(57)【要約】  薬動力学（ＰＫ）パラメーターの見地から、新しい化学的独立体（ＮＣＥ）の試験における処理能力の増大についての必要性が継続して存在する。本目的は、より高い処理能力、動物間の変動性の試験および覚醒ラットにおけるＮＣＥの日常的な生物学的利用能研究のために必要とされる動物数の低減を可能にする新しい研究方法の有効性を確認することであった。この計画は、尾静脈を介する連続的な血液サンプリングと組み合わせて、伏在静脈を介する静脈内（ｉｖ）投与のための新しい方法を使用する。多数回のサンプリング方法が単回のサンプリング（断頭）と比較され、そしてヘマトクリット（Ｈｃｔ）に及ぼす影響が研究された。伏在静脈中への直接注射が内在する頸静脈カテーテルを用いるｉｖ投与と比較された。異なる化学構造のＣＥを用いて、伏在静脈を介する直接注射と尾静脈からの多数回サンプリングの組み合わせが、コンパレーター法に匹敵する血漿濃度と、それに続くＰＫの結果を生むことが示された。さらにまた、Ｈｃｔレベルは、１日当たり２．１ｍｌまでの総血液サンプリング容量を用いて推奨されるレベル内に止まった。新しい技術は、予備的な外科手術のために要求される時間を低減することによって処理能力を増大し、濃度時間曲線が各動物から収集できるので、主なＰＫパラメーターの動物間の比較を可能にすることによって品質を増大し、そして要求される動物数を低減する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）伏在静脈をとおしての化学的独立体の静脈内投与工程；
（ｂ）尾静脈からの血液のサンプリング工程、
を含んでなる、覚醒ラットにおける薬動力学パラメーターの決定のための分析方法。
【請求項２】
（ｂ）工程において多数の血液サンプルが尾静脈から採取されることを特徴とする、請求項１に記載の分析方法。
【請求項３】
（ｂ）工程の後に、血液／血漿サンプルが生物学的分析技術を用いて分析され、薬動力学パラメーターを決定される（ｃ）工程をさらに含むことを特徴とする、請求項１〜２のいずれか１つに記載の分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも、ａ）伏在静脈をとおしての化学的独立体（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｔｉｔｙ）の静脈内投与工程、およびｂ）尾静脈からの血液のサンプリングの工程を含んでなる、覚醒ラットにおける新しい静脈内薬物投与および血液サンプリングモデルに関する。
【背景技術】
【０００２】
全体として製薬工業は、市場へ新しい化学的独立体（ＮＣＥ）を提供するために負う開発時間と費用を鋭敏に意識している。薬物発見ＡＤＭＥ（Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  Ｅｘｃｒｅｔｉｏｎ（吸収、分布、代謝、排出））分野内には、化学的独立体（ＣＥ）の初期の薬物様性質を研究する多くの異なる方法が存在する。２つの主な領域は、１個／２個のパラメーターまたはエンドポイントを研究するイン・ビトロのアッセイシステムおよび全動物系を用いるイン・ビボのモデルを必要とする領域である。今日まで、多大な努力が、高処理能のイン・ビトロ代謝および吸収アッセイ（非特許文献１）および生物学的分析（ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ）アッセイにおける高速分析能力（非特許文献２）の開発に焦点を当ててきた。薬物発見の努力の一部として、イン・ビボの薬動力学（ＰＫ）パラメーターの見地からのＣＥの試験における処理能力の増大について継続した必要性が存在する。ＣＥのこれらのパラメーターおよび生物学的利用能を得るために、化合物は、静脈内（ｉｖ）および経口（ｐｏ）経路を介して投薬され、血液が種々の時点においてサンプリングされ、次いで、問題の化合物について、例えば、タンデム質量分析計に連結された液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって分析される。全動物体における吸収および素因（ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）を説明するＰＫパラメーター（例えば、クリアランス、分布容積、消失半減期および経口的生物学的利用能）が、次に、血漿濃度時間プロフィルから計算される。ＣＥのイン・ビボのＰＫ評価における処理能力を増加する努力は、生物学的分析の一定期間内の仕事量を最小化するために混合物投薬およびサンプル保存に焦点を絞った（非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５および非特許文献６）。しかしながら、これらの方法は欠点を伴っていた。カセット投薬は、動物における副作用と薬物・薬物相互作用の可能性を増大し、生物学的分析に累を及ぼすことがある。また、血漿サンプルの投薬後の保存を伴う生物学的分析は、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにおける不当な同時溶離と、それに続くイオン抑制を防ぐためのサンプルの希釈とさらなる方法の展開時間のために信用が低下しうる。
【非特許文献１】Ｂａｊｐａｉ，Ｍ．；Ａｄｋｉｓｏｎ，Ｋ．Ｋ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｄｅｖ．２０００，３，６３−７１
【非特許文献２】Ｃｏｘ，Ｋ．Ａ．；Ｗｈｉｔｅ，Ｒ．Ｅ．；Ｋｏｒｆｍａｃｈｅｒ，Ｗ．Ａ．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ．Ｓｃｒｅｅｎ．２００２，５，２９−３７
【非特許文献３】Ａｌｌｅｎ，Ｍ．Ｃ．；Ｓｈａｈ，Ｔ．Ｓ．；Ｄａｙ，Ｗ．Ｗ．Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１９９８，１５，９３−９７
【非特許文献４】Ｏｌａｈ，Ｔ．Ｖ．；ＭｃＬｏｕｇｈｌｉｎ，Ｄ．Ａ．；Ｇｉｌｂｅｒｔ，Ｊ．Ｄ．Ｒａｐｉｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１９９７，１１，１７−２３
【非特許文献５】Ｈｏｐ，Ｃ．Ｅ．；Ｗａｎｇ，Ｚ．；Ｃｈｅｎ，Ｑ．；Ｋｗｅｉ，Ｇ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９８，８７，９０１−９０３
【非特許文献６】Ｓｈａｆｆｅｒ，Ｊ．Ｅ．；Ａｄｋｉｓｏｎ，Ｋ．Ｋ．；Ｈａｌｍ，Ｋ．；Ｈｅｄｅｅｎ，Ｋ．；Ｂｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．１９９９，８８，３１３−３１８
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は、覚醒ラットにおける新しい伏在静脈を用いるｉｖ投与経路および尾静脈を介する血液サンプリング、特に多数回の血液サンプリングの組み合わせアプローチである分析方法を設計し、そして有効性を確認すること（ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ）によって日常的なラットのＰＫ研究のイン・ライフまたはイン・ビボ部分の処理能力を増大することであった。また、この分析方法は、血液／血漿サンプルの処理／分析および主要なＰＫパラメーターの評価を可能にするために適当な生物学的分析技術を含有することができる。
【０００４】
したがって、本発明は、
ａ）伏在静脈をとおしての化学的独立体の静脈内投与工程；
ｂ）尾静脈からの血液のサンプリング工程：
を含んでなる、覚醒ラットにおける薬動力学パラメーターの決定のための分析方法に関する。
【０００５】
本出願に関して、ＣＥは、天然または合成起源、例えば、限定されるものではないが、いずれか薬剤、活性化合物、ビタミン、タンパク質およびウイルスからのすべての化合物または化学品である。
【０００６】
伏在静脈投与
本出願に関して、伏在静脈は、後趾から血液を流出させるための後趾の表面に位置する静脈である。
【０００７】
ラットＰＫ研究の存命期における数種の方法（用量投与および血液サンプリング）が産業を横断して用いられてきたが、全方法について各々はそれ自体の利点と欠点を有している。ｉｖ投薬とサンプリングの経路に関して先行技術は次のように記述している：
１）それぞれ尾静脈へのｉｖ投与および尾静脈からのサンプリング；利点は予備的な外科手術が要求されないことであるが、血液サンプルは、投与部位に残留している残用量溶液のために初期のサンプリング時点で汚染される可能性がある。また、ある静脈で十分にサンプリングできなかった場合、他の側面の静脈が過剰のサンプリングのために損傷されることになりかねない；
２）尾静脈投与および眼窩叢を介するサンプリング；利点は、投薬およびサンプリングが２つの別個の部位から行われ、そして予備的な外科手術は要求されないが、動物は血液採取前に麻酔されなければならないことである。各動物は２４時間内の限られた時間数においてこの種の手順だけを受けなければならない。十分な濃度時間プロフィルとＰＫパラメーターを構築するためには、数匹の動物が必要な時点で使用されて、十分な血液サンプルを得なければならない；
３）尾静脈投与および頸動脈／頸静脈からの連続血液サンプリング；利点は、投薬およびサンプリングが２つの別個の部位から行われ、そして少量の頻繁な血液サンプルが血漿濃度時間プロフィルの十分な説明のために同じ動物内で採取できるが、予備的な外科手術が要求されることである。同じ議論は、内在する頸静脈カニューレを介するｉｖ投与と尾静脈からのサンプリングの組み合わせについても同じく真実である；
４）同じ内在する頸静脈カテーテルを介するｉｖ投与と血液サンプリング；利点は、少量の頻繁な血液サンプルが血漿濃度時間プロフィルの十分な説明のために同じ動物内で採取できるが、初期時点における血液サンプルは、カニューレに残留している残投薬溶液のために汚染される可能性があり、そしてまた予備的な外科手術が要求されることである；
５）伏在静脈をとしてのｉｖ投与および麻酔されたラットの尾静脈からの血液のサンプリング（２００３年２月１９日に公表された欧州特許第１  ２８４  １３９  Ａ１号）。現出願との相違は、ラットが麻酔されている代わりに覚醒しているという事実である。こ
の相違は小さいと思われるかもしれないが、本発明による方法は、この科学領域において実施され、公表された大量の仕事にもかかわらず、以前には決して公表されてなかった。明らかに、本発明は技術的な先入観を克服し、そしてさらに、ｏ．ａ．投与される化学的独立体と麻酔性および／または催眠性薬物、例えば、ナトリウムペントバルビタールとの間の相互作用が排除されたという利点を提供する。また、麻酔性および／または催眠性薬物の投与によって影響を受ける他のパラメーターが、特にＣＮＳ−薬物、例えば抗−抗不安薬、抗精神病薬、抗うつ薬および抗疼痛薬の試験の場合に、本発明による方法において影響を受けないことは言うまでもない。またさらに、ラットは麻酔後の覚醒を必要とされないので、サンプルは、はるかに速い速度で同じラットから、かつ例えばラットの代謝を乱すことなく採取することができるという利点が提供される。
【０００８】
本発明の１つの態様は、覚醒ラットにおける伏在静脈中へのＣＥの直接注射を介する、新しいｉｖ投与経路を設計し、有効性を確認することである。この方法ａ．ｏ．は、予備的な外科手術と回復のために要求される時間（１〜２日）を低減する。異なる化学構造をもつＣＥ（ｎ＝１１）が、頸静脈または伏在静脈を介して投与された。血液が、尾静脈を介する多数回の血液サンプリング技術を用いて種々の時点でサンプリングされ（参照、さらに）、血漿サンプルが、適当なＣＥについて分析され、そして主要なＰＫパラメーターが、２つのｉｖ経路の間で比較された。
【０００９】
伏在静脈は血液サンプリングに関する先行技術において既知である（Ａ．Ｈｅｍ，Ａ．Ｊ．Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｐ．Ｓｏｌｂｅｒｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ
１９９８，３２，３６４−３６８）ことが注目される。
【００１０】
多数回の血液サンプリング
血液サンプリング手順に関しては、要求される時点においてサンプルを収集する数種の先行技術の方法がある。１つの可能性は、ＣＥが１組の動物（例えば、ｎ＝３）に投与され、この動物が血液収集のために適当な時点で犠牲にされる（断頭によって）ことである。利点は、大量の血液サンプルが得られることであるが、今日のＬＣ／ＭＳ／ＭＳの使用は、非常に少量のサンプルが収集されて分析されるのを可能にする。この方法から得られる血漿濃度レベルは、各々異なる時点でサンプリングされた、１組の多数動物の血液サンプルから得られる。したがって、データの解析および主要なＰＫパラメーターの計算は、平均血漿濃度時間プロフィルにおいてのみ実施できる。したがって、このサンプリング方法は、ＰＫの結果における個体間の変動の研究を不可能にする。主な欠点は、研究に必要な大量の動物である。
【００１１】
本発明のさらなる態様は、血液サンプル、特に多数の血液サンプルが同じラットから異なる時点で尾静脈から採取される、新しいサンプリング管理法を研究することである。多数回の血液サンプリング方法は、十分な濃度時間プロフィルが個々の動物から得られるのを可能にするので、各動物からの主なＰＫパラメーターの計算ができる。この方法では、動物間の可変性が試験でき、そして１種のＣＥについて日常的な生物学的利用能の研究を実施するために要求される動物数が有意に低減できる。異なる化学構造をもつＣＥが、ラットに経口的に投与され、そして単回の血液サンプリング（断頭）によるか、または種々の時点において尾静脈からの多数回のサンプリングによって血液が採取された。血漿サンプルは、適当なＣＥについて解析され、そして血漿濃度時間プロフィルおよび計算されたＰＫパラメーターが２種のサンプリング技術の間で比較された。動物の福祉には影響を与えことなく、適当な血漿濃度時間プロフィルを構築し、適当な抽出手順と、その後のＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析を実施できるように、各ラットからの数および量の両方において十分な血漿サンプルが要求される。したがって、血液学的パラメーター、例えばヘマトクッリト（Ｈｃｔ）に及ぼす多数回のサンプリングの強い影響が、所望の期間にわたって種々の量における血液採取後に研究された。
【００１２】
したがって、さらに本発明は、段階（ｂ）において多数の血液サンプルが尾静脈から採取される、覚醒ラットにおける薬動力学パラメーターの決定のための分析方法に関する。
【００１３】
さらに本発明は、方法が、血液／血漿サンプルが薬動力学パラメーターを決定するための生物学的分析技術を用いて分析される、段階（ｂ）の後に組み入れられる段階（ｃ）をさらに含む、覚醒ラットにおける薬動力学パラメーターの決定のための分析方法に関する。
【００１４】
実験
１．材料および方法
１．１．動物
オスのＳＰＦ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２００〜３００ｇ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が研究を通じて使用された。動物は研究の各部分の前に１週間順化させられた。水道水および食餌は自由に摂取された。
【００１５】
１．２．多数回の血液サンプリング技術の有効性確認
尾静脈を介する多数回の血液サンプリングのために、動物は、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＆  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｊａｎｓｓｅｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａ）によって開発された齧歯類用円筒状拘束器中に置かれた。ラットの尾はサンプリングを容易にするために赤外線ランプを用いて暖められた。静脈の血液は、ＥＤＴＡを含有するＭｕｌｔｉｖｅｔｔｅ６００ＫＥチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）中に２７Ｇ注射針によって回収された。
【００１６】
１．２．１．ヘマトクッリトレベルに及ぼす多数回の血液サンプリングの影響
ラットのＨｃｔレベルに及ぼす必要なサンプリング期間にわたって採取された血液の容量の影響が研究された（１群当たりｎ＝５）。０．３ｍｌ（総血液容量２．１ｍｌ）および０．４ｍｌ（総血液容量２．８ｍｌ）の多数回（７ｘ）の血液サンプリング容量が比較された。血液は７および２０分、１，２，４，８および２４時間目に採取された。
【００１７】
Ｈｃｔの容積％は、全血液を分析して白血球および赤血球、血小板および網状赤血球をカウントする、診断用機器（Ａｄｖｉａ  １２０，Ｂａｙｅｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｂｒｕｓｓｅｌ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて計算された。
【００１８】
１．２．２．多数回サンプリング法の薬動力学有効性確認
種々の化学構造物の血漿濃度プロフィルおよび主要なＰＫパラメーターが経口投与後に研究された。血液サンプルが、多数回または単回のサンプリング方法のいずれかによって尾静脈から採取された。
【００１９】
１．２．２．１．試験化合物および調合物
両方法のために、１化合物について同じ調合物が使用されて、結果におけるいずれかの相異が調合物の影響によるものではないことを確認した。試験化合物ＪＮＪ１（ファルネシルトランスフェラーゼ化合物）、ＪＮＪ２（ガランタミン（ｇａｌａｎｔａｍｉｎｅ）臭化水素酸塩）およびＪＮＪ３（ＣＲＦアンタゴニスト）が、０．２５〜１ｍｇ／ｍｌの最終濃度において脱ミネラル水または１０％ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン（ＨＰ−β−ＣＤ）溶液中で調合された。全調合物は光を遮られて室温で保存され、そして定量分析された。動物は容量１０ｍｌ／ｋｇを用いて胃挿管法によって経口的に投薬された。
【００２０】
１．２．２．２．血液サンプリング
化合物を投与後、血液サンプルが所望の時点で採取された。単回のサンプリング方法では、１時点当たり３動物が断頭によって犠牲にされ、そして血液が１０ｍｌのＢ−Ｄ  Ｓｔｅｒｉｌｅ  ＥＤＴＡ  Ｋ３  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒチューブ中に瀉血によって回収された。多数回サンプリング技術では、０．３ｍｌ静脈血液が前記のように尾静脈から繰り返し収集された。各化合物では、３匹のラットが完全血漿濃度時間プロフィルのために使用された。血漿サンプルは、２．４節に記述されたように個々に適確化された研究ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いて適当な化合物について分析された。
【００２１】
１．３．頸静脈または伏在静脈を介する投与後の血漿ＰＫパラメーターの比較
種々の疾病標的および化学的種別／構造にわたる化合物（ｎ＝１１、ここでは必ずしもすべてが報告されていない）の血漿濃度プロフィルおよび主要ＰＫパラメーターが、覚醒ラットにおいて頸静脈（カテーテル）または伏在静脈（直接注射）を介する投与後に比較された。
【００２２】
１．３．１．試験化合物および調合物
両ｉｖ投与経路のために、１化合物について同じ調合物が使用されて、結果における何かの相異が調合物の影響によるものではないことを確認した。化合物（ｎ＝１１；これらにはＪＮＪ４（５ＨＴ２−アンタゴニズム、Ｄ２−アンタゴニズムおよびＳＳＲＩ活性を有する抗精神病薬）、ＪＮＪ５（ＮＫ１２３−アンタゴニスト）およびＪＮＪ６（ＨＳＤ１１βアンタゴニスト）がある）が、１．２５ｍｇ／ｍｌの最終濃度において水溶液またはＨＰ−β−ＣＤ溶液（１０〜２０％，ｐＨ範囲４〜７）として調合された。全調合物はマンニトールで等張化され、光を遮られて室温で保存され、そして定量分析された。全化合物について、調合物は両ｉｖ投与経路に対して２ｍｇ／ｋｇにおいて投薬された。
【００２３】
１．３．２．静脈内投与経路
１．３．２．１．頸静脈を介するｉｖ投与
内在するカテーテルが一般の麻酔下で頸静脈中に入れられた。外科手術は無菌条件下で実施され；外科手術が実施された全表面は、無菌の吸収性不透過性外科用テーブル掛け（Ｕｎｉｄｒａｐｅ，Ｖｙｇｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）で覆われ、外科用器具は１／１０ヒビタン（ｈｉｂｉｔａｎｅ）（５％）／アルコール（７０％）混合液で滅菌され、そして外科手術は無菌の外科用パウダー・フリー手袋（ＮｕＴｅｘＴＭ、Ａｎｓｅｌｌ  Ｍｅｄｉｃａｌ，Ｍａｌａｓｉａ）を用いて実施された。麻酔の導入および気管挿管が３０／７０Ｏ２／Ｎ２Ｏ混合気体中で４％イソフルラン（ｉｓｏｆｌｕｒａｎｅ）（ＦｏｒｅｎｃｅＴＭ；Ａｂｂｏｔｔ，Ｅｎｇｌａｎｄ）下で実施された。ラットは３０／７０Ｏ２／Ｎ２Ｏ混合気体中で１．５％イソフルランを用いる一般麻酔下で維持された。ｉｖカテーテルはＳｉｌａｓｔｉｃＴＭ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ配管（４ｃｍ，ＩＤ  ０．６４ｍｍ  ＯＤ
１．１９ｍｍ；Ｄｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＵＳＡ）およびポリエチレン配管（４ｃｍ，ＰＥ５０；ＩＤ  ０．５８ｍｍおよびＯＤ  ０．９６５ｍｍ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）から構築された。チューブはＬｏｃｔｉｔｅ４０４工業用接着剤（Ｌｏｃｔｉｔｅ、ＵＳＡ）を用いて一緒に固定された。カテーテルは頸静脈中に挿入され、そして鎖骨下の静脈中に進入されて良好な血液採取を可能にした。カテーテルの位置は、カニューレ中へ血液を回収し、次いでヘパリン添加生理食塩水（１００Ｉ．Ｕ．／ｍｌ；Ｈｅｐａｒｉｎ  Ｌｅｏ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を流すことによって確認された。カテーテルは２個の縫合を用いてその位置に維持された。カニューレはヘパリン添加生理食塩水で再び満たされて、それを開放して保った。カニューレは、大きな針を用いて皮下に潜り込ませられ、そしてうなじの小切開を通して外部へ出された。カニューレの末端は取り外し可能なスチールの栓で閉じられた。すべての傷口は無菌の縫合糸（ＭｅｒｓｉｌｋＴＭ４／０，ＥｔｈｉｃｏｎＴＭ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて閉じられた。全動物は、用
量投与前に単独のケージにおいて４８時間回復させられ、そして食餌および水道水を自由に摂取した。調合物を投薬（各化合物についてｎ＝３）後、カテーテルは０．１ｍｌの生理食塩水を流された。
【００２４】
１．３．２．２．伏在静脈を介するｉｖ投与
覚醒ラット（各化合物についてｎ＝３）は、ポリエチレンチューブＰＥ１０（ＩＤ  ０．２８ｍｍおよびＯＤ  ０．６１ｍｍ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）に連結された針（ＭｉｃｒｏｌａｎｃｅＴＭ３，２７Ｇ３／４，０．４ｘ１９，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｉｒｅｌａｎｄ）を用いて伏在静脈を介する直接注入を与えられた。投与前に、脚は毛を剃られ、そして伏在静脈は、より肉眼的に見えるように近位部位においてややつまみ上げられた。ラットは用量投与の間タオルにより拘束された。
【００２５】
１．３．２．３．血液サンプリング
個々の血液サンプル（０．３ｍｌ／時点；総血液容量２．１ｍｌ）が多数回のサンプリング技術によって投与後７および２０分、１，２，４，８および２４時間目に回収された。各化合物および各投与経路では、３〜５匹のラットが完全血漿濃度プロフィルのために使用された。血漿サンプルは以下に記述されるように個々に適確化された研究ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法を用いて適当な化合物について分析された。
【００２６】
実験プロトコールは、ＮＩＨによって出版された（１９８５）「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ
ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ」に準ずる。
【００２７】
１．４．生物学的分析
１．４．１．方法の開発
ＦＤＡによる生物学的分析方法の有効性確認（Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ，Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ＵＳ  ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，ＣＤＥＲ，２００１）は、発見、初期の開発的または機械的ＰＫ研究においては要求されない。それにもかかわらず、有効な決定を可能にするために十分な正確さと精度をもつ血漿濃度を提供できる分析方法を使用することは欠かせない。その目的のために、適確化された研究ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法が各化合物について開発された。得られる方法は、校正曲線および組毎の研究サンプルと一緒に分析される独立の品質管理サンプルの統計学によって表される、ＦＤＡ基準に類似の正確さと精度を示した。さらに、限定される血漿の安定性（３７℃で２時間）が、動物のサンプリングと分析との間における血漿サンプルの全取り扱いをカバーするように検討された。アッセイ間の正確さおよび精度は検討されなかった。
【００２８】
１．４．２．サンプル調製
全化合物について、個々の校正曲線が、ブランクのＥＤＴＡラット血漿（期待される濃度範囲をカバーする）において構築された。独立の品質管理サンプル（ＱＣ）は、全校正範囲をカバーする、２並列における４個の濃度レベルにおけるラットＥＤＴＡ血漿において調製された。研究サンプル、校正およびＱＣサンプルは、一般的なサンプル調製方法を用いて抽出された。サンプルの調製後、（再構築される）残留物がポリプロピレン自動サンプラーバイアルにピペットで添加され、そして個々の適確化された研究方法を用いて分析された。
【００２９】
１．４．３．ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ 
残留物の一定分量が、多数の反応を追跡する（ＭＲＭ）タンデム質量分析に連結された液体クロマトグラフィー（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）（ＡＰＩ−３０００または４０００，Ａｐ
ｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｎａｄａ）を用いて分析された。クロマトグラフィーによる分離は、分析される化合物のクロマトグラフィーでの挙動に依存する、市販品に基づく脱活性化された種々のバンドのＣ−１８カラムにおいて得られた。質量分析計は、ＴｕｒｂｏｌｏｎＳｐｒａｙＴＭ方式（陽イオンエレクトロスプレーイオン化）において操作された。各化合物について、質量分析計は、選択的な親・娘遷移（ｐａｒｅｎｔ−ｄａｕｇｈｔｅｒ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）を測定するように最適化された。クロマトグラフィーのピークの積分は、Ａｎａｌｉｓｔソフトウエア・バージョン１．２（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｎａｄａ）を用いて実施された。最終濃度は直線回帰モデルを用いる、校正曲線応答からの補間によって計算された。両正確さおよび精度は、正確なＰＫ計算を可能にする全化合物についての期待値内にあった。
【００３０】
１．５．データ解析
限定されるＰＫ分析は、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎＴＭ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（Ｖｅｒｓｉｏｎ３．３）を用いて実施された。単回のサンプリング方法では、非区分の（ｎｏｎ−ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌ）データ解析が、平均血漿濃度プロフィル（ｎ＝３／時点）について実施された。多数回のサンプリング方法では、非区分のデータ解析が、各動物（ｎ＝３）から得られた血漿濃度時間プロフィルについて実施された。次いで、平均値が計算されて、多数回および単回のサンプリング法が比較された。計算されたＰＫパラメーターは，最大血漿濃度（Ｃｍａｘ），最大血漿濃度に達する時間（Ｔｍａｘ）、血漿半減期（ｔ１／２）および曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔおよびＡＵＣｉｎｆ）により計算された化合物の曝露（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）について観察された。注射経路（頸静脈カニューレおよび伏在静脈）の比較では、半減期（ｔ１／２）、分布容積（Ｖｄｓｓ（区分解析）またはＶｄｚ（非区分解析）），総血漿クリアランス（Ｃｌ）および曲線下面積（ＡＵＣｌａｓｔおよびＡＵＣｉｎｆ）の主パラメーターが各個々の動物について決定されて、動物間の比較を可能にした。
【００３１】
２．結果
２．１．多数回の血液サンプリング技術の有効性確認
２．１．１．ヘマトクリットレベルに及ぼす多数回の血液サンプリングの影響
図１は、０．３ｍｌの容量で多数回のサンプリング後のラット（ｎ＝６）におけるヘマトクリット（Ｈｃｔ）の容積％を示す。初期の血液サンプルは、４２％の中央値をもつ４２〜４５容積％の範囲のＨｃｔ値を示した。中央値Ｈｃｔ値は徐々に減少し、最終サンプリング点（２４時間目）では３９％の値をもたらした。一元ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定は、Ｈｃｔレベルが第５血液サンプルの後（ｔ＝８および２４時間目）では初期時点に較べて有意に（ｐ＜０．０５）減少されたことを表した。しかしながら、これらのレベル（３７〜４２％の範囲）は、健康なラットについての期待値の範囲（３６〜４８％）（Ｈａｖｅｎａａｒ，Ｒ．；Ｒｉｔｓｋｅｓ−Ｈｏｌｔｉｎｇａ，Ｊ．；Ｍｅｉｊｅｒ，Ｊ．Ｃ．；Ｚｗａｒｔ，Ｐ．Ｂｉｏｌｏｇｉｅ  ｅｎ  ｚｏｏｔｅｃｈｎｉｅｋ．Ｉｎ  Ｐｒｏｅｆｄｉｅｒｎ  Ｅｎ  Ｄｉｅｒｐｒｏｅｖｅｎ；ｖａｎ  Ｚｕｔｐｈｅｎ，Ｌ．Ｆ．Ｍ．，Ｂａｕｍａｎｓ，Ｖ，，Ｂｅｙｎｅｎ，Ａ．Ｃ．，Ｅｄｓ．；Ｗｅｔｅｎｓｃｈａｐｐｅｌｉｊｋｅ  ｕｔｉｇｅｖｅｒｉｊ  Ｂｕｎｇｅ：Ｕｔｒｅｃｈｔ，１９９１；ｐｐ．２０−７４）内になお存在した。
【００３２】
図２は、０．４ｍｌの容量で多数回のサンプリング後のラット（ｎ＝６）におけるＨｃｔの容積％を示す。初期の血液サンプルは、４４％の中央値をもつ４２〜５１容積％の範囲のＨｃｔ値を示した。中央値Ｈｃｔ値は徐々に減少し、最終サンプリング点（２４時間目）では３８％の値をもたらした。一元ＡＮＯＶＡおよびｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｓｔｕｄｅｎｔのｔ検定は、Ｈｃｔレベルが第２血液サンプルの後（ｔ＝１，２，４，８および２４時間目）では初期時点に較べて有意に（ｐ＜０．０５）減少されたことを表した。ｔ＝２４ｈでは、これらのレベルは３５〜３９％の範囲であった。
【００３３】
２．１．２．多数回サンプリング法の薬動力学有効性確認
個々の化合物（以降、ＪＮＪ１、ＪＮＪ２およびＪＮＪ３と呼ばれる）の経口投与後の単回または多数回の血液サンプリングに続く個別または平均の基礎ＰＫパラメーターが、表１〜３において示される。結果から分かるように、両サンプリング技術は、示される３種の化合物について同等のＰＫパラメーターを生じた。例としてＪＮＪ１を用いた場合、平均の最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）は、単回サンプリング群の１ｈにおける４１．４ｎｇ／ｍｌに対して多数回サンプリング群では１±１ｈにおいて６３．６±１７．５ｎｇ／ｍｌに達した。半減期（ｔ１／２）は、単回サンプリング群の１．９２ｈに較べて多数回サンプリング群では２．０２±０．３ｈであった。ＡＵＣｉｎｆによって測定される曝露は、多数回サンプリング群では２９４±４６ｎｇ．ｈ／ｍｌおよび単回サンプリング群では２２４ｎｇ．ｈ／ｍｌであった。この状況は他の２種のＪＮＪ化合物については一定に止まった。血漿濃度および主ＰＫパラメーターに関する動物間の変動性は、多数回サンプリング群から観察されるように低かった。
【００３４】
２．２．頸静脈または伏在静脈を介する投与後の血漿ＰＫパラメーターの比較
７種の化合物（本明細書で報告されたものは全てではない）が２種の経路を用いて投薬された。全化合物が血漿濃度時間曲線および主ＰＫパラメーターのレベルにおいて同等の結果を示した。例として、化合物ＪＮＪ４，ＪＮＪ５およびＪＮＪ６を、頸静脈カニューレを介するか、または直接伏在静脈中に２．５ｍｇ／ｋｇ、単回のｉｖ投与を行った後に、血漿濃度時間プロフィルおよび基礎ＰＫパラメーターが表４〜６および図３〜５のグラフにおいて提示される。結果から分かるように、両サンプリング技術は、示される３種の化合物について同等の血漿濃度時間プロフィルおよび主ＰＫパラメーターを生じた。例としてＪＮＪ４を用いると、両投与経路の平均（ｎ＝％）血漿濃度時間プロフィルは類似のパターンを示した（図３）。血漿濃度は頸静脈投与については２．９ｈおよび伏在静脈投与については３．２ｈの算出された半減期（ｔ１／２）をもって単段階的に低下した（表４）。平均血漿クリアランス（Ｃｌ）は、頸静脈投与については１．７ｌ／ｈ／ｋｇおよび伏在静脈投与については１．６ｌ／ｈ／ｋｇにおいて評価された。平均分布容積（Ｖｄｓｓ）は、頸静脈投与については７．３  ｌ／ｋｇおよび伏在静脈投与については７．５  ｌ／ｋｇにおいて評価された。頸静脈投与についての算出された平均曝露（ＡＵＣｉｎｆ）は１４４５ｎｇ．ｈ／ｍｌおよび伏在静脈投与では１５１２ｎｇ．ｈ／ｍｌであった。ＪＮＪ５について図４から分かるように、血漿濃度は、投薬後８時間まで検出できるだけであった。しかしながら、類似する濃度時間プロフィルおよび対応するＰＫパラメーターが計算された（表５）。
【００３５】
グラフから分かるように、ＪＮＪ６の血漿濃度は、最初の１時間にわたって全く急速に低下し、その後の時点では低い血漿レベルを生成した（図５）。２種の投与経路からのＰＫパラメーターは、血漿クリアランスおよびＡＵＣ（曲線下面積）では同等の値を示すが、最終の血漿半減期および分布容積の値は大きな相異を示す（表６）。このことは、投薬後２〜２４時間の血漿濃度における小さい減少による。全般に、ラットに関しては、この範囲を越えて血漿半減期の値は長く、そして分布容積は高いと考えられる。この化合物によって実施された他の研究（ここでは報告されなかった）から、化合物は主要な器官への広範な組織分布を受け、ここで観察された高い値の分布容積が確認された。
【００３６】
３．検討
３．１．多数回サンプリング技術
単回の血液サンプリング方法は、ラットにおいて血漿ＰＫを研究するために使用される数種の方法の１つである。この方法に由来する結果は、多数の動物から得られ、異なる時点においてサンプリングされ、そして保存された（各時点における血液サンプルまたは分析データ）。次いで、データの解析および主要ＰＫパラメーターの計算が、保存されたデ
ータの平均血漿濃度時間プロフィルにおいて実施された。このサンプリング方法は、動物間のＰＫの結果における変動の研究を不可能にする。したがって、個々の動物における多数回のサンプリングを伴う新しいサンプリング管理法が研究された。十分な血漿サンプルが各ラットから採取されて、動物の良好な状態に影響しない、すなわちＨｃｔのレベルにおける適当な濃度時間プロフィルを構築した。Ｈｃｔにおける変化は、多くの内因性および外因性物質の結合および分布に影響するので、薬物のＰＫにおける重要な因子である、血液細胞の量が変化したことを示す。ラットのＨｃｔレベルが、所望の期間にわたって異なる容量において血液を採取後試験された。血液サンプルの大きさは、生物学的分析のために十分な容量でなければならず、すなわち、抽出手順および続くＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析に合致しなければならない。各動物からのいくつかの異なる時点（ｔ＝７および２０分、１，２，４，８および２４ｈ）における尾静脈を介する０．３ｍｌの容量をもつサンプル（１日当たり総容量２．１ｍｌ）は、ラットのＨｃｔ値に限られた影響を有すると思われた。血液採取によるＨｃｔの容積％における減少があったけれども、最終血液サンプルの値（３７〜４２％）は、なお、健康なラットにおける期待値（３６〜４８％）内の範囲であった。７  ０．４ｍｌの容量サンプリング（総容量２．８ｍｌ）は、Ｈｃｔ値に対してより多くの影響をもつようであった。Ｈｃｔ容積％は、２回目の血液サンプルの後では有意に減少し始め、そして最終（ｔ＝２４ｈ）血液サンプルでは、健康なラットの期待値以下の値を示した（３５〜３９％）。これらの値は２．４ｍｌ以上の容量において期待される健康なレベル以下に低下し始めるので、これらのデータは、２４時間以内の総容量２．１ｍｌの血液採取はＨｃｔレベルに劇的な影響を与えないことを示している。しかしながら、これらのレベルは、なお限界線であることを記述しなければならない。Ｈｃｔ値に及ぼすサンプリング容量の影響を最小にするために、１日当たり２．１ｍｌの総サンプリング容量以下が、さらなる研究のために推奨された。各時点にける尾静脈からの０．３ｍｌの血液採取は、血漿濃度時間曲線および主ＰＫパラメーターの算出を十分に説明するために各動物から採取されるのに十分なサンプル（７）を可能にする。
【００３７】
多数回および単回のサンプリング技術を用いる指定された化合物の血漿濃度プロフィルについて実施されたＰＫ研究の結果の比較は、新しいサンプリング方法の比較と、それに続く有効性確認を可能にした。この結果は、一定の時点において３匹の個々の動物からの７回の少量（０．３ｍｌ）の血液サンプルのサンプリングが、１時点当たり３匹の個々の動物を使用することに対して同等の結果を与え、それによって、多数回のサンプリング技術が、代替法として使用できることを例証した。多数回のサンプリング方法は、動物間の変動性が試験できるように、異なる時点で多数の血液サンプルが同じ動物から採取できるという利点を有する。３化合物について、動物間の変動性が実際に低いことが示された。また、それは、１種のＣＥについての日常的な生物学的利用能の研究を実施するのに必要とされる動物数を劇的に低下させる。このサンプリング方法は、確実な、再現性のあるものであり、そしてここに、ラットにおけるすべての生物学的利用能の研究において実行された。
【００３８】
このサンプリング技術を用いる場合、理想的には、尾静脈は、投与部位からの汚染の危険性と、その後のサンプリングの問題（静脈の過度の使用と衰退による）のために、化合物のｉｖ投与の経路として使用されてはならない。この態様を克服するために、本研究者らの薬物発見グループでは、化合物は、日常的に、内在する頸静脈カテーテルを介する注入によって投与された。しかしながら、麻酔下で頸静脈中に内在するカテーテルを入れることは、時間の浪費（外科手術と回復時間のために）であり、そして若干の動物にはトラウマを惹起した。したがって、新しいｉｖ投与経路、覚醒ラットにおいて伏在静脈を介する直接注射が研究された。
【００３９】
３．２．伏在静脈投与
伏在静脈は頸静脈に較べて比較的細いが、注射部位を通過する血液流動は、全身的な循
環中に化合物を運ぶのに十分な能力をもっている。この新しい技術の利点は、すべての血液容器の結紮がカテーテルの慢性的移植に較べられるようには起きないので、動物における血液供給を変化させずに残せることである。その他の利点は、それが、外科手術と回復時間を必要としないので、時間を節約できることである。このことは順に、ｉｖＰＫパラメーターに関するＮＣＥの試験において処理能力の速度向上を助ける。本研究は、伏在静脈を介する投与が古典的な投与技術（頸静脈を介する）の１つを用いて得られる類似のＰＫプロフィルをもたらすか否かを研究するために計画された。化学構造と溶解度において多様な化合物が使用されて、この新しい技術が、種々の疾病領域標的（５）および種々の調合物（蒸留水、１０〜２０％ヒドロキシル−β−シクロデキストリン）を包含する多種類の化学的独立体（ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）について使用できることが示された。２つの異なる経路を介する１２種の異なる化合物の投薬後に得られたＰＫ結果の比較は、尾静脈からの多数回のサンプリングと共役された伏在静脈中への直接注射が、血液サンプリングの同じ方法による頸静脈投与後のそれと類似する血漿濃度時間プロフィルおよび同等のＰＫ結果を生じることを例証した。すべての化合物について、両ｉｖ経路を介する投与が血漿濃度レベルの若干の個体間の変動性をもたらすが、これは、動物を用いて作業した場合に期待され、かつ許容できる範囲内にあることが示された。
【００４０】
３．３．結論
新しい技術は、予備的な外科手術および回復のために要求される時間（１〜２日）を低減し、そして濃度時間曲線が各動物から収集できるので、主なＰＫパラメーターの動物間の比較を可能にする。日常的な少量血液サンプルのサンプリングは、ラットのＨｃｔには何の大きな影響も与えず、そして生物学的分析の考慮すべき問題に適合している。最後には、１時点毎に個々の動物を使用する研究および／または麻酔を伴うサンプリング手順に較べると、そのような日常的研究に必要とされる動物数における低減が可能である。
【００４１】
多数回のサンプリング技術と組み合わせて伏在静脈を介する新しい投与経路は、ｉｖ投与が要求される薬物発見におけるすべての将来のラット研究のために、日常的に使用することができる。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ラットにおける０．３ｍｌの容量の多数回サンプリングによるヘマトクリットレベルに及ぼす影響を示すグラフである。
【図２】ラットにおける０．４ｍｌ容量の多数回サンプリングによるヘマトクリットレベルに及ぼす影響を示すグラフである。
【図３】ラットにおける２．５ｍｇ／ｋｇのＪＮＪ５の頸静脈または伏在静脈を介する単回静脈内投与後の平均（ｎ＝５）血漿濃度の経時変化を示すグラフである。
【図４】ラットにおける２．５ｍｇ／ｋｇのＪＮＪ５の頸静脈または伏在静脈を介する単回静脈内投与後の平均（ｎ＝３）血漿濃度の経時変化を示すグラフである。
【図５】ラットにおける２．５ｍｇ／ｋｇのＪＮＪ５の頸静脈または伏在静脈を介する単回静脈内投与後の平均（ｎ＝３）血漿濃度の経時変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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