(57)【要約】  本発明は、第１の観点においては、（ａ）１又は複数のポリマーと、少なくとも１つの分子篩とを接触せしめ；そして任意には、（ｂ）前記分子篩からポリマーを単離することにより、前記ポリマーにおける選択された成分の含有率を調節するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）１又は複数のポリマーと、少なくとも１つの分子篩とを接触せしめ；そして任意には、
（ｂ）前記分子篩からポリマーを単離することにより、前記ポリマーにおける選択された成分の含有率を調節するための方法。
【請求項２】
前記調節されるべき成分が、原子、分子、イオン又は化合物である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記成分がイオンである請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記イオンが二価イオンである請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記二価イオンがCa2+である請求項４記載の方法。
【請求項６】
前記成分が、前記ポリマーを含んで成る液体から除去されるか又は部分的に除去される請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記成分が、前記ポリマーから除去されるか又は部分的に除去される請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記成分が、もう１つの成分により交換される請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記生成物における成分バランスが調節される請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記Ca2+が、もう１つの成分により交換される請求項５記載の方法。
【請求項１１】
前記Ca2+が、ナトリウムにより交換される請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記Ca2+が、ナトリウムにより交換され、そして前記ポリマーにおけるナトリウム形に対するカルシウム形の比率が調節される請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記ポリマーが、生ポリマーである請求項１〜12のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
前記生ポリマーが多糖である請求項13記載の方法。
【請求項１５】
前記多糖が、グルコサミノグリカンである請求項14記載の方法。
【請求項１６】
前記グリコサミノグリカンが、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸、及びケラチン硫酸又はそれらの誘導体を含んで成る請求項15記載の方法。
【請求項１７】
前記分子篩がゼオライトである請求項１〜16のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
前記ゼオライトが、タイプ４ゼオライトを含んで成る請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記分子篩の孔がナトリウムイオンを含む請求項１〜18のいずれか１項記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマーと前記分子篩との接触が、ｉ）懸濁又は混合；ii)分子篩の充填された、沈殿された、拡張された又は流動化された層を通してのポリマー担持の液体の通過；又はiii)身体供給材料、プレ−被膜又は濾過への助力として使用される分子篩との接触により提供される請求項１〜19のいずれか１項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１又は複数のポリマーにおける選択された成分の含有率を調節するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景：
ポリマー類及びそれらの誘導体は、広範囲の用途に使用される。食品、化粧、医学及び医薬産業に適用され得る生ポリマーが特に興味の対象である。それらの種々の用途を満たすためには、所望しない成分を除去し、そしてさらに、最終生成物における成分のバランスを調節するためにポリマーを精製することがしばしば必要である。
【０００３】
身体中の最も豊富なヘテロ多糖は、グリコサミノグリカンである。グリコサミノグリカンは、反復する二糖単位からなる枝なしの炭水化物ポリマーである（ケラタン硫酸のみが炭水化物のコアー領域において枝分かれされている）。二糖単位は一般的に、第１のサッカリド単位として、２種の変性された糖、すなわちN−アセチルガラクトサミン（GalNAc）又はN−アセチルグルコサミン（GlcNAc）の１つを含んで成る。第２の単位は通常、ウロン酸、例えばグルクロン酸（GlcUA）又はイズロネートである。
【０００４】
グリコサミノグリカンは負に荷電された分子であり、そして溶液において高い粘度を付与する拡張されたコンホメーションを有する。グリコサミノグリカンは、細胞の表面上に又は細胞外マトリックスに位置する。グリコサミノグリカンはまた、溶液において低い圧縮性を有し、そして結果として、生理学的潤滑液、例えば関節として理想的である。グリコサミノグリカンの剛性が、細胞に構造的に結合性を付与し、そして細胞間に通路を提供し、細胞移動可能にする。最高の生理学的に重要なグリコサミノグリカンは、ヒアルロナン、コンドロイチン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、デルマタン硫酸及びケラタン硫酸である。ほとんどのグリコサミノグリカンは、特定のオリゴ糖構造を通してプロテオグリカンコアータンパク質に共有結合する。ヒアルロナンは、一定のプロテオグリカンと大きな凝集体を形成するが、しかし遊離炭水化物鎖がプロテオグリカンと非共有複合体を形成する場合、例外である。
【０００５】
身体中でのヒアルロナンの多くの役割は同定されている（Laurent T. C. and Fraser J. R. E. , 1992, FASEB J. 6: 2397-2404; 及び Toole B. P. , 1991, "Proteoglycans and hyaluronan in morphogenesis and differentiation."In : Cell Biology of the Extracellular Matrix, pp. 305-341, Hay E. D. , ed., Plenum, New Yorkを参照のこと）。ヒアルロナンは、硝子軟骨、滑膜関節液及び皮膚組織（真皮及び表皮の両者）に存在する。ヒアルロナンはまた、多くの生理学的機能、例えば付着、成長、細胞運動性、癌、脈管形成及び創傷治癒における役割を有すると思われる。ヒアルロナンのユニークな物理的及び生理学的性質のために、それは眼及び関節の手術に使用され、そして他の医学的方法においても評価される。
【０００６】
HAは、多くの組織、例えば皮膚、腱、筋肉及び軟骨の細胞のための機械的な支持体として、生物において重要な役割を演じ、すなわちそれは、細胞内マトリックスの主成分である。HAはまた、生物学的工程、例えば組織の保湿及び湿潤において他の重要な部分を演じている。
HAは、上記天然の組織から抽出され得るが、但し今日、感染剤の移行の可能性ある危険性を低め、そして生成物の均等性、品質及び利用性を高めるために、微生物学的方法により、それを調製することが好ましい。
【０００７】
HA及びその種々の分子サイズ画分、及びそれらのそれぞれの塩は、特に関節症の処理における薬剤として、特に眼科学及び美容外科における天然の器官及び組織のための助剤及び/又は置換剤として、及び化粧製品における剤として使用されて来た。ヒアルロナンの生成物はまた、整形外科、リウマチ学及び皮膚学への使用のためにも開発されて来た。
HAはまた、衛生及び手術製品のために使用される種々のポリマー材料、例えばポリウレタン、ポリエステル、等のための、それらの材料を生物適合性にする効果を有する添加剤としても使用され得る。
【０００８】
生ポリマー使用法、特にHA使用法及びそれらの誘導体（それらのいくつかは上記に言及されている）の多様性、及び医薬組成物又は手術製品及び特定の用途のために製造された製品におけるHAの頻繁な使用のために、最終製品における他の汚染性成分を実質的に有さない高純度のHA製品を供給する必要がしばしばある。ポリマー、特にHA中の非ポリマー含有率及びイオン組成もまた重要である。しばしば、HA中のナトリウム塩は、最も生物適合形として好ましく、そして他のHA塩（Fe, Ca, Cu, Zn, Al, Mg, Mn）、特にHA中のCa2+塩は回避される。
【０００９】
しかしながら、一定の用途においては、HAのもう１つの塩を好むか、又はカウンターイオンの調節されたバランスを創造することが所望される。例えば、カルシウムの調節されたレベルが創傷保護用途において実際、所望され、調節された亜鉛レベルが足の潰瘍（Diabetologia Croatica 30-3, 2001）を攻撃するために及び抗菌性質（Acta Pharm Hung. 2002; 72(1): 15-24）のために提案されており；そして調節されたイオンレベルが時々、いくつかのタイプのヒアルロン酸ゲルにおける流動学的性質を調節するために使用されており（CN 1473572A；WO95/04132号）、そして低い鉄レベルはしばしば、HAポリマーの分解に対する敏感性を低めるために所望する。
【００１０】
従来、主にナトリウム塩形を有し、そして低いか又はCa2+をまったく有さず、そして低いか又はまったく他の金属イオン含有物を有さないポリマー、例えばHAが、発酵工程段階の間、及び続く精製段階の間、カルシウム及び他の所望しないイオンの存在を注意して回避することにより供給されて来た。所望するイオンバランスは従来、例えばナトリウム塩、例えば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、等の添加から、高ナトリウムイオン濃度の環境を、まず創造することにより達成される。次に、HA分子から生成されるカルシウムイオンは、HA分子から除去され得るか、又は逆に、広範囲の従来のポリマー単離方法のいずれかにより除去され得る。
【００１１】
最も通常には、ポリマー又は特にHAは、化学的に、及び/又は有機溶媒、例えばエタノール、イソプロピルアルコール、アセトン、クロロホルム、CETAB、等を添加し、それにより、上清液において生成され、そして所望しないイオンを除去することにより、沈殿されるか又は結晶化され得る（CZ 9700350号; WO 84/ 03302号; EP 0694616A2号 及びEP 0144 019号は、この方法のいくつかの例である）。生成されるイオンはまた、ダイアフィルトレーション技法の限外濾過により、ポリマーから分離され得る（WO 95/04132号; GB2249315A号）。水性抽出及び他の通常のポリマー分離技法を使用することもまた可能である。
【００１２】
ポリマーからの所望しない成分、しばしばCa2+を置換するための他の方法は、金属イオン封鎖剤、例えばEDTA、リン酸塩（CN85103674A号）、等による金属イオン封鎖、又はイオン交換吸着樹脂の適用（EPO694616A2号）を包含する。
【００１３】
上記技法における固有の欠点は、選択された方法及び使用される活性剤に依存して、次のようなことである：反復された適用（例えば、反復された沈殿及び再懸濁又は広範囲のダイアフィルトレーション）が所望するバランスを達成するために必要とされ；そして/又は成分選択性は不良であり；そして/又は成分の容量は不良であり；そして/又は置換又は金属封鎖効率は低く；そして/又は工程が、除去するのが困難であり、そして/又は毒性である他の成分を導入し；そして/又は工程の流れの条件が、所望する成分バランスを達成するのに操作される必要がある。
【００１４】
従って、ポリマーに関連する成分のバランスを操作するための他の方法が、最終ポリマー生成物における成分バランスを調節する従来の手段についての上記困難性のために、所望される。本発明は、さらに、記載されるであろういくつかの利点を提供するような方法を提供する。
【発明の開示】
【００１５】
発明の要約：
本発明は、第１の観点においては、
（ａ）１又は複数のポリマーと、少なくとも１つの分子篩とを接触せしめ；そして任意には、
（ｂ）前記分子篩からポリマーを単離することにより、前記ポリマーにおける選択された成分の含有率を調節するための方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の特定の記載：
本発明は、所望しないか又は選択された成分を、除去するか又はより所望の成分により置換し、そして/又はポリマーに関連する成分のバランスを操作することにより、ポリマーから前記成分の含有率を調節するための方法を提供する。成分の除去又は操作は、ポリマー生成物と適切な分子篩とを、成分を除去するか又は交換するか、又は成分バランスを操作するのに十分な時間、接触することにより実施される。いくつかの用途においては、分子篩をポリマー生成物から除去することが便利であり；しかしながら、所望には、分子篩がポリマーから分離され得る。
【００１７】
用語“ポリマー”とは、本明細書においては、多くの反復する小さな化学単位又は分子から製造される物質である。ポリマーは天然又は合成のものであり得る。
用語“ポリマー”はまた、本明細書においては、液体ポリマー、又はポリマーの懸濁液を含んで成る。
【００１８】
除去されるか又は操作されるべき“成分”は、原子、分子、イオン又は化学物を含んで成る。
本明細書においては、表現“調節”とは、ポリマー、又はポリマー担持の液体からの成分の除去（完全に又は部分的に）、交換及び/又は成分の含有率の平衡化を意味する。
【００１９】
ポリマー及び/又はポリマー担持の液体に関連する成分を調節し、減じ又は選択することが所望される多くの用途が存在する：
i)例えば、生物適合性に関しては、ナトリウム形でのヒアルロン酸が好ましい。さらに、特定の用途に関する制限がしばしば所望され、例えばカルシウム含有ポリマーはそれ自体不溶性であり（例えば、アルキン酸カルシウム）、又は通常のリン酸緩衝液において問題のある沈殿を創造し、又は活性成分又は配合化学物質との不良な反応を創造する。逆に言えば、いくつかの用途において、カルシウムの調節されたレベルが、創傷保護製品についてのアルギン酸塩において特定されている。Fe, Ca, Cu, Zn, Al, Mg, 他のイオン及び他の成分も同様である。
【００２０】
ii)イオン含有率及びイオン型はポリマーの粘度及び他の性質に影響を及ぼし；他の成分に対しても同様である。イオン含有率は、例えば亜鉛含有ヒドロゲルの創造のために、注意して且つ正確に調節されるべきである。
iii)ポリマーを不安定化する分子、例えばFe及びCuは、除去され、調節され、又はもう１つの低い有害性のイオンにより置換され得る。
iv)ポリマー生成物はしばしば、臭気又は色彩分子の除去を必要とする。
【００２１】
本発明は、成分バランスの操作のための従来の適用される方法よりも多くの利点を提供する。本発明の分子篩は、製造工程のいずれかの点で、例えばポリマー生成物の製造の間又はその後−処理として、原料に適用され得る。さらに、前記工程の条件、例えばpH、温度、ポリマー濃度、等は、他の従来の適用される方法におけるほど決定的ではない。
【００２２】
分子篩は、特定の成分又は成分グループに対して高い選択性であり得る。反応の平衡は通常、急速に達成され、これは、ポリマーに関連する成分バランスに関して、生成物特徴のより早い加工及びより接近した調節を意味する。分子篩は、操作されるべき成分についての高い能力を示し、そして従って、一般的に単一の分子篩処理についての必要性が存在する。従来の固体−液体分離方法による分子篩の単純な添加、接触及び続く除去は、専用装置の必要性がなく、そして可溶性反応物又は添加物を続いて除去する必要性が無いことを意味する。
【００２３】
さらに、工程を単純化する、ポリマー溶液における分子篩を除去することが可能である。工程の費用はまた、本発明の方法が、最後の生成物において所望しない成分を含む原料の上流段階、例えば脱イオン水の代りに、発酵及び希釈のための水道水（Ca2+含有）における使用を可能にするので、低められ得る。さらに、分子篩はしばしば、直接的にプレ−平衡化又はプレ−処理についての必要性を伴わないで添加され得る。分子篩は一般的に、毒性において低い。
【００２４】
高分量汚染物/不純物：
本発明の方法はポリマー生成物からの成分の除去のために適用されるので、成分はさらに、下流の精製段階についてのいずれの問題をも引起さないで、上流の加工段階において添加され得る。
本発明の方法は便利には、ポリマー生成物からのカルシウムの除去のために適用されるので、Ca2+は、下流の精製段階についてのいずれの問題をも引起さないで、上流の加工段階において添加され得る。
【００２５】
カルシウム又は他の二価塩の添加は、初期精製転換における凝集により、高分子量の汚染物/不純物の除去を可能にし；興味あるグルコサミノグリカンの細胞フリー調製物からそれらの不純物を除去することもまた可能である。これは、さらに、WO2004/001054号に記載されている。成分、特に上流の加工段階の間、カルシウムの添加の可能性が、従来の方法に比較して、本発明のさらなる利点を構成する。
【００２６】
上記利点は、
（ａ）１又は複数のポリマーと、少なくとも１つの分子篩とを接触せしめ；そして任意には、
（ｂ）前記分子篩からポリマーを単離する段階を含んで成る、前記ポリマーからの選択された（しばしば、所望しない）成分の含有率を調節するための方法により提供される。
【００２７】
本明細書において“選択された成分の含有率の調節”とは、成分の除去（完全に又は部分的に）、及び/又はより所望の成分による前記成分の置換（交換）、及び/又はポリマー又はポリマー担持液体に関連する成分のバランスの操作を意味する。
【００２８】
本明細書における“分子篩”とは、小さな分子から大きな分子を分離することに使用され得る、分子サイズの孔を有する材料を意味する。それらは、ゼオライト、炭素分子篩、シリカゲル、活性化されたアルミナを包含するが、但しそれらだけには限定されない。典型的には、分子篩は、一定サイズ以下の分子のみの侵入を可能にする窓を有するケージ様構造を創造する格子構造を有する。異なった材料源及び異なった構造条件を用いることにより、異なったアクセス寸法の広範囲の分子篩を生成することが可能である。前記寸法は、特定の篩の結晶構造に由来するので、その特定の分子篩のためにしばしば規則通りであり得る。
【００２９】
異なった分子篩により許容されるいくつかの分子の例は、分子篩に対するさらなる詳細として、表17.3"Classification of Some Molecular Sieves" from Chemical Engineering, Volume 2, 4th Edition ; JM Coulson and JF Richardson; Pergamon Press, 1991に与えられている。分子篩の適切な構造及び性質のより包括的なデータベースは、International Zeolite Association (http://www.iza-online.org/) at (http://www.iza-structure.org/databases/)により提供されている。分子篩についての適切な基本的テキストは、次のものを包含する：DW Breck: Zeolite Molecular Sieves, Wiley, New York, 1974; RM Barrer, Hydrothermal Chemistry of Zeolites, Academic Press, 1982; Intro to Zeolite Science and Practice, H van Bekkum, EM Flannigen, PA Jacobs and JC Jansen, Studies in Surface Science, Vo1 137, 1-1060, (2001) Elsevier, Amsterdam。
【００３０】
特定の態様においては、分子篩はゼオライトである。ゼオライトの従来の定義は、結晶性、多孔性アルミノシリケートである。しかしながら、従来のゼオライトと実質的に同一であるが、しかし珪素及びアルミニウム以外の要素を有する、酸化物構造から成る材料のいくつかの比較的最近の発見が前記定義を拡張している。ほとんどの研究者は現在、ゼオライトのそれらの定義における高い結晶度のために、十分に定義された孔構造を有する実質的にすべてのタイプの多孔性酸化物構造を包含する。
【００３１】
本明細書においては、上記すべては、用語“ゼオライト”に包含される。我々がゼオライトと呼ぶそれらの結晶性材料においては、金属原子（従来、珪素又はアルミニウム）が、中心での金属カチオン及び４つの先端での酸素アニオンから成るおおよその四面体を形成するために、４つの酸素アニオンにより囲まれている。その四面体金属は、T−原子と呼ばれ、そして次にそれらの四面体は規則的な配置で積層し、チャネルが形成される。生じる積層についての可能な手段は実質的に無限であり、そして数百のユニーク構造が知られている。
【００３２】
ゼオライトチャネル（又は孔）は顕微鏡的に小さく、そして実際、それらは“分子篩”としばしば呼ばれる分子サイズの寸法を有する。そのチャネルのサイズ及び形状は、吸着工程のためにそれらの材料の性質に対して意外な効果を有し、そしてこの性質が分離工程へのそれらの使用を導く。成分は、孔におけるそれらの可能な配向に関連する形状及びサイズの効果を通して、及び/又は吸着の強度の差異により分離され得る。従って、成分は選択的に除去され得る。
【００３３】
珪素は典型的には、４＋酸化状態で存在するので、珪素−酸素四面体は電気的に中性である。しかしながら、ゼオライトにおいては、アルミニウムは典型的には、３＋酸化状態で存在し；その結果、アルミニウム−酸素四面体は、電気的に欠失する１つの電子である中心を形成する。従って、ゼオライト骨格は典型的にはアニオン性であり、そして荷電を補足するカチオンが電気的中性を維持するために孔中に存在する。
【００３４】
本発明の特定の態様においては、分子篩は、ゼオライト群から選択され、ここで材料の多孔度は除去される成分と適合でき、さらなる態様においては、材料の多孔度はCa2+と適合でき；さらなる態様においては、電気的中性を維持するためにゼオライト孔に存在するイオンはポリマー生成物における所望されるそれらの孔であり；さらなる態様においては、ナトリウムジョンは、電気的中性を維持するためにゼオライト孔に存在するイオンである。
【００３５】
“タイプ４”として従来分類されているそれらの分子篩は、約0.4nmのリンデ篩４A寸法を有するカルシウムイオンの金属イオン封鎖のために適切な分子篩寸法を有する。多くのそれらの分子篩は、電気的中性を維持するためにゼオライト孔中に存在するナトリウムイオンを有する。
本発明の特定の態様においては、ゼオライトはタイプ４ゼオライトである。さらなる態様においては、分子篩の孔はナトリウムイオンを含む。
【００３６】
本発明の１つの態様においては、ポリマーは生ポリマーである。“生ポリマー”とは、生物系において形成されるいずれかのポリマー物質（例えば、多糖類、タンパク質、核酸類、等であるが、但しそれらだけには限定されない）である。通常の生ポリマーの次の多くの例が存在するが、但しそれらだけには限定されない：キトサン、グルカン、ケラチン、セルロース、ゼラチン、グリコサミノグルカン及びすべてのそれらのポリマーの誘導体。
特定の態様においては、生ポリマーは多糖であり、そしてさらに特定の態様においては、多糖はグリコサミノグリカンである。
【００３７】
グリコサミノグリカン：
本発明によれば、グリコサミノグリカンは、少なくとも700ドルトンの分子量；好ましくは少なくとも10,000ドルトンの分子量；より好ましくは少なくとも20,000ドルトンの分子量；さらにより好ましくは少なくとも30,000ドルトンの分子量を有するいずれかの炭水化物ポリマーであり得る。
【００３８】
好ましいグルコサミノグリカンは、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、コンドロイチン（非硫酸）、ヘパリン、ヘパリン硫酸、デルマタン硫酸及びケラチン硫酸である。ヒアルロン酸は、15,000,000ドルトンまでの分子量を有する直鎖を形成するために、D−グルクロン酸及びN−アセチル−D−グルコサミンの交互及び反復単離により構成される。
本発明の好ましいグルコサミノグリカンは、700〜15,000,000ドルトンの分子量を有するグルコサミノグリカンである。
【００３９】
本出願及び請求項における用語“ヒアルロン酸”とは、その酸形又はその塩形、例えばヒアルロン酸ナトリウム、ヒアルロン酸カリウム、ヒアルロン酸マグネシウム、ヒアルロン酸カルシウム、又は他のものの形でのヒアルロン酸を意味する。
用語“ヒアルロン酸”とは、細胞表面、脊椎贓物の結合組織の塩基性細胞外物質、関節の滑液、眼の眼内流体、ヒト臍帯組織及び鶏冠において天然において存在する、D−グルクロン酸及びN−アセチル−D−グルコサミン酸の残基により構成される、異なった分子量を有する酸性多糖類を意味するために文献において使用される。
【００４０】
用語“ヒアルロン酸”とは、種々の分子量を有するD−グルクロン酸及びN−アセチル−D−グルコサミン酸の交互の残基、又はその分解された画分を有する一連の多糖類を意味するものとして実際使用され、そして従って、“ヒアルロン酸”の複数用語を用いることが、より正しいと思われる。しかしながら、単一用語は、この記載においてすべて同じに使用され；さらに、略語“HA”は時折、この集合的な用語の代わりに使用されるであろう。
生ポリマー、例えばグルコサミノグルカンは、動物組織から、又はより好ましくは、生ポリマーを発現する宿主細胞を培養することにより供給され得る。
【００４１】
発酵ブイヨン：
グリコサミノグリカンは、いずれかの発酵ブイヨンから得られる。さらに、グリコサミノグリカンは、宿主細胞を培養することを含んで成る方法により生成できるグリコサミノグリカンである。
【００４２】
宿主細胞は好ましくは、微生物であり得る。前記微生物は、単細胞微生物、例えば原核細胞、又は非単細胞微生物、例えば真核細胞であり得る。有用な単細胞微生物は、細菌細胞、例えばグラム陽性細菌、例えばバチルス細胞、例えばバチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ファーマス（Bacillus firmus）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウス（Bacillus megaterium）、バチルス・プミラス（Bacillus pumilus）、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）及びバチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）；又は例えばストレプト細胞、例えばストレプトミセス・リビダンス（Streptomyces lividans）又はストレプトミセス・ムリナス（Streptomyces murinus）：又はグラム陰性細菌、例えばE. コリ又はシュードモナス sp.であるが、但しそれらだけには限定されない。
【００４３】
特定の態様においては、細菌宿主細胞は、バチルス・レンタス細胞、バチルス・リケニホルミス細胞、バチルス・ステアロサーモフィラス細胞又はバチルス・サブチリス細胞である。組換え発現のために特に適合された変異体バチルス・サブチリスが、WO98/22598号に記載されている。
【００４４】
宿主細胞は、真核細胞、例えば哺乳類細胞、昆虫細胞、植物細胞又は菌類細胞である。有用な哺乳類細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞、HeLa細胞、子供ハムスター腎臓（BHK）細胞、COS細胞、又は例えばAmerican Type Culture Collectionから入手できるいずれかの数の他の不滅化された細胞系を包含する。形質転換方法、選択マーカー遺伝子及び発現構造体のいずれか他の部分は、当業者に良く知られ且つ入手できるそれらから選択され得る。
【００４５】
宿主細胞は菌類細胞であり得る。“菌類”とは、本明細書において使用される場合、門アスコミコタ（Ascomycota）、バシジオミコタ（Basidiomycota）、キトリジオミコタ（Chytridiomycota）及びヅイゴミコタ（Zygomycota）、及びオーミコタ（Oomycota）、並びに栄養胞子菌を包含する。アスコミコタの代表的グループは、例えばニューロスポラ（Neurospora）、ユーペニシリウム（Eupenicillium）(＝ペニシリウム)、エメチセラ（Emericella）(＝アスペルギラス)、ユーロチウム（Eurotium）（＝アスペルギラス）及び下記に列挙される真の酵母を包含する。
【００４６】
バシジオミコタの例は、マッシュルーム、サビ菌及び黒穂菌を包含する。キトリジオミコタの代表的グループは、例えばアロミセス（Allomyces）、ブラストクラジエラ（Blastocladiella）、コエロモセトウス（Coelomocetous）、水性菌（水カビ）、例えばアキリア（Achlya）を包含する。栄養胞子菌類の例は、アスペルギラス、ペニシリウム、カンジダ及びアルテマリアを包含する。ズイゴミコタの代表的な例は、例えばリゾパス及びムコルを包含する。
【００４７】
菌類宿主細胞は、酵母細胞であり得る。“酵母”とは、本明細書において使用される場合、子嚢胞子酵母（Endomycetals）、担子胞子酵母、及び不完全菌類（Blastomycetes）に属する酵母を包含する。子嚢胞子酵母は、科スペルモプソラセアエ（Spermophthoraceae）及びサッカロミセタセアエ（Saccharomycetaceae）に分けられる。後者は４種の亜科シゾサッカロミコイデアエ（Schizosaccharomycoideae）（例えば、属シゾサッカロミセス）、ナドソニオイデアエ（Nadsonioideae）、リオキコイデアエ（Lipomycoideae）及びサッカロミコイデアエ（Saccharomycoideae）（例えば、属ピチア、クルイベロミセス及びサッカロミセス）から成る。
【００４８】
担子胞子酵母は、属リューコスポリジム（Leucosporidim）、ロドスポリジウム（Rhodosporidium）、スポリジオポラス（Sporidiobolus）、フィロバジジウム（Filobasidium）及びフィロバシジエラ（Filobasidiella）を包含する。不完全菌類に属する酵母は、２種の科スポロボロミセタセアエ（Sporobolomycetaceae）（例えば、属サロボロミセス及びブレラ）及びクリプトコカセアエ（Cryptococcaceae）（例えば、属カンジダ）に分けられる。
【００４９】
もう１つの態様においては、菌類宿主細胞は、糸状菌細胞である。“糸状菌”は、ユーミコタ及びオーミコタのすべての糸状形を包含する。糸状菌は一般的に、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン及び他の複合多糖類から構成される菌子体壁により特徴づけられる。成長増殖は、菌子拡張によってであり、そして炭素代謝は絶対好気性である。対照的に、酵母、例えばサッカロミセス・セレビシアエによる成長は、単細胞葉状体の発芽によってであり、そして炭素異化は発酵性であり得る。より特定の態様においては、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギラス、フサリウム、ヒューミコラ、ムコル、マイセリオプソラ、ニューロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラジウム及びトリコダーマ（但し、それらだけには限定されない）の種の細胞である。
【００５０】
菌類細胞は、それ自体知られている態様での、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、及び細胞壁の再生を包含する方法により形質転換され得る。
【００５１】
興味あるグリコサミノグリカンを生成する微生物は、当業界において知られている方法を用いて、グルコサミノグリカンの生成のために適切な栄養培地において培養される。例えば、微生物は、実験室又は産業用発酵器において、振盪フラスコ培養、小規模又は大規模発酵（連続、バッチ、供給−バッチ又は固体状態発酵を包含するが、但しそれらだけには限定されない）により培養され得る。培養は、当業界において知られている方法を用いて、炭素及び窒素源、及び無機塩を含んで成る適切な栄養培地において行われる。適切な培地は、商業的供給者から入手できるか、又は公開された組成（例えば、ATCCのカタログにおける）に従って調製され得る。微生物において生成されるグリコサミノグリカンの生成の例として、WO2003/054163号は、バチルス宿主細胞におけるヒアルロン酸の生成を記載する。
【００５２】
上記で言及されたように、所望する成分バランスを有する精製されたグリコサミノグリカン、例えばナトリウム塩形でのヒアルロン酸の生成のための従来の方法は、下記を包含する：
−ナトリウムイオンに富んでいる環境下でのポリマーの沈殿；
−ナトリウムイオンに富んでいる環境下での結晶化；
−リン酸塩による、及びナトリウムイオンに富んでいる環境の適用による所望しない成分の沈殿；
−ナトリウムイオンに富んでいる環境下での透析又はダイアフィルトレーション；
−金属イオン封鎖及びナトリウムイオンに富んでいる環境の適用；及び
−ポリマー精製のための他の従来の手段。
【００５３】
カルシウムを除去するための既知方法に関連する１つの問題は、それらがほとんど常に、さらなる加工段階により除去される必要がある可溶性汚染物を導くことである。さらに、それらの方法はしばしば、続いて生成物からの除去が困難であり、そして最終用途に対して毒性であるか又は有害であり得る化学沈殿物又は他の酸を利用する。これは、過剰のナトリウムイオンの存在下でのカルシウムの競争的置換において事実である。置換されたカルシウム及び過剰のナトリウムカウンターイオンが除去される必要がある。それは、また金属イオン封鎖剤、例えばEDTAを用いる場合である。EDTAは続いて除去されるべきである。また、リン酸塩によるカルシウムイオンの沈殿は、除去されるべき過剰の沈殿剤、及び形成される沈殿物を必要とする。
【００５４】
そのような加工段階は、反応平衡は、可溶性成分の濃度が変化するにつれて変化し、反応平衡はしばしば比較的低く、操作されるべき成分についての能力はしばしば比較的低く、技法は単に狭い範囲の加工条件（例えば、pH、イオン強度、ポリマー濃度、等）に対して作動するので、調節するのに容易ではない。さらに、それらはしばしば、時間の浪費であり、そして１回以上の適用を必要とし、生成物を分解に対して敏感にし、そして生成物における成分バランスを調節するのに選択的又は効果的手段ではない。
【００５５】
本発明によれば、変性されるべきポリマー又はポリマー担持液体と適切なタイプの分子篩とを、適切な条件下で接触し；そして必要なら、前記ポリマーから分子篩を分離する段階を含んで成る方法が提供される。変性されるべき前記ポリマー担持液体と分子篩との間の接触は、多くの次の手段（但し、それらだけには限定されない）のいずれかにより達成され得る：
【００５６】
・単純な懸濁又は一緒での混合、
・充填され、沈降され、振盪され、流動化された分子篩の層を通しての前記ポリマー担持液体の通過、
・身体供給材料、プレ−被膜、又は濾過への助力として使用される分子篩との接触。
ポリマー生成物における所望する成分バランスを達成するために必要とされる分子篩のタイプ、量及び接触条件は、当業者において単純に決定され得る。
【００５７】
本発明に従って除去されるか又は操作されるべき成分は、原子、分子、イオン又は化合物を包含する。特定の分子篩タイプにより除去され得る成分の例は、表17.3 "Classification of Some Molecular Sieves" from Chemical Engineering, Volume 2, 4th Edition ; JM Coulson and JF Richardson; Pergamon Press, 1991に与えるそれらを包含するが、但しそれらだけには限定されない。分子篩の適切な構造及び性質のより包括的なデータベースは、International Zeolite Association (http://www.iza-online.org/) at (http://www.iza-structure.org/databases/)により提供されている。分子篩についての適切な基本的テキストは、次のものを包含する：
【００５８】
・DW Breck: Zeolite Molecular Sieves, Wiley, New York, 1974; 
・RM Barrer: Hydrothermal Chemistry of Zeolites, Academic Press, 1982; 
・Intro to Zeolite Science and Practice, H van Bekkum, EM Flannigen, PA Jacobs and JC Jansen, Studies in Surface Science, Vo1 137, 1-1060, (2001) Elsevier, Amsterdam。
【００５９】
特に、ゼオライトは、（除去するか又は操作する）有機溶媒（例えば、アルコール、アルデヒド、ケトン、等を包含するが、但しそれらだけには限定されない）、金属イオン、アニオン、第四アンモニウム化合物、SDS, EDTA, CETAB, TCA, セチルピリミジン塩化物、等の含有率を調節するために使用され得る。
特に、分子篩は、イオン、より特定にはカチオンを除去するか又はそのバランスを操作するために使用され得る。
【００６０】
１つの態様においてはイオンは二価イオン、より特定にはCa2+である。
特定の態様においては、本発明は、分子篩を用いて、ポリマーからカルシウムイオンの含有率を調節するための方法に関する。
特定の態様においては、本発明は、分子篩を用いて、ポリマーからカルシウム及びナトリウムイオンの含有率を調節するための方法に関する。
【００６１】
除去されるか、又は部分的に除去されるべき成分は、ポリマーを含んで成る液体に懸濁され得るか、又は成分はポリマー上に結合されるか又は存在することができる。
さらなる態様においては、成分はもう１つの成分により交換される。Caイオンは例えばNaイオンにより交換され得る。
さらなる態様においては、生成物における成分バランスが調節される。特定の態様においては、分子篩は、ゼオライトである。
【００６２】
本明細書における“適切な条件”とは、工程の流れのそれらの条件、及び成分の除去又は操作に影響を及ぼすために、当業者により容易に決定され得るそれらの条件を意味する。適切な条件は次のものを包含するが、但しそれらだけには限定されない：分子篩タイプ、分子篩タイプ、分子篩用量、温度、pH、ポリマー濃度、イオン強度、溶媒濃度、混合、インキュベーション時間、等。
より特定の態様においては、ポリマーは、グリコサミノグリカンである。
【００６３】
分子篩は、次の多くの手段（但し、それらだけには限定されない）のいずれかにより、ポリマーから除去され得る：濾過、遠心分離、浮遊、沈殿、相排除、等。いくつかの場合、ポリマー担持流体における分子篩を除去する必要はなく、又は除去することが所望される。
【００６４】
本発明の特定成分の除去又は操作方法は、例えばpH、温度、粘度、濃度、混合、イオン強度、添加剤、成分、等の操作（但し、それらだけには限定されない）を通して、最適化され得るか、又は改良され得る。１つよりも多くのポリマーが、同じポリマー担持液体において処理され得る。１つよりも多くの分子篩による処理が、ポリマー担持液体を操作するために使用され得る。
【００６５】
特定の態様においては、本発明の方法は、適切なゼオライトを用いて、ポリマー担持液体におけるインの調節（除去、交換及び/又は平衡化）を提供する。特に、ポリマーは、グルコサミノグリカンである。
より特定の態様においては、ポリマーはヒアルロン酸である。もう１つの特定の態様においては、本発明の方法は、適切なゼオライトを用いて、ポリマー自体上のイオンの含有率の調節を提供する。特に、ポリマーは、ヒアルロン酸である。
【００６６】
さらにもう１つの態様においては、本発明の方法は、適切な分子篩を用いて、ポリマー自体上のカルシウム及びナトリウムイオンの含有率の調節を提供する。特に、ポリマーは、ヒアルロン酸である。
【実施例】
【００６７】
例１．カルシウム除去段階を伴わないでのヒアルロン酸精製：
この実験においては、組換バチルス・サブチリスの発酵から得られたヒアルロン酸の5g/lの溶液を、通常の水道水により希釈し、そして濾過し、宿主細胞を除去した。次に、濾液を、脱イオン水に対して集中的に透析し、HA分子自体上に存在しない多量の遊離カルシウムを除去した。得られる透析された生成物は、ヒアルロン酸の質量に対して4.4重量％のカルシウムを含んだ。
【００６８】
例２．ナトリウム塩に対するダイアフィルトレーションによる従来のカルシウム除去段階によるヒアルロン酸精製：
この実験においては、ヒアルロン酸を、実験１に記載のようにして得た。次の通りに、過剰のナトリウムイオンの存在下でカルシウムの競争置換を包含するカルシウム調製段階（本発明の分子篩を包含しない）を、導入した：
【００６９】
ヒアルロン酸溶液を、過剰のナトリウムイオンに対してダイアフィルトレートした。それにより、生成されるカルシウムイオンを、ダイアフィルトレーション膜を通しての通過により溶液から除去した。ヒアルロン酸からの生成されるカルシウムイオンを同等に、ポリマー沈殿により除去した。本発明の場合、ヒアルロン酸溶液を、一定体積で３×体積の10重量％硫酸ナトリウム溶液に対してダイアフィルトレートし、続いて脱イオン水に対して集中的に透析し、過剰のスルフェート及びナトリウムイオンを除去した。得られる生成物は、ヒアルロン酸に対して1.2重量％のカルシウムを含んだ。
【００７０】
例３．カリオン交換樹脂を用いてのヒアルロン酸のカルシウム含有率の調節：
ヒアルロン酸を、上記例１に記載のようにして生成した。ナトリウムイオン形でSO3-(＞２当量/l)を有する強いカチオン交換樹脂を用いて、ポリマー中のカルシウムイオン含有率を操作した。
交換樹脂の性能を、前述のヒアルロン酸製造及び精製工程を通して適合される条件の範囲について特徴づけた。
【００７１】
１つの例においては、1.0重量％の交換樹脂を、ヒアルロン酸に対して２重量％のカルシウムを含むヒアルロン酸の0.5重量％溶液に添加した。撹拌下での120分のインキュベーションの後、残渣を溶液から濾過した。得られる濾液は、ヒアルロン酸に対して0.5重量％のカルシウムのカルシウム含有率を有するヒアルロン酸を含んだ。同じ条件下での240分間のインキュベーションの後、ヒアルロン酸に対するカルシウム含有率は、検出以下であった。
【００７２】
例４．カチオン交換ゲルを用いてのヒアルロン酸のカルシウム含有率の調節：
ヒアルロン酸を、上記例１に記載のようにして生成した。スルホネート化された官能基（2.05当量/l）を有する強いカチオン交換ゲルを用いて、ポリマー中のカルシウムイオン含有率を操作した。
交換樹脂の性能を、前述のヒアルロン酸製造及び精製工程を通して適合される条件の範囲について特徴づけた。
【００７３】
１つの例においては、0.25重量％の交換ゲルを、ヒアルロン酸に対して２重量％のカルシウムを含むヒアルロン酸の0.5重量％溶液に添加した。混合物を、撹拌下でインキュベートし、そして１時間で達成される平衡化を可能にした。ゲルを、溶液から濾過した。得られる濾液は、ヒアルロン酸に対して0.3重量％のカルシウムのカルシウム含有率を有するヒアルロン酸を含んだ。同じ条件下で、ナトリウム形での１重量％の交換ゲルが、ヒアルロン酸に対するカルシウム含有率を、検出以下に低めた。
【００７４】
もう１つのパイロット規模の例においては、ナトリウム形での0.5重量％の交換ゲルを、前処理を伴わないで、211ppmのカルシウムを含むヒアルロン酸の0.7重量％溶液に添加した。その混合物を、ゲルを溶液から濾過する前、2時間、撹拌下でインキュベートした。得られる濾過は、同じ条件下で卓上規模実験に密接に対応するヒアルロン酸に対して14ppmのカルシウムを含んだ。同じ条件下で、１重量％の交換ゲルが、ヒアルロン酸に対するカルシウム含有率を、検出以下に低めた。
【００７５】
出発材料、及びナトリウムでの１重量％の交換ゲルにより処理された濾液を、脱イオン水に対して透析し、遊離イオンを除去した。得られるヒアルロン酸の分析から、ナトリウム形での１重量％の交換ゲルによる処理に続いて、ヒアルロン酸上のイオンが、ナトリウムイオンにより置換されたことが見出された。
【００７６】
例５．カチオン交換ゲルを用いての発酵ブイヨンにおける鉄の低減：
ゲルタイプは、官能基、スルホネート（2.05重量/l）を有する強いカチオン交換体であった。
過剰のイオン交換ゲルを用いて、発酵ブイヨン中の鉄のレベルを低めた。イオン、例えば鉄、銅及び他のものが、ヒアルロン酸の安定性を、分解の方に低めることが示されている。
【００７７】
ヒアルロン酸を含む原発酵ブイヨンを、通常の水道水による希釈及び濾過により透明にし、微生物を除去した。次に、この透明化されたブイヨンをインキュベートし、そして過剰（10重量％）の交換ゲルと共に１時間、撹拌した。次に、交換ゲルを溶液から濾過した。濾液中の鉄含有率が、透明化されたブイヨンにおける0.4重量％（ヒアルロン酸に対する）に比較して、検出以下であることが見出された（ヒアルロン酸に対して＜1ppm）。
【００７８】
元の透明化されたブイヨン及び鉄を除去するために処理されたブイヨンを続いて、熱処理した。交換ゲルにより処理された材料は、同じ条件下で未処理の透明化されたブイヨン材料よりも、分子量に関して、実質的により熱安定性であることが見出された。
透明化されたブイヨンの処理は、分子量プロフィール、又は含まれるヒアルロン酸の濃度を変えなかった。
【００７９】
他の工程の流体及び成分が、実験３及び４に示される適用及び方法に類似するそれらにより調節されることが見出された。透明化された発酵ブイヨンからの成分の除去は、熱分解に対してヒアルロン酸を安定化した。
【００８０】
例６．粉末化された珪酸アルミニウムタイプ4Aゼオライトのナトリウム形を用いての、ヒアルロン酸中のカルシウム含有率の調節及びナトリウムイオンによるヒアルロン酸上のイオンの置換：
ヒアルロン酸を、上記例１に記載のようにして生成した。ナトリウム形での粉末化されたタイプ4Aゼオライトを用いて、ポリマー中のカルシウムイオン含有率を操作した。
交換樹脂の性能を、前述のヒアルロン酸製造及び精製工程を通して適合される条件の範囲について特徴づけた。特徴を、卓上及びパイロット規模で再生し、そして例１におけるようにして生成された種々のヒアルロン酸バッチを試験した。
【００８１】
ゼオライトは、mgゼオライト当たりヒアルロン酸担持溶液から、それらの２種が接触される場合、約0.06mgのカルシウムを除去できることが見出された。この比率は、使用される工程の条件（例えば、pH温度、HA温度、等）に、ほとんど無関係であることが見出された。これは、ゼオライトの単純な添加により、ヒアルロン酸担持溶液におけるカルシウムレベルを調節することを非常に単純にした。平衡は、すべての場合、15分以下で達成された。
典型的な例においては、わずか0.2重量％の粉末化されたゼオライトが、142ppmのカルシウムを含むヒアルロン酸溶液と、プレ−平衡化又はプレ−処理を伴わないで、直接的に添加により接触された。撹拌下での20分間のインキュベーションの後、ゼオライトを溶液から濾過した。得られる濾液は、14ppmのカルシウムを含んだ。同じ方法下での0.3重量％のゼオライトとの接触は、検出限界以下にカルシウムを低めた。
ヒアルロン酸出発材料を、0.3重量％の粉末化されたゼオライトによる処理の後、分析した。0.3重量％のゼオライトによる処理に続いて、ヒアルロン酸上のイオンがナトリウムイオンにより置換されたことが見出された。
ヒアルロン酸の処理は、分子量プロフィール又は濃度を変えず、そして処理されたヒアルロン酸の詳細な特徴化は、有害な変化を示さなかった。
ヒアルロン酸含有溶液からのカルシウム除去の程度は、再現的に予測され、そして調節され得ることが見出された。ヒアルロン酸上のイオンは、ナトリウムイオンにより置換された。ヒアルロン酸に対する悪影響は存在しなかった。
【００８２】
例７．粉末化された珪酸アルミニウムタイプ４Aゼオライトのナトリウム形を用いての発酵ブイヨンにおける鉄の低減：
イオン、例えば鉄、銅及び他のものが、ヒアルロン酸の安定性を分解の方に低めることは示されている。過剰のナトリウム形の粉末化された珪酸アンモニウムタイプ４Aゼオライトを用いて、発酵ブイヨン中の鉄のレベルを低めた。
組換えバチルス・サブチリスの発酵から得られた原発酵ブイヨンを、通常の水道水により希釈し、そして濾過し、宿主細胞を除去し、24ppmの鉄イオンを含む3.5g/lのヒアルロン酸溶液を得た。次に、この透明化されたブイヨンをインキュベートし、そして過剰（３重量％）の粉末化されたゼオライトと共に１時間、撹拌した。次に、ゼオライトを溶液から濾過した。濾液中の鉄含有率が、検出以下であることが見出された（ヒアルロン酸に対して＜1ppm）。
【００８３】
元の透明化されたブイヨン及び鉄を除去するために処理されたブイヨンを続いて、熱処理した。交換ゲルにより処理された材料は、同じ条件下で未処理の透明化されたブイヨン材料よりも、分子量に関して、実質的により熱安定性であることが見出された。
透明化されたブイヨンの処理は、分子量プロフィール、又は含まれるヒアルロン酸の濃度を変えなかった。
【００８４】
例８．粒質タイプ４Aゼオライトのナトリウム形を用いての、ヒアルロン酸のカルシウム含有率の調節及びナトリウムイオンによるヒアルロン酸上のイオンの置換：
カルシウムイオン除去及びナトリウムイオンによる置換のための粒質ゼオライトの性能を、前述のヒアルロン酸製造及び精製工程を通して適合される条件の範囲について特徴づけた。特徴を、卓上及びパイロット規模で再生し、そして例１におけるようにして生成された種々のヒアルロン酸バッチを試験した。
【００８５】
典型的には、この粒質タイプ４Aゼオライトは、mgゼオライト当たりヒアルロン酸担持溶液から、それらの２種が接触される場合、約0.1mgのカルシウムを除去できることが見出された。この比率は、使用される工程の条件に、ほとんど無関係であることが見出された。これは、ヒアルロン酸担持溶液におけるカルシウムレベルを調節することを非常に単純にした。平衡は、すべての場合、10分以下で達成された。
【００８６】
典型的な例においては、0.2重量％の粒質ゼオライトが、220ppmのカルシウムを含むヒアルロン酸溶液と接触された。撹拌下での20分間のインキュベーションの後、ゼオライトを溶液から濾過した。得られる濾液は、20ppmのカルシウムを含んだ。同じ条件下での0.25重量％のゼオライト（II）との接触は、検出限界以下にカルシウムを低めた。
出発材料からのヒアルロン酸を、0.25重量％の粒質ゼオライトによる処理の後、分析した。0.25重量％のゼオライトによる処理に続いて、ヒアルロン酸上のイオンがナトリウムイオンにより置換されたことが見出された。
【００８７】
ヒアルロン酸の処理は、分子量プロフィール又は濃度を変えず、そして処理されたヒアルロン酸の詳細な特徴化は、有害な変化を示さなかった。
ヒアルロン酸含有溶液からのカルシウム除去の程度は、再現的に予測され、そして調節され得ることが見出された。ヒアルロン酸上のイオンは、ナトリウムイオンにより置換された。ヒアルロン酸に対する悪影響は存在しなかった。
【国際調査報告】
2008540702.tif 000002
2008540702.tif 000003
2008540702.tif 000004