(57)【要約】  本発明は、細胞外マトリックス成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシン、フィブロネクチン）の沈着の増加および／または異常な血管形成を伴う障害を包含するがそれだけには限定されない非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害を、治療、管理、予防および／または改善するために設計した方法および組成物に関する。そのような障害の非限定的な例には、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬が含まれる。本発明の方法は、ＥｐｈＡ２および／またはその内在性リガンドであるエフリンＡ１のモジュレーターである１つまたは複数の薬剤を有効量で投与することを含む。本発明はまた、１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、単独で、またはそのような非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮障害の治療に有用な１つまたは複数の他の薬剤と組み合わせて含む、医薬組成物も提供する。診断方法およびＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのスクリーニング方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
その治療を必要としている患者において非新生物性過剰増殖性の上皮もしくは内皮細胞障害またはその症状を治療する方法であって、前記患者に治療上有効な量のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを投与することを含む方法。
【請求項２】
前記非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害が線維症である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記線維症が肝臓、腎臓、肺、心臓または網膜の線維症である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記非新生物性過剰増殖性の上皮または内皮細胞が、順番が硬変、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記投与により、未処理の上皮細胞または内皮細胞層中におけるＥＣＭ成分の沈着レベルと比較して、上皮細胞または内皮細胞層中におけるＥＣＭ成分の沈着が予防または遅延される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＥＣＭ成分がコラーゲン、プロテオグリカン、テネイシンまたはフィブロネクチンである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記投与により、未処理ＥｐｈＡ２−内在性リガンドの結合の量と比較して、ＥｐｈＡ２−内在性リガンドの結合が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記内在性リガンドがエフリンＡ１である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記投与により、未処理のＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化のレベルと比較して、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記投与により、ＥｐｈＡ２の遺伝子発現が増加する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記投与により、エフリンＡ１の遺伝子発現が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターがＥｐｈＡ２のリガンド結合ドメインを含むＥｐｈＡ２ポリペプチド断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターがＥｐｈＡ２抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターがエフリンＡ１抗体またはその抗原結合断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記モノクローナル抗体がヒト抗体である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記モノクローナル抗体がヒト化されている、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターが小分子アンタゴニスト、酵素活性アンタゴニスト、エフリンＡ１のｓｉＲＮＡまたはｅｉＲＮＡ分子、エフリンＡ１アンチセンス分子、ドミナントネガティブＥｐｈＡ２分子、ドミナントネガティブエフリンＡ１分子、ＥｐｈＡ２ベースのワクチンおよびエフリンＡ１ベースのワクチンからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターが、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性またはタンパク質蓄積を増加させる、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
非新生物性過剰増殖性の上皮または内皮細胞障害に対し、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１の発現または活性を変更しない１つまたは複数の追加の治療を施すことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記追加の治療が免疫調節剤を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記免疫調節剤がＩＬ−９に免疫特異的に結合する抗体である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記追加の治療が抗血管形成剤を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記追加の治療が抗炎症剤を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記症状が、血管形成の増加である、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照により本明細書中に組み込まれる２００４年１０月２７日出願の米国特許仮出願第60/622,517号に基づく優先権を主張するものである。
【０００２】
１．発明の分野
本発明は、細胞外マトリックス成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシン、フィブロネクチン）の沈着の増加および／もしくは異常な（すなわち増加した）血管形成に関連する障害を包含するがそれだけに限定はされない非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害を、治療、管理、あるいは予防するために設計した方法および組成物に関する。そのような障害の非限定的な例には、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬が含まれる。本発明は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害を予防、治療または管理する方法であって、ＥｐｈＡ２および／もしくはその内在性リガンドであるエフリン（Ephrin）Ａ１の発現および／または活性を調節（modulate）する薬剤を有効量で投与することを含む方法を提供する。本発明によれば、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害を治療、予防または管理するために、１つまたは複数の他の治療を、ＥｐｈＡ２および／もしくはその内在性リガンドであるエフリンＡ１の発現および／または活性を調節する薬剤と組み合わせて投与することができる。
【０００３】
本発明はまた、ＥｐｈＡ２および／もしくはその内在性リガンドであるエフリンＡ１の発現および／または活性を調節する薬剤を含む医薬組成物も提供する。本発明の医薬組成物はさらに、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害を予防、治療ならびに／あるいは管理するための、１つもしくは複数の他の予防剤または治療剤を含むことができる。そのような医薬組成物は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の予防、治療ならびに／または管理に有用である。本発明はさらに、診断方法ならびに予防上および／または治療上有用な薬剤のスクリーニング方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
２．発明の背景
ＥｐｈＡ２
ＥｐｈＡ２（上皮細胞キナーゼ）は、受容体チロシンキナーゼのＥｐｈファミリーの１３０ｋＤａのメンバーである（Zantek N.他、1999、Cell Growth Differ. 10:629-38；Lindberg R.他、1990, MoI. Cell. Biol. 10:6316-24）。ＥｐｈＡ２の機能は不明であるが、結腸上皮の増殖、分化、およびバリアー機能（Rosenberg他、1997、Am. J. Physiol. 273:G824-32）、血管網の構築、内皮遊走、毛細血管形態形成、ならびに血管形成（Stein他、1998、Genes Dev. 12:667-78）の制御、神経系の文節化および軸索経路探索（Bovenkamp D.およびGreer P.、2001、DNA Cell Biol. 20:203-13）、腫瘍血管新生（Ogawa K.他、2000、Oncogene 19:6043-52）、癌転移（国際公開公報第WO 01/941 1020号、第WO 96/36713号、第WO 01/12840号、第WO 01/12172号）を行うことが示唆されている。
【０００５】
ＥｐｈＡ２の天然リガンドはエフリンＡ１である（Eph命名法委員会、1997、Cell 90(3):403-4；Gale他、1997、Cell Tissue Res. 290(2): 227-41）。ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用は、器官表面上の細胞の固定を支援し、また、ＥｐｈＡ２の自己リン酸化によるＥｐｈＡ２発現の減少によって上皮および／もしくは内皮細胞の増殖をダウンレギュレーションすると考えられている（Lindberg他、1990、上記）。天然条件下では、この相互作用は器官を保護する上皮細胞バリアーの維持を支援し、また、上皮細胞の増殖および成長の制御を支援する。しかし、上皮細胞が保護バリアーを形成することを妨げるか、あるいは上皮および／もしくは内皮細胞の破壊および／または脱落を引き起こして適切な治癒が起こることを妨げるような症状も存在する。
【０００６】
線維症
肝臓、腎臓、肺、および他の内臓の進行性線維症は、しばしば、死または移植の必要性を引き起こす器官不全をもたらす。米国および世界中で、数百万人がこれらの疾患に冒されている。たとえば、肝線維症は、米国における非悪性胃腸管系の死の主要な原因である。さらに、線維症の進行が、慢性肝疾患に罹患している患者における罹患率および死亡率の唯一最重要な決定要因であるということが次第に認識されてきている（Poynard, T.P.他、1997、Lancet 349:825-832）。線維症は、基質成分の過剰な沈着を特徴とする。これは、正常な組織構造の破壊および組織機能低下をもたらす。
【０００７】
肺線維症は損傷因子によって引き起こされる場合があり、過敏性肺炎および強力な炎症反応に関連している。特発性肺線維症（ＩＰＦ）は、肺胞中の単核細胞および間質中のわずかな細胞浸潤を特徴とする剥離性間質性肺炎（ＤＩＰ）に関連している。ＥＰＦはまた、斑状の間質浸潤および肺胞壁の肥厚を特徴とする通常型間質性肺炎（ＵＩＰ）にも関連している。肺線維症の組織学には、肺胞壁肥厚（これには「蜂巣化」効果が含まれ得る）、化生上皮、ならびに増殖／ＥＣＭの蓄積、筋線維芽細胞の分化、および線維芽細胞病巣を含めた線維芽細胞への変化が含まれる。
【０００８】
創傷治癒および線維症は類似した経路を辿る。これらはどちらも、上皮への損傷、次いで線維芽細胞の増殖および分化ならびにＥＣＭの沈着を含む。これらはどちらもＴＧＦβおよびＰＤＧＦなどの細胞シグナル伝達メッセンジャーによって媒介されている。創傷治癒では、創傷が治癒したあとに組織再生は止まるが、線維症では、細胞増殖は停止せず、ＥＣＭの沈着の持続およびプロテアーゼ活性の欠乏がもたらされる。ブレオマイシンは、マウスの感受性系統への投与から４週間以内に肺上皮細胞死、次いで急性好中球流入、その後に慢性炎症および実質線維症を誘発する。肺線維症のモデルとしてのブレオマイシンで処理した肺上皮細胞は、肺実質内の線維増殖および他の病理状態を含めたヒトＰＦの主要な病理的特徴を再現している（DunsmoreおよびShapiro、2004、J. CHn. Invest. 113:180-182）。ブレオマイシンによって誘発させた線維症は、Ｆａｓに媒介されるアポトーシスを遮断する可溶性Ｆａｓを加えることによって予防することができる（Kuwano他、1999、J. CHn. Invest. 104:13-9）。ＩＰＦ組織の上皮中における、Ｆａｓに媒介されるアポトーシスは、Ｆａｓおよび／またはＦａｓリガンドの増加を特徴とする。それに対応して、上皮アポトーシスの減少を引き起こす可溶性Ｆａｓなどの因子も線維症に対する保護を示す。
【０００９】
石綿肺症（間質性線維症）とは、アスベスト繊維を吸入したことによるびまん性肺線維症と定義される。CA. Staples、1992、Radiologic Clinics of North America、30(6):l 195。これは、職業関連の肺損傷の主要な原因の１つである。Merck Index、1999(第17版)、622。石綿肺症は１５〜２０年間の潜伏期間の後に起こることを特徴とし、被爆がなくなった後も疾患が進行するが、胸膜溶菌斑が存在しない場合には稀にしか起こらない。C. Peacock、2000、Clinical Radiology、55: 425。線維症は最初に呼吸細気管支内およびその周辺で起こり、肺の胸膜下部分の下葉を冒し、その後、中心に向かって進行する。CA. Staples、Radiologic Clinics of North America、30 (6):1 195、1992。石綿肺症は、空咳に加えて進行性呼吸困難の潜行性の発症を引き起こしうる。肺癌の発生率は石綿肺症に罹患している喫煙者で増加し、用量応答関係が観察されている。Merck Index、1999(第17版)、623。
【００１０】
線維性疾患を診断および治療するために、さらなる治療法が必要とされている。たとえば、石綿肺症などの線維性肺疾患に有効であることが知られている治療は存在しない。
【００１１】
血管形成および線維症
血管形成とは、既存の血管構造からの新しい血管の形成であり、多種多様な分子シグナルを伴う複数ステップのプロセスである。ＥｐｈＡのＲＴＫを含めた受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）に対するリガンドは、血管形成の重要な媒介物質として関連付けられている（Cheng他、2002、MoI. Cancer Res. 1:2-l 1）。ＥｐｈＡ２とその内在性リガンドであるエフリンＡ１との相互作用は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に媒介される内皮細胞の遊走、生存、出芽および血管新生の最大誘発に必要であることが示されている（Cheng他、2002、MoI. Cancer Res. 1:2-1 1）。
【００１２】
最近の観察により、血管形成と、線維症、特に肺線維症の病理とがつながっている可能性が示唆されている（Noble, W.、2003、Amer. J. Respiratory Cell &MoI. Biol. 29:S27-S31）。研究により、特発性肺線維症（ＥＰＦ）に罹患している患者の肺組織と実験的線維症とにおける血管形成活性の増加に相関関係が実証されている（Keane他、1997、J. Immunol. 159:1437-1443）。この血管形成活性の増加は、特定の血管形成促進性ケモカイン（たとえば、インターロイキン−８（ＩＬ−８））と抗血管形成性ケモカイン（たとえば、誘導タンパク質（Inducible protein）−１０（ＩＰ−１０））との不均衡に起因すると考えられている。ＩＰ−１０はＩＦＮ−γによって誘導されることが示されており、それはヒトおよび動物の研究において進行性肺線維症を阻止する。
【００１３】
現在、ＩＰＦの従来の治療は、最も一般的には、有効性を欠き、有害な副作用の程度が高いことが示唆されている手法であるコルチコステロイドのみからなる（WurfelおよびRaghu、http://www.chestnet.org/education/onine/pccu/vol 16/lessons 13_141essonl 3.php）。したがって、線維症および異常な血管形成に関連する疾患を治療するための新規治療が必要である。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
３．発明の概要
本発明は、ＥｐｈＡ２とその内在性リガンドとの結合を破壊または減少させる薬剤が、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分沈着の増加に関連する障害および異常な（すなわち増加もしくは減少した）血管形成に関連する障害を包含するがそれだけには限定されない非新生物性過剰増殖性の上皮細胞ならびに／または内皮細胞障害の進行を、予防、低減、あるいは遅延させることができるという発見に部分的には基づいている。そのような障害の非限定的な例には、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬が含まれる。特定の理論または機構には拘束されないが、ＥｐｈＡ２とその内在性リガンド（たとえば、エフリンＡ１）との結合の破壊あるいは減少は、ＥｐｈＡ２を発現する上皮細胞の増殖、成長、および／もしくは生存を増加させるか、ＥＣＭ成分の沈着を減少させるか、および／またはリガンドに誘発されるＥｐｈＡ２シグナル伝達を破壊もしくは減少させてＥｐｈＡ２タンパク質の蓄積および／もしくは安定性を増加させることによって上皮細胞層の組織化を維持し得る。あるいは、またはそれに加えて、特定の理論または機構には拘束されないが、ＥｐｈＡ２とその内在性リガンドとの結合の破壊もしくは減少は、血管形成、具体的には血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）に誘発される血管形成を阻害または減少させ得る。
【００１５】
本発明は、非新生物性過剰増殖性の上皮細胞および／もしくは内皮細胞障害（細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の沈着の増加に関連する障害や異常な血管形成に関連する障害を含むがそれだけには限定されない）またはその症状を予防、管理、治療および／あるいは改善する方法であって、それを必要としている被験体に、有効量のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、非新生物性過剰増殖性の上皮細胞および／もしくは内皮細胞障害（それだけには限定されないが、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の沈着の増加に関連する障害や異常な血管形成に関連する障害を含む）またはその症状を予防、管理、治療および／あるいは改善する方法であって、それを必要としている被験体に、有効量のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター以外の有効量の治療（たとえば、鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、または免疫モジュレーター）とを投与することを含む方法も提供する。
【００１６】
非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害の非限定的な例には、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬が含まれる。
【００１７】
本発明は、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１のモジュレーター（「ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター」）を提供する。ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの非限定的な例は、（ｉ）ＥｐｈＡ２および／もしくはＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）の発現を、たとえば、転写レベル、転写後レベル、翻訳レベルもしくは翻訳後レベルで調節；ならびに／または（ｉｉ）エフリンＡ１の活性を調節（直接あるいは間接的に）することによって、生物学的効果を与える薬剤である。
【００１８】
ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの例には、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を阻害または低減させる薬剤（本明細書中では以降「ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤」）が含まれる。ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤の非限定的な例には、（ｉ）ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導する薬剤（たとえば、エフリンＡ１の可溶形態（たとえば、単量体形態もしくは多量体形態）や、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達およびリン酸化を誘導する抗体（すなわちＥｐｈＡ２アゴニスト抗体））；（ｉｉ）ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２アンタゴニスト抗体およびエフリンＡ１のドミナントネガティブ型）；（ｉｉｉ）エフリンＡ１に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２の可溶形態、およびエフリンＡ１に結合してエフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する抗体）；ならびに（ｉｖ）エフリンＡ１に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型および抗エフリンＡ１抗体）が含まれる。
【００１９】
さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２の発現を調節する薬剤が含まれる。このような薬剤は、ＥｐｈＡ２の発現を減少／ダウンレギュレーションするか（たとえば、ＥｐｈＡ２アンチセンス分子、ＲＮＡｉおよびリボザイム）、または細胞表面上のＥｐｈＡ２の量が結合に利用可能な内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）の量を上回って未結合のＥｐｈＡ２の量が増加するようにＥｐｈＡ２の発現を増加／アップレギュレーションすることができる（たとえば、ＥｐｈＡ２をコードしている核酸）。
【００２０】
他の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとは、エフリンＡ１の発現を調節する薬剤である。このような薬剤は、エフリンＡ１の発現を減少／ダウンレギュレーションするか（たとえば、エフリンＡ１アンチセンス分子、ＲＮＡｉおよびリボザイム）、またはエフリンＡ１の発現を増加／アップレギュレーションすることができる（たとえば、エフリンＡ１をコードしている核酸）。
【００２１】
さらに他の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１のタンパク質安定性またはタンパク質蓄積を調節する薬剤が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性および／または蓄積を増加させる。
【００２２】
さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとは、キナーゼ活性（たとえば、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ１、または細胞膜でＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１と会合することが知られている異種タンパク質の、キナーゼ活性）を調節する薬剤である。
【００２３】
さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を妨げるかまたは低減させるが、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を阻害も低減もさせない薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２細胞内発現抗体(intrabody)）；およびエフリンＡ１に結合し、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは低減させるが、エフリンＡ１とＥｐｈ  ＥｐｈＡ２との相互作用を阻害も低減もさせない薬剤（たとえば、エフリンＡ１抗体）が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端（cytoplasmic tail）リン酸化を減少させる。
【００２４】
本発明の好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存および／または増殖を増加させる。
【００２５】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型；ＥｐｈＡ２の可溶形態（たとえば、ＥｐｈＡ２−Ｆｃ）；エフリンＡ１アンチセンス分子；ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２−リガンドの相互作用に干渉し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導しない抗ＥｐｈＡ２抗体；および抗エフリンＡ１抗体が含まれる。他の実施形態では、抗ＥｐｈＡ２および／または抗エフリンＡ１抗体は細胞毒性剤に連結されていてもよい。
【００２６】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡｌ／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の発現を減少させる薬剤ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性またはタンパク質蓄積を調節する薬剤ではない。本発明の別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、キナーゼ活性（たとえば、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ１、または細胞膜でＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１と会合することが知られている異種タンパク質の、キナーゼ活性）を調節する薬剤ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２アゴニスト抗体ではない。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２アンチセンス分子ではない。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、エフリンＡ１またはその断片の可溶形態ではない。
【００２７】
別の具体的な実施形態では、本発明は、被験体に有効量の１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを投与することを含む、それを必要としている被験体において硬変もしくは線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）を予防、治療または管理する方法を提供する。さらなる具体的な実施形態では、本発明は、被験体に有効量のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター以外の有効量の治療とを投与することを含む、治療を必要としている被験体において硬変もしくは線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）を予防、治療または管理する方法を提供する。
【００２８】
具体的な実施形態では、本発明は、それを必要としている被験体に有効量のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを投与することを含む、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬を予防、管理、治療または改善する方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、有効量のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター以外の有効量の治療とを投与することを含む、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬を予防、管理、治療または改善する方法を提供する。
【００２９】
本発明は、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１を調節する（たとえば、発現および／もしくは活性を増加または減少させる）、たとえば、ＥｐｈＡ２−内在性リガンドの結合を減少させる、エフリンＡ１の遺伝子発現を減少させるか、ＥｐｈＡ２の遺伝子発現をアップレギュレーションするか、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性もしくはタンパク質蓄積を増加させるか、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させるか、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の増殖を増加させるか、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存を増加させる（たとえば、アポトーシスを防止することによって）か、上皮ならびに／もしくは内皮細胞層の完全性を維持／再構成するか、および／または血管形成を予防するもしくは遅延させる、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの、スクリーニングおよび同定方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、上皮および／もしくは内皮細胞層におけるＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン）の沈着を予防するまたは遅延させることによって硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）などの非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の進行を予防ならびに／または遅延させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの、スクリーニングおよび同定方法を提供する。別の実施形態では、本発明は、血管形成を調節することによって硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症、および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の進行を予防ならびに／または遅延させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの、スクリーニングおよび同定方法を提供する。
【００３０】
具体的な実施形態では、本発明は、１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、単独で、あるいはＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターに基づくものではない１つもしくは複数の他の予防剤または治療剤と組み合わせて投与することを含む、それを必要としている被験体において血管形成を予防、軽減または減速させる方法を提供する。代替実施形態では、本発明は、１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、単独で、あるいはＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターに基づくものではない１つもしくは複数の他の予防剤または治療剤と組み合わせて投与することを含む、それを必要としている被験体において血管形成を増加またはアップレギュレーションする方法を提供する。
【００３１】
本発明は、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害を治療、管理、または予防するために設計した、予防レジメンおよび治療レジメンならびに医薬組成物を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、上皮および／もしくは内皮細胞層におけるＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン）の沈着を予防するまたは減速させる、かつ／あるいは血管形成を調節する予防レジメン、治療レジメンおよび医薬組成物を提供し、また非新生物性過剰増殖性の上皮細胞障害、具体的には線維症および／もしくは線維症関連疾患の治療、管理または予防における、そのような組成物およびレジメンの使用を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、血管形成を予防、軽減、または減速させる方法を提供する。別の具体的な実施形態では、本発明は、血管形成を増加またはアップレギュレーションする方法を提供する。
【００３２】
本発明はさらに、非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害（たとえば、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬）の治療の有効性を評価するための、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを用いた診断方法を提供し、ここで、モニタリングする治療は、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターに基づくものであってもよいが、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターに基づくものでなくてもよい。特定の実施形態では、本発明の診断方法は過剰増殖領域のイメージング方法を提供する。また、本発明の診断方法を用いて、非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害（たとえば、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬）の予後を診断するまたはそれを予測し得る。本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはまた、凍結もしくは固定化細胞の免疫組織化学的分析または組織アッセイにも用い得る。
【００３３】
本発明はまた、本発明の医薬組成物または診断試薬を含むキットも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
３．１  用語
本明細書中で用いる用語「薬剤」とは、所望の生物学的効果を有する分子をいう。薬剤には、それだけには限定されないがペプチド、ポリペプチド、タンパク質、翻訳後修飾されたタンパク質、抗体などを含めたタンパク性分子；小分子（１０００ダルトン未満）、無機または有機化合物；ならびにそれだけには限定されないが二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ（たとえば、アンチセンス、ＲＮＡｉなど）、アプタマー、および三重らせん核酸分子を含めた核酸分子、が含まれるがそれだけには限定されない。薬剤は、任意の知られている生物（それだけには限定されないが、動物（たとえば、哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳動物））、植物、細菌、真菌、および原生生物、またはウイルスを含む）、または合成分子のライブラリーに由来するか、あるいはそれから得ることができる。ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターである薬剤は、（ｉ）ＥｐｈＡ２および／もしくはＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１の発現を、たとえば、転写レベル、転写後レベル、翻訳レベルもしくは翻訳後レベルで；ならびに／または（ｉｉ）ＥｐｈＡ２および／もしくはＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１の活性を、（直接あるいは間接的に）調節する。
【００３５】
タンパク性薬剤（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または抗体）に関して本明細書中で用いる用語「類似体」とは、第２のタンパク性薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはエフリンＡ１ポリペプチド）と類似もしくは同一の機能を保有するが、必ずしも第２のタンパク性薬剤と類似もしくは同一のアミノ酸配列または構造を含んでいる必要はないタンパク性薬剤をいう。類似のアミノ酸配列を有するタンパク性薬剤とは、以下のうちの少なくとも１つを満たすタンパク性薬剤をいう：（ａ）第２のタンパク性薬剤のアミノ酸配列と少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するタンパク性薬剤；（ｂ）ストリンジェントな条件下で、少なくとも２０個のアミノ酸残基、少なくとも３０個のアミノ酸残基、少なくとも４０個のアミノ酸残基、少なくとも５０個のアミノ酸残基、少なくとも６０個のアミノ残基、少なくとも７０個のアミノ酸残基、少なくとも８０個のアミノ酸残基、少なくとも９０個のアミノ酸残基、少なくとも１００個のアミノ酸残基、少なくとも１２５個のアミノ酸残基、または少なくとも１５０個のアミノ酸残基の第２のタンパク性薬剤をコードしているヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列によってコードされているタンパク性薬剤；および（ｃ）第２のタンパク性薬剤をコードしているヌクレオチド配列に少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列によってコードされているタンパク性薬剤。第２のタンパク性薬剤に類似した構造を有するタンパク性薬剤とは、第２のタンパク性薬剤と類似した二次、三次または四次構造を有するタンパク性薬剤をいう。タンパク性薬剤の構造は、それだけには限定されないが、Ｘ線結晶構造解析、核磁気共鳴、および結晶電子顕微鏡観察を含めた、当業者に知られている方法によって決定することができる。好ましくは、タンパク性薬剤はＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１の活性を有する。
【００３６】
２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列の同一性％を決定するために、最適な比較を目的として配列のアラインメントを行う（たとえば、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸の配列または核酸配列中にギャップを導入することができる）。その後、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列中のある位置が、第２の配列中の対応する位置において同じアミノ酸残基またはヌクレオチドによって占有されている場合は、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列間の同一性％は、配列間で共通している同一の位置の数の関数である（すなわち、同一性％＝同一の重複した位置の数／位置の数の合計×１００ ％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。
【００３７】
２つの配列間の同一性％の決定は、数学アルゴリズムを用いて達成することもできる。２つの配列の比較に利用する数学アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、KarlinおよびAltschul、1990、Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 87: 2264-2268のアルゴリズムをKarlinおよびAltschul、1993、Proc. Natl. Acad. ScL U.S.A. 90: 5873-5877に記載のように改変したものである。このようなアルゴリズムは、Altschul他、1990、J. MoI. Biol. 215: 403のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを、たとえば、スコア＝１００、ワード長＝１２に設定してＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を行って、本発明の核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータを、たとえば、スコア−５０、ワード長＝３に設定してＢＬＡＳＴタンパク質検索を行って、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ有りアラインメントを得るために、Altschul他、1997、Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載のようにギャップ有りＢＬＡＳＴを利用することができる。あるいは、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係性を検出する反復検索を行うことができる（同上）。ＢＬＡＳＴ、ギャップ有りＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（たとえば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期設定パラメータを用いることができる（たとえば、ＮＣＢＩウェブサイトを参照）。配列の比較に利用する数学アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、MyersおよびMiller、1988、CABIOS 4 : 11-17のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合は、ＰＡＭ１２０重み残基表（weight residue table）、ギャップ長ペナルティ１２、および
ギャップペナルティ４を用いることができる。
【００３８】
２つの配列間の同一性％は、上述のものと類似の、ギャップを許容するかまたは許容しない技術を用いて、決定することができる。同一性％を計算するにあたって、典型的には１つの完全一致のみを計数する。
【００３９】
非タンパク性類似体に関して本明細書中で用いる用語「類似体」とは、第１の有機または無機分子と類似もしくは同一の機能を保有し、第１の有機または無機分子と構造的に類似した、第２の有機または無機分子をいう。
【００４０】
本明細書中で用いる用語「ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する抗体」および類似用語は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはＥｐｈＡ２ポリペプチドの断片に特異的に結合するが、非ＥｐｈＡ２ポリペプチドに特異的に結合しない抗体をいう。好ましくは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体は、他の抗原と交差反応しない。ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体は、たとえば、免疫アッセイまたは当業者に知られている他の技術によって同定することができる。好ましくは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体は、ＥｐｈＡ２活性のみを調節し、他の活性には顕著な影響を与えない。
【００４１】
本明細書中で用いる用語「エフリンＡ１に免疫特異的に結合する抗体」および類似用語は、エフリンＡ１ポリペプチドまたはエフリンＡ１ポリペプチドの断片に特異的に結合し、非エフリンＡ１ポリペプチドには特異的に結合しない抗体をいう。好ましくは、エフリンＡ１ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体は、他の抗原と交差反応しない。エフリンＡ１ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体は、たとえば、免疫アッセイまたは当業者に知られている他の技術によって同定することができる。好ましくは、エフリンＡ１ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体は、エフリンＡ１活性のみを調節し、他の活性には顕著な影響を与えない。
【００４２】
本発明の抗体には、それだけには限定されないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えによって産生した抗体、多特異性抗体（二重特異的抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内発現抗体（intrabody）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（たとえば、単一特異性および二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド連結Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記の任意のもののエピトープ結合断片が含まれる。具体的には、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、ＥｐｈＡ２抗原またはエフリンＡ１抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位（たとえば、抗ＥｐｈＡ２抗体または抗エフリンＡ１抗体の１つもしくは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む分子が含まれる。本発明の抗体は、免疫グロブリンの任意の型（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡｉおよびＩｇＡ２）またはサブクラスのものでありうる。
【００４３】
本明細書中で用いる用語「細胞増殖刺激性」とは、タンパク性分子（それだけには限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、翻訳後修飾されたタンパク質、抗体などを含む）、小分子（１０００ダルトン未満）、無機または有機化合物、および核酸分子（それだけには限定されないが、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ、または二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ（たとえば、アンチセンス、ＲＮＡｉなど）、アプタマー、および三重らせん核酸分子を含む）が、ｉｎ  ｖｉｖｏもしくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞の増殖、成長および／または生存を維持、増幅、加速、あるいは延長する能力をいう。細胞の増殖、成長および／または生存を検出する任意の方法、たとえば、細胞増殖アッセイまたは上皮バリアー完全性アッセイを用いて、ある薬剤が細胞増殖刺激剤であるかどうかのアッセイを行うことができる。細胞増殖刺激剤はまた、過剰増殖もしくは損傷した細胞の確立されたコロニーに加えた場合に、上皮の維持、再生、または再構成も引き起こし得る。
【００４４】
タンパク性薬剤（たとえば、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、および抗体）に関して本明細書中で用いる用語「誘導体」とは、アミノ酸残基の置換、欠失、および／または付加の導入によって変更されたアミノ酸配列を含むタンパク性薬剤をいう。本明細書中で用いる用語「誘導体」はまた、修飾された、すなわちある種の分子とタンパク性薬剤との共有結合によって修飾されたタンパク性薬剤もいう。たとえば、限定はしないが、タンパク性薬剤の誘導体は、たとえば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって製造され得る。タンパク性薬剤の誘導体はまた、それだけには限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた当業者に知られている技術を用いた化学修飾によっても製造され得る。さらに、タンパク性薬剤の誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含み得る。タンパク性薬剤の誘導体は、それが由来するタンパク性薬剤と同じ機能を保有する。具体的な実施形態では、タンパク性薬剤の誘導体は、ＥｐｈＡ２ポリペプチド、エフリンＡ１ポリペプチド、ＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはエフリンＡ１ポリペプチドの断片、ＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体、エフリンＡ１ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体の誘導体である。一実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチド、エフリンＡ１ポリペプチド、ＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはエフリンＡ１ポリペプチドの断片、ＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体、またはエフリンＡ１ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体の誘導体は、ＥｐｈＡ２ポリペプチド、エフリンＡ１ポリペプチド、ＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはエフリンＡ１ポリペプチドの断片、ＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体、またはエフリンＡ１ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体と類似もしくは同一の機能を保有する。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチド、エフリンＡ１ポリペプチド、ＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはエフリンＡ１ポリペプチドの断片、ＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体、またはエフリンＡ１ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体の誘導体は、変更していないポリペプチドと比較した場合に活性が変更されている。たとえば、抗体誘導体もしくはその断片は、より密接にそのエピトープと結合するか、またはタンパク質分解に対してより耐性を有することができる。
【００４５】
非タンパク性誘導体に関して本明細書中で用いる用語「誘導体」とは、第１の有機または無機分子の構造に基づいて形成した第２の有機または無機分子をいう。有機分子の誘導体には、それだけには限定されないが、たとえば、ヒドロキシル、メチル、エチル、カルボキシル、ニトリル、もしくはアミン基の付加または欠失によって修飾された分子が含まれる。有機分子はまた、たとえば、エステル化、アルキル化および／またはリン酸化されていてもよい。
【００４６】
本明細書中で用いる用語「有効量」とは、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害またはその症状の重症度および／もしくは持続期間を低減および／または改善するため、前記障害の進行を予防するため、前記障害の退縮を引き起こすため、前記障害に関連する１つもしくは複数の症状の再発、発生、または発症を予防するため、あるいは別の治療（たとえば、予防剤もしくは治療剤）の予防的または治療的効果を増強もしくは向上させるために十分な、治療（たとえば、予防剤または治療剤）の量をいう。有効量のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの非限定的な例を、下記セクション４．７．３に提供する。
【００４７】
本明細書中で用いる用語「内在性リガンド」または「天然リガンド」とは、通常はｉｎ  ｖｉｖｏで特定の受容体に結合する分子をいう。たとえば、エフリンＡ１はＥｐｈＡ２の内在性リガンドである。
【００４８】
本明細書中で用いる用語「ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター」とは、（ｉ）ＥｐｈＡ２および／もしくはＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１の発現を、たとえば、転写レベル、転写後レベル、翻訳レベルもしくは翻訳後レベルで調節；ならびに／または（ｉｉ）ＥｐｈＡ２および／もしくはＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１の活性を、調節（直接あるいは間接的に）することによって、生物学的効果を与える薬剤をいう。ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの例には、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を阻害または低減させる薬剤（本明細書中では以降「ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤」）が含まれる。ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤の非限定的な例には、（ｉ）ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導する薬剤（たとえば、エフリンＡ１の可溶形態（たとえば、単量体形態もしくは多量体形態）、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達およびリン酸化を誘導する抗体（すなわちＥｐｈＡ２アゴニスト抗体））；（ｉｉ）ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２アンタゴニスト抗体およびエフリンＡ１のドミナントネガティブ型）；（ｉｉｉ）エフリンＡ１に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２の可溶形態およびエフリンＡ１に結合してエフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する抗体）；ならびに（ｉｖ）エフリンＡ１に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型および抗エフリンＡ１抗体）が含まれる。
【００４９】
さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２の発現を調節する薬剤が含まれる。このような薬剤は、ＥｐｈＡ２の発現を減少／ダウンレギュレーションするか（たとえば、ＥｐｈＡ２アンチセンス分子、ＲＮＡｉおよびリボザイム）、または細胞表面上のＥｐｈＡ２の量が結合に利用可能な内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）の量を上回って未結合のＥｐｈＡ２の量が増加するようにＥｐｈＡ２の発現を増加／アップレギュレーションすることができる（たとえば、ＥｐｈＡ２をコードしている核酸）。
【００５０】
他の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとは、エフリンＡ１の発現を調節する薬剤である。このような薬剤は、エフリンＡ１の発現を減少／ダウンレギュレーションするか（たとえば、エフリンＡ１アンチセンス分子、ＲＮＡｉおよびリボザイム）、またはエフリンＡ１の発現を増加／アップレギュレーションすることができる（たとえば、エフリンＡ１をコードしている核酸）。
【００５１】
さらに他の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１のタンパク質安定性またはタンパク質蓄積を調節する薬剤が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性および／または蓄積を増加させる。
【００５２】
さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとは、キナーゼ活性（たとえば、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ１、または細胞膜でＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１と会合することが知られている異種タンパク質の、キナーゼ活性）を調節する薬剤である。
【００５３】
さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を妨げるかまたは低減させるが、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を阻害も低減もさせない薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２細胞内発現抗体）；およびエフリンＡ１に結合し、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは低減させるが、エフリンＡ１とＥｐｈ  ＥｐｈＡ２との相互作用を阻害も低減もさせない薬剤（たとえば、エフリンＡ１抗体）が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させる。
【００５４】
本発明の好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存および／または増殖を増加させる。
【００５５】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型；ＥｐｈＡ２の可溶形態（たとえば、ＥｐｈＡ２−Ｆｃ）；エフリンＡ１アンチセンス分子；ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２−リガンドの相互作用に干渉し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導しない抗ＥｐｈＡ２抗体；および抗エフリンＡ１抗体が含まれる。他の実施形態では、抗ＥｐｈＡ２および／または抗エフリンＡ１抗体は細胞毒性剤に連結されていてもよい。
【００５６】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の発現を減少させる薬剤ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性またはタンパク質蓄積を調節する薬剤ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、キナーゼ活性（たとえば、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ１、または細胞膜でＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１と会合することが知られている異種タンパク質の、キナーゼ活性）を調節する薬剤ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２アゴニスト抗体ではない。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２アンチセンス分子ではない。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、エフリンＡ１またはその断片の可溶形態ではない。
【００５７】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、以下の細胞作用の１つ、２つまたはすべてを示す：（ｉ）ＥｐｈＡ２を発現する細胞の増殖の増加；（ｉｉ）ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存の増加（たとえば、アポトーシスおよび／もしくは壊死を予防または低減することによる）；（ｉｉｉ）上皮および／もしくは内皮細胞層の完全性の維持ならびに／または再構成。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシンおよびフィブロネクチン）の沈着を予防、低減または遅延させる。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、血管形成を予防、低減または減速させる。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシンおよびフィブロネクチン）の沈着を予防、低減または遅延させ、血管形成を予防、低減または減速させる。
【００５８】
本明細書中で用いる用語「ＥｐｈＡ２ポリペプチド」とは、ＥｐｈＡ２、その類似体、誘導体もしくは断片、またはＥｐｈＡ２、その類似体、誘導体もしくは断片を含む融合タンパク質をいう。ＥｐｈＡ２ポリペプチドは、任意の種由来であり得る。特定の実施形態では、用語「ＥｐｈＡ２ポリペプチド」とは、ＥｐｈＡ２の成熟したプロセッシングされた形態をいう。他の実施形態では、用語「ＥｐｈＡ２ポリペプチド」とは、ＥｐｈＡ２の未成熟形態をいう。本実施形態に従って、本発明の抗体は、ＥｐｈＡ２の未成熟形態中の、ＥｐｈＡ２の成熟したプロセッシングされた形態に対応する部分に免疫特異的に結合する。
【００５９】
ＥｐｈＡ２ポリペプチドのヌクレオチドおよび／もしくはアミノ酸配列は、文献または公共データベースで見つけることができ、あるいはヌクレオチドならびに／またはアミノ酸配列は、当業者に知られているクローニングおよび配列決定技術を用いて決定することができる。たとえば、ヒトＥｐｈＡ２のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースで見つけることができる（たとえば、アクセッション番号ＢＣ０３７１６６、Ｍ５９３７１およびＭ３６３９５を参照）。ヒトＥｐｈＡ２のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで見つけることができる（たとえば、アクセッション番号ＡＡＨ３７１６６およびＡＡＡ５３３７５を参照）。ＥｐｈＡ２のアミノ酸配列のさらなる非限定的な例を下記表１に示す。
【表１】
2008518022.tif 000002
【００６０】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドは任意の種由来のＥｐｈＡ２である。好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドはヒトＥｐｈＡ２である。
【００６１】
本明細書中で用いる用語「エフリンＡ１ポリペプチド」とは、エフリンＡ１、その類似体、誘導体もしくは断片、またはエフリンＡ１、その類似体、誘導体もしくは断片を含む融合タンパク質をいう。エフリンＡ１ポリペプチドは、任意の種由来であり得る。特定の実施形態では、用語「エフリンＡ１ポリペプチド」とは、エフリンＡ１の成熟したプロセッシングされた形態をいう。他の実施形態では、用語「エフリンＡ１ポリペプチド」とは、エフリンＡ１の未成熟形態をいう。本実施形態に従って、本発明の抗体は、エフリンＡ１の未成熟形態中の、エフリンＡ１の成熟したプロセッシングされた形態に対応する部分に免疫特異的に結合する。
【００６２】
エフリンＡ１ポリペプチドのヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列は、文献または公共データベースで見つけることができるか、あるいはヌクレオチドならびに／またはアミノ酸配列は、当業者に知られているクローニングおよび配列決定技術を用いて決定することができる。たとえば、ヒトエフリンＡ１のヌクレオチド配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースで見つけることができる（たとえば、アクセッション番号ＢＣ０３２６９８を参照）。ヒトエフリンＡ１のアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースで見つけることができる（たとえば、アクセッション番号ＡＡＨ３２６９８を参照）。エフリンＡ１のアミノ酸配列のさらなる非限定的な例を下記表２に示す。
【表２】
2008518022.tif 000003
【００６３】
具体的な実施形態では、エフリンＡ１ポリペプチドは任意の種由来のエフリンＡ１である。好ましい実施形態では、エフリンＡ１ポリペプチドはヒトエフリンＡ１である。
【００６４】
本明細書中で用いる用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性または免疫原性活性を有する、ポリペプチドまたはタンパク質の部位もしくは断片をいう。具体的な実施形態では、用語「エピトープ」とは、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトにおいて抗原性または免疫原性活性を有する、ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはエフリンＡ１ポリペプチドの部分をいう。免疫原活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するポリペプチドまたはタンパク質の部位もしくは断片である。具体的な実施形態では、免疫原活性を有するエピトープは、動物において抗体応答を誘発するＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはエフリンＡ１ポリペプチドの部分である。抗原活性を有するエピトープは、当業者に周知の任意の方法、たとえば、免疫アッセイによって決定される、抗体が免疫特異的に結合するポリペプチドまたはタンパク質の部位もしくは断片である。具体的な実施形態では、抗原活性を有するエピトープは、当分野で周知の任意の方法、たとえば、免疫アッセイによって決定される、抗体が免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはエフリンＡ１ポリペプチドの部分である。抗原エピトープは、必ずしも免疫原性である必要はない。
【００６５】
タンパク性薬剤に関して本明細書中で用いる用語「断片」とは、別のポリペプチドまたはタンパク質の、少なくとも５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも３０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも４０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも６０個の連続したアミノ残基、少なくとも７０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも８０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも９０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１００個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１２５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１５０個の連続したアミノ酸残基、少なくとも１７５個の連続したアミノ酸残基、少なくとも２００個の連続したアミノ酸残基、もしくは少なくとも２５０個の連続したアミノ酸残基のアミノ酸配列を含む、ペプチドまたはポリペプチドをいう。具体的な実施形態では、断片は、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチド、またはＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体の、断片である。一実施形態では、タンパク質またはポリペプチドの断片は、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの機能を保持している。別の実施形態では、ポリペプチドまたはタンパク質の断片は、ポリペプチドまたはタンパク質の少なくとも２つ、３つ、４つ、もしくは５つの機能を保持している。好ましくは、ＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはその断片、またはエフリンＡ１ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する抗体の断片は、それぞれＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはその断片、またはエフリンＡ１ポリペプチドもしくはその断片に免疫特異的に結合する能力を保持している。好ましくは、抗体断片はエピトープ結合断片である。
【００６６】
本明細書中で用いる用語「融合タンパク質」とは、第１のポリペプチドもしくはタンパク質またはその断片、類似体もしくは誘導体のアミノ酸配列、および異種ポリペプチドもしくはタンパク質（すなわち、第１のポリペプチドもしくはタンパク質またはその断片、類似体もしくは誘導体とは異なるか、あるいは通常は第１のポリペプチドもしくはタンパク質またはその断片、類似体もしくは誘導体の一部ではない、第２のポリペプチドもしくはタンパク質またはその断片、類似体もしくは誘導体）のアミノ酸配列を含む、ポリペプチドまたはタンパク質をいう。一実施形態では、融合タンパク質は、異種タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドと融合させた予防剤または治療剤を含む。本実施形態に従って、異種タンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドは、異なる種類の予防剤または治療剤であっても、そうでなくてもよい。たとえば、免疫調節活性を有する２つの異なるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドを１つに融合させて融合タンパク質を形成し得る。好ましい実施形態では、融合タンパク質は、異種タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドと融合する前のもとのポリペプチドまたはタンパク質の活性と比較して、活性が保持されているか、または向上している。
【００６７】
本明細書中で用いる用語「ヒト化抗体」とは、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む、非ヒト（たとえば、ネズミ）抗体、好ましくはキメラ抗体の形態をいう。多くの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域または相補性決定（ＣＤＲ）残基を所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、ウサギもしくは非ヒト霊長類などの非ヒト生物種由来の抗体（ドナー抗体）からの超可変領域残基またはＣＤＲ残基で置き換えた、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、たとえば、ヒト化抗体の親和性を向上させるために、ヒト免疫グロブリンの１つもしくは複数のフレームワーク領域（ＦＲ）残基を、構造モデリングに基づいて対応する非ヒト残基または他の残基で置き換える。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体またはドナー抗体中にはみとめられない残基を含み得る。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練するために行う。一般に、ヒト化抗体は、超可変領域のすべてまたは実質的にすべてが非ヒト免疫グロブリンの超可変領域に一致しており、ＦＲのすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のＦＲである可変ドメインを、少なくとも１つ、典型的には２つの実質的にすべてを含む。また、ヒト化抗体は、場合により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部分も含む。さらなる詳細については、Jones他、1986、Nature 321 :522-525；Reichmann他、1988、Nature 332:323-329；Presta、1992、Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596；およびQueen他、米国特許第5,585,089号を参照されたい。
【００６８】
本明細書中で用いる用語「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」とは、互いに少なくとも３０％（好ましくは、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９８％）同一であるヌクレオチド配列が、一般的に互いにハイブリダイズされたまま保たれる、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の条件を説明している。そのようなストリンジェントな条件は当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、N.Y. (1989)、6.3.1-6.3.6に見られる。
【００６９】
一般に、ストリンジェントな条件は、所定のイオン強度ｐＨにおいて具体的な配列について熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低く選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下で）温度である（標的配列は過剰に存在するので、Ｔｍでは、平衡状態でプローブの５０％が占有される）。ストリンジェントな条件は、ｐＨ７．０〜８．３で、塩濃度がナトリウムイオン約１．０Ｍ未満、典型的には約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）、温度は短いプローブ（たとえば、１０〜５０個のヌクレオチド）について少なくとも約３０℃、長いプローブ（たとえば、５０個を超えるヌクレオチド）について少なくとも約６０℃である。また、ストリンジェントな条件は、不安定化剤、たとえば、ホルムアミドを加えることによっても達成し得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションでは、陽性シグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍である。
【００７０】
１つの非限定的な例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）で、約４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．１×ＳＳＣ、０．２％のＳＤＳで、約６８℃での１回または複数回の洗浄である。好ましい非限定的な例では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣで約４５℃でのハイブリダイゼーション、次いで０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで、５０〜６５℃での１回または複数回の洗浄（すなわち、５０℃、５５℃、６０℃または６５℃で１回もしくは複数回の洗浄）である。本発明の核酸には、これらの条件下で、ＡまたはＴヌクレオチドのみからなるヌクレオチド配列だけにハイブリダイズする核酸分子は含まれないことを理解されたい。
【００７１】
本明細書中で用いる用語「過剰増殖性細胞障害」および「過剰細胞蓄積障害」とは、細胞過剰増殖もしくは過剰な細胞蓄積の任意の形態が病理状態または障害の症状を引き起こすかあるいはそれに寄与する、新生物性でない（すなわち非新生物性の）障害をいう。一部の実施形態では、過剰増殖細胞または過剰細胞蓄積障害は、過剰増殖している上皮細胞によって特徴付けられる。過剰増殖性上皮細胞障害には、それだけには限定されないが、硬変、および肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜または他の内臓の線維症、および線維症関連疾患が含まれる。他の実施形態では、過剰増殖細胞または過剰細胞蓄積障害は、過剰増殖している内皮細胞によって特徴付けられる。他の実施形態では、過剰増殖細胞または過剰細胞蓄積障害は、過剰増殖している線維芽細胞によって特徴付けられる。さらに他の実施形態では、過剰増殖細胞または過剰細胞蓄積障害は、異常な血管形成を特徴とする。本発明の方法に包含される、異常な血管形成に関連する障害には、それだけには限定されないが、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬が含まれる。
【００７２】
本明細書中で用いる用語「超可変領域」とは、抗原結合を担っている、抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２４〜３４（Ｌｌ）、５０〜５６（Ｌ２）、８９〜９７（Ｌ３）および重鎖可変ドメインの３１〜３５（Ｈｌ）、５０〜６５（Ｈ２）、９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat他、Sequences of Proteins of Immunological Interest、第5版、Public Health Service、National Institutes of Health、メリーランド州Bethesda(1991)）由来のアミノ酸残基、ならびに／または「超可変ループ」（すなわち、軽鎖可変ドメインの残基２６〜３２（Ｌｌ）、５０〜５２（Ｌ２）、９１〜９６（Ｌ３）および重鎖可変ドメインの２６〜３２（Ｈｌ）、５３〜５５（Ｈ２）、９６〜１０１（Ｈ３）；ChothiaおよびLesk、1987、J. MoI. Biol. 196:901-917）由来の残基を含む。「フレームワーク領域」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義した超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００７３】
本明細書中で用いる用語「免疫調節剤」とは、被験体の免疫系を調節する薬剤をいう。具体的には、免疫調節剤は、被験体の免疫系が１つまたは複数の外来抗原に応答する能力を変更する薬剤である。具体的な実施形態では、免疫調節剤は、被験体の免疫応答の一態様をシフトさせる薬剤である。本発明の好ましい実施形態では、免疫調節剤は、被験体の免疫応答を阻害または低減させる薬剤である（すなわち免疫抑制剤）。好ましくは、被験体の免疫応答を阻害または低減させる免疫調節剤は、被験体の免疫系が１つもしくは複数の外来抗原に応答する能力を阻害または低減させる。特定の実施形態では、ＩＬ−９に免疫特異的に結合する抗体は免疫調節剤である。具体的な実施形態では、免疫調節剤は、ＣＤ２に免疫特異的に結合する抗体。抗ＣＤ２抗体の非限定的な例には、シプリズマブがある（Medlmmune, Inc.、国際公開公報第WO 02/098370号および第WO 02/069904号））。別の具体的な実施形態では、免疫調節剤は、αｖβ３に結合する薬剤である。インテグリンαｖβ３に免疫特異的に結合する抗体の非限定的な例には、１１Ｄ２（Ｓｅａｒｌｅ）、ＬＭ６０９（Ｓｃｒｉｐｐｓ）、およびＶＩＴＡＸＩＮ（商標）（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）が含まれる。
【００７４】
本明細書中で用いる用語「ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合する」および類似用語は、ＥｐｈＡ２受容体または１つもしくは複数のその断片に特異的に結合し、他の受容体またはその断片に特異的に結合しない、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、および抗体またはその断片をいう。用語「エフリンＡ１に免疫特異的に結合する」および類似用語は、エフリンＡ１または１つもしくは複数のその断片に特異的に結合し、他のリガンドまたはその断片に特異的に結合しない、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、融合タンパク質、および抗体またはその断片をいう。ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１に免疫特異的に結合するペプチド、ポリペプチド、タンパク質、もしくは抗体、またはその断片は、たとえば、免疫アッセイまたは結合親和性を検出するために当分野で知られている他のアッセイによって決定されるように、より低い親和性で他のペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に結合してもよい。ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１に免疫特異的に結合する抗体もしくは断片は、関連する抗原と交差反応性を有していてもよい。好ましくは、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１に免疫特異的に結合する抗体もしくはその断片は、たとえば、免疫アッセイまたは当業者に知られている他の技術によって同定することができる。抗体またはその断片は、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの実験技術を用いて決定されるように、任意の交差反応性抗原よりも高い親和性でＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１に結合する場合には、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１に特異的に結合する。抗体の特異性に関する議論については、たとえば、Paul編、1989、Fundamental Immunology、第2版、Raven Press、New York、ページ332-336を参照されたい。好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１に免疫特異的に結合する抗体は、他の抗原と結合も交差反応もしない。別の実施形態では、融合タンパク質であるＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１に結合する抗体は、融合タンパク質のＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１である部分に特異的に結合する。
【００７５】
本明細書中で用いる用語「組み合わせて」とは、複数の治療を用いることをいう。用語「組み合わせて」の使用は、治療を非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害に罹患している被験体に投与する順序を限定しない。第１の治療は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患していたか、それに罹患しているか、またはそれに罹り易い被験体に、第２の治療を投与する前（たとえば、１分間、５分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間前）、それと同時に、あるいはそれに次いで（たとえば、１分間、５分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、もしくは１２週間後）投与することができる。任意の追加の治療は、他の追加の治療と任意の順序で投与することができる。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、１つもしくは複数の治療（たとえば、障害を治療するために現在投与されている非ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター、鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、または免疫調節剤）と組み合わせて投与することができる。
【００７６】
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシンおよびフィブロネクチン）の沈着に関して本明細書中で用いる用語「増加」とは、正常な健康な被験体および／もしくは正常な健康な細胞集団の上皮および／または内皮細胞層中におけるＥＣＭ成分の沈着レベルと比較した、ＥＣＭ成分の増加を伴う非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害（たとえば、硬変および線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症））に罹患した被験体の上皮および／または内皮細胞層中におけるＥＣＭ成分の沈着の増加をいう。具体的な実施形態では、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患した被験体の上皮および／または内皮細胞層中におけるＥＣＭ成分の沈着は、正常な健康な被験体および／もしくは正常な健康な細胞集団の上皮および／または内皮細胞層中におけるＥＣＭ成分の沈着レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％増加し、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍もしくは少なくとも１０倍に増加している。
【００７７】
血管形成に関して本明細書中で用いる用語「増加」とは、正常な健康な被験体および／もしくは正常な健康な細胞集団における血管形成または血管形成活性のレベルと比較した、異常な血管形成もしくは血管形成活性に関連した非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害（たとえば、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎および乾癬）に罹患している被験体における血管形成あるいは血管形成活性の増加をいう。具体的な実施形態では、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患した被験体における血管形成または血管形成活性のレベルは、正常な健康な被験体および／もしくは正常な健康な細胞集団中における血管形成または血管形成活性のレベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％増加し、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍もしくは少なくとも１０倍に増加している。
【００７８】
タンパク性薬剤もしくは核酸以外の有機または無機分子（小分子でも大分子でも）に関して本明細書中で用いる用語「単離した」とは、異なる有機または無機分子を実質的に含まない有機または無機分子をいう。好ましくは、有機または無機分子は、第２の異なる有機または無機分子を６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、もしくは９９％含まない。好ましい実施形態では、有機および／または無機分子は単離されている。
【００７９】
タンパク性薬剤（たとえば、ペプチド、ポリペプチド、融合タンパク質、または抗体）に関して本明細書中で用いる用語「単離した」とは、それが由来する細胞もしくは組織源からの細胞性物質または混入タンパク質を実質的に含まない、あるいは化学合成した場合には化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まない、タンパク性薬剤をいう。用語「細胞性物質を実質的に含まない」には、タンパク性薬剤がそれを単離したまたは組換えによって産生した細胞由来の細胞成分から分離されている、タンパク性薬剤調製物が含まれる。したがって、細胞性物質を実質的に含まないタンパク性薬剤には、約３０％未満、２０％未満、１０％未満、もしくは５％未満（乾重量）の異種タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、または抗体（「混入タンパク質」とも呼ぶ）を含むタンパク性薬剤調製物が含まれる。タンパク性薬剤を組換えによって産生する場合は、同様に培地を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、培地がタンパク性薬剤調製物の体積の約２０％未満、１０％未満、または５％未満を表す。タンパク性薬剤を化学合成によって生成する場合は、化学物質前駆体または他の化学物質を実質的に含まないことが好ましく、すなわち、タンパク性薬剤の合成に関与する化学物質前駆体または他の化学物質から分離されている。したがって、このようなタンパク性薬剤調製物は、約３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満（乾重量）の、目的のタンパク性薬剤以外の化学物質前駆体または化合物を含む。具体的な実施形態では、本明細書中に開示するタンパク性薬剤は単離されている。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１タンパク質モジュレーターは単離されている。
【００８０】
核酸分子に関して本明細書中で用いる用語「単離した」とは、その核酸分子の天然源中に存在する他の核酸分子から分離された核酸分子をいう。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離した」核酸分子は、好ましくは、他の細胞性物質を実質的に含まず、または組換え技術によって産生した場合は培地を実質的に含まず、または化学合成した場合は化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。具体的な実施形態では、核酸分子は単離されている。好ましい実施形態では、核酸分子であるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは単離されている。
【００８１】
本明細書中で用いる用語「低忍容性」とは、患者が治療の副作用に苦しんでおり、副作用の有害作用および／もしくは害が治療の利点を上回るために、患者が治療から利益を得られないかつ／または治療を継続しないであろう状態をいう。
【００８２】
本明細書中で用いる用語「管理する」、「管理すること」および「管理」とは、障害の治癒をもたらさない、被験体が治療から得る有益効果をいう。特定の実施形態では、障害の進行もしくは悪化を防ぐ（すなわち疾患の進行を留める）ように障害を「管理する」ために、被験体に１つまたは複数の治療を投与する。
【００８３】
本明細書中で用いる用語「新生物性」とは、遠位部位に転移して非新生細胞とは異なる表現型形質、たとえば、軟寒天などの三次元基質中におけるコロニーの形成またはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）などの三次元の基底膜もしくは細胞外マトリックス調製物中における管状ネットワークもしくはくもの巣状マトリックスの形成を示す可能性を有する細胞を伴う疾患をいう。非新生細胞は軟寒天中でコロニーを形成せず、三次元の基底膜または細胞外マトリックス調製物中において明確な球状様構造を形成する。新生物細胞は、様々な機構によってではあるが、その発生の際に特徴的な一組の機能的能力を獲得する。そのような能力には、アポトーシスの回避、成長シグナルの自給自足、抗成長シグナルに対する非感受性、組織の侵襲／転移、無限複製の可能性、および血管形成の持続が含まれる。したがって、「非新生物性」とは、病的状態、疾患、または障害が癌細胞を伴わないことを意味する。
【００８４】
本明細書中で用いる用語「病理状態を引き起こす細胞表現型」または「病理状態を引き起こす上皮および／もしくは内皮細胞表現型」とは、非新生物性の上皮および／もしくは内皮過剰増殖性障害の病理状態を引き起こすかまたはそれに寄与する、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞が行う機能をいう。病理状態を引き起こす上皮細胞表現型には、ムチンの分泌、ムチン分泌細胞への分化、炎症性因子の分泌、および過剰増殖が含まれる。病理状態を引き起こす内皮細胞表現型には、細胞遊走の増加（転移は含まず）、細胞体積の増加、細胞外マトリックス分子（たとえば、コラーゲン、テネイシン  フィブロネクチン、プロテオグリカンなど）もしくはマトリックスメタロプロテイナーゼ（たとえば、ゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、およびストロメライシン）の分泌、過剰増殖、および／または異常な血管形成が含まれる。これらの病理状態を引き起こす細胞表現型の１つもしくは複数は、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜もしくは他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害に罹患している患者において、症状を引き起こすかあるいはそれに寄与する。
【００８５】
本明細書中で用いる語句「製薬上許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の規制当局に認可されているか、または動物、より詳細にはヒトで使用するために米国薬局方、欧州薬局方、もしくは他の一般に認知されている薬局方に記載されていることを意味する。
【００８６】
本明細書中で用いる用語「増強する」とは、その一般的または許容されている用量における治療の有効性の向上をいう。
【００８７】
本明細書中で用いる用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」とは、治療（たとえば、予防剤もしくは治療剤）の投与、または治療の組合せ（たとえば、予防剤もしくは治療剤の組合せ）の投与の結果もたらされる、被験体における非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮障害の発生または発症の阻止、あるいは非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮障害の１つもしくは複数の症状の再発、発症、または発生の予防をいう。
【００８８】
本明細書中で用いる用語「予防剤」とは、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの、非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害、またはその症状の再発、拡大あるいは発症を予防することができる任意の薬剤をいう。特定の実施形態では、用語「予防剤」とは、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをいう。特定の他の実施形態では、用語「予防剤」とは、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター以外の薬剤をいう。好ましくは、予防剤は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害またはその１つもしくは複数の症状の発症、発生、進行ならびに／あるいは重篤度を、予防または妨害するために有用であることが知られているか、使用されてきたか、あるいは現在使用されている薬剤である。
【００８９】
本明細書中で用いる「予防上有効な量」とは、非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害（それだけには限定されないが、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬を含む）またはその症状の再発、拡大あるいは発症の予防をもたらすために十分な、治療（たとえば、予防剤）の量をいう。予防上有効な量は、非新生物性過剰増殖性の細胞障害のかかりやすい患者、たとえば、遺伝的にかかりやすい患者もしくは以前にそのような障害に罹患していた患者において非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害の発生、拡大あるいは再発を予防するために十分な、治療（たとえば、予防剤）の量をいう場合がある。また、予防上有効な量は、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害の予防において予防上の利点をもたらす治療（たとえば、予防剤）の量をいう場合がある。さらに、治療（たとえば、本発明の予防剤）に関して予防上有効な量とは、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害の予防において予防上の利点をもたらす、単独で、あるいは１つもしくは複数の他の治療（たとえば、その障害を予防するために現在投与されている非ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター、鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、または免疫調節剤）と組み合わせた、その治療（たとえば、予防剤）の量をいう。本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの量に関連して用いた場合は、この用語は、全体的な予防を向上させる量、または別の治療（たとえば、予防剤）の予防的有効性を増強するもしくはそれと相乗作用を示す量を包含することができる。
【００９０】
本明細書中で使用する「プロトコル」には、投薬スケジュールおよび投薬レジメンが含まれる。
【００９１】
本明細書中で用いる用語「不応性」とは、１つもしくは複数の治療（たとえば、現在利用可能な治療）に応答性を示さない、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害をいう。特定の実施形態では、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害が治療に不応性であるということは、該障害に関連する症状の少なくともある程度の顕著な部分がその治療によって排除または軽減されないことを意味する。硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または細胞障害が不応性であるかどうかの判定は、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは細胞障害に対する治療の有効性のアッセイを行うための当分野で知られている任意の方法によって、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行うことができる。
【００９２】
本明細書中で用いる語句「副作用」とは、治療（たとえば、予防剤または治療剤）の所望しないかつ有害な作用を包含する。有害作用は常に所望しないものであるが、所望しない作用は必ずしも有害ではない。治療（たとえば、予防剤または治療剤）の有害作用は、有害または不快または危険であり得る。副作用の例には、それだけには限定されないが、嘔気、嘔吐、摂食障害、腹部痙攣、発熱、疼痛、体重減少、脱水、脱毛症、呼吸困難、不眠症、眩暈、粘膜炎、神経および筋肉効果、疲労、口渇、および食欲不振、投与部位における発疹または腫脹、発熱、悪寒および疲労などのインフルエンザ様の症状、消化管の問題ならびにアレルギー反応が含まれる。患者が経験するさらなる望ましくない効果は多数存在し、当分野で知られている。その多くはPhysicians ' Desk Reference (第58版、2004)に記載されている。
【００９３】
本明細書中で用いる用語「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」とは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片であり、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖中に存在するものをいう。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、これによりｓｃＦｖが抗原結合のために所望の構造を形成することが可能となる。ｓｃＦｖの総説については、Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻, RosenburgおよびMoore編、Springer-Verlag、New York、ページ269-315(1994)を参照されたい。
【００９４】
本明細書中で用いる用語「被験体」および「患者」は、互換的に用いられる。本明細書中で用いる場合、被験体は好ましくは非霊長類（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラットなど）および霊長類（たとえば、サルおよびヒト）などの哺乳動物、最も好ましくはヒトである。一実施形態では、被験体は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害に罹患している哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施形態では、被験体は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／あるいは内皮細胞障害に罹患している家畜（たとえば、ウマ、ブタ、もしくはウシ）、ペット（たとえば、モルモット、イヌもしくはネコ）、または実験動物（たとえば、モデル動物）である。別の実施形態では、被験体は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／あるいは内皮細胞障害を発生する危険性のある哺乳動物、好ましくはヒトである（たとえば、免疫無防備状態もしくは免疫抑制状態の哺乳動物、または遺伝的にかかりやすい哺乳動物）。別の実施形態では、被験体は、免疫無防備状態または免疫抑制状態ではない哺乳動物、好ましくはヒトである。別の実施形態では、被験体は、リンパ球数が約５００個の細胞／ｍｍ３未満でない哺乳動物、好ましくはヒトである。
【００９５】
本明細書中で用いる用語「相乗的な」とは、任意の２つ以上の単独の治療（たとえば、１つもしくは複数の予防剤または治療剤）の相加効果よりも有効である、治療の組合せ（たとえば、予防剤または治療剤）をいう。治療の組合せ（たとえば、予防剤または治療剤の組合せ）の相乗効果により、非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害に罹患している被験体に、治療の１つまたは複数（たとえば、１つもしくは複数の予防剤または治療剤）をより低い用量で用いること、および／あるいは前記治療をより低い頻度で投与することが可能となる。治療（たとえば、予防剤もしくは治療剤）をより低い用量で利用できること、および／または前記治療をより低い頻度で投与できることにより、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害を予防または治療することにおける前記治療の有効性を低下させずに、前記治療の被験体への投与に関連する毒性が低減される。さらに、相乗効果は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の予防または治療における治療（たとえば、予防剤または治療剤）の有効性の向上をもたらすことができる。最後に、治療（たとえば、予防剤または治療剤）の組合せの相乗効果により、任意の単一の治療の使用に関連する有害もしくは所望しない副作用が回避または低減され得る。
【００９６】
本明細書中で用いる用語「治療剤」とは、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害の治療、管理、予防、または症状軽減に用いることができる任意の薬剤をいう。特定の実施形態では、用語「治療剤」とは、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをいう。特定の他の実施形態では、用語「治療剤」とは、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター以外の薬剤をいう。好ましくは、治療剤は、非新生物性の上皮および／もしくは内皮細胞障害または１つもしくは複数のその症状の、予防、治療、管理、または改善に有用であることが知られているか、使用されてきたか、あるいは現在使用されている薬剤である。
【００９７】
本明細書中で用いる「治療上有効な量」とは、非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害（硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬など）を治療、管理、または改善するため、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の１つまたは複数の症状を改善するため、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の発症または重篤度を遅延または最小限にするため、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の進行を予防するため、非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害の退行を引き起こすため、別の治療の治療効果を増強または向上させるため、あるいは非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の治療または管理において治療上の利点をもたらすために十分な、治療（たとえば、治療剤）の量をいう。好ましくは、「治療上有効な量」とは、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に関連する症状を排除、変更、または制御するために十分な量である。本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの量に関連して用いた場合は、この用語は、全体的な治療効果を向上させる量、所望しない効果を低減させるもしくは回避する量、または別の治療の治療上の有効性を増強もしくはそれと相乗作用を示す量を包含することができる。
【００９８】
本明細書中で用いる用語「治療（ｔｈｅｒａｐｙ）」とは、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害の予防、治療または管理に用いることができる、任意のプロトコル、方法および／あるいは薬剤をいう。特定の実施形態では、用語「複数の治療」および「治療」とは、生物療法、支持療法、ならびに／あるいは、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害、または医療従事者などの当業者に知られている１つもしくは複数のその症状の治療、管理、予防、あるいは改善に有用な他の治療をいう。
【００９９】
本明細書中で用いる用語「治療する」、「治療すること」および「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」とは、１つもしくは複数の治療（たとえば、予防剤または治療剤）を投与した結果もたらされる、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害の症状の根絶、軽減または改善、特に根絶、除去、変更、または制御をいう。特定の実施形態では、このような用語は、１つもしくは複数の治療（たとえば、予防剤または治療剤）を、そのような障害に罹患している被験体に投与した結果もたらされる、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害の拡大を最小限にするかまたは遅延させることをいう。
【０１００】
４．発明の詳細な説明
本発明は、非新生物性過剰増殖性の上皮細胞および／もしくは内皮細胞障害（それだけには限定されないが、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の沈着の増加に関連する障害や異常な血管形成に関連する障害を含む）またはその症状を予防、管理、治療および／あるいは改善する方法であって、それを必要としている被験体に、有効量のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、非新生物性過剰増殖性の上皮細胞および／もしくは内皮細胞障害（それだけには限定されないが、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分の沈着の増加に関連する障害および増加したもしくは異常な血管形成に関連する障害を含む）またはその症状を予防、管理、治療ならびに／あるいは改善する方法であって、それを必要としている被験体に、有効量のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター以外の有効量の治療（たとえば、鎮痛剤、麻酔剤、抗生物質、または免疫調節剤）とを投与することを含む方法も提供する。ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの非限定的な例には、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を阻害または低減させる薬剤（本明細書中では以降「ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤」）が含まれる。ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤の非限定的な例には、（ｉ）ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導する薬剤（たとえば、エフリンＡ１の可溶形態（たとえば、単量体形態もしくは多量体形態）、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達およびリン酸化を誘導する抗体（すなわちＥｐｈＡ２アゴニスト抗体））；（ｉｉ）ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２アンタゴニスト抗体およびエフリンＡ１のドミナントネガティブ型）；（ｉｉｉ）エフリンＡ１に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２の可溶形態およびエフリンＡ１に結合してエフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する抗体）；ならびに（ｉｖ）エフリンＡ１に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型および抗エフリンＡ１抗体）が含まれる。
【０１０１】
さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２の発現を調節する薬剤が含まれる。このような薬剤は、ＥｐｈＡ２の発現を減少／ダウンレギュレーションするか（たとえば、ＥｐｈＡ２アンチセンス分子、ＲＮＡｉおよびリボザイム）、または細胞表面上のＥｐｈＡ２の量が結合に利用可能な内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）の量を上回って未結合のＥｐｈＡ２の量が増加するようにＥｐｈＡ２の発現を増加／アップレギュレーションすることができる（たとえば、ＥｐｈＡ２をコードしている核酸）。
【０１０２】
他の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとは、エフリンＡ１の発現を調節する薬剤である。このような薬剤は、エフリンＡ１の発現を減少／ダウンレギュレーションするか（たとえば、エフリンＡ１アンチセンス分子、ＲＮＡｉおよびリボザイム）、またはエフリンＡ１の発現を増加／アップレギュレーションすることができる（たとえば、エフリンＡ１をコードしている核酸）。
【０１０３】
さらに他の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１のタンパク質安定性またはタンパク質蓄積を調節する薬剤が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性および／または蓄積を増加させる。
【０１０４】
さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとは、キナーゼ活性（たとえば、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ１、または細胞膜でＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１と会合することが知られている異種タンパク質の、キナーゼ活性）を調節する薬剤である。
【０１０５】
さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を妨げるかまたは低減させるが、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を阻害も低減もさせない薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２細胞内発現抗体）；およびエフリンＡ１に結合し、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは低減させるが、エフリンＡ１とＥｐｈ  ＥｐｈＡ２との相互作用を阻害も低減もさせない薬剤（たとえば、エフリンＡ１抗体）が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させる。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存および／または増殖を増加させる。
【０１０７】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型；ＥｐｈＡ２の可溶形態（たとえば、ＥｐｈＡ２−Ｆｃ）；エフリンＡ１アンチセンス分子；ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２−リガンドの相互作用に干渉し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導しない抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体；および抗エフリンモノクローナルＡｌ抗体が含まれる。他の実施形態では、抗エフリンＡ１モノクローナル抗体は細胞毒性剤に連結されていてもよい。
【０１０８】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の発現を減少させる薬剤ではない。本発明の別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、キナーゼ活性（たとえば、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ１、または細胞膜でＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１と会合することが知られている異種タンパク質の、キナーゼ活性）を調節する薬剤ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性またはタンパク質蓄積を調節する薬剤ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２アゴニスト抗体ではない。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２アンチセンス分子ではない。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、エフリンＡ１またはその断片の可溶形態ではない。
【０１０９】
本発明は、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１を調節する（たとえば、発現および／もしくは活性を増加または減少させる）ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター、たとえば、ＥｐｈＡ２−内在性リガンドの結合を減少させるか、エフリンＡ１の遺伝子発現を減少させるか、ＥｐｈＡ２の遺伝子発現をアップレギュレーションするか、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性もしくはタンパク質蓄積を増加させるか、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させるか、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の増殖を増加させるか、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存を増加させる（たとえば、アポトーシスを防止することによって）か、上皮および／もしくは内皮細胞層の完全性を維持／再構成するか、ならびに／または血管形成を予防するもしくは遅延させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの、スクリーニングおよび同定方法を提供する。具体的な実施形態では、本発明は、上皮および／もしくは内皮細胞層におけるＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン）の沈着を予防するまたは遅延させることによって硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）などの非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の進行を予防ならびに／または遅延させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの、スクリーニングおよび同定方法を提供する。
【０１１０】
一実施形態では、本発明は、血管形成を予防、減少または減速させることによる、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の進行を予防ならびに／または遅延させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのスクリーニングおよび同定方法を提供する。代替実施形態では、本発明は、血管形成を増加させることによる、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の進行を予防ならびに／または遅延させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのスクリーニングおよび同定方法を提供する。
【０１１１】
本発明は、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害を治療、管理、または予防するために設計した、医薬組成物ならびに予防レジメンおよび治療レジメンを提供する。具体的な実施形態では、本発明は、上皮および／もしくは内皮細胞層におけるＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン）の沈着を予防するかまたは減速させる、かつ／あるいは血管形成を調節する医薬組成物ならびに予防レジメンおよび治療レジメン、ならびに非新生物性過剰増殖性の上皮細胞障害、具体的には線維症および／もしくは線維症関連疾患の治療、管理または予防における、そのような組成物およびレジメンの使用を提供する。
【０１１２】
具体的な実施形態では、本発明は、血管形成を減少させるように設計した、予防レジメンおよび治療レジメンならびに医薬組成物を提供する。別の実施形態では、本発明は、血管形成を増加させるように設計した、予防レジメンおよび治療レジメンならびに医薬組成物を提供する。
【０１１３】
本発明はさらに、非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害（たとえば、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬）の治療の有効性を評価するための、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを用いた診断方法を提供し、ここで、モニタリングする治療は、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１ベースのものであってもよく、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１ベースのものでなくてもよい。特定の実施形態では、本発明の診断方法は過剰増殖領域のイメージングを行う方法を提供する。また、本発明の診断方法を用いて、非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害（たとえば、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬）の予後を診断するかまたはそれを予測し得る。本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはまた、凍結もしくは固定化細胞の免疫組織化学的分析または組織アッセイにも用い得る。
【０１１４】
本発明はまた、本発明の医薬組成物または診断試薬を含むキットも提供する。
【０１１５】
４．１  ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター
本発明は、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１のモジュレーター（「ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター」）を提供する。ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの非限定的な例は、（ｉ）ＥｐｈＡ２および／もしくはＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）の発現を、たとえば、転写レベル、転写後レベル、翻訳レベルもしくは翻訳後レベルで調節；ならびに／または（ｉｉ）エフリンＡ１の活性を調節（直接あるいは間接的に）することによって、生物学的効果を与える薬剤である。
【０１１６】
ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの例には、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を阻害または低減させる薬剤（本明細書中では以降「ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤」）が含まれる。ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤の非限定的な例には、（ｉ）ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導する薬剤（たとえば、エフリンＡ１の可溶形態（たとえば、単量体形態もしくは多量体形態）、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達およびリン酸化を誘導する抗体（すなわちＥｐｈＡ２アゴニスト抗体））；（ｉｉ）ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２アンタゴニスト抗体およびエフリンＡ１のドミナントネガティブ型）；（ｉｉｉ）エフリンＡ１に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２の可溶形態およびエフリンＡ１に結合してエフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する抗体）；ならびに（ｉｖ）エフリンＡ１に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型および抗エフリンＡ１抗体）が含まれる。
【０１１７】
さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２の発現を調節する薬剤が含まれる。このような薬剤は、ＥｐｈＡ２の発現を減少／ダウンレギュレーションするか（たとえば、ＥｐｈＡ２アンチセンス分子、ＲＮＡｉおよびリボザイム）、または細胞表面上のＥｐｈＡ２の量が結合に利用可能な内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）の量を上回って未結合のＥｐｈＡ２の量が増加するようにＥｐｈＡ２の発現を増加／アップレギュレーションすることができる（たとえば、ＥｐｈＡ２をコードしている核酸）。
【０１１８】
他の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとは、エフリンＡ１の発現を調節する薬剤である。このような薬剤は、エフリンＡ１の発現を減少／ダウンレギュレーションするか（たとえば、エフリンＡ１アンチセンス分子、ＲＮＡｉおよびリボザイム）、またはエフリンＡ１の発現を増加／アップレギュレーションすることができる（たとえば、エフリンＡ１をコードしている核酸）。
【０１１９】
さらに他の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１のタンパク質安定性またはタンパク質蓄積を調節する薬剤が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性および／または蓄積を増加させる。
【０１２０】
さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとは、キナーゼ活性（たとえば、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ１、または細胞膜でＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１と会合することが知られている異種タンパク質の、キナーゼ活性）を調節する薬剤である。
【０１２１】
さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を妨げるかまたは低減させるが、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を阻害も低減もさせない薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２細胞内発現抗体）；およびエフリンＡ１に結合し、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは低減させるが、エフリンＡ１とＥｐｈ  ＥｐｈＡ２との相互作用を阻害も低減もさせない薬剤（たとえば、エフリンＡ１抗体）が含まれる。好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させる。
【０１２２】
本発明の好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存および／または増殖を増加させる。
【０１２３】
本発明の別の好ましい実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型；ＥｐｈＡ２の可溶形態（たとえば、ＥｐｈＡ２−Ｆｃ）；エフリンＡ１アンチセンス分子；ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２−リガンドの相互作用に干渉し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導しない抗ＥｐｈＡ２モノクローナル抗体；および抗エフリンＡ１モノクローナル抗体が含まれる。他の実施形態では、抗エフリンＡ１モノクローナル抗体は細胞毒性剤に連結されていてもよい。
【０１２４】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の発現を減少させる薬剤ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性またはタンパク質蓄積を調節する薬剤ではない。本発明の別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、キナーゼ活性（たとえば、ＥｐｈＡ２、エフリンＡ１、または細胞膜でＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１と会合することが知られている異種タンパク質の、キナーゼ活性）を調節する薬剤ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２アゴニスト抗体ではない。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２アンチセンス分子ではない。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、エフリンＡ１またはその断片の可溶形態ではない。
【０１２５】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の発現を減少またはダウンレギュレーションする薬剤である（たとえば、ＥｐｈＡ２アンチセンス分子、ＲＮＡｉおよびリボザイム）。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２の発現を少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％減少またはダウンレギュレーションし、または少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／２．５、少なくとも１／３、少なくとも１／３．５、少なくとも１／４、少なくとも１／４．５、少なくとも１／５、少なくとも１／７もしくは少なくとも１／１０に減少またはダウンレギュレーションする。代替実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、細胞表面上のＥｐｈＡ２の量が結合に利用可能な内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）の量を上回って未結合のＥｐｈＡ２の量が増加する（たとえば、ＥｐｈＡ２をコードしている核酸）ように、ＥｐｈＡ２の発現を増加またはアップレギュレーションする薬剤である。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２の発現を少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％増加またはアップレギュレーション、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍もしくは少なくとも１０倍に増加またはアップレギュレーションする。
【０１２６】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性および／またはタンパク質蓄積を低減させる薬剤である。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、本明細書中に記載のアッセイまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性および／またはタンパク質蓄積の発現を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％低減させ、または少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／２．５、少なくとも１／３、少なくとも１／３．５、少なくとも１／４、少なくとも１／４．５、少なくとも１／５、少なくとも１／７もしくは少なくとも１／１０に低減させる。代替実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性および／またはタンパク質蓄積を増加させる薬剤である。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性および／またはタンパク質蓄積の発現を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％増加し、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍もしくは少なくとも１０倍に増加させる。
【０１２７】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、エフリンＡ１の発現を阻害または減少させる薬剤である（たとえば、エフリンＡ１アンチセンス分子、ＲＮＡｉおよびリボザイム）。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロットもしくはＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、エフリンＡ１の発現を少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％減少させ、または少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／２．５、少なくとも１／３、少なくとも１／３．５、少なくとも１／４、少なくとも１／４．５、少なくとも１／５、少なくとも１／７もしくは少なくとも１／１０に減少させる。
【０１２８】
別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を妨げるかまたは低減させるが、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を阻害または低減させない薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２細胞内発現抗体）である。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％低減させ、または少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／２．５、少なくとも１／３、少なくとも１／３．５、少なくとも１／４、少なくとも１／４．５、少なくとも１／５、少なくとも１／７もしくは少なくとも１／１０に低減させる。本実施形態に従って、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイにおいて、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）との相互作用を低減させないか、または対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下しか低減させない。
【０１２９】
別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、エフリンＡ１に結合し、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは低減させるが、エフリンＡ１とＥｐｈＡ２との相互作用を阻害または低減させない薬剤である。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、エフリンＡ１のシグナル伝達を少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％低減させ、または少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／２．５、少なくとも１／３、少なくとも１／３．５、少なくとも１／４、少なくとも１／４．５、少なくとも１／５、少なくとも１／７もしくは少なくとも１／１０に低減させる。本実施形態に従って、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイにおいて、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）との相互作用を低減させないか、あるいは対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、５％以下、１０％以下、１５％以下、２０％以下、２５％以下、３０％以下、３５％以下、４０％以下しか低減させず、または１／２以下、１／１．５以下もしくは１倍以下しか低減させない。
【０１３０】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤である。一実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導する薬剤である（たとえば、エフリンＡ１の可溶形態、および、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達およびリン酸化を誘導する抗体（すなわちアゴニスト抗体））。特定の実施形態では、そのようなＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイにおいて、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）との相互作用を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％低減させ、または少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／２．５、少なくとも１／３、少なくとも１／３．５、少なくとも１／４、少なくとも１／４．５、少なくとも１／５、少なくとも１／７もしくは少なくとも１／１０に低減させる。本実施形態に従って、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍もしくは少なくとも１０倍、誘導する。
【０１３１】
別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する薬剤である（たとえば、抗体）。特定の実施形態では、そのようなＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、本明細書中に記載のアッセイまたは当分野で知られているアッセイにおいて、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）との相互作用を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％低減させ、または少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／２．５、少なくとも１／３、少なくとも１／３．５、少なくとも１／４、少なくとも１／４．５、少なくとも１／５、少なくとも１／７もしくは少なくとも１／１０に低減させる。本実施形態に従って、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、または２倍以下、１．５倍以下、もしくは１倍以下誘導する。
【０１３２】
別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、エフリンＡ１に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する薬剤である（たとえば、ＥｐｈＡ２の可溶形態、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型、およびエフリンＡ１に結合してエフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する抗体）。特定の実施形態では、そのようなＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、本明細書中に記載のアッセイまたは当分野で知られているアッセイにおいて、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％低減させ、または少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／２．５、少なくとも１／３、少なくとも１／３．５、少なくとも１／４、少なくとも１／４．５、少なくとも１／５、少なくとも１／７もしくは少なくとも１／１０に低減させる。本実施形態に従って、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、本明細書中に記載のまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、エフリンＡ１のシグナル伝達を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％、または少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも４．５、少なくとも５倍、少なくとも７倍もしくは少なくとも１０倍誘導する。
【０１３３】
別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、エフリンＡ１に結合し、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する薬剤である（たとえば、抗体）。特定の実施形態では、そのようなＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、本明細書中に記載のアッセイまたは当分野で知られているアッセイにおいて、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％低減させ、または少なくとも１／１．５、少なくとも１／２、少なくとも１／２．５、少なくとも１／３、少なくとも１／３．５、少なくとも１／４、少なくとも１／４．５、少なくとも１／５、少なくとも１／７もしくは少なくとも１／１０に低減させる。本実施形態に従って、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤は、本明細書中に記載のアッセイまたは当分野で知られているアッセイ（たとえば、免疫アッセイ）において、対照（たとえば、リン酸緩衝生理食塩水）と比較して、エフリンＡ１のシグナル伝達を、４０％以下、３５％以下、３０％以下、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、または２倍以下、１．５倍以下もしくは１倍以下で誘導する。
【０１３４】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の遺伝子発現を阻害または低減させる薬剤（たとえば、ＥｐｈＡ２アンチセンス、ＲＮＡｉもしくはリボザイム）ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２に結合し、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導する薬剤であるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１阻害剤ではない。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達およびリン酸化を誘導する抗体（すなわちアゴニスト抗体）。
【０１３５】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、以下の細胞効果の１つ、２つまたはすべてを有する：（ｉ）ＥｐｈＡ２を発現する細胞の増殖の増加；（ｉｉ）ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存の増加（たとえば、アポトーシスおよび／もしくは壊死を防止または低減させることによる）；（ｉｉｉ）上皮および／もしくは内皮細胞層の完全性の維持ならびに／または再構成。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシンおよびフィブロネクチン）の沈着を予防、低減または遅延させる。具体的な実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、血管形成を調節する。本発明の特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、血管形成を予防、低減または減速させる。代替実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、血管形成を増加させる。
【０１３６】
本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、それだけには限定されないが、タンパク性分子（それだけには限定されないが、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、翻訳後修飾されたタンパク質、抗体、リステリア菌（Listeria）ベースおよび非リステリア菌（Listeria）ベースのワクチンなどを含む）、小分子（１０００ダルトン未満）、無機または有機化合物、核酸分子（それだけには限定されないが、二本鎖、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖もしくは一本鎖ＲＮＡ（たとえば、アンチセンス、媒介ＲＮＡｉなど）、および三重らせん核酸分子を含む）、アプタマー、ならびに上記の任意のものの誘導体が含まれる。
【０１３７】
４．２  ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとしてのポリペプチド
本発明の方法は、ポリペプチドであるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを包含する。具体的な実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、上皮および／もしくは内皮細胞層におけるＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン）の沈着を予防、低減または遅延させる。別の具体的な実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、血管形成を調節する。特定の実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、血管形成を予防、低減または減速させる。別の実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、血管形成を増加させる。
【０１３８】
一実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは抗体である。好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター抗体はモノクローナル抗体、より好ましくはヒトまたはヒト化抗体である。別の実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１の可溶形態である。別の実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１のドミナントネガティブ型である。
【０１３９】
一実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１相互作用阻害剤である。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２抗体であり、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達（それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２の自己リン酸化を含む）を誘導する。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２抗体であり、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達（それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２の自己リン酸化を含む）を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する。特定の実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２抗体ではなく、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導する。
【０１４０】
具体的な実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、エフリンＡ１に免疫特異的に結合するエフリンＡ１抗体であり、それはＥｐｈＡｌとエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、エフリンＡ１に免疫特異的に結合するエフリンＡ１抗体であり、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する。
【０１４１】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２に結合するエフリンＡ１またはエフリンＡ１の断片の可溶形態であり、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達（それだけには限定されないが、自己リン酸化を含む）を誘導する。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２に結合するエフリンＡ１またはエフリンＡ１の断片の可溶形態であり、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との相互作用を妨げるかまたは低減させ、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達（それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２の自己リン酸化を含む）を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する。
【０１４２】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）に結合するＥｐｈＡ２またはＥｐｈＡ２の断片の可溶形態であり、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）に結合するＥｐｈＡ２またはＥｐｈＡ２の断片の可溶形態であり、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する。
【０１４３】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）に結合するＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型であり、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を誘導する。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）に結合するＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型であり、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド（好ましくはエフリンＡ１）との相互作用を妨げるかまたは低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を妨げるかまたは非常に低いレベル〜無視できるレベルで誘導する。
【０１４４】
本発明は、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて１５日間を超える、好ましくは２０日間を超える、２５日間を超える、３０日間を超える、３５日間を超える、４０日間を超える、４５日間を超える、２カ月を超える、３カ月を超える、４カ月を超える、または５カ月を超える半減期（たとえば、血清半減期）を示すタンパク性ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター（たとえば、抗体およびポリペプチドのＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター）を包含する。哺乳動物、好ましくはヒトにおけるタンパク性ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの半減期の増加は、哺乳動物内においてより高濃度の前記タンパク性ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをもたらし、それは、前記ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの投与頻度を低減させ、かつ／または前記タンパク性ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの投与量を低減させる。増加したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を有するタンパク性ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、当業者に知られている技術によって生成することができる。たとえば、増加したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示すタンパク性ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、アミノ酸残基の改変（たとえば、置換、欠失または付加）によって生成することができる。一実施形態では、タンパク性ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターが抗体である場合は、改変するこのようなアミノ酸残基は、ＦｃドメインとＦｃＲｎ受容体との相互作用に関与している残基であってよい（たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれる、国際公開公報第WO 97/34631号および２００１年１２月１２日出願、題名「延長された半減期を示す分子、組成物およびその使用（Molecules With Extended Half-Lives, Compositions and Uses Thereof）」の米国特許出願第10/020,354号を参照されたい）。増加したｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を示すタンパク質ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはまた、前記ポリペプチドに高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー分子を結合させることによっても生成することができる。ＰＥＧは、多官能性リンカーを用いてもしくは用いずに、ＰＥＧと前記ポリペプチドのＮもしくはＣ末端との部位特異的なコンジュゲーションによって、またはリシン残基上に存在するε−アミノ基を介して、前記タンパク性ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターに結合させることができる。生物活性の損失がほとんどない直鎖または分岐ポリマーの誘導体化を用いる。ＰＥＧ分子とタンパク性ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとの適切なコンジュゲーションを確保するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によってコンジュゲーションの程度を綿密にモニタリングする。未反応のＰＥＧは、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィーまたはイオン交換クロマトグラフィーによって、タンパク性ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。
【０１４５】
４．２．１  ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとしての抗体
一実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは抗体、好ましくはモノクローナル抗体である。別の好ましい実施形態では、抗体はヒトまたはヒト化抗体である。本発明の抗体ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１に免疫特異的に結合し、ＥｐｈＡ２および／もしくはエフリンＡ１の活性ならびに／または発現を調節する。具体的な実施形態では、その抗体は、上皮および／もしくは内皮細胞層におけるＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン）の沈着を予防、低減または遅延させる。別の具体的な実施形態では、その抗体は、血管形成を調節する。特定の実施形態では、その抗体は、血管形成を予防、低減または減速させる。代替実施形態では、抗体は、血管形成を増加させる。
【０１４６】
具体的な実施形態では、本発明の抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインに免疫特異的に結合し（たとえば、ＥｐｈＡ２リガンド結合部位の内部またはその外側のどちらかにあるエピトープで）、ＥｐｈＡ２の分解を引き起こさずにＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させる。別の具体的な実施形態では、該抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインに結合し（たとえば、ＥｐｈＡ２リガンド結合部位の内部またはその外側のどちらかにあるエピトープで）、ＥｐｈＡ２−リガンドの相互作用の程度を阻害または低減させる。別の具体的な実施形態では、本発明の抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインに免疫特異的に結合し（たとえば、ＥｐｈＡ２リガンド結合部位の内部またはその外側のどちらかにあるエピトープで）、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達（それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２の自己リン酸化を含む）を減少させる。さらに別の実施形態では、本発明の抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメインに免疫特異的に結合し（たとえば、ＥｐｈＡ２リガンド結合部位の内部またはその外側のどちらかにあるエピトープで）、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達（それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２の自己リン酸化を含む）を減少させ、ＥｐｈＡ２−リガンドの相互作用の程度を阻害または低減させる。具体的な実施形態では、本発明の抗体は、ＧｅｎＢａｎｋデータベース（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４２２．２）に開示されているヒトＥｐｈＡ２のリガンド結合ドメインに免疫特異的に結合する（たとえば、アミノ酸残基２８〜２０１で）。
【０１４７】
一実施形態では、本発明の抗体は、エフリンＡ１に免疫特異的に結合し（たとえば、ＥｐｈＡ２結合部位の内部またはその外側のどちらかにあるエピトープで）、ＥｐｈＡ２への結合を妨げるかまたは低減させる。別の実施形態では、本発明のエフリンＡ１抗体は、エフリンＡ１に免疫特異的に結合し（たとえば、ＥｐｈＡ２結合部位の内部またはその外側のどちらかにあるエピトープで）、エフリンＡ１を発現する細胞においてエフリンＡ１のシグナル伝達を調節する（誘導または阻害する）。別の具体的な実施形態では、本発明の抗体は、エフリンＡ１に免疫特異的に結合し（たとえば、ＥｐｈＡ２結合部位の内部またはその外側のどちらかにあるエピトープで）、エフリンＡ１のシグナル伝達を減少させ、ＥｐｈＡ２−エフリンＡ１の相互作用の程度を阻害または低減させる。別の具体的な実施形態では、本発明の抗体は、エフリンＡ１に免疫特異的に結合し（たとえば、ＥｐｈＡ２結合部位の内部またはその外側のどちらかにあるエピトープで）、エフリンＡ１のシグナル伝達を誘導し、ＥｐｈＡ２−エフリンＡ１の相互作用の程度を阻害または低減させる。さらなる実施形態では、本発明の抗体は、エフリンＡ１に免疫特異的に結合し（たとえば、エフリンＡ１のクラスタリングに関与するエピトープで）、エフリンＡ１とＳｒｃファミリーキナーゼ（たとえば、Ｆｙｎ）などの他の分子との相互作用を阻害または低減させ、エフリンＡ１のシグナル伝達を阻害または低減させる。
【０１４８】
本発明の抗体には、それだけには限定されないが、合成抗体、モノクローナル抗体、組換えによって産生した抗体、多特異性抗体（二重特異的抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、細胞内発現抗体、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（たとえば、単一特異性および二重特異性などを含む）、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド結合Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、および上記の任意のもののエピトープ結合断片が含まれる。具体的には、本発明の抗体には、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある部分、すなわち、ＥｐｈＡ２抗原またはエフリンＡ１抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位（たとえば、抗ＥｐｈＡ２抗体または抗エフリンＡ１抗体の１つもしくは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ））を含む分子が含まれる。本発明の抗体は、免疫グロブリン分子の任意の型（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものでありうる。
【０１４９】
本発明は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合し、ＥｐｈＡ２を作動させる、すなわち、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を誘導し、ＥｐｈＡ２の発現を減少させる、アゴニスト抗体を包含する。アゴニストＥｐｈＡ２抗体は、ＥｐｈＡ２の自己リン酸化を誘導し、それにより、次いでＥｐｈＡ２の分解を引き起こしてＥｐｈＡ２の発現をダウンレギュレーションし、およびＥｐｈＡ２とその内在性リガンド（たとえば、エフリンＡ１）との相互作用を阻害し得る。そのような抗体は、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる米国特許公開第US2004/0,091,486Al号（２００４年５月１３日）、および第US2004/0,028,685Al号（２００４年２月１２日）中に開示されている。
【０１５０】
本発明はまた、ラクダ化単一ドメイン抗体を含めた単一ドメイン抗体も包含する（たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれる、Muyldermans他、2001、Trends Biochem. ScL 26:230；Nuttall他、2000、Cur. Pharm. Biotech. 1:253；ReichmannおよびMuyldermans、1999、J. Immunol. Meth. 231:25；国際公開公報第WO 94/04678号および第WO 94/25591号；米国特許第6,005,079号を参照）。一実施形態では、本発明は、単一ドメイン抗体が形成されるように改変した、任意のＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１抗体のＶＨドメインのアミノ酸配列を有する２つのＶＨドメインを含む、単一ドメイン抗体を提供する。別の実施形態では、本発明はまた、任意のＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１抗体のＶＨＣＤＲの１つまたは複数を含む２つのＶＨドメインを含む、単一ドメイン抗体も提供する。
【０１５１】
本発明の抗体には、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１細胞内発現抗体が含まれる（セクション４．２．１．１を参照）。細胞内発現抗体である本発明の抗体ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１に免疫特異的に結合し、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１の発現および／あるいは活性を調節する（増加もしくは減少させる）。具体的な実施形態では、本発明の細胞内発現抗体は、ＥｐｈＡ２の細胞内ドメインに免疫特異的に結合し、ＥｐｈＡ２の分解を引き起こさずにＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させる。別の実施形態では、本発明の細胞内発現抗体は、ＥｐｈＡ２に免疫特異的に結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達（それだけには限定されないが、ＥｐｈＡ２の自己リン酸化を含む）を妨げるかまたは低減させるが、ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との相互作用を阻害も低減もさせない。
【０１５２】
本発明の方法で用いる抗体は、鳥および哺乳動物を含めた任意の動物起源由来であり得る（たとえば、ヒト、ネズミ、ロバ、ヒツジ、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、またはニワトリ）。最も好ましい実施形態では、抗体はヒトのものであるか、ヒト化したものである。本明細書中で用いる「ヒト」抗体には、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体が含まれ、さらにヒト免疫グロブリンライブラリーからまたはヒト遺伝子由来の抗体を発現するマウスから単離した抗体が含まれる。
【０１５３】
本発明の方法で用いる抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより高い多特異性を有するものであり得る。多特異性抗体は、ＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはエフリンＡ１ポリペプチドの異なるエピトープに免疫特異的に結合してもよく、またはＥｐｈＡ２ポリペプチドもしくはエフリンＡ１ポリペプチドと異種ポリペプチドもしくは固体担体物質などの異種エピトープとの両方に免疫特異的に結合してもよい。たとえば、国際公開公報第WO 93/17715号、第WO 92/08802号、第WO 91/00360号、および第WO 92/05793；Tutt他、1991、J. Immunol. 147:60-69；米国特許第4,474,893号、第4,714,681号、第4,925,648号、第5,573,920号、および第5,601,819号；ならびにKostelny他、1992、J. Immunol. 148:1547-1553を参照されたい。
【０１５４】
４．２．１．１  細胞内発現抗体（intrabody）
特定の実施形態では、本発明で用いる抗体は細胞内エピトープに結合する、すなわち、細胞内発現抗体である。具体的な実施形態では、本発明の細胞内発現抗体はＥｐｈＡ２の細胞質ドメインに結合し、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達（たとえば、自己リン酸化）を妨げる。細胞内発現抗体は、抗原に免疫特異的に結合することができる抗体部分を少なくとも含み、好ましくはその分泌をコードしている配列を含まない。そのような抗体は細胞内で抗原に結合する。一実施形態では、細胞内発現抗体は一本鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）を含む。ｓｃＦｖは、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む抗体断片であり、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖中に存在する。一般に、ｓｃＦｖポリペプチドはさらにＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含み、これにより、ｓｃＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成することが可能となる。ｓｃＦｖについての総説については、Pluckthun、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies、第113巻、RosenburgおよびMoore編、Springer-Verlag、New York、ページ269-315(1994)を参照されたい。さらなる実施形態では、細胞内発現抗体は作動可能な分泌配列をコードしておらず、したがって細胞内に留まることが好ましい（一般に、Marasco、WA、1998、「Intrabodies: Basic Research and Clinical Gene Therapy Applications」Springer :New Yorkを参照）。
【０１５５】
細胞内発現抗体の産生は当業者に周知であり、たとえば、その全体が参照により組み込まれる米国特許第6,004,940号；第6,072,036号；第5,965,371号に記載されている。さらに、細胞内発現抗体の構築は、その全体が本明細書中に参照により組み込まれるOhageおよびSteipe、1999、J. MoI. Biol. 291:1 119-1 128；Ohage他、1999、J. MoI. Biol. 291:1 129-1 134；ならびにWirtzおよびSteipe、1999、Protein Science 8:2245-2250に記載されている。抗体の組換え産生について記載されているものなどの組換え分子生物学的技術も、細胞内発現抗体の産生に用い得る。
【０１５６】
一実施形態では、本発明の細胞内発現抗体は、抗原に対する完全抗体（すなわち、定常ドメインおよび可変領域の全体を有する）の結合効率の少なくとも約７５％を保有している。より好ましくは、細胞内発現抗体は、完全抗体の結合効果の少なくとも８５％を保持している。さらにより好ましくは、細胞内発現抗体は、完全抗体の結合効果の少なくとも９０％を保持している。さらにより好ましくは、細胞内発現抗体は、完全抗体の結合効果の少なくとも９５％を保持している。
【０１５７】
細胞内発現抗体を産生するにあたって、目的のＶＨおよびＶＬ鎖の両方の可変領域をコードしているポリヌクレオチドは、たとえば、ハイブリドーマｍＲＮＡまたは脾臓ｍＲＮＡを、このようなドメインのＰＣＲ増幅の鋳型として用いることによって、クローニングすることができる（Huse他、1989、Science 246:1276）。好ましい一実施形態では、ＶＨおよびＶＬドメインをコードしているポリヌクレオチドは、リンカーをコードしているポリヌクレオチド配列によって結合され、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）となる。ｓｃＦｖは、典型的には、配列ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨを有する単一のペプチドを含む。リンカーは、重鎖および軽鎖がその適切なコンホメーションの配向で結合することを可能にするように選択する（たとえば、本明細書中に参照により組み込まれるHuston他、1991、Methods in Enzym. 203:46-121を参照）。さらなる実施形態では、リンカーは、天然のＦｖコンホメーションの歪みを最小化するために、その融合点と可変ドメインのそれぞれとの間の距離（たとえば、３．５ｎｍ）の全長に及んでもよい。そのような実施形態では、リンカーは、少なくとも５個のアミノ酸残基、少なくとも１０個のアミノ酸残基、少なくとも１５個のアミノ酸残基、またはそれ以上のポリペプチドである。さらなる実施形態では、リンカーは、結合部位のＶＨおよびＶＬドメインとの立体干渉を引き起こすべきでない。そのような実施形態では、リンカーは、３５個以下のアミノ酸、３０個以下のアミノ酸、または２５個以下のアミノ酸である。したがって、最も好ましい実施形態では、リンカーの長さは１５〜２５個のアミノ酸残基である。さらなる実施形態では、リンカーは親水性であり、ＶＨおよびＶＬドメインが抗原の検出に必要なコンホメーションを採ることができるように十分柔軟である。細胞内発現抗体は、同じＶＨおよびＶＬドメインの間に様々なリンカー配列を挿入して産生することができる。特定のＶＨおよびＶＬドメインのペアに適した特性を有するリンカーは、それぞれの抗原結合の程度を評価することによって経験的に決定することができる。リンカーの例には、限定はされないが、表３に開示した配列が含まれる。
【表３】
2008518022.tif 000004
【０１５８】
一実施形態では、細胞内発現抗体は細胞質内で発現される。他の実施形態では、細胞内発現抗体は様々な細胞内位置に局在化されている。そのような実施形態では、細胞内発現抗体を特定位置に方向付けるために、細胞内発現抗体ポリペプチドに特異的な局在化配列を結合させることができる。細胞内発現抗体は、たとえば、以下の細胞内位置に局在化させることができる：小胞体（Munro他、1987、Cell 48:899-907；Hangejorden他、1991、J. Biol. Chem. 266:6015）；核（Lanford他、1986、Cell 46:575；Stanton他、1986、PNAS 83:1772；Harlow他、1985、MoI. Cell Biol. 5:1605；Pap他、2002、Exp. Cell Res. 265:288-93）；核小体領域（Seomi他、1990、J. Virology 64:1803；Kubota他、1989、Biochem. Biophys. Res. Comm. 162:963；Siomi他、1998、Cell 55:197）；エンドソーム区画（Bakke他、1990、Cell 63:707-716）；ミトコンドリア基質（Pugsley, A. P.、1989、「Protein Targeting」、Academic Press, Inc.）；ゴルジ体（Tang他、1992、J. Bio. Chem. 267:10122-6）；リポソーム（Letourneur他、1992、Cell 69:1 183）；ペルオキシソーム（Pap他、2002、Exp. Cell Res. 265:288-93）；トランスゴルジネットワーク（Pap他、2002、Exp. Cell Res. 265:288-93）；および形質膜（Marchildon他、1984、PNAS 81:7679-82；Henderson他、1987、PNAS 89:339-43；Rhee他、1987、J. Virol. 6 1:1045-53；Schultz他、1984、J. Virol. 133:431-7；Ootsuyama他、1985、Jpn. J. Can. Res. 76:1 132-5；Ratner他、1985、Nature 313:277-84）。局在化シグナルの例には、限定はされないが、表４に開示した配列が含まれる。
【表４】
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【０１５９】
ＶＨおよびＶＬドメインは、一般に保存された構造的ジスルフィド結合を有する免疫グロブリンドメインからなる。細胞内発現抗体が還元環境（たとえば、細胞質）で発現される実施形態では、この構造的特徴は存在することができない。ジスルフィド結合の形成が存在しないことにより生じる免疫グロブリン構造の安定性の減少を相補するために、細胞内発現抗体ポリペプチド配列に突然変異を作製することができる。一実施形態では、細胞内発現抗体のＶＨおよび／またはＶＬドメインは、その発現が還元環境内で安定されるように１つもしくは複数の点突然変異を含む（Steipe他、1994、J. MoI. Biol. 240:188-92；WirtzおよびSteipe、1999、Protein Science 8:2245-50；OhageおよびSteipe、1999、J. MoI. Biol. 291:1 119-28；Ohage他、1999、J. MoI Biol. 291:1 129-34参照）。
【０１６０】
治療剤としての細胞内発現抗体タンパク質
一実施形態では、組換えによって発現させた細胞内発現抗体タンパク質を患者に投与する。このような細胞内発現抗体ポリペプチドは、予防的または治療的効果を媒介するために細胞内になければならない。本発明のこの実施形態では、細胞内発現抗体ポリペプチドは「膜透過配列」を伴う。膜透過配列は、細胞の外側から細胞膜を通って細胞の内部まで達することができるポリペプチドである。別のポリペプチドと連結させた場合は、膜透過配列は、そのポリペプチドの、細胞膜を横切る転移も誘導することもできる。
【０１６１】
一実施形態では、膜透過配列はシグナルペプチドの疎水性領域である（たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれるHawiger、1999、Curr. Opin. Chem. Biol. 3:89-94；Hawiger、1997、Curr. Opin. Immunol. 9:189-94；米国特許第5,807,746号および第6,043,339号を参照）。膜透過配列の配列は、任意のシグナルペプチドの疎水性領域に基づくことができる。シグナルペプチドは、たとえば、ＳＩＧＰＥＰデータベースから選択することができる（たとえば、von Heijne、1987、Prot. Seq. Data Anal. 1:41-2；von HeijneおよびAbrahmsen、1989、FEBS Lett. 224:439-46を参照）。特定の細胞種を細胞内発現抗体ポリペプチドの挿入の標的とする場合は、膜透過配列は、その細胞種に内在するシグナルペプチドに基づくことが好ましい。別の実施形態では、膜透過配列はウイルスタンパク質（たとえば、ヘルペスウイルスタンパク質ＶＰ２２）またはその断片である（たとえば、Phelan他、1998、Nat. Biotechnol. 16:440-3を参照）。特定の細胞内発現抗体および／または特定の標的細胞種に適した特性を有する膜透過配列は、細胞膜を横切る細胞内発現抗体の転移を誘導するそれぞれの膜透過配列の能力を評価することによって、経験的に決定することができる。膜透過配列の例には、限定はされないが、下記表５に開示した配列が含まれる。
【表５】
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【０１６２】
別の実施形態では、膜透過配列は誘導体であることができる。この実施形態では、膜透過配列のアミノ酸配列は、アミノ酸残基の置換、欠失、付加、および／または修飾の導入によって変更されている。たとえば、限定はしないが、ポリペプチドは、たとえば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との連結などによって修飾され得る。膜透過配列ポリペプチドの誘導体は、それだけには限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた当業者に知られている技術を用いた化学修飾によって修飾し得る。さらに、膜透過配列ポリペプチドの誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含み得る。一実施形態では、ポリペプチド誘導体は、変更していないポリペプチドと類似もしくは同一の機能を保有する。別の実施形態では、膜透過配列ポリペプチドの誘導体は、変更していないポリペプチドと比較した場合に活性が変更されている。たとえば、誘導体膜透過配列ポリペプチドは、より効率的に細胞膜を通りぬけて転移することができるか、またはタンパク質分解に対してより耐性を有することができる。
【０１６３】
膜透過配列は、いくつかの方法で細胞内発現抗体に結合させることができる。一実施形態では、膜透過配列および細胞内発現抗体は融合タンパク質として発現される。この実施形態では、標準の組換えＤＮＡ技術を用いて、膜透過配列をコードしている核酸を、細胞内発現抗体をコードしている核酸に結合させる（たとえば、Rojas他、1998、Nat. Biotechnol. 16:370-5を参照）。さらなる実施形態では、膜透過配列および細胞内発現抗体をコードしている核酸の間に配置されたスペーサーペプチドをコードしている核酸配列が存在する。別の実施形態では、それぞれを別々に組換えによって発現させた後、膜透過配列ポリペプチドを細胞内発現抗体ポリペプチドに結合させる（たとえば、Zhang他、1998、PNAS 95:9184-9を参照）。この実施形態では、ポリペプチドを、当分野の標準方法によって、ペプチド結合または非ペプチド結合によって連結させることができる（たとえば、グルタルアルデヒドなどの架橋結合試薬またはチアゾリジノ結合を用いて、たとえば、Hawiger、1999、Curr. Opin. Chem. Biol. 3:89-94を参照）。
【０１６４】
膜透過配列−細胞内発現抗体ポリペプチドの投与は、非経口投与、たとえば、標的細胞を有する組織または器官に供給する血管を通じた局所灌流を含めた静脈内注射によって、あるいはエアロゾルの吸入、皮下または筋肉内注射、皮膚創傷および病変などへの局所投与、たとえば、移植用に調製した骨髄細胞内に直接形質移入し、次いで被験体内に移植すること、および器官内に直接形質移入し、次いで被験体内に移植することによって行うことができる。さらなる投与方法には、経口投与（特に複合体がカプセル封入されている場合）、または直腸投与（特に複合体が坐薬形態にある場合）が含まれる。製薬上許容される担体には、生物学的にまたは他の様式で望ましくないものではない任意の物質が含まれる、すなわち、その物質は、いかなる望ましくない生物学的効果も引き起こさずに、またはそれが含まれる医薬組成物の他の成分のどれとも有害な様式で相互作用せずに、選択した複合体と共に個体に投与し得る。
【０１６５】
膜透過配列−細胞内発現抗体ポリペプチドの投与条件は、当分野の教示を考慮して、容易に決定することができる（たとえば、Remington 's Pharmaceutical Sciences、第18版、E.W. Martin編、Mack Publishing Co:、ペンシルバニア州Easton(1990)を参照）。特定のｉｎ  ｖｉｖｏの細胞種を、たとえば、器官または腫瘍の局所灌流によって標的とする場合は、標的組織由来の細胞の生検を行い、複合体をその組織に輸送するのに最適な用量をｉｎ  ｖｉｔｒｏで決定し、濃度および時間を含めたｉｎ  ｖｉｖｏ用量の最適化を行うことができる。あるいは、標的細胞のｉｎ  ｖｉｖｏの用量の最適化を行うために同じ細胞種の培養細胞を用いることもできる。
【０１６６】
治療剤としての細胞内発現抗体遺伝子治療
別の実施形態では、細胞内発現抗体をコードしているポリヌクレオチドを患者に投与する（たとえば、遺伝子治療と同様に）。この実施形態では、セクション４．８．１に記載の方法を用いて本発明のポリヌクレオチドを投与することができる。
【０１６７】
４．２．１．２  抗体コンジュゲート
本発明は、異種タンパク質もしくはポリペプチド（またはその断片、好ましくは少なくとも１０個、少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも４０個、少なくとも５０個、少なくとも６０個、少なくとも７０個、少なくとも８０個、少なくとも９０個もしくは少なくとも１００個のアミノ酸のポリペプチド）と組換えによって融合させたかまたは化学的にコンジュゲート（共有および非共有結合をどちらも含む）させて融合タンパク質として産生させたＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター（たとえば、ＥｐｈＡ２および／もしくはエフリンＡ１に免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２および／もしくはエフリンＡ１抗体またはその断片）の使用を包含する。たとえば、抗体を、特定の細胞表面受容体に特異的な抗体と融合またはコンジュゲートさせることによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで特定の細胞種を異種ポリペプチドの標的とするために抗体を用い得る。異種ポリペプチドと融合またはコンジュゲートさせた抗体は、当分野で知られている方法を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ免疫アッセイおよび精製方法でも用い得る。たとえば、その全体が参照により組み込まれる国際公開公報第WO 93/21232号；第EP 439,095号；Naramura他、1994、Immunol. Lett. 39:91-99；米国特許第5,474,981号；Gillies他、1992、PNAS 89:1428-1432；およびFell他、1991、J. Immunol. 146:2446-2452を参照されたい。具体的な実施形態では、検出、治療、管理、またはモニタリングされる障害は、限定はされないが、細胞外マトリックス成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシン、フィブロネクチン）の沈着の増加および／もしくは異常な血管形成に関連する障害を含めた非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害である。そのような障害の非限定的な例には、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬が含まれる。
【０１６８】
本発明にはさらに、抗体断片と融合またはコンジュゲートさせた異種ポリペプチドを含む組成物が含まれる。たとえば、異種ポリペプチドを、Ｆａｂ断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、もしくはその一部分と融合またはコンジュゲートさせてもよい。タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドを抗体もしくは抗体断片と融合またはコンジュゲートさせる方法は、当分野で知られている。たとえば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、および第5,112,946号；欧州特許第EP 307,434号および第EP 367,166号；国際公開公報第WO 96/04388号および第WO 91/06570号；Ashkenazi他、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 10535-10539；Zheng他、1995、J. Immunol. 154:5590-5600；ならびにViI他、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11337-11341を参照されたい（前記参考文献は、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる）。
【０１６９】
さらなる融合タンパク質、たとえば、本発明のＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１モジュレーターのうちの任意のものの融合タンパク質は、遺伝子シャフリング、モチーフシャフリング、エクソンシャフリング、および／またはコドンシャフリングの技術（「ＤＮＡシャフリング」と総称される）によって作製され得る。ＤＮＡシャフリングは、本発明の抗体またはその断片の活性を変更するために用い得る（たとえば、より高い親和性およびより低い解離速度を有する抗体またはその断片）。一般に、米国特許第5,605,793号；第5,811,238号；第5,830,721号；第5,834,252号；および第5,837,458号、Patten他、1997、Curr. Opinion Biotechnol. 8:724-33；Harayama、1998、Trends Biotechnol. 16:76；Hansson他、1999、J. MoI. Biol. 287:265；ならびにLorenzoおよびBlasco、1998、BioTechniques 24:308を参照されたい（これらの特許および出版物のそれぞれは、その全体が本明細書中に参照により組み込まれる）。抗体もしくはその断片、またはコードされている抗体もしくはその断片は、組換え前に、誤りがちな（error-prone）ＰＣＲ、無作為ヌクレオチド挿入または他の方法による、無作為突然変異誘発に供することによって、変更し得る。ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１に免疫特異的に結合する、抗体または抗体断片をコードしているポリヌクレオチドの１つもしくは複数の部分は、１つもしくは複数の異種分子の１つもしくは複数の成分、モチーフ、セクション、部分、ドメイン、断片などと組み換え得る。
【０１７０】
さらに、精製を容易にするために、抗体またはその断片をペプチドなどのマーカー配列と融合させることができる。好ましい実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、とりわけｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．、９２５９  Ｅｔｏｎ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｈａｔｓｗｏｒｔｈ、カリフォルニア州、９１３１１）中に提供されているタグなど、その多くが市販されているヘキサヒスチジンペプチドである。たとえば、Gentz他、1989、PNAS 86:821に記載のように、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の便利な精製を提供する。精製に有用な他のペプチドタグには、それだけには限定されないが、インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する赤血球凝集素「ＨＡ」タグ（Wilson他、1984、Cell 37:767）および「flag」タグが含まれる。
【０１７１】
他の実施形態では、本発明の抗体またはその断片もしくは変異体を、診断的薬剤または検出可能な薬剤にコンジュゲートさせる。そのような抗体は、特定の治療の有効性を決定することなど、臨床試験手順の一部として、癌の発生もしくは進行のモニタリングまたは予後診断に有用でありうる。さらに、そのような抗体は、それだけには限定されないが、細胞外マトリックス成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシン、フィブロネクチン）の沈着の増加および／または異常な血管形成に関連する障害を含めた、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の発生または進行のモニタリングあるいは予後診断に有用でありうる。そのような障害の非限定的な例には、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬が含まれる。一実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２抗体またはエフリンＡ１抗体を、診断的薬剤または検出可能な薬剤にコンジュゲートさせる。より具体的な実施形態では、抗体はＥｐｈＡ２抗体またはエフリンＡ１抗体である。
【０１７２】
このような診断および検出は、それだけには限定されないが西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼなどの様々な酵素；それだけには限定されないがストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンなどの補欠分子族；それだけには限定されないがウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンなどの蛍光物質；それだけには限定されないがルミノールなどの発光物質；それだけには限定されないがルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンなどの生物発光物質；それだけには限定されないがビスマス（２１３Ｂｉ）、炭素（１４Ｃ）、クロム（５１Ｃｒ）、コバルト（５７Ｃｏ）、フッ素（１８Ｆ）、ガドリニウム（１５３Ｇｄ、１５９Ｇｄ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、ゲルマニウム（６８Ｇｅ）、ホルミウム（１６６Ｈｏ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、ランタニウム（１４０Ｌａ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、マンガン（５４Ｍｎ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、リン（３２Ｐ）、プラセオジム（１４２Ｐｒ）、プロメチウム（１４９Ｐｍ）、レニウム（１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ）、ロジウム（１０５Ｒｈ）、ルテミウム（９７Ｒｕ）、サマリウム（１５３Ｓｍ）、スカンジウム（４７Ｓｃ）、セレン（７５Ｓｅ）、ストロンチウム（８５Ｓｒ）、硫黄（３５Ｓ）、テクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、スズ（１１３Ｓｎ、１１７Ｓｎ）、トリチウム（３Ｈ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、イッテルビウム（１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ）、イットリウム（９０Ｙ）、亜鉛（６５Ｚｎ）などの放射性物質；様々な陽電子放射断層撮影を用いた陽電子放射金属、ならびに非放射性常磁性金属イオンを含めるが、それだけには限定されない検出可能な物質に、抗体を結合させることによって達成することができる。
【０１７３】
本発明はさらに、予防剤または治療剤にコンジュゲートさせた抗体もしくはその断片の使用を包含する。抗体またはその断片を、細胞毒素、たとえば、細胞分裂抑制剤もしくは細胞破壊剤、治療剤または放射性金属イオン、たとえば、α−放射源などの治療成分にコンジュゲートさせ得る。細胞毒素または細胞毒性剤には、細胞に有害なすべての薬剤が含まれる。治療的成分には、それだけには限定されないが、代謝拮抗剤（たとえば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）；アルキル化剤（たとえば、メクロレタミン、チオエパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）およびロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、シスジクロロアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）、およびシスプラチン）；アントラサイクリン（たとえば、ダウノルビシン（以前はダウノマイシン）およびドキソルビシン）；抗生物質（たとえば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ＡＭＣ））；アウリスタチン（ａｕｒｉｓｔａｔｉｎ）分子（たとえば、アウリスタチンＰＨＥ、ブリオスタチン１、およびソラスタチン（ｓｏｌａｓｔａｔｉｎ）１０；すべて本明細書中に参照により組み込まれるWoyke他、Antimicrob. Agents Chemother. 46:3802-8 (2002)、Woyke他、Antimicrob. Agents Chemother. 45:3580-4 (2001)、Mohammad他、Anticancer Drugs 12:735-40 (2001)、Wall他、Biochem. Biophys. Res. Commun. 266:76-80 (1999)、Mohammad他、Int. J. Oncol. 15:367-72 (1999)を参照）；ホルモン（たとえば、糖質コルチコイド、プロゲスチン、アンドロゲン、およびエストロゲン）、ＤＮＡ修復酵素阻害剤（たとえば、エトポシドまたはトポテカン）、キナーゼ阻害剤（たとえば、化合物ＳＴ１５７１、メシル酸イマチニブ（Kantarjian他、Clin Cancer Res. 8(7):2167-76 (2002)）；細胞毒性剤（たとえば、パクリタキセル、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭化エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルコルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、プロマイシン、その類似体または相同体、および米国特許第6,245,759号、第6,399,633号、第6,383,790号、第6,335,156号、第6,271,242号、第6,242,196号、第6,218,410号、第6,218,372号、第6,057,300号、第6,034,053号、第5,985,877号、第5,958,769号、第5,925,376号、第5,922,844号、第5,91 1,995号、第5,872,223号、第5,863,904号、第5,840,745号、第5,728,868号、第5,648,239号、第5,587,459号に開示されている化合物）；ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（たとえば、Ｒｌ１５７７７、ＢＭＳ−２１４６６２、およびたとえば、米国特許第6,458,935号、第6,451,812号、第6,440,974号、第6,436,960号、第6,432,959号、第6,420,387号、第6,414,145号、第6,410,541号、第6,410,539号、第6,403,581号、第6,399,615号、第6,387,905号、第6,372,747号、第6,369,034号、第6,362,188号、第6,342,765号、第6,342,487号、第6,300,501号、第6,268,363号、第6,265,422号、第6,248,756号、第6,239,140号、第6,232,338号、第6,228,865号、第6,228,856号、第6,225,322号、第6,218,406号、第6,21 1,193号、第6,187,786号、第6,169,096号、第6,159,984号、第6,143,766号、第6,133,303号、第6,127,366号、第6,124,465号、第6,124,295号、第6,103,723号、第6,093,737号、第6,090,948号、第6,080,870号、第6,077,853号、第6,071,935号、第6,066,738号、第6,063,930号、第6,054,466号、第6,051,582号、第6,051,574号、第6,040,305号に開示されているもの）；トポイソメラーゼ阻害剤（たとえば、カンプトテシン；イリノテカン；ＳＮ−３８；トポテカン；９−アミノカンプトテシン；ＧＧ−２１１（ＧＩ１４７２１１）；ＤＸ−８９５１ｆ；ＩＳＴ−６２２；ルビテカン；ピラゾロアクリジン；ＸＲ−５０００；セイントピン（ｓａｉｎｔｏｐｉｎ）；ＵＣＥ６；ＵＣＥｌ０２２；ＴＡＮ−１５１８Ａ；ＴＡＮ−１５１８Ｂ；ＫＴ６００６；ＫＴ６５２８；ＥＤ−１１０；ＮＢ−５０６；ＥＤ−１１０；ＮＢ−５０６；およびレベッカマイシン）；ブルガレイン（ｂｕｌｇａｒｅｉｎ）；Ｈｏｅｓｃｈｔ色素３３３４２およびヘキスト色素３３２５８などのＤＮＡ副溝結合剤；ニチジン；ファガロニン（ｆａｇａｒｏｎｉｎｅ）；エピベルベリン；コラリン（ｃｏｒａｌｙｎｅ）；β−ラパコン；ＢＣ−４−１；ビスホスホネート（たとえば、アレンドロネート、シマドロント（ｃｉｍａｄｒｏｎｔｅ）、クロドロネート、チルドロネート、エチドロネート、イバンドロネート、ネリドロネート、オルパンドロネート（ｏｌｐａｎｄｒｏｎａｔｅ）、リセドロネート、ピリドロネート（ｐｉｒｉｄｒｏｎａｔｅ）、パミドロネート、ゾレンドロネート）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤、（たとえば、ロバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、スタチン、セリバスタチン、レスコール、ルピトール、ロスバスタチンおよびアトルバスタチン）；アンチセンスオリゴヌクレオチド（たとえば、米国特許第6,277,832号、第5,998,596号、第5,885,834号、第5,734,033号、および第5,618,709号に開示されているもの）；アデノシン脱アミノ酵素阻害剤（たとえば、リン酸フルダラビンおよび２−クロロデオキシアデノシン）；イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））；トシツモマブ（Ｂｅｘｘａｒ（登録商標）））、ならびにそれらの製薬上許容される塩、溶媒和物、クラスレート、およびプロドラッグが含まれる。具体的な実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターにコンジュゲートさせる予防剤または治療剤は、標的細胞（たとえば、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１を発現する細胞）に対して細胞毒性がない。
【０１７４】
さらに、抗体を、放射性物質、または放射性金属イオンとコンジュゲートさせるのに有用な大環状キレート剤などの治療的成分にコンジュゲートさせることができる（放射性物質の例は上記を参照）。特定の実施形態では、大環状キレート剤は、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これは、リンカー分子を介して抗体に結合させることができる。このようなリンカー分子は当分野で一般的に知られており、それぞれがその全体が参照により組み込まれるDenardo他、1998、CHn Cancer Res. 4:2483-90；Peterson他、1999、Bioconjug. Chem. 10:553；およびZimmerman他、1999、Nucl. Med. Biol. 26:943-50に記載されている。
【０１７５】
さらに、抗体またはその断片を、所定の生物学的応答を改変する予防的もしくは治療的成分または薬物部分にコンジュゲートさせ得る。治療的成分または薬物部分は、古典的な化学治療剤に限定されると解釈されるべきでない。たとえば、薬物部分は、所望の生物活性を有するタンパク質、ペプチド、またはポリペプチドであり得る。そのようなタンパク質には、たとえば、アブリン、リシンＡ、シュードモナス（pseudomonas）外毒素、コレラ毒素、もしくはジフテリア毒素などの毒素；腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経成長因子、血小板由来成長因子、組織プラスミノーゲン活性化剤、アポトーシス剤、たとえば、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＡＩＭ  Ｉ（国際公開公報第WO 97/33899号参照）、ＡＩＭ  ＩＩ（国際公開公報第WO 97/3491 1号参照）、Ｆａｓリガンド（Takahashi他、1994、J. Immunol.、6:1567-1574）、およびＶＥＧＦ（国際公開公報第WO 99/23105号参照）、抗血管形成剤、たとえば、アンジオスタチン、エンドスタチンもしくは凝血経路の成分（たとえば、組織因子）などのタンパク質；または、たとえば、リンホカイン（たとえば、インターフェロンγ（「ＩＦＮ−γ」）、インターロイキン−１（「ＩＬ−Ｉ」）、インターロイキン−２（「ＩＬ−２」）、インターロイキン−４（「ＩＬ−４」）、インターロイキン−５（「ＩＬ−５」）、インターロイキン−６（「ＩＬ−６」）、インターロイキング−７（「ＩＬ−７」）、インターロイキン−１０（「ＩＬ−ＩＯ」）、インターロイキン−１２（「ＩＬ−１２」）、インターロイキン−１５（「ＩＬ−１５」）、インターロイキン−２３（「ＩＬ−２３」）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（「ＧＭ−ＣＳＦ」）、および顆粒球コロニー刺激因子（「ＧＣＳＦ」））、もしくは成長因子（たとえば、成長ホルモン（「ＧＨ」））、または凝血剤（たとえば、カルシウム、ビタミンＫ、それだけには限定されないが、ハーゲマン因子（ＸＩＩ因子）、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、プレカリクレイン（ＰＫ）、凝血タンパク質因子ＩＩ（プロトロンビン）、Ｖ因子、ＸＩＩａ因子、ＶＩＩＩ因子、ＸＩＩＩａ因子、ＸＩ因子、ＸＩａ因子、ＩＸ因子、ＩＸａ因子、Ｘ因子、フィブリノーゲンのαおよびβ鎖由来のリン脂質線維素ペプチドＡおよびＢ、フィブリン単量体などの組織因子）などの生物学的応答モジュレーターが含まれ得る。具体的な実施形態では、ＩＬ−９ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体を、ロイコトリエン拮抗剤（たとえば、モンテルカスト、ザフィルルカスト、プランルカスト、およびザイルートン）とコンジュゲートさせる。
【０１７６】
さらに、抗体を、２１３Ｂｉ等のα−放射源やそれだけには限定されないが、１３１Ｉｎ、１３１Ｌ、１３１Ｙ、１３１Ｈｏ、１３１Ｓｍを含めた放射性金属イオンとコンジュゲートさせるのに有用な大環状キレート剤などの放射性金属イオンなどである予防的または治療的成分に、ポリペプチドまたは上に記載したうちの任意のものをコンジュゲートさせることができる。特定の実施形態では、大環状キレート剤は１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）であり、これは、リンカー分子を介して抗体に結合させることができる。このようなリンカー分子は当分野で一般的に知られており、それぞれがその全体で参照により組み込まれるDenardo他、1998、Clin Cancer Res. 4(10):2483-90；Peterson他、1999、Bioconjug. Chem. 10(4):553-7；およびZimmerman他、1999、Nucl. Med. Biol. 26(8):943-50に記載されている。
【０１７７】
別の実施形態では、抗体をリポソームと融合またはコンジュゲートさせることができ、そのリポソームは予防剤または治療剤をカプセル封入するために用いる（たとえば、Park他、1997、Can. Lett. 118:153-160；Lopes de Menezes他、1998、Can. Res. 58:3320-30；Tseng他、1999、Int. J. Can. 80:723-30；Crosasso他、1997、J. Pharm. Sci. 86:832-9を参照）。好ましい実施形態では、リポソームの薬物動態学およびクリアランスは、リポソーム製剤中にＰＥＧの脂質誘導体を取り込ませることによって向上する（たとえば、Allen他、1991、Biochem Biophys Acta 1068:133-41；Huwyler他、1997、J. Pharmacol. Exp. Ther. 282:1541-6を参照）。
【０１７８】
抗体に予防的または治療的成分をコンジュゲートさせる技術は周知である。成分は、限定はされないが、アルデヒド／シッフ結合、スルフヒドリル結合、酸不安定性結合、シス−アコニチル（ａｃｏｔｉｎｙｌ）結合、ヒドラゾン結合、酵素分解性結合を含めた、当分野で知られている任意の方法によって、抗体にコンジュゲートさせることができる（一般に、Garnett、2002、Adv. DrugDeliv. Rev. 53:171-216を参照）。抗体に予防的または治療的成分をコンジュゲートさせるためのさらなる技術は周知であり、たとえば、Arnon他、「Monoclonal Antibodies For Immunotargeting Of Drugs In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies And Cancer Therapy、Reisfeld他編、ページ243-56(Alan R. Liss, Inc. 1985)；Hellstrom他、「Antibodies For Drug Delivery」、Controlled Drug Delivery(第2版)、Robinson他編、ページ623-53(Marcel Dekker, Inc. 1987)；Thorpe、「Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In Cancer Therapy: A Review」、Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications、Pinchera他編、ページ475-506 (1985)；「Analysis, Results, And Future Prospective Of The Therapeutic Use Of Radiolabeled Antibody In Cancer Therapy」、Monoclonal Antibodies For Cancer Detection And Therapy、Baldwin他編、ページ303-16(Academic Press 1985)、およびThorpe他、1982、Immunol. Rev. 62:1 19-58を参照されたい。抗体をポリペプチド部分と融合またはコンジュゲートさせる方法は当分野で知られている。たとえば、米国特許第5,336,603号、第5,622,929号、第5,359,046号、第5,349,053号、第5,447,851号、および第5,1 12,946号；第EP 307,434号；第EP 367,166号；国際公開公報第WO 96/04388号および第WO 91/06570号；Ashkenazi他、1991、PNAS 88: 10535-10539；Zheng他、1995、J Immunol. 154:5590-5600；ならびにViI他、1992、PNAS 89:1 1337-11341を参照されたい。抗体とある部分との融合は、必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して行われてもよい。そのようなリンカー分子は当分野で一般的に知られており、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参照により組み込まれるDenardo他、1998、Clin Cancer Res. 4:2483-90；Peterson他、1999、Bioconjug. Chem. 10:553；Zimmerman他、1999、Nucl. Med. Biol. 26:943-50；Garnett、20Q2、Adv. Drug Deliv. Rev. 53:171-216に記載されている。
【０１７９】
あるいは、抗体を第２の抗体にコンジュゲートさせて、その全体が本明細書中に参照により組み込まれるSegal、米国特許第4,676,980号に記載の抗体ヘテロコンジュゲ−トを形成させることができる。
【０１８０】
遊離した薬剤と比較した、コンジュゲートさせた薬剤の相対的効果は、いくつかの要素に依存しうる。たとえば、抗体−薬剤の細胞内への取込み速度（たとえば、エンドサイトーシスによる）、抗体からの薬剤の放出速度／効率、細胞からの薬剤の輸送速度などはすべて、薬剤の作用に影響を与える場合がある。薬剤の標的送達に用いる抗体は、当分野で知られている任意の方法によって、関連する細胞種（すなわち、治療する障害に関連する細胞種）によってエンドサイトーシスを受ける能力についてアッセイを行うことができる。さらに、標的細胞内における薬剤の作用が妨害されないように、当分野で知られている任意の方法によって、薬剤を抗体にコンジュゲートさせるために用いる連結の種類のアッセイを行うべきである。
【０１８１】
本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター（たとえば、それぞれＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合するＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１抗体）にコンジュゲートさせた予防的もしくは治療的成分または薬物は、限定はされないが、細胞外マトリックス成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシン、フィブロネクチン）の沈着の増加および／または異常な血管形成に関連する障害を含めた、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害を治療、管理または予防するための所望の予防的あるいは治療的効果が達成されるように選択されるべきである。そのような障害の非限定的な例には、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬が含まれる。臨床家または他の医療従事者は、どの治療的成分または薬物を、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチドまたはその断片に免疫特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせるかを決定する際に、疾患の性質、疾患の重篤度、および被験体の状態を考慮すべきである。
【０１８２】
また、抗体を、標的抗原の免疫アッセイまたは精製に特に有用な固体担体に付着させてもよい。そのような固体担体には、それだけには限定されないが、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンが含まれる。
【０１８３】
あるいは、上述の方法のうち任意のものを用いて、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１融合タンパク質であるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを作製し得る（下記セクション４．２．２を参照）。
【０１８４】
４．２．１．３  抗体の産生方法
抗原に免疫特異的に結合する抗体は、抗体を合成するための当分野で知られている任意の方法、具体的には化学合成、または、好ましくは組換え発現技術によって産生することができる。
【０１８５】
抗原に免疫特異的なポリクローナル抗体は、当分野で周知の様々な手順によって産生することができる。たとえば、ヒト抗原に特異的なポリクローナル抗体を含む血清の産生を誘導するために、ヒト抗原を、それだけには限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含めた様々な宿主動物に投与することができる。宿主種に応じて、免疫学的応答を増大させるために、それだけには限定されないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質、ペプチド、油性乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（カルメット−ゲラン桿菌（bacille Calmette-Guerin））およびコリネバクテリウムパルブム（corynebacterium parvum）などの潜在的に有用ヒトアジュバントを含めた様々なアジュバントを用い得る。このようなアジュバントも当分野で周知である。
【０１８６】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、およびファージディスプレイ技術の使用、またはそれらの組合せを含めた当分野で知られている広範な技術を用いて調製することができる。たとえば、モノクローナル抗体は、当分野で知られており、たとえば、Harlow他、Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press、第2版、1988)；Hammerling他、Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas 563 681 (Elsevier、N.Y.、1981)に教示されているものを含めたハイブリドーマ技術を用いて産生することができる（前記参考文献は、その全体で参照により組み込まれる）。本明細書中で用いる用語「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ技術によって産生した抗体に限定されない。用語「モノクローナル抗体」とは、任意の真核性、原核性、またはファージのクローンを含めた単一のクローンに由来する抗体をいい、それを産生した方法を指すわけではない。
【０１８７】
ハイブリドーマ技術を用いて特異的抗体を産生およびスクリーニングする方法は日常的であり、当分野で周知である。手短に述べると、マウスを非マウス抗原で免疫化し、免疫応答が検出され、たとえば、抗原に特異的な抗体がマウス血清中で検出されれば、マウスの脾臓を収集して脾細胞を単離することができる。その後、周知の技術によって脾細胞を任意の適切な骨髄腫細胞、たとえば、ＡＴＣＣから入手可能な細胞系ＳＰ２０由来の細胞と融合させる。ハイブリドーマは、限界希釈によって選択およびクローニングする。その後、当分野で知られている方法によって、本発明のポリペプチドに結合することができる抗体を分泌する細胞についてハイブリドーマクローンのアッセイを行う。一般に抗体を高レベルで含む腹水は、マウスを陽性ハイブリドーマクローンで免疫化することによって産生することができる。
【０１８８】
本発明は、モノクローナル抗体の産生方法、および本発明の抗体を分泌するハイブリドーマ細胞を培養することを含む方法によって産生した抗体を提供し、好ましくは、非マウス抗原で免疫化したマウスから単離した脾細胞を骨髄腫細胞と融合させることによってハイブリドーマを産生し、その後、融合により生じたハイブリドーマを、抗原に結合することができる抗体を分泌するハイブリドーマクローンについてスクリーニングを行う。
【０１８９】
特異的な特定のエピトープを認識する抗体断片は、当業者に知られている任意の技術によって産生し得る。たとえば、本発明のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片は、免疫グロブリン分子のタンパク質分解的切断によって産生することができ、パパイン（Ｆａｂ断片を生じさせるため）またはペプシン（Ｆ（ａｂ’）２断片を生じさせるため）などの酵素を用いる。Ｆ（ａｂ’）２断片は、可変領域、軽鎖定常領域および重鎖のＣＨ１ドメインを含む。さらに、本発明の抗体はまた、当分野で知られている様々なファージディスプレイ方法を用いて産生することもできる。
【０１９０】
ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインが、それをコードしているポリヌクレオチド配列を保有するファージ粒子の表面上に表示されている。具体的には、ＶＨおよびＶＬドメインをコードしているＤＮＡ配列を動物ｃＤＮＡライブラリー（たとえば、ヒトまたはマウスの患部組織のｃＤＮＡライブラリー）から増幅する。ＰＣＲによってＶＨおよびＶＬドメインをコードしているＤＮＡをｓｃＦｖリンカーと一緒に組み換え、ファージミドベクター内にクローニングする。ベクターを大腸菌（E.coli)内にエレクトロポレーションし、大腸菌（E.coli）をヘルパーファージに感染させる。これらの方法で用いるファージは、典型的にはｆｄおよびＭ１３を含めた線維状ファージであり、ＶＨおよびＶＬドメインは通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩのどちらかに組換えによって融合させる。特定の抗原に結合する抗原結合ドメインを発現するファージは、抗原、たとえば、標識した抗原あるいは固体表面もしくはビーズに結合または捕捉させた抗原を用いて、選択または同定することができる。本発明の抗体の作製に用いることができるファージディスプレイ方法の例には、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参照により組み込まれるBrinkman他、1995、J. Immunol. Methods 182:41-50；Ames他、1995、J. Immunol. Methods 184:177-186；Kettleborough他、1994、Eur. J. Immunol. 24:952-958；Persic他、1997、Gene 187:9-18；Burton他、1994、Advances in Immunology 57:191-280；国際特許出願第PCT/GB91/O1 134号；国際公開公報第WO 90/02809号、第WO 91/10737号、第WO 92/01047号、第WO 92/18619号、第WO 93/1 1236号、第WO 95/15982号、第WO 95/20401号、および第WO97/13844号；ならびに米国特許第5,698,426号、第5,223,409号、第5,403,484号、第5,580,717号、第5,427,908号、第5,750,753号、第5,821,047号、第5,571,698号、第5,427,908号、第5,516,637号、第5,780,225号、第5,658,727号、第5,733,743号および第5,969,108に開示されているものが含まれる。
【０１９１】
上記参考文献に記載のように、ファージの選択後、ファージの抗体コード領域を単離してヒト抗体を含めた抗体全体、または任意の他の所望の抗原結合断片を産生するために用い、たとえば、下に記述するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母、および細菌を含めた任意の所望の宿主中で発現させることができる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えによって産生する技術は、PCT公開公報第WO 92/22324号；Mullinax他、1992、BioTechniques 12(6):864-869；Sawai他、1995、AJRI 34:26-34；およびBetter他、1988、Science 240:1041-1043に開示されているものなどの当分野で知られている方法を用いて利用することもできる（前記参考文献は、その全体が参照により組み込まれる）。
【０１９２】
抗体全体を産生するためには、ＶＨまたはＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含むＰＣＲプライマーを用いて、ｓｃＦｖクローン中でＶＨまたはＶＬ配列を増幅することができる。当業者に知られているクローニング技術を利用して、ＰＣＲ増幅したＶＨドメインを、ＶＨ定常領域、たとえば、ヒトγ４定常領域を発現するベクター内にクローニングすることができ、ＰＣＲ増幅したＶＬドメインを、ＶＬ定常領域、たとえば、ヒトκまたはλ定常領域を発現するベクター内にクローニングすることができる。好ましくは、ＶＨまたはＶＬドメインを発現するためのベクターは、ＥＦ−ｌαプロモーター、分泌シグナル、可変ドメインのクローニング部位、定常ドメイン、およびネオマイシンなどの選択マーカーを含む。また、ＶＨおよびＶＬドメインを、必要な定常領域を発現する１つのベクター内にクローニングしてもよい。その後、当業者に知られている技術を用いて重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系内に同時形質移入して、完全長の抗体、たとえば、ＩｇＧを発現する安定的または一過性の細胞系を作製する。
【０１９３】
ヒトにおける抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイを含めた一部の使用では、ヒト化抗体またはキメラ抗体を用いることが好ましい場合がある。完全ヒト抗体およびヒト化抗体が、ヒト被験体の治療処置にとって特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いる上述のファージディスプレイ方法を含めた当分野で知られている様々な方法によって、産生することができる。そのそれぞれがその全体で本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第4,444,887号および第4,716,111号；ならびに国際公開公報第WO 98/46645号、第WO 98/50433号、第WO 98/24893号、第WO98/16654号、第WO 96/34096号、第WO 96/33735号、および第WO 91/10741号も参照されたい。
【０１９４】
機能的な内在性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて、ヒト抗体を製造することもできる。たとえば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体を、無作為にまたは相同組換えによってマウス胚性幹細胞内に導入し得る。あるいは、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域をマウス胚性幹細胞内に導入し得る。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、相同組換えによるヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入とは別に、または同時に、非機能的になり得る。具体的には、ＪＨ領域のホモ接合性欠失により、内在性の抗体産生が妨げられる。改変した胚性幹細胞を増殖させ、胚盤胞内に微量注入してキメラマウスを作製する。その後、キメラマウスを繁殖させて、ヒト抗体を発現するホモ接合性子孫を作製する。トランスジェニックマウスを、選択した抗原、たとえば、本発明のポリペプチドの全体または一部分を用いて、通常の様式で免疫化する。抗原に対するモノクローナル抗体は、従来のハイブリドーマ技術を用いて、免疫化したトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスが保有するヒト免疫グロブリン導入遺伝子はＢ細胞の分化中に再編成され、次いでクラススイッチおよび体細胞突然変異を受ける。したがって、このような技術を用いることによって、治療上有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を産生することが可能である。ヒト抗体を産生するためのこの技術の概要については、LonbergおよびHuszar、1995、Int. Rev. Immunol. 13:65 93を参照されたい。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を産生するためのこの技術ならびにそのような抗体を産生するためのプロトコルの詳細については、たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれる国際公開公報第WO 98/24893号、第WO 96/34096号、および第WO 96/33735号；ならびに米国特許第5,413,923号、第5,625,126号、第5,633,425号、第5,569,825号、第5,661,016号、第5,545,806号、第5,814,318号、および第5,939,598号を参照されたい。さらに、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（カリフォルニア州Ｆｒｅｅｍｏｎｔ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ）などの企業は、上述した技術に類似の技術を用いて選択した抗原に対するヒト抗体を提供することに従事できる。
【０１９５】
キメラ抗体とは、抗体の異なる部分が異なる免疫グロブリン分子に由来する分子である。キメラ抗体の産生方法は当分野で知られている。たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれるMorrison、1985、Science 229:1202；Oi他、1986、BioTechniques 4:214；Gillies他、1989、J. Immunol. Methods 125:191-202；および米国特許第5,807,715号、第4,816,567号、第4,816,397号、および第6,311,415号を参照されたい。
【０１９６】
しばしば、抗原結合性を変更、好ましくは向上させるために、フレームワーク領域中のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法、たとえば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、および特定の位置における異常なフレームワーク残基の同定するための配列比較によって、同定する（たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第5,585,089号；およびRiechmann他、1988、Nature 332:323を参照されたい）。
【０１９７】
ヒト化抗体とは、事前に決定した抗原に結合することができ、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するフレームワーク領域および非ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を実質的に有するＣＤＲを含む、抗体もしくはその変異体またはその断片である。ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメイン（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂｃ、Ｆｖ）の実質的にすべてを含み、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべてが、非ヒト免疫グロブリン（すなわちドナー抗体）のそれに対応し、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてが、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれである。好ましくは、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含む。通常、抗体は、軽鎖と重鎖の少なくとも可変ドメインとの両方を含む。また、抗体は重鎖のＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４領域も含んでいてよい。ヒト化抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含めた任意の免疫グロブリンクラス、ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含めた任意のアイソタイプから選択することができる。通常、定常ドメインは補体結合の定常ドメインであり、ヒト化抗体が細胞毒性活性を示すことが所望され、クラスが典型的にはＩｇＧ１である。そのような細胞毒性活性が望ましくない場合は、定常ドメインはＩｇＧ２クラスのものであってもよい。ヒト化抗体は複数のクラスまたはアイソタイプ由来の配列を含んでいてもよく、所望のエフェクター機能を最適化するために特定の定常ドメインを選択することは、当分野の通常の技術範囲内にある。ヒト化抗体のフレームワークおよびＣＤＲ領域は、親配列に正確に対応している必要はなく、たとえば、ドナーＣＤＲもしくはコンセンサスフレームワークは、その部位におけるＣＤＲもしくはフレームワーク残基がコンセンサスまたは移入抗体のどちらにも対応しないように、少なくとも１つの残基の置換、挿入あるいは欠失によって突然変異誘発が行われていてもよい。しかし、このような突然変異は大規模ではない。通常は、ヒト化抗体の残基の少なくとも７５％、大抵は９０％、最も好ましくは９５％を超える残基が親フレームワークおよびＣＤＲ配列の残基に対応する。ヒト化抗体は、それだけには限定されないが、ＣＤＲ移植（たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参照により組み込まれる欧州特許第EP 239,400号；国際公開公報第WO 91/09967号；ならびに米国特許第5,225,539号、第5,530,101号、および第5,585,089号を参照）、化粧張り（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）または表面再仕上げ（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参照により組み込まれる欧州特許第EP 592,106号および第EP 519,596号；Padlan、1991、Molecular Immunology 28(4/5):489-498；Studnicka他、1994、Protein Engineering 7(6):805-814；ならびにRoguska他、1994、PNAS 9 1:969-973を参照）、鎖シャフリング（たとえば、それぞれがその全体で本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第5,565,332号を参照）、ならびに、たとえば、そのそれぞれがその全体で本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第6,407,213号、米国特許第5,766,886号、国際公開公報第WO 9317105号、Tan他、J. Immunol. 169:1 119 25 (2002)、Caldas他、Protein Eng. 13(5):353 60 (2000)、Morea他、Methods 20(3):267 79 (2000)、Baca他、J. Biol. Chem. 272(16):10678 84 (1997)、Roguska他、Protein Eng. 9(10):895 904 (1996)、Couto他、Cancer Res. 55 (23補遺):5973s-5977s (1995)、Couto他、Cancer Res. 55(8):1717 22 (1995)、Sandhu JS、Gene 150(2):409 10 (1994)、およびPedersen他、J. MoI. Biol. 235(3):959 73 (1994)に開示されている技術を含めた、当分野で知られている様々な技術を用いて産生することができる。しばしば、抗原結合を変更、好ましくは向上させるために、フレームワーク領域中のフレームワーク残基をＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換する。これらのフレームワーク置換は、当分野で周知の方法、たとえば、抗原結合に重要なフレームワーク残基を同定するためのＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用のモデリング、および特定の位置における異常なフレームワーク残基を同定するための配列比較によって、同定する。（たとえば、その全体で本明細書中に参照により組み込まれるQueen他、米国特許第5,585,089号；およびRiechmann他、1988、Nature 332:323を参照されたい。）
さらに、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１またはその断片に免疫特異的に結合する抗体は、次に、当業者に周知の技術を用いて抗原を「模倣する」抗イディオタイプ抗体を産生するために、利用することができる。（たとえば、GreenspanおよびBona、1989、FASEB J. 7(5):437-444；ならびにNissinoff、1991、J. Immunol 147(8):2429-2438を参照）。
【０１９８】
４．２．２  ＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１断片ならびにＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとしてのエフリンＡ１断片
一実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２ポリペプチドである。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンモジュレーターはＥｐｈＡ２の断片（「ＥｐｈＡ２断片」）である。本実施形態に従って、ＥｐｈＡ２断片は、好ましくは、エフリンＡ１に結合する能力を保持している。好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２断片は、エフリンＡ１に結合する能力を保持しており、内在性ＥｐｈＡ２とＥｐｈＡ２の内在性リガンド、好ましくはエフリンＡ１との結合を阻害または低減させる。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンモジュレーターは、エフリンＡ１またはその断片に特異的に結合し、他のエフリン分子またはその断片に結合しないＥｐｈＡ２断片である。
【０１９９】
ＥｐｈＡ２断片の非限定的な例には、限定はされないが、ヒトＥｐｈＡ２のリガンド結合ドメイン（アミノ酸残基２８〜２０１）ならびに以下のドメイン、すなわち、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（アミノ酸残基３３２〜４２４）；第２のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（アミノ酸残基４３９〜５１９）；チロシンキナーゼ触媒ドメイン（アミノ酸残基６０７〜８７４）；および／または不稔性αモチーフ「ＳＡＭ」ドメイン（アミノ酸残基９０２〜９６８）、のうち任意の１つまたは複数を含むＥｐｈＡ２断片が含まれ、それらの配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースに見出される（たとえば、ヒトＥｐｈＡ２はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４２２．２）。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２断片は可溶性である（すなわち膜結合性でない）。別の具体的な実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２断片は、ＥｐｈＡ２の膜貫通ドメイン（たとえば、アミノ酸残基５２０〜６０６）を欠き、膜結合されない。さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２断片は、細胞外ドメインまたはその断片を含み、膜貫通ドメインまたはその断片を欠き、したがってＥｐｈＡ２は膜結合されない。さらなる実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２断片は、ＥｐｈＡ２の細胞質ドメインまたは細胞質ドメインの断片を含み、膜貫通ドメインまたはその断片を欠き、したがってＥｐｈＡ２は膜結合されない。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２断片はＥｐｈＡ２の細胞外ドメインまたはその断片のみを含む。別の具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２断片は、リガンド結合ドメイン（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４２２．２に開示されているヒトＥｐｈＡ２のアミノ酸残基２８〜２０１）のみを含む。具体的な実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２断片は、ＥｐｈＡ２のヒトの細胞外ドメインの特定の断片を含む（たとえば、アミノ酸残基１〜２５、１〜５０、１〜７５、１〜１００、１〜１２５、１〜１５０、１〜１７５、１〜２００、１〜２２５、１〜２５０、１〜２７５、１〜３００、１〜３２５、１〜３５０、１〜３７５、１〜４００、１〜４２５、１〜４５０、１〜４７５、１〜５００、または１〜５２５）。別の具体的な実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２断片は、ＥｐｈＡ２の膜貫通ドメインを欠き、したがってＥｐｈＡ２は膜結合されない。
【０２００】
ＥｐｈＡ２断片には、内在性ＥｐｈＡ２配列に１００％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％同一であるポリペプチドが含まれる。２つのアミノ酸配列の同一性％の決定は、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を含めた当業者に知られている任意の方法によって決定することができる。具体的な実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２断片は、ＥｐｈＡ２の類似体または誘導体であってよい。たとえば、本発明のＥｐｈＡ２断片には、修飾された、すなわち、任意の種類の分子の該ポリペプチドへの共有結合によって修飾された誘導体が含まれる。たとえば、限定はしないが、ポリペプチド誘導体（たとえば、ＥｐｈＡ２ポリペプチド誘導体）には、たとえば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞性リガンドとの連結などによって修飾したポリペプチドが含まれる。多数の化学修飾のうち任意のものを、それだけには限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた既知の技術によって実施し得る。さらに、誘導体は、１つまたは複数の非古典的アミノ酸を含み得る。下記セクション４．２．３も参照されたい。
【０２０１】
具体的な実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、細胞質ドメインまたはシグナル伝達に必要なその一部分を欠く、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型である。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型は、エフリンＡ１に結合する能力を保持しているが、シグナル伝達を行うことができず、低〜無視できるシグナル伝達を誘導するか、またはリガンド−受容体の相互作用の際に活性化されるシグナル伝達経路のすべてを誘導することはない。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２に関して低〜無視できるシグナル伝達とは、リガンド結合の際において、本明細書中に記載のもしくは当業者に周知のｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイにおける対照と比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％の、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達の任意の態様での減少をいう。本発明の特定の態様では、ＥｐｈＡ２のシグナル伝達には、ＥｐｈＡ２とその内在性リガンド（たとえば、エフリンＡ１）とが結合した際に活性化されるシグナル伝達経路のうちの、任意の１つまたは複数を包含する。そのようなシグナル伝達経路の非限定的な例には、それだけには限定されないが、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）／ＥＲＫ経路、Ｒａｓ経路、およびＳｒｃキナーゼファミリーを伴う経路が含まれる（他のＥｐｈ受容体経路については、すべてその全体が本明細書中に参照により組み込まれるCheng他、2002、Cytokine & Growth Factor Rev. 13:75-85；KullanderおよびKlein、2002、Nature Rev. 3:475-486；HolderおよびKlein、1999、Development 126:2033-2044；Zhou、1998、Pharmacol. Ther. 77:151-181；ならびにNakamotoおよびBergemann、2002、Microscopy Res. & Technique 59:58-67を参照）。
【０２０２】
ＥｐｈＡ２のシグナル伝達を測定するために、当業者に知られている様々なアッセイを行い得る。たとえば、リガンド結合の際にＥｐｈＡ２のシグナル伝達が活性化されているかどうかを決定するために、エフリンＡ１で処理していない対照細胞と比較して、エフリンＡ１で処理した細胞中に存在するリン酸化されたＥｐｈＡ２の量を測定することによって、ＥｐｈＡ２のリン酸化を測定し得る。ＥｐｈＡ２は、当業者に知られている任意のタンパク質免疫沈降方法および本発明のＥｐｈＡ２抗体を用いて単離し得る。その後、抗ホスホチロシン抗体（Ｕｐｓｔａｔｅ  Ｔｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ）を用いて、当業者に知られている任意の標準的な免疫ブロッティング方法を用いて、リン酸化されたＥｐｈＡ２を測定し得る。たとえば、Cheng他、2002、Cytokine & Growth Factor Rev. 13:75-85を参照されたい。別の実施形態では、リガンド結合の際にＥｐｈＡ２のシグナル伝達が活性化されているかどうかを決定するために、当業者に知られている標準的な免疫沈降および免疫ブロッティングアッセイを用いて、エフリンＡ１で処理していない対照細胞と比較して、エフリンＡ１で処理した細胞中に存在するリン酸化されたＭＡＰＫの量を測定することによって、ＭＡＰＫのリン酸化を測定し得る（たとえば、その全体が参照により本明細書中に組み込まれるMiao他、2003、J. Cell Biol. 7:1281-1292を参照）。
【０２０３】
一実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはエフリンＡ１ポリペプチドである。具体的な実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはエフリンＡ１の断片（「エフリンＡ１断片」）である。本実施形態に従えば、エフリンＡ１断片は、好ましくは、ＥｐｈＡ２に結合する能力を保持している。好ましい実施形態では、エフリンＡ１断片は、ＥｐｈＡ２に結合する能力を保持しており、内在性エフリンＡ１と内在性ＥｐｈＡ２との結合を阻害または低減させる。
【０２０４】
エフリンＡ１断片の非限定的な例には、限定はされないが、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに開示されているヒトエフリンＡ１（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００４４１９（バリアント１）およびＮＰ＿８７２６２６（バリアント２））の任意の断片が含まれる。具体的な実施形態では、エフリンＡ１断片は可溶性である（すなわち膜結合性でない）。具体的な実施形態では、本発明のエフリンＡ１断片はヒトエフリンＡ１の細胞外ドメインまたはその断片を含む。さらなる実施形態では、本発明のエフリンＡ１断片は、ヒトエフリンＡ１の細胞外ドメインまたはその断片を含み、膜結合されない。具体的な実施形態では、本発明のエフリンＡ１断片は、ヒトエフリンＡ１ バリアント１の細胞外ドメインの特異的断片またはその断片を含み、膜結合されない。他の具体的な実施形態では、本発明のエフリンＡ１断片は、ヒトエフリンＡ１ バリアント２の細胞外ドメインの特異的断片またはその断片を含み、膜結合されない。
【０２０５】
エフリンＡ１断片には、内在性エフリンＡ１配列に１００％、９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％同一であるポリペプチドが含まれる。２つのアミノ酸配列の同一性％の決定は、ＢＬＡＳＴタンパク質検索を含めた当業者に知られている任意の方法によって決定することができる。具体的な実施形態では、本発明のエフリンＡ１断片は、エフリンＡ１の類似体または誘導体であることができる。たとえば、本発明のエフリンＡ１断片には、修飾された、すなわち、任意の種類の分子の該ポリペプチドへの共有結合によって修飾された誘導体が含まれる。たとえば、限定はしないが、ポリペプチド誘導体（たとえば、エフリンＡ１ポリペプチド誘導体）には、たとえば、グリコシル化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解的切断、細胞性リガンドとの連結などによって修飾したポリペプチドが含まれる。多数の化学修飾のうち任意のものを、それだけには限定されないが、特異的化学切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含めた既知の技術によって実施し得る。さらに、誘導体は、１つまたは複数の非典型的アミノ酸を含み得る。下記セクション４．２．３も参照されたい。
【０２０６】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１融合タンパク質である。融合タンパク質であるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターについては、たとえば、上記セクション４．２．１．１でさらに詳細に記載している。好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１融合タンパク質は可溶性である。ＥｐｈＡ２融合タンパク質の非限定的な例には、ＥｐｈＡ２−ＦｃなどのＥｐｈＡ２の可溶形態が含まれる（たとえば、その全体が参照により本明細書中に組み込まれるCheng他、2002、MoI. Cancer Res. 1:2-11を参照）。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部分と融合させたＥｐｈＡ２を含む。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ部分と融合させた、エフリンＡ１に結合するその能力を保持しているＥｐｈＡ２断片（たとえば、ＥｐｈＡ２の細胞外ドメイン）を含む（たとえば、その全体が本明細書中に参照により組み込まれるCarles-Kinch他、2002、Cancer Res. 62:2840-2847；およびCheng他、2002、MoI. Cancer Res. 1:2-l 1を参照）。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２融合タンパク質は、異種タンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン）と融合させた、エフリンＡ１に結合するその能力を保持しているＥｐｈＡ２断片を含む。
【０２０７】
エフリンＡ１融合タンパク質の非限定的な例には、エフリンＡ１−ＦｃなどのエフリンＡ１の可溶形態が含まれる（たとえば、その全体が参照により本明細書中に組み込まれるDuxbury他、2004、Biochem. & Biophys. Res. Comm. 320:1096-1 102を参照）。具体的な実施形態では、エフリンＡ１融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧのＦｃドメインと融合させたエフリンＡ１を含む。別の実施形態では、エフリンＡ１融合タンパク質は、ヒト免疫グロブリンＩｇＧのＦｃドメインと融合させた、ＥｐｈＡ２に結合するその能力を保持しているエフリンＡ１断片を含む。さらなる実施形態では、エフリンＡ１融合タンパク質は、異種タンパク質（たとえば、ヒト血清アルブミン）と融合させた、ＥｐｈＡ２に結合するその能力を保持しているエフリンＡ１断片を含む。
【０２０８】
本明細書中に記載のタンパク質−タンパク質の相互作用を研究するための生化学的、生物物理学的、遺伝的、および／もしくはコンピュータ技術を用いて、または当分野で知られている任意の方法によって、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１の断片を作製し、エフリンＡ１またはＥｐｈＡ２それぞれに結合する能力についてアッセイを行うことができる。定性的または定量的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ  ｖｉｖｏで、タンパク質結合（たとえば、ＥｐｈＡ２とエフリンＡ１との結合の検出）を検出する方法の非限定的な例には、ＧＳＴ親和性結合アッセイ、ファー・ウエスタンブロット分析、表面プラズモン共鳴（ＳＲＰ）、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、蛍光偏光（ＦＰ）、等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）、円二色性（ＣＤ）、タンパク質断片相補アッセイ（ＰＣＡ）、様々なツーハイブリッド系、ならびにコンピュータ解析用のＳｃａｎｓｉｔｅプログラムなどのプロテオミクスおよびバイオインフォマティクスに基づいた手法が含まれる（たとえば、その全体が本明細書中に参照により組み込まれるFu, H.、2004、Protein-Protein Interactions: Methods and Applications(Humana Press、ニュージャージー州Totowa)；およびProtein-Protein interactions: A Molecular Cloning Manual、2002、Golemis編(Cold Spring Harbor Laboratory Press、ニューヨーク州Cold Spring Harbor)を参照）。
【０２０９】
４．２．３．１  ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをコードしているポリヌクレオチド
本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとしては、上記セクション４．２．１および４．２．２に開示したポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドから生成されるポリペプチドが含まれる。一実施形態では、本発明の抗体には、セクション４．６に記載のアッセイの１つもしくは複数においてＥｐｈＡ２および／もしくはエフリンＡ１の発現ならびに／または活性を調節するモノクローナル抗体をコードしているポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドから生成されるＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１モノクローナル抗体が含まれる。別の実施形態では、本発明の方法で用いるＥｐｈＡ２断片またはエフリンＡ１断片には、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１の断片をコードしているポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドから生成されるポリペプチドが含まれる。ハイブリダイゼーション条件としては、限定はされないが、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃での、フィルターに結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーションと、その後の０．２×ＳＳＣ／０．１％ ＳＤＳ中、約５０〜６５℃での１回もしくは複数回の洗浄のようなストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、また、６×ＳＳＣ中、約４５℃での、フィルターに結合したＤＮＡとのハイブリダイゼーションと、その後の０．１×ＳＳＣ／０．２％のＳＤＳ中、約６０℃での１回もしくは複数回の洗浄のような高度にストリンジェントな条件、あるいは当業者に知られている任意の他のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が含まれる（たとえば、Ausubel, F.M.他編、1989、Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、Green Publishing Associates, Inc.およびJohn Wiley and Sons, Inc.、NY、6.3.1〜6.3.6および2.10.3ページを参照）。
【０２１０】
本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとしては、本明細書中に記載のポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドが含まれる。本明細書中に記載のポリペプチド（たとえば、本発明の抗体、またはＥｐｈＡ２断片およびエフリンＡ１断片）をコードしているポリヌクレオチドは、当分野で知られている任意の方法によって入手および配列決定し得る。たとえば、本発明の方法で用いるポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをコードしているポリヌクレオチドは、化学合成したオリゴヌクレオチドから構築してもよく（たとえば、Kutmeier他、1994、BioTechniques 17:242に記載）、これは、手短に述べると、ポリペプチドをコードしている配列の一部を含む重複オリゴヌクレオチド群を合成すること、それらのオリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションをおこなうこと、次いで、ＰＣＲによってライゲーションしたオリゴヌクレオチドの増幅を行うことを含む。
【０２１１】
あるいは、本発明の方法で用いるポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをコードしているポリヌクレオチドは、適切な由来源からの核酸から産生し得る。特定のポリペプチドをコードしている核酸を含むクローンは入手可能でないが、ポリペプチドの配列が知られている場合は、ポリペプチドをコードしている核酸を化学合成するか、適切な由来源（たとえば、本発明の抗体を発現するように選択したハイブリドーマ細胞やＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１を発現する上皮および／または内皮細胞などの、所望のポリペプチドを発現する任意の組織もしくは細胞から作製した抗体ｃＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリー、あるいはそれから単離した核酸、好ましくはポリＡ＋ＲＮＡ）から、配列の３’および５’末端にハイブリダイズ可能な合成プライマーを用いたＰＣＲ増幅によって、または、たとえば、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをコードしているｃＤＮＡライブラリー由来のｃＤＮＡクローンを同定するために特定の遺伝子配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングすることによって、得てもよい。その後、当分野で周知の任意の方法を用いて、ＰＣＲによって産生した増幅核酸を複製可能なクローニングベクター内にクローニングし得る。
【０２１２】
本発明の方法で用いるポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのヌクレオチド配列が決定されたのち、ヌクレオチド配列を操作するための当分野で周知の方法、たとえば、組換えＤＮＡ技術、部位特異的突然変異誘発、ＰＣＲなど（たとえば、どちらもその全体が本明細書中に参照により組み込まれるSambrook他、1990、Molecular Cloning, A Laboratory Manual、第2版、Cold Spring Harbor Laboratory、ニューヨーク州Cold Spring Harbor、およびAusubel他編、1998、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NYに記載の技術を参照）を用いて、ヌクレオチド配列の操作を行ってもよく、これにより、様々なアミノ酸配列を有するポリペプチドが産生され、たとえば、アミノ酸の置換、欠失、および／または挿入が生じる。
【０２１３】
たとえば、部位特異的突然変異誘発およびＰＣＲ媒介突然変異誘発を含めた当業者に知られている標準の技術を用いて、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをコードしているヌクレオチド配列中に突然変異を導入することができ、これによりアミノ酸の置換がもたらされる。好ましくは、誘導体には、最初のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと比較して、１５個未満のアミノ酸置換、１０個未満のアミノ酸置換、５個未満のアミノ酸置換、４個未満のアミノ酸置換、３個未満のアミノ酸置換、または２個未満のアミノ酸置換が含まれる。好ましい実施形態では、誘導体は、１つまたは複数の予測上の非必須アミノ酸残基の位置において保存的アミノ酸置換を有する。
【０２１４】
本発明はまた、フレームワークまたは可変領域中に突然変異（たとえば、１つもしくは複数のアミノ酸置換）を有する任意のＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１抗体のアミノ酸配列を含む、抗体あるいは抗体断片の使用も包含する。好ましくは、これらの抗体中の突然変異により、それらが免疫特異的に結合する特定の抗原に対する抗体の結合力（avidity）および／または親和性（affinity）が維持あるいは増強される。当業者に知られている標準技術（たとえば、免疫アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイ）を用いて、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとその結合パートナーとの結合の程度をアッセイすることができる。具体的な実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターが抗体、ＥｐｈＡ２断片、エフリンＡ１断片、ＥｐｈＡ２融合タンパク質、エフリンＡ１融合タンパク質またはＥｐｈＡ２のドミナントネガティブ型である場合は、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１への結合を、必要に応じて評価することができる。
【０２１５】
４．２．３．２  ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの組換え産生
ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター（それだけには限定されないが、その誘導体、類似体またはその断片を含む）の組換え発現は、ポリペプチドをコードしているポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を要する。ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをコードしているポリヌクレオチドを一旦取得すれば、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを産生するためのベクターを、当分野で周知の技術を用いた組換えＤＮＡ技術によって産生し得る。当業者に周知の方法を用いて、ポリペプチドコード配列ならびに適切な転写および翻訳調節シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。そこで、含まれるポリヌクレオチドを発現することによってタンパク質を調製する方法を本明細書中に記載する。これらの方法には、たとえば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ遺伝的組換えが含まれる。したがって、本発明は、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをコードしているヌクレオチド配列を含む、複製可能なベクターを提供する。
【０２１６】
慣用技術によって発現ベクターを宿主細胞に導入し、その後、形質移入された細胞を慣用技術によって培養してポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを産生する。したがって、本発明には、異種プロモーターに作動可能に連結したポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをコードしているポリヌクレオチドを含む宿主細胞が含まれる。
【０２１７】
ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを発現させるために様々な宿主−発現ベクター系を利用し得る（たとえば、米国特許第5,807,715号を参照）。そのような宿主−発現系は、それによって目的のコード配列を産生したのちに精製し得る運搬体を表すが、適切なヌクレオチドコード配列で形質転換または形質移入した場合に本発明のポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをｉｎ  ｓｉｔｕで発現し得る細胞も表す。これらには、限定はされないが、微生物、たとえば、抗体コード配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡもしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換した細菌（たとえば、大腸菌（E. coli）および枯草菌（B. subtilis））；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した酵母（たとえば、サッカロミセスピキア（Saccharomyces Pichia））；ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターコード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえば、バキュロウイルス）に感染させた昆虫細胞系；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（たとえば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染させた、もしくは抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（たとえば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；または哺乳動物細胞（たとえば、メタロチオネインプロモーター）のゲノムもしくは哺乳動物ウイルス（たとえば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現構築体を保有する哺乳動物細胞系（たとえば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳＯ、および３Ｔ３細胞）が含まれる。特に組換えポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター全体の発現には、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）などの細菌細胞、より好ましくは真核細胞を、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの発現に用いる。たとえば、ヒトサイトメガロウイルス由来の主要な中間初期遺伝子プロモーター配列などのベクターを組み合わせたチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物細胞は、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター、特に抗体ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの有効な発現系である（Foecking他、1986、Gene 45:101；およびCockett他、1990、BioTechnology 8:2）。具体的な実施形態では、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターをコードしているヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーター、誘導性プロモーターまたは組織特異的プロモーターによって制御される。
【０２１８】
細菌系では、発現させるポリペプチドに意図する使用に応じて、いくつかの発現ベクターを有利に選択し得る。たとえば、医薬組成物を作製するために大量のそのようなタンパク質を産生する場合は、容易に精製される融合タンパク質産物の高レベルな発現を誘導するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、それだけには限定されないが、融合タンパク質が産生されるように抗体コード配列が個別にフレーム内でｌａｃＺコード領域と共にベクター内にライゲーションされていてもよい、大腸菌（E. coli）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther他、1983、EMBO 12:1791）；ｐＩＮベクター（InouyeおよびInouye、1985、Nucleic Acids Res. 13:3101-3109；Van HeekeおよびSchuster、1989、J. Biol. Chem. 24:5503-5509）；などが含まれる。外来ポリペプチドをグルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために、ｐＧＥＸベクターも用い得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合、次いで遊離グルタチオンの存在下における溶出によって、溶解細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローニングした標的遺伝子産物をＧＳＴ部分から遊離させることができるように、トロンビンまたはＸａ因子のプロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０２１９】
昆虫系では、外来遺伝子を発現させるためのベクターとしてオートグラファ・カリフォルニカ（Autographa californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）を用いる。このウイルスはスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞中で増殖する。抗体コード配列をウイルスの非必須領域（たとえば、多角体遺伝子）内に個別にクローニングし、ＡｃＮＰＶプロモーター（たとえば、多角体プロモーター）の制御下に置いてもよい。
【０２２０】
哺乳動物宿主細胞では、いくつかのウイルス発現系を利用し得る。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合は、目的のポリペプチドコード配列をアデノウイルス転写／翻訳調節複合体、たとえば、後期プロモーターおよび三者間リーダー配列にライゲーションさせ得る。その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ組換えによってこのキメラ遺伝子をアデノウイルスゲノム中に挿入し得る。ウイルスゲノムの非必須領域（たとえば、Ｅ１またはＥ３領域）中への挿入により、生存可能であり、感染した宿主中でポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを発現することができる組換えウイルスがもたらされる（たとえば、LoganおよびShenk、1984、PNAS 8 1:355-359を参照）。挿入したポリペプチドコード配列の効率的な翻訳には、特定の開始シグナルも必要になるであろう。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列が含まれる。さらに、挿入物全体の翻訳を保証するために、開始コドンは所望のコード配列の読み枠と一致していなければならない。これらの外来翻訳調節シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の様々な起源であってよい。発現効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることによって増強し得る（たとえば、Bittner他、1987、Methods in Enzymol. 153:516-544を参照）。
【０２２１】
さらに、挿入した配列の発現を調節する、または所望の特定の様式で遺伝子産物を修飾およびプロセッシングする宿主細胞株を選択し得る。タンパク質産物のそのような修飾（たとえば、グリコシル化）およびプロセッシング（たとえば、切断）は、タンパク質の機能に重要であり得る。様々な宿主細胞が、タンパク質や遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾について特徴的かつ特異的な機構を有する。発現される外来タンパク質の正しい修飾およびプロセッシングが保証されるように適切な細胞系または宿主系を選択することができる。この目的を達成するために、遺伝子産物の一次転写物の適切なプロセッシング、グリコシル化、およびリン酸化の細胞機構を保有する真核宿主細胞を用い得る。そのような哺乳動物宿主細胞には、それだけには限定されないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２ＯおよびＴ４７Ｄ、ＮＳＯ（免疫グロブリン鎖を内在的にまったく産生しないネズミ骨髄腫細胞系）、ＣＲＬ７Ｏ３ＯならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞が含まれる。
【０２２２】
組換えタンパク質の長期かつ高収率の産生には、安定した発現が好ましい。たとえば、抗体分子を安定して発現する細胞系を作製し得る。ウイルス複製起点を含む発現ベクターを用いるよりも、宿主細胞を、適切な発現調節エレメント（たとえば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって調節されるＤＮＡおよび選択マーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、遺伝子操作した細胞を富化培地中で１〜２日間増殖させ、その後、選択培地に切り替える。組換えプラスミド中の選択マーカーにより選択に対する耐性が与えられ、細胞はプラスミドをその染色体に安定して組み込むことが可能となり、増殖して巣を形成し、ひいてはそれをクローニングして細胞系へと拡張させることができる。この方法は、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを発現する細胞系を作製するために有利に用い得る。このような遺伝子操作した細胞系は、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと直接または間接的に相互作用する組成物のスクリーニングおよび評価に特に有用であり得る。
【０２２３】
限定はされないが、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子（Wigler他、1977、Cell 11:223）、グルタミン合成酵素遺伝子、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（SzybalskaおよびSzybalski、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48:202）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（Lowy他、1980、Cell 22:8-17）を始めとする様々な選択系を、それぞれｔｋ細胞、ｇｓ細胞、ｈｇｐｒｔ細胞またはａｐｒｔ細胞で用い得る。また、以下の遺伝子を選択する基礎として代謝拮抗剤耐性を用いることができる：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Wigler他、1980、PNAS 77:357；O'Hare他、＼98l、PNAS 78:1527）；ミコフェノール酸に対する耐性を与えるｇｐｔ（MulliganおよびBerg、1981、PNAS 78:2072）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を与えるｎｅｏ（WuおよびWu、1991、Biotherapy 3:87；Tolstoshev、1993、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573；Mulligan、1993、Science 260:926；ならびにMorganおよびAnderson、1993、Ann. Rev. Biochem. 62: 191；1993年5月、TIB TECH 11:155-）；およびハイグロマイシンに対する耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Santerre他、1984、Gene 30:147）。所望の組換えクローンを選択するために組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られている方法を通常通りに適用すればよく、そのような方法は、たとえば、その全体が本明細書中に参照により組み込まれるAusubel他編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY(1993)；Kriegler、Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual、Stockton Press、NY(1990)；ならびに第12章および第13章、Dracopoli他編、Current Protocols in Human Genetics、John Wiley & Sons、NY(1994)；Colberre-Garapin他、1981、J. MoI. Biol. 150:1に記載されている。
【０２２４】
ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの発現レベルは、ベクターの増幅によって増加させることができる（総説には、BebbingtonおよびHentschel、「ＤＮＡクローニングにおける哺乳動物細胞中でクローニングした遺伝子を発現させるための遺伝子増幅に基づいたベクターの使用(The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA clonint)」、第3巻（Academic Press、New York、1987）を参照）。ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを発現するベクター系中のマーカーが増幅可能であるなら、宿主細胞の培養物中に存在する阻害剤のレベルの増加により、マーカー遺伝子のコピー数が増加する。増幅した領域はポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの遺伝子に関連しているので、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの産生も増加する（Crouse他、1983、MoI. Cell. Biol. 3:257）。
【０２２５】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、すなわち重鎖に由来するポリペプチドをコードする第１のベクター、および軽鎖に由来するポリペプチドをコードしている第２のベクターにより、同時形質移入してもよい。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの等量での発現を可能にする同一の選択マーカーを含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖ポリペプチドをどちらもコードしており、かつ発現することができる単一のベクターを用いてもよい。そのような状況では、毒性がある遊離重鎖の過剰を回避するために、軽鎖を重鎖の前に配置すべきである（Proudfoot、1986、Nature 322:52；およびKohler、1980、PNAS 77:2197）。重鎖および軽鎖のコード配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０２２６】
組換え発現によって本発明のポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを製造したのち、これを、ポリペプチドを精製するための当分野で知られている任意の方法、たとえば、クロマトグラフィー（たとえば、イオン交換、親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差的溶解、またはタンパク質を精製するための任意の他の標準技術によって精製し得る。さらに、精製を容易にするために、ポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを本明細書中に記載のまたは他に当分野で知られている異種ポリペプチド配列と融合させてもよい。
【０２２７】
抗体である本発明のポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、抗体分子の定常領域をコードしているヌクレオチド配列が既に含まれるベクターを用いて発現させ得る（たとえば、米国特許第5,919,900号：第5,747,296号：第5,789,178号：第5,591,639号：第5,658,759号：第5,849,522号：第5,122,464号：第5,770,359号：第5,827,739号；国際公開公報第WO 89/01036号：第WO 89/10404号；Bebbington他、1992、BioTechnology 10:169を参照）。重鎖全体、軽鎖全体、または重鎖全体および軽鎖全体の両方を発現させるために、抗体の可変ドメインをそのようなベクター内にクローニングし得る。二本鎖抗体を発現させる好ましい実施形態では、免疫グロブリン分子全体を発現させるために、重鎖および軽鎖の両方をコードしているベクターを宿主細胞中で同時発現させればよい。
【０２２８】
具体的な実施形態では、本発明のポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター（たとえば、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質）の発現は、構成的プロモーターによって制御される。別の実施形態では、本発明のポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター（たとえば、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質）の発現は、誘導性プロモーターによって制御される。別の実施形態では、本発明のポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター（たとえば、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ペプチド、ポリペプチド、タンパク質または融合タンパク質）の発現は、組織特異的プロモーターによって制御される。たとえば、ＥｐｈＡ２は、Ｈｏｘａ１およびＨｏｘｂ１ホメオボックス転写因子によって制御され（たとえば、その全体が参照により本明細書中に組み込まれるChen他、1998、J. Biol. Chetn. 273:24670-24675を参照、エフリンＡ１は、ホメオボックス転写因子ＨｏｘＢ３によって制御される（たとえば、その全体が参照により本明細書中に組み込まれるMyers他、2000、J. Cell Biol. 148:343-351を参照）。
【０２２９】
一実施形態では、本発明の方法は、ＩＬ−９アンタゴニストまたは本発明の別の予防剤もしくは治療剤をコードしている核酸を含む組成物を投与することを含み、ここで、前記核酸は、適切な宿主中でＩＬ−９アンタゴニスト、本発明の別の予防剤または治療剤、あるいはその断片もしくはキメラタンパク質または重鎖もしくは軽鎖を発現する発現ベクターの一部である。具体的には、そのような核酸は、抗体コード領域に作動可能に連結したプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、前記プロモーターは誘導性または構成的、任意選択で組織特異的である。
【０２３０】
４．３  ポリヌクレオチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター
本発明のポリペプチドＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターに加えて、本発明の方法では核酸分子を用いることができる。一実施形態では、核酸分子ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の発現もしくはリガンド（好ましくはエフリンＡ１）結合における利用可能性を増加させるために、ＥｐｈＡ２のすべてまたは一部分をコードしうる。別の実施形態では、核酸分子ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２との結合に利用可能なエフリンＡ１の量を増加させるために、エフリンＡ１のすべてまたは一部分をコードしうる。当分野で知られている任意の方法を用いて、核酸分子を用いたＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１の発現を増加させることができる。さらなる実施形態では、核酸ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターが、エフリンＡ１とのリガンド結合に利用可能な内在性ＥｐｈＡ２の量を低減させる。さらなる実施形態では、核酸分子ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２との結合に利用可能なエフリンＡ１の量を低減させる。それだけには限定されないが、アンチセンスおよびＲＮＡ干渉技法を含めた、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１の発現を減少させる当分野で知られている任意の方法を、本発明の方法で用いることができる。したがって、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターには、エフリンＡ１の発現もしくはＥｐｈＡ２結合における利用可能性を増加または減少させる役割を果たす薬剤、およびＥｐｈＡ２の発現もしくは内在性ＥｐｈＡ２リガンド（好ましくはエフリンＡ１）との結合における利用可能性を増加または減少させる役割を果たす薬剤が包含される。
【０２３１】
４．３．１  アンチセンス
本発明は、ＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１アンチセンス核酸分子、すなわち、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１をコードしているセンス核酸のすべてもしくは一部に相補的な分子、二本鎖ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１  ｃＤＮＡ分子のコード鎖に相補的な分子、あるいはＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１  ｍＲＮＡ配列に相補的な分子を包含する。ＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１アンチセンス核酸分子は、たとえば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに開示されているヒトＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１  ｍＲＮＡ配列を用いて、当業者に知られている任意の方法によって産生することができる。
【０２３２】
具体的な実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４３１．２に開示されているヒトＥｐｈＡ２  ｍＲＮＡ配列を用いてＥｐｈＡ２アンチセンス核酸分子を産生し得る。ＥｐｈＡ２アンチセンス核酸分子の例は、たとえば、どちらもその全体が本明細書中に参照により組み込まれるCheng他、2002、MoI. Cancer Res. 1:2-1 1およびCarles-Kinch他、2002、Cancer Res. 62:2840-2847にも開示されている。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２アンチセンス核酸分子は、ヒトＥｐｈＡ２のコード鎖もしくはセンス鎖によってコードされているヒトＥｐｈＡ２の以下の領域：リガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、第１のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、第２のフィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン、チロシンキナーゼドメイン、またはＳＡＭドメイン、のうち任意のもの（もしくはその一部分）に相補的であってよい。
【０２３３】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２アンチセンス核酸分子は、５’−ＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＣＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＣＧＣＣＧ−３’（配列番号４０）および／または５’−ＧＣＣＧＣＧＴＣＣＣＧＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＡＣＣ−３’（配列番号４１）ではない。別の具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２アンチセンス核酸分子は、５’−ＣＣＡＧＣＡＧＴＡＣＣＧＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＧ−３’（配列番号４２）および／または５’−ＧＣＣＧＣＧＴＣＣＣＧＴＴＣＣＴＴＣＡＣＣＡＴＧＡＣＧＡＣＣ−３’（配列番号４３）ではない。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２アンチセンス核酸分子ではない。
【０２３４】
好ましい実施形態では、本発明のアンチセンスＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ヒトエフリンＡ１アンチセンス核酸分子である。具体的な実施形態では、ヒトエフリンＡ１アンチセンス核酸分子は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０３２６９８に開示されているヒトエフリンＡ１  ｍＲＮＡ配列を用いて製造し得る。エフリンＡ１アンチセンス核酸分子の例は、たとえば、その全体が参照により本明細書中に組み込まれるPotla他、2002、Cancer Lett. 175(2): 187-95に開示されている。具体的な実施形態では、本発明のエフリンＡ１アンチセンス核酸分子は、Potla他、2002、Cancer Lett. 175(2):187-95に開示されているエフリンＡ１アンチセンス核酸分子ではない。特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはエフリンＡ１アンチセンス核酸分子ではない。
【０２３５】
アンチセンス核酸はセンス核酸と水素結合することができる。アンチセンス核酸は、コード鎖の全体またはその一部分のみ、たとえば、タンパク質コード領域（もしくはオープンリーディングフレーム）のすべてまたは一部に相補的でありうる。アンチセンス核酸分子は、本発明のポリペプチドをコードしているヌクレオチド配列のコード鎖の非コード領域のすべてまたは一部に対してアンチセンスでありうる。非コード領域（「５’および３’非翻訳領域」）とは、アミノ酸に翻訳されない、コード領域に隣接する５’および３’配列である。
【０２３６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さは、たとえば、約５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５または５０個のヌクレオチドでありうる。本発明のアンチセンス核酸は、当分野で知られている手順を用いて、化学合成および酵素ライゲーション反応を用いて構築することができる。たとえば、アンチセンス核酸（たとえば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、または分子の生物学的安定性を増加させるかもしくはアンチセンス核酸とセンス核酸との間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるように設計された様々に修飾されたヌクレオチド（たとえば、ホスホロチオエート修飾されたもの）を用いて化学合成することができ、たとえば、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジンで置換したヌクレオチドを用いることができる。あるいは、アンチセンス核酸は、核酸をアンチセンス方向にサブクローニングした発現ベクターを用いて、生物学的に製造することができる（すなわち、挿入した核酸から転写されるＲＮＡは目的とする標的核酸、すなわちエフリンＡ１に対してアンチセンス方向のものとなる）。
【０２３７】
本発明のアンチセンス核酸分子は、典型的には、本発明の選択したポリペプチドをコードしている細胞ｍＲＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡにハイブリダイズまたは結合して、たとえば、転写および／あるいは翻訳を阻害することによって発現を阻害するように、被験体に投与するか、またはｉｎ  ｓｉｔｕで産生させる。ハイブリダイゼーションは、安定した二重鎖を形成する従来のヌクレオチド相補性によるものであるか、または、たとえば、ＤＮＡ二重鎖に結合するアンチセンス核酸分子の場合は、二重らせんの主溝中の特異的相互作用によるものでありうる。本発明のアンチセンス核酸分子の投与経路の例には、組織部位における直接注射が含まれる。あるいは、選択した細胞を標的とするようにアンチセンス核酸分子を修飾し、その後、全身投与することができる。たとえば、全身投与には、たとえば、アンチセンス核酸分子を細胞表面受容体もしくは抗原に結合するペプチドまたは抗体と連結させることによって、アンチセンス分子を、選択した細胞表面上で発現される受容体または抗原に特異的に結合するように修飾することができる。アンチセンス核酸分子は、本明細書中に記載のベクターを用いて細胞に送達することもできる。アンチセンス分子の十分な細胞内濃度を達成するためには、アンチセンス核酸分子が強力なｐｏｌ  ＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩＩプロモーターの調節下に置かれるベクター構築体が好ましい。
【０２３８】
本発明のアンチセンス核酸分子はα−アノマー核酸分子でありうる。α−アノマー核酸分子は相補的ＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、その場合、通常のβ−ユニットとは反対に、その鎖は互いに平行である（Gaultier他、1987、Nucleic Acids Res. 15:6625）。アンチセンス核酸分子はまた、２’−ｏ−メチルリボヌクレオチド（Inoue他、1987、Nucleic Acids Res. 15:6131）またはキメラＲＮＡ−ＤＮＡ類似体（Inoue他、＼9S7, FEBS Lett. 215:327）も含むことができる。
【０２３９】
４．３．２  ＲＮＡ干渉
特定の実施形態では、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子を用いてエフリンＡ１の発現を減少させる。他の実施形態では、ＲＮＡｉ分子を用いてＥｐｈＡ２の発現を減少させる。ＲＮＡｉとは、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）がそれ自身の配列に対応する遺伝子の発現を抑制する能力と定義される。ＲＮＡｉは、転写後遺伝子サイレンシングまたはＰＴＧＳとも呼ばれる。通常、細胞の細胞質中に見つかるＲＮＡ分子は一本鎖ｍＲＮＡの分子のみであるので、細胞は、ｄｓＲＮＡを認識し、２１〜２５塩基対（二重らせんで約２回転）を含む断片へと切断する酵素を有する。その断片のアンチセンス鎖はセンス鎖から十分に離れて、内在性細胞ｍＲＮＡ分子（たとえば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＣ０３２６９８のヒトエフリンＡ１  ｍＲＮＡ配列）上の相補的センス配列とハイブリダイズする。このハイブリダイゼーションは二本鎖領域中のｍＲＮＡの切断を誘導し、したがって、それがポリペプチドへと翻訳されないようにする。したがって、特定の遺伝子に対応するｄｓＲＮＡを導入することにより、特定の組織中におけるかつ／または選ばれた時点におけるその遺伝子の細胞自身の発現がノックアウトされる。
【０２４０】
二本鎖（ｄｓ）ＲＮＡを用いて、哺乳動物における遺伝子発現を妨害することができる（WiannyおよびZernicka-Goetz, 2000、Nature Cell Biology 2: 70-75；その全体が本明細書中に参照により組み込まれる）。ｄｓＲＮＡは、エフリンＡ１のヌル突然変異体と同じ表現型を生じさせるための、エフリンＡ１機能の阻害性ＲＮＡまたはＲＮＡｉとして用いる（WiannyおよびZernicka-Goetz, 2000、Nature Cell Biology 2 : 70-75）。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡをコードしているｄｓＤＮＡ（たとえば、ヘアピン構造として）を用いて、細胞中でＲＮＡｉ媒介ｄｓＤＮＡを発現させる。
【０２４１】
４．３．２  ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとしてのアプタマー
具体的な実施形態では、本発明は、ＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１のアプタマーを提供する。当分野で知られているように、アプタマーとは、特定の分子標的（たとえば、本明細書中に記載のＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１タンパク質、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチドおよび／またはＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１エピトープ）に強固に結合する核酸（たとえば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）からなる高分子である。個々のアプタマーは、直鎖状ヌクレオチド配列によって記載することができ、典型的には約１５〜６０個のヌクレオチド長である。アプタマー中のヌクレオチド鎖は、その分子を複雑な三次元形状に折り畳む分子内相互作用を形成し、この三次元形状により、アプタマーがその標的分子の表面に強固に結合することが可能となる。すべての可能性のあるヌクレオチド配列の世界に存在する分子形状の並外れた多様性を考えると、タンパク質および小分子を含めた多様な分子標的に対してアプタマーが得られ得る。高い特異性に加えて、アプタマーはその標的に対して非常に高い親和性を有する（たとえば、タンパク質ではピコモルから低ナノモルの範囲の親和性）。アプタマーは化学的に安定しており、失活させずに沸騰または凍結することができる。これらは合成分子であるので様々な修飾を受け入れることができ、これにより、特定の用途のためにそれらの機能を最適化することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏ用途では、血液中の酵素による分解に対する感度が劇的に低減するようにアプタマーの修飾を行うことができる。さらに、アプタマーの修飾を用いて、その体内分布または血漿滞留時間を変更することもできる。
【０２４２】
ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１またはその断片に結合することができるアプタマーの選択は、当分野で知られている方法によって達成することができる。たとえば、ＳＥＬＥＸ（指数的富化によるリガンドの体系的進化）法（その全体が参照により本明細書中に組み込まれるTuerkおよびGold、1990、Science 249:505-510）を用いてアプタマーを選択することができる。ＳＥＬＥＸ方法では、標的分子（たとえば、本明細書中に記載のＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１タンパク質、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチドおよび／またはＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１エピトープあるいはその断片）を用いて、核酸分子の大きなライブラリー（たとえば、１０１５種の異なる分子）の作製および／またはスクリーニングを行う。標的分子を一定期間の間、ヌクレオチド配列のライブラリーと共にインキュベーションする。その後、いくつかの方法を用いてアプタマー標的分子を混合物中の未結合の分子から物理的に単離することができ、未結合の分子を廃棄することができる。その後、標的分子に対して最も高い親和性を有するアプタマーを標的分子から精製分離し、酵素的に増幅して、標的分子に結合することができるアプタマーが実質的に富化されている新しい分子ライブラリーを生じることができる。その後、富化されたライブラリーを用いて、選択、分離、および増幅の新しいサイクルを開始することができる。この選択、分離および増幅のプロセスを５〜１５サイクル行った後には、ライブラリーは、標的分子に強固に結合する少数のアプタマーまで減少している。その後、混合物中の個々の分子を単離し、それらのヌクレオチド配列を決定し、結合親和性および特異性に関するそれらの特性を測定ならびに比較することができる。その後、単離したアプタマーをさらに精製して、標的結合および／またはアプタマー構造（すなわち、そのコア結合ドメインにまで末端切断されたアプタマー）に寄与しないすべてのヌクレオチドを排除することができる。アプタマー技術の総説には、たとえば、その教示全体が本明細書中に参照により組み込まれるJayasena、1999、Clin. Chem. 45:1628-1650を参照されたい）。
【０２４３】
特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、本発明の抗体について本明細書中に記載の結合特異性および／または機能的活性を有する。したがって、たとえば、特定の実施形態では、本発明は、本発明の抗体について本明細書中に記載したのと同じかまたは同様の結合特異性を有するアプタマーに向けられている（たとえば、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチド、脊椎動物のＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチドの断片、脊椎動物のＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチドのエピトープ領域（たとえば、本発明の抗体によって結合されるＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１のエピトープ領域）に対する結合特異性）。特定の実施形態では、本発明のアプタマーは、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１ポリペプチドに結合して、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１ポリペプチドの１つもしくは複数の活性を阻害することができる。
【０２４４】
４．４  ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとしてのワクチン
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１ワクチンである。本明細書中で用いる用語「ＥｐｈＡ２ワクチン」は、ＥｐｈＡ２を発現する細胞に対する免疫応答を誘発または媒介する、任意の試薬でありうる。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２ワクチンは、本発明のＥｐｈＡ２抗原ペプチド、ＥｐｈＡ２抗原ペプチドの発現運搬体（たとえば、裸核酸またはウイルスもしくは細菌ベクターまたは細胞）（たとえば、ＥｐｈＡ２抗原ペプチドを送達する）、あるいは本発明のＥｐｈＡ２抗原ペプチドで予備刺激したＴ細胞もしくは抗原提示細胞（たとえば、樹状細胞もしくはマクロファージ）である。本明細書中で用いる用語「ＥｐｈＡ２抗原ペプチド」および「ＥｐｈＡ２抗原ポリペプチド」とは、ＥｐｈＡ２の１つもしくは複数のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含む、ＥｐｈＡ２ポリペプチドまたはその断片、類似体、もしくは誘導体をいう。ＥｐｈＡ２ポリペプチドは任意の種由来であり得る。特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドとは、ＥｐｈＡ２の成熟したプロセッシングされた形態をいう。他の実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドとは、ＥｐｈＡ２の未成熟形態をいう。ＥｐｈＡ２ワクチンの説明については、たとえば、それぞれその全体が参照により本明細書中に組み込まれる2004年3月26日出願の米国仮出願第60/556,601号、題名「ＥｐｈＡ２ワクチン（EphA2 Vaccines）」；2004年8月18日出願の米国仮出願第＿＿＿、題名「ＥｐｈＡ２ワクチン（EphA2 Vaccines）」（代理人整理番号第１０２７１−１３６−８８８号）；2004年10月1日出願の米国仮出願第＿＿＿、題名「ＥｐｈＡ２ワクチン（EphA2 Vaccines）」（代理人整理番号第１０２７１−１４３−８８８号）；および2004年10月7日出願の米国仮出願第＿＿＿、題名「ＥｐｈＡ２ワクチン（EphA2 Vaccines）」（代理人整理番号第１０２７１−１４８−８８８号）を参照されたい。
【０２４５】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはエフリンＡ１ワクチンである。本明細書中で用いる用語「エフリンＡ１ワクチン」は、エフリンＡ１を発現する細胞上のエフリンＡ１に対する免疫応答を誘発または媒介する、任意の試薬でありうる。特定の実施形態では、エフリンＡ１ワクチンは、本発明のエフリンＡ１抗原ペプチド、エフリンＡ１抗原ペプチドの発現運搬体（たとえば、裸核酸またはウイルスもしくは細菌ベクターまたは細胞）（たとえば、エフリンＡ１抗原ペプチドを送達する）、あるいは本発明のエフリンＡ１抗原ペプチドで予備刺激したＴ細胞もしくは抗原提示細胞（たとえば、樹状細胞もしくはマクロファージ）である。本明細書中で用いる用語「エフリンＡ１抗原ペプチド」および「エフリンＡ１抗原ポリペプチド」とは、エフリンＡ１の１つもしくは複数のＢ細胞エピトープまたはＴ細胞エピトープを含む、エフリンＡ１ポリペプチドまたはその断片、類似体、もしくは誘導体をいう。エフリンＡ１ポリペプチドは任意の種由来であり得る。特定の実施形態では、エフリンＡ１ポリペプチドとは、エフリンＡ１の成熟したプロセッシングされた形態をいう。他の実施形態では、ＥｐｈＡ２ポリペプチドとは、エフリンＡ１の未成熟形態をいう。
【０２４６】
したがって、本発明は、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１を過剰発現する細胞に対する細胞性免疫応答、液性応答、またはその両方を誘発あるいは媒介することができるＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１抗原ペプチドを発現するＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原ペプチド発現運搬体である、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターに基づく薬剤を提供する。免疫応答が細胞性免疫応答である場合は、Ｔｃ、ＴｈＩまたはＴｈ２免疫応答でありうる。好ましい実施形態では、免疫応答はＴｈ２細胞性免疫応答である。別の好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１抗原ペプチド発現運搬体によって発現されるＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１抗原ペプチドは、細胞外マトリックス成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、テネイシン、フィブロネクチン）の沈着の増加および／もしくは異常な（たとえば、増加した）血管形成に関連する疾患または障害に関与するＥｐｈＡ２ならびに／あるいはエフリンＡ１を発現する細胞に対する免疫応答を誘発することができる、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１抗原ペプチドである。そのような障害の非限定的な例には、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬が含まれる。
【０２４７】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原発現運搬体は、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原ペプチドを発現する微生物である。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原発現運搬体は、弱毒化した細菌である。細菌の非限定的な例には、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）が含まれ、また、ライム病菌（Borrelia burgdorferi）、マルタ熱菌（Brucella melitensis）、大腸菌（Escherichia coli）、侵入性大腸菌（enteroinvasive Escherichia coli）、在郷軍人病菌（Legionella pneumophila）、チフス菌（Salmonella typhi）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、赤痢菌属菌（Shigella）、連鎖球菌属菌（Streptococcus）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、エルシニア・エンテロコーチカ（Yersinia enterocohtica）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、トリ結核菌（Mycobacterium avium）、ウシ結核菌（Mycobacterium bovis）、ヒト結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ＢＣＧ、マイコプラズマ・ホミニス（Mycoplasma hominis）、リケッチア・クインターナ（Rickettsiae quintana）、クリプトコッカス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、ニューモシスチス・カルニ（Pneumocystis carnii）、アイメリア・アセルブリナ（Eimeria acervulina）、イヌネオスポラ（Neospora caninum）、熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、サルコシスチス・スイホミニス（Sarcocystis suihominis）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、アマゾンリーシュマニア（Leishmania amazonensis）、森林型熱帯リーシュマニア（Leishmania major）、メキシコリーシュマニア（Leishmania mexacana）、レプトモナス・カリオフィラス（Leptomonas karyophilus）、フィトモナス属菌（Phytomonas）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、エンセファートゾーン・クニクリ（Encephahtozoon cuniculi）、ノゼマ・ヘルミンソーラム（Nosema helminthorum）、ウニカリヨン・レゲリ（Unikaryon legeri）が含まれるがそれらに限定されない。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターワクチンはリステリア菌（Listeria）に基づくものである。本明細書中で用いるように、リステリア菌（Listeria）に基づくワクチンはＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原ペプチドを発現する。さらなる実施形態では、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原ペプチドを発現するリステリア菌（Listeria）に基づくワクチンは弱毒化されている。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターワクチンはリステリア菌（Listeria）に基づくものでもＥｐｈＡ２に基づくものでもない。
【０２４８】
別の実施形態では、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原ペプチド発現運搬体は、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原ペプチドを発現するウイルスである。ウイルスの非限定的な例には、ＲＮＡウイルス（たとえば、一本鎖ＲＮＡウイルスおよび二本鎖ＲＮＡウイルス）、ＤＮＡウイルス（たとえば、二本鎖ＤＮＡウイルス）、エンベロープウイルス、ならびに非エンベロープウイルスが含まれる。ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原ペプチド発現運搬体として有用なウイルスの他の非限定的な例には、レトロウイルス（それだけには限定されないがレンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルスが含まれる。ヒト被験体への投与に好ましいウイルスは弱毒化ウイルスである。ウイルスは、たとえば、ウイルスを紫外線照射もしくは化学突然変異原などの突然変異原に被爆させることによって、多重継代および／もしくは非許容宿主中での継代によって、ならびに／またはウイルスの毒性および病原性が低減するようにウイルスを遺伝的に変更することによって、弱毒化することができる。
【０２４９】
微生物は、当分野で周知のいくつかの技術によって作製することができる。たとえば、微生物の抗生物質感受性株を選択することができ、微生物を突然変異させることができ、毒性因子を欠く突然変異体を選択することができ、細胞壁リポ多糖が変更された新しい微生物株を構築することができる。特定の実施形態では、微生物は、宿主細胞中、特にマクロファージおよび好中球での微生物の生存を確実にする毒性因子をコードしているＤＮＡ配列を、たとえば、相同組換え技術および化学的もしくはトランスポゾン突然変異誘発によって欠失させるかまたは破壊することによって、弱毒化することができる。すべてではないが、これらの研究された毒性因子の多くがマクロファージ中での生存に関連しており、これらの因子はストレス、たとえば、酸性化が原因で、マクロファージ内で特異的に発現され、また特異的な宿主細胞応答、たとえば、マクロピノサイトーシスを誘導するために用いられる。Fields他、1986、Proc. Natl. Acad. ScL USA 83:5189-5193。細菌毒性因子には、たとえば、細胞溶解素；デフェンシン耐性座位；ＤＮＡ  Ｋ；線毛；ＧｒｏＥＬ；ｉｎｖ座位；リポタンパク質；ＬＰＳ；リソソーム融合阻害；マクロファージ生存座位；酸化的ストレス応答座位；ｐｈｏ座位（たとえば、ＰｈｏＰおよびＰｈｏＱ）；ｐｈｏ活性化遺伝子（ｐａｇ；たとえば、ｐａｇＢおよびｐａｇＣ）；ｐｈｏＰおよびｐｈｏＱにより制御される遺伝子（ｐｒｇ）；ポリン；血清耐性ペプチド；毒性プラスミド（ｓｐｖＢ、ｔｒａＴおよびｔｙ２など）が含まれる。
【０２５０】
微生物を弱毒化させるさらに別の方法は、その微生物の毒性を司っている微生物の置換基を修飾することである。たとえば、細菌性敗血症の病理的効果の主な原因はリポ多糖（ＬＰＳ）または内毒素である。この応答をもたらすＬＰＳの成分は脂質Ａ（ＬＡ）である。ＬＡの毒性効果の排除または緩和により、１）患者における敗血症性ショックの危険性が低減され、２）細菌ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１抗原ペプチド発現運搬体をより高レベルで許容することができるので、弱毒化した細菌がもたらされる。
【０２５１】
ロドバクター（Rhodobacter）（ロドシュードモナス（Rhosopseudomonas））・スフェロイデス（sphaeroides）およびロドバクター・カプスラータ（Rhodobacter capsulatus）はそれぞれ、実験動物において敗血症性ショック応答を誘発せず、さらには内毒素アンタゴニストであるモノホスホリル脂質Ａ（ＭＬＡ）を保有する。Loppnow他、1990、Infect. Immun. 58:3743-3750；Takayma他、1989、Infect. Immun. 57:1336-1338。ロドバクター（Rhodobacter）以外のグラム陰性細菌を遺伝的に変更してＭＬＡを産生させ、それにより、敗血症性ショックを誘発させるその可能性を低減させることができる。
【０２５２】
細菌のＬＰＳを変更するためのさらに別の例は、ＬＰＳ生合成経路中に突然変異を導入することを含む。いくつかの細菌において、ＬＰＳ生合成中のいくつかの酵素的ステップ、およびそれらを調節する遺伝子座位が同定されており、ＬＰＳ経路中に遺伝的および酵素的病変を有するいくつかの突然変異細菌株が単離されている。特定の実施形態では、ＬＰＳ経路突然変異体はｆｉｒＡ突然変異体である。ｆｉｒＡは、内毒素生合成の第３のステップを制御する酵素ＵＤＰ−３−Ｏ（Ｒ−３０ヒドロキシミリストイル）−グリコシアミンＮ−アシルトランスフェラーゼをコードしている遺伝子である（Kelley他、1993、J Biol. Chem. 268:19866-19874）。
【０２５３】
弱毒化された表現型を保証し、非弱毒化表現型への復帰を回避する方法として、複数の様式で、たとえば、脂質Ａ産生の経路中の突然変異と、ウラシル生合成、プリン生合成、およびアルギニン生合成などの１つもしくは複数の栄養素または代謝物に対する栄養要求性に対する１つあるいは複数の突然変異とで弱毒化されるように細菌の遺伝子操作を行い得る。
【０２５４】
ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１抗原ペプチドは、異種遺伝子発現カセットを用いて細菌などの微生物中で発現されることが好ましい。異種遺伝子発現カセットは、典型的には以下の順序のエレメントからなる：（１）原核プロモーター；（２）シャイン−ダルガノ配列；（３）分泌シグナル（シグナルペプチド）；および（４）異種遺伝子。場合により、細菌染色体内に安定して組み込ませる構築体には、異種遺伝子発現カセットは転写終結配列も含み得る。必要ではないが、異種遺伝子発現カセット中の最後の順序のエレメントとして転写終結配列を含めることにより、読み過ごし転写による隣接遺伝子の発現の制御に対する極性効果を予防し得る。
【０２５５】
微生物ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１ワクチン内に導入する発現ベクターは、微生物によって産生したＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１ペプチドおよび任意選択でプロドラッグ変換酵素が、微生物によって分泌されるように設計されていることが好ましい。いくつかの細菌分泌シグナルが当分野で周知であり、本発明の組成物および方法で用い得る。本発明の特定の実施形態では、抗生物質に対してより感受性を有する、かつ／または化合物を投与した際に細胞死を受けるように、細菌ＥｐｈＡ２抗原ペプチド発現運搬体を遺伝子操作する。本発明の他の実施形態では、標的のＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１を発現する細胞に自殺遺伝子を送達するために、細菌ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１抗原ペプチド発現ビヒクルの遺伝子操作を行う。これらの自殺遺伝子としては、単純ヘルペスチミジンキナーゼ（ＴＫ）および細菌シトシン脱アミノ酵素（ＣＤ）などのプロドラッグ変換酵素が含まれる。ＴＫは、無毒性の基質であるアシクロビルおよびガンシクロビルをリン酸化し、ゲノムＤＮＡ内にそれらを取り込ませることにより、それらに毒性を与える。ＣＤは、無毒性の５−フルオロシトシン（５−ＦＣ）を、ＲＮＡ内に取り込まれることにより毒性となる５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）へと変換する。本発明に包含されるプロドラッグ変換酵素のさらなる例には、マイトマイシンＣおよびポルフィロマイシンに作用するチトクロームｐ４５０  ＮＡＤＰＨ酸化還元酵素が含まれる（Murray他、1994、J Pharmacol. Exp. Therapeut. 270:645-649）。使用し得る他の例示的なプロドラッグ変換酵素には、カルボキシペプチダーゼ；β−グルクロニダーゼ；ペニシリン−Ｖ−アミダーゼ；ペニシリン−Ｇ−アミダーゼ；β−ラクタマーゼ；β−グルコシダーゼ；ニトロ還元酵素；およびカルボキシペプチダーゼＡが含まれる。
【０２５６】
グラム陽性微生物で用いることができる例示的な分泌シグナルには、ＳｅｃＡ（Sadaie他、1991、Gene 98:101-105）、ＳｅｃＹ（Suh他、1990、MoI. Microbiol. 4:305-314）、ＳｅｃＥ（Jeong他、1993、MoI. Microbiol. 10:133-142）、ＦｔｓＹおよびＦｆＨ（PCT/NL 96/00278号）、ならびにＰｒｓＡ（国際公開公報第WO 94/19471）が含まれる。グラム陰性微生物で用い得る例示的な分泌シグナルには、ＳｅｃＢおよび熱ショックタンパク質などの可溶性細胞質タンパク質のもの；表在性膜関連タンパク質ＳｅｃＡのもの；ならびに内在性膜タンパク質ＳｅｃＹ、ＳｅｃＥ、ＳｅｃＤおよびＳｅｃＦのものが含まれる。
【０２５７】
ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１抗原ペプチドおよび場合によりプロドラッグ変換酵素の発現を駆動するプロモーターは、ペプチドもしくは酵素が連続的に発現されるように構成的であっても、ペプチドもしくは酵素が誘発分子の存在下でのみ発現されるように誘発性であっても、またはペプチドもしくは酵素が特定の細胞種でのみ発現されるように細胞種特異的調節であってもよい。たとえば、適切な誘導性プロモーターは、細菌の「ＳＯＳ」応答を司っているプロモーターでありうる（Friedberg他、DNA Repair and Mutagenesis、ページ407-455、Am. Soc. Microbiol. Press、1995）。そのようなプロモーターは、ヒトでの使用が承認されているマイトマイシンなどの化学療法アルキル化剤（Oda他、1985、Mutation Research 147:219-229；Nakamura他、1987、Mutation Res. 192:239-246；Shimda他、1994、Carcinogenesis 15:2523-2529）を含めた多数の薬剤によって誘導可能である。この群に属するプロモーターエレメントには、ｕｍｕＣ、ｓｕｌＡなどが含まれる（Shinagawa他、1983、Gene 23: 167-1 74；Schnarr他、1991、Biochemie 73:423-431）。ｓｕｌＡプロモーターには、ｓｕｌＡ遺伝子のＡＴＧおよびそれに続く２７個のヌクレオチド、ならびにＡＴＧの上流の７０個のヌクレオチドが含まれる（Cole、1983、Mol. Gen. Genet. 189:400-404）。したがって、これは、外来遺伝子の発現および開始コドンを欠く配列の遺伝子融合体の作製のどちらにも有用である。
【０２５８】
特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターワクチンは、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原ペプチド発現運搬体として細菌を含まない。他の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはＥｐｈＡ２ワクチンおよび／またはエフリンＡ１ワクチンではない。さらに他の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、単独のＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１抗原ペプチド（すなわち発現運搬体なし）ではない。
【０２５９】
４．５  予防／治療方法
本発明は、１つもしくは複数のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターまたは本発明の細胞増殖刺激剤を投与することを含む、被験体におけるＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチン）の沈着の増加および／もしくは異常な血管形成に関連する障害を含むがそれだけに限定はされない非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害を治療、管理、あるいは予防する方法を提供する。そのような障害の非限定的な例には、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬が含まれる。本発明はまた、１つもしくは複数のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターおよび１つもしくは複数の他の治療（そのような治療の例には、下記セクション４．５．２を参照）を投与することを含む、非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害を治療、管理あるいは予防する方法も提供する。好ましくは、そのような他の治療は、ＥＣＭ成分の沈着の増加に関連する障害および異常な血管形成に関連する障害を含むがそれだけに限定はされない非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／または内皮細胞障害の治療、管理、あるいは予防に有用である。具体的な実施形態では、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症ならびに乾癬の治療、予防もしくは管理に有用な、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター以外の治療を、本発明によるＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１モジュレーターと組み合わせて用いる。
【０２６０】
本明細書中に提供する投与の用量および頻度は、有効量、治療上有効および予防上有効という用語の範囲に包含される。用量および頻度はさらに、典型的には、投与する特定の治療剤または予防剤、非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害の重篤度や種類、投与経路、ならびに患者の年齢、体重、応答、および過去の病歴に応じて、各患者に特異的な要素に依存して変化する。適切なレジメンは、そのような要素を考慮することによって、および、たとえば、文献中に報告され、Physician 's Desk Reference (第58版、2004)に推奨される用量に従うことによって、当業者が選択することができる。本発明によって提供される予防剤および治療剤の具体的な投与の用量ならびに頻度には、セクション４．７．３を参照されたい。
【０２６１】
４．５．１  患者集団
本発明は、１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを投与することを含む、被験体における非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害、その症状を治療、管理、または予防する方法を包含する。被験体、好ましくは、非霊長類（たとえば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、犬、ラットなど）および霊長類（たとえば、カニクイザルなどのサル、およびヒト）などの哺乳動物である。具体的な実施形態では、被験体は非ヒト動物である。好ましい実施形態では、被験体はヒトである。
【０２６２】
本発明の方法は、１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは細胞障害を患っている、またはそれを患うと予測される患者（たとえば、その遺伝的素因を有する患者もしくは以前にそれに罹患していた患者）に投与することを含む。そのような患者は、たとえば、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターでない治療を用いて、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害を以前に治療したことがあってもよいし、または現在治療していてもよい。本発明によれば、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、それだけには限定されないが、第１、第２、第３および第４の一連の治療を含めた任意の一連の治療として用い得る。さらに、本発明によれば、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターでない治療の任意の有害作用または不忍容性が起こる前に用いることができる。本発明は、それだけには限定されないが、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬を含めた非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害の発症または再発を予防するために、１つもしくは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを投与する方法を包含する。
【０２６３】
一実施形態では、本発明はまた、現在の治療の代替治療として非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞または障害を治療あるいは管理する方法も提供する。具体的な実施形態では、現在の治療は患者にとって毒性が強すぎる（すなわち、許容できないもしくは耐えられない副作用をもたらす）と判明しているものであるか、または判明し得るものである。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、現在の治療と比較して副作用を減少させる。別の実施形態では、患者は現在の治療に不応性であると判明している。そのような実施形態では、本発明は、任意の他の非新生物性過剰増殖性の細胞または過剰細胞蓄積障害の治療なしで、１つもしくは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを投与することを提供する。特定の実施形態では、非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害を治療するために、１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、それを必要としている患者に、別の治療の代わりに投与することができる。
【０２６４】
本発明はまた、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターでない治療に不応性であるかもしくは不応性となった患者において、非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害の症状を治療あるいは改善するために、１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを投与する方法も包含する。症状が不応性であるかどうかの判断は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害中の罹患した細胞、特に上皮および／もしくは内皮細胞、またはＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターでない治療に不応性であるかもしくは不応性となった患者に対する、治療の有効性のアッセイを行うための当分野で知られている任意の方法によって、ｉｎ  ｖｉｖｏあるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏのどちらかによって行うことができる。
【０２６５】
４．５．２  他の予防剤／治療剤
本発明は、１つもしくは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを１つもしくは複数の治療と組み合わせて投与することによって、非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害を治療、管理あるいは予防する方法を提供する。好ましくは、これらの他の治療は、現在使用されている、あるいは非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の治療、管理または予防に有用である。具体的な実施形態では、本発明は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害を治療、管理または予防する方法であって、それを必要としている被験体に、有効量のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター以外の有効量の治療とを投与することを含む方法を提供する。非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害またはその症状の予防、管理、治療あるいは改善に有用であることが知られているか、使用されてきたか、現在使用されている任意の治療（たとえば、予防剤もしくは治療剤）を、本明細書中に記載の本発明に従ってＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと組み合わせて用いることができる。非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害またはその症状を予防、治療、管理、ならびに／または改善するために使用されてきた、あるいは現在使用されている治療、具体的には予防剤または治療剤に関する情報については、たとえば、Gilman他、Goodman and Gilman's: The Pharmacological Basis of Therapeutics、第10版、McGraw-Hill、New York、2001；The Merck Manual of Diagnosis and Therapy、Berkow, M.D.他編、第17版、Merck Sharp & Dohme Research Laboratories、ニュージャージー州Rahway、1999；ならびにCecil Textbook of Medicine、第20版、BennettおよびPlum編、W.B. Saunders、Philadelphia、1996を参照されたい。治療剤または予防剤には、それだけには限定されないが、小分子、合成薬、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、核酸（たとえば、それだけには限定されないがアンチセンスヌクレオチド配列、三重らせん、ＲＮＡｉ、生物活性のあるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドをコードしているヌクレオチド配列を含めたＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチド）、抗体、合成または天然無機分子、模倣薬剤、ならびに合成または天然有機分子が含まれる。予防剤および治療剤の例には、それだけには限定されないが、免疫調節剤、抗炎症剤（たとえば、副腎コルチコイド、コルチコステロイド、（たとえば、ベクロメタゾン、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニソロン、プレドニソロン、プレドニソン、ヒドロコルチゾン）、糖質コルチコイド、ステロイドおよび非ステロイド性抗炎症薬（たとえば、アスピリン、イブプロフェン、ジクロフェナク、およびＣＯＸ−２阻害剤）、抗コリン剤（たとえば、臭化イプラトロピウムおよび臭化オキシトロピウム）、スルファサラジン、ペニシラミン、ダプソン、抗ヒスタミン、抗マラリア剤（たとえば、ヒドロキシクロロキン）、抗ウイルス剤、ならびに抗生物質（たとえば、ダクチノマイシン（以前はアクチノマイシン）、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ペニシリン、ミトラマイシン、およびアンスラマイシン（ＡＭＣ））が含まれる。
【０２６６】
一実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、それを必要としている被験体に、現在使用されている、あるいは硬変および／もしくは線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）を治療、管理、予防ならびに／または改善することが知られている治療と組み合わせて、投与する。具体的な実施形態では、非新生物性の上皮および／または内皮細胞障害は肺線維症であり、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターでない治療は、たとえば、ＣｏｎＸｎ（商標）などの組換えヒトリラキシン、メチルプレドニゾロン、シクロホスファミド、コルチコステロイド、アザチオプリン、シクロホスファミド、ペニシラミン、コルヒチン、シクロスポリン、プレドニゾリン、ピルフェニドン、ＴＧＦ−β阻害剤、ＩＮＦ−γ、ＴＮＦ−αアンタゴニスト、抗血管形成因子（たとえば、ＩＰ−１０）、アンジオテンシン−変換酵素阻害剤、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、Ｎ−アセチルシステイン、および／またはエンドセリン受容体アンタゴニストである。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎および／もしくは乾癬を治療、管理、予防ならびに／または改善するために現在使用されているかまたは知られている治療と組み合わせて投与する。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、それを必要としている被験体に、免疫調節剤と組み合わせて投与する。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、それを必要としている被験体に、抗炎症剤と組み合わせて投与する。別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、それを必要としている被験体に、抗血管形成剤と組み合わせて投与する。さらに別の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、それを必要としている被験体に、ＴＮＦ−αアンタゴニストと組み合わせて投与する。
【０２６７】
その治療は、それを必要としている被験体に逐次的または同時に投与することができる。具体的には、その治療は、その治療が一緒に作用して、それ以外の方法で投与した場合と比べて増加した利点を提供することができるように、完全に同時に、または一定時間間隔以内に順番に、被験体に投与すべきである。具体的な実施形態では、本発明の併用療法は、有効量の１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと、本発明の前記ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと同じ作用機構を有する、有効量の少なくとも１つの他の治療とを含む。具体的な実施形態では、本発明の併用療法は、有効量の１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと、前記本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとは異なる作用機構を有する、有効量の少なくとも１つの他の治療（たとえば、予防剤または治療剤）とを含む。特定の実施形態では、本発明の併用療法は、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと一緒に機能して相加または相乗効果を有することによって、１つまたは複数の本発明の抗体の予防的または治療的効果を向上させる。特定の実施形態では、本発明の併用療法は、予防剤または治療剤に関連する副作用を低減させる。様々な実施形態では、１時間未満の間隔、約１時間の間隔、約１時間〜約２時間の間隔、約２時間〜約３時間の間隔、約３時間〜約４時間の間隔、約４時間〜約５時間の間隔、約５時間〜約６時間の間隔、約６時間〜約７時間の間隔、約７時間〜約８時間の間隔、約８時間〜約９時間の間隔、約９時間〜約１０時間の間隔、約１０時間〜約１１時間の間隔、約１１時間〜約１２時間の間隔、２４時間以下の間隔または４８時間以下の間隔で、治療を患者に投与する。好ましい実施形態では、２つ以上の治療を１回の患者来院で投与する。
【０２６８】
併用療法の予防剤または治療剤は、同じ医薬組成物中で被験体、好ましくはヒト被験体に投与することができる。あるいは、併用療法の予防剤または治療剤は、個別の医薬組成物中で被験体に同時に投与することができる。予防剤または治療剤は、同じまたは異なる投与経路によって被験体に投与し得る。
【０２６９】
具体的な実施形態では、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害またはその症状を予防、治療、管理ならびに／または改善するために、本明細書中に記載の１つもしくは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを含む医薬組成物を、被験体、好ましくはヒトに投与する。本発明によれば、本発明の医薬組成物は、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に関連する１つもしくは複数の症状の予防、治療または改善に現在使用されているか、使用されてきたか、あるいは有用であることが分かっている本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター以外の１つもしくは複数の治療（たとえば、予防剤または治療剤）も含み得る。
【０２７０】
４．５．２．１  免疫調節治療
特定の実施形態では、本発明は、１つまたは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターおよび１つまたは複数の免疫調節剤（すなわち、被験体において免疫応答を調節する薬剤）を含む組成物、ならびに、前記組成物を投与することを含む、被験体において非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害（たとえば、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬）またはその症状を治療、管理あるいは予防する方法を提供する。本発明はまた、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、１つまたは複数の免疫調節剤と組み合わせて投与することを含む、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害またはその症状を治療、管理あるいは予防する方法も提供する。本発明の具体的な実施形態では、免疫調節剤はヒト被験体において免疫応答を阻害または抑制する。免疫調節剤は当業者に周知であり、本発明の方法および組成物で用いることができる。
【０２７１】
当業者に周知の任意の免疫調節剤を本発明の方法および組成物で用い得る。免疫調節剤は、被験体において免疫応答の１つもしくは複数またはすべての態様に影響を与えることができる。免疫応答の態様には、それだけには限定されないが、炎症反応、補体カスケード、白血球やリンパ球の分化、増殖、および／またはエフェクター機能、リンパ球、単球および／または好塩基球の数、ならびに免疫系の細胞間の細胞連絡が含まれる。本発明の特定の実施形態では、免疫調節剤は免疫応答の１つの態様を調節する。他の実施形態では、免疫調節剤は、免疫応答の複数の態様を調節する。本発明の好ましい実施形態では、免疫調節剤を被験体に投与することにより、被験体の免疫応答能力の１つもしくは複数の態様が阻害または低減される。本発明の具体的な実施形態では、免疫調節剤は、被験体において免疫応答を阻害または抑制する。本発明によれば、免疫調節剤は、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体ではない。特定の実施形態では、免疫調節剤は抗炎症剤ではない。特定の実施形態では、免疫調節剤は抗血管形成剤ではない。他の実施形態では、免疫調節剤はＴＮＦαアンタゴニストではない。特定の実施形態では、免疫調節剤は化学療法剤である。特定の実施形態では、免疫調節剤は化学療法剤ではない。
【０２７２】
免疫調節剤の例には、それだけには限定されないが、サイトカイン、ペプチド模倣体、および抗体（たとえば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、ＦａｂもしくはＦ（ａｂ）２断片またはエピトープ結合断片）などのタンパク性薬剤、核酸分子（たとえば、アンチセンス核酸分子および三重らせん）、小分子、有機化合物、ならびに無機化合物が含まれる。具体的には、免疫調節剤には、それだけには限定されないが、メトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、サイトキサン、イムラン、シクロスポリンＡ、ミノサイクリン、アザチオプリン、抗生物質（たとえば、ＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルプレドニゾロン（ＭＰ）、コルチコステロイド、ステロイド、ミコフェノール酸モフェチル、ラパマイシン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルグアリン、ブレキナール、マロノニトリロアミド（たとえば、レフルナミド）、Ｔ細胞受容体モジュレーター、サイトカイン受容体モジュレーター、およびモジュレーター肥満細胞モジュレーターが含まれる。
【０２７３】
具体的な実施形態では、免疫調節剤はＴ細胞受容体モジュレーターである。本明細書中で用いる用語「Ｔ細胞受容体モジュレーター」とは、Ｔ細胞受容体のリン酸化、Ｔ細胞受容体に関連するシグナル伝達経路の活性化および／またはサイトカインなどのＴ細胞受容体の活性に関連する特定のタンパク質の発現を調節する薬剤をいう。そのような薬剤は、Ｔ細胞受容体のリン酸化、および／もしくはサイトカインなどのＴ細胞受容体の活性に関連する特定のタンパク質の発現を、直接または間接的に調節し得る。Ｔ細胞受容体モジュレーターの例には、それだけには限定されないが、抗Ｔ細胞受容体抗体（たとえば、抗ＣＤ４抗体（たとえば、ｃＭ−Ｔ４１２（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）、ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１（登録商標）（ＩＤＥＣおよびＳＫＢ）、ｍＡＢ４１６２Ｗ９４、ＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅおよびＯＫＴｃｄｒ４ａ（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ））、抗ＣＤ３抗体（たとえば、Ｎｕｖｉｏｎ（Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ）、ＯＫＴ３（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、またはキメラ抗ＣＤ２０  ＩｇＧ１抗体であるＲＩＴＵＸＡＮ（商標）（ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍ／Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、Ｒｏｃｈｅ／Ｚｅｔｔｙａｋｕ）、抗ＣＤ５抗体（たとえば、抗ＣＤ５リシン連結イムノコンジュゲート）、抗ＣＤ７抗体（たとえば、ＣＨＨ−３８０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、抗ＣＤ８抗体、抗ＣＤ４０リガンドモノクローナル抗体（たとえば、ＩＤＥＣ−１３１（ＩＤＥＣ））、抗ＣＤ５２抗体（たとえば、ＣＡＭＰＡＴＨ  ＩＨ（Ｉｌｅｘ））、抗ＣＤ２抗体（たとえば、シプリズマブ（Medlmmune, Inc.、国際公開公報第WO 02/098370号および第WO 02/069904号））、抗ＣＤＩＩａ抗体（たとえば、Ｘａｎｅｌｉｍ（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））、抗Ｂ７抗体（たとえば、ＩＤＥＣ−１１４）（ＩＤＥＣ）））、ＣＴＬＡ４−免疫グロブリン、およびＬＦＡ−３ＴＩＰ（Biogen、国際公開公報第WO 93/08656号および米国特許第6,162,432号）が含まれる。具体的な実施形態では、Ｔ細胞受容体モジュレーターはシプリズマブである（Medlmmune, Inc.、国際公開公報第WO 02/098370号および第WO 02/069904号）。
【０２７４】
具体的な実施形態では、免疫調節剤はサイトカイン受容体モジュレーターである。本明細書中で用いる用語「サイトカイン受容体モジュレーター」とは、サイトカイン受容体のリン酸化、サイトカイン受容体に関連するシグナル伝達経路の活性化、および／またはサイトカインもしくはサイトカイン受容体などの特定のタンパク質の発現を調節する薬剤をいう。そのような薬剤は、サイトカイン受容体のリン酸化、サイトカイン受容体に関連するシグナル伝達経路の活性化、および／もしくはサイトカインなどの特定のタンパク質の発現を、直接または間接的に調節し得る。サイトカイン受容体モジュレーターの例には、それだけには限定されないが、可溶性サイトカイン受容体（たとえば、ＴＮＦ−α受容体の細胞外ドメインまたはその断片、ＩＬ−１β受容体の細胞外ドメインまたはその断片、およびＩＬ−６受容体の細胞外ドメインまたはその断片）、サイトカインまたはその断片（たとえば、インターロイキンＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−ＩＯ、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦ）、抗サイトカイン受容体抗体（たとえば、抗ＩＦＮ受容体抗体、抗ＩＬ−２受容体抗体（たとえば、Ｚｅｎａｐａｘ（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  Ｌａｂｓ））、抗ＩＬ−３受容体抗体、抗ＩＬ−４受容体抗体、抗ＩＬ−６受容体抗体、抗ＩＬ−９受容体抗体、抗ＩＬ−１０受容体抗体、抗ＩＬ−１２受容体抗体、抗ＩＬ−１３受容体抗体、抗ＩＬ−１５受容体抗体、および抗ＩＬ−２３受容体抗体）、抗サイトカイン抗体（たとえば、抗ＩＦＮ抗体、抗ＴＮＦ−α抗体、抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−３抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−８抗体（たとえば、ＡＢＸ−ＩＬ−８（Ａｂｇｅｎｉｘ））、抗ＩＬ−９抗体、抗ＩＬ−１２抗体、抗ＩＬ−１３抗体、抗ＩＬ−１５抗体、および抗ＩＬ−２３抗体）が含まれる。
【０２７５】
具体的な実施形態では、サイトカイン受容体モジュレーターはＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはその断片である。別の実施形態では、サイトカイン受容体モジュレーターは抗ＩＬ−１β抗体、抗ＩＬ−６抗体、抗ＩＬ−１２受容体抗体、または抗ＴＮＦ−α抗体である。別の実施形態では、サイトカイン受容体モジュレーターはＴＮＦ−α受容体の細胞外ドメインまたはその断片である。特定の実施形態では、サイトカイン受容体モジュレーターはＴＮＦ−αアンタゴニストではない。
【０２７６】
好ましい実施形態では、免疫調節剤はＩＬ−９の量を減少させる。より好ましい実施形態では、免疫調節剤は、ＩＬ−９に免疫特異的に結合する抗体（好ましくはモノクローナル抗体）またはその断片である（たとえば、すべてその全体が本明細書中に参照により組み込まれる2004年4月12日出願のReedの米国特許出願第10/823,810号、題名「呼吸病態の予防または治療方法（Methods of Preventing or Treating Respiratory Conditions）」（代理人整理番号第１０２７１−１１３−９９９号）、2004年4月12日出願のReedの米国特許出願第10/823,523号、題名「組換えＩＬ−９抗体およびその使用（Recombinant IL-9 Antibodies and Uses Thereof）（代理人整理番号第１０２７１−１１２−９９９）、および2004年4月12日出願のReedの米国仮出願第60/561,845号、題名「抗ＩＬ−９抗体配合物およびその使用（Anti-IL-9 Antibody Formulations and Uses Thereof）（代理人整理番号第１０２７１−１２６−８８８号）を参照。特定の作用機構に縛られることを意図しないが、抗ＩＬ−９抗体を使用することにより、ＩＬ−９が生物学的効果を有する能力が中和され、したがって、炎症細胞の動員が遮断または減少される。
【０２７７】
一実施形態では、サイトカイン受容体モジュレーターは肥満細胞モジュレーターである。代替実施形態では、サイトカイン受容体モジュレーターは肥満細胞モジュレーターではない。肥満細胞モジュレーターの例には、それだけには限定されないが、幹細胞因子（ｃ−ｋｉｔ受容体リガンド）阻害剤（たとえば、ｍＡｂ７Ｈ６、ｍＡｂ８Ｈ７ａ、ｐＡｂ１３３７、ＦＫ５０６、ＣｓＡ、デキサムタゾン、およびフルコンシノニド（ｆｌｕｃｏｎｃｉｎｏｎｉｄｅ））、ｃ−ｋｉｔ受容体阻害剤（たとえば、ＳＴＩ５７１（以前はＣＧＰ５７１４８Ｂとして知られていた））、肥満細胞プロテアーゼ阻害剤（たとえば、ＧＷ−４５、ＧＷ−５８、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、カルフォスチンＣ、サイトカラシンＤ、ゲニステイン、ＫＴ５９２６、スタウロスプロイン、およびラクトフェリン）、リラキシン（「ＲＬＸ」）、ＩｇＥアンタゴニスト（たとえば、抗体ｒｈｕＭＡｂ−Ｅ２５オマリズマブ、ＨＭＫ−１２および６ＨＤ５、ｍＡＢ  Ｈｕ−９０１）、ＩＬ−３アンタゴニスト、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１０アンタゴニスト、ならびにＴＧＦ−βが含まれる。
【０２７８】
免疫調節剤は、Ｂ細胞マーカーおよび／もしくは受容体の結合ならびに／または活性化を妨害するために選択し得る。具体的な実施形態では、免疫調節剤は、Ｂ細胞マーカーおよび／または受容体に結合する抗体である。
【０２７９】
免疫調節剤は、Ｔヘルパーサブセット（ＴＨ１またはＴＨ２）とＢ細胞との相互作用に干渉して中和抗体の形成を阻害するために選択し得る。ＴＨ（Ｔヘルパー）細胞によるＢ細胞の活性化に必要な相互作用に干渉するかまたはそれを遮断し、したがって中和抗体の産生を遮断する抗体は、本発明の方法において免疫調節剤として有用である。たとえば、Ｔ細胞によるＢ細胞の活性化は、Ｔヘルパー細胞上のＣＤ４０リガンドとＢ細胞上のＣＤ４０抗原との結合、ならびにＴ細胞上のＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４リガンドとＢ細胞上のＢ７抗原との結合などの、特定の相互作用が起こることを必要とする（Durie他、Immunol. Today、15(9):406-410 (1994)）。両方の相互作用がなければ、Ｂ細胞は、活性化して中和抗体の産生を誘導することができない。
【０２８０】
ＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）−ＣＤ４０の相互作用は、Ｔヘルパー細胞の活性化および機能のどちらにおいてもその活性が幅広いこと、ならびにそのシグナル伝達経路中に重複が存在しないことから、免疫応答を遮断するための望ましいポイントである。したがって、本発明の具体的な実施形態では、１つまたは複数の免疫調節剤を投与する時にＣＤ４０ＬとＣＤ４０との相互作用を一過的に遮断する。これは、ＴＨ細胞上のＣＤ４０リガンドを遮断して、Ｔヘルパー細胞上のＣＤ４０リガンドとＢ細胞上のＣＤ４０抗原との通常の結合を妨害する薬剤を用いて処理することによって、達成することができる。ＣＤ４０リガンド（抗ＣＤ４０Ｌ）（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏから入手可能；たとえば、1993年8月18日公開の欧州特許出願第555,880号を参照）または可溶性ＣＤ４０分子に対する抗体を選択し、本発明の方法に従って免疫調節剤として用いることができる。
【０２８１】
免疫調節剤は、ＴＨ１細胞と細胞傷害性Ｔリンパ球（「ＣＴＬ」）との相互作用を阻害し、ＣＴＬに媒介される死滅の発生を低減させるために選択され得る。免疫調節剤は、ＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、分化、活性ならびに／または機能を変更（たとえば、阻害もしくは抑制）するために選択し得る。たとえば、ＣＤ４＋および／もしくはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖、分化、活性ならびに／または機能を枯渇あるいは変更するために、Ｔ細胞に特異的な抗体を免疫調節剤として用いることができる。
【０２８２】
本発明の一実施形態では、Ｔ細胞、好ましくは記憶Ｔ細胞を低減または枯渇させる免疫調節剤を、ＩＬ−９ポリペプチドの異常な発現および／もしくは活性を特徴とするあるいはそれに関連する疾患または障害、ＩＬ−９Ｒまたは１つもしくは複数のそのサブユニットの異常な発現を特徴とするあるいはそれに関連する疾患または障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、増殖性疾患、感染症（好ましくは呼吸感染症）に、罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、本発明の方法に従って投与する。たとえば、米国特許第4,658,019号を参照されたい。本発明の別の実施形態では、ＣＤ８＋Ｔ細胞を不活性化させる免疫調節剤を、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、本発明の方法に従って投与する。具体的な実施形態では、抗ＣＤ８抗体を用いてＣＤ８＋Ｔ細胞を低減または枯渇させる。
【０２８３】
別の実施形態では、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞のＴＨ０、ＴＨ１、および／またはＴＨ２サブセットの１つもしくは複数の生物活性（たとえば、分化、増殖、および／またはエフェクター機能）を低減あるいは阻害する免疫調節剤を、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、本発明の方法に従って投与する。そのような免疫調節剤の一例はＩＬ−４である。ＩＬ−４は、ＴＨ１細胞を消費してＴＨ２細胞の抗原特異的活性を増強する（たとえば、Yokota他、1986、Proc. Natl. Acad. Sci., USA、83:5894-5898；および米国特許第5,017,691号を参照）。Ｔヘルパー細胞（具体的には、ＴＨ１および／もしくはＴＨ２細胞）の生物活性（たとえば、増殖、分化、ならびに／またはエフェクター機能）に影響を与える免疫調節剤の他の例には、それだけには限定されないが、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２３、およびインターフェロン（ＩＦＮ）−γが含まれる。
【０２８４】
別の実施形態では、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に本発明の方法に従って投与する免疫調節剤は、抗原の提示を妨げるサイトカインである。具体的な実施形態では、本発明の方法で用いる免疫調節剤はＩＬ−１０である。ＩＬ−１０は、細菌排除を伴うマクロファージの作用を低減または阻害する。
【０２８５】
免疫調節剤は、肥満細胞の活性化、脱顆粒、増殖、および／もしくは浸潤を低減または阻害するために選択し得る。特定の実施形態では、免疫調節剤は、肥満細胞と、それだけには限定されないが幹細胞因子（ｃ−ｋｉｔリガンド）、ＩｇＥ、ＩＬ−４、環境刺激物、および感染性因子を含めた肥満細胞活性化剤との相互作用を妨害する。具体的な実施形態では、免疫調節剤は、それだけには限定されないが花粉、塵ダニ、タバコの煙、および／またはペットの鱗屑などの環境刺激物に対する肥満細胞の応答を低減または阻害する。別の具体的な実施形態では、免疫調節剤は、ウイルス、細菌、および真菌などの感染性因子に対する肥満細胞の応答を低減または阻害する。肥満細胞の活性化、脱顆粒、増殖、および／もしくは浸潤を低減または阻害する肥満細胞モジュレーターの例には、それだけには限定されないが、幹細胞因子（ｃ−ｋｉｔ受容体リガンド）阻害剤（たとえば、ｍＡｂ７Ｈ６、ｒｎＡｂ８Ｈ７ａ、およびｐＡｂ１３３７（Mendiaz他、1996、Eur J Biochem 293(3):842-849を参照）、ＦＫ５０６およびＣｓＡ（Ito他、1999 Arch Dermatol Res 291(5):275-283）、デキサムタゾンおよびフルコンシノニド（Finooto他、1997、J. Clin. Invest. 99(7): 1721-1 728を参照））、ｃ−ｋｉｔ受容体阻害剤（たとえば、ＳＴＩ５７１（以前はＣＧＰ５７１４８Ｂとして知られていた）（Heinrich他、2000 Blood 96(3):925-932を参照））、肥満細胞プロテアーゼ阻害剤（たとえば、ＧＷ−４５およびＧＷ−５８（Temkin他、2002、J Immunol 169(5):2662-2669を参照）、ワートマニン、ＬＹ２９４００２、カルフォスチンＣ、およびサイトカラシンＤ（Vosseller他、1997、MoI Biol Cell 1997:909-922を参照）、ゲニステイン、ＫＴ５９２６、およびスタウロスプロイン（Nagai他 1995、Biochem Biophys Res Commun 208(2):576-581を参照）、およびラクトフェリン（He他、2003 Biochem Pharmacol 65(6): 1007-101 5を参照））、リラキシン（「ＲＬＸ」）（Bani他、2002 Int Immunopharmacol 2(8): 1195-1294を参照）、）、ＩｇＥアンタゴニスト（たとえば、抗体ｒｈｕＭＡｂ−Ｅ２５オマリズマブ（Finn他、2003 J Allergy Clin Immuno 111(2):278-284；Corren他、2003 J Allergy Clin Immuno 11l(l):87-90；BusseおよびNeaville、2001 Curr Opin Allergy Clin Immunol. 1(1): 105-108；ならびにTangおよびPowell、2001、Eur J Pediatr 160(12): 696-704を参照）、ＨＭＫ−１２および６ＨＤ５（Miyajima他、2202 Int Arch Allergy Immuno 128(l):24-32を参照）、およびｍＡＢ  Ｈｕ−９０１（van Neerven他、2001 Int Arch Allergy Immuno 124(l-3):400を参照）、ＩＬ−３アンタゴニスト、ＩＬ−４アンタゴニスト、ＩＬ−１０アンタゴニスト、ならびにＴＧＦ−β（Metcalfe他、1995、Exp Dermatol 4(4 Pt 2):227-230を参照）が含まれる。
【０２８６】
好ましい実施形態では、免疫調節剤として利用するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチド（抗体を含む）は、そのタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに対する免疫応答の可能性を低減させるように、タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのレシピエントと同じ種に由来する。別の好ましい実施形態では、被験体がヒトである場合は、免疫調節剤として利用するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドは、ヒトまたはヒト化したものである。免疫調節剤の免疫調節活性は、共刺激分子およびサイトカインなどの特定のタンパク質の発現についてＣＴＬアッセイ、増殖アッセイ、免疫アッセイ（たとえば、ＥＬＩＳＡ）によって、ならびにＦＡＣＳによって確認することができる。
【０２８７】
本発明によれば、１つまたは複数の免疫調節剤を、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体の前、それに次いで、またはそれと同時に投与する。好ましくは、１つまたは複数の免疫調節剤を、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と組み合わせて、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、免疫応答の１つもしくは複数の態様を低減または阻害するために、当業者による必要性の判断に従って投与する。当業者に周知の任意の技術を用いて特定の被験体における免疫応答の１つまたは複数の態様を測定して、免疫調節剤を前記被験体に投与することが必要な時期を決定することができる。好ましい実施形態では、被験体において約５００個の細胞／ｍｍ３、好ましくは６００個の細胞／ｍｍ３、６５０個の細胞／ｍｍ３、７００個の細胞／ｍｍ３、７５０個の細胞／ｍｍ３、８００個の細胞／ｍｍ３、９００個の細胞／ｍｍ３、１０００個の細胞／ｍｍ３、１１００個の細胞／ｍｍ３、または１２００個の細胞／ｍｍ３の平均絶対リンパ球数が維持される。別の好ましい実施形態では、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体の絶対リンパ球数が５００個の細胞／ｍｍ３以下、５５０個の細胞／ｍｍ３以下、６００個の細胞／ｍｍ３以下、６５０個の細胞／ｍｍ３以下、７００個の細胞／ｍｍ３以下、７５０個の細胞／ｍｍ３以下、または８００個の細胞／ｍｍ３以下である場合は、免疫調節剤を投与しない。
【０２８８】
好ましい実施形態では、１つまたは複数の免疫調節剤を、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１ポリペプチドに免疫特異的に結合する抗体と組み合わせて、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、免疫応答の１つもしくは複数の態様を一過的に低減または阻害するために投与する。免疫系の１つもしくは複数の態様のこのような一過性の阻害または軽減は、時間単位、日単位、週単位、または月単位で持続することができる。好ましくは、免疫応答の１つもしくは複数の態様の一過性の阻害または軽減は、数時間（たとえば、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２４時間、３６時間、もしくは４８時間）、数日間（たとえば、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、もしくは１４日間）、または数週間（たとえば、３週間、４週間、５週間もしくは６週間）持続する。免疫応答の１つもしくは複数の態様の一過性の軽減または阻害により、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの予防的および／または治療的効果が増強される。
【０２８９】
免疫調節活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドをコードしている核酸分子、または免疫調節活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドを、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、本発明の方法に従って投与することができる。さらに、免疫調節活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの誘導体、類似体、または断片をコードしている核酸分子、あるいは免疫調節活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの誘導体、類似体、または断片を、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、本発明の方法に従って投与することができる。好ましくは、そのような誘導体、類似体、および断片は、完全長の野生型タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの免疫調節活性を保持している。
【０２９０】
４．５．２．２  抗炎症治療
当業者に周知の炎症性障害の治療に有用な薬剤を含めた任意の抗炎症剤を本発明の組成物および方法で用いることができる。抗炎症剤の非限定的な例には、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド性抗炎症薬、抗コリン剤（たとえば、硫酸アトロピン、硝酸メチルアトロピン、および臭化イプラトロピウム（ＡＴＲＯＶＥＮＴ（商標）））、β２−作用剤（たとえば、アブテロール（ＶＥＮＴＯＬＩＮ（商標）およびＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（商標））、ビトルテロール（ＴＯＲＮＡＬＡＴＥ（商標））、レバルブテロール（ＸＯＰＯＮＥＸ（商標））、メタプロテレノール（ＡＬＵＰＥＮＴ（商標））、ピルブテロール（ＭＡＸＡＩＲ（商標））、テルブトレイン（ＢＲＥＴＨＡＩＲＥ（商標）およびＢＲＥＴＨＩＮＥ（商標））、アルブテロール（ＰＲＯＶＥＮＴＩＬ（商標）、ＲＥＰＥＴＡＢＳ（商標）、およびＶＯＬＭＡＸ（商標））、フォルモテロール（ＦＯＲＡＤＩＬ  ＡＥＲＯＬＩＺＥＲ（商標））、およびサルメテロール（ＳＥＲＥＶＥＮＴ（商標）およびＳＥＲＥＶＥＮＴ  ＤＩＳＫＵＳ（商標）））、ならびにメチルキサンチン（たとえば、テオフィリン（ＵＮＩＰＨＹＬ（商標）、ＴＨＥＯ−ＤＵＲ（商標）、ＳＬＯ−ＢＩＤ（商標）、およびＴＥＨＯ−４２（商標）））が含まれる。ＮＳＡＩＤの例には、それだけには限定されないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸ（商標））、ジクロフェナク（ＶＯＬＴＡＲＥＮ（商標））、エトドラク（ＬＯＤＩＮＥ（商標））、フェノプロフェン（ＮＡＬＦＯＮ（商標））、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮ（商標））、ケトララック（ＴＯＲＡＤＯＬ（商標））、オキサプロジン（ＤＡＹＰＲＯ（商標））、ナブメントン（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））、スリンダク（ＣＬＩＮＯＲＩＬ（商標））、トルメンチン（ＴＯＬＥＣＴＩＮ（商標））、ロフェコキシブ（ＶＩＯＸＸ（商標））、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥ（商標）、ＮＡＰＲＯＳＹＮ（商標））、ケトプロフェン（ＡＣＴＲＯＮ（商標））およびナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮ（商標））が含まれる。このようなＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ酵素（たとえば、ＣＯＸ−Ｉおよび／またはＣＯＸ−２）を阻害することによって機能する。ステロイド性抗炎症薬の例には、それだけには限定されないが、糖質コルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮ（商標））、コルチコステロイド（たとえば、メチルプレドニソロン（ＭＥＤＲＯＬ（商標）））、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドニゾン（ＰＲＥＤＮＩＳＯＮＥ（商標）およびＤＥＬＴＡＳＯＮＥ（商標））、プレドニゾロン（ＰＲＥＬＯＮＥ（商標）およびＰＥＤＩＡＰＲＥＤ（商標））、トリアムシノロン、アズルフィジン、ならびにエイコサノイドの阻害剤（たとえば、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン（ロイコトリエンの非限定的な例およびそのような薬剤の典型的な用量には、下記表６を参照））が含まれる。
【０２９１】
特定の実施形態では、抗炎症剤は、喘息または１つもしくは複数のその症状の予防、管理、治療、および／あるいは改善に有用な薬剤である。そのような薬剤の非限定的な例には、アドレナリン作動性刺激剤（たとえば、カテコールアミン（たとえば、エピネフリン、イソプロテレノール、イソエタリン）、レソルシノール（たとえば、メタプロテレノール、テルブタリン、フェノテロール）、およびサリゲニン（たとえば、サルブタモール））、副腎コルチコイド、ブルココルチコイド、コルチコステロイド（たとえば、ベクロメタドンス、ブデソニド、フルニソリド、フルチカゾン、トリアムシノロン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、およびプレドニゾン）、他のステロイド、β２アゴニスト（たとえば、アルブツエロール、ビトルテロール、フェノテロール、イソエタリン、メタプロテレノール、ピルブテロール、サルブタモール、テルブタリン、フォルモテロール、サルメテロール、およびアルブタモールテルブタリン）、抗コリン剤（たとえば、臭化イプラトロピウムおよび臭化オキシトロピウム）、ＩＬ−４アンタゴニスト（抗体を含む）、ＩＬ−５アンタゴニスト（抗体を含む）、ＩＬ−１３アンタゴニスト（抗体を含む）、ＰＤＥ４−阻害剤、ＮＦ−κ−β阻害剤、ＶＬＡ−４阻害剤、ＣｐＧ、抗ＣＤ２３、セレクチンアンタゴニスト（ＴＢＣ１２６９）、肥満細胞プロテアーゼ阻害剤（たとえば、トリプターゼキナーゼ阻害剤（たとえば、ＧＷ−４５、ＧＷ−５８、およびゲニステイン）、ホスファチジルイノシチド−３’（ＰＢ）−キナーゼ阻害剤（たとえば、カルフォスチンＣ）、他のキナーゼ阻害剤（たとえば、スタウロスポリン）（Temkin他、2002 J Immunol 169(5):2662-2669；Vosseller他、1997 MoI. Biol. Cell 8(5):909-922；およびNagai他、1995 Biochem Biophys Res Commun 208(2): 576-5 81を参照））、Ｃ３受容体アンタゴニスト（抗体を含む）、免疫抑制剤（たとえば、メトトレキサートおよび金塩）、肥満細胞モジュレーター（たとえば、クロモリンナトリウム（ＩＮＴＡＬ（商標））およびネドクロミルナトリウム（ＴＩＬＡＤＥ（商標）））、ならびに粘液溶解剤（たとえば、アセチルシステイン））が含まれる。具体的な実施形態では、抗炎症剤はロイコトリエン阻害剤である（たとえば、モンテルカスト（ＳＩＮＧＵＬＡＩＲ（商標））、ザフィルルカスト（ＡＣＣＯＬＡＴＥ（商標））、プランルカスト（ＯＮＯＮ（商標））、またはジロートン（ＺＹＦＬＯ（商標））（表６を参照））。
【表６】
2008518022.tif 000007
【０２９２】
特定の実施形態では、抗炎症剤は、アレルギーまたは１つもしくは複数のその症状の予防、治療、管理、および／あるいは改善に有用な薬剤である。そのような薬剤の非限定的な例には、抗メディエーター薬（たとえば、抗ヒスタミン剤、抗ヒスタミン剤の非限定的な例およびそのような薬剤の用量には、下記表７を参照）、コルチコステロイド、鬱血除去剤、交感神経刺激薬（たとえば、α−アドレナリン作動薬およびβ−アドレナリン作動薬）、ＴＮＸ９０１（Leung他、2003、N Engl J Med 348(1 1):986-993）、ＩｇＥアンタゴニスト（たとえば、抗体ｒｈｕＭＡｂ−Ｅ２５オマリズマブ（Finn他、2003 J Allergy Clin Immuno 111(2):278-284；Corren他、2003 J Allergy Clin Immuno 11l(l):87-90；BusseおよびNeaville、2001 Curr Opin Allergy Clin Immuno l(l):105-108；ならびにTangおよびPowell、2001、Eur J Pediatr 160(12): 696-704を参照）、ＨＭＫ−１２および６ＨＤ５（Miyajima他、2202 Int Arch Allergy Immuno 128(l):24-32を参照）、ｍＡＢ  Ｈｕ−９０１（van Neerven他、2001 Int Arch Allergy Immuno 124(l-3):400を参照）、テオフィリンおよびその誘導体、糖質コルチコイド、ならびに免疫療法剤（たとえば、アレルゲンの繰返しの長期的な注射、短期脱感作、およびハチ毒免疫療法）が含まれる。
【表７】
2008518022.tif 000008
【０２９３】
抗炎症治療ならびにその用量、投与経路、および推奨される使用法は当分野で知られており、Physician 's Desk Reference (第58版、2004)などの文献中に記載されている。
【０２９４】
４．５．２．３  抗血管形成治療
当業者に周知の任意の抗血管形成剤を本発明の組成物および方法で用いることができる。抗血管形成性剤の非限定的な例には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、ならびに血管形成を低減または阻害するＴＮＦ−α、核酸分子（たとえば、アンチセンス分子または三重らせん）、有機分子、無機分子、および小分子に免疫特異的に結合する抗体などの抗体（たとえば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、およびその抗原結合断片）が含まれる。具体的には、抗血管形成剤の例には、それだけには限定されないが、エンドスタチン、アンジオスタチン、アポミグレン（ａｐｏｍｉｇｒｅｎ）、抗血管形成抗トロンビンＩＩＩ、フィブロネクチンの２９ｋＤａのＮ末端および４０ｋＤａのＣ末端タンパク質分解断片、ｕＰＡ受容体アンタゴニスト、プロラクチンの１６ｋＤａのタンパク質分解断片、血小板因子−４の７．８ｋＤａのタンパク質分解断片、血小板因子−４の抗血管形成性の２４個のアミノ酸の断片、１３．４０と呼ばれる抗血管形成因子、トロンボスポンジンＩの抗血管形成性の２２個のアミノ酸のペプチド断片、ＳＰＡＲＣ、ＲＧＤおよびＮＧＲ含有ペプチドの抗血管形成性の２０個のアミノ酸のペプチド断片、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲンおよびＥＧＦの抗血管形成小ペプチド、インテグリンαｖβ３アンタゴニスト、酸性線維芽細胞成長因子（ａＦＧＦ）アンタゴニスト、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）アンタゴニスト、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）アンタゴニスト（たとえば、抗ＶＥＧＦ抗体（たとえば、ＡＶＡＳＴＩＮ（商標）（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ））、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）アンタゴニスト（たとえば、抗ＶＥＧＦＲ抗体）および抗インテグリンアンタゴニスト（たとえば、血塊形成を予防するために血小板上の糖タンパク質Ｉｌｂ／ＩＩＩａ受容体に結合するＲＥＯＰＲＯ（登録商標）（アブシキシマブ）（Ｃｅｎｔｏｃｏｒ））が含まれる。
【０２９５】
インテグリンαｖβ３アンタゴニストの例には、それだけには限定されないが、非触媒性メタロプロテイナーゼ断片、ＲＧＤペプチド、ペプチド模倣体、融合タンパク質、ディスインテグリンまたはその誘導体もしくは類似体などのタンパク性薬剤、ならびにインテグリンαｖβ３に免疫特異的に結合する抗体、核酸分子、有機分子、および無機分子が含まれる。インテグリンαｖβ３に免疫特異的に結合する抗体の非限定的な例には、１１Ｄ２（Ｓｅａｒｌｅ）、ＬＭ６０９（Ｓｃｒｉｐｐｓ）、およびＶＩＴＡＸＩＮ（商標）（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）が含まれる。小分子ペプチドメトリックインテグリンαｖβ３アンタゴニストの非限定的な例には、Ｓ８３６（Ｓｅａｒｌｅ）およびＳ４４８（Ｓｅａｒｌｅ）が含まれる。ディスインテグリンの例には、それだけには限定されないが、Ａｃｃｕｔｉｎが含まれる。本発明はまた、以下の米国特許および国際公開に開示されているインテグリンαｖβ３アンタゴニストのうち任意のものの、本発明の組成物および方法における使用も包含する：それぞれその全体が本明細書中に参照により組み込まれる米国特許第5,149,780号；第5,196,511号；第5,204,445号；第5,262,520号；第5,306,620号；第5,478,725号；第5,498,694号；第5,523,209号；第5,578,704号；第5,589,570号；第5,652,109号；第5,652,110号；第5,693,612号；第5,705,481号；第5,753,230号；第5,767,071号；第5,770,565号；第5,780,426号；第5,817,457号；第5,830,678号；第5,849,692号；第5,955,572号；第5,985,278号；第6,048,861号；第6,090,944号；第6,096,707号；第6,130,231号；第6,153,628号；第6,160,099号；および第6,171,588号；ならびに国際公開公報第WO 95/22543号；第WO 98/33919号；第WO 00/78815号；および第WO 02/070007号。好ましい実施形態では、抗血管形成剤はＶＩＴＡＸＩＮ（商標）（Ｍｅｄｌｍｍｕｎｅ，Ｉｎｃ．）またはその抗原結合断片である。
【０２９６】
本発明の具体的な実施形態では、抗血管形成剤はエンドスタチンである。天然に存在するエンドスタチンは、コラーゲンＸＶＩＩＩのＣ末端の約１８０個のアミノ酸からなる（コラーゲンＸＶＩＩＩの２つのスプライシング型をコードしているｃＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１８０８１およびＡＦ１８０８２を有する）。本発明の別の実施形態では、抗血管形成剤はプラスミノーゲン断片である（プラスミノーゲンのコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００３０１およびＡ３３０９６で見つけることができる）。アンジオスタチンペプチドは、天然ではプラスミノーゲンの４つのクリングルドメイン、すなわちクリングル１〜クリングル４を含む。組換えクリングル１、２および３は天然ペプチドの抗血管形成特性を保有している一方で、クリングル４はそのような活性を有さないことが実証されている（Cao他、1996、J. Biol. Chem. 271:29461-29467）。したがって、アンジオスタチンペプチドは、クリングル１、クリングル２およびクリングル３からなる群から選択された少なくとも１つ、好ましくは複数のクリングルドメインを含む。具体的な実施形態では、抗血管形成性ペプチドは、ヒトアンジオスタチン分子の４０ｋＤａのアイソフォーム、ヒトアンジオスタチン分子の４２ｋＤａのアイソフォーム、ヒトアンジオスタチン分子の４５ｋＤａのアイソフォーム、またはそれらの組合せである。別の実施形態では、抗血管形成剤は、プラスミノーゲンのクリングル５ドメインであり、これはアンジオスタチンよりも強力な血管形成阻害剤である（アンジオスタチンはクリングルドメイン１〜４を含む）。本発明の別の実施形態では、抗血管形成剤は抗トロンビンＩＩＩである。本明細書中では以降抗トロンビンと呼ぶ抗トロンビンＩＩＩは、タンパク質を血管構造壁に繋ぎ止めるヘパリン結合ドメインおよびトロンビンと相互作用する活性部位ループを含む。抗トロンビンがヘパリンに繋ぎ止められている場合は、このタンパク質はコンホメーション変化を誘発し、これにより、活性ループがトロンビンと相互作用して、トロンビンによる前記ループのタンパク質分解的切断をもたらすことが可能となる。タンパク質分解的切断現象は抗トロンビンのコンホメーションの別の変化をもたらし、これにより、（ｉ）トロンビンと抗トロンビンとの相互作用の界面が変更され、（ｉｉ）ヘパリンから複合体が放出される（Carrell、1999、Science 285:1861-1862およびそれ中の参考文献）。Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ他（1999、Science 285:1926-1928）は、切断された抗トロンビンが強力な抗血管形成活性を有することを発見した。したがって、一実施形態では、抗血管形成剤は抗トロンビンの抗血管形成型である。本発明の別の実施形態では、抗血管形成剤はフィブロネクチンの４０ｋＤａおよび／または２９ｋＤａのタンパク質分解断片である。
【０２９７】
本発明の別の実施形態では、抗血管形成剤はウロキナーゼプラスミノーゲン活性化剤（ｕＰＡ）受容体アンタゴニストである。この実施形態の一態様では、アンタゴニストはｕＰＡのドミナントネガティブ突然変異体である（たとえば、Crowley他、1993、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5021-5025を参照）。この実施形態の別の態様では、アンタゴニストはペプチドアンタゴニストまたはその融合タンパク質である（Goodson他、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 9 1:7129-7133）。この実施形態のさらに別の態様では、アンタゴニストはドミナントネガティブ可溶性ｕＰＡ受容体である（Min他、1996、Cancer Res. 56:2428-2433）。本発明の別の実施形態では、本発明の治療分子は、約１２０個のアミノ酸を含むプロラクチンの１６ｋＤａのＮ末端断片、またはその生物活性のある断片である（プロラクチンのコード配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０００９４８で見つけることができる）。本発明の別の実施形態では、抗血管形成剤は７．８ｋＤａの血小板因子−４断片である。本発明の別の実施形態では、本発明の治療分子は、血小板因子−４の抗血管形成性の１３個のアミノ酸の断片、１３．４０と呼ばれる抗血管形成因子、トロンボスポンジンＩの抗血管形成性の２２個のアミノ酸のペプチド断片、ＳＰＡＲＣの抗血管形成性の２０個のアミノ酸のペプチド断片、ラミニン、フィブロネクチン、プロコラーゲン、もしくはＥＧＦの抗血管形成小ペプチド、またはインテグリンαｖβ３もしくはＶＥＧＦ受容体の小ペプチドアンタゴニストに対応する小ペプチドである。別の実施形態では、小ペプチドはＲＧＤまたはＮＧＲモチーフを含む。特定の実施形態では、抗血管形成剤はＴＮＦ−αアンタゴニストである。他の実施形態では、抗血管形成剤はＴＮＦ−αアンタゴニストではない。
【０２９８】
抗血管形成活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドをコードしている核酸分子、または抗血管形成活性を有するタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、本発明の方法に従って投与することができる。さらに、抗血管形成活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの誘導体、類似体、断片、または変異体をコードしている核酸分子、あるいは抗血管形成活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの誘導体、類似体、断片、または変異体を、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、本発明の方法に従って投与することができる。好ましくは、そのような誘導体、類似体、変異体、および断片は、完全長の野生型タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの抗血管形成活性を保持している。
【０２９９】
抗血管形成剤として用いることができるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、当分野で周知のまたは本明細書中に記載の任意の技術によって産生することができる。当分野で周知のまたは本明細書中に記載の技術を利用して抗血管形成活性を有するタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの遺伝子操作を行って、タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させることができる。好ましくは、市販されている抗血管形成剤を本発明の組成物および方法で用いる。薬剤の抗血管形成活性は、当業者に周知の任意の技術によってｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで決定することができる。
【０３００】
４．５．２．４  ＴＮＦ−αアンタゴニスト
当業者に周知の任意のＴＮＦ−αアンタゴニストを本発明の組成物および方法で用いることができる。ＴＮＦ−αアンタゴニストの非限定的な例には、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、融合タンパク質、ＴＮＦ−αに免疫特異的に結合する抗体などの抗体（たとえば、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、Ｆｖ、ＳｃＦｖ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ）２断片、およびその抗原結合断片）、核酸分子（たとえば、アンチセンス分子または三重らせん）、有機分子、無機分子、ならびにＴＮＦ−αの機能、活性および／もしくは発現を遮断、低減、阻害または中和する小分子が含まれる。様々な実施形態では、ＴＮＦ−αアンタゴニストは、当業者に知られているアッセイにおいて、ＴＮＦ−αの機能、活性および／または発現を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）などの対照と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％低減させる。
【０３０１】
ＴＮＦ−αに免疫特異的に結合する抗体の例には、それだけには限定されないが、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）；Ｃｅｎｔａｃｏｒ）、Ｄ２Ｅ７（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Ｋｎｏｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏ．、ニュージャージー州Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ）、ＨＵＭＩＣＡＤＥ（商標）としても知られるＣＤＰ５７１およびＣＤＰ−８７０（どちらもＣｅｌｌｔｅｃｈ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ、英国Ｓｌｏｕｇｈのもの）、ならびにＴＮ３−１９．１２（Williams他、1994、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 2762-2766；Thorbecke他、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:7375-7379）が含まれる。本発明はまた、本発明の組成物および方法中における、以下の米国特許に開示されているＴＮＦ−αに免疫特異的に結合する抗体の使用も包含する：それぞれその全体が本明細書中に参照により組み込まれる第5,136,021号；第5,147,638号；第5,223,395号；第5,231,024号；第5,334,380号；第5,360,716号；第5,426,181号；第5,436,154号；第5,610,279号；第5,644,034号；第5,656,272号；第5,658,746号；第5,698,195号；第5,736,138号；第5,741,488号；第5,808,029号；第5,919,452号；第5,958,412号；第5,959,087号；第5,968,741号；第5,994,510号；第6,036,978号；第6,114,517号；および第6,171,787号。可溶性ＴＮＦ−α受容体の例には、それだけには限定されないが、ｓＴＮＦ−Ｒｌ（Ａｍｇｅｎ）、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標）；Ｉｍｍｕｎｅｘ）およびそのラット相同体ＲＥＮＢＲＥＬ（商標）、ＴＮＦｒＩ、ＴＮＦｒＩＩ（Kohno他、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8331-8335）、およびＴＮＦ−αＩｎｈ（Seckinger他、1990、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5188-5192）に由来するＴＮＦ−αの可溶性阻害剤が含まれる。
【０３０２】
一実施形態では、本発明の組成物および方法で用いるＴＮＦ−αアンタゴニストは可溶性ＴＮＦ−α受容体である。具体的な実施形態では、本発明の組成物および方法で用いるＴＮＦ−αアンタゴニストは、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（商標）；Ｉｍｍｕｎｅｘ）またはそのまたはその断片、誘導体もしくは類似体である。別の実施形態では、本発明の組成物および方法で用いるＴＮＦ−αアンタゴニストは、ＴＮＦ−αに免疫特異的に結合する抗体である。具体的な実施形態では、本発明の組成物および方法で用いるＴＮＦ−αアンタゴニストは、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標）；Ｃｅｎｔａｃｏｒ）、その誘導体、類似体またはその抗原結合断片である。
【０３０３】
本発明に包含される他のＴＮＦ−αアンタゴニストには、それだけには限定されないが、インターフェロンγで活性化したマクロファージを介してＴＮＦ−α産生を遮断することが知られているＩＬ−１０（Oswald他、1992、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:8676-8680）、ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（Ashkenazi他、1991、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10535-10539）、ネズミ産物ＴＢＰ−Ｉ（Ｓｅｒｏｎｏ／Ｙｅｄａ）、ワクチンＣｙｔｏＴＡｂ（Ｐｒｏｔｈｅｒｉｃｓ）、アンチセンス分子ｌ０４８３８（ＩＳＩＳ）、ペプチドＲＤＰ−５８（ＳａｎｇＳｔａｔ）、サリドマイド（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＣＤＣ−８０１（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＤＰＣ−３３３（Ｄｕｐｏｎｔ）、ＶＸ−７４５（Ｖｅｒｔｅｘ）、ＡＧＩＸ−４２０７（ＡｔｈｅｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＩＴＦ−２３５７（Ｉｔａｌｆａｒｍａｃｏ）、ＮＰＩ−１３０２１−３１（Ｎｅｒｅｕｓ）、ＳＣＩＯ−４６９（Ｓｃｉｏｓ）、ＴＡＣＥ標的（Ｉｍｍｕｎｉｘ／ＡＨＰ）、ＣＬＸ−１２０５００（Ｃａｌｙｘ）、Ｔｈｉａｚｏｌｏｐｙｒｉｍ（Ｄｙｎａｖａｘ）、オーラノフィン（Ｒｉｄａｕｒａ）（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、キナクリン（メパクリンジクロロハイドレート）、テニダップ（Ｅｎａｂｌｅｘ）、メラニン（Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、およびＵｒｉａｃｈの抗ｐ３８ＭＡＰＫ剤が含まれる。
【０３０４】
ＴＮＦ−αアンタゴニスト活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドをコードしている核酸分子、またはＴＮＦ−αアンタゴニスト活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドを、炎症性疾患もしくは自己免疫疾患に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、本発明の方法に従って投与することができる。さらに、ＴＮＦ−αアンタゴニスト活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの誘導体、類似体、断片または変異体をコードしている核酸分子、あるいはＴＮＦ−α拮抗活性を有するタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドの誘導体、類似体、断片または変異体を、炎症性疾患もしくは自己免疫疾患に罹患する危険があるかまたはそれに罹患している被験体に、本発明の方法に従って投与することができる。好ましくは、そのような誘導体、類似体、変異体および断片は、完全長の野生型タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドのＴＮＦ−αアンタゴニスト活性を保持している。
【０３０５】
ＴＮＦ−αアンタゴニストとして用いることができるタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、当分野で周知のまたは本明細書中に記載の任意の技術によって産生することができる。当分野で周知のまたは本明細書中に記載の技術を利用して、ＴＮＦ−αアンタゴニスト活性を有するタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドの遺伝子操作を行って、そのようなタンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期を増加させることができる。好ましくは、市販されており、ＴＮＦ−αアンタゴニストとして機能することが知られている薬剤を、本発明の組成物および方法で用いる。薬剤のＴＮＦ−αアンタゴニスト活性は、当業者に周知の任意の技術によってｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで決定することができる。
【０３０６】
４．６  本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの同定
本発明は、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのアッセイおよびスクリーニング方法であって、薬剤を、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１を発現する細胞、特に上皮細胞および／または内皮細胞と共にインキュベートし、その後、対照（たとえば、ＰＢＳまたはＩｇＧ）と比較して、ＥｐｈＡ２および／もしくはエフリンＡ１の遺伝子発現を調節する能力ならびに／またはＥｐｈＡ２および／もしくはエフリンＡ１の活性を調節する能力についてアッセイを行って、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを同定することによる方法を提供する。本発明はまた、たとえば、動物モデルにおける硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬などの非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害の症状（病理症状を含む）の軽減による、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを同定するためのｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの使用も包含する。
【０３０７】
４．６．１  ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター
本発明は、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのアッセイ方法およびスクリーニング方法を提供する。そのような本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化によってＥｐｈＡ２の内部移行および分解を減少させる。したがって、ＥｐｈＡ２タンパク質のレベルは、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターが存在しない場合よりも高く維持される。一実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化を減少させる。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、ＥｐｈＡ２の内部移行および分解を減少させる。ＥｐｈＡ２のリン酸化のレベルもしくは発現のレベルのアッセイを行うための当分野で公知の任意の方法、たとえば、免疫沈降、ウエスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、およびリン酸化アッセイ（たとえば、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、カリフォルニア州Ｔｅｍｅｃｕｌａから入手可能なＯＭＮＩ−ＰＨＯＳＴＭキット）を用いてＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのスクリーニングを行って、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化またはＥｐｈＡ２の分解を減少させるその能力を決定することができる。リガンドに媒介されるＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化は、ＥｐｈＡ２細胞質側末端とＳＨＣのＰＴＢドメインおよびＳＨ２ドメインとの相互作用を生じさせ、ＥＲＫキナーゼの核移行およびリン酸化を促進し、ならびにＥｌｋ−Ｉ転写因子の核誘導を増大させることが示されている（PrattおよびKinch、2002、Oncogene 21:7690-9）。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、リガンドに媒介されるＥｐｈＡ２のシグナル伝達を減少させる。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、リガンドに媒介されるＥｐｈＡ２とＳＨＣとの相互作用を減少させる。別の具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、リガンドに媒介されるＥＲＫキナーゼの核移行および／またはリン酸化を減少させる。別の具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、リガンドに媒介されるＥｌｋ−Ｉ転写因子の核誘導を減少させる。リガンドに媒介されるＥｐｈＡ２のシグナル伝達のアッセイを行うための当分野の任意の方法、たとえば、レポーター遺伝子アッセイ、免疫沈降、免疫ブロッティング、ＧＳＴ融合タンパク質プルダウンアッセイを用いてＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのスクリーニングを行って、リガンドに媒介されるＥｐｈＡ２のシグナル伝達を減少させるその能力を決定することができる（たとえば、PrattおよびKinch、2002、Oncogene 21:7690-9を参照）。
【０３０８】
４．６．２  エフリンＡ１の酵素活性を増大させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター
本発明は、エフリンＡ１の酵素活性を増大させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのアッセイ方法およびスクリーニング方法を提供する。そのようなＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、エフリンＡ１を発現する細胞、特に上皮細胞および／または内皮細胞中に存在する候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの、エフリンＡ１の酵素活性のレベルを増加させる能力のアッセイを行うことによって同定される。一部の実施形態では、候補薬剤を、エフリンＡ１がその受容体（たとえば、ＥｐｈＡ２）に結合していない場合に存在する、エフリンＡ１の酵素活性を増加させるその能力についてスクリーニングする。他の実施形態では、候補薬剤は、エフリンＡ１がその受容体（たとえば、ＥｐｈＡ２）に結合していない場合に活性である、エフリンＡ１のシグナル伝達カスケードによってシグナル伝達を増加させるその能力についてスクリーニングを行う（たとえば、Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ジョージア州Ｎｏｒｃｒｏｓｓから入手可能なＣＡＴａｌｙｓｅレポーター遺伝子アッセイなどのレポーター遺伝子アッセイにおいて）。
【０３０９】
４．６．３  ＥｐｈＡ２−内在性リガンドの相互作用を減少させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター
本発明は、ＥｐｈＡ２−内在性リガンドの相互作用を減少または破壊するＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターについてのアッセイ方法およびスクリーニング方法を提供する。一実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター（好ましくは、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１と構造的または機能的に類似したエピトープを保有するもの）を、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１を発現する細胞での細胞のＥｐｈＡ２と細胞のエフリンＡ１との相互作用／結合を破壊するように細胞のＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１と競合的に結合する能力についてスクリーニングする。ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１とのそのような非内在性リガンドとの結合は、その内在性リガンドと結合するＥｐｈＡ２が誘発する種類または度合のシグナル伝達をもたらさないことが好ましい。別の実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター（好ましくは、ＥｐｈＡ２もしくはエフリンＡ１に結合する可溶性内在性リガンド結合細胞外ドメイン）を、エフリンＡ１と細胞のＥｐｈＡ２との相互作用を阻害するようにＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１と競合的に結合する能力についてスクリーニングする。エフリンＡ１または細胞のＥｐｈＡ２と競合的に結合するＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの数は、それだけには限定されないが、ＥＬＩＳＡ、免疫ブロット、放射性免疫沈降などをはじめとする様々な公知の技術によって分析することができる。本発明は、セクション４．２．２に記載のタンパク質−タンパク質相互作用アッセイにおいて、細胞のＥｐｈＡ２とその内在性リガンドであるエフリンＡ１との結合の割合が、対照と比較して、９９％未満、９５％未満、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、１％未満である組成物を提供する。好ましい実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、それだけには限定されないが、細胞外マトリックス成分（たとえば、コラーゲン、プロテオグリカンおよびフィブロネクチン）の沈着の増加に関連する障害をはじめとする非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害に関連する血管形成を予防するかまたは遅延させるその能力についてスクリーニングする。そのような障害の非限定的な例としては、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）ならびに線維症関連疾患が挙げられる。
【０３１０】
４．６．４  細胞増殖刺激剤
本発明は、ＥｐｈＡ２を発現する細胞、特に上皮細胞および／もしくは内皮細胞の増殖／成長／生存を促進する本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのアッセイ方法ならびにスクリーニング方法を提供する。当分野で周知の多くのアッセイを用いて、生存、成長、および／または増殖を評価することができる。たとえば、細胞増殖は、（３Ｈ）−チミジンの取込みを測定することによって、直接細胞計数によって、細胞周期マーカー（Ｒｂ、ｃｄｃ２、サイクリンＡ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅなど）などの既知の遺伝子の転写、翻訳または活性の変化の検出によってアッセイすることができる。そのようなタンパク質およびｍＲＮＡならびに活性のレベルは、当分野で周知の任意の方法によって決定することができる。たとえば、タンパク質は、市販されている抗体（たとえば、多くの細胞周期マーカー抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．のものである）を用いたウエスタンブロットまたは免疫沈降などの公知の免疫診断方法によって定量することができる。ｍＲＮＡは、当分野で周知かつ日常的である方法、たとえば、ノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護、逆転写と関連させたポリメラーゼ連鎖反応などによって定量することができる。細胞の生存は、トリパンブルー染色または当分野で公知の他の細胞死もしくは生存マーカーを用いることによって評価することができる。
【０３１１】
本発明は、それだけには限定されないが、以下のものをはじめとする当分野で公知の様々な技術による、細胞周期分析および細胞増殖分析を提供する。
【０３１２】
一例として、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の取込みを、増殖細胞を特定するアッセイとして用い得る。ＢＲＤＵアッセイでは、新しく合成されたＤＮＡへのＢＲＤＵの取込みによって、ＤＮＡ合成を受けている細胞集団を特定する。その後、抗ＢＲＤＵ抗体を用いて新しく合成されたＤＮＡを検出し得る（Hoshino他、1986、Int. J. Cancer 38:369；Campana他、1988、J. Immunol. Meth. 107:79を参照）。
【０３１３】
細胞増殖は、（３Ｈ）−チミジンの取込みを用いても調べることができる（たとえば、Chen、1996、Oncogene 13:1395-403；Jeoung、1995、J. Biol. Chem. 270: 18367-73を参照）。このアッセイは、Ｓ期ＤＮＡ合成の定量的な特徴付けを可能にする。このアッセイでは、ＤＮＡを合成している細胞が、新しく合成されたＤＮＡに（３Ｈ）−チミジンを取り込む。その後、シンチレーションカウンター（たとえば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ３８００液体シンチレーションカウンター）での放射性同位体の計測などの当分野の標準的技術によって取込みを測定し得る。
【０３１４】
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の検出も、細胞増殖を測定するために用い得る。ＰＣＮＡは、発現が増殖細胞中、特に細胞周期のＧ１初期およびＳ期に上昇しており、したがって増殖細胞のマーカーとして役割を果たし得る、３６ｋＤａのタンパク質である。陽性細胞は、抗ＰＣＮＡ抗体を用いた免疫染色によって特定する（Li他、1996、Curr. Biol. 6:189-99；Vassilev他、1995、J. Cell ScL 108:1205-15を参照）。
【０３１５】
細胞増殖は、細胞集団の試料の経時的な計数によって測定し得る（たとえば、毎日の細胞計数）。細胞は、赤血球計および光学顕微鏡観察を用いて計数し得る（たとえば、ＨｙＬｉｔｅ赤血球計、Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。対象となる集団の増殖曲線を得るために、細胞数を時間に対してプロットする。好ましい実施形態では、この方法によって計数する細胞をまずトリパンブルー色素（Ｓｉｇｍａ）と混合して生細胞は色素を排出するようにし、集団の生存メンバーとして計数する。
【０３１６】
細胞のＤＮＡ含有量および／または分裂指数は、たとえば、細胞のＤＮＡ倍数値に基づいて測定し得る。たとえば、細胞周期のＧ１期にある細胞は、一般に２ＮのＤＮＡ倍数値を有する。ＤＮＡが複製されたが有糸分裂まで進行していない細胞（たとえば、Ｓ期中の細胞）は、２Ｎよりも大きく、最大４ＮのＤＮＡ含有量の倍数値を示す。倍数値および細胞周期の動態学は、ヨウ化プロピジウムアッセイを用いてさらに測定し得る（たとえば、Turner他、1998、Prostate 34:175-81を参照）。あるいは、ＤＮＡ倍数性は、コンピューター処理のマイクロデンシトメーター染色システムでのＤＮＡフォイルゲン染色（化学量論的にＤＮＡに結合する）の定量によって決定し得る（たとえば、Bacus、1989、Am. J. Pathol. 135:783-92を参照）。別の実施形態では、ＤＮＡ含有量は、染色体の伸展標本を作製することによって分析し得る（Zabalou、1994、Hereditas. 120:127-40；Pardue、1994、Meth. Cell Biol. 44:333-351）。
【０３１７】
細胞周期タンパク質（たとえば、ＣｙｃＡ、ＣｙｃＢ、ＣｙｃＥ、ＣｙｃＤ、ｃｄｃ２、Ｃｄｋ４／６、Ｒｂ、ｐ２１、ｐ２７など）の発現は、細胞または細胞集団の増殖状態に関する重要な情報を提供する。たとえば、抗増殖シグナル伝達経路の特定は、ｐ２１ｃｉｐ１の誘導によって示され得る。細胞中のｐ２１の発現レベルの増大は、細胞周期のＧ１への移行の遅延をもたらす（Harper他、1993、Cell 75:805-816；Li他、1996、Curr. Biol. 6:189-199）。ｐ２１の誘導は、市販されている特異的な抗ｐ２１抗体（たとえば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いた免疫染色によって特定し得る。同様に、細胞周期タンパク質は、市販されている抗体を用いたウエスタンブロット分析によって調べることができる。別の実施形態では、細胞周期タンパク質を検出する前に細胞集団を同期させる。細胞周期タンパク質はまた、対象となるタンパク質に対する抗体を用いたＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取器）分析によっても検出し得る。
【０３１８】
本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはまた、細胞増殖が減少または阻害されるように細胞周期の長さもしくは細胞周期の速度を変化させるその能力によって同定することもできる。一実施形態では、細胞周期の長さは、細胞集団の倍加時間によって決定する（たとえば、１つもしくは複数の候補ＥｐｈＡ２剤と接触させたかまたは接触させていない細胞を用いる）。別の実施形態では、ＦＡＣＳ分析を用いて、細胞周期の進行期を分析するか、またはＧ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ画分を精製する（たとえば、Delia他、1997、Oncogene 14:2137-47を参照）。
【０３１９】
４．６．５  細胞層の完全性を増大させるＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター
本発明は、細胞層、特に上皮細胞層および／もしくは内皮細胞層の完全性の維持または再構築を増大させる本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのアッセイ方法ならびにスクリーニング方法を提供する。候補薬剤を、二室チャンバ（たとえば、ボイデンチャンバ、ウッシングチャンバ、トランウェルチャンバなど）中で、上皮細胞層および／もしくは内皮細胞層の完全性を維持ならびに／または再構築するその能力についてスクリーニングする。たとえば、上皮細胞の単層が培地の上部ウェルおよび下部ウェルの間に存在するように二室チャンバを準備することができる。候補ＥｐｈＡ２剤が存在する場合および存在しない場合における細胞層の完全性を、いくつかの方法によって確認することができる。たとえば、チャンバのウェル間の受動的溶質流動の度合が、細胞層の完全性の指標である場合がある。マーカー分子（たとえば、染色、放射性標識）をウェルの一方に加え、マーカー分子が他方のウェル中の培地にアクセスするのにかかる時間を測定することができる。あるいは、細胞層の完全性を示すために経上皮電気抵抗を測定する。細胞層の完全性の増大は、経上皮電気抵抗の増大によって示される。一般的には、KimおよびSuh、1993、Am. J. Physiol. 264:1308-15ならびにNilsson他、1996、Eur. J. Endocrinol. 135:469-80を参照されたい。
【０３２０】
４．６．６  病理状態を引き起こす上皮または内皮細胞表現型を阻害する薬剤
表現型
本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、１つ以上の病理状態を引き起こす上皮または内皮細胞表現型（たとえば、ムチン分泌、ムチン分泌細胞への分化、炎症性因子の分泌、ＥＣＭ因子（特にフィブロネクチン）の分泌、過剰増殖、および／または異常な血管形成）を低減させ得る（かつ好ましくは阻害し得る）。当業者は、候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターに対し、そのような挙動を低減させる（かつ好ましくは阻害する）能力についてアッセイを行うことができる。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、病理状態を引き起こす上皮または内皮細胞表現型を、対照（たとえば、ＰＢＳまたはＩｇＧ）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％もしくは少なくとも９９％低減させる（かつ好ましくは阻害する）。
【０３２１】
一部の実施形態では、肺上皮のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いて候補薬剤のスクリーニングを行うことができる。細胞を培養して、気道の上皮組織に非常によく似ているヒト由来の気管／気管支上皮細胞（たとえば、ＮＨＢＥまたはＴＢＥ細胞）から偽重層化した高度に分化したモデル組織を形成させることができる。培養物を空気−液体界面にある細胞培養挿入物上で増殖させることができ、これにより、気道炎症および刺激性の研究、ならびに吸入毒性研究における揮発性物質の気相曝露が可能となる。吸入薬物送達研究のために経上皮透過性を測定することができる。そのようなモデル系は、ＥｐｉＡｉｒｗａｙＴＭ組織モデル系（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．、メリーランド州Ａｓｈｌａｎｄ）のように市販されている。
【０３２２】
ムチン分泌
一実施形態では、病理状態を引き起こす上皮細胞表現型はムチン分泌である。候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、いくつかのｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって、ムチン分泌を減少または阻害するその能力についてアッセイすることができる。培養気道杯細胞からのムチン放出を測定するために用いることができるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの一例は、ハムスター気管表面上皮（ＨＴＳＥ）細胞培養系である（米国特許第6,245,320号参照）。簡潔に述べると、７〜８週齢の雄のゴールデンシリアンハムスター（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、インディアナ州Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ）から得た気管を用いてＨＴＳＥ細胞を回収する。その後、ＨＴＳＥ細胞を、Kim他、1989、Exp. Lung Res. 15:299-314に記載のようにコラーゲンゲル上で培養する。Kim他、1989、Am. J. Resp. Cell Mol. Biol. 1:137-143に記載のようにコンフルエントな培養物を標識培地と共に２４時間インキュベートすることによって、ムチンを代謝的に放射標識する。２４時間のインキュベーション時間ののち、使用済み培地（前処理試料）を回収し、標識された培養物をＣａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まないＰＢＳで２回洗浄し、その後、候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの存在下で３０分間追跡する。追跡される培地は処理試料と呼ぶ。追跡時間ののち、遠心分離によって浮遊細胞および細胞細片を処理試料から除去し、その標識されたムチン含有量についてアッセイを行う。セファロースＣＬ−４Ｂ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、スウェーデンＵｐｓａｌａ）ゲル濾過カラムクロマトグラフィー後に排出され、かつヒアルロニダーゼに耐性のある高分子量の糖質コンジュゲートを、ムチンであると定義する（Kim他、1985、J. Biol. Chem. 260:4021 :4027を参照）。その後、Kim他、1987、PNAS 84:9304-9308に記載のようにカラムクロマトグラフィーによってムチンを測定する。候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターとのインキュベーションの前後にＨＴＳＥ培養物中で分泌されたムチンの量を決定することができる。
【０３２３】
分化した特徴を維持している、空気／液体界面系中で維持した初代気管上皮細胞培養物（Adler他、1992、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 6:550-556）および肺上皮細胞株（たとえば、ＮＴＨ−２９２細胞）などの他のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いることができる。それだけには限定されないが、タンパク質発現レベルにはウエスタンブロットおよびＥＬＩＳＡ、ならびにＲＮＡ発現レベルにはＰＣＲおよびノーザンブロットをはじめとする、標準的な分子生物学的技術を用いてムチンの量を決定することができる。
【０３２４】
ｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを同定することもできる。喘息またはＣＯＰＤの動物モデルを用いて本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを同定することもできる。たとえば、内毒素／ＬＰＳで誘発した肺の炎症のネズミモデルを用いて、ムチン分泌細胞の分化に対する候補ＥｐｈＡ２アゴニスト剤の影響のアッセイを行うことができる（Steiger他、1995、J. Am. Respir. Cell Mol. Biol, 12:307-14および米国特許第6,083,973号）。簡潔に述べると、肺の炎症は、ＬＰＳ（緑膿菌（Pseudomonas aeriginos）由来のＬＰＳ；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）を４００μｇ／ｋｇ／用量／日で３日間、繰り返して投与することによって、マウスまたはラットで誘発することができる。動物は、最初のＬＰＳ投与の２４時間前から開始して、１日１回、候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターで処置することができる。最後のＬＰＳ投与の２４時間後に、深い麻酔下での全採血によって動物を屠殺する。肺をリン酸緩衝生理食塩水（２×５ｍｌ）で洗浄して、粘液層を洗浄して取り出す。気管支洗浄液を１０分間遠心分離し、細胞を含まない上清を凍結し、存在するムチンの量を決定するために分析するまで−２０℃で保存する。ムチン分泌の量は、当分野で公知の任意の方法、たとえば、アルシアンブルーおよび／もしくは過ヨウ素酸シッフ染色を用いたドットブロットアッセイによって、または抗ムチン抗体を用いたウエスタンブロット／ＥＬＩＳＡ分析によってによって決定することができる。
【０３２５】
ＩＬ−４（Temann他、1997、Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 16:471-8）、ＩＬ−１３（Kuperman他、2002、Nat. Med. 7月1日号、印刷前の電子発行）もしくはＩＬ−９を全身的または肺組織中のみで過剰発現するマウスなど、喘息／ＣＯＰＤの他の動物モデルを用いてＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを同定することもできる。病理症状の軽減、ならびに気管支洗浄液中に存在するムチンの量の減少または誘発される痰の試料の量の減少を用いて、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを同定することができる（Fahy他、1993、Am. Rev. Respir. Dis. 147:1132-1137）。動物モデルの別の例は、ＴＨ１またはＴＨ２レシピエントマウスの空中アレルゲン吸入誘発が、気道へのＴＨエフェクター細胞遊走をもたらし、かつ強い好中球（ＴＨ１）および好酸球（ＴＨ２）肺粘膜炎症反応に関連する、ネズミ養子移入モデルである（Cohn他、1997、J. Exp. Med. 186, 1737-1747）。ＣＯＰＤの動物モデルの総説としては、SzelenyiおよびMarx、2001、Arzneimittelforschung 51:1004-14を参照されたい。
【０３２６】
ムチン分泌細胞への分化
一実施形態では、病理状態を引き起こす上皮細胞表現型は、ムチン分泌細胞（たとえば、杯細胞）への分化である。候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、上皮細胞がムチン分泌細胞へと分化することを低減または阻害するその能力についてアッセイすることができる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で）。喘息またはＣＯＰＤの動物モデルを用いて、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを同定することができる。たとえば、ＬＰＳで誘発させた肺の炎症に罹患している動物を用いて、ムチン分泌細胞の分化に対する候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの影響のアッセイを行うことができる（米国特許第6,083,973号参照）。候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターで処理したかまたは未処理の対照であるＬＰＳ誘発肺炎症の動物を屠殺し、その後、１０％の中性緩衝ホルマリンで、一定速度の気管内点滴によって（１ｍｌ／分で５ｍｌ）肺灌流を行う。その後、肺葉を切除し、固定液中に２４時間浸したのち、加工する。標準的な方法を用いて５μｍのパラフィン切片を作製することができる。切片をアルシアンブルー（ｐＨ２．５）および／または過ヨウ素酸／シッフ試薬および／または抗ムチン抗体で染色して、肺組織中の粘液物質を検出する。杯細胞の過形成の形態計測分析は、直径が２ｍｍ以上であるすべての気道を計数し、陽性染色細胞を含む気道の割合を決定することによって行うことができる。
【０３２７】
炎症性因子の分泌
一実施形態では、病理状態を引き起こす上皮または内皮細胞表現型は炎症性因子の分泌である。肥満細胞および好酸球が最初に炎症反応の媒介物質を放出する場合があるが、過剰増殖性障害中の上皮細胞は、その表現型を、サイトカインおよびケモカインを分泌するものへと変化させる（Holgate他、1999、Clin. Exp. Allergy 29:90-5）。サイトカイン／ケモカインの産生または分泌のアッセイを行うための当分野で公知の任意の方法を用いて、候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターで処理した上皮細胞もしくは内皮細胞と未処理の細胞との、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの差異を定量することができる。特定の実施形態では、ＩＬ−４、ＩＬ−９、および／もしくはＩＬ−１３の産生または分泌を評価する。
【０３２８】
非新生物性の過剰増殖
一実施形態では、病理状態を引き起こす上皮または内皮細胞表現型は非新生物性の過剰増殖である。当分野で周知の多くのアッセイを用いて、生存、成長および／または増殖を評価することができる。たとえば、細胞増殖は、（３Ｈ）−チミジンの取込みを測定することによって、直接細胞計数によって、細胞周期マーカー（Ｒｂ、ｃｄｃ２、サイクリンＡ、Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｅなど）などの既知の遺伝子の転写、翻訳または活性の変化の検出によってアッセイすることができる。そのようなタンパク質およびｍＲＮＡのレベルならびに活性は、当分野で周知の任意の方法によって決定することができる。たとえば、タンパク質は、市販されている抗体（たとえば、多くの細胞周期マーカー抗体はＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｉｎｃ．のものである）を用いたウエスタンブロットまたは免疫沈降などの公知の免疫診断方法によって定量することができる。ｍＲＮＡは、当分野で周知かつ日常的である方法、たとえば、ノーザン分析、ＲＮａｓｅ保護、逆転写と関連させたポリメラーゼ連鎖反応などによって定量することができる。細胞の生存は、トリパンブルー染色または当分野で公知の他の細胞死もしくは生存マーカーを用いることによって評価することができる。
【０３２９】
本発明は、それだけには限定されないが、以下をはじめとする当分野で公知の様々な技術による、細胞周期および細胞増殖の分析を提供する。
【０３３０】
一例として、ブロモデオキシウリジン（ＢＲＤＵ）の取込みを、増殖細胞を特定するアッセイとして用い得る。ＢＲＤＵアッセイでは、新しく合成されたＤＮＡへのＢＲＤＵの取込みによって、ＤＮＡ合成を受けている細胞集団を特定する。その後、抗ＢＲＤＵ抗体を用いて新しく合成されたＤＮＡを検出し得る（Hoshino他、1986、Int. J. Cancer 38:369；Campana他、1988、J Immunol. Meth. 107:79参照）。
【０３３１】
細胞増殖は、（３Ｈ）−チミジンの取込みを用いても調べることができる（たとえば、Chen、1996、Oncogene 13:1395-403；Jeoung、1995、J. Biol. Chem. 270: 18367-73参照）。このアッセイは、Ｓ期ＤＮＡ合成の定量的な特徴付けを可能にする。このアッセイでは、ＤＮＡを合成している細胞が、新しく合成されたＤＮＡに（３Ｈ）−チミジンを取り込む。その後、シンチレーションカウンター（たとえば、Ｂｅｃｋｍａｎ  ＬＳ３８００液体シンチレーションカウンター）での放射性同位体の計測などの当分野の標準的な技術によって取込みを測定し得る。
【０３３２】
増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の検出も、細胞増殖を測定するために用い得る。ＰＣＮＡは、発現が増殖細胞中、特に細胞周期のＧ１初期およびＳ期に上昇しており、したがって増殖細胞のマーカーとして役割を果たし得る、３６キロダルトンのタンパク質である。陽性細胞は、抗ＰＣＮＡ抗体を用いた免疫染色によって特定される（Li他、1996、Curr. Biol. 6:189-99；Vassilev他、1995、J Cell ScL 108:1205-15参照）。
【０３３３】
細胞増殖は、細胞集団の試料の経時的な計数によって測定し得る（たとえば、毎日の細胞計数）。細胞は、赤血球計および光学顕微鏡観察を用いて計数し得る（たとえば、ＨｙＬｉｔｅ赤血球計、Ｈａｕｓｓｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）。対象となる集団の増殖曲線を得るために、細胞数を時間に対してプロットする。好ましい実施形態では、この方法によって計数する細胞をまずトリパンブルー色素（Ｓｉｇｍａ）と混合して生細胞は色素を排出するようにし、集団の生存メンバーとして計数する。
【０３３４】
細胞のＤＮＡ含有量および／または分裂指数は、たとえば、細胞のＤＮＡ倍数値に基づいて測定し得る。たとえば、細胞周期のＧ１期にある細胞は、一般に２ＮのＤＮＡ倍数値を有する。ＤＮＡが複製されたが有糸分裂まで進行していない細胞（たとえば、Ｓ期中の細胞）は、２Ｎよりも大きく、最大４ＮのＤＮＡ含有量の倍数値を示す。倍数値および細胞周期の動態学は、ヨウ化プロピジウムアッセイを用いてさらに測定し得る（たとえば、Turner他、1998、Prostate 34:175-81を参照）。あるいは、ＤＮＡ倍数性は、コンピューター処理のマイクロデンシトメーター染色システムでのＤＮＡフォイルゲン染色（化学量論的にＤＮＡに結合する）の定量によって決定し得る（たとえば、Bacus、1989、Am. J. Pathol. 135:783-92を参照）。別の実施形態では、ＤＮＡ含有量は、染色体の伸展標本を作製することによって分析し得る（Zabalou、1994、Hereditas. 120: 127-40；Pardue、1994、Meth. Cell Biol. 44:333-351）。
【０３３５】
細胞周期タンパク質（たとえば、ＣｙｃＡ、ＣｙｃＢ、ＣｙｃＥ、ＣｙｃＤ、ｃｄｃ２、Ｃｄｋ４／６、Ｒｂ、ｐ２１、ｐ２７など）の発現は、細胞または細胞集団の増殖状態に関する重要な情報を提供する。たとえば、抗増殖シグナル伝達経路の特定は、ｐ２１ｃｉｐ１の誘導によって示すことができる。細胞中のｐ２１の発現レベルの増大は、細胞周期のＧ１への移行の遅延をもたらす（Harper他、1993、Cell 75:805-816；Li他、1996、Curr. Biol. 6:189-199）。ｐ２１の誘導は、市販されている特異的な抗ｐ２１抗体（たとえば、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）を用いた免疫染色によって特定し得る。同様に、細胞周期タンパク質は、市販されている抗体を用いたウエスタンブロット分析によって調べることができる。別の実施形態では、細胞周期タンパク質を検出する前に細胞集団を同期させる。細胞周期タンパク質はまた、目的タンパク質に対する抗体を用いたＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞分取器）分析によっても検出し得る。
【０３３６】
本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターはまた、細胞増殖が減少または阻害されるように細胞周期の長さもしくは細胞周期の速度を変化させるその能力によって同定することもできる。一実施形態では、細胞周期の長さは、細胞集団の倍加時間によって決定される（たとえば、１つもしくは複数の候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと接触させたかまたは接触させていない細胞を用いる）。別の実施形態では、ＦＡＣＳ分析を用いて、細胞周期の進行期を分析するか、またはＧ１、Ｓ、およびＧ２／Ｍ画分を精製する（たとえば、Delia他、1997、Oncogene 14:2137-47を参照）。
【０３３７】
４．６．７  病理状態を引き起こす内皮細胞表現型を阻害するＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター
本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、好ましくは、病理状態を引き起こす内皮細胞表現型（たとえば、細胞遊走の増加（転移は含まず）、細胞体積の増加、細胞外マトリックス分子（たとえば、コラーゲン、フィブロネクチン、テネイシン、プロテオグリカンなど）の分泌もしくはマトリックスメタロプロテイナーゼ（たとえば、ゼラチナーゼ、コラゲナーゼ、およびストロメライシン）の分泌、過剰増殖、および血管形成の増加）を低減させ得る（かつ好ましくは阻害し得る）。当業者は、候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、そのような挙動を低減させる（かつ好ましくは阻害する）能力についてアッセイすることができる。具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、病理状態を引き起こす内皮細胞表現型を、対照（たとえば、ＰＢＳまたはＩｇＧ）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または少なくとも９９％低減させる（かつ好ましくは阻害する）。
【０３３８】
細胞遊走
一実施形態では、病理状態を引き起こす内皮細胞表現型は細胞遊走の増加（転移を含まない）である。候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、内皮細胞遊走を減少または阻害する能力についてアッセイすることができる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で）。当分野で公知の任意のアッセイを用いて、内皮細胞遊走を測定することができる。たとえば、遊走は、ボイデンチャンバ遊走アッセイで評価することができる。簡潔に述べると、内皮細胞（たとえば、平滑筋細胞）をチャンバの上部ウェルに加えることができる。細胞を付着させたのち、１つまたは複数の候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを上部チャンバに加えることができる。誘引物質（たとえば、ＰＤＧＦ）を下部チャンバの培地に加えるかまたは加えずに、細胞を下部チャンバに遊走させることができる。通り抜けて下部チャンバまで遊走した細胞を染色および計数することができる。
【０３３９】
フィブロネクチンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼなどの細胞外マトリックス分子の分泌
一実施形態では、病理状態を引き起こす内皮細胞表現型は、フィブロネクチンまたはマトリックスメタロプロテイナーゼなどの細胞外マトリックス分子の分泌である。細胞外マトリックス分子およびマトリックスメタロプロテイナーゼの産生または分泌のアッセイを行うための当分野で公知の任意の方法を用いて、候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターで処理した細胞と未処理の内皮細胞との差異をｉｎ  ｖｉｔｒｏもしくはｉｎ  ｖｉｖｏで定量することができる。たとえば、ウエスタンブロットもしくはノーザンブロット分析、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応、またはＥＬＩＳＡアッセイを用いて発現レベルを定量することができる。マトリックスメタロプロテイナーゼの活性は、ザイモグラフィーをはじめとする当分野で公知の任意の方法によってアッセイすることができる（たとえば、Badier-Commander、2000、J. Pathol. 192:105-112を参照）。
【０３４０】
具体的な一実施形態では、ゼラチナーゼ−Ａ（ＭＭＰ−２としても知られる）の発現レベルおよび／または活性レベルを減少させる能力を用いて、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのスクリーニングを行う。別の実施形態では、フィブロネクチンの発現を調節する能力を用いて、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのスクリーニングを行う。
【０３４１】
非新生物性の過剰増殖
一実施形態では、病理状態を引き起こす内皮細胞表現型は、非新生物性の過剰増殖および／または異常な血管形成である。当分野で周知の多くのアッセイを用いて、生存、成長および／または増殖を評価することができる。セクション４．６に記載の任意のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを用いて、候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターが存在する場合もしくは存在しない場合において内皮細胞の成長、増殖および／または細胞生存を評価することができる。内皮細胞過剰増殖の動物モデルを用いることもできる。たとえば、再狭窄のｉｎ  ｖｉｖｏモデルには、ニュージーランドホワイト種ウサギを用いることができる（たとえば、Feldman他、2000、Circulation;l01:908-16；Feldman他、2001、Circulation 103:3117-22；Frederick他、2001、Circulation 104:3121-4を参照）。簡潔に述べると、直径３ｍｍのバルーンを用いて両側腸骨動脈バルーン血管形成術を行う（３×ｌ分間の膨張、１０ａｔｍ）；その後、バルーンの上に装着した長さ１５ｍｍのＣｒｏｗｎステント（Ｃｏｒｄｉｓ）を右腸骨動脈のみに移植した（３０秒間の膨張、１０ａｔｍ）。傷害の１、３、７、３０、または６０日間後に動物を安楽死させた。それぞれの時点で、右（ステント）および左（バルーン血管形成術）の腸骨動脈を回収し、氷冷生理食塩水を流し、すべての脂肪組織を取り除き、２つまたは３つのセグメントに分割した。切除した動脈の形態計測分析および免疫組織化学を行う。ステント有りおよびステント無しの動脈のセグメントを４％パラホルムアルデヒドで固定する。動脈のヘマトキシリン−フロキシン−サフランで染色した断面切片の形態計測分析を行う。免疫組織化学には、動脈セグメントをＯＣＴコンパウンドに包埋し、微小ピンセットでステントの支柱を取り除いたあとに液体窒素および冷イソペンタン中で凍結させる。それぞれのブロックから４マイクロメートルの断面切片を得て、たとえば、抗細胞外マトリックス分子または抗マトリックスメタロプロテイナーゼ抗体で免疫染色を行う。
【０３４２】
血管形成
候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、血管形成を調節するその能力についてアッセイすることができる（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方で）。血管形成または血管形成活性を評価するための多くのアッセイが当分野で周知である。血管形成アッセイの一般的な総説としては、たとえば、Auerbach他、2003、Clinical Chemistry 49:32-40（その全体が参照により本明細書中に組み込まれる）を参照されたい。たとえば、マウス角膜血管形成アッセイを行い得る（たとえば、Cheng他、Mol. Cancer Res.、2002、1:2-l1およびKenyon他、1996、Invest. Ophthalmol. Vis. Sd. 37:1625-1632を参照）。簡潔に述べると、スクラルファートと、ビヒクル単独（ＰＢＳもしくはＩｇＧ）、血管形成因子（たとえば、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ）または本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターのいずれかとを含むヒドロンペレットを作製する。ペレットを、マウス（たとえば、Ｃ５７／ＢＬ６；Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、メイン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）の角膜縁の１ｍｍ外側に作った角膜マイクロポケット内に、外科的に移植する。移植後５日目に、ペレットを含む経線中の極軸から３５〜５０°の初期角度で、Ｚｅｉｓｓスプリットランプを用いて、角膜の写真撮影を行う。全角膜画像のうち血管新生化した割合（ＶＡ）、ならびに血管新生した領域（ＲＶＤ）および全角膜画像（ＴＶＤ）内の両方における血管新生毛細血管を特徴付けるピクセルの比を、Ｂｉｏｑｕａｎｔソフトウェア（Ｖａｎｄｅｒｂｉｌｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ、テネシー州Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ）を用いて計算する。統計的解析は、両側対応スチューデントｔ検定を用いることによって行い得る。血管形成を調節する候補ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを同定するために用いることができる血管形成アッセイの他の非限定的な例としては、ＣＡＭアッセイ、マトリゲルプラグアッセイ、内皮細胞遊走アッセイ、管形成アッセイ、大動脈輪アッセイ、およびニワトリ大動脈弓アッセイが含まれる（Auerbach他、2003、Clinical Chemistry 49:32-40）。
【０３４３】
４．７  治療の生物活性
４．７．１  毒性
本発明の予防的および／または治療的プロトコルの毒性ならびに有効性は、細胞培養物または実験動物における、たとえば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％に対して治療上有効な用量）を決定するための標準的な製薬上の手順によって決定することができる。毒性と治療効果との用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比として表すことができる。高い治療指数を示す予防剤および／または治療剤が好ましい。毒性副作用を示す予防剤および／または治療剤を用いてもよいが、未罹患細胞に対する潜在的な損傷を最小限にすることで、副作用を低減させるために、そのような薬剤を患部組織の部位に標的化させる送達系を設計することに注意を払うべきである。
【０３４４】
細胞培養物アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトで用いるための予防剤および／または治療剤の投与量範囲の設定に用いることができる。そのような薬剤の投与量は、僅かな毒性または毒性なしの、ＥＤ５０が含まれる循環濃度の範囲内にあることが好ましい。投与量は、用いる剤形および利用する投与経路に応じてこの範囲内で変動し得る。本発明の方法で用いるどの薬剤においても、治療上有効な用量を最初は細胞培養物アッセイから推定することができる。細胞培養物で決定されたＩＣ５０（すなわち、症状の最大半値阻害を達成する試験化合物の濃度）が含まれる循環血漿濃度範囲を達成するために、用量を動物モデルで設定し得る。このような情報を用いて、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定することができる。血漿中のレベルは、たとえば、高速液体クロマトグラフィーによって測定し得る。
【０３４５】
４．７．２  アッセイ
本発明のプロトコルおよび組成物は、ヒトで使用する前に、所望の治療的または予防的活性についてｉｎ  ｖｉｔｒｏで、その後ｉｎ  ｖｉｖｏで試験することが好ましい。たとえば、特定の予防的または治療的プロトコルの実施が指示されるかどうかを決定するために用いることができるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイとしては、患者の組織試料を培養して増殖させ、プロトコルに曝すか、または他の様式でそれを実施し、組織試料に対するそのようなプロトコルの効果（たとえば、ＥｐｈＡ２−内在性リガンドの結合の減少、エフリンＡ１の遺伝子発現の減少、ＥｐｈＡ２の遺伝子発現のアップレギュレーション、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性もしくはタンパク質蓄積の増加、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化の減少、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の増殖の増加、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存の増加、上皮および／もしくは内皮細胞層の完全性の維持／再構築、ＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン）の沈着の減少、ならびに／または血管形成の減少）を観察する、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物アッセイが挙げられる。接触させた細胞の前述の特性のうち任意のものの実証は、治療剤が患者の状態の治療に有効であることを示す。あるいは、患者由来の細胞を培養する代わりに、上皮および／もしくは内皮細胞株の細胞を用いて治療剤および方法のスクリーニングを行い得る。当分野で標準的な多くのアッセイを用いて、このような生存、成長、および／または増殖を評価することができる。たとえば、細胞増殖は、３Ｈ−チミジンの取込みを測定することによって、直接細胞計数によって、プロトオンコジーン（たとえば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）などの既知の遺伝子または細胞周期マーカーの転写活性の変化を検出することによって、アッセイすることができる。細胞の生存はトリパンブルー染色によって評価することができる。
【０３４６】
一部の実施形態では、障害が非新生物性過剰増殖性の肺上皮細胞障害である場合は、肺上皮のｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルを用いて、本発明のプロトコルおよび組成物の予防的／治療的有用性を実証することができる。細胞を培養して、気道の上皮組織に非常によく似ているヒト由来の気管／気管支上皮細胞（たとえば、ＮＨＢＥ細胞またはＴＢＥ細胞）から偽重層化した高度に分化したモデル組織を形成させることができる。培養物を空気−液体界面にある細胞培養挿入物上で増殖させることができ、これにより、気道炎症および刺激性の研究、ならびに吸入毒性研究における揮発性物質の気相曝露が可能となる。吸入薬物送達研究のために経上皮透過性を測定することができる。そのようなモデル系は、ＥｐｉＡｉｒｗａｙＴＭ組織モデル系（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．、メリーランド州Ａｓｈｌａｎｄ）のように市販されている。一部の実施形態では、細胞培養物を、本発明の治療的および／もしくは予防的プロトコルに曝すか、または他の様式でそれを実施し、細胞培養物に対するそのようなプロトコルの効果（たとえば、ＥｐｈＡ２−内在性リガンドの結合の減少、エフリンＡ１の遺伝子の発現および／もしくは翻訳の減少、ＥｐｈＡ２の遺伝子の発現および／もしくは翻訳のアップレギュレーション、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性もしくはタンパク質蓄積の増加、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化の減少、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の増殖の増加、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存の増加、上皮および／もしくは内皮細胞層の完全性の維持／再構築、ＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン）の沈着の減少、ならびに／または血管形成の減少）を観察する。接触させた細胞の前述の特性のうち任意のものの実証は、治療剤が非新生物性過剰増殖性の肺上皮細胞障害の治療に有効であることを示す。さらに、当分野で標準的なアッセイを用いて、細胞の生存、成長、および／または増殖を評価することができる。たとえば、細胞増殖は、３Ｈ−チミジンの取込みを測定することによって、直接細胞計数によって、プロトオンコジーン（たとえば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）などの既知の遺伝子または細胞周期マーカーの転写活性の変化を検出することによって、アッセイすることができる。細胞の生存はトリパンブルー染色によって評価することができる。
【０３４７】
他の実施形態では、障害は肺線維症であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルはブレオマイシンで処理したＢｅａｓ−２Ｂ細胞（ＳＶ４０ウイルスで形質転換させた気管支上皮細胞）である。別の実施形態では、肺線維症のｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、マウスの感受性系統のブレオマイシン処理である。ブレオマイシンは、マウスにおいて肺上皮細胞死、次いで急性好中球流入、その後に慢性炎症および実質線維症を誘発する。肺線維症のモデルとしてのブレオマイシン処理肺上皮細胞は、ＩＰＦなどのヒト肺線維性疾患の主要な病理的特長を再現する。一部の実施形態では、ブレオマイシンで処理したＢｅａｓ−２Ｂ細胞またはブレオマイシンで処理したマウスを、本発明の治療的もしくは予防的プロトコルに曝すか、または他の様式でそれを実施し、このようなブレオマイシン処理マウス由来の細胞培養物または組織試料に対するそのようなプロトコルの効果（たとえば、ＥｐｈＡ２−内在性リガンドの結合の減少、エフリンＡ１の遺伝子の発現および／もしくは翻訳の減少、ＥｐｈＡ２の遺伝子の発現および／もしくは翻訳のアップレギュレーション、ＥｐｈＡ２のタンパク質安定性もしくはタンパク質蓄積の増加、ＥｐｈＡ２の細胞質側末端リン酸化の減少、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の増殖の増加、ＥｐｈＡ２を発現する細胞の生存の増加、上皮および／もしくは内皮細胞層の完全性の維持／再構築、ＥＣＭ成分（たとえば、コラーゲン）の沈着の減少、ならびに／または血管形成の減少）を観察する。接触させた細胞の前述の特性のうち任意のものの実証は、治療剤が非新生物性過剰増殖性の肺上皮細胞障害の治療に有効であることを示す。さらに、当分野で標準のアッセイを用いて、細胞の生存、成長、および／または増殖を評価することができる。たとえば、細胞増殖は、３Ｈ−チミジンの取込みを測定することによって、直接細胞計数によって、プロトオンコジーン（たとえば、ｆｏｓ、ｍｙｃ）などの既知の遺伝子または細胞周期マーカーの転写活性の変化を検出することによって、アッセイすることができる。細胞の生存はトリパンブルー染色によって評価することができる。
【０３４８】
治療で用いる化合物は、ヒトで試験する前に、それだけには限定されないが、ラット、マウス、ニワトリ、ウシ、サル、ウサギ、ハムスターなどをはじめとする適切な動物モデル系で試験することができる。その後、化合物を適切な臨床試験で用いることができる。本発明の好ましい実施形態では、肺線維症の動物モデルはマウスの感受性系統のブレオマイシン処理である。
【０３４９】
さらに、当業者に公知の任意のアッセイを用いて、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）もしくは線維症関連疾患などの非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害を治療あるいは予防するために本明細書中に開示されている組合せ治療の、予防的および／または治療的有用性を評価することができる。
【０３５０】
４．７．３  投与量
それだけには限定されないが、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬をはじめとする非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の治療、管理、または予防に有効となる本発明の組成物の量は、標準的な研究技術によって決定することができる。たとえば、上記疾患の任意のものの治療、管理、または予防に有効となる組成物の投与量は、組成物を、たとえば、当業者に公知の動物モデル（たとえば、ブレオマイシンで処理したマウスモデル）などの動物モデルに投与することによって決定することができる。さらに、最適な投与量範囲の特定を支援するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを任意選択で用いてもよい。
【０３５１】
好ましい有効用量の選択は、当業者に知られているいくつかの要素を考慮することによって、当業者によって決定することができる（たとえば、臨床試験によって）。そのような要素には、治療もしくは予防する障害、関与する症状、患者の体重、患者の免疫状態および投与した医薬組成物の精度を反映する当業者に知られている他の要素が含まれる。
【０３５２】
配合物中に用いる正確な用量は、投与経路、ならびに、それだけには限定されないが、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬をはじめとする非新生物性過剰増殖性の上皮および／または内皮細胞障害の重篤度にも依存し、実施者の判断およびそれぞれの患者の状況に応じて決定すべきである。有効用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは動物モデル試験系から導いた用量応答曲線から推定し得る。
【０３５３】
本発明に包含される抗体、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質については、患者に投与する投与量は、典型的には患者の体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与する投与量は、患者の体重１ｋｇあたり０．０００１ｍｇ〜２０ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜１０ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜５ｍｇ、０．０００１〜２ｍｇ、０．０００１〜１ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．７５ｍｇ、０．０００１ｍｇ〜０．５ｍｇ、０．０００１ｍｇ／ｋｇ〜０．２５ｍｇ、０．０００１〜０．１５ｍｇ、０．０００１〜０．１０ｍｇ、０．００１〜０．５ｍｇ、０．０１〜０．２５ｍｇ、０．０１〜０．１０ｍｇ、０．１ｍｇまたは２０ｍｇ、より好ましくは患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。一般に、ヒト抗体およびヒト化抗体は、外来ポリペプチドに対する免疫応答により、他の生物種由来の抗体よりも人体内でより長い半減期を有する。したがって、多くの場合、ヒト抗体の低い投与量および頻度のより低い投与が可能である。さらに、本発明に包含される抗体、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドおよび融合タンパク質またはその断片の投与量ならびに投与の頻度は、たとえば、脂質化などの修飾によって抗体の取込みおよび組織貫通を増強させることによって低減させることができる。
【０３５４】
小分子では、小分子の例示的な用量としては、被験体もしくは試料重量１キログラムあたりミリグラムまたはマイクログラム量の小分子が挙げられる（たとえば、約１マイクログラム／キログラム〜約５００ミリグラム／キログラム、約１００マイクログラム／キログラム〜約５ミリグラム／キログラム、または約１マイクログラム／キログラム〜約５０マイクログラム／キログラム）。
【０３５５】
患者に対して実施する他の治療では、様々な免疫調節性治療剤の典型的な用量が当分野で知られている。本発明を考慮すると、特定の好ましい実施形態は、併用療法の処方計画において、単一の薬剤の投与について推奨される投与量よりも低い投与量の投与を包含するであろう。
【０３５６】
特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１抗原ペプチドおよび抗イディオタイプ抗体は、静脈内注射用には１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、および２５ｍｇ／ｍｌで、繰返しの皮下投与および筋肉内注射には５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、および８０ｍｇ／ｍｌで配合する。
【０３５７】
ＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターが細菌ワクチンである場合は、ワクチンは、約１×１０２ＣＦＵ／ｍｌ〜約１×１０１２ＣＦＵ／ｍｌの範囲の量、たとえば、１×１０２ＣＦＵ／ｍｌ、５×ｌ０２ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、５×１０３ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、５×１０４ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、５×１０５ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０６ＣＦＵ／ｍｌ、５×ｌ０６ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０７ＣＦＵ／ｍｌ、５×ｌ０７ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０８ＣＦＵ／ｍｌ、５×ｌ０８ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０９ＣＦＵ／ｍｌ、５×ｌ０９ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０１０ＣＦＵ／ｍｌ、５×ｌ０１０ＣＦＵ／ｍｌ、１×１０１１ＣＦＵ／ｍｌ、５×１０１１ＣＦＵ／ｍｌ、または１×１０１２ＣＦＵ／ｍｌで配合することができる。
【０３５８】
ＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１抗原ペプチドまたは抗イディオタイプ抗体では、患者に投与する投与量は、典型的には患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜１００ｍｇである。好ましくは、患者に投与する投与量は、患者の体重１ｋｇあたり０．１ｍｇ〜２０ｍｇ、より好ましくは患者の体重１ｋｇあたり１ｍｇ〜１０ｍｇである。
【０３５９】
本発明の細菌性ＥｐｈＡ２およびエフリンＡ１ワクチンの投与量に関して、投与量はコロニー形成単位（ｃ．ｆ．ｕ．）の値に基づいている。一般に、様々な実施形態では、投与量範囲は約１．０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ〜約１×１０１０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；約１．０ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ〜約１×１０８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；約１×１０２ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ〜約１×１０８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ；約１×１０４ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇ〜約１×１０８ｃ．ｆ．ｕ．／ｋｇである。有効用量は、動物モデル試験系から導いた用量応答曲線から推定し得る。特定の例示的な実施形態では、投与量範囲は、ネズミＬＤ５０の０．００１倍〜１０，０００倍、ネズミＬＤ５０の０．０１倍〜１，０００倍、ネズミＬＤ５０の０．ｌ倍〜５００倍、ネズミＬＤ５０の０．５倍〜２５０倍、ネズミＬＤ５０の１倍〜１００倍、およびネズミＬＤ５０の５倍〜５０倍である。特定の具体的な実施形態では、投与量範囲は、ネズミＬＤ５０の０．００．１倍、０．０１倍、０．ｌ倍、０．５倍、１倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、５００倍、１，０００倍、５，０００倍または１０，０００倍である。
【０３６０】
本発明は、それだけには限定されないが、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬をはじめとする、非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の予防、治療、管理、または予防に有効であると以前に考えられていたよりも低い用量の既知の治療を投与する、任意の方法を提供する。好ましくは、より低い用量の既知の免疫調節剤を、より低い用量の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと組み合わせて投与する。
【０３６１】
４．８  医薬組成物
本発明の組成物には、単位剤形の調製に用いることができる、経口医薬組成物（たとえば、無菌的でない組成物）および非経口医薬組成物（すなわち、被験体または患者への投与に適した無菌的な組成物）の製造に有用なバルク薬物が含まれる。そのような組成物は、予防上もしくは治療上有効な量の本明細書中に開示されている予防剤および／または治療剤、あるいはそれらの薬剤と製薬上許容される担体との組合せを含む。好ましくは、本発明の組成物は、予防上または治療上有効な量の１つもしくは複数の本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターおよび製薬上許容される担体を含む。さらなる実施形態では、本発明の組成物はさらに、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター以外の１つもしくは複数の予防剤または治療剤、たとえば、免疫調節剤、抗炎症剤、抗血管形成剤またはＴＮＦ−αアンタゴニストを含む。
【０３６２】
具体的な実施形態では、用語「製薬上許容される」とは、連邦政府もしくは州政府の規制機関に認可されているか、または動物、より詳細にはヒトで使用するために米国薬局方もしくは他の一般に認知されている薬局方に記載されていることを意味する。用語「担体」とは、治療剤と一緒に投与する希釈剤、賦形剤アジュバント（たとえば、フロイントアジュバント、より好ましくはＣｈｉｒｏｎ（カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ）から入手可能なＭＦ５９Ｃ．１アジュバント、賦形剤、またはビヒクルをいう。他のそのようなアジュバントとしては、それだけには限定されないが、水酸化アルミニウムなどの鉱物ゲル；リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオンなどの界面活性物質；他のペプチド；油性乳剤；ならびにＢＣＧおよびコリネバクテリウムパルブム（Corynebacterium parvum）などの潜在的に有用なヒトアジュバントが挙げられる。製薬用担体は、水、および油（ピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油等の石油、動物、野菜または合成起源のものなど）などの、無菌的な液体であることができる。医薬組成物を静脈内投与する場合は、水が好ましい担体である。生理食塩水およびデキストロース水溶液およびグリセロール液も、液体担体として、特に注射用溶液用に用いることができる。適切な製薬用賦形剤としては、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどが挙げられる。組成物は、所望する場合は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むことができる。これらの組成物は、溶液剤、懸濁液剤、乳剤、錠剤、丸薬、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとることができる。
【０３６３】
一般に、本発明の組成物の成分は、個別にまたは一緒に混合して、単位剤形で、たとえば、乾燥凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として、活性剤の量を示したアンプルまたはサシェなどの密閉容器中で供給する。点滴によって組成物を投与する場合は、無菌的な製薬グレードの水または生理食塩水を含む輸液ボトルと共に分配することができる。注射によって組成物を投与する場合は、投与前に成分を混合し得るように、無菌的な注射用水または生理食塩水のアンプルを提供することができる。
【０３６４】
本発明の組成物は、中性または塩の形態で製剤化することができる。製薬上許容される塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等に由来するものなどの陰イオンと形成させた塩、およびナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等に由来するものなどの陽イオンと形成させた塩が含まれる。
【０３６５】
様々な送達系が公知であり、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーター、または本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターと非新生物性過剰増殖性の上皮および／もしくは内皮細胞障害の予防／治療に有用なＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターでない治療との組合せを投与するために用いることができ、これには、たとえば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル中へのカプセル封入、抗体または抗体断片を発現することができる組換え細胞、受容体に媒介されるエンドサイトーシス（たとえば、WuおよびWu、1987、J. Biol. Chem. 262:4429-4432を参照）、レトロウイルスまたは他のベクターの一部としての核酸の構築などがある。
【０３６６】
本発明の治療（たとえば、予防剤または治療剤）の投与方法としては、それだけには限定されないが、非経口投与（たとえば、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内および皮下）、硬膜外、ならびに粘膜（たとえば、鼻腔内、吸入、および経口経路）が挙げられる。具体的な実施形態では、本発明の予防剤または治療剤を筋肉内投与、静脈内投与、または皮下投与する。予防剤または治療剤は、任意の都合よい経路によって、たとえば、点滴またはボーラス注射によって、上皮または粘膜皮膚（たとえば、口腔粘膜、直腸および腸管粘膜など）からの吸収によって投与してよく、他の生物活性のある薬剤と共に投与してよい。投与は全身性または局所的であることができる。
【０３６７】
具体的な実施形態では、本発明の予防剤または治療剤を、治療を必要としている領域に局所に投与することが望ましい場合がある。これは、たとえば、それだけには限定されないが、局所注入、注射によって、または移植片を用いて（該移植片は、シラスチック膜などの膜もしくは線維をはじめとする多孔性、非多孔性、またはゼラチン性物質である）、達成し得る。
【０３６８】
さらに別の実施形態では、予防剤または治療剤は徐放系または持続放出系中で送達することができる。一実施形態では、ポンプを用いて徐放性または持続放出を達成し得る（Langer、上記；Sefton、1987、CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20；Buchwald他、1980、Surgery 88:507；Saudek他、1989、N. Engl. J. Med. 321 :574参照）。別の実施形態では、高分子材料を用いて本発明の抗体もしくはその断片の徐放性または持続放出を達成することができる（たとえば、Medical Applications of Controlled Release、LangerおよびWise編、CRC Pres.、フロリダ州Boca Raton(1974)；Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance、SmolenおよびBall編、Wiley、New York(1984)；RangerおよびPeppas、1983、J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61を参照；Levy他、1985、Science 228:190；During他、1989、Ann. Neurol. 25:351；Howard他、1989、J. Neurosurg. 7 1:105)；米国特許第5,679,377号；同第5,916,597号；同第5,912,015号；同第5,989,463号；同第5,128,326号；国際公開第WO 99/15154号および同第WO 99/20253号も参照されたい。持続放出製剤中で用いるポリマーの例としては、それだけには限定されないが、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（メタクリル酸）、ポリグリコリド（ＰＬＧ）、ポリ酸無水物、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレングリコール）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、およびポリオルトエステルが含まれる。好ましい実施形態では、持続放出製剤中で用いるポリマーは、不活性であり、浸出可能な不純物を含まず、保管中に安定であり、無菌的であり、生分解性である。さらに別の実施形態では、徐放系または持続放出系を予防または治療の標的の近傍に配置することができ、これにより全身用量の一部分のみで足りることになる（たとえば、Goodson、Medical Applications of Controlled Release、上記、第2巻、ページ115-138(1984)を参照）。
【０３６９】
徐放系は、Ｌａｎｇｅｒの総説（1990、Science 249:1527-1533）に記載されている。当業者に知られている任意の技術を用いて、本発明の１つまたは複数の治療剤を含む持続放出製剤を生成することができる。たとえば、米国特許第4,526,938号；国際公開第WO 91/05548号および同第WO 96/20698号；Ning他、1996、Radiotherapy & Oncology 39:179-189；Song他、1995、PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397；Cleek他、1997、Pro. Int'l. Symp. Control. ReI. Bioact. Mater. 24:853-854；ならびにLam他、1997、Proc. Int'l. Symp. Control ReI. Bioact. Mater. 24:759-760（そのそれぞれがその全体で本明細書中に参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０３７０】
本発明に従って使用する医薬組成物は、１つもしくは複数の生理的に許容される担体または賦形剤を用いて、従来の様式で製剤化することができる。好ましくは、薬剤を製剤化して全身投与する。製剤化および投与の技術は、「Remington: The Science and Practice of Pharmacy」、第19版、1995、Lippincott Williams & Wilkins、メリーランド州Baltimoreに見出すことができる。
【０３７１】
したがって、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターならびにその生理的に許容される塩および溶媒和物は、吸入またはガス注入による投与（口もしくは鼻のどちらかから）あるいは経口、非経口または粘膜投与（頬腔、経膣、直腸、舌下など）用に製剤化し得る。好ましい実施形態では、局所または全身非経口投与を用いる。
【０３７２】
経口投与のためには、医薬組成物は、たとえば、結合剤（たとえば、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンもしくはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（たとえば、ラクトース、微結晶セルロースもしくはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（たとえば、ステアリン酸マグネシウム、タルクもしくはシリカ）；崩壊剤（たとえば、ジャガイモデンプンもしくはグリコール酸ナトリウムデンプン）；または湿潤剤（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム）などの製薬上許容される賦形剤を用いて、従来の手段によって調製した、錠剤あるいはカプセルの剤形をとり得る。錠剤は、当分野で周知の方法によってコーティングしてもよい。経口投与用の液体製剤は、たとえば、溶液剤、シロップ剤もしくは懸濁液剤の剤形をとってもよく、または使用前に水もしくは他の適切なビヒクルで調製する乾燥製品としてもよい。そのような液体製剤は、従来の手段によって、懸濁化剤（たとえば、ソルビトールシロップ、セルロース誘導体または水素化食用脂）；乳化剤（たとえば、レシチンまたはアカシア）；非水性ビヒクル（たとえば、アーモンド油、油状エステル、エチルアルコールまたは精留植物油）；および保存料（たとえば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸またはソルビン酸）などの製薬上許容される添加剤を用いて調製し得る。製剤は、必要に応じて緩衝塩、香料、着色剤および甘味剤も含み得る。
【０３７３】
活性化合物に徐放性を与えるために経口投与用の製剤を適切に配合し得る。
【０３７４】
頬腔投与のためには、組成物は、従来の様式で製剤化した錠剤またはロゼンジの剤形をとり得る。
【０３７５】
吸入による投与のためには、本発明に従って使用する予防剤または治療剤を、適切な噴霧剤、たとえば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適切な気体を用いて加圧パックまたは噴霧器からのエアロゾルスプレーの形態で好都合に送達する。加圧エアロゾルの場合は、計量された量を送達するための弁を備えることによって単位投与量を決定し得る。吸入器またはガス注入器で用いるための、たとえば、ゼラチンのカプセルおよびカートリッジを、化合物とラクトースまたはデンプンなどの適切な粉末基材との散剤混合物を含むように製剤化し得る。
【０３７６】
予防剤または治療剤を、注射、たとえば、ボーラス注射または持続注入による非経口投与用に製剤化し得る。注射用の製剤は、単位剤形、たとえば、アンプル中で、または複数用量容器で、保存料を加えて提供し得る。組成物は懸濁液剤、溶液剤または油性もしくは水性ビヒクル中の乳剤などの剤形をとってよく、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤用物質を含んでいてもよい。あるいは、活性成分は、使用前に適切なビヒクル、たとえば、無菌的な発熱物質を含まない水で調製するための散剤形態であってもよい。
【０３７７】
また予防剤または治療剤を、たとえば、カカオ脂もしくは他のグリセリドなどの従来の坐薬基材を含む、坐薬または保留浣腸などの直腸製剤中に製剤化してもよい。
【０３７８】
既に記載した製剤に加えて、予防剤または治療剤をデポー製剤として製剤化してもよい。このような長時間作用性の製剤は、移植（たとえば、皮下もしくは筋肉内）または筋肉内注射によって投与し得る。したがって、たとえば、予防剤または治療剤を適切な高分子もしくは疎水性物質（たとえば、許容される油中の乳剤として）またはイオン交換樹脂と共に、あるいはやや溶けにくい誘導体、たとえば、やや溶けにくい塩として製剤化し得る。
【０３７９】
本発明はまた、予防剤または治療剤が量を示したアンプルもしくはサシェなどの密閉容器中に封入されることも提供する。一実施形態では、予防剤または治療剤を密閉容器中で乾燥滅菌凍結乾燥粉末または水を含まない濃縮物として供給し、これを、たとえば、水または生理食塩水で、被験体への投与に適した濃度まで再調製することができる。
【０３８０】
本発明の好ましい実施形態では、様々な化学療法剤、生物学的／免疫療法的治療剤およびホルモン性治療剤の製剤化ならびに投与は当分野で知られており、多くの場合Physician 's Desk Reference, 第58版(2004)に記載されている。
【０３８１】
本発明の他の実施形態では、放射性同位体などの放射線療法剤を、カプセル中の液体または飲料として、経口で与えることができる。放射性同位体は、静脈内注射用に製剤化することもできる。熟練した腫瘍専門医は、好ましい製剤および投与経路を決定することができる。
【０３８２】
特定の実施形態では、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターは、静脈内注射のためには１ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、および２５ｍｇ／ｍｌで、繰返しの皮下投与および筋肉内注射のためには５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、および８０ｍｇ／ｍｌで製剤化する。
【０３８３】
所望する場合は、組成物を、活性成分を含む１つもしくは複数の単位剤形を含み得るパックまたはディスペンサー装置中で提供してもよい。パックは、たとえば、ブリスターパックなど金属またはプラスチック箔を含んでいてもよい。パックまたはディスペンサー装置には、投与の指示を添付してもよい。
【０３８４】
４．８．１．遺伝子治療
具体的な実施形態では、ヌクレオチドである本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターを、それだけには限定されないが、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬をはじめとする非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害を、遺伝子治療によって治療、管理、または予防するために、投与する。遺伝子治療とは、被験体に、発現されるかまたは発現可能な核酸を投与することによって行う治療をいう。本発明の具体的な実施形態では、アンチセンス核酸が産生され、予防的または治療的効果を媒介する。本発明の別の具体的な実施形態では、遺伝子治療はＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターワクチン系治療ではない（たとえば、ＥｐｈＡ２またはエフリンＡ１ワクチンではない）。
【０３８５】
当分野で利用可能な遺伝子治療方法のうち任意のものを、本発明に従って用いることができる。例示的な方法を以下に記載する。
【０３８６】
遺伝子治療方法の一般的な総説としては、Goldspiel他、1993、Clinical Pharmacy 12:488；WuおよびWu、1991、Biotherapy 3:87；Tolstoshev、1993、Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573；Mulligan、1993、Science 260:926-932；ならびにMorganおよびAnderson、1993、Ann. Rev. Biochem. 62:191；1993年5月、TIBTECH 11:155を参照されたい。用いることができる組換えＤＮＡ技術の分野で一般的に知られている方法は、Ausubel他編、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、NY(1993)；およびKriegler、Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual、Stockton Press、NY(1990)に記載されている。
【０３８７】
好ましい態様では、本発明の組成物は、ＥｐｈＡ２および／もしくはエフリンＡ１の発現を減少させるＥｐｈＡ２ならびに／またはエフリンＡ１核酸を含み、該核酸は、適切な宿主中で核酸を発現する発現ベクターの一部である。具体的には、そのような核酸はプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、該プロモーターは誘導性または構成的であり、組織特異的であってもよい。別の特定の実施形態では、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１の発現を減少させる核酸ならびに任意の他の所望の配列が、ゲノム中の所望の部位での相同組換えを促進する領域につなげられており、したがってエフリンＡ１の発現を減少させる核酸の染色体内発現がもたらされる、核酸分子が使用される（KollerおよびSmithies、1989、PNAS 86:8932；Zijlstra他、1989、Nature 342:435）。
【０３８８】
被験体への核酸の送達は、直接的であるか、すなわち、被験体を核酸もしくは核酸保有ベクターに直接曝すか、または間接的である、すなわち、細胞をまずｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて核酸で形質転換し、その後被験体に導入する。これらの２つの手法は、それぞれｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子治療として知られている。具体的な実施形態では、核酸配列をｉｎ  ｖｉｖｏで直接投与する。これは、当分野で公知の多数の方法のうち任意のもの、たとえば、それらを適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、それらが細胞内に入るように、たとえば、欠陥レトロウイルスもしくは弱毒化レトロウイルスまたは他のウイルスベクターを用いた感染によって（米国特許第4,980,286号参照）、または裸のＤＮＡの直接注入によって、または微粒子銃（たとえば、遺伝子銃；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）を用いることによって、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくは形質移入剤でコーティングするか、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセルへのカプセル封入によって、または核に侵入することが知られているペプチドと連結させて投与することによって、または受容体に媒介されるエンドサイトーシスに供されるリガンドと連結させて投与することによって（たとえば、WuおよびWu、1987、J. Biol. Chem. 262:4429を参照）（受容体を特異的に発現する標的細胞種を用いることができる）などにより投与することによって、達成することができる。別の実施形態では、核酸−リガンドの複合体を形成することができ、その場合、リガンドが膜融合ウイルスペプチドを含むためエンドソームが破壊され、これにより核酸がリソソーム分解を回避することが可能となる。さらに別の実施形態では、特異的な受容体を標的化することによって、核酸をｉｎ  ｖｉｖｏで細胞特異的な取込みおよび発現に向かわせることができる（たとえば、国際公開第WO 92/06180号；同第WO 92/22635号；同第WO 92/20316号；同第WO 93/14188号、同第WO 93/20221号を参照）。あるいは、核酸を細胞に導入し、相同組換えにより、発現のために宿主細胞ＤＮＡ内に取り込ませることができる（KollerおよびSmithies、1989、PNAS 86:8932；ならびにZijlstra他、1989、Nature 342:435）。
【０３８９】
具体的な実施形態では、ＥｐｈＡ２および／またはエフリンＡ１の発現を減少させる核酸配列を含むウイルスベクターを用いる。たとえば、レトロウイルスベクターを用いることができる（Miller他、1993、Meth. Enzymol. 217:581参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージングおよび宿主細胞ＤＮＡへの取込みに必要な要素を含む。遺伝子治療で用いる核酸配列を１つまたは複数のベクター内にクローニングし、これにより、被験体への核酸の送達が促進される。レトロウイルスベクターについてのさらなる詳細は、Boesen他、1994、Biotherapy 6:291-302に見出すことができ、この文献には、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするためにｍｄｒｌ遺伝子を造血幹細胞に送達するレトロウイルスベクターの使用が記載されている。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示している他の参考文献は、以下のとおりである：Clowes他、1994、J. Clin. Invest. 93:644-651；Klein他、1994、Blood 83:1467-1473；SalmonsおよびGunzberg、1993、Human Gene Therapy 4:129-141；ならびにGrossmanおよびWilson、1993、Curr. Opin. in Genetics Devel. 3:110-114。
【０３９０】
アデノウイルスは、遺伝子治療で用いることができる他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、遺伝子を気道上皮に送達するために特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは、天然には気道上皮に感染して、ここで軽い疾患を引き起こす。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染することができるという利点を有する。KozarskyおよびWilson、1993、Current Opinion in Genetics Development 3:499は、アデノウイルス系の遺伝子治療の総説を提供している。Bout他、1994、Human Gene Therapy 5:3-10は、遺伝子をアカゲザルの気道上皮に導入するためのアデノウイルスベクターの使用を実証している。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用の他の例は、Rosenfeld他、1991、Science 252:431；Rosenfeld他、1992、Cell 68:143；Mastrangeli他、1993、J. Clin. Invest. 91:225；国際公開WO 94/12649号；およびWang他、1995、Gene Therapy 2:775に見出すことができる。好ましい実施形態では、アデノウイルスベクターを用いる。
【０３９１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）も、遺伝子治療での使用が提案されている（Walsh他、1993、Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300；および米国特許第5,436,146号）。
【０３９２】
遺伝子治療の別の手法は、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、またはウイルス感染などの方法によって遺伝子を組織培養物中の細胞に導入することを含む。通常、導入方法には、細胞への選択マーカーの導入が含まれる。その後、細胞を選択条件下に置いて、導入された遺伝子を取り込んでそれを発現している細胞を単離する。その後、それらの細胞を被験体に送達する。
【０３９３】
この実施形態では、核酸を細胞内に導入したのち、得られた組換え細胞をｉｎ  ｖｉｖｏで投与する。このような導入は、それだけには限定されないが、トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、核酸配列を含むウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターを用いた感染、細胞融合、染色体に媒介される遺伝子導入、マイクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合などをはじめとする、当分野で公知の任意の方法によって実施することができる。外来遺伝子を細胞内に導入するための多数の技術が当分野で知られており（たとえば、LoefflerおよびBehr、1993、Meth. Enzymol. 217:599；Cohen他、1993、Meth. Enzymol. 217:618を参照）、レシピエント細胞の必須の発生的機能および生理的機能が破壊されない限り、本発明に従って用い得る。この技術は、核酸が細胞によって発現可能であり、また、好ましくはその細胞子孫に遺伝性かつ発現可能であるように、細胞への核酸の安定した導入を提供すべきである。
【０３９４】
得られる組換え細胞は、当分野で知られている様々な方法によって被験体に送達することができる。使用が想定される細胞の量は所望の効果、患者の状態などに依存し、当業者によって決定することができる。
【０３９５】
４．９  キット
本発明は、本発明のＥｐｈＡ２／エフリンＡ１モジュレーターの入った１つもしくは複数の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。さらに、それだけには限定されないが、硬変、線維症（たとえば、肝臓、腎臓、肺、心臓、網膜、および他の内臓の線維症）、喘息、虚血、アテローム性動脈硬化症、糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、血管再狭窄、黄斑変性症、関節リウマチ、骨関節炎、小児血管腫、尋常性疣贅、カポジ肉腫、神経線維腫症、劣性栄養障害性表皮水疱症、強直性脊椎炎、全身性ループス、ライター症候群、シェーグレン症候群、子宮内膜症、子癇前症、アテローム性動脈硬化症、冠動脈疾患、乾癬性関節症および乾癬をはじめとする非新生物性過剰増殖性の上皮ならびに／もしくは内皮細胞障害の治療、管理または予防に有用な１つもしくは複数の他の予防剤または治療剤、あるいは他の関連薬剤も、製薬パックまたはキットに含めることができる。特定の実施形態では、他の予防剤または治療剤は免疫調節剤（たとえば、抗ＩＬ−９抗体）である。本発明はまた、本発明の医薬組成物の１つまたは複数の成分の入った１つもしくは複数の容器を含む医薬パックあるいはキットも提供する。場合によっては、そのような容器は、製薬もしくは生物学的製品の製造、使用または販売を規制している政府機関が規定した形式の注意書きを伴うことができ、その注意書きはその機関によるヒト投与用の製造、使用または販売の認可を反映する。
【０３９６】
５．均等物
当業者は、日常的な実験を超えることなく、本明細書中に記載の本発明の具体的な実施形態の多くの均等物を認識するか、または確認することができるであろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【０３９７】
本明細書中で言及するすべての刊行物、特許および特許出願は、本明細書中でそれぞれの個々の刊行物、特許および特許出願が具体的かつ個別に、本明細書中に参照により組み込まれていると示されている場合と同じ程度に、本明細書中に参照により組み込まれる。
【配列表】
2008518022000001.app