(57)【要約】  本発明の各実施態様は、物体の集団のマルチスペクトル画像を集め、集められた画像を解析し、集められた画像内の識別可能な測光及び／又は形態計測フィーチャを使用して、その集団の少なくとも１つの特性を測定することを含んでいる。例示的な一応用では物体が生物細胞である。限定しない特に好ましい一実施態様では、それぞれの個々の物体の複数の画像が同時に集められる。ある実験的研究では、測定されている特性が、接合細胞間のシナプスを含んでいる。これらの接合細胞は、画像化された物体の集団全体の部分集団を表すことができる。限定しない特に好ましい一実施形態では、本発明が、異なる生物細胞の接合による細胞分子の再分布の定量化を可能にする。重要なことは、このような定量化は、標準顕微鏡法及びフローサイトメトリでは実行できないということである。
2008539724.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
一群の物体が共有する１つ又は複数の特性を決定する方法であって、
（ａ）前記物体の集団と該物体の集団を画像化するために使用される画像化システムとの間に相対的な移動がある間に、画像データを集めるために前記物体の集団を画像化するステップと、
（ｂ）前記物体の集団に含まれる一群の物体が示す物体フィーチャを識別するステップと
を有することを特徴とする方法。
【請求項２】
前記画像データを使用して、前記物体フィーチャに関連した少なくとも１つの特性を測定するステップをさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
（ａ）前記画像データを使用して前記物体の部分集団を構成するステップであって、前記物体の部分集団が前記物体の集団に含まれるステップと、
（ｂ）前記物体の部分集団が示す物体フィーチャを識別するステップと
をさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記物体の集団を画像化するステップは、前記物体の集団の中の個々の物体の複数の画像を同時に集めるステップを有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記物体の集団の中の個々の物体の複数の画像を同時に集めるステップは、以下の画像タイプである明視野画像と暗視野画像と蛍光画像のうちの少なくとも２つを同時に集めるステップを有することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記物体の集団は、異なる少なくとも２つのタイプの物体を含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記物体の集団を画像化する前に、前記異なる少なくとも２つのタイプの物体のうちの少なくとも１つの物体に標識を付けるステップをさらに有することを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記物体は、生物細胞を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記物体の集団は、Ｔ細胞及び抗原提示細胞を含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）前記画像データを使用して前記物体の部分集団を構成するステップであって、前記物体の部分集団が前記物体の集団に含まれるステップと、
（ｂ）前記物体の部分集団が示す物体フィーチャを識別するステップと
をさらに有することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記画像データを使用して前記物体の部分集団を構成するステップは、接合した細胞を含む前記部分集団を構成するステップを有することを特徴とする請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記物体の部分集団が示す物体フィーチャを識別するステップは、前記接合細胞間のシナプスを識別するステップを有することを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記物体の集団を画像化する前に、前記物体の集団に含まれる複数の個々の物体に標識を付けるステップをさらに有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
物体との間に相対的な移動がある間に、前記物体の複数の画像を生成するように構成された画像化システムであって、
（ａ）前記物体から伝わった光が通過し、集光路に沿って進むように配置された集光レンズと、
（ｂ）該集光レンズを通過した前記光を受け取り、該光を複数の別個の光ビームに分散させるように前記集光路上に配置されたスペクトル分散構成要素であって、それぞれの光ビームは、該スペクトル分散構成要素から離れて異なる所定の方向に導かれるスペクトル分散構成要素と、
（ｃ）該スペクトル分散構成要素から前記光ビームを受け取り、該光ビームのそれぞれに対応する複数の画像を生成するように配置された画像化レンズであって、該画像化レンズによってそれぞれの画像は、異なる所定の位置に向かって投影される画像化レンズと、
（ｄ）前記複数の画像を受け取るように配置された検出器であって、前記複数の画像は、以下の画像タイプである明視野画像と暗視野画像と蛍光画像のうちの少なくとも２つを含む検出器と
を備えたことを特徴とする画像化システム。
【請求項１５】
（ａ）物体の集団の複数の画像を集めて、前記物体の集団に対応する画像データのセットを生成するステップと、
（ｂ）前記物体の集団に含まれる一群の物体が示す物体フィーチャを識別するステップと、
（ｃ）前記画像データを使用して、前記物体フィーチャに関連した少なくとも１つの特性を測定するステップと
を実行するように構成されたプロセッサをさらに備えたことを特徴とする請求項１４に記載の画像化システム。
【請求項１６】
物体の集団に対応する画像データが記憶されたメモリと、プロセッサとをさらに含み、該プロセッサが、
（ａ）前記物体の集団に含まれる一群の物体が示す物体フィーチャを識別するステップと、
（ｂ）前記画像データを使用して、前記物体フィーチャに関連した少なくとも１つの特性を測定するステップと
を実行するように構成されていることを特徴とする請求項１４に記載の画像化システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、無傷の（ｉｎｔａｃｔ）細胞内、細胞の表面及び細胞間の分子を検出し、定量化し、物体の特性を決定する方法及び画像化システムに関し、より詳細には、細胞間コミュニケーション（ｉｎｔｅｒ−ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ）を実施する分子の分布を解析して、物体の特性を決定する方法及び画像化システムに関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫系の細胞間コミュニケーションは、免疫機能にとって必要不可欠である。Ｔ細胞の分化及び成熟の過程は、樹状細胞と成熟中のＴ細胞との間の直接接触を伴い、この接触の間に、「自己」に関連した抗原を、免疫応答を引き起こすことなく認識し、それによって自己免疫を防ぐＴ細胞の能力に基づいて、生き残るＴ細胞が選択される。成熟後、Ｔ細胞は、細菌、ウイルスなどに由来する非自己抗原にＴ細胞をさらす抗原提示細胞と物理的に頻繁に相互作用し、最終的に、提示された抗原源に対する持続的な免疫応答を顕在化させるＴ細胞集団（ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）の増殖を引き起こす。
【０００３】
接触した細胞の画像によって、細胞間コミュニケーションの研究は大幅に容易になる。細胞の固定は、生化学的シグナリング（ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）機構を途絶させる恐れがあるため、この画像は生細胞から得ることが理想的である。それらの細胞は生きており、したがって、非常に動的であるため、接合細胞の複数の画像を同時に得ることが望ましい。さらに、免疫細胞は一般に非付着性であり、異種表面との接触はシグナリング過程を混乱させる可能性があるため、それらの細胞は、懸濁流体中で直接に画像化することが望ましい。最後に、培養細胞のモデル系とは対照的に、全血から得られた比較的にまれな１次Ｔ細胞と抗原提示細胞との接合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を使用して、生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でのふるまいを最もよくモデル化することができるよう、十分に解析的な処理能力を提供することが望ましい。
【０００４】
【特許文献１】米国特許第６２４９３４１号明細書
【特許文献２】米国特許第６２１１９５５号明細書
【特許文献３】米国特許第６４７３１７６号明細書
【特許文献４】米国特許第６５８３８６５号明細書
【特許文献５】米国特許出願第０９／９８９０３１号明細書
【特許文献６】米国特許第６６０８６８２号明細書
【特許文献７】米国特許第６５３２０６１号明細書
【特許文献８】米国特許第６７６３１４９号明細書
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、当技術分野では、流れの中の細胞接合体の検出及び定量化を可能にする技術であって、懸濁液ベースの細胞系及び１次細胞を研究する機会を提供するであろう技術の必要性が認識されている。さらに、マルチスペクトル解析用の細胞懸濁液を調製する方法も求められている。本発明はこのような必要性を満たし、さらに、関連したその他の利点を提供する。
【０００６】
本発明は、このような状況に鑑みてなされたもので、その目的とするところは、細胞間コミュニケーションを実施する分子の分布を解析して、物体の特性を決定する方法及び画像化システムを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明の各実施態様は、物体の集団のマルチスペクトル画像を集め、集められた画像を解析し、集められた画像内の識別可能な測光（ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｃ）及び／又は形態計測フィーチャ（ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｆｅａｔｕｒｅ）を使用して、その集団の少なくとも１つの特性を測定することに関する。例示的な一応用では物体が生物細胞である。特に好ましい実施態様では、測光フィーチャと形態計測フィーチャの両方が解析に使用される。限定しない特に好ましい実施態様では、それぞれの個々の物体の複数の画像が同時に集められる。
【０００８】
解析を容易にするために、本発明の少なくとも一実施態様は、画像化機器を使用して細胞（又は物体）の集団の画像データを集める前に、物体のこの集団の少なくとも１つのサブセット（ｓｕｂｓｅｔ）に標識を付けることを対象とする。本発明は、一般に、Ｎ−１個の固有の標識を使用して実現することができ、また、異なる物体タイプの数と同じ数の標識を使用して、あるいは物体タイプの数よりも多くの標識を使用して実現することもできる。Ｎは、区別される異なる物体タイプの数である。
【０００９】
生物細胞などの物体を解析するために使用することができる本発明の実施態様に基づく例示的なステップは、物体の集団の画像データを集めるステップと、後の解析のために、画像データから物体の部分集団を識別するステップとを含んでいる。限定しない特に好ましい実施態様では、物体が生物細胞であり、部分集団が、接合した細胞に対応する。次に、後の研究のために、部分集団内の物体の特定のフィーチャ（ｆｅａｔｕｒｅ）が識別される。フィーチャという用語は、容易に判別することができる物体の特定の構造、領域又は部分を指すことが意図される。例えば、ある解析は、部分集団内のそれぞれの物体の核又は内部体積に焦点を合わせ、他の解析は、部分集団内のそれぞれの物体の細胞膜又は外側境界に焦点を合わせることができる。本発明の特に好ましい実施態様では、後の研究のために選択されるフィーチャが、細胞接合体間のシナプス（ｃｙｎａｐｓｅ）である。部分集団内の物体ごとに、後の研究のために選択されたフィーチャが識別される。集められた画像の測光及び／又は形態計測データを使用して、選択されたフィーチャの少なくとも１つの特性が測定される。
【００１０】
解析のためのフィーチャが識別された後、異なるいくつかの技術を使用して、その部分集団の画像データを操作することができる。例示的な技術は、ゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）と呼ばれ、測光又は形態計測画像化に関するデータを操作する。他の例示的な技術がバックゲーティング（ｂａｃｋｇａｔｉｏｎ）であり、この技術は、ゲーティングされたデータのサブセットをさらに定義することを含んでいる。
【００１１】
厳密に必要というわけではないが、クロストーク（ｃｒｏｓｓｔａｌｋ）を低減させ、空間分解能を高めるために、集められた画像データ、特に同時マルチチャネル画像化を使用して集められた画像データに対して信号処理が実行されることが好ましい。
【００１２】
限定しない特に好ましい実施態様では、測定されている特性が、接合細胞間のシナプスを含んでいる。これらの接合細胞は、画像化された物体の集団全体の部分集団を表すことができる。限定しない特に好ましい実施形態では、本発明が、異なる生物細胞の接合による細胞分子の再分布の定量化を可能にする。重要なことは、このような定量化は、標準顕微鏡法及びフローサイトメトリ（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）では実行できないということである。
【００１３】
接合細胞間のシナプスの解析は、細胞間コミュニケーションの研究を容易にする。本発明の好ましい実施態様では、生物細胞の集団から集められた画像が、明視野画像、暗視野画像及び蛍光画像のうちの少なくとも１つの画像の収集物を含んでいる。このような実施態様では、コミュニケーション経路上でなんらかの役割を果たしていると疑われている分子に蛍光標識が付けられ、これによって、細胞間相互作用の結果としての分子の量及び分子の分布の変化を検出することを可能にする。集められた明視野及び／又は暗視野画像は、単に抗原提示細胞からＴ細胞を区別するだけの別個の蛍光識別マーカの必要性を排除し、それによってコミュニケーション経路上に含まれる異なる分子の同時研究により多くの蛍光プローブ（ｐｒｏｂｅ）を使用することを可能にすることによって、蛍光標識を強化する。本発明の実施態様では、画像化されている生物細胞の集団が、全血から得られた比較的にまれな１次Ｔ細胞と抗原提示細胞との接合体を含んでいる。
【００１４】
以上の各実施態様及び付随する本発明の利点の多くは、以下の詳細な説明を添付図面とともに参照することによってより理解されたときに、より容易に理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
＜概要＞
本発明の一実施態様は、流体の流れとともに運ばれた接合した生物細胞を画像化し、解析する画像化システム及びその方法に関する。少なくとも１つの実施形態では、生物細胞の複数の画像が同時に集められ、これらの複数の画像が、以下の画像タイプ、すなわち、明視野画像、暗視野画像及び蛍光画像のうちの少なくとも２つを含んでいる。生物細胞（又は判別可能な形態学的フィーチャを有する物体）の集団の複数の画像が集められる。画像が集められた後、それらの画像を処理して、画像の部分集団（ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ）を識別することができる。この部分集団中の画像を処理して、この部分集団中の細胞接合体間の接触点（すなわち、シナプス）を識別する。この部分集団中の画像をさらに処理して、識別されたシナプスにおける少なくとも１つの特性を測定する。
【００１６】
以下の開示及び特許請求の範囲に関しては、物体の集団という用語が、複数の物体を含む一群の物体を示す。したがって、物体の集団は２つ以上の物体を含まなければならない。
【００１７】
本発明に必要な画像データを集めるのに使用される好ましい画像化システムは、主要な以下の特性を含んでいる。  
１．高速度測定
２．非常に大きな試料又は連続試料を処理する能力
３．高いスペクトル分解能及びスペクトル幅
４．良好な空間分解能
５．高い感度
６．低い測定変動
【００１８】
具体的には、最近開発されたＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）（Ａｍｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（米ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ））と呼ばれる画像化フローサイトメータ（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）技術は、上述したそれぞれの原理特性の達成において長足の進歩を遂げた。ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）機器は、図１乃至図１９に関して先に詳細に説明した流れ画像化システムの商用実施形態である。フローサイトメトリ分野におけるこれらの重大な進歩は、同一譲受人に譲渡された特許文献１から５に記載されている。ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）プラットホームは、本発明に従って処理される画像データを得るために使用される特に好ましい画像化機器であるが、本発明は、この特定の機器の使用のみに限定されない。
【００１９】
上述したとおり、生物細胞の集団から画像データを集めるだけでなく、本発明の一実施態様は、集められた画像データを処理して、画像化された集団に含まれる接合した細胞間のシナプスにおける少なくとも１つの特性を測定することを含んでいる。好ましい画像解析ソフトウェアパッケージはＩＤＥＡＳ（登録商標）（Ａｍｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社（米ワシントン州Ｓｅａｔｔｌｅ））である。ＩＤＥＡＳ（登録商標）パッケージは、細胞ごとに、複数の形態学的測定及び蛍光強度測定を含む約２００個のフィーチャを評価する。これらのフィーチャは、細胞集団を定義し、特徴づける目的に使用することができる。ＩＤＥＡＳ（登録商標）パッケージは、ユーザが、生物学的に関連した細胞部分集団を定義し、ゲーティング、バックゲーティングなどの標準サイトメトリ解析を使用して部分集団を解析することを可能にする。しかし、本発明では、他の画像解析方法又は他の画像解析ソフトウェアパッケージを実現することもでき、この好ましい画像解析ソフトウェアパッケージは例示的なものであり、本発明を限定するものではない。
【００２０】
＜好ましい画像化システムの概要＞
図１は、流れの中の物体の複数の画像を同時に集めるために使用することができる例示的な流れ画像化システムの概略図である。つまり、流体の流れ５０４とともに運ばれた（生物細胞などの）物体５０２の画像を捕捉するときにＴＤＩ（ｔｉｍｅ−ｄｅｌａｙ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ；時間遅れ積分）を使用する、（ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）プラットホームの機能を説明する）好ましい流れ画像化システム５１０の概略図である。
【００２１】
画像化システム５１０は、ＴＤＩ画像化検出器（ＴＤＩカメラ）５０８を、画像化システム５１０内を流れる流体の流れと同期させるために使用される速度検出サブシステムを含んでいる。重要なことは、画像化システム５１０が、物体の複数の画像を同時に集めることができることである。画像化システム５１０の特に好ましい一実施態様は、マルチスペクトル画像化用に構成され、以下の６つのスペクトルチャネルで動作することができる。つまり、ＤＡＰＩ蛍光（４００〜４６０ｎｍ）、暗視野（４６０〜５００ｎｍ）、ＦＩＴＣ蛍光（５００〜５６０ｎｍ）、ＰＥ蛍光（５６０〜５９５ｎｍ）、明視野（５９５〜６５０ｎｍ）、及びディープレッド（Ｄｅｅｐ  Ｒｅｄ）（６５０〜７００ｎｍ）である。ＴＤＩ画像化検出器５０８は、１画素あたり１０ビットのディジタル分解能を提供することができる。本発明で使用される画像化システム５１０の開口数は、一般に０．７５であり、画素サイズは約０．５ミクロンである。しかし、この流れ画像化システム５１０は、６つのスペクトルチャネルにも、また、上述した開口サイズ又は画素サイズ及び分解能にも限定されない。
【００２２】
光源５０６を使用して、移動している物体５０２が照明される。この光源５０６は、レーザ、発光ダイオード、白熱電球又はガス放電アークランプとすることができ、この画像化システム５１０は、広帯域光あるいは１つ又は複数の所望の波長又は波長帯の光を、物体の速度及び１つ又は複数の他の特性を検出するのに必要な強度で物体に送達するために使用される、レンズ、開口、フィルタなどの光学調節要素を含むことができる。物体からの光は、ビームスプリッタ（ｂｅａｍ  ｓｐｌｉｔｔｅｒ）５０３によって２つの光路に分割される。一方の光路に沿って進む光は、速度検出サブシステムに誘導され、もう一方の光路に沿って進む光はＴＤＩ画像化検出器５０８に誘導される。これらの光路に沿って光を所望の方向に誘導し、その光を集束させるために、複数のレンズ５０７が使用される。示されてはいないが、所望の光源以外の光源からの光が実質的に排除されるように、例えば、物体の内部／表面の蛍光又は燐光分子によって発せられる波長に対応する狭い波長帯の光、あるいは、光源５０６によって提供される波長（１つ又は複数）を有する光だけを、速度検出サブシステム及び／又はＴＤＩ画像化検出器５０８に送達する、フィルタ又はフィルタセットを含めることができる。
【００２３】
速度検出サブシステムは、物体５０２ａからの光を周波数の関数として変調する光学格子５０５ａと、（光電子増倍管、固体光検出器などの）光感応検出器（光検出器）５０５ｂと、信号調節ユニット５０５ｃと、速度計算ユニット５０５ｄと、ＴＤＩ画像化検出器５０８が、画像化システム５１０内を流れる流体の流れ５０４と同期していることを保証するタイミング制御ユニット５０５ｅとを含んでいる。光学格子５０５ａは、物体から受け取った光を変調し、受け取った光を発した物体の速度に対応する変調周波数を有する変調された光を生み出す、交互に並んだ複数の透明なバー（ｂａｒ）と不透明なバーとを含むことが好ましい。好ましくは、バーの幅と照明されている物体のサイズとがほぼ同じになるように、光学格子５０５ａの光学倍率及びルーリングピッチ（ｒｕｌｉｎｇ  ｐｉｔｃｈ）が選択される。したがって、この光学格子５０５ａのルーリングによって、細胞又は他の物体から集められた光は、物体が問合せ領域、すなわち、視野を通過するときに、遮断と透過を交互に繰り返す。この変調された光は光検出器５０５ｂに向かって誘導され、この光検出器５０５ｂは、物体の速度を決定するためにプロセッサが解析することができる信号を生成する。したがって、速度測定サブシステムは、ＴＤＩ画像化検出器５０８にタイミング信号を提供するために使用される。
【００２４】
信号調節ユニット５０５ｃは、プログラム可能なコンピューティングデバイスを含むことが好ましいが、この目的に、ＡＳＩＣチップ又はディジタルオシロスコープを使用することもできる。光検出器５０５ｂの信号の周波数が測定され、その周波数の関数として物体の速度が計算される。ＴＤＩ画像化検出器５０８のクロックレート（ｃｌｏｃｋ  ｒａｔｅ）を調整するため、ＴＤＩ画像化検出器タイミング制御ユニット５０５ｅに速度に依存した信号が定期的に送達される。ＴＤＩ画像化検出器５０８のクロックレートは、ＴＤＩ画像化検出器５０８を横切る物体の画像の速度を小さな許容限度内に収めるように調整される。この許容限度は、ＴＤＩ画像化検出器５０８の出力信号の縦の画像スミアリング（ｓｍｅａｒｉｎｇ）が許容範囲内にあることを保証するように選択される。速度の更新は、流れ（物体）の速度が変化するときにクロック周波数を許容範囲内に保つ十分な頻度で実施されなければならない。
【００２５】
物体５０２ａからの光の一部を光検出器５０５ｂに迂回させ、物体５０２ａからの光の一部をＴＤＩ画像化検出器５０８に迂回させるためにビームスプリッタ５０３が使用された。ＴＤＩ画像化検出器５０８に向かって誘導される光路上には、物体５０２ａからの光を複数の波長に分離する、スタックされた複数のダイクロイックフィルタ（ｄｉｃｈｒｏｉｃ  ｆｉｌｔｅｒ）５０９がある。ＴＤＩ画像化検出器５０８上に物体５０２ａの像を形成するために、レンズ５０７の１つが使用される。
【００２６】
画像化システム５１０で使用されるものなどのＴＤＩ画像化検出器５０８の動作理論は次のとおりである。物体が流管５１１（図１）の中を移動し、ＴＤＩ画像化検出器５０８によって画像化される容積を通過するときに、物体からの光が、ＴＤＩ画像化検出器５０８の面を横切って移動する物体の画像を形成する。ＴＤＩ画像化検出器５０８は、電荷結合デバイス（ＣＣＤ）のアレイを含むことが好ましく、このＣＣＤのアレイは、所与の１本の電荷のライン（ｌｉｎｅ）が画像中の１本のラインにロックされたままになり、又は画像中の１本のラインと同期したままになるように、それぞれのクロックサイクルで電荷を列ごとに転送することができるように特別に設計される。この電荷の列は、その列がアレイの一番下に達したときにアレイからメモリへ記録される。ＴＤＩ画像化検出器５０８によって生成された、物体の画像に対応する信号のそれぞれのラインの強度は、画像及びその結果生じる対応する信号がＣＣＤアレイを横切って伝搬するときに、時間に沿って積分される。この技術は、物体の低レベルの蛍光放射による画像に応答するときの大きな値のフィーチャであるＴＤＩ画像化検出器５０８の信号対雑音比を、非積分型の検出器に比べて大幅に向上させる。ＴＤＩ画像化検出器５０８の適正な動作は、ＣＣＤアレイを横切って電荷信号が、物体の画像がＣＣＤアレイを横切って移動するときのクロックレートと同期してクロックされることを要求する。物体の速度を決定することによって、この同期を容易にする正確なクロック信号を提供することができ、本発明は、物体の速度、したがって、ＴＤＩ画像化検出器５０８のＣＣＤアレイを横切って画像が移動するときの画像の速度の正確な推定値を使用する。このタイプの流れ画像化システムが、同一譲受人に譲渡された特許文献１に開示されている。これにより、その開示、明細及び図面はその全体が、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。
【００２７】
図２は、図１の流れ画像化システムによって生成された画像の写真を示す図である。「ＢＦ」と標識された縦の列５２０は、流体の流れ５０４とともに運ばれた球形の物体５０２によって光源５０６からの光が吸収されたことによって生成された画像を含んでいる。標識「ＢＦ」は「明視野（ｂｒｉｇｈｔ  ｆｉｅｌｄ）」を指し、この用語は、光がある領域を通過し、その領域にある物体が光を吸収することによって画像中に暗い領域が生み出される、画像にコントラストを生み出す方法に由来する。したがって、背景は明るく、物体は暗い。したがって、縦列５２０は「明視野チャネル」である。明視野画像が含まれることは例に過ぎず、本発明の技術的範囲を限定するものではないことを理解されたい。好ましくは、本発明は、明視野画像と蛍光画像の組合せ、又は暗視野像と蛍光画像の組合せを利用する。
【００２８】
図２に示された残りの３つ縦列５２２、５２４及び５２６は、それぞれ「λ１」、「λ２」及び「λ３」と標識されている。これらの縦列は、流体の流れとともに運ばれた物体によって発せられた光を使用して生成された画像を含んでいる。このような光は、（反射光を使用して生成される画像とは対照的に）蛍光過程によって発せられることが好ましい。蛍光は、入射放射の吸収によって刺激された物質による発光（又は他の電磁放射の発射）である。蛍光は、一般に、刺激放射が存続する限り持続する。それらが蛍光を発するときには、生み出された光のスペクトルに基づいて、多くの物質（特に蛍光染料）を識別することができる。したがって、縦列５２２、５２４及び５２６は「蛍光チャネル」と呼ばれる。
【００２９】
例示的な追加の流れ画像化システム５１０が、同一譲受人に譲渡された特許文献２及び６に開示されており、これにより、それらの開示、明細及び図面はその全体が、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。先に詳細に説明し、参照によって本明細書に組み込まれた画像化システムは、生物細胞集団の画像を得るために使用される従来の画像化システムに優る相当な利点を有する。これらの利点は、光学分散系と、導かれた細胞及び他の物体の像に応答して出力信号を生み出すＴＤＩ画像化検出器との組合せからなる複数の画像化システムを別々に使用することから生じる。重要なことは、単一の物体の複数の画像を一度に集めることができることである。解析に共通のＴＤＩ画像化検出器を使用して、物体特徴を、吸収、分散、反射又はプローブの発光によって識別するために、それぞれの物体の画像をスペクトル分解することができる。他の画像化システムは複数の検出器を含み、それぞれが単一のスペクトルチャネルを担当する。
【００３０】
これらの画像化システムを使用して、細胞及び他の物体の形態学的特性、測光特性及びスペクトル特性を、光散乱、反射、吸収、蛍光、燐光、ルミネセンスなどを含む光学信号を測定することによって決定することができる。形態学的パラメータは、核の面積、周囲の長さ、テクスチャ（ｔｅｘｔｕｒｅ）又は空間周波数内容、重心位置、形状（すなわち円形、楕円形、バーベル形など）、体積、及びこれらの任意のパラメータの比を含んでいる。本発明を用いて、細胞の細胞質の同様のパラメータを決定することもできる。本発明を用いた測光は、核の光学濃度、細胞質の光学濃度、背景の光学濃度、及びこれらの任意の値の比の決定を可能にする。本発明を用いて画像化している物体を、蛍光又は燐光を発するように刺激することができ、又は、この物体を、刺激なしで光を生み出す発光性とすることができる。それぞれのケースで、物体からの光を本発明のＴＤＩ画像化検出器５０８上で画像化して、発せられた光の存在及び振幅、細胞又は他の物体中の光信号（１つ又は複数）が発せられた別々の位置の数、信号源の相対的な配置、ならびに物体のそれぞれの位置において発せられた光の色（波長又は波長帯）を決定する。
【００３１】
本発明を含む画像化システムの最初の応用は、おそらく、画像化システム５１０の中を流れる流体とともに運ばれた細胞の先に挙げた１つ又は複数のパラメータを決定する細胞アナライザ（ａｎａｌｙｚｅｒ）として使用される。しかし、本発明を使用して、識別可能な測光及び形態計測フィーチャを有する他の移動物体を画像化することもできる。
【００３２】
＜マルチスペクトル画像化システムを使用した細胞構造／シナプスの解析方法＞
上述したとおり、本発明の各実施態様は、生物細胞の集団のマルチスペクトル画像を集めることと、集められた画像を解析して、集められたマルチスペクトル画像から識別された接合細胞のシナプスなどの細胞フィーチャにおいて示された少なくとも１つの特性を測定することの両方を含んでいる。したがって、本発明の一実施態様は、流れの中の物体（例えば細胞）のマルチモード画像から得られた測光フィーチャと形態計測フィーチャの両方を使用して、非付着性細胞タイプと付着性細胞タイプの両方に含む異質細胞集団中の細胞フィーチャを識別することに関する。以下では、細胞が凝集しやすい懸濁液又は流れの中の細胞を解析する方法であって、形態計測及び測光フィーチャを提供する包括的なマルチスペクトル画像化と組み合わせて、例えば、標準顕微鏡法及びフローサイトメトリでは実行不可能な細胞分子の再分布の定量化を可能にすることができる方法をより詳細に説明する。
【００３３】
上述したとおり、明視野、暗視野及び４チャネルの蛍光に対応する画像データを集めるために、好ましい流れ画像化システム（例えばＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）プラットホーム）を使用して、流れの中の細胞のマルチスペクトル画像を同時に得ることができる。ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）プラットホームは、先に詳細に説明した画像化システムに基づく商用実施形態である。一般に、細胞は、コアストリーム（ｃｏｒｅ  ｓｔｒｅａｍ）を形成するように流体力学的に一点に集められ、暗視野画像化と蛍光画像化の両方のために直角に照明される。同時に細胞は、明視野画像化のために、スペクトルが制限された源（例えばフィルタを通した白色光又は発光ダイオード）によって透過照明される。細胞からの光は、画像化対物レンズによって集められ、電荷結合検出器（ＣＣＤ）上に投影される。この光学系は開口数０．７５であり、物体空間のＣＣＤ画素サイズは、毎秒約１００細胞のイベントレート（ｅｖｅｎｔ  ｒａｔｅ）での高分解能画像化を可能にする０．５μ2である。各画素は、強度分解能１０ビットでディジタル化され、１画素あたり３０の最小ダイナミックレンジ（ｄｙｎａｍｉｃ  ｒａｎｇｅ）を提供する。実際には、複数の画素にまたがる信号の広がりが、画像あたり一般に４０を超える有効ダイナミックレンジを提供する。さらに、それぞれのマルチスペクトル画像に対してＣＣＤの感度を独立に制御することができ、その結果、物体に関連した全ての画像にわたって合計で約６０のダイナミックレンジが提供される。ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）プラットホームは、本発明に従って画像データを得る特に好ましい流れ画像化システムだが、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）プラットホームは、例示的な画像化システムを表すことを意図したものであり、本発明を限定するものではない。後により詳細に説明する画像解析を達成することを可能にするのに十分な、生物細胞の集団の画像を集めることができる任意の画像化機器は、本発明に基づいて実現することができる。
【００３４】
好ましい画像化システム、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）プラットホームを再び参照すると、光は、ＣＣＤ上へ投影される前に、異なるスペクトル帯を検出器上の異なる横方向位置に誘導するスペクトル分解光学系を通過する（このようなスペクトル分解は、画像化システムのさまざまな好ましい実施形態の説明に関して以前に詳細に説明している）。この技術を用いて、画像は、それぞれが異なるスペクトル（すなわち、色）成分に対応し、他のサブ画像から空間的に分離された複数のサブ画像（ｓｕｂ−ｉｍａｇｅ）からなる一組のサブ画像に光学的に分解される（好ましくは６つのサブ画像。すなわち、明視野、暗視野及び４つの異なる蛍光画像）。この処理は、細胞の重なり合った領域から発せられた可能性がある信号を検出器上で物理的に分離することによって、細胞内の信号の識別及び定量化を可能にする。スペクトル分解はさらにマルチモード画像化、すなわち、明視野、暗視野及び複数の蛍光色の同時検出を可能にする。このスペクトル分解処理は、従来の複合画像のディジタル画像処理によってではなく、画像形成処理中に実施される。
【００３５】
ＣＣＤは、検出器と画像化中の物体との間の相対移動が高速であっても感度及び画像品質を維持する専用検出器読出しモードである時間遅れ積分（ｔｉｍｅ−ｄｅｌａｙ−ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ：ＴＤＩ）と呼ばれる技術を使用して操作することができる。どのＣＣＤでもそうであるように、画像光子は画素アレイ内で光電荷に変換される。しかし、ＴＤＩ操作では、これらの光電荷が、流れの軸と平行に、検出器を下って、画素から画素へ連続的にシフトされる。この光電荷シフトの速度が、流れている細胞の画像の速度と同期している場合、その効果は、カメラを物理的にパンする（ｐａｎｎｉｎｇ）のと同様であり、従来のフローサイトメトリよりも桁数が大きい信号積分時間にもかかわらず、画像のストリーキング（ｓｔｒｅａｋｉｎｇ）が回避される。例えば、機器は、毎秒約３０メガ画素の連続データ転送速度で動作し、それぞれの物体からの信号を１０ミリ秒の間積分することができ、このことは、比較的に速い速度で得られた細胞画像内のかすかな蛍光プローブさえ検出することを可能にする。脈動しない高度に層状の流れを達成するポンプ及び流体システム設計を慎重におこなうことによって、画像化処理の時間尺度に関する細胞の回転又は横方向への平行移動が排除される（例えば、特許文献７参照）。
【００３６】
物体の画像の存在を検出し、データ記憶の基準として使用することができるいくつかの基本的な形態計測及び測光フィーチャを計算するために、リアルタイムアルゴリズムが、ＣＣＤから読み取られた全ての画素を解析する。１０，０００〜２０，０００個の細胞を含むデータファイルのサイズは一般に約１００ＭＢであり、したがって、このデータファイルは、標準パーソナルコンピュータを使用して記憶し、解析することができる。このＴＤＩ読出し処理は「不動作時間」なしで連続的に動作し、このことは全ての細胞を画像化することができることを意味し、接触している又は接触していない２つ以上の細胞を一度に同時に画像化することは、データ取得に障害を提示しない。
【００３７】
このような画像化システムを使用して、細胞及び他の物体の形態学的特性、測光特性及びスペクトル特性を、光散乱、反射、吸収、蛍光、燐光、ルミネセンスなどを含む光学信号を測定することによって決定することができる。本明細書で使用されるとき、形態学的パラメータは基本パラメータ（例えば、核の形状）とすることができ、又は複合パラメータ（例えば、細胞サイズと核サイズの差として細胞質サイズを識別するなど）とすることができる。例えば、形態学的パラメータは、核の面積、周囲の長さ、テクスチャ又は空間周波数内容、重心位置、形状（すなわち、円形、楕円形、バーベル形など）、体積、及びこれらの任意のパラメータの比を含むことができる。形態学的パラメータは、さらに、細胞の細胞質のサイズ、テクスチャ又は空間周波数内容、体積などを含むことができる。本明細書で使用されるとき、上述した画像化システムを用いた測光は、核の光学濃度、細胞質の光学濃度、背景の光学濃度、及びこれらの任意の値の比の決定を可能にすることができる。画像化中の物体を、蛍光又は燐光を発するように刺激することができ、又は、この物体を、刺激なしで光を生み出す発光性とすることができる。それぞれのケースで、物体からの光を画像化システムのＴＤＩ画像化検出器上で画像化して、発せられた光の存在及び振幅、細胞又は他の物体中の光信号（１つ又は複数）が発せられた別々の位置の数、信号源の相対的な配置、ならびに物体のそれぞれの位置において発せられた光の色（波長又は波長帯）を決定することができる。
【００３８】
本発明の開示は、流れ中の物体のマルチモード画像から得られた測光フィーチャと形態計測フィーチャの両方を使用する方法を提供する。このような方法は、画像化システムの中を流れる流体とともに運ばれた異質細胞集団中の１つ又は複数の細胞状態又は細胞タイプ、及び細胞フィーチャを決定する細胞アナライザとして使用することができる。これらの例示的な方法は、識別可能な測光及び形態計測フィーチャを有する他の移動物体を画像化し、区別するために使用することもできる。本明細書で使用されるとき、ゲーティングは、測光又は形態計測画像化に関係したデータのサブセットを示す。ゲート（ｇａｔｅ）は、例えば、後に解析される粒子の特性を定義するために使用することができるデータのサブセットの数値又はグラフの境界であり得る。ここではゲートを、例えば、「焦点が合っている」細胞、又は尾部を有する精子細胞、又は尾部のない精子細胞、又は精子細胞以外の細胞、又は精子細胞の凝集体、又は細胞破片を含むプロットの境界として定義した。さらに、バックゲーティングは、前記サブセットデータのサブセットとすることができる。例えば、前方散乱対側方散乱プロットを、追加のマーカからのヒストグラム（ｈｉｓｔｏｇｒａｍ）と組み合わせて使用して、細胞の最初のサブセット内の細胞のサブセットをバックゲーティングすることができる。
【００３９】
本明細書に記載された画像化システムを使用する際には、物体が発光性である場合（すなわち、物体が光を生み出す場合）には、物体（細胞）の画像を生成するために別個の光源が必要ないことを明らかにしておかなければならない。しかし、本明細書に記載された画像化システムの応用の多くは、１つ又は複数の光源を使用して、画像化中の物体に入射する光を提供することを要求する。光源の位置は、入射光と物体との間の相互作用、及びＴＤＩ画像化検出器上の画像から得ることができる情報の種類にかなりの影響を及ぼす。
【００４０】
物体に入射した光を用いて物体を画像化することに加えて、光源を使用して、物体からの発光を刺激することもできる。例えば、蛍光色素（例えば、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ、Ｃｙ３、Ｃｙ５又はＣｙ５．５など）に接合したプローブと接触している細胞は、光によって励起されると蛍光を発し、励起された蛍光色素プローブから、ＴＤＩ画像化検出器上に画像化することができる対応する特性発光スペクトルを生み出す。あるいは、光源を使用して物体上の蛍光色素プローブの励起を引き起こし、それによってＴＤＩ画像化検出器が、プリズムによって提供された物体からの光のスペクトル分散の結果としてＴＤＩ画像化検出器上のさまざまな位置にプローブによって生み出された蛍光スポットを画像化することを可能にすることもできる。ＴＤＩ画像化検出器の表面でのこれらの蛍光スポットの配置は、それらの発光スペクトル及び物体中のそれらの位置によって決まる。
【００４１】
それぞれの光源は、所望の画像化システムの応用に応じて、コヒーレント、非コヒーレント、広帯域又は狭帯域光とすることができる光を生み出すことができる。したがって、狭帯域光源が必要でない応用では、タングステンフィラメント光源を使用することができる。プローブからの蛍光の発射を刺激するなどの応用では、狭帯域レーザ光が好ましい。これは、狭帯域レーザ光がさらに、物体によって散乱された光から、スペクトル分解されたひずみのない物体の画像を生成することを可能にするためである。任意のスポットの発光スペクトルがレーザ光の波長とは異なる波長を有する限り、この散乱光画像は、ＴＤＩ画像化検出器上に生み出された蛍光スポットから別個に解像される。光源は、連続波（ＣＷ）又はパルス型光源とすることができ、パルスレーザであることが好ましい。パルス型照明源が使用される場合、ＴＤＩ検出に関連した積分期間を延長することによって、複数のパルスからの信号の積分を可能にすることができる。さらに、光は、ＴＤＩ画像化検出器と同期してパルスされる必要はない。
【００４２】
本発明の実施形態では、画像化中の物体と画像化システムとの間に相対的な移動が存在する。ほとんどの場合、画像化システムを移動させるよりも物体を移動させたほうが便利である。場合によっては、物体を静止したままにし、画像化システムを物体に対して移動させることも企図される。他の代替として、画像化システムと物体の両方を移動させることもでき、この移動は、異なる方向及び／又は異なる速度とすることができる。
【００４３】
＜例示的な高次方法ステップ＞
図３は、生物細胞などの物体を解析するために使用することができる本発明の一実施態様に基づく例示的なステップを概略的にフローチャート示した図である。このフローチャート４００のブロック４０２では、先に詳述した例示的な画像化システムなどの画像化システム５１０を使用して、生物細胞の集団から画像データを集める。ブロック４０４では、ユーザが、後の解析のために画像の部分集団を識別する。後述する実験的研究では、後の解析のために、接合細胞（すなわち１つに接合された細胞）の部分集団に対応する画像データを選択した。ブロック４０６では、後の解析のために、部分集団中の示された特定の形態学的フィーチャを選択する。前記実験的研究では、接合細胞のシナプス（すなわち、接合細胞の細胞が１つに接合した部分）を、後の解析のための形態学的フィーチャとして選択した。ブロック４０８では、選択された形態学的フィーチャに対応する選択された画像部分集団の画像データを解析して、形態学的フィーチャの少なくとも１つの特性を識別する。
【００４４】
細胞（又は物体）の集団の後の画像解析を容易にするため、画像化機器を使用してその集団の画像データを集める前に、１つ又は複数の異なるタイプの物体に標識を付けることが望ましいことがある。後に詳細に説明する実験的研究では、全体集団が、それぞれ別の標識が付けられた２つの異なるタイプの生物細胞を含んでいる。しかし、画像化する物体のそれぞれに標識を付けるのは一例であり、本発明を限定しない。後により詳細に説明するように、２つの異なる細胞タイプのうちの一方にだけ標識が付けられた接合細胞によって示されたシナプスの少なくとも１つの特性を測定するため、本発明の技術を使用して画像データを解析することができる。本発明は、一般に、Ｎ−１個の固有のプローブを使用して実現することができ、また、異なる細胞タイプの数と同じ数のプローブを使用して、あるいは細胞タイプの数よりも多くのプローブを使用して実現することもできる。Ｎは、研究中の接合体内の区別される異なる細胞タイプの数である。
【００４５】
厳密に必要というわけではないが、本発明の稼働中の実施形態では、マルチチャネル画像化のクロストークを低減させ、空間分解能を高めるために追加の処理を実施した。その中で実施されたクロストークの低減処理は、同一譲受人に譲渡された特許文献８に記載されており、これにより、その明細、開示、及び図面はその全体が、参照によって本明細書に明確に組み込まれる。その他のタイプのクロストーク低減技法を実施することもできる。
【００４６】
＜例示的な細胞接合体の解析＞
図４は、図１の流れ画像化システムを使用して集められ、図３に示した方法ステップに従って解析された例示的な画像データから形成された複合画像を示す図で、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）プラットホームを使用して集められた例示的な画像データから形成された複合画像である。
【００４７】
上述したとおり、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）プラットホームは、図１に関して先に詳細に説明した流れ画像化機器に基づく商用実施形態である。それぞれの縦の列４１０〜４１８は、同時に集められた異なるチャネル（すなわち、異なるスペクトル画像）に対応する。したがって、囲み４２６の中のそれぞれの画像は、２つの生物細胞からなる同じ接合体を表す。同様に、他の横列はそれぞれ、同じ１つ又は複数の物体を表す。これらの画像データは、１０，０００を超える抗原特異性Ｔ細胞と抗原パルス抗原提示細胞とからなる集団に基づいて集められたものである。Ｔ細胞は、ＨＬＡ（ヒト白血球抗原）−ＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）で染色され、その結果、Ｔ細胞は緑色に染められた。抗原提示細胞は、ＣＤ８６−ＰＥ（フィコエリトリン）で染色され、その結果、抗原提示細胞は赤く染められた。緑色に染められたＴ細胞と赤く染められた抗原提示細胞の両方を、３７℃で３０分間一緒にインキューベートし、その後、これらの細胞を、これらの細胞が流れ画像化機器を通過するときにそれぞれの細胞の異なる複数のスペクトル画像が同時に集められるように、ＩｍａｇｅＳｔｒｅａｍ（登録商標）流れ画像化機器に導入した。次いで、染色されたＴ細胞と染色された抗原提示細胞からなる集団の画像データを、ＩＤＥＡＳ（登録商標）ソフトウェアを使用して評価した。以前に指摘したとおり、この特定のソフトウェアパッケージの使用は一例に過ぎず、本発明を限定することを意図したものではない。他の画像解析ソフトウェアパッケージが使用可能である。
【００４８】
染色されたＴ細胞と染色された抗原提示細胞とからなる集団全体から画像データが集められた後（画像データの収集は図３のブロック４０２に対応する）、その結果得られた画像を解析して、細胞接合体（すなわち、緑色に染められたＴ細胞に対応する細胞とそれに接合した赤く染められた抗原提示細胞の組合せ）の部分集団を識別した。なお、部分集団の定義は、図３のブロック４０４に対応する。細胞接合体は、ＦＩＴＣ染料とフィコエリトリン（ＰＥ）染料の両方に関して陽性染色する物体として識別した。この実験的研究の目的上、部分集団は、接合体１つにつき限定された数の細胞（すなわち、２〜３個）を有する接合体だけを含んでいなければならないとしたが、本明細書に記載されている技術は、これよりも多くの細胞を含む接合体にも適用可能である。次いで、細胞接合体の部分集団をさらに、それぞれ同じ焦点面にあると考えられる限られた数の細胞を含む細胞接合体だけを含むものと限定した。部分集団を定義する過程については後に詳細に説明する。この実験的研究に関して、使用された画像解析ソフトウェアは、それぞれ後に説明する２つの異なる機構を利用して、部分集団を定義することを可能にした。
【００４９】
部分集団の定義についてさらに説明する前に、図４をより詳細に説明しておくことは有益であろう。縦列４１０は、細胞接合体の明視野画像を含んでいる。縦列４１０のそれぞれの細胞接合体は明らかに、互いに接合された２つの細胞を含んでいる。縦列４１２はカラー画像であり、それぞれの細胞接合体が、緑色に染色された１つのＴ細胞４２０と、赤く染色された１つの抗原提示細胞４２２とを含むことを明らかに示している。後に詳述するとおり、縦列４１４のそれぞれの画像は、細胞接合体のＴ細胞部分を識別するためのマスクの使用に基づき、縦列４１６のそれぞれの画像は、細胞接合体の抗原提示細胞部分を識別するためのマスクの使用に基づく。縦列４１８は、それぞれの細胞接合体のシナプス部分４２４ａ〜４２４ｇがマスクによって強調表示された細胞接合体の明視野画像を含んでいる。次いで、この部分集団のマスクされたシナプスに含まれる画像データを解析して、少なくとも１つの特性を識別することができる。Ｔ細胞及び抗原提示細胞を含むこの例示的な研究において測定されている特性については後に詳細に説明する。
【００５０】
この例示的な研究で実行された解析は、最初に、少なくとも１つのＴ細胞及び１つの抗原提示細胞を含む細胞集合を識別し、単一のＴ細胞及び単一の抗原提示細胞だけからなる集合体に絞り込み（縦列４１２）、これらの２つの細胞間の接触領域（すなわち、シナプス）を構成し（縦列４１８）、それぞれの細胞のシナプスの外側の領域を構成する（縦列４１４及び４１６）ことに基づく。細胞接合体ごとにシナプス領域及びシナプス外領域を構成した後、細胞表面マーカＣＤ８６に特異的なプローブである赤色信号の平均強度を、それぞれの抗原提示細胞のシナプス及びシナプス外領域について別々に定量化することができる。シナプス内の平均ＣＤ８６強度とシナプス外の平均ＣＤ８６強度の比をとった場合、シナプスへのＣＤ８６の移動又はそのシナプスからのＣＤ８６の排除はそれぞれ、その比が１から増大又は低下することによって明らかにされる。
【００５１】
図５は、図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図で、例示的な画像化処理ソフトウェアからのスクリーンショット（ｓｃｒｅｅｎ  ｓｈｏｔ）を示す図である。図５における左の部分の点プロット４２６は、データファイル内の全ての物体の緑色強度（ｘ軸）対赤色強度（ｙ軸）プロットである。孤立Ｔ細胞は、ＨＬＡについては明るいが、ＣＤ８６ついては暗く、そのためプロットの右下の象限に配置される。孤立抗原提示細胞は、ＨＬＡについては暗いが、ＣＤ８６については明るく、そのためのプロットの左上の象限に配置される。少なくとも１つのＴ細胞及び１つの抗原提示細胞を含む接合体はプロットの右上の象限に現れる。これらの２重陽性（ｄｏｕｂｌｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）細胞は、プロットの右上のドット集合体の周囲に長方形の領域４２８を描くことによって、後続の解析のために「ゲーティング」される。このゲーティング技術は、部分集団を選択する（図３のブロック４０４の方法ステップの）１つの例である。なお、図５のスクリーンショットは、明視野画像４１０ａ、ＣＤ８６赤色染色に対応するスペクトル画像４３４、ＦＩＴＣ緑色染色に対応するスペクトル画像４３６、及び暗視野画像４３８を含んでいる。
【００５２】
領域４２８においてゲーティングされた２重陽性集団は、１つのＴ細胞と１つの抗原提示細胞との接合体だけでなく、おそらくは３つ以上の細胞の集合体も含み、このような３つ以上の細胞の集合体が含まれることは、（この例示的な研究が、１つの抗原提示細胞及び１つのＴ細胞を含む単純な接合体に焦点を合わせることを意図したものであるため）望ましくない。図５の第２の散布プロット４３０は、明視野画像を使用した３つ以上の細胞からなる接合体の排除を示す。明視野面積（ｘ軸）対明視野アスペクト比（ｙ軸）を使用して、データファイル内の全ての細胞がプロットされている。他方の点プロット中に構成された２重陽性ゲート内に含まれるそれぞれの物体の記号及び色を変更することによって、この２重陽性集団はこのプロット上に「バックゲーティング」される。２重陽性集団が、主として単一の細胞からなる単陽性（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ）集団よりも大きい傾向があり、単陽性集団よりも幅広いアスペクト比の範囲にまたがることは明白である。２つの細胞だけからなる接合体を主として含む２重陽性物体のサブセットが、長方形のゲート４３２を使用して選択された。このゲートの境界は、図の左上に示された２重陽性画像のギャラリ（ｇａｌｌｅｒｙ）から２細胞接合体の集団を定義し、この集団をこの点プロット上にバックゲーティングして、２細胞接合体の一般的な面積値及びアスペクト比値の範囲を決定することによって決定された。
【００５３】
あるいは、オペレータは、集められた画像データを見て、１つのＴ細胞及び１つの抗原提示細胞を含む１つ又は複数の細胞接合体を視覚的に識別し、その細胞接合体を選択し、次いで、オペレータが識別した特定の細胞接合体と強く相関する画像データを有する他の全ての細胞接合体を（前述のゲーティング及びバックゲーティング技法を使用して）識別するよう画像解析ソフトウェアに指示することができる。
【００５４】
シナプス領域（重なり又は接触領域）内の分子マーカの強度をシナプスの外側領域に対して定量化するためには、最初にシナプスを構成する必要がある。抗原提示細胞とＴ細胞との間の重なり領域は、複数の方法で構成することができる。重なり領域を構成する１つの方法は、重なり領域が大幅に増大した画素値を示すように、スペクトル画像内のそれぞれの位置の画素内の信号の変換（例えば、信号の積）である計算された画像を生成する方法である。次いで、両方のスペクトル画像内の未変換画素よりも高いレベルにセットされた単純なしきい値関数が、これらの２つのスペクトル画像間で共通する計算された画像の画素を優先して選択する。次いで、これらの共通する画素アドレスを使用して、元の信号レベルを参照して、シナプスの内側と外側の両方を定量化することができる。
【００５５】
他の方法は、それぞれの細胞画像の範囲の輪郭を描く２値マスクを、細胞１つにつき１つ使用する方法である。マスクの範囲は、背景レベルよりも強い画像信号を検出する能力によって限定される。例えば、図４の点プロット４２６内に示された画像などの同じ細胞集合体の２つのスペクトル画像を考える。それぞれの細胞が異なる色（この場合には赤／緑色）で標識されている場合、赤及び緑色のスペクトルチャネル（縦列４１４及び４１６）はそれぞれ１つの細胞のみの画像を含んでいる。これを拡張すると、それぞれの画像マスクは１つの細胞だけに対応する。マスクは２値マスクであるため、それぞれのマスクを含む画素の（ｘ，ｙ）座標を使用したブールＡＮＤ演算は、２つの細胞画像間の共通する画素だけを含む新しいマスク（すなわちマスク４２４ａ）を与える。この方法は、それぞれの細胞タイプが固有のプローブを担持し、ブールＡＮＤ演算がそれぞれの画像に対して対ごとに実行され、ＯＲ関数を使用して合計される限り、３細胞タイプ以上の接合体にも拡張可能である。
【００５６】
他の方法は、接合体のそれぞれの細胞に対する固有のプローブの使用を必要としない。その代わりに、明視野（透過光）などのプローブフリー（ｐｒｏｂｅ−ｆｒｅｅ）画像化モダリティ（ｍｏｄａｌｉｔｙ）を使用して、接合体全体を画像化し、マスクする。接合体が、抗原提示細胞及びＴ細胞からなる場合、これらの２つの細胞タイプのうちの一方だけにプローブを付ければよい。次いで、ブールＸＯＲ関数を使用して、プローブを付けた細胞画像のマスクを明視野画像のマスクから差し引いて、プローブが付けられていない細胞のマスクを構成する。次いで、プローブが付けられていない細胞マスク又はプローブを付けた細胞マスクを膨張（ｄｉｌａｔｉｎｇ）させ、それを、ブールＡＮＤ関数を使用してもう一方のマスクと結合することによって、以前の例とほぼ同様に、シナプスを定義することができる。この方法は、Ｎ−１個の固有プローブだけを必要とする以前の方法に優る利点を有する。Ｎは、研究中の接合体内の区別される異なる細胞タイプの数である。
【００５７】
次に、上述したマスキング技術をより詳細に説明する。最初に、最初に画像化された１０，０００を超える物体（このケースでは生物細胞）の画像を解析して、細胞接合体の部分集団を識別した。この最初の識別処理では、最初に画像化された１０，０００を超える物体の中から、１０９５個の物体（すなわち、細胞接合体）からなる最初の部分集団を識別した。次いで、限られた数の細胞を含み、かつ、ともに焦点の合った細胞を含む細胞接合体を含む細胞接合体の部分集団をさらに定義した。このようにして、最初の部分集団に含まれる１０９５個の物体の中から、１７８個の細胞接合体からなる部分集団を選択した。使用された画像化ソフトウェアに関しては、チャネル３（ＦＩＴＣ）及び４（ＰＥ）の「マスク」内に、それらが細胞膜の境界にしっかりと付着するように「ユーザモディフィケーション（Ｕｓｅｒ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」が作成され、それぞれ「ＵＭ３」及び「ＵＭ４」としてさらに使用されるように定義された。図４を参照すると、縦列４１４の画像がＦＩＴＣマスク（ＵＭ３）に対応し、縦列４１６の画像がＰＥマスク（ＵＭ４）に対応する。
【００５８】
図６は、図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図で、チャネル３及び４のマスクを生成するために使用された例示的な画像解析ソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースのスクリーンショットを示す図である。図７は、図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図で、チャネル３及び４のマスクを結合するブール論理を使用してシナプスマスクを生成するために使用された例示的な画像解析ソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースのスクリーンショットを示す図である。説明したマスクの例、ならびに接合体の明視野及び蛍光画像が図４に示されている。
【００５９】
図８は、図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図で、抗原提示細胞全体のＣＤ８６の平均信号強度（ＣＤ８６平均強度）を決定するために使用された例示的な画像解析ソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースのスクリーンショットを示す図である。図９は、図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図で、Ｔ細胞と抗原提示細胞の間の相互作用部位（すなわち、シナプス）内だけのＣＤ８６の平均信号強度（ＣＤ８６シナプス強度）を決定するために使用された例示的な画像解析ソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースのスクリーンショットを示す図である。
【００６０】
次いで、シナプスにおけるＣＤ８６信号の平均強度を、抗原提示細胞全体のＣＤ８６の平均強度で割ることによって、Ｔ細胞／抗原提示細胞界面（すなわち、シナプス）における信号強度を正規化した複合フィーチャを生成した。
【００６１】
図１０は、図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図で、Ｔ細胞／抗原提示細胞界面における信号強度を正規化するために使用された例示的な画像解析ソフトウェアのグラフィカルユーザインタフェースのスクリーンショットを示す図である。この方法を使用すると、測定中の分子（このケースではＣＤ８６）のシナプスへの重大な再分布がある場合、計算結果は＞１．０となるであろう。対照的に、＜１．０の数値は、シナプス以外への関心の分子の再分布を示すであろう。最後に、１．０に近い計算結果は、細胞膜上の分子の再分布があまり起こっていないことを示すであろう。この実験的研究の結果が、ＣＤ８６の平均シナプス強度に対する度数を示す図１１のグラフに示されている。
【００６２】
両方の細胞が同じ焦点面にあるように見える接合体の識別を「客観化」するために、赤と緑の両方の信号を含む細胞のアスペクト比を決定する第２のコンピュータ支援処理も使用された。この方法では、Ｔ細胞と抗原提示細胞の両方を含む接合体の「アスペクト比」がプロットされた。図１２は、Ｔ細胞と抗原提示細胞の両方を含む接合体の度数をグラフに示した図である。
【００６３】
０．９に近い比を有する接合体（すなわち、０．８と１．０の間の比を有する細胞）は、おそらく、対物レンズに対して「エンドオン（ｅｎｄ−ｏｎ）」方向に２つの細胞を見ている接合体か、又はより多くの細胞が「ボール（ｂａｌｌ）」を形成した接合体であると考えられた。この推測は、ゲーティングされた部分集団の目視解析によってその妥当性が確認された。図１３は、０．９に近い比を有する接合体の画像を含んでいる。
【００６４】
０．３に近いアスペクト比を有する接合体（すなわち、０．２と０．４の間の比を有する細胞）は、おそらく、接合体１つにつき３つ以上の細胞を含み、したがって焦点が合っていない細胞を含む確率が高いと考えられた。この推測も、ゲーティング部分集団の目視解析によってその妥当性が確認された。図１４は、０．３に近い比を有する接合体の画像を含んでいる。
【００６５】
０．５に近い（０．４から０．６の範囲の）アスペクト比を有する接合体は、接合体１つにつき２つの細胞を含む割合が最も高い可能性が最もあると考えられ、この予想も、データの目視によってその妥当性が確認された。図１５は、０．５に近い比を有する接合体の画像を含んでいる。
【００６６】
（正規化された）平均シナプスＣＤ８６強度の計算も実行され、やはり約１．０の値を示した（先に説明したマスクベースの技術を使用して決定された値と一致した）。図１６は、０．５に近いアスペクト比を有する接合体の度数を、ＣＤ８６の平均シナプス強度に対してグラフに示した図である。
【００６７】
次に、０．５のアスペクト比を有する細胞に「フォーカスゲート（Ｆｏｃｕｓ  Ｇａｔｅ）」が課せられ、合理的に良好な焦点にあると考えられる細胞（すなわち、明視野チャネルの「グラジエントマックス（Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍａｘ）」値が＞０．５の細胞）の部分集団が評価された。図１７は、合理的に良好な焦点にあると考えられる細胞接合体の頻度をグラフに示した図である。
【００６８】
（正規化された）平均シナプスＣＤ８６強度の計算が実行され、やはり約１．０の値を示した。図１８は、ＣＤ８６の正規化された平均シナプス強度に対する度数をグラフに示した図である。
【００６９】
＜例示的なコンピューティング環境＞
上述したとおり、本発明の一実施態様は、物体の集団の構成要素から同時に集められた複数の画像を画像解析することを含んでいる。例示的な画像解析ソフトウェアパッケージについてはすでに参照した。
【００７０】
図１９は、図３に示した方法ステップを実施するために使用される例示的なコンピューティングシステムを概略的に示す図である。図１９及びそれに関係する以下の説明は、図１９に示されたコンピューティングデバイスに機能的に関係したコンピューティングデバイスを使用して必要な画像処理が実施される、本発明を実施するのに適したコンピューティング環境の全般的な簡単な説明を提供することを意図したものである。この必要な画像処理は、ラップトップ及び他のポータブルコンピュータ、マルチプロセッサシステム、ネットワークコンピュータ、メインフレームコンピュータ、ハンドヘルドコンピュータ、パーソナルデータアシスタント（ＰＤＡ）、ならびにプロセッサと、このプロセッサによって実行されたときに複数の機能を実行する機械命令を記憶したメモリとを含む他のタイプのコンピューティングデバイスを含む、多くの異なるタイプのコンピューティングデバイスによって実施することができる。
【００７１】
本発明において必要な画像処理を実施するのに適した例示的なコンピューティングシステム１５０は、入力装置１５２と、出力装置１６２、例えば、ディスプレイとに機能的に結合された処理ユニット１５４を含んでいる。処理ユニット１５４は、本発明の機能を実施する（集団の構成要素によって示された少なくとも１つの特性を測定することを可能にするために、同時に集められた物体の集団の構成要素の複数の画像を解析する）画像処理／画像解析プログラムを含む機械命令を実行する中央処理ユニット（ＣＰＵ１５８）を含んでいる。少なくとも１つの実施形態では、この機械命令が、図３に示したフローチャートならびに例示的なスクリーンショットを参照して以前に説明した機能と概ね一致した機能を実行する。この目的に適したＣＰＵは、Ｉｎｔｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ＡＭＤ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、Ｍｏｔｏｒｏｌａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社他から入手可能である。
【００７２】
処理ユニット１５４には、さらに、ランダムアクセスメモリ１５６（ＲＡＭ）及び不揮発性メモリ１６０が含まれ、不揮発性メモリ１６０は一般に、リードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、及びハードドライブ、オプティカルドライブなどのある形態の記憶装置を含んでいる。これらのメモリ装置は、ＣＰＵ１５８に双方向に結合される。このような記憶装置は当技術分野ではよく知られている。機械命令及びデータは、不揮発性メモリ１６０からＲＡＭ１５６へ一時的にロードされる。メモリには、さらに、オペレーティングシステムソフトウェア及び補助ソフトウェアが記憶される。別個には示されていないが、コンピューティングシステム１５０に通電するのに必要な電力を提供する電源が必要である。
【００７３】
入力装置１５２は、動作環境への入力を可能にする任意の装置又は機構とすることができる。これには、マウス、キーボード、マイクロホン、モデム、ポインティングデバイス又は他の入力装置が含まれる。ただしこれらに限定されるわけではない。図１９には特に示されていないが、所望の画像処理を達成するために集められた画像データをコンピューティングシステム１５０が使用できるように、コンピューティングシステム１５０は、図１に概略的に示されたシステムなどの画像化システムに論理的に結合されている。もちろん、画像化システムにコンピューティングシステムを直接に論理的に結合するのではなしに、画像化システムによって集められたデータを、携帯型記憶媒体などの多くの異なるデータ転送装置によって、コンピューティングシステムに単純に転送することもできる。出力装置１６２は、一般に、出力を人間が認知するように設計されたモニタ又はコンピュータディスプレイを含んでいる。
【００７４】
本発明を、本発明を実施する好ましい形態及びその変更形態に関して説明したが、添付の特許請求の範囲に含まれる多くの他の変更を本発明に実施することができる。したがって、本発明の技術的範囲は、以上の説明によって一切限定されず、その代わり、添付の特許請求の範囲を参照することによって完全に決定されることが意図されている。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】図１は、流れの中の物体の複数の画像を同時に集めるために使用することができる例示的な流れ画像化システムの概略図である。
【図２】図１の流れ画像化システムによって生成された画像の写真を示す図である。
【図３】生物細胞などの物体を解析するために使用することができる本発明の一実施態様に基づく例示的なステップを概略的にフローチャート示した図である。
【図４】図１の流れ画像化システムを使用して集められ、図３に示した方法ステップに従って解析された例示的な画像データから形成された複合画像を示す図である。
【図５】図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図である。
【図６】図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図である。
【図７】図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図である。
【図８】図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図である。
【図９】図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図である。
【図１０】図３に示した方法ステップを実現するために使用される例示的なグラフィカルユーザインタフェースを示す図である。
【図１１】図３に示した方法ステップに従って解析された部分集団の度数を、ＣＤ８６の平均シナプス強度に対してグラフに示した図である。
【図１２】Ｔ細胞と抗原提示細胞の両方を含む細胞接合体の部分集団の度数をグラフに示した図である。
【図１３】アスペクト比が約０．９の細胞接合体の画像を含む図である。
【図１４】アスペクト比が約０．３の細胞接合体の画像を含む図である。
【図１５】アスペクト比が約０．５の細胞接合体の画像を示す図である。
【図１６】アスペクト比が約０．５の接合体の度数を、ＣＤ８６の平均シナプス強度に対してグラフに示した図である。
【図１７】合理的に良好な焦点にあると考えられる細胞接合体の度数をグラフに示した図である。
【図１８】図３に示した方法ステップに従って集められ、解析された部分集団の度数を、ＣＤ８６の正規化された平均シナプス強度に対してグラフに示した図である。
【図１９】図３に示した方法ステップを実施するために使用される例示的なコンピューティングシステムを概略的に示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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