(57)【要約】本発明は、免疫学的障害を処置するための薬学的組成物および方法を提供する。本発明はまた、好酸球アポトーシスを誘発する薬学的組成物および方法、ならびにその必要な個体において好酸球アポトーシスを誘発する工程を含む、好酸球関連障害を処置するための方法を提供する。本発明はまた、免疫学的障害を処置または予防するための方法を提供する。この方法は、その必要な患者に対してＰｉｎ１インヒビターの有効量を投与する工程を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的障害を処置または予防するための方法であって、免疫学的障害を処置または予防を必要とする患者に対してＰｉｎ１インヒビターの有効量を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２】
前記Ｐｉｎ１インヒビターが、ドミナントネガティブなペプチドインヒビター、抗体、低分子インヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または短鎖干渉性核酸分子（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記免疫学的障害が好酸球関連障害である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記好酸球関連障害が、気管支喘息、好酸球関連鼻腔内炎症、または眼の好酸球関連炎症である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記免疫学的障害が喘息である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記免疫学的障害が臓器拒絶に関連する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記臓器拒絶が器官移植に関連する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｐｉｎ１インヒビターが、器官または組織の拒絶を予防するために免疫抑制剤と組み合わせて投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記免疫抑制剤がシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６であり、かつ前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
好酸球とＰｉｎ１インヒビターとを接触させる工程を包含する、好酸球中でアポトーシスを誘発するための方法。
【請求項１２】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがドミナントネガティブなペプチドインヒビター、抗体、低分子インヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または短鎖干渉性核酸分子（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
Ｐｉｎ１インヒビターを特定する方法であって、以下の工程：
ａ．ジュグロンに構造的に関連する１つまたは複数の有機化合物をスクリーニングする工程と；
ｂ．可能性のあるインヒビターがＰｉｎ１の活性を阻害するか否かを決定する工程と；
を包含する、方法。
【請求項１５】
免疫学的障害を処置または予防するための化合物を特定する方法であって、以下の工程：
ａ．Ｐｉｎ１を発現する複数の細胞を提供する工程と、
ｂ．候補化合物の存在下および非存在下において、Ｐｉｎ１の活性について細胞をアッセイする工程と、
ｃ．該Ｐｉｎ１活性が該候補化合物の存在下において、該候補化合物の非存在下よりも少ない場合、免疫学的障害を処置するための化合物として該化合物を特定する工程と、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ともに、２００５年５月１２日に出願された米国仮特許出願第６０／６８０，３８７および同第６０／６８０，４４１の利益を主張する（これらの各々の開示は、本明細書に参考として援用される。）。
【０００２】
これらの研究は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の補助金（グラント番号ＨＬ０５６３９６）によりなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（発明の分野）
本発明は、免疫学的障害を処置するための薬学的組成物および方法に関する。詳細には、本発明は、好酸球関連障害を処置するための薬学的組成物および方法、ならびにその必要な個体において好酸球アポトーシスを誘発するための方法に関する。本発明はまた、活性化された免疫および他の細胞によるサイトカイン発現をブロックするための薬学的組成物および方法、ならびに器官移植拒絶を予防または軽減するための方法および薬学的組成物を提供する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
哺乳動物の造血系は、細胞免疫を媒介する多数の細胞タイプを含む。哺乳動物の器官において良好な健康状態には重要であるが、複雑な免疫学的な系の調節不全は、多数の病理的な疾患および障害においてある役割を果たすとされている。さらに、器官移植においてと同様、免疫学的な系の正常な働きでさえ不利であり得、そして望ましくない結果となる場合がある。
【０００５】
免疫学的な系がある役割を果たすと考えられる哺乳動物の疾患状態の１例は、喘息である。正常な個体由来の末梢血から単離された好酸球の集団は、培養の３日後に約５％という生存している細胞を含む。対照的に、喘息の個体から単離された好酸球の培養物は、３日後に約９５％という生存している細胞を含む。この相違がヒトにおける喘息の疫学において重要であるということが、ヒトおよびマウスの喘息モデルにおける研究によって支持されており、ここでは喘息は、アレルゲンを動物に注射し、続いてそのアレルゲンを吸入チャレンジすることによって誘発され得る。注目すべきであるが、このプロトコールが好酸球を欠くマウスで用いられた場合には、喘息は生じない。好酸球についての喘息における役割は、好酸球の特定の生理学的特性によってさらに示される；例えば、これらの細胞は、血管作動性物質およびサイトカインを放出し得、そして肺疾患の瘢痕化をもたらし得る。喘息の影響は、喘息患者の肺における好酸球集団を排除または減少させることによって減弱または排除され得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、増大する好酸球の活性化および蓄積と関連する、喘息のような障害を有する患者の肺において好酸球の生存または持続を阻害または軽減し得る、臨床的に有効な化合物および薬剤が、当該分野で必要である。同様に、ドナーの組織および器官の移植レシピエントの免疫学的拒絶の効力および持続を軽減させるために、組織および器官移植片レシピエントを処置するためのさらに有効な方法が、当該分野で必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
本発明は、動物の免疫学的な系を含む免疫学的な系または細胞の機能不全によって生じる病理的な疾患および障害を含む、免疫学的障害、ならびに免疫学的な系または免疫学的な系を含む細胞の正常な機能が移植片拒絶のような病変を生じる、器官移植レシピエントにおいて生じるような障害を処置または予防するための、薬学的組成物および方法を提供する。本明細書において提供される場合、本発明は、Ｐｉｎ１インヒビター化合物を含む薬学的組成物、ならびにＰｉｎ１インヒビターおよび／またはその薬学的に受容可能な塩の治療上有効な量をこのような処置の必要な患者に投与する工程を包含する、この薬学的組成物を用いる方法、を提供する。
【０００８】
特定の局面では、本発明は、免疫系または免疫学的な系を含む細胞の病的な活性または調節不全で特徴付けられるかまたはそれに関連する疾患および障害を処置するための薬学的な組成物および方法を提供する。特定の局面では、本発明は、免疫細胞、例えば、末梢血単球そして特に好酸球において、アポトーシスを誘発するための薬学的組成物および方法を提供し、この方法は、このような細胞とＰｉｎ１インヒビターまたはその薬学的組成物とを接触させる工程を包含する。
【０００９】
他の局面では、本発明は、免疫細胞、例えば、末梢血単球および詳細には好酸球の存在、および詳細には過剰、持続または活性によって誘発される病的な影響を阻害または軽減するための薬学的組成物および方法を提供し、この方法は、治療上有効な量のＰｉｎ１インヒビターおよび／またはその薬学的に受容可能な塩を、免疫学的疾患または障害、詳細には、好酸球の過剰、持続または活性化によって特徴付けられる疾患または障害などを有するかまたは有すると疑われる患者に対して投与する工程を包含する。特定の実施形態では、この方法は、末梢血単球および詳細には好酸球においてアポトーシスを誘発する工程を包含する。特定の実施形態では、本発明は、喘息を処置する薬学的組成物および方法を提供する。
【００１０】
他の局面では、本発明はさらに、器官移植を含む組織移植によって生じる急性および慢性の組織拒絶を寛解させるための薬学的組成物および方法を提供し、この方法は、その必要な患者に対して１つ以上のＰｉｎ１インヒビターの治療上有効な量を投与する工程を包含する。特定の局面では、器官移植レシピエントは、術前、術中、および／または術後にＰｉｎ１インヒビターで処置され得る。
【００１１】
本発明の特定の好ましい実施形態は、特定の好ましい実施形態および特許請求の範囲の以下のより詳細な説明から明白になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（好ましい実施形態の詳細な説明）
本発明は、詳細には、免疫細胞においてアポトーシスを誘発することによって、免疫細胞のレベル、量または活性を軽減するための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、詳細には末梢血単球および詳細には好酸球に関係する。本明細書において開示される場合、本発明の組成物および方法は、この細胞とＰｉｎ１インヒビターまたはその薬学的組成物とを接触させる工程を包含する。
【００１３】
特定の実施形態では、本発明は、免疫学的障害を有するか、または有すると疑われる患者において免疫学的障害を処置または予防する薬学的組成物および方法を提供し、この方法は、この患者に対して１つまたは複数のＰｉｎ１インヒビターを投与する工程を包含する。免疫学的障害としては一般に、動物における免疫学的な系または免疫学的な系を含む細胞の調節不全によって生じる病理的疾患および障害、ならびに免疫学的な系または免疫学的な系を含む細胞の正常な機能が移植片拒絶のような病理的結果を生じる、器官移植レシピエントにおいて生じるような障害が挙げられる。本発明は詳細には、Ｐｉｎ１インヒビター化合物を含む薬学的組成物、ならびにＰｉｎ１インヒビターおよび／またはその薬学的に受容可能な塩の薬学的組成物の治療上有効な量をこのような処置の必要な患者に投与することによってこのような薬学的組成物を用いるための方法を提供する。
【００１４】
本明細書において用いる場合、「患者（ｐａｔｉｅｎｔ）」、「哺乳動物（ｍａｍｍａｌ）」および「動物（ａｎｉｍａｌ）」という用語は、ヒトおよび動物の被験体を包含する。
【００１５】
本明細書において用いる場合、「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「処置する、処理する（ｔｒｅａｔ）」とは、治療処置および予防的な方法の両方を指す。処置の必要なものとしては、免疫学的障害を既に有しているもの、およびその障害を有する傾向にあるもの、またはその障害が予防されるべきものが挙げられる。
【００１６】
本明細書において用いる場合、「障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」とは、本発明に従う処置に由来して有利である任意の状態である。「障害」および「状態（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ）」は、本明細書において交換可能に用いられ、そして不適切な免疫応答に関連する慢性および急性の免疫学的障害または免疫学的疾患を含み、これには哺乳動物を免疫学的障害に対してかかり易くさせる病理的状態を含む。
【００１７】
本明細書において用いる場合、「免疫学的障害（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」とは、任意の医学的状態または障害であって、免疫細胞が組織および／または器官に浸潤して、それによって機能の損傷または損失を生じる状態または障害を包含し、これには、限定はしないが、好酸球関連障害、自己免疫疾患、移植片生着、骨髄および器官移植、輸血に起因する異種感作（ａｌｌｏｓｅｎｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ）、毒素性ショック症候群、Ｔ細胞依存性Ｂ細胞媒介性疾患、慢性免疫細胞機能不全に関連する慢性炎症性疾患、リンパ球増殖性障害（例えば、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症およびクリオグロブリン血症）およびガンが挙げられる。自己免疫疾患の非限定的な例としては、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、免疫性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、多発性硬化症、糖尿病および乾癬が挙げられる。慢性炎症性疾患の非限定的な例としては、炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎）、グレーブス病、橋本甲状腺炎および真性糖尿病が挙げられる。
【００１８】
「免疫学的疾患（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ）」および「免疫学的障害（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」という用語はまた、超過敏反応のような抗体産生の阻害によって寛解される任意の臨床状態を包含する。超過敏反応は、例えば、花粉症（枯草熱）（ｈａｙ  ｆｅｖｅｒ）、アレルギー、喘息、アトピーおよび急性の浮腫によって生じ得る。抗体媒介性の超過敏反応を生じる疾患の非限定的な例としては、全身性エリテマトーデス、関節炎（例えば、関節リウマチ、反応性関節炎、乾癬性関節炎）、腎症（例えば、糸球体腎炎、膜性、膜性増殖性、巣状分節状、巣状壊死性、半月状、増殖性−尿細管症）、皮膚障害（例えば、天疱瘡および類天疱瘡、結節性紅斑）、内分泌障害（例えば、甲状腺炎、グレーブス病、橋本病およびインスリン依存性糖尿病）、種々の肺症（例えば、外因性の肺胞炎）、種々の脈管障害、腹腔疾患、ＩｇＡの異常生成を伴う疾患、多くの貧血および血小板減少症、ギラン・バレー症候群および重症筋無力症が挙げられる。
【００１９】
他の実施形態では、本発明は、動物の免疫系の特定の細胞成分、詳細には好酸球に対する薬学的組成物および方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、特に免疫細胞においてアポトーシスを誘発することによって、免疫細胞のレベル、量または活性を軽減するための薬学的組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は詳細には、末梢血単球、特に好酸球に関する。さらに他の実施形態では、本発明は、免疫学的障害、例えば、末梢血単球細胞、特に好酸球によって特徴付けられるかまたは好酸球に関連する障害を有するかまたは有すると疑われる患者を処置する方法を提供し、この方法は、このような細胞において、そして詳細にはこのような患者における好酸球においてアポトーシスを誘発する工程を包含する。
【００２０】
本明細書において用いる場合、「末梢血単球で特徴付けられるかまたは末梢血単球に関連する（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄ  ｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｅｌｌ）」障害、および「好酸球関連障害（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」とは、末梢血単球、特に好酸球の活性化および蓄積のレベルが上昇され、そして病態生理学の条件で重要な役割を果たす、生理学的な状態または病態をいう。好酸球関連障害の非限定的な例としては、過敏性症候群、例えば、気管支喘息、慢性好酸球性肺炎、春季カタル、アレルギー性結膜炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性副鼻腔炎およびアレルギー性胃腸病、ならびに他の好酸球関連疾患、例えば、好酸球性胃腸炎、アトピー性皮膚炎、水疱性類天疱瘡、好酸球増多関連偶発性血管性浮腫および潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００２１】
特定の実施形態では、本発明は、末梢血単球細胞、詳細には好酸球においてアポトーシスを誘発するための方法および薬学的組成物を提供する。本明細書において用いる場合、末梢血単球、詳細には好酸球のアポトーシスは、この細胞と１つまたは複数のＰｉｎ１インヒビターとを接触させることによって誘発される。本明細書において用いる場合、「Ｐｉｎ１インヒビター（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）」は、例えば、ドミナントネガティブなペプチド、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または短鎖干渉性核酸分子（ｓｉＲＮＡ）、または低分子インヒビター、例えば、ジュグロンまたはＰｉＢ（ジエチル−１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８リン酸化テトラオキソベンゾ［ｌｍｎ］フェナントロリン−２，７−ジアセテート）エチル１，３，６，８−テトラヒドロ−１，３，６，８−テトラオキソ−ベンゾ［ｌｍｎ］フェナントロリン−（２Ｈ，７Ｈ）−ジアセテート）であってもよい。
【００２２】
「ドミナントネガティブなペプチド（ｄｏｍｉｎａｎｔ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、活性なタンパク質を細胞機構とのその相互作用から除き得るか、またはこの活性なタンパク質と競合し得、それによって活性なタンパク質の影響を軽減し得るタンパク質の改変体である。例えば、末梢血単球、特に好酸球におけるドミナントネガティブなＰｉｎ１ペプチドの発現または誘導は、下の実施例に記載されるＴＡＴ−ＷＷＰｉｎ１ドミナントネガティブインヒビターのように、活性なＰｉｎ１タンパク質の機能の低下を生じ、そしてアポトーシスを誘発する。当業者は、Ｐｉｎ１タンパク質のドミナントネガティブな改変体について能力を評価し得、そして標準的な突然変異誘発技術を用いて、本発明の方法において有効な１つ以上のドミナントネガティブな改変体ポリペプチドを作成し得る。例えば、天然のＰｉｎ１ペプチドの配列は、部位特異的突然変異誘発、スキャニング突然変異誘発、部分的遺伝子欠失または短縮などによって変異され得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）。突然変異誘発されたＰｉｎ１ペプチドの集団は、例えば、下の実施例に記載された方法を用いてＰｉｎ１活性の減少または阻害のために試験され得る。このようなペプチドは、細胞に直接、単独で、または例えば、ペネトラチン（ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）タグ（ＨＩＶまたはアンテナエペディア（ａｎｔｅｎｎａｅｐｅｄｉａ））を介して、標的もしくはキャリア分子に結合体化されて導入されてもよいし、あるいはペプチドをコードする遺伝子構築物（例えば、ウイルスベクター中において細胞へ導入されたポリヌクレオチドによってコードされる）の標的化導入によってこのような細胞中で発現されてもよい。
【００２３】
他の実施形態では、本発明は、Ｐｉｎ１に選択的に結合する抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメント、およびＰｉｎ１タンパク質の活性を選択的に阻害するかまたは妨害するための方法を提供する。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、ならびにその免疫学的に活性なフラグメントの調製のための標準的な方法は、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ（１９８８，ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）に記載されるように、当該分野で周知である。抗体フラグメント、特にＦａｂフラグメント、ならびにエピトープ結合能力および特異性を保持する他のフラグメントを生成するための方法も周知であって、「ヒト化（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ）」抗体を含む、完全にヒト抗体およびキメラ抗体も同様である。「ヒト化」抗体としては、例えば、ヒト抗体の一部でマウス抗体の特定の部分を置換することによって、ヒト被験体に対する投与の間に生じ得る負の免疫の影響を減じるために、「ヒト化」されている、マウスで生成された抗体が挙げられる。従って、本発明は、限定はしないが、１つ以上の領域が相同なヒト部分または非ヒト部分によって置換されている単鎖抗体、単鎖Ｆｖ抗体、Ｆ（ａｂ）抗体、Ｆ（ａｂ）’抗体および（Ｆａｂ’）２抗体、キメラ抗体、および完全ヒト抗体を含む、Ｐｉｎ１の抗体インヒビターの使用を包含する。単鎖抗体は、国際特許出願公開番号ＷＯ８８／０１６４９および米国特許第４，９４６，７７８号および同第５，２６０，２０３号に詳細に考察される。このようなインヒビターは、例えば、ペネトラチンタグ（ＨＩＶまたはアンテナエペディア）を介して、または組み換え方法（例えば、ウイルスベクターにおいて細胞へ導入されたポリヌクレオチドによってコードされる）によって送達され得る。
【００２４】
さらなる実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、末梢血単球、特に好酸球においてアポトーシスを誘発するためにＰｉｎ１活性を阻害するために用いられ得る。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、発現制御配列（三重らせん形成）に対して、またはＰｉｎ１のｍＲＮＡに対して相補的であって、かつハイブリダイズする核酸分子であってもよい。例えば、Ｐｉｎ１遺伝子の少なくとも一部に対して相補的である配列を有する、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡ分子が、細胞に導入され得る。アンチセンスプローブは、当該分野で公知のようなＰｉｎ１遺伝子の配列を用いる利用可能な技術によって設計され得る。代表的には、各々のこのようなアンチセンス分子は、Ｐｉｎ１のｍＲＮＡの開始部位（５’末端）に相補的である。アンチセンス分子が対応するＰｉｎ１のｍＲＮＡにハイブリダイズする場合、このｍＲＮＡの翻訳は妨げられるかまたは減少される。
【００２５】
他の実施形態では、Ｐｉｎ１インヒビターは、短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）であってもよい。「短鎖干渉性ＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）」または「ｓｉＲＮＡ」という用語は本明細書において用いる場合、例えば、Ｂａｓｓ，２００１，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４２８〜４２９；Ｅｌｂａｓｈｉｒら、２００１，Ｎａｔｕｒｅ  ４１１：４９４〜４９８；およびＫｒｅｕｔｚｅｒら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４４８９５；Ｚｅｒｎｉｃｋａ−Ｇｏｅｔｚら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／３６６４６；Ｆｉｒｅ，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／３２６１９；Ｐｌａｅｔｉｎｃｋら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／０１８４６；ＭｅｌｌｏおよびＦｉｒｅ，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／２９０５８；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓ−Ｄｅｐａｉｌｌｅｔｔｅ，国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ９９／０７４０９；およびＬｉら、国際ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／４４９１４に開示されるようにＲＮＡ干渉すなわち「ＲＮＡｉ」し得る二本鎖の核酸分子をいう。本明細書において用いる場合、ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡのみを含む分子に限定される必要はなく、さらに、ＲＮＡｉの能力または活性を有する化学的に改変されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを包含してもよい。ｓｉＲＮＡ分子は、例えば、Ａｍｂｉｃｏｎ，Ｉｎｃ．（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を通じて利用可能なアルゴリズムおよび生成物を用い、当該分野で公知の方法を用いて設計され得る。
【００２６】
本発明のＰｉｎ１  ｓｉＲＮＡ分子は、自己相補性のセンスおよびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であって、アンチセンス領域がＰｉｎ１またはその一部のヌクレオチド配列に相補的であるヌクレオチド配列を含み、かつこのセンス領域がＰｉｎ１核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する、二重ポリヌクレオチド分子であってもよい。このＰｉｎ１のｓｉＲＮＡ分子は、２つの別々のオリゴヌクレオチドであって、一方の鎖がセンス鎖であって他方がアンチセンス鎖であり、このアンチセンス鎖およびセンス鎖が自己相補性である、オリゴヌクレオチドからアセンブリされてもよい。Ｐｉｎ１のｓｉＲＮＡ分子はまた、核酸ベースまたは非核酸ベースのリンカーによって連結された自己相補性センス領域およびアンチセンス領域を有する単一のオリゴヌクレオチドからアセンブリされてもよい。このＰｉｎ１のｓｉＲＮＡ分子は、実質的に対称的な二重鎖、非対称的な二重鎖、ヘアピン、または非対称性のヘアピン二次構造を形成し得るポリヌクレオチドであってもよい。このＰｉｎ１のｓｉＲＮＡ分子はまた、例えば、Ｍａｒｔｉｎｅｚら、２００２，Ｃｅｌｌ  １１０：５６３〜５７４およびＳｃｈｗａｒｚら、２００２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  １０：５３７〜５６８に考察されるように、Ｐｉｎ１ヌクレオチド配列またはその一部に対して相補的であるヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドであって、さらに末端リン酸基、例えば、５’，３’−二リン酸または５’−リン酸を含み得る一本鎖ポリヌクレオチドを含んでもよい。
【００２７】
一本鎖ヘアピン構造を含む本発明のＰｉｎ１  ｓｉＲＮＡ分子は、相補的な配列のハイブリダイゼーションを可能にするスペーサー配列によって隔てられた約１５〜約３０のヌクレオチドの２つの相補的な配列を有する、約３６〜約７０ヌクレオチド長であってもよい。従って、一本鎖ヘアピン構造は、この分子の二重部分を含む約１５〜約３０塩基対を有する。１実施形態では、ヘアピンｓｉＲＮＡは、相補的なｓｉＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションに適合する長さの二重鎖部分およびループ部分において約１８、１９、２０または２１塩基対を有する。ヒトＰｉｎ１は、アクセッション番号ＮＭ＿００６２２１（ＧｅｎＢａｎｋ，ＮＣＢＩ）によって特定された核酸配列によってコードされ、これから有効なｓｉＲＮＡ種が同定され得る。
【００２８】
さらに他の実施形態では、Ｐｉｎ１活性は、低分子インヒビターを用いて阻害され得る。有機低分子のライブラリーは、商業的に入手可能である（例えば、ＣｈｅｍＢｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡおよびＬＩＯＮ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）し、または標準的な方法（例えば、ＴｈｏｍｐｓｏｎおよびＥｌｌｍａｎ，１９９６，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９６：５５５〜６００）に従って調製されてもよい。低分子ライブラリーは、例えば、下の実施例に記載される方法を用いてＰｉｎ１のインヒビターについてスクリーニングまたはアッセイされ得る。特定の実施形態では、ジュグロン、ジュグロンの薬学的に受容可能な塩、および／またはジュグロンを含む組成物は、Ｐｉｎ１の低分子インヒビターとして有用である。
【００２９】
特定の実施形態では、低分子Ｐｉｎ１インヒビターは、ジュグロンのような公知のＰｉｎ１インヒビターの構造的な特徴に基づいて構造に基づく薬物デザインを用いて開発され得る。構造に基づく薬物デザインの種々の方法は、当該分野において、例えば、Ｍａｕｌｉｋら、１９９７、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，に開示されており、これは本明細書に開示される全ての引用文献、出願および特許と同様に、その全体が参照によって本明細書に援用される。Ｍａｕｌｉｋらは、例えば、指示されたデザインであって、適切に選択されたフラグメントのフラグメントライブラリーから新規な分子を作製するプロセスを使用者が指示するデザインの方法；ランダムなデザインであって、使用者がフラグメントおよびその組み合わせをランダムに変異させるように遺伝子アルゴリズムまたは他のアルゴリズムを用いるが、同時に候補のインヒビター／化合物／アポトーシス誘発因子の適応度を評価するように選択基準を適用するランダムデザイン；ならびにグリッドベースのアプローチであって、３つの三次元レセプター構造と低分子フラグメントプローブとの間の相互作用エネルギーを使用者が計算し、その後に有益なプローブ部位を一緒に連結させるグリッドベースのアプローチ、を開示する。
【００３０】
いくつかのコンピュータープログラムが、当該分野で公知であって、本発明の可能性のあるインヒビターを設計するのにおいて用いられ得、これには限定はしないが以下が挙げられる：
ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，１９８５，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：８４９〜８５７、これは種々の官能基の特徴を有するプローブと高分子表面との間の可能性のある相互作用部位を決定するプログラムであって、類似の阻害性タンパク質または分子の構造を決定するための表面部位を分析するために用いられ得る。ＧＲＩＤ計算は、プローブとして分子上に適切な阻害性の基を用い（例えば、プロトン化した一級アミン）、適切なエネルギーコンターレベル（ｅｎｅｒｇｙ  ｃｏｎｔｏｕｒ  ｌｅｖｅｌｓ）でアクセス可能な位置の周囲に潜在的なホットスポットを特定するために用いられる。ＧＲＩＤはＯｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能である；
ＭＣＳＳ（ＭｉｒａｎｋｅｒおよびＫａｒｐｌｕｓ，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：２９〜３４）。ＭＣＳＳは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．より入手可能である。
ＡＵＴＯＤＯＣＫ（ＧｏｏｄｓｅｌｌおよびＯｌｓｅｎ，１９９０，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：１９５〜２０２）。ＡＵＴＯＤＯＣＫは、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である；
ＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚら，１９８２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９〜２８８）。プログラムＤＯＣＫは、活性部位またはリガンド結合部位を分析するために用いられ得、そして相補的な立体的特性を有するリガンドを示唆する。ＤＯＣＫは、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である；
ＡＬＡＤＤＩＮ（Ｖａｎ  Ｄｒｉｅら，１９８９，Ｊ．Ｃｏｍｐ−Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．３：２２５）；
ＣＬＩＸ（ＤａｖｉｅおよびＬａｗｒｅｎｃｅ，１９９２，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １２：３１〜４１）；
ＧＲＯＵＰＢＵＩＬＤ（ＲｏｔｓｔｅｉｎおよびＭｕｒｃｋｏ，１９９３，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１７００）；
ＧＲＯＷ（ＭｏｏｎおよびＨｏｗｅ，１９９１，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １１：３１４）；
ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，１９９２，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ  ６：６１〜７８；ならびにＲｏｔｓｔｅｉｎおよびＭｕｒｃｋｏ，１９９２，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１７００〜１７１０）。ＬＵＤＩは、Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能である；
ＬＥＧＥＮＤ（ＮｉｓｈｉｂａｔａおよびＩｔａｉ，１９９１，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４７：８９８５）。ＬＥＧＥＮＤは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓから入手可能である；ならびにＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏから入手可能）。
【００３１】
他の分子モデリング技術も、本発明に従って用いられ得、これには限定はしないが、Ｃｏｈｅｎら，１９９０，Ｊ．Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．３３：８８３〜８９４；ＮａｖｉａおよびＭｕｒｃｋｏ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２：２０２〜２１０；ならびにＪｏｒｇｅｎｓｅｎ，１９９８，「ＢＯＳＳ−Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ」Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｐ．Ｖ．Ｒ．Ｓｃｈｌｅｙｅｒ編）Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓｔｒａ，Ａｔｈｅｎｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．５：３２８１〜３２８５）が挙げられる。
【００３２】
１実施形態では、モデリングの間に、薬剤として投与される分子について有益であり得る化学部分を潜在的なインヒビターに導入することが可能であり得る。例えば、Ｐｉｎ１に対するインヒビターの結合に直接影響し得ないが、例えば、薬学的に受容可能なキャリアにおけるこのインヒビターの全体的な溶解度、このインヒビターのバイオアベイラビリティおよび／またはこのインヒビターの毒性に寄与する化学部分を、この潜在的なインヒビターに導入するかまたはそれから除くことが可能であり得る。目的のインヒビターの薬理学を最適化するための考慮および方法は、例えば、「Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，」１９８５，第８版（Ｇｏｏｄｍａｎ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｒａｌｌ，Ｎｉｅｓ，＆Ｔａｙｌｏｒ編），Ｐｅｒｇａｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ａｎｄ  Ｄｕｆｆｙ，２０００，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１０：１１５５〜１１５８に見出され得る。
【００３３】
また、コンピュータープログラム「ＱｉｋＰｒｏｐ」（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ，Ｐｏｒｔｌａｎｄ，ＯＲ）は、目的の有機分子の物理的に有意な説明および薬学的に関連する特性のために迅速な予測を提供するために用いられ得る。
【００３４】
潜在的なインヒビターはまた、コンピューターモデリングプログラムで構造的なアナログを体系的に改変することによって、Ｐｉｎ１インヒビター、例えばジュグロンに対するそれらの構造的な類似性に基づいて選択され得る。例えば、このような分析は、ＨＩＶプロテアーゼインヒビターを開発するために記載されている（Ｌａｍら，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：３８０〜３８４；Ｗｌｏｄａｗｅｒら、１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：５４３〜５８５；Ａｐｐｅｌｔ，１９９３，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  １：２３〜４８；Ｅｒｉｃｋｓｏｎ，１９９３，Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  １：１０９〜１２８）。
【００３５】
コンピューターモデリングを用いて設計された候補インヒビターは、化合物の市販のライブラリーから得てもよいし、または新規に合成されてもよい。化学的合成の適切な方法としては、当業者に公知の医薬品化学およびコンビナトリアル化学技術が挙げられる（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２版（Ｊ．Ｍａｒｃｈ）１９７７，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ  Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＢ．Ａ．Ｂｕｎｉｎ，Ｔｈｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｉｎｄｅｘ，１９９８，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと）。
【００３６】
候補インヒビターは、多くの従来の結合アッセイ、例えば、固体支持体上の放射性リガンドレセプター結合アッセイ、または溶液中で行われる蛍光−偏光アッセイなどのうちの１つで結合活性についてスクリーニングされてもよい（例えば、Ｉｍｍｕｎｅ  ａｎｄ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｓｓａｙｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｉｎ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｐａｔｒｉｃｋ  Ｅｎｇｌｅｂｉｅｎｎｅ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ  ２０００を参照のこと）。
【００３７】
潜在的なインヒビターが、Ｐｉｎ１の活性を阻害するか否かを決定することは、例えば、下の実施例に記載されるような好酸球アポトーシスアッセイを用いて達成され得る。
【００３８】
別の実施形態では、Ｐｉｎ１インヒビターを特定するための本発明の方法は、以下の工程を包含する：（ａ）ジュグロンのようなＰｉｎ１インヒビターに構造的に関連する１つまたは複数の有機化合物をスクリーニングする工程と；（ｂ）この潜在的なインヒビターがＰｉｎ１の活性を阻害するか否かを決定する工程。１局面では、このスクリーニングは、とりわけ、上記のようなコンピューター補助のモデリングツールを用いて、構造／活性の関係の分析によって同定されたファルマコフォアまたは構造的な特徴を用いる工程を包含する。潜在的なインヒビターの活性を決定する工程は、上記のように達成され得る。
【００３９】
別の実施形態では、本発明は、免疫学的障害を処置するための化合物を特定する方法を提供し、この方法は、以下：（ａ）Ｐｉｎ１を発現する複数の細胞を提供する工程と、（ｂ）候補化合物の存在下および非存在下において、Ｐｉｎ１の活性について細胞をアッセイする工程と；（ｃ）Ｐｉｎ１活性が候補化合物の非存在下よりも候補化合物号物の存在下で少ない場合、免疫学的障害を処置するための化合物としてこの化合物を特定する工程とを包含する。Ｐｉｎ１活性についてのアッセイは、例えば、本明細書において記載される方法を用いて達成され得る。
【００４０】
ファルマコフォアの概念は、文献中で十分に記載されている（例えば、Ｍａｙｅｒら、１９８７，Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ  １：３〜１６；ＨｏｐｆｉｎｇｅｒおよびＢｕｒｋｅ，１９９０，Ｃｏｎｃｅｐｔｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ，Ｍ．Ａ．ＪｏｈｎｓｏｎおよびＧ．Ｍ．Ｍａｇｇｉｏｒａ編、Ｗｉｌｅｙを参照のこと）。１実施形態では、本発明のファルマコフォアは、ジュグロンのようなＰｉｎ１インヒビターの最も重要な共通の構造的特徴に基づいて生成される。本明細書において用いる場合、「ファルマコフォアコンピュータープログラム（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）」は、ジュグロンのようなＰｉｎ１インヒビターと構造的に類似である化合物を同定するための３次元（３−Ｄ）分子データベースのコンピューターマイニングのために用いられるソフトウェアを包含し、そしてＰｉｎ１活性を阻害し得る。
【００４１】
本発明の方法において用いられ得るファルマコフォアのコンピュータープログラムとしては、限定はしないが、ＤＩＳＣＯ（Ａｂｂｏｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ａｂｂｏｔ  Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．）；触媒（Ｂｉｏ−ＣＡＤ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ．）；およびＣｈｅｍ  ＤＢＳ−３Ｄ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．）が挙げられる。
【００４２】
化学構造のデータベースは、例えば、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｄａｔａ  Ｃｅｎｔｅｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕ．Ｋ．）およびＣｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ（Ｃｏｌｕｍｂｕｓ，ＯＨ）から入手可能である。
【００４３】
一旦、本発明の方法を用いて潜在的なインヒビターを特定すれば、この潜在的なインヒビターは、ＧＲＡＭ、ＤＯＣＫまたはＡＵＴＯＤＯＣＫのようなドッキングプログラムを用いてコンピューターモデリングの使用を通じて試験され得る（Ｄｕｎｂｒａｃｋら、１９９７，Ｆｏｌｄｉｎｇ＆Ｄｅｓｉｇｎ  ２：Ｒ２７〜４２）。この手順は、例えば、潜在的なインヒビターの形状および化学的構造が結合部位を補完する程度を確認するためにＰｉｎ１：ジュグロン結合部位に対する候補化合物のコンピューターフィッティングを含んでもよい（Ｂｕｇｇら、１９９３，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｅｃｅｍｂｅｒ：９２〜９８；Ｗｅｓｔら，１９９５，ＴＩＰＳ  １６：６７〜７４）。コンピュータープログラムはまた、２つの結合パートナー（すなわち、リガンド結合部位および候補化合物）の誘引、反発および立体障害を評価するために用いられ得る。
【００４４】
本発明の別の実施形態では、Ｐｉｎ１を首尾よく阻害する、ジュグロンのようなＰｉｎ１インヒビターの構造的なアナログが、結合特性を増強するためにコンピューターモデリングプログラムによって体系的に改変され得る。例えば、このような化合物は、水素結合、イオン相互作用またはファンデルワールス相互作用のような、化学的相補性に関連する基準を満足させるように改変されてもよい。
【００４５】
一旦、候補化合物が特定されれば、これは市販されているような化合物のライブラリーから選択されてもよいし、あるいは候補化合物は、新規に合成されてもよい。１つまたは比較的小グループでさえ特定の化合物の新規な合成は、薬物設計の当該分野で公知である。
【００４６】
候補化合物は、その化合物がＰｉｎ１に結合し得るか否かを決定するために、Ｐｉｎ１またはＰｉｎ１インヒビター結合部位を含むＰｉｎ１のフラグメントとともに標準の結合アッセイに入れられ得る。候補化合物はまた、その化合物がＰｉｎ１活性を阻害し得るか否かを決定するために、本明細書に記載されるようなＰｉｎ１活性アッセイにおいて用いられてもよい。
【００４７】
当業者は、単に慣用的な実験を用いてドミナントネガティブなＰｉｎ１ペプチド、Ｐｉｎ１抗体、改変体、フラグメント、ｓｉＲＮＡ分子または低分子Ｐｉｎ１インヒビターがＰｉｎ１の機能的なインヒビターであるか否かを決定するために本明細書に記載されたアッセイおよび当該分野で周知のアッセイを容易に用い得る。例えば、この活性は、下の実施例に記載されるように好酸球においてアポトーシスを誘発する能力について試験され得る。
【００４８】
好ましい実施形態では、本発明の方法は、治療上有効な量の１つまたは複数のＰｉｎ１インヒビターと一緒に薬学的に受容可能な希釈剤、キャリア、可溶化剤、乳化剤、防腐剤および／またはアジュバントを含む薬学的組成物であって、患者に適切に投与された場合所望の治療効果を誘導し得る薬学的組成物を投与する工程を包含する。好ましくは受容可能な処方物は、使用される投与量および濃度ではレシピエントに対して毒性ではない。
【００４９】
１つまたは複数のＰｉｎ１インヒビターを含む薬学的組成物に関して「治療上有効な（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ）」という表現は、本発明によれば、末梢血単球、特に好酸球、または免疫系の他の細胞の存在、過剰、持続または活性化によって誘導される病理学的効果を予防または軽減し得るこの薬学的組成物の量を意味すると理解される。例えば、ある薬学的組成物は、免疫学的障害、例えば好酸球関連障害を有する患者が、この薬学的組成物で処置された場合、この処置の前の症状に比べて症状の重篤度が低下するかまたは症状が減弱する場合、治療上有効である。患者に投与される薬学的組成物はまた、免疫学的障害に関連する症状が、このような症状の病歴を有する患者、またはこのような症状がみられる可能性が高いと考えられる患者において発症することを妨げられる場合に、治療上有効である。
【００５０】
特定の実施形態では、本発明の方法において有用な薬学的組成物は、その組成物の例えば、ｐＨ，浸透圧、粘性、透明度、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、分解または放出の速度、吸着または浸透を、改変、維持または保存するための処方物質を含んでもよい。このような実施形態では、適切な処方物質としては、限定はしないが、アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン）；抗生物質；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム）；緩衝液（例えば、ホウ酸塩、炭酸水素塩、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸）；充填剤（例えば、マンニトールまたはグリシン）；キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））；錯化剤（例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−サイクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン）；賦形剤（ｆｉｌｌｅｒｓ）；単等類；二糖類；および他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン）；タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたはイムノグロブリン）；着色料、香味量および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）；低分子量ポリペプチド；塩形成する対イオン（例えば、ナトリウム）；防腐剤（例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素）；溶媒（例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール）；糖アルコール（例えば、マンニトールまたはソルビトール）；懸濁剤；サーファクタントまたは湿潤剤（例えば、プルロニックス（ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパル）；安定性増強剤（例えば、スクロースまたはソルビトール）；等張化向上剤（ｔｏｎｉｃｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ）（例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは、塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトールソルビトール）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤（ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ）および／または薬学的なアジュバントが挙げられる。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ，第１８版、（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ、編）１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照のこと。
【００５１】
特定の実施形態では、最適の薬学的組成物は、例えば、意図される投与経路、送達方式および所望の用量に依存して当業者によって決定される。例えば、ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、前出を参照のこと。特定の実施形態では、このような組成物は、本発明のＰｉｎ１インヒビターの物理的状態、安定性、インビボ放出の速度、およびインビボのクリアランスの速度に影響し得る。
【００５２】
特定の実施形態では、薬学的組成物における一次ビヒクルまたはキャリアは、事実上、水性または非水性のいずれであってもよい。例えば、適切なビヒクルまたはキャリアは、注射用水、生理食塩水または人工の脊髄液であってもよく、非経口的な投与のための組成物中で共通の他の物質を補充されてもよい。中性の緩衝化生理食塩水または血清アルブミンを混合された生理食塩水はさらに、例示的なビヒクルである。好ましい実施形態では、本発明の薬学的組成物は、約７．０〜８．５のＴｒｉｓ緩衝液、または約ｐＨ４．０〜５．５の酢酸緩衝液を含み、そしてさらにソルビトール、スクロース、Ｔｗｅｅｎ−２０および／またはその適切な代用品を含んでもよい。本発明の特定の実施形態では、Ｐｉｎ１インヒビター組成物は、所望の程度の純度を有する選択された組成物と、任意の処方剤（ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、前出）とを、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で混合することによって、貯蔵のために調製されてもよい。さらに、特定の実施形態では、Ｐｉｎ１インヒビター生成物は、スクロースのような適切な賦形剤を用いて凍結乾燥物として処方されてもよい。
【００５３】
本発明の薬学的組成物は、非経口送達のために選択されてもよい。あるいは、この組成物は、吸入のためにまたは消化管を通じた送達、例えば経口のために、選択され得る。このような薬学的に受容可能な組成物の調製は、当該分野の技術の範囲内である。
【００５４】
処方物の成分は、投与部位に受容可能である濃度で好ましくは存在する。特定の実施形態では、緩衝液を用いて、この組成物を生理学的なｐＨでまたはわずかに低いｐＨで、代表的には約５〜約８のｐＨ範囲内で維持する。
【００５５】
非経口投与が意図される場合、本発明における使用のための治療組成物は、薬学的に受容可能なビヒクル中に所望のＰｉｎ１インヒビターを含む、パイロジェンフリーで、非経口的に受容可能な水溶液の形態で提供されてもよい。非経口注射のために特に適切なビヒクルは、滅菌水であって、Ｐｉｎ１インヒビターは、適切に保存された無菌の、等張液として処方される。特定の実施形態では、この調製物は、所望の分子と、ある因子、例えば、デポ注射を介して送達され得る生成物の制御放出または徐放性放出を提供し得る、注射用マイクロスフェア、生体内分解性粒子、ポリマー化合物（例えば、ポリ乳酸またはポリグリコール酸）、ビーズまたはリポソームとの処方物を含んでもよい。特定の実施形態では、ヒアルロン酸はまた、循環中における維持期間を促進するためにも用いられ得る。特定の実施形態では、移植可能な薬物送達ビヒクルを用いて、所望のＰｉｎ１インヒビターを誘導してもよい。
【００５６】
本発明の薬学的組成物は、吸入のために処方されてもよい。これらの実施形態では、Ｐｉｎ１インヒビターは、乾燥の吸入可能な粉末として有利に処方される。好ましい実施形態では、Ｐｉｎ１インヒビター吸入溶液はまた、エアロゾル送達のための噴霧剤とともに処方されてもよい。特定の実施形態では、溶液は、噴霧されてもよい。従って肺投与および処方の方法はさらに、参照によって援用され、そして化学的に改変されたタンパク質の肺送達を記載する、国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９４／００１８７５に記載される。
【００５７】
処方物は経口的に投与され得ることも企図される。この方式で投与されるＰｉｎ１インヒビターは、錠剤およびカプセルのような固体投与形式の配合において慣習的に用いられるキャリアとともに（またはキャリアなしで）処方され得る。特定の実施形態では、カプセルは、処方物の活性部分を、バイオアベイラビリティが最大化され、そして前全身性の分解が最小化されるときに胃腸管のポイントで放出するように、設計され得る。さらなる因子が、Ｐｉｎ１インヒビターの吸収を促進するために含まれてもよい。希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、潤滑剤、懸濁剤、錠剤崩壊剤および結合剤もまた使用されてもよい。
【００５８】
本発明の薬学的組成物は好ましくは、錠剤の製造に適切である非毒性賦形剤との混合物における１つまたは複数のＰｉｎ１インヒビターの有効量を含むように提供される。滅菌水または別の適切なビヒクルに錠剤を溶解することによって、溶液は、単位剤形で調製され得る。適切な賦形剤としては、限定はしないが、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムもしくは炭酸水素塩、ラクトースもしくはリン酸カルシウム；または結合剤、例えば、デンプン、ゼラチン、もしくはアカシア；または潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸もしくは滑石が挙げられる。
【００５９】
さらなる薬学的組成物が当業者に明白であり、これには、徐放性送達または制御送達の処方物中にＰｉｎ１インヒビターを含む処方物を包含する。種々の他の徐放性または制御送達手段、例えば、リポソームキャリア、生体内分解性微小粒子または多孔性ビーズおよびデポ注射物を処方するための技術も当業者に公知である。例えば、参照によって援用され、そして薬学的組成物の送達のための多孔性のポリマー微小粒子の制御放出を記載している国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ９３／００８２９を参照のこと。徐放性の調製物は、成形された物体、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態で、半透性のポリマーマトリクスを含んでもよい。徐放性のマトリクスとしては、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリラクチド（各々が参照によって援用される、米国特許第３，７７３，９１９号および欧州特許出願公開番号ＥＰ０５８４８１に記載される）、Ｌグルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタミン酸塩のコポリマー（Ｓｉｄｍａｎら、１９８３，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２２：５４７〜５５６）、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、１９８１，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．１５：１６７〜２７７およびＬａｎｇｅｒ，１９８２，Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．１２：９８〜１０５）、エチレン酢酸ビニル（Ｌａｎｇｅｒら、前出）またはポリ−Ｄ（−）−３−ヒドロキシ酪酸（欧州特許出願公開番号ＥＰ１３３，９８８）を挙げることができる。徐放性組成物はまた、当該分野で公知の任意のいくつかの方法によって調製され得るリポソームを含んでもよい。例えば、Ｅｐｐｓｔｅｉｎら、１９８５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：３６８８〜３６９２；参照によって援用される、欧州特許出願公開番号ＥＰ０３６，６７６号；ＥＰ０８８，０４６号およびＥＰ１４３，９４９号を参照のこと。
【００６０】
インビボ投与のために用いた薬学的組成物は代表的には、滅菌調製物として提供される。滅菌は、滅菌濾過膜を通じた濾過によって達成され得る。組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および再構成の前または後のいずれに行なわれてもよい。非経口投与のための組成物は、凍結乾燥型でまたは溶液中で保管されてもよい。非経口組成物は一般には、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針による穿刺可能な栓を有する静脈内溶液バッグまたはバイアル中に入れられる。
【００６１】
一旦、薬学的組成物が処方されれば、これは、溶液、懸濁液、ゲル、エマルジョン、固体として、または脱水もしくは凍結乾燥粉末として滅菌バイアル中に保管されてもよい。このような処方物は、レディー・ツー・ユース型または投与の前に再構成される形態（例えば、凍結乾燥）のいずれで保管されてもよい。
【００６２】
本発明の方法において有用なＰｉｎ１インヒビターは、薬学の当該分野で周知である方法を用いて、患者における取り込み、分布および／または吸収を補助するために、他の分子、分子構造または化合物の混合物、例えば、リポソーム、レセプター標的化分子、経口、直腸、局所または他の処方物と混合されても、カプセル化されても、結合体化されてもそうでなければ会合されてもよい。
【００６３】
本発明のＰｉｎ１インヒビターは、従来の非毒性の薬学的に受容可能なキャリア、アジュバントおよびビヒクルを含む投薬単位の処方物で、経口的に、局所的に、非経口的に、吸入もしくは噴霧によってまたは直腸的に投与され得る。本明細書において用いる場合、非経口という用語は、経皮、皮下、脈管内（例えば、静脈内）、筋肉内、またはくも膜下注射もしくはインフュージョン技術などを包含する。さらに、一般式Ｉの化合物および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的処方物が提供される。一般式Ｉの１つ以上の化合物は、１つ以上の非毒性の薬学的に受容可能なキャリアおよび／または希釈剤および／またはアジュバントと、そして所望の場合他の活性な成分と組み合わせて存在してもよい。一般式Ｉの化合物を含む薬学的組成物は、経口使用のために適切な形態で、例えば、錠剤、トローチ、トローチ剤、水性もしくは油性の懸濁液、分散性の粉末もしくは顆粒、エマルジョン、硬性もしくは軟性のカプセル、またはシロップもしくはエリキシル剤であってもよい。
【００６４】
経口使用を意図する組成物は、薬学的組成物の製造のために当該分野で公知の任意の方法に従って調製されてもよく、そしてこのような組成物は、薬学的に優れかつ口当たりのよい調製物が得られるように、甘味料、香味料、着色料および防腐剤からなる群より選択される１つ以上の因子を含んでもよい。錠剤は、錠剤の製造に適切である非毒性の薬学的に受容可能な賦形剤と混合して活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；造粒剤および分散剤、例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤、例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシア、および潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸または滑石であってもよい。この錠剤は、コーティングされなくてもよいし、または公知の技術によってコーティングされてもよい。ある場合には、このようなコーティングは、胃腸管における分解および吸収を遅らせて、それによって長期間にわたって持続的な作用を与えるために公知の技術によって調製されてもよい。例えば、時間遅延物質、例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルが使用されてもよい。
【００６５】
経口使用のための処方物はまた、硬性のゼラチンカプセルであって、活性成分が不活性固体希釈剤、例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンと混合されているゼラチンカプセルとして、または軟性のゼラチンカプセルであって、活性成分が水または油状培地、例えば、ピーナツ油、液体パラフィンまたはオリーブオイルと混合されているゼラチンカプセルとして与えられてもよい。
【００６６】
経口使用のための処方物はまた、トローチ剤として提示されてもよい。
【００６７】
水性懸濁液は、水性懸濁液の製造のために適切な賦形剤と混合されて活性物質を含む。このような賦形剤は、懸濁剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカント・ゴムおよびアカシア・ゴムである；分散剤または湿潤剤は、天然に存在するホスファチド、例えば、レシチン、またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物、例えばステアリン酸ポリオキシエチレン、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール由来の部分的エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分的エステルとの縮合生成物、例えば、ポリエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。この水性懸濁物はまた、１つ以上の防腐剤、例えば、エチル、またはｎ−プロピルｐ−ヒドロキシベンゾエート、１つ以上の着色料、１つ以上の香味料、および１つ以上の甘味料、例えば、スクロースまたはサッカリンを含んでもよい。
【００６８】
油状懸濁物は、植物油、例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油もしくはココナツ油中で、または鉱油、例えば液体パラフィン中で、活性成分を分散させることによって処方され得る。この油状懸濁物は、増粘剤、例えば、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコールを含んでもよい。甘味料および香味料は、口当たりのよい経口調製物を提供するために添加され得る。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって保存され得る。
【００６９】
水の添加による水性懸濁液の調製のために適切な分散性粉末および顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤および１つ以上の防腐剤と混合して活性成分を提供する。適切な分散剤または湿潤剤または懸濁剤は、上記で既に言及されたもので例示されている。さらなる賦形剤、例えば、甘味料、香味料および着色料もまた存在し得る。
【００７０】
本発明の薬学的組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態であってもよい。この油相は、植物油もしくは鉱油またはそれらの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、天然に存在するゴム、例えば、アカシア・ゴムまたはトラガカント・ゴム、天然に存在するホスファチド、例えば、ダイズ、レシチン、ならびに脂肪酸およびヘキシトール、無水物由来のエステルまたは部分的エステル、例えば、ソルビタンモノオレエート、ならびにこのような部分的エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートであってもよい。このエマルジョンはまた、甘味料および香味料を含んでもよい。
【００７１】
シロップおよびエリキシルは、香味料、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、グルコースまたはスクロースと処方されてもよい。このような処方物はまた、粘滑薬（ｄｅｍｕｌｃｅｎｔ）、防腐剤、香味料および／または着色料を含んでもよい。この薬学的組成物は、適切な注射用水または油質の懸濁物の形態であってもよい。この懸濁物は、上記に言及されている適切な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を用いて当該分野で公知の方法に従って処方され得る。この滅菌注射用調製物はまた、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液として、毒性でない非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中に含まれる、滅菌注射用水または懸濁物であってもよい。とりわけ、使用され得る受容可能なビヒクルおよび溶媒は、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液である。さらに、滅菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁培地として慣習的に使用される。この目的のために、合成のモノグリセリドまたはジグリセリドを含む、任意の当たり障りのない（ｂｌａｎｄ）不揮発性油を使用してもよい。さらに、脂肪酸、例えば、オレイン酸は、注射可能な調製物の際に役立つ。
【００７２】
本発明のＰｉｎ１インヒビターはまた、例えば、薬物の直腸投与のために坐剤の形態で投与されてもよい。これらの組成物は、この薬物を、通常の温度で固形であるが、直腸温では液体である適切な非刺激性である賦形剤であって、従って直腸で溶けて薬物を放出する賦形剤と混合することによって調製され得る。このような物質としてはココアバターおよびポリエチレングリコールが挙げられる。
【００７３】
本発明のＰｉｎ１インヒビターは、無菌培地中で非経口的に投与され得る。この薬物は、用いられるビヒクルおよび濃度に依存して、ビヒクル中で懸濁されても、または溶解されてもよい。有利には、アジュバント、例えば、局所麻酔薬、防腐剤および緩衝剤は、ビヒクル中で溶解されてもよい。
【００７４】
眼または他の外部組織、例えば、口および皮膚の障害については、処方物は好ましくは、局所のゲル、スプレー、軟膏もしくはクリームとして、または坐剤として適用され、これには、例えば、０．０７５〜３０（ｗ／ｗ）％、好ましくは０．２〜２０（ｗ／ｗ）％、そして最も好ましくは０．４〜１５（ｗ／ｗ）％という総量中の活性成分を含む。軟膏中で処方される場合、活性成分は、パラフィンまたは水混和性の軟膏基剤のいずれかとともに使用されてもよい。
【００７５】
あるいは、活性成分は、水中油型クリーム基剤とともにクリーム中に処方されてもよい。必要に応じて、クリーム基剤の水相は、例えば、少なくとも３０（ｗ／ｗ）％の多価アルコール、例えば、プロピレングリコール、ブタン−１，３−ジオール、マンニトール、ソルビトール、グリセロール、ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物を含んでもよい。局所処方物は、所望により、皮膚または他の患部を通じて活性成分の吸収または浸透を増強し得る化合物を含んでもよい。このような皮膚浸透増強剤の例としてはジメチルスルホキシドおよび関連のアナログが挙げられる。
【００７６】
本発明の化合物はまた、経皮デバイスによって投与されてもよい。好ましくは、局所投与は、リザーバおよび多孔性膜のタイプまたは種々の固体マトリックスのいずれかのパッチを用いて達成される。いずれの場合も、活性剤は、連続的にリザーバまたはマイクロカプセルから膜を通して、レシピエントの皮膚または粘膜と接触している活性剤浸透性の接着剤に送達される。この活性剤が皮膚を通して吸収される場合、この活性剤の、制御され、かつ予め決定されたフローが、レシピエントに投与される。マイクロカプセルの場合、カプセル化剤もまた膜として機能し得る。経皮パッチは、アクリルエマルジョンおよびポリエステルパッチのような接着系とともに適切な溶媒系中に化合物を含んでもよい。
【００７７】
本発明のエマルジョンの油相は、公知の方式で公知の成分から構成され得る。この相は単に乳化剤を含むだけであるが、これによって、少なくとも１つの乳化剤と、脂肪もしくはオイルと、または脂肪およびオイルの両方との混合物を含み得る。好ましくは、疎水性乳化剤は、安定化剤として機能する親油性乳化剤とともに含まれる。これはまた、オイルおよび脂肪の両方を含むことが好ましい。まとめると、乳化剤（単数または複数）は、安定化剤（単数または複数）とともに（または安定化剤（単数または複数）なしで）、いわゆる乳化ワックスを形成し、このワックスはオイルおよび脂肪と一緒になって、いわゆる乳化軟膏基剤を形成し、これがクリーム処方物の油分散相を形成する。本発明の処方物における使用のために適切な乳化剤およびエマルジョン安定化剤としては、とりわけ、Ｔｗｅｅｎ６０、Ｓｐａｎ８０、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセリルモノステアレートおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００７８】
処方のために適切なオイルまたは脂肪の選択は、所望の体裁的な特性を達成することに基づく。なぜなら、薬学的なエマルジョン処方物において用いられる可能性が高いほとんどのオイル中において活性化合物の溶解度は、極めて低いからである。従ってクリームは、好ましくは、チューブまたは他の容器からの漏出を回避するために、適切な粘稠度を有する、脂ぎっておらず、非染色性で、かつ水洗い可能な生成物であるべきである。直鎖または分枝鎖、一塩基または二塩基のアルキルエステル、例えば、ジ−イソアジペート、イソセチルステアレート、ココナツ脂肪酸のプロピレングリコールジエステル、イソプロピルミリステート、デシルオレエート、イソプロピルパルミテート、ブチルステアレート、２−エチルヘキシルパルミテートまたは分枝鎖エステルの混合物が用いられてもよい。これらは、必要な特性に応じて単独で、または組み合わせて用いられ得る。あるいは、高融点の脂質、例えば、白色軟性パラフィン（ｗｈｉｔｅ  ｓｏｆｔ  ｐａｒａｆｆｉｎ）および／または液体パラフィンまたは他の鉱油が用いられてもよい。
【００７９】
眼への局所投与に適切な処方物はまた、点眼液を含み、ここでは活性な成分が適切なキャリアに、特に、活性成分のための水溶液に溶解または懸濁されている。この抗炎症性活性成分は好ましくは、０．５〜２０％、有利には０．５〜１０％、そして詳細には約１．５％（ｗ／ｗ）の濃度でこのような処方物中に存在する。
【００８０】
治療目的のためには、本発明のＰｉｎ１インヒビターは通常、示された投与経路に適切な１つ以上のアジュバントと組み合わされる。口から投与される場合、この化合物は、ラクトース、スクロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、セルロースアルキルエステル、滑石、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウム塩およびカルシウム塩、ゼラチン、アカシア・ゴム、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドンおよび／またはポリビニルアルコールと混合され、次いで都合のよい投与のために錠剤化またはカプセル化されてもよい。このようなカプセルまたは錠剤は、ヒドロキシプロピルメチルセルロースにおける活性化合物の分散において提供され得るように、徐放性の処方物を含んでもよい。非経口投与のための処方物は、水性または非水性の等張性の滅菌注射用液または懸濁液の形態であってもよい。これらの溶液および懸濁液は、経口投与のための処方物における使用について言及されたキャリアまたは希釈剤の１つ以上を有する滅菌粉末または顆粒から調製されてもよい。この化合物は、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、綿実油、ピーナツ油、ゴマ油、ベンジルアルコール、塩化ナトリウム、および／または種々の緩衝液に溶解されてもよい。他のアジュバントおよび投与法式は、薬学の当該分野において十分に公知であってかつ周知である。
【００８１】
１日あたり体重１ｋｇあたり約０．１ｍｇ〜約１４０ｍｇの範囲の用量レベルが上述の条件の処置において有用である（１日あたり１患者あたり約０．５ｍｇ〜約１４ｇ）。単回の剤形を生成するためにキャリア物質と組み合わされ得る活性成分の量は、処置される宿主および特定の投与法式に依存して変化する。単位剤形は一般に、約１ｍｇ〜約５００ｍｇの間の活性成分を含む。毎日の用量は、１日あたり１〜４用量で投与され得る。皮膚状態の場合は、罹患部位に対して、１日あたり２〜４回本発明の化合物の局所調製物を適用することが好ましいかもしれない。
【００８２】
しかし、理解されるとおり、任意の特定の患者についての特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、年齢、体重、全身健康状態、性別、食餌、投与時間、投与経路および排出速度、薬物併用および治療を受けている特定の疾患の重篤度を含む、種々の要因に依存する。
【００８３】
非ヒト動物に対する投与のために、この組成物はまた、動物の飼料または飲用水に添加されてもよい。動物がその食餌とともに治療上適切な量の組成物をとるようにこの動物に飼料および飲用水組成物を処方することが簡便であり得る。この飼料または飲用水への添加のための事前混合物としてこの組成物を提供することも好都合であり得る。
【００８４】
投薬頻度は、この処方物で用いられる特定のＰｉｎ１インヒビターの薬物動態パラメーターに依存する。代表的には、臨床家は、所望の効果を達成する用量に達するまで、この組成物を投与する。従って、この組成物は、単回用量として投与されても、または経時的に２回以上の用量（これは、同じ量の所望の分子は含んでも含まなくてもよい）として投与されても、または移植デバイスもしくはカテーテルを介する連続インフュージョンとして投与されてもよい。適切な投薬のさらなる微調整は当業者によって慣用的に行われ、そして当業者らによって慣用的に行われる課題の領域の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量応答データの使用を通じて確認され得る。特定の実施形態では、Ｐｉｎ１インヒビターは、長期間にわたって患者に投与され得る。
【００８５】
本発明の薬学的組成物および／またはＰｉｎ１インヒビターは、単独で、または他の治療剤と組み合わせて、詳細には、他の免疫抑制剤と組み合わせて投与され得る。例えば、薬学的組成物またはＰｉｎ１インヒビターは、移植された組織または器官の急性または慢性の拒絶を防止するために用いられ、この免疫抑制剤は、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）であっても、またはＦＫ５０６（Ｔａｃｒｏｌｉｍｕｓ）であってもよい。本明細書における実施例に考察されるとおり、Ｐｉｎ１インヒビターおよび既存の治療剤、例えば、ＣｓＡの組み合わせによって、既存の治療剤の最適以下の量（すなわち、移植療法において用いられる伝統的な量と比較して低量）という使用が可能になり、これによって患者に対してより低い毒性を提供する。
【００８６】
本発明はまた、単回用量の投与単位を生成するためのキットを提供する。本発明のキットは各々が、乾燥したタンパク質を有する第一の容器と、水性の処方物を有する第二の容器の両方を含んでもよい。本発明の特定の実施形態では、単一およびマルチチャンバのプレフィルドシリンジ（例えば、液体シリンジおよびライオシリンジ（ｌｙｏｓｙｒｉｎｇｅｓ））を含むキットが提供される。
【００８７】
文脈上他が必要でない限り、本明細書に用いられる単数形は、複数を包含するものであり、そして複数の用語は単数を包含するものとする。
【実施例】
【００８８】
以下の実施例は、行った実験および達成された結果を含んでおり、例示の目的のみで与えられるものであり、本発明の限定と解釈されるべきではない。
【００８９】
（実施例１：）
（好酸球生存に対するペプチド−プロリルイソメラーゼインヒビターの影響）
好酸球（Ｅｏｓ）は代表的には、正常な個体の血液に低レベル（ＰＢＭＣの１〜２％）で存在し、約３日の寿命で迅速に交代する。喘息では、Ｅｏｓは、肺に遊走して、そこではＥｏｓが気道および実質で見出され得る。活発な喘息では、Ｅｏｓは、総気道免疫細胞の５０％を含み得る。気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬ）によってＥｏｓを取り出した後、肺のＥｏｓは、顕著に長いインビトロ生存（＞７日）を示し、これは、抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体で減弱され得る。これらの細胞はまた、呼吸バースト、サイトカイン発現およびプロスタグランジン放出を含む、全身性の活性化の証拠を示す。
【００９０】
肺好酸球増多症は、喘息のような病理学的条件に関連し、好酸球の数の増大およびこのような障害の活性状態に基づく。好酸球は、とりわけ、ヒアルロン酸によって活性化されることが公知であり、そして活性化の特徴のうちの１つはサイトカインＧＭ−ＣＳＦの発現の増大である（Ｅｓｎａｕｌｔら、２００２，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ（Ｗａｒｓｚ）．５０：１２１〜１３０）。自己分泌ＧＭ−ＣＳＦ発現は次に、好酸球の生存を促進する。活性化はまた、分析的に容易に検出され得る、タンパク質リン酸化の変化に関する。ＧＭ−ＣＳＦ発現および好酸球生存に対するヒアルロン酸（ＨＡ）活性化に関する機構を特徴付けるために、ＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ崩壊（ｄｅｃａｙ）を測定した。これらの実験で、ＨＡ処置の数時間内のＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡは３倍を上回って安定であって、増大したサイトカインｍＲＮＡ蓄積および最終的には分泌を説明することが示された。しかし、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ（ＭＡＰＫ）ＥＲＫは、ＰＤ９８０５９で薬理学的に阻害され、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡは蓄積できなかった。この影響は急速に生じ（インヒビターの添加の１０〜３０分内）、そしてＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡは、ＨＡで活性化された細胞よりも残りの細胞に特徴的な速度で破壊されたことが見出された。これらの影響は急速に生じ、このことは、ＥＲＫ活性がＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ安定化に継続して必要であること、そしてＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの崩壊におけるＥＲＫ媒介性の変化は、崩壊プロセスに関与するかそれを調節するタンパク質のリン酸化における変化を反映した（なぜなら、新規なタンパク質合成には十分な時間がなかったからである）ことを示唆している。
【００９１】
それらのタンパク質の同一性は、２次元のゲル分析によるリン酸化タンパク質のパターンを、ＨＡ処理後とＭＡＰＫ  ＥＲＫインヒビターであるＰＤ９８０５９の存在下におけるＨＡ処理後とで比較することによって決定された。このために、アレルギー性鼻炎または喘息を有する患者から静脈穿刺によって末梢血を得た；患者は、血液を採取した時点で症候性ではなかった。末梢血好酸球（Ｅｏｓ）は、ＥｓｎａｕｌｔおよびＭａｌｔｅｒ（２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：４６５８〜９６）に記載されるとおり、ネガティブな免疫磁性手順を用いて精製した。単離後、Ｅｏｓをインビトロで、１０％ウシ胎仔血清（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）および５０μｇ／ｍｌのゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を含むＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）中で、３７℃で５％ＣＯ２中で維持して、代謝的に標識して、１００μｇ／ｍｌのＨＡを含む培養条件下での処置（全部で約５時間、下を参照のこと）によって活性化した。Ｅｏｓの生存度（１×１０６細胞／ｍｌ）を、血球計数器を用いてトリパンブルー染色によって評価して、処置の間に９８％を超えて生きていたことが明らかになった。
【００９２】
複数のドナー由来のＥｏｓを、３２Ｐ−オルトリン酸塩とともに１時間プレインキュベートして、ＨＡ単独で４時間、または４時間のＨＡ処置後に３０分のＥＲＫインヒビターＰＤ９８０５６とのインキュベーションによって処理した。各々の条件下で処置した約７００μｇのＥｏｓ由来の細胞質タンパク質を、等電点電気泳動に、続いて８〜１８％のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ポリアクリルアミド勾配ゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）中での分子量に基づく分離に供した。このゲルは最初にオートラジオグラフィーで分析し、ついでＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｇ−２５０で染色した。増大または減少したリン酸化に相当する変更した３２Ｐ含量を示すスポットを、ＭＡＬＤＩ−ＭＳによって配列決定して、ゲル中のこれらの位置でのタンパク質の同一性を確認した。５つのタンパク質で、ＨＡ処理に関するリン酸化の有意な減少が示された（表１に示される）。
【００９３】
【表１】
2008540571.tif 000002
ペプチジル−プロリルイソメラーゼ（ＰＰＩ）サイクロフィリンＡ（ＣＹＡ）は特に注目すべきである。なぜならＣＹＡインヒビター、シクロスポリンＡ（ＣＳＡ）は、気管支生検におけるＩＬ−２およびＧＭ−ＣＳＦ遺伝子発現ならびに好酸球蓄積に関与しているからである（ＳｃｈｒｅｉｂｅｒおよびＣｒａｂｔｒｅｅ，１９９２，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  １３：１３６〜４２；Ｋｈａｎら，２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ．Ｍｅｄ．１６２：１３７７〜８２）。ＰＰＩのシクロスポリンＡおよびＦＫ５０６結合タンパク質は、リン酸化したアミノ酸（例えば、プロリン残基の直前であるセリン、トレオニンまたは他のアミノ酸）でｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化を触媒する。Ｐｉｎ１、哺乳動物のＰＰＩａｓｅファミリーの３番目のメンバーは、より大きい特異性を示し、プロリン（Ｐｒｏ）残基の直前のリン酸化セリンまたはトレオニン残基｛Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ｝の間のペプチド結合を異性化するだけである。Ｐｉｎ１は、ＮＩＭＡおよびＣｄｃ２５Ｃのようなタンパク質を標的すること、および異性化後、他のタンパク質とのそれらの相互作用を変更することによって真核生物の細胞周期を調整する。Ｐｉｎ１活性の非存在下では、細胞は細胞周期を通して進行できず、かつＧ０期で蓄積する。
【００９４】
（実施例２：）
（ＧＭ−ＣＳＦ放出、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ安定化および細胞生存のために必要なＰｉｎ１）
ＰＰＩａｓｅインヒビターシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、気道細胞によるＧＭ−ＣＳＦの発現に関与している（Ｋｉｔａ，Ｈ．ら，１９９１，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．１７４：７４５〜７４８；Ｋｈａｎ，Ｌ．Ｎ．ら，２０００，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１６２：１３７７〜１３８２）が、特異的であってかつ不可逆的なＰｉｎ１インヒビターである（Ｈｅｎｎｉｎｇ，Ｌ．ら，１９９８，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３７：５９５３〜５９６０）ジュグロンの影響は、未知である。分泌されたＧＭ−ＣＳＦは、インビトロにおけるＥｏｓ生存に必須であるので、ヒアルロン酸（ＨＡ）での活性化後のＦＫ５０６、ＣｓＡおよびジュグロンの細胞依存性に対する影響を評価した。ＨＡは、サイトカイン分泌においてＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ安定化の極致を生じる（Ｅｓｎａｕｌｔ，Ｓ．＆Ｍａｌｔｅｒ，Ｊ．Ｓ，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：６７８０〜６７８７）。
【００９５】
精製された末梢血Ｅｏｓを、ＨＡ単独またはＨＡに加えて種々の濃度のＣｓＡ、ジュグロンまたはＦＫ５０６（全て、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）とともにインキュベートして、細胞生存度を４日で決定した。前の結果（Ｅｓｎａｕｌｔ，Ｓ．＆Ｍａｌｔｅｒ，Ｊ．Ｓ，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：６７８０〜６７８７）と一致して、コントロールである未処理のＥｏｓの生存は、５〜２０％（ドナー次第）であって、これは、ＨＡ処理後に３〜５倍増大した（図１Ａおよび図１Ｂ）。抗ＧＭ−ＣＳＦ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡから入手）は生存の増強を完全に防止し（示さず）、このことは、ＨＡがＧＭ−ＣＳＦ分泌を誘導したことを実証している。ＣｓＡは、ジュグロン（０．１または１．０μＭで５％生存）と同様に、Ｅｏｓ細胞死を誘導した（１６μＭで約１０％生存）（図１Ａおよび図１Ｂ）が、ＦＫ５０６は影響を有さなかった。Ｅｏｓ死滅の機構は、ウエスタンブロッティングによって評価された。図１Ｃで示されたとおり、活性化カスパーゼ３（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手した抗体を用いて同定）が、未処理の培養物であるコントロールで検出されたが、ＨＡ処理後には存在しなかった。ジュグロンでの処理は、カスパーゼ３活性化を生じるＨＡの防御効果を拮抗した。従って、これらの結果は、ＨＡが、ＧＭ−ＣＳＦの誘導を介して、カスパーゼ媒介性アポトーシスを妨げたことを示す。逆に、ジュグロンでのＰｉｎ１の不活性化は、好酸球においてカスパーゼ３活性化およびアポトーシスを生じた。
【００９６】
この生存度の減少は、ＧＭ−ＣＳＦ分泌の阻害、ＧＭ−ＣＳＦレセプターシグナル伝達の遮断またはＧＭ−ＣＳＦ非依存性機構を通じたアポトーシスの誘発を反映し得る。ＧＭ−ＣＳＦ発現および活性の調節に関連する減少した好酸球生存の原因を検討するために、組み換えヒト（ｒｈ）ＧＭ−ＣＳＦ（１００ｐｇ／ｍｌ）を、種々の濃度のＣｓＡおよびジュグロンの存在下でＥｏｓ培養物に添加して、好酸球生存を培養の４日目に決定した。ＣｓＡは、ＨＡまたはＧＭ−ＣＳＦでの活性化にかかわらずＥｏｓアポトーシスを誘発した。対照的に、ＧＭ−ＣＳＦは、低濃度でジュグロンのアポトーシス促進効果を拮抗できた（０．１μＭ、図１Ａおよび図１Ｂ）。これらのデータは、Ｐｉｎ１阻害がＨＡ処理後のＧＭ−ＣＳＦ放出を妨げたことを示唆した。
【００９７】
この可能性を評価するために、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡレベルを、ＲＴ／ＰＣＲサザンブロットハイブリダイゼーション実験によって測定した。これらの結果（図２Ａおよび図２Ｂに示す）によって、ＨＡ処理は、１．６μＭまたは１６μＭでＣｓＡによって影響されない形で、２〜４倍までＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡのレベルを一貫して増大させたことが実証された。しかし、ジュグロン処理は、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡを、用量依存性の様式で未処理のコントロールのレベルまで減少させた（図２Ａおよび図２Ｂ）。これらのデータによって、Ｐｉｎ１はＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの上方制御、サイトカイン分泌およびＥｏｓ生存の増強に必要であったが、ＣｓＡは、非ＧＭ−ＣＳＦ依存性機構を通じてＥｏｓアポトーシスを誘発したことが示唆された。
【００９８】
ジュグロンの効果が非特異的であることが依然として考えられた。ジュグロン処理の観察された効果のＰｉｎ１特異性を実証するために、Ｅｏｓに、Ｎ末端ＴＡＴペネトラチンタグに融合されたＰｉｎ１のＷＷドメインを形質導入した。ＷＷドメインは、内因性Ｐｉｎ１活性をブロックすることによりドミナントネガティブとして機能する（Ｌｕら、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２３８１〜２３８４）。
【００９９】
これらの実験の結果は図２Ｃに示す。ＨＡとともに添加された場合、ＴＡＴ−ｗｗ−Ｐｉｎ１はＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの上方制御を完全に妨げた（図２Ｃ）が、コントロール構築物（ＴＡＴ−ＧＦＰ）は影響を有さなかった。Ｅｏｓ生存は、ＴＡＴ−ｗｗ−Ｐｉｎ１処理した培養物でのＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ豊富さと密接に平行し（図２Ｄ）、未処理の休止コントロールと識別できなかった。しかし、ｒｈＧＭ−ＣＳＦでのＴＡＴ−ｗｗ−Ｐｉｎ１処理培養物の増強は生存を完全に復帰させた（図２Ｄ）。これらの結果によって、Ｐｉｎ１活性は、ＨＡ誘発性ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ転写、および／または安定性に必要であったが、ＧＭ−ＣＳＦ自体の抗アポトーシス効果には必要ではなかったことが示された。
【０１００】
ＨＡまたはＴＮＦ−αに加えてフィブロネクチンでのＥｏｓの活性化は、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ崩壊の速度を低下させることが以前に実証された（ＥｓｎａｕｌｔおよびＭａｌｔｅｒ，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：４６５８〜４６６３；ＥｓｎａｕｌｔおよびＭａｌｔｅｒ  ２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：６７８０〜６７８７）。この証拠およびジュグロン処理後のＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡクリアランスの急速な反応速度論を考慮して（図２Ｂ）、Ｅｏｓは、転写インヒビターアクチノマイシンＤの添加の前にＨＡまたはＨＡプラスジュグロンで活性化された。そしてＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ崩壊を、ＲＴ−ＰＣＲサザンブロット分析によって決定した。ジュグロンの非存在下（ＨＡ単独）では、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡは、極めて安定であった（ｔ１／２＞８０分）（図２Ｅ）。この安定性は、Ｐｉｎ１遮断後に４倍まで減少された（ｔ１／２約２１分）。これらの結果によって、Ｐｉｎ１が、ＨＡ媒介性ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ転写の活性化、そして制御されたサイトカイン分泌およびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ崩壊を調節することによる細胞生存より「下流（ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ）」で作用したことが実証された。
【０１０１】
（実施例３：）
（Ｐｉｎ１はＡＵＦ１に会合し、そしてジュグロン処理後に急速に分解される）
上記の実施例２に示される結果を考慮して、サイトカインｍＲＮＡの崩壊は、好酸球のＨＡ活性化およびＰｉｎ１のジュグロン不活性化の影響においてある役割を果たすことが証明された。新しいデータは、サイトカインｍＲＮＡの崩壊の制御におけるＡＵ−リッチｍＲＮＡ結合タンパク質（ＡＲＥＢＰ）を意味する：ＡＲＥＢＰの安定化および不安定化の両方は規定されている（Ｃａｒｂａｌｌｏら，２０００，Ｂｌｏｏｄ９５：１８９１〜１８９９；Ｆａｎら、１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：３４４８〜３４６０；Ｃａｐｏｗｓｋｉら，２００１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：５９７０〜５９７６）。ＡＲＥＢＰのほとんどがリンタンパク質であり、その多くが潜在的なＰｉｎ１認識部位（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）を含む（図６）。
【０１０２】
従って、Ｐｉｎ１が、リン酸化依存性ＰＰＩａｓｅ活性を通じた結合活性もしくはタンパク質／タンパク質相互作用の引き続く調整による、種々のＡＲＥＢＰとの物理的な相互作用を通じてＧＭ−ＣＳＦ崩壊を調節した可能性を検討した。このためにＥｏｓ細胞質抽出物を、抗Ｐｉｎ１抗体（Ｇａｒｙ  Ｂｒｅｗｅｒ，Ｒｏｂｔ  Ｗｏｏｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，ＮＪから入手）を用い、続いて抗ＡＲＥＢＰ抗体でのイムノブロットによって免疫沈降させた。これらの結果を図３Ａに示す。検出されたＡＲＥＢＰのうち、ＡＵＦ１およびＨｕＲは一貫して、Ｐｉｎ１で同時沈降された（ただし、後者はかろうじて検出可能であって、一方その他は、どの状況下でも検出されなかった）。ＡＵＦ１の全ての４つのアイソフォーム（ｐ４５、ｐ４２、ｐ４０およびｐ３７）は、ｐ４５およびｐ４０においてのみ見出されるＰｉｎ１異性化部位（Ｓｅｒ８３−Ｐｒｏ８４）の存在にかかわらずＰｉｎ１で同時沈殿された（図３Ａ）（Ｗｉｌｓｏｎら、２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３３０３９〜３３０４８）。ＲＮａｓｅの存在下または非存在下において免疫沈降されたＰｉｎ１によって、ｐ４２およびｐ３７  ＡＵＦ１が、可能性としては他のＡＵＦ１アイソフォームを含む、タンパク質間の相互作用を介してＰｉｎ１と会合したことが示されている。抗ＡＵＦ１抗体での逆免疫沈降はまた、Ｐｉｎ１を沈殿させた。これらの観察によって、Ｐｉｎ１がＧＭ−ＣＳＦまたは他のＡＲＥ含有ｍＲＮＡと独立した全てのＡＵＦ１アイソフォームと相互作用したことが示された。
【０１０３】
次いで、ＡＵＦ１とＰｉｎ１との間の相互作用に対するＨＡおよびジュグロンの処理の影響を検査した。いくらか予想外に、ＨＡは、各々のアイソフォームにおけるＰｉｎ１結合部位の存在と一致して、細胞質Ｐｉｎ１の量にも、そのＡＵＦ１に対する結合にも影響を有さなかった（図３Ａ）。しかし、ジュグロンは、ｐ３７アイソフォームの温存があったが、Ｐｉｎ１およびＡＵＦ１の両方のレベルを急速に減少させた（図３Ａ）。実際、ジュグロンに対する１２０分の曝露によって、ｐ４５、ｐ４２およびｐ４０ならびにＰｉｎ１は、細胞質クリアランスの指標であるＩＰから本質的に消失した。ＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１を用いる静止またはＨＡ活性化Ｅｏｓの形質導入は、Ｐｉｎ１にもＡＵＦ１にもレベルに影響を有さず、このことは、ジュグロンによるＰｉｎ１の不可逆性の酵素阻害が、両方のタンパク質の分解を誘発したことを示唆している。
【０１０４】
Ｐｉｎ１異化作用の細胞内部位は未知であるが、ＡＵＦ１はプロテオソーム中で分解されることが公知であった。プロテオソームの分解は、極めて急速であって、ジュグロン処理後に観察されたＰｉｎ１およびＡＵＦ１の損失の観察された反応速度論を説明し得る。この可能性に取り組むため、ＥｏｓをプロテオソームインヒビターＭＧ１３２（４時間）（Ｓｉｇｍａ）およびジュグロン（回収の１０分前）に曝露して、溶解物をイムノブロットした。図３Ｃに示されるとおり、ジュグロン誘発性ｐ４５、ｐ４２およびｐ４０ＡＵＦ１分解は、ＭＧ１３２処理の際に完全にブロックされた。ＭＧ１３２濃度が高ければ、ＡＵＦ１は、未処理の細胞で検出されたレベルよりも大きいレベルまで蓄積し、このことは、このタンパク質の正常な異化作用がプロテアソーム中で生じたことを示唆している。これらの条件下で、ＭＧ１３２はＰｉｎ１分解を部分的にしか妨げず、このことは、Ｐｉ１が別の細胞のタンパク質分解性の系（単数または複数）を通じて分解されたことを示した。
【０１０５】
定常状態のＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡレベル（図２Ａ〜２Ｅおよび図３Ｄに示される）を、好酸球において分析し、そしてその結果によって、ジュグロンが、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡにおけるＨＡ媒介性の増大を拮抗したことが示された。上記に示されるデータに基いて（図２Ａ〜図２Ｅ）、これは、加速されたＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ崩壊を反映する可能性が高い。しかし、ＭＧ１３２は、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡのジュグロン誘発性の減少を拮抗した（図３Ｄ）が、細胞がＭＧ１３２単独で処理された場合には、観察可能な影響はなかった。これらのデータは、ＡＲＥのｍＲＮＡ崩壊がプロテアソーム活性を要するという以前の観察と一致した（Ｌａｒｏｉａら、２００２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１８４２〜１８４６）。多くのｍＲＮＡの転写は、ＭＧ１３２での細胞の長期の処理によって影響されないので（Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ，１９９８，ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：７１５１〜７１６０）、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡレベルの観察された増強はおそらく、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ安定化を反映したと思われる。
【０１０６】
（実施例４：）
（Ｐｉｎ１は、ＡＲＥＢＰとＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡとの相互作用を調節した）
ＡＵＦ１は、複数の細胞タイプにおけるＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡに結合することが示されている。逆説的に、結合は、ＡＲＥのｍＲＮＡの安定化および不安定化の両方に関連している（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａら、１９９９，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｉｃｄｓ  Ｒｅｓ．２７：１４６４〜１４７２；Ｓａｒｋａｒら、２００３，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２３：６６８５〜６６９３）。ＡＵＦ１でのＧＭ−ＣＳＦの分割は、ＨＡ活性化またはＨＡプラスＰｉｎ１インヒビターの後に、休止しているＥｏｓにおいて評価した。抗ＡＵＦ１免疫沈降ペレットのＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット分析は、ＨＡ処理後に劇的に減少された、休止期の細胞におけるＡＵＦ１と会合した細胞のＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの実質的な割合を示した（図４Ａ、右）。ジュグロン（１０分、図４Ａ、左）またはＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１に対する短時間の曝露は、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの定常状態レベルにほとんど影響を有さず（図４Ａ、左）、ただし、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡとＡＵＦ１との再会合を生じた（図４Ａ、右）。ジュグロン（１５〜３０分）（図２Ｂ）に対する、またはＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１（３０分）（図４Ｂ）に対するわずかに長い曝露は、ＡＵＦ１に対して結合したＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの量をさらに増大したが、定常状態のＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの量は休止期の細胞においてみられる量に対して急速に減少した（示さず、そして図２Ａおよび図２Ｃ）。まとめると、これらの観察によって、ＡＵＦ１−ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ相互作用は、休止期の細胞における急速な崩壊を誘引したことが示唆された。ＨＡ媒介性の細胞活性化は、ただしＰｉｎ１が酵素的に機能的な場合にのみ、この相互作用を防止し得た。この機構は、ＨＡが、そのｍＲＮＡ結合活性の損失とともにＡＵＦ１のＰｉｎ１媒介性の異性化を誘発したという概念と一致する。
【０１０７】
細胞質ｍＲＮＡがタンパク質と会合する傾向を考慮して、ＨＡ処理後に別のタンパク質がＡＵＦ１を置き換えたか否かを決定するために実験を設計した。１つの可能性は、ｈｎＲＮＰ  Ｃであって、これは、Ｅｏｓ活性化後にＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡに対する結合の増大を示す（ＥｓｎａｕｌｔおよびＭａｌｔｅｒ，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：６７８０〜６７８７）。従って、細胞質抽出物の抗ｈｎＲＮＰ  Ｃ（Ｓｉｇｍａ）免疫沈降物を、ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロットハイブリダイゼーション分析によってＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡについて検査した。以前の観察（Ｅｓｎａｕｌｔら、２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７１：６７８０〜６７８７）と一致して、ＨＡ処理は、ｈｎＲＮＰ  Ｃに対するＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ結合の急速な増大を誘導した（図４Ｂ）。ＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１との細胞のインキュベーションは、ｈｎＲＮＰ  Ｃと会合したＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡを急速に減少させ、そしてＡＵＦ１とのＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ会合を増大した。ＨｕＲは存在したが、いずれの条件下でもＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡとは会合せず、そしてＰｉｎ１およびＡＵＦ１の会合は、ＨＡ（図３Ａ）によってもＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１によっても影響されなかった。さらに、ｈｎＲＮＰ  Ｃは、抗Ｐｉｎ１抗血清とは同時沈降しなかった。これらのデータによって、Ｐｉｎ１活性の非存在下では、休止期の細胞（Ｐｉｎ１は、リン酸化後に活性が少なくなる、図５Ａ；Ｌｕら、２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２３８１〜２３８４）またはＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１処理後でさえ、ＡＵＦ１はｈｎＲＮＰ  Ｃを置き換え、そしてＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡに結合し、その分解をもたらしたことが示唆された。ＨＡ処理後、このプロセスは逆転されて、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ安定化が生じた。
【０１０８】
（実施例５：）
ＨＡは、ＡＵＦ１およびＰｉｎ１のリン酸化を変更した
タンパク質複合体からのＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの損失（図４Ａおよび図４Ｂ）にかかわらずＰｉｎ１およびＡＵＦ１の会合はＨＡによって影響されなかった（図２Ａ）ので、ＡＵＦ１および／またはＰｉｎ１が、ＨＡ媒介性のシグナル伝達によって改変されたとの仮説が立てられた。ホルボールエステル誘発ｐ４０  ＡＵＦ１のＳｅｒ８３およびＳｅｒ８７の脱リン酸は、ＩＬ−１βおよびＴＮＦ−αのｍＲＮＡの安定化を伴っていた（Ｗｉｌｓｏｎら、２００３，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３３０２９〜３３０３８）。従って、コントロールまたはＨＡ処理Ｅｏｓからの細胞質抽出物を、抗ホスホセリン、抗ＡＵＦ１または抗Ｐｉｎ１抗体でイムノブロットした。休止期の細胞では、ｐ４５およびｐ４０  ＡＵＦ１は脱リン酸され、これは、ＨＡ処理によって一貫して増大され、そしてＥｒｋインヒビターであるＰＤ９８０５９によって部分的に拮抗された（図５）。ＨＡ処理は、イソメラーゼ活性を増大することが示されているＰｉｎ１を再現性に脱リン酸した（Ｌｕら，２００１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２３８１〜２３８４）。さらに、Ｐｉｎ１は、非リン酸化基質よりもｐＳｅｒ８３−Ｐｒｏに対して１０００倍を上回る活性を示した（Ｙａｆｆｅら、１９９７，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１９５７〜１９６０）。これらのデータによって、ＨＡによって誘発された、Ｐｉｎ１およびＡＵＦ１の翻訳後改変の観察された組み合わせが、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡへの結合の損失を伴うＡＵＦ１異性化を生じることが示唆された。
【０１０９】
（実施例６）
（ＰＢＭＣおよびＴ細胞におけるＰｉｎ１およびサイトカインｍＲＮＡの調節）
上記のデータは明確に、活性化されたＥｏｓによるＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ安定性およびサイトカイン分泌の調節においてＰｉｎ１が関与しているとみなし、これは喘息の病因に重要な洞察を提供した。これらの観察によって、Ｐｉｎ１が他の免疫細胞によって他のサイトカインの産生を制御し得ることが示唆された。従って末梢血単球（正常なドナーの瀉血によって得られた、約７０％のＴ細胞、２０％のＢ細胞、５〜１０％のマクロファージ／単球）を、最適濃度の分裂促進因子（ホルボールエステル（２０ｎｇ／ｍｌ）、およびＰＨＡ（４０μｇ／ｍｌ）、両方ともＳｉｇｍａ由来）とともにインキュベートして、サイトカインのｍＲＮＡのレベルを、ノーザンブロットまたはリアルタイムのＲＴ／ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）およびＥＬＩＳＡによるサイトカイン分泌によって測定した。血球は、培地中で希釈されたヘパリン処理全血から調製し、そしてＰＢＭＣは、記載されたとおり（Ｓｅｄｇｗｉｃｋら、２００３，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９：７０２〜９）Ｐｅｒｃｏｌｌ勾配によって単離した。ＩＬ−２、ＩＬ−８、ＴＮＦα、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡを最初に評価した。なぜなら、これらのサイトカインは全てＧＭ−ＣＳＦと３’ＵＴＲ  ＡＵ−リッチエレメントを共有するからである。ＩＬ−８を除いて、これらのｍＲＮＡは、ノーザンブロットによって休止期の細胞では検出不能であった（図７）。しかし、分裂促進因子刺激の４時間内にサイトカイン発現は劇的に増大した。対照的に、ＰＢＭＣが、１μＭのジュグロンの存在下で分裂促進的に刺激された場合、サイトカインのｍＲＮＡ蓄積はほぼ完全にブロックされ（図７、図８）、一方、刺激の２時間後のジュグロン処理は、部分的な効果を有した（図９）。ｑＰＣＲ分析によって、４時間内に１０００倍〜５０００倍まで増大されたサイトカインｍＲＮＡは代表的には、ジュグロン処理によって６５〜９０％まで抑制された（図８、図９）。ＥＬＩＳＡ（図１０）は、Ｐｉｎ１阻害後にサイトカイン放出において比例的な減少を示し、これによって、サイトカイン合成のためのｍＲＮＡ蓄積の重要性が実証された。
【０１１０】
Ｐｉｎ１阻害およびジュグロンによって非特異的に影響される非二次事象が上記のｍＲＮＡ蓄積を担っていたことを確認するため、ＰＢＭＣをＰＭＡ／ＰＨＡ活性化と同時にＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１とともにインキュベートした。ＴＡＴ−ＧＦＰで処理したコントロール細胞に比較して、サイトカインのｍＲＮＡレベルは５０〜６０％まで減少された（図１１）。従って、Ｐｉｎ１活性は、ＰＢＭＣのＰＭＡ／ＰＨＡ刺激後の複数のサイトカインｍＲＮＡの蓄積に必要であった。
【０１１１】
より生理学的なアゴニストの効果を評価して、それがＰｉｎ１遮断によって同様に阻害され得るか否かを決定した。ＰＢＭＣを抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体とともに、ジュグロンとともに（またはジュグロンなしで）４時間インキュベートして、その後に回収およびｑＰＣＲを行なった。ＰＭＡ／ＰＨＡでみられるとおり、Ｐｉｎ１阻害は、サイトカインｍＲＮＡ蓄積および分泌を防止し（図９）、そしてＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１をジュグロンの代わりに用いた場合、同様のデータが得られた。従って、Ｐｉｎ１は、重要な中間体であって、これはＴ細胞レセプターおよびＣＤ２８同時刺激シグナル伝達を調整し、その活性は、サイトカインｍＲＮＡ蓄積および活性化された免疫細胞からのサイトカイン放出のために必要であった。
【０１１２】
好酸球での上記のデータに基いて、Ｐｉｎ１遮断は、サイトカインのｍＲＮＡを不安定化させたという仮説がされた。従って、ＰＢＭＣは、分裂促進的な抗体およびＴＡＴ−ｗｗｐｉｎ１またはＴＡＴ−ＧＦＰとともに４時間インキュベートした。その時点で、アクチノマイシンＤ（ａｃｔＤ，Ｓｉｇｍａ）を添加して、ｑＰＣＲによって測定される、さらなる転写およびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ崩壊をブロックした。示されるとおり（図１２）、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡは、ＴＡＴ−ＧＦＰとともに（またはＴＡＴ−ＧＦＰなしで）分裂促進性の刺激後にＰＢＭＣにおいて極めて安定であった。非刺激細胞において、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡは極めて不安定であった。分裂促進因子プラスＴＡＴ−ｗｗ−Ｐｉｎ１とともにインキュベートした細胞は、刺激されていないコントロールに近い急速なＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ崩壊を示した。従って、好酸球においてと同様に、Ｐｉｎ１は、ＰＢＭＣによるサイトカインｍＲＮＡの活性依存性の安定化を調節する。
【０１１３】
ＰＢＭＣは、異種であるので、この細胞集団は、ネガティブ選択によってＴ細胞に分画した（Ｓｅｄｇｗｉｃｋら、２００３，Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２９：７０２〜９に記載されるとおり）。代表的には、これによって、９８％を上回る純度のＣＤ３陽性細胞の培養物を生じた。次いで、これらを抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈから入手）で活性化し、そしてサイトカイン遺伝子発現に対するＰｉｎ１遮断の効果をｑＰＣＲによって評価した。示されるとおり（図１３）、精製されたＴ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８処理の後の強力な活性化を示し、そして４時間までＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡレベルにおける１５００〜５０００倍の増大を有した。抗体とともに添加したジュグロン（１μＭ）は、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡを８０〜９５％まで減少させた。ＰＩ／アネキシン染色およびフローサイトメトリーに基づいて、活性化Ｔ細胞は、活性化されなかった細胞と等価の生存度を示した。
【０１１４】
Ｔ細胞活性化および遊走に関するサイトカインｍＲＮＡを含むＡＲＥの蓄積はまた、脾細胞においてリアルタイムＰＣＲによって検査した。バルクのラット脾細胞を、以下のように、インビトロにおいてイオノマイシン／ＰＭＡ（Ｉ／Ｐ）またはＩ／Ｐに加えて種々の濃度のジュグロンで活性化させた。正常なＷＹＫラット由来の５×１０５個の脾細胞を、４８時間、イオノマイシンなし、またはイオノマイシンに加えてＰＭＡ（Ｉ／Ｐ）で、ジュグロンなし、またはジュグロン１μＭ（Ｉ／Ｐ／Ｊ１）と、またはジュグロン０．１μＭ（Ｉ／Ｐ／Ｊ０．１）とともに培養した。ＩＬ−２（２ｎｇ／ｍｌ）をまた、示された培養物に対して２４時間後に添加した。４８時間後、その培養物にさらに、ＢｒｄＵ、ジュグロン（１または０．１μＭ）およびＩＬ−２（２ｎｇ／ｍｌ）を示されたとおり補充した。その増殖は、製造業者（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）によって推奨されたとおり、比色定量アッセイ（４５０ｎｍ）によって、５’−ブロモ−２’−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ）との１８時間のインキュベーション後にモニターした。
【０１１５】
期待どおり、休止期の細胞は、低レベルのＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＴＧＦ−βのｍＲＮＡを発現した（図１４Ａ）。Ｉ／Ｐの４時間後、サイトカインのｍＲＮＡは、２倍（ＴＧＦ−β）〜５００倍（ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ）程度まで増大した。ジュグロン（１μＭ）はＩ／Ｐ誘発性ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２のｍＲＮＡの蓄積を完全にブロックし、ＴＮＦ−αのｍＲＮＡのレベルを有意に減少させ、そしてＴＧＦ−βおよびＣＸＣＬ−１０のｍＲＮＡを休止期のレベル未満に減少させた。ジュグロン濃度（０．１μＭ）が低いほど、ＩＦＮ−γのｍＲＮＡの蓄積のみが有意に阻害され、一方でＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ−１０（ＩＰ−１０）およびＴＧＦ−βのｍＲＮＡはＩ／Ｐ活性化細胞から大きく変化しなかった。これらのデータによって、Ｐｉｎ１阻害に対するかなりの感度が示唆されたが、Ｐｉｎ１は、休止期のまたは活性化されたラット脾細胞による多様なサイトカインｍＲＮＡの生成を調節したことが確認された。
【０１１６】
サイトカイン同化作用は、以下のように、コントロール、活性化またはジュグロン処理活性化脾細胞によって測定された。脾細胞によるＩＦＮγ分泌は、製造業者によって記載されるとおりＥＬＩＳＰＯＴ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）によって評価した。細胞の三連の連続希釈物をＰＭＡ（１０ｎｇ／ｍｌ）に加えてイオノマイシン（１μＭ）とともに４８時間培養した。ＢＡＬ液中のＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の濃度は、ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて決定した。
【０１１７】
定常状態のｍＲＮＡレベルと一致して、ジュグロン処理したＩ／Ｐ刺激された脾臓細胞によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２分泌における劇的な減少が、ＥＬＩＳＡによって明らかになった。ｍＲＮＡについてと同様、サイトカイン分泌は、１μＭでの最大効果を有する、ジュグロンに対する用量依存性の応答を示した（図１４Ｂ）。サイトカインを生成することができないことは、細胞死の機能ではなかった。なぜなら等価なレベルのアポトーシスが、Ｉ／Ｐ対Ｉ／Ｐ／ジュグロン処理脾細胞で観察されたからであった（図１４Ｃ）。ＢｒｄＵ取り込みに基づいて、ジュグロン（１μＭ）は、外因性のＩＬ−２の添加に関わらず、ＤＮＡ合成を効率的に抑制した（図１４Ｄ）。従って、Ｐｉｎ１遮断は、増殖および活性化されたラット脾細胞による炎症促進性サイトカインの同化作用を抑制した。
【０１１８】
（実施例７）
（肺移植片拒絶におけるＰｉｎ１の役割）
サイトカイン同化作用に必要な重要なシグナル伝達分子としてＰｉｎ１の同定によって、これは器官移植の状況での免疫抑制の価値のある標的であり得ることが示唆された。従って、クラスＩのＨＬＡがミスマッチであるラットへの同所性肺同種移植の拒絶を妨げるＰｉｎ１の阻害の能力を試験した。これは、十分確立されたげっ歯類モデルであって、Ｆ３４４ラットの全体的な左肺は、レシピエントのＷＫＹラットにおいてカフを介して移植および再結合された（Ｍｉｚｏｂｕｃｈｉら、２００４，Ｊ  Ｈｅａｒｔ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２３：８８９〜９３）。従って、この移植物を、換気してかつ血管移植したが、内在性の右肺はレシピエントに残った。免疫抑制の非存在下では、器官は、３〜４日内に極めて急速かつ顕著な拒絶を受けた（Ｒ．Ｂｒａｕｎ，ＵＷ  Ｄｅｐｔ  ｏｆ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，私信）。３日後までに、外面は、かなり出血性であって、容積が減少し、そして組織病理学的な検査によって、ＰＭＮ、リンパ球およびマクロファージから構成される集中的な細胞浸潤、肺胞の閉塞および線維症が示された。
【０１１９】
ジュグロンがこのモデルの系において移植された肺組織になんらかの影響を有したか否かを決定するために、動物に手術の日およびそれに続く各々の日に、１ｍｇ／ｋｇのジュグロンをＩＰで投与した（注射の直前に生理食塩水中で１×に希釈した、エタノールまたはクロロホルム中へ１０〜２０×に溶解）。いくつかの実験では、用量を分割して、１日あたり２回送達した。８日目、動物を屠殺して、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を、両方の肺で行い、続いて固定のために４％ホルマリンを浸透させた。２日後、切片をパラフィン包埋ブロックから切り出して、Ｈ＆Ｅで染色した。脾臓および末梢血を含む他の器官も回収した。図１５に示されるとおり、８日目に分析したコントロールの移植片は、大量の炎症性細胞浸潤、壊死および完全な肺胞の損失および線維性瘢痕を伴う典型的な拒絶を示した。ジュグロン処理動物は、一貫しておりかつ再現性の肺温存を示した（図１６）。ジュグロン処理動物由来の肺組織における肺胞は大部分インタクトであった（ただし、マクロファージである可能性が高い、偶発的な大型の丸い細胞が小さい空隙で観察された）。血管周囲および気管支周囲のリンパ凝集物はまた、ジュグロン処理動物由来の組織に存在したが、好中球は、ほとんど存在せず、そして炎症は、肺胞へは進行しなかった。ジュグロンを投与された８匹の移植ラットのうち６匹で実質的に同一なデータが得られた；２匹の失敗例は、これらの研究では初期であって、薬物不溶性を反映する可能性が高い。これらのデータによって、Ｐｉｎ１は移植拒絶に必要であったことが初めて実証され、そしてこのＰＰＩａｓｅが免疫抑制のための代替的な治療標的として示唆された。Ｐｉｎ１はシクロスポリン（ｃｙｃｌｏｐｈｉｌｉｎ）であるが、これは、カルシニュリンとは相互作用せず（シクロスポリンＡと同様である）、これによってＣｓＡおよびＰｉｎ１遮断が相加的または相乗的であり得ることが可能になる。
【０１２０】
次に、コントロールとジュグロン処理移植レシピエントとの間の免疫学的な変化を分析した。Ｐｉｎ１阻害の１週間後、末梢血ＣＤ４＋、ＣＤ８＋細胞およびγ／δリンパ球の絶対的なカウントおよび比は、大きく影響されなかった。コントロール対未処理の動物から回収した脾細胞（移植の８日後）をＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（１μＭ）の最適濃度で刺激して、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γ発現についてＥｌｉｓｐｏｔによって分析した。示されるとおり（図１７）、これらのサイトカインを発現する細胞の数は、約６０〜７０％まで有意に減少した。脾臓全体上に対するＲＴ−ＰＣＲ分析は、Ｅｌｉｓｐｏｔデータ（図１８）と一致して、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２およびＩＦＮγのｍＲＮＡレベルにおける有意な変化を示した。処置した動物由来のＢＡＬは、未処理のコントロールよりも５０％少ない総細胞を示したが、絶対数は、非移植の対側の肺における数を上回ったままだった。ジュグロン処理動物由来の肺のＩＬ−２およびＩＦＮ−γについてのＲＴ−ＰＣＲによって、非処理コントロールと比較して約３５％というＩＬ−２およびＩＦＮ−γのｍＲＮＡが示された。これらのデータは、Ｐｉｎ１遮断にかかわらず、ある程度の炎症が生じたことを示唆した。これは、寛容化の応答、または抑制性の応答であり得る（すなわち、これは、ＣＤ８＋サプレッサーまたは制御性Ｔ細胞から構成される）。これらの結果によって、Ｐｉｎ１の遮断が、同種免疫応答および免疫細胞活性化に関連する状態、ならびに引き続く組織傷害での補充を妨げたこと、従って、Ｐｉｎ１不活性化が免疫抑制治療の標的であったことが示された。
【０１２１】
（Ｐｉｎ１阻害は、急性および慢性の拒絶を妨げた）
Ｐｉｎ１によって調節されたサイトカインおよびケモカインは、器官移植後の免疫学的および病理学的事象に広範に関連している。さらに、Ｐｉｎ１は、ＣｙＡおよびＦＫＢＰ１２も含むＰＰＩａｓｅファミリーの酵素のメンバーである。それぞれ、シクロスポリンＡおよびＦＫ５０６でのこれらのサイクロフィリンでの妨害は、器官移植後の臨床的な免疫抑制の現在の頼みの綱であるので、本発明者らは、Ｐｉｎ１遮断が臓器拒絶に同様の影響を有したか否かを評価した。本発明者らは、広範に使用されておりかつ強力に免疫原性のラット同所性の、単一左肺移植モデルを用いた（Ｈａｑｕｅら、２００２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６９：１５４２〜１５４９；Ｓｅｋｉｎｅら、１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：４０８４〜４０９３）。ドナーの器官は、正常な機能を可能にするレシピエントの気管支および脈管系に対してカフを介して付着される。レシピエント（ＷＫＹ）は、ドナー（Ｆ３４４）とはクラスＩのＭＨＣ抗原で異なる。従って、非免疫抑制動物は、数日内の顕著な急性拒絶、および肺胞、胸膜および気管支周囲のコラーゲン沈着、生存可能な肺細胞の損失および最終的な器官の損失を１〜２週内に伴う慢性拒絶を経験する。
【０１２２】
肺移植拒絶に対する１ｍｇ／ｋｇのジュグロンの毎日の単回腹腔内（ＩＰ）注射の効果を評価した。左肺の同所性の移植は、カフ技術を用いて以前に報告されたとおり行った（Ｍｉｚｕｔａら、１９９１，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．１０２：１５９〜１６０；Ｍｉｚｕｔａら，１９８９，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．９７：５７８〜５８１）。要するに、ラットをイソフルランおよび酸素の混合物の吸入によって麻酔して、挿管して、イソフルランおよび酸素の混合物で換気して、麻酔を維持した。そのドナーラットを仰臥位において、心臓および肺をひとまとめに取り出した。左肺を切除して、肺静脈、気管支および肺動脈を、テフロン（登録商標）カフを通過させて、近位端をカフを越えて裏返した。レシピエントのラットでは左開胸術を行った。ドナーの肺静脈、気管支および肺動脈を、対応するレシピエントの臍の構造に挿入して、絹の独立円周の結紮術（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｃｉｒｃｕｍｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｌｉｇａｔｕｒｅｓ）で固定した。胸壁を閉じて、イソフルランを停止した。
【０１２３】
ジュグロンを、エタノールに溶解して、５ｍｌの生理食塩水に希釈した。コントロールの動物には、５ｍｌの生理食塩水に溶解しただけのエタノールを与えた。処理は、移植の日に開始した。７日目または１４日目に、動物を屠殺して、肺を肉眼で、そして組織病理学によって評価した。未処理の動物では、移植片は視覚的に縮小しており、そして胸膜の表面は出血性であった（図１９Ａ）。触診によって、固くかつ曲がらない一貫性が明らかになった。ジュグロン処理した動物は、拒絶の全体的な徴候を示さず（図１９Ｄ）、そして移植された肺は対側のコントロールとは識別不能であった。顕微鏡的に、未処理の移植肺は、好中球、リンパ球およびマクロファージから主になる急性の炎症性細胞浸潤をともなう重度の拒絶を示した。肺胞構造は全体的に削除され、そして小気道は炎症性細胞でパックされた（図１９Ｂ）。これらの変化は、ジュグロン処理動物中に全く存在せず、これは、正常な肺胞構造、胸膜の厚みおよび気道開通性を示した（図１９Ｅ）。
【０１２４】
偶発性の丸いマクロファージが、いくつかの肺胞に存在した。同一のデータが１０の処理動物のうち８匹で観察された。２つの失敗例はこのシリーズにおいて早期であって、薬物溶解度の問題を示す可能性が高かった。ＢＡＬ液の分析によって、コントロール動物に比較してジュグロン処理動物に存在する全部の細胞の有意に減少した数（ｐ＜０．０５）が示された。天然の右肺由来のＢＡＬ液における、または移植された左肺におけるＣＤ４、ＣＤ８またはγδＴ細胞の相対的な割合では有意な相違は見出されず、これは、主にＣＤ４＋Ｔ細胞を示すコラーゲンＶ寛容化動物とは対照的であった。これらのデータによって、Ｐｉｎ１遮断は急性の移植片拒絶を劇的に減弱することが実証された。
【０１２５】
未処理のコントロールの組織病理学的分析によって、肺胞、気管支周囲および胸膜のコラーゲンの沈着が明らかになった（図１９Ｃ）。肺胞空間は、類線維素物質で満たされ、生きた肺細胞の完全な損失があった。胸膜は顕著に線維性であって、代表的には、その正常な厚みを２０倍上回り、増殖性の線維芽細胞が明確に視認できた。しかし、ジュグロン処理した動物は、肺胞壁内または気管支周囲に最小限のコラーゲン沈着、生存肺細胞の維持および概して正常な構造を示した（図１９Ｆ）。従って、Ｐｉｎ１阻害は、コラーゲン沈着および慢性移植片拒絶でみられたものに匹敵する肺の喪失を防止した。
【０１２６】
ＢＡＬおよび縦隔リンパ節の細胞におけるＰｉｎ１活性は、以下のとおり移植後７日で検査した。活性は、Ｓｈｅｎら、２００５，Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２：１２８０〜７に記載されるように測定した。リンパ節、脾臓および気管支肺胞洗浄液由来の白血球を、５０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１００ｍＭのＮａＣｌを含有する緩衝液、ｐＨ７．０中で凍結融解サイクルを繰り返すことによって溶解した。総タンパク質（１０μｌ中に１０μｇ）を、２ｍＭのジチオトレイトールおよび０．０４ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを補充した７０μｌのＨＥＰＥＳ−ＮａＣｌ緩衝液と混合した。次いで、５μｌのα−キモトリプシン（６０μｇ／μｌを０．００１ＮのＨＣｌ中に含有）を添加して、徹底的に混合した。最終的にジメチルスルホキシドに溶解し、４８０ｍＭのＬｉＣｌおよびトリフルオロエタノール中で１００μｇ／ｍｌの濃度でプレインキュベートした５μｌのテトラペプチド基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮａ（配列番号１）；Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）を添加した。３９０ｎｍでの吸光度を、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  ＤＵ８００分光光度計を用いて３０分にわたって測定した。
【０１２７】
シスからトランスへの異性化後、末端４−ニトロアニリド基は、キモトリプシンによって切断して、３９０ｎｍでの吸光度によって検出し得る。移植された左肺由来のＢＡＬ細胞におけるＰｉｎ１活性は、ジュグロン処置ラットでは有意に減少した（図２０Ａ）。これらの細胞の溶解物へのジュグロンの添加は、Ｐｉｎ１活性にさらなる影響を有さず、このことは最大のインビボ抑制を示した。Ｐｉｎ１活性は、未処理のコントロールＢＡＬ細胞では有意に上昇した。イソメラーゼ活性は、ジュグロンの添加によって処理動物由来の溶解物中で見られたよりもインビトロで減少され得る。同様に、ジュグロン処理動物由来の縦隔リンパ節細胞は、Ｐｉｎ１活性を示さなかったが、コントロール動物は、実質的な上昇を示し、これはやはり、インビトロでジュグロンによってブロックされ得る（図２０Ｂ）。従って、ＭＨＣ不適合の移植は、反応性の免疫細胞においてＰｉｎ１活性の上昇を誘発した。これらの変化は、ジュグロンのインビボ投与によって妨げられ得る。
【０１２８】
Ｐｉｎ１タンパク質レベルは、抗Ｐｉｎ１イムノブロット分析によって処理動物対コントロール動物の縦隔リンパ節で分析した。予想どおり、ジュグロン処理動物は、コントロールの動物に比較して縦隔リンパ節においてかなり減少したＰｉｎ１タンパク質を示した（図２０Ｃ）。これらの同じ動物の脾臓におけるＰｉｎ１のレベルおよび活性は、コントロールとジュグロン処理動物との間で相違せず、このことは、不適合の移植片を排出する最も近位のリンパ節中で最大であった、区画化された免疫応答を示唆している。
【０１２９】
（ＩＦＮ−γおよびＣＸＣＬ−１０は、Ｐｉｎ１阻害後に減少した）
ＩＦＮ−γおよびＩＬ−２のレベルを、上記のとおり、移植１週間後の動物で測定した。ＥＬＩＳＡによるＢＡＬ液の分析では、ＩＦＮ−γの高度に有意な減少（図２１）およびＩＬ−２濃度のほぼ有意な減少（図２１）を示した。これらのデータによって、Ｐｉｎ１ブロックが、ＢＡＬ液内の主な集団であったＴ細胞によるサイトカイン産生を妨げたことが示唆された。
【０１３０】
次いで、縦隔リンパ節細胞をｑＰＣＲによってサイトカインｍＲＮＡの発現について分析した。ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＣＸＣＬ−１０およびＴＮＦ−αをコードするｍＲＮＡは、コントロールよりもジュグロン処理動物で有意に低かったが、ＩＬ−４およびＴＧＦ−β１は影響されなかった（図２２Ａ）。これらのデータによって、Ｐｉｎ１は、サイトカインのｍＲＮＡのサブセットの調節に関与することが示唆された。注目すべきことに、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＣＸＣＬ−１０およびＴＮＦ−αの全てが３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）ＡＲＥを含み、休止期の細胞で急速に分解され、そして実質的な活性依存性の安定化を示す。ＩＬ−４のｍＲＮＡはまた、ＡＵ−リッチエレメントを含むが、これは局所的に高度に発現され、そして休止期の細胞では比較的安定である。ＴＧＦ−β１のｍＲＮＡは、複数のＡＲＥを欠き、そして代表的には休止期の細胞では緩徐に崩壊する。
【０１３１】
線維芽細胞におけるＴＧＦ−β１シグナル伝達がＰｉｎ１に依存するか否かを決定するために、培養した肺線維芽細胞をＴＧＦ−β１で刺激した。初代肺線維芽細胞は、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）から入手し、そして製造業者によって記載されるとおり培養した。４継代細胞を、８０％コンフルエンスまで増殖させ、血清枯渇培地に４８時間移して、その後にＴＧＦβ（１ｎｇ／ｍｌ）を用いて４時間、ジュグロンとともに（またはジュグロンなしで）刺激した。細胞を溶解して、コラーゲンＩＩＩ発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析のためにＲＮＡを単離した。示されるとおり（図２２Ｄ）、刺激された線維芽細胞は、コラーゲンＩおよびＩＩＩのｍＲＮＡの実質的な増大を示し、これは、ジュグロンの濃度の増大によって用量依存性の方式で減少された。従って、ＴＧＦ−β１のレベルの上昇にかかわらず、肺線維芽細胞によるコラーゲン産生は、Ｐｉｎ１阻害によってブロックされた。
【０１３２】
ジュグロン処理動物における脾細胞由来のサイトカインｍＲＮＡも検査した。製造業者によって記載されるとおりに用いたＥＬＩＳＰＯＴ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に基づいて、活性化脾臓細胞によるＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の産生は、ジュグロン処理動物において有意に減少された（図２２Ｃ）。ＱＰＣＲによって、ＩＦＮ−γおよびＣＸＣＬ−１０のｍＲＮＡが有意に減少されたが、ＩＬ−２、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−４のｍＲＮＡの発現はコントロールと変化しなかったことが明らかになった（図２２Ｂ）。従って、Ｐｉｎ１阻害は脾臓、ＢＡＬおよび縦隔リンパ節においてＩＦＮ−γおよびＣＸＣＬ−１０のｍＲＮＡを選択的に減少した。
【０１３３】
（ＩＦＮ−γおよびＣＸＣＬ−１０の過剰発現は、Ｐｉｎ１遮断を克服して拒絶を誘発した）
図２１および図２２に示された結果によって、Ｐｉｎ１は、活性化された縦隔リンパ節およびＢＡＬ免疫細胞によるＩＦＮ−γおよびＣＸＣＬ−１０の誘導に必要であったことが実証された。関連性の役割ではなく原因を実証するために、ＩＦＮ−γおよびＣＸＣＬ−１０発現ベクターを組み合わせて、レシピエントにおける再結紮の直前にドナー肺へ吹き込んだ。潜在的なＰｉｎ１媒介性の転写後調節を回避するために、３’ＵＴＲなしのコード領域のみを、構成的に活性なＣＭＶプロモーターの下流に挿入した。ｐｃＤＮＡ１（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）をＸｂａＩおよびＸｈｏＩ部位で開いて、ＩＦＮ−γおよびＣＸＣＬ−１０のコード領域をコードするＰＣＲ生成物を、標準的な方法を用いる付着末端ライゲーションを介して挿入した。推定上のクローンを配列決定して、全長インサートが適切な方向で存在することを確認した。増幅後、プラスミドを沈殿させ、洗浄し、そして無菌のＴｒｉｓ−ＨＣｌ／ＥＤＴＡ（ＴＥ）中で１ｍｇ／ｍｌに再懸濁して、１００μｌを吹き込みに用いた。
【０１３４】
次いで、拒絶に対する肺ＩＦＮ−γおよびＣＸＣＬ−１０発現の効果を検査した。移植後１週間までに、肺移植片は、未処理のコントロール中で顕著な拒絶を受け（図１９Ａ、図１９Ｂ）、これは、ジュグロンによって妨げられた（図１９Ｂ、図１９Ｄ）。ＩＦＮ−γおよびＣＸＣＬ−１０の強制的な発現によってＰｉｎ１遮断にかかわらず重度の細胞浸潤が生じた（図２３Ａおよび図２３Ｂ対、図２３Ｃおよび図２３Ｄ）。トランスジェニックサイトカインは、未処理のレシピエントでみられたレベルに匹敵するレベルでＢＡＬ中で検出可能であった。これらの結果によって、急性拒絶のプロセスにおけるＩＦＮ−γおよびＣＸＣＬ−１０の中心的な役割が支持され、そしてＰｉｎ１阻害後のサイトカイン抑制は部分的に、移植片温存を担うことが示唆された。
【０１３５】
（ジュグロンおよびシクロスポリンＡは、相加効果を示した）
組み合わせたシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）およびジュグロン療法が相加的であるか、または相乗的であるかを決定するために、以下の実験を行なった。ジュグロンを１００％エタノール中に１４ｍＭ（２．４４ｍｇ／ｍｌ）に溶解した。注射のために、この溶液の１００〜１５０μｌ（動物の体重次第）を、５ｍｌの生理食塩水に希釈して、３０分内に腹腔内に注射した。最適以下の投与のために、この溶液の１０〜２５μｌを注射した。コントロールの動物には、５ｍｌの生理食塩水に含まれる１００％エタノールの体重に対し適切な容積（それぞれ、１００〜１５０μｌ；１０〜２５μｌ）を投与した。ＣｓＡを、１００％のエタノール中に２５ｍｇ／ｍｌで溶解した。注射のために、この溶液の１０〜２５μｌ（動物の体重次第）を、５ｍｌの生理食塩水に希釈して、移植前および２日後に注射した。
【０１３６】
ＣｓＡは、０．１ｍｇ／ｋｇのジュグロンと一緒に１ｍｇ／ｋｇの用量で３日間腹腔内に注射し、次いでこれをさらに４日間、単独で継続した。シクロスポリンは通常、２５ｍｇ／ｋｇ／日で３日間用い、これで、ラットにおいて長期に生存する肺移植片受け入れを誘導するが、５ｍｇ／ｋｇ／日の用量では中度〜重度の拒絶が観察された（Ｐｉｅｒｏｇら、２００５，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．２７：１０３０〜１０３５）。ＣｓＡ単独（１ｍｇ／ｋｇ／日）で処置した移植された動物は、中度の移植片変色を示した（図２４Ａ）が、顕微鏡的に重篤な細胞浸潤は、実質全体に拡散しており、気管支周囲および血管周囲の領域に病変があった（図２４Ａ）。同様に、Ｐｉｎ１の最適以下の阻害は、重篤な拒絶の症状をもたらし、実質的な細胞浸潤および出血をともなった（図２４Ｂ）。対照的に、ＣｓＡおよびジュグロンの併用の最適以下の処置では、同定可能な細胞浸潤のない優れた移植片防御が得られた（図２４Ｃ）。これらのデータによって、Ｐｉｎ１およびカルシニュリンの併用阻害は相加的または相乗的であったことが示され、そしてＣｓＡの投与量は、Ｐｉｎ１阻害が治療レジメンに添加された場合には減少され得ることが示唆された。
【０１３７】
前述の開示は、本発明の特定の特異的な実施形態を強調していること、そしてそれに等価な全ての改変および代替は、添付の特許請求の範囲に示されるとおり本発明の趣旨および範囲内であることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】図１Ａ〜図１Ｃは、Ｐｉｎ１が好中球（Ｅｏｓ）生存に必要であったことを示す。図１Ａおよび図１Ｂでは、精製されたＥｏｓは、未処理（Ｒ）であるか、ヒアルロン酸（ＨＡ）単独で処理（ＨＡ、１００μｇ／ｍｌ、全ての実験で用いられる）、ＨＡプラスシクロスポリン（ＣｓＡ）（ＨＡ＋ＣｓＡ）、組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ）（ＧＭ、１００ｐｇ／ｍｌ）単独、ｒｈＧＭ−ＣＳＦプラスＣｓＡ、ＨＡプラスジュグロン（ｊｕｇｌｏｎｅ）（ＨＡ＋Ｊｕｇ）またはｒｈＧＭ−ＣＳＦプラスジュグロンを用いて４日間、生存度アッセイ前に示した濃度で処理した。図１Ｃでは、細胞は未処理である（−）か、またはＨＡもしくはＨＡプラスジュグロンを用いて４時間もしくは２４時間処理した。細胞溶解物のイムノブロット解析は、抗カスパーゼ３抗体を用いて行われた。βアクチンは、内部の負荷コントロールとして働いた。
【図２】図２Ａ〜図２Ｅは、Ｐｉｎ１阻害が、好酸球中でＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡ崩壊を加速したことを示す。図２Ａでは、Ｅｏｓは、ＴｒｉＲｅａｇｅｎｔでの溶解およびＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡについてのＲＴ−ＰＣＲ／Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロット分析の前に４時間、図１Ａと同様に処理した。ＧＭ−ＣＳＦ生成物およびコントロールのβアクチンＲＴ−ＰＣＲ生成物のゲル電気泳動を示す。図２Ｂでは、細胞はＨＡを用いて４時間処理し、次いで収集およびＲＴ−ＰＣＲ分析の前にジュグロン（１μＭ）を示した時間で添加して、ここでＧＭ−ＣＳＦまたはβアクチンのｍＲＮＡ発現を上記と同様に分析した。図２Ｂでは、「Ｃ」とは、ｃＤＮＡ添加なしのＰＣＲ反応混合物を指す。図２Ｃでは、細胞は未処理（−／−左のレーン）であるか、またはＨＡ単独、ＨＡプラス種々の濃度（１６０または３２０ｎＭ）のＴＡＴ結合体化緑色蛍光タンパク質（ＴＡＴ−ＧＦＰ）もしくはＴＡＴ結合体化Ｐｉｎ１ドメイン（ＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１）とともに４時間インキュベートして、図２Ａと同様に分析した。図２Ｄでは、コントロール（−／−）、ＨＡ（１００μｇ／ｍｌ）、ｒｈＧＭ−ＣＳＦ（１００ｐｇ／ｍｌ）、ＨＡまたはＧＭ−ＣＳＦプラスＴＡＴ−ＧＦＰ（１６０ｎＭ）またはＨＡもしくはＧＭ−ＣＳＦプラスＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１（１６０ｎＭ）処理したＥｏｓを、下の実施例２に開示されるように細胞生存度アッセイの前に４日間培養した。図２Ｅでは、好酸球は、アクチノマイシンＤ（５μｇ／ｍｌ）の添加の前にＨＡまたはＨＡプラスジュグロン（１μＭ、回収の１時間前）を用いて４時間処理して、ＲＴ−ＰＣＲ／Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロット分析のために示した時間に細胞を回収した。これらの実験では、ＰＣＲは、それぞれ３０サイクル（ＨＡ処理細胞）または３３サイクル（ＨＡプラスジュグロンで処理した細胞）行った。ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの計算された半減期は、下のパネルに示される。
【図３】図３Ａ〜３Ｄは、Ｐｉｎ１がＡＵＦ１（ＡＵリッチエレメントＲＮＡ結合タンパク質１（ＡＵ−ｒｉｃｈ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １））に会合したことを示す。図３Ａでは、Ｅｏｓは未処理（−／−）であるか、ＨＡまたはＨＡプラスジュグロン（１μＭ）を用いて４時間処理された。細胞溶解物は、抗Ｐｉｎ１抗体を用いて免疫沈降され、続いて抗ＡＵＦ１または抗Ｐｉｎ１抗体を用いてイムノブロットされた。非免疫ＩｇＧを、陰性のコントロールとして用い、一方、ＨｅＬａ細胞抽出物を陽性コントロール（「Ｃ」）として用いた。図３Ｂでは、Ｅｏｓ由来の細胞質タンパク質のイムノブロットにより、ＨＡを用いて４時間処理し、または収集の前に示した時間、ジュグロン（１μＭ）で同時処理した。図３Ｃでは、細胞は、未処理であった（−／−／−）か、ＨＡ単独、ＨＡプラスジュグロン（収集の１０分前）、またはＨＡプラス２０μＭもしくは１００μＭのＭＧ１３２（４時間）プラスジュグロン（収集の１０分前）で４時間処理し、細胞溶解液は、示した抗体を用いてイムノブロットした。レーン「Ｃ」は、陽性コントロールとして用いたＨｅＬａ細胞溶解物である。図３Ｄでは、Ｅｏｓは、ＭＧ１３２を２０μＭしか用いなかったことを除けば、図３Ｃについて記載されたとおり処理した。細胞は、ＲＴ−ＰＣＲ／Ｓｏｕｔｈｅｒｎブロット分析の前に総ＲＮＡ単離のためにＴｒｉＲｅａｇｅｎｔで溶解した。
【図４】図４Ａ〜図４Ｂは、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡが、種々のＡＵ−リッチｍＲＮＡ結合タンパク質（ＡＲＥＢＰ）の間で分配したことを示す。図４Ａでは、細胞は、未処理（Ｒ）であったか、ＨＡで４時間、またはＨＡプラスジュグロン（１μＭ、収集の１０分前に添加）（ＨＡ＋Ｊ１０’）で処理して、溶解した。溶解物の４０パーセントを、総ＲＮＡ単離のために用い、そして残りの６０％をＡＵＦ１免疫沈降のために用いた。次いで両方のサンプルを、ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロット分析によって、βアクチンおよびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡについて分析した。図４Ｂでは、細胞は、未処理（−／−）であったか、ＨＡで４時間、またはＨＡプラスＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１（実施例４で下に記載されるとおり；１００ｎＭ）（収集の前に示した時間インキュベートした）で処理して、その後に溶解して、示した抗体を用いて免疫沈降（ＩＰ）させた。溶解物の４０％を、ＲＴ−ＰＣＲ／サザンブロットのために用い、そして残りの６０％をＴＡＴ−ｗｗＰｉｎ１に会合するＡＵＦ１を検出するために抗Ｈｉｓを用いてウエスタンブロットした。図４Ａにおけるレーン「Ｃ」は、ｃＤＮＡ添加なしのＰＣＲを指す；図４Ｂにおけるレーン「Ｃ」は、陽性のＧＭ−ＣＳＦ  ＰＣＲコントロールである。
【図５】図５では、ｐ４５およびｐ４０  ＡＵＦ１がリン酸化され、これは一貫してＨＡ処理によって増大され、そして得られた細胞においてＥｒｋインヒビターであるＰＤ９８０５９によって部分的に拮抗されたことが示される。細胞は、未処理であった（−／−／−）か、ＨＡ単独（４時間）、ＨＡ（４時間）プラスジュグロン（収集の１０分前に１μＭ添加）、またはＨＡプラスＥｒｋインヒビターＰＤ９８０５９（ＰＤ）（収集の３０分前に５０μＭ添加）で処理した。細胞質抽出物は、示したとおり抗ホスホセリン、抗ＡＵＦ１または抗Ｐｉｎ１抗体でイムノブロットした。
【図６】図６は、ＮＣＢＩタンパク質データベースのスクリーニングによって同定されたとおりヒトＡＲＥＢＰにおける仮説のＰｉｎ１部位（Ｓ／Ｔ−Ｐｒｏ）を示す。同時免疫沈降（ＩＰ）の結果は、「＋」によって示す。
【図７】図７は、ジュグロンを用いたＰｉｎ１のブロックが、末梢血単球（ＰＢＭＣ）によるサイトカインｍＲＮＡ蓄積を防止したことを示す。ＰＢＭＣは、ヘパリン処理全血のＰｅｒｃｏｌｌ（登録商標）勾配遠心分離によって健康なドナーから単離した。細胞は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を補充したＲＰＭＩ  １６４０培地中において１×１０６細胞／ｍｌで培養し、その後、ＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＰＨＡ（５μｇ／ｍｌ）（Ｐ／Ｐ）またはＰＭＡ，ＰＨＡおよびジュグロン（１μＭ）（Ｐ／Ｐ／Ｊ）を添加した；「Ｒ」は、さらなる物質の添加なしのコントロールのレーンを意味する。４時間後、細胞を溶解して、回収したＲＮＡの１０μｇをノーザンブロットして、図の左側に示されるプローブを用いてハイブリダイズした。「Ａ」および「Ｂ」は、２つの異なるドナーでの結果を指す。
【図８】図８は、ジュグロンがＰＢＭＣによるサイトカインｍＲＮＡ蓄積を阻害したことを示す。ＰＢＭＣは、３例のドナーから上の図７に記載されたとおり調製して、ＰＨＡ／ＰＭＡ（図７に示される）ジュグロン（１μＭ）を加えるかまたは加えずに処理した。４時間後、ＲＮＡを細胞から単離して、示されるサイトカインｍＲＮＡについて定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）に用いた。データは、ジュグロンでのサンプル中の阻害％として示される。
【図９】図９は、分裂促進的な抗体での活性化後に、精製されたＴ細胞がＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡを蓄積することをＰｉｎ１阻害が妨げたことを示す。精製されたＴ細胞は、ＰＢＭＣの陰性選択によって調製され（フローサイトメトリーに基づいて９８％を超えるＴ細胞が純粋）、そして抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の組み合わせで活性化された。ジュグロンは、示されるように０．１または１μＭで抗体とともに、または種々の時点（示される）で、１μＭで抗体の後に添加された。総インキュベーション時間の４時間後に、細胞を溶解して、ｍＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲのためにＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡについて用いた。「Ｒ」とは、コントロールの未処理の細胞を指し、そしてデータは、これらの結果に正規化されている。
【図１０】図１０は、Ｐｉｎ１阻害が、活性化ＰＢＭＣによるサイトカイン分泌を防止したことを示す。ＰＢＭＣは、上記のように調製されて、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  １６４０中で１×１０６細胞／ｍｌで培養された。「Ｒ」とは、添加なしの培養（コントロール）を指しており、「Ｐ／Ｐ」とは、ＰＭＡおよびＰＨＡ（上記のとおり）（Ｐ／Ｐ）またはＰＭＡ、ＰＨＡおよび１μＭのジュグロン（Ｐ／Ｐ／Ｊ）で刺激された細胞を意味する。上清は、４時間後に収集して、示されるサイトカインについてＥＬＩＳＡによって分析した。全ての「Ｙ」軸は、サイトカインのｐｇ／ｍｌで表す。
【図１１】図１１は、ドミナントネガティブなＰｉｎ１  ＷＷペプチドが、ＰＢＭＣにおけるＧＭ−ＣＳＦ  ｍＲＮＡ蓄積をブロックしたことを示す。４つのドナー由来のＰＢＭＣを、上記の図１０に記載されたとおり、分裂促進的な抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化させた。抗体添加の時点で、２０ｎＭのＴＡＴ−ｗｗ−Ｐｉｎ１またはＴＡＴ−ＧＦＰを細胞に添加した。４時間で、ＲＮＡを単離して、ＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡについてＲＴ−ｑＰＣＲに供した。＊は、ＧＦＰ処理されるかまたはコントロールの活性化細胞のいずれかと比較したＴＡＴ−ｗｗ−Ｐｉｎ１処理培養物の間のｐ＜０．０５という統計学的な有意差を有する結果を示す。
【図１２】図１２は、ドミナントネガティブなＰｉｎ１ペプチド（ＴＡＴ−ｗｗ−Ｐｉｎ１）がＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡを不安定化したことを示す。ＰＢＭＣは、添加なし（休止中）で培養し、図１１において上記されるように分裂促進的な抗体単独（ＣＤ３／ＣＤ２８）で、抗体プラスＴＡＴ−ＧＦＰ（２０ｎＭ）（ＣＤ３／ＣＤ２８＋ＧＦＰ）または抗体プラスＴＡＴ−ｗｗ−Ｐｉｎ１（２０ｎＭ）（ＣＤ３／ＣＤ２８＋ＷＷ）で活性化した。４時間後、アクチノマイシンＤ（ａｃｔＤ；５μｇ／ｍｌ）を添加してＲＮＡ転写をブロックして、細胞を、示された時点でＲＮＡ単離およびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡについてのＲＴ−ｑＰＣＲのために収集した。データは、ａｃｔＤの添加の時点で存在するＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの量に対して正規化してプロットする。
【図１３】図１３は、精製されたＴ細胞が分裂促進的な抗体での活性化後にＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４またはＴＮＦαのｍＲＮＡが蓄積することを、Ｐｉｎ１阻害が妨げたことを示す。精製されたＴ細胞は、ＰＢＭＣの陰性選択によって調製され（フローサイトメトリーに基づいて９８％を超えるＴ細胞が純粋）、そして抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体の組み合わせで活性化された。ジュグロンは、示されるとおり抗体とともに０．１または１μＭで添加した。総インキュベーション時間の４時間後に、細胞を溶解して、示されるサイトカインｍＲＮＡについてＲＴ−ｑＰＣＲのためにｍＲＮＡを用いた。「−」とは、活性化されたが、ジュグロンには曝露されないコントロール細胞を指す。
【図１４−１】図１４Ａ〜図１４Ｄは、サイトカインｍＲＮＡおよびＤＮＡの合成が、活性化脾細胞においてＰｉｎ１阻害によって抑制されることを示す。図１４Ａでは、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＣＸＣＬ−１０およびＴＧＦ−βのｍＲＮＡを、逆転写、ｑＰＣＲによりラット脾細胞で分析した。イオノマイシン／ＰＭＡ刺激サンプルを１００に正規化して、他はその値の％として表した。このデータは、未処理の健常動物の脾細胞を用いる３つの個々の実験の平均±ＳＥＭである。
【図１４−２】図１４Ａ〜図１４Ｄは、サイトカインｍＲＮＡおよびＤＮＡの合成が、活性化脾細胞においてＰｉｎ１阻害によって抑制されることを示す。図１４Ｂは、図１４Ａにおいて記載されるような、培養物からの２４時間後の分泌されたＩＦＮ−γおよびＩＬ−２のグラフを示す。図１４Ｃは、図１４Ａにおいて記載されるように処理された培養物の２４時間後の代表的な細胞生存度を示す。細胞は、ヨウ化プロピジウムで染色し、フローサイトメトリーによって分析した。示した結果は、３つの実験の代表である。図１４Ｄは、図１４Ａに記載されるような条件下での培養の４８時間後のＢｒｄＵ取り込みを示すグラフを示す；白抜きのカラム、外因性ＩＬ−２なし；影付きのカラム、培養開始の２４時間後に添加したＩＬ−２（２ｎｇ／ｍｌ）。このデータは、未処理の健常動物の脾細胞を用いる３つの独立した実験の平均±ＳＥＭである。
【図１５】図１５は、ＷＫＹラットがＦ３４４ラットから同所性の肺移植を拒絶したことを示す。各々のＷＫＹラット（２５０〜３００ｇの重量）は、その左肺を除去されており、そしてＦ３４４ドナーラット由来の同種間の肺で置き換えられた。気管支および肺の血管を再度接続して、胸部を縫合し、そしてその動物をケージに戻した。毎日１０ｍｌの生理食塩水をＩＰ注射して、水分補給を維持した。８日後、動物を屠殺して、両方の肺を取り出し、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）を行って、４％ホルムアルデヒドを用いて肺を２日間穏やかに膨張させた。脱水およびパラフィン包埋後、ランダムな切片を調製して、Ｈ＆Ｅ（ヘマトキシリンおよびエオシン）による標準的な方法を用いて染色して、病理について検査した。代表的な５×および１０×の顕微鏡視野を示す。出血性壊死、広範囲の炎症および肺胞の総除去を示した。未処理の動物由来の脾臓をまた、ＥｌｉｓｐｏｔおよびＲＴ−ｑＰＣＲのために収集した。
【図１６】図１６は、ＷＫＹラットが、１ｍｇ／ｋｇのジュグロンで毎日処置された場合、同種間肺移植片を拒絶しなかったことを示す。動物を、術日および各々の翌日に、１０ｍｌの生理食塩水に溶解した１ｍｇ／ｋｇのジュグロンを、ＩＰ注射を介して投与したこと以外は、上記の図１５に示されるとおり処置した。代表的な肺組織のこれらの顕微鏡写真は、上の図１５におけるコントロールの動物について示されたのと同じ倍率を用いて調製した。この図によって、肺の構造および肺胞腔がジュグロン処理した移植した動物で維持されたこと、そしてジュグロンで処理したラットにおける移植された肺では免疫細胞の炎症も損傷もなかったことが示される。
【図１７】図１７は、ジュグロン処理された移植レシピエント由来の脾細胞が、ジュグロンで処理されていない移植動物由来の脾細胞よりも有意に少ないインターフェロン（ＩＦＮ−γ）およびインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生コロニーを示したことを示す。コントロールまたはジュグロン処理された移植レシピエント由来の脾細胞（２０００）を、３日間、イオノマイシン（１μＭ）およびＰＭＡ（２０ｎｇ／ｍｌ）で活性化してその後、抗ＩＬ−２またはＩＦＮγ抗体の添加および発色およびカウントを行った。
【図１８】図１８は、ジュグロン処理した移植した動物由来の脾細胞が有意に減少したＩＬ−２、ＩＦＮγおよびＴＮＦαのｍＲＮＡレベルを示したことを示す。脾臓は、ＩＬ−２、ＩＦＮまたはＴＮＦαについてｍＲＮＡ単離およびＲＴ−ｑＰＣＲのために未処理またはジュグロン処理したラットからの移植の８日後に処理した。ジュグロン処理したｍＲＮＡレベルを、これらの分析では１００％に設定した。
【図１９】図１９は、Ｐｉｎ１が急性および慢性の拒絶に必要であることを示す。図１９Ａおよび図１９Ｄは、コントロール、未処理の移植片（図１９Ａ）、およびジュグロン処理（１ｍｇ／ｋｇ；図１９Ｄ）由来の肺の肉眼的形態を示す。肺は、移植片が左になるように配向する。図１９Ｂおよび図１９Ｅは、コントロールの未処理（図１９Ｂ）またはジュグロン処理（図１９Ｅ）由来のヘマトキシリン染色およびエオシン染色した切片を示す。図１９Ｃおよび図１９Ｆは、コントロール、未処理（図１９Ｃ）およびジュグロン処理（図１９Ｆ）のトリクロム染色切片を示す。これらは、８つのコントロールおよび８つのジュグロン処理移植片レシピエント由来の代表的な切片である。
【図２０】図２０は、Ｐｉｎ１活性が、ジュグロン処理された動物由来のＢＡＬ細胞中でブロックされることを示す。図２０Ａは、Ｐｉｎ１イソメラーゼアッセイに用いた、未処理のコントロール（黒菱形）またはジュグロン処理（黒三角）由来のＢＡＬ液の細胞を示すグラフを示す。ジュグロン（１μＭ）をまた、等量のコントロール（白菱形）およびジュグロン処理（白三角）サンプルに対してインビトロで添加して、イソメラーゼアッセイを繰り返した。図２０Ｂは、Ｐｉｎ１イソメラーゼアッセイに用いた、２つの未処理のコントロール（黒菱形、白菱形）または１つのジュグロン処理動物（黒三角）由来の縦隔リンパ節を示すグラフを示す。図２０Ｃは、コントロール、未処理（−ジュグロン）またはジュグロン処理動物（＋ジュグロン）由来の縦隔リンパ節の抗Ｐｉｎ１抗体または抗アクチン抗体でのイムノブロットを示す。
【図２１】図２１は、Ｐｉｎ１のブロックがＩＦＮ−γ産生をインビボで阻害することを示す。ＢＡＬ液におけるＩＦＮ−γおよびＩＬ２の濃度はＥＬＩＳＡによって決定した。データは、移植の７日後の３つの実験の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４ラット）として示す。洗浄液は、分析の前に１０倍に濃縮した。洗浄液の回収は全ての動物で同様であって、示されるデータは、濃縮されたサンプル由来のデータである。＊はｐ＜０．０１を意味する。
【図２２】図２２は、ＩＦＮ−γ、ＣＸＣＬ１０およびＣｏｌＩがＰｉｎ１遮断によって最も影響されることを示す。図２２Ａは、ｘ軸にそって示されるサイトカインについての逆転写、ｑＰＣＲのために用いた、コントロールまたはジュグロン処置由来の縦隔リンパ節を示すグラフを示す。未処理のコントロールにおける値を１００％に正規化して、示されるデータは、ジュグロン処理したサンプルにおける変化の％に相当する。示されるデータは、４つの実験の平均±ＳＥＭ（ｎ＝４ラット）である。＊は、コントロールサンプルからｐ＜０．０５を意味する。図２２Ｂは、上記（図２２Ａ）で記載されたとおりｑＰＣＲについて用いた脾細胞を示すグラフを示す。＊は、ｐ＜０．０５を、＊＊は、ｐ＜０．０１を意味する。図２２Ｃは、Ｅｌｉｓｐｏｔによって定量したＩＦＮ−γ陽性の脾細胞を示すグラフを示す。＊はｐ＜０．０５を意味する。図２２Ｄは、８０％コンフルエンスまで増殖した初代肺線維芽細胞を示すグラフを示しており、これは４８時間血清枯渇し、その後、刺激なし（Ｃ）、１ｎｇ／ｍｌ  ＴＧＦβ１（Ｔ）またはＴＧＦβ１プラス１、２、３、４または５μＭのジュグロン（示されるとおり）で１２時間、その後、溶解、ＲＮＡ単離およびｑＰＣＲによるコラーゲンＩまたはコラーゲンＩＩＩのｍＲＮＡを決定した。値は、コントロール（１００％）に対して正規化する。
【図２３】図２３は、ＣＸＣＬ−１０およびＩＦＮγの過剰発現がＰｉｎ１遮断を克服することを示す。ドナーの肺には、レシピエントにおける再結紮の直前に１００μｇの各々のＣＸＣＬ−１０およびＩＦＮγ発現ベクターを吹き込んだ。次いで動物を、図２およびＨ＆Ｅ染色後の組織病理学的分析のように、未処理（図２３Ａおよび図２３Ｂ）であるか、またはジュグロンを１ｍｇ／ｋｇで用いて１週間処理した（図２３Ｃおよび図２３Ｄ）。複数の動物由来の代表的な切片を示す。
【図２４】図２４は、ジュグロンおよびＣｓＡが相乗的であることを示す。移植は、図１９に記載されるように行って、動物は７日後に回収した。図２４Ａは、ＣｓＡを１ｍｇ／ｋｇ／日で３日間用いて処置した動物由来の肺を示す。図２４Ｂは、ジュグロンを０．１ｍｇ／ｋｇ／日で７日間用いて処置した動物由来の肺を示す。図２４Ｃは、ＣｓＡを１ｍｇ／ｋｇ／日で３日間、に加えてジュグロンを０．１ｍｇ／ｋｇ／日で７日間用いて処置した動物由来の肺を示す。全ての条件について、回収時点での移植片の肉眼的形態は左に示し、Ｈ＆Ｅで染色した５×および２０×の代表的な切片は、中央および右のパネルに示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月9日(2007.11.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的障害を処置または予防するための組成物であって、免疫学的障害を処置または予防を必要とする患者への投与に適する、Ｐｉｎ１インヒビターの有効量を含む、組成物。
【請求項２】
前記Ｐｉｎ１インヒビターが、ドミナントネガティブなペプチドインヒビター、抗体、低分子インヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または短鎖干渉性核酸分子（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫学的障害が好酸球関連障害である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記好酸球関連障害が、気管支喘息、好酸球関連鼻腔内炎症、または眼の好酸球関連炎症である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫学的障害が喘息である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫学的障害が臓器拒絶に関連する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記臓器拒絶が器官移植に関連する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記Ｐｉｎ１インヒビターが、器官または組織の拒絶を予防するために免疫抑制剤と組み合わせての投与に適する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫抑制剤がシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６であり、かつ前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｐｉｎ１インヒビターを含む、好酸球中でアポトーシスを誘発するための組成物であって、該組成物は、好酸球との接触に適する、組成物。
【請求項１２】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがドミナントネガティブなペプチドインヒビター、抗体、低分子インヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または短鎖干渉性核酸分子（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｐｉｎ１インヒビターを特定する方法であって、以下の工程：
ａ．ジュグロンに構造的に関連する１つまたは複数の有機化合物をスクリーニングする工程と；
ｂ．可能性のあるインヒビターがＰｉｎ１の活性を阻害するか否かを決定する工程と；
を包含する、方法。
【請求項１５】
免疫学的障害を処置または予防するための化合物を特定する方法であって、以下の工程：
ａ．Ｐｉｎ１を発現する複数の細胞を提供する工程と、
ｂ．候補化合物の存在下および非存在下において、Ｐｉｎ１の活性について細胞をアッセイする工程と、
ｃ．該Ｐｉｎ１活性が該候補化合物の存在下において、該候補化合物の非存在下よりも少ない場合、免疫学的障害を処置するための化合物として該化合物を特定する工程と、
を包含する、方法。
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月11日(2008.1.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫学的障害を処置または予防するための組成物であって、免疫学的障害を処置または予防を必要とする患者への投与に適する、Ｐｉｎ１インヒビターの有効量を含む、組成物。
【請求項２】
前記Ｐｉｎ１インヒビターが、ドミナントネガティブなペプチドインヒビター、抗体、低分子インヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または短鎖干渉性核酸分子（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記免疫学的障害が好酸球関連障害である、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記好酸球関連障害が、気管支喘息、好酸球関連鼻腔内炎症、または眼の好酸球関連炎症である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記免疫学的障害が喘息である、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記免疫学的障害が臓器拒絶に関連する、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記臓器拒絶が器官移植に関連する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記Ｐｉｎ１インヒビターが、器官または組織の拒絶を予防するために免疫抑制剤と組み合わせての投与に適する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記免疫抑制剤がシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６であり、かつ前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
Ｐｉｎ１インヒビターを含む、好酸球中でアポトーシスを誘発するための組成物であって、該組成物は、好酸球との接触に適する、組成物。
【請求項１２】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがドミナントネガティブなペプチドインヒビター、抗体、低分子インヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または短鎖干渉性核酸分子（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｐｉｎ１インヒビターを特定する方法であって、以下の工程：
ａ．ジュグロンに構造的に関連する１つまたは複数の有機化合物をスクリーニングする工程と；
ｂ．可能性のあるインヒビターがＰｉｎ１の活性を阻害するか否かを決定する工程と；を包含する、方法。
【請求項１５】
免疫学的障害を処置または予防するための化合物を特定する方法であって、以下の工程：
ａ．Ｐｉｎ１を発現する複数の細胞を提供する工程と、
ｂ．候補化合物の存在下および非存在下において、Ｐｉｎ１の活性について細胞をアッセイする工程と、
ｃ．該Ｐｉｎ１活性が該候補化合物の存在下において、該候補化合物の非存在下よりも少ない場合、免疫学的障害を処置するための化合物として該化合物を特定する工程と、
を包含する、方法。
【請求項１６】
免疫学的障害を処置または予防するための医薬の製造におけるＰｉｎ１インヒビターの使用。
【請求項１７】
前記Ｐｉｎ１インヒビターが、ドミナントネガティブなペプチドインヒビター、抗体、低分子インヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または短鎖干渉性核酸分子（ｓｉＲＮＡ）である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項１６に記載の使用。
【請求項１９】
前記免疫学的障害が好酸球関連障害である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２０】
前記好酸球関連障害が、気管支喘息、好酸球関連鼻腔内炎症、または眼の好酸球関連炎症である、請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記免疫学的障害が喘息である、請求項１６に記載の使用。
【請求項２２】
前記免疫学的障害が臓器拒絶に関連する、請求項１６に記載の使用。
【請求項２３】
前記臓器拒絶が器官移植に関連する、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
前記Ｐｉｎ１インヒビターが、器官または組織の拒絶を予防するために免疫抑制剤と組み合わせての投与に適する、請求項１６に記載の使用。
【請求項２５】
前記免疫抑制剤がシクロスポリンＡまたはＦＫ５０６であり、かつ前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項２４に記載の使用。
【請求項２６】
好酸球中でアポトーシスを誘発するための医薬の製造におけるＰｉｎ１インヒビターの使用。
【請求項２７】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがドミナントネガティブなペプチドインヒビター、抗体、低分子インヒビター、アンチセンスオリゴヌクレオチド、または短鎖干渉性核酸分子（ｓｉＲＮＡ）である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
前記Ｐｉｎ１インヒビターがジュグロンである、請求項２６に記載の使用。
【国際調査報告】
2008540571.tif 000028
2008540571.tif 000029
2008540571.tif 000030