(57)【要約】  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の減少、及び腫瘍浸潤ＣＤ４＋  Ｔ細胞の相当な増加による、浸潤免疫細胞の相当な変化をもたらす、ＣＤ４／ＣＤ８比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる方法。特定の比率で、サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦと、インターロイキン２（ＩＬ−２）と、を含有する、無血清且つマイトジェンフリーの混合物である白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）を、８００ＩＵ／日（ＩＬ−２に換算）の用量で週５日、３週間投与すると、パラダイムシフトが生じた。このパラダイムシフトは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の著明な浸潤、並びに癌巣中の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）及び炎症細胞（特に、好中球）の密度及び局所分布の明白且つ特異的な変化によって規定される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍中のＣＤ４／ＣＤ８比を変化させる方法であって、
腫瘍に、治療有効量の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物を投与するステップを含む方法。
【請求項２】
８００ＩＵ／ｍＬ（ここで、ＩＵは、ヒトＩＬ−２に関する世界保健機関第１次国際標準、８６／５０４で規定されている、インターロイキン２に関する国際単位を表す。）の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物を週５回、３週間に渡って投与する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
８００ＩＵ／ｍＬの無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物のうちの４００ＩＵ／ｍＬを腫瘍塊周囲の４つの異なる部位に、１００ＩＵ／ｍＬが４つの部位の各々に注射されるように注射し、４００ＩＵ／ｍＬを腫瘍塊と同側の外リンパに注射する、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
外リンパへの４００ＩＵ／ｍＬの注射を、腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物が、下記特定比率で、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択されるサイトカインと、インターロイキン２（ＩＬ−２）と、を含有する、請求項１に記載の方法。
ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率：０．４〜１．５
ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率：３．２〜１０．９
ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率：１．５〜１０．９
ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率：２．２〜４．８
【請求項６】
サイトカインの前記特定比率が下記の通りである、請求項５に記載の方法。
ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率：０．６〜０．８
ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率：７．７〜１１．３
ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率：４．９〜７．１
ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率：３．５〜４．５
【請求項７】
腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる方法であって、
癌に、治療有効量の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物を投与するステップを含む方法。
【請求項８】
８００ＩＵ／ｍＬ（ここで、ＩＵは、ヒトＩＬ−２に関する世界保健機関第１次国際標準、８６／５０４で規定されている、インターロイキン２に関する国際単位を表す。）の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物を週５回、３週間に渡って投与する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
８００ＩＵ／ｍＬの無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物のうちの４００ＩＵ／ｍＬを腫瘍塊周囲の４つの異なる部位に、１００ＩＵ／ｍＬが４つの部位の各々に注射されるように注射し、４００ＩＵ／ｍＬを腫瘍塊と同側の外リンパに注射する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
外リンパへの４００ＩＵ／ｍＬの注射を、腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に行う、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物が、下記特定比率で、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択されるサイトカインと、インターロイキン２（ＩＬ−２）と、を含有する、請求項７に記載の方法。
ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率：０．４〜１．５
ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率：３．２〜１０．９
ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率：１．５〜１０．９
ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率：２．２〜４．８
【請求項１２】
サイトカインの前記特定比率が下記の通りである、請求項１１に記載の方法。
ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率：０．６〜０．８
ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率：７．７〜１１．３
ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率：４．９〜７．１
ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率：３．５〜４．５
【請求項１３】
下記特定比率で、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択されるサイトカインと、インターロイキン２（ＩＬ−２）と、を含有する、無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物。
ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率：０．４〜１．５
ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率：３．２〜１０．９
ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率：１．５〜１０．９
ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率：２．２〜４．８
【請求項１４】
サイトカインの前記特定比率が下記の通りである、請求項１３に記載の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物。
ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率：０．６〜０．８
ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率：７．７〜１１．３
ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率：４．９〜７．１
ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率：３．５〜４．５
【請求項１５】
下記特定比率で、ＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦからなる群より選択されるサイトカインと、インターロイキン２（ＩＬ−２）と、を含有し、
薬学的に許容される賦形剤、担体又は添加剤を随意的に更に含有する、癌治療用の医薬組成物。
ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率：０．４〜１．５
ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率：３．２〜１０．９
ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率：１．５〜１０．９
ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率：２．２〜４．８
【請求項１６】
サイトカインの前記特定比率が下記の通りである、請求項１５に記載の医薬組成物。
ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率：０．６〜０．８
ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率：７．７〜１１．３
ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率：４．９〜７．１
ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率：３．５〜４．５
【請求項１７】
ＩＬ−３を更に含有し、ＩＬ−３のＩＬ−２に対する比率が、０．３８〜０．６８、好ましくは０．５３±０．１５である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
ＩＬ−６を更に含有し、ＩＬ−６のＩＬ−２に対する比率が、３７．２〜５３．８、好ましくは４６±５．９である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
ＩＬ−８を更に含有し、ＩＬ−８のＩＬ−２に対する比率が、２６１〜５６１．５、好ましくは４１１±１０．６である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
ＩＬ−１αを更に含有し、ＩＬ−１αのＩＬ−２に対する比率が、０．５６〜０．９４、好ましくは０．７５±０．１９である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ＩＬ−１０を更に含有し、ＩＬ−１０のＩＬ−２に対する比率が、２．８７〜３．２２、好ましくは３．０±０．１８である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
ＩＬ−１６を更に含有し、ＩＬ−１６のＩＬ−２に対する比率が、１．１６〜２．８４、好ましくは１．８４±０．６８である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
Ｇ−ＣＳＦを更に含有し、Ｇ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率が、２．１６〜３．７８、好ましくは２．９７±０．８１である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
ＴＮＦ−βを更に含有し、ＴＮＦ−βのＩＬ−２に対する比率が、１．１７〜２．４３、好ましくは１．８±０．６３である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
ＭＩＰ−１αを更に含有し、ＭＩＰ−１αのＩＬ−２に対する比率が、１５．７〜３７．１６、好ましくは２２．７±７．０である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
ＭＩＰ−１βを更に含有し、ＭＩＰ−１βのＩＬ−２に対する比率が、１７．１〜２８．５、好ましくは２２．８±５．７である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ＲＡＮＴＥＳを更に含有し、ＲＡＮＴＥＳのＩＬ−２に対する比率が、２．３〜２．７、好ましくは２．５±０．１３である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
ＥＧＦを更に含有し、ＥＧＦのＩＬ−２に対する比率が、０．２６７〜０．２８３、好ましくは０．２７５±０．００８である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
ＰＧＥ２を更に含有し、ＰＧＥ２のＩＬ−２に対する比率が、３．６３〜５．４２、好ましくは４．５±０．８７である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ＴｘＢ２を更に含有し、ＴｘＢ２のＩＬ−２に対する比率が、２３．４７〜２５．１３、好ましくは２４．３±０．８３である、請求項１６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【イントロダクション】
【０００１】
[1]  本特許又は出願は、カラーを用いて作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を有する本出願又は特許出願公報のコピーは、請求及び必要な料金の支払いにより、特許庁より提供される。
【０００２】
[2]  本発明は、ＣＤ４／ＣＤ８比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる方法に関する。８００ＩＵ／日（ＩＬ−２に換算）を週５日投与する白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）治療を合計３週間行うと、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の減少、及び腫瘍浸潤ＣＤ４＋  Ｔ細胞の相当な増加による、浸潤免疫細胞の相当な変化が見られる。口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）患者の対照無処置群で見られる低いＣＤ４／ＣＤ８比は、ＬＩ治療により、間質内及び上皮内で劇的に上昇した。また、進行した原発性ＯＳＣＣ患者に、８００ＩＵ／日（ＩＬ−２に換算）を週５日投与するネオアジュバントＬＩ治療を３週間行った結果、パラダイムシフトが生じた。このパラダイムシフトは、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の著明な浸潤、並びに癌巣中の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）及び炎症細胞（特に、好中球）の密度及び局所分布の明白且つ特異的な変化によって規定される。
【０００３】
[3]  白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）は、特定の比率で、サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦと、インターロイキン２（ＩＬ−２）と、を含有する、無血清且つマイトジェンフリーの混合物である。ＬＩは、癌細胞が細胞周期増殖期に入るのを誘導し、それによって化学療法、放射線療法及び免疫療法に対する感受性を高めるのにも有効である。２００３年７月３日出願の米国特許出願１０／６１１９１４（参照されることにより、本明細書にそのまま組み込まれる。）に記載のように、ＬＩは、癌治療のために単独で、又は他剤と組み合わせて使用することができ、それによって癌治療の成功率、及び癌患者の無病生存率を増加させる。
【発明の背景】
【０００４】
[4]  腫瘍宿主相互作用は腫瘍発達の複雑な機構であり、抗癌治療のためのますます重要な標的となっている（Ｔｉｍａｒら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ＩＩＩ．Ｔａｒｇｅｔ  ａｒｒａｙ  ａｎｄ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ」、Ｐａｔｈｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｓ  ９：４９（２００３））。癌細胞、免疫エフェクター細胞、炎症細胞、腫瘍脈管構造及び間質の間の細胞間相互作用は、複雑で多面的な相互作用を示す。この複雑な双方向性ネットワークの個々のメンバーの機能の治療的調整は、より強い腫瘍制御をもたらすと考えられる。
【０００５】
[5]  良好な免疫療法の抗癌作用は、一般に、標的腫瘍細胞上の腫瘍抗原及びＭＨＣ抗原の発現、エフェクター機構への癌細胞の感受性、並びに抗癌エフェクター機構の活性の誘導／増大をもたらす（Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅ、「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｒｅｐ  ３：４６（２００１）；Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅら、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｌｏｃａｌ  ａｎｄ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：５６５４（１９９３））。サイトカインを用いて免疫エフェクター機構を強化することにより上記目標を達成する、実行可能な免疫戦略がいくつか存在する。口腔扁平上皮癌（ＯＳＣＣ）は最近まで免疫療法の標的とは考えられていなかったが、Ｗｈｉｔｅｓｉｄｅらによる先駆的な研究は、免疫療法的アプローチが、この極めて攻撃的な癌を管理する新たな方法となりうることを示唆した。
【０００６】
[6]  初期の結果は、ｒｈＩＬ−２の局所投与に関して、奏効率の変動が大きい（６〜６５％）ことを示した（Ｖｌｏｃｋら、「Ｐｈａｓｅ  Ｉｂ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  ｉｎｔｒａｎｏｄａｌ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ：ａｎ  ｅａｓｔｅｒｎ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ｇｒｏｕｐ  ｔｒｉａｌ」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １５：１３４（１９９４）；Ｃｏｒｔｅｓｉｎａら、「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｉｎｊｅｃｔｅｄ  ａｒｏｕｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  １３：１２５（１９９１））。ＯＳＣＣ患者へのｒｈＩＬ−２の局所投与を含む第３相試験の結果、全生存率と同様に無病生存率が有意に（ｐ＜０．０３）上昇した（Ｄｅ  Ｓｔｅｆａｎｉら、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｒｏｐｈａｒｙｎｘ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎｓ」、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  １９：１２５（１９９６）；Ｄｅ  Ｓｔｅｆａｎｉら、「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｗｉｔｈ  ｐｅｒｉｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｅｃｔａｂｌｅ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｏｒａｌ  ｃａｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｏｒｏｐｈａｒｙｎｘ」、Ｃａｎｃｅｒ  ９５：９０（２００２））。ｒｈＩＬ−２で治療されたＯＳＣＣ患者から得られた腫瘍組織の組織学的検査では、巣状壊死を有するＣＤ２５＋／ＨＬＡＤＲ＋／ＣＤ３＋Ｔ細胞の増加が示された（Ｖａｌｅｎｔｅら、「Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｓｕｂｓｅｔｓ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｆｒｏｍ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｐｅｒｉｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２」、Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌ  ３：７０２（１９９０）。
【０００７】
[7]  天然のサイトカインの混合物と天然のＩＬ−２とを用いた臨床試験は、３０％〜５３．３％の奏効率を示した（Ｈａｄｄｅｎら、「Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒａｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ」、Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ  １２０：３９５（１９９４）；Ｖｅｒａｓｔｅｇｕｉら、「Ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ＩＲＸ−２）ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｗｉｔｈ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎｄｕｃｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃ  １９：６１９（１９９７）；Ｍｅｎｅｓｅｓら、「Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｒｅｃｅｉｖｉｎｇ  ｐｅｒｉｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｍｉｘｔｕｒｅ（ＩＲＸ−２）ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ｓｕｒｇｅｒｙ」、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ  １２２：４４７（１９９８）；Ｂａｒｒｅｒａら、「Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ」、Ａｒｃｈ．（２０００））。組織病理学的分析は、天然のサイトカイン混合物が、腫瘍の顕著な用量依存性Ｔリンパ球浸潤及び腫瘍断片化を誘導することを示した。
【０００８】
[8]  他方、特定の比率で、サイトカインＩＬ−１β、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ及びＧＭ−ＣＳＦと、インターロイキン２（ＩＬ−２）と、を含有する、無血清且つマイトジェンフリーの白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）混合物は、ＣＤ３＋、ＣＤ２５＋Ｔリンパ球が腫瘍細胞巣に浸潤すること、及び癌細胞が細胞周期モードに入ることを誘導した（Ｔｉｍａｒら、「Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ（Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ（登録商標））Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  Ｐｅｒｉｔｕｍｏｒａｌ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  Ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｏｎ  Ｔｕｍｏｒ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａ：Ａ  Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  Ｎｅｗ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ａｕｇｍｅｎｔｉｎｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ  １１３：２２０６（２００３））。
【０００９】
[9]  Ｔｉｍａｒらに報告されているように、約２０ＩＵ〜１６００ＩＵ、又は特に４００ＩＵ若しくは８００ＩＵの白血球インターロイキン（ＬＩ）注射が、２週間に渡って、週３回、腫瘍周囲に投与され、或いは、約２０ＩＵ〜１６００ＩＵ、又は特に４００ＩＵ若しくは８００ＩＵが、週５回投与された（ここで、ＩＵは、ヒトＩＬ−２に関する世界保健機関第１次国際標準、８６／５０４で規定されている、インターロイキン２に関する国際単位を表す）。これらの用量を、従来の療法より前の第１選択の治療として、進行した原発性ＯＳＣＣの患者に投与すると、炎症細胞ではなく浸潤免疫細胞において腫瘍内変化が誘導された。ＣＤ２５＋発現の増加によって明らかなように、癌巣に移動したＴ細胞集団、及び浸潤ＣＤ８＋  Ｔ細胞が活性化された。
【００１０】
[10]  腫瘍破壊のためにＣＤ８＋  細胞傷害性Ｔ細胞が必要であることが科学文献で一般に認められているが、ＯＳＣＣの腫瘍細胞上のＨＬＡクラス１の発現の欠如は、ＯＳＣＣにおけるＣＤ８＋  細胞ターゲッティングを排除しているようである。従って、ＯＳＣＣへの良好な免疫応答のためには、腫瘍中の低いＣＤ４／ＣＤ８比を逆転させる必要がある。
【００１１】
[11]  特に、ナイーヴな無処置のＯＳＣＣ患者における腫瘍及びその周囲の間質中の、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に対するＣＤ８＋  Ｔ細胞の優勢は、ＯＳＣＣに特異的なものではなく、他の多くの固形腫瘍で見られる。同様に、低いＣＤ４／ＣＤ８比が基底細胞癌、子宮頸癌及び乳癌で検出されているが、これは、それらの腫瘍によって、患者において後天的な免疫抑制状態が誘導されることを示唆している（Ｒｏｈｒｂａｃｈら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ  ｏｆ  ｏｃｕｌａｒ  ｂａｓａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｇｒａｅｆｅｓ  Ａｒｃｈ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  ２３９：３５（２００１）；Ｓａｎｔｉｎら、「Ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｌｉｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  １  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｏｒｓ  ａｎｄ  ＤＲ＋Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｕｍｏｒ  ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｃａｎｃｅｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｃｅｒｖｉｘ」、Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  ８１：４２４（２００１）；Ｂｅｎ−Ｈｕｒら、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｒｐｈｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｔｕｄｙ」、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２２（２Ｂ）：１２３１（２００２））。
【００１２】
[12]  総合すると、これらの研究及び観察は、天然のサイトカインの混合物による局所療法が、ＯＳＣＣの治療への実行可能なアプローチであることを示している。しかし、誘導された、腫瘍における細胞浸潤の変化、腫瘍組織学的変化、並びに、臨床的に測定された反応の間の関係は評価されなかった。
【００１３】
[13]  従って、癌巣内の抗原提示細胞（樹状細胞）及び炎症細胞（特に、好中球）の密度及び局所分布を特異的に調整する必要がある。また、腫瘍免疫細胞浸潤の構成を変化させて、腫瘍内ＣＤ４／ＣＤ８比を逆転させる必要がある。また、ＬＩの投与と組み合わせて、ＣＤ４／ＣＤ８比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させて、残存腫瘍細胞の放射線療法に対する感受性を高める方法を提供する必要がある。
【００１４】
[14]  Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期及びＭ期からなる（細胞周期の異なる相の）群から選択される細胞周期へ腫瘍細胞を誘導する方法も必要である。この新たな方法は、化学療法、免疫療法及び放射線療法と共に、また、ＣＤ４／ＣＤ８比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させることにより、相乗的に適用することができる。
【００１５】
[15]  ＣＤ４／ＣＤ８比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させることにより、公知の組成物又は方法に優る予想外の効果を示す、特定の比率で、ＩＬ−１β及びＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２、並びにＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２、を含有する、新規の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物が必要であるのみならず、癌腫瘍一般を前感作することも必要である。
【発明の概要】
【００１６】
[16]  本発明の一部は、特定の比率で、サイトカインＩＬ−１β及びＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２、並びにＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２を含有する、無血清且つマイトジェンフリーの白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）混合物を用いて、ＣＤ４／ＣＤ８比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる方法に基づく。本発明は、医薬として、或いは、癌治療（例えば、化学療法、免疫療法及び放射線療法）と共に用いるアジュバントとして有用な組成物の開発も可能にする。
【００１７】
[17]  本発明の実施形態では、新生物又は免疫系疾患において、無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物を用いてＣＤ４／ＣＤ８比を変化させる方法が開示される。このような方法は、腫瘍細胞を殺傷する放射線療法又は他の物理療法と併用する、癌治療のための前感作ステップを提供する。Ｇ１期、Ｓ期、Ｇ２期及びＭ期からなる（細胞周期の異なる相の）群から選択される感受性細胞周期相に腫瘍細胞を誘導する方法も企図される。本発明は、特定の１種の癌に限定されず、いかなる種類の癌も包含する。
【００１８】
[18]  具体的な適用例としては、白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）の総日用量の半量を腫瘍周囲に投与し、総日用量の他の半量を３週間に渡って、週５回、外リンパに投与することが挙げられる。総日用量は、ＩＬ−２に換算して８００ＩＵ／ｍＬ（ここで、ＩＵは、ヒトＩＬ−２に関する世界保健機関第１次国際標準、８６／５０４で規定されている、インターロイキン２に関する国際単位を表す。）である。全用量の半分は、腫瘍周囲用量である。すなわち、４００ＩＵは、腫瘍塊周囲の４つの異なる部位に注射する。各部位に約１００ＩＵ／ｍＬ（ＩＬ−２に換算）が投与されるように、腫瘍周囲用量の１／４ずつを４つの部位の各々に注射する。ＬＩは、可視的／触知可能な腫瘍塊の周縁部に皮内投与する。４００ＩＵ（ＩＬ−２に換算）の全用量の残りの半分は、同一受診時に、腫瘍周囲への投与に続いて、腫瘍部位と同側の外リンパに投与する。外リンパへの注射は、注射された腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に行う。
【００１９】
[19]  本発明の他の実施形態は、以下の特定比率のサイトカイン及びインターロイキン２（ＩＬ−２）を含有する白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）を包含する。ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率（ＩＬ−１β／ＩＬ−２）が０．４〜１．５、好ましくは０．７±０．１；ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率（ＴＮＦ−α／ＩＬ−２）が３．２〜１０．９、好ましくは９．５±１．８；ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率（ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２）が１．５〜１０．９、好ましくは６．０±１．１；ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率（ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−２）が２．２〜４．８、好ましくは４．０±０．５。
【００２０】
[20]  他の具体的な適用例では、無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン製剤又は医薬組成物は、他の異なるサイトカイン及び他の生物活性小分子を含有し、生物活性小分子及びＩＬ−２の比率は以下の通りである。ＩＬ−３のＩＬ−２に対する比率が０．３８〜０．６８、好ましくは０．５３±０．１５；ＩＬ−６のＩＬ−２に対する比率が３７．２〜５３．８、好ましくは４６±５．９；ＩＬ−８のＩＬ−２に対する比率が２６１〜５６１．５、好ましくは４１１±１０．６；ＩＬ−１αのＩＬ−２に対する比率が０．５６〜０．９４、好ましくは０．７５±０．１９；ＩＬ−１０のＩＬ−２に対する比率が２．８２〜３．２２、好ましくは３．０±０．１８；ＩＬ−１６のＩＬ−２に対する比率が１．１６〜２．８４、好ましくは１．８４±０．６８；Ｇ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率が２．１６〜３．７８、好ましくは２．９７±０．８１；ＴＮＦ−βのＩＬ−２に対する比率が１．１７〜２．４３、好ましくは１．８±０．６３；ＭＩＰ−１αのＩＬ−２に対する比率が１５．７〜３７．１６、好ましくは２２．７±７．０；ＭＩＰ−１βのＩＬ−２に対する比率が１７．１〜２８．５、好ましくは２２．８±５．７；ＲＡＮＴＥＳのＩＬ−２に対する比率が２．３〜２．７、好ましくは２．５±０．１３；ＥＧＦのＩＬ−２に対する比率が０．２６７〜０．２８３、好ましくは０．２７５±０．００８；ＰＧＥ２のＩＬ−２に対する比率が３．６３〜５．４２、好ましくは４．５±０．８７；ＴｘＢ２のＩＬ−２に対する比率が２３．４７〜２５．１３、好ましくは２４．３±０．８３。
【００２１】
[21]  本発明の他の目的及び利点は、以下で説明する。開示の一部を構成する添付図面及び表は、本発明の原理を例示し、また、明細書と共にそれを説明する。当業者には、本発明の他の態様が、添付図面及び以下の詳細な説明を参考にすれば明白になることが理解されよう。
【００２２】
[22]  本発明を、以下の説明及び具体的な実施形態により、また、添付図面も用いて、より詳細に説明する。
【発明の詳細な説明及び好適な実施形態】
【００２３】
[32]  本発明は、癌腫瘍一般を前感作する方法、並びに、特定の比率で、ＩＬ−１β及びＩＬ−２、ＴＮＦ−α及びＩＬ−２、ＩＦＮ−γ及びＩＬ−２、並びにＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−２、を含有する、新規の無血清且つマイトジェンフリーのサイトカイン混合物に関する。そのような新規サイトカイン混合物の１つは、白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）であり、免疫調整能力を示している。癌患者における免疫抑制の臨床的重要性は、意外なことに、治療前、特に細胞周期相への腫瘍細胞の突入前に癌を前感作する方法に影響を及ぼす。
【００２４】
[33]  更に、週５回、３週間の、腫瘍周囲への４００ＩＵ／ｍＬの白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）の投与、及び外リンパへの４００ＩＵ／ｍＬの投与は、ＣＤ４／ＣＤ８比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させた。腫瘍周囲への投与は、腫瘍塊周囲の４つの異なる部位に１００ＩＵ／ｍＬ（ＩＬ−２に換算）を注射することによって行う。各部位に約１００ＩＵ／ｍＬ（ＩＬ−２に換算）が投与されるように、全腫瘍周囲用量の１／４ずつを４つの部位の各々に注射する。８００ＩＵ（ＩＬ−２に換算）の全用量の残りの半分は、同一受診時に、腫瘍周囲への投与に続いて、腫瘍部位と同側の外リンパに投与する。外リンパへの注射は、注射された腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に行う。ＩＵは、ヒトＩＬ−２に関する世界保健機関第１次国際標準、８６／５０４で規定されている、インターロイキン２に関する国際単位を表す。
【００２５】
[34]  白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）は、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージを含むヒト末梢血単核細胞から産生される、無血清、マイトジェンフリー且つ抗生物質フリーの製剤である。ＬＩには、一体としてＬＩ固有の生物活性にとって重要な３つのサイトカイン「ファミリー」が存在する。それらには、直接的細胞傷害性／細胞増殖抑制性及び殺ウイルス性／ウイルス増殖抑制性のサイトカイン（ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ等）、リンパ球増殖性サイトカイン（ＩＬ−１、ＩＬ−２等）、並びに走化性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α等）が含まれる。更に、ＬＩを構成する異なるサイトカイン及び生体小分子のすべては、Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージを含むヒト末梢血単核細胞のレクチン（ＰＨＡ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激に由来する。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配による遠心分離は、供与体全血から白血球（Ｔ細胞、Ｂ細胞及びマクロファージを含む。）を分離し、一連の洗浄（生理緩衝液中）は、リンパ球の単離、並びに供与体全血の単離白血球成分からの赤血球、細胞破片及び他の不要な細胞成分の除去を促進する。
【００２６】
[35]  ＬＩは、以下の特定比率のサイトカイン及びインターロイキン２（ＩＬ−２）を含有する。ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率（ＩＬ−１β／ＩＬ−２）が０．４〜１．５、好ましくは０．７±０．１；ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率（ＴＮＦ−α／ＩＬ−２）が３．２〜１０．９、好ましくは９．５±１．８；ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率（ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２）が１．５〜１０．９、好ましくは６．０±１．１；ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率（ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−２）が２．２〜４．８、好ましくは４．０±０．５。
【００２７】
[36]  各製剤中には、ＬＩ内の他の異なるサイトカイン及び他の生物活性小分子も存在し、生物活性小分子及びＩＬ−２の比率は以下の通りである。ＩＬ−３のＩＬ−２に対する比率が０．３８〜０．６８、好ましくは０．５３±０．１５；ＩＬ−６のＩＬ−２に対する比率が３７．２〜５３．８、好ましくは４６±５．９；ＩＬ−８のＩＬ−２に対する比率が２６１〜５６１．５、好ましくは４１１±１０．６；ＩＬ−１αのＩＬ−２に対する比率が０．５６〜０．９４、好ましくは０．７５±０．１９；ＩＬ−１０のＩＬ−２に対する比率が２．８２〜３．２２、好ましくは３．０±０．１８；ＩＬ−１６のＩＬ−２に対する比率が１．１６〜２．８４、好ましくは１．８４±０．６８；Ｇ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率が２．１６〜３．７８、好ましくは２．９７±０．８１；ＴＮＦ−βのＩＬ−２に対する比率が１．１７〜２．４３、好ましくは１．８±０．６３；ＭＩＰ−１αのＩＬ−２に対する比率が１５．７〜３７．１６、好ましくは２２．７±７．０；ＭＩＰ−１βのＩＬ−２に対する比率が１７．１〜２８．５、好ましくは２２．８±５．７；ＲＡＮＴＥＳのＩＬ−２に対する比率が２．３〜２．７、好ましくは２．５±０．１３；ＥＧＦのＩＬ−２に対する比率が０．２６７〜０．２８３、好ましくは０．２７５±０．００８；ＰＧＥ２のＩＬ−２に対する比率が３．６３〜５．４２、好ましくは４．５±０．８７；ＴｘＢ２のＩＬ−２に対する比率が２３．４７〜２５．１３、好ましくは２４．３±０．８３。
【００２８】
[37]  白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）は、特性評価プロトコルを用いて試験したが、以下のサイトカイン及び他の生物活性小分子を含有しない。ＩＬ−４、ＩＬ−７及びＩＬ−１５、ＴｆＲ、ｓＩＣＡＭ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＩＦＮ−α、ＥＰＯ、ＬＴＣ４、ＴＧＦ−β２、ＦＧＦベーシック、アンギオゲニン、ｓＥ−セレクチン、ＳＣＦ及びＬＩＦ。ＬＩは、ＩＬ−１２及びＬＴＢ４を微量（アッセイの検出レベルより少し多い。）しか含有しない。
【００２９】
[38]  米国特許第５０９３４７９号、４３９０６２３号、４３８８３０９号、４４０６８３０号、４６６１４４７号、４６８１８４４号及び４４６４３５５号（すべて、参照されることにより、本明細書に組み込まれる。）で開示されているように、製造過程では、単核細胞を、段階密度勾配遠心分離によってヒト供与体の「バフィーコート」から分離し、培養物中の供与体白血球からのＩＬ−２及び他のサイトカインの産生及び分泌を高めるためにＰＨＡと共に培養する。その後、培養上清を無菌的に収集、清澄化し、通常のウイルス排除工程に付する。次に、上清を、限外濾過及び微量濾過により更に約１０倍濃縮する。
【００３０】
[39]  この時点で、ヒト血清アルブミン注射剤ＵＳＰを加え、更に緩衝液を加えて濃縮物を生理的ｐＨにして、表示量（例えば、４００ＩＵ／ｍＬ）に従う標的ＩＬ−２濃度にする。次に、濃縮物を第２の微量濾過（定格０．２２ミクロンフィルター）で濾過し、無菌の血清型バイアルに無菌的に分配し、そのＩＬ−２含量に従ってラベル表示する。製品の効力は、細胞傷害性Ｔリンパ球系（ＣＴＬＬ−２）による放射性標識チミジンの取込みによって測定する。最終的な注射剤は、５つのマーカーサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの存在について、ＥＬＩＳＡにより更に試験する。
【００３１】
（定義）
[40]  ＩＬ−２：  インターロイキン２（ＩＬ−２）。ＣＤ４＋  ヘルパーＴリンパ球（正式には、Ｔ細胞増殖因子として知られる。）によって合成される１５．５ｋＤの糖タンパク質。ＩＬ−２は、それを産生するＣＤ４＋  Ｔリンパ球及び他の免疫系細胞（Ｂリンパ球、ＣＤ８＋  Ｔリンパ球、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞等を含む。）に作用するオートクリン作用を有する。
【００３２】
[41]  ＩＬ−１β：  インターロイキン１ベータ（ＩＬ−１β）。活性化された単核貪食細胞によって合成され、循環中に遊離型で存在し、炎症反応を媒介する１７ｋＤのサイトカイン。ＣＤ４＋  Ｔリンパ球に作用してそれらの増殖を促進し、また、増殖因子及び分化因子としてＢリンパ球に作用する。また、単核貪食細胞によるＩＬ−６の合成を誘導する。
【００３３】
[42]  ＴＮＦ−α：  腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）。刺激された単球、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞によって合成され、循環中に三量体で存在する、１５７アミノ酸（ａａ）残基のタンパク質。ＴＮＦは、直接的抗腫瘍作用を媒介し、腫瘍細胞溶解を引き起こし、白血球の動員を促進し、血管形成を誘導し、線維芽細胞増殖を促進する。
【００３４】
[43]  ＩＦＮ−γ：  インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）。活性化されたＴリンパ球及びＮＫ細胞によって合成され、細胞内微生物及び腫瘍細胞を破壊する単球の能力を高める、単球の強力な活性化剤である、２１〜２４ｋＤの糖タンパク質ホモ二量体。直接的抗ウイルス活性及び増殖抑制活性を有し、多くの細胞型にＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）クラスＩＩ細胞表面分子複合体を発現させ、また、ＭＨＣクラスＩの発現を増加させる。
【００３５】
[44]  ＧＭ−ＣＳＦ：  顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）。循環中に単量体として存在し、マクロファージ及びＴリンパ球、線維芽細胞及び内皮細胞によって産生される１２７ａａタンパク質。造血細胞のための成長因子であり、骨髄単球系の増殖及び分化を刺激する。
【００３６】
[45]  ＩＬ−３：  インターロイキン−３（ＩＬ−３）。活性化されたＣＤ４＋  Ｔヘルパーリンパ球によって合成され、一部の造血細胞の増殖を促進してＴリンパ球の増殖及び分化を促進することによりコロニー刺激因子の作用を行う、２０ｋＤのリンホカイン。
【００３７】
[46]  ＩＬ−６：  インターロイキン−６（ＩＬ−６）。活性化されたＴリンパ球、単核の貪食細胞、内皮細胞及び線維芽細胞によって産生される２６ｋＤのサイトカイン。多くの細胞に作用するが、活性化されたＢリンパ球の抗体分泌形質細胞への分化を可能にする特殊機能を有し、また、肝細胞を誘導して急性期タンパク質（炎症反応への関与が示唆されている。）及びフィブリノーゲンを形成させる。
【００３８】
[47]  ＩＬ−８：  インターロイキン−８（ＩＬ−８）。マクロファージ及び内皮細胞によって産生される８ｋＤのタンパク質。好中球及びＴリンパ球のための強力な走化性因子であり、内皮細胞への好中球の付着を促進する。
【００３９】
[48]  ＩＬ−１α：  インターロイキン１α（ＩＬ−１α）。３３ｋＤの前駆体分子から切断され、活性化された単核貪食細胞によって合成され、循環中では遊離型が稀にしか見られず、膜関連物質の作用を行う１７ｋＤのサイトカイン（ＩＬ−１βに類似）。ＩＬ−１βによる炎症反応の媒介を補助する。
【００４０】
[49]  ＩＬ−１０：  インターロイキン−１０（ＩＬ−１０）。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋  Ｔリンパ球、単球、マクロファージ、活性化されたＢリンパ球及びケラチノサイトによって産生される１８ｋＤのポリペプチド。抗原を特にＴＨ１型の細胞に提示し、且つＩＬ−６及びＴＮＦを分泌する、マクロファージの能力を抑制する。
【００４１】
[50]  ＩＬ−１６：  インターロイキン−１６（ＩＬ−１６）。ＣＤ８＋  Ｔリンパ球、好酸球、肥満細胞及び呼吸上皮細胞によって産生される１４ｋＤの四量体タンパク質。ＣＤ４＋  Ｔリンパ球及び単球に対する強い化学誘引性を有する。
【００４２】
[51]  Ｇ−ＣＳＦ：  顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）。マクロファージ、内皮細胞、線維芽細胞及び間質細胞によって産生される、２２〜２５ｋＤのホモ二量体糖タンパク質。髄内の顆粒球前駆細胞を増加させ、血中好中球の増加を持続させる。微生物感染細胞及び腫瘍細胞の破壊において重要であると考えられるスーパーオキシド産生を増大させる好中球の能力を強化する。
【００４３】
[52]  ＴＮＦ−β：  腫瘍壊死因子ベータ（ＴＮＦ−β）。活性化されたリンパ球によって産生される２５ｋＤのタンパク質。培養中の腫瘍細胞を殺傷し、線維芽細胞の増殖を刺激することができる。更に、ＴＮＦ−αの他の大部分の作用と類似の作用を有する。
【００４４】
[53]  ＭＩＰ−１α：  マクロファージ炎症性タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）。マクロファージ及び他の細胞によって産生される６６ａａ単量体タンパク質。単球、Ｔリンパ球及び好酸球に対する化学誘引物質である。
【００４５】
[54]  ＲＡＮＴＥＳ：  Ｔリンパ球によって産生され、単球、Ｔリンパ球及び好酸球に対する化学誘引物質であり、炎症を促進する８ｋＤタンパク質。
【００４６】
[55]  ＥＧＦ：  上皮成長因子（ＥＧＦ）。５３ａａ残基の三硫酸化ポリペプチド。ＥＧＦはチロシンキナーゼファミリーのメンバーであり、分裂応答の刺激及び創傷治癒の補助を含む複数の機能を有する。
【００４７】
[56]  ＰＧＥ２：  プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）。ＰＧＥ２は、シクロオキシゲナーゼ酵素反応を介してアラキドン酸から導かれる生物活性脂質のファミリーに属する。活性化された単球によって放出され、Ｔリンパ球及びマクロファージ上のＭＨＣクラスＩＩの発現をブロックする。
【００４８】
[57]  ＴｘＢ２：  トロンボキサンＢ２（ＴｘＢ２）。ＴｘＢ２は、酵素トロンボキサンシンテターゼを介するプロスタグランジン及びエンドペルオキシダーゼＰＧＨ２の異性化により、多価不飽和脂肪酸から導かれる生物活性化合物のメンバーである。ＴｘＢ２は、血栓塞栓性疾患及びアナフィラキシー反応で生理的役割を果たす。
【００４９】
[58]  ＣＤ２５＋細胞：  ＣＤ２５は、インターロイキン２受容体（ＩＬ−２Ｒ）のα鎖、又はＴａｃ抗原と称されることも多く、５５ｋＤの分子量を有し、活性化されたＴ細胞及びＢ細胞並びに活性化マクロファージ上に存在する単鎖糖タンパク質である。ＩＬ２受容体として機能する。ＣＤ２５抗原は、ＩＬ−２Ｒのβ鎖と共に、ＩＬ−２に対する高親和性受容体複合体を形成する。
【００５０】
[59]  ＣＴＬＬ−２（細胞系）：  Ｃ５７Ｂ１／６マウスから得られるマウス細胞傷害性Ｔリンパ球の系統。このＴ細胞系は、成長及び増殖をＩＬ−２の外来性供与源に依存する。
【００５１】
[60]  Ｆａｓ−ＦａｓＬ：  Ｆａｓ／Ｆａｓリガンド系。Ｆａｓ抗原、アポトーシスを媒介する細胞表面膜貫通タンパク質、及びアポトーシスのシグナルを細胞に伝達する好中球上の相補性Ｆａｓ活性化サイトカインの組合せ。Ｆａｓは、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体スーパーファミリーに属するＩ型の膜タンパク質であり、ＦａｓＬはＴＮＦファミリーのメンバーである。ＦＡＳリガンドは、３１ｋＤａ（キロダルトン）（２７８アミノ酸）の膜結合型タンパク質である。Ｆａｓ−Ｆａｓリガンド系は、自己反応性リンパ球系細胞の排除を含む多くの生物過程で重要な役割を果たす。Ｆａｓリガンドは、主に、活性化されたＴリンパ球で発現し、細胞傷害性Ｔリンパ球及びナチュラルキラー細胞の主たるエフェクター分子の１つである。
【００５２】
[61]  ＨＬＡ−ＤＲ＋リンパ球：  ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−ＤＲ抗原（ヒトの主要組織適合遺伝子領域である第６染色体上の白血球領域で見られるグルー配列（ｇｌｕｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）により決定される一群の多形性糖タンパク質）を含むリンパ球。
【００５３】
[62]  ＩＵ（国際単位）：  比重及び力価の国際標準（例えば、ヒトＩＬ−２のためのＷＨＯ第１次国際標準、８６／５０４）との比較に基づく、生物学的製剤の効力の測定単位。国際単位は、生物活性単位を報告するための、公表されている、公認の標準化された唯一の方法であり、国際的な共同研究の産物である。
【００５４】
[63]  Ｕ（生物活性の尺度としての単位）：  種々の名称付き「単位（ｕｎｉｔ）」の短縮形。各研究所は参照として導き出すが、これは当該研究を実施している研究所に固有のものである。各「単位（ｕｎｉｔ）」は研究所によって異なり、国際単位（ＩＵ）のような国際的に認められた標準ではない。
【００５５】
[64]  単核浸潤：  それらが「通常は」存在しない組織における単球、形質細胞及びリンパ球の存在。又は、それらが本来は少数しか存在しないクラスターにおける上記細胞の多数の、又は豊富な存在。
【００５６】
[65]  ＴＣＲζ鎖：  Ｔ細胞受容体−ゼータ鎖。ゼータサブユニットはＴＣＲ複合体の一部であり、ＴＣＲ細胞表面受容体とリガンド（抗原）との相互作用を標的とする。細胞質（細胞質ゾル）内に伸長するゼータサブユニットでは、Ｔ細胞活性化によりチロシン残基がリン酸化されるが、これは、ＴＣＲライゲーション後のシグナル伝達との関係を示唆する。
【００５７】
[66]  ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）：  それらが浸潤する腫瘍から単離されたＴリンパ球。腫瘍浸潤リンパ球は、細胞傷害性を殆どないし全く有しない。ＴＩＬは、主にＣＤ４＋、ＣＤ８＋のＴ細胞を含み、ＩＬ−２存在下の培養によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖することができる。これらの細胞はＩＬ−２による処理で活性化され、それらが単離された腫瘍に対して、通常のリンホカイン活性化細胞よりも攻撃的であることが多い。ＴＩＬの細胞毒性活性は、ＩＦＮ−γによって強化することができる。ＴＩＬのｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性は、ＴＧＦ−βによってブロックすることができる。
【００５８】
[67]  ＺＡＰ７０：  サイトゾルに存在するチロシンキナーゼであるＴＣＲζ鎖と関連する７０ｋＤのゼータ関連タンパク質。ＺＡＰ７０は、Ｔリンパ球受容体情報伝達の維持に関与し、最終的にＩＬ−２を産生するシグナル伝達を媒介すると考えられる。ＺＡＰ７０遺伝子はＴ細胞及びナチュラルキラー細胞で発現し、ヒト染色体２ｑ１２にマッピングされている。
【００５９】
[68]  ζ（ゼータ）鎖：  ＴＣＲζ鎖を参照。ゼータ鎖遺伝子は、ヒト第１染色体上に位置する。このタンパク質の細胞外ドメインは９アミノ酸の長さを有し、膜貫通ドメインは、負に荷電したアスパラギン酸残基を含み、細胞質内ドメインは１１３アミノ酸の長さを有する。細胞質内のテールは、ＣＤ３鎖の細胞質内のテールで見られる抗原認識モチーフのうちの３つを含む。ゼータ鎖は、ＮＫ細胞のＦｃ（断片、結晶性）−γ受容体等の他の受容体とも関連する。
【００６０】
[69]  ＵＳＰ：  米国薬局方各条。
【００６１】
[70]  Ｐ：  「ｐ＜０．０１」。所定の条件下で起こる事象の確率の水準を意味する数理統計学用語。
【００６２】
[71]  ＡＮＯＶＡ（分散分析）：  統計及び数学の教科書（例えば、「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｓ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔｓ」、Ｈａｒｒｉｓｏｎ  Ｍ．Ｗａｄｓｗｏｒｔｈ，Ｊｒ．編、ＭｃＧｒａｗ  Ｈｉｌｌ  １９９０、及び「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｏｐｅｒａｔｉｏｎｓ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａ」、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｐ．Ｈｉｒｓｃｈ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｋ．Ｒｉｅｇｅｌｍａｎ編、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，１９９６）に記載されているような単一因子分析。
【００６３】
（ＬＩの作用様式及び特性評価）
[72]  白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）は、本明細書に記載のように、所定の条件下で産生される天然かつ自然発生のヒトサイトカインの、生物学的に活性で、毒性が最小限の免疫調節性混合物である。ＬＩは、抗癌及び抗ウイルス療法において、或いは、癌、感染症、及び免疫調節に応答する他の疾患のために広範に適用可能なネオアジュバント療法において使用することができる。
【００６４】
[73]  動物試験では、「混合したインターロイキン」がｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫調節活性及び免疫賦活活性を有することが示されている（Ｈａｄｄｅｎら、「Ｍｉｘｅｄ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｖ  Ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃａｌｌｙ  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｔ  Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｈｙｄｒｏｃｏｒｔｉｓｏｎｅ−Ｔｒｅａｔｅｄ  Ａｇｅｄ  Ｍｉｃｅ」、Ｃｅｌｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４４：２２８〜２３６（１９９２））。「混合したインターロイキン」の局所／領域注射は局所の免疫抑制を克服すると仮定する（但し、いかなる理論にも限定されるものではない）。その後、腫瘍抗原に対する破壊寛容が生じ、有効な局所抗腫瘍免疫応答の発生を可能にする。Ｇｏｌｕｍｂｅｋら、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  Ｒｅｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  ｂｙ  Ｔｕｍｏｒ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  Ｓｅｃｒｅｔｅ  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４」、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：７１３〜７１６（１９９１）が報告しているように、腫瘍領域へのインターロイキンの局所注入、又は腫瘍へのインターロイキン遺伝子のトランスフェクションは、抗腫瘍免疫応答を著しく高め、結果として腫瘍退縮をもたらすことも知られている。
【００６５】
[74]  しかし、腫瘍の活発な増殖を引き起こすことなく悪性細胞を細胞周期相に誘導すること、並びにＣＤ４／ＣＤ８比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させるというＬＩの効果は、以下の特定比率で、サイトカイン及びインターロイキン２（ＩＬ−２）を含有し、或いは、以下の特定比率（対ＩＬ−２）で、他の異なるサイトカイン及び他の生物活性小分子を更に含有する組成物、例えば、白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）については、これまで知られていなかった。ＩＬ−１βのＩＬ−２に対する比率（ＩＬ−１β／ＩＬ−２）が０．４〜１．５、好ましくは０．７±０．１；ＴＮＦ−αのＩＬ−２に対する比率（ＴＮＦ−α／ＩＬ−２）が３．２〜１０．９、好ましくは９．５±１．８；ＩＦＮ−γのＩＬ−２に対する比率（ＩＦＮ−γ／ＩＬ−２）が１．５〜１０．９、好ましくは６．０±１．１；ＧＭ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率（ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−２）が２．２〜４．８、好ましくは４．０±０．５。ＩＬ−３のＩＬ−２に対する比率が０．３８〜０．６８、好ましくは０．５３±０．１５；ＩＬ−６のＩＬ−２に対する比率が３７．２〜５３．８、好ましくは４６±５．９；ＩＬ−８のＩＬ−２に対する比率が２６１〜５６１．５、好ましくは４１１±１０．６；ＩＬ−１αのＩＬ−２に対する比率が０．５６〜０．９４、好ましくは０．７５±０．１９；ＩＬ−１０のＩＬ−２に対する比率が２．８２〜３．２２、好ましくは３．０±０．１８；ＩＬ−１６のＩＬ−２に対する比率が１．１６〜２．８４、好ましくは１．８４±０．６８；Ｇ−ＣＳＦのＩＬ−２に対する比率が２．１６〜３．７８、好ましくは２．９７±０．８１；ＴＮＦ−βのＩＬ−２に対する比率が１．１７〜２．４３、好ましくは１．８±０．６３；ＭＩＰ−１αのＩＬ−２に対する比率が１５．７〜３７．１６、好ましくは２２．７±７．０；ＭＩＰ−１βのＩＬ−２に対する比率が１７．１〜２８．５、好ましくは２２．８±５．７；ＲＡＮＴＥＳのＩＬ−２に対する比率が２．３〜２．７、好ましくは２．５±０．１３；ＥＧＦのＩＬ−２に対する比率が０．２６７〜０．２８３、好ましくは０．２７５±０．００８；ＰＧＥ２のＩＬ−２に対する比率が３．６３〜５．４２、好ましくは４．５±０．８７；ＴｘＢ２のＩＬ−２に対する比率が２３．４７〜２５．１３、好ましくは２４．３±０．８３。
【００６６】
[75]  ＬＩの手術前の投与は、当技術分野から予測されるような、腫瘍がより速く成長し、より速く再発するリスクを増加させることなく、細胞周期相にある腫瘍細胞数を増加させる。ＬＩはまた、ＣＤ４／ＣＤ８比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させる。腫瘍細胞を細胞周期に誘導する能力はＬＩに固有のものであり、この治験薬に存在する異なるサイトカインの相乗効果、並びに宿主の免疫系及び腫瘍細胞に及ぼす上記サイトカインの差別的影響によるものである。ＣＤ４／ＣＤ８比及び腫瘍への単核細胞浸潤を変化させるＬＩの用量依存性投与からも、パラダイムシフトが分かる。
【００６７】
（患者）
[76]  白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）治療群及び対照患者群に関する情報は、表１及び２に示す。治療群及び対照群の腫瘍の原発部位は、それぞれ表１及び２に示す。４１人の患者を対象としたが、評価可能であったのは３９人のみである。これらの対照被験者は、患者の腫瘍の大きさ、腫瘍部位、腫瘍段階、性別及び年齢に基づいて治療群と一致させた。
【００６８】
【表１】
2008501697.tif 000002
【００６９】
【表２】
2008501697.tif 000003
【００７０】
（患者組入基準）
[77]  これまで未治療の頭頸部癌（口腔扁平上皮癌、ＯＳＣＣ）患者２１人がＬＩ投与群に含まれる。患者組入基準は、既知の転移性疾患がなく、６カ月を超える予想生存期間を有し、ＯＳＣＣの治療又は他の免疫療法を受けたことがなく、組織学的に確定された頭頸部扁平上皮癌を有する１８才以上の患者である。妊娠している患者、ＬＩ投与部位に放射線治療を施した患者、十二指腸潰瘍若しくは胃潰瘍の患者、又は喘息患者は除外される。
【００７１】
（評価可能な患者）
[78]  合計４１人の患者が選択され、評価可能な患者は３９人である。ＬＩ治療群は２１人の患者から構成され、評価可能な患者は１９人である。ＬＩ治療群患者のうちの２人は、その後、（１）口蓋垂の未分化癌、及び（２）口腔底の腺癌を有することが確認される。これらの２人の患者は、治験薬の投与を含む療法の全コースを受けるが、口腔の扁平上皮癌の基準を満たさなかったため、組織病理／免疫組織化学分析の一部を行わない。対照群は、生検で確定された口腔扁平上皮癌を有し、腫瘍は口腔内の同じ領域にあり、腫瘍の大きさ及び疾患段階が治験薬（ＬＩ）処置群と類似した患者２０人で構成された。
【００７２】
（治療プロトコル）
[79]  白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）投与は、以下の方法で実施する。総日用量（ＩＬ−２に換算して８００ＩＵ／ｍＬ）の半分（４００ＩＵ）を腫瘍周囲に（腫瘍周囲用量の１／４（約１００ＩＵ）を腫瘍塊周囲の４つの各部位に）注射して、総日用量の半分（ＩＬ−２に換算して４００ＩＵ）を、３週間に渡って週５回、腫瘍部位と同側に（引き続き、また、同一受診時に）外リンパに投与する。ＬＩは、可視的／触知可能な腫瘍塊の周縁に皮内投与する。外リンパへの注射は、注射した腫瘍塊と同側の頸部リンパ節群領域内の下顎後方領域に投与する。
【００７３】
[80]  シクロホスファミド３００ｍｇ／ｍ２注射液の単回静脈内注入を、最初のＬＩ投与の３日前に行う。インドメタシン（２５ｍｇ）を、シクロホスファミド投与の３日後から外科手術の２４時間前まで、１日３回、総日用量７５ｍｇで経口的に（食物と一緒に）自己投与する。硫酸亜鉛（亜鉛元素に換算して５０ｍｇ）及び総合ビタミン剤を、シクロホスファミド投与の３日後から外科手術の２４時間前まで、１日１回自己投与する。
【００７４】
[81]  すべての患者（ＬＩ処置群及び対照群）は、最後のＬＩ投与の１〜２週後に外科手術を受け、次いで、手術の１〜４週後に放射線療法を受ける。ＬＩ前処理は、この患者集団では創傷治癒に悪影響を与えなかった。
【００７５】
（患者検査）
[82]  試験に組み入れる前に、患者の一般評価を行った。既往歴も調査した。登録した後、完全な身体検診、血液検査、血液生化学精密検査、胸部心臓Ｘ線撮影及び心電図検査を実施した。可能であれば、ベースライン画像を得るために原発腫瘍部位の画像化を行った。すべての患者に、垂直な２つの外径の計測による、原発腫瘍のベースライン２次元測定を行う。患者は、以降の各診察で面接を受け、適当なアンケートを用いて生活の質（例えば、疼痛の程度、舌運動性の程度、等）について質問される。治療にあたる医師が、各診察時に毒性を評価した。
【００７６】
（白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ））
[83]  白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）は、マイトジェンと共に培養した輸血用血液に関してＦＤＡが要求する検査に合格した後に米国赤十字から得た、選択されたヒト末梢血単核細胞から調製する。初回ドナーは認めない。その後、無血清培養上清を無菌的に収集、清澄化し、通常のウイルス排除工程に付し、濃縮、微量濾過する。ヒト血清アルブミン注射剤ＵＳＰを濃縮物に加え、得られた溶液を生理的ｐＨに調整し、標的ＩＬ−２濃度にし、第２の微量濾過を実施する。製剤化された薬液を無菌の血清型バイアルに無菌的に分配し、ＩＬ−２の含量に従ってラベル表示する。製品の効力は、ＩＬ−２依存性細胞系である細胞傷害性Ｔリンパ球系（ＣＴＬＬ−２）の使用による放射性標識チミジンの（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）取込みによって測定する。最終的な注射剤は、ＥＬＩＳＡにより、或いは、５つのマーカーサイトカインＩＬ−２、ＩＬ−１β、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦ−αの存在により更に試験する。ＬＩについては、無菌性、細菌内毒素、ｐＨ及び総タンパク質濃度に関する品質管理試験、並びに他の物理化学的試験を更に実施する。
【００７７】
[84]  白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）は、腫瘍周囲、腫瘍内、外リンパ又は皮下への投与のための、２．２ｍＬの薬剤を含むホウ珪酸ガラス血清バイアル（ＩＬ−２（４００ＩＵ／ｍＬ）と表示されている。）中で凍結された状態で提供される。ＬＩについては、同一性、無菌性、細菌内毒素、ｐＨ及び総タンパク質濃度に関する品質管理試験を実施する。各バイアルは、微粒子汚染及び外観を検査する。製剤は３ｍｇ／ｍＬの総タンパク質含量を有し、材料は無菌及びパイロジェン（ｐｙｒｏｇｅｎ）フリーで提供される。ＬＩは、−２０℃で保存した場合、製造年月日から２４カ月の指定有効期間を有する。
【００７８】
（シクロホスファミド）
[85]  シクロホスファミド注射剤ＵＳＰ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ−Ｓｑｕｉｂｂ、ＵＫ）は、シクロホスファミド１００ｍｇ当たり塩化ナトリウム４５ｍｇ、マンニトール７５ｍｇ又は重炭酸ナトリウム約８２ｍｇを含有する無菌の散剤として提供され、静脈内注射の前に再構成する。
【００７９】
（インドメタシン）
[86]  インドメタシンＵＳＰ（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ、Ｆｒａｎｃｅ）は、食物と同時摂取する経口自己投与用２５ｍｇ錠剤として提供される。
【００８０】
（硫酸亜鉛及び総合ビタミン）
[87]  硫酸亜鉛（亜鉛元素に換算して５０ｍｇ、Ｒ．Ｐ．Ｓｃｈｅｒｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｌｅａｒｗａｔｅｒ、Ｆｌｏｒｉｄａ、ＵＳＡ）及びＯＴＣ総合ビタミン剤は、クリニックから各患者に自己投与用に提供される。
【００８１】
（病理学的検査）
[88]  単一の病理プロトコルには、本明細書に記載の、外科的に切除された検体の調製及び固定、並びに総体的、肉眼的及び顕微的検査、組織学及び免疫組織化学的処置が記載されている。口腔病変の診断は、疑われる病変の切除生検で決定する。この癌は、Ｔ２−３Ｎ０−２Ｍ０に分類されている。他のすべての患者組入基準を満たすＴ２−３Ｎ０−２Ｍ０患者のみを、免疫療法用に選択する。２次元／３次元測定で決定される腫瘍反応を、ＬＩ治療計画終了時に評価し、患者の腫瘍切除の予定を決定する。切除した組織は生食緩衝ホルマリンを含む前標識された容器に入れて、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色、腫瘍反応の免疫組織化学及び病理学評価のために、パラフィン包埋及び薄い切片スライドの調製の前に一晩固定する。
【００８２】
（組織学的検査）
[89]  組織病理分析は、３つの異なる腫瘍領域、すなわち表面（ゾーン１）、中心（ゾーン２）及び腫瘍・間質境界面（ゾーン３）で実施する。壊死腫瘍細胞の組織学的検査、ＡＪＣＣ類別、及び発生は、ＨＥ染色切片から判定される。腫瘍中の腫瘍上皮成分対間質の割合は、下記２つの方法で測定される。（１）結合組織をマロリー（三重染色）に従って染色し、（２）スライドを、ＩｍａｇｅＰｒｏ分析ソフトウェア（ＭｅｄｉａＣｉｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、ＭＤ）により癌巣（腫瘍上皮）の面積について測定する。切除された組織を含むスライドは、癌細胞を標識する汎サイトケラチン抗体（Ａ１Ａ３＋ＣＫ１９）（ＤＡＫＯ（Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）製）を用いて、サイトケラチンを標識する。スライドは顕微鏡で検査し、ＩｍａｇｅＰｒｏ分析ソフトウェアを用いて分析する。
【００８３】
（単核細胞浸潤の特性評価）
[90]  腫瘍細胞巣の近傍に存在する単核細胞を、免疫組織化学により（パラフィン切片から）測定する。抗原性を取り出すために、切片を脱蝋してマイクロ波で処理する。これまで一貫して、脱蝋されたパラフィン切片を染色することが実証されている、市販の抗体のみを用いる。好中球は、抗ミエロペルオキシダーゼ抗体（ＤＡＫＯ製のマウスモノクローナル）を用いて標識し、造血幹細胞は、マウスモノクローナル抗ＣＤ３４抗体（ＤＡＫＯ）で標識し、マクロファージ細胞集団は、ＣＤ６８抗原（マウスモノクローナル抗ＣＤ６８、ＤＡＫＯ）の発現により同定し、樹状細胞は、ＣＤ１ａマーカー（マウスモノクローナル抗ＣＤ１ａ、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈ、Ｐａｒｉｓ、Ｆｒａｎｃｅ）の発現により同定する。リンパ球系細胞は、ＬＣＡ抗原の発現（マウスモノクローナル抗ＣＤ４５、ＤＡＫＯ）により同定する。Ｔ細胞は、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（ＤＡＫＯ）により同定する。細胞傷害性Ｔ細胞は、抗ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞抗体（ＤＡＫＯ）によるＣＤ８の発現によって同定する。エフェクターＣＤ４Ｔ細胞は、抗ＣＤ４＋  Ｔ細胞抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ、Ｎｅｗｃａｓｔｌｅ  Ｕｐｏｎ  Ｔｙｎｅ、ＵＫ）を用いて同定する。ＮＫ細胞は、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ製のＣＤ５６／ＣＤ５７抗原マウスモノクローナル抗ＣＤ５６及び抗ＣＤ５７抗体を用いて同定する。いずれの場合も、適当な抗体（同じアイソタイプの抗体）の陽性及び陰性対照スライドを調製して評価する。腫瘍上皮及び間質内のＩＬ−２Ｒ発現細胞は、ＩＬ−２Ｒ、ＣＤ２５に対するマウスモノクローナル抗体（Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ）を用いて同定する。いずれの場合も、陰性対照スライドは、目的の標的に非特異的である、アイソトープを一致させたモノクローナル抗体を用いて調製する。
【００８４】
[91]  すべての免疫組織化学的（ＩＨＣ）標識を、ビオチン化抗マウス／抗ウサギＩｇＧリンカー及びストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて、特異的に結合した抗体を明らかにする、ＤＡＫＯ  ＬＳＡＢ−２キットを用いて行う。用いるクロマゲンは、ＡＥＣ（赤）標識である。切片は、ヘマトキシリンを用いて核を対比染色する。
【００８５】
（ホットスポット法）
[92]  単核細胞密度は、「ホットスポット」法に基づいて測定する。試験腫瘍面密度は、腫瘍浸潤単核細胞密度の最も高い領域で測定する。この方法は、組織内の細胞浸潤の極端な不均一性を最小化する。
【００８６】
（病理学的評価）
[93]  ＬＩ治療群及び対照の腫瘍生検材料を、ＨＥ染色を用いて、腫瘍の顕微的所見により評価する。ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１ａ及びＣＤ２５の標識も実施するが、その場合、試料の大きさは５つの標識すべての実施を可能とするものとする。対照群及びＬＩ治療群には、完全な分析プログラムを使用する。観察用スライドの選択は、３０倍の拡大率を用いて行う。組織学的分析の間は、１００倍の拡大率を用いる。組織切片の病理学的及び組織学的評価並びに形態測定は、試験のことを知らされていない３人の独立した病理学者（ＪＴ、ＣＳＦ及びＢＤ）が実施する。当技術分野で公知の、他の病理学的及び組織学的評価を用いることも可能である。
【００８７】
（統計分析）
[94]  病理学データはＡＮＯＶＡ、単一因子分析によって分析し、＜０．０５（α＝０．０５）の「ｐ」値を統計学的に有意と考える。
【００８８】
（組織学的評価）
[95]  すべてのＬＩ治療患者（１９）及び対照患者（２０）の組織診、Ｂｒｏｄｅｓスコア及びＴＮＭ（腫瘍節転移）段階を表３及び４に示す。ＬＩ治療患者及び対照患者は、表３及び４に示すように、組織学的にも、また、ケラチン化（Ｂｒｏｄｅｓスコア）又はＴＮＭ段階に関しても異ならなかった（Ｏｄｅｌｌら、「Ｔｈｅ  Ｐｒｏｇｏｓｔｉｃ  Ｖａｌｕｅ  ｏｆ  Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃ  Ｇｒａｄｉｎｇ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｉｎ  Ｓｍａｌｌ  Ｌｉｎｇｕａｌ  Ｓｑｕａｍｏｕｓ  Ｃｅｌｌ  Ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ；Ｔｈｅ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｐａｔｔｅｒｎ  ｏｆ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ」、Ｃａｎｃｅｒ  ７４：７８９（１９９４））。このことは、両群の腫瘍において、ＣＫ−１９及び汎ＣＫの、不均質性の高い発現を示すサイトケラチン免疫染色パターンから確認される。
【００８９】
【表３】
2008501697.tif 000004
【００９０】
【表４】
2008501697.tif 000005
【００９１】
[96]  ＬＩ治療患者１９人のうちの２人は、切除された腫瘍内に癌組織を有していない。これらの２人の患者は、表４に示すように、１００％の腫瘍減少を示す、ＬＩに対する完全臨床奏効例であると考えられる。他の２症例は、組織学的に検証された５０％を超える腫瘍体積の減少を示し、部分奏効（応答大）の例であると考えられる。更に別の患者４名は、３０％を超え、５０％未満の体積の減少を示し、応答小の例であると考えられる。表４及び５に示す病理学的判定によれば、この試験のＬＩ治療群の客観的奏効率は２１％であり、全体的には、１９人の患者中８人、すなわち４２％で応答が測定された。
【００９２】
【表５】
2008501697.tif 000006
【００９３】
（腫瘍浸潤リンパ球）
[97]  ＯＳＣＣにおけるリンパ球系細胞浸潤は、特に腫瘍間質においては、主としてＴ細胞によって占められる。図１に示すように、対照（非ＬＩ治療）群では、腫瘍及び間質に浸潤するＣＤ８＋  Ｔ細胞の数は、ＣＤ４＋  Ｔ細胞よりも多かった（２：１）。その結果、対照（非ＬＩ治療）群のＣＤ４／ＣＤ８比は、図２に示すように、試験した腫瘍のすべての領域（表面［Ｒ１］、中心［Ｒ２］及び腫瘍・間質境界面［Ｒ３］）で１を大きく下回る（約０．５）。他方、ＬＩ治療は、間質及び腫瘍上皮巣の両方で、ＣＤ４＋  Ｔ細胞の密度及び数の有意な（ｐ＜０．０５）増加（図２）、並びにＣＤ８＋  Ｔ細胞の密度の有意な（ｐ＜０．０５）減少を誘導する（図２）。この傾向は、同じ分析を治療応答群のみ（図１及び３）に適用する場合にも維持される。すなわち、ＬＩ治療は、ＯＳＣＣ腫瘍における細胞浸潤の構成において、低い（＜１）ＣＤ４／ＣＤ８比から、高い（＞２．５〜３．５）ＣＤ４／ＣＤ８比への顕著な変化をもたらした（図２及び３）。
【００９４】
[98]  ＣＤ３４＋  単核細胞及びＣＤ５６＋  ＮＫ細胞は、腫瘍面積又は検査対象の患者集団に関わりなく、間質及び腫瘍上皮巣では見られない。類似した所見が、ＬＩ治療群及び対照群のＯＳＣＣ患者で報告されている。
【００９５】
[99]  ＬＩ治療群では、抗原提示樹状細胞（ＣＤ１ａ＋）は大部分腫瘍上皮巣に位置し、腫瘍間質の境界面で最も豊富である。調査した３領域（表面（Ｒ１）、腫瘍中心（Ｒ２）及び腫瘍・間質境界面（Ｒ３））における樹状（ＣＤ１ａ＋）細胞の分布に及ぼす、ＬＩ治療の差別的影響が観察される。詳細には、図４に示すように、腫瘍中心では変化が観察されず、ＣＤ１ａ＋  樹状細胞の減少が腫瘍表面で検出され、その増加が腫瘍・間質境界面に存在する。図４に示すように、ＣＤ１ａ＋  樹状細胞の、腫瘍表面から腫瘍・間質境界面への移動は、臨床応答サブグループ分析においてより顕著である。２名の完全奏効例は、免疫組織化学分析を排除する観察可能な腫瘍組織を有しない。
【００９６】
（炎症細胞）
[100]  切除した腫瘍検体中の好中球及びマクロファージ浸潤の存在は、それぞれミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＸ）及びＣＤ６８マーカーの染色で測定する。形態計測は、腫瘍の３領域（表面［Ｒ１］、中心［Ｒ２］及び腫瘍・間質境界面［Ｒ３］）で行う。
【００９７】
[101]  図５に示すように、マクロファージ密度の分析は、ＬＩ治療が間質内のＣＤ６８＋  マクロファージの存在は変化させないが、上皮内では有意に（ｐ＜０．００２）減少させることを示す。
【００９８】
[102]  図６に示すように、ＬＩ治療は、分析した領域（Ｒ１、Ｒ２又はＲ３）に関わりなく、好中球の上皮内密度を有意（ｐ＜０．００５）に増加させる。
【００９９】
（腫瘍壊死）
[103]  図７に示すように、壊死の組織学的所見は、ＬＩ治療と対照との間で顕著な差を示す。表６に示すように、多巣性の顕微的壊死は、対照群（対照患者の４／２０）に対して、ＬＩ治療群（治療患者の１０／１７）で著しく頻繁に起こる。
【０１００】
【表６】
2008501697.tif 000007
【０１０１】
（腫瘍間質／癌巣比率）
[104]  腫瘍間質に対する癌細胞巣の割合は、癌巣に対するＬＩ治療の選択的作用を示す。Ｍａｌｌｏｒｙトリクローム法で染色され、ピンクに標識された癌巣を有する切除組織試料、及び腫瘍組織内の上皮巣の割合は、図８に示すように、ＩｍａｇｅＰｒｏソフトウェアを用いて形態計測により測定する。ＬＩ治療は、対照（非ＬＩ治療）と比較して、腫瘍組織中の癌細胞巣の割合の有意な（ｐ＜０．００５、ＡＮＯＶＡ単一因子分析）減少を誘導する。
【０１０２】
[105]  上皮周囲膠原病は、対照患者及びＬＩ治療患者の両方で頻度の点で類似するが、間質性の上皮内線維症は、表７に示すように、対照群（対照患者の２／２０、すなわち１０％）と比較して、ＬＩ治療群（治療患者の１０／１９、すなわち５３％）で有意（ｐ＜０．０１）により頻繁に起こる。
【０１０３】
【表７】
2008501697.tif 000008
【０１０４】
[106]  従来の療法より前の第１選択の治療として、進行した原発性ＯＳＣＣの患者に投与される白血球インターロイキン（ＬＩ）注射剤は、炎症細胞ではなく浸潤免疫細胞において腫瘍内変化を誘導する。Ｔ細胞集団は、癌巣に移動する。約２０ＩＵ〜１６００ＩＵ、又は特に４００ＩＵ若しくは８００ＩＵのＬＩを２週間に渡って週３回、或いは、約２０ＩＵ〜１６００ＩＵ、又は特に４００ＩＵ若しくは８００ＩＵを週５回、腫瘍周囲に投与すると、浸潤性のＣＤ８＋  Ｔ細胞はＣＤ２５＋の発現を増加させる。本治療法は、２週間の治療計画終了時に腫瘍組織の大量壊死をもたらさないので、結合組織と腫瘍上皮成分との比率に顕著な変化は見られない。
【０１０５】
[107]  これは、本明細書で記載されている、手術前の３週間のＬＩによる前治療、及びその後の放射線療法の後に、対照群と比較して、ＬＩ治療されたＯＳＣＣ患者の腫瘍重量の有意な減少をもたらす方法と対照的である。この方法では、週５日、合計３週間に渡って、８００ＩＵ／日（ＩＬ−２に換算）のＬＩによる前処理を行うことが企図され、それによって浸潤性免疫細胞の相当な調整が誘導される。ＣＤ８＋  Ｔ細胞数（ｐ＜０．０５）は、腫瘍浸潤性ＣＤ４＋  Ｔ細胞の有意（ｐ＜０．０５）な増加に伴って減少する。これらの変化は、腫瘍中のＣＤ４／ＣＤ８比の基本的な変化を導く。
【０１０６】
[108]  ＯＳＣＣ患者の対照無処置群で見られた低いＣＤ４／ＣＤ８比（＜１）は、ＬＩ治療の結果、間質及び上皮内で劇的に増加した（ＣＤ４／ＣＤ８比が＞２から＞３．５へ）。このように、進行した原発性ＯＳＣＣ患者の高用量（ＩＬ−２に換算して８００ＩＵ／日を週５日、３週間）ネオアジュバントＬＩ治療は、顕著なＣＤ４＋  Ｔ細胞浸潤のパラダイムシフトをもたらす。癌巣内の抗原提示細胞（樹状細胞）及び炎症細胞（特に、好中球）の密度及び局所分布の明瞭且つ特異的な変化は、図９のＬＩによる宿主免疫活性化の模式図に示される。
【０１０７】
[109]  宿主抗腫瘍免疫応答の腫瘍浸潤細胞成分の複雑な変化（癌巣の多巣性壊死等）、及びＬＩ治療ＯＳＣＣ患者で検出される結合組織の割合の増加も起こる。これらの変化は、ネオアジュバントＬＩ投与によって誘導される、ＯＳＣＣに対する抗腫瘍免疫応答が成功したことを示す。
【０１０８】
[110]  ＯＳＣＣへの免疫応答の成功のためには、腫瘍中の低い（＜１）ＣＤ４／ＣＤ８比を逆転させることが必要である。特に、ナイーヴな無処置ＯＳＣＣ患者における腫瘍及びその周囲の間質中でＣＤ４＋  Ｔ細胞に対してＣＤ８＋  Ｔ細胞が優勢であることは、ＯＳＣＣに特異的なものではなく、他の多くの固形腫瘍でも見られる。同様に、低いＣＤ４／ＣＤ８比が基底細胞癌、子宮頸癌及び乳癌において検出されるが、これは、それらの腫瘍によって、患者（宿主）において後天的な免疫抑制状態が誘導されることを示唆している。
【０１０９】
[111]  ＬＩ治療により誘導された、ＯＳＣＣにおける宿主免疫細胞の細胞性浸潤の組織病理学的変化は、ＬＩ前治療群で４２％の総合奏効率をもたらす。客観的奏効率は２１％であり、評価可能な１９人のＬＩ治療患者中２名が病理検査で完全奏効と確認された。
【０１１０】
[112]  ＬＩ治療群と、臨床的及び病理学的退縮が１９中８症例で観察されたＬＩ治療奏効例サブグループに記載の者と、の組織病理学的比較は、免疫細胞組成から炎症性細胞密度及び残留腫瘍の組織学に至るすべての試験パラメータが、ＬＩ治療患者の上記２サブグループで非常に類似していることを示す。これらのデータは、ＬＩ治療群が比較的均一にＬＩ治療に応答したが、抗癌病理学的効果が異なることを示唆する。この矛盾は、ＯＳＣＣ患者の免疫感受性（Ｉｒ遺伝子及びＨＬＡの差）及び／又は免疫能レベル（試験参加時）が差別的であることによって説明することが可能である。それらは、異なるＬＩ治療患者において、機能性免疫応答障害の強弱をもたらした可能性がある。ＭＨＣ−Ｉ抗原、副刺激分子の標的癌細胞上の発現、及びそれらのＦＡＳ−リガンド発現の欠如、又はＴＣＲ−ζ鎖の異常、ＣＤ８＋  Ｔ細胞のアポトーシス感受性、及びＣＤ３４＋  細胞の存在は、いずれもＯＳＣＣにおける免疫応答不全に寄与する（Ｃｒｕｚら、「Ｌａｃｋ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｏｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｏｒａｌ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ」、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８１：８８１（１９９９）；Ｌａｎｇら、「Ｉｍｐａｉｒｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」、Ａｒｃｈ  Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ  Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ  １２５：８２（１９９９）；Ｌｕｔｚら、「Ｈｕｍａｎ  ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５９：５７９３（１９９９）；Ｈｏｆｆｍａｎｎら、「Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ」、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ８：２５５３（２００２）；Ｒｅｉｃｈｅｒｔら、「Ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｔｕｍｏｒａｌ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ζ−ｃｈａｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｏｒａｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ」、Ｃａｎｃｅｒ  ９１：２１３６（２００１）；Ｋｕｓｓら、「Ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ＣＤ８＋  ＣＤ４５ＲＯ−ＣＤ２７−Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｈａｖｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｄｅｔｅｃｔｓ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｑｕａｍｏｕｓ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ」、Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ８８：２２３（２００３）；Ｓｃｈｍｉｄｔら、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｗｈｉｃｈ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｔｈａｔ  ｓｅｃｒｅｔｅ  ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ」、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １：９５（１９９９）；Ｒｉｖｏｌｔｉｎｉら、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ  ２−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ  ｏｆ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｔｕｍｏｒｓ」、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５０：５５５１（１９９０）；Ｙｏｕｎｇら、「Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈｅａｄ  ａｎｄ  ｎｅｃｋ  ｃａｎｃｅｒ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ」、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６７：３３３（１９９６）。従って、癌細胞標的の感受性を並行して調整する試みなしに免疫系を排他的にターゲッティングすることは、治療の総合奏効率の改善にはつながらない。
【０１１１】
[113]  進行した原発性ＯＳＣＣ患者に対する、本明細書に記載の用量によるＬＩネオアジュバント前治療は、腫瘍を浸潤する免疫細胞の種類（ＣＤ８＋  Ｔ細胞ではなく、主としてＣＤ４＋  Ｔ細胞）のパラダイムシフトをもたらす。このシフトは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞浸潤が優勢で、腫瘍浸潤ＣＤ４＋  Ｔ細胞が殆ど存在しない対照群の僅かな抗腫瘍反応と比較して、腫瘍細胞壊死、及び腫瘍質量の顕著な減少をもたらす。腫瘍免疫細胞浸潤構成のパラダイムシフト（腫瘍内ＣＤ４／ＣＤ８比の逆転）は、ＬＩ治療患者が残留腫瘍細胞の放射線療法に対する感受性の増加を示した既報告の臨床所見、及び、ＬＩ治療のＯＳＣＣ患者の再発までの時間の延長及び再発率の減少（対照（無処置）のＯＳＣＣ患者と比較）で測定される治療の生物学的影響と相俟って、ＯＳＣＣ及び他の固形腫瘍の治療への新たなアプローチをもたらす。
【０１１２】
[114]  本発明は以上の説明の通りであるが、本発明を様々に改変することができることは明らかであろう。そのような改変は、本発明の精神及び範囲から逸脱するものとみなされるべきではなく、そのような改変はすべて、特許請求の範囲に包含されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】ＬＩ治療、（治療）応答サブグループ、及び対照における、ＣＤ４及びＣＤ８浸潤細胞密度（ＨＰＦ（高倍率視野）当たりの細胞数）を示す図である（平均±ＳＥＭで示す。）（対照と比較してＣＤ４＋  Ｔ細胞密度が増加（ｐ＜０．０５）、対照と比較してＣＤ８＋  Ｔ細胞が減少（ｐ＜０．０５））。
【図２】ＯＳＣＣ（口腔扁平上皮癌）腫瘍（上皮内及び間質）で検出された、ＬＩ治療及び対照におけるＣＤ４／ＣＤ８比を示す図である。対照と比較してＣＤ４／ＣＤ８比が逆転（対照における＜１のＣＤ４／ＣＤ８比から、ＬＩ治療群における＞２．５のＣＤ４／ＣＤ８比へ）。
【図３】ＯＳＣＣ（口腔扁平上皮癌）腫瘍（上皮内及び間質）で検出された、ＬＩ治療（応答サブグループ）及び対照におけるＣＤ４／ＣＤ８比を示す図である。対照と比較してＣＤ４／ＣＤ８比が逆転（対照における＜１のＣＤ４／ＣＤ８比から、ＬＩ治療応答サブグループにおける＞３．５のＣＤ４／ＣＤ８比へ）。
【図４】ＯＳＣＣ（口腔扁平上皮癌）の腫瘍表面（Ｒ１）、腫瘍中心（Ｒ２）及び腫瘍・間質境界面（Ｒ３）における、樹状（ＣＤ１ａ）細胞の浸潤及び局在化を示す図である。ＬＩ治療及び対照における、ＨＰＦ（高倍率視野）内のＣＤ１ａ＋細胞数（平均±ＳＥＭで示す）。
【図５】ＯＳＣＣ（口腔扁平上皮癌）の腫瘍間質及び腫瘍上皮におけるマクロファージ（ＣＤ６８）細胞の浸潤を示す図である。ＬＩ治療及び対照における、ＨＰＦ（高倍率視野）内のＣＤ６８＋細胞数（平均±ＳＥＭで示す。）（対照と比較して、ＬＩ治療群における上皮内のマクロファージ数が減少、ｐ＜０．００２）。
【図６】ＯＳＣＣ（口腔扁平上皮癌）の腫瘍表面（Ｒ１）、腫瘍中心（Ｒ２）及び腫瘍・間質境界面（Ｒ３）における好中球（ＭＰＸ、ミエロペルオキシダーゼ）細胞の浸潤及び局在化を示す図である。ＬＩ治療及び対照における、ＨＰＦ（高倍率視野）内のＭＰＸ＋細胞数（平均±ＳＥＭで示す。）（対照と比較して、ＬＩ治療群における上皮内の好中球密度が増加、ｐ＜０．００５）。
【図７】ＯＳＣＣ（Ｈ＆Ｅ染色）における、壊死の組織学的所見を示す図である。パネル「Ａ」は、ＯＳＣＣの上皮内巣における壊死の欠如を示す対照である。パネル「Ｂ」は、すべての癌巣が壊死性であり、組織片及び白血球で満たされていることを示すＬＩ治療群である。
【図８】ＬＩ治療及び対照群における、ＯＳＣＣ（口腔扁平上皮癌）の癌巣の割合に及ぼす治療の影響を示す図である（形態計測分析で測定）（対照と比較して、ＬＩ治療群における癌巣の割合が減少、ｐ＜０．００５）。
【図９】白血球インターロイキン注射剤（ＬＩ）による免疫活性化を示す図である。ＬＩは、協働してインビボで腫瘍への協調的免疫攻撃を引き起こす、サイトカイン、ケモカイン及びリンパ球増殖性リンホカインを含む。ＬＩは、腫瘍及び局所リンパ節の近傍に注射される。第１に、壊死因子（例えば、ＴＮＦ−α）が腫瘍細胞死を引き起こして、腫瘍抗原を放出させる。第２に、腫瘍・間質境界面の抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）がこれらの腫瘍抗原を処理して、ＣＤ４＋  Ｔ細胞に提示する。第３に、リンパ球増殖性リンホカイン（例えば、ＩＬ−２）が、局所リンパ節及び腫瘍部位でＴ細胞の増殖を引き起こす。第４に、ＬＩ内の走化性因子（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−８）が、腫瘍特異的免疫細胞及び炎症細胞を腫瘍部位に誘導して腫瘍への免疫細胞浸潤に影響を与え、腫瘍に対する炎症反応を引き起こして腫瘍破壊に至らせる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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