(57)【要約】組織−選択的プロモーター配列、および組織−選択的プロモーター配列に操作可能にカップリングされた第二のプロモーター配列であって、最小ウイルスプロモーター配列を含む第二のプロモーター配列を含むプロモーターが開示される。これらのプロモーター配列を含む核酸および組成物も開示される。また、組織−選択的プロモーター配列を、最小ウイルスプロモーター配列を含む第二のプロモーター配列と操作可能にカップリングさせることを含む、組織−選択的プロモーターの機能を改良する方法も開示される。また、遺伝子を細胞に送達する方法、過剰増殖性疾患を持つ被験体を治療する方法、および本明細書中に記載された新規なプロモーター配列の使用を含む細胞をイメージングする方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）組織−選択的プロモーター配列；および
ｂ）該組織−選択的プロモーター配列に操作可能にカップリングされた第二のプロモーター配列であって、最小ウイルスプロモーター配列を含む第二のプロモーター配列；
を含み、該組織−選択的プロモーター配列の該第二のプロモーター配列への操作可能なカップリングの結果、該組織−選択的プロモーター配列の改良されたプロモーター機能がもたらされる、プロモーター。
【請求項２】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、またはＡＦＰプロモーター配列ヒトα−ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒツジβ−ラクトグロブリンプロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、アデノウイルスＶＡ１プロモーター配列、ヒトｔＲＮＡプロモーター配列、５ＳリボソームＲＮＡプロモーター配列、またはこれらのプロモーター配列のいずれかの機能的ハイブリッドまたは組合せである、請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
前記組織−選択的プロモーター配列が腫瘍−選択的プロモーター配列としてさらに定義される、請求項１記載のプロモーター。
【請求項４】
前記組織−選択的プロモーター配列が低酸素症−特異的プロモーター配列である、請求項１記載のプロモーター。
【請求項５】
前記低酸素症−特異的プロモーター配列が低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）または低酸素症誘導因子である、請求項４記載のプロモーター。
【請求項６】
前記低酸素症誘導因子がＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、またはＨＩＦ−３αである、請求項５記載のプロモーター。
【請求項７】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列である、請求項１記載のプロモーター。
【請求項８】
前記ｈＴＥＲＴプロモーター配列が配列番号１である、請求項７記載のプロモーター。
【請求項９】
前記最小ウイルスプロモーター配列がアデノウイルスプロモーター配列、バキュロウイルスプロモーター配列、ＣＭＶプロモーター配列、パルボウイルスプロモーター配列、ヘルペスウイルスプロモーター配列、ポックスウイルスプロモーター配列、アデノ−関連ウイルスプロモーター配列、セミリキフォレストウイルスプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ワクシニアウイルスプロモーター配列、またはレトロウイルスプロモーター配列である、請求項１記載のプロモーター。
【請求項１０】
前記最小ウイルスプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項９記載のプロモーター。
【請求項１１】
前記ミニ−ＣＭＶ配列が配列番号２である、請求項１０記載のプロモーター。
【請求項１２】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列であり、前記第二のプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項１記載のプロモーター。
【請求項１３】
前記プロモーターが配列番号３を含む、請求項１２記載のプロモーター。
【請求項１４】
プロモーターを含む核酸であって、該プロモーターは：
ａ）組織−選択的プロモーター配列；および
ｂ）第一のプロモーター配列に操作可能にカップリングされた第二のプロモーター配列であって、最小ウイルスプロモーター配列を含む第二のプロモーター配列；
を含み、該組織−選択的プロモーター配列の該第二のプロモーター配列への操作可能なカップリングの結果、該第一のプロモーター配列の改良されたプロモーター機能がもたらされる、核酸。
【請求項１５】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、ＡＦＰプロモーター配列、ヒトα−ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒツジβ−ラクトグロブリンプロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、アデノウイルスＶＡ１プロモーター配列、ヒトｔＲＮＡプロモーター配列、５ＳリボソームＲＮＡプロモーター配列、またはこれらのプロモーター配列のいずれかの機能的ハイブリッドまたは組合せである、請求項１４記載の核酸。
【請求項１６】
前記組織−選択的プロモーター配列が腫瘍−選択的プロモーター配列としてさらに定義される、請求項１４記載の核酸。
【請求項１７】
前記組織−選択的プロモーター配列が低酸素症−特異的プロモーター配列である、請求項１４記載の核酸。
【請求項１８】
前記低酸素症−特異的プロモーター配列が低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）または低酸素症誘導因子である、請求項１７記載の核酸。
【請求項１９】
前記低酸素症誘導因子がＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、またはＨＩＦ−３αである、請求項１８記載のプロモーター。
【請求項２０】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列である、請求項１５記載の核酸。
【請求項２１】
前記ｈＴＥＲＴプロモーター配列が配列番号１である、請求項２０記載の核酸。
【請求項２２】
前記最小ウイルスプロモーター配列がアデノウイルスプロモーター配列、バキュロウイルスプロモーター配列、ＣＭＶプロモーター配列、パルボウイルスプロモーター配列、ヘルペスプロモーター配列、ポックスウイルスプロモーター配列、アデノ関連ウイルスプロモーター配列、セミリキフォレストウイルスプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ワクシニアウイルスプロモーター配列、またはレトロウイルスプロモーター配列である、請求項１４記載の核酸。
【請求項２３】
前記最小ウイルスプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項２２記載の核酸。
【請求項２４】
前記ミニ−ＣＭＶ配列が配列番号２である、請求項２３記載の核酸。
【請求項２５】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列であって、前記第二のプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項１４記載の核酸。
【請求項２６】
前記プロモーターが配列番号３を含む、請求項２５記載の核酸。
【請求項２７】
前記プロモーターに操作可能にカップリングされた遺伝子を含むとしてさらに定義される、請求項１４記載の核酸。
【請求項２８】
前記遺伝子が治療遺伝子または選択可能マーカーである、請求項２７記載の核酸。
【請求項２９】
前記治療遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、またはホルモンをコードする遺伝子である、請求項２８記載の核酸。
【請求項３０】
前記治療遺伝子がＲｂ、ＣＦＴＲ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ−ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ  ｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、ｍｄａ７、ＦＵＳ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＡＤＰ、ｐ５３、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＹＥＳ、ＭＡＤＨ４、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＴＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、Ｒａｐ１Ａ、シトシンデアミナーゼ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ＢＲＣＡ２、ｚａｃ１、ＡＴＭ，ＨＩＣ−１、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＰＴＥＮ、ＩＮＧ１、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＯＶＣＡ１、ＭＡＤＲ２、５３ＢＰ２、ＩＲＦ−１、ｚａｃ１、ＤＢＣＣＲ−１、ｒｋｓ−３、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、β＊（ＢＬＵ）、ＬＵＣＡ−１（ＨＹＡＬ１）、ＬＵＣＡ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１（ＮＰＲＬ２）、ＳＥＭ  Ａ３またはＭＣＣである、請求項２９記載の核酸。
【請求項３１】
前記治療遺伝子がＦＵＳ１である、請求項３０記載の核酸。
【請求項３２】
前記選択可能マーカーが薬物選択マーカー、酵素、または免疫学的マーカーである、請求項２８記載の核酸。
【請求項３３】
プラスミドに含まれるものとしてさらに定義される、請求項１４記載の核酸。
【請求項３４】
前記プロモーター配列に操作可能にカップリングされたレポーター配列を含むものとしてさらに定義される、請求項１４記載の核酸。
【請求項３５】
前記レポーター配列がソマトスタチン受容体アミノ酸配列、ヨウ化ナトリウムシンポーターアミノ酸配列、真核生物緑色蛍光蛋白質アミノ酸配列、赤色蛍光蛋白質アミノ酸配列、ルシフェラーゼアミノ酸配列、β−ガラクトシダーゼアミノ酸配列、またはチミジンキナーゼアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項３４記載の核酸。
【請求項３６】
前記ソマトスタチン受容体アミノ酸配列が組換えソマトスタチン受容体アミノ酸配列、ソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列、または突然変異したソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列である、請求項３５記載の核酸。
【請求項３７】
前記ソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列がソマトスタチン受容体タイプ２Ａアミノ酸配列である、請求項３６記載の核酸。
【請求項３８】
前記レポーター配列がＩＲＥＳおよび第二の遺伝子と操作可能にカップリングされた、請求項３４記載の核酸。
【請求項３９】
前記第二の遺伝子が第二のレポーターに操作可能にカップリングされた、請求項３８記載の核酸。
【請求項４０】
前記第二のレポーターがソマトスタチン受容体アミノ酸配列、ヨウ化ナトリウムシンポーターアミノ酸配列、ルシフェラーゼアミノ酸配列、真核生物緑色蛍光蛋白質アミノ酸配列、またはチミジンキナーゼアミノ酸配列である、請求項３９記載の核酸。
【請求項４１】
前記第二の遺伝子が選択可能マーカーまたは治療遺伝子を含む、請求項３８記載の核酸。
【請求項４２】
前記第二の遺伝子が、腫瘍サプレッサー遺伝子である治療遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、またはホルモンをコードする遺伝子である、請求項４１記載の核酸。
【請求項４３】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列であり、前記第二のプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列であり、該プロモーターはＦＵＳ１をコードする遺伝子に操作可能にカップリングされ、そして、前記核酸はプラスミドに含まれる、請求項４１記載の核酸。
【請求項４４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のプロモーターを含む組成物。
【請求項４５】
被験体における細胞への前記プロモーターの送達用の送達ビヒクルを含むものとしてさらに定義される、請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
前記送達ビヒクルが核酸、プラスミド、ウイルスベクター、原核生物細胞、真核生物細胞、または脂質である、請求項４５記載の組成物。
【請求項４７】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項４６記載の組成物。
【請求項４８】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
前記脂質がリポソームに含まれる、請求項４６記載の組成物。
【請求項５０】
前記リポソームがカチオン性脂質を含む、請求項４９記載の組成物。
【請求項５１】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌである、請求項５０記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌがさらにナノ粒子を含む、請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
請求項１４〜４３のいずれかに記載の核酸を含む組成物。
【請求項５４】
被験体における細胞への前記核酸の送達用の送達ビヒクルを含むものとしてさらに定義される、請求項５３記載の組成物。
【請求項５５】
前記送達ビヒクルがウイルスベクターまたは脂質である、請求項５４記載の組成物。
【請求項５６】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項５５記載の組成物。
【請求項５７】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項５６記載の組成物。
【請求項５８】
前記ビヒクルがリポソームを含む、請求項５５記載の組成物。
【請求項５９】
前記リポソームがカチオン性脂質を含む、請求項５８記載の組成物。
【請求項６０】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌである、請求項５９記載の組成物。
【請求項６１】
前記ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌがさらにナノ粒子を含む、請求項６０記載の組成物。
【請求項６２】
ａ）組織−選択的プロモーター配列を選択し；
ｂ）第二のプロモーター配列を選択し、第二のプロモーター配列は最小ウイルスプロモーター配列を含み；次いで、
ｃ）該組織−選択的プロモーター配列を該第二のプロモーター配列に操作可能にカップリングさせる；
ことを含み、該組織−選択的プロモーター配列の該第二のプロモーター配列への操作可能なカップリングの結果、該組織−選択的プロモーター配列の改良された機能をもたらす、組織−選択的プロモーターの機能を改良する方法。
【請求項６３】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、ＡＦＰプロモーター配列、ヒトα−ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒツジβ−ラクトグロブリンプロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、アデノウイルスＶＡ１プロモーター配列、ヒトｔＲＮＡプロモーター配列、５ＳリボソームＲＮＡプロモーター配列、またはこれらのプロモーター配列のいずれかの機能的ハイブリッドまたは組合せである、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記組織−選択的プロモーター配列が低酸素症−特異的プロモーター配列である、請求項６２記載の方法。
【請求項６５】
前記低酸素症−特異的プロモーター配列が低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）または低酸素症誘導因子である、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記低酸素症誘導因子がＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、またはＨＩＦ−３αである、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記組織−選択的配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列である、請求項６２記載の方法。
【請求項６８】
前記ｈＴＥＲＴプロモーター配列が配列番号１である、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記最小ウイルスプロモーター配列がアデノウイルスプロモーター配列、バキュロウイルスプロモーター配列、ＣＭＶプロモーター配列、パルボウイルスプロモーター配列、ヘルペスウイルスプロモーター配列、ポックスウイルスプロモーター配列、アデノ−関連ウイルスプロモーター配列、セミリキフォレストウイルスプロモーター配列、ワクシニアウイルスプロモーター配列、またはレトロウイルスプロモーター配列である、請求項６２記載の方法。
【請求項７０】
前記最小ウイルスプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記ミニ−ＣＭＶ配列が配列番号２である、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列であって、前記第二のプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項６２記載の方法。
【請求項７３】
前記プロモーターが配列番号３を含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載のプロモーターに操作可能にカップリングされた遺伝子を含む組成物を調製し；次いで、
ｂ）該組成物を細胞と接触させ、該接触の結果、該遺伝子の該細胞への送達をもたらす；
ことを含む、遺伝子を細胞に送達する方法。
【請求項７５】
前記組成物が、さらに、送達ビヒクルを含む、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記送達ビヒクルがウイルスベクターまたは脂質である、請求項７４記載の方法。
【請求項７７】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項７７記載の方法。
【請求項７９】
前記ウイルスベクターがプロタミン−複合体化ウイルスベクターとしてさらに定義される、請求項７５記載の方法。
【請求項８０】
前記プロタミン−複合体化ウイルスベクターがプロタミン−複合体化アデノウイルスベクターである、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記送達ビヒクルがカチオン性脂質を含む、請求項７５記載の方法。
【請求項８２】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰ：ｃｈｏｌである、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
前記ＤＯＴＡＰ：ｃｈｏｌがＤＯＴＡＰ：ｃｈｏｌナノ粒子としてさらに定義される、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
前記細胞が癌細胞である、請求項７４記載の方法。
【請求項８５】
前記癌細胞が被験体におけるものである、請求項８４記載の方法。
【請求項８６】
ａ）請求項１４〜４３のいずれかに記載の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む医薬組成物を入手し；次いで、
ｂ）医薬上有効量の該組成物を被験体に投与する；
ことを含む、過剰増殖性疾患を持つ被験体を治療する方法。
【請求項８７】
前記被験体が癌を持つ患者である、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
前記癌が乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、肝臓癌、子宮頚癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、頭部および頚部の癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ系癌、胃癌、膵臓癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病である、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
前記癌が肺癌である、請求項８８記載の方法。
【請求項９０】
前記被験体が二次的抗−癌療法を受けている、請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
ａ）細胞を、前記プロモーターがレポーターアミノ酸配列に操作可能にカップリングされた請求項１４〜４３のいずれかに記載の核酸を含む組成物と接触させ；次いで、
ｂ）該レポーターに由来するシグナルを測定することによって該レポーター配列の細胞発現を検出する；
ことを含む、細胞をイメージングする方法。
【請求項９２】
前記細胞が被験体におけるものであって、前記細胞をイメージングする方法が被験体における組織をイメージングする方法としてさらに定義される、請求項９１記載の方法。
【請求項９３】
前記細胞が癌細胞であって、前記細胞をイメージングする方法が癌を持つ患者における腫瘍をイメージングする方法としてさらに定義される、請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
前記レポーターが酵素アミノ酸配列、レポーターアミノ酸配列、またはリボザイムＲＮＡ配列である、請求項９１記載の方法。
【請求項９５】
前記レポーターアミノ酸配列が組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列、チミジンキナーゼアミノ酸配列、ドーパミン受容体アミノ酸配列、内皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アミノ酸配列、プラスミノーゲンアミノ酸配列、ウロキナーゼ−タイプのプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）アミノ酸配列、ホルモン受容体アミノ酸配列、またはヨウ化ナトリウムシンポーターアミノ酸配列である、請求項９４記載の方法。
【請求項９６】
前記レポーターアミノ酸配列が組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列である、請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
前記組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列が組換えソマトスタチン受容体アミノ酸配列、組換えソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列、または突然変異したソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列である、請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
前記組換えソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列は組換えソマトスタチンタイプ２Ａ受容体アミノ酸配列である、請求項９７記載の方法。
【請求項９９】
前記組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列をコードする核酸が、切形された組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体をコードする核酸を含む、請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
前記切形された組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体をコードする核酸がカルボキシ末端切形を含む、請求項９９記載の方法。
【請求項１０１】
前記切形の結果、前記組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列の内部化および／またはシグナリングの改変をもたらす、請求項１００記載の方法。
【請求項１０２】
前記レポーターアミノ酸配列をコードする核酸が該レポーターアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端の異種リーダー配列を含み、該リーダー配列はレポーターアミノ酸配列を特定の非細胞性位置へ誘導する、請求項９１記載の方法。
【請求項１０３】
前記レポーターアミノ酸配列をコードする核酸が、さらに、前記レポーターアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端に融合した蛋白質タグを含む、請求項９１記載の方法。
【請求項１０４】
前記蛋白質タグが酵素活性を有する、請求項１０３記載の方法。
【請求項１０５】
前記蛋白質タグがヘマグルチニンＡ、β−ガラクトシダーゼ、チミジンキナーゼ、トランスフェリン、ｍｙｃ−タグ、ＶＰ１６、（Ｈｉｓ）６−タグ、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである、請求項１０４記載の方法。
【請求項１０６】
前記イメージングを、腫瘍の外科的切除を受けている患者に対して手術内で行う、請求項９３記載の方法。
【請求項１０７】
遺伝子が前記プロモーターに操作可能にカップリングされており、前記細胞をイメージングする方法が遺伝子を細胞に送達する方法としてさらに定義される、請求項９１記載の方法。
【請求項１０８】
前記遺伝子が治療遺伝子であって、前記細胞をイメージングする方法が治療遺伝子を細胞に送達する方法としてさらに定義される、請求項９２記載の方法。
【請求項１０９】
前記治療遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、またはホルモンをコードする遺伝子である、請求項１０８記載の方法。
【請求項１１０】
前記治療遺伝子がＲｂ、ＣＦＴＲ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ−ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ  ｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、ｍｄａ７、ＦＵＳ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＡＤＰ、ｐ５３、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＹＥＳ、ＭＡＤＨ４、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＴＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、Ｒａｐ１Ａ、シトシンデアミナーゼ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ＢＲＣＡ２、ｚａｃ１、ＡＴＭ，ＨＩＣ−１、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＰＴＥＮ、ＩＮＧ１、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＯＶＣＡ１、ＭＡＤＲ２、５３ＢＰ２、ＩＲＦ−１、ｚａｃ１、ＤＢＣＣＲ−１、ｒｋｓ−３、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、β＊（ＢＬＵ）、ＬＵＣＡ−１（ＨＹＡＬ１）、ＬＵＣＡ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１（ＮＰＲＬ２）、ＳＥＭ  Ａ３またはＭＣＣである、請求項１０９記載の方法。
【請求項１１１】
前記治療遺伝子がＦＵＳ１である、請求項１１０記載の方法。
【請求項１１２】
さらに、被験体への遺伝子の投与後に、該被験体において該遺伝子の生体内分布を測定する方法としてさらに定義される、請求項９２記載の方法。
【請求項１１３】
さらに、被験体における治療遺伝子の投与に対する応答を測定する方法としてさらに定義される、請求項９１記載の方法。
【請求項１１４】
シグナルの測定が、蛍光イメージング分析、免疫組織化学分析、化学発光イメージング、光学イメージング、磁気共鳴イメージング、または放射性イメージングを行うものとしてさらに定義される、請求項９１記載の方法。
【請求項１１５】
放射性イメージングがγカメライメージングとしてさらに定義される、請求項１１４記載の方法。
【請求項１１６】
シグナルの測定が１１１Ｉｎ−オクトレオチド−ＳＳＲＴ２Ａレポーター系でのγ−カメライメージングとしてさらに定義される、請求項１１５記載の方法。
【請求項１１７】
シグナルの測定が超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）―オクトレオチド−ＳＳＴＲ２Ａレポーターおよびコントラスト増強系を用いる磁気共鳴イメージングとしてさらに定義される、請求項１１４記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年３月９日に出願された、米国仮特許出願第６０／６５９，９３５号（この全体が、参考として本明細書に援用される）に関する。米国政府は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈからの補助金ＣＡ７１６１８および米国国防省からの補助金ＤＡＭＤ１７−０２−１−０７０６にしたがって、本発明に権利を有する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、概して、分子生物学、癌生物学、および遺伝子治療の分野に関する。さらに詳しくは、本発明は、組織−選択的プロモーター配列、および組織−選択的プロモーター配列に操作可能にカップリングされた第二プロモーター配列を含む新規なプロモーターを含む組成物、および新規なプロモーターを利用する方法に関し、第二のプロモーター配列は最小プロモーター配列、好ましくは最小ウイルスプロモーター配列を含む。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（関連分野の説明）
成功する遺伝子治療に対する主な妨げの１つは、注目する組織に標的化することができる効果的な送達系の欠如である。例えば、癌患者における腫瘍に対して癌のための遺伝子治療を標的化することができるのは有利であろう。腫瘍−標的化導入遺伝子発現のための１つの手段は、腫瘍に対して選択的であるプロモーターの使用を介して遺伝子発現を制御することである。
【０００４】
１つのそのようなプロモーターはヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）プロモーターである。ｈＴＥＲＴはテロメラーゼの触媒サブユニットである。テロメラーゼは、染色体末端の完全な複製を担うリボヌクレオ蛋白質複合体である（非特許文献１）。多くの研究は、悪性腫瘍の大部分がテロメラーゼ活性を発現し（Ｋｉｍら、１９９６）、他方、ほとんどの正常な細胞は発現しない（Ｓｈａｙ  ａｎｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，１９９６）ことを示している。ヒトにおけるテロメラーゼ活性に関する３つの主な成分が同定されている：（ａ）ＲＮＡ成分［ｈＴＥＲ（Ｆｅｎｇら、１９９５）］：（ｂ）テロメラーゼ−関連蛋白質［ｈＴＥＰ１（Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、１９９７）］：（ｃ）テロメラーゼ触媒ユニットまたはヒトテロメラーゼ逆転写酵素［ｈＴＥＲＴ（Ｍｅｙｅｒｓｏｎら、１９９７；Ｎａｋａｍｕｒａら、１９９７）］。しかしながら、イン・ビトロでのテロメラーゼ活性の復元のためにはｈＴＥＲおよびｈＴＥＲＴのみが必要とされ（Ｎａｋａｙａｍａら、１９９８）、従って、ヒトにおけるテロメラーゼの最小触媒コアを表す（Ｂｅａｔｔｉｅら、１９９８）。
【０００５】
ｈＴＥＲＴのプロモーター領域は従前にクローン化され、特徴付けられている（非特許文献２）。ｈＴＥＲＴプロモーターによるジフテリアトキシンＡ−鎖、ＦＡＤＤ、カスパーゼおよびＢａｘ等の細胞傷害性またはプロアポトーシス遺伝子のテロメラーゼ−特異的発現は、プラスミドおよびアデノウイルス等の種々の遺伝子導入系において首尾よく達成され、報告されている（例えば、Ａｂｄｕｌ−Ｇｈａｎｉら、２０００；ａｎｄ  Ｋｏｍａｔａら、２００１）。
【０００６】
しかしながら、ほとんどの他の固有の哺乳動物プロモーターのようなｈＴＥＲＴプロモーターの転写促進強度は、通常、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０初期プロモーター等の通常に使用されるウイルスプロモーターよりもかなり弱い。その結果、遺伝子治療のための使用は低い導入遺伝子発現の問題によって妨げられている。
【０００７】
イン・ビトロおよびイン・ビボにおける哺乳動物細胞での修飾されていないｈＴＥＲＴプロモーターの弱い転写増強能力を克服するために、幾人かの研究者は、二元アデノウイルスベクター系を開発しており、ｈＴＥＲＴプロモーターおよび導入遺伝子は第一ベクター中のＧａｌ４遺伝子またはテトラサイクリン応答性エレメント（ＴＲＥ）の制御下に置かれる（非特許文献３；非特許文献４Ｇｕら、２０００；Ｇｕら、２００２）。第二ベクターは、ＶＰ１６蛋白質またはＴｅｔ−Ｏｎ／Ｔｅｔ−Ｏｆｆトランスアクチベーター等のエンハンサーを発現して、ｈＴＥＲＴからの導入遺伝子発現を増加させる。しかしながら、系は、２つの別々のベクターの使用に関連した欠陥のため、臨床的適用のためには余りにも複雑で非現実的である。特に、デュアルベクター系はランダムであって制御できない。なぜならば、双方のベクターにとって、同時に同一細胞に入るのは困難だからである。さらに、それは潜在的には、多数のベクターおよび多数の治療的に無関係な成分、ならびに系に関与する遺伝子産物の使用のため、増大した毒性をもたらし得る。
【非特許文献１】Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、Ｊ．Ｌｉｐｉｄ．Ｒｅｓ．（１９９１）３２（１２）：１９１１−１９１８
【非特許文献２】Ｔａｋａｋｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（１９９９）５９（３）：５５１−５５７
【非特許文献３】Ｇｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．（２０００）６０：５３５９−５３６４
【非特許文献４】Ｇｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ（２００２）２１：４７５７−４７６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、増強された組織−選択的導入遺伝子の発現を可能にする、より効果的な組織−選択的プロモーター、またはプロモーター機能を容易にする改良された方法が必要とされている。この領域におけるプロモーター技術は、遺伝子治療で用いるベクター、ならびにレポーターベースのイメージング様式等の高い導入遺伝子発現を必要とする他の技術の臨床的適用および開発を容易にするであろう。この技術を単一ベクターに組み合わせると、デュアルまたは多数ベクターに関連する毒性を減少させるのを助けるであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明者らは、組織−選択的であってイン・ビトロおよびイン・ビボにて導入遺伝子の高度に有効な発現を促進するある種の新規なキメラプロモーターを開発した。特に、本発明者らは、最小ウイルスプロモーター配列に融合した組織−特異的プロモーター配列から構成されるある種の新規なキメラプロモーター、およびこれらの新規なプロモーターを利用する方法を開発した。例えば、必須のｈＴＥＲＴプロモーター配列をミニ−ＣＭＶプロモーター配列と最適に融合させることによって作成された、ミニＣＭＶ（ｈＴＭＣ）プロモーター配列に融合したｈＴＥＲＴ配列を含む新規なキメラプロモーターが開発された。本発明者らは、また、組織−選択的プロモーターの機能を改良する方法を開発した。これらのプロモーターを用い、本発明者らは、イン・ビトロおよびイン・ビボにて高い腫瘍特異性および高い導入遺伝子発現を共に達成することができた。本明細書中に記載されるように、これらのプロモーターは、被験体において過剰増殖性病を治療する目的で、または細胞においてレポート配列をイメージングするためなどの、遺伝子を細胞に導入する方法において広い適用を有する。
【００１０】
本発明のある実施形態は、概して、組織−選択的プロモーター配列、および組織選択的プロモーター配列に操作可能にカップリンクされた第二のプロモーター配列を含むプロモーターに関し、第二のプロモーター配列は最小ウイルスプロモーター配列を含み、組織−選択的プロモーター配列を第二のプロモーター配列に操作可能にカップリングさせる結果、組織−選択的プロモーター配列の改良されたプロモーター機能がもたらされる。「プロモーター配列」は、そこで転写開始および転写速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。プロモーター配列は後に明細書中でより詳細に議論される。
【００１１】
「組織−選択的プロモーター配列」は、本明細書中においては、他の組織タイプにおいてはかなり「サイレント」であるか、あるいは比較的低いレベルで発現させつつ、１つの組織において遺伝子の転写を駆動することができるプロモーター配列を言うと定義される。組織−特異的プロモーター配列は後に明細書中にてより詳細に議論する。当業者に知られたいずれの組織−選択的プロモーター配列も、本発明のプロモーター配列に含めることが考えられる。例示的な組織−選択的プロモーターはｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、またはＡＦＰプロモーター配列ヒトαラクトラルブミンプロモーター配列、ヒツジβラクトグロブリンプロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、アデノウイルスＶＡ１プロモーター配列、ヒトｔＲＮＡプロモーター配列、５ＳリボソームＲＮＡプロモーター配列、またはこれらのプロモーター配列のいずれかの機能的ハイブリッド、または組合せを含む。
【００１２】
組織−選択的プロモーター配列は、ヒトまたは他の哺乳動物であるかを問わず、被験体のいずれかの組織タイプにおいて活性であり得る。例えば、組織−選択的プロモーターは心臓、肺、食道、筋肉、腸、乳房、前立腺、胃、膀胱、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、ニューロン、筋肉細胞、白血球、不滅化細胞、新形成細胞、腫瘍細胞、癌細胞、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、唾液腺、胆嚢、泌尿器系膀胱、気管、咽頭、喉頭、大動脈、動脈、毛細血管、静脈、胸腺、下顎リンパ節、腸間膜リンパ節、骨髄、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、脳、大脳、小脳、髄質、橋、脊髄、坐骨神経、骨格筋、平滑筋、骨、精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、陰茎、卵巣、子宮、乳腺、膣、皮膚、眼、または視神経において活性であり得る。
【００１３】
ある実施形態において、組織選択的プロモーター配列は、腫瘍−選択的プロモーター配列である。組織−選択的プロモーター配列は、本明細書中においては、他の組織タイプにおいてはかなり「サイレント」であるか、あるいは比較的低いレベルで発現しつつ、腫瘍細胞において遺伝子の転写を駆動することができるプロモーター配列と定義される。例えば、腫瘍−選択的プロモーター配列はｈＴＲプロモーター配列、ｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、またはＡＦＰプロモーター配列、ＭＵＣ−１ムチン−様糖蛋白質、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕ癌遺伝子、シクロ−オキシゲナーゼ、Ｅ２Ｆ転写因子１、チロシナーゼ関連蛋白質、チロシナーゼ、またはスルビビンであり得る。
【００１４】
ある実施形態においては、組織−特異的プロモーター配列は、低酸素症−特異的プロモーター配列である。低酸素症−特異的プロモーター配列は、本明細書中においては、細胞が低酸素状態に暴露された場合に、非−低酸素状態で他の組織タイプにおいてはかなり「サイレント」であるか、あるいは比較的低いレベルで発現されつつ、遺伝子の転写を駆動することができるプロモーター配列と定義される。当業者に知られたいずれの低酸素症−特異的プロモーター配列も、本発明で含めるのに考えられる。例えば、低酸素症−特異的プロモーター配列は低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）または低酸素症誘導因子であり得る。例えば、低酸素症誘導因子はＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、またはＨＩＦ−３αであり得る。
【００１５】
本発明のある特定の実施形態において、組織−選択的プロモーター配列はｈＴＥＲＴプロモーター配列である。例えば、ｈＴＥＲＴプロモーター配列は配列番号１であり得る。
【００１６】
最小ウイルスプロモーター配列またはコアプロモーター配列は、本明細書中においては、トランスアクチベーターまたは転写複合体の成分を核酸中の特定の位置に結合させ、そこに位置させる能力を維持するヌクレオチド配列を含むプロモーターの部分を言うと定義される。不活性であるか、あるいは上流活性化の不在下でかなり低下したプロモーター活性を有するプロモーターエレメント、特にＴＡＴＡエレメントは、最小又はコアプロモーターと言う。適当な転写因子の存在下で、最小プロモーターは転写を行うように機能する。最小またはコアプロモーターは、かくして、転写開始に必要な全ての基本的なエレメント、例えば、ＴＡＴＡボックスおよび／またはイニシエーターのみからなる。当業者に知られたいずれの最小ウイルスプロモーター配列も、本発明のプロモーター配列に含めることが考えられる。最小ウイルスプロモーター配列は、例えば、アデノウイルスプロモーター配列、バキュロウイルスプロモーター配列、ＣＭＶプロモーター配列、パルボウイルスプロモーター配列、ヘルペスウイルスプロモーター配列、ポックスウイルスプロモーター配列、アデノ関連ウイルスプロモーター配列、セミリキフォレストウイルスプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ワクシニアウイルスプロモーター配列、またはレトロウイルスプロモーター配列であり得る。
【００１７】
ある特定の実施形態において、プロモーター配列はミニ−ＣＭＶプロモーター配列である。例えば、ミニ−ＣＭＶは配列番号２であり得る。いくつかの実施形態において、組織−選択的プロモーター配列はｈＴＥＲＴプロモーター配列であり、および第二のプロモーター配列はミニ−ＣＭＶプロモーター配列である。例えば、プロモーター配列は、ミニ−ＣＭＶ配列に操作可能にカップリングしたｈＴＥＲＴプロモーター配列を含む配列番号３を含むことができる。
【００１８】
本発明のある他の実施形態は、概して、プロモーターを含む核酸に関し、プロモーターは組織−選択的プロモーター配列、および組織−選択的プロモーター配列に操作可能にカップリングされた第二のプロモーター配列を含み、第二のプロモーター配列は最小ウイルスプロモーター配列を含み、組織−選択的プロモーター配列を第二のプロモーター配列に操作可能にカップリングさせると、第一のプロモーター配列の改良されたプロモーター機能がもたらされる。本明細書中で用いるとき、「核酸」は、概して、ヌクレオベースを含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその誘導体もしくはアナログの分子、すなわち、「ストランド」を言う。核酸は後に明細書中でより詳細議論する。前記した組織−選択的プロモーター配列および最小ウイルスプロモーター配列のいずれも、本発明の核酸配列に取り込むことができる。先に議論したように、組織−選択的プロモーター配列は、ある実施形態においては、組織−選択的プロモーター配列、または低酸素症−特異的プロモーター配列をさらに定義することができる。ある特定の実施形態において、組織−選択的プロモーター配列は、例えば、配列番号１に記載された配列等のｈＴＥＲＴプロモーター配列である。さらに、いくつかの実施形態において、核酸は、組織−選択的プロモーター配列に操作可能にカップリングしていてもしていなくてもよい、１以上のさらなるプロモーター配列を含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態において、核酸はプロモーターに操作可能にカップリングされた１以上の遺伝子を含む。当業者に知られたいずれの遺伝子も、遺伝子を細胞に送達する方法において含めることが考えられる。用語「遺伝子」は、簡明さのために機能的蛋白質、ポリペプチドまたはペプチド−コーディングユニットを言うように用いられる。遺伝子は、後に明細書中においてより詳細に議論する。いずれの遺伝子も、本発明の核酸配列で考えられる。例えば、遺伝子は、治療遺伝子または選択マーカーであり得る。治療遺伝子は、本明細書中においては、病気を治療または予防する目的で被験体に投与することができる遺伝子を言う。例えば、治療遺伝子は、過剰増殖性疾患の治療または予防のために被験体に投与される遺伝子であり得る。ある特定の実施形態において、過剰増殖性疾患は癌である。治療遺伝子は、例えば、腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、またはホルモンをコードする遺伝子であり得る。例示的な治療遺伝子はＲｂ、ＣＦＴＲ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ−ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ  ｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、ｍｄａ７、ＦＵＳ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＡＤＰ、ｐ５３、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＹＥＳ、ＭＡＤＨ４、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＴＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、Ｒａｐ１Ａ、シトシンデアミナーゼ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ＢＲＣＡ２、ｚａｃ１、ＡＴＭ，ＨＩＣ−１、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＰＴＥＮ、ＩＮＧ１、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＯＶＣＡ１、ＭＡＤＲ２、５３ＢＰ２、ＩＲＦ−１、ｚａｃ１、ＤＢＣＣＲ−１、ｒｋｓ−３、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、β＊（ＢＬＵ）、ＬＵＣＡ−１（ＨＹＡＬ１）、ＬＵＣＡ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１（ＮＰＲＬ２）、ＳＥＭ  Ａ３またはＭＣＣを含む。ある特定の実施形態において、治療遺伝子はＦＵＳ１である。
【００２０】
選択可能マーカーは、本明細書中においては、発現された場合に、細胞に同定可能な特徴を付与し、選択可能マーカーなしの細胞から選択可能マーカーを含有する細胞の容易な同定、単離および／または選択を可能にする核酸配列を言うように定義される。当業者に公知のいずれの選択可能マーカーも、本発明の核酸において選択可能マーカーとして含めることが考えられる。例えば、選択可能マーカーは薬物選択マーカー、酵素、または免疫学的マーカーであり得る。いくつかの実施形態において、本発明の核酸はプラスミドに含まれる。
【００２１】
本発明の核酸配列のいくつかの実施形態は、プロモーター配列に操作可能にカップリングされた１以上のレポーター配列を含む。本明細書中で用いるとき、「レポーター」、「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、細胞に存在する他の遺伝子配列またはコードされたポリペプチドから検出可能であって、かつ識別できるいずれの遺伝子配列またはコードされたポリペプチド配列も言う。例示的なレポーター配列は、スマトスタチン受容体アミノ酸配列、ヨウ化ナトリウムシンポーターアミノ酸配列、真核生物緑色蛍光蛋白質アミノ酸配列、赤色蛍光蛋白質アミノ酸配列、ルシフェラーゼアミノ酸配列、β−ガラクトシラーゼアミノ酸配列、またはチミジンキナーゼアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを含む。スマトスタチンレポーターアミノ酸配列は、例えば、組換えスマトスタチン受容体アミノ酸配列、スマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列、または突然変異したスマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列であり得る。ある実施形態において、スマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列は、スマトスタチン受容体タイプ２Ａアミノ酸配列である。
【００２２】
レポーター配列は第二の遺伝子にＩＲＥＳでカップリングさせることができる。ＩＲＥＳは本明細書中で他の箇所で議論する。第二の遺伝子は、先に議論した遺伝子のいずれも含めた、当業者に知られたいずれの遺伝子でもあり得る。遺伝子は第二のレポーターに操作可能にカップリングされていてもしなくてもよい。第二のレポーターは、先に議論したレポーターを含めた、当業者に知られたいずれのレポーターでもあり得る。例えば、第二のレポーターはスマトスタチン受容体アミノ酸配列、ヨウ化ナトリウムシンポーターアミノ酸配列、ルシフェラーゼアミノ酸配列、真核生物緑色蛍光蛋白質アミノ酸配列、またはチミジンキナーゼアミノ酸配列であり得る。いくつかの実施形態において、第二の遺伝子は選択マーカーまたは治療遺伝子を含む。治療遺伝子は先に議論し、本明細書中の他の箇所で議論する。本発明の核酸のある実施形態においては、組織−選択的プロモーター配列はｈＴＥＲＴプロモーター配列であり、第二のプロモーター配列はミニ−ＣＭＶプロモーター配列であり、およびプロモーターはＦＵＳ１をコードする遺伝子に操作可能にカップリングされている。これらの実施形態において、核酸配列はプラスミドに含まれていても含まれていなくてもよい。
【００２３】
本発明はまた、概して、プロモーターを含む組成物にも関し、プロモーターは前記した本発明のプロモーターのいずれかを含む。本発明の組成物は、被験体における細胞へのプロモーターの送達用の送達ビヒクルを含んでも含まなくてもよい。送達ビヒクルは、本明細書中においては、核酸の細胞への送達を容易にすることができるいずれの剤も言うように定義される。細胞は被験体のいずれの細胞でもあり得る。被験体は哺乳動物等のいずれの被験体でもあり得る。ある特定の実施形態において、被験体はヒトである。当業者であれば、被験体における細胞への核酸配列の送達を容易にするのに用いられる送達ビヒクルに精通しているであろう。例えば、送達ビヒクルは核酸、プラスミド、ウイルスベクター、原核生物細胞、真核生物細胞、または脂質であり得る。いずれのウイルスベクターも本発明の組成物に含めることが考えられる。例えば、ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターであり得る。本発明のある特定の実施形態において、ウイルスベクターはアデノウイルスである。さらに、送達ビヒクルとして用いられる当業者に知られたいずれの脂質も考えられる。いくつかの実施形態において、脂質はリポソームに含まれる。リポソームは、送達ビヒクルとして用いるのに適した当業者に知られたいずれのリポソームでもあり得る。例えば、リポソームはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ等のカチオン性脂質を含むことができる。リポソームはＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌナノ粒子等のナノ粒子に含めることができる。ナノ粒子は、本明細書中においては直径が１マイクロメートル未満の直径を有する粒子をいうと定義される。
【００２４】
本発明のあるさらなる実施形態は、概して、前記した核酸のいずれかを含む組成物に関する。前記した核酸のいずれかを含む組成物は、さらに送達ビヒクルを含むことができ、被験体における細胞への核酸の送達用の送達ビヒクル。前記した送達ビヒクルのいずれも、本発明のこれらの実施形態に含めるのに適している。例えば、いくつかの実施形態において、送達ビヒクルは先に議論したウイルスベクターまたは脂質である。
【００２５】
本発明の他の実施形態は、概して、（１）組織−選択的プロモーター配列を選択し；（２）第二のプロモーター配列は配列を選択し、第二のプロモーター配列は最小ウイルスプロモーター配列を含み；次いで、（３）組織−選択的プロモーター配列を第二のプロモーター配列に操作可能にカップリングさせ、組織−特異的プロモーター配列を第二のプロモーター配列へ操作可能にカップリングさせる結果、組織−選択的プロモーター配列の改良された機能がもたらされる；ことを含む、組織−選択的プロモーターの機能を改良する方法に関する。先に議論した組織−選択的プロモーター配列のいずれも、本発明のこれらの実施形態で用いるのに適している。例えば、先に議論したように、組織−選択的プロモーター配列はｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、ＡＦＰプロモーター配列、ヒトαラクトアルブミンプロモーター配列、ヒツジβラクトグロブリンプロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、アデノウイルスＶＡ１プロモーター配列、ヒトｔＲＮＡプロモーター配列、５ＳリボソームＲＮＡプロモーター配列、またはこれらのプロモーター配列のいずれかの機能ハイブリットまたは組合せであり得る。組織−選択的プロモーター配列は、先に議論したように、いずれの低酸素症−特異的プロモーター配列であってもよい。本発明の方法のある特定の実施形態において、組織−選択的配列は配列番号１等のｈＴＥＲＴプロモーター配列である。本発明の方法の最小ウイルスプロモーター配列は、先に議論した最小ウイルスプロモーター配列のいずれかを含むことができる。例えば、本発明の方法のある特定の実施形態において、最小ウイルスプロモーター配列はミニ−ＣＭＶプロモーター配列である。例えば、ミニ−ＣＭＶ配列は配列番号２であり得る。
【００２６】
いくつかの実施形態において、組織−選択的プロモーター配列はｈＴＥＲＴプロモーター配列であり、第二のプロモーター配列はミニ−ＣＭＶプロモーター配列である。例えば、プロモーターは配列番号３を含むことができる。
【００２７】
本発明のなおさらなる実施形態は、概して、（１）プロモーターに操作可能にカップリングされた遺伝子を含む組成物を調製し、プロモーターは前記した本発明の新規なプロモーターのいずれかであり；次いで、（２）組成物を細胞に接触させ、接触の結果、遺伝子が細胞に送達される；ことを含む遺伝子を細胞に送達する方法に関する。細胞は被験体のいずれの細胞でもあり得る。さらに、先に議論したように、被験体は哺乳動物等のいずれの被験体でもあり得る。ある特定の実施形態において、被験体はヒトである。例えば、ヒトは過剰増殖性疾患等の病気を持つ患者であり得る。例えば、過剰増殖性疾患は癌であってよい。癌等の過剰増殖性疾患は、後に明細書中においてより詳細に議論する。
【００２８】
組成物は、いくつかの実施形態において、遺伝子の細胞への送達を容易にするのに用いられる送達ビヒクルを含む。先に議論した送達ビヒクルのいずれも、本発明のこれらの実施形態で用いるのに適している。例えば、送達ビヒクルは、前記したウイルスベクターまたは脂質のいずれかであり得る。ウイルスベクターおよび脂質もまた、明細書中で後により詳細に議論する。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターはアデノウイルスベクターである。例えば、ベクターはプロタミン−複合体化ウイルスベクターであり得る。
【００２９】
本発明のなおさらなる実施形態は、概して、（１）前記した新規な核酸配列のいずれかを含むポリヌクレオチドの医薬組成物を得；次いで、（２）医薬上有効量の組成物を被験体に投与することを含む、過剰増殖性疾患を持つ被験体を治療する方法に関する。先に議論したように、被験体は哺乳動物等のいずれの被験体でもあり得る。哺乳動物は病気を持つ患者等のヒトであってよい。病気は、被験体に悪影響し得るいずれの病気でもあり得る。ある特定の実施形態において、被験体はヒトであって、病気は癌等の過剰増殖性疾患である。癌は、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、肝臓癌、子宮頚癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、頭部および首癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ系癌、胃癌、膵臓癌、精巣癌、リンパ腫または白血病等のいずれの癌でもあり得る。ある特定の実施形態において、癌は肺癌である。いくつかの実施形態において、被験体は二次的抗癌療法を受けているものである。化学療法、外科的療法、放射線療法、免疫療法、またはさらなる遺伝子治療等の当業者に知られたいずれの二次的抗癌療法も考えられる。二次的抗癌療法は、後に明細書中で詳細に議論する。
【００３０】
また、本発明は、概して、（１）細胞を、前記した核酸のいずれかを含む組成物と接触させ、プロモーターはレポーターアミノ酸配列に操作可能にカップリングされており；次いで、（２）レポーターから由来するシグナルを測定することによって、レポーター配列の細胞発現を検出することを含む、細胞をイメージングする方法に関する。本明細書中で用いるとき、用語「レポーター」、「レポーター遺伝子」、または「レポーター配列」とは、細胞に存在する他の遺伝子配列、またはコードされたポリペプチドから検出可能であって、識別できるいずれの遺伝子配列またはコードされたポリペプチド配列も言う。レポーターは後に明細書中においてより詳細に議論する。細胞はいずれの細胞でもあり得る。ある実施形態において、細胞は哺乳動物等の被験体における細胞である。哺乳動物はヒトであってよい。ヒトは過剰増殖性疾患等の病気を持つ患者であってよい。例えば、過剰増殖性疾患は癌であり得る。いくつかの実施形態において、例えば、細胞は被験体におけるものであり、細胞をイメージングする方法は、被験体における組織をイメージングする方法とさらに定義される。「組織」とは、本明細書中においては、形態学的に同様な細胞、および身体中で具体的な機能を一緒に行う会合した細胞内物質の集合体を言う。例えば、組織は肺組織、腎臓組織、乳房組織などであってよい。組織は癌性腫瘍におけるような新形成細胞を含むものであってもよい。本発明のイメージング方法のある実施形態においては、細胞は癌細胞であり、細胞をイメージングする方法は、癌を持つ患者において腫瘍をイメージングする方法とさらに定義される。
【００３１】
レポーターは当業者に知られたいずれのレポーターでもあり得る。例えば、レポーターは酵素アミノ酸配列、受容体アミノ酸配列、またはリボザイムＲＮＡ配列であってよい。例えば、レポーターアミノ酸配列は組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列、チミジンキナーゼアミノ酸配列、ドーパミン受容体アミノ酸配列、内皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アミノ酸配列、プラスミノーゲンアミノ酸配列、ウロキナーゼタイプのプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）アミノ酸配列、ホルモン受容体アミノ酸配列、またはナトリウム／ヨウ化物シンポーターアミノ酸配列であり得る。本発明のある特定の実施形態において、レポーターアミノ酸配列は組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体（ＧＰＣＲ）アミノ酸配列である。当業者に知られたいずれの組換えＧＰＣＲアミノ酸配列も、レポーターとして用いることが考えられる。例えば、ＧＰＣＲはアセチルコリン受容体：Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、またはＭ５；アデノシン受容体：Ａ１；Ａ２Ａ；Ａ２Ｂ；またはＡ３；アドレノセプター：α１Ａ、α１Ｂ、α１Ｄ、α２Ａ、α２Ｂ、α２Ｃ  β１、β２、またはβ３；アンジオテンシン受容体：ＡＴ１、またはＡＴ２；ボンペシン受容体：ＢＢ１、ＢＢ２、またはＢＢ３；ブセジキニン受容体：Ｂ１、Ｂ２、カルシトニン、エイニリン、ＣＧＲＰ、またはアドレノメジュリン受容体；カンナビノイド受容体：ＣＢ１、またはＣＢ２；ケモカイン受容体：ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸ３ＣＲ１、またはＸＣＲ１；化学走性受容体：Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、またはｆＭＬＰ；コレシストキニンおよびガストリン受容体：ＣＣＫ１、またはＣＣＫ２；コルチコトロピン−放出因子受容体：ＣＲＦ１、またはＣＲＦ２；ドーパミン受容体：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、またはＤ５；エンドセリン受容体：ＥＴ（Ａ）またはＥＴ（Ｂ）；ガラニン受容体：ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、またはＧＡＬ３；グルタメート受容体：ｍｇｌ１、ｍｇｌ２、ｍｇｌ３、ｍｇｌ４、ｍｇｌ５、ｍｇｌ６、ｍｇｌ７、またはｍｇｌ８；糖蛋白質ホルモン受容体：ＦＳＨ、ＬＳＨ、またはＴＳＨ；ヒスタミン受容体：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、またはＨ４；５−ＨＴ受容体：５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｆ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｆ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５Ａ、５−ＨＴ５Ｂ、５−ＨＴ６、または５−ＨＴ７；ロイコトリエン受容体：ＢＬＴ、ＣｙｓＬＴ１、またはＣｙｓＬＴ２；リソリン脂質受容体：ｅｄｇ１、ｅｄｇ２、ｅｄｇ３、またはｅｄｇ４；メラノコリン受容体：ＭＣ１；ＭＣ２；ＭＣ３；ＭＣ４、またはＭＣ５；メラトニン受容体：ＭＴ１、ＭＴ２、またはＭＴ３；ニューロペプチドＹ受容体：Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、またはＹ６；ニューロテンション受容体：ＮＴＳ１、またはＮＴＳ２；オピオイド：ＤＯＰ、ＫＯＰ、ＭＯＰ、またはＮＯＰ；Ｐ２Ｙ受容体：Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、またはＰ２Ｙ１２）；ペルオキシソームプロリフェレーター：ＰＰＡＲ−α、ＰＰ��Ｒ−β、またはＰＰＡＲ−γ；プロスタノイド受容体：ＤＰ、ＦＰ、ＩＰ、ＴＰ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、またはＥＰ４；プロテアーゼ−活性化受容体：ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４；スマトスタチン受容体：ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ２Ａ、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、またはＳＳＴＲ５；タキキニン受容体：ＮＫ１、ＮＫ２、またはＮＫ３；チロトロピン−放出ホルモン受容体：ＴＲＨ１、またはＴＲＨ２；ウロテンシン−ＩＩ受容体；血管活性化腸ペプチドまたは下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド受容体：ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２、またはＰＡＣ１；またはバソプレッシンまたはオキシトシン受容体：Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２、またはＯＴである。
【００３２】
本発明のイメージングの方法のある特定の実施形態において、組換えＧＰＣＲアミノ酸配列は組換えソマトスタチン受容体アミノ酸配列、組換えソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列、または突然変異したソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列である。例えば、組換えソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列は組換えソマトスタチンタイプ２Ａ受容体アミノ酸配列であってよい。
【００３３】
本発明のある特定の実施形態において、組換えＧＰＣＲアミノ酸配列は切形された組換えＧＰＣＲをコードする核酸を含む。切形はＮ−末端またはＣ−末端いずれかにおける切形であり得る。いくつかの実施形態において、切形はカルボキシ末端の切形である。切形の結果、ＧＰＣＲとしてのＧＰＣＲの機能の改変をもたらしてももたらさなくてもよい。例えば、いくつかの実施形態において、切形の結果、組換えＧＰＣＲアミノ酸配列の内部化および／またはシグナリングの改変をもたらす。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態において、レポーターアミノ酸配列をコードする核酸はレポーターアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端において異種リーダー配列を含み、リーダー配列はレポーターアミノ酸配列を特定の非細胞性位置に誘導する。本発明のさらなる実施形態において、レポーターアミノ酸配列をコードする核酸は、さらに、レポーターアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端に融合した蛋白質タグを含む。用語「タグ」、「タグ配列」または「蛋白質タグ」とは、化学的部分、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドもしくはアミノ酸、ペプチドまたは蛋白質または他の化学物質いずれかをいい、これは、別の配列に付加された場合に、さらなる利用性を供するか、またはその配列の特に検出または単離において有用な特性を付与する。かくして、例えば、ホモポリマー核酸配列、または捕獲オリゴヌクレオチドに対して相補的な核酸配列をプライマーまたはプローブ配列に加えて、延長産物またはハイブリダイズした産物の引き続いての単離を容易にすることができる。蛋白質タグの場合には、ヒスチジン残基（例えば、４〜８連続ヒスチジン残基）を蛋白質のアミノ−またはカルボキシ−末端いずれかに付加して、キレーティング金属クロマトグラフィーによる蛋白質単離を容易にすることができる。別法として、特異的抗体分子または他の分子（例えば、フラグエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニン蛋白質の膜貫通エピトープ、蛋白質Ａ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合蛋白質、マルトース結合蛋白質、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど）に対して反応性であるアミノ酸配列、ペプチド、蛋白質またはエピトープもしくは結合決定基を表す融合パートナーを蛋白質に付加して、アフェニティーまたは免疫アフェニティークロマトグラフィー、免疫組織化学、または本明細書中に記載された非−侵入性検出方法等の手法による蛋白質の単離、局所化および／または同定を容易にすることができる。化学タグ部位は、核酸または蛋白質いずれかに付加して、アビジン試薬との相互作用による単離または検出を容易にすることができるビオチンなどの分子を含む。多数の他のタグ部位が当業者に知られており、また、当業者によって考えることができ、この定義の範囲内にあると考えられる。蛋白質タグは、いくつかの実施形態において、酵素活性を有することができる。本発明のいくつかの実施形態において、蛋白質タグは酵素活性を有する。そのような蛋白質タグの例はヘマグルチニンＡ、βガラクトシダーゼ、チミジンキナーゼ、トランスフェリン、ｍｙｃ−タグ、ＶＰ１６、（Ｈｉｓ）６−タグ、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼを含む。
【００３５】
本発明のある特別な実施形態において、イメージングは被験体に対して操作内で行われる。被験体は、病気の組織の除去等のいずれかの理由で外科的処置を受けているものであり得る。例えば、腫瘍の外科的切除を受けている患者に対する本発明のいくつかの実施形態において。
【００３６】
本発明のイメージングの方法のさらなる実施形態において、遺伝子をプロモーターに操作可能にカップリングさせ、細胞をイメージングする方法は、遺伝子を細胞に送達する方法とさらに定義される。かくして、例えば、細胞のイメージング、および細胞への遺伝子送達は、本発明のある実施形態においては、同時に行うことができる。
【００３７】
例えば、遺伝子は、本発明の他の実施形態との関係で先に議論した遺伝子のいずれかであってよい。例えば、遺伝子は治療遺伝子であってよい。先に議論したように、治療遺伝子の例は腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、ホルモンをコードする遺伝子を含む。例えば、治療遺伝子はＲｂ、ＣＦＴＲ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ−ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ  ｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、ｍｄａ７、ＦＵＳ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＡＤＰ、ｐ５３、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＹＥＳ、ＭＡＤＨ４、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＴＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、Ｒａｐ１Ａ、シトシンデアミナーゼ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ＢＲＣＡ２、ｚａｃ１、ＡＴＭ，ＨＩＣ−１、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＰＴＥＮ、ＩＮＧ１、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＯＶＣＡ１、ＭＡＤＲ２、５３ＢＰ２、ＩＲＦ−１、ｚａｃ１、ＤＢＣＣＲ−１、ｒｋｓ−３、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、β＊（ＢＬＵ）、ＬＵＣＡ−１（ＨＹＡＬ１）、ＬＵＣＡ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１（ＮＰＲＬ２）、ＳＥＭ  Ａ３またはＭＣＣであり得る。本発明のある特別な実施形態において、治療遺伝子はＦＵＳ１である。
【００３８】
先に議論したように、イメージングの方法は、さらに、遺伝子を細胞に送達する方法を含むことができる。本発明のある実施形態においては、レポーターをイメージして、被験体の病気の組織への遺伝子送達等の細胞への遺伝子送達を追跡する。かくして、本発明のある実施形態においては、イメージングの方法は、遺伝子の被験体への投与に続いて、被験体における遺伝子の生体内分布を測定する方法と定義される。いくつかの実施形態において、イメージングの方法は、さらに、被験体において治療遺伝子の投与に対する応答を測定する方法と定義される。
【００３９】
当業者に知られたシグナルを測定するいずれの方法も、本発明のイメージングの方法に含まれると考えられる。イメージングの例示的な方法は蛍光イメージング分析、免疫組織化学分析、化学発光イメージング、光学イメージング、磁気共鳴イメージング、または放射線イメージングを行うことを含む。シグナルを測定する方法は、本明細書中の他の箇所において詳細に議論する。他の例はＣＴイメージングおよび超音波を含む。当業者に知られた放射線イメージングのいずれの方法も、本発明の関係で使用されるシグナルを測定する方法として考えられる。例えば、いくつかの実施形態において、放射線イメージングはγカメライメージングとさらに定義される。当業者であれば、γカメライメージングに非常に精通しているであろう。ある特定の実施形態において、シグナルの測定は、１１１ＩＮ−オクトレオチド−ソマトスタチン受容体タイプ２Ａ（ＳＳＲＴ２Ａ）レポーター系でのγカメライメージングとさらに定義される。さらに、当業者であれば、磁気共鳴イメージングに精通しているであろう。ある特定の実施形態において、シグナルの測定は、超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）−オクトレオチド−ＳＳＴＲ２Ａ受容体およびコントラスト促進剤系を用いる磁気共鳴イメージングとさらに定義される。ＳＰＩＯはＭＲＩのためのコントラスト剤であり、それを用いて、正常な組織バックグラウンドに対するコントラストを増強させることによって腫瘍組織の分解能を増強させる（その各々をここに具体的に引用して援用するＡｒｔｅｍｏｖら、２００３；Ｚｈａｏら、２００２；Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｃｕｒｔｉｓ，２００４を参照）。当業者であれば、磁気共鳴イメージングにおけるようなイメージングでのコントラスト剤の使用に精通しているであろう。イメージングでのコントラスト剤および例示的なコントラスト剤の使用が、後に明細書中でさらに詳細に議論する。
【００４０】
本発明のある態様は、組織−選択的プロモーター機能を増強させて、注目する組織に向けられたイメージング等の他の技術の開発を容易にする方法を含む。Ｕｍｅｏｋａら、２００４にレビューされている。種々のイメージング技術が腫瘍をイメージするのに利用できる。これらのイメージング技術は癌の検出、診断、および治療モニタリングで適用することができる。コンピュータ断層撮影、磁気共鳴イメージング、および超音波技術等の外部イメージングの方法の改良は、腫瘍および転移を可視化するための感度を増大させた（Ｔｅａｒｎｅｙら、１９９７；ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ａｎｄ  Ｈａｎｓｅｌｌ，２００３）。しかしながら、構造的および解剖学的イメージングにおける制限因子は、悪性組織を具体的に同定できない。組織病理学的調査は、依然として、新形成病巣の検出のための最も効果的な方法である。かくして、腫瘍−選択的イメージングは、ヒト癌の治療においてかなり価値があるであろう。なぜならば、それは顕微鏡的分析なくして腫瘍の場所をつきとめることを可能にするからである。特に、直接的視覚による検出のためにはあまりにも小さな腫瘍をイン・サイチュでイメージできる場合、外科医は適当な外科的マージンでもって腫瘍を正確に切除できるであろう。イメージングのこれらの形態は腫瘍−選択的である適当なマーカーを必要とする。先に議論した組織−選択的プロモーターの有用性を改良する方法は、組織―選択的イメージングの改良された方法の開発に適用することができる。
【００４１】
本明細書中において用いるように、「ある」は１以上を意味することができる。特許請求の範囲で用いるように、用語「含む」と組み合わせて用いる場合、用語「ある」は１、または１を超えることを意味することができる。本明細書中で用いるとき、「もう１つの」は、少なくとも第二のまたはそれ以上を意味することができる。
【００４２】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な記載から明らかとなるであろう。しかしながら、詳細な記載および具体例は本発明の好ましい実施形態を示しつつ、説明のためだけに掲げることが理解されるべきである。というのは、本発明の精神および範囲内にある種々の変形および修飾は、この詳細な記載から当業者に明らかとなるだろうからである。
【００４３】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明のある態様をさらに示すために含める。本発明は、本明細書中に示された特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することによって良好に理解できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４４】
（例示的な実施形態の説明）
成功した癌遺伝子治療に対する主な妨げの１つは、腫瘍に特異的に標的化できる効果的な送達系の欠如である。腫瘍―標的化導入遺伝子発現のための１つの手段は、腫瘍―特異的プロモーターを介して導入遺伝子発現を制御することである。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）はテロメラーゼの触媒サブユニットであり、これは不滅化細胞および＞８５％のヒト癌においてかなり活性であるが、ほとんどの正常な体細胞においては休止している。ｈＴＥＲＴプロモーターはクローン化されており、正常な細胞ではそうではないが、腫瘍細胞においては導入遺伝子の発現を標的化することができることが示されている。しかしながら、ほとんどの他の固有の哺乳動物プロモーターのように、ｈＴＥＲＴプロモーターの転写―促進強度は、ＣＭＶおよびＳＶ４０初期プロモーター等の通常に使用されるウイルスプロモーターよりもかなり弱い。その結果、癌遺伝子治療のためのその使用は、低い導入遺伝子発現の問題によって妨げられている。これらの問題を回避するために、本発明者らは、組織―選択的プロモーター配列、および組織−選択的プロモーター配列に操作可能にカップリングされた第二のプロモーター配列を含むある種の新規なキメラまたはハイブリッドプロモーターを開発し、第二のプロモーター配列は最小ウイルスプロモーター配列を含む。本発明者らは、また、組織―選択的プロモーター配列を第二のプロモーター配列に操作可能にカップリングさせることを含む組織―プロモーターの機能を改良するある種の新規な方法も開発し、第二のプロモーター配列は最小ウイルスプロモーター配列を含む。本明細書中に記載される新規なプロモーターは、被験体における過剰増殖性疾患の治療のため、または被験体における細胞等の細胞をイメージングする目的などのための、遺伝子を細胞に導入する方法に適用することができる。本明細書中に記載された新規なプロモーターは、改良された導入遺伝子発現が有益であるいずれの方法にも適用することができる。
【００４５】
Ａ．プロモーターおよびプロモーターを含む核酸
本発明の核酸は、組織−選択性プロモーター配列、および組織−選択的プロモーター配列に操作可能にカップリングされた第二のプロモーター配列を含むキメラまたはハイブリッドプロモーターを含み、第二のプロモーター配列は最小プロモーター配列、好ましくは最小ウイルスプロモーター配列を含む。キメラプロモーター配列は、本発明の他の核酸エレメントと組み合わせて用いて、本明細書中に記載される種々の核酸ベクターおよび核酸ベクター系を構築することができる。
【００４６】
１．核酸
用語「核酸」は当該分野でよく知られている。本明細書中で用いるとき、「核酸」は、一般には、ヌクレオベースを含む、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはその誘導体もしくはアナログの分子（すなわち、ストランド）をいう。ヌクレオベースは、例えば、ＤＮＡで見出される天然に生じるプリンまたはピリミジン塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアミン「Ｇ」、チミン「Ｔ」またはシトシン「Ｃ」）、またはＲＮＡで見出される天然に生じるプリンまたはピリミジン塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」または「Ｃ」）を含む。用語「核酸」は、各々が用語「核酸」の下位概念としての用語「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」を含む。用語「オリゴヌクレオチド」とは、長さが約３〜約１００ヌクレオベースの間の分子をいう。用語「ポリヌクレオチド」とは、長さが約１００ヌクレオベースを超える少なくとも１つの分子をいう。
【００４７】
これらの定義は、一般には、一本鎖分子をいうが、特定の実施形態においては、一本鎖分子に対して部分的に、実質的にまたは十分に相補的なさらなるストランドも含む。かくして、核酸は、特定の配列を含む分子の１以上の相補的ストランドまたは「相補体」を含む二本鎖分子または三本鎖分子を含むことができる。
【００４８】
用語「ベクター」は、そこでそれが複製できる細胞への導入のために核酸配列を挿入することができるキャリアをいうために用いる。用語「発現ベクター」または「核酸ベクター」とは、核酸配列または転写できる遺伝子産物の少なくとも一部をコードする「カセット」、および特定の宿主細胞において操作可能に連結されたコーディング配列の転写および、恐らくは、翻訳に必要な核酸配列をいう、「調節」または「制御」配列を含有するベクターをいう。転写および翻訳を支配する制御配列に加えて、発現ベクターは同様に他の機能を発揮する核酸配列を含有することができる。
【００４９】
２．プロモーター配列
「プロモーター配列」は、そこで転写の開始および速度が制御される核酸配列の領域である制御配列である。それは、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子等の、そこに調節蛋白質および分子が結合することができる遺伝子エレメントを含有することができる。フレーズ「操作可能に位置した」、「操作可能に連結した」、「制御下」、および「転写制御した」は、プロモーターが、その配列の転写開始および発現を制御するために、核酸配列に対して正しい機能的位置および向きにあることを意味する。プロモーターは、核酸配列の転写活性化に関与するシス−作用性調節配列をいう「エンハンサー」と組み合わされて用いても用いなくてもよい。一緒にすると、適当なプロモーターまたはプロモーター／エンハンサー組み合わせ、および注目する遺伝子は、発現カセットを含む。１以上の発現カセットを所与の核酸ベクターまたは発現ベクターに存在させてもよい。ある態様においては、ひとつの発現カセットは、第二の発現カセットのプロモーターに相互作用するトランスアクチベーターをコードすることができる。１以上の発現カセットを、同一および／または異なる発現ベクターに存在させることができる。
【００５０】
プロモーターは、コーディングセグメントまたはエクソンの上流に位置する５’非―コーディング配列の一部を単離することによって得ることができるように、遺伝子または配列と天然で会合しているものであり得る。そのようなプロモーターは「内因性」ということができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流いずれかに位置した、核酸配列と天然で会合したものであり得る。別法として、コーディング核酸セグメントを、その天然の環境においては核酸配列と通常は会合していないプロモーターといわれる組換えまたは異種プロモーターの制御下に置くことによって、ある種の利点が得られるであろう。本発明のある態様においては、異種プロモーターはキメラプロモーターであってよく、２以上の内因性の、異種または合成プロモーター配列のエレメントが操作可能にカップリングされて、組換えプロモーターを生じる。
【００５１】
組換えまたは異種エンハンサーは、その天然の環境において、核酸配列と通常は会合していないエンハンサーもいう。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサーおよびいずれかの他の原核生物、ウイルスまたは真核生物細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に生じない」、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または発現を改変する突然変異を含有するプロモーターまたはエンハンサーを含むことができる。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成により生産することに加えて、配列は、本明細書中に開示された組成物と組み合わせて、ＰＣＲ（商標）を含めた、組換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を用いて生産することができる（各々をここに引用して援用する米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照）。そのようなプロモーターを用いて、レポーター発現、例えば、少数の名称を挙げればガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼを駆動することができる。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非―核オルガネラ内の配列の転写および／または発現を指令する制御配列を同様に使用することができると考えられる。
【００５２】
発現用に選択された細胞型、オルガネラおよび生物においてＤＮＡセグメントの発現を効果的に指令するプロモーターおよび／またはエンハンサーが典型的には用いられるであろう。分子生物学の分野における当業者であれば、一般には、蛋白質発現のためのプロモーター、エンハンサー、および細胞型の組合せの使用を知っている。例えば、ここに引用して援用するＳａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９）を参照。使用されるプロモーターは、例えば、組換え蛋白質および／またはペプチドの生産で有利な、導入されたＤＮＡセグメントの発現を指令する適当な条件下で、構成的、組織−特異的、誘導性、および／または有用であろう。プロモーターは異種、または内因性、またはその組合せであってよい。
【００５３】
ａ．組織−選択的プロモーター配列
プロモーターは、種々の組織タイプにおいて、およびいくつかの異なる生物の種において機能的であり、あるいはその機能は特定の種および／または特定の組織または細胞型に制限され得る。さらに、プロモーターは構成的に活性であり得、あるいはそれは、ある種の条件下（例えば、低酸素症、あるいはプロモーターを含有する発現カセット中のエンハンサーエレメントの存在）、あるいは生物のある種の発生段階の間に（例えば、胎児においては活性、成人においてはサイレント）、ある物質（例えば、組織−特異的因子）によって選択的に活性化され得る。
【００５４】
本発明の実施において有用なプロモーターは好ましくは組織−特異的であり、すなわち、それらは、他の組織タイプにおいてはかなり「サイレント」であり、あるいは比較的低レベルで発現されつつ、１つの組織において遺伝子の転写を駆動することができる。しかしながら、組織−特異的または組織−選択的プロモーターは、それらがサイレントである組織において検出可能な量の「バックグラウンド」または「基礎」活性を有することができる。プロモーターが標的組織において選択的に活性化される程度は、選択性比率（標的組織における活性／対照組織における活性）として表すことができる。この点に関して、本発明の実施で有用な組織特異的プロモーターは、典型的には、約２、３、４、または５よりも大きな選択性比率を有する。好ましくは、選択性比率は約１０または１５よりも大きい。
【００５５】
あるプロモーターは、単一組織タイプに活性が制限されないが、それにも拘わらず、それらが組織の１つの群において活性であり、もう１つの群において活性が低く、あるいはサイレントであり得る点で選択性を示すことができることがさらに理解されるであろう。そのようなプロモーターは「組織特異的」または「組織選択的」とも言われ、本発明で用いられることが考えられる。例えば、種々の腫瘍細胞で活性なプロモーターは、癌の治療で有用であり得、これは、身体の多数の異なる領域のいずれかで行うことができる。
【００５６】
組織−特異的プロモーターは、例えば、異なった組織において、あるいは成長の異なる段階において、あるいは過形成である細胞において異なって発現される遺伝子のプロモーター領域から誘導することができる。
【００５７】
特定のプロモーターの制御下にある遺伝子の発現のレベルは、プロモーター領域を操作することによって変調することができる。例えば、プロモーター領域内の異なるドメインは異なる遺伝子−調節活性を保有することができる。これらの異なる領域の役割は、典型的には、特異的領域が欠失されたプロモーターの異なる変種を有するベクター構築体を用いて評価される（すなわち、欠失分析）。そのような実験で用いるベクターは、典型的には、異なる条件下で各プロモーター変種の活性を測定するのに用いられるレポーター配列を含有する。そのような欠失分析の適用は、望ましい活性を含有するプロモーター配列の同定を可能とし、かくして、コアプロモーターエレメントを含めた特定のプロモータードメインを同定する。このアプローチを用いて、例えば、組織特異性を付与することができる最小領域、または限定されないが、コアＣＭＶプロモーター、ミニ―ＣＭＶ等の他のプロモーターエレメントと組み合わせた場合に、頑強な転写応答を付与する最小領域を同定することができる。
【００５８】
本明細書中に記載された多数の組織特異的プロモーターは、本発明を実施するのに特に有利であろう。ほとんどの場合に、これらのプロモーターは、選択されたベクターへのクローニングに適した便宜な制限消化断片として単離することができる。ある態様においては、本発明は、限定されないが、ｈＴＥＲＴプロモーターを含む。別法として、プロモーター断片は、ポリメラーゼ鎖反応を用いて、あるいはオリゴヌクレオチド合成によって単離することができる。これらのプロモーター断片のクローニングは、制限部位をプライマーの５’末端に取り込むことによって容易にすることができる。
【００５９】
当業者であれば、本発明との関係で含めることができる種々のタイプの組織−選択的プロモーター配列に精通しているであろう。これらのプロモーターの例示的なリストを表１に含める。
【００６０】
表１は本発明に関連して、組織−選択的プロモーター配列の源として使用することができるエレメント／プロモーターの非限定的例をリストする。
【００６１】
【表１−１】
2008532521.tif 000002
【００６２】
【表１−２】
2008532521.tif 000003
ｂ．プロモーター配列を操作可能にカップリングさせる方法
用語「プロモーター」は「プロモーターエレメント」および「プロモーター配列」と交換可能に用いられる。同様に、用語「エンハンサー」は、「エンハンサーエレメント」および「エンハンサー配列」と交換可能に用いられる。プロモーターは、適当な細胞内調節因子に結合した場合に、プロモーター−依存性転写を増強し（「エンハンサー」）または抑制する（「レプレッサー」）他のプロモーター、プロモーターエレメント、および／または調節配列／エレメントとカップリングすることができる。プロモーター、エンハンサー、またはレプレッサーは、そのようなエレメントが導入遺伝子の転写速度または効率を制御し、またはそれに影響する場合に、導入遺伝子に「操作可能に連結している」といわれる。例えば、導入遺伝子コーディング配列の５’末端の近位側に位置するプロモーター配列は、通常、導入遺伝子に操作可能に連結されている。本明細書中で用いるとき、用語「調節エレメント」は「調節配列」と交換可能に用いられ、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御エレメント、またはそのようなエレメントのいずれかの組合せをいう。
【００６３】
プロモーターはそれらが制御する遺伝子に対して５’側（上流）に位置する。多くの真核生物プロモーターは２つのタイプの認識配列：ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメントを含有する。転写開始部位から２５−３０ｂｐ上流に位置したＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩを指令して、正しい部位としてＲＮＡ合成を開始するのに関与すると考えられる。対照的に、上流プロモーターエレメントは転写が開始する速度を決定する。これらのエレメントはそれらの向きに拘わらず作用することができるが、それらはＴＡＴＡボックスから１００〜２００ｂｐ上流内に位置しなければならない。
【００６４】
エンハンサーエレメントは、連結された相同または異種プロモーターから１０００倍まで転写を刺激することができる。それらの向きが逆であっても、エンハンサーエレメントはしばしば活性なままである（Ｌｉら、Ｊ．Ｂｉｏ．Ｃｈｅｍ．１９９０，２６６：６５６２−６５７０）。さらに、プロモーターエレメントとは異なり、転写開始部位から下流に、例えば、イントロン内に、あるいはプロモーターからかなりの距離にさえ置かれた場合に、エンハンサーは活性であり得る（Ｙｕｔｚｅｙら、Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏ．１９８９，９：１３９７−１４０５）。
【００６５】
当該分野で知られているように、この距離におけるある程度の変動はプロモーターの機能の喪失なくして収容することができる。同様に、導入遺伝子に対して調節遺伝子の位置決定は、機能の喪失なくしてかなり変動させることができる。調節エレメントの多数のコピーは共働して作用することができる。典型的には、発現ベクターは、１以上のエンハンサー配列、続いて、５’から３’の向きに、全て導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーター配列、続いて、ポリアデニル化配列を含む。
【００６６】
３．遺伝子
本発明のある実施形態は、注目する１以上の遺伝子に操作可能にカップリングされた、本明細書中に記載された新規なプロモーター配列の１つを含む核酸配列に関する。本発明のある他の実施形態は細胞をイメージングする方法に関し、方法は遺伝子を細胞に送達する方法とさらに定義される。これらの実施形態において、遺伝子はプロモーターに操作可能にカップリングされている。当業者に知られたいずれの遺伝子も、遺伝子を細胞に送達する方法で含ませることが考えられる。用語「遺伝子」は、簡単のために、機能的蛋白質、ポリペプチド、またはペプチド−コーディングユニットをいうのに用いられる。
【００６７】
本発明のある実施形態において、遺伝子は治療遺伝子である。「治療遺伝子」は、病気を治療しまたは予防する目的のために被験体に投与できる遺伝子である。例えば、治療遺伝子は癌の治療または予防のために被験体に投与される遺伝子であり得る。治療遺伝子の例は、限定されないが、Ｒｂ、ＣＦＴＲ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ−ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ  ｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、ｍｄａ７、ｆｕｓ、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＡＤＰ、ｐ５３、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＹＥＳ、ＭＡＤＨ４、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＴＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、Ｒａｐ１Ａ、シトシンデアミナーゼ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ＢＲＣＡ２、ｚａｃ１、ＡＴＭ、ＨＴＣ−１、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＰＴＥＮ、ＩＮＧ１、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＯＶＣＡ１、ＭＡＤＲ２、５３ＢＰ２、ＩＲＦ−１、Ｒｂ、ｚａｃ１、ＤＢＣＣＲ−１、ｒｋｓ−３、ＣＯＸ−１、ＴＥＰＩ、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、またはＭＣＣを含む。
【００６８】
本発明のある実施形態において、治療遺伝子は腫瘍サプレッサー遺伝子である。腫瘍サプレッサー遺伝子は、細胞に存在する場合に、細胞の腫瘍形成性、悪性、または過剰増殖表現型を低下させる遺伝子である。この定義は腫瘍サプレッサー遺伝子の全長核酸配列、ならびに全長配列に由来するいずれかの長さの非−全長配列双方を含む。配列は、特異的宿主細胞においてコドン優先性を提供するために導入することができる天然の配列または複数配列の縮重コドンを含むことがさらに理解される。
【００６９】
この定義内の腫瘍サプレッサー核酸の例は、限定されないが、ＡＰＣ、ＣＹＬＤ、ＨＩＮ−１、ＫＲＡＳ２ｂ、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐ２７ｍｔ、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ＰＴＥＮ、Ｒｂ、ウテログロビン、Ｓｋｐ２、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＣＨＫ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＣＣ、ＤＰＣ４、ＭＡＤＲ２／ＪＶ１８、ＭＥＮ１、ＭＥＮ２、ＭＴＳ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＶＨＬ、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＣＦＴＲ、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ、ｒａｓ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、Ｇｅｎｅ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、β＊（ＢＬＵ）、Ｌｕｃａ−１（ＨＹＡＬ１）、Ｌｕｃａ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１（ＮＰＲＬ２）、またはＳＥ  ＭＡ３ポリペプチドをコードする遺伝子、およびＦＵＳ１を含む。ＦＵＳ１等の染色体３ｐ２１．３遺伝子は、ここに具体的に引用してその全部を援用する、米国特許出願公開ＮＯ．２００２０１６４７１５にかなり詳細に議論されている。
【００７０】
他の例示的腫瘍サプレッサー遺伝子は、ｗｗｗ．ｃｉｓｅ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／〜ｙｙ１／ＨＴＭＬ−ＴＳＧＤＢ／Ｈｏｍｅｐａｇｅ．ｈｔｍｌ．における腫瘍サプレッサー遺伝子のデータベースに記載されている。このデータベースを、具体的にここに引用して、本出願のこのおよび全ての他のセクションに援用する。先に議論した腫瘍サプレッサー遺伝子をコードする核酸は、腫瘍サプレッサー遺伝子、またはそれに由来する核酸（例えば、各腫瘍サプレッサーアミノ酸配列の活性な断片をコードするｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびそのサブ配列）、ならびにこれの配列を含むベクターを含む。当業者であれば、本発明に適用することができる腫瘍サプレッサー遺伝子に精通しているであろう。
【００７１】
本発明のある実施形態において、治療遺伝子は、アポトーシスを誘導する遺伝子（すなわち、プロ−アポトーシス遺伝子）である。「プロ−アポトーシス遺伝子アミノ酸配列」とは、細胞に存在する場合に、アポトーシスを誘導し、または促進するポリペプチドをいう。本発明では、当業者に知られたいずれのプロ―アポトーシス遺伝子も含めることが考えられる。例示的なプロ−アポトーシス遺伝子はＣＤ９５、カスパーゼ−３、Ｂａｘ、Ｂａｇ−１、ＣＲＡＤＤ、ＴＳＳＣ３、ｂａｘ、ｈｉｄ、Ｂａｋ、ＭＫＰ−７、ＰＥＲＰ、ｂａｄ、ｂｃｌ−２、ＭＳＴ１、ｂｂｃ３、Ｓａｘ、ＢＩＫ、ＢＩＤ、およびｍｄａ７を含む。ｍＤＡ７に関する情報は、その各々をここに具体的に引用してその全体を援用する、米国特許出願公開Ｎｏ．２００５０２５０１２７、２００４０００９９３９、２００３０２２５０２５、および２００２０１８３２７１に例えば見出すことができる。当業者であれば、本発明の方法および組成物で適用することができる、本明細書中に具体的に記載されていないプロ−アポトーシス遺伝子および他のそのような遺伝子に精通しているであろう。
【００７２】
治療遺伝子はサイトカインをコードする遺伝子でもあり得る。用語「サイトカイン」は、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用する１つの細胞集団によって放出される蛋白質についての一般的用語である。「サイトカイン」とは、細胞に存在する場合に、サイトカインの機能のいくらかまたは全てを維持するポリペプチドをいう。この定義は、全長配列、ならびに全長配列に由来するいずれかの長さの非−全長配列を含む。先に議論したように、配列は、特異的宿主細胞においてコドン優先性を提供するために導入することができる天然配列または複数配列の縮重コドンを含むことがさらに理解される。
【００７３】
そのようなサイトカインの例はリンフォカイン、モノカイン、成長因子および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモン等の成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体ホルモン（ＬＨ）等の糖蛋白質ホルモン；肝臓成長因子；プロスタグランジン、線維芽細胞成長因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン、ＯＢ蛋白質；腫瘍壊死因子−αおよびβ；ムレリアン−刺激物質；マウスゴナドトロピン−関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−β等の神経成長因子；血小板−成長因；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−β等のトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン−様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、および−γのようなインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）等のコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＬＩＦ、Ｇ−ＧＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ｋｉｔ−リガンドまたはＦＬＴ−３等のインターフェロン（ＩＬ）である。
【００７４】
サイトカインの別の例はＩＬ−１０である。ＩＬ−１０は免疫系細胞ならびにいくつかの腫瘍細胞によって生産される多能性ホモダイマーサイトカインである（Ｅｋｍｅｋｃｉｏｇｌｕら、１９９９）。その免疫抑制機能は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−６のそれを含めた、プロ炎症性サイトカイン合成の優れた阻害を含む（Ｄｅ  Ｗａａｌ  Ｍａｌｅｆｙｔら、１９９１）。ＩＬ−１０−様サイトカインのファミリーは染色体１ｑ３２上の小さな１９５ｋｂ遺伝子クラスターにコードされ、ＩＬ−１０に対して構造的および配列相同性を持つ多数の細胞蛋白質（ＩＬ−１０、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＭＤＡ−７）からなる（Ｋｏｔｅｎｋｏら、２０００；Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、２０００；Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、２００１；Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒら、２０００；Ｋｎａｐｐら、２０００；Ｊｉａｎｇら、１９９５ａ；Ｊｉａｎｇら、１９９６）。
【００７５】
サイトカインファミリーの最近発見された推定メンバーはＭＤＡ−７である。ＭＤＡ−７はＩＬ−１０ファミリーメンバーとして特徴付けられており、ＩＬ−２４としても知られている。染色体の位置転写調節、ネズミおよびラット相同発現、および推定蛋白質構造は、全て、サイトカインであるＭＤＡ−７に帰属される（Ｋｎａｐｐら、２０００；Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０００；Ｓｏｏら、１９９９；Ｚｈａｎｇら、２０００）。その全てが迅速な分解のためにｍＲＮＡを標的化するそれらの３’ＵＴＲにおいてＡＵ−リッチなエレメントを含有するＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦα、およびＩＦＮγ転写体と同様に、ＭＤＡ−７はその３’ＵＴＲにおいて３つのＡＲＥを有する１７。ｍｄａ−７  ｍＲＮＡはヒトＰＢＭＣで同定されており（Ｅｋｍｅｋｃｉｏｇｌｕ，ら、２００１）、ヒトＭＤＡ−７蛋白質のサイトカイン機能は従前には報告されていないが、ＭＤＡ−７は遺伝子および蛋白質配列特徴に基づいてＩＬ−２４として命名されている。（ＮＣＢＩデータベースアクセションＸＭ＿００１４０５）。
【００７６】
治療遺伝子の他の例は酵素をコードする遺伝子を含む。その例は、限定されないが、ＡＣＰデサチュラーゼ、ＡＣＰヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホスホリラーゼ、ＡＴＰａｓｅ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ヒアルロンシンターゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰａｓｅ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、リゾチウム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ、ペプチデアーゼ、プラナーゼ、レコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、レポーター遺伝子、インターロイキン、またはサイトカインを含む。
【００７７】
治療遺伝子のさらなる例は、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバミラーゼ、アルギノスクシネートシンテターゼ、アルギノスクシネートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセトアセテートヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、α−１抗トリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、低密度−リポ蛋白質受容体、ポルフォビリノーゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンβ−シンターゼ、分岐鎖ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリル−ＣｏＡ、デヒドロゲナーゼ、プロピオリルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、β−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−プロテイン、Ｔ−プロテイン、メンケス病銅−輸送ＡＴＰａｓｅ、ウィルソン病銅−輸送ＡＴＰａｓｅ、シトシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース−１−ホスフェートウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセルブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、またはヒトチミジンキナーゼをコードする遺伝子を含む。
【００７８】
治療遺伝子はホルモンをコードする遺伝子も含む。その例は、限定されないが、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤ラクトゲン、黄体ホルモン、卵胞−刺激ホルモン、絨毛ゴナドトロピン、甲状腺−刺激ホルモン、レプチン、アドレノコルチコトロピン、アンジオテンシンＩ、アンジオテンシンＩＩ、β−エンドルフィン、β−メラノサイト刺激ホルモン、コレシストキニン、エンドセリンＩ、ゲラニン、胃阻害ペプチド、グルカゴン、インスリン、リポトロピン、ニューロフィジン、スマトスタチン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、β−カルシトニン遺伝子関連ペプチド、悪性因子の高カルシウム血症、副甲状腺ホルモン−関連蛋白質、副甲状腺ホルモン−関連蛋白質、グルカゴン−様ペプチド、パンクレアスタチン、パンクレアチックペプチド、ペプチドＹＹ、ＰＨＭ、セクレチン、血管活性腸ペプチド、オキシトシン、バスプレッシン、バソトシン、エンケファリンアミド、メトルフィナンアミド、αメラノサイト刺激ホルモン、心房ナトリウム利尿性因子、アミリン、アミロイドＰ成分、コルチコトロピン放出ホルモン、成長ホルモン放出因子、黄体ホルモン−放出ホルモン、ニューロペプチドＹ、サブスタンスＫ、サブスタンスＰ、またはチロトロピン放出ホルモンをコードする遺伝子を含む。
【００７９】
当業者に理解されるように、用語「治療遺伝子」はゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、および蛋白質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合蛋白質および突然変異体を発現し、または発現するように適合させることができるより小さな作成された遺伝子セグメントを含む。治療遺伝子をコードする核酸分子は、約５〜約１２０００またはそれ以上のヌクレオチド、ヌクレオシド、または塩基対の連続核酸配列を含むことができる。
【００８０】
「他のコーディング配列から実質的に単離された」は、注目する遺伝子が拡散セグメントのコーディング領域の一部を形成し、およびセグメントは、大きな染色体断片または他の機能的遺伝子またはｃＤＮＡコーディング領域等の、天然に生じるコーディング核酸の大きな部分を含有しないことを意味する。もちろん、これは元来単離された核酸セグメントをいい、ヒトの操作によってのちにセグメントに加えられた遺伝子またはコーディング領域を排除しない。
【００８１】
「治療遺伝子」の定義の中には、「生物学的に機能的に同等な」治療遺伝子が含まれる。従って、治療遺伝子のアミノ酸と同一または機能的に同等なアミノ酸に対して約７０％〜約９９％相同性を有する配列は、生物学的に機能的に同等な配列であり、但し、蛋白質の生物学的活性は維持されているものとする。
【００８２】
４．選択マーカー
本発明のある実施形態において、本発明の核酸構築体は、マーカーを発現ベクターに含めることによってイン・ビトロまたはイン・ビボで同定することができる。そのようなマーカーは、同定可能な変化を細胞に付与し、発現ベクターを含有する細胞の同定を容易にする。一般に、選択可能マーカーは、選択を可能にする特性を付与するものである。陽性選択可能マーカーは、マーカーの存在がその選択を可能にするものであり、他方、陰性選択可能マーカーは、その存在がその選択を妨げるものである。陽性選択可能マーカーの例は薬物抵抗性マーカーである。選択可能およびスクリーニング可能なマーカーの例は当業者によく知られている。
【００８３】
５．レポーター
本明細書中で用いるように、用語「レポーター」、「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」等は、細胞に存在する他の遺伝子配列またはコードされたポリペプチドから検出可能であって、識別可能であるいずれの遺伝子配列またはコードされたポリペプチド配列もいう。好ましくは、レポーター配列は、その存在によって、または検出可能なシグナルの発生をもたらすその活性によって、容易に検出可能な蛋白質をコードする。ある態様において、検出可能な部位はフルオロフォア、ルミノフォア、マイクロスフェア、酵素、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、および／またはナノスフェアを含むことができ、それらのすべては、受容体を認識し、および／またはそれと相互反応する抗体またはリガンドにカップリングさせることができる。種々の実施形態において、本発明の核酸配列はレポーター核酸配列を含み、あるいは検出可能なポリペプチドを生起させる産物をコードする。レポーターは、検出可能なシグナルを直接的にまたは間接的に生じさせることができるレポーター分子であるか、あるいはそれをコードする。一般には、必ずしも必要はないが、レポーター遺伝子は、そうでなければ細胞によって生産されないＲＮＡおよび／または検出可能な蛋白質をコードする。多くのレポーター遺伝子が記載されており、いくつかは遺伝子調節の実験のために市販されている。例えば、その開示をここに引用して援用するＡｌａｍ  ａｎｄ  Ｃｏｏｋ，１９９０，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８８：２４５−２５４を参照。検出することができるシグナルは、限定されないが、色、蛍光、ルミネセンス、同位体または放射性同位体シグナル、細胞表面タグ、細胞生存率、細胞栄養要求性の救済、細胞成長および薬物抵抗性を含む。レポーター配列は限定されないが、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシガーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリ性ホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、例えば、Ｇ−プロテイン結合受容体、ソマトスタチン受容体を含めた膜結合蛋白質、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザヘマグルチニン蛋白質、シンポーター（ＮＩＳ等）、およびそれに対して向けられた高アフィニティー抗体またはリガンドが存在するか、あるいは慣用的な手段によって生産することができる当該分野でよく知られた他のもの、およびとりわけ、ヘマグルチミンまたはＭｙｃからの抗原タグドメインに適切に融合された膜結合蛋白質を含む融合蛋白質をコードするＤＮＡ配列を含む。
【００８４】
ある実施形態において、レポーターアミノ酸配列はＧ−プロテイン結合受容体アミノ酸配列である。例示的なＧ−プロテイン結合受容体はアセチルコリン受容体：Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、またはＭ５；アデノシン受容体：Ａ１；Ａ２Ａ；Ａ２Ｂ；またはＡ３；アドレノセプター：α１Ａ、α１Ｂ、α１Ｄ、α２Ａ、α２Ｂ、α２Ｃ  β１、β２、またはβ３；アンジオテンシン受容体：ＡＴ１、またはＡＴ２；ボンベシン受容体：ＢＢ１、ＢＢ２、またはＢＢ３；ブラジキニン受容体：Ｂ１、Ｂ２、カルシトニン、アイニリン、ＣＧＲＰ、またはアドレノメジュリン受容体；カンナビノイド受容体：ＣＢ１、またはＣＢ２；ケモカイン受容体：ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸ３ＣＲ１、またはＸＣＲ１；化学走性受容体：Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、またはｆＭＬＰ；コレシストキニンおよびガストリン受容体：ＣＣＫ１、またはＣＣＫ２；コルチコトロピン−放出因子受容体：ＣＲＦ１またはＣＲＦ２；ドーパミン受容体：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４またはＤ５；エンドセリン受容体：ＥＴ（Ａ）またはＥＴ（Ｂ）；ガラニン受容体：ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、またはＧＡＬ３；グルタメート受容体：ｍｇｌ１、ｍｇｌ２、ｍｇｌ３、ｍｇｌ４、ｍｇｌ５、ｍｇｌ６、ｍｇｌ７、またはｍｇｌ８；糖蛋白質ホルモン受容体：ＦＳＨ、ＬＳＨ、またはＴＳＨ；ヒスタミン受容体：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、またはＨ４；５−ＨＴ受容体：５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｆ、５−ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｆ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５Ａ、５−ＨＴ５Ｂ、５−ＨＴ６、または５−ＨＴ７；ロイコトリエン受容体：ＢＬＴ、ＣｙｓＬＴ１、またはＣｙｓＬＴ２；リソリン脂質受容体：ｅｄｇ１、ｅｄｇ２、ｅｄｇ３、またはｅｄｇ４；メラノコルリン受容体：ＭＣ１；ＭＣ２；ＭＣ３；ＭＣ４、またはＭＣ５；メラトニン受容体：ＭＴ１、ＭＴ２、またはＭＴ３；ニューロペプチドＹ受容体：Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、またはＹ６；ニューロテンション受容体：ＮＴＳ１、またはＮＴＳ２；オピオイド：ＤＯＰ、ＫＯＰ、ＭＯＰ、またはＮＯＰ；Ｐ２Ｙ受容体：Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、またはＰ２Ｙ１２；ペルオキシソームプロリフェレーター：ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−β、またはＰＰＡＲ−γ；プロスタノイド受容体：ＤＰ、ＦＰ、ＩＰ、ＴＰ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、またはＥＰ４；プロテアーゼ−活性化受容体：ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、またはＰＡＲ４；ソマトスタチン受容体：ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ２Ａ、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、またはＳＳＴＲ５；タキキニン受容体：ＮＫ１、ＮＫ２、またはＮＫ３；チロトロピン−放出ホルモン受容体：ＴＲＨ１、またはＴＲＨ２；ウロテンシン−ＩＩ受容体、血管活性腸ペプチドまたは下垂体アデニレートシクラーゼ活性化ペプチド受容体：ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２、またはＰＡＣ１；またはバソプレッシンまたはオキシトシン受容体：Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２、またはＯＴを含む。レポーターとしてのスマトスタチン受容体の使用は、明細���の本セクションおよび明細書のすべての他のセクションについて、ここに具体的に引用してその全体を援用する、米国特許出願公開Ｎｏ．２００２０１７３６２６にかなり詳細に議論されている。
【００８５】
ある実施形態において、レポーター核酸またはポリペプチドの発現は成長の利点を付与し、成長利点の程度は、宿主細胞の成長条件を変化させることによって制御可能である。
【００８６】
他の実施形態において、レポーター配列は蛍光蛋白質をコードする。本発明に従って用いることができる蛍光蛋白質の例は緑色蛍光蛋白質（ＧＦＰ）、増強された緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ緑色蛍光蛋白質、ＧＦＰｍｕｔ２、ＧＦＰｕｖ４、増強された黄色蛍光蛋白質（ＥＹＦＰ）、増強されたシアン蛍光蛋白質（ＥＣＦＰ）、増強された青色蛍光蛋白質（ＥＢＦＰ）、ディスコソーマ（ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）からのレモン色および赤色蛍光蛋白質（ｄｓＲＥＤ）を含む。
【００８７】
他の実施形態において、レポーター遺伝子は細胞表面タグをコードすることができる。この実施形態との関係において、方法は、さらに、宿主細胞を、細胞表面タグに対して特異的な蛍光標識抗体と接触させ、それにより、ＦＡＣＳまたは他のソーティング、または単離方法によって単離することができる宿主細胞を標識する工程を含むことができる。
【００８８】
種々の実施形態において、レポーター配列の少なくとも１つの発現の所望のレベルは、レポーター配列の基礎転写レベルと比較した、レポーター配列の発現のレベルの増大、減少、または変化無しである。特定の実施形態において、レポーター配列の１つの発現の所望のレベルは、レポーター配列の基礎転写レベルと比較したレポーター配列の発現のレベルの増加である。
【００８９】
種々の実施形態において、レポーター配列は、独立して、同時に、または独立してかつ同時に分析することができるユニークな検出可能蛋白質類をコードする。ある実施形態においては、レポーター配列の少なくとも１つは蛍光蛋白質をコードする。別の実施形態において、レポーター配列の少なくとも１つの発現レベルはＦＡＣＳによって分析することができる。
【００９０】
他の実施形態において、宿主細胞は真核生物細胞または原核生物細胞であってよい。例示的な真核生物細胞は酵母および哺乳動物細胞を含む。哺乳動物細胞はヒト細胞、および癌細胞等の病理学的表現型を呈する種々の細胞を含む。
【００９１】
本発明のある実施形態において、レポーターはリボザイムＲＮＡ配列である。蛋白質は伝統的には核酸の触媒のために用いられてきたが、別のクラスのマクロ分子がこの努力において有用なものとして出現した。リボザイムは、核酸を部位特異的に切断するＲＮＡ−蛋白質複合体である。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を保有する特異的な触媒ドメインを有する（Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｃｏｏｋ，１９８７；Ｇｅｒｌａｃｈら、１９８７；Ｆｏｒｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｙｍｏｎｓ，１９８７）。例えば、非常に多数のリボザイムは、ホスホエステル導入反応を非常に高い程度の特異性をもって加速し、しばしば、オリゴヌクレオチド基質においていくつかのホスホエステルのただ１つを切断する（Ｃｏｏｋら、１９８１；Ｍｉｃｈｅｌ  ａｎｄ  Ｗｅｓｔｈｏｆ，１９９０；Ｒｅｉｎｈｏｌｄ−Ｈｕｒｅｋ  ａｎｄ  Ｓｈｕｂ，１９９２）。この特異性は、基質が特異的塩基−対合相互作用を介して化学反応に先立ってリボザイムの内部ガイド配列（「ＩＧＳ」）に結合する要求に帰せられてきた。
【００９２】
６．スプライシング部位
ほとんどの転写された真核生物ＲＮＡ分子は、ＲＮＡスプライシングを受けて、初代転写体からイントロンを除去する。ゲノム真核生物配列を含有するベクターは、蛋白質発現のための転写体の適切なプロセッシングを確保するためにドナーおよび／またはアクセプタースプライシング部位を必要とするであろう（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、１９９７）。
【００９３】
７．ポリアデニル化シグナル
転写体の適切なポリアデニル化を行うためには、発現構築体にポリアデニル化シグナルが含まれ得る。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の成功裡の実施に対して非常に重要であるとは考えられず、および／またはいずれのそのような配列も使用してよい。特定の実施形態は、種々の標的細胞において便宜であり、および／またはよく機能することが知られている、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナルを含む。また、発現カセットのエレメントは転写終止部位であると考えられる。これらのエレメントはメッセージレベルを増強し、および／またはカセットから他の配列へのリードスルーを最小化するように働くことができる。
【００９４】
８．終止シグナル
本発明のベクターまたは構築体は、少なくとも１つの終止シグナルを含むことができる。「終止シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写体の特異的終止に関与するＤＮＡ配列から構成される。かくして、ある実施形態においては、ＲＮＡ転写体の生産を終える終止シグナルが考えられる。ターミネーターは、望ましいメッセージレベルを達成するのにイン・ビボで必要であり得る。
【００９５】
真核生物系において、ターミネーター領域は、新しい転写体の部位特異的切断を行って、ポリアデニル化部位を露出させる特異的ＤＮＡ配列を含むこともできる。これは、特殊化された内因性ポリメラーゼにシグナルを与えて、約２００Ａ残基のストレッチ（ポリＡ）を転写体の３’末端に加える。このポリＡテイルで修飾されたＲＮＡ分子は、より安定なように見え、より効率的に翻訳される。かくして、真核生物に関係する他の実施形態において、ターミネーターはＲＮＡの切断についてのシグナルを含むのが好ましく、ターミネーターシグナルはメッセージのポリアデニル化を促進するのがより好ましい。ターミネーターおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルを増強させ、カセットから他の配列へのリードスルーを最小化するように働くことができる。
【００９６】
本発明で用いることが考えられるターミネーターは、限定されないが、例えば、ウシ成長ホルモンターミネーター等の遺伝子の終止配列、または例えばＳＶ４０ターミネーター等のウィルスターミネーター配列を含めた、本明細書中に記載されたまたは当業者に知られたいずれの公知の転写のターミネーターも含む。ある実施形態において、終止シグナルは、配列切形のためなどにより、転写可能または翻訳可能配列の欠如であり得る。
【００９７】
９．複製起点
宿主細胞においてベクターを増殖させるためには、それは、そこで複製が開始する特異的核酸配列である１以上の複製起点部位（しばしば、「オリ（ｏｒｉ）」という）を含有することができる。別法として、宿主細胞が酵母であるとき、自律複製配列（ＡＲＳ）を使用することができる。
【００９８】
１０．ＩＲＥＳ
本発明のある実施形態においては、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）エレメントを用いて、マルチジーン、またはポリシストロニックメッセージを作製する。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソームスキャンニングモデルを回避することができ、内部部位で翻訳を開始することができる（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）。ピコルナウィルス科の２つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）からのＩＲＥＳエレメント（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）、ならびに哺乳動物メッセージからのＩＲＥＳ（Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，１９９１）が記載されている。ＩＲＥＳエレメントは異種オープンリーディングフレームに連結することができる。多数のオープンリーディングフレームが一緒に転写することができ、各々はＩＲＥＳによって分離され、ポリシストロニックメッセージを生じる。ＩＲＥＳエレメントによって、各オープンリーディングフレームは効果的な翻訳のためにリボソームに接近可能である。多数の遺伝子が、単一プロモーター／エンハンサーを用いて効果的に発現されて、単一のメッセージを転写することができる（米国特許第５，９２５，５６５号および第５，９３５，８１９号；ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５７８１）。
【００９９】
Ｂ．細胞をイメージングする方法
本発明のある実施形態は、細胞を、本明細書中に記載された新規なプロモーターの１以上を含む核酸を含む組成物と接触させ、プロモーターはレポーターアミノ酸配列に操作可能にカップリングされており、次いで、レポーターに由来するシグナルを測定することによってレポーター配列の細胞発現を検出することを含む細胞をイメージングする方法に関する。細胞は単離された細胞であってよく、あるいはそれは被験体における組織等の組織の一部であってよい。ある実施形態において、細胞は、癌を持つ被験体における腫瘍に含まれる腫瘍細胞である。
【０１００】
１．シグナルを測定する方法
測定すべきシグナルは、単離されたイメージング手法の一部として、あるいは（後により詳細に議論する）１を超えるイメージング様式を用いるイメージング手法の一部として測定することができる。例えば、イメージング手法は後に議論するＣＴ、ＭＲＩ、またはＰＥＴであってよい。しかしながら、ある態様においては、イメージングは、被験体に対する外科的手法の間に手術内で行われる。ある実施形態においては、例えば、レポーターを用いて、外科医が切除を望む特定の組織タイプを選択的に標識することができる。例えば、ある実施形態においては、切除すべき組織は腫瘍組織であって、手術内イメージングは腫瘍組織のイメージングである。操作内で行われるイメージングを用いて切除すべき細胞の検出を誘導する。操作内イメージングは、治療遺伝子の投与と同時に行っても行わなくてもよく、治療遺伝子はレポーター配列に操作可能にカップリングされている。
【０１０１】
ある実施形態において、イメージングは被験体への治療遺伝子の投与と同時に行われる。例えば、レポーターアミノ酸配列に操作可能にカップリングされるに加えて、プロモーターを治療遺伝子に操作可能にカップリングすることもできる。治療遺伝子は、当業者に知られたいずれのタイプの治療遺伝子であってもよい。例えば、治療遺伝子は腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、またはホルモンをコードする遺伝子であってよい。当業者に知られたいずれの治療遺伝子も、本発明の方法によって考えられる。治療遺伝子では、本明細書中において、他の箇所でより詳細に議論する。
【０１０２】
治療遺伝子に操作可能にカップリングされたレポーターアミノ酸配列の同時投与は、被験体における遺伝子の生体内分布の測定に適用することもできる。かくして、本明細書中に記載された細胞をイメージングする方法を適用して、癌を持つ被験体における腫瘍中の治療遺伝子の生体内分布等の、組織中の治療遺伝子の生体内分布を測定することができる。
【０１０３】
レポーターアミノ酸配列のイメージングは、当業者に知られたいずれの方法によって行うこともできる。例えば、レポーターは、被験体への標識リガンドの投与によってイメージすることができ、標識されたリガンドはレポーターアミノ酸配列に向けられる。他の実施形態において、リガンドは、１１１−Ｉｎ−オストレオチドのような放射性標識プローブである。さらなる実施形態において、リガンドは、レポーターアミノ酸配列に対して向けられた蛍光プローブ、またはレポーターアミノ酸配列に対して向けられた抗体である。
【０１０４】
レポーターに由来するシグナルを測定するための当業者に知られたいずれの方法も、本発明に含めることが考えられる。検出の例示的方法を以下に示す。
【０１０５】
ａ．γカメライメージング
イメージングのための種々の核医薬技術が当業者に知られている。これらの技術のいずれも、本発明のイメージング方法に関係して適用し、レポーターからのシグナルを測定することができる。例えば、γカメライメージングは、レポーターに由来するシグナルを測定するのに利用できるイメージングの方法として考えられる。当業者であれば、γカメライメージングの適用のための技術に精通しているであろう（例えば、ここに具体的に引用して援用するＫｕｎｄｒａら、２００２を参照）。１つの実施形態において、シグナルの測定は、１１１−Ｉｎ−オクトレオチド−ＳＳＲＴ２Ａレポーター系のγカメライメージングの使用を含むことができる。
【０１０６】
ｂ．コンピュータ断層撮影（ＣＴ）
コンピュータ断層撮影（ＣＴ）が、本発明に関係するイメージング様式として考えられる。種々の角度から、時々は千を超える一連のＸ線を取り、次いで、それをコンピュータと合わせることによって、ＣＴは身体のいずれかの部分の三次元イメージを形成することを可能にする。コンピュータは、いずれかの角度から、かついずれかの深さにおける二次元スライスを提示するようにプログラムされる。
【０１０７】
ＣＴにおいては、放射線不透明コントラスト剤の静脈内注射は、最初のＣＴスキャンが診断的でない場合には、柔軟組織塊の同定および表示を助けることができる。同様に、コントラスト剤は、柔軟組織または骨病巣の血管系を評価するのを助ける。例えば、コントラスト剤の使用は、腫瘍と隣接する血管構造との関係の表示を助けることができる。
【０１０８】
ＣＴコントラスト剤は、例えば、ヨウ素化コントラスト媒体を含む。これらの剤の例はイオタラメート、イオヘキソール、ジアトリゾエート、イオパミドール、エチオドール、およびイオパノエートを含む。ガドリウム剤もＣＴコントラスト剤として使用できることが報告されている（例えば、Ｈｅｎｓｏｎら、２００４を参照）。例えば、ガドペンテート剤は（Ｓｔｒｕｎｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｄ，２００４に議論された）ＣＴコントラスト剤として用いられてきた。
【０１０９】
本発明の実施形態において、例えば、レポーター、またはレポーターに融合されたタグに対して向けられたリガンドをＣＴコントラスト剤で標識することができる。次いで、ＣＴイメージングの実行を用いて、レポーターに由来するシグナルを測定することができる。
【０１１０】
ｃ．磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）
磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）は、イメージを生じさせるのに高強度磁石およびラジオ周波数シグナルを用いるＣＴよりも新しいイメージング様式である。生物学的組織における最も豊富な分子種は水である。最終的に、イメージング実験においてシグナルを生起させるのは水プロトン核の量子力学（スピン）である。ＭＲＩにおいては、イメージすべき試料を強力な静磁場（１〜１２テスラ）に入れ、スピンをラジオ周波数（ＲＦ）放射のパルスで励起して、試料中に正味の磁化を生じさせる。次いで、種々の磁場勾配および他のＲＦパルスをスピンに作用させて、空間的情報を記録されたシグナルに暗号化する。これらのシグナルを収集し、分析することによって、ＣＴイメージのように、二次元スライスで通常は示される三次元イメージを計算するのが可能である。
【０１１１】
ＭＲイメージングで用いるコントラスト剤は、他のイメージング技術で用いるのとは異なる。それらの目的は、同一のシグナル特徴を持つ組織成分の間を区別するのを助け、（Ｔ１−重み付けスピン−エコーＭＲイメージ上により強力なシグナル、およびＴ２−重み付けイメージ上により強度の低いシグナルを生じさせる）緩和時間を短縮させることである。ＭＲＩコントラスト剤の例は、ガドリニウムキレート、マンガンキレート、クロムキレート、および鉄粒子を含む。
【０１１２】
ＣＴおよびＭＲＩは共に、組織境界および血管構造を区別するのを助ける解剖学的情報を提供する。ＣＴと比較して、ＭＲＩの不利点はより低い患者許容性、ペースメーカーおよびある種の他の移植された金属デバイスの禁忌、および多数の原因に関連する人工物を含み、その少なからずは動きである（Ａｌｂｅｒｉｃｏら、２００４）。他方、ＣＴは迅速で、よく許容され、かつ容易に利用できるが、ＭＲＩよりも低いコントラスト分解能を有し、ヨウ素化コントラストおよび電離放射線を必要とする（Ａｌｂｅｒｉｃｏら、２００４）。ＣＴおよびＭＲＩ双方の不利点は、いずれのイメージング様式も細胞レベルで機能的な情報を提供しないことである。例えば、いずれの様式も細胞生存率に関する情報も提供しない。
【０１１３】
ＣＴイメージングについて前記したように、リガンドが受容体、または受容体に融合したタグに向けられるＭＲＩコントラスト剤で標識されたリガンドは、レポーターに由来するシグナルの存在を決定するためにＭＲＩを用いて測定することができる。
【０１１４】
ｄ．ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ
細胞生存率等の細胞レベルの情報に関する情報を提供するイメージング様式は、陽電子射出断層撮影法（ＰＥＴ）および単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）を含む。ＰＥＴにおいては、患者は、身体を通って移動する物質としてモニターできる陽電子を発するわずかな放射性物質を摂取し、またはそれが注射される。１つの普通の適用では、例えば、患者に、陽電子エミッターを付着させたグルコースを与え、彼らの脳を彼らが種々の仕事を行うときにモニターする。脳は働くにつれグルコースを使用するので、ＰＥＴイメージはどこで脳の活動が高いのかを示す。
【０１１５】
ＰＥＴに密接に関連するのは、単光子放射型コンピュータ断層撮影法、またはＳＰＥＣＴである。２つの間の主な差は、陽電子を発する物質の代わりにＳＰＥＣＴは高エネルギーフォトンを発する放射性トレーサーを用いることである。ＳＰＥＣＴは冠動脈病を診断するのに価値があり、既に約２５０万のＳＰＥＣＴ心臓研究が毎年合衆国において行われている。
【０１１６】
イメージングのためのＰＥＴ放射性医薬は、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、８２Ｒｂ、６２Ｃｕ、および６８Ｇａ等の陽電子−エミッターで通常は標識される。ＳＰＥＣＴ放射性医薬は、通常、９９ｍＴｃ、２０１Ｔｌ、および６７Ｇａ等の陽電子エミッターで標識する。脳イメージングに関しては、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ放射性医薬は、血液−脳−関門透過性、脳灌流および代謝受容体−結合および抗原−抗体結合に従って分類される（Ｓａｈａら、１９９４）。９９ｍＴｃＯ４−ＤＴＰＡ、２０１Ｔｌ、および［６７Ｇａ］シトレート等の血液−脳−関門ＳＰＥＣＴ剤は通常の脳細胞によって排除されるが、改変されたＢＢＢにより腫瘍細胞に侵入する。［１２３Ｉ］ＩＭＰ、［９９ｍＴｃ］ＨＭＰＡＯ、［９９ｍＴｃ］ＥＣＤ等のＳＰＥＣＴ灌流剤は親油性剤であり、従って、正常な脳に拡散する。重要な受容体−結合ＳＰＥＣＴ放射性医薬は［１２３Ｉ］ＱＮＥ、［１２３Ｉ］ＩＢＺＭ、および［１２３Ｉ］イオマゼニルを含む。これらのトレーサーは特異的受容体に結合し、受容体関連病の評価において重要なものである。
【０１１７】
ｅ．光学イメージング
光学イメージングは、医薬の特別な領域において広く普及した許容性を獲得した別のイメージング様式である。その例は蛍光イメージング分析、免疫組織化学イメージング分析、および化学発光イメージング分析を含む。当業者であれば、イメージング様式のこれらの形態に非常に精通しているであろう。さらなる例は、細胞成分の光学標識、およびフルオレセインアンジオグラフィーおよびヨードシアニン緑色アンジオグラフィー等のアンジオグラフィーを含む。光学イメージング剤の例は、例えば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、ヨードシアニングリーン、オレゴングリーン、オレゴングリーン誘導体、ローダミングリーン、ローダミングリーンの誘導体、エオシン、エリスロシン、テキサスレッド、テキサスレッドの誘導体、マラカイトグリーン、ナノ金スルホスクシンイミジルエステル、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン、ピリジルオキサゾール誘導体、カスケードイエロー色素、ダポキシル色素を含む。
【０１１８】
ｆ．超音波
広く普及した許容性を獲得した別の生物医学イメージング様式は超音波である。超音波イメージングは、柔軟組織構造のリアルタイム断面および三次元イメージさえ、および身体中の血液流動情報を提供するのに非侵入的に用いられてきた。血管、組織および器官のイメージを作成するための高周波音波およびコンピュータ。
【０１１９】
血流の超音波イメージングは、血管のサイズおよび深さ等の多数の因子によって制限され得る。超音波コントラスト剤（比較的最近の開発）はペルフルオリン、およびペルフルオリンアナログを含み、これらは、灰色−スケールイメージおよびドップラーシグナルを増強させるのを助けることによってこれらの制限を克服するように設計される。
【０１２０】
２．マルチ様式イメージング
本発明のいくつかの実施形態においては、１を超えるイメージング様式を用いるイメージングを用いて、レポーターに由来するシグナルを測定することができる。当業者に知られたいずれの２以上のイメージングの様式も本発明で適用して、レポーターに由来するシグナルを測定することができる。
【０１２１】
イメージング様式は、２つのイメージング様式にコンジュゲートされたオリゴ糖を含む診断的に有効な量の化合物を含む組成物の投与の間または後のいずれかの時点に行われる。例えば、イメージング実験は、本発明のデュアルイメージング化合物投与の間にあるいはその後いずれかの時点において行うことができる。いくつかの実施形態において、第一のイメージング様式は、デュアルイメージング剤の投与と同時に、またはデュアルイメージング剤の投与から約１秒、１時間、１日、またはいずれかの期間の後に、あるいはこれらの述べられた時間のいずれかの間におけるいずれかの時点に開始して行われる。本発明のいくつかの実施形態において、第二のイメージング様式は、第一のイメージング様式と同時に、または第一のイメージング様式後のいずれかの時点で行うことができる。例えば、第二のイメージング様式は、第一のイメージング様式の完了から約１秒、約１時間、約１日、またはそれ以上の期間後に、あるいはこれらの述べられた時間のいずれかの間におけるいずれかの時点に行うことができる。当業者であれば、本発明によって考えられる種々のイメージング様式の実行に精通しているであろう。さらに、当業者であれば、１を超えるイメージング様式を用いるイメージングを利用するイメージング機器およびイメージング技術に精通しているであろう。
【０１２２】
その例は、限定されないが、ＣＴおよびＭＲＩ、ＣＴおよびＰＥＴ、ＣＴおよびＳＰＥＣＴ、ＣＴおよび超音波、ＣＴおよび光学イメージングなどを含む。
【０１２３】
３．リガンド
リガンドは、本明細書中においては、別の化学的構成要素に結合してより大きな複合体を形成するイオン、分子または分子群をいうように定義される。本発明との関係において、リガンドは、レポーター、または（例えば、レポーターアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端に融合した蛋白質タグ等）レポーター配列に結合したアミノ酸配列に結合して、より大きな複合体を形成できるイオン、分子または分子群である。当業者に知られたいずれのリガンドも、本発明との関係ではリガンドとして用いることが考えられる。本発明のいくつかの実施形態において、リガンドをイメージすべき細胞と接触させることができる。リガンドは細胞によって内部化されてもされなくてもよい。レポーターが細胞表面に局所化されると、リガンドは、これらの実施形態においては、レポーターに結合し、またはレポーターと会合することができる。リガンドをレポーターに結合させるいずれの方法も本発明によって考えられる。ある他の実施形態において、リガンドは細胞によって内部化でき、細胞内のレポーターに結合し、または会合することができる。
【０１２４】
リガンドは、検出することができるシグナルを発生することができるような特性を有する分子または分子の部分であってよい。当業者に知られたいずれのイメージング様式もリガンドをイメージするのに適用することができる。いくつかの実施形態において、リガンドは、イメージすることができる分子または分子の部分に結合することができる。例えば、リガンドは放射性核種に結合することができ、放射性核種は当業者に知られた核医薬技術を用いてイメージすることができる。例えば、リガンドは１１１−Ｉｎ−オクトレオチドであってよい。他の実施形態において、例えば、リガンドは、当業者によく知られているイメージング技術を用いて検出することができるコントラスト剤に結合することができる。例えば、リガンドは、ＣＴコントラスト剤またはＭＲＩコントラスト剤に結合することができる。
【０１２５】
本発明のある実施形態において、リガンドはレポーターに結合することができ、リガンドは、今度は、当業者に知られたイメージング様式を用いて測定することができるシグナルを発生する。他の実施形態において、リガンドは、レポーターに融合された蛋白質タグに結合することができる。かくして、例えば、イメージングはリガンドからのシグナルを測定することを含み、これは、今度は、細胞内または被験体内のレポーター配列の局所化をもたらすであろう。
【０１２６】
４．イメージングで用いるための放射性イメージングおよび放射性核種
「放射性イメージング」は、本明細書中においては、シグナルの測定における放射性核種または価金属イオンの適用を含むいずれのイメージングもいうように定義される。種々の価金属イオンまたは放射性核種が放射性イメージングで有用であることが知られている。その例は、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ，１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６２Ｃｕ、２０１Ｔｌ、７２Ａ、および１５７Ｇｄを含む。
【０１２７】
多数の因子がヒトにおける最適な放射性イメージングで考えられなければならない。検出の効率を最大化するためには、１００〜２０ｋｅＶ範囲のγエネルギーを発する価金属イオンが好ましい。「γエミッター」は、本明細書中においては、いずれかの範囲のγエネルギーを発する剤と定義される。当業者であれば、γエミッターである種々の価金属イオンに精通しているであろう。患者に対する吸収された放射性用量を最小化するためには、放射性核種の物理的半減期はイメージング手法が許容する限り短くなければならない。いずれかの日に、かつ該日のいずれかの時点に行うべき調査を可能にするためには、臨床的サイトで常に入手可能な放射性核種の源を有するのが有利である。９９ｍＴｃは好ましい放射性各種である。なぜならば、それは１４０ｋｅＶのγ線を発し、それは６時間の物理的半減期を有し、およびそれはモリブデン−９９／テクネチウム−９９ｍ発生器を用いて容易に現場で利用できるからである。当業者であれば、ヒトにおいて最適な放射性イメージングを決定する方法に精通しているであろう。
【０１２８】
本発明の組成物のいくつかの実施形態において、βエミッターまたはγエミッターではない治療金属イオンである価金属イオンはリガンドまたはレポーターアミノ酸配列に結合することができる。例えば、治療金属イオンは白金、コバルト、銅、ヒ素、セリンおよびタリウムであってよい。これらの治療金属イオンを含む化合物は、癌の治療等の過剰増殖性疾患の治療に向けられた本発明の方法で適用することができる。
【０１２９】
本発明のある実施形態において、本発明のイメージング方法で用いられる核酸は、放射性標識することができるアミノ酸配列をコードする。コードされたレポーター配列の放射性標識は直接的とするこができ、あるいはそれは、蛋白質タグまたはレポーター配列に結合することができるリガンドの放射性標識によるように間接的とすることができる。本発明によって提供される放射性標識剤、化合物および組成物は、適量の放射能を有するものが提供される。例えば、９９ｍＴｃ放射性複合体の形成において、一般には、ｍＬ当たり約０．０１ミリキュリー（ｍＣｉ）〜約３００ｍＣｉの濃度の放射能を含有する溶液中で放射性複合体を形成するのが好ましい。
【０１３０】
一旦コードされた配列が放射性標識されれば、それは、哺乳動物身体中の腫瘍等の部位を可視化するためにイメージすることができる。本発明によると、放射性標識は、当業者に知られたいずれの方法によっても投与される。例えば、投与は、放射性標識リガンドとして投与される単一単位注射用量であってよい。滅菌生理食塩水または血漿等の当業者に知られた通常の担体もいずれも利用することができる。一般に、投与すべき単位用量は約０．０１ｍＣｉ〜約３００ｍＣｉ、好ましくは１０ｍＣｉ〜約２００ｍＣｉの放射能を有する。単位用量で注射すべき溶液は約０．０１ｍＬ〜約１０ｍＬである。
【０１３１】
放射性標識試薬の静脈内投与後に、器官または腫瘍のイン・ビボでのイメージングを、所望ならば、放射性標識試薬を患者に導入した後に数時間またはそれ以上以内に行うことができる。ほとんどの場合、十分な量の投与された用量が、１時間の約０．１以内にイメージすべき領域に蓄積するであろう。
【０１３２】
前記したように、イメージングは、当業者に知られたいずれの方法を用いても行うことができる。その例はＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、およびγシンチグラフィーを含む。γシンチグラフィーにおいては、放射性標識はγ放射線放出放射性核種であり、放射性トレーサーはγ放射線検出カメラを用いて位置させる（このプロセスは、しばしば、γシンチグラフィーといわれる）。イメージされた部位は検出可能である。なぜならば、放射性トレーサーは病理学的部位（陽性対照といわれる）に位置するように選択されるが、別法として、放射性トレーサーは（陰性対照といわれる）そのような病理学的部位に位置しないように特異的に選択されるからである。
【０１３３】
５．イメージングと共に遺伝子を送達する方法
本発明のある実施形態は、遺伝子を同時投与することを含み、遺伝子は、レポーターアミノ酸配列をコードする核酸に操作可能にカップリングされている。例えば、遺伝子は治療遺伝子であってよい。治療遺伝子は本明細書中において他の箇所で詳細に議論される。治療遺伝子は、酵素障害の治療、ホルモン欠乏の治療、または癌の治療等のいずれかの目的で投与することができる。
【０１３４】
かくして、例えば、本発明のイメージング方法は、遺伝子の被験体への投与に続いて、治療遺伝子等の遺伝子の生体内分布を同時に測定するのに適用することができる。さらに、イメージングの方法を、被験体における治療遺伝子の投与に対する応答を測定する方法と同時に適用することもできる。前記したイメージング方法を用いて腫瘍内の位置等の被験体の組織内での遺伝子の存在の場所をつきとめることができる。かくして、イメージング方法を用いて、腫瘍内での腫瘍細胞生存率を測定することができ、治療遺伝子の投与に続いての療法に対する応答に続いて適用することができる。
【０１３５】
Ｃ．細胞への核酸の送達のための送達ビヒクル
本発明のある実施形態は、一般には、本明細書中に記載された１以上の新規なプロモーター、および被験体における細胞へのプロモーター配列の送達用の送達ビヒクルを含む組成物に関する。当業者であれば、これらの実験方法は当該分野でよく知られているので、核酸の送達用の送達ビヒクルの使用を理解するであろう。
【０１３６】
当業者に公知のいずれの送達ビヒクルも、本発明で用いられる送達ビヒクルとして考えられる。例えば、送達ビヒクルはプラスミド、ウイルスベクター、脂質、原核生物細胞、または真核生物細胞を含むことができる。
【０１３７】
１．ウイルスベクター
本発明のいくつかの実施形態において、送達ビヒクルはウイルスベクターである。「ウイルスベクター」を用いる細胞への核酸送達の技術は当該分野でよく知られている。ウイルスベクターは、（ａ）発現カセットのパッケージングを支持し、および（ｂ）最終的に、そこにクローン化された組換え遺伝子構築体を発現するのに十分なウイルス配列を含有する構築体を含むことを意図する。
【０１３８】
当業者に知られたいずれのウイルスベクターも、本発明における送達ビヒクルとして考えられる。例えば、ウイルスベクターはアデノウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、セミリキフォレストウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターであってよい。
【０１３９】
ある実施形態において、送達ビヒクルはアデノウイルスベクターである。アデノウイルスベクターはゲノムＤＮＡへの組込みについて低い能力を有することが知られているが、この特徴は、これらのベクターによってもたらされる遺伝子導入の高い効率によって相殺される。
【０１４０】
アデノウイルスは、臨床的状況において遺伝子導入用で現在最も普通に使用されるベクターである。これらのベクターの利点の中には、それらは分裂しないおよび分裂する細胞双方への遺伝子送達において効率的であり、多量に生産することができることがある。ベクターは、アデノウイルスの遺伝子工学により作製された形態を含む。遺伝子組織化またはアデノウイルス、３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡウイルスの知識は、アデノウイルスＤＮＡの大きな片の、７ｋｂまでの外来性配列での置換を可能にする（Ｇｒｕｎｈａｕｓら、１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染は染色体取り込みをもたらさない。なぜならば、アデノウイルスＤＮＡは潜在的な遺伝子毒性なくしてエピソーム様式で複製できるからである。また、アデノウイルスは構造的に安定しており、広範な増幅後にゲノム再編成は検出されていない。
【０１４１】
アデノウイルスは、その中程度のサイズのゲノム、操作の容易性、高い力価、広い標的−細胞範囲および高い感染性のため遺伝子導入ベクターとして用いるには特に適している。当業者であれば、アデノウイルスベクターを用いる実験方法に精通しているであろう。
【０１４２】
アデノウイルスベクターは複製欠陥であってよく、あるいは少なくとも条件付で欠陥であってよく、およびアデノウイルスベクターの性質は、本発明の成功した実施に対して臨界的であるとは考えられない。アデノウイルスは４２の異なる公知の血清型またはサブグループＡ−Ｆのいずれかであってよい。サブグループＣのアデノウイルスタイプ５は、本発明で用いる条件付複製−欠陥アデノウイルスベクターを得るのに好ましい出発物質である。これは、アデノウイルスタイプ５は、それについて非常に多くの生化学的および遺伝子的情報が知られているヒトアデノウイルスであって、それは、歴史的には、ベクターとしてアデノウイルスを使用する殆どの構築で用いられてきたからである。
【０１４３】
アデノウイルスの成長および操作は当業者に知られており、イン・ビトロおよびイン・ビボで広い宿主範囲を呈する。この群のウイルスは高い力価、例えば、ｍｌ当たり１０９−１０１１プラーク−形成単位で得ることができ、それらはかなり感染性である。アデノウイルスのライフサイクルは、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来性遺伝子はエピソームであって、従って、宿主細胞に対して低い遺伝子毒性を有する。野生型アデノウイルスでのワクチン接種の研究において副作用は報告されておらず（Ｃｏｕｃｈら、１９６３；Ｔｏｐら、１９７１）、イン・ビボ遺伝子導入ベクターとしてのそれらの安全性および治療能力を示す。
【０１４４】
レトロウイルスは、逆−転写のプロセスによって、感染された細胞においてそれらのＲＮＡを二本鎖ＤＮＡへ変換する能力によって特徴付けられる一本鎖ＲＮＡウイルスの群である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。次いで、得られたＤＮＡはプロウイルスとして細胞染色体に安定に組み込まれ、ウイルス蛋白質の合成を指令する。組込みの結果、受容体細胞およびその子孫においてウイルス遺伝子配列の保持がもたらされる。レトロウイルスゲノムは、各々、キャプシド蛋白質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をコードする３つの遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖを含有する。ｇａｇ遺伝子から上流に見出される配列は、ゲノムのビリオンへのパッキングのためのシグナルを含有する。２つの長いターミナルリピート（ＬＴＲ）配列がウイルスゲノムの５’および３’末端に存在する。これらは強力なプロモーターおよびエンハンサー配列を含み、宿主細胞ゲノムへの組込みでも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ，１９９０）。
【０１４５】
レトロウイルスベクターを構築するためには、注目する遺伝子をコードする核酸を、ある種のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入して、複製−欠陥であるウイルスを生じる。当業者であれば、レトロウイルスベクターを構築するために利用できるよく知られた技術に精通しているであろう。
【０１４６】
アデノ−関連ウイルス（ＡＡＶ）は本発明で用いられる魅力的はベクター系である。というのは、それは高い組込み頻度を有し、それは分裂していない細胞に感染することができ、かくして、それを、組織培養中の哺乳動物細胞への遺伝子の送達で有用とするからである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）。ＡＡＶは感染性に対して広い宿主範囲を有し（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，ら、１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎ，ら、１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ，ら、１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，ら、１９８８）、これは、本発明で用いるために適用可能であることを意味する。ｒＡＡＶベクターの生成および使用に関する詳細は、各々、ここに引用して援用する、米国特許第５，１３９，９４１号および米国特許第４，７９７，３６８号に記載されている。
【０１４７】
ＡＡＶは、それが、培養された細胞における生産的感染を受けるには、もう１つのウイルス（アデノウイルス、またはヘルペスウイルス科のメンバーいずれか）との共感染を必要とする点で依存的パルボウイルスである（Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）。ヘルペスウイルスとの共感染の不在下では、野生型ＡＡＶゲノムはその末端を通じてヒト染色体１９に取り込まれ、それはプロウイルスとして潜伏状態で存在する（Ｋｏｔｉｎら、１９９０；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９９１）。しかしながら、ｒＡＡＶは、ＡＡＶ  Ｒｅｂ蛋白質もまた発現されるのでなければ、組込用の染色体１９に制限されない（Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９９４）。ＡＡＶプロウイルスを運ぶ細胞がヘルパーウイルスによって過剰感染されると、ＡＡＶゲノムは染色体から、または組換えプラスミドから「救済」され、通常の生産的感染が確立される（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８；Ｋｏｔｉｎら、１９９０；Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２）。
【０１４８】
典型的には、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、２つのＡＡＶターミナルリピートが近接する注目する遺伝子を含有するプラスミド（各々、ここに引用して援用するＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９）、およびターミナルリピート、例えば、ｐＩＭ４５なくして野生型ＡＡＶコーディング配列を含有する発現プラスミド（ここに引用して援用するＭｃＣａｒｔｙら、１９９１）を共トランスフェクトすることによって作成される。当業者であれば、ＡＡＶウイルスを用いてベクターを生じさせるのに利用できる技術に精通しているであろう。
【０１４９】
単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）は、ニューロン細胞に対するその向性のため神経系の障害を治療するのにかなりの興味を生じさせたが、このベクターもまたその広い宿主範囲を仮定して他の組織のために開発することができる。ＨＳＶを魅力的なベクターとする別の因子は、ゲノムのサイズおよび組織化である。ＨＳＶは大きいので、複数遺伝子または発現カセットの取り込みは他のより小さなウイルス系におけるよりも問題は少ない。加えて、変化する性能（時間的、強度等）を持つ異なるウイルス制御配列の利用性は、他の系におけるよりも大きな程度での発現の制御を可能にする。ウイルスが比較的少数のスプライスされたメッセージを有し、遺伝子操作をさらに容易にすることも利点である。
【０１５０】
ＨＳＶもまた操作するのが比較的容易であり、高い力価まで成長させることができる。かくして、十分なＭＯＩを達成するのに必要な容量の観点から、および反復投与の低い必要性において、送達は問題が少ない。遺伝子治療ベクターとしてのＨＳＶのレビューについては、Ｇｌｏｒｉｏｓｏら（１９９５）を参照。当業者であれば、ベクターとしてＨＳＶを使用するためのよく知られた技術に精通しているであろう。
【０１５１】
ワクシニアウイルスベクターは、それらの構築の容易性、得られる発現の比較的高いレベル、広い宿主範囲、およびＤＮＡを運ぶ大きな能力のため広範に用いられてきた。ワクシニアは、顕著な「Ａ−Ｔ」優先性を呈する約１８６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡゲノムを含有する。約１０．５ｋｂのインバーテッドターミナルリピートはゲノムに近接する。必須の遺伝子の大部分は、ポックスウイルスの中で最も高度に保存された中心領域内にマップされるようである。ワクシニアウイルスにおける見積もられたオープンリーディングフレームは１５０〜２００の数である。双方のストランドはコードしているが、リーディングフレームの広範な重複は普通ではない。
【０１５２】
他のウイルスベクターを本発明における構築体として使用してよい。例えば、ポックスウイルス等のウイルスに由来するベクターを使用してよい。ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスの分子的にクローン化された株は、異種ウイルス蛋白質の発現のための複製コンビテントワクシニアベクターとして遺伝子的に精錬されている（Ｄａｖｉｓら、１９９６）。研究は、ＶＥＥ感染が優れたＣＴＬ応答を刺激することを示しており、ＶＥＥが免疫化のための極端に有用なベクターであり得ることを示唆している（Ｃａｌｅｙら、１９９７）。本発明においては、ＶＥＥウイルスは樹状細胞を標的化するのに有用であり得ると考えられる。
【０１５３】
ポリヌクレオチドは、特異的結合リガンドを発現するように作成されたウイルスベクター内に収容することができる。かくして、ウイルス粒子は標的細胞の同族受容体に特異的に結合し、内容物を細胞に送達する。レトロウイルスベクターの特異的標的化を可能にするように設計された新規なアプローチは、ウイルスエンベロープへのラクトース残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて開発された。この修飾は、シアロ糖蛋白質受容体を介する肝細胞の特異的感染を可能にすることができる。
【０１５４】
組換えレトロウイルスの標的化のための別のアプローチが設計されており、そこでは、レトロウイルスエンベロープ蛋白質に対する、および特異的細胞レポーターに対するビオチニル化抗体を用いた。抗体は、ストレプトアビジンを用いることによってビオチン成分を介してカップリングされた（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主要組織適合性複合体クラスＩおよびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用い、それらは、イン・ビトロにおいて異所性ウイルスでの、表面抗原を保有する種々のヒト細胞の感染を示した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０１５５】
腫瘍溶解ウイルスもまた本発明におけるベクターとして考えられる。腫瘍溶解ウイルスは、本明細書中においては、それらが正常な細胞を殺すよりもしばしば腫瘍または癌細胞を殺すウイルスを一般にはいうように定義される。例示的な腫瘍溶解ウイルスは、ＡＤＰを過剰発現するアデノウイルスを含む。ＡＤＰの過剰発現は、野生型レベルのＡＤＰを発現するウイルスからのＡＤＰの発現と比較した、ＡＤＰ発現のいずれかの増加と定義することができる。これらのウイルスは、具体的に引用して、その全体が出願の本セクションおよび出願の全ての他のセクションにその各々が援用される、米国特許出願公開Ｎｏ．２００４０２１３７６４、米国特許出願公開Ｎｏ．２００２００２８７８５、および米国特許出願第０９／３５１，７７８号において詳細に議論されている。
【０１５６】
本発明においてベクターとして使用することができる他のウイルスベクターは、ワクチン、またはデュアルワクチンおよび免疫療法適用において適用することできるウイルスベクターを含む。ウイルスベクター、およびウイルスベクターを用いるワクチン接種および免疫療法についての技術は、その各々を、具体的に引用して、その全体が出願の本セクションおよび本出願の全ての他のセクションに一体化されるＰＣＴ出願ＷＯ０３３３０２９、ＷＯ０２０８４３６、ＷＯ０２３１１６８、およびＷＯ０２９５２８７により詳細に記載されている。ワクチン接種およびデュアル免疫療法／ワクチン接種のための技術に適用することができるさらなるベクターは前記した腫瘍溶解ウイルスを含む。
【０１５７】
他のウイルスベクターはバキュロウイルスベクター、パルボウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、αウイルスベクター、セミリキフォレストウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびレトロウイルスベクターも含む。ポックスウイルス等のウイルスに由来するベクターを使用することができる。ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスの分子的にクローン化された株は、異種ウイルス蛋白質の発現のための複製コンピテントワクチンベクターとして遺伝子的に精錬されてきた（Ｄａｖｉｓら、１９９６）。研究は、ＶＥＥ感染が優れたＣＴＬ応答を刺激することを示し、ＶＥＥが免疫化のための極端に有用なベクターであろうことを示唆している（Ｃａｌｅｙら、１９９７）。本発明においては、ＶＥＥウイルスは樹状細胞を標的化するのに有用であり得ると考えられる。
【０１５８】
２．非ウイルスベクター
細胞へのプロモーター等の核酸の導入に適用することができるいずれの非−ウイルス送達ビヒクルもまた本発明によって考えられる。当業者であれば、入手可能な非ウイルス送達ビヒクルの範囲に精通しているであろう。
【０１５９】
ある実施形態において、細胞に送達される核酸はプラスミドに含まれる。当業者であれば、細胞へ注目する拡散配列を送達するのに用いることができる剤としてのプラスミドに精通しているであろう。
【０１６０】
ある他の実施形態において、細胞へ送達すべき核酸は細胞に含まれる。当業者に知られたいずれの細胞タイプも核酸についての送達として考えられる。例えば、細胞は原核生物細胞または真核生物細胞であってよい。
【０１６１】
核酸の細胞への送達のためのいずれの方法も、本発明によって考えられる。これらの方法はリン酸カルシウム沈殿（Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，１９７３；Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）ＤＥＡＥ−デキストラン（Ｇｏｐａｌ，１９８５）、エレクトロポレーション（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、直接的マイクロインジェクション（Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，１９８５）、ＤＮＡ−負荷リポソーム（Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９）およびリポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞音波処理（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、高速マイクロインジェクションを用いる遺伝子衝撃（Ｙａｎｇら、１９９０）、ポリカチオン（Ｂｏｕｓｓｓｉｆら、１９９５）および受容体−媒介トランスフェクション（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８７；Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，１９８８）を含む。これらの技術のいくつかはイン・ビボまたはイクス・ビボ使用について首尾よく適合させることができよう。当業者であれば、非ウイルスベクターの使用に関する技術に精通しており、本明細書中に開示されたものよりも他のタイプの非ウイルスベクターが本発明によって考えられることを理解するであろう。
【０１６２】
本発明のさらなる実施形態において、発現カセットはリポソームまたは脂質処方物において捕獲することができる。リポソームは、リン脂質二層膜および内部水性媒体によって特徴付けられる小胞構造である。マルチラメラリポソームは水性媒体によって分離された多数の脂質層を有する。リン脂質を過剰の水性溶液に懸濁させた場合、それらは自然に形成される。脂質成分は、閉じた構造の形成の前に自己−再編成を受け、水を捕獲し、脂質二層の間に溶質を溶解させる（Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，１９９１）。また、リポフェクタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と複合体化された遺伝子構築体も考えられる。当業者であれば、リポソームおよび脂質形成を利用する技術に精通しているであろう。
【０１６３】
脂質ベースの非−ウイルス処方は、アデノウイルス遺伝子治療に対する代替法を提供する。多くの細胞培養研究は脂質ベースの非−ウイルス遺伝子導入を記載してきたが、脂質ベースの処方を介する系統的遺伝子送達は制限されてきた。非−ウイルス脂質ベースの遺伝子送達の主な制限は、非−ウイルス送達ビヒクルを含むカチオン性脂質の毒性である。リポソームのイン・ビボ毒性は、イン・ビトロおよびイン・ビボ遺伝子導入の結果の間の矛盾を部分的に説明する。この矛盾するデータに寄与する別の因子は、血清蛋白質の存在下および不在下におけるリポソーム安定性の差である。リポソームおよび血清蛋白質の間の相互作用は、リポソームの安定性特徴に対して劇的なインパクトを有する（Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，１９９７）。カチオン性リポソームは負に帯電した血清蛋白質を引き付け、それに結合する。血清蛋白質によって被覆されたリポソームはマクロファージによって溶解され、または摂取され、循環からのそれらの除去に至る。現在のイン・ビボリポソーム送達方法は皮下、皮内、腫瘍内または頭蓋内注射を用いて、循環におけるカチオン性脂質に関連する毒性および安定性の問題を回避する。リポソームおよび血漿蛋白質の相互作用は、イン・ビトロ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７）およびイン・ビボ遺伝子導入（Ｚｈｕら、１９９３；Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５；Ｔｈｉｅｒｒｙら、１９９５；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、１９９５；Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈら、１９９６）の効率の間の矛盾を担う。
【０１６４】
脂質処方物の生産は、しばしば、（１）逆相蒸発、（ＩＩ）脱水−再水和、（ＩＩＩ）洗剤透析および（ＩＶ）薄いフイルム水和後のリポソーム混合物の音波処理または系列的押出によって達成される。一旦製造されれば、脂質構造を用いて、循環にある場合には、毒性（化学療法剤）または不安定（核酸）である化合物をカプセル化することができる。リポソームカプセル化の結果、そのような化合物についてのより低い毒性およびより長い血清半減期がもたらされた（Ｇａｂｉｚｏｎら、１９９０）。多数の病気治療は、慣用的な療法を増強させ、または新規な療法、特に過剰増殖性疾患を治療するための療法を確立するために脂質ベースの遺伝子導入戦略を用いる。
【０１６５】
本発明のある実施形態においては、送達ビヒクルはＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子を含む。ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子は、ここに具体的に引用して援用するＴｅｍｐｌｅｔｏｎら、１９９７により詳細に議論されている。
【０１６６】
Ｄ．過剰増殖性疾患の治療および予防
１．過剰増殖性疾患
本発明では、医薬上有効量の本明細書中に記載されたプロモーター配列のいずれかを含む組成物を投与することによって被験体において過剰増殖性疾患を予防し、阻害し、または治療する方法が考えられる。病気を予防し、阻害し、または治療する目的で被験体に適用し、または投与することができる本明細書中に記載されたいずれかのプロモーター配列を含むいずれの核酸配列も、本明細書中に記載された医薬組成物に含めることが考えられる。
【０１６７】
病気は、核酸配列の被験体への投与を介する治療または予防に使用することができる被験体に影響し得るいずれの病気でもあり得る。例えば、病気は過剰増殖性疾患であってよい。過剰増殖性疾患は、細胞の異常な成長または増殖に関連する病気である。過剰増殖性疾患は、被験体における病巣として発現される病気であってよい。例示的な過剰増殖性疾患巣は、プレ−悪性病巣、癌および腫瘍を含む。
【０１６８】
治療すべき病気の他の例は、自己免疫疾患等の感染症および炎症病を含む。本発明の方法および組成物は、病気の免疫療法または免疫予防に適用することができる抗原を送達することができる。当業者であれば、本明細書中に記載された医薬組成物および方法を用いる予防または治療に使用できるであろう多くの疾病に精通しているであろう。
【０１６９】
２．定義される成長阻害
本明細書中に記載される方法のある実施形態は、被験体における過剰増殖性疾患の成長を阻害する方法に関する。過剰増殖性疾患巣の「成長を阻害する」は広く定義され、例えば、病巣の成長を遅らせること、または停止させることを含む。病巣の成長の阻害は、病巣のサイズの低下、または病巣の細胞のアポトーシスの誘導を含むこともできる。アポトーシスの誘導とは、薬物、トキシン、化合物、組成物または生物学的要素がアポトーシス、またはプログラムされた細胞の死滅を細胞に与える情況をいう。特定の実施形態において、細胞は腫瘍細胞である。病巣の成長は、病巣の細胞に対する免疫応答の誘導によって阻害できる。
【０１７０】
Ｅ．医薬組成物
本発明の医薬組成物は、本明細書中に記載された新規なプロモーター配列の１以上を含む、治療上または診断上有効量の核酸を含む。フレーズ「医薬上または薬理学上許容される」、または「治療上有効な」、または「診断的に有効な」とは、例えば、適切には、ヒト等の動物に投与される場合、有害な、アレルギー性または他の厄介な反応を生じない分子要素および組成物をいう。治療上有効なまたは診断上有効な組成物の調製は、ここに引用して援用するＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄ．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０によって例示されるように、本開示に徴して当業者に知られているであろう。さらに、動物（例えば、ヒト）投与では、調製物は、ＦＤＡ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｎｄａｒｄｓによって要求される滅菌性、パイロジェン性、一般的安全および純度標準を満足すべきであろうことは理解されるであろう。
【０１７１】
本明細書中で用いるとき、「治療上有効量を含む組成物」または「診断上有効量を含む組成物」は、当業者に知られているように、いずれかのおよび全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、保存剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定化剤、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、フレーバー剤、染料、同様な物質およびその組合せを含む。いずれの慣用的な担体も有効成分と適合しない限り、本発明の組成物でのその使用が考えられる。
【０１７２】
本発明の組成物は、固体、液体またはエアロゾル形態で投与されるか否か、注射としてのそのような投与経路について滅菌していることが要求されるか否かに応じて、異なるタイプの担体を含むことができる。本発明のデュアルイメージング剤およびデュアル治療剤は、当業者に知られているように、静脈内、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、頭蓋内、関節内、前立腺内、胸膜内、気管内、鼻内、硝子体内、膣内、直腸内、局所、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、皮下、結膜下、小胞内、粘膜内、心臓周囲内、臍帯内、眼内、経口、局所、局所的、注射、注入、連続的注入、局所化された灌流浴標的細胞へ直接的に、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物（例えば、リポソーム）中にて、または他の方法によって、または前記のいずれかの組合せによって投与することができる。
【０１７３】
患者に投与される本発明の組成物の現実に要求される量は、体重、疾患の重症度、治療すべき病気のタイプ、従前のまたは同時治療的介入、患者の原発性、および投与経路等の身体的および生理学的因子によって決定することができる。投与に責任がある実行者は、いずれにせよ、組成物中の有効成分の濃度、および個々の被験体についての適切な用量を決定するであろう。
【０１７４】
ある実施形態において、医薬組成物は、例えば、デュアルイメージング剤またはデュアル治療剤の少なくとも約０．１％を含むことができる。他の実施形態において、有効成分は単位の重量の約２％〜約７５％の間、または約２５％〜約６０％の間、例えば、その中で誘導されるいずれかの範囲を含むことができる。他の非限定的例において、用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重、あるいはこの範囲内のいずれかの量、または投与当たり１０００ｍｇ／ｋｇ／体重よりも大きないずれかの量を含むこともできる。
【０１７５】
いずれの場合においても、組成物は、１以上の成分の酸化を遅らせるために種々の抗酸化剤を含むことができる。加えて、微生物の作用の防止は、限定されないが、パラベン（例えば、メチルパラベン、プロペルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロザールまたはその組合せを含めた、種々の抗菌剤および抗真菌剤等の保存剤によって実現することができる。
【０１７６】
本発明の組成物は遊離塩基、中性または塩形態で処方することができる。医薬上許容される塩は、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄等の無機塩基；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、またはプロカイン等の有機塩基に由来する遊離カルボキシル基を用いて形成される塩を含む。
【０１７７】
組成物が液体形態である実施形態において、担体は、限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）およびその組合せを含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって；例えば、液体ポリオールまたは脂質等の担体中の分散液による必要な粒子サイズの維持によって；例えば、ヒドロキシプロピルセルロース等の界面活性剤；またはそのような方法の組合せの使用によって維持することができる。多くの場合において、例えば、糖、塩化ナトリウムまたはその組合せ等の等張剤を含むのが好ましい。
【０１７８】
滅菌注射溶液は、前記した種々の量の他の成分と共に必要な量の適当な溶媒中に放射性標識エチレンジシステイン誘導体を配合し、必要であれば、続いて濾過滅菌によって調製される。一般には、分散液は、基本的な分散媒体および／または他の成分を含有する滅菌ビヒクルに種々の滅菌された有効成分を配合することによって調製される。滅菌注射溶液、懸濁液もしくはエマルジョンの調製用の滅菌粉末の場合には、調製の好ましい方法は、その従前に滅菌濾過された液体媒体から有効成分＋いずれかのさらなる所望の成分の粉末を生じる真空乾燥または凍結−乾燥技術である。液体媒体は、もし必要であれば、適切に緩衝化すべきであり、液体希釈剤は十分な生理食塩水またはグルコースでの注射に先立ってまず等張とすべきである。直接的注射のための高度に濃縮された組成物の調製も考えられ、溶媒としてのＤＭＳＯの使用は、極端に迅速な浸透をもたらすと考えられ、高濃度の活性な剤を小さな領域に送達する。
【０１７９】
組成物は製造および貯蔵条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用に対して保存されなければならない。エンドトキシン汚染は安全なレベル、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇ蛋白質未満において最小に維持すべきことは認識されるであろう。
【０１８０】
特定の実施形態において、注射組成物の延長された吸収は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチン、またはその組合せ等の吸収を遅延させる剤の組成物における使用によって実現することができきる。
【０１８１】
Ｆ．細胞および細胞タイプ
本発明のある実施形態は、一般には、本明細書中に記載された新規なプロモーターの１つに操作可能にカップリングされた遺伝子を含む組成物を調製し、次いで、組成物を細胞と接触させることを含む、遺伝子を細胞に送達する方法に関し、接触は遺伝子の細胞への送達をもたらす。本発明の他の態様は、一般には、細胞を、本明細書中に記載された新規なプロモーターの１以上を含む組成物と接触させ、プロモーターはレポーターアミノ酸配列に操作可能にカップリングされ、次いで、レポーターから由来するシグナルを測定することによりレポーター配列の細胞発現を検出することを含む、細胞をイメージする方法に関する。
【０１８２】
当業者に知られたいずれの細胞タイプも、本発明の方法で含めるための細胞として考えられる。例えば、細胞は正常な健康な細胞であり得る。別法として、細胞は病気の細胞であり得る。例えば、病気は癌等の過剰増殖性疾患であってよい。細胞はいずれの組織タイプのものであってもよい。例えば、細胞は乳癌細胞、肺癌細胞、前立腺癌細胞、卵巣癌細胞、脳癌細胞、肝臓癌細胞、子宮頚癌細胞、結腸癌細胞、腎臓癌細胞、皮膚癌細胞、頭部および頚部の癌細胞、骨癌細胞、食道癌細胞、膀胱癌細胞、子宮癌細胞、リンパ系癌細胞、胃癌細胞、すい臓癌細胞、精巣癌細胞、リンパ腫細胞、または白血病細胞であってよい。
【０１８３】
Ｇ．二次的抗−癌療法
本発明の態様において、過剰増殖性疾患を治療するための特許請求される方法を、別の剤または治療方法、好ましくは、別の癌治療と組み合わせて用いることができる。特許請求されるデュアル治療剤での治療は、数分〜数週間の範囲の間隔だけ、他の治療方法に先行し、またはそれに遅れてもよい。別の剤を投与する実施形態において、一般には、剤が依然として細胞に対して有利には組合せ効果を発揮できるように、各送達の時間の間にかなりの時間が経過しないように保障する。例えば、本発明のデュアル治療剤を実質的に同時に（すなわち、約１分未満内に）１つの剤の２、３、４以上の用量を投与してもよい。他の態様において、治療剤または方法は、本発明のデュアル治療剤または複数剤の投与から約１分〜約４８時間以上先立って、および／または後にあるいは本明細書中に記載されていない量の時間先立って、および／または後に投与してもよい。ある他の実施形態において、本発明のデュアル治療剤は、外科的処置または遺伝子治療等の別の治療様式の投与から約１日〜約２１日先立って、および／または後に投与してもよい。いくつかの状況においては、しかしながら、治療のための時間をかなり延長するのが望ましく、各投与の間には数週間（例えば、約１〜８週間以上）経過させる。
【０１８４】
種々の組合せを使用することができ、デュアル化学療法および放射線療法のための特許請求された剤は、誘導体が「Ａ」であり、いずれかの他の治療剤または方法であり得る第二の剤は「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ。
【０１８５】
本発明のデュアル治療剤の患者への投与は、もしあれば、これらの剤の毒性を考慮して、化学治療剤の投与のための一般的なプロトコルに従うであろう。治療サイクルは必要であれば反復されるであろうと予測される。また、種々の標準的な療法、ならびに外科的介入を記載されたヒ素剤と組み合わせて投与することができると考えられる。これらの療法は、限定されないが、さらなる化学療法、さらなる放射線療法、免疫療法、遺伝子治療および外科的処置を含む。
【０１８６】
ａ．化学療法
癌療法は、化学および放射線ベースの治療での種々の組合せ療法も含む。組合せ療法は、例えば、シスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトテシン、イフォスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソ尿素、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲン受容体結合剤、タキソール、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルメシル−蛋白質トランスフェラーゼ阻害剤、トランス白金、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキセートまたは前記のいずれかのアナログまたは誘導体変種を含む。
【０１８７】
ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ広く用いられてきた他の因子は、通常はγ−線、Ｘ−線、または腫瘍細胞に対する放射性同位体の向けられた送達として知られるものを含む。マイクロ波およびＵＶ−照射等の、ＤＮＡ損傷因子の他の形態も考えられる。これらの因子のすべては、ＤＮＡに対して、ＤＮＡの前駆体に対して、ＤＮＡの複製および修復に対して、および染色体の組立および維持に対して、広い範囲の損傷の影響を最も及ぼすようである。Ｘ−線についての用量範囲は、長時間（３〜４週間）についての５０〜２００レントゲンの日用量から、２０００〜６０００レントゲンの単一用量の範囲である。放射性同位体についての用量範囲は広く変化し、同位体の半減期、発せられる放射線の強度およびタイプ、および新形成細胞による摂取に依存する。用語「接触された」および「曝露された」は、細胞に適用される場合、本明細書中においては、それにより治療構築体および化学療法もしくは放射線療法剤が標的細胞に送達され、標的細胞に直接隣接して置かれるプロセスを記載するのに用いられる。細胞の殺傷または静止を達成するためには、双方の剤は、細胞を殺傷し、またはそれが分裂するのを妨げるのに有効な組合せ量にて細胞に送達される。
【０１８８】
ｃ．免疫療法
免疫治療剤は、一般には、癌細胞を標的化し、それを破壊するための免疫エフェクター細胞および分子の使用に依拠する。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面のいくつかのマーカーに対して特異的な抗体であってよい。抗体単独は治療のエフェクターとして働くことができ、あるいはそれは他の細胞を動員して、現実に細胞殺傷を行わせることができる。抗体は薬物またはトキシン（化学治療剤、放射性ヌクレオチド、リシンＡ鎖、コレラトキシン、百日咳トキシンなど）に対してコンジュゲートすることもでき、標的化剤として単に働かせることができる。別法として、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的または間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってよい。種々のエフェクター細胞は細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞を含む。
【０１８９】
免疫療法は、かくして、遺伝子療法と組み合わせた、組合せ療法の一部として使用できよう。組合せ療法のための一般的アプローチを以下に議論する。一般には、腫瘍細胞は、標的化に使用できる、すなわち、他の細胞の大部分に存在しないいくつかのマーカーを担持しなければならない。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれかは本発明の関係で標的化に適しているであろう。通常の腫瘍マーカーは癌性胚抗原、前立腺特異的抗原、泌尿器系腫瘍関連抗原、胎児抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲン受容体、ラミニン受容体、ｅｒｂＢおよびｐ１５５を含む。
【０１９０】
ｄ．遺伝子
なお別の実施形態において、二次的治療は第二の遺伝子治療であり、そこでは、本発明の核酸組成物の前に、後に、または同時に治療ポリヌクレオチドを投与する。遺伝子産物をコードするベクターと組み合わせたデュアル治療剤の送達は、標的組織に対して組合せ抗−過剰増殖効果を有するであろう。
【０１９１】
ｅ．外科的処置
癌を持つ個人のほぼ６０％は、予防剤、診断またはステージング、治癒的および緩和的外科的処置を含むいくつかのタイプの外科的処置を受けるであろう。治癒的外科的処置は、本発明の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子治療、免疫療法および／または別の療法等の、他の療法と組み合わせて用いてもよい癌治療である。治癒的外科的処置は、癌性組織の全てまたは一部を物理的に除去し、切り出し、および／または破壊する切除を含む。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去をいう。腫瘍切除に加えて、外科的処置による治療はレーザー外科的処置、低温外科的処置、電子外科的処置、および顕微鏡で制御された外科的処置（モー（Ｍｏｈｓ）の外科的処置）を含む。本発明は、表層癌、プレ癌、または偶然の量の正常な組織の除去と組み合わせて用いることができるとさらに考えられる。
【実施例】
【０１９２】
Ｈ．実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含める。以下の実施例に開示された技術は本発明の実施においてよく機能する本発明者らによって発見された技術を表し、かくして、その実施のための好ましい態様を構成すると考えることができることは当業者に認識されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示を踏まえて、開示される特別な実施形態において多くの変化をなすことができ、依然として、本発明の精神および範囲を逸脱することなく同様なまたは類似の結果を得ることができるのを認識すべきである。
【０１９３】
実施例１
分子癌療法についてのレポーターおよび腫瘍サプレッサー遺伝子の新規なｈＴＥＲＴ−ミニ−ＣＭＶ（ｈＴＭＣ）プロモーター−媒介腫瘍−選択的および高効率発現
１．ｈＴＭＣプロモーターの構築
ｈＴＥＲＴ−ミニ−ＣＭＶ（ｈＴＭＣ）プロモーターを含めたある種の新規なキメラプロモーターは、必須のｈＴＥＲＴプロモーター配列と最小ＣＭＶプロモーターエレメントとを最適に融合させることによって作製した。ＰＣＲを用いて、４６３ｂｐのｈＴＥＲＴ調節領域および１４７ｂｐの最小ＴＡＴＡボックス、およびＣＭＶプロモーターからの転写開始領域を増幅した。ハイブリッドｈＴＥＲＴおよびＣＭＶプロモーターは、種々の組合せ、および腫瘍−選択性ならびに正常および腫瘍細胞トランスフェクタントにおける転写促進の強さの点におけるそれらの性能をテストすることによって最適化した。この最適化された新規なｈＴＭＣプロモーターを用い、高い腫瘍−特異性および高い導入遺伝子発現の双方を、イン・ビボでのｈＴＭＣ−ＥＧＦＰレポーター系を用いてここに示されるように、イン・ビトロおよびイン・ビボで達成した。
【０１９４】
２．ｈＴＭＣ−含有プラスミドベクターの構築
ａ．ｐＬＪ１４３／ＫＧＢ２／ＦＵＳ１。このｐＬＪ１４３／ＫＧＢ２／ＦＵＳ１プラスミドベクター（図１）は、イン・ビボでの導入遺伝子の効率的な発現を確実とするための３’末端におけるＥ１エンハンサー、および５’末端におけるＢＧＨ−ポリＡシグナル配列と共にＣＭＶ最小プロモーターによって駆動される哺乳動物遺伝子−発現カセットからなる。カナマイシン−抵抗性遺伝子を選択可能マーカーとして選択して、患者における抗生物質−体制の発生を回避した。最小のｐＭＢ１複製起点（ＯＲＩ）配列を用いて、細菌宿主株ＤＨ５ａにおけるプラスミドの高−コピー複製および生産を駆動する。プラスミド骨格は、プラスミドＤＮＡ生産のより高い収率、およびプラスミドＤＮＡ調製当たりのより高い濃度の組換えプラスミドＤＮＡを保障するための最小のものである。ｐＬＪ１４３／ＫＧＢ２／ＦＵＳ１ベクターのＤＮＡ配列は自動ＤＮＡ配列決定によって確認され、ＦＤＡによって相Ｉ臨床試験（ヒト遺伝子導入プロトコル＃０２０１−５１３）に対して認可されている。このプラスミドは、前臨床および臨床適用における分子癌療法および非−侵入性イメージングのための、レポーター遺伝子および腫瘍サプレッサー遺伝子を腫瘍−選択的に発現するための一連のｈＴＭＣ−含有プラスミドベクターの構築用の骨格として用いる。
【０１９５】
ｂ．ｐＬＪ２８０／ＫＧＢ２／ＥＶ。ｐＬＪ２８０／ＫＧＢ２／ＥＶプラスミドベクター（図２）は、ＦＵＳ１遺伝子インサートを除いて全ての元の配列エレメントを含有するｐＬＪ１４３／ＫＧＢ２／ＦＵＳ１ベクターに由来する空の（ＥＶ）プラスミドベクターである。ｐＬＪ１４３プラスミドベクター中の４１３ｂｐ  ＦＵＳ１断片は、Ｐｓｔ  Ｉでの制限消化によって除去し、残りのプラスミド配列は再度連結して、空のベクターを形成した。
【０１９６】
ｃ．ｐＬＪ３３１／ｄＣｐＧ−ＫＧＢ２／ＦＵＳ１。ｐＬＪ３３１／ｄＣｐＧ−ＫＧＢ２／ＦＵＳ１ベクター（図３）は、カナマイシン抵抗性遺伝子が、９９コドン用法（ＧまたはＣ）が（ＡまたはＴ）に改変されている合成カナマイシン遺伝子によって置き換えられた以外は、同一のプラスミドＤＮＡ骨格を含有する。この合成カナマイシン遺伝子は、もとのＤＮＡ配列に形成された潜在的ＣｐＧ島を完全に減少させることができるが、依然として、細菌培養における組換えプラスミドベクターを選択するカナマイシン抗生物質を用いる能力を依然として残す。脱ＣｐＧ化プラスミドはイン・ビボにおいて免疫原性が低いと仮定されており、かくして、プラスミド：ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子の全身投与による前臨床および臨床適用において毒性は低いと推定される。
【０１９７】
ｄ．ｐＬＪ３３６／ｄＣＰＧ−ＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１。ｐＬＪ３３１／ｄＣｐＧ−ＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１ベクター（図４）は、慣用的なＣＭＶプロモーターがｈＴＭＣプロモーターによって置き換えられたｐＬＪ３３１に由来する。このベクターは、前臨床モデルおよび臨床試験における分子癌療法のための新規な３ｐ２１．３腫瘍サプレッサー遺伝子ＦＵＳ１の腫瘍−選択的かつ高−効率発現を可能にする。
【０１９８】
ｅ．ｐＬＪ２８４／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＥＶ。ｐＬＪ２８４／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＥＶプラスミドベクター（図５）は、ＣＭＶプロモーターがｈＴＭＣプロモーターによって置き換えられたｐＬＪ２８０に由来する。このベクターはイン・ビトロおよびイン・ビボにて陰性対照として用いられる。
【０１９９】
ｆ．ｐＬＪ２８６／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰ。ｐＬＪ２８６／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰプラスミドベクター（図６）は、真核生物緑色蛍光蛋白質（ＥＧＦＰ）発現カセットを駆動するｈＴＭＣプロモーターを含有する。このＥＧＦＰは、蛍光イメージング分析によって、あるいはイン・ビトロおよびイン・ビボでの細胞溶解物および組織セクション中の抗−ＥＧＦＰ抗体を用いる免疫組織化学分析によって、ＥＧＦＰのｈＴＭＣプロモーター−駆動腫瘍−選択的発現、ベクタートランスフェクション効率、およびＥＧＦＰの生体内分布を評価するためのレポーター遺伝子として用いられる。
【０２００】
ｇ．ｐＬＪ２９３／ｐＫＧＢ２／ＥＧＦＰ。ｐＬＪ２９３／ｐＫＧＢ２／ＥＧＦＰプラスミドベクター（図７）は、元の非−選択的ＣＭＶプロモーターを含有し、ＥＧＦＰの腫瘍−選択的発現とｈＴＭＣ−ＥＧＦＰベクターとのイン・ビトロおよびイン・ビボでの比較のために対照ベクターとして用いられる。
【０２０１】
ｈ．ｐＬＪ２８７／ｐＫＧＢ２／ｈＴＥＲＴ−ＥＧＦＰ。ｐＬＪ２８７／ｐＫＧＢ２／ｈＴＥＲＴ−ＥＧＦＰプラスミドベクター（図８）は、（哺乳動物細胞において非常に弱い転写促進強度を持つが、腫瘍−選択的発現を持つ）元のｈＴＥＲＴプロモーターを含有し、ＥＧＦＰの高−効率発現と、ｈＴＥＲＴ−ミニ−ＣＭＶハイブリッド、ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰベクターとのイン・ビトロおよびイン・ビボでの比較のための対照ベクターとして用いる。
【０２０２】
ｉ．ｐＬＪ２９６／ＫＧＢ２／ＳＳＲＴ２Ａ。ｐＬＪ２９６／ＫＧＢ２／ＳＳＲＴ２Ａプラスミドベクター（図９）は、ｐＬＪ１４３プラスミドベクター中に導入遺伝子ＦＵＳ１を含有する４１３ｂｐ断片が、ＳＳＲＴ２Ａ  ｃＤＮＡインサート（１１１０ｂｐ）＋さらなるＤＮＡ断片（２２４ｂｐ）（ＳＳＲＴ２Ａの効果的な発現および検出に必要なＴ７プロモーター配列、ＶＪ２Ｃ−ＳＰ、およびＨＡ  Ｎ−末端融合タグを含有する）によって置き換えられた以外は、ｐＬＪ１４３と正確に同一のＤＮＡ骨格配列を有する。ベクターは、動物モデルおよびヒト臨床試験における全身イメージングのための１１１Ｉｎ−オクトレオチドでのγ−カメライメージング（ＧＣＩ）による非−侵入性分子イメージングのためのベクターとして用いることができる。
【０２０３】
ｊ．ｐＬＪ３４６／ＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＳＳＲＴ２Ａ。ｐＬＪ３４６／ＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＳＳＲＴ２Ａプラスミド（図１０）は、ＣＭＶプロモーターが、イン・ビボにてＳＳＲＴ２Ａレポーター遺伝子の腫瘍−特異的発現を駆動するためのｈＴＭＣプロモーターで置き換えられたｐＬＪ２９６に由来する。このベクターは、ＳＳＲＴ２Ａの腫瘍−特異的イメージングを可能とし、ＧＣＩによるイン・ビボイメージのバックグラウンドを有意に低下させる。
【０２０４】
ｋ．ｐＬＪ２９４／ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ＩＲＥＳ−ＳＳＴＲ２Ａ。ｈＴＥＲＴプロモーターの制限を克服し、導入遺伝子発現を増大させるために、および１１１Ｉｎ−オクトレオチド−ＳＳＲＴ２Ａ系でのγ−カメライメージングによるイン・ビボでの導入遺伝子発現の腫瘍−特異的イメージングを増強するために、新規なベクターであるｐＬＪ２９４／ｈＴＭＣ−ＳＳＲＴ２Ａ−ＩＲＥＳ−ＦＵＳ１ベクター（図１１）を開発し、そこでは、ｈＴＭＣプロモーターは腫瘍細胞のみにおける高レベルの遺伝子発現を選択的に駆動し、他方、ＩＲＥＳエレメントは２つの個々の遺伝子、レポーターＳＳＲＴ２Ａおよび治療遺伝子ＦＵＳ１の同等レベルでの同時発現を可能とし、これは、かくして、ＦＵＳ１の正常な機能および発現の定量に干渉することなく、レポーターＳＳＲＴ２Ａ遺伝子でのイン・ビボでの治療ＦＵＳ１遺伝子発現の測定を可能にする。このベクターは、ＦＵＳ１等の癌治療遺伝子の生体内分布、導入遺伝子の発現およびクリアランス、および前臨床および臨床試験での１１１Ｉｎ−オクトレオチド−ＳＳＲＴ２Ａレポーター系とのＧＣＩによる組換えプラスミドＤＮＡ：ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子の全身投与による腫瘍における治療効果の非−侵入性モニタリングを可能にする。
【０２０５】
ｌ．ｐＬＪ２９０／ｐＫＧＢ２／ＦＵＳ１−ＩＲＥＳ−ＳＳＴＲ２Ａ。ｐＬＪ２９０／ｐＫＧＢ２／ＳＳＴＲ２Ａプラスミドベクター（図１２）は、ｐＬＪ２９４ベクターにおけるように、プロモーターがｈＴＭＣプロモーターではなく慣用的なＣＭＶ以外は、同様のプラスミドＤＮＡ骨格およびＦＵＳ１−ＩＲＥＳ−ＳＳＴＲ２Ａ成分を含有する。このベクターは、イン・ビボでのｈＴＭＣ−含有ｐＬＪ２９４ベクターとの比較のための対照ベクターとして用いることができる。
【０２０６】
ｍ．ｐＬＪ３４０／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−Ｌｕｃ。ｐＬＪ３４０／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−Ｌｕｃプラスミドベクター（図１３）は、ｈＴＭＣ−プロモーター−駆動ホタルルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）発現カセットを含有する。この新規なベクターは、小動物モデルにおいてケミルミナンスカメラによって腫瘍−特異的導入遺伝子発現および生体内分布をモニターするための非−侵入性イメージングを行うための便利なレポーターとしてのＬｕｃの使用を可能にする。
【０２０７】
ｎ．ｐＬＪ３４１／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ／ＦＵ１−ＩＲＥＳ−Ｌｕｃ。ｐＬＪ３４１／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ／ＦＵ１−ＩＲＥＳ−Ｌｕｃベクター（図１４）は、ＳＳＴＲ２Ａレポーター遺伝子がＬｕｃレポーター遺伝子で置き換えられたｐＬＪ２９４／ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ＩＲＥＳ−ＳＳＴＲ２Ａに由来する。ｈＴＭＣプロモーターは腫瘍細胞においてのみ高レベルの遺伝子発現を選択的に駆動し、他方、ＩＲＥＳエレメントは２つの個々の遺伝子であるレポーターＬｕｓおよび治療遺伝子ＦＵＳ１の等しいレベルでの同時発現を可能とし、かくして、ケミルミナンスカメラを用いる前臨床モデルにおいてＦＵＳ１の正常な機能および発現の定量に干渉することなく、レポーターＬｕｃ遺伝子と共にイン・ビボでの治療ＦＵＳ１遺伝子発現の測定を可能にする。このベクターは、前臨床試験において、ＦＵＳ１等の癌治療遺伝子の生体内分布、導入遺伝子の発現およびクリアランスおよび組換えプラスミドＤＮＡ：ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子の全身投与による腫瘍における治療効率の非−侵入性モニタリングを可能にする。このベクターは放射性物質の使用を必要とせず、前臨床小動物モデルにおける癌治療遺伝子の非−侵入的かつ腫瘍−特異的な分子イメージングのための高感度の、便利かつ安全なツールであろう。
【０２０８】
３．イン・ビトロにおけるｈＴＭＶプロモーターによって駆動される腫瘍−特異的導入遺伝子発現
イン・ビトロにおけるｈＴＭＣプロモーターによって駆動される導入遺伝子発現の腫瘍−特異性および効率を評価するために、プラスミドｐＬＪ２８６／ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰを用いて、（本研究所で調製された）ＤＯＴＰイン・ビトロトランスフェクティング試薬を用いて種々の正常なおよび癌細胞系をトランスフェクトした。ｐＬＪ２８７／ｈＴＥＲＴ−ＥＧＦＰおよびｐＬＪ２９３／ＣＭＶ−ＥＧＦＰベクターを対照として用い、ＰＢＳ治療単独をモックとして用いた。これらのプロモーターによって媒介されるＥＧＦＰ発現の活性を、ＦＡＣＳによるトランスフェクションから４８時間後にＧＦＰの発現レベルを分析することによって、種々の培養されたヒト癌系細胞（Ｈ１２９９、Ａ５４９、ＨｅＬａおよび２９３Ｆ）、ＮＨＦＢ細胞、正常な線維芽細胞（ＷＩ−３８）およびＶＡ−１３において評価した。全てのテストした癌細胞系において、高レベルのＥＧＦＰの発現がＣＭＶ−およびｈＴＭＣ−プロモーター含有ベクター双方によってトランスフェクトされた細胞で観察されたが、ｈＴＥＲＴ−ＥＧＦＰ−トランスフェクト癌細胞においては痕跡レベルのＥＧＦＰ発現が検出されたに過ぎなかった（図１５Ａ、パネル２９３Ｆ、Ａ５４９、Ｈ１２９９、Ｈｅｌａ；図１５Ｂおよび図１５Ｃ）。対照的に、もしＥＧＦＰの発現がＣＭＶ−ＥＧＦＰベクターによってトランスフェクトされた細胞で依然として普遍的に検出できたとしても、ＥＧＦＰの発現は、ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰまたはｈＴＥＲＴ−ＥＧＦＰベクターいずれかでトランスフェクトされた正常な細胞ＨＢＥＣ、ＷＩ−３８およびＶＡ−１３細胞で検出できなかった（図１５Ａ、パネルＨＢＥＣ、ＷＩ−３８、ＶＡ−１３、および図１５Ｂおよび図１５Ｃ）。これらの結果は、ｈＴＥＲＴ−ミニ−ＣＭＶハイブリッドｈＴＭＣプロモーターによって媒介される導入遺伝子の腫瘍−特異的かつ高効率の発現を示す。
【０２０９】
４．イン・ビボでのｈＴＭＣプロモーターの転写活性
イン・ビボにてｈＴＭＣプロモーターによって誘導された導入遺伝子発現のレベルを調べるために、まず、１×１０６細胞／マウスのヒトＮ４１７  ＳＣＬＣ細胞の胸スペースへの注射によって、ヒトＳＣＬＣ腫瘍をマウスの肺において確立した。腫瘍細胞注射から３週間後に、（直径が２〜５ｍｍの平均サイズの）固体腫瘍をマウスの肺および内側胸膜中で確立した。ヒトＮ４１７  ＳＣＬＣ腫瘍―担持動物に種々のＥＧＦＰ−リポプレックスを静脈内注射し、ＥＧＦＰ発現を、元のＣＭＶおよびｈＴＥＲＴプロモーターまたはｈＴＭＣプロモーターいずれかによって駆動する。注射から４８時間後に、動物を殺し、器官を収集し、直ちに凍結した。新鮮な凍結組織セクションをＥＧＦＰ発現のために蛍光顕微鏡下で調べた。この新規なプロモーターを用い、イン・ビボでのｈＴＭＣ−ＥＧＦＰレポーター系を用いてここに示されるように、高い腫瘍−特異性および高い導入遺伝子発現双方をイン・ビトロおよびイン・ビボで達成した（図１６）。高レベルのＥＧＦＰ発現は、いずれかの他の正常な組織ではなく、ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰで処理された動物における腫瘍細胞でのみ検出された（図１６Ａ、パネルｈＴＭＣ）。対照的に、非常に弱い腫瘍−特異的ＥＧＦＰ発現がＴＥＲＴ−ＥＧＦＰで処理された動物で検出され、非−選択的発現が、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ構築体によって処理された動物において腫瘍および正常な細胞のあらゆる箇所で検出された。これらの結果は、高レベルの腫瘍−特異的導入遺伝子発現が、イン・ビボにてｈＴＭＣプロモーター−駆動遺伝子転写によって達成できることを示す。加えて、これらの結果は、このベクターが、例えばＤＮＡ：ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子による、組換えｈＴＭＣ−プロモーター含有プラスミドベクターの全身投与によるヒト原発性および転移性癌についての腫瘍−標的化分子療法で用いることができることを示す。
【０２１０】
５．１１１Ｉｎ−オクトレオチド−ＳＳＲＴ２Ａレポーター系でのγ−カメライメージングによって治療遺伝子発現を評価するための腫瘍−標的化非−侵入的分子イメージング
遺伝子導入をモニターするための多くのイン・ビボ分子イメージング方法は、導入された遺伝子の産物に局在化した、静脈内注射された放射性標識化合物の検出のためのガンマーカメラ、ＳＰＥＣＴ、またはＰＥＴイメージングの感度に依拠するが、それらのほとんどは注目する遺伝子を直接的に検出せず、また全身使用についてＦＤＡ認可された放射性医薬を開発しない。１１１Ｉｎ−オクトレオチドを臨床的に用いて、主としてスマトスタチン受容体タイプ２（ＳＳＴＲ２Ａ）を過剰発現する腫瘍の場所を突き止める。ＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ−発現プラスミド（ｐＨＡ−ＳＳＴＡ２Ａ）でトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞におけるＳＳＴＲ２Ａ産物の細胞表面膜局所化は、抗−ＨＡ抗体での免疫蛍光分析によって首尾よく検出されている。ｐＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ−トランスフェクタントによって生産されたＨＴ１０８０腫瘍を担持するマウスに、γ−カメラによる生体内分布およびイメージング実験のために１１１Ｉｎ−オクトレオチドを注射した（図１７Ｂ）。ＳＳＴＲ２Ａ発現は、受容体結合および腫瘍による１１１Ｉｎ−オクトレオチド放射性トレーサー取り込み双方に有意に相関することも示された（図１７Ｃ）。このアプローチは臨床的な使用可能性を示した。なぜならば、１１１Ｉｎ−オクトレオチドでの腫瘍−担持動物への検出された遺伝子導入はヒトで既に用いられているのと同様な用量におけるものであり、また、注目する遺伝子の導入を直接的かつ非侵入的にモニターするのが可能であることを示したからである。
【０２１１】
ｈＴＥＲＴプロモーターの制限を克服し、導入遺伝子発現を増加させるため、および１１１Ｉｎ−オクトレオチドＳＳＲＴ２Ａ系でのγ−カメライメージングによるイン・ビボでの導入遺伝子発現の腫瘍−特異的イメージングを増強するために、新規なプラスミドベクターであるｐＬＪ２９４／ｈＴＭＣ−ＳＳＲＴ２Ａ−ＩＲＥＳ−ＦＵＳ１ベクターはｈＴＭＣプロモーターによって選択的に駆動されて、腫瘍細胞においてのみ高レベルの遺伝子発現を提供し、他方、ＩＲＥＳエレメントは２つの個々の遺伝子であるレポーターＳＳＴＲＴ２Ａおよび治療遺伝子ＦＵＳ１の同等レベルでの同時発現を可能とするであろう。これは、ＦＵＳ１の正常な機能および発現の定量に干渉することなく、レポーターＳＳＴＲ２Ａ遺伝子でのイン・ビボにおける治療ＦＵＳ１遺伝子発現の測定を可能とするであろう。ＳＳＴＲ２Ａ遺伝子（図１７Ｃ、緑色、細胞表面膜）およびＦＵＳ１遺伝子（図１７Ｃおよび図１７Ｄ、赤色、ミトコンドリア、ＥＲ、および核膜周囲の位置）双方の共発現および区別される細胞下局所化は、免疫蛍光イメージング分析によって明らかに示される（図１７Ｄ）。放射性−医薬１１１Ｉｎ−オクトレオチドでの非侵入的かつ感受性のγ−カメライメージングと組み合わせたこれらの新規な治療ベクターは、マウスにおけるＳＳＴＲ２Ａ−ＦＵＳ１−リポプレクッス−媒介遺伝子導入の分布、クリアランス、発現および効率の効果的なモニタリングを可能とするであろう。
【０２１２】
６．ヌードマウスにおける、ｐｈＴＭＣ−ＦＵＳ１  ＤＮＡ  ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子の全身投与での腫瘍−標的化分子によるＳＣＬＣ腫瘍成長の阻害、および非−侵入的磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）
容量定量的情報を入手し、および水の局所的環境における変異に基づく組織の間のイメージ強度を区別するための検出に対する非−侵入的アプローチ、および能力は、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）を、広い範囲の実験的癌研究のための強力なツールとする。ｐｈＴＭＣ−ＦＵＳ１  ＤＮＡ：ＤＯＴＡＰ：コレステロールナノ粒子の全身投与によるヒト肺原発性および転移癌に対する腫瘍−標的化分子療法の効率を評価し、およびイン・ビボにてｈＴＭＣ−媒介ＦＵＳ１遺伝子発現および抗−腫瘍効果を非侵入的にモニターするために、実験を行って、種々のＭＲパラメーターを用いて腫瘍の外観を特徴付け、および胸内スペースおよび肺においてヒトＳＣＬＣ腫瘍異種移植片を担うヌードマウスにおける、腫瘍成長、およびｈＴＭＣ−ＦＵＳ１ナノ粒子での全身治療の治療効果をモニターした（図１８）。腫瘍細胞（１００ＰＢＳ中、１×１０６）の胸スペースへの直接的注射によって、ヌードマウスをヒトＮ４１７ＳＣＬＣによって接種した。固体腫瘍異種移植片は、肺において１０〜１５日以内に確立され、あるいは骨または脳に転移した。ＭＲＩは、尾静脈注射を介するＤＯＴＡＰ：コレステロール複合体化ｐｈＴＭＣ−ＦＵＳ１プラスミドＤＮＡ（ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１ナノ粒子）の全身投与による処置の前および後に行った。腫瘍細胞接種から約２週間後であって、処置の前に、ＭＲＩ分析を行い、これは、肺において腫瘍の存在を明瞭に検出した（矢印によって示される図１８のａ、ｂ、ｉおよびｊ）。これらの予備的結果は、腫瘍成長および治療効果を追跡するためにＭＲＩを用いる利点も明瞭に示す。対照ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰナノ粒子で処理された動物における腫瘍は、処置前のもの（図１８のａおよびｂ）と比較して、ＭＲＩによって検出される増大した腫瘍容量（図１８のｃおよびｄ）によって示されるように成長し続けたが、腫瘍成長は、ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１ナノ粒子での処置によって有意に抑制された（図１８、ｋおよびｌ−対−図１８、ｉおよびｊ）。ＭＲイメージは、また、ＭＲＩ分析直後に殺された凍結された全マウスの肺ブロック−面（ＬＢＦ）セクションからの無傷イメージで組織学的によって確証された（図１８、ｇ、ｈ、ｏおよびｐ）。腫瘍の位置およびサイズはＭＲＩおよびＬＢＦ双方のイメージにおいて完全にマッチした。これらの実験において、ＭＲＩを、同一動物におけるＣＴスキャニング（図１８、ｅ、ｆ、ｍおよびｎ）によって生じたイメージと比較した。腫瘍は動物のいくつかにおいて検出できたが、腫瘍と隣接する正常な組織との境界、または腫瘍の容量はＣＴによっては区別できず、かつ測定できなかった。これらのデータは、小動物モデルにおける、および臨床的実施における、腫瘍スクリーニング、検出、定量において非侵入的ＭＲＩを用いる接近性および利点、およびｈＴＭＣ−媒介抗−腫瘍遺伝子の治療効果の評価を示す。
【０２１３】
材料および方法
１．細胞系および細胞培養。ヒトＮＳＣＬＣ細胞系ＮＣＩ−Ｈ１２９９およびＡ５４９、ＳＣＬＣ細胞系Ｎ４１７、および頸部細胞系Ｈｅｌａ、不滅の腎臓細胞２９３Ｆは、元来、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎから入手し、我々の研究所（Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）で維持した。正常なヒト気管支上皮細胞系、ＨＢＥＣ、正常な肺線維芽細胞の細胞系ＷＩ−３８およびＶＡ−１３はＣｌｏｎｅｔｉｃｓ（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤ）から購入し、製造業者によって推奨される培地中にて、かつ製造業者の指令に従って培養した。全ての細胞を、３７℃にて、５％ＣＯ２を含有する湿潤化雰囲気中で培養した。
【０２１４】
２．トランスフェクション、およびイン・ビトロ遺伝子発現の分析。ＦｕＧｅｎｅ６試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｃ．，）または（我々の研究所において生じさせた）を、ＤＯＴＡＰプラスミドベクターでのイン・ビトロトランスフェクションで用いた。ＰＢＳをモックトランスフェクションとして用いた。全てのトランスフェクション効率は、トランスフェクションの４８時間後に、レポーターＥＧＦＰ発現のパーセンテージによって検出した。簡単に述べれば、細胞を６−ウェルプレートにおけるプロモータートランスフェクションに１日先立って平板培養し、トランスフェクションの時点において６０〜８０％密集であった。４８時間のトランスフェクションの後に、浮遊するおよび接着性の双方の細胞をトリプシン処理によって収穫し、ＰＢＳによって洗浄し、ＥＧＦＰのパーセンテージをＦＡＣＳ分析によって定量した。
【０２１５】
３．動物実験。４〜６週齢の雌Ｎｕ／ＮｕマウスはＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）から入手した。全ての動物を維持し、全ての動物実験は、Ｍ．Ｄ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒにおける動物コア施設で確立された制度的ガイドラインに従って行った。マウスを１００μｌのＰＢＳ中の１×１０６  Ｎ４１７細胞／マウスで胸内スペースに注射した。腫瘍接種から３週間後に、マウスを、１００μｌ  ＤＯＴＡＰ／コレステロール中の２５μｇプラスミドＤＮＡでの尾静脈を介する全身投与によってレポーターまたは治療遺伝子−発現プラスミドＤＮＡナノ粒子で注射した。注射から２日後に、全てのマウスを犠牲にし、腫瘍、肺、肝臓、脾臓、腎臓および脳を収集し、さらなるＥＧＦＰ発現分析のために冷凍して貯蔵した。
【０２１６】
４．ヒトＮＳＣＬＣ皮下腫瘍異種移植片マウスモデル。ｎｕ／ｎｕマウスにおけるＮＳＣＬＣ  Ａ５４９およびＨ１２９９皮下腫瘍接種のための手法は従前に記載されている（その各々をここに具体的に引用して援用するＪｉら、２００２およびＵｎｏら、２００４を参照）。簡単に述べれば、注射の丁度１日前に、マウスに３５０Ｒｄ１３７Ｃｓにて照射した。１００ｍｌのＰＢＳ中に懸濁させた１×１０７腫瘍細胞を動物に皮下注射した。約１０〜１４日後に、固体腫瘍が形成し始めるであろう。イン・ビボイメージングのために、動物に、各々、１００ｍｌのＤ５Ｗ（水中５％デキストロース）中の２５ｍｇプラスミドＤＮＡ：１０ナノモルナノ粒子／腫瘍の容量にて、ＤＯＴＡＰ−コレステロール−複合体化ｐＬＪ２９６／ＳＳＲＴ２Ａプラスミドベクター（ＳＳＲＴ２Ａ−リポプレックス）で腫瘍内注射した。ＰＢＳおよび空のベクターを、各々、モックおよび陰性対照として用いる。イン・ビボイメージングは注射から２４〜４８時間後に行う。比較のために、注射から２４時間〜４８時間後に腫瘍を動物から取り出し、固定し、ＨＡ−ＳＳＲＴ２Ａ融合蛋白質についてのＨＡ抗体でのさらなる病理学的免疫組織学的分析のためにセクション化する。
【０２１７】
５．ヒトＮＳＣＬＣ実験肺転移マウスモデル。簡単に述べれば、注射から丁度一日前に３５０Ｒｄ１３７Ｃｓにてマウスを照射した。尾静脈注射を介して２００μｌ  ＰＢＳ中のＡ５４９細胞（１〜２×１０６）でｎｕ／ｎｕマウスを接種した。肺実験的転移腫瘍コロニーは接種から７〜２０日後に形成された。イン・ビボイメージングのために、各々、１００ｍｌのＤ５Ｗ（水中５％デキストロース）中の２５ｍｇプラスミドＤＮＡ：１０ナノモルのリポソーム／腫瘍の容量にて、マウスをＤＯＴＡＰ−コレステロール−複合体化ｐＬＪ２９６／ＳＳＲＴ２Ａプラスミドベクター（ＳＳＲＴ２Ａ−リポプレックス）で静脈注射した。ＰＢＳおよび空のベクターを、各々、モックおよび陰性対照として用いる。イン・ビボイメージングは、注射から２４〜４８時間後に行った。イン・ビボイメージングと比較するために、注射から２４〜４８時間後に肺を収穫し、肺表面の転移性コロニーをインディアンインクで染色した。肺表面の腫瘍コロニーを、処理群の知識なくして解剖顕微鏡下でカウントし、ＨＡ−ＳＳＲＴ２Ａ融合蛋白質についてのＨＡ抗体でのさらなる病理学的免疫組織化学的分析のために肺組織をセクション化した。
【０２１８】
６．ヒトＮＳＣＬＣ  Ｈ４６０胸内腫瘍異種移植片マウスモデル。注射の丁度１日前に、３５０Ｒｄ１３７Ｃｓにてマウスを照射した。動物を麻酔しつつ、胸内注射を介して、１００μｌ  ＰＢＳ中のＨ４６０細胞（５×１０６）でｎｕ／ｎｕマウスを接種する。胸スペース内部の原発性腫瘍、および骨、リンパ節、または脳における転移性腫瘍は、接種から７〜１０日後に形成される。イン・ビボイメージングのために、各々、１００ｍｌのＤ５Ｗ（水中５％デキストロース）中の２５ｍｇプラスミドＤＮＡ：１０ナノモルのリポソーム／腫瘍の容量にて、動物をＤＯＴＡＰコレステロール−複合体化ｐＬＪ２９６／ＳＳＲＴ２Ａプラスミドベクター（ＳＳＲＴ２Ａナノ粒子）で静脈内注射した。ＰＢＳおよび空のベクターを、各々、モックおよび陰性対照として用いた。注射から２４時間〜４８時間後にイン・ビボイメージングを行った。イン・ビボイメージングと比較するために、注射から２４時間〜４８時間後に腫瘍を収穫し、ＨＡ−ＳＳＲＴ２Ａ融合蛋白質についてのＨＡ抗体でのさらなる病理学的免疫組織化学的分析のためにセクション化した。全動物断面化を行って、イン・ビボイメージングを確認した。
【０２１９】
７．イン・ビボ遺伝子発現の分析。異なるプロモーターでの凍結されたセクション化正常組織および腫瘍におけるＥＧＦＰの発現を、備え付けたデジタルカメラで記録した。簡単に述べれば、凍結された腫瘍を５〜１０μｍセクションに切断し、氷上の４％パラホルムアルデヒド中で１０分間固定し、ＰＢＳ中ですすいだ。風乾後に、組織試料を蛍光増強カバー培地（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）およびカバーグラスで被覆し、デジタルカメラおよびイメージング分析ソフトウェアを備えた蛍光顕微鏡下で調べた。
【０２２０】
８．ＴＵＮＥＬ−反応でのイン・サイチュ細胞死滅分析による、ｈＴＭＣ−またはＣＭＶ−ＦＵＳ１ナノ粒子処理マウスにおけるアポトーシスの誘導。アポトーシスの誘導は、ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ナノ粒子によって処理されたヒト肺癌腫瘍−担持マウスにおける腫瘍で検出されるが、正常な肺および他の組織においては検出されない（図１９）。比較により、凍結されたマウス組織セクションにおけるＴＵＮＥＬ染色でのイン・サイチュアポトーシス分析による蛍光イメージによって示されるように、慣用的なＣＭＶ−ＦＵＳ１−ナノ粒子によって処理されたマウスでは選択性は観察されない（図１９）。
【０２２１】
実施例２
全身癌遺伝子治療のための導入遺伝子の新規な合成ＨＴＥＲＴ−ミニ−ＣＭＶキメラプロモーター−駆動腫瘍−特異的および高−効率発現
首尾よい癌遺伝子治療に対する主な妨げの１つは、原発性および転移性腫瘍に特異的に標的化することができる効果的な全身送達系の欠如である。ｈＴＥＲＴプロモーターはクローン化されており、腫瘍における導入遺伝子発現を標的化することができるが、正常な細胞においてはできないことが示されている。しかしながら、ほとんどの他の固有の哺乳動物プロモーターのように、ｈＴＥＲＴプロモーターの弱い転写−促進強度は、癌遺伝子治療についてのその直接的使用を妨げてきた。これらの問題を回避するために、新規なキメラｈＴＥＲＴ−ミニ−ＣＭＶ（ｈＴＭＣ）プロモーターが開発されており、これは、必須のｈＴＥＲＴ調節配列を最小ＣＭＶプロモーターエレメントと最適に融合させることによって作製された。種々のヒト癌および正常な細胞を種々のＥＧＦＰ−構築体でトランスフェクトし、そこでは、ＥＧＦＰ発現は、元のＣＭＶおよびｈＴＥＲＴプロモーターいずれかによって、またはｈＴＭＣプロモーターによってイン・ビトロにて駆動される。トランスフェクタントにおけるＥＧＦＰの発現は、蛍光顕微鏡下での蛍光イメージング（ＦＩ）によって可視化され、ＥＧＦＰ−陽性細胞の集団および蛍光強度はＦＡＣＳ分析によって定量された。ｈＴＭＣプロモーターによって駆動された高レベルのＥＧＦＰ発現は全ての腫瘍細胞で検出されたが、正常な細胞では検出されなかった。ｈＴＥＲＴプロモーターによって駆動されるＥＧＦＰ発現の同様な腫瘍−選択性は観察できるが、発現のレベルは、同一トランスフェクション効率下では、ｈＴＭＣプロモーターによって駆動されるものよりも数１００倍低かった。また、胸内ヒトＮ４１７肺腫瘍異種移植片を担うヌードマウスへのＤＯＴＡＰ：コレステロール−複合体化ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰ−ナノ粒子の全身注射によって、ｈＴＭＣプロモーターの効率もイン・ビボで評価した。それに合致して、高レベルのＥＧＦＰ発現はｈＴＭＣ−ＥＧＦＰで処理された動物での腫瘍細胞においてのみ検出できたが、いずれの他の正常な組織においても検出されなかった。さらに、前記Ｎ４１７腫瘍マウスモデルを用いて、非−侵入的および定量的ＭＲイメージング分析によって、新規なｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ナノ粒子での全身処理の治療効率を評価した。腫瘍成長の有意な阻害（Ｐ＜０．００１）が、ＭＲイメージングおよび容量分析によって示されるように、未処理の、またはｈＴＭＣ−ＥＧＦＰ−ナノ粒子によって処理されたものと比較して、２週間未満の処理においてｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ナノ粒子によって処理された動物で検出された。アポトーシスの誘導は、凍結された組織試料におけるＴＵＮＥＬ染色でのイン・サイチュ細胞死滅分析によって示されるように、腫瘍細胞においてはやはり検出されたが、ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ナノ粒子によって処理されたマウスにおいては周囲の正常な肺または他の正常な組織においては検出されなかった。これらの結果は、イン・ビトロおよびイン・ビボにおける高腫瘍特異性および高−効率治療遺伝子発現双方を達成するｈＴＭＣプロモーターを用いる能力を明瞭に示し、腫瘍−標的化分子癌療法のための治療ｈＴＭＣ−ナノ粒子の全身投与の使用の翻訳適用を示唆する。
【０２２２】
本明細書中で開示され特許請求される組成物および方法の全ては、本開示を踏まえて、過度な実験なくして行い、実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態にて記載してきたが、本発明の概念、精神および範囲を逸脱することなく、変形を本明細書中に記載された組成物および方法、および方法の工程または方法の配列に適用できることが当業者に明らかであろう。より具体的には、化学的におよび生理学的に関連するある種の剤は、同一または同様な効果を達成しつつ、本明細書中に記載された試薬を置き換えることができるのは明らかであろう。全てのそのような同様な置換および修飾は当業者に明らかであり、添付の請求の範囲によって規定される発明の精神、範囲および概念内にあるとみなされる。
【０２２３】
文献
以下の文献は、本明細書中に記載されたものを補充する例示的な手法または他の詳細を提供する程度に、ここに具体的に引用して援用する：
米国特許第４，６８３，２０２号明細書
米国特許第４，７９７，３６８号明細書
米国特許第５，１３９，９４１号明細書
米国特許第５，９２５，５６５号明細書
米国特許第５，９２８，９０６号明細書
米国特許第５，９３５，８１９号明細書
Ａｂｄｕｌ−Ｇｈａｎｉら、Ｍｏｌ．  Ｔｈｅｒ．，  ２：  ５３９−５４４，  ２０００．
Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ７（９）：１１１１−１１２２，  １９９６．
Ａｌａｍ  ａｎｄ  Ｃｏｏｋ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １８８：２４５−２５４，  １９９０．
Ａｌｂｅｒｉｃｏら、Ｓｕｒｇ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎ．  Ａｍ．，  １３（１）：１３−３５，  ２００４．
Ａｎｇｅｌら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：２２５６，  １９８７．  
Ａｒｔｅｍｏｖら、Ｍａｇ．  Ｒｅｓｏｎ．  Ｍｅｄ．，  ４９：４０３−４０８，  ２００３．
Ａｔｃｈｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ，  Ｃｅｌｌ，  ４６：２５３，  １９８６．
Ａｔｃｈｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ，  Ｃｅｌｌ，  ４８：１２１，  １９８７．
Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ，  ２７（２  Ｐｔ  １）：２９９−３０８，  １９８１．
Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ，  ３３（３）：７２９−７４０，  １９８３．
Ｂｅａｔｔｉｅら、Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．，  ８（３）：１７７−１８０，  １９９８．
Ｂｅｒｋｈｏｕｔら、Ｃｅｌｌ，  ５９：２７３−２８２，  １９８９．
Ｂｌａｃｋｂｕｒｎら、Ｊ．  Ｌｉｐｉｄ．  Ｒｅｓ．，  ３２（１２）：１９１１−１９１８，  １９９１．
Ｂｌｕｍｂｅｒｇら、Ｃｅｌｌ，  １０４（１）：９−１９，  ２００１．
Ｂｏｄｉｎｅ  ａｎｄ  Ｌｅｙ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：２９９７，  １９８７．
Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ，  ４１：５２１，  １９８５．
Ｂｏｓｚｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ５（７）：１６１５−１６２３，  １９８６．
Ｂｏｕｓｓｉｆら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２（１６）：７２９７−７３０１，  １９９５．
Ｂｒａｄｄｏｃｋら、Ｃｅｌｌ，  ５８：２６９，  １９８９．  
Ｂｕｌｌａ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６２：１４３７，  １９８６．  
Ｃａｌｅｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７１（４）：３０３１−３０３８，  １９９７．
Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：１９９３，  １９８８．  
Ｃａｍｐｅｒｅ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，  ３：５３７，  １９８９．
Ｃａｍｐｏら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３０３：７７，  １９８３．  
Ｃｅｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６１：２６９，  １９８７．
Ｃｅｌａｎｄｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：１３１４，  １９８８．
Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４（８）：３５９６−６０１，  １９９７．
Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：２１５３，  １９８９．  
Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ７（８）：２７４５−２７５２，  １９８７．
Ｃｈｏｉら、Ｃｅｌｌ，  ５３：５１９，  １９８８．  
Ｃｏｆｆｉｎ，  Ｉｎ：  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｆｉｅｌｄｓら、（Ｅｄｓ．），  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  １４３７−１５００，  １９９０．
Ｃｏｈｅｎら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ５：７５，  １９８７．  
Ｃｏｓｔａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：８１，  １９８８．
Ｃｏｕｃｈら、Ａｍ．  Ｒｅｖ．  Ｒｅｓｐ．  Ｄｉｓ．，  ８８：３９４−４０３，  １９６３．
Ｃｒｉｐｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：３７４５，  １９８７．
Ｃｕｌｏｔｔａ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｒ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：１３７６，  １９８９．
Ｄａｎｄｏｌｏら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ４７：５５−６４，  １９８３．  
Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：１４６−１４８，  １９９６．
Ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３１２（５９９１）：２４２−２４６，  １９８４．  
ｄｅ  Ｗａａｌら、Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．，  １７４：１２０９-１２２０，  １９９１．
Ｄｅｓｃｈａｍｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０：１１７４−１１７７，  １９８５．  
Ｄｕｍｏｕｔｉｅｒら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６４（４）：１８１４−１８１９．，  ２０００．
Ｅｄｂｒｏｏｋｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：１９０８，  １９８９．
Ｅｄｌｕｎｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０：９１２−９１６，  １９８５．  
Ｅｋｍｅｋｃｉｏｕｇｌｕら、Ｍｅｌａｎｏｍａ  Ｒｅｓ．，  ９（３）：２６１−２７２，  １９９９．
Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ，ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４：８４６３−８４６７，  １９８７．
Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４（２１）：７４１３−７４１７，  １９８７．
Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｎｄ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：６１７８，  １９８８．  
Ｆｅｎｇら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６９（５２２８）：１２３６−１２４１，  １９９５．
Ｆｉｒａｋ  ａｎｄ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：３６６７，  １９８６．
Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ，  Ｇｅｎｅ，  ４５（１）：１０１−１０５，  １９８６．  
Ｆｒａｌｅｙら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  ３：６２９−６３５，  １９８５．
Ｆｕｊｉｔａら、Ｃｅｌｌ，  ４９：３５７，  １９８７．  
Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５０（１９）：６３７１−６３７８，  １９９０．
Ｇａｌｌａｇｈｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．，  １（７）：４４２−４５０，  ２０００．
Ｇｈｏｓｈ  ａｎｄ  Ｂａｃｈｈａｗａｔ，  Ｉｎ：  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ，  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｌｉｇａｎｄｓ，  Ｗｕら、（Ｅｄｓ．），  Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，  ＮＹ，  ８７−１０４，  １９９１．
Ｇｉｌｌｅｓら、Ｃｅｌｌ，  ３３：７１７，  １９８３．
Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ４（１）：８７−９９，  １９９５．
Ｇｌｏｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：３７３５，  １９８７．  
Ｇｏｄｂｏｕｔら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：１１６９，  １９８８．  
Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：１４４７，  １９８８．
Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎら、Ｃｅｌｌ，  ４５：６０１，  １９８６．  
Ｇｏｐａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ５：１１８８−１１９０，  １９８５．
Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６−４６７，  １９７３．
Ｇｒｅｅｎｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  １０：２７２，  １９８９．
Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｃｅｌｌ，  ４１：８８５，  １９８５．  
Ｇｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６０：５３５９−５３６４，  ２０００．
Ｇｕら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  ２１：４７５７−４７６４，  ２００２．
Ｇｕｐｔａ  ａｎｄ  Ｃｕｒｔｉｓ，  Ｊ．  Ｍａｔ．  Ｓｃｉ．  Ｍａｔ．  Ｍｅｄ．，  １５：４９３−４９６，  ２００４．
Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １０１（３）：１０９４−１０９９，  １９８５．
Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎら、Ｇｅｎｅ  Ｄｅｖ．，  １１：３１０９−３１１５，  １９９７．
Ｈａｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：６７３，  １９８８．
Ｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：２４９，  １９８６．  
Ｈｅｎｓｏｎら、ＡＪＮＲ  Ａｍ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．，  ２５（６）：９６９−９７２，  ２００４．
Ｈｅｒｒ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｃｅｌｌ，  ４５：４６１，  １９８６．
Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６１：２５９９，  １９８７．  
Ｈｉｒｓｃｈら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：１９５９，  １９９０．  
Ｈｏｌｂｒｏｏｋら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １５７：２１１，  １９８７．
Ｈｏｒｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：２３９６，  １９８９．
Ｈｗａｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：５８５，  １９９０．  
Ｉｍｂｒａ  ａｎｄ  Ｋａｒｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２３：５５５，  １９８６．
Ｉｍｌｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：２５５８，  １９８７．  
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：２５５５，  １９８８．  
Ｊａｍｅｅｌ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：７１０，  １９８６．
Ｊａｙｎｅｓら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：６２，  １９８８．  
Ｊｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６２：２７１５−２７２０，  ２００２．
Ｊｉａｎｇら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ，  １１（１２）：２４７７−２４８６，  １９９５．
Ｊｉａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３（１７）：９１６０−９１６５，  １９９６．
Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：３３９３，  １９８９．
Ｋａｄｅｓｃｈ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：２５９３，  １９８６．
Ｋａｒｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：６０６，  １９８７．
Ｋａｔｉｎｋａら、Ｃｅｌｌ，  ２０：３９３，  １９８０．  
Ｋａｗａｍｏｔｏら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：２６７，  １９８８．  
Ｋｉｌｅｄｊｉａｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：１４５，  １９８８．  
Ｋｉｍら、Ｃｅｌｌ，  ８７：３４３−３５５，  １９９６．
Ｋｌａｍｕｔら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：１９３，  １９９０．
Ｋｎａｐｐら、Ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，  １５２（１）：２１７−２２７，  ２０００．
Ｋｏｃｈら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：３０３，  １９８９．
Ｋｏｍａｔａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６１（１５）：５７９６−５８０２，  ２００１．
Ｋｏｔｅｎｋｏら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９７（４）：１６９５−１７００，  ２０００．
Ｋｏｔｉｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７（６）：２２１１−２２１５，  １９９０．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｔｃｈａｎ，  Ｉｎ：    Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｇｌｕｚｍａｎ  （Ｅｄ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ：    Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ，  １９８２．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｔｃｈａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：３２５，  １９８３．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ，  ３８：４８３，  １９８４．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ，  ５３：４５，  １９８８．  
Ｋｕｈｌら、Ｃｅｌｌ，  ５０：１０５７，  １９８７．  
Ｋｕｎｄｒａら、Ｊ．  Ｎｕｃ．  Ｍｅｄ．，  ４３：４０６−４１２，  ２００２．
Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ８３：８２８３，  １９８６．  
Ｌａｓｐｉａら、Ｃｅｌｌ，  ５９：２８３，  １９８９．  
Ｌａｔｉｍｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：７６０，  １９９０．  
Ｌａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６０（２）：５１５−５２４，  １９８６．
Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８（１０）：３９８８−３９９６，  １９８８．
Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，  ２９５：７９，  １９８２．  
Ｌｉら、Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６６：６５６２−６５７０，  １９９０．
Ｌｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：８５０，  １９９０．
Ｌｕｒｉａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：３３０７，  １９８７．  
Ｌｕｓｋｙ  ａｎｄ  Ｂｏｔｃｈａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８３：３６０９，  １９８６．  
Ｌｕｓｋｙら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：１１０８，  １９８３．  
Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５３：９０−９４，  １９９１．
ＭｃＣａｒｔｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６５（６）：２９３６−２９４５，  １９９１．
ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６２（６）：１９６３−１９７３，  １９８８．
Ｍｅｙｅｒｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，  ９０：７８５−７９５，  １９９７．
Ｍｉｋｓｉｃｅｋら、Ｃｅｌｌ，  ４６：２０３，  １９８６．  
Ｍｏｒｅａｕら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ９：６０４７，  １９８１．  
Ｍｕｅｓｉｎｇら、Ｃｅｌｌ，  ４８：６９１，  １９８７．
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５８：９７−１２９，  １９９２．
Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２７７：９５５−９５９，  １９９７．
Ｎａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，  １８：６５−６８，  １９９８．
Ｎｇら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １７：６０１，  １９８９．  
Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２１：１８５−１９０，  １９８２．
Ｏｎｄｅｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：１０１７，  １９８７．  
Ｏｒｎｉｔｚら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：３４６６，  １９８７．
ＰＣＴ  Ａｐｐｌｎ．  ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５７８１
Ｐｅｃｈら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：３９６，  １９８９．  
Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４（６１８０）：３２０−３２５，  １９８８．
Ｐｅｒｅｚ−Ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：１１１６，  １９９０．
Ｐｉｃａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０７：８３，  １９８４．
Ｐｉｎｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，  １：２６８，  １９８７．  
Ｐｏｒｔｏｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：１０７６，  １９９０．  
Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：７１６１−７１６５，  １９８４．
Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｃｅｌｌ，  ３５：７４１，  １９８３．
Ｑｕｉｎｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：４７１３，  １９８９．
Ｒｅｄｏｎｄｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４７：１２２５，  １９９０．  
Ｒｅｉｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｔｔｅｒ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：３５７１，  １９８９．  
Ｒｉｐｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：２２２４，  １９８９．  
Ｒｉｐｐｅ，ら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １０：６８９−６９５，  １９９０．
Ｒｏｓｅｎら、Ｃｅｌｌ，  ４１：８１３，  １９８８．  
Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６：９０７９−９０８３，  １９８９．
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｉｎ：    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００１．
Ｓａｍｕｌｓｋｉら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  １０：３９４１−３９５０，  １９９１．
Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６３：３８２２−３８２８，  １９８９．  
Ｓａｔａｋｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：９７０，  １９８８．  
Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０１：８１，  １９８８．
Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｉｎｉａｋ，  Ｃｅｌｌ，  ５９：２２９，  １９８９．
Ｓｈａｕｌ  ａｎｄ  Ｂｅｎ−Ｌｅｖｙ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：１９１３，  １９８７．  
Ｓｈａｙら、Ｌｅｕｋｅｍｉａ，  １０（８）：１２５５−１２６１，  １９９６．
Ｓｈｅｌｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  １：１６５−１６９，  １９９４．  
Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：５０，  １９８９．
Ｓｌｅｉｇｈ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｔｔ，  Ｊ．  ＥＭＢＯ，  ４：３８３１，  １９８５．  
Ｓｏｌｏｄｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３４（４１）：１３５３７−１３５４４，  １９９５．
Ｓｏｏら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７４（１）：１−１０，  １９９９．
Ｓｏｏら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７４（１）：１−１０，  １９９９．
Ｓｐａｌｈｏｌｚら、Ｃｅｌｌ，  ４２：１８３，  １９８５．  
Ｓｐａｎｄａｕ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：４２７，  １９８８．
Ｓｐａｎｄｉｄｏｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｅ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２：１１９３，  １９８３．
Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ２４８：１，  １９８７．
Ｓｔｒｕｎｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｄ，  Ｅｕｒ．  Ｒａｄｉｏｌ．，  １４（６）：１０５５−１０６２，  ２００４．
Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｌｉｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：３３１５，  １９８７．  
Ｓｗａｒｔｚｅｎｄｒｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  ８５：１７９，  １９７５．
Ｔａｋａｋｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５９（３）：５５１−５５７，  １９９９．
Ｔａｋｅｂｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：４６６，  １９８８．
Ｔｅａｒｎｅｙら、Ｊ  Ｕｒｏｌ．，  １５７（５）：１９１５−１９１９，  １９９７．
Ｔｅｍｐｌｅｔｏｎら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １５：６４７−６５２，  １９９７．
Ｔｈｉｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２（２１）：９７４２−９７４６，  １９９５．
Ｔｈｉｅｓｅｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：６１４，  １９８８．
Ｔｏｐら、Ｊ．  Ｉｎｆｅｃｔ．  Ｄｉｓ．，  １２４：１５５−１６０，  １９７１．
Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４：２０７２−２０８１，  １９８４．  
Ｔｒｅｉｓｍａｎ，  Ｃｅｌｌ，  ４２：８８９，  １９８５．
Ｔｒｏｎｃｈｅら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ７：１７３，  １９９０．
Ｔｒｕｄｅｌ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，  ６：９５４，  １９８７．
Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ９（３）：２４３−２４８，  １９９５．
Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ６：７１６−７１８，  １９８６．
Ｔｙｎｄｅｌｌら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  ９：６２３１，  １９８１．
Ｕｍｅｏｋａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６４（１７）：６２５９−６２６５，  ２００４．
Ｕｎｏら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６４：２９６９−２９７６，  ２００４．
Ｖａｎｎｉｃｅ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：１３０５，  １９８８．  
Ｖａｓｓｅｕｒら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７７：１０６８，  １９８０．  
Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｃａｌａｍｅ，  Ｃｅｌｌ，  ４７：２４１，  １９８６．
Ｗｅｂｅｒら、Ｃｅｌｌ，  ３６：９８３，  １９８４．
Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：９８８，  １９８４．
Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｃｅｌｌ，  ５９：６４９，  １９８９．
Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７：  ８８７−８９２，  １９８８．
Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６２：４４２９−４４３２，  １９８７．
Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ４  （９）：９５０−９６０，  １９９７．  
Ｙａｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：９５６８−９５７２，  １９９０．  
Ｙｕｔｚｅｙら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：１３９７，  １９８９．
Ｙｕｔｚｅｙら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：１３９７−１４０５，  １９８９．  
Ｚｈａｎｇら、Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｊｉｅ  Ｈｅ  Ｈｅ  Ｈｕ  Ｘｉ  Ｚａ  Ｚｈｉ．，  ２３（６）：３５８−３６０，  ２０００．
Ｚｈａｏら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．  Ｃｈｅｍ．，  １３：８４０−８４４，  ２００２．
Ｚｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６１（５１１８）：２０９−２１１，  １９９３。
【図面の簡単な説明】
【０２２４】
【図１】プラスミドベクターｐＬＪ１４３／ＫＧＢ２／ＦＵＳ１の図。
【図２】プラスミドベクターｐＬＪ２８０／ＫＧＢ２／ＥＶの図。
【図３】プラスミドベクターｐＬＪ３３１／ｄＣｐＧ−ＫＧＢ２／ＦＵＳ１の図。
【図４】ｈＴＭＣ−含有プラスミドベクターｐＬＪ３３６／ｄＣＰＧ−ＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１の図。
【図５】ｈＴＭＣ−含有プラスミドベクターｐＬＪ２８４／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＥＶの図。
【図６】ｈＴＭＣ−含有プラスミドベクターｐＬＪ２８６／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰの図。
【図７】プラスミドベクターｐＬＪ２９３／ｐＫＧＢ２／ＥＧＦＰの図。
【図８】プラスミドベクターｐＬＪ２８７／ｐＫＧＢ２／ｈＴＥＲＴ−ＥＧＦＰの図。
【図９】プラスミドベクターｐＬＪ２９６／ＫＧＢ２／ＳＳＲＴ２Ａの図。
【図１０】ｈＴＭＣ−含有プラスミドベクターｐＬＪ３４６／ＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−ＳＳＲＴ２Ａの図。
【図１１】ｈＴＭＣ−含有プラスミドベクターｐＬＪ２９４／ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ＩＲＥＳ−ＳＳＴＲ２Ａの図。
【図１２】プラスミドベクターｐＬＪ２９０／ｐＫＧＢ２／ＦＵＳ１−ＩＲＥＳ−ＳＳＴＲ２Ａの図。
【図１３】プラスミドベクターｐＬＪ３４０／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ−Ｌｕｃの図。
【図１４】プラスミドベクターｐＬＪ３４１／ｐＫＧＢ２／ｈＴＭＣ／ＦＵ１−ＩＲＥＳ−Ｌｕｃの図。
【図１５】図１５Ａ、図１５Ｂ、図１５Ｃ。蛍光イメージング分析（図１５Ａ）およびＦＡＣＳによる定量的分析（図１５Ｂ、ＥＧＦＰ陽性細胞、および図１５Ｃ、全蛍光強度／１０００細胞）による正常および癌細胞トランスフェクタントにおけるＥＧＦＰの発現。
【図１６】図１６Ａ、図１６Ｂ。ＥＧＦＰ−リポプレックスの全身注射によるマウスの種々の組織におけるＥＧＦＰの発現。図１６Ａ。肺Ｈ４１７腫瘍は、ヌードマウスにおける１×１０６  Ｎ４１７細胞の気管内注射によって確立した。マウスを静脈内注射によって種々のＥＧＦＰ−リポプレックス（２０μｇ  ＤＮＡ：４０ｎｍｏｌ  ＤＯＴＡＰ：コレステロール／マウス）で処理した。動物を注射から４８時間のちに殺し、腫瘍、腎臓、脾臓、肺および肝臓の新鮮な凍結された試料を直ちに調製した。凍結したセクションを４％パラホルムアルデヒド中で固定し、蛍光顕微鏡下で直ちにＥＧＦＰの発現を調べた。ｈＴＭＣ、ヒトＴＥＲＴ−ミニ−ＣＭＶプロモーター。図１６Ｂ。ＦＡＣＳ分析による腫瘍および正常なマウス組織におけるＥＧＦＰ発現の定量。
【図１７】図１７Ａ、図１７Ｂ、図１７Ｃ、図１７Ｄ。図１７Ａ：ＨＴ１０８０トランスフェクタントにおけるＳＳＲＴ２Ａ発現の免疫蛍光イメージ分析。図１７Ｂ：図１７Ａに示された対応するＳＳＲＴ２Ａ−発現（図１７Ａ）の（Ａ、Ｂ、およびＣ）および非―発現（図１７Ｄ）細胞から接種した皮下腫瘍を担うヌードマウスのγカメライメージ。動物を１１１Ｉｎ−オクトレオチド（１３ＭＢｑ）で静脈内注射し、２４時間後にイメージした。図１７Ｃ：ｐＬ２９０／ＦＵＳ１−ＩＲＥＳ−ＳＳＲＴ２ＡプラスミドトランスフェクトＨ１２９９細胞におけるＳＳＲＴ２Ａ（緑色）およびＦＵＳ１（赤色）の共発現。図１７Ｄ：腫瘍によるラジオトレーサー取り込みの修正。％ＩＤ／ｇ＝グラム当たりの％注射用量。
【図１８】尾静脈注射を介するｈＴＭＣ−ＥＧＦＰ−またはｈＴＭＣ−ＦＵＳ１ナノ粒子＋Ｇｌｅｖｅｃの全身投与による処理前および後におけるＮ４１７  ＳＣＬＣ腫瘍―担持マウスのＭＲＩ、ＣＴ、およびＬｕｎｇ  Ｂｌｏｃｋ  Ｆａｃｅ（ＬＢＦ）イメージング分析。気管内注射によるＮ４１７腫瘍細胞の接種から１４日後に、動物をＭＲＩ（前記）によって腫瘍の発生についてスクリーニングした。処理から２週間後に、動物をＭＲまたはＣＴいずれかによってイメージし、次いで、殺し、全動物を直ちに凍結し、ブロックフェースセクションを調製し、無傷でイメージして、イン・ビボＭＲＩおよびＣＴイメージにマッチさせた。
【図１９】ＴＵＮＥＬ−反応でのイン・サイチュ細胞死滅分析によるｈＴＭＣ−またはＣＭＶ−ＦＵＳ１ナノ粒子処理マウスにおけるアポトーシスの誘導。
【図１】
2008532521.tif 000004
【図２】
2008532521.tif 000005
【図３】
2008532521.tif 000006
【図４】
2008532521.tif 000007
【図５】
2008532521.tif 000008
【図６】
2008532521.tif 000009
【図７】
2008532521.tif 000010
【図８】
2008532521.tif 000011
【図９】
2008532521.tif 000012
【図１０】
2008532521.tif 000013
【図１１】
2008532521.tif 000014
【図１２】
2008532521.tif 000015
【図１３】
2008532521.tif 000016
【図１４】
2008532521.tif 000017
【図１５】
2008532521.tif 000018
【図１６】
2008532521.tif 000019
【図１７】
2008532521.tif 000020
【図１８】
2008532521.tif 000021
【図１９】
2008532521.tif 000022
【配列表】
2008532521000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月21日(2007.12.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）組織−選択的プロモーター配列；および
ｂ）該組織−選択的プロモーター配列に操作可能にカップリングされた第二のプロモーター配列であって、最小ウイルスプロモーター配列を含む第二のプロモーター配列；
を含み、該組織−選択的プロモーター配列の該第二のプロモーター配列への操作可能なカップリングの結果、該組織−選択的プロモーター配列の改良されたプロモーター機能がもたらされる、プロモーター。
【請求項２】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、またはＡＦＰプロモーター配列ヒトα−ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒツジβ−ラクトグロブリンプロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、アデノウイルスＶＡ１プロモーター配列、ヒトｔＲＮＡプロモーター配列、５ＳリボソームＲＮＡプロモーター配列、またはこれらのプロモーター配列のいずれかの機能的ハイブリッドまたは組合せである、請求項１記載のプロモーター。
【請求項３】
前記組織−選択的プロモーター配列が腫瘍−選択的プロモーター配列としてさらに定義される、請求項１記載のプロモーター。
【請求項４】
前記組織−選択的プロモーター配列が低酸素症−特異的プロモーター配列である、請求項１記載のプロモーター。
【請求項５】
前記低酸素症−特異的プロモーター配列が低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）または低酸素症誘導因子である、請求項４記載のプロモーター。
【請求項６】
前記低酸素症誘導因子がＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、またはＨＩＦ−３αである、請求項５記載のプロモーター。
【請求項７】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列である、請求項１記載のプロモーター。
【請求項８】
前記ｈＴＥＲＴプロモーター配列が配列番号１である、請求項７記載のプロモーター。
【請求項９】
前記最小ウイルスプロモーター配列がアデノウイルスプロモーター配列、バキュロウイルスプロモーター配列、ＣＭＶプロモーター配列、パルボウイルスプロモーター配列、ヘルペスウイルスプロモーター配列、ポックスウイルスプロモーター配列、アデノ−関連ウイルスプロモーター配列、セミリキフォレストウイルスプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ワクシニアウイルスプロモーター配列、またはレトロウイルスプロモーター配列である、請求項１記載のプロモーター。
【請求項１０】
前記最小ウイルスプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項９記載のプロモーター。
【請求項１１】
前記ミニ−ＣＭＶ配列が配列番号２である、請求項１０記載のプロモーター。
【請求項１２】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列であり、前記第二のプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項１記載のプロモーター。
【請求項１３】
前記プロモーターが配列番号３を含む、請求項１２記載のプロモーター。
【請求項１４】
プロモーターを含む核酸であって、該プロモーターは：
ａ）組織−選択的プロモーター配列；および
ｂ）第一のプロモーター配列に操作可能にカップリングされた第二のプロモーター配列であって、最小ウイルスプロモーター配列を含む第二のプロモーター配列；
を含み、該組織−選択的プロモーター配列の該第二のプロモーター配列への操作可能なカップリングの結果、該第一のプロモーター配列の改良されたプロモーター機能がもたらされる、核酸。
【請求項１５】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、ＡＦＰプロモーター配列、ヒトα−ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒツジβ−ラクトグロブリンプロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、アデノウイルスＶＡ１プロモーター配列、ヒトｔＲＮＡプロモーター配列、５ＳリボソームＲＮＡプロモーター配列、またはこれらのプロモーター配列のいずれかの機能的ハイブリッドまたは組合せである、請求項１４記載の核酸。
【請求項１６】
前記組織−選択的プロモーター配列が腫瘍−選択的プロモーター配列としてさらに定義される、請求項１４記載の核酸。
【請求項１７】
前記組織−選択的プロモーター配列が低酸素症−特異的プロモーター配列である、請求項１４記載の核酸。
【請求項１８】
前記低酸素症−特異的プロモーター配列が低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）または低酸素症誘導因子である、請求項１７記載の核酸。
【請求項１９】
前記低酸素症誘導因子がＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、またはＨＩＦ−３αである、請求項１８記載のプロモーター。
【請求項２０】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列である、請求項１５記載の核酸。
【請求項２１】
前記ｈＴＥＲＴプロモーター配列が配列番号１である、請求項２０記載の核酸。
【請求項２２】
前記最小ウイルスプロモーター配列がアデノウイルスプロモーター配列、バキュロウイルスプロモーター配列、ＣＭＶプロモーター配列、パルボウイルスプロモーター配列、ヘルペスプロモーター配列、ポックスウイルスプロモーター配列、アデノ関連ウイルスプロモーター配列、セミリキフォレストウイルスプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ワクシニアウイルスプロモーター配列、またはレトロウイルスプロモーター配列である、請求項１４記載の核酸。
【請求項２３】
前記最小ウイルスプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項２２記載の核酸。
【請求項２４】
前記ミニ−ＣＭＶ配列が配列番号２である、請求項２３記載の核酸。
【請求項２５】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列であって、前記第二のプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項１４記載の核酸。
【請求項２６】
前記プロモーターが配列番号３を含む、請求項２５記載の核酸。
【請求項２７】
前記プロモーターに操作可能にカップリングされた遺伝子を含むとしてさらに定義される、請求項１４記載の核酸。
【請求項２８】
前記遺伝子が治療遺伝子または選択可能マーカーである、請求項２７記載の核酸。
【請求項２９】
前記治療遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、またはホルモンをコードする遺伝子である、請求項２８記載の核酸。
【請求項３０】
前記治療遺伝子がＲｂ、ＣＦＴＲ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ−ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ  ｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、ｍｄａ７、ＦＵＳ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＡＤＰ、ｐ５３、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＹＥＳ、ＭＡＤＨ４、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＴＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、Ｒａｐ１Ａ、シトシンデアミナーゼ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ＢＲＣＡ２、ｚａｃ１、ＡＴＭ，ＨＩＣ−１、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＰＴＥＮ、ＩＮＧ１、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＯＶＣＡ１、ＭＡＤＲ２、５３ＢＰ２、ＩＲＦ−１、ｚａｃ１、ＤＢＣＣＲ−１、ｒｋｓ−３、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、β＊（ＢＬＵ）、ＬＵＣＡ−１（ＨＹＡＬ１）、ＬＵＣＡ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１（ＮＰＲＬ２）、ＳＥＭ  Ａ３またはＭＣＣである、請求項２９記載の核酸。
【請求項３１】
前記治療遺伝子がＦＵＳ１である、請求項３０記載の核酸。
【請求項３２】
前記選択可能マーカーが薬物選択マーカー、酵素、または免疫学的マーカーである、請求項２８記載の核酸。
【請求項３３】
プラスミドに含まれるものとしてさらに定義される、請求項１４記載の核酸。
【請求項３４】
前記プロモーター配列に操作可能にカップリングされたレポーター配列を含むものとしてさらに定義される、請求項１４記載の核酸。
【請求項３５】
前記レポーター配列がソマトスタチン受容体アミノ酸配列、ヨウ化ナトリウムシンポーターアミノ酸配列、真核生物緑色蛍光蛋白質アミノ酸配列、赤色蛍光蛋白質アミノ酸配列、ルシフェラーゼアミノ酸配列、β−ガラクトシダーゼアミノ酸配列、またはチミジンキナーゼアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドである、請求項３４記載の核酸。
【請求項３６】
前記ソマトスタチン受容体アミノ酸配列が組換えソマトスタチン受容体アミノ酸配列、ソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列、または突然変異したソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列である、請求項３５記載の核酸。
【請求項３７】
前記ソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列がソマトスタチン受容体タイプ２Ａアミノ酸配列である、請求項３６記載の核酸。
【請求項３８】
前記レポーター配列がＩＲＥＳおよび第二の遺伝子と操作可能にカップリングされた、請求項３４記載の核酸。
【請求項３９】
前記第二の遺伝子が第二のレポーターに操作可能にカップリングされた、請求項３８記載の核酸。
【請求項４０】
前記第二のレポーターがソマトスタチン受容体アミノ酸配列、ヨウ化ナトリウムシンポーターアミノ酸配列、ルシフェラーゼアミノ酸配列、真核生物緑色蛍光蛋白質アミノ酸配列、またはチミジンキナーゼアミノ酸配列である、請求項３９記載の核酸。
【請求項４１】
前記第二の遺伝子が選択可能マーカーまたは治療遺伝子を含む、請求項３８記載の核酸。
【請求項４２】
前記第二の遺伝子が、腫瘍サプレッサー遺伝子である治療遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、またはホルモンをコードする遺伝子である、請求項４１記載の核酸。
【請求項４３】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列であり、前記第二のプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列であり、該プロモーターはＦＵＳ１をコードする遺伝子に操作可能にカップリングされ、そして、前記核酸はプラスミドに含まれる、請求項４１記載の核酸。
【請求項４４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のプロモーターを含む組成物。
【請求項４５】
被験体における細胞への前記プロモーターの送達用の送達ビヒクルを含むものとしてさらに定義される、請求項４４記載の組成物。
【請求項４６】
前記送達ビヒクルが核酸、プラスミド、ウイルスベクター、原核生物細胞、真核生物細胞、または脂質である、請求項４５記載の組成物。
【請求項４７】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項４６記載の組成物。
【請求項４８】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスである、請求項４７記載の組成物。
【請求項４９】
前記脂質がリポソームに含まれる、請求項４６記載の組成物。
【請求項５０】
前記リポソームがカチオン性脂質を含む、請求項４９記載の組成物。
【請求項５１】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌである、請求項５０記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌがさらにナノ粒子を含む、請求項５１記載の組成物。
【請求項５３】
請求項１４〜４３のいずれかに記載の核酸を含む組成物。
【請求項５４】
被験体における細胞への前記核酸の送達用の送達ビヒクルを含むものとしてさらに定義される、請求項５３記載の組成物。
【請求項５５】
前記送達ビヒクルがウイルスベクターまたは脂質である、請求項５４記載の組成物。
【請求項５６】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項５５記載の組成物。
【請求項５７】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項５６記載の組成物。
【請求項５８】
前記ビヒクルがリポソームを含む、請求項５５記載の組成物。
【請求項５９】
前記リポソームがカチオン性脂質を含む、請求項５８記載の組成物。
【請求項６０】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌである、請求項５９記載の組成物。
【請求項６１】
前記ＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌがさらにナノ粒子を含む、請求項６０記載の組成物。
【請求項６２】
ａ）組織−選択的プロモーター配列を選択し；
ｂ）第二のプロモーター配列を選択し、第二のプロモーター配列は最小ウイルスプロモーター配列を含み；次いで、
ｃ）該組織−選択的プロモーター配列を該第二のプロモーター配列に操作可能にカップリングさせる；
ことを含み、該組織−選択的プロモーター配列の該第二のプロモーター配列への操作可能なカップリングの結果、該組織−選択的プロモーター配列の改良された機能をもたらす、組織−選択的プロモーターの機能を改良する方法。
【請求項６３】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、ＡＦＰプロモーター配列、ヒトα−ラクトアルブミンプロモーター配列、ヒツジβ−ラクトグロブリンプロモーター配列、Ｕ６プロモーター配列、Ｈ１プロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、アデノウイルスＶＡ１プロモーター配列、ヒトｔＲＮＡプロモーター配列、５ＳリボソームＲＮＡプロモーター配列、またはこれらのプロモーター配列のいずれかの機能的ハイブリッドまたは組合せである、請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
前記組織−選択的プロモーター配列が低酸素症−特異的プロモーター配列である、請求項６２記載の方法。
【請求項６５】
前記低酸素症−特異的プロモーター配列が低酸素応答エレメント（ＨＲＥ）または低酸素症誘導因子である、請求項６４記載の方法。
【請求項６６】
前記低酸素症誘導因子がＨＩＦ−１α、ＨＩＦ−２α、またはＨＩＦ−３αである、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
前記組織−選択的配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列である、請求項６２記載の方法。
【請求項６８】
前記ｈＴＥＲＴプロモーター配列が配列番号１である、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記最小ウイルスプロモーター配列がアデノウイルスプロモーター配列、バキュロウイルスプロモーター配列、ＣＭＶプロモーター配列、パルボウイルスプロモーター配列、ヘルペスウイルスプロモーター配列、ポックスウイルスプロモーター配列、アデノ−関連ウイルスプロモーター配列、セミリキフォレストウイルスプロモーター配列、ワクシニアウイルスプロモーター配列、またはレトロウイルスプロモーター配列である、請求項６２記載の方法。
【請求項７０】
前記最小ウイルスプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記ミニ−ＣＭＶ配列が配列番号２である、請求項７０記載の方法。
【請求項７２】
前記組織−選択的プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列であって、前記第二のプロモーター配列がミニ−ＣＭＶプロモーター配列である、請求項６２記載の方法。
【請求項７３】
前記プロモーターが配列番号３を含む、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
請求項１〜１３のいずれかに記載のプロモーターに操作可能にカップリングされた遺伝子を含む、遺伝子を細胞に送達するための組成物であって、該細胞との接触に適し、該接触の結果、該遺伝子の該細胞への送達をもたらす、組成物。
【請求項７５】
前記組成物が、さらに、送達ビヒクルを含む、請求項７４記載の組成物。
【請求項７６】
前記送達ビヒクルがウイルスベクターまたは脂質である、請求項７４記載の組成物。
【請求項７７】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノ−関連ウイルスベクター、またはポックスウイルスベクターである、請求項７６記載の組成物。
【請求項７８】
前記ウイルスベクターがアデノウイルスベクターである、請求項７７記載の組成物。
【請求項７９】
前記ウイルスベクターがプロタミン−複合体化ウイルスベクターとしてさらに定義される、請求項７５記載の組成物。
【請求項８０】
前記プロタミン−複合体化ウイルスベクターがプロタミン−複合体化アデノウイルスベクターである、請求項７９記載の組成物。
【請求項８１】
前記送達ビヒクルがカチオン性脂質を含む、請求項７５記載の組成物。
【請求項８２】
前記カチオン性脂質がＤＯＴＡＰ：ｃｈｏｌである、請求項８１記載の組成物。
【請求項８３】
前記ＤＯＴＡＰ：ｃｈｏｌがＤＯＴＡＰ：ｃｈｏｌナノ粒子としてさらに定義される、請求項８２記載の組成物。
【請求項８４】
前記細胞が癌細胞である、請求項７４記載の組成物。
【請求項８５】
前記癌細胞が被験体におけるものである、請求項８４記載の組成物。
【請求項８６】
過剰増殖性疾患を持つ被験体を治療するための組成物であって、請求項１４〜４３のいずれかに記載の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、組成物。
【請求項８７】
前記被験体が癌を持つ患者である、請求項８６記載の組成物。
【請求項８８】
前記癌が乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌、肝臓癌、子宮頚癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、頭部および頚部の癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、リンパ系癌、胃癌、膵臓癌、精巣癌、リンパ腫、または白血病である、請求項８７記載の組成物。
【請求項８９】
前記癌が肺癌である、請求項８８記載の組成物。
【請求項９０】
前記被験体が二次的抗−癌療法を受けている、請求項８９記載の組成物。
【請求項９１】
細胞をイメージングするための組成物であって、プロモーターがレポーターアミノ酸配列に操作可能にカップリングされた請求項１４〜４３のいずれかに記載の核酸を含み、該組成物は、該細胞との接触に適し、該レポーター配列の細胞発現は、該レポーター由来のシグナルを測定することによる検出に適する、組成物。
【請求項９２】
前記細胞が被験体におけるものであって、前記細胞をイメージングするための組成物が被験体における組織をイメージングするための組成物としてさらに定義される、請求項９１記載の組成物。
【請求項９３】
前記細胞が癌細胞であって、前記細胞をイメージングするための組成物が癌を持つ患者における腫瘍をイメージングするための組成物としてさらに定義される、請求項９２記載の組成物。
【請求項９４】
前記レポーターが酵素アミノ酸配列、レポーターアミノ酸配列、またはリボザイムＲＮＡ配列である、請求項９１記載の組成物。
【請求項９５】
前記レポーターアミノ酸配列が組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列、チミジンキナーゼアミノ酸配列、ドーパミン受容体アミノ酸配列、内皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）アミノ酸配列、プラスミノーゲンアミノ酸配列、ウロキナーゼ−タイプのプラスミノーゲンアクチベーター受容体（ｕＰＡＲ）アミノ酸配列、ホルモン受容体アミノ酸配列、またはヨウ化ナトリウムシンポーターアミノ酸配列である、請求項９４記載の組成物。
【請求項９６】
前記レポーターアミノ酸配列が組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列である、請求項９５記載の組成物。
【請求項９７】
前記組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列が組換えソマトスタチン受容体アミノ酸配列、組換えソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列、または突然変異したソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列である、請求項９６記載の組成物。
【請求項９８】
前記組換えソマトスタチンタイプ２受容体アミノ酸配列は組換えソマトスタチンタイプ２Ａ受容体アミノ酸配列である、請求項９７記載の組成物。
【請求項９９】
前記組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列をコードする核酸が、切形された組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体をコードする核酸を含む、請求項９８記載の組成物。
【請求項１００】
前記切形された組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体をコードする核酸がカルボキシ末端切形を含む、請求項９９記載の組成物。
【請求項１０１】
前記切形の結果、前記組換え７回膜貫通Ｇ−プロテイン関連受容体アミノ酸配列の内部化および／またはシグナリングの改変をもたらす、請求項１００記載の組成物。
【請求項１０２】
前記レポーターアミノ酸配列をコードする核酸が該レポーターアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端の異種リーダー配列を含み、該リーダー配列はレポーターアミノ酸配列を特定の非細胞性位置へ誘導する、請求項９１記載の組成物。
【請求項１０３】
前記レポーターアミノ酸配列をコードする核酸が、さらに、前記レポーターアミノ酸配列のＮ−末端またはＣ−末端に融合した蛋白質タグを含む、請求項９１記載の組成物。
【請求項１０４】
前記蛋白質タグが酵素活性を有する、請求項１０３記載の組成物。
【請求項１０５】
前記蛋白質タグがヘマグルチニンＡ、β−ガラクトシダーゼ、チミジンキナーゼ、トランスフェリン、ｍｙｃ−タグ、ＶＰ１６、（Ｈｉｓ）６−タグ、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである、請求項１０４記載の組成物。
【請求項１０６】
前記イメージングを、腫瘍の外科的切除を受けている患者に対して手術内で行う、請求項９３記載の組成物。
【請求項１０７】
遺伝子が前記プロモーターに操作可能にカップリングされており、前記細胞をイメージングするための組成物が遺伝子を細胞に送達するための組成物としてさらに定義される、請求項９１記載の組成物。
【請求項１０８】
前記遺伝子が治療遺伝子であって、前記細胞をイメージングするための組成物が治療遺伝子を細胞に送達するための組成物としてさらに定義される、請求項９２記載の組成物。
【請求項１０９】
前記治療遺伝子が腫瘍サプレッサー遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、またはホルモンをコードする遺伝子である、請求項１０８記載の組成物。
【請求項１１０】
前記治療遺伝子がＲｂ、ＣＦＴＲ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ−ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ  ｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、ｍｄａ７、ＦＵＳ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＡＤＰ、ｐ５３、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＹＥＳ、ＭＡＤＨ４、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＴＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、Ｒａｐ１Ａ、シトシンデアミナーゼ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ＢＲＣＡ２、ｚａｃ１、ＡＴＭ，ＨＩＣ−１、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＰＴＥＮ、ＩＮＧ１、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＯＶＣＡ１、ＭＡＤＲ２、５３ＢＰ２、ＩＲＦ−１、ｚａｃ１、ＤＢＣＣＲ−１、ｒｋｓ−３、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、Ｇｅｎｅ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、β＊（ＢＬＵ）、ＬＵＣＡ−１（ＨＹＡＬ１）、ＬＵＣＡ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１（ＮＰＲＬ２）、ＳＥＭ  Ａ３またはＭＣＣである、請求項１０９記載の組成物。
【請求項１１１】
前記治療遺伝子がＦＵＳ１である、請求項１１０記載の組成物。
【請求項１１２】
さらに、被験体への遺伝子の投与後に、該被験体において該遺伝子の生体内分布を測定するための組成物としてさらに定義される、請求項９２記載の組成物。
【請求項１１３】
さらに、被験体における治療遺伝子の投与に対する応答を測定するための組成物として定義される、請求項９１記載の組成物。
【請求項１１４】
シグナルの測定が、蛍光イメージング分析、免疫組織化学分析、化学発光イメージング、光学イメージング、磁気共鳴イメージング、または放射性イメージングとしてさらに定義される、請求項９１記載の組成物。
【請求項１１５】
放射性イメージングがγカメライメージングとしてさらに定義される、請求項１１４記載の組成物。
【請求項１１６】
シグナルの測定が１１１Ｉｎ−オクトレオチド−ＳＳＲＴ２Ａレポーター系でのγ−カメライメージングとしてさらに定義される、請求項１１５記載の組成物。
【請求項１１７】
シグナルの測定が超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）―オクトレオチド−ＳＳＴＲ２Ａレポーターおよびコントラスト増強系を用いる磁気共鳴イメージングとしてさらに定義される、請求項１１４記載の組成物。
【国際調査報告】
2008532521.tif 000023
2008532521.tif 000024
2008532521.tif 000025
2008532521.tif 000026
2008532521.tif 000027