(57)【要約】軽鎖および重鎖可変領域配列がそれぞれ配列番号1および配列番号2である抗ヒトテネイシンモノクローナル抗体、ヒトテネイシンのA(1-4)-D領域内の抗原性エピトープに結合することが出来るそのタンパク分解断片、ヒトテネイシンのA(1-4)-D領域内の抗原性エピトープに結合することが出来るその組換え誘導体、その接合体およびその類似機能アナログが記載される。
2008506355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
軽鎖および重鎖可変領域配列がそれぞれ配列番号1および配列番号2である、好ましくはマウスの抗ヒトテネイシンモノクローナル抗体、ヒトテネイシンのA(1-4)-D領域内の抗原性エピトープに結合することが出来るそのタンパク分解断片、ヒトテネイシンのA(1-4)-D領域内の抗原性エピトープに結合することが出来るその組換え誘導体、その接合体および類似機能アナログ。
【請求項２】
さらなるマーカーおよび診断薬を含んでいてもよい請求項1の抗体の断片。
【請求項３】
マウス定常領域がそのヒト対応物によって置換されている、請求項1の抗体の組換え誘導体。
【請求項４】
マウス定常領域が生物学的に活性の成分によって置換されている、請求項1の抗体の組換え誘導体。
【請求項５】
マウス定常領域が医薬上活性な成分によって置換されている、請求項1の抗体の組換え誘導体。
【請求項６】
マウス定常領域がアビジンファミリーのメンバーによって置換されている、請求項1の抗体の組換え誘導体。
【請求項７】
生物学的に活性な物質と接合している請求項1の抗体の誘導体。
【請求項８】
請求項1のビオチン化抗体または請求項2のビオチン化断片または請求項4-7のいずれかのビオチン化誘導体。
【請求項９】
請求項1の抗体または請求項2の断片をコードするDNA。
【請求項１０】
請求項9のDNAを含むベクター。
【請求項１１】
請求項10のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１２】
配列番号1および配列番号2のヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質またはその断片。
【請求項１３】
請求項12のタンパク質またはその断片をコードするDNA。
【請求項１４】
請求項1の抗体の特異的CDR(相補性決定領域)および該CDRを含むタンパク質。
【請求項１５】
セントロ・ジ・バイオテクノロジー・アバンザーテ、ラルゴ・ロッサナ・ベンジ・１０、ジェノア、イタリーに2003年11月12日にブダペスト条約にしたがって受託番号 PD03003として寄託された、請求項1の抗体を産生するハイブリドーマ。
【請求項１６】
以下の工程を含む請求項1の抗体の調製方法：
a)動物をヒトテネイシンのA(1-4)-D 断片で免疫化する工程;
b)該動物の体性脾臓細胞を免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞と融合させる工程;
c)モノクローナル抗体を選択する工程。
【請求項１７】
ビオチン化されていてもよい請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片またはその組換え誘導体またはその接合体またはアナログ、またはビオチン化されていてもよい請求項2のその断片、または請求項4-7のいずれかのそのビオチン化誘導体の、テネイシンの発現によって特徴付けられる疾患の治療または診断に有用な医薬製品の調製のための使用。
【請求項１８】
該疾患が腫瘍である請求項17の使用。
【請求項１９】
該腫瘍が神経膠腫、乳癌、肺癌、線維肉腫および扁平上皮癌からなる群から選択される請求項18の使用。
【請求項２０】
ビオチン化されていてもよい請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片またはその組換え誘導体またはその接合体またはアナログ、またはビオチン化されていてもよい請求項2のその断片、または請求項4-7のいずれかのそのビオチン化誘導体の、固形腫瘍の２段階周術期療法に有用な医薬製品の調製のための使用。
【請求項２１】
ビオチン化されていてもよい請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片またはその組換え誘導体またはその接合体またはアナログ、またはビオチン化されていてもよい請求項2のその断片、または請求項4-7のいずれかのそのビオチン化誘導体を、少なくとも１つの医薬上許容される媒体および/または賦形剤との混合物として含む、医薬または診断組成物。
【請求項２２】
以下の5つのバイアルからなる全身性放射免疫療法、特に三段階プレ標的化放射免疫療法のためのキット:ビオチン化されていてもよい請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片またはその組換え誘導体またはその接合体またはアナログ、またはビオチン化されていてもよい請求項2の断片、または請求項4-7のいずれかのビオチン化誘導体を含むバイアル1;アビジンを含むバイアル2;ストレプトアビジンを含むバイアル3;ビオチン化ヒトアルブミンを含むバイアル4;およびビオチン DOTAを含むバイアル5。
【請求項２３】
以下の3つのバイアルからなる局所領域放射免疫療法のためのキット; ビオチン化されていてもよい請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片またはその組換え誘導体またはその接合体またはアナログ、またはビオチン化されていてもよい請求項2のその断片、または請求項4-7のいずれかのビオチン化誘導体を含むバイアル1;アビジンを含むバイアル2;およびビオチン DOTAを含むバイアル3。
【請求項２４】
それぞれバイアル5またはバイアル3中の該ビオチン DOTAが式(I)の化合物である請求項22または23のキット：
【化１】
2008506355.tif 000005
(I)
［式中、
Qは、-(CH2)n-基であり、ここでnは4〜12の整数であり、この場合R'は存在しない、または、
Qは、-(CH2)a-CH(R')b-(CH2)b-からなる群から選択され、ここでaおよびbは独立に0〜nの整数であり、R'は以下に定義する通りである、または、
Qは、シクロヘキシル、フェニル、この場合R'は該シクロヘキシルまたはフェニル環上の置換基である; 
Rは、水素または-Λ、ここで、-Λは式(II)の大環状分子である、
【化２】
2008506355.tif 000006
(II)
ここで、種々のYは、同一であっても異なっていてもよく、水素、直鎖状または分枝状C1-C4アルキル、-(CH2)m-COOHからなる群から選択され、ここでmは、1〜3の整数である、
Xは、水素、または基-CH2-Uであり、ここで、Uは、メチル、エチル、およびp-アミノフェニルからなる群から選択される、または、
Xは、基-(CHW)o-Zであり、ここで、oは1〜5の整数であり、Wは、水素、メチルまたはエチルであり、Zは、O、N-R1およびSから選択される１以上のヘテロ原子を含む5-または6-員複素環基であり、ここで、R1は、水素または直鎖状または分枝状C1-C4 アルキルである;または、Zは、-NH2、-NH-C(=NH)-NH2、または-S-R2からなる群から選択され、ここで、R2は直鎖状または分枝状C1-C4 アルキルである;
pは、2または3の整数である;
R'は、水素、直鎖状または分枝状 C1-C4 アルキル、-(CH2)q-Tからなる群から選択され、ここで、Tは、-S-CH3、-OH、-COOHからなる群から選択され、そして、qは1または2の整数である;
R''は、R'と同義であるが、その上に以下の条件に従う: Rが-Λである場合、R''は水素である; Rが水素である場合、R''は-Λである、あるいは、RおよびR''が、それぞれ、-(CH2)r-Λ(Rについて) および-Λ(R'について)であり、ここでrは4〜12の整数である、ここで、Qは、-(CH2)n-基であり、ここでnは4〜12の整数である］。
【請求項２５】
該バイアル3がアビジンダイマーを含み、ここで、２つのアビジン分子がスベラートにより-NH2基を介して結合している、請求項22-24のいずれかのキット。
【請求項２６】
該バイアル3がアビジンダイマーを含み、ここで、２つのアビジン分子が分子量3,400のポリエチレングリコールによって-COOH基を介して結合している、請求項22-24のいずれかのキット。
【請求項２７】
ビオチン化されていてもよい請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片またはその組換え誘導体またはその接合体またはアナログ、またはビオチン化されていてもよい請求項2のその断片、または請求項4-7のいずれかのそのビオチン化誘導体が、別の抗テネイシン抗体、好ましくは該タンパク質のEGF-様領域を標的化する抗体と組み合わされている、請求項22または23のキット。
【請求項２８】
ビオチン化されていてもよい請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片またはその組換え誘導体またはその接合体またはアナログ、またはビオチン化されていてもよい請求項2のその断片、または請求項4-7のいずれかのそのビオチン化誘導体が、別の腫瘍特異的抗体と組み合わされている、請求項22または23のキット。
【請求項２９】
ビオチン化されていてもよい請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片またはその組換え誘導体またはその接合体またはアナログ、またはビオチン化されていてもよい請求項2のその断片、または請求項4-7のいずれかのそのビオチン化誘導体の、腫瘍免疫局在化方法において有用な組成物の調製のための使用。
【請求項３０】
ビオチン化および/または放射標識されていてもよい請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片またはその組換え誘導体またはその接合体またはアナログ、またはビオチン化されていてもよい請求項2のその断片、または請求項4-7のいずれかのそのビオチン化誘導体を含む、注射に好適な、好ましくはバイアルの形態である、容器。
【請求項３１】
腫瘍に罹患しているかまたは罹患していることが予測されるヒトに対する、ビオチン化されていてもよい請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片またはその組換え誘導体またはその接合体またはアナログ、またはビオチン化されていてもよい請求項2のその断片、または請求項4-7のいずれかのそのビオチン化誘導体の投与、および、該腫瘍の検出を含む、腫瘍イメージング方法。
【請求項３２】
抗体またはそのタンパク分解断片または組換え誘導体または接合体またはアナログが放射標識されている請求項31の方法。
【請求項３３】
請求項1の抗体またはそのタンパク分解断片または組換え誘導体または接合体またはアナログ、または請求項2の断片、または請求項4-7のいずれかの誘導体と、第二のテネイシン特異的抗体とを含む組合せ。
【請求項３４】
循環テネイシンレベル、特にA(1-4)-D 領域を含むアイソフォームのレベルを測定するための請求項33の組合せの使用であって、該第二の抗体が第二の抗原性エピトープに結合する条件下での、サンドイッチ型インビトロELISAアッセイにおける、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗ヒトテネイシンモノクローナル抗体、それを得る方法および材料、テネイシンを発現する腫瘍の診断および治療法における該抗体の使用、および医療分野における使用に好適な該抗体を含む材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
腫瘍治療の特異性はしばしば治療の成功の判定における制限因子となっている。実際、多数の抗癌剤による毒作用の発症およびその低い耐容性はその使用および患者の生活の質を制限している。
【０００３】
毒性の低減は癌細胞のみに対する治療の選択性と直接関連している。モノクローナル抗体は腫瘍に特異的に局在化させるための理想的な手段であり、アビジン/ビオチン増幅システムと組み合わせると、活性分子を腫瘍部位に送達する非常に強力な方法を構成する。
【０００４】
テネイシンは、胚形成の際、および瘢痕形成および腫瘍発達のプロセスの際の成体組織、ならびに新規に形成された血管において発現する細胞外マトリックス分子である。テネイシンは正常成体組織には実質的に存在せず、一方、例えば以下のような多くの固形腫瘍の間質において発現する；神経膠腫(Burdon、et al.、Cancer Res.、43:2796-2805、1983)、乳癌(Chiquet-Ehrismann、et al.、1986)、肺癌(Natali、et al.、Intl. J. Cancer、54:56-68、1989)、線維肉腫および扁平上皮癌(Ramos、D.M. et al.、Intl. J. Cancer、75:680-687、1998)。テネイシンは神経膠腫において発現するが、対応する正常脳組織には発現しない。テネイシンの詳細な議論については、WO 92/04464、Wistar および関連引用文献を参照されたい。
【０００５】
EP 0 496 074に基づくと、G. Paganelli et alは、腫瘍の全身性および局所領域治療のための「三段階プレ標的化」と称される方法を開発しており、その結果は以下に報告されている: Cremonesi、M.、et al.、Eur. J. Nucl. Med.、26(2):110-120、1999; Paganelli、G.、et al.、Eur. J. Nucl. Med.、26(4):348-357、1999; Paganelli、G.、et al.、Cancer Biother. & Radiopharm.、16(3):227-235、2001; Grana、C.、et al.、Br. J. Cancer、86:207-212、2001。
【０００６】
このタイプの癌治療のその他の参考文献はWO 94/04702、およびUS 5578287である。
【０００７】
商標PAGRIT（登録商標）としても知られている三段階プレ標的化治療は、ビオチン化抗-テネイシンモノクローナル抗体、ストレプトアビジンおよび90Y-ビオチンの逐次静脈内投与に基づき、それぞれストレプトアビジンおよび90Y-ビオチンに先だってアビジンおよびビオチン化アルブミンを投与して(「追跡」工程)、抗体およびストレプトアビジンの血中濃度を低減させる。３段階プレ標的化方法の選択性は抗-テネイシンモノクローナル抗体の使用による。細胞表面抗原に向けた標的化と比較して、細胞外マトリックス分子の標的化は、腫瘍細胞自体による抗原発現の調節により影響を受けないという利点をもたらす。プレ標的化治療の用量、投与時間および「追跡」は、最適な腫瘍対非腫瘍の生体内分布比を得るために確立されている。
【０００８】
Paganelli (Paganelli、G.、et al.、Eur. J. Nucl. Med.、26(4):348-357、1999)による研究に供した、神経膠芽腫 (GBM)または未分化星状細胞腫(AA)に罹患している48名の患者において得られた結果は、ストレプトアビジンに対するアレルギー反応の例が多数みられた他は実質的に毒性は無いこと、および治療の予備的有効性を示すものであった。実際、治療の終了の2ヶ月後、25%の患者は腫瘤の低減を示し(完全な応答 = 6%、部分的応答 = 11%、少ない応答 = 8%)、52%の患者は安定に維持され、総応答率は77%であった。平均余命が6ヶ月未満であるかかる患者の多数において、治療に対する応答は１年を超えて持続した。
【０００９】
ビオチン化抗テネイシン抗体の役割は、腫瘍への局在化と、ビオチン化分子を介してアビジンおよび次いで90Y-ビオチンの蓄積を媒介し、放射性同位元素を直接腫瘍内部に向かわせることである。抗テネイシン抗体はすでに以下の特許および特許出願の対象である: US 5,624,659、Duke University; JP 2219590、Rikagaku; WO 92/04464、Wistar;および WO 03/072608、Sigma-Tau。
【００１０】
１つの特定の抗テネイシン抗体が: Siri、A.、et al、Nucl. Acid Res.、19(3):525-531、1991; Balza、E.、et al、FEBS 332:39-43、1993に記載されており;その治療目的での使用が:  Riva、P.、et al.、Acta Oncol. 38(3): 351-9、1999; Riva、P.、et al、 Cancer、80 (12): 2733-42; 1997; Riva、P.、et al,. Int. J. Cancer、5: 7-13、1992に記載されている。
【００１１】
上記研究において該抗体の作成に用いたクローンはBC-2と称される。本出願人は、クローンBC-2は工業的開発には適さないことを示した。というのはクローンBC-2は追加的な(おそらく親ミエローマ株由来の)非機能性軽鎖を産生し、その発現レベルはラージスケールでの産生プロセスの開発の際に増加するため、抗体の工業的規模の精製が妨げられるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
それゆえ医薬用途に要求される純度レベルにて工業的規模にて産生できる抗-テネイシンモノクローナル抗体の必要性が認識されている。
【００１３】
Sigma Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.Aが出願人である以前の特許出願 WO 03/072608には、追加的な非機能性軽鎖を生じない抗テネイシン抗体ST2146の作成が記載されており、これは非機能性軽鎖が混入している抗体 BC-4と共有される抗原性エピトープを認識することが出来る。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の目的である抗体ST2485は、BC-2と部分的に共有されており、それゆえ同じタンパク質領域に位置するエピトープを認識する。この領域は様々な腫瘍組織において高発現している。それゆえ癌診断または標的化に使用される、この領域に特異的な均質なモノクローナル抗体を得ることが重要である。
【００１５】
さらに、本発明は抗体ST2485は抗体ST2146に加えてテネイシンに結合する利点を有し、したがって２つの抗体の併用を伴うプレ標的化方法に有用であることを示した。
【００１６】
発明の概要
このたび上記問題を解決する抗ヒトテネイシンモノクローナル抗体が見いだされた。というのは該抗体は、非機能性軽鎖を有さず、別の抗テネイシン抗体と組み合わせて用いた場合に相加性の利点を提供するためである。この抗体はそれを得る方法およびその治療における使用、特にテネイシンの発現を特徴とする疾患、例えば、腫瘍の治療に有用な産物の調製のための使用と共に本発明の目的である。
【００１７】
本発明は、さらなるマーカーおよび診断薬を含んでいてもよい抗体および抗体断片、該抗体および抗体断片を得る方法、該抗体およびその断片を含む医薬組成物、および、それらを利用する診断および治療方法、ならびに該方法の実施に有用なキットに関する。
【００１８】
本発明はまた、該抗体またはその断片をコードするDNA、かかるDNAを含むベクター、かかるベクターを含む宿主細胞、ヌクレオチド配列、配列番号1および配列番号2によってコードされるタンパク質、該タンパク質および断片をコードするDNA、特異的相補性決定領域(CDR)およびかかるCDRを含むタンパク質にも関する。特に、本発明の目的はまた、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマである。
【００１９】
本発明の目的である抗体は、それぞれ、図17および18に示される、配列番号1および配列番号2である軽鎖および重鎖の可変領域の配列を特徴とする。簡潔に説明すると、本発明の目的である抗体は名称ST2485によって同定される。また、ST2485の断片またはそのキメラまたは組換え誘導体は、本発明の範囲内において製造および使用することができる。本発明の目的はまた、ヒトテネイシンのA1-4-D 領域内の抗原性エピトープに結合することが出来る該抗体のタンパク分解断片である。本発明の記載において、抗体断片の意味するところは、ヒトテネイシン CのA1-4-D 領域内の抗原性エピトープに結合することが出来る断片である。
【００２０】
本発明によると、該抗体またはタンパク分解断片は好ましくはビオチン化されている。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、抗体ST2485を産生するcST2485と称されるハイブリドーマ細胞株である。
【００２２】
該ハイブリドーマ細胞株は、セントロ・ジ・バイオテクノロジー・アバンザーテ・ラルゴ・ロッサナ・ベンジ・１０・ジェノア・イタリー（Centro di Biotecnologie Avanzate、Largo Rossana Benzi 10、Genoa、Italy）に2003年11月12日にブダペスト条約の規定により、受託番号 PD03003として寄託されている。
【００２３】
本発明の目的はまた、ビオチン化されていてもよい抗体ST2485の組換え誘導体である。具体的には、好ましい組換え誘導体としては、マウス定常領域が、そのヒト対応物に置換されているもの(Ferrer、C.、et al.、J. Biotechnol.、52: 51-60、1996)、またはマウス定常領域が、生物学的に活性の成分、例えば、アビジンファミリーのメンバー (Penichet ML.、Manuel、L.、et al.、J.  Immunol.、163: 44214426、1999)、腫瘍に向けられた免疫学的エフェクターの刺激に有用な成長因子(例えば、G-CSF、GM-CSF) に置換されているもの、あるいはマウス定常領域が、医薬上活性な成分、例えば、スーパー抗原、毒素、サイトカインまたは抗癌治療効力の増強に有用なあらゆるその他のタンパク質(Di Massimo、AM、et al.、British J. Cancer、75(6):822-828、1997; Parente D.、et al.、Anticancer Research、17(6A):4073-4074、1997) に置換されているものが挙げられる。かかる誘導体を得る方法は当業者に周知である。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、ビオチン化されていてもよい抗体ST2485の接合化(conjugated)誘導体である。
【００２５】
具体的には、好ましい接合化誘導体は、生物学的に活性の成分が常套システムによって抗体に結合しているものである。生物学的に活性の化合物の例としては、アビジンファミリーのメンバー、腫瘍に向けられた免疫学的エフェクターの刺激に有用な成長因子(例えば、G-CSF、GM-CSF)、またはマウス定常領域が、医薬上活性な成分、例えば、スーパー抗原、毒素、サイトカインまたは抗癌治療効力の増強に有用なあらゆるその他のタンパク質、抗癌剤、および放射性同位元素に置換されたものが挙げられる。
【００２６】
本発明のさらなる目的は該抗体またはその誘導体の、商標 PAGRIT（登録商標）としても知られている三段階プレ標的化と称される、テネイシンを発現する癌に罹患している対象への好ましくはビオチン化されている抗体ST2485またはそのタンパク分解断片の投与を含む方法によって好ましくは実施される癌放射免疫療法のための方法に有用な医薬製品の調製のための使用である。
【００２７】
本発明の目的である抗体およびその接合体の組換え誘導体は、癌治療に有利に用いることが出来る。それゆえ、抗体およびその断片または誘導体の、テネイシンを発現する腫瘍の治療用医薬の調製における使用は、本発明のさらなる目的を構成する。
【００２８】
放射免疫療法の実施のために、一方は全身用であり他方は局所用である２つの治療用キットが記載される。これらのキットは商標 PAGRIT（登録商標）によっても知られている。全身用キットは以下を含む5つのバイアルからなる：本発明によるビオチン化抗体またはその断片または誘導体を含むバイアル1;アビジンを含むバイアル2;ストレプトアビジンを含むバイアル3;ビオチン化ヒトアルブミンを含むバイアル4;およびビオチンDOTA (即ちWO 02/066075に記載のビオチン誘導体)を含むバイアル5。局所用キットは全身用キットのバイアル1、2および5に対応する3つのバイアルからなる。バイアルは治療すべき対象、好ましくはヒト対象における注射に好適なように調製される。放射免疫療法の実施のために、本発明の目的である試薬を単独でまたはPAGRIT（登録商標）キットのその他の成分と組み合わせて用いた、腫瘤の外科的除去を経ている患者の手術中治療に基づくIART (Intraoperative Avidination for Radionuclide Treament)と称される方法が記載される。
【００２９】
特定の容器、好ましくは、抗体またはその断片をビオチン化形態にて含む注射に好適なバイアルの形態の容器は本発明のさらなる目的を構成する。
【００３０】
本発明の１つの態様によると、治療用キットにおいて、ビオチン化抗体はその他の抗テネイシン抗体、好ましくは該タンパク質のEGF-様領域に対する抗体と組み合わされる。あるいは、ビオチン化抗体は腫瘍に特異的なその他の抗体と結合させてもよい。このタイプの方法の一般的説明は、EP 0 496 074、European Journal of Nuclear Medicine Vol.26、No4; April、1999;348-357、US 5,968,405に記載されている。
【００３１】
本発明のさらなる目的は、腫瘍におけるインビボ免疫局在決定による後で行う診断目的(「イメージング」)のために画像を取得するためのモノクローナル抗体ST2485の使用である。
【００３２】
本発明のさらなる目的は、テネイシンの血中濃度を測定するための診断キットの生産のための試験において第二の抗テネイシン抗体と組み合わされたモノクローナル抗体ST2485の使用である。
【００３３】
これらおよびその他の本発明の目的は、実施例および図面も参照して以下に詳細に説明する。
【００３４】
図面の簡単な説明
図1:ヒトテネイシン CおよびBC-2-様抗体の作成に用いた戦略の略図。
【００３５】
図2:還元および非還元条件下における抗体ST2485のSDS-PAGE (a、b)およびウェスタンブロット(c、d) 分析。還元条件下において、抗体の軽鎖のレベルにてダブルバンドが観察される(b、d)。
【００３６】
図3: 酵素 PNGaseF (Flavobacterium由来ペプチド-N-グリコシダーゼ)での消化による脱グリコシル化に供された抗体ST 2485のSDS-PAGE 分析:高分子量軽鎖バンドの消失が観察される。 
【００３７】
図4: 抗体ST2485およびBC-2のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィープロファイル。
【００３８】
図5:ウェスタンブロット分析によるヒトテネイシンおよびTn (A(1-4)-D) 断片に対するST2485の結合特異性。
【００３９】
図6:テネイシン C (a)またはTn (A(1-4)-D) 断片 (b)に対する結合についてのST2485とBC-2との間の競合ELISA。
【００４０】
図7:テネイシン C (a)およびTn (A(1-4)-D) 断片 (b)に対するBC-2と比較したST2485の免疫反応性。
【００４１】
図8:テネイシン C (a)およびTn (A(1-4)-D) 断片 (b)に対するビオチン化 ST2485およびBC-2の免疫反応性。
【００４２】
図9: LMM3 腫瘍 (マウス乳癌)および正常マウス腸において発現するマウステネイシンとの抗体ST2485の交差反応性。
【００４３】
図10: ヌードマウスにおけるST2485 生体内分布研究に採用したプロトコール。
【００４４】
図11および11a: BC-2と比較した様々な投与用量でのST2485の生体内分布。投与したすべての用量において、腫瘍におけるST2485の蓄積は少なくともBC-2の２倍である。
【００４５】
図12および12a: BC-2と比較したST2485の腫瘍対非腫瘍比。これらの比は投与したすべての用量において抗体ST2485の方が高い。
【００４６】
図13: ELISA試験による抗テネイシン抗体ST2485およびST2146のインビトロ干渉 (a)および相加性試験 (b)。
【００４７】
図14および14a: BiaCore 分析による抗体ST2485およびST2146のインビトロ相加性試験。
【００４８】
図15: 抗体ST2485およびST2146のインビボ相加性研究に採用したスキーム。
【００４９】
図16:腫瘍1g当たりに局在している抗体のngにて表した、抗体ST2485およびST2146のインビボ相加性。
【００５０】
図17: 配列番号1、ST2485軽鎖可変領域(VL)の配列。コードされるアミノ酸配列は配列番号3に示す。
【００５１】
図18: 配列番号2、ST2485重鎖可変領域(VH)の配列。コードされるアミノ酸配列は配列番号4に示す。
【００５２】
発明の詳細な説明
本発明者らは、ハイブリドーマ細胞株 cST2485から産生されるST2485と称される新規抗ヒトテネイシン抗体を調製し、その軽鎖および重鎖可変領域配列はそれぞれ配列番号1および配列番号2である。該抗体はヒトテネイシンのA(1-4)-D領域内の抗原性エピトープに結合することが出来る。
【００５３】
本発明による抗体のタンパク分解断片はヒトテネイシンのA(1-4)-D領域内の抗原性エピトープに結合することが出来る。
【００５４】
本発明による抗体の組換え誘導体は、当業者に周知の常套方法にしたがって得られる。好ましい組換え誘導体は、マウス定常領域が、そのヒト対応物、または生物学的にまたは医薬上活性な成分、またはアビジンファミリーのメンバーによって置換されているものである。
【００５５】
本発明によると、接合化誘導体は当該技術分野において周知の常套方法により得られる。好ましい接合化誘導体は生物学的に活性な部分が抗体に結合しているものである。生物学的に活性な部分の例としては、アビジンファミリーのメンバー、腫瘍に向けられた免疫学的エフェクターの刺激に有用な成長因子(例えば、G-CSF、GM-CSF)、薬理学的に活性な部分、例えば、毒素、スーパー抗原、サイトカインまたは治療上の抗癌作用の増強に有用なその他のあらゆるタンパク質、抗癌剤、および放射性同位元素が挙げられる。
【００５６】
組換えおよび接合化誘導体の調製に関するさらなる情報については、WO 03/072608を参照されたい。
【００５７】
本発明によると、モノクローナル抗体の組換えまたは接合化誘導体はまた、「誘導体」とも称される。
【００５８】
本発明の１つの好ましい態様において、抗体、その断片および誘導体はビオチン化されていてもよい。
【００５９】
本発明による抗体、その断片および誘導体はまた、有利なことにさらなるマーカーおよび診断薬を含んでいてもよい。
【００６０】
本発明はまた、上記のモノクローナル抗体またはその断片をコードするDNAも含む。本発明はまた、該DNAを含むベクター、および該ベクターを含む宿主細胞も含む。
【００６１】
ベクターおよび宿主細胞はこの分野に属する周知の事実の範囲内である。
【００６２】
本発明はまた、ヌクレオチド配列、配列番号1および配列番号2によってコードされるタンパク質またはその断片、およびそれをコードするDNAも含む。
【００６３】
本発明はまた、上記抗体の特異的CDR(相補性決定領域) および該CDRを含むタンパク質も含む。
【００６４】
本発明による抗体を調製する方法は、以下の段階からなる:
a)動物、好ましくはマウスの、ヒトテネイシンのA(1-4)-D 断片による免疫化;
b)該動物の体性脾臓細胞と免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞との融合;
c)モノクローナル抗体の選択。
【００６５】
モノクローナル抗体ST2485は上記のハイブリドーマ細胞株 cST2485により産生される。
【００６６】
本発明によると、ビオチン化されていてもよい、抗体またはその断片またはその誘導体は、テネイシンの発現を特徴とする疾患の治療および診断に有用な医薬製品の調製に用いられる。具体的には、該疾患は腫瘍であり、より具体的には、神経膠腫、乳癌、肺癌、線維肉腫および扁平上皮癌が挙げられる。
【００６７】
一つの好ましい側面において、上記医薬製品は国際特許出願WO 03/07268に記載の固形腫瘍の２段階周術期療法において用いられる。このタイプの療法において、ビオチン化抗体、次いでアビジンが投与され、実際の次に投与する抗癌剤のための「人工受容体」を構築する。この場合、抗癌剤はビオチンによって送達され、ビオチンは抗癌剤との複合体を形成するのに好適な、以下ビオチン化合物と称する化合物中に含まれ、術後期に全身投与される。ビオチンは、実際、アビジンが存在する場所にのみ局在し、この場合には、それは手術の間に数時間(例えば、4〜72時間)早く外科医によって導入されているために、治療についての興味がある領域にアビジンが存在することを確信することが出来る。これは、原発腫瘍の除去とアジュバント療法の間の経過時間を劇的に短縮する点で有利である。
【００６８】
本発明の工業的側面に関して、本明細書に記載される抗体は、医薬分野における慣行にしたがって、医薬組成物または治療または診断キットに好適に製剤される。
【００６９】
医薬組成物およびキットは、全く当該技術分野において常套のタイプのものであり、周知の事実に基づくのみで当業者によって調製できる。医薬組成物の例は、本発明において引用されている文献において提供されている。キットについても同様である。特に好ましいのは、Paganelli et alによる、そしてEP 0 496 074、WO 02/066075、WO 03/072608、およびWO 03/075960における上記研究において記載されている腫瘍放射免疫療法用のキットである。放射免疫療法キットの特定の使用は、WO 03/069632に記載の装置によって実行することができる。
【００７０】
少なくとも１つの医薬上許容される賦形剤または媒体との混合物中に、ビオチン化されていてもよい抗体またはその誘導体または断片を含む医薬組成物も本発明の範囲に含まれる。
【００７１】
本発明の特定の態様において、キットは全身性放射免疫療法、特に三段階プレ標的化放射免疫療法のために提供され、5つのバイアルを含み、バイアル1はビオチン化されていてもよい抗体またはその断片または組換え誘導体またはその接合体またはアナログを含み; バイアル2はアビジンを含み;バイアル3はストレプトアビジンを含み;バイアル4はビオチン化ヒトアルブミンを含み;そしてバイアル5はビオチン DOTAを含む。
【００７２】
本発明の別の態様において、キットは局所領域放射免疫療法のためのものであり、全身用キットのバイアル1、2および5と同じである3つのバイアルを含む。
【００７３】
特に好ましい態様において、ビオチン DOTAを含むバイアルにおける、該ビオチン DOTAは式(I)の化合物である。
【化１】
2008506355.tif 000003
(I)
［式中、
Qは、-(CH2)n-基、ここで、nは4〜12の整数であり、この場合、R'は存在しない、または、
Qは、-(CH2)a-CH(R')b-(CH2)b-からなる群から選択され、ここで、aおよびbは独立に0〜nの整数であり、R'は以下に定義する通りである、または、
Qは、シクロヘキシル、フェニルであり、この場合、R'はシクロヘキシルまたはフェニル環上の置換基である; 
Rは、水素または-Λ、ここで-Λは式(II)の大環状分子、
【化２】
2008506355.tif 000004
(II)
ここで、様々なYは、同一であっても異なっていてもよく、水素、直鎖状または分枝状C1-C4アルキル、-(CH2)m-COOHからなる群から選択され、ここでmは1〜3の整数である、
Xは、水素、または基-CH2-U、ここでUは、メチル、エチル、およびp-アミノフェニルからなる群から選択され、または、
Xは、基-(CHW)o-Zであり、ここでoは1〜5の整数であり、Wは、水素、メチルまたはエチル、Zは、O、N-R1およびSから選択される１以上のヘテロ原子を含む5-または6-員複素環基であり、ここで、R1は水素または直鎖状または分枝状C1-C4 アルキルである;またはZは、-NH2、-NH-C(=NH)-NH2、または-S-R2からなる群から選択され、ここでR2は直鎖状または分枝状C1-C4 アルキルである;
pは2または3の整数である;
R'は、水素、直鎖状または分枝状C1-C4 アルキル、-(CH2)q-Tからなる群から選択され、ここで、Tは、-S-CH3、-OH、-COOHからなる群から選択され、そして、qは1または2の整数である;
R''はR'と同義であるが、その上に以下の条件に従う: Rが-Λの場合、R''は水素である; Rが水素の場合、R''は-Λである、あるいはRおよびR''は、それぞれ、(Rについて)-(CH2)r-Λおよび(R'について)-Λであり、ここでrは4〜12の整数である、ここで、Qは、-(CH2)n- 基であり、ここでnは4〜12の整数である］。
【００７４】
これらの化合物はWO 02/066075に記載されている。
【００７５】
特に好ましい態様において、アビジンを含むバイアルにおいて、アビジンは２分子のアビジンがスベラートにより-NH2 基を介して結合しているアビジンダイマーであるか、または、２分子のアビジンがWO 03/075960に記載のように分子量3,400のポリエチレングリコールにより-COOH基を介して結合しているアビジンダイマーである。
【００７６】
本発明によるキットにおいて、ビオチン化されていてもよい抗体、そのタンパク分解断片、その誘導体は、好ましくはタンパク質のEGF-様領域を標的化するその他の抗テネイシン抗体との組合せにおいて存在してもよいし、その他の腫瘍特異的抗体との組合せにおいて存在してもよい。
【００７７】
本発明のすべての側面は、テネイシンを発現する腫瘍の療法への適用に加えて、腫瘍の診断、特に腫瘍免疫局在化方法、例えば、イメージングにも適用される。
【００７８】
本発明のさらなる目的は、好ましくは注射に好適なバイアルの形態であって、ビオチン化および/または放射標識されていてもよい、抗体またはそのタンパク分解断片またはその誘導体を含む容器である。
【００７９】
本発明の別の側面において、抗体またはその断片、組換え誘導体、またはアナログは、循環テネイシンレベル、特にA(1-4)-D 領域を含むアイソフォームのレベルを測定する目的で、第二の抗体がテネイシンの第二の抗原性エピトープに結合する条件下で、サンドイッチ型インビトロ ELISAアッセイにおいて、第二のテネイシン特異的抗体と組み合わせて用いられる。
【００８０】
以下の実施例により本発明をさらに説明する。
実施例 1
BC-2 特異性を有するが非機能性軽鎖を産生しない新規ハイブリドーマを作成する目的で、Balb/cマウスを、BC-2によって認識されるエピトープを含むヒトテネイシンのA(1-4)-D 断片で免疫した(Siri、A.、et al.、Nucl. Acid Res.、19(3):525-531、1991; Balza、E.、et al.、FEBS、332:39-43、1993)。ヒトテネイシンCおよびBC-2-様抗体の作成に用いた戦略の略図を図1に示す。標準的方法にしたがって、Tn (A(1-4)-D) 断片で免疫したマウスの脾臓細胞を、免疫グロブリンを産生しないミエローマ細胞Sp2/0-Ag14と融合し(Cianfriglia、M.、et al.、Methods Enzymol.、121:193-210、1986)、得られたハイブリドーマ集団をSK-Mel 28 ヒトメラノーマ細胞(ICLC HTL99010)からの精製テネイシンに対するELISA試験によるスクリーニングに供した。抗テネイシン抗体を分泌するハイブリドーマをFCSを含有する増殖培地における限界希釈によって２回、そして動物起源のタンパク質非含有培地(Animal Derived Component Free Medium HyClone、HyQR Perbio)において２回クローニングした。
【００８１】
ST2485標準物質の産生は、2-リットルのバイオリアクター中でcST2485 ハイブリドーマ細胞を培養することにより達成した; cST2485 Post Production Cell Bank (PPCB)の２回連続の限界希釈サブクローニングにより、サブクローン cST2485/A3e/A12fが選択され、Master Cell Bank (MCB)およびWorking Cell Bank (WCB)の生成に用いた。
【００８２】
ST2485はIgG1/k アイソタイプのマウス免疫グロブリンである。
【００８３】
図2は還元および非還元条件での抗体ST2485のSDS-PAGE (a、b)およびウェスタンブロット(c、d)分析を示す。還元条件(b、d)において、抗体の軽鎖のレベルにダブルバンドが観察される;ウェスタンブロット分析はこの２本のバンドが免疫グロブリンの軽鎖として免疫反応性であることを示す。図3に示す、抗体ST2485のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー分析は、わずかに非対称的なピークにより抗体が軽度に不均質なことを確認する。一方、同じ分析において、抗体BC-2は顕著に不均質なプロファイルを示し、ここで３本のピークが識別可能であり、そのなかでピーク1のみが完全に機能的な均質な抗体に対応する。
【００８４】
抗体ST 2485の不均質性を規定するために、抗体ST 2485のサンプルを酵素 PNGaseF (フラボバクテリウム属由来ペプチド-N-グリコシダーゼ)によるN-グリコシド残基の消化に供した。酵素消化は製造業者に指示された条件でProzyme 脱グリコシル化キット (カタログ番号GE51001)を用いて行った: およそ 8μgのST2485および5 mUの酵素を一晩37℃で10μlの反応混合物中で反応させた。消化済または未消化の抗体ST2485を還元条件で12% ポリアクリルアミドゲルで泳動した。ゲルをクーマシーブリリアントブルーで染色した。
【００８５】
図4に示す還元条件でのSDS-PAGE 分析によって示されるように、消化により高分子量軽鎖バンドが消失した。この知見は抗体ST2485の２本の軽鎖バンドはそのグリコシル化 (高分子量)および非グリコシル化(低分子量) バリアントに対応することを示す。潜在的 N-グリコシル化部位の存在は、免疫グロブリンcDNA配列データによっても確認された(図17)。
【００８６】
カッパ軽鎖の可変領域をM. Sassano et al. Nucl. Ac. Res. (1994) 22、1768-1769に記載のように、抗体の定常領域を認識する以下のプライマー対を用いて環状 cDNAから増幅した(5' GGGAAGATGGATACA-GTTGGTG (配列番号5)、5' CAAGAGCTTCAACAGGAATGAG (配列番号6) )。
【００８７】
図5に示すウェスタンブロット分析により示されるように、テネイシンA(1-4)-D 領域に対するST2485の結合は特異的である。該抗体はヒトテネイシンおよびA(1-4)-D 断片に結合したが、BC-4 抗体によって認識されるエピトープを含む同タンパク質のEGF様断片には結合しなかった。
【００８８】
図6に示す２つの抗体、抗体ST2485およびBC-2抗体の間の競合ELISAアッセイによって示されるように、ST2485はヒトテネイシンに、特有のエピトープにおいて、または、BC-2と部分的に共有されたエピトープにおいて結合する。ビオチン化抗体BC-2を予備的実験にて確立された濃度にて、漸増濃度の非ビオチン化 BC-2 (曲線1)またはST2485 (曲線2)とともに、抗原テネイシンC (a)またはTn A(1-4)-D 断片(b)で感作されたプレート上に分注した。ビオチン化抗体の結合はHRP-ストレプトアビジンおよび関連する発色基質TMBの添加の後に測定する。抗体ST2485は、BC-2のテネイシンC またはTn A(1-4)-D 断片への結合の40%の阻害をもたらした。
【００８９】
図7に示すように、ST2485の免疫反応性をテネイシンCおよびTn A(1-4)-D 断片に対するELISAアッセイによってBC-2との比較において評価した。抗体ST2485およびBC-2および正常マウス免疫グロブリン(nMIgG)を漸増濃度にてテネイシンC(a)またはTn A(1-4)-D 断片(b) で感作されたプレート上に分注した;アルカリホスファターゼで標識した二次抗マウス抗体および関連発色基質(pNPP)の添加により抗体の用量応答曲線を決定することが出来た。OD 1.0を得るために必要なST2485の量は、全テネイシン(a)に対するBC-2の量のおよそ13分の1であり、Tn (A1-4-D) 断片(b) に対するBC-2の量のおよそ10分の1である。
【００９０】
BIAcore 分析によってテネイシンCおよびTn (A1-4-D) 断片の両方に対する抗体ST2485の親和性を評価した。テネイシンCに対するST2485のKD1は9.77 x 10-10 M (ka1 = 6.02 x 105; kd1 = 5.88 x 10-4)であり、BC-2のKD1は2.54 x 10-7 M (ka1 = 9.85 x 103; kd1 = 2.5 x 10-3)である。Tn (A1-4-D) 断片に対するST2485のKD1は9.72 x 10-10 M (ka1 = 3.28 x 105; kd1 = 3.19 x 10-4)であり、BC-2のKD1は7.39 x 10-8 M (ka1 = 2.68 x 104; kd1 = 1.93 x 10-3)である。
【００９１】
ビオチン化の後の免疫反応性の維持はプレ標的化において使用される抗体の基本的な要求条件であるため、ビオチン化 ST2485 (8.3 ビオチン/分子)の挙動をビオチン化BC-2 (7.6 ビオチン/分子)と比較してELISAおよびBIAcore アッセイによって評価した。図8に関して、ビオチン化および非ビオチン化抗体ST2485およびBC-2ならびに正常マウス免疫グロブリン(nMIgG)を漸増濃度にてテネイシンC (a)またはTn A(1-4)-D 断片 (b)で感作されたプレート上に分注した;アルカリホスファターゼで標識した二次抗-マウス抗体および関連発色基質 (pNPP)の添加により、非ビオチン化抗体と比較しての各ビオチン化抗体の用量応答曲線の判定(残余の免疫反応性)が可能となった。テネイシンCに対するビオチン化 ST2485およびBC-2の残余の免疫反応性はそれぞれ76%および88%であった。Tn A(1-4)-D 断片に対する、ST2485およびBC-2の残余の免疫反応性はそれぞれ73%および83%であった。
【００９２】
テネイシン全体に対するビオチン化抗体のBIAcore 分析は、ビオチン化 ST2485について、KD1 親和性 = 2.88 x 10-9 M (ka1 = 2.8 x 105; kd1 = 8.07x10-4)およびビオチン化 BC-2について、KD1 親和性 = 3.71 x 10-7 M (ka1 = 6.0 x 103; kd1 = 2.23 x 10-3)を示した。したがってビオチン化 ST2485は良好な免疫反応性および親和性特徴を維持しており、ビオチン化 BC-2と比較しておよそ100倍のテネイシンに対する親和性を保持していた。
【００９３】
様々なヒト腫瘍(乳房、肺、胃、大腸)に対する免疫組織化学研究によって、ST2485の局在が細胞外マトリックスのレベルであることが示され、BC-2についての報告と類似していた(Natali、PG、et al.、Int. J. Cancer、47: 811-16、1991)。これらの研究はまた、図9において見られるように、正常マウス組織において発現しているものを含むマウステネイシンとの交差反応性を、ST2485が有する能力を示した。ホルマリン中に固定されたLMM3 腫瘍 (マウス乳癌)および正常マウス腸の切片を10 μg/mlのST2485または正常マウス IgG1 抗体 (対照)とともにインキュベートした。ビオチン化二次抗-マウス抗体およびアビジン-ビオチン-ペルオキシダーゼ複合体 (Vectastain Elite ABC キット)とのインキュベーションの後、テネイシンとの結合が、発色基質 DAB (Vector)の添加により検出された。対照はMayerのヘマトキシリンを用いて行った。LMM3およびマウス腸切片はST2485について陽性であるが、対照抗体については陽性ではない。抗体BC-2はパラフィン包埋された固定組織切片を認識することができないため、BC-2と比較してのこれらの研究は行うことが出来なかった。正常組織により発現しているものを含む、マウステネイシンを認識するST2485の能力により、以下に記載するマウスモデルにおける抗体生体内分布研究において得られた結果の重要性が大きなものとなる。
【００９４】
抗体が腫瘤に局在する能力を評価するために、ビオチン化 125I-標識化ST2485およびBC-2の生体内分布研究を行った。これらの研究は図10に模式的に示すプロトコールにしたがって、テネイシンを発現するヒト腫瘍を移植されたヌードマウスにおいて行った。
【００９５】
動物の皮下に0.1 mlの滅菌塩類溶液中の4 x 106のヒト大腸癌HT-29細胞を接種した。15日後、腫瘍の大きさがおよそ200 mgに達すると、５匹の動物の群に125I-BC2、125I-ST2485、または正常 マウス125I-免疫グロブリン(nMIg)を静脈内投与し、これら抗体はいずれもビオチン化されており(7-9 ビオチン/mol)、５種類の用量で投与した:100μlの滅菌PBS中0.2-0.5-1-2-5 μg/マウス。抗体の投与の５日後、動物を屠殺し、血液、脾臓、腎臓、肝臓および腫瘍のサンプルを採取して、放射能の存在について調べた。屠殺の24時間前に動物に、100μlの滅菌PBS中のアビジンを、抗体の100倍の用量にて静脈内投与した(追跡)。
【００９６】
図11および11aに示す結果は、BC-2およびST2485はともに、用量にかかわりなく腫瘍に特異的に局在することを示す(抗体の量は組織1グラム当たりに注入した用量のパーセンテージとして表す: %ID/gr)。さらに、アッセイしたすべての用量においてST2485はBC-2と比較して腫瘍により多く局在化しており、常により高い腫瘍対非腫瘍比を維持していた(図12および12a)。特に、1μg/マウスの用量での腫瘍におけるST2485の蓄積は注入用量の16%であり、一方BC-2の蓄積はアッセイしたいずれの用量においても5%を上回ることはなかった。1μg/マウスの用量において、ST2485についての腫瘍:血液比は20 (至適用量)を超え、一方抗体BC-2についてはこの比はアッセイしたいずれの用量においても6を上回ることはなかった。その他の器官において、1μg/マウスの用量でのST2485の腫瘍対非腫瘍比は、それぞれ脾臓、腎臓および肝臓について9、26、および43であった。一方、BC-2については、これらの比はアッセイしたいずれの用量においても常に7を下回った。腫瘍対非腫瘍比を図12および12aに示す。
【００９７】
ST2416はタンパク質のEGF-様領域に局在するエピトープに対して作成されたものであるので(De Santis、R.、et al.、Br. J. Cancer、88: 996-1003、2003、WO 03/072608)、PAGRIT（登録商標）およびIART法における抗テネイシン抗体ST2485およびST2146の併用の可能性を評価するために、インビトロおよびインビボ相加性実験をこれら２つの抗体について行った。図13は、テネイシンCで感作されたプレートにて行われた２つのELISA試験において、抗体ST2485およびST2146の間でエピトープ干渉が無いこと(13a)およびそれらの抗原に対する結合の相加性がみられること(13b)を示す。干渉を評価するために、(a) 様々な濃度のビオチン化抗体ST2485を、飽和濃度のST2146の非存在下(1)および存在下(2)においてテネイシンCで感作されたマイクロプレートに分配した:重ね合わさった曲線1および2は、２つの抗体の間のエピトープ干渉の非存在を示す。というのは、ビオチン化 ST2485のテネイシンに対する結合は、ST2146の存在によって影響を受けていないからである(逆もまた同じ;データは示さず)。曲線3は、飽和非ビオチン化ST2485 (対照)の存在下でビオチン化 ST2485を播いた場合に得られたシグナルを示す。
【００９８】
図13bは、テネイシンCで感作されたマイクロプレートにおいて、単独または共に、飽和用量にてビオチン化抗体ST2485およびST2146が分配された、相加性試験を示す:２つの抗体の混合物はシグナルの和と同一のシグナルを生じ、したがって、これら２つの抗体の結合は相加的であることが示された。
【００９９】
これら２つの抗体のインビトロ相加性はまた、図14および14aに示すようにBIACore 分析を用いてアッセイした。テネイシンを記載された方法にしたがって(De Santis R.; et al.; Br. J. Cancer、88: 996-1003、2003)、チップ(CM5 センサーチップ、Biosense)に固定化した。２つの第一の抗体の連続注射を飽和濃度(10μM)で投与し(aにおいてST2485、cにおいてST2146)、次いで第二の抗テネイシン抗体を注射した(aにおいてST2146、cにおいてST2485)。センサーグラム、a)およびc)は、これら２つの抗体が、各単一の抗体によって生じる共鳴シグナルにおける増加によって示されるように、対応するエピトープに相加的にそれぞれに結合することが出来ることを示す。センサーグラムb)およびd)は、それぞれ、アイソタイプ一致(isotypical)対照抗体、mIgG2bおよびmIgG1を後で投与した、ST2485およびST2146の注射を示す。
【０１００】
２つの抗体ST2485およびST2146の相加性研究を以前に記載された動物モデルにおいてインビボでも行った。研究スキームを図15に示し、腫瘍1g当たりの抗体ngとして表した、得られた結果を図16に示す。データは、動物モデルにおいても２つの抗体が相加性を示すことを確認する。２つの標識化抗体の混合物は、実際、理論値(２つの個々の標識化抗体の数学的和)の93%に達する腫瘍における蓄積を示した。対照動物の群を、干渉を避けるため放射標識化抗体および第二の「非放射性」抗体の混合物で処理した。
【０１０１】
カッパ軽鎖の可変領域を環状 cDNAから出発して抗体の軽鎖定常領域を認識するプライマー対(5' GGGAAGATGG-ATACAGTTGGTG 3' (配列番号5)、5' CAAGAGCTTCAACAGGAAT-GAG 3' (配列番号6) ) を用いてM. Sassano、et al.、Nucl. Ac. Res.、(1994) 22、1768-1769に記載のように増幅した。
【０１０２】
ガンマ重鎖の可変領域を環状 cDNAから出発して抗体の重鎖定常領域を認識するプライマー対(5' ATGGAGTTAG-TTTGGGCAGCAG 3' (配列番号7)、5' GCACAACCACCATACTGAG-AAG 3' (配列番号8) )を用いて M. Sassano、et al.、Nucl. Ac. Res.、(1994) 22、1768-1769に記載のように増幅した。
【０１０３】
図17は、ST2485の軽鎖可変領域(VL)の配列である配列番号1を示す。
【０１０４】
図18は、ST2485の重鎖可変領域(VH)の配列である配列番号2を示す。
【０１０５】
BC-2と比較してのST2485の比較特徴決定により、抗体ST2485は以下の特徴を有することが示された: 
-抗体ST2485は、BC-2のエピトープに近いかまたは部分的に重複するヒトテネイシンのA(1-4)-D 領域内にあるエピトープを認識する;
-抗体ST2485は、観察される不均質性が軽鎖グリコシル化バリアントに起因するという点で軽鎖および重鎖の組成に関して均質な抗体である;
-抗体ST2485は、BC-2より免疫反応性が高い;
-抗体ST2485は、抗原に対してBC-2よりも高い親和性を有する;
-抗体ST2485は、ビオチン化の後の免疫反応性の維持に関してBC-2に匹敵する;
-抗体ST2485は、動物モデルにおける腫瘍局在化に関してBC-2よりも優れている;
-抗体ST2485は、インビトロおよび動物モデルにおけるインビボの両方で抗-テネイシンモノクローナル抗体ST2146と共に相加的にテネイシンCに結合する。
【０１０６】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【０１０７】
【図１】ヒトテネイシン CおよびBC-2-様抗体の作成に用いた戦略の略図。
【図２】還元および非還元条件下における抗体ST2485のSDS-PAGE (a、b)およびウェスタンブロット(c、d) 分析。還元条件下において、抗体の軽鎖のレベルにてダブルバンドが観察される(b、d)。
【図３】酵素 PNGaseF (Flavobacterium由来ペプチド-N-グリコシダーゼ)での消化による脱グリコシル化に供された抗体ST 2485のSDS-PAGE 分析:高分子量軽鎖バンドの消失が観察される。
【図４】抗体ST2485およびBC-2のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィープロファイル。
【図５】ウェスタンブロット分析によるヒトテネイシンおよびTn (A(1-4)-D) 断片に対するST2485の結合特異性。
【図６】テネイシン C (a)またはTn (A(1-4)-D) 断片 (b)に対する結合についてのST2485とBC-2との間の競合ELISA。
【図７】テネイシン C (a)およびTn (A(1-4)-D) 断片 (b)に対するBC-2と比較したST2485の免疫反応性。
【図８】テネイシン C (a)およびTn (A(1-4)-D) 断片 (b)に対するビオチン化 ST2485およびBC-2の免疫反応性。
【図９】LMM3 腫瘍 (マウス乳癌)および正常マウス腸において発現するマウステネイシンとの抗体ST2485の交差反応性。
【図１０】ヌードマウスにおけるST2485 生体内分布研究に採用したプロトコール。
【図１１】BC-2と比較した様々な投与用量でのST2485の生体内分布。投与したすべての用量において、腫瘍におけるST2485の蓄積は少なくともBC-2の２倍である。
【図１２】BC-2と比較したST2485の腫瘍対非腫瘍比。これらの比は投与したすべての用量において抗体ST2485の方が高い。
【図１３】ELISA試験による抗テネイシン抗体ST2485およびST2146のインビトロ干渉 (a)および相加性試験 (b)。
【図１４】BiaCore 分析による抗体ST2485およびST2146のインビトロ相加性試験。
【図１５】抗体ST2485およびST2146のインビボ相加性研究に採用したスキーム。
【図１６】腫瘍1g当たりに局在している抗体のngにて表した、抗体ST2485およびST2146のインビボ相加性。
【図１７】配列番号1、ST2485軽鎖可変領域(VL)の配列。コードされるアミノ酸配列は配列番号3に示す。
【図１８】配列番号2、ST2485重鎖可変領域(VH)の配列。コードされるアミノ酸配列は配列番号4に示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−ａ】
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【図１３】
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【図１４−ａ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−ａ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月7日(2006.11.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０７】
【図１】ヒトテネイシン CおよびBC-2-様抗体の作成に用いた戦略の略図。
【図２】還元および非還元条件下における抗体ST2485のSDS-PAGE (a、b)およびウェスタンブロット(c、d) 分析。還元条件下において、抗体の軽鎖のレベルにてダブルバンドが観察される(b、d)。
【図３】酵素 PNGaseF (Flavobacterium由来ペプチド-N-グリコシダーゼ)での消化による脱グリコシル化に供された抗体ST 2485のSDS-PAGE 分析:高分子量軽鎖バンドの消失が観察される。
【図４】抗体ST2485およびBC-2のヒドロキシアパタイトクロマトグラフィープロファイル。
【図５】ウェスタンブロット分析によるヒトテネイシンおよびTn (A(1-4)-D) 断片に対するST2485の結合特異性。
【図６】テネイシン C (a)またはTn (A(1-4)-D) 断片 (b)に対する結合についてのST2485とBC-2との間の競合ELISA。
【図７】テネイシン C (a)およびTn (A(1-4)-D) 断片 (b)に対するBC-2と比較したST2485の免疫反応性。
【図８】テネイシン C (a)およびTn (A(1-4)-D) 断片 (b)に対するビオチン化 ST2485およびBC-2の免疫反応性。
【図９】LMM3 腫瘍 (マウス乳癌)および正常マウス腸において発現するマウステネイシンとの抗体ST2485の交差反応性。
【図１０】ヌードマウスにおけるST2485 生体内分布研究に採用したプロトコール。
【図１１−１】BC-2と比較した様々な投与用量でのST2485の生体内分布。
【図１１−２】BC-2と比較した様々な投与用量でのST2485の生体内分布。
【図１２−１】BC-2と比較したST2485の腫瘍対非腫瘍比。
【図１２−２】BC-2と比較したST2485の腫瘍対非腫瘍比。
【図１３】ELISA試験による抗テネイシン抗体ST2485およびST2146のインビトロ干渉 (a)および相加性試験 (b)。
【図１４−１】BiaCore 分析による抗体ST2485およびST2146のインビトロ相加性試験。
【図１４−２】BiaCore 分析による抗体ST2485およびST2146のインビトロ相加性試験。
【図１５】抗体ST2485およびST2146のインビボ相加性研究に採用したスキーム。
【図１６】腫瘍1g当たりに局在している抗体のngにて表した、抗体ST2485およびST2146のインビボ相加性。
【図１７】配列番号1、ST2485軽鎖可変領域(VL)の配列。コードされるアミノ酸配列は配列番号3に示す。
【図１８】配列番号2、ST2485重鎖可変領域(VH)の配列。コードされるアミノ酸配列は配列番号4に示す。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１】
2008506355.tif 000032
【図２】
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【図３】
2008506355.tif 000034
【図４】
2008506355.tif 000035
【図５】
2008506355.tif 000036
【図６】
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【図７】
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【図８】
2008506355.tif 000039
【図９】
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【図１０】
2008506355.tif 000041
【図１１−１】
2008506355.tif 000042
【図１１−２】
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【図１２−１】
2008506355.tif 000044
【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【図１５】
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【図１６】
2008506355.tif 000050
【図１７】
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【図１８】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年11月15日(2006.11.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008506355000001.app
【国際調査報告】
2008506355.tif 000053
2008506355.tif 000054
2008506355.tif 000055
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