(57)【要約】特定の宿主細胞において発現されると、低減した、不適切または意図しない転写特性を有する合成核酸分子を調製する方法。本発明は、親核酸配列、例えば、野生型核酸配列に対して低下した、例えば、９０％以下、例えば８０％、７８％、７５％または７０％以下の核酸配列同一性を有し、より少ない調節配列、例えば、転写調節配列を有する合成ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子（ポリヌクレオチド）を提供する。一実施形態では、合成ヌクレオチド配列は、合成ヌクレオチド配列と親核酸配列との間の配列の相違、例えば、場合によって、異なっているコドンの結果が無作為に選択された場合に得られるものよりも少ない調節配列を有する。
2008513021.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択可能なポリペプチドのコード領域を有する合成ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、該合成ヌクレオチド配列が、対応する選択可能なポリペプチドをコードする親核酸配列と９０％以下の核酸配列同一性を有し、該配列同一性の低下が、該親核酸配列中のコドンと比較した、該合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンの結果であり、該ヌクレオチド配列が、該親核酸配列によってコードされる対応する選択可能なポリペプチドに対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する選択可能なポリペプチドをコードし、該合成ヌクレオチド配列が、該合成ヌクレオチド配列と該親核酸配列との間で異なる配列でのコドンの無作為選択から得られる調節配列の平均数よりも少ない数の調節配列を有し、該合成ヌクレオチド配列が、細胞において発現されると、アンピシリン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンまたはネオマイシンに対する耐性を付与する、単離核酸分子。
【請求項２】
前記調節配列が、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）部位、プロモーターモジュールおよび／またはプロモーター配列を含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項３】
前記異なるコドンの大部分が、所望の宿主細胞の好ましいコドンであるものおよび／または該宿主細胞における低使用コドンではないものである、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項４】
前記合成核酸配列中の異なるコドンの大部分が、哺乳類においてより高頻度で用いられるものである、請求項３に記載の単離核酸分子。
【請求項５】
前記合成核酸配列中の異なるコドンの大部分が、ヒトにおいて好ましいコドンである、請求項３に記載の単離核酸分子。
【請求項６】
前記異なるコドンの大部分が、コドンＣＧＣ、ＣＴＧ、ＡＧＣ、ＡＣＣ、ＣＣＣ、ＧＣＣ、ＧＧＣ、ＧＴＧ、ＡＴＣ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＴＡＣ、ＴＧＣおよびＴＴＣである、請求項３に記載の単離核酸分子。
【請求項７】
前記核酸分子が、選択可能なポリペプチドとルシフェラーゼとの融合物をコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項８】
前記ルシフェラーゼが、ウミシイタケルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼまたはコメツキムシルシフェラーゼである、請求項７に記載の単離核酸分子。
【請求項９】
前記親核酸配列が、野生型ｎｅｏ、ｈｙｇ、ｂｌａまたはｐｕｒｏ配列である、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１０】
前記親核酸配列が、配列番号１、配列番号６、配列番号１５または配列番号４１である、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１１】
前記合成ヌクレオチド配列が、配列番号４、配列番号５、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号３０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３または配列番号８４中のオープンリーディングフレームを含む、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１２】
前記合成ヌクレオチド配列が、少なくとも１０％少ない調節配列を有する、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１３】
前記合成ヌクレオチド配列が、増加した数のＡＧＣセリンをコードするコドン、増加した数のＡＴＣイソロイシンをコードするコドン、増加した数のＣＣＣプロリンをコードするコドンおよび／または増加した数のＡＣＣトレオニンをコードするコドンを有する、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１４】
前記異なる合成ヌクレオチド配列中のコドンが、前記親核酸配列中の対応するコドンと同一のアミノ酸をコードする、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１５】
配列番号４、配列番号５、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号３０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３または配列番号８４のいずれか１種中のオープンリーディングフレーム、またはその相補体に対して、少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１６】
前記核酸分子が、前記選択可能なポリペプチドと、１種以上のその他のペプチドまたはポリペプチドとの融合物をコードし、少なくとも該選択可能なポリペプチドが、該合成核酸配列によってコードされる、請求項１に記載の単離核酸分子。
【請求項１７】
１種以上のその他のペプチドが、タンパク質不安定化配列を有するペプチドである、請求項１６に記載の単離核酸分子。
【請求項１８】
請求項１に記載の核酸分子を含むプラスミド。
【請求項１９】
多重クローニング領域をさらに含む、請求項１８に記載のプラスミド。
【請求項２０】
前記目的のオープンリーディングフレームをさらに含む、請求項１８に記載のプラスミド。
【請求項２１】
前記合成ヌクレオチド配列と作動可能に連結された、特定の宿主細胞において機能的なプロモーターをさらに含む、請求項１８に記載のプラスミド。
【請求項２２】
前記プロモーターが原核細胞において機能的である、請求項２１に記載のプラスミド。
【請求項２３】
前記プロモーターが真核細胞において機能的である、請求項２１に記載のプラスミド。
【請求項２４】
前記目的のオープンリーディングフレームと作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項２０に記載のプラスミド。
【請求項２５】
ホタルルシフェラーゼをコードする合成ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、該合成ヌクレオチド配列が、配列番号４３を有する親核酸配列に対して８０％以下の核酸配列同一性を有するか、またはホタルルシフェラーゼをコードする配列番号１４を有する親核酸配列に対して８５％以下の核酸配列同一性を有し、該配列同一性の低下が、該親核酸配列中のコドンと比較した、該合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンの結果であり、該合成ヌクレオチド配列が、親核酸配列によってコードされる対応するルシフェラーゼに対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するホタルルシフェラーゼをコードし、該合成ヌクレオチド配列が、該合成ヌクレオチド配列と該親核酸配列との間で異なる配列でのコドンの無作為選択から得られる調節配列の平均数よりも少ない数の調節配列を有する、単離核酸分子。
【請求項２６】
前記調節配列が、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）部位、プロモーターモジュールおよび／またはプロモーター配列を含む、請求項２５に記載の単離核酸分子。
【請求項２７】
前記異なるコドンの大部分が、所望の宿主細胞の好ましいコドンであるものおよび／または該宿主細胞における低使用コドンではないものである、請求項２５に記載の単離核酸分子。
【請求項２８】
前記合成核酸分子中の異なるコドンの大部分が、哺乳類においてより高頻度で用いられるものである、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項２９】
前記合成核酸分子中の異なるコドンの大部分が、ヒトにおいて好ましいコドンである、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項３０】
前記異なるコドンの大部分が、コドンＣＧＣ、ＣＴＧ、ＡＧＣ、ＡＣＣ、ＣＣＣ、ＧＣＣ、ＧＧＣ、ＧＴＧ、ＡＴＣ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＴＡＣ、ＴＧＣおよびＴＴＣである、請求項２７に記載の単離核酸分子。
【請求項３１】
前記合成ヌクレオチド配列が、配列番号２１、配列番号２２または配列番号２３中のオープンリーディングフレーム中の配列を含むか、またはそれに対して少なくとも９０％のヌクレオチド配列同一性を有する、請求項２５に記載の単離核酸分子。
【請求項３２】
前記合成核酸分子が哺乳類宿主細胞において、前記親核酸配列のものよりも高いレベルで発現される、請求項２５に記載の単離核酸分子。
【請求項３３】
前記合成核酸分子が、増加した数のＡＧＣセリンをコードするコドン、増加した数のＣＣＣプロリンをコードするコドン、増加した数のＡＴＣイソロイシンをコードするコドンおよび／または増加した数のＡＣＣトレオニンをコードするコドンを有する、請求項２５に記載の単離核酸分子。
【請求項３４】
前記合成ヌクレオチド配列が、少なくとも１０％少ない転写調節配列を有する、請求項２５に記載の単離核酸分子。
【請求項３５】
前記異なる合成ヌクレオチド配列中のコドンが、前記親核酸配列中の対応するコドンと同一のアミノ酸をコードする、請求項２５に記載の単離核酸分子。
【請求項３６】
前記核酸分子が、前記ルシフェラーゼと、１種以上のその他のペプチドまたはポリペプチドとの融合物をコードし、少なくとも該ルシフェラーゼが、該合成核酸配列によってコードされる、請求項２５に記載の単離核酸分子。
【請求項３７】
１種以上のその他のペプチドが、タンパク質不安定化配列を有するペプチドである、請求項３６に記載の単離核酸分子。
【請求項３８】
請求項２５に記載の核酸分子を含むプラスミド。
【請求項３９】
多重クローニング領域をさらに含む、請求項３８に記載のプラスミド。
【請求項４０】
前記合成ヌクレオチド配列と作動可能に連結されたプロモーターをさらに含む、請求項３８に記載のプラスミド。
【請求項４１】
請求項１に記載の核酸分子の合成ヌクレオチド配列をさらに含む、請求項３８に記載のプラスミド。
【請求項４２】
細胞において機能的なプロモーターと連結している請求項２５に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４３】
前記プロモーターが真核細胞において機能的である、請求項４２に記載の発現ベクター。
【請求項４４】
前記発現ベクターが多重クローニング部位をさらに含む、請求項４２に記載の発現ベクター。
【請求項４５】
前記プロモーターが哺乳類細胞において機能的である、請求項４２に記載の発現ベクター。
【請求項４６】
前記合成ヌクレオチド配列が、コザックコンセンサス配列と作動可能に連結されている、請求項４２に記載の発現ベクター。
【請求項４７】
配列番号７４を含むヌクレオチド配列または配列番号７４に対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を含むヌクレオチド配列を含むプラスミドであって、ヌクレオチド配列が配列番号４１に対して９０％未満の核酸配列同一性を有するオープンリーディングフレームを含み、宿主細胞における該オープンリーディングフレームの発現がアンピシリンに対する耐性を付与するプラスミド。
【請求項４８】
請求項４２に記載の発現カセットを含む宿主細胞。
【請求項４９】
請求項１７、３８または４７に記載のプラスミドを含む宿主細胞。
【請求項５０】
請求項１７、３８または４７に記載のプラスミドを含む、適切な収容手段に入っているキット。
【請求項５１】
ポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドの相補体であって、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号４、配列番号５、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号３０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３とハイブリダイズし、選択可能なポリペプチドまたはホタルルシフェラーゼをコードする、ポリヌクレオチド、または該ポリヌクレオチドの相補体。
【請求項５２】
配列番号１も、配列番号６も、配列番号１５も、配列番号４１も、配列番号１４も、配列番号４３も有さない、請求項５１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５３】
望ましいペプチドもポリペプチドもコードしないが、転写および／または翻訳を阻害する配列を含む合成ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、該合成ヌクレオチド配列が、望ましいペプチドもポリペプチドもコードしない対応する親核酸配列に対して異なる配列を有する少なくとも２０ヌクレオチドを有し、該合成ヌクレオチド配列が、該親核酸配列に対して、９０％以下の核酸配列同一性を有し、該配列の相違が、該親核酸配列よりも少ない数の該合成ヌクレオチド配列中の１以上の調節配列の結果である、単離核酸分子。
【請求項５４】
前記合成ヌクレオチド配列が配列番号４９を有する、請求項５３に記載の単離核酸分子。
【請求項５５】
多重クローニング領域および／またはポリ（Ａ）部位をさらに含む、請求項５３に記載の単離核酸分子。
【請求項５６】
前記転写を阻害する配列が、１以上のポリ（Ａ）部位を含む、請求項５３に記載の単離核酸分子。
【請求項５７】
前記翻訳を阻害する配列が、１以上のリーディングフレーム中に１以上の停止コドンを含む、請求項５３に記載の単離核酸分子。
【請求項５８】
前記親核酸配列が多重クローニング領域を含む、請求項５３に記載の単離核酸分子。
【請求項５９】
前記親核酸配列が、転写および／または翻訳を阻害する配列を含む、請求項５３に記載の単離核酸分子。
【請求項６０】
前記親核酸配列が配列番号７６を有する、請求項５３に記載の単離核酸分子。
【請求項６１】
前記合成ヌクレオチド配列が、前記親核酸配列よりも、少ない数の１以上の制限エンドヌクレアーゼ認識部位を有する、請求項５３に記載の単離核酸分子。
【請求項６２】
請求項５３に記載の核酸分子を含むプラスミド。
【請求項６３】
プラスミドであって、配列番号８９、配列番号９０を含む配列、もしくはそれと少なくとも９０％の核酸配列同一性を有する配列、またはその相補体を含み、該配列は、少なくとも１種の選択可能なポリペプチドおよび／またはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする、プラスミド。
【請求項６４】
多重クローニング領域をさらに含む、請求項６３に記載のプラスミド。
【請求項６５】
別の選択可能なポリペプチドまたはスクリーニング可能なポリペプチドをさらに含む、請求項６３に記載のプラスミド。
【請求項６６】
前記少なくとも１種の選択可能なポリペプチドまたはスクリーニング可能なポリペプチドが、１以上のタンパク質不安定化配列を含む、請求項６３または６５に記載のプラスミド。
【請求項６７】
前記少なくとも１種の選択可能なポリペプチドおよび／またはスクリーニング可能なポリペプチドの配列が配列番号４１ではない、請求項６３に記載のプラスミド。
【請求項６８】
アンピシリン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンまたはネオマイシンに対する耐性を付与する選択可能なポリペプチドのコード領域を有する少なくとも１００ヌクレオチドの合成ヌクレオチド配列であって、該選択可能なポリペプチドの親核酸配列の対応する領域に対して９０％以下の核酸配列同一性を有し、該配列の同一性の低下が、該親核酸配列中の対応する領域中のコドンに対する、該合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンの結果であり、該合成ヌクレオチド配列は、該合成ヌクレオチド配列と該親核酸配列との間で異なる配列でのコドンの無作為選択から得られる調節配列の平均数よりも少ない数の調節配列を有する、合成ヌクレオチド配列。
【請求項６９】
選択可能なポリペプチドをコードし、該選択可能なポリペプチドのコード領域を有する少なくとも１００ヌクレオチドの合成ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、該合成ヌクレオチド配列が、該選択可能なポリペプチドの親核酸配列中の対応する領域に対して９０％以下の核酸配列同一性を有し、該配列の同一性の低下が、該親核酸配列中のコドンに対する、該合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンの結果であり、該合成ヌクレオチド配列が、該親核酸配列によってコードされる選択可能なポリペプチドの対応する領域に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する選択可能なポリペプチドの領域をコードし、該合成ヌクレオチド配列が、該合成ヌクレオチド配列と該親核酸配列との間で異なる配列でのコドンの無作為選択から得られる調節配列の平均数よりも少ない数の調節配列を有し、該単離核酸分子が、細胞において発現されると、アンピシリン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンまたはネオマイシンに対する耐性を付与する、単離核酸分子。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
（背景）
転写、ＤＮＡの配列からのＲＮＡ分子の合成は、遺伝子発現の最初のステップである。ＤＮＡ転写を調節する配列としては、プロモーター配列、ポリアデニル化シグナル、転写因子結合部位およびエンハンサーエレメントが挙げられる。プロモーターは、転写を特異的に開始できるＤＮＡ配列であり、３つの一般領域からなる。コアプロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼおよびその補助因子がＤＮＡと結合する配列である。コアプロモーターのすぐ上流は、次にポリメラーゼ複合体を補充する活性化複合体の組み立てを担ういくつかの転写因子結合部位を含む近位プロモーターである。近位プロモーターのさらに上流に位置する遠位プロモーターもまた、転写因子結合部位を含む。転写終結およびポリアデニル化は、転写開始同様、部位特異的であり、規定の配列によってコードされる。エンハンサーは複数の転写因子結合部位を含む調節領域であり、エンハンサーおよびプロモーターが同一ＤＮＡ分子内に位置する限り、プロモーターに対するエンハンサーの配向および距離にかかわらず、応答性プロモーターからの転写レベルを有意に高めることができる。遺伝子から産生される転写物の量は、転写後機構によって調節される場合もあり、最も重要なものは、スプライスドナー配列とスプライスアクセプター配列との間で一次転写物から介在配列（イントロン）を除去するＲＮＡスプライシングである。
【０００２】
自然選択とは、表現型レベルで生じる遺伝子型−環境相互作用が、個体の繁殖成功の差、ひいては、集団の遺伝子プールの改変をもたらすという仮説である。自然選択によって影響を受ける核酸分子のいくつかの特性として、コドン使用頻度、ＲＮＡ二次構造、イントロンスプライシングの効率および転写因子またはその他の核酸結合タンパク質との相互作用が挙げられる。これらの特性は、遺伝コードの縮重性のために、対応するアミノ酸配列を変更することなく自然選択によって最適化され得る。
【０００３】
ある条件下では、ポリペプチドをコードする天然ヌクレオチド配列を、代替適用にポリペプチドをより適合させるよう合成によって変更することが有用である。一般的な一例として、外来宿主細胞において発現される場合に、遺伝子のコドン使用頻度を変更することがある。遺伝コードの重複性によりアミノ酸が複数のコドンによってコードされることが可能であるが、種々の生物は、いくつかのコドンを他のものよりも好む。同一の遺伝子産物を維持しながらコドン使用頻度を調整することによって、非天然宿主細胞におけるタンパク質翻訳の効率を実質的に増大できることがわかっている（特許文献１、特許文献２および特許文献３）。
【０００４】
しかし、コドン使用を変更することは、次に、不適切な転写調節配列の合成核酸分子への意図しない導入をもたらし得る。これは転写に悪影響を及ぼし、その結果、合成ＤＮＡの異常な発現をもたらし得る。異常な発現とは、正常なレベルまたは期待されるレベルの発現からの逸脱と定義される。例えば、プロモーターから下流に位置する転写因子結合部位は、プロモーター活性をもたらすことが実証されている（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。さらに、プロモーター配列の不在下でエンハンサーエレメントが活性を発揮し、その結果、ＤＮＡ転写レベルが上昇すること、または、プロモーター配列の不在下で転写調節配列の存在が遺伝子発現の基礎レベルを高めることは珍しくない。
【０００５】
したがって、必要とされるのは、特定の宿主細胞における発現のために、コドン使用が変更された合成核酸分子を、不適切または意図しない転写調節配列を導入することもなく作製する方法である。
【特許文献１】米国特許第５，０９６，８２５号明細書
【特許文献２】米国特許第５，６７０，３５６号明細書
【特許文献３】米国特許第５，８７４，３０４号明細書
【非特許文献１】Ｍｉｃｈａｅｌら、ＥＭＢＯ．Ｊ．，（１９９０）９，４８１
【非特許文献２】Ｌａｍｂら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．，（１９９８）５１，２１８
【非特許文献３】Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖｅｌ．，（１９９８）５０，３７７
【非特許文献４】Ｊｏｎｅｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９７）１７，６９７０
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、親核酸配列、例えば、野生型核酸配列に対して低下した、例えば、９０％以下、例えば８０％、７８％、７５％または７０％以下の核酸配列同一性を有し、より少ない調節配列、例えば、転写調節配列を有する合成ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子（ポリヌクレオチド）を提供する。一実施形態では、合成ヌクレオチド配列は、合成ヌクレオチド配列と親核酸配列との間の配列の相違、例えば、場合によって、異なっているコドンの結果が無作為に選択された場合に得られるものよりも少ない調節配列を有する。一実施形態では、合成ヌクレオチド配列は、天然に存在する（天然または野生型）対応するポリペプチド（タンパク質）のアミノ酸配列と少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％または１００％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする。したがって、ある具体的なアミノ酸変更が合成ヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドの特定の表現型の特徴を変更することが望ましいことであり得ると認識される。アミノ酸配列同一性は少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基にわたってであることが好ましい。本発明の一実施形態では、合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンは、親核酸配列中の対応するコドンと同一のアミノ酸をコードすることが好ましい。
【０００７】
したがって、一実施形態では、本発明は、選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドのコード領域を有する合成ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子であって、合成ヌクレオチド配列が、対応する選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする親核酸配列に対して、９０％、例えば８０％以下の核酸配列同一性を有し、合成ヌクレオチド配列が、親核酸配列によってコードされる対応する選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドに対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有する選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドをコードすることを特徴とする、単離核酸分子を提供する。低下したヌクレオチド配列同一性は、親核酸配列中のコドンに対する、合成ヌクレオチド配列中の異なるコドンの結果であり得る。本発明の合成ヌクレオチド配列は、親核酸配列に対して、例えば、合成ヌクレオチド配列と親核酸配列との間で異なる配列でのコドンまたはヌクレオチドの無作為選択から得られる調節配列の平均数に対して、減少した数の調節配列を有する。一実施形態では、核酸分子は、選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドを他の配列とともにコードする合成ヌクレオチド配列を含み得る。例えば、選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドのオープンリーディングフレームの一部を形成する合成ヌクレオチド配列は、オープンリーディングの少なくとも１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個またはそれより多いヌクレオチドを含み得、ヌクレオチドは親核酸配列中の対応する配列に対して低下した核酸配列同一性を有する。一実施形態では、親核酸配列は、配列番号１、配列番号６、配列番号１５もしくは配列番号４１、その相補体またはそれに対して９０％、９５％もしくは９９％の核酸配列同一性を有する配列である。
【０００８】
一実施形態では、本発明の核酸分子は、哺乳類細胞における、より好ましくは、ヒト細胞における発現のために最適化されている配列を含む（例えば、目的の細胞における発現のために配列を最適化する方法を開示するＷＯ０２／１６９４４を参照のこと）。例えば、コザック配列および／もしくは１以上のイントロンを導入することまたはその他の調節配列の数を減少させること、並びに／またはコドン使用を、１種以上の真核生物においてより頻繁に用いられるコドン、例えば、核酸分子を用いて形質転換される真核宿主細胞においてより頻繁に用いられるコドンに変更することによって、核酸分子を真核細胞における発現のために最適化することができる。
【０００９】
一実施形態では、合成ヌクレオチド配列は、ベクター、例えば、プラスミド中に存在し、このようなベクターは、その他の最適化された配列を含み得る。一実施形態では、合成ヌクレオチド配列は、選択可能なポリペプチドを含むポリペプチドをコードし、合成ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号５、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号３０、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４２、配列番号４４、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、その相補体、または対応する全長および場合により、野生型（機能的）ポリペプチド、例えば、配列番号１、配列番号６、配列番号１５もしくは配列番号４１によってコードされるポリペプチドと実質的に同様の活性を有するポリペプチドをコードするその断片、またはその他の親もしくは野生型配列とともに、対応する全長および場合により野生型ポリペプチドと実質的に同様の活性を有するポリペプチドをコードするその一部を含む配列中のオープンリーディングフレームに対して、少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する。本明細書において、「実質的に同様の活性」とは、対応する全長および場合により野生型（機能的）ポリペプチドの少なくとも約７０％、例えば、８０％、９０％以上の活性である。一実施形態では、単離核酸分子は、選択可能なポリペプチドを含む融合ポリペプチドをコードする。
【００１０】
ホタルルシフェラーゼのコード領域を有する合成ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子も提供し、合成核酸分子の核酸配列同一性は、ホタルルシフェラーゼをコードする親核酸配列、例えば、配列番号１４または配列番号４３を有する親核酸配列と比較して、９０％以下、例えば、８０％、７８％、７５％以下であり、合成ヌクレオチド配列は、配列の相違、例えば、異なるコドンが無作為に選択された場合に得られるものよりも少ない調節配列、例えば、転写調節配列を有する。合成ヌクレオチド配列は、天然に存在するポリペプチドまたは親ポリペプチドのアミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることが好ましい。したがって、ある具体的なアミノ酸変更が合成ヌクレオチド配列によってコードされるルシフェラーゼの特定の表現型の特徴を変更することが望ましいことであり得ると認識される。アミノ酸配列同一性は少なくとも１００個の連続するアミノ酸残基にわたってであることが好ましい。一実施形態では、合成ヌクレオチド配列は、ホタルルシフェラーゼを含むポリペプチドをコードし、合成ヌクレオチド配列は、例えば、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、その相補体、または対応する全長および場合により野生型（機能的）ポリペプチド、例えば、配列番号１４もしくは配列番号４３によってコードされるポリペプチドと実質的に同様の活性を有するポリペプチドをコードするその断片、またはその他の配列とともにホタルルシフェラーゼをコードするその一部を含む配列中のオープンリーディングフレームに対して、少なくとも９０％以上の核酸配列同一性を有する。例えば、ホタルルシフェラーゼのオープンリーディングフレームの一部を形成する合成ヌクレオチド配列は、オープンリーディングの少なくとも１００個、１５０個、２００個、２５０個、３００個またはそれより多いヌクレオチドを含み得、ヌクレオチドは親核酸配列中の対応する配列に対して低下した核酸配列同一性を有する。
【００１１】
他の実施形態では、本発明は、目的のペプチドまたはポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含まない合成ヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する。例えば、合成ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームを有し得るが、機能的もしくは望ましいペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を含まず、しかし、１以上のリーディングフレーム中の１以上の停止コドン、１以上のポリ（Ａ）アデニル化部位および／または２種以上の制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）のための連続する配列、すなわち、多重クローニング領域（多重クローニング部位、「ＭＣＳ」とも呼ばれる）を含み得、一般に、少なくとも２０個、例えば、少なくとも３０個の長さのヌクレオチドおよび最大１０００個以上のヌクレオチド、例えば、最大１０，０００個のヌクレオチドであり、合成ヌクレオチド配列は、対応する親核酸配列に対してより少ない調節配列、例えば、転写調節配列を有する。一実施形態では、ペプチドまたはポリペプチドをコードしない合成ヌクレオチド配列は、親核酸配列に対して９０％以下、例えば、８０％以下の核酸配列同一性を有し、配列同一性の低下は、親核酸配列に対して、減少した数の合成ヌクレオチド配列中の調節配列の結果である。
【００１２】
合成ヌクレオチド配列において減少される調節配列としては、限定されないが、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）アデニル化部位（以下、ポリ（Ａ）配列またはポリ（Ａ）部位）、エンハンサー配列、プロモーターモジュールおよび／またはプロモーター配列、例えば、原核生物のプロモーター配列のいずれかの組合せが挙げられる。概して、合成核酸分子は、対応する親または野生型ヌクレオチド配列中に存在する、調節配列の少なくとも１０％、２０％、５０％以上を欠き、例えば、調節配列の実質的にすべて、例えば８０％、９０％以上、例えば、調節配列の９５％以上を欠く。調節配列、例えば、転写調節配列は、当技術分野では周知である。合成ヌクレオチド配列はまた、減少した数の制限酵素認識部位も有する場合もあり、選択した配列、例えば、合成ヌクレオチド配列の５’および／もしくは３’末端もしくはその付近の、コザック配列などの配列ならびに／または、例えば、目的の核酸配列の５’および／もしくは３’の多重クローニング領域に、望ましい制限酵素認識部位、例えば、合成ヌクレオチド配列を指定の位置に導入するために有用な制限酵素認識部位を含むよう改変することができる。
【００１３】
一実施形態では、本発明の合成ヌクレオチド配列は、親または野生型核酸配列のものとは異なるコドン組成を有する。本発明において用いる好ましいコドンは、特定の生物において同一アミノ酸に対する少なくとも１種のその他のコドンよりも高頻度で用いられるものおよび／またはその生物において低使用コドンではないものおよび／または合成ヌクレオチド配列の発現のためにクローニングもしくはスクリーニングするために用いられる生物（例えば、大腸菌）において低使用コドンではないものである。さらに、特定のアミノ酸に対するコドン（すなわち、３種以上のコドンを有するアミノ酸）は、その他の（好ましくない）コドンよりもより高頻度で用いられる２種以上のコドンを含み得る。ある生物において別の生物におけるよりも高頻度で用いられるコドンが合成ヌクレオチド配列中に存在することで、それらのコドンをより高頻度で用いる生物の細胞に導入された場合に、異常な発現の危険性が低下した合成ヌクレオチド配列および／またはある条件下では、それらの細胞における野生型（改変されていない）核酸配列の発現よりも高いものであり得るレベルでそれらの細胞において発現される合成ヌクレオチド配列がもたらされる。例えば、選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする本発明の合成核酸分子は、同一条件下（例えば、細胞培養条件、ベクター骨格など）で細胞または細胞抽出物において、親または野生型（改変されていない）核酸配列のものに対して、例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０倍以上高いレベルで発現され得る。一実施形態では、本発明の合成ヌクレオチド配列は、１０％より多く、２０％以上、例えば、３０％、３５％、４０％または４５％より多く、例えば、５０％、５５％、６０％以上のコドンで、親または野生型核酸配列のものとは異なるコドン組成を有する。
【００１４】
本発明の一実施形態では、異なるコドンは哺乳類においてより高頻度で用いられるものであり、別の実施形態では、異なるコドンは、植物においてより高頻度で用いられるものである。個々の種類の哺乳類、例えば、ヒトは、別の種類の哺乳類とは異なるセットの好ましいコドンを有し得る。同様に、個々の種類の植物は、別の種類の植物とは異なるセットの好ましいコドンを有し得る。本発明の一実施形態では、異なるコドンの大部分は、所望の宿主細胞において好ましいコドンであり、かつ／または特定の宿主細胞において低使用コドンではないものである。哺乳類（例えば、ヒト）および植物の好ましいコドンは、当技術分野では公知である（例えば、Ｗａｄａら、１９９０）。例えば、好ましいヒトコドンとしては、限定されないが、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＣＴＧ（Ｌｅｕ）、ＡＧＣ（Ｓｅｒ）、ＡＣＣ（Ｔｈｒ）、ＣＣＣ（Ｐｒｏ）、ＧＣＣ（Ａｌａ）、ＧＧＣ（Ｇｌｙ）、ＧＴＧ（Ｖａｌ）、ＡＣＴ（Ｉｌｅ）、ＡＡＧ（Ｌｙｓ）、ＡＡＣ（Ａｓｎ）、ＣＡＧ（Ｇｌｎ）、ＣＡＣ（Ｈｉｓ）、ＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＧＡＣ（Ａｓｐ）、ＴＡＣ（Ｔｙｒ）、ＴＧＣ（Ｃｙｓ）およびＴＴＣ（Ｐｈｅ）が挙げられる（Ｗａｄａら、１９９０）。したがって、本発明の合成ヌクレオチド配列は、増加した数の好ましいヒトコドン、例えば、ＣＧＣ、ＣＴＧ、ＴＣＴ、ＡＧＣ、ＡＣＣ、ＣＣＣ、ＧＣＣ、ＧＧＣ、ＧＴＧ、ＡＣＴ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＴＡＣ、ＴＧＣ、ＴＴＣまたはそれらのいずれかの組合せを有することによって野生型核酸配列とは異なるコドン組成を有する。例えば、本発明の合成ヌクレオチド配列は、親または野生型核酸配列に対して増加した数のＡＧＣセリンをコードするコドン、ＣＣＣプロリンをコードするコドンおよび／またはＡＣＣトレオニンをコードするコドンまたはそれらのいずれかの組合せを有し得る。同様に、植物においてより高頻度で用いられる増加した数のコドンを有する合成ヌクレオチド配列は、限定されないが、ＣＧＣ（Ａｒｇ）、ＣＴＴ（Ｌｅｕ）、ＴＣＴ（Ｓｅｒ）、ＴＣＣ（Ｓｅｒ）、ＡＣＣ（Ｔｈｒ）、ＣＣＡ（Ｐｒｏ）、ＣＣＴ（Ｐｒｏ）、ＧＣＴ（Ｓｅｒ）、ＧＧＡ（Ｇｌｙ）、ＧＴＧ（Ｖａｌ）、ＡＴＣ（Ｉｌｅ）、ＡＴＴ（Ｉｌｅ）、ＡＡＧ（Ｌｙｓ）、ＡＡＣ（Ａｓｎ）、ＣＡＡ（Ｇｌｎ）、ＣＡＣ（Ｈｉｓ）、ＧＡＧ（Ｇｌｕ）、ＧＡＣ（Ａｓｐ）、ＴＡＣ（Ｔｙｒ）、ＴＧＣ（Ｃｙｓ）、ＴＴＣ（Ｐｈｅ）またはそのいずれかの組合せを含む増加した数の植物コドンを有することによって野生型核酸配列とは異なるコドン組成を有する（Ｍｕｒｒａｙら、１９８９）。好ましいコドンは、異なる種類の植物について異なり得る（Ｗａｄａら、１９９０）。
【００１５】
合成核酸配列中のヌクレオチド置換は、多数の因子、例えば、増加した数のヌクレオチド置換、例えば、サイレントヌクレオチド置換（同一のアミノ酸をコードする）をもたらすものおよび／または減少した数の調節配列を有することを望むことによって影響を受け得る。ある（例えば、転写因子結合部位の除去を可能にする）環境下では、好ましくないコドンを、好ましいコドン以外のコドンまたは調節配列の数を減少させるのに好ましいコドン以外のコドンで置換することが望ましい場合がある。
【００１６】
本発明はまた、発現カセットまたはベクターを提供する。本発明の発現カセットまたはベクターは、それぞれ、細胞において機能的であるプロモーターと作動可能に連結された本発明の合成ヌクレオチド配列を含むか、または合成ヌクレオチド配列を含む。好ましいプロモーターは、哺乳類細胞において機能的であるものおよび植物細胞において機能的であるものである。場合によって、発現カセットは、その他の配列、例えば、選択可能なポリペプチドまたはルシフェラーゼのオープンリーディングフレームおよび／またはコザック配列の５’および／または３’に１以上の制限酵素認識配列を含んでよく、その他の配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、その他のオープンリーディングフレームおよび／またはポリ（Ａ）部位のための多重クローニング領域を含み得る大きなポリヌクレオチド分子、例えば、プラスミド、コスミド、人工染色体またはベクター、例えば、ウイルスベクターの一部であってよい。一実施形態では、本発明のベクターは、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、その相補体、またはそれらに対して少なくとも８０％の核酸配列同一性を有し、選択可能なおよび／またはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする配列を含む。
【００１７】
一実施形態では、ベクター骨格、例えば、合成ヌクレオチド配列の３’のポリ（Ａ）部位、場合により合成配列である形質転換された原核細胞を選択するのに有用な遺伝子、場合により合成配列である形質転換された真核細胞を選択するのに有用な遺伝子、隣接して連結している望ましいオープンリーディングフレームへの転写および／もしくは翻訳を減少させるための非コード領域、ならびに／または場合により１以上のタンパク質不安定化配列を含む選択可能なもしくはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列の５’および／もしくは３’の多重クローニング領域を場合により有するものに、選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列を導入する（２００３年９月１６日に出願された米国出願番号第１０／６６４，３４１号参照のこと、なお、その開示内容は参照により本明細書に組み込まれる）。一実施形態では、選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列を有するベクターは、合成配列と作動可能に連結しているプロモーターおよび／またはエンハンサーを欠いている場合もある。他の実施形態において、本発明は、選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列と作動可能に連結しているプロモーター、例えば、原核生物のプロモーターまたは真核生物のプロモーターを含むベクターを提供する。このようなベクターは、１以上の多重クローニング領域、例えば、さらなるオープンリーディングフレームを導入するのに有用であるもの、および／またはオープンリーディングフレームの発現のためのプロモーターであって選択可能なもしくはスクリーニング可能なポリペプチドのためのプロモーターとは場合により異なるプロモーター、ならびに／または原核生物の複製起点を場合により含んでいてもよい。本明細書において「ベクター骨格」は、例えば、原核細胞においてそれらの配列を含む細胞を同定するのに有用な配列（オープンリーディングフレーム）と、例えば、原核細胞におけるベクター維持のためのそれらのプロモーター、複製起点と、場合により、例えば、プロモーターおよび／または目的のオープンリーディングフレームの挿入のための多重クローニング領域、ならびに転写および／または翻訳を阻害する配列を含めた１以上のその他の配列とを含み得る。
【００１８】
本発明の合成ヌクレオチド配列を含む宿主細胞、単離ポリペプチド（例えば、本発明の合成ヌクレオチド配列によってコードされる融合ポリペプチド）および組成物ならびに、適した収容手段中に、本発明の合成ヌクレオチド配列、それによってコードされるポリペプチド、または合成ヌクレオチド配列を含む発現カセットもしくはベクター、場合により指示手段を含むキットも提供する。宿主細胞は、植物または脊椎動物細胞、例えば、哺乳類細胞、例えば、限定されないが、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジもしくは齧歯類（例えば、ウサギ、ラット、フェレット、ハムスターもしくはマウス）細胞などの真核細胞あるいは原核細胞であり得る。
【００１９】
本発明はまた、親、例えば、野生型の、または合成の核酸配列を遺伝子操作することによって、本発明の合成ヌクレオチド配列を調製する方法を提供する。本方法は、親核酸配列、例えば、選択可能なもしくはスクリーニング可能なポリペプチドをコードするものまたはペプチドもしくはポリペプチドをコードしないものにおいて複数の調節配列を変更して（例えば、減少させるか、排除する）、減少した数の調節配列を有する合成ヌクレオチド配列を得ることを含み、合成ヌクレオチド配列がポリペプチドをコードする場合には、親核酸分子と同一のアミノ酸をコードすることが好ましい。減少される転写調節配列としては、限定されないが、いずれかの転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）部位、エンハンサー配列、プロモーターモジュールおよび／またはプロモーター配列が挙げられる。合成ヌクレオチド配列中の配列の変更は、調節配列の増加をもたらさないことが好ましい。一実施形態では、合成ヌクレオチド配列は、親核酸配列によってコードされるポリペプチドのアミノ酸に対して、少なくとも８５％、９０％、９５％または９９％または１００％の連続アミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。
【００２０】
したがって、一実施形態では、オープンリーディングフレームを含む合成核酸分子を調製する方法を提供する。この方法は、レポータータンパク質、例えば、ホタルルシフェラーゼまたは選択可能なポリペプチドをコードする親核酸配列、例えば、アンピシリン、ピューロマイシン、ハイグロマイシンもしくはネオマイシンに対する耐性をコードするものにおいてコドンおよび／または調節配列を変更して、対応するレポーターポリペプチドをコードし、親核酸配列に対して、例えば、少なくとも１０％以上、例えば、２０％、３０％、４０％、５０％以上少ない調節配列を有する合成ヌクレオチド配列を得ることを含む。合成ヌクレオチド配列は、親核酸配列に対して９０％、例えば、８５％、８０％または７８％以下の核酸配列同一性を有し、親核酸配列によってコードされるポリペプチドに対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドをコードする。変更される調節配列としては、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）部位、プロモーターモジュールおよび／またはプロモーター配列が挙げられる。一実施形態では、合成核酸配列は、中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション下で親核酸配列またはその相補体とハイブリダイズするが、ストリンジェント条件下ではハイズリダイズしない。一実施形態では、異なるコドンは、親核酸配列中の対応するコドンと同一のアミノ酸をコードする。
【００２１】
本発明の方法によって調製された合成（さらなる合成を含む）ヌクレオチド配列、例えば、導入された調節配列または制限エンドヌクレアーゼ認識配列が場合により除去された、さらなる合成ヌクレオチド配列も提供する。したがって、本発明の方法は、いずれかのオープンリーディングフレームにおいてコドン使用頻度を変更し、かつ／もしくは調節配列の数を減少させるために、またはいずれかの核酸配列、例えば、非コード配列において調節配列の数を減少させるために使用できる。選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする合成ヌクレオチド配列におけるコドン使用頻度は、可能性ある調節配列の数も親核酸分子に対して減少させながら、そのヌクレオチド配列の発現が望まれる宿主生物のものを反映するよう変更されることが好ましい。
【００２２】
ペプチドまたはポリペプチドをコードしない合成核酸分子を調製する方法も提供する。この方法は、少なくとも２０個のヌクレオチドを有する親核酸配列中のヌクレオチドであって、機能的または望ましいペプチドまたはポリペプチドを場合によってはコードしない、そして転写および／または翻訳を阻害する配列を場合によっては含むヌクレオチドを変更して、目的のペプチドまたはポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含まない合成ヌクレオチド配列を得ることを含み、例えば、合成ヌクレオチド配列は、オープンリーディングフレームを有し得るが、機能的または望ましいペプチドまたはポリペプチドをコードする配列を含まず、しかし、１以上のリーディングフレーム中の１以上の停止コドン、１以上のポリ（Ａ）アデニル化部位および／または２種以上の制限エンドヌクレアーゼのための連続する配列、すなわち、多重クローニング領域を含み得る。合成ヌクレオチド配列は、一般に、少なくとも２０個、例えば、少なくとも３０個の長さのヌクレオチドおよび最大１０００個以上のヌクレオチド、例えば、最大１０，０００個のヌクレオチドであり、ペプチドまたはポリペプチドをコードしない対応する親核酸配列、例えば、転写および／または翻訳を阻害する配列を場合により含む親核酸配列に対して、より少ない調節配列、例えば、転写調節配列を有する。ヌクレオチドは、親核酸配列中の１以上の調節配列、例えば、転写因子結合配列、イントロンスプライス部位、ポリ（Ａ）部位、エンハンサー配列、プロモーターモジュールおよび／またはプロモーター配列を減少するよう変更する。
【００２３】
本発明はまた、発現ベクターを調製する方法を提供する。この方法は、多重クローニング領域によって５’および／または３’末端で隣接されている選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする、本発明の合成ヌクレオチド配列を含むヌクレイック（ｎｕｃｌｅｉｃ）分子を有する線状化プラスミドを提供することを含む。プラスミドは、多重クローニング領域において切断する少なくとも１種の制限エンドヌクレアーゼとプラスミドを接触させることによって線状化する。線状化したプラスミドおよび線状化したプラスミドの末端と適合する末端を有する発現カセットをアニーリングすると、発現ベクターが得られる。一実施形態では、少なくとも２種の、その一方のみが多重クローニング領域において切断する制限エンドヌクレアーゼによって切断することによってプラスミドを線状化する。
【００２４】
プロモーターまたはオープンリーディングフレームをクローニングする方法も提供する。この方法は、多重クローニング領域および選択可能なもしくはスクリーニング可能なポリペプチドをコードする本発明の合成配列ならびに／またはペプチドもしくポリペプチドをコードしない本発明の合成配列を有する線状化したプラスミドであって、その少なくとも一方が多重クローニング領域において切断する少なくとも２種の制限エンドヌクレアーゼにプラスミドを接触させることによって線状化されたプラスミドを提供することと、線状化したプラスミドを、線状化したプラスミドの末端と適合する末端を有する、プロモーターまたはオープンリーディングフレームを含むＤＮＡとアニーリングすることとを含むことを含む。
【００２５】
ベクター骨格中に存在するホタルルシフェラーゼおよびいくつかの選択可能なポリペプチド核酸配列、ならびに非コード領域の合成配列を調製するための例示的方法を以下に説明する。例えば、これらの方法は、その他の望ましい物理的または生化学的特性に負の影響を及ぼさずに、同様のまたは大幅に上昇したレベルの哺乳類発現を示し、また、調節エレメントを大幅に欠く、選択可能な合成ポリペプチド核酸分子を製造することができる。
【００２６】
本発明が多数の遺伝子を用いる適用ならびに、限定されないが、生命科学研究、農業遺伝学、遺伝子治療、発生科学および薬剤開発を含めて多数の科学分野にわたる適用を有することは明確である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
（発明の詳細な説明）
（定義）
本明細書において、用語「核酸分子」または「核酸配列」とは、非コード配列またはコード配列を含む、核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡを指す。コード配列は、ポリペプチドまたはタンパク質前駆体の生成に必要である。ポリペプチドは、所望のタンパク質活性が保持される限りは、全長コード配列によってコードされてもよいし、コード配列のいずれかの部分によってコードされてもよい。非コード配列とは、ポリペプチドまたはタンパク質前駆体をコードせず、調節エレメント、例えば、転写因子結合部位、ポリ（Ａ）部位、制限エンドヌクレアーゼ部位、停止コドンおよび／またはプロモーター配列を含み得る核酸を指す。
【００２８】
「合成の」核酸配列とは、天然には見られないものである。すなわち、分子生物学的技術、化学的技術および／または情報科学技術を用いて導かれる。
【００２９】
本明細書において「核酸」とは、ヌクレオチドの共有結合している配列であり、これでは、あるヌクレオチドのペントースの３’位が、次のペントースの５’位とホスホジエステル基によって連結しており、ヌクレオチド残基（塩基）は特定の配列、すなわち、線形順序のヌクレオチドに結合している。本明細書において「ポリヌクレオチド」とは、約１００個のヌクレオチド長よりも大きい配列を含む核酸である。本明細書において「オリゴヌクレオチド」または「プライマー」とは、短いポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部である。一般に、オリゴヌクレオチドは約２〜約１００個の塩基の配列を含む。語句「オリゴ」が、語句「オリゴヌクレオチド」の代わりに用いられることもある。
【００３０】
核酸分子は「５’末端」（５’端）および「３’末端（３’端）」を有するといわれるが、これは、核酸ホスホジエステル結合が、５’炭素と、置換モノヌクレオチドのペントース環の３’炭素とで生じるためである。新しい結合が５’炭素に対するものとなるポリヌクレオチドの末端が、その５末端ヌクレオチドである。新しい結合が３’炭素に対するものとなるポリヌクレオチドの末端が、その３末端ヌクレオチドである。本明細書において、末端クレオチドとは、３’または５’末端の末端位置にあるヌクレオチドである。
【００３１】
ＤＮＡ分子は「５’末端」および「３’末端」を有するといわれるが、これは、あるモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸が、その隣のものの３’酸素とホスホジエステル結合を介して一方向に結合するよう、モノヌクレオチドが反応してオリゴヌクレオチドが生成するからである。したがって、オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素と結合していない場合には「５’末端」と呼ばれ、３’酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸と結合していない場合には「３’末端」と呼ばれる。
【００３２】
本明細書において、核酸配列は、大きなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの内部にある場合であっても、５’および３’末端を有するといわれる場合がある。直鎖または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個のエレメントが「下流」または３’エレメントの「上流」または５’であるといわれる。この専門用語は、転写は、ＤＮＡ鎖に沿って５’から３’への様式で進行するという事実を反映する。通常、連結している遺伝子（例えば、オープンリーディングフレームまたはコード領域）の転写を指示するプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、概して、コード領域の５’または上流に位置している。しかし、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントおよびコード領域の３’に位置する場合であってもその効果を発揮できる。転写終結およびポリアデニル化シグナルは、コード領域の３’または下流に位置している。
【００３３】
本明細書において用語「コドン」とは、特定のアミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれるよう、または開始もしくは停止シグナルを指定する３個のヌクレオチドの配列からなる基本的な遺伝コード単位である。用語「コード領域」とは、構造遺伝子に関して用いられる場合には、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として新生ポリペプチド中に見られるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。通常、コード領域は、５’側では、開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」によって、３’側では、停止コドン（例えば、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）によって結合されている。一部の例では、コード領域がヌクレオチドトリプレット「ＴＴＧ」によって開始することも知られている。
【００３４】
「タンパク質」、「ポリペプチド」または「ペプチド」とは、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）にかかわらず、アミノ酸のいずれかの鎖を意味する。本発明の核酸分子はまた、天然に存在するタンパク質またはその断片の変異体をコードする場合もある。このような変異体タンパク質は、由来する、天然に存在する（天然または野生型）タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも８５％、好ましくは９０％、最も好ましくは９５％または９９％同一であるアミノ酸配列を有することが好ましい。
【００３５】
ポリペプチド分子は、「アミノ末端」（Ｎ末端）および「カルボキシ末端」（Ｃ末端）を有するといわれるが、これはペプチド結合が、第１のアミノ酸残基の骨格アミノ基と第２のアミノ酸残基の骨格カルボキシ基との間に生じるからである。用語「Ｎ末端」および「Ｃ末端」は、ポリペプチド配列に関しては、それぞれ、ポリペプチドのＮ末端およびＣ末端領域の部分を含むポリペプチドの領域を指す。ポリペプチドのＮ末端領域の一部を含む配列としては、大部分がポリペプチド鎖のＮ末端側の半分に由来するアミノ酸が挙げられるが、このような配列に限定されない。例えば、Ｎ末端配列は、ポリペプチドのＮ末端側半分およびＣ末端側半分の両方に由来する塩基を含むポリペプチド配列の内部部分を含み得る。同様のことが、Ｃ末端領域に当てはまる。Ｎ末端およびＣ末端領域はそれぞれ、必ずしもそうではないが、ポリペプチドの最終的なＮ末端およびＣ末端を規定するアミノ酸を含み得る。
【００３６】
本明細書において、用語「野生型」とは、天然に存在する供給源から単離されたその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子とは、ある集団において最も高頻度で観察されるものであり、したがって、任意に設計された「野生型」の型の遺伝子である。対照的に、用語「突然変異体」とは、野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、配列および／または機能的特性の改変（すなわち、変更された特徴）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然に存在する突然変異体は単離でき、これらは野生型遺伝子または遺伝子産物と比較した場合に、それらが変更した特徴を有するという事実によって同定されるということは留意されなくてはならない。
【００３７】
本明細書において用語「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」とは、組換えＤＮＡ分子から発現されるタンパク質分子を指す。対照的に、本明細書において用語「天然タンパク質」は、天然に存在する（すなわち、非組換え）供給源から単離されたタンパク質を示すために用いられる。分子生物学的技術を用いて、天然型のタンパク質と比較して同一の特性を有するタンパク質の組換え型を製造することができる。
【００３８】
用語「融合ポリペプチド」とは、異種配列（例えば、非ルシフェラーゼアミノ酸またはタンパク質）と連結している目的のタンパク質（例えば、ルシフェラーゼ）を含むキメラタンパク質を指す。
【００３９】
本明細書において、用語「細胞」、「細胞株」、「宿主細胞」とは、互換的に用いられ、すべてのこのような呼称は、これらの呼称の後代または潜在的後代を含む。「形質転換細胞」とは、本発明の核酸分子が、例えば、一時的トランスフェクションを介して導入されている細胞（またはその祖先に導入されている細胞）を意味する。場合により、本発明の核酸分子合成遺伝子を適した細胞株に導入し、合成遺伝子によってコードされるタンパク質またはポリペプチドを産生できる、安定にトランスフェクトされた細胞株を作製することもできる。ベクター、細胞およびこのような細胞株を構築する方法は、当技術分野で周知である。語句「形質転換体」または「形質転換細胞」とは、導入の数に関わらず、最初に形質転換された細胞に由来する一次形質転換細胞を含む。すべての後代は、意図的な突然変異または偶発的な突然変異のために、ＤＮＡ含量において正確には同一でない場合もある。それにもかかわらず、最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同一の機能性を有する変異株後代は、形質転換体の定義に含まれる。
【００４０】
核酸は、種々の種類の突然変異を含むことが知られている。「点」突然変異とは、単一の塩基位置でのヌクレオチドの配列における野生型配列からの変更を指す。突然変異とはまた、核酸配列が野生型配列とは異なるような１個以上の塩基の挿入または欠失も指す。
【００４１】
用語「相同性」とは、２種以上の配列間の相補性の程度を指す。部分相同性または完全相同性（すなわち、同一性）があり得る。相同性は、配列解析ソフトウェア（例えば、ＥＭＢＯＳＳ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／Ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＥＭＢＯＳＳ／ｏｖｅｒｖｉｅｗ／ｈｔｍｌで入手できる、欧州分子生物学公開ソフトウェア一式（ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ））を用いて測定されることが多い。このようなソフトウェアは、種々の置換、欠失、挿入およびその他の改変に対して相同性の程度を割り当てることによって類似した配列をマッチさせる。保存的置換とは、通常、以下の群内の置換を含む：グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン；セリン、トレオニン；リシン、アルギニン；およびフェニルアラニン、チロシン。
【００４２】
用語「単離された」とは、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」におけるように核酸に関連して用いられる場合、同定され、その供給源において通常付随している少なくとも１種の夾雑物から分離された核酸配列を指す。したがって、単離された核酸は、それが天然に見い出される形または設定とは異なる形または設定で存在する。対照的に、単離されていない核酸（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡ）は、それらが天然に存在する状態で見い出される。例えば、所与のＤＮＡ配列（例えば、ある遺伝子）は、宿主細胞染色体で隣の遺伝子に近接して見い出され、ＲＮＡ配列（例えば、特定のタンパク質をコードする特定のｍＲＮＡ配列）は、細胞において、多数のタンパク質をコードする多数のその他のｍＲＮＡとの混合物として見い出される。しかし、単離された核酸は、一例として、細胞において通常発現しており、天然の細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあるか、またはそうでなければ、天然に見い出される核酸配列とは異なる核酸配列によって隣接されている核酸を含む。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドは、一本鎖型または二本鎖型で存在し得る。単離された核酸またはオリゴヌクレオチドがタンパク質を発現するために利用される場合には、オリゴヌクレオチドは、最少で、センスまたはコード鎖を含む（すなわち、オリゴヌクレオチドは一本鎖であり得る）が、センスおよびアンチセンス鎖の両方を含む場合もある（すなわち、オリゴヌクレオチドは二本鎖であり得る）。
【００４３】
用語「単離された」とは、「単離されタンパク質」または「単離されたポリペプチド」におけるように、ポリペプチドに関連して用いられる場合は、同定され、その供給源において通常付随している少なくとも１種の夾雑物から分離されたポリペプチドを指す。したがって、単離されたポリペプチドは、それが天然に見い出される形または設定とは異なる形または設定で存在する。対照的に、単離されていないポリペプチド（例えば、タンパク質および酵素）は、それらが天然に存在する状態で見い出される。
【００４４】
用語「精製された」または「精製するために」とは、幾らかの夾雑物を目的の成分、例えば、タンパク質または核酸から除去する何らかのプロセスの結果を意味する。それによって、サンプル中の精製された成分のパーセントが増大する。
【００４５】
本明細書において用語「作動可能に連結された」とは、所与の遺伝子の転写および／または所望のタンパク質分子の合成を指示できる核酸分子が生成するような方法での核酸配列の結合を指す。この用語はまた、機能的（例えば、酵素的に活性な、結合パートナーと結合できる、阻害できる、など）タンパク質またはポリペプチドが生成するような方法での、アミノ酸をコードする配列の結合も指す。
【００４６】
用語「組換えＤＮＡ分子」とは、天然では通常は一緒に見い出されない、少なくとも２種のヌクレオチド配列を含むハイブリッドＤＮＡ配列を意味する。
【００４７】
用語「ベクター」は、ＤＮＡの断片を挿入またはクローニングでき、ＤＮＡセグメントを細胞に導入するために使用でき、細胞において複製可能である核酸分子に関連して用いられる。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、ウイルス、コスミドなどに由来し得る。
【００４８】
本明細書において、用語「組換えベクター」および「発現ベクター」とは、所望のコード配列と、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に必要な適当なＤＮＡまたはＲＮＡ配列とを含むＤＮＡまたはＲＮＡ配列を指す。原核生物の発現ベクターは、宿主細胞における自律増殖のためのプロモーター、リボソーム結合部位、複製起点および場合によりその他の配列、例えば、任意のオペレーター配列、任意の制限酵素部位を含む。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼをＤＮＡと結合させ、ＲＮＡ合成を開始させるＤＮＡ配列と定義される。真核生物の発現ベクターは、プロモーターと、場合により、ポリアデニル化シグナルと、場合により、エンハンサー配列とを含む。
【００４９】
タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドとは、遺伝子のコード領域を含む核酸配列を意味する。言い換えれば、核酸配列は、遺伝子産物をコードする。コード領域は、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの形で存在し得る。ＤＮＡの形で存在する場合には、オリゴヌクレオチドは一本鎖（すなわち、センス鎖）である場合も、二本鎖である場合もある。適した制御エレメント、例えば、エンハンサー／プロモーター、スプライスジャンクション、ポリアデニル化シグナルなどは、転写の適切な開始および／または一次ＲＮＡ転写物の正しいプロセシングを可能にするために必要とあれば、遺伝子のコード領域に近接近して位置し得る。あるいは、本発明の発現ベクターに利用されるコード領域は、内因性のエンハンサー／プロモーター、スプライスジャンクション、介在配列、ポリアデニル化シグナルなどを含む場合もある。さらなる実施形態では、コード領域は内因性および外因性の両方の制御エレメントの組合せを含み得る。
【００５０】
用語「調節エレメント」または「調節配列」とは、核酸配列の発現の何らかの局面を制御する遺伝因子または配列を指す。例えば、プロモーターは、作動可能に連結されたコード領域の転写の開始を促進する調節エレメントである。その他の調節エレメントとしては、限定されないが、転写因子結合部位、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、終結シグナルおよびエンハンサーエレメントが挙げられる。
【００５１】
真核生物では転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞性タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイからなる。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、種々の真核生物の供給源、例えば、酵母、昆虫および哺乳類の細胞中の遺伝子から単離されている。プロモーターおよびエンハンサーエレメントはウイルスからも単離されており、類似の制御エレメント、例えば、プロモーターは、原核生物においても見い出される。個々のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的のタンパク質を発現させるために用いる細胞型に応じて変わる。広い宿主域を有する真核生物のプロモーターおよびエンハンサーもあれば、制限された小集団の細胞型において機能的であるものもある。例えば、ＳＶ４０初期遺伝子エンハンサーは、多数の哺乳類種に由来する広範な細胞型において極めて活性であり、哺乳類細胞におけるタンパク質の発現に広く用いられてきた。広範な哺乳類細胞型において活性な、プロモーター／エンハンサーエレメントの２つのその他の例として、ヒト延長因子１遺伝子に由来するもの  （Ｕｅｔｓｕｋｉら、１９８９；Ｋｉｍら、１９９０およびＭｉｚｕｓｈｉｍａおよびＮａｇａｔａ，１９９０）ならびにラウス肉腫ウイルス（Ｇｏｒｍａｎら、１９８２）およびヒトサイトメガロウイルス（Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５）の長い末端反復がある。
【００５２】
用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターおよびエンハンサー機能の両方（すなわち、上記のプロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントによって提供される機能）を提供できる配列を含むＤＮＡのセグメントを表す。例えば、レトロウイルスの長い末端反復は、プロモーターおよびエンハンサー機能の両方を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」であっても「外因性」であっても「異種」であってもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターとは、ゲノムにおいて所与の遺伝子と天然に結合しているものである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターとは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）によって遺伝子の近位に配置され、その結果、遺伝子の転写が、結合されたエンハンサー／プロモーターによって指示されるものである。
【００５３】
発現ベクターに「スプライシングシグナル」が存在することで、真核生物の宿主細胞において組換え転写物の高レベルの発現がもたらされることが多い。スプライシングシグナルは、一次ＲＮＡ転写物からのイントロンの除去を媒介し、スプライスドナーおよびアクセプター部位からなる（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。よく用いられるスプライスドナーおよびアクセプター部位として、ＳＶ４０の１６ＳＲＮＡ由来のスプライスジャンクションがある。
【００５４】
真核細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的な発現には、得られた転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を指示するシグナルの発現が必要である。転写終結シグナルは、通常、ポリアデニル化シグナルの下流に見られ、数百個のヌクレオチド長である。本明細書において、用語「ポリ（Ａ）部位」または「ポリ（Ａ）配列」とは、新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を指示するＤＮＡ配列を表す。ポリ（Ａ）テールを欠く転写物は不安定であり迅速に分解されるので、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターに用いられるポリ（Ａ）シグナルは、「異種」であってもよいし、「内因性」であってもよい。内因性ポリ（Ａ）シグナルとは、ゲノムにおいて所与の遺伝子のコード領域の３’末端に天然に見られるものである。異種ポリ（Ａ）シグナルとは、ある遺伝子から単離されており、別の遺伝子の３’に配置されたものである。よく用いられる異種ポリ（Ａ）シグナルとして、ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルがある。ＳＶ４０ポリ（Ａ）シグナルは、２３７ｂｐのＢａｍＨ  Ｉ／Ｂｃｌ  Ｉ制限断片に含まれ、終結およびポリアデニル化の両方を指示する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）。
【００５５】
真核生物の発現ベクターはまた、「ウイルスレプリコン」または「ウイルスの複製起点」を含み得る。ウイルスレプリコンとは、適当な複製因子を発現する宿主細胞におけるベクターの染色体外複製を可能にするウイルスのＤＮＡ配列である。ＳＶ４０またはポリオーマウイルスの複製起点のいずれかを含むベクターは、適当なウイルスＴ抗原を発現する細胞において高コピー数（最高１０４コピー／細胞）に複製する。対照的に、ウシパピローマウイルスまたはエプスタイン−バーウイルス由来のレプリコンを含むベクターは、低コピー数（約１００コピー／細胞）で染色体外に複製する。
【００５６】
用語「インビトロ」とは、人工環境および人工環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。インビトロ環境としては、限定されないが、試験管および細胞溶解物が挙げられる。用語「インビボ」とは、天然環境（例えば、動物または細胞）および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。
【００５７】
用語「発現系」とは、目的の遺伝子の発現を調べる（例えば、検出する）ためのいずれかのアッセイまたは系を指す。分子生物学の当業者には理解されるであろうが、多種多様な発現系のいずれを使用することもできる。広範な適した哺乳類細胞が広範な供給源（例えば、ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，  Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＤ）から入手可能である。形質転換またはトランスフェクションする方法および発現媒体を選択する方法は、選択した宿主系に応じて変わる。形質転換およびトランスフェクションする方法は、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９２に記載されている。発現系は、目的の遺伝子（例えば、レポーター遺伝子）が調節配列と結合しており、遺伝子の発現を阻害するか誘導する薬剤で処理した後に遺伝子の発現がモニターされる、インビトロ遺伝子発現アッセイを含む。遺伝子発現の検出は、いずれの適した手段を介してもよく、限定されないが、発現されたｍＲＮＡまたはタンパク質（例えば、レポーター遺伝子の検出可能な産物）の検出または目的の遺伝子を発現する細胞の表現型の検出可能な変化を介することが挙げられる。発現系はまた、切断事象またはその他の核酸もしくは細胞性変化が検出されるアッセイを含み得る。
【００５８】
本明細書において同定されるすべてのアミノ酸残基は、天然のＬ−立体配置である。標準的なポリペプチドの命名法に沿い、アミノ酸残基の略語は以下の対応表に示されるとおりである。
【００５９】
【表１】
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用語「相補的」または「相補性」は、塩基対形成法則によって関係づけられる、ヌクレオチドの配列に関連して用いられる。例えば、配列５’「Ａ−Ｇ−Ｔ」３’については、配列３’「Ｔ−Ｃ−Ａ」５’に対して相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが、塩基対形成法則によってマッチされる「部分」であってもよい。または、核酸間の「完全」もしくは「全」相補性でもあり得る。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に大きな影響を及ぼす。これは、増幅反応、ならびに核酸のハイブリダイゼーションに応じて変わる検出法では特に重要である。
【００６０】
二本鎖核酸配列、例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムクローンに関連して用いる場合には、用語「実質的に相同な」とは、本明細書に記載される低ストリンジェンシーの条件下で二本鎖核酸配列のいずれかの鎖または両方の鎖とハイブリダイズできるいずれかのプローブを指す。
【００６１】
「プローブ」とは、（その長さに関して）探索される変性された核酸中の配列に対して十分に相補的であるよう設計されたオリゴヌクレオチドを指し、選択したストリンジェンシー条件下で結合される。
【００６２】
プローブおよび変性された核酸との関連で「ハイブリダイゼーション」および「結合」は、互換的に用いられる。変性された核酸とハイブリダイズまたは結合されるプローブは、ポリヌクレオチド中の相補配列と塩基対形成される。個々のプローブがポリヌクレオチドと塩基対形成されたままであるかどうかは、相補性の程度、プローブの長さ、および結合条件のストリンジェンシーに応じて変わる。ストリンジェンシーが高いほど、相補性の程度は高くなくてはならず、かつ／またはプローブは長くなくてはならない。
【００６３】
用語「ハイブリダイゼーション」は、相補的核酸鎖の対形成に関連して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸鎖間の会合の強度）は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、例えば、塩濃度、形成されたハイブリッドのＴｍ（融解温度）、他の成分の存在（例えば、ポリエチレングリコールの有無）、ハイズリダイズする鎖のモル濃度および核酸鎖のＧ：Ｃ含量を含め、当技術分野で周知の多数の因子によって影響を受ける。
【００６４】
用語「ストリンジェンシー」は、核酸ハイブリダイゼーションが実施される温度、イオン強度および他の化合物の存在の条件に関連して用いられる。「高ストリンジェンシー」条件を用いると、核酸塩基対形成は、高頻度の相補的塩基配列を有する核酸断片間のみで起こる。したがって、互いに完全に相補的でない核酸がハイブリダイズされるか、一緒にアニーリングされることが望まれる場合には、「中」または「低」ストリンジェンシー条件が必要であることが多い。当技術分野では、中または低ストリンジェンシー条件を含むよう多数の同等条件を用いることができることは周知である。一般に、ハイブリダイゼーション条件の選択は当業者には明白であり、通常、ハイブリダイゼーションの目的、ハイブリダイゼーションの種類（ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡ）、および配列間の所望の関連性のレベルによって導かれる（例えば、方法の総括論議について、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，１９８５）。
【００６５】
核酸二本鎖の安定性は、ミスマッチされた塩基の数が増加するにつれ低下し、ハイブリッド二本鎖中のミスマッチの相対的な位置に応じてより大幅にまたはより小幅にさらに低下されることがわかっている。したがって、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを用いて、このような二本鎖の安定性を最大にするか、または最少にすることができる。ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは以下によって変更できる：ハイブリダイゼーションの温度を調節すること、ハイブリダイゼーションミックス中のヘリックス不安定化物質、例えば、ホルムアミドのパーセンテージを調節すること；ならびに洗浄溶液の温度および／または塩濃度を調節すること。フィルターハイブリダイゼーションには、ハイブリダイゼーションの最終ストリンジェンシーを、ハイブリダイゼーション後洗浄に用いる塩濃度および／または温度によって決定することが多い。
【００６６】
「高ストリンジェンシー条件」とは、核酸ハイブリダイゼーションに関連して用いられる場合、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合には、４２℃での、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調節）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート試薬および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、４２℃での０．１×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中での洗浄と同等の条件を含む。
【００６７】
「中ストリンジェンシー条件」は、核酸ハイブリダイゼーションに関連して用いられる場合、約５００ヌクレオチド長のプローブを用いる場合には、４２℃での、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調節）、０．５％ＳＤＳ、５×デンハート試薬および１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、４２℃での１．０×ＳＳＰＥ、１．０％ＳＤＳを含む溶液中での洗浄と同等の条件を含む。
【００６８】
「低ストリンジェンシー条件」は、４２℃での、５×ＳＳＰＥ（４３．８ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、６．９ｇ／ｌ  ＮａＨ２ＰＯ４Ｈ２Ｏおよび１．８５ｇ／ｌ  ＥＤＴＡ、ＮａＯＨを用いてｐＨ７．４に調節）、０．１％ＳＤＳ、５×デンハート試薬［５０×デンハートは５００ｍｌあたり以下を含む：５ｇフィコール（タイプ４００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、５ｇ  ＢＳＡ（画分Ｖ；Ｓｉｇｍａ）］および１００ｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる溶液中での結合またはハイブリダイゼーションと、それに続く、４２℃での５×ＳＳＰＥ、０．１％ＳＤＳを含む溶液中での洗浄と同等の条件を含む。
【００６９】
用語「Ｔｍ」は、「融解温度」に環連して用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団の５０％が解離されて一本鎖になる温度である。核酸のＴｍを算出するための方程式は、当技術分野では周知である。ハイブリッド核酸のＴｍは、１Ｍ塩でのハイブリダイゼーションアッセイから採択される式を用いて推定されることが多く、ＰＣＲプライマーのＴｍを算出するためによく用いられる：「（Ａ＋Ｔの数）×２℃＋（Ｇ＋Ｃの数）×４℃」。（Ｃ．Ｒ．Ｎｅｗｔｏｎら、ＰＣＲ，第２巻、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（ニューヨーク、１９９７），２４頁）。この式は、２０ヌクレオチドよりも長いプライマーに対しては不正確であることがわかった。（同文献）。Ｔｍ値の他の簡単な推定は以下の方程式によって算出できる：核酸１Ｍ  ＮａＣｌの水溶液中にある場合に、Ｔｍ＝８１．５＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）（例えば、ＡｎｄｅｒｓｏｎおよびＹｏｕｎｇ，  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，１９８５）。当技術分野には、Ｔｍの算出に関して構造ならびに配列の特徴を考慮する他のより精巧な計算が存在する。算出されるＴｍは、単に推定値であって、通常、最適温度は経験的に決定される。
【００７０】
用語「プロモーター／エンハンサー」は、プロモーターおよびエンハンサー機能の両方（すなわち、上記のように、プロモーターエレメントおよびエンハンサーエレメントによって提供される機能）を提供できる配列を含むＤＮＡのセグメントを表す。例えば、レトロウイルスの長い末端反復は、プロモーターおよびエンハンサー機能の両方を含む。エンハンサー／プロモーターは、「内因性」であっても「外因性」であっても「異種」であってもよい。「内因性」エンハンサー／プロモーターとは、ゲノムにおいて所与の遺伝子と天然に結合しているものである。「外因性」または「異種」エンハンサー／プロモーターとは、遺伝子操作（すなわち、分子生物学的技術）によって遺伝子の近位に配置され、その結果、遺伝子の転写が、結合されたエンハンサー／プロモーターによって指示されるものである。
【００７１】
用語「配列相同性」とは、２種の核酸配列間の塩基マッチの割合または２種のアミノ酸配列間のアミノ酸マッチの割合を意味する。配列相同性がパーセンテージとして表される場合、例えば、５０％は、パーセンテージは、いずれか他の配列と比較される一配列から得られる配列の長さにわたるマッチの割合を表す。ギャップ（２種の配列のいずれかにおける）は、マッチングを最大にするよう認められる。通常、１５塩基以下のギャップの長さが用いられ、６塩基以下が好ましく、２塩基以下がより好ましい。オリゴヌクレオチドをプローブまたは処理として用いる場合には、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列との間の配列相同性は、一般に、２０個の可能性あるオリゴヌクレオチド塩基対マッチのうち少なくとも１７標的塩基マッチ（８５％）であり、好ましくは１０個の可能性ある塩基対マッチのうち少なくとも９マッチ（９０％）であり、そしてより好ましくは２０個の可能性ある塩基対マッチのうち少なくとも１９マッチ（９５％）である。
【００７２】
２種のアミノ酸配列は、それらの配列間に部分または完全同一性がある場合に相同である。例えば、８５％の相同性は、２種の配列を最大マッチングのために整列させると、アミノ酸の８５％が同一であることを意味する。ギャップ（マッチングされている２種の配列のいずれかにおける）はマッチングの最大化で許容される。５以下のギャップの長さが好ましく、２以下がより好ましい。あるいはおよび好ましくは、２種のタンパク質配列（または少なくとも１００個のアミノ酸の長さのそれらに由来するポリペプチド配列）は、それらが、突然変異データマトリックスおよび６以上のギャップペナルティーを用いるプログラムＡＬＩＧＮを用いて５より大きいアラインメントスコアを有する（標準偏差単位において）場合に、この用語が本明細書において用いられるように相同である。Ｄａｙｈｏｆｆ，  Ｍ．  Ｏ．，  ｉｎ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，  １９７２，  第５巻，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，１０１〜１１０頁およびこの巻の付録２、１〜１０頁を参照のこと。２種の配列またはその一部は、それらのアミノ酸がＡＬＩＧＮプログラムを用いて最適に整列された場合に８５％以上同一である場合に相同であることがより好ましい。
【００７３】
以下の用語は、２種以上のポリヌクレオチド間の配列関係を説明するために用いられる。「参照配列」、「比較ウィンドウ」」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセンテージ」および「実質的同一性」。「参照配列」とは、配列比較の基準として用いられる規定された配列である。参照配列は大きな配列のサブセット、例えば、配列表に示される全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメントである場合もあり、または完全ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列を含む場合もある。通常、参照配列は少なくとも２０個のヌクレオチド長であり、少なくとも２５個のヌクレオチド長であることがより高頻度にあり、少なくとも５０個または１００個のヌクレオチド長であることが多い。２種のポリヌクレオチドは各々（１）２種のポリヌクレオチド間で同様の配列（すなわち、完全ポリヌクレオチド配列の一部）を含む場合もあり、また（２）２種のポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに含む場合もあるので、２種（またはそれよい多い）のポリヌクレオチド間の配列比較は、通常、２種のポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンドウ」にわたって比較して局所領域の配列類似性を同定および比較することによって実施される。
【００７４】
本明細書において「比較ウィンドウ」とは、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドからなる概念的なセグメントを指し、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の一部は、２種の配列の最適アラインメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較した場合に２０パーセント以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。
【００７５】
比較のための配列のアライメントの方法は、当技術分野では周知である。したがって、いずれか２種の配列間のパーセント同一性の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成できる。このような数学アルゴリズムの好ましい、限定されない例として、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（１９８８）、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（１９８１）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（１９７０）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性の検索方法（１９８８）、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（１９９０）、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌにおいて改変されたもの（１９９３）がある。
【００７６】
これらの数学アルゴリズムのコンピュータによる実現を配列の比較のために利用して配列同一性を求めることができる。このような実現としては、限定されないが：ＣｌｕｓｔａｌＷ（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｃｌｕｓｔａｌｗ／で入手可能）；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）およびＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８中のＴＦＡＳＴＡが挙げられる。これらのプログラムを用いるアライメントは、デフォルトパラメータを用いて実施できる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムはＨｉｇｇｉｎｓら（１９８８）；Ｈｉｇｇｉｎｓら（１９８９）；Ｃｏｒｐｅｔら（１９８８）；Ｈｕａｎｇら（１９９２）およびＰｅａｒｓｏｎら（１９９４）によって十分に記載されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（前掲）に基づいている。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌのアルゴリズム（前掲）に基づいている。比較目的でギャップ付きアラインメントを得るために、ギャップ付きＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０中）をＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９７）に記載のとおり用いることができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０中）を用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することもできる。Ａｌｔｓｃｈｕｌら（前掲）を参照のこと。ＢＬＡＳＴ、ギャップ付きＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合には、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列にはＢＬＡＳＴＮ、タンパク質にはＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメータを使用できる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．参照のこと。アライメントはまた、視診によって手作業で実施することもできる。
【００７７】
用語「配列同一性」とは、２種のポリヌクレオチド配列が、比較のウィンドウにわたって同一であること（すなわち、ヌクレオチドごとをベースに）を意味する。用語「配列同一性のパーセンテージ」とは、２種のポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたって述べられた割合のヌクレオチドについて同一であること（すなわち、ヌクレオチドごとをベースに）を意味する。用語「配列同一性のパーセンテージ」は、２種の最適に整列された配列を比較のウィンドウにわたって比較することと、両配列中に同一の核酸塩基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、ＵまたはＩ）が生じる位置の数を調べてマッチした位置の数を得ることと、マッチした位置の数を比較のウィンドウ中の位置の全数（すなわち、ウィンドウサイズ）で除することと、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることとによって算出される。本明細書において、用語「実質的同一性」とは、ポリヌクレオチド配列の特徴を表し、これでは、ポリヌクレオチドは少なくとも２０個のヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたって、頻繁には、少なくとも２０個〜５０個のヌクレオチド、好ましくは、少なくとも３００個のヌクレオチドのウィンドウにわたって参照配列と比較して少なくとも６０％、好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、最大約８５％、いっそうより好ましくは少なくとも９０〜９５％、より通常では少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含み、配列同一性のパーセンテージは、比較のウィンドウにわたって、参照配列と、参照配列の総計２０パーセント以下の欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列とを比較することによって算出される。参照配列は、より大きな配列のサブセットであり得る。
【００７８】
ポリペプチドに適用される、用語「実質的同一性」とは、２種のペプチド配列が、デフォルトギャップ加重を用いてプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどによって最適に整列された場合に、少なくとも約８５％の配列同一性、好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９９％の配列同一性を共有することを意味する。
【００７９】
（本発明の合成ヌクレオチド配列および方法）
本発明は、合成ヌクレオチド配列を含む組成物、ならびに、特定の細胞型に存在する場合に、減少した不適切もしくは意図しない転写特性を含めて望ましい特徴を有するポリペプチドもしくはタンパク質として効率的に発現されるか、または不適切もしくは意図しない転写特性をもたらさない合成ヌクレオチド配列が得られるそれらの配列を調製する方法を提供する。
【００８０】
自然選択とは、表現型レベルで生じる遺伝子型−環境相互作用が、個体の繁殖成功の差、ひいては、集団の遺伝子プールの改変をもたらすという仮説である。一般に、天然に見い出されるタンパク質のアミノ酸配列は、自然選択による最適化を受けていると認められている。しかし、アミノ酸は、タンパク質の活性に大きく寄与しないタンパク質の配列内に存在し、これらのアミノ酸はほとんど影響なく、または全く影響なくその他のアミノ酸と変更できる。さらに、タンパク質は、その天然環境外で、またはその自然選択の条件とは異なる目的のために有用であり得る。これらの状況では、アミノ酸配列を合成よって変更し、種々の適用におけるその有用性のためにタンパク質をより適応させることができる。
【００８１】
同様に、タンパク質をコードする核酸配列も自然選択によって最適化される。コードＤＮＡと、その転写されたＲＮＡとの間の関係は、ＤＮＡに対するいずれの変化も、得られるＲＮＡに影響を及ぼすようなものである。したがって、自然選択は、両分子に対して同時に働く。しかし、この関係は核酸とタンパク質との間には存在しない。複数のコドンが同一のアミノ酸をコードするために、多数の異なるヌクレオチド配列が同一のタンパク質をコードし得る。５００個のアミノ酸からなる特定のタンパク質は、理論上は、１０１５０種より多い異なる核酸配列によってコードされ得る。
【００８２】
自然選択は、対応するタンパク質の適切なコード化を達成するよう核酸に作用する。おそらくは、核酸分子のその他の特性も自然選択によって影響を受ける。これらの特性としては、コドン使用頻度、ＲＮＡ二次構造、イントロンスプライシングの効率および転写因子またはその他の核酸結合タンパク質との相互作用が挙げられる。これらの他の特性はタンパク質翻訳の効率および得られる表現型を変更し得る。遺伝コードの重複性のために、これらのその他の特性は対応するアミノ酸配列を変更することなく自然選択によって最適化され得る。
【００８３】
いくつかの条件下では、タンパク質をコードする天然ヌクレオチド配列を、代替適用にそのタンパク質をより適応させるよう合成によって変更することが有用である。一般的な一例として、外来宿主において発現される場合に、遺伝子のコドン使用頻度を変更することがある。遺伝コードの重複性によりアミノ酸が複数のコドンによってコードされることが可能であるが、種々の生物はいくつかのコドンを他のものよりも好む。コドン使用頻度は、広く分かれた進化の歴史を有する生物について最も異なる傾向がある。進化的に離れた生物間で遺伝子を導入する場合には、コドン使用頻度を調整することによってタンパク質翻訳の効率を実質的に高めることができることがわかっている（米国特許第５，０９６，８２５号、同５，６７０，３５６号および同５，８７４，３０４号を参照のこと）。
【００８４】
一実施形態では、レポーター遺伝子のコドン使用が実験細胞の最適コドン使用に相当していないことが多いために、レポーター遺伝子の配列を改変する。他の実施形態では、レポーター遺伝子の配列を改変して、調節配列、例えば、レポーター遺伝子または連結している遺伝子の発現を変更し得るものを除去する。例として、大腸菌由来であり、哺乳類細胞においてよく用いられるβ−ガラクトシダーゼ（β−ｇａｌ）およびクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）レポーター遺伝子；大腸菌由来であり、植物細胞においてよく用いられるβ−グルクロニダーゼ（ｇｕｓ）レポーター遺伝子；昆虫由来であり、植物および哺乳類細胞においてよく用いられるホタルルシフェラーゼ（ｌｕｃ）レポーター遺伝子および腔腸動物由来であり、植物および哺乳類細胞においてよく用いられるウミシイタケルシフェラーゼおよび緑色蛍光タンパク質（ｇｆｐ）レポーター遺伝子が挙げられる。レポーター遺伝子発現の高感度の定量化を達成するには、遺伝子産物の活性が、実験宿主細胞に対して内因性であってはならない。したがって、レポーター遺伝子は、通常、独特の特徴的表現型を有する生物から選択される。したがって、これらの生物は実験宿主細胞から広く分かれた進化の歴史を有することが多い。
【００８５】
これまでに、より最適なコドン使用頻度を有するが、依然として同一の遺伝子産物をコードする遺伝子を作製するために、既存のコドンを、実験宿主細胞にとって一般的により好都合なコドンで置換することによって合成核酸配列が作製されている（米国特許第５，０９６，８２５号、同５，６７０，３５６号および同５，８７４，３０４号を参照のこと）。結果は、合成遺伝子のコドン使用頻度の正味の改善であった。しかし、その他の特性の最適化は考慮されず、そのためにこれらの合成遺伝子は自然選択によって最適化された遺伝子を反映しないと思われた。
【００８６】
詳しくは、コドン使用頻度の改善は、タンパク質への翻訳におけるその役割に基づくＲＮＡ配列の最適化のみを対象とするものである。したがって、先に記載した方法は、ＲＮＡへの転写において、合成遺伝子の配列がＤＮＡの役割にどのように影響を及ぼすかについて対応しなかった。転写因子が合成ＤＮＡとどのように相互作用し、結果として、遺伝子転写を調節あるいは影響を及ぼすかについての考慮がなされなかったことは最も明白である。天然に見られる遺伝子については、ＤＮＡは、天然の宿主細胞によって最適に転写され、適当にフォールディングされた遺伝子産物をコードするＲＮＡを得る。対照的に、合成遺伝子は、これまでは転写特性については最適化されていなかった。むしろ、この特性は無視されてきたか、成り行きに任されてきた。
【００８７】
この問題はすべての遺伝子にとって重要であるが、実験宿主細胞における転写挙動を定量化するために最もよく用いられるレポーター遺伝子および遺伝子のベクター骨格配列にとっては特に重要である。種々の生理条件下、種々の細胞型において数百の転写因子が同定されており、より多くが存在すると思われるが、まだ同定されていない。これらの転写因子のすべてが、導入された遺伝子またはそれに連結している配列の転写に影響を及ぼし得る。本発明の有用な合成レポーター遺伝子またはベクター骨格は、その遺伝子またはベクター骨格の構造が変更されているために、宿主細胞の内因性の転写特性に影響を及ぼすか、それらの転写特性を乱す最少の危険しか有さない。特に有用な合成レポーター遺伝子またはベクター骨格は、新規セットおよび／または多種多様な実験条件下で望ましい特性を有する。これらの特性を最良に達成するために、合成遺伝子または合成ベクター骨格の構造は、広範な宿主細胞および生理条件内で転写因子との相互作用について最少の可能性を有さなくてはならない。レポーター遺伝子またはベクター骨格と、宿主細胞の内因性の転写因子との間の相互作用の可能性を最少にすることは、個々の実験内で遺伝子またはベクター骨格の不適当な転写特性の危険を低減すること、種々の環境における遺伝子またはベクター骨格の適用性を高めることおよび得られる実験データの許容性を高めることによって、レポーター遺伝子またはベクター骨格の価値を高める。
【００８８】
対照的に、元の宿主生物に由来するゲノムクローンまたはｃＤＮＡクローンに基づく、天然のヌクレオチド配列を含むレポーター遺伝子、または１種もしくは種々の異なる生物中に見られる天然の配列を含むべクター骨格は、外因性の宿主中に存在する場合に転写因子と相互作用し得る。この危険は、２つの事情に起因する。第１に、天然ヌクレオチド配列は、天然宿主生物内の遺伝子転写に影響を及ぼすよう自然選択によって最適化された配列を含む。しかし、これらの配列はまた、配列が外因性の宿主中に、すわなち、関係から離れて存在する場合にも、転写に影響を及ぼし、ひいては、レポーター遺伝子またはベクター骨格としての性能に干渉し得る。第２に、ヌクレオチド配列は、天然の宿主生物には存在せず、したがって、自然選択に関与しなかった転写因子と不用意に相互作用し得る。このような不用意な相互作用の可能性は、実験細胞とレポーター遺伝子またはベクター骨格の天然生物との間の進化的分離が大きいほど高まる。
【００８９】
転写因子とのこれらの起こり得る相互作用は、コドン使用頻度が変更された合成遺伝子を用いる場合には乱される可能性がある。しかし、ベクター骨格において、コドン使用頻度のみに基づいてコドンを選択することまたは配列を無作為に置換することもしくは配列を無作為に並べることによって設計された合成レポーター遺伝子配列は、得られた配列が不適当な転写活性を修正する自然選択の恩恵を受けていないために、その他の意図しない転写因子結合部位を含む可能性がある。転写因子との不用意な相互作用はまた、コードされるアミノ酸配列が、例えば、アミノ酸置換を導入するよう人為的に変更されている場合はいつでも生じ得る。同様に、これらの変化は自然選択に付されておらず、したがって、望まれていない特性を示し得る。
【００９０】
したがって、本発明は、特定の宿主細胞において発現された場合に、転写因子およびその他のトランス作用因子とのヌクレオチド配列の望ましくない相互作用の危険を低減し、それによって不適当または意図しない特性を低減する合成ヌクレオチド配列を調製する方法を提供する。本方法によって、特定の宿主細胞のために改善されたコドン使用頻度を含み、調節配列、例えば、転写因子結合部位の出現が減少した合成遺伝子および／または調節配列の出現が減少したベクター骨格配列が得られることが好ましい。本発明はまた、改善されたコドン使用頻度を含み、転写因子結合部位の出現が減少し、さらなる有益な構造上の特性を有する合成遺伝子を調製する方法を提供する。このようなさらなる特性としては、不適当なＲＮＡスプライシングジャンクション、ポリ（Ａ）付加シグナル、望ましくない制限酵素認識部位、リボゾーム結合部位および／または二次構造モチーフ、例えば、ヘアピンループがないことが挙げられる。
【００９１】
一実施形態では、ポリペプチドをコードする親核酸配列を、特定の細胞における発現のために最適化する。例えば、野生型配列中のコドンを特定の（選択した）細胞において優先的に用いられるコドンで置換することによって核酸配列を最適化し、コドン置換がまた、調節配列の数を低減する。好ましいコドンは、選択した細胞において相対的に高いコドン使用頻度を有し、その導入によって、相対的に少ない調節配列、例えば転写因子結合部位、および相対的に少ないその他の望ましくない構造上の特性の導入がもたらされることが好ましい。したがって、最適化されたヌクレオチド配列は、改善されたコドン使用頻度による改善された発現レベル、および望ましくない転写調節配列の数の減少による不適当な転写挙動の低減された危険を有し得る。他の実施形態では、親ベクター骨格配列を変更して、調節配列および場合により制限エンドヌクレアーゼ部位を除去し、そして、その他の望ましい特性、例えば、１以上のリーディングフレーム中の１以上の停止コドン、１以上のポリ（Ａ）部位および／もしくは制限エンドヌクレアーゼ部位の存在を場合により保持または付加する。
【００９２】
本発明は、核酸配列、例えば、ｃＤＮＡなどの天然配列またはインビトロで操作されたものを用いて使用できる。例示的な遺伝子として、限定されないが、ラクタマーゼ（β−ｇａｌ）、ネオマイシン耐性（Ｎｅｏ）、ハイグロマイシン耐性（Ｈｙｇ）、ピューロマイシン耐性（Ｐｕｒｏ）、アンピシリン耐性（Ａｍｐ）、ＣＡＴ、ＧＵＳ、ガラクトピラノシド、ＧＦＰ、キシロシダーゼ、チミジンキナーゼ、アラビノシダーゼ、ルシフェラーゼなどをコードするものが挙げられる。本明細書において、「レポーター遺伝子」とは、その遺伝子を発現する細胞に別個の表現型を与え、ひいては、その遺伝子を有する細胞がその遺伝子を有さない細胞から区別されるのを可能にする遺伝子である。このような遺伝子は、化学的手段によって、すなわち、選抜物質（例えば、除草剤、抗生物質など）の使用によって「選抜」できる形質をマーカーが付与するかどうか、またはマーカーが、観察または試験によって、すなわち、「スクリーニング」によって同定できる、単なる「レポーター」形質であるかどうかに応じて、選択可能なまたはスクリーニング可能なポリペプチドのいずれかをコードし得る。用語、選択可能なまたはスクリーニング可能なマーカー遺伝子内には、形質転換された細胞を同定または選択する手段として、その分泌を検出できる「選択可能なマーカー」をコードする遺伝子も含まれる。例として、抗体相互作用によって同定され得る選択可能な抗原、あるいはその触媒活性によって検出され得る選択可能な酵素をコードするマーカーも挙げられる。選択可能なタンパク質は、例えば、ＥＬＩＳＡによって検出可能な小さい拡散性のタンパク質および細胞膜に挿入または捕獲されるタンパク質をはじめ、いくつかの種類に分類される。
【００９３】
本開示内容の要素を、特定の遺伝子およびベクター骨格配列の使用を通じて詳細に例示する。もちろん、適した遺伝子およびベクター骨格の多数の例は、当技術分野では公知であり、本発明の実施に使用できる。したがって、以下の議論は包括的なものではなく例示的なものであるということは理解されよう。本明細書に開示される技術および当技術分野で公知の一般的な組換え技術を踏まえて、本発明は、いずれかの遺伝子またはベクター骨格配列の変更を可能にする。
【００９４】
例示的な遺伝子として、限定されないが、ｎｅｏ遺伝子、ｐｕｒｏ遺伝子、ａｍｐ遺伝子、β−ｇａｌ遺伝子、ｇｕｓ遺伝子、ｃａｔ遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、ｈｙｇ遺伝子、ｈｉｓＤ遺伝子、ｂｌｅ遺伝子、ｍｐｒｔ遺伝子、ｂａｒ遺伝子、ニトリラーゼ遺伝子、変異アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）またはアセトアシッド（ａｃｅｔｏａｃｉｄ）シンターゼ遺伝子（ＡＡＳ）、メトトレキサート耐性ｄｈｆｒ遺伝子、ダラポン（ｄａｌａｐｏｎ）脱ハロゲン酵素遺伝子、５−メチルトリプトファンに対する耐性を付与する変異アントラニル酸シンターゼ遺伝子（ＷＯ９７／２６３６６）、Ｒ−遺伝子座遺伝子、β−ラクタマーゼ遺伝子、ｘｙｌＥ遺伝子、α−アミラーゼ遺伝子、チロシナーゼ遺伝子、ルシフェラーゼ（ｌｕｃ）遺伝子（例えば、ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ  ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、またはコメツキムシルシフェラーゼ（ピロフォラス・プラジオフタラムス（Ｐｙｒｏｐｈｏｒｕｓ  ｐｌａｇｉｏｐｈｔｈａｌａｍｕｓ）遺伝子）、エクオリン遺伝子または蛍光タンパク質遺伝子が挙げられる。
【００９５】
本発明の方法は、限定されるものではないが、再帰プロセスによって実施できる。このプロセスは、特定の種におけるコドン使用に基づいて、好ましいコドンを標的分子、例えば、天然ヌクレオチド配列中の各アミノ酸に割り当てるステップと、好ましいコドンを有する核酸配列中の可能性ある転写調節配列、例えば、転写因子結合部位を、例えば、このような結合部位のデータベースを用いて同定するステップと、場合により、その他の望ましくない配列を同定するステップと、望ましくない転写因子結合部位またはその他の配列が生じる位置にて代替コドン（すなわち、同一のアミノ酸をコードする）で置換するステップとを含む。コドンが異なるバージョンについては、各バージョンにおいて代替の好ましいコドンで置換されている。必要に応じて、可能性ある転写因子またはその他の望ましくない配列の同定および排除を、ヌクレオチド配列が最大数の好ましいコドンおよび最小数の転写調節配列またはその他の望ましくない配列を含めた不要な配列を含むことを達成するまで反復できる。また、場合により、望ましい配列、例えば、制限酵素認識部位を導入することもできる。合成ヌクレオチド配列を設計し構築した後、親核酸配列に対するその特性を、当技術分野で周知の方法によって調べることができる。例えば、特定の細胞における、一連のベクター中の合成および標的核酸の発現を比較できる。
【００９６】
したがって、一般に、本発明の方法は、標的核酸配列および目的の宿主細胞、例えば、植物（双子葉植物または単子葉植物）、真菌、酵母または哺乳類細胞を同定するステップを含む。好ましい宿主細胞として、哺乳類宿主細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、Ｈｅｌａ、ＣＶ−１およびＮＩＨ３Ｔ３細胞がある。宿主細胞における好ましいコドン使用、および場合により、宿主細胞における低コドン使用、例えば、高使用哺乳類コドンならびに低使用大腸菌および哺乳類コドンに基づいて、置換されるコドンを決定する。置換されるコドンの選択と同時に、それに続いて、またはそれに先行して、標的配列中の所望のおよび不要の配列、例えば、望ましくない転写調節配列を同定する。転写調節配列および制限エンドヌクレアーゼ部位を含めたこれらの配列は、データベースおよびソフトウェア、例えばＴＲＡＮＳＦＡＣ（登録商標）（転写因子データベース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ｃｏｍ／）、Ｍａｔｃｈ（商標）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｅ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．ｃｏｍ／）、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒ（Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ）、ＥＰＤ（真核生物のプロモーターデータベース、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｐｄ．ｉｓｂ−ｓｉｂ．ｃｈ／）、ＲＥＢＡＳＥ（登録商標）（制限酵素データベース、ＮＥＢ、ｈｔｔｐ：／／ｒｅｂａｓｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ）、ＴＥＳＳ（転写エレメント検索システム、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｌ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｔｅｓｓ／）、ＭＡＲ−Ｗｉｚ（Ｆｕｔｕｒｅｓｏｆｔ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｆｕｔｕｒｅｓｏｆｔ．ｏｒｇ）、Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ（登録商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｄｎａｓｔａｒ．ｃｏｍ）、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ）およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  Ｓｕｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．ｏｒｇ／ＳＭＳ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）を用いて同定できる。その他のデータベースおよび配列解析ソフトウェアへのリンクは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ａｌｉｎｋｓ．ｈｔｍｌに列挙されている。１種以上の配列を同定した後、改変を導入できる。所望の合成ヌクレオチド配列を得ると、当技術分野で周知の方法（例えば、重複するプライマーを用いる核酸増幅反応）によって調製でき、その構造および機能特性、例えば、限定されないが、相同性パーセント、特定の配列、例えば、制限部位の有無、変更されたコドンのパーセント（例えば、特定のコドンの増加または減少した使用）および／または発現率を標的核酸配列と比較する。
【００９７】
以下に記載するように、本方法を用いて、ホタルルシフェラーゼと、選択可能なポリペプチドと、ベクター骨格のための合成配列とをコードする合成レポーター遺伝子を作製した。合成配列は、対応するタンパク質の天然または親配列よりも、より高いレベルの発現および／または低減した異常発現を支援できる。天然および親配列は、哺乳類細胞において発現された場合に異常転写特性を示す場合があるが、これが合成配列では明らかではないことがあり得る。
【００９８】
（合成ヌクレオチド配列の例示的使用）
本発明の合成遺伝子は、その天然対応物（または、ほぼそのようなもの）と同一のタンパク質をコードするが、コード領域（小数のアミノ酸変化は、天然の対応タンパク質の特性を増強するために、例えば、ルシフェラーゼの発光を増強するために望ましいものであり得るということが認識されている）および非コード領域中の調節エレメントを大きく欠きながら改善されたコドン使用を有することが好ましい。これにより、合成遺伝子がコードするタンパク質の発現レベルが増大し、タンパク質の異常発現の危険が低減する。例えば、弱いプロモーターによって媒介され得る、遺伝子調節の多数の重要な事象についての研究は、レポータータンパク質の不適切な発現に由来する不十分なレポーターシグナルによって制限されている。また、いくつかの選択マーカーの使用も、外因的な細胞におけるそのマーカーの発現によって制限されることがある。したがって、その細胞に対してコドン使用が改善されており、その他の望ましくない配列（例えば、転写因子結合部位）が減少している合成選択マーカー遺伝子は、そうでなければそれらのマーカーの宿主として望ましくない細胞におけるそれらのマーカーの使用を可能にし得る。
【００９９】
プロモータークロストークは、トランスフェクション効率を標準化するためにコレポーター遺伝子を用いる場合のもう１つの問題である。合成遺伝子の発現が増強されるにつれ、コレポーターの発現を駆動するための、強力なプロモーターを含むＤＮＡの量が減少する場合があり、または弱いプロモーターを含むＤＮＡが用いられる場合がある。さらに、本発明の合成レポーター遺伝子からのバックグラウンド発現の減少があり得る。この特性は、遺伝子からの散発性の発現を最少にすることおよびその他の調節経路に起因する干渉を低減することによって合成レポーター遺伝子をより望ましいものにする。
【０１００】
インビボ生物学的研究または薬物スクリーニングのために使用できる画像システムにおけるレポーター遺伝子の使用は、本発明の合成遺伝子の他の使用である。合成遺伝子によってコードされるタンパク質は、その発現レベルの増大のために、画像システムによってより容易に検出され得る。実際、合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を用い、トランスフェクトされたＣＨＯ細胞における発光を、器具使用の助けなしで視覚的に検出した。
【０１０１】
さらに、合成遺伝子を用いて、トランスフェクトするのが難しい細胞、例えば、一次細胞における転写を調べるために、ならびに／または調節経路および遺伝因子の分析を向上させるために、融合タンパク質、例えば、分泌リーダー配列または細胞局在化配列との融合物を発現させることができる。その他の使用としては、限定されないが、極限感度を必要とする稀な事象の検出（例えば、ＲＮＡリコーディングの研究）、インビトロ翻訳またはインビトロ転写−翻訳結合システム、例えば、ＴｎＴ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  Ｗｉｓ．）の効率を改善するためのＩＲＥＳとの使用、異なる宿主生物（例えば、植物、真菌など）に対して最適化されたレポーターの研究、薬物毒性をモニターするためのコレポーターとして、マルチウェルアッセイにおけるレポーター分子として、そして異なるシグナル伝達経路およびその他の調節機構によるレポーターシグナルの干渉の可能性を最少にするという利点を有する薬物スクリーニングにおけるレポーター分子としての複数の遺伝子の使用が挙げられる。
【０１０２】
さらに、本発明の合成ヌクレオチド配列の使用として、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、蛍光顕微鏡、インビトロおよびインビボで遺伝子発現レベル、細胞内局在またはターゲッティング（融合タンパク質）を検出および／または測定するための（例えば、プロモーター強度を調べるため）、マーカーとして、較正において、キットにおいて（例えば、二重アッセイのための）、インビボイメージングのための、調節経路および遺伝因子を分析するための、およびマルチウェル形式においての使用が挙げられる。
【０１０３】
さらに、レポーター遺伝子は転写事象を測定するために広く用いられるが、その有用性は、レポーター発現の忠実度および効率によって制限され得る。例えば、米国特許第５，６７０，３５６号では、ホタルルシフェラーゼ遺伝子（ｌｕｃ＋と呼ばれる）がルシフェラーゼ発現レベルを向上するよう改変された。高レベル発現が観察されながらも、より高い発現が調節制御を改善したということは決定されなかった。
【０１０４】
本発明を以下の制限するものではない実施例によってさらに説明する。詳しくは、本発明の合成核酸分子は、その他の方法によって、ならびに、本明細書に記載される方法の変法によって導くことができる。
【実施例】
【０１０５】
（実施例１）
（合成コメツキムシ（ＲＤおよびＧＲ）ルシフェラーゼ核酸分子）
ＬｕｃＰｐ／ＹＧは、黄−緑色発光を発する野生型コメツキムシルシフェラーゼである（Ｗｏｏｄ，  １９８９）。ＹＧ＃８１−６Ｇ０１と名付けられたＬｕｃＰｐｌＹＧの変異株を考えた。ＹＧ＃８１−６Ｇ０１はペルオキシソームターゲッティングシグナルを欠き、ルシフェリンおよびＡＴＰについて低いＫＭを有し、野生型と比べて増大したシグナル安定性および増大した温度安定性を有する（ＰＣＴ／ＷＯ９９１４３３６）。ＹＧ＃８１−６Ｇ０１は、位置２２４のＡｌａをＶａｌに変更することによって緑色発光を発するよう（Ａ２２４Ｖは緑色シフト変異である）、またはアミノ酸置換Ａ２２４Ｈ、Ｓ２４７Ｈ、Ｎ３４６ＩおよびＨ３４８Ｑ（赤色シフト変異セット）を同時に導入することによって赤色発光を発するよう変異させた（ＰＣＴ／ＷＯ９５１８８５３）。
【０１０６】
親遺伝子としてＹＧ＃８１−６Ｇ０１を用い２種の合成遺伝子配列を設計した。一方は、緑色発光を発するルシフェラーゼ（ＧＲ）をコードし、もう一方は赤色発光を発するルシフェラーゼ（ＲＤ）をコードする。両遺伝子とも、１）哺乳類細胞における発現のために最適化されたコドン使用を有するよう、２）減少した数の転写調節部位、例えば、哺乳類転写因子結合部位、スプライス部位、ポリ（Ａ）部位およびプロモーター、ならびに原核生物（大腸菌）調節部位を有するよう、３）望ましくない制限部位、例えば、標準クローニング手順を干渉する可能性があるものを欠くよう、そして４）両方が同一細胞内に存在する場合に遺伝子再配列を最小化するために互いに比較して低いＤＮＡ配列同一性を有するよう設計した。さらに、所望の配列、例えば、コザック配列または制限酵素認識部位を同定し、導入してもよい。
【０１０７】
すべての設計基準を同時に同様に十分満たすことはできなかった。転写調節部位の減少について以下の優先順位を確立した：転写因子（ＴＦ）結合部位の排除に最高の優先順位を与え、続いて、スプライス部位およびポリ（Ａ）部位の排除、最後に、原核生物の調節部位に与えた。調節部位を除去する場合には、戦略は、最も重要な変化が最後に行われることを確実にするために、より重要でないものから最も重要なものへ働くこととした。次いで、配列を新規の優先順位のより低い部位の出現について再点検し、必要に応じてさらなる変更を行った。したがって、本明細書に記載されるコンピュータプログラムを用いて合成ＧＲおよびＲＤ遺伝子配列を設計するプロセスは、以下に詳述する５種の、場合により反復されるステップを含めた。
【０１０８】
１．コドン使用を最適化し、Ａ２２４Ｖを変更してＧＲｖｅｒ１を作製し、別にＡ２２４Ｈ、Ｓ２４７Ｈ、Ｈ３４８ＱおよびＮ３４６Ｉを変更してＲＤｖｅｒ１を作製した。これらの特定のアミノ酸変更は、配列に対するすべてのその後の操作を通じて維持した。
【０１０９】
２．望ましくない制限部位、原核生物の調節部位、スプライス部位、ポリ（Ａ）部位を除去し、それによってＧＲｖｅｒ２およびＲＤｖｅｒ２を作製した。
【０１１０】
３．転写因子結合部位を除去し（第１のパス）、上記のステップ２に列挙されるいずれかの新しく生じた望ましくない部位を除去し、それによってＧＲｖｅｒ３およびＲＤｖｅｒ３を作製した。
【０１１１】
４．上記のステップ３によって生じた転写因子結合部位を除去し（第２のパス）、上記のステップ２に列挙されるいずれかの新しく生じた望ましくない部位を除去し、それによってＧＲｖｅｒ４およびＲＤｖｅｒ４を作製した。
【０１１２】
５．上記のステップ４によって生じた転写因子結合部位を除去し（第３のパス）、上記のステップ２に列挙される部位がないことを確認し、それによってＧＲｖｅｒ５およびＲＤｖｅｒ５を作製した。
【０１１３】
６．ＧＲｖｅｒ５およびＲＤｖｅｒ５設計配列の断片に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いＰＣＲによって、実際の遺伝子を構築し、それによってＧＲ６およびＲＤ７を作製した。ＧＲ６は、配列決定の際に、アミノ酸位置４９のセリン残基がアスパラギンに変異されていることおよびアミノ酸位置２３０のプロリンがセリンに変異されていることがわかった（Ｓ４９Ｎ、Ｐ２３０Ｓ）。ＲＤ７は、配列決定の際に、アミノ酸位置３６のヒスチジンがチロシンに変異されていることがわかった（Ｈ３６Ｙ）。これらの変更はＰＣＲプロセスの間に生じた。
【０１１４】
４．上記のステップ６で記載された変異（ＧＲ６についてのＳ４９Ｎ、Ｐ２３０ＳおよびＲＤ７についてのＨ３６Ｙ）を戻し、ＧＲｖｅｒ５．１およびＲＤｖｅｒ５．１を作製した。
【０１１５】
５．ＲＤｖｅｒ５．１を、位置３５１のアルギニンコドンをグリシンコドンに変更することによってさらに改変し（Ｒ３５１Ｇ）、それによって、ＲＤｖｅｒ５．１と比較してスペクトル特性が改善されたＲＤｖｅｒ５．２を作製した。
【０１１６】
６．ＲＤｖｅｒ５．２を、発光強度を高めるようさらに変異させ、それによって４つのさらなるアミノ酸変更（Ｍ２Ｉ、Ｓ３４９Ｔ、Ｋ４８８Ｔ、Ｅ５３８Ｖ）と３つのサイレントな単一塩基変更をコードするＲＤ１５６−１Ｈ９を作製した（その開示内容が参照により本明細書に組み込まれる、２０００年８月２４日に出願された米国特許出願番号第０９／６４５，７０６号参照）。
【０１１７】
（１．コドン使用を最適化し、発光色を決定する変異を導入する）
この設計ステップの開始遺伝子配列はＹＧ＃８１−６Ｇ０１とした。
【０１１８】
ａ）コドン使用を最適化する：
この戦略はコドン使用を、ヒト細胞における最適発現に適応させること、同時に大腸菌低使用コドンを避けることである。これらの必要条件に基づいて、３以上のコドンを含む全てのアミノ酸について、ヒト細胞における発現にとって最良の２種のコドンを選択した（Ｗａｄａら、１９９０を参照のこと）。６コドンを含むアミノ酸についてのコドン対の選択では、選択に、最大数のミスマッチした塩基を有する対によったバイアスをかけ、最小配列同一性を有するＧＲおよびＲＤ遺伝子の設計を可能にした（コドン差異）：
Ａｒｇ：ＣＧＣ／ＣＧＴ  Ｌｅｕ：ＣＴＧ／ＴＴＧ  Ｓｅｒ：ＴＣＴ／ＡＧＣ
Ｔｈｒ：ＡＣＣ／ＡＣＴ  Ｐｒｏ：ＣＣＡ／ＣＣＴ  Ａｌａ：ＧＣＣ／ＧＣＴ
Ｇｌｙ：ＧＧＣ／ＧＧＴ  Ｖａｌ：ＧＴＣ／ＧＴＧ  Ｉｌｅ：ＡＴＣ／ＡＴＴ
コドンのこの選択に基づいて、ＹＧ＃８１−６Ｇ０１ルシフェラーゼタンパク質配列をコードする２種の遺伝子配列を、コンピュータで作製した。２種の遺伝子は、最小のＤＮＡ配列同一性を有し、同時にコドン使用が極めて類似するよう設計した。これを達成するために、２種の遺伝子中の各コドンを、交代様式で（例えば、Ａｒｇ（ｎ）は遺伝子１ではＣＧＣであり、遺伝子２ではＣＧＴであり、Ａｒｇ（ｎ＋１）は遺伝子１ではＣＧＴであり、遺伝子２ではＣＧＣである）、上記の制限されたリストからのコドンで置換した。
【０１１９】
設計プロセスにおけるその後のステップについては、その他の設計基準を満たすためにこの制限された最適コドン選択に対して変更を行わなくてはならないことが予想されたが、以下の、哺乳類細胞における低使用コドンはより高い優先順位の基準を満たすために必要とされない限り用いなかった：
Ａｒｇ：ＣＧＡ  Ｌｅｕ：ＣＴＡ  Ｓｅｒ：ＴＣＧ
Ｐｒｏ：ＣＣＧ  Ｖａｌ：ＧＴＡ  Ｉｌｅ：ＡＴＡ
また、以下の、大腸菌における低使用コドンも、差し支えのない場合は避けた（これらのうち３つが、哺乳類細胞についての低使用リストと一致していることは留意しなくてはならない）：
Ａｒｇ：ＣＧＡ／ＣＧＧ／ＡＧＡ／ＡＧＧ
Ｌｅｕ：ＣＴＡ  Ｐｒｏ：ＣＣＣ  Ｉｌｅ：ＡＴＡ。
【０１２０】
ｂ）発光色を決定する変異を導入する：
上記のように、２種のコドン最適化遺伝子配列のうち一方に、単一緑色シフト変異を導入し、もう一方に、４つの赤色シフト変異を導入した。
【０１２１】
この第１の設計ステップから得た２種の出力配列をＧＲｖｅｒ１（バージョン１ＧＲ）およびＲＤｖｅｒ１（バージョン１ＲＤ）と名付けた。それらのＤＮＡ配列は６３％同一である（５９４のミスマッチ）が、発光色を決定する、それらがコードするタンパク質は４個のアミノ酸しか異なっていない（ＤＮＡおよびタンパク質配列のアライメントについては、図２および３参照のこと）。
【０１２２】
表１および２は、一例として、ヒト遺伝子、親遺伝子ＹＧ＃８１−６Ｇ０１、コドン最適化合成遺伝子ＧＲｖｅｒ１およびＲＤｖｅｒ１ならびに設計プロセスのステップ５の完了後の最終バージョンの合成遺伝子（ＧＲｖｅｒ５およびＲＤｖｅｒ５）におけるバリンおよびロイシンのコドン使用を示す。
【０１２３】
【表２】
2008513021.tif 000004
（２．望ましくない制限部位、原核生物の調節部位、スプライス部位およびポリ（Ａ）部位を除去する）
この設計ステップの出発遺伝子配列は、ＧＲｖｅｒ１およびＲＤｖｅｒ１であった。
【０１２４】
ａ）望ましくない制限部位を除去する：
望ましくない制限部位の存在および位置を調べるために、両合成遺伝子の配列を、標準的な配列解析ソフトウェア（ＧｅｎｅＰｒｏバージョン６．１０、Ｒｉｖｅｒｓｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｅｎｔ．）を用いて制限酵素認識配列のデータベース（ＲＥＢＡＳＥバージョン７１２、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｒｅｂａｓｅ）に対して比較した。
【０１２５】
具体的には、以下の制限酵素を望ましくないとして分類した：
−ＢａｍＨ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｓｆｉ  Ｉ、Ｋｐｎ  Ｉ、Ｓａｃ  Ｉ、Ｍｌｕ  Ｉ、Ｎｈｅ  Ｉ、Ｓｍａ  Ｉ、Ｘｈｏ  Ｉ、Ｂｇｌ  Ｉ、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ、Ｎｃｏ  Ｉ、Ｎａｒ  Ｉ、Ｘｂａ  Ｉ、Ｈｐａ  Ｉ、Ｓａｌ  Ｉ、
−よく用いられるその他のクローニング部位：ＥｃｏＲ  Ｉ、ＥｃｏＲ  Ｖ、Ｃｌａ  Ｉ、
−８塩基カッター（複合構築物によく用いられる）、
−ＢｓｔＥ  ＩＩ（Ｎ末端融合を可能にする）
−Ｘｃｍ  Ｉ（Ｔ−ベクタークローニングのために用いられるＡ／Ｔオーバーハングを生成させることができる）。
合成遺伝子中に見られる場合に望ましくない制限部位を排除するために、合成遺伝子配列の１以上のコドンを上記１ａに記載したコドン最適化指針に従って変更した。
【０１２６】
ｂ）原核生物（大腸菌）の調節配列を除去する：
原核生物の調節配列の存在および位置を調べるために、両合成遺伝子の配列を、標準的な配列解析ソフトウェア（ＧｅｎｅＰｒｏ）を用いて以下のコンセンサス配列の存在について検索した：
−ＴＡＴＡＡＴ（プロモーターの−１０プリブノーボックス）
−ＡＧＧＡまたはＧＧＡＧ（リボソーム結合部位；下流１２塩基以内のメチオニンコドンと対形成する場合にのみ考慮される）。
合成遺伝子中に見られる場合にこのような調節配列を排除するために、合成遺伝子の１以上のコドンを上記の１ａで記載したコドン最適化指針に従って配列で変更した。
【０１２７】
ｃ）スプライス部位を除去する：
スプライス部位の存在および位置を調べるために、各合成遺伝子の一次ＲＮＡ転写物に対応するＤＮＡ鎖を、標準的な配列解析ソフトウェア（ＧｅｎｅＰｒｏ）を用いて以下のコンセンサス配列の存在について検索した（Ｗａｔｓｏｎら、１９８３を参照のこと）：
−スプライスドナー部位：ＡＧ│ＧＴＲＡＧＴ（エキソン│イントロン）、検索はＡＧＧＴＲＡＧおよびより低いストリンジェンシーＧＧＴＲＡＧＴについて実施した、
−スプライスアクセプター部位：（Ｙ）ｎＮＣＡＧ│Ｇ（イントロン│エキソン）、検索はｎ＝１で実施した。
合成遺伝子中に見られるスプライス部位を排除するために、合成遺伝子配列の１以上のコドンを上記の１ａで記載したコドン最適化指針に従って変更した。概して、一方の遺伝子におけるスプライスアクセプター部位は、もう一方の遺伝子にそれらを導入すること無く排除することが難しかったが、これはそれらが２つしかないＧｌｎコドン（ＣＡＧ）の一方を含む傾向があったためである。それらは、２種の遺伝子間の配列同一性をわずかに高めることを代償にＧｌｎコドンＣＡＡを両遺伝子中に配置することによって除去した。
【０１２８】
ｄ）ポリ（Ａ）部位を除去する：
ポリ（Ａ）部位の存在および位置を調べるために、両合成遺伝子の配列を、標準的な配列解析ソフトウェア（ＧｅｎｅＰｒｏ）を用いて以下のコンセンサス配列の存在について検索した：
−ＡＡＴＡＡＡ。
合成遺伝子中に見られる各ポリ（Ａ）付加部位を排除するために、合成遺伝子配列中の１以上のコドンを上記の１ａで記載したコドン最適化指針に従って変更した。この第２の設計ステップから得た２種の出力配列をＧＲｖｅｒ２およびＲＤｖｅｒ２と名付けた。それらのＤＮＡ配列は６３％同一であった（５９０のミスマッチ）。
【０１２９】
（３．転写因子（ＴＦ）結合部位を除去し、次いでステップ２ａ〜ｄを反復する）
この設計ステップの出発遺伝子配列は、ＧＲｖｅｒ２およびＲＤｖｅｒ２であった。
起こり得るＴＦ結合部位の存在、位置および同一性を調べるために、両合成遺伝子の配列をクエリー配列として用いて転写因子結合部位のデータベース（ＴＲＡＮＳＦＡＣ  ｖ３．２）を検索した。ＴＲＡＮＳＦＡＣデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｔｒａｎｓｆａｃ．ｇｂｆ．ｄｅ／ＴＲＡＮＳＦＡＣ／ｉｎｄｅｘ：ｈｔｍｌ）は、遺伝子調節ＤＮＡ配列（ＴＦ結合部位）およびそれらと結合し且つそれらを介して作用するタンパク質（ＴＦ）に関する情報を保有する。ＴＲＡＮＳＦＡＣリリース３．２のＳＩＴＥ表には、個々の（推定）ＴＦ結合部位（真核生物の遺伝子中のＴＦ結合部位、突然変異形成研究およびランダムオリゴヌクレオチド混合または具体的な理論考察に基づくインビトロ選択手順に起因する人工配列中のＴＦ結合部位、ならびにコンセンサス結合部位を含む）の４，４０１のエントリーが含まれている（ＦａｉｓｓｔおよびＭｅｙｅｒ，  １９９２から）。
【０１３０】
合成遺伝子配列中のこれらのＴＦ結合部位の位置を定め、示すために用いたソフトウェアツールはＴＥＳＳ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、ｈｔｔｐ：／／ａｇａｖｅ．ｈｕｍｇｅｎ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ｔｅｓｓ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）であった。フィルター処理した文字列ベースの検索オプションを、以下のユーザー定義の検索パラメータを用いて使用した：
−因子選択属性：生物分類
−検索パターン：哺乳類
−最大許容可能なミスマッチ％：０
−最小エレメント長：５
−最小対数尤度：１０
このパラメータ選択は、少なくとも５塩基長である哺乳類ＴＦ結合部位（データベース中の４，４０１のエントリーのうち約１，４００）のみが検索に含まれることを指定する。クエリー配列における完全マッチおよび最小対数尤度（ＬＬＨ）スコア１０を有するＴＦ結合部位のみが報告されることをさらに指定する。ＬＬＨスコアリング法は、明確なマッチに２を、部分的に曖昧なマッチ（例えば、ＡまたはＴがＷにマッチ）に１を、「Ｎ」に対するマッチに０を割り当てる。例えば、上記で指定したパラメータを用いる検索は、ＴＡＴＡＡ（配列番号５０）（ＬＬＨ＝１０）、ＳＴＲＡＴＧ（配列番号５１）（ＬＬＨ＝１０）およびＭＴＴＮＣＮＮＭＡ（配列番号５２）（ＬＬＨ＝１０）について、これら４種のＴＦ結合部位がクエリー配列中に存在する場合には「ヒット」（陽性結果またはマッチ）をもたらすが、ＴＲＡＴＧ（配列番号５３）（ＬＬＨ＝９）についてはもたらさない。検索パラメータを再評価するために、より低いストリンジェンシーの試験を設計プロセスの最後に実施した。
【０１３１】
ＴＥＳＳを、既知のＴＦ結合部位を含むニセのクエリー配列を用いて試験した際に、プログラムは、クエリー配列の３’末端で終了する部位に対するマッチを報告できないことがわかった。したがって、すべてのクエリー配列の３’末端に追加のヌクレオチドを加えてこの問題を解消した。
【０１３２】
上記のパラメータを用いるＴＦ結合部位についての第１の検索により、２種の合成遺伝子（ＧＲｖｅｒ２およびＲＤｖｅｒ２）の各々について、約１００個の転写因子結合部位（ヒット）が見い出された。上記の１ａに記載したコドン最適化指針に従って合成遺伝子配列の１以上のコドンを変更することによって、すべての部位を排除した。しかし、いくつかのこれらの変更が新規ＴＦ結合部位、その他の調節部位および新規制限部位を生じさせることが予想された。したがって、記載したように、ステップ２ａ〜ｄを反復し、４個の新規制限部位および２個の新規スプライス部位を除去した。この第３の設計ステップから得た２種の出力配列を、ＧＲｖｅｒ３およびＲＤｖｅｒ３と名付けた。それらのＤＮＡ配列は６６％同一である（５４１のミスマッチ）。
【０１３３】
（４．新規転写因子（ＴＦ）結合部位を除去し、次いで、ステップ２ａ〜ｄを反復する）
この設計ステップの出発遺伝子配列は、ＧＲｖｅｒ３およびＲＤｖｅｒ３であった。
この第４のステップは、ステップ３に記載したプロセスの繰り返しである。新規に導入されたＴＦ結合部位の検索により、２種の合成遺伝子の各々について約５０のヒットが得られた。上記の１ａに記載したコドン最適化指針に全体的に従って、合成遺伝子配列の１以上のコドンを変更することによって、すべての部位を排除した。しかし、より高い使用コドン〜中程度使用コドンを用いて、すべてのＴＦ結合部位の排除が可能であった。最低優先順位は、ＧＲおよびＲＤ遺伝子間で低い配列同一性を維持することとした。次いで、記載したように、ステップ２ａ〜ｄを反復した。この第４の設計ステップから得た２種の出力配列を、ＧＲｖｅｒ４およびＲＤｖｅｒ４と名付けた。それらのＤＮＡ配列は６８％同一であった（５０６のミスマッチ）。
【０１３４】
（５．新規転写因子（ＴＦ）結合部位を除去し、次いで、ステップ２ａ〜ｄを反復する）
この設計ステップの出発遺伝子配列はＧＲｖｅｒ４およびＲＤｖｅｒ４であった。
この第５のステップは、上記のステップ３に記載されるプロセスの別の繰り返しである。ステップ４において導入された新規ＴＦ結合部位の検索によって、２種の合成遺伝子の各々について約２０のヒットが得られた。上記の１ａに記載したコドン最適化指針に全体的に従って、合成遺伝子配列の１以上のコドンを変更することによって、すべての部位を排除した。しかし、より高い使用コドン〜中程度使用コドン（これらはすべて「好ましい」と考えられる）を用いて、すべてのＴＦ結合部位の排除が可能であった。最低優先順位は、ＧＲおよびＲＤ遺伝子間で低い配列同一性を維持することとした。１つのアクセプタースプライス部位のみは排除できなかった。次いで、記載したように、ステップ２ａ〜ｄを反復した。最終ステップとして、ステップ３で指定した両遺伝子中にすべてのＴＦ結合部位がないことを確認した。この第５の最後の設計ステップから得た２種の出力配列をＧＲｖｅｒ５およびＲＤｖｅｒ５と名付けた。それらのＤＮＡ配列は６９％同一である（５０４のミスマッチ）。
【０１３５】
（ＧＲｖｅｒ５およびＲＤｖｅｒ５のさらなる評価）
ａ）ＴＥＳＳに低ストリンジェンシーパラメータを使用する：
上記のステップ３に記載したとおりにＴＦ結合部位の検索を反復したが、より低いストリンジェントのユーザー定義のパラメータを用いた：
−ＬＬＨを１０のかわりに９に設定することは、新規ヒットをもたらさなかった、
−ＬＬＨを０〜８（含有）に設定することによって、２つのさらなる部位、ＭＡＭＡＧ（２２ヒット）およびＣＴＫＴＫ（２４ヒット）についてヒットがもたらされた、
−ＬＬＨを８に、最小エレメント長を４に設定することによって、検索により、（上記の２つの部位に加え）ＡＰ−１、ＮＦ−１およびｃ−Ｍｙｂについて異なる４塩基部位が得られたが、これらは上記のステップ３〜５において排除される、それらのより長い制限コンセンサス部位の短縮型である。
新規部位を導入せずにこれらの部位の完全排除を試みることは現実的ではなかったので、さらなる変更は行わなかった。
【０１３６】
ｂ）異なるデータベースを検索する：
真核生物のプロモーターデータベース（リリース４５）は、真核生物の遺伝子の確実にマッピングされた転写開始部位についての情報（１２５３種の配列）を含む。このデータベースを、アメリカ国立バイオテクノロジー情報センターのサイト（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）で、（ほぼ同一の配列を迅速に見い出すよう最適化された；Ａｌｔｓｃｈｕｌら、１９９０を参照のこと）デフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴＮ１．４．１１を使用して検索した。このアプローチを試験するために、ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサーを含むｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌベクター配列の一部をクエリー配列として用いたところ、予期されたＳＶ４０配列に対するヒットが得られた。２種の合成遺伝子をクエリー配列として用いた場合にはヒットは見い出されなかった。
【０１３７】
（ＧＲｖｅｒ５およびＲＤｖｅｒ５合成遺伝子特性の概要）
両遺伝子とも、この段階ではまだ単にコンピュータにおける「仮想的な」配列であったが、哺乳類高使用コドンを強く支持し、哺乳類および大腸菌低使用コドンを最小にするコドン使用を有する。
【０１３８】
両遺伝子はまた、５以上の明確な塩基からなる真核生物のＴＦ結合部位、ドナーおよびアクセプタースプライス部位（１つの例外：ＧＲｖｅｒ５は１つのスプライスアクセプター部位を含む）、ポリ（Ａ）部位、特定の原核生物（大腸菌）の調節配列および望まない制限部位を完全に欠く。
【０１３９】
ＧＲｖｅｒ５とＲＤｖｅｒ５との間の遺伝子配列同一性は６９％に過ぎないが（５０４の塩基ミスマッチ）、それらによってコードされるタンパク質は９９％同一である（４アミノ酸ミスマッチ）。それらの、親配列ＹＧ＃８１−６Ｇ１との同一性は７４％（ＧＲｖｅｒ５）および７３％（ＲＤｖｅｒ５）である。それらの塩基組成は、親ＹＧ＃８１−６Ｇ０１の４０．２％ＧＣと比較して、４９．９％ＧＣ（ＧＲｖｅｒ５）および４９．５％ＧＣ（ＲＤｖｅｒ５）である。
【０１４０】
（合成遺伝子の構築）
２種の合成遺伝子は、サーモサイクラーにおける合成オリゴヌクレオチドからの組み立てと、それに続く全長遺伝子のＰＣＲ増幅によって構築した（Ｓｔｅｍｍｅｒら、（１９９５）Ｇｅｎｅ．１６４，４９〜５３頁と同様）。合成遺伝子の設計目標と干渉する意図しない変異は修正した。
【０１４１】
ａ）合成オリゴヌクレオチドの設計：
合成オリゴヌクレオチドは、大部分は４０マーであり、各設計された遺伝子の完全な両鎖（１，６２６ｂｐ）およびクローニングに必要とされる隣接領域（各遺伝子について全体で１，９５０ｂｐ）を集団でコードする。一方の鎖を指定する５’および３’境界は、通常、反対側の鎖を指定するオリゴヌクレオチドの境界に対して２０塩基の平均オフセット／重複を生じるよう配置した。
【０１４２】
両遺伝子の隣接領域の末端は、増幅プライマー
【０１４３】
【化１】
2008513021.tif 000005
の末端とマッチさせ、本研究者の大腸菌発現ベクターｐＲＡＭ（ＷＯ９９／１４３３６）への遺伝子のクローニングを可能にした。
【０１４４】
全部で１８３種のオリゴヌクレオチドを設計した：上流および下流隣接配列を集団でコードする１５種のオリゴヌクレオチドおよび２種の遺伝子の両鎖をコードする１６８（４×４２）種のオリゴヌクレオチド。
【０１４５】
１８３種のオリゴヌクレオチドすべてをＯＬＩＧＯソフトウェアのヘアピン分析にかけ（Ｗｏｊｃｉｅｃｈ  Ｒｙｃｈｌｉｋによる、ＯＬＩＧＯ  ４．０プライマー分析ソフトウェア（ｃ）１９８９−１９９１）、有害である可能性のある分子内ループ形成を同定した。分析結果を評価するための指針は、Ｄｒ．Ｓｉｍｓ（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ  Ｃｕｓｔｏｍ  Ｇｅｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ部門）の推奨に従って設定した：ΔＧ＜−１０のオリゴ形成ヘアピンは避けなければならず、オリゴヌクレオチドの３’末端を含むΔＧ≦−７のヘアピンを形成するものも避けるべきであるが、全体でΔＧ≦−５であるものは、この適用に対して問題を引き起こさないはずである。この分析によって、ΔＧが−７．１〜−４．９の間のヘアピンを形成し得る２３種のオリゴヌクレオチドを同定した。これらのうち５種は、ブロックされているかほぼブロックされている３’末端（０〜３個の遊離塩基）を有し、それらの３’末端の１〜４個の塩基を除去することと、その塩基を隣接するオリゴヌクレオチドに付加することによって再設計した。
【０１４６】
ポリ（Ａ）テールに対して相補的である配列を包含する４０マーのオリゴヌクレオチドは、極めて低い複雑度の３’末端（１３個の連続するＴ塩基）を有していた。高い複雑度の３’末端を有するさらなる４０マーを設計したが、その結果、反対の鎖のその相補オリゴヌクレオチドの１種との重複が減少した（２０塩基のかわりに１１塩基）。
【０１４７】
サーモサイクラーベースの組み立て反応において使用するためのオリゴヌクレオチドを設計したにもかかわらず、それらははまた、遺伝子構築のためのライゲーションベースのプロトコールにおいても使用できた。このアプローチでは、オリゴヌクレオチドを、ペアワイズ様式でアニーリングし、得られた短い二本鎖断片を、粘着オーバーハングを用いてライゲーションする。しかし、これには、すべてのオリゴヌクレオチドがリン酸化されることが必要である。
【０１４８】
ｂ）遺伝子の組み立ておよび増幅
第１のステップでは、２種の合成遺伝子の各々を９８種のオリゴヌクレオチドから別個の反応で組み立てた。各反応の総容積は５０μｌとした：
０．５μＭ  オリゴヌクレオチド（＝０．２５ｐｍｏｌｅの各オリゴ）
１．０Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ
０．０２Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ（各）
０．１％  ゼラチン
サイクリング条件：（９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間および７２℃で３０秒間）×５５サイクル。
【０１４９】
第２のステップでは、組み立てた合成遺伝子の各々を別個の反応で増幅した。各反応の総容積は５０μｌとした：
２．５ｌ  組み立て反応液
５．０Ｕ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ
０．１Ｕ  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ
１Ｍ  各プライマー（ｐＲＡＭｔａｉｌｕｐ、ｐＲＡＭｔａｉｌｄｎ）
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ（各）
サイクリング条件：（９４℃で２０秒間、６５℃で６０秒間、７２℃で３分間）×３０サイクル。
【０１５０】
組み立て且つ増幅した遺伝子を、ｐＰＡＭベクターにサブクローニングし、大腸菌で発現させたところ、１〜２％の発光ＧＲまたはＲＤクローンが得られた。５個のＧＲおよび５個のＲＤクローンを単離し、さらに分析した。５個のＧＲクローンのうち、３個は正しいインサートサイズを有しており、そのうち１個は弱い発光であり、１個は変更された制限パターンを有していた。５個のＲＤクローンのうち、２個が正しい大きさのインサートを有していたが制限パターンが変更されており、それらのうち１個は弱い発光であった。全体として、分析により、遺伝子中の多数の変異の存在、おそらくは、組み立ておよび増幅反応において導入されたエラーの結果が示された。
【０１５１】
ｃ）修正組み立ておよび増幅
本発明者らは、全長合成遺伝子中に存在する多数の変異を除去するために、各遺伝子について、プルーフリーディングＤＮＡポリメラーゼＴｌｉを用いてさらなる組み立ておよび増幅反応を実施した。組み立て反応には、９８種のＧＲまたはＲＤオリゴヌクレオチドに加え、上記の変異を有する対応する全長クローンに由来する少量のＤＮＡを含めた。これによりオリゴが、鋳型中に存在する変異を修正することが可能となる。
【０１５２】
各合成遺伝子について、以下の組み立て反応を実施した。各反応の総容積は５０μｌとした：
０．５μＭ  オリゴヌクレオチド（＝０．２５ｐｍｏｌｅの各オリゴ）
０．０１６ｐｍｏｌ  プラスミド（正しいインサートサイズを有するクローンの混合物）
２．５Ｕ  Ｔｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ（各）
０．１％  ゼラチン
サイクリング条件：９４℃で３０秒間、次いで、（９４℃で３０秒間、５２℃で３０秒間、７２℃で３０秒間）を５５サイクル、次いで７２℃で５分間。
【０１５３】
各組み立て反応物で以下の増幅反応を実施した。各増幅反応の総容積は５０μｌとした：
１〜５μｌの組み立て反応物
４０ｐｍｏｌの各プライマー（ｐＲＡＭｔａｉｌｕｐ、ｐＲＡＭｔａｉｌｄｎ）
２．５ＵのＴｌｉ  ＤＮＡポリメラーゼ
２ｍＭ  ＭｇＣｌ２
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ（各）
サイクリング条件：９４℃で３０秒間、次いで、（９４℃で２０秒間、６５℃で６０秒間、７２℃で３分間）を３０サイクル、次いで７２℃で５分間。
【０１５４】
修正組み立ておよび増幅ステップから得られた遺伝子を、ｐＰＡＭベクターにサブクローニングし、大腸菌で発現させたところ、７５％の発光ＧＲまたはＲＤクローンが得られた。ＷＯ９９／１４３３６に記載されるスクリーニングロボットを用いて４４個のＧＲおよび４４個のＲＤクローンを分析した。６個の最良のＧＲおよびＲＤクローンを手作業で分析し、１個の最良のＧＲおよびＲＤクローンを選択した（ＧＲ６およびＲＤ７）。ＧＲ６の配列解析により、コード領域中に２つの点変異が示され、その双方がアミノ酸置換をもたらした（Ｓ４９ＮおよびＰ２３０Ｓ）。ＲＤ７の配列解析により、コード領域中に３つの点変異が示され、それらのうち１つがアミノ酸置換をもたらした（Ｈ３６Ｙ）。サイレント点変異は、合成遺伝子の全体的な設計基準と矛盾する調節部位または制限部位は全く導入しなかったことが確認された。
【０１５５】
ｄ）意図しないアミノ酸置換の回復
ＧＲ６およびＲＤ７合成遺伝子中に存在する意図しないアミノ酸置換を、ＧＲｖｅｒ５およびＲＤｖｅｒ５設計配列とマッチするよう部位特異的突然変異誘発によって逆転させ、それによってＧＲｖｅｒ５．１およびＲＤｖｅｒ５．１を作製した。変異した領域のＤＮＡ配列を配列解析によって確認した。
【０１５６】
ｅ）スペクトル特性を改善する
アミノ変更（Ｒ３５１Ｇ）を導入することによってＲＤｖｅｒ５．１遺伝子をさらに改変してそのスペクトル特性を改善し、それによってＲＤｖｅｒ５．２を作製した。
【０１５７】
（ＲＤおよびＧＲ遺伝子を含むｐＧＬ３ベクター）
親コメツキムシルシフェラーゼＹＧ＃８１−６Ｇ１（「ＹＧ」）および合成コメツキムシルシフェラーゼ遺伝子ＧＲｖｅｒ５．１（「ＧＲ」）、ＲＤｖｅｒ５．２（「ＲＤ」）およびＲＤ１５６−１Ｈ９を、４種のｐＧＬレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）にクローニングした：
−ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ＝プロモーターなし、エンハンサーなし
−ｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ＝ＳＶ４０プロモーター、ＳＶ４０エンハンサー
−ｐＧＬ３−Ｅｎｈａｎｃｅｒ＝ＳＶ４０エンハンサー（ルシフェラーゼコード配列の３’）
−ｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ＝ＳＶ４０プロモーター。
【０１５８】
ＧＲおよびＲＤ合成遺伝子の組み立てに用いたプライマーは、それらの遺伝子のｐＰＡＭベクターへのクローニングを容易にした。哺乳類細胞における分析のために、遺伝子をｐＧＬ３ベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）に導入するために、ｐＰＡＭベクター中の各遺伝子（ＰＲＡＭ  ＲＤｖｅｒ５．１、ｐＲＡＭ  ＧＲｖｅｒ５．１およびｐＲＡＭ  ＲＤ１５６−１Ｈ９）を増幅して、遺伝子の５’末端にＮｃｏ  Ｉ部位および３’末端にＸｂａ  Ｉ部位を導入した。ｐＲＡＭ  ＲＤｖｅｒ５．１およびｐＲＡＭ  ＧＲｖｅｒ５．１のプライマーは以下の通りであった：
ＧＲ→５’  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＣＧ  ＴＧＡ  ＧＡＡ  ３’（配列番号５６）または
ＲＤ→５’  ＧＧＡ  ＴＣＣ  ＣＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＡＣＧ  ＣＧＡ  ３’（配列番号５７）および
５’  ＣＴＡ  ＧＣＴ  ＴＴＴ  ＴＴＴ  ＴＣＴ  ＡＧＡ  ＴＡＡ  ＴＣＡ  ＴＧＡ  ＡＧＡ  Ｃ  ３’（配列番号５８）。
【０１５９】
ｐＲＡＭ  ＲＤ１５６−１Ｈ９のプライマーは、以下の通りであった：
５’  ＧＣＧ  ＴＡＧ  ＣＣＡ  ＴＧＧ  ＴＡＡ  ＡＧＣ  ＧＴＧ  ＡＧＡ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＴＣ  ３’（配列番号５９）および
５’  ＣＣＧ  ＡＣＴ  ＣＴＡ  ＧＡＴ  ＴＡＧ  ＴＡＡ  ＣＣＧ  ＣＣＧ  ＧＣＣ  ＴＴＣ  ＡＣＣ  ３’（配列番号６０）。
【０１６０】
ＰＣＲには以下を含めた：
１００ｎｇ  ＤＮＡプラスミド
１μＭ  プライマー上流
１μＭ  プライマー下流
０．２ｍＭ  ｄＮＴＰ
１×バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）
５ユニット  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）
５０μｌまでの滅菌ナノピュアＨ２Ｏ。
【０１６１】
サイクリングパラメータは以下とした：９４℃で５分間、（９４℃で３０秒間、５５℃で１分間および７２℃で３分間）×１５サイクル。精製したＰＣＲ産物をＮｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、同様にＮｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化したｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌとライゲーションし、ライゲーションされた産物を大腸菌に導入した。ルシフェラーゼ遺伝子をその他のｐＧＬ３レポーターベクター（ｂａｓｉｃ、ｐｒｏｍｏｔｅｒおよびｅｎｈａｎｃｅｒ）に挿入するために、各ルシフェラーゼ遺伝子を含むｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクターをＮｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、同様にＮｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化したその他のｐＧＬ３ベクターとライゲーションし、ライゲーションされた産物を大腸菌に導入した。ｐＧＬ３ベクター中のＧＲｖｅｒ５．１およびＲＤｖｅｒ５．１（およびＲＤ１５６−１Ｈ９、以下参照）核酸配列によってコードされるポリペプチドは、オリゴヌクレオチド中の開始コドンのＮｃｏ  Ｉ部位の結果として位置２にバリンへのアミノ酸置換を有することは留意されたい。
【０１６２】
内部Ｎｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉ部位のために、ＹＧ＃８１−６Ｇ０１中の天然遺伝子をコード領域の上流のＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位から下流のＨｐａ  Ｉ部位まで増幅し、これはＧＲおよびＲＤクローンに見られる隣接配列を含んだ。上流プライマー（５’−ＣＡＡ  ＡＡＡ  ＧＣＴ  ＴＧＧ  ＣＡＴ  ＴＣＣ  ＧＧＴ  ＡＣＴ  ＧＴＴ  ＧＧＴ  ＡＡＡ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＡＡＧ  ＣＧＡ  ＧＡＧ−３’；配列番号６１）および下流プライマー（５’−ＣＡＡ−ＴＴＧ  ＴＴＧ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＡＣＴ  ＴＧＴ  ＴＴＡ  ＴＴ−３’；配列番号６２）をＹＧ＃８１−６Ｇ０１と混合し、上記のＰＣＲ条件を用いて増幅した。精製したＰＣＲ産物を、Ｎｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、同様にＨｉｎｄ  ＩＩＩおよびＨｐａ  Ｉで消化したｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌとライゲーションし、ライゲーションされた産物を大腸菌に導入した。ＹＧ＃８１−６Ｇ０１をその他のｐＧＬ３レポーターベクター（ｂａｓｉｃ、ｐｒｏｍｏｔｅｒおよびｅｎｈａｎｃｅｒ）に挿入するために、ＹＧ＃８１−６Ｇ０１を含むｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクターをＮｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、同様にＮｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化したその他のｐＧＬ３ベクターとライゲーションし、ライゲーションされた産物を大腸菌に導入した。ｐＧＬ３ベクター中のＹＧ＃８１−６Ｇ０１のクローンは、塩基７８６でＡの代わりにＣを有し、これが残基２６２でＰｈｅからＬｅｕへのアミノ酸配列の変更をもたらすことは留意されたい。位置２６２の変更されたアミノ酸が酵素の生化学に影響を及ぼすかどうかを調べるために、ＹＧ＃８１−６Ｇ０１のクローンを元の配列に類似するよう変異させた。次いで、大腸菌における発現、物理的安定性、基質結合および発光出力速度論について両クローンを試験した。有意な相違は見られなかった。
【０１６３】
合成遺伝子および親遺伝子から発現された部分精製した酵素を用いて、ルシフェリンおよびＡＴＰのＫｍを調べた（表３参照のこと）。
【０１６４】
【表３】
2008513021.tif 000006
インビトロ真核生物転写／翻訳反応もまた、ＰｒｏｍｅｇａのＴＮＴ  Ｔ７  Ｑｕｉｃｋシステムを用い、製造業者の使用説明書に従って実施した。発光レベルは、合成ＧＲおよびＲＤ遺伝子については、それぞれ、親遺伝子（ルミノメータースペクトル感度について補正された）と比較して、１〜３７倍および１〜７７倍高かった（反応時間に応じて）。
【０１６５】
合成コメツキムシルシフェラーゼ遺伝子および野生型コメツキムシ遺伝子が哺乳類細胞において改善された発現を有するかどうかを試験するために、合成遺伝子および親遺伝子の各々を一連のｐＧＬ３ベクターにクローニングし、ＣＨＯ細胞に導入した（表８）。すべての場合において、合成コメツキムシ遺伝子は天然遺伝子よりも高い発現を示した。具体的には、合成ＧＲおよびＲＤ遺伝子の発現は、それぞれ、親の発現よりも１９００倍および４０倍高かった（天然ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子と比較することによって標準化したトランスフェクション効率）。さらに、データ（ｂａｓｉｃ対ｃｏｎｔｒｏｌベクター）は、合成遺伝子が低下した基礎レベル転写を有することを示す。
【０１６６】
さらに、ｃｏｎｔｒｏｌに対する活性のパーセンテージが天然および合成遺伝子間で比較されるｅｎｈａｎｃｅｒベクターを用いる実験では、データは、合成遺伝子は異常な転写特性の危険性が低下しているということを示した。詳しくは、親遺伝子は、ベクター中のエンハンサーによって活性化される１以上の内部転写調節配列を含み、従って、レポーター遺伝子として適さないと思われたが、合成ＧＲおよびＲＤ遺伝子は鮮やかなレポーター応答を示した（天然ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子と比較することによって標準化されたトランスフェクション効率）。表８参照。
【０１６７】
（実施例２）
（合成ウミシイタケルシフェラーゼ核酸分子）
調製した合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子は、１）導入されたコザック配列、２）哺乳類（ヒト）発現のために最適化されたコドン使用、３）不要の制限部位の低減または排除、４）原核生物の調節部位（リボソーム結合部位およびＴＡＴＡボックス）の除去、５）スプライス部位およびポリ（Ａ）部位の除去ならびに６）哺乳類転写因子結合配列の低減または排除を含んでいた。
【０１６８】
コドン最適化と、転写因子結合部位およびその他の調節部位ならびに制限部位の除去とからなるラウンドを繰り返すことによる、合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のコンピュータを使用した設計のプロセスは、以下の３つのステップで説明できる：
１．野生型ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を親遺伝子として用い、コドン使用を最適化し、１個のアミノ酸を変更して（Ｔ→Ａ）コザックコンセンサス配列を作製し、望ましくない制限部位を排除し、それによって合成遺伝Ｒｌｕｃｖｅｒ１を作製した。
【０１６９】
２．原核生物の調節部位、スプライス部位、ポリ（Ａ）部位および転写因子（ＴＦ）結合部位を除去する（第１のパス）。次いで、新規に作製されたＴＦ結合部位を除去する。次いで、新規に生じた望ましくない制限酵素部位、原核生物の調節部位、スプライス部位およびポリ（Ａ）部位を、新規ＴＦ結合部位を導入せずに除去する。これによってＲｌｕｃｖｅｒ２を作製した。
【０１７０】
３．Ｒｌｕｃｖｅｒ２の３個の塩基を変更し、それによってＲｌｕｃ−ｆｉｎａｌを作製した。
【０１７１】
４．次いで、Ｒｌｕｃ−ｆｉｎａｌ設計配列に対応する合成オリゴヌクレオチドから実際の遺伝子を構築した。組み立てまたはＰＣＲプロセスに起因するすべての変異を修正した。この遺伝子がＲｌｕｃ−ｆｉｎａｌである。
【０１７２】
（コドン選択）
Ｇｅｎｂａｎｋ（受託番号Ｍ６３５０１）のウミシイタケルシフェラーゼ配列を用いて出発し、ヒト細胞における最適発現のためのコドン使用に基づいて、また、大腸菌低使用コドンを避けるようコドンを選択した。ヒト細胞における発現のための最良のコドン（または同様の頻度で見られる場合には最良の２種のコドン）を、２以上のコドンを含むすべてのアミノ酸について選択した（Ｗａｄａら、１９９０）：
【０１７３】
【化２】
2008513021.tif 000007
１個のアミノ酸に対して２種のコドンが選択される場合には、それらを交互方式で用いた。合成遺伝子のその他の基準を満たすために、最初の最適コドン選択を後にある程度改変した。例えば、コザック配列の導入には、アミノ酸位置２でＡｌａに対してＧＣＴの使用が必要であった（以下を参照のこと）。
【０１７４】
哺乳類細胞における以下の低使用コドンは、必要でない限り用いなかった：Ａｒｇ：ＣＧＡ、ＣＧＵ；Ｌｅｕ：ＣＴＡ、ＵＵＡ；Ｓｅｒ：ＴＣＧ；Ｐｒｏ：ＣＣＧ；Ｖａｌ：ＧＴＡおよびＩｌｅ：ＡＴＡ。また、大腸菌における以下の低使用コドンも、差し支えのない場合は避けた（これらのうち３つが、哺乳類細胞についての低使用リストと一致していることは留意しなくてはならない）：Ａｒｇ：ＣＧＡ／ＣＧＧ／ＡＧＡ／ＡＧＧ、Ｌｅｕ：ＣＴＡ；Ｐｒｏ：ＣＣＣ；Ｉｌｅ：ＡＴＡ。
【０１７５】
（コザック配列の導入）
コザック配列：５’ａａｃｃＡＴＧＧＣＴ３’（配列番号６３）（Ｎｃｏ  Ｉ部位に下線が引かれており、コード領域は大文字で示されている）を合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子に導入した。コザック配列の導入は、２番目のアミノ酸をＴｈｒからＡｌａ（ＧＣＴ）に変更する。
【０１７６】
（望ましくない制限部位の除去）
実施例１に記載したように、ＲＥＢＡＳＥバージョン８０８（１９９８年８月１日にアップデートされた；制限酵素データベース；ｗｗｗ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｒｅｂａｓｅ）を用いて、望ましくない制限部位を同定した。以下の望ましくない制限部位（実施例１において記載したものに加えて）を、実施例１に記載したプロセスに従って除去した：ＥｃｏＩＣＲ  Ｉ、ＮｄｅＩ、ＮｓｉＩ、ＳｐｈＩ、ＳｐｅＩ、ＸｍａＩ、ＰｓｔＩ。
【０１７７】
すべてのこれらの変更を取り入れるウミシイタケルシフェラーゼ（Ｒｌｕｃ）のバージョンは、Ｒｌｕｃｖｅｒ１である。
【０１７８】
（原核生物（大腸菌）の調節配列、スプライス部位およびポリ（Ａ）部位の除去）
転写調節部位を排除するための優先順位およびプロセスは、実施例１に記載したとおりとした。
【０１７９】
（ＴＦ結合部位の除去）
実施例１に記載したものと同一の、プロセス、ツールおよび基準を用いたが、ＴＲＡＮＳＦＡＣデータベースの新規バージョン３．３を用いた。
【０１８０】
Ｒｌｕｃｖｅｒ１から原核生物の調節配列、スプライス部位およびポリ（Ａ）部位を除去した後に、ＴＦ結合部位についての第１の検索によって約６０のヒットが同定された。合成ウミシイタケ遺伝子のアミノ酸配列を変更せずに除去できなかった３つを除き、すべての部位を排除した
１．ＣＡＣ結合タンパク質Ｔ０００７６のＷ（ＴＧＧＴＧＧ）に対する２つのコドンから構成される位置６３の部位、
２．ｍｙｃ−ＤＦ１  Ｔ００５１７のＫＭＶ（ＡＡＮ  ＡＴＧ  ＧＴＮ）に対するコドンから構成される位置５２２の部位、
３．ｍｙｃ−ＤＦ１  Ｔ００５１７のＥＭＧ（ＧＡＲ  ＡＴＧ  ＧＧＮ）に対するコドンから構成される位置８８５の部位。
（新規に導入された）ＴＦ結合部位についてその後の第２の検索により約２０のヒットが得られた。上記の３つの部位のみは残し、すべての新規部位を排除した。最後に、新規に導入された制限部位、原核生物の調節配列、スプライス部位およびポリ（Ａ）部位はいずれも、可能であれば新規ＴＦ結合部位を導入することなく除去した。
【０１８１】
Ｒｌｕｃｖｅｒ２が得られた。
【０１８２】
実施例１においてと同様、ＴＥＳＳフィルター処理文字列検索についてより低いストリンジェンシーの検索パラメータを指定し、合成ウミシイタケ遺伝子をさらに評価した。
【０１８３】
ＬＬＨを１０から９に減少させ、最小エレメント長を５から４に減少させると、ＴＥＳＳフィルター処理文字列検索はいずれの新規ヒットも示さなかった。上記に列挙したパラメータ変更に加え、生物分類を「哺乳類」から「脊椎動物」に拡大した場合に、検索によって、さらに４つのみのＴＦ結合部位が得られた。Ｍｉｎ  ＬＬＨを８と０との間にさらに減少した場合には、検索によって、Ｒｌｕｃｖｅｒ２中に４つのマッチを組み合わせて有する２つのさらなる５塩基部位（ＭＡＭＡＧおよびＣＴＫＴＫ）、ならびにいくつかの４塩基部位が示された。実施例１においてと同様、ＥＰＤ（真核生物のプロモーターデータベース、リリース４５）中のエントリーに対するヒットについて、Ｒｌｕｃｖｅｒ２を調べた。３つのヒットを、１つはＭｕｓ筋プロモーターＨ−２Ｌ＾ｄに対するもの（Ｃｅｌｌ，４４，２６１（１９８６））、１つは単純ヘルペスウイルス１型プロモーターｂ’ｇ’２．７ｋｂに対するもの、１つはヒトＤＨＦＲプロモーター（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７６，１６９（１９８４））に対するものと決定した。しかし、Ｒｌｕｃｖｅｒ２にさらなる変更は行わなかった。
【０１８４】
（Ｒｌｕｃｖｅｒ２の特性の概要）
−３０種の低使用コドンのすべてを排除した。コザック配列の導入により、２番目のアミノ酸をＴｈｒからＡｌａに変更した；
−塩基組成：５５．７％ＧＣ（ウミシイタケ野生型親遺伝子：３６．５％）；
−１つの望ましくない制限部位は排除できなかった：位置４８８のＥｃｏＲ  Ｖ；
−合成遺伝子は原核生物のプロモーター配列を有していなかったが、位置８６７〜７３の（Ｍｅｔコドンの約１３塩基上流）１つの可能性ある機能的リボソーム結合部位（ＲＢＳ）を排除できなかった；
−すべてのポリ（Ａ）部位を排除した；
−スプライス部位：２つのドナースプライス部位は排除できなかった（両方ともアミノ酸配列ＭＧＫを共有する）；
−ＴＦ部位：＞４の明確な塩基からなるコンセンサスを含むすべての部位を排除し（約２８０のＴＦ結合部位を除去し）、アミノ酸配列の変更を避けることを優先したために３つを例外とした。
【０１８５】
ｐＧＬ３に導入した場合には、Ｒｌｕｃ−ｆｉｎａｌはコザック配列（ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴ；配列番号６５）を有する。Ｒｌｕｃｖｅｒ２に対するＲｌｕｃ−ｆｉｎａｌ中の変更は、遺伝子組み立ての間に導入された。１つの変更は位置６１９のＣからＡであり、これは真核生物のプロモーター配列を排除し、遺伝子を組み立てるために用いられる対応するオリゴヌクレオチド中のヘアピン構造の安定性を低下させた。その他の変更は、位置２１８〜２２０でのＣＧＣからＡＧＡへの変更を含んでいた（ＰＣＲにとってより良好なオリゴヌクレオチドをもたらした）。
【０１８６】
（遺伝子組み立て戦略）
合成ウミシイタケルシフェラーゼに用いた遺伝子組み立てプロトコールは、実施例１において記載したものと同様とした。
【０１８７】
【化３】
2008513021.tif 000008
得られた合成遺伝子断片を、Ｎｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉを用いてｐＲＡＭベクターにクローニングした。正しい大きさのインサートを有する２つのクローンを配列決定した。各クローンから得た合成遺伝子中に４〜６の変異が見い出された。これらの変異を部位特異的突然変異誘発（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ製のＧｅｎｅ  Ｅｄｉｔｏｒ）によって固定化し、これら２種の遺伝子間で正しい領域を交換した。修正した遺伝子を、配列決定によって確認した。
【０１８８】
（その他のベクター）
ｐＧＬ−３  ｃｏｎｔｒｏｌベクター骨格中の合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のための発現ベクターを調製するために、各酵素２μｌおよび１０×バッファーＢ５μｌを含む最終容積５０μｌ（ナノピュア水を用いて容積を５０μｌにした）において５μｇのｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌをＮｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化した。消化反応物は、３７℃で２時間インキュベートし、全混合物を、１×ＴＡＥ中１％アガロースゲルに流した。所望のベクター骨格断片をＱｉａｇｅｎのＱＩＡＱｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて精製した。
【０１８９】
天然ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子断片を、２種のオリゴヌクレオチド、Ｎｃｏ  Ｉ−ＲＬ−ＦおよびＸｂａ  Ｉ−ＲＬ−Ｒを用いてｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクターにクローニングし、ｐＲＬ−ＣＭＶを鋳型として用いて天然ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子をＰＣＲ増幅した。Ｎｃｏ  Ｉ−ＲＬ−Ｆの配列は
【０１９０】
【化４】
2008513021.tif 000009
（配列番号６８）であり、Ｘｂａ  Ｉ−ＲＬ−Ｒの配列は
【０１９１】
【化５】
2008513021.tif 000010
（配列番号６９）である。ＰＣＲ反応は、以下のとおり実施した：
反応混合物（１００μｌに対して）：
ＤＮＡ鋳型（プラスミド）    １．０μｌ（１．０ｎｇ／最終１μｌ）
１０×反応バッファー        １０．０μｌ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．）
ｄＮＴＰ（各２５ｍＭ）      １．０μｌ（最終２５０μＭ）
プライマー１（１０μＭ）    ２．０μｌ（０．２μＭ最終）
プライマー２（１０μＭ）    ２．０μｌ（０．２μＭ最終）
Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ  ２．０μｌ（２．５Ｕ／μｌ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．）
８２．０μｌ再蒸留水
ＰＣＲ反応：９４℃で２分間；（９４℃で２０秒間、６５℃で１分間、７２℃で２分間、次いで７２℃で５分間）×２５サイクル加熱し、次いで、氷上でインキュベートする。ＰＣＲ増幅した断片をゲルから切り出し、ＤＮＡを精製し、−２０℃で保存した。
【０１９２】
天然ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子断片をｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクターに導入するために、５μｇの天然ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子のＰＣＲ産物（ＲＡＭ−ＲＬ−合成）をＮｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化した。所望のウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子断片を精製し、−２０℃で保存した。
【０１９３】
次いで、１００ｎｇのインサートおよび１００ｎｇのｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクター骨格を制限酵素Ｎｃｏ  ＩおよびＸｂａ  Ｉで消化し、一緒にライゲーションした。次いで、２μｌのライゲーション混合物を、ＪＭ１０９コンピテント細胞に形質転換した。８個のアンピシリン耐性クローンを選び、それらのＤＮＡを単離した。ｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ−陰性およびｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ−合成の各陽性クローンから得たＤＮＡを精製した。ＤＮＡ配列決定によってベクター中の天然遺伝子および合成遺伝子の正しい配列を確認した。
【０１９４】
合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子が哺乳類細胞において改善された発現を有するかどうかを調べるために、遺伝子を哺乳類発現ベクターｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌベクターにＳＶ４０プロモーターおよびＳＶ４０初期エンハンサーの制御下でクローニングした。また、天然ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を、合成遺伝子および天然遺伝子からの発現を比較できるようにｐＧＬ−３ｃｏｎｔｒｏｌベクターにクローニングした。次いで、発現ベクターを４種の一般的な哺乳類細胞株（ＣＨＯ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＨｅｌａおよびＣＶ−１；表９）にトランスフェクトし、ベクター間で合成遺伝子対天然遺伝子について発現レベルを比較した。用いたＤＮＡの量は、合成遺伝子からの発現が異なる発現レベルで一貫して増加していることを確認するために２つの異なるレベルとした。結果は、これらの細胞における合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子の発現の７０〜６００倍の増加を示す（表４）。
【０１９５】
【表４】
2008513021.tif 000011
ルシフェラーゼレポーターの１つの重要な利点は、その短いタンパク質半減期である。発現の増強はタンパク質半減期の延長にも起因し得るが、そうであれば、このことは新規遺伝子の望ましくない不利点を生じさせる。この可能性は、シクロヘキシミドチェイス（「ＣＨＸチェイス」）実験によって除外され、これによって、ヒト化ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子に起因するタンパク質半減期の増大はないことが実証された。
【０１９６】
発現の増大は、１つの発現ベクター骨格に制限されないこと、ならびにプロモーター特異的および／または細胞特異的であることを確実にするために、合成ウミシイタケ遺伝子（Ｒｌｕｃ−ｆｉｎａｌ）ならびに天然ウミシイタケ遺伝子を、種々のプロモーター下、種々のベクター骨格にクローニングした。合成遺伝子は、その野生型対応物と比較して、発現の増大を常に示した（表５）。
【０１９７】
【表５】
2008513021.tif 000012
【０１９８】
【表６】
2008513021.tif 000013
偽の発現が減少した場合、合成遺伝子は、プロモーターのないベクターにおいてより低い基礎レベル転写を示すはずである。合成および天然ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を、ｐＧＬ３−ｂａｓｉｃベクターにクローニングし、転写の基礎レベルを比較した。合成遺伝子自体が増大した発現効率を有するので、プロモーターのないベクターからの活性を直接比較して基礎転写の相違を判断することはできないが、むしろ、これは、ｃｏｎｔｒｏｌベクターに対するプロモーターのないベクターからの活性のパーセンテージ（プロモーターおよびエンハンサーエレメントの双方を含む十分に機能的な発現ベクターにおける発現で除したｂａｓｉｃベクターからの発現）を比較することによって考慮される。このデータは、合成ウミシイタケルシフェラーゼは、哺乳類細胞において天然遺伝子よりも低いレベルの基礎転写を有することを実証する（表６）。
【０１９９】
エンハンサーがプロモーター活性を実質的に刺激できることは、当業者には周知である。合成遺伝子の不適切な転写特性の危険性が低下しているかどうかを試験するために、天然および合成遺伝子を、エンハンサーエレメントを有するベクター（ｐＧＬ３−ｅｎｈａｎｃｅｒベクター）に導入した。合成遺伝子はより高い発現効率を有するために、両者の活性を直接比較してエンハンサーの存在下での転写レベルを比べることはできないが、これは、ｃｏｎｔｒｏｌベクターに対するｅｎｈａｎｃｅｒベクターからの活性のパーセンテージ（プロモーターおよびエンハンサーエレメントの双方を含む十分に機能的な発現ベクターにおける発現で除したエンハンサーの存在下での発現）を用いることによって考慮される。このような結果は、天然遺伝子が存在する場合には、エンハンサー単独で転写をｃｏｎｔｒｏｌの４２〜１２４％刺激できるが、同一ベクターにおいて天然遺伝子が合成遺伝子によって置換されると、同一エンハンサーおよび強力なＳＶ４０プロモーターが用いられる場合も、活性は１〜５％という値にしかならないことを示す。これは、合成遺伝子の偽の発現の危険性が低下していることを明確に実証する（表６）。
【０２００】
合成ウミシイタケ遺伝子（Ｒｌｕｃ−ｆｉｎａｌ）をインビトロ系に用いて翻訳効率を天然遺伝子と比較した。Ｔ７クイックカップルド転写／翻訳系（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）において、ＴＮＴ反応混合物にｐＲＬ−ｎｕｌｌ天然プラスミド（Ｔ７プロモーターの制御下に天然ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する）または同量のｐＲＬ−ｎｕｌｌ−合成プラスミド（Ｔ７プロモーターの制御下に合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を有する）を加え、ルシフェラーゼ活性を５分毎に６０分まで測定した。デュアルルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．）を用いてウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。データは、合成遺伝子から改善された発現が得られることを示した。合成遺伝子の翻訳効率の増大をさらに証明するために、インビトロ転写系によってＲＮＡを調製し、次いで精製した。ｐＲＬ−ｎｕｌｌ（天然または合成）ベクターをＢａｍＨＩを用いて線状化した。複数回のフェノール−クロロホルム抽出と、それに続くエタノール沈殿によってＤＮＡを精製した。インビトロ  Ｔ７転写系を用いてＲＮＡを調製した。ＲＮアーゼを含まないＤＮアーゼを用いることによってＤＮＡ鋳型を除去し、フェノール−クロロホルム抽出と、それに続く複数回のイソプロパノール沈殿によってＲＮＡを精製した。合成遺伝子または天然遺伝子いずれかの、同量の精製したＲＮＡをウサギ網状赤血球溶血液またはコムギ胚芽溶解物に加えた。再度、合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子ＲＮＡが天然のものよりも多くのルシフェラーゼを生成した。これらのデータは、合成配列によって翻訳効率が改善されていることを示唆する。なぜ合成遺伝子がコムギ胚芽において高度に発現されたかを調べるために、植物コドン使用を調べた。高等植物における最低使用コドンは哺乳類におけるものと一致していた。
【０２０１】
レポーター遺伝子アッセイを広く用いて転写調節事象を調べた。これは、試験プロモーターを含む一次レポーター構築物とともに、サンプル間のトランスフェクション効率を含む実験変動を標準化するための内部対照として構成プロモーター下の第２の対照レポーターを細胞にトランスフェクトする同時トランスフェクション実験で実施されることが多い。対照レポーターシグナル、対照レポーターと一次レポーターとの間のプロモータークロストークの可能性、ならびに実験条件による対照レポーターの調節の可能性が、信頼できるコレポーターベクターを選択するために考慮する重要な点である。
【０２０２】
上記のように、合成ウミシイタケルシフェラーゼ遺伝子を種々のプロモーター下で種々のベクター骨格にクローニングすることによってベクター構築物を作製した。すべての構築物が、試験した３種の哺乳類細胞株においてより高度の発現を示した（表５）。したがって、合成ウミシイタケルシフェラーゼは、より良好な発現効率を有する場合、哺乳類細胞にトランスフェクトされた際により多量のシグナルを発する。
【０２０３】
より多量のシグナルが得られるので、同一のレポーターシグナルを達成するのにより弱いプロモーター活性しか必要でなく、このためにプロモーター干渉の危険性が低下する。５０ｎｇのｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（ホタルｌｕｃ＋）および５種の異なる量の天然ｐＲＬ−ＴＫプラスミド（５０、１００、５００、１０００もしくは２０００ｎｇ）のうち１種または合成ｐＲＬ−ＴＫ（５、１０、５０、１００もしくは２００ｎｇ）を用いてＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。各トランスフェクションに、ｐＵＣ１９担体ＤＮＡを加えて全部で３μｇＤＮＡとした。１０倍少ないｐＲＬ−ＴＫ  ＤＮＡが、天然遺伝子と同様またはそれより多いシグナルを生じ、一次レポーターｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌからの発現を阻害する危険性が低下した。
【０２０４】
実験処理が、遺伝子内の潜在性部位を活性化し、コレポーター発現の誘導または抑制を引き起こすことがあり、これによってトランスフェクション効率を標準化するためのコレポーターとしての機能が損なわれる。一例として、ＴＰＡが、ＭＣＦ−７細胞をトランスフェクトする場合に、野生型遺伝子を保有するコレポーターベクターの発現を誘導するということがある。ＭＣＦ−７細胞のウェルあたり５００ｎｇのｐＲＬ−ＴＫ（天然）、５μｇの天然および合成ｐＲＧ−Ｂ、２．５μｇの天然および合成ｐＲＧ−ＴＫをトランスフェクトした。１００ｎｇ／ウェルのｐＧＬ３−ｃｏｎｔｒｏｌ（ホタルｌｕｃ＋）をすべてのＲＬプラスミドと同時トランスフェクトした。担体ＤＮＡ、ｐＵＣ１９を用いて、トランスフェクトされる総ＤＮＡを５．１μｇ／ウェルとした。ウェルあたり１５．３μｌのＴｒａｎｓＦａｓｔトランスフェクション試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を加えた。１６時間後、細胞をトリプシン処理し、プールし、６ウェルディッシュの６個のウェルに分割し、ウェルに８時間接着させた。次いで、３つのウェルを０．２ｎＭの腫瘍プロモーター、ＴＰＡ（ホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＃５２４４００−Ｓ）で処理し、３つのウェルに２０μｌのＤＭＳＯを用いてニセの処理を施した。ＴＰＡ添加の２４時間後、細胞を、０．４ｍｌのＰａｓｓｉｖｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒを用いて回収した。結果は、合成遺伝子を用いることによって、実験上の刺激によるコレポーター発現の望ましくない変化を避けることができることを示した（表７）。これは、合成遺伝子を用いることにより、異常発現の危険性が低減し得るということを実証する。
【０２０５】
【表７】
2008513021.tif 000014
（実施例３）
（合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子）
ｌｕｃ＋遺伝子（米国特許第５，６７０，３５６号）を、２つのアプローチを用いて最適化した。第１のアプローチ（戦略Ａ）では、調節配列、例えば、コドンを最適化し、コンセンサス転写因子結合部位（ＴＦＢＳ）を除去した（異なるバージョンのプログラムおよびデータベースが用いられたが、実施例４参照のこと）。第１のアプローチで得た配列は、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ１〜ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ８を含む（「Ｆ」を用いる表記は、構築物が隣接配列を含んでいたことを示す）。ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ１はコドン最適化されており、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ２は、転写因子結合部位を含む同定された望ましくない配列を除去する第１ラウンドの後に得られた配列であり、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ３は、転写因子結合部位を含む同定された望ましくない配列を除去する第２ラウンドの後に得られ、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ４は転写因子結合部位を含む同定された望ましくない配列を除去する第３ラウンドの後に得られ、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ５は転写因子結合部位を含む同定された望ましくない配列を除去する第４ラウンドの後に得られ、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ６はプロモーターモジュールおよびＲＢＳの除去後に得られ、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ７は転写因子結合部位を含む同定された望ましくない配列のさらなる除去後に得られ、そしてｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ８は制限酵素認識部位を改変した後に得られた。
種々のＰ．ピラリス（ｐｙｒａｌｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子バージョンのペアワイズＤＮＡ同一性：
【０２０６】
【表８】
2008513021.tif 000015
ｌｕｃ＋は、以下の配列を有する：
【０２０７】
【化６】
2008513021.tif 000016
そしてｈｌｕｃ＋は、以下の配列を有する：
【０２０８】
【化７】
2008513021.tif 000017
【０２０９】
【表９】
2008513021.tif 000018
ｌｕｃ＋ｖｅｒ２Ａ１−ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２Ａ５は、以下の配列を有する（配列番号１６〜２０）：
【０２１０】
【化８】
2008513021.tif 000019
【０２１１】
【化９】
2008513021.tif 000020
【０２１２】
【化１０】
2008513021.tif 000021
【０２１３】
【化１１】
2008513021.tif 000022
【０２１４】
【化１２】
2008513021.tif 000023
【０２１５】
【化１３】
2008513021.tif 000024
【０２１６】
【化１４】
2008513021.tif 000025
ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２Ａ６を改変して、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２Ａ７を得た：
【０２１７】
【化１５】
2008513021.tif 000026
【０２１８】
【化１６】
2008513021.tif 000027
多重クローニング領域中にＢｇｌＩ部位を含むベクターについては、ホタル配列中に存在するＢｇｌＩ部位を除去できる。ＢｇｌＩ部位を欠く、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＡＦ８由来のルシフェラーゼ遺伝子は、４種の哺乳類細胞株、すなわち、ＮＩＨ３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＨＥＫ２９３細胞においてアッセイされた場合に発現の平均７．２倍の増大を示す。
ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２Ａ８は以下の配列を有する：
【０２１９】
【化１７】
2008513021.tif 000028
【０２２０】
【化１８】
2008513021.tif 000029
第２のアプローチについては、ホタルルシフェラーゼｌｕｃ＋コドンを哺乳類発現のために最適化し、コンセンサス転写因子結合部位およびＣＧジヌクレオチド（ＣＧ島、メチル化の可能性のある部位）の数を減少させた。第２のアプローチによって以下が得られた：バージョンｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＢＦ１〜ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＢＦ５。ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＢＦ１はコドン最適化されており、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＢＦ２は転写因子結合部位を含む同定された望ましくない配列を除去する第１ラウンドの後に得られた配列であり、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＢＦ３は転写因子結合部位を含む同定された望ましくない配列を除去する第２ラウンドの後に得られた配列であり、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＢＦ４は転写因子結合部位を含む同定された望ましくない配列を除去する第３ラウンドの後に得られた配列であり、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＢＦ５は転写因子結合部位を含む同定された望ましくない配列を除去する第４ラウンドの後に得られた配列であり、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＢＦ６はプロモーターモジュールおよびＲＢＳの除去後に得られ、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＢＦ７は転写因子結合部位を含む同定された望ましくない配列のさらなる除去後に得られ、そしてｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２ＢＦ８は制限酵素認識部位を改変した後に得られた。
【０２２１】
ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２Ｂ１〜Ｂ５は以下の配列を有する（配列番号２４〜２８）：
ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２Ｂ１
【０２２２】
【化１９】
2008513021.tif 000030
【０２２３】
【化２０】
2008513021.tif 000031
【０２２４】
【化２１】
2008513021.tif 000032
【０２２５】
【化２２】
2008513021.tif 000033
【０２２６】
【化２３】
2008513021.tif 000034
【０２２７】
【化２４】
2008513021.tif 000035
【０２２８】
【化２５】
2008513021.tif 000036
【０２２９】
【化２６】
2008513021.tif 000037
【０２３０】
【化２７】
2008513021.tif 000038
【０２３１】
【化２８】
2008513021.tif 000039
【０２３２】
【化２９】
2008513021.tif 000040
【０２３３】
【化３０】
2008513021.tif 000041
【０２３４】
【化３１】
2008513021.tif 000042
【０２３５】
【表１１】
2008513021.tif 000043
＊プロモーターモジュールは、相乗的または拮抗的機能を示すことがわかっている、スペーサーによって分離された２つのＴＦＢＳを含む複合調節エレメントとして規定される。
【０２３６】
（実施例４）
（合成選択可能ポリペプチド遺伝子）
（設計プロセス）
（配列を規定する）
維持されなくてはならないタンパク質配列：
−Ｎｅｏ：ｐＣＩ−ｎｅｏ（Ｐｒｏｍｅｇａ）のｎｅｏ遺伝子由来のもの（配列番号１）
−Ｈｙｇ：ｐｃＤＮＡ３．１／Ｈｙｇｒｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のｈｙｇ遺伝子由来のもの（配列番号６）
出発配列のＤＮＡ隣接領域：
−５’末端：ｐＣＩ−ｎｅｏのｎｅｏ遺伝子由来のコザック配列（ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡ；配列番号３４））、ＰｆｌＭＩ部位（ＣＣＡＮＮＮＮＮＴＧＧ、配列番号３５）および末端のＮｓ（検索アルゴリズムエラーを避け、かつ、ＯＲＦ１を維持するため）：
ｎｅｏ／ｈｙｇ：ＮＮＮＮＮＣＣＡｎｎｎｎｎＴＧＧＣＣＡＣＣ−ＡＴＧ−Ｇ（配列番号３６）
変更：ＰｆｌＭＩをＳｂｆＩ（ＣＣＴＧＣＡＧＧ）で置換する
−３’末端：２つの停止コドン（少なくとも１つのＴＡＡ）、ＰｆｌＭＩ部位（方向性クローニングを可能にするために５’末端のものと適合しない）および末端のＮｓ（検索アルゴリズムエラーを避けるため）：
ｎｅｏ／ｈｙｇ：ＴＡＡＴＡＡＣＣＡｎｎｎｎｎＴＧＧＮＮＮ（配列番号３７）
変更：ＰｆｌＭＩをＡｆｌＩＩ（ＣＴＴＡＡＧ）で置換する
（コドン使用を規定する）
コドン使用はＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒ．ｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）から得た：
基づいたもの：ＧｅｎＢａｎｋリリース１３１．０［２００２年８月１５日］（Ｎａｋａｍｕｒａら、２０００）。
【０２３７】
Ｃｏｄｏｎ使用表は以下についてダウンロードした：
ＨＳ：ヒト［ｇｂｐｒｉ］５０，０３１  ＣＤＳ（２１，９３０，２９４コドン）
ＭＭ：マウス［ｇｂｒｏｄ］２３，１１３  ＣＤＳ（１０，３４５，４０１コドン）
ＥＣ：大腸菌［ｇｂｂｃｔ］１１，９８５  ＣＤＳ（３，６８８，９５４コドン）
ＥＣ  Ｋ１２：大腸菌Ｋ１２［ｇｂｂｃｔ］４，２９１  ＣＤＳ（１，３６３，７１６コドン）
→ＨＳおよびＭＭを比較したところ、極めて類似していることがわかり、ＨＳ表を使用する。
【０２３８】
→ＥＣおよびＥＣ  Ｋ１２を比較したところ、極めて類似していることがわかり、ＥＣ  Ｋ１２表を使用する。
【０２３９】
コドン選択戦略：
全体的な戦略は、低使用大腸菌コドンを避けながら、コドン使用を哺乳類細胞における最適発現に適合させることである。各アミノ酸に対して１つの「最良の」コドンを選択し、これを用いて所望のタンパク質配列を逆翻訳して出発遺伝子配列を得た。
【０２４０】
ｎｅｏおよびｈｙｇ遺伝子の設計のために戦略Ａを選択した（表１２参照）。（戦略Ａ：最適化したコドンバイアス：コドンの強調はＨＳにおいて最高使用頻度を示す。最良コドンとはＨＳにおいて最高使用を有するものである（ただし、わずかに低い使用を有するコドンが大腸菌において実質的により高い使用を有する場合は除く））。
【０２４１】
【表１２】
2008513021.tif 000044
（出発遺伝子配列を作製する）
ベクターＮＴＩ８．０（Ｉｎｆｏｒｍａｘ）において特注のコドン使用表を使用する（「戦略Ａ」）
ｎｅｏおよびｈｙｇタンパク質配列を逆翻訳する
ｎｅｏ（ＰｒｏｍｅｇａのｐＣＩ−ｎｅｏ由来のネオマイシン遺伝子に基づく）
【０２４２】
【化３２】
2008513021.tif 000045
【０２４３】
【化３３】
2008513021.tif 000046
【０２４４】
【化３４】
2008513021.tif 000047
【０２４５】
【表１３】
2008513021.tif 000048
「ｈ」は、ヒト化コドンを示し、「Ｆ」は、５’および３’隣接配列の存在を示す。
【０２４６】
開始（コドン最適化）遺伝子配列を作製する：
ｈｎｅｏ（ｈｎｅｏ−Ｆ内の隣接領域を含まないヒト化開始遺伝子配列）
【０２４７】
【化３５】
2008513021.tif 000049
【０２４８】
【化３６】
2008513021.tif 000050
（配列モチーフの同定および除去に用いたプログラムおよびデータベース）
すべてＧｅｎｏｍａｔｉｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｍｂＨ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ）製：
ＧＥＭＳ  Ｌａｕｎｃｈｅｒリリース３．５．２（２００３年６月）
ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒプロフェッショナルリリース６．２．１  ２００３年６月
Ｍａｔｒｉｘ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｌｉｂｒａｒｙバージョン３．１．２  ２００３年６月（１２８ファミリー中、３１８脊椎動物マトリクスを含む）
ＭｏｄｅｌＩｎｓｐｅｃｔｏｒプロフェッショナルリリース４．８  ２００２年１０月
Ｍｏｄｅｌ  Ｌｉｂｒａｒｙバージョン３．１  ２００３年３月（２２６モジュール）
ＳｅｑｕｅｎｃｅＳｈａｐｅツール
ユーザー定義マトリクス。
【０２４９】
（出発遺伝子配列から除去する配列モチーフ）
（優先順位の順に）
制限酵素認識配列：
ユーザー定義マトリクスサブセットｎｅｏおよびｈｙｇ参照のこと。ｈｌｕｃ＋バージョン２．０の設計に用いたものと同様
通常、クローニング（ｐＧＬ４）に必要とされるものまたはクローニングによく用いられるものを含む
変更：同様に、ＳｂｆＩ、ＡｆｌＩ、ＡｃｃＩＩＩ
転写因子結合配列：
デフォルトスコアまたはそれより大きいスコアを有するプロモーターモジュール（規定の配向を有する２つのＴＦ結合部位）
少なくともコアのスコア＝０．７５／マトリクス＝最適化を有する脊椎動物ＴＦ結合配列
真核生物の転写調節部位：
コザック配列
（＋）鎖中のスプライスドナー／アクセプター配列
（＋）鎖中のポリＡ付加配列
原核生物の転写調節配列：
大腸菌プロモーター
大腸菌ＲＢＳ（Ｍｅｔコドンの上流２０ｂｐ未満にある場合）。
【０２５０】
（ユーザー定義のマトリクスサブセット「ｎｅｏ＋ｈｙｇ」）
フォーマット：マトリクス名（コア類似性閾値／マトリクス類似性閾値）
【０２５１】
【化３７】
2008513021.tif 000051
【０２５２】
【化３８】
2008513021.tif 000052
【０２５３】
【化３９】
2008513021.tif 000053
（ユーザー定義のマトリクスサブセット「ｎｅｏ＋ｈｙｇ−ＥＣ」）
フォーマット：マトリクス名（コア類似性閾値／マトリクス類似性閾値）
【０２５４】
【化４０】
2008513021.tif 000054
【０２５５】
【化４１】
2008513021.tif 000055
【０２５６】
【化４２】
2008513021.tif 000056
（ユーザー定義のマトリクスサブセット「ｐＧＬ−０７２５０３」）
フォーマット：マトリクス名（コア類似性閾値／マトリクス類似性閾値）
【０２５７】
【化４３】
2008513021.tif 000057
【０２５８】
【化４４】
2008513021.tif 000058
【０２５９】
【化４５】
2008513021.tif 000059
（配列モチーフの除去のための戦略）
上記で指定された望ましくない配列モチーフを、指定のタンパク質および隣接配列の保持を可能にする代替コドンを選択することによって出発遺伝子配列から除去した。代替コドンは、全体のコドン選択戦略とできる限り一致するように選択した。
【０２６０】
一般的なステップ：
−マトリクスファミリーサブセット「ｎｅｏ＋ｈｙｇ」または「ｎｅｏ＋ｈｙｇ−ＥＣ」を用いるＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒを用い、およびデフォルト設定を用いるＭｏｄｅｌＩｎｓｐｅｃｔｏｒを用い、望ましくない配列マッチを同定する。
−ＳｅｑｕｅｎｃｅＳｈａｐｅｒを用い、起こり得る置換コドンを同定し、望ましくない配列マッチを除去する（ＯＲＦは維持する）。
−新規バージョンの合成遺伝子配列に変更を組み込み、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒおよびＭｏｄｅｌＩｎｓｐｅｃｔｏｒを用いて再分析する。
【０２６１】
特定のステップ：
−まず、サブセット「ｎｅｏ＋ｈｙｇ−ＥＣ」および閾値（０．７０／Ｏｐｔ−０．２０）を残すＳｅｑｕｅｎｃｅＳｈａｐｅｒデフォルトを用いて望ましくない配列マッチを除去するよう試みる。
−このアプローチで除去できない配列マッチには、閾値（例えば、０．７０／Ｏｐｔ−０．０５）を残す、より低いＳｅｑｕｅｎｃｅＳｈａｐｅｒを用いる。
−なお除去できない配列マッチには、手作業で選択した置換コドンの異なる組み合わせを試みる（特に４塩基以上の変更が必要であり得る場合には）。それが新規配列マッチを導入する場合には、上記のステップを用いてそれらを除去するよう試みる（異なる出発配列が異なる除去解決法を可能にすることもある）。
−サブセット「ｎｅｏ＋ｈｙｇ」を用いて問題のある大腸菌配列マッチが導入されているかどうかを調べ、そうであれば、非大腸配列について先に記載される類似のアプローチを用いてそれらを除去するよう試みる。
隣接（非−ＯＲＦ）配列に類似の戦略を用いる。
隣接クローニング部位における変更の後、サブセット「ｐＧＬ４−０７２５０３」を用いて最後に調べる。
【０２６２】
ｎｅｏおよびｈｙｇをコドン最適化した後、ｈｎｅｏおよびｈｈｙｇが得られた。ｈｎｅｏおよびｈｈｙｇから調節配列を除去し、ｈｎｅｏ−１Ｆおよびｈｈｙｇ−１Ｆを得た（隣接領域を含まない対応する配列は、それぞれ、配列番号３８および３０である）。ｈｎｅｏ−１Ｆおよびｈｈｙｇ−１Ｆから調節配列を除去し、ｈｎｅｏ−２Ｆおよびｈｈｙｇ−２Ｆを得た（隣接領域を含まない対応する配列は、それぞれ、配列番号３９および４２である）。ｈｎｅｏ−２Ｆおよびｈｈｙｇ−２Ｆから調節配列を除去し、ｈｎｅｏ−３Ｆおよびｈｈｙｇ−３Ｆを得た。５’および３’クローニング部位を変更することによってｈｎｅｏ−３Ｆおよびｈｈｙｇ−３Ｆをさらに改変し、ｈｎｅｏ−３ＦＢおよびｈｈｙｇ−３ＦＢを得た：
ｈｎｅｏ−３（第３ラウンドの配列除去後のサブセットｎｅｏ＋ｈｙｇ）は、以下の配列を有する：
【０２６３】
【化４６】
2008513021.tif 000060
ｈｎｅｏ−３ＦＢ（ＰｆｌＭＩ部位を５’末端においてＳｂｆＩに、３’末端においてＡｆｌＩＩに変更する）は、以下の配列を有する：
【０２６４】
【化４７】
2008513021.tif 000061
ｈｈｙｇ−３（第３ラウンドの配列除去後のサブセットｎｅｏ＋ｈｙｇ）は、以下の配列を有する：
【０２６５】
【化４８】
2008513021.tif 000062
ｈｈｙｇ−３ＦＢ（ＰｆｌＭＩ部位を５’末端においてＳｂｆＩに、３’末端においてＡｆｌＩＩに変更する）は、以下の配列を有する：
【０２６６】
【化４９】
2008513021.tif 000063
（ｈｎｅｏ−３ＦＢおよびｈｈｙｇ−３ＦＢの解析）
ｈｎｅｏ−３ＦＢは転写因子結合配列、例えば、プロモーターモジュール、マッチを有さない（ＧＥＭＳリリース３．５．２  ２００３年６月；脊椎動物ＴＦ結合配列ファミリー（コア類似性：０．７５／マトリクス類似性：ｏｐｔ）；およびプロモーターモジュール（デフォルトパラメータ：最適化された閾値または最大スコアの８０％））。他方、ｈｈｙｇ−３ＦＢは、残存する４つの転写因子結合配列マッチを有するが、プロモーターモジュールは有さない（表１０）。以下の転写因子結合配列がｈｈｙｇ−３ＦＢ中に見られた。
【０２６７】
１）Ｖ＄ＭＩＮＩ
ファミリー：筋イニシエーター（２つのメンバー）
最良マッチ：筋イニシエーター配列１
参照：Ｌａｕｒａ  Ｌ．  Ｌｏｐｅｚ  ＆  Ｊａｍｅｓ  Ｗ．Ｆｉｃｋｅｔｔ
“Ｍｕｓｃｌｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：Ａ  Ｃａｔａｌｏｇ  ｏｆ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ”
ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｉｌ．ｕｐｅｎｎ．ｅｄｕ／ＭＴＩＲ／ＨｏｍｅＰａｇｅ．ｈｔｍｌ
ＯＲＦ中の位置：−７〜１１。
【０２６８】
２）Ｖ＄ＰＡＸ５
ファミリー：ＰＡＸ−５／ＰＡＸ−９Ｂ細胞特異的活性化タンパク質（４つのメンバー）
最良マッチ：Ｂ−細胞細胞特異的活性化タンパク質
参照：ＭＥＤＬＩＮＥ  ９４０１０２９９
ＯＲＦ中の位置：２７１〜２９９。
【０２６９】
３）Ｖ＄ＡＲＥＢ
ファミリー：Ａｔｐ１ａ１調節エレメント結合（４つのメンバー）
最良マッチ：ＡＲＥＢ６
参照：ＭＥＤＬＩＮＥ  ９６０６１９３４
ＯＲＦ中の位置：３１０〜３２２。
【０２７０】
４）Ｖ＄ＶＭＹＢ
ファミリー：ＡＭＶ−ウイルスｍｙｂ癌遺伝子（２つのメンバー）
最良マッチ：ｖ−Ｍｙｂ
参照：ＭＥＤＬＩＮＥ  ９４１４７５１０
ＯＲＦ中の位置：６１９〜６２９。
【０２７１】
ｈｎｅｏ−３Ｆ中に残存するその他の配列は、Ｍｅｔの８塩基上流に１つの大腸菌ＲＢＳ（ＯＲＦ位置３３４〜３３７）を含んでいた。ｈｎｅｏ−３ＦＢは、ＳｂｆＩの５’クローニング部位の一部としてスプライスアクセプター部位（＋）およびＰｓｔＩ部位、ならびにＭｅｔの８塩基上流に１つの大腸菌ＲＢＳ（ＯＲＦ位置３３４〜３３７）を含んでいた。ｈｈｙｇ−３Ｆはその他の配列マッチは全く有していなかった。ｈｈｙｇ−３ＦＢは、ＳｂｆＩの５’クローニング部位の一部としてスプライスアクセプター部位（＋）およびＰｓｔＩ部位を含んでいた。
【０２７２】
続いて、ｈｎｅｏ−３Ｆおよびｈｈｙｇ−３Ｆから調節配列を除去し、ｈｎｅｏ−４およびｈｈｙｇ−４を得た。次いで、ｈｎｅｏ−４から調節配列を除去し、ｈｎｅｏ−５を得た。
【０２７３】
【表１４】
2008513021.tif 000064
＊プロモーターモジュールは、相乗的または拮抗的機能を示すことがわかっている、スペーサーによって分離された２つの転写因子結合部位を含む複合調節エレメントとして規定される。
【０２７４】
表１５には種々の遺伝子の同一性がまとめられている。
【０２７５】
【表１５】
2008513021.tif 000065
ＳＶ４０プロモーターによって隣接された合成ネオマイシン遺伝子および合成ポリ（Ａ）部位を含む発現カセット（ｈＮｅｏ−カセット）を以下に示す。
【０２７６】
【化５０】
2008513021.tif 000066
ＳＶ４０プロモーターによって隣接された合成ピューロマイシン遺伝子および合成ポリ（Ａ）部位を含む発現カセット（ｈＰｕｒｏ−カセット）を以下に示す。
【０２７７】
【化５１】
2008513021.tif 000067
【０２７８】
【化５２】
2008513021.tif 000068
【０２７９】
【化５３】
2008513021.tif 000069
【０２８０】
【化５４】
2008513021.tif 000070
【０２８１】
【化５５】
2008513021.tif 000071
【０２８２】
【化５６】
2008513021.tif 000072
【０２８３】
【化５７】
2008513021.tif 000073
ｈＨｙｇｒｏ（５’末端の近傍のＯＲＦ内にＳａｃＩ部位、３’末端に１２アミノ酸をコードするインフレームリンカーを挿入、ＯＲＦ内の３’末端に付加されたＳｎａＢＩ部位）
【０２８４】
【化５８】
2008513021.tif 000074
【０２８５】
【化５９】
2008513021.tif 000075
【０２８６】
【化６０】
2008513021.tif 000076
本発明の合成ヌクレオチド配列は融合構築物中で使用できる。例えば、選択可能なポリペプチドの合成配列を、野生型配列または異なるポリペプチドをコードする別の合成配列と融合することができる。例えば、以下の例の合成ウミシイタケルシフェラーゼ−ｎｅｏ配列中のｎｅｏ配列を、本発明の合成ｎｅｏ配列と置換できる：
【０２８７】
【化６１】
2008513021.tif 000077
【０２８８】
【化６２】
2008513021.tif 000078
【０２８９】
【化６３】
2008513021.tif 000079
（実施例５）
（選択された合成配列中の部位を同定するために用いた転写因子結合部位）
（ＴＦ結合部位ライブラリー）
ＴＦ結合部位ライブラリー（「Ｍａｔｒｉｘ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ」）は、ＧＥＭＳ  Ｌａｕｎｃｈｅｒパッケージの一部である。表１６は、個々の配列の設計に用いたＭａｔｒｉｘ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｌｉｂｒａｒｙのバージョンを示し、表１７はＭａｔｒｉｘ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｌｉｂｒａｒｙバージョン２．４中の脊椎動物ＴＦ結合部位（「マトリクス」）のすべての一覧、ならびに４．１までの後のバージョンにおいて脊椎動物マトリクスになされたすべての変更（「ＧＥＮＯＭＡＴＩＸ  ＭＡＴＲＩＸ  ＦＡＭＩＬＹ  ＬＩＢＲＡＲＹ  ＩＮＦＯＲＭＡＴＩＯＮバージョン２．４〜４．１」の項）を示す。（ＧｅｎｏｍａｔｉｘはすべてのＭａｔｒｉｘ  Ｌｉｂｒａｒｙ  ｆａｍｉｌｙ  ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎに対して著作権を有する）。
【０２９０】
【表１６】
2008513021.tif 000080
＊ａｍｐ遺伝子を含むｐＧＬ４中のＮｏｔＩ−ＮｃｏＩ断片（ｐＧＬ−４Ｂ−ＮＮ３）
＊＊ＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ−Ｖｅｒ２（ｐＧＬ４Ｂ−ＮＮ３中のＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ断片と置換）
【０２９１】
【表１７Ａ−１】
2008513021.tif 000081
【０２９２】
【表１７Ａ−２】
2008513021.tif 000082
【０２９３】
【表１７Ａ−３】
2008513021.tif 000083
【０２９４】
【表１７Ａ−４】
2008513021.tif 000084
【０２９５】
【表１７Ａ−５】
2008513021.tif 000085
【０２９６】
【表１７Ａ−６】
2008513021.tif 000086
【０２９７】
【表１７Ａ−７】
2008513021.tif 000087
【０２９８】
【表１７Ａ−８】
2008513021.tif 000088
【０２９９】
【表１７Ａ−９】
2008513021.tif 000089
【０３００】
【表１７Ａ−１０】
2008513021.tif 000090
【０３０１】
【表１７Ａ−１１】
2008513021.tif 000091
【０３０２】
【表１７Ａ−１２】
2008513021.tif 000092
【０３０３】
【表１７Ａ−１３】
2008513021.tif 000093
【０３０４】
【表１７Ａ−１４】
2008513021.tif 000094
【０３０５】
【表１７Ｂ−１】
2008513021.tif 000095
【０３０６】
【表１７Ｂ−２】
2008513021.tif 000096
名前を変えたウェイトマトリクス
・Ｖ＄ＭＥＩＳ１．０１はＶ＄ＭＥＩＳ１  ＨＯＸＡ９．０１に名前を変更
他のファミリーに移動したウェイトマトリクス
・Ｖ＄ＢＥＬ１．０１はＶ＄ＡＰ１ＦからＶ＄ＢＥＬ１に移動
・Ｖ＄ＮＦ１．０１はＶ＄ＭＹＯＦからＶ＄ＮＦ１に移動
・Ｖ＄ＥＲ．０１はＶ＄ＲＯＲＡからＶ＄ＥＲＥＦに移動
・Ｖ＄Ｔ３Ｒ．０１はＶ＄Ｔ３ＲＨからＶ＄ＲＯＲＡに移動
・Ｖ＄ＣＬＴＲ＿ＣＡＡＴ．０１はＶ＄ＰＣＡＴからＶ＄ＲＣＡＴに移動
・Ｖ＄ＦＡＳＴ１．０１はＶ＄ＳＭＡＤからＶ＄ＦＡＳＴに移動
除去したウェイトマトリクス
・Ｖ＄ＭＵＳＣＬＥ＿ＩＮＩ．０３
【０３０７】
【表１７Ｃ】
2008513021.tif 000097
改変されたウェイトマトリクス
・Ｖ＄ＡＭＬＩ．０１
・Ｖ＄ＡＭＬ３．０１
他のファミリーに移動したウェイトマトリクス
Ｖ＄ＡＲＮＴ．０１はＶ＄ＥＢＯＸからＶ＄ＨＩＦＦに移動（ＡＲＮＴはＨＩＦ１  Ｂの同義語である）
除去されたウェイトマトリクス
・Ｖ＄ＳＥＦ１．０１
・Ｖ＄ＯＣＴ１．０３
バージョン３．１．１（２００３年４月）
マトリクスＶ＄ＩＲＦ３．０１およびＶ＄ＩＲＦ７．０１を修正した。
バージョン３．１．２（２００３年６月）
マトリクスＶ＄ＧｆＩ１Ｂ．０１を修正した。
【０３０８】
【表１７Ｄ】
2008513021.tif 000098
改変されたウェイトマトリクス
・Ｖ＄ＧＦＩ１．０１
【０３０９】
【表１７Ｅ】
2008513021.tif 000099
改変されたウェイトマトリクス
・Ｖ＄ＧＲＥ．０１
・Ｖ＄ＮＦＹ．０３
他のファミリーに移動したウェイトマトリクス
・Ｖ＄ＢＡＣＨ１．０１はＶ＄ＡＰ１ＦからＶ＄ＡＰ１Ｒに移動
・Ｖ＄ＮＦＥ２．０１はＶ＄ＡＰ１ＦからＶ＄ＡＰ１Ｒに移動
・Ｖ＄ＴＣＦ１１ＭＡＦＧ．０１はＶ＄ＡＰ１ＦからＶ＄ＡＰ１Ｒに移動
・Ｖ＄ＶＭＡＦ．０１はＶ＄ＡＰ１ＦからＶ＄ＡＰ１Ｒに移動
【０３１０】
【表１７Ｆ】
2008513021.tif 000100
改変されたウェイトマトリクス
・Ｖ＄ＣＭＹＢ．０１
・Ｖ＄ＰＴＸ１．０１
著作権（ｃ）Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＧｍｂＨ  １９９８〜２００４−無断複写・転載を禁ずる。
【０３１１】
（実施例６）
（個々の選択可能遺伝子の設計の概要）
（ＴＦ結合部位および検索パラメータ）
各ＴＦ結合部位（「マトリクス」）は、機能的に類似のマトリクスが集まり、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒプロフェッショナル（検索プログラム）によって重複性マッチが排除されているマトリクスファミリーに属する。検索は脊椎動物ＴＦ結合部位に限定した。検索は、マトリクスファミリーによって実施した。すなわち、結果は、各部位のファミリーに由来する最良のマッチのみを示す。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒデフォルトパラメータを、コアおよびマトリクス類似性値に用いた（コア類似性＝０．７５、マトリクス類似性＝最適化）。
【０３１２】
【表１８】
2008513021.tif 000101
注記：上記配列名は、ＯＲＦのみを表す（隣接配列を含むＨｈｙｇｒｏを除く）。配列名への「Ｆ」の付加は、上流および下流隣接配列の存在を示す。さらなる文字（例えば、「Ｂ」）は、変更が隣接領域にのみ行われたことを示す。
【０３１３】
【表１９−１】
2008513021.tif 000102
【０３１４】
【表１９−２】
2008513021.tif 000103
【０３１５】
【表１９−３】
2008513021.tif 000104
【０３１６】
【表１９−４】
2008513021.tif 000105
【０３１７】
【表２０−１】
2008513021.tif 000106
【０３１８】
【表２０−２】
2008513021.tif 000107
【０３１９】
【表２０−３】
2008513021.tif 000108
【０３２０】
【表２１−１】
2008513021.tif 000109
【０３２１】
【表２１−２】
2008513021.tif 000110
【０３２２】
【表２１−３】
2008513021.tif 000111
（実施例７）
（合成ホタルルシフェラーゼ遺伝子の設計の概要）
（ＴＦ結合部位および検索パラメータ）
ＴＦ結合部位は、ＧＥＭＳ  Ｌａｕｎｃｈｅｒパッケージの一部であるＴＦ結合部位ライブラリー（「Ｍａｔｒｉｘ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｌｉｂｒａｒｙ」）に由来する。各ＴＦ結合部位（「マトリクス」）は、機能的に類似のマトリクスが集まり、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒプロフェッショナル（検索プログラム）によって重複性マッチが排除されているマトリクスファミリーに属する。検索は脊椎動物ＴＦ結合部位に限定した。検索は、マトリクスファミリーによって実施した。すなわち、結果は、各部位のファミリーに由来する最良のマッチのみを示す。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒデフォルトパラメータを、コアおよびマトリクス類似性値に用いた（コア類似性＝０．７５、マトリクス類似性＝最適化）。
【０３２３】
【表２２】
2008513021.tif 000112
【０３２４】
【表２３−１】
2008513021.tif 000113
【０３２５】
【表２３−２】
2008513021.tif 000114
【０３２６】
【表２３−３】
2008513021.tif 000115
【０３２７】
【表２３−４】
2008513021.tif 000116
【０３２８】
【表２３−５】
2008513021.tif 000117
【０３２９】
【表２４−１】
2008513021.tif 000118
【０３３０】
【表２４−２】
2008513021.tif 000119
【０３３１】
【表２４−３】
2008513021.tif 000120
【０３３２】
【表２４−４】
2008513021.tif 000121
【０３３３】
【表２４−５】
2008513021.tif 000122
【０３３４】
【表２４−６】
2008513021.tif 000123
【０３３５】
【表２４−７】
2008513021.tif 000124
【０３３６】
【表２４−８】
2008513021.tif 000125
【０３３７】
【表２４−９】
2008513021.tif 000126
（実施例８）
（ｐＧＬ４配列の設計の概要）
図２は、ｐＧＬ４ベクターの設計スキームを表す。ｂｌａ遺伝子と、ｂｌａと多重クローニング領域との間の配列とを含むが、第２のオープンリーディングフレームは含まないｐＧＬ３中のベクター骨格の一部を改変してｐＧＬ４を得た。ｐＧＬ４は、ＮｏｔＩとＳｐｅＩと部位の間にアンピシリン耐性遺伝子を含み、その配列を哺乳類発現のためにコドンを最適化するためではなく、調節配列を除去するように改変し（ｂｌａ−１−ｂｌａ−５）、ＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ断片は多重クローニング領域と翻訳トラップとを含む。翻訳トラップは、各リーディングフレーム中に少なくとも２つの停止コドンを有する約６０個のヌクレオチドを含む。親ベクター由来のＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ断片、ｐＧＬ４−ｂａｓｉｃｓ−５Ｆ２Ｇ−２を、望ましくない調節配列を減少するよう改変した（ＭＣＳ−１〜ＭＣＳ−４；配列番号７６〜７９）。得られた配列のうち１種、ＭＣＳ−４を、改変したアンピシリン耐性遺伝子ｂｌａ−５（配列番号４０）と組み合わせると、ｐＧＬ４Ｂ−４ＮＮ（配列番号９５）が得られた。ｐＧＬ４Ｂ−４ＮＮをさらに改変した（ｐＧＬ４−ＮＮ１−３；配列番号９６〜９８）。ＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ断片中のさらなるポリＡ配列がベクター骨格からの発現をさらに減少させるかどうかを調べるために、種々のポリＡ配列をそれに挿入した。例えば、ｐＧＬ４ＮＮ−Ｂｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎは、ＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ断片中にｃ−ｍｏｓポリＡ配列を含んでいた。しかし、ポリＡ配列中の調節配列の除去は二次構造、ひいては、それらの配列の機能を変更する場合がある。
【０３３８】
一ベクターでは、ｐＧＬ３由来のＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ断片（ＳｐｅＩ−ＮｃｏＩｓｔａｒｔバージョン２；配列番号４８）を改変して、１つの転写因子結合部位および１つの制限酵素認識部位を除去し、多重クローニング領域を変更したところ、ＳｐｅＩ−ＮｃｏＩ  ｖｅｒ２（配列番号４９）が得られた。
【０３３９】
（ＴＦ結合部位および検索パラメータ）
各ＴＦ結合部位（「マトリクス」）は、機能的に類似のマトリクスが集まり、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒプロフェッショナル（検索プログラム）によって重複性マッチが排除されているマトリクスファミリーに属する。検索は脊椎動物ＴＦ結合部位に限定した。検索は、マトリクスファミリーによって実施した。すなわち、結果は、各部位のファミリーに由来する最良のマッチのみを示す。配列ＭＣＳ−１を除き（コア類似性＝１．００、マトリクス類似性＝最適化）、ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒデフォルトパラメータをコアおよびマトリクス類似性値に用いた（コア類似性＝０．７５、マトリクス類似性＝最適化）。
【０３４０】
【表２５】
2008513021.tif 000127
【０３４１】
【表２６−１】
2008513021.tif 000128
【０３４２】
【表２６−２】
2008513021.tif 000129
【０３４３】
【表２７−１】
2008513021.tif 000130
【０３４４】
【表２７−２】
2008513021.tif 000131
【０３４５】
【表２７−３】
2008513021.tif 000132
【０３４６】
【表２７−４】
2008513021.tif 000133
【０３４７】
【表２７−５】
2008513021.tif 000134
【０３４８】
【表２７−６】
2008513021.tif 000135
【０３４９】
【表２７−７】
2008513021.tif 000136
【０３５０】
【表２７−８】
2008513021.tif 000137
【０３５１】
【表２７−９】
2008513021.tif 000138
【０３５２】
【表２８−１】
2008513021.tif 000139
【０３５３】
【表２８−２】
2008513021.tif 000140
【０３５４】
【表２９−１】
2008513021.tif 000141
【０３５５】
【表２９−２】
2008513021.tif 000142
【０３５６】
【表２９−３】
2008513021.tif 000143
本明細書に記載されるデータベース、検索プログラムなどを用いて、ベクター骨格中に存在するコンセンサス転写因子結合部位（アンピシリン耐性遺伝子を含む）の数をｐＧＬ３中の２２４からｐＧＬ４中の４０に減少させ、プロモーターモジュールの数をｐＧＬ３中の１０からｐＧＬ４中の４に減少させた。ｐＧＬ４中の、ｐＧＬ３に対するその他の改変としては、ｆ１複製起点の除去および多重クローニング領域の再設計が挙げられる。
【０３５７】
ＭＣＳ−１〜ＭＣＳ−４は、以下の配列を有する（配列番号７６〜７９）
【０３５８】
【化６４】
2008513021.tif 000144
【０３５９】
【化６５】
2008513021.tif 000145
【０３６０】
【化６６】
2008513021.tif 000146
【０３６１】
【表３０】
2008513021.tif 000147
【０３６２】
【化６７】
2008513021.tif 000148
【０３６３】
【化６８】
2008513021.tif 000149
【０３６４】
【化６９】
2008513021.tif 000150
【０３６５】
【化７０】
2008513021.tif 000151
【０３６６】
【化７１】
2008513021.tif 000152
【０３６７】
【化７２】
2008513021.tif 000153
（実施例１０）
（合成遺伝子において除去された配列の概要）
（検索パラメータ）
ＴＦＢＳ検索は脊椎動物ＴＦ結合部位に限定した。検索は、マトリクスファミリーによって実施した。すなわち、結果は、各部位のファミリーに由来する最良のマッチのみを示す。ＭａｔＩｎｓｐｅｃｔｏｒデフォルトパラメータを、配列ＭＣＳ−１を除いて（コア類似性＝１．００、マトリクス類似性＝最適化）、コアおよびマトリクス類似性値に用いた（コア類似性＝０．７５、マトリクス類似性＝最適化）。
【０３６８】
プロモーターモジュール検索にはすべての利用可能なプロモーターモジュール（脊椎動物およびその他）を含め、デフォルトパラメータ（最適化閾値、または最高スコアの８０％）を用いて実施した。
【０３６９】
スプライス部位検索は、スプライスアクセプターまたはドナーコンセンサス配列について実施した。
【０３７０】
【表３１−１】
2008513021.tif 000154
【０３７１】
【表３１−２】
2008513021.tif 000155
【０３７２】
【表３１−３】
2008513021.tif 000156
解析に、５つの配列、すなわち、ｈｌｕｃ＋ｖｅｒ２Ａ１、ｂｌａ−１、ｈｎｅｏ−１、ｈｐｕｒｏ−１、ｈｈｙｇ−１（ヒト化コドン使用）を用い、５種の配列中３種に以下のファミリー由来のＴＦＢＳが見出された：
Ｖ＄ＡＨＲＲ（ＡＨＲ−ａｒｎｔヘテロ二量体およびＡＨＲ関連因子）
Ｖ＄ＥＴＳＦ（ヒトおよびマウスＥＴＳ１因子）
Ｖ＆ＮＦＫＢ（核因子κＢ／ｃ−ｒｅｌ）
Ｖ＄ＶＭＹＢ（ＡＭＶ−ウイルスｍｙｂ癌遺伝子）
Ｖ＄ＣＤＥＦ（細胞周期レギュレーター：細胞周期依存性エレメント）
Ｖ＄ＨＡＮＤ（ＨＡＮＤ２およびＥ１２のｂＨＬＨ転写因子二量体）
Ｖ＄ＮＲＳＦ（ニューロン制限的サイレンサー因子）
Ｖ＄ＷＨＺＦ（翼状らせんおよびＺＦ５結合部位）
Ｖ＄ＣＭＹＢ（Ｃ−ｍｙｂ細胞性転写アクチベーター）
Ｖ＄ＭＩＮＩ（筋イニシエーター）
Ｖ＄Ｐ５３Ｆ（ｐ５３腫瘍サプレッサー−腫瘍サプレッサーＲｂの負の調節
Ｖ＄ＺＦ５Ｆ（ＺＦ５  ＰＯＺドメインジンクフィンガー）
Ｖ＄ＤＥＡＦ（キイロショウジョウバエ由来の変形上皮自己調節因子−１のホモログ）
Ｖ＄ＭＹＯＤ（筋芽細胞決定因子）
Ｖ＄ＰＡＸ５（ＰＡＸ−５／ＰＡＸ−９Ｂ細胞特異的活性化タンパク質）
Ｖ＄ＥＧＲＦ（ＥＧＲ／神経成長因子誘導性タンパク質Ｃ＆関連因子）
Ｖ＄ＮＥＵＲ（ニューロＤ、β２、ＨＬＨドメイン）
Ｖ＄ＲＥＢＶ（エプスタイン−バーウイルス転写因子Ｒ）。
【０３７３】
以下のファミリー由来のＴＦＢＳは、５種の配列中の４種で見い出された：
Ｖ＄ＥＴＳＦ（ヒトおよびマウスＥＴＳ１因子）
Ｖ＄ＣＤＥＦ（細胞周期レギュレーター：細胞周期依存性エレメント）
Ｖ＄ＨＡＮＤ（ＨＡＮＤ２およびＥ１２のｂＨＬＨ転写因子二量体）
Ｖ＄ＮＲＳＦ（ニューロン制限的サイレンサー因子）
Ｖ＄ＰＡＸ５（ＰＡＸ−５／ＰＡＸ−９Ｂ細胞特異的活性化タンパク質）
Ｖ＄ＮＥＵＲ（ニューロＤ，β２、ＨＬＨドメイン）；ならびに
以下のファミリー由来のＴＦＢＳは、５種の配列中の５種で見い出された：
Ｖ＄ＰＡＸ５（ＰＡＸ−５／ＰＡＸ−９Ｂ細胞特異的活性化タンパク質）。
【０３７４】
【化７３】
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【０３７５】
【化７４】
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すべての刊行物、特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。上記の明細書中では、本発明を、その特定の好ましい実施形態に関連して説明したが、多数の詳細は例示目的で示されており、本発明にはさらなる実施形態が生じやすいことおよび本明細書における詳細のいくらかは、本発明の基本原則から逸脱することなく相当に変えることができるということは当業者には明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０３７６】
【図１】コドンおよびその対応するアミノ酸。
【図２】ｐＧＬ４ベクターの設計スキーム。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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