(57)【要約】  組織操作された非ヒト肉製品およびかかる肉製品の製造方法が開示される。肉製品は、生体外で増殖された食用の筋細胞を含む。筋細胞は、増殖されて、次いで、支持構造に付着されてもよく、および任意の非ヒト細胞に由来してもよい。肉製品は、筋細胞と共に生体外で増殖される、脂肪細胞もしくは軟骨細胞またはその両方のごとき他の細胞を含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体外で増殖された非ヒト筋細胞を含む、非ヒト食肉製品。
【請求項２】
支持構造をさらに含み、および非ヒト筋細胞が該支持構造に付着されている、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項３】
非ヒト筋細胞が骨格筋細胞である、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項４】
非ヒト筋細胞が、哺乳類、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬虫類および両生類からなる群より選択される動物に由来するものである、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項５】
非ヒト肉製品が有害な微生物汚染を実質的に含まない、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項６】
非ヒト筋細胞が多能性または全能性細胞に由来するものである、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項７】
非ヒト筋細胞が電流に曝されたものである、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項８】
生体外で増殖された非ヒト脂肪細胞をさらに含む、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項９】
非ヒト脂肪細胞が非ヒト筋芽細胞から分化形質転換される、請求項８記載の非ヒト肉製品。
【請求項１０】
非ヒト脂肪細胞が多能性または全能性非ヒト幹細胞に由来するものである、請求項８記載の非ヒト肉製品。
【請求項１１】
生体外で増殖された非ヒト軟骨細胞をさらに含む、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項１２】
非ヒト軟骨細胞が支持構造および非ヒト筋細胞の間に位置付けられる、請求項１０記載の非ヒト肉製品。
【請求項１３】
非ヒト軟骨細胞が機械的ストレスに曝されたものである、請求項１０記載の非ヒト肉製品。
【請求項１４】
下記工程：
生体外で非ヒト筋肉幹細胞を培養し；
非ヒト筋肉幹細胞を支持構造上に播種し；次いで
非ヒト筋肉幹細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する：
を含む、非ヒト食肉製品の製造方法。
【請求項１５】
非ヒト筋肉幹細胞の増殖工程が、非ヒト筋肉幹細胞を異なる型の非ヒト筋細胞へ分化させることを含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１６】
非ヒト筋細胞を電流または振動電流に曝す工程をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
非ヒト肉製品に組み込まれるべき栄養素を添加する工程をさらに含む、請求項１３記載の方法。
【請求項１８】
非ヒト筋細胞が、哺乳類、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬虫類および両生類からなる群より選択される動物に由来するものである、請求項１３記載の方法。
【請求項１９】
非ヒト肉製品が有害な微生物汚染を実質的に含まない、請求項１３記載の方法。
【請求項２０】
下記工程：
非ヒト筋細胞および非ヒト脂肪細胞を生体外で共培養し；
非ヒト筋細胞および非ヒト脂肪細胞を支持構造に播種し；次いで
非ヒト筋細胞および非ヒト脂肪細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する：
を含む、非ヒト食肉の製造方法。
【請求項２１】
下記工程：
生体外で非ヒト筋肉幹細胞を培養し；
非ヒト筋肉幹細胞を支持構造に播種し；
非ヒト筋肉幹細胞を脂肪酸で処理して、非ヒト筋肉幹細胞を脂肪細胞に分化形質転換させ；次いで
脂肪細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する：
を含む、非ヒト食肉の製造方法。
【請求項２２】
下記工程：
生体外で非ヒト軟骨細胞を培養し；
非ヒト軟骨細胞を支持構造に播種し；
非ヒト筋細胞を非ヒト軟骨細胞と共に支持構造上またはその付近で培養し；次いで
非ヒト筋細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する：
を含む、非ヒト食肉製品の製造方法。
【請求項２３】
非ヒト軟骨細胞が機械的ストレスに曝されたものである、請求項２０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の分野は食肉製品の製造および獲得に関する。特に、本発明の分野は組織操作された食肉に関する。
【背景技術】
【０００２】
牛肉、豚肉、子羊肉、鶏肉または魚肉のごとき肉製品は食用に望ましい製品である。現在、肉製品は丸ごとの動物から製造されているが、これは、農業生産された全穀物のかなりの部分が食用ではなく飼料として用いられているために、極めて非効率的な製造方法である。米国では、例えば、家畜用飼料は、生産された全ての小麦、トウモロコシおよび他の穀物の約７０％を占める。加えて、１ポンドの牛肉を製造するためには、動物用飲料水としておよび家畜用飼料を育てるために数千ポンドの水が必要である。一方で、世界中では、ある種の理由により、８億人以上が栄養不良状態であり、および毎日５万人が餓死している。
【０００３】
現行の肉製造方法は環境に有害でもある。１ポンドの牛肉を育てるために、熱帯雨林は約５００平方フィートの速度で激減している。同様に、漁業用海洋生物に関する現代の技法は非常に効果的になっており、海洋および湖水では魚が乱獲されている。かつては一般的だった種が今では危険にさらされているか、または絶滅している。
【０００４】
これらの問題に対処するために、現行の科学的な取り組みでは、家畜の繁殖または成長の効率を増大させることに焦点が当てられてきた。例えば、成長ホルモンを用いて家畜の成長を加速させ、それにより、穀物および水の消費を減少させる。典型的に、成長ホルモンが家畜に注射されるが、丸ごとの動物のトランスジェニックまたはクローニングのごとき遺伝子工学的技法を用いて成長ホルモンを導入する新規方法も開発されている。それにも関わらず、現行の肉製造方法は家畜を育てるのに水、穀物および土地を必要とする。
【０００５】
現行の肉製造方法に関する別の問題は食品汚染を含む。毎年、平均して、米国人は摂取したものに起因して１回は病気になり、および９，０００人がそのために死亡している。食品汚染を制御するための政府の現在の戦略は、加工中に肉を検査することである。しかし、ＵＳＤＡおよびＦＤＡは、農場に対する規制権力を有さないために、病原体が発生する農場を滅多に規制しない。それにも関わらず、大腸菌０１５６：Ｈ７を除き、危険な細菌は生肉に「固有のもの」であると法律的に考えられている。しかし、「固有の細菌」の２つ、カンピロバクターおよびサルモネラ菌は、全ての病気の８０％の原因となり、ならびに肉および鶏肉の消費に起因する全ての死の７５％の原因となる。
【０００６】
鶏肉産業において、例えば、ブロイラー鶏の２５％および鶏ひき肉の４５％もが、サルモネラ菌に関する検査で陽性を示してもやむを得ないことが報告されている。疾病管理センターは、カンピロバクターが全ニワトリの７０％〜９０％に感染すると推定している。カンピロバクター感染は激しい腹痛、出血性下痢および熱を惹起する。毎年、米国では、カンピロバクター感染により約８００人が死に至る。カンピロバクター感染はギラン・バレー症候群ももたらし、該疾患は数週間にわたって集中治療を必要とする。より多くの抗生物質耐性株が発達するにつれて、これらの細菌に起因する重度の病気および死の発生率が増大し得る。このため、家畜用補助飼料として抗生物質を使用し続けることに疑問を抱く科学者もいる。
【０００７】
それ故に、現行の製造方法よりも効果的、安全かつ健康的に食用肉製品を製造する必要がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明は、組織操作された肉製品およびかかる肉製品の製造方法に関する。本発明の一の実施態様において、肉製品は生体外で増殖された筋細胞を含む。これらの筋細胞は、培養されて、次いで、支持構造に付着されてもよく、ならびに任意の非ヒト細胞に由来してもよい。本発明の好ましい一の実施態様において、肉製品は、任意の有害な微生物または寄生虫による汚染を実質的に含まない。本発明の別の実施態様は、筋細胞および筋細胞と一緒に生体外で増殖された他の細胞、例えば、脂肪細胞もしくは軟骨細胞またはその両方を含む肉製品に関する。本発明の別の実施態様において、肉製品は、電流または振動電流に曝された筋細胞を含む。
【０００９】
好ましい実施態様の概要
概して、肉製品は動物の筋肉から得られる。肉屋は、ステーキ、鶏胸肉、ラムチョップ、魚切り身、ポークチョップ等として販売するために牛肉、鶏肉、子羊肉、魚肉または豚肉の対応する部分を切り出す。肉製品は、ミートボール、ハンバーガー用パテ、フィッシュボール、ソーセージ、サラミ、ボローニャソーセージ、ハム等に加工され得るひき肉のごとき肉製品派生物も含む。肉製品は、ジャーキーのように風味付けられるかまたは乾燥された筋肉組織または肉を含んでもよい。
【００１０】
本発明の一の実施態様は、食用とされ得る肉製品の製造方法を含む。該方法は、インビトロで筋肉幹細胞を培養し、次いで、生体外でこれらの細胞を特定の型の筋細胞、例えば、骨格筋細胞または平滑筋細胞へ分化させることを含んでもよい。筋細胞は、食用の任意の非ヒト動物、例えば、哺乳類（例えば、ウシ、バッファロー、ブタ、ヒツジ、シカ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、カモ、ダチョウ、シチメンチョウ、キジ等）、魚類（例えば、メカジキ、サーモン、マグロ、スズキ、マス、ナマズ等）、無脊椎動物（例えば、ロブスター、カニ、エビ、アサリ、カキ、ムール貝、ウニ等）、爬虫類（例えば、ヘビ、アリゲータ、カメ等）および両生類（例えば、カエルの足）に由来してもよい。好ましくは、筋細胞は、筋細胞、脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞を生じる多能性胚性間葉性幹細胞に由来する。筋細胞は、全能性胚性幹細胞、例えば、上記動物の胞胚期、受精卵、胎盤または臍帯からの細胞に由来してもよい。
【００１１】
筋細胞を培養にて筋肉組織に増殖させて、該組織を２または３次元の足場または支持構造のごとき支持構造に付着させてもよい。筋細胞は、剥離および食用加工され得る数層の細胞を形成するペトリディッシュのごとき２次元支持構造上で増殖されてもよい。２次元支持構造の他の例は、膜の片面に接する培地から細胞が付着している他の面への栄養素の拡散を可能とする多孔性膜を含んでもよい。この種の培養条件において、さらなる細胞層は、膜の両面から培地に細胞を曝露させることにより成し遂げられてもよい。すなわち、細胞は、膜の片面からと、および膜上で増殖する細胞を被覆する培地からの拡散を通じて栄養素を受け取る。
【００１２】
筋細胞は３次元支持構造上、その周辺、またはその中で増殖されてもよい。所望により、支持構造を異なる大きさ、形状および構造に変形して、筋細胞に形状および構造を提供し、増殖させて、ステーキ、テンダーロイン、すね肉、鶏胸肉、ドラムスティック、ラムチョップ、魚切り身、ロブスターテイル等のごとき様々な型の筋肉組織に類似させてもよい。支持構造は、天然または合成の生体材料から作成されてもよく、該材料は、好ましくは、摂取されても有害ではないように非毒性である。天然生体材料は、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンまたは他の細胞外マトリックスを含んでもよい。合成生体材料は、例えば、ヒドロキシアパタイト、アルギナート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸またはそれらのコポリマーを含んでもよい。支持構造は固形または半固形支持体として形成されてもよい。
【００１３】
最適な細胞および組織増殖を提供するために、好ましくは、支持構造は高い空隙率を有し、細胞付着のために最大の表面積を提供する。３次元支持構造は、肉製品の内部にある細胞に栄養素を送達し、および該細胞からの代謝産物を循環させるための、分岐した血管ネットワークを含むように形成されてもよい。この特定の実施態様において、分岐した血管ネットワークは、上記した非毒性の天然または合成生体材料を用いることにより食用となり得る。さらに、支持構造は、支持構造に共有または非共有結合した接着ペプチド、細胞接着分子または他の成長因子を含んでもよい。ペプチドの例は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＡｓｐまたはＡｒｇ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ−Ｖａｌのごとき配列を含む。Ｎｉｋｌａｓｏｎ，Ｌ．，ら，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｂｌｏｏｄ  Ｖｅｓｓｅｌｓ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｔｉｓｓｕｅｓ，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５（４）：３０３−３０６（１９９７）。この参考文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００１４】
一方で、これらの筋細胞に関する培養条件は、静的、攪拌または動的流動条件を含んでもよい。大規模な製造のために好ましい方法はバイオリアクターを用いることであり、該装置はより大量の細胞を産生し、ならびに栄養素、気体、代謝産物および調節分子の流れに対する制御を増大させる。さらに、バイオリアクターは、物理的および機械的シグナル、例えば、特定の生体分子を産生するように細胞を刺激する圧縮を提供してもよい。Ｖａｃａｎｔｉ，Ｊ．，ら，Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｖｉｎｇ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｌａｎｃｅｔ，３５４  Ｓｕｐｐｌ．１，ｐＳＩ３２−３４（１９９９）。この参考文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００１５】
本発明の別の実施態様において、生体外で増殖された筋細胞に由来する肉製品は、任意の非ヒト動物にも由来する脂肪細胞を含んでもよい。概して、脂身はより美味しいが、脂肪含有量が高くなるにつれ、心疾患のごとき有害な健康状態の危険性が高くなる。それ故に、最適な風味および健康効果を有する肉製品を生産するために、脂肪細胞に対する筋細胞の比率がインビトロで調節されてもよい。調節は、培地に初めに播種される筋細胞および脂肪細胞の比率を制御することにより、および／または所望により筋細胞または脂肪細胞に作用する成長因子または分化因子の濃度および比率を変えることにより成し遂げられてもよい。
【００１６】
本発明の別の実施態様において、軟骨細胞に由来する軟骨は、初めに、支持構造と一緒に基礎となる支持層または構造を形成してもよい。その後、筋細胞もしくは脂肪細胞またはその両方が該軟骨細胞層上に播種されてもよい。筋細胞および軟骨細胞の相互作用は、組織形成に必要とされる必須の調節シグナルをさらに提供してもよい。筋細胞および軟骨細胞を有する肉製品の例は、鶏胸肉またはポークリブを含む。
【００１７】
本発明の好ましい一の実施態様において、無菌技法を用いて、細菌、菌類、ウイルス、プリオン、原虫または上記の任意の組み合わせのごとき有害な微生物を実質的に含まない肉製品をもたらす筋細胞を培養してもよい。有害な微生物は、サルモネラ菌、カンピロバクター、大腸菌０１５６：Ｈ７等のごとき病原型微生物を含んでもよい。加えて、培養にて増殖された筋細胞は、丸ごとの動物の筋肉に感染し、および十分に調理されていない肉を摂取することによりヒトに伝達する、サナダムシのごとき寄生虫を実質的に含まない。無菌技法は、生物学的生産ラインの最後に肉製品を包装する際に用いられてもよい。かかる品質保証は、当該分野において既に知られている微生物または化学物質に関する標準的アッセイによりモニターされてもよい。「実質的に含まない」とは、微生物または寄生虫の濃度が臨床上有意な汚染レベルより低いこと、すなわち、その摂取が疾患または有害な健康状態に至り得るレベルより低いことを意味する。
【００１８】
本発明の別の好ましい実施態様において、生体外で増殖された筋細胞に由来する肉製品は、電流または振動電流に曝されてもよい。丸ごとの動物に由来する筋肉組織とは異なり、生体外またはインビトロで増殖された筋肉組織は運動することがない（例えば、足を動かすために用いられることはない）。それ故に、筋細胞、筋肉組織または肉製品をインビトロで電流または振動電流に曝すことにより、運動を模倣させ、ならびに生体外で増殖された肉と丸ごとの動物に由来する肉との間の質感の類似性を増大させてもよい。電流または振動電流は、生体外での筋細胞の増殖速度を増大させてもよい。電流または振動電流を筋肉幹細胞か、または幹細胞から分化した後の筋細胞にアプライしてもよい。
【００１９】
本発明の別の実施態様において、丸ごとの動物に由来する肉製品には通常欠けているビタミンのごとき他の栄養素を添加して、肉の栄養価を増大してもよい。これは、成長培地に栄養素を連続的に添加することによってか、または遺伝子工学技法により成し遂げられてもよい。例えば、ビタミンＤ、Ａまたは様々なビタミンＢ複合体のごとき特定のビタミンの生合成に関与する酵素に関する１または複数の遺伝子を、培養された筋細胞にトランスフェクションし、特定のビタミンを産生させてもよい。
【００２０】
本発明の別の実施態様において、制御因子、成長因子または他の遺伝子産物を遺伝子工学により筋細胞に導入してもよい。筋原性制御因子（「ＭＲＦ」）として知られいるこれらの因子はインビボで筋肉の成長を刺激および調節してもよいが、通常、インビボまたはインビトロでは筋細胞によって産生されない。それ故に、培養された筋細胞における筋原性制御因子の発現は、インビトロでの筋細胞の産生を増大してもよい。
【００２１】
本発明の別の実施態様において、インビトロでの筋細胞に由来する肉製品は様々な肉製品派生物を含んでもよい。これらの派生物は、例えば、インビトロで増殖された筋肉組織を細かく刻み、次いで、適切な調味料を混合して、ミートボール、フィッシュボール、ハムバーガーパテ等を作成することにより、調製されてもよい。該派生物は、例えば、ビーフジャーキー、ハム、ボローニャソーセージ、サラミ等にカットおよびスライスされた筋細胞の層から調製されてもよい。それ故に、本発明の肉製品は、動物の肉に由来するあらゆる種類の食品を製造するために用いられてもよい。
【００２２】
以下の実施例は、当業者がインビトロで肉製品を生産するための本発明の利用方法を説明している。本明細書に明示されていない細胞生物学、細胞培養および免疫組織化学の方法は、既に、科学文献において十分に報告されている。
【実施例】
【００２３】
実施例Ｉ
本実施例は、インビトロでの肉製品の生産において用いるための多能性間葉性幹細胞の単離を説明する。間葉性幹細胞は、筋細胞、脂肪細胞、骨細胞および軟骨細胞を生じる。間葉性幹細胞は、ヒト以外の任意の動物の胚の胚組織から解離および単離されてもよい。例えば、ウシにおいて、好ましくは、多能性筋肉幹細胞に富む胚性間葉性組織は３０〜４０日齢以下で胚から単離される。一旦単離されると、胚組織は、リン酸緩衝生理食塩水（「ＰＢＳ」）ｐＨ７．４５中、約１ミリメーター×１ミリメーターの大きさの小片に細分化されてもよい。５〜１０片の細分化された組織を、３００μｌの、ＰＢＳ中の０．２５％のトリプシンおよび０．１％のＥＤＴＡ中、穏やかに攪拌しながら、３０分間３７℃でインキュベーションする。その後、組織を、重力または穏やかな遠心分離によりチューブの底に沈殿させておいてもよい。次いで、トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を含有する上清を吸引し、次いで、１０〜３０分間３７℃で、３００μｌのＰＢＳ中の０．１％のコラゲナーゼと置換してもよい。所望により、コラゲナーゼ消化を数サイクル繰り返してもよい。損傷した細胞から放出されるＤＮＡのために、溶液の粘度に応じて、各サイクルの間に４０μｌのＤＮａｓｅ  ＩをＰＢＳ中１ｍｇ／ｍｌでコラゲナーゼ溶液に加えてもよい。
【００２４】
１０ｍＭのＨｅｐｅｓ、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１０〜２０％の熱不活性化ウシ胎児またはウシ血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｏｇａｎ，Ｕｔａｈ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したＤＭＥＭもしくはＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２またはそれらの１：１の比の混合物（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍａｒｙｌａｎｄ）のごとき培地（「完全培地」）を加えることにより、反応を停止させてもよい。組織を穏やかにピペッティングすることにより細胞を完全に解離させ、次いで、遠心分離を用いて、完全培地中で細胞を１〜２回洗浄する。次いで、細胞を、天然生体材料（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンもしくは他の細胞外マトリックス）または合成生体材料（例えば、ヒドロキシアパタイト、アルギナート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸もしくはそれらのコポリマー）またはその両方でコーティングされてもよい適切な大きさのペトリディッシュにセットし、次いで、３７℃で培養し、次いで、５％のＣ０２で平衡させてもよい。
【００２５】
実施例ＩＩ
間葉性幹細胞を単離した後、それらを培養下で筋芽細胞または筋肉幹細胞について富化させてもよい。実施例Ｉに記載のように解離および洗浄した後、初めに、細胞を異なるペトリディッシュ上に別々にセットする。６０ｍｍのペトリディッシュを用いて、初めに、細胞を完全培地中で２〜４時間インキュベーションしてもよい。この時間内で、上皮細胞は直ぐにペトリディッシュに付着する傾向があるが、筋芽細胞は上清中にとどまったままである。次いで、上清を集め、次いで、筋芽細胞を、実施例Ｉに記載したような天然または合成生体材料でコーティングした異なるペトリディッシュ上にセットしてもよい。成長培地へ骨格筋肉成長因子、プロスタグランジンＦ２α（「ＰＧＦ２α」）およびインスリン様成長因子Ｉ（「ＩＧＦ−１」）のごとき成長因子を加えることにより筋芽細胞を富化させてもよい。
【００２６】
さらに、筋肉特異的な成長または分化因子、例えば、２４ｐｇ／ｍｌ〜２８ｐｇ／ｍｌの濃度のＰＧＦ２αおよび１０−６Ｍ〜１０−５Ｍのインスリンを補足した完全培地または最小培地（例えば、ウシ胎児血清を欠如した完全培地）中で筋芽細胞を培養することにより、筋芽細胞を特定の筋細胞に分化させてもよい。通常ニューロン細胞に神経支配されるインビボでの筋細胞をより厳密に模倣するために、培地にアセチルコリンのごとき適切な神経伝達物質を加えてもよい。
【００２７】
実施例ＩＩＩ
或いは、筋芽細胞は全能性胚幹細胞から富化されてもよい。全能性細胞は、体外受精技法を用いる動物の体外受精卵、臍帯または胎盤に存在する幹細胞、または胞胚期の細胞から単離された胚性幹（ＥＳ）細胞に由来してもよい。例えば、ＥＳ細胞を収集し、トリプシンを用いて穏やかに解離させ、次いで、組換え白血病抑制因子（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）および増殖が止まった胚線維芽細胞のごとき支持細胞と共にインビトロで培養してもよい。これらの全能性細胞をＰＧＦ２αまたはＩＧＦ−１のごとき成長因子で処理し、細胞を誘導させて、筋芽細胞に分化させてもよい。
【００２８】
実施例ＩＶ
標準的な免疫組織化学またはｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション技法を用いて、筋芽細胞または筋細胞（分化した筋細胞）を同定してもよい。簡潔に記載すると、培養下で増殖させた筋芽細胞または筋細胞を、上記した適切な細胞外マトリックスでコーティングしたガラススライドに移してもよい。上記の条件を用いて、これらの細胞を所望の数および分化に増殖させてもよい。十分な増殖および分化期間の後、細胞を４％のホルムアミドで固定する。細胞内抗体マーカーまたはヌクレオチドプローブを用いる場合は、１％のＮＰ−４０またはトリトン−Ｘを用いて細胞膜を透過性としてもよい。筋芽細胞または筋細胞に特異的なマーカーに対する抗体、例えば、Ｓｉｇｍａ（登録商標）から入手可能なミオシン、タイチン、アルファ−アクチニンを用いて、標準的な蛍光免疫組織化学技法を利用して、細胞を同定してもよい。或いは、これらのマーカー用の一本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡプローブをｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーションに用いてもよい。
【００２９】
加えて、筋細胞が以下に記載の３次元支持構造に付着する場合、それらを凍結し、分割し、次いで、Ｓｉｇｍａ（登録商標）から入手可能なミオシン、タイチン、１２１０１、トロポニンＴ、アルファアクチニンに対する抗体のごとき抗体マーカーを用いて同定してもよい。
【００３０】
実施例Ｖ
２または３次元の足場または支持体は、天然生体材料（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンもしくは他の細胞外マトリックス）または合成生体材料（例えば、ヒドロキシアパタイト、アルギナート、ポリグリコール酸、ポリ乳酸およびそれらのコポリマー）またはその両方から変形されてもよい。好ましくは、３次元の足場は、形成された筋肉組織の内部に栄養素および培地を到達させるための分岐状経路を含むように変形される。材料およびこれらの足場の構築方法の例は、米国特許第５，６８６，０９１号（題名“Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｆｏａｍｓ  Ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ”）；第５，８６３，９８４号（題名“Ｂｉｏｓｔａｂｌｅ  Ｐｏｒｏｕｓ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ”）；第５，７７０，４１７号（題名“Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ  Ｆｉｂｒｏｕｓ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ａｔｔａｃｈｅｄ  Ｃｅｌｌ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｖａｓｃｕｌａｒｉｚｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎ  ｖｉｖｏ”）；および第５，９１６，２６５号（題名“Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ｆｏｒ  Ｕｓｅ  ａｓ  ａ  Ｃｅｌｌ  Ｓｅｅｄｉｎｇ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ａｎｄ  Ｉｍｐｌａｎｔ”）により提供される。これらの特許は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００３１】
好ましくは、支持構造は、異なる大きさ、形状および構造に変形され、ステーキ、テンダーロイン、すね肉、鶏胸肉、ドラムスティック、ラムチョップ、魚切り身、ロブスターテイル等のごとき様々な型の肉製品に類似する筋肉組織の増殖を可能とする。
【００３２】
実施例ＶＩ
脂肪細胞、軟骨細胞および骨細胞は全て多能性間葉性幹細胞または全能性胚性幹細胞から分化できる。幹細胞は実施例ＩまたはＩＩＩに記載のように単離されてもよい。幹細胞をＤＭＥＭもしくはＨａｍ’ｓ  Ｆ−１２またはそれらの１：１の比の混合物中で培養してもよい。培地に甲状腺ホルモン、トランスフェリン、インスリンおよび他の成長因子、例えば、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子および成長ホルモンを加えてもよい。
【００３３】
脂肪細胞について、分化は、脂肪細胞系列へのコミットメントを誘導することが知られているＢＭＰ−４およびＢＭＰ−２のごとき骨形態形成蛋白質（「ＢＭＰ」）で幹細胞を処理することにより成し遂げられてもよい。Ａｈｒｅｎｓら，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−２  ｏｒ  −４  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎｔｏ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ，ＤＮＡ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１２：８７１−８８０（１９９３）；Ｗａｎｇら，Ｂｏｎｅ  Ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−２  ｃａｕｓｅｓ  ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃ３Ｈ１０Ｔ１／２  ａｎｄ  ３Ｔ３  Ｃｅｌｌ，Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ９：５７（１９９３）。これらの参考文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００３４】
ＢＭＰに加えて、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ（「ＰＰＡＲガンマ」）のアゴニスト、例えば、ＢＲＬ４９６５３（ｒｏｓｉｇｌｉｔａｚｏｎｅ）を用いて、脂肪細胞の分化を促進してもよい。Ｓｏｔｔｉｌｅ  ａｎｄ  Ｓｅｕｗｅｎ，ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ−２  ｓｔｉｍｕｌａｔｅｓ  ａｄｉｐｏｇｅｎｉｃ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ  ｃｅｌｌ  ｉｎ  ｓｙｎｅｒｇｙ  ｗｉｔｈ  ＢＲＬ  ４９６５３  ９（ｒｏｓｉｇｌｉｔｚａｏｎｅ），ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，４７５（３）：２０１−２０４（２０００）。この参考文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００３５】
特定の状況において、長鎖脂肪酸（「ＬＣＦＡ」）もしくはチアゾリジンジオンまたはその両方で筋芽細胞または筋衛星細胞を処理することにより、筋芽細胞をさらに誘導して、脂肪芽細胞（脂肪細胞前駆体）へ分化形質転換してもよい。Ｇｒｉｍａｌｄｉら，Ｔｒａｎｓ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｂｌａｓｔｓ  ｔｏ  ａｄｉｐｏｂｌａｓｔｓ：ｔｒｉｇｇｅｒｉｎｇ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ，Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎｓ  Ｌｅｕｋｏｔ  Ｅｓｓｅｎｔ  Ｆａｔｔｙ  Ａｃｉｄｓ，５７（１）：７１−７５（１９９７）；Ｔｅｂｏｕｌら，Ｔｈｉａｚｏｌｉｄｉｎｅｄｉｏｎｅｓ  ａｎｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｃｏｎｖｅｒｔ  ｍｙｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ａｄｉｐｏｓｅ−ｌｉｋｅ  ｃｅｌｌｓ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０（４７）：２８１８３−２８１８７（１９９５）。これらの参考文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００３６】
従って、筋細胞および脂肪細胞を特定の比率で播種し、次いで、共培養することにより、所望の脂肪含有量の肉製品が生産されてもよい。或いは、初めに、幹細胞を筋芽細胞に分化させておき、その後に、所望により、ＬＣＦＡまたはチアゾリジンジオンを異なる濃度および異なる曝露時間で加え、筋芽細胞を脂肪細胞に分化形質転換させてもよい。さらに、筋細胞および脂肪細胞の増殖は、成長および分化因子の濃度を制御することにより調節されてもよい。例えば、最終的な肉製品においてより少ない脂肪細胞が所望されるならば、より低濃度のＢＭＰ因子を培地に加え、一方で、より高濃度のＰＧＦ２αおよび／またはインスリンを加えて、筋細胞の増殖を促進してもよい。
【００３７】
実施例ＶＩＩ
軟骨細胞を動物の膝または胸郭から単離してもよい。実施例Ｉに記載のものと同様の技法を用いて、膝または胸郭から単離した組織を細かく刻み、コラゲナーゼで消化し、次いで、完全培地で洗浄する。次いで、細胞を別々にプレートにセットし、軟骨細胞の純度を増大させる。
【００３８】
機械的ストレスに応答して軟骨細胞が分化することが知られている。それ故に、好ましくは、米国特許第５，９２８，９４５号（題名“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｈｅａｒ  Ｆｌｏｗ  Ｓｔｒｅｓｓ  ｔｏ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｏｒ  Ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｄｕｃｅ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ”）に記載されているように、細胞をずれ流動ストレスに曝してもよい。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００３９】
初め、軟骨細胞は３次元足場において支持細胞の第一層を形成してもよい。次いで、筋芽細胞もしくは脂肪細胞またはその両方を軟骨細胞層上に播種し、次いで、所望の大きさまで増殖させる。そのようなものとして、軟骨細胞層はさらなる接着または成長因子を筋細胞に提供してもよい。
【００４０】
実施例ＶＩＩＩ
インビトロで増殖された筋細胞とインビボで増殖された筋細胞とは、インビボ細胞が運動または身体動作において使用されるという点で異なる。筋肉はインビボで使用されるので、例えば四肢の筋細胞は、四肢の動作に従って収縮および弛緩する。故に、インビボでの筋細胞の増殖をより厳密に模倣するために、インビトロで増殖された細胞を、電流もしくは振動電流または電流もしくは振動電流のパルスに曝して筋細胞を収縮させてもよい。電気プローブを培地に埋め込み、中程度の電流を送達してもよい。或いは、支持構造を電気伝導性材料でコーティングしてもよい。電気伝導性材料およびそれらで支持構造をコーティングする方法の例は、米国特許第５，８４３，７４１号（題名“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ａｌｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｃｈｏｒａｇｅ  Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｏｎ  ａｎ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｎｄｕｃｔｉｎｇ  Ｐｏｌｙｍｅｒ”）に記載されている。該文献は出典明示によりその全てが本明細書の一部となる。
【００４１】
上記実施例は、生体外で肉製品を生産する方法を説明している。これらの実施例は単なる例示であり、本発明を限定するものではない。上記実施例の修飾および組み合わせは本発明の精神を逸脱するものではないことが理解される。
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月12日(2007.9.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体外で増殖された非ヒト筋細胞を含む、非ヒト食肉製品。
【請求項２】
支持構造をさらに含み、および非ヒト筋細胞が該支持構造に付着されている、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項３】
非ヒト筋細胞が骨格筋細胞である、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項４】
非ヒト筋細胞が、哺乳類、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬虫類および両生類からなる群より選択される動物に由来するものである、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項５】
非ヒト肉製品が有害な微生物汚染を実質的に含まない、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項６】
非ヒト筋細胞が多能性または全能性細胞に由来するものである、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項７】
非ヒト筋細胞が電流に曝されたものである、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項８】
生体外で増殖された非ヒト脂肪細胞をさらに含む、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項９】
非ヒト脂肪細胞が非ヒト筋芽細胞から分化形質転換される、請求項８記載の非ヒト肉製品。
【請求項１０】
非ヒト脂肪細胞が多能性または全能性非ヒト幹細胞に由来するものである、請求項８記載の非ヒト肉製品。
【請求項１１】
生体外で増殖された非ヒト軟骨細胞をさらに含む、請求項１記載の非ヒト肉製品。
【請求項１２】
非ヒト軟骨細胞が支持構造および非ヒト筋細胞の間に位置付けられる、請求項１０記載の非ヒト肉製品。
【請求項１３】
非ヒト軟骨細胞が機械的ストレスに曝されたものである、請求項１０記載の非ヒト肉製品。
【請求項１４】
下記工程：
生体外で非ヒト筋肉幹細胞を培養し；
非ヒト筋肉幹細胞を支持構造上に播種し；次いで
非ヒト筋肉幹細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する：
を含む、非ヒト食肉製品の製造方法。
【請求項１５】
非ヒト筋肉幹細胞の増殖工程が、非ヒト筋肉幹細胞を異なる型の非ヒト筋細胞へ分化させることを含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
非ヒト筋細胞を電流または振動電流に曝す工程をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１７】
非ヒト肉製品に組み込まれるべき栄養素を添加する工程をさらに含む、請求項１４記載の方法。
【請求項１８】
非ヒト筋細胞が、哺乳類、鳥類、魚類、無脊椎動物、爬虫類および両生類からなる群より選択される動物に由来するものである、請求項１４記載の方法。
【請求項１９】
非ヒト肉製品が有害な微生物汚染を実質的に含まない、請求項１４記載の方法。
【請求項２０】
下記工程：
非ヒト筋細胞および非ヒト脂肪細胞を生体外で共培養し；
非ヒト筋細胞および非ヒト脂肪細胞を支持構造に播種し；次いで
非ヒト筋細胞および非ヒト脂肪細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する：
を含む、非ヒト食肉の製造方法。
【請求項２１】
下記工程：
生体外で非ヒト筋肉幹細胞を培養し；
非ヒト筋肉幹細胞を支持構造に播種し；
非ヒト筋肉幹細胞を脂肪酸で処理して、非ヒト筋肉幹細胞を脂肪細胞に分化形質転換させ；次いで
脂肪細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する：
を含む、非ヒト食肉の製造方法。
【請求項２２】
下記工程：
生体外で非ヒト軟骨細胞を培養し；
非ヒト軟骨細胞を支持構造に播種し；
非ヒト筋細胞を非ヒト軟骨細胞と共に支持構造上またはその付近で培養し；次いで
非ヒト筋細胞を増殖させて非ヒト肉製品を製造する：
を含む、非ヒト食肉製品の製造方法。
【請求項２３】
非ヒト軟骨細胞が機械的ストレスに曝されたものである、請求項２０記載の方法。
【国際調査報告】
2008513006.tif 000002
2008513006.tif 000003
2008513006.tif 000004