(57)【要約】  本発明は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマー（「グロブロマー」）またはその誘導体、前記グロブロマーまたは誘導体の濃縮方法、前記グロブロマーまたは誘導体を含む組成物、前記グロブロマーまたは誘導体に対して特異性を有する抗体およびアプタマー、そのような抗体およびアプタマーの製造方法、診断、治療および他の目的のための前記グロブロマーもしくは誘導体または前記抗体もしくはアプタマーの使用、ならびに前記グロブロマーもしくは誘導体または前記抗体もしくはアプタマーの相当する使用方法に関するものである。
2008531635.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｘが、数１．．２４からなる群から選択される非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体。
【請求項２】
オリゴマーが非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４０）オリゴマーである請求項１のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項３】
オリゴマーが非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）オリゴマーである請求項１のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項４】
Ｘが数８．．２４からなる群から選択される請求項１から３のいずれか一項のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項５】
Ｘが数１２．．２４からなる群から選択される請求項１から３のいずれか一項のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項６】
Ｘが数１２．．２０からなる群から選択される請求項１から３のいずれか一項のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項７】
可溶性である請求項１から６のいずれか一項のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項８】
誘導体が、検出を容易にする基で共有結合的に標識されたオリゴマーである請求項１から７のいずれか一項のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項９】
検出を容易にする基が、フルオロフォア、発色団、化学発光団、酵素活性基、高電子密度基、ハプテン類、強抗原性構造、アプタマー、キレート基、特異的タンパク質−タンパク質相互作用メディエータ、磁性基および放射性基からなる群から選択される請求項８のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項１０】
誘導体が、イン・ビボ分解を促進する基でフラッグ付けされたオリゴマーである請求項１から９のいずれか一項のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項１１】
イン・ビボ分解を促進する基がユビキチンである請求項１０のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項１２】
精製された請求項１から１１のいずれか一項のオリゴマーまたは誘導体。
【請求項１３】
オリゴマーまたは誘導体を含む調製物中の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の濃縮方法であって、オリゴマーまたは誘導体を捕捉する段階および濃縮形態でオリゴマーまたは誘導体を得る段階を有する方法。
【請求項１４】
オリゴマーまたは誘導体を捕捉する段階が、オリゴマーまたは誘導体に結合する薬剤と調製物とを接触させる段階を有する請求項１３の方法。
【請求項１５】
前記薬剤が固定化されている請求項１４の方法。
【請求項１６】
前記薬剤が、オリゴマーまたは誘導体に対する特異性を有する抗体である請求項１４または１５の方法。
【請求項１７】
濃縮形態でオリゴマーまたは誘導体を得る段階が、捕捉されたオリゴマーまたは誘導体を脱着させる段階を有する請求項１３から１６のいずれか一項の方法。
【請求項１８】
捕捉オリゴマーまたは誘導体を脱着する段階が、捕捉オリゴマーまたは誘導体を高塩濃度緩衝液または酸性溶液と接触させる段階を有する請求項１７の方法。
【請求項１９】
調製物中の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたは誘導体の量を測定する段階をさらに有する請求項１３から１８のいずれか一項の方法。
【請求項２０】
オリゴマーまたは誘導体を含む調製物中の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を濃縮する方法であって、調製物からオリゴマーまたは誘導体以外の少なくとも一つの物質を除去する段階を有する方法。
【請求項２１】
オリゴマーまたは誘導体以外の物質がＡβモノマーまたはＡβフィブリロマーである請求項２０の方法。
【請求項２２】
物質を除去する段階が、物質に特異的に結合する薬剤と調製物を接触させる段階を有する請求項２１または２２の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が固定化されている請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、物質に特異的に結合する抗体である請求項２２または２３の方法。
【請求項２５】
物質を除去する段階が、物質に結合する抗体と調製物とを接触させる段階、および次いで抗体に結合した物質についてタンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーを行う段階を有する請求項２０から２４のいずれかの方法。
【請求項２６】
調製物中の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の量を測定する段階をさらに有する方法。
【請求項２７】
請求項１３から２６のいずれか一項の方法によって得ることができる非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を含む組成物。
【請求項２８】
オリゴマーまたは誘導体の量が組成物の少なくとも９９重量％である請求項１から１２のいずれか一項に記載の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を含む組成物。
【請求項２９】
オリゴマーまたは誘導体の量が、組成物の少なくとも９９．９重量％である請求項２８の組成物。
【請求項３０】
オリゴマーまたは誘導体の量が、組成物の少なくとも９９．９９重量％である請求項２８の組成物。
【請求項３１】
組成物がワクチンである請求項２７から３０のいずれか一項の組成物。
【請求項３２】
オリゴマーまたは誘導体に対して特異性を有する抗体を製造するための、請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の使用。
【請求項３３】
請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に特異性を有する抗体の製造方法であって、オリゴマーまたは誘導体を含む抗原を提供する段階；抗体レパートリーまたは潜在的抗体レパートリーを前記抗原に対して曝露する段階；および前記レパートリーから前記オリゴマーまたはその誘導体に特異的に結合する抗体を選択する段階を有する方法。
【請求項３４】
抗原で生物を免疫化することで、レパートリーをイン・ビボで抗原に曝露する請求項３３の方法。
【請求項３５】
請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有する抗体。
【請求項３６】
請求項３３または３４の方法によって得ることができる、請求項３５の抗体。
【請求項３７】
抗体のオリゴマーまたは誘導体に対するアフィニティが、モノマーＡβ（１−４２）に対するより少なくとも１０倍大きい、請求項３５または３６の抗体。
【請求項３８】
抗体のオリゴマーまたは誘導体に対するアフィニティが、モノマーＡβ（１−４０）に対するよりも少なくとも１０倍大きい、請求項３５から３７のいずれか一項の抗体。
【請求項３９】
抗体のオリゴマーまたは誘導体に対するアフィニティが、フィブリロマーＡβ（１−４２）に対するよりも少なくとも１０倍大きい、請求項３５から３８のいずれか一項の抗体。
【請求項４０】
抗体のオリゴマーまたは誘導体に対するアフィニティが、フィブリロマーＡβ（１−４０）に対するよりも少なくとも１０倍大きい、請求項３５から３９のいずれか一項の抗体。
【請求項４１】
抗体のオリゴマーまたは誘導体に対するアフィニティが、プロトフィブリロマーＡβ（１−４２）に対するよりも少なくとも１０倍大きい、請求項３５から４０のいずれか一項の抗体。
【請求項４２】
抗体のオリゴマーまたは誘導体に対するアフィニティが、プロトフィブリロマーＡβ（１−４０）に対するよりも、少なくとも１０倍大きい、請求項３５から４１のいずれか一項の抗体。
【請求項４３】
抗体が、オリゴマーまたは誘導体の約２０から約３０のアミノ酸位置の間に位置するエピトープに結合する請求項３５から４２のいずれか一項の抗体。
【請求項４４】
オリゴマーまたは誘導体に対して特異性を有するアプタマーを製造するための、請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の使用。
【請求項４５】
請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有するアプタマーの製造方法であって、オリゴマーまたは誘導体を含む結合標的を提供する段階；アプタマーレパートリーまたは潜在的アプタマーレパートリーを前記結合標的に曝露する段階；および前記レパートリーから、前記オリゴマーまたはその誘導体に特異的に結合するアプタマーを選択する段階を有する方法。
【請求項４６】
請求項４５の方法によって得ることができる、請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有するアプタマー。
【請求項４７】
アプタマーが標識および／またはフラッグ付けされている請求項４６のアプタマー。
【請求項４８】
アミロイドーシスの治療または予防のための医薬組成物を製造するための、請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の使用。
【請求項４９】
医薬組成物が能動免疫化用のワクチンである請求項４８の使用。
【請求項５０】
オリゴマーがＣＮＳに進入することができない請求項４８または４９の使用。
【請求項５１】
組成物が、グロブロマーに対して強い抗体介在非炎症性応答を誘発することができる請求項４８から５０のいずれか一項の使用。
【請求項５２】
医薬組成物が、静脈、筋肉および皮下から選択される経路を介して投与される請求項４８から５１のいずれか一項の使用。
【請求項５３】
治療または予防を必要とする被験者におけるアミロイドーシスの治療または予防方法であって、被験者に対して請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を投与する段階を有する方法。
【請求項５４】
非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を投与する段階が能動免疫化のためである請求項５３の方法。
【請求項５５】
アミロイドーシスを治療または予防するための医薬組成物を製造するための、請求項３５から４３のいずれか一項に定義された抗体の使用。
【請求項５６】
医薬組成物が受動的免疫化のためのものである請求項５５の使用。
【請求項５７】
治療または予防を必要とする被験者におけるアミロイドーシスの治療または予防方法であって、被験者に対して請求項３５から４３のいずれか一項に定義された抗体を投与する段階を有する方法。
【請求項５８】
抗体を投与する段階が能動免疫化のためのものである請求項５７の方法。
【請求項５９】
調製物中のオリゴマーまたは誘導体を検出するための、請求項３５から４３のいずれか一項に定義された抗体の使用。
【請求項６０】
調製物中のオリゴマーまたは誘導体の量を測定するための、請求項３５から４３のいずれか一項に定義された抗体の使用。
【請求項６１】
調製物中の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を検出する方法であって、調製物を請求項３５から４３のいずれか一項に定義された抗体と接触させる段階およびオリゴマーまたは誘導体と抗体とによって形成された複合体を検出する段階を有し、複合体の存在がオリゴマーまたは誘導体の存在を示すものである方法。
【請求項６２】
方法が、調製物中に存在するオリゴマーまたは誘導体の量を測定する段階をさらに有する請求項６１の方法。
【請求項６３】
請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の、被験者におけるオリゴマーまたは誘導体に対して特異性を有する自己抗体を検出するための組成物を製造するための使用。
【請求項６４】
被験者がアミロイドーシスを有することが疑われ、および自己抗体の検出が被験者においてアルツハイマー病を診断するためのものである請求項６３の使用。
【請求項６５】
請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の、サンプル中におけるオリゴマーまたは誘導体に対して特異性を有する自己抗体を検出するための使用。
【請求項６６】
サンプルが、アミロイドーシスを有することが疑われる被験者由来のものであり、ならびに自己抗体の検出が被験者でのアミロイドーシスの診断のためのものである請求項６５の使用。
【請求項６７】
被験者における非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有する自己抗体を検出する方法であって、被験者に対して請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を投与する段階ならびに抗体およびオリゴマーまたは誘導体によって形成された複合体を検出する段階を有し、複合体の存在が自己抗体の存在を示すものである方法。
【請求項６８】
被験者がアミロイドーシスを有することが疑われ、および自己抗体の検出が被験者におけるアミロイドーシスの診断のためである請求項６７の方法。
【請求項６９】
サンプル中の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有する自己抗体を検出する方法であって、サンプルを請求項１から１２のいずれか一項に定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体と接触させる段階ならびに抗体およびオリゴマーまたは誘導体によって形成された複合体を検出する段階を有し、複合体の存在が自己抗体の存在を示すものである方法。
【請求項７０】
サンプルが、アミロイドーシスを有することが疑われる被験者由来のものであり、および自己抗体の検出が被験者でのアミロイドーシスの診断のためのものである請求項６９の方法。
【請求項７１】
アミロイドーシスを有することが疑われる被験者が、アミロイドーシスを有するか、あるいはアミロイドーシスになるリスクが増大した被験者である請求項６９または７０の方法。
【請求項７２】
アミロイドーシスが、アルツハイマー病およびダウン症候群のアミロイドーシスからなる群から選択される請求項４８から７１のいずれか一項の方法または使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマー（「グロブロマー」）もしくはその誘導体、前記グロブロマーもしくは誘導体を濃縮する方法、前記グロブロマーもしくは誘導体を含む組成物、前記グロブロマーもしくは誘導体に対して特異性を有する抗体およびアプタマー、そのような抗体およびアプタマーの製造方法、診断、治療その他の目的における前記グロブロマーもしくは誘導体または前記抗体もしくはアプタマーの使用、ならびに前記グロブロマーもしくは誘導体または前記抗体もしくはアプタマーの相当する使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルツハイマー病（ＡＤ）は、進行性の認識能力喪失および細胞外アミロイド沈着物、細胞内神経線維変化およびいくつかの脳領域におけるニューロン喪失を含む特徴的な神経病理学特徴を特徴とする一般的な神経変性性および痴呆性の障害である（Mattson, M. P. Pathways towards and away from Alzheimer′s disease. Nature 430, 631-639 (2004)；Hardy, J. & Selkoe, D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer′s disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297, 353-356 (2002)）。アミロイド沈着物の主要な構成要素は、アミロイドβペプチド類である。
【０００３】
アルツハイマー病における病理の顕著な特徴の一つは、凝集し、特徴的なプラークの主要抗体であるアミロイドβ（Ａβ）１−４２の過剰の形成である。Ａβ（１−４２）は、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）に由来し、Ａβ（１−４２）の産生増加を生じるＡＰＰの異常プロセシングが、過去の集中的研究の内容であった。ハーディおよびヒギンスによるアミロイドカスケード仮説（Hardy, J .A. & Higgins, G,A. Alzheimer′s disease: the amyloid cascade hypothesis. Science 256, 184 - 185 (1992)）は、Ａβ（１−４２）の産生増加により、それが凝集して径の大きいフィブリルとなり（いわゆるプロトフィブリルから始まる）、最終的にプラーク様沈着物となると仮定し、さらには線維性Ａβ沈着物がアルツハイマー病における神経病理症状の理由であると仮定した。この仮説は、最近まで最も好まれたものであったが、認知症およびアミロイドプラーク負荷の相関は、ＡＤ患者においてはかなり乏しい（Katzman, R. et al. Clinical, pathological, and neurochemical changes in dementia: a subgroup with preserved mental status and numerous neocortical plaques. Ann Neural 23, 138-144 (1988)；Naslund, J. et al. Correlation between elevated levels of amyloid beta-peptide in the brain and cognitive decline. JAMA 283, 1571-1577 (2000)）。注目すべき点として、ダウン症候群でも同様の所見が得られており、それは同じ機序の関与を示唆している。
【０００４】
最初は単にフィブリルおよびプラーク形成のプロセスの中間体として報告されていたオリゴマーが、最近はＡＤ病理とともに重要な有毒種として議論されるようになった。ＡＤ患者の脳における可溶性のオリゴマーＡβの発生（Kuo, Y. M. et al. Water-soluble Abeta (N-40, N-42) oligomers in normal and Alzheimer disease brains. J Biol Chem 271, 4077-4081 (1996)）は、プラーク負荷よりＡＤ症状とより良好に相関する（Kuo, Y.M. et al. Water-soluble Abeta (N-40, N-42) oligomers in normal and Alzheimer disease brains. J Biol Chem 271, 4077-4081 (1996)；McLean, CA. et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegen-eration in Alzheimer′s disease. Ann Neurol 46, 860-866 (1999)）。これにより、改訂アミロイドカスケード仮説が出された（Hardy, J. & Selkoe, D.J. The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297, 353-356 (2002)）。
【０００５】
前線維性可溶性Ａβの皮質レベルとニューロン喪失の程度および認識障害の重度との間の非常に強い相関が最初に認められて以来、不溶性線維性凝集体ではなくＡβ（１−４２）グロブロマーのような可溶性集合体がＡＤにおける初期のニューロンの変化を誘発する可能性が非常に注目されるようになった（McLean, CA. et al. Soluble pool of Abeta amyloid as a determinant of severity of neurodegeneration in Alzheimer′s disease. Ann Neural 46, 860-866 (1999)；Lue, L.F. et al. Soluble amyloid beta peptide concentration as a predictor of synaptic change in Alzheimer′s disease. Am J Pathol. 155, 853-862 (1999)；Wang, J., Dickson, D.W., Trojanowski, J. Q. & Lee, V. M. The levels of soluble versus insoluble brain Abeta distinguish Alzheimer′s disease from normal and pathologic aging. Exp Neurol 158, 328-337 (1999)）。
【０００６】
最近の研究から、可溶性でオリゴマー型のＡβがイン・ビトロで生じる可能性が明らかになった（Lambert, M. P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)；Walsh, D. M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)）。これらの可溶性でオリゴマー型のＡβの一部が、シナプス棘への特異的結合時にニューロンに対して有害であることが明らかになった（Lacor, P. N. et al. Synaptic targeting by Alzheimer′s-related amyloid β oligomers. J Neurosci 24, 10191-10200 (2004)）。この特異的相互作用は、観察される海馬長期増強作用（ＬＴＰ）の阻害、シナプス可塑性の実験的パラダイムおよび記憶に関与している可能性がある（Lambert, M. P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)；Walsh, D. M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)）。
【０００７】
ＡＤ病因における可溶性Ａβ型の非常に重要な役割を示すさらなる証拠が、ヒトＡＰＰについてトランスジェニックであるマウスにおける不溶性Ａβの沈着の前に認識障害が十分に発達するという報告から得られている（Buttini, M. et al. Modulation of Alzheimer-like synaptic and cholinergic deficits in transgenic mice by human apolipoprotein E depends on isoform, aging, and overexpression of amyloid beta peptides but not on plaque formation. J Neurosci 22, 10539-10548 (2002)；Hsia, A. Y. et al. Plaque-independent disruption of neural circuits in Alzheimer′s disease mouse models. Proc. Natl. Acad Sci U. S. A 96, 3228-3233 (1999)；Mucke, L et al. High-level neuronal expression of abeta 1-42 in wild-type human amyloid protein precursor transgenic mice: synaptotoxicity without plaque formation. J Neurosci 20, 4050-4058 (2000)）。それ以降、多くの研究者が合成Ａβ調製物を用いて、可溶性Ａβ介在神経毒性のモデル形成を行ってきた（ウォルシュら（Walsh, D. M. & Selkoe, D.J. Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer′s disease. Neuron 44, 181-193 (2004)）による総説）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
しかしながら、可溶性オリゴマー、プロトフィブリルおよびフィブリルなどの各種重合構造に水溶液中で急速に凝集するＡβペプチド（特に、Ａβ（１−４２））の固有の傾向（Stine, W. B., Jr., Dahlgren, K.N., Krafft, GA & LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem 278, 11612-11622 (2003)）によって、認められる神経毒性効果を一つの具体的な形態の多量体Ａβ会合に帰することができなくなった。従って、最近、いくつかのグループが可溶性Ａβ（１−４２）集合体の単離およびそれらの神経毒性活性の試験を試みている。ランバートら（Lambert, M. P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)）は、小型の可溶性Ａβ（１−４２）凝集体の混合物（ＳＤＳ−ＰＡＧＥで４から１８ｋＤａ）について記載しており、彼らはそれを「Ａβ由来拡散性リガンド」（ＡＤＤＬ）と称している。彼らは、５００ｎＭという低い濃度のＡＤＤＬが細胞培養物でのニューロン死を引き起こし、ＬＴＰをほとんど完全に遮断することを示すことができた（Lambert, MP. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)；Wang, H.W. et al. Soluble oligomers of beta amyloid 1-42 inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus. Brain Res 924, 133-140 (2002)）。
【０００９】
別の非合成アプローチでは、突然変異ヒトＡＰＰを発現する細胞系によってＡβオリゴマーが培地中に放出された（Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)；Podlisny, M. B. et al. Aggregation of secreted amyloid beta-protein into sodium dodecyl sulfate-stable oligomers in cell culture. J Biol Chem 270, 9564-9570 (1995)）。特性決定されていないＡβ（１−４２）オリゴマーを含むこのならし培地の小分けサンプルは、低ナノモル濃度にてイン・ビボおよびイン・ビトロでＬＴＰをブロックした（Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)；Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, M. J., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)）。
【００１０】
ＷＯ９８／３３８１５およびＷＯ０１／１０９００（G .A Krafft et al.）には、長期強化（ＬＴＰ）を選択的に遮断する神経毒性原理としての特定の拡散性アミロイドβ１−４０−または１−４２由来痴呆性リガンド、いわゆるＡＤＤＬ（アミロイドベータ（Ａβ）由来拡散性リガンド）が記載されている。ＷＯ９８／３３８１５およびＷＯ０１／１０９００により、ＡＤＤＬが神経毒性種であり、脳におけるＡＤＤＬの存在がアルツハイマー病（ＡＤ）の主要な症状の発生および進行の原因因子であり、従って主要な危険因子であることが示唆されている。ＡＤ病理におけるＡβオリゴマーの関連性が、ＡＤ患者の脳でのそれらの検出によって強調されてきた（Gong, Y. et al. Alzheimer′s disease-affected brain: presence of oligomeric Aβ ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 100, 10417-10422 (2003)）。
【００１１】
ランベルトらの報告（Lambert et al., 1998）、ウォルシュらの報告（Walsh et al., 2002）、ゴングらの報告（Gong et al., 2003）、ＷＯ９８／３３８１５およびＷＯ０１／１０９００で使用されている「拡散性」という用語は、ＡＤＤＬ（オリゴマーＡβ（１−４２）またはＡβ（１−４０））特有の特徴が、ラットの海馬に注射した時に、注射跡に残るオリゴ−またはポリ−Ａβ（１−４２）またはＡβ（１−４０）フィブリルとは対照的に、急速に拡散するというものであることを意味している（A.M. Manelli et al., Journal of Molecular Neuroscience, 2004, Vol. 23, 235-246）。同様に、脳室内注射後、「拡散性」オリゴマーは、液体内で広がり、ＣＮＳの表面下層に浸透することが認められた。  これらの報告があるにも拘わらず、明確、純粋および安定な調製物が現時点では入手できないことから、Ａβオリゴマーの病理および機能への実験的アプローチは現在もなお困難であるために、基礎となる病理学的構造の確認ができなかった。
【００１２】
神経病理効果が単一の明瞭なオリゴマーＡβ種によるものと考えられるようになったのは、ＷＯ２００４／０６７５６１（Abbott GmbH & Co. KG）が新規で非常に安定なＡβ（１−４２）オリゴマー種について記載して以降であった。
【００１３】
このオリゴマＡβ種の均質性および特徴的な球形空間構造のゆえに、それは「Ａβ（１−４２）グロブロマー」と称された。Ａβ（１−４２）グロブロマーは、イン・ビトロで合成Ａβペプチドから容易かつ再現性良く形成することができる。物理化学的特性決定では、アミロイド前駆体タンパク質と交差反応しないＡβ（１−４２）グロブロマー特異的抗体の発生を生じるマウスおよびウサギでの強力な抗原である、大きさが約６０ｋＤａである非常に水溶性の高い球状Ａβ（１−４２）オリゴマー（「Ａβ（１−４２）グロブロマー」）が明らかになっている。
【００１４】
驚くべきことに、そして予想外に、ＷＯ２００４／０６７５６１（Abbott GmbH & Co., KG）に記載の前記可溶性球状Ａβ（１−４２）オリゴマー（「グロブロマー」）は、ニューロンの樹状突起に特異的に結合するが、海馬細胞培養物におけるグリアには特異的に結合しない。組織への結合は非常に強く、ラットでの脳室内注射後には直ちに除去される。結果的に、現在の検出限界内では、ＡＤ患者の脳脊髄液中でＡβ（１−４２）グロブロマーは検出されなかった。驚くべきことに、そして予想外に、これは、ＷＯ２００４／０６７５６１（Abbott GmbH & Co. KG）による痴呆性Ａβ（１−４２）グロブロマーが、アルツハイマー病の発症および進行に関与する毒性原理が、ＷＯ９８／３３８１５および上記の同様の刊行物によって推定される「拡散性」ではなく「非拡散性」という特徴によって特徴づけられることを意味している。非拡散性Ａβ（１−４２）グロブロマーの記憶障害力は、ラット海馬切片における長期増強（ＬＴＰ）の完全遮断によって示される。従って、Ａβ（１−４２）グロブロマーの選択的中和が、ＡＤ治療において非常に有効であると予想される。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
そこで本発明者らは、この特定の非拡散性球状オリゴマーが、Ａβフィブリル形成から独立の新たな凝集経路で形成され、アルツハイマー病における新規な病理学的疾患実体を代表するものであると推定している。それがＡＤ患者およびＡＰＰトランスジェニックマウスの脳に存在し、やはりニューロンに特異的に結合し、ＬＴＰを遮断することから、本発明者らは、新たな構造的エピトープを特徴とするこの球状Ａβオリゴマーが、Ａβオリゴマーに関連する神経病理を解明し、特定の治療によってＡＤ患者の不具合に臨床的に対処する上でのこれまでに例のない可能性を提供するものと考えている。
【００１６】
さらに本発明者らは、イン・ビボでポリクローナル抗体５５９８またはモノクローナル抗体８Ｆ５のような抗Ａβグロブロマー抗体を用いることで、交差反応性種がＡβ（１−４２）配列に制限されず、他のＡβ（ｘ−ｙ）種、例えばＡβ（１−４０）およびＡβ（１−３８）にも拡大可能であることを示すことができた。
【００１７】
従って本発明は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマー（「グロブロマー」）またはその誘導体であって、Ｘが数１．．２４からなる群から選択されるものに関する。
【００１８】
本明細書で使用される場合、略称Ａ．．Ｂは、両端を含むＡからＢまでの全ての自然数を含む集合を指し、例えば「１７．．２０」は数１７、１８、１９および２０の群を指す。ハイフンは、アミノ酸の連続した配列を指し、すなわち「Ｘ−Ｙ」は両端を含むアミノ酸Ｘからアミノ酸Ｙまでの配列を含む。従って、「Ａ．．Ｂ−Ｃ．．Ｄ」は、これら２つの集合の構成員間での全ての可能な組み合わせを含み、例えば「１７．．２０−４０．．４２」は、１７−４０、１７−４１、１７−４２、１８−４０、１８−４１、１８−４２、１９−４０、１９−４１、１９−４２、２０−４０、２０−４１および２０−４２の全てを含む。別段の断りがない限り、数はいずれも、成熟ペプチドの開始を指し、１はＮ−末端アミノ酸を指す。「Ａβ（Ｘ−Ａ．．Ｂ）」という用語は、「Ａβ（Ｘ−Ａ／Ｂ）」という用語と同義語であり、それと互換的に用いることができる。
【００１９】
特定の実施形態によれば、非拡散性球状オリゴマーまたはその誘導体は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４０）オリゴマーおよび非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）オリゴマーまたはそれらの誘導体からなる群から選択され、Ｘは数８．．２４からなる群から、好ましくは数１２．．２４からなる群から、より好ましくは数１２．．２０からなる群から、最も好ましくは数１７．．２０からなる群から選択される。
【００２０】
別の特定の実施形態によれば、非拡散性球状オリゴマーまたはその誘導体は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８）オリゴマー、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３９）オリゴマーおよび非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４１）オリゴマーまたはその誘導体からなる群から選択される。
【００２１】
さらに別の特定の実施形態によれば、非拡散性球状オリゴマーまたはその誘導体は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４３）オリゴマーまたはその誘導体からなる群から選択される。
【００２２】
非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーの誘導体には特には、架橋された、好ましくは化学的に架橋された、より好ましくはアルデヒド架橋された、最も好ましくはグルタルジアルデヒド架橋された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーなどがある。
【００２３】
非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーのさらに別の誘導体には、検出を容易にする基、好ましくは例えばフルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン、オワンクラゲ蛍光タンパク質、ギンボ蛍光タンパク質またはそれらの組み合わせもしくは蛍光活性誘導体などのフルオロフォア；発色団；例えばルシフェラーゼ、好ましくはフォチナス・フィラリスルシフェラーゼ、海洋発光細菌（Vibrio fischeri）ルシフェラーゼまたはそれらの組み合わせもしくは化学発光活性な誘導体などの化学発光団；例えばペルオキシダーゼ（例：西洋わさびペルオキシダーゼ）またはそれの酵素的に活性な誘導体などの酵素活性基；例えば重金属含有基（例：金含有基）などの高電子密度基；例えばフェノール誘導ハプテンなどのハプテン；抗原性であると予想される、例えばコラスカーおよびトンガオンカー（Kolaskar and Tongaonkar）のアルゴリズムによって抗原性であると予想されるペプチド配列などの強抗原性構造；別の分子へのアプタマー；ヘキサヒスチジニルなどのキレート形成基；ｆｏｓ／ｊｕｎペアの構成員などの別の特異的タンパク質−タンパク質相互作用に介在する天然もしくは天然由来タンパク質構造；強磁性基などの磁性基；または１Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉまたはそれらの組み合わせを含む基などの放射性基に共有結合的に連結されていることで標識された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーなどがある。そのような標識基およびそれらのタンパク質への付着方法は当業界で公知である。
【００２４】
本発明の別の特定の実施形態では、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーの誘導体は、共有結合的に連結されていることで、または非共有結合的高アフィニティ相互作用によって、好ましくは失活、金属イオン封鎖、分解および／または沈殿を促進する基に共有結合的に連結されていることでフラッグ付けされた、好ましくはイン・ビボ分解を促進する基で、より好ましくはユビキチンでフラッグ付けされた少なくとも１種類のモノマーサブユニットを含む非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーである。このフラッグ付けオリゴマーをイン・ビボで組み立てることが特に好ましい。
【００２５】
非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーの別の誘導体には、架橋および標識または架橋およびフラグ付けを行われた非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーなどがある。
【００２６】
本発明の好ましい実施形態では、オリゴマーまたはその誘導体は可溶性である。
【００２７】
いくつかのＡβ（１−４２）およびＡβ（Ｘ−４２）オリゴマーならびにそれらの誘導体の製造方法が、ＷＯ２００４／０６７５６１に記載されている。本発明の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体は、同様にして製造することができる。
【００２８】
従って本発明は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたは特にはそれの架橋、標識および／またはフラグ付け誘導体の製造方法であって、好適なＡβタンパク質またはその誘導体の調製物を界面活性剤と接触させてから界面活性剤濃度を低下させる段階、ならびに非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーを得る段階を有する方法に関するものでもある。方法の詳細な説明はＷＯ２００４／０６７５６１に開示されており、それの内容は参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２９】
誘導体化および／または切断は、オリゴマー化の前または後に行うことができる。従って、方法で使用するのに好適なＡβタンパク質またはその誘導体は、誘導体化されていても良いＡβ（Ｘ−３８．．４３）モノマーを含み、Ｘは好ましくは数１．．２４からなる群から、より好ましくは数１．．２２からなる群から、最も好ましくは数１．．２０からなる群から選択される。
【００３０】
別形態で、そしてイン・ビトロ診断方法に特に有用な本発明の「非拡散性」球状Ａβ（１−４２）オリゴマー（「グロブロマー」）は、ＡＰＰ−またはアミロイドβ発現性組換えもしくは非組み換え由来細胞系および／または液体、特には脳もしくは脊髄組織および／または液など（これらに限定されるものではない）のヒトまたは動物神経細胞から抽出することもでき、次に代表的な切断Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーおよび／またはその誘導体のような「非拡散性」球状Ａβ（１−３８．．４３）オリゴマー（「グロブロマー」）またはその誘導体に対する特異性を有する抗体を用いることで、そうして得られる抽出液もしくは処理済み抽出液中で直接検出することができる。
【００３１】
本発明の特に好ましい実施形態において、得られる非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体について、当業界で公知の技術により、１以上の追加の精製段階、例えば沈殿および再溶解を行う。
【００３２】
そこで本発明は、オリゴマーまたはその誘導体を含む調製物中で非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたは誘導体を濃縮する方法であって、オリゴマーまたは誘導体を捕捉する段階およびオリゴマーまたは誘導体を濃縮形態（「能動的」または「陽性」濃縮）で取得する段階を有する方法に関するものでもある。
【００３３】
本発明の好ましい実施形態において、オリゴマーまたは誘導体を濃縮する方法は、調製物を、オリゴマーまたは誘導体に結合する薬剤と接触させる段階を有する。
【００３４】
本発明の特に好ましい実施形態では、前記薬剤は固定化されている。
【００３５】
本発明の特に好ましい実施形態では、前記薬剤はオリゴマーまたは誘導体に対して特異性を有する抗体である。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、濃縮形態でオリゴマーまたは誘導体を得る段階は、捕捉オリゴマーまたは誘導体を脱着させる段階を有し、好ましくは捕捉オリゴマーもしくは誘導体を脱着させる段階が、捕捉オリゴマーまたは誘導体を高塩濃度緩衝液もしくは酸性液と接触させる段階を有するようにする。
【００３７】
本発明はさらに、オリゴマーまたは誘導体を含む調製物中で非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を濃縮する方法であって、調製物からオリゴマーまたは誘導体以外の少なくとも１種類の物質を除去する段階（「受動的」または「陰性」濃縮）を有する方法に関する。オリゴマーまたは誘導体以外の物質がＡβモノマーまたはＡβフィブリロマー（fibrillomer）、好ましくは両方であり、さらには物質を除去する段階が調製物を物質に特異的に結合する薬剤と接触させる段階を有することが好ましい。
【００３８】
本発明の特に好ましい実施形態では、前記薬剤は固定化されている。
【００３９】
本発明の特に好ましい実施形態では、前記薬剤は、好ましくは高アフィニティで物質に特異的に結合する抗体である。非グロブロマーＡβ種を除去するのに使用可能な抗体には、シグネット（Signet）カタログ番号９１３５からの抗Ａβ（３３−４２）ポリクローナル抗体およびそれのモノクローナル等価物、例えばシグネットカタログ番号９１４２からのｍＡｂ１２Ｆ４または抗Ａβ（１−４２）ｍＡｂ、Ｃ末端クローンＢＤＩ７８０（精製、凍結乾燥品；バイオデザイン（Biodesign）カタログ番号Ｑ６７７８０Ｍ）など、Ｃ末端Ａβ（１−４２）種に特異的な抗Ａβ（３３−４２）抗体などがある。
【００４０】
本発明のより好ましい実施形態では、物質を除去する段階は、物質に結合する抗体と調製物を接触させる段階、そして次に抗体に結合した物質について、抗体−抗原複合体の除去のためのアフィニティクロマトグラフィー、好ましくはタンパク質Ａアフィニティクロマトグラフィーを行う段階を有する。
【００４１】
そこで本発明は、精製非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に関するものでもある。本発明の１実施形態によれば、精製非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体は、上記で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を濃縮する方法によって得ることができるものである。別の態様において、精製非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体は、９９重量％強、好ましくは９９．９重量％強、好ましくは９９．９９重量％強の純度を有するものである。
【００４２】
本発明はさらに、本発明の方法によって得ることができる非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を含む組成物、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体であって、オリゴマーまたは誘導体の量が組成物の少なくとも９９重量％、好ましくは組成物の少なくとも９９．９重量％、より好ましくは組成物の少なくとも９９．９９重量％であるものに関するものである。
【００４３】
特に精製された本発明の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体には多くの用途があり、それの一部について下記で説明する。
【００４４】
１態様において本発明は、オリゴマーまたは誘導体に対して特異性を有する抗体を製造する上での非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の使用に関する。従って本発明は、上記で定義の非拡散性球状Ａββ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有する抗体の製造方法であって、
−オリゴマーまたは誘導体を含む抗原を提供する段階；
−抗体レパートリーまたは潜在的抗体レパートリーを前記抗原に曝露する段階；ならびに
−前記レパートリーから、前記オリゴマーまたはその誘導体に特異的に結合する抗体を選択する段階
を有する方法に関するものである。
【００４５】
ここで、理解しておくべき点として、「潜在的抗体レパートリー」とは、アミノ酸または相当する核酸配列のライブラリ、コレクション、アセンブリまたは集合、あるいは抗体レパートリーをイン・ビボまたはイン・ビトロで製造するのに使用可能なアミノ酸配列のそのようなライブラリ、コレクション、アセンブリまたは集合の形成原を指す。本発明の好ましい実施形態では、形成原は、動物の適応的免疫系、特には当業者には公知の組換え方法によって抗体の多様性を生じる哺乳動物の免疫系の抗原産生部分である。本発明の別の好ましい実施形態では、形成原は、ランダム核酸配列の形成系であり、次に、好適な抗体骨格に挿入することで、それを用いてイン・ビトロで抗体レパートリーを得ることができる。
【００４６】
本発明の好ましい実施形態では、生物を抗原で免疫化することで、抗体レパートリーまたは潜在的抗体レパートリーを、抗原にイン・ビボで曝露する。本発明の別の好ましい実施形態では、潜在的抗体レパートリーは、好適な核酸のライブラリであり、それを、当業界で報告されているイン・ビトロアフィニティスクリーニング、例えばファージディスプレイおよびパニングシステムにより、抗体に曝露する。
【００４７】
別の態様では、本発明は、上記で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有する抗体に関するものでもある。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態では、抗体は、上記のレパートリーまたは潜在的レパートリーから抗体を選択する段階を有する方法によって得ることができる。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態では、抗体のオリゴマーまたは誘導体に対するアフィニティは、抗体のモノマーＡβ（１−４２）に対する結合アフィニティの少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらに好ましくは少なくとも１０００倍、例えば少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらに好ましくは少なくとも１００００倍、例えば少なくとも２００００倍、少なくとも３００００または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍である。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態において、抗体のオリゴマーまたは誘導体に対するアフィニティは、抗体のモノマーＡβ（１−４０）に対する結合アフィニティの少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍、さらに好ましくは少なくとも１０００倍、例えば少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらに好ましくは少なくとも１００００倍、例えば少なくとも２００００倍、少なくとも３００００または少なくとも５００００倍、最も好ましくは少なくとも１０００００倍である。
【００５１】
便宜上、本発明の抗体は、低アフィニティを有する、最も好ましくはＫＤが１×１０−８Ｍ以下のアフィニティを有する、例えばＫＤが３×１０−８Ｍ以下のアフィニティを有する、ＫＤが１×１０−７以下のアフィニティを有する、例えばＫＤが３×１０−７Ｍ以下のアフィニティを有する、またはＫＤが１×１０−６Ｍ以下のアフィニティを有する、例えばＫＤが３×１０−５Ｍ以下のアフィニティを有する、またはＫＤが１×１０−５Ｍ以下のアフィニティを有する一方またはより好ましくは両方のモノマーに結合する。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態において、抗体のオリゴマーまたは誘導体に対するアフィニティは、抗体のフィブリロマーＡβ（１−４２）への結合アフィニティの少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍およびさらに好ましくは少なくとも１０００倍、例えば少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらに好ましくは少なくとも１００００倍、例えば少なくとも２００００倍、少なくとも３００００または少なくとも５００００倍および最も好ましくは少なくとも１０００００倍である。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態において、抗体のオリゴマーまたは誘導体に対するアフィニティは、抗体のフィブリロマーＡβ（１−４０）に対する結合アフィニティの少なくとも２倍、例えば少なくとも３倍または少なくとも５倍、好ましくは少なくとも１０倍、例えば少なくとも２０倍、少なくとも３０倍または少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも１００倍、例えば少なくとも２００倍、少なくとも３００倍または少なくとも５００倍およびさらに好ましくは少なくとも１０００倍、例えば少なくとも２０００倍、少なくとも３０００倍または少なくとも５０００倍、さらに好ましくは少なくとも１００００倍、例えば少なくとも２００００倍、少なくとも３００００または少なくとも５００００倍および最も好ましくは少なくとも１０００００倍である。
【００５４】
便宜上、本発明の抗体は、低アフィニティを有する、最も好ましくはＫＤが１×１０−８Ｍ以下のアフィニティを有する、例えばＫＤが３×１０−８Ｍ以下のアフィニティを有する、ＫＤが１×１０−７以下のアフィニティを有する、例えばＫＤが３×１０−７Ｍ以下のアフィニティを有する、またはＫＤが１×１０−６Ｍ以下のアフィニティを有する、例えばＫＤが３×１０−５Ｍ以下のアフィニティを有する、またはＫＤが１×１０−５Ｍ以下のアフィニティを有する一方またはより好ましくは両方のフィブリルに結合する。
【００５５】
特に好ましい実施形態によれば、本発明はグロブロマー特異的抗体に関する。それには特には、Ａβグロブロマーの場合より、モノマー型およびフィブリロマー型の両方のＡβについて比較的小さいアフィニティを有する抗体などがある。
【００５６】
本明細書における「より大きいアフィニティ」という用語は、一方での未結合抗体および未結合グロブロマーと他方での抗体−グロブロマー複合体との間の平衡が抗体−グロブロマー複合体の方に傾いている相互作用の程度を指す。同様に、本明細書における「より小さいアフィニティ」という用語は、一方での未結合抗体および未結合グロブロマーと他方での抗体−グロブロマー複合体との間の平衡が、未結合抗体および未結合グロブロマーの方に傾いている相互作用の程度を指す。
【００５７】
本発明はさらに、オリゴマーまたは誘導体に対する特異性を有するアプタマーの製造における、上記で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の使用に関するものでもある。
【００５８】
本発明はまた、特許請求の範囲で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対する特異性を有するアプタマーの製造方法であって、
−オリゴマーまたは誘導体を含む結合標的を提供する段階；
−アプタマーレパートリーまたは潜在的アプタマーレパートリーを前記結合標的に曝露する段階；ならびに
−前記レパートリーから、前記オリゴマーまたはその誘導体に特異的に結合するアプタマーを選択する段階
を少なくとも有する方法に関するものでもある。
【００５９】
本明細書における「アプタマー」とは、それの標的、好ましくはペプチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、より好ましくは約３から１００モノマー、特には約５から３０モノマーのペプチド、ＤＮＡもしくはＲＮＡ配列、最も好ましくは約５から３０アミノ酸のペプチドに対して特異的非共有結合が可能である小分子を指し、それは一端または両端で、相対的に大きい分子、好ましくは生化学機能に介在する相対的に大きい分子、より好ましくは失活および／または分解を誘発する相対的に大きい分子、最も好ましくはユビキチン、または好ましくは破壊を促進する相対的に大きい分子、より好ましくは酵素もしくは蛍光タンパク質に結合することができる。
【００６０】
ここで理解しておくべき点として、「潜在的アプタマーレパートリー」とは、イン・ビボまたはイン・ビトロでアプタマーレパートリーを形成するのに用いることができるアミノ酸配列のライブラリ、コレクション、アセンブリもしくは集合または相当する核酸配列、あるいはそのようなアミノ酸配列のライブラリ、コレクション、アセンブリもしくは集合の形成原を指す。
【００６１】
本発明はまた、上記で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対する特異性を有するアプタマーに関するものでもあり、そのアプタマーは上記の方法によって得ることができる。
【００６２】
本発明の好ましい実施形態において、アプタマーは、検出を容易にする基、好ましくは例えばフルオレセインイソチオシアネート、フィコエリトリン、オワンクラゲ蛍光タンパク質、ギンボ蛍光タンパク質またはそれらの組み合わせもしくは蛍光活性誘導体などのフルオロフォア；発色団；例えばルシフェラーゼ、好ましくはフォチナス・フィラリスルシフェラーゼ、海洋発光細菌（Vibrio fischeri）ルシフェラーゼまたはそれらの組み合わせもしくは化学発光活性な誘導体などの化学発光団；例えばペルオキシダーゼまたはそれの酵素的に活性な誘導体などの酵素活性基；例えば金などの重金属；例えばフェノール誘導ハプテンなどのハプテン；例えば抗原性であると予想されるペプチド配列などの抗原性構造；他のアプタマー；ｆｏｓ／ｊｕｎペアの構成員などの別の特異的タンパク質−タンパク質相互作用に介在する天然もしくは天然由来タンパク質構造；または１Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓまたは１２５Ｉまたはそれらの組み合わせを含む基などの放射性基に共有結合的に連結されていることで標識されている。
【００６３】
本発明の別の好ましい実施形態において、共有結合的に連結されていることで、または非共有結合的高アフィニティ相互作用によって、好ましくはアプタマーがそれの標的に結合する際に失活、金属イオン封鎖、分解および／または沈殿を促進する基に共有結合的に連結されていることでフラッグ付けされ、好ましくはイン・ビボ分解を促進する基で、より好ましくはユビキチンでフラッグ付けされている。
【００６４】
本発明はまた、アルツハイマー病の治療もしくは予防のための医薬組成物を製造する上での、特許請求の範囲で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の使用に関するものでもある。
【００６５】
本発明の好ましい実施形態において、医薬組成物は、能動免疫化用のワクチンである。
【００６６】
従って本発明は、処置を必要とする被験者でのアルツハイマー病の治療または予防方法であって、その被験者に対して、遅疑された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を投与する段階を有する方法に関するものでもある。
【００６７】
本発明の好ましい実施形態において、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の投与は、被験者をアルツハイマー病に対して能動的に免疫化することに関するものである。
【００６８】
組成物の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体が、患者ＣＮＳの脳にほとんど進入できないことが特に好ましい。
【００６９】
非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を含む医薬組成物が、Ａβグロブロマーに対する強い免疫応答、好ましくはＡβグロブロマーのみに向かう強い免疫応答、より好ましくはＡβグロブロマーのみに対する強い非炎症性抗体に基づく免疫応答を誘発することができることも、特に好ましい。従って、本発明の最も好ましい実施形態において、医薬組成物は、免疫アジュバント、好ましくは免疫応答を非炎症性抗体系に対して向けるアジュバントおよびシグナル伝達分子、例えばサイトカインを含む。そのようなアジュバントおよびシグナル伝達分子は当業者には公知である。
【００７０】
能動免疫化用の医薬組成物を、静脈経路、筋肉経路および皮下経路からなる群から選択される経路によって投与することが特に好ましい。組成物を、注射、ボラス注入および連続注入から選択される方法によって投与することも特に好ましく、その各方法は１回、繰り返し、または一定間隔で行うことができる。
【００７１】
本発明の特定の実施形態では、埋込可能機器を用いることで、長期連続注入が行われる。本発明の別の特定の実施形態では、組成物は、埋込可能な持続性もしくは徐放性デポー製剤として用いられる。好適な製剤および機器は当業者には公知である。所定経路に用いられる方法の詳細は、疾患の段階および重度、ならびに被験者の全体的な医学的パラメータによって決まるものであり、好ましくは治療を行う医師または獣医の裁量で個別に決定される。
【００７２】
本発明の特別に好ましい実施形態では、能動免疫化用の医薬組成物は、製薬上許容される保存剤、製薬上許容される着色剤、製薬上許容される保護コロイド、製薬上許容されるｐＨ調節剤および製薬上許容される浸透圧調節剤からなる群から選択される１以上の物質を含む。そのような物質は、当業界で報告されている。
【００７３】
本発明の抗体およびアプタマーも多くの可能な用途を有するものであり、それの一部を下記に記載する。それらは、スクリーニング目的、すなわち検出に、そして所望に応じて非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の量を、そのようなオリゴマーまたは誘導体を含むと推定されるか含むことがわかっている調製物中で測定する上で特に有用である。
【００７４】
従って、本発明の抗体は、イン・ビトロおよびイン・ビボの両方で、それらが結合する非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を検出することができる。従って前記抗体は、例えば調製物中の、例えばアミロイドーシスが疑われる被験者に由来するサンプル、アミロイドーシスを有することが疑われる被験者、例えばヒト個体その他の哺乳動物で前記オリゴマーまたは誘導体を検出するのに用いることができる。
【００７５】
従って本発明は、調製物中における非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体の検出方法であって、本発明の抗体をオリゴマーまたは誘導体に作用するようにさせることで前記オリゴマーまたはその誘導体に結合させる段階（およびそれによって好ましくは、抗体およびオリゴマーまたは誘導体を含む複合体を形成する段階）を有する方法に関するものである。前記オリゴマーは、例えばイン・ビトロで検出することができる。例えば、本発明の抗体は、調製物、例えば前記オリゴマーまたは誘導体を含むかそれを含むと推定される被験者由来のサンプルまたは細胞培養物に加えることで、前記調製物中の前記オリゴマーまたは誘導体を検出することができる。あるいは、オリゴマーまたは誘導体は、イン・ビボで個体において検出することができる。
【００７６】
本発明はまた、アミロイドーシスの治療もしくは予防のための医薬組成物を製造する上での、上記で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対する特異性を有する抗体の使用に関するものでもある。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態において、医薬組成物は受動的免疫化用である。
【００７８】
従って本発明は、処置を必要とする被験者でのアミロイドーシスの治療もしくは予防方法であって、被験者に対して請求の範囲で定義された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対する特異性を有する抗体を投与する段階を有する方法に関するものでもある。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態では、抗体の投与は、受動的免疫化のためのものである。
【００８０】
本明細書において「アミロイドーシス」という用語は、身体の各種組織における特定のタンパク質（アミロイド類、線維タンパク質およびそれらの前駆体）の異常な折り重なり、集合、凝集および／または蓄積を特徴とする多くの障害を指す。アルツハイマー病およびダウン症候群では、神経組織が冒され、脳のアミロイド血管障害（ＣＡＡ）では血管が冒される。本発明の特定の実施形態によれば、アミロイドーシスは、アルツハイマー病（ＡＤ）およびダウン症候群のアミロイドーシスからなる群から選択される。
【００８１】
本発明の抗体を用いることで得られる一つの結果は、アルツハイマー病またはアルツハイマー病になるリスク上昇の診断を、検出範囲内で、被験者における非拡散性可溶性球状Ａβ（１−４２）および／またはＡβ（１−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）の測定に容易に頼ることができないというものであった。しかしながら、驚くべきことに、そして予想外に、前記診断が、本発明の非拡散性可溶性球状Ａβ（１−４２）オリゴマー（「グロブロマー」）に特異的に結合する自己抗体の有無の測定に関係し得ることが認められた。
【００８２】
驚くべき点であるが、グロブロマー仮説と一致している点として、グロブロマーエピトープが、内因性免疫応答を生じる内因性抗原であることが認められた。この内因性免疫応答は、少なくとも下記の３つの独立の特徴を特徴とする。
【００８３】
１．抗Ａβグロブロマー自己抗体のレベルが、アルツハイマー病では上昇する。特に、驚くべき点として、これらの自己抗体がＡＤ患者の血清で上昇する。現在までのところ、数名の研究者が、ＡＤ患者の血清中の自己抗体を報告している。３つの論文（S. Brettschneider et al., ″Decreased Serum Amyloid 1-42 Autoantibody Levels in Alzheimer′s Disease, Determined by a Newly Developed Immuno-Precipitation Assay with Radiolabeled Amyloid 1-42 Peptide, Biol Psychiatry 2005, 57, 813-816；M. E. Weksler, et al., ″Patients with Alzheimer disease have lower levels of serum antiamyloid peptide antibodies than healthy elderly individuals″ Exp. Gerontology 37, (2002), 943-948；およびY. Du et al., ″Reduced levels of amyloid β-peptide antibody in Alzheimer disease″, Neurology 57, 801-805 (2001)）によれば、抗Ａβ抗体のレベルは、アルツハイマー病患者において軽度に上昇するが、あまり大きく上昇しないと報告されている。
【００８４】
２．抗Ａβグロブロマー自己抗体は主として、抗原複合体で結合する。本明細書に記載の自己抗体は驚くべきことに、実施例７の方法に従って血清を酸性緩衝液で前処理することで示される抗原−抗体複合体の一部としても、かなりの量で検出される。これは、その免疫系が内因性抗体に対して複合体形成することで、誤って折り畳まれたグロブロマーエピトープを能動的に排除しようとしていることを示す強力な証拠である。
【００８５】
３．抗Ａβグロブロマー自己抗体レベルは、抗Ａβモノマー自己抗体のレベルよりかなり高い。実施例７および図２４で本明細書において記載のように、それらはモノマーＡβペプチドと比較して約５から１０倍高い。抗原−抗体複合体の割合が高いことに加えて、これは、内因性免疫系によってグロブロマーが能動的に排除されつつあることを示す別のパラメータである。
【００８６】
そこで本発明は、被験者における上記で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有する自己抗体を検出するための組成物を製造する上でのオリゴマーまたは誘導体の使用に関するものでもある。
【００８７】
本発明の好ましい実施形態において、被験者は、いずれかの形態のアミロイドーシス、例えばアルツハイマー病を有することが疑われ、自己抗体の検出は被験者におけるいずれかの形態のアミロイドーシス、例えばアルツハイマー病の有無を診断することを目的としたものである。本発明の好ましい実施形態において抗体は、上記で定義の非拡散性球状オリゴマーまたは架橋誘導体の標識誘導体を用いて検出される。
【００８８】
本発明はまた、サンプル中の上記で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有する自己抗体を検出する上での、オリゴマーまたは誘導体の使用に関するものでもある。
【００８９】
本発明の好ましい実施形態では、サンプルは、アミロイドーシス、例えばアルツハイマー病を有することが疑われる被験者由来のものであり、自己抗体の検出は、被験者におけるアミロイドーシス、例えばアルツハイマー病の有無を診断することを目的としたものである。本発明の好ましい実施形態では、抗体は上記の非拡散性球状オリゴマーまたは架橋誘導体の標識誘導体を用いて検出される。
【００９０】
本発明はまた、被験者における非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有する自己抗体を検出する方法であって、被験者に対して、上記で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体を投与する段階および抗体およびオリゴマーまたは誘導体によって形成された複合体を検出する段階を有し、複合体の存在が自己抗体の存在を示す方法に関するものでもある。本発明の好ましい実施形態では、方法は、上記で記載の非拡散性球状オリゴマーまたはそれの架橋誘導体の標識誘導体の使用を含む。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態では、被験者はアミロイドーシスを有することが疑われ、自己抗体の検出は被験者におけるそのアミロイドーシスの有無を診断することを目的としたものである。本発明の好ましい実施形態において抗体は、上記の非拡散性球状オリゴマーまたは架橋誘導体の標識誘導体を用いて検出される。
【００９２】
本発明はまた、サンプル中の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体に対して特異性を有する自己抗体の検出方法であって、上記で定義の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたはその誘導体とサンプルを接触させる段階および抗体およびオリゴマーまたは誘導体によって形成された複合体を検出する段階を有し、複合体の存在は自己抗体の存在を示すものである方法に関するものでもある。本発明の好ましい実施形態において、方法は、上記の非拡散性球状オリゴマーまたはそれの架橋誘導体の標識誘導体の使用を含む。
【００９３】
本発明の好ましい実施形態において、サンプルはアミロイドーシスを有することが疑われる被験者由来のものであり、自己抗体の検出は、その被験者におけるアミロイドーシスの有無を診断することを目的としたものである。本発明の好ましい実施形態において、抗体は、上記の非拡散性球状オリゴマーまたは架橋誘導体の標識誘導体を用いて検出される。
【００９４】
アミロイドーシスを有することが疑われる被験者が、アミロイドーシスを有するか、アミロイドーシスを生じる危険性が高い被験者であることが特に好ましい。
【００９５】
本発明の１実施形態において、サンプルは、前記方法によって調べることができる生体液である。それには、血漿、全血、乾燥全血、血清、脳脊髄液または組織および細胞の水系もしくは有機−水系抽出物などがある。
【００９６】
本発明の特定の実施形態によれば、上記の自己抗体を検出する段階はさらに、自己抗体／抗原複合体の解離を生じさせる調製物（サンプル）の前処理を含む。従って、そのような前処理を含む方法を用いて調製物（サンプル）中に存在する自己抗体の量を求めることができ、前記前処理を含まない方法を用いて、なおも抗原に結合可能な自己抗体の量を測定することができる。さらに、その両方の方法により、複合体化自己抗体の量を間接的に測定することが可能である。
【００９７】
自己抗体／抗原複合体の解離を誘発する上で好適な条件は、当業者には公知である。例えば、得られる調製物（サンプル）のｐＨが１から５の範囲、好ましくは２から４の範囲、特には２から３の範囲となるような緩衝液を用いる等により、調製物（サンプル）を酸で処理することが良い可能性がある。好適な緩衝液には、生理的濃度での塩類、例えばＮａＣｌおよび酢酸などがある。抗体／抗原複合体の分離方法は、ＷＯ２００５／０３７２０９に記載されており、その文献は参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【００９８】
すなわち、抗体／抗原複合体中の抗原から抗体を解離させる段階は、抗体／抗原複合体を含むサンプルを解離緩衝液と接触させる段階；サンプルをインキュベートする段階；および適宜にサンプルを濃縮する段階を有する。
【００９９】
解離緩衝液は、上記で示した範囲のｐＨを有するＰＢＳ緩衝液であることができる。例えば、約１．５％ＢＳＡおよび０．２Ｍ酢酸グリシン（ｐＨ２．５）または１４０ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．５８％酢酸を含むＰＢＳ緩衝液が好適である。
【０１００】
２０から４０℃の範囲の温度で数分間、例えば１０から３０分間、例としては２０分間のインキュベーションが十分であることがわかっている。
【０１０１】
濃縮は、自体が公知の方法で、例えばサンプルをセントリプレプ（Centriprep）ＹＭ３０（Amincon Inc.）に通すことで行うことができる。
【０１０２】
本発明の１実施形態では、Ａβ（Ｘ−３８．．４３）グロブロマーまたはその誘導体を、固相上でコーティングする。次に、サンプル（例：全血、脳脊髄液、血清など）をその固相と接触させる。自己抗体がサンプル中に存在すると、そのような抗体は固相上でＡβ（Ｘ−３８．．４３）グロブロマーまたはその誘導体に結合し、そして直接または間接的方法によって検出される。直接法は、複合体自体の存在、従って自己抗体の存在を単純に検出する工程を有する。間接法では、結合自己抗体に接合体を加える。その接合体は、シグナル発生化合物または標識に結合した第１の結合自己抗体に結合する第２の抗体を含む。第２の抗体が、結合した第１の自己抗体に結合したら、シグナル発生化合物が測定可能なシグナルを発生させる。次に、そのようなシグナルはサンプル中の第１の自己抗体が存在することを示す。
【０１０３】
診断イムノアッセイで用いられる固相の例には、多孔質および非多孔質材料、ラテックス粒子、磁性粒子、微粒子（米国特許第５７０５３３０号参照）、ビーズ、膜、マイクロタイターウェルおよびプラスチック管がある。固相材料ならびに所望に応じて接合体に存在する抗原もしくは抗体を標識する方法の選択は、所望のアッセイ方式の性能特性に基づいて決める。
【０１０４】
上記のように、接合体（または指示試薬）は、シグナル発生化合物または「標識」に結合した抗体（または恐らくは抗抗体、アッセイに応じて決まる）を含む。このシグナル発生化合物または標識は、それ自体が検出可能であるか、１以上の別の化合物と反応して、検出可能な生成物を形成することができる。シグナル発生化合物の例については上記で説明しているが、特には発色団、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓおよび１４Ｃ）、化学発光化合物（例：アクリジニウム）、粒子（可視または蛍光）、核酸、錯形成剤または酵素（例：アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびリボヌクレアーゼ）などの触媒などがある。酵素を用いる場合（例：アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、発色基質、蛍光基質または発光基質を加えることで、検出可能なシグナルが発生する。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例：ポリメラーゼ連鎖反応）およびラマンスペクトル測定などの他の検出システムも有用である。
【０１０５】
キットも、本発明の範囲に含まれる。より具体的には、本発明は、被験者における自己抗体の存在を確認するためのキットを含むものである。詳細には、サンプル中の自己抗体の存在を確認するためのキットは、ａ）本明細書で定義のＡβ（Ｘ−３８．．４３）グロブロマーまたはその誘導体；およびｂ）検出可能なシグナルを発生させることができるシグナル発生化合物に結合した抗体を含む接合体を含む。そのキットは、抗原に結合する試薬を含む対照またはキャリブレータをも含むことができる。
【０１０６】
本発明はまた、試験サンプル中の自己抗体を検出するための別の種類のキットを含むものである。そのキットは、ａ）対象とする自己抗体に特異的な抗抗体およびｂ）上記で定義のＡβ（Ｘ−３８．．４３）グロブロマーまたはその誘導体を含むことができる。Ａβ（Ｘ−３８．．４３）グロブロマーまたはその誘導体に結合する試薬を含む対照またはキャリブレータも含むことができる。より具体的には、キットは、ａ）自己抗体に対して特異的である抗抗体およびｂ）Ａβ（Ｘ−３８．．４３）グロブロマーまたはその誘導体を含む接合体を含むことができ、接合体は検出可能なシグナルを発生させることができるシグナル発生化合物に結合している。やはり、そのキットも、抗原に結合する試薬を含む対照またはキャリブレータを含むことができる。
【０１０７】
キットは、各容器がプリセットの固相を有するバイアル、瓶または帯片などの一つの容器および個々の接合体を含む他の容器を含むこともできる。これらのキットは、洗浄試薬、処理試薬および指示試薬などのアッセイを行う上で必要な他の試薬のバイアルおよび容器を含むこともできる。
【０１０８】
本発明の好ましい実施形態では、そのような自己抗体は、オクタガム（Octagam；登録商標）（Octapharma Inc., Vienna, Austria）などの市販の免疫グロブリン調製物から抽出することもでき、治療用にさらに精製することもできる。
【０１０９】
驚くべきことに、そして予想外に、上記の調製物以外の調製物のスクリーニングによって、そのような調製物が本発明の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたは誘導体に対して特異性を有する抗体と反応する物質を含み得ることがわかった。前記抗体に対してある種の結合アフィニティを有するが、本発明の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたは誘導体に相当するとは言えないそのような物質は、以下において、球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマー（「グロブロマー」）エピトープまたは球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマー（「グロブロマー」）構造エピトープと称する。
【０１１０】
本発明の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたは誘導体に対して特異性を有する抗体に対して結合アフィニティを有するために、Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーエピトープを含む前記物質を、そのようなエピトープを含むと推定される調製物で検出することができ、それらの量を前記調製物で求めることができ、それらを濃縮することができる。従って本発明は、Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーエピトープsinＡβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーエピトープを含むと推定されるかそれを含むことが知られている調製物中で、そのようなエピトープを検出し、それの量を測定し、ないしはそれを濃縮するためのスクリーニング方法に関するものでもある。検出および濃縮されたら、前記物質には、本発明の非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８．．４３）オリゴマーまたは誘導体に関して前述した用途と同様の用途がある可能性がある。
【０１１１】
図面において、
図１は、Ａβ処理経路の模式図である。Ａβ（１−４２）オリゴマーは、繊維型オリゴマー（「フィブリロマー」）および球形型オリゴマー（「グロブロマー」）という２つの異なる形態で存在する。このモデルは、モノマーからフィブリルまたはグロブロマーのいずれかを生じる２つの互いに排他的な経路を示している。線維性経路に代えてグロブロマー経路とする「決定」は、脂肪酸によって促進されると推定されるモノマーレベルでの立体配座シフトによって行う。
【０１１２】
図２は、イン・ビトロ安定性を比較するための、各種温度での保存後におけるモノマーおよびグロブロマーのウェスタンブロットを示す図であり、Ａ）はＡβ（１−４２）グロブロマー（列１：標準分子マーカータンパク質；列２：１日後、ＰＢＳ、ＲＴ；列３：１日後、ＰＢＳ、３７℃；列４：４日後、ＰＢＳ、ＲＴ；列５：４日後、ＰＢＳ、３７℃）、Ｂ）はＡβ（１−４２）モノマー（列１：標準分子マーカータンパク質；列２：１日後、ＰＢＳ、−２０℃；列３：１日後、ＰＢＳ、−０℃；列４：１日後、ＰＢＳ、ＲＴ；列５：１日後、ＰＢＳ、３７℃）である。
【０１１３】
図３は、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１２−４２）グロブロマーおよびＡβ（２０−４２）グロブロマーで免疫化されたウサギおよびマウスの抗体力価を表す図である。
【０１１４】
図４は、ＡＤ脳およびＴＧ２５７６脳におけるＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープの検出結果を示す図であり、Ａ）は３個のＡＤ脳サンプルおよび１個のブレイン−ネット（Brain-Net,Munich）によって提供された高齢対照サンプルについてのデータであり；Ｂ）は、ＡＤ脳におけるＡβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１−４２）モノマーおよびＡβ（１−４０）モノマーのレベルであり；Ｃ）は、Ａβ（１−４２）グロブロマー特異抗体８Ｃ５によるＡＤ脳プラークの免疫染色であり；Ｄ）は、ＴＧ２５７６および対照野生型マウス脳におけるＡβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１−４２）モノマーおよびＡβ（１−４０）モノマーのレベルである。
【０１１５】
図５は、ＣＮＳにおけるＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープの検出結果を示す図であり、Ａ）は、サンドイッチ−ＥＬＩＳＡでの２ＡＤ患者２名およびＭＣＩ患者４名のＣＳＦサンプルの抗血清５５９８（捕捉抗体）およびモノクローナル非選択的抗Ａβ（１−４２）グロブロマー抗体６Ｂ１（一次抗体）との反応性であり、Ｂ）は、ラットでのＡβ（１−４２）グロブロマーの脳室内注射後のＡβ（１−４２）グロブロマーの免疫染色であり；Ｃ）は、ラット海馬でのＡβ（１−４２）グロブロマー注射後のＡβ（１−４２）グロブロマーの免疫染色である。
【０１１６】
図６は、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープの特性決定を行うための、Ａβ（３３−４２）指向ＰＡｂ（シグネット（Signet）９１３５）の各種Ａβ調製物との反応性を示す図である。前記抗体はアンモニア緩衝液に溶解したＡβ（１−４２）モノマーのみと反応し、ＡβグロブロマーおよびＡβ（１−４０）とは反応せず、アンモニア緩衝液に溶かしたフィブリル傾向（prone）Ａβ（１−４２）モノマーと比較してグロブロマーでのエピトープがアクセス把握できないか変化していることを示している。
【０１１７】
図７は、サンドイッチＥＬＩＳＡでの抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー由来抗体５５９８の反応性を示す図である。ウサギ抗Ａβ（１−４２）グロブロマーアフィニティ−精製ＰＡb５５９８は、他のＡβ形態と比較してＡβ（１−４２）グロブロマーに対して選択性を示す。
【０１１８】
図８は、下記のＥＬＩＳＡで測定される、Ａβ（１−４２）グロブロマーおよびＡβ（１−４０）モノマー標準調製物の抗Ａβグロブロマー特異的ＰＡｂ５５９８による前処理の効果を示す図であり、
−Ａβ（１−４２）グロブロマー、±５５９８欠乏、ＡβグロブロマーＥＬＩＳＡ：＞１０倍シフト（黒から灰色）；
−Ａβ（１−４０）モノマー、±５５９８欠乏、Ａβ（３０−４０）ＥＬＩＳＡ：効果なし（暗緑色から明緑色）；
−Ａβ（１−４０）モノマー、±５５９８欠乏、ＡβグロブロマーＥＬＩＳＡ：１０倍シフト（暗青色から明青色）；
ＡβグロブロマーエピトープがＡβ（１−４０）でも検出可能であることを示している。
【０１１９】
図９は、実施例５に従って得られるＡβ（２０−４２）グロブロマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラムを示す図である。
【０１２０】
図１０は、実施例６に従って得られるＡβ（１２−４２）グロブロマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラムを示す図である。
【０１２１】
図１１は、Ａβ（１−４２）グロブロマーの形成に関するデータをまとめた図である。合成Ａβ（１−４２）から出発して、球状構造を有する安定で明確なオリゴマーである３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーを得ることができる。
【０１２２】
（ａ）３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマー形成の第１段階として、合成Ａβ（１−４２）ペプチドをＨＦＩＰに溶かし、次に溶媒留去し、ＤＭＳＯに再懸濁させる。０．２％ＳＤＳを含むＰＢＳ中でのインキュベーションによって、中間体１６／２０ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーが得られる。水でさらに希釈し、インキュベーションすることで、成熟３８／４８Ａβ（１−４２）ｋＤａグロブロマーが得られ、それを透析し、メタノール／酢酸中で沈殿させて、緩衝液交換を行うことができる。
【０１２３】
（ｂ）３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマー形成の数段階を、クーマシー染色４  ２０％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で視覚化している。列：（１）中間体１６／２０ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマー、（２）グルタルジアルデヒド架橋中間体１６／２０ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマー、（３）３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマー、（４）グルタルジアルデヒド架橋３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマー（５）９５℃で５分間のＳＤＳサンプル緩衝液中での熱変性後の３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマー、（６）９５℃で５分間のＳＤＳサンプル緩衝液中での熱変性後のグルタルジアルデヒド架橋３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマー、（７）ランベルトらの報告（Lambert, M. P. et al., Diffusible, non-fibrillary ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)）に従って製造されたＡβオリゴマー。Ａβ形態は、ｍ＝モノマー、ｉ＝中間体１６／２０ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマー、ｇ＝３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーおよびｆ＝線維性Ａβ（１−４２）で示してある。
【０１２４】
（ｃ）各種温度にてＰＢＳ中でインキュベーションすることによるＡβ（１−４２）モノマーと比較した３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーの時間的安定性。列１から４：ＲＴおよび３７℃で１日（１、２）およびＲＴおよび３７℃で４日間（３、４）員キュベーションした後の３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマー。列５から８：−２０℃、０℃、ＲＴおよび３７℃で１日後のＡβ（１−４２）ＮＨ４ＯＨ調製物。
【０１２５】
（ｄ）スパロース（Superose）１２カラム上でのサイズ排除クロマトグラフィー：Ａβ（１−４２）グロブロマー（上段）、グルタルジアルデヒド架橋Ａβ（１−４２）グロブロマー（中段）および溶解後ＲＴで５分インキュベーションしたＡβ（１−４２）ＮＨ４ＯＨ調製物（下段）。
【０１２６】
（ｅ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、クーマシー染色によって視覚化したＡβ（１−４２）グロブロマーおよび得られた切断断片（ｔ−ｇで示してある）の限定タンパク質分解。得られたＣ末端断片（ＳＥＬＤＩ  ＭＳによって分析）は括弧内に示してある。列：（１）未消化Ａβ（１−４２）グロブロマー（ＡＡ１４２、４５１４Ｄａ）（２）パパイン（未検出）、（３）エラスターゼ（未検出）、（４）サーモリシン（ＡＡ４  ４２、４２００Ｄａ；ＡＡ２０  ４２、２２１８Ｄａ；ＡＡ２４  ４２、１７５６Ｄａ）、（５）キモトリプシン（ＡＡ２１  ４２、２０６７Ｄａ）、（６）トリプシン（ＡＡ６  ４２、３８９７Ｄａ；ＡＡ１７  ４２、２５７８Ｄａ）（７）サーモリシン消化後に分離された可溶性Ａβ１−１９ペプチド濾液。
【０１２７】
（ｆ）Ａβ（１−４２）グロブロマー（上段）およびグルタルジアルデヒド架橋Ａβ（１−４２）グロブロマー（下段）を、サーモリシンによってタンパク質分解し、得られたペプチド断片をＳＥＬＤＩ−ＭＳによって分析した。
【０１２８】
図１２は、ドットブロット法およびＥＬＩＳＡ法で高いアフィニティおよび特異性を有するＡβ（１−４２）グロブロマー特異的抗体の反応性を示す図である。
【０１２９】
（ａ）Ａβエピトープ結合およびアフィニティに関する抗Ａβ抗体の比較。Ａβ（１−４２）グロブロマー特異的ポリクローナルウサギ抗体５５９８およびマウスモノクローナル抗体８Ｆ５はＡβサブユニット間エピトープを認識するが、非特異的抗Ａβマウスモノクローナル抗体６Ｇ１および６Ｅ１０はＡβサブユニット内エピトープを認識する。８Ｆ５および６Ｇ１のアフィニティを、ＥＬＩＳＡからのスキャッチャード分析によって求めた。
【０１３０】
（ｂ）多様なＡβ型に対する抗Ａβ（１−４２）グロブロマー抗体の特異性を、ドット−ブロットイムノアッセイによって求めた。Ａβ（１−４２）グロブロマー特異的抗体５５９８および８Ｆ５（下段）は、非特異的抗体６Ｇ１および６Ｅ１０（上段）とは対照的に、主としてＡβ（１−４２）グロブロマー型を認識し、Ａβ１−４０または凝集Ａβ（１−４２）を含むＡβ（１−４２）の標準調製物は認識しない。
【０１３１】
（ｃ）捕捉抗体としての５５９８および検出抗体としての６Ｇ１を用いたＡβ（１−４２）グロブロマーの定量ならびに捕捉抗体としての６Ｅ１０およびそれぞれ検出抗体としての９１３２（ＡＡ３０−４０を認識）および９１３５（ＡＡ３３−４２を認識）を用いたＡβ（１−４０）またはＡβ（１−４２）レベルの定量という３つの異なるサンドイッチＥＬＩＳＡによる標準調製物中のＡβ型の区別の定量。
【０１３２】
（ｄ）特異的Ａβ型の標準が、他のＡβ型で交差汚染されている。値は、適切なＥＬＩＳＡによって測定された％単位でのグロブロマー型と非グロブロマー型の間の比として計算したものである。既報のイン・ビトロ形成Ａβオリゴマー（＊ランベルトらの報告（Lambert, M. P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)）による）およびならし培地での細胞培養に基づくＡβオリゴマー（＊＊ウォルシュらの報告（Walsh, D. M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)）による）をこの実験に含めた。
【０１３３】
図１３は、Ａβ（１−４２）グロブロマーがアルツハイマー患者およびＡＰＰトランスジェニックマウスの脳に存在することを示す図である。
【０１３４】
（ａからｆ）アルツハイマー病患者の皮質切片（ａからｃ）および１２ヶ月齢Ｔｇ２５７６マウスの皮質の横断面（ｄからｆ）での、チオフラビンＳ（ａ、ｄ）、Ａβ（１−４２）グロブロマー特異的抗体８Ｆ５（ｂ、ｅ）、または両方（ｃ、ｆ）によるアミロイドプラークの染色−スケールバー（ａからｆについて）：２０μｍ。
【０１３５】
（ｇからｈ）アルツハイマー病患者（ｎ＝３）（ｇ）または１２ヶ月齢Ｔｇ２５７６マウス（ｎ＝８）（ｈ）の皮質の可溶性画分におけるＡβ（１−４２）グロブロマーまたはモノマーＡβ種の濃度。年齢を合わせた対照ヒト（ｇ）またはＣ５７Ｂ１６対照マウス（ｎ＝４）（ｈ）の脳では、水平方向の線で示した検出限界を超えるＡβ種濃度はなかった（＜ｄ．ｌ．）。
【０１３６】
（ｉ）軽度の認識障害（灰色のバー；ｎ＝４）またはアルツハイマー病患者（黒いバー；ｎ＝２）の患者の脳脊髄液中のＡβ（１−４２）グロブロマーまたはモノマーＡβ種の濃度。１０ｐｇ／ｍＬの検出限界（水平方向の線）を超えるＡβグロブロマーはいずれの群でも認められなかった。
【０１３７】
図１４は、Ａβ（１−４２）グロブロマー形成がある種の脂肪酸によって誘発され得ることを示している。Ａβ（１−４２）グロブロマー形成の一般的手順の後、重合段階でのＳＤＳを中性ｐＨの各種脂肪酸に交換した。列：（１）誘発剤を含まない対照、（２）０．２％ＳＤＳを含む陽性対照、（３）０．５％ラウリン酸（１２：０）、（４）０．５％オレイン酸（１８：１）、（５）リノレン酸（１８：３）、（６）エイコサペンタン酸（２０：５）、（７）ドコサテトラエン酸（２２：４）、（８）ドコサヘキサン酸（２２：６）、（９）０．２％ＳＤＳを含む陽性対照、（１０）１％アラキドン酸。Ａβ（１−４２）グロブロマーの収率（ｇ、矢印で示してある）は各種脂肪酸間で異なる。
【０１３８】
図１５は、Ａβ（１−４２）グロブロマーが培養齢に応じて海馬ニューロンに特異的に結合することを示す図である。培養海馬ニューロンを、２００ｎＭのＡβ型（モノマー濃度＝１７ｎＭ  Ａβ（１−４２）グロブロマーに基づいて）とともにインキュベートし、抗Ａβ６Ｅ１０抗体（Ａβ非特異的６Ｅ１０を用いて、Ａβ（１−４２）モノマーおよびＡβ（１−４２）グロブロマー結合の量的比較ができるようにした。）を用いる免疫蛍光によって視覚化した。
【０１３９】
（ａ）Ａβ（１−４２）グロブロマーは、１５分間のインキュベーション（３７℃、５％ＣＯ２）後に、ＡβおよびＡβ（１−４２）モノマーを含まない対照と対照的に、海馬ニューロンの表面上に分断された結合を示した。
【０１４０】
（ｂ）海馬培養物に対するＡβ（１−４２）グロブロマー結合について、異なる日にイン・ビトロで（ＤＩＶ）試験を行った。ＤＩＶ８ではＡβ（１−４２）グロブロマーの結合（約１％）はほとんど認められなかったが、ＤＩＶ１１およびＤＩＶ１５では、ほとんどの全ての（約９０％）海馬ニューロンがＡβ１４２グロブロマーに結合していた。サンプルＤＩＶ１５における挿入図は、樹状突起方向とそれから若干離れた所の分断された結合を示している（矢印）。
【０１４１】
（ｃ）海馬培養物を、ニューロンマーカーとしての抗ＭＡＰ２およびグリア細胞マーカーとしての抗ＧＦＡＰで二重染色した。ＧＦＡＰ陽性細胞は、ＭＡＰ２陽性細胞とは対照的にＡβ（１−４２）グロブロマー結合を示さなかった。Ａβシグナルについての顕微鏡設定は、個々の実験間で一定に維持した。スケールバーは４０μｍ（挿入図＝１０μｍ）である。
【０１４２】
図１６（Ｉ）は、Ａβ（１−４２）グロブロマーが高結合のために限定的な組織浸透を有することを示している。
【０１４３】
（ａ）ラット脳での脳室内注入後の特異的抗体８Ｆ５（Ｃｙ３；赤）によるＡβ（１−４２）グロブロマーの染色。細胞核は、ＤＡＰＩで対比染色する（青）。スケールバー：１００μｍ。
【０１４４】
（ｂからｃ）ラット皮質への皮質内注入から１日後（ｂ）または７日後（ｃ）でのＡβ（１−４２）グロブロマーの染色（赤）。細胞核は、ＤＡＰＩで対比染色する（青）。スケールバー：２００μｍ。
【０１４５】
図１６（ＩＩ）は、Ａβ（１−４２）グロブロマーが高結合のために限定的な組織浸透を有することを示している。
【０１４６】
（ａ）ラット脳での脳室内注入後の特異的抗体８Ｆ５（Ｃｙ３）によるＡβ（１−４２）グロブロマーの染色。細胞核は、ＤＡＰＩで対比染色する。スケールバー：１００μｍ。
【０１４７】
（ｂ）ラット皮質への皮質内注入から７日後でのＡβ（１−４２）グロブロマーの染色。細胞核は、ＤＡＰＩで対比染色する。スケールバー：２００μｍ。
【０１４８】
（ｃ）同じラットの右皮質へのＡβ（１−４２）グロブロマー（黒丸）および左皮質へのＡβ（１−４２）モノマー（白丸）の同等量の注射後における標識容量（平均±標準誤差）の時間経過。注射から１日後（ｎ＝２）、４日後（ｎ＝３）および７日後（ｎ＝２）に、特異的抗体８Ｆ５を用いてＡβ（１−４２）グロブロマーを検出し、抗体６Ｇ１を用いてＡβ（１−４２）モノマーを検出した。
【０１４９】
図１７は、Ａβ（１−４２）グロブロマーがイン・ビトロで長期増強を完全に遮断することを示す図である。
【０１５０】
（ａ）対照（正方形；ｎ＝９）および４２ｎＭ  Ａβ（１−４２）グロブロマー処理（菱形；ｎ＝６）ラットの脳切片でのＬＴＰ誘発。フィールドＥＰＳＰ勾配は、基底線値に対する変化パーセントとして表した（平均±標準誤差）。
【０１５１】
（ｂ）強直誘発の前（１）、直後（２）および９０分後（３）に取った対照（上列）およびＡβ（１−４２）グロブロマー処理（下列）切片の代表的トレース。
【０１５２】
（ｃ）入力／出力関係は、対照群（正方形；ｎ＝１１）およびＡβ（１−４２）グロブロマー群（菱形；ｎ＝５）で同様である。水平方向バー：２ｍｓ；垂直方向バー：１ｍＶ。
【０１５３】
図１８は、Ａβ−ペプチド多量体化の２つの経路機序のモデル案を示す図である。最初の段階は、ＡＰＰのβ−およびγ−セクレターゼ開裂によるＡβ−モノマー形成である。恐らくは固有の要素または環境的要素に応じて、ＡＡβ（１−４２）ペプチド多量体化の２つの独立の経路が起こると考えられる。報告されているフィブリル経路（Lomakin, A., Chung, D. S., Benedek, G. B., Kirschner, D.A. und Teplow, D.B., On the nucleation and growth of amyloid beta-protein fibrils: detection of nuclei and quantisation of rate constants, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., A93, 1125-1129 (1996)）は、古典的な重合反応速度論に従う。Ａβ（１−４２）モノマーは、準安定核形成構造（フィブリロマー）ならびにプロトフィブリルおよびβシート二次構造からなる安定なＡβフィブリルへのモノマーのさらなる会合を介して重合する。Ａβ（１−４２）グロブロマー経路は、異なるＡβ−ペプチド数を有する構造への多量体化を特徴とする。第１段階として、Ａβ（１−４２）グロブロマー中間体が形成され、それはさらに自己会合して、異なる数のＡβ−ペプチド（ｎ＝１２）を有する安定なＡβ（１−４２）グロブロマー構造となる。Ａβ（１−４２）グロブロマーは、フィブリルへのさらなる重合化の傾向は持たない。Ａβ（１−４２）グロブロマーにおいて、疎水性Ｃ末端が球状構造の内部に延びていることで、水相への露出が回避されている。より疎水性の高いＮ末端が外側表面に露出している。Ａβ（１−４２）２グロブロマーは、βシート二次構造によって安定化される。Ａβ（１−４２）グロブロマーの高い溶解度ならびに明瞭で安定な特性によって、この特定の球状構造が得られる。
【０１５４】
図１９は、Ａβ（１−４２）グロブロマーの円偏光二色性スペクトラムを示す図である。スペクトラムは、報告の方法（追補の方法を参照）に従ってＰＢＳに緩衝液交換したばかりのグロブロマーを用いて７．２ｍｇ／ｍＬでＡβ（１−４２）グロブロマーについて収集したものである。波長の関数としての光電子増倍管電圧（ＨＴＳ）を挿入図に示してある。２１６ｎｍに強い極小値が認められ、高いβシート含有量を示している。２０８ｎｍや２２２ｎｍには極小値は認められず、アルファヘリックスがほとんどないことを示唆している。
【０１５５】
図２０は、１００ｐｍｏｌ（行Ａ）、１０ｐｍｏｌ（行Ｂ）および１ｐｍｏｌ（行Ｃ）のＡβ（１−４２）グロブロマー（列１）；０．１％プルロニック（Pluronic）Ｆ５８中のＡβ（１−４２）モノマー（列２）；Ａβ（２０−４２）グロブロマー（列３）；グルタルアルデヒド架橋Ａβ（１−４２）グロブロマー（列４）；ランベルトらの報告（M. P. Lambert et al., J. Neurochem. 79, 595-605 (2001)）に従って４℃または室温または３７℃で製造したＡＤＤＬ（列５）；Ａβ（１２−４２）グロブロマー（列６）；Ａβ（１−４０）モノマー（列７）；０．１％ＮＨ４ＯＨに溶かしたＡβ（１−４２）（列８）；Ａβ（１−４２）フィブリル調製物（列９）；およびシグマ（Sigma）からのＰＢＳ希釈ＡＰＰ（列１０）のＡ）ヒト血漿およびＢ）ＣＳＦとの反応性のドットブロットを示す図である。
【０１５６】
図２１は、能動免疫化ＡＰＰ／Ｌｏマウスでの新たな対象認識作業を示す図である。すでに知っている対象より新たな対象を調べるという優先傾向が、Ａβ（１−４２）モノマー（ｎ＝７）、Ａβ（２０−４２）グロブロマー（ｎ＝９）またはＡβ（１−４２）グロブロマー（ｎ＝８）のいずれかで免疫化したマウス群、あるいは媒体を注射したマウス群（ｎ＝８）において示されている。データは、平均±標準誤差である。初期免疫化後、マウスは３ヶ月間にわたって３週間ごとに追加免疫した。グロブロマーによる免疫化によって、認識指数、すなわち試験中の新たな対象に対する優先傾向に有意な増加が生じた（ＡＮＯＶＡとそれに続く事後ｔ検定でＰ＜０．０１）。
【０１５７】
図２２は、生理食塩水（対照）、抗体８Ｆ５および抗体６Ｇ１で処理したマウスの認識指数の棒グラフである（データは、３時間前に導入された対象と比較した新たな対象で経過した相対的時間量の動物８匹／群での平均±標準誤差を示している。各試験について、１０分間調査が可能であった。）。
【０１５８】
図２３は、抗体８Ｆ５によって免疫沈殿されたＡＤ脳抽出物からのＳＥＬＤＩ質量分析スペクトルデータを示す図である。Ａβ（１−４２）（ｍ／ｚ＝４５１４）だけでなく、Ａβ（１−４０）種（ｍ／ｚ＝４３２９．９）ならびにＡβ（１−３８）種（ｍ／ｚ＝４１３１．６）も認識することがわかる。
【０１５９】
図２４は、各種アミロイドベータ抗原に向かうヒト血清／血漿由来の自己抗体レベルを示す図である。
【０１６０】
（ａ）反射密度値はいずれも、１００ｐＭｏｌの抗原濃度から取ったものである。
【０１６１】
−遊離画分値は、未処理血清／血漿から取ったものである。
−総画分値は、酸処理血清／血漿から取ったものである。
−結合画分値＝総画分値−遊離画分値。
（ｂ）抗Ａβグロブロマー自己抗体レベルは、抗Ａβモノマー自己抗体レベルより高く、健常対照と比較してＡＤ患者で最も高い。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１６２】
本明細書、特許請求の範囲および図面を通じての略称：ＡＤ、アルツハイマー病；Ａβ、アミロイドβペプチド；ＡＰＰ、アミロイド前駆体タンパク質；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＣＤ、円偏光二色性分光法；ＤＩＶ、イン・ビトロ日数；ＤＭＳＯ、ジメチルスルホキシド；ＧＡＢＡ、γ−アミノ酪酸；ＨＦＩＰ、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール；ＬＴＰ、長期増強；ＮａＨ２ＰＯ４、リン酸ナトリウム；ＰＢＳ、リン酸緩衝生理食塩水；ＳＤＳ、ドデシル硫酸ナトリウム；ＳＥＬＤＩ−ＭＳ、表面増強レーザー脱離／イオン化質量分析；ＴＢＳ、Ｔｒｉｓ緩衝生理食塩水である。
【０１６３】
アミロイドβ（１−４２）（Ａβ（１−４２））オリゴマーは最近、アルツハイマー病（ＡＤ）の病理およびダウン症候群などの関連する状態における中間毒性種および推定病因物質および危険因子として議論されるようになっており、下記で説明するそれらの脂肪酸との関与から、それらがある種の代謝障害の痴呆効果において何らかの薬剤を果たす可能性があることが示唆される。特に本発明は、イン・ビトロで容易に製造可能であり、ＡＤ患者およびＡβ（１−４２）過剰産生トランスジェニックマウスの脳に存在する非常に安定なＡβ（１−４２）オリゴマー種に関するものである。物理化学的特性から、大きさが６０ｋＤａである純粋で非常に水溶性の高い球状オリゴマーであることがわかり、本発明者らはそれを「Ａβ（１−４２）グロブロマー」と称した。
【０１６４】
本明細書で提供のデータは、Ａβ（１−４２）グロブロマーが、線維凝集経路から独立に形成された難分解性の構造体であることを示している。それは、アミロイド前駆体タンパク質、Ａβ（１−４０）およびＡβ（１−４２）モノマーおよびＡβフィブリルとはほとんど交差反応しないＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープ特異的抗体の形成を誘発するマウスおよびウサギにおける強力な抗原である。Ａβ（１−４２）グロブロマーは、ニューロンの樹状突起に特異的に結合するが、海馬細胞培養物中のグリアには結合せず、ラット海馬切片において長期増強を完全に遮断する。本明細書で提供されるデータはさらに、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープが前述のオリゴマー調製物中に少なくとも低量で存在すると考えられる基本的病原性構造素因を代表するものであり、それの形成がＡＤにおける初期の病理事象であることを示唆している。Ａβ（１−４２）グロブロマー構造エピトープの選択的中和は、ＡＤ治療において高い可能性を有すると期待される。
【０１６５】
ＡβペプチドがＬＴＰを遮断する能力が、当業界において報告されている。
【０１６６】
ＬＴＰの同様の遮断が、約４０ｎＭという低濃度のＡβ（１−４２）グロブロマーで認められた。しかしながら、既報の可溶性オリゴマーとは対照的に、本発明による調製物は、低分子Ａβ（１−４２）オリゴマーの混合物を含むものではなく、１種類の均一かつ安定な化学種のみからなるものであった。従って、グロブロマーに要求される有効濃度が既報の調製物について報告されているものより一桁低いということは、実際に有害効果を行っているのは前記調製物のうちのごくわずかな部分のみであることを示している可能性がある。
【０１６７】
既報のＡβオリゴマー調製物は主として、機能、すなわち所定濃度での神経毒性効果を特徴としたものであった。これらの神経毒性効果に加えて、本発明のＡβ（１−４２）グロブロマーの固有の高安定性および明瞭な化学的性質および立体的な配置によって、均一性、分子量および球状性および構造的トポロジーに関する特徴付けが可能となった。
【０１６８】
Ａβ（１−４２）グロブロマーのイン・ビトロ形成は、水素結合を切断する薬剤によって誘発される合成Ａβ（１−４２）の変性で始まり、次に再折り畳みによって新たな配座となった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析でこの配座遷移はほぼ完全であったが、Ａβ（１−４２）グロブロマーは、見かけの分子量３８／４８ｋＤａを有する特徴的な二重帯域を示した。しかしながら、グルタルアルデヒドとの架橋によって、これら２つの帯域が結合されて一つになり、それはＡβ（１−４２）グロブロマーが一つの立体配座のみで存在することを示している。サイズ排除クロマトグラフィーによっても均質性が示され、そこではＡβ（１−４２）グロブロマーは広いが一つのピークを生じ、それが架橋後により明瞭に、すなわちより狭くなった。そこで、自然条件下での架橋Ａβ（１−４２）グロブロマーのサイズ排除クロマトグラフィーで、約６０ｋＤａの分子量であって分散がごく小さいことがわかり、それは分析的超遠心分離によっても確認された。計算から、Ａβ（１−４２）グロブロマーが、約１２から１４、好ましくは１２個のＡβサブユニットからなることが示唆され、さらなる実験データから、それが不安定な四量体中間体を介して形成されることが示唆される。
【０１６９】
いくつかの実験が、Ａβ（１−４２）グロブロマーの球状性および構造的トポロジーを扱っている。成熟Ａβ（１−４２）グロブロマーの場合、ほぼ完全に球状の構造に架橋するとさらに凝縮する溶融球状構造が確認された。
【０１７０】
最初に、狭い溶離プロファイルを有するＡβ（１−４２）グロブロマー、特には架橋型のもののサイズ排除クロマトグラフィーは、球状性を示唆している。さらに、流体力学的容量をこれらのデータから計算することができ、アミノ酸総数に関連付けることができることから、折り畳みの程度の尺度が得られる（Tcherkasskaya, O. & Uversky, V. N. Denatured collapsed states in protein folding: example of apomyoglobin. Proteins 44, 244-254 (2001)；Uversky, V.N. Natively unfolded proteins: a point where biology waits for physics. Protein Sci 11 , 739-756 (2002)）。
【０１７１】
第２に、各種非特異的プロテアーゼによるＡβ（１−４２）グロブロマーの消化によって、Ｎ末端部位から約２０種類のアミノ酸が開裂して生じるが、プロテアーゼ耐性のＣ末端核のオリゴマー構造は保持される。この結果は、１２種類の単一Ａβサブユニットのそれぞれが同じ方向を向くＡβ（１−４２）グロブロマーを形成する均一な構造トポロジーをも示していた。
【０１７２】
第３に、質量分析で、架橋がＮ末端およびＬｙｓ−１６のアミノ基間のみで起こり、Ｌｙｓ−２８では起こらなかったことから、均一球状性および構造トポロジーが確認された。
【０１７３】
第４に、そして最後に、Ａβ（１−４２）およびＡβ（１−４０）濃度の測定のための従来のＥＬＩＳＡで使用されるＡβ（３３−４２）およびＡβ（３３−４０）に対して選択的な抗体は、Ａβ（１−４２）グロブロマーと反応せず、それもやはりＣ末端が影響されないことを示している。
【０１７４】
ＣＤスペクトル測定では、かなりの割合のＡβ（１−４２）グロブロマー、恐らくはＣ末端が、β−構造（図１１参照）に存在することが示唆され、それは病的な重合型でのアミロイドタンパク質の一般的特徴である（Rochet, J. C. & Lansbury, P.T., Jr. Amyloid fibrillogenesis: themes and variations. Curr Opin Struct. Biol 10, 60-68 (2000)）。Ａβ（１−４２）グロブロマーの得られたモデルでは、疎水性Ｃ末端（Ａβ（２４−４２））が内部核を形成し、親水性のＮ末端（Ａβ（１−１９−２３））が外側表面で露出することで、Ａβ（１−４２）グロブロマーの水溶性が非常に高くなる（図１８参照）。
【０１７５】
要約すると、本発明のＡβ（１−４２）グロブロマーは、拡散性でないことで識別される、可溶性Ａβオリゴマーに関して既報のものと同等のＬＴＰに対する神経病理効果を有する均質、明瞭および安定な化学種である（Lambert, M. P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)；Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)；Wang, H.W. et al. Soluble oligomers of beta amyloid1-42 inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus. Brain Res 924, 133-140 (2002)；Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, M.J., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)）。
【０１７６】
拡散性および非拡散性リガンドの概念を理解するためには、イン・サイツで形成されるＡＰＰ由来Ａβ（１−４２）モノマーのプロセシングには、
ａ）フィブリル経路；ｂ）グロブロマー経路．
という２つの独立の経路があることを理解することが重要である。
【０１７７】
これらのうち、フィブリル経路は、２０年以上にわたりイン・ビトロおよびイン・ビボでのＡβプロセシングにおいて量的に支配的な経路であると特徴づけられてきた。Ａβ（１−４０）および特にはＡβ（１−４２）またはＡβ（１−３８）、Ａβ（１−３９）、Ａβ（１−４１）もしくはＡβ（１−４３）などの関連する誘導体がモノマー単位から出発して容易に重合し、オリゴマー（２から２４個のモノマーの会合）およびプロトフィブリル（２４個を超えるモノマーの会合）を介して連続的に成長して、最終的に不溶性フィブリルとなり、それがイン・ビトロまたはイン・ビボで脳組織または血管壁に沈着することが認められている。このフィブリル形成は非常に顕著であることから、比較的初期の研究者らはＡβの痴呆効果がそれによるものであるとしていた。グロブロマーとは異なる、本発明者らが「フィブリロマー」（図１参照）と称することを提案しているオリゴマーの特別な下位集合が、この場合は中間体となっていることを理解することが重要である。
【０１７８】
本明細書において本発明は、イン・サイツで形成された準安定Ａβの安定化のための新たな経路について説明するものであり、それにはモノマーのレベルでの構造的配座を別の３次元構造に切り換える段階があり、それによって次に、本発明者らが「グロブロマー化」という呼称を与えた異なる種類の会合が生じる。特徴的な点として、Ａβ（１−４２）の空間構造が変わったことから（図１）、そのプロセシングによって最終球状型オリゴマー核構造（「グロブロマー」）が生じ、それは非最終線維型オリゴマー核構造（「フィブリロマー」）とは全く異なるものである。ここで「最終」とは、フィブリロマーとは異なり、グロブロマーがさらに集合してフィブリルとはならないことを意味する。
【０１７９】
Ａβ（１−４２）グロブロマーが安定であり、さらに高分子の凝集体の中間体ではないことから、それらの形成が線維凝集体形成への別経路を反映することが提案されている。可溶性オリゴマーがニューロンに対して有毒であるか、他の形態でニューロン機能に対して有害であると仮定すると、フィブリル経路に沿ったものは、さらなる重合によって成熟フィブリルとなることで「自然に」失活すると考えられ（Caughey, B. & Lansbury, P. T. Protofibrils, pores, fibrils, and neurodegeneration: separating the responsible protein aggregates from the innocent bystanders. Annu. Rev Neurosci 26, 267-298 (2003)）、それは金属イオン封鎖によるＡβ捕捉への自然の試みを代表するものと考えられる。対照的に、Ａβ（１−４２）グロブロマーは、生理条件下で長期安定性を有する神経毒性Ａβ（１−４２）多量体として別経路のエンドポイントである（図１８参照）。
【０１８０】
Ａβ（１−４２）グロブロマーの妥当性に関しては、それがＡＤ患者の脳に存在する必要がある。従って、ＡＤ患者とヒトＡＰＰに対してトランスジェニックであるマウスの両方の脳プラーク沈着物において、選択的モノクローナル抗体が生じ、線維性ＡβとともにＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープが検出されている。これらの所見と平行して、ＡＤＤＬはＡＤ患者の脳でも検出されている（Lacor, P.N. et al. Synaptic targeting by Alzheimer′s-related amyloid beta oligomers. J Neurosci 24, 10191-10200 (2004);
Gong, Y. et al. Alzheimer′s disease-affected brain: presence of oligomeric A beta ligands (ADDLs) suggests a molecular basis for reversible memory loss. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 100, 10417-10422 (2003)）。上記の定義によれば、ＡＤＤＬが、拡散性であると記載されている点において、グロブロマーと本質的にことなることは明らかであろう。しかしながら、上記で説明したように、それらの効果の少なくとも一部は実際に、グロブロマー特異的抗体と交差反応するＡＤＤＬ調製物中に存在するこれまでに検出されていない量の物質によるものである可能性がある。従ってＡＤＤＬは、低量のＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープを含むと言えるかも知れない。Ａβ（１−４２）グロブロマー特異的抗体を用いると、前記エピトープの量を約５％と確認することができる。そのような量は、前記調製物で認められた神経毒性効果をある程度説明できるものでもある。
【０１８１】
Ａβ（１−４２）グロブロマーがＡＤ脳において自然に発生することを考慮すると、これまでイン・ビトロのみで示されていたＡβ（１−４２）グロブロマーがイン・ビボでどのように生じ得るかが不明なままである。この疑問は、最初のＡβ（１−４２）グロブロマー製造プロセスで用いたＳＤＳに代えて天然脂肪酸を用いることで対処されている。その脂肪酸のうちのいくつかが存在することで、Ａβ（１−４２）グロブロマーへの凝集も生じた。同じ効果が、単独でまたは脂肪酸との組み合わせで、アニオン系界面活性剤（例：ＳＤＳ）またはポリアニオン性剤（例：グリコサミノグリカンヘパリン）で起こることも予想される。これらの化学的に異なる薬剤は、立体配座変化の誘発および安定化ならびに核形成のためにアニオン帯電した表面を提供することでアミロイドタンパク質の凝集またはオリゴマー化を誘発する能力を共有しており、それはミセルまたは小胞の形態でのアニオン性表面が実際に、Ａβ（１−４２）グロブロマー形成を誘発可能であることを示唆している。アニオン性膜または脂質ラフトは、イン・ビボでこの機能を行うことができる。これは、ある種の代謝障害によって、特には脂質代謝障害によって誘発される認知症に、グロブロマー形成も関与している可能性があり、従って本発明がこの状態の診断および治療においても有用となり得ることを示唆するものである。
【０１８２】
Ａβ（１−４２）グロブロマーのイン・ビボでの作用の機序および部位は、現時点では不明である。親水性の外殻によって可溶性であるが、それらは脳脊髄液では検出できず、むしろ、特にＡβ（１−４２）モノマーと比較した場合に、急速かつ強固に組織に結合する。このＡβ（１−４２）グロブロマーの結合は、初代培養においてそれが海馬ニューロンを特異的に標的としたことから生理的に関連があると思われ、特異的な結合機序が示唆される。
【０１８３】
いくつかの所見から、親水性Ａβ（１−４２）グロブロマーの海馬ニューロンとの相互作用が非特異的であり、既知であるＡβペプチドの脂質二重層への挿入のような現象に基づいたものである可能性は排除される（McLaurin, J. & Chakrabartty, A. Membrane disruption by Alzheimer beta-amyloid peptides mediated through specific binding to either phospholipids or gangliosides. Implications for neurotoxicity. J Biol Chem 271, 26482-26489 (1996)；V.erdier, Y., Zarandi, M. & Penke, B. Amyloid beta-peptide interactions with neuronal and glial cell plasma membrane: binding sites and implications for Alzheimer′s disease. J Pept Sci 10, 229-248 (2004)）。
【０１８４】
最も重要な点として、モノマーＡβ（１−４２）（無毒であることが知られており、さらには抗痴呆効果を有することが示唆される）は、ニューロン構造に対して検出可能な結合を示さなかった（Plant, L.D. et al.: The production of amyloid beta peptide is a critical requirement for the viability of central neurons. J. Neurosci.23, 5531-5535）。次に、Ａβ（１−４２）グロブロマー 結合は、細胞培養の段階に強く依存しており、神経細胞のみに限定されていて、グリア細胞は未標識のままであった。樹状突起に沿ったＡβ（１−４２）グロブロマーの分断された結合パターンは、ニューロンに結合し、ＰＳＤ−９５のようなシナプス後マーカーと共局在化することが明らかになっているＡＤＤＬのパターンと類似している（Lacor, P.N. et al. Synaptic targeting by Alzheimer′s-related amyloid beta oligomers. J Neurosci 24, 10191-10200 (2004)）。従って、結合Ａβ（１−４２）グロブロマーがシナプス後突起に特異的に局在し、それの結合が樹状突起棘に限定されるように思われる。そこで、それはまだ特性決定されていない受容体に結合し、電気化学的情報処理を妨害するが、細胞の必須の状態監視生化学は妨害しないものと推定される。これによって、基本的な神経生理学ならびに短期増強は未変化のままとしながらでのＬＴＰ１の特異的遮断が説明されるものと考えられる。ＬＴＰの抑制（基本的な膜生理学の抑制ではなく）も、Ａβ（１−４２）グロブロマーがイン・ビボで学習および記憶を特異的に妨害する可能性があることを示しており、Ａβ（１−４２）グロブロマーがＡＤ患者で認められる記憶障害の原因であることを示唆している。
【０１８５】
本発明において、「神経毒性」とは、個々の細胞の生存性に対する影響とは無関係に、ニューロンおよび／またはシナプス機能の大幅な喪失を指すものと理解される。
【０１８６】
Ａβ（１−４２）グロブロマーはイン・ビトロにおいて生理的条件下で安定であることが認められているが、イン・ビボ条件下での分解も同様である。 非 特異的プロテアーゼを用いた実験から、球状構造から突き出た親水性Ｎ末端が開裂して、切断Ａβ（１−４２）グロブロマーが生じる可能性が明らかになった。最近、ＡＤにおける各種Ｎ末端切断Ａβ種の存在が報告されており（Sergeant, N. et al. Truncated beta-amyloid peptide species in pre-clinical Alzheimer′s disease as new targets for the vaccination approach. J Neurochem 85, 1581-1591 (2003)）、実際にＮ末切断が脳における可能な生理事象であることが示唆される。
【０１８７】
ＬＴＰの遮断は、Ａβ（１−４２）グロブロマーおよび既報のＡβオリゴマー調製物の共通の病態生理学的特徴であるように思われる（Lambert, M. P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)；Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)；Wang, H.W. et al. Soluble oligomers of beta amyloid 1-42 inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus. Brain Res 924, 133-140 (2002)；Wang, Q., Walsh, D. M., Rowan, MJ. , Selkoe, DJ. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)）。
【０１８８】
恐らく、いくつかの可溶性オリゴマーがＡＤの初期において生じ、同じニューロン機能を標的とする。具体的には、突然変異ヒトＡＰＰを発現する細胞系によって産生される他の機能的に特性決定されているＡβ（１−４２）オリゴマー（Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)；Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, M.J., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)）は、むしろプレフィブリル型のものである。本発明者らは、同様の細胞系によって放出されるＡβオリゴマーの中でＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープは認めなかった。
【０１８９】
そうではあっても、この細胞系から得られるＡβ（１−４２）オリゴマー（Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)；Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, MJ., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)）は、効果的にＬＴＰを遮断し、それは各種の可溶性Ａβ（１−４２）オリゴマー種が無毒性であることを示している（Lambert, M. P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453, 1998)；Walsh, D.M. et al Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)；Wang, H.W. et al. Soluble oligomers of beta amyloid 1-42 inhibit long-term potentiation but not long-term depression in rat dentate gyrus. Brain Res 924, 133 - 140 (2002)；Wang, Q., Walsh, D.M., Rowan, M.J., Selkoe, D.J. & Anwyl, R. Block of long-term potentiation by naturally secreted and synthetic amyloid beta-peptide in hippocampal slices is mediated via activation of the kinases c-Jun N-terminal kinase, cyclin-dependent kinase 5, and p38 mitogen-activated protein kinase as well as metabotropic glutamate receptor type 5. J Neurosci 24, 3370-3378 (2004)）。
【０１９０】
しかしながら、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープの残留汚染は、ＡＤＤＬを含む可溶性Ａβ（１−４２）オリゴマー混合物の病理学的性質の原因としてのＡＤＤＬの小さいが非常に重要な部分である可能性もある。これとは無関係に、Ａβ（１−４２）グロブロマーを用いた作業は、明瞭で均質なＡβ（１−４２）多量体の群を得る上で非常に有利である。これは、科学的または治療上の目的のために抗体を作る際に明らかである。
【０１９１】
本発明はまた、各種グロブロマーエピトープに対して異なる特異性を有するモノクローナルおよびポリクローナル抗体に関するものでもある。
【０１９２】
第１のモノクローナルマウス抗体６Ｇ１は、全ての構造型のＡβ（１−Ｘ）種によって共有される代表的な無差別のＮ末端に位置する直鎖Ａβエピトープに結合することが明らかになっている。従って、６Ｇ１は、 非常に強力であるが、６Ｅ１０と同様の免疫型プロファイルを有することが認められている。
【０１９３】
対照的に、他の２つの抗体であるマウスモノクローナル抗体８Ｆ５およびアフィニティ−精製ポリクローナルウサギ抗体ＰＡｂ５５９８は、Ａβモノマーまたはフィブリルと比較してＡβ（１−４２）グロブロマーに対して選択的であった。しかしながら、それらはいずれも、切断Ａβ（２０−４２）オリゴマーと交差反応することから、アミノ酸２０を越えてマップする。これらの抗体は変性ＳＤＳウェスタンブロッティング後ではなく天然ＳＤＳのウェスタンブロッティング後にグロブロマーにアクセスすることから（データは示していない）、両方の抗体ともアミノ酸２０および３０の領域における構造的非直鎖エピトープ中間サブユニットを認識するものと考えられる。そのような構造的エピトープは最近、各種一次配列を有する多様なアミロイドタンパク質によって共有されていることで、共有された共通構造によってそれらの神経毒性機能が誘発されると言われている（Kayed, R. et al. Common structure of soluble amyloid oligomers implies common mechanism of pathogenesis. Science 300, 486-489 (2003)；Glabe, CG. Conformation-dependent antibodies target diseases of protein misfolding. Trends Biochem Sci 29, 542-547 (2004)）。
【０１９４】
これらの抗体は、ＡＤ患者およびヒトＡＰＰトランスジェニックマウスの脳においてＡβ（１−４２）グロブロマーを探す手段を提供するものである。当初、Ａβ（１−４２）モノマー調製物と比較して選択性が低いことについての懸念があった。後に、ＡＤ患者のＣＳＦサンプルとＡＰＰ過剰発現細胞のならし培地の両方での豊富なＡβモノマー存在下にＡβ（１−４２）グロブロマーが欠乏していることが、 最初に確認されたよりはるかにＡβ（１−４２）グロブロマーに対する選択性が高いことを照明していることが認められた。実際、Ａβ（１−４２）モノマーのイン・ビトロ標準調製物 は、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープの汚染物を含んでおり、Ａβ（１−４２）グロブロマー選択的抗体によって汚染の程度を確認することができた。従って、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープが、人工的な３８／４８ｋＤａグロブロマー調製物においては主要成分であるが、別の既報のＡβオリゴマー調製物（Lambert, M. P. et al. Diffusible, nonfibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)）では少量成分であることが明らかになった。
【０１９５】
Ａβ（１−４２）グロブロマーに対して生じた抗体によって、各種のイン・ビトロ調製物およびイン・ビボでこの種の検出が可能となるだけでなく、所定のオリゴマー種を選択的に失活させる手段をも提供する。ＡＤ発生における特異的神経毒性タンパク質の役割を調べる可能性以外に、構造的エピトープを認識するそのような特異的抗体は、他の一般的で毒性が相対的に低いＡβ（１−４２）種に対する抗体反応に関連する副作用が回避できることから、治療において優れているものと予想される。この点において、Ａβ（１−４２）グロブロマーが優れた免疫応答を組み込んで高い抗体力価を生じることで、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対する能動的および受動的免疫化の可能性が提供されることは、注目すべき興味深い点である。
【０１９６】
従って、Ａβ（１−４２）グロブロマーならびに組換え、ヒト化および／またはキメラ抗体などの誘導体を含むそれに対して形成された特異的抗体は、アルツハイマー病および他のＡβグロブロマーが関与する状態の診断および治療において、そしてそれらの状態の診断および／または治療において有用な物質の製造において有用であると期待される。これら状態が、ある種の形態の高脂血症などの代謝障害によって生じるダウン症候群および認知症を含み得ることは明らかである。
【０１９７】
本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）」という用語は、ＸおよびＹの両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙまでのアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡＴ（アミノ酸位置１から４３に相当）またはそれの天然変異体のアミノ酸位置Ｘからアミノ酸位置Ｙのアミノ酸配列、特には位置Ｘおよび位置Ｙの両方あるいはいずれもグロブロマー形成を妨害し得ない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸１２またはＸ（いずれか数値の高い方）からアミノ酸４２またはＹ（いずれか数値の低い方）の部分に別のアミノ酸置換がなく、より好ましくはアミノ酸２０またはＸ（いずれか数値の高い方）からアミノ酸４２またはＹ（いずれか数値の低い方）の部分に追加のアミノ酸置換がなく、最も好ましくはアミノ酸２０またはＸ（いずれか数値の高い方）からアミノ酸４０またはＹ（いずれか数値の低い方）の部分に追加のアミノ酸置換がない配列（ここで、「追加の」アミノ酸置換とは、自然には認められない、標準的な配列からの誘導である）を含むＡ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオワ」）、Ａ４２ＴおよびＡ４２Ｖ（数値は、Ａβペプチドの開始に関係するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものを指す。
【０１９８】
より具体的には、本明細書における「Ａβ（１−４２）」という用語は、１および４２の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置１からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡまたはそれの天然変異体、特にはＡ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオワ」）、Ａ４２ＴおよびＡ４２Ｖ（数字は１および４２の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものまたはいずれもグロブロマー形成を妨害しない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４２の部分に別のアミノ酸置換を持たない配列を指す。同様に、本明細書における「Ａβ（１−４０）」という用語は、１および４０の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置１からアミノ酸位置４０のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＤＡＥＦＲＨＤＳＧＹＥＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶまたはそれの天然変異体、特にはＡ２Ｔ、Ｈ６Ｒ、Ｄ７Ｎ、Ａ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）およびＤ２３Ｎ（「アイオワ」）（数値は１および４０の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものまたはいずれもグロブロマー形成を妨害しない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４０の部分に別のアミノ酸置換を持たない配列を指す。
【０１９９】
より具体的には、本明細書における「Ａβ（１２−４２）」という用語は、１２および４２の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置１２からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡまたはそれの天然変異体、特にはＡ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオワ」）、Ａ４２ＴおよびＡ４２Ｖ（数値は、１２および４２の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものまたはいずれもグロブロマー形成を妨害しない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくはアミノ酸２０からアミノ酸４２までの部分に別のアミノ酸置換を持たない配列を指す。
【０２００】
より具体的には、本明細書における「Ａβ（２０−４２）」という用語は、２０および４２の両方を含むヒトアミロイドβタンパク質のアミノ酸位置２０からアミノ酸位置４２のアミノ酸配列、特にはアミノ酸配列ＦＡＥＤＶＧＳＮＫＧＡＩＩＧＬＭＶＧＧＶＶＩＡまたはそれの天然変異体、特にはＡ２１Ｇ（「フランドル」）、Ｅ２２Ｇ（「北極」）、Ｅ２２Ｑ（「オランダ」）、Ｅ２２Ｋ（「イタリア」）、Ｄ２３Ｎ（「アイオワ」）、Ａ４２ＴおよびＡ４２Ｖ（数値は２０および４２の両方を含むＡβペプチドの開始に関するものである）からなる群から選択される少なくとも１個の突然変異を有するものまたはいずれもグロブロマー形成を妨害しない３個以下の別のアミノ酸置換を有し、好ましくは別のアミノ酸置換を持たない配列を指す。
【０２０１】
本明細書における「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」（Ａβ（Ｘ−Ｙ）球状オリゴマー）という用語は、均質性および明瞭な物理特性を有する上記で定義のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド可溶性で球形の非共有結合的会合を指す。１態様によれば、Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーは、アニオン系界面活性剤とともにインキュベーションすることで得ることができるＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの安定な非フィブリル性のオリゴマー集合体である。モノマーおよびフィブリルとは対照的に、これらのグロブロマーは、指定の集合体数のサブユニット（例えば、ＷＯ２００４／０６７５６１に記載の初期集合体型、ｎ＝４から６、「オリゴマーＡ」および後期集合体型、ｎ＝１２から１４、「オリゴマーＢ」）を特徴とする。グロブロマーは、３次元球状型構造（「モルテン・グロビュール」、Barghom et al., 2005, J Neurochem, 95, 834-847参照）を有する。それらは、下記の特徴のうちの１以上によってさらに特徴付けることができる。
【０２０２】
−無差別プロテアーゼ（サーモリシンまたはエンドプロテアーゼＧｌｕＣなど）によってＮ末端アミノ酸Ｘ−２３を開裂して、切断型のグロブロマーを生じることができる。
【０２０３】
−無差別プロテアーゼおよび抗体ではＣ末端アミノ酸２４−Ｙはアクセスできない。
【０２０４】
−切断型のこれらグロブロマーは、グロブロマー配座において核エピトープＡβ（２０−Ｙ）のアクセス性がより良好な前記グロブロマーの３次元核構造を維持している。
【０２０５】
本発明によれば、特には本発明の抗体の結合アフィニティの評価に関して、本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー」という用語は、ＷＯ２００４／０６７５６１（参照によって本明細書に組み込まれるものとする）の方法によって得ることができる製造物を指す。
【０２０６】
前記方法は、天然、組換えもしくは合成Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドまたはその誘導体を開く段階；少なくとも部分的に開かれたＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドまたはその誘導体を界面活性剤に曝露する段階；製剤の作用を低減する段階；ならびにインキュベーションを続ける段階を有する。
【０２０７】
ペプチドの畳み解除に関しては、例えばヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）などの水素結合切断剤を、タンパク質に作用させることができる。作用温度が約２０から５０℃、特には約３５から４０℃である場合、数分間、例えば約１０から６０分間の作用時間で十分である。次に、蒸発乾固させた残留物、好ましくは濃縮された状態のものを、例えばジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの水系緩衝液と混和性の好適な有機溶媒に溶解させることで、少なくとも部分的に畳み解除されたペプチドまたはその誘導体の懸濁液が得られ、それを次に用いることができる。必要に応じて、ストック懸濁液を、低温、例えば約−２０℃で長期間にわたって保管することができる。
【０２０８】
あるいは、ペプチドまたはその誘導体を、若干酸性の、好ましくは水系の溶液、例えば約１０ｍＭのＨＣｌ水溶液に取ることができる。通常数分間のインキュベーション時間後、不溶成分を遠心によって除去する。１００００ｇで数分間が都合が良い。これらの方法段階は好ましくは、室温、すなわち２０から３０℃の範囲の温度で行う。遠心後に得られる上清は、Ａβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドまたはその誘導体を含み、低温、例えば約−２０℃でしばらくの間保存することができる。
【０２０９】
その後の界面活性剤への曝露は、ペプチドまたはその誘導体のオリゴマー化による中間体型オリゴマーの形成に関係するものである（ＷＯ２００４／０６７５６１では、オリゴマーＡと称されている）。これに関しては、界面活性剤は十分な中間体オリゴマーが製造されるまで、少なくとも部分的に畳み解除されたペプチドまたはその誘導体に作用させることができる。
【０２１０】
イオン系の界面活性剤、特にはアニオン系界面活性剤を用いることが好ましい。
【０２１１】
特定の実施形態によれば、下記式（Ｉ）の界面活性剤が用いられる。
【０２１２】
Ｒ−Ｘ
式中、基Ｒは、６から２０個、好ましくは１０から１４個の炭素原子を有する未分岐もしくは分岐アルキルまたは６から２０個、好ましくは１０から１４個の炭素原子を有する未分岐または分岐アルケニルであり、基Ｘは酸性基もしくはそれの塩であり、Ｘは好ましくは下記のもの：
−ＣＯＯ−Ｍ＋、−ＳＯ３Ｍ＋、特には
−ＯＳＯ３Ｍ＋から選択され、Ｍ＋は水素カチオンまたは好ましくはアルカリ金属およびアルカリ土類金属カチオンおよびアンモニウムカチオンから選択される無機もしくは有機カチオンである。
【０２１３】
有利なものは、Ｒが未分岐アルキル（その中で、特に言及すべきものはアルク−１−イル基である）である式（Ｉ）の界面活性剤である。特に好ましいものは、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。ラウリン酸およびオレイン酸も有利に使用可能である。界面活性剤であるラウロイルサルコシン（サルコシル（sarkosyl）ＮＬ−３０またはガルドール（Gardol；登録商標）とも称される）のナトリウム塩も特に有利である。
【０２１４】
界面活性剤作用の時間は特に、オリゴマー化を受けるペプチドまたはその誘導体が畳み解除されたか否か、そしてそうであればどの程度畳み解除されたかによって決まる。畳み解除段階によれば、ペプチドまたはその誘導体が水素結合切断剤で、すなわち、特にはヘキサフルオロイソプロパノールで処理されている場合は、作用温度が約２０から５０℃、特には約３５から４０℃である場合には、数時間、有利には約１から２０時間、特には約２から１０時間の範囲の作用時間で十分である。畳み解除が少ないか実質的に畳み解除されていないペプチドまたはその誘導体が出発点である場合、それに相当して長い作用時間が良い。そのペプチドまたはその誘導体が、例えばＨＦＩＰ処理に対する代替法として上記で示した手順に従って前処理されている場合、または前記ペプチドまたはその誘導体に対して直接オリゴマー化を行う場合、作用温度が約２０から５０℃、特には約３５から４０℃である場合には、約５から３０時間、特には約１０から２０時間の範囲の作用時間で十分である。インキュベーション後、有利には遠心によって不溶成分を除去する。１００００ｇで数分間が良い。
【０２１５】
選択される界面活性剤濃度は、使用される界面活性剤によって決まる。ＳＤＳを用いる場合、０．０１から１重量％、好ましくは０．０５から０．５重量％の範囲の濃度、例えば約０．２重量％が良いことがわかっている。ラウリン酸またはオレイン酸を用いる場合、例えば０．０５から２重量％、好ましくは０．１から０．５重量％の範囲、例えば約０．５重量％という若干高い濃度が良い。
【０２１６】
界面活性剤作用は、ほぼ生理的範囲での塩濃度で起こるべきである。従って特には、５０から５００ｍＭ、好ましくは１００から２００ｍＭの範囲、特には約１４０ｍＭのＮａＣｌ濃度が良い。
【０２１７】
界面活性剤作用のその後の低減およびインキュベーションの継続は、さらなるオリゴマー化による本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーの取得に関連するものである（ＷＯ２００４／０６７５６１では、オリゴマーＢと称されている）。以前の段階から得られた組成物は常に界面活性剤および生理的範囲での塩濃度を含むことから、界面活性剤作用、好ましくはさらには塩濃度を低減することが良い。これは、界面活性剤および塩の濃度を低減することで、例えば好都合には水または相対的に低い塩濃度の緩衝液、例えばＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．３）で希釈することで行うことができる。約２から１０の範囲、有利には約３から８の範囲、特には約４の希釈係数が好適であることがわかっている。界面活性剤作用の低減は、前記界面活性剤作用を中和し得る物質を加えることによっても達成できる。これらの例には、精製および抽出手段の途中で細胞を安定化させることができる物質のような界面活性剤を錯化させることができる物質、例えば特定のＥＯ／ＰＯブロックコポリマー、特にはピウロニック（Piuronic；登録商標）Ｆ６８という商品明でのブロックコポリマーなどがある。特定の臨界ミセル濃度付近もしくはそれより高い濃度範囲でのアルコキシル化、特にはエトキシル化アルキルフェノール類（例えば、トリトン（Triton；登録商標）Ｘシリーズのエトキシル化ｔ−オクチルフェノール類、特にはトリトン（登録商標）Ｘ１００、３−（３−クロラミドプロピルジメチルアンモニオ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ（登録商標）））またはアルコキシル化、特にはエトキシル化ソルビタン脂肪酸エステル類（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）シリーズ、特にはＴｗｅｅｎ（登録商標）２０）を、同等に用いることができる。
【０２１８】
次に、本発明の十分なＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーが産生されるまで、溶液をインキュベートする。作用温度が約２０から５０℃、特には約３５から４０℃である場合は、数時間の範囲、好ましくは約１０から３０時間の範囲、特には約１５から２５時間の範囲の作用時間で十分である。次に、溶液を濃縮し、残留物があれば遠心によってそれを除去することができる。この場合もやはり、１００００ｇ数分間が良いことがわかっている。遠心後に得られた上清は、本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーを含む。
【０２１９】
本発明のＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーは、自体が公知の方法で、例えば限外濾過、透析、沈殿または遠心によって最終的に回収することができる。
【０２２０】
例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、変性条件下でのＡβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマーの電気泳動分離によって二重帯域が生じることがさらに好ましく（例えば、Ａβ（１−４２）の場合には見かけの分子量が３８／４８ｋＤａ）、分離前のグロブロマーのグルタルジアルデヒド処理時に、これら２つの帯域が一つにまとまることが特に好ましい。グロブロマーのサイズ排除クロマトグラフィーによって単一ピーク（例えば、Ａβ（１−４２）の場合には約６０ｋＤａの分子量に相当）となることも好ましい。
【０２２１】
Ａβ（１−４２）ペプチド、Ａβ（１２−４２）ペプチドおよびＡβ（２０−４２）ペプチドから出発すると、前記プロセスは、Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１２−４２）グロブロマーおよびＡβ（２０−４２）グロブロマーを得る上で特に好適である。
【０２２２】
本発明の特定の実施形態では、Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー（Ｘは数２．．２４からなる群から選択され、Ｙは上記で定義の通りである）は、Ａβ（１−Ｙ）グロブロマーを切断してより短い形のもの（Ｘが、数２．．２４からなる群から選択され、Ｘは好ましくは２０または１２であり、Ｙが上記で定義の通りである）とすることで得られるものであり、それは適切なプロテアーゼで処理することで行うことができる。例えば、Ａβ（２０−４２）グロブロマーは、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対してサーモリシンタンパク質分解を行うことで得ることができ、Ａβ（１２−４２）グロブロマーは、Ａβ（１−４２）グロブロマーに対してエンドプロテナーゼＧｌｕＣタンパク質分解を行うことで得ることができる。所望の程度のタンパク質分解に達したら、公知の方法でプロテアーゼを失活させる。次に、得られたグロブロマーを、本明細書ですでに説明した手順に従って単離し、必要に応じて、さらなる後処理および精製段階によってさらに処理することができる。前記プロセスについての詳細な説明は、ＷＯ２００４／０６７５６１に開示されており、それは参照によって本明細書に組み込まれるものとする。
【０２２３】
本明細書において「Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマー」という用語は、単離型のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチド、好ましくは本質的に非共有結合的相互作用で他のＡβペプチドと関わっていないＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの一形態を指す。実際には、Ａβ（Ｘ−Ｙ）モノマーは通常、水溶液の形態で提供される。本発明の特に好ましい実施形態では、水系モノマー溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％のＮＨ４ＯＨを含む。本発明の別の特に好ましい実施形態では、水系モノマー溶液は、０．０５％から０．２％、より好ましくは約０．１％のＮａＯＨを含む。使用される場合（例えば、本発明の抗体の結合アフィニティを測定するため）、前記溶液を適切な方法で希釈することが良い可能性がある。さらに通常は、前記溶液は、それの調製から２時間以内、特には１時間以内、特別には３０分以内に使用することが良い。
【０２２４】
本明細書において「フィブリル」という用語は、電子顕微鏡で線維性構造を示し、コンゴレッドに結合し、そして偏光下に複屈折を示し、Ｘ線回折パターンが交差β構造である非共有結合的に会合した個々のＡβ（Ｘ−Ｙ）ペプチドの集合体を含む分子構造を指す。
【０２２５】
本発明の別の態様において、フィブリルは、界面活性剤非存在下での、例えば０．１Ｍ  ＨＣｌ中での好適なＡβペプチドの自己誘発ポリマー凝集を含むことで、２４単位超、好ましくは１００単位超の凝集物形成を生じるプロセスによって得ることができる分子構造である。このプロセスは当業界では公知である。簡便には、Ａβ（Ｘ−Ｙ）フィブリルは水溶液の形態で使用される。本発明の特に好ましい実施形態では、Ａβペプチドを０．１％ＮＨ４ＯＨに溶かし、それを２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）で１：４希釈し、その後にｐＨを再調節して７．４とし、その溶液を３７℃で２０時間インキュべートし、その後に１００００ｇで１０分間遠心し、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に再懸濁させることで、水系フィブリル溶液が得られる。
【０２２６】
本発明はさらに、下記の内容に関するものである。
【０２２７】
可溶性球状Ａβ（１−４２）オリゴマーについて得られた結果は、個々の可溶性球状Ａβ（１−４０）オリゴマーならびに個々の切断Ａβ（Ｘ−３８）、Ａβ（Ｘ−３９）、Ａβ（Ｘ−４０）、Ａβ（Ｘ−４１）、Ａβ（Ｘ−４２）またはＡβ（Ｘ−４３）、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマーおよび／またはそれらの個々の架橋オリゴマーにも関連し、適用可能である。従って、本発明によれば、「可溶性球状Ａβ（１−４２）オリゴマー（「グロブロマー」）」という用語は、例えば「可溶性球状Ａβ（１−４０）オリゴマー」ならびに「可溶性球状Ａβ（Ｘ−４２）オリゴマーs」および「可溶性球状Ａβ（Ｘ−４０）オリゴマー」および／またはそれの架橋誘導体（「ｘは、それぞれの場合で独立に数２．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択され、その略称の意味は上記の通りである（すなわち、１．．２４は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３および２４を表す等である。）。）も含むものと理解される。
【０２２８】
さらに、非拡散性水溶性球状Ａβ（１−４２）オリゴマー（「グロブロマー」）に関する本発明による結果は、個々のＡβ（Ｘ−４２）オリゴマーおよび／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（Ｘは、それぞれの場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される。）、ならびにそれらの架橋誘導体に関しても関連があり、適用可能であることが認められた。
【０２２９】
上記スクリーニング方法をさらに検討している途上で、本発明者らは、文献に記載されている化学製造物についても調べた。驚くべきことに、本発明の発明者らは、ＷＯ９８／３３８１５（および同様の刊行物）によるオリゴマーは、均質な同定可能な物質や同定可能な物質の均質な混合物ではないことを認めた。予想外に、本発明者らは、ＷＯ９８／３３８１５（および同様の刊行物）によるオリゴマーが実際に、約５％の非拡散性可溶性球状Ａβ（１−４２）オリゴマーエピトープ（「グロブロマーエピトープ」）およびof約９５％のフィブリルへの経路上のプロトフィブリル前駆体（「フィブリロマー」）としての拡散性オリゴマーなどのフィブリル傾向モノマーの混合物を含むことを認めた。
【０２３０】
さらに驚くべきことに、他の公知のＡβ（１−４２）オリゴマー調製物も、約５％の量の非拡散性可溶性球状Ａβ（１−４２）オリゴマーエピトープ（「グロブロマーエピトープ」）を含むことも認められている。
【０２３１】
計算から、Ａβ（１−４２）グロブロマーが１２個または約１２個のＡβサブユニットからなることが示唆されるが、エピトープ構造に同じ特徴的変化を有するが、Ａβ鎖数が少ない（例えば、４個のサブユニットのみ）集合体が存在する可能性が高く、それが示唆される。代表的にはこれは、ＷＯ２００４／０６７５６１（Abbott GmbH & Co. KG）に記載の「オリゴマーＡ」の場合である（図１８参照）。
【０２３２】
本発明の１態様によれば、患者から取った１以上の代表的サンプルにおいて、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）、および／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、各場合で独立に、数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）に対して特異性を有する自己抗体の存在（＝陽性診断）もしくは非存在（＝陰性診断）または量を求める段階を特徴とする、定性的（＝陽性または陰性）または定量的にイン・ビトロまたはイン・ビボでアルツハイマー病（ＡＤ）の有無または患者のＡＤにかかるリスクについてヒトもしくは動物患者において診断する方法が提供される。
【０２３３】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、サンプルが、細胞、細胞集合体、身体組織（細胞）サンプル、体液サンプルおよび身体組織（細胞）／体液サンプルからなる群から選択され、前記各サンプルが動物身体、好ましくはヒト、非ヒト動物もしくは非ヒトトランスジェニック動物身体からのものであることを特徴とする。
【０２３４】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体が、非拡散性可溶性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体（Ｘは各場合で独立に、数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）の約２０から約３０のアミノ酸位置の間に位置するグロブロマー構造型特異的エピトープに関して選択的であることを特徴とする。
【０２３５】
本明細書および特許請求の範囲における上記または別の箇所で使用される場合の「約」という言葉は、０から１、２もしくは３アミノ酸位置の通常の実験範囲および製造範囲内で正確な位置が変動し得ることを示すために用いられる。
【０２３６】
「約２０から約３０のアミノ酸位置」という用語は、本発明および本明細書で使用されるいかなる箇所でも、それに限定されることなく、少なくとも「約２０から約３０のアミノ酸位置」、「約２１から約３０のアミノ酸位置」、「約２２から約３０のアミノ酸位置」、「約２３から約３０のアミノ酸位置」および「約２４から約３０のアミノ酸位置」という用語を含むものと理解すべきである。「約３０」という用語は、「約２０」という用語の意味とは独立に、それに限定されるものではなく、少なくとも２６．．３４からなる群から選択される数を含むものと理解されるものとする。「約２０」という用語は、「約３０」という用語の意味とは独立に、それに限定されるものではなく、少なくとも１６．．２４からなる群から選択される数を含むものと理解されるものとする。
【０２３７】
好ましい実施形態によれば、上記の方法は、サンプルが細胞、細胞集合体、身体組織（細胞）サンプル、体液サンプルおよび身体組織（細胞）／体液サンプルからなる群から選択され、前記各サンプルが動物身体、好ましくはヒト、非ヒト動物もしくは非ヒトトランスジェニック動物身体からのものであることを特徴とする。
【０２３８】
好ましい実施形態によれば、上記の方法は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体が、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体（Ｘは各場合で独立に、数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）の約２０から約３０のアミノ酸位置の間に位置するグロブロマー構造型特異的エピトープに関して選択的であることを特徴とする。
【０２３９】
好ましい実施形態によれば、上記の方法は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２４０】
本発明の別の態様によれば、１以上の自体が公知であるペプチド精製プロセスを用いることによる製造物から、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれらの架橋誘導体を選択的および可逆的に捕捉する段階を有することを特徴とする濃縮方法が提供される。
【０２４１】
本発明のさらに別の態様によれば、人工的または天然の調製物における少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）、および／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の量を測定する方法であって、調製物もしくはそれの代表的部分を少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマーおよび／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有する特異的モノクローナルもしくはポリクローナル抗体と接触させ、次に得られた抗体−グロブロマー結合生成物の量を測定する段階を有することを特徴とする方法が提供される。
【０２４２】
本発明の好ましい実施形態によれば、前記方法は、下記またはＷＯ２００４／０６７５６１に記載のドットブロットおよびＥＬＩＳＡ抗Ａβイムノアッセイである。
【０２４３】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体が、非拡散性可溶性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体の約２０から約３０のアミノ酸位置またはそれの中間に位置するグロブロマー構造型特異的エピトープに対して特異的であることを特徴とする。
【０２４４】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記方法は、１以上の自体が公知であるペプチド精製方法段階を用いることで、調製物中に含まれる非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の量を濃縮することを特徴とする。
【０２４５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の濃縮方法は、５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上、より好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、より好ましくは９９重量％以上、より好ましくは９９．９重量％以上、より好ましくは９９．９９重量％以上の、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の量の濃縮を特徴とする。
【０２４６】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の濃縮方法は、１以上の自体が公知であるペプチド精製工程段階を用いることで、調製物から非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体を選択的および可逆的に捕捉する段階を有することを特徴とする。
【０２４７】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の濃縮方法は、１以上の自体が公知であるペプチド精製工程段階を用いることで、調製物から非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体以外の物質を可逆的にまたは非可逆的に除去する段階を有することを特徴とする。
【０２４８】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の濃縮方法は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体の量を測定する段階が、濃縮段階のうちの１以上を行った後にのみ行われることを特徴とする。
【０２４９】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の測定および／または濃縮方法は、得られた非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が、濃縮段階および／または測定段階の前、途中および／または後に行うことができる１以上の自体が公知である架橋段階を用いることで架橋されることを特徴とする。
【０２５０】
架橋は、例えばグルタルジアルデヒドで処理することで行うことができる。好適な架橋方法は、ＷＯ２００４／０６７５６１に記載されている。架橋段階は、濃縮手順の前、途中および／または後に行うことができる。
【０２５１】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の測定および／または濃縮方法は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２５２】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の、上記の方法によって得られた、または上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体が提供される。
【０２５３】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の、上記の方法によって得られた、または上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体が提供される。
【０２５４】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２５５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の、上記の方法によって得られた、または上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択され）および／またはそれの架橋誘導体を含む組成物が得られる。
【０２５６】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の組成物は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２５７】
本発明の別の態様によれば、上記の方法によって得られたまたは上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の、処置を必要とする患者のアルツハイマー病（ＡＤ）に対する能動免疫化のためのワクチンとしての使用が提供される。
【０２５８】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者のアルツハイマー病（ＡＤ）に対する特異的アプタマーの製造における、上記の方法によって得られたまたは上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の使用が提供される。
【０２５９】
上記で確認された精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）に対して好適な特異的アプタマーの製法方法は、当業者には公知である。例えば公開ドイツ特許出願第ＤＥ１９９１６４１７Ａ１号を参照する。
【０２６０】
「能動的」または「受動的」免疫化という用語は、患者の疾患治療に関して、アルツハイマー病（ＡＤ）の発生もしくは発達もしくは進行が防止または遅延されるかニューロン欠損の程度および認識障害の重度に関連するＡＤの病因を停止または速度低下させることを意味するものとする。
【０２６１】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者のアルツハイマー病（ＡＤ）に対する受動的免疫化用の医薬の製造における、上記の方法によって得られたまたは上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の使用が提供される。
【０２６２】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者におけるアルツハイマー病に対する受動的免疫化において有用である、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有するモノクローナルまたはポリクローナル、天然もしくは組換えヒトもしくは動物またはキメラ抗体を製造する上での、上記の方法によって得られたまたは上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の使用が提供される。
【０２６３】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記のいずれかの使用は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２６４】
本発明の別の態様によれば、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有するモノクローナルまたはポリクローナル、天然もしくは組換えヒト、ヒト化、動物またはキメラ抗体の製造方法であって、免疫系を有する生物を、上記の方法によって得られたまたは上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体と接触させる段階、ならびに非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有する抗体または非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／または架橋誘導体に対して特異性を有する抗体を産生する細胞を生物から単離する段階、そして適宜に得られた抗体の化学的配列および／または構造を決定する段階を有することを特徴とする製造方法が提供される。
【０２６５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２６６】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者でのアルツハイマー病（ＡＤ）に対する能動的または受動的免疫化のための、上記方法に従って得られたまたは上記方法に従って得ることができる、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有するモノクローナルまたはポリクローナル、天然もしくは組換え、ヒト化、ヒト、動物またはキメラ抗体が提供される。
【０２６７】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記のモノクローナルまたはポリクローナル、天然もしくは組換え、ヒト化、ヒト、動物またはキメラ抗体は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２６８】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者でのアルツハイマー病（ＡＤ）に対する能動的または受動的免疫化のための、上記方法に従って得られたまたは上記方法に従って得ることができる非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有するモノクローナルまたはポリクローナル、天然もしくは組換え、ヒト、ヒト化、動物またはキメラ抗体を含む組成物が提供される。
【０２６９】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、前記組成物は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２７０】
本発明の別の態様によれば、アルツハイマー病（ＡＤ）であるかアルツハイマー病になるリスクが高い患者を陽性または陰性と診断する方法であって、患者から採取した１以上の代表的サンプルにおいて、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマーs（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体に対する自己抗体の存在（陽性診断）または非存在（陰性診断）を測定する段階を特徴とする方法が提供される。
【０２７１】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、サンプルが細胞、細胞集合体、身体組織（細胞）サンプル、体液サンプルおよび身体組織（細胞）／体液サンプルからなる群から選択され、前記各サンプルがヒト、動物またはトランスジェニック動物身体からのものであることを特徴とする。
【０２７２】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２７３】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者でのアルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病にかかるリスク上昇を確認するための診断マーカーとしての非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体に対するヒト化、ヒト、動物またはキメラ抗体の使用が提供される。
【０２７４】
本発明の好ましい実施形態によれば、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）に対するヒト化、ヒト、動物またはキメラ抗体の使用が、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２７５】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者でのアルツハイマー病またはダウン症候群などの関連疾患の治療もしくは予防のための医薬製造における、患者の脳内の脂肪酸レベルを低下させる１以上の薬剤の使用が提供される。
【０２７６】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者でのアルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病にかかるリスク上昇を確認するための診断マーカーとして有用な、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−Ｙ）オリゴマー（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択され、Ｙは各場合で独立に数３８、３９、４１および４３からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体が提供される。
【０２７７】
本明細書、特許請求の範囲および図面を含む本発明に関して、「Ａβ（１−４２）オリゴマー」という用語は、Ａβ（Ｘ−４２）オリゴマー、Ａβ（Ｘ−４０）オリゴマーおよび／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）を含むものと理解される。
【０２７８】
特に、本明細書、請求項および図面を通じて、下記の定義が適用可能である。
【０２７９】
本発明によれば、「可溶性」という用語は、約１５ｍｇ／ｍＬ以下またはそれ以上の高いもしくはかなりの水溶性（親水性）を有するＡβ（１−Ｙ）グロブロマーに関して、あるいはタンパク質（例：ＨＡＳ）または界面活性剤（例：プルリオール、プルロニックＦ６８）の存在下に水系生理緩衝液溶液中で低、中等度もしくは高溶解度を有する切断Ａβ（Ｘ−Ｙ）グロブロマー（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択され、Ｙは各場合で独立に数３８．．４３からなる群から選択される）に関して定義されるものである。
【０２８０】
本発明によれば、「Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー」という用語は、「Ａβ（Ｘ−３８）オリゴマー」、「Ａβ（Ｘ−３９）オリゴマー」、「Ａβ（Ｘ−４０）オリゴマー」、「Ａβ（Ｘ−４１）オリゴマー」、「Ａβ（Ｘ−４２）オリゴマー」および「Ａβ（Ｘ−４３）オリゴマー」および／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）からなる群から選択される少なくとも一つのＡβオリゴマーを含むものと定義される。
【０２８１】
本発明によれば、「Ａβ（Ｘ−３８）オリゴマー」という用語は、少なくとも一つのＡβ（Ｘ−３８）オリゴマーおよび／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）を含むものと定義される。
【０２８２】
本発明によれば、「Ａβ（Ｘ−３９）オリゴマー」という用語は、少なくとも一つのＡβ（Ｘ−３９）オリゴマーおよび／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）を含むものと定義される。
【０２８３】
本発明によれば、「Ａβ（Ｘ−４０）オリゴマー」という用語は、少なくとも一つのＡβ（Ｘ−４０）オリゴマーおよび／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）を含むものと定義される。
【０２８４】
本発明によれば、「Ａβ（Ｘ−４１）オリゴマー」という用語は、少なくとも一つのＡβ（Ｘ−４１）オリゴマーおよび／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）を含むものと定義される。
【０２８５】
本発明によれば、「Ａβ（Ｘ−４２）オリゴマー」という用語は、少なくとも一つのＡβ（Ｘ−４２）オリゴマーおよび／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）を含むものと定義される。
【０２８６】
本発明によれば、「Ａβ（Ｘ−４３）オリゴマー」という用語は、少なくとも一つのＡβ（Ｘ−４３）オリゴマーおよび／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）を含むものと定義される。
【０２８７】
本発明の別の態様によれば、アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤにかかるリスクの有無についてヒトまたは非ヒト動物被験者で定性的（＝陽性または陰性）または定量的にイン・ビトロまたはイン・ビボ診断を行う方法であって、前記被験者から採取した１以上の代表的サンプルで、少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ、および／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）に対して特異性を有する自己抗体の存在（＝陽性診断）もしくは非存在（＝陰性診断）または量を測定する段階を有することを特徴とする方法が提供される。
【０２８８】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、サンプルが、細胞、細胞集合体、身体組織（細胞）サンプル、体液サンプルおよび身体組織（細胞）／体液サンプルからなる群から選択され、前記各サンプルが動物身体、好ましくはヒト、非ヒトもしくは非ヒトトランスジェニック動物身体からのものであることを特徴とする。
【０２８９】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記方法は、モノクローナルまたはポリクローナル抗体が、少なくとも、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体（Ｘは各場合で独立に、数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）の約２０から約３０のアミノ酸位置の間に位置するグロブロマー構造型特異的エピトープに関して選択的であることを特徴とする。
【０２９０】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０２９１】
本発明の別の態様によれば、人工的または天然の調製物における少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）、および／またはそれの架橋誘導体（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の量を測定する方法であって、調製物もしくはそれの代表的部分を少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つのＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープおよび／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有する特異的モノクローナルもしくはポリクローナル抗体と接触させ、次に得られた抗体−グロブロマー結合生成物の量を測定する段階を有することを特徴とする方法が提供される。
【０２９２】
特には、モノクローナルまたはポリクローナル抗体が、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体の約２０から約３０のアミノ酸位置またはそれの中間に位置するグロブロマー構造型特異的エピトープについて特異的であることを特徴とする、最後の態様による方法が提供される。
【０２９３】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、１以上の自体が公知であるペプチド精製工程段階を用いることで、調製物中に含まれる非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の量を濃縮することを特徴とする。
【０２９４】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の濃縮方法は、５０重量％以上、好ましくは６０重量％以上、より好ましくは７０重量％以上、より好ましくは８０重量％以上、より好ましくは９０重量％以上、より好ましくは９５重量％以上、より好ましくは９９重量％以上、より好ましくは９９．９重量％以上、より好ましくは９９．９９重量％以上の、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の量の濃縮を特徴とする。
【０２９５】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の濃縮方法は、１以上の自体が公知であるペプチド精製工程段階を用いることで、調製物から非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体を選択的および可逆的に捕捉する段階を有することを特徴とする。
【０２９６】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の濃縮方法は、１以上の自体が公知であるペプチド精製工程段階を用いることで、調製物から非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体以外の物質を可逆的にまたは非可逆的に除去する段階を有することを特徴とする。
【０２９７】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の濃縮方法は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくはＡβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体の量を測定する段階が、濃縮段階のうちの１以上を行った後にのみ行われることを特徴とする。
【０２９８】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の測定および／または濃縮方法は、得られた非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が、濃縮段階および／または測定段階の前、途中および／または後に行うことができる１以上の自体が公知である架橋段階を用いることで架橋されることを特徴とする。
【０２９９】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の測定および／または濃縮方法は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０３００】
本発明の別の態様によれば、上記の、上記の方法によって得られた、または上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体が提供される。
【０３０１】
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記の精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０３０２】
本発明の別の態様によれば、上記の、上記の方法によって得られた、または上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体を含む組成物が提供される。
【０３０３】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の組成物は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０３０４】
本発明の別の態様によれば、上記の方法によって得られたまたは上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の、処置を必要とする患者のアルツハイマー病（ＡＤ）に対する能動免疫化のためのワクチンとしての使用が提供される。
【０３０５】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者のアルツハイマー病（ＡＤ）に対する特異的アプタマーの製造における、上記の方法によって得られたまたは上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の使用が提供される。
【０３０６】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者のアルツハイマー病（ＡＤ）に対する受動的免疫化のための医薬の製造における、上記の方法によって得られたまたは上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の使用が提供される。
【０３０７】
本発明の別の態様によれば、少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有するモノクローナルまたはポリクローナル、天然もしくは組換えヒトまたは動物またはキメラ抗体の製造における、上記の方法によって得られたまたは上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体の使用が提供される。
【０３０８】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の使用は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０３０９】
本発明の別の態様によれば、少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有するモノクローナルまたはポリクローナル、天然もしくは組換えヒト、ヒト化、動物またはキメラ抗体の製造方法であって、（ｉ）免疫系を有する生物を、上記の方法によって得られたまたは上記の方法によって得ることができる、精製されたまたは本質的に精製されたまたは高度に精製された非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体と接触させる段階、ならびに（ｉｉ）少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有する抗体を、生物から単離する段階ならびに（ｉｉｉ）適宜に、得られた抗体の化学配列および／または構造を決定する段階を特徴とするか、あるいは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有する抗体を、少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ（「グロブロマー」）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有する抗体を産生する細胞または細胞系から単離する段階を特徴とする方法が提供される。
【０３１０】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０３１１】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者におけるアルツハイマー病（ＡＤ）に対する能動的または受動的免疫化のための、上記の方法に従って得られたまたは得ることができる少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有するモノクローナルまたはポリクローナル、天然もしくは組換え、ヒト化、ヒト、動物またはキメラ抗体が提供される。
【０３１２】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記のモノクローナルまたはポリクローナル、天然もしくは天然または組換え、ヒト化、ヒト、動物またはキメラ抗体は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、非拡散性球状好ましくはＡβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０３１３】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者でのアルツハイマー病（ＡＤ）に対する能動的または受動的免疫化のための、上記の方法に従って得られたまたはその方法によって得ることができる少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有するモノクローナルまたはポリクローナル、天然または組換え、ヒト、ヒト化、動物またはキメラ抗体を含む組成物が提供される。
【０３１４】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の組成物は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０３１５】
本発明の別の態様によれば、アルツハイマー病（ＡＤ）またはＡＤにかかるリスクの有無についてヒトまたは非ヒト動物被験者を陽性または陰性で診断する方法であって、患者から採取した１以上の代表的サンプルで、少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有する自己抗体の存在（＝陽性診断）もしくは非存在（＝陰性診断）を測定する段階を有することを特徴とする方法が提供される。
【０３１６】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、サンプルが、細胞、細胞集合体、身体組織（細胞）サンプル、体液サンプルおよび身体組織（細胞）／体液サンプルからなる群から選択され、前記各サンプルがヒト、非ヒトまたはトランスジェニック動物身体に由来することを特徴とする。
【０３１７】
本発明の好ましい実施形態によれば、上記の方法は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０３１８】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者でのアルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病にかかるリスク上昇を確認するための診断マーカーとしての、少なくとも非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ（「グロブロマー」）（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体に対して特異性を有するヒト化、ヒト、動物またはキメラ抗体の使用が提供される。
【０３１９】
本発明の好ましい実施形態によれば、前述した少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー構造エピトープ、好ましくは少なくとも一つの非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー構造エピトープ（「グロブロマー」）に対して特異性を有するヒト化、ヒト、動物またはキメラ抗体の使用は、非拡散性球状Ａβ（Ｘ−３８／４３）オリゴマー、好ましくは非拡散性球状Ａβ（Ｘ−４２）−および／またはＡβ（Ｘ−４０）オリゴマー（「グロブロマー」）が可溶性であることを特徴とする。
【０３２０】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者でのアルツハイマー病またはダウン症候群などの関連疾患の治療もしくは予防のための医薬製造における、患者の脳内の脂肪酸レベルを低下させる１以上の薬剤の使用が提供される。
【０３２１】
本発明の別の態様によれば、処置を必要とする患者でのアルツハイマー病（ＡＤ）またはアルツハイマー病にかかるリスク上昇を確認するための診断マーカーとして有用な、非拡散性球状ＡβＸ−Ｙオリゴマー（Ｘは、各場合で独立に数１．．２４、好ましくは８．．２４、より好ましくは１２．．２４、より好ましくは１２．．２０および最も好ましくは１７．．２０からなる群から選択され、Ｙは各場合で独立に数３８．．４３からなる群から選択される）および／またはそれの架橋誘導体が提供される。
【０３２２】
診断用途との関連で、本発明は、アルツハイマー病が疑われる患者でのその疾患の診断方法を含むものである。この方法には、ａ）患者から生体サンプルを単離する段階；ｂ）グロブロマー／抗体複合体を形成する上で十分な時間および条件下に、生体サンプルを上記抗体のいずれかと接触させる段階；およびｃ）サンプル中でのグロブロマー／抗体複合体の存在、前記患者でのアルツハイマー病の診断を示す複合体の存在を検出する段階を有する。
【０３２３】
本発明の別の方法には、アルツハイマー病が疑われる患者でのその疾患の診断方法であって、ａ）患者から生体サンプルを単離する段階；ｂ）抗体／グロブロマー複合体を形成する上で十分な時間および条件下に、生体サンプルをグロブロマーと接触させる段階；ｃ）得られた抗体／グロブロマー複合体に接合体を、その接合体が結合した抗体に結合する上で十分な時間および条件で加える段階であって、接合体が検出可能なシグナルを発生させることができるシグナル発生化合物に結合した抗体を含むものである段階；およびｄ）シグナル発生化合物によって発生したシグナルを検出することで生体サンプル中に存在し得る抗体の存在を検出する段階であって、シグナルが患者におけるアルツハイマー病の診断を示すものである段階を有する方法が含まれる。
【０３２４】
本発明には、アルツハイマー病が疑われる患者でのアルツハイマー病の別の診断方法であって、ａ）患者から生体サンプルを単離する段階；ｂ）抗体／精製グロブロマー複合体を形成する上で十分な時間および条件で、生体サンプルをグロブロマーと接触させる段階；およびｃ）サンプル中の抗体／精製グロブロマー複合体の存在を検出する段階であって、複合体の存在が患者でのアルツハイマー病の診断を示すものである段階を有する方法が含まれる。
【０３２５】
さらに、本発明には、アルツハイマー病であることが疑われる患者でのアルツハイマー病の別の診断方法であって、ａ）患者から生体サンプルを単離する段階；抗抗体／抗体複合体を形成できるだけの時間および条件で、生体サンプルを、サンプル中の抗体に対して特異的な抗抗体と接触させる段階；ｂ）得られた抗抗体／抗体複合体に接合体を、結合抗体に接合体が結合できるだけの時間および条件で加える段階であって、接合体が検出可能なシグナルを発生させることができるシグナル発生化合物に結合したグロブロマーを含む段階；およびｃ）シグナル発生化合物によって発生したシグナルを検出する段階であって、シグナルが患者でのアルツハイマー病の診断を示すものである段階を有する方法が含まれる。
【０３２６】
さらに、本発明には、アルツハイマー病の治療または予防のための化合物を確認する方法が含まれる。この方法には、ａ）１以上の対象化合物を上記の精製グロブロマーに、その１以上の化合物が精製グロブロマーに結合するかそれを中和するだけの時間および条件で曝露する段階；およびｂ）精製グロブロマーに結合するかそれを中和する化合物を確認する段階であって、確認された化合物はアルツハイマー病の治療または予防で使用されるものである段階を有する。
【０３２７】
さらに本発明には、患者におけるアルツハイマー病の治療または予防で有用な小分子を設計する方法が含まれる。この方法は、ａ）上記の精製グロブロマー、単離β−アミロイドタンパク質組成物または単離β−アミロイドタンパク質組成物の集合体などのタンパク質の三次元構造を分析する段階；ｂ）段階ａ）で選択されたタンパク質の表面上の１以上のエピトープを確認する段階；およびｃ）段階ｂ）の確認されたエピトープまたはエピトープに結合する小分子を設計する段階であって、分子がアルツハイマー病の治療または予防に使用されるものである段階を有する。
【０３２８】
本発明はさらに、アルツハイマー病の治療または予防で使用されるモノクローナル抗体を確認する方法を含む。この方法は、ａ）上記精製グロブロマーを、モノクローナル抗体のライブラリに、そのモノクローナル抗体の１以上がグロブロマーに結合し、グロブロマー／抗体複合体を形成するだけの時間および条件で曝露する段階；ｂ）グロブロマー／抗体複合体の存在を確認する段階；およびｃ）複合体内の１以上の抗体が何であるかを決定する段階であって、１以上の抗体がアルツハイマー病の治療もしくは予防で用いられるものである段階を有する。
【０３２９】
さらに、留意すべき点として、本発明のグロブロマー（ならびにそれに向かう抗体）は各種診断アッセイで使用可能である。
【０３３０】
本発明の１実施形態において、グロブロマーまたはそれの部分を、固相上にコーティングする（または液相に存在する）。次に、試験サンプルもしくは生体サンプル（例：全血、脳脊髄液、血清など）を固相と接触させる。抗体がサンプル中に存在する場合、そのような抗体は固相上の抗原に結合し、直接法もしくは間接法によって検出される。直接法は、複合体自体の存在、従って抗体の存在を単に検出する段階を有する。間接法では、接合体を結合抗体に加える。その接合体は、シグナル発生化合物または標識に結合した、第１の接合体に結合する第２の抗体を含む。第２の抗体が結合した第１の抗体に結合すると、シグナル発生化合物が測定可能なシグナルを発生させる。そのようなシグナルは、試験サンプル中の第１の抗体の存在を示す。
【０３３１】
診断イムノアッセイで用いられる固相の例には、多孔質および非多孔質材料、ラテックス粒子、磁性粒子、微粒子（米国特許第５７０５３３０号参照）、ビーズ、膜、マイクロタイターウェルおよびプラスチック管がある。固相材料ならびに所望に応じて接合体に存在する抗原もしくは抗体を標識する方法の選択は、所望のアッセイ方式の性能特性に基づいて決める。
【０３３２】
上記のように、接合体（または指示試薬）は、シグナル発生化合物または標識に結合した抗体（または恐らくは抗抗体、アッセイに応じて決まる）を含む。このシグナル発生化合物または「標識」は、それ自体が検出可能であるか、１以上の別の化合物と反応して、検出可能な生成物を形成することができる。シグナル発生化合物の例には、発色団、放射性同位元素（例：１２５Ｉ、１３１Ｉ、３２Ｐ、３Ｈ、３５Ｓおよび１４Ｃ）、化学発光化合物（例：アクリジニウム）、粒子（可視または蛍光）、核酸、錯形成剤または酵素（例：アルカリホスファターゼ、酸ホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼおよびリボヌクレアーゼ）などの触媒などがある。酵素を用いる場合（例：アルカリホスファターゼまたは西洋ワサビペルオキシダーゼ）、発色基質、蛍光基質または発光基質を加えることで、検出可能なシグナルが発生する。時間分解蛍光、内部反射蛍光、増幅（例：ポリメラーゼ連鎖反応）およびラマンスペクトル測定などの他の検出システムも有用である。
【０３３３】
上記イムノアッセイによって調べることができる生体液の例には、血漿、全血、乾燥全血、血清、脳脊髄液または組織および細胞の水系もしくは有機−水系抽出物などがある。
【０３３４】
本発明の別の実施形態では、試験サンプルを、本発明の特異的抗体（例：ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体など）でコーティングした固相（または液相）に曝露することができる。上記のグロブロマーがサンプル中に存在する場合には、固相に結合し、次に上記の直接法もしくは間接法によって検出することができる。より具体的には、間接法では、標識またはシグナル発生化合物に結合した第２の抗体（結合抗原に結合するもの）を含む接合体の添加を行う。第２の抗体が結合抗原に結合すると、検出可能なシグナルが発生し、それは試験サンプル中のグロブロマーまたはそれの一部などのアルツハイマーのタンパク質の存在を示す。
【０３３５】
本発明はまた、試験サンプル中の抗体の存在を検出する第３の方法をも包含する。この方法は、（ａ）抗体を含む可能性がある試験サンプルを、抗抗体／抗原複合体を形成することができるだけの時間および条件で、抗原に特異的な抗抗体（例：グロブロマーまたはそれの一部）と接触させる段階；（ｂ）得られた抗抗体／抗原複合体に、結合した抗体に抗原が結合できるだけの時間および条件で抗原を加える段階であって、抗原が本明細書で定義のグロブロマーまたはそれの一部を含む段階；ならびに（ｃ）得られた抗抗体／抗体／抗原複合体に接合体を加える段階であって、接合体が検出可能なシグナルを検出することができるシグナル発生化合物に結合したモノクローナルまたはポリクローナル抗体を含む組成物を含み、、モノクローナルまたはポリクローナル抗体が抗原に向かうものである段階；ならびに（ｄ）シグナル発生化合物が発生するシグナルを検出することで、試験サンプル中に存在し得る抗体の存在を検出する段階を有する。抗抗体に対する抗体を含む対照またはキャリブレータを用いることができる。抗原混合物はさらに、所望に応じてＰ３０を含むことができる。
【０３３６】
キットも、本発明の範囲に含まれる。より具体的には、本発明は、患者における抗体の存在を確認するためのキットを含むものである。詳細には、試験サンプル中の抗体の存在を確認するためのキットは、ａ）本明細書で定義の抗原（例：グロブロマーまたはそれの部分）；およびｂ）検出可能なシグナルを発生させることができるシグナル発生化合物に結合した抗体を含む接合体を含む。そのキットは、抗原に結合する試薬を含む対照またはキャリブレータをも含むことができる。
【０３３７】
本発明はまた、試験サンプル中の抗体を検出するための別の種類のキットを含むものである。そのキットは、ａ）対象とする抗体に特異的な抗抗体およびｂ）上記で定義の抗原またはそれの部分を含むことができる。抗原に結合する試薬を含む対照またはキャリブレータも含むことができる。より具体的には、キットは、ａ）抗体に対して特異的である抗抗体およびｂ）抗原を含む接合体を含むことができ、接合体は検出可能なシグナルを発生させることができるシグナル発生化合物に結合している。やはり、そのキットも、抗原に結合する試薬を含む対照またはキャリブレータを含むことができる。
【０３３８】
キットは、各容器がプリセットの固相を有するバイアル、瓶または帯片などの一つの容器および個々の接合体を含む他の容器を含むこともできる。これらのキットは、洗浄試薬、処理試薬および指示試薬などのアッセイを行う上で必要な他の試薬のバイアルおよび容器を含むこともできる。
【０３３９】
下記の実施例によって本発明をさらに説明するが、これら実施例はいかなる点においても限定的であると解釈すべきではない。
【実施例】
【０３４０】
（実施例１）
フィブリル傾向モノマーの製造
バッケム（Bachem, Weil am Rhein, Germany）が化学合成したカタログ番号Ｈ−１３６８のＡβ（１−４２）固体粉末１ｍｇを、０．１％ＮＨ４ＯＨ水溶液（調製したばかり）０．５ｍＬに溶かし、室温で３０秒間振盪して、濃度２ｍｇ／ｍＬの透明溶液を得た。
【０３４１】
得られたＡβ（１−４２）モノマー調製液を、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）１．５ｍＬで希釈して、最終タンパク質濃度を０．５ｍｇ／ｍＬとした。このＡβ（１−４２）フィブリル傾向モノマー調製液のｐＨを５％塩酸で調節してｐＨ７．４とし、次に調製液を氷浴上に置いて直ちに使用するようにした。
【０３４２】
いずれの段階も迅速に行って、製造中のＡβ（１−４２）の重合開始を回避した。
【０３４３】
モノマーの最大安定性は、４℃で１時間または室温で１５分間であることが認められた。あるいは、サンプルを直ちに−８０℃で冷凍し、最長１から２週間にわたって−８０℃で保存することができた。この極端に低い温度であっても、Ａβプロトフィブリルおよびフィブリル重合プロセスは開始し、２週間を超えて保存すると調製液は不安定となった。
【０３４４】
（実施例２）
Ａβ（Ｘ−４２）グロブロマーおよびフィブリル傾向モノマーの安定性
Ａβ（１−４２）グロブロマーの溶液を、ＷＯ２００４／０６７５６１の実施例５ａの方法に従って調製した。すなわち、Ａβ（１−４２）合成ペプチド（カタログ番号Ｈ−１３６８、バッケム、スイス）を、約６ｍｇ／ｍＬで１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に懸濁させ、振盪下に３７℃で１．５時間インキュベートして完全に溶解させた。スピードバック（SpeedVac）で留去することでＨＦＩＰを除去し、Ａβ（１−４２）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で濃度５ｍＭで再懸濁させ、２０秒間超音波処理した。ＨＦＩＰ前処理したＡβ（１−４２）をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で希釈して４００μＭとし、および１／１０容量の２％ＳＤＳ（Ｈ２Ｏ溶液）を加えた（最終濃度０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））。３７℃で６時間のインキュベーションによって、１６／２０ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマー中間体が得られた。３倍容量のＨ２Ｏでさらに希釈し、３７℃で１８時間インキュベーションすることで、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーを形成した。３０００×ｇで２０分間遠心後、サンプルを限外濾過（３０ｋＤａカットオフ）によって濃縮し、５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）に対して透析し、１００００×ｇで１０分間遠心し、３８／４８ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマーを含む上清を抜き取った。脂肪酸誘発３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーに関しては、ＳＤＳに代えて、１／１０容量の０．５％脂肪酸を加えた。架橋の場合、３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーを、濃縮および透析に先立って、１ｍＭグルタルジアルデヒドで室温にて２時間透析し、次に室温（ＲＴ）で３０分間エタノールアミン（５ｍＭ）処理した。３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーの制限タンパク質分解を、１／５０（ｍｇ／ｍｇ）の個々のプロテアーゼおよび室温で２０時間のインキュベーションを用いて行って、相当する切断型を得た。
【０３４５】
濃度は、次のように評価した。実験的に測定された分子量に基づくと、Ａβ（１−４２）グロブロマーは、約１２個のモノマーからなると近似された。従って、記載の濃度も近似値である。例えば、示されたＡβ（１−４２）グロブロマー濃度４２ｎＭは、モノマーに基づいた５００ｎＭＡβ（１−４２）グロブロマー濃度と等価であると考えられる。
【０３４６】
２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４中０．５ｍｇ／ｍＬのサンプルを、室温および３７℃でそれぞれ１日および４日間インキュベートした。サンプルの１０μＬ小分け試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３４７】
Ａβ（１−４２）（バッケム、ペプチド合成）を２ｍｇ／ｍＬで０．１％ＮＨ４ＯＨに溶かし、実施例１の方法に従って水で１：４希釈した（０．５ｍｇ／ｍＬ）。このＡβ（１−４２）フィブリル傾向調製物を、−２０℃；０℃；室温（約２０から２２℃に相当）および３７℃の各温度で２４時間インキュベートした。各サンプル１０μＬの小分け試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。
【０３４８】
結果は図２に示してある。
【０３４９】
Ａβ（１−４２）グロブロマーは室温および３７℃の両方でＰＢＳ中にて少なくとも４日間安定であるが、Ａβ（１−４２）モノマーはＰＢＳ中にて０℃で１日後であってもメガダルトンまで顕著な重合を示し、室温で１日後にかなり重合を示し、３７℃で１日後には実質的に完全な重合を示すことが認められた。
【０３５０】
（実施例３）
イン・ビボでのＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープの存在の確認
本発明の特異的抗体を用いて、アルツハイマー病患者（図１３ａからｃ参照）およびＡＰＰトランスジェニックＴｇ２５７６マウス（図１３ｄからｆ参照）の脳内のアミロイドプラークにおけるＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープを検出することが可能であった。
【０３５１】
免疫蛍光のほとんどが、チオフラビンＳ陽性プラークに関連しており（図１３ａ、ｄ参照）、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープがプラーク周囲に高密度の縁を形成した（図１３ｃ、ｆ参照）。脳抽出物のＰＢＳ可溶性画分に関して、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープの相対量の定量が可能であった。アルツハイマー病患者（図１３ｇ参照）およびＴｇ２５７６マウス（図１３ｈ参照）の両方において、総Ａβのうちのごく少量がＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープ構造のものであることが判明した。Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープは、プラークだけでなく、やはり低い総Ａβ（１−４２）濃度を有する若い２．５ヶ月齢のＴｇ２５７６マウスの脳においても検出された。これはアミロイドプラーク発生のかなり前であり、これによって１１ヶ月齢から開始して総Ａβ（１−４２）レベルが大きく上昇し（図１３ｉ参照）、グロブロマーエピトープ形成が比較的低いＡβ（１−４２）濃度であっても高頻度であることが示されている。驚くべきことに、軽度の認識障害患者（図１３ｊ参照、灰色の棒線）およびアルツハイマー病患者（図１３ｊ参照、黒色棒線）の脳脊髄液では、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープは全く検出されなかった。しかしながら、神経構造に迅速かつ容易に結合することから、脳脊髄液から定量的に除去されることが、グロブロマーの明瞭な特徴であることから、この陰性所見は、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープの濃度が検出限界以下であるためである可能性がある。
【０３５２】
その検出は、下記の材料および方法を用いて行った。
【０３５３】
３．１：死後ＡＤヒト脳組織でのＡβグロブロマーエピトープの抽出および検出
３．１．Ａ：試薬リスト
−抽出緩衝液：５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；３５ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４。
【０３５４】
−完全プロテアーゼ阻害薬カクテル錠剤；ロッシュ・ダイアグノスティクス社（Roche Diagnostics GmbH）カタログ番号６９７４９８；４℃で保存。
【０３５５】
−抽出緩衝液＋完全阻害薬カクテル：完全阻害薬カクテル１錠を水１ｍＬに溶かす。１／１００完全阻害薬カクテル溶液を抽出緩衝液に加える。
【０３５６】
３．１．Ｂ：ヒトＡＤ脳からの１段階抽出手順
−８０℃冷凍死後ヒトＡＤおよび年齢を合わせた対照脳組織サンプルを、ブレイン−ネット（Brain-Net、ミュンヘン）から入手した。５０ｍＬファルコン（falcon）管中にて、抽出緩衝液および完全阻害薬カクテル９ｍＬを、冷凍脳組織材料１ｇに加えた。サンプルをウルトラ・ターラクス（Ultra Turrax）ホモジナイザーによって氷上で２分間均質化し、均質化サンプルを超遠心管に入れ、８℃で１５００００ｇにて１時間遠心した。上清を注意深く回収し、１５ｍＬファルコン管中にて−８０℃で保存して、下記のさらなるＥＬＩＳＡ試験に供した。
【０３５７】
３．１．Ｃ：サンドイッチＥＬＩＳＡ
３．２．Ｂ．に記載の通りである。
【０３５８】
３．２：Ａβ過剰産生ＡβトランスジェニックマウスＴｇ２５７６の脳組織におけるＡβグロブロマーエピトープの抽出および検出
３．２．Ａ：抽出手順（３．１．Ａに記載の必要な試薬）
スウェーデンの家族性アルツハイマー病の二重突然変異（Ｋ６７０Ｎ；Ｍ６７１Ｌ）を有するヒトＡＰＰ遺伝子を有し、それを過剰発現する３ヶ月齢雌Ｔｇ２５７６マウス数匹を、タコニクス（Taconics）（ＵＳＡ）から購入し、１２ヶ月齢まで本発明者らの動物ケア施設で飼育した。１２ヶ月齢ＡＰＰ過剰発現ＴＧ２５７６マウス（タコニクス社）または３ヶ月齢Ｃ５７野生型マウスからの冷凍皮質１００ｍｇを、２．５ｍＬＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ−緩衝液＋完全阻害薬カクテル（湿重量１０ｍｇ／０．２５ｍＬ）で洗った。サンプルをガラスポッター（potter）中で予備均質化し、超音波細胞破壊装置を用いて、０℃の氷浴中にて１から２秒間で５回超音波処理した。サンプルの小分け試料２ｍＬずつを、超遠心管中にて３７℃で終夜１６時間インキュベートし、８℃にて１０００００ｇで１時間にわたり遠心した。上清を注意深く取り出し、−２０℃で保存してＥＬＩＳＡ分析に供した。
【０３５９】
３．２．Ｂ：サンドイッチＥＬＩＳＡ
３．２．Ｂ．１：試薬リスト
１．Ｆ９６サート・マキシソープ（Cert. Maxisorp）ＮＵＮＣ免疫プレートカタログ番号４３９４５４
２．捕捉抗体
アフィニティ精製した抗ＡβｐＡｂウサギ５５９８（精製手順Ｌａｂｊ．：１２８６／１５５）；ＰＢＳ溶液；濃度：０．２４ｍｇ／ｍＬ；−２０℃で保存
３．コーティング緩衝液
１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム；ｐＨ９．６
４．ＥＬＩＳＡ用ブロッキング試薬；ロッシュ・ダイアグノスティクス社（Roche Diagnostics GmbH）カタログ番号１１１２５８９
５．ＰＢＳＴ緩衝液
２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４
６．プロテアーゼを含まないアルブミンウシ画分Ｖ；セルバ（Serva）カタログ番号１１９２６．０３；４℃で保存
７．ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ緩衝液：２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４＋０．５％ＢＳＡ
８．Ａβ（１−４２）オリゴマー標準原液；５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）溶液；濃度：１０．７７ｍｇ／ｍＬ；−２０℃で保存
９．抗ＡβマウスｍＡｂクローン６Ｂ１；ＰＢＳ溶液；濃度：１．２ｍｇ／ｍＬ；−８０℃で保存
１０．抗マウス−ＰＯＤ接合体；Ｆａ．ジャクソン・イムノリサーチ（Fa. Jackson Immuno Research）カタログ番号７１５−０３５−１５０
１１．展開
ＴＭＢ；ロッシュ・ダイアグノスティクス社カタログ番号９２８１７０６０；４２ｍＭ  ＤＭＳＯ溶液
３％Ｈ２Ｏ２水溶液
１００ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４．９
１２．停止溶液：２Ｍ硫酸。
【０３６０】
３．２．Ｂ．２：試薬の製造
１．捕捉抗体：
ＷＯ２００４／０６７５６１の実施例２５に記載の手順に従ってウサギを免疫化することで、ウサギポリクローナル抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー抗体５５９８を得た。
【０３６１】
セファロース固定化Ａβ（１−４２）グロブロマー上でのアフィニティクロマトグラフィーによって、このウサギ抗血清から５５９８を精製した。
【０３６２】
−Ａβ（１−４２）グロブロマーセファロースの製造：
Ａβ（１−４２）グロブロマーの製造：Ａβ（１−４２）Ｆａ．バッケム９ｍｇをＨＦＩＰ（１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール）１．５ｍＬに溶かし、３７℃で１．５時間インキュベートした。溶液をスピードバックで溶媒留去し、ＤＭＳＯ３９６μＬに懸濁させた（５ｍＭＡβ原液）。サンプルを超音波水浴で２０秒間超音波処理し、１０分間振盪し、−２０℃で終夜保存した。サンプルをＰＢＳ（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４）５５４μＬで希釈し、２％ＳＤＳ水溶液４９５μＬを加えた（ＳＤＳ含有量０．２％）。
【０３６３】
混合物を３７℃で７時間インキュベートし、Ｈ２Ｏ  １６３３５μＬで希釈し、３７℃でさらに１６時間インキュベートした。その後、Ａβ（１−４２）グロブロマー溶液を３０００ｇで２０分間遠心した。最終Ａβ（１−４２）グロブロマー上清を廃棄し、それを固定化に用いた。
【０３６４】
ＮＨＳ活性化セファロースの製造：続いて、ＮＨＳ活性化セファロース・ファスト・フロー（Fast Flow）（Amersham Biosciences；カタログ番号１７−０９０６−０１）２．０ｇを、下記の液で２回洗浄した。
【０３６５】
イソプロパノール３０％の１ｍＭ  ＨＣｌ溶液（氷冷）２５ｍＬで２回；
１ｍＭ  ＨＣｌ（氷冷）２５ｍＬで２回；
最後に、５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３（ｐＨ７．５）（氷冷）２５ｍＬで２回。
【０３６６】
固定化：Ａβ（１−４２）グロブロマー溶液１０ｍＬを、ＮＨＳ活性化セファロース２．０ｇと混合し、室温で２時間インキュベートした。反応混合物を４０００ｇで遠心し、上清を廃棄した。
【０３６７】
ブロック：５０ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；２５０ｍＭエタノールアミン；０．０５％ＳＤＳ（ｐＨ７．５）１０ｍＬを加えた後、樹脂を室温で１時間インキュベートした。セファロース材料を濾過によって回収し、５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；３５ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％ＳＤＳ；ｐＨ７．４  ２５ｍＬで４回洗浄した。
【０３６８】
架橋：セファロース材料を５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；３５ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％ＳＤＳ；ｐＨ７．４  １０ｍＬに再懸濁させ、４０ｍＭグルタルアルデヒド水溶液１ｍＬ（調製したばかり）と混合した。インキュベーション（２時間、室温）および遠心（１０分間、４０００ｇ）後、上清を廃棄し、セファロースを５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；３５ｍＭ  ＮａＣｌ；２５０ｍＭエタノールアミン；０．０５％ＳＤＳ；ｐＨ７．４  １０ｍＬで室温にて１時間処理した。混合物を４０００ｇで１０分間遠心し、上清を廃棄した。
【０３６９】
エタノールアミンブロッキング反応を繰り返し、最終的にセファロース材料を濾過によって回収し、５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；３５ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％ＳＤＳ；ｐＨ７．４  ２５ｍＬで４回洗浄した。
【０３７０】
最終のＡβ（１−４２）グロブロマーセファロース材料に、５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；３５ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％ＳＤＳ；０．０２％ＮａＮ３；ｐＨ７．４  ４．０ｍＬを加え、冷蔵庫中にて４℃で保存して（セファロース０．５ｇ／ｍＬ）、さらなるアフィニティクロマトグラフィーに供した。
【０３７１】
−アフィニティクロマトグラフィー
Ａβ（１−４２）グロブロマーセファロース材料０．８ｇを濾過によって回収し、ＴＢＳ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ；１５０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．５）１０ｍＬで４回洗浄した。ウサギ血清５５９８をＴＢＳ緩衝液で希釈した（１：１）。このサンプル４０ｍＬを、Ａβ（１−４２）グロブロマーセファロース０．８ｇに加え、８℃で終夜インキュベートした。Ａβ（１−４２）グロブロマー−セファロースをカラムに充填し、ＴＢＳ緩衝液２５ｍＬで洗浄した。０．５８％酢酸の１４０ｍＭ  ＮａＣｌ溶液で溶離を行い、溶出したＵＶ活性分画を回収した。２ＭＴｒｉｓ緩衝液、ｐＨ８．５を加えることで溶出分画（免疫精製Ｐａｂ５５９８原液）を直ちにｐＨ７．５に調節し、−８０℃で保存した。
【０３７２】
−抗体液の調製：
５５９８ＰＡｂ原液を解凍し、コーティング緩衝液で１：２４０希釈した。
【０３７３】
２．ブロッキング試薬：
ブロッキング試薬を水１００ｍＬに溶かして、ブロッキング原液を調製し、１０ｍＬずつの少量サンプルを−２０℃で保存する。
【０３７４】
各プレートについてブロッキング原液３ｍＬを水２７ｍＬで希釈してブロックを行う。
【０３７５】
３．Ａβ（１−４２）グロブロマー標準希釈液：
Ａ−Ａβ（１−４２）グロブロマー標準原液１μＬをＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ  １０７６μＬに加える＝１０μｇ／ｍＬ
Ｂ−１０μｇ／ｍＬＡβ（１−４２）グロブロマー標準液５μＬを、ＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ  ４９９５μＬに加える＝１０ｎｇ／ｍＬ。
【０３７６】
【表１】
2008531635.tif 000003
【０３７７】
【表２】
2008531635.tif 000004
【０３７８】
４．一次抗体６Ｂ１：
マウスモノクローナル抗体６Ｂ１を、Ａβ（１−４２）グロブロマーによる免疫化を介した標準的手順によって得た。その抗体は、標準的な手順を用いてハイブリドーマから精製した。
【０３７９】
濃縮抗ＡβｍＡｂクローン６Ｂ１をＰＢＳＴ＋０．５％ＢＳＡ−緩衝液で希釈した。希釈係数は１／６０００＝０．２μｇ／ｍＬであった。その抗体を直ちに使用した。
【０３８０】
５．標識試薬：
抗マウス−ＰＯＤ接合体凍結乾燥品を水０．５ｍＬで再生する。グリセリン５００μＬを加え、１００μＬずつの小分け試料を−２０℃で保存して、以後の使用に供する。濃縮標識試薬をＰＢＳＴ緩衝液で希釈する。希釈係数は１／５０００である。直ちに使用する。
【０３８１】
６．ＴＭＢ溶液：
１００ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．９）２０ｍＬをＴＭＢ溶液２００μＬおよび３％過酸化物溶液２９．５μＬと混合する。直ちに使用する。
【０３８２】
３．２．Ｂ．３．サンプルプレートの準備（留意すべき点として、標準およびサンプルはいずれも２連で行う）
【０３８３】
【表３】
2008531635.tif 000005
【０３８４】
３．２．Ｂ．４：手順
１．ウェル当たり抗ＡβｐＡｂウサギ５５９８溶液１００μＬを加え、４℃で終夜インキュベートする。
２．抗体溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴ緩衝液２５０μＬで３回洗浄する。
３．ウェル当たりブロック溶液３００ｍＬを加え、室温で２時間インキュベートする。
４．ブロック溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴ緩衝液２５０μＬで３回洗浄する。
５．標準およびサンプルの調製後、ウェル当たり１００μＬの標準およびサンプルをプレートに加える。室温で２時間および４℃で終夜インキュベートする。
６．標準／サンプル溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴ緩衝液２５０μＬで３回洗浄する。
７．ウェル当たり一次抗体溶液２９９μＬを加え、室温で１．５時間インキュベートする。
８．抗体溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴ緩衝液２５０μＬで３回洗浄する。
９．ウェル当たり標識溶液２００μＬを加え、室温で１時間インキュベートする。
１０．標識溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴ緩衝液２５０μＬで３回洗浄する。
１１．各ウェルにＴＭＢ溶液１００μＬを加え、室温でインキュベートする（５から１５分）。
１２．発色を観察し、ウェル当たり停止溶液５０μＬを加える。
１３．４５０ｎｍで読み取りを行う。
１４．標準曲線から結果を計算する。
１５．評価：
未知サンプルからの消光が較正曲線の線形性範囲内にない場合、割り当てられたサンプル希釈でＥＬＩＳＡを繰り返す。
【０３８５】
これらのデータから、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープが、イン・ビボではアルツハイマー病の非常に初期の段階で存在し、全ての臨床的徴候より先に生じると言うことができる。従って、それが、ＡＤおよび関連状態の早期検出およびリスク評価において有用となり得るものと推定される。
【０３８６】
（実施例４）
球状Ａβ（１−４２）オリゴマーの形成および特性決定
球状Ａβ（１−４２）オリゴマー形成手順の最初の段階（図１１ａ参照）は、合成Ａβ（１−４２）ペプチドをＨＦＩＰで前処理することによる既存の構造的不均質物の除去である（Stine, W.B., Jr., Dahlgren, K.N., Krafft, G.A. & LaDu, M.J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem 278, 11612-11622 (2003)）。ＤＭＳＯに再懸濁させた後、０．２％ＳＤＳ中でインキュベーションすることで、最初に１６／２０ｋＤａ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での２つの帯域の見かけの質量）を有する中間体オリゴマーＡβ型を形成する。さらなる希釈およびインキュベーションで、この中間体は自己会合して、最終の３８／４８ｋＤａオリゴマーＡβ型となり、それは球状構造のものであることが認められたことから、以下においては３８／４８ｋＤａ球状Ａβ（１−４２）オリゴマーまたは簡単にＡβ（１−４２）グロブロマーと称する（図１１ｂ参照）。
【０３８７】
グロブロマー画分からの残留フィブリル傾向モノマーの分離は、固定化タンパク質Ａに結合したフィブリル傾向Ａβ（１−４２）モノマーに特異的な抗体を用いるアフィニティクロマトグラフィーを介した、またはフィブリル傾向Ａβ（１−４２）モノマーの直接抗体除去（免疫沈殿または免疫吸着）を介した除去によって行うことができる。これらの方法について、下記でより詳細に説明する。
【０３８８】
中間体１６／２０ｋＤａおよび最終３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーの両方のグルタルジアルデヒド架橋によって、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上の２つの帯域が合体して一つになり、一様のＡβ（１−４２）グロブロマー構造を示した。Ａβ（１−４２）グロブロマー構造を形成するＡβ（１−４２）ペプチド相互作用は専ら非共有結合性である。熱変性によってＡβ（１−４２）グロブロマーはモノマーＡβ（１−４２）に戻ったが、架橋Ａβ（１−４２）グロブロマーは戻らなかった。そうではあっても、非共有結合的に連結されたＡβ（１−４２）グロブロマーは、体温（３７℃）で長期安定性を示した。Ａβ（１−４２）グロブロマー構造はイン・ビトロで４日間まで維持され、明瞭な分解やフィブリルへのさらなる重合はなかった。
【０３８９】
対照的に、０．１％ＮＨ４ＯＨ（Ａβ（１−４２）ＮＨ４ＯＨ調製物）に溶かしたＡβ（１−４２）ペプチドの標準モノマー調製物（バッケム、スイス）は、すでにインキュベーション１日後に高度の凝集を示した（図１１ｃ参照）。
【０３９０】
スペロース（Superose）１２ＨＲ１０／３０カラム（Amersham Biosciences, Germany）および流動緩衝液としてのＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用いて、分子量分布に関してＡβ型を分析した。一組の標準タンパク質を用いてカラムの較正を行った。Ｈ４タンパク質チップ（Ciphergen Biosystems, USA）および基質としてのα−シアノ−４−ヒドロキシ−桂皮酸の５０％アセトニトリル／０．５％トリフルオロ酢酸溶液を用いるＳＥＬＤＩ−ＭＳによって、Ａβ−ペプチド質量を求めた。
【０３９１】
自然条件下では（ＰＢＳ、ｐＨ７．４）、Ａβ（１−４２）グロブロマーのサイズ排除クロマトグラフィーは、単一であるが広いピークを約１００ｋＤａで示した（図１１ｄ参照）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥと同様、架橋Ａβ（１−４２）グロブロマーは、６０ｋＤａに狭いピークを有する低下した見かけの分子量を示し、Ａβ（１−４２）グロブロマーがグルタルジアルデヒド架橋で凝集する単一の球形のみで存在することを示唆している。
【０３９２】
対照的に、Ａβ（１−４２）ＮＨ４ＯＨ調製物は、非常に不安定で、フィブリル化傾向のものであった。再懸濁から約５分後ですでに、顕著な凝集が検出可能であり（主要ピーク１１ｋＤａ、少量ピーク７４ｋＤａ）、インキュベーション１時間後に、明白なフィブリル凝集によって、Ａβがクロマトグラフィーカラムに入らなかった（データは示していない）。無差別プロテアーゼを用いるタンパク質分解によって、Ｎ末端から前方に約アミノ酸２０までＡβ（１−４２）グロブロマーが切断されて、Ｃ末端部分および球形構造は影響されずに残った（図１１ｅ参照）。サーモリシン開裂産物のＳＥＬＤＩ−ＭＳ分析は、Ａβ（１−４２）グロブロマーの架橋によって、Ａβ（４−４２）開裂産物の損失が生じ、Ａβ（２０−４２）が維持されることを示していた（図１１ｆ参照）。従って、架橋はＮ末端およびＬｙｓ−１６のみに影響したが、Ｌｙｓ−２８には影響しなかったことから、それはＡβ（１−４２）グロブロマーの内部に隠されていたに違いない。
【０３９３】
下記では、残留フィブリル傾向モノマーのＡβ（１−４２）グロブロマー溶液をきれいにする好適な方法について説明する。これらのいずれも、列記したものに加えて下記の試薬を必要とする。
【０３９４】
−タンパク質Ａセファロース４ファストフロー（Fast Flow）アマシャム・バイオサイエンシーズ（Amersham Biosciences）カタログ番号１７−０９７４−０１
−ＰＢＳ緩衝液：２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％プルロニックＦ６８；ｐＨ７．４。
【０３９５】
４．１：タンパク質Ａ結合フィブリル傾向Ａβ（１−４２）特異的抗体アフィニティクロマトグラフィーを介したＡβ（１−４２）グロブロマー調製物中のＡβ（１−４２）フィブリル傾向モノマーの汚染除去によるＡβ（１−４２）グロブロマーの精製
４．１．Ａ：試薬リスト
−捕捉抗体抗Ａβ（１−４２）ウサギｐＡｂ；ビオチン化ＩｇＧの５０％グリセリン含有ＰＢＳ溶液；濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ；シグネット（Signet）カタログ番号９１３５；−８０℃で保存
−Ａβ（１−４２）オリゴマー標準原液；５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４溶液；３５ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４；濃度：１０．７７ｍｇ／ｍＬ；−２０℃で保存。
【０３９６】
４．１．Ｂ：試薬の製造
１．捕捉抗体希釈液：濃縮抗Ａβ（１−４２）ｐＡｂを、ＰＢＳで１：５希釈して、０．１ｍｇ／ｍＬとする。
【０３９７】
２．タンパク質Ａセファロース上での捕捉抗体の固定化：タンパク質Ａセファロース２０μＬをＰＢＳ−緩衝液２００μＬと平衡状態とし、次に３０００ｇで５分間遠心し、上清を廃棄する。手順を４回繰り返す。抗Ａβ（１−４２）ｐＡｂの１：５ＰＢＳ希釈液１００μＬをタンパク質Ａセファロースペレットに加え、室温で１時間振盪する。３０００ｇで５分間遠心する。上清を廃棄し、タンパク質ＡセファロースをＰＢＳ２００μＬで３回洗浄し、次に各回３０００ｇで５分間遠心する。上清を廃棄する。
【０３９８】
３．Ａ１−４２オリゴマー標準希釈液：Ａβ（１−４２）オリゴマー標準原液５０μＬをＰＢＳ４５０μＬに加える＝１．０８ｍｇ／ｍＬ。
【０３９９】
４．１．Ｃ：手順
Ａβ（１−４２）オリゴマー標準希釈液５００μＬを、タンパク質Ａセファロース固定化抗Ａβ（１−４２）ｐＡｂ樹脂２０μＬに加える。サンプルを室温で２時間、さらに４℃で１６時間振盪してから、３０００ｇで５分間遠心する。
【０４００】
Ａβフィブリル傾向汚染物（フィブリロマー類）はアフィニティ基質と反応し、上清はグロブロマーエピトープ純度＞＞９５％で精製Ａβグロブロマーを含む。
【０４０１】
このサンプルの純度は、その手順を２回繰り返すことでさらに向上し、上清でグロブロマーエピトープ純度＞９９％が得られた。
【０４０２】
４．２：フィブリル傾向Ａβ（１−４２）の直接除去を介したＡβ（１−４２）粗調製物中のＡβ（１−４２）フィブリル傾向モノマーの汚染を除去することによるＡβグロブロマーの精製
４．２．Ａ：試薬リスト
−Ｆ９６サート・マキシソープＮＵＮＣ免疫プレートカタログ番号４３９４５４
−捕捉抗体抗Ａβ（１−４２）ウサギｐＡｂ；ビオチン化ＩｇＧ溶液の５０％グリセリン含有ＰＢＳ溶液；濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ；シグネットカタログ番号９１３５；−８０℃で保存
−コーティング緩衝液：１００ｍＭ炭酸水素ナトリウム；ｐＨ９．６
−ＥＬＩＳＡ用ブロッキング試薬；ロッシュ・ダイアグノスティクス社カタログ番号１１１２５８９
−ＰＢＳＴ緩衝液：２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４
−Ａβ（１−４２）オリゴマー標準原液；５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）溶液；濃度：１０．７７ｍｇ／ｍＬ；−２０℃で保存
【０４０３】
４．２．Ｂ：試薬の製造
１．捕捉抗体：濃縮抗Ａβ（１−４２）ｐＡｂをコーティング緩衝液で１：１００希釈する。
２．ブロッキング試薬：ブロッキング試薬を水１００ｍＬに溶かして、ブロッキング原液を調製し、１０ｍＬずつの小分け試料を−２０℃で保存する。各プレートについてブロッキング原液３ｍＬを水２７ｍＬで希釈して、ブロックを行う。
【０４０４】
３．Ａβ（１−４２）グロブロマー標準希釈液：Ａβ（１−４２）グロブロマー標準原液１μＬを、ＰＢＳＴ１０７６μＬに加える＝１０μｇ／ｍＬ  Ａβ（１−４２）グロブロマー標準溶液。
【０４０５】
４．２．Ｃ：手順
１ウェル当たり抗Ａβ（１−４２）ｍＡｂクローン・シグネット９１３５溶液１００μＬを加え、４℃で終夜インキュベートする。抗体溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴ緩衝液２５０μＬで３回洗浄する。ウェル当たりブロック溶液３００μＬを加え、室温で２時間インキュベートする。ブロック溶液を廃棄し、ウェルをＰＢＳＴ緩衝液２５０μＬで３回洗浄する。標準の調製後、各ウェルに対してＡβ（１−４２）グロブロマー標準溶液１００μＬをプレートに加える。室温で２時間、そして４℃で終夜にわたってインキュベートする。Ａβ（１−４２）グロブロマー標準溶液を１５ｍＬファルコン管に回収し、それは純度＞９５％を有する。
【０４０６】
マイクロタイタープレートで上記の免疫アフィニティ手順を繰り返すことで、球状エピトープ純度をさらに高めることができる。この手順後、Ａβ（１−４２）グロブロマー溶液は、Ａβフィブリル傾向型構造（モノマーおよびフィブリロマー）に関して＞＞９９％純度となる。
【０４０７】
４．３：タンパク質Ａ結合フィブリル傾向Ａβ（１−４２）特異的抗体アフィニティクロマトグラフィーを介したＡβ（１−４２）ＡＤＤＬ調製物中のＡβフィブリル傾向モノマーの汚染を除去することによるＡβグロブロマーエピトープの濃縮
４．３．Ａ：試薬リスト
−捕捉抗体抗Ａβ（１−４２）ウサギｐＡｂ；ビオチン化ＩｇＧ溶液の５０％グリセリン含有ＰＢＳ溶液；濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ；シグネットカタログ番号９１３５；−８０℃で保存
−Ａβ（１−４２）ＡＤＤＬ標準原液；Ｆ１２培地中の溶液；濃度０．１２ｍｇ／ｍＬ；−８０℃で保存。
【０４０８】
４．３．Ｂ：試薬の製造
１．タンパク質Ａ−セファロースの平衡化：タンパク質Ａセファロース２０μＬをＰＢＳ緩衝液２００μＬと、次に０．５８％酢酸２００μＬと平衡状態とし、カラム中にてＰＢＳ緩衝液２００μＬでさらに洗浄する。平衡化タンパク質Ａ−セファロースを管に入れ、等容量のＰＢＳ−緩衝液を基質に加える。
【０４０９】
２．Ａβ（１−４２）ＡＤＤＬ標準希釈液：Ａβ（１−４２）ＡＤＤＬ標準原液４２μＬをＰＢＳ５８μＬに加える＝０．０５ｍｇ／ｍＬ。
【０４１０】
４．３．Ｃ：手順
抗Ａβ（１−４２）ウサギｐＡｂ；ビオチン化ＩｇＧ溶液２０μＬを、Ａβ（１−４２）ＡＤＤＬ溶液１００μＬに加える。サンプルを室温で２時間振盪する。ＰＢＳ緩衝液中の平衡化タンパク質Ａセファロース懸濁液１０μＬをサンプルに加え、室温で１時間振盪してから、３０００ｇで５分間遠心する。
【０４１１】
Ａβフィブリル傾向汚染物（フィブリロマー）はアフィニティ基質と反応し、上清はグロブロマーエピトープ純度＞＞５５％を示す。
【０４１２】
このサンプルの純度は、その手順を２回繰り返すことでさらに向上し、上清でグロブロマーエピトープ純度＞９５％が得られた。
【０４１３】
４．４：タンパク質Ａ結合フィブリル傾向Ａβ（１−４２）特異的抗体アフィニティクロマトグラフィーを介したＡβ（１−４２）ＡＤＤＬ調製物中のフィブリル傾向Ａβの汚染除去によるＡβグロブロマーエピトープの濃縮
４．４．Ａ：試薬リスト
−捕捉抗体：抗Ａβ（１−４２）ｍＡｂＣ末端クローンＢＤＩ７８０；精製、凍結乾燥；バイオデザイン（Biodesign）カタログ番号Ｑ６７７８０Ｍ；−２０℃で保存
−Ａβ（１−４２）−ＡＤＤＬ標準原液；Ｆ１２培地中溶液；濃度：０．１２ｍｇ／ｍＬ；−８０℃で保存。
【０４１４】
４．４．Ｂ：試薬の製造
１．タンパク質Ａ−セファロースの平衡化：タンパク質Ａセファロース２０μＬをＰＢＳ緩衝液２００μＬと、次に０．５８％酢酸２００μＬと平衡状態とし、カラム中にてＰＢＳ緩衝液２００μＬでさらに洗浄する。平衡化タンパク質Ａ−セファロースを管に入れ、等容量のＰＢＳ−緩衝液を基質に加える。
【０４１５】
２．捕捉抗体の再生：抗体１００μｇを水１ｍＬで再生して、０．１ｍｇ／ｍＬとする。
【０４１６】
３．Ａβ（１−４２）ＡＤＤＬ標準希釈液：Ａβ（１−４２）ＡＤＤＬ標準原液４２μＬをＰＢＳ５８μＬに加える＝０．０５ｍｇ／ｍＬ。
【０４１７】
４．４．Ｃ：手順
抗Ａβ（１−４２）ウサギｐＡｂ；ビオチン化ＩｇＧ溶液１００μＬを、Ａβ（１−４２）ＡＤＤＬ溶液１００μＬに加える。サンプルを室温で２時間振盪する。ＰＢＳ緩衝液中の平衡化タンパク質Ａセファロース懸濁液１０μＬをサンプルに加え、室温で１時間振盪してから、３０００ｇで５分間遠心する。Ａβフィブリル傾向汚染物（フィブリロマー）はアフィニティ基質と反応し、上清はグロブロマーエピトープ純度＞＞５０％を示す。
【０４１８】
このサンプルの純度は、その手順を２回繰り返すことでさらに向上し、上清でグロブロマーエピトープ純度＞９０％が得られた。
【０４１９】
４．５：タンパク質Ａ結合フィブリル傾向Ａβ（１−４２）特異的抗体アフィニティクロマトグラフィーを介したＡβ（１−４２）ＮＨ４ＯＨ調製物中のＡβフィブリロマーの汚染除去によるＡβグロブロマーエピトープの濃縮
４．５．Ａ：試薬リスト
−捕捉抗体抗Ａβ（１−４２）ウサギｐＡｂ；ビオチン化ＩｇＧ溶液の５０％グリセリン含有ＰＢＳ溶液；濃度：０．５ｍｇ／ｍＬ；シグネットカタログ番号９１３５；−８０℃で保存
−Ａβ（１−４２）ＮＨ４ＯＨ標準原液；０．１％ＮＨ４ＯＨ中の溶液；濃度：２ｍｇ／ｍＬ；−８０℃で保存。
【０４２０】
４．５．Ｂ：試薬の製造
１．タンパク質Ａ−セファロースの平衡化：タンパク質Ａセファロース２０μＬをＰＢＳ緩衝液２００μＬと、次に０．５８％酢酸２００μＬと平衡状態とし、カラム中にてＰＢＳ緩衝液２００μＬでさらに洗浄する。平衡化タンパク質Ａ−セファロースを管に入れ、等容量のＰＢＳ−緩衝液を基質に加える。
【０４２１】
２．Ａβ（１−４２）ＮＨ４ＯＨ標準希釈液：Ａβ（１−４２）ＡＤＤＬ標準原液２．５μＬをＰＢＳ９７．５μＬに加える＝０．０５ｍｇ／ｍＬ。
【０４２２】
４．５．Ｃ：手順：４．３．Ｃ下の方法と同様。
【０４２３】
（実施例５）
ペプチドＡβ（２０−４２）を原料とするＡβ（２０−４２）グロブロマーの形成
ａ）グロブロマー原液の調製
β−アミロイド（２０−４２）タンパク質（凍結乾燥、アナスペック社（Anaspec Inc.）、番号４０８／４５２−５０５５／３３９０８）０．５ｍｇを１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール２５μＬに溶かし、エッペンドルフ管中３７℃で１時間インキュベートし、次に１００００ｇで１０分間遠心した。上清を除去して、Ａβ（２０−４２）原液２０ｍｇ／ｍＬ（９ｍＭ）を得て、それは−８０℃で保存することができた。
【０４２４】
ｂ）最終的な安定なＡβ（２０−４２）グロブロマーの製造
実施例５ａ）からのＡβ（２０−４２）原液４μＬを、２ｍＭリン酸ナトリウム、１４ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）１９６μＬおよび１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液２０μＬと混合してから、インキュベーション６℃で２０時間インキュベーションし、最後に１００００ｇで１０分間遠心した。上清を、約１８０μＭ  Ａβ（２０−４２）グロブロマー調製物として回収し、それは−２０℃で保存することができた。その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図９）によってサンプルを分析したところ、生成物は３２ｋＤａで出現した。実施例４に記載の精製方法によってさらに精製することができる。
【０４２５】
（実施例６）
ペプチドＡβ（１２−４２）を原料とするＡβ（１２−４２）グロブロマーの形成
ａ）グロブロマー原液の調製
β−アミロイド（１２−４２）タンパク質（凍結乾燥、アナスペック社（Anaspec Inc.）、番号４０８／４５２−５０５５／３３９０７Ａ）０．５ｍｇを原料とし、実施例５ａ）に記載の手順を行って、Ａβ（１２−４２）原液２０ｍｇ／ｍＬ（６．２ｍＭ）を得て、それは−８０℃で保存することができた。
【０４２６】
ｂ）最終的な安定なＡβ（１２−４２）グロブロマーの製造
実施例６ａ）からのＡβ（１２−４２）原液４μＬを、実施例５ｂ）の方法に従って処理して、約１２０μＭ  Ａβ（１２−４２）グロブロマー調製物を得て、それは−２０℃で保存することができた。
【０４２７】
その後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図１０）によってサンプルを分析したところ、生成物は１２ｋＤａでほぼ定量的に出現した。実施例４に記載の精製方法によってさらに精製することで、超高純度のＡβ（１２−４２）グロブロマーが得られると考えられる。
【０４２８】
（実施例７）
血漿またはＣＳＦのドットブロットによるヒト体液中の抗グロブロマー自己抗体の検出
血漿または血清サンプルの処理
ａ）血清または血漿から、自己抗体の遊離画分の力価を直接測定した。
【０４２９】
ｂ）下記のような血漿／血清サンプルの前処理によって、総自己抗体の力価を測定した。血漿／血清１００μＬを１４０ｍＭ  ＮａＣｌ＋０．５８％酢酸１０ｍＬと混合し、２０分間インキュベートしてから、セントリプレプ（Centriprep）ＹＭ３０（アミコン社（Amicon Inc.））で濃縮して１ｍＬとした。
【０４３０】
次に、血漿／血清サンプルについて抗Ａβ自己抗体を評価した。このために、０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡを補充したＰＢＳ中の１００ｐｍｏｌ／μＬから０．０１ｐｍｏｌ／μＬの範囲の個々のＡβ（１−４２）型の一連の希釈液を製造した。各サンプル１μＬを、ニトロセルロース膜上にブロットした。検出のために、相当するマウス血漿サンプルを用いた（１：４００希釈）。アルカリホスファターゼ接合抗マウス−ＩｇＧおよび染色試薬ＮＢＴ／ＢＣＩＰを用いて、免疫染色を行った。
【０４３１】
ドットブロット用Ａβ−標準
１．Ａβ（１−４２）グロブロマー
Ａβ（１−４２）オリゴマー（下記においてＡβ（１−４２）グロブロマーと称する）の製造は、ＷＯ２００４／０６７５６１に記載されている。
【０４３２】
２．Ａβ（１−４２）モノマー
ヒトＡβ（１−４２）（バッケム社カタログ番号Ｈ−１３６８）３ｍｇを、１．７ｍＬエッペンドルフ管中にてＨＦＩＰ（６ｍｇ／ｍＬ懸濁液）０．５ｍＬに溶かし、透明溶液が得られるまで３７℃で１．５時間振盪した（エッペンドルフ・サーモミキサー、１４００ｒｐｍ）。サンプルを、スピードバック濃縮装置で乾燥させ（１．５時間）、ＤＭＳＯ  １３．２μＬに再懸濁させ、１０秒間振盪し、次に超音波処理（２０秒間）および１０分間の振盪（例えばエッペンドルフ・サーモミキサー、１４００ｒｐｍ）を行った。２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．１％プルロニックＦ６８；ｐＨ７．４  ６ｍＬを加え、室温で１時間攪拌した。サンプルを３０００ｇで２０分間遠心した。上清を廃棄し、沈殿を２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；１％プルロニックＦ６８、ｐＨ７．４  ０．６ｍＬに溶かした。ofＨ２Ｏ  ３．４ｍＬを加え、室温で１時間攪拌してから、３０００ｇで２０分間遠心した。上清各０．５ｍＬの小分けサンプル８個を−２０℃で保存して、その後の使用に供した。
【０４３３】
３．Ａβ（１２−４２）グロブロマー
Ａβ（１２−４２）オリゴマー（以下において、Ａβ（１２−４２）グロブロマーと称する）の製造については、ＷＯ２００４／０６７５６１に記載されている。
【０４３４】
４．Ａβ（１２−４２）モノマー
０．１％ＮａＯＨ中の５ｍｇ／ｍＬ溶液（アナスペック社）を調製し、−２０℃で保存した。
【０４３５】
５．Ａβ（１７−４２）グロブロマー
トリプシンを用いた開裂によるＡβ（１−４２）オリゴマーを原料とする切断Ａβ（１７−４２）グロブロマーの製造
Ａβ（１−４２）グロブロマー（濃度１２．５ｍｇ／ｍＬ、Ａβ（１−４２）−グロブロマーの製造については、ＷＯ２００４／０６７５６１に記載されている）０．１ｍＬを、緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）２．４ｍＬおよび０．２ｍｇ／ｍＬトリプシン溶液（ロッシュ社）の２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）溶液１２５μＬと混合する。反応混合物を室温で２０時間攪拌する。次に、１００ｍＭフルオロリン酸ジイソプロピルの水溶液２５μＬを加え、混合物をさらに１％強度ＳＤＳ溶液８０μＬでＳＤＳ含有量０．０３％に調節する。反応混合物を、１０ｋＤａセントリプレプ管を用いて濃縮して約０．２５ｍＬとする。その濃縮液を緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）０．６２５ｍＬと混合し、再度濃縮して０．２５ｍＬとする。
【０４３６】
６．Ａβ（１７−４２）モノマー
０．１％ＮａＯＨ中の５ｍｇ／ｍＬ溶液（アナスペック社）を調製し、−２０℃で保存した。
【０４３７】
７．Ａβ（２０−４２）グロブロマー
Ａβ（２０−４２）オリゴマー（以下において、Ａβ（２０−４２）グロブロマーと称する）の製造は、ＷＯ２００４／０６７５６１に記載されている。
【０４３８】
８．Ａβ（２０−４２）モノマー
０．１％ＮａＯＨ中の５ｍｇ／ｍＬ溶液（アナスペック社）を調製し、−２０℃で保存した。
【０４３９】
９．Ａβ（１−４０）モノマー
ヒトＡβ（１−４０）、（バッケム社カタログ番号Ｈ−１１９４）１ｍｇを、エッペンドルフ管中にてＨＦＩＰ（４ｍｇ／ｍＬ懸濁液）０．２５ｍＬに懸濁させた。管を３７℃で１．５時間振盪して（例えば、エッペンドルフサーモミキサー中、１４００ｒｐｍ）、透明溶液を得て、次にスピードバック濃縮装置で乾燥させた（１．５時間）。サンプルをＤＭＳＯ（２１．７ｍｇ／ｍＬ溶液＝５ｍＭ）４６μＬに再溶解させ、１０秒間振盪させ、次に２０秒間超音波処理した。１０分間の振盪（例えば、エッペンドルフサーモミキサー中、１４００ｒｐｍ）後、サンプルを−２０℃で保存して、その後の使用に供した。
【０４４０】
１０．Ａβ（１−４２）フィブリル
ヒトＡβ（１−４２）（バッケム社カタログ番号Ｈ−１３６８）１ｍｇを０．１％ＮＨ４ＯＨ水溶液（エッペンドルフ管）５００μＬに溶解させ、サンプルを室温で１分間攪拌した。この調製したばかりのＡβ（１−４２）溶液１００μＬを２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）３００μＬで中和した。１％ＨＣｌでｐＨをｐＨ７．４に調節した。サンプルを３７℃で２４時間インキュベートし、遠心した（１００００ｇで１０分間）。上清を廃棄し、フィブリルペレットを、１分間渦攪拌することで、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ７．４）４００μＬに再懸濁させた。
【０４４１】
ドットブロット用材料
Ａβ−標準
２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４＋０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ中のＡβ−抗原の順次希釈
１）１００ｐｍｏｌ／μＬ
２）１０ｐｍｏｌ／μＬ
３）１ｐｍｏｌ／μＬ
４）０．１ｐｍｏｌ／μＬ
５）０．０１ｐｍｏｌ／μＬ。
【０４４２】
ニトロセルロース
トランス−ブロット・トランスファー培地、純粋ニトロセルロース膜（０．４５μｍ）；Ｆａ．ＢＩＯ−ＲＡＤ
抗マウスＡＰ
ＡＱ３３０（Ｆａ．ケミコン（Fa. Chemicon））
検出試薬
ＮＢＴ／ＢＣＩＰ錠（ロッシュ）
ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）
Ａ−７８８８（ＳＩＧＭＡ）
ブロッキング試薬
５％低脂肪乳のＴＢＳ溶液
緩衝液
ＴＢＳ
２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液ｐＨ７．５
＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
ＴＴＢＳ
２５ｍＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ−緩衝液ｐＨ７．５
＋１５０ｍＭ  ＮａＣｌ
＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ＋０．２ｍｇ／ｍＬＢＳＡ
２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４緩衝液ｐＨ７．４
＋１４０ｍＭ  ＮａＣｌ
＋０．２ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ
抗体溶液Ｉ
Ａβ（２０−４２）グロブロマーを用いた能動免疫化試験からのマウス血漿サンプル（１％低脂肪乳のＴＢＳ溶液２０ｍＬで１：４００希釈したもの）
抗体溶液ＩＩ
１：５０００希釈
１％低脂肪乳のＴＢＳ溶液中の抗マウス−ＡＰ。
【０４４３】
ドットブロット手順
１）異なるＡβ−標準（５連続希釈で）各１μＬを、互いに約１ｃｍ離してニトロセルロース膜上にドット付与した。
【０４４４】
２）Ａβ−標準ドットを、ニトロセルロース膜上にて室温（ＲＴ）で少なくとも１０分間風乾する（＝ドットブロット）。
【０４４５】
３）ブロッキング
ドットブロットを、５％低脂肪乳のＴＢＳ溶液３０ｍＬとともに室温で１．５時間インキュベートする。
【０４４６】
４）洗浄
ブロッキング溶液を廃棄し、ドットブロットをＴＴＢＳ  ２０ｍＬともに振盪しながら室温で１０分間インキュベートする。
【０４４７】
５）抗体溶液Ｉ
洗浄緩衝液を廃棄し、ドットブロットを抗体溶液Ｉとともに室温で終夜インキュベートする。
【０４４８】
６）洗浄
抗体溶液Ｉを廃棄し、ドットブロットをＴＴＢＳ  ２０ｍＬとともに振盪しながら室温で１０分間インキュベートする。洗浄溶液を廃棄し、ドットブロットをＴＴＢＳ  ２０ｍＬとともに振盪しながら室温で１０分間インキュベートする。洗浄溶液を廃棄し、ドットブロットをＴＢＳ  ２０ｍＬとともに振盪しながら室温で１０分間インキュベートする。
【０４４９】
７）抗体溶液ＩＩ
洗浄緩衝液を廃棄し、ドットブロットを抗体溶液ＩＩとともに室温で１時間インキュベートする。
【０４５０】
８）洗浄
抗体溶液ＩＩを廃棄し、ドットブロットをＴＴＢＳ  ２０ｍＬとともに振盪しながら室温で１０分間インキュベートする。洗浄溶液を廃棄し、ドットブロットをＴＴＢＳ  ２０ｍＬとともに振盪しながら室温で１０分間インキュベートする。洗浄溶液を廃棄し、ドットブロットをＴＢＳ  ２０ｍＬとともに振盪しながら室温で１０分間インキュベートする。
【０４５１】
９）現像
洗浄溶液を廃棄する。ＮＢＴ／ＢＣＩＰ  １錠をＨ２Ｏ  ２０ｍＬに溶かし、ドットブロットをこの溶液とともに５分間インキュベートする。Ｈ２Ｏで十分に洗浄することで現像を停止する。
【０４５２】
１０）濃度計分析
強度の濃度測定分析（バイオラッド（BioRad）濃度計およびソフトウェアパッケージであるクオンティティ・ワン（Quantity one）（バイオラッド））を用いて、量的評価を行った。図２４中の評価では、１００ｐＭｏｌ屈折率密度（refractive density）値を読取値として取った。
【０４５３】
結果は図２４ａおよびｂに示してある。
【０４５４】
ヒトアルツハイマー病患者の血漿が、Ａβ（１２−４２）グロブロマーおよびＡβ（２０−４２）グロブロマーに対して反応性の自己抗体を含み、ヒトアルツハイマー病患者のＣＳＦがＡβ（１２−４２）グロブロマーおよびＡβ（２０−４２）グロブロマーに対して反応性である自己抗体を含むという結論が得られる。
【０４５５】
これらの結果は、グロブロマーに対する抗体の存在を評価することで、体液中のグロブロマー（これ自体では、標的に対するアフィニティが高いために検出が困難である）の存在を調べることが実行可能であることを示している。それはさらに、病態生理学的存在としてのグロブロマーの地位を高めるものである。
【０４５６】
（実施例８）
能動免疫化
説明
Ｔｈｙ１プロモーターの制御下でのロンドン突然変異を有するヒトＡＰＰを有し、過剰発現するＡＰＰトランスジェニックマウス（ＡＰＰ／Ｌｏ；Moechars et al., 1999）の能動免疫化によって、新規対象認識作業における記憶障害が改善した。Ａβ（１−４２）グロブロマーまたはＡβ（１−４２）グロブロマーで免疫化したＡＰＰ／Ｌｏマウスでは、そのマウスが３時間前に遭遇した既知の対象と比較して新たな対象についての調査指数が高くなることを本発明者らは認めたが、Ａβ（１−４２）モノマーで免疫化したマウスでは認めなかった（図２１）。第１の遭遇時に対象調査時間として測定されたマウスの好奇心は群間で変わらなかった。従って、Ａβ（１−４２）グロブロマーおよびＡβ（２０−４２）グロブロマーを用いた能動免疫化によって、対象に対する短期的記憶に選択的改善があった。
【０４５７】
方法
−ＡＰＰトランスジェニックマウスの能動免疫化
本試験では、ＡＰＰ［Ｖ７１７Ｉ］Ｃ５７ＢＩ×ＦＶＢ雌マウス（ｎ＝３６；６週齢）を用いた（Moechars et al., 1999）。マウスはいずれも、実験動物の飼育、繁殖および取り扱いに関するベルギー倫理法に従い、動物飼育施設（the Catholic University Leuven, Campus Gasthuisberg）で飼育および繁殖させた。
【０４５８】
動物は、３週齢でポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって遺伝子型特定し、試験開始時に２回目のＰＣＲによって二重チェックした。全てのマウスを盲検的に無作為化し、年齢を合わせ、無作為に処置に割り当てた。動物を、試験開始前日に処置群ごとに再度ケージに入れて、新たなケージの状況に馴致させた。動物には、濾過済みで無菌（ＵＶ灯）の飲料水および標準的なマウス飼料（Muracon-G, Trouw Nutrition, Gent）を自由に摂取させた。飼料は、十分に換気された貯蔵室で乾燥および低温条件下で保管した。水および飼料の量は１日１回チェックし、必要な場合は補充し、標準飼料は週２回入れ替えた。マウスは、明１４時間／暗１０時間、明期開始午後７時という日夜逆転リズム下に、硬い床とわら屑を敷いた層を有する標準的な金属ケージＲＶＳＴ２型（面積５４０ｃｍ２）中で飼育した。
【０４５９】
マウスに、次の溶液のいずれか：リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ；ｐＨ７．４）、Ａβ（１−４２）（バッケム、Ｈ１３６８）の０．２５％ＮＨ４ＯＨ溶液１００μｇ、Ａβ（１−４２）グロブロマー１００μｇまたはＡβ（１−４２）グロブロマー３０μｇを腹腔内投与した（注射１回当たり２００μＬ；ｎ＝群当たり７から９匹）。初回の注射は５０％（体積基準）完全フロイントアジュバント（Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA、整理番号２６３８１０）を含んだものであり、追加免疫注射は５０％（体積比）不完全フロイントアジュバント（Difco Laboratories, Detroit, Michigan, USA、整理番号２６３９１０）を含んだものであった。化合物の投与は、３ヶ月の間３週間ごとに行った（第０／３／６／９／１２週）。
【０４６０】
−免疫化マウスでの新規対象認識作業
最後の注射後、全てのマウスについて新規対象認識作業を行わせた。使用したプロトコールは、 デバヒターらの報告（Dewachter I. et al., Journal of Neuroscience, 2002, 22(9): 3445-3453）の方法に従った。マウスは、黒色の鉛直壁および透明な床があり、箱の下側に設置されたランプによって薄暗く照明されたプレキシガラス開放箱（５２×５２×４０ｃｍ）に１時間馴致させた。翌日、動物は同じ箱に入れ、１０分間の習得試験を行わせた。この試験中、マウスは対象Ａ（青色ボールまたは赤色立方体、同様の大きさで±４ｃｍ）の存在下にオープン・フィールドに個別に置き、対象Ａを探る期間（時間ＡＡ）および頻度 （頻度ＡＡ）（動物の鼻が＜１ｃｍの距離で対象の方に向き、マウスが対象の方向で活発に臭いをかぐ場合）をコンピュータ化システムによって記録した（エトビジョン（Ethovision）、Noldus information Technology, Wageningen, the Netherlands）。３時間後に行った１０分間の保持試験（第２の試験）中、新規な対象（対象Ｂ、赤色立方体または青色ボール）を、オープンフィールドに慣れた対象（対象Ａ）とともに置いた（それぞれ頻度Ａおよび頻度Ｂならびに時間Ａおよび時間Ｂ）。
【０４６１】
新規対象を探る期間の両方の対象を探る期間に対する比と定義される認識指数（ＲＩ）［時間Ｂ／（時間Ａ＋時間Ｂ）×１００］を用いて、非空間記憶を測定した。習得試験中に対象Ａを探った期間および頻度（時間ＡＡおよび頻度ＡＡ）を用いて、好奇心を測定した。
【０４６２】
−結果
能動免疫化プロセス中、マウスの異なる処置群間の体重増は同じであり、免疫化手順の副作用がないことを示していた。最初の対象遭遇中、全ての群が同じ好奇心を示した。すなわち、時間ＡＡおよび頻度ＡＡにおいて統計的有意差はなかった。第２の遭遇時には、Ａβ（１−４２）グロブロマーおよびＡβ（２０−４２）グロブロマーで免疫化されたマウスは未知対象を有意に長く調べた（すなわち５０％（＝記憶がないための偶然のレベル；Ｐ＜０．０１；スチュデントのｔ検定）を超えるＲＩ）が、Ａβ（１−４２）モノマーまたは媒体で処理したマウスではそれはなかった。さらに、Ａβ（１−４２）グロブロマーおよびＡβ（２０−４２）グロブロマーで免疫化したマウスのＲＩは、Ａβ（１−４２）モノマーまたは媒体で処理したマウスのＲＩより有意に高かった（Ｐ＜０．０１；ＡＮＯＶＡおよびそれに続く事後ホルム−シダックｔ検定）。
【０４６３】
（実施例９）
受動的免疫化
説明
Ｔｈｙ１プロモーターの制御下でのロンドン突然変異を有するヒトＡＰＰを有し、過剰発現するＡＰＰトランスジェニックマウス（ＡＰＰ／Ｌｏ；Moechars et al., 1999）の受動免疫化によって、新規対象認識作業における記憶障害が改善した。ＰＢＳ処置マウスと比較してマウスモノクローナル抗体６Ｇ１および８Ｆ５では、そのマウスが３時間前に遭遇した既知の対象と比較して新たな対象についての調査指数が高くなることを本発明者らは認めた（図２２）。第１の遭遇時に対象調査時間として測定されたマウスの好奇心は群間で変わらなかった。従って、マウスモノクローナル抗体６Ｇ１および８Ｆ５を用いた受動免疫化によって、対象に対する短期的記憶に選択的改善があった。
【０４６４】
方法
マウスおよび飼育条件は、実施例８で用いたプロトコールと同じとした。マウスに、Ａβグロブロマーに対して形成されたモノクローナル抗体６Ｂ１および８Ｆ５  ２５０μｇのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（２５０μＬ）溶液またはＰＢＳ単独（全ての群についてｎ＝８）を２週間にわたり週１回腹腔内投与した（合計で２回の注射）。最後の注射から１日後に、実施例８に記載の対象認識作業を行った。
【０４６５】
結果
第１の対象遭遇時には、全ての群が同じ好奇心を示した。すなわち、頻度ＡＡに統計的有意差はなかった。第２の遭遇時には、マウスモノクローナル抗体６Ｇ１および８Ｆ５で免疫化したマウスは、未知対象を有意に長く調べた（すなわち５０％（＝記憶がないための偶然のレベル；Ｐが少なくとも＜０．０５；スチュデントのｔ検定）を超えるＲＩ）が、ＰＢＳのみを注射したマウスではそれはなかった。
【０４６６】
（実施例１０）
脂肪酸によるＡβ（１−４２）グロブロマー形成の誘発
各種脂肪酸について、それらをイン・ビトロＡβ（１−４２）グロブロマー形成の誘発剤としてＳＤＳに代えて用いることが可能であるか否かを調べた。
【０４６７】
結果を図１４に示してある。これからわかるように、ラウリン酸、オレイン酸およびアラキドン酸も特徴的な３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーを誘発したが、エイコサペンタン酸は部分的に移動したオリゴマーを生じ、リノレン酸、ドコサヘキサン酸およびドコサテトラエン酸は検出限界内で特徴的な３８／４８ｋＤａＡβ二重帯域を生じることはできなかった。
【０４６８】
これらのデータは、ＡＰＰの誤った開裂を生じることでＡβの過剰産生を生じる未だ特性決定されていない因子だけでなく、恐らくはＡβでの配座変化を誘発するか、ないしはグロブロマー形成が起こり得る足場として働くミセルもしくは小胞の形態でのアニオン性表面を提供することによる脂質の直接触媒的影響によっても、イン・ビボのグロブロマー形成が促進されることを示唆している。これは、ある種の脂質代謝障害の痴呆効果におけるグロブロマーの役割ならびに脳脂質代謝に影響する薬剤もしくは組成物のＡＤおよび関連状態に対する有用と思われる効果を示し得ることから、特に興味深いものである。
【０４６９】
（実施例１１）
Ａβ（１−４２）グロブロマーのイン・ビボ結合
ラットでの頭蓋内注射を行って、Ａβ（１−４２）グロブロマーのイン・ビボ投与の実施可能性を調べた。電気生理学的および組織学的試験のため、雄スプレーグ−ドーリーラットを、約８週齢でジャンビエ（Janvier）（フランス）から入手した。全ての動物は標準条件下（１２時間日／夜サイクル、２２℃、湿度５０％）に維持し、飼料および水道水は自由に摂取させ、本発明者らの動物コロニーに到着してから少なくとも１週間後に回復させた。
【０４７０】
ラット（２６０から４３０ｇ）はペントバルビタール（腹腔内投与６０ｍｇ／ｋｇ；ナルコレン（Narcoren））で麻酔し、文献（Paxinos and Watson36）に従って定位固定装置に固定した。心室内投与の場合、ラット１８匹に対して、尾１．０、側部１．５および腹部３．９という組み合わせ（ブレグマへのｍｍ数）を用いて右心室にＡβ（１−４２）グロブロマー０．８ｎｍｏｌの定位微量注射を行った。総量４．３μＬを５分間の間電動式マイクロポンプ（ＷＰＩ、ドイツ）に取り付けた１０μＬハミルトン（Hamilton）注射器によって注入し、カニューレはさらに２分間その箇所に放置した。皮質内注射の場合、ラット８匹に対して、尾２．０、側部２．０および腹部２．０という組み合わせ（ブレグマへのｍｍ数）を用いてＡβ（１−４２）グロブロマー（１μＬ中０．１５ｎｍｏｌ）の定位微量注射を行った。注入液を５分間の間１０μＬハミルトン注射器によって投与し、カニューレはさらに５分間その箇所に放置した。
【０４７１】
動物を回復させ、それから１、４および７日後に屠殺して、免疫組織化学分析および生化学ドットブロット分析によって、心室／注射部位から周囲組織へのＡβ（１−４２）グロブロマーの浸透を調べた。従って、ラットに対してナルコレンで深く麻酔を施した。Ａβ（１−４２）グロブロマーが脳脊髄液（ＣＳＦ）から除去されるか否かを分析するため、一部のラットにおいて、環椎後頭骨膜を露出させ、大槽を１ｍＬ注射器および０．３ｍｍカニューレで遮った後にＣＳＦ数μＬを抜き取った。次に、ラットを経心臓的に１０ｍＭ  ＰＢＳ（ｐＨ７．２）で５分間潅流させ、次に４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）のＰＢＳ溶液を潅流させた。脳を摘出し、３０％ショ糖を含む４％ＰＦＡのＰＢＳ溶液中で終夜後固定し（postfixed）、３０％ショ糖のＰＢＳ溶液に移し入れて凍結保護した。
【０４７２】
Ａβ（１−４２）グロブロマーの染色のため、４０μｍ切片を凍結ミクロトームで切り取り、５％ロバ血清（Serotec）のＴＢＳＴ溶液に２０分間自由に浮遊させてインキュベートした。次に、切片をＡβ（１−４２）グロブロマーに対して特異的であるモノクローナル一次抗体８Ｆ５に、ＴＢＳＴ中１：１０００の希釈率で移して２４時間経過させた。Ｃｙ３標識ロバ抗マウス抗体（Jackson Laboratories）を用いて１時間蛍光標識した。段階間および終了後に、切片をＴＢＳＴで３回５分間にわたり十分に洗浄し、その後にスライドガラス上に乗せ、風乾し、ＤＡＰＩを含むベクタシールド（Vectashield）最高硬度封入剤（Vector Laboratories）でカバーグラスとして細胞核を肉眼観察した。インキュベーションはいずれも室温で行った。一部の切片は、０．０５％チオフラビンＳ（シグマ、ドイツ）の５０％エタノール溶液でも１０分間染色し、次に１００％エタノールで５分間のリンスを２回行ってから、ベクタシールドに包埋した。標識の分析を、共焦点蛍光顕微鏡（Zeiss LSM 510 Meta、ドイツ）下に行った。
【０４７３】
３回目の心室への注射によって、心室壁の細胞へのＡβグロブロマーの急速かつ永続的な結合が生じたが（図１６（ＩＩ）ａ参照）、それらは脳脊髄液からは完全に消失した（ＣＳＦ；データは示していない）。ラットＣＳＦへのイン・ビトロでの各種濃度の投与で用量依存的な回復が生じたことから、注射したＡβ（１−４２）グロブロマーは、ＣＳＦ中の他のタンパク質によってマスクされなかった。結合Ａβグロブロマーは、上衣に留まり、下層の脳組織には検出可能な拡散はなく、心室壁方向での細胞密度は変化しないように見えたことから明らかな細胞傷害性はなかった。脳内注射によっては組織浸透が小さいことも示されており、そこではＡβグロブロマー染色が注射部位近くに限定されており、数日間低下しなかった（図１６（ＩＩ）ｂからｃ参照）。生化学分析により、注射されたＡβ（１−４２）グロブロマーの大部分が、少なくとも７日間海馬になおも存在することが確認された（データは示していない）。対照的に、注射されたＡβ（１−４２）モノマーは相対的に広い面積を染色し、７日後に標識が低下し（図１６（ＩＩ）ｃ）、Ａβ（１−４２）グロブロマーより組織浸透が良好であることが示唆された。
【０４７４】
（実施例１２）
Ａβ（１−４２）グロブロマーの海馬ニューロンへの特異的結合
本発明者らは、初代海馬ニューロンとの相互作用を研究することで、Ａβ（１−４２）グロブロマーの生理的関連性を調べた。
【０４７５】
ラット脳からの海馬細胞（QBM Cell Science, Canada）を、３７℃、５％ＣＯ２でＢ２７を補充したニューロベーサル（Neurobasal）培地（インビトロゲン（Invitrogen）、ドイツ）中のポリ−Ｌ−リジンをコーティングしたカバーグラス（ＢＤバイオサイエンシーズ（BD Biosciences）、ドイツ）上の２４ウェルプレートで培養した。一部の培養物に、有糸分裂阻害薬（ウリジン３５μｇ／ｍＬ、５−フルオロ−２′−デオキシウリジン１５μｇ／ｍＬ）をＤＩＶ６で加えて、グリアを伴う過剰成長を防止した。別段の断りがない限り、海馬細胞はＤＩＶ１３から１４で用いた。Ａβ型を加えた場合、Ａβ型を含む新鮮な３７℃温培地７５０μＬを、合計１ｍＬに代えた。インキュベーションは、３７℃、５％ＣＯ２で１５分間行った。Ａβ−モノマー（０．５ｍｇ／ｍＬ）原液はＨＦＩＰ溶液であり、Ａβ（１−４２）グロブロマーは３５ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４溶液とした。
【０４７６】
細胞を培地１ｍＬで３回リンスし、３．７％緩衝ホルムアルデヒド（Accustain, Sigma、ドイツ）で固定した。非特異的結合部位を１０％正常ヤギ血清のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）とともに室温で９０分間インキュベーションすることでブロックし、細胞内対比染色の場合にはそれに０．１％Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を加えた。次に、一次抗体（抗Ａβ６Ｅ１０（Signet Laboratories、米国）、１：２０００；抗ＧＦＡＰ（Dako Cytomation、ドイツ）、１：２５００；抗ＭＡＰ２（Chemicon International、ドイツ）、１：１０００）および二次抗体（アレクサ（Alexa）488、１：５００；アレクサ６３５、１：５００；Molecular Probes、ドイツ）を、１０％正常ヤギ血清のＰＢＳ溶液（ｐＨ７．４）中にて室温で２時間インキュベートした。各抗体インキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、最終的にプロロング（ProLong）退色防止試薬（Molecular Probes、ドイツ）に入れた。
【０４７７】
Ａβ（１−４２）グロブロマーは、Ａβ（１−４２）を含まない対照や２００ｎＭモノマーＡβ（１−４２）を含む対照とは対照的に、１７ｎＭの濃度（２００ｎＭモノマー濃度と等価）で海馬ニューロンに対して強い結合を示した（図１５ａ参照）。Ａβ（１−４２）のモノマー構造はＨＦＩＰ原液によって確保された。海馬ニューロンがＡβ（１−４２）を結合する能力に対するＨＦＩＰの可能な負の効果は、Ａβ（１−４２）グロブロマーとともに同等容量のＨＦＩＰをインキュベーションすることによって防止され、Ａβ（１−４２）グロブロマー単独の場合と差はなかった。海馬ニューロンは、２ｎＭという低値でＡβ（１−４２）グロブロマーに結合した（データは示さなかった）。Ａβ（１−４２）グロブロマーの神経突起に対する結合は強く分断されており、シナプス終末または樹状突起棘に対する特異的結合を示唆している（図１５ｂ、挿入図参照）。Ａβ（１−４２）グロブロマー結合の培養ニューロン齢への強い依存性が認められた。ＤＩＶ８では、海馬結合はほとんど認められなかったが（約１％）、ＤＩＶ１１およびＤＩＶ１５ではＡβ（１−４２）グロブロマー結合が顕著であった（約９０％）（図１５ｂ参照）。Ａβ（１−４２）グロブロマー結合のその高い特異性は、ニューロンへの制限された結合によってさらに実証されたが、この海馬調製物中のグリアはＡβ（１−４２）グロブロマーに結合しなかった（図１５ｃ参照）。さらに、多様な神経細胞系がＡβ（１−４２）グロブロマー結合に関して陰性であった（データは示していない）。
【０４７８】
（実施例１３）
Ａβ（１−４２）グロブロマーによる長期増強の完全阻害
シナプス機能に対するＡβ（１−４２）グロブロマーの効果を確認するため、本発明者らは、Ａβ（１−４２）グロブロマーとともにまたはそれを用いずに潅流した脳切片のＣＡ１領域からの細胞外電位を記録した。
【０４７９】
切片は、雄スプレーグ−ドーリーラット（７から８週齢）から得た。摘出した脳半球を剃毛し、ビブラトームを用いて切った。切片（４００μＭ）を、インターフェース記録チャンバに直接移し入れ、流量１．８ｍＬ／分の酸素化人工ＣＳＦ（ａＣＳＦ：１１８ｍＭ  ＮａＣｌ、１．２４ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、１０ｍＭグルコース、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２．５ｍＭ  ＣａＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、２５．６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）で３３℃にて連続的に潅流した。得たばかりの切片を少なくとも１時間平衡化させてから、記録を行った。ＣＳＦを満たしたガラス微小電極を用いて、ＣＡ１の放線状層から電場電位を得た（０．８から１．２ＭΩ）。双極タングステン電極によって、シェーファー・コラテラル（Schaffer collateral）を刺激した（０．５ＭΩ、Science Products GmbH、ドイツ）。定電圧二相パルス（０．１ｍｓ／相；範囲１から５Ｖ）を、ｆＥＰＳＰ最大値の３０％を与える強度で毎分１回印加した。同じ強度およびパルス長を用いる２列の１００Ｈｚ（列間間隔１０秒で１秒／列）によってＬＴＰを誘発した。Ａβ群では、強直誘発前８０から１２０分に開始して、実験全体を通じて４２ｎＭ  Ａβ（１−４２）グロブロマーを潅流した。入力／出力関係を測定してから基底線記録を行った（Ａβ（１−４２）グロブロマーのウォッシュ・イン（wash-in）から６４から９４分後）。シグナルはパワー（Power）ＣＥＤ１４０１によってデジタル化し、ソフトウェアのシグナル（Signal）２．１４（Cambridge Electronic Design Ltd., Cambridge）を用いて解析した。統計的比較のため、データはＳＡＳを用いる二元配置反復測定ＡＮＯＶＡによって解析した。
【０４８０】
Ａβ（１−４２）グロブロマー処理切片のＣＡ１樹状突起層から得たフィールドＥＰＳＰは、大きさおよび形状が正常であるように見え（図１７ｂ参照）、興奮性シナプス伝達が影響されていないことを示していた。フィールドＥＰＳＰは、シナプス抑制の欠如も示さず（すなわち、複数集合スパイク）、ＧＡＢＡ作動性伝達が影響を受けていないことを示していた。さらに、Ａβ（１−４２）グロブロマー処理切片と未処理切片の平均入力／出力関係の比較（図１７ｃ参照）で、基本的なシナプス機能がＡβ（１−４２）グロブロマーによって損なわないことが示された。しかしながら、高周波刺激誘発ＬＴＰを調べると、Ａβ（１−４２）グロブロマー処理（４２ｎＭ）切片は完全なブロックを示した（図１７ａ参照）。増強は、テタヌス刺激から３０分以内に基底線レベルまで減衰した。Ａβ（１−４２）グロブロマー群では短期増強が容易に誘発できたが、増強は強直誘発から５分後という早期に有意に障害された（ｐ＜０．０５）。対照的に、対照切片は少なくとも１時間にわたって安定なＬＴＰを示し、全記録時間を通じて少なくとも３０％の増強があった。一部の実験では、記録チャンバの流出部でのＡβ（１−４２）グロブロマー濃度を測定し、５０から７０％のＡβ（１−４２）グロブロマーを検出することができ、それはかなりの量（全量ではないとしても）のＡβ（１−４２）グロブロマーが実験中に切片に到達していたことが示していた。従って、基本的なシナプス伝達には影響を与えないままで、ＬＴＰを特異的に阻害するには、４２ｎＭ未満のＡβ（１−４２）グロブロマーで十分であった。
【０４８１】
（実施例１４）
Ａβ（１−４２）に対する抗体
抗Ａβ（２０−４２）グロブロマーポリクローナル抗体５５９８を免疫化ウサギから形成し、固定化Ａβ（１−４２）グロブロマーに対してアフィニティ精製した。使用した方法は、当業界で実証済みのものである。すなわち、Ａβ（１−４２）合成ペプチド（カタログ番号Ｈ−１３６８、バッケム、スイス）を、約６ｍｇ／ｍＬで１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ＨＦＩＰ）に懸濁させ、３７℃で振盪下に１．５時間にわたってインキュベートすることで完全に溶解させた。スピードバックでの留去によってＨＦＩＰを完全に除去し、Ａβ（１−４２）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に５ｍＭの濃度で再懸濁させ、２０秒間超音波処理した。ＨＦＩＰ前処理Ａβ（１−４２）をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）で希釈して４００μＭとし、１／１０容量の２％ＳＤＳ（Ｈ２Ｏ溶液）を加えた（最終濃度０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））。３７℃で６時間のインキュベーションによって、１６／２０ｋＤａのＡβ（１−４２）グロブロマー中間体が得られた。３倍容量のＨ２Ｏでさらに希釈し、３７℃で１８時間インキュベーションすることで、３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーを形成した。３０００×ｇで２０分間遠心した後、サンプルを限外濾過（３０ｋＤａカットオフ）によって濃縮し、５ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４に対して透析し、１００００×ｇで１０分間遠心し、３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーを含む上清を抜き取った。脂肪酸誘発３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーの場合、ＳＤＳに代えて１／１０容量の０．５％脂肪酸を加えた。架橋の場合には、３８／４８ｋＤａ  Ａβ（１−４２）グロブロマーを処理してから、濃縮および１ｍＭグルタルジアルデヒドによるＲＴで２時間の透析、そして次に室温（ＲＴ）で３０分間のエタノールアミン（５ｍＭ）処理を行った。３８／４８ｋＤａＡβ（１−４２）グロブロマーの制限タンパク分解を、１／５０（ｍｇ／ｍｇ）の個々のプロテアーゼおよび室温で２０時間のインキュベーションを用いて実施した。
【０４８２】
マウスの免疫化によって高い力価となり（１：１００００から１０００００）、強力なＡβ（１−４２）グロブロマー特異的（８Ｆ５）および非特異的モノクローナル抗体（６Ｇ１）が得られた。非特異的６Ｇ１および基準抗体６Ｅ１０とは対照的に、特異的抗体８Ｆ５は自然ＰＡＧＥ−ウェスタンブロットによってのみＡβ（１−４２）グロブロマーを検出したが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥウェスタンブロット分析によっては検出しなかったことで（データは示していない）、核Ａβ（１−４２）グロブロマー構造中でのより複雑な界面活性剤解離可能なサブユニット間エピトープへの結合が示された（図１２ａ参照）。各種のＡβ（１−４２）およびＡβ（１−４０）標準調製物に対するドットブロット分析によって、Ａβ（１−４２）グロブロマーと非グロブロマーＡβ型（標準Ａβ（１−４０／４２）モノマー調製物で認識に有意差が示され、特異的８Ｆ５および５５９８についてはＡβ（１−４２））が凝集したが、アイソフォーム非特異的抗体６Ｇ１および６Ｅ１０の場合には凝集しなかった（図１２ｂ参照）。６Ｇ１および６Ｅ１０ではなく８Ｆ５および５５９８のグロブロマー特異性が、サンドイッチＥＬＩＳＡでのＡβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１−４２）モノマー、Ａβ（１−４０）およびｓＡＰＰα結合の定量によって確認された（図１２ｃ参照）。しかしながら、本発明者らの特異的抗体がＣＳＦサンプル中のＡβモノマーと比較して＜０．５％という低いレベルでＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープを検出しなかったことから、本発明者らの合成標準調製物のＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープによるわずかな交差汚染のために、抗体の選択性が過小評価されたと推定される（図１３中のデータ参照）。合成Ａβ調製物中の交差汚染の程度を、ＥＬＩＳＡ値比から計算した（図１２ｄ参照）。Ａβ（１−４２）ＮＨ４ＯＨ調製物およびランベルトらの報告（Lambert, M. P. et al. Diffusible, non-fibrillar ligands derived from Abeta 1-42 are potent central nervous system neurotoxins. Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 95, 6448-6453 (1998)）に従って製造したＡβオリゴマーにおいて、約５％のＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープおよび９５％のＡβ（１−４２）モノマーエピトープが測定されたが、本発明のＡβ（１−４２）グロブロマー調製物は純度９５％のものであり、モノマーＡβ（１−４２）についての交差汚染シグナルは５％のみであった。Ｖ７１７Ｆ突然変異を有するＡＰＰを発現するＣＨＯ細胞からのならし培地で（ウォルシュらの報告（Walsh, D.M. et al. Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein pqtently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature 416, 535-539 (2002)）による）、Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープレベルは検出限界以下であった。
【０４８３】
（実施例１５）
グロブロマー選択的抗ＡβｍＡｂ８Ｆ５を用いた免疫沈殿後におけるＡＤ脳組織抽出物中の内因性アミロイドβ（１−３８）、（１−４０）および（１−４２）レベル
ヒトＡＤ脳（ブレイン−ネット（Brain-net）、ミュンヘンからのサンプル）１５４ｍｇを、抽出緩衝液１．３９ｍＬで０℃にて懸濁させた。サンプルを、乳棒を２０回押し当てることでガラス坩堝中にて均質化した。均質化組織を１０００００ｇで１時間遠心した。上清をヒトＡＤ脳抽出物として取った。
【０４８４】
材料
塩基性緩衝液：
５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％テルギトール（Tergitol）ＮＰ−４０、０．１％ＳＤＳｐＨ７．６（１０Ｍ  ＨＣｌで調節）
抽出緩衝液：
緩衝液１００ｍＬ
＋Ｈ２Ｏ  １ｍＬに溶かした完全プロテアーゼ阻害薬カクテル（Ｆａ．ロッシュ番号１６９７４９８）１錠
＋使用直前に調製した２５０ｍＭ  ＰＭＳＦ（メタノールに溶かしたもの）２００μＬ。
【０４８５】
抗ＡβｍＡｂｓのＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂへの固定化
ｍＡｂ８Ｆ５：
ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（アマシャム社（Amersham Inc.）番号１７−０４３０−０１）０．４ｇを１ｍＭ  ＨＣｌ水溶液１０ｍＬに加え、室温で３０分間インキュベートした。ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂを１ｍＭ  ＨＣｌ  １０ｍＬで３回洗浄し、最後に１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；５００ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ８．３  １０ｍＬで２回洗浄した。各固定化抗体について、ＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ基質１００μＬを、０．５ｍｇ／ｍＬ抗ＡβｍＡｂ８Ｆ５の１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；５００ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ８．３溶液９５０μＬに加えた。室温で２時間振盪後、サンプルを１００００ｇで５分間遠心した。次に、１００ｍＭエタノールアミン；１００ｍＭ  ＮａＨＣＯ３；５００ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ８．３緩衝液５００μＬをビーズに加え、サンプルを室温で１時間振盪した。
【０４８６】
抗ＡβｍＡｂ８Ｆ５−セファロースサンプルを１００００で５分間遠心し、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４５００μＬで５回洗浄した。保存用に冷凍する前に、アジ化ナトリウムを最終濃度０．０２％まで加えることで、サンプルを安定化させた。
【０４８７】
免疫沈殿
ｍＡｂ８Ｆ５−セファロース：
ヒトＡＤ脳抽出物１５０μＬを、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４０ｍＭ  ＮａＣｌ；０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０；ｐＨ７．４  １５０μＬで希釈した。これらのサンプルを、抗Ａβｍａｂ８Ｆ５−セファロース基質２μＬに加え、室温で１．５時間攪拌した。サンプルを１００００ｇで５分間遠心した。上清を廃棄し、抗ＡβｍＡｂ８Ｆ５−セファロースをＰＢＳ  ５０μＬで２回洗浄し、１分間攪拌し、遠心した（１００００ｇで５分間）。上清を廃棄し、セファロースビーズを２ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４；１４ｍＭ  ＮａＣｌ；ｐＨ７．４  ５０μＬに懸濁させ、次に室温で１分間攪拌し、そして１００００ｇで５分間遠心した。次の段階で、抗ＡβｍＡｂ−セファロースビーズを、５０％ＣＨ３ＣＮ；０．２％ＴＦＡの水溶液１０μＬで処理した。室温で１０分間振盪後、サンプルを１００００ｇで５分間遠心した。上清を回収した。
【０４８８】
ＳＥＬＤＩ−ＭＳを用いたＡβ（１−ｘｘ）の測定：
抗ＡβｍＡｂ８Ｆ５−セファロースＩＰ溶出液２μＬを、Ｈ４タンパク質チップアレイ配置Ａ−ＨＦａ．シフェルゲン（Fa. Ciphergen）部品番号Ｃ５５３−００２８のスポット上にドット形成した。チップを風乾した。その後、３．３３ｍｇ／ｍＬＣＨＣＡの５０％ＣＨ３ＣＮ；０．５％ＴＦＡ水溶液２μＬをスポット上にドット形成した。チップを再度風乾し、ＳＥＬＤＩ質量スペクトル計（シフェルゲン社）で分析した。
【０４８９】
条件：
強度：２００
感度：６
質量範囲：８００から１００００Ｄａ
較正：７Ｆａ．シフェルゲン部品番号Ｃ１００−０００５のオール−イン−ワンペプチド標準混合物。
【図面の簡単な説明】
【０４９０】
【図１】Ａβ処理経路の模式図である。
【図２】イン・ビトロ安定性を比較するための、各種温度での保存後におけるモノマーおよびグロブロマーのウェスタンブロットを示す図である。
【図３】Ａβ（１−４２）グロブロマー、Ａβ（１２−４２）グロブロマーおよびＡβ（２０−４２）グロブロマーで免疫化されたウサギおよびマウスの抗体力価を表す図である。
【図４】ＡＤ脳およびＴＧ２５７６脳におけるＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープの検出結果を示す図である。
【図５】ＣＮＳにおけるＡβ（１−４２）グロブロマーエピトープの検出結果を示す図である。
【図６】Ａβ（１−４２）グロブロマーエピトープの特性決定を行うための、Ａβ（３３−４２）指向ＰＡｂ（シグネット９１３５）の各種Ａβ調製物との反応性を示す図である。
【図７】サンドイッチＥＬＩＳＡでの抗Ａβ（２０−４２）グロブロマー由来抗体５５９８の反応性を示す図である。
【図８】下記のＥＬＩＳＡで測定される、Ａβ（１−４２）グロブロマーおよびＡβ（１−４０）モノマー標準調製物の抗Ａβグロブロマー特異的ＰＡｂ５５９８による前処理の効果を示す図である。
【図９】実施例５に従って得られるＡβ（２０−４２）グロブロマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラムを示す図である。
【図１０】実施例６に従って得られるＡβ（１２−４２）グロブロマーのＳＤＳ−ＰＡＧＥクロマトグラムを示す図である。
【図１１】Ａβ（１−４２）グロブロマーの形成に関するデータをまとめた図である。
【図１２】ドットブロット法およびＥＬＩＳＡ法で高いアフィニティおよび特異性を有するＡβ（１−４２）グロブロマー特異的抗体の反応性を示す図である。
【図１３】Ａβ（１−４２）グロブロマーがアルツハイマー患者およびＡＰＰトランスジェニックマウスの脳に存在することを示す図である。
【図１４】Ａβ（１−４２）グロブロマー形成がある種の脂肪酸によって誘発され得ることを示す図である。
【図１５】Ａβ（１−４２）グロブロマーが培養齢に応じて海馬ニューロンに特異的に結合することを示す図である。
【図１６】図１６（Ｉ）はＡβ（１−４２）グロブロマーが高結合のために限定的な組織浸透を有することを示す図である。図１６（ＩＩ）はＡβ（１−４２）グロブロマーが高結合のために限定的な組織浸透を有することを示す図である。
【図１７】Ａβ（１−４２）グロブロマーがイン・ビトロで長期増強を完全に遮断することを示す図である。
【図１８】Ａβ−ペプチド多量体化の２つの経路機序のモデル案を示す図である。最初の段階は、ＡＰＰのβ−およびγ−セクレターゼ開裂によるＡβ−モノマー形成である。
【図１９】Ａβ（１−４２）グロブロマーの円偏光二色性スペクトラムを示す図である。
【図２０】１００ｐｍｏｌ（行Ａ）、１０ｐｍｏｌ（行Ｂ）および１ｐｍｏｌ（行Ｃ）のＡβ（１−４２）グロブロマー（列１）；０．１％プルロニック（Pluronic）Ｆ５８中のＡβ（１−４２）モノマー（列２）；Ａβ（２０−４２）グロブロマー（列３）；グルタルアルデヒド架橋Ａβ（１−４２）グロブロマー（列４）；ランベルトらの報告（M. P. Lambert et al., J. Neurochem. 79, 595-605 (2001)）に従って４℃または室温または３７℃で製造したＡＤＤＬ（列５）；Ａβ（１２−４２）グロブロマー（列６）；Ａβ（１−４０）モノマー（列７）；０．１％ＮＨ４ＯＨに溶かしたＡβ（１−４２）（列８）；Ａβ（１−４２）フィブリル調製物（列９）；およびシグマ（Sigma）からのＰＢＳ希釈ＡＰＰ（列１０）のＡ）ヒト血漿およびＢ）ＣＳＦとの反応性のドットブロットを示す図である。
【図２１】能動免疫化ＡＰＰ／Ｌｏマウスでの新たな対象認識作業を示す図である。
【図２２】生理食塩水（対照）、抗体８Ｆ５および抗体６Ｇ１で処理したマウスの認識指数の棒グラフである。
【図２３】抗体８Ｆ５によって免疫沈殿されたＡＤ脳抽出物からのＳＥＬＤＩ質量分析スペクトルデータを示す図である。
【図２４】各種アミロイドベータ抗原に向かうヒト血清／血漿由来の自己抗体レベルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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