(57)【要約】  脱灰骨基質（ＤＢＭ）および天然骨形成タンパク質（ｎＢＭＰ）は、非コラーゲン性骨タンパク質の複雑な混合物である。これらの混合物は、組換え分子として入手可能な、多くのＢＭＰを含有する。ＢＭＰの入手可能性および活性に影響を及ぼしうる分子の、これらの物質中の存在に関する情報は、非常に限られている。アルカリ−尿素を用いるなどのＤＢＭの化学抽出は、ＤＢＭの造骨活性を阻害する水溶性抽出物を生じる。細胞外ＢＭＰリガンド・アンタゴニストであるノギンは、ＤＢＭ由来の水溶性抽出物中に見られる。示差化学抽出は、ＤＢＭおよびｎＢＭＰから、非造骨性分子または造骨阻害分子を除去する、有用な手段である。
2008540328.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カオトロピック溶媒で抽出されている脱灰骨基質（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ）を含む組成物であって、抽出された脱灰骨基質が骨誘導活性を有し、そして抽出された脱灰骨基質が、天然の脱灰骨基質より少ない非造骨性タンパク質を有する、前記組成物。
【請求項２】
カオトロピック溶媒が、約１Ｍ〜約４．５Ｍの間の濃度で尿素を含む、請求項１の組成物。
【請求項３】
カオトロピック溶媒が、約６Ｍ尿素および０．１Ｍ  ＫＯＨの間の濃度で尿素を含む、請求項１の組成物。
【請求項４】
脱灰骨基質のカオトロピック溶媒での第一の抽出、およびカオトロピック溶媒、イオン性界面活性剤または非変性濃度の酸での第二の抽出由来の抽出されている非コラーゲン性タンパク質を含む組成物であって、該非コラーゲン性タンパク質が造骨活性を有し、そして等量の抽出されていないタンパク質より少ない非造骨性タンパク質を有する、前記組成物。
【請求項５】
第二の抽出カオトロピック溶媒が、約４Ｍグアンジジン（ｇｕａｎｄｉｄｉｎｅ）ＨＣｌおよび約６Ｍ尿素を含む、請求項３の組成物。
【請求項６】
第二の抽出イオン性界面活性剤が約１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む、請求項３の組成物。
【請求項７】
第二の抽出酸が約１〜２Ｍクエン酸を含む、請求項３の組成物。
【請求項８】
脱灰骨基質または天然ＢＭＰを含み、非造骨性タンパク質を実質的に含まない、造骨活性を有する組成物。
【請求項９】
脱灰骨基質または天然ＢＭＰを含み、天然ＤＢＭまたはＢＭＰより少ない造骨阻害タンパク質を有する、造骨活性を有する組成物。
【請求項１０】
脱灰骨基質または天然ＢＭＰを含み、等量の天然ＤＢＭまたはＢＭＰより少ないノギンを有する、造骨活性を有する組成物。
【請求項１１】
ＢＭＰノギンなどの阻害性タンパク質を、減少したレベルで有するかまたは実質的に含まない、脱灰骨基質またはＢＭＰを含む組成物。
【請求項１２】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７の少なくとも１つをさらに含む、請求項１、２または３の組成物。
【請求項１３】
（ａ）骨組織からＤＢＭを得て；
（ｂ）ＤＢＭをカオトロピック溶媒で抽出して；
（ｃ）生じたＤＢＭを単離する
工程を含む、減少したレベルの造骨阻害因子を有するＤＢＭを産生するための方法。
【請求項１４】
骨形成を増進する際に使用するための薬剤であって、療法的有効投薬量のＤＢＭまたはＢＭＰを含むか、あるいは等量の天然ＤＢＭまたはＢＭＰに比較して減少したレベルのＢＭＰ阻害剤を有する、前記薬剤。
【請求項１５】
副甲状腺ホルモン、フッ化ナトリウム、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子ＩＩまたはトランスフォーミング増殖因子ベータ、ビスホスホネート、エストロゲン受容体調節剤、カルシトニン、ビタミンＤまたはカルシウムを含む群より選択される少なくとも１つの剤をさらに含む、請求項１４の薬剤。
【請求項１６】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７の少なくとも１つの療法的有効投薬量をさらに含む、請求項１４の薬剤。
【請求項１７】
ノギンを実質的に含まないＤＢＭまたはｎＢＭＰで、哺乳動物細胞を処理することを含む、骨形成を誘導する方法。
【請求項１８】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７の少なくとも１つで、哺乳動物細胞を処理することをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項１９】
等量の天然ＤＢＭまたはｎＢＭＰに比較して減少したレベルのノギンを有するＤＢＭまたはｎＢＭＰで、哺乳動物細胞を処理することを含む、骨形成を誘導する方法。
【請求項２０】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７の少なくとも１つで、哺乳動物細胞を処理することをさらに含む、請求項１９の方法。
【請求項２１】
療法的に有効な用量の、副甲状腺ホルモン、フッ化ナトリウム、インスリン様増殖因子Ｉ、インスリン様増殖因子ＩＩまたはトランスフォーミング増殖因子ベータ、ビスホスホネート、選択的エストロゲン受容体調節剤、カルシトニン、ビタミンＤ、またはカルシウムを含む群より選択される少なくとも１つの剤で、哺乳動物細胞を処理することをさらに含む、請求項１９の方法。
【請求項２２】
哺乳動物細胞を刺激して、未処理細胞における生物学的マーカーのレベルより高いレベルで、骨形成の生物学的マーカーを発現させる方法であって、カオトロピック溶媒で抽出されており、そして天然ＤＢＭまたはＢＭＰに比較し、等量の抽出されていないノギンに比較して、減少したレベルの造骨阻害タンパク質を有する、ＤＢＭまたはｎＢＭＰに、哺乳動物細胞を曝露することを含む、前記方法。
【請求項２３】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７の少なくとも１つで、哺乳動物細胞を処理することをさらに含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
生物学的マーカーが、アルカリホスファターゼ活性、カルシウム取り込み、ミネラル化またはオステオカルシンｍＲＮＡの発現の少なくとも１つの増加である、請求項２２の方法。
【請求項２５】
骨形成が望ましい場所に隣接した場所に、造骨性細胞を投与し；そして天然ＤＢＭまたはｎＢＭＰに比較して減少したレベルのノギンを有するＤＢＭまたはＢＭＰを、骨形成が望ましい場所に隣接した場所に投与することを含む、骨形成を誘導する方法。
【請求項２６】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７の少なくとも１つを投与することをさらに含む、請求項２５の方法。
【請求項２７】
支持体を含む製品であって、前記支持体がＤＢＭまたはＢＭＰを含むか、あるいは前記ＤＢＭまたはｎＢＭＰが、天然ＤＢＭまたはＢＭＰに比較して減少したレベルのノギンを有し、そして前記ＤＢＭまたはＢＭＰが造骨活性を有する、前記製品。
【請求項２８】
固体支持体上に固定されたタンパク質をさらに含む、請求項２７の製品であって、前記タンパク質が、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７またはその断片の少なくとも１つを含み、前記断片が造骨活性を有する、前記製品。
【請求項２９】
表面を有する支持体を含む移植片であって、移植片表面の少なくとも一部が、等量の天然ＤＢＭまたはｎＢＭＰに比較して減少したレベルのノギンを有するＤＢＭまたはＢＭＰを、骨形成を増進するのに十分な量で含む、前記移植片。
【請求項３０】
ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７の少なくとも１つをさらに含む、請求項２９の移植片。
【請求項３１】
支持体が、ピン、ねじ、プレート、または人工関節の形に形成されている、請求項２９の移植片。
【請求項３２】
移植片の少なくとも表面に、造骨性哺乳動物細胞がさらに含まれる、請求項２９の移植片。
【請求項３３】
増加したレベルの造骨阻害因子を有する組成物を産生する方法であって：
（ａ）骨組織からＤＢＭを得て；
（ｂ）カオトロピック溶媒でＤＢＭを抽出し；
（ｃ）造骨阻害因子を含む水溶性分画を単離する
工程を含む、前記方法。
【請求項３４】
造骨阻害因子がノギンである、請求項３３の方法。
【請求項３５】
ＤＢＭの造骨活性を阻害するためのタンパク質であって、脱灰骨基質のカオトロピック溶媒での抽出由来の水溶性抽出物（ｅｘｔｒａｃｔａｔｅ）から得られている、前記タンパク質を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府が資金援助した研究または開発に関する言及
本研究は、復員軍人援護局によって支援された。米国政府は、本発明において、特定の権利を有しうる。
発明の分野
本発明は、一般的に、造骨因子に関し、そしてより詳細には、脱灰骨基質（ｄｅｍｉｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｂｏｎｅ  ｍａｔｒｉｘ）（「ＤＢＭ」）および／または天然骨形成タンパク質（「ｎＢＭＰ」）、造骨活性の少なくとも１つの内因性阻害剤が除去されているＤＢＭおよび／またはｎＢＭＰを含む組成物、ＤＢＭおよび／またはｎＢＭＰを含む製品、ならびに該組成物および該製品を用いて骨形成を誘導する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
正常骨形成は、発生中に起こり、そして傷害後の修復を行い、そして成人の生活においては、骨格の完全性を保持するため、リモデリングが起こる。骨形成およびリモデリングは、一般的に、破骨細胞による骨吸収および骨芽細胞による骨形成を伴い、これらは増殖因子によって制御される。したがって、細胞分化、骨形成および骨吸収における平衡間のいかなる干渉も、骨形成、修復およびホメオスタシスに影響を及ぼしうる。
【０００３】
ノギンは、前口動物門および新口動物（ｄｅｕｔｅｒｓｔｏｍｅ）門両方に存在し、そして非常に保存されており、そして初期発生において、骨形成タンパク質（「ＢＭＰ」）と相互作用して、胚配向および組織層形成に影響を及ぼすタンパク質である（Ｒｅｄｄｉ，  Ａ．Ｈ．（２００１）「骨および軟骨発生における骨形成タンパク質および同族（ｃｏｇｎａｔｅ）結合性タンパク質間の相互作用：ノギン、コーディンおよびＤＡＮ」Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ．  ３：１−５．  Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ；  Ｌ．Ｂ．ら（１９９６）「シュペーマン・オーガナイザー・シグナル、ノギンは、骨形成タンパク質４に結合し、そして該タンパク質を不活性化する」Ｃｅｌｌ  ８６：５９９−６０６）。ノギンは、６４ｋＤホモ二量体として分泌される３３ｋＤ糖タンパク質であり、そして原腸陥入中、背側外胚葉から神経組織を誘導し、そして側部中胚葉の特異化を腹側（血管、間充織）の運命から背側（筋肉、心臓、前腎）の運命に変化させる点で、ゼノパス属（Ｘｅｎｏｐｕｓ）において、シュペーマン・オーガナイザーの活性成分の機能を実行することが示された（Ｓｍｉｔｈ，  Ｗ．Ｃ．ら（１９９３）「分泌されたノギンタンパク質は、ゼノパス属中胚葉の背側化において、シュペーマン・オーガナイザーを模倣する」Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：５４７−５４９．  Ｌａｍｂ，  Ｔ．Ｍ．ら（１９９３）「分泌されたポリペプチド・ノギンによる神経誘導」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：７１３−７１８）。ＢＭＰ−４が、ゼノパス属発生において、腹側化因子として作用し（Ｄａｌｅ，  Ｌ．ら（１９９２）「骨形成タンパク質４：初期ゼノパス属発生における腹側化因子」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：５７３−５８５．  Ｊｏｎｅｓ，  Ｃ．Ｍ．ら（１９９２）「ゼノパス属中胚葉誘導における後部腹側化因子としてのＤＶＲ−４（骨形成タンパク質−４）」Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １１５：６３９−６４７）、そして神経誘導を阻害する（Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｐ．Ａ．およびＨｅｍｍａｔｉ−Ｂｒｉｖａｎｌｏｕ，  Ａ．（１９９５）「ＢＭＰ４による、上皮の誘導および神経運命の阻害」Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：３３１−３３３）ことが立証されてきており、ノギンが、ＢＭＰ−４と相互作用することによって機能しうることが示唆された。続く研究によって、ノギンが強力にＢＭＰ−４に結合し、そして細胞性受容体へのＢＭＰ−４の結合を遮断することによってその活性を阻害することが立証された（Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ，  Ｌ．Ｂ．ら（１９９６）「シュペーマン・オーガナイザー・シグナル、ノギンは、骨形成タンパク質４に結合し、そして該タンパク質を不活性化する」Ｃｅｌｌ  ８６：５９９−６０６．  Ｇｒｏｐｐｅ，  Ｊ．，  Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ，  Ｊ．ら（２００２）「システイン・ノット・タンパク質、ノギンによる、ＢＭＰシグナル伝達阻害の構造的基礎」Ｎａｔｕｒｅ  ４２０：６３６−６４２）。
【０００４】
ノギンは、脊椎動物骨格において、重要な制御機能を実行する（Ｂｒｕｎｅｔ，  Ｌ．Ｊ．ら（１９９８）「哺乳動物骨格における、ノギン、軟骨形態形成、および関節形成」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１４５５−１４５７．  Ｄｅｖｌｉｎ，  Ｒ．Ｄ．ら（２００３）「ノギンの骨格過剰発現は、骨減少症および骨形成減少を生じる」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４：１９７２−１９７８．  Ｎａｋａｍｕｒａ，  Ｙ．，  Ｗａｋｉｔａｎｉ，  Ｓ．，  Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｊ．ら（２００３）「ｂｍｐ−２が誘導する異所性骨形成中の、ＢＭＰ受容体およびノギンの時間的および空間的発現プロフィール」Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎ．  Ｒｅｓ．  １８：１８５４−１８６２．  Ｓｔｏｔｔｍａｎｎ，  Ｒ．Ｗ．ら（２００１）「ＢＭＰアンタゴニスト、コーディンおよびノギンは、マウス下顎成長において、必須であるが重複する役割を有する」Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２４０：４５７−４７３）。ｒｈＢＭＰ−２での処理後、骨芽細胞様表現型を明示することに基づいて単離されたＷ−２０−１７マウス骨髄間質細胞において、ノギンは、ＢＭＰ−４が誘導するアルカリホスファターゼの発現を減少させた（Ｔｈｅｉｓ，  Ｒ．Ｓ．ら（１９９２）「Ｗ−２０−１７間質細胞において、組換えヒト骨形成タンパク質−２は骨芽細胞性分化を誘導する」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １３０：１３１８−１３２４）。ノギンは、マウスにおいて、凝縮中の軟骨において発現されることが示されており、そしてノギンを欠くように遺伝子改変されたマウスは、より短いがより太い肢、および多数の不動結合を有することが見出された（Ｂｒｕｎｅｔ，  Ｌ．Ｊ．ら（１９９８）「哺乳動物骨格における、ノギン、軟骨形態形成、および関節形成」Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８０：１４５５−１４５７）。ノギン遺伝子のヒト突然変異は、進行性骨化性線維形成異常症および不動結合症候群と関連することが示されてきている（Ｓｅｍｏｎｉｎ，  Ｏ．ら（２００１）「進行性骨化性線維形成異常症患者におけるノギン遺伝子の３つの新規突然変異の同定」Ａｍ．  Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｇｅｎｅｔ．  １０２：３１４−３１７．  Ｇｏｎｇ，  Ｙ．ら（１９９９）「ノギンをコードする遺伝子におけるヘテロ接合性突然変異は、ヒト関節形態形成に影響を及ぼす」Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．  ２１：３０２−３０４）。
【０００５】
骨チャンバーにおける、修飾ノギンまたは野生型ノギンの送達は、ラットにおいて、４週間の時点で、新規骨の内部増殖を減少させた（Ａｓｐｅｎｂｅｒｇ，  Ｐ．ら（２００１）「骨形成タンパク質アンタゴニスト、ノギンは、膜性骨化を阻害する」Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒａｌ．  Ｒｅｓ．  １６：４９７−５００）。オステオカルシン・プロモーターの調節下で、ノギンを過剰発現するトランスジェニックマウスは、骨塩密度減少、小柱（ｔｒａｂｅｃｕｌａｒ）数および体積の減少、骨形成速度の減少を示すが、破骨細胞数減少を伴う、正常な小柱破骨細胞表面を示した（Ｄｅｖｌｉｎ，  Ｒ．Ｄ．ら（２００３）「ノギンの骨格過剰発現は、骨減少症および骨形成減少を生じる」Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４：１９７２−１９７８）。レトロウイルスベクターを介して送達されたノギンは、脱灰骨基質、またはベクターが送達するＢＭＰ−４によって誘導される、異所性骨形成を阻害した（Ｈａｎｎａｌｌａｈ，  Ｄ．ら（２００４）「ノギンのレトロウイルス送達は、動物モデルにおいて、ＢＭＰ−４、脱灰骨基質、および外傷によって誘導される、異所性骨化の形成を阻害する」Ｊ．  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ．  ８６：８０−９１）。
【０００６】
脱灰骨基質（ＤＢＭ）および天然骨形成タンパク質（ｎＢＭＰ）は、少なくとも１つの内因性ＢＭＰを含有する、非コラーゲン性骨タンパク質の部分的に精製された抽出物である。ＢＭＰは、骨形成タンパク質／非コラーゲン性タンパク質（ＢＭＰ／ＮＣＰまたはＢＭＰ）と記載される増殖因子ファミリーに属する。具体的には、ＢＭＰ−２およびＢＭＰ−４が、そこから単離されてきており、そしてこれらはタンパク質のＴＧＦ−βファミリーに属する。しかし、ＤＢＭおよびｎＢＭＰはまた、ＢＭＰ活性の増進剤および阻害剤も含む。
【０００７】
例えば、最近、ＢＢＰは、組換えＢＭＰによって引き起こされる骨化を増進することが開示された。さらに、ｉｎ  ｖｉｖｏでＢＭＰとともにＢＢＰを用いると、骨形成が、より迅速に、より高い度合いまで、そしてより少量のｒｈＢＭＰ−２で起こるようになる。
【０００８】
ＤＢＭおよびｎＢＭＰは、造骨潜在能力を示し、そしてこれらを用いて、いくつかの臨床的状況における骨治癒を増進しうる（Ｕｒｉｓｔ，  Ｍ．Ｒ．（１９６５）「骨：自己誘導による形成」Ｓｃｉｅｎｃｅ  １５０：８９３−８９９；Ｒｅｄｄｉ，  Ａ．Ｈ．およびＨｕｇｇｉｎｓ，  Ｃ．（１９７２）「青年期ラットにおける、正常線維芽細胞のトランスフォーメーションにおける生化学的順序」Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ６９：１６０１−３１６０５、ならびにＵｒｉｓｔ，  Ｍ．Ｒ．ら（１９８４）「ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーによる、ウシ骨形成タンパク質の精製」Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１：３７１−３７５（Ｕｒｉｓｔ，  Ｍ．Ｒ．「骨形成タンパク質の新たな概念」（１９９１）：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ：  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ中，  Ａ．Ｄ．  Ｄｉｘｏｎ，  Ｂ．Ｇ．  Ｓａｒｎａｔ、およびＤ．Ａ．Ｎ．  Ｈｏｙｔｅ（監修），  ｐｐ．１８９−１９８．（Ｃ．Ｒ．Ｃ．  Ｐｒｅｓｓ，  ボストン））。ＤＢＭに見られるＢＭＰ関連タンパク質の数およびその制御機能の複雑さから、ＤＢＭおよびｎＢＭＰなどの部分的に精製された混合物は、ＢＭＰの入手可能性および活性に影響を及ぼす、いくつかの分子を含有する可能性が高い。組換えＢＭＰが利用可能であるが、臨床的使用において、最低限有効な投薬量のＢＭＰを用いるコストが、限定要因となっている。したがって、増加した造骨活性を有するＤＢＭおよびｎＢＭＰが望ましい。
【０００９】
例えば、骨障害（骨粗しょう症など）、骨傷害（平坦な（例えば膜性）および長い（例えば軟骨内）骨の骨折治癒、非癒合骨折、および再建手術など）、膝／臀部／関節修復の部位、または歯周炎を治療する置換手術、歯周再生、歯の移植片再構築のための歯槽堤増大を治療するには、安全で、有効であり、そして手ごろな価格の組成物、デバイスおよび方法が望ましい。
【００１０】
さらに、骨形成を増進するための他の方法と組み合わせた組成物および方法の使用が望ましい。
例えば、ＢＭＰ作用の動力学または全体の造骨潜在能力を改善する活性化剤および物質を添加することによるか、あるいはＢＭＰ作用の阻害剤を除去することによって、ＤＢＭおよびｎＢＭＰを改善することが望ましい可能性もある。
【００１１】
さらに、ＤＢＭにおけるＢＭＰ（ＢＭＰ−２、−４および−７（「オステオゲニン」として知られる）など）の造骨活性に不都合に影響を及ぼすことなく、ＢＭＰの阻害剤を除去するための方法が望ましい。やはり望ましいのは、プロセシングされていないＤＢＭから得られた天然ＤＢＭまたはｎＢＭＰより、体積または重量あたり、より多くの骨を産生するＤＢＭおよび／またはｒＢＭＰである。最後に、ＤＢＭの造骨潜在能力に不都合に影響を及ぼさない方法が望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
発明の概要
本発明の１つの側面において、造骨活性の阻害剤のレベルを減少させるか、または該阻害剤を除去することによって、ＤＢＭまたはｎＢＭＰの造骨活性を増加させることが望ましく、そしてより具体的には、ＢＭＰ作用の阻害剤を除去することが望ましい。
【００１３】
本発明の１つの側面において、アルカリ−尿素抽出を用いて、ＤＢＭまたはｎＢＭＰ由来の水溶性抽出物（ｅｘｔｒａｃｔａｔｅ）中、限定されるわけではないがノギンを含む阻害性タンパク質のレベルを実質的に減少させるか、または該タンパク質を除去することも可能である。
【００１４】
本発明は、骨ホメオスタシスを維持し、骨形成を増進し、そして／または骨修復を増進するため、剤を用いた、全身送達法または局所治療法を含むことも可能である。本発明は、骨ホメオスタシスを維持し、骨形成を増進し、そして／または骨修復を増進するため、細胞を用いた、全身送達法または局所治療法を含むことも可能である。
【００１５】
本発明の１つの適用において、骨粗しょう症などの骨関連障害において、形成、局所修復、効果的な骨ホメオスタシスを誘導する方法を適用することも可能である。
本発明はまた、骨形成を誘導するかまたは骨修復を増進するため、物質でコーティングされたか、または分化した細胞が植え付けられた、移植片などのデバイスも含むことも可能である。本発明はまた、骨形成または骨修復が望ましい部位での、物質または分化した細胞の適用も含むことも可能である。例えば、骨形成または骨修復を刺激することによって、骨折を固定するか、骨形成を増進するか、または人工装具移植片を安定化させるために用いられる、限定されるわけではないが、ピン、ねじおよびプレートを、移植片が含むことも可能である。
【００１６】
本発明は、少なくとも、ＤＢＭまたはｎＢＭＰが、例えば、骨形成、およびＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４またはＢＭＰ−７などの他の造骨物質の活性を増進しうる点で、好適である。したがって、臨床適用のため、より少ない用量の造骨物質を使用することも可能である。これは、少なくとも、臨床治療がより手ごろな価格になりうる点で意味がある。さらに本発明は、少なくとも、ＢＢＰを用いて、ＤＢＭおよび／またはｎＢＭＰの造骨潜在能力をさらに増進しうる点で好適である。
【００１７】
これらとともに他の目的、特徴および利点が、例示的態様の以下の詳細な説明および付随する図を再検討することから、ここで、明らかになるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
詳細な説明
脱灰骨基質（ＤＢＭ）およびそこから精製される天然骨形成タンパク質（ｎＢＭＰ）は、異所性軟骨内骨形成を誘導し、これは、いくつかの臨床的状況において、骨治癒を増進するのに使用可能である。これらの物質は、多くのタンパク質の複雑な混合物であり、そしていくつかの既知の骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、およびおそらくＢＭＰ結合性タンパク質またはＢＭＰの阻害剤を含有する。したがって、造骨活性が増加したＤＢＭ関連物質が望ましい。
【００１９】
本発明は、骨ホメオスタシスを維持し、骨形成を増進して、骨の形成を促進し、そして／または骨修復を増進するための、ＤＢＭ、ｎＢＭＰなどの剤、ならびに／あるいはタンパク質および方法に関する。
【００２０】
１つの態様は、非造骨性タンパク質（ノギンなど）を除去するかまたはその量を減少させるように抽出されたＤＢＭおよび／またはｎＢＭＰを作製するための方法、ならびにこうしたＤＢＭおよび／またはｎＢＭＰを含む組成物を含むことも可能である。抽出は、例えば、約１Ｍ〜４．５Ｍの濃度の尿素などのカオトロピック溶媒を用いてもよい。好ましくは、ＤＢＭ抽出は、その中のＤＢＭまたはｎＢＭＰの骨誘導活性を除去しないような方式で行うべきである。
【００２１】
さらに、１つの態様は、上述のように抽出されたＤＢＭまたはｎＢＭＰから非コラーゲン性タンパク質などのタンパク質を作製する方法、および該タンパク質を含む組成物を含むことも可能である。第二の抽出は、カオトロピック溶媒（例えば約４Ｍクアンジジン（ｑｕａｎｄｉｄｉｎｅ）ＨＣｌ、６Ｍ尿素）、イオン性界面活性剤（例えば、約１％のドデシル硫酸ナトリウム）または非変性濃度の酸（例えば、約１〜約２Ｍのクエン酸）の１つを用いてもよい。
【００２２】
より具体的には、本発明の態様は、骨ホメオスタシスを維持し、骨形成を増進し、そして／または骨修復を増進するための剤の全身適用および／または局所適用を含むことも可能である。方法または化合物が骨ホメオスタシスを維持する能力の臨床指標は、少なくともＤＥＸＡスキャニングによって評価した際、体全体の異なる部位での骨密度の改善によって証明される。治癒しつつある骨折における骨形成増進は、選択した時間間隔での骨折部位の通常のＸ線によってルーチンに評価される。定量的ＣＴスキャニングなど、上記指標を決定するためのより進歩した技術を用いてもよい。
【００２３】
より具体的には、本発明の態様は、骨形成を刺激する剤の使用を含むことも可能である。本発明の態様は、ＤＢＭおよび／またはｎＢｍｐなど、続いて骨細胞（骨芽細胞）に分化する前駆細胞の増殖を誘導する剤の使用を含むことも可能である。
【００２４】
本発明の態様はまた、破骨細胞性骨吸収を阻害する剤の使用も含むことも可能である。破骨細胞性骨吸収を達成する、本発明において有用でありうる剤には、限定されるわけではないが：ビスホスホネート、選択的エストロゲン受容体調節剤、カルシトニン、ビタミンＤおよび／またはカルシウム補給が含まれる。本発明の態様はまた、骨芽細胞性骨形成を誘導する剤の使用も含むことも可能である。本発明において有用でありうる剤には、限定されるわけではないが、ＰＴＨ、フッ化ナトリウム、ならびにインスリン様増殖因子ＩおよびＩＩおよびトランスフォーミグ増殖因子ベータなどの増殖因子が含まれる。
【００２５】
抽出されたＤＢＭ、ｎＢＭＰまたは非コラーゲン性タンパク質の造骨効果を示すために用いられるｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、以前、他の造骨性化合物の類似の振る舞いを立証する際に用いられてきた。特に、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、以前、ＢＭＰおよびインスリン様増殖因子（ＩＧＦ）などの化合物のｉｎ  ｖｉｖｏ造骨効果を成功裡に予測することが可能であった。具体的には、ｉｎ  ｖｉｖｏモデルは、マウス後四半部アッセイにおいて、ＢＢＰがＢＭＰ−２の造骨潜在能力を増進することを立証した。これらのｉｎ  ｖｉｖｏモデルにおける化合物の造骨効果の立証は、ｉｎ  ｖｉｖｏのヒトにおいて、その効果を立証する試験の前に、必要である。
【００２６】
骨形成を達成する、本発明において有用でありうる剤には、限定されるわけではないが、抽出されたＤＢＭ、ｎＢＭＰおよび／または非コラーゲン性タンパク質単独、あるいは、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７などの他の造骨剤、または石灰化もしくは骨形成を達成する際に活性があることが見出されている、これらのペプチドのいずれかの一部と組み合わせたものが含まれる。さらに、例えば、ＢＰＰを添加して、ＢＭＰ−２の造骨潜在能力を増進することも可能である。
【００２７】
療法的有効用量。本発明において有用な剤の療法的有効用量は、上述のように、剤が石灰化または骨形成を増進する能力によって測定される際、患者に対する陽性の効果、または細胞における望ましい効果を有するものである。各剤の療法的有効用量を調節して、負の副作用を最小限にしつつ、望ましい臨床的効果を達成することも可能である。特定の患者に適した個々の措置および用量レベルを決定する場合、投与経路、疾患の重症度、患者の年齢および体重、患者が摂取している他の薬物、および主治医が通常考慮する他の要因に応じて、個々の適用に関して、剤の投薬量を選択することも可能である。少なくとも、抽出されたＤＢＭ、ｎＢＭＰ、または非コラーゲン性タンパク質は、同重量または同体積の天然ＤＢＭまたは天然ＢＭＰ（「抽出されていない」）に比較して、より活性が高い療法物質を生じうる点で、望ましい。ノギンを実質的に含まないＤＢＭおよびｎＢＭＰの療法的に有効な投薬量は、ノギンを含むＤＢＭおよびｎＢＭＰのものより少ないと決定されうる。
【００２８】
剤形。選択した剤の種類および投与経路を考慮することによって、剤形に含まれる剤の療法的有効用量を選択することも可能である。剤形は、薬学業の当業者に知られるように、患者への投薬を促進するため、アジュバントおよび薬学的に許容しうるキャリアーを含む他の不活性成分と組み合わせて、剤を含むことも可能である。
【００２９】
望ましい純度を有する剤を、場合による生理学的に許容しうるキャリアー、賦形剤または安定化剤と混合することによって、凍結乾燥ケークまたは水溶液の形で、保管用に療法的配合物を調製することも可能である。許容しうるキャリアー、賦形剤または安定化剤は、使用する投薬量および濃度で、レシピエントに対して非毒性であり、そしてリン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質を含む。他の構成要素には、グリシン、ブルタミン（ｂｌｕｔａｍｉｎｅ）、アスパラギン、アルギニン、またはリジン；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；および／またはＴｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤が含まれてもよい。
【００３０】
剤形を、皮膚適用のための局所調製物（例えばローション、クリーム、軟膏、経皮パッチ等）中に提供してもよい。また、剤形を、例えば、皮下（徐放カプセル中など）、静脈内、腹腔内、筋内または呼吸適用のための調製物中に提供してもよい。
【００３１】
１つの態様において、剤形は、摂取した際に、体内の剤のレベルの上昇を生じる、経口調製物（例えば液体、カプセル、カプレット等）であってもよい。経口調製物は、希釈剤、結合剤、徐放剤、潤滑剤および崩壊剤（ｄｉｓｉｎｉｇｒａｎｔｓ）を含むキャリアーを含んでもよい。
【００３２】
いずれか１つまたは組み合わせた剤を剤形に含んでもよい。あるいは、剤の組み合わせを別個の剤形中で投与してもよい。治療のため、少なくとも２つの剤への曝露があるように、剤の組み合わせを同時に投与してもよい。
【００３３】
さらなる剤。本発明は、骨形成および／または石灰化を増進するため、抽出されたＤＢＭ、ｎＢＭＰおよび／またはＤＭＰタンパク質と独立にまたは相乗的に作用するさらなる剤を用いた治療を含むことも可能である。例えば、非造骨性タンパク質またはペプチドのレベルが減少したＤＢＭおよび／またはｎＢＭＰを、ＢＭＰ、ＢＰＰ、ビスホスホネート、エストロゲン受容体調節剤などのホルモン療法治療、カルシトニン、ビタミンＤ、カルシウム補給、ＰＴＨ（Ｆｏｒｔｅｏまたはテリパラチド、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙなど）、フッ化ナトリウム、ならびに／あるいはインスリン様増殖因子ＩおよびＩＩおよびトランスフォーミング増殖因子ベータなどの、骨に対する陽性効果を有する増殖因子と組み合わせることも可能である。当業者は、標準的療法投薬量パラメータを用いて、療法各々に関して許容される投薬量を決定可能であろうし、そして第二の剤の効果が相乗的である場合には、ＤＢＭおよび／またはＢＭＰの減少した投薬量を決定可能であろう。
【００３４】
図４は、本発明記載の１つの方法の流れ図を示す。方法のこの態様において、間充織幹細胞などの哺乳動物細胞を、患者または細胞ドナーから採取することも可能である（１００）。骨形成または修復が望ましい場所に細胞を注入するか、あるいはまず、少なくとも１つの剤（抽出されたＤＢＭ、ＢＭＰまたはタンパク質など）で処理して、骨形成または特異的骨芽細胞性分化を誘導することも可能である（１０２）。次いで、全身性に、または骨形成が望ましい、選択した部位などで、細胞を患者に投与することも可能である（１０４）。さらに、ＤＢＭおよびｎＢＭＰなどの骨形成を達成する少なくとも１つのさらなる剤単独、あるいは例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７もしくは他の造骨因子、またはＢＭＰ−２の造骨活性を増進するＢＰＰと組み合わせたもので、患者を局所的または全身性に処置することも可能である（１０６）。
【００３５】
図５ＡおよびＢは、本発明の２つの態様を示す。図５Ａにおいて、本発明は、表面を有する支持体（２０１）を含む、ｉｎ  ｖｉｖｏで使用するための移植片またはグラフト（２００）を含むことも可能であり、ここで、移植片表面の少なくとも一部には、抽出されたＤＢＭ、ｎＢＭＰおよび／またはＤＢＭ抽出から回収された非コラーゲン性タンパク質の抽出物（２０３）が、周囲組織中の骨形成、軟骨形成、または石灰化を誘導するのに十分な量で含まれ、そして移植片は、ＢＢＰおよび／またはＢＭＰを発現する造骨性細胞を含むことも可能である。移植片は、ピン、ねじ、プレートまたは人工関節の形に成形されていてもよく、この移植片を骨（２０２）と隣接させるかまたは接触させて配置してもよく、骨除去、骨折または他の骨傷害の部位（２０４）の形成または修復を刺激することによって、骨折を固定するか、骨形成を増進するか、または人工装具移植片を安定化させるために、これらを用いる。
【００３６】
図５Ｂに示すように、本発明はまた、骨（２０２）に隣接するかまたは接触した、抽出されたＤＢＭおよび／またはｎＢＭＰ含有組成物（２０６）のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ（コラーゲンまたは軟骨細胞の培養物上など）またはｉｎ  ｖｉｖｏ適用を含み、骨形成または石灰化が望ましい、骨除去、骨折または他の骨傷害の部位（２０４）で移植片（２００）を含むことも可能である。抽出されたＤＢＭ、ｎＢＭＰ、および／またはＤＢＭ抽出から回収された非コラーゲン性タンパク質の抽出物を、ＢＢＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−４、ＢＭＰ−７またはコラーゲン培養物などの他の剤と組み合わせて適用することも可能である。例えば：ヒトにおいて骨関連傷害を治療するため、幹細胞もまた、調べられてきている。健康な個体から病気の個体への骨芽細胞前駆体幹細胞の注入は、何人かの骨形成が不十分な患者において、骨密度を改善することが示されてきた。
【００３７】
図６は、本発明記載の１つの方法の流れ図を示す。例えば、当業者に知られる方法を用いて、骨からＤＢＭを得ることも可能である。ＤＢＭをアルカリ−尿素溶液中で抽出することも可能であり、そしてアルカリ−尿素−ＤＢＭ溶液を、約１０．５のｐＨなどに調整することも可能である。ＤＢＭをアルカリ−尿素溶液から分離することも可能であり、そして場合によって、当業者に知られる方法を用いて、生じたＤＢＭからｎＢＭＰを産生することも可能である。ＤＢＭまたはｎＢＭＰをさらに抽出して、造骨活性を持つ非コラーゲン性タンパク質を得ることも可能である。生じたＤＢＭまたはｎＢＭＰを、骨形成が望ましい部位でのｉｎ  ｖｉｖｏ移植などに用いることも可能である。
【実施例】
【００３８】
（実施例１）
ＤＢＭからＢＭＰ活性の増進剤または阻害剤を除去する潜在能力に関して、化学抽出を試験する、一連の研究を行った。１つのこうした処理は、アルカリ尿素での一晩抽出であり、これを用いて、タンパク質の正味荷電に基づいて、ＤＢＭからタンパク質を除去した。抽出されたＤＢＭの造骨活性を、等量の濃縮された抽出物が添加されているＤＢＭのものに比較した。
材料および方法
脱灰骨基質の産生。脱灰骨基質（ＤＢＭ）を、Ｕｒｉｓｔ（Ｕｒｉｓｔ，  Ｍ．Ｒ．，  Ｈｕｏ，  Ｙ．Ｋ．，  Ｂｒｏｗｎｅｌｌ，  Ａ．Ｇ．，  Ｈｏｈｌ，  Ｗ．Ｍ．，  Ｂｕｙｓｋｅ，  Ｊ．，  Ｌｉｅｔｚｅ，  Ａ．，  Ｔｅｍｐｓｔ，  Ｐ．，  Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ，  Ｍ．およびＤｅＬａｎｇｅ，  Ｒ．Ｊ．（１９８４）「ヒドロキシアパタイト・クロマトグラフィーによる、ウシ骨形成タンパク質の精製」Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ８１：３７１−３７５．  Ｕｒｉｓｔ，  Ｍ．Ｒ．「骨形成タンパク質の新たな概念」（１９９１）：Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ：  Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ中，  Ａ．Ｄ．  Ｄｉｘｏｎ，  Ｂ．Ｇ．  Ｓａｒｎａｔ、およびＤ．Ａ．Ｎ．  Ｈｏｙｔｅ（監修），  ｐｐ．１８９−１９８．（Ｃ．Ｒ．Ｃ．  Ｐｒｅｓｓ，  ボストン））に先に記載されるように調製した。簡潔には、新鮮な骨を清浄にし、粉砕し、プロテアーゼ阻害剤の存在下で水で洗浄し、１：１（ｖ／ｖ）クロロホルム：メタノールで脱脂し、０．６Ｍ  ＨＣｌで脱灰し、再び洗浄し、そして凍結乾燥した。
【００３９】
脱灰骨基質のアルカリ−尿素抽出。等体積の６Ｍ尿素および０．１Ｍ  ＫＯＨを添加することによって調製しておいた溶液中で、ＤＢＭを抽出した。この溶液のｐＨをＨＣｌで１０．５に調整し、そして２ｍＭ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）、０．１ｍＭベンズアミジンＨＣｌ、および０．０２％ＮａＮ３の溶液にした。この溶液中で、粉砕したＤＢＭを攪拌しながら低温中で一晩放置した。５リットル／ｋｇの比率を用いた。１Ｍ  ＫＯＨを用いて、溶液のｐＨを０．５時間、１時間、および４時間の時点で１０．５に調整したが、連続して調整はしなかった。翌日、デカントすることによって上清を除去し、そして次いで、残った固体物質を、プロテアーゼ阻害剤を含有する多量の水で、低温中で一晩洗浄し、そして続いて、ろ過によって収集し、そして凍結乾燥した。抽出された上清を収集し、そして２０体積の水に対して、低温中、４８時間の期間に渡って２回交換しつつ、透析した。６〜８ｋＤ分子量カットオフの透析チューブを使用した（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、カリフォルニア州ラグーナヒルのＳｐｅｃｔｒｏｐｏｒ）。透析した上清を、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＧＳＡローター（Ｋｅｎｄｒｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ、コネチカット州ニュータウン）中、１０，０００ｒｐｍで３０分間、４℃で遠心分離した。沈殿物および上清を別個に凍結乾燥した。続く実験には、水溶性分画を用いた。
【００４０】
造骨活性のｉｎ  ｖｉｖｏアッセイ。セプルベダ動物被験体委員会およびＶＡロサンゼルス郡研究および開発委員会によって認可されたｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを用いて、試験物質の造骨活性を試験した。５〜８週齢の雄ＮＩＨスイス−ウェブスター・ヌードマウスを用いた（Ｔａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ、ニューヨーク州ジャーマンタウン）。アッセイ前に、試験しようとするＤＢＭを、１００番および２０番の針金のふるいを通して、分類した。１５０〜８５０マイクロメートルの特定のサイズを持つ物質を、＃５ゼラチンカプセル中に入れ、そしてクロロホルム蒸気への曝露によって滅菌した。アッセイを行うため、小動物麻酔装置（ＶｅｔＥｑｕｉｐ、カリフォルニア州プレザントン）を通じて、２ｌ／分で、酸素中で送達される１％イソフルランを用いて、マウスを麻酔した。動物を手術台に固定し、そして後四半部上の毛皮を剃った。７０％エタノールで皮膚を清浄にし、そして後四半部に隣接した脊椎上で正中切開を行った。鋏での鈍的切開を用いて、一方の側の大腿四頭筋を暴露した。鋏の先端を用いて、筋肉中に小さな袋（ｐｏｕｃｈ）を作製し、そして試験物質を含有する＃５カプセルをこの袋に挿入した。次いで、３つの１１ｍｍ  Ｍｉｃｈｅｌ外科クリップで皮膚を閉じ、そして監視するため、動物をケージに戻した。２８日後、動物を屠殺し、そして後四半部を取り除いた。小部分Ｘ線キャビネット（Ｆａｘｉｔｒｏｎ、イリノイ州ウィーリング）を用いて、標本の放射線検査を達成した。次いで、標本を緩衝ホルマリンにいれ、そして組織学的検査のため、ルーチンのプロセシングに提出した。移植片は、２５ｍｇの出発物質ＤＢＭ、２５ｍｇの抽出されたＤＢＭ、または２５ｍｇの濃縮された水溶性抽出物を加えた２５ｍｇの抽出されたＤＢＭからなった。
【００４１】
電気泳動およびウェスタンブロッティング。標準的装置および製造者（ＢｉｏＲａｄ、カリフォルニア州ハーキュルス）に提供される使用説明書を使用して、非還元条件下のＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動およびウェスタンブロッティングを行った。Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（ミネソタ州ミネアポリス）から、ノギン／Ｆｃ組換えキメラタンパク質およびヤギ抗マウス・ノギンを得た。０．０７５μｇ／ｍｌの最終濃度で、一次抗体を用いた。二次抗体は、アルカリホスファターゼにコンジュゲート化されたロバ抗ヤギＩｇＧであり、そしてこれを１：２５００希釈で用いた（Ｐｉｅｃｅ、イリノイ州ロックフォード）。Ｐｉｅｒｃｅ（イリノイ州ロックフォード）からの抑制因子試薬とともに、ＢＣＩＰ／ＮＢＴを用いて、発色を達成した。
【００４２】
ＤＢＭ出発物質、抽出されたＤＢＭ、および抽出物の相対的ノギン含量を決定するため、４００μｌのＬａｅｍｍｌｉ試料緩衝液を５０ｍｇの各物質に添加した。試料を煮沸し、勢いよく混合し、そして遠心機中で簡単に回転させた。約２．５ｍｇの物質に相当する、２０μｌのアリコットを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって分離した。平行してゲルを泳動し、そして等量が装填されたことを確かめるため、クーマシーブルーで染色した。
結果
ＤＢＭの造骨活性に対する抽出物の影響。図１および２は、ＤＢＭの造骨活性に対する、等量（２５ｍｇ）の水溶性抽出物の影響を放射線学的に示す。図１に示す結果は、ＤＢＭ出発物質（図１、左側の２標本）および抽出されたＤＢＭ（図１、右側の２標本）の造骨活性を確認し、そして比較する。ＤＭＢおよび抽出されたＤＭＢは、石灰化の広い領域に見られうるように、どちらも、異所性骨形成を誘導した（矢印で示す）。組織学的検査によって、石灰化が、造骨性の骨形成と関連し、そして単にジストロフィー性石灰化でないことが確認された。
【００４３】
図２に示す結果は、抽出されたＤＢＭの造骨潜在能力に対する水溶性抽出物の影響を示す。抽出されたＤＢＭ（２５ｍｇ）およびアルカリ−尿素抽出物の水溶性分画（２５ｍｇ）の両方を含有する４つの移植片のいずれにも、異所性骨形成はまったく観察されなかった（図２、４つの標本すべて）。
【００４４】
水溶性抽出物中の、ＢＭＰ阻害剤、ノギンの存在の立証。図３は、抗マウス・ノギン一次抗体を用いて発色させた、ＤＢＭ、抽出されたＤＢＭ、抽出物、および組換えノギン／Ｆｃキメラタンパク質のウェスタンブロットを示す。ノギン／Ｆｃキメラタンパク質のＭｒは６０ｋＤであり、一方、天然（二量体）ノギンの期待されるＭｒは６４ｋＤである（Ｓｍｉｔｈ，  Ｗ．Ｃ．ら（１９９３）「分泌されたノギンタンパク質は、ゼノパス属中胚葉の背側化において、シュペーマン・オーガナイザーを模倣する」Ｎａｔｕｒｅ  ３６１：５４７−５４９）。本研究は、ＤＢＭ出発物質（図３、レーンＣ）および特に抽出されたＤＢＭ（図３、レーンＢ）におけるよりはるかに高いレベルで、一般的に、ＤＢＭのアルカリ−尿素抽出物の水溶性分画（図３、レーンＡ）に、ＢＭＰ活性の既知の阻害剤であるノギンが存在することを確認する。
【００４５】
本明細書は本発明の特定の態様を記載するが、一般の当業者は、本発明の概念から逸脱することなく、本発明のバリエーションを考案可能である。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】図１は、ＤＢＭ（左）または抽出されたＤＢＭ（右）を２５ｍｇ移植した２８日後のヌードマウスの後四半部のＸ線写真である。標本すべてにおいて、異所性骨形成が観察される（矢印を参照されたい；大腿上部の不透明性が増加した領域に注目されたい）。
【図２】図２は、抽出されたＤＢＭ  ２５ｍｇに加えてアルカリ−尿素抽出物の水溶性分画を２５ｍｇ移植した２８日後のヌードマウスの後四半部のＸ線写真である（矢印は、移植部位を示す；濃縮された抽出物中の物質が、ＤＢＭの造骨潜在能力を阻害している）。
【図３】図３は、各試験物質２．５ｍｇに相当するタンパク質中のノギン検出のためのウェスタンブロットである。レーンＡ：ＤＭＢのアルカリ−尿素抽出物の水溶性分画；Ｂ：アルカリ−尿素で抽出されたＤＢＭ；Ｃ：未処理ＤＢＭ；Ｄ：１μｇの組換えノギン／Ｆｃキメラタンパク質（ノギンは、抽出物および未処理ＤＢＭ中に存在するが、処理されたＤＢＭ中には存在しない。矢印は、６４ｋＤの期待されるＭｒを持つ、レーンＤ中の組換えノギンを指す。レーンＡ、Ｂ、またはＣ中に見られる天然ノギンは、６０ｋＤのＭｒを有すると期待される）。
【図４】図４は、本発明の１つの方法の流れ図である。
【図５】図５ＡおよびＢは、本発明の２つの態様の略図である。
【図６】図６は、本発明の１つの方法の流れ図である。
【図１】
2008540328.tif 000003
【図２】
2008540328.tif 000004
【図３】
2008540328.tif 000005
【図４】
2008540328.tif 000006
【図５Ａ】
2008540328.tif 000007
【図５Ｂ】
2008540328.tif 000008
【図６】
2008540328.tif 000009
【国際調査報告】
2008540328.tif 000010
2008540328.tif 000011
2008540328.tif 000012