(57)【要約】本発明は、ゲムシタビンの新規なアミドプロドラック、その組成物、及びそれらを使用する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式の化合物。
【化１】
2008524218.tif 000005
【請求項２】
１−（２，２−ジフルオロ−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−プロピル−１−オキソペンチル）アミノピリミジン−２−オン  ｐ−トルエンスルホン酸共結晶である化合物。
【請求項３】
１−（２，２−ジフルオロ−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−プロピル−１−オキソペンチル）アミノピリミジン−２−オン  ｐ−トルエンスルホン酸水和物共結晶（２：１：１）である請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の化合物と、医薬的に許容できる賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項５】
前記組成物が腸溶性コートされている、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
哺乳類における感受性新生物を治療する方法であって、それを必要とする哺乳類に、治療上有効量の請求項１〜３のいずれかに記載の化合物を投与することを含む方法。
【請求項７】
前記感受性新生物が、Ｔ細胞リンパ腫、軟部組織肉腫、膵臓癌、乳癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、及び膀胱癌からなる群より選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
感受性新生物の治療用医薬を製造するための請求項１〜３のいずれかに記載の化合物の使用。
【請求項９】
医薬品としての使用するための請求項１、２、又は３から選択される化合物。
【請求項１０】
Ｔ細胞リンパ腫、軟部組織肉腫、膵臓癌、乳癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌、又は膀胱癌の治療用医薬の製造における、請求項１、２、又は３から選択される化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、経口投与が可能で、非経口剤より胃腸毒性特性が少なく、バイオアべイラビリティが良好な状態で、無傷な状態で腸管から肝門部の血脈を通過でき、低用量で非経口剤の有効性を維持できるゲムシタビンの新規的なプロドラッグに関する。
【背景技術】
【０００２】
塩酸ゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシシチジン塩酸塩）は、現在、様々な癌の治療のための凍結乾燥粉末製剤ジェムザール（登録商標）として製造及び販売されている、既知の抗ウイルス作用を持った抗腫瘍薬である。ジェムザール（登録商標）、その製造方法及び使用方法は、米国特許第号５，４６４，８２６号明細書及び米国特許第４，８０８，６１４号明細書に記載されている。ジェムザール（登録商標）は、現在、膵臓癌、乳癌及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療用として認可されており、卵巣癌に対して評価中である。更に、ジェムザール（登録商標）はＨＣＶの治療、並びに免疫機能のモジュレーターに使用することもできる（米国特許第６，５５５，５１８号明細書参照）。ジェムザール（登録商標）は、現在、１週間に１回、最大７週間、約１０００〜１２５０ｍｇ／ｍ２の用量で３０分にわたって静脈点滴し、その後、１週間の治療休止を設けることで投与されている。
【０００３】
ゲムシタビンの経口使用は、初回通過代謝の結果として経口のバイオアベイラビリティが低いことから制限がある（Ｓｈｉｐｌｅｙ  ＬＡ．ら，  “Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ，  ａｎｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｄｅｏｘｙｃｙｔｉｄｉｎｅ  ａｎａｌｏｇ，  ｉｎ  ｍｉｃｅ，  ｒａｔｓ，  ａｎｄ  ｄｏｇｓ”，  Ｄｒｕｇ  ＆  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ．  ２０（６）：  ８４９−５５，  １９９２）。更に、経口投与した場合のゲムシタビンは、１６７、３３３、又は５００ｍｇ／ｋｇ用量のゲムシタビンを単回経口投与（強制投与）したマウスにおける腸管全長にわたる軽度から重度の粘膜上皮欠損（萎縮性腸疾患）を特徴とする用量を制限する有害な腸病変の発生に関与する（Ｈｏｒｔｏｎ  ＮＤら，  “Ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｓｅ  ｏｒａｌ  ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  ｉｎ  ｍｉｃｅ”，  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｐｏｓｔｅｒ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，  Ｏｒｌａｎｄｏ，  ＦＬ，  Ｍａｒｃｈ  ２７−３１，  ２００４）。これまでのマウス研究において、静脈投与による比較暴露では致死性も胃腸毒性も生じていない。
【０００４】
ゲムシタビンのプロドラッグ及び持続型徐放製剤を調製する方法は、当技術分野で周知である。このようなプロドラッグ及び持続型徐放製剤は、以下において記述されている。
国際公開第０４／０４１２３０３号パンフレット「Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  Ｐｒｏｄｒｕｇｓ，  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  Ｔｈｅｒｅｏｆ」，  Ｇａｌｌｏｐら
国際公開第９８／３２７６２号パンフレット「Ｇｅｍｃｉｔａｂｉｎｅ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ，」  Ｍｙｈｒｅｎ，  Ｆｉｎｎら
国際公開第０２／０９７６８号パンフレット「Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｏｌｙｅｓｔｅｒｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙａｍｉｄｅｓ，」  Ｕｈｒｉｃｈ，  Ｋａｔｈｒｙｎ  Ｅ．
国際公開第０２／７６４７６号パンフレット「Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ａｒｏｍａｔｉｃ  ａｃｉｄｓ，」  Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｂ．ら
国際公開第０２／６５９８８号パンフレット「Ｔｅｒｍｉｎａｌｌｙ−ｂｒａｎｃｈｅｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｌｉｎｋｅｒｓ  ａｎｄ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ａｓ  ｐｒｏｄｒｕｇ，」  Ｃｈｏｅ，  Ｙｕｎ  Ｈｗａｎｇら
【０００５】
ゲムシタビンアミド誘導体は、当技術分野で、ゲムシタビンの合成に有用な中間体であること（例えば、Ｂｒｉｔｔｏｎら，米国特許第５，４２０，２６６号明細書、及びＧｒｉｎｄｅｙら，米国特許第５，４６４，８２６号明細書参照）、また、ゲムシタビン投与のためのプロドラッグ成分として有用であること（例えば、Ｇａｌｌｏｐら，国際公開第０４／０４１２０３号パンフレット参照）が記載されている。
【０００６】
経口投与が可能であり、実質的な分解を伴わずに無傷な状態で腸管を通過し、許容できる安全性と有効性をもってゲムシタビンを罹患部位に送達するゲムシタビンのプロドラッグの必要性が依然として存在する。
【０００７】
驚くことに、本発明者らは、実質的に無傷な状態で腸細胞を通り抜け、肝臓に主要なゲムシタビン代謝産物であるデオキシフルオロウリジン（ｄＦｄＵ）が顕著に蓄積することなくゲムシタビンを加水分解し、経口用ゲムシタビンよりも毒性が小さく、かつ、経口投与した場合に妥当な有効性と安全性を維持する、優れた新規なゲムシタビンアミド誘導体を発見した。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、式Ｉの化合物を提供する。
【化１】
2008524218.tif 000002
Ｉ
【０００９】
本発明の別の態様は、式Ｉの化合物と、１又は複数の薬理学的に許容できる賦形剤と、を含む新規な医薬組成物を提供する。
【００１０】
また、本発明は、感受性新生物の治療のための式Ｉの化合物の使用であって、そのような治療を必要とする哺乳類における使用を提供する。
【００１１】
本発明は、感受性ウイルス感染の治療のための式Ｉの化合物の使用であって、そのような治療を必要とする哺乳類における使用を提供する。
【００１２】
また、本発明は、感受性新生物又は感受性ウイルス感染の治療用医薬を製造するための式Ｉの化合物の使用を提供する。
【００１３】
更にまた、本発明は、式Ｉの化合物を調製する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本願明細書で使用される用語は、以下の意味を有する。
【００１５】
「哺乳類」とは、皮膚が毛に覆われていること、雌は子を養うために乳汁を産生する乳腺を有することを特徴とする、哺乳類種の様々な温血脊椎動物、最も好ましくは、ヒトを意味する。
【００１６】
「薬理学的に許容できる賦形剤」とは、薬理学的に許容できる調剤担体、液剤、又は製剤の特性を増強するための添加剤を指す。このような賦形剤は、製剤の他の成分と適合し、レシピエントに害があってはならず、それらは当業者に周知である。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  第１９版，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １９９５参照。
【００１７】
「共結晶」とは、非共有結合的相互作用によって安定性を担う２つ以上の分子の物理的会合を意味する。この分子複合体の１又は複数の成分は結晶格子が安定したフレームワークを提供する。場合によっては、ゲスト分子が無水物又は溶媒和物として結晶格子に組み込まれる（例えば、“Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｈａｓｅｓ．Ｄｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ−ｃｒｙｓｔａｌｓ  Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ  ａ  Ｎｅｗ  Ｐａｔｈ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅｓ？”  Ａｌｍａｒａｓｓｏｎ，  Ｏ．ら，  Ｔｈｅ  Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  １８８９−１８９６，  ２００４参照）。好ましい共結晶としては、ｐ−トルエンスルホン酸及びベンゼンスルホン酸がある。
【００１８】
「薬理学的に許容できる共結晶」とは、製剤の他の成分と適合し、レシピエントに害のない共結晶を意味する。
【００１９】
「感受性新生物」とは、式Ｉの化合物の経口投与によって治療されうる哺乳類における組織の異常な増殖を指す。このプロドラッグがゲムシタビンへと加水分解すれば、このプロドラッグの投与は、固形及び非固形の多種多様な癌に対して広域の活性を示すと期待される。好ましくは、感受性新生物としては、Ｔ細胞リンパ腫、軟組織肉腫、膵臓癌、乳癌、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、卵巣癌及び膀胱癌が含まれる。
【００２０】
本発明の化合物はウイルス感染、特にＨＣＶの感染の治療に有用である。
【００２１】
「治療上有効な量」とは、研究者、医師、臨床医が求める、組織、系又は哺乳類の所望される生体応答又は薬効応答を誘発する化合物／組成物の量を意味する。
【００２２】
ゲムシタビンは誘導体化可能な３つの官能基、３’及び５’ヒドロキシル基とＮ４−アミノ基を含む。式Ｉの化合物は、好適な保護基を用いて３’及び５’ヒドロキシル官能基を遮断した後にＮ４−アミノ基をアシル化することによって調製することができる。典型的な保護基は周知であり、当技術分野のＰｒｏｔｅｃｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，  第３版  Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｇｒｅｅｎｅ，  Ｐｅｔｅｒ  Ｗｕｔｓ  （Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）  １９９９に見られる。Ｎ４−アミノ基のアシル化は、酸塩化物又は酸無水物との反応によるか、又は有機化学分野の当業者に周知のＮ，Ｎ−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド（ＥＤＣ）、１，１−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）又は他の類似試薬等のカップリング試薬の存在下でのカルボン酸（ｃａｒｂｏｘｃｙｌｉｃ  ａｃｉｄ）との反応によって達成されうる。あるいは、式Ｉの化合物は、保護基を用いずに製造することもできる。この場合、一付加物、二付加物及び三付加物の混合物が形成され、この混合物から目的生成物を分離すればよい。
【００２３】
以下、実施例により本発明の化合物の合成を更に示す。出発材料及び試薬は全て、当技術分野で周知かつ認知されたものであり、容易に入手できるか、本願明細書に記載の方法によって製造される。ゲムシタビン（２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシシチジン）の製造方法は、例えば、米国特許第４，８０８，６１４号明細書に開示されている。
【実施例】
【００２４】
実施例１
１−（２，２−ジフルオロ−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−プロピル−１−オキソペンチル）アミノピリミジン−２−オン
【化２】
2008524218.tif 000003
２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシシチジン（１０．０ｇ，３８．０ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１００ｍＬ）に溶解し、窒素下で攪拌しながら０℃まで冷却する。クロロトリメチルシラン（２４．０ｍＬ，１９０．０ｍｍｏｌ）を滴下し、内部温度が５℃を超えないように維持する。０℃で２時間攪拌を続ける。別のフラスコで、２−プロピルペンタン酸（６．０ｇ，４１．８ｍｍｏｌ）を無水アセトニトリル（１００ｍＬ）に溶解する。１，１−カルボニルジイミダゾール（６．８ｇ，４１．８ｍｍｏｌ）を少量ずつ３０分かけて加え、２時間攪拌する。このアセトニトリル溶液を前記ピリジン溶液に０℃で滴下し、周囲温度になるまで反応させる。反応物を一晩４５℃で加熱した後、３０〜３５℃まで冷却し、無水エタノール１００ｍＬを加え、４５℃で３０分間加熱する。水５０ｍＬを加え、４５℃で５時間加熱した後、周囲温度まで冷却し、真空濃縮する。酢酸エチルと水とで粗残渣を分液する。リン酸で約ｐＨ２まで酸性化し、有機層を分離する。水層を更なる酢酸エチルで逆抽出する。有機溶液と混合し、飽和重炭酸ナトリウム溶液及び飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄し、硫酸マグネシウムで乾燥させ、真空濃縮する。塩化メチレン中３０％〜６０％の酢酸エチル勾配で溶離するシリカゲルクロマトグラフィー（１２０ｇ）により精製する。目的生成物を白色の破砕性泡沫として単離する（１１．２ｇ，収率７７％）。
【００２５】
ＭＳ  （ＥＳ）：  ｍ／ｚ  ３９０．３  ＝  ［Ｍ＋Ｈ］＋
ＭＳ  （ＥＳ）：  ｍ／ｚ  ３８８．３  ＝  ［Ｍ−Ｈ］＋
１ＨＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，  ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ０．８３  （ｔ，  ６Ｈ），  １．１５−１．３６  （ｍ，  ６Ｈ），  １．４６−１．５５  （ｍ，  ２Ｈ），  ２．６０  （ｄｄｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝１４．４，  ９．６，  ５．６，  ５．６  Ｈｚ），  （ｄｄｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝１２．６，  ６．２，  ３．６  Ｈｚ），  ３，７７−３．８１  （ｍ，  １Ｈ），  ３，８７  （ｄｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．４，  ３．０  Ｈｚ），  ４．１２−４．２２  （ｍ，  １Ｈ），  ５．２７  （ｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝５．６  Ｈｚ），  ６．１５  （ｔ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．４  Ｈｚ），  ６．２９  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝６．４  Ｈｚ），  ７．３１  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝７．２  Ｈｚ），  ８．２３  （ｄ，  １Ｈ，  Ｊ＝８．０  Ｈｚ），  １１．０３  （ｓ，  １Ｈ）
【００２６】
実施例２
１−（２，２−ジフルオロ−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−プロピル−１−オキソペンチル）アミノピリミジン−２−オン  ｐ−トルエンスルホン酸水和物共結晶（２：１：１）共結晶（２：１：１）
０．７０９ｇ（１．８２ｍｍｏｌ）の実施例１の化合物を９ｍＬメタノールに溶解する。別のフラスコで、ｐ−トルエンスルホン酸の０．２５Ｍ水性原液を調製する。この水溶液３．６ｍＬ（０．９ｍｍｏｌ）を滴下する。水約５ｍＬを加え、混合物を室温で、沈殿が生じるまで攪拌する（約３０分）。沈殿固体を真空濾取し、風乾する。
【００２７】
共結晶の分析：
ｐ−トルエンスルホン酸、ゲムシタビン及び実施例１の化合物の既知濃度溶液を調製する。実施例１のｐ−トルエンスルホン酸共結晶サンプルを分析し、成分組成を決定する。
【００２８】
２：１：１比の２−プロピル−ペンタノイル）］−２’，２’−ジフルオロ−２’−デオキシ−シチジン／ｐ−トルエンスルホン酸／水の％トルエンスルホン酸を以下のように測定した。
理論値１７．８％ｐ−トルエンスルホン酸
結果値１９．１％ｐ−トルエンスルホン酸
ＨＰＬＣ：
カラム：Ｗａｔｅｒｓ  Ａｔｌａｎｔｉｓ  ｄＣ１８，  ３．０μｍ，  ４．６ｉ．ｄ．×１５０  ｍｍ
カラム温度：５０℃
ＵＶ波長：２４８ｎｍ
【００２９】
１．移動相
Ａ．５／９５アセトニトリル／水＋０．１％ＴＦＡ
Ｂ．５０／５０アセトニトリル／水＋０．１％ＴＦＡ
【００３０】
２．勾配
【表１】
2008524218.tif 000004
【００３１】
実施例３
１−（２，２−ジフルオロ−２−デオキシ−β−Ｄ−リボフラノシル）−４−（２−プロピル−１−オキソペンチル）アミノピリミジン−２−オンベンゼンスルホン酸共結晶（１：１）
酢酸エチル５ｍＬに、実施例１の化合物５５０ｍｇを加える。混合物をおよそ５５℃に加熱する。１モル当量のベンゼンスルホン酸を原液で加える。更に、酢酸エチル約１０ｍＬを、必要に応じ、沈殿を粉砕するために音波処理を施しながら加える。この懸濁液を室温まで放冷し、真空濾過によって単離する。単離した固体を風乾する。融点：１７１℃
【００３２】
式Ｉの化合物及びその溶媒和物は経口使用が可能であり、通常、経口投与されるので、経口投与が好ましい。
【００３３】
医薬組成物は薬理学分野において周知の方法で製造される。医薬組成物は、有効成分のビヒクル又は媒体として提供される固体、半固体、又は液体材料であってよい。好適な担体又は賦形剤は当技術分野で周知である。医薬組成物は経口、吸入、非経口、又は局所用に適合させることができ、錠剤、カプセル剤、エアゾール剤、吸入剤、坐剤、液剤、懸濁剤等の形態で患者に投与することができる。本発明の化合物は、例えば、不活性希釈剤と共に、又はカプセル剤もしくは圧縮錠剤として経口投与することができる。治療的経口投与のためには、これらの化合物に賦形剤を配合し、錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、ウエハース、チューイングガム等の形態で使用することができる。これらの製剤は好ましくは、有効成分として少なくとも１％の本発明の化合物を含有するが、形態に依存しており、投与単位の重量の１％〜約９０％の間とするのが都合がよい。組成物中に存在する化合物の量は、好適な用量が得られるような量である。本発明の好ましい組成物及び製剤は、当業者に周知の方法によって決定することができる。
【００３４】
錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤等は、ポビドン、ヒドロキシプロピルセルロース、微結晶性セルロース又はゼラチン等の結合剤；デンプン、ラクトース、微結晶性セルロース、或いはリン酸二カルシウム、又はクロスカルメロース、クロスポビドン、ナトリウムデンプングリコラート、コーンスターチ等の崩壊剤等の賦形剤又は希釈液；ステアリン酸マグネシウム、立体化学的な酸、タルク又は水素化植物油等の潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；ラウリル硫酸ナトリウム及びポリソルベート８０等の湿潤剤のうち１又は複数のアジュバントを含有してもよく、スクロース、アスパルテーム或いはサッカリン等の甘味剤、又はハッカ、サリチル酸メチル或いはオレンジ香料等の香料を添加してもよい。投与単位形態がカプセル剤である場合、上記種類の物質に加えて、ポリエチレングリコール又は脂肪油等の液体担体を含有してもよい。他の投与単位形態には、投与単位の物理的形態を改変する他の様々な物質、例えばコーティング剤が含まれてもよい。投与単位形態は腸溶コートされているのが好ましい。
【００３５】
よって、錠剤又は丸剤は、糖、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリメタクリレート、又は他の被覆剤で被覆してもよい。シロップ剤は、本発明の化合物の他、甘味剤としてのスクロース、ある種の保存剤、色素及び着色剤、並びに香味剤を含有してもよい。これら様々な組成物の製造に用いられる材料は薬理学的に純粋であり、かつ、その使用量で無毒でなければならない。
【００３６】
式Ｉの化合物は一般に、広い用量範囲で有効である。例えば、１日当たりの用量は、単回量又は分割量で、通常、約１５ｍｇ／日〜約２００ｍｇ／日の範囲内であり、より好ましくは、約８５ｍｇ／日である。上記の範囲の下限より少ない用量レベルで十分な場合もあるし、有害な副作用を生じることなくより高い用量を使用できる場合もあるので、上記の用量範囲は本発明の範囲を何ら限定するものではない。実際に投与される化合物の量は、治療する症状、選択される投与経路、実際の化合物すなわち投与する化合物、各患者の年齢、体重及び応答、並びに患者の症状の重篤度を含む関連状況を鑑みて、医師により決定される。
【００３７】
ｐＨ化学安定性アッセイ
ｐＨ化学安定性は、半自動ＨＰＬＣ技術を用いて評価される。式Ｉの化合物のサンプルは、胃腸管のｐＨ範囲（ｐＨ１〜ｐＨ８）に相当する５種類のバッファーで１００ｍｃｇ／ｍＬとして調製する。サンプルを、４０℃でインキュベートしたＨＰＬＣオートサンプラーに入れる。サンプルを１時間間隔で最大２４時間、ゲムシタビンから式Ｉの化合物を分離するＨＰＬＣカラムを備えたＨＰＬＣに繰り返し注入する。式Ｉの化合物のピーク面積はＵＶ検出により経時的に監視し、最初のピーク面積と比較して安定性を判定する。
【００３８】
４時間後、ｐＨ範囲１〜８で、分解してゲムシタビンとなった実施例１の化合物は２５％未満であった。
【００３９】
薬物動態アッセイ
マウス薬物動態
雄ＣＤ−１マウスにおいて、およそ１０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを含むように選択した用量で経口投与した後の、式Ｉの化合物の薬物動態特性を評価する。指定した動物（ｎ＝３／各時点／各化合物）を、投与してから０．０８、０．２５、０．５、１、２、及び６時間後に屠殺し、全身の血液サンプルを、ゲムシタビンの更なる代謝を阻害するためにテトラヒドロウリジン（血液中の終濃度０．５ｍＭ）の入ったＥＤＴＡ処理チューブに採取する。肝門血を採取するため、更に３個体を０．０８時間の時点で屠殺する。血漿を遠心分離により単離し、分析まで冷凍する。ゲムシタビン及びプロドラッグの血漿濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって測定する。薬物動態パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウエア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）を用いて計算する。各プロドラッグの薬物動態パラメーターを、同じ試験計画で経口塩酸ゲムシタビンの投与から得られたものと比較する。
【００４０】
実施例の化合物は、ＣＤ−１マウスに経口投与した場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで強い加水分解を受けてゲムシタビンを放出した。ＣＤ−１マウスにおいて実施例１の化合物を投与した場合、直接塩酸ゲムシタビンを経口投与した場合に比べて、血漿のゲムシタビン暴露が高かった。無傷なプロドラッグの吸収は、経口投与から０．０８時間後の肝門血漿における実施例１の化合物の濃度が比較的高いことにより確認される。
【００４１】
サル薬物動態アッセイ
カニクイザルにおいてクロスオーバー計画の経口投与と静脈内投与の後に、ゲムシタビン及び式Ｉの化合物の薬物動態特性を評価する。化合物はおよそ１０ｍｇ／ｋｇのゲムシタビンを含むように選択した用量で投与する。血液サンプルを、示された間隔で最大４８時間、テトラヒドロウリジン（血液中の終濃度０．５ｍＭ）の入ったＥＤＴＡ処理チューブに採取する。経口投与期間、動物をラニチジン（静脈内、５ｍｇ／ｋｇ）で前処置する。血漿を遠心分離により単離し、分析まで冷凍する。ゲムシタビン及びプロドラッグの血漿濃度をＬＣ／ＭＳ／ＭＳ分析によって測定する。薬物動態パラメーターを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎソフトウエア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  ＣＡ）を用いて計算する。
【００４２】
実施例の化合物は、カニクイザルに静脈内投与した場合、ｉｎ  ｖｉｖｏで強い加水分解を受けてゲムシタビンを遊離した。カニクイザルにおいて実施例１の化合物を投与した場合、直接塩酸ゲムシタビンを経口投与した場合に比べて、口内のゲムシタビン暴露が高かった。
【００４３】
加水分解アッセイ
小腸ホモジネートアッセイ
式Ｉの化合物の、腸管での酵素加水分解に対する安定性を測定するため、ＣＤ−１マウス、ビーグル犬、カニクイザル、及びヒトの上部小腸切片から小腸上皮細胞の粗ホモジネートを調製する。マウス及び犬ホモジネートは新しく採取した組織から調製するが、サル及びヒトホモジネートは事前に冷凍した組織から調製する。細胞を腸片から静かに掻き出し、集め、ポリトロン（ＰＴ−１０−８５）を用い、５０ｍＭ酢酸バッファー中でホモジナイズする。タンパク質濃度を、標準的な分光光度法により測定する。調製したホモジネートを使用するまで−７０℃で保存する。
【００４４】
小腸ホモジネート（ＳＩＨ）中の式Ｉの化合物の加水分解速度は、ｐＨ７．５の酢酸バッファー中で最大６時間、式Ｉの化合物（１００μＭ）をＳＩＨ（総タンパク質２．５〜５ｍｇ／ｍＬ）とともにインキュベートすることによって測定する。反応をアセトニトリルでクエンチした後、加水分解により遊離したゲムシタビンの濃度をＬＣ／ＭＳ分析によって測定する。加水分解速度を、スクリーニング試験の３０分の時点で、式Ｉの化合物の同定試験における加水分解対時間曲線の直線部分の傾きから計算する。
【００４５】
実施例１の化合物は、小腸ホモジネートアッセイでは、遅い加水分解速度を示した。加水分解はサル及びヒトホモジネートで最も遅く、インキュベーション６時間でゲムシタビンに変換されたのは化合物全体の３％未満であった。
【００４６】
肝臓Ｓ９加水分解アッセイ
肝臓酵素による式Ｉの化合物の加水分解を、肝臓加水分解アッセイによって測定する。ＣＤ−１マウス、ビーグル犬、カニクイザル、及びヒト肝臓から肝臓ホモジネートを調製する。肝臓組織をハサミで小さく切った後、ポリトロン（ＰＴ−１０−８５）を用い、５０ｍＭ酢酸バッファー中で１分間ホモジナイズする。各々から、４℃にて９，０００ｘｇで１０分間の超遠心分離により、ミトコンドリアの後の（Ｓ９）画分を調製する。マウス、犬、及びサル肝臓Ｓ９画分は新しく採取した組織から調製するが、ヒト肝臓Ｓ９は事前に冷凍した組織から調製する。遠心分離後、上清を採取し、タンパク質濃度を標準的な分光光度法により測定する。調製したＳ９画分を使用まで−７０℃で保存する。
【００４７】
肝臓Ｓ９中での式Ｉの化合物の加水分解速度を、ｐＨ８．０のリン酸緩衝生理食塩水中で最大６時間、化合物（１００μＭ）をＳ９（総タンパク質２ｍｇ／ｍＬ）とともにインキュベートすることによって測定する。反応をアセトニトリルでクエンチした後に、加水分解により遊離したゲムシタビンの濃度を、ＬＣ／ＭＳ分析によって測定する。加水分解速度を、スクリーニング試験の３０分の時点で、式Ｉの化合物の同定試験における加水分解対時間曲線の直線部分の傾きから計算する。
【００４８】
実施例１の化合物は、記載されている全ての種の肝臓Ｓ９で加水分解された。加水分解はサル及びヒトホモジネートで最も早く、インキュベーション６時間でゲムシタビンに変換されたのは化合物全体のおよそ３５％であった。
【００４９】
毒性アッセイ
４日間マウススクリーニング
経口投与された式Ｉの化合物により生じる毒性を評価するため、雌ＣＤ−ａマウスに４日間毎日投与した場合の、式Ｉの化合物の胃腸毒性特性を、４日マウス試験でゲムシタビン８ｍｇ／ｋｇを投与した場合の胃腸毒性の結果履歴と比較する。
【００５０】
５〜８週齢の雌ＣＤ−１マウスに式Ｉの化合物を強制経口投与により投与する。用量レベルは、ゲムシタビンおよそ８ｍｇ／ｋｇモル当量となるように選択する。用量１０ｍＬ／ｋｇを用い、４日連続で毎日１回投与する。４回目の投与からおよそ５〜８時間後に剖検を行う。
【００５１】
臨床徴候、臨床化学、肉眼病理、及び限定組織病理（回腸、空腸、及び肝臓）を評価する。等用量の式Ｉの化合物と塩酸ゲムシタビンをそれぞれ投与した後に見られた萎縮性の腸変化、又は腸疾患の重篤度は有意に軽減していた。
【００５２】
１４日間マウス試験
式Ｉの化合物が１４日の強制経口投与の後、マウスにおいて有害な作用を生じるかどうかを評価するため、また、１回投与の後又は１４回投与の後の、式Ｉの化合物並びに及びその代謝産物である塩酸ゲムシタビン及びデオキシフルオロウリジンの血漿濃度を測定するため、１４日間マウス試験を行う。
【００５３】
９〜１２週齢の雄及び雌ＣＤ−１マウスに式Ｉの化合物ｒｕｇを強制経口投与により投与する。用量範囲を選択して、最大許容量及び用量制限毒性を決定する。１０ｍＬ／ｋｇの用量を用い、１日１回投与する。
【００５４】
臨床徴候、体重、食物消費、血液学、臨床化学、式Ｉの化合物並びに代謝産物である塩酸ゲムシタビン及びデオキシフルオロウリジンの血漿濃度、並びに病理（肉眼病理、臓器重量、及び組織病理学）を評価する。
【００５５】
モル当量ベースで、実施例１の化合物は、塩酸ゲムシタビンに対しておよそ２倍の全身暴露を生じたが、伴う腸疾患は塩酸ゲムシタビンよりも少ない。
【００５６】
７日間犬試験
ビーグル犬に７日間投与した場合の式Ｉの化合物の毒性特性を評価するため、また、１回投与の後又は７回投与の後の、式Ｉの化合物並びに代謝産物である塩酸ゲムシタビン及びデオキシフルオロウリジンの血漿濃度を測定するため、７日間犬試験を行う。
【００５７】
６〜４８か月齢の雄及び雌ビーグル犬に、式Ｉの化合物をカプセル剤により経口投与する。用量範囲は、最大許容量及び用量制限毒性を決定するよう努力して選択する。１ｍＬ／ｋｇの用量を用い、１日１回投与する。
【００５８】
臨床徴候、体重、食物消費、体温、血液学（凝固を含む）、臨床化学、尿検査、式Ｉの化合物並びにその代謝産物である塩酸ゲムシタビン及びデオキシフルオロウリジンの血漿濃度、並びに病理（肉眼病理、臓器重量、及び組織病理学）を評価した。血液毒性、及びＧＩ毒性を含む他の毒性は、非経口ゲムシタビンについて従前に記載されているものと一致する。よって、これらの毒性に経口投与経路に独特なものはなかった。
【００５９】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ
ＨＣＴ−１１６結腸腫瘍細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて標準的な組織培養条件下で増殖させ、採取し、洗浄し、５×１０６細胞（Ｍａｔｒｉゲル，  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，  Ｉｎｃ中１：１懸濁液）を雌ヌードマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，  ＣＤ１  ｎｕ／ｎｕ，  ２４〜２７ｇ，移植２４時間以内に４５０ラドで照射）の後腹部に皮下注射する。腫瘍は、治療の開始前に約１００ｍｍ３にまで増殖させる。様々な用量レベルのビヒクル対照、式Ｉの化合物、又は塩酸ゲムシタビンを、各実験に示されている回数、マウスに強制経口投与により投与する（１０ｍｌ／ｋｇ）。化合物を、毎日１４日間、又は１日置きに計７回、又は２日置きに計４回のいずれかで投与する。毎日の投与計画では、式Ｉの化合物を１００ｍＭリン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ６．０中に調剤し、１日置き及び２日置きの投与計画では、１％カルボキシメチルセルロースナトリウム、０．５％ラウリル硫酸ナトリウム、０．０５％アンチフォーム１５０及び０．０８５％ポビドン中に調剤する。塩酸ゲムシタビンは、経口投与用の生理食塩水で調製する。腫瘍の大きさをカリパスにより測定し、式ｌ×ｗ２×０．５３６（式中、ｌは垂直直径の長い方であり、ｗは短い方である）から腫瘍体積（ｍｍ３）を見積もる。治療の開始から１週間に１回、全てのデータ（腫瘍測定値及び動物体重）を取り込み、コンピューターに基づく腫瘍測定システムを用いて解析する。
【００６０】
実施例１の化合物で見られた抗腫瘍効力を、等用量の塩酸ゲムシタビンで得られたものと比較した。しかし、実施例１の化合物による処置において、全体的な毒性は同量の塩酸ゲムシタビンを投与した動物より低かった。
【国際調査報告】
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