(57)【要約】  本発明は、ウイルスワクチンの開発および製造に関する。特に、本発明は、ウイルスベクターおよびワクチンの工業生産の分野、より詳細には、ウイルスベクターおよびウイルスの製造のための、鳥類胚幹細胞、好ましくはニワトリ胚幹細胞由来のＥＢｘ細胞株の使用に関する。本発明は、ヒトおよび動物のウイルス感染を予防するためのウイルスワクチンの工業生産に特に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
鳥類胚性幹細胞ＥＢｘ（登録商標）において、アデノウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択されるウイルスを複製する方法であって、
ａ）該ＥＢｘ（登録商標）細胞を培養器内で、無血清培地Ｎ°１中、懸濁状態で増殖させる工程；
ｂ）該細胞密度が少なくとも１５０万細胞／ｍｌであるときに、該細胞を該選択されたウイルスに感染させる工程；
ｃ）感染直前に、感染と同時に、または感染直後に、細胞培養物に無血清培地Ｎ°２を添加する工程；および
ｄ）ウイルス複製を可能にするために、感染細胞をさらに培養する工程；さらに
ｅ）所望により、該ウイルスを採取する工程
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記培養器が、連続攪拌槽型バイオリアクターである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記無血清培地Ｎ°１と前記無血清培地Ｎ°２が同じ培地である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記無血清培地Ｎ°１と前記無血清培地Ｎ°２が異なる組成を有する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
無血清培地Ｎ°１に、０．２５〜１０容量の無血清培地Ｎ°２が加えられる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記無血清培地Ｎ°１および／または前記無血清培地Ｎ°２に、アミノ酸、脂質、脂肪酸、コレステロール、炭水化物、非動物起源のタンパク質加水分解物、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの成分が補給される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞に、アミノ酸、脂肪酸、炭水化物、非動物起源のタンパク質加水分解物、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの成分を供給するさらなる工程を含んでなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記供給が工程ａ）〜ｄ）中に、好ましくは工程ｂ）〜ｄ）中に生じる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記供給が毎日生じる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記供給が継続的に生じる、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記供給が１日当たり１回以上生じる、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
前記供給が１日当たり１回未満生じる、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
アミノ酸が、アスパラギンおよびグルタミン、またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
グルタミンの供給が、工程ａ）〜ｄ）中に行われ、前記培地中のグルタミン濃度が０．５ｍＭ〜５ｍＭの間、好ましくはおよそ２ｍＭに維持される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
炭水化物が、Ｄ−グルコース、およびＤ−ガラクトース、またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
Ｄ−グルコースの供給が、工程ｂ）〜ｄ）中に行われ、前記培地中のＤ−グルコース濃度が、Ｄ−グルコースがおよそ０．５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、好ましくはおよそ２ｇ／ｌに維持される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
脂肪酸が、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
非動物起源のタンパク質加水分解物が、細菌トリプトン、酵母トリプトン、植物加水分解物、またはそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＥＢｘ（登録商標）細胞が、集塊細胞として懸濁状態で培養される、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
工程ａ）においてＥＢｘ（登録商標）細胞培養物の、１つの培養器から別の培養器への少なくとも１回の継代、好ましくは少なくとも総ての継代、がＥＢｘ（登録商標）細胞集塊を破壊することなく希釈により行われる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
工程ａ）においてＥＢｘ（登録商標）細胞培養物の、１つの培養器から別の培養器への少なくとも１回の継代、好ましくは少なくとも総ての継代、が細胞集塊を遠心分離および／または破壊する工程を含まない、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程ｃ）が感染工程ｂ）後、好ましくは工程ｂ）のおよそ１時間後、に行われる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
感染工程ｂ）が、ｍ．ｏ．ｉ（多重感染度）約１０〜１０−６、好ましくは約１０−３〜１０−５、およびより好ましくは約１０−４、で行われる、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスが、改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルス、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス（すなわち、ＡＬＶＡＣ）、ユキヒメドリ痘ウイルス、キュウカンチョウ痘ウイルス、鳩痘ウイルス、オウム科のポックスウイルス、ウズラ痘ウイルス、スズメ痘ウイルス、ムクドリ痘ウイルス、シチメンチョウ痘ウイルスからなる群の中から選択される天然ポックスウイルスまたは組換えポックスウイルスである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ウイルスが、麻疹ウイルス、および流行性耳下腺炎ウイルスからなる群の中から選択される天然ウイルスまたは組換えウイルスである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記ウイルスが、ヒトインフルエンザウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルスの中から選択される、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ヒトインフルエンザウイルスが、Ｈ１Ｎ１株、Ｈ２Ｎ２株、Ｈ３Ｎ２株、Ｈ４Ｎ２株、Ｈ４Ｎ６株、Ｈ５Ｎ１株、Ｈ７Ｎ７およびＨ９Ｎ２株の中から選択されるＡ株である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
工程ａ）の培養が、バッチ培養、反復バッチ培養、フェドバッチ培養、または灌流培養により行われる、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
工程ｂ）における感染が、前記細胞密度がバッチ法またはフェドバッチ法において、少なくともおよそ４００万細胞／ｍｌ、好ましくは６００万細胞／ｍｌ、である場合に行われる、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
工程ｂ）における感染が、前記細胞密度が灌流法において少なくとも８００万細胞／ｍｌ、好ましくはおよそ９００万〜１０００万細胞／ｍｌである場合に行われる、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
工程ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）における無血清培養培地のｐＨが、６．５〜７．８の範囲である、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
工程ｄ）が、採取前の２〜１０日間続く、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
細胞培養が、３０℃〜３９℃の間を含む温度、好ましくはおよそ３７℃で行われる、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法により得られた、ウイルス。
【請求項３５】
請求項３４に記載のウイルスを、適切な場合にはその免疫応答を増強する物質と組み合わせて含む、ワクチン。
【請求項３６】
前記ウイルスが、無傷ウイルス粒子として存在する、請求項３５に記載のワクチン。
【請求項３７】
前記ウイルスが、分解されたウイルスの粒子として存在する、請求項３５に記載のワクチン。
【請求項３８】
前記ウイルスが、弱毒化ウイルスとして存在する、請求項３５に記載のワクチン。
【請求項３９】
請求項３４に記載のウイルスの構成成分を、適切な場合にはその免疫応答を増強する物質と組み合わせて含む、ワクチン。
【請求項４０】
前記ウイルスの単離タンパク質を含む、請求項３５に記載のワクチン。
【請求項４１】
請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法により得ることができ、かつ工程ｄ）において採取される感染細胞株ＥＢｘ（登録商標）を含んでなる、ワクチン。
【請求項４２】
請求項３４に記載のウイルスまたはその構成成分を含む、診断用組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ウイルスワクチンの開発および製造に関する。特に、本発明は、ウイルスベクターおよびワクチンの工業生産の分野、より詳細には、ウイルスベクターおよびウイルスの製造のための、鳥類細胞、好ましくはニワトリ胚性幹細胞株（embryonic derived stem cell line）の使用に関する。本発明は、ヒトおよび動物のウイルス感染を予防するためのウイルスワクチンの工業生産に特に有用である。
背景
【０００２】
集団予防接種は、パンデミックインフルエンザの大発生やパンデミック間期におけるインフルエンザの大発生などのウイルスパンデミックを制御するだけでなく、米国での最近の炭疽菌によるテロ行為のようなバイオテロの脅威を防止する最も簡単で最も効果的なアプローチであろう。しかしながら、卵に基づいた方法で現在生産されているインフルエンザワクチンおよび天然痘ワクチンのような多くのウイルスワクチンに関しては、ワクチン製造業者の現在の生産能力がパンデミックまたはバイオテロ攻撃時の要求を賄うには十分でない可能性が高い。
【０００３】
予測不可能な周期で、抗原連続変異（antigenic drift）または再集合によって起こる軽い季節性インフルエンザのエピデミックに加えて、全く新しいインフルエンザウイルス亜型に関する抗原不連続変異（antigenic shifts）が出現し、ヒト集団はこれらの新しい亜型に対して免疫を持たない。それらの亜型は、急速に世界中に広まる世界的パンデミックを引き起こす。これらのパンデミックは前世紀に３つ起こった（１９１８年、１９５７年、１９６８年）。１９１８年が最も深刻で、世界の人口のおよそ５０％が感染し、そのうちの約２５％が臨床疾患に罹患した；全死亡数は推計２０〜４０百万人であり、特に働き盛りの人々が発症した。このパンデミックは以後１０年間人口増加を抑制した。最近では、新しいインフルエンザウイルス（Ｈ５Ｎ１）が香港で出現した際、１９９７年に死亡率が高く、パンデミックを起こす可能性のある大発生が起こり、罹患患者（主に若年成人）の３分の１が死亡した。幸いにも、そのウイルスは人から人へ広がらず、その大発生をすぐに止めることができた。類似したウイルスが香港で２００３年に単離された。米国では、次のパンデミックが１９５７年または１９６８年のパンデミックと同等で１９１８年のパンデミックと異なるのものであるとすれば、次のパンデミックの影響により外来通院１８〜４２百万人、入院３１４，０００〜７３４，０００人、死亡８９，０００〜２０７，０００人になると推定される(Meltzer Ml, Cox NJ and Fukuda K. The economic impact of pandemic influenza in the United States: priorities for intervention. Emerging Infectious Diseases 1999; 5:659-671)。このように推定された影響を世界人口に比例させて予想すると、次のパンデミックの世界的な影響は概算で流感患者１０〜２０億人、重症疾患患者５３０〜１２３０万人、死亡１５０〜３５０万人と見積もることができる。
【０００４】
パンデミックの可能性を除き、インフルエンザＡ型ウイルスおよびＢ型ウイルスのドリフト変異体（drifted variants）によって起こる例年のインフルエンザエピデミックで毎シーズン人口の約１０〜２０％が感染し、熱性疾患、入院、および死亡を引き起こしている。インフルエンザの総負担を予測するためには間接的統計的手法が用いられてきたが、これらの手法には、インフルエンザエピデミック期中の罹患率および死亡率の季節的増加を定量する様々な統計モデルが含められる(Simonsen L, Clarke MJ, Williamson GD, Stroup DF, Arden NH, Schonberger LB. The impact of influenza epidemics on mortality: introducing a severity index. Am J. Public Health 1997; 87:1944-1950)。この手法を用いると、米国での平均的なインフルエンザシーズンでは、現在インフルエンザ患者２５〜５０百万人、入院１５０，０００人、死亡２０，０００〜４０，０００人となる。インフルエンザ罹患の年齢別リスクが米国でのものと同様であるとすれば、パンデミック間期におけるインフルエンザの年平均世界的負担は、だいたい、インフルエンザ患者およそ１０億人、重症疾患患者およそ３〜５百万人、死亡２５０，０００〜５００，０００人であるといえる（ＷＨＯ報告書, Geneva, April 2003: State of the art of new vaccines Research & Development - Initiative for Vaccine Research参照）。
【０００５】
現在入手可能なインフルエンザワクチンは、パンデミック間期におけるインフルエンザ関連疾患を予防するのに効果的であり、入院および死亡の予防に関しても非常に効果的である。これらの実績にもかかわらず、先進国でも途上国でも、１つにはワクチンの価格が割高であり、予防接種を毎年しなくてはならないことから、まだ今のところ「高リスク集団」には誰にも届いていない。しかしながら、ごく最近、インフルエンザワクチンの利用は世界的に見て増加し始め、２００３年にはおよそ２３，５００万用量に達したが、パンデミックワクチン需要には現在のワクチン生産とにまだかなり大きなギャップがある。実際、世界保健機関（ＷＨＯ）の推定では、重症インフルエンザ発症「高リスク」の約１２億人の人々（６５歳以上の高齢者、乳児、小児、慢性的な健康上の問題を有する成人、医療従事者など）が存在する。
【０００６】
認可を受けたインフルエンザワクチンを生産するのに用いられている現在の卵に基づいた系（egg-based system）は、５０年以上にわたって信頼されているにもかかわらず、その限界を示しており、それらには以下が含まれる：
・個々の生産キャンペーンで大量の卵の調達および品質管理を必要とする、長く、煩雑な、資源消費する製造方法。この現在の卵に基づいた生産システムでは、潜在的利益率が低すぎるため、卵由来インフルエンザワクチンの事業を始めようと追随する製薬会社は現れない；
・インフルエンザシーズンの少なくとも６ヶ月前にどのウイルス株をワクチンに含めるかを選択する必要性。どの株をインフルエンザワクチンに含めるべきかについてのこの早期決定は必ずしも適当ではなく、そのワクチンを生産するには長い準備期間が必要とされることにより中途での是正処置は不可能である；
・増加し続ける需要を満たすのに十分なインフルエンザワクチンを毎年生産する必要性（２００４年、先進工業国においては約２５０百万用量、米国だけで約１００百万用量）。卵由来インフルエンザワクチン製造業者の英国にあるプラントの汚染による米国での２００４〜２００５年冬の最近のインフルエンザワクチン不足は、この問題を浮き彫りにしている。さらに、インフルエンザワクチンの現在の世界的な生産能力では、世界的な「高リスク」集団の一部を守るのでさえ十分ではない。実際には、世界的なインフラストラクチャーでパンデミックインフルエンザワクチンの適時配布および送達を処理することができるかどうかが問題である；
・ワクチンを製造するための何億もの受精鶏卵の必要条件。ドナーニワトリ群がエピデミック感染症である場合に卵の供給が不足するというリスクを伴う；
・弱毒化生インフルエンザウイルスの場合、高価な特定病原体不在の（ＳＰＦ）鶏卵を使用する必要性；
・ＢＳＥ非発生国(BSE-exempt countries)からのウシ血清の使用に伴うインフレ傾向のコスト(inflationist cost)；
・一部の個体における卵由来成分のアレルゲン性；
・強毒性で、ニワトリにとって致命的なウイルスの増殖に卵を使用できないこと。
【０００７】
さらに、現在のワクチン技術では狭範囲の生産によりワクチンを生産するため、備蓄中の利用可能なワクチンが全く新しいインフルエンザウイルスパンデミック株を防御する可能性は低い。
【０００８】
また、この数年で最近の炭疽菌によるテロ行為のようなバイオテロの脅威は、数多くの西洋諸国政府の主な懸案問題となっている。米国政府は、バイオテロ法(the Bioterrorism Preparedness and Response Act in 2002)の施行により生物攻撃に対する迅速診断、防御、および反応の適切な措置を採っている。生物兵器は、実際には、比較的入手しやすく、バイオテロリスト組織にとって集団および政府を脅し、怖がらせる安価で効果的な方法となる。特に、生物兵器としての天然痘ウイルスの使用は近年増加し、いくつかの国はかかる危険に対処する非常事態計画を策定した。
【０００９】
天然痘は、意図的な散布の場合に広範囲にわたる被害をもたらす最大の可能性を有すると考えられており、その後にペスト、炭疽菌およびボツリヌス中毒が続く。天然痘は１９８０年に根絶され、それ以後、それらの予防接種プログラムは世界の総ての国で行われなくなった。このことによりウイルス感染に対する集団免疫が着実に低下した。このように低下したことによって、もしバイオテロリストが放ったならば天然痘ウイルスはさらに危険な剤となる。米国疾病管理センター(the US Center for Disease Control)（ＣＤＣ）は天然痘をクラスＡバイオテロ剤(a class A bioterrorist agent)として、すなわち、増殖しやすく、死亡率の高い、最も危険な微生物に分類した。
【００１０】
迅速な集団予防接種は天然痘の大発生を制御する理想的なアプローチとなり得る。米国政府は、さらなるワクチンの備蓄を追加確保すること、軍関係者および主要医療従事者に予防接種すること、全人口（それらの健康状態にかかわらず）に与えることができる安全なワクチンの開発計画を確立することによりリードしてきた。他の政府は、米国の進捗を監視するとともに、自国の緊急時への備えを評価している。
【００１１】
最近において、政府は、国営研究所または配給商業テンダー(issuing commercial tenders)で自国の第一世代備蓄を入手または生産していた。動物から直接採取された第一世代ワクチンは有効であることは分かっていたが、それらのワクチンは不純物と細菌を含んでいる場合が多く、その不純物と細菌が、特には、免疫障害を有する個体において副作用および合併症の可能性を大いに高める。天然痘が根絶して以来、迅速に参加し、天然痘ワクチンを生産することができた製薬会社はごく限られていた。それらのうち、適正製造基準に従って認定細胞細胞物におけるDryvax（登録商標）とＬｉｓｔｅｒ−Ｅｌｓｔｒｅｅワクシニア株を用いて第二世代ワクチンを生産することができた製薬会社はさらに少なかった。しかしながら、第一世代と同様、これらのワクチンも免疫障害を有する個体には適していない。第一世代ワクチンと第二世代ワクチンを用いた集団予防接種では、百万人に１人が死亡し、１０倍多い患者に重篤な疾患を引き起こす合併症をもたらす可能性があった。そのため、さらに数少ない製薬会社によってより安全な第三世代ワクチンが開発されてきた。第三世代ワクチンは、１９７０年代の独国での天然痘根絶キャンペーン中に用いられた改変ワクシニアＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）ウイルスの株に基づいたものである。臨床試験では、ＭＶＡは約１５０，０００人の個体（従来の天然痘ワクチン接種ではリスクがあると見なされた多くの個体を含む）に投与され、重大な副作用はなかった。
【００１２】
これらの天然痘ワクチンは総て、ニワトリ胚から単離された一次ニワトリ胚繊維芽細胞で生産される。これらの生産システムは、いくつかの深刻な限界を伴い、それらには以下が含まれる:
・個々の生産キャンペーンで大量の卵またはＣＥＦの調達および品質管理を必要とする、長く、煩雑な、資源消費する製造方法；
・多くの場合、高価な特定病原体不在の（ＳＰＦ）ニワトリ胚を使用する必要性；
・ドナーニワトリ群がエピデミック感染症である場合に卵の供給が不足するというリスク;
・ＢＳＥ非発生国からのウシ血清の使用に伴うインフレーショニストコスト；
・一部の個体における卵のアレルゲン性；
・強毒性で、ニワトリにとって致命的なウイルスの増殖に卵を使用できないこと。
【００１３】
卵に基づいたＣＥＦ生産方法は、依然として比較的信頼できる方法であるが、細胞に基づいた効率的な生産システムは、ウイルスを増殖させるための、より迅速で、より安価で、かつ煩雑さのより少ない方法を提供するという点で大きな改善を示すであろう。さらに、インフルエンザパンデミックの場合には、細胞培養物に基づいた製造方法はさらなる利点を与える：
・パンデミック株が同定され、単離され、分配されたらすぐに、インフルエンザワクチンの生産を開始することができる；
・卵の製造に必要な、いわゆる高増殖性再集合体(High Growth Reassortants)（孵化鶏卵での高収率増殖に適合させたウイルス）の開発を待つ必要がない；
・卵で由来の方法の場合には６〜９ヶ月であるが、株の受取りのおよそ９週間後に一次ワクチンバッチが入手可能である；
・細胞由来の方法は、卵では十分に増殖できなかった株の生産を可能にする（例えば、１９９７年の鳥類香港インフルエンザ）；
・パンデミック中に卵不足問題が起こらない。
【００１４】
さらに、ウイルスワクチンの製造に、卵またはＣＥＦプラットフォームの代わりに細胞株を使用することには、ワクチンの安全性に関連して次のさらなる利点があるであろう：ワクチン処方物に抗生物質添加剤が含まれないこと；毒性のある防腐剤（チオマーサルなど）が不要であること；内毒素レベルが減少すること、卵アレルギー問題がないこと；タンパク質および無血清培地で増殖すること（外来因子／ＢＳＥがない）；ウイルスワクチン製剤が高純度であること。
【００１５】
よって、卵またはニワトリ−胚繊維芽細胞に基づいた現在のウイルスワクチン生産技術を改良することが急務である。ウイルスワクチンの製造のための卵およびＣＥＦ生産システムに代わるものとしての細胞培養プラットフォームの開発は、現在のワクチン生産の障害および時間の制約を克服するための最も迅速でかつ期待できる解決法であると思われる。さらに、細胞培養生産技術は、パンデミックまたはテロ攻撃に直面して、ワクチン生産能力をグレードアップする可能性を向上させるであろう。
【００１６】
これらの特定の要件に基づいて、本発明者は、ヒトワクチンおよび獣医ワクチン、ならびにワクチン候補の効率的な複製を可能にし、かつ工業規格、規制規格および医療規格を満たす新規の安定した鳥類細胞株の開発に着手するために、鳥類生態学および鳥類胚幹（embryonic stem）（ＥＳ）細胞の専門知識を利用した。こうして、本発明者は、独自の方法（ＷＯ０３／０７６６０１およびＷＯ０５／００７８４０参照）を用いて、ニワトリＥＳ細胞から、遺伝的、化学的、またはウイルス不死化の工程なく得られる、十分に特徴付けられ、立証された一連の細胞株（ＥＢｘ（登録商標）細胞）を作り出した。ＥＢｘ（登録商標）細胞は、十分に立証された２段階法を用い、規制基準を考慮して作り出された：
【００１７】
段階１：ニワトリＥＳ細胞の単離、in vitro培養、および増殖：
胚幹細胞は以下の点で独特である：（ｉ）胚幹細胞は未分化細胞としてin vitroで無限に自己複製することができる、（ii）胚幹細胞は無限の再生能を有する、（iii）胚幹細胞は安定した染色体の含有量を維持する；（ｉｖ）胚幹細胞は高レベルのテロメラーゼおよび特定の細胞表面マーカーを発現する。世界中で多く努力されているにもかかわらず、ＥＳ細胞は極めて限られた数の種（マウス、ヒト、サル）からしか単離に成功していない。本発明者は、ここ数年にわたって、様々な鳥類種からＥＳ細胞を単離し、確立するためにかなりの力を注いできた。かかる研究努力がニワトリＥＳ細胞の単離および特徴付けの成功につながった [Pain et al. 1999. Cell Tissues Organs 165: 212-219]。こうして、本発明者は、分化誘導を行わない、ニワトリＥＳ細胞の効率的なin vitro培養および大規模増殖を可能にする独自の手順を開発した。
【００１８】
段階２：ＥＢｘ（登録商標）細胞の誘導：
次いで、本発明者はニワトリＥＳ細胞から安定した接着細胞株および懸濁細胞株を誘導する独自の方法を確立した。その方法には、細胞培養培地からの血清、フィーダー細胞、および増殖因子の段階的な除去および細胞の懸濁培養への適合が含まれる。これらの胚性ニワトリ細胞株は、ＥＳ細胞の所望の特徴の大部分（すなわち、無限増殖、テロメラーゼのようなＥＳ特異的マーカーの発現、核型の安定性）を維持しており、加えて、新しい「工業向きの」特徴（無血清培地中懸濁状態での増殖）も示した。
【００１９】
胚性ニワトリ細胞株の魅力のある生物学的特性に基づき、本発明者はさらなる開発のために、接着細胞株ＥＢ４５（ＷＯ０３／０７６６０１およびＷＯ０５／００７８４０ではＳ８６Ｎ４５と名付けられている）（この細胞株から懸濁細胞株ＥＢ１４が誘導された）などのいくつかのニワトリＥＢｘ（登録商標）細胞株を選択した。より好ましくは、本発明のニワトリＥＢｘ（登録商標）細胞は、ＥＢ４５およびＥＢ１４細胞株の中から選択される。より好ましい実施形態では、ニワトリＥＢｘ（登録商標）細胞株はＥＢ１４またはそのサブクローンＥＢ１４−０７４である。簡単にするために、ＥＢ１４およびＥＢ１４−０７４を本明細書においてＥＢ１４と名付ける。ＥＢ４５およびＥＢ１４細胞は長期培養（＞１５０代継代）下で胚幹細胞表現型（すなわち、高い核−細胞質比）を示す。ＥＢ４５およびＥＢ１４細胞は大きな核と核小体を有する小細胞であり、原形質膜から伸びる短い仮足を示す（図１）。ＥＢ４５およびＥＢ１４細胞は代謝的に高活性であり、リボソームおよびミトコンドリアリッチの細胞質を示す。ＥＢ４５およびＥＢ１４細胞の遺伝解析では、それらが雄２倍体であり、何代にもわたって遺伝学的に安定しているということが分かった（図２）。ＥＢ４５およびＥＢ１４細胞は、アルカリ性ホスファターゼ、幹細胞特異的細胞表面マーカー（ＥＭＥＡ−１およびＳＳＥＡ−１など）（図５）、およびＥＳ細胞特異的ＥＮＳ１遺伝子（図４）を発現する。とりわけ注目すべきは、ＥＢ４５およびＥＢ１４細胞が、継代を通じて安定に維持されている高レベルのテロメラーゼ酵素活性も発現することである（図３）。テロメラーゼは、連続細胞増殖および染色体の安定性を促すという点において重要な酵素である。免疫抑制された新生ラットモデルで行われた３週間と２．５ヶ月の腫瘍原性の解析では、ＥＢ１４細胞がin vivoで非腫瘍形成性であるということが分かった。ＥＢ４５およびＥＢ１４細胞は、極めて短い世代時間（３９℃（ニワトリの体温）でおよそ１６時間および３７℃でおよそ２０時間）により特徴付けられる。そのため、これらの細胞株は独特の特性を示し、その独特の特性によりインフルエンザワクチンおよび天然痘ワクチンなどのウイルスワクチンの工業生産用のより効率的で、より安全で、かつ費用対効果の高い細胞基質となる。
【００２０】
ＥＢｘ（登録商標）細胞、さらに詳しくは本発明のＥＢ１４細胞は、インフルエンザワクチンおよび天然痘ワクチン、ならびに孵化卵でまたはニワトリ一次繊維芽細胞で現在生産されている他の主要なヒトおよび動物ウイルスワクチン（表１）（麻疹ワクチン、流行性耳下腺炎ワクチン、黄熱病ワクチン、またはＨＩＶもしくは癌などの感染性疾患に備えて治験中のポックスウイルス）の製造には高価値のものであろう。現在のデータで、ＥＢｘ（登録商標）細胞株の、さらに詳しくはいくつかの組換えウイルスおよび野生型ウイルスを複製する能力はすでに証明されている。例えば、予備試験により、ＥＢｘ（登録商標）細胞がインフルエンザウイルス（仏国優先権書類、２００５年４月１１日出願の特許出願  ＦＲ  ０５  ０３５８３、実施例３、３０〜４１頁参照）および改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（ＷＯ０５／００７８４０参照）の複製を支えていることが確認されている。
【００２１】
【表１】
2008537681.tif 000002
【００２２】
ＥＢｘ（登録商標）細胞、さらに詳しくはＥＢ１４細胞の上記の独特の特性は、ＥＢｘ（登録商標）細胞においてウイルスワクチンを製造するための特定の方法の開発を示唆する。実際、理論にとらわれることなく、代謝レベルの高いＥＢｘ（登録商標）細胞では、細胞増殖およびウイルス複製を確実にするのに十分なエネルギーを細胞培養培地により細胞に供給されることが必要である。本発明の目的は、卵においておよびＣＥＦにおいて現在生産されているウイルスワクチンの工業生産のために、鳥類胚性幹細胞ＥＢｘ（登録商標）、さらに詳しくはＥＢ１４細胞に基づいた、革新的で効率的な製造方法を提供することである。
説明
【００２３】
本発明は、鳥類胚性幹細胞ＥＢｘ（登録商標）、より好ましくはＥＢ１４細胞において、ウイルスを複製する方法であって、
好ましくは無動物血清培地で培養されたＥＢｘ細胞の培養物を目的のウイルスに感染させる工程；
該ウイルスを複製するために、感染ＥＢｘ細胞を培養する工程；
細胞培養物上清中および／または該細胞内のウイルスを採取する工程
を含む方法を提供する。
【００２４】
好ましい実施形態によれば、前記方法は
ａ）前記ＥＢｘ（登録商標）、より好ましくはＥＢ１４細胞を培養器内で、無血清培地Ｎ°１中、懸濁状態で（in suspension）増殖させる工程；
ｂ）前記細胞密度が少なくとも１５０万細胞／ｍｌであるときに、前記細胞を前記選択されたウイルスに感染させる工程；
ｃ）感染直前に、感染と同時に、または感染直後に、前記細胞培養物に無血清培地Ｎ°２を添加する工程；および
ｄ）ウイルス複製を可能にするために、前記感染細胞をさらに培養する工程；さらに
ｅ）所望により、前記ウイルスを採取する工程
を含む。
【００２５】
本明細書において、「ウイルス」とは、天然に存在するウイルスだけでなく、弱毒化ウイルス、再集合体ウイルス、ワクチン株、ならびに組換えウイルスおよびウイルスベクター、などを包含する。本発明のウイルスは、好ましくは、アデノウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、オルソミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、およびレトロウイルスからなる群から選択される。
【００２６】
好ましい実施形態では、前記ウイルス、その関連ウイルスベクター、ウイルス粒子、およびウイルスワクチンは、ポックスウイルスのファミリー、より好ましくはポックスウイルス亜科(chordopoxviridae)に属するものである。一実施形態では、前記ウイルスまたはその関連ウイルスベクター、ウイルス粒子、およびウイルスワクチンは、鶏痘ウイルス、カナリア痘ウイルス（すなわち、ＡＬＶＡＣ）、ユキヒメドリ痘ウイルス(juncopox virus)、キュウカンチョウ痘ウイルス(mynahpox virus)、鳩痘ウイルス、オウム科のポックスウイルス（psittacine pox virus）、ウズラ痘ウイルス、スズメ痘ウイルス、ムクドリ痘ウイルス、シチメンチョウ痘ウイルスの中から選択されるアビポックスウイルスである。もう１つの好ましい実施形態によれば、前記ウイルスは、Ｌｉｓｔｅｒ−Ｅｌｓｔｒｅｅワクシニアウイルス株、改変ワクシニアウイルス（ＡＴＣＣから入手することができる改変ワクシニアウイルスＡｎｋａｒａ（ＭＶＡ）（ＡＴＣＣ番号ＶＲ−１５０８）、ＮＹＶＡＣ(Tartaglia et al., 1992 Virology 188: 217-232)、ＬＣ１６ｍ８（Sugimoto et Yamanouchi 1994 Vaccine 12:675-681)、ＣＶＩ７８(Kempe et al., 1968 Pediatrics 42: 980-985)など）、およびその他の組換えまたは非組換えワクシニアウイルスの中から選択されるワクシニアウイルスである。
【００２７】
もう１つの好ましい実施形態では、前記ウイルス、その関連ウイルスベクター、そのウイルス粒子、およびワクチンは、オルソミクソウイルスファミリー、特に、インフルエンザウイルスに属するものである。インフルエンザウイルスは、ヒトインフルエンザウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、ウマインフルエンザウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ネコインフルエンザウイルスからなる群から選択される。インフルエンザウイルスは、好ましくは、Ａ株、Ｂ株、およびＣ株で選択される。Ａ株としては、血球凝集素およびノイラミニダーゼが異なる亜型（限定されるものではないが、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、Ｈ４Ｎ２、Ｈ４Ｎ６、Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２、Ｈ７Ｎ７およびＨ９Ｎ２など）を有するウイルスを挙げることができる。Ｈ１Ｎ１株としては、Ａ／Ｐｏｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４、Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９、Ａ／Ｂｅｉｊｉｎｇ／２６２／９５、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／２８２／９６、Ａ／Ｔｅｘａｓ／３６／９１、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅを挙げることができる。Ｈ３Ｎ２株としては、Ａ／Ｐａｎａｍａ／２００７／９９、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／９９、Ａ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／３３／９４を挙げることができる。Ｂ株としては、限定されるものではないが、Ｂ／Ｐｏｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４、Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９、Ｂ／Ｖｉｅｎｎａ／１／９９、Ｂ／Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ／１／８６、Ｂ／Ｍｅｍｐｈｉｓ／１／９３、Ｂ／Ｈａｒｂｉｎ／７／９４、Ｎ／Ｓｈａｎｄｏｎｇ／７／９７、Ｂ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／３３０／０１、Ｂ／Ｙａｍａｎａｓｈｉ／１６６／９８を挙げることができる。本発明のインフルエンザウイルスは、野生型ウイルス、感染者から得られた一次ウイルス分離株、組換えウイルス、弱毒化ウイルス、温度感受性ウイルス、低温適応ウイルス、再集合体ウイルス、逆遺伝子操作ウイルスの中から選択される。
【００２８】
本発明のウイルスがインフルエンザウイルスである場合には、本発明の方法は、ウイルス増殖を可能にする条件において前記培養培地にタンパク質分解酵素を添加するさらなる工程を含む。前記タンパク質分解酵素は、トリプシン、キモトリプシン、サーモリシン、ペプシン、パンクレアチン、パパイン、プロナーゼ、サブチリシンＡ、エラスターゼ、フリン、およびカルボキシペプチダーゼからなる群から選択される。好ましい実施形態によれば、前記酵素はトリプシンである。細胞培養培地中のトリプシンの終濃度は、およそ０．５〜１ｍｇ／ｍｌ間から２５ｍｇ／ｍｌまでで構成される。より好ましくは、細胞培養培地中のトリプシンの終濃度は、０．０１〜１０ｕｓｐ／ｍｌ（ｕｓｐ：米国薬局方の単位）、好ましくはおよそ０．０５〜２ｕｓｐ／ｍｌ間、より好ましくはおよそ０．３〜１ｕｓｐ／ｍｌの間で構成される。好ましくは、前記タンパク質分解酵素は原核生物宿主で生産された組換えタンパク質である。
【００２９】
もう１つの好ましい実施形態では、前記ウイルス、その関連ウイルスベクター、そのウイルス粒子、およびワクチンは、パラミクソウイルスのファミリー、特に、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、流行性耳下腺炎（ムンプス）ウイルス、および風疹ウイルスに属するものである。
【００３０】
もう１つの好ましい実施形態では、前記ウイルス、その関連ウイルスベクター、そのウイルス粒子、およびワクチンは、ビルナウイルスのファミリー、特に、伝染性ファブリーキウス嚢病ウイルスに属するものである。
【００３１】
組換えウイルスとしては、限定されるものではないが、異種遺伝子を含んでなるウイルスベクターが挙げられる。いくつかの実施形態では、前記ウイルスの複製のためのヘルパー機能は、宿主細胞ＥＢｘ（登録商標）、ヘルパーウイルス、またはヘルパープラスミドにより提供される。代表的なベクターとしては、限定されるものではないが、鳥類または哺乳類細胞に感染するものが挙げられる。
【００３２】
本明細書において、「鳥類」とは、分類学的分類「ａｖａ」の生物のいずれもの種、亜種または品種を指すことを意図する（限定されるものではないが、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミュー、およびヒクイドリのような生物など）。前記用語は、セキショクヤケイ(Gallus gallus)またはニワトリ（例えば、ホワイトレグホン(White Leghorn)、ブラウンレグホン(Brown Leghorn)、バールロック(Barred-Rock)、サセックス(Sussex)、ニューハンプシャー(New Hampshire)、ロードアイランド(Rhode Island)、オーストラロープ(Australorp)、ミノルカ(Minorca)、アムロックス(Amrox)、カリフォルニアグレイ(California Gray)、イタリアンパーティッジカラード(Italian Partidge-colored)）の様々な系統、ならびに一般に繁殖されるシチメンチョウ、キジ、ウズラ、アヒル、ダチョウ、および他の家禽の系統を包含する。好ましい実施形態では、本発明の鳥類細胞はニワトリ細胞である。
【００３３】
本発明の培養器は、より好ましくは、連続攪拌槽型バイオリアクター、Wave（商標）バイオリアクター、Bello（商標）バイオリアクター、スピナーフラスコ、フラスコ、および細胞工場の中から選択される。一般に、細胞は、マスターセルバンクまたはワーキングセルバンクのバイアルから、様々なサイズのＴ−フラスコまたはローラーボトルを通じて、好ましくは最後にバイオリアクターまでスケールアップされる。得られた細胞懸濁液は、次いで、さらなる培養のために、一般には種生産バイオリアクター（一般に２０〜３０Ｌ容量）に、いくつかの実施形態では、より大型の生産バイオリアクター（一般に１５０〜１８０Ｌ容量）に送り込まれる。種バイオリアクターに対する第２の（より大型の）バイオリアクターの容量比は、細胞株を第１のバイオリアクターで増殖させる程度によって異なるが、一般には３：１〜１０：１、例えば、（６〜８）：１の範囲である。好ましい実施形態によれば、前記培養器は、温度、通気、ｐＨ、および他の管理条件の制御を可能にし、かつ：
前記細胞、滅菌酸素、様々な培養培地などを投入するのに適した注入口；
細胞および培地を除去するための排出口；および
前記バイオリアクター内で前記培養培地を攪拌する手段
を備えた連続攪拌槽型バイオリアクターである。
【００３４】
本発明によれば、「無血清培地」（ＳＦＭ）とは、調製済の細胞培養培地、すなわち、これが細胞の生存および細胞増殖を可能にする血清の添加を必要としないということを意味する。この培地は必ずしも化学的に定義される必要はなく、様々な起源の、例えば、植物由来の加水分解物を含んでもよい。好ましくは、前記ＳＦＭは「非動物起源」であり、すなわち、それが動物またはヒト起源の成分を含まない（ＦＡＯ状態：「動物起源を含まない」）と見なされる。ＳＦＭでは、天然血清タンパク質は組換えタンパク質に置き換えられる。あるいは、本発明に従うＳＦＭ培地はタンパク質を含まず（ＰＦ培地：「無タンパク質培地」）かつ／または化学的に定義される（ＣＤＭ培地：「ケミカリー・ディファインド培地」）。ＳＦＭ培地は次のいくつかの利点を示す：（ｉ）まず第１に、かかる培地の規格に適合していること（実際、ＢＳＥ、ウイルスなどの外来因子による汚染の危険がない）；（ii）精製方法の最適化；（iii）より明確に定義された培地のため、前記方法におけるより優れた再現性。市販のＳＦＭ培地の例は：ＶＰ  ＳＦＭ（InVitrogen Ref 11681-020、カタログ２００３）、Ｏｐｔｉ  Ｐｒｏ（InVitrogen Ref 12309-019、カタログ２００３）、Ｅｐｉｓｅｒｆ（InVitrogen Ref 10732-022、カタログ２００３）、Ｐｒｏ  ２９３  Ｓ−ＣＤＭ（Cambrex ref 12765Q、カタログ２００３）、ＬＣ１７（Cambrex Ref BESP302Q）、Ｐｒｏ  ＣＨＯ  ５−ＣＤＭ（Cambrex ref 12-766Q、カタログ２００３）、ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ（Hyclone Ref SH30515-02）、ＨｙＱ  ＳＦＭ４ＣＨＯ−Ｕｔｉｌｉｔｙ（Hyclone Ref SH30516.02）、ＨｙＱ  ＰＦ２９３（Hyclone ref SH30356.02）、ＨｙＱ  ＰＦ  Ｖｅｒｏ（Hyclone Ref SH30352.02）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ２９３  ｍｅｄｉｕｍ（JRH Biosciences ref 14570-1000M）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ３２５  ＰＦ  ＣＨＯ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ（JRH Biosciences ref 14335-1000M）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ＶＰＲＯ  ｍｅ  ｄｉｕｍ（JRH Biosciences ref 14560-1000M）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ３０２  ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ（JRH Biosciences ref 14312-1000M）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ６５３１９（JRH Biosciences）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ６５４２１（JRH Biosciences）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ６５６２５（JRH Biosciences）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ６５６２６（JRH Biosciences）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ６５６２７（JRH Biosciences）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ６５６２８（JRH Biosciences）、Ｅｘ  ｃｅｌｌ  ６５６２９（JRH Biosciences）、ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｍｅｄｉｕｍ３（動物成分を含まない）（SIGMA-Aldrich, ref. G-9916）（以後、Ｇ９９１６培地と呼ぶ）である。
【００３５】
第１の好ましい実施形態によれば、前記無血清培地Ｎ°１と前記無血清培地Ｎ°２は同じ培地である。
【００３６】
第２の好ましい実施形態によれば、前記無血清培地Ｎ°１と前記無血清培地Ｎ°２は異なる組成を有する。例えば、前記無血清培地Ｎ°１はＥｘ  ｃｅｌｌ  ６５３１９（SAFC Biosciences）であり、前記無血清培地Ｎ°２はＯｐｔｉ  Ｐｒｏ  ｍｅｄｉｕｍ（InVitrogen Ref 12309-019、カタログ２００３）であってもよい。
【００３７】
好ましい実施形態によれば、前記無血清培地Ｎ°１はＥｘ  ｃｅｌｌ  ６５３１９（JRH Biosciences）である。第２の好ましい実施形態によれば、前記無血清培地Ｎ°１はＥｘ  ｃｅｌｌ  ６５４２１（JRH Biosciences）である。
【００３８】
好ましい実施形態によれば、前記無血清培地Ｎ°２はＥｘ  ｃｅｌｌ  ６５３１９（JRH Biosciences）である。第２の好ましい実施形態によれば、前記無血清培地Ｎ°２はＧ９９１６（SIGMA-Aldrich）である。
【００３９】
本発明の方法は、無血清培地１の全てまたは一部の除去、その後の無血清培地１の無血清培地Ｎ°２による置き換えを含む。しかしながら、前記無血清培地１のかなりの割合（例えば、約５０％まで）を除去し、前記無血清培地１を、例えば、スピンフィルターで、除去しながら、それに前記無血清培地Ｎ°２を補充することがより便宜である。好ましい実施形態によれば、無血清培地Ｎ°２は、無血清培地Ｎ°１の一部を除去しないで、無血清培地Ｎ°１にそのまま加えられる。１容量の無血清培地Ｎ°１に０．２５〜１０容量間の無血清培地Ｎ°２が加えられる。好ましい実施形態では、１容量の無血清培地Ｎ°１におよそ０．５〜８容量の無血清培地Ｎ°２が加えられる。より好ましい実施形態では、１容量の無血清培地Ｎ°１におよそ３〜６容量の無血清培地Ｎ°２が加えられる。
【００４０】
前記無血清培地Ｎ°１および／または前記無血清培地Ｎ°２には、アミノ酸、脂質、脂肪酸、コレステロール、炭水化物、非動物起源のタンパク質加水分解物、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの成分が補給される。
【００４１】
あるいは、本発明の方法は、フェドバッチ法であり、この方法は前記細胞に、アミノ酸、脂質、炭水化物、非動物起源のタンパク質加水分解物、界面活性剤、およびそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの成分を供給するさらなる工程を含む。第１の好ましい実施形態によれば、前記供給は工程ａ）〜ｄ）中に、あるいは工程ｂ）〜ｄ）中にのみ、あるいは工程ｄ）中にのみ生じる。前記供給は毎日または継続的に生じ得る。前記供給が不連続である場合には、前記供給は１日当たり１回、１日当たり１回以上、または１日当たり１回未満生じ得る。
【００４２】
本発明のＳＦＭ培地は、アミノ酸、ビタミン、有機および無機塩、炭水化物源を含む数多くの成分を含み、各成分はin vitroでの細胞の培養を支える量で存在する。しかしながら、細胞増殖またはウイルスの生産性を向上させるためには、ＳＦＭ培地に追加の成分が添加される。
【００４３】
前記細胞培養物に添加されるアミノ酸の選択は、前記培養中の前記細胞によるアミノ酸消費を解析することにより決定し得る。好ましい実施形態によれば、前記培地に添加されるアミノ酸は、アスパラギンおよびグルタミン、またはそれらの混合物からなる群から選択される。より好ましい実施形態では、添加されるのはグルタミンであり、グルタミンの供給は、前記培地中のグルタミン濃度をおよそ０．５ｍＭ〜およそ５ｍＭ、好ましくはおよそ１ｍＭ〜およそ３ｍＭ、および最も好ましくはおよそ２ｍＭの間に維持するために、工程ａ）〜ｄ）中に行われる。好ましい実施形態では、グルタミンの供給は継続的に生じる。
【００４４】
好ましい実施形態によれば、前記培地に添加される炭水化物は、Ｄ−グルコース、Ｄ−スクロース、およびＤ−ガラクトース、またはそれらの混合物からなる群から選択される。より好ましい実施形態によれば、添加される炭水化物はＤ−グルコースである。Ｄ−グルコースの供給は、前記培地中のＤ−グルコース濃度をＤ−グルコースおよそ０．５ｇ／ｌ〜２５ｇ／ｌ、好ましくはＤ−グルコースおよそ１ｇ／ｌ〜１０ｇ／ｌ、好ましくはＤ−グルコースおよそ２〜３ｇ／ｌの間に維持するために、工程ａ）〜ｄ）中に、より好ましくは、ｂ）〜ｄ）中に行われる。好ましい実施形態では、Ｄ−グルコースの供給は継続的に生じる。
【００４５】
好ましい実施形態によれば、前記脂質はコレステロール、ステロイド、および脂肪酸（パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、およびそれらの誘導体など）、またはそれらの混合物からなる群から選択される。より好ましくは、前記脂肪酸はSIGMA-ALDRICH（Ref. F7050）製のものであり、前記培養培地にはおよそ０．３５ｕｌ／ｍｌの脂肪酸溶液が添加される。
【００４６】
好ましい実施形態によれば、前記、非動物起源のタンパク質加水分解物は、細菌トリプトン、酵母トリプトン、植物加水分解物（ダイズ加水分解物など）、またはそれらの混合物からなる群から選択される。好ましい実施形態では、前記、非動物起源のタンパク質加水分解物は酵母加水分解物である。
【００４７】
「加水分解物」とは、ダイズペプトンまたは酵母抽出物の酵素消化物を包含する。その加水分解物はそれぞれ、さらに酵素的に（例えば、パパインにより）消化され得る複数のダイズペプトンまたは酵母抽出物調製物から得ることができ、かつ／または自己分解、加熱分解、および／もしくは原形質分離により形成することができる。加水分解物はまた、JRH BioSciences (Lenaxa, KA)、Quest International (Norwich, N.Y.)、OrganoTechnie S.A. (France)、またはDeutsche Hefewerke GmbH (Germany)などの供給源から商業的に得ることもできる（Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、Ｈｙ−Ｓｏｙ、Ｈｙ−Ｙｅａｓｔ  ４１２、およびＨｉ−Ｙｅａｓｔ  ４４４など）。ＷＯ９８／１５６１４にも酵母抽出物の供給源が開示されている。ＷＯ００／０３０００にも酵母抽出物およびダイズ加水分解物の供給源が開示されている。本発明の培地に用いられる加水分解物は、好ましくは、粗画分から精製される。これは効率培養の妨げとなる可能性のある不純物を、好ましくは、この精製中に排除し、そうすることによって、前記加水分解物の濃度を改善するためである。精製は、限外濾過もしくはＳｅｐｈａｄｅｘクロマトグラフィー（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ２５またはＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ１０、あるいは等価材料を使用）、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、または「逆相」クロマトグラフィーによって可能である。好ましくは、精製は、１０ｋＤａカットオフフィルターを利用した限外濾過によって行われる。これらの方法は当該分野では公知である。これらの方法を用いて、規定分子量のダイズまたは酵母加水分解物を含む画分を選択することができる。好ましくは、ダイズおよび酵母加水分解物の平均分子量は、好ましくは約２２０〜３７５ダルトンである。
【００４８】
好ましくは、前記細胞培養培地中に酵母加水分解物は含められる。例えば、JRH-BIOSCIENCES (Ref 58902)から得られる酵母加水分解物  ５０Ｘ（およそ２００ｇ／ｌ）は、前記培養培地中におよそ０．１Ｘ〜２Ｘ、好ましくはおよそ０．５Ｘ〜およそ１Ｘを含む終濃度で、前記細胞培養培地中に含められる。前記細胞培養培地にダイズ加水分解物を添加してもよい。例えば、JRH-BIOSCIENCES (Ref 58903100M)から得られるダイズ加水分解物５０Ｘは、前記培養培地中におよそ０．１Ｘ〜２Ｘ、好ましくはおよそ１Ｘを含む終濃度で添加される。あるいは、米国出願第２００４／００７７０８６号に記載のように、ダイズ加水分解物と酵母加水分解物の混合物を前記細胞培養培地に添加してもよい。
【００４９】
前記培地には、補助剤、例えば、重炭酸ナトリウムのような緩衝物質、酸化安定剤、機械的ストレスを中和する安定剤、またはプロテアーゼ阻害剤を含めてよい。必要に応じて、前記培地に、消泡剤としてポリプロピレングリコール（ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６１  、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−７１、またはＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１０８）などの非イオン性界面活性剤を添加することができる。界面活性剤を添加しない場合に、上昇し、破裂する気泡がそれらの気泡(「散布している」)の表面に存在する細胞に損傷をもたらす可能性があるため、細胞を通気の負の効果から守るためにこれらの薬剤が一般に用いられる。非イオン性界面活性剤の量は、好ましくは約０．０５〜約１０ｇ／Ｌ、一般には約０．１〜約５ｇ／Ｌである。本発明のもう１つの実施形態によれば、細胞培養培地中の界面活性剤の濃度は前記細胞集塊のサイズを大きくするために低下してよい。
【００５０】
本発明の一実施形態によれば、前記細胞培養物への無血清培地Ｎ°２の添加は、感染工程ｂ）後に、好ましくは工程ｂ）のおよそ０．５〜４時間後に、およびより好ましくは工程ｂ）のおよそ１時間後に行われる。本発明のもう１つの実施形態によれば、前記細胞培養物への無血清培地Ｎ°２の添加は、感染工程ｂ）の前に、好ましくは工程ｂ）のおよそ０．５〜４時間後に、およびより好ましくは工程ｂ）のおよそ１時間前に行われる。本発明のもう１つの実施形態によれば、前記細胞培養物への無血清培地Ｎ°２の添加は、感染工程ｂと同時に行われる。
【００５１】
工程ｂ）のウイルス感染は、ｍ．ｏ．ｉ（多重感染度）約１０〜１０−６、好ましくは約１０−２〜１０−５、およびより好ましくは約１０−４で行われる。当業者ならば前記ウイルスの種類に応じて最適なｍ．ｏ．ｉを決定することができる。
【００５２】
工程ｃ）では、前記感染細胞は、好ましくは、少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１２０時間、少なくとも１４４時間の間培養される。前記ウイルスがポックスウイルスである場合には、前記感染細胞は少なくとも１４４時間培養される。
【００５３】
本発明の方法では、工程ａ）の細胞培養は、バッチ培養、反復バッチ培養、フェドバッチ培養、または灌流培養により行われる。より好ましくは、工程ａ）の細胞培養はフェドバッチ培養により行われる。工程ｂ）における感染は、前記細胞密度がバッチ法またはフェドバッチ法により少なくともおよそ４００万細胞／ｍｌ、好ましくは６００万細胞／ｍｌ、より好ましくは８００万細胞／ｍｌであるときに行われる。灌流法を用いる場合には、工程ｂ）における感染は、前記細胞密度が少なくとも８００万細胞／ｍｌ、好ましくはおよそ９００万〜１０００万細胞／ｍｌ、またはさらに高いときに行われる。
【００５４】
工程ａ）、ｂ）、ｃ）、およびｄ）における無血清培養培地のｐＨは、好ましくは、バイオリアクターによりモニタリングされる。そのｐＨは６．５〜７．８の範囲、好ましくはおよそ６．８〜７．５の範囲、およびより好ましくはおよそ７．２であるものとする。
【００５５】
本発明の方法では、工程ｄ）は採取前の２〜１０日間続く。好ましい実施形態によれば、工程ｄ）は採取前の３〜７日間続く。
【００５６】
前記細胞培養は、前記ウイルスの種類に応じて、３２℃〜３９℃間を含む温度で行われる。インフルエンザウイルスの生産では、細胞培養物の感染は、好ましくは、３３℃で行われる。
【００５７】
ＥＢｘ（登録商標）細胞は、懸濁培養において増殖する能力を有し、細胞はわずかな細胞〜数百個を超える細胞までのルーズな凝集体として集塊化する。理論にとらわれることなく、前記集塊のサイズは、細胞培養培地の組成に応じて異なることがある。例えば、ポリプロピレングリコール（ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６１、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、ＳＹＮＰＥＲＯＮＩＣ  Ｆ−６８、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−７１、またはＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｆ−１０８）などの界面活性剤が存在することや攪拌は、前記集塊サイズに影響を与え得る。本発明者は、現在、前記方法の少なくとも工程ａ）中に、本発明のＥＢｘ（登録商標）細胞を互いに凝集させて、集塊を形成させることにより、ウイルス収量を高め得ることを見出した。マスターセルバンクおよびワーキングセルバンクのバイアルからの、様々なサイズのＴ−フラスコまたはローラーボトルを通じた、バイオリアクターまでのスケールアップ中、前記懸濁細胞は、新鮮培地へ希釈することによるか、または遠心分離後、細胞ペレットを新鮮培地へ再懸濁することにより、一般に、より大型の容器に継代接種される。本発明者は、前記細胞の継代接種中、前記培養物中に大細胞集塊を維持することが推奨されることが分かった。そうするためには、ＥＢｘ（登録商標）細胞におけるウイルスの複製を高めるために細胞集塊を破壊しないほうがよい。例えば、Ｔ−フラスコまたはローラーボトルでの工程ａ）の培養の初期段階中に、前記細胞培養物を希釈して、前記細胞をより大型の容器に継代接種することは推奨されるが、遠心分離することも、前記細胞集塊をピペット操作または攪拌により破壊することも推奨されない。しかしながら、大きすぎる集塊は高ウイルス生産には準最適である。それゆえ、当業者ならば、工程ａ）の初期段階の細胞継代接種中にピペット操作または攪拌により前記集塊を部分破壊することでウイルス収量が高まり得るかどうかを定めることができる。好ましい実施形態によれば、、ポックスウイルス、好ましくはＭＶＡ、ＡＬＶＡＣ、および鶏痘ウイルスは、わずかな細胞から少なくとも百個を超える細胞、少なくとも２百個の細胞、少なくとも５百個の細胞、少なくとも数千個の細胞までのルーズな凝集体の集塊ＥＢｘ（登録商標）を増殖させる工程ａ）を含む本発明の方法により得られる。
【００５８】
本発明は、ウイルスを増殖させるのに用いられる、細胞集塊として懸濁状態で増殖可能な他の細胞種、例えば、限定されるものではないが、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）、ＶＥＲＯ細胞、ＰｅｒＣ６、ＭＤＣＫにも適している。
【００５９】
本発明はまた、本発明の方法により得ることが可能なウイルスにも関する。
【００６０】
本発明はまた、本発明のウイルスを含むワクチンにも関する。ウイルスワクチンを製造する方法は、本発明に従うウイルスを複製する方法であって、該方法のウイルスの採取の工程ｅ）が濾過、濃縮、冷凍、および安定化剤の添加による安定化の中から選択される少なくとも１つの工程を含んでいる方法を含む。前記ウイルスの採取は当業者に周知の技術に従って行われる。好ましい実施形態によれば、前記ウイルスを採取する工程は、細胞培養物の遠心分離により得られる細胞培養物上清を回収すること、その後、濾過すること、濃縮すること、冷凍すること、および安定化剤の添加によりウイルス調製物を安定化することを含む。例えば、インフルエンザウイルスについては、Furminger, In Nicholson, Webster and Hay (Eds) Textbook of influenza, chapter 24 pp324-332参照。
【００６１】
本発明によるウイルスワクチンを製造する方法はまた、採取されたウイルスを不活性化するさらなる工程を含んでもよい。不活性化は、好ましくは、ホルムアルデヒド、β−プロピオラクトン、エーテル、エーテルおよび洗剤（すなわち、Tween 80（商標）など）、臭化セチルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）、およびＴｒｉｔｏｎ  Ｎ１０２、デオキシコール酸ナトリウム、ならびにトリ（Ｎ−ブチル）リン酸で処置することにより行われる。
【００６２】
もう１つの実施形態によれば、本発明はまた、本発明の方法により得ることが可能なウイルスからのウイルス抗原タンパク質の調製方法であって、以下のさらなる工程を含む方法にも関する。
ａ）所望により、完全ウイルスを含む細胞培養物上清をデオキシリボ核酸制限酵素、好ましくはＤＮアーゼ（ＥＣ３．１．２１群およびＥＣ３．１．２２群の分類参照）およびヌクレアーゼ（ＥＣ３．１．３０群およびＥＣ３．１．３１群の分類参照））とともにインキュベートする工程。好ましくはＤＮＡ消化酵素はベンゾナーゼ（Benzonヌクレアーゼ）またはＤＮアーゼＩである；
ｂ）陽イオン洗剤の添加工程。陽イオン洗剤の例は；限定されるものではないが：セチルトリメチルアンモニウム塩（ＣＴＡＢなど）、ミリスチルトリメチルアンモニウム塩、リポフェクチン、ＤＯＴＭＡおよびTween（商標）；
ｃ）抗原タンパク質の単離工程。この最後の工程は遠心分離または限外濾過により実現し得る。
前記ワクチン中のウイルスは無傷ウイルス粒子としてまたは分解されたウイルスの粒子として存在することができる。一実施形態によれば、前記ワクチンは死菌ワクチンまたは不活化ワクチンである。もう１つの実施形態によれば、前記ワクチンは、本発明の方法により、好ましくは血清なしに、得ることが可能であり、所望により濾過および／または濃縮されており、かつ前記ウイルスを含んでいるＥＢｘ細胞培養物上清を主に含んでなる弱毒化生ワクチンである。第３の実施形態によれば、前記ワクチンは、本発明の方法に従って調製されたウイルスから得ることが可能なウイルス抗原タンパク質を含んでなっている。
【００６３】
本発明はまた、本発明の方法により得ることが可能であり、かつ工程ｄ）において採取される感染細胞株ＥＢｘ（登録商標）、好ましくはＥＢ１４を含んでなるワクチンを提供することにも関する。
【００６４】
本発明のワクチンは、本発明のウイルスをその免疫応答を増強する薬学上許容される物質と組み合わせて含んでよい。その免疫応答を増強する物質の限定されない例には、不完全フロイントアジュバント、サポニン、水酸化アルミニウム塩、リゾレシチン、プルトニックポリオール(plutonic polyols)、ポリアニオン、ペプチド、カルメット・ゲラン菌（ＢＣＧ）、およびコリネバクテリウムパルブム(Corynebacterium parvum)が含まれる。合成アジュバントの例はＱＳ−２１である。加えて、免疫賦活タンパク質（インターロイキン  Ｉｌ１、Ｉｌ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ１２、ＩＬ１３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子など）を用いて、前記ワクチンの免疫応答を高めてよい。
【００６５】
本発明のワクチンは、所望により鼻腔内投与経路に適合させた、好ましくは液体処方物、冷凍調製物、脱水冷凍調製物である。
【００６６】
本発明のワクチンは、好ましくは、天然痘ウイルスおよびインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ならびに風疹ウイルスの中から選択されるウイルスに感染したヒトの予防および／または治療のための処置に用いられる。本発明の組換えウイルスワクチンは、癌または感染性疾患（エイズなど）のような慢性疾患の予防および／または治療のための処置にも用いられ得る。
【００６７】
本発明のＥＢｘ（登録商標）細胞株は、再集合ウイルスを生み出し、生産するのに有用である。インフルエンザウイルスなどの分節ゲノムを有するウイルスは、再集合することがある。本発明のＥＢｘ（登録商標）細胞がインフルエンザウイルスの少なくとも２つの異なる株に同時に感染すると、その宿主細胞には２つの異なる株由来の分節ゲノムの混合物が存在する。ウイルス集合中、理論的には、ゲノム分節のあらゆる組合せが生じ得る。よって、特定の再集合ウイルスは、抗体、例えば、所望の特徴を有するウイルスを用いて、選択または排除することにより単離され得る（Kilnourne E. D in Plotkin SA and Mortimer E.A. Eds, Vaccines 1994参照）。
【００６８】
本発明のＥＢｘ（登録商標）細胞株は、逆遺伝学によりインフルエンザウイルスを生み出し、生産するのにも有用である（Enami, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3802-3805 (1990); Enami et Palese, J. Virol. 65:2511-2513 (1991); Luytjes, Cell 59:1107-1113 (1989)参照）。
【００６９】
本発明はまた、本発明のウイルスまたはそれらの構成成分を含む診断用組成物にも関する。
【００７０】
下記実施例により本発明をより詳細に説明する。次の調製物および実施例は、当業者がより明確に理解し、本発明を実践することができるように示される。しかしながら、本発明は、例示された実施形態により範囲は限定されず、それらの実施形態は本発明の個々の態様を単に例示にするものであり、機能的に同等である方法は本発明の範囲内である。実際、前述の説明および添付の図面から、本明細書に記載のものだけでなく、本発明の様々な修飾が当業者には明らかになるであろう。かかる修飾は添付の請求項の範囲に入るものである。説明の残りの部分では下記図面の説明について触れる。
【実施例】
【００７１】
実施例
実施例１：ＥＢｘ（登録商標）細胞株の誘導方法
鳥類胚性幹細胞株ＥＢｘ（登録商標）の確立方法はこれまでにＷＯ０３／０７６６０１およびＷＯ０５／００７８４０において記載されている。簡潔には、ＥＢｘ（登録商標）細胞株のこの確立方法は次の工程を含む：
ａ）鳥類細胞、好ましくは鳥類胚幹細胞の、それらの細胞の増殖を可能にするあらゆる因子を含む完全培養培地で、かつ、好ましくは不活性化し、動物血清を補給した、マウス繊維芽細胞のフィーダー層の存在下での単離、培養、および増殖；
ｂ）前記因子、前記血清、および前記フィーダー層を段階的または完全除去するための、前記培養培地を改変することによる継代；
ｃ）外因性増殖因子、不活性化フィーダー層、および低レベルの血清（または血清なし）の不在下での基礎培地で増殖させることができる接着または非接着鳥類細胞株を確立すること；
工程ｃ）の基礎培地がまだ低レベルの血清（すなわち、およそ２％以下）を含む場合には、前記方法は、所望により、外因性増殖因子と不活性化フィーダー層はもう含んでいないが、低レベルの血清を含んでいる基礎培地を、以下の中から選択される培養培地と交換する追加の工程ｄ）を含む場合がある：
【００７２】
無血清培地で希釈した、血清を補給した基礎培地（ｉ）、連続継代の間、該基礎培地（ｉ）で前記鳥類細胞を培養する（該基礎培地（ｉ）中の無血清培地の割合は外因性増殖因子、不活性化フィーダー層、および血清を含まない前記基礎培地の完全消失まで段階的に増加される）；
血清を補給した無血清培地（ii）、連続継代の間、該培地（ii）で前記鳥類細胞を培養する（該培地（ii）中の血清の割合は無血清培地が得られるまで段階的に減少される）；
無血清培地（iii）、培地（iii）で前記鳥類細胞を培養し、その後、培地の変更に適応させた前記鳥類細胞を無血清培地中に維持する。
【００７３】
本明細書において「それらの増殖を可能にする因子」とは、前記鳥類培養細胞の生存および増殖に必要な増殖因子を意味する。本発明によれば、その増殖因子には栄養素およびサイトカインが含まれる。栄養素は、主としてＳＣＦ、ＩＧＦ−１、およびｂＦＧＦである。サイトカインは、主として、ｇｐ１３０タンパク質に関連する受容体を介して作用するサイトカイン（ＬＩＦ、インターロイキン１１、インターロイキン６、インターロイキン６受容体、ＣＮＴＦ、オンコスタチン、およびカルジオトロフィン）である。
【００７４】
工程ａ）の鳥類細胞は、鳥類胚細胞の中から、より好ましくは鳥類胚幹細胞および鳥類一次細胞の中から選択される細胞である。好ましい実施形態では、前記細胞は、鳥類胚、より好ましくはニワトリ胚から得られる発生ステージＸ胚盤葉細胞(dissociated stage X blastodermal cells)の細胞群の懸濁物から単離される全能性または多能性鳥類胚幹細胞である（EYAL-GILADIの分類: EYAL-GILADI and KOCHAN, 1976, <<From cleavage to primitive streack formation : a complementary normal table and a new look at the first stages of the development in the chick>>. "General Morphology" Dev. Biol. 49 : 321-337参照）。これらの鳥類胚幹細胞は、３９℃での培養において４８〜７２時間の間を含む遅い倍加時間を特徴とする。
【００７５】
前記ＥＢｘ（登録商標）細胞株確立方法の工程ｂ）の培養培地の改変は、増殖因子、血清、および／またはフィーダー層を段階的または完全除去するために、同時に、連続して、または別々に行うことができる。培養培地の離脱順序は、以下から選択してよい：
フィーダー層／血清／増殖因子；
フィーダー層／増殖因子／血清；
血清／増殖因子／フィーダー層；
血清／フィーダー層／増殖因子；
増殖因子／血清／フィーダー層；
増殖因子／フィーダー層／血清。
好ましい実施形態では、離脱順序は増殖因子／フィーダー層／血清である。
【００７６】
この方法は、血清枯渇培地でまたは血清を全く含まない培地で増殖することができる安定した株が得られるまでこれらの新しい漸増的に激変する培養条件に適合させた細胞クローンの選択を可能にする。確立された株ＥＢｘ（登録商標）は、好ましくは、外因性増殖因子および血清を含まない培地で、フィーダー細胞なく、懸濁状態で増殖する非接着幹細胞である。
【００７７】
「完全培養培地」とは、増殖因子および動物血清が補給された基礎培地を意味する。完全培養培地の例は、Pain et al. (1996, Development 122:2339-2348)、欧州特許第７８７，１８０号、ならびに米国特許第６，１１４，１６８号、同第５，３４０，７４０号、同第６，６５６，４７９号、および同第５，８３０，５１０号に記載されている。本発明によれば、「基礎培地」とは、それのみで、少なくとも細胞の生存、さらに良くは細胞増殖を可能にする古典的培地処方を有する培地を意味する。基礎培地の例は、前述のＳＦＭ培地、またはＢＭＥ（イーグル基礎培地）、ＭＥＭ（イーグル最少培地）、培地１９９、ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変イーグル培地）、ＧＭＥＭ（グラスゴー改変イーグル培地）、ＤＭＥＭ−ハムＦ１２、ハム−Ｆ１２、およびハム−Ｆ１０、イスコフの改変ダルベッコ培地、マッコイの５Ａ培地、ＲＰＭＩ  １６４０などの培地である。基礎培地は、無機塩（例えば：ＣａＣｌ２、ＫＣｌ、ＮａＣｌ、ＮａＨＣＯ３、ＮａＨ２ＰＯ４、ＭｇＳＯ４など）、アミノ酸、ビタミン（チアミン、リボフラビン、葉酸、Ｄ−Ｃａ  パントテン酸など）、および他の成分（グルコース、β−メルカプトエタノール、ピルビン酸ナトリウムなど）を含む。
【００７８】
増殖因子の２つのファミリー：サイトカインおよび栄養素は概略的に区別することが可能である。前記サイトカインは、主として、ｇｐ１３０タンパク質に関連する受容体を介して作用するサイトカインである。従って、ＬＩＦ、インターロイキン１１、インターロイキン６、インターロイキン６受容体、ＣＮＴＦ、オンコスタチン、およびカルジオトロフィンは、特定鎖の受容体レベルでの動員、および受容体の単量体型または時にヘテロ二量体型のｇｐ１３０タンパク質との組合せを含む類似した作用機序を有する。前記栄養素は、主として、ＳＣＦ、ＩＧＦ−１、およびｂＦＧＦである。より好ましくは、前記完全培地は、基礎培地、インスリン増殖因子１（ＩＧＦ−１）、繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インターロイキン６（ＩＬ−６）、インターロイキン６受容体（ＩＬ−６Ｒ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、所望により、インターロイキン１１（ＩＬ−１１）、および動物血清を含む。前記鳥類細胞、好ましくは工程ａ）の鳥類胚細胞は、数継代の間、完全培地中で培養される。前記培地は、ＬＩＦ、ＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ、ＩＬ−１１、オンコスタチン、カルジオトロフィンの群で選択される増殖因子の少なくとも１つによって補完される。好ましい実施形態によれば、前記完全培養培地は、ＩＧＦ−１およびＣＮＴＦが補給された基礎培地である。もう１つの好ましい実施形態によれば、前記完全培養培地は、ＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ、所望により、ＩＬ−１１が補給された基礎培地である。前記基礎培地中の増殖因子ＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ、所望により、ＩＬ−１１の濃度は、約０．０１〜１０ｎｇ／ｍｌ、好ましくは０．１〜５ｎｇ／ｍｌ、およびより好ましくは約１ｎｇ／ｍｌで構成される。
【００７９】
およそ３〜１０継代の後、前記完全培地の増殖因子を枯渇させる（工程ｂ）。好ましくは、枯渇は、各増殖因子に対して、一継代から別の継代へ、一段階で直接行われる。あるいは、増殖因子の枯渇は、前記完全培地中の増殖因子濃度の段階的な減少によって漸進的に行われる。より好ましい実施形態では、前記増殖因子枯渇は、少なくとも２つの増殖因子に対して同時に行われる。好ましい実施形態では、前記完全培養培地がＩＧＦ−１およびＣＮＴＦを補給した基礎培地である場合、前記増殖因子枯渇は１回の枯渇により行われる。もう１つの好ましい実施形態では、前記完全培養培地がＩＧＦ−１、ＣＮＴＦ、ＩＬ−６、ＩＬ−６Ｒ、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ、所望により、ＩＬ−１１を補給した基礎培地である場合、前記増殖因子枯渇は２回の枯渇により行われる：第１に、前記完全培地からＳＣＦ、ＩＬ６、ＩＬ６Ｒ、ｂＦＧＦ、所望により、ＩＬ１１を直接除去する；その後、前記鳥類細胞を、ＩＧＦ１およびＣＮＴＦ、所望により、ＩＬ−１１を含み、動物血清を補給した完全培地中で少なくとも１回の継代の間培養状態で維持する。第２に、前記培養培地からＩＧＦ１およびＣＮＴＦ、所望により、ＩＬ−１１を直接除去し、この培地は最終的に、血清を補給しただけの前記基礎培地を含む。通常、前記培地は、およそ２０〜３０継代で増殖因子が完全に枯渇する。
【００８０】
好ましい実施形態では、前記フィーダー細胞枯渇は前記増殖因子枯渇後に行われる。フィーダー細胞枯渇は、段階的であり、数継代かけて行われる。前記鳥類細胞は、ここで、工程ａ）における濃度よりも低い濃度、およそ４×１０４細胞／ｃｍ２〜５×１０４細胞／ｃｍ２でフラスコに播種される。フィーダー細胞はおよそ４．２×１０４細胞／ｃｍ２でフラスコに播種される。段階的に、フラスコ中のフィーダー細胞の濃度を減少させる。実際には、２〜４継代に同じ濃度のフィーダー細胞が用いられ、その後、さらなる２〜４継代などにはより低い濃度のフィーダー細胞が用いられる。そのフラスコにはその後、およそ４．２×１０４フィーダー細胞／ｃｍ２で接種され、次におよそ２．２×１０４フィーダー細胞／ｃｍ２、次におよそ１．８×１０４フィーダー細胞／ｃｍ２、次におよそ１．４×１０４フィーダー細胞／ｃｍ２、次におよそ１．１×１０４フィーダー細胞／ｃｍ２、次におよそ０．９×１０４フィーダー細胞／ｃｍ２、次におよそ０．５×１０４フィーダー細胞／ｃｍ２で播種される。その後、そのフラスコには６．５×１０４鳥類細胞／ｃｍ２〜７．５×１０４鳥類細胞／ｃｍ２で、かつフィーダー細胞なしで播種される。鳥類細胞はフラスコ中のフィーダー細胞濃度減少の結果良好な状態にないという仮説から、鳥類細胞は、フィーダー細胞枯渇を続行するために、事前に同じフィーダー細胞濃度でさらなる継代のために培養される。
【００８１】
もう１つの好ましい実施形態では、前記血清枯渇は前記増殖因子枯渇および前記フィーダー細胞枯渇後に行われる。前記基礎培地は以下の中から選択される培地により変更される：
【００８２】
新規無血清培地（ii）で希釈した、血清を補給した前記基礎培地（ｉ）。その後、連続継代を通じて該培地（ｉ）で前記鳥類細胞を培養する（該培地（ｉ）中の無血清培地の割合は、血清を補給した前記基礎培地の完全消失まで漸進的に増加される（段階的希釈））。
【００８３】
血清を補給した、新規無血清培地（ii）。その後、連続継代を通じて該培地（ii）で前記鳥類細胞を培養する（該培地（ii）中の血清の割合は無血清培地が得られるまで漸進的に減少される（段階的離脱））。
【００８４】
血清を補給していない、新規無血清培地（ii）。その後、無血清培地（ii）で前記鳥類細胞直接培養する（直接的離脱）。
好ましい実施形態では、前記血清枯渇は漸進的離脱により行われる
【００８５】
前記フィーダー細胞は、好ましくは照射により不活性化したか、またはマイトマイシンで化学的に処理した動物細胞である。前記フィーダーは、ＳＣＦなどの増殖因子を発現するように遺伝子を操作してよい。好ましくは、前記フィーダー細胞は、ＳＴＯ（アメリカンタイプカルチャーコレクション(American Type Culture Collection) ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１５０３）などのマウス繊維芽細胞株である。
【００８６】
この方法は、かなりの期間にわたるin vitroでの培養下で維持されるＥＢｘ（登録商標）という名前のついた鳥類胚性細胞株の確立につながる。有利なことに、工程ｃ）で得られたＥＢｘ（登録商標）細胞は、少なくとも５０日間、１００日間、１５０日間、３００日間、または好ましくは少なくとも６００日間増殖することができる。得られたＥＢｘ（登録商標）細胞はより長い時間が経過しても生存しているため、６００日は期限ではない。例えば、ＥＢ１４細胞のマスターセルバンクは、Ｐ１６０継代で生産されたものであり、ＥＢ１４のエンドオブプロダクションセルバンク(End of Production Cell Bank)はＰ１８４で生産されたものであり、ＥＢ１４細胞はなお増殖することが可能である。それゆえ、これらの株は、外因性増殖因子、血清、および／または不活性化フィーダー層を含まない基礎培養培地で無限に増殖することが可能であると考えられる。「株」という表現は、大なり小なり同じ形態学的特徴および表現型の特徴を保持しながら、in vitroでの培養下で無限に増殖することが可能である細胞の任意の集団を意味すると理解される。当然、前述の方法は、確立された株から得られる細胞に由来する細胞クローンを得ることを可能にする。これらのクローンは、分裂によってそれらが得られる細胞と遺伝学的に同一である細胞である。
【００８７】
確立された細胞株およびそれらに由来する細胞（工程ｃまたはｄ）は、好ましくは胚性鳥類幹細胞株であり、より正確にはそれらの細胞は多能性鳥類胚性幹細胞である。本発明の方法により得ることができる鳥類胚性幹細胞ＥＢｘ（登録商標）は、３９℃でおよそ２４時間以内の倍加時間の小円形の個別細胞である。本発明の方法により得ることができる細胞は、少なくともｐ６０継代、少なくともｐ７０継代、少なくともｐ８０継代、少なくともｐ９０継代、少なくともｐ１００継代、少なくともｐ１１０継代、少なくともｐ１２０継代、少なくともｐ１３０継代、少なくともＰ１５０継代、少なくともＰ１６０継代、少なくともＰ１７０継代、少なくともＰ１８０継代、またはそれ以降の細胞である。本発明による鳥類胚性幹細胞は、以下の特徴の少なくとも１つを有する：
高い核−細胞質比、
内因性アルカリ性ホスファターゼ活性、
内因性テロメラーゼ活性、
ＳＳＥＡ−１（ＴＥＣ０１）、ＳＳＥＡ−３、およびＥＭＡ−１に対する特異的抗体との反応性。
それらの細胞はＥＮＳ１遺伝子を発現する；
【００８８】
本発明の方法の工程ａ）の鳥類細胞の倍加時間（３９℃で４８〜７２時間）よりも短い倍加時間（同じ培養条件で約２４時間またはそれ以下）。
これらのＥＢｘ（登録商標）細胞株は、基礎培地、特に、当業者によって一般に使用される様々な添加剤を補給した、SAFC社のＥｘｃｅｌｌ培地、ＤＭＥＭ、ＧＭＥＭ、ハムＦ１２、またはマッコイなどの培地で無限に増殖することが可能である。添加剤としては、非必須アミノ酸、ビタミンおよびピルビン酸ナトリウム、脂肪酸、酵母およびダイズ加水分解物が挙げられ得る。しかしながら、これらの細胞は、グルタミンを含まない基礎培地で増殖することが可能である。これらの細胞株およびそれらに由来する細胞は、接着細胞または懸濁細胞のいずれかとして増殖する特徴を有する。
【００８９】
好ましくは、本発明のＥＢｘ（登録商標）細胞、好ましくはＥＢ１４細胞は、上述の総ての特徴を有し、ウイルスワクチン、ならびに組換えペプチドおよびタンパク質（すなわち、抗体など）などの生物製剤の生産に有用である。
【００９０】
実施例２：ＥＢ１４細胞の特徴付け
２．１−ＥＢ１４細胞核型
ＥＢ１４細胞の核型解析は、Pr. Michel Franck Laboratory, Unite de zootechnie, ethnologie et economie rurale, Ecole Nationale Veterinaire, 1 avenue Bourgelat, 69280 Marcy I'Etoile, Franceで行われた。
【００９１】
ＥＢ１４細胞を２つの異なる継代数（１０５代および１１８代継代）において、当業者に周知の標準的な技術を用いることにより核型を決定した。予想通り、１０５代および１１８代継代のＥＢ１４細胞は２倍体核型を示す（図２）：
１０５代継代：染色体構造の数＝７８（調べた中期細胞５３個に関する平均：７８．４１−標準偏差：４．９５１）
１１８代継代：染色体構造の数＝７９（調べた中期細胞５０個に関する平均：７９．６８−標準偏差：３．７３３）。
【００９２】
ニワトリゲノムは、２タイプの染色体対：大染色体および小染色体を含む。１１５代継代の解析により、大染色体構造の数が１８（平均１７．８２および標準偏差０．８３３）であり、小染色体構造の数が６０（平均６０．６および標準偏差４．７）であることが分かる。１１８代継代の解析により、大染色体構造の数が１８（平均１８．２４および標準偏差０．７９７）であり、小染色体構造の数が６０（平均６１．４４および標準偏差３．６８８）であることが分かる。調べた２つの継代間には染色体分布における有意な偏差はない。
【００９３】
ＥＢ１４細胞株は、１０５代および１１８代継代で正常な雄（ＺＺ）２倍体核型を示し、このことはＥＢ１４細胞の染色体の安定性を立証する。
【００９４】
２．２−免疫抑制された新生ラットモデルにおけるＥＢ１４細胞の腫瘍原性解析
免疫抑制された新生ラットモデルにおいて１２７代継代のＥＢ１４細胞の腫瘍原性を評価した(Sanofi-Aventis, France)（ＷＨＯ技術報告書番号８７８（１９９８）。Ｈｅｌａ細胞を陽性対照として用いた。１０匹の免疫抑制された新生ラットにＥＢ１４細胞１０００万個を皮下注射し、さらなる１０匹の免疫抑制された新生ラットにＨｅｌａ細胞１０００万個を皮下注射した。総ての動物は、０日目、＋２日目、＋７日目、および＋１４日目に０．１ｍｌの抗胸腺細胞ラット血清を受けた。注射部位の小結節を検出するため、動物を３週間の間定期的に観察した。３週間後、動物を殺し、注射部位および他の器官における細胞増殖を検出するために検査した。ＥＢ１４細胞の注射部位または遠隔臓器では小結節も腫瘍も見られなかった。免疫抑制された新生ラットモデルではＥＢ１４は非腫瘍形成性である。
【００９５】
２．３−ＥＢ１４細胞は鳥類インフルエンザウイルス受容体およびヒトインフルエンザウイルス受容体を発現する
ＥＢ１４細胞において鳥類インフルエンザウイルスに対する受容体（Ｓｉａ  ２−３Ｇａｌ）およびヒトインフルエンザウイルスに対する受容体（Ｓｉａ  ２−６Ｇａｌ）の検出を、ジゴキシゲニン標識レクチン(Boehringer)を用いることによる蛍光セルソーター解析により行う：
・Sambuca nigra (SNA) agglutininレクチンはＳｉａ  ２−６Ｇａｌと特異的に結合する；
・Maackia amurensis (MAA) agglutininレクチンはＳｉａ  ２−３Ｇａｌと特異的に結合する。
【００９６】
ＥＢ１４細胞株およびＭＤＣＫ細胞株を１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５で洗浄し、同じバッファーに５．１０６終濃度に再懸濁した。細胞を氷上で３０分、その後、ＳＮＡまたはＭＡＡの存在下でさらに１５〜３０分インキュベートした。レクチン処理した細胞を、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ  ｐＨ７．５で洗浄した後、ＦＩＴＣ標識抗ジゴキシゲニン抗体とともに氷上で１５〜３０分間インキュベーションを行った。その後、細胞をＮａＣｌ  ０．９％で洗浄し、ＦＡＣＳ解析した。
【００９７】
ＥＢ１４細胞は、Ｓｉａ  ２−６Ｇａｌ残基およびＳｉａα２−３Ｇａｌ残基を有する、オリゴ糖を含む細胞表面受容体を発現する（図６）。
【００９８】
実施例３：ＥＢ１４細胞におけるＭＶＡの生産
３．１−材料と方法
緑色蛍光タンパク質遺伝子をコードする組換えＭＶＡウイルスを用いた。伝染性ＭＶＡ−ＧＦＰウイルスの力価測定をＤＦ−１細胞において行った。簡潔には、細胞を、５％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）(SAFC)および２ｍＭ  Ｌ−グルタミン(Biowhittaker)を補給したＤＭＥＭ培地(Biowhittaker)の入った９６平底ウェルプレートに密度  １５．１０３細胞／ウェルで播種した。２４時間後、細胞を、ＤＭＥＭで１０倍連続希釈したサンプルに感染させ、３７℃、５％ＣＯ２で加湿雰囲気中１週間インキュベートした。ウイルス感染性を、全体的な細胞変性効果（ＣＰＥ）およびＵＶ照射した感染細胞の顕微鏡観察により測定した。次いで、ＴＣＩＤ５０力価をReed and Muench法(1938, A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97)に従って算出した。
【００９９】
３．２−組織培養フラスコにおける感染
３．２．１−材料
容器：Ｆ１７５フラスコ(Starstedt, Ref. 83 1812502)
回転式攪拌装置：IKA社のＫＳ２６０または等価物
ソニケーター：IKA社のＵ５０（ＵＳ５０−３プローブでモニタリングされる）
培地：２．５ｍＭグルタミン(Cambrex Ref. BE17605E)含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９(SAFC-JRH)；
【０１００】
３．２．２−方法
工程１：ＥＢ１４細胞の調製
細胞は感染試験開始の２週間前に調製する。
第０日目：ＥＢ１４細胞をＦ１７５フラスコにおいて、２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地２５ｍｌ中０．４×１０６細胞／ｍＬで播種する［集塊破壊後の第１回目の播種］。細胞を攪拌下（６０ｒｐｍ）、３７℃、７，５％ＣＯ２、加湿雰囲気でインキュベートする。
第１日目：２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地２５ｍｌを添加する。
第２日目：２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地５０ｍｌを添加する。
第３日目：細胞を計数する。１アリコートのＥＢ１４細胞を新しいＦ１７５フラスコにおいて、２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地２５ｍｌ中０．４×１０６細胞／ｍＬで播種する。これが希釈＋１となる。
第４日目：２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地２５ｍｌを添加する。
第５日目：２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地５０ｍｌを添加する。
第６日目：細胞を計数する。１アリコートのＥＢ１４細胞を新しいＦ１７５フラスコにおいて、２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地２５ｍｌ中０．４×１０６細胞／ｍＬで播種する。これが希釈＋２となる。
【０１０１】
このように、その後も、好ましくは＋３〜＋７の間、より好ましくは＋３〜＋５の間を含む希釈までこのように細胞の増幅を続ける。その後に、工程２の細胞感染に移るとよい。
【０１０２】
ＥＢｘ（登録商標）細胞大型集塊を含む細胞培養物を得るためには（以後「大型集塊」状態と呼ぶ）、この細胞をより大型の容器への希釈により継代接種する際に、ＥＢｘ（登録商標）細胞を遠心分離せず、その集塊をピペット操作および攪拌により破壊しない。逆に、ＥＢｘ（登録商標）細胞集塊を実質的に含まない細胞培養物を得るためには、この細胞を継代接種する際に、その集塊をピペット操作または攪拌により破壊する（以後「集塊不在」状態と呼ぶ）。
【０１０３】
工程２：ＭＶＡ−ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）によるＥＢ１４細胞の感染
第１日目：ＥＢ１４細胞をＦ１７５フラスコにおいて、２．５ｍＭグルタミンを含有するJRH社のＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地４０ｍＬ中、０．４×１０６細胞／ｍＬで播種する。細胞を攪拌下（６０ｒｐｍ）、３７℃、７，５％ＣＯ２、加湿雰囲気でインキュベートする。
第２日目および第３日目：細胞を計数する。
第４日目：細胞を計数する。フラスコ内の細胞密度が約４×１０６細胞／ｍｌであるときに、ＥＢ１４細胞を、１フラスコ当たりウイルス感染用ミックス１ｍｌを用いてＭＯＩ  ０．０１ＴＣＩＤ５０／細胞で感染させる。ウイルス感染用ミックスは、２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地でのウイルスの希釈により使用直前に調製する。接種材料はそれぞれ、１５ｍｌのFalcon（商標）チューブに入れて氷上で３０秒超音波処理する（振幅１００％および連続サイクル）。接種材料は、室温で温めた後、細胞培養物と混合する。接種後、感染させた培養培地を３７℃で１時間インキュベートする。その後、そのフラスコに６０ｍｌの新鮮培地、２．５ｍＭグルタミン、０．５×Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、および０．３５ｍｌ／Ｌ脂肪酸を補給したＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９を添加する。その感染細胞培養物を３７℃で少なくとも１４４時間の間（ｎｂ：ウイルスの生産ピークはｐｉ＋７２時間〜ｐｉ＋１２０時間の間である）さらにインキュベートする。
【０１０４】
細胞培養物サンプル（１ｍＬ）は２４時間ごとに採取し、−８０℃で冷凍保存する。サンプル採取の前に細胞培養物をゆっくりとしたピペット操作によりホモジナイズする。各採取サンプルのウイルス力価測定は、試験の最後にＴＣＩＤ５０／ｍＬ  Reed and Muenchの方法(1938)を用いて行う。
【０１０５】
３．３−スピナーにおける感染
３．３．１−材料
容器：５００ｍｌおよび１Ｌスピナーボトル(Corning)
回転式攪拌装置：IKA社のＫＳ２６０または等価物
ソニケーター：IKA社のＵ５０（ＵＳ５０−３プローブでモニタリングされる）
培地：２．５ｍＭグルタミン(Cambrex Ref. BE17605E)含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９(SAFC-JRH)；
【０１０６】
３．３．２−方法
工程１：ＥＢ１４細胞の調製
細胞は感染試験開始の２週間前に調製する。
第０日目：ＥＢ１４細胞をＦ１７５フラスコにおいて、２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地２５ｍｌ中、０．４×１０６細胞／ｍＬで播種する［集塊破壊後の第１回目の播種］。細胞を攪拌下（６０ｒｐｍ）、３７℃、７，５％ＣＯ２、加湿雰囲気でインキュベートする。
第１日目：２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地２５ｍｌを添加する。
第２日目：２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地５０ｍｌを添加する。
第３日目：細胞を計数する。１アリコートのＥＢ１４細胞を新しいＦ１７５フラスコにおいて、２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地２５ｍｌ中、０．４×１０６細胞／ｍＬで播種する。これが希釈＋１となる。
第４日目：２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地２５ｍｌを添加する。
第５日目：２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地５０ｍｌを添加する。
第６日目：細胞を計数する。１アリコートのＥＢ１４細胞を新しいＦ１７５フラスコにおいて、２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地２５ｍｌ中、０．４×１０６細胞／ｍＬで播種する。これが希釈＋２となる。
【０１０７】
このように、その後も、好ましくは＋３〜＋７の間、より好ましくは＋３〜＋５の間を含む希釈までこのように細胞の増幅を続ける。その後に、工程２の細胞感染に移るとよい。
【０１０８】
ＥＢｘ（登録商標）細胞大型集塊を含む細胞培養物を得るためには（以後「大型集塊」と呼ぶ）、この細胞をより大型の容器への希釈により継代接種する際に、ＥＢｘ（登録商標）細胞を遠心分離せず、その集塊をピペット操作および攪拌により破壊しない。逆に、ＥＢｘ（登録商標）細胞集塊を実質的に含まない細胞培養物を得るためには、この細胞を継代接種する際に、その集塊をピペット操作または攪拌により破壊する（以後「集塊不在」と呼ぶ）。
【０１０９】
工程２：ＭＶＡ−ＧＦＰによるＥＢ１４細胞の感染
第１日目：ＥＢ１４細胞を５００ｍｌ（または１，０００ｍｌ）のスピナーボトルにおいて、２．５ｍＭグルタミンを含有するJRH社のＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地１５０ｍＬ（または３００ｍｌ）中、０．４×１０６細胞／ｍＬで播種する。細胞を攪拌下（１００ｒｐｍ）、３７℃、７，５％ＣＯ２、加湿雰囲気でインキュベートする。
第２日目および第３日目：細胞を計数する。
第４日目：細胞を計数する。スピナー内の細胞密度が約４×１０６細胞／ｍｌであるときに、ＥＢ１４細胞を、１スピナーボトル当たりウイルス感染用ミックス１ｍｌを用いてＭＯＩ  ０．０１ＴＣＩＤ５０／細胞で感染させる。ウイルス感染用ミックスは、２．５ｍＭグルタミン含有Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９培地でのウイルスの希釈により使用直前に調製する。接種材料はそれぞれ、１５ｍｌのFalcon（商標）チューブに入れて氷上で３０秒超音波処理する（振幅１００％および連続サイクル）。接種材料は、室温で温めた後、細胞培養物と混合する。接種後、感染させた培養培地を３７℃で１時間インキュベートする。その後、その５００ｍｌ（または１，０００ｍｌ）のスピナーボトルに６０ｍｌの新鮮培地、２．５ｍＭグルタミン、０．５×Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ、および０．３５ｍｌ／Ｌ脂肪酸を補給したＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９を添加する。その感染細胞培養物を３７℃で少なくとも１４４時間の間（ｎｂ：ウイルスの生産ピークはｐｉ＋７２時間〜ｐｉ＋１２０時間の間である）さらにインキュベートする。
【０１１０】
細胞培養物サンプル（１ｍＬ）は２４時間ごとに採取し、−８０℃で冷凍保存する。サンプル採取の前に細胞培養物をゆっくりとしたピペット操作によりホモジナイズする。各採取サンプルのウイルス力価測定は、試験の最後にＴＣＩＤ５０／ｍＬ  Reed and Muenchの方法(1938)*を用いて行う。*Reed L & Muench H (1938) A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97.
【０１１１】
３．４−３Ｌ−攪拌槽型バイオリアクターにおける感染
３．４．１−方法
細胞の解凍
細胞の冷凍バイアルは液体窒素中−１９６℃で保存される；各冷凍バイアルには２０．１０６細胞入っている。冷凍バイアルを急速解凍するためには、冷凍バイアルを３７℃の予温した水浴で直接解凍する。その細胞懸濁液を予温した培養培地３０ｍＬの入った５０ｍＬのＰＰ滅菌チューブにピペットで移す。その細胞懸濁液を室温で３００±２０ｇにて５分遠心分離し、その上清を廃棄し、ペレットを新鮮培養培地１５ｍｌに再懸濁し、ゆっくりとホモジナイズする。この細胞懸濁液をＴ７５ｃｍ２フラスコに入れ、７．５％ＣＯ２雰囲気下、オービタルシェーカーで５０ｒｐｍにて３７℃でインキュベートする。培養の２４時間後および４８時間後、その細胞培養物に予温した培養培地１５ｍｌを添加する。培養の７２時間後、サンプルを採取し（バルクホモジナイゼーション後）、計数を行う：＞４０．１０６細胞と見込まれる。その後、第１回目の増幅を行う。
【０１１２】
第１回目の細胞増幅：遠心分離、解離、および希釈
懸濁細胞をフラスコから５０ｍＬのＰＰ滅菌チューブに採取する。室温で３００±２０ｇにて５分遠心分離した後、その上清を廃棄し、ペレットに予温した新鮮培養培地１０ｍＬを添加する。この細胞集塊を１０ｍＬのピペットでゆっくりと解離し、細胞懸濁液を必要に応じて１つの５０ｍＬのＰＰ滅菌チューブにプールする。必要に応じて新鮮な予温した培養培地を添加して、培養物量を最終２０ｍＬまでとする。トリパンブルーを用いて計数を行って、細胞密度および細胞生存率（細胞生存率は一般におよそ８０％である）を決定する。１つのＴ１７５ｃｍ２フラスコにおいて、予温した培養培地４０ｍｌに０．４．１０６細胞．ｍＬ−１を播種する。この細胞培養物を７．５％ＣＯ２雰囲気下、オービタルシェーカーで５０ｒｐｍにて３７℃でインキュベートする。第２日目に、その細胞培養物に予温した培養培地６０ｍｌを添加する。第３日目に、細胞の希釈を行う。
【０１１３】
希釈＋１〜＋５（遠心分離を行わず、解離を行わず、希釈のみ）．
（ゆっくりと混合した後）Ｔ１７５フラスコからサンプルを採取して、トリプタンブルーを用いて計数を行って、細胞密度を決定する。（ゆっくりと混合した後）Ｔ１７５フラスコからサンプルを採取して、総量２５ｍｌの予温した培養培地の入った１つのＴ１７５ｃｍ２フラスコに０．４．１０６細胞．ｍＬ−１播種する。これが希釈＋１となる。
第１日目に、予温した培養培地５０ｍｌを添加する。第２日目に、希釈＋１の場合と同じ方法を用いて希釈＋２を行う（上記参照）。このように、希釈＋３〜＋５まで細胞の増幅を行う。３Ｌバイオリアクターの場合の接種材料は、希釈＋３〜希釈＋５までから調製することができる。接種材料として２つのＴ１７５フラスコを調製する。
【０１１４】
３Ｌ攪拌槽型バイオリアクターにおける細胞の播種
播種−第０日目
接種材料を調製する（３Ｌ−バイオリアクターに接種するには３２０．１０６細胞が必要である）。２つのＴ１７５フラスコにプールする。ゆっくりと混合した（細胞集塊を破壊してはならない）後サンプルを採取して、トリパンブルーを用いて計数を行って、細胞密度を決定する。１５０ｍＬの細胞混合物を調製して、バイオリアクターにおける最終培養物量８００ｍｌに細胞濃度０．４０．１０６細胞．ｍＬ−１を得る。
【０１１５】
細胞播種の前に、容器内のｐＨを７．２に設定する（ｐＨはＣＯ２表面注入により低下するため）。ｐＯ２は５０％Ｏ２飽和に設定する（質量流量調整器を、５０ｍＬ．分−１の最大スパージャー流量に相当する１００％に調整する）。この処理の初めには、ｐＨをＣＯ２表面注入により維持し、後には、７．５％ＮａＨＣＯ３を添加することにより制御する。表面通気は流速０．３ｍＬ．分−１の空気で開始する。
【０１１６】
培養物の追跡調査／栄養物の添加（第１日目、第２日目）
定期的に細胞の計数を行う。培養期間を通じて、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  Ｂａｓｉｃソフトウェアを用いて、グルタミン酸塩、グルタミン、乳酸塩、およびグルコースなどの代謝物を解析する。必要に応じて代謝物の濃度を調整する。例えば、グルタミン濃度を２ｍＭに調整する。
【０１１７】
ＭＶＡ−ＧＦＰによる感染（第３日目）
細胞密度は、培養の３日後に、３．１０６細胞．ｍＬ−１より高くなっているはずである。目的の細胞密度に達していた場合には（３〜５．１０６細胞．ｍＬ−１）、ウイルス感染をＭＯＩ  １０−２ＴＣＩＤ５０／細胞で行う。ウイルス株を氷上で解凍する。感染用ミックスは、生産培地１０ｍＬを用いて５０ｍＬのＰＰ滅菌チューブで調製する。感染用ミックスは氷上で３０秒間超音波処理する（振幅１００％および連続サイクル）。その感染用ミックスをバイオリアクターに接種する。ウイルス吸着の１時間後、その容器に最終生産培地を添加する。Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９生産培地１．５Ｌに、Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅおよび脂肪酸をそれぞれ、終濃度０．５Ｘおよび０．３５ｍｌ／Ｌまで補給する（最終量：２，３Ｌ）。
【０１１８】
その後の生産／栄養物の添加（第４日目、第５日目、第６日目、第７日目、第８日目、第９日目、第１０日目）
ＭＶＡウイルスの生産ピークは感染の７２時間後〜１２０時間後の間に達する。毎日バイオリアクターからおよそ１５ｍｌのサンプルを採取して、細胞の計数、細胞形態解析を行い、ＣＰＥを観察する。培養期間を通じて、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  Ｂａｓｉｃソフトウェアを用いて、グルタミン酸塩、グルタミン、乳酸塩、およびグルコースなどの代謝物を解析する。必要に応じて代謝物の濃度を調整する。例えば、必要に応じてグルタミン濃度を２ｍＭに調整する。必要に応じてグルコース濃度を２ｇ．Ｌ−１に調整する。
【０１１９】
解析
試験終了時に、採取したサンプル総てを用いて、ウイルス力価測定を実施する。
３．５−結果
３．５．１−３ＬフェドバッチバイオリアクターにおけるＥＢ１４細胞の細胞増殖速度
攪拌槽型バイオリアクターにおいてＥＢ１４細胞を規定どおりに培養する。ＥＢ１４由来バイオマスを、細胞密度５〜６．１０６細胞／ｍＬに達するまで、細胞増殖培地中に３７℃で蓄積させる。次いで、その混合物をおよそ３倍希釈し、細胞増殖速度を１０日間かけて追跡調査する。かかる条件では、通常、５〜８日目あたりに細胞密度１２００〜１６００万細胞／ｍｌに達する（図７Ａ）。ＥＢ１４細胞の分割比は増加してよい。図７Ｂは１０倍希釈したＥＢ１４細胞の増殖速度を示している。
【０１２０】
３．５．２−ＥＢ−１４細胞の柔軟性：接着細胞におけるＭＶＡ−ＧＦＰウイルスのプラーク精製
ＥＢ１４細胞は懸濁培養により増殖する。しかしながら、ＥＢ１４細胞はフラスコおよびプレートにおいて接着状態で増殖する能力も有する。この特徴によって、本発明者らは、接着ＥＢ１４細胞におけるＭＶＡ−ＧＦＰのプラーク精製の実施を可能にする。そうするために、ＭＶＡ−ＧＦＰウイルスの１０倍連続希釈物を、２４時間前に６ウェルプレートに密度７．１０４細胞／ｃｍ２で播種された接着ＥＢ−１４細胞に接種した。ウイルス吸着後、細胞の上に１．２％ＬＭＰアガロース／２．５％ＦＣＳ  ＤＭＥＭの混合物の層を形成し、３７℃で数日間インキュベートした。最後に、ウェルをニュートラルレッドで染色した。その後、プラーク形成単位の力価を算出することができ、希釈により単離プラークを得る。
【０１２１】
３．５．３−感染ＥＢ１４細胞におけるＭＶＡ−ＧＦＰウイルスの増殖に対する生産培地および集塊サイズの影響
ＥＢ１４に、細胞増殖培地（Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９）での細胞増殖中にＴ１７５攪拌槽型フラスコ内で、小型または大型集塊を形成させた。次いで、集塊を１０−２ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＶＡ−ＧＦＰウイルスに感染させ、その混合物をいくつかの生産培地（Ｏｐｔｉｐｒｏ、Ｅｘｃｅｌｌ  ３１９、Ｅｘｃｅｌｌ  ４２１、Ｅｘｃｅｌｌ  ６２５、Ｅｘｃｅｌｌ  ６２６、Ｅｘｃｅｌｌ  ６２７、Ｅｘｃｅｌｌ  ６２８、Ｅｘｃｅｌｌ  ６２９、Ｇ９９１６）で希釈した。ＥＢ１４細胞の大型集塊が存在することによりウイルス感染および増殖が向上し（図８）、より高いＭＶＡウイルス力価がもたらされる（図９）。ウイルス生産培地に、ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（補給物１）および脂肪酸（補給物２）などの補給物を添加することにより、ＭＶＡウイルス力価はさらに向上する。図１０で示されるように、培地にｙｅａｓｔｏｌａｔｅ  １Ｘ（補給物１）を添加しただけの場合には、ＭＶＡ−ＧＦＰウイルス収量が増加するが、細胞増殖培地にｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（補給物１）および脂肪酸（補給物２）を添加した場合には、相乗効果までも得られる。実際に、脂肪酸１Ｘ単独ではウイルス力価は増加しない。
【０１２２】
３．５．４−３Ｌ−バイオリアクターにおけるＭＶＡウイルスの生産
細胞増殖期中にＥＢ１４由来バイオマスをＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９増殖培地中に蓄積させた。次いで、細胞を１０−２ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＶＡ−ＧＦＰウイルスに感染させ、その混合物をＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９生産培地で希釈した。Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９の添加後、細胞密度は低下した（第３日目）が、第５日目には感染細胞の細胞密度は増加し、４百万細胞／ｍｌに達した。細胞増幅中に遠心分離が行われないという事実により、感染の２〜４日後に培養により大型集塊サイズを得ることが可能になる（図１１）。かかる条件では、ＭＶＡ−ＧＦＰ生産性は高い。感染後６日目以降、ＭＶＡ−ＧＦＰの力価はおよそ１０８．３２  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（細胞濃度１．４９×１０６細胞／ｍｌ）であり、この値はＴＣＩＤ５０／細胞＝４１４（増幅係数４１，０００）に相当する（図１２）。ＥＢ１４細胞を、（例えば、希釈により）集塊を破壊しないで増幅する場合には、３Ｌ−バイオリアクターにおいて大型集塊の不在下で細胞培養物に得られるウイルス力価（増幅係数およそ１９００およびＴＣＩＤ５０／細胞＝１９）よりも高いウイルス力価が得られるようである。
【０１２３】
３．５．５−ＭＶＡ感染ＥＢ１４細胞の標準超微細構造
ＭＶＡウイルスに感染したＥＢ１４細胞を電子顕微鏡(Drs. Daniele Spehner & Robert Drillien, IGBMC, Strasbourg France)により解析した。ＥＢ１４細胞において生産されるＭＶＡウイルスの成熟は標準的であり、一次ニワトリ胚繊維芽細胞において認められる成熟と同様である。
【０１２４】
実施例４：ＥＢ１４細胞におけるインフルエンザウイルスの生産
４．１−材料および方法
４．１．１−インフルエンザウイルス感染性試験（ＴＣＩＤ５０）
伝染性インフルエンザウイルスの力価測定をＭＤＣＫ細胞において行った。簡潔には、細胞を、２．５ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補給したＵｌｔｒａＭＤＣＫ培地の入った９６平底ウェルプレートに密度３．１０３細胞／ウェルで播種した。２４時間後、細胞を、６μｇ．ｍＬ−１トリプシン−ＥＤＴＡを含むＵｌｔｒａＭＤＣＫで１０倍連続希釈したサンプルに感染させ、３３℃、５％ＣＯ２で加湿雰囲気中１週間インキュベートした。その後、ウイルス複製を、ニワトリ赤血球を用いてＨＡアッセイにより試験し、ＴＣＩＤ５０力価をReed and Muench法(1938)*に従って算出した。
*Reed L, Muench H, 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints. Am. J. Hyg. 27, 493-97.
【０１２５】
４．１．２−一元放射免疫拡散法（ＳＲＩＤ）
インフルエンザウイルス感染ＥＢ１４細胞由来のサンプル中の血球凝集素濃度を、Wood and colleagues*に記載のとおり決定した。簡潔には、ガラスプレートを抗インフルエンザ血清を含む（ＮＩＢＳＣにより提供された推奨濃度）アガロースゲルでコーティングした。ゲルをセットした後、参照およびサンプルの適当な希釈物１０μＬを直径３ｍｍの穴のあいたウェルにのせた。湿室内、室温で１８〜２４時間のインキュベーション後、プレートを０．９％ＮａＣｌに浸漬し、蒸留水で洗浄した。その後、そのゲルをプレスし、乾燥させた。プレートをクーマシーブリラントブルー溶液で１５分間染色し、はっきりとした染色域が目に見えるようになるまでメタノールと酢酸の混合物で２回脱染した。プレートを乾燥させた後、抗原のウェル周囲の染色域の直径を直角に２方向に測定した。表面に対する抗原希釈物の用量反応曲線を作成し、それらの結果を標準的な傾斜比法に従って算出した。*Wood JM. Et al. "An improved single-radial-immunodiffusion technique for the assay of influenza haemagglutinin antigen: application for potency determinations of inactivated whole virus and subunit vaccines". J Biol Stand. 1977;5(3):237-47).
【０１２６】
４．１．３−インフルエンザ血球凝集素タンパク質のウエスタンブロット解析
ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、Laemmli UK (1970, Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 259:680-685)によって記載されているとおり、１０％ポリアクリルアミドゲルで行った。変性タンパク質（１％ＳＤＳ、７０ｍＭ  β−メルカプトエタノール）を、半乾燥ブロッティング手法によりポリビニリデンジフルオライドメンブレン(hybond P, Amersham)に移した(Kyhse-Andersen J (1984) Electroblotting of multiple gels : a simple apparatus without buffer tank for rapid transfer of proteins from polyacrylamide to nitrocellulose. J Biochem Biophys Methods 10:203-209)。ブロットを、１％ＦＣＳ(SAFC)を補給したＴＢＳＴ中の５％脂肪乾燥粉乳からなる混合物を用いて室温で１時間ブロッキングした。その後、それらのブロットを、特異的ポリクローナル抗ＨＡヒツジ血清（１：５００(NIBSC)を補給したブロッキング溶液中で一晩インキュベートした。それらのブロットをＴＢＳＴで６回洗浄し、ブロッキング溶液中でｈｒｐコンジュゲートウサギ抗ヒツジＩｇＧポリクローナル抗体（１：５０００(Rockland)とともに室温で１時間インキュベートした。ＴＢＳＴで６回洗浄した後、最後に、化学発光（ＥＣＬキット, Amersham）およびフィルム（Ｈｙｐｅｒｆｉｌｍ, Amersham）を用いてタンパク質コンジュゲート複合体を明らかにした。
【０１２７】
４．２−３Ｌ−バイオリアクターにおけるＥＢ１４細胞のインフルエンザウイルス感染
４．２．１−材料および装置
細胞解凍用材料
Ｔ７５ｃｍ２フラスコ(Sarstedt, カタログ番号831813502)
培養培地（無血清培地）
Ｌ−グルタミン  ２００ｍＭ(Biowhittaker, カタログ番号BE17-605E)
回転式攪拌装置  IKA社のＫＳ２６０(Fisher Bioblock, カタログ番号F35044)
【０１２８】
細胞増幅用材料
Ｔ１７５ｃｍ２フラスコ(Sarstedt, カタログ番号831812502)
培養培地（無血清培地）：２．５ｍＭグルタミンを添加したＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９(JRH, カタログ番号65319-1000M 1687)
Ｌ−グルタミン  ２００ｍＭ(Biowhittaker, カタログ番号BE17-605E)
Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ  ＵＦ溶液  ５０Ｘ(JRH, カタログ番号58902-100M)
Ｄ（＋）グルコース（４５％）(Sigma, カタログ番号G8769)
【０１２９】
生産用材料
生産培地（無血清培地）：２．５ｍＭ  ｇｌｎを補給したＥｘｃｅｌｌ  ６５６２９(JRH, カタログ番号65629)
Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ  ＵＦ溶液  ５０Ｘ(JRH, カタログ番号58902-100M)
Ｌ−グルタミン  ２００ｍＭ(Biowhittaker, カタログ番号BE17-605E)
Ｄ（＋）グルコース（４５％）(Sigma, カタログ番号G8769)
トリプシン(Trypzean 1X, Sigma, カタログ番号T3449)
７．５％重炭酸ナトリウム溶液(Sigma, カタログ番号205-633-8)
インフルエンザウイルス株（−８０℃で冷凍）
【０１３０】
４．２．２−方法
細胞の解凍
細胞の冷凍バイアルは液体窒素中−１９６℃で保存される；各冷凍バイアルには２０．１０６細胞入っている。冷凍バイアルを３７℃の予温した水浴で直接解凍する。その細胞懸濁液を予温した培養培地３０ｍＬの入った５０ｍＬのＰＰ滅菌チューブに入れる。遠心分離（室温で３００±２０ｇにて５分）後、ペレットに新鮮培養培地１５ｍｌを添加し、ゆっくりとホモジナイズする。そのサンプルを、トリパンブルーを用いて計数する。良好な培養を保証するためには、計数では≧２０．１０６細胞でなければならず、生存率は＞７０％でなければならない。この細胞懸濁液をＴ７５ｃｍ２フラスコに入れ、７．５％ＣＯ２雰囲気下、オービタルシェーカーで５０ｒｐｍにて３７℃でインキュベートする。培養の２４時間後および４８時間後、その培養物に予温した培養培地１５ｍｌを添加する。培養の７２時間後、サンプルを採取し（バルクホモジナイゼーション後）、計数を行う：２０〜３０．１０６細胞と見込まれる。その後、第１回目の増幅を行う。
【０１３１】
第１回目の細胞増幅：遠心分離、解離、および希釈
懸濁細胞をフラスコから５０ｍＬのＰＰ滅菌チューブに採取し、室温で３００±２０ｇにて５分遠心分離する。ペレットに予温した新鮮培養培地１０ｍＬを添加する。この細胞集塊をゆっくりと解離し、細胞懸濁液をプールし、新鮮な予温した培養培地を添加して、容量を最終４０ｍＬにする。１つのＴ１７５ｃｍ２フラスコにおいて、予温した培地４０ｍｌに０．２５．１０６細胞．ｍＬ−１を入れ、７．５％ＣＯ２雰囲気下、オービタルシェーカーで５０ｒｐｍにて３７℃でインキュベートする。第２日目に、予温した培養培地６０ｍｌを添加する。第３日目に、第２回目の増幅を行う。
【０１３２】
３Ｌ攪拌槽型バイオリアクターにおける細胞の播種
播種−第０日目
接種材料を調製する（３Ｌ−バイオリアクターに接種するには３２０．１０６細胞が必要である）。２つのＴ１７５フラスコにプールする。ゆっくりと混合した（細胞集塊を破壊してはならない）後サンプルを採取して、トリパンブルーを用いて計数を行って、細胞密度を決定する。１５０ｍＬの細胞混合物を調製して、バイオリアクターにおける最終培養物量８００ｍｌに細胞濃度０．４０．１０６細胞．ｍＬ−１を得る。
細胞播種の前に、容器内のｐＨを７．２に設定する（ｐＨはＣＯ２表面注入により低下するため）。ｐＯ２は５０％Ｏ２飽和に設定する（質量流量調整器を、５０ｍＬ．分−１の最大スパージャー流量に相当する１００％に調整する）。この処理の初めには、ｐＨをＣＯ２表面注入により維持し、後には、７．５％ＮａＨＣＯ３を添加することにより制御する。表面通気は流速０．３ｍＬ．分−１の空気で開始する。
【０１３３】
培養物の追跡調査／栄養物の添加(第１日目、第２日目)
定期的に細胞の計数を行う。培養期間を通じて、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  Ｂａｓｉｃソフトウェアを用いて、グルタミン酸塩、グルタミン、乳酸塩、およびグルコースなどの代謝物を解析する。必要に応じて代謝物の濃度を調整する。例えば、グルタミン濃度を２ｍＭに調整する。
【０１３４】
感染−第３日目
細胞密度は、培養の３日後に、４〜５．１０６細胞．ｍＬ−１より高くなっているはずである。目的の細胞密度に達していた場合には、ウイルス感染をＭＯＩ  １０−４で行う。容器の温度を３３℃に設定する。ウイルス株を氷上で解凍する。感染用ミックスは、生産培地１０ｍＬで調製する。感染用ミックスをバイオリアクターに接種した後、ウイルス吸着を１時間の間行う。最終生産培地を調製する：生産培地１．５Ｌ中にトリプシンを添加して、容器における終濃度０．３Ｕ．ｍＬ−１を得（全体で２．３Ｌ）、０．５Ｘ  Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅを添加する。その後、予温した最終生産培地を添加する。
【０１３５】
その後の生産／栄養物の添加（第４日目、第５日目、第６日目、第７日目、第８日目、第９日目、第１０日目）
毎日バイオリアクターからおよそ１５ｍｌのサンプルを採取して、細胞の計数、細胞形態解析を行い、ＣＰＥを観察する。培養期間を通じて、ＢｉｏＰｒｏｆｉｌｅ  Ｂａｓｉｃソフトウェアを用いて、グルタミン酸塩、グルタミン、乳酸塩、およびグルコースなどの代謝物を解析する。必要に応じて代謝物の濃度を調整する。例えば、必要に応じてグルタミン濃度を２ｍＭに調整する。必要に応じてグルコース濃度を２ｇ．Ｌ−１に調整する。
【０１３６】
解析
試験終了時に、採取したサンプル総てを用いて、ウイルス力価測定、ヘマグルチニンアッセイ（ＨＡＵ）、およびＨＡ抗原の定量（ウエスタンブロット、ＳＲＩＤ）を実施する。
【０１３７】
４．３−結果
本発明者らは、ＥＢ１４細胞がインフルエンザウイルスの様々なＡおよびＢ株の複製のための信頼できる効率的な細胞基質であることを証明している。インフルエンザウイルスの生産は、フラスコおよびスピナー（データは示さず）、ならびにバイオリアクターなどの様々な容器において行うことができる。３Ｌおよび３０Ｌ攪拌槽型バイオリアクターにおけるインフルエンザウイルス生産の再現性のある効率的なフェドバッチ法は、本発明者らによって得られた。フラスコでは通常、血球凝集素２５ｍｇ／ｌを上回る生産性が得られるが、インフルエンザウイルスのＡおよびＢ株に関してはフラスコにおいて通常、血球凝集素３５ｍｇ／ｌを上回る生産性が得られる。
【図面の簡単な説明】
【０１３８】
【図１】ＥＢ１４細胞の透過型電子顕微鏡解析  ＥＢ１４細胞は、ネズミ胚幹細胞（ｍＥＳ）の表現型によく似た、典型的な胚幹細胞の形態（すなわち、高い核−細胞質比）を示している。ＥＢ１４細胞は大きな核と核小体を有する小円形細胞であり、原形質膜から伸びる短い仮足を有する。ＥＢ１４細胞は代謝的に高活性であり、リボソームおよびミトコンドリアリッチの細胞質を有する。ＥＢ１４細胞の細胞形態は、ニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）のものとは異なっている。
【図２】１０５代および１１８代継代におけるＥＢ１４細胞の核型解析  無血清培地で１０５代および１１８代継代まで培養したＥＢ１４細胞の解析では、ＥＢ１４細胞の２倍性を確認し、１８本の大染色体と３０本の小染色体が存在していた（上のパネル）。この結果はニワトリ細胞の予想染色体数（下のパネル）と一致している。
【図３】ＥＢ１４細胞におけるテロメラーゼ発現  無血清培地で培養した異なる継代数のＥＢ１４細胞におけるテロメラーゼ発現をRoche社テロメラーゼ検出キット(Telomerase OCR ELISA)を用いることにより調査した。テロメラーゼは、ＥＢ１４細胞において高度に発現していることが分かる。８９代継代、１６０代継代（ＥＢ１４細胞マスターセルバンクに相当する）、および１７９代継代（生産継代の終点に相当する）において示されるように、高レベルのテロメラーゼ発現は継代の間維持される。イヌＭＤＣＫ細胞株は陰性対照として用いられ、イヌＭＤＣＫ細胞株はテロメラーゼを発現しない。ＣＥＦ細胞でも同様にテロメラーゼ発現は見られなかった（データは示さず）。
【図４】ＥＮＳ１遺伝子はＥＢ１４細胞において発現される  ＥＮＳ１遺伝子は、ニワトリＥＳ細胞において特異的に発現されるといわれていた(Acloque & al., Mech Dev. 103, p79-91 , 2001)。ＥＢ１４細胞におけるＥＮＳ１遺伝子の発現をＲＴ−ＰＣＲにより評価した。鳥類胚幹細胞（ＥＳ細胞）、産卵時に採取した鳥類胚細胞、および様々な継代数のＥＢ１４細胞（Ｐ２１、Ｐ１５９、Ｐ１６０）はＥＮＳ１遺伝子を強く発現することが分かるが、一方、鳥類細胞株ＤＦ１（米国特許第５，６７２，４８５号）およびニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）はこの遺伝子を発現しない。そのＲＮＡの存在を制御するために、同じサンプルで並行してハウスキーピングＧＡＰＤＨ遺伝子の解析を行う（下のパネル）。
【図５】ＥＢ１４細胞株（左のパネル）およびＤＦ１細胞株（右のパネル）におけるＥＳ細胞特異的マーカーの発現  ＥＢ１４細胞はＥＭＥＡ１遺伝子およびＳＳＥＡ１遺伝子を発現するが、一方、ＤＦ１細胞はそれらの遺伝子を発現しない。パキシリン遺伝子は対照として用いられるユビキタス遺伝子である。ＥＢ１４細胞は細胞マーカーＴＲＯＭＡ−１、ＭｅＩＭ、ＴＲＡ−１−６０、およびＳＳＥＡ３を発現しない。
【図６】ＥＢ１４細胞株およびＭＤＣＫ細胞株における受容体ＳＡ  ２−３およびＳＡａ２−６の細胞表面発現  細胞をジゴキシゲニン標識レクチンとともにインキュベートする：Sambuca nigra agglutininレクチンはＳｉａ２−６Ｇａｌと特異的に結合するが、一方、Maackia amurensis agglutininレクチンはＳｉａ２−３Ｇａｌと特異的に結合する。細胞と結合するレクチンは、当業者に周知の技術に従ってＦＩＴＣ標識抗ジゴキシゲニン抗体を用いて明らかにする。ＦＩＴＣ標識細胞は蛍光セルソーター（ＦＡＣＳ）を用いて数える。ＳＡα２−３およびＳＡａ２−６分子は、鳥類インフルエンザウイルスおよびヒトインフルエンザウイルスそれぞれの受容体であるといわれている。
【図７】３Ｌ−フェドバッチバイオリアクターにおけるＥＢ１４細胞の増殖速度  図７Ａ−ＥＢ１４由来バイオマスを、細胞密度５〜６．１０６細胞／ｍＬに達するまで、０．５Ｘ  ｙｅａｓｔｏｌａｔｅを補給した細胞増殖培地中に３７℃で蓄積させた。次いで、その混合物を２．９倍希釈し、細胞増殖速度を１０日間かけて追跡調査した。５日目には細胞密度１３百万細胞／ｍｌに達した。図７Ｂ−３ＬフェドバッチバイオリアクターにおけるＥＢ−１４細胞の細胞増殖速度に対する分割比の柔軟性：１／１０の分割定量（最終量２．１Ｌでは密度０．４．１０６細胞／ｍＬで０．２３Ｌ）での細胞播種後、ＥＢ１４由来バイオマスをＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９(SAFC)増殖培地中に３７℃で１１日間かけて蓄積させた。フェドバッチ法としてＬ−グルタミン（２ｍＭ）およびＤ−（＋）−グルコース（２ｇ／Ｌ）濃度を毎日調整し、バイオリアクターパラメーターを以下のとおり固定した：回転速度：８０ｒｐｍ、ｐＯ２：５０％、ｐＨ：７，２０。
【図８】感染ＥＢ１４細胞におけるＭＶＡ−ＧＦＰウイルスの増殖に対する生産培地および集塊サイズの影響：ＧＦＰ発現  ＥＢ１４に、細胞増殖用ＳＦＭ培地（SAFC：Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９）での細胞増殖中にＴ１７５攪拌槽型フラスコ内で、小型（左のパネル）または大型（右のパネル）集塊を形成させた。次いで、集塊を１０−２ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＶＡ−ＧＦＰウイルスに感染させ、その混合物をいくつかの生産用ＳＦＭ培地（Ｏｐｔｉｐｒｏ、Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９、Ｅｘｃｅｌｌ  ６５６２９）で希釈した。３７℃での７日間のウイルス増殖期間中、ＵＶ照射した感染細胞の写真を毎日撮影した。対照：細胞増殖および生産用培地としてｏｐｔｉｐｒｏ(INVITROGEN)を用いた。
【図９】感染ＥＢ１４細胞におけるＭＶＡ−ＧＦＰウイルスの増殖に対する生産培地および集塊サイズの影響：感染性ウイルス力価測定  ＥＢ１４に、細胞増殖培地（SAFC：Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９）での細胞増殖中にＴ１７５攪拌槽型フラスコ内で、小型（左のパネル）または大型（右のパネル）集塊を形成させた。次いで、集塊を１０−２ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＶＡ−ＧＦＰウイルスに感染させ、その混合物をいくつかの生産培地（Ｏｐｔｉｐｒｏ、Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９、、Ｅｘｃｅｌｌ  ６５４２１、Ｅｘｃｅｌｌ  ６５６２５、Ｅｘｃｅｌｌ  ６５６２６、Ｅｘｃｅｌｌ  ６５６２７、Ｅｘｃｅｌｌ  ６５６２８、Ｅｘｃｅｌｌ  ６５６２９、Ｇ９９１６）で希釈した。３７℃での７日間のウイルス増殖期間中、サンプルを毎日採取し、試験終了時にＴＣＩＤ５０の力価測定を行った。
【図１０】感染ＥＢ１４細胞におけるＭＶＡ−ＧＦＰウイルスの増殖に対する生産培地および補給物の影響  ＥＢ１４に、細胞増殖培地（SAFC：Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９）での細胞増殖中にＴ１７５攪拌槽型フラスコ内で、小型集塊を形成させた。次いで、細胞を１０−２ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＶＡ−ＧＦＰウイルスに感染させ、その混合物を、１Ｘ  ｙｅａｓｔｏｌａｔｅ（補給物１）および／もしくは１Ｘ脂肪酸（補給物２）を補給したまたは補給しないいくつかの生産培地（左から右のパネルへ：培地  Ｅｘｃｅｌｌ  ６５３１９、Ｅｘｃｅｌｌ  ６５６２９、またはＧ９９１６）で希釈した。３７℃での７日間のウイルス増殖期間中、サンプルを毎日採取し、試験終了時にＴＣＩＤ５０の力価測定を行った。
【図１１】３ＬフェドバッチバイオリアクターでのＭＶＡ−ＧＦＰウイルスに感染したＥＢ−１４細胞におけるＧＦＰ発現  細胞増殖期中にＥＢ１４由来バイオマスをＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９増殖培地中に蓄積させた。次いで、細胞を１０−２ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＶＡ−ＧＦＰウイルスに感染させ、その混合物をＧ９９１６生産培地で希釈した。その後、３７℃でＵＶ照射した感染細胞の写真（倍率  Ｘ５またはＸ１０）毎日撮影した。（ＰＩ：感染後）。
【図１２】３Ｌフェドバッチバイオリアクターにおいて増殖したＥＢ１４由来ＭＶＡ−ＧＦＰインフルエンザウイルスの感染性ウイルス力価測定  細胞増殖期中にＥＢ１４由来バイオマスをＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９増殖培地中に蓄積させた。次いで、細胞を１０−２ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＶＡ−ＧＦＰウイルスに感染させ、その混合物を、１×Ｙｅａｓｔｏｌａｔｅを補給したＥｘｃｅｌｌ  ６５３１９で希釈した。３７℃での９日間のウイルス増殖期間中、サンプルを毎日採取し、試験終了時にＴＣＩＤ５０の力価測定を行い、ＣＥＦ細胞で得られた力価と比較した。
【図１３】ＥＢ１４細胞において生産されたＭＶＡ−ＧＦＰウイルスの電子顕微鏡写真解析  ＥＢ１４を１０−２ＴＣＩＤ５０／細胞のＭＶＡ−ＧＦＰウイルスに感染させ、感染の１８時間後、４８時間後、および７２時間後に採取した。固定し、包理したサンプルの薄片を電子顕微鏡(Dr. D.Spehner, IGBMC, Strasbourg)により調べた。
【図１４】ＥＢ１４細胞において生産された多様なヒトインフルエンザ株の感染性ウイルス力価測定  ＥＢ１４細胞を、Ｔ１７５攪拌槽型フラスコ内で０．７５ＵＳＰ／ｍＬの組換えトリプシンの存在下で１０−４ＴＣＩＤ５０／細胞の様々なＡ／Ｈ３Ｎ２ヒトインフルエンザ株、Ａ／Ｈ１Ｎ１ヒトインフルエンザ株、およびＢヒトインフルエンザ株に感染させた。サンプルを２４時間ごとに採取し、試験終了時にウシ血清の不在下でのＭＤＣＫ細胞の力価測定によりＴＣＩＤ５０力価を解析した（左のパネル）。一部の感染ＥＢ１４細胞では並行して電子顕微鏡による解析を行い、インフルエンザウイルス粒子の生産を明らかにした（右のパネル；Dr. D.Spehner, IGBMC, Strasbourg）。
【図１５】ＥＢ１４細胞における多様なインフルエンザウイルス株の生産的複製  図１５Ａ−様々なインフルエンザウイルス株に感染したＥＢ１４細胞における血球凝集素（ＨＡ）のウエスタンブロット解析  ＥＢ１４細胞をＴ１７５振盪型フラスコ内で無血清培地で培養し、その細胞を０．７５ＵＳＰ／ｍＬのトリプシンの存在下で指示ウイルス株に多重感染度１０−４で感染させる。４μＬの細胞培養物上清を毎日採取し、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの電気泳動およびウエスタンブロッティングにより解析する。タンパク質をポリビニリデンジフルオライドメンブレンにエレクトロブロットし、ＨＡの未切断サブユニット（ＨＡ０）または切断後サブユニット（ＨＡ１およびＨＡ２）を、特異的ポリクローナル抗ＨＡヒツジ血清とのインキュベーションにより検出した。免疫染色にはペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒツジＩｇＧを用いた。各ウイルス株について、感染の７２時間〜１６８時間後のＨＡの蓄積を標準的卵由来ＨＡ試薬の増加量と比較する。図１５Ｂ−様々なインフルエンザウイルスについてのＥＢ１４由来ＨＡ生産レベルのＳＲＩＤによる解析  ＥＢ１４細胞を、Ｔ１７５振盪型フラスコ内で０．７５ＵＳＰ／ｍＬのトリプシンの存在下で１０−４ＴＣＩＤ５０／細胞の様々なＡ／Ｈ３Ｎ２ヒトインフルエンザ株、Ａ／Ｈ１Ｎ１ヒトインフルエンザ株、およびＢヒトインフルエンザ株に感染させた。サンプルを２４時間ごとに採取し、試験終了時に連続放射免疫拡散法(Serial Radial Immunodiffusion)（ＳＲＩＤ）による解析を行った。各ウイルス株について、ＨＡ蓄積の算出を明確に定義された対応する標準的な抗原の用量反応曲線と対応させる。
【図１６】３Ｌ−バイオリアクターでのＥＢ１４細胞におけるＡ／Ｈ３Ｎ２インフルエンザウイルス株の生産  図１６Ａ−Ａ／Ｈ３Ｎ２／ＮｅｗＹｏｒｋ／５５／２００５インフルエンザウイルス株に感染したＥＢ１４細胞の増殖速度  細胞増殖期中にＥＢ１４バイオマスを細胞増殖培地中に３７℃で蓄積させた。次いで、細胞を１０−４ＴＣＩＤ５０／細胞のＡ／Ｈ３Ｎ２／ＮｅｗＹｏｒｋ／５５／２００５インフルエンザウイルスに感染させ、その混合物を、０．３ＵＳＰ／ｍＬのトリプシンを補給したＥｘｃｅｌｌ６５６２９生産培地（培地Ｅ）で希釈し、温度を３３℃に下げた。１０日間のウイルス増殖期間中、サンプルを毎日採取し、−８０℃で保存した。左のパネル：細胞密度（×１０６細胞／ｍＬ）、右のパネル：総細胞数（黄色菱形、×１０７細胞）および生存率（赤色円、％）。図１６Ｂ−ウエスタンブロット法およびＳＲＩＤ法によるＨＡの解析  生産されたＨＡを検出および定量するために、感染後７日間かけて３Ｌバイオリアクターから採取したサンプルを、特異的ポリクローナル抗ＨＡヒツジ血清を用いて解析した。左のパネル：４μＬのウイルス上清のウエスタンブロット解析は、抗ＨＡヒツジ抗体とともに、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒツジＩｇＧを用いて免疫染色した。ＨＡの蓄積を標準的卵由来試薬の増加量と比較する。ＨＡ０：未切断ＨＡサブユニット、ＨＡ１およびＨＡ２：切断されたＨＡサブユニット。右のパネル：１０μＬのウイルス上清のＳＲＩＤによる定量。ＨＡ含量の算出を同じ標準的試薬の用量反応曲線と対応させる。
【図１７】３Ｌ−バイオリアクターでのＥＢ１４細胞におけるＢインフルエンザウイルス株の生産 図１７Ａ−Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９インフルエンザウイルス株に感染したＥＢ１４細胞の増殖速度  細胞増殖期中にＥＢ１４細胞を細胞増殖培地中に３７℃で蓄積させた。次いで、細胞を１０−４ＴＣＩＤ５０／細胞のＢ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９インフルエンザウイルスに感染させ、その混合物を、０．３ＵＳＰ／ｍＬのトリプシンを補給したSAFC社のＥｘｃｅｌｌ  ６５６２９生産培地（培地Ｅ）で希釈し、温度を３３℃に下げた。１０日間のウイルス増殖期間中、サンプルを毎日採取し、−８０℃で保存した。左のパネル：細胞密度（×１０６細胞／ｍＬ）、右のパネル：総細胞数（黄色菱形、×１０７細胞）および生存率（赤色円、％）。図１７Ｂ−ＥＢ１４由来Ｂ／Ｊｏｈａｎｎｅｓｂｕｒｇ／５／９９インフルエンザウイルスＨＡのウエスタンブロット解析  生産されたＨＡを検出するために、感染後７日間かけて採取したサンプルを、特異的ポリクローナル抗ＨＡヒツジ血清を用いて解析した。４μＬのウイルス上清を用いて、ウエスタンブロット解析を行い、この解析では抗原捕捉抗体を、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒツジＩｇＧを用いて免疫染色した。ＨＡの蓄積を標準的卵由来抗原の増加量と比較する。ＨＡ０：未切断ＨＡサブユニット、ＨＡ１およびＨＡ２：切断されたＨＡサブユニット。
【図１８】３０Ｌ−バイオリアクターでのＥＢ１４細胞におけるＡ／Ｈ１Ｎ１インフルエンザウイルス株の生産  図１８Ａ−Ａ／Ｈ１Ｎ１／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９インフルエンザウイルス株に感染したＥＢ１４細胞の増殖速度  細胞増殖期中にＥＢ１４細胞を細胞増殖培地中に３７℃で蓄積させた。次いで、細胞を１０−４ＴＣＩＤ５０／細胞のＡ／Ｈ１Ｎ１／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９インフルエンザウイルスに感染させ、その混合物を、０．３ＵＳＰ／ｍＬのトリプシンを補給したSAFC社の培地Ｅｘｃｅｌｌ  ６５６２９生産培地（培地Ｅ）で希釈し、温度を３３℃に下げた。８日間のウイルス増殖期間中、サンプルを毎日採取し、−８０℃で保存した。左のパネル：細胞密度（×１０６細胞／ｍＬ）、右のパネル：総細胞数（黄色菱形、×１０７細胞）および生存率（赤色円、％）。図１８Ｂ−ＥＢ１４由来Ａ／Ｈ１Ｎ１／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／９９インフルエンザウイルスの血球凝集素の解析  生産されたＨＡを検出および定量するために、感染後７日間かけて採取したサンプルを、特異的ポリクローナル抗ＨＡヒツジ血清を用いて解析した。左のパネル：４μＬのウイルス上清のウエスタンブロット解析、この解析では抗原捕捉抗体を、抗ＨＡヒツジ抗体とともに、ペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗ヒツジＩｇＧを用いて免疫染色した。ＨＡの蓄積を標準的卵由来試薬の増加量と比較する。ＨＡ０：未切断ＨＡサブユニット、ＨＡ１およびＨＡ２：切断されたＨＡサブユニット。右のパネル：１０μＬのウイルス上清のＳＲＩＤによる定量。ＨＡ含量の算出を同じ標準的試薬の用量反応曲線と対応させる。
【図３】
2008537681.tif 000003
【図５】
2008537681.tif 000004
【図６】
2008537681.tif 000005
【図７】
2008537681.tif 000006
【図９】
2008537681.tif 000007
【図１０】
2008537681.tif 000008
【図１２】
2008537681.tif 000009
【図１】
2008537681.tif 000010
【図２】
2008537681.tif 000011
【図４】
2008537681.tif 000012
【図８】
2008537681.tif 000013
【図１１】
2008537681.tif 000014
【図１３】
2008537681.tif 000015
【図１４】
2008537681.tif 000016
【図１５】
2008537681.tif 000017
【図１６】
2008537681.tif 000018
【図１７】
2008537681.tif 000019
【図１８】
2008537681.tif 000020
【国際調査報告】
2008537681.tif 000021
2008537681.tif 000022
2008537681.tif 000023