(57)【要約】  本発明は、一般式Ｉのペプチドであって、【化１】2008503503.tif 000022ここで、Ｒ１及びＲ２は、異なるものまたは同一のものであって、水素、炭素原子数１〜１０（特に１〜３）で構成された飽和または不飽和の炭化水素成分であり、Ｚ１は、ヒスチジンまたはプロリンの成分であり、Ｚ２は、アルギニン成分、あるいは、開始がアルギニン成分であって、特に２〜３０のアミノ酸で構成されたペプチド成分または蛋白成分である、ペプチドの利用に関するものであり、ペプチドは、ショックの治療用製剤調製の際に誘導される、ヒトフィブリンのＢβ鎖（すなわち、Ｂβ１５−４２）におけるＶＥ‐カドヘリン結合モチーフと一致する生物学的特性を有する。
2008503503.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式Ｉのペプチドであって、
【化１】
2008503503.tif 000016
ここで、
Ｒ１及びＲ２は、異なるものまたは同一のものであって、水素、炭素原子数１〜１０（特に１〜３）で構成された飽和または不飽和の炭化水素成分であり、
Ｚ１は、ヒスチジンまたはプロリンの成分であり、
Ｚ２は、アルギニン成分、あるいは、開始がアルギニン成分であって、特に２〜３０のアミノ酸で構成されたペプチド成分または蛋白成分である、ペプチドの利用であって、
上記ペプチドは、ショックの治療用製剤調製の際に誘導される、ヒトフィブリンのＢβ鎖（すなわち、Ｂβ１５−４２）におけるＶＥ‐カドヘリン結合モチーフと一致する生物学的特性を有する、利用。
【請求項２】
請求項１に記載の利用であって、
上記ペプチドが一般式ＩＩ
【化２】
2008503503.tif 000017
（ここで、
Ｚ１は、ヒスチジンまたはプロリンの成分であり、
Ａｒｇはアルギニン成分であり、
Ｚ３は、プロリンまたはバリン成分であり、
Ｚ４は、ロイシンまたはバリン成分であり、
Ｚ５は、特に２〜３０のアミノ酸で構成されたペプチド成分もしくは蛋白成分、炭素原子数１〜１０（特に１〜３）で構成されたアルコール成分、または、有機もしくは無機塩基成分である）
で表されることを特徴とする、利用。
【請求項３】
請求項２に記載の利用であって、
Ｚ５がフィブリンのＡα鎖に由来するペプチド成分であることを特徴とする、利用。
【請求項４】
請求項２に記載の利用であって、
Ｚ５がフィブリンのＢβ鎖に由来するペプチド成分であることを特徴とする、利用。
【請求項５】
請求項２に記載の利用であって、
Ｚ５が、下記アミノ酸配列を含むペプチド成分であり、
【化３】
2008503503.tif 000018
Ｚ１がヒスチヂン成分であり、
Ａｒｇがアルギニン成分であり、
Ｚ３がプロリン成分であり、
Ｚ４がロイシン成分であること特徴とする、利用。
【請求項６】
請求項２に記載の利用であって、
Ｚ５が、下記アミノ酸配列を含むペプチド成分であり、
【化４】
2008503503.tif 000019
Ｚ１がプロリンの成分であり、
Ａｒｇがアルギニン成分であり、
Ｚ３がバリン成分であり、
Ｚ４がバリン成分であること特徴とする、利用。
【請求項７】
Ｎ末端が下記配列
【化５】
2008503503.tif 000020
であるペプチドの利用であって、
上記ペプチドは、ショックの治療用製剤調製の際に誘導される、ヒトフィブリンのＢβ鎖（すなわち、Ｂβ１５−４２）におけるＶＥ‐カドヘリン結合モチーフと一致する生物学的特性を有する、利用。
【請求項８】
請求項７に記載の利用であって、
上記ペプチドが、
【化６】
2008503503.tif 000021
であることを特徴とする、利用。
【請求項９】
請求項１〜８の何れかの利用であって、
ショックは、細菌毒素、播種性血管内凝固障害、壊疽性筋膜炎、ウィルス感染（特にフィロウィルス、アレナウィルス、ブニアウィルス、フラビウィルス、デング熱ウィルスにより引き起こされる）出血性ショック、病原菌または自己免疫疾患により引き起こされる急性出血性呼吸不全、器官損傷（特に、心筋梗塞、血管手術、器官クランプ、出血性ショック、肺梗塞、肝炎、腸炎、外科的処置、及び脳梗塞）後の器官障害、移植器官における器官機能障害で構成されるグループからの１つまたは１つ以上と関連性がある、利用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の背景〕
本発明は、ショックの治療用医薬品に関するものである。
【０００２】
ショックは、多くの異なる病理学的障害の深刻な合併症であり、心臓血管系が血流圧を維持できなくなるという特徴になっている。病原菌が、直接的もしくは間接的に、心臓血管系の機能停止を引き起こす。細菌、細菌毒素、ウィルス、及び、（さらに重要なことだが）不適切な細胞または（炎症及び血液凝固を含む）体液宿主の応答により、血管緊張障害、血管バリア機能障害、心筋収縮性障害、及び器官機能障害が引き起こされる。そして、これら障害の単独または組み合わせにより、ショックが起こり、結果的に患者が死ぬ。細菌感染の治療は、細菌を殺す抗生物質治療が頼りになる。しかしながら、抗生物質は毒血症を治療しないとともに、不適切な細胞または体液宿主の応答に対して正確ではない。グラム陰性菌において、リポ多糖類（ＬＰＳまたは菌体内毒素）は、グラム陰性ショックの初期に応答する。グラム陽性菌は、内毒血症ではなく、様々な器官障害及び感染性ショックを引き起こし得る。しかしながら、グラム陽性菌の細胞壁もまた、リポタイコ酸（ＬＴＡ）及びペプチドグリカン（ＰｅｐＧ）様の毒素を含んでいる。ＬＴＡ及びＰｅｐＧは、サイトカインを解除し、ｉＮＯＳを誘導する際に共同して機能する。そして、その結果、ショック及び器官障害を引き起こすことになる。
【０００３】
内毒血症、敗血症、及び感染性ショックは、大量の一酸化窒素（ＮＯ）生成に関連している。循環性ショックに関する昇圧剤による過剰な血管拡張及び血管の反応性低下は、誘導性ＮＯ合成酵素アイソフォーム（ｉＮＯＳ）の阻害剤で打ち消されうる(Southan and Szabo, Biochem Pharmacol. 1996;51:383-94, Thiemermann Gen Pharmacol 1997;29:159-66)。しかしながら、ｉＮＯＳ阻害剤は、毒素により引き起こされる器官損傷を低減させない(Wray et al. Shock 1998;9:329-335)。
【０００４】
抗ウィルス薬は、ほとんどの感染に対し有効ではないので、ウィルス感染により引き起こされるショックの治療は、より大きな課題である。病原菌を除去する目的だけの治療は、病原菌に起因するショックの患者には不十分である。なぜなら、この病原菌により誘導される二次的事象には、炎症反応及び凝固系の異変が含まれており、これら二次的事象は、独立しているとともに、原因となる病原菌が死滅したか否かに関わらず、患者を死に至らせるかもしれないからである。特定の治療は有効ではない。それゆえ、現行の処置は、症状を軽減することを目的としており、機械的人工換気、補液、心臓作用薬の利用、並びに酸素飽和度、ヘモグロビン、グルコース、及び肝臓機能の厳密な制御が含まれる。例えば、大量のステロイド投与、または抗トロンビンによる凝固阻害により、炎症反応を制御するだけでは、生存率を向上させない。これまでに、死亡率低下に顕著な効果を示すことが実証されている分子は、活性蛋白Ｃ’のみである。活性蛋白Ｃ’は、凝固／フィブリン溶解、及び炎症過程と相互に影響し合う。
【０００５】
感染過程中のショックは、ほとんど、フィブリン形成及び断片化フィブリン産生に付随する血漿フィブリノゲンの顕在的または非顕在的な変化に関連する。フィブリン溶解経路と同様に、この凝固の活性化は、結果として、顕在的または非顕在的な播種性血管内凝固症候群（ＤＩＣ）を引き起こす。播種性血管内凝固症候群の結果、血管閉塞及び器官末端障害が起こり、その結果、凝固因子の消耗により出血が起きる。敗血症は、ＤＩＣの最も共通した原因になっている。重要なのは、フィブリノゲン、フィブリン、及び断片化フィブリンは、血液凝固の役割を果たすだけでなく、細胞及び細胞外マトリックスの蛋白と結合するいくつかの部位を有することである。この結合部位により、フィブリノゲン、フィブリン、及び断片化フィブリンは、白血球、血小板、内皮細胞、及び細胞外マトリックス構造と相互作用する。これにより、細胞活性、細胞移動、サイトカイン解除が起こり、終には、炎症反応が起きる。炎症におけるフィブリノゲンまたはフィブリンの役割は、十分に記載されている(Altieri Thromb Haemost 82:781-786; Herrick et al. Int J Biochem Cell Biol 31:741-46)。また、この分子のＤ領域には、マトリックス蛋白、内皮細胞、血小板、及び凝固細胞と結合する多くの部位が含まれている。フィブリンのＥ領域はＣＤ１１ｃと結合する(Loike et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:1044-48)。
【０００６】
我々は、最近、凝固におけるフィブリンＢβ１５−４２配列の新規の役割を記述した（ＷＯ０２／４８１８０）。この配列は、フィブリンのＥ領域に存在し、フィブリノペプチドが切断されたときにのみ活性化する。断片化フィブリンは、β鎖のフリーのＮ末端に、この配列を含み、内皮と結合し、凝固を引き起こす。そして、フィブリンのＢβ鎖１５−４２のアミノ酸と整合するペプチドは、内皮表面と断片化フィブリンとの結合をブロックし、試験管内で血液凝固をブロックする（ＷＯ０２／４８１８０）。細胞内では、このペプチドは、心筋炎症を妨げ、虚血／再灌流の状況で、心筋梗塞の規模を低減する（ＷＯ０２／４８１８０）。
【０００７】
フィブリン断片化は、フィブリン形成障害及びフィブリン溶解障害のいかなる状況でも起きる。特に、病原菌に起因するショックの状況下では、この異常なフィブリン形成及びフィブリン溶解が主な問題となる。多くの疾患（例えばデング熱）での、フィブリン形成／フィブリン溶解における成果と欠陥との直接的な関連が記載されている(van Gorp et al. J Med Virol 2002, 67:549-54, Mairuhu et al. Lancet Inf Dis 2003; 3:33-41)。成人呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）は、病勢の盛んな血管外フィブリン沈着という特徴を有する急性肺障害の一型である(Idell Am J Respir Med. 2002; 1:383-91)。肺血管及び播種性血管内凝固症候群における血栓症が、ＡＲＤＳとともに観察された。
【０００８】
主な公衆衛生問題としての、デング熱（ＤＦ）及び出血性デング熱（ＨＤＦ）の持続／大域的な発生の理由は、複雑である。保菌生物を制御する措置は、ＤＦ／ＨＤＦを排除するのに成功していない。最近、公的セクタがデング熱研究のために資金捻出する（２００１年では、見積もりで１億５０００万ＵＳドル）主な焦点は、分子疫学、免疫病理生理学、第二世代ワクチン検索研究、及び、保菌生物制御に関する新規のあるいは向上した方法である。
【０００９】
ＵＳＡ及びタイでは、いくつかの候補となるワクチンについて、臨床試験が行われている。しかしながら、感染患者を治療するための薬剤が、市場に出ていない。さらに悪いことに、商業化学療法の研究開発が活発化していないようである。世界保健機構は、ＤＦ／ＨＤＦと戦うための戦略的意思決定を発表した。この意思決定には、最優先の目的として、プロテアーゼまたは他の研究が進んでいない酵素に有向する抗ウィルス薬の開発、血管透過性増大または止血異常の原因に有向する抗媒介物質の開発が含まれる。
【００１０】
〔発明の概要〕
本発明は、一般式Ｉのペプチドの利用に関するものである。
【００１１】
【化１】
2008503503.tif 000003
【００１２】
ここで、Ｒ１及びＲ２は、異なるものまたは同一のものであって、水素、炭素原子数１〜１０（特に１〜３）で構成された飽和または不飽和の炭化水素成分であり、
Ｚ１は、ヒスチジンまたはプロリンの成分であり、
Ｚ２は、アルギニン成分、あるいは、開始がアルギニン成分であって、特に２〜３０のアミノ酸で構成されたペプチド成分または蛋白成分であり、
上記ペプチドは、ショックの治療用製剤調製の際に誘導される、ヒトフィブリンのＢβ鎖（すなわち、Ｂβ１５−４２）におけるＶＥ‐カドヘリン結合モチーフと一致する生物学的特性を有する。
【００１３】
また、一般式ＩＩのペプチド、
【００１４】
【化２】
2008503503.tif 000004
【００１５】
を利用することが好ましい。ここで、
Ｚ１は、ヒスチジンまたはプロリンの成分であり、
Ａｒｇはアルギニン成分であり、
Ｚ３は、プロリンまたはバリン成分であり、
Ｚ４は、ロイシンまたはバリン成分であり、
Ｚ５は、特に２〜３０のアミノ酸で構成されたペプチド成分もしくは蛋白成分、炭素原子数１〜１０（特に１〜３）で構成されたアルコール成分、または、有機もしくは無機塩基成分である。
【００１６】
さらに、Ｚ５がフィブリンのＡα鎖またはＢβ鎖に由来するペプチド成分である、ペプチドを利用することが好ましい。
【００１７】
さらに、Ｚ５が、下記アミノ酸配列を含むペプチド成分であり、
【００１８】
【化３】
2008503503.tif 000005
【００１９】
Ｚ１がヒスチヂン成分であり、
Ａｒｇがアルギニン成分であり、
Ｚ３がプロリン成分であり、
Ｚ４がロイシン成分である、ペプチドを利用することが好ましい。
【００２０】
さらに、Ｚ５が、下記アミノ酸配列を含むペプチド成分であり、
【００２１】
【化４】
2008503503.tif 000006
【００２２】
Ｚ１がプロリンの成分であり、
Ａｒｇがアルギニン成分であり、
Ｚ３がバリン成分であり、
Ｚ４がバリン成分である、ペプチドを利用することが好ましい。
【００２３】
また、本発明は、Ｎ末端が下記配列であるペプチドの利用に関するものである。
【００２４】
【化５】
2008503503.tif 000007
【００２５】
上記ペプチドは、ショックの治療用製剤調製の際に誘導される、ヒトフィブリンのＢβ鎖（すなわち、Ｂβ１５−４２）におけるＶＥ‐カドヘリン結合モチーフと一致する生物学的特性を有する。
【００２６】
本発明の利用のさらに好ましい形態は、上記ペプチドが、
【００２７】
【化６】
2008503503.tif 000008
【００２８】
であることを特徴とするものである。
【００２９】
特にショック条件は、上述のペプチドで治療可能になることが示された。ここで、ショックは、細菌毒素、播種性血管内凝固障害、壊疽性筋膜炎、ウィルス感染（特にフィロウィルス、アレナウィルス、ブニアウィルス、フラビウィルス、デング熱ウィルスにより引き起こされる）出血性ショック、病原菌または自己免疫疾患により引き起こされる急性出血性呼吸不全、器官損傷（特に、心筋梗塞、血管手術、器官クランプ、出血性ショック、肺梗塞、肝炎、腸炎、外科的処置、及び脳梗塞）後の器官障害、移植器官における器官機能障害で構成されるグループからの１つまたは１つ以上と関連性がある。
【００３０】
〔発明の詳細な説明〕
ペプチド及び蛋白
ペプチドは、固相ペプチド合成により製造され、ヌクレオシル１００‐１０Ｃ１８カラム(PiChem, Graz, Austria)を用いた逆相ＨＰＬＣにより精製される。なお、β１５−１４領域は、保存アミノ酸置換を考慮すると、生物種間で１００％の類似性がある。Ａα１−５１、βＢ１−１１８、及びγ１−７８からなる、フィブリノゲンのＮ末端ジスルフィドノット（ＮＤＳＫ）は、以前の記載（ＷＯ０２／４８１８０）に基づいて調製された。フィブリンのＮ末端ジスルフィドノット（ＮＤＳＫ‐ＩＩ，フィブリノペプチドＡ及びＢが欠けている）は、ＮＤＳＫをトロンビン（１Ｕ／１ｍｇＮＤＳＫ）で、３７℃３時間処理することにより調製された。そして、未処理のトロンビンは、１０ｍＭディスプロピルフルオロリン酸塩(Fluka, Milwaukee, WI)により、３７℃２時間中和した。そして、全ての生成物は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で透析された。
【００３１】
ＥＬＩＳＡ
ペプチドＢβ１５−４２は、ＶＥカドヘリンと結合する。
【００３２】
フィブリンのＢβ鎖（Ｂβ１５−４２）が内皮細胞と相互作用することにより、形態変化(Bunce et al. J Clin Invest 89:842-50; Bach et al. Exp Cell Res 238:324-34; Chalupowicz et al. J Cell Biol 130:207-15; Hamaguchi et al. Blood 81:2348-56; Francis et al. Blood cells 19:291-306) 、増殖 (Sporn et al. Blood 86:1802-10) 、フォンヴィレブランド因子 (Ribes et al. J Clin Invest 79:117-23, Ribes et al. J Clin Invest 84:435-42; Erban and Wagner, J Biol Chem 267, 2451-58) 及びＩＬ−８（可能性として） (Qi et al. Blood 90:3593-3602) の解除、及び、ＣＤ５４の膜発現 (Harly et al. Art Thromb Vasc Biol 20:652-658) が起きる。ＶＥカドヘリンは、配列Ｂβ１５−４２と結合するリガンドとして同定されたものである。そして、ＥＬＩＳＡが開発され、フィブリンまたは断片化フィブリンによる、この内皮細胞及び／またはＶＥカドヘリンの相互作用が実証された。Martinezらは、抗パンカドヘリン抗体を用いて、フィブリンと一緒に培養した後の内皮細胞からカドヘリンを捕捉した(Martinez et al. Ann NY Acad Sci 936:386-405)。放射性標識した断片化フィブリンまたはペプチドＢβ１５−４２に、ＨＵＶＥＣ単一層（ＶＥカドヘリンを発現する）が被せられた(Bach et al. J Biol Chem 273:30719-28; Harley et al. Art Thromb Vasc Biol 20:652-658)。遺伝子組み換えＶＥカドヘリンが、Gorlatov 及びMedvedにより用いられた(Biochemistry 41:4107-16)。そして、さらに他の人達が、ＥＬＩＳＡを用いて、血液中の断片化フィブリンを検出した。そして、ほとんどの場合、Ｂβ１５−４２モチーフに対する抗体を含み、フィブリノゲン分子内の識別可能な配列に対する抗体を用いていた(Fareed et al. Clin Chem 8:1845-53総説)。
【００３３】
我々は、他の人達により述べられたものと同一の原理で働く改変型ＥＬＩＳＡを開発した。しかしながら、ここに記載されたＥＬＩＳＡの目的は、フィブリン断片化産物を定量することではなく、Ｂβ１５−４２配列とＶＥカドヘリンとの結合に介在する蛋白、ペプチド、または化合物を探索することである。切端型蛋白、全長蛋白、またはＢβ１５−４２結合部位を妨げない他の蛋白が結合した蛋白、としてのＶＥカドヘリンが、フィブリンのＢβ１５−４２配列と相互作用することが認められることを原理としている。この系では、付加的に他の物質を導入し、この物質がＶＥカドヘリン／Ｂβ１５−４２結合を阻害するか否かを測定することができる。
【００３４】
具体的には、９６ウェル蛋白固定板(Exiqon, Vedbaek, DK)に、ＰＢＳに入っている遺伝子組み換えヒトＶＥカドヘリンＦＣ融合蛋白(8nM/ml; R&D System, Minneapolis)を被覆し、４℃で一晩放置した。そして、この板を洗浄し、Ｃ末端にFLAG配列(DYKDDDDK)をタグ付けしたペプチドＢβ１５−４２(GHRPLDKKREEAPSLRPAPPPISGGGYR)、またはFRAGタグ付けされたランダムペプチド(DRGAPAHRPPRGPISGRSTPEKEKLLPG)とともに、０−８０μMolでインキュベートした。洗浄後、結合したFRAGタグペプチドを、ペルオキシダーゼ標識の抗FRAG抗体(Sigma, St. Louis, USA)及び発色基質とインキュベートすることにより検出した。ＥＬＩＳＡ板読み取り装置により、波長４５０ｎｍでの光学密度を決定した。データは、３つの独立した実験（各実験は３組で行われた）の平均値を表している。下表から、ペプチドＢβ１５−４２は、濃度に依存して、ＶＥカドヘリンと結合していることがわかる。一方、ランダムペプチドは顕著な結合を示さなかった。
【００３５】
【表１】
2008503503.tif 000009
【００３６】
ペプチドＢβ１５−４２と断片化フィブリンとは、ＶＥカドヘリンとの結合において、競合する。
【００３７】
次の段階では、我々は、このＥＬＩＳＡを利用し、Ｂβ１５−４２配列及びＶＥカドヘリンの結合と競合する他のペプチド／化合物をスクリーニングできるか否かを分析した。予想どおり、ペプチドＢβ１５−４２（ポジティブコントロールとして用いられた）は、FRAGタグペプチドＢβ１５−４２の結合を完全に阻害した。ランダムペプチドまたは溶媒（ネガティブコントロールとして用いられた）は、全く影響がなかった。さらに短いペプチドは、Ｂβ１５−４２とＶＥカドヘリンとの結合を部分的に阻害していた。ＮＤＳＫ−ＩＩは、Ｂβ１５−４２の濃度依存的な結合を阻害していた。モル比が２４：１で、Ｂβ１５−４２とＮＤＳＫ−ＩＩ（５０％阻害）との間が平衡状態に達していた。
【００３８】
上記プラスチック表面に、８ｎＭの濃度で、ＶＥカドヘリンを被覆した。そして、示されたペプチドを２００μＭの濃度で添加し、ＮＤＳＫまたはＮＤＳＫ−ＩＩを示された濃度で添加した。FLAGタグＢβ１５−４２（１２μＭ）の結合の検出は、上述のように行った。
【００３９】
【表２】
2008503503.tif 000010
【００４０】
デングウィルス感染マウス治療におけるペプチドＢβ１５−４２の有効性
材料及び方法
ウィルス  デングウィルス２型（ＤＥＮ−２）であるＰ２３０８５株は、ステイトコレクションオブウィルス、モスクワ、ロシアから、感染ＩＣＲマウス脳を凍結乾燥した懸濁物質の形で得られた。得られたデングウィルスは、先の記載のように、乳飲みＩＣＲマウスの脳に感染させた(Atrasheuskaya et al. FEMS Immunology and Medical Microbiology. 35, 33-423)。１０％の脳懸濁物質をウィルスストックとし、−４０℃で保管した。ウィルス力価は、脳懸濁物質の連続希釈法により決定した。脳懸濁物質を、１０マウス（４週齢ＢＡＬＢ／ｃ）それぞれのグループに腹腔内接種し、死亡率を記録した。ウィルス力価は、計算され、７．４  ｌｇＬＤ５０／ｍｌであった。感染ウィルスを用いた全作業は、最大封じ込め生物学的安全レベル３（ＢＳＬ−３）のＳＲＣ  ＶＢ「ベクター」（ロシア）の実験室内で行われた。
【００４１】
動物
４週齢、同系雄ＢＡＬＢ／ｃマウス（ハプロタイプＨ−２ｄ）は、ステイトリサーチセンターオブヴィロロジーアンドバイオテクノロジー「ベクター」の動物施設より受け取った。動物は、適宜、食料及び水とともに、独立したケージに置かれた。
【００４２】
検定法
メトキシフルラン麻酔下のマウスの眼窩腔から、感染前及びＤＥＮ−２試験後の血液を採取した。各時点のために３つのマウスを使用し、血液を揃えた。
【００４３】
セル−ダイン９００ヘマトロジーアナライザー(Sequoia-Tumer corporation, USA,CA)を用いて、循環血小板（ＰＬＴ）、赤血球（ＲＢＣ）、白血球（ＷＳＣ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、及び、赤血球容積率（ＨＣＴ）を決定した。
【００４４】
血清を得るために、揃えた血液の一部分を遠心分離し、実験終了まで−８０℃で保管した。Ｒ＆Ｄシステム製の酵素免疫アッセイキットを製造社の取扱説明書に基づいて使用し、サイトカインの血清レベルを測定した。検出レベルは、次の通りである。ＴＮＦ−α、５．１ｐｇ／ｍｌ未満、インターロイキン（ＩＬ）−１β、３．０ｐｇ／ｍｌ未満；ＩＬ−６、３．１ｐｇ／ｍｌ未満；ＩＦＮγ、２０ｐｇ／ｍｌ未満。
【００４５】
動物血液中のデングウィルスは、先の記載のように、ＲＴ−ＰＣＲにより同定された(Harris et al. J. Clin. Microbiol. 36, 2634-2639)。血液の全ＲＮＡは、キアゲン（ドイツ）からのキットを用いて回収された。プライマーは、次の通りである。すなわち、上流プライマーを、5’AATATGCTGAAACGCGAGAGAAACCG（位置１３６−１６１）とし、下流プライマーを、5’AAGGAACGCCACCAAGGCCATG（位置２３７−２５８）として、１１９ｂｐの産物を増幅した。ウィルスロードを定量するために、先の記載のように、ＤＥＮ−２をベローＥ６細胞の培養液に滴下した(Harris et al. J. Clin. Microbiol. 36, 2634-2639)。誘発試験後０日及び２２日に、生存マウスの血液における抗ＤＥＮ−２抗体を、先の記載のように、ＥＬＩＳＡにより分析した(Ignatyev et al. J. Biotechnology. 44, 111-118)。
【００４６】
実験設計
同系４週齢雄ＢＡＬＢ／ｃマウスは、６つの主グループに分配された。各グループには、５０のマウスが含まれる。そして、全ての動物の腹腔内に、マウス用に調整された（上述の）ＤＥＮ−２株２３０８５を、投与量１ＬＤ５０で感染させた。そして、病的状態の兆候を毎日観察した。全ての主グループ（Ａ１−Ｆ１）のうち第１サブグループのマウスを、死亡率のコントロールとして用いた。各サブグループには、２０のマウスが含まれている。第２サブグループ（Ａ２−Ｆ２）の動物を、血清試料を得るのに用いた。各サブグループには、３０のマウスが含まれている。
【００４７】
グループの説明，各グループについてｎ＝５０
コントロールグループは、ウィルスのみを接種している。
【００４８】
ペプチドＢβ１５−４２による治療は、感染後３日目から感染後８日目まで、それぞれ４８００μｇ／ｋｇを腹腔注射して、１日に２回行われた。誘発試験後１日目、３日目、５日目、７日目、１１日目、２２日目の選択された時点に、血液及び血清試料を取得した。
【００４９】
学生によるカイ２乗検定により、統計学的な分析を行った。Ｐ値＜０．０５が有意であるとみなされる。
【００５０】
【表３】
2008503503.tif 000011
【００５１】
グラム陰性ショック
体重２３０−２８０ｇのウィスターラット（雄）は、チアバースチサンラゲ(Tierversuchsanlage)（デュッセルドルフ大学）に保管されており、適宜、水を加え、標準の規定食で飼育されている。全ての処置は、ＡＡＡＬＡＣガイドライン及び「ガイドフォーザケアーアンドユースオブラボラトリーアニマル」(Department of Health and Human Service, National Institutes of Health, Publication No.86-23)に基づいて行われた。さらに、全ての実験は、デュッセルドルフ大学及びその国の倫理研究委員会により承認されている。先の記載(Zacharowski et al. Crit Care Med 2000, Zacharowski et al. Crit Care Med 2001; 29:1599-1608) のように、チオペンタールナトリウム（１２０ｍｇ／ｋｇ腹腔内）により、ラットを麻酔し、チオペンタールナトリウムを必要量補充することで、麻酔を維持した。
【００５２】
気管にカニューレを挿入し呼吸を確保し、断熱材で直腸温度を３７℃に維持した。右頸動脈にカテーテルを挿入し、圧力変換器に連結させた。そして、ＩＢＭコンピュータにインストールされたデータ収集システム(MacLab 8e, ADI Instrument, Germany)に示された動脈圧（ＭＡＰ）及び心拍数（ＨＲ）の位相平均を測定した。右頸静脈にカテーテルを挿入し、薬剤を投与した。膀胱にもカテーテルを挿入し、尿流を確保し、腎臓障害後の発生を妨げている。実験中、全ての動物について、１．０ｍｌ／ｋｇ／ｈ（０．９％塩素酸ナトリウム、生理食塩水，頸静脈に静脈注射して）補液を行った。外科処置完了後に、心臓血管に関するパラメーターを１５分間安定させ、６時間絶えず記録した。ＬＰＳ誘導される多くの器官障害のモデルでは、必ず６時間の間に、ＡＳＴ及びＡＬＴの血清レベルの顕著な上昇が起きる。一方、尿素及びクレアチニンの血清レベルの顕著な上昇は、２時間後にすでに観察される。
【００５３】
以下３グループについて研究した。
偽手術が施されているラット（ｓｈａｍ），
グラム陰性ショックが施されているラット（大腸菌(E.coli)からのリポ多糖類、及び血清型０．１２７：Ｂ８（６ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を５分間腹腔内に接種させた。１時間後、生理食塩水（２．４ｍｌ／ｋｇ）：（ＬＰＳ＋生理食塩水）を接種させた。）
グラム陰性ショックが施されているラット（大腸菌(E.coli)からのリポ多糖類、及び血清型０．１２７：Ｂ８（６ｍｇ／ｋｇ腹腔内）を５分間腹腔内に接種させた。１時間後、Ｂβ１５−４２（２．４ｍｌ／ｋｇ）：（ＬＰＳ＋Ｂβ１５−４２）を接種させた。）
【００５４】
【表４】
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【００５５】
グラム陰性ショック誘導６時間後に、右頸動脈に配置したカテーテルから血液を採取した。血液試料を遠心分離（室温で３分間、１６１０×ｇ）し、血漿を分離した。多くの器官の障害／機能障害の生物学的表示値として、血漿中の次のマーカー酵素を測定した。
【００５６】
肝臓障害は、アスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＬＴ、肝臓柔細胞障害に対する特異マーカー）、及びアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ、肝臓障害に対する非特異マーカー）の血漿レベルの上昇を測定することにより、評価した。
【００５７】
腎臓障害は、尿素（腎臓及び／または異化作用の排出機能障害に関する表示値）及びクレアチニン（腎糸球体の濾過作用低下、ここでは腎臓機能障害の表示値）の血漿レベルの上昇を測定することにより、評価した。膵臓の機能及び障害の間接的マーカーとして、血漿レベルのグルコース及びアミロースを測定した。
【００５８】
さらに、肺機能／障害の間接的マーカーとして、動脈の酸素濃度を測定した（実験室レベルの値）。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
【表６】
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【００６１】
実験が完了するまで、全てのグループについて、器官（肺、肝臓、心臓、及び腎臓）組織の検査を行った。この組織をフォルムアルデヒド緩衝液（リン酸緩衝生理食塩水中で４％）で室温固定し、ウィーンに送った。標準的なＨ＆Ｅ組織染色では、差異が見られなかった。しかしながら、酸性フクシン（オレンジＧ）を用いた、フィブリントロンビン付着の組織染色では、ＬＰＳ＋Ｂβ１５−４２（ｐ＜０．０５）で治療した動物と比較して、ＬＰＳのみを接種したコントロールが、フィブリン数が顕著に増加していることが観察された。偽手術した動物では、フィブリントロンビンがなかった。
【００６２】
【表７】
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【国際調査報告】
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