(57)【要約】  本発明は、ヒト・リボヌクレアーゼ１（ＲＮａｓｅ１）ｈＲＩ錯体の３次元（３−Ｄ）原子構造により規定されたＲＮａｓｅ１とヒト・リボヌクレアーゼ阻害剤（ｈＲＩ）との間の相互作用の分析により確認したヒト・リボヌクレアーゼ１の細胞傷害性変異株に関する。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の３次元構造及びＲＮａｓｅ１変異株をデザインする方法も開示されている。
2008546391.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト・リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  １）の生来の配列から少なくとも２つのアミノ酸変化を含む、ヒト・リボヌクレアーゼの遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ変異株であって、前記変化が、静電反発を介したヒト・リボヌクレアーゼによるヒト・リボヌクレアーゼ阻害剤（ｈＲＩ：ｈｕｍａｎ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）の回避を生じ、前記第１の変化が、ヒト・リボヌクレアーゼの８５〜９４のアミノ酸残基の領域におけるアミノ酸置換であり、前記第２の変化が、ヒト・リボヌクレアーゼのアミノ酸残基４、７、１１、３１、３２、３８、３９、４１、４２、６６、６７、７１、１１１及び１１８からなる群から選択された位置における変質、置換又はアミノ酸交換であり、前記変異型のヒト・リボヌクレアーゼが、生来のヒト・リボヌクレアーゼに比べて高い細胞傷害活性を示す、遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ変異株。
【請求項２】
生来の配列である、配列番号２に関連して静電反発を介してリボヌクレアーゼ１によりヒト・リボヌクレアーゼ阻害剤（ｈＲＩ）の回避を生じる残基４、３８、３９、６７、８８、８９、９１及び１１８におけるアミノ酸変化を含むヒト・リボヌクレアーゼ変異株であって、前記変異型リボヌクレアーゼ１が、その生来のリボ核酸分解活性を維持し、前記生来のリボヌクレアーゼ１よりもＲＩに対して低い結合親和性を有し、前記生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、ヒト・リボヌクレアーゼ変異株。
【請求項３】
変異株が、Ｒ４Ｃ／Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｌ／Ｇ８９Ｒ／Ｒ９１Ｇ／Ｖ１１８Ｃである、請求項２に記載の変異株。
【請求項４】
生来の配列である、配列番号２に関連して残基３９、６７、８８、８９及び９１におけるアミノ酸変化を含むヒト・リボヌクレアーゼ変異株であって、前記変異型リボヌクレアーゼ１が、その生来のリボ核酸分解活性を維持し、前記生来のリボヌクレアーゼ１よりもＲＩに対して低い結合親和性を有し、前記生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、ヒト・リボヌクレアーゼ変異株。
【請求項５】
変異株が、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄである、請求項４に記載の変異株。
【請求項６】
変異株が、Ｒ３９Ｌ／Ｎ６７Ｌ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｌ／Ｒ９１Ｌである、請求項４に記載の変異株。
【請求項７】
生来の配列である、配列番号２に関連して残基３９、６７、８９及び９１におけるアミノ酸変化を含むヒト・リボヌクレアーゼ変異株であって、前記変異型リボヌクレアーゼ１が、その生来のリボ核酸分解活性を維持し、前記生来のリボヌクレアーゼ１よりもＲＩに対して低い結合親和性を有し、前記生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、ヒト・リボヌクレアーゼ変異株。
【請求項８】
変異株がＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄである、請求項７に記載の変異株。
【請求項９】
生来の配列である、配列番号２に関連して残基３９、６７、８８及び９１におけるアミノ酸変化を含むヒト・リボヌクレアーゼ変異株であって、前記変異型リボヌクレアーゼ１が、その生来のリボ核酸分解活性を維持し、前記生来のリボヌクレアーゼ１よりもＲＩに対して低い結合親和性を有し、前記生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、ヒト・リボヌクレアーゼ変異株。
【請求項１０】
変異株が、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｒ９１Ｄである、請求項９に記載の変異株。
【請求項１１】
生来の配列である、配列番号２に関連して残基３９、６７、８８及び８９におけるアミノ酸変化を含むヒト・リボヌクレアーゼ変異株であって、前記変異型リボヌクレアーゼ１が、その生来のリボ核酸分解活性を維持し、前記生来のリボヌクレアーゼ１よりもＲＩに対して低い結合親和性を有し、前記生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、ヒト・リボヌクレアーゼ変異株。
【請求項１２】
変異株が、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄである、請求項１１に記載の変異株。
【請求項１３】
生来の配列である、配列番号２に関連して残基３９、８８、８９及び９１におけるアミノ酸変化を含むヒト・リボヌクレアーゼ変異株であって、前記変異型リボヌクレアーゼ１が、その生来のリボ核酸分解活性を維持し、前記生来のリボヌクレアーゼ１よりもＲＩに対して低い結合親和性を有し、前記生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、ヒト・リボヌクレアーゼ変異株。
【請求項１４】
変異株が、Ｒ３９Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄである、請求項１３に記載の変異株。
【請求項１５】
生来の配列である、配列番号２に関連して残基３８、３９、６７及び８８におけるアミノ酸変化を含むヒト・リボヌクレアーゼ変異株であって、前記変異型リボヌクレアーゼ１が、その生来のリボ核酸分解活性を維持し、前記生来のリボヌクレアーゼ１よりもＲＩに対して低い結合親和性を有し、前記生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、ヒト・リボヌクレアーゼ変異株。
【請求項１６】
変異株が、Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｒである、請求項１５に記載の変異株。
【請求項１７】
生来の配列である、配列番号２に関連して残基６７、８８、８９及び９１におけるアミノ酸変化を含むヒト・リボヌクレアーゼ変異株であって、前記変異型リボヌクレアーゼ１が、その生来のリボ核酸分解活性を維持し、前記生来のリボヌクレアーゼ１よりもＲＩに対して低い結合親和性を有し、前記生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、ヒト・リボヌクレアーゼ変異株。
【請求項１８】
変異株が、Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄである、請求項１７に記載の変異株。
【請求項１９】
ヒト・リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  １）の生来の配列から少なくとも２つのアミノ酸変化を含む、ヒト・リボヌクレアーゼの遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ変異株であって、前記変化が、静電反発を介したヒト・リボヌクレアーゼ１によるヒト・リボヌクレアーゼ阻害剤（ｈＲＩ）の回避を生じ、前記第１の変化が、ヒト・リボヌクレアーゼ１のアミノ酸残基９１におけるアミノ酸置換であり、前記第２の変化が、ヒト・リボヌクレアーゼのアミノ酸残基４、７、１１、３１、３２、３８、３９、４１、４２、６６、６７、７１、１１１及び１１８からなる群から選択された位置における変質、置換又はアミノ酸交換であり、前記変異型ヒト・リボヌクレアーゼ１が、生来のヒト・リボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ変異株。
【請求項２０】
ヒト・リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  １）の生来の配列から少なくとも２つのアミノ酸変化を含む、ヒト・リボヌクレアーゼの遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ変異株であって、前記変化が、静電反発を介したヒト・リボヌクレアーゼ１によるヒト・リボヌクレアーゼ阻害剤（ｈＲＩ）の回避を生じ、前記第１の変化が、ヒト・リボヌクレアーゼ１のアミノ酸残基８８におけるアミノ酸置換であり、前記第２の変化が、リボヌクレアーゼ１のアミノ酸残基４、７、１１、３１、３２、３８、３９、４１、４２、６６、６７、７１、１１１及び１１８からなる群から選択された位置における変質、置換又はアミノ酸交換であり、前記変異型リボヌクレアーゼ１が、生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ変異株。
【請求項２１】
細胞傷害性リボヌクレアーゼ１１変異株を作るためにヒト・リボヌクレアーゼ１（ＲＮａｓｅ  １）を修飾する方法であって、前記方法が
ｈＲＩ・リボヌクレアーゼ１錯体の３次元構造において静電アンカー残基を識別する工程と、
静電反発を介してｈＲＩへの結合を抑制するためにリボヌクレアーゼ１において識別された前記アンカー残基を修飾する工程を含み、前記変異株が、生来のリボ核酸分解活性を維持し、前記生来のリボヌクレアーゼ１よりもｈＲＩに対して低い結合親和性を有し、前記生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、ヒト・リボヌクレアーゼ１を修飾する方法。
【請求項２２】
変異型ヒト・リボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  １）の有効量を細胞に供給することを含む、癌細胞の増殖を阻害する方法であって、前記変異型リボヌクレアーゼ１が、生来のリボ核酸分解活性を維持し、前記生来のリボヌクレアーゼ１よりもＲＩに対して低い結合親和性を有し、前記生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す、癌細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２３】
プロテインデータバンク識別番号１Ｚ７Ｘにより規定された、ｈＲＩ・リボヌクレアーゼ１錯体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の説明
本出願は、２００５年６月１６日に出願された米国特許仮出願第６０／６９１，３１１号の利益を主張している。本出願は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０００２】
連邦政府が後援した研究又は開発に関する説明
本発明は、政府機関である国立衛生研究所（ＮＩＨ：ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）により授与された連邦政府の支援、即ち助成金ＣＡ０７３８０８及びたんぱく質構造イニシアチブＰ５０ＧＭ−６４５９８によりなされた。連邦政府は本発明において一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
リボヌクレアーゼは、ＲＮＡの分解を触媒する酵素である。十分に研究されたリボヌクレアーゼは、ウシのリボヌクレアーゼＡ（ＲＮａｓｅ  Ａ）であり、このリボヌクレアーゼＡの生物学的推定機能は、反すう消化器内に蓄積されている大量のＲＮＡを分解することである。ＲＮａｓｅ  Ａスーパーファミリーは、ＲＮａｓｅ  Ａと同族の酵素として分類された一群のＲＮａｓｅ酵素である。このスーパーファミリーは、抗増殖性、細胞傷害性、胚毒性、精子不形成性、及び抗腫瘍性などの諸活性を含む多数の興味深い生物学的特性を有する。このファミリーの１メンバーは、もともと卵母細胞及びノーザン・ヒョウガエルラナ・ピピーンズ（Ｒａｎａ  ｐｉｐｉｅｎｓ）の初期の胚から単離されたリボヌクレアーゼＡの同族体である。
【０００４】
このカエル（ラナ・ピピーンズ）リボヌクレアーゼは、ヒトの細胞内に置かれた場合、ＲＩにより強力に抑制されることはなく、そのＲＮａｓｅ活性が細胞のＲＮＡを破壊し、標的細胞を死滅させる。カエル・リボヌクレアーゼのインビトロ及びインビボ両方の抗腫瘍特性は、米国特許第５，５５９，２１２号に記載され、特許請求されている。このリボヌクレアーゼ分子は、今では、Ｏｎｃｏｎａｓｅ（登録商標）（ＯＮＣ）として知られている。ＲＮＡを分解する特性は、ＯＮＣの細胞傷害性にとって必須である。ＯＮＣは、現在、臨床試験において癌治療薬としての評価が行われている。
【０００５】
化学療法剤としてのＯＮＣの適合性に関する重大な制約は、用量を限定する腎臓毒性である。ＯＮＣは、ＲＮａｓｅ・スーパーファミリーの哺乳類のメンバーよりもはるかに高い濃度で腎臓内に保持される。マウスはＯＮＣに対して抗体を産生するが、ＲＮａｓｅ  Ａに対しては産生しないので、ＯＮＣについてはアレルギーの問題もあるが、リボヌクレアーゼＡとはＯＮＣはそのアミノ酸の約３０％を共有する。これは、ＲＮａｓｅファミリーの他のメンバーが、ＯＮＣに類似した細胞傷害性を持たせることができるならば、臨床治療薬として評価する場合、適切な候補薬になりうることを示唆している。
【０００６】
哺乳類では、ＲＮａｓｅ活性のレベルは、リボヌクレアーゼ阻害剤（ＲＩ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）により調節され、該阻害剤はすべての哺乳類の細胞の細胞質ゾルに存在する５０ｋＤａのたんぱく質である。ＲＩはロイシンに富むたんぱく質ファミリーのメンバーであり、蹄鉄型分子内に系統的に配置された１５個の交互反復体から構成されている。ＲＩは多数のシスティン残基（ヒトＲＩでは３２）を有し、これは、ＲＩが細胞質ゾルのような還元雰囲気においてのみ、その形状と機能とを保持できることを意味している。ＲＩは、ＲＮａｓｅスーパーファミリーのメンバーに、１つのＲＩがＲＮａｓｅの１つの分子に結合するように作用し、そのように結合したときは、酵素の活性部位の立体的な妨害によりリボヌクレアーゼの触媒活性を、ＲＩが完全に抑制する。ＲＮａｓｅに対するＲＩの結合は、非常にタイトな結合であり、非常に高い結合親和性を有する。
【０００７】
ＲＮａｓｅスーパーファミリーの一部のメンバー、特にＯＮＣ及びウシの精液リボヌクレアーゼは、ＲＩを避ける生来の(naitive)能力を有する。ＲＩを避ける特質は、主として、ＯＮＣ及びウシの精液リボヌクレアーゼの細胞傷害性によるものである。生来細胞傷害性ではないＲＮａｓｅスーパーファミリーのメンバーは、ＲＩへの結合を抑制するように該メンバーのアミノ酸構成を修飾することにより細胞傷害性にすることができることも判明している。
【０００８】
ブタＲＩ（ｐＲＩ：ｔｈｅ  ｐｏｒｃｉｎｅ  ＲＩ）−ＲＮａｓｅ  Ａの３次元構造を用いて、ＲＮａｓｅ  Ａが、ＯＮＣよりもインビトロでヒトの白血病細胞に対して毒性が強くなるように遺伝子操作された。ＲＩ・ＲＮａｓｅ  Ａの界面の破壊は、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ  Ａの界面における補完性領域を破壊したアミノ酸置換を用いてＲＮａｓｅ  Ａ変異株をデザインすることにより達成された。これらのアミノ酸置換は立体的に破壊するアミノ酸を組み込むか、又は水素結合を除去することにより、短距離のｐＲＩ・ＲＮａｓｅ  Ａ相互作用を標的にした。この方法は、引用により全体が本明細書に組み込まれている米国特許第５，８４０，２９６号に記載されている。類似の補完性領域が、ＲＮａｓｅ  Ａの密接な同族体であるウシの精液のリボヌクレアーゼ（ＢＳ−ＲＮＡＳＥ、配列相同性８７％）に適用された。しかし、同じ補完性領域に突然変異を有するＢＳ−ＲＮＡＳＥ変異株は、ＯＮＣ又は最も細胞傷害性の強いＲＮａｓｅ  Ａ変異株（Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａ）よりも細胞傷害性が低かった。この方法は、ＢＳ−ＲＮＡＳＥについて予測された細胞傷害性のレベルに到達しなかった。
【０００９】
更に、ＲＮａｓｅ  Ａ変異株の創造において今までなされた大抵の研究は、ウシのＲＮａｓｅ  Ａについてなされた。しかし、ウシのＲＮａｓｅ  Ａ（配列番号１，ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＡＡＡ７２７５７）の配列及び構造がヒトの膵臓のリボヌクレアーゼ１（ＲＮａｓｅ  １）（引用により全体が本明細書に組み込まれている、配列番号２，ＧｅｎＢａｎｋのアクセッション番号ＣＡＧ２９３１４）とは異なる。ＲＮａｓｅ  Ａ及びその同族体、ＲＮａｓｅ１は、アミノ酸配列の約７０％の配列同一性を共有している。ウシのたんぱく質は、ヒトの治療に使用するために受け入れことができることが分かっているが、保存的方法は、ヒトのたんぱく質を使用することが異種間の抗原性の問題を最小にすることができることから、ヒト・リボヌクレアーゼの変異株を利用するのがよい。従って、治療、診断又は研究に使用するのに有効で、細胞傷害性の強いヒト・リボヌクレアーゼの変異株をデザインすることが望ましい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の３次元（３−Ｄ）原子構造により規定されたヒト・リボヌクレアーゼ阻害剤（ｈＲＩ）とＲＮａｓｅ１との相互作用の分析により確認されたヒト・リボヌクレアーゼ１（ＲＮａｓｅ  １）の変異株(variant)として要約される。
【００１１】
１つの特徴においては、本発明は以前に開示されたすべての遺伝子操作されたリボヌクレアーゼに比べて改良された細胞傷害性特性を有するＲＮａｓｅ１を規定している。
【００１２】
別の特徴においては、本発明は修飾されたアミノ酸配列を有する変異型のＲＮａｓｅ１を提供し、この変異型ＲＮａｓｅ１はそのリボ核酸分解活性を維持し、この変異型ＲＮａｓｅ１は生来のＲＮａｓｅ１よりもＲＩに対する親和性が低く、生来のリボ核酸分解活性を維持する。
【００１３】
この特徴においては、ヒト・ＲＮａｓｅ１変異株は、その生来の配列から少なくとも２つのアミノ酸変化を含み、この変化は静電反発を介したＲＮａｓｅ１によるヒトｈＲＩの回避を生じ、第１の変化はＲＮａｓｅ１の８５〜９４のアミノ酸残基の領域におけるアミノ酸置換であり、第２の変化はＲＮａｓｅ１のアミノ酸残基４、７、１１、３１、３２、３８、３９、４１、４２、６６、６７、７１、１１１及び１１８からなる群から選択された位置における変質、置換又はアミノ酸交換であり、この変異型ＲＮａｓｅ１は生来のリボヌクレアーゼ１に比べて高い細胞傷害活性を示す。
【００１４】
関連した特徴においては、ヒトＲＮａｓｅ１変異株は、その生来の配列から少なくとも２つのアミノ酸変化を含み、この変化は静電反発を介したＲＮａｓｅ１によるヒトｈＲＩの回避を生じ、第１の変化はＲＮａｓｅ１の８８又は９１のアミノ酸残基におけるアミノ酸置換であり、第２の変化はＲＮａｓｅ１のアミノ酸残基４、７、１１、３１、３２、３８、３９、４１、４２、６６、６７、７１、１１１及び１１８からなる群から選択された位置における変質、置換又はアミノ酸交換であり、この変異型ＲＮａｓｅ１は生来のＲＮａｓｅ１に比べて高い細胞傷害活性を示す。
【００１５】
本発明は、更に、生来の配列から修飾されたアミノ酸を有するＲＮａｓｅ１の変異株を提供する。典型的な変異株は、本明細書の下で表５に提示されている。望ましい機能を有する追加の変異株も、本発明の範囲内にある。
【００１６】
好ましい態様では、ＲＮａｓｅ１変異株はＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄにより規定され、野生型（生来の）ＲＮａｓｅ１よりもｈＲＩに対して少なくとも１０7倍低い親和性及び２７００倍低い会合速度を有する。
【００１７】
別の態様では、本発明は、新規で細胞傷害性のＲＮａｓｅ１を産生するために、生来のＲＮａｓｅ１のアミノ酸配列を修飾する方法を提供する。
【００１８】
本発明は、リボ核酸分解活性を維持する変異型ＲＮａｓｅ１を産生するために、生来のリボ核酸分解活性を維持している生来のＲＮａｓｅ１のアミノ酸配列を修飾する方法であり、該変異型ＲＮａｓｅ１は、生来のＲＮａｓｅ１よりもＲＩに対する結合親和性が低く、生来のリボ核酸分解活性を維持している。
【００１９】
本発明は、修飾されたＲＮａｓｅ１の有効量を細胞に供給することを含む癌細胞の増殖を抑制する方法でもあり、該変異型ＲＮａｓｅ１は、生来のＲＮａｓｅ１よりもＲＩに対する結合親和性が低く、生来のリボ核酸分解活性を維持している。
【００２０】
別の特徴においては、本発明は、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の３次元構造における静電アンカー残基を識別することにより細胞傷害性ＲＮａｓｅ１変異株を遺伝子操作する方法、及び静電反発を介してｈＲＩへの結合を抑制するためにＲＮａｓｅ１において識別されたアンカー残基を修飾する方法を提供し、この変異株は、生来のリボ核酸分解活性を維持し、生来のＲＮａｓｅ１よりもｈＲＩに対して低い結合親和性を有し、生来のＲＮａｓｅ１に比べて高い細胞傷害活性を示している。
【００２１】
別の特徴においては、本発明は、プロテインデータバンク識別番号１Ｚ７Ｘにより規定されたｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の結晶を提供する。
【００２２】
ＲＮａｓｅ１変異株をデザインするためにｈＲＩ*ＲＮａｓｅ１錯体の３次元構造座標を用いる方法も開示されており、ＲＮａｓｅ１変異株は生来のリボ核酸分解活性を維持し、生来のＲＮａｓｅ１よりもｈＲＩに対して低い結合親和性を有し、生来のＲＮａｓｅ１に比べて高い細胞傷害活性を示している。
【００２３】
特に明記しないかぎり、本明細書で使われたすべての技術及び科学用語は、本発明が所属する技術分野の当業者が普通に理解する意味と同じ意味を有する。本発明の実施又はテストするのに適した方法及び物質については下で説明するが、当該技術分野で周知の、本明細書で説明されたものと類似又は同等の他の方法及び物質も使用することができる。
【００２４】
本発明の他の目的、利点及び特徴は、添付図面に関連して行われた次のような説明から明らかになるであろう。
【００２５】
この特許又は出願ファイルは、少なくとも１つの着色した図を含んでいる。カラー図を有するこの特許又は特許出願の刊行物のコピーは、必要な手数料を納付して要請すれば当局から提供されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明は、生来のＲＮａｓｅ１に比べて増加した細胞傷害活性を示すために遺伝子操作された新規なヒト・リボヌクレアーゼ１変異株に関連している。これは、ヒト・リボヌクレアーゼ１（ＲＮａｓｅ１）分子に結合したヒト・リボヌクレアーゼ阻害剤（ｈＲＩ）分子の３次元（３−Ｄ）原子結晶構造を決めることにより初めて可能になった。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の構造は、１．９５Åの解像度を有し、原子座標は、公に利用できる配列データベースであるプロテインデータバンク（ＰＤＢ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）に、識別番号１Ｚ７Ｘとして預けられた。
【００２７】
ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の３−Ｄ構造を用いて、錯体中のｈＲＩとＲＮａｓｅ１との間の相互作用の特徴を明らかにし、ＲＩ結合への特定のＲＮａｓｅ１残基のエネルギー的寄与を決めるために用いた。長距離の静電力と会合速度との間の相互作用は、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体におけるアンカー残基の静電寄与を確認するために分析した。これらの残基は、（１）静電反発を介したアンカー残基の結合を抑制することによりｈＲＩを回避し、（２）生来のＲＮａｓｅ１に比べて細胞傷害活性を増加させるために、合理的に修飾した。ここで説明した論理を用いて、ヒト・リボヌクレアーゼに基づく化学療法剤の開発に対する主な障害は克服することができたと考えられる。
【００２８】
広範囲の実施形態において、本発明は、その生来の配列から少なくとも２つのアミノ酸変化を有するＲＮａｓｅ１の遺伝子操作されたリボヌクレアーゼ変異株を提供し、この変化は静電反発を介したＲＮａｓｅ１によるｈＲＩの回避を生じ、第１の変化はＲＮａｓｅ１の８５〜９４のアミノ酸残基の領域におけるアミノ酸置換であり、第２の変化はＲＮａｓｅ１のアミノ酸残基４、７、１１、３１、３２、３８、３９、４１、４２、６６、６７、７１、１１１及び１１８からなる群から選択された位置における変質、置換又はアミノ酸交換であり、この変異型ＲＮａｓｅ１は生来のＲＮａｓｅ１に比べて細胞傷害活性を示す。この種の変異株は、本明細書ではＸＮＮＹという表記により指定され、Ｙは位置ＮＮ（例えば、Ｒ４Ｃ）に通常存在する残基Ｘの置換されたアミノ酸残基である。
【００２９】
本明細書で使われている用語「生来の」、「野生型」、「修飾されていない」は、互いに同義語である。これらは、天然に存在する資源から単離された場合、その遺伝子の産生物の特徴を有する遺伝子産生物を意味している。野生型遺伝子は、個体群において最も頻繁に認められる遺伝子であり、従って、該遺伝子の任意にデザインされた「正常な」又は「野生型」形態である。
【００３０】
対照的に、用語「変異株」、「修飾された」又は「突然変異体」は、野生型遺伝子産生物と比較した場合、配列及び又は機能特性の修飾を示す（即ち、変質した特徴）遺伝子産生物を意味している。本発明は、ＲＮａｓｅ１の変異株を提供する。典型的な変異株は表５に示している。
【００３１】
１つの実施形態では、本発明は、生来の配列である、配列番号２に関連して静電反発を介したＲＮａｓｅ１によるヒト・リボヌクレアーゼ阻害剤（ｈＲＩ）の回避を生じ、残基４、３８、３９、６７、８８、８９、９１及び１１８におけるアミノ酸変化を有するＲＮａｓｅ１変異株を提供し、この変異型ＲＮａｓｅ１は生来のリボ核酸分解活性を維持し、生来のリボヌクレアーゼよりもＲＩに対する低い結合親和性を有し、生来のＲＮａｓｅ１に比べて高い細胞傷害活性を示す。
【００３２】
この実施形態に基づいて、我々は、ヒトの膵臓のリボヌクレアーゼの有益な変異株である、Ｒ４Ｃ／Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｌ／Ｇ８９Ｒ／Ｒ９１Ｇ／Ｖ１１８Ｃ  ＲＮａｓｅ１を合成した。この酵素は、ここで提示されたｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の原子構造により呼び起こされた８つの残基が変化する。残基Ｇｌｙ３８、Ａｒｇ３９、Ａｓｎ６７、Ａｓｎ８８、Ｇｌｙ８９、及びＡｒｇ９１は、すべて、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の界面の近くにある。この変異株におけるこれらの残基の置き替えは、界面を妨げるようにデザインされている。Ａｒｇ４及びＶａｌ１１８も、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１の界面の近くにある。システィン残基によるこれらの置き替えは、この界面を妨害し、並びにこの酵素に余分の立体的安定性を与えるものと思われる、Ｃｙｓ４とＣｙｓ１１８との間に新しいジスルフィド結合を形成することができるようにデザインされている。このＲＮａｓｅ１変異株は、（１）生来のＲＮａｓｅ１の酵素活性のほとんどすべてを維持し、（２）ｈＲＩを回避し、（３）かなりの細胞傷害活性を示す。
【００３３】
好ましい実施形態では、本発明は生来の配列である配列番号２に関連して残基３９、６７、８８、８９及び９１におけるアミノ酸変化を有するＲＮａｓｅ１変異株を提供し、これらの変異株は生来のリボ核酸分解活性を維持し、生来のＲＮａｓｅ１よりもＲＩに対する低い結合親和性を有し、生来のＲＮａｓｅ１に比べて高い細胞傷害活性を示す。
【００３４】
これらのＲＮａｓｅ１変異株は、長距離静電力と会合速度との間の関係を適用することによりデザインされた。好ましいＲＮａｓｅ１変異株は、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄにより規定され、野生型ＲＮａｓｅ１よりもｈＲＩに対する親和性は１０7倍低く、会合速度は２７００倍低い。会合速度が２７００低下したのは、ＲＮａｓｅ１におけるアスパラギン酸塩による静電反発が２５倍に上がり、ＲＮａｓｅ１中の位置３９及び９１における静電引力が１１０倍低下したためであった。
【００３５】
ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体では、Ａｓｎ６７のような立体的に制約された残基よりも、Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１のような荷電した主要な残基の静電引力が、ｈＲＩがＲＮａｓｅ１を認識するのに役立つことが指摘されている。ＲＩがその蹄鉄状の構造を用いると、溶媒に曝された主要な荷電残基（特にＡｒｇ３９及びＡｒｇ９１）では、長距離の静電相互作用によりＲＮａｓｅ１とのそのタイトな相互作用を測定することができるようになる。
【００３６】
ＲＮａｓｅ１の他の新規な変異株が、生来のリボ核酸分解活性を維持し、生来のＲＮａｓｅ１よりもＲＩに対して低い結合親和性を有し、生来のＲＮａｓｅ１に比べて高い細胞傷害活性を有することも、本明細書に記載されている。これらは、（１）残基３９、６７、８９及び９１、好ましくはＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ、（２）残基３９、６７、８８及び９１、好ましくはＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｒ９１Ｄ、（３）残基３９、６７、８８及び８９、好ましくはＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ、（４）残基３９、８８、８９及び９１、好ましくはＲ３９Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ、（５）残基３８、３９、６７及び８８、好ましくはＧ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｒ、残基６７、８８、８９及び９１、好ましくは６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄにおいて生来の配列である配列番号２に比べてアミノ酸変化を有するＲＮａｓｅ１変異株を含む。
【００３７】
別の実施形態では、本発明は、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の３次元構造において静電アンカー残基を識別することにより細胞傷害性ＲＮａｓｅ１変異株を作るためにＲＮａｓｅ１を修飾し、静電反発を介してｈＲＩへの結合を抑制するためにＲＮａｓｅ１において識別されたアンカー残基を修飾する方法を提供する。ここで、これらの変異株は生来のリボ核酸分解活性を維持し、生来のＲＮａｓｅ１よりもＲＩに対する低い結合親和性を有し、生来のＲＮａｓｅ１に比べて高い細胞傷害活性を示す。従って、ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との間の静電引力を利用することにより、我々はヒト・リボヌクレアーゼをベースにした化学療法剤の開発において大きな障害を克服するためにＲＩの抑制結合を回避しうるＲＮａｓｅ１の変異株を開発することができた。
【００３８】
別の実施形態では、本発明は、変異型ＲＮａｓｅ１の有効量を細胞に供給することを含む、癌又は腫瘍細胞の増殖を抑制する方法を提供し、該変異型ＲＮａｓｅ１は生来のＲＮａｓｅ１に比べて高い細胞傷害活性を示す。
【００３９】
「高い細胞傷害性」とは、修飾されたＲＮａｓｅ１が、対応する修飾されていないか、又は生来の（野生型）ＲＮａｓｅ１よりも大きな細胞傷害性を示すことを意味している。下の実施例では、細胞傷害性はヒトの赤白血病細胞系Ｋ−５６２を用いて評価した。本発明の修飾されたリボヌクレアーゼは、本明細書に記載されている細胞に加えて他の腫瘍細胞に対しても細胞傷害性であると予想されている。細胞増殖の抑制は、修飾又は未修飾のＲＮａｓｅ１で処置したＫ−５６２細胞の内、生き残りのパーセンテージを計算して決められる。１００％生存は、ホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ）の溶液で処置した生き残り細胞の数であると考えられている。
【００４０】
「有効量」は、腫瘍細胞の増殖を顕著に低減させるのに必要なリボヌクレアーゼの量を意味している。
【００４１】
修飾リボヌクレアーゼは、細胞の生存能力を少なくとも約１０％低減するのが好ましい。修飾リボヌクレアーゼは、細胞の生存能力を少なくとも約２０％低減するのがより好ましい。修飾リボヌクレアーゼは、細胞の生存能力を約５０％、又は約７５％程度低減するのが最も好ましい。
【００４２】
別の実施形態では、本発明は、プロテインデータバンク識別番号１Ｚ７Ｘにより規定されたｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体を提供する。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の３Ｄ結晶構造は、初めてここで記載されている。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の３次元構造は、ｈＲＩを回避し、生来の酵素に比べて高い細胞傷害活性を示すＲＮａｓｅ１を合理的にデザインするツールとして使うことができる。
【００４３】
ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の３Ｄ構造の研究価値は、当業者には理解されている。Ｘ線結晶学から得られた構造が、たんぱく質・リガンド錯体の唯一の静止スナップ写真であると見込まれている。実際に、ＲＮａｓｅ１のようなたんぱく質は、非常に柔軟な高分子であり、種々の時間スケールでそれらの立体構造を変えている。潜在的結合部位へのアクセスは、特定の立体構造においてのみ利用することができる。技法、即ち分子ダイナミックス、普通のモード又はモンテカルロ方法は、他のＲＮａｓｅ１をデザインする場合に１つ又はそれ以上の代表的な構造を得るために使われる。
【００４４】
この特許明細書には、たんぱく質及びアミノ酸配列の実施例がいくつか含まれているが、たんぱく質のすべての配列は、本発明のたんぱく質又はコンセプトを本質的に変えることなく小さな変化及び修正を受けやすい。類似のサイズ及び極性のアミノ酸の保存的変化は、常に可能であり、たんぱく質の機能を変えることもたまにある。ＲＮａｓｅ１全体は、ＲＮａｓｅ１としての活性には逆影響を与えることなく小さなアミノ酸追加、置換の除去のいずれかにより、配列のさらなる修飾を受けやすい。アミノ酸配列におけるこれらの種類の変化は、本明細書で用いた専門用語の範囲内にあると解釈される。
【００４５】
保存的アミノ酸置換には、類似の極性の別のアミノ酸により置換することができる配列内の１つ又はそれ以上のアミノ酸残基があり、これは機能上等価物として作用し、サイレントな変質を生じる。配列内のアミノ酸の置換基は、該アミノ酸が属する部類の他のメンバーから選択される。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンがある。芳香族環構造を含むアミノ酸には、フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシンがある。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システィン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンがある。正に荷電した（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジン及びヒスチジンがある。負に荷電した（酸性の）アミノ酸には、アスパラチン酸とグルタミン酸とがある。この種の変質は、ポリアクリルアミド・ゲル電気泳動又は等電点により測定された見かけの分子量に影響を及ぼすことは期待されないであろう。アミノ酸の略称は当該技術分野では周知である。
【００４６】
本発明の方法の純粋に典型的であると考えられる以下の実施例を検討することにより、本発明は更に明確になる。
【実施例】
【００４７】
１．実験の概要
ＲＮａｓｅ１変異株のデザイン
一般に、たんぱく質錯体の平衡解離定数（Ｋd）は、会合速度（ｋon）及び解離速度（ｋoff）に影響を及ぼしている分子間因子により支配されていると当業者は考えている。解離速度は、ファンデルワールス相互作用、水素結合、疎水性相互作用、及び塩橋を含む短距離で作用する因子により影響を受ける。しかし、会合速度は主として拡散に依存するが、クーロン静電因子により大きくすることができる。長距離静電力の多くは、荷電アミノ酸を脱溶媒和するための大きなエネルギー損失によりたんぱく質間の相互作用を不安定化する。しかし、スピードが必要な場合は、会合速度、従って、錯体の親和性は静電エネルギーを最適化することにより増加させることができる。
【００４８】
互いに相互作用するたんぱく質のパートナーに対して低い親和性を有するたんぱく質をデザインする場合に、運動速度の成分（ｋon又はｋoff）のいずれかを標的にすることができるかもしれない。ＲＩ・ＲＮａｓｅ界面の抑制について行われた以前の研究は、解離速度を効果的に上げるＲＩ・ＲＮａｓｅ間の短距離の分子間の接触に焦点を当てたものであった。ＲＮａｓｅ  Ａのヒト同族体である、ＲＮａｓｅ１の親和性に有害な影響があり、短距離相互作用を用いると証明するのがより困難になった。
【００４９】
この障害を克服するために、我々は、１．９５Åの解像度におけるｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１の結晶構造を測定し、ｈＲＩ（遺伝子バンク識別番号Ｐ１３４８９）に対してミクロモルのレベルの親和性を有するＲＮａｓｅ１の変異株をデザインするために構造情報を用いた。我々は、ＲＮａｓｅ１を用いてＲＮａｓｅ  Ａにおいて識別された類似の補完性残基についても研究し、これらのＲＮａｓｅ１残基からＲＩ結合へのエネルギー的寄与を明らかにした。錯体会合速度に対するこれらの荷電残基（例えば、Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１）の寄与に基づいて、我々は、たんぱく質間の相互作用を測定する場合の「静電アンカー」残基の役割を規定している。静電アンカー残基が、（１）会合速度のかなりの向上に寄与し、（２）タイトな水素結合により錯体形成を維持、することによりたんぱく質間の認識を決める。全般的に見れば、ＲＮａｓｅ１によるＲＩの回避は、立体的寄与と静電寄与の両方を必要とするが、会合速度定数がかなり低下することによりミクロモルのレベルの親和性に促進される。
【００５０】
従って、（１）高い配列同一性を有する２つのリボヌクレアーゼである、ＲＮａｓｅ１及びＲＮａｓｅ  Ａとの錯体におけるＲＩの分子認識パターンを分析し、（２）合理性に基づくＲＮａｓｅ１変異株をデザインするＲＩ結合に含まれた特定の残基のエネルギー寄与（例えば、立体的及び静電）の差を詳しく調べて、本発明の細胞傷害性ＲＮａｓｅ１変異株は開発された。このデザイン方法の成果の１つは、野生型ＲＮａｓｅ１よりもｈＲＩに対する親和性が１０7倍低く、会合速度が２７００倍低い細胞傷害性ＲＮａｓｅ１変異株を遺伝子操作することであった。
【００５１】
ＲＩによる膵臓のリボヌクレアーゼの認識における違い
高速原子密度評価器（ＦＡＤＥ）アルゴリズムにより、ｐＲＩとＲＮａｓｅ  Ａとの間の高い形状補完性の領域が明らかにされた。高い形状補完性を有することが確認された領域、即ちＤ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａ（ｈＲＩについて、Ｋd＝５１０ｎＭ）及びＣ３１Ａ／Ｃ３２Ａ／Ｇ３８Ｒ／Ｋ３９Ｄ／Ｇ８８ＲのＢＳ−ＲＮＡＳＥ（ｈＲＩについて、Ｋd＝１１０ｎＭ）に、破壊性突然変異体を挿入することにより、ＲＩに対する親和性が顕著に低下することが明らかになった。同じ論理及び形状補完性領域を用いて、我々は、Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ１をデザインした（表５）。ＲＮａｓｅ１に適用した場合、この方法はＲＮａｓｅ１に対するｈＲＩの親和性を低減することもできなかった。ＲＮａｓｅ１のこの４重変異株に対するｈＲＩの結合親和性は、野生型ＲＮａｓｅ１に対するｈＲＩの親和性に近かった。その結果として、我々はＲＮａｓｅ  ＡからＲＮａｓｅ１のＲＩ認識を、何が分離したか決めたいと思った。
【００５２】
残基３９。ＲＮａｓｅ  ＡのＡｒｇ３９は、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ  Ａに対して最高の形状補完性値を有し、第２のアンカー残基であると提議された。Ａｒｇ３９をＧ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａにおいてアスパラギン酸塩に突然変異させると、Ｒ３９Ｄ／Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａが得られ、Ｒ３９Ｄ突然変異はＲＩ親和性を７２５倍下げた。ＲＮａｓｅ１では、Ａｒｇ３９はｈＲＩとより一層タイトな相互作用を有して、３つの水素結合を形成し、結果としてＲ３９Ｄのエネルギー寄与はΔΔΔＧ＝２．２ｋｃａｌ／ｍｏｌにおいて調べた残基の中で２番目に高い。
【００５３】
ＲＮａｓｅ  Ａと同様に、Ａｒｇ３９がＡｓｐに突然変異するとＲＮａｓｅ１に対するｈＲＩの親和性を低下させるが、Ｒ３９Ｄを有する変異株の細胞傷害性は類似のＲＩ回避を有する他の変異株よりも比例的に低い。ＲＮａｓｅ１変異株の細胞傷害性に対するＲ３９Ｄの負の影響の部分は、触媒活性が３倍低下することにより説明できるが、活性の増加では、Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１の高い細胞傷害性を完全に説明することはできない。Ｒ３９Ｄを有するＲＮａｓｅ１の変異株における細胞傷害性の偏りのある大きな低下は、細胞表面結合におけるＡｒｇ３９の役割を支持している。Ａｒｇ３９はＲＮａｓｅ１上の２つの正に荷電したパッチの間に位置しており（図５）、そのために位置３９における負の電荷は、内面化及び細胞傷害性の大きな低下を比例的に産生している正の両パッチの細胞表面結合を弱めることがある。
【００５４】
残基６７。以前、ｈＲＩによるＡｓｎ６７の認識は、ＲＮａｓｅ１又はＲＮａｓｅ  Ａではなく、アンギオジェニンに選択的に結合するＲＩ変異株を発現させるために利用された。18ｈＲＩの位置４０８及び４１０においてトリプトファンを組み込むことにより、アンギオジェニンのみに結合した非常に選択的なｈＲＩの変異株が遺伝子操作された。ｈＲＩの残基４０８−４１０の結合を立体的に妨害するためのＲＮａｓｅ１のＡｓｎ６７におけるトリプトファン置換は、同等の結合変化を産生しなかった（データは示されていない）。しかし、位置６７におけるアスパラギン酸塩は、この錯体を１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌだけ不安定化する（表５）。
【００５５】
Ａｓｎ６７は、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ  Ａ界面の表面積の埋設及び分子運動の欠如により、該界面における主要なアンカー残基であると提議された。22Ａｓｎ６７が錯体形成において役割を果たしているという主張と一致して、我々は、位置６７における突然変異により生じたエネルギー的不安定化はかなりのもの（ΔΔΔＧ＝１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ）であることを見出した。しかし、Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１は、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の安定化に対してより全体的なエネルギーを提供している。
【００５６】
β４−β５ループ。β４−β５ループ領域においてＲＮａｓｅ  Ａから何がＲＮａｓｅ１のＲＩ認識を分離したかを判断するために、図２に示したように、ＲＩ（緑）に結合した時の、ＲＮａｓｅ  Ａ（青）及びＲＮａｓｅ１（紫）のβ４−β５ループの間で３次元構造の比較が行われた。これは、プログラム・セコイア（Ｓｅｑｕｏｉａ）を用いてＲＮａｓｅ１とＲＮａｓｅ  Ａのアルファ炭素を整列させることにより達成され、画像はプログラムＰｙＭＯＬを用いて創った。（Ａ）ＲＩで隠されたβ４−β５ループの構造。残基８８−９１の側鎖は、棒として示されている。アミノ酸は、リボヌクレアーゼの色に対応する色で標識を付けている。（Ｂ）ＲＩに結合したβ４−β５ループの配向。ＲＮａｓｅ  Ａ（鎖Ｅ）はＲＮａｓｅ１（鎖Ｚ）に対して整列させ、次いで、ＲＮａｓｅ１に対するアラインメントに基づいてｈＲＩ（鎖Ｙ）内にモデルを作った。水素結合は破線として示している。ｈＲＩとＲＮａｓｅ  Ａとの間の水素結合はｈＲＩとｐＲＩとのアラインメントに基づいて仮説を立てている。
【００５７】
この比較アラインメントを行うことにより、我々は、アルギニン突然変異のＧｌｙ８８がＲＮａｓｅ  Ａに対するｐＲＩの親和性を１０4Ｍ低下させ、ｈＲＩに対するＢＳ−ＲＮＡＳＥの親和性を２５０倍低下させた先の結果とは対照的に、ＲＮａｓｅ１においてＡｓｎ８８をアルギニンで置換しても親和性の類似の低下は生じないことを発見した。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の結晶構造において、β４−β５ループはｐＲＩとＲＮａｓｅ  Ａに類似した立体構造をとる（図２）。β４−β５ループにおけるＲＮａｓｅ１とＲＮａｓｅ  Ａとの間の１つの大きな違いは残基８８を有することである。残基８８では、ＲＮａｓｅ１のＡｓｎ８８は、ＲＮａｓｅ  ＡにおけるＧｌｙ８８のようにＴｒｐ２６１及びＴｒｐ２６３により形成されたポケット内に折り曲げる代わりにＧｌｕ２６４と水素結合する。ＲＮａｓｅ１内のＡｓｎ８８は、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１界面の外表面に位置し、ＲＩに対する高い親和性を維持しながらアルギニン又は炭水化物鎖の構造的容積を収容することができる。
【００５８】
ＲＮａｓｅ１のＧｌｙ８９は、ＲＮａｓｅ  ＡにおいてＧｌｙ８８の構造類似体を構成すると提議されているが、ＲＮａｓｅ１内のＧｌｙ８９における突然変異の研究は、やはり、ＲＩに対する低い親和性を有する変異株を産生することはできなかった。ＲＮａｓｅ１におけるＧｌｙ８９は、ＲＮａｓｅ  ＡＡのＳｅｒ８９をより密接に覆う（図２）が、Ｇｌｙ８９は、ＲＮａｓｅ  ＡにおいてＳｅｒ８９について見られたＧｌｕ２０６と水素結合することはできない。
【００５９】
ＲＮａｓｅ１のＧｌｙ８９は、更に、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１においてＴｒｐ２６１及びＴｒｐ２６３とのファンデルワールス接触を有するが、Ｇｌｙ８９はＲＮａｓｅ  ＡにおけるＧｌｙ８８よりも大きな柔軟性を有するように思われる。その結果、ｈＲＩは、野生型に近い親和性を維持しながら、ＲＮａｓｅ１中のＧｌｙ８９におけるアスパラギン酸塩又はアルギニン置換に調節することができる（図２）。
【００６０】
調べた５つの残基の中で、Ａｒｇ９１は、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体（ΔΔＧ＝２．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ）に対して最大のエネルギー的影響を有した。Ａｒｇ９１は、ｈＲＩ表面の負に荷電した曲がり部分においてｈＲＩに接触し（図５）、Ａｒｇ９１はｈＲＩのＧｌｕ２８７と２つの水素結合を形成する。ＲＮａｓｅ  ＡのＬｙｓ９１は、ｐＲＩにＲＮａｓｅ  Ａを固着する場合に第２の掛け金を掛ける役割を果たすと提議されているが、ＲＮａｓｅ１では、Ａｒｇ９１はｈＲＩによる認識に対する主要なアンカー残基として役立つかもしれない。
【００６１】
アスパラギン酸塩を用いてＡｒｇ９１を置換すると、ｈＲＩのＧｌｕ２８７へのタイトな水素結合に役立ち、Ａｒｇ９１の引力を静電反発で置き替えた。荷電間の引力のこのようなロス及び位置９１における静電反発の取得は、全体的な結合親和性における最大の変化を生じた。
【００６２】
静電アンカー残基
１４の酵素・阻害剤錯体の調査において、１４の錯体はすべて正のΔＧelec,3を有し、これは静電力が錯体形成の負の力であったことを意味している。しかし、ＲＩ・ＲＮＡＳＥ錯体は特殊なたんぱく質間の界面である。ｈＲＩへのアンギオジェニンの結合は、−１２．３ｋｃａｌ／ｍｏｌの静電相互作用エネルギーを有し、計算した速度は１０6Ｍ-1ｓ-1の静電力により増加する。他の錯体とは対照的に、ＲＩ・ＲＮＡＳＥ錯体では、静電力が結合において主要な役割を果たしている。
【００６３】
図３に、ｈＲＩ（緑）とＲＮａｓｅ１（紫）との間の主要な形状補完性残基の１σにおける電子密度を示している。詳細に示した特定の残基は、（Ａ）Ａｒｇ３９、（Ｂ）Ａｓｎ６７、（Ｃ）Ａｒｇ９１である。強調した領域は、壁に眼のある立体的な(wall-eyed stereo)様式で示し、たんぱく質間の水素結合は黒い破線で示している。画像はプログラムＰｙＭＯＬを用いて作成した。図３は、ｈＲＩと最初に接触する立体障害のある残基の代わりに、Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１のような主要な溶媒に曝された荷電残基の静電力が会合速度を促進することを示している。
【００６４】
具体的には、Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１は、Ａｓｎ６７、Ａｓｎ８８又はＧｌｙ８９よりも結合エネルギーに対して少なくとも０．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ多く寄与する。Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１の荷電表面が、Ｒ３９Ｌ／Ｎ６７Ｌ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｌ／Ｒ９１Ｌ  ＲＮａｓｅ１においてこれらの荷電のロイシンへの置換が会合速度を１１０倍低下させる時に会合速度を決める。従って、我々が静電アンカー残基として規定しているＡｒｇ３９及びＡｒｇ９１は、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体において特殊な役割を果たしている。たんぱく質間の錯体の形成に掛け金を掛ける残基は、錯体形成に大きなエネルギー力を与え、そのたんぱく質結合パートナーの認識に関する主要なマーカーである。
【００６５】
Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１のような静電残基は、ｈＲＩの静電表面により最初に認識されるので、これらの基準に合っている（図５）。具体的には、図５はｈＲＩ（緑）とＲＮａｓｅ１（紫）との相互作用を静電的に表示している。ＲＮａｓｅ１、残基３９及び９１のたんぱく質接触電位は、標識付き（Ａ）、ｈＲＩ（Ｂ）及びｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１（Ｃ）であることを示している。青（正）及び赤（負）の強度は、局所的静電環境を示している。真空静電力は計算し、画像はプログラムＰｙＭＯＬを用いて作成した。
【００６６】
更に、静電残基Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１は、錯体の会合速度に強く影響を及ぼす（表６）。従って、Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１は、ｈＲＩに結合したＲＮａｓｅ１をタイトな水素結合を介して保持し（図３）、錯体中で他の接触を形成することを可能にする。Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１は、Ａｓｎ６７のステリックス(sterics)よりも長い間隔にわたりｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体を形成させ、最終的にはｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の親和性により多くの結合エネルギーを供給する。ＲＮａｓｅ  ＡのＡｒｇ３９及びＬｙｓ９１は、ＲＩ結合において役割を果たしていると提議されているが、これらの残基の静電力がｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体に供給している主要な機能は過小評価されていた。
【００６７】
回避のエネルギー
荷電アミノ酸は、たんぱく質表面上の露出アミノ酸全体の１９％を占めているが、たんぱく質間の平均界面では露出している荷電残基は比較的少ない。たんぱく質間の界面における荷電間の相互作用は、結合している露出荷電残基を脱溶媒するためにエネルギー的不利益が大きいのでエネルギー的に不利である。脱溶媒のエネルギー的不利益は、錯体形成時に部分的に露出した溶媒の主要な荷電相互作用を残すことにより回避することができる。図３では、複数の溶媒分子の電子密度は、ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との間の目視できる周囲の重要な荷電相互作用である。ＲＩは、比較的大きな表面積を溶媒に露出し、主要な荷電残基を一部だけ脱溶媒和するために、風変わりな馬蹄型のものを使用しているようである。このような溶媒への露出により、ＲＮａｓｅ１と結合しているＲＩが被る脱溶媒和によるエネルギー面の不利益が低減し、静電力を錯体形成のためのエネルギーとして使えることになる。
【００６８】
ＲＮａｓｅ１の表面上の正の電荷（図５）は、基質の結合を促進し、その結果ＲＮａｓｅ１の生物学的活性を維持する必要がある。ＲＩは、ＲＮａｓｅ１に対して荷電表面が、長距離静電力を用いて、タイトに且つ迅速にＲＮａｓｅ１を抑制する必要があることから利点を得ている。図５は、ＲＮａｓｅ１及びｈＲＩ上の正及び負の電荷分布を、それぞれ、強調している。結晶構造において、Ａｒｇ３９及びＡｒｇ９１はＲＩの負の内表面にタイトに封入され（図５）、ｈＲＩの負の表面にＲＮａｓｅ１を固着している。
【００６９】
主要な静電アンカーにおいて負に荷電したアスパラギン酸塩残基を組み込むことにより、我々は、ＲＮａｓｅ１に関するｈＲＩの平衡解離定数をほぼ７桁下げた。Ａｒｇ３９及びＡｓｎ６７における突然変異とＲＮａｓｅ１変異株との比較により、静電力がどのようにしてＲＩ結合の回避に役立っているかを説明している。位置３９及び６７におけるアスパラギン酸塩の静電反発が、それぞれ、２．２及び１．９ｋｃａｌ／ｍｏｌ錯体を不安定化している（表５）。アスパラギン酸塩残基の代わりに、野生型残基が残基３９においてグリシンに、残基６７（Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ１）においてアルギニンに取り替えられるならば、この錯体の類似の不安定化は認められない（トータルのΔΔＧ＝３．０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。従って、残基Ａｒｇ３９及びＡｓｎ６７の静電力は、ＲＮａｓｅ１変異株の親和性を決める場合に大きな役割を果たしている。
【００７０】
全体としては、ＲＮａｓｅ１におけるアスパラギン酸塩置換によるＲＩ結合の反発は、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１における単一突然変異の復帰による失われた結合エネルギー（８．２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）は、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１の場合に失われた結合エネルギー（９．３ｋｃａｌ／ｍｏｌ）より少ないので超加法的である。たんぱく質間の錯体における超加法的突然変異の例は少ないが、ｈＲＩ・アンギオジェニンの場合に認められている。しかし、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１の場合の超加法的結果は、ｈＲＩ・ＲＮＡＳＥＡにおける以前の突然変異が超加法的であったので、驚くべきことである。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体への突然変異の超加法性は、一部は方法により、一部は突然変異のタイプにより説明することができる。ＲＮａｓｅ１において複数の置換を併用することにより、追加の突然変異が単一の突然変異では見られないようなＲＩとの破壊的接触を発現するように、生来のＲＮａｓｅ１がねじ曲げられた。また、アラニン置換に代わるアスパラギン酸塩置換の静電反発は、比較的大きな表面積を撹乱し、突然変異のエネルギー的不安定化を増大させることができる。例えば、アーカイブス１における４つすべてのアスパラギン酸塩置換のΔΔΔＧ値は、単一水素結合（Ａｓｎ８８とＡｌａ８８との）の除去に関するΔΔΔＧ値よりも大きい（表５）。全体としては、大抵の回避ＲＮａｓｅ  Ａ変異株と同等の親和性を有するＲＮａｓｅ１の変異株を発現させるために、我々はｈＲＩとＲＮａｓｅ１との間のタイトな静電引力を利用した。
【００７１】
会合及び解離の速度
静電力は、長距離にわたるたんぱく質間の錯体の形成を操作し、拡散が限定するプロセスの会合速度を増大させる。我々は、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１ＤのＲＮａｓｅ１の回避の増加に導いた運動定数を決めるために、表５からのＲＮａｓｅ１の２つの変異株の間の運動速度定数の差を測定した。全体としては、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１ＤのＲＮａｓｅ１の解離速度定数（３１００倍）及び会合速度定数（２７００倍）の変化は、各々が野生型ＲＮａｓｅ１に比べたｈＲＩに対する親和性の低減の半分を説明する（表６）。Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１ＤのＲＮａｓｅ１のミクロモル・レベルの親和性に対する会合速度の大きな寄与は、その速度をＲ３９Ｌ／Ｎ６７Ｌ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｌ／Ｒ９１Ｌ  ＲＮａｓｅ１に比べるとより明確になる（表６）。
【００７２】
Ｒ３９Ｌ／Ｎ６７Ｌ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｌ／Ｒ９１Ｌ  ＲＮａｓｅ１に比べてＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１のＲＩ回避が５０倍に上がっていることは、長距離静電反発により、会合速度に対する該反発の作用を介してほぼ完全に促進される。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体形成に対する残基３９、６７、８８、８９及び９１の静電力の全体的な影響は、ロイシン置換による引力のロスによる会合速度の１１０倍の低下と、アスパラギン酸塩置換による反発力の取得による会合速度の２５倍の低下とを組み合わせることにより近似させることができる。全体としては、静電力はｈＲＩに対するＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１の親和性を２７００倍低下させるのに寄与し、これらの実験結果がＲＮａｓｅにＲＩが結合する際の静電力の重要性に関する以前の計算を補足する。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１に関する実施例は、電荷が会合速度に強く影響を及ぼす場合、たんぱく質が静電アンカー残基を用いて溶液中のこれらのたんぱく質パートナーを認識する追加の方法を発展できたことを実証している。
【００７３】
これらの結果は、ヒトＲＮａｓｅ１の細胞傷害性変異株はここで明らかにされたデータに基づいて作ることができることを実証している。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の原子座標について検討すると、より一層細胞傷害性の強いＲＮａｓｅ１の変異株が得られるのではないかと、我々は予想している。
【００７４】
２．方法及び物質に関する詳細な説明
物質：大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞及びｐＥＴ２２ｂ（＋）は、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のノバゲン（Ｎｏｖａｇｅｎ）から得た。蛍光性リボヌクレアーゼ基質６−ＦＡＭ−ｄＡｒＵ（ｄＡ）２−６−ＴＡＭＲＡは、アイオワ州コラルビル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ）のインテグレーテッドＤＮＡテクノロジーズ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から得た。酵素は、ウィスコンシン州マジソン（Ｍａｄｉｓｏｎ）のプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）から得た。Ｋ−５６２細胞は、バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）から得た。細胞培養媒体及び助剤は、カリフォルニア州カールスバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ）のインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から得た。［メチル−3Ｈ］チミジン（６．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ）は、マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ）のパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）から得た。Ｈｉｔｒａｐ  ＮＨＳ−エステル・カラムは、ニュージャージー州ピスカタウエイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）のアメルシャム・バイオサイエンシズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）から得た。ＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳ−エステル・カラムの付属品としてのリボヌクレアーゼＡタイプＩＩＩ−Ａは、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）のシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）から得た。セントルイスのシグマ・アルドリッチから得たＭＥＳ緩衝液は、微量のオリゴマー性ビニルスルホン酸を除去するためにアニオン交換クロマトグラフィにより精製した。他のすべての化学物質は市販の試薬級又はそれ以上の品質のものでありさらなる精製はせずにそのまま用いた。テリフィック・ブロス（ＴＢ：Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ）は、１．００Ｌ中に、トリプトン（１２ｇ）、酵母エキス（２４ｇ）、グリセロール（４ｍＬ）、ＫＨ２ＰＯ４（２．３１ｇ）、及びＫ２ＨＰＯ４（１２．５４ｇ）を含む。ホスフェート緩衝食塩水（ＰＢＳ：ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）ｐＨ７．４は、１．００Ｌ中に、ＮａＣｌ（８．０ｇ）、ＫＣｌ（２．０ｇ）、Ｎａ２ＨＰＯ４・７Ｈ２Ｏ（１．１５ｇ）、ＫＨ２ＰＯ４（２．０ｇ）、及びＮａＮ３（０．１０ｇ）を含む。
【００７５】
装置：蛍光測定は、ニュージャージー州サウス・ブルンスウイック（Ｓｏｕｔｈ  Ｂｒｕｎｔｈｗｉｃｋ）のフォトン・テクノロジー・インターナショナル（Ｐｈｏｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）の試料撹拌付きクアンタマスター１（ＱｕａｎｔａＭａｓｔｅｒ１）光子計数蛍光計を用いて行った。熱変性データは、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）のバリアン（Ｖａｒｉａｎ）のケアリー（Ｃａｒｙ）温度調節器を備えたケアリー３ダブルビーム分光光度計を用いて集めた。ゲノムＤＮＡ中への［メチル−３Ｈ］チミジンの組み込みは、マサチューセッツ州ウエルズリー（Ｗｅｌｌｅｓｌｅｙ）のパーキンエルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）のミクロベータ・トリルックス（Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｔｒｉｌｕｘ）液体シンチレーション及びルミネッセンス計数器を用いたシンチレーション計数により定量した。リボヌクレアーゼ１及びその変異株の質量は、カリフォルニア州フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）のアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）のボイジャー・デプロ・バイオスペクトロメトリ・ワークステーション（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＰＲＯ  Ｂｉｏｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ）を用いて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光法により確認した。
【００７６】
ＲＮａｓｅ１の精製：ＲＮａｓｅ１は、先に説明した同じ酸化リフォールディング法を用いて封入体から精製した。19ＲＮａｓｅ１の変異株は、製造者のプロトコルに従って、カリフォルニア州ラ・ホーヤ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）のストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のクイックチェンジ部位特異的突然変異生成又はクイックチェンジ・マルチ部位特異的突然変異生成により創った。変異株は、野生型ＲＮａｓｅ１の場合に用いた手順と同じ手順を用いて精製した。19位置１９にフリーのシスティン残基を有するＲＮａｓｅ１の変異株は、蛍光プローブを取り付ける前に５，５’−ジチオ−ビス（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）で保護した。次いで、使用直前に、ＴＮＢで保護した変異株は、３倍モル過剰のジチオスレイトール（ＤＴＴ）を用いて保護基を外し、ニュージャージー州ピスカタウエイのアメルシャム・バイオサイエンシズのＰＤ−１０脱塩カラムを用いてクロマトグラフィにより塩を除去した。ミズーリ州セントルイスのシグマ・アルドリッチから得た５−ヨードアセトアミド・フルオレセインとのＲＮａｓｅ１複合体は、１０倍モル過剰の５−ヨードアセトアミド・フルオレセインとの２５℃における４−６時間の反応により調製した。複合体は、ＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＦＦカラムを用いてクロマトグラフィにより精製した。ＲＮａｓｅ１及びその変異株の分子質量は、ボイジャー・デプロ・バイオスペクトロメトリ・ワークステーションを用いて、マトリックス支援レーザー脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）質量分光法により確認した。
【００７７】
ｈＲＩの精製：ｈＲＩは先に説明した手順と同様に精製した。要するに、ｈＲＩの場合ｃＤＮＡを含むｐＥＴ−２２ｂ（＋）プラスミドは、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に変換し、次いで、単一コロニーを用いてアンピシリン（１５０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ媒体（２５ｍＬ）に植菌した。スタート時の培養液を３７℃、２５０ｒｐｍにて１６時間増殖し、アンピシリン（２００μｇ／ｍＬ）を含むＴＢ媒体（１．００Ｌ）の培養液に植菌した。
【００７８】
これらの培養液は、ＯＤ600が３．０以上になるまで３７℃、２２５ｒｐｍにて増殖させた。ｈＲＩｃＤＮＡの発現は、ＩＰＴＧ（０．５ｍＭ）を添加して誘発され、１８℃、２２５ｒｐｍにて１６時間増殖させた。細菌は、遠心分離（１２，０００×ｇで１０分間）により集め、ＥＤＴＡ（１０ｍＭ）及びＤＴＴ（１０ｍＭ）を含む３０ｍＬの５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ緩衝液に、ｐＨ７．５で再懸濁させた。細菌はフレンチ圧力セルに２度通して溶解させ、細胞の破片は超遠心分離により除去した。ＲＮａｓｅ  Ａは、製造者のプロトコルに従って２つの５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  ＮＨＳエステル・カラムにおいて樹脂に共有結合させた。上澄みは、直列に接続したこれら２つのカラムに装填した。ＲＮａｓｅ  Ａ親和性カラムから溶離したピークは、ＤＴＴ（１０ｍＭ）及びＥＤＴＡ（１ｍＭ）を含む４Ｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液に、ｐＨ７．５で１６時間透析し、更にＨｉＴｒａｐ  Ｑカラムを用いてクロマトグラフィにより精製した。46溶離したｈＲＩの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９９％を超えていることが証明された（データは示されていない）。
【００７９】
錯体の精製：精製ＲＮａｓｅ１（５０ｍｇ／ｍＬ）及びｈＲＩ（１０ｍｇ／ｍＬ）を、それぞれ、１．２〜１．０のモル比で混合した。この溶液を２５℃で６０分間培養して錯体を形成させた。この錯体を、ＤＴＴ（１０ｍＭ）及びグリセロール（２容量％）を含む、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液と、ｐＨ７．５で予め平衡化した５ｍＬのＨｉＴｒａｐ  Ｑカラムに装填した。この錯体は、直線的傾斜の３０カラム容量以上のＮａＣｌ（０−０．４Ｍ）を用いて溶離させた。フリーのＲＮａｓｅ１は貫流で溶離し、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体は約０．１５ＭのＮａＣｌで溶離した。精製した錯体は、ＤＴＴ（１０ｍＭ）及びグリセロール（２容量％）を含む、２０ｍＭのＨｅｐｅｓ−ＮａＯＨ緩衝液に対して、ｐＨ７．５にて、４℃で１６時間透析した。最後に、この錯体は、ドイツ・ハノーバーのビバサイエンス（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）ＡＧのＶｉｖａｓｐｉｎ２０ｍＬ遠心濃縮装置で、６，０００×ｇにて最終濃度が１０ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。アリコートは急速冷凍し、−８０℃で貯蔵した。
【００８０】
結晶化：ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の結晶は、精製ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１（０．９μＬ）及びクエン酸塩緩衝溶液（５．１μＬ）の混合物を含む懸滴溶液とともにメチルエーテルＰＥＧ２０００（容積対重さで１０％）、硫酸アンモニウム（１ｍＭ）、及びＤＴＴ（２５ｍＭ）を含む、ｐＨ４．２の２０ｍＭクエン酸ナトリウム緩衝液における懸滴蒸気拡散により得られた。回折品質の結晶は２５℃で１週間以内に成長した。たんぱく質結晶は、２５容量％まで増量したエチレングリコールを含む貯蔵溶液に浸漬し、極低温窒素ガス流において急速冷却した。
【００８１】
回折データは、アルゴンヌ・ナショナル・ラボラトリーズ（Ａｒｇｏｎｎｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）のＳＥＲ−ＣＡＴ  Ｓｅｃｔｏｒ２２で集めた。この結晶はデータ収集中１００Ｋに維持し、Ｘ線は０．９９９９７Åの波長に合わせた。回折画像は、ＨＫＬ２０００を用いて統合し、縮尺を変えた。フェーズは、出発モデルとしてＰＤＢ入力１ＤＦＪを有するＣＣＰ４パッケージソフトからＭＯＬＲＥＰを用いて分子置換を介して測定した。Ａｒｐ−Ｗａｒｐ50を用いて初期モデルを造り、該モデルはＸｆｉｔ51を用いて造るモデルの交互サイクル及びＲＥＦＭＡＣを用いた洗練さを備えていた。リボヌクレアーゼ阻害剤と錯体を形成したヒト・リボヌクレアーゼ阻害剤のｘ−線構造の構造座標は、引用により全体が本明細書に組み込まれているアセッション又は識別番号１Ｚ７Ｘを有するプロテインデータバンク（ＰＤＢ）に預けられた。
【００８２】
リボ核酸分解活性：リボヌクレアーゼ１及びその変異株のリボ核酸分解活性を、６−ＦＡＭ−ｄＡｒＵ（ｄＡ）2−６−ＴＡＭＲＡを用いて定量した。ウリジン・リボヌクレオチドにおけるこの基質の開裂により、蛍光が１８０倍に上がる。ＮａＣｌ（０．１０Ｍ）を含む、ｐＨ６．０の２ｍｌの０．１０ＭのＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液において、２３（±２）℃でアッセイを行った。蛍光データは、下記式
ｋcat／ＫM＝（ΔＩ／Δｔ）／（（Ｉf−Ｉo）［Ｅ］）
に合致し、式中ΔＩ／Δｔは初期反応速度を表し、Ｉoはリボヌクレアーゼを添加する前の蛍光強度であり、Ｉfは完全な基質加水分解後の最終蛍光に相当し、［Ｅ］は総リボヌクレアーゼ濃度である。
【００８３】
立体構造の安定性：立体構造の安定性は２８７ｎＭにおける吸光度の温度の上昇による変化に従って決定した。ＰＢＳ中にリボヌクレアーゼ（０．１−０．２ｍｇ／ｍＬ）を含むＰＢＳの温度を０．１５℃／ｍｉｎにて２０から８０℃へ上げた。Ａ287は１℃間隔で測定し、吸光度の変化は変性の２状態モデルに合致しており、該モデルでは遷移曲線の中点における温度はＴmに対応している。
【００８４】
ＲＩ回避：ｈＲＩに対するＲＮａｓｅ１変異株の親和性は、先に報告した少し変更した蛍光競合アッセイを用いて測定した。要するに、ＤＴＴ（５ｍＭ）を含む２．０ｍＬのＰＢＳ、フルオレセイン標識付きＧ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａ（５０ｎＭ）及び標識の付いていないＲＮａｓｅ１変異株は２３（±２）℃で２０分間培養した。結合していないフルオレセイン標識付きＧ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａの初期蛍光強度は、３分間監視した（励起：４９１ｎｍ，発光：５１１ｎｍ）。次いで、ｈＲＩを５０ｎＭまで加え、最終蛍光強度を測定した。ユタ州ソルトレークシティーのレッドロック・ソフトウエア（Ｒｅｄ  Ｒｏｃｋ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）のプログラムＤＥＬＴＡＧＲＡＰＨ５．５を用いて結合等温線の非線形最小二乗分析により、Ｋd値を得た。ｈＲＩとフルオレセイン標識付きＧ８８ＲＲＮａｓｅ  Ａとの錯体のＫd値は、１．４ｎＭである。
【００８５】
運動アッセイ：ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との錯体の解離速度定数は、先に説明した手順と類似の手順により測定した。要するに、ｈＲＩとフルオレセイン標識付きＲＮａｓｅ１変異株との等モル濃度により、ＤＴＴ（５ｍＭ）含有ＰＢＳにおいて平衡に到達させることができた。等モル濃度では、Ｋd値は、各ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体について以前に測定した値よりも２０倍高かった。平衡に到達後、１００モル過剰の野生型ＲＮａｓｅ  Ａ（シグマ・アルドリッチ）を加えてフリーｈＲＩを除去した。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１変異株錯体が不可逆的に解離した時に蛍光が増加した。解離速度定数、ｋd、を計算するために、これらのデータを式１に合致させた。式中、Ｆoは野生型ＲＮａｓｅ  Ａを添加する前の蛍光であり、Ｆooは錯体が完全に解離した後の蛍光である。
Ｆ＝Ｆo＋(Ｆoo−Ｆo)（１−ｅkdl）    （１）
【００８６】
細胞傷害性：Ｋ−５６２細胞の増殖に対するＲＮａｓｅ１及びその変異株の作用を、先に説明したとおりに調べた。要するに、リボヌクレアーゼとともに４４時間培養後、Ｋ−５６２細胞は［メチル−3Ｈ］チミジンで４時間処理し、細胞のＤＮＡ内への放射性チミジンの組み込みを液体シンチレーション計数により定量した。結果は、ＰＢＳのみを加えた対照Ｋ−５６２細胞への組み込みと比較した、ＤＮＡ内に組み込まれた［メチル−3Ｈ］チミジンのパーセンテージとして示している。データは各濃度の３度の測定の平均値であり、実験全体は三重に繰り返した。ＩＣ50の値は、非線形回帰を用いた曲線を式２に合致させて計算し、νは［メチル−3Ｈ］チミジン・パルスに続く総ＤＮＡ合成であり、ｈは曲線の勾配である。
【００８７】
【数１】
2008546391.tif 000003
【００８８】
結果
ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との間の重要な相互作用
ＲＮａｓｅ１及びＲＮａｓｅ  Ａは、７０％の配列同一性を共有するが、先の突然変異生成に関する研究は、これらがＲＩにより認識される方法に変動があることを示唆している。ＲＩ結合におけるこれらの違いを構造的に明らかにするために、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の結晶を本明細書で以下に説明するように低イオン性条件下で成長させた。この構造は、Ｒ値０．１７５（Ｒフリーは０．２３６）に、及び解像度１．９５Åに洗練した（表１）。
【００８９】
【表１】
2008546391.tif 000004
【００９０】
aＲmerge＝３h３i*Ｉi（ｈ）−＜Ｉ（ｈ）＞／３h３iＩi（ｈ）
式中、Ｉi（ｈ）は反射の個々の測定の強度であり、＜Ｉ（ｈ）＞は反射の平均強度である。
bＲcryst＝３h**Ｆobs*−*Ｆcalc**／３h*Ｆobs，式中、Ｆobs及びＦcalcは、それぞれ、実測及び計算した構造因子振幅である。
cＲfreeは、構造洗練から削除されたランダムに選択された固有の反射の５．０％を用いてＲcryst  として計算した。
【００９１】
表２、３及び４は、対応の優先出願である米国特許出願第６０／６９１，３１１号の別表Ａに含まれた生のデータの分析結果の一部をまとめている。原子座標も、プロテインデータバンクに提出された（アセッション番号，Ｎｏ．１Ｚ７Ｘ）。表３は、ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との間の相互作用の分析からのデータを示し、ＲＮａｓｅ１がｈＲＩに結合される時に、ｈＲＩ中のアミノ酸残基から３．２０オングストローム未満であるヒトＲＮａｓｅ１構造中のこれらのアミノ酸残基を識別する。３．２０Åの間隔は、２つの分子の間の有意な相互作用が存在する最大間隔であり、従って、これら２つの分子の間の相互作用を変えるために置換することができる。このリストは、これらの残基の一部を含み、これらの残基の変動が、細胞傷害性分子、特に残基８８へのＲＮａｓｅ  Ａの変換を実証した。
【００９２】
【表２】
2008546391.tif 000005
【００９３】
表３及び４は、下の構造分析で使用された結晶を形成した２つの異なる分子錯体（Ｗ−Ｘ及びＹ−Ｚ）中の分子の原子位置の分析により明らかにされた、ｈＲＩとヒトＲＮａｓｅ１との間の最も密接な相互作用の位置を示している。これら２つの分子錯体の３次元構造は類似しているが、表３及び表４から分かるように同一ではない。
【００９４】
【表３】
2008546391.tif 000006
【００９５】
【表４】
2008546391.tif 000007
【００９６】
生データをこのように要約すると、アミノ酸残基Ａｒｇ３９、Ａｓｎ８８及びＡｒｇ９１は、ｈＲＩの結合を妨害するためにＲＮａｓｅ１を修飾する主な位置を表していることが理解できる。その結果、ＲＮａｓｅ１はインビボの阻害剤の作用を回避し、化学療法剤を目的としてＲＮａｓｅ１の細胞傷害性を上げることができそうである。
【００９７】
単位細胞におけるＲＮａｓｅ１の両鎖からの接触は、図１Ａに提示している。ＲＮａｓｅ  Ａの二次構造は、ｈ（α−らせん）、ｓ（β−ストランド）又はｔ（ターン）を用いて識別する。ＲＩとファンデルワールス接触又は疎水性接触している残基は青である。ＲＩと水素結合している残基は赤である。保存システィン残基は黄色である。主要な触媒残基はブラックボックスの中にある。ＲＮａｓｅ１の鎖Ｘでは（図１ａ）、結合クエン酸分子が３つのすべての触媒残基、Ｈｉｓ１２、Ｈｉｓ１１８及びＬｙｓ４１に対してタイトな水素結合を形成する。結合したクエン酸塩がＲＮａｓｅ１の裂け目に結合している基質を混乱させ、Ａｒｇ１０及びＬｙｓ６６に顕著な立体構造の変化を生じさせる。鎖ＸのＬｙｓ６６が、ｈＲＩのＡｓｎ４０６に対して水素結合を形成する。しかし、鎖Ｚでは（図１Ｂ，１Ｚ７ＸからのＲＮａｓｅ１鎖Ｚの３次元構造）、ｈＲＩの場合ファンデルワールス相互作用のみが認められた。残基は、活性部位残基が強調されないことを除いて、図１Ａの配列アラインメントと同じスキームを用いて、着色される。画像は、カリフォルニア州サウスサンフランシスコのデラノ・サイエンティフィック（ＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のプログラムＰｙＭＯＬを用いて創った。ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１及びｐＲＩ・ＲＮａｓｅ  Ａの構造の間の比較を容易にするために、15鎖Ｙ（ｈＲＩ）及びＺ（ＲＮａｓｅ１）（結合クエン酸塩なしに）は、比較のためのｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体として役立つ。
【００９８】
ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１とｐＲＩ・ＲＮａｓｅ  Ａのアルファ炭素の間の標準偏差（ｒｍｓｄ）は２．８Åである。錯体間のずれの多くは、ｈＲＩとは異なり、ｐＲＩはＲＮａｓｅ  Ａと結合すると立体構造が変わるので、ｈＲＩとｐＲＩとのアラインメント（標準偏差＝１．６Å）に由来する。ＲＮａｓｅ１及びＲＮａｓｅ  Ａのアルファ炭素は、ずれが少ない（標準偏差＝０．６Å）。アンギオジェニン及びｈＲＩを用いて結晶化された他のヒト・リボヌクレアーゼであるＥＤＮは、それぞれ、ＲＮａｓｅ１から７．４及び６．３Åの標準偏差を与えた。アンギオジェニン及びＥＤＮの場合標準偏差がかなり高いのは、ヒト・リボヌクレアーゼの中に構造の変化があることを示し、ＲＮａｓｅ１とＲＮａｓｅ  Ａとの間に類似性があることを強調している。
【００９９】
ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１の錯体とｐＲＩ・ＲＮａｓｅ  Ａの錯体との間に接触残基が保護されることは、図１Ａに示されている。ＲＮａｓｅ１の活性部位表面上にＲＩ接触残基が局在化することは、図１Ｂに示されている。ＲＩとの接触残基の総数（２３）は、ＲＮａｓｅ１とＲＮａｓｅとの間に保護される。ＲＮａｓｅ１及びＲＮａｓｅ  ＡとのＲＩによる認識の違いは、ＲＩと水素結合を形成することが認められたリボヌクレアーゼ残基の数にある。ＲＮａｓｅ１では、ＲＮａｓｅ  Ａにおける８に比べて、１３の残基がＲＩに対して少なくとも１つの水素結合を形成する。
【０１００】
ＲＮａｓｅ  Ａ及びＢＳ−ＲＮＡＳＥのＲＩへの結合に関する先の研究は、３つの構造領域、即ち残基３８／３９、残基６７、及びβ４−β５ループにおける残基に焦点を当てていた。図２及び３は、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体についてこれらの領域の水素結合ネットワーク及び電子密度を強調している。ＲＮａｓｅ１のＡｒｇ３９はｈＲＩと３つの水素結合を形成するが、これらの水素結合はＲＮａｓｅ  Ａの場合Ａｒｇ３９と一緒には存在しない。ＲＮａｓｅ１のＡｒｇ３９は、Ｇｌｕ４０１と２座水素結合を、ｈＲＩのＴｙｒ４３４とは主鎖水素結合を形成する。Ａｓｎ６７からＲＩに対して形成された水素結合は、ｐＲＩ・ＲＮａｓｅ  Ａ中のＶａｌ４０５（ｈＲＩ中のＬｅｕ４０９）からｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１中のＴｙｒ４３７へ移動する。β４−β５ループは、Ａｓｎ８８、Ｇｌｙ８９及びＡｒｇ９１を含む水素結合を形成する（図２）。ＲＮａｓｅ１のＡｒｇ９１は、そのグアニジノ基の窒素からｈＲＩのＧｌｕ２８７へ２つのタイトな水素結合（＜３．０Å）を形成する（図３）。
【０１０１】
対照的に、ＲＮａｓｅ  ＡのＬｙｓ９１は、ｐＲＩのＧｌｕ２８７から離れていき、水素結合は認められなかった。15補完性領域の構造環境に基づいて、ＲＮａｓｅ１の２つの変異株がデザインされた。ＲＮａｓｅ１の１つの変異株（Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｒｌ  ＲＮａｓｅ１）は、位置３８／３９におけるアミノ酸交換及び位置６７及び８８におけるかさばった残基の組み込みにより、ＲＮａｓｅ  Ａの最も細胞傷害性の強い変異株（Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａ）を再現している。他のＲＮａｓｅ１変異株（Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１）は、同じ領域を利用しているが、立体容積の代わりにＲＩの結合を抑制するために静電反発を利用している。
【０１０２】
リボ核酸分解活性
ＲＩの存在下でＲＮＡを開裂するリボヌクレアーゼの能力は、インビトロにおけるその細胞傷害性と緊密に相関している。ＲＮａｓｅ変異株では、その細胞傷害性能力を十分発揮するためには、ＲＩ結合を低減する突然変異は、生来の触媒活性に有害な影響を及ぼしてはならない。25その結果、ＲＮａｓｅ１の変異株は、テトラヌクレオチド基質に対するこれらの変異株の触媒活性について調べた。ＲＮａｓｅ  Ａ、ＲＮａｓｅ１及びそれらの変異株のｋcat／ＫM値は、表５に示している。野生型ＲＮａｓｅ１のｋcat／ＫM値は、先に報告された値よりも１０倍高い。強力なリボソーム阻害剤であるオリゴビニル・スルホネートを反応緩衝液から除去した時に、ＲＮａｓｅ  Ａについて触媒活性の類似の増加を測定した。
【０１０３】
【表５】
2008546391.tif 000008
【０１０４】
aｋcat／ＫM（±ＳＥ）の値は、ＮａＣｌ（０．１０Ｍ）を含む、ｐＨ６．０の２ｍｌの０．１０Ｍ  のＭＥＳ−ＮａＯＨ緩衝液（ＯＶＳフリー）において、２５℃で開裂した６−ＦＡＭ−ｄＡｒＵ（ｄＡ）2−６−ＴＡＭＲＡの触媒作用について測定した（９）。
bＲＮａｓｅ１及びその変異株のＴm（±２℃）の値は、紫外分光法によりＰＢＳ中で測定し  た。
cＫd（±ＳＥ）値は、ｈＲＩとの錯体について２５℃で測定した（１０）
dΔΔＧの値は、式：ΔΔＧ＝−ＲＴｌｎ（Ｋd野生型／Ｋd変異株）を用いて計算した。
eΔΔΔＧの値＝ΔΔＧR39D/N67D/N88A/G89D/R91D RNase 1−ΔΔＧRNase 1変異株。
fＩＣ50（±ＳＥ）の値は、リボヌクレアーゼで処置されたＫ−５６２細胞のＤＮＡ内への［メチル−3Ｈ］チミジンの組み込みに関するものであり、式１を用いて計算した。
gルツコスキ（Ｒｕｔｋｏｓｋｉ）らから。
hリー（Ｌｅｅ）らから。
iサキセナ（Ｓａｘｅｎａ）らから。
【０１０５】
ＲＮａｓｅ１のすべての変異株のｋcat／ＫM値は野生型酵素の６倍以内にある。ＲＮａｓｅ  Ａとは異なり、残基３８／３９、残基６７及びＲＮａｓｅ１のβ４−β５ループ内の残基における置換は、触媒活性に有害な影響がある。これらの残基の影響は、Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ１及びＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１の活性が、それぞれ、５倍及び３．３倍に低下することから分かる。この傾向から外れているのは、Ｒ３９Ｌ／Ｎ６７Ｌ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｌ／Ｒ９１Ｌであり、その触媒活性はこれらの残基における置換による影響を受けない。このような不一致は、置換されたロイシンと基質ヌクレオチド塩基との間の好ましい疎水性相互作用を補償することから生じるように思われるが、突然変異した位置の中で基質結合に含まれることが先に提議された位置はない。
【０１０６】
Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１の中のただ１つの置換を野生型アミノ酸に戻すことにより（表５）、ｋcat／ＫM値に対する個々の突然変異の寄与を推定することができる。例えば、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１において、位置３９におけるアスパラギン酸塩残基はＮ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１において活性を２．５倍低下させる。Ｒ９１Ｄ及びＮ８８Ａの突然変異が、それぞれ、ｋcat／ＫM値を１．３倍と１．９倍に上げるので、置換Ｎ６７Ｄ又はＧ８９Ｄは、ｋcat／ＫM値を１．６倍下げる原因である。Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１における各置換の触媒活性に対する寄与は、全部で５つの単一置換のｋcat／ＫM値の総変化（２．６倍）が、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１におけるｋcat／ＫM値の３．３倍の低減に接近しているので、加法的であるように思われる。
【０１０７】
Ｒ４Ｃ／Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｌ／Ｇ８９Ｒ／Ｒ９１Ｇ／Ｖ１１８Ｃリボヌクレアーゼ１については、類似のアッセイ条件下で（１．４±０．８）×１０6Ｍ-1ｓ-1のｋcat／ＫM値を有する野生型酵素の酵素活性のほとんどすべてを維持することが判明した。
【０１０８】
熱安定性
リボヌクレアーゼの熱安定性は、たんぱく質分解の影響を受けやすく、そのために細胞傷害性とも関連している。すべてのＲＮａｓｅ１変異株のＴm値は表５に示している。野生型のＲＮａｓｅ１のＴm値は、先に報告した値に近い。以前の研究と一致して、ＲＮａｓｅ１の表面に荷電パッチを組み込んでも、Ｔm値は６℃以上は下がらない。残基３８／３９、残基６７におけるアルギニン置換も、アスパラギン酸塩置換も、あるいはβ４−β５ループ内の残基も、Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ１及びＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１が野生型ＲＮａｓｅ１と同等のＴm値（それぞれ、６１及び５８℃）を有するので、立体構造上の安定性をあまり乱さない。立体的安定性の最大の変化は、アスパラギン酸塩置換の特定の組み合わせの場合に認められる。例えば、Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ及びＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｒ９１ＤはＴm値を６℃下げ、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄは３℃下げる。これらＲＮａｓｅ１の各々は、Ｎ６７ＤとＲ９１Ｄとの両方の置換を有し、Ｎ６７Ｄ又はＲ９１Ｄ置換のみを有する変異株は野生型の安定性を有する。位置６７及び９１は、ＲＮａｓｅ１活性部位の反対側に位置しているので、熱安定性に対するこれらの相乗的寄与に関する説明を行うには更に研究を必要とする。全体としては、ＲＮａｓｅ１のすべての変異株は生理学的温度を超えても十分安定である。
【０１０９】
リボヌクレアーゼ阻害剤の回避
ＲＩは、フェムトモルの領域に、平衡解離定数を有し、最もタイトな非共有結合的生物相互作用の１つを形成する、ＲＮａｓｅ  Ａスーパーファミリーの複数のメンバーと結合する。ＲＮａｓｅ  Ａの残基３８／３９、６７及び８８（Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａ）を突然変異することにより、ｈＲＩ・ＲＮＡＳＥＡ錯体の平衡解離定数が７桁上がった（表５）。ＲＮａｓｅ１の類似の変異株（Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ１）は、野生型に近い親和性を維持した（表５）。しかし、Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ１の中のアルギニン残基を複数のアスパラギン酸塩残基及び１つのアラニン残基で置換すると、ＲＮａｓｅ１に対するＲＩの親和性がほぼ１０7倍低下する。Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１（１．７μＭ）のＫd値は、あらゆるＲＮａｓｅ  Ａ変異株（２．９μＭ）について測定した最高値に近い。Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１のアスパラギン酸塩置換を、等比体積のアミノ酸であるロイシン（Ｒ３９Ｌ／Ｎ６７Ｌ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｌ／Ｒ９１Ｌ  ＲＮａｓｅ１）で置き替えると、平衡解離定数は５０倍に上がる。ロイシン置換は、静電引力のロス及び立体障害により、７ｋｃａｌ／ｍｏｌのＲＩ結合エネルギーが分裂するが、同じ位置においてアスパラギン酸塩残基の静電反発により更に、２．４ｋｃａｌ／ｍｏｌの結合エネルギーが乱される。
【０１１０】
表６では、ＲＩ回避に対する静電力の影響が更に拡大され、ｈＲＩの錯体及び２つのフルオレセインで標識を付けたＲＮａｓｅ１変異株の個々の運動速度定数が示されている。解離速度は、ＲＮａｓｅ１においてＲ３９Ｌ／Ｎ６７Ｌ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｌ／Ｒ９１Ｌの置換で野生型ＲＮａｓｅ１より１４００倍速くなるが、アスパラギン酸塩置換（Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１）ではほとんど一定（２倍に増加）のままである。会合速度は、ロイシン置換（１１０倍低下）及びアスパラギン酸塩置換（２５倍低下）により、より比例的に影響を受ける。ロイシンの場合も、アスパラギン酸塩の場合も、会合速度にかなりの変化が見られ、ｋon値、引力（ロイシン置換）及び反発力の取得（アスパラギン酸塩置換）を下げることができる２つの静電力を実証している。全体としては、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１に対するｈＲＩの結合親和性のほぼ１０7倍の低下には、解離速度（３１００倍）及び会合速度（２７００倍）による同等の寄与が含まれている。しかし、Ｒ３９Ｌ／Ｎ６７Ｌ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｌ／Ｒ９１Ｌ  ＲＮａｓｅ１を越えたＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１のＫd値の５０倍の追加低下は、会合速度の低下により促進される。
【０１１１】
【表６】
2008546391.tif 000009
【０１１２】
aｋoff（±ＳＥ）の値は、ｈＲＩからのフルオレセインで標識を付けたＲＮａｓｅ１変異株の放出量の時間による変化を追跡し、曲線を式１に合致させて決定した。括弧内の値は野生型ＲＮａｓｅ１からの低下倍率を示す。
bｋonの値は式、Ｋd＝ｋoff／ｋonを用いて計算した。括弧内の数値は野生型ＲＮａｓｅ１からの低下倍率を表している。
cｋoffの値は式、Ｋd＝ｋoff／ｋonを用いて計算した。式中、Ｋd値はＢｏｉｘらから得た値であり、ｋon値はｈＲＩ・ＲＮＡＳＥＡに関する値であり、Ｌｅｅらから得た。
dｈＲＩ・ＲＮＡＳＥＡに関するｋonの値はＬｅｅらから得た。
【０１１３】
Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１の全体の結合定数に対する、該ＲＮａｓｅ１における個々の突然変異の影響は、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１における各置換を野生型アミノ酸に戻すことにより明らかにする。表５では、ＲＩ親和性にほとんど影響を及ぼさない残基のΔΔΔＧ値が小さくなっている。ΔΔΔＧ値が小さくなっているのは、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１において、１つの残基が野生型アミノ酸残基に戻された時にΔΔΔＧ値の変化が小さいことを反映したものである。ΔΔΔＧ値のランクは突然変異に対するエネルギー寄与により決まり、Ｎ８８Ａ＜Ｇ８９Ｄ＜Ｎ６７Ｄ＜Ｒ３９Ｄ＜Ｒ３１Ｄのようになっている。
【０１１４】
図４Ａは、各ＲＮａｓｅ１変異株の結合等温線をプロットし、ｈＲＩに対するＲＮａｓｅ１変異株の親和性を示している。ｈＲＩに対する結合は、フルオレセインで標識を付けたＧ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａ（５０ｎＭ）を用いた競合アッセイにより測定した。結合Ｆ*−Ａ１９Ｃ  Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａの濃度は、ｈＲＩと結合した時に出るフルオレセイン発光の低下を追跡して測定した。データ点は、少なくとも３つの別々の平均測定値（±ＳＥ）である。ｈＲＩ親和性が低減する順番の変異株：Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ（■）、Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ（△）、Ｒ３９Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ（●）、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｒ９１Ｄ（○）、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ（▼）、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ（□）である。この実験の結果は、個々の突然変異について上で示した傾向と同じ傾向を示している。位置９１のアスパラギン酸塩は、回避に対してエネルギー面で２．８ｋｃａｌ／ｍｏｌ寄与し、他の残基よりも０．６ｋｃａｌ／ｍｏｌ多い。逆に、８８と８９の両方の位置において、アスパラギン酸塩の寄与はわずか１．５ｋｃａｌ／ｍｏｌにすぎず、これは他のいかなる置換のエネルギー寄与よりも低く、異種残基がｐＲＩ・ＲＮａｓｅ  Ａに比べてｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体形成においてより重要な役割を果たしていることを示している。
【０１１５】
Ｒ４Ｃ／Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｌ／Ｇ８９Ｒ／Ｒ９１Ｇ／Ｖ１１８Ｃ  ＲＮａｓｅ１について、ｈＲＩとＲ４Ｃ／Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｌ／Ｇ８９Ｒ／Ｒ９１Ｇ／Ｖ１１８Ｃ  ＲＮａｓｅ１との錯体のＫdの値は（５．５±１．６）×１０-8Ｍであることが判明した。野生型ＲＮａｓｅ１とｈＲＩとの錯体の平衡解離定数、Ｋd、の値は、分からないが、ウシの膵臓のリボヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ  Ａ）とブタのＲＩとの錯体のＫd値は１０-14に近いようである。
【０１１６】
荷電及び細胞傷害性
リボヌクレアーゼの細胞傷害性は、先行リボヌクレアーゼの属性及びリボヌクレアーゼの分子荷電のすべてにより支配される。リボヌクレアーゼの分子荷電と細胞傷害性との間の相互作用は、図４Ｂ及び表５の結果から分かる。
【０１１７】
特に、図４Ｂは、Ｋ−５６２細胞の増殖に対するリボヌクレアーゼの作用を示している。細胞性ＤＮＡ内への［メチル−3Ｈ］チミジンの組み込みを用いて、リボヌクレアーゼ存在下のＫ−５６２細胞の増殖を監視した。データ点は、三重に行われた少なくとも３つの別々の実験の平均値（±ＳＥ）である。変異株を細胞傷害性が増加する順番で示すと、次のようになる。Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａ（△）、Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａ（○）、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１（▲）、Ｒ３９Ｌ／Ｎ６７Ｌ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｌ／Ｒ９１Ｌ  ＲＮａｓｅ１（●）、Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１ＤＲＮａｓｅ１（◆）、Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８ＲＲＮａｓｅ１（■）及び野生型ＲＮａｓｅ１（□）である。表５からのＲＮａｓｅ１の他のすべての変異株は、Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ１の曲線と同等の曲線を有し、明確にするためのものは示されていない。
【０１１８】
図４Ｂは、Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａが、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１に比べて、同じ立体構造上の安定性、６倍高いｋcat／ＫM値、３倍低いＫd値を有するが、これらのＩＣ50値は非比例的に大きく８７倍異なる。Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１ＤＲＮａｓｅ１のＩＣ50値はわずかに１３．３μＭであり、毒性は、野生型ＲＮａｓｅ１よりも強い（図４）が、Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａより２倍低い。Ｄ３８Ｒ／Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｒ／Ｇ８８Ｒ  ＲＮａｓｅ  Ａ（＋６）とＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１（０）との間で有意に異なる唯一の生化学特性は、正味荷電である。
【０１１９】
表５からＲＮａｓｅ１の他の変異株のＩＣ50値はすべて、このアッセイの測定可能範囲の外側にある。しかし、Ｒ３９Ｌ／Ｎ６７Ｌ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｌ／Ｒ９１Ｌ  ＲＮａｓｅ１及びＮ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１は、２５μＭでＫ−５６２細胞の約６０％を壊し（図４）、これらのＩＣ50値を２５μＭより少し上にした。Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１ＤＲＮａｓｅ１以外の大抵のＲＮａｓｅ１変異株の細胞傷害性に欠陥があるのは、ＲＩに対する親和性の増加又はＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１に比べて熱安定性がないことにより説明することができる。この傾向から外れているのはＮ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１であり、そのＫd値はＲ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄの５７倍低く、そのＩＣ50値はわずか２倍高いと推定されている。Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１の異常な細胞傷害性の一部は、Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１よりも触媒活性が３倍上がっていることによるものと考えられるが、増加した活性はＮ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１の不釣合いに高い細胞傷害性を完全に説明することはできない。
【０１２０】
更に、ヒトの慢性骨髄性白血病細胞系Ｋ−５６２を用いて我々が行ったアッセイでは、野生型ＲＮａｓｅ１は＞５０μＭのＩＣ50値を有する。対照的に、Ｒ４Ｃ／Ｇ３８Ｒ／Ｒ３９Ｇ／Ｎ６７Ｒ／Ｎ８８Ｌ／Ｇ８９Ｒ／Ｒ９１Ｇ／Ｖ１１８Ｃ  ＲＮａｓｅ１は、１５μＭのＩＣ50値を有するかなりの細胞傷害活性を呈する。
【０１２１】
総合すれば、先行実施例は、触媒効果を少し犠牲にして、変異株がＲＩ結合を回避するようにｈＲＩとＲＮａｓｅ１との間の静電相互作用を利用した細胞傷害性リボヌクレアーゼ変異株の創製を実証している。本発明は、この出願で開示された特定の実施形態に限定されず、特許請求の範囲内にある実施形態の変形形態をすべて包含することは明らかである。
【０１２２】
化学療法剤としてのヒト・リボヌクレアーゼ
リボヌクレアーゼは癌の化学療法剤として大いに有望である。12ノーザンヒョウガエルからのＲＮａｓｅ１の同族体である、ＯＮＣは、現在、悪性中皮腫の治療のためのフェーズＩＩＩの臨床試験が行われている。しかし、ＲＮａｓｅ１の薬物療法剤は、高い触媒活性、13低い腎臓毒性、及び低い免疫原性を含む、ＯＮＣを越えた複数の利点を有する。自然界では細胞傷害性ではないリボヌクレアーゼの薬物療法学を発展させるためには、熱安定性、触媒活性、電荷、及び特にＲＩ回避を含む複数の生化学属性について注意深く検討する必要がある。
【０１２３】
ｈＲＩに対する親和性が低いＲＮａｓｅ１の変異株は、自然のアミノ酸置換を用いて遺伝子操作することが困難であった。しかし、ｈＲＩ・ＲＮａｓｅ１錯体の結晶構造から得られた構造及び静電に関する情報を用いて、我々は、ミクロモル領域においてＲＩに対して親和性を有するＲＮａｓｅ１の変異株をデザインすることにより細胞傷害性に対するこの障害を除去した。Ｒ３９Ｄ／Ｎ６７Ｄ／Ｎ８８Ａ／Ｇ８９Ｄ／Ｒ９１Ｄ  ＲＮａｓｅ１は、ほぼ、生来の触媒活性及び立体構造上の安定性を有するが、その細胞傷害性は低い正の電荷（表５及び図４）により妨害される。低い正味の電荷を有するリボヌクレアーゼ変異株は、類似の活性、安定性及びＲＩ親和性を有するリボヌクレアーゼに比べた場合、高いＩＣ50値を有する。13しかし、リボヌクレアーゼ上の電荷は、末端に、ＲＮａｓｅ  Ａの毒性を増加させる追加の正電荷を加えることにより増大させることができる。ｈＲＩによるＲＮａｓｅ１の抑制を大幅に低減することにより、我々は、リボヌクレアーゼ細胞傷害性に対するバリアを排除し、ヒト・リボヌクレアーゼをベースにした療法への道を開いた。
【０１２４】
リボヌクレアーゼとＲＩとの間のタイトで抑制的な錯体が、たんぱく質間の錯体の会合に対して静電力の影響を調べる優れたモデル・システムを提供した。このために、我々は、ｈＲＩとこれらの相互作用は予測することは困難であったＲＮａｓｅ１、ＲＮａｓｅ  Ａの構造及び配列同族体について考えた。ｈＲＩとの錯体におけるＲＮａｓｅ１のＸ線結晶構造を測定し、主要な静電突然変異多発箇所を調べて、我々は、ｈＲＩに対してミクロモルの親和性を有するＲＮａｓｅ１の変異株を創ることができた。主要な荷電残基の置換により、結合親和性の変化が最大となり、たんぱく質間の相互作用のアンカー残基、静電アンカー残基の新種が示唆される。Ａｒｇ３９又はＡｒｇ９１のような静電アンカーの突然変異は、錯体の会合速度に影響を及ぼすことにより親和性を変える。我々は、ＲＮａｓｅ１に対する静電アンカーを利用することによりＲＮａｓｅ１に対するｈＲＩの親和性を１０7倍低下させた。従って、ＲＩ結合を回避するＲＮａｓｅ１の変異株は、ヒト・リボヌクレアーゼを用いた化学療法剤の開発における大きな工程を表している。
【０１２５】
上の説明で言及されたすべての刊行物及び特許は、あたかも本明細書で明らかに説明したかのように、引用により本明細書に組み込まれている。前述の発明は、理解を深めるために実例及び実施例によりかなり詳細に説明したが、本発明の特定の適用は、当業者にとっては日常最適化の問題であり、本発明の意図又は添付した特許請求の範囲から逸脱することなく実施することができる。
【０１２６】
関連文献
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【図面の簡単な説明】
【０１２７】
【図１Ａ】ＲＮａｓｅ１及びＲＮａｓｅ  Ａの残基とＲＩが接触していることを示した図であり、ＲＮａｓｅ  Ａ及びＲＮａｓｅ１のアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図１Ｂ】ＲＮａｓｅ１及びＲＮａｓｅ  Ａの残基とＲＩが接触していることを示した図であり、ＰＤＢ識別番号１Ｚ７ＸからのＲＮａｓｅ１鎖Ｚの３次元構造を示す。
【図２Ａ】ＲＩに結合した時のＲＮａｓｅ１及びＲＮａｓｅ  Ａのβ４−β５ループの色分けした比較を示した図である。
【図２Ｂ】ＲＩに結合した時のＲＮａｓｅ１及びＲＮａｓｅ  Ａのβ４−β５ループの色分けした比較を示した図である。
【図３Ａ】ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との間の主要な形状補完性残基の１σにおける電子密度を示した図である。
【図３Ｂ】ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との間の主要な形状補完性残基の１σにおける電子密度を示した図である。
【図３Ｃ】ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との間の主要な形状補完性残基の１σにおける電子密度を示した図である。
【図４Ａ】ＲＮａｓｅ１及びその変異株のｈＲＩ親和性及び細胞傷害性を示した図である。
【図４Ｂ】ＲＮａｓｅ１及びその変異株のｈＲＩ親和性及び細胞傷害性を示した図である。
【図５Ａ】ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との相互作用の静電表現を示した図である。
【図５Ｂ】ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との相互作用の静電表現を示した図である。
【図５Ｃ】ｈＲＩとＲＮａｓｅ１との相互作用の静電表現を示した図である。
【図１】
2008546391.tif 000011
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2008546391000001.xml
【国際調査報告】
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