(57)【要約】本発明は、トロンビンによる活性化の速度が野生型FXIIIよりも速いバリアントXIII因子に関する。前記バリアントXIII因子が適用される、フィブリン血餅形成を増強させる方法、薬学的組成物、および医薬の製造における使用が開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者におけるフィブリン血餅形成を増強させるための方法であって、以下の工程を備える方法：
a)トロンビンによる活性化の速度が野生型FXIIIよりも速いバリアントXIII因子を提供すること；
b)効果的な量のバリアントXIII因子を被験者に投与すること。
【請求項２】
請求項1に記載の方法であって、活性化ペプチドのポジション28〜41を含んでいる領域中の少なくとも１つのアミノ酸が、XIII因子バリアントにおいて修飾されている方法。
【請求項３】
請求項2に記載の方法であって、前記修飾は、T28D, V29F, E30L, L31A, Q32E, V34(G, L), V35(M,K,Q,R,E,H,L,T,N,S,A), P36(L,V), G38(S,A), V39(F,Y,W,R,M), N40(R,K,W,H,Q,A,S)およびL41Vからなる群から選択される方法。
【請求項４】
請求項1に記載の方法であって、ポジション34〜40における残基は、VVPRSFR, VLPRSFR, VTPRSFR, LLPRSFR, LTPRSFR, VVPRSYR, VLPRSYR, VTPRSYR, LLPRSYR, LTPRSYRまたはLTPRGVNの群から選択されるアミノ酸配列により置換されている方法。
【請求項５】
請求項1〜4の何れか１項に記載の方法であって、バリアントXIII因子の投与は、VIIa因子の投与と組み合わされる方法。
【請求項６】
請求項1〜5の何れか１項に記載の方法であって、前記XIII因子および前記VIIa因子は、ヒトである方法。
【請求項７】
請求項5に記載の方法であって、前記XIII因子およびVIIa因子は、組換え型のヒトXIII因子およびVIIa因子である方法。
【請求項８】
トロンビンによる活性化の速度が野生型FXIIIよりも速いバリアントXIII因子を含んでいる薬学的組成物。
【請求項９】
請求項8に記載の薬学的組成物であって、活性化ペプチドのポジション28〜41を含んでいる領域中の少なくとも１つのアミノ酸が、XIII因子バリアントにおいて修飾されている薬学的組成物。
【請求項１０】
請求項9に記載の薬学的組成物であって、前記修飾は、T28D, V29F, E30L, L31A, Q32E, V34(G, L), V35(M,K,Q,R,E,H,L,T,N,S,A), P36(L,V), G38(S,A), V39(F,Y,W,R,M), N40(R,K,W,H,Q,A,S)およびL41Vからなる群から選択される薬学的組成物。
【請求項１１】
請求項8に記載の薬学的組成物であって、ポジション34〜40における残基は、VVPRSFR, VLPRSFR, VTPRSFR, LLPRSFR, LTPRSFR, VVPRSYR, VLPRSYR, VTPRSYR, LLPRSYR, LTPRSYRまたはLTPRGVNの群から選択されるアミノ酸配列により置換されている薬学的組成物。
【請求項１２】
請求項8〜11の何れか１項に記載の薬学的組成物であって、VIIa因子またはバリアントVIIa因子を更に含んでいる薬学的組成物。
【請求項１３】
XIII因子バリアントおよびVIIa因子またはバリアントVIIa因子を別々の容器手段中に具備しているパーツのキットの形態の請求項12に記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
被検者の出血の発症を治療する医薬の製造のための、トロンビンによる活性化の速度が野生型FXIIIよりも速いXIII因子バリアントの使用。
【請求項１５】
請求項14に記載の使用であって、活性化ペプチドのポジション28〜36またはポジション38〜41を含んでいる領域中の少なくとも１つのアミノ酸が、XIII因子バリアントにおいて修飾されている使用。
【請求項１６】
請求項15に記載の使用であって、前記修飾は、T28D, V29F, E30L, L31A, Q32E, V34(G, L), V35(M,K,Q,R,E,H,L,T,N,S,A), P36(L,V), G38(S,A), V39(F,Y,W,R,M), N40(R,K,W,H,Q,A,S)およびL41Vからなる群から選択される使用。
【請求項１７】
請求項14に記載の使用であって、ポジション34〜40における残基は、VVPRSFR, VLPRSFR, VTPRSFR, LLPRSFR, LTPRSFR, VVPRSYR, VLPRSYR, VTPRSYR, LLPRSYR, LTPRSYRまたはLTPRGVNの群から選択されるアミノ酸配列により置換されている使用。
【請求項１７】
請求項14〜17の何れか１項に記載の使用であって、前記医薬がVIIa因子またはバリアントVIIa因子を更に含む使用。
【請求項１８】
活性化ペプチドのポジション28〜41を含んでいる領域中の少なくとも１つのアミノ酸が修飾され、該修飾はT28D, V29F, E30L, L31A, Q32E, V34(G), V35(M,K,Q,R,E,H,T,N,S,A), P36(L,V), G38(S,A), V39(F,Y,W,R,M), N40(R,K,W,H,Q,A,S)およびL41Vからなる群から選択されるXIII因子バリアント。
【請求項１９】
ポジション34〜40中の残基はアミノ酸配列VVPRSFRまたはVLPRSFRまたはVTPRSFRまたはLLPRSFRまたはLTPRSFRまたはVVPRSYRまたはVLPRSYRまたはVTPRSYRまたはLLPRSYRまたはLTPRSYRまたはLTPRGVNで置換されている、請求項18に記載のXIII因子バリアント。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
［発明の分野］
被験者におけるフィブリン血餅形成（fibrin clot formation）を増強させる方法およびバリアントXIII因子を含んでいる薬学的組成物。
【０００２】
［発明の背景］
止血は、血管壁に対する傷害後に循環血液に暴露された組織因子（TF）と、総FVIIタンパク質の質量（mass）の約１％に対応する量で循環中に存在するFVIIaとの間の複合体の形成によって開始される。この複合体は、ＴＦを有する細胞にアンカーされ、そして細胞表面においてＦＸをＦＸａに及びＦＩＸをＦＩＸａに活性化する。ＦＸａは、プロトロンビンをトロンビンに活性化し、これがＦＶＩＩＩ、ＦＶ、ＦＸＩ、およびＦＸＩＩＩを活性化する。さらに、この止血における初期段階で形成される限られた量のトロンビンは、血小板をも活性化する。血小板に対するトロンビンの作用に続き、これらは、複数の他の現象のうちでも、形を変え、それらの表面に電荷をもったリン脂質を露出する。この活性化された血小板の表面は、さらなるＦＸ活性化および完全なトロンビン生成のための鋳型を形成する。活性化された血小板表面において、活性化された血小板の表面上に形成されたＦＩＸａ−ＦＶＩＩｌａ複合体を経て、さらなるＦＸの活性化が生じ、次いでＦＸａは、ＦＶａと複合体を形成し、プロトロンビンをトロンビンに転換する。次いで、トロンビンは、フィブリノーゲンを、初期の血小板栓（platelet plug）を安定化するフィブリンに転換する。最終的に、FXIIIaは、フィブリン単量体に接着し、フィブリン線維を架橋し、血餅に対するフィブリン溶解インヒビター（即ち、アルファ２−抗プラスミン）に共有結合性に付着し、これによって機械的な力およびフィブリン溶解（fibrinolysis）に対抗する抵抗性が提供される。 
FVIIは主に一本鎖（single-chain）の酵素原として血漿中に存在し、これがFxaによって、その二本鎖（two-chain）の活性型のFVIIaに切断される。組換え活性型VIIa因子（rFVIIa）は、止血性（pro-haemostatic）の薬剤として開発されている。rFVIIaの投与は、迅速で高度に有効な止血性の応答を、出血を伴う血友病被験者（該被験者は、抗体形成により凝固因子製品で治療することができない）に提供する。また、VII因子の欠乏（deficiency）を伴う出血している被験者又は正常な凝固系を有しているが、過剰な出血を受けている被験者は、rFVIIaでうまく治療することができる。
【０００３】
薬理学的な用量のrFVIIaは、活性化された血小板表面におけるトロンビンの形成を増大する。これは、ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩを欠損し、それゆえ完全なトロンビン形成のための最も強力な経路を欠いている血友病被検者において生じる。また、血小板数の低下または機能に欠陥がある血小板の存在下では、追加的（extra）なrFVIIaがトロンビン形成を増大する。
【０００４】
FXIIIは、トランスグルタミナーゼである。トロンビンによってFXIIIaへと活性化される際に、前記酵素はフィブリンモノマーおよび他の基質の間で分子内ガンマ―グルタミル―イプシロン―リジンの架橋の形成を触媒する。これによって架橋されたフィブリンが形成され、血餅に対する機械的な抵抗性が提供される。さらに幾つかの抗フィブリン溶解性、止血性、および接着性のタンパク質が血餅へと架橋されて、プラスミンおよび他のタンパク分解性の酵素による溶解に対し機械的な抵抗性が増大した強いフィブリン構造が提供される。XIII因子は、「フィブリノリガーゼ（fibrinoligase）」および「フィブリン安定化因子（fibrin stabilizing factor）」としても知られている。FXIIIは、血漿および血小板に認められる。前記酵素は、２つのa-サブユニットおよび２つのbサブユニットからなるテトラマー酵素原（a2b2と称される）として血漿中に並びに２つのa-サブユニットからなる酵素原(a2と称される)として血小板中に存在する。 
双方の酵素原a2b2およびa2は、トロンビンおよびカルシウムによって活性化される。カルシウムは、傷害の部位での凝集物上で血小板から放出される。トロンビンは、a−サブユニットのアミノ酸残基37と38との間のペプチド結合を切断する。a2b2-酵素原の場合において、b-サブユニットは、活性化されたa-サブユニットから解離される。トロンビンおよびカルシウムの活性化に続いて、a-サブユニットにおける活性部位システインが暴露され、完全に活性化された酵素が形成される。重篤な血小板減少症を伴う被験者が、FXIIIの血漿レベルが低いことが見出されている。さらにまた、同種間の幹細胞移植後の移植片対宿主合併症（graft-versus-host complications）を伴う患者および心臓外科を経験している患者は、FXIIIの血漿レベルが減少する。 
手術または重大な外傷（trauma）に付随して過度に出血し、輸血の必要がある被検者では、出血を経験していない人々よりも多くの合併症を発症することが周知である。しかしながら、人血または血液製剤（凝固欠陥の治療のための血小板、白血球、血漿に由来する濃縮物、その他）の投与を必要とする中等度の出血も、ヒト・ウイルス（肝炎、ＨＩＶ、パルボウイルス、および他の現在未知のウイルス）を伝達するリスクと関連する合併症に至る可能性がある。大量の輸血を必要とする大量の出血は、肺および腎機能の障害を含む多臓器不全の発症を引き起こすかもしれない。一旦、被験者がこれらの深刻な合併症を発症すると、幾つかのサイトカインおよび炎症反応に関与しているイベントのカスケードが開始され、如何なる治療も極めて困難となり、残念なことに頻繁に不成功となる。従って、手術における並びに主要な組織損傷の治療における主な目標は、出血を避けること、または最小にすることである。
【０００５】
このような出血を避けるため又は最小にするために、フィブリン溶解酵素によって容易に溶解されない安定で堅固な止血栓（haemostatic plugs）の形成を確実にすることが重要である。さらにまた、このような栓または血餅の迅速で効率的な形成を確実にすることは、重要である。
【０００６】
日本国特許出願第2-167234A号は、フィブリノーゲン, プロトロンビン, 血液凝固因子VII, 血液凝固因子IX, 血液凝固因子X, 血液凝固因子XIII, 抗トロンビン, プロテイナーゼインヒビター, およびカルシウムイオンを含んでいることを特徴とする生組織（bio-tissue）に対する接着剤（adhesive）に関する。
【０００７】
日本国特許出願第59-116213A号は、活性な成分として血液凝固因子を含有している組織接着剤として使用されるエアロゾル組成物に関する。血液凝固因子は、血液凝固因子I, II, III, IV, V, VII, VIII, IX, X, XI, XII, およびXIII, プレカリクレイン, 高重合体キニノーゲン（high polymer kininogen）およびトロンビンから選択されてもよい。FXIIIおよびトロンビンの組み合わせが好適である。
【０００８】
WO93/12813(ZymoGenetics)は、外科処置を受けている被験者の手術中の失血を減少させるためのFXIIIの使用に関する。また、前記組成物は、アプロチニンを含んでいてもよい。FXIIIは、被験者に大量瞬時投与（bolus injection）として投与される（典型的には手術の１日前）。
【０００９】
欧州特許第225.160（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、凝固因子の欠陥または凝固因子インヒビターによって引き起こされるものではない出血障害の治療のための、ＦＶＩＩａ組成物および方法に関する。
【００１０】
欧州特許第８２，１８２号（Ｂａｘｔｅｒ  Ｔｒａｖｅｎｏｌ  Ｌａｂ．）は、被験者において、血液凝固因子の欠陥に、または血液凝固因子に対するインヒビターの効果に対抗する際に使用するためのＶＩＩａ因子の組成物に関する。
【００１１】
国際特許公開番号ＷＯ９３／０６８５５（Ｎｏｖｏ  Ｎｏｒｄｉｓｋ）は、ＦＶＩＩａの局所適用に関する。
【００１２】
Kjalke等〔Kjalke et al, Thromb Haemost, 1999 (Suppl), 0951〕は、血友病AまたはBの状態を模倣しているモデル系における、追加的な外来性FVIIaの投与および活性化した血小板表面上のトロンビンの形成における効果に関する。
【００１３】
FXIIIバリアント（FXIII variants）の活性化は、Isetti and Maurer (2004) Biochemistry, 43:4150-4159; Lee et al. (2002) Exp Mol Med 34:385-390; Trumbo and Maurer (2002) Biochemistry, 41:2859-2868; Ariens et al. (2000) Blood 96: 988-995; Schroeder et al., (2001), Thromb Res 104: 467-474で研究されている。
【００１４】
P4-P’3ポジションでのアミノ酸配列LTPRSFRは、トロンビン切断部位に対する至適な共通配列として記載されている（Harris JL et al. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 7754-7759, Bianchini EP et al. J Biol Chem. 2002, 277: 20527-20534）。P命名システム(…P3 , P2 , P1,  P’1 , P’2 , P’3 …)を使用して、基質ペプチドにおける個々のアミノ酸ポジションを割り当てる。それ故、P4 からP’3,の基質番号の残基に関して、P4およびP’3は、それぞれＮおよびＣ末端側における切断部位から4および3残基を隔ていることを意味する。P1−P’1ペプチド結合が、酵素で加水分解される。酵素上の対応しているサブサイト（subsites）は、S4 からS’3に番号づけされる(Schechter and Berger, Biochem Biophys Res Comm 1968, 32:898-902; and 1967, 27:157-162)。
【００１５】
当該技術分野において、改善された、信頼のおける、かつ広く適用できる、凝固を増強する、安定な止血栓を迅速に形成する、および被験者、特にトロンビン生成が損なわれている被験者における完全な止血を達成する方法が依然として必要とされている。 
［発明の概要］
本発明のFXIIIバリアントは、被験者における出血の発症を治療するために使用される際に、安定な止血栓を迅速に形成する方法および薬学的組成物に適用することができる。本発明のFXIIIバリアントは、トロンビンによる迅速(野生型FXIIIと比較して)な活性化と血液凝固の間のε-リジン-ガンマ-グルタミル架橋の形成を通じたフィブリンの迅速な分子間重合とを提供する。
【００１６】
本発明の第一側面は、フィブリン血餅形成を増強させる方法に関し、該方法は以下の工程を備える：
a)トロンビンによる活性化の速度が野生型FXIIIよりも速いバリアントXIII因子を提供すること；
b)効果的な量のバリアントXIII因子を被験者に投与すること。
【００１７】
本発明の更なる側面は、トロンビンによる活性化の速度が野生型FXIIIよりも速いバリアントXIII因子を含んでいる薬学的組成物に関する。
本発明の更なる側面は、被検者の出血の発症を治療する医薬の製造のための、トロンビンによる活性化の速度が野生型FXIIIよりも速いXIII因子バリアントの使用に関する。
本発明の好適な態様において、活性化ペプチドのポジション28〜41を含んでいる領域中の少なくとも１つのアミノ酸が、XIII因子バリアントにおいて修飾されている。
【００１８】
本発明のさらに好適な態様において、修飾は、T28D, V29F, E30L, L31A, Q32E, V34(G, L), V35(M,K,Q,R,E,H,L,T,N,S,A), P36(L,V), G38(S,A), V39(F,Y,W,R,M), N40(R,K,W,H,Q,A,S)およびL41Vからなる群から選択される。
【００１９】
さらに好ましい態様において、前記修飾は、ポジション34〜40に、VVPRSFR, VLPRSFR, VTPRSFR, LLPRSFR, LTPRSFR, VVPRSYR, VLPRSYR, VTPRSYR, LLPRSYR, LTPRSYRまたはLTPRGVNの群から選択されるアミノ酸配列による置換を含む。
【００２０】
本発明の更なる態様において、バリアントXIII因子の投与は、VIIa因子の投与と組み合わされる。
【００２１】
本発明の更なる態様において、XIII因子バリアントおよびVIIa因子またはVIIa因子バリアントの双方は、ヒトである。
【００２２】
本発明の更なる態様において、XIIIおよびVIIa因子は、組換え型のヒトXIII因子およびVIIa因子である。
【００２３】
更なる好適な態様において、本発明の薬学的組成物は、XIII因子バリアントおよびVIIa因子またはバリアントVIIa因子を別々の容器手段中に具備しているパーツのキット（a kit-of-parts）の形態である。
【００２４】
本発明の更なる側面は、活性化ペプチドのポジション28-41を含んでいる領域中の少なくとも１つのアミノ酸が修飾されているXIII因子バリアントに関し、該修飾は、T28D, V29F, E30L, L31A, Q32E, V34(G), V35(M,K,Q,R,E,H,T,N,S,A), P36(L,V), G38(S,A), V39(F,Y,W,R,M), N40(R,K,W,H,Q,A,S)およびL41Vからなる群から選択される。
【００２５】
本発明の好適な態様において、バリアントXIII因子のポジション34-40中の残基は、アミノ酸配列VVPRSFRまたはVLPRSFRまたはVTPRSFRまたはLLPRSFRまたはLTPRSFRまたはVVPRSYRまたはVLPRSYRまたはVTPRSYRまたはLLPRSYRまたはLTPRSYRまたはLTPRGVNで置換されている。
【００２６】
［発明の記載］
トロンビンによるFXIIIの迅速な活性化
FXIII野生型のＮ末端50アミノ酸残基は、次の配列：MSETSRTAFG  GRRAVPPNNS  NAAEDDLPTV  ELQGVVPRGV  NLQEFLNVTSを有する。
【００２７】
本発明の好適な態様において、前記方法および組成物のXIII因子の野生型配列は、トロンビン切断部位に近接するアミノ酸を変化させることによって修飾され、以下のＮ末端配列を生じる（修飾は下線）
FXIII(V34L, V35T): MSETSRTAFG  GRRAVPPNNS  NAAEDDLPTV  ELQGLTPRGV   NLQEFLNVTS
FXIII LTPRSYR: MSETSRTAFG  GRRAVPPNNS  NAAEDDLPTV  ELQGLTPRSY RLQEFLNVTS
FXIII LTPRSFR: MSETSRTAFG  GRRAVPPNNS  NAAEDDLPTV  ELQGLTPRSF RLQEFLNVTS
本発明は、XIII因子バリアントがこれらの配列を含む方法または組成物のみならず、トロンビン活性化の速度が増加した他のXIII因子バリアントが使用された方法または組成物にも限定されない。
【００２８】
本発明において、アミノ酸の三文字または一文字の表示は、表1に示したとおり、これらの通常の意味で使用される。明示的に示されない限り、本明細書において言及されるアミノ酸は、Ｌアミノ酸である。例えば、V34における最初の文字は、野生型XIII因子の示されたポジションにおいて天然に存在するアミノ酸を表すこと、そして、たとえば、［V34L］−FXIIIは、示されたポジションにおいて天然に存在する１文字コードVによって表されるアミノ酸が、１文字コードLによって表されるアミノ酸で置換されたFXIIIバリアントを示すことが理解される。
【表１】
2008531645.tif 000002
「VIIa因子」または「FVIIa」の用語は、交換可能（interchangeably）に使用されえる。VIIa因子の用語には、酵素原のVII因子(一本鎖のVII因子)が含まれる。「XIII因子」または「FXIII」の用語は、交換可能に使用されえる。 
XIII因子分子の機能に重要な領域の外側に置換を作成し、なおも活性なポリペプチドを生じさせることができることは当業者には明らかであろう。XIII因子ポリペプチドの活性に必須であり、したがって好ましくは置換を受けないアミノ酸残基は、部位特異的突然変異生成またはアラニン  スキャニング変異生成（例えば、Cunningham and Wells, 1989, Science 244: 1081-1085を参照されたい）などの当該技術分野において既知の処置にしたがって同定しえる。後者の技術では、分子において正に荷電したすべての残基に変異が導入され、そして生じる変異体分子を、分子の活性に重要であるアミノ酸残基を同定するために、凝固因子について、架橋性活性をそれぞれ試験する。また、基質−酵素の相互作用部位は、核磁気共鳴解析、結晶学、または光親和性標識化（例えば、de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, Journal of Molecular Biology 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Letters 309: 59-64を参照されたい）などの技術によって決定される、三次構造解析によって決定することもできる。
【００２９】
１つのヌクレオチドをもう一つのヌクレオチドに交換するための、核酸配列への突然変異の導入は、当該技術分野において既知の任意の方法を使用した、部位特異的変異誘発によって達成されてもよい。関心対象のインサートを有するスーパーコイル二重鎖DNAベクターおよび所望の変異を含む２つの合成プライマーを利用する処置が、特に有用である。前記ベクターの反対の鎖に対してそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを、Pfu  DNAポリメラーゼによって温度サイクリングの間に伸長する。プライマの取り込みにおいて、ねじれ型のニック（staggered nicks）を含んでいる変異プラスミドが産生される。温度サイクリングの後、産物をメチル化およびヘミメチル化されたDNAに特異的であるDpnlで産物を処理して、親のDNA鋳型を消化し、変異を含んでいる合成されたDNAを選択する。遺伝子混合技術またはファージディスプレイ技術などの、バリアントを、作出、同定、および単離するための当該技術分野において既知のその他の処置を使用してもよい。
【００３０】
本発明において、VIIa因子の「効果的な量（effective amount）」およびXIII因子の「効果的な量」は、疾患及びその合併症を治癒（cure）させる、軽減（alleviate）する、または部分的に抑える（partially arrest）するために、出血もしくは失血を予防（prevent）または減少させるために十分な、VIIa因子およびXIII因子の量として規定される。
【００３１】
本発明にしたがって投与されるVIIa因子の量およびXIII因子の量は、好ましくは約1:100〜約100:1(μgのVIIa因子  ：  μgのXIII因子)、例えば、約1:60〜約25:1、例えば、1:30〜約10:1、例えば、約1:15〜約5:1、好ましくは約1:7〜約1:1の比で変動する。
【００３２】
本発明において、「トロンビン生成の障害を有する被験者（subjects with an impaired thrombin generation）」は、活性化した血小板の表面で完全なトロンビンバースト（thrombin burst）を発生できない被験者を意味し、これには正常な量および機能の凝固因子、血小板、およびフィブリノーゲンを含んでいる完全に機能している正常な止血系を有している被験者よりも低いトロンビン生成能力の被験者が含まれ、FIXおよび／またはFVIII(血友病AおよびB)を欠損しているか又は欠陥のあるFIXおよび／またはFVIIIを有しているか又はFIXおよび／またはFVIIIに対するインヒビターを有している被験者；FXIを欠損している被験者；血小板の低下または血小板の機能に欠陥を伴う被験者(例えば、血小板減少症または血小板無力症  Glanzmannまたは過度の出血を伴う被験者)；および低レベルのプロトロンビン, FXまたはFVIIを有している被験者が含まれる。 
低い血漿フィブリノーゲン濃度の被験者（例えば、複数の外傷または広範な手術の結果として、複数回輸血された被験者）は、容易に溶解される緩い（looser）および不安定なフィブリン栓の形成をも患っている。
【００３３】
「完全な止血（full haemostasis）」の用語は、有効に出血を止め、線溶系によって容易に溶かされない、傷害の部位における安定かつ堅固（solid）なフィブリンの血餅または栓の形成を意味する。 
「VIIa因子の活性（activity of factor VIIa）」または「VIIa因子活性（factor VIIa-activity）」の用語は、トロンビンを生成する能力を意味し；該用語は、組織因子の非存在下で活性化された血小板の表面においてトロンビンを生成する能力をも含む。
【００３４】
「正常な止血系の増強（enhancement of the normal haemostatic system）」の用語は、トロンビンを生成する能力の増強を意味する。
【００３５】
本明細書において使用される、「出血障害（bleeding disorder）」の用語は、出血の際に現れる、先天性の（congenital）、後天性の（acquired）、または誘導される（induced）、細胞または分子起源の任意の欠陥（defect）を表す。例は、凝固因子欠損(例えば、血友病AおよびBまたは凝固因子XIもしくはVIIの欠損)、凝固因子インヒビター、欠陥のある血小板機能、血小板減少症（thrombocytopenia）、またはフォンウィルブランド病である。
【００３６】
「出血の発症（bleeding episodes）」の用語は、外科および他の形態の組織損傷の双方に関連した主要な問題である非制御の（uncontrolled）及び過剰な出血を含む。非制御の及び過剰な出血は、基本的には正常な凝固系を有している被験者（しかしながら、これらの被験者は、出血、凝固タンパク質の希釈、フィブリン溶解の増大、および出血の希釈効果による血小板数の低下の結果として、凝固障害を発病している）および凝固または出血障害を有している被験者に生じる可能性がある。凝固因子欠損（血友病AおよびBまたは凝固因子XIもしくはVIIIの欠損）または凝固因子インヒビターは、出血障害の原因である可能性がある。過剰な出血は、正常に機能している血液凝固カスケード(前記凝固因子の任意に関して、凝固因子の欠損またはインヒビターがない)を有する被験者においても生じ、また、欠陥のある血小板機能、血小板減少症、またはフォンウィルブランド病が原因である可能性がある。このような場合において、前記出血は、血友病（haemophilia）により生じる出血にたとえられる。というのも、止血系（血友病におけるような）が、必須の凝固「化合物（compounds）」（たとえば、血小板またはフォンビルブラント因子タンパク質）を欠損しているか又は異常であるからであり、これが大きな出血の原因となる。手術または甚大な外傷に関連して、広範な組織損傷を受けている被験者では、正常な止血機構による即時性の止血を動員（demand）することでは手に負えず、彼らは、基本的（外傷前）に正常な止血機構であるにもかかわらず出血を発生してしまうであろう。また、満足な止血を達成することは、出血が外科的な止血の可能性が制限されている器官（例えば、脳、内耳領域、および目）において発生する場合に問題となる。同じ問題は、種々の器官（肝臓、肺、腫瘍組織、胃腸管）からの生検を行うプロセスにおいて並びに腹腔鏡検査手術（laparoscopic surgery）において起こるであろう。これら全ての状況において共通することは、手術の技術（縫合、クリップ、その他）によって止血を実現することが困難なことであり、このようなことは出血がびまん性（diffuse）である場合（出血性胃炎および大量の子宮出血）でも同様である。急性（Acute）の及び多量（profuse）の出血は、与えられた治療によって止血の欠陥が誘導される抗凝固療法の被験者においても生じるであろう。係る被験者は、抗凝血性効果（anticoagulant effect）が急速に中和される（counteracted）べき場合において、外科的な介入を必要とするだろう。根治的な恥骨後前立腺摘除術（Radical retropubic prostatectomy）は、局在型の前立腺癌を有する被験者に対して、一般的に実施される処置（procedure）である。手術は、顕著で、時々大量の失血を生じることから、頻繁に面倒な事態を生じる。前立腺切除の間の顕著な失血（blood loss）は、主に多様な密度の脈管部位（vascularized sites）を伴った、複雑な解剖学的な状況に関連する；このような脈管部位は、外科的な止血に容易に到達せず、広い領域からびまん性の出血を生じるだろう。不満足な止血の場合において問題を発生させるであろう別の状況は、正常な止血機構を有する被験者が血栓塞栓性疾患（thromboembolic disease）を予防するための抗凝固療法を施された場合である。係る療法には、ヘパリン、他の形態のプロテオ���リカン、ワルファリンまたは他の形態のビタミンＫ−アンタゴニスト、並びにアスピリンおよび他の血小板凝集インヒビターが含まれるだろう。
【００３７】
本発明の一態様において、前記出血は血友病に関連する。別の態様において、前記出血は、獲得されたインヒビター（aquired inhibitors）を伴う血友病に関連する。別の態様において、前記出血は血小板減少症に関連する。別の態様において、前記出血はフォンウィルブランド病に関連する。別の態様において、前記出血は重度の組織損傷に関連する。別の態様において、前記出血は重篤な外傷に関連する。別の態様において、前記出血は外科に関連する。別の態様において、前記出血は腹腔鏡検査手術に関連する。別の態様において、前記出血は出血性胃炎（haemorrhagic gastritis）に関連する。別の態様において、前記出血は、びまん性の子宮出血（uterine bleeding）に関連する。別の態様において、前記出血は、機械的な止血（mechanical haemostasis）の可能性が制限される器官において生じる。別の態様において、前記出血は脳、内耳領域、または目において生じる。別の態様において、前記出血は生検を行うプロセスに関連する。別の態様において、前記出血は抗凝固療法に関連する。
【００３８】
本発明による組成物は、さらにTFPI-インヒビターを含んでもよい。係る組成物は、好ましくは血友病ＡまたはＢを有している被験者に投与されるべきである。
【００３９】
本発明による組成物は、さらにVIII因子を含んでもよい。係る組成物は、好ましくはVIII因子に対するインヒビターを有していない被験者に投与されるべきである。
【００４０】
本発明において、「治療（treatment）」の用語は、例えば手術におけるものなどの予想される出血を防止すること、および例えば血友病における又は外傷（trauma）におけるものなどのすでに起こっている出血を、前記出血を阻害するか又は最小にする目的で、調節することの両者を含むことを意味する。VIIa因子およびXIII因子の予防的投与（Prophylactic administration）は、それゆえ「治療」の用語に含まれる。
【００４１】
本明細書に使用される「被験者（subject）」の用語は、任意の動物、特にヒトなどの哺乳類を意味することが企図され、適切な場合は、「患者（patient）」の用語と交換可能に使用されてもよい。
【００４２】
略語
ＴＦ          ：    組織因子
ＦＶＩＩ      ：    ＶＩＩ因子の一本鎖、不活性化型
ＦＶＩＩａ    ：    ＶＩＩ因子の活性化型
ｒＦＶＩＩａ  ：    組換えＶＩＩ因子の活性化型
ＦＸＩＩＩ    ：    ＸＩＩＩ因子の酵素原、不活性化型
ＦＸＩＩＩａ  ：    ＸＩＩＩ因子の活性化型
ｒＦＸＩＩＩ  ：    組換え型のＦＸＩＩＩ
ｒＦＸＩＩＩａ：    組換え型のＦＸＩＩＩａ
a, a2          ：    ＦＸＩＩＩまたはｒＦＸＩＩＩのアルファ−またはa−サブユニット
b, b2          ：    ＦＸＩＩＩまたはｒＦＸＩＩＩのベータ−またはb−サブユニット
ＦＸＩＩＩ−a2  ：    ２つのa−サブユニットを含んでいるダイマー型のＦＸＩＩＩ
ＦＸＩＩＩ−a2b2：    ２つのa−サブユニットおよび２つのb−サブユニットを含んでいるテトラマー型のＦＸＩＩＩ
ＦＶＩＩＩ      ：    ＶＩＩＩ因子の酵素原、不活性化型
ｒＦＶＩＩＩ    ：    組換え型のＦＶＩＩＩ
ＦＶＩＩＩａ    ：    ＶＩＩＩ因子の活性化型
ｒＦＶＩＩＩａ  ：    組換え型のＦＶＩＩＩａ
ＴＦＰＩ        ：    組織因子経路インヒビター（tissue factor pathway inhibitor）
化合物の調製
バリアント  FXIII。
【００４３】
組換え型のXIII因子を調製する方法は、当該技術において既知である。例えば、文献〔Davie et al., EP 268,772; Grundmann et al., AU-A-69896/87; Bishop et al., Biochemistry 1990, 29: 1861-1869; Board et al., Thromb. Haemost. 1990, 63: 235-240; Jagadeeswaran et al., Gene 1990, 86: 279-283; およびBroker et al., FEBS Lett. 1989, 248: 105-110, これらは参照によってその全体が本明細書中に援用される〕を参照されたい。一態様において、XIII因子のa2ダイマーは、米国特許出願07/741,263号（この文献はその全体が参照によって援用される）として開示されたように、酵母  Saccharomyces cerevisiaeにおいて細胞質で調製される。細胞を収穫し、溶解し、そして清澄化したライセート（cleared lysate）が調製される。前記ライセートを、中性から若干アルカリ性のpHで、誘導体化アガロース〔例えば、DEAE Fast-Flow Sepharose.TM.(Pharmacia)〕のカラムを用いる陰イオン交換クロマトグラフィーで分画する。XIII因子を、次にカラム溶出液から、溶出液を濃縮し、pHを5.2-5.5に調整することによって沈殿させる（例えば、コハク酸アンモニウム緩衝剤に対しダイアフィルトレーションする）。沈殿物を、次に溶解し、さらに従来のクロマトグラフィー技術（例えば、ゲル濾過および疎水性相互作用クロマトグラフィー）を用いて精製する。
【００４４】
また、XIII因子バリアントは、Lai TS等〔Lai TS, Santiago MA, Achyuthan KE, Greenberg CS (1994) Protein Expr Purif. 5:125-32〕に記載のように発現されてもよい。
【００４５】
バリアントXIII因子は、天然のVII因子をコードしている核酸において、アミノ酸コドンを変更すること又は幾つかのアミノ酸コドンを除去することにより、周知の手段（例えば、部位特異的突然変異）を用いて、野生型XIII因子をコードしている核酸配列を修飾することによって産生されてもよい。
【００４６】
VII因子またはバリアントVII因子。
【００４７】
本発明での使用に適したヒト精製VIIa因子は、たとえばHagenら〔Hagen et al., (1986) Proc Natl Acad Sci USA 83: 2412-2416〕に記載されているように、または欧州特許第200.421号（ZymoGenetics, Inc.）に記載されているように、好ましくはDNA組換技術によって作出される。DNA組換技術によって産生されたVIIa因子は、標準（authentic）のVIIa因子または幾分修飾されたVIIa因子であってもよい〔但し、係るVIIa因子は、標準のVIIa因子（野生型のVIIa因子）と血液凝固に関して実質的に同じ生物活性を有する〕。係る修飾されたVIIa因子は、天然のVII因子をコードしている核酸において、アミノ酸コドンを変更すること又は幾つかのアミノ酸コドンを除去することにより、周知の手段（例えば、部位特異的突然変異）を用いて、野生型VII因子をコードしている核酸配列を修飾することによって産生されてもよい。
【００４８】
また、VII因子は、文献〔Broze and Majerus (1980) J Biol Chem 255: 1242-1247, およびHedner and Kisiel (1983) J Clin Invest. 71: 1836-1841〕により記載された方法で産生してもよい。これらの方法によって、検出可能な量のその他の血液凝固因子を伴わずにＶＩＩ因子が産生される。なお、さらに精製されたＶＩＩ因子調製物を、最終的な精製工程として付加的にゲル濾過を含ませることによって得てもよい。次いで、既知の手段（例えば、XIIa因子、IX因子、またはXa因子などの幾つかの異なる血漿タンパク質によって）によって、VII因子は活性化VIIa因子に変換される。或いは、Bjoernら（Research Disclosure, 269 September 1986, pp. 564-565）によって記載されているように、VII因子をMono Q（登録商標）（Pharmacia fine Chemicals）などのイオン交換クロマトグラフィーに通すことにより活性化させてもよい。 
非ヒトXIII因子の調製および特徴付けは、Nakamura等（Nakamura et al. (1975) J Biochem 78: 1247-1266）によって開示されている。また、本発明は、獣医学の処置の範囲内における、係るXIII因子バリアントおよびVIIa因子タンパク質の使用を包含する。 
投与および薬学的組成物
計画的な介入（deliberate interventions）に関連した治療のために、VII因子およびXIII因子バリアントは、介入を行う前の約24時間以内（例えば、介入を行う前の約12時間以内、約6時間以内、約3時間以内、1時間以内）に投与されてもよい。
【００４９】
また、計画的な介入（deliberate interventions）に関連した治療のために、VII因子およびXIII因子バリアントは、介入の間または直後（例えば、介入の後の48時間まで、好ましくは36時間まで、例えば、24時間、好ましくは18時間まで、例えば、12時間まで、好ましくは6時間まで、例えば、3時間、例えば、1時間まで）に投与されてもよい。
【００５０】
VII因子およびXIII因子バリアントは、典型的には介入後の1日又はそれ以上（その後、例えば3日又はそれ以上、例えば5日又はそれ以上、例えば7日又はそれ以上）の間に投与される。投与は、典型的には投与の効果が観察されるかぎり継続される。凝固剤としての投与は、本明細書に記載されているような様々な経路によるものであってもよい。
【００５１】
VII因子の用量は、初回の及び維持の量（loading and maintenance doses）として７０ｋｇの被験者について、約0.05 mg〜約500 mg/日、例えば約1 mg〜約200 mg/日、または例えば約2 mg/日〜約100 mg/日、好ましくは約3 mg/日〜約50 mg/日、例えば約3.5 mg/日〜25 mg/日の範囲である。前記用量は、被験者の重量、症状、および症状の重篤さに依存する。 
XIII因子バリアントの用量は、初回の及び維持の量（loading and maintenance doses）として７０ｋｇの被験者について、約0.05 mg〜約500 mg/日、例えば約1 mg〜約200 mg/日、または例えば約2 mg/日〜約100 mg/日、好ましくは約3 mg/日〜約75 mg/日、例えば4 mg/日〜50 mg/日、例えば5 mg/日〜30 mg/日、例えば10〜25 mg/日の範囲である。前記用量は、被験者の重量、症状、および症状の重篤さに依存する。 
本発明の組成物およびキットは、出血の発症または凝固障害を患っている被験者の治療または予防などにおける、ヒトおよび家畜の医学に有用である。本発明における使用に関して、VIIa因子およびXIII因子バリアントは、任意で薬学的に許容される担体と製剤化される。好ましくは、前記薬学的組成物は、非経口的に、すなわち静脈内に、皮下に、または筋肉内に投与される、又はそれは連続的な若しくはパルス状（pulsatile）の輸液により投与されてもよい。 
製剤は、１つまたは複数の希釈液、乳化剤、保存剤、緩衝液、賦形剤、その他を更に含んでもよく、液体、粉末、エマルジョン、徐放性（controlled release）、その他などの形態で提供されてもよい。この技術分野の当業者であれば、本発明の組成物を適切な方法で及びRemington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990に開示されたものなどの是認された実務に従って製剤化しえる。非経口投与に関する組成物は、VII因子およびXIII因子を、薬学的に許容される担体（好ましくは、水溶性担体）と組み合わせ（好ましくは、該担体中に溶解される）て具備する。水、緩衝水（buffered water）、0.4％塩類溶液（saline）、0.3％グリシンなどの種々の水溶性担体を使用してもよい。また、本発明のＶＩＩ因子バリアントを、傷害の部位に対してデリバリーまたはターゲティングするために、リポソーム調製物（liposome preparations）に製剤化することができる。リポソーム調製物は、例えば、U.S.4,837,028, U.S.4,501,728, およびU.S.4,975,282に一般的に記載されている。 
静脈内輸液のための典型的な薬学的組成物は、250ｍｌの無菌のリンゲル液および10ｍｇのVIIa因子および／またはXIII因子バリアントを含有するように作出することができるだろう。非経口的に投与可能な組成物を調製するための実施の方法は、当業者に知られている又は明らかであり、例えば、文献〔Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA (1990)〕に更に詳細に記載されている。 
簡単には、本発明に従って使用するために適した薬学的組成物は、VIIa因子、またはXIII因子バリアント、またはVIIa因子と組み合わせたXIII因子バリアントを、好ましくは精製した形態で、適切なアジュバントおよび適切な担体または希釈液と混合して作出される。適切な生理的に許容される担体または希釈剤には、滅菌水および生理食塩水が含まれる。前記組成物は、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどの、ｐＨを調整する及び緩衝化する薬剤、張度（tonicity）を調整する薬剤などの、生理学的条件に近づけるために必要とされるような、薬剤的に許容される補助物質（auxiliary substances）を含有してもよい。また、適切なアジュバントは、精製されたVIIa因子および／またはXIII因子バリアントを安定化するために、カルシウム、タンパク質（例えば、アルブミン）、または他の不活性なペプチド（例えば、グリシルグリシン）またはアミノ酸（例えば、グリシンまたはヒスチジン）を含む。他の生理的に許容されるアジュバントは、非還元糖（non-reducing sugars）、ポリアルコール(例えば、ソルビトール、マンニトール、またはグリセロール)、ポリサッカライド（例えば、低分子量のデキストリン）、洗剤(例えば、ポリソルベート)および抗酸化剤(例えば、亜硫酸水素塩およびアスコルベート)である。アジュバントは、一般に0.001〜4% w/vの濃度で存在する。また、前記薬学的組成物には、プロテアーゼインヒビター、例えば、アプロチニンまたはトラネキサム酸、および保存剤が含有されてもよい。さらにまた、調製物には、TFPIインヒビターおよび／またはVIII因子が含有されてもよい。
【００５２】
前記組成物は、従来のよく知られた滅菌法技術で殺菌し得る。生じる水溶液は、使用のためにパックされるか、又は無菌条件下で濾過して凍結乾燥され、凍結乾燥された調製物は投与の前に滅菌水溶液と混合されてもよい。 
これらの製剤におけるVIIa因子、XIII因子バリアント、またはVIIa因子とXIII因子の組み合わせの濃度は、広範囲に変化してもよく、すなわち、約0.5重量％未満（通常、少なくとも約１重量％以上）から15または20重量％程度にまで変更することができ、選択される特定の投与方法に応じて、主に液体体積、粘性、その他によって選択される。
【００５３】
注射または輸液、特に注射による投与が好ましい。このようにして、VIIa因子またはXIII因子バリアントは、VIIa因子およびXIII因子の両方を含んでいる溶解された凍結乾燥粉末または液状製剤の１つの剤形のもの、或いはVIIa因子を含んでいる溶解された凍結乾燥粉末または液状製剤の１つの剤形のもの、及びXIII因子バリアントを含んでいる溶解された凍結乾燥粉末または液状製剤のもう１つの剤形のもの、のいずれかの標品などの静脈内投与に適した形態で調製される。 
VIIa因子およびXIII因子バリアントの局所的デリバリー（例えば、局所的適用）は、例えば、噴霧、灌流、二重バルーンカテーテル、ステント、血管グラフトまたはステントに組み込むこと、バルーンカテーテルを被覆するために使用されるヒドロゲル、または他の樹立された方法によって行ってもよい。一日の維持レベル（daily maintenance levels）を必要とする外来患者に対し、VIIa因子またはXIII因子バリアントを、例えば携帯型のポンプシステムを用いた連続的な点滴により投与してもよい。いずれにしても、前記薬学的組成物は、被験者を有効に治療するために十分なVIIa因子またはXIII因子バリアントの量を提供するべきである。
【００５４】
VIIa因子およびXIII因子バリアントの組み合わせは、インビトロ血餅形成および安定性アッセイでrFVIIa単独と比較して、改善効果を示す（例5を参照されたい）。さらにまた、前記データは、既にFXIIIを含有している血液に添加された場合、FXIII  V34LはwtFXIIIの効果に必要とされるものよりも低濃度で、血餅形成および機械的な強度（mechanical strength）に有意な効果を有することを実証している。
【００５５】
VII因子およびXIII因子バリアントを含有している組成物を、予防的および／または治療的な処置のために投与することができる。治療的な適用において、組成物は、既に疾患を患っている被験者に対して、疾患及びその合併症を治癒する、軽減する、または部分的に抑えるために十分な量で、上記の通りに投与される。これを達成するのに十分な量は、「効果的な量」または「治療上効果的な量（therapeutically effective amount）」と定義される。当業者に理解されるであろうとおり、本目的のために効果的な量は、疾患または傷害の重篤さ並びに被験者の体重および一般的な状態に依存する。本発明の材料（materials）は、一般に重篤な疾病または傷害の状態において、即ち生命に脅威となる又は潜在的に生命に脅威となる状況において使用し得ることを考慮に入れておかなければならない。係る場合において、外来物質の極小化およびヒトにおけるVIIa因子およびXIII因子バリアントの免疫原性の一般的な欠損（lack）の点からみて、治療する医師によって、これらの組成物を実質的に過剰に投与することが可能で望ましいと感じられるであろう。
【００５６】
予防的適用において、VIIa因子およびXIII因子バリアントを含有している組成物は、被験者自身の凝固能力を増強するために、疾病状態または傷害に感受性があるか又はさもなければリスクのある被験者に投与される。このような量は、「予防上効果的な用量（prophylactically effective dose）」であると定義される。 
組成物または複数組成物の単回または複数回の投与は、治療する医師により選択される用量レベル（dose levels）で実施することができる。前記組成物は、日または週につき、１回または複数回で投与されてもよい。このような薬学的組成物の効果的な量は、出血の発症に対し臨床的に有意な効果を提供する量である。このような量は、一つには治療される特定の症状、被験者の年齢、重量、および一般的な健康、並びに当業者に明らかな他の因子に依存する。
【００５７】
前記組成物は、予測された出血の前に投与されてもよい（出血が生じたとき又は出血が開始した後）。前記組成物は、単一の用量または複数の用量として投与してもよい。しかしながら、好ましくは、与えられる用量および被験者の症状に依存して、例えば、1、2、4、6、または12時間の間隔で複数の用量で与えられてもよい。例えば、止血効果がFXIIIの遊離の内在性b-サブユニットのレベルを超えているa-サブユニットの用量でのみ達成される場合において、相対的に短いインターバルで与えられた複数の用量が、内在性のb-サブユニットとの複合型ではなくXIII因子バリアントのa-サブユニットの残部（surplus）として高いXIII因子バリアントのレベルを維持するために必要とされ、相対的に速く排除されるであろう。 
前記組成物は、適切な濃度のVIIa因子およびXIII因子バリアントの両方またはXIII因子バリアント単独を含んでいる単一の調製物の形態であってもよい。また、前記組成物は、VIIa因子を含んでいる第１の単位剤形（unit dosage form）およびXIII因子バリアントを含んでいる第２の単位剤形、および任意にVIII因子および／またはTFPIインヒビターを含んでいる１つもしくは複数の更なる単位剤形からなるキットの形態であってもよい。この場合、VIIa因子およびXIII因子バリアントは、好ましくは、互いに約１〜２時間以内、例えば、互いに３０分以内、または好ましくは１０分以内、またはより好ましくは互いに５分以内に、順番（sequentially）に投与されるべきである。２つの単位剤型のいずれを、最初に投与してもよい。 
本発明は別々に投与されてもよい活性成分を組み合わせて治療することによる出血の発症の予防または治療、または凝固治療に関するので、本発明はキットの形態で別々の薬学的組成物を組み合わせることにも関する。前記キットは、少なくとも２つの別々の薬学的組成物を含む。前記キットは、別々の瓶または別々の箔パケット（foil packet）などの別々の組成物を含むための容器手段を含む。典型的には、前記キットは、別々の成分の投与のための説明書を含む。別々の成分が好ましくは異なる剤形で、異なる投与間隔（dosage intervals）で投与されるときに又は個々の成分の組み合わせの滴定（titration）が処方する医師によって要求されているときに、前記キット形態は特に有利である。
【００５８】
アッセイ
XIII因子およびXIIIバリアント活性の試験：
XIII因子トランスグルタミナーゼ活性を試験し、適切なXIII因子バリアントを選択することに適したアッセイは、以下の例に記載のとおり行うことができる。代わりに、文献〔Methods of Enzymology, Vol. 45 (1976), Proteolytic Enzymes, Part B, pages 177-191 (Ed. Lorand, L.)〕などに記載された単純なインビトロ検査を、使用してもよい。 
本発明は、以下の例によってさらに説明されるが、保護の範囲を限定するものとして解釈されない。これまでの記載において及び以下の例において開示された特性は、別々及びその任意の組み合わせの両方ともが本発明をその多様な形態に具現化するための材料（material）である。
【例】
【００５９】
一般的な処置
プラスミドおよびＤＮＡ
全てのプラスミドは、C-POTタイプのものであり、WO EP 171 142に記載されているものと類似し、これらは出芽酵母（S. cerevisiae）におけるプラスミドの選択および安定化のための分裂酵母（Ｓchizosaccharomyces pombe）トリオースホスファートイソメラーゼ遺伝子（POT）を含有することで特徴づけられる。
【００６０】
酵母系統および形質転換
酵母（S.cerevisiae）の系統MT663(MATa/α pep4-3/pep4-3 HIS4/his4 tpi1::LEU2/tpi1::LEU2 Cir+)または酵母の系統ME1719(MATa/α leu2/leu2 HIS4/HIS4 pep4-3/pep4-3 Δtpi::LEU2/Δtpi::LEU2 Δura3/Δura3 Δyps1::URA3/Δyps1::ura3 Cir+)を、形質転換のための宿主細胞として使用した。MT663は、WO 92/11378の出願に関連して、ドイツ微生物細胞培養コレクション（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkul-turen）に寄託され、寄託番号DSM6278が付与された。系統ME1719は、WO98/01535に記載されている。系統MT663およびME1719の形質転換を、それぞれWO97/22706およびWO98/01535に記載のとおり行なった。
【００６１】
発酵。
【００６２】
CITプロモーターに基づく構築物を有する系統は、炭素源としてグルコースおよびエタノールの双方を用いた流加発酵法（fed-batch fermentations）で培養された。種菌は、6%グルコースを炭素源として用いるバッチ培養（batch cultivation）で調製された。ペプチドに富む培地を含有している主発酵槽は、容量基準で12.5%の量のバッチ培養を播種された。成長培地は、50 g/Lの液体の酵母抽出物(50%乾燥物質), 3.6g/L KH2PO4, 2.3g/L K2SO4, 1.5g/L MgSO4・7H2O, 0.064g/K FeSO4・7H2O, 0.016g/L MnSO4・H2O, 0.011g/L CuSO4・5H2O, 0.016g/L ZnSO4・7H2O, 0.8g/L クエン酸, 2g/L m-イノシトール, 0.2g/L 塩化コリン, 0.2g/L チアミン, HCl, 0.1g/L ピリドキシン, HCl, 0.2g/L ナイアシンアミド, 1g/L Ca-パントテン酸, 0.005g/L ビオチン, 0.05g/L パラアミノ安息香酸, 0.66mL/Lの消泡剤(PEO/PPOブロック共重合体)からなる。播種に続いて、グルコース溶液（26%w/w）の連続的な添加が開始された。このグルコースでの流加培養による成長は、４２時間の間連続され、次に６時間エタノールでの流加培養で成長させた。基礎的な発酵パラメータは、温度:28°C, pH=5.8, 通気1-2 vvm, 頭部空間圧（head space pressure） 0.5 baroである。pHは、17%(w/w)のNH4OHの添加で維持された。
【００６３】
培養ブロスは、発酵プロセスの終了に際して収穫された。バイオマス（biomass）は、遠心分離で単離された。 
FXIII/FXIIIバリアントの精製
FXIIIは、酵母細胞の細胞内で本来のコンホメーションで発現された。 
精製方法は、４工程からなる。
【００６４】
1.  酵母細胞の破壊
2.  FXIIIを含有している上清の単離。
【００６５】
3.  陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでのFXIIIの粗製（crude）のサンプルの精製。
【００６６】
4.  疎水性相互作用クロマトグラフィーカラムでの最終的な純度へのFXIIIの更なる精製。
【００６７】
5.  陰イオン交換クロマトグラフィーカラムでの濃縮および緩衝液交換。
【００６８】
酵母細胞は、培養物から収穫され、緩衝液（pH8）および安定化剤（ex.ジおよびトリオール）およびプロテアーゼインヒビターに再懸濁された。
【００６９】
前記懸濁液は、細胞壁を高圧(1-2kBar)で破壊する細胞破砕機（cell disrupter）に通過させられた。
【００７０】
上清は、細胞片から濾過または遠心分離で単離された。
【００７１】
FXIII(wtまたはバリアント)を含有している上清は、pH8に調整され、陰イオン交換カラム〔可能性の１つはSource30Q (Amersham Ge cat no 17-1275)である〕に適用された。
【００７２】
適用後に、前記カラムは、低伝導度の平衡化緩衝液で洗浄された。伝導度を増加させることによって、サンプルをグラジエントで溶出する。前記タンパク質をジオールおよびトリオール（プロパンジオールおよびグリセロールex.）を添加することによって安定化することが重要である。
【００７３】
陰イオン交換体カラムからのプールは、K-PO4緩衝液で高伝導度に調整された。このサンプルは、HICカラム(フェニルまたはブチル-カラム)に適用された。前記カラムを平衡緩衝液で高伝導度で洗浄し、溶出を伝導度を徐々に減少させることによって実施した。使用される緩衝液は、異なる伝導度でのK-PO4であってもよい。
【００７４】
最終的なプールを、ジオールおよびトリオールを添加することによって安定化させた。
【００７５】
濃縮は、陰イオン交換カラムに多量のタンパク質を低伝導度の緩衝液に含むものを適用することによって達成できる。溶出は段階的に行なわれ、プールにはFXIIIが高濃度で含有される。
【００７６】
溶出はNaClおよびジオールまたはトリオールで行なわれた。そして、最終的なプールは、PBS条件(ジオールまたはトリオールを有する)で調製された。
【００７７】
生産物は、最終的な可溶性の調製物とする前に凍結された。
【００７８】
純度および収量は、SDS-pageおよびHPLC-IEXシステムで調査された。
【００７９】
例1
ヒトFXIIIV34Lに関する酵母発現系の構築。
【００８０】
ヒトwtFXIIIをコード化しているDNAを、PCRを用いて脾臓（Stratagene）のcDNAから得た。簡単に説明すると、wtFXIIIをコード化しているDNAを、PfuUltra HotstartＤＮＡポリメラーゼ(ストラタジーン#600392)を用いた３つの別々のＰＣＲ反応で増幅した、即ち：DNA断片１を、オリゴヌクレオチド  oMJ398(GACCTTGTGAATTCAAAAATGTCAGAAACTTCCAG)およびoMJ387(GTTTAGAATTCACGTTCCCATC)を用いて増幅し；ＤＮＡ断片2をオリゴヌクレオチド  oMJ388(GATGGGAACGTGAATTCTAAAC)およびoMJ396(CCTTCTTGAACTCTGCCTTCGGG)を用いて増幅し；ＤＮＡ断片3をオリゴヌクレオチド  oMJ395(CCCGAAGGCAGAGTTCAAGAAGG)およびASA-F13-1(TCTCAGCTTCCTCTAGATTCACATGGAAGGTCGTCTTTGAATCTG)を用いて増幅した。PCR反応は、10μＭの各オリゴヌクレオチド, 2.5μlの脾臓cDNA, 5μlの10X PfuUltra緩衝剤, 2.5mM dNTP, 5μlのDMSO, 1μlのPfuUltraポリメラーゼおよび21.5μlのH2Oを含有していた。94°Cで2分間での最初のインキュベーション後に、ＰＣＲ反応を３５サイクル（94°Cを30 sec., 55°Cを30 sec., 72°Cを1分間）行い、次に１０分間72°Cでインキュベーションした。生じたPCR断片を、アガロースゲルに流し、GFX-PCRゲルバンド精製キット(Amersham Biosciences #27-9602-01)を用いて精製した。ＤＮＡ断片2および3を、オリゴヌクレオチドoMJ388およびASA-F13-1をＰＣＲに用いて結合し、ＤＮＡ断片  2bを得た。ＤＮＡ断片2bを、上記のとおり精製し、ＤＮＡ断片1とオリゴヌクレオチドoMJ386およびASA-F13-1を用いてＰＣＲで結合し、ユニークなEcoRI部位を５’末端に及びユニークなXbaI部位を３’末端に備えた完全なwtFXIII配列をコード化しているＤＮＡ断片を得た。このＤＮＡ断片を、EcoRIおよびXbaIで切断し、同じ制限酵素で切断したpBluescript SKに連結した。生じたプラスミドは、pMD005と命名された。 
V34L変異を構築するために、ＤＮＡ断片をpMD005からM13フォワードプライマーとoMJ343 (GTTGACGCCCCGGGGCACCAAGCCCTGAAG)を組合わせて用いて増幅した。生じたPCR断片を、EcoRIおよびXmaIで切断し、pMD005のEcoRI/NdeIベクター断片および171bpのpMD005のNdeI/XmaI断片に連結した。生じたプラスミドは、#2と命名された。このプラスミドをEcoRI/XbaIで消化し、FXIIIV34Lをコード化しているＤＮＡ断片をアガロースゲル電気泳動後に得た。この断片を、pME2835からのNcoI/XbaIベクター断片（WO 00/04172に記載されたpAK729.6のNcoI/XbaIベクター断片、WO0244388に記載されたとおり得られたプラスミドからのTPI1プロモーターを含有しているNcoI/EcoRI断片またはCIT1プロモーターを含有しているNcoI/EcoRI断片と同一である）に連結した。生じたプラスミドを、それぞれpAW001およびpAW002と命名した。発現プラスミドを、アンピシリンの存在下で成長させた大腸菌（E.coli）中で増幅し、標準技術(Sambrook et al., 1989)を用いて単離した。前記プラスミドDNAは、適切な制限ヌクレアーゼ（例えば、EcoRI, XbaI）で挿入に関してチェックされ、そして配列分析によって適切なFXIIIV34Lの配列を含有することが示された。
【００８１】
プラスミドpAW001およびpAW002を、出芽酵母の系統ME1719に形質転換した。プラスミドpAW001およびpAW002を保持している酵母の形質転換体を、YPD(1%酵母抽出物, 2%ペプトン, 2%グルコース)寒天(2%)プレートで炭素源としてグルコースを利用することによって選択した。各々（yAW001およびyAW002）から１つの形質転換体を、発酵のために選択した。
【００８２】
例2
ヒトFXIIIV34L, V35Tに関する酵母発現系の構築。
【００８３】
速いトロンビン切断速度を達成する可能性があるFXIIIバリアント、ヒトFXIII  V34L, V35Tを、ＰＣＲで構築した。50μlのPCR増幅を、50〜100ngの鋳型, 0.4〜2mMのプライマーペア, 200mMのdNTPsおよび2UのＤＮＡポリメラーゼを用いたExpandTM High Fidelity PCRシステム(Roche, Switzerland)で実施した。伸長反応を、反応混合物を94°Cで30secで予備加熱することによって開始し、次に20サイクルの94°Cで30sec, 55°Cで30secおよび72°Cで60secを行なった。PCR増幅産物をアガロースゲル電気泳動で評価し、PCR増幅産物をQIAquickTM PCR精製キット（Qiagen, Germany）で精製した。818bp.のPCR産物を、オリゴヌクレオチドoFlSu086(CTTGTCAAATTGAATTTTC)およびoFlSu087(GTTGACGCCCCGGGGAGTCAAGCCCTGAAGCTCC)並びにpAW002を鋳型として用いて増幅した。精製したPCR産物を、EcoRI-XmaIで消化し、139bp断片とし、pAW002からの1252bpのEcoRI-NcoI断片および11362bpのNcoI-XmaI断片と連結して、pFE029を作出した。ヌクレオチド配列の検証後に、pFE029を酵母系統ME1719およびMT663の形質転換に使用し、バリアントFXIII V34L,V35Tの細胞内発現を生じた。プラスミドpFE029を保持している酵母の形質転換体を、YPD(1%酵母抽出物, 2%ペプトン, 2%グルコース)の寒天(2%)プレートで炭素源としてグルコースを利用することによって選択した。各々の酵母株（それぞれ、yFE029およびyFE029A）から１つの形質転換体を、発酵のために選択した。
【００８４】
例3
トロンビン切断アッセイによるFXIII活性化速度の分析
FXIII a2-サブユニットは、トロンビン切断で活性化された。トロンビンは、Arg37のＣ末端側のペプチド結合を切断し、FXIIIa(活性化タンパク質)および活性化ペプチド(残基1-37)を放出する。
【００８５】
トロンビンが切断してFXIIIを活性化する速度は、基本的に文献〔Trumbo and Maurer (2000) J Biol Chem 275: 20627-20631およびBalogh et al. 2000 Blood. 96: 2479-86〕に記載の方法を若干修飾したＨＰＬＣに基づくアッセイで分析された。活性化反応を、rFXIIIをヒトトロンビンと100mM Tris/HCl pH 7.5, 150mM NaCl, 5mM CaCl2, 0.1%PEG8000(総容積125μl)から構成される緩衝液中で混合することによって開始した(総容積125μl)。rFXIII濃度を7μM(単量体の濃度)で一定に維持し、トロンビンを1-10nM(wt), 0.3-3nM(V34L), 0.2-1.2nM(V34L,V35T)の間で変動させた。反応を、30゜Cで10min(wt, V34L, V34L,V35T)行い、25μlの2%トリフルオロ酢酸(TFA)で停止した。停止させた反応混合物を、HPLC分析までガラス製の自動試料採取器のバイアル(Waters 186000234)中に4゜Cで保存した。反応産物を、Waters Alliance HPLCシステム(Waters 2695 Separations Module)に光ダイオードアレイ検出器(Waters 2996)を備えた装置において4.6x250mmのC8カラム(Grace Vydac 208TP54)を用いた逆相HPLC分析で分離した。吸光度を、214nmおよび280nmで測定した。溶媒Aは0.1%TFAをH2O中に含む溶媒であり、溶媒Bは0.085%TFAをCH3CN中に含む溶媒である。前記カラムを30゜Cに維持し、自動試料採取器をHPLCを実施する間に4゜Cに維持した。システムを15%のB溶媒で1ml/minで平衡化し、100μlの停止サンプル（quenched sample）を注入した。15%Bから50%Bの直線勾配を、活性化ペプチド（activation peptide）を溶出するために1ml/minで20minで行なった。活性化ペプチドに対応するピークを、保持時間および280nmでのシグナルの欠除（214nmでのシグナルと組合せて）に基づいて同定した。保持時間は、10.2 min(wt), 11.6 min(V34L)および10.4 min(V34L,V35T)であった。活性化ペプチドのピークを、Waters Milleniumソフトウェアを用いて定量した。標準曲線を、rFXIIIタンパク質を完全に活性化することによって作った（従って、rFXIIIを全体的にrFXIIIa+活性化ペプチドへと転換した）。初期の正確なrFXIII濃度は、既知であった。そして、様々な量の溶液(3.3〜333ピコモル)を、214nmでのシグナル  対  活性化ペプチドのピコモルの標準曲線を作るためにHPLCに注入した。活性化ペプチド産生の速度を、各rFXIIIバリアントに関するトロンビン濃度に対してプロットした。そして、ターンオーバー数を次に直線近似曲線（linear fitted curves）の傾きによって決定した。KaleidaGraph(Synergy software)を、データのフィッティングおよび提示に使用した。 
トロンビン濃度に対してプロットされた活性化ペプチド産生を、図１に示す。野生型XIII因子は、塗潰した四角と円とで示され（二重決定）、V34Lを中抜きの四角およびV34L, V35Tを塗潰した三角として示す。それぞれのrFXIIIバリアントを基質として用いた場合に、近似曲線の勾配はトロンビンのターンオーバー数を反映する。
【００８６】
以下の表に要約したとおり、FXIII V34LおよびFXIII V34L,V35Tバリアントの双方は、wtと比較してトロンビンによって早く活性化される。トロンビンのターンオーバー数は、それぞれV34LおよびV34L,V35T,に対して3.2および7.5倍増加する。
【表２】
2008531645.tif 000003
例4
血餅溶解におけるFXIIIの効果。
【００８７】
tPA誘導性溶解に対抗する血餅の安定性におけるrFXIIIおよびバリアントの効果を、次のアッセイで分析した、即ち：rFXIIIまたはrFXIIIバリアントを、150 mM NaCl, 3.5 mM KCl, および0.1% BSA),および20μlのtPA(終濃度0.2nM), および20μlの正常なヒトクエン酸処理血漿プールの100μl混合物を含有している20mM HEPES（pH 7.4）とマイクロタイタープレート中で希釈した。凝固を、60μlのトロンビン(終濃度0.02U/ml)とカルシウム(終濃度20mM)の混合物を添加することによって開始させ、光学濃度(OD)を405nmで連続的に3hrsの間SpectraMax340マイクロプレートリーダー（Molecular Devices）中で測定した。図2は、異なる濃度のrFXIII wtを含有しているサンプルの光学濃度を示している。血餅が形成される際に、ODの増加が観察される。最大のODに達した後に、tPA誘導性のフィブリン溶解によって血餅が溶解され、ODが減少する。rFXIIIは用量依存的に血餅溶解の時間を増加させ、これによってrFXIIIがフィブリン溶解に対抗した血餅の耐性を改善することが実証された。このフィブリン溶解に対抗する耐性は、最大半減OD（half-maximal OD）が、溶解期の期間に達した最大半減ODを達成するまでの時間を測定することによって定量することができる（参照サンプルの「血餅溶解時間（clot-lysis time）」は図２に記載されている）。図３は、様々な濃度のwt FXIIIおよびrFXIIIバリアントの血餅溶解時間を示している。等モル濃度で、rFXIII V34L, V35Tは、rFXIII V34Lよりも大きな血餅安定化効果を有していた。これはフィブリン溶解に対抗して血餅を安定化することにおいてwt FXIIIよりもより効果的であった。 
例5
全血における血小板減少状態でのFXIIIの効果
血餅の形成および安定性におけるrFXIIIバリアントの効果は、トロンボエラストグラフィ(TEG)で血小板減少症を模倣する状態で評価された。5000系のTEG分析計(Haemoscope Corporation)を、分析に使用した。クエン酸で安定化した正常なヒト血液の血小板密度を、Medonic CA 620血球カウンターで決定した。前記血液を、室温で30min維持し、ヒト血漿プールで希釈して10,000血小板/μlの最終的な血小板密度を得た。rFVIIa(終濃度25nM)、野生型のrFXIII A-サブユニット(wtFXIII)又はそのバリアント(終濃度30または120nM)、並びにrFVIIaおよびFXIIIの組合せを12.5μlの総容量で、TEGサンプルカップ中の20μlの15mM CaCl2に添加した。全希釈を、20mM hepes, 150mM NaCl, pH7.4(HBS)で作製した。320μlの容量の血小板減少症の血液を、ヒト組織因子(Innovin, Dade Behring, 最終的な希釈1:50,000)およびtPA (American Diagnostica, 終濃度1.8nM)で緩徐に混合し、前記サンプルカップに直ぐに添加した。血餅形成に続いて、120minの連続計測を行なった。全分析を、二重に行なった。表1は、血栓形成の最大速度（MTG）および血餅の最大強度〔最大幅（maximal amplitude, MA）〕に対する値を示す。25nM FVIIaおよび30nM FXIII V34Lを含有しているサンプルは、25nM rFVIIaおよび30nM wtFXIIIで形成された血餅よりも有意に大きなＭＡを示した(p<0.05, 両側ペアードｔ検定)；また、FVIIaおよび120nM FXIII V34Lで形成された血餅は、rFVIIaおよび120nM wtFXIIIで形成された血餅よりも有意に大きなＭＡおよびＭＴＧを示した(それぞれp<0.01およびp<0.05, 両側ペアードｔ検定)。前記データは、FXIII V34Lの血餅安定化効果が、wtFXIIIのものよりも有意に増加していたことを実証している。 
【表３】
2008531645.tif 000004
例6 
FXIII欠乏時のFXIIIの効果
正常な血小板を添加されたFXIII欠乏性血漿におけるFXIIIバリアントの効果を、例５に記載のとおりトロンボエラストグラフィで評価した。血小板リッチな血漿（Platelet-rich plasma）を、クエン酸で安定化させた正常なヒト血液から、200 X gで10分間遠心分離することによって調製した。血小板を、15 mM Hepes, pH 7.4, 138 mM NaCl, 5 mM CaCl2, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, 5.5 mM デキストロース, および1mg/ml BSAで平衡化されたSpeharose CL6Bカラム上でゲル濾過を行なうことによって単離し、そして312 X gで4分間遠心分離することによって穏やかに沈降させた。血小板を、アッセイにおいて150,000/μlの最終的な血小板密度に、FXIII欠乏性の血漿(George King)で再構成した。そして、トロンボエラストグラフィを、例5に記載のとおり行った。FXIIIバリアントに関するMTGおよびMAの値を、表2に示す。 
等モルの濃度のwt FXIII, FXIII V34L, およびFXIII V34L, V35Tを比較した場合、FXIII V34LはMTGおよびMAをwt FXIIIで行うよりも増加させ、FXIII V34L, V35LはMTGおよびMAをFXIII V34Lで行うよりも増加させた。これによって、FXIIIバリアントが血餅の形成および安定性においてwt rFXIIIよりも効果的であることが実証された。
【表４】
2008531645.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【００８８】
記載なし
【図１】
2008531645.tif 000006
【図２】
2008531645.tif 000007
【図３】
2008531645.tif 000008
【国際調査報告】
2008531645.tif 000009
2008531645.tif 000010