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、2004年6月7日出願の米国仮特許出願第60/577,961号、2004年6月7日出願の米国仮特許出願第60/578,075号、2004年9月17日出願の米国仮特許出願第60/610,746号および2005年5月9日出願の米国仮特許出願第60/679,427号の恩典を主張し、これらの出願それぞれの開示がすべての趣旨で全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
RNA干渉(RNAi)は、二本鎖RNA(dsRNA)によって引き起こされる、相補的な標的単鎖mRNAの分解かつ対応する翻訳配列の「サイレンシング(silencing)」を誘発する、進化的に保存された配列特異的メカニズムである(McManus and Sharp, Nature Rev. Genet. 3:737(2002))（非特許文献１）。RNAiは、より長いdsRNA鎖を、生物学的に活性な約21〜23ヌクレオチド長の「低分子干渉RNA」(siRNA)配列に酵素的に切断することによって機能する(Elbashir et al., Genes Dev. 15:188(2001))（非特許文献２）。
【０００４】
siRNAは、関心対象の遺伝子産物の転写および翻訳をダウンレギュレートするまたはサイレンシングするのに用い得る。例えば、肝炎のような肝臓の疾患および障害に関連する遺伝子をダウンレギュレートすることが望ましい。特に、肝炎ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子をダウンレギュレートすることが望ましい。
【０００５】
干渉RNAについては、治療的に有用である、効果的かつ安全な核酸送達システムが求められている。ウイルスベクターは比較的効率のよい遺伝子送達システムであるが、野生型への復帰の可能性ならびに免疫応答の懸念など、様々に制限される欠点がある。その結果、非ウイルス遺伝子送達システムがますます注目を集めている(Worgall, et al., Human Gene Therapy 8:37 (1997); Peeters, et al., Human Gene Therapy 7:1693 (1996); Yei, et al., Gene Therapy 1:192 (1994); Hope, et al., Molecular Membrane Biology 15:1(1998))（非特許文献３〜６）。さらにまた、ウイルスシステムは、血中より急速に排除され、肺、肝臓および膵臓などの「一次通過」臓器へのトランスフェクションが制限される。これに加えて、これらシステムでは、その後の注射による送達に問題を起こす免疫応答を誘発する。
【０００６】
プラスミドDNA-カチオン性リポソーム複合体は、現在最も一般的に用いられている非ウイルス性遺伝子送達ビークルである(Felgner, Scientific American 276:102 (1997); Chonn, et al., Current Opinion in Biotechnology 6: 698 (1995))（非特許文献７、８）。例えば、昆虫細胞をトランスフェクトするために、両親媒性化合物、中性脂質および界面活性剤から作られたカチオン性リポソーム複合体は、米国特許第6,458,382号（特許文献１）に開示されている。カチオン性リポソーム複合体は、米国特許出願第2003/0073640号（特許文献２）にも開示されている。
【０００７】
カチオン性リポソーム複合体は、全身適用に不適な大型の、画定度の低いシステムであり、さらに毒性の強い有害な副作用を誘発することがある(Harrison, et al., Biotechniques 19:816 (1995); Li, et al., The Gene 4:891 (1997); Tam, et al., Gene Ther. 7:1867 (2000))（非特許文献９〜１１）。リポプレックスは、大型の、正の電荷を持った集合体であることから、インビボ投与されると速やかに排除され、一次通過臓器、特に肺で最も高い発現レベルが観察されている(Huang, et al., Nature Biotechnology 15:620 (1997); Templeton, et al., Nature Biotechnology 15:647 (1997); Hofland, et al., Pharmaceutical Research 14:742 (1997))（非特許文献１２〜１４）。
【０００８】
他のリポソーム送達システムは、例えば逆ミセル、アニオン性およびポリマーリポソームの使用を含む。逆ミセルは、米国特許第6,429,200号（特許文献３）に開示されている。アニオン性リポソームは、米国特許出願第2003/0026831号（特許文献４）に開示されている。デキストリンまたはグリセロール-ホスホコリンを組み入れるポリマーリポソームは、それぞれ米国特許出願第2002/0081736号（特許文献５）および第2003/0082103号（特許文献６）に開示されている。
【０００９】
封入された核酸を含む、全身送達のための遺伝子送達システムは、小さくなければならず(即ち、直径約100nm未満)、また疾患組織への送達を達成するために、血中に長期間、無傷で留まらなければならない。そのためには、血管コンパートメントの細胞および他の成分と相互作用しない、極めて安定で血清耐性である核酸含有粒子が必要である。粒子はまた、所望の核酸の細胞内送達を促進するために、疾患部位の標的細胞と容易に相互作用しなければならない。
【００１０】
最近の研究は、核酸が、二重層脂質小胞に封入された単一プラスミドからなる小型(直径約70nm)の「安定化核酸脂質粒子」(SNALP)に封入できることを示している(Wheeler, et al., Gene Therapy 6:271 (1999))（非特許文献１５）。これらSNALPは、典型的な「融合性」脂質であるジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、低レベルのカチオン性脂質を含有し、ポリ(エチレングリコール)(PEG)コーティングの存在によって水性媒体中で安定化する。SNALPは、静脈(i.v.)注射後に長期の血中寿命を示し、遠位腫瘍部位での血管透過性が高いためにかかる部位へ優先的に蓄積することから、全身的に用いられており、これらの腫瘍部位で導入遺伝子発現を媒介できる。ルシフェラーゼマーカー遺伝子を含有するSPLPの静脈注射後に、腫瘍部位で観察される導入遺伝子発現のレベルは、プラスミドDNAカチオン性リポソーム複合体(リポプレックス)または裸のDNAを用いて得ることができるレベルよりも高い。
【００１１】
従って、当技術分野では、細胞内に、干渉RNAなどの核酸を導入するための新規でより効率的な方法および組成物が今なお強く求められている。これに加えて、当技術分野では、肝炎などの疾患を、ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子をダウンレギュレートすることによって治療または予防する方法も求められている。本発明は、この、およびその他ニーズに応えるものである。
【００１２】
【特許文献１】米国特許第6,458,382号
【特許文献２】米国特許出願第2003/0073640号
【特許文献３】米国特許第6,429,200号
【特許文献４】米国特許出願第2003/0026831号
【特許文献５】米国特許出願第2002/0081736号
【特許文献６】米国特許出願第2003/0082103号
【非特許文献１】McManus and Sharp, Nature Rev. Genet. 3:737(2002)
【非特許文献２】Elbashir et al., Genes Dev. 15:188(2001)
【非特許文献３】Worgall, et al., Human Gene Therapy 8:37 (1997)
【非特許文献４】Peeters, et al., Human Gene Therapy 7:1693 (1996)
【非特許文献５】Yei, et al., Gene Therapy 1:192 (1994)
【非特許文献６】Hope, et al., Molecular Membrane Biology 15:1(1998)
【非特許文献７】Felgner, Scientific American 276:102 (1997)
【非特許文献８】Chonn, et al., Current Opinion in Biotechnology 6: 698 (1995)
【非特許文献９】Harrison, et al., Biotechniques 19:816 (1995)
【非特許文献１０】Li, et al., The Gene 4:891 (1997)
【非特許文献１１】Tam, et al., Gene Ther. 7:1867 (2000))
【非特許文献１２】Huang, et al., Nature Biotechnology 15:620 (1997)
【非特許文献１３】Templeton, et al., Nature Biotechnology 15:647 (1997)
【非特許文献１４】Hofland, et al., Pharmaceutical Research 14:742 (1997)
【非特許文献１５】Wheeler, et al., Gene Therapy 6:271 (1999)
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、一または複数の干渉RNA分子を封入する新規で安定な核酸脂質粒子(SNALP)、SNALPを作製する方法、ならびにSNALPを送達および／または投与する方法を、含む。
【００１４】
一つの態様では、本発明は干渉RNAおよび下記構造を有する式IまたはIIのカチオン性脂質を含む、核酸脂質粒子を提供する：
2008501730.tif 000003
式中、R1およびR2は、HおよびC1〜C3アルキルよりなる群から独立に選択され；R3およびR4は、約10〜約20個の炭素原子を有するアルキル基からなる群より独立に選択され、ここで、R3およびR4の少なくとも一つは、少なくとも2つの不飽和部位を含んでいる。好ましい態様では、カチオン性脂質は、1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)および1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)から選択される。好ましい態様では、干渉RNA分子は、核酸脂質粒子の脂質二重層内に完全に封入されており、核酸脂質粒子内の核酸は、水溶液中においてヌクレアーゼによる分解に対し耐性である。好ましい態様では、核酸粒子は、哺乳動物に対し実質的に無毒である。核酸脂質粒子は、さらに非カチオン性脂質、二重層安定化成分(即ち粒子の凝集を防ぐ複合脂質、カチオン性ポリマー脂質、ステロール(例えばコレステロール)およびその組み合わせを含むことができる。
【００１５】
いくつかの態様では、干渉RNAは、約60ヌクレオチド長未満の低分子干渉RNA分子または25ヌクレオチド長より長い二本鎖RNAである。いくつかの態様では、干渉RNAは、プラスミド、特に標的配列のDNA鋳型を含むプラスミドから転写される。
【００１６】
一つの態様では、非カチオン性脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)およびジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシラート(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、16-0-モノメチルPE、16-0-ジメチルPE、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE)、ステロール(例えばコレステロール)ならびにそれらの混合物より選択される。
【００１７】
一つの態様では、粒子の凝集を阻止する複合脂質は，ポリエチレングリコール(PEG)脂質複合体、ポリアミド (ATTA)脂質複合体およびそれらの混合物の一つまたは複数である。一つの局面では、PEG脂質複合体は、PEG-ジアルキルオキシプロピル(DAA)、PEG-ジアシルグリセロール(DAG)、PEGリン脂質、PEG-セラミドおよびそれらの混合物の一つまたは複数である。一つの局面では、PEG-DAG複合体は、PEG-ジラウロイルグリセロール(C12)、PEG-ジミリストイルグリセロール(C14)、PEG-ジパルミトイルグリセロール(C16)およびPEG-ジステアロイルグリセロール(C18)の一つまたは複数である。一つの局面では、PEG-DAA複合体は、PEG-ジラウリルオキシプロピル(C12)、PEG-ジミリスチルオキシプロピル(C14)、PEG-ジパルミチルオキシプロピル(C16)およびPEG-ジステアリルオキシプロピル(C18)の一つまたは複数である。
【００１８】
本発明の核酸脂質粒子は、干渉RNA配列を含む核酸の治療的送達に有用である。特に、本発明の目的は、関心対象の標的核酸配列の転写および翻訳をダウンレギュレートするか、またはサイレンシングすることによって、哺乳動物の疾患を治療するためのインビトロ法およびインビボ法を提供することである。いくつかの態様では、干渉RNAは、核酸脂質粒子に処方され、粒子はかかる治療を必要とする患者に投与される。別の態様では、細胞を患者から取り出して干渉RNAをインビトロ送達し、患者に再注射する。一つの態様では、本発明は、カチオン性脂質、非カチオン性脂質、凝集を阻止する複合脂質および干渉RNAを含む核酸脂質粒子に細胞を接触させることによって、細胞内に核酸を導入する方法を提供する。
【００１９】
一つの態様では、核酸脂質粒子の全注射量の少なくとも約5%、10%、15%、20%または25%が、注射後約8、12、24、36または48時間、血漿中に存在する。別の態様では、核酸脂質粒子の全注射量の20%、30%、40%より多くが、および60%、70%または80%程度が、注射後約8、12、24、36または48時間、血漿中に存在する。一つの態様では、肺、肝臓、腫瘍の細胞、または炎症部位にある細胞内の干渉RNAの存在を、投与後約8、12、24、36、48、60、72または96時間目に検出できる。一つの態様では、標的配列の発現のダウンレギュレーションは、投与後約8、12、24、36、48、60、72または96時間目に検出できる。一つの態様では、標的配列の発現のダウンレギュレーションは、もっぱら腫瘍細胞内、または炎症部位の細胞で起こる。一つの態様では、投与部位から遠位部にある細胞内での干渉RNAの存在は、核酸脂質粒子の静脈投与から少なくとも4日後に検出可能である。別の態様では、肺、肝臓または腫瘍にある細胞内の干渉RNAの存在は、核酸脂質粒子注射後、少なくとも4日目に検出できる。別の態様では、核酸脂質粒子は、非経口的または腹膜内投与される。
【００２０】
粒子は、血中で安定であり、血管外部位および標的細胞集団への到達をもたらす薬力学的挙動に必要な大きさであることから、静脈内の核酸移動に適している。本発明はまた、核酸脂質粒子を含む、薬学的に許容される組成物も提供する。
【００２１】
本発明の別の態様は、干渉RNAのインビボ送達の方法を提供する。カチオン性脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻止する複合脂質および干渉RNAを含む核酸脂質粒子は、被験体(例えばヒトなどの哺乳動物)に投与(例えば静脈内)される。いくつかの態様では、本発明は、干渉RNAを哺乳動物被検体の肝臓へインビボ送達するための方法を提供する。
【００２２】
本発明の更なる態様は、哺乳動物被検体の疾患または障害を治療する方法を提供する。カチオン性脂質、非カチオン性脂質、粒子の凝集を阻止する複合脂質および干渉RNAを含む、治療有効量の核酸脂質粒子が、哺乳動物被検体(例えばマウスなどの齧歯類、ヒトもしくはサルなどの霊長類)に投与される。いくつかの態様では、疾患または障害には遺伝子の発現および／または過剰発現が関連しており、遺伝子の発現または過剰発現は、干渉RNAによって低下する。
【００２３】
発明の詳細な説明
序
本発明は、低分子干渉RNA(siRNA)分子が、式I、IIまたはそれらの混合物のカチオン性脂質を含むSNALPに封入できるという予想外な成功を立証する。本明細書に記載のSNALPを用いて、細胞にsiRNAを送達し、関心対象の標的配列をサイレンシングさせることができる。任意の広範囲な濃度の、追加のカチオン性脂質、非カチオン性脂質およびその他脂質を含むSNALPを用いて、本発明を実施できる。SNALPは、任意の供給源に由来しかつ任意のポリヌクレオチド配列を含む干渉RNA配列を含む任意の核酸を用いて調製でき、ならびに数多くある方法のうち任意の方法を用いて調製できる。
【００２４】
定義
「脂質」という用語は、脂肪酸のエステルを含み、水に不溶性であるが多くの有機溶媒に溶解性であることを特徴とする、有機化合物の群を指すが、これに限定されない。それらは、通常少なくとも3つの部類に分けられる：(1)脂肪および油ならびにロウを含む「単純脂質」；(2)リン脂質および糖脂質を含む「複合脂質」；(3)ステロイドなどの「誘導脂質」。
【００２５】
「脂質小胞」とは、化合物を送達するのに用いることができる下記を含む任意の脂質組成物を指すが、これらに限定されない：水容積が両親媒性脂質二重層により封入されているリポソーム；または脂質が、干渉RNA配列を含むプラスミドなどの巨大分子成分を含む内部を小さくなった水性内部と一緒に、被覆しているリポソーム；あるいは比較的不規則な脂質混合物内に、封入成分が含まれている脂質凝集物もしくはミセル。
【００２６】
本明細書で使用する「脂質封入された」とは、完全に封入された化合物、部分的に封入された化合物、またはその両方の化合物を提供する脂質調合物を指すことができる。好ましい態様では、核酸は脂質調合物内に完全に封入される(例えば、SPLP、pSPLPまたはその他SNALPを形成する)。
【００２７】
本明細書で使用する用語「SNALP」は、SPLPを包含する、安定な核酸脂質粒子を指す。SNALPは、核酸(例えばssDNA、dsDNA、ssRNA、ミクロRNA(miRNA)、低分子ヘアピン型RNA(shRNA)、dsRNA、siRNA、または干渉RNAがそこから転写されるプラスミドを包含するプラスミド)を含む、小さくなった水性内部を覆っている脂質の小胞である。本明細書で使用する「SPLP」という用語は、脂質小胞内に封入された核酸(例えばプラスミド)を含む、核酸脂質粒子を指す。SNALPおよびSPLPは、典型的には、カチオン性脂質、非カチオン性脂質および粒子の凝集を阻止する脂質(例えばPEG脂質複合体)を含有する。SNALPおよびSPLPは、それらが静脈内投与後の延長した血中での寿命の、および遠位部位(例えば投与部位から物理的に離れている部位)での蓄積を示し、これら遠位部位でのトランスフェクトされた遺伝子の発現を仲介できることから、全身性に適用される。SPLPは、国際公開公報第00/03683号に記載の封入縮合剤-核酸複合体を含む「pSPLP」を包含する。
【００２８】
「小胞形成脂質」という用語は、疎水性成分および極性頭部基を有し、またそれ自体が、多くのリン脂質が例示するように、水中にて自発的に二重層小胞を形成できる任意の両親媒性脂質を包含することを意図している。
【００２９】
「小胞採用脂質」という用語は、他の両親媒性脂質と共に、その疎水性成分が二重膜の内側の疎水性領域と接触し、かつその極性頭部は膜外側の極性表面に向かって配置されるように、脂質二重層内に安定して組み入れられる任意の両親媒性脂質を包含することを意図している。小胞採用脂質としては、それ自体が非膜小胞相を採る傾向にあるものの、二重膜安定化成分存在下において二重層構造を形成することができる脂質を包含する。典型的な例はDOPE(ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン)である。二重層安定化成分としては、SNALPの凝集を阻止する複合脂質、ポリアミドオリゴマー(例えばATTA脂質誘導体)、ペプチド、タンパク質、界面活性剤、脂質誘導体、米国特許第5,885,613号に記載されているようなジアルキルオキシプロピルに結合しているPEG、ジアシルグリセロールに結合しているPEG、ホスファチジル-エタノールアミンに結合しているPEG、およびセラミドに複合しているPEGなどのPEG脂質誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００３０】
「両親媒性脂質」という用語は、一部分、脂質物質の疎水性部分が疎水相内に配向され、一方親水性部分は水相に配向される任意の好適物質を指す。両親媒性脂質は、通常、脂質小胞の主要成分である。親水性特性は、炭水化物、リン酸塩、カルボン基、硫酸基、アミノ基、スルフヒドリル基、ニトロ基、ヒドロキシ基およびその他類似の基のような極性または荷電基の存在に由来する。疎水性は、長鎖飽和および不飽和脂肪族炭化水素基、かつ一または複数の芳香族、脂環式または複素環式基によって置換されたような基を含むが、これらに限定されない非極性基を含有することによって付与できる。両親媒性化合物の例は、リン脂質、アミノ脂質およびスフィンゴ脂質を含むが、これらに限定されない。リン脂質の代表例は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジン酸、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン、リゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリンまたはジリノレオイルホスファチジルコリン含むが、これらに限定されない。スフィンゴリピド、グリコスフィンゴリピド類、ジアシルグリセロールおよびβ-アシルオキシ酸のような、リンを欠いたその他化合物も、両親媒性脂質として表される群に入る。これに加え、上記両親媒性脂質は、トリグリセリドおよびステロールを包含する他の脂質と混合することもできる。
【００３１】
「中性脂質」という用語は、選択されたpHにおいて、非電荷または中性の両性イオンの形のいずれかで存在する多くの脂質種の任意のものを指す。生理学的pHにおいては、このような脂質としては、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、コレステロール、セレブロシドおよびジアシルグリセロールが挙げられる。
【００３２】
「非カチオン性脂質」という用語は、上記のようにアニオン性脂質と同様に、いかなる中性の脂質も指す。非カチオン性脂質は、例えばジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)およびジオレオイルホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシラート(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、16-0-モノメチルPE、16-0-ジメチルPE、18-1-トランスPEならびに1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE)を含む。
【００３３】
「アニオン性脂質」という用語は、生理学的pHにおいて負に帯電した任意の脂質を指す。これら脂質としては、ホスファチジルグリセロール、カルジオリピン、ジアシルホスファチジルセリン、ジアシルホスファチジン酸、N-ドデカノイルホスファチジルエタノールアミン、N-スクシニルホスファチジルエタノールアミン、N-グルタリルホスファチジルエタノールアミン、リシルホスファチジルグリセロール、パルミトイルオレイルホスファチジルグリセロール(POPG)および中性脂質に結合した他のアニオン性修飾基を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
「カチオン性脂質」という用語は、生理学的pHなどの選択したpHにおいて、正味の正電荷を持つ多くの脂肪種の任意のものを指す。このような脂質としては、下記を含むが、これらに限定されない：1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)および1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(DODAC); N-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTMA); N, N-ジステアリル-N,N-臭化ジメチルアンモニウム(DDAB); N-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(DOTAP); 3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(DC-Chol)ならびにN-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-yl)-N,N-ジメチル-N-臭化アンモニウムヒドロキシエチル(DMRIE)。下記の脂質は、カチオン性で、生理的pHの下で正電荷を有する：DODAP、DODMA、DMDMA等。
【００３５】
「疎水性脂質」という用語は、長鎖の、飽和および不飽和の、脂肪族炭化水素基および一もしくは複数の芳香族、脂環式もしくは複素環式基によって置換されていてもよいそれらの基を含むが、これらに限定されない。好適例としては、ジアシルグリセロール、ジアルキルグリセロール、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパンおよび1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンを含むが、これらに限定されない。
【００３６】
「融合性」という用語とは、リポソーム、SNALPまたはその他薬物送達システムの、細胞膜と融合する能力を指す。膜は、原形質膜でも、または細胞小器官、例えばエンドゾーム、核等を取り巻いている膜のいずれでもあり得る。
【００３７】
「ジアシルグリセロール」という用語は、共にグリセロールの1-および2-位置にエステル結合によって結合した2〜30個の炭素結合を有する、2-脂肪アシル鎖、R1およびR2を有する化合物を指す。アシル基は飽和しても、または様々な不飽和度を有し得る。ジアシルギリセロールは下記一般式を有する：
2008501730.tif 000004
【００３８】
「ジアルキルオキシプロピル」という用語は、R1およびR2が共に2〜30個の炭素を独立に有する、2-アルキル鎖を有する化合物を指す。アルキル基は飽和しても、または様々な不飽和度を有し得る。ジアルキルオキシプロピルは下記一般式を有する：
2008501730.tif 000005
「ATTA」または「ポリアミド」という用語は、米国特許第6,320,017号および第6,586,559号に開示されている化合物を指すが、これらに限定されない。これら化合物としては、下記式を有する化合物を含む：
2008501730.tif 000006
式中、Rは、水素、アルキルおよびアシルからなる群より選択されるメンバーであり；R1は、水素およびアルキルからなる群より選択されるメンバーであり；または任意で、RおよびR1、ならびにそれらが結合する窒素は、アジド部分を形成し；R2は、水素、任意で置換されているアルキル、任意で置換されているアリール、およびアミノ酸の側鎖から選択さる群のメンバーであり；R3は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノおよびNR4R5からなる群より選択されるメンバーであり、ここで、R4およびR5は、独立に水素またはアルキルであり；nは、4〜80であり；mは、2〜6であり；pは、1〜4であり；およびqは、0または1である。他のポリアミドが本発明の化合物に使用できることは、当業者には明らかであろう。
【００３９】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では相互交換的に用いられて、アミノ酸残基のポリマーを指す。本用語は、一または複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工の化学的模擬物であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然のアミノ酸ポリマーおよび非天然のアミノ酸ポリマーに用いられる。本明細書で用いる場合、本用語は、完全長タンパク質(即ち抗原)を含む、任意の長さのアミノ酸鎖を包含しており、ここで、アミノ酸残基は共有ペプチド結合によって結合している。
【００４０】
「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および合成アミノ酸、ならびに天然のアミノ酸と類似の様式で機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模擬物を指す。「塩基性アミノ酸」という用語は、生理学的pHのような選択されたpHにおいて、正味の正電荷を有する天然のアミノ酸、ならびに合成アミノ酸、および／またはアミノ酸模擬物を指す。この群としては、リジン、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、ヒスチジン等が挙げられるが、これらに限定されない。天然のアミノ酸は、遺伝的コードによってコードされたアミノ酸、ならびに後に修飾を受けたアミノ酸、例えばヒドロキシプロリン、α-カルボキシグルタミン酸およびO-ホスホセリンである。アミノ酸類似体は、天然のアミノ酸と同一の基本的化学構造、即ち水素に結合したα炭素、カルボキシル基、アミノ基およびR基を有する化合物、例えばホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムを指す。このような類似体は、修飾されたR基(例えばノルロイシン)または修飾されたペプチド主鎖を有するが、天然のアミノ酸と同一の基本的化学構造を維持している。「アミノ酸模擬物」は、アミノ酸の一般化学構造とは異なる構造を有するが、天然のアミノ酸に類似した様式で機能する化合物を指す。
【００４１】
アミノ酸は、本明細書では、周知の三文字のシンボルによって、またはIUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionが提唱する一文字シンボルのいずれかによって表してよい。ヌクレオチドも同様に、これら一般に受け入れられている一文字コードによって表される。
【００４２】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は、少なくとも2個のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを、一本鎖または二本鎖のいずれかの形で含有するポリマーを指す。特に限定しない限り、本用語は、参照核酸に類似の結合特性を有し、天然のヌクレオチドと類似の様式で代謝される、天然ヌクレオチドの既知類似体を含有する核酸を包含する。特に指示のない限り、ある核酸配列は、保存的に変更されたその変異体(例えば縮重コドン置換)、対立遺伝子、オルトログ、SNP、および相補的配列、ならびに明示的に示した配列も暗黙の内に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、一または複数の選択された(または全ての)コドンの三番目の位置が、混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を作成することによって達成できる(Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); and Cassol et al. (1992); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994))。「ヌクレオチド」は、糖であるデオキシリボース(DNA)またはリボース(RNA)、塩基およびリン酸基を含有する。ヌクレオチドは、リン酸基を介して互いに結合する。「塩基」は、プリンおよびピリミジンを含み、それらはさらに天然化合物のアデニン、チミン、グアイニン、シトシン、ウラシル、イノシン、および天然類似体、ならびにプリンおよびピリミジンの合成誘導体を含み、それらはアミン、アルコール、チオール、カルボキシレートおよびハロゲン化アルキルなどの、しかしこれらに限定されない新規反応基を配置する変更を含むが、これらに限定されない。DNAはアンチセンス、プラスミドDNA、プラスミドDNAの一部、凝縮前DNA、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の産物、ベクター(P1、PAC、BAC、YAC、人工染色体)、発現カセット、キメラ配列、染色体DNA、またはこれらの群の誘導体の形でもよい。核酸という用語は、遺伝子、cDNA、遺伝子がコードするmRNAおよび干渉RNA分子と相互交換的に用いられる。
【００４３】
「保存的に変更された変異体」は、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関する「保存的に変更された変異体」とは、同一または本質的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸配列を指し、または核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合には、本質的に同一の配列を指す。遺伝子コードの縮重によって、数多くの機能的に同一である核酸が、任意の所与のタンパク質をコードする。例えば、コドンGCA、GCC、GCGおよびGCUは全てアミノ酸のアラニンをコードしている。従って、ある一つのコドンによってアラニンが指定されている場所の全てについて、コードするポリペプチドを変えることなしに、このコドンを、記載の対応コドンのいずれかに変更し得る。このような核酸変異体は、保存的に変更された変異体の一種の「サイレント変異体」である。本明細書では、あるポリペプチドをコードする全ての核酸配列は、その核酸の全ての可能なサイレント変異体も記述する。当業者は、核酸中の各コドン(通常メチオニンの唯一のコドンであるAUG、および通常トリプトファンの唯一のコドンであるTGGを除く)は、機能的に同一の分子を産するように変更することができる。よって、あるポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異体は、各記載の配列に内在している。
【００４４】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチドまたは前駆体(例えばA、B、C、D、EまたはG型肝炎ウイルス；単純ヘルペスウイルス)の産生に必要な部分長または全長のコード配列を含む、核酸(例えばDNAまたはRNA)配列を指す。
【００４５】
「遺伝子産物」は、本明細書で用いる場合、RNA転写物のような遺伝子の産物を指す。
【００４６】
「干渉RNA」または「RNAi」または「干渉RNA配列」という用語は、特定mRNAの分解を引き起こし、所望のmRNA標的転写物からの翻訳を干渉するのに用いることができる二重鎖RNAを指す。約15〜30ヌクレオチド長の短いRNAiは、「低分子干渉RNA」または「siRNA」と呼ばれる。より長いRNAiは、一般的に「二本鎖RNA」または「dsRNA」と呼ばれる。dsRNAまたはsiRNAを転写する(例えばヘアピン二重鎖として)DNA分子もRNAiを提供する。dsRNAを転写するためのDNA分子は、米国特許第6,573,099号において、ならびに米国特許公開第20020160393号および第20030027783号において開示されている。siRNAを転写するためのDNA分子は、Tuschl and Borkhardt, Molecular Interventions, 2:158 (2002)に概要されている。
【００４７】
遺伝子または核酸の「サイレンシング」または「ダウンレギュレーション」とは、標的核酸配列、即ちRNAiが標的とする配列の転写および／または翻訳の検出可能な減少、あるいは干渉RNAまたは他の核酸配列の非存在下で検出される正常レベルに比した標的配列またはタンパク質の量または活性の減少を意味するものである。検出可能な減少とは、わずか約5%または10%、あるいは約80%、90%または100%程度あってもよい。より一般的には、検出可能な減少は、約20%、30%、40%、50%、60%、または70%である。
【００４８】
本明細書で用いる場合、「水溶液」という用語は、全体または一部が水を含む組成物を指す。
【００４９】
本明細書で用いる場合、「有機脂質溶液」という用語は、全体または一部が脂質を有する有機溶媒を含む組成物を指す。
【００５０】
「遠位部」は、本明細書で用いる場合、物理的に離れた部位を指すが、これは隣接の毛細血管床に限定されず、しかし生体全体に広く分布する部位も含む。
【００５１】
核酸脂質粒子と関連した場合の「血清安定」とは、遊離DNAを有意に分解する血清またはヌクレアーゼアッセイに曝した場合でも、粒子が有意な分解をしないことを意味する。好適アッセイとしては、例えば、下記実施例に記載するような、標準的血清アッセイまたはDNaseアッセイを含む。
【００５２】
本明細書で使用する「全身送達」は、生体内に化合物を広く分布させる送達を指す。ある投与技術は、ある化合物は全身送達できるが、他のものはできない。全身送達は、有用な、好ましくは治療的な量の化合物を大部分の体部に触れさせることを意味する。広範囲の分布を得るには、一般的に、投与部位から遠位にある疾患部位に到達する前に、化合物が急速に分解または排除されない(一次通過臓器(肝臓、肺等)によるか、または急速な非特異的な細胞との結合によるなど)ような血中での寿命が求められる。核酸脂質粒子の全身送達は、例えば静脈内、皮下、腹腔内送達を含む、当技術分野公知の手段で実施できる。好ましい態様では、核酸脂質粒子の全身送達は、静脈内送達による。
【００５３】
安定核酸脂質粒子(SNALP)およびその特性
安定核酸脂質粒子、または別名SNALPは、一般的にはカチオン性脂質(即ち式IまたはIIのカチオン性脂質)および核酸を含む。このようなSNALPはまた、非カチオン性脂質および二重層安定化成分(即ちSNALPの凝集を阻止する複合脂質)を含むことが好ましい。本発明のSNALPは、典型的には、約50nm〜約150nm、より典型的には約100nm〜約130nm、最も一般的には約110nmから約115nmの平均直径を有し、また実質的に無毒である。これに加えて、本発明のSNALP中に存在する核酸は、水溶液中においてヌクレアーゼによる分解に耐性である。
【００５４】
一つの態様では、本発明は、本発明のカチオン性脂質、即ち式I、式IIの脂質またはそれらの組み合わせを含む、安定化核酸脂質粒子(SPLPまたはSNALP)およびその他の脂質ベースのキャリアシステム(例えばリポソーム、ミセル、ビロソーム、脂質-核酸粒子、核酸複合体、およびそれらの混合物)を提供する。本発明の脂質-核酸粒子は、典型的には、核酸、式Iまたは式IIのカチオン性脂質、非カチオン性脂質およびPEG脂質複合体を含む。式Iまたは式IIのカチオン性脂質は、典型的には、該粒子中に存在する全脂質の約2%〜約60%、約5%〜約50%、約10%〜約45%、約20%〜約40%または約30%を含む。非カチオン性脂質は、典型的には、該粒子内に存在する全脂質の約5%〜約90%、約10%〜約85%、約20%〜約80%、約30%〜約70%、約40%〜約60%または約48%を含む。PEG脂質複合体は、典型的には、該粒子中に存在する全脂質の約1%〜約20%、約1.5%〜約18%、約4%〜約15%、約5%〜約12%または約2%を含む。本発明の核酸脂質粒子は、さらにコレステロールを含んでよい。コレステロールは、存在する場合、典型的には、該粒子中に存在する全脂質の約10%〜約60%、約12%〜約58%、約20%〜約55%または約48%を含む。核酸脂質粒子の成分比は、例えば本明細書に記載のERPアッセイを用いた場合に変わるかもしれないことは、当業者は容易に理解できるだろう。例えば、全身送達の場合、カチオン性脂質は該粒子中に存在する全脂質の約5%〜約15%を含み、また局所もしくは局部送達の場合には、カチオン性脂質は該粒子中に存在する全脂質の約40%〜約50%を含むだろう。
【００５５】
A.  カチオン性脂質
式IおよびIIのカチオン性脂質は、単独で、または一もしくは複数のその他カチオン性脂質種もしくは非カチオン性脂質種と組み合わせるかのいずれかで、本発明に用いることができる。式IおよびIIのカチオン性脂質は、下記構造を有する：
2008501730.tif 000007
式中、R1およびR2は、独立に選択され、HまたはC1〜C3アルキルである。R3およびR4は、独立に選択され、かつ約10〜約20個の炭素原子を有するアルキル基であり；R3およびR4の少なくとも一つは、少なくとも2つの不飽和部位を含む。一つの態様では、R3およびR4は、共に同一であり、即ちR3およびR4は共にリノレイル(C18)等である。別の態様では、R3およびR4は、異なっており、即ちR3は、ミリスチル(C14)であり、R4は、リノレイル(C18)である。好ましい態様では、本発明のカチオン性脂質は対称性、即ちR3およびR4は、共に同一である。別の好ましい態様では、R3およびR4は、共に少なくとも2つの不飽和部位を含む。いくつかの態様では、R3およびR4は、ドデカジエニル、テトラデカジエニル、ヘキサデカジエニル、リノレイルおよびイコサジエニルから独立に選択される。好ましい態様では、R3およびR4は、共にリノレイルである。いくつかの態様では、R3およびR4は、少なくとも3つの不飽和部位を含み、また独立に、例えばドデカトリエニル、テトラデクトリエニル、ヘキサデカトリエニル、リノレニルおよびイコサトリエニルから選択される。
【００５６】
本明細書に記載の式Ｉおよび式IIのカチオン性脂質は、典型的には、生理学的pHなどの選択されたpHにおいて、正味の正電荷を帯びている。驚くべきことに、複数の不飽和部位、例えば少なくとも2または3つの不飽和部位を持つアルキル鎖を含むカチオン性脂質が、高い膜流動性を有する脂質-核酸粒子の形成にとって特に有効であることが見出されている。多くのカチオン性脂質および関連する類似体は、本発明においても有用であり、同時係属中の米国特許出願第08/316399号；米国特許第5,208,036号、第5,264,618号、第5,279,833号および第5,283,185号、ならびに国際公開公報第WO 96/10390号に記載されている。
【００５７】
追加の適切なカチオン性脂質は、例えばジオクタデシルジメチルアンモニウム (「DODMA」)、ジステアリルジメチルアンモニウム(「DSDMA」)、N,N-ジオレイル-N,N-ジメチルアンモニウムクロリド(「DODAC」); N-(2,3-ジオレイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド(「DOTMA」); N,N-ジステアリル-N,N-臭化ジメチルアンモニウム (「DDAB」); N-(2,3-ジオレオイルオキシ)プロピル)-N,N,N-トリメチルアンモニウムクロリド (「DOTAP」); 3-(N-(N',N'-ジメチルアミノエタン)-カルバモイル)コレステロール(「DC-Chol」)およびN-(1,2-ジミリスチルオキシプロパ-3-イル)-N,N-ジメチル-N-臭化アンモニウムヒドロキシエチル(「DMRIE」)を含む。多数のこれらの脂質および関連する類似体は、本発明においても有用であり、米国特許第5,208,036号、第5,264,618号、第5,279,833号、第5,283,185号、第5,753,613号および第5,785,992号に記載されている。
【００５８】
B.  非カチオン性脂質
本発明に用いる非カチオン性脂質は、安定した複合体を産生できる、様々ある中性の、非荷電性の、双極性またはアニオン性脂質のいずれかであり得る。それらは、好ましくは中性であるが、正または負に耐電していてもよい。本発明に有用である非カチオン性脂質の例としては次のものを含む：レシチン、ホスファチジルエタノールアミン、リゾレシチン、リゾホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピン、ホスファチジン酸、セレブロシデス、ジセチルリン酸、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、ジオレオイルホスファチジルコリン(DOPC)、ジパルミトイルホスファチジルコリン(DPPC)、ジオレオイルホスファチジルグリセロール(DOPG)、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール(DPPG)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、パルミトイルオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン(POPE)およびジオレオイル-ホスファチジルエタノールアミン4-(N-マレイミドメチル)-シクロヘキサン-1-カルボキシラート(DOPE-mal)、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジミリストイルホスホエタノールアミン(DMPE)、ジステアロイル-ホスファチジル-エタノールアミン(DSPE)、16-0-モノメチルPE、16-0-ジメチルPE、18-1-トランスPE、1-ステアロイル-2-オレオイル-ホスファチジエタノールアミン(SOPE)などのリン脂質関連物質。コレステロールなどの非カチオン性脂質またはステロールが存在してもよい。脂質を含んでいる追加の非リン酸は、例えばステアリルアミン、ドデシルアミン、ヘキサデシルアミン、パルミチン酸アセチル、グリセロールリシノール酸、ヘキサデシルステアラート、イソプロピルミリスチン酸、両性アクリルポリマー、トリエタノールアミン硫酸ラウリル、アルキル硫酸アリールポリオキシエチレン脂肪酸アミド、ジオクタデシル臭化ジメチルアンモニウム等、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリンおよびセレブロシデスである。リソホスファチジルコリンおよびリソホスファチジルエタノールアミンのような他の脂質も存在してよい。非カチオン性脂質はさらに、同時係属中の米国特許出願第08/316,429号に記載されている、リン脂質またはセラミド(PEG-Cerと呼ばれる)と複合体を形成するPEG 2000、PEG 5000およびポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコールをベースとしたポリマーも含む。
【００５９】
好ましい態様では、非カチオン性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン(例えばジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリンおよびジリノレオイルホスファチジルコリン)、ジアシルホスファチジルエタノールアミン(例えばジオレオイルホスファチジルエタノールアミンおよびパルミトイルオレオイルホスファチジルエタノールアミン)、セラミドまたはスフィンゴミエリンである。これら脂質のアシル基は、C10〜C24炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基であることが好ましい。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルである。特に好ましい態様では、非カチオン性脂質は、コレステロール、1,2-sn-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、または卵スフィンゴミエリン(ESM)である。
【００６０】
C.  二重層安定化成分
カチオン性および非カチオン性脂質に加えて、本発明のSPLPは、ATTA脂質、または、例えば国際公開公報第第WO 05/026372号に記載のジアルキルオキシプロピルに結合したPEG(PEG-DAA)、例えば米国特許公開第20030077829号および第2005008689号に記載のジアシルグリセロールに結合したPEG(PEG-DAG)、ホスファチジルエタノールアミン(PE)に結合したPEG(PEG-PE)、またはセラミドに複合したPEG、あるいはそれらの混合物(米国特許第5,885,613を参照されたい)などのPEG脂質といった二重層安定化構成成分(BSC)を含む。一つの好ましい態様では、SPLPの凝集を阻止するBSCは、複合脂質である。好適な複合脂質としては、PEG脂質複合体、ATTA脂質複合体、カチオン性ポリマー脂質複合体(CPL)またはそれらの混合物を含むが、これらに限定されない。一つの好ましい態様では、SPLPは、PEG脂質複合体またはATTA脂質複合体のいずれかを、CPLと一緒に含む。
【００６１】
PEGはポリエチレングリコールであり、2つの末端ヒドロキシル基を有する、エチレンPEG反復単位の、直線状の水溶性ポリマーである。PEGは、その分子量に応じて分類されている；例えばPEG 2000は約2,000ダルトンの平均分子量を有しており、PEG 5000は約5,000ダルトンの平均分子量を有している。PEGは、Sigma Chemical Co.およびその他の会社より市販されており、例えば下記を含む：モノメトキシポリエチレングリコール(MePEG-OH)、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシナート(MePEG-S)、モノメトキシポリエチレングリコール-スクシンイミジルスクシナート（(MePEG-S-NHS)、モノメトキシポリエチレングリコール-アミン(MePEG-NH2)、モノメトキシポリエチレングリコール-トレシラート(MePEG-TRES)およびモノメトキシポリエチレングリコール-イミダゾイル-カルボニル(MePEG-IM)。加えて、モノメトキシポリエチレングリコール酢酸(MePEG-CH2COOH)は、例えばPEG-DAA複合体を含むPEG-脂質複合体を調製するのに特に有用である。
【００６２】
好ましい態様では、PEGは、約550ダルトン〜約10,000ダルトン、より好ましくは約750ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,500ダルトン〜約3,000ダルトン、さらにより好ましくは、約2,000ダルトン、または約750ダルトンの平均分子量を有する。PEGは、任意でアルキル、アルコキシ、アシルまたはアリール基で置換できる。PEGは、脂質に直接複合できるか、またはリンカー部分を介して脂質に結合してもよい。使用可能な、脂質へのPEGのカップリングに適した任意のリンカー部分としては、例えば非エステル含有リンカー部分およびエステル含有リンカー部分を含む。好ましい態様では、リンカー部分は非エステル含有リンカー部分である。本明細書で用いる場合、「非エステル含有リンカー成分」という用語は、カルボキシルエステル結合(-OC(O)-)を含まないリンカー部分を指す。好適な非エステル含有リンカー部分としては、アミド(-C(O)NH-)、アミノ(-NR-)、カルボニル(-C(O)-)、カルバメート(-NHC(O)O-)、尿素(-NHC(O)NH-)、ジスルフィド(-S-S-)、エーテル(-O-)、スクシニル(-(O)CCH2CH2C(O)-)、スクシンアミジル(-NHC(O)CH2CH2C(O)NH-)、エーテル、ジスルフィド等、ならびにそれらの組合せ(カルバメートリンカー部分とアミドリンカー部分の両方を含有するリンカーなど)が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様では、カルバメートリンカーを用いて、PEGを脂質に結合する。
【００６３】
別の態様では、エステル含有リンカー部分を用いて、PEGを脂質に結合する。好適なエステル含有リンカー部分としては、例えば、カーボネート(-OC(O)O-)、スクシノイル、リン酸エステル(-O-(O)POH-O-)、スルホネートエステルおよびそれらの組合せを含む。
【００６４】
様々な鎖長および飽和度の、様々なアシル鎖基を有するホスファチジルエタノールアミンを、ポリエチレングリコールに複合させて二重層安定化成分を形成できる。このようなホスファチジルエタノールアミンは市販されているか、または当業者公知の通常の技術を用いて単離または合成できる。C10〜C20の範囲の炭素鎖長を持つ飽和または不飽和脂肪酸を含有するホスファチジルエタノールアミンが好ましい。モノまたはジ不飽和脂肪酸、および飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸との混合物を有するホスファチジルエタノールアミンも用いることができる。好適なホスファチジルエタノールアミンとしては、下記を含むが、これらに限定されない：ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(DMPE)、ジパルミトリルホスファチジルエタノールアミン(DPPE)、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)およびジステアロイルホスファチジルエタノールアミン(DSPE)。
【００６５】
「ATTA」または「ポリアミド」という用語は、米国特許第6,320,017号および第6,586,559号に開示されている化合物を指すが、これらに限定されない。このような化合物としては、下記式を有する化合物を含む：
2008501730.tif 000008
式中、Rは、水素、アルキルおよびアシルからなる群より選択されたメンバーであり；R1は、水素およびアルキルからなる群より選択されるメンバーであるか；または任意で、RおよびR1、ならびにそれらが結合する窒素は、アジド部分を形成し；R2は、水素、任意で置換されているアルキル、任意で置換されているアリール、およびアミノ酸の側鎖から選択さる群のメンバーであり；R3は、水素、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、メルカプト、ヒドラジノ、アミノおよびNR4R5からなる群より選択されるメンバーであり、ここで、R4およびR5は、独立に水素またはアルキルであり；nは、4〜80であり；mは、2〜6であり；pは、1〜4であり；およびqは、0または1である。他のポリアミドが本発明の化合物に使用できることは、当業者には明らかであろう。
【００６６】
「ジアシルグリセロール」という用語は、共にグリセロールの1-および2-位置にエステル結合によって結合した2〜30個の炭素結合を有する、2-脂肪アシル鎖、R1およびR2を有する化合物を指す。アシル基は、飽和しても、または様々な不飽和度を有し得る。ジアシルギリセロールは下記一般式を有する：
2008501730.tif 000009
【００６７】
「ジアルキルオキシプロピル」という用語は、R1およびR2が共に2〜30個の炭素を独立に有する、2-アルキル鎖を有する化合物を指す。アルキル基は飽和しても、または様々な不飽和度を有し得る。ジアルキルオキシプロピルは下記一般式を有する：
2008501730.tif 000010
【００６８】
一つの好ましい態様では、PEG脂質は、下記式を有するPEG-DAA複合体である：
2008501730.tif 000011
【００６９】
式VIでは、R1およびR2は、約10〜22個の炭素原子を有する長鎖アルキル基であり、独立に選択される。長鎖アルキル基は、飽和でも不飽和でもあり得る。好適アルキル基としては、ラウリル(C12)、ミリスチル(C14)、パルミチル(C16)、ステアリル(C18)およびイコシル(C20)を含むが、これらに限定されない。好ましい態様では、R1およびR2は、同一であり、即ちR1とR2は、共にミリスチル(即ちジミリスチル)であるか、R1およびR2は共にステアリル(即ちジステアリル)である。
【００７０】
上記の式VIでは、「R1およびR2」は、独立に選択され、かつ約10〜約20個の炭素原子を有するアルキル基であり；PEGはポリエチレングリコールであり；およびLは上記非エステル含有リンカー部分である。好適なアルキル基としては、ラウリル(C12)、ミリスチル(C14)、パルミチル(C16)、ステアリル(C18)およびイコシル(C20)を含むが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様では；R1およびR2は、同一であり、すなわちそれらは共にミリスチル(C14)であるか、または共にパルミチル(C16)であるか、または共にステアリル(C18)である。好ましい態様では、アルキル基は、飽和している。
【００７１】
上記の式VIでは、「PEG」は、約550ダルトン〜約10,000ダルトン、より好ましくは約750ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,000ダルトン〜約5,000ダルトン、より好ましくは約1,500ダルトン〜約3,000ダルトンの範囲の、および、よりさらに好ましくは約2,000ダルトン、または約750ダルトンの平均分子量を有するポリエチレングリコールである。PEGは、任意でアルキル、アルコキシ、アシルまたはアリールで置換できる。好ましい態様では、末端のヒドロキシル基はメトキシまたはメチル基で置換されている。
【００７２】
上記の式VIでは、「L」は非エステル含有リンカー部分またはエステル含有リンカー部分である。好ましい態様では、Lは非エステル含有リンカー部分である。好適な非エステル含有リンカーとしては、アミドリンカー部分、アミノリンカー部分、カルボニルリンカー部分、カルバメートリンカー部分、尿素リンカー部分、エーテルリンカー部分、ジスルフィドリンカー部分、スクシンアミジルリンカー部分およびそれらの組合せを含むが、それらに限定されるわけではない。好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、カルバメートリンカー部分(すなわち、PEG-C-DAA複合体)である。別の好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、アミドリンカー成分(すなわち、PEG-A-DAA複合体)である。好ましい態様では、非エステル含有リンカー部分は、スクシンアミジイルリンカー部分(すなわちPEG-S-DAA複合体)である。
【００７３】
PEG-DAA複合体は、当業者公知の標準的技術および試薬を用いて合成される。PEG-DAA複合体は、様々なアミド、アミン、エーテル、チオ、カルバメートおよび尿素結合を含有することを認めるだろう。当業者は、これら結合を形成するための方法および試薬が周知であり、容易に利用できることを認めるだろう。例えばMarch, ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY (Wiley 1992), Larock, COMPREHENSIVE ORGANIC TRANSFORMATIONS (VCH 1989);およびFurniss, VOGEL'S TEXTBOOK OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5th ed. (Longman 1989)を参照されたい。さらに、PEG-DAA複合体の合成の様々な時点において、存在する任意の官能基が保護および脱保護を必要とすることがあることも明らかであろう。当業者は、このような技術が周知であると認識するであろう。例えばGreen and Wuts, PROTECTIVE GROUPS IN ORGANIC SYNTHESIS (Wiley 1991)を参照されたい。
【００７４】
好ましい本態様において、PEG-DAA複合体は、ジラウリルオキシプロピル(C12)-PEG複合体、ジミリスチルオキシプロピル(C14)-PEG複合体、ジパルミトイルオキシプロピル(C16)-PEG複合体またはジステリルオキシプロピル(C18)-PEG複合体である。当業者は、本発明のPEG-DAA複合体に、他のジアルキルオキシプロピルを使用できることに容易に理解するだろう。
【００７５】
前記に加えて、PEGの代わりに、他の親水性ポリマーを使用できることも当業者に容易に明らかになるだろう。PEGの代わりに用いることができる好適ポリマーの例としては、ポリビニルピロリドン、ポリメチルオキサゾリン、ポリエチルオキサゾリン、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミド、ポリメタクリルアミドおよびポリジメチルアクリルアミド、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ならびにヒドロキシメチルセルロースもしくはヒドロキシエチルセルロースなどの誘導体化セルロースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７６】
前記成分に加えて、本発明のSNALPおよびSPLPは、脂質二重層に挿入して正電荷を付与するために設計されているカチオン性ポリ(エチレングリコール)(PEG)脂質、またはCPLをさらに含むことができる(Chen, et al., Bioconj. Chem. 11:433-437 (2000)を参照されたい)。本発明での使用、ならびにSPLPおよびSPLP-CPLの作製方法および使用方法での使用のために好適なSPLPおよびSPLP-CPLは、例えば米国特許第6,852,334号および国際公開公報第WO 00/62813号に開示されている。本発明に有用であるカチオン性ポリマー脂質(CPL)は、下記の構造的特徴を有する：(1)脂質二重層内へCPLを組み込むための、疎水性脂質などの脂質アンカー；(2)脂質アンカーをカチオン頭部基に連結するための、ポリエチレングリコールなどの親水性スペーサー；および(3)プロトン化可能なカチオン性頭部基を産生するための、天然のアミノ酸などのポリカチオン性部分。
【００７７】
好適CPLとしては、下記式VIIの化合物を含む：
A-W-Y (VII)
式中、A、WおよびYは、下記の通りである。
【００７８】
式VIIに関しては、「A」は、脂質アンカーとして働く両親媒性脂質、中性脂質または疎水性脂質のような脂質成分である。好適脂質の例としては、小胞形成脂質または小胞採用脂質が挙げられ、かつジアシルグリセロリル、ジアルキルグリセロリル、N-N-ジアルキルアミノ、1,2-ジアシルオキシ-3-アミノプロパンおよび1,2-ジアルキル-3-アミノプロパンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
「W」は、親水性のポリマーまたはオリゴマーなどのポリマーまたはオリゴマーである。好ましくは、親水性ポリマーは、非免疫原性であるか、また固有免疫原性が低い生体適合性ポリマーである。または、親水性ポリマーは、適切なアジュバントと共に使用するのであれば、弱免疫原性であってもよい。好適な非免疫原性ポリマーとしては、PEG、ポリアミド、ポリ酢酸、ポリグリコール酸、ポリ乳酸／ポリグリコール酸コポリマーおよびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい態様では、ポリマーは約250〜約7000ダルトンの分子量を有する。
【００８０】
「Y」はポリカチオン性成分である。ポリカチオン性成分という用語は、選択pHにおいて、好ましくは生理学的pHにおいて、正電荷を、好ましくは少なくとも2つの正電荷を有する化合物、誘導体または官能基を指す。好適ポリカチオン性成分としては、アルギニン、アスパラギン、グルタミン、リジンおよびヒスチジンなどの塩基性アミノ酸およびそれらの誘導体；スペルミン；スペルミジン；カチオン性デンドリマー；ポリアミン；ポリアミン糖；ならびにアミノポリ多糖を含む。ポリカチオン性成分は、直鎖状テトラジンなどの直鎖状構造、枝分かれ構造またはデンドリマー構造であってよい。ポリカチオン性成分は、選択したpH値において、約2〜約15の正電荷、好ましくは約2〜約12の正電荷を、より好ましくは約2〜約8の正電荷を有する。どのポリカチオン性成分を使用するかの選択は、所望するリポソーム応用のタイプによって決まるだろう。
【００８１】
ポリカチオン性成分の電荷は、リポソーム成分全体に分布しても、またはリポソーム成分のある特定領域への電荷密度の散在的な集中、例えば電荷スパイクのいずれでもよい。電荷密度がリポソーム上に分布する場合は、電荷密度は均等または不均等に分布し得る。ポリカチオン性成分の電荷分布の全ての変形が、本発明に包含される。
【００８２】
脂質「A」と非免疫原性ポリマー「W」とは、様々な方法によって、好ましくは共有結合によって結合できる。「A」と「W」の共有結合には、当業者公知の方法を用いることができる。好適な結合法としては、アミド、アミン、カルボキシル、カーボネート、カルバメート、エステルおよびヒドラゾン結合が挙げられるが、これらに限定されない。「A」および「W」が結合を遂行するための必須の相補的官能基を有していることが当業者には明らかであろう。これら2つの基、即ち脂質側の基とポリマー側の基との反応により、所望する結合が提供される。例えば脂質がジアシルグリセロールであり、かつ末端のヒドロキシルを、例えばNHSおよびDCCで活性化して活性エステルを形成し、次にアミノ基を含有するポリマー、ポリアミドなどと反応させる場合(米国特許第6,320,017号および第6,586,559号を参照されたい)、2つの基の間にはアミド結合が形成される。
【００８３】
ある例では、ポリカチオン性成分は、標的化リガンドなどのリガンドを付着するか、またはカルシウムを錯体化するためのキレート成分を持つことができる。リガンドを付着した後、カチオン性成分は正電荷を維持することが好ましい。ある例では、付着するリガンドは正電荷を有する。好適リガンドとしては、反応性官能基を有する化合物または素子を含み、かつ脂質、両親媒性脂質、キャリア化合物、生体親和性化合物、生体材料、生体ポリマー、生物医学的素子、分析可能な化合物、治療活性化合物、酵素、ペプチド、タンパク質、抗体、免疫賦活性剤、放射線標識、蛍光物質、ビオチン、薬物、ハプテン、DNA、RNA、多糖、リポソーム、ビロソーム、ミセル、免疫グロブリン、官能基、その他標的化成分、または毒素を含むが、これらに限定されない。
【００８４】
D.  核酸成分
本発明の核酸成分は、関心対象の遺伝子の発現をサイレンシングする(例えば部分的または完全に阻止する)干渉RNAを含む。干渉RNAは、複数の形態で提供できる。例えば、干渉RNAは、一または複数の単離された低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖、より長い二本鎖RNA(dsRNA)またはDNAプラスミド内の転写カセットから転写されたsiRNAもしくはdsRNAとして提供できる。干渉RNAは、単独で、または関心対象の遺伝子と関連する疾患または障害の治療に用いられる通常薬物の投与と組み合わせて投与できる。関心対象の遺伝子としては、ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子、肝臓および腎臓の疾患および障害と関連する遺伝子、腫瘍形成および細胞の形質転換と関連する遺伝子、血管形成遺伝子、炎症および自己免疫応答に関連する遺伝子などの免疫調節遺伝子、リガンドレセプター遺伝子、ならびに神経退行障害に関連する遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００８５】
1.  siRNA配列の選択
好適なsiRNA配列は、当技術分野において周知の任意の手段を使用して同定され得る。典型的には、Elbashirら、Nature 411:494-498 (2001)およびElbashirら、EMBO J 20:6877-6888 (2001)に記載された方法を、ReynoldsらNature Biotech. 22 (3):326-330 (2004)に説明された合理的設計規則と組み合わせる。
【００８６】
典型的には、関心対象の標的遺伝子転写物の開始コドンAUGの3'側、約50〜約100ヌクレオチド内の配列を、ジヌクレオチド配列(例えばAA、CC、GGまたはUU)について細かく調べる(例えばElbashir, et al., EMBO J 20: 6877-6888 (2001)を参照されたい)。ジヌクレオチド配列の3'側直近のヌクレオチドは、潜在的siRNA標的配列と同定される。典型的には、ジヌクレオチド配列の3'側直近の19、21、23、25、27、29、31、33、35またはそれ以上のヌクレオチドは、潜在的siRNA標的部位と同定される。いくつかの態様では、ジヌクレオチド配列は、AA配列であり、AAジヌクレオチドの3'側直近の19ヌクレオチドは、潜在的siRNA標的部位と同定される。典型的なsiRNA標的部位は、標的遺伝子の全長上の様々な位置に間隔を開けて存在する。siRNA配列のサイレンシング効率をさらに高めるために、潜在的siRNA標的部位をさらに分析し、他のコーディング配列と相同的な領域を含有しない部位を同定してもよい。例えば、約21塩基対の好適なsiRNA標的部位は、典型的には、16〜17より長い、他のコーディング配列と相同的である連続塩基対を有することはない。siRNA配列をRNA Pol IIIプロモータから発現させなければならない場合には、4つより多い連続するAまたはTを持たないsiRNA標的配列を選択する。
【００８７】
ひとたび潜在的siRNA標的部位が同定されたならば、siRNA標的部位に相補的なsiRNA配列を設計してもよい。それらのサイレンシング効率を上げるために、siRNA配列を、合理的に設計アルゴリズムによって分析し、下記の特徴の一つまたはそれ以上を有する配列を同定してもよい：(1)約25%〜約60%G/CのG/C含有量；(2)センス鎖の位置15〜19の少なくとも3つがA/U；(3)内部反復がない；(4)センス鎖の位置19がA；(5)センス鎖の位置3がA；(6)センス鎖の位置10がU；(7)センス鎖の位置19がG/Cでない；および(8)センス鎖の位置13がGでない。これら各特徴の好適値を割り当てるアルゴリズムを組み込み、かつsiRNAの選択に有用である、siRNA設計ツールは、例えばhttp://boz094.ust.hk/RNAi/siRNAに見いだすことができる。
【００８８】
いくつかの態様では、ひとたび潜在的siRNA配列が同定されたならば、配列は、例えば2004年7月2日出願の同時係属の米国仮特許出願第60/585301号；2004年7月19日出願の第60/589363号；2004年11月12日出願の第60/627326号；および2005年3月25日出願の60/665297号に記載されているように、免疫賦活性モティーフ（例えば、GU-リッチモティーフ）の有無のために分析される。ひとたび特定されれば、免疫賦活性siRNA分子を修飾し、それらの免疫賦活性特性を増減すること、および非免疫賦活性分子をそれらが免疫賦活性特性を有するように修飾できる。
【００８９】
siRNAの生成
siRNAは、例えば一または複数の、単離された低分子干渉RNA(siRNA)二重鎖、より長い二本鎖RNA(dsRNA)などの、またはDNAプラスミド内の転写カセットから転写されたsiRNAまたはdsRNAのような形を含む、複数の形で提供できる。siRNAは、化学的に合成してもよい。好ましくは合成または転写されたsiRNAは、約1〜4ヌクレオチド、好ましくは約2〜3ヌクレオチドの3'オーバーハング、および5'リン酸基末端を有する。siRNA配列は、オーバーハングを有しても(例えば(Elbashir et al., Genes Dev. 15:188 (2001); Nykanen, et al., Cell 107:309 (2001)に記載の3'または5'オーバーハング)、あるいはオーバーハングを欠いてもよい(即ち、平滑末端を有する)。
【００９０】
RNA集団を用いて、長い前駆体RNAを提供すること、または選択した標的配列と実質的な、または完全な同一性を有する長い前駆体RNAを用いてsiRNAを作ることができる。RNAは、当業者周知の方法に従って、細胞もしくは組織から単離、合成、および／またはクローニングできる。RNAは混合集団(細胞もしくは組織から得る、cDNAから転写する、サブトラクトする、選択等)であり得、または単一の標的配列を表し得る。RNAは天然に存在する(例えば組織もしくは細胞サンプルより単離した)、インビトロ合成(例えばT7もしくはSP6ポリメラーゼ、およびPCR産物もしくはクローニングしたcDNAを用いた)；あるいは化学的に合成できる。
【００９１】
長いdsRNAを形成するには、合成RNAの場合、同様に相補体もインビトロ合成し、ハイブリダイズしてdsRNAを形成する。天然のRNA集団を用いる場合は、例えばRNA集団に対応するcDNAを転写するか、またはRNAポリメラーゼを用いることによって、RNA相補体も提供される(例えば、大腸菌(E. coli) RNAse IIIまたはダイサー(Dicer)による消化のためのdsRNAを形成する)。次に前駆体RNAをハイブリダイズし、消化のための二本鎖RNAを形成する。dsRNAは、被検体に直接投与でき、または投与前にインビトロで消化してもよい。
【００９２】
または、一または複数のsiRNA鋳型をコードする、一または複数のDNAプラスミドを用いてsiRNAを提供する。siRNAは、RNAポリメラーゼIII転写ユニットを有するプラスミド内にて、例えば小核RNA U6またはヒトRNase P RNA H1の天然の転写ユニットに基づいて、DNA鋳型から、ヘアピンループを持った二重鎖に自動的に折りたたまれる配列として転写できる(Brummelkamp, et al., Science 296:550 (2002); Donze, et al., Nucleic Acids Res. 30:e46 (2002); Paddison, et al., Genes Dev. 16:948 (2002); Yu, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99:6047 (2002); Lee, et al., Nat. Biotech. 20:500 (2002); Miyagishi, et al., Nat. Biotech. 20:497 (2002); Paul, et al., Nat. Biotech. 20:505 (2002); and Sui, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 99:5515 (2002)を参照されたい)。典型的には、転写ユニットまたはカセットは、所望のsiRNA配列の転写のための鋳型と作動可能に連結したH1-RNAまたはU6プロモータなどのRNA転写プロモータ配列、ならびに2〜3個のウリジン残基およびポリチミジン(T5)配列(ポリアデニル化シグナル)を含む終止配列を含むであろう(前記、Brummelkamp, Science)。選択したプロモータは、構成的または誘導的転写体に提供できる。RNA干渉分子のDNA定方向転写のための組成物および方法は、米国特許第6,573,099号に詳しく記載されている。転写ユニットは、プラスミドまたはDNAベクター内に組み入れられ、そこから干渉RNAは転写される。治療目的のための遺伝物質のインビボ送達に好適なプラスミドは、米国特許第5,962,428号および第5,910,488号に詳しく記載されている。選択したプラスミドは、標的細胞の一過的または安定的送達のために提供できる。元来、所望遺伝子配列を発現させるために設計されたプラスミドを変更し、siRNAの転写のための転写単位カセットを含有させることができる。
【００９３】
RNAを単離する方法、RNAを合成する方法、核酸をハイブリダイズする方法、cDNAライブラリを作製しかつスクリーニングする方法、およびPCRを実施する方法は、当技術分野において周知である(例えば、Gubler & Hoffman, Gene 25:263-269 (1983); 前記、Sambrook et al.; 前記、Ausubel et al.を参照されたい)、PCR方法に関しては同様に当技術分野において周知である(米国特許第4,683,195号および第4,683,202号; PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Innis et al., eds,1990)を参照されたい)。発現ライブラリは、また、当業者にとって周知である。本発明において使用する一般法を開示している追加の基本教本は、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990);およびCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds., 1994))を含む。
【００９４】
好適プラスミドは、関心対象の遺伝子産物の部分長配列または全長配列をコードする鋳型配列を、発現可能な形で含むように遺伝子工学的に作られる。鋳型配列は、単離された、または合成されたsiRNAおよびdsRNAを提供するのにも用いることができる。一般的には、関心対象の遺伝子産物の転写および翻訳をダウンレギュレートすること、またはサイレンシングすることが望まれる。
【００９５】
関心対象の遺伝子
関心対象の遺伝子としては、ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子、代謝性疾患および障害(例えば肝臓の疾患および障害)と関連する遺伝子、腫瘍形成および細胞の形質転換と関連する遺伝子、血管形成遺伝子、炎症および自己免疫応答に関連する遺伝子のような免疫調節遺伝子、リガンドレセプター遺伝子、ならびに神経退行障害に関連する遺伝子を含むが、これらに限定されない。
【００９６】
ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子
ウイルスの感染および生存に関連する遺伝子としては、細胞に結合し、その中に侵入して複製するために、ウイルスが発現する遺伝子を含むが、これらに限定されない。特に関心の高いものは、慢性ウイルス疾患に関連するウイルス配列である。特に関心の高いウイルス配列としては、肝炎ウイルスの配列(Hamasaki, et al., FEBS Lett. 543:51 (2003); Yokota, et al., EMBO Rep. 4:602(2003); Schlomai, et al., Hepatology 37:764 (2003); Wilson, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100:2783 (2003); Kapadia, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100:2014 (2003); およびFIELDS VIROLOGY (Knipe et al. eds. 2001))、ヒト免疫不全ウイルス(HIV) (Banerjea, et al., Mol. Ther. 8:62 (2003); Song, et al., J. Virol. 77:7174 (2003); Stephenson JAMA 289:1494 (2003); Qin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 100:183 (2003))、ヘルペスウイルス(Jia, et al., J. Virol. 77:3301 (2003))、ならびにヒト乳頭腫ウィルス(HPV) (Hall, et al., J. Virol. 77:6066 (2003); Jiang, et al., Oncogene 21:6041 (2002))を含む。サイレンシングできる例示的な肝炎ウイルス核酸配列としては、転写および翻訳に関与する核酸配列(例えばEn1、En2、X、P)、構造タンパク質(例えばCおよびC関連タンパク質；カプシドならびにS、M、および／もしくはLタンパク質を含むエンベロープタンパク質、またはその断片)をコードする核酸配列(例えば、前記、FIELDS VIROLOGY, 2001を参照されたい)。サイレンシング可能な例示的なC型肝炎核酸配列としては：セリンプロテアーゼ(例えばNS3/NS4)、ヘリカーゼ(例えばNS3)、ポリメラーゼ(例えばNS5B)ならびにエンベロープタンパク質(例えばE1、E2およびp7)を含むが、これらに限定されない。A型肝炎核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_001489に記載されている；B型肝炎ウイルス核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_003977に記載されている；C型肝炎ウイルス核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_004102に記載されている；D型肝炎ウイルス核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_001653に記載されている；E型肝炎ウイルス核酸配列は、例えばGenbankアクセッション番号NC_001434に記載されている；およびG型肝炎ウイルス核酸配列は、Genbankアクセッション番号NC_001710に記載されている。
【００９７】
代謝性疾患および障害に関連する遺伝子
代謝性疾患および障害(例えば肝臓が標的となる障害、ならびに肝疾患および障害)に関連する遺伝子としては、例えば異脂肪血症(例えば肝臓Xレセプター(例えばLXRαおよびLXRβ Genbankアクセッション番号 NM_007121)、ファルネソイドXレセプター(FXR)(GenbankアクセッションNM_005123、ステロール調節エレメント結合タンパク質(SREBP)、Site-1プロテアーゼ(S1P)、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素A還元酵素(HMG補酵素A還元酵素)、アポリポプロテイン(ApoB)、およびアポリポプロテイン(ApoE))、ならびに糖尿病(例えばグルコース6-ホスファターゼ)で発現している、例えば遺伝子を含む(例えば、Forman et al., Cell 81:687 (1995); Seol et al., Mol. Endocrinol. 9:72 (1995), Zavacki et al., PNAS USA 94:7909 (1997); Sakai, et al., Cell 85:1037-1046 (1996); Duncan, et al., J. Biol. Chem. 272:12778-12785 (1997); ,Willy, et al., Genes Dev. 9(9):1033-45 (1995); Lehmann, et al., J. Biol. Chem. 272(6):3137-3140 Janowski, et al., Nature 383:728-731 (1996); Peet, et al., Cell 93:693-704 (1998)を参照されたい)。当業者は、代謝性疾患および障害(例えば肝臓が標的となる障害、ならびに肝疾患および障害)が、肝臓自体で発現している遺伝子だけでなく、他の器官および組織で発現している遺伝子も含むことに気づくだろう。
【００９８】
腫瘍形成に関連する遺伝子
腫瘍形成および細胞形質転換に関連する遺伝子配列の例は、下記を含む：MLL融合遺伝子、BCR-ABL(Wilda, et al., Oncogene, 21:5716 (2002); Scherr, et al., Blood 101:1566)、TEL-AML1、EWS-FLI1、TLS-FUS、PAX3-FKHR、BCL-2、AML1-ETOおよびAML1-MTG8 (Heidenreich, et al., Blood 101:3157 (2003))などの転座配列； 多剤耐性遺伝子(Nieth, et al., FEBS Lett. 545:144 (2003); Wu, et al, Cancer Res. 63:1515 (2003))、サイクリン(Li, et al., Cancer Res. 63:3593 (2003); Zou, et al., Genes Dev. 16:2923 (2002))、β-カテニン(Verma, et al., Clin Cancer Res. 9:1291(2003))、テロメラーゼ遺伝子(Kosciolek, et al., Mol Cancer Ther. 2:209 (2003))、c-MYC、N-MYC、BCL-2、ERBB1およびERBB2 (Nagy, et al. Exp. Cell Res. 285:39 (2003))などの過剰発現配列；ならびにRAS(Tuschl and Borkhardt, Mol. Interventions, 2:158 (2002)に概説されている)などの変異配列。例えば、DNA修復酵素をコードする配列のサイレンシングは、化学療法薬の投与と組み合わせて用いられる(Collins, et al., Cancer Res. 63:1550 (2003))。腫瘍移動と関連するタンパク質をコードする遺伝子もまた、関心対象の標的配列であり、例えばインテグリン、セクレンおよび金属プロテアーゼである。前記の例は限定的ではない。腫瘍形成または細胞の形質転換、腫瘍の増殖あるいは腫瘍の移動を容易にし、または促進する遺伝子の任意の全配列または部分配列も、関心対象の遺伝子配列に含めることができる。
【００９９】
血管形成／抗血管形成遺伝子
血管形成遺伝子は、新規の血管の形成を促進できる。特に関心の対象となるものは、血管内皮成長因子(VEGF) (Reich, et al., Mol. Vis. 9:210 (2003))またはVEGFrである。VEGFrを標的とするsiRNA配列は、例えば、英国特許第2396864号；米国特許公開第20040142895号；およびカナダ特許第2456444号に記載されている。
【０１００】
抗血管形成遺伝子は、新規の血管形成を阻止できる。これら遺伝子は、血管形成が疾患の病理的発生に役割を果たしている癌の治療に特に有用である。抗血管形成遺伝子の例は、エンドスタチン(例えば米国特許第6,174,861号を参照されたい)、アンジオスタチン(例えば米国特許第5,639,725号を参照されたい)およびVEGF-R2(例えばDecaussin et al. (1999) J. Pathol. 188(4): 369-737を参照されたい)を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
免疫調節遺伝子
免疫調節遺伝子は、一または複数の免疫応答を調節する遺伝子である。免疫調節遺伝子の例としては、成長因子(例えばTGF-α、TGF-β、EGF、FGF、IGF、NGF、PDGF、CGF、GM-CSF、SCF等)、インターロイキン(例えばIL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-20等)、インターフェロン(例えばIFN-α、IFN-β、IFN-γ等)、TNF(例えばTNF-α)およびFlt3-リガンドなどのサイトカインを含む。FasおよびFasリガンド遺伝子もまた関心対象の免疫調節標的配列である(Song, et al., Nat. Med. 9:347 (2003))。造血細胞およびリンパ細胞の二次シグナル伝達分子をコードする遺伝子もまたは本発明に含まれ、例えばブルトンのチロシンキナーゼ(Btk)のようなTecファミリーキナーゼがある(Heinonen, et al., FEBS Lett. 527:274(2002))。
【０１０２】
細胞レセプターリガンド
細胞レセプターリガンドとしては、細胞表面レセプター(例えばインスリンレセプター、EPOレセプター、G-タンパク質共役レセプター、チロシンキナーゼ活性を有するレセプター、サイトカインレセプター、成長因子レセプター等)に結合し、レセプターが関与する生理学的経路(例えばグルコースレベル調節、血液細胞の発生、有糸分裂誘発等)を調節(例えば阻害する、活性化する等)できるリガンドを含む。細胞レセプターリガンドの例としては、サイトカイン、成長因子、インターロイキン、インターフェロン、エリスロポイエチン(EPO)、インスリン、グルカゴン、Gタンパク質共役レセプターリガンド等が挙げられる。トリヌクレオチドリピート(例えばCAGリピート)拡張部をコードする鋳型は、脊髄延髄性筋萎縮症およびハンチントン病などのトリヌクレオチドリピート拡張部が引き起こす神経退行性障害での病原配列のサイレンシングに用いることができる(Caplen et al., Hum. Mol. Genet. 11:175 (2002))。
【０１０３】
腫瘍抑制遺伝子
腫瘍抑制遺伝子とは、細胞、特に腫瘍細胞の増殖を阻止できる遺伝子である。それゆえに、腫瘍細胞へのこれら遺伝子の送達は、癌の治療に有用である。腫瘍抑制遺伝子としては、p53 (Lamb et al., Mol. Cell. Biol. 6:1379-1385 (1986), Ewen et al., Science 255:85-87 (1992), Ewen et al. (1991) Cell 66:1155-1164, and Hu et al., EMBO J. 9:1147-1155(1990))、RB1 (Toguchida et al. (1993) Genomics 17:535-543)、WT1 (Hastie, N. D., Curr. Opin. Genet. Dev. 3:408-413 (1993))、NF1 (Trofatter et al., Cell 72:791-800 (1993), Cawthon et al., Cell 62:193-201 (1990))、VHL (Latif et al., Science 260:1317-1320 (1993))、APC (Gorden et al., Cell 66:589-600 (1991))、DAPキナーゼ(例えばDiess et al. (1995) Genes Dev. 9:15-30を参照されたい)、p16 (例えばMarx (1994) Science 264 (5167):1846を参照されたい）、ARF (例えばQuelle et al. (1995) Cell 83(6):993-1000を参照されたい)、ニューロフィブロミン(例えばHuynh et al. (1992) Neurosci. Lett. 143(1-2):233-236を参照されたい)ならびにPTEN (例えばLi et al. (1997) Science 275 (5308):1943-1947を参照されたい)が含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
SNALPの調製
本発明は、プラスミドまたはその他の核酸を脂質二重層に封入し、分解から保護する、血清安定核酸脂質粒子を調製する方法を提供する。本発明の方法で作成した粒子は、典型的には約50nm〜約150nm、より典型的には約100nm〜約130nm、最も典型的には約110nmから約115nmの大きさを有する。粒子は、連続混合法、界面活性剤透析法、または有機溶媒を利用し、成分混合中に単相を提供する逆相法の改良法を含むが、これに限定されない本技術分野で公知の任意の方法によって形成できる。
【０１０５】
好ましい態様では、カチオン性脂質は式IおよびIIの脂質、あるいはその組み合わせである。別の好ましい態様では、非カチオン性脂質は、ESM、DOPE、DOPC、DPPE、DMPE、16:0 モノメチルホスファチジルエタノールアミン、16:0 ジメチルホスファチジルエタノールアミン、18:1 トランスホスファチジルエタノールアミン、18:0 18:1 ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)、16:0 18:1 ホスファチジルエタノールアミン、DSPE、ポリエチレングリコールをベースとしたポリマー(例えばPEG 2000、PEG 5000、PEG修飾ジアシルグリセロール、またはPEG修飾ジアルキルオキシプロピル)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール、あるいはそれらの組み合わせである。さらに別の態様では、有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテル、またはそれらの組み合わせである。
【０１０６】
特に好ましい態様では、核酸はプラスミドである；カチオン性脂質は、式IまたはIIの脂質、あるいはそれらの組み合わせである；非カチオン性脂質はESM、DOPE、PEG-DAA、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロール、またはそれらの組み合わせ(例えばDSPCおよびPEG-DAA)；ならびに有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテルまたはそれらの組み合わせである。
【０１０７】
特に好ましい態様では、本発明は連続混合法によって、例えば下記の段階を含む工程によって、産生された核酸脂質粒子を提供する：siRNAなどの核酸もしくはプラスミドを含む水溶液を第一容器に提供する段階、および第二容器に有機脂質溶液を提供する段階、ならびに実質的に即時に核酸(例えばsiRNA)を封入したリポソームを産生するために有機脂質溶液が水溶液と混合するように、水溶液と有機脂質溶液とを混合する段階。この工程およびこの工程を実施するための装置は、米国特許公開第20040142025号に詳しく記載されている。
【０１０８】
脂質および緩衝液を、混合チャンバーのような混合環境に連続的に導入する作業によって、脂質溶液は緩衝液により連続的に希釈され、それによって、リポソームは混合時に、実質的に即時に作られる。本明細書で用いる場合、「緩衝液による脂質溶液の連続的希釈」(および、その変形)という句は、一般的に脂質溶液が水和工程中に、十分な速さで、十分な力によって希釈され、効率的に小胞を形成することを意味する。核酸を含む水溶液を、有機脂質溶液と混合することによって、有機脂質溶液は、緩衝液(即ち水溶液)が存在する状態で、連続段階的希釈を受け、核酸脂質粒子を作る。
【０１０９】
連続混合法を用いて形成された血清安定核酸脂質粒子は、典型的には、約50nmから約150nm、より典型的には約100nm〜約130nm、最も典型的には約110nmから約115nmの大きさを有する。こうして形成した粒子は凝集せず、場合によっては分粒し、均一な粒子サイズを達成する。
【０１１０】
いくつかの態様では、粒子は界面活性剤透析を用いて形成される。任意の特定の形成メカニズムと結びつける意図なしに、プラスミドまたはその他核酸(例えばsiRNA)をカチオン性脂質の界面活性剤溶液と接触させ、被覆核酸複合体を形成する。これら被覆核酸は凝集および沈殿することがある。しかしながら、界面活性剤の存在がこの凝集を減らし、被覆核酸と過剰な脂質(典型的には非カチオン性脂質)との反応を可能にし、プラスミドまたはその他核酸が脂質二重層内に封入されている粒子を形成させる。従って、本発明は、下記の段階を含む、血清安定核酸脂質粒子の調製法を提供する：
(a)界面活性剤溶液中で核酸とカチオン性脂質を合わせ、被覆核酸脂質複合体を形成する段階；
(b)非カチオン性脂質を被覆核酸脂質複合体と接触させて、核酸脂質複合体および非カチオン性脂質を含む界面活性剤溶液を形成する段階；ならびに
(c)段階(b)の界面活性剤溶液を希釈して、核酸が脂質二重層内に封入されており、粒子が血清安定的であり、かつ約50〜約150nmの大きさを有する血清安定核酸脂質粒子の溶液を提供する段階。
【０１１１】
被覆核酸脂質複合体の初期溶液は、核酸とカチオン性脂質とを界面活性剤溶液中で合わせることによって形成される。
【０１１２】
これらの態様では、界面活性剤溶液は、好ましくは、臨界ミセル濃度15〜300mM、より好ましくは20〜50mMを有する中性界面活性剤の水溶液である。好適な界面活性剤の例としては、例えばN,N'-((オクタノイルイミノ)-ビス-(トリメチレン))-ビス-(D-グルコンアミド)(BIGCHAP)；BRIJ 35；デオキシ-BIGCHAP；ドデシルポリ(エチレングリコール)エーテル、Tween 20；Tween 40；Tween 60；Tween 80；Tween 85；Mega 8；Mega 9；Zwittergent(登録商標)3-08；Zwittergent(登録商標)3-10；Triton X-405；ヘキシル-、ヘプチル-、オクチル-およびノニル-β-D-グルコピラノシド；ならびにヘプチルチオグルコピラノシドを含み；このうちオクチルβ-D-グルコピラノシドおよびTween-20が最も好ましい。界面活性剤溶液中の界面活性剤の濃度は、典型的には約100mM〜約2M、好ましくは約200mM〜約1.5Mである。
【０１１３】
カチオン性脂質および核酸は、典型的には、合わせて約1:1〜約20:1、好ましくは約1:1〜約12:1、およびより好ましくは約2:1〜約6:1の電荷比(+/-)を産生する。これに加えて、溶液中の核酸の全濃度は、典型的には、約25μg/mL〜約1mg/mL、好ましくは約25μg/mL〜約200μg/mLであり、より好ましくは約50μg/mL〜約100μg/mLである。界面活性剤溶液中の核酸およびカチオン性脂質の組み合わせは、被覆複合体の形成にとって十分である期間、典型的には室温で維持される。または、核酸およびカチオン性脂質は、界面活性剤溶液の中で合わせ、約37℃までの温度に温めることができる。温度に特に感受性である核酸の場合は、被覆複合体は、低温、典型的には約4℃までの温度で形成できる。
【０１１４】
好ましい態様では、形成された核酸脂質粒子内の脂質に対する核酸の比率(質量／質量比)は、約0.01〜約0.08の範囲であろう。原料の比率も、典型的には精製段階で未封入核酸ならびに空のリポソームが除去されることから、この範囲内にはいる。別の好ましい態様では、核酸脂質粒子調製は、全脂質10mg当たり役400μgの核酸を用いるか、または約0.01〜約0.08の、より好ましくは約0.04の対脂質核酸比を用いるが、これは核酸50μg当たり、総脂質1.25mgに相当する。
【０１１５】
次に、被覆核酸脂質複合体の界面活性剤溶液は非カチオン性脂質と接触させられ、核酸脂質複合体および非カチオン性脂質の界面活性剤溶液を提供する。この段階に有用な非カチオン性脂質としては、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミド、スフィンゴミエリン、セファリン、カルジオリピンおよびセレブロシドが挙げられる。好ましい態様では、非カチオン性脂質は、ジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、セラミドまたはスフィンゴミエリンである。これら脂質のアシル基は、C10〜C24炭素鎖を有する脂肪酸に由来するアシル基であることが好ましい。より好ましくは、アシル基は、ラウロイル、ミリストイル、パルミトイル、ステアロイルまたはオレオイルである。特に好ましい態様では、非カチオン性脂質は、1,2-sn-ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)、パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン(POPC)、卵ホスファチジルコリン(EPC)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、コレステロールまたはそれらの混合物である。最も好ましい態様では、核酸脂質粒子は、インビボでの特性を高めた融合性粒子であり、非カチオン性脂質はDSPCまたはDOPEであろう。これに加えて、本発明の核酸脂質粒子は、コレステロールを更に含むことができる。別の好ましい態様では、非カチオン性脂質は、米国特許第5,820,873号および米国特許公開第20030077829号に記載されている、ジアシルグリセロール、セラミドもしくはリン脂質と複合したPEG 2000、PEG 5000およびポリエチレングリコールなどのポリエチレングリコールをベースとするポリマーを更に含むだろう。更に好ましい態様では、非カチオン性脂質は、ジアルキルオキシプロピルに複合したPEG 2000、PEG 5000およびポリエチレングリコールなどの、ポリエチレングリコールをベースとしたポリマーを更に含むだろう。
【０１１６】
本方法で使用する非カチオン性脂質の量は、典型的には核酸50μg当たり、総脂質で約2〜約20mgである。好ましくは、総脂質量は約5〜約10mg/50μg核酸である。
【０１１７】
核酸脂質複合体および非カチオン性脂質の界面活性剤溶液の形成に続いて、界面活性剤は、好ましくは透析によって取り除かれる。界面活性剤の除去により、脂質二重層の形成が起こり、これが核酸を取り囲み、約50nm〜約150nm、より典型的には約100nm〜約130nm、最も典型的には約110〜約115nmの大きさを持つ血清安定核酸脂質粒子を提供する。こうして形成された粒子は凝集せず、場合によっては分粒し、均一な粒子サイズを得る。
【０１１８】
血清安定核酸脂質粒子は、リポソームの分粒に利用できる任意の方法によって分粒できる。分粒は、所望のサイズ範囲および比較的狭い粒子サイズ分布を得るために実施してもよい。
【０１１９】
粒子の所望サイズへの分粒には、複数の技術が利用可能である。リポソームに使用され、かつ本発明の粒子へ応用可能な一つの分粒方法は、米国特許第4,737,323号に記載されている。水槽またはプローブ超音波のいずれかによって粒子懸濁液を超音波処理することで、約50nm未満の大きさの粒子を産生することができる。均質化は、剪断エネルギーによって大型の粒子をより小さな粒子に断片化する別の方法である。典型的な均質化手順では、粒子は、選択した粒子サイズ、典型的には約60〜80nmが観察されるまで、標準的なエマルジョンホモジェニナイザーに繰り返しかけられる。両方法では、粒子サイズ分布は、通常のレーザー光線粒子サイズ測定またはQELSによってモニタリングできる。
【０１２０】
粒子を小口径のポリカーボネート膜または非対称セラミック膜を通し押し出すことも、比較的よく画定されたサイズ分布に粒子サイズを減少させるのに有効な方法である。典型的には、懸濁液は、所望の粒子サイズ分布が得られるまで、一または複数回膜を循環させる。粒子は、連続的に口径が小さくなる膜を通して、押し出し、サイズを段階的に減少させることを達成してもよい。
【０１２１】
別の一群の態様では、本発明は、次の段階を含む、血清安定核酸脂質粒子の調製方法を提供する：
(a)有機溶媒中のカチオン性脂質および非カチオン性脂質を含む混合液を調製する段階；
(b)核酸の水溶液を、段階(a)の該混合液と接触させて、清澄な単相を提供する段階；ならびに
(c)該有機溶媒を除去して、該核酸が脂質二重層に封入されており、かつ該粒子が血清安定でかつ約50〜約150nmの大きさを有する核酸脂質粒子の懸濁液を提供する段階。
【０１２２】
本態様の群において有用である核酸(またはプラスミド)、カチオン性脂質、および非カチオン性脂質は、上記界面活性剤透析法に関し記載されたものと同じである。
【０１２３】
有機溶媒の選択では、典型的には、溶媒の極性および粒子形成の後半段階での除去可能の容易さを考慮するであろう。可溶化剤としても用いられる有機溶媒は、核酸および脂質の、清澄な単相混合液を提供するのに十分な量で存在する。適切な溶媒は、クロロホルム、ジクロロメタン、ジエチルエーテル、シクロヘキサン、シクロペンタン、ベンゼン、トルエン、メタノール、またはプロパノール、イソプロパノール、ブタノール、tert-ブタノール、イソブタノール、ペンタノールおよびヘキサノールなどの他の脂肪族アルコールを含むが、これらに限定されない。二つまたはそれ以上の溶媒の組合せも、本発明において使われてもよい。
【０１２４】
核酸とカチオン性および非カチオン性脂質の有機溶液との接触は、典型的には水溶液である核酸の第一溶液と、脂質の第二有機溶液とを一緒に混合することによって成し遂げられる。当業者は、この混合が、任意の、様々な方法、例えばボルテックスミキサーを用いるような機械的手段によって実施できることを了解するだろう。
【０１２５】
核酸を脂質有機溶液に接触させた後、有機溶媒を除去し、それにより血清安定核酸脂質粒子の水性懸濁液が形成される。有機溶媒を除去するのに用いる方法としては、典型的なものでは、減圧による蒸発または不活性ガス(例えば窒素もしくはアルゴン)の混合液への吹き込みが挙げられる。
【０１２６】
こうして形成された血清安定核酸脂質粒子は、典型的には、約50nmから約150nm、より典型的には約100nmから約130nm、最も典型的には約110nmから115nmに分粒される。さらにサイズを減少させるか、または粒子のサイズを均一化するために、上記のような分粒を実施できる。
【０１２７】
別の態様では、方法はさらに、本組成物を用いる細胞への送達の遂行に有用である非脂質ポリカチオンを含むだろう。好適な非脂質ポリカチオンの例としては、ヘキサジメトリンブロミド(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USAより商品名POLYBRENE(登録商標)で販売されている)またはその他のヘキサジメトリンの塩が含むが、これらに限定されない。その他の好適ポリカチオンとしては、例えばポリ-L-オルニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミンの塩を含む。
【０１２８】
ある態様では、核酸脂質粒子の形成は、単相系(例えばBligh and Dyer単相、または水性溶媒および有機溶媒の混合物)あるいは二相系のいずれかにおいて、好適に混合されることで実施できる。
【０１２９】
複合体の形成を単相系で行う場合は、カチオン性脂質および核酸は、それぞれある量の単相系に溶解される。二つの溶液を合わせて単一の混合液とし、この中で複合体が形成される。または、複合体は、カチオン性脂質が核酸(水相に存在する)に結合し、それを有機相に「引き込む」二相系で形成することもできる。
【０１３０】
別の態様では、本発明は、下記の段階を含む、血清安定核酸脂質粒子の調製法を提供する：
(a)核酸を、非カチオン性脂質および界面活性剤を含む溶液と接触させて核酸脂質混合液を形成する段階；
(b)カチオン性脂質を核酸脂質混合液と接触させて、核酸の負の電荷部分を中和し、核酸および脂質の電荷中和混合液を形成する段階；ならびに
(c)電荷中和混合液から界面活性剤を除去して、核酸が分解から保護されている核酸脂質粒子の溶液を提供する段階。
【０１３１】
一群の態様では、非カチオン性脂質および界面活性剤の溶液は水溶液である。核酸と、非カチオン性脂質および界面活性剤の溶液との接触は、典型的には、核酸の第一溶液および脂質と界面活性剤との第二溶液を一緒に混合することによって成し遂げられる。当業者は、この混合が、任意の、様々な方法、例えばボルテックスミキサーを用いるような機械的手段によって実施できることを了解するだろう。好ましくは、核酸溶液もまた界面活性剤溶液である。本方法に使用する非カチオン性脂質の量は、典型的には、使用するカチオン性脂質の量に基づいて決定され、かつ典型的にはカチオン性脂質の約0.2〜5倍、好ましくは使用するカチオン性脂質の量の約0.5〜約2倍である。
【０１３２】
いくつかの態様では、核酸は、例えば米国特許出願第09/744,103号に記載のように、事前に濃縮される。
【０１３３】
こうして形成された核酸脂質混合液をカチオン性脂質と接触させ、存在する核酸(または他のポリアニオン性物質)に伴う負の電荷部分を中和する。使用するカチオン性脂質の量は、典型的には、核酸の負電荷の少なくとも50%を中和するのに十分な量であろう。好ましくは、負電荷は、少なくとも70%が中和され、より好ましくは少なくとも90%が中和される。本発明に有用であるカチオン性脂質としては、例えばDLinDMA、およびDLenDMAが含まれる。これらの脂質および関連する類似体は、2004年6月７日出願の米国仮特許出願第60/578,075号；2004年9月17日出願の第60/610,746号；および2005年5月9日出願の第60/679,427号に記載されている。
【０１３４】
カチオン性脂質と核酸脂質混合物との接触は、数多くある技術のいずれか、好ましくはカチオン性脂質の溶液と核酸脂質混合物を含む溶液とを一緒に混合することによって成し遂げられる。二つの溶液を混合すること(または任意の別の様式で接触させること)により、核酸に伴う負電荷部分は中和される。それでもなお、核酸は非凝縮状態を保ち、親水性の特徴を獲得する。
【０１３５】
カチオン性脂質を核酸脂質混合物と接触させた後、界面活性剤(または界面活性剤と有機溶媒との組み合わせ)を除去し、それにより核酸脂質粒子を形成する。界面活性剤の除去に用いる方法としては、典型的なものとして透析を含む。有機溶媒が存在する場合は、除去は、典型的には、減圧での蒸発、または不活性ガス(例えば窒素もしくはアルゴン)の混合液への吹き込みによって成し遂げられる。
【０１３６】
こうして形成した粒子は、典型的には約50nm〜数ミクロン、より典型的には約50nm〜約150nm、よりさらに典型的には約100nm〜約130nm、最も典型的には約110nm〜約115nmの大きさであろう。さらにサイズを減少させるか、粒子のサイズを均一にするために、核酸脂質粒子を超音波処理、濾過、またはリポソームの調合に用いられかつ当業者に公知であるその他の分粒技術に供することができる。
【０１３７】
別の態様では、方法はさらに、本組成物を用いた細胞のリポフェクションの実施に有効である非脂質ポリカチオンを加えることを含む。好適な非脂質ポリカチオンの例としては、ヘキサジメトリンブロミド(Aldrich Chemical Co., Milwaukee, Wisconsin, USAより(商品名POLYBRENE(登録商標)で販売されている)またはヘキサジメトリンのその他の塩を含む。その他の好適ポリカチオンとしては、例えばポリ-L-オルニチン、ポリ-L-アルギニン、ポリ-L-リジン、ポリ-D-リジン、ポリアリルアミンおよびポリエチレンイミンの塩を含む。これらの塩の付加は、粒子が形成された後が好ましい。
【０１３８】
別の局面では、本発明は、下記の段階を含む核酸脂質粒子の調製法を提供する：
(a)溶液中で、ある量のカチオン性脂質を核酸と接触させ、疎水性の核酸脂質複合体を提供する段階：溶液は、約15〜35%の水、約65〜85%の有機溶媒、および約0.85〜約2.0の+/-電荷比を生ずるのに十分な量のカチオン性脂質を含む；
(b)溶液中で、疎水性の核酸脂質複合体を、非カチオン性脂質と接触させ、核酸脂質混合液を提供する段階；ならびに
(c)核酸脂質混合液から有機溶媒を除去して、分解から核酸が保護されている核酸脂質粒子を提供する段階。
【０１３９】
本発明のこの局面に有用である核酸、非カチオン性脂質、カチオン性脂質および有機溶媒は、界面活性剤を用いる上記の方法に関し記載したものと同一である。一群の態様では、段階(a)の溶液は、単相である。別の群の態様では、段階(a)の溶液は、二相である。
【０１４０】
好ましい態様では、非カチオン性脂質は、ESM、DOPE、DOPC、ポリエチレングリコールベースのポリマー(例えばPEG 2000、PEG 5000、PEG修飾されたジアシルグリセロールまたはPEG修飾されたジアルキルオキシプロピル)、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、DPPE、DMPE、16:0 モノメチルホスファチジルエタノールアミン、16:0 ジメチルホスファチジルエタノールアミン、18:1 トランスホスファチジルエタノールアミン、18:0 18:1 ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)、16:0 18:1 ホスファチジルエタノールアミン、DSPE、コレステロールあるいはそれらの組み合わせである。さらに他の好ましい態様では、有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテルまたはそれらの組み合わせである。
【０１４１】
一つの態様では、核酸は、干渉RNAが転写されるプラスミドである；カチオン性脂質は、DLindMA、DLenDMA、DODAC、DDAB、DOTMA、DOSPA、DMRIE、DOGSまたはそれらの組み合わせである；非カチオン性脂質は、ESM、DOPE、DAG-PEG、ジステアロイルホスファチジルコリン(DSPC)、DPPE、DMPE、16:0 モノメチルホスファチジルエタノールアミン、16:0 ジメチルホスファチジルエタノールアミン、18:1 トランスホスファチジルエタノールアミン、18:0 18:1 ホスファチジルエタノールアミン(SOPE)、16:0 18:1 ホスファチジルエタノールアミンDSPE、コレステロールまたはそれらの組み合わせである(例えばDSPCおよびPEG-DAA);かつ有機溶媒は、メタノール、クロロホルム、塩化メチレン、エタノール、ジエチルエーテルまたはそれらの組み合わせである。
【０１４２】
上記のように、核酸とカチオン性脂質との接触は、典型的には、核酸の第一溶液と脂質の第二溶液を一緒に混合することによって、好ましくはボルテックスミキサーによるような機械的手段によって成し遂げられる。生じた混合液は、上記の複合体を含有する。次に、これら複合体は、非カチオン性脂質の付加と、有機溶媒の除去によって粒子に変換される。非カチオン性脂質の付加は、典型的には、複合体を含有する混合液に非カチオン性脂質を単純に付加することによって成し遂げられる。付加を逆にもし得る。続く有機溶媒の除去は、当業者公知であり、上記した方法によっても成し遂げることができる。
【０１４３】
本発明のこの局面に用いられる非カチオン性脂質の量は、典型的には、電荷中和された核酸脂質複合体を提供するのに用いられるカチオン性脂質の約0.2〜約15倍(モルベースで)である。好ましくは、この量は、使用したカチオン性脂質の量の約0.5〜約9倍である。
【０１４４】
さらに別の局面では、本発明は、上記の方法で調製された核酸脂質粒子を提供する。これらの態様では、核酸脂質粒子は、正味の電荷が中性であるか、より高い遺伝子リポフェクション活性を持つ粒子を提供する総電荷を担持するかのいずれかである。好ましくは、粒子の核酸成分は、望ましくないタンパク質の産生を干渉する核酸である。好ましい態様では、核酸は干渉RNAを含み、非カチオン性脂質は卵スフィンゴミエリンであり、カチオン性脂質はDLinDMA、またはDLenDMAである。好ましい態様では、核酸は干渉RNAを含み、非カチオン性脂質は、DSPCとコレステロールとの混合物であり、カチオン性脂質は、DLinDMAまたはDLenDMAである。別の好ましい態様では、非カチオン性脂質は、コレステロールをさらに含んでもよい。
【０１４５】
SNALP-CPL(CPL含有SNALP)を作製するための各種一般法を、本明細書で論ずる。二つの一般的技術として、「後挿入」技術、即ちCPLの、例えば事前形成したSNALPへの挿入、ならびにCPLが、例えばSNALP形成段階の間に、脂質混合体に含める「標準」技術を含む。後挿入技術は、SNALP二重膜の外面に主にCPLを有するSNALPを生じ、一方標準技術は、内面および外面の両方にCPLを有するSNALPを提供する。方法は、リン脂質から作られた小胞(コレステロールを含有できる)、ならびにPEG脂質(PEG-DAAおよびPEG-DAGのような)を含有する小胞に特に有用である。SNALP-CPLの作製方法は、例えば米国特許第5,705,385号、第6,586,410号、第5,981,501号、第6,534,484号；第6,852,334号；米国特許公開第20020072121号；および国際公開公報第00/62813号において教示される。。
【０１４６】
核酸脂質粒子調合物の投与
ひとたび形成されれば、本発明の血清安定核酸脂質粒子は、核酸の細胞内への導入に有用である。それゆえに、本発明は、核酸(例えばプラスミドもしくはsiRNA)の細胞内への導入方法も提供する。方法は、まず上記のように粒子を形成すること、次に粒子を細胞と、核酸の細胞内への送達が起こるのに十分な時間接触させることによって、インビトロまたはインビボで実施される。
【０１４７】
本発明の核酸脂質粒子は、それらが混合または接触させられるほとんどいかなるタイプの細胞にも吸着させることができる。ひとたび吸着すると、粒子は細胞部分によりエンドサイトーシスされるか、脂質と細胞膜を交換するか、または細胞と融合するかのいずれかを成し得る。粒子の核酸部分の移送または取り込みは、これら経路の任意の一つによって起こる。特に、融合が起こる場合は、粒子膜は細胞膜内に組み入れられ、粒子の内容物は細胞内液と合わさる。
【０１４８】
本発明の核酸脂質粒子は、単独で、または投与経路および標準的な医薬的慣行に従って選択された、生理学的に許容されるキャリア(生理学的食塩水またはリン酸緩衝液)との混合物中のいずれかで投与できる。一般的には、標準の生理食塩水が薬学的に許容されるキャリアとして用いられるであろう。その他の好適キャリアとしては、例えば水、緩衝化水、0.4%食塩水、0.3%グリシン等を含み、かつ安定性を高めるために、アルブミン、リポタンパク質、グロブリンなどの糖タンパク質を含む。
【０１４９】
薬学的キャリアは、一般的には、粒子形成後に加えられる。従って、粒子が形成された後に、粒子は、標準の生理学的食塩水のような薬学的に許容されるキャリアの中で希釈することができる。
【０１５０】
医薬調合物中の粒子の濃度は極めて広く、即ち重量の約0.05%未満、通常は約2〜5%かまたは少なくとも2〜5%から、10〜30%程度までであり、選択された具体的な投与様式に従って、主に液体の容積、粘度等から選択されるだろう。例えば、濃度を高くして、治療に伴う液体の負荷を小さくしてもよい。これは、アテローム性動脈硬化症関連鬱血性心不全または重症高血圧の患者に特に望ましいだろう。または、刺激性脂質から構成された粒子は、低濃度に希釈し、投与部位の炎症を軽減できる。
【０１５１】
本発明の薬学的組成物は、通常の、周知の滅菌技術により滅菌してもよい。水溶液は、使用のために包装するか、または無菌的条件で濾過して凍結乾燥でき、凍結乾燥製剤は、投与前に無菌水溶液と合わせられる。組成物は、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウムなどのpH調節および緩衝化剤、ならびに張性調節剤等、生理学的状態に近づけるのに必要な、薬学的に許容される補助物質を含有できる。これに加えて、粒子懸濁液は、貯蔵中のフリーラジカルおよび脂質の過酸化損傷から脂質を保護する脂質保護剤を含んでよい。アルファトコフェロールなどの脂肪親和性フリーラジカルクエンチャー、およびフェリオキシアミンのような水溶性イオン特異的キレート化剤が好適である。
【０１５２】
核酸脂質粒子は、ゲル、オイル、乳剤、局所クリーム、ペースト、軟膏、ローション等を含む、広範囲の局所投与形態に組み入れることができるが、これらに限定されない。
【０１５３】
E.  インビボ投与
インビボ遺伝子治療のための全身送達、即ち血流のような体部システムを介した、治療用核酸の遠位部標的細胞への送達は、国際公開公報第WO 96/40964号、米国特許第5,705,385号、第5,976,567号、第5,981,501号および第6,410,328号に開示されているような核酸脂質粒子を用いて達成されている。後者の形式は、血清中でのヌクレアーゼ分解から核酸を保護し、非免疫原性であり、小サイズであり、反復投与に好適である、完全に封入された核酸脂質粒子を提供する。
【０１５４】
インビボ投与では、投与は当技術分野公知の任意の様式、例えば注射、経口投与、吸入、経皮適用、または直腸投与によって行える。投与は、単回または分割投与により成し遂げられる。薬学的組成物は、好ましくは、非経口的、即ち関節内、静脈内、腹腔内、皮下、または筋肉内に投与される。より好ましくは、薬学的組成物は、ボーラス注射によって静脈内または腹腔内投与される(例えばStadler, et al.、米国特許第5,286,634号を参照されたい)。細胞内の核酸送達は、また、Straubringerら、Methods Enzymol, Academic Press, New York. 101:512 (1983)；Manninoら、Biotechniques 6:682 (1988)；Nicolauら、Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 6:239 (1989)およびBehr, Acc. Chem. Res. 26:274 (1993)で考察されている。薬物療法学に基づいた脂質投与のさらに他の方法は、例えばRahmanら、米国特許第3,993,754号；Sears、米国特許第4,145,410号；Papahadjopoulosら、米国特許第4,235,871号；Schneider、米国特許第4,224,179号；Lenkら、米国特許第4,522,803号；およびFountainら、米国特許第4,588,578号に記載されている。脂質核酸粒子は、疾患部位への直接注射、または疾患部位から遠位にある部位への注射によって投与できる(例えばCulver, HUMAN GENE THERAPY, MaryAnn Liebert, Inc., Publishers, New York. pp.70-71(1994)を参照されたい)。
【０１５５】
本発明の組成物は、単独で、またはその他好適成分との組み合わせのいずれにおいても、吸入により投与されるエアゾール調合物(即ち、それらは「噴霧」できる)にできる(Brigham, et al., Am. J. Sci. 298(4):278 (1989)を参照されたい)。エアゾール調合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの、加圧された、許容される噴射剤に入れることができる。
【０１５６】
例えば関節内(関節の中)、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内および皮下経路によるなどの非腸管投与に好適な調合物としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤および調合物を対象とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含有できる、水性または非水性の等張性無菌注射液を含み、かつ懸濁化剤、可溶化剤、増量剤、安定化剤および保存剤を含むことができる水性および非水性の無菌懸濁液を含む。本発明の実施では、組成物は、例えば静脈注射、経口、局所、腹腔内、膀胱内、またはクモ膜下に投与できる。
【０１５７】
経口投与に好適な調合物は、(a)パッケージされた核酸の有効量が、水、生理食塩水もしくはPEG 400などの希釈液に懸濁している溶液；(b)それぞれが所定量の活性成分を、液体、固体、顆粒またはゲルの形で含有している、カプセル、サシェまたは錠剤；(c)適切な液体の懸濁液；ならびに(d)好適乳化剤からなってよい。錠剤形式は、ラクトース、ショ糖、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ポテトスターチ、微結晶セルロース、ゼラチン、コロイド二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、およびその他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、芳香剤、色素、崩壊剤、ならびに薬学的に適合したキャリアの一つまたは複数を含んでよい。トローチ剤形式は、例えばショ糖などの香味料の中に活性成分を含むことができ、同じく香剤は、活性成分に加えて当技術分野公知のキャリアを含有する、ゼラチンとグリセリンまたはショ糖とアカシア乳剤などの不活性基材、ゲル等の中に活性成分を含んでよい。
【０１５８】
一般的に、静脈投与する場合、核酸脂質調合物は、好適な薬学的キャリアと調合される。本発明の組成物および方法には、多くの、薬学的に許容されるキャリアを用いることができる。本発明における使用のための好適な調合物は、例えばREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Company, Philadelphia, PA, 17th ed. (1985)に見出される。多様な水性キャリア、例えば水、緩衝化水、0.4%食塩水、0.3%グリシン等が使用でき、かつ安定性を高めるために、アルブミン、リポタンパク質、グロブリン等の糖タンパク質を含んでも良い。一般的に、標準の緩衝化食塩水(135〜150mM NaCl)は、薬学的に許容されるキャリアとして用いられるが、その他好適キャリアも十分である。これら組成物は、濾過などの通常のリポソーム滅菌技術によって滅菌できる。組成物は、必要に応じて、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレアート等の、pH調節および緩衝化剤、張性調節剤、湿潤剤等、生理学的状態に近づけるのに必要な、薬学的に許容される補助物質を含有できる。これら組成物は、上記に参照した技術を用いて滅菌でき、またはそれに代わって、それらは無菌条件下に産生できる。得られた水溶液は、使用のために包装するか、または無菌的条件で濾過し、および凍結乾燥でき、凍結乾燥製剤は、投与前に無菌水溶液と合わせられる。
【０１５９】
本発明の核酸脂質粒子の医薬製剤を調製する場合、精製して空粒子を減らすかもしくは取り除くか、または核酸を外面に付けた粒子を一定量使用することが望ましい。
【０１６０】
本発明の方法は、様々な宿主で実施できる。好ましい宿主としては、鳥類(例えばアヒル)、霊長類(例えばヒトおよびチンパンジー、ならびにその他ヒト以外の霊長類)、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類(例えばラットおよびマウス)、ウサギおよびブタのような哺乳動物種が挙げられる。
【０１６１】
投与する粒子量は、脂質に対する核酸の割合；使用する具体的な核酸、診断対象となる疾患状態；患者の年齢、体重および状態、ならびに医師の判断に依存するだろうが、一般的には約0.01〜約50mg/kg体重、好ましくは約0.1〜約5mg/kg体重または約108〜1010粒子／注射であろう。
【０１６２】
F.  干渉RNA送達のための細胞
本発明の組成物および方法は、広範囲のタイプの細胞をインビボおよびインビトロで処理するのに用いる。好適な細胞としては、例えば造血前駆(幹)細胞、繊維芽細胞、ケラチノサイト、肝細胞、内皮細胞、骨格および平滑筋細胞、骨芽細胞、ニューロン、静止リンパ細胞、最終分化細胞、遅または非細胞周期一次細胞、実質細胞、リンパ様細胞、上皮細胞、骨細胞等を含む。
【０１６３】
干渉RNAを封入している核酸脂質粒子のインビボ送達は、任意の細胞型の腫瘍細胞を標的化するのに特に適している。インビボ研究は、SNALPが腫瘍部位に蓄積すること、および優先的に腫瘍細胞にトランスフェクトすることを示している。Fenskeら、Method Enzymol, Academic Press, New York 346:36 (2002)を参照されたい。方法および組成物は、哺乳動物を含む、特に獣医学的に重要な動物、例えば、ヒト細胞集団に加えて、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、齧歯類、ウサギ、ブタ等、広範囲の脊椎動物の細胞と共に用いることができる。
【０１６４】
細胞の組織培養が必要になる範囲は、当技術分野において周知である。Freshney (1994) (Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition Wiley-Liss, New York)、Kuchler et al. (1977) Biochemical Methods in Cell Culture and Virology、Kuchler, R. J., Dowden, Hutchinson and Ross, Inc.、かつそこに言及された参照は、細胞培養への一般手引きを提供する。培養細胞系は、単層細胞の形をとることが多いが、細胞懸濁液も用いられる。
【０１６５】
G.  SNALPの検出
いくつかの態様では、核酸脂質粒子は、粒子の投与後8、12、24、48、60、72または96時間目に、被検体内に検出できる。粒子の存在は、被検体からの細胞、組織またはその他生物学的サンプルにおいて検出できる。粒子は、例えば粒子の直接検出、干渉RNA配列の検出、関心対象の標的配列の検出(即ち、関心対象配列の発現または発現低下を検出することによって)、またはそれらの組み合わせによって検出される。
【０１６６】
1.  粒子の検出
核酸脂質粒子は、本明細書では、当技術分野公知の任意の方法を用いて検出される。例えば、標識は、SNALPの成分または他の脂質をベースとするキャリアシステムに、当技術分野周知の方法を用いて直接、または間接的にカップリングできる。多種多様な標識を用いることができ、標識は必要とする感度、SNALPとの複合の容易さ、安定性要求、および利用できる装置および消耗品に拠って選ばれる。好適標識としては、蛍光色素(例えばフルオロセイン、ならびにフルオロセインイソチオシアネート(FITC)およびOregon Green(商標)などの誘導体；ローダミン、およびテキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート(TRITC)等などの誘導体、ジゴキイシゲニン、ビオチン、フィコエリスリン、AMCA、CyDyes(商標)等の分光標識；3H、125I、35S、14C、32P、33P等の放射性標識；西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素；金コロイドまたは着色ガラス製ビーズもしくはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等のプラスチック製ビーズなどの分光比色標識を含むが、これらに限定されない。標識は、当技術分野公知のいずれかの手段によって検出できる。
【０１６７】
2.  核酸の検出
核酸は、本明細書では、数多くある当業者周知の手段のいずれかによって検出および定量化される。核酸の検出は、サザン分析、ノーザン分析、ゲル電気泳動、PCR、放射標識、シンチレーション測定およびアフィニティークロマトグラフィーなどの周知の方法により行われる。分光光度測定、ラジオグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)、薄層クロマトグラフィー(TLC)、高拡散クロマトグラフィーのなどの、その他の分析的な生化学的方法も用いてもよい。
【０１６８】
核酸ハイブリダイゼーションの形式の選択は重要ではない。様々な核酸ハイブリダイゼーションの形式が当業者に公知である。例えば、一般的な形式としては、サンドイッチアッセイおよび競合もしくは置換アッセイを含む。ハイブリダイゼーション技術は、「Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach」Ed. Hames, B. D. and Higgins, S. J., IRL Press, 1985に一般的に記載されている。
【０１６９】
ハイブリダイゼーションアッセイの感度は、検出対象の標的核酸を増幅する核酸増幅システムを用いることで高めてもよい。分子プローブとして使用する配列の増幅、または続くサブクローニング用の核酸断片の生成に好適なインビトロ増幅技術は、公知である。当業者にこのようなインビトロ増幅を十分に導く技術の例は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、リガーゼチェインリアクション(LCR)、Qβ-レプリカーゼ増幅およびその他のRNAポリメラーゼを媒介した技術(例えばNASBA(商標))を含め、Sambrookら、In Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000およびAusubelら、SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, eds., Current Protocols、Greene Publishing Associates, Inc.とJohn Wiley & Sons, Inc.,(2002)とのジョイントベンチャー、ならびにMullisら(1987)、米国特許第4,683,202号； PCR Protocols A Guide to Methods and Applications (Innis et al. eds) Academic Press Inc. San Diego, CA (1990) (Innis)； Arnheim & Levinson (October 1,1990), C&EN 36； The Journal Of NIH Research, 3:81 (1991); (Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1173 (1989); Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990); Lomellら、J. Clin. Chem., 35:1826 (1989); Landegrenら、Science, 241:1077 (1988) ; Van Brunt, Biotechnology, 8:291 (1990); Wu and Wallace, Gene, 4:560 (1989) ; Barringerら、Gene, 89:117 (1990)、ならびにSooknanan and Malek, Biotechnology, 13: 563 (1995)に見出される。インビトロ増幅した核酸をクローニングする改良法が、Wallaceら、米国特許第5,426,039号に記載されている。当技術分野に記載されている別の方法は、核酸配列ベース増幅(NASBA(商標)、Cangene, Mississauga, Ontario)およびQベータレプリカーゼシステムである。これらのシステムは、PCRまたはLCRプライマーが、選択した配列が存在する場合にのみ伸長または連結するように設計されている突然変異体を直接同定するのに用いることができる。または、選択した配列を、一般的には、例えば非特異的PCRプライマーを用いて増幅し、その後増幅した標的領域を、突然変異を示す特異的配列でプロービングできる。
【０１７０】
プローブとして使用するためのオリゴヌクレオチド、例えばインビトロ増幅法において遺伝子プローブ、または阻害成分として使用するためのオリゴヌクレオチドは、典型的には、BeaucageおよびCaruthers、Tetrahedron Letts., 22(20):1859 1862(1981)に記載の固相ホスホールアミドトリエステル法に従って、例えばNeedham VanDevanterら、Nucleic Acids Res., 12:6159 (1984)記載のような自動合成装置を用いて、化学的に合成される。オリゴヌクレオチドの精製は、必要な場合には、未変性アクリルアミドゲル電気泳動またはPearsonおよびRegnier, J. Chrom., 255:137 149(1983)に記載のアニオン交換HPLCのいずれかを用いて典型的に実施される。合成オリゴヌクレオチドの配列は、、Grossman and Moldave(eds.)Academic Press, New York, Methods in Enzymology, 65:499の中の、MaxamおよびGilbert(1980)の化学的分解法を用いて検証できる。
【０１７１】
転写レベルを決定する別の手段は、インサイチューハイブリダイゼーションである。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイは周知であり、Angerer et al., Methods Enzymol., 152:649(1987)に一般的に記載されている。インサイチューハイブリダイゼーションアッセイでは、細胞は、固体支持物、典型的にはガラススライドに固定される。DNAをプロービングする場合は、細胞は、熱またはアルカリで変性させられる。次に細胞は、適度の温度でハイブリダイゼーション溶液と接触させられ、標識された特異的プローブとアニーリングさせられる。プローブは、放射性同位元素または蛍光レポーターで標識されるのが好ましい。
【０１７２】
H.  トランスフェクション効率
本明細書に記載の核酸脂質粒子のトランスフェクション効率は、ERPアッセイを用いて最適化できる。例えば、ERPアッセイを用いて、SNALPの各種カチオン性脂質、非カチオン性脂質および二重層安定化成分の効果を、それらのエンドソーム膜の結合／取り込み、または融合／脱安定化に及ぼす相対的効果に基づいて識別できる。このアッセイにより、SNALPの各成分がトランスフェクション効率にどれだけ影響しているか定量的に決めることができ、それによりSNALPを最適化できる。本明細書で説明するように、エンドソーム放出パラメータ、またはERPは、次のように定義されている：
レポーター遺伝子発現／細胞
SNALP取り込み／細胞
【０１７３】
任意のレポーター遺伝子(例えばルシフェラーゼ、β-ガラクトシダーゼ、グリーン蛍光タンパク質等)も用いることができることは、当業者にとって容易に明らかになるだろう。これに加えて、もし投与が細胞内への取り込みを抑制または妨害するのであれば、脂質構成成分(または、SNALPもしくは脂質ベース調合物のいずれかの構成成分)を検出可能な標識で標識することもできる。本発明のERPアッセイを用いることで、当業者は様々な脂質構成成分(例えば式IまたはIIのカチオン性脂質、非カチオン性脂質、PEG脂質誘導体、PEG-DAA複合体、ATTA脂質誘導体、カルシウム、CPL、コレステロール等)の細胞取り込みおよびトランスフェクション効率に及ぼす影響を評価でき、それによってSPLPまたはその他脂質ベースのキャリアシステムを最適化できる。様々なSPLPまたはその他脂質ベース調合物それぞれについてERPを比較することによって、最適化されたシステム、例えば最高のトランスフェクション効率と相まって、最大の細胞内取り込みを示すSPLPまたはその他脂質ベースの調合物を容易に決定できる。
【０１７４】
本発明のERPアッセイを実施するための好適な標識物としては、蛍光色素(例えばフルオロセイン、ならびにフルオロセインイソチオシアネート(FITC)およびOregon Green(商標)などの誘導体；ローダミン、およびテキサスレッド、テトラローダミンイソチオシアネート(TRITC)などの誘導体、ジゴキイシゲニン、ビオチン、フィコエリスリン、AMCA、CyDyes(商標)等の分光標識物；3H、125I、35S、14C、32P、33P等の放射性標識物；西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ等の酵素；金コロイドまたは着色ガラス製ビーズもしくはポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックス等などのプラスチック製ビーズなどの分光比色標識を含むが、これらに限定されない。標識は、当技術分野公知のいずれかの手段によってSNALPの成分に直接、または間接的にカップリングできる。上記に示したように、極めて多様な標識を用いることができ、標識は必要とする感度、SNALPとの複合の容易さ、安定性要求、および利用できる装置および消耗品に拠って選ばれる。
【０１７５】
本発明は、具体的な実施例によって、さらに詳しく説明する。下記の実施例は、例示を目的として提供されており、いかなる様式によっても本発明を制限するものではない。当業者は、同一の結果を実質的に生み出す変更または修正が可能な様々な、重要でないパラメータを容易に認識するだろう。
【実施例】
【０１７６】
下記の実施例は、例示を目的として提供されるものであり、請求の本発明を制限しない。
【０１７７】
実施例1：材料および方法
材料：DPPS、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)およびコレステロールは、Avanti Polar Lipid(Alabaster, AL)より購入した。TNSは、Sigma-Aldrich Canada(Oakville, ON)より得た。RiboGreenは、Molecular Probes(Eugene, OR)より得た。アルキルメシレートは、Nu-Chek Prep, Inc. (Elysian, MN, USA)から購入した。siRNA(抗ルシフェラーゼおよびミスマッチコントロール)は、Dharmacon (Lafayette, CO, USA)より購入した。抗ルシフェラーゼセンス配列は、
2008501730.tif 000012
であった。抗ルシフェラーゼアンチセンス配列は、
2008501730.tif 000013
であった。他の化学薬品は、全てSigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada)より購入した。
【０１７８】
DSDMAおよびDODMAの合成： DSDMAおよびDODMAは、それぞれのアルキルブロミドを用いて、DOTMA前駆体の方法から導いた方法により合成した(Felgner et al., PNAS USA, 84, 7413-7417 (1987))。3-(ジメチルアミノ)-1,2-プロパンジオール(714mg、6mmol)および95%水素化ナトリウム(NaH、1.26g、50mmol)をベンゼン(30mL)中、アルゴン下に、30分間攪拌した。修正(オレイルまたはステアリルのいずれか)アルキルブロミド(5.0g、15mmol)を加え、反応液をアルゴン下に18時間還流した。次に反応混合液を、氷槽内で、エタノールをゆっくり加えクエンチングしながら冷却した。さらに150mLのベンゼンで希釈した後、混合液を蒸留水(2×150mL)およびブライン(150mL)で洗浄し、必要に応じてエタノール(約20mL)を用いて相分離を補助した。有機相を、硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させた。粗生成物を、シリカゲル(Kiesel Gel 60)カラムで0〜5%メタノールを含有するクロロホルムにより溶出し、精製した。カラム分画を、薄層クロマトグラフィー(TLC)(シリカゲル、クロロホルム／メタノール 9:1 v/v、モリブデン酸塩により視覚化)により分析し、純粋な生成物(Rf=0.5)を含有する分画をプールして、濃縮した。生成物は、30分間、60℃で、活性炭(1g)のエタノール(75ml)懸濁液中で攪拌することによって脱色した。活性炭は、セライトを通し濾過することで取り除き、エタノール溶液を濃縮して、典型的には2.4g (65%)の純粋な生成物を得た。
2008501730.tif 000014
【０１７９】
1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)および1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDMA)の合成： 3-(ジメチルアミノ)-1,2-プロパンジオール(714mg、6mmol)および95%水素化ナトリウム(NaH、1.26g、50mmol)をベンゼン(30mL)中、窒素下に、30分間攪拌した。リノレイルメシレート(5.0g、15mmol)を加え、反応液を窒素下で3時間還流した。反応混合液を、氷槽内で、エタノールをゆっくり加えクエンチングしながら冷却した。さらに150mLのベンゼンで希釈した後、混合液を蒸留水(2×150mL)およびブライン(150mL)で洗浄した。有機相を、硫酸マグネシウムで乾燥させ、蒸発させ、粗生成物を得た。粗生成物を、シリカゲル(Kiesel Gel 60)カラムで0〜5%メタノールを含有するクロロホルムにより溶出し、精製した。カラム分画を、薄層クロマトグラフィー(TLC)(シリカゲル、クロロホルム／メタノール 9:1 v/v、モリブデン酸塩浸漬により視覚化)により分析し、純粋生成物(Rf=0.5)を含有する分画をプールして、濃縮した。
【０１８０】
DLinDMAの脱色および更なる精製を、第二カラムを用いて実施し、今回は20〜50%酢酸エチルのヘキサン溶液を用いて溶出した。カラム分画を、TLC(シリカゲル、酢酸エチル／ヘキサン 1:1 v/v、モリブデン酸塩により視覚化)により分析し、純粋生成物(Rf=0.4)を含有する分画をプールして、濃縮した。本明細書に記載の手順は、典型的には、2.2g (60%)の純粋生成物を生ずる。
【０１８１】
DLenDMAを合成するためは、リノレニルメシレートをリノレイルメシレートに置き換えて、それ以外の合成、脱色および精製反応を上記のようにして実施する。
【０１８２】
PEG2000-C-DMAの合成： PEG-C-DMAは次のようにして合成した。簡単に述べると、C14脂質アンカーを、まず3-アルキルオキシプロパン-1,2-ジオールのヒドロキシル基をミリスチルブロミドでアルキル化することによって調製した。それに続いて、アリル基をパラジウム触媒によって取り除き、C14ヒドロキシル脂質を得た。ヒドロキシル基を、メシル化およびアミノ化によって第一アミンに変換し、脂質アンカーである1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-アミンを得た。PEGとの複合は、モノメトキシポリ(エチレングリコール)(平均分子量2000)を過剰量のジホスゲンで処理してクロロホルメートを形成することによって実施した。C14アミン脂質アンカーを付加し、一晩攪拌し、本明細書ではPEG-C-DMAと呼ぶPEG2000-C-DMAを得た。
【０１８３】
SNALP調製： DSPC:Chol:PEG-C-DMA:カチオン性脂質(20:48:2:30モルパーセント)の脂質組成を有するSNALPは、エタノール希釈法による自発的小胞形成を用いて調製した［Jeffs et al., Pharm. Res. In Press (2005)]。サンプルを、向流限外濾過カートリッジ(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)を用いて、100mLのPBS(20洗浄容積)に対し透析濾過し、Acrodisc 0.2μm Posidyneフィルター(Pall Corp., Ann Arbor, MI)を通し無菌濾過した。最終サンプルのsiRNA濃度は、RiboGreenアッセイおよびsiRNA標準曲線を用いて決定した。粒子サイズおよび多分散性は、Malvern Instruments Zetasizer 3000HSA(Malvern, UK)を用いて決定した。核酸封入は、RiboGreenアッセイを用いて決定し、Triton X-100存在下および非存在下での蛍光を比較した。RiboGreenの蛍光は、Varian Eclipse分光蛍光計(Varian Inc)を用い、λex=500nm、λem=525nmで測定した。
【０１８４】
TNSアッセイ： 20μMのSNALP脂質および6μMのTNSを、蛍光キュベットの中で、20mMリン酸ナトリウム、25mMクエン酸、20mM酢酸アンモニウムおよび150mMのNaClの溶液2mLと、pHを4.5〜9.5に変化させて混合した。蛍光を、各pHについて、Varian Eclipse分光蛍光計(Varian Inc)を用い、λex=322nm、λem=431nmに設定して決定した。次に、様々なpHにおける各システムの蛍光を、pH4.5の値に対し標準化した。pKa値は、存在する分子の50%が荷電を持つ点である。最小蛍光がゼロ電荷を表し、最大蛍光が100%電荷を表すとすることによって、pKaは、最小電荷および最大電荷の値のちょうど中間点のpHを測定することによって予測できる。
【０１８５】
31P核磁気共鳴分光測定： 多重膜小胞(MLV)は、DPPSおよびカチオン性脂質をモル比1:1で含むように調製した。これは、クロロホルム溶液から脂質を乾燥させ、10mmNMRチューブに移し、1.5mLの10mMクエン酸ナトリウム、pH4で水和することによって成し遂げた。1000スキャンに相当する自由誘導減衰(FID)を、3.0μs、パルス間遅延が1sの60o  パルス、およびスペクトル幅25000Hzで得た。ゲーテッド2レベルプロトンデカップリングを用い、最低サンプル加熱での十分なデカップリングを保証した。フーリエ変換前に、50Hzのライン拡張に相当する対数増倍をFIDを適用した。サンプル温度(+/-1℃)は、Bruker B-VT1000可変温度ユニットを用いて制御した。化学シフトは、85%リン酸を外部標準として参照した。
【０１８６】
インビトロトランスフェクション： 細胞は、10%ウシ胎児血清(FBS)(CanSera)および0.25mg/mL G418 (Invitrogen)を含有するMEM(Invitrogen)で培養した。Neuro2A-G細胞(安定にトランスフェクトされ、ルシフェラーゼを発現するNeuro2A細胞［R.E. Kingston, in Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2, pp.9.1.4-9.1.9, John Wiley & Sons, Inc. (1997)］を、24ウェルプレートに4×104細胞／ウェルの濃度で接種し、一晩増殖させた。細胞を、用量0.0625〜1.0μg/mLの核酸(AntiLucアクティブコントロールまたはミスマッチコントロール)のSNALPで処理し、48時間、37℃および5%CO2でインキュベートした。次に細胞をPBSで洗浄し、0.1%のTriton X-100を含有する250mMのリン酸ナトリウム、200μLを用いて溶解した。各ウェルのルシフェラーゼ活性は、Luciferase Reagent(Promega)、および標準ルシフェラーゼタンパク質(Roche)を用いて決定した。各発光は、Berthold MicroLumatPlus LB96Vプレートルミノメーターを用いて測定した。得られたルシフェラーゼ活性は、次にMicro BCAアッセイキット(Pierce)を用いて、タンパク質量について標準化した。次に、各システムについて、コントロールに対するルシフェラーゼノックダウンを決定した。
【０１８７】
細胞取り込み： SNALPを、非交換性のトリチウム標識脂質コレステリルヘキサデシルエーテル(3H-CHE)(11.1μCi/μmol全脂質)を取り込ませて調製した［Bally et al., in Liposome Technology, Vol.III, pp.27-41, CRC Press (1993)］。Neuro2A細胞(ATCC、VA、USA)を、12ウェルプレートに、最小必須培地の中に1.6×105細胞の割合で接種した。翌日、培地を取り除き、0.5μg/mL核酸の放射線標識SNALPを含有する培地に交換した。24時間後、培地および取り込まれなかったSNALPを取り除き、付着細胞を優しく4回PBSで洗浄し、次にLysis Buffer(0.1% Triton X-100含有250mMリン酸)で溶解した。得られた細胞溶解物(500μL)を、5mLのPicofluor 40 (Perkin Elmer)の入ったガラス製シンチレーションバイアルに加え、Beckman LS6500シンチレーションカウンター(Beckman Instruments)を用いて3H-CHEを測定した。細胞溶解物のタンパク質含有量は、Micro BCAアッセイ(Pierce)を用いて測定した。取り込みは、細胞タンパク質1mg当たりの、細胞に加えられた全活性量のパーセンテージとして表した。
【０１８８】
Cy3標識siRNA含有SNALPの取り込み： SNALPは、蛍光団Cy3(Cy3-siRNAはSirna Therapeutics Inc, Boulder, COより贈られた)で標識されたsiRNAを用い、前述のように調合した。封入、siRNA濃度および粒子サイズは、記載のようにして決定した。
【０１８９】
取り込み研究用に、8×104個のNeuro2A-G細胞を、4ウェルチャンバースライド(BD Falcon, Mississauga, ON)で、0.25mg/mLのG418を含有するMEMの中で一晩増殖させた。Cy3-siRNAを含有するDSDMA、DODMA、DLinDMAおよびDLenDMA SNALP、ならびに裸のCy3-siRNAおよび未標識のDSDMA SNALPを、細胞に0.5μg/mL siRNAで置いた。トランスフェクション培地と4時間インキュベーションした後、細胞をPBSで洗浄し、次にG418含有MEMで洗浄し、最後にPBSでもう一度洗浄した。次に細胞を、4%パラホルムアルデヒドのPBS溶液で、10分間、室温で固定した。細胞をPBSで洗浄し、300nMのDAPI(Molecular Probes, Eugene, OR)のPBSで5分間染色した。細胞をPBSで洗浄し、封入媒体ProLong Gold Antifade Reagent(Molecular Probes, Eugene, OR)を用い、カバースライドを被せた。細胞は、蛍光能力を持つよう改造したOlympus BX60 Microscopeを用いて観察した。細胞内のCy3蛍光は、ローダミンキューブセット(Microgen Optics, Redding, CA)を用いて視覚化し、DAPI蛍光は、DAPIキューブセット(Carsen Group, Markham, ON)を用いて視覚化した。デジタル画像は、Olympus DP70カメラシステムで捕捉した。細胞の写真は、Cy3蛍光検査の場合には露出時間1/4秒、およびDAPI蛍光を調べる場合には1/80秒で撮影した。
【０１９０】
実施例2：siRNA封入SNALP調合物
本実施例は、短鎖または長鎖PEG-DAGのいずれかを用いて調合され、有機脂質溶液および水性緩衝液を連続的に混合することによって産生されたSNALPへのsiRNAの封入を実証する。用いたPEG-DAG脂質は、PEG-ジミリスチルグリセロール(C14)(PEG-DMG)およびPEG持ステアリルグリセロール(C18)(PEG-DSG)であった。この方法によってDSPC：コレステロール：DODMA：PEG-DMG/PEG-DSG SNALPに封入された抗βガラクトシダーゼ(β-gal)siRNAは、≧90%の封入(Ribogreen アッセイ)および約120nmの粒子サイズ(Malvern sizer)を示した。この調製物は、次の特性を有した：
4ml調製物：DSPC:Chol:DODMA:PEG-DMGリポソーム内、抗B-gal siRNA
初期混合＝94%封入
希釈混合後＝98%封入
インキュベーション混合後＝97%封入
一晩透析後＝96%封入
粒子サイズ＝109.7nm
多分散性＝0.14
8ml調製物：DSPC:Chol:DODMA:PEG-DMGリポソーム内、抗B-gal siRNA
希釈後およびインキュベートした混合＝89%
一晩透析後＝91%
粒子サイズ＝127.5nm
多分散性＝0.11
8ml調製物：DSPC:Chol:DODMA:PEG-DSGリポソーム内、抗B-gal siRNA
希釈後およびインキュベートした混合＝90%
一晩透析後＝90%
無菌フィルター後＝90%
粒子サイズ＝111.6nm
多分散性＝0.24
【０１９１】
実施例3：siRNA封入SNALP調合物のインビトロ送達による、細胞における細胞内発現のダウンレギュレーション
本実施例は、抗β-Gal siRNAを封入しているDSPC:Cholesterol:DODMA:PEG-DMGリポソームをインビトロ送達されたCT26.CL25細胞におけるβ-Gal発現のダウンレギュレーションを実証する。結果は、図4に示す。
【０１９２】
0.2μgのオリゴフェクタミン封入抗β-Gal siRNAのインビトロ送達は、未暴露のコントロール細胞に比べ、β-Gal活性を約60%低下させた。DSPC:Cholesterol:DODMA:PEG-DMGリポソーム内への1.5μgの抗β-Galの封入は、未暴露のコントロール細胞に比べ、β-Gal活性を約30%低下させた。
【０１９３】
実施例4：血清安定性のアッセイ
上記の技術に従って調合された脂質／治療用核酸粒子は、様々な方法によって、血清安定性についてアッセイできる。
【０１９４】
例えば、典型的なDNase 1消化では、関心対象の粒子に封入された1μgのDNAを、総量100μLの5mM HEPES、150mM NaCl、10.0mM MgCl2、pH7.4の中でインキュベートする。DNase処理したサンプルは、100または10UのDNase I (Gibco-BRL)のいずれかで処理する。コントロール実験に1.0%のTriton X-100を加え、脂質調合物が酵素を直接不活性化しないことを確実にできる。サンプルは37℃で30分間インキュベートし、その後、500μLのDNAZOLを加え、さらに1.0mLのエタノールを加えてDNAを単離する。サンプルを、卓上型微量遠心機で、30分間、15,000rpmの遠心分離にかける。上清をデカントし、得られたDNA沈渣を80%エタノールで2回洗浄し、乾燥させる。このDNAを30μLのTE緩衝液に再懸濁する。このサンプル20μLを1.0%アガロースゲルに負荷し、TAE緩衝液を用いた電気泳動に供する。
【０１９５】
典型的な血清アッセイでは、遊離状態、封入されている、または封入＋0.5% Triton X100のDNA 50μgを、小分けして1.5mLのEppendorfチューブに入れた。このチューブに、45μlの正常マウスまたはヒト血清、dH2O(最終容積を50μLにする)を加えた。チューブを、パラフィルムで密封し、37℃でインキュベートした。ヌクレアーゼで消化しなかった(標準物)の遊離状態、封入されている、または封入＋0.5% Triton X100のサンプルを、Eppendorfチューブにいれた状態で液体窒素凍結し、-20℃で保存した。小分けサンプルを様々な時点で取り出し、プロテイナーゼK (133μg/mL)を含有するGDP緩衝液に加え、直ぐに液体窒素中で凍結して反応を停止した。全時点での採取が終了したら、サンプルを水槽中で、55℃でインキュベートしてプロテイナーゼKを活性化して、残った全てのエクソヌクレアーゼを変性させる。プロテイナーゼK消化したサンプルをポリアクリルアミドゲルにかけて、エクソヌクレアーゼ分解のレベルを評価した。
【０１９６】
上記開示の粒子は、このような処理の結果、たとえ100UのDNase 1が存在していても、DNA分解量(部分的または全部)が5%未満、好ましくは検出不可能な量であることを示すことにより、血清安定性を証明した。これは、完全に分解した遊離状態のDNA、およびそのような処理後もDNAが実質的(即ち20%を超える、多くは80%を超える)に分解したプラスミド／脂質複合体(DOTMAまたはDODAC:DOPE複合体など)と好対照である。
【０１９７】
実施例5：SNALPの特徴付け
本実施例は、腫瘍担持マウスへのSNALP封入プラスミドの静脈投与の結果から生じた疾患部位標的化および遺伝子発現について記載する。
【０１９８】
プラスミドDNAは、小(直径約70nm)核酸脂質粒子(即ちSNALP)に封入され、1粒子当たり1プラスミドを含み、ポリ(エチレングリコール)(PEG)コーティングなどの二重層安定化成分の存在により安定化された脂質二重層内に封入されている。SNALPは、静脈等の後、長い血中寿命を示し、未変性プラスミドの遠位部送達を促進し、結果として疾患部位でのレポーター遺伝子を発現させた。
【０１９９】
長い血中時間を持つSNALPは、腫瘍1g当たり全注射量の5〜10%、または細胞当たり1000コピーを超えるプラスミドDNAに相当するレベルまで蓄積して遺伝子発現のレベルを上昇させるが、それは他のどの組織に観察されるレベルよりも二桁より高いものであった。興味深いことに、肝臓は全注射量の20〜30%を蓄積したが、肝臓では、極めて低い遺伝子発現レベルが観察された。これは、PEG化SNALPの肝細胞の取り込みが制限されていることによると考えられた。図8〜10を参照されたい。
【０２００】
二重層安定化成分を含有する核酸脂質粒子のインビボ送達およびトランスフェクション能力は、DSPEアンカー、PEG3400スペーサー鎖、およびカチオン性頭部基からなるカチオン性PEG脂質(CPL)を組み入れることで更に高められた。CPLをSNALPに2〜4mol%の濃度で組み入れたとき、生ずるCPL-SNALPは、元のSNALPと同様のサイズおよび安定性を有した。CPLの組み入れは、細胞内送達を劇的に上昇させ、それに伴いインビトロおよびインビボで測定したいずれについても、トランスフェクション活性を高めた。具体的には、CPL-SNALPは、元のSNALPに比べ、105倍のインビトロ遺伝子発現を生じた。CPL-SNALPを静脈内投与すると、それらは元のSNALPに比べ、肝臓での遺伝子発現の実質的な増加(250倍)をもたらした。CPL-SNALP能力の上昇は、肝臓に特異的であった。肺、腎臓、脾臓または心臓で測定された遺伝子発現のレベルは変わらず、その結果肝臓とその他臓器では、測定された遺伝子発現に二桁以上の差がついた。
【０２０１】
これらの結果は、PEG脂質含有システムの送達特性が、全身への遺伝子送達を達成するのに必要な安定性および均一な小サイズを維持したまま、調整できる可能性を描いている。具体的には、それらは、疾患特異的標的化および組織特異的遺伝子発現が、非ウイルス遺伝子送達システムの脂質組成を変更することによって、事前に決めることができることを証明している。
【０２０２】
実施例6：PEG-DAG複合体を含有するSNALP
本実施例は、一連のPEG-ジアシルグリセロール脂質(PEG-DAG)SNALPの調製を証明する。本実施例では、封入された核酸は、プラスミドである。
【０２０３】
PEG-DAG SNALPは、10mol%のPEGジラウリルグリセロール(C12)、PEGジミリスチルグリセロール(C14)、PEGジパルミトイルグリセロール(C16)またはPEGジステリルグリセロール(C18)を組み入れて調製し、インビトロトランスフェクション活性、薬物動態、および腫瘍担持マウスへの全身投与より生じた遺伝子発現の生体内分布について評価した。PEG-DAG脂質含有SNALPは、PEGセラミド含有SNALPと同様の、アシル鎖長とインビトロトランスフェクション活性との間の相関性を示した。短いアシル鎖アンカー(ジミリスチル(C14)およびジパルミトイル(C16))は、より長いアシル鎖アンカー(ジステリル(C18))を組み入れたものに比べ、安定性は低いが、より高いインビトロトランスフェクション活性を有するSNALP粒子を生じた。PEG-DAG含有SNALPの薬物動態の評価から、PEG脂質成分とSNALPの血中寿命との間の相関性が確認された。PEGジミリスチルグリセロール(C14)、PEGジパルミトイルグリセロール(C16)およびPEGジステリルグリセロール(C18)含有SNALPは、それぞれ0.75、7および15時間の血中半減期を示した。換言すれば、長い血中寿命は、腫瘍送達およびそれに伴う遺伝子発現の上昇と相関する。
【０２０４】
静脈投与をするとすぐに、PEGジステリルグリセロール(C18)含有SNALPは、肺を含む、いわゆる「一次通過」器官を迂回し、遠位腫瘍組織での遺伝子発現を引き出した。腫瘍で観察されたレポーター遺伝子の発現レベルは、他のどの組織で観察されたものよりも100〜1000倍の差を示した。これは、PEGセラミドC20を含有するSNALPの挙動と好対照である。SNALPへのPGE-DAGの組み入れは、非ウイルストランスフェクションシステムの全身投与後の腫瘍におけるプラスミドDNAの蓄積および遺伝子発現を導く受動的な疾患部位標的化には、サイズが小さいこと、表面電荷の低い、血中寿命の長いことが不可欠であることを確認した。図5〜10を参照されたい。
【０２０５】
材料および方法
材料
DOPEおよびDSPCは、Northern Lipid (Vancouver, BC)より得た。DODACおよびPEGジアシルグリセロールは、Inex Pharmaceuticals (Burnaby, BC)により製造された。その他の材料、HEPES、OGPおよび3H-コレステリルヘキサデシルエーテルは、複数の商業供給元から得た。
【０２０６】
DOPE:DODAC:PEGジアシルグリセロール(82.5:7.5:10)の多重膜小胞は、Hepes緩衝化食塩水(150mM NaClおよび10mM HEPES)中での、48時間の界面活性剤透析によって調製した。脂質保存溶液は、エタノールで調製し、次に乾燥させて脂質薄膜を作り、これを最終200mM OGPに戻した。LUVは、3H-コレステリルヘキサデシルエーテルで、1uCi/1mgに標識した。粒子サイズは、nicomp分析によって決定した。放射活性は、Picofluor20を用いたシンチレーション測定によって決定した。
【０２０７】
PEGジアシルグリセロール含有SNALPは、塩濃度を変化させて最大のDNA封入を得ることによって、界面活性剤透析により調合した。最適塩濃度は、48時間の界面活性剤透析について選んだ。空小胞は、一段階のショ糖遠心分離によって取り除いた。PEGジミリステリルグリセロール含有SNALPについて5.0%ショ糖を用いた以外は、3.5%のショ糖を用いて、プラスミド含有PEGジアシルグリセロール調合物から空小胞を分離した。空小胞は、チューブの頂部に移動するので、これを分画して取り除いた。
【０２０８】
インビトロトランスフェクション
5×104細胞／mlを、24ウェルプレートに入れた(1ml)。細胞を、24時間放置して増殖させた。トランスフェクション培地500μl (2.5μg/ウェル)を加え、次に記載の時点までインキュベートした。時点到達後、トランスフェクション培地を吸引し、完全培地に24時間、37℃、5.0% CO2に暴露した。完全培地を取り除いた。細胞をPBSで2回洗浄し、実験日まで-70℃で保存した。細胞を150μlの、プロテアーゼインヒビターを含む1×CCLRを用いて溶解した。プレートを5分間振盪した。各サンプル20μlを、96ウェル発光プレートで、ルシフェラーゼ活性について二重にアッセイした。
【０２０９】
薬物動態、生体内分布、およびインビボ遺伝子発現
薬物動態および生体内分布は、データを示した放射活性量について標準化することにより、全て決定した。約500μlの血液を、心臓穿刺によって得た。赤血球および血漿を、遠心分離(4℃、3000rpm、10分間)により分離し、血漿100μlを用いて放射活性値を決定した。指定された時点で器官を集め、溶解マトリックスチューブで均質化し(Fast Prep、2×15秒、強度4.5)、その一部をアッセイした。
【０２１０】
遺伝子発現は、ルシフェラーゼアッセイによって決定した。器官を集め、均質化し、実験を通し氷上に維持した。溶解物を遠心分離(10,000rpm、5分間)し、上清20μlを、96ウェル発光プレートで、ルシフェラーゼ活性について二重にアッセイした。結果は、図7〜10に示す。
【０２１１】
インビトロ遺伝子サイレンシング
細胞を、上記の方法に従って、PEG脂質複合体およびCMVプロモータ制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLPで、および抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPでトランスフェクトした。遺伝子発現は、ルシフェラーゼアッセイによって決定した。結果は、図17に示す。
【０２１２】
実施例7：PEGジアルキルオキシプロピル複合体を含むSPLPに封入された核酸の発現
本実施例は、PEGジアルキルオキシプロピル複合体を含むSPLPに封入された核酸の発現を比較する実験について記載する。全てのSPLP調合物は、CMVプロモータ(pLO55)の制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含む。
2008501730.tif 000015
【０２１３】
脂質(DSPC:CHOL:DODMA:PEG脂質)は、下記のモル比でSPLP内に存在した(20:55:15:10)。次の調合物を作製した：
A:PBS無菌濾過、5mL
B:PEG-DSGを含むpL055-SPLP、0.50mg/mLで2mL。
C:PEG-A-DSAを含むpL055-SPLP、0.50mg/mLで2mL。
D:PEG-A-DPAを含むpL055-SPLP、0.50mg/mLで2mL。
E:PEG-A-DMAを含むpL055-SPLP、0.50mg/mLで2mL。
2008501730.tif 000016
【０２１４】
0日目に、各マウスに1.5×106個のNeuro2A細胞を投与した。腫瘍が適切な大きさ(200〜400mm3)に達した時点でマウスを無作為化し、SPLP調合物またはPBSを静脈内(IV)注射によって単回投与し処理した。投与量は、投与日に行った体重測定に基づいた。SPLP投与48時間後にマウスを犠牲にし、それらの血液を採取し、次の組織を収集して、重量を測定し、直ちに凍結して、更なる分析まで-80℃で貯蔵した：腫瘍、肝臓(2分割)、肺、脾臓および心臓。
【０２１５】
集めた組織の遺伝子発現は、発現したルシフェラーゼレポータタンパク質の酵素活性をアッセイすることによって決定した。結果は、図11および12に示す。
【０２１６】
結果は、PEGジアルキルオキシプロピル(すなわちPEG-DAA)を含むSPLPは、PEGジアシルグリセロールを含むSPLPと実質同じ程度に、遠位腫瘍をトランスフェクトするのに好都合に使用できることを示している。さらには、PEGジアルキグリセロール含有SPLPに見られたトランスフェクションレベルは、PEGジアシルグリセロール(例えばPEG-DSG)含有SPLPに見られるものと同様である。結果はまた、PEG-ジアシルグリセロール系と同様に、非腫瘍組織では、殆どトランスフェクションが起こらなかったことも証明した。さらには、PEGジアルキルオキシプロピルを含むSPLPは、他のSPLP調合物に比べて低い毒性を示した。
【０２１７】
実施例8：PEGジアルキルオキシプロピル複合体を含むSNALP
本実施例は、一連のPEGジアルキルオキシプロピル脂質SNALP(即ち封入されたsiRNAを含有するSPLP)の生体内分布(局所および全身)ならびに薬物動態を分析した実験を記載した。
【０２１８】
局所生体内分布
Neuro-2a腫瘍担持マウスにおける、抗βガラクトシダーゼsiRNA含有SNALPの全身投与後に生じるSPLPの局所分布を、蛍光顕微鏡を用いて決定すること。
A:  PBS
B:  抗βgal siRNA-ローダミン-PE標識-DSPC:Chol:DODMA:PEG-A-DMA SNALP(1:20:54:15:10)
2008501730.tif 000017
【０２１９】
0日目に、各マウスに1.5×106個のNeuro2A細胞を投与した。腫瘍が適切な大きさ(200〜400mm3、典型的には第9〜12日目)に達した時点でマウスを無作為化し、100μgのsiRNAを含むSNALP調合物またはPBSを静脈内(IV)注射によって、230μlの総容積で単回投与し処理した。投与量は、投与日に行った体重測定に基づいた。SPLP投与24時間後にマウスを犠牲にし、それらの血液を採取し、次の組織を収集して、重量を測定し、直ちに凍結して、更なる分析まで-80℃で貯蔵した：腫瘍、肝臓(2分割)、肺、脾臓および心臓。
【０２２０】
SNALPの局所分布は、蛍光顕微鏡によって決定した。SNALPの蓄積は、例えば肝臓で見られ、PEGジアルキルオキシプロピルを含むSNALPが血管外に溢出できること、即ち血液から出て標的組織または器官に向かえることを証明している。
【０２２１】
薬物動態および全身生体内分布
本実施例は、Neuro2A腫瘍を皮下接種されたマウスにおける、CMVプロモータ(LO55)制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびに抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPの薬物動態および生体内分布を例示する。
2008501730.tif 000018
【０２２２】
全てのサンプルは、0.5mg/ml核酸で提供された。次のSPLPおよびSNALP調合物を調製した：
A.[3H]CHE-LO55-DSPC:Chol:DODMA:PEG-A-DMA(20:55:15:10)
B.[3H]CHE-抗-luc siRNA-DSPC:Chol:DODMA:PEG-A-DMA(20:55:15:10)
C.[3H]CHE-LO55-DSPC:Chol:DODMA:PEG-C-DMA(20:55:15:10)
D.[3H]CHE-LO55-pSPLP(PEI)(即ち、事前濃縮SPLP)
E.[3H]CHE-LO55-DSPC:Chol:DODMA:PEG-DSG(20:55:15:10)
2008501730.tif 000019
【０２２３】
0日目に、30匹のオスA/Jマウス(Jackson Laboratories)に、1.5×106細胞の投与量のNeuro 2A細胞を、総容積50μLのリン酸緩衝化食塩水として皮下に接種した。腫瘍が適切な大きさ(典型的には第9日目またはそれ以降)に達した時点で、上記のSPLPまたはSNALP調製物を200μl(100μg核酸)静脈内投与した。SPLPまたはSNALP投与から0.25、１、2、4および8時間後に、マウスの体重を測定し、血液(典型的には25μL)を尾切開して採取した。SPLPまたはSNALP投与24時間後にマウスを犠牲にし、血液を採取し、[3H]CHEのクリアランスをアッセイした。器官(例えば肝臓、肺、脾臓、腎臓、心臓)および腫瘍を収集して、[3H]CHEの蓄積を評価した。結果は、図13〜16に示す。
【０２２４】
全ての調合物のなかでPEG-DSGを含有するSPLPが最も長く血中に留まり、6時間後に、注射量の50%が残った。興味深いことに、pSPLPでは初めの15分以内に初期の急速なクリアランスが見られたが、これは他のいずれの調合物にも見られなかった。1時間後、pSPLPのクリアランスプロフィールは、SPLPとよく似ていた。このpSPLPサンプルの、初期の急速なクリアランスは、実際には2種類の粒子が存在しており、一方は非常に急速に排泄され、もう一方はSPLPと極めてよく似た挙動をすることを示していよう。
【０２２５】
C14 PEG-A-DMAを用い調合した抗Luc siRNA含有小胞(SNALP)は、C18 PEG-DSGを含有するSPLPよりも、より急速な血液からのクリアランスを示した。しかしながら、このSNALP調合物は、同一のPEG脂質を用いて調合されたSPLPより有意に遅い血液クリアランスを示した。この結果についての可能な理由は、siRNA含有粒子が、プラスミド含有SPLPよりも素早く細胞性免疫系から逃避できるからであろう。
【０２２６】
PEG-C-DMAを含むSPLPは、血液からの急速なクリアランスを証明したが、これは、PEG-A-DMAを含むSPLPについて観察されたものと実質的に同一であった。これら調合物の両方について、血漿半減期は約2時間であり、C18 PEG脂質を含有するSPLPより低かった。
【０２２７】
PEG-DSGを含有するSPLPは、組織1グラム当たり、10.9%注射量という最も高い腫瘍蓄積を示した。C14 PEG脂質、PEG-A-DMAおよびPEG-C-DMA、を含む2種類のSPLP調合物は、組織1グラム当たり6.1%および5.9%注射量の、より低い蓄積を示した。SiRNA SNALPは、同一のPEG脂質を有するSPLPサンプルより若干高い7.3%の腫瘍蓄積を示したが、このことは、このSNALPの血漿半減期とも比較的よく相関した。pSPLP調合物は、7.5%の腫瘍蓄積を示したが、これは類似のPEG-DSG SPLPより低かった。
【０２２８】
PEG-DSG含有SPLPおよびpSPLPの、心臓および肺での蓄積は、他のSPLPおよびSNALPより高く、C18 PEG脂質を有する粒子の長い血中半減期と一致した。試験した全サンプルについて、血漿半減期と肝臓への蓄積との間に逆相関関係があったが、この傾向が脾臓へのサンプル蓄積には見られないことは、驚くに値しない。腎臓への蓄積は、試験した全ての調合物で非常に低く、蓄積は1グラムの組織当たり注射量の1.2〜2.4%であった。
【０２２９】
実施例9：SNALPSを用いた遺伝子発現のサイレンシング
本実施例は、CMVプロモータの制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLPおよび抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPを同時投与した後の、Neuro2A腫瘍担持マウスにおける遺伝子発現のサイレンシングを例証する。
2008501730.tif 000020
2008501730.tif 000021
【０２３０】
36匹のオスA/Jマウス(Jackson Laboratories)に、0日に、1.5×106細胞投与量のNeuro 2A細胞を、全容積50μLのリン酸緩衝化食塩水液として皮下に接種した。腫瘍が適切な大きさに達した時点(一般的には9日目またはそれ以後)で、200〜240μlのPBS、SPLP、または上記実施例6の記載に従い調製したSNALP調合物(全核酸量100μg)を静脈内に投与した。PBS、SPLPまたはSPLPとSNALPとの混合物を投与した24、48または72時間後に、マウスを犠牲にして器官(例えば肝臓、肺、脾臓、腎臓、心臓)および腫瘍を集め、ルシフェラーゼ活性について評価した。結果は、図18〜22に示す。
【０２３１】
結果は、pL055 SPLPおよび抗luc siRNA SNALP(共にPEG-A-DMAを含有する)の同時投与は、単回静脈内投与48時間後に、ルシフェラーゼ遺伝子発現を最大40%下げることを実証した。
【０２３２】
実施例10：安定トランスフェクトCT26-CL25細胞でのβ-Gal活性のダウンレギュレーション
SNALPを、β-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子に対するsiRNA二重鎖を含むように調製し、β-ガラクトシダーゼ発現安定細胞株：2×104細胞／ウェルで接種されたCT26CL25に、1.0μg/mL siRNAの濃度で用いた。細胞は、24時間SNALPに暴露され、96時間後にβ-ガラクトシダーゼ活性を測定した。培養細胞の90%でサイレンシングが観察されたが、これはインビボにおける、細胞の40%での標的タンパク質のサイレンシングに対応する。
【０２３３】
実施例11：単回静脈内投与後の、ローダミン標識SNALPの肝臓内分布
SNALPを、使用するβ-ガラクトシダーゼレポーター遺伝子に対するsiRNA二重鎖を含むように調製し、尾静脈を通してA/Jマウスに静脈内投与した。24時間目に組織を集め、急速凍結し、切片にしてSNALPの散布を視覚化した。細胞は、ローダミンで染色され、核を染めるDAPIで二重染色された。SNALPのインビボ生体内分布はもっぱら肝臓であり、投与したSNALP物質の50%程が肝臓に送達された。肝臓に送達されたSNALPは、拡散パターンを示し、肝臓全体に分布した。
【０２３４】
実施例12：カチオン性脂質を含むSPLPに封入されたsiRNA送達後の、遺伝子発現のサイレンシング
本実施例は、下記を含むSNALPによるNeuro2A細胞のインビトロトランスフェクション後の、核酸の発現を比較した実験を記載する：(1)DODAC、DODMAまたはDLinDMA；(2)PEG-C-DMA；および(3)SNALPに封入されたルシフェラーゼに対するsiRNA二重鎖(即ち、次の配列：
2008501730.tif 000022
を含み、
2008501730.tif 000023
に相補的はDNA配列を標的化するsiRNA)。Neuro2A細胞は、CMVプロモータ(pLO55)制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドで安定にトランスフェクションされた。次に、安定にトランスフェクトされた細胞を下記を含むSNALPでトランスフェクトした：15、20、25、30、35または40%のDODAC、DODMAまたはDLinDMA；2%のPEG-C-DMA、およびSNALPに封入されているルシフェラーゼに対するsiRNA二重鎖。SNALPによるトランスフェクション48時間後に、ルシフェラーゼタンパク質の発現を測定した。30%DLinDMAを含むSNALPは、DODACまたはDODMAを含むSNALPに比べ、Neuro2A細胞でのルシフェラーゼ発現をより効率的に低下させた。これらの結果は、図23に示す。
【０２３５】
最も低い、見かけ上の相転移温度を持つ、最も融合能の高い脂質であるDLinDMAは、SNALPに組み入れた時に最大のノックダウンを生じ、ルシフェラーゼ発現は未処理のコントロールのわずか21%であった。これにDLenDNA調合物(32%)およびDODMA (54%)が続いた。ノックダウン効率とカチオン性脂質のHII相形成能力との間に観察された密接な対応関係は、この2つのパラメータが関連していることを示唆している。
【０２３６】
実施例13：不飽和カチオン性脂質を含有するSNALPは、高い遺伝子サイレンシング活性を示す
4種類のカチオン性脂質(即ち、DSDMA、DODMA、DLinDMAおよびDLenDNA)のそれぞれを含有するSNALPの、安定トランスフェクトNeuro2A細胞に遺伝子サイレンシングをもたらす能力について評価した。安定にトランスフェクトされ、ルシフェラーゼを発現しているNeuro2A細胞を、抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで、48時間処理した。遺伝子サイレンシング効率は、これら細胞に残存しているルシフェラーゼ活性を、ミスマッチsiRNAを含有するコントロールSNALPで処理した細胞に残存している該活性と比較することによって評価した。
【０２３７】
飽和脂質DSDMAを含む調合物は、活性を全く示さなかった。脂質のアルキル鎖の不飽和度が増すとRNA干渉能力が増し、DLinDMA粒子は遺伝子発現の80%のノックダウンを生じた。31P-NMRは、DLinDMAが、一連のもののなかで最も低い相転移温度を有すること、従って、最も融合性の高い脂質であることを明らかにした。最も不飽和脂質であるDLenDMAを含む粒子は、DLinDMAを含有する粒子に比べ、若干効率で劣った。全ての結果は、t検定によって有意であることが分かった(0.5μg/mlの siRNA濃度においてP<0.05、および1.0μg/mlのsiRNA濃度においてP<0.01)。誤差バーは、n=3の標準偏差を表している。結果は、図24に示す。
【０２３８】
実施例14：各種SPLP調合物による器官のインビボトランスフェクション
本実施例は、15%DLinDMAを含むSPLPを用いた器官のインビボトランスフェクションを使用して、CMVプロモータの制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを封入しているSPLPをNeuro2A腫瘍担持オスA/Jマウスに投与できることを証明する実験を記載する。SPLPの調合は下記の通りであった：
2008501730.tif 000024
【０２３９】
ルシフェラーゼ遺伝子発現は、肝臓、肺、脾臓、心臓および腫瘍について、SPLP静脈投与48時間後に評価した。結果は、図25に示す。
【０２４０】
実施例15：追加のSPLP調合物による腫瘍のインビボトランスフェクション
本実施例は、DLinDMAまたはDODMA、およびPEG-C-DMAを様々なパーセンテージ(15%、10%、5%または2.5%)で含むSPLPを用いて、器官のインビボトランスフェクションを証明する実験を記載する。ルシフェラーゼをコードするプラスミドを封入しているSPLPを、Neuro2A腫瘍担持オスA/Jマウスに投与した。SPLPの調合は下記の通りであった：
2008501730.tif 000025
【０２４１】
ルシフェラーゼ遺伝子発現は、SPLP静脈投与48時間後に、腫瘍について評価した。結果は、図26に示す。
【０２４２】
実施例16：PEG-C-DMAを含む脂質小胞の血液クリアランス
本実施例は、PEG-C-DMAを様々なパーセンテージで含む脂質小胞の血液クリアランス率を評価するために実施した実験を記載する。3H-CHE標識SPLP、SNALPまたは空小胞を、単一静脈投与量で、オスA/Jマウスに投与した。SPLPはカチオン性脂質のDODMAを含み、SNALPはカチオン性脂質DLinDMAを含んだ。脂質小胞の調合は下記の通りであった：
2008501730.tif 000026
【０２４３】
マウスの血漿中に残存する注射投与した脂質小胞のパーセンテージを、3H-CHE-標識SPLP、SNALP、または空小胞を投与した後、1、2、4および24時間目に測定した。結果は、図27に示す。
【０２４４】
実施例17：PEG-C-DMAを含む脂質小胞の生体内分布
本実施例は、PEG-C-DMAを様々なパーセンテージで含む脂質小胞の生体内分布を評価するために実施した実験を記載する。3H-CHE標識SPLP、SNALPまたは空小胞を、単一静脈投与量で、Nuero 2A腫瘍担持オスA/Jマウスに投与した。SPLPはカチオン性脂質のDODMAを含み、SNALPはカチオン性脂質DLinDMAを含んだ。脂質小胞の調合は次の通りであった：
2008501730.tif 000027
【０２４５】
注射投与した脂質小胞のパーセンテージを、3H-CHE-標識小胞投与48時後に、該マウスの肝臓、脾臓、肺および腫瘍について評価した。結果は、図28に示す。
【０２４６】
実施例18：遠位部腫瘍での遺伝子発現のサイレンシング
本実施例は、DLinDMAを含み、かつ抗ルシフェラーゼsiRNA配列を封入するSNALP投与後の、遠位部腫瘍での遺伝子サイレンシングを証明した実験を記載する。
【０２４７】
Neuro2A細胞を、CMVプロモータ(pLO55)の制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドで安定にトランスフェクトし、Neuro2A-G細胞を生成した。オスA/JマウスにNeuro2A-G細胞を接種した。抗ルシフェラーゼsiRNA配列(即ち、下記の配列：
2008501730.tif 000028
を含み：
2008501730.tif 000029
に相補的はDNA配列を標的化するsiRNA)を封入しているSNALPを、Neuro2A-G腫瘍担持A/Jマウスに静脈内投与した。SNALP調合物は下記の通りであった：
2008501730.tif 000030
【０２４８】
ルシフェラーゼ遺伝子発現を、DLinDMAを含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNA配列を封入しているSNALP投与48時間後に評価した。結果は、図29に示す。
【０２４９】
実施例19：インビトロでの、Neuro2A-G腫瘍細胞における遺伝子発現のサイレンシング
本実施例は、DLinDMAを含みかつ上記実施例3に記載の抗ルシフェラーゼsiRNA配列を封入しているSNALPと接触させた後の、哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングを証明する実験を記載する。Neuro2A細胞を、上記実施例3に記載のルシフェラーゼをコードするプラスミドで安定にトランスフェクトし、Neuro2A-G細胞を生成した。Neuro2A-G細胞を、SNALP調合物と24または48時間接触させた。SNALP調合物は、PEG-C-DLA(C12)またはPEG-C-DMA(C14)のいずれかを含み、かつ下記のものである：
2008501730.tif 000031
【０２５０】
ルシフェラーゼ遺伝子発現を、Neuro2A-G細胞と、抗ルシフェラーゼsiRNA配列を封入しているSNALPと接触させた24または48時間後に測定した。結果は、図30に示す。
【０２５１】
実施例20：インビトロでの、Neuro2A-G腫瘍細胞における遺伝子発現のサイレンシング
本実施例は、DLinDMAを含み、上記実施例3に記載の抗ルシフェラーゼsiRNA配列を封入しているSNALPと接触させた後の、哺乳動物細胞における遺伝子サイレンシングを証明する実験を記載する。Neuro2A細胞を、上記実施例3に記載のルシフェラーゼをコードするプラスミドで安定にトランスフェクトし、Neuro2A-G細胞を生成した。Neuro2A-G細胞を、クロロキン存在下および非存在下で、SNALP調合物と48時間接触させた。SNALP調合物は、様々なパーセンテージのPEG-C-DMA(C14)、およびDODMAまたはDLinDMAのいずれかを含有した。調合は下記の通りであった：
2008501730.tif 000032
【０２５２】
ルシフェラーゼ遺伝子発現を、Neuro2A-G細胞を、抗ルシフェラーゼsiRNA配列を封入しているSNALPと接触させた後、48時間目に測定した。結果は、図31に示す。
【０２５３】
上記記載は、例証であって制限するものではないことを理解しなければならない。上記記載を読むことによって、多くの態様が当業者に明らかになるだろう。それゆえに、本発明の範囲は、上記記載の参照によって定まるものではなく、添付の請求の範囲を参照することによって、かかる請求範囲が題するものに均等である全範囲に沿って定まるものとする。全ての論文および参照物の開示は、特許出願、特許およびPCT公報、ならびにGenBankアクセッション番号を含め、参照により全ての趣旨で全体として本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【０２５４】
【図１】本発明の2種類の例示的カチオン性脂質の構造を示す：1,2-ジリノレイルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)および1,2-ジリノレニルオキシ-N,N-ジメチルアミノプロパン(DLenDNA)。
【図２】DLinDMAの合成の概略を示す。
【図３】DLenDNAの合成の概略を示す。
【図４】DSPC:コレステロール:DODMA:PEG-DMGリポソームに封入された抗β-ガラクトシダーゼsiRNAのインビトロ送達による、CT26.CL25細胞でのβ-ガラクトシダーゼ発現のダウンレギュレーションを示す。
【図５】PEG-DAGを含有するSNALPがPEGセラミドC20を含有するSNALPと同等であることを示した、LUVを用いたクリアランス研究を示す。
【図６】PEG-DAGを含有するSNALPの薬物動態を示す。
【図７】PEG-DAGを含有するSNALPの生体内分布特性を示す。
【図８】Neuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、PEGセラミドC20含有SPLP対PEG-DAG含有SPLPのIV投与24時間後の、ルシフェラーゼ遺伝子発現を示す。
【図９】Neuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、PEGセラミドC20含有SPLP対PEG-DAG含有SPLPのIV投与48時間後の、ルシフェラーゼ遺伝子発現を示す。
【図１０】Neuro-2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、PEGセラミドC20含有SPLP対PEG-DAG含有SPLPのIV投与72時間後の、ルシフェラーゼ遺伝子発現を示す。
【図１１】PEG-DAA複合体およびPEG-DAG複合体を含むSPLPを静脈内投与した48時間後の、腫瘍におけるルシフェラーゼ遺伝子発現を表すデータを示す。
【図１２】PEG-DAA複合体およびPEG-DAG複合体を含むSPLPを静脈内投与した後の、肝臓、肺、脾臓、心臓および腫瘍におけるルシフェラーゼ遺伝子発現を表すデータを示す。
【図１３】PEG-DAA複合体およびCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPを投与した後の、Neuro2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおけるクリアランス研究からのデータを示す。
【図１４】Neuro2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、PEG-DAA複合体およびCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPの薬物動態特性研究からのデータを示す。
【図１５】PEG-DAA複合体またはPEG-DAG複合体を含みかつCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、PEG-DAG複合体を含みかつCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するpSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPを投与した後の、Neuro2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおけるクリアランス研究からのデータを示す。
【図１６】Neuro2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおける、PEG-DAA複合体またはPEG-DAG複合体を含みかつCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、PEG-DAG複合体を含みかつCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するpSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPの薬物動態特性研究からのデータを示す。
【図１７】PEG脂質複合体を含みかつCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG脂質複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理した、ルシフェラーゼ発現細胞におけるルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビトロデータを示す。
【図１８】PEG-DAA複合体を含みかつCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理した、Neuro2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおけるルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。
【図１９】PEG-DAA複合体を含みかつCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理した、Neuro2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおけるルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。
【図２０】PEG-DAA複合体を含みかつCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理した、Neuro2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおけるルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。
【図２１】PEG-DAA複合体を含みかつCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理した、Neuro2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおけるルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。
【図２２】PEG-DAA複合体を含みかつCMVプロモータ制御下のルシフェラーゼをコードするプラスミドを含有するSPLP、ならびにPEG-DAA複合体を含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを含有するSNALPで処理した、Neuro2a腫瘍担持オスA/Jマウスにおけるルシフェラーゼ発現のサイレンシングを証明するインビボデータを示す。
【図２３】DODAC、DODMAまたはDLinDMAを含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNA配列を封入しているSPLP(即ちSNALP)による、ルシフェラーゼを安定して発現しているNeuro2a細胞のインビトロトランスフェクション後の遺伝子発現のサイレンシングを表すデータを示す。
【図２４】SNALP媒介のインビトロ遺伝子サイレンシングを表すデータを示す。
【図２５】ルシフェラーゼをコードするプラスミド封入SPLPの静脈内送達48時間後の、腫瘍におけるルシフェラーゼ遺伝子発現を示すデータ。SPLPは、PEG-C-DMA複合体、およびDOMDMAまたはDLinDMAのいずれかを含む。PEG成分は、2000または750のいずれかの分子量を有する。
【図２６】ルシフェラーゼをコードするプラスミドを封入しているSPLPの静脈投与48時間後の、Neuro2A腫瘍担持オスA/Jマウスにおけるルシフェラーゼ遺伝子発現を示すデータ。SPLPは、様々なパーセンテージ(即ち15%、10%、5%または2.5%)のPEG-C-DMA、およびDODMAまたはDLinDMAのいずれかを含んでいた。
【図２７】様々なパーセンテージ(即ち2%、5%、10%または15%)のPEG-C-DMAを含有する、3H-CHE-標識SPLPまたはSNALP、あるいは空小胞の単回静脈内投与後の、オスA/Jマウスの血漿中に残存するSPLP、SNALPまたは空小胞の注射投与量パーセンテージを表すデータを示す。
【図２８】様々なパーセンテージのPEG-C-DMAを含む3H-CHE-標識調合物の単回静脈内投与48時間後の、Neuro2A腫瘍担持オスA/JマウスにおけるSPLP、SNALPまたは空小胞の生体内分布を表すデータを示す。SNALPおよび空小胞はDLinDMAを含んでいた。SPLPはDODMAを含んでいた。
【図２９】DLinDMAを含むSNALPの静脈内投与48時間後の、A/Jマウスにおける、遠位安定Neuro2A-G細胞でのルシフェラーゼ発現のサイレンシングを表すデータを示す。
【図３０】DLinDMAを含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを封入しているSNALP調合物送達後の、Neuro2A-G細胞におけるルシフェラーゼ発現のサイレンシングを表すデータを示す。
【図３１】DLinDMAを含みかつ抗ルシフェラーゼsiRNAを封入しているSNALP調合物送達後の、Neuro2A-G細胞におけるルシフェラーゼ発現のサイレンシングを表すデータを示す。SNALP調合物の送達は、クロロキン非存在下または存在下で実施した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月19日(2007.10.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
実施例1：材料および方法
材料：DPPS、1,2-ジステアロイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DSPC)およびコレステロールは、Avanti Polar Lipid(Alabaster, AL)より購入した。TNSは、Sigma-Aldrich Canada(Oakville, ON)より得た。RiboGreenは、Molecular Probes(Eugene, OR)より得た。アルキルメシレートは、Nu-Chek Prep, Inc. (Elysian, MN, USA)から購入した。siRNA(抗ルシフェラーゼおよびミスマッチコントロール)は、Dharmacon (Lafayette, CO, USA)より購入した。抗ルシフェラーゼセンス配列は、
2008501730.tif 000071
であった。抗ルシフェラーゼアンチセンス配列は、
2008501730.tif 000072
であった。他の化学薬品は、全てSigma-Aldrich (Oakville, ON, Canada)より購入した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
実施例12：カチオン性脂質を含むSPLPに封入されたsiRNA送達後の、遺伝子発現のサイレンシング
本実施例は、下記を含むSNALPによるNeuro2A細胞のインビトロトランスフェクション後の、核酸の発現を比較した実験を記載する：(1)DODAC、DODMAまたはDLinDMA；(2)PEG-C-DMA；および(3)SNALPに封入されたルシフェラーゼに対するsiRNA二重鎖(即ち、次の配列：
2008501730.tif 000073
を含み、
2008501730.tif 000074
に相補的はDNA配列を標的化するsiRNA)。Neuro2A細胞は、CMVプロモータ(pLO55)制御下にあるルシフェラーゼをコードするプラスミドで安定にトランスフェクションされた。次に、安定にトランスフェクトされた細胞を下記を含むSNALPでトランスフェクトした：15、20、25、30、35または40%のDODAC、DODMAまたはDLinDMA；2%のPEG-C-DMA、およびSNALPに封入されているルシフェラーゼに対するsiRNA二重鎖。SNALPによるトランスフェクション48時間後に、ルシフェラーゼタンパク質の発現を測定した。30%DLinDMAを含むSNALPは、DODACまたはDODMAを含むSNALPに比べ、Neuro2A細胞でのルシフェラーゼ発現をより効率的に低下させた。これらの結果は、図23に示す。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008501730000001.app
【国際調査報告】
2008501730.tif 000075
2008501730.tif 000076
2008501730.tif 000077
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