(57)【要約】  標的核酸に対して特異的な捕獲プローブ、標的核酸及び変性剤を含有する混合物を用いて、本混合物の温度を上げて短時間でインキュベートして、試料から標的核酸を効率的に捕獲する方法を開示する。標的核酸に特異的に結合する捕獲プローブ及び変性剤を含有し、標的核酸と混合して温度を上げて短時間でインキュベートすると捕獲プローブと標的核酸の効率的ハイブリダイゼーションを促進する、組成物を開示する。
2008539736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料から目的の標的核酸を単離する方法であって、
標的核酸を含有する試料と、標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする捕獲プローブとを、変性剤（ｄｅｎａｔｕｒａｎｔ  ｃｈｅｍｉｃａｌ）及び捕獲プローブに特異的に結合する固定化プローブを含有する液相中で混合して、反応混合物を調製し、
反応混合物を約６０〜９５℃の第１温度で約１５分間以内インキュベートし、
反応混合物を約２５〜４２℃の第２温度で約２０分間以内インキュベートし、これにより標的核酸に特異的にハイブリダイズした捕獲プローブ及び捕獲プローブに特異的に結合した固定化プローブから構成されるハイブリダイゼーション複合体を形成し、ここで、ハイブリダイゼーション複合体は固定化プローブを介して支持体に付着し、そして
支持体に付着したハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離する
ことを含む方法。
【請求項２】
変性剤が８Ｍ尿素であり、第１温度でのインキュベーションが約９５℃で約１０分間以内である、請求項１の方法。
【請求項３】
変性剤が０．５〜４．２Ｍ濃度のイミダゾールであり、第１温度でのインキュベーションが約６０℃で約１〜１５分間である、請求項１の方法。
【請求項４】
変性剤が３．０〜３．５Ｍ濃度のイミダゾールであり、第１温度でのインキュベーションが６０℃で約１〜１５分間である、請求項１の方法。
【請求項５】
変性剤が２．０〜２．７Ｍ濃度のイミダゾールであり、第１温度でのインキュベーションが約９０〜９５℃で約３〜１０分間である、請求項１の方法。
【請求項６】
変性剤が２．７Ｍのイミダゾールであり、第１温度でのインキュベーションが約７５〜９５℃で約３〜１５分間であり、さらに反応混合物を第１と第２のインキュベーション工程の間に約６０℃で約２０分間インキュベートすることを含む、請求項１の方法。
【請求項７】
第１温度のインキュベーションが約９５℃で約３〜１５分間である、請求項６の方法。
【請求項８】
標的核酸が、完全若しくは部分の二本鎖核酸又は他の二次若しくは三次構造を含む核酸である、請求項１の方法。
【請求項９】
捕獲プローブが、標的核酸に結合する標的特異的配列及び特異的結合対を介して固定化プローブに結合するテール領域から構成される、請求項１の方法。
【請求項１０】
テール領域が、固定化プローブの相補配列に特異的にハイブリダイズすることにより固定化プローブに結合する、請求項９の方法。
【請求項１１】
さらに、支持体に付着したハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離した後、標的核酸又は標的核酸から生成したインビトロ増幅生成物を検出する工程を含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
試料から目的の標的核酸を単離する方法であって、
標的核酸を含有する試料と、標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする捕獲プローブとを、変性剤及び捕獲プローブに特異的に結合する固定化プローブを含有する液相中で混合して、反応混合物を調製し、
反応混合物を約２５℃で約１〜６０分間インキュベートし、これにより標的核酸に特異的にハイブリダイズした捕獲プローブ及び捕獲プローブに特異的に結合した固定化プローブから構成されるハイブリダイゼーション複合体を形成し、ここで、ハイブリダイゼーション複合体は固定化プローブを介して支持体に付着し、そして
支持体に付着したハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離する
ことを含む方法。
【請求項１３】
変性剤が約１Ｍ濃度の尿素である、請求項１２の方法。
【請求項１４】
変性剤が０．０５〜０．５Ｍ濃度のイミダゾールであり、インキュベーション工程が約２〜３０分間である、請求項１２の方法。
【請求項１５】
変性剤が約０．５Ｍ濃度のイミダゾールであり、インキュベーション工程が約１５分間である、請求項１２の方法。
【請求項１６】
標的核酸を特異的に捕獲するための組成物であって、少なくとも１つの標的核酸、標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの捕獲プローブ、捕獲プローブに特異的に結合する固定化プローブ、及び０．０５〜４．２Ｍ濃度のイミダゾール又は１〜８Ｍ濃度の尿素を含有する溶液相ハイブリダイゼーション混合物を含む組成物。
【請求項１７】
溶液相ハイブリダイゼーション混合物が０．０５〜０．５Ｍ濃度のイミダゾールを含有する、請求項１６の組成物。
【請求項１８】
溶液相ハイブリダイゼーション混合物が１．７〜３．５Ｍ濃度のイミダゾールを含有する、請求項１６の組成物。
【請求項１９】
溶液相ハイブリダイゼーション混合物が２．０〜２．７Ｍ濃度のイミダゾールを含有する、請求項１６の組成物。
【請求項２０】
組成物が、第１標的配列に特異的にハイブリダイズする第１捕獲プローブ、及び第１標的配列とは異なる第２標的配列に特異的にハイブリダイズする第２捕獲プローブを含有する、請求項１６の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
開示の組成物及び方法は、分子生物学、より具体的には、試料等の複合混合物から当該混合物中で標的核酸に特異的な核酸オリゴマー及び変性剤を用いて核酸を単離することに関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸のインビトロ増幅及びインビトロハイブリダイゼーション等多くの分子生物学的方法では、その後の操作を有効にするために核酸をある程度調製又は精製することが必要である。核酸精製法としては、非特異的な試料中に存在する全ての核酸を精製する方法、又は異なるタイプの核酸を物理的特性に基づいて単離する方法又は特定の核酸を試料から単離する方法が開発されてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
多くの核酸単離法では、操作が複雑で又は苛酷な化学物質を用い、完了するのに長時間かかる。目的の核酸を他の試料成分から分離するための簡単で効果的かつ迅速な方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
発明の概要
試料から目的の標的核酸を単離する方法であって、以下の工程を含む方法を開示する：標的核酸を含有する試料と、標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする捕獲プローブとを、変性剤及び捕獲プローブに特異的に結合する固定化プローブを含有する液相中で混合して反応混合物を調製し、反応混合物を約６０〜９５℃の第１温度で約１５分間以内インキュベートし、反応混合物を約２５〜４２℃の第２温度で約２０分間以内インキュベートし、これにより標的核酸に特異的にハイブリダイズした捕獲プローブ及び捕獲プローブに特異的に結合した固定化プローブから構成されるハイブリダイゼーション複合体を形成し、ここで、ハイブリダイゼーション複合体は固定化プローブを介して支持体に付着し、そして支持体に付着したハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離する。好ましい態様では、変性剤は８Ｍ尿素で、第１インキュベーションは約９５℃で約１０分間以内である。好ましい態様では、変性剤は０．５〜４．２Ｍ濃度のイミダゾールで、第１インキュベーションは約６０℃で約１〜１５分間である。他の好ましい態様では、３．０〜３．５Ｍ濃度のイミダゾールを用い、第１温度６０℃で約１〜１５分間インキュベートする。他の好ましい態様では、イミダゾールは２．０〜２．７Ｍの濃度で、第１インキュベーションは約９０〜９５℃で約３〜１０分間である。ある好ましい態様では、変性剤は２．７Ｍ濃度のイミダゾールで、第１インキュベーション温度は約７５〜９５℃で約３〜１５分間であり、この方法はさらに反応混合物を第１と第２のインキュベーション工程の間に約６０℃で約２０分間インキュベートすることを含む。２．７Ｍ濃度のイミダゾールを用いる好ましい態様では、第１インキュベーション温度は約９５℃で約３〜１５分間であり、この方法は反応混合物を第１と第２のインキュベーション工程の間に約６０℃で約２０分間インキュベートすることを含む。ある態様では、標的核酸は、完全若しくは部分の二本鎖核酸又は他の二次若しくは三次構造を含む核酸である。１の態様では、捕獲プローブは、標的核酸に結合する標的特異的配列及び特異的結合対を介して固定化プローブに結合するテール領域から構成される。好ましい態様では、捕獲プローブのテール領域は、固定化プローブの相補配列に特異的にハイブリダイズすることにより固定化プローブに結合する。ある好ましい態様は、支持体に付着したハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離した後、標的核酸又は標的核酸から生成したインビトロ増幅生成物を検出する工程をも含む。
【０００５】
試料から目的の標的核酸を単離する方法であって、以下の工程を含む方法を開示する：標的核酸を含有する試料と、標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする捕獲プローブとを、変性剤及び捕獲プローブに特異的に結合する固定化プローブを含有する液相中で混合して反応混合物を調製し、反応混合物を約２５℃で約１〜６０分間インキュベートし、これにより標的核酸に特異的にハイブリダイズした捕獲プローブ及び捕獲プローブに特異的に結合した固定化プローブから構成されるハイブリダイゼーション複合体を形成し、ここで、ハイブリダイゼーション複合体は固定化プローブを介して支持体に付着し、そして支持体に付着したハイブリダイゼーション複合体を他の試料成分から分離する。好ましい態様では、変性剤は約１Ｍ濃度の尿素である。他の好ましい態様では、変性剤は０．０５〜０．５Ｍ濃度のイミダゾールで、インキュベーションは約２〜３０分間である。好ましい態様では、イミダゾールは約０．５Ｍの濃度で、インキュベーションは約１５分間である。
【０００６】
標的核酸を特異的に捕獲するための組成物であって、少なくとも１つの標的核酸、標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの捕獲プローブ、捕獲プローブに特異的に結合する固定化プローブ、及び０．０５〜４．２Ｍ濃度のイミダゾール又は１〜８Ｍ濃度の尿素を含有する溶液相ハイブリダイゼーション混合物を含む組成物を開示する。ある好ましい態様では、混合物は０．０５〜０．５Ｍのイミダゾールを含有し、一方、他の好ましい態様では、混合物は１．７〜３．５Ｍ濃度のイミダゾールを含有する。ある好ましい態様では、ハイブリダイゼーション混合物は２．０〜２．７Ｍのイミダゾールを含有する。好ましい態様では、組成物は、第１標的配列に特異的にハイブリダイズする第１捕獲プローブ、及び第１標的配列とは異なる第２標的配列に特異的にハイブリダイズする第２捕獲プローブを含有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
発明の詳細な説明
開示の標的捕獲方法は、溶液中に例えばイミダゾール又は尿素の変性剤を含有し、混合物を約６０〜９５℃の温度範囲で約２〜１５分間インキュベートするハイブリダイゼーション条件を用いて混合物中の標的核酸に捕獲プローブをハイブリダイズさせることにより、特異的標的核酸を試料から単離する。好ましい態様では、標的核酸は完全又は部分の二本鎖ＤＮＡである。この方法の好ましい態様は、捕獲プローブ及びその標的を含有する溶液中に１．７〜３．２Ｍのイミダゾールを含有し、これを７５〜９５℃で約３〜７分間インキュベートするハイブリダイゼーション条件を用いる。
【０００８】
開示の他の方法では、溶解した変性剤、例えば０．５Ｍイミダゾール又は１Ｍ尿素を含有する混合物中、室温（約２５℃）で約１５〜６０分間インキュベートして捕獲プローブを標的核酸に特異的にハイブリダイズさせ、捕獲プローブを固定化プローブに結合させることにより、目的の標的核酸を試料から単一インキュベーション工程で単離する。好ましい態様では、捕獲プローブは２’−メトキシＲＮＡ基から構成される核酸オリゴマー、又は１以上のＬＮＡ残基を含む。好ましい態様ではは、３０分間の室温インキュベーションを用いて標的特異的捕獲プローブにより目的の標的核酸を捕獲する。
【０００９】
当該方法は、完全若しくは部分の二本鎖であるか、又は他の二次若しくは三次構造を含む目的の核酸を単離するのに特に有用である。ある態様では、捕獲プローブ及び標的核酸を含有する混合物中に溶解した変性剤を用いて、約６０〜９５℃で比較的短時間、例えば約１〜１５分間インキュベートすることにより達成される、ハイブリダイゼーションにおける相乗効果を用いる。この標的捕獲方法の好ましい態様は、変性剤が約２．１〜４．２Ｍ濃度のイミダゾールであるハイブリダイゼーション条件を用いる。他の態様は、イミダゾールが約２．７〜３．２Ｍの濃度範囲であるハイブリダイゼーション条件を用いる。この標的捕獲方法の好ましい態様は、溶解した約２．７Ｍのイミダゾール、及び少なくとも１種類の標的核酸に特異的な少なくとも１つの標的特異的捕獲プローブを含有するハイブリダイゼーション混合物を用いて、標的核酸を効率的に結合し、ここで、ハイブリダイゼーション条件は、混合物を約７５〜９５℃、より好ましくは約８５〜９５℃で、３〜７分間インキュベートすることを含む。
【００１０】
本明細書に記載する標的捕獲方法は、２種類以上の捕獲プローブを伴う一組の標的捕獲条件を用いて同一標的核酸を試料から捕獲するか、又は、２種類以上の異なる標的核酸を同一試料から捕獲することができる。すなわち、用いる標的捕獲条件下で全てのプローブが実質的に類似のハイブリダイゼーション特性を示せば、各プローブが目的の標的配列に特異的である、２種類以上の異なる標的特異的捕獲プローブは、同一反応混合物中同一条件下で作用できる。例えば１の態様は、第１標的核酸に特異的な第１捕獲プローブ及び第１標的核酸とは異なる第２標的核酸に特異的な第２捕獲プローブを用いる；第１及び第２捕獲プローブは、約６０〜９５℃で短時間インキュベートされるイミダゾールを含有する単一反応混合物中で、その各標的に対して実質的に類似のハイブリダイゼーション特性を示し、その後、捕獲された第１及び第２標的核酸を他の試料成分から分離する；標的捕獲方法である。他の態様は、標的核酸中の第１配列に特異的な第１捕獲プローブ及び同一標的核酸中の第２配列に特異的な第２捕獲プローブを用いる；第１及び第２捕獲プローブは、約６０〜９５℃で短時間インキュベートされるイミダゾールを含有する単一反応混合物中、その各標的配列に対して実質的に類似のハイブリダイゼーション特性を示し、その後、捕獲された標的核酸を他の試料成分から分離する；標的捕獲方法である。
【００１１】
本明細書に開示する組成物としては、特に標的配列が完全若しくは部分の二本鎖である核酸又は他の二次若しくは三次構造を含む核酸中にある場合、標的配列への捕獲プローブオリゴマーの特異的ハイブリダイゼーション効率を高めるために、尿素又はイミダゾール等の変性剤を含有するハイブリダイゼーション反応混合物の標的特異的捕獲プローブがあげられる。組成物としてはハイブリダイゼーション反応混合物を調製するための成分があげられ、混合物としては溶液中の変性剤、好ましくはイミダゾールがあげられ、この溶液としては、目的の標的核酸に特異的な少なくとも１つの捕獲プローブ、捕獲プローブに結合する固定化した結合対又はハイブリダイゼーション溶液中の化学成分（例えば塩類、緩衝剤）等の１以上の標的捕獲反応成分が含まれてもよい。当該組成物としては、目的の標的核酸に特異的な少なくとも１つの捕獲プローブ及び変性剤、好ましくはイミダゾールを溶液相混合物中に含有する、特異的ポリヌクレオチド標的捕獲を実施するためのキットがあげられる。好ましいキットの態様は、イミダゾール、目的の標的核酸に特異的な捕獲プローブオリゴマー、及び捕獲プローブに対する固定化した結合対を含有する溶液を包含する。他のキットの態様としては、試料中の標的核酸を検出するアッセイで、単離した捕獲された標的核酸を処理する際に用いる、捕獲された標的核酸を他の試料成分から精製するための洗浄液又は捕獲された標的核酸に含まれる配列をインビトロ増幅する際に用いる構成要素及び／又は捕獲された核酸若しくは捕獲された標的核酸から形成された増幅生成物の検出に用いる構成要素等の１以上の構成要素もあげられる。
【００１２】
好ましい標的捕獲試薬としては、目的の核酸（すなわち標的核酸）中の配列に特異的にハイブリダイズする少なくとも１つの捕獲プローブ及び標的核酸を含有する試料と混合すると混合物を約６０〜９５℃の温度で短時間インキュベートした際にハイブリダイゼーション混合物に相乗効果を生じさせるのに十分な変性剤があげられる。当該混合物は、例えば捕獲プローブを含有する所定の標的捕獲試薬と標的核酸を含有する試料とを混和することにより調製できる。当該ハイブリダイゼーション条件を達成するための混合物は、捕獲プローブの導入と同時に変性剤と標的核酸含有試料を混合することにより調製でき、又は捕獲プローブを試料と混合する前又は後に変性剤を添加してもよい。好ましい態様としては、標的捕獲のためのハイブリダイゼーション条件で用いる最終混合物を調製するために用いる工程は最少である。好ましい標的捕獲試薬としては、標的特異的捕獲プローブと、捕獲プローブ−標的核酸複合体を他の試料成分から効率的に分離するために捕獲プローブを結合する固定化した結合対が共にあげられる。捕獲プローブのハイブリダイゼーション特性が実質的に同一で、選択した変性剤及びインキュベーション温度を含む、同一のハイブリダイゼーション条件下で目的の各標的配列を効率的に捕獲するのであれば、試薬は、２以上の標的特異的捕獲プローブ等の１以上の標的特異的捕獲プローブを含有してもよいことが認識されるであろう。試薬の好ましい１態様としては、イミダゾール、及び約２５〜９０℃で約３０分間以内のハイブリダイゼーション混合物インキュベーションを含む単一のハイブリダイゼーション条件で、第１捕獲プローブと第２捕獲プローブはそれらの各標的に対して実質的に類似のハイブリダイゼーション反応速度を示す、第１標的核酸に特異的な第１捕獲プローブ、及び第１標的核酸とは異なる第２標的核酸に特異的な第２捕獲プローブがあげられる。他の試薬の態様としては、標的捕獲に用いる単一のハイブリダイゼーション条件で、第１捕獲プローブと第２捕獲プローブは各標的に対して実質的に類似のハイブリダイゼーション反応速度を示す、標的核酸中の第１配列に特異的な第１捕獲プローブ及び同一標的核酸中の第２配列に特異的な第２捕獲プローブがあげられる。
【００１３】
本明細書に記載する組成物及び方法は、部分若しくは完全二本鎖である標的核酸（例えばｄｓＤＮＡ）又は他の二次構造（例えばヘアピン構造）を含む標的核酸を、比較的緩和な条件で単離するのに特に有用である。他の公知の単離法は、標的核酸を一本鎖にするために標的核酸を変性する工程（例えば５〜１０分間の煮沸）を含むことが多いが、当該処理は実施困難であり、容器が開放又は爆発した場合に実験者又は実験装置が汚染することがあり、核酸の単離の効率を妨げる凝固集合体又は破損核酸等の構造体を生成する。さらに、変性が不十分であったり又は変性核酸が標的捕獲前に再アニールしたりすると、捕獲が最適にならない場合がある。
【００１４】
本明細書に記載する組成物及び方法は、核酸又は細胞を含有する試料等の複合体混合物から、目的の核酸配列を精製するのに有用であり、試料を常法で処理して細胞内核酸を溶液中へ放出させることができる。本方法は、特異的配列を検出する診断アッセイ、生物材料の存在を検出する法医学検査又は水、環境若しくは食品試料中の汚染物質を検出するための検査等の分子生物学的なアッセイ又は操作に用いる核酸を調製するのに有用である。本明細書に記載する組成物及び方法は、多様な用途に用いられるインビトロ核酸増幅のための核酸を調製するのに有用である。本方法は、標的核酸を濃縮し、後のアッセイ工程を妨害する可能性のある他の試料成分から標的核酸を分離するため、アッセイの特異性及び／又は感度を改善するのに有用である。本方法は実施するのが比較的簡単であるため、検体を手作業又は自動操作によりスクリーニングするのに有用である。
【００１５】
「試料」又は「検体」は、標的核酸が成分混合物の一部として、例えば水若しくは環境試料、食品、法医学分析のために採集した材料又は診断検査のための生検試料中に存在する可能性のある組成物をいう。「生物試料」は、生体又は死体の生物由来の組織又は材料であって、標的核酸を含有する可能性のあるものをいい、例えば細胞、組織、細胞若しくは組織から調製した溶解物、喀痰、末梢血、血漿、血清、子宮頚スワブ試料、生検組織（例えばリンパ節）、呼吸器若しくは滲出物、消化器、尿、便、精液又は他の体液若しくは材料があげられる。組織及び／又は細胞構造を物理的に破壊して細胞内成分を、標準法で分析用試料を調製するために用いる酵素、緩衝剤、塩類、界面活性剤、その他の化合物を含有する溶液中へ放出させるために試料を処理することができる。
【００１６】
「核酸」は、ヌクレオチド又は窒素複素環塩基若しくは塩基類似体をもつ類似体が互いに連結してポリヌクレオチドを形成したものを含む多量体化合物をいい、一般的なＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ、及びそれらの類似体であるポリマーがあげられる。核酸「主鎖」は多様な結合から構成されてもよく、これには１以上の糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」すなわちＰＮＡ；国際特許公開ＷＯ９５／３２３０５）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合又はその組合わせがあげられる。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、又は置換、例えば２’−メトキシ若しくは２’−ハライド置換を含む類似化合物でもよい。窒素塩基は、一般的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、その類似体（例えばイノシンその他；The Biochemistry of the Nucleic Acids 5-36, Adams et al.編, 第11版, 1992を参照）、プリン又はピリミジンの誘導体（例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−又はアザ−プリン、デアザ−又はアザ−ピリミジン、５又は６位に置換基をもつピリミジン塩基、２、６又は８位に置換基をもつプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジンピリミジン類、及びＯ４−アルキル−ピリミジン類；米国特許第５，３７８，８２５号及び国際公開ＷＯ９３／１３１２１）でもよい。核酸は、主鎖が１以上の位置に窒素塩基を含まない１以上の「非塩基」残基を含有してもよい、（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は一般的なＲＮＡ又はＤＮＡ糖、塩基及び結合のみを含むか、又は、一般的な成分と置換体の両方を含むことができる（例えば２’−メトキシ結合をもつ一般的な塩基又は一般的な塩基と類似体の両方を含むポリマー）。本用語には、相補的ＲＮＡ及びＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を高める、「ロックされた核酸」（ＬＮＡ）、１以上の二環式フラノース単位がＲＮＡ模擬糖配置内にロックされたＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体があげられる（Vester et al., 2004, Biochemistry 43(42): 13233-41）。ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及ぼしうるオリゴマーの態様としては、ＰＮＡオリゴマー、２’−メトキシ若しくは２’−フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、又は荷電した結合（例えばホスホロチオエート）又は中性基（例えばメチルホスホネート）を含むハイブリダイゼーション複合体の全体的な電荷、電荷密度又は立体会合に影響を及ぼすオリゴマーがあげられる。
【００１７】
「オリゴマー」又は「オリゴヌクレオチド」は、一般に１，０００ヌクレオチド（ｎｔ）未満の核酸をいい、サイズ範囲が約２〜５ｎｔの下限及び約５００〜９００ｎｔの上限であるものがあげられる。ある好ましい態様は、サイズ範囲が約５〜１５ｎｔの下限及び約５０〜６００ｎｔの上限であるオリゴマーであり、他の好ましい態様は、サイズ範囲が約１０〜２０ｎｔの下限及び約２２〜１００ｎｔの上限のものである。オリゴマーは天然源から精製できるが、好ましくは周知の酵素法又は化学的方法で合成する。オリゴマーを、オリゴマーをいうと理解される機能名（例えば捕獲プローブ、プライマー又はプロモータープライマー）とすることもできる。
【００１８】
「捕獲プローブ」、「捕獲オリゴヌクレオチド」、又は「捕獲オリゴマー」は、標的核酸中の標的配列に特異的にハイブリダイズし、固定化プローブ上の結合対に結合して、標的核酸を支持体に捕獲する核酸オリゴマーをいう。捕獲オリゴマーの好ましい態様としては、通常は同一オリゴマー上にある２つの結合領域である標的特異的領域及び固定化プローブ結合領域があげられるが、当該領域は１以上のリンカーにより互いに結合した２つの異なるオリゴマー上にあってもよい。
【００１９】
「固定化プローブ」、「固定化オリゴマー」、又は「固定化核酸」は、捕獲オリゴマーを支持体に直接又は間接的に結合させる核酸結合対をいう。支持体に結合した固定化プローブは、捕獲プローブに結合した標的を試料中の結合していない物質から分離するのを促進する、いかなる支持体（例えばマトリックス、又は溶液中の粒子）も使用でき、多様な材料（例えばナイロン、ニトロセルロース、ガラス、ポリアクリラート、混合ポリマー、ポリスチレン、シランポリプロピレン、又は金属）のいずれかで作製できる。好ましい支持体は例えば単分散常磁性ビーズ（均一サイズ±５％）等の磁気付着性粒子であり、これに固定化プローブが直接（例えば共有結合、キレート形成、又はイオン性相互作用により）又は間接的に（例えばリンカーにより）結合するが、この結合は核酸ハイブリダイゼーション条件で安定である。
【００２０】
「分離」又は「精製」は、試料の１以上の成分を他の試料成分から分離すること、例えばある核酸を、タンパク質、炭水化物、脂質又は他の核酸をも含有する可能性のある一般に水性溶液から分離することをいう。好ましい態様では、分離又は精製の工程により標的核酸が少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも約９０％、よりさらに好ましくは少なくとも約９５％分離される。
【００２１】
「ハイブリダイゼーション条件」は、完全又は部分的に相補的な核酸配列が、通常は標準的塩基対合により、ハイブリダイゼーション二重体又は複合体を形成する累積的な物理的及び化学的条件をいう。当該条件は当業者に周知であり、ハイブリダイゼーション複合体形成に関与する核酸の配列組成に基づいて推定できるか、又はルーチン試験で経験的に判定できる（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual,第2版（Cold Spring Harbor Laboratory Press, ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，1989）,§§1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51,及び11.47-11.57、特に§§9.50-9.51, 11.12-11.13,11.45-11.47及び11.55-11.57）。
【００２２】
「十分に相補的」とは、連続した核酸塩基配列が一連の相補的塩基間での標準的な塩基対合（水素結合）により他の塩基配列にハイブリダイズしうることを意味する。相補配列は、標準的な塩基対合（例えばＧ：Ｃ、Ａ：Ｔ又はＡ：Ｕ）によりオリゴマー配列中の各部分でその標的配列に対比して完全に相補的でありうるか、又は、塩基対合により相補的ではない１以上の位置を含みうるが（非塩基残基を含む）、その場合は、オリゴマー配列全体が適切なハイブリダイゼーション条件でその標的配列と特異的にハイブリダイズしうるため、十分に相補的である。オリゴマー中の連続塩基は、目的の標的配列に対して少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは完全に相補的である。
【００２３】
「核酸の増幅」は、多数コピーの標的核酸配列若しくはその相補配列又はその断片（すなわち完全ではない標的核酸を含有する増幅配列）を生成する周知のいかなるインビトロ手順をもいう。周知の操作の例としては、転写介在増幅法（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅法（ＮＡＳＢＡ）その他（米国特許第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号、第５，４３７，９９０号、第５，１３０，２３８号、第４，８６８，１０５号及び第５，１２４，２４６号）、レプリカーゼ介在増幅法（米国特許第４，７８６，６００号）、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応法（ＬＣＲ）（欧州特許出願第０３２０３０８号）及び鎖置換増幅法（ＳＤＡ）（米国特許第５，４２２，２５２号）等の転写関連増幅法があげられる。
【００２４】
「検出プローブ」は、ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅した配列を含む標的核酸配列に特異的にハイブリダイズし、標的核酸を検出できる核酸オリゴマーをいう。検出は直接（標的に直接結合したプローブ）又は間接的（プローブを標的に連結する中間構造体にハイブリダイズしたプローブ）のいずれでもよい。プローブの標的配列とは、一般に、より大きな配列内にありプローブが特異的にハイブリダイズする特異的配列をいう。検出プローブは、標的配列特異的配列及び標的配列の存否に応じてプローブの三次元構造に寄与する他の配列又は構造体を含んでもよい（米国特許第５，１１８，８０１号、第５，３１２，７２８号、第６，８３５，５４２号及び第６，８４９，４１２号）。
【００２５】
「標識」は、検出される又は検出可能なシグナルを発生する部分又は化合物をいい、核酸プローブに直接又は間接的に結合することができる。直接結合を用いる態様としては、共有結合又は非共有結合、例えば水素結合、疎水性若しくはイオン性相互作用及びキレート若しくは配位錯体の形成があげられる。間接結合を用いる態様としては、架橋部分又はリンカーの使用、例えば抗体又は追加オリゴヌクレオチド（１以上）によるものがあげられ、検出可能なシグナルを増強するためにこれらを用いてもよい。検出可能な部分は、標識、例えば放射性核種、ビオチン又はアビジン等のリガンド、酵素、酵素基質、反応性基、検出可能な色を付与する色素又は粒子（例えばラテックス又は金属のビーズ）等の発色団、発光性化合物（例えば生物発光性、リン光性又は化学発光性の化合物）及び蛍光性化合物でもよい。好ましい態様としては、均一アッセイ系で検出できる「均一検出可能な標識」があげられる、混合物中で結合プローブが非結合プローブと比較して検出可能な変化を示し、このためハイブリダイズした標識プローブをハイブリダイズしていない標識プローブから物理的に分離しない均一態様で標識を検出できる（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号及び第５，６５８，７３７号）。均一検出可能な好ましい標識としては、化学発光性化合物、より好ましくは、標準的ＡＥ又は周知のＡＥ誘導体等のアクリジニウムエステール（ＡＥ）化合物（米国特許第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号及び第５，６３９，６０４号）があげられる。標識の合成方法、標識を核酸に結合させる方法及び標識からのシグナルを検出する方法は周知である（Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版, 10章、ならびに米国特許第５，６５８，７３７号、第５，６５６，２０７号、第５，５４７，８４２号、第５，２８３，１７４号及び第４，５８１，３３３号）。
【００２６】
特に定義しない限り、本明細書中で用いる技術用語は当業者が一般に理解しているもの又はDictionary of Microbiology and Molecular Biology,第２版（Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons,ニューヨーク州ニューヨーク）,The Harper Collins Dictionary of Biology (Hale & Marham, 1991, Harper Perennial,ニューヨーク州ニューヨーク)等の技術文献及び上記に類する刊行物中の定義と同様の意味である。別途記載しない限り、本明細書中で使用又は意図する技術は標準的な周知の方法である。
【００２７】
開示した標的捕獲方法は、他の成分を含有する溶液中での核酸プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション効率を高めることにより得られる。当該方法は、イミダゾール又は尿素等の変性剤を含有するハイブリダイゼーション混合物を、例えば６０〜９５℃に温度を上げて短時間でインキュベートした場合に得られる相乗効果を利用し、その後、捕獲プローブ及び標的核酸を含有するハイブリダイゼーション複合体を他の混合物成分から分離することができる。好ましい態様は、インキュベーション温度約７５〜９５℃及びイミダゾールを含む混合物を用いて、捕獲プローブとその標的配列の特異的ハイブリダイゼーションの効率及び速度を高める。他の好ましい態様は、約１．７〜２．７Ｍのイミダゾールを含有する溶液中に少なくとも１つの捕獲プローブオリゴマー及び目的のその標的核酸を含有する溶液から構成される組成物である。
【００２８】
「標準」方法である標的捕獲方法は、類似の工程を用いるが、混合物中に変性剤が含まれない（米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５２号及び第６，５３４，２７３号）。本明細書に開示する方法は、比較的緩和な条件下、特に部分又は完全な二本鎖標的核酸（例えばｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド）の効率的な標的捕獲を提供する。開示の方法は、特に、単離した標的核酸をインビトロ増幅及び／又は検出等後続操作に用いるアッセイについて、アッセイの性能及び感度を改善するのに有用である。本明細書中に記載する比較的緩和な条件としては、室温で用いるか、又は、例えば約６０〜９５℃に１５分間以内の短時間加熱してもよい、ハイブリダイゼーション混合物中の変性剤があげられる。
【００２９】
好ましい捕獲プローブオリゴマーとしては、標的核酸中の配列に特異的に結合する標的特異的配列及び標的核酸を含有するハイブリダイゼーション複合体を混合物中の他の物質から分離するための固定化プローブに結合する部分があげられる。ある好ましい捕獲オリゴマーの態様としては、支持体上に固定化した相補配列にハイブリダイズするテール配列（例えば実質的にホモポリマー型の配列）があげられる。他の捕獲プローブの態様は、結合対のメンバーである部分（例えばビオチニル化ＤＮＡと、固定化したアビジン又はストレプトアビジン）により固定化プローブに結合する。標的特異的配列とテール配列をもつ捕獲プローブを用いる態様では、変性剤を含むハイブリダイゼーション条件下で、標的核酸を含有する試料と捕獲プローブを混合し、捕獲プローブの標的特異的部分はその標的配列に特異的にハイブリダイズし、テール部分は固定化した相補配列にハイブリダイズして、標的配列を支持体に連結して他の成分から分離することができる。好ましい態様では、第１工程で標的特異的部分が標的核酸にハイブリダイズし、第１工程で好ましい溶液相ハイブリダイゼーション反応速度を利用する、第２工程でテール部分が固定化配列にハイブリダイズする。好ましい態様では、ハイブリダイゼーション条件としては、捕獲プローブ及び標的核酸を含有する混合物中に可溶性変性剤を含有させ、混合物を６０〜９５℃、好ましくは７５〜９５℃で１５分間以内インキュベーションして捕獲プローブと標的核酸のハイブリダイゼーション二重体を形成させ、その後、温度を下げて（例えば約２５〜４２℃）インキュベートして標的核酸、捕獲プローブオリゴマー及び固定化プローブから構成されるハイブリダイゼーション複合体を形成することがあげられる。捕獲プローブと固定化プローブが核酸以外の結合対のメンバーで結合する態様では、ハイブリダイゼーション条件は、捕獲プローブ−標的のハイブリダイゼーション二重体を形成し、かつ捕獲プローブを結合対のメンバーにより固定化プローブに結合させることができる。
【００３０】
固定化プローブは、標的捕獲方法に用いるハイブリダイゼーション条件で安定ないかなる結合によっても支持体に結合させることができる。好ましい態様では、遠心分離、濾過、磁気付着又は他の物理的若しくは電気化学的分離法等の既知の方法で溶液から回収できる、単分散粒子である支持体を用いる。捕獲プローブと標的核酸を含有するハイブリダイゼーション複合体が付着した支持体を他の試料成分から分離する。ある態様では、支持体に結合したハイブリダイゼーション複合体を、複合体が支持体上に保持される条件下で１回以上洗浄して、捕獲された標的核酸から他の核酸を含む他の成分をさらに分離する。標的核酸は単離されて支持体に濃縮されるが、支持体上の標的核酸濃度は最初の試料中の濃度より濃い。単離された標的核酸を、支持体に付着した状態又は支持体から溶離して、インビトロ増幅及び／又は検出等多様な後続操作に使用できる。
【００３１】
本明細書に記載する標的捕獲方法を利用して、各捕獲プローブが標的配列に特異的である２種類以上の捕獲プローブをハイブリダイゼーション混合物中に含有させて、２種類以上の核酸を同一試料から同時に単離できる。例えばハイブリダイゼーション混合物は、第１標的に特異的な第１捕獲プローブ及び第２標的に特異的な第２捕獲プローブを含有することができ、ここで、各捕獲プローブは同一のハイブリダイゼーション条件下で目的の標的にハイブリダイズする。各捕獲プローブが同一の固定化プローブに結合してもよく、又は個々の捕獲プローブに特異的な固定化プローブに結合してもよい。１の態様では、第１及び第２捕獲プローブは共にポリ−Ａテール領域を含み、相補的ポリ−Ｔ配列を含む同一の固定化プローブに結合し、同一支持体上で第１及び第２標的が精製される。好ましい態様では、第１捕獲プローブは第１支持体上の第１固定化プローブに結合し、第２捕獲プローブは第２支持体上の第２固定化プローブに結合し、第１標的は第１支持体上で、第２標的は第２支持体上で精製される。第１支持体と第２支持体の示す分離特性が異なる場合、全ての捕獲複合体が同一反応混合物中で形成されたとしても、第１支持体上の第１標的は第２支持体上の第２標的から容易に分離される。当該方法を利用し、全てが実質的に同一のハイブリダイゼーション条件で機能して多数の標的を混合物から単離された、異なる捕獲プローブの組合わせを用いて、単一試料から多数の標的を単離できる。
【００３２】
標識標的複合体を作製するために標識した検出プローブにハイブリダイズさせた、標的ＲＮＡ（トラコーマクラミジア（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）２３ＳｒＲＮＡ）を既知量含有する試料を用いて最初の標的捕獲試験を実施した。標的捕獲は、上記標識標的複合体について、上記ｒＲＮＡに含まれる配列に相補的な５’側標的特異的配列及びオリゴヌクレオチドに相補的な３’側テール配列を含む、磁性ビーズ上に固定化された捕獲プローブを用いて行った。標的捕獲混合物は、変性剤（尿素又はイミダゾール）含有溶液又は非含有溶液、室温から６０℃まで、１〜６０分の間の種々の時間を含む、種々のハイブリダイゼーション条件下でインキュベートした。ビーズ上に捕獲された標識標的複合体を他の混合物成分から分離し、結合した検出プローブからのシグナルを測定して標的を検出した。ｒＲＮＡ中の異なる標的配列に特異的な多数の捕獲プローブの標的捕獲効率を室温で試験したところ、多くはイミダゾール（例えば０．０５〜１Ｍ）を含有する場合に捕獲効率が高まった。次に、室温での標的捕獲に有効な捕獲プローブを種々の条件で試験して、標的捕獲の効率及び／又は反応速度が高まるハイブリダイゼーション条件を判定した。例えば、ある標的捕獲試験では、他の相補配列が標的ＲＮＡに結合するのを促進するために、ｒＲＮＡ中の配列に相補的な１以上のヘルパーオリゴヌクレオチドをも含めた（米国特許第５，０３０，５５７号）。一般に、捕獲プローブは、標的特異的部分に２’−メトキシＲＮＡを含み、テール部分にＤＮＡを含むように合成した。標的捕獲条件の相対効率は、捕獲された標的を混合物から分離した後、捕獲標的に結合した検出プローブから得られたシグナルを測定することにより判定した。異なる捕獲プローブは、同一条件下で異なる効率を示したが、イミダゾールを反応混合物に含ませると、試験したほぼ全ての捕獲プローブの標的捕獲効率が高まった。例えば、標的捕獲混合物に０．５Ｍのイミダゾールを含有させて、６０℃で１分間、４２℃で１０分間、又は室温で１５分間インキュベートした場合、相対的に速やかな動態でｒＲＮＡ標的は効率的に捕獲（７５〜９０％）された。当該実験は、変性剤を含有するハイブリダイゼーション条件は、反応混合物中に変性剤を含有しない同様のハイブリダイゼーション条件と比較して一般に標的捕獲の効率及び反応速度を高めることを示した。当該試験の多くは、イミダゾールが存在する場合にはイミダゾールなしで実施した同様のアッセイと比較してバックグラウンドシグナルが高かった（例えば標的捕獲プローブを含有しない対照で）が、これはその後の試験で検出条件を改変する（すなわち、選択試薬のｐＨをｐＨ９．２に高め、選択工程でより長時間、例えば５〜１０分間インキュベートする）と実質的に排除された。標的捕獲反応にイミダゾールを用いて、温度を下げて（２５〜４２℃）インキュベートして実施したアッセイでは、イミダゾールを含有しない反応混合物中で同一捕獲プローブを用いて、温度を上げて（６０℃）でインキュベートして実施した標的捕獲アッセイと比較して、一般に検出可能な全シグナルが低かった。しかし、反応混合物にイミダゾールが含まれると、混合物中にイミダゾ��ルを含有しない対応反応と比較して、試験した多数の異なるプローブ及びインキュベーション条件で、標的捕獲効率が度々高まったことが観察された。
【００３３】
効率的な標的捕獲方法の態様を、標的特異的配列及び粒状支持体上の固定化オリゴマーに相補的なテール部分を含む捕獲プローブを用いて捕獲した合成部分ｄｓＤＮＡ標的を用いたモデル系で示した。当該成分を、塩類及び緩衝剤を異なる濃度の変性剤とを含有する溶液中で混合し、捕獲プローブの標的特異的部分をその標的核酸とハイブリダイズさせるために種々の温度（例えば約６０〜９５℃）で短時間（１０分間以内）インキュベートし、次いでテール部分を固定化オリゴマーにハイブリダイズさせるために、温度を下げて（例えば室温〜４２℃）インキュベートした。複合体が付着した粒子を混合物中の他の成分から分離し、捕獲された標的核酸を、標的核酸又は標的核酸から生成した増幅生成物にハイブリダイズした標識検出プローブのシグナルを均一アッセイで測定して検出することにより検出した。本モデル系は、ハイブリダイゼーション混合物中に変性剤を含めた場合、変性剤が捕獲プローブのテールと固定化プローブのハイブリダイゼーションを妨害せずに、捕獲プローブの標的特異的領域とその標的配列のハイブリダイゼーションが比較的緩和なインキュベーション条件下で効率的に行われ、標的が効率的に捕獲されるという予想外の結果を示した。特定の理論又は作用機序に拘束されたくはないが、これは、標的ＤＮＡの二本鎖部分の変性が高まり、これにより他の標的捕獲工程を阻害せずに標的配列が捕獲プローブとハイブリダイズしやすくなった結果であると思われる。
【００３４】
ウイルス標的を用いて、本明細書に開示する標的捕獲のための組成物及び方法を用いた標的捕獲効率の増大を示すこともできる。標的の１つは完全二本鎖ゲノムであるＢＫウイルス（ＢＫＶ）であり、他の標的は複製時期に応じて部分又は完全の二本鎖ゲノムになるＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）であった。変性剤を含まない標準的な標的捕獲方法（米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５２号及び第６，５３４，２７３号に記載）で当該標的イルスを試験した場合、ウイルスゲノムの捕獲は最適に達せず、例えば試料中の標的核酸の回収は６０％未満であった。標準的な標的捕獲方法を用いたウイルスアッセイは、捕獲されたウイルス核酸をインビトロ増幅して増幅配列を検出した場合ですら比較的非感受性であった。標準的な標的捕獲操作の前に、ウイルスＤＮＡを含有する試料を高温（９５℃）で加熱して標的ＤＮＡを変性させた場合ですら、アッセイ感度はわずかに改善されたにすぎない。一方、標的捕獲反応でイミダゾールを含む本明細書に開示する効率的な標的捕獲方法の態様を用いるとアッセイ感度が改善された。効率的な標的捕獲方法の態様としては、変性剤であるイミダゾール又は尿素を反応混合物に含有させること及び、標的捕獲操作の初期に混合物を加熱することの組合わせがあげられ、その結果、標的捕獲効率及びアッセイ感度が大幅に改善する予想外の相乗効果が得られた。例えばインビトロ核酸増幅前に標的捕獲操作にイミダゾールを含む１態様では、ＨＢＶサブタイプＢ、Ｃ及びＡを含有する試料中のＨＢＶの検出率は９５％であった（効率的標的捕獲方法でないアッセイと比較して、各２８倍、４倍及び２倍）。標的捕獲混合物中に尿素を用いた他の態様では、標的捕獲操作の最初の工程で混合物を９５℃でインキュベートした後、捕獲したＨＢＶ ＤＮＡをインビトロで増幅し、増幅した配列を検出した。ＢＫＶ ＤＮＡ捕獲の他の態様は、イミダゾールを含む捕獲混合物を高温で短時間、その後温度を下げてインキュベートし、捕獲したＢＫＶ ＤＮＡを他の成分から分離することにより、標準的な標的捕獲方法に用いた同様のアッセイと比較してアッセイ感度が１０倍改善された。当該比較アッセイでは、捕獲したＢＫＶ ＤＮＡをインビトロで増幅し、増幅したＢＫＶ配列を標識検出プローブで検出した。
【００３５】
開示した標的捕獲方法及び組成物の態様を記載する例を示す。場合によっては、標的の捕獲後、捕獲した核酸に他の工程、例えば公知方法によるインビトロ増幅及び／又は標識プローブを用いる検出を追加した（例えば米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号、増幅；米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号及び第５，６５８，７３７号、検出プローブの標識化、ハイブリダイゼーション及び検出の各工程）。場合によっては、変性剤を含有しない標準的な標的捕獲方法を用いて実施したアッセイ（米国特許第６，１１０，６７８号、第６，２８０，９５２号及び第６，５３４，２７３号）と比較できる、変性剤を含有する種々の態様の標的捕獲方法を用いて実施したアッセイを記載する。特記しない限り、以下のアッセイに一般に用いた試薬は下記のとおりである。試料移送試薬：１１０ｍＭラウリル硫酸リチウム（ＬＬＳ）、１５ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、１５ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ６．７；標的捕獲試薬（ＴＣＲ）：７８９ｍＭ ＨＥＰＥＳ、２３０ｍＭコハク酸、１０％ｗ／ｖＬＬＳ、６７９ｍＭ ＬｉＯＨ、０．０３％消泡剤、ｐＨ６．４及び１００μｇ／ｍｌの、（ｄＴ）１４オリゴマーが共有結合した常磁性粒子（０．７〜１．０５μの粒子、ＳＥＲＡ−ＭＡＧ（商標）ＭＧ−ＣＭ、Seradyne, Inc.,インディアナ州インディアナポリス）；又は（Ｃ−タイプ）２５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．８８Ｍ ＬｉＣｌ、３１０ｍＭ ＬｉＯＨ、１００ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ６．４及び２５０μｇ／ｍｌの、（ｄＴ）１４オリゴマーが共有結合した常磁性粒子（０．７〜１．０５μの粒子、Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（商標）ＭＧ−ＣＭ）。洗浄液：１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、６．５ｍＭ ＮａＯＨ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．３％（ｖ／ｖ）エタノール、０．０２％（ｗ／ｖ）メチルパラベン、０．０１％（ｗ／ｖ）プロピルパラベン及び０．１％（ｗ／ｖ）ラウリル硫酸ナトリウム、ｐＨ７．５。増幅試薬：他のＴＭＡ反応成分と混合して下記を含有する混合物を調製するための濃厚溶液：４７．６ｍＭ Ｎａ−ＨＥＰＥＳ、１２．５ｍＭ Ｎ−アセチル−Ｌ−システイン、２．５％ＴＲＩＴＯＮ（商標）Ｘ−１００、５４．８ｍＭ ＫＣｌ、２３ｍＭ ＭｇＣｌ２、３ｍＭ ＮａＯＨ、０．３５ｍＭ各ｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ）、７．０６ｍＭ ｒＡＴＰ、１．３５ｍＭ ｒＣＴＰ、１．３５ｍＭ ＵＴＰ、８．８５ｍＭ ｒＧＴＰ、０．２６ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、５％ｖ／ｖグリセロール、２．９％トレハロース、０．２２５％エタノール、０．０７５％メチルパラベン、０．０１５％プロピルパラベン及び０．００２％フェノールレッド、ｐＨ７．５〜７．６。プライマー及び／又はプローブは増幅試薬中にあってもよく、又は別個に混合物に添付してもよい。ＴＭＡ用酵素：反応当たり約９０Ｕ／μｌ ＭＭＬＶ逆転写酵素（ＲＴ）及び約２０Ｕ／μｌ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（１ＵのＲＴは１ｎｍｏｌのｄＴＴＰを２００〜４００μＭのオリゴｄＴ−プライムドポリＡ鋳型を用いて３７℃１０分間で取り込み、１Ｕ Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼは１ｎｍｏｌ ＡＴＰをＲＮＡ中へＤＮＡ鋳型中のＴ７プロモーターを用いて３７℃１時間で取り込む）。プローブ試薬：下記溶液中のＡＥ−標識した検出プローブ：（ａ）１００ｍＭコハク酸リチウム、３％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１０ｍＭメルカプトエタンスルホネート（ＭＥＳ）及び３％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン又は（ｂ）１００ｍＭコハク酸リチウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ及び１０ｍＭ ＭＥＳ。ハイブリダイゼーション試薬：（Ｃ−タイプ）１００ｍＭコハク酸、２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１００ｍＭ ＬｉＯＨ、１５ｍＭアルドリチオール−２（ａｌｄｒｉｔｈｉｏｌ−２）、１．２Ｍ ＬｉＣｌ、２０ｍＭ ＥＤＴＡ及び３．０％（ｖ／ｖ）エタノール、ｐＨ４．７；又は（Ｐ−タイプ）１９０ｍＭコハク酸、１７％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、３ｍＭ ＥＤＴＡ及び３ｍＭ ＥＧＴＡ、ｐＨ５．１。選択試薬：６００ｍＭホウ酸、１８２．５ｍＭ ＮａＯＨ、１％（ｖ／ｖ）オクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）、ｐＨ８．５又はｐＨ９．２；ハイブリダイズしなかった検出プローブオリゴマー上のＡＥ標識を加水分解するためのもの。検出試薬は検出試薬Ｉ：１ｍＭ硝酸及び３２ｍＭ Ｈ２Ｏ２、ならびに検出試薬ＩＩ：１．５Ｍ ＮａＯＨを含み、ＡＥ標識から化学発光を発生させる（米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，７４４号及び第５，６５８，７３７号を参照）。
【００３６】
変性剤を含む標的捕獲方法と比較するため、標準的な標的捕獲方法を簡単に記載する。標準法では、一般に標的核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）を含有する試料と、標的核酸に特異的な捕獲プローブ（すなわち、用いるハイブリダイゼーション条件で標的核酸に含まれる配列に特異的にハイブリダイズするプローブ）約１．７５ｐｍｏｌ及び常磁性粒子（ｄＴ１４プローブを０．７〜１．０５μの粒子（Seradyne）にカルボジイミド反応で結合させた（Lund, et al., 1988, Nuc. Acids Res. 16: 10861-10880））に付着した固定化プローブ約１００μｇを、標的捕獲試薬中で混合する。混合物は、標的核酸にハイブリダイズする増幅オリゴマー（例えばプライマー）を含有してもよい（米国特許第６，５３４，２７３号）。標準的な標的捕獲混合物を５５〜６０℃で約１５〜３０分間加熱した後室温（ＲＴ）で５〜１５分間冷却し、順に捕獲プローブと標的核酸をハイブリダイズさせた後、固定化プローブを捕獲プローブ：標的核酸複合体にハイブリダイズさせる。容器に磁界をかけて複合体が付着した粒子を溶液相から分離し、濃縮し（米国特許第４，８９５，６５０）上清を除去する。粒子を洗浄液（例えば室温で１ｍｌ）に懸濁して洗浄し、磁気分離を繰り返す。
【００３７】
捕獲された標的核酸を検出操作により検出するか、あるいはインビトロ核酸増幅法により処理して標的核酸配列の一部を増幅して検出することができる。例えば転写介在増幅（ＴＭＡ）では、洗浄した粒子を７５μｌの増幅試薬に懸濁し、プライマー及び酵素を添加して混合物を調製して４１．５〜４２℃で１〜２時間インキュベートする（米国特許第５，３９９，４９１号及び第５，５５４，５１６号）。多様なインビトロ増幅方法及び／又は検出方法を採用できるが、増幅した配列は増幅配列に特異的にハイブリダイズするＡＥ−標識で検出でき、結合したプローブ上のＡＥ−標識からの化学発光を検出して相対光単位（ＲＬＵ）として示す（米国特許第５，６５８，７３７号第２５欄２７−４６行を参照、Nelson et al., 1996, Biochem. 35: 8429-8438, 8432）。
【００３８】
本明細書に記載する標的捕獲方法は、目的の標的核酸に特異的な捕獲プローブ、核酸ハイブリダイゼーションを促進する混合物を調製するための試薬（例えば塩類、緩衝剤）、標的核酸（一般に試料から添加）、及び添加した固定化プローブを、好ましくは懸濁状態で含有する溶液相混合物中に、変性剤、好ましくはイミダゾールを含む。標的捕獲混合物は、アッセイに用いる、ヘルパーオリゴマー、インビトロ増幅プライマーオリゴマー及び／又は検出プローブオリゴマー等の追加オリゴマーを含んでよい。ある態様では、捕獲プローブを含有する標的捕獲試薬の変性剤を標的核酸含有試料と混合して混合物を調製し、温度を上げて（例えば６０〜９５℃）で短時間（例えば１〜１５分間）インキュベートする。好ましい態様ではは、本混合物を７５〜９５℃で約３分間インキュベートした後、標的捕獲操作を実施する。効率的な標的捕獲方法の個々の態様に用いる具体的な温度及びインキュベーション時間は、選択した個々の捕獲プローブと標的核酸の組合わせに基づいて変更できるが、本発明方法では標的捕獲混合物中に変性剤を含み、混合物を短時間（例えば１〜３０分間、好ましくは１〜１５分間）、ハイブリダイゼーション温度（例えば室温〜９５℃）でインキュベーションした後、分離工程を行い、捕獲された標的を混合物から分離する。本明細書に記載する標的捕獲方法は、アッセイ感度を高めるほか、手作業又は自動化方式で実施しやすく、全アッセイ時間が数分間延びるにすぎない。本明細書に開示する効率的な標的捕獲方法の態様は、特に部分若しくは完全な二本鎖である標的核酸又は二次若しくは三次構造の領域を含む標的核酸のアッセイ感度を高めるのに有用である。
【実施例】
【００３９】
実施例１：二次又は三次構造をもつことが知られているＲＮＡの標的捕獲
本実施例は、一般に、多数の捕獲プローブで、比較的低いインキュベーション温度、例えば室温〜約４２℃で、二次又は三次構造をもつことが知られているＲＮＡ（２３Ｓ ｒＲＮＡ）の標的捕獲の効率及び反応速度を高めるイミダゾールを含有するハイブリダイゼーション条件を示す。標的ＲＮＡ中の二次及び／又は三次構造は、捕獲プローブとの相互作用を阻害し、標的捕獲を制限する場合がある。ｒＲＮＡ中の配列に対して相補的な標識検出プローブにハイブリダイズしたトラコーマクラミジアの２３Ｓ ｒＲＮＡの既知量を用いて実験を行い、捕獲する前に標的ＲＮＡを標識した。一般に２００ｆｍｏｌｅの２３Ｓ ｒＲＮＡと、ＡＥ−標識した合成オリゴヌクレオチド１ｐｍｏｌｅを、ハイブリダイゼーション試薬中でハイブリダイズさせた（６０℃で３０分間の後に室温に冷却）。ハイブリダイズした検出プローブ：標的混合物のアリコートを、捕獲プローブ、固定化プローブを含有し、既知濃度の変性剤を含有するか又は含有しない標的捕獲試薬（ＴＣＲ）と混合し、混合物を室温（約２５℃）〜６０℃で１〜６０分間インキュベートした後、捕獲された標的を採集した。捕獲プローブ（配列番号６〜３０）は各々、前記ｒＲＮＡに含まれる配列に相補的な５’側標的特異的配列及び３’側Ａ３０テール配列を含有し、標的特異的領域の２’−メトキシＲＮＡ及びＤＮＡテール領域を用いて合成した。固定化プローブは、支持体としての磁性マイクロ粒子（ＳＥＲＡ−ＭＡＧ（商標））に付着したｄＴ１５オリゴヌクレオチドであった。あるアッセイでは、標的ｒＲＮＡへの他の相補配列の結合を促進するために、ｒＲＮＡ中の他の配列に相補的な１以上のヘルパーオリゴヌクレオチドを標的捕獲反応混合物中に含んでいた（米国特許第５，０３０，５５７号Ｈｏｇａｎら）。変性剤は１Ｍ尿素又は０．０５〜１．８Ｍイミダゾールであった。標的の捕獲後、磁性粒子に付着した標識ｒＲＮＡ標的を磁気誘引により溶液相から分離し、上清を除去し、複合体が付着した粒子を洗浄液で多数回洗浄し、ハイブリダイズしていない検出プローブ中のＡＥ標識を選択試薬で加水分解した後、標的に結合した標識プローブの化学発光をルミノメーターで検出した（実質的に米国特許第５，６５８，７３７号に記載の相対光単位（ＲＬＵ）として）。
【００４０】
室温又は６０℃１Ｍ尿素存在下で実施した標的捕獲アッセイでは、標的捕獲混合物中に尿素を用いなかった以外は同様に処理した対照試料から検出されたシグナルと比較して、捕獲されたＲＮＡから検出されるＲＬＵが高かった（２．２〜３．１倍高い）。尿素の水溶液は加熱に際して分解する場合がある（ＮＨ３を放出）ので、標的捕獲混合物中にイミダゾールを用いてその後の実験を行った。
【００４１】
一連のアッセイでは、室温でイミダゾール（０．０５〜１Ｍ）存在下、２３Ｓ ｒＲＮＡ中の異なる標的配列に特異的な捕獲プローブ（配列番号６〜２９）の標的捕獲効率を個別に試験し、混合物がイミダゾールを含有しない対応反応と比較してイミダゾールが存在する場合は１以外の全ての標的捕獲が高まった（例えば、固定化した部分で検出したＲＬＵが１．３〜８．８倍増強）。その後、捕獲プローブのいくつかを（配列番号６、８、１７、２０〜２２、２４及び２７）異なるハイブリダイゼーション条件で試験した（２５℃、４２℃及び６０℃でインキュベート、イミダゾールの存在及び不存在下）。各捕獲プローブ及び条件について、溶液相から分離した捕獲され標的に結合した検出プローブから発生する化学発光を測定して、相対標的捕獲効率を判定した。イミダゾールを含有しない反応を室温で個別に試験した種々の捕獲プローブは種々の効率でｒＲＮＡを捕獲した（元の標的の０〜７０％）。一方、反応中に０．５Ｍのイミダゾールが存在する場合は１つを除いて全ての捕獲プローブでより多くのｒＲＮＡを捕獲した（元の標的の２．６〜８９％）。例えば、ある捕獲プローブでは、０．５Ｍのイミダゾールを含有する反応物をインキュベートした場合、室温（約７５％の標的を１５分間までに捕獲）、４２℃（約９０％の標的を１０分間までに捕獲）、又は６０℃（約９０％の標的を１分間で捕獲）で、ｒＲＮＡ捕獲が高レベルであった。これに対し、イミダゾールが存在しない場合、室温では標的捕獲が効率的でなかった（６０分間までに捕獲したのは約１１％の標的）。
【００４２】
標的捕獲の反応速度を測定するために、捕獲プローブ（配列番号６、２０、２１及び２４）を、イミダゾールを含有しないか、又は０．０５〜０．１Ｍのイミダゾールを含有するハイブリダイゼーション混合物中室温で用いて、トラコーマクラミジア２３Ｓ ｒＲＮＡを捕獲した。当該プローブは、０．１Ｍのイミダゾールを含有する反応では５分間のインキュベーション後、イミダゾールを含有しない対応反応と比較して、より多くの標的を捕獲した。捕獲プローブ（配列番号６、２０、２１）を、室温で２、１５及び３０分間インキュベートする同様のアッセイで試験した。０．０５Ｍのイミダゾールの存在下では、イミダゾールを含有しない対応反応と比較して、全てのプローブはわずか２分後に、標的の捕獲が増大した。その後、１の捕獲プローブ（配列番号２０）を、０．０５Ｍのイミダゾールを含有又は含有しない、室温、４２℃又は６０℃で５、１５又は３０分間インキュベートする反応で試験後、捕獲された標的からのシグナルを測定した。混合物中にイミダゾールを含有する全ての条件について、イミダゾールを含有しない対応反応と比較して標的捕獲効率が高く、最大増大は長期インキュベーション（１５分間では室温で１．７倍の増大、４２℃及び６０℃で１．３倍の増大；３０分間では室温で１．４倍の増大、４２℃及び６０℃で１．１〜１．２倍の増大）と比較すると５分後であった（室温で２．２倍の増大、４２℃及び６０℃で１．７倍の増大）。当該結果は、イミダゾールの存在下で標的捕獲の反応速度が高まったことを示す。
【００４３】
実施例２：部分二本鎖ＤＮＡ中に存在する合成標的の標的捕獲
本実施例は、反応混合物中のイミダゾールの濃度が異なり、全て６０℃で１５分間インキュベートした後、室温で３０分間インキュベートした場合の標的捕獲効率を示す。当該試験のために、配列番号１の鎖及びそれの相補鎖（配列番号２）を合成し、互いにハイブリダイズさせて（各３５ｐｍｏｌを２０μｌのハイブリダイゼーション試薬（Ｐ−タイプ）中、６０℃で１時間インキュベートし、室温に冷却した）、部分二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を作製した。得られたｄｓＤＮＡは、一方の末端に、検出プローブ（配列番号：４）に対して相補的な３０ｎｔの一本鎖ＤＮＡを含有していた。各標的捕獲反応混合物には、１０ｆｍｏｌｅのｄｓＤＮＡ標的が０．２ｍｌの試料移送試薬中に含まれ、これに、０〜３．１８Ｍのイミダゾールを含有する０．２ｍｌ標的捕獲試薬（ＴＣＲ、Ｃ−タイプ）；ｄＴ１４オリゴマーが共有結合した常磁性粒子（Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（商標））５０μｇを含有する０．１ｍｌＴＣＲ；及び５’側標的特異的領域（ｄｓＤＮＡの標的鎖中の配列に相補的な２５ｎｔのＬＮＡ）及び３’側ポリＡテール領域を含有する２０ｐｍｏｌｅの捕獲プローブ（配列番号：３）；を添加した。反応物を６０℃で１５分間、次いで室温で３０分間インキュベートし、捕獲されて磁性支持体に付着した標的ＤＮＡを上記のように上清から分離した。ペレットを１回洗浄し（０．５ｍｌのハイブリダイゼーション試薬Ｐ−タイプを使用）、次いでＡＥ標識した検出プローブ（１００ｆｍｏｌｅの配列番号：４；０．１ｍｌのハイブリダイゼーション試薬Ｐ−タイプ中）をペレットと混合し、混合物を６０℃で１５分間インキュベートして、捕獲された鎖にプローブをハイブリダイズさせた。結合した検出プローブからの化学発光を実質的に上記のように検出した（０．２ｍｌの選択試薬（ｐＨ９．２）を各混合物に添加し、６０℃で７分間インキュベートし、検出試薬Ｉ及びＩＩを順に添加して、化学発光をルミノメーターで５秒間測定）。標的を含有しないバックグラウンド対照を同様に処理した。結果を表１に示し、正味ＲＬＵ（検出した全ＲＬＵからバックグラウンドＲＬＵを差し引いたもの）及び捕獲した元の標的に対する比率として報告する。当該結果は、反応混合物中に２．３８Ｍ及び３．１８Ｍのイミダゾールがあると、同じ条件下でイミダゾールがそれより少量の場合の反応又はイミダゾールを含有しない反応と比較して、試料からの標的捕獲が大幅に増大したことを示す。
【００４４】
【表１】
2008539736.tif 000003
【００４５】
標的捕獲混合物がＯ〜３．４Ｍのイミダゾールを含有する以外は同条件を用いて、さらに試験を行った。結果を表２に示すが、これは、６０℃でインキュベートした２．６Ｍ〜３．４Ｍのイミダゾールを含有する反応物から元の標的の約１／３以上が捕獲され、３Ｍ〜３．４Ｍのイミダゾールを含有する混合物からは６５％以上が捕獲されたことを示す。
【００４６】
【表２】
2008539736.tif 000004
【００４７】
実施例３：合成ｄｓＤＮＡ中に存在する標的鎖の標的捕獲
５’側標的特異的領域（配列番号３のｖ）にＬＮＡ又はＤＮＡ残基がある、異なる合成捕獲プローブを用いて、実質的に実施例２に記載した条件を用いてさらに試験を行った。各標的捕獲反応物は、０．２ｍｌの試料移送試薬中に２０ｆｍｏｌｅ ｄｓＤＮＡ標的があり、これに０〜４．２Ｍイミダゾールを含有する０．２ｍｌ ＴＣＲ（Ｃ−タイプ）；ｄＴ１４オリゴマーが共有結合した常磁性粒子（Ｓｅｒａ−Ｍａｇ（商標））５０μｇを含有する０．１ｍｌ ＴＣＲ；及び５’側標的特異的領域にＬＮＡ又はＤＮＡ残基を含有する２０ｐｍｏｌｅ捕獲プローブを添加した。反応物を６０℃で１５分間、次いで室温で３０分間インキュベートし、捕獲、洗浄及び検出工程は上記のように処理した。対照を同様に処理したが、これらは標的を含有せず（バックグラウンド対照）又は捕獲プローブを含有しなかった（正味ＲＬＵ：９２）。当該試験結果を表３に示し、正味ＲＬＵ（バックグラウンドＲＬＵを検出した全ＲＬＵから差し引いたもの）及び各反応条件で捕獲した標的の比率として報告する。当該結果は、反応混合物中に３．５Ｍ及び４．２Ｍのイミダゾールが存在すると、２．１Ｍイミダゾールを含有する反応と比較して、標的捕獲効率が増大することを示す。標的捕獲効率の増大は、ＬＮＡ及びＤＮＡ両方の捕獲プローブでみられ、ＤＮＡプローブと比較してＬＮＡプローブはより多くの標的を捕獲した。
【００４８】
【表３】
2008539736.tif 000005
【００４９】
反応混合物中に３．２Ｍイミダゾールを用いて、実質的に上記と同条件を用いて標的捕獲アッセイを実施し、異なるＬＮＡ部分を含む捕獲プローブを同じ配列のＤＮＡ捕獲プローブと比較した。当該試験では、２５−ｎｔ標的捕獲領域が完全又は部分的にＬＮＡである捕獲プローブは、標的捕獲としてＤＮＡ捕獲プローブより効率がよかった（ＤＮＡプローブの５７．４％と比較して６４〜６５％）。標的特異的領域及び一部のテール領域（３０−ｎｔポリＡのうち１０）がＬＮＡである捕獲プローブは、ＤＮＡプローブ（５７．４％）と比較してさらに標的捕獲効率が高かった（８６％）。
【００５０】
反応物中に３．２Ｍのイミダゾールを含有又は含有しない、同じ標的捕獲条件を用い、標的鎖（配列番号１）に特異的な２つの異なる検出プローブを用いて、部分ｄｓＤＮＡ標的（配列番号１を配列番号２にハイブリダイズさせたもの）が標的捕獲操作中に変性するかを判定した。１の検出プローブ（配列番号４、ｎｔ１８−１９にＡＥ標識）は標的鎖の５’末端の標的配列、すなわち部分ｄｓＤＮＡのうち全条件下で一本鎖の部分に特異的であった。第２の検出プローブ（配列番号５、ｎｔ１８−１９にＡＥ標識）は標的鎖の３’末端の標的配列、すなわち標的捕獲混合物に添加した場合に部分ｄｓＤＮＡのうち二本鎖である部分に特異的であった。ＬＮＡ（ｎｔ１−２５）捕獲プローブ又はＤＮＡ捕獲プローブを含有する標的捕獲反応混合物を、６０℃で２０分間、その後室温で２０分間インキュベートし、２つの検出プローブにつき他の一定部分を用いて、磁気捕獲、洗浄及び検出の各工程を上記のように処理した。比較のため、配列番号１のＤＮＡ鎖を各検出プローブで検出して、完全一本鎖標的に関するシグナルを測定した。標的捕獲反応にイミダゾールを用いない場合は、部分ｄｓＤＮＡ標的からの標的鎖の捕獲の効率は悪く（３．８〜９．２％）、その一方で標的捕獲反応にイミダゾールを用いた場合は、標的鎖の捕獲の効率はよかった（７９〜１００％）。標的捕獲反応中にイミダゾールがある場合、互いに検出プローブからのシグナルの検出が類似していた。すなわち、捕獲後の標的捕獲混合物では、３’側検出プローブで検出したＲＬＵは、５’側検出プローブで検出したＲＬＵと類似した。上記結果は、６０℃でインキュベートしたイミダゾールを含有する混合物から捕獲した鎖が一本鎖であったことを示す。
【００５１】
実施例４：イミダゾール及び９５℃でインキュベーションしたＨＢＶサブタイプＢの標的捕獲
本実施例は、標的捕獲試薬（ＴＣＲ）中にイミダゾールが存在すると、標的捕獲、ＨＢＶ配列のインビトロ増幅（ＴＭＡ）及び化学発光性標識プローブを用いた増幅配列の検出を互いに組み合わせたアッセイ型（米国特許第５，７９０，２１９号、ＭｃＤｏｎｏｕｇｈら；米国特許出願公開第２００４００２９１１１号，Ｌｉｎｎｅｎら；ＰＲＯＣＬＥＩＸ（登録商標）Ultrio Hepatitis B Virus (HBV) Discriminatory Assay（ｄＨＢＶ）（Ｂ型肝炎ウイルス鑑別アッセイ）,Chiron Corp.,カリフォルニア州エモリービル）でＨＢＶサブタイプＢの検出感度が改善されたことを示す。本実施例は、標的捕獲においてイミダゾールが存在すると、高温インキュベーションと組合わせてアッセイ感度が著しく改善されたことを示す。ＨＢＶサブタイプＢを含有することが知られている臨床血清パネルの試料（１：３の希釈度で使用）を用いて当該条件を試験した。各実験条件で２０回の追試を実施し、標準的な標的捕獲方法を用いた後同じ増幅及び検出アッセイ工程を実施した対照アッセイ条件と対比して、標的捕獲改変の効果を判定した。陰性対照（７回の追試）は正常血清（ＨＢＶなし）を含有し、同等に試験した。アッセイは供給業者の指示（ＰＲＯＣＬＥＩＸ（登録商標）Ultrio Hepatitis B Virus (HBV) Discriminatory Assay（ｄＨＢＶ）パッケージインサートIN0142 Rev. 1 及び10-01-07-271 Rev. C.1）を用いて実施したが、要約すると下記のようである。イミダゾール（結晶質、ＦＷ６８．０８）を標準標的捕獲試薬（ＴＣＲ）に直接添加して最終濃度１．７Ｍ又は２．７Ｍにした。対照試料の試験管には、５００μｌの試料及びイミダゾールを含有しない４００μｌ ＴＣＲを入れた。改変標的捕獲方法では、試験管にさらにイミダゾールを含有する４００μｌ ＴＣＲを入れて、８００μｌ ＴＣＲ中の最終濃度１．７Ｍ又は２．７Ｍにした。９５℃でインキュベーション工程を施さない標的捕獲試験管をシールし、混合し、室温に１５分間保持し、６０℃で２０分間、次いで室温で１５分間インキュベートした後、磁性指示体上のハイブリダイゼーション複合体を分離した。９５℃でインキュベーション工程を施す標的捕獲試験管をシールし、混合し、室温に１５分間保持し、撹拌せずに９５℃で１５分間インキュベートし、次いで６０℃で２０分間、室温で１５分間インキュベートした。捕獲した核酸を含む粒子を磁気分離する処理を試験管に施し、粒子上で捕獲された核酸を洗浄し、次いでＨＢＶ配列のインビトロ増幅及び検出を実施する操作を行った。要するに、捕獲したＨＢＶ核酸の特異的配列をＨＢＶ特異的プライマー及びＴＭＡの組合わせにより増幅して増幅生成物を生成させ、これを増幅したＨＢＶ配列に特異的に結合する標識プローブとのハイブリダイゼーションにより検出した（米国特許出願公開第２００４００２９１１１号）。均一検出アッセイで結合したプローブに伴う標識からシグナルを発生させ、化学発光（ＲＬＵ）として検出した。結果を表４に示す。
【００５２】
【表４】
2008539736.tif 000006
【００５３】
上記結果は、反応中のイミダゾール及び９５℃インキュベーションを含む標的捕獲方法により、反応混合物中のイミダゾール及び９５℃でのインキュベーションをしない標的捕獲方法と比較して、アッセイでＨＢＶの検出が改善されたことを示す。
【００５４】
実施例５：温度範囲でのＨＢＶサブタイプＡ、Ｂ及びＣの効率的な標的捕獲
本実施例は、実施例４に記載した効率的な標的捕獲方法でＨＢＶサブタイプＡ、Ｂ及びＣのアッセイ感度が改善され、イミダゾールの存在により標的捕獲効率がある温度範囲で改善されたことを示す。イミダゾールを用いて多様な温度で実施する標的捕獲方法を、サブタイプＡ、Ｂ及びＣについてのＨＢＶ臨床血清パネルの試料を用いて試験した。各サブタイプ（１：３の希釈度）につき３０回の追試を実施して、２．７Ｍイミダゾールを含有するＴＣＲを６４℃、７５℃、８５℃、９０℃又は９５℃で１２分間インキュベートした場合に標的捕獲に及ぼす効果を判定した。異なる温度でアッセイを実質的に実施例４の記載により、行った。ＴＣＲがイミダゾールを含有せず、インキュベーションを室温で実施した対照（「室温−イミダゾールなし」）を含む、試験結果をいくつか図１に示す。当該結果は、３種類のインキュベーション温度（６４℃、８５℃及び９５℃）を用いた標的捕獲の場合、２．７Ｍイミダゾールの存在が３種類の異なるＨＢＶ核酸標的に効果を及ぼしたこと示す：サブタイプＡ（中等度の濃さの棒）、サブタイプＢ（濃い棒）及びサブタイプＣ（薄い棒）。他の日（１日目及び２日目）に実施したアッセイで、異なる条件（ｘ−軸）を用いて試験した試料の陽性結果の比率（ｙ−軸）を示す。棒の上方の数字は被験試料についてのＨＢＶの陽性検出％を示す。これら及び他の結果から、イミダゾールを含む効率的な標的捕獲方法の温度範囲は、ＨＢＶサブタイプＡ及びＣでは広範に、ＨＢＶサブタイプＢでは狭い範囲（９０〜９５℃）で、アッセイ感度が改善された。
【００５５】
実施例６：部分ｄｓＤＮＡ／ＲＮＡウイルス、ＨＢＶサブタイプＢの標的捕獲
本実施例は、反応混合物中のイミダゾールと９５℃インキュベーションを組合わせた効率的な標的捕獲方法は、高温の核酸変性を一般に要するより短時間で実施できることを示す。すなわち、２．７Ｍのイミダゾールを用いた９５℃でのインキュベーションで、短時間で相乗効果が達成されたことが示された。
【００５６】
インキュベーション時間は異なるが、実質的に実施例４及び５の記載によりアッセイを実施した。ＴＣＲ中にイミダゾールを含有する標的捕獲方法を、ＨＢＶサブタイプＢ臨床血清パネルの試料で実施した。混合物中に２．７Ｍのイミダゾールを含有するＴＣＲを用い、９５℃で１、３、５及び７分間インキュベートする、２０回の追試（１：１０の希釈度）を試験した。ＴＣＲは、標的核酸とは無関係の内部対照核酸をも含有した。当該試験を、標準的な標的捕獲方法による類似試験と比較した。両試験共に、捕獲された核酸を実質的に実施例４及び５の記載により増幅工程及び検出工程に用いた。図２に示す結果は、イミダゾールが標的捕獲混合物中に存在する場合、混合物中のイミダゾール又は９５℃でのインキュベーションを含まない標準的な標的捕獲方法を用いて実施した同じアッセイと比較して、３分間の９５℃のインキュベーション工程でアッセイ感度が著しく改善されたことを示す。図２は試験条件（ｘ−軸）で陽性検出％（ｙ−軸及び各棒の上方の数字）が増大したことを示す。当該結果は、イミダゾール存在下で標的捕獲効率を高める相乗効果を生じるには、９５℃で３分間以上のインキュベーションが適切であることを示す。
【００５７】
実施例７：異なる変性剤を用いて実施した標的捕獲
本実施例は、標的捕獲操作が８Ｍ尿素又は２Ｍイミダゾール存在下での標的捕獲及び９５℃でのインキュベーションを含む場合のＤＮＡ標的の検出に及ぼす効果を示す。標的ポリヌクレオチドは、ＨＢＶ遺伝子型Ｃに特異的な配列であった。実質的に実施例５及び６の記載に従って実施したアッセイ、すなわち、異なる標的捕獲方法を用いて、捕獲核酸のインビトロ増幅及び増幅配列の検出を同様に実施して、２０の追試試料を各条件で試験した。当該アッセイで、試料を下記の変法で標的捕獲した場合に得られた結果を比較した：（１）ＴＣＲ＋８Ｍ尿素、（２）９５℃のインキュベーション、（３）ＴＣＲ＋８Ｍ尿素＋９５℃のインキュベーション、及び（４）ＴＣＲ＋２Ｍイミダゾール＋９５℃のインキュベーション；全て、反応中の尿素若しくはイミダゾール又は９５℃でのインキュベーションを含まない標準的な標的捕獲方法と比較した。要するに、アッセイプロトコルは下記のとおりであった。３バージョンのＴＣＲを調製直後に用いた：２Ｍイミダゾール含有ＴＣＲ、８Ｍ尿素含有ＴＣＲ及び標準ＴＣＲ（尿素又もイミダゾールも含まない）。反応試験管に各４００μｌの１バージョンのＴＣＲを添加し、これに５００μｌのＨＢＶ遺伝子型Ｃ（ＨＢＶ−Ｃ）又は５００μｌの正常血清（陰性対照）を添加した。試験管をシールして混合した。試験管のいくつかを９５℃で１０分間の後、室温で５分間インキュベートし、一方、他の試験管を室温で１５分間インキュベートした（すなわち９５℃のインキュベーションなし）。次いで標準的な標的捕獲プロトコルを前記に従って実施した（６０℃で２０分間、室温で１５分間、核酸捕獲粒子の磁気分離及び洗浄工程）。捕獲された標的ポリヌクレオチドをＴＭＡでＨＢＶ特異的プライマーを用いて増幅し、増幅配列に特異的なＡＥ−標識プローブで増幅配列を検出して化学発光を発生させたものを検出して（ＲＬＵ）、アッセイから陽性又は陰性のどの結果が得られたかを判定するのに用いた（５０，０００より大きいＲＬＵを陽性とみなした）。当該アッセイの結果を表５にまとめる。
【００５８】
【表５】
2008539736.tif 000007
【００５９】
上記結果は、標的捕獲反応混合物に２Ｍイミダゾール又は８Ｍ尿素に加えて９５℃のインキュベーションとを組合わせると、ＨＢＶ標的の検出感度が著しく高まることを示す。反応混合物に変性剤（イミダゾール又は尿素）を含み、９５℃でインキュベートする標的捕獲条件は、９５℃のインキュベーションのみ行う又は尿素は含むが９５℃のインキュベーションは行わない標的捕獲混合物と比較して、上記条件の相乗効果を示した。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】混合物中２．７Ｍのイミダゾールの存在下に、室温、６４℃、８５℃及び９５℃で、３種類の核酸標的、ＨＢＶサブタイプＡ（中等度の濃さの棒）、ＨＢＶサブタイプＢ（濃い棒）及びＨＢＶサブタイプＣ（薄い棒）に関する標的捕獲の結果を、室温でイミダゾール非含有混合物中で実施した標的捕獲と比較して示す棒グラフである。
【図２】９５℃で１、３、５及び７分間インキュベートした２．７Ｍのイミダゾールを含有する混合物からのＨＢＶサブタイプＢの核酸の標的捕獲の結果を、イミダゾール非含有混合物中で実施した標的捕獲と比較して示す棒グラフである。
【図１】
2008539736.tif 000008
【図２】
2008539736.tif 000009
【配列表】
2008539736000001.app
【国際調査報告】
2008539736.tif 000010
2008539736.tif 000011