(57)【要約】  本発明は、微生物学産業及び医薬産業、遺伝子工学、バイオテクノロジーに関する。出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母菌系統を、ヒトα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）の構造遺伝子を含む組換えプラスミドＤＮＡの構築をもとに、分泌型の可溶のＡＦＰの合成及び生成をもたらす調節プロモーターの制御下で得、このＡＦＰはヒトＡＦＰの活性と同一又は類似の活性を有する。得られた組換えＡＦＰを有効物質として、腫瘍学、免疫療法、美容学における使用のための、並びにまた、癌及び胎児の病態の診断のための治療用物質を調製するために用いることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＡＬ１酵母菌遺伝子のプロモーター領域、ＭＦα１酵母菌遺伝子の分泌のプレプロ領域、ヒト成熟α−フェトプロテインの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列、及びＣＹＣ１酵母菌遺伝子の転写終結のフィールドを含む、配列番号１の発現カセット。
【請求項２】
ヒト成熟α−フェトプロテインの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列が、ヒト成熟α−フェトプロテイン（配列番号２）、又は１つ若しくは複数のアミノ酸残基の欠失、付加、若しくは置換を有するその修飾型をコードする合成の遺伝子であり、修飾されたヒトα−フェトプロテインの形成をもたらし、その配列の少なくとも８０％は、修飾された構造を有する前記生成物におけるヒト成熟α−フェトプロテインの機能上の生物活性を保持してヒト成熟α−フェトプロテイン（配列番号２）のアミノ酸配列に対応する、請求項１に記載の発現カセット。
【請求項３】
請求項１、２に記載の発現カセット、細菌プラスミドｐＵＣ１８のフラグメント、２−μｍ酵母菌プラスミドの複製開始の領域、タンパク質の正確な集合及び望ましい生成物の培養基中への分泌をもたらすＫＡＲ２遺伝子、ジスルフィド結合の正確な形成をもたらすＰＤ１１遺伝子、並びに選択的ＵＲＡ３及び選択的ＰＧＫ１酵母菌マーカーを含む、組換えｐＫＸプラスミド。
【請求項４】
請求項３に記載のｐＫＸプラスミドで形質転換することにより、ヒト組換えα−フェトプロテインを分泌する能力を有する、真核生物の産生株細胞。
【請求項５】
Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＶＫＰＭ）にＮｏ．Ｙ−３１１５で寄託されている、ヒト組換えα−フェトプロテインを分泌する能力を有する、産生株細胞系統出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＢＳ７２３／ｐＫＸ。
【請求項６】
請求項４に記載の真核生物細胞を培養すること、組換えα−フェトプロテインを培養基中に分泌する能力を有する細胞、及び培養基から組換えα−フェトプロテインを単離するステップを含む、血清起源のヒト成熟α−フェトプロテインの生物活性を有する組換えα−フェトプロテインを調製するための方法。
【請求項７】
真核生物の細胞が酵母菌細胞であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
酵母菌細胞が、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＶＫＰＭ）にＮｏ．Ｙ−３１１５で寄託されており、組換えα−フェトプロテインを分泌する能力を有する、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＢＳ７２３／ｐＫＸ系統の細胞であることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
培養を、グルコース２％、グリセリン１．５％、酵母抽出物１％、ペプトン２％、蒸留水を含む培地で２３〜３３℃の温度で行い、更なる緩衝作用及びｐＯ＞２０％まで可溶性酸素を加えることにより培地のｐＨを４．５〜７．０に保持することを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
請求項６に記載の方法により調製され、ヒト成熟血清ＡＦＰの特性を有し、前記特性は免疫学的反応及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト成熟血清ＡＦＰの活性の１０％以上のレベルでＢ細胞Ｒａｊｉリンパ腫細胞の増殖を阻害するその能力により決定される、組換えα−フェトプロテイン。
【請求項１１】
請求項１０に記載の組換えα−フェトプロテイン、並びに薬学的に許容できる担体及び賦形剤を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する薬剤組成物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の組換えα−フェトプロテイン、並びにドキソルビシン、ビンクリスチン、フルオロウラシル、メタトレキセート（ｍｅｔａｔｒｅｘａｔｅ）、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、タモキシフェン、フルタミド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シクロスポリンＣ、レチノイン酸の誘導体、カロチノイド、ステロイドホルモン、並びに薬学的に許容できる担体及び賦形剤を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する相乗的組成物。
【請求項１３】
有効量の請求項１０に記載の組換えα−フェトプロテイン、請求項１１に記載の薬剤組成物、又は請求項１２に記載の相乗的組成物をそれを必要とする患者に投与することを含む、癌を治療し、又は癌の進行を予防するための方法。
【請求項１４】
請求項１０に記載の組換えα−フェトプロテイン、及びシクロスポリンＣ、並びに薬学的に許容できる担体及び賦形剤を含む、免疫抑制作用及び免疫調節作用を有する相乗的組成物。
【請求項１５】
請求項１０に記載の組換えα−フェトプロテインの有効量を薬学的に許容できる担体及び賦形剤と共にそれを必要とする患者に投与し、又は請求項１４に記載の組成物を投与することを含む、自己免疫疾患を治療し、免疫状態を正すための方法。
【請求項１６】
組成物が、請求項１０に記載の組換えα−フェトプロテイン、並びに薬学的に許容できる担体及び賦形剤を含む、幹細胞の増殖を刺激する薬剤組成物。
【請求項１７】
組成物が、請求項１０に記載の組換えα−フェトプロテイン、並びにビタミンＡ、Ｅ、Ｄの誘導体、抗酸化剤、ステロイドホルモン、植物起源のイソフラボン、並びに薬学的に許容できる担体及び賦形剤を含む、幹細胞の増殖を刺激する相乗作用の組成物。
【請求項１８】
有効量の請求項１０に記載の組換えα−フェトプロテイン、請求項１６に記載の薬剤組成物、又は請求項１７に記載の相乗作用の組成物で細胞に作用することを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞の増殖を刺激するための方法。
【請求項１９】
有効量の請求項１０に記載の組換えα−フェトプロテイン、請求項１６に記載の薬剤組成物、又は請求項１７に記載の相乗作用の組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む、ｉｎ  ｖｉｖｏで幹細胞の増殖を刺激するための方法。
【請求項２０】
請求項１０に記載の組換えα−フェトプロテイン、美容学的に許容できる担体及び賦形剤、並びに、任意選択でビタミンＡ、Ｅ、Ｄの誘導体、抗酸化剤、ステロイドホルモン、植物起源のイソフラボンを含む、皮膚を若返らせ、皮膚の老化を防ぐ美容用組成物。
【請求項２１】
前記組成物を個体の皮膚上に適用することを含む、皮膚を若返らせ、皮膚の老化を防ぐための、請求項２０に記載の美容用組成物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物産業及び医薬産業、遺伝子工学、バイオテクノロジーに関する。本発明による組換えα−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は、血清から得られるヒトＡＦＰの活性を保持し、腫瘍学、免疫療法、美容学における使用を意図するものである。
【背景技術】
【０００２】
α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）は、哺乳動物の胎児血清の主要成分であり、周産期の発達の間に胎児の肝臓及び卵黄嚢により合成される。出生直後に血清中のＡＦＰレベルは急激に低下し、健康な成年個体ではその発現は検出されなくなる（Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．、１９９１年、Ａｄｖ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、５６巻、２５３〜３１２頁）。ＡＦＰの合成は、肝臓腫瘍の悪性の進行及び胚細胞性奇形芽腫の際に復活し、例えば、急性ウィルス性肝炎又は肝硬変の間に、再生を伴う、肝臓に対する化学的及び機械的損傷の場合に、より低い程度まで検出可能である（Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｙ  Ｇ．Ｊ．、２００２年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．、２巻、８９〜１１５頁）。
【０００３】
ヒトＡＦＰは、アミノ酸５９０個から成り、約４％の炭水化物成分を含む糖タンパク質である（Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｔ．ら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０巻、４６０４〜４６０８頁；Ｐｕｃｃｉ  Ｐ．ら、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻、５０６１〜５０６６頁）。ＡＦＰの主要な特性の１つに、多価不飽和脂肪酸、ステロイドホルモン、金属、レチノイド、疎水性抗生物質などの様々な低分子の化学物質の非共有の収着がある（Ａｕｓｓｅｌ  Ｓ．及びＭａｓｓｅｙｅｆｆ  Ｒ．、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１９巻、１１２２〜１１２７頁；Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．、１９９４年、Ｊ．Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｏｎｃｏｌ．、９巻、１１〜１４頁）。胎児発達の初期段階では、ＡＦＰは、脂肪酸及び他の低分子物質のための輸送担体としてアルブミンに代わる（Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．、１９９１年、Ａｄｖ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、５６巻、２５３〜３１２頁）。
【０００４】
ＡＦＰ分子は、タンパク質の３次構造の集合の過程の複雑さを大幅に増大させる１５の鎖間ジスルフィド結合により結合している３つの球形の構造領域から成る（Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｔ．ら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８０巻、４６０４〜４６０８頁；Ｐｕｃｃｉ  Ｐ．ら、１９９１年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０巻、５０６１〜５０６６頁）。更に、ＡＦＰ分子の重要な構造上の要素は、分子の正確な受容及び機能を提供する炭水化物成分である（Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．、１９９１年、Ａｄｖ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、５６巻、２５３〜３１２頁）。
【０００５】
アミノ酸残基５９０個から成るポリペプチド鎖の他に、血清胎児性ＡＦＰ、又は肝臓癌細胞が分泌するＡＦＰの分子構造は、Ｎグリコシル化によりアスパラギンに連結する１つのオリゴ糖基を含んでいる（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｋ．ら、１９９３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻、２９７０〜２９７５頁）。オリゴ糖ＡＦＰ鎖の構造は異質性であり、様々な因子、即ち、肝臓癌の進行の段階、又は胎児の発達の段階に依存している。オリゴ糖は、ＡＦＰ分子の構造上の特性に影響を及ぼし、抗原の決定及び受容体結合センターの内容に含まれ得る（Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．、１９９１年、Ａｄｖ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、５６巻、２５３〜３１２頁）。細菌の細胞で発現される組換えＡＦＰは、血清ＡＦＰと異なり、グリコシル化されておらず、これはＭｕｒｇｉｔａの研究で特徴付けられた生成物の特徴的な違いであり（米国特許第６３３１６１１号、第６６２７４４０号、第６４１６７３４号）、その結果、それを血清の類似体と区別し、酵母菌のシステムで発現される組換えＡＦＰとも区別する構造上及び機能上の特性がある。酵母菌における異種性のタンパク質の発現の間中、血清の類似体におけるのと同じアミノ酸残基に対してそれらのグリコシル化が行われるが、オリゴ糖自体の構造は、鎖の構成、長さ、及び分枝に関して大幅に異なることが知られており、鎖は対応するタンパク質の構造上及び機能上の特性におけるある種の区別も予め決定するものである（Ｈａｒｄ  Ｋ．ら、１９９８年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、２４８巻、１１１頁）。
【０００６】
ＡＦＰは、胚細胞、幹細胞、活性化された免疫細胞、癌細胞、又はある種のレトロウィルスにより形質転換された細胞など、特定のＡＦＰ受容体（ＡＦＰＲ）を発現する細胞により、選択的に吸収されることがある（Ｕｒｉｅｌ  Ｊ．ら、１９８９年、Ｊｉｚｅｊｅｗｓｋｙ  Ｇ．Ｉ．、Ｊａｋｏｂｓｏｎ  Ｈ．Ｉ．（編集）、「α−フェトプロテインの生物学的特性（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）」Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２巻、１０３〜１１７頁）。正常の成熟細胞はＡＦＰを吸収する能力を喪失しており、特定のＡＦＰＲを発現しない。ＡＦＰのこの特性を考慮して、癌細胞の増殖を抑制する細胞増殖抑制性の物質及び他の物質を腫瘍に送達することを目標にする目的で、ＡＦＰの治療的使用のための方法が提唱されている（Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．、１９９４年、Ｊ．Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｏｎｃｏｌ．、９巻、１１〜１４頁；Ｔｓｕｋａｄａ  Ｙ．ら、１９９４年、Ｊ．Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｏｎｃｏｌ．、９巻、９９〜１０３頁）。
【０００７】
ＡＦＰには数々の機能上の特性があり、これらは現在熱心に研究されている。胎児血清アルブミンの類似体としてのＡＦＰの古典的概念を、現在、細胞の増殖、発達、及びプログラムされた死の調節を行うＡＦＰの能力に関するデータが補足している（Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｙ  Ｇ．Ｊ．、２００２年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．、２巻、８９〜１１５頁）。特に、組換えＡＦＰは、血清及び培養の類似体と同様に、エストロゲン依存性の腫瘍組織及び正常組織の増殖を抑制することができることが示された（Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ．Ａ．ら、１９９７年、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、４５巻、１６９〜１７９頁；Ｂｅｎｎｅｔ  Ｊ．Ａ．ら、１９９８年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４巻、２８７７〜２８８４頁）。最近では、ＡＦＰの腫瘍抑制活性が、典型的な形態学的変化、増殖の阻止、細胞毒性、及びＤＮＡフラグメンテーションを特徴とする、アポトーシスを引き起こすメカニズムにしたがって行われることが確立された（Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ  Ｌ．Ｎ．、１９９７年、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．、１８巻、２６１〜２７４頁；Ｄｕｄｉｃｈ  Ｅ．Ｉ．ら、１９９８年、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．、１９巻、３０〜４０頁；Ｄｕｄｉｃｈ  Ｅ．Ｉ．ら、１９９９年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２６６巻、１〜１３頁；Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ  Ｌ．ら、２００３年、Ｅｕｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０巻、４３８８〜４３９９頁）。
【０００８】
初期の研究では、ＡＦＰが免疫細胞の分化及び活性化を調節する能力が示された。特に、ＡＦＰは、アロ抗原又は自己抗原で活性化された免疫細胞を抑制することができ、様々なサイトカインの遺伝子の発現を阻害することができる（Ｙａｍａｓｈｉｔａ  Ｋ．ら、１９９３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５３巻、２９７０〜２９７５頁；米国特許第５９６５５２８号）。一方、ＡＦＰは、未熟な骨髄細胞、幹細胞、及び胎児細胞の増殖の明らかな刺激を引き起こす（Ｄｕｄｉｃｈ  Ｅ．Ｉ．ら、１９９８年、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．、１９３０〜４０頁；米国特許第６６２７４４０号）。
【０００９】
ＡＦＰのこれらの特性、及び、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける癌細胞によるＡＦＰの吸収の選択性の増加もまた（Ｕｒｉｅｌ  Ｊ．ら、１９８９年、Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｙ  Ｇ．Ｉ．、Ｊａｋｏｂｓｏｎ  Ｈ．Ｉ．編集、「α−フェトプロテインの生物学的特性（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ａｌｐｈａ−Ｆｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）」、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、２巻、１０３〜１１７頁）、自己免疫疾患（米国特許第５９６５５２８号）及び腫瘍学的疾患（米国特許第６４１６７３４号；Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｙ  Ｇ．Ｊ．、２００２年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．、２巻、８９〜１１５頁）の処置において、治療用調製物として医薬におけるその使用のための基礎を明らかにした。更に、ＡＦＰは伝統的に、腫瘍学的疾患及び胎児の発達の病態の初期診断のための腫瘍胎児性マーカーとして使用されている（Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．、１９９１年、Ａｄｖ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、５６巻、２５３〜３１２頁）。しかし、天然のＡＦＰを薬物として使用するということは、原材料が不足しているので、技術的に不可能である。
【００１０】
伝統的に、ＡＦＰを獲得するための供給源は、妊婦の血清、臍帯胎児血清、又は癌患者の腹水である。明らかに、これらの供給源は、医薬の目的のためのタンパク質物質の生成に許容できない、というのは、第一に、原材料の供給源への接近が特に制限されており、その中のＡＦＰ含量は低く、第二にウィルス又はプリオンでの感染の危険性が増え続けているからである。
【００１１】
様々な微生物で組換えＡＦＰ（ｒＡＦＰ）の発現、及び精製に関する初期のデータが公開された（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｒ．ら、１９９０年、  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、４６巻、１６７９〜１６８６頁；Ｎｉｓｈｉ  Ｓ．ら、１９８８年、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、１０４巻、９６８〜９７２頁；米国特許第５２０６１５３号；米国特許第６３３１６１１号）。このようにして、ヒトｒＡＦＰの細胞内生成が、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｒ．ら、１９９０年、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、４６巻、１６７９〜１６８６頁；米国特許第５２０６１５３号）、及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（米国特許第６３３１６１１号、Ｂｏｉｓｍｅｎｕ  Ｒ．ら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１０巻、１０〜２６頁）で行われた。大腸菌で発現された組換えＡＦＰは、胎児の類似体の免疫調節活性及び腫瘍抑制活性を保持していることが示された（Ｂｏｉｓｍｅｎｕ  Ｒ．ら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、１０巻、１０〜２６頁；Ｂｅｎｎｅｔｔ  Ｊ．Ａ．ら、１９９７年、Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．、４５巻、１６９〜１７９頁）。これらの発現システムの主な欠点は、異種性のタンパク質を分泌することができず、その生成が特に低レベルであることである。更に、組換え系統産生株のバイオマスから望ましい生成物を得るには、変性及び復元の更なる過程を行うことが必要とされたが、生成物の収量の大幅な減少をもたらし、結果として費用が実質的に増大した。また、細菌の発現システムを使用する場合には、既知の内毒素活性を有する外皮のリポ多糖での生成物の汚染の問題も重大である。
【００１２】
本発明に最も類似する技術上の解決法は、参考文献（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｒ．ら、１９９０年、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、４６巻、１６７９〜１６８６頁；米国特許第５２０６１５３号）に記載されているヒトＡＦＰの系統産生株である。これらの供給源には、ヒトＡＦＰの細胞内生成を行う酵母菌の系統産生株である出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が公表されており、そのアミノ酸配列は、ラットＡＦＰのシグナルペプチドに対応する更なる切片を含んでいる。この発明は、酵母菌系統の生成物の分泌を同定するが、この生成物はヒト成熟ＡＦＰの特性を有し、ヒト成熟ＡＦＰの配列に対応する配列番号２のオリジナル配列を有する。この特殊性は、本発明に記載する生成物と、以前に開示されたものとを区別するものである（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｒ．ら、１９９０年、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、４６巻、１６７９〜１６８６頁；米国特許第５２０６１５３号）。更に、引用した参考文献に記載されたこれらの系統の欠点は、細胞内集合に対するメカニズムがなく、液体培養物へのＡＦＰの分泌がないということであり、このため費用が大幅に上がり、精製された組換えＡＦＰを調製用の量で調製する過程をより複雑にし、極めて低レベルのＡＦＰの生成をもたらす。更に、引用した研究の著者らは（Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｒ．ら、１９９０年、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、４６巻、１６７９〜１６８６頁；米国特許第５２０６１５３号）修飾された組換えＡＦＰを得たが、その配列はシグナルペプチド及びリンカーペプチドも含み、このタンパク質の構造修飾は、免疫学的特異性の変更をもたらし、その結果、静脈内投与又は皮下投与での免疫反応性の病態の危険性の増大をもたらすので、その医薬への使用の可能性を制限するものである。
【００１３】
酵母細胞で、ジスルフィド結合（ＡＦＰ内で）の形成で正確なフォールディングが起こるタンパク質の生成物を異種性に分泌する場合、重要なのは産生株の細胞での酵母菌のジスフフィドイソメラーゼ（Ｐｄｉ）の生成レベルである（Ｓｈｕｓｔａ  Ｅ．Ｖ．ら、１９９８年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、１６巻、７７３〜７７７頁）。更に、シャペロン様酵母菌タンパク質Ｂｉｐの量の増大が、この酵素と相乗する作用をもたらす（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ａ．Ｓ．ら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、１００１７〜１００２２頁）。
【００１４】
酵母菌はプロテイナーゼの分泌がない生物体であると伝統的にみなされているが（Ｃｈｕｎｇ  Ｂ．Ｈ．及びＰａｒｋ  Ｋ．Ｓ．、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、５７巻、２４５〜２４９頁）、ＨＳＡを含む数々のタンパク質に対して酵母菌を培養する過程でこれらが分解されることが示されており、細胞に付随する未だに未同定のプロテイナーゼの存在に関連している（Ｃｈｕｎｇ  Ｂ．Ｈ．及びＰａｒｋ  Ｋ．Ｓ．、１９９８年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．、５７巻、２４５〜２４９頁；Ｋａｎｇ  Ｈ．Ａ．ら、２０００年、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、５３巻、５７５〜５８２頁）。列挙した要因は全て、液体培養物中に効果的に分泌される、ＡＦＰの酵母菌産生株の作成の間中考慮に入れることが必要とされる。
【００１５】
現在組換えＡＦＰの調製に存在する方法の欠点を考慮に入れると、組換えＡＦＰを発現し、分泌するためのシステムの技術の更なる改良、特に、天然の３次構造の細胞内集合を提供し、望まれる生成物を液体培養物中に引き続き分泌する異種性のタンパク質をより高度に発現する能力を有する新規な組換え系統の開発が必要とされていることが明らかになっている。
【００１６】
このように、その特性に関してヒト血清ＡＦＰと同一又は類似しており、したがってヒト血清ＡＦＰが伝統的に使用されている分野においてそれを使用することを可能にする、産業的に適用可能なＡＦＰの調製方法を開発する必要は、最新技術から客観的に続いているものである。
【００１７】
記載した目的の達成は、その特性に関してヒト血清ＡＦＰと同一又は類似のポリペプチドを培養基中に生成することができる、新規な微生物の系統を作り出すことにより可能である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
その特性がヒト血清ＡＦＰの特性と同一又は類似の組換えＡＦＰを調製するために、分泌された可溶性の形態のＡＦＰの合成及び生成をもたらす系統産生株を開発することが必要であった。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
ヒト成熟ＡＦＰの活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むプラスミドで、親系統を形質転換することにより遺伝子工学の方法を使用して系統産生株を得た。
【００２０】
酵母菌の発現システムで生成された分泌された組換えＡＦＰは、ヒト成熟ＡＦＰの特性と同一又は類似の特性を有し、この特性は、免疫学的分析で決定され、Ｂ細胞Ｒａｊｉリンパ腫、及び、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養物におけるアポトーシス誘導性の作用に感受性な他のヒトの細胞系の増殖を抑制するその能力により決定される。このＡＦＰは、得られたＡＦＰ、及び、伝統的な方法により得られ配列番号２で表したアミノ酸配列を有するヒト成熟血清ＡＦＰと同一の作用機序を提供する。本発明によるＡＦＰを調製する方法を行うための条件により、天然のヒトＡＦＰと比べて欠点が最小のポリペプチドの集合がもたらされる。
【００２１】
酵母菌で生成されたヒト組換えＡＦＰとヒト血清ＡＦＰとの特性の近接性は、単離の過程は変性−復元のステップを必要とせず、同時に、得られたポリペプチドのグリコシル化、並びに分子のフォールディング及びジスルフィド結合の形成ももたらすという点で、プラスミドの組成においてヒト成熟ＡＦＰをコードするＤＮＡ配列を含む発現カセットを含むことにより提供される。酵母菌の発現システムで分泌型で生成された組換えヒトＡＦＰは、Ｎ型によりグリコシル化されているが、特許（Ｍｕｒｇｉｔａ  Ｒ．Ａ．米国特許第６３３１６１１号、第６６２７４４０号、第６４１６７３４号）に記載されている組換え細菌ＡＦＰはグリコシル化されていないという点で、プロユーカリオティック（ｐｒｏｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ）の発現システムで生成された組換え類似体と異なる。酵母菌の発現システムで分泌型で生成されたヒト組換えＡＦＰは、オリゴ糖鎖の組成及び構造により血清の類似体と異なるが、オリゴ糖鎖の組成及び構造は、酵母菌の系統及び栄養培地に含まれる糖の組成により決定される。
【００２２】
宿主細胞から必要とされる活性を有する分泌されたタンパク質の高収率を得るために、ＡＦＰ遺伝子をコードするプラスミドに、いくつかのさらなる遺伝子を加えたが、さらなる遺伝子は、高レベルの遺伝子の転写、分泌の過程におけるタンパク質のフォールディング、及びジスルフィド結合の正確な形成をもたらした。
【００２３】
その結果、ＡＦＰを発現し、分泌するために細胞を形質転換する能力を有するｐＫＸプラスミドが得られた。
【００２４】
前述のプラスミドの助けで、組換えα−フェトプロテインを分泌する能力を有する真核生物の産生株細胞を得た。
【００２５】
好ましい変異株では、出芽酵母ＹＢＳ７２３のレシピエント系統を始原細胞として使用したが、この系統はＲｕｓｓｉａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＶＫＰＭ）にＮｏ．Ｙ−３１１５で寄託されている系統産生株出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸを得るために、ｐＫＸプラスミドにより形質転換されたものである。
【００２６】
形質転換された系統を培養する間、ＡＦＰは、伝統的な生化学的方法を使用してそれから純粋な形態で単離することができる培地中に分泌される。
【００２７】
形質転換された細胞から得られた、単離されたＡＦＰを、腫瘍細胞の増殖を阻害する薬剤組成物の成分で用い、薬剤組成物は、得られたＡＦＰ並びに薬学的に許容できる担体及び賦形剤を含む。
【００２８】
単離したＡＦＰを、腫瘍細胞の増殖を阻害する相乗作用の組成物の構成で用い、相乗作用の組成物は、得られたＡＦＰ、及び化学療法の調製物、並びに薬学的に許容できる担体及び賦形剤を含む。
【００２９】
単離されたＡＦＰを用いて、それをベースとする薬剤組成物、又はその相乗作用の組成物を含む薬剤組成物、癌を治療し、又はその進行を予防するための方法が開発されており、この方法は、有効量のＡＦＰ、薬剤組成物、又は相乗作用の組成物を患者に投与することを想定するものである。
【００３０】
得られたＡＦＰは、ヒト血清ＡＦＰの特性に関して類似しているので、得られたＡＦＰは、免疫抑制作用及び免疫調節作用を有する相乗作用の組成物の構成で用いられ、この場合、組成物は、ＡＦＰ、及びシクロスポリンＣ、並びに薬学的に許容できる担体及び賦形剤を含む。
【００３１】
単離されたＡＦＰ、又は前述の相乗作用の組成物を使用して、自己免疫疾患を治療し、免疫状態を正すための方法が開発されており、この方法は、有効量のＡＦＰ又は相乗作用の組成物をシクロスポリンＣと共に患者に投与することを含む。
【００３２】
幹細胞の増殖を刺激するＡＦＰの能力を考慮して、本発明者らは、幹細胞の増殖を刺激する薬剤組成物を提唱しており、この組成物は、得られたＡＦＰ、並びに薬学的に許容できる担体及び賦形剤を含み、並びに幹細胞の増殖を刺激する相乗作用の組成物も提唱され、この組成物は、得られたＡＦＰ、及びビタミンＡ、Ｅ、Ｄの誘導体、抗酸化剤、ステロイドホルモン、植物起源のイソフラボンを薬学的に許容できる担体及び賦形剤と共に含む。
【００３３】
単離されたＡＦＰ、前述の薬剤組成物又は相乗作用の組成物を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで幹細胞の増殖を刺激するための方法が提唱され、この方法は、有効量のＡＦＰ、又は対応する組成物で細胞に作用することを含む。
【００３４】
更に、ｉｎ  ｖｉｖｏで幹細胞の増殖を刺激するための方法が提唱され、この方法は、患者に有効量のＡＦＰ、又は前述の薬剤組成物若しくは相乗作用の組成物を投与することを含む。
【００３５】
単離されたＡＦＰの機能的活性に基づいて、皮膚を若返らせ、皮膚の老化を防ぐための美容用組成物が提唱されており、組成物は、得られたＡＦＰを美容上許容できる担体及び賦形剤と共に含み、任意選択でビタミンＡ、Ｅ、Ｄの誘導体、抗酸化剤、ステロイドホルモン、植物起源のイソフラボンを含む。
【００３６】
得られた美容用の組成物を、皮膚を若返らせ、皮膚の老化を防ぐために使用する方法が、本発明の枠組み内で提唱され、この方法は、組成物を個体の皮膚上に適用することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
本発明を理解するために、主な技術上の目的は、望まれるタンパク質を液体培養物中に効果的に分泌することができるＡＦＰの酵母菌産生株の系統を作成することであった。この目的は、ヒトＡＦＰの調節された合成をコードする組換えＤＮＡのｐＫＸプラスミド、及び、溶解した分泌型のＡＦＰの１０ｍｇ／ｌ以上の発現レベルの合成及び生成をもたらす出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸ系統を構築することにより解決される。溶解した分泌型の望まれるタンパク質の高レベルの合成は、ｐＫＸプラスミドが、シャペロン重鎖結合タンパク質ＢｉＰをコードするＫＡＲ２遺伝子の同時の増幅と共にＧＡＬ１遺伝子のプロモーターを含むという点でもたらされる（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ａ．Ｓ．、ら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、１００１７〜１００２２頁）。レシピエントの系統のゲノムでは、タンパク質の分泌プロセスの間中ジスルフィド結合の形成に関与するジスルフィドイソメラーゼ酵素をコードするＰＤ１１遺伝子の増幅がある（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ａ．Ｓ．ら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２７１巻、１００１７〜１００２２頁）。
【００３８】
組換えプラスミドＤＮＡは、遺伝子の高レベルの転写をもたらすＧＡＬ１プロモーター遺伝子、及び、シャペロン重鎖結合タンパク質ＢｉＰをコードし、タンパク質に対する分泌プロセスの間中タンパク質のフォールディングに関与し、望まれるタンパク質の液体培養物中への高レベルの生成をもたらすＫＡＲ２遺伝子の制御下で、ヒトＡＦＰ遺伝子を含む。更に、ジスルフィド結合の正確な形成、及びタンパク質の天然の３次構造の形成をもたらすために、ジスルフィドイソメラーゼをコードするＰＳ１１遺伝子を用いる。
【００３９】
ヒトＡＦＰ遺伝子をコードする組換えｐＫＸプラスミドＤＮＡ（図１）は、以下の特徴により特徴付けられる。
ヒトＡＦＰを効果的に分泌するための発現プラスミドである。
サイズは１３３０１ｂｐである。
配列番号２のヒト成熟α−フェトプロテインのアミノ酸配列をコードするフラグメントを含む。
【００４０】
細菌のプラスミドであるｐＵＣ１８のフラグメント、２−μｍの酵母菌プラスミドの開始領域、選択的な酵母菌マーカーＰＧＫ１、シャペロン重鎖結合タンパク質ＢｉＰをコードするＫＡＲ２酵母菌遺伝子、ジスルフィドイソメラーゼ酵素をコードするＰＤ１１遺伝子、ＡＦＰゲノムを有する発現カセットを含む。
配列番号１のヌクレオチド配列が表す発現カセットの構造には、ＧＡＬ１酵母菌遺伝子のプロモーター領域、ＭＦα１酵母菌遺伝子の分泌のプレプロ領域、ヒト成熟ＡＦＰをコードする領域、ＣＹＣ１酵母菌遺伝子の転写終結のフィールドが含まれる。このプラスミドを細胞中に導入すると、高度に効果的なＧＡＬ１プロモーターの使用によりＡＦＰ遺伝子の高レベルの転写が実現される。コード領域が液体培養物におけるヒト成熟ＡＦＰをコードするＤＮＡ配列に対応する場合は、ＭＦα１の分泌のプレプロ領域を導入することで、予想される配列番号２のアミノ酸配列でのタンパク質の効果的な分泌を伴うＡＦＰの正確な分泌のプロセシングがもたらされる。
提唱されたプラスミド構築の著しい差異は、ａｆｐ遺伝子は高度に効果的なＧＡＬ１プロモーターの制御下にあること、並びに、ジスルフィド結合の正確な形成、及びタンパク質の天然の３次構造の形成をもたらすためにＰＤ１１及びＫＡＲ２遺伝子を用いることである。
【００４１】
指摘されたプラスミドでのそのような形質転換を受けやすいあらゆる真核生物細胞を、作成したプラスミドの助けで形質転換することができる。形質転換の方法及びステップは当業者にはよく知られているので、細胞の選択は重要ではない。しかし、細胞のタイプ、及び得られた形質転換体を培養するための状態に応じてＡＦＰの発現のレベルが変化しうるが、必要なペプチドの発現の事実が、親細胞の形質転換が成功する条件下で起こる。
【００４２】
遺伝子型ｐｇｋ１／ｐｇｋ１のレシピエント系統ＹＢＳ７２３を用いて、出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸの系統を得た。ｐｇｋ１／ｐｇｋ１のホモ接合体により、酵母菌の出芽酵母が標準の消化可能な範囲内である任意の単一の炭素源を含む培地全てにおいて、この系統が増殖することが不可能になっている。ｇａｌ８０：：ＰＤ１１／ｇａｌ８０：：ＰＤ１１のホモ接合体は、ＧＡＬ１遺伝子のプロモーターの調節の変化をもたらし、ジスルフィドイドイソメラーゼ酵素をコードし、タンパク質の分泌過程の間中ジスルフィド結合の形成に関与するＰＤ１１遺伝子のゲノムを同時に増幅する。
【００４３】
ＹＢＳ７２３系統は、この方法（Ｉｔｏ  Ｈ．ら、１９８３年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５３巻、１６３〜１６８頁）にしたがってｐＫＸプラスミドにより形質転換される。形質転換は、炭素源として２％グルコースを含むフルバリュー（ｆｕｌｌ−ｖａｌｕｅ）の酵母菌培地（バクトペプトン２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、バクトアガー２０ｇ／ｌ）上で増殖する能力にしたがって選択された。このようなクローンの１つは、ＹＢＳ７２３／ｐＫＸと呼ばれる。
【００４４】
得られた２倍体の酵母菌系統出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸは、以下の特徴により特徴付けられる：
遺伝子の特徴：遺伝子型ｐｇｋ１／ｐｇｋ１  ｇａｌ８０：：ＰＤ１１／ｇａｌ８０：：ＰＤ１１；
形態学的特徴：２％グルコースを単一の炭素源とする固形栄養培地上に増殖した４８時間培養の栄養細胞は、長円形の形状で、細胞の大きさは３．６×７．１μｍであり、原形質（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｍａ）は均質であり、繁殖は出芽による。酵母抽出物及びペプトン（ＹＥＰ）を含む固形培地上で３０℃で増殖させると、増殖の７２時間後にカラム（ｃｏｌｕｍｎ）は以下の外観を呈する：
１）グルコースを含むＹＥＰ培地上−辺縁は滑らかで、表面は光沢があり、円錐形の輪郭で、クリーム様の粘稠性のある白色カラム
２）デンプンを含むＹＥＰ培地上−辺縁は凸凹で、表面は光沢がなく、レンズ様の輪郭で、粒状の粘稠性の白色カラム
３）糖みつを含むＹＥＰ培地上−表面に鈍いしわがあり、辺縁は凸凹で、凸面体の輪郭で、クリーム様の粘稠性のある白色カラム
液体培地における増殖−デンプンを含むＹＥＰ培地３２℃で、培養後最初の２４時間の間に、液体は白濁し、白色の残留物を生じ、固まらず、頭頂膜を形成しない。
物理化学的特徴：通性嫌気性。増殖温度−２３〜３３℃（最適３１℃）。培養のｐＨ３．８〜６．７（最適５．０）。ＡＦＰ分泌の最高レベルはｐＨ６．８〜７．０でみられる。
炭素源の同化作用：グルコース、ガラクトース、フルクトース、マルトース、サッカロース、デキストリン、デンプンを発酵する。
窒素源の同化作用：アミノ酸、尿素、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムを同化する。
特徴的な特異性：デンプンに富む（２％）培地上で培養した場合に、ディッシュで＋４℃、２４時間培養後、暗色の縁に取り囲まれたデンプンの退色帯が表れる。
病原性：出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸ系統に病原性はない。
貯蔵方法：この系統は、グルコースを含むアガライズドの（ａｇａｒｉｚｅｄ）リッチな培地上で、＋４℃で３カ月間貯蔵される。
【００４５】
得られた出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸ系統は、分泌型のＡＦＰの産生株であり、Ｒｕｓｓｉａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＶＫＰＭ）にＮｏ．Ｙ−３１１５で寄託されている。
【００４６】
本出願者らが提唱する組換えＡＦＰの細胞系統産生株は、既存の原型にまさる数々の利点を有している：
望まれる生成物の生成が、液体培養物中に分泌型で行われる。
最終生成物のアミノ酸配列が、配列番号２のヒト成熟ＡＦＰの配列に対応する。
血清の胎児性の類似体と同様、出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸ系統産生株が生成したｒＡＦＰはグリコシル化されている。
ジスルフィド結合の形成をもたらすジスルフィドイソメラーゼ酵素ＰＤ１１をコードする遺伝子、並びに、タンパク質の正確な集合及び望まれる生成物の培養基中への分泌をもたらすシャペロン重鎖結合タンパク質ＢｉＰをコードするＫＡＲ２遺伝子の発現の増大により、望まれる生成物の収量は大幅に増大する。
【００４７】
ＤＮＡをコードする配列は、全体としてフェトプロテインの不活性型の獲得をもたらすことのない、遺伝暗号の変性に関する置換、及び、いくつかの置換、挿入、欠失を含むことがあることは全く明らかである。可能な変形は、当業者であれば知っている。得られたポリペプチドは、あるアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸との置換を想定すると、アミノ酸配列の枠組み内の保存的アミノ酸置換も含むことができる。しかし、本発明が請求する特徴の範囲内では、１次、２次、及び３次構造を有する、得られたポリペプチドの必要とされる活性を妨害することがない、特に、免疫学的分析、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養でＢ細胞Ｒａｊｉリンパ腫の細胞の増殖を抑制するその能力にしたがって決定して、ヒト成熟ＡＦＰの特性と同一又は類似の特性を有するこれらのポリペプチドだけが存在する。
【００４８】
得られたポリペプチドがヒト成熟血清ＡＦＰの特性を有すると考えられている機能上の活性の指標を、免疫学的反応にしたがって、及び、ヒト成熟血清ＡＦＰの活性の１０％以上のレベルでＢ細胞Ｒａｊｉリンパ腫の細胞の増殖をｉｎ  ｖｉｔｒｏで阻害するその能力にしたがって決定する。
【００４９】
組成物の構成の中で得られたポリペプチドを実際に使用する場合には、賦形剤、希釈剤、保存剤、バッファー溶液、生理学的溶液、塩化ナトリウムの０．９％溶液、薬物形態の生成中に用いる技術的な添加物などの、伝統的な更なる構成成分を用いる。組成物は、非経口、経口、静脈内、筋肉内などの投与又は外用の使用に供する、液体（溶液、懸濁液、クリーム、乳液など）でもよく、固体（使用前に再構成する凍結乾燥粉末、担体上に吸着させた調製物など）でもよい。その場合、外用の使用の組成物は、組織における有効物質の吸収及び拡散を促進する添加物を含むことができる。
【００５０】
本発明の相乗作用の組成物は、別の有効物質の、組成物における存在を提供し、この場合、２つの有効物質が同時に存在する場合には、その１つは本発明によるＡＦＰであり、これらの作用の効果は、各物質を別々に用いた場合よりも相対的に高い。
【００５１】
当業者であれば各有効成分を別々に投与する変形が明らかであるので、相乗作用の組成物は、本発明の実施形態の好ましい変形の１つであることは、きわめて明白である。例えば、抗癌治療の場合には、有効成分の各調製物を、投与時間により、又は様々な投与方法により分けて、別々に投与することも、同時に一緒に投与することもできる。具体的な選択は、患者の状態、疾患の重症度、以前の治療などによる。
【００５２】
処置のための治療投与量の選択は、必要とされる治療効果が得られるのであれば、患者の体重１ｋｇあたり０．００１〜１０ｍｇの広範囲における任意の投与量であることができる。得られたＡＦＰは、活性に関して類似又は近接の特性を有するので、これはヒトＡＦＰの伝統的な投与量に対応する。本発明によるＡＦＰは、ヒトの正常の免疫系が「異物」として認識しない類似のアミノ酸配列を有するので、その限定的な投与量は、ヒトＡＦＰの投与量に対応する。
【００５３】
本発明を以下の実施例により説明するが、これらは限定的な性質のものではなく、しかし、本発明の実施形態を実証することを意図し、実施形態の最良の変形の理解を意図するものである。
【実施例】
【００５４】
（実施例１）
ｓｕｍＲＮＡの単離、及び中間体の組換えプラスミドＤＮＡｐＴｒｃａｆｐの構築
製造元の方法にしたがって、Ｔｒｉｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、米国）の助けで、ヒト肝細胞癌ＨｅｐＧ２の細胞系から全ｍＲＮＡを単離した。遺伝子ａｆｐの３’末端に相補的なプライマーオリゴ（ｄＴ）１８、又はＧＡＡＧＴＡＡＴＴＴＡＡＡＣＴＣＣＣＡＡＡＧＣ（３Ｒ）の存在下で、Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）を用いて、ｃＤＮＡを得た。引き続きクローニングをするために得られたマトリックスの増幅は、
【化１】
2008506384.tif 000002
のプライマーの存在下で行ったが、その１番目は成熟タンパク質遺伝子の５’配列に対応し（太文字で選び出したもの）、制限酵素ＣｌａＩの認識部位を含み、２番目は遺伝子の３’末端切片に相補的であり（太文字で選び出したもの）、ＨｉｎｄＩＩＩの認識部位を含む。遺伝子の増幅は、１００μｌの体積で行った。反応混合物には、ｃＤＮＡ１０ｎｇ、プライマー（１）及び（２）各３０ｐＭ、ｄＮＴＰの混合物（各０．２ｍＭ）、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  １０ｍＭ、ｐＨ８．８、ＫＣｌ  １０ｍＭ、ＭｇＳＯ４２．５ｍＭ、ＤＮＡポリメラーゼ２．５単位Ｐｆｕ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）、及びＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ１単位（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ社）が含まれていた。９５℃／４０秒、３９℃／４０秒、７２℃／１分の計画にしたがって２５サイクルを行った。反応生成物を、１％アガロースゲルで電気泳動して分析し、約１７９０ｂｐの長さの細片を切り出し、ゲルからＤＮＡを抽出し、制限酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩで処理し、ベクターｐＴｒｃ９９Ａをベースにして先に得られたプラスミドｐＴｒｃＴＥＧＦ中にクローニングし（Ａｍａｎｎ  Ｅ．ら、１９８８年、Ｇｅｎｅ、６９巻、３０１〜３１５頁）、これらの同じ制限酵素で処理した。その結果、プラスミドｐＴｒｃａｆｐが得られ、どのクローニングが行われたかに関して制限酵素ＣｌａＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いて、また、その認識部位がＡＦＰ遺伝子の内部にあるＳｐｅＩ、ＭｕｎＩ、ＳｅｃＩ、及びＳｔｙＩを用いて制限酵素分析により確認し、ＰＣＲの助けでクローニングしたＤＮＡ切片のヌクレオチド配列の決定により、その構造を確認した。この方法にしたがって、また、Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅａｄｅｒ（登録商標）ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ、リトアニア）を使用して配列決定を行った。
【００５５】
（実施例２）
ヒトＡＦＰ遺伝子をコードする合成ｃＤＮＡの調製
合成されたＡＦＰ遺伝子を得るために、６２〜６８ｂの長さを有する３６のオリゴヌクレオチドを化学的に合成した。これらのオリゴヌクレオチドをベースにして、ポリメラーゼ連鎖反応の方法により、そのそれぞれがベクターｐＵＣ１８にクローニングされる２本鎖フラグメントを６つ得た。クローニングされたフラグメント全ての１次構造を、配列決定により確認した。正確なヌクレオチド構造を有するフラグメントを、次いで、プラスミドｐＵＣ１８のフラグメントの形態で、制限／ライゲーションの方法により望ましい遺伝子中に逐次的に回収した。同様の方法で、欠失、変異、又はアミノ酸残基の付加を含む、修飾型のＡＦＰを発現するためにｃＤＮＡを得た。
【００５６】
（実施例３）
組換えプラスミドＤＮＡｐＫＸの構築
プラスミドｐＴｒｃａｆｐを、プライマー
【化２】
2008506384.tif 000003
の存在下で、ＰＣＲ用のマトリックスとして用いた。
【００５７】
制限部位ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ（下線付き）を、プライマーの配列にセットする。制限酵素ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで処理後、増幅の結果として得られたＤＮＡフラグメントを、プロモーターＧＡＬ１及び分泌のＭＦα１のプレプロ領域を含むベクターｐＵＣ１８／ＧＡＬ１−ｐｐ上にクローニングした。その結果、プラスミドｐＵＣ１８／ＧＡＬ−１ｐｐ／ａｆｐが得られた。ＰＣＲの可能なエラーを排除するために、プラスミドのＮｃｏＩ／ＸｈｏＩフラグメントの配列を決定した。プロモーターＧＡＬ１、分泌のＭＦα１のプレプロ領域を含み、ヒトＡＦＰ遺伝子の部分をコードする（図２）プラスミドｐＵＣ１８／ＧＡＬ−１ｐｐ／ａｆｐのＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｘｈｏｌバイレプリコン（ｂｉｒｅｐｌｉｃｏｎ）（酵母菌−大腸菌）ベクターｐＰＤＸに移した。その結果、プラスミドｐＰＤＸ／ＧＡＬ−ｐｐ／ａｆｐが得られた。プラスミドｐＰＤＸ／ＧＡＬ１−ｐｐ／ａｆｐのＣｌａＩ／ＸｈｏＩフラグメントを、ＫＡＲ２遺伝子の存在によりｐＰＤＸと異なるｐＰＫのＣｌａＩ／ＸｈｏＩベクターに移した。その結果得られたプラスミドを、ｐＫＸと命名した（図１）。同様の方法で、最も広く使われている酵母菌コドンから成る合成ヒトＡＦＰ遺伝子を含むプラスミドｐＫＸ−１を得た（図３）。プラスミドｐＫＸ−１は、ヒト成熟ＡＦＰの合成遺伝子を含むという点で、ｐＫＸと異なる。
【００５８】
（実施例４）
ヒトＡＦＰの系統産生株の獲得
出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸ系統を得るために、この方法（Ｉｔｏ  Ｈ．ら、１９８３年、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１５３巻、１６３〜１６８頁）によりプラスミドｐＫＸにより、レシピエント系統ＹＢＳ７２３を形質転換した。形質転換体は、炭素源として２％グルコースを含むフルバリューの酵母菌培地（バクトペプトン２０ｇ／ｌ、酵母抽出物１０ｇ／ｌ、バクトアガー２０ｇ／ｌ）上に増殖できるかどうかによって選択した。このようなクローンの１つを、ＹＢＳ７２３／ｐＫＸと呼ぶ。
【００５９】
（実施例５）
ヒトＡＦＰの系統産生株出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸの生産性の決定
系統産生株ＹＢＳ７２３／ｐＫＸの細胞を、バイアルで、以下の成分：グルコース２％、グリセリン１．５％、酵母抽出物１％、ペプトン２％、蒸留水の培地上で、ロッカー（２５０ｒｐｍ）上２６℃で増殖させた。０．１Ｍリン酸バッファーを添加して、培地のｐＨを７．０に維持した。細胞の最初のタイターは、５×１０６であった。増殖のタイターが７〜８×１０８の定常期に移行した後、培養液の増殖７２時間後に試料を採取した。培養物を１００００ｒｐｍで１分間遠心分離した後に、液体培養物の試料を得、以下の分析で用いた。ＣＬの試料を、ドデシル硫酸ナトリウムを含む１２．５％ポリアクリルアミドゲルで電気泳動することにより分析した。ゲルをＣｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｒ−２５０で着色し（図４）、スキャンして、全タンパク質及びＡＦＰ特異的タンパク質の相対的含有量を決定した。電気泳動及びスキャニングのデータによると、ＣＬにおけるＡＦＰの全含有量は全タンパク質の約１０〜２５％であるが、タンパク質の部分的な細胞内変性が存在する。ＣＬにおけるＡＦＰの相対的含有量を、ＡＦＰに対するポリクローナル抗体の存在下で免疫ブロット法の方法により決定した（図４）。液体培養物におけるＡＦＰの定量的含有量も、ヒトＡＦＰに対するモノクローナル抗体及びポリクローナル抗体のセットを用いて、免疫酵素学的分析（ＩＥＡ）法により決定した。ＩＥＡのデータによると、液体培地におけるＣＬにおけるＡＦＰの平均含有量は、５ｍｇ／ｌに達した。
【００６０】
（実施例６）
高密度培地における、ヒトＡＦＰ系統産生株出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸの生産性の決定
ＹＢＳ７２３／ｐＫＸ系統の流加培養を、２６℃、ｐＨ７．０の発酵槽（自動維持）で行った。溶存酸素ｄＯの含有量を、＞２０％に維持した。発酵の間中、以下の組成の培地で補給を行った：酵母抽出物３０ｇ／ｌ、ペプトン６０ｇ／ｌ、グルコース１００ｇ／ｌ。補給物の供給は、培養物の増殖速度μ＝０．０３をもたらすような速度であった。最適の２８０単位に等しいＯＤ５０を達成した後、ＣＬにおけるＡＦＰの含有量を分析した。ＹＢＳ７２３／ｐＫＸの高密度培養物のＣＬにおけるＡＦＰの相対的含有量及び全含有量を、上記実施例４に記載した通りに決定した。高密度培地で培養する場合には、ＩＦＡデータによるＣＬにおけるｒＡＦＰの含有量は７０ｍｇ／ｌに達した。
【００６１】
（実施例７）
系統産生株ＹＢＳ７２３／ｐＫＸのＣＬからのヒト組換えＡＦＰの単離及び特徴付け
系統産生株ＹＢＳ７２３／ｐＫＸのＣＬからのｒＡＦＰの単離を、以前の記載（Ｄｕｄｉｃｈら、１９９９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３８巻、１０４０６〜１０４１４頁）に少々変更を加えて行った。液体培養物は、細胞濃縮用「Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ」上で限外ろ過により３ｌから２００ｍｌに濃縮し、０．００５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌバッファー、４℃に対して透析し、次いで、０．５時間、１００００ｒｐｍで遠心分離した。
【００６２】
イオン交換クロマトグラフィー
遠心分離後に得られた上清を、イオン交換カラムＤＥＡＥ−セファロース  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、２７×４ｃｍ）上に適用し、０．０１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ  ＮａＣｌで平衡にした。吸着剤に結合しない成分は開始バッファーでカラムから洗浄し、望ましい生成物の溶出は０．２Ｍ  ＮａＣｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌバッファー溶液、ｐＨ７．５で、１ｍｌ／分の速度で行った。
【００６３】
アフィニティークロマトグラフィー
ｒＡＦＰを含む分画を合わせ、ＮａＣｌの濃度を０．５Ｍとし、０．０５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５及び０．５Ｍ  ＮａＣｌで平衡にしたポリクローナル抗−ＡＦＰウサギ抗体と複合させたセファロースＣＬ−４Ｂを含むアフィニティーカラムに適用した。タンパク質の抗体に結合していないタンパク質のアウトプットの後、吸着されたｒＡＦＰを０．００５Ｍ  ＨＣｌで溶出した。ｐＨを５．０から３．５に達成した際の材料のアウトプットのピークを、２８０ｎｍにおける吸光度により決定した。ｒＡＦＰの溶液に、２ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ溶液、ｐＨ７．５を添加することによりｐＨ７．５に中性化した。
【００６４】
ゲルクロマトグラフィー
ｒＡＦＰの更なる精製を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００（１．８×７．０ｃｍ）の０．１Ｍリン酸バッファー溶液、ｐＨ７．０；０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含むカラムで、速度０．５ｍｌ／分で、ゲルクロマトグラフィーによって行った。精製したｒＡＦＰの溶液を、窒素の圧力下、細胞「Ａｍｉｃｏｎ」（膜ＹＭ−３０）に濃縮した。
【００６５】
試料の分析
得られたｒＡＦＰ調製物の同定及び純度を、β−メルカプトエタノールを含む１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでＬａｍｍｌｙによるゲル電気泳動の方法により調節し、引き続き、Ｃｏｏｍａｓｓｉｅにより着色し（図４Ａ）、１次抗体１：５００、及び２次抗体１：５０００の力価でＰＶＤＦ膜上でウェスタンブロット分析を行い、Ｈｙｂｏｎｄ  ＥＣＬ−ニトロセルロース膜上でドットブロット（図４Ｂ）、ＩＦＡを行った。
【００６６】
溶液におけるタンパク質の濃度の決定を、胎児ＡＦＰの標準溶液を対照として用い、また、２７８ｎｍの分光光度法で、Ｂｒｅｄｆｏｒｄ法により消失係数Ｅ１％，２７８ｎｍ＝０．５３を考慮に入れて、２７８ｎｍの吸光度測定を行った。
【００６７】
（実施例８）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト組換えＡＦＰの生物学的活性の決定
ｒＡＦＰ及びその修飾型の機能上の活性を、以前に記載されたように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの培養物中でＢ細胞Ｒａｊｉリンパ腫の細胞の増殖を抑制するその能力にしたがって決定した（Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ  Ｌ．Ｎ．、１９９７年、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．、１８巻、２６１〜２７４頁；Ｄｕｄｉｃｈ  Ｅ．Ｉ．ら、１９９８年、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．、１９巻、３０〜４０頁）。新鮮な培地で予備的に洗浄したＲａｊｉ細胞を、１０％ウシ胎児血清の存在下ＲＰＭＩ−１６４０培地０．１ｍｌ中５×１０３にしたがって９６胞状プレートの各セル中に配置し、次いで、１２時間、様々な投与量のＡＦＰを添加した。細胞の増殖を、培養の終わりの４時間の間に［Ｈ３］−チミジンの導入による標準方法により測定した。比較のために、胎児起源のｅｍｂｒＡＦＰ及び酵母菌ｒＡＦＰの２つのＡＦＰの試料で、用量依存性の反応性を試験した（図５）。両調製物とも、これらの細胞に関して、細胞増殖抑制性の活性の発現を表すことは明らかである。同様に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＦＰに基づいて調製物の活性を決定するために、ＡＦＰの抑制作用に感受性がある、ヒト肝臓癌ＨｅｐＧ２、乳癌ＭＣＦ−７、前立腺癌ＬｎＣａｐ、骨髄芽球腫Ｕ−９３７、及びその他などの、癌細胞の任意の他の系統を用いることができる（Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ  Ｌ．Ｎ．、１９９７年、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．、１８巻、２６１〜２７４頁；Ｄｕｄｉｃｈ  Ｅ．Ｉ．ら、１９９８年、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．、１９巻、３０〜４０頁）。
【００６８】
（実施例９）
抗癌調製物としての組換えＡＦＰの使用
ｒＡＦＰ及びその修飾型をベースにした抗癌調製物を、原発性の又は転移の肝臓癌、血液の癌（白血病、骨髄芽球腫、リンパ腫）、乳癌、前立腺癌などの悪性新生物の増殖を阻止するために用いることができる。ＡＦＰに対するこのタイプの腫瘍細胞の感受性を決定するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び、またｉｎ  ｖｉｖｏでも異なる方法を使用することができる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで活性を決定する方法は、先の実施例８に記載してある。ｉｎ  ｖｉｖｏでＡＦＰをベースにした調製物の腫瘍抑制作用を決定するために、例えば、Ｒａｊｉ、ＨｅｐＧ２、ＬｎＣａｐ、ＭＣＦ−７、及びその他などの癌細胞のヒト系統を皮下に、又は腹腔内に埋め込んだヌードマウスの使用で、動物に対するモデルを使用することができる。例えば、Ｂ細胞Ｒａｊｉリンパ腫の細胞を、マウス１匹あたり１〜５×１０６の量で皮下投与した。ＡＦＰ及びその誘導体の投与を、腫瘍細胞を１〜１０ｍｇ／ｋｇの量で腹腔内又は静脈内に埋め込む７日前に開始した。生理学的バッファー溶液（ＰＢＳ）を、対照として用いた。腫瘍の大きさを、マイクロメーターの助けで毎日測定して、評価した。
【表１】
2008506384.tif 000004
【００６９】
酵母菌ｒＡＦＰ又はその誘導体をベースにした調製物を投与する方法は、その中に、同時に又は逐次に化学療法の調製物を投与することも含むことができる。このような化学療法の調製物の例として以下のものを挙げることができる：ドキソルビシン、ビンクリスチン、フルオロウラシル、メタトレキセート（ｍｅｔａｔｒｅｘａｔｅ）、アクチノマイシンＤ、マイトマイシンＣ、タモキシフェン、フルタミド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、シクロスポリン、レチノイド、カロチノイドなど。通常、化学療法の調製物は、標準の投与量、又は通常の治療用より少ない最適以下の投与量で投与することができる。ｒＡＦＰとドキソルビシンと（Ａ）、及びｒＡＦＰとオールトランスレチノイン酸（ｔＲＡ）と、の組合せ作用の効果を、例として図６に示す。調製物の同時投与の場合には、最適以下の投与量の使用の場合の相乗作用の腫瘍抑制効果が観察される。
【００７０】
（実施例９）
幹細胞の増殖を刺激するための組換えＡＦＰの使用
肺、及びヒト網膜の胎児性の繊維芽細胞の１次培養物を、合法の妊娠中絶後に得た５〜１０週の胎児の対応する組織の０．２％トリプシン溶液で処理することにより得た。細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＣＦＳ）の存在下、ＲＰＭＩ−１６４０培地で培養した。ＡＦＰの細胞増殖抑制作用を、以前に記載された通りに測定した（Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ  Ｌ．Ｎ．、１９９７年、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．、１８巻、２６１〜２７４頁；Ｄｕｄｉｃｈ  Ｅ．Ｉ．ら、１９９８年、Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．、１９巻、３０〜４０頁）。０．１５ｍｌの培地に４×１０４の量の細胞を、新鮮な培地で徹底的に洗浄し、９６弓形プレートの各セルに配置し、次いで、様々な投与量のＡＦＰを加え、２４時間培養した。細胞の増殖を、培養の終わりの４時間の間に、［Ｈ３］−チミジンを含むことによる標準方法により測定した。
【００７１】
ＡＦＰの細胞の増殖に対する投与量依存性の効果も、ヒト胎児性繊維芽細胞の１次培養物に対して試験した。ＡＦＰは、これらの細胞に刺激効果を有し、対照の５０〜９０％に達した（図７）。
【００７２】
（実施例１０）
美容学における組換えＡＦＰの使用
ＡＦＰは肝細胞の増殖を刺激する能力を有し、胎児の細胞に対する増殖因子であるという事実を考慮すると、美容用のマスク、クリーム、及びローションの調製物に対する使用の可能性が提唱されている。ｒＡＦＰは、リポソーム、ミクロソーム、及びナノソームのための賦形剤として用いることができる。ＡＦＰは、疎水性のリガンド、特に脂溶性ビタミン、ステロイド、イソフラビノイド、多価不飽和脂肪酸と結合することができるという事実を考慮して（Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．、１９９１年、Ａｄｖ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．、５６巻、２５３〜３１２頁；Ａｕｓｓｅｌ  Ｃ．及びＭａｓｓｅｙｅｆｆ  Ｒ．、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１１９巻、１１２２〜１１２７頁；Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．、１９９４年、Ｊ．Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｏｎｃｏｌ．、９巻、１１〜１４頁）、ｒＡＦＰの、レチノイド、カロチノイド、トコフェロール（ｔｏｋｏｆｅｒｏｌ）、ビタミンＤの誘導体などの脂溶性ビタミンとの組合せ使用、エストロゲン及びアンドロゲンの誘導体などのステロイドとの組合せ使用が示されている。このようなステロイドの例として、エストラジオール及びその他を使用することができる。
（参考文献）
Ａｍａｎｎ  Ｅ．，Ｏｃｈｓ  Ｂ．，Ａｂｅｌ  Ｋ．−Ｊ．（１９８８）  大腸菌遺伝子での未融合および融合タンパク質の発現に有用な、厳しく調節されたｔａｃプロモーターベクター。６９（２）：３０１−１５．
Ａｕｓｓｅｌ，Ｃ．＆  Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｒ．（１９９４）  アラキドン酸のヒトα−フェトプロテインの結合とのレチノイドおよびビリルビンの相互作用。Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１１９，１１２２−１１２７．
Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ａ．，Ｓｅｍｅｎｉｕｋ，Ｄ．Ｊ．，Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｈ．Ｉ．＆  Ｍｕｒｇｉｔａ，Ｒ．Ａ．（１９９７）  エストロゲン依存性乳がんの成長阻害剤としての天然および組換えヒトα−フェトプロテイン間の相似性。Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．４５，１６９−１７９．
Ｂｅｎｎｅｔ，Ｊ．Ａ．，Ｚｈｕ，Ｓ．，Ｐａｇａｎｏ−Ｍｉｒａｒｃｈｉ，Ａ．，Ｋｅｌｌｏｍ，Ｔ．Ａ．＆  Ｊａｃｏｂｓｏｎ，Ｈ．Ｉ．（１９９８）  ヒト肝がん由来のα−フェトプロテインは、エストロゲン依存性ヒト乳がん異種移植片の成長を妨げる。Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４，２８７７−２８８４．
Ｂｏｉｓｍｅｎｕ  Ｒ．，Ｓｅｍｅｎｉｕｋ  Ｄ．，Ｍｕｒｇｉｔａ  Ｒ．Ａ．（１９９７）  大腸菌で発現したヒトおよびマウス組換えα−フェトプロテインの精製および特性。Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ．１０：１０−２６．
Ｃｈｕｎｇ  Ｂ．Ｈ．，Ｐａｒｋ  Ｋ．Ｓ．（１９９８）  出芽酵母でのヒト副甲状腺ホルモンの分泌生成中のタンパク質分解減少に対する簡潔な解決法。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．５７：２４５−２４９．
Ｄｅｕｔｓｃｈ，Ｈ．Ｆ．（１９９１）  α−フェトプロテインの化学および生物学。Ａｄｖ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．５６，２５３−３１２．
Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．（１９９４）  α−フェトプロテイン存在下、ヒト腫瘍細胞によるアドリアマイシン−アラキドン酸複合体の取り込み。Ｊ．Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｏｎｃｏｌ．９：１１−１４．
Ｄｕｄｉｃｈ，Ｅ．Ｉ．，Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ，Ｌ．Ｎ．，Ｇｏｒｂａｔｏｖａ，Ｅ．Ａ．，Ｄｕｄｉｃｈ，Ｉ．Ｖ．，Ｋｈｒｏｍｙｋｈ，Ｌ．Ｍ．，Ｔａｔｕｌｏｖ，Ｅ．Ｂ．，Ｇｒｅｃｈｋｏ，Ｇ．Ｋ．＆  Ｓｕｋｈｉｋｈ，Ｇ．Ｔ．（１９９８）  様々なタイプの腫瘍および正常細胞に対するα−フェトプロテインの成長調節活性。Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．１９，３０−４０．
Ｄｕｄｉｃｈ  Ｅ．Ｉ．，Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ  Ｌ．Ｎ．，Ｄｕｄｉｃｈ  Ｉ．Ｖ．，Ｇｏｒｂａｔｏｖａ  Ｅ．Ａ．，Ｔｏｋｈｔａｍｙｓｈｅｖａ，Ｎ．，Ｔａｔｕｌｏｖ  Ｅ．Ｂ．，Ｎｉｋｏｌａｅｖａ  Ｍ．Ａ．＆  Ｓｕｋｈｉｋｈ  Ｇ．Ｔ．（１９９９）  α−フェトプロテインは、ＣＤ９５、ＴＮＦＲ１およびＴＮＦＲ２から独立した経路を介し、カスパーゼ−３様プロテアーゼの活性化を通じて、腫瘍細胞でのアポトーシスを誘導する。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２６６：１−１３
Ｄｕｄｉｃｈ，Ｉ．Ｖ．，Ｔｏｋｈｔａｍｙｓｈｅｖａ，Ｎ．，Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ，Ｌ．，Ｄｕｄｉｃｈ，Ｅ．，Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｊ．及び  Ｋｏｒｐｅｌａ，Ｔ．（１９９９）  ヒトα−フェトプロテインの２つの安定した消化断片の分離的、構造的、機能的特性。Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３８：１０４０６−１０４１４．
Ｉｔｏ  Ｈ．，Ｆｕｋｕｄａ  Ｙ．，Ｍｕｒａｔａ  Ｋ．，Ｋｉｍｕｒａ  Ａ．（１９８３）  アルカリカチオンで処置した無傷の酵母細胞の形質転換。Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１９８３，１５３：１６３−１６８．
Ｈａｒｄ  Ｋ，Ｂｉｔｔｅｒ  Ｗ，Ｋａｍｅｒｌｉｎｇ  ＪＰ，Ｖｌｉｅｇｅｎｔｈａｒｔ  ＪＦ．（１９８９）  出芽酵母で生成されたヒトインスリン様成長因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）のＯ−マンノシル化。ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２４８：１１１−４．
Ｑｕｉｒｋ  Ａ．Ｙ．，Ｇｅｉｓｏｗ  Ｍ．Ｊ．，Ｗｏｏｄｒｏｗ  Ｊ．Ｒ．，Ｂｕｒｔｏｎ  Ｓ．Ｊ．，Ｗｏｏｄ  Ｐ．Ｃ．，Ｓｕｔｔｏｎ  Ａ．Ｄ．，Ｌｏｈｎｓｏｎ  Ｒ．Ａ．，Ｄｏｄｓｗｏｒｔｈ  Ｎ．（１９８９）  出芽酵母からの組換えヒト血清アルブミンの生成。Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１：２７３−２８７．
Ｋａｎｇ  Ｈ．Ａ．，Ｃｈｏｉ  Ｅ．Ｓ．，Ｈｏｎｇ  Ｗ．Ｋ．，Ｋｉｍ  Ｊ．Ｙ．，Ｋｏ  Ｓ．Ｍ．，Ｓｏｈｎ  Ｊ．Ｈ．，Ｒｈｅｅ  Ｓ．Ｋ．（２０００）  酵母菌出芽酵母で分泌された組換え血清アルブミンのタンパク質分解の安定性。Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．５３：５７５−５８２．
Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｙ  Ｇ．Ｊ．（２００２）  がんにおけるα−フェトプロテインの生物学的役割：抗がん剤治療に対する展望。Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ．Ｔｈｅｒ．２：８９−１１５．
Ｍｏｒｉｎａｇａ，Ｔ．，Ｓａｋａｉ，Ｍ．，Ｗｅｇｍａｎｎ，Ｔ．Ｇ．，及び  Ｎａｍａｏｋｉ，Ｔ．（１９８３）  ヒトα−フェトプロテインの主要構造およびそのｍＲＮＡ。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０，４６０４−４６０８．
Ｍｕｒｇｉｔａ  Ｒ．，免疫抑制剤としての組換えヒトα−フェトプロテイン。米国特許第５，９６５，５２８  Ｃ０７Ｋ  １４／４７，１９９９．
Ｍｕｒｇｉｔａ  Ｒ．，細胞増殖剤としての組換えヒトα−フェトプロテイン  米国特許第６，６２７，４４０  Ｃ１２Ｎ  ００５／００，２００３．
Ｍｕｒｇｉｔａ  Ｒ．，がんの治療および診断のための組換えα−フェトプロテイン  ６，４１６，７３４，Ａ６１Ｋ  ０５１／００，２００２．
Ｍｕｒｇｉｔａ  Ｒ．Ａ．クローンヒトα−フェトプロテインの発現および精製。米国特許第６，３３１，６１１  Ｃ０７Ｋ  ０１４／００，２００１．
Ｎｉｓｈｉ  Ｓ．，Ｋｏｙａｍａ  Ｙ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｔ．，Ｓｏｄａ  Ｍ．，Ｋａｉｒｉｙａｍａ  Ｃ．Ｂ．（１９８８）  大腸菌および酵母菌でのラットα−フェトプロテインｃＤＮＡの発現。Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０４：９６８−９７２．
Ｐｕｃｃｉ，Ｐ．，Ｓｉｃｉｌｉａｎｏ，Ｒ．，Ｍａｌｏｒｎｉ，Ａ．，Ｍａｒｉｎｏ，Ｇ．，Ｔｅｃｃｅ，Ｍ．，Ｆ．，Ｃｅｃｃａｒｉｎｉ，Ｃ．，及び  Ｔｅｒｒａｎａ，Ｂ．（１９９１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：５０６１−５０６６．
Ｕｒｉｅｌ  Ｊ．，Ｌａｂｏｒｄａ  Ｊ．，Ｎａｖａｌ  Ｊ．，Ｇｅｕｓｋｅｎｓ  Ｍ（１９８９）  腫瘍細胞におけるα−フェトプロテインレセプター。Ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ；ｉｎ  Ｍｉｚｅｊｅｗｓｋｙ  Ｇ．Ｉ．，Ｊａｋｏｂｓｏｎ  Ｈ．Ｉ．（ｅｄｓ）：α−フェトプロテインの生物学的特性。Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，ｖｏｌ．２：１０３−１１７．
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ａ．Ｓ．，Ｂｏｃｋｈａｕｓ  Ｊ．Ａ．，Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．Ｄ．（１９９６）  Ｂｉｐレベルの減少は出芽酵母での異種タンパク質分泌を減少させる。Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７１：１００１７−１００２２．
Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ，Ｌ．Ｎ．，Ｄｕｄｉｃｈ，Ｅ．Ｉ．＆  Ｄｕｄｉｃｈ，Ｉ．Ｖ．（１９９７）  α−フェトプロテインによるヒト肝がん細胞でのアポトーシスの誘導。Ｔｕｍｏｒ  Ｂｉｏｌ．１８，２６１−２７４．
Ｓｅｍｅｎｋｏｖａ，Ｌ．，Ｄｕｄｉｃｈ，Ｅ．，Ｄｕｄｉｃｈ，Ｉ．，Ｔｏｋｈｔａｍｉｓｈｅｖａ，Ｎ．，Ｔａｔｕｌｏｖ，Ｅ．，Ｏｋｒｕｚｈｎｏｖ，Ｙ．，Ｇａｒｃｉａ−Ｆｏｎｃｉｌｌａｓ，Ｊ．，Ｐａｌｏｐ−Ｃｕｂｉｌｌｏ  Ｊ．−Ａ．，Ｋｏｒｐｅｌａ  Ｔ．（２００３）  α−フェトプロテインは、積極的にチトクロームＣ−媒介カスパーゼ活性とアポプトソーム複合体生成を調節する。Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７０：４３８８−４３９９．
Ｓｌｅｅｐ  Ｄ．，Ｂｅｌｆｉｅｌｄ  Ｇ．Ｐ．，Ｇｏｏｄｅｙ  Ａ．Ｒ．（１９９０）  ５つの異なるリーダー配列を使用した酵母菌出芽酵母からのヒト血清アルブミンの分泌。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：４２−４６．
Ｓｈｕｓｔａ  Ｅ．Ｖ．，Ｒａｉｎｅｓ  Ｒ．Ｔ．，Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ａ．，Ｗｉｔｔｒｕｐ  Ｋ．Ｄ．（１９９８）  一本鎖抗体フラグメントの生成に対する出芽酵母の分泌能の増加。Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：７７３−７７７．
Ｔａｍａｏｋｉ  Ｔ．，Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｔ．，Ｎｉｓｈｉ  Ｓ．（１９９３）  ヒトα−フェトプロテインの生産方法およびその生成物。米国特許第５，２０６，１５３，Ｃ０７Ｋ  ０１３／００；Ｃ１２Ｎ  ０１５／６２．
Ｔｓｕｋａｄａ  Ｙ．，Ｈｉｂｉ  Ｎ．，Ｏｈｋａｗａ  Ｋ．，Ｄｅｕｔｓｃｈ  Ｈ．Ｆ．（１９９４）  ラット腫瘍細胞系に対するダウノマイシン不飽和脂肪酸複合体の細胞破壊効果。Ｊ．Ｔｕｍｏｒ  Ｍａｒｋｅｒ  Ｏｎｃｏｌ．９：９９−１０３．
Ｙａｍａｓｈｉｔａ，Ｋ．，Ｔａｋｅｔａ，Ｋ．，Ｎｉｓｈｉ，Ｓ．，Ｆｕｋｕｓｈｉｍａ  Ｋ．，及び  Ｏｈｋｕｒａ  Ｔ．（１９９３）  ヒト臍帯血清α−フェトプロテインの糖鎖。Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３，２９７０−２９７５．
Ｙａｍａｍｏｔｏ  Ｒ．，Ｓａｋａｍｏｔｏ  Ｔ．，Ｎｉｓｈｉ  Ｓ．，Ｓａｋａｉ  Ｍ．，Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｔ．，Ｔａｍａｏｋｉ  Ｔ．（１９９０）  酵母菌におけるヒトα−フェトプロテインの発現。Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，４６：１６７９−１６８６．
【図面の簡単な説明】
【００７３】
以下の図は、示した本発明の主題を説明するものである。
【図１】ヒトα−プロテイン遺伝子を有する発現カセット、細菌プラスミドｐＵＣ１８のフラグメント、２−μｍ酵母菌プラスミドの複製開始領域、選択的ＰＧＫ１酵母菌マーカーである、ジスルフィドイソメラーゼ酵素をコードするＰＤ１１遺伝子、及びタンパク質の正確な集合及び望まれる生成物を培地中に分泌することをもたらすＫＡＲ２遺伝子を含む、ヒト成熟α−フェトプロテインの配列をコードするｐＫＸプラスミドの構造を示す図である。
【図２】ｐＫＸプラスミドの組成内にヒトα−フェトプロテインをコードする配列を含む発現カセットの構造を示す図である。ＧＡＬ１酵母菌遺伝子のプロモーター領域をイタリック体で示してある。ＭＦα１酵母菌遺伝子の分泌のプレプロ領域を太字で示してある。ヒトα−フェトプロテイン分子のアミノ酸配列を大文字で示してある。
【図３】ＡＦＰをコードし、最も多く使用される酵母菌のコドンから成る合成遺伝子の構造を示す図である。ＡＦＰアミノ酸配列は、血清ヒトＡＦＰのアミノ酸配列と同一であり、太字で選び出してある。
【図４】様々な量の、酵母菌培養物、出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸ液体培地から得られた精製された組換えα−フェトプロテインを線上に適用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（Ａ）及び免疫ブロッティング分析（Ｂ）の結果を示す図である。ｐ．    マーカータンパク質（９４、６７、４３、３０、２０ｋＤ）  ２．抗ＡＦＰ−セファロース（０．３μｇ）を充填したカラムのアフィニティークロマトグラフィー後のｒＡＦＰ  ３．Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００（０．４μｇ）を充填したカラムのゲルクロマトグラフィー後のｒＡＦＰ  ４．ｒＡＦＰ（０．１μｇ）  ５．Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００（０．６μｇ）後のｒＡＦＰ  ６．Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−２００（０．５μｇ）後のｒＡＦＰ  ７．胎児性ｅＡＦＰ（０．４μｇ）
【図５】酵母菌系統産生株出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸが発現した胎児性血清ｅＡＦＰ及び組換えｒＡＦＰから得られた、精製されたＡＦＰの異なる２個のサンプルについてＡＦＰ濃度に関する、Ｂ細胞Ｒａｊｉリンパ腫細胞の増殖の用量依存性を示す図である。細胞の増殖を［Ｈ３］−チミジンの取り込みにより測定し、ＡＦＰとの１２時間培養後の実験用培養物における増殖の阻害の、添加物のない対照に対するパーセント値で表した。
【図６】（Ａ）骨髄芽球腫Ｕ９３７細胞に関し、本発明によるｒＡＦＰと組合せ使用したドキソルビシンの腫瘍抑制作用の相乗的増強を示す図である。（Ｂ）本発明によるｒＡＦＰ及びレチノイン酸（プロビタミンＡ、酸）の組合せ使用での全体的な腫瘍抑制効果の相乗的増強を示す図である。細胞の増殖を［Ｈ３］−チミジンの取り込みにより測定し、ＡＦＰとの１２時間培養後の実験用培養物における増殖の阻害の、添加物のない対照に対するパーセント値で表した。
【図７】本発明によるｒＡＦＰの、胎児性の肺及び網膜の細胞の１次培養物から得た胎児性幹細胞の増殖に対する刺激効果を示す図である。細胞の増殖を培養の終わり４時間の間の［Ｈ３］−チミジンの取り込みの標準の方法により測定し、ＡＦＰのない対照に対する、試験培養物における増殖の刺激のパーセントで表した。  配列のリストは、配列番号１、及び配列番号２の配列を含み、これらは、それぞれ、ｐＫＸプラスミドの組成におけるヒトα−フェトプロテインの配列のコード化を含む発現カセットのヌクレオチド配列、及び、ヒト成熟ＡＦＰのアミノ酸配列である。  発現カセットのヌクレオチド配列は、ＧＡＬ１酵母菌遺伝子のプロモーター領域、ＭＦα１酵母菌遺伝子の分泌のプレプロ領域、ヒトα―フェトプロテイン遺伝子のコード配列、及びＣＹＣ１酵母菌遺伝子の転写終結のフィールドを含む。この発現カセットは、酵母菌系統産生株出芽酵母ＹＢＳ７２３／ｐＫＸシステムにおいてヒト成熟α−フェトプロテインの配列をコードするｐＫＸプラスミドの組成に含まれる。
【図１】
2008506384.tif 000005
【図２ａ】
2008506384.tif 000006
【図２ｂ】
2008506384.tif 000007
【図２ｃ】
2008506384.tif 000008
【図２ｄ】
2008506384.tif 000009
【図２ｅ】
2008506384.tif 000010
【図２ｆ】
2008506384.tif 000011
【図２ｇ】
2008506384.tif 000012
【図３ａ】
2008506384.tif 000013
【図３ｂ】
2008506384.tif 000014
【図３ｃ】
2008506384.tif 000015
【図３ｄ】
2008506384.tif 000016
【図３ｅ】
2008506384.tif 000017
【図３ｆ】
2008506384.tif 000018
【図４】
2008506384.tif 000019
【図５】
2008506384.tif 000020
【図６】
2008506384.tif 000021
【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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