(57)【要約】この組成物は、細菌細胞外被の脂質でポリアニオン性の成分を結合し、中和しうるカセリシジンなどの抗菌性ペプチドとＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチド（ＲＩＰ）とを併用する。別の実施形態では、ＲＩＰは抗生物質と併用され、抗菌性ペプチドと併用されることも、あるいはされないこともある。この組成物は、細菌性敗血症の治療において使える利点がある。
2008534686.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬剤組成物であって、前記組成物を投与される哺乳類の患者において、ある量のＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチド（ＲＩＰ）及び細菌細胞外被の脂質でポリアニオン性の成分を結合し、中和しうるポリカチオン性抗菌性ペプチドを含む薬剤組成物。
【請求項２】
前記ＲＩＰが、
ａ）Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである５個の連続アミノ酸配列ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦ：あるいは
ｂ）Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである前記配列ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦとは２つの置換又は欠失による違いがある配列を有するアミノ酸を含む請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項３】
前記ＲＩＰが、配列ＹＳＰＸ１ＴＮＦから構成されておらず、式中Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸である請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項４】
前記ＲＩＰが、前記配列ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦとは１つの置換又は欠失による違いがある配列を有するアミノ酸を含み、式中Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項５】
前記ＲＩＰが、アミノ酸配列ＹＫＰＸ１ＴＮＦを含み、式中Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸である請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項６】
前記ＲＩＰ配列中のＸ２がＫである請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項７】
前記ＲＩＰが、アミノ酸配列ＩＫＫＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦを含み、式中Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項８】
前記ＲＩＰが配列ＰＣＴＮＦを含む請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項９】
前記ＲＩＰが配列ＹＫＰＩＴＮＦを含む請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項１０】
前記ＲＩＰが配列ＹＫＰＷＴＮＦを含む請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項１１】
前記ＲＩＰの長さがアミノ酸１０個に相当する請求項２に記載の薬剤組成物。
【請求項１２】
前記ＲＩＰが前記組成物の約０．１〜５０重量％を含む請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１３】
前記ＲＩＰが前記組成物の約２〜２０重量％を含む請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１４】
前記ＲＩＰが精製される請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１５】
前記抗菌性ペプチドがリポタイコ酸（ＬＴＡ）に結合し、中和する請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１６】
前記抗菌性ペプチドがカセリシジンである請求項１５に記載の薬剤組成物。
【請求項１７】
前記抗菌性ペプチドがヒトのカセリシジン又はＢＭＡＰ−２８である請求項１６に記載の薬剤組成物。
【請求項１８】
前記薬剤組成物がリポソームをさらに含む請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項１９】
抗生物質をさらに含む請求項１に記載の薬剤組成物。
【請求項２０】
哺乳類の患者において細菌感染のリスクを処置、又は低減する方法であって、前記患者にある量のＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチド（ＲＩＰ）及び細菌細胞外被の脂質でポリアニオン性の成分を結合し、中和しうる抗菌性ペプチドを含む組成物を投与することを含み、前記ＲＩＰ及び抗菌性ペプチドが、前記患者の細菌感染のリスクを処置又は低減するのに有効な量にて存在する方法。
【請求項２１】
細菌感染のリスクの処置又は低減が、臨床症状の発現を防止すること、臨床症状の進行を抑制すること、又は臨床症状を緩和することを含む請求項２０の方法。
【請求項２２】
前記細菌感染が抗生物質耐性細菌により生じる請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記細菌感染が細菌性敗血症である請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記細菌感染が身体の特定の組織、皮膚又は領域に限局されている請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記感染が蜂巣炎、角膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎又は乳腺炎である請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記細菌感染がバイオフィルムに関連する請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
前記細菌感染がブドウ球菌種によって生じる請求項２０に記載の方法。
【請求項２８】
前記細菌感染が黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、表皮ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）によって生じる請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細菌感染が、バシラス種、枯草菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、セレウス菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、炭疽菌（ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、リステリア種、Ｌ．イノクア（ｉｎｎｏｃｕａ）、Ｌ．モノクトゲネス（ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿連鎖球菌（ｓｔｒｅｐｔｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、大腸菌（ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又はクロストリジウム・アセトブチリカム（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｔｙｌｉｃｕｍ）によって生じる請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記投与が、局所的、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮的、鼻から又はイオン導入の各ルートによる請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記投与が、デポ型システム、カプセル封入、移植又は医療デバイスへのコーティングにより行われる請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記患者への抗生物質の投与をさらに含む請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
前記患者がヒトである請求項２０に記載の方法。
【請求項３４】
組成物を投与される哺乳類の患者の細菌感染のリスクを処置又は低減するのに有効な量の抗生物質とＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチド（ＲＩＰ）とを含む薬剤組成物であって、前記抗生物質が、アミノグリコシド、ベータ・ラクタム、セファロスポリン又はバンコマイシンである薬剤組成物。
【請求項３５】
前記ＲＩＰが、
ａ）Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである、５個の連続アミノ酸配列Ｙ２ＰＸ１ＴＮＦ：あるいは
ｂ）Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである前記配列ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦとは２つの置換又は欠失による違いがある配列を有するアミノ酸を含む請求項３４に記載の薬剤組成物。
【請求項３６】
前記ＲＩＰが、前記配列ＹＳＰＸ１ＴＮＦから構成されておらず、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸である請求項３５の薬剤組成物。
【請求項３７】
前記ＲＩＰが、前記配列ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦとは１つの置換又は欠失による違いがある配列を有するアミノ酸を含み、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである請求項３５の薬剤組成物。
【請求項３８】
前記ＲＩＰが、前記アミノ酸配列ＹＫＰＸ１ＴＮＦを含み、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸である請求項３５の薬剤組成物。
【請求項３９】
前記ＲＩＰ配列中のＸ２がＫである請求項３５の薬剤組成物。
【請求項４０】
前記ＲＩＰが、前記アミノ酸配列ＩＫＫＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦを含み、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである請求項３５の薬剤組成物。
【請求項４１】
前記ＲＩＰが前記配列ＰＣＴＮＦを含む請求項３５の薬剤組成物。
【請求項４２】
前記ＲＩＰが前記配列ＹＫＰＩＴＮＦを含む請求項３５の薬剤組成物。
【請求項４３】
前記ＲＩＰが前記配列ＹＫＰＷＴＮＦを含む請求項３５の薬剤組成物。
【請求項４４】
前記ＲＩＰの長さがアミノ酸１０個に相当する請求項３５の薬剤組成物。
【請求項４５】
前記ＲＩＰが前記組成物の約０．１〜５０重量％を含む請求項３４の薬剤組成物。
【請求項４６】
前記ＲＩＰが前記組成物の約２〜２０重量％を含む請求項３４の薬剤組成物。
【請求項４７】
前記ＲＩＰが精製される請求項３４の薬剤組成物。
【請求項４８】
前記薬剤組成物がリポソームをさらに含む請求項３４の薬剤組成物。
【請求項４９】
さらに抗菌性ペプチドをさらに含む請求項３４の薬剤組成物。
【請求項５０】
前記抗生物質がイミペネム又はバンコマイシンである請求項３４の薬剤組成物。
【請求項５１】
哺乳類の患者の細菌感染のリスクを処置又は低減する方法であって、前記患者に、ある量のＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチド（ＲＩＰ）及び前記患者の細菌感染のリスクを処置又は低減するのに有効な量の抗生物質を投与することを含み、前記抗生物質がアミノグリコシド、ベータ・ラクタム、セファロスポリン又はバンコマイシンである方法。
【請求項５２】
細菌感染のリスクの処置又は低減が臨床症状の発現を防止すること、臨床症状の進行を抑制すること、あるいは臨床症状を緩和することを含む請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記細菌感染が抗生物質耐性細菌により生じる請求項５１の方法。
【請求項５４】
前記細菌感染が細菌性敗血症である請求項５１の方法。
【請求項５５】
前記細菌感染が身体の特定の組織、皮膚又は領域に限局される請求項５１の方法。
【請求項５６】
前記感染が蜂巣炎、角膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎又は乳腺炎である請求項５１の方法。
【請求項５７】
前記細菌感染がバイオフィルムに関連している請求項５１の方法。
【請求項５８】
前記細菌感染がブドウ球菌種によって生じる請求項５１の方法。
【請求項５９】
前記細菌感染が黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌によって生じる請求項５８の方法。
【請求項６０】
前記細菌感染が、バシラス種、枯草菌、セレウス菌、炭疽菌、リステリア種、Ｌ．イノクア、Ｌ．モノクトゲネス、化膿連鎖球菌、ラクトコッカス・ラクチス、エンテロコッカス・フェカリス、大腸菌又はクロストリジウム・アセトブチリカムによって生じる請求項５１の方法。
【請求項６１】
前記投与が、局所的、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮的、鼻から又はイオン導入の各ルートによる請求項５１の方法。
【請求項６２】
前記投与が、デポ型システム、カプセル封入、移植又は医療デバイスへのコーティングにより行われる請求項６１の方法。
【請求項６３】
前記患者への抗菌性ペプチドの投与をさらに含む請求項５１の方法。
【請求項６４】
前記患者がヒトである請求項５１の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の説明
本出願は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれている２００５年４月４日に出願された米国特許仮出願第６０／６６８，１３２号の利益を主張している。
【０００２】
本出願は、全般的に細菌感染のリスクを処置又は低減するための薬理組成物及び方法に関し、特に、ＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチド及び抗菌性ペプチド及び／又はアミノグリコシド、ベータ・ラクタム、セファロスポリン又はバンコマイシンである抗生物質を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
敗血症
敗血症は、抗菌性薬剤が改善され、対症療法も進歩しているにも関わらず、依然として死亡の主因である。敗血症は、全身性炎症、循環不全及び多臓器機能不全症候群（ＭＯＤＳ）と関連がある。黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌とグラム陰性菌との両方が、敗血症を発症しうる。敗血症の発生率は現在上昇中である。アンガスら（Ａｎｇｕｓ  ｅｔ  ａｌ．），クリティカル・ケア・メディシン（Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ，２９：１３０３−１０（２００１）。グラム陰性菌は、菌の外膜からリポ多糖体（ＬＰＳ）又は内毒素を放出し、これが敗血症ショックを発現させる。対照的に、一部のグラム陽性菌は、毒素ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）などの細菌性超抗原たんぱく質系列において２３〜２９ｋＤａのポリペプチドであるエンテロトキシン及び発熱性外毒素Ａなどの外毒素を放出することにより敗血症ショックを生じる。外毒素は、可溶性物質であり、宿主に対する有害な作用により宿主細胞の正常な代謝を変質させる。一方、エンテロトキシンは、腸細胞に対して特異的な外毒素である。ド・キンプら（Ｄｅ  Ｋｉｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．），プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９２：１０３５９−６３（１９９５）；ケンガサランら（Ｋｅｎｇａｔｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．），ザ・ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．），１８８：３０５−１５（１９９８）；ルルウエリンら（Ｌｌｅｗｅｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．），ザ・ランセット・インフェクシャス・ディジージズ（Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．）２：５６−１６２（２００２）；ファン  アメルスフールトら（Ｖａｎ  Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．），クリニカル・マイクロバイオロジー・レビューズ（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．），１６：３７９−４１４（２００３）を参照のこと。
【０００４】
グラム陽性菌細胞壁成分であるペプチドグリガン（ＰＧ）とリポタイコ酸（ＬＴＡ）も、炎症反応を生じることが証明されている。ＰＧは剛構造を有し、Ｎ−アセチルムラミン酸にＮ−アセチルグルコサミン（β１−４）が結合した反復単位からなる。ＬＴＡ分子は、反復ポリ−（ポリオールホスフェート）単位を含み、グリコシル残基又はＤ−アラニンで修飾されているアルジトールが存在する場合は非常に変わりやすい。ＬＴＡは、ＣＤ１４、表面受容体への結合によりマクロファージ及び多形核白血病を活性化する。なお、表面受容体はリポ多糖体との反応も媒介する。ＬＴＡは、ＰＧと相乗的に作用してＴＮＦ−αとＩＬ−６とを放出し、とりわけ酸化窒素シンターゼ（ＮＯＳ：ｎｉｔｒｉｃ  ｏｘｉｄｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ）を誘発し、循環不全、ＭＯＤＳ（多臓器機能不全症候群）及び死亡に至る。ド・キンプ（Ｄｅ  Ｋｉｍｐｅ）（１９９５）、ケンガサラン（Ｋｅｎｇａｔｈａｒａｎ）（１９９８）、ホイマンら（Ｈｅｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．）インフェクシャス・イムノロジー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）６２：２７１５−２１（１９９４）；スコットら（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）インフェクシャス・イムノロジー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．）６９：８７５−８８（２００１）を参照のこと。
【０００５】
菌体密度感知及びＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチド
最近の研究により、コレラ菌（ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、緑膿菌（ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及び黄色ブドウ球菌（ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含む細菌種の病理学における菌体密度感知の重要性が証明された。菌体密度感知は、それにより細菌集団が隣接細胞から入力を受け取り、細菌自身が宿主内で生き残ることを可能にする適切な反応を引き出すメカニズムである。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０：４３８−４０（１９９８）；ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）セル（Ｃｅｌｌ）１１０：３０３−１４（２００２）；ヘンツァーら（Ｈｅｎｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）ジ・ＥＭＢＯジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）２２：３８０３−１５（２００３）；コレムら（Ｋｏｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．）ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．）２２３：１６７−７５（２００３）を参照のこと。ブトウ球菌では、菌体密度感知は、疾患の進行に関与した複数の毒素の群落形成、播種及び産生を含む細菌毒性に関係があるたんぱく質の発現を支配する。これらの毒性因子の一部は、エンテロトキシン及び毒素ショック症候群毒素−１（ＴＳＳＴ−１）であり、これらは、超抗原として作用し、宿主免疫系の過剰刺激を生じ、サイトカインの過剰放出を引き起こし、Ｔ細胞の過剰増殖を誘発する。
【０００６】
黄色ブドウ球菌における菌体密度感知システムでは、エフェクターである菌体密度感知分子ＲＮＡＩＩＩ活性化ペプチド（ＲＡＰ：ＲＮＡＩＩＩ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ）は、ブドウ球菌の中で厳密に保護される２１ｋＤａのたんぱく質である「ＲＮＡＩＩＩ活性化たんぱく質の標的」（ＴＲＡＰ：ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ＲＮＡＩＩＩ−ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）を燐酸化する。ＴＲＡＰの燐酸化は、細菌の癒着と毒素合成の原因であるＲＮＡＩＩＩと呼ばれる調節ＲＮＡ分子の下流産生を促進する。バラバン（Ｂａｌａｂａｎ）（１９９８）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７６：２６５８−６７（２００１）。ＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチド（ＲＩＰ）と呼ばれるＲＡＰの拮抗薬は、ＴＲＡＰの燐酸化を抑制し、それにより毒性因子の下流産生、細菌の癒着、バイオフィルムの形成、及び生体感染を強く抑制する。ＲＩＰの作用メカニズムは、普通の抗生物質とは異なり、細菌を撲滅する代わりに、ＲＩＰは細菌の細胞間の伝染を抑制し、細菌を宿主の防御に対してより脆弱なものにする。バラバン（Ｂａｌａｂａｎ）（１９９８）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２１：１３０１−１１（２０００）；ゴブら（Ｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２２：１６０９−２０（２００１）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１８７：６２５−３０（２００３）；シリオニら（Ｃｉｒｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）１０８：７６７−７１（２００３）；リベイロら（Ｒｉｂｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２４：１８２９−３６（２００３）；ジャコメッティら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）アンチマイクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４７：１９７９−８３（２００３）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）キドニイ・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．）２３：３４０−４５（２００３）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）アンチマイクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４８：２５４４−５０（２００４）；デルアクアら（Ｄｅｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．）ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１９０：３１８−２０（２００４）を参照のこと。
【０００７】
抗菌性ペプチド
遺伝学的に符号化された抗菌性ペプチドは、大抵の多細胞生物における先天性免疫応答の重要な成分であり、該生物は多くの微生物に対する宿主防御の第一線をなす。抗菌性ペプチドは、多面的な免疫調節機能を有し、直接的抗菌活性とＬＴＡ／ＬＰＳ結合能力とを付与されている。循環食細胞中の抗菌性ペプチドは、巻き込まれた微生物の撲滅に寄与し、該ペプチドは、解剖室を微生物の侵入から保護し、上皮表面における局所的防御機構として作用する。キャノン（Ｃａｎｏｎ）ネーチャー（Ｎａｔｕｒｅ）３２８：４７８（１９８７）；スコット（Ｓｃｏｔｔ）（１９９９）；ハンコックら（Ｈａｎｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．）プロシーディングス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９７：８５６−６１（２０００）；ジャコメッティら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）ガッツ（Ｇｕｔ）５２：８７４−７８（２００３）；グフら（Ｇｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．）インフェクシャス・イムノロジー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）６４：４９２２−２７（１９９６）を参照のこと。
【０００８】
カセリシジンは、上皮表面上と食細胞の顆粒内で、いくつかの哺乳類の種により不活性前駆体として産生される関連抗菌性ペプチドの系列である。カセリシジンは、グラム陰性菌、グラム陽性菌及び真菌に対する広範囲の抗菌活性に影響を及ぼし、選択性は広く重なるが、抗菌性ペプチド種の間の効能にはかなりの違いもある。その他の抗菌性ペプチドと同様に、カセリシジンはＬＰＳを結合し、ＬＰＳの炎症促進作用を中和する。ザネティら（Ｚａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）３７４：１−５（１９９５）；ザネティら（Ｚａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）カレント・ファーマシューティカル・デザイン（Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．）８：７７９−９３（２００２）；ザネティら（Ｚａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・リューコサイト・バイオロジー（Ｊ．Ｌｅｕｋ．Ｂｉｏｌ．）７５：３９−４８（２００４）；ジャコメッティら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）アメリカン・ジャーナル・オブ・レスピラトリー・アンド・クリティカル・ケア・メディシン（Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．）１６９：１８７−９４（２００４）を参照のこと。
【０００９】
カセリシジンは、ＧＧＬＲＳＬＧＲＫＩＬＲＡＷＫＫＹＧＰＩＩＶＰＩＩＲＩ−ＮＨ２の一次アミノ配列とアミド化されたＣ末端を有する鎖長が２７個のアミノ酸であるＢＭＡＰ−２８を含む。ＢＭＡＰ−２８は、マイクロモル未満の濃度において抗生物質耐性臨床分離株を体外で撲滅し、生理学的塩濃度において強くて広範な活性スペクトルを保持する。ＢＭＡＰ−２８は、急性腹膜炎モデルにおいて致死的腹腔内感染から体内でマウスを効率的に保護する。スケルラバイら（Ｓｋｅｒｌａｖａｊ  ｅｔ  ａｌ．）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）７１：２８３７５−８１（１９９６）；ベニンカサら（Ｂｅｎｉｎｃａｓａ  ｅｔ  ａｌ．）ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２４：１７２３−３１（２００３）を参照のこと。
【００１０】
普通の抗生物質は、敗血症及びその他の重篤な疾患の根底にある病状を処置しているうちに効率が低下する。例えば、ブドウ球菌は、抗生物質耐性を獲得する能力が高いために、現在、「スーパーバグ」と見なされている。したがって、細菌感染、特に黄色ブドウ球菌などのグラム陽性菌からの感染を処置するより優れた組成物及び方法が引き続き求められている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、細菌感染、特にブドウ球菌敗血症に関連した疾患を処置するための持続しているニーズを満たすためにＲＩＰ及び抗菌性ペプチドを含む治療組成物を提供する。ＲＩＰそれ自身は、ＬＴＡに誘発されたＴＮＦ−αとＮＯとの産生を抑制し、ＲＩＰとカセリシジン抗菌性ペプチドは、ＬＴＡに誘発されたＴＮＦ−αとＮＯとの産生を相乗的に抑制する。体内に投与された場合、ＲＩＰそれ自身は、死亡率と菌血症とを低減し、ＲＩＰとカセリシジン抗菌性ペプチドとは、体内で死亡率と菌血症とを相乗的に低減するように作用する。この組成物は、従来の抗生物質による化学療法と併用して使用することができるが、この組成物は抗生物質に耐性がある細菌に対して有効であるという利点があり、従来の化学療法の代わりの療法として使用することができる。
【００１２】
本発明の第１の態様によると、ポリカチオン性抗菌性ペプチドとＲＩＰとを含む組成物は、ＬＴＡ又はＬＰＳなどの細菌細胞の外被の脂質でポリアニオン性の成分に結合し、中和しうる。この組成物において有効な抗菌性ペプチドには、ヒトのカセリシジン又はＢＭＡＰ−２８などのカセリシジンがある。
【００１３】
この組成物は、さらに、普通の抗生物質又は宿主によるこの組成物の吸着を助長又は遅延する薬剤などその他の薬学的に許容できる薬剤を含む。薬剤、例えば、リポソーム又はナノ粒子は、この組成物を所望の位置又は細胞型に供給あるいはこれらの位置又は細胞型を標的にすることを助長する医薬品に含まれる。この組成物は、局所適用、摂取又は非経口投与などの許容できる方法又は医療デバイスへのコーティングとして投与できるように処方される。
【００１４】
ＲＩＰが、５個の連続アミノ酸配列ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦ、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳであり、あるいは前記配列ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦとは２つの置換又は欠失による違いがある配列を有するアミノ酸を含み、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである。１つの実施形態では、ＲＩＰが、配列ＹＳＰＸ１ＴＮＦから構成されておらず、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸である。一方、ＲＩＰが、前記配列ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦとは１つの置換又は欠失による違いがある配列を有するアミノ酸を含み、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである。その他の種々の実施形態では、ＲＩＰは、アミノ酸配列ＹＫＰＸ１ＴＮＦ、式中Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、アミノ酸配列ＩＫＫＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦ、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳであり、又は配列ＰＣＴＮＦ、ＹＫＰＩＴＮＦ又はＹＫＰＷＴＮＦの１つを含む。ＲＩＰは、長さがアミノ酸１０個に相当し、組成物の約０．１〜５０重量％又は約２〜２０重量％を含む。
【００１５】
本発明の第２の態様により、細菌感染に関連した疾患を処置する方法は、ＬＴＡ又はＬＰＳなどの細菌細胞の外被の脂質でポリアニオン性の成分に結合し、中和しうる抗菌性ペプチドとＲＩＰとを含む組成物の哺乳類の患者への投与を含む。本発明の方法は、細菌細胞外被の脂質でポリアニオン性の成分により生じた細菌性敗血症などの炎症反応を含む細菌感染の処置又は細菌感染のリスクを低減する上で特に有利である。この方法は、全身性細菌感染又は身体の特定の組織、皮膚又は領域に限局された感染の処置に使える。感染は、蜂巣炎、角膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎又は乳腺炎などその他の疾患にも関係している。投与は、局所的、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮的、鼻から又はイオン導入の各ルート、さらに、デポ型システム、カプセル封入、又は移植により行われる。
【００１６】
この方法は、バイオフィルムに関連した細菌感染の処置、バイオフィルムに関連した疾患、特に病状が細菌細胞外被の脂質でポリアニオン性の成分により生じた炎症反応を含む疾患のリスクの低減に有効である。例えば、この組成物は、移植されたデバイスがバイオフィルムを発現するリスクを低減するために患者の体内に挿入されたデバイスの被覆に使える。
【００１７】
この方法は、さらに、やけど、外傷などに罹患している患者など、細菌により生じた感染を有するか、又はそのおそれがある患者で行うことができる。一方、この組成物は、進行中の感染を処置し、細菌感染の発症を遅延させ、又は感染発現のリスクを低減させるために投与することができる。
【００１８】
１つの実施形態では、この組成物を投与される患者は、黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌を含む連鎖球菌種、又はその抗生物質耐性株などのグラム陽性菌により感染するか、又は該菌による感染のおそれがある。その他の実施形態では、病原体は、Ｌ．イノクア及びＬ．モノクトゲネスを含むリステリア種、ラクトコッカス種、エンテロコッカス種、大腸菌、クロストリジウム・アセトブチリカム、及び枯草菌、炭疽菌及びセレウス菌を含むバシラス種又はその抗生物質耐性株であるかもしれない。この方法は、局所適用、摂取、非経口投与などの薬理学的に許容できる手段により、又は医療デバイスへのコーティングとしてこの組成物を投与されることを含む。
【００１９】
本発明の第３の態様によると、細菌感染に関連した疾患を処置する方法は、哺乳類の患者、例えば、ヒトの細菌感染のリスクを処置するか、又は低減するのに有効な量のアミノグリコシド、ベータ・ラクタム、セファロスポリン又はバンコマイシンである抗生物質及びＲＩＰを含む組成物を投与することを含む。特に、この抗生物質は、イミペネム又はバンコマイシンでよい。この組成物は、さらに抗菌性ペプチドを含んでもよい。本発明の第４の態様では、哺乳類の患者、例えば、ヒトの細菌感染のリスクを処置するか、又は低減する方法は、同じこの組成物を患者に投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
この組成物は、ＬＴＡ（リポタイコ酸）又はＬＰＳ（リポ多糖）などの細菌細胞外被の脂質でポリアニオン性の成分を結合し、中和しうるポリカチオン性抗菌性ペプチドとＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチドを結合する。抗菌性ペプチドはカセリシジンでよい。本発明のＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチドは、一般に、ＲＮＡＩＩＩ活性を抑制し、燐酸化ＴＲＡＰ（ＲＮＡＩＩＩ活性化たんぱく質の標的）を低減し、体外モデルにおいてサイトカイン又はＮＯの産生を抑制し、関連活性を示しうるペプチドである。細胞壁成分と細菌性敗血症の病理学における外毒素との重要性を認識すると、この組成物は、細菌性敗血症を処置する方法又は細菌病理学がＬＴＡ又はＬＰＳなどの細菌細胞外被の脂質でポリアニオン性の成分に関連している類似の状態において有効に使用できる。
【００２１】
この組成物は、代わりに又はさらに追加して、ベータ・ラクタム、アミノグリコシド、セファロスポリン又はバンコマイシンなどの普通の抗生物質とＲＩＰ（菌体密度感知抑制剤）とを結合する。この種の組成物は、感染患者が、抗生物質耐性細菌に感染しているか、又は感染するリスクがある場合に特に有利である。何故ならば、ＲＩＰは、この種の普通の抗生物質とは異なるメカニズムによりその抗菌作用を発揮するからである。例えば、この種の組成物は、普通の抗生物質を用いた化学療法を扱いにくくする傾向があるバイオフィルムに関連した感染のリスクを処置又は低減するのに特に有効である。このような扱いにくさは、感染患者に抗生物質の継続使用を強いることになり、これは耐性細菌の発生を助長することになる。一部の抗生物質、例えば、ペニシリン系列、最近ではバンコマイシン系列の抗生物質に対する抵抗が広がっているので、これらの抗生物質の使用は厳格に制限されている。ＲＩＰを含むこの組成物の使用は、これらの抗生物質の使用を復活させているが、ＲＩＰはバイオフィルムを排除又は低減する能力があるので、それにより抗生物質による継続療法に対する障害を低減し、これらの抗生物質に対して発現された抵抗の一部を克服していることが認められている。
【００２２】
１つの実施形態では、この方法は、グラム陽性菌によるリスクを処置又は低減するために使われる。本発明の方法は、蜂巣炎、角膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎又は乳腺炎などの疾患の処置にも有効である。この組成物は、宿主患者におけるブドウ球菌による感染を処置するのに有効な量を投与してもよいが、この組成物は、Ｌ．イノクア及びＬ．モノクトゲネスを含むリステリア種、ラクトコッカス種、エンテロコッカス種、大腸菌、クロストリジウム・アセトブチリカム、及び枯草菌、炭疽菌及びセレウス菌を含むバシラス種又はその抗生物質耐性株により生じた感染の処置にも有効である。
【００２３】
本発明のＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチド
菌体密度感知抑制剤であるＲＩＰは、細菌の増殖には影響を及ぼさないが、外毒素の産生に導く形質導入信号を妨害することにより細菌の病原ポテンシャルを低減する。ＲＩＰは、その標的分子であるＴＲＡＰの燐酸化を抑制することにより毒素の産生を妨害する。ＴＲＡＰはａｇｒ遺伝子座の上流活性剤である。対照的に、抗菌性ペプチドの作用メカニズムには、細菌の外側の膜バリアの崩壊と細胞質膜の撹乱が含まれる。さらに、ポリカチオン性抗菌性ペプチドは、ＬＴＡ又はＬＰＳなどの細菌細胞外被の脂質でポリアニオン性の成分を結合し、中和する。ＲＩＰ及び抗菌性ペプチドは、異なるメカニズムにより作用するので、両者は相乗的に作用し、細菌感染を処置することができる。
【００２４】
ＲＩＰは一般式ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦを含み、式中Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである。具体的なＲＩＰ配列は、引用により明細書に組み込まれている米国特許第６，２９１，４３１号とゴブら（Ｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２２：１６０９−２０（２００１）とで開示されている。ＲＩＰ配列は、アミノ酸配列ＫＫＹＸ２ＰＸ１ＴＮを含むポリペプチドを含み、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである。ＲＩＰ配列は、ＹＳＰＸ１ＴＮＦを含むポリペプチドも含み、Ｘ１はＣ又はＷ及びＹＫＰＩＴＮである。１つの実施形態では、上の一般式ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦを含むＲＩＰは、このＲＩＰが活性を示すならば、さらに、１つ又は２つのアミノ酸の置換、欠失及びその他の修飾により修飾される。
【００２５】
ＲＩＰ及びＲＩＰ製剤の活性を測定する検定システム
上に記載したように、ＲＩＰが菌体密度感知メカニズムを抑制するメカニズムは、ＴＲＡＰの燐酸化の抑制を含む。表皮ブドウ球菌の中にＴＲＡＰ及びＴＲＡＰの燐酸化が存在する証拠があることは、黄色ブドウ球菌と表皮ブドウ球菌の両方に類似した菌体密度感知メカニズムがあり、ＲＩＰがバイオフィルムの形成を妨害する可能性があり、両種によって生じた感染があることを示している。さらに、ＴＲＡＰはすべてのブドウ球菌の株及び種の中に保護される証拠があり、したがって、ＲＩＰはあらゆる型のブドウ球菌に対して有効である。さらに、その他の感染を生じる細菌は、枯草菌、炭疽菌、セレウス菌、Ｌ．イノクア及びＬ．モノクトゲネスを含むＴＲＡＰに対して配列類似性を有するたんぱく質を有するように思われる。その上、ＲＡＰ（ＲＮＡＩＩＩ活性化ペプチド）は、ｒｐｌｂ遺伝子により符号化されたリボソームのたんぱく質Ｌ２の相同分子体である。ｒｐｌｂ遺伝子により符号化されたＲＡＰ相同分子体のその説明について引用により本明細書に組み込まれているコレムら（Ｋｏｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．）ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．）２２３：１６７−７５（２００３）を参照のこと。Ｌ２は、連鎖球菌種、リステリア種、ラクトコッカス種、エンテロコッカス種、大腸菌、クロストリジウム・アセトブチリカム、及びバシラス種を含む細菌の中に高度に保護される。この発見は、黄色ブドウ球菌におけるＲＡＰの機能の撹乱を狙った処置は、Ｌ２合成細菌を処置する場合も同様に有効であることを示している。
【００２６】
本発明によるＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチドは活性を示し、この活性は日常の多数の検査を用いて調べることができる。例えば、ＲＩＰは、ＲＮＡＩＩＩの産生を抑制し、引用により本明細書に組み込まれているバラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２１：１３０１−１１（２０００）に記載された検査方法を用いて体外でＴＲＡＰの燐酸化を抑制しうる。ＲＩＰ活性は、ブドウ球菌による感染の抑制を含む。ＲＩＰは、ブドウ球菌における菌体密度感知システムの周知の機能を用いて妨害することにより、ブドウ球菌が毒素に癒着し、毒素を産生するのを抑制する。ＲＩＰはＲＡＰによるＴＲＡＰ燐酸化の誘発と競合し、ＴＲＡＰの燐酸化を抑制する。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７６：２６５８−６７（２００１）を参照のこと。これが、細胞の癒着とバイオフィルムの形成を低減し、ＲＮＡＩＩＩの合成を抑制し、毒性の表現型を鎮める。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０：４３８−４０（１９９８）を参照のこと。合成ＲＩＰ類似体ＹＳＰＷＴＮＦ（−ＮＨ２）のアミド形は、体外でＲＮＡＩＩＩを効果的に抑制し、蜂巣炎（黄色ブドウ球菌・スミス・ディフューズに対してマウスでテストした）、敗血症関節炎（黄色ブドウ球菌ＬＳ−１に対してマウスでテストした）、角膜炎（黄色ブドウ球菌８３２５−４に対してウサギでテストした）、骨髄炎（黄色ブドウ球菌ＭＳに対してウサギでテストした）、及び乳腺炎（黄色ブドウ球菌・ニューボウルド（Ｎｅｗｂｏｕｌｄ）３０５，ＡＥ−１，及び環境感染に対して牝ウシでテストした）を含む生体黄色ブドウ球菌感染を鎮める。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２１：１３０１−１１（２０００）及び表１を参照のこと。これらの結果は、ＲＩＰ活性の範囲及びＲＩＰ活性の検定に利用できるデータを示し、さらに、ＲＩＰがブドウ球菌感染を予防し、鎮めるために有効な治療分子として役立つことがあることを示している。
【００２７】
【表１】
2008534686.tif 000003
【００２８】
スクリーニング検定は結合検定でよく、この検定では１つ又はそれ以上の分子が標識に結合し、検出可能な信号を発生する。精製したＲＩＰを用いて３次元結晶構造を決定することができ、該構造は分子間相互作用のモデル化に使用することができる。一方、スクリーニング検定は、ＲＮＡＩＩＩの産生及び／又は毒性因子の産生に対する候補ＲＩＰの効果を決めることができる。例えば、ブドウ球菌におけるｒｎａｉｉｉ転写に対する候補ペプチドの効果を測定することができる。この種のスクリーニング検定は、当該分野で周知の手順に従って、ＣＡＴ（クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）、β−ガラクトシダーゼなどのレポーター遺伝子システムを含む組み換え宿主細胞を利用することができる。一方、スクリーニング検定は、当該分野で周知の交配技術を用いてｒｎａｉｉｉ転写又は毒性因子の転写を検出することができる。
【００２９】
ＲＩＰ製剤の体外高速処理分析
ＲＩＰ組成物に関する次のスクリーニング検定は、特定のＲＩＰ又はＲＩＰ組成物又は製剤が、所望のレベルの生物活性を示すかどうかを決めるために使われる検定型の例を挙げている。この検定システムでは、ａｇｒ発現がノーザンブロット法により確認されるＲＮＡＩＩＩレポーター遺伝子検定を用いた高速処理検定でテストされる。ｒｎａｉｉｉ：：ｂｌａＺ融合組成物を含む早期の指数関数的増殖（２×１０７コロニー形成ユニット（ＣＦＵ））における黄色ブドウ球菌細胞は、３７℃で２．５−５時間振とうする９６個のくぼみがあるプレートにおけるテストＲＩＰ製剤の濃度の上昇とともに増殖する。この検定では、β−ラクタマーゼがＲＮＡＩＩＩのレポーター遺伝子として作用する。細菌の生存能力は、ＯＤ６５０ｎｍを測定し、さらに、ＣＦＵを決めるために被覆することによりテストする。β−ラクタマーゼ活性は、β−ラクタマーゼの基質であるニトロセフィンを添加して測定する。β−ラクタマーゼによるニトロセフィンの加水分解は、４９０ｎｍと６５０ｎｍとにおける相対的吸着の変化により示され、この場合黄色はＲＮＡＩＩＩの合成がないこと、ピンク色はＲＮＡＩＩＩの合成があることを、それぞれ、示している。
【００３０】
高速処理検定で効能を示す製剤は、さらに、ノーザンブロット法により確認する。細菌は、候補ＲＩＰ製剤と同様に増殖する。次いで、細胞は遠心分離により集め、ＲＮＡ全体は抽出し、アガロースゲル電気泳動により分離し、ノーザンブロットする。ＲＮＡＩＩＩは、例えば、ＰＣＲにより産生された放射標識を付けたＲＮＡＩＩＩ特異性ＤＮＡへの交配により検出される。例えば、ランダムペプチドを含む対照製剤は、０−１０μｇ／１０７個の細菌においてテストする。
【００３１】
ＲＩＰ製剤の体内分析
候補ペプチドは、ヒト以外の動物モデルにおいてブドウ球菌毒性因子産生に対する効果についてスクリーニングすることにより体内で活性を検査することもできる。候補薬剤は、ブドウ球菌で感染した動物又は候補薬剤とともにブドウ球菌の感染用量を投与された動物に投与される。候補薬剤を投与する様式は、所望の結果について適切であればなんでもよい。例えば、候補薬剤は、静脈内、筋肉内、皮下、又は所望の効果がえられそうな組織内に直接、注射により投与されるか、又は候補薬剤を局所的、経口などで投与することができる。この薬剤は、動物の体内に埋め込まれるデバイスの被覆に使用することができる。薬剤の作用は、ブドウ球菌に関連した病変の数とサイズの算定、感染の微生物的証拠、全体的な健康状態の観察など適切な方法により監視することができる。
【００３２】
選択された動物モデルは、ブドウ球菌の特定の病原株又はその疾患に対して候補薬剤が選別される標的疾患を含む当該分野で周知の多数の要因により変動する。例えば、毒素産生に関連した感染を鎮めるＲＩＰ製剤の能力を評価する場合、マウスの敗血症／蜂巣炎モデルは特に有効である。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０：４３８−４０（１９９８）。このモデルは、例えば、この製剤が細菌性外毒素及び毒性細胞壁成分を結合し、中和しうるポリカチオン性の抗菌性ペプチドとＲＩＰとを含む場合特に好ましく、製剤がこのようなものを含まなければ炎症反応及び毒素性ショック症候群を誘発するおそれがある。
【００３３】
マウスの敗血症／蜂巣炎モデルでは、無毛の免疫応答性マウス（ｎ＝１０）は、通常、サイトデックス・ビーズとともに５×１０８ＣＦＵの黄色ブドウ球菌株スミス・ディフューズを含む１００μＬの生理食塩水を皮下注射により攻撃される。処方されたＲＩＰは、静脈用量の１０倍の用量を静脈又は経口により強制的に投与される。代表的な静脈用量は、＜１０ｍｇ（ＲＩＰ）／ｋｇ（宿主体重）になる。動物は５日間観察され、病変のサイズを測定する。一部の動物は感染により最初の４８時間以内に敗血症により死亡し、その他は種々のサイズの病変を発現すると見込まれている。
【００３４】
ラット移植モデルは、バイオフィルム形成に関連した感染を製剤が鎮める能力の評価に使用することができるので、特に有効である。ジャコメッティら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）アンチマイクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４７：１９７９−８３（２００３）；シリオニら（Ｃｉｒｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）１０８：７６７−７１（２００３）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１８７：６２５−３０（２００３）。このモデルは、細菌の攻撃とバイオフィルム感染との間の時間間隔が、通常、７２時間あり、ＲＩＰ製剤の最適投与ルートと用量をテストすることができるので、薬が使用される状況が非常に重要である。このモデルは、バイオフィルムは抗生物質に対して極度に耐性であることが判明しているので、より攻撃的な活性テストを与える。
【００３５】
ラット移植モデルを用いると、ＲＩＰは、移植片が２０μｇ／ｍＬのＲＩＰに２０分間浸漬された場合、又はＲＩＰが腹腔内ルートにより１０ｍｇ（ＲＩＰ）／ｋｇ（体重）にて注入された場合、感染を４桁低減することが証明された。ラット移植モデルを用いたこれらの結果は、ＲＩＰのみを用いた場合より一層高いか、低いＲＩＰ濃度を用いて上に記載した体外検定により決定した最も有望なＲＩＰ製剤の場合に反復される。即ち、製剤の効能は、効果があると知られている用量における腹腔内ＲＩＰ投与と比較することができる。手術時に局所的並びに非経口でＲＩＰを投与することは、このモデルシステムにおいて感染予防は１００％有効である。デルアクアら（Ｄｅｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．）ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシァス・ディジージズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１９０：３１８−２０（２００４）。したがって、本発明のＲＩＰ製剤は、同じか、又は類似の条件下で行えるのが好ましい。ＲＩＰ製剤は、細菌攻撃後０−６日間にバイオフィルム形成の前及び／又は後に毎日投与することができる。
【００３６】
代表的実験では、ウィスターのおとなのオスラット（ｎ＝１０）に麻酔をかけ、１．５ｃｍの切り口による中央の線の各サイドに皮下ポケットを作る。１ｃｍ２の無菌コラーゲンにより密封した二重ベロアを編んだポリエチレンテレフタレート（ダクロン）移植片（商標Ａｌｂｏｇｒａｆｔ，イタリア）を生理食塩水、ＲＩＰ、又はＲＩＰ製剤に浸漬し、ポケット内に埋め込む。ポケットはスキン・クリップで閉鎖し、２×１０７ＣＦＵ／ｍＬの細菌を、ツベルクリン注射器を用いて移植片表面に植え込み、皮下に流体を満たしたポケットを作る。これらの動物は個々のかごにもどし、毎日調査する。動物は、移植片感染後０−６日にＲＩＰ又はＲＩＰ製剤の静脈投与又は経口投与を受ける。フリーＲＩＰは、陽性の対照として腹腔内ルートを介して投与する。移植片は、埋め込み後７日目に取りだし、ＣＦＵは、周知の操作、例えば、ジャコメッティら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２００３）によるものである。取り出した移植片は、無菌のチューブに入れ、無菌の生理食塩水で洗浄し、ホスフェート緩衝生理食塩水を１０ｍＬ含むチューブに入れ、５分間超音波で分解して移植片から癒着細菌を除去する。超音波処理後、移植片を顕微鏡でチェックし、細菌がすべて除去されていることを確認する。生存能力のある細菌の数量化は、血液寒天プレート上の細菌懸濁液の連続希釈液（０．１ｍＬ）を培養して行う。すべてのプレートは４８時間３７℃で培養し、プレートあたりのＣＦＵの数を求めた。注目すべきは、抗生物質に敏感な細菌か、又は細菌耐性抗生物質のいずれかについて１０分以下の超音波処理の効果をテストして細胞生存能力（ＣＦＵ／ｍＬ）に顕著な差がなかったことである。この方法の検出限界は約１０ＣＦＵ／ｍＬである。
【００３７】
本発明の抗菌性ペプチド
本発明で有効な抗菌性ペプチドは、ＬＴＡ又はＬＰＳなどの細菌細胞外被の脂質でポリアニオン性の成分を結合し、中和する能力を有する。脂質でポリアニオン性の成分は、細菌細胞外被に埋め込まれているか、又は可溶性の形態をしている。いずれにしても、抗菌性ペプチドは、この成分に結合し、宿主において炎症反応を引き起こすその能力を妨害するか、又は抑制する。グラム陰性組織体の場合、カチオン性抗菌性ペプチドはＬＰＳに結合し、それによりその内毒素活性を失わせる。スコットら（Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．）インフェクシャス・イムノロジー（Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．）６７：２００５−０９（１９９９）を参照のこと。同様に、グラム陽性菌では、カチオン性抗菌性ペプチドがＬＴＡを結合し、中和する。スコット（Ｓｃｏｔｔ）（２００１）を参照のこと。本発明の１つの実施形態では、抗菌性ペプチドはＬＴＡ又はグラム陽性菌のタイコ酸に結合する。
【００３８】
抗菌性ペプチドは、抗生物質耐性株を含むグラム陰性菌とグラム陽性菌との両方を撲滅するか、又は中和する、広範囲の活性を有する。ハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ），ザ・ランセット・インフェクシャス・ディジージズ（Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．）１：１５６−６４（２００１）を参照のこと。引用により全体が本明細書に組み込まれている、ワン（Ｗａｎｇ），ネブラスカ大学医療センター，抗菌性ペプチド・データベース，http://aps.unmc.edu/AP/main.php（最後の修正、２００５年３月５日）により、本発明に対して潜在的に有効な抗菌活性を有する約５００の抗菌性ペプチドのデータベースが与えられている。抗菌性ペプチドは、通常、１２から５０個のアミノ酸残基から構成され、ポリカチオン性である。通常、これらのアミノ酸の約５０％は疎水性であり、且つこれらは一般に両親媒性であり、これらの一次アミノ酸配列は疎水性残基と極性残基とを交互に含む。抗菌性ペプチドは、４つの構造カテゴリー、（ｉ）複数のジサルファイド結合により安定化されているβ−シート構造（例えば、ヒト・デフェンシン−１）、（ｉｉ）共有結合により安定化されたループ構造（例えば、バクテネシン）、（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｔｒｐ）に富む、拡張らせんペプチド（例えば、インドリシジン）、及び（ｉｖ）両親媒性α−らせん（例えば、マガイニン及びセクロピン）の１つに合致している。フワンら（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）バイオケミストリー・アンド・セル・バイオロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）７６：２３５−４６（１９８８）；スタークら（Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．）アンチマイクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４６：３５８５−９０（２００２）を参照のこと。
【００３９】
少なくともヒト、牝ウシ、ヒツジ、ウサギ、マウス及びブタに存在する最近発見された種類の抗菌性ペプチドであるカセリシジンは、これらの構造モチーフをすべて利用している。ガンツら（Ｇａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．）カレント・オピニオン・イン・ヘマトロジー（Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ．）４：５３−５８（１９９７）を参照のこと。これらのカセリシジンは、約１００個のアミノ酸からなる高度に保護されたＮ末端プロペプチドのセグメントと抗菌性ペプチドのモチーフを符号化するＣ末端ドメインとを共有している。フワンら（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）バイオケミストリー・アンド・セル・バイオロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）７６：２３５−４６（１９８８）を参照のこと。ヒトでは、好中球活性化により、エラスターゼ媒介細胞内たんぱく質分解による開裂とＣ末端抗菌性ペプチドの生成が起きる。ＦＡＬＬ−３９、ｈＣＡＰ１８、ＬＬ−３７又はＣＡＭＰとも呼ばれるヒト・カセリシジンは、その能動的処理形において、３７個のアミノ酸からなる両親媒性α−らせんカチオン性ペプチドである。ザネティら（Ｚａｎｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）ＦＥＢＳレターズ（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．）３７４：１−５（１９９５）を参照のこと。ＬＬ−３７の発現は、ヒトの好中球、睾丸細胞、気道上皮、及び炎症の部位におけるケラチン形成細胞において検出されている。
【００４０】
α−らせんの部類の両親媒性カチオン性ペプチドは、通常、μｇ／ｍＬの領域で最低細菌濃度を示し、この領域はその他の抗菌性薬剤と同じ程度である。両親媒性カチオン性ペプチドは、複数の抗生物質に対して耐性が高い病原菌を含む広範囲のグラム陰性菌とグラム陽性菌との病原菌を撲滅することができる。ハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ），ドラッグス（Ｄｒｕｇｓ）５７：４６９−７３（１９９９）を参照のこと。これらのペプチドは、まず、負に荷電した細菌表面に結合することにより細菌を撲滅し、次いで、細胞膜内に入ることによりその膜の完全性を壊す。両親媒性カチオン性のα−らせん抗菌性ペプチドの顕著な特徴は、少なくとも＋２の正味の正電荷を有する親水性表面を提供する両親媒性二次構造内に収めるこれらのペプチドの能力である。多数の異なるアミノ酸配列の組み合わせにより、ペプチドはこの特徴的な構造を達成することができる。結果的に、数百の宿主由来の両親媒性カチオン性α−らせんペプチドは、今まで示されてきたすべての一次配列の比較のレベルにおいて限局された配列相同性を示すとされている。フワンら（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）バイオケミストリー・アンド・セル・バイオロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）７６：２３５−４６（１９８８）を参照のこと。ＲＩＰについて上に記載したスクリーニング検定は、特に、ＲＩＰ及び抗菌性ペプチドの両方を含む組成物の形で活性について抗菌性ペプチドの選別にも使える。
【００４１】
ＲＩＰ及び抗菌性ペプチドの両方について、本明細書で使われている用語“たんぱく質”、“ポリペプチド”又は“ペプチド”は、修飾配列（例えば、グリコシル化、ＰＥＧ化、保存アミノ酸置換及び、５−オキソプロピル、アミド化、Ｄ−アミノ酸などの保護基を含む）を含む。アミノ酸置換は、通常、次の群、グリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン及びフェニルアラニン、チロシン内にある保存置換を含む。当業者は、抗菌性ペプチドは普通の抗生物質を含まないと認識している。
【００４２】
本発明のたんぱく質、ポリペプチド及びペプチドは、自然に存在するか、組み換えにより作るか、又は当該分野で周知の方法による化学合成により作られる。天然ペプチドは細菌に対して毒性があるにも関わらず、当業者は、細菌の宿主において抗菌性ペプチドを組み換えにより産生する種々の方法を知っている。引用により全体が本明細書に組み込まれている、米国特許第５，５８９，３６４及び５，７８９，３７７号は、生物学的に並びに治療上かなりの活性を有する両親媒性ペプチドを組み換えにより産生する適切な方法を２例開示している。例えば、Ｋ−１２細胞に欠けた大腸菌プロテアーゼは、両親媒性抗菌性ペプチドとたんぱく質とを結合する炭水化物の少なくとも一部を含む開裂可能な融合たんぱく質を発現するベクターにより変質される。融合たんぱく質は細胞内で発現され、炭水化物結合部分が発現した融合たんぱく質の精製を容易にし、次いで融合たんぱく質が開裂され、実質的に炭水化物結合たんぱく質残基を含まない両親媒性ペプチドが得られる。そのようにして作られた生物学的に活性な両親媒性ペプチドは、さらに、化学的処理又は酵素を用いた処理を受け、所望の生物学的特性と治療特性を有する化学的に異なる両親媒性抗菌性ペプチドを得る。１つの実施形態では、ＲＩＰを符号化するＤＮＡは抗菌性ペプチドを符号化するＤＮＡと共発現されるので、組み換え発現はＲＩＰと抗菌性ペプチドとの両方を産生する。例えば、符号化ＤＮＡは、同じ促進剤に関する操作可能なコントロールの下で同じ遺伝子構図に含まれる。別の実施形態では、符号化ＤＮＡの読み枠は、枠内で融合されるので、構図はＲＩＰと抗菌性ペプチドとの両方の配列を含む融合たんぱく質を発現する。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）アンチマイクロバイアル・エージェント・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４８：２５４４−５０（２００４）を参照のこと。
【００４３】
本発明のたんぱく質、ポリペプチド及びペプチドは、精製又は単離することができる。「精製された」は、天然の状態で見出された化合物に普通に付随する成分から、実質的にフリー、例えば、約６０％フリー、約７５％フリー、又は約９０％フリーである化合物を意味している。「単離された」化合物は、その化合物が天然に存在する環境とは異なる環境にあることである。
【００４４】
薬剤組成物及び処置方法
用語「処置」又は「処置している」は、個々の動物、例えば、哺乳類、好ましくはヒトにおける何らかの治療的介入を意味している。処置には、（ｉ）臨床症状を発現しないように、例えば、感染が発現する及び／又は危険な状態になるのを防ぐ「予防」、（ｉｉ）臨床症状の発現の阻止、例えば、進行中の感染を止め、感染を完全に排除したり、又はもはや危険でない程度まで進行を止める「抑制」、及び（ｉｉｉ）臨床症状の退行、例えば、感染により生じた熱及び／又は炎症の緩和を生じる「緩和」がある。処置には、バイオフィルム形成の予防、抑制、又は緩和を含めてもよい。細菌感染を有する「リスクにさらされた」患者への投与は、この患者が細菌感染について必ずしも診断を受ける必要はないが、患者の状態は感染について患者を普通より高いリスクに置き、例えば、患者が火傷を負っていることを意味する。細菌感染を有する「疑い」のある患者への投与は、患者が感染の初期兆候をいくつか示し、例えば、体温が上がっているが、診断はまだなされていないか、確認されていないことを意味する。
【００４５】
用語「有効量」は、処置するのに十分な用量を意味する。治療効果をあげるのに必要な活性成分の量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態及び投与されたその他の薬剤を含む多様な因子に依存し、したがって、処置用量は安全性と効能を優先して漸増する必要がある。通常、体外で使われる用量が、活性成分の体内投与の場合の有効量を決める有用な指針になる。特定の障害を処置する有効用量に関する動物テストにより、さらにヒトへの予想用量が得られる。医薬品中の活性成分の濃度は、通常、約０．１％未満から、少なくとも約２重量％、２０％〜５０％程度又はそれ以上まで変動し、選択された個々の投与様式により、第一に流体容積、粘度などにより選択される。種々の適切な考察は、例えば、グッドマンとギルマン（Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ）著，「治療の薬理学的基礎」（Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ），ハードマンら（Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）編，第１０版，マックグローヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）（２００１）及びレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著，「薬学の科学と実務」（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ），フィラデルフィア科学大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ），第２１版，マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．），ペンシルバニア州（ＰＡ）イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）（２００５）に記載されている。これらの文献は引用により全体が本明細書に組み込まれている。そこでは、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮的、鼻又はイオン導入などの各ルートによる投与を含む投与方法が論議されている。
【００４６】
本発明の組成物は、投与方法により種々の単位投与形態で投与してもよい。例えば、経口投与に適した単位投与形態には、粉末、錠剤、ピル及びカプセルなどの固体投与形態、並びにエリキシル剤、シロップ及び懸濁液などの液体投与形態がある。活性成分は、無菌液体投与形態にて非経口投与することもできる。ゼラチンカプセルは、活性成分、並びに不活性成分としてグルコース、ラクトース、スクロース、マニトール、澱粉、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウムなどの粉末担体を含む。
【００４７】
本発明の組成物に添加してもよい不活性成分の例には、望ましい色、味、安定性、緩衝能力、分散性を与える薬剤又は赤色酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インクなどのその他の成分がある。類似の希釈剤を用いて圧縮錠剤を作ることができる。錠剤とカプセルは、いずれも、数時間にわたり薬物を連続的に放出して放出持続型製品として作ることができる。圧縮錠剤は、砂糖又はフィルムで被覆して、不快な味を隠し、大気から錠剤を保護し、あるいは消化管で選択的に崩壊させるように腸溶コーティングをすることができる。経口投与用の液体投薬形態は、患者が服用しやすいように着色剤や香料を含むことができる。
【００４８】
本発明の組成物は、エマルジョン、泡状物、ミセル、不溶性単層、液晶、リン脂質分散体、薄層などを含むリポソームを介して投与することもできる。これらの製剤では、供給される本発明の組成物は、単独あるいは、抗体などの標的分子、又はその他の治療のための組成物又は免疫原性組成物とともに、リポソームの一部として組み込まれる。したがって、本発明の所望の組成物で満たしたか、又は該組成物で装飾したリポソームは、全身に投与するか、又は特定の組織に向けることができる。
【００４９】
本発明で使用するリポソームは、標準小胞形成脂質から形成され、該脂質は、一般に、中性及び負に荷電したリン脂質、並びにコレステロールなどのステロールを含む。脂質は、一般に、所望のリポソームのサイズ、酸不安定性及び血流中の安定性により選択される。リポソームの調製には、スゾカら（Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）アニュアル・レビュー・オブ・バイオフィジックス・アンド・バイオエンジニアリング（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．）９：４６７（１９８０），米国特許第４，２３５，８７１、４，５０１，７２８、４，８３７，０２８及び５，０１９，３６９号に記載されている多様な方法が利用できる。これらの文献及び特許は、引用により本明細書に組み込まれている。本発明の組成物を含むリポソーム懸濁液は、特に投与の方法、供給される本発明の組成物及び処置される疾患の進行度により変わる用量にて静脈、局所、局部などに投与される。
【００５０】
固体組成物では、普通の毒性のない固体担体が使われ、該担体には、例えば、薬品級のマニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどがある。経口投与の場合、医療上許容できる毒性のない組成物は、先に挙げた担体などの普通に使われる賦形剤のうちいずれかを通常で活性成分の１０−９５％、より好ましくは、２５−７５％の濃度で組み込むことにより形成される。本発明の組成物は、デポ型システム、カプセル封入形態、当該分野で周知の技術による移植により投与される。同様に、組成物はポンプ、例えば、浸透圧ポンプにより特定の組織に投与することができる。
【００５１】
エアロゾルを投与する場合は、本発明の組成物は界面活性剤及び推進剤とともに微粉砕して供給するのが好ましい。この種の薬剤の代表は、脂肪族多価アルコール又はその環状無水物を有するカプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノレイン酸、リノレニン酸、オレステリン酸及びオレイン酸などの６〜２２個の炭素原子を含む脂肪酸のエステル又は部分エステルである。混合グリセリド又は天然グリセリドなどの混合エステルは使用してもよい。界面活性剤は、組成物の０．１〜２０重量％、好ましくは０．２５〜５重量％を占める。通常、組成物のバランスは推進剤によりとられる。鼻腔内投与の場合のレシチンのように、必要により担体を含めることもできる。
【００５２】
本発明では、「組成物の投与」は、各活性成分の治療濃度が、患者の体内で同じ時間に達せられるように、同じ患者に同じかほぼ同じ時間にＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチド及び抗菌性ペプチド及び／又は抗生物質別の製剤として投与することを含む。この用語は、ＲＩＰ及び抗菌性ペプチドが投与されるのと同じかほぼ同じ時間に、別の製剤としてＲＩＰ及び抗菌性ペプチドを含む同じ製剤において患者に抗生物質を投与するか、又は抗生物質を投与することを含む。例えば、この方法は、ＲＩＰ、抗菌性ペプチド及び抗生物質を含む別のピルの経口共投与を含む。有効な抗生物質には、アミノグリコシド（例えば、ゲンタマイシン）、ベータ・ラクタム（例えば、ペニシリン）、セファロスポリン又はバンコマイシンがある。ＲＩＰ及び抗菌性ペプチドの投与は、抗生物質を投与する約４８時間以内に、好ましくは約２−８時間以内に、最も好ましくは抗生物質の投与と同時に行われる。
【００５３】
所望の薬理学的活性を有する化合物は、病原性細菌感染の処置、予防、抑制又は緩和のために生理学的に許容できる担体とともに宿主に投与される。治療薬は、経口、局所的、非経口、腹腔内、静脈内、肺内（即ち、吸入）など種々の方法で投与することができる。投与方法により、これらの化合物は種々の方法で処方することができる。
【００５４】
製剤内の治療に有効な化合物の濃度は、約０．１−１００ｗｔ％の範囲で変わる。用量は、最高の治療反応が得られるように調節する。例えば、数回に分割した用量を毎日投与するか、又は治療状況により指示された比率で用量を低減してもよい。感染を処置するヒトの用量レベルが知られており、一般に、１日につき、約０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ（体重）、好ましくは約６〜２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１２〜１００ｍｇ／ｋｇになる。もちろん、投与された製剤の量は、患者と苦痛の重篤性、投与の方法とスケジュール及び処方医の判断に依存する。一般に、血清濃度は、１０日未満で感染を処置するのに十分なレベルに維持されるべきである。ただし本発明による利点は、比較的低い組成物濃度における１０日より長い間の処置を延長する能力があることである。何故ならば、細菌は、処置により、この組成物に対する抵抗を発現する見込みが低減したからである。
【００５５】
薬剤組成物は、顆粒、錠剤、ピル、坐薬、カプセル、懸濁液、軟膏、ローションなどの種々の形で調製することができる。経口及び局所的使用に適した、医薬品グレードの有機又は無機担体又は希釈剤は、治療上活性な化合物を含む組成物の調製に使用することができる。当該分野で周知の希釈剤には、水性媒体、植物性及び動物性油脂類がある。安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧を変えるための塩類又は十分なｐＨ値を確保するための緩衝液及び皮膚浸透促進剤は、助剤として使用することができる。これらの組成物は、その他の医薬賦形剤、担体などを含むことがある。適切な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストローズ、グリセロール、エタノールなどである。医薬組成物を調製する方法は、当業者には周知の方法である。例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）著，「薬学の科学と実務」（Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ），フィラデルフィア科学大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ），第２１版，マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．），ペンシルバニア州（ＰＡ）イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）（２００５）を参照のこと。
【００５６】
この組成物は、病変全体を低減したり、あるいは細菌により誘発された全身性炎症症候群（ＳＩＲＳ）、蜂巣炎、角膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、乳腺炎、皮膚感染、肺炎、心内膜炎、髄膜炎、手術後の外傷の感染、デバイスに関連した感染及び毒性ショック症候群を含む細菌性敗血症に加えて細菌性感染により生じた種々の疾患における疾患症状の発現を遅延させるのに有効である。
【００５７】
バイオフィルム関連感染の処置
細菌自身を合成する水和ポリマー性マトリックスにおいて、表面会合体に付着する細菌がバイオフィルムを形成する。これら固着性群落の形成並びに抗菌性薬剤に対するこれらの群落に固有の抵抗が、持続性且つ慢性の多くの細菌感染の根底にある。コスタートンら（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８４：１３１８−２２（１９９９）を参照のこと。バイオフィルムは、不活性表面、又は死んだ組織上で優先的に発現し、通常、医療デバイス並びに死骨の腐骨などの死んだ組織のかけらの上に生じるが、バイオフィルムは心内膜炎の場合のように生きている組織上にも形成することができる。バイオフィルムは１つ又はそれ以上の場所で徐々に成長し、バイオフィルム感染は明らかな症状を徐々に発現することが多い。固着性細菌の細胞は、抗原を放出し、抗体の産生を刺激するが、抗体はバイオフィルム内で細菌を撲滅することができず、周囲の組織に対する複合免疫損傷を生じるおそれがある。優れた細胞及び体液免疫反応を有する患者においてさえ、バイオフィルム感染が、宿主防御メカニズムにより消散するのはまれである。抗生物質療法は、通常、バイオフィルムから放出された浮遊細胞により生じた症状を解消するが、バイオフィルムを撲滅することはできない。このため、バイオフィルム感染は、通常、固着性個体群が身体から手術により除去されるまでは、抗生物質療法のサイクル後反復症状を示す。したがって、一旦形成されたバイオフィルムの根絶を試みるよりも、バイオフィルム形成を予防するのが好ましい。
【００５８】
本発明の組成物と方法とは、バイオフィルムに関連した細菌感染の処置、又はバイオフィルム、特に細菌の病原性が細菌細胞外被の脂質でポリアニオン性の成分に関連している細菌により生じたバイオフィルムに関連した疾患のリスクを低減する場合に有効である。例えば、アミノグリコシド、ベータ・ラクタム、セファロスポリン又はバンコマイシンなどの抗生物質とＲＩＰとを含む組成物は、バイオフィルムのリスクを処置又は低減するために使用される。別の実施形態では、バイオフィルムに関連する感染のリスクを処置又は低減する普通の抗生物質に加えて、又はその代わりに、ＲＩＰが抗菌性ペプチドと併用される。
【００５９】
この組成物は、埋め込まれたデバイスがバイオフィルムを発現するリスクを低減するために、患者の体内に挿入されるデバイス、例えば、手術デバイス、カテーテル、補綴具又はその他の移植片の被覆に使用することができる。一方、この組成物は、局所的感染の処置において組成物の高い、局所的濃度を与えるために埋め込まれる。この実施形態では、この組成物は持続性薬剤として与えられ、持続放出用に処方される。下の表２は、この組成物及び方法が有効であると見込まれている院内感染のリストの一部である。
【００６０】
【表２】
2008534686.tif 000004
【実施例】
【００６１】
ＲＩＰ及びＢＭＡＰ−２８を含む組成物を、ＲＡＷ２６４．７細胞に体外で投与した。この組成物は、ＬＴＡにより誘発されたＴＮＦ−αの放出、ＮＯの産生、敗血症ショックの種々の動物モデルにおける循環虚脱に寄与する強力な血管拡張剤の作用を阻害することが判明した。別の試験では、ＲＩＰ及びＢＭＡＰ−２８を含む組成物は、マウスの敗血症モデルにおいて有効であることが証明された。
【００６２】
１．１  材料及び方法
微生物：商業的に入手可能な黄色ブドウ球菌の品質調節株であるＡＴＣＣ２５９２３を用いた。
【００６３】
試薬：黄色ブドウ球菌からのＬＴＡ（イタリア・ミラノのシグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を内毒素を含まない水に再懸濁させ、等分し、−２０℃で短期間貯蔵した。ＬＴＡ製剤のＬＰＳ汚染は、バイオウイットテーカー（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）（米国メリーランド州ウォーカーズビル（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ））のリムラス検定により測定して、２ｎｇ／ｍＬ未満であった。
【００６４】
ペプチド合成のカップリング試薬であるＰＡＬ−ＰＥＧ−ＰＳ樹脂、並びにＦｍｏｃアミノ酸は、アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（米国のフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）市）から購入した。ペプチド合成グレードのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチル−２−ピロリドン、ジクロロメタン並びにＨＰＬＣグレードのアセトニトリルはバイオソルブ（Ｂｉｏｓｏｌｖｅ）（オランダのファルケンスヴァード（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ））から購入した。トリフルオロ酢酸、Ｎ−メチルモルホリン及びトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）は、アクロスキミカ（Ａｃｒｏｓ  Ｃｈｉｍｉｃａ）（ベルギーのベールス（Ｂｅｅｒｓｅ））から購入した。
【００６５】
薬剤：天然ＲＩＰ（ＹＳＰＷＴＮＦ−ＮＨ２）のアミド形はネオシステム（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ）（フランスのストラスブルク）により合成し、ＨＰＬＣにより９９％へ精製した。ＲＩＰ粉末は、必要な最高濃度である２０倍の蒸留水に溶解した。
【００６６】
ＢＭＡＰ−２８（ＧＧＬＲＳＬＧＲＫＩＬＲＡＷＫＫＹＧＰＩＩＶＰＩＩＲＩ−ＮＨ２）は、Ｆｍｏｃ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙを用いてミリゲン（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ）９０５０自動合成器（アプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）（米国のフォスター（Ｆｏｓｔｅｒ）市）でＣ末端アミド化ペプチドとして化学的に合成した。スケルラバイ（Ｓｋｅｒｌａｖａｊ）（１９９６）を参照のこと。分子質量は、ＡＰＩＩ装置（カナダ・トロントのＰＥ  ＳＣＩＥＸ）を用いて、エレクトロスプレー質量分析器（ＥＳ−ＭＳ）により測定した。精製したペプチドは、内毒素を含まない水に溶解し、等分し、−２０℃で貯蔵した。ペプチド濃度は、ＢＭＡＰ−２８の２８０ｎｍにおける吸光度を測定し、モル吸光係数をＴｒｐについては５５５９、Ｔｙｒについては１２８０として決めた。
【００６７】
この検定により、ペプチドの一連の希釈液を、（ｉ）ＲＡＷ２６４．７細胞に関する体外検定の細胞培養媒体液として、（ｉｉ）体外感受性テストのポリプロピレン・チューブ内に０．２％ウシ血清アルブミンを含む０．０１％酢酸として、及び（ｉｉｉ）体内試験の生理食塩水として、調製した。イミペネム（イタリア・ミラノのメルク、シャープ＆ドーム（Ｍｅｒｃｋ，Ｓｈａｒｐ＆Ｄｏｈｍｅ））並びにバンコマイシン（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））粉末は、製造者の勧めにより希釈した。すべての溶液は、検定当日に新たに調製した。各化合物について調べた濃度範囲は、０．２５−０．２５６ｍｇ／Ｌであった。
【００６８】
ＲＡＷ２６４．７細胞によるサイトカインの産生：マウスマクロファージ細胞系ＲＡＷ２６４．７は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））から得られ、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００単位／ｍＬのペニシリン及び１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを、加湿した３７℃の培養器中で補完したＲＰＭＩ中に保持した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、上の媒体中１０６「細胞／くぼみ」において２４個のくぼみがあるプレートで、５％ＣＯ２中３７℃で一晩培養した。ＲＰＭＩは、１晩増殖した細胞から吸引し、新たな媒体で置換した。各ペプチドが次の濃度、即ち２μＭのＢＭＡＰ−２８、４μＭのＢＭＡＰ−２８、２０μＭのＲＩＰ、２μＭのＢＭＡＰ−２８と併用する２０μＭのＲＩＰの存在下又は無存在下、５％ＣＯ２中３７℃で黄色ブドウ球菌からの５μｇ／ｍＬのＬＴＡを用いて細胞を培養した。ペプチドはＬＴＡと同時に添加した。２４時間培養後、上澄みを除去し、製造者の仕様書により、酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ；イタリア・ミラノのユーロクローン・ライフ・サイエンシズ（Ｅｕｒｏｃｌｏｎｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））によりＴＮＦ−αの産生についてテストした。試料はすべて２通りにテストした。ＴＮＦ−αの検出限界は、０．０２５ｎｇ／ｍＬ未満であった。ＲＩＰの作用の特異性を実証するために、２０μｇ／ｍＬの不活性ＲＩＰペプチド類似体（ＹＫＰＥＴＮＦ−ＮＨ２，ネオシステム（Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍ）（フランスのストラスブルク）を用いて追加実験を行った。
【００６９】
酸化窒素（ＮＯ）の検出：ＲＡＷ２６４．７細胞は、上に記載した通りに培養した。ＬＴＡに刺激されて上澄み中で２４時間にわたり産生されたＮＯの量は、製造者の使用説明書によりグリース試薬（オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ）のモレキュラー・プローブス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））を用いて安定なＮＯ代謝産物であるニトリルの蓄積から推定した。
【００７０】
感受性テスト：抗生物質に対する感受性は、臨床実験室の基準に関する全国委員会により概説された操作「好気的に増殖する細菌の抗菌性感受性テストの希釈方法」、即ち認可された基準Ｍ７−Ａ６、ペンシルバニア州ビラノバ（２００３）によるミクロな液体希釈方法を用いて測定した。ＭＩＣは、観察可能な増殖が抑制される最低抗生物質濃度として取られた。実験は３通りに行われた。
【００７１】
動物：２３〜３０ｇのＢＡＬＢ／ｃのオスのマウスが、すべての実験で使われた。すべての動物は個々のかごに収容され、かごは一定温度(２２℃）と湿度におかれ、１２時間の明暗のサイクルがあり、試験中食料と水は自由に入手できた。この試験は、イタリア・アンコナのマーシュ科学技術大学のＩ．Ｎ．Ｒ．Ｃ．Ａ，−Ｉ．Ｒ．Ｒ．Ｃ．Ｓ．の動物研究倫理委員会により承認された。
【００７２】
接種材料の調製：黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３は、脳−心臓注入培養液中３７℃で一晩増殖させた。細菌が対数増殖期にある場合、懸濁液は１０００ｇにて１５分間遠心分離し、上澄みは廃棄し、細菌は無菌食塩水に再懸濁し、約１×１０７ＣＦＵ／ｍＬの濃度に到達した。
【００７３】
熱殺菌された黄色ブドウ球菌は、約２．５×１０９ｃｅｌｌｓ／ｍＬを含むホスフェート緩衝食塩水中で細菌懸濁液を１０分間沸騰させ、１分間超音波分解させて調製した。熱処理の効果は、細菌を１晩増殖させ、増殖がないことを確かめて確認した。
【００７４】
接種材料の移植：すべての動物は、ケラチンの筋肉内注入（３０ｍｇ／ｋｇ（体重））により麻酔をかけた。マウスには、上述の細菌懸濁液を０．２ｍＬ、即ち（ｉ）２．０×１０６ＣＦＵの黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３（モデル１）、又は（ｉｉ）５．０×１０８の熱殺菌された細胞（モデル２）を、０日に、尾の静脈から静脈内（ｉ．ｖ．）に注入し７２時間監視した。
【００７５】
抗生物質療法：細菌攻撃後、直ぐに（モデル１ａ及び２ａ）又は６時間経過して（モデル１ｂ及び２ｂ）、マウスは、ランダムに、同位体塩化ナトリウム溶液（対照グループ）、１０ｍｇ／ｋｇのＲＩＰ単独、又は２ｍｇ／ｋｇのＢＭＡＰ−２８、７ｍｇ／ｋｇのイミペネム及び７ｍｇ／ｋｇのバンコマイシンと併用して、静脈から投与された。各グループには２０匹のマウスがいた。これらの動物は個々のかごに戻され、その後７２時間監視された。この試験の評価項目は、致死率（モデル１）、定量的血液培養（菌血症、モデル１）、並びにＴＮＦ−α又はＩＬ−６血漿濃度（モデル２）であった。毒性は、補足ＲＩＰと攻撃なしのＢＭＡＰ−２８処置グループにおける薬剤関連副作用（炎症の局所徴候、体重の低下、嘔吐、下痢及び熱）の存在に基づいて評価した。
【００７６】
処置の評価：培養のための血液試料は、細菌攻撃の２４時間後、無菌の経皮穿刺により尾の静脈から得た。この時間の前に死亡した動物はテストしなかった。細胞の培養を定量的に行うために、血液試料は連続的に希釈し、各希釈液の０．１ｍＬを血液寒天プレート上に散布し、３５℃で４８時間培養し、コロニー形成ユニット（ＣＦＵ）を数えた。検出限界は１０ＣＦＵ／ｍＬ未満であった。
【００７７】
ＴＮＦ−α及びＩＬ−６の血漿濃度：血漿中のＴＮＦ−α及びＩＬ−６（モデル２）を測定するために、注入から０、６、１２、２４及び４８時間後に尾の静脈から血液試料を集めた。ＴＮＦ−αの濃度は、固体相サンドイッチ酵素免疫測定吸着法（ＥＬＩＳＡ）を用いて測定した。色の強度は、ＭＲ７００マイクロプレート・リーダー英国、ゲルンシーのダイナテック・ラボラトリーズ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））で４５０ｎｍにおける吸光度を読み取り測定した。各試料の結果は、存在するＴＮＦ−αの量を決めるために基準曲線と比較した。試料はすべて２通りに行った。この検定法によるＴＮＦ−αの最低の感知限界は、０．０５ｎｇ／ｍＬであった。ＩＬ−６の血漿濃度も、上に記載したＥＬＩＳＡにより測定した。定量化は、基準曲線に基づいて行った。検出限界は、１２ｐｇ／ｍＬであった。これらの検定は、２通りに行った。
【００７８】
統計分析：グループ間の致死率は、フィッシャーの正確なテストを利用して比較した。定量的血液培養からのデータは、平均値±平均値の標準偏差（ＳＤ）として提示し、グループ間の統計学的比較は分散分析により行った。ポストｈｏｃの比較は、ボンフェローニのテストにより行った。血漿ＩＬ−６及びＴＮＦ−αの平均値は、分散分析によりグループ間で比較して行った。ｐ値が０．０５以下の場合、有意性を受け入れた。
【００７９】
１．２  結果
サイトカイン及びＮＯの産生：ＬＴＡが媒介した細胞反応に対するＲＩＰ及びＢＭＡＰ−２８の効果を決めるために、ＬＴＡが誘発したＴＮＦ−αの産生及びＲＡＷ２６４．７細胞によるＮＯの産生を抑制する、単独又は併用のこれらのペプチドの能力を分析した。
【００８０】
ＴＮＦ−αの濃度は、ＬＴＡが存在しない場合に培養された細胞の上澄み中の０．０６８〜０．０９２ｎｇ／ｍＬであり、ＬＴＡが存在する場合は３４．６〜５０．６ｎｇ／ｍＬであった。図１に示したように、ＲＩＰとＢＭＡＰ−２８とは、単独又は併用で、テストしたあらゆる濃度において、ＬＴＡにより刺激されたＲＡＷ２６４．７細胞によるＴＮＦ−αの産生を低下させた。図１のデータは、平均値±少なくとも３回の実験の標準偏差として提示している。
【００８１】
具体的には、ＢＭＡＰ−２８は、図１に示したように、ＬＴＡにより誘発されたＴＮＦ−αの放出を用量に依存する様式で低下、即ち２μＭペプチドでは７４．５±６％低下させ、４μＭペプチドではほぼ完全に抑制する。意味深いことに、ＲＩＰ単独の場合は、２０μＭ濃度においてＬＴＡにより誘発されたＴＮＦ−αの放出を４５．６±１０％低下させた。２０μＭのＲＩＰと２μＭのＢＭＡＰ−２８を併用した場合は、８５．４±３．１％の抑制を示した（図１）。用いた濃度では、ＬＴＡが存在しない場合にＴＮＦ−αとＮＯとを放出させるペプチドはなかった（図示していない）。
【００８２】
両ペプチドは、単独で投与した場合、ＬＴＡにより刺激されたＮＯの発生を低下させ、２μＭのＢＭＡＰ−２８では７６±９．８％、２０μＭのＲＩＰでは５３．３±８．１％、それぞれ、低下させる。ＮＯの濃度は、ＲＩＰをＢＭＡＰ−２８と併用した時にさらに低下した（８４．７±８．８％抑制）（図２）。ＲＩＰの抑制作用は、不活性ＲＩＰペプチド類似体がＴＮＦ−αとＮＯとを低下させなかった（データは示していない）ので、特異的であった。培養された細胞の上澄み液で検出されたＮＯの濃度は、それぞれ、ＬＴＡなしの場合が５．９８〜９．１７μＭ、ＬＴＡありの場合が２４．３９〜２６．４２μＭであった。図２のデータは、少なくとも３回の実験の平均値±標準偏差として提示している。
【００８３】
意味深いことに、ＲＩＰ単独では、ＬＴＡに刺激されたＴＮＦ−αとＮＯとの産生を低下させ、これは、ＲＩＰがこれらの効果を明白に示した初めてのデータである。本発明は提案した作用メカニズムにより限局されないが、この結果は菌体密度感知の抑制によりＲＩＰの周知の毒素産生の抑制に加えて、ＲＩＰがさらに別のメカニズムによって細菌により誘発された敗血症を抑制する能力を有する可能性があることを示唆している。さらに、この体外データは、ＢＭＡＰ−２８がＬＴＡに直接結合するか、又はそのレポーターがＲＡＷ２６４．７細胞に結合する概念と一致している。
【００８４】
感受性テスト：ブドウ球菌分離株は、ＢＭＡＰ−２８、イミペネム及びバンコマイシンに対して感受性を示し、これらは、それぞれ、２．００、０．５０及び０．２５ｍｇ／ＬのＭＩＣを示した。最後に、ＲＩＰは、その作用メカニズムから予想されたように、これら２つの株（ＭＩＣ＞２５６ｍｇ／Ｌ）に対して体外では撲滅活性を全く示さなかった。
【００８５】
マウス敗血症モデル：ＲＩＰとＢＭＡＰ−２８とが、敗血症の処置において潜在的な治療価値を有するか否かをテストするために、先に記載したマウスの敗血症モデルを適用した。敗血症の誘発剤として、生きた黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３又は同じ株の熱殺菌した細胞を用いた。致死率、血漿の細菌数、及び血管ＴＮＦ−α又はＩＬ−６を２つの動物モデルで評価した。モデル１では、高いタイターの黄色ブドウ球菌を用いて攻撃後直ぐに又は６時間して動物を処置し、菌血症と死亡が記録された。モデル２では、熱殺菌し、超音波分解した細菌を注入後サイトカイン濃度を測定した。細菌攻撃６時間後薬剤で処置すると、敗血症の発現と治療開始の間に間隔が存在する臨床症状に類似した症状を呈する。ＲＩＰとＢＭＡＰ−２８との効果を、普通に用いる抗生物質と比較した。
【００８６】
モデル１ａ（攻撃後即時処置）：表３Ａに示したように、マウスが黄色ブドウ球菌ＡＴＣＣ２５９２３により攻撃され、直ぐに食塩水で処置した場合（対照グループＣ１）は、致死率は７２時間以内に１００％になった。対照的に、直ぐに薬剤で処置すると、対照よりかなり高い（ｐ＜０．０５）効果を示した。具体的には、イミペネム、バンコマイシン、ＢＭＡＰ−２８及びＲＩＰで処置したグループについては、それぞれ、３０％、２０％、３０％及び７０％の致死率が認められた。ＲＩＰとＢＭＡＰ−２８とを併用すると、５％というかなり低い致死率を示し、ＲＩＰを、イミペネム又はバンコマイシンと併用した時は、ＲＩＰなしに抗生物質を投与した時の致死率に比べて約２倍低い致死率が認められた。
【００８７】
同じモデルにおいて、対照グループにおける定量的血液培養は、４．３±１．１×１０６ＣＦＵ／ｍＬを示した（表３Ａ）。ＢＭＡＰ−２８は、３．７±０．９×１０３ＣＦＵ／ｍＬの値を有する抗菌活性を示し、一方、バンコマイシン単独では低いカウント（７．８±１．８×１０１ＣＦＵ／ｍＬ）を示した。バンコマイシンをＲＩＰと併用すると、２つの薬剤の相乗相互作用により最低の細菌数（２．８±０．６×１０１ＣＦＵ／ｍＬ）を得た。最後に、すべてを併用処置したグループは、イミペネム処置グループ及びＢＭＡＰ処置グループ（Ｐ＜０．０５）と比較した場合かなり低い細菌数が得られた。
【００８８】
モデル１ｂ（攻撃６時間後の処置）：表３Ｂに示したように、細菌攻撃３６０分後の薬剤投与の、致死率及び細菌数への効果は同程度であったが、直ぐに処置したグループで認められた値よりわずかに低かった。やはり、ＲＩＰとイミペネム又はバンコマイシンとの間のＣＦＵ／ｍＬに対する相乗効果は、抗生物質単独の効果に比べてほぼ２倍であった。
【００８９】
【表３Ａ】
2008534686.tif 000005
【００９０】
【表３Ｂ】
2008534686.tif 000006
【００９１】
モデル２ａ（体内におけるＴＮＦ−αとＩＬ−６との産生）：ＴＮＦ−αとＩＬ−６との血漿ピーク濃度は、それぞれ、０．２ｍＬの熱殺菌細胞静脈投与の６時間後と１２時間後に認められた。ＲＩＰ及びＢＭＡＰ−２８処置（単独又は併用）により、対照グループであるイミペネム又はバンコマイシンによる処置と比較してＴＮＦ−αとＩＬ−６との血漿濃度の顕著な低下（Ｐ＜０．０５）をもたらした。普通の抗生物質を用いた処置又は未処置のグループでは、サイトカインの血漿濃度の大きな差異は認められなかった（図３Ａ及び図４Ａ）。最後に、ＴＮＦ−αとＩＬ−６との血漿濃度の最も大きな低下は、ＲＩＰとＢＭＡＰ−２８とを併用して処置したグループで認められた。ただし、ＲＩＰと抗生物質であるイミペネム又はバンコマイシンの併用も、ＴＮＦ−αとＩＬ−６との血漿濃度を低下させた。
【００９２】
モデル２ｂ（ＴＮＦ−αとＩＬ−６との体内産生）：熱殺菌した細菌の攻撃後３６０分における薬剤の投与は、血漿サイトカイン濃度に対して異なる影響を与える。事実、ＴＮＦ−αとＩＬ−６との血漿濃度における一定の増加が、対照、イミペネム及びバンコマイシンで処置したマウスにおいて認められ、一方、細菌攻撃後３６０分におけるＲＩＰとＢＭＡＰ−２８との投与、並びにこれらの併用により一定の低下が誘発された（図３Ｂ及び４Ｂ）。ＲＩＰ、ＢＭＡＰ−２８及びこれらの併用の全体が、イミペネム及びバンコマイシンにより処置した各グループ、並びに対照に比べて血漿サイトカイン濃度の顕著な低下をもたらした。興味深いことに、イミペネムとバンコマイシンとの間でも顕著な差が認められた。モデル２ａに類似して、ＲＩＰとＢＭＡＰ−２８との併用により、ＴＮＦ−αとＩＬ−６との血漿濃度が大きく低下した。
【００９３】
最後に、薬剤関連副作用の臨床証拠を有する動物はなく、以前に感染したことがないＲＩＰとＢＭＡＰ−２８とで追加処置したグループでは、生理学的パラメータの変化は認められなかった。
【００９４】
死亡率及び菌血症に関する最良の結果は、ＲＩＰをＢＭＡＰ−２８と併用した時に得られ、これらの作用モードが補足的なものであることを示唆している。ＲＩＰとＢＭＡＰ−２８との併用はサイトカインの濃度を低減する上でも最も有効であり、これら２つの薬剤は、サイトカイン活性化の誘発剤である細胞壁成分を中和し、毒素の産生を抑制する能力があることを確認している。
【００９５】
本明細書で言及されたすべての刊行物と特許とは、引用により本明細書に援用されており、これらの刊行物と特許との引用に関連した具体的な方法及び／又は材料を開示し、記載している。本明細書で検討された刊行物及び特許は、本出願の出願日より前に、これらが、単に、開示されたことを示しているだけである。本明細書では、本発明が先行発明によりこの種の刊行物又は特許を先行する資格がないと認めるように解釈すべきものは何もない。さらに、付与された公開又は発行の日付は、これとは別に確認する必要があるかもしない、実際の日付と異なることがある。
【００９６】
前述の明細書は、説明のために実施例を提示して本発明の原理を教示したが、当業者は、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形式及び細部の種々の変更ができることを、本開示を読むことにより認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】ＬＴＡ（リポタイコ酸）により刺激を受けたＴＮＦ（腫瘍壊死因子）−α産生に対するウシの抗菌性ペプチドＢＭＡＰ−２８とＲＩＰとの作用を、培養されたＲＡＷ２６４．７細胞における対照の濃度のパーセンテージとして示す。培養液上澄みにおけるＴＮＦ−α濃度は、図のキーに示した試薬の存在下におけるＬＴＡ刺激後２４時間測定した。
【図２】ＬＴＡにより刺激を受けたＮＯ産生に対するＢＭＡＰ−２８とＲＩＰとの作用を、培養されたＲＡＷ２６４．７細胞における対照の濃度のパーセンテージとして示す。培養液上澄みにおけるＮＯ濃度は、図のキーに示した試薬の存在下におけるＬＴＡ刺激後２４時間測定した。
【図３Ａ】血漿中のＴＮＦ−α濃度（ｎｇ/ｍＬ）に対する細菌攻撃後０分における種々の薬剤の投与効果を、マウスモデルにおける時間（時間）の関数として示す。ＲＮＡＩＩＩ抑制ペプチドは「ＲＩＰ」と省略し、ＢＭＡＰ−２８はウシの抗菌性ペプチドであり、イミペネムは「ＩＭＰ」と省略し、さらにバンコマイシンは「ＶＡＮ」と省略している。
【図３Ｂ】血漿中のＴＮＦ−α濃度（ｎｇ/ｍＬ）に対する細菌攻撃後３６０分（６時間）における種々の薬剤の投与効果を、マウスモデルにおける時間（時間）の関数として示す。
【図４Ａ】血漿中のＩＬ−６濃度（ｐｇ/ｍＬ）に対する細菌攻撃後０分における種々の薬剤の投与効果を、マウスモデルにおける時間（時間）の関数として示す。
【図４Ｂ】血漿中のＩＬ−６濃度（ｐｇ/ｍＬ）に対する細菌攻撃後３６０分（６時間）における種々の薬剤の投与効果を、マウスモデルにおける時間（時間）の関数として示す。
【図１】
2008534686.tif 000007
【図２】
2008534686.tif 000008
【図３Ａ】
2008534686.tif 000009
【図３Ｂ】
2008534686.tif 000010
【図４Ａ】
2008534686.tif 000011
【図４Ｂ】
2008534686.tif 000012
【国際調査報告】
2008534686.tif 000013