(57)【要約】特定のＩｇＧ４−Ｆｃ又はＨＳＡの誘導体に融合して、排出半減期が延長され、かつクリアランスが遅延した、生物活性を有する融合タンパク質を形成するＦＧＦ−２１化合物を提供する。これらＦＧＦ−２１化合物融合タンパク質及び組成物は、２型糖尿病、肥満症、及びメタボリック症候群の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端及びＣ末端を有する第二ポリペプチドに融合した、Ｎ末端及びＣ末端を有する第一ポリペプチドを含む異種融合タンパク質であって、
該第一ポリペプチドはＦＧＦ−２１化合物であり、
該第二ポリペプチドは、
（ａ）免疫グロブリンのＦｃ部分、
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部分の類似体、及び
（ｃ）免疫グロブリンのＦｃ部分の断片、
からなる群から選択され、
該第一ポリペプチドのＣ末端は、
（ｄ）ペプチドリンカー、
（ｅ）グリシンリッチペプチド、
（ｆ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、１．５、２、３、４、５又は６である）を有するペプチド、及び
（ｇ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］３を有するペプチド、
からなる群から選択されるリンカーを介して、該第二ポリペプチドのＮ末端に融合されている異種融合タンパク質。
【請求項２】
Ｎ末端及びＣ末端を有する第二ポリペプチドに融合した、Ｎ末端及びＣ末端を有する第一ポリペプチドを含む異種融合タンパク質であって、
該第一ポリペプチドはＦＧＦ−２１化合物であり、
該第二ポリペプチドは、
（ａ）免疫グロブリンのＦｃ部分、
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部分の類似体、及び
（ｃ）免疫グロブリンのＦｃ部分の断片、
からなる群から選択され、
該第一ポリペプチドのＮ末端は、
（ｄ）ペプチドリンカー、
（ｅ）グリシンリッチペプチド、
（ｆ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、１．５、２、３、４、５又は６である）を有するペプチド、及び
（ｇ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］３を有するペプチド、
からなる群から選択されるリンカーを介して、該第二ポリペプチドのＣ末端に融合されている異種融合タンパク質。
【請求項３】
該ＦＧＦ−２１化合物は、配列番号４の配列を含む免疫グロブリンのＦｃ部分に融合されている、請求項１又は２に記載の異種融合タンパク質。
【請求項４】
Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、及びＬ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）からなる群から選択される異種融合タンパク質。
【請求項５】
Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、及びＩ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）からなる群から選択される異種融合タンパク質。
【請求項６】
Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、及びＬ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）からなる群から選択される異種融合タンパク質。
【請求項７】
該リンカーは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群から選択される配列を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の異種融合タンパク質。
【請求項８】
Ｎ末端及びＣ末端を有する第二ポリペプチドに融合した、Ｎ末端及びＣ末端を有する第一ポリペプチドを含む異種融合タンパク質であって、
該第一ポリペプチドはＦＧＦ−２１化合物であり、
該第二ポリペプチドは、
（ａ）ヒトアルブミン、
（ｂ）ヒトアルブミンの類似体、及び
（ｃ）ヒトアルブミンの断片、
からなる群から選択され、
該第一ポリペプチドのＣ末端は、該第二ポリペプチドのＮ末端に融合されている異種融合タンパク質。
【請求項９】
Ｎ末端及びＣ末端を有する第二ポリペプチドに融合した、Ｎ末端及びＣ末端を有する第一ポリペプチドを含む異種融合タンパク質であって、
該第一ポリペプチドはＦＧＦ−２１化合物であり、
該第二ポリペプチドは、
（ａ）ヒトアルブミン、
（ｂ）ヒトアルブミンの類似体、及び
（ｃ）ヒトアルブミンの断片、
からなる群から選択され、
該第一ポリペプチドのＮ末端は、該第二ポリペプチドのＣ末端に融合されている異種融合タンパク質。
【請求項１０】
Ｎ末端及びＣ末端を有する第二ポリペプチドに融合した、Ｎ末端及びＣ末端を有する第一ポリペプチドを含む異種融合タンパク質であって、
該第一ポリペプチドはＦＧＦ−２１化合物であり、
該第二ポリペプチドは、
（ａ）ヒトアルブミン、
（ｂ）ヒトアルブミンの類似体、及び
（ｃ）ヒトアルブミンの断片、
からなる群から選択され、
該第一ポリペプチドのＣ末端は、
（ｄ）ペプチドリンカー、
（ｅ）グリシンリッチペプチド、
（ｆ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、１．５、２、３、４、５又は６である）を有するペプチド、及び
（ｇ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］３を有するペプチド
からなる群から選択されるリンカーを介して、該第二ポリペプチドのＮ末端に融合されている異種融合タンパク質。
【請求項１１】
Ｎ末端及びＣ末端を有する第二ポリペプチドに融合した、Ｎ末端及びＣ末端を有する第一ポリペプチドを含む異種融合タンパク質であって、
該第一ポリペプチドはＦＧＦ−２１化合物であり、
該第二ポリペプチドは、
（ａ）ヒトアルブミン、
（ｂ）ヒトアルブミンの類似体、及び
（ｃ）ヒトアルブミンの断片、
からなる群から選択され、
該第一ポリペプチドのＮ末端は、
（ｄ）ペプチドリンカー、
（ｅ）グリシンリッチペプチド、
（ｆ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、１．５、２、３、４、５又は６である）を有するペプチド、及び
（ｇ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］３を有するペプチド、
からなる群から選択されるリンカーを介して、該第二ポリペプチドのＣ末端に融合されている異種融合タンパク質。
【請求項１２】
該ペプチドリンカーは、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号９からなる群から選択される配列を含む、請求項１０又は１１に記載の異種融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１３に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１５】
請求項１４に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種融合タンパク質の少なくとも一種を発現する宿主細胞。
【請求項１７】
異種融合タンパク質が検出可能な量にて発現する条件下で、請求項１３に記載のポリヌクレオチドを転写及び翻訳するステップを含む、異種融合タンパク質の製造方法。
【請求項１８】
（ａ）治療的有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種融合タンパク質、及び
（ｂ）許容される医薬担体を含む、肥満症、２型糖尿病、又はメタボリック症候群の１又はそれ以上を発症している患者の治療に有用な医薬組成物。
【請求項１９】
治療的有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種融合タンパク質を投与することを含む、インスリン非依存型糖尿病患者の治療方法。
【請求項２０】
治療的有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種融合タンパク質を投与することを含む、メタボリック症候群患者の治療方法。
【請求項２１】
治療的有効量の請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種融合タンパク質を投与することを含む、肥満症患者の治療方法。
【請求項２２】
インスリン非依存型糖尿病を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種融合タンパク質の使用。
【請求項２３】
メタボリック症候群を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種融合タンパク質の使用。
【請求項２４】
肥満症を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の異種融合タンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドの生体内半減期の延長効果を有する、タンパク質に融合した繊維芽細胞増殖因子２１化合物に関する。これら融合タンパク質は、インスリン非依存型糖尿病、肥満症及びメタボリック症候群の治療に使用し得る。
【背景技術】
【０００２】
繊維芽細胞増殖因子は、発達中の組織及び成ヒト組織で幅広く発現する巨大なポリペプチドであり（Ｂａｉｒｄ等、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ、３：２３９−２４３、１９９１）、血管新生、有糸分裂誘発、パターン形成、細胞分化、代謝調節及び組織損傷の修復を含む多数の生理学的機能において重要な役割を果たしている（ＭｃＫｅｅｈａｎ等、Ｐｒｏｇ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５９：１３５−１７６、１９９８）。刊行物によれば、ＦＧＦファミリーは、現在、２２のメンバーから構成されている（Ｒｅｕｓｓ等、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓ．３１３：１３９−１５７（２００３））。
【０００３】
繊維芽細胞増殖因子２１（ＦＧＦ−２１）は、肝臓で優位に発現することが報告されており、虚血性血管疾患、創傷治癒、及び肺、気管支又は肺胞の細胞機能の損失に関連した疾患、並びに他の多数の疾患の治療に用いることが説明されている（Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ等、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１４９２：２０３−２０６、（２０００）、米国特許第６、７１６、６２６号、及び国際公開第０１／１８１７２号パンフレット）。より最近になって、ＦＧＦ−２１は、マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞内でインスリンの存在又は非存在下でグルコースの取り込みを促進し、ｏｂ／ｏｂ及びｄｂ／ｄｂマウス、並びに８週齢のＺＤＦラットにて、食後及び空腹時の血中グルコース濃度を用量依存的に低下させることが報告されており、２型糖尿病及び肥満症の治療法としてＦＧＦ−２１を使用することの基礎となっている（国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット）。
【０００４】
本発明は、長い循環半減期を有するタンパク質、例えば免疫グロブリンのＦｃ部分又はアルブミンをＦＧＦ−２１化合物に融合させると、天然のＦＧＦ−２１よりも排出半減期が延長しクリアランスが低下した、生物活性を有するＦＧＦ−２１融合タンパク質が形成されるという発見に基づくものである。
【０００５】
本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質は、野生型ＦＧＦ−２１の生物活性の全部又は一部を維持しながら、野生型ＦＧＦ−２１と比較して長い作用時間を有するため、野生型ＦＧＦ−２１よりも治療法としてより有用であり、また使用の際の利便性が高い。
【０００６】
したがって、本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質は、２型糖尿病、肥満症、及びメタボリック症候群を含むがこれらに限定されない疾患を有する対象者の治療に有用であり、持続的な暴露に起因する効力の増大、及び必要な投与量の低下により、対象者の利便性、及び服薬コンプライアンスが増すといった特定の利点を有する。
【０００７】
【特許文献１】米国特許第６、７１６、６２６号
【特許文献２】国際公開第０１／１８１７２号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０３／０１１２１３号パンフレット
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の化合物は、Ｎ末端及びＣ末端を有する第二ポリペプチドに融合した、Ｎ末端及びＣ末端を有する第一ポリペプチドを含む異種融合タンパク質であって、該第一ポリペプチドはＦＧＦ−２１化合物であり、該第二ポリペプチドは、
（ａ）免疫グロブリンのＦｃ部分、
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部分の類似体、及び
（ｃ）免疫グロブリンのＦｃ部分の断片、
からなる群から選択され、該第一ポリペプチドのＣ末端がリンカーを介して該第二ポリペプチドのＮ末端に融合されているか、代替的に、該第一ポリペプチドのＮ末端がリンカーを介して該第二ポリペプチドのＣ末端に融合されている異種融合タンパク質を含む。該リンカーは、ペプチドリンカー、グリシンリッチペプチド、及び配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、１．５、２、３、４、５又は６である）を有するペプチド、からなる群から選択されることが好ましい。
【０００９】
本発明の更なる化合物は、Ｎ末端及びＣ末端を有する第二ポリペプチドに融合した、Ｎ末端及びＣ末端を有する第一ポリペプチドを含む異種融合タンパク質であって、該第一ポリペプチドはＦＧＦ−２１化合物であり、該第二ポリペプチドは
（ａ）ヒトアルブミン、
（ｂ）ヒトアルブミンの類似体、及び
（ｃ）ヒトアルブミンの断片、
からなる群から選択され、該第一ポリペプチドのＣ末端が該第二ポリペプチドのＮ末端に融合されているか、代替的に、該第一ポリペプチドのＮ末端が該第二ポリペプチドのＣ末端に融合されている異種融合タンパク質を含む。該ＦＧＦ−２１化合物は、リンカーを介して該第二ポリペプチドに融合され得る。該リンカーは、ペプチドリンカー、グリシンリッチペプチド、及び配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、１．５、２、３、４、５又は６である）を有するペプチド、からなる群から選択されることが好ましい。
【００１０】
本発明は、本発明の異種融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドを含むベクター、及び本発明のベクターがトランスフェクトされた、すなわち該ベクターで形質転換された宿主細胞も含む。また本発明は、異種融合タンパク質が検出可能な量で発現する条件下で、本発明のポリヌクレオチドを転写及び翻訳するステップを含む、異種融合タンパク質の製造方法も含む。
【００１１】
本発明の別の一実施態様は、ＦＧＦ−２１融合タンパク質からなる医薬組成物と、２型糖尿病、肥満症、又はメタボリック症候群に罹患する患者の治療方法とを包含し、該方法は、治療的有効量の本発明の異種融合タンパク質を該患者に投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
開示され特許請求される本発明のために、次の用語を以下のように定義する。
【００１３】
ＦＧＦ−２１は、２７個のアミノ酸からなるリーダー配列を含む２０８個のアミノ酸からなるポリペプチドである。ヒトＦＧＦ−２１は、マウスＦＧＦ−２１と約７９％のアミノ酸相同性を示し、ラットＦＧＦ−２１と約８０％のアミノ酸相同性を示す。ヒトＦＧＦ−２１又はその突然変異タンパク質は、本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質のためのポリペプチド鋳型として好ましいが、当業者であれば代替的に哺乳動物のＦＧＦ−２１ポリペプチド配列に基づいて容易に融合タンパク質を製造し得ることが理解されよう。
【００１４】
本発明のアミノ酸の位置は、以下に示す成熟した、１８１アミノ酸からなる野生型すなわち天然のヒトＦＧＦ−２１ポリペプチド（配列番号１）から決定される。
【００１５】
2008506635.tif 000002
【００１６】
成熟したヒト１８１アミノ酸からなるＦＧＦ−２１ポリペプチドをコードする、対応するＤＮＡ配列は以下のとおりである（配列番号２）。
【００１７】
2008506635.tif 000003
【００１８】
本発明の方法にて有用なＦＧＦ−２１としては、配列番号１に示すヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質、類似体、及び誘導体が好ましく、以下これらを纏めてＦＧＦ化合物と称する。ＦＧＦ−２１化合物はＦＧＦ−２１と十分な相同性を示すため、ＦＧＦ−２１受容体に結合して、グルコース取り込み促進、又は本願に記載する他の生理学的効果を生じるシグナル伝達経路を開始させる能力を有する。例えば、ＦＧＦ−２１化合物は、実施例１に記載した細胞ベースのアッセイによって、グルコース取り込み活性を測定することができる。
【００１９】
「対象者」又は「患者」は、哺乳動物、好ましくはヒトである。
２型糖尿病（インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ））は、インスリン量に対してグルコース産生が過剰となり、またグルコースクリアランスが不十分である結果として血糖値が過剰に高い状態に維持されることにより特徴付けられる。
【００２０】
耐糖能異常は、グルコースに対する感受性が著しく高くなった状態と定義することができる。
高血糖は、血中の糖（グルコース）が過剰になった状態と定義する。
低血糖は、血糖値が低下し過ぎて、身体活動にとって十分なエネルギーを提供し得ない場合に発生する。
【００２１】
高インスリン血は、血中インスリン濃度が正常値よりも高い状態と定義する。
インスリン抵抗性は、正常な量のインスリンが、正常以下の生物学的反応を引き起こす状態と定義する。
【００２２】
メタボリック症候群は、以下の徴候の少なくとも３つの集まりと定義し得る。腹部脂肪−殆どの男性で、ウエスト約１０１．６ｃｍ（４０インチ）又はそれ以上、高血糖−断食後、少なくとも１１０ミリグラム／デシリットル（ｍｇ／ｄｌ）、高トリグリセリド−血流中、少なくとも１５０ｍｇ／ｄＬ、低ＨＤＬ−４０ｍｇ／ｄｌ未満、及び血圧１３０／８５又はそれ以上。
【００２３】
天然又は野生型とは、配列番号１に示すような、成熟した１８１アミノ酸からなるヒトＦＧＦ−２１ポリペプチドを指す。用語「天然」又は「野生型」は、問題のポリペプチドの対立遺伝子変異体を包含することを意図する。
【００２４】
用語「アミノ酸」は、本願において最も広い意味で使用され、天然に存在するアミノ酸、並びにアミノ酸変異体及び誘導体を含む天然に存在しないアミノ酸が含まれる。当業者は、この広い定義を考慮すれば、本願に引用されるアミノ酸には、例えば、天然に存在するタンパク新生Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、例えばアミノ酸変異体及び誘導体のような化学修飾アミノ酸、例えばノルロイシン、β−アラニン、オルニチン等の天然に存在する非タンパク新生アミノ酸、並びにアミノ酸の特徴として当該技術分野にて知られている性質を有する、化学合成された化合物を含むことが認識されよう。天然に存在しないアミノ酸の例は、α−メチルアミノ酸（例、α−メチルアラニン）、Ｄ−アミノ酸、ヒスチジン様アミノ酸（例、２−アミノ−ヒスチジン、β−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、α−フルオロメチル−ヒスチジン及びα−メチル−ヒスチジン）、側鎖内に余分のメチレンを有するアミノ酸（「ホモ」アミノ酸）、並びに側鎖内のカルボン酸官能基が、スルホン酸基で置換されたアミノ酸（例、システイン酸）を含む。しかしながら、本発明のＦＧＦ−２１化合物は、本願に別に特に提供される以外、天然に存在するアミノ酸のみを含むことが好ましい。
【００２５】
ＦＧＦ−２１化合物を示すために本願に使用される命名法において、アミノ酸は、三文字コード、又は代替的に標準的な一文字コードを用いて識別される。突然変異は、元のアミノ酸の三文字コード、続くアミノ酸番号、続く代替アミノ酸の三文字コードで示す。各突然変異タンパク質の数による指定は、配列番号１を基準とする。例えば、第１１８位のロイシン（すなわち、Ｌｅｕ１１８又はＬ１１８）のシステイン（Ｃｙｓ）による置換は、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ又はＬ１１８Ｃと指定する。同様に、第１５２位のイソロイシン及び第１６３位のセリン（Ｉｌｅ１５２／Ｓｅｒ１６３）の負電荷アミノ酸であるグルタミン酸（Ｇｌｕ）による二重置換は、Ｉｌｅ１５２Ｇｌｕ／Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕ又はＩ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅと指定する。
【００２６】
本願で使用される「生体外での効力」は、細胞ベースのアッセイにおけるＦＧＦ−２１融合タンパク質のグルコース取り込みの測定値、及びＦＧＦ−２１化合物の生物学的効力の測定値を意味する。生体外での効力は「ＥＣ５０」として表され、これは単一用量反応実験において５０％活性を示す化合物の有効濃度である。本発明の目的において、生体外での効力は３Ｔ３−Ｌ１細胞を使用したグルコース取り込みアッセイにより決定される（実施例１）。
【００２７】
用語「血中濃度半減期」は、なくなる前に、関連した分子の半分が血漿中を循環するようになるまでの時間を指す。代替的に使用される用語は、「排出半減期」である。血中濃度半減期又は排出半減期の文脈にて使用される用語「延長された作用時間」又は「より長い作用時間」は、類似した条件下で測定して、ＦＧＦ−２１融合タンパク質の半減期が、基準分子（例、ポリペプチドの非融合形態、又は天然ポリペプチド）の半減期と比較して有意に延長していることを示す。本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質は、類似したＦＧＦ−２１化合物の排出半減期よりも長い排出半減期を有することが好ましい。本願の実施例３に報告されている半減期は排出半減期であり、これは排出の末期の対数線形の割合（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｌｏｇ−ｌｉｎｅａｒ  ｒａｔｅ）に相当する。当業者は、半減期がクリアランス及び分布容積の両方の関数として変化する誘導パラメータであることを理解されよう。
【００２８】
クリアランスは、身体が薬物を排出する能力の測定値である。例えば薬物に対する修飾を要因としてクリアランスが低下するにつれて、半減期が延長することが期待されよう。しかしながら、この相反的な関係は、分布容積に変化がない場合にのみ正確である。末期の対数線形半減期（ｔ１／２）、クリアランス（Ｃ）、及び分布容積（Ｖ）間の簡便な概算的関係は、式：
【数１】
2008506635.tif 000004
で表される。クリアランスは、排出される薬物の量を示すのではなく、薬物が完全に解放されるために必要な血液又は血漿のような生物学的流体の容積を示す。クリアランスは、単位時間当たりの容積として表される（実施例３参照）。
【００２９】
本発明の異種融合タンパク質は、免疫グロブリンのＦｃ部分、免疫グロブリンのＦｃ部分の類似体、免疫グロブリンのＦｃ部分の断片、ヒトアルブミン、ヒトアルブミン類似体又はヒトアルブミン断片に融合したＦＧＦ−２１化合物を含む。ＦＧＦ−２１化合物のＣ末端は、直接又はペプチドリンカーを介して、アルブミン又はＦｃタンパク質のＮ末端に融合され得る。反対に、ＦＧＦ−２１化合物のＮ末端が、直接又はペプチドリンカーを介して、アルブミン又はＦｃタンパク質のＣ末端に融合されてもよい。これらの異種融合タンパク質は生物活性を有し、また天然ＦＧＦ−２１と比較して延長された半減期を有する。
【００３０】
「ヒトＦＧＦ−２１突然変異タンパク質」は、野生型の成熟タンパク質の少なくとも１個のアミノ酸が、別の１個のアミノ酸で置換されているヒトＦＧＦ−２１を含むものと定義する。ＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の例は、米国特許出願公開第６０／５２８、５８２号、米国特許出願公開第６０／６０６、８０５号、米国特許出願公開第６０／６０６、８３０号、及び米国特許出願公開第６０／６３５、８８２号に記載されており、これらは参照することにより本願に援用される。一般的に突然変異タンパク質は、野生型タンパク質のある変更された性質、構造又は機能を有する。例えば、突然変異タンパク質は、好ましい生物活性プロファイルを保持する一方で、濃縮溶液中で向上された又は改良された物理学的安定性（例、疎水性により仲介される凝集が少ない）を有し得る。突然変異タンパク質は（例えば、ｍ−クレゾール、フェノール、ベンジルアルコールのような）薬剤保存剤に対する適合性がより高い場合があり、そのため貯蔵中にタンパク質の生理化学的性質及び生物活性が維持される保存医薬製剤を調製することができる。突然変異タンパク質は、イースト内で発現される場合、Ｏ−グリコシル化が低下され得る。突然変異タンパク質は、野生型ＦＧＦ−２１と比較して、脱アミド化が低下され得る。本願に使用されているように、これらの用語は限定的なものではなく、所定の突然変異タンパク質が、野生型タンパク質の１個又は２個以上の変更された性質を持つことは全く可能である。
【００３１】
向上した薬剤的安定性を有するＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の例は、以下の１個又は２個以上のアミノ酸の、電荷アミノ酸及び／又は極性非電荷アミノ酸による置換を含む：グリシン４２、グルタミン５４、アルギニン７７、アラニン８１、ロイシン８６、フェニルアラニン８８、リシン１２２、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、プロリン１３０、アルギニン１３１、ロイシン１３９、アラニン１４５、ロイシン１４６、イソロイシン１５２、アラニン１５４、グルタミン１５６、グリシン１６１、セリン１６３、グリシン１７０、又はセリン１７２。ここでアミノ酸の番号は、配列番号１に基づく。電荷アミノ酸は、正電荷又は負電荷アミノ酸として定義する。正電荷アミノ酸は、ヒスタジン、リシン、アルギニン、及びそれらの天然に存在しない類似体（例、γアミノ酪酸、オルニチン等）を含むものと定義する。負電荷アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸、及びそれらの天然に存在しない類似体（例、アミノアジピン酸）を含むものと定義する。極性非電荷アミノ酸は、セリン、トレオニン、アスパラギン、グルタミン、及びそれらの天然に存在しない類似体を含むものと定義する。好ましい突然変異タンパク質は、Ｇｌｎ５４Ｇｌｕ、Ｌｅｕ１３９Ｇｌｕ、Ａｌａ１４５Ｇｌｕ、Ｌｅｕ１４６Ｇｌｕ、Ｉｌｅ１５２Ｇｌｕ、Ｇｌｎ１５６Ｇｌｕ、Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕ、及びＩｌｅ１５２Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕである。
【００３２】
向上した薬剤的安定性を有する更なるＦＧＦ−２１突然変異タンパク質の例は、以下の２個又は３個以上がシステインで置換されたＦＧＦ−２１を含む：アルギニン１９、チロシン２０、ロイシン２１、チロシン２２、トレオニン２３、アスパラギン酸２４、アスパラギン酸２５、アラニン２６、グルタミン２７、グルタミン２８、アラニン３１、ロイシン３３、イソロイシン３５、ロイシン３７、バリン４１、グリシン４２、グリシン４３、グルタミン酸５０、グルタミン５４、ロイシン５８、バリン６２、ロイシン６６、グリシン６７、リシン６９、アルギニン７２、フェニルアラニン７３、グルタミン７６、アルギニン７７、アスパラギン酸７９、グリシン８０、アラニン８１、ロイシン８２、グリシン８４、セリン８５、プロリン９０、アラニン９２、セリン９４、フェニルアラニン９５、ロイシン１００、アスパラギン酸１０２、チロシン１０４、チロシン１０７、セリン１０９、グルタミン酸１１０、プロリン１１５、ヒスチジン１１７、ロイシン１１８、プロリン１１９、アスパラギン１２１、リシン１２２、セリン１２３、プロリン１２４、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、アスパラギン酸１２７、アラニン１２９、プロリン１３０、グリシン１３２、アラニン１３４、アルギニン１３５、ロイシン１３７、プロリン１３８、又はロイシン１３９。ここでアミノ酸の番号は、配列番号１に基づく。
【００３３】
天然に存在するＣｙｓ７５−Ｃｙｓ９３ジスルフィド結合に加えて人工的なジスルフィド結合を有する、ＦＧＦ−２１の特定の突然変異タンパク質は以下のようなものである：Ｇｌｎ７６Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１０９Ｃｙｓ、Ｃｙｓ７５−Ｓｅｒ８５Ｃｙｓ、Ｃｙｓ７５−Ａｌａ９２Ｃｙｓ、Ｐｈｅ７３Ｃｙｓ−Ｃｙｓ９３、Ｓｅｒ１２３Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１２５−Ｃｙｓ、Ａｓｐ１０２Ｃｙｓ−Ｔｙｒ１０４Ｃｙｓ、Ａｓｐ１２７Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１３２Ｃｙｓ、Ｓｅｒ９４Ｃｙｓ−Ｇｌｕ１１０Ｃｙｓ、Ｐｒｏ１１５Ｃｙｓ−Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ、Ａｓｎ１２１Ｃｙｓ−Ａｓｐ１２７Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１００Ｃｙｓ−Ａｓｐ１０２Ｃｙｓ、Ｐｈｅ９５Ｃｙｓ−Ｔｙｒ１０７Ｃｙｓ、Ａｒｇ１９Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１３８Ｃｙｓ、Ｔｙｒ２０Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３９Ｃｙｓ、Ｔｙｒ２２Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３７Ｃｙｓ、Ａｒｇ７７Ｃｙｓ−Ａｓｐ７９Ｃｙｓ、Ｐｒｏ９０Ｃｙｓ−Ａｌａ９２Ｃｙｓ、Ｇｌｕ５０Ｃｙｓ−Ｌｙｓ６９Ｃｙｓ、Ｔｈｒ２３Ｃｙｓ−Ａｓｐ２５Ｃｙｓ、Ａｌａ３１Ｃｙｓ−Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ、Ｔｈｒ２３Ｃｙｓ−Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ、Ｖａｌ４１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ８２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ５８Ｃｙｓ−Ｖａｌ６２Ｃｙｓ、Ｇｌｎ５４Ｃｙｓ−Ｌｅｕ６６Ｃｙｓ、Ｉｌｅ３５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ６７Ｃｙｓ、Ｇｌｙ６７Ｃｙｓ−Ａｒｇ７２Ｃｙｓ、Ｉｌｅ３５Ｃｙｓ−Ｇｌｙ８４Ｃｙｓ、Ａｒｇ７２Ｃｙｓ−Ｇｌｙ８４Ｃｙｓ、又はＡｒｇ７７Ｃｙｓ−Ａｌａ８１Ｃｙｓ。ここでアミノ酸の番号は配列番号１に基づく。人工的なジスルフィド結合を有する好ましい突然変異タンパク質は、Ｔｙｒ２２Ｃｙｓ−Ｌｅｕ１３９Ｃｙｓ、Ａｓｐ２４Ｃｙｓ−Ａｒｇ１３５Ｃｙｓ、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ｇｌｙ１３２Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１３０Ｃｙｓ、Ｈｉｓ１１７Ｃｙｓ−Ａｌａ１２９Ｃｙｓ、Ｌｅｕ８２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１１９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ８０Ｃｙｓ−Ａｌａ１２９Ｃｙｓ、Ｇｌｙ４３Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ、Ｇｌｙ４２Ｃｙｓ−Ａｒｇ１２６Ｃｙｓ、Ｇｌｙ４２Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２８Ｃｙｓ−Ｐｒｏ１２４Ｃｙｓ、Ｇｌｎ２７Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１２３Ｃｙｓ、Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ、又はＡｓｐ２５Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓである。人工的なジスルフィド結合を有する最も好ましい突然変異タンパク質は、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ、Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ、Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ、Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ／Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ、Ｉｌｅ１５２Ｇｌｕ−Ｓｅｒ１６３Ｇｌｕ／Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ、及び、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ／Ｓｅｒ１６７Ａｌａである。
【００３４】
イースト内で発現された際の、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ−グリコシル化の容量が低下されたヒトＦＧＦ−２１の突然変異タンパク質、又はその生物活性ペプチドの例は、Ｓｅｒ１６７のＳｅｒ又はＴｈｒを除く任意のアミノ酸による置換と、以下の２つ又は３つ以上のシステインによる置換との組み合わせを含む：アルギニン１９、チロシン２０、ロイシン２１、チロシン２２、トレオニン２３、アスパラギン酸２４、アスパラギン酸２５、アラニン２６、グルタミン２７、グルタミン２８、アラニン３１、ロイシン３３、イソロイシン３５、ロイシン３７、バリン４１、グリシン４２、グリシン４３、グルタミン酸５０、グルタミン５４、ロイシン５８、バリン６２、ロイシン６６、グリシン６７、リシン６９、アルギニン７２、フェニルアラニン７３、グルタミン７６、アルギニン７７、アスパラギン酸７９、グリシン８０、アラニン８１、ロイシン８２、グリシン８４、セリン８５、プロリン９０、アラニン９２、セリン９４、フェニルアラニン９５、ロイシン１００、アスパラギン酸１０２、チロシン１０４、チロシン１０７、セリン１０９、グルタミン酸１１０、プロリン１１５、ヒスチジン１１７、ロイシン１１８、プロリン１１９、アスパラギン１２１、リシン１２２、セリン１２３、プロリン１２４、ヒスチジン１２５、アルギニン１２６、アスパラギン酸１２７、アラニン１２９、プロリン１３０、グリシン１３２、アラニン１３４、アルギニン１３５、ロイシン１３７、プロリン１３８、又はロイシン１３９。ここでアミノ酸の番号は、配列番号１に基づく。イースト内で発現した際の、野生型ヒトＦＧＦ−２１と比較してＯ−グリコシル化容量が低下された、最も好ましい突然変異タンパク質の例は、Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ｌｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、Ａｌａ２６Ｃｙｓ−Ｌｙｓ１２２Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａ、又はＬｅｕ２１Ｃｙｓ−Ｌｅｕ３３Ｃｙｓ／Ｌｅｕ１１８Ｃｙｓ−Ａｌａ１３４Ｃｙｓ−Ｓｅｒ１６７Ａｌａである。
【００３５】
ＦＧＦ−２１化合物は「ＦＧＦ−２１誘導体」も含み、これは、ＦＧＦ−２１又はＦＧＦ−２１類似体のアミノ酸配列を有するが、更にそのアミノ酸側方基、α−炭素原子、末端アミノ基、又は末端カルボン酸基の１個又は２個以上に化学修飾を有する分子として定義される。化学修飾は、化学部分（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｉｅｔｙ）の付加、新たな結合の形成、及び化学部分の除去を含むが、これらに限定されるものではない。
【００３６】
アミノ酸側方基の修飾は、リシンε−アミノ基のアシル化、アルギニン、ヒスチジン又はリシンのＮ−アルキル化、グルタミン酸又はアスパラギン酸のカルボン酸基のアルキル化、及びグルタミン又はアスパラギンの脱アミドを含むが、これらに限定されるものではない。末端アミノ基の修飾は、デスアミノ、Ｎ−低級アルキル、Ｎ−ジ−低級アルキル、及びＮ−アシル修飾を含むが、これらに限定されるものではない。末端カルボキシル基の修飾は、アミド、低級アルキルアミド、ジアルキルアミド及び低級アルキルエステル修飾を含むが、これらに限定されるものではない。更に、１個若しくは２個以上の側方基、又は末端基は、タンパク質の化学者に周知の保護基により保護し得る。アミノ酸のα−炭素は、モノ又はジメチル化され得る。
【００３７】
本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質は、天然ＦＧＦ−２１と同様の生体外での生物活性を有する。本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質のいくつかは、特定のアッセイで測定した結果によれば、天然ＦＧＦ−２１より低い生物活性を有し得る。この活性の低下は、その化合物の延長された半減期及び／又はより低いクリアランス値により補償され、排出半減期が延長されたＦＧＦ−２１化合物にとってはむしろ好ましい特性であり得る。
【００３８】
本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質は、グリコシル化部位を含んでいてもよい。グリコシル化とは、タンパク質の特定部位に糖部分を加える化学修飾を意味する。タンパク質のグリコシル化は、正確な電荷、立体配座、及びタンパク質成熟の安定化を確実にする役割を有し、またタンパク質を細胞表面に付着させ、最終的にタンパク質を分泌させる。最も重要な点として、グリコシル化は、生体内で多くのタンパク質のクリアランス速度に影響を与える。糖はＯ−結合又はＮ−結合され得る。一般に、Ｏ−結合した糖は、セリン及びトレオニンのヒドロキシル基酸素に加えられる一方、Ｎ−結合した糖はアスパラギンのアミド窒素に加えられる。Ｎ−グリコシル化のコンセンサス部位は、Ａｓｎ  Ｘ１  Ｘ２であり、ここでＸ１は、Ｐｒｏを除く任意のアミノ酸、Ｘ２はＳｅｒ又はＴｈｒである。
【００３９】
＜異種Ｆｃ融合タンパク質＞
上述したＦＧＦ−２１化合物は、直接又はペプチドリンカーを介して、免疫グロブリンのＦｃ部分に融合され得る。免疫グロブリンは、ジスルフィド結合により纏められた、通常２つの軽鎖及び２つの重鎖からなるポリペプチド鎖を含む分子である。各鎖において、１つのドメイン（Ｖ）は、分子の抗体特異性に応じて、可変のアミノ酸配列を有する。他のドメイン（Ｃ）は、同一クラスの分子に共通する一定の配列を有する。
【００４０】
本願で使用されているように、免疫グロブリンのＦｃ部分は、免疫学の分野で一般にその用語に付与された意味を有する。詳細には、この用語は、抗体から２つの抗原結合領域（Ｆａｂ断片）を除去することによって得られる抗体断片を指す。Ｆａｂ断片を除去する一つの方法は、免疫グロブリンをパパインプロテアーゼで消化するものである。それによって、非共有相互作用及びジスルフィド結合を介して関連する両方の重鎖からの、定常領域のほぼ同一寸法を有する断片からＦｃ部分が形成される。Ｆｃ部分は、ヒンジ領域を含んでもよく、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを通って抗体のＣ末端に延びる。ヒト及びマウス免疫グロブリンの代表的なヒンジ領域は、抗体Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ、Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ、Ｃ．Ａ．Ｋ．、ｅｄ．、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、１９９２に見出すことができ、その教示は参照することにより本願に援用される。Ｆｃ部分は、更に１つ又は２つ以上のグリコシル化部位を含んでいてもよい。ヒンジ領域、ＣＨ２及びＣＨ３ドメイン、並びに８２位の１個のＮ−グリコシル化部位を含む代表的なＦｃタンパク質のアミノ酸配列を、以下に示す。
【００４１】
2008506635.tif 000005
［配列番号３］
【００４２】
異なるエフェクター及び薬物動態的な特性を有する５種のヒト免疫グロブリンＦｃ領域、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、及びＩｇＥが存在する。ＩｇＧは、血清中で最も豊富な免疫グロブリンである。ＩｇＧはまた、全免疫グロブリン中、最も長い血中半減期を有する（２３日）。他の免疫グロブリンと異なり、ＩｇＧはＦｃ受容体に結合した後、効率的に再循環される。４つのＩｇＧサブクラスＧ１、Ｇ２、Ｇ３及びＧ４が存在し、その各々は異なる効果又は機能を有する。これらのエフェクター機能は、一般にＦｃ受容体（ＦｃγＲ）との相互作用、又はＣ１ｑの結合及び補体の固定によって仲介される。ＦｃγＲに対する結合は、抗体依存性細胞により仲介される細胞融解を起こし得るのに対し、補体因子に対する結合は、補体により仲介される細胞融解（ｃｅｌｌ  ｌｙｓｉｓ）を起し得る。Ｆｃ部分が、その半減期を延長させる能力のみで利用される異種Ｆｃ融合タンパク質をデザインする際、エフェクター機能のいずれも最小にすることが重要である。ＩｇＧの全サブクラスがＦｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２、ＣＤ６４）に結合することができるが、Ｇ１及びＧ３はＧ２及びＧ４よりも能力が高い。ＩｇＧのＦｃ受容体結合領域は、ＣＨ２ドメインのヒンジ及びカルボキシ末端の両方の領域に位置する残基によって形成される。
【００４３】
所望の生体内効果に応じて、本発明の異種融合タンパク質は、上述した任意のアイソタイプを含んでもよく、あるいは補体及び／又はＦｃ受容体結合機能が変更された突然変異Ｆｃ領域を含んでもよい。したがって、本発明の異種融合タンパク質は、ＦＧＦ−２１化合物に融合した免疫グロブリンの完全Ｆｃ部分、免疫グロブリンのＦｃ部分の断片、又は免疫グロブリンのＦｃ部分の類似体を含み得る。
【００４４】
本発明の融合タンパク質は、単鎖タンパク質から構成されていても、又は複数鎖ポリペプチドとして存在してもよい。２つ又は３つ以上のＦｃ融合タンパク質は、これらがＦｃ領域間で自然に形成されるジスルフィド結合を介して相互作用するように製造され得る。これらの多量体は、ＦＧＦ−２１化合物に関して同種でもよいし、又は融合タンパク質のＦｃ部分のＮ末端に融合した異なるＦＧＦ−２１化合物を含んでいてもよい。
【００４５】
融合タンパク質の最終構造に関わらず、Ｆｃ又はＦｃ様の領域は、Ｃ末端又はＮ末端にて融合したＦＧＦ−２１化合物の生体内血中半減期を延長する役割を果たす必要がある。また、融合ＦＧＦ−２１化合物は、ある程度の生物活性を保持する必要がある。生物活性は、周知の生体外及び生体内方法により測定することができる。代表的な生物学的アッセイを、以下の実施例１及び実施例２に記載する。
【００４６】
本発明の異種融合タンパク質に使用されるＦｃ領域は、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４のＦｃ領域に由来することが好ましい。本発明の異種融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ４に由来するが、野生型ヒト配列の１箇所又は２箇所以上が置換されているＦｃ部分を含むことがより好ましい。本願で使用されているように、免疫グロブリンのＦｃ部分は、免疫学の分野で一般にその用語に付与された意味を有する。詳細には、この用語は、２つの抗体結合領域（Ｆａｂ断片）を含まない抗体断片を指す。Ｆｃ部分は非共有相互作用及びジスルフィド結合を介して関連する両方の重鎖からの抗体の定常領域から構成される。Ｆｃ部分は、ヒンジ領域を含んでもよく、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを通って抗体のＣ末端に延びる。Ｆｃ部分は、更に１つ又は２つ以上のグリコシル化部位を含んでもよい。
【００４７】
したがって、本発明の異種融合タンパク質は、ヒトＩｇＧ４のＦｃ領域に由来し、これは他のＩｇＧサブタイプと比較してＦｃγＲ及び補体因子を結合する能力が低いためである。本発明のＦＧＦ−２１化合物に融合した免疫グロブリンのヒトＩｇＧ４  Ｆｃ部分は、配列番号４の配列を含む。
【００４８】
2008506635.tif 000006
［配列番号４］
ここで、
第１１位のＸａａはＰｒｏ又はＳｅｒであり、
第１６位のＸａａはＰｒｏ又はＧｌｕであり、
第１７位のＸａａはＰｈｅ、Ｖａｌ又はＡｌａであり、
第１８位のＸａａはＬｅｕ、Ｇｌｕ又はＡｌａであり、
第８０位のＸａａはＡｓｎ又はＡｌａであり、及び
第２３０位のＸａａはＬｙｓ又は欠失している。
【００４９】
更に、本発明の異種融合タンパク質の一部であるＩｇＧ４  Ｆｃ領域は、エフェクター機能を排除する１つ又は２つ以上の以下の置換を含んでいてもよい。２２８残基目のセリンのプロリンによる置換、２３３残基目のグルタミン酸のプロリンによる置換、２３４残基目のフェニルアラニンのアラニン又はバリンによる置換、及び、２３５残基目のロイシンのアラニン又はフルタミン酸による置換（ＥＵナンバリング、Ｋａｂａｔ、Ｅ．Ａ．等（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ｎｏ．９１−３２４２）。これらの残基は、各々、配列番号４の第１１位、第１６位、第１７位、及び第１８位に対応する。更に、ＩｇＧ４  Ｆｃ領域内の、配列番号４の第８０位に対応する２９７（ＥＵナンバリング）残基目のＡｓｎのＡｌａ置換によるＮ−結合グリコシル化部位の排除もまた、異種融合タンパク質内に残留するエフェクター活性を確実に排除する別の一方法である。
【００５０】
天然分子内に存在するＣ末端のリシン残基は、本願にて説明する異種融合タンパク質のＩｇＧ４由来のＦｃ部分内では削除され得る（配列番号４の第２３０位、削除されたリシンをｄｅｓ−Ｋと記す）。リシンがＣ末端コドンでコードされているある細胞型（例えばＮＳ０細胞）内で発現する融合タンパク質は、その分子の一部がＣ末端アミノ酸としてリシンを有するか、又は分子の一部でリシンが削除されているかの点で、異種である。この削除は、哺乳動物のある種の細胞内での発現中のプロテアーゼ作用によるものである。したがって、この異種性を回避するために、Ｆｃ融合体発現コンストラクトは、リシンのためのＣ末端コドンが欠如していることが好ましい。
【００５１】
本願に説明するＦＧＦ−２１化合物のＣ−末端アミノ酸は、Ｌで示すグリシンリッチ（Ｇリッチ）リンカーを介して、ＩｇＧ４  Ｆｃ類似体部分のＮ末端に融合されることが好ましい。Ｌの直前の数は、ＦＧＦ−２１化合物をＦｃ部分から分離しているリンカーの数を指す。本発明の異種融合タンパク質の生体内での機能及び安定性は、小さいペプチドリンカーを加えて場合によっては望ましくないドメイン相互作用を防止することにより最適化され得る。更に、Ｇリッチリンカーは幾分かの構造的可撓性を付与するため、ＦＧＦ−２１化合物は、標的細胞上の受容体と生産的に相互作用できる。しかしながら、これらリンカーは、融合タンパク質が生体内で免疫原性となる危険性を有意に増大し得る。したがって、必要以上の長さを付与せずに、望ましくないドメイン相互作用を防止し、及び／又は生物活性及び／又は安定性を最適化することが好ましい。本発明の異種融合タンパク質には、このリンカーのより多数のコピーを使用し得るが、このリンカーの一つのコピーを使用して、延長された投与及び反復投与に関連した免疫原性の危険性を最小にすることが好ましい。
【００５２】
本発明の異種融合タンパク質のＦＧＦ−２１化合物と、Ｆｃ又はＨＳＡ部分とは、１、１．５又は２回リピートのＧリッチペプチドリンカーを介して互いに融合されることが好ましい。最も好ましいグリシンリッチリンカーを１Ｌで示し、これは配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号５）を含む。更なる好ましいペプチドリンカーは、１．５Ｌで示すリンカー、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号６）、２Ｌで示すリンカー、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号７）、Ｈ１で示すリンカー、Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（配列番号８）、及び、Ｓ１で示すリンカー、Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号９）を含む。場合によっては、３、４、５、又は６回リピートのＧリッチペプチドリンカーを使用してもよい。
【００５３】
以下に示す異種融合タンパク質において、ＩｇＧ４は、配列番号４で示すヒトＩｇＧ４  Ｆｃ配列の類似体を指す。異種融合タンパク質のＩｇＧ４  Ｆｃ部分の置換を、括弧内に示す。野生型アミノ酸をその一般的な略語で示し、続いてＥＵナンバリング系により完全ＩｇＧ４配列内の位置番号を示し、続いて一般的な略語で示される、その位置の置換アミノ酸を示す。
【００５４】
本発明の好ましいＦＧＦ−２１−Ｆｃ−異種融合タンパク質は、下記のタンパク質を含む：Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｉ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、及びＩ１５２Ｅ／Ｓ１６３Ｅ／Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）。
【００５５】
本発明のより好ましいＦＧＦ−２１−Ｆｃ異種融合タンパク質は、下記のタンパク質を含む：Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、及びＬ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）。
【００５６】
本発明の更に好ましいＦＧＦ−２１−Ｆｃ異種融合タンパク質は、以下のタンパク質を含む：Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、及びＬ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）。
【００５７】
＜異種アルブミン融合タンパク質＞
上述したＦＧＦ−２１化合物は、直接又はペプチドリンカーを介して、アルブミン又はその類似体、断片、若しくは誘導体に融合され得る。
【００５８】
一般に、本発明の融合タンパク質の一部を構成するアルブミンタンパク質は、任意の種からクローン化したアルブミンに由来する。しかしながら、ヒトにおける融合タンパク質の免疫原性の危険性を低減するために、ヒトアルブミン、並びにヒトアルブミンの断片及び類似体が好ましい。ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）は、分子量６６、５００の５８５アミノ酸からなる非グリコシル化ポリペプチド単鎖から構成される。ヒトＨＡＳのアミノ酸配列は、以下のとおりである。
【００５９】
2008506635.tif 000007
［配列番号１０］
【００６０】
［Ｍｅｌｏｕｎ等、（１９７５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ５８：１３６、Ｂｅｈｒｅｎｓ等、（１９７５）Ｆｅｄ．Ｐｒｏｃ．３４：５９１、Ｌａｗｎ等、（１９８１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ９：６１０２−６１１４、Ｍｉｎｇｈｅｔｔｉ等、（１９８６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：６７４７参照］。アルブミンの多様な多型変異体、並びに類似体及び断片が記載されている［Ｗｅｉｔｋａｍｐ等、（１９７３）Ａｎｎ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．３７：２１９参照］。例えば、欧州特許第３２２、０９４号において、発明者等はより短い多様なＨＳＡ形態を開示している。これら断片のいくつかは、ＨＳＡ（１−３７３）、ＨＳＡ（１−３８８）、ＨＳＡ（１−３８９）、ＳＡ（１−３６９）、及びＨＳＡ（１−４１９）、並びに１−３６９と１−４１９間の断片を含む。欧州特許第３９９、６６６号は、ＨＳＡ（１−１７７）及びＨＳＡ（１−２００）、並びにＨＳＡ（１−１７７）とＨＳＡ（１−２００）間の断片を含むアルブミン断片を開示している。
【００６１】
本発明の異種融合タンパク質は、断片、類似体、及び誘導体を含む任意のアルブミンタンパク質と結合したＦＧＦ−２１化合物を含むことが理解される。このような融合タンパク質は生物活性を有し、ＦＧＦ−２１化合物単独と比較して長い血中半減期を有する。したがって、融合タンパク質のアルブミン部分は、天然ヒトアルブミンのそれと等しい血中半減期を必ずしも有さない。より長い半減期を有するか、又は天然ヒトアルブミン及び関心のＦＧＦ−２１化合物の中間の半減期を有する断片、類似体、及び誘導体は周知であり、又は合成することができる。
【００６２】
本発明の異種融合タンパク質は、保存的アミノ酸置換を有するＦＧＦ−２１化合物、及び／又は、融合タンパク質のＦｃ又はアルブミン部分を有するタンパク質を包含する。「保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）」とは、アミノ酸が、同一の正味電荷と、ほぼ同一の大きさ及び形状を有する他の一アミノ酸と置き換わることを意味する。脂肪族又は置換脂肪族のアミノ酸側鎖を有するアミノ酸は、その側鎖の炭素原子及びヘテロ原子の合計数が約５個以上異ならない場合、ほぼ同一の大きさを有する。これらは、その側鎖の枝数が２個以上異ならない場合、ほぼ同一の形状を有する。その側鎖にフェニル又は置換フェニル基を有するアミノ酸は、ほぼ同一の大きさ及び形状を有すると考えられる。本願にて別に特に述べない限り、保存的置換は、天然に存在するアミノ酸によって行われることが好ましい。
【００６３】
上記に概説したように、本発明の融合タンパク質のアミノ酸置換は、例えば親水性、疎水性、電荷、大きさ等の、アミノ酸側鎖置換基の相対的な同一性に基づく置換であり得る。更に、置換は二次的な構造的性向に基づいて行われ得る。例えば、捻れたアミノ酸は、捻れ構造を保存するアミノ酸で置換され得る。本ペプチド等にサイレント変化をもたらす保存的アミノ酸変化を起こすための、前述した様々な特徴を考慮に入れた典型的な置換は、天然に存在するアミノ酸が属するクラスの他のメンバーのうちから選択されてもよい。アミノ酸は、以下の４つのグループに分割され得る：（１）酸性アミノ酸、（２）塩基性アミノ酸、（３）中性極性アミノ酸、及び（４）中性非極性アミノ酸。
【００６４】
本発明のＦＧＦ−２１化合物は、周知の任意の手段により生成及び／又は単離され得る。融合タンパク質の大きさを原因として、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）に記載されているような、組み換え法を用いることが好ましい。
【００６５】
多様なタンパク質精製法を使用することができ、そのような方法は当該技術分野にて周知であり、例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８２：８３−９（１９９０）及びＳｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ＮＹ（１９８２）に記載されている。選択される精製ステップ（一種又は複数）は、例えばＦＧＦ−２１に使用する製造工程の種類に依存するであろう。
【００６６】
野生型ヒトＩｇＧ４タンパク質は、様々なソースから得ることができる。例えば、このタンパク質は、目的ｍＲＮＡを検出可能なレベルで発現する細胞から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることが出来る。ライブラリーは、特定の目的タンパク質のために、公表されたＤＮＡ又はタンパク質配列を用いてデザインされたプローブによってスクリーニングされ得る。例えば、免疫グロブリンの軽鎖又は重鎖の定常領域は、Ａｄａｍｓ等、（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：２７１１−２７１９、Ｇｏｕｇｈｅｔ等、（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９：２７０２−２７１０、Ｄｏｌｂｙ等、（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：６０２７−６０３１、Ｒｉｃｅ等、（１９８２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７９：７８６２−７８６２、Ｆａｌｋｎｅｒ等、（１９８２）Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：２８６−２８８、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ等、（１９８４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２：２３９−２５６に記載されている。
【００６７】
選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９８９）に記載されている標準的な手法を用いて実施され得る。免疫グロブリンタンパク質をコードする遺伝子を単離する代替的な手段としては、ＰＣＲ方法体系の使用がある［Ｓａｍｂｒｏｏｋ等、前出、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ等、ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ（１９９５）］。公表された配列に基づき、ＰＣＲプライマーをデザインし得る。
【００６８】
一般に、特定のライブラリーからクローン化した完全長野生型配列は、融合タンパク質の一部であるＦＧＦ−２１化合物に対してより長い血中半減期を与える能力を保持した、本発明のＩｇＧ４  Ｆｃ類似体の断片を作成する鋳型としての役割を有し得る。ＩｇＧ４  Ｆｃ類似体の断片は、ＰＣＲ技術により、その所望の断片の末端に対応する配列にハイブリダイズするようデザインされたプライマーを用いて生成し得る。ＰＣＲプライマーはまた、発現ベクター内へのクローン化を容易にするために、制限酵素部位を形成するようデザインされ得る。
【００６９】
次いで、ＦＧＦ−２１化合物をコードするＤＮＡを、本願に記載するＩｇＧ  Ｆｃタンパク質をコードするＤＮＡにインフレームで連結して、融合タンパク質をコードする遺伝子を構成し得る。ＦＧＦ−２１化合物及びＩｇＧ４  Ｆｃ断片をコードするＤＮＡは、連結前に、又は完全融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ内でのいずれかにて突然変異させ得る。様々な突然変異誘発の技術が周知である。ＦＧＦ−２１化合物をコードする遺伝子と、ＩｇＧ４  Ｆｃ類似体タンパク質をコードする遺伝子とは、Ｇに富んだンカーペプチドをコードするＤＮＡを介して、インフレームで結合されてもよい。
【００７０】
ＦＧＦ−２１化合物は、多様な生物活性を有する。ＦＧＦ−２１は、ＮＩＤＤＭ治療法が有するような低血糖の危険性を有さないため、インスリン非依存型糖尿病（ＮＩＤＤＭ、２型）の治療法として特に期待できる。ＦＧＦ−２１は肥満症及びメタボリック症候群の治療手段としても想定される。
【００７１】
本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質の使用は、２型糖尿病、肥満症及びメタボリック症候群を治療する医薬品の製造における使用を含むことも考慮される。ＦＧＦ−２１融合タンパク質を、他の周知の修飾と組み合わせてＦＧＦ−２１の半減期を延長することによって、融合タンパク質のみ又は他の修飾方法のみと比較して更に化合物の半減期を延長し得る。
【００７２】
本願で使用されているように、用語「ＦＧＦ−２１化合物」は、本願に記載する化合物の薬剤的に許容される塩も含む。本発明のＦＧＦ−２１化合物は、十分に酸性な、十分に塩基性な、又はその両方の官能基を含むことができ、したがって多くの無機塩基、並びに無機及び有機酸のいずれとも反応して塩を形成する。
【００７３】
本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質は、非経口投与に特に適しており、また経口、鼻腔内投与、又は吸入によっても送達され得る。非経口投与は、例えば筋内、静脈内、皮下、又は腹腔内注射等による全身投与を含み得る。ＦＧＦ−２１融合タンパク質は、上述した疾病の治療のために、医薬組成物の一部としての許容可能な医薬担体、希釈剤又は賦形剤と併せて対象者に投与され得る。医薬組成物は、ＦＧＦ−２１の溶液、又は非経口的に投与される場合、懸濁液であってもよい。適切な医薬担体は、ペプチド又はペプチド誘導体と相互作用を起こさない不活性成分を含み得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ  Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡに記載されているような標準的な製剤処方技術を使用することができる。非経口投与のための適切な医薬担体は、例えば、滅菌水、生理食塩水、静菌性生理食塩水（約０．９％ｍｇ／ｍｌのベンジルアルコールを含有する生理食塩水）、リン酸緩衝生理食塩水、Ｈａｎｋ’ｓ溶液、乳酸リンゲル液及び同様物を含む。数個の適切な賦形剤の例は、乳糖、右旋糖、ショ糖、トレハロース、ソルビトール、及びマンニトールを含む。
【００７４】
本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質は、血漿濃度が延長された期間有効な範囲を維持するように、投与用に調製されてもよい。
【００７５】
ＦＧＦ−２１融合タンパク質の「治療的有効量」は、対象者に投与された際に、許容不可能な副作用を起こすことなく、所望の治療的及び／又は予防的効果を供する量を意味する。「所望の治療的効果」は、以下の１つ又は２つ以上を含む。１）疾病又は状態に関連した症状（１つ又は複数）の改善、２）疾病又は状態に関連した症状の発症の遅延、３）治療しなかった場合と比較して長い寿命、及び４）治療しなかった場合と比較して高い生活の質。例えば、２型糖尿病治療のためのＦＧＦ−２１融合タンパク質の「有効量」は、治療しなかった場合と比較して血中グルコース濃度がより良く制御され、したがって例えば網膜症、神経障害又は腎臓病のような糖尿病性合併症の発症が遅延される量を意味する。糖尿病予防のためのＦＧＦ−２１融合タンパク質の「有効量」は、予防しなかった場合と比較して、例えばスルホニル尿素、チアゾリジンジオン、インスリン及び／又はビスグアニジンのような抗血糖降下薬による治療を必要とする血中グルコース濃度上昇の開始を遅延させる量を意味する。また、対象者に投与されるＦＧＦ−２１融合タンパク質の「治療的有効量」は、疾病のタイプ及び重症度、並びに例えば全身の健康状態、年齢、性別、体重及び薬物耐性のような対象者の特質にも依存するものと思われる。
【００７６】
当業者は、良い医療行為及び個々の患者の臨床的状態から、ＦＧＦ−２１融合タンパク質を含有する治療組成物の薬剤的に有効な用量と、投与計画とを容易に最適化し得る。本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質の典型的な用量は、体重当たりで約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの範囲に亘るであろう。用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１．０ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲に亘ることが好ましい。用量は、体重当たりで約１〜５ｍｇ／ｋｇが最も好ましい。投与されるＦＧＦ−２１融合タンパク質の適切な用量は、血中グルコース濃度を低下させ、またグルコースをより速くより有効に利用することによりエネルギー消費を増大させ、したがって２型糖尿病、肥満症及びメタボリック症候群の治療に有用である。投薬の頻度は、ＦＧＦ−２１融合タンパク質の血中半減期／クリアランスにより決定される。投薬は約２日置きが好ましいと思われる。投薬は週に約２回がより好ましいと思われる。投薬は週に約１回が更に好ましいと思われる。投薬は月に約２回が最も好ましいと思われる。
【００７７】
本発明を詳細に説明してきたが、本発明は、本発明を例示するために本願に含まれ、本発明を限定することを意図しない以下の実施例によってより明確に理解されるであろう。
本願に引用する全特許文献及び刊行物は、参照することにより明白に本願に援用される。
【実施例】
【００７８】
＜製造例１＞
ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞におけるＦＧＦ−２１融合タンパク質の発現及び精製
代替的に、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞（ＥｄｇｅＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇａｉｅｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して哺乳動物細胞発現系でＦＧＦ−２１融合タンパク質を生成する。ＦＧＦ−２１融合タンパク質を、商業的に入手可能なｐＥＡＫ１０の改変を表す独自に開発した発現ベクター内の、ＭＣＳ内のＮｈｅＩとＸｂａＩ制限部位間にサブクローニングする。ＦＧＦ−２１融合タンパク質をコードするｃＤＮＡ配列をＩｇκリーダー配列と共にインフレームで融合して、組織培地内における所望の生成物の分泌を高める。発現は、強力なウイルスＣＭＶプロモーターにより駆動される。ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞を、例えばＦｕｇｅｎｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ  ＩＮ、ＵＳＡ）のような標準的なトランスフェクション試薬と、適量の組み換えプラスミドとを、単層又は懸濁培地として用いて、十分な細胞密度にて過渡的にトランスフェクトする。細胞を無血清培地内で３７℃及び５％Ｃ０２にてインキュベートし、５日間、毎日収集物を作成する。一般に、ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ懸濁培地中の発現レベルは、〜３０ｍｇ／Ｌである。哺乳動物細胞におけるＦＧＦ−２１融合タンパク質の発現では、ＨＰＩＰ、すなわちＮ末端にメチオニン残基を含まない天然Ｎ末端配列が得られる。
【００７９】
ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞からＦＧＦ−２１融合タンパク質を精製するために、濃縮した細胞培地の上清を、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した５ｍｌ  ＨｉＴｒａｐ  ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＦＦカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）にロードし、タンパク質を５０ｍＭクエン酸、ｐＨ３．３で溶出する。分画をＴｒｉｓ及び０．５Ｍ  ＮａＯＨで直ちに中性化する。分画プールをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ３０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルター装置（ＵＦＣ９０３０２４）で濃縮し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）にロードする。分画をＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析し、プールし、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ３０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルター装置で濃縮し、０．２２μｍ  ＭＩＬＬＥＸ−ＧＶフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＳＬＧＶＲ２５ＣＳ）を用いてフィルター滅菌する。２８０ｎｍ（散乱補正）における吸収により、最終濃度を測定する。ＭＡＬＤＩ及びＮ末端配列を使用してタンパク質を確認する。
【００８０】
ＨＥＫ２９３ＥＢＮＡ細胞からＦＧＦ−２１  ＨＳＡ融合タンパク質を精製するために、濃縮した細胞培地の上清を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．５で平衡化した自己充填２０ｍｌ  ＦＦ  Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムにロードする。直線勾配を設けた０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌを用いてタンパク質を溶出し、適当な分画をプールし、０．１％ＴＦＡを含むアセトニトリルを加えて最終濃度を２０％とし、０．１％ＴＦＡ水溶液で平衡化したＶｙｄａｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃ４  １０×２５０ｍｍカラム（Ｃａｔ＃２１４ＴＰ５１０）に材料をロードする。直線勾配を設けた２０〜５０％アセトニトリルを用いて、タンパク質を溶出する。分画プールをＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ３０Ｋ  Ａｍｉｃｏｎ超遠心分離フィルター装置（ＵＦＣ９０３０２４）で濃縮し、ＰＢＳ、ｐＨ７．４で平衡化した２６／６０  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）にロードする。分画をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、プールし、濃縮して、フィルター滅菌する。２８０ｎｍ（散乱補正）における吸収により、最終濃度を測定する。ＭＡＬＤＩ及びＮ末端配列を使用してタンパク質を確認する。
【００８１】
＜製造例２＞
イーストにおけるＦＧＦ−２１融合タンパク質の発現
ＦＧＦ−２１融合タンパク質を生成させる更なる別の発現系は、例えばＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ又はＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのようなイーストである。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ内で生成させるために、商業的に入手可能なシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）は、組み換えタンパク質を高いレベルで発現させる強力なＡＯＸ１（アルコールオキシダーゼ）プロモーターを伴うベクターを使用する。代替的に、高いレベルの恒常的発現のために、ＧＡＰ遺伝子（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）からのプロモーターを使用するベクターを利用することもできる。多コピーＰｉｃｈｉａ発現ベクターによって、ゲノム内に組み込まれた目的遺伝子の多コピーを伴う株を得ることができる。組み換えＰｉｃｈｉａ株内の目的遺伝子のコピー数を増大させることにより、タンパク質発現レベルを上昇させることができる。
【００８２】
＜実施例１＞
マウス３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞における糖取り込み
３Ｔ３−Ｌ１細胞をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）から入手した。ダルベッコ改変イーグル培地中に、鉄を加えた１０％ウシ胎児血清を含有する増殖培地（ＧＭ）中で細胞を培養した。標準的な脂肪細胞分化のために、細胞がコンフルエントとなった２日後（０日目と称す）に、細胞を１０％ウシ胎児血清、１０μｇ／ｍｌインスリン、１μＭデキサメタゾン、及び０．５μＭイソブチルメチルキサンチンを含有する分化培地（ＤＭ）に４８時間暴露した。次いで、細胞を１０％ウシ胎児血清、及び１０μｇ／ｍｌのインスリンを含有する後分化培地（ｐｏｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ）内で維持した。
【００８３】
（グルコース輸送アッセイ）０．１ｍＭ  ２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］糖の蓄積によりアッセイされる六炭糖取り込みを、以下のように測定した。１２ウェルプレート内の３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞を、３７℃に暖めた、０．２％ＢＳＡを含有するＫＲＰバッファー（１３６ｍＭ  ＮａＣｌ、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４、０．９ｍＭ  ＣａＣｌ２、０．９ｍＭ  ＭｇＳＯ４、ｐＨ７．４）で２回洗浄し、０．２％ＢＳＡを含有するリーボビッツＬ−１５培地中で室内空気中３７℃で２時間インキュベートし、０．２％ＢＳＡを含有するＫＲＰバッファーで再度２回洗浄し、ワートマニンの非存在下（Ｍｅ２ＳＯのみ）又は存在下で０．２％ＢＳＡを含有するＫＲＰバッファー中で、室内空気中３７℃で３０分間インキュベートした。次いでインスリンを１５分間加えて最終濃度１００ｎＭとし、２−デオキシ−Ｄ−［１４Ｃ］グルコースの取り込みを最後の４分間測定した。１０μＭサイトカラシンＢの存在下で測定した非特異的取り込みを、全部の値から減じた。タンパク質濃度をＰｉｅｒｃｅのビシンコニン酸アッセイにより決定した。各実験につき、取り込みを常規的に３回又は４回測定した。
【００８４】
生体外での効力（ＥＣ５０）を、野生型ＦＧＦ−２１の生体外での活性と比較した。本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質の生体外効力を、表１にて野生型ＦＧＦ−２１と比較した。表１に示すように、本発明のＦＧＦ−２１融合タンパク質は、野生型ＦＧＦ−２１と比較して、様々な程度で生体外効力を低下させている。しかしながら、生体外効力の低下は、ＦＧＦ−２１融合タンパク質の持続時間（血漿半減期）の延長により補償されると思われる。
【００８５】
【表１】
2008506635.tif 000008
＊ＦＧＦ−２１のＣ末端が融合タンパク質のＮ末端に融合
＊＊ＦＧＦ−２１のＣ末端がリンカーペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３を介して融合タンパク質のＮ末端に融合
＊＊＊ＦＧＦ−２１のＮ末端が（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３を介して融合タンパク質のＣ末端に融合
【００８６】
＜実施例２＞
Ｏｂ／ｏｂマウスモデルにおけるＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質の生体内での分析
Ｏｂ／ｏｂマウスモデルは、高血糖、インスリン抵抗性及び肥満症の動物モデルである。雄のｏｂ／ｏｂマウスを使用して、ＦＧＦ−２１融合タンパク質による処理後の血中グルコース濃度及びトリグリセリド濃度を、ＦＧＦ−２１単独の場合と比較して監視した。雄のｏｂ／ｏｂマウス（７週齢）の試験グループは、（１）ｓ．ｃ．ビヒクルコントロール（０．９％ＮａＣｌ、０．１ｍｌ／マウス）、７日間、（２）ＦＧＦ−２１、１１μｇ／日、７日間の連続注入（Ａｌｚｅｔ  ｐｕｍｐｓ  １００７Ｄ、１００ｍｃｌ、０．５ｍｃｌ／ｈ）、（３）ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質、２．５５ｎＭ、０日目のみ投与、（４）ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質、１．５ｎＭ、０日目のみ投与、（５）ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質、０．５ｎＭ、０日目のみ投与であった。ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質は、０．１ｍｌにてｓ．ｃ．投与された。
【００８７】
標準的なプロトコールを使用して、投薬から１時間後の血中グルコース濃度を毎日、７日間測定した。ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質の、延長された作用時間を表２に示す。０日目の単回投薬は、血中グルコース濃度を６日間低下させている。
【００８８】
【表２】
2008506635.tif 000009
＊ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質：ＦＧＦ−２１のＣ末端が、リンカーペプチドを用いずにＩｇＧ４  ＦｃのＮ末端に融合
【００８９】
別の実験では、雄のｏｂ／ｏｂマウスを使用して、リンカーペプチドと融合したＦＧＦ−２１融合タンパク質の単回処置後の血中グルコース濃度を、ＦＧＦ−２１単独の連続注入と比較して監視した。雄のｏｂ／ｏｂマウス（７週齢）の試験グループは、（１）ビヒクルコントロール（０．９％ＮａＣｌ）、７日間の連続注入（Ａｌｚｅｔ  ｐｕｍｐｓ  １００７Ｄ、１００ｍｃｌ、０．５ｍｃｌ／ｈ）、（２）ＦＧＦ−２１、３．４ｎＭ、７日間の連続注入、（３）ＦＧＦ−２１−Ｌ−Ｆｃ融合タンパク質、３．４ｎＭ、０．１ｍｌにて０日目のみｓ．ｃ．投与、（４）Ｆｃ−Ｌ−ＦＧＦ−２１融合タンパク質、３．４ｎＭ、０．１ｍｌにて０日目のみｓ．ｃ．投与、（５）ＦＧＦ−２１−Ｌ−ＨＳＡ融合タンパク質、３．４ｎＭ、０．１ｍｌにて０日目のみｓ．ｃ．投与であった。上記の融合タンパク質にて、Ｌはペプチドリンカー、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３である。
【００９０】
グループ（１）及び（２）の動物は７日間、連続注入により投薬され、グループ（３）及び（５）の動物は、０日目のみ投薬された。標準的なプロトコールを使用して、投薬から１時間後の血中グルコース濃度を毎日、７日間測定した。ＦＧＦ−２１融合タンパク質の卓越的に延長された作用時間を、表３に示す。０日目の単回投薬は、血中グルコース濃度を７日間低下させている。
【００９１】
更に、実験の７日目に、血中トリグリセリド濃度を測定した。ＦＧＦ−２１融合タンパク質の著しく延長された作用時間を、表４に示す。０日目の単回投薬は、血中トリグリセリド濃度を７日間低下させている。
【００９２】
【表３】
2008506635.tif 000010
＊ＦＧＦ−２１のＣ末端がＩｇＧ４  ＦｃのＮ末端に融合
＊＊ＩｇＧ４  ＦｃのＣ末端がＦＧＦ−２１のＮ末端に融合
＋ＦＧＦ−２１のＣ末端がＨＡＳのＮ末端に融合
【００９３】
【表４】
2008506635.tif 000011
＊ＦＧＦ−２１のＣ末端が、リンカーペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３を介して融合タンパク質のＮ末端に融合
＊＊ＦＧＦ−２１のＮ末端が、リンカーペプチド（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）３を介して融合タンパク質のＣ末端に融合
【００９４】
＜実施例３＞
ＦＧＦ−２１融合タンパク質の薬物動態学的分析
ＦＧＦ−２１融合タンパク質を、静脈内（ＩＶ）又は皮下（ＳＣ）経路で、０．４ｍｇ／ｋｇの投与量にてＣＤ−１マウスに投与した。投薬後、０〜３３６時間の様々な時間にて動物を採血した。各サンプルから血漿を収集して、ラジオイムノアッセイにより分析した。モデル依存（ＩＶデータ）法及びモデル非依存（ＳＣデータ）法（ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ  Ｐｒｏ）を使用して薬物動態学的パラメータを計算し、下の表５に示した。ＩＶ投与により、天然ＦＧＦ−２１の０．５時間の排出半減期に対して、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質は約５３．９時間の排出半減期を有した。ＳＣ投与により、天然ＦＧＦ−２１の０．６時間の排出半減期に対して、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質は約２４時間の排出半減期を有した。両方の投与経路により、ＦＧＦ−２１−Ｆｃ融合タンパク質は天然ＦＧＦ−２１と比較した場合、長期の作用時間を示した。
【００９５】
ＩＶ投与により、天然ＦＧＦ−２１の０．５時間の排出半減期に対して、ＦＧＦ−２１−ＨＳＡ融合タンパク質は約１４．３時間の排出半減期を有した。ＳＣ投与により、天然ＦＧＦ−２１の０．６時間の排出半減期に対して、ＦＧＦ−２１−ＨＳＡ融合タンパク質は約８時間の排出半減期を有した。両方の投与経路により、ＦＧＦ−２１−ＨＳＡ融合タンパク質は天然ＦＧＦ−２１と比較した場合、長期の作用時間を示した。
【００９６】
【表５】
2008506635.tif 000012
【配列表】
2008506635000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年11月10日(2006.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008506635000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月6日(2006.12.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｎ末端及びＣ末端を有する第二ポリペプチドに融合した、Ｎ末端及びＣ末端を有する第一ポリペプチドを含む異種融合タンパク質であって、
該第一ポリペプチドはＦＧＦ−２１化合物であり、
該第二ポリペプチドは、
（ａ）免疫グロブリンのＦｃ部分、
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部分の類似体、
（ｃ）免疫グロブリンのＦｃ部分の断片、
（ｄ）ヒトアルブミン、
（ｅ）ヒトアルブミンの類似体、及び
（ｆ）ヒトアルブミンの断片、
からなる群から選択され、
該第一ポリペプチドのＣ末端は、
（ｇ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９からなる群から選択されるペプチドリンカー、
（ｈ）グリシンリッチペプチド、
（ｉ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、１．５、２、３、４、５又は６である）を有するペプチド、及び
（ｊ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］３を有するペプチド、
からなる群から選択されるリンカーを介して、該第二ポリペプチドのＮ末端に融合している異種融合タンパク質。
【請求項２】
Ｎ末端及びＣ末端を有する第二ポリペプチドに融合した、Ｎ末端及びＣ末端を有する第一ポリペプチドを含む異種融合タンパク質であって、
該第一ポリペプチドはＦＧＦ−２１化合物であり、
該第二ポリペプチドは、
（ａ）免疫グロブリンのＦｃ部分、
（ｂ）免疫グロブリンのＦｃ部分の類似体、
（ｃ）免疫グロブリンのＦｃ部分の断片、
（ｄ）ヒトアルブミン、
（ｅ）ヒトアルブミンの類似体、及び
（ｆ）ヒトアルブミンの断片、
からなる群から選択され、
該第一ポリペプチドのＮ末端は、
（ｇ）配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、又は配列番号９からなる群から選択されるペプチドリンカー、
（ｈ）グリシンリッチペプチド、
（ｉ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］ｎ（式中、ｎは１、１．５、２、３、４、５又は６である）を有するペプチド、及び
（ｊ）配列［Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ］３を有するペプチド、
からなる群から選択されるリンカーを介して、該第二ポリペプチドのＣ末端に融合されている異種融合タンパク質。
【請求項３】
Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−１．５Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）、Ｌ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｎ２９７Ａ）、及びＬ１１８Ｃ／Ａ１３４Ｃ／Ｓ１６７Ａ−２Ｌ−ＩｇＧ４（Ｓ２２８Ｐ、Ｆ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、Ｎ２９７Ａ）からなる群から選択される異種融合タンパク質。
【請求項４】
（ａ）治療的有効量の請求項１〜３のいずれかに記載の異種融合タンパク質、及び
（ｂ）許容される医薬担体を含む、肥満症、２型糖尿病、又はメタボリック症候群の１又はそれ以上を発症している患者の治療に有用な医薬組成物。
【請求項５】
医薬品の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載の異種融合タンパク質の使用。
【請求項６】
肥満症、２型糖尿病、又はメタボリック症候群を治療するための医薬品の製造における、請求項１〜３のいずれかに記載の異種融合タンパク質の使用。
【国際調査報告】
2008506635.tif 000021
2008506635.tif 000022
2008506635.tif 000023
2008506635.tif 000024
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