(57)【要約】ストレプトミセスｓｐ発酵ブロスから出発する、タクロリムス（Ｉ）(１７−アリル−１,１４−ジヒドロキシ−１２−[２−(４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル)−１−メチルビニル]−２３，２５−ジメトキシ−１３,１９,２１,２７−テトラメチル−１１,２８−ジオキシ−４−アザトリシクロ−[２２.３.１.０4.9]オクタコス−１８−エン−２,３,１０,１６−テトラオン)の精製および回収の方法。本プロセスは不純物分離の生産性と選択性の点で特に有利である。2008518984.tif 000010
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
銀イオンを含む水／有機溶媒混合物中へのストレプトミセスｓｐの発酵生成物の溶解と、Ｃ１８逆相シリカゲルカラムによる溶液の溶離を含む、タクロリムス(Ｉ)の精製方法。
【化１】
2008518984.tif 000009
【請求項２】
前記銀イオンが銀塩から放出される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記銀塩が硝酸銀または過塩素酸銀である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
銀イオン濃度が０．０５〜１．３０モル／ｌの範囲である、請求項１ないし３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記濃度が０．２０〜０．３０モル／ｌの範囲である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記有機溶媒がアセトン、メタノールおよびアセトニトリルから選ばれる、請求項１ないし５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
非イオン性樹脂によるクロマトグラフィ精製段階と標準相シリカゲルによるクロマトグラフィ精製段階をさらに含む、請求項１ないし６のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に薬理的に活性な免疫抑制剤および抗菌性三環式マクロライドに関し、特にタクロリムス（Ｉ）の回収と精製の方法に関する。
【０００２】
【化１】
2008518984.tif 000003
【背景技術】
【０００３】
タクロリムス（Ｉ）（１７−アリル−１,１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３,２５−ジメトキシ−１３,１９,２１,２７−テトラメチル−１１,２８−ジオキシ−４−アザトリシクロ−［２２.３.１.０4.9］オクタコス−１８−エン−２,３,１０,１６−テトラオン）はストレプトミセスｓｐの発酵により製造される三環式マクロライドであり、移植拒絶反応の重大局面、自己免疫疾患、伝染病などの治療に使用される。
【０００４】
欧州特許ＥＰ０１８４１６２は、発酵および化学合成によるタクロリムスおよびそれらの誘導体の製造方法を開示している。特に、ストレプトミセスｓｐ.による発酵は、タクロリムスに加えて、ＦＫ５２０として通常公知の１７−エチル−誘導体（ＩＩ）（１７−エチル−１,１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３,２５−ジメトキシ−１３,１９,２１,２７−テトラメチル−１１，２８−ジオキシ−４−アザトリシクロ−［２２.３.１.０4.9］オクタコス−１８−エン−２,３,１０,１６−テトラオン）、および１７−プロピル誘導体（ＩＩＩ）（１７−プロピル−１,１４−ジヒドロキシ−１２−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルビニル］−２３,２５−ジメトキシ−１３,１９,２１,２７−テトラメチル−１１,２８−ジオキシ−４−アザトリシクロ−［２２.３.１.０4.9］オクタコス−１８−エン−２,３,１０,１６−テトラオン）も生成させる。
【０００５】
【化２】
2008518984.tif 000004
【０００６】
【化３】
2008518984.tif 000005
【０００７】
ＥＰ０１８４１６２は、タクロリムスとその副成物の物理化学的特徴のほかに、その抽出、精製および回収の方法も開示している。特に、発酵ブロス（ｂｒｏｔｈ）からの生成物の回収は公知抽出方法によって達成される。例えば、ブロスまたはミセリウム（ｍｉｃｅｌｉｕｍ）から活性（ａｃｔｉｖｉｔｙ）を抽出するため慣用溶媒の使用；イオン交換アニオン樹脂およびカチオン樹脂ならびに非イオン性吸着樹脂による吸収／溶離；シリカゲル、アルミナおよびセルロースなどの慣用のクロマトグラフ保持体による精製；活性炭での脱色、結晶化および再結晶などである。
【０００８】
ＥＰ０１８４１６２にしたがって、発酵ブロスからタクロリムスおよびその副生物の抽出と回収は次のように実施される：
−溶媒（たとえばアセトンやメタノール）によるミセリウムおよび／または発酵ブロスの抽出；
−非イオン吸着性樹脂（特にＨＰ−２０）による精製；
−精製した溶液を蒸発させて油にする；
−シリカゲル（特にＦｕｊｉ Ｄｅｖｉｓｏｎ Ｃｏ.のグレード１２シリカゲル）による精製、２〜３回繰返して粉末を得る；
−上述不純物の分離のための分取高速液体クロマトグラフィー(ＨＰＬＣ)による精製。
【０００９】
非イオン吸着樹脂およびシリカゲルによる精製工程は、発酵ブロス中に含まれる化合物（すなわち微生物によってつくられた物質、無機塩および出発物質から誘導される物質）の大部分を除去し、一方、不純物(ＩＩ)および(ＩＩＩ)は分取ＨＰＬＣによって除去されるが、工業的規模での生産性および適用性は全く不十分である。
【００１０】
ＵＳ６４９２５１３は、銀塩（特に硝酸銀）で前処理されたイオン交換カチオン樹脂によって不純物(ＩＩ)および(ＩＩＩ)からタクロリムスを精製することを教示している。同じ炭素原子数を有する不飽和脂肪酸のシス−トランス異性体の分離に銀塩を使用することは文献(Ｊ.Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、１４９(１９７８)、４１７)で知られている。銀塩は不飽和化合物とπ−錯体を形成し、したがってそれらの構造にしたがって分離される。ＵＳ６４９２５１３の方法は、銀錯体の形成のため、タクロリムスがカチオン性イオン交換樹脂に他の２つの不純物よりも多く保持されるので、１７−飽和側鎖を有する２つの不純物から（１７−アリル側鎖を有する）タクロリムスの分離が可能となる。
【００１１】
ＵＳ６５７６１３５は、特に次の部分構造を有する非イオン性吸着樹脂による不純物（ＩＩ）および（ＩＩＩ）からのタクロリムスの分離について教示している。
【００１２】
【化４】
2008518984.tif 000006
【００１３】
式中Ｒは水素であるかまたはハロゲン原子である。
【００１４】
タクロリムスから誘導される幾つかの分解生成物が文献において公知である(Ｙ.Ｎａｍｉｋｉら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ、４０、Ｎ°５／６、１９９５年３月）。
【００１５】
これらの分解生成物は発酵ブロス中に既に存在し、各種抽出段階中、操作条件に応じて増加することができる。
【００１６】
ＵＳ６４９２５１３およびＵＳ６５７６１３５に開示の方法は、不純物(ＩＩ)および(ＩＩＩ)からタクロリムスの分離を可能にするが、他の分解不純物からの分離は可能でない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
タクロリムスは分解不純物からＣ１８逆相シリカによって銀錯体（ＩＶ）として好都合に精製できることがわかった。
【００１８】
【化５】
2008518984.tif 000007
【００１９】
特に、本発明の方法は、銀イオンを含む水／有機溶媒混合物中へのストレプトミセスｓｐ.発酵生成物の溶解と、Ｃ１８逆相シリカゲルカラムによる該溶液の溶離を含む。
【００２０】
銀イオンが溶液中で銀塩、好ましくは硝酸銀または過塩素酸銀塩から放出される。銀イオンの濃度は好ましくは０．０５〜１．３０モル／ｌ、より好ましくは０．２０〜０．３０モル／ｌの範囲にある。
【００２１】
精製しようとする生成物が溶解される溶媒混合物の有機溶媒は、タクロリムスが可溶で、好ましくはアセトン、メタノールおよびアセトニトリルから選択される有機溶媒である。
【００２２】
Ｃ１８逆相シリカの量は粗生成物の重量の８倍、好ましくは１２〜１４倍である。π−錯体タクロリムス−銀の溶離は、溶解に使用したのと同じ溶媒混合物で、有機溶媒の量を徐々に増加させ、クロマトグラフィカラムから適当な留分を採集して実施した。溶離液中の銀イオン濃度は０．０５モル／ｌ〜１．３０モル／ｌの範囲となる。逆相シリカは異なる粒度分布、好ましくは５〜１５μｍおよび７０〜２３０μｍ、を有するＣ１８シリカである。溶離した留分の分析のための分析方法は、文献（Ｙ.Ｎａｍｉｋｉら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ４０、Ｎ°５／６、１９９５年３月）に開示されているもので、それにより、ＲＲＴを計算することによって不純物(ＩＩ)、(ＩＩＩ)および他の分解不純物を同定することが可能である。
【００２３】
本発明の方法はまた、たとえばＥＰ０１８４１６２にしたがって、非イオン性樹脂によるクロマトグラフ精製および標準相シリカゲルによるクロマトグラフ精製を含むこともできる。これらの精製工程はＣ１８逆相シリカゲルによる精製の前でも後でも実施できる。特に好ましい実施態様にしたがって、これらの追加精製は以降に詳細に述べるように前に実施することができる。
【００２４】
適切に濾過された発酵ブロスまたはミセリウムは、たとえばケトンまたはアルコール、好ましくはアセトンやメタノールなどのタクロリウムが可溶な有機溶媒で抽出され；該抽出生成物を非イオン吸着樹脂による吸着クロマトグラフィに、次いで標準相シリカゲルクロマトグラフィにかけて、タクロリムス、不純物（ＩＩ）と（ＩＩＩ）および発酵ブロスから誘導される他の化合物からの分解生成物（微生物によって生成する物質、無機塩、および出発物質から誘導される物質）を精製する。得られた生成物は有機水溶液中に溶解され、Ｃ１８逆相シリカゲルにより溶離されて、π−錯体タクロリムス−銀(ＩＶ)を回収する。これはタクロリムスが可溶な有機溶媒、たとえばエチルアセテートで抽出される。抽出生成物は既知方法で濃縮、結晶化される。
【００２５】
吸着樹脂による精製は、好ましくは三菱化学(シリーズＳＰ２００またはＳＰ８００)またはロームアンドハース(Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ)(シリーズＸＡＤ)製で市場入手可能な吸着樹脂を用いて実施される。好ましい溶媒はケトンまたはアルコールであり、さらに好ましいのはアセトンおよびメタノールである。
【００２６】
標準相シリカゲルによる精製は、好ましくは７０〜２３０メッシュの異なる粒子径を有する、市場入手可能なシリカゲルを使用して実施される。溶媒は好ましくはアルカン、エステル、ケトンおよびアルコールであり、より好ましくはｎ−ヘキサンおよびエチルアセテートである。
【００２７】
抽出および結晶化は文献に開示されたタクロリムスの溶媒抽出法と回収方法にしたがって実施される。好ましくは、精製されたπ−錯体タクロリムス−銀を含む溶液は減圧下に濃縮して有機溶媒を除去し、続いて０．５〜３倍容積の有機溶媒、好ましくはエチルアセテートで抽出する。有機相は１倍容積の脱イオン水で２〜３回洗浄し、続いて濃縮して少量にする。得られた溶液を有機溶媒（好ましくはアセトニトリル）中に溶解後、脱イオン水の添加によってタクロリムスが一水和物結晶として沈澱する。得られた結晶は高純度が特徴である（Ｙ.Ｎａｍｉｋｉら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ４０、Ｎ°５／６、１９９５年３月に報告のＨＰＬＣ法によりＨＰＬＣ面積％＞９９％）。
【００２８】
本発明の方法は、生産性、不純物分離の選択性および最終生成物の品質と云う点で従来既知の方法よりも特に優れている。生産性に関しては、本発明方法は単位粗生成物当りのクロマトグラフ保持体（Ｃ１８逆相シリカ）の必要量がＵＳ６５７６１３５（クロマトグラフキャリアがＨＰ２０ｓｓ）に開示のものよりも著しく少ない（約５〜８倍）。粗生成物のＣ１８逆相シリカに対する％重量比が５〜８％であるのに対し、ＵＳ６５７６１３５の方法では粗生成物のクロマトグラフ保持体ＨＰ２０ｓｓに対する％比は１％である。クロマトグラフ保持体の単位重量当りの生成物の高収量は、工業規模での生産性およびコストの観点から顕著な進歩を可能とする。精製段階の容量と同じである最終生成物の量は５〜８倍減少し、その結果銀塩（特にＡｇＮＯ3）によるコストも減少する。
【００２９】
それ故、Ｃ１８逆相シリカによる単独のクロマトグラフ工程のみにより工業的規模で高純度最終生成物が提供される。
【００３０】
本発明をこれから幾つかの実施例により詳細に説明する。
【実施例】
【００３１】
（実施例１）  吸着樹脂による抽出および精製
５０ｌの発酵ブロスに５０ｌのアセトンと１ｋｇの濾過助剤ジカライト（Ｄｉｃａｌｉｔｅ）を加える。室温で１時間攪拌後、スラリーを濾過する。得られた透明溶液を２ｌの吸着樹脂ＸＡＤ１６（ロームアンドハース製）により吸収させる。活性を６ｌの２５／７５  水／アセトンで溶離させる。得られた溶液を濃縮してアセトンを除去する。水溶液相（１．５ｌ）を１．５ｌのエチルアセテートで抽出する。この相を分離し、有機相を濃縮してオイルとする。
【００３２】
（実施例２）  シリカゲルによる精製
油状相に１８０ｇのシリカゲル（０．０６３〜０．２００ｍｍ、メルク）と１８０ｍｌのエチルアセテートを加える。この混合物を攪拌し、その後蒸発させて粉末にし、これをｎ−ヘキサン中１ｌのシリカゲル（０．０６３〜０．２００ｍｍ、メルク）を含むカラムに充填した。４ｌのｎ−ヘキサン、次いで４ｌの７５／２５  ｎ−ヘキサン／エチルアセテート、および最後に１０ｌのエチルアセテートで溶離させて精製を行った。溶離した留分を集め、それら各留分を、溶離剤として水／アセトニトリルを有するＣ１８カラムでＨＰＬＣによって分析した。活性富化留分をプールし、濃縮して白−帯黄色の固体（１２ｇ）を得た。
【００３３】
（実施例３）  π−錯体タクロリムス−銀の溶解と精製
実施例２の固体（１２ｇ、タクロリムス８．５ｇを含む）を３０ｇのＡｇＮＯ3を含む５０／５０  水／アセトン溶液４００ｍｌ中に溶解させる。この溶液を２００ｍｌのＣ１８逆相シリカ１５μｍ（Ｇｒａｃｅ−Ａｍｉｃｏｎ社製）中を通過させる。この後、５１ｇのＡｇＮＯ3を含む５０／５０ 水／アセトン溶液１０００ｍｌで、最後に２０／８０ 水／アセトン溶液２５０ｍｌでカラムを溶離させる。溶離液はＹ.Ｎａｍｉｋｉら、Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉａ ４０、Ｎ°５／６、１９９５年３月に報告されている分析方法にしたがって分析される留分に分けられる。以下の表はＣ１８逆相シリカによる各精製工程中のタクロリムス濃度と不純物濃度の変化を報告している。
【００３４】
留分２、３、４および５を一緒にして４００ｍｌに濃縮する。４００ｍｌのエチルアセテートを加え、次いで有機相を分離して４００ｍｌの脱イオン水で３回洗浄する。有機相を濃縮して少量の容積（１０〜１５ｍｌ）にする。
【００３５】
（実施例４）  タクロリムスの回収
実施例３により得られた溶液に７００ｍｌのアセトニトリルを加える。１２００ｍｌの脱イオン水を２５℃の温度で徐々に（１〜２時間）加え、該溶液を５℃に冷却後、この温度で１２〜１４時間放置する。濾過後、７．０ｇのタクロリムスが高純度（ＨＰＬＣ面積％＞９９％）で得られる。
【００３６】
【表１】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月8日(2006.8.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
適切に濾過された発酵ブロスまたはミセリウムは、たとえばケトンまたはアルコール、好ましくはアセトンやメタノールなどのタクロリウムが可溶な有機溶媒で抽出され；該抽出生成物を非イオン吸着樹脂による吸着クロマトグラフィに、次いで標準相シリカゲルクロマトグラフィにかけて、タクロリムス、不純物（ＩＩ）と（ＩＩＩ）および発酵ブロスから誘導される他の化合物からの分解生成物（微生物によって生成する物質、無機塩、および出発物質から誘導される物質）を精製する。得られた生成物は銀イオンを含む有機水溶液中に溶解され、Ｃ１８逆相シリカゲルにより溶離されて、π−錯体タクロリムス−銀(ＩＶ)を回収する。これはタクロリムスが可溶な有機溶媒、たとえばエチルアセテートで抽出される。抽出生成物は既知方法で濃縮、結晶化される。
【国際調査報告】
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