(57)【要約】  本発明は、高められたレベルの活性で、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼ、好ましくはＰａｂＡＢ二部分タンパク質（それは融合タンパク質であってもよい）を使ってインビボで発酵により行われ、それによって、回収されるＡＤＣおよび４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）を含む培養液を得る、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）の生合成生産方法に関する。本発明はまた、ｐ−アミノフェニルアラニンへのＡＤＰのさらなる転化方法にも関する。本発明はさらに、３，４−ＣＨＡの回収を含む、かかる４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼのおよびイソコリメートを［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる酵素、好ましくはフェナジン生合成タンパク質ＰｈｚＤの共同作用による［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の生合成生産に関する。本発明はまた、かかる方法の任意のものでの使用のための発現ベクターおよびホスト細胞にも関する。本発明はさらに、触媒活性生成物としての、特にキラル触媒としての３，４−ＣＨＡの使用に関する。そして本発明は最後に３，４−ＣＨＡからのリン酸オセルタミビルの合成に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生合成生産が、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）および４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）を含む発酵培養液を得ながら、高められたレベルの活性で４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼを持ったホスト微生物中でインビボで発酵により行われること、かつ、これらの化合物が、一緒にか、または個別にかのどちらかで、発酵培養液から回収されることを特徴とする、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼのクラスに属する酵素によって少なくとも触媒される４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）の生合成生産方法。
【請求項２】
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼがＰａｂＡＢ二部分タンパク質であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
二部分タンパク質が放線菌類（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群からの種に、もしくはかかる二部分酵素を含有する植物に由来するか、またはそれぞれＰａｂＡおよびＰａｂＢをコードする遺伝子の融合によって構築されることを特徴とする請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＰａｂＡＢ二部分タンパク質が、そのようなものとしてまたは融合タンパク質として、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）およびストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる属の群からの種に由来することを特徴とする請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
ＰａｂＡＢ二部分タンパク質が、そのようなものとしてまたは融合タンパク質として、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリア・グラビス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ  ｇｒａｖｉｓ）ＮＣＴＣ１３１２９、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・ヴェネズエラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、ストレプトミセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ，ｓｐ．）ＦＲ−００８、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトミセス・チオルテウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｉｏｌｕｔｅｕｓ）、およびストレプトミセス・アヴェルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）からなる種の群からの種の１つに由来することを特徴とする請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ＰａｂＡＢ二部分タンパク質がコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ  １３０３２に由来することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
形成された４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）および４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）が、反応抽出およびクロマトグラフィーからなる群から選択された分離法、場合により引き続き結晶化によって、一緒にか、または個別にかのどちらかで、前記発酵培養液から回収されることを特徴とする請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
生合成生産が、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）および４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）を含む発酵培養液を得ながら、高められたレベルの活性で４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼを持ったホスト微生物中でインビボで発酵により行われること、かつ、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）と４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）との混合物中の４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）が、４−アミノ−４−デオキシプレフェネート・デヒドロゲナーゼとアミノトランスフェラーゼとの共同作用を用いて、そしてそれらの高められたレベルの活性でｐ−アミノフェニルアラニンへ転化されること、かつ、ｐ−アミノフェニルアラニンが発酵培養液から回収されることを特徴とする、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼのクラスに属する酵素によって少なくとも触媒される４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）の生合成生産方法に統合されたｐ−フェニルアラニンの生合成生産方法。
【請求項９】
生合成生産が、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼの、およびイソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる酵素の共同作用によって、およびそれらの高められたレベルの活性で行われること、かつ、［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）がそのように得られた発酵培養液から回収されることを特徴とする、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼのクラスに属する酵素によって少なくとも触媒される［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の生合成生産方法。
【請求項１０】
生合成生産がホスト微生物中でインビボで発酵により行われることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼがＰａｂＡＢ二部分タンパク質であることを特徴とする請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰａｂＡＢ二部分タンパク質が請求項３〜６のいずれか一項に記載の、またはそれに従ったタンパク質であること、かつ、イソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる酵素がまた４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−６−アミノ−５−ヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＡ）へ転化することができることを特徴とする請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
イソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる酵素がフェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質であることを特徴とする請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質がシュードモナス属（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、ストレプトミセス属、およびエルビニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）からなる属の群からの種に由来することを特徴とする請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質が緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・オーレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、およびパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）種からなる群から選択された種に由来することを特徴とする請求項１３または１４に記載の方法。
【請求項１６】
フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質が緑膿菌ＡＴＣＣ  １７９３３に由来することを特徴とする請求項１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
ＰａｂＡＢ二部分タンパク質が大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ジフテリア・グラビスＮＣＴＣ１３１２９、コリネバクテリウム・エフィシエンス、サッカロミセス・セレビシエ、ストレプトミセス・グリセウス、ストレプトミセス・ヴェネズエラエ、ストレプトミセス種．ＦＲ−００８、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトミセス・チオルテウス、およびストレプトミセス・アヴェルミチリスからなる種の群から選択された種に由来することを特徴とする請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
ＰａｂＡＢ二部分タンパク質がコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ  １３０３２に由来することを特徴とする請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
形成された［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）が前記反応混合物から結晶化によって、または反応抽出およびクロマトグラフィーからなる群から選択された分離法、場合により引き続いて結晶化によって回収されることを特徴とする請求項９〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属、エシェリキア属、およびピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる属の群から選択されたホスト生物中で行われることを特徴とする請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法での使用のための発現ベクター。
【請求項２２】
バチルス属、コリネバクテリウム属、エシェリキア属、およびピチア属からなる属の群から選択されたホスト生物の１つからのホスト細胞であって、標準条件下その自然環境でのかかる酵素の、すなわち、
・請求項３〜６のいずれか一項に従って使用されるようなＰａｂＡＢ二部分タンパク質、または
・４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼ（好ましくはＰａｂＡＢ二部分タンパク質）、ならびに４−アミノ−４−デオキシプレフェネート・デヒドロゲナーゼおよびアミノトランスフェラーゼ、または
・４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼ（好ましくはＰａｂＡＢ二部分タンパク質）、およびイソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる酵素、または
・４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼ（好ましくはＰａｂＡＢ二部分タンパク質）、およびイソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができるおよび４−アミノ−４−デオキシイソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−６−アミノ−５−ヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＡ）へ転化することができる酵素、または
・ＰａｂＡＢ二部分タンパク質およびフェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質、または
・ＰａｂＡＢ二部分タンパク質および標識フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質
の生来の活性のレベルと比べて高められたレベルの活性での次の活性または活性の組み合わせの少なくとも１つを含むホスト細胞。
【請求項２３】
触媒活性生成物としての、特にキラル触媒としての、請求項９〜１９のいずれか一項に記載の方法によって得られた、［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の使用。
【請求項２４】
ａ）［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）を、好ましくは３，４−ＣＨＡの合成に関する請求項のいずれか一項に従った３，４−ＣＨＡの生合成によって提供する工程と、
任意の順の工程ｂ）〜ｅ）
ｂ）カルボン酸官能基のそのエチルエステルへのエステル化、
ｃ）ヒドロキシル官能基のその３−ペンタノールエーテルへのエーテル化、
ｄ）Ｃ−３のアミノ基のアセチル化、
ｅ）Ｃ−４のＮ−含有基に関してトランス位でのアミノ官能基の導入、
続いて、
ｆ）組み合わせられた反応工程ｂ）、ｃ）、ｄ）、およびｅ）の結果として３，４−ＣＨＡから製造された生成物のリン酸オセルタミビルへの転化
とを含む、リン酸オセルタミビルの合成方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、その第１実施形態で、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼのクラスに属する酵素によって少なくとも触媒される４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）の生合成生産方法に関する。前記方法では４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）と４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）との混合物が発酵培養液中に形成される。前記実施形態の統合されたその後の工程で、本発明はまたｐ−アミノフェニルアラニンの合成にも関する。
【０００２】
用語「生合成生産」は本明細書で用いるところでは、より狭い意味が意図されることが文脈から明らかでない限り、その最も広い可能な意味で用いられる。それは、インビトロで実施される方法だけでなく、インビボで発酵により実施される方法をも含む。一般に、インビボ法は、生きている細胞（用語「生きている細胞」はそれによってまた、いわゆる休止細胞も含む）を用いるときに実施される方法であり、一方、インビトロ法は通常、細胞溶解物または（部分的に）精製された酵素を用いて実施される。しかしながら、生化学生産は本明細書で意味されるところでは、また透過性細胞を用いて実施されてもよく、インビボとインビトロとの区別は、しかしながら、透過性細胞で実施中の方法については意味をなさない。本発明の方法はまた固定化ホスト細胞、固定化酵素などを用いて実施できることは明らかであろう。特許請求の範囲が「インビボ」法に限定される場合、これは明確に示されるであろう。技術的な観点から厳密に言えば、用語「発酵により」はしばしば、ある方法が酸素なしでまたは限定された酸素供給下に実施されることを意味するであろうが、該用語は本特許出願との関連では最も広い可能な意味で用いられ、好気性方法も同様に含む。それは、発酵技術者に利用できるすべての一般的なテクニックを本発明に従った方法で用い得ることを示すつもりである。
【０００３】
本発明はまた、第２実施形態では、［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の生合成生産方法に関する。この化合物［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）はまたトランス−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸とも言われる。
【０００４】
さらに、本発明はまた、本発明の実施形態のどの方法でも用いることができるようなホスト細胞、発現ベクター、プラスミドなどにも関する。
【０００５】
もっとさらなる実施形態では、本発明は、触媒活性生成物としての、特にキラル触媒としての［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の使用に関する。
【０００６】
最後に、本発明はまた、本発明に従って生産することができるような、［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）のさらなる転化にも関する。特に、それは、ホフマン−ラ・ロッシュ、スイス国（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−Ｌａ  Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）の商品名タミフル（Ｔａｍｉｆｌｕ）（登録商標）で公知の抗インフルエンザ医薬品のための活性原料であるリン酸オセルタミビル（ＩＵＰＡＣ（国際純正応用化学連合）名称：リン酸（３Ｒ、４Ｒ、５Ｓ）−４−Ｎ−アセチルアミノ−３−（１−エチルプロポキシ）−５−Ｎ−アミノ−１−シクロヘキセン−１−カルボン酸エチル［１：１］）と呼ばれる製品の生産のための新規合成ルートでのさらなる転化に関する。
【０００７】
４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）の生合成生産は、Ｋ．Ｓ．アンダーソン（Ｋ．Ｓ．Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、ＪＡＣＳ  １１３（１９９１）、３１９８〜３２００頁から公知である。パーソンズ（Ｐａｒｓｏｎｓ）らは、Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４２（２００３）、５６８４〜５６９３頁において、５６９０頁で、それにとってＡＤＣが明らかに不満足な基質であるフェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質の影響下でＡＤＣが辛うじて加水分解されるにすぎないと記載している。
【０００８】
［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の生合成はこれまで全く記載されたことがなかった。リン酸オセルタミビルの合成についてはこれまでは１０より多い反応工程を含む全く骨の折れる方法が利用可能であるにすぎない。例えば、ローロフ（Ｒｏｈｌｏｆｆ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６３（１９９９）、４５４５〜４５５０頁によって記載されているような、キナ酸から出発する１２工程方法に、またはフェーダースピール（Ｍ．Ｆｅｄｅｒｓｐｉｅｌ）ら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ３（１９９９），２６６〜２７４頁によって記載されるようなシキミ酸から出発する１１工程方法に言及することができる。
【０００９】
４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）への生合成ルートは、例えば、テング（Ｔｅｎｇ）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０７巻（１９８５）、５００８〜５００９頁から公知であるが、ＡＤＰの生合成生産および回収は、それがＡＤＣについて公知であるように、恐らく生成物ＡＤＰが不安定であると考えられるので、記載されたことがなかった。テングらのこの参考文献はまた、ブランク（Ｂｌａｎｃ）ら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃ．２３巻（１９９７）、１９１〜２０２頁の開示と同様に、アミノデオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）への、それぞれｐ−アミノフェニルアラニンへの可能な生合成ルートを示しているが、生成物ＡＤＰおよびＡＤＣの、それぞれｐ−アミノフェニルアラニンの発酵ルートおよび回収は全く示唆されていない。
【００１０】
公知方法の不利点は、
ａ）アミノデオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）の生合成生産については、これまでｍｇ−スケールでの、および２、３ｍｇ／ｌの非常に低い濃度での合成が記載されてきたにすぎず、従って、かかる反応混合物からのＡＤＣの回収が非常に困難である、
ｂ）［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の生合成生産については、方法がまだ全く利用可能ではない、
ｃ）リン酸オセルタミビルの最新合成については、これまで１０工程より多い反応シーケンスが必要とされる
ことである。
【００１１】
従って、アミノデオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）の改善された生合成法、［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の合成のための完全に新規な生合成法、およびリン酸オセルタミビルの改善された合成方法に対するニーズがある。
【００１２】
上記の問題はすべて、本明細書の請求項１で特許請求されているような基本的特徴を有する、本発明によって解決された。
【００１３】
本発明者らは、驚くべきことに、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼのクラスに属する酵素によって少なくとも触媒される、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）の生合成生産が、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）および４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）を含む発酵培養液を得ながら、高められたレベルの活性で４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼを持ったホスト微生物中でインビボで発酵により行われること、かつ、これらの化合物が、一緒にか、または個別にかのどちらかで、発酵培養液から回収されることを今見いだした。
【００１４】
ＡＤＣ合成は自然界でコリスミ酸からのフォレート（ｆｏｌａｔｅ）合成での第１工程であるので、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼ酵素は自然界で豊富に入手可能である。それらはすべてのフォレート原栄養株有機体中に、例えば、バクテリア、酵母、植物および低級真核生物中に存在すると推測される。アミノデオキシコリスミ酸シンターゼ酵素はまたｐ−アミノベンゾエート合成にも関与していることが知られている。
【００１５】
本明細書で用いるところでは、用語「高められたレベルの活性」は、（示されるような任意の特定酵素の）活性のレベルが標準条件下でその自然環境（すなわち自然源細胞）での前記酵素の（生来の）活性のレベルより高いことを意味する。活性レベルを高めることは当業者に公知のあらゆる種類の方法によって、例えば、かかる酵素をコードする遺伝子の過剰発現、かかる遺伝子のマルチコピー、または例えばより強いプロモータ、誘導プロモータなどを用いて、改善された翻訳および／または転写効率の遺伝子への提供によって達成することができる。
【００１６】
ＡＤＣシンターゼ、および任意のケースで大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）からのものは単一ユニットの形で存在することが知られているが、時々二部分（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）酵素として現れる。単一ユニットは、例えば、いわゆるＰａｂＡタンパク質（グルタミンからアンモニアを発生させることが知られているタンパク質）より、またはいわゆるＰａｂＢタンパク質（コリスミ酸中へ直接アンモニアを挿入することが知られているタンパク質）よりなってもよい。
【００１７】
Ｇ．バセット（Ｇ．Ｂａｓｓｅｔｔ）らは、ＰＮＡＳ  １０１（２００４）、１４９６〜１５０１頁で、融合したＰａｂＡおよびＰａｂＢ領域を含有する二部分タンパク質が植物でのＡＤＣの合成に関与していると記載している。バセットらの論文でも行われているように、文献でのこれらのＡＤＣシンターゼは時々（そして、本発明者らが誤って信じているように）ＰＡＢＡシンターゼ（ｐ−アミノ安息香酸シンターゼ）とも言われることが注目されるべきである。本発明者らは、自分たちの研究で、ＰＡＢＡシンターゼと間違って命名された酵素がＡＤＣ（ＡＤＰとの混合で）の形成にすべて本当につながること、およびｐ−アミノベンゾエートの形成（仮に観察される場合でも、それは多くてもマイナー副生物としてである）が本発明のプロセス実施形態でほとんど起こらないことを示した。バセットらが確認したように、ｐ−アミノベンゾエートへの転化はタンパク質ＰａｂＣの追加存在を必要とする。従って、ｐａｂＣは存在するかもしれないが、ｐ−アミノベンゾエートが全く形成されないことは本発明の方法で最も驚くべきことである。
【００１８】
本発明のこの第１実施形態の好ましい実施形態では、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）の生合成生産は、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼがＰａｂＡＢ二部分タンパク質であることによって行われる。
【００１９】
本明細書で意図されるところでは、用語「４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼＰａｂＡＢ二部分タンパク質」は、ＰａｂＡ（グルタミンからアンモニアを発生させることが知られているタンパク質）およびＰａｂＢ（コリスミ酸中へ直接アンモニアを挿入することが知られているタンパク質）の機能を組み合わせている任意の活性なタンパク質（すなわち、ＡＤＣシンターゼの機能性を有する任意のタンパク質）を表す。原則として、用語「二部分タンパク質」は本明細書で用いるところでは、用語「融合タンパク質」または「共有結合したタンパク質複合体」のどちらとも同じ意味で用いることができる。
【００２０】
本発明の第１実施形態に従った方法は、ホスト微生物中でインビボで実施される。先行技術の方法では、インビトロ合成だけが記載されている。
【００２１】
特に、そして好ましくは、二部分タンパク質は、放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）の群からの種、もしくはかかる二部分酵素を含有する植物に由来するか、またはＰａｂＡおよびＰａｂＢをそれぞれコードする遺伝子の融合によって構築される。遺伝子の融合方法は当業者に周知であり、例えば、ＰＣＲ法、クローニングなどよりなってもよい。
【００２２】
従って、二部分タンパク質は、植物からの天然由来（二部分）タンパク質か、または人工的に構築されたものであってもよい。本発明者らは、ＰａｂＡタンパク質とＴｒｐＤタンパク質とも言われるある種のグルタミン・アミノトランスフェラーゼとの間にむしろ高いホモロジーがあること、およびＰａｂＢタンパク質とＴｒｐＥタンパク質とも言われるある種のアントラニル酸シンターゼとの間にむしろ高いホモロジーがあることを観察した。従って、二部分タンパク質のそれぞれＰａｂＡ、ＰａｂＢ部分、の代わりに、またはそれらと一緒に、ＴｒｐＤ（ＰａｂＡの代わりに）およびＴｒｐＥ（ＰａｂＢの代わりに）もまた本発明の方法に適用することができる。
【００２３】
これは、次の組み合わせ：ＰａｂＡ／ＰａｂＢ、ＴｒｐＤ／ＰａｂＢ、ＰａｂＡ／ＴｒｐＥ、およびＴｒｐＤ／ＴｒｐＥのいずれもがすべて本発明（のこの第１実施形態）に従って有利な結果につながることを意味する。それ故、酵素活性のすべてのかかる組み合わせは、用語４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼＰａｂＡＢ二部分タンパク質に包含される。
【００２４】
ＴｒｐＤおよびＴｒｐＥは自然界でトリプトファン合成の第１工程に関与するので、これらの酵素は自然界で豊富に入手可能である。それらはすべてのＬ−トリプトファン原栄養株有機体中に、例えばバクテリア、酵母、植物および低級真核生物中に存在すると推測される。
【００２５】
従って、二部分タンパク質ＰａｂＡ／ＰａｂＢ、ＴｒｐＤ／ＰａｂＢ、ＰａｂＡ／ＴｒｐＥ、およびＴｒｐＤ／ＴｒｐＥの部分のそれぞれをコードする遺伝子は、当業者に周知であり、入手可能である。
【００２６】
好ましくは、ＰａｂＡＢ二部分タンパク質は、そのようなものとしてまたは融合タンパク質として、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）またはストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）からなる属の群からの種に由来する。ＡＤＣの生合成のための本発明に従って方法では、ＰａｂＡＢ二部分タンパク質はより好ましくは、そのようなものとしてまたは融合タンパク質として、大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）、コリネバクテリウム・ジフテリア・グラビス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ  ｇｒａｖｉｓ）ＮＣＴＣ１３１２９、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ストレプトミセス・グリセウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）、ストレプトミセス・ヴェネズエラエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｖｅｎｅｚｕｅｌａｅ）、ストレプトミセス種ＦＲ−００８（これらはポリケチドＦＲ−００８の合成に関与する株である）、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｐｒｉｓｔｉｎａｅｓｐｉｒａｌｉｓ）、ストレプトミセス・チオルテウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｔｈｉｏｌｕｔｅｕｓ）、およびストレプトミセス・アヴェルミチリス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ）からなる種の群からの種の１つに由来する。ストレプトミセス種ＦＲ−００８株の例は、ＫＣＴＣ  １０５２９ＢＰで２００３年１０月２０日にタイプ・カルチャーのための韓国コレクション（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ）にデポジットされた株である。ＰａｂＡＢ二部分タンパク質はコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ  １３０３２に由来することが最も好ましい。
【００２７】
上述のように、タンパク質は「高められたレベルの活性で」存在するべきである。これは、（示されるような任意の特定酵素の）活性のレベルが標準条件下でその自然環境（すなわち自然源細胞）での前記酵素の（生来の）活性のレベルより高いことを意味する。
【００２８】
最良の結果は、その中でタンパク質が発現されるホスト微生物が６２０ｎｍで約０．５〜１００の範囲の、好ましくは多くても５０のＯ．Ｄ．（光学密度）に達した後に実生産のスタートのタイミングが開始されるようなやり方でＰａｂＡＢ二部分タンパク質の発現が操作されるときに達成される。この発現は、誘発ありまたはなしで達成することができる。発現が誘発ありで達成されるケースでは、それは好ましくは強力なプロモータ、例えばプタッック（ｐｔａｃ）プロモータの助けを借りて行われ、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）によって誘発される。
【００２９】
本発明のこの第１実施形態では、形成された４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）および４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）は、反応抽出およびクロマトグラフィーからなる群から選択された分離法、場合により引き続き結晶化によって、一緒にまたは個別に、前記得られた発酵培養液から好ましくは回収される。
【００３０】
本発明のこの第１実施形態のその後のおよび統合されたバージョンで、ｐ−アミノフェニルアラニンの合成は達成される。これは、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼのクラスに属する酵素によって少なくとも触媒される４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）の生合成生産方法に統合されたｐ−アミノフェニルアラニンの生合成生産であって、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）および４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）を含む発酵培養液を得ながら、高められたレベルの活性で４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼを持ったホスト微生物中でインビボで発酵により行われ、かつ、４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸（ＡＤＣ）と４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）との混合物中の４−アミノ−４−デオキシプレフェネート（ＡＤＰ）が４−アミノ−４−デオキシプレフェネート・デヒドロゲナーゼとアミノトランスフェラーゼとの共同作用を用いて、それらの高められたレベルの活性でｐ−アミノフェニルアラニンへ転化され、かつ、当該ｐ−アミノフェニルアラニンが発酵培養液から回収される生合成生産によって行われる。
【００３１】
アミノトランスフェラーゼは、任意の好適な資材源からのＬ−またはＤ−特異的アミノトランスフェラーゼであってもよい。勿論、次にｐ−アミノフェニルアラニンは次の工程でその誘導体へ転化されてもよい。
【００３２】
４−アミノ−４−デオキシプレフェネートデヒドロゲナーゼは好ましくはＰａｐＣタンパク質である。遺伝子ｐａｐＣは、例えば、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリスでのプリスチナマイシン生合成から公知である（ブランク（Ｂｌａｎｃ）ら、Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２３（１９９７）、１９１〜２０２頁を参照されたい）。ｐａｐＣ遺伝子は、ストレプトミセス・ヴェネズエラエでのクロラムフェニコール合成に関与するようなｃｍｌＣ遺伝子（また４−アミノ−４−デオキシプレフェネート・デヒドロゲナーゼもコードする）と酷似している（Ｈｅら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１４７（２００１）、２８１７〜２８２９頁を参照されたい）。本発明の目的のためには、ｃｍｌＣによってコードされるタンパク質はまたＰａｐＣタンパク質であると考えられる。
【００３３】
ＡＤＰのｐ−アミノフェニルアラニンへの転化は、Ｒ．Ａ．メール（Ｒ．Ａ．Ｍｅｈｌ）ら、ＪＡＣＳ  １２５（２００３）、９３５〜９３９頁の論文に記載されており、ここで９３６頁の図１に示されているように）ＰａｐＡ、ＰａｐＢおよびＰａｐＣのその後の作用、続いて大腸菌アミノトランスフェラーゼとの相互作用はｐ−アミノフェニルアラニンの形成につながる。これらの著者らがｐ−アミノフェニルアラニンの生合成のためのＳ．ヴェネズエラエからのｃｍｌ遺伝子を確かにクローン化したが、彼らがＳ．プリスチナエスピラリス遺伝子の標識に従って行われたであろうようにｐａｐでこれらの遺伝子を標識したことは注目されるべきである。本発明の上記の実施形態に従って、ｐ−アミノフェニルアラニンへの転化に関与する酵素の数、および従って工程の数は、メールらによって記載されたルートでより１つ少ない。
【００３４】
本発明は、その第２実施形態では、アミノデオキシコリスミ酸シンターゼのクラスに属する酵素によって少なくとも触媒される［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の生合成生産方法であって、生合成生産が４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼのおよびイソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる酵素の共同作用によって、および高められたレベルの活性で行われ、かつ、［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）がそのように得られた発酵培養液から回収される方法に関する。２，３−ＣＨＤはまた、［２Ｓ，３Ｓ］−２，３−ジヒドロキシ−２，３−ジヒドロ安息香酸と言うこともできる。
【００３５】
本発明のこの実施形態では、生合成生産は、ホスト微生物中でインビボで発酵により実施されてもよいし、または例えば前述の酵素活性を含む酵素製剤を用いることによって、インビトロで酵素的に実施されてもよい。かかる酵素製剤は、例えば、キャリア上の酵素の形で、または休止細胞中に、または細胞溶解物として、または（部分的に）精製された酵素として、または当業者に公知の任意の他の形で存在してもよい。
【００３６】
本明細書で意味するところでは、語句「共同作用で、および高められたレベルの活性で」は、述べられる両酵素が一緒に作用し、そしてそれらのそれぞれが標準条件下でその自然環境（すなわち自然源細胞）での前記酵素の（生来の）活性のレベルより高いレベルの（かかる酵素の）活性で用いられつつあることを示す。前に示されたように、酵素の活性レベルを高めることは当業者に公知のあらゆる種類の方法によって、例えば、かかる酵素をコードする遺伝子の過剰発現、かかる遺伝子のマルチコピー、または例えばより強いプロモータ、誘導プロモータなどを用いて、改善された翻訳および／または転写効率の遺伝子への提供によって達成することができる。
【００３７】
原則として、化学的観点から、ＡＤＣは［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）のモノ置換（すなわち、保護された）形であると考えられてもよいであろうことが注目される。実際には、逆に、ＡＤＣはまた３，４−ＣＨＡの誘導体と呼ばれてもよいかもしれない。ＡＤＣおよび３，４−ＣＨＡは両方とも興味あるさらなる化合物の合成のための重要な中間体である。
【００３８】
好ましくは、［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の生合成生産は、ホスト微生物中でインビボで発酵により行われる。
【００３９】
イソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる好適な酵素は、イソコリスマターゼ［ＥＣ  ３．３．２．１］の酵素クラスから得ることができる。勿論、ＡＤＣの３，４−ＣＨＡへの所望の転化のために最適化されるように工作されたこのクラスのタンパク質の突然変異株および突然変異タンパク質はまた、それらがもはやイソコリスミ酸の２，３−ＣＨＤへの転化を触媒することができない場合でさえ、本出願の脈略の中で、前記クラスの酵素内に入ると考えられる。
【００４０】
本発明のこの第２実施形態では、４−アミノ−４−デオキシ−コリスミ酸シンターゼは最も好ましくはＰａｂＡＢ二部分タンパク質である。ＰａｂＡＢ二部分タンパク質については、本発明の第１実施形態に関して本特許出願の前述部分で行われたようなすべての見解が適用される。
【００４１】
好ましくは、イソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる酵素はイソコリスマターゼ（ｉｓｏｃｈｏｒｉｓｍａｔａｓｅ）酵素である。
【００４２】
特に、この実施形態では、ＰａｂＡＢ二部分タンパク質は、本発明の第１実施形態について上に記載されたようなタンパク質であり、イソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる酵素はまた、４−アミノ−４−デオキシイソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−６−アミノ−５−ヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＡ）へ転化することもできる。
【００４３】
［５Ｓ，６Ｓ］−６−アミノ−５−ヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＡ）はまた、［２Ｓ，３Ｓ］−２−アミノ−３−ヒドロキシ−２，３−ジヒドロ安息香酸、またはトランス−２，３−ジヒドロ−３−ヒドロキシアントラニル酸とも言うことができる。
【００４４】
イソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる酵素はフェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質であることが最も好ましい。［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）はまた、［２Ｓ，３Ｓ］−２，３−ジヒドロキシ−２，３−ジヒドロ安息香酸と言うこともできる。
【００４５】
ＰｈｚＤをコードする遺伝子は、例えば、マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）ら、ＪＡＣＳ  １２３（２００１）、９４５９〜９４６０頁の論文から公知である。フェナジン遺伝子は、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０（１９９８）、２５４１〜２５４８頁に記載されているように、Ｄ．マブロジ（Ｄ．Ｍａｖｒｏｄｉ）らによって特定され、配列決定された。
【００４６】
さらに、「Ｐｈｅｎａｚｉｎｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ：ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ」という表題の、Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．１０４（２００４）、１６６３〜１６８５頁におけるＪ．Ｂ．ローセン（Ｊ．Ｂ．Ｌａｕｒｓｅｎ）らの論文で、フェナジン天然物はシュードモナス属およびストレプトミセス属、ならびに土壌または海洋生息環境からの２、３の他の属から主として単離されると述べられている。かかる他の種の例は、メタノサルシーナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）Ｇｏｅ１、ペラジオバクター・バリアビリス（Ｐｅｌａｇｉｏｂａｃｔｅｒ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、ビブリオ株（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｔｒａｉｎｓ）、エルビニア・ハービコラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ｈｅｒｂｉｃｏｌａ）（これはパントエア・アグロメランス（Ｐａｎｔｏｅａ  ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）とも命名される株である）、バークホルデリア・フェナジニウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ  ｐｈｅｎａｚｉｎｉｕｍ）、ワックスマニア・アエラタ（Ｗａｋｓｍａｎｉａ  ａｅｒａｔａ）、および粘液細菌種（Ｓｏｒａｎｇｉｕｍ  ｓｐｅｃｉｅｓ）である。従って、ＰｈｚＤと同種のタンパク質は好ましくはかかる株の任意のものから得られる。
【００４７】
このように、好ましくは、フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質は、シュードモナス属、パントエア属（Ｐａｎｔｏｅａ）、ストレプトミセス属、およびエルビニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）からなる属の群からの種に由来する。特に、フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質は、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、シュードモナス・オーレオファシエンス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ）、蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）、シュードモナス・クロロラフィス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｃｈｌｏｒｏｒａｐｈｉｓ）、およびパントエア・アグロメランス種からなる群から選択された種に由来する。最も好ましくは、フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質は緑膿菌ＡＴＣＣ  １７９３３に由来する。
【００４８】
本発明のこの第２実施形態では、ＰａｂＡＢ二部分タンパク質は、そのようなものとしたまたは融合タンパク質として、エシェリキア属、コリネバクテリウム属、サッカロミセス属またはストレプトミセス属からなる属の群からの種に由来し、最も好ましくは大腸菌、コリネバクテリウム・グルタミカム、コリネバクテリウム・ジフテリア・グラビスＮＣＴＣ１３１２９、コリネバクテリウム・エフィシエンス、サッカロミセス・セレビシエ、ストレプトミセス・グリセウス、ストレプトミセス・ヴェネズエラエ、ストレプトミセス種ＦＲ−００８、ストレプトミセス・プリスチナエスピラリス、ストレプトミセス・チオルテウス、およびストレプトミセス・アヴェルミチリスからなる種の群から選択される。
【００４９】
最も好ましくは、二部分タンパク質は、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ  １３０３２に由来する。それは、フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質がそのＣ−またはＮ−末端で標識されている場合に有利である。そうならば、その時はフェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質は、Ｈｉｓ、ＭｙｃおよびＳｔｒｅｐタグからなる群から選択された、５〜１５単位の短いタグ・シーケンスで好ましくは標識される。タグ群のこの選択内では、フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質は、そのＮ−末端で（５〜１５Ｈｉｓ単位で）好ましくはＨｉｓ−標識される。
【００５０】
加えて、それは、本発明に従った方法のこの実施形態で、フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質の発現がＨｉｓ−ｐｈｚＤ遺伝子の上流のＴ７ポリメラーゼ・プロモ−タによってコントロールされる場合に極めて有利である。これは、Ｔ７ポリメラーゼがない大腸菌のようなホスト株で特に、Ｔ７プロモータのかかる効果が予期されるべきではないので、最も驚くべきである。最も好ましくは、フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質はＨｉｓ１０
−標識されている。
【００５１】
［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）は、当業者に公知の任意の方法によって、本発明のこの第２実施形態で得られた発酵培養液から回収することができる。好ましくは、それは、結晶化によって、または反応抽出およびクロマトグラフィーからなる群から選択された分離法、場合により続いて結晶化によって前記発酵培養液から回収される。
【００５２】
本発明の第１および第２実施形態の方法は、好適なホスト生物中インビボで実施することができる。本発明の第１および第２実施形態に従った方法がインビボで、すなわち生きている細胞中で実施されるとき、原核細胞ならびに、コリスミ酸への生合成経路がそこに存在する場合には、真核細胞が、本発明の方法のためのホスト細胞として用いられてもよい。本発明の第２実施形態に従った方法はまたインビトロで（酵素的に）実施されてもよいことが注目されるべきである。
【００５３】
本発明に従ったインビボ法のためのホスト生物は、発酵法に好適な任意のホストであることができる。しかしながら、最も好ましくは、（本発明の第１または第２実施形態の）方法は、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム属、エシェリキア属、およびピチア属（Ｐｉｃｈｉａ）からなる属の群から選択されたホスト生物中で行われる。
【００５４】
本発明はさらに、本発明の方法請求項の任意のものに従った方法であって、インビボで実施される方法での使用のための発現ベクターにも関する。本明細書で意味されるところでは、発現ベクターは、必要とされる遺伝子のすべてを一緒に単一ベクター上に含んでもよいし、または異なるベクターで異なる遺伝子を含んでもよい。ベクター、またはそれらの発現カセット（オペロン）、またはそれに関連する遺伝子は、染色体に組み込まれていてもよい。
【００５５】
さらに、本発明は、バチルス属、コリネバクテリウム属、エシェリキア属、およびピチア属からなる属の群から選択されたホスト生物の１つからのホスト細胞であって、標準条件下その自然環境でのかかる酵素の、すなわち、
・請求項３〜８のいずれか一項に従って使用されるようなＰａｂＡＢ二部分タンパク質、または
・４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼ（好ましくはＰａｂＡＢ二部分タンパク質）、ならびに４−アミノ−４−デオキシプレフェネート・デヒドロゲナーゼおよびアミノトランスフェラーゼ、または
・４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼ（好ましくはＰａｂＡＢ二部分タンパク質）、およびイソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができる酵素、または
・４−アミノ−４−デオキシコリスミ酸シンターゼ（好ましくはＰａｂＡＢ二部分タンパク質）、およびイソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−５，６−ジヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＤ）へ転化することができるおよび４−アミノ−４−デオキシイソコリスミ酸を［５Ｓ，６Ｓ］−６−アミノ−５−ヒドロキシシクロヘキサ−１，３−ジエン−１−カルボン酸（２，３−ＣＨＡ）へ転化することができる酵素、または
・ＰａｂＡＢ二部分タンパク質およびフェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質、または
・ＰａｂＡＢ二部分タンパク質および標識フェナジン生合成ＰｈｚＤタンパク質
の生来の活性のレベルと比べて高められたレベルの活性での次の活性または活性の組み合わせの少なくとも１つを含むホスト細胞にも関する。
【００５６】
大腸菌中でのｐ−アミノベンゾエートの生合成に取り組む参考文献に、ｐａｂＡおよびｐａｂＢ遺伝子の組み合わされた過剰発現が記載されてきたことは注目される。Ｙｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８７巻（１９９０）、９３９１〜９３９５頁に、およびニコルズ（Ｎｉｃｈｏｌｓ）ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４巻（１９８９）、８５９７〜８６０１頁の以前の研究に言及することができる。しかしながら、後の２文書は、ＰａｂＡＢタンパク質の過剰発現も、そのアミノトランスフェラーゼとの組み合わせも示しも、示唆もしていない。従って、上にリストされた具体的なホスト細胞は新規である。
【００５７】
勿論、本発明の脈略の中で、用いられるホストはまた、所望の生成物の生合成を高めるための修正をさらに含んでもよい。例えば、コリスミ酸活性と競合するかもしれない活性をコードする遺伝子は削除されてもよく（例えば、染色体から、コリスミ酸・ムターゼ／プレフェネート・デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子ｔｙｒＡ、および／またはコリスミ酸・ムターゼ／プレフェネート脱水酵素をコードするｐｈｅＡの削除）、または一般的な芳香族経路のキー酵素は過剰発現されてもよい（例えば、ＤＡＨＰシンターゼをコードするａｒｏＦの過剰発現）。
【００５８】
本発明者らはさらに、本発明の方法の第２実施形態に従って製造された［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）が触媒として、特にキラル触媒として、例えば、３，４−ＣＨＡとのＺｎ−錯体の存在下に４−ニトロベンズアルデヒドとアセトンとのアルドール縮合で非常に好適に使用できることを見いだした。３，４−ＣＨＡはキラル分子である。３，４−ＣＨＡでのキラル触媒作用で得られたキラル生成物の鏡像体過剰率、例えば生成物［Ｓ］−１−ｐ−ニトロフェニル−２−ヒドロキシブタン−３−オンのｅ．ｅ．は、配位子としてのＬ−プロリンとのＺｎ−錯体を用いる公知のキラル触媒作用反応のケースより驚くべきことにもはるかに高い。様々な一般レビューおよび論文は、Ｌ−プロリンのような化合物での不斉触媒作用を教示している。例えば、リスト、Ｂ．（Ｌｉｓｔ  Ｂ．）ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２巻（２０００）、２３９５〜２３９６頁；ダルコ、Ｐ．Ｉ（Ｄａｌｋｏ，Ｐ．Ｉ．）ら、Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４０（２００１）、３３７２６〜２２７４８頁、；リスト、Ｂ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５８（２００２）、５５７３〜５５９０頁、；チャンドラセクハー、Ｓ．（Ｃｈａｎｄｒａｓｅｋｈａｒ、Ｓ．）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４５巻（２００４），４５８１〜４５８２頁；バーケッセル、Ａ．（Ｂｅｒｋｅｓｓｅｌ，Ａ．）ら、Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ  Ｏｒｇａｎｏｃａｔａｌｙｓｉｓ、ＶＣＨ、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ、２００４；シーヤッド、Ｊ．（Ｓｅａｙａｄ、Ｊ．）ら、Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．３巻（２００５）、７１９〜７２４頁を参照されたい。
【００５９】
一方、α−アミノ酸、Ｌ−プロリン以外の他のアミノ酸も示される、を用いるキラル触媒作用は、例えば、２つの最近の定期刊行物、すなわち、Ｚｎ塩を用いた触媒作用を示すダーブレ、Ｔ．（Ｄａｒｂｒｅ、Ｔ．）ら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００３、１０９０〜１０９１頁、および例えば不斉アルドール反応での使用を示すアメジコー、Ｍ．（Ａｍｅｄｊｋｏｕｈ、Ｍ．）、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ：Ａｓｙｍｍｅｔｒｙ  １６巻（２００５）、１４１１〜１４１４頁から公知であることは注目できる。
【００６０】
しかしながら、上述のレビューおよび論文のどれも、アミノ基がカルボン酸基に関してα−またはβ−位にない、かかるアミノ酸および／またはその誘導体のキラル触媒作用についての使用に関していかなる教示も提供していない。しかしながら、β−アミノ酸（β−アラニン）がクネーベナーゲル（Ｋｎｏｅｖｅｎａｇｅｌ）反応、α−アミノ酸（α−アラニンのような）によって触媒され得ない反応での触媒として（例えばプロウト、Ｆ．Ｓ．（Ｐｒｏｕｔ，Ｆ．Ｓ）によって、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１８巻（１９５３）、９２８〜９３３頁に）確かに既に記載されたことが注目されてもよい。しかしかかる開示は、触媒として、特に明らかなキラル触媒として３，４−ＣＨＡを利用することは明らかにできない。
【００６１】
従っておよび驚くべきことに、本発明はまた、本発明のこのさらなる独立した実施形態で、本発明の第２実施形態に従った方法によって得られる［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）の触媒活性生成物としての、特にキラル触媒としての使用にも関する。
【００６２】
最後に、本発明はまた、本発明に従って生産することができるような［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）のさらなる転化にも関する。かかるさらなる転化は、３，４−ＣＨＡのあらゆる種類の誘導体を得るために都合よく実施することができる。かかるさらなる転化の良い例は（リン酸）オセルタミビルの合成である。
【００６３】
これまで、（リン酸）オセルタミビルのすべての合成は、正しい相対および絶対立体配置でのターゲット分子の４および５位に２つの窒素官能基の導入を必要とする。出発化合物としてシキメートを用いる、これまで公表された最短ルートは１１工程を必要とする。これは、図式的に、下のスキーム１に表される。
【化１】
2008501326.tif 000002
【００６４】
下のスキーム２から理解できるように、３，４−ＣＨＡだけでなくＡＤＣも、Ｃ−３の酸素置換基に関して正しい絶対および相対立体配置でＣ−４に窒素官能基を含有する。このように、本発明に従った、すなわち３，４−ＣＨＡの生合成から出発する（リン酸）オセルタミビルの合成は、Ｃ−５のアミノ基が正しく導入されなければならないだけであるから、非常に簡略化される。Ｃ−５アミノ基の導入は、例えばアジリジン化およびそれに続く還元（Ｘ．Ｅ．Ｈｕ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ６０（２００４）、２７０１〜２７４３頁を参照されたい）によって、または直接にか、例えば、標準的なテクニック（例えば、Ｍ．Ｂ．ガスク（Ｍ．Ｂ．Ｇａｓｃ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９（１９８３）、７０３〜７３１頁によって記載されているような）に従ったソルボ水銀化（ｓｏｌｖｏｍｅｒｃｕｒａｔｉｏｎ）およびそれに続く還元によるかのどちらかでのアミノ化によって行うことができる。３，４−ＣＨＡの保護は標準的なテクニックによって行うことができる。従って、様々な順番の工程で、好ましくは（しかし必ずしもではなく）下のスキーム２に示されるようなＣ−５位でまだアミノ化されなければならない完全保護の化合物（スキーム２で「新規中間体」と言われる）を経由して実施することができる一連の個々の反応工程として、かかる短縮された一連の反応工程の後、かかる短縮された一連の反応工程は実施されてもよい。しかしながら、かかる個々の反応工程の多くの異なる順番は、本発明に従って製造された３，４−ＣＨＡから出発して可能である。さらに、本発明に従った生合成による以外の別の方法で製造された３，４−ＣＨＡもまた、リン酸オセルタミビルにつながるその後の反応工程用の出発原料として用いることができる。
【化２】
2008501326.tif 000003
【００６５】
それ故特に、本発明はまた、
ａ）［３Ｒ，４Ｒ］−４−アミノ−３−ヒドロキシシクロヘキサ−１，５−ジエン−１−カルボン酸（３，４−ＣＨＡ）を、好ましくは３，４−ＣＨＡの合成に関する請求項のいずれか一項に従った３，４−ＣＨＡの生合成によって提供する工程と、
任意の順の工程ｂ）〜ｅ）
ｂ）カルボン酸官能基のそのエチルエステルへのエステル化、
ｃ）ヒドロキシル官能基のその３−ペンタノールエーテルへのエーテル化、
ｄ）Ｃ−３のアミノ基のアセチル化、
ｅ）Ｃ−４のＮ−含有基に関してトランス位でのアミノ官能基の導入、
続いて
ｆ）組み合わせられた反応工程ｂ）、ｃ）、ｄ）、およびｅ）の結果として３，４−ＣＨＡから製造された生成物のリン酸オセルタミビルへの転化
とを含む、リン酸オセルタミビルの新規合成方法にも関する。
【００６６】
例えば、工程ｂ）、エステル化で好適に適用することができる反応は、フェーダースピールら、Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ＆  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９９、２６６〜２７４頁、特に２７３頁のシキミ酸ルートの第１工程での中間体２３の２４への転化によって記載された。工程ｃ）のエーテル化は、当業者に公知のあらゆる方法によって行われてもよい。工程ｄ）のアセチル化は、例えば、カープフ（Ｋａｒｐｆ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６６（２００１）、２０４４〜２０５１頁によって、特に２０４９頁の中間体１７の１８への転化で記載されている方法を用いて行うことができる。例えば、工程ｅ）でのようなアミノ官能基の導入は、アジリジン化またはアミノ化（それぞれ、上述のＸ．Ｅ．Ｈｕの論文、Ｍ．Ｂ．ガスク（Ｍ．Ｂ．Ｇａｓｃ）らのそれを参照されたい）によって実施されてもよい。リン酸オセルタミビルへの最終転化は、例えば、カール（Ｃａｒｒ）ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６２（１９９７）、８６４０〜８６５３頁、特に８６４８頁の中間体１２の１３への転化によって記載されているように行うことができる。
【００６７】
実験の部に先行する添付の化学式シートは、この出願で述べられる様々な化合物、すなわち、
コリスミ酸
イソコリスミ酸
３，４−ＣＨＡ（トランス位のアミノ基およびヒドロキシ基）
２，３−ＣＨＡ（トランス位のアミノ基およびヒドロキシ基）
３，４−ＣＨＤ（トランス位のヒドロキシ基）
２，３−ＣＨＤ（トランス位のヒドロキシ基）
ＡＤＣ
ＡＤＩＣ
ＡＤＰ
ｐ−アミノフェニルアラニン
の構造を示す。
【００６８】
本発明は本明細書で以下、本発明の範囲を限定することを決して意図されない多数の実施例実施例を用いて説明される。
【００６９】
実験の部で言及されるヌクレオチドのシーケンス列挙、すなわち［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．１］〜［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．１０］は実験の部の終わりに示される。それらはまた、電子形式（パテントルン（Ｐａｔｅｎｔｌｎ））で提出されるであろう。
【化３】
2008501326.tif 000004
【００７０】
実験の部Ｉ（実施例１〜８）：単一遺伝子のクローン化ならびにＡＤＣおよび３，４−ＣＨＡ生合成オペロンの構築
実施例１〜８のための一般手順
プラスミドＤＮＡ単離、ゲル電気泳動、核酸の酵素的制限修飾、大腸菌形質転換などのような標準的な分子クローン化技術は、サムブロック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州によって記載されているように行った。合成オリゴデオキシヌクレオチドは、ＭＷＧ−バイオテック（ＭＷＧ−Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）（エバースベルグ（Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ）、独国）から入手した。ＤＮＡシーケンス解析は、ＧＡＴＣバイオテック（ＧＡＴＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＧ）（コンスタンツ（Ｋｏｎｓｔａｎｚ）、独国）およびアゴワ（ＡＧＯＷＡ  ＧｍｂＨ）（ベルリン（Ｂｅｒｌｉｎ）、独国）によって行われた。
【００７１】
実施例１〜８についての概論
ＡＤＣおよび３，４−ＣＨＡ生合成遺伝子発現ベクターとして、プラスミドｐＪＦ１１９ＥＨを選んだ；ヒュールステ（Ｆｕｅｒｓｔｅ）ら（Ｇｅｎｅ、４８（１９８６）、１１９〜１３１頁）。該発現システムはＩＰＴＧ誘導可能ｔａｃプロモータを用い、そしてインデューサなしでクローン化外来遺伝子の発現を極めて低く保つｌａｃリプレッサー（ＩａｃＩｑ遺伝子）を持っている。さらに、緑膿菌のｐｈｚＤ遺伝子を、Ｎ−末端Ｈｉｓ・タッグ（Ｈｉｓ・Ｔａｇ）（登録商標）シーケンスおよびプロテアーゼ・ファクターＸａ認識部位を含有するＰｈｚＤタンパク質を生産する発現ベクターｐＥＴ１６ｂ（カルビオケム−ノバビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ＧｍｂＨ）、シュバールバッハ（Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ）／Ｔｓ．、独国）にクローン化した。
【００７２】
実施例１：プラスミドｐＣ２６の構築
緑膿菌ＡＴＣＣ  １７９３３からのゲノムＤＮＡはアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、バージニア州、米国から入手した。フェナジン生合成タンパク質ＰｈｚＤをコードする、ＰＡ１９０２のためのオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）を含む７０６ｂｐフラグメントを、次のプライマー：
５’−ＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧＣＴＴＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＧＣＡＴＧＡＧＣ−３’  ［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．１］
（Ｈｉｎｄｌｌｌ認識部位に下線を引いた）および
５’−ＧＴＧＧＧＣＡＡＡＧＣＴＴＴＣＡＴＴＣＣＡＧＣＡＣＣＴＣＧＴＣＧＧＴＧＧ−３’  ［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．２］
（Ｈｉｎｄｌｌｌ認識部位に下線を引いた）
を用いて、緑膿菌ＡＴＣＣ  １７９３３からの染色体ＤＮＡ（受入番号ＡＥ００４６１６のヌクレオチド３８５７−４４８０；増幅領域ヌクレオチド３８４０−４４８０）からのＰＣＲによって増幅させた。
【００７３】
本出願との関連で用いられるすべてのヌクレオチド・シーケンスのリストは、本明細書に添付されるシーケンス列挙で提示する。
【００７４】
増幅フラグメントの正確なサイズは、アガロースゲル電気泳動によって確認し、フラグメントをゲルから精製した。フラグメントを、突出末端を生み出すために酵素Ｈｉｎｄｌｌｌで消化させた。プラスミドｐＪＦ１１９ＥＨをＨｉｎｄｌｌｌで消化させ、脱リン酸した。２つのフラグメントを次に結紮し、大腸菌ＤＨ５α（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＧｍｂＨ）、カールスルーエ（Ｋａｒｌｓｒｕｈｅ）、独国）の化学的に有能な（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）細胞の形質転換のために用いた。形質転換体を、１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上で選択した。（シーケンシングによって確認されるように）正確な挿入シーケンスを示すプラスミドをｐＣ２６と呼んだ。
【００７５】
ｐｈｚＤ遺伝子が緑膿菌のゲノムに２倍存在することは注目されるべきである。正確なコピーは、受入番号ＡＥ００４８３８ヌクレオチド２６２３−３２４６（ＰＡ４２１３）下に見いだすことができる。
【００７６】
実施例２：プラスミドｐＣ４９の構築
フェナジン生合成タンパク質ＰｈｚＤをコードする緑膿菌ｐｈｚＤ遺伝子を、ＰＣＲを用いてｐＥＴ１６ｂにサブクローン化した。ＰｈｚＤ・ＯＲＦを、プライマーとして
５’−ＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡＣＣＧＴＣＡＴＡＴＧＡＧＣＧＧＣＡＴＴＣＣＣＧ−３’
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．３］
（Ｎｄｅｌ認識部位に下線を引いた）および
５’−ＣＣＧＧＴＴＣＴＧＣＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣＡＧＧＣ−３’  ［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．４］
（ＢａｍＨｌ認識部位に下線を引いた）
を用い、テンプレートとしてｐＣ２６（実施例１を参照されたい）プラスミドＤＮＡを用いて増幅させた。
【００７７】
増幅フラグメントの正確なサイズ（７１２ｂｐ）は、アガロースゲル電気泳動によって確認した。フラグメントおよびプラスミドｐＥＴ１６ｂをＮｄｅｌおよびＢａｍＨｌで消化させた。２つのフラグメントを結紮し、大腸菌ＤＨ５αで形質転換させた。形質転換体を、１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上で選択した。（シーケンシングによって確認されるように）正確な挿入シーケンスを示すプラスミドをｐＣ４９と呼んだ。
【００７８】
実施例３：プラスミドｐＣ５３の構築
ゲノムＤＮＡを、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）、マナッサス（Ｍａｎａｓｓａｓ）、バージニア州、米国から入手したコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ  １３０３２から調製した。アミノデオキシコリスミ酸シンターゼのためのＯＲＦ（Ｃｇ１０９９７）を含む１９０７ｂｐフラグメントを、次のプライマー：
５’−ＴＴＴＴＡＧＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴＣ−３’  ［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．５］
（Ｂｇｌｌｌ認識部位に下線を引いた）および
５’−ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣＧＴＣＡＴＧＧＧａＡＡＴＴＣＡＡＣ−３’  ［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６］
（ＢａｍＨｌ認識部位に下線を引いた、内部ＥｃｏＲｌ認識部位を破壊するために、変更されるヌクレオチドを小文字で示して）
を用いて、コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ  １３０３２染色体ＤＮＡ（受入番号ＮＣ  ００３４５０のヌクレオチド１０５２０００−１０５３８８３、増幅領域ヌクレオチド１０５２０００−１０５３８８８）からのＰＣＲによって増幅させた。
【００７９】
増幅フラグメントの正確なサイズは、アガロースゲル電気泳動によって確認し、フラグメントをゲルから精製した。フラグメントを、突出末端を生み出すために酵素ＢｇｌｌｌおよびＢａｍＨｌで消化させた。プラスミドｐＪＦ１１９ＥＨをＢａｍＨｌで消化させ、脱リン酸した。２つのフラグメントを次に結紮し、大腸菌ＤＨ５αの化学的に有能な細胞の形質転換のために用いた。形質転換体を、１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上で選択した。（シーケンシングによって確認されるように）正確な挿入シーケンスを示すプラスミドをｐＣ５３と呼んだ。
【００８０】
実施例４：プラスミドｐＣ５６の構築
この実施例では、実施例１および３からのクローン化ｐａｂＡＢおよびｐｈｚＤを発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨで結合させた。ｐＣ５３中のｐａｂＡＢ遺伝子をＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨｌでの消化によって発現ベクターから切除し、ｐａｂＡＢ遺伝子を含有するこのＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動によって精製した。プラスミドｐＣ２６をＥｃｏＲｌおよびＢａｍＨｌで消化させ、ＰａｂＡＢ・ＥｃｏＲｌ／ＢａｍＨｌフラグメントと一緒に結紮し、そして大腸菌ＤＨ５αで形質転換させた。形質転換体を、１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上で選択した。（制限マッピングによって確認されるように）ｐＪＦ１１９ＥＨにおいて正確な順番で２つの遺伝子を含むプラスミドをｐＣ５６と称した。
【００８１】
実施例５：プラスミドｐＣ７８の構築
この実施例では、実施例２および３からのクローン化ｐａｂＡＢおよびｐｈｚＤを発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨで結合させた。ｐＣ４９中のｐｈｚＤ遺伝子をＢｇｌｌｌおよびＢａｍＨｌでの消化によって発現ベクターから切除し、ｐｈｚＤ遺伝子を含有するこのＤＮＡフラグメントをゲル電気泳動によって精製した。プラスミドｐＣ５３をＢａｍＨｌで消化させ、脱リン酸化し、ＰｈｚＤ・Ｂｇｌｌｌ／ＢａｍＨｌフラグメントと一緒に結紮し、大腸菌ＤＨ５αで形質転換させた。形質転換体を、１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上で選択した。（制限マッピングによって確認されるように）ｐＪＦ１１９ＥＨにおいて正確な順番で２つの遺伝子を含むプラスミドをｐＣ７８と称した。
【００８２】
実施例６：プラスミドｐＦ３４の構築
ゲノムＤＮＡを、大腸菌Ｗ３１１０株ＬＪ１１０（Ｔ．ゼッペンフェルド（Ｔ．Ｚｅｐｐｅｎｆｅｌｄ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（２０００）、４４４３〜４４５２頁）から調製した。ＤＡＨＰシンターゼ（ｔｙｒ）のための遺伝子ａｒｏＦを含む１２１３ｂｐフラグメントを、次のプライマー：
５’−ＣＴＡＴＣＧＡＡＴＴＣＧＡＧＣＡＴＡＡＡＣＡＧＧＡＴＣＧＣＣ−３’  ［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．７］
（ＥｃｏＲｌ認識部位に下線を引いた）および
５’−ＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡＡＣＣＡＧＴＴＣＣＣＧＧＧＧＣＴＴＣＧＣ−３’  ［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．８］
（Ｓｍａｌ認識部位に下線を引いた）
を用いて、大腸菌ＬＪ１１０染色体ＤＮＡ（受入番号ＡＥ０００３４６のヌクレオチド５８７２−６９４２、増幅領域ヌクレオチド５７８６−６９６５）からのＰＣＲによって増幅させた。
【００８３】
増幅フラグメントの正確なサイズは、アガロースゲル電気泳動によって確認した。フラグメントおよびプラスミドｐＪＦ１１９ＥＨをＥｃｏＲｌおよびＳｍａｌで消化させた。２つのフラグメントを結紮し、そして大腸菌ＤＨ５αで形質転換させた。形質転換体を、１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上で選択した。（シーケンシングによって確認されるように）正確な挿入シーケンスを示すプラスミドをｐＦ３４と呼んだ。
【００８４】
実施例７：プラスミドｐＣ９９、ｐＣ１００、ｐＣ１０１の構築
この実施例では、実施例３、４、および５からのクローン化ｐａｂＡＢおよびｐｈｚＤを発現ベクターｐＪＦ１１９ＥＨでａｒｏＦと結合させた。プラスミドｐＦ３４を酵素ＳｍａｌおよびＳｃａｌで消化させ、５５９５ｂｐフラグメントをゲルから精製した。
【００８５】
７．１  プラスミドｐＣ９９の構築
プラスミドｐＣ５３をＥｃｏＲｌで消化させ、突出末端にＫｌｅｎｏｗ酵素を用いて情報を与えた。次に、ｐａｂＡＢ遺伝子をＳｃａｌでの消化によって切除し、２７７４ｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動によって精製した。ｐＦ３４からの５５９５ｂｐのＤＮＡフラグメントおよび２７７４ｂｐのＤＮＡフラグメントを結紮し、大腸菌ＤＨ５αで形質転換させた。形質転換体を、１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上で選択した。（制限マッピングによって確認されるように）ａｒｏＦおよびｐａｂＡＢ遺伝子を含むプラスミドをｐＣ９９と称した。
【００８６】
７．２  プラスミドｐＣ１００の構築
プラスミドｐＣ５６をＥｃｏＲｌで消化させ、突出末端にＫｌｅｎｏｗ酵素を用いて情報を与えた。次に、ｐａｂＡＢ−ｐｈｚＤ・ＤＮＡフラグメントをＳｃａｌでの消化によって切除し、３４２１ｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動によって精製した。ｐＦ３４からの５５９５ｂｐのＤＮＡフラグメントおよび３４２１ｂｐのＤＮＡフラグメントを結紮し、大腸菌ＤＨ５αで形質転換させた。形質転換体を、１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上で選択した。（制限マッピングによって確認されるように）ａｒｏＦ、ｐａｂＡＢ、およびｐｈｚＤ遺伝子を含むプラスミドをｐＣ１００と称した。
【００８７】
７．３  プラスミドｐＣ１０１の構築
プラスミドｐＣ７８をＥｃｏＲｌで消化させ、突出末端にＫｌｅｎｏｗ酵素を用いて情報を与えた。次に、ｐａｂＡＢ−ｐｈｚＤ・ＤＮＡフラグメントをＳｃａｌでの消化によって切除し、３６１３ｂｐのＤＮＡフラグメントを電気泳動によって精製した。ｐＦ３４からの５５９５ｂｐのＤＮＡフラグメントおよび３６１３ｂｐのＤＮＡフラグメントを結紮し、大腸菌ＤＨ５αで形質転換させた。形質転換体を、１００ｍｇ・ｌ−１アンピシリンを含有するＬＢ寒天平板上で選択した。（制限マッピングによって確認されるように）ａｒｏＦ、ｐａｂＡＢ、およびｐｈｚＤ遺伝子を含むプラスミドをｐＣ１０１と称した。
【００８８】
実施例８：ホスト株Ｆ４の構築
大腸菌Ｗ３１１０株ＬＪ１１０（Ｔ．ゼッペンフェルドら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２（２０００）、４４４３〜４４５２頁）のｐｈｅＡ・ｔｙｒＡ・ａｒｏＦ遺伝子座を、Ｋ．Ａ．ダチェンコ（Ｋ．Ａ．Ｄａｔｓｅｎｋｏ）およびＢ．Ｌ．ワーナー（Ｂ．Ｌ．Ｗａｎｎｅｒ）、ＰＮＡＳ、９７（２０００）、６６４０〜６６４５頁に従って不活性化させた。不活性化カセットを、次のプライマー：
５’−ＡＡＣＴＴＣＧＴＣＧＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡＡＧＡＡＧＡＧＴＡＧＴＣＣＴＴＴＡＴＡＴＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ−３’  ［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．９］
５’−ＡＧＴＧＴＡＡＡＴＴＴＡＴＣＴＡＴＡＣＡＧＡＧＧＴＡＡＧＧＧＴＴＧＡＡＡＧＣＧＣＧＡＣＴＡＡＡＴＴＧＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ−３’  ［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．１０］
を用いてプラスミドｐＫＤ４からのＰＣＲによって増幅させた。
【００８９】
ｐｈｅＡ・ｔｙｒＡ・ａｒｏＦ遺伝子座が欠失している株をＦ４と称した。
【００９０】
実験の部ＩＩ（実施例９〜１２）：ＡＤＣ＋ＡＤＰ、および３，４−ＣＨＡの生産
実施例９：フェッド−バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）バイオリアクターでのＡＤＣとＡＤＰとの混合物の発酵生産
グルコースからの大腸菌Ｆ４／ｐＣ９９のＡＤＣ生産を無機培地で研究した。前培養培地は、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．３ｇ・ｌ−１）、ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０１５ｇ・ｌ−１）、ＫＨ２ＰＯ４（３．０ｇ・ｌ−１）、Ｋ２ＨＰＯ４（１２．０ｇ・ｌ−１）、ＮａＣｌ（０．１ｇ・ｌ−１）、（ＮＨ４）２ＳＯ４（５．０ｇ・ｌ−１）、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．０７５ｇ・ｌ−１）、クエン酸Ｎａ・３Ｈ２Ｏ（１．０ｇ・ｌ−１）、チアミン・ＨＣＩ（０．０１２５ｇ・ｌ−１）、Ｌ−チロシン（０．０５ｇ・ｌ−１）、およびＬ−フェニルアラニン（０．０５ｇ・ｌ−１）よりなった。追加のミネラルを、Ａｌ２（ＳＯ４）３・１８Ｈ２Ｏ（２．０ｇ・ｌ−１）、ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ（０．７５ｇ・ｌ−１）、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（２．５ｇ・ｌ−１）、Ｈ３ＢＯ３（０．５ｇ・ｌ−１）、ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ（２０．０ｇ・ｌ−１）、Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ（３．０ｇ・ｌ−１）、ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ（２０ｇ・ｌ−１）、ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（１５．０ｇ・ｌ−１）からなる微量成分溶液（１．０ｍｌ・ｌ−１）の形で加えた。グルコース原液（５００ｇ・ｌ−１）を別々にオートクレーブ滅菌し、滅菌した培地に１５ｇ・ｌ−１の最終濃度まで加えた。
【００９１】
大腸菌Ｆ４／ｐＣ９９の保存培養物を、５０％グリセロールを含有するルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地中−８０℃で保存した。１ｍｌ供給原料を用いてアンピシリン（１００ｍｇ・ｌ−１）を含有する２００ｍｌの前培養培地に接種し、２つの１ｌ振盪フラスコに分け、３７℃および１８０ｒｐｍで１６時間培養した。
【００９２】
発酵培地は、次の変更を除いて前培養用のものと同じものであった：ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．９ｇ・ｌ−１）、Ｋ２ＨＰＯ４は除いた、ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ（０．１１２５ｇ・ｌ−１）、クエン酸Ｎａ・３Ｈ２Ｏ（１．５ｇ・ｌ−１）、チアミン・ＨＣＩ（０．０７５ｇ・ｌ−１）、Ｌ−チロシン（０．１５ｇ・ｌ−１）、およびＬ−フェニルアラニン（０．３ｇ・ｌ−１）。追加ミネラルを微量成分溶液（１．５ｍｌ・ｌ−１）の形で加えた。
【００９３】
流加培養を５ｌのラブフォース（Ｌａｂｆｏｒｓ）バイオリアクター（インフォース（Ｉｎｆｏｒｓ）、アインスバッハ（Ｅｉｎｓｂａｃｈ）、スイス国）中、２リットル初期容量、培養温度３７℃、ｐＨ６．８で、１０％接種で２７．２５時間行った。ｐＨは１２．５％アンモニアおよび２．５ＮのＫＯＨ滴定によって調整した。８．２５時間後にＬ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンのフィード（１ＮのＫＯＨに溶解した５ｇ・ｌ−１Ｌ−チロシン、６ｇ・ｌ−１Ｌ−フェニルアラニン；フィード速度７ｇ・ｈ−１）を開始した。９．２５時間後にグルコースのフィード（５００ｇ・ｌ−１；フィード速度１２．５ｇ・ｈ−１）を開始した。約４．０のＯＤ６２０ｎｍで７．５時間後にＡＤＣ生産が０．１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘発された。
【００９４】
培養上清のサンプルを凍結乾燥させ、Ｄ２Ｏに再溶解させた。３０３Ｋでの６００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲは、予期される共鳴スペクトルを示した。共鳴すべての帰属は、幾つかの２Ｄ  ＮＭＲテクニック（１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、１Ｈ−１Ｈ  ＴＯＣＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＣＯＳＹおよび１Ｈ−１３ＣロングレンジＨＭＢＣ）を用いて行った。スペクトルはすべてＡＤＣおよびＡＤＰの存在を裏付けた。存在するＡＤＣの量は７ｇ・ｌ−１であると測定された。（ＡＤＣおよびＡＤＰに加えて、１６ｇ・ｌ−１のその前駆体コリスミ酸がＨＰＬＣ分析によって測定されるように存在した。）
【００９５】
別個のバッチでＡＤＣとＡＤＰとの混合物をイオン交換クロマトグラフィー（ダウエックス（Ｄｏｗｅｘ）５０Ｗｘ８、Ｈ＋−形、０．５Ｍアンモニア溶液で溶出）によってＡＤＣおよびＡＤＰの様々な比で、しばしばＡＤＰ過剰で発酵上清から単離した。コリスミ酸を定量的に除去した。最終生成物はほぼ１：１のＡＤＣおよびＡＤＰを含有した。
【００９６】
実施例１０：３，４−ＣＨＡのインビトロ生産
プラスミドｐＣ４９（実施例２を参照されたい）を抱く大腸菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ（カルビオケム−ノバビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ＧｍｂＨ）、シュバールバッハ（Ｓｃｈｗａｌｂａｃｈ）／Ｔｓ．、独国）の単コロニーを、アンピシリン（１００ｍｇ・ｌ−１）を含有する２００ｍｌのＬＢ培地で３７℃で培養した。０．６のＯＤ６００ｎｍで、細胞はＩＰＴＧ（１ｍＭ）の添加によって誘発された。４時間後に細胞を収穫し、緩衝液（２０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのジチオトレイトール（ＤＴＴ）、２０ｍＭのイミダゾール）に再懸濁させ、後での使用のために−７０℃で凍結させた。
【００９７】
凍結細胞を水浴中３０℃で解凍し、次に完全な溶解のために氷上で１時間インキュベートした。細胞残屑を遠心分離によって除去し、得られた細胞なし抽出物を２５ｍｌのＮｉ−ＮＴＡスーパーフロー（Ｓｕｐｅｒｆｌｏｗ）カラム（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、独国）にかけた。洗浄工程（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、２０ｍＭのイミダゾール）の後にＨｉｓ・ＰｈｚＤタンパク質を、増加する濃度のイミダゾール（最高２５０ｍＭ）を含有する緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、３００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）での溶出によって少なくとも９５％純度で得た。部分精製された抽出物をさらなる研究に用いた。
【００９８】
３ｍｌの３，４−ＣＨＡ生産分析試料は０．２ＭのＫ−リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．６）、８５ｍｇのＡＤＣ、および６２．５μｇの部分精製されたＨｉｓ・ＰｈｚＤを含有した。分析をＨｉｓ・ＰｈｚＤの添加によって開始し、３７℃で２時間後に停止した。タンパク質をセントリコン（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ）１０カラム（ミリポア（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ）、エッシュボルン（Ｅｓｃｈｂｏｒｎ）、独国）による遠心分離によって除去した。反応混合物をイオン交換クロマトグラフィーによって分離した。サンプルをＤ２Ｏに溶解させ、３００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲによって２９３Ｋで分析し、３，４−ＣＨＡの存在を確認した。
【００９９】
実施例１１：振盪フラスコでの３，４−ＣＨＡの発酵生産
グルコースからの、それぞれ、大腸菌株Ｆ４／ｐＣ１００およびＦ４／ｐＣ１０１の３，４−ＣＨＡ生産を無機培地で研究した。この無機培地は、グルコース（１０ｇ・ｌ−１）を除いて、実施例９に記載したような前培養培地と同じものであった。
【０１００】
大腸菌Ｆ４／ｐＣ１００およびＦ４／ｐＣ１０１の保存培養物を、５０％グリセロールを含有するルリア−ベルターニ（ＬＢ）培地中−８０℃で保存した。１．８ｍｌ供給原料を用いて５００ｍｌ振盪フラスコ中でアンピシリン（１００ｍｇ・ｌ−１）を含有する５０ｍｌの無機培地に接種し、３７℃および１８０ｒｐｍで１６時間培養した。この培養物の１２５μｌを次に用いて５００ｍｌ振盪フラスコ中で５０ｍｌの同じ培地に接種し、３７℃および１８０ｒｐｍで２４時間培養した。約１．５のＯＤ６２０ｎｍで３．２５時間後に、細胞は０．１ｍＭＩＰＴＧを添加することによって誘発された。
【０１０１】
培養上清のサンプルを凍結乾燥させ、Ｄ２Ｏに再溶解させた。３０３Ｋでの６００ＭＨｚの１Ｈ−ＮＭＲは、予期される共鳴スペクトルを示した。共鳴すべての帰属は、幾つかの２Ｄ  ＮＭＲテクニック（１Ｈ−１Ｈ  ＣＯＳＹ、１Ｈ−１Ｈ  ＴＯＣＳＹ、１Ｈ−１３Ｃ  ＣＯＳＹおよび１Ｈ−１３ＣロングレンジＨＭＢＣ）を用いて行った。スペクトルはすべて３，４−ＣＨＡの存在を裏付けた。存在量は株Ｆ４／ｐＣ１００およびＦ４／ｐＣ１０１についてそれぞれ、３０ｍｇ・ｌ−１および１５０ｍｇ・ｌ−１であると測定された。（３，４−ＣＨＡに加えて、それぞれ、１０２ｍｇ・ｌ−１および５２０ｍｇ・ｌ−１の３，４−ＣＨＤが存在したが、ＡＤＣ、ＡＤＰ、およびｐ−アミノ安息香酸はＨＰＬＣおよびＮＭＲ分析によって測定されるように存在しなかった。）
【０１０２】
実施例１２：フェッド−バッチ・バイオリアクターでの３，４−ＣＨＡの発酵生産
Ｆ４／ｐＣ１０１の前培養を実施例９に記載したように行った。発酵培地は実施例９でのものと同じものであった。
【０１０３】
流加培養を５ｌのラブフォース・バイオリアクター（インフォース、アインスバッハ（Ｅｉｎｓｂａｃｈ）、スイス国）中、２リットル初期容量、培養温度３７℃、ｐＨ６．８で、１０％接種で３１．２５時間行った。ｐＨは１２．５％アンモニアおよび２．５ＮのＫＯＨ滴定によって調整した。７．５時間後にＬ−チロシンおよびＬ−フェニルアラニンのフィード（１ＮのＫＯＨに溶解した５ｇ・ｌ−１Ｌ−チロシン、６ｇ・ｌ−１Ｌ−フェニルアラニン；フィード速度７ｇ・ｈ−１）を開始した。６．５時間後にグルコースのフィード（５００ｇ・ｌ−１；フィード速度１２．５ｇ・ｈ−１）を開始した。約７．５のＯＤ６２０ｎｍで７．０時間後に、３，４−ＣＨＡ生産が０．１ｍＭのＩＰＴＧの添加によって誘発された。上清を３，４−ＣＨＡについて１Ｈ−ＮＭＲによって分析し、存在量は１．７ｇ・ｌ−１であると測定された。前記量の３，４−ＣＨＡに加えて、５．４ｇ・ｌ−１での３，４−ＣＨＤが存在することが分かり、ならびに非常に少量の、およそそれらの検出限界で、ＡＤＣ（＜３７ｍｇ・ｌ−１）およびｐ−アミノ安息香酸（＜２７ｍｇ・ｌ−１）がＨＰＬＣ分析によって測定されるように存在した。
【０１０４】
３，４−ＣＨＡを、イオン交換クロマトグラフィーによって発酵上清から、約９０重量％の収率で単離した。
【０１０５】
実験の部で言及されるヌクレオチドの全シーケンスは本明細書で以下にリストされ、電子形式（パテントルン）で提出されるであろう。
【０１０６】
実験の部ＩＩＩ（実施例１３および１４、比較例ＡおよびＢ）：本発明に従って得られた３，４−ＣＨＡの触媒としての使用
実施例１３：本発明の前記実施形態に従って得られた純３，４−ＣＨＡでの触媒作用（および比較例Ａ：Ｌ−プロリンでの同じ反応）
本発明者らは、モデル反応（カーディロ、Ｇ（Ｃａｒｄｉｌｌｏ，Ｇ．）ら、Ｓｙｎｔｈ．Ｃｏｍｍｕｎ．、３３巻、１５８７〜１５９４頁に記載されているものに類似のクネーベナーゲル縮合）を用いて、触媒としてＬ−プロリンを用いた同じ反応と比較して、３，４−ＣＨＡそれ自体が前記反応のための触媒として使用できることを実証した。
【０１０７】
比較例Ａ
３−メチルブチルアルデヒド（１．５５ミリモル、０．８０１ｇ／ｍｌの密度を有する１７２μｌの液体）をＤＭＳＯに溶解させ、Ｌ−プロリン（０．２ミリモル、２３．０ｍｇ）を加えた。次に、５分後に、マロン酸ジメチル（４ミリモル、１．１５６ｇ／ｍｌの密度を有する４５９μｌの液体）を加え、混合物を室温（ｒ．ｔ．）で一晩撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。２９７ｍｇの縮合生成物、２−（３−メチル−ブチリデン）マロン酸ジメチルを得た。従って、縮合生成物の収率は９６％であった。
【０１０８】
実施例１３
３−メチルブチルアルデヒド（１．５５ミリモル、０．８０１ｇ／ｍｌの密度を有する１７２μｌの液体）をＤＭＳＯに溶解させ、３，４−ＣＨＡ（０．２ミリモル、３１．０ｍｇ）を加えた。次に、５分後に、マロン酸ジメチル（４ミリモル、１．１５６ｇ／ｍｌの密度を有する４５９μｌの液体）を加え、混合物を室温（ｒ．ｔ．）で７０時間撹拌した。反応混合物を酢酸エチルで希釈し、水で２回洗浄した。有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。１８３ｍｇの縮合生成物、２−（３−メチル−ブチリデン）マロン酸ジメチルを得た。従って、縮合生成物の収率は４６％であった。
【０１０９】
実施例１４：本発明の前記実施形態に従って得られた純３，４−ＣＨＡのＺｎ−錯体でのキラル触媒作用
（および比較例Ｂ：Ｌ−プロリンでの同じ反応）
本発明者らは、モデル反応（ダーブレ、Ｔ．（Ｄａｒｂｒｅ，Ｔ．）ら、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．２００３、１０９０〜１０９１頁によって記載されている合成に類似の３，４−ＣＨＡの亜鉛−錯体を用いるアルドール縮合）を用いて、触媒としてＬ−プロリンの亜鉛−錯体を用いた同じ反応と比較して、３，４−ＣＨＡの亜鉛−錯体が、例えば４−ヒドロキシ−４−（４−ニトロフェニル）ブタン−２−オンの形成で、不斉触媒活性を示すことを実証した。良好なｅ．ｅ．を前記反応生成物について得ることができる。
【０１１０】
同じ反応を、触媒として酢酸亜鉛だけを用いて行ったときには転化は全く観察されなかった。
【０１１１】
比較例Ｂ
Ｌ−プロリン（４．３４ミリモル、４９９ｍｇ）をＭｅＯＨに溶解させ、引き続いてトリエチルアミン（ＴＥＡ、０．７３ｇ／ｍｌの密度を有する０．６ｍｌの液体）を加えた。混合物を室温（ｒｔ）で１０分間撹拌した。次に、酢酸亜鉛（２．１７ミリモル、４７６ｍｇ）を混合物に加え、無色の沈澱が前記添加の直後に現れた。１時間撹拌した後、固体物質を濾過し、乾燥させて５３２ｍｇ（４１％）の亜鉛−（Ｌ−プロリン）２錯体を得た。この錯体は、次の１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）特性：δ＝１．８７（ｂｒ  ｓ，３Ｈ），２．２９（ｂｒ  ｍ，１Ｈ），３．０４（ｂｒ  ｓ，１Ｈ），３．１９（ｂｒ  ｍ，１Ｈ），３．９２（ｂｒ  ｓ，１Ｈ）によってキャラクタリゼーションされた。
【０１１２】
水中の少量の上記亜鉛−（Ｌ−プロリン）２錯体（０．０５ミリモル；１０ｍｌの水中の１５ｍｇの錯体）を次に５ｍｌのアセトン中の４−ニトロベンズアルデヒド（１．０ミリモル、１５１ｍｇ）の溶液に加え、反応混合物を不活性条件（Ｎ２）下にｒｔで撹拌した。４時間後に、反応混合物を蒸発させ、残渣をクロロホルムに溶解させた。すべての不溶性物質を濾過した。濾液を次にロータリー蒸発させて１７３ｍｇ（８３％収率、１１％ｅ．ｅ．）の４−ヒドロキシ−４−（４−ニトロフェニル）ブタン−２−オンを与えた。ｅ．ｅ．の測定は、キラル相ＨＰＬＣ（キラルパック（Ｃｈｉｒａｌｐａｋ）ＡＳ、ダイセル（Ｄａｉｃｅｌ））によって行った。
【０１１３】
この生成物は、次の１Ｈ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）特性：δ＝２．２３（ｓ，３Ｈ），２．８６（ｍ，２Ｈ），３．６１（ｂｒ  ｓ，１Ｈ，ＯＨ），５．２８（ｄｄ，Ｊ＝７．７，４．６Ｈｚ，１Ｈ），７．５５（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ），８．２２（ｄ，Ｊ＝９．１Ｈｚ，２Ｈ）によって；それぞれ次の１３Ｃ−ＮＭＲ（Ｄ２Ｏ）特性：δ＝３０．９（ＣＨ３），５１．７（ＣＨ２），６９．１（ＣＨ），１２４．０（２×ＣＨ），１２６．６（２×ＣＨ），１５０．１（２×Ｃｑ），２０８．８（Ｃ＝Ｏ）によってキャラクタリゼーションされた。
【０１１４】
実施例１４
３，４−ＣＨＡ（１．０８ミリモル、１６７ｍｇ）をＭｅＯＨに溶解させ、同量の水を加え、引き続いてトリエチルアミン（ＴＥＡ、１．０８ミリモル、０．７３ｇ／ｍｌの密度を有する１５０μｌの液体）を加えた。混合物をｒｔで１０分間撹拌した。次に、酢酸亜鉛（０．５４ミリモル、１１９ｍｇ）を混合物に加えた。１時間撹拌した後、固体物質を濾過した。濾液から、２４０μｌのＴＥＡの添加後に、白色固体が沈澱し、それを分離し、乾燥させて１０４ｍｇ（３０％収率）の亜鉛−（３，４−ＣＨＡ）２錯体を与えた。
【０１１５】
水中の少量の上記亜鉛−（３，４−ＣＨＡ）２錯体（０．０５ミリモル；１０ｍｌの水中の１８．８ｍｇの錯体）を次に５ｍｌのアセトン中の４−ニトロベンズアルデヒド（１．０ミリモル、１５１ｍｇ）の溶液に加え、反応混合物を不活性条件（Ｎ２）下にｒｔで撹拌した。７０時間後に、反応混合物を蒸発させ、残渣をクロロホルムに溶解させた。不溶性物質を濾過した。濾液を次にロータリー蒸発させて９０ｍｇ（４３％生成物、８８％ｅ．ｅ．）の４−ヒドロキシ−４−（４−ニトロフェニル）ブタン−２−オンを与えた。ｅ．ｅ．の測定は、キラル相ＨＰＬＣ（キラルパックＡＳ、ダイセル）によって行った。
【０１１６】
この生成物のｅ．ｅ．が反応時間および転化率への依存性をほとんど全く示さなかった：４２時間の反応時間後および約２４％転化率でさえも生成物は９０％ｅ．ｅ．のレベルで鏡像体過剰であったことは注目されるべきである。
【０１１７】
オリゴヌクレオチドのシーケンス列挙
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．１］
ＧＡＧＣＧＣＡＡＡＧ  ＣＴＴＣＣＣＣＴＧＧ  ＡＧＡＣＣＧＴＧＧＣ  ＡＴＧＡＧＣ  ３６
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．２］
ＧＴＧＧＧＣＡＡＡＧ  ＣＴＴＴＣＡＴＴＣＣ  ＡＧＣＡＣＣＴＣＧＴ  ＣＧＧＴＧＧ  ３６
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．３］
ＣＣＣＣＴＧＧＡＧＡ  ＣＣＧＴＣＡＴＡＴＧ  ＡＧＣＧＧＣＡＴＴＣ  ＣＣＧ  ３３
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．４］
ＣＣＧＧＴＴＣＴＧＣ  ＧＴＴＣＴＧＡＴＴＴ  ＧＧＡＴＣＣＴＡＴＣ  ＡＧＧＣ  ３４
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．５］
ＴＴＴＴＡＧＡＴＣＴ  ＧＴＧＧＴＴＴＴＧＴ  ＣＡＧＡＧＧＡＴＧＴ  Ｃ  ３１
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．６］
ＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴ  ＡＣＧＴＣＡＴＧＧＡ  ＡＡＴＴＣＡＡＣ  ２８
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．７］
ＣＴＡＴＣＧＡＡＴＴ  ＣＧＡＧＣＡＴＡＡＡ  ＣＡＧＧＡＴＣＧＣＣ  ３０
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．８］
ＣＡＣＴＴＣＡＧＣＡ  ＡＣＣＡＧＴＴＣＣＣ  ＧＧＧＧＣＴＴＣＧＣ  ３０
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．９］
ＡＡＣＴＴＣＧＴＣＧ  ＡＡＧＡＡＧＴＴＧＡ  ＡＧＡＡＧＡＧＴＡＧ  ＴＣＣＴＴＴＡＴＡＴ  ＴＧＡＧＴＧＴＡＴＣ  ＧＴＧＴＡＧＧＣＴＧ  ＧＡＧＣＴＧＣＴＴＣ  ７０
［ＳＥＱ  ＩＤ：Ｎｏ．１０］
ＡＧＴＧＴＡＡＡＴＴ  ＴＡＴＣＴＡＴＡＣＡ  ＧＡＧＧＴＡＡＧＧＧ  ＴＴＧＡＡＡＧＣＧＣ  ＧＡＣＴＡＡＡＴＴＧ  ＣＡＴＡＴＧＡＡＴＡ  ＴＣＣＴＣＣＴＴＡＧ  ７０
【配列表】
2008501326000001.app
【国際調査報告】
2008501326.tif 000005
2008501326.tif 000006
2008501326.tif 000007
2008501326.tif 000008
2008501326.tif 000009
2008501326.tif 000010
2008501326.tif 000011