(57)【要約】分析物のアッセイシステムで、システムは固体支持体と６対以上のオリゴヌクレオチドを有する。対の各オリゴヌクレオチドは少なくとも部分的に対の他のオリゴヌクレオチドに対して相補的である。それぞれの対は第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを有する。第一オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定されており、第二オリゴヌクレオチドはそれに付着した分析物結合剤を有する。オリゴヌクレオチドは約３７℃から約４５℃で実施するアッセイに用いた場合、最大で３個の連続する同一ヌクレオチド及び約１０％未満のクロスハイブリダイゼーションを有する。
2008532527.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物のアッセイシステムであって、
ａ）固体支持体、及び
ｂ）６対以上のオリゴヌクレオチドであって、対の各オリゴヌクレオチドが、対の他方のオリゴヌクレオチドと少なくとも部分的に相補的であり、それぞれの対は第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含み、前記第一オリゴヌクレオチドはそれに付着している分析物結合剤を含み、前記第二オリゴヌクレオチドは前記固体支持体に固定されている、オリゴヌクレオチド
を含み、
前記オリゴヌクレオチドは、最大３個の連続する同一ヌクレオチドを有し、
前記オリゴヌクレオチドは、約３７℃から約４５℃で実施されるアッセイにおいて用いられる場合、１０％未満のクロスハイブリダイゼーションを有する、アッセイシステム。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが約３７℃から約４５℃で実施されるアッセイにおいて用いられる場合、３％未満のクロスハイブリダイゼーションを有する、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが約３７℃から約４５℃で実施されるアッセイにおいて用いられる場合、１％未満のクロスハイブリダイゼーションを有する、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドがさらに、
３個以下の連続する自己相補的ヌクレオチド、及び
６個以下の連続するプリンを含む、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項５】
各オリゴヌクレオチドがさらに、
他のオリゴヌクレオチドとマッチする１２個以下の連続するヌクレオチド、及び
他のオリゴヌクレオチドの相補体とマッチする１２個以下の連続するヌクレオチドを含む、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項６】
前記オリゴヌクレオチドが約５４℃から約７５℃のＴｍを有する、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項７】
各オリゴヌクレオチドが配列番号１〜２６６の異なる１つに由来する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項８】
各オリゴヌクレオチドが配列番号１〜２６６の異なる１つである、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項９】
さらに少なくとも１２対のオリゴヌクレオチドを含む、請求項８記載のアッセイシステム。
【請求項１０】
さらに少なくとも４８対のオリゴヌクレオチドを含む、請求項８記載のアッセイシステム。
【請求項１１】
さらに少なくとも９６対のオリゴヌクレオチドを含む、請求項８記載のアッセイシステム。
【請求項１２】
さらに１３３対のオリゴヌクレオチドを含む、請求項８記載のアッセイシステム。
【請求項１３】
各対の前記第二オリゴヌクレオチドに結合した異なる分析物結合剤が存在し、各々の異なる分析物結合剤が１つ又は複数のサンプルにおいて異なる分析物に対して特異性を有する、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項１４】
１つ又は複数のオリゴヌクレオチド対に由来する一方又は両方のオリゴヌクレオチドがさらにそれに付着されるリンカー分子、又はリンカー核酸配列を含む、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項１５】
前記リンカー分子が１つ又は複数のオリゴヌクレオチド対に由来する一方のオリゴヌクレオチドに共有結合しており、
前記リンカー分子が固体支持体に共有結合しており、そして
前記リンカー分子がオリゴヌクレオチドを固体支持体に付着させる、請求項１４記載のアッセイシステム。
【請求項１６】
前記異なるオリゴヌクレオチドの各々が、予め定義した異なる領域において前記固体支持体の表面に付着される、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項１７】
前記固体支持体がビーズである、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項１８】
前記分析物が核酸、ポリペプチド又は蛋白質、炭水化物、リガンド、脂質、ステロイド、代謝産物、乱用薬物、ウイルス抗原、細菌性抗原、及び全細胞からなる群から選択される、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項１９】
前記分析物が抗体及びその結合フラグメント、ホルモン、レクチン、受容体、ステロイド、細胞表面抗原、サイトカイン、成長因子、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、疾患マーカー、発癌マーカー、一塩基多型を有するゲノムＤＮＡからなる群から選択される蛋白質又はポリペプチドである、請求項１８記載のアッセイシステム。
【請求項２０】
１つ又は複数の特定の分析物の検出用キットの形態で提供される、請求項１記載のアッセイシステム。
【請求項２１】
結合アッセイにおいて使用するための少なくとも４８対のオリゴヌクレオチドのセットであって、セット中のそれぞれのオリゴヌクレオチドが、
ａ）最大３個の連続する同一ヌクレオチド、
ｂ）約３７℃から約４５℃で実施されるアッセイにおいて用いられる場合、約１０％未満のクロスハイブリダイゼーションを含む、オリゴヌクレオチドのセット。
【請求項２２】
それぞれのオリゴヌクレオチドがさらに、
ａ）３個以下の連続する自己相補的ヌクレオチド、及び
ｂ）６個以下の連続するプリンを含む、請求項２１記載の少なくとも４８対のオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項２３】
それぞれのオリゴヌクレオチドがさらに、
ｃ）他のオリゴヌクレオチドとマッチする１２個以下の連続するヌクレオチド、
ｄ）他のオリゴヌクレオチドの相補体とマッチする１２個以下の連続するヌクレオチド、
ｅ）他のオリゴヌクレオチドとの６０％以下の相同性、
ｆ）他のオリゴヌクレオチドの相補体との６０％以下の相同性、および
ｇ）約５４℃から約７５℃までのＴｍを含む、請求項２２記載の少なくとも４８対のオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項２４】
それぞれのオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜２６６の異なる１つに由来する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを含む、請求項２１記載の少なくとも４８対のオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項２５】
それぞれのオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜２６６の異なる１つである、請求項２１記載の少なくとも４８対のオリゴヌクレオチドのセット。
【請求項２６】
サンプル中の分析物を検出する方法であって、
ａ）６対以上の相補的なオリゴヌクレオチドを選択するステップであって、各対が第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを有し、前記第一オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定されており、前記第二オリゴヌクレオチドはそれに付着した分析物結合剤を含み、各ヌクレオチドは配列番号１〜２６６に由来する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有する、ステップと、
ｂ）１つ又は複数の分析物を含むサンプルを提供するステップと、
ｃ）１つ又は複数の分析物を、分析物結合剤がそれぞれの分析物に結合できる条件下で、前記第二オリゴヌクレオチドと混合するステップと、
ｄ）検出可能な標識を前記第二オリゴヌクレオチドに付着させるステップと、
ｅ）相補的なオリゴヌクレオチドの選択的なハイブリダイゼーションを促進する条件下で、６対以上のオリゴヌクレオチドを混合して、結合した分析物又は標識を有するハイブリダズされたオリゴヌクレオチドを形成するステップと、
ｆ）１つ又は複数の結合した分析物又は標識を検出するステップと、
を含む、方法。
【請求項２７】
（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、および（ｆ）のステップのうちの少なくとも１つが、約２０℃から約５５℃までの温度で実施される、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
核酸配列のコレクションを生成する方法であって、
ａ）複数のオリゴヌクレオチドを生成するステップであって、それぞれのオリゴヌクレオチドが予め決定したＴｍを有する、ステップと、
ｂ）前記生成したオリゴヌクレオチドのうちの１つを選択するステップと、
ｃ）前記選択したオリゴヌクレオチドが、
ｉ．約３個よりも多い連続する自己相補的ヌクレオチド、
ｉｉ．約３個よりも多い同一ヌクレオチド、
ｉｉｉ．約６個よりも多い連続するプリンを有する場合、前記選択したオリゴヌクレオチドを廃棄するステップと、
ｄ）前記選択したオリゴヌクレオチドをコレクション中の他のオリゴヌクレオチドと比較し、前記選択したオリゴヌクレオチドが、
ｉ．前記コレクション中の任意のオリゴヌクレオチドとマッチする１２個よりも多い連続するヌクレオチド、
ｉｉ．前記コレクション中の任意のオリゴヌクレオチドの相補体とマッチする１２個よりも多い連続するヌクレオチドを有する場合、前記選択したオリゴヌクレオチドを廃棄するステップと、
ｅ）ステップ（ｃ）及び（ｄ）において廃棄されない場合に、前記選択したオリゴヌクレオチドを前記コレクションに加えるステップと、
を含む、方法。
【請求項２９】
前記コレクションが少なくとも２４個のオリゴヌクレオチドを含むまで、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を繰り返すことを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記コレクションが少なくとも９６個のオリゴヌクレオチドを含むまで、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を繰り返すことを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３１】
前記コレクションが少なくとも１９２個のオリゴヌクレオチドを含むまで、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を繰り返すことを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
前記コレクションが少なくとも２６６個のオリゴヌクレオチドを含むまで、ステップ（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、及び（ｅ）を繰り返すことを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
クロスハイブリダイゼーションについて前記コレクション中のオリゴヌクレオチドを試験し、約３７℃から約４５℃で実施されるアッセイにおいて前記コレクション中の他のオリゴヌクレオチドと約１０％を超えてクロスハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを、前記コレクションから廃棄する追加ステップを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
クロスハイブリダイゼーションについて前記コレクション中のオリゴヌクレオチドを試験し、約３７℃から約４５℃で実施されるアッセイにおける前記コレクション中の他のオリゴヌクレオチドと約３％を超えてクロスハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを、前記コレクションから廃棄する追加ステップを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
前記生成するステップが、実質的に同じ長さを有するヌクレオチド配列のライブラリーを生成することを含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
請求項２８記載の方法により生成された少なくとも９６個のオリゴヌクレオチドのコレクション。
【請求項３７】
分析物のアッセイシステムであって、
ａ）固相担体、
ｂ）前記固相担体に結合した少なくとも１２個の非相補的なオリゴヌクレオチド
を含み、それぞれのオリゴヌクレオチドは、
ｉ．約５４℃から約７５℃のＴｍ、および
ｉｉ．約３７℃から約４５℃で実施されるアッセイにおいて用いられる場合、約１０％未満のクロスハイブリダイゼーションを含む、アッセイシステム。
【請求項３８】
それぞれのオリゴヌクレオチドがさらに、
最大３個の連続する同一ヌクレオチド、及び
６個以下の連続するプリンを含む、請求項３７記載のアッセイシステム。
【請求項３９】
それぞれのオリゴヌクレオチドがさらに、
他のオリゴヌクレオチドとマッチする１２個以下の連続するヌクレオチド、
他のオリゴヌクレオチドの相補体とマッチする１２個以下の連続するヌクレオチド、及び
３個以下の連続する自己相補的ヌクレオチドを含む、請求項３７記載のアッセイシステム。
【請求項４０】
それぞれのオリゴヌクレオチドが、配列番号１〜２６６の異なる１つである、請求項３７記載のアッセイシステム。
【請求項４１】
さらに前記固相担体に結合した少なくとも４８個の非相補的なオリゴヌクレオチドを含む、請求項３７記載のアッセイシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、米国特許出願第１１／０７８，５９１号（発明の名称「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  Ｆｏｒ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘｅｄ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ａｓｓａｙｓ」、２００５年３月１１日出願）に関連し、その内容は、参考としてその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
背景
以下の説明は、本発明に関連する情報についてまとめたものであり、ここに示した情報または参照した出版物のいずれも本発明の特許請求の範囲の先行技術であることを示すものではない。
【０００３】
オリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、分析物の分類、検出、特定を含む広範囲の多様な分析アッセイ及び診断アッセイに有用である。同時に、さらに多数の要素及び特徴について、サンプルをスクリーニングすることが望ましい。したがって、所定のアッセイにおいて用いられるオリゴヌクレオチドの数は増加し続けている。所定のアッセイにおいて用いられるオリゴヌクレオチドの数は増加しているので、非相補的なオリゴヌクレオチドが互いにクロスハイブリダイズしないことが重要である。残念ながら、このような非特異的なクロスハイブリダイゼーションはよくある問題で、オリゴヌクレオチドベースのアッセイで、特に複数のオリゴヌクレオチド対を用いる場合に、偽陽性、又は偽陰性信号の主要な原因である。
【０００４】
オリゴヌクレオチドのクロスハイブリダイゼーションが生じるのは、１つにはオリゴヌクレオチド中の異なるヌクレオチド及びヌクレオチド配列の改変物の間で、ベーススタッキングエネルギーの変動性によるものである。オリゴヌクレオチドのクロスハイブリダイゼーションに影響を与えている別のパラメータのセットは、ハイブリダイゼーション反応条件である。使用したオリゴヌクレオチドの長さは、個別のオリゴヌクレオチドが自ら折り曲げることができる点まで長くすることができるので、自己相補性が問題となる。余りにも均一なオリゴヌクレオチドは、サンプルの望ましくないコンポーネントに結合すると考えられるので、用いるオリゴヌクレオチドはヒトゲノムにおける共有の反復配列に対して余り均一でないことが重要である。
【０００５】
複数のオリゴヌクレオチドを利用したアッセイシステムの設計及び実施につき問題をもたらすその他の要因は、実質すべての対のオリゴヌクレオチドが実質的に同じＴｍを有することが望ましい。すなわちすべての対オリゴヌクレオチドが実質的に同じ率で、同じ時間フレーム内でハイブリダイズする、及びオリゴヌクレオチドがともに比較的に迅速にハイブリダイズすることが望ましい。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
必要なことは、異なる対の間に有意なクロスハイブリダイゼーションを有さない、またその結果として偽陽性又は偽陰性シグナルを有さないオリゴヌクレオチド対のセットを利用する複数の分析物の検出に役立つオリゴヌクレオチドベースのアッセイシステムである。すべての対オリゴヌクレオチドが実質的に同じ率でハイブリダイズし、実質的に同じＴｍを有し、また相補的オリゴヌクレオチド対がともに比較的迅速にハイブリダイズできるオリゴヌクレオチドベースのアッセイシステムの必要性も同じく存在する。さらに多重化結合アッセイのためのオリゴヌクレオチドのセットを生成する改良された方法も必要である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
したがって、本発明は、その実施形態において、固体支持体及び６対以上のオリゴヌクレオチドを有する分析物のアッセイシステムを目的としている。それぞれの対のオリゴヌクレオチドは、他の対のオリゴヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補的である。各対は第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを有し、第一オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定されており、第二オリゴヌクレオチドはそれに付着した分析物結合剤を有する。オリゴヌクレオチドは、約３７℃から約４５℃で実施されるアッセイに用いた場合、最高で３個の連続する同一ヌクレオチド及び約１０％未満のクロスハイブリダイゼーションを有する。さらなる実施形態において、システムは少なくとも１２、２４、４８、９６、１３３対のオリゴヌクレオチドを有していてよい。各オリゴヌクレオチドは配列番号１〜２６６の異なる１つに由来する少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有していてよい。各オリゴヌクレオチドは配列番号１〜２６６の異なる１つであってよい。
【０００８】
本発明はまた、結合アッセイに使用する少なくとも４８対のオリゴヌクレオチドのセット（約３７℃から約４５℃で実施するアッセイに用いる場合、セット中の各オリゴヌクレオチドは最高３個の連続する同一ヌクレオチド及び約１０％未満のハイブリダイゼーションを有する）を目的としている。
【０００９】
本発明はまた、サンプル中の分析物の検出法を目的としており、６対以上の相補的オリゴヌクレオチド対を選択するステップを含み、各対は第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを有し、第一オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定され、第二オリゴヌクレオチドはそれに付着した分析物結合剤を含み、各ヌクレオチドは配列番号１から配列番号２６６までの少なくとも１５個の連続するヌクレオチドを有する。１つ又は複数の分析物を有するサンプルが提供される。１つ又は複数の分析物は、分析物結合剤がそれぞれの分析物を結合できる条件下で第二オリゴヌクレオチドと混合する。分析物と第二オリゴヌクレオチドを第二オリゴヌクレオチド上で、検出可能な標識に付着するようにさらに加工する。結合した分析物又は標識をつけ、ハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを形成するために、６対以上のオリゴヌクレオチドを相補的なオリゴヌクレオチドの選択的ハイブリダイゼーションを容易にする条件下で混合する。次に結合した分析物又は標識を検出する。
【００１０】
本発明はまた、核酸配列のコレクションを生成する方法を目的としており、該方法は複数のオリゴヌクレオチドを生成するステップを含み、オリゴヌクレオチドのそれぞれは予め決定したＴｍを有する。複数のオリゴヌクレオチド中の１つを分析のために選択する。選択したオリゴヌクレオチドが約４個以上の連続する自己相補的ヌクレオチドを有するか、又は約４個以上の連続する同一ヌクレオチドを有するか、又は約７個以上の連続するプリンを有する場合には選択したオリゴヌクレオチドを廃棄する。選択したオリゴヌクレオチドをコレクション中のすべてのオリゴヌクレオチドと比較し、選択したオリゴヌクレオチドがコレクション中のすべてのオリゴヌクレオチドとマッチする１３個以上の連続するヌクレオチドを有する場合、又はコレクション中のすべてのオリゴヌクレオチドの相補体とマッチする１３個以上の連続するヌクレオチドを有する場合には廃棄する。廃棄しない場合は、選択したオリゴヌクレオチドをコレクションの中に含める。
【００１１】
本発明はまた分析物のアッセイキットを目的としており、キットは固相担体を有し、固相担体には少なくとも１２個の非相補的オリゴヌクレオチドが結合され、各オリゴヌクレオチドは約５４℃から約７５℃のＴｍを有し、約３７℃から約４５℃で実施するアッセイにおいて用いるときに約１０％未満のクロスハイブリダイゼーションを有する。
【００１２】
本発明のこれらの特徴、様態、及び有利な点は以下の説明、添付した特許請求の範囲、及び附属の図に関してより詳しく理解されるであろう。
【００１３】
配列表
本出願に際しては、本申請において参照したヌクレオチド配列を含む１枚のディスケットを提出した。ディスケットに関する情報を参照して本書に加える。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
説明
以下の考察において、本発明の実施形態及びこれらの実施形態のいくつかの改変例を説明する。しかし、本考察は、発明をこれらの特定の実施形態に限定するものと解釈するべきではない。当業者は同様の多数の他の実施形態を認識するであろう。好ましいものとして、または特に好ましいものとして言及されてここに記述されたすべての実施形態は、好ましいとしていても、絶対不可欠なものではない。
【００１５】
定義
「核酸」及び「ポリヌクレオチド」という用語は、ここにおいて常に、自然に存在するか、又は合成された二重鎖デオキシリボ核酸（以下、「ＤＮＡ」）、単鎖ＤＮＡ、又はリボ核酸（以下、「ＲＮＡ」）を含むものとして用いる。
【００１６】
ここで用いた「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然の、又は改変したモノマーの線形のオリゴマー、改変した骨格、又は改変した結合を含む核酸である。それにはワトソンクリック型の塩基対などのように通常のパターンのモノマー対モノマー反応によりオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド標的と特異的に結合できるデオキシリボヌクレオシド、リボヌクレオシド、そのアノマー形、ペプチド核酸（ＰＮＡｓ）その他のものが含まれる。通常、モノマーはホスホジエステル結合又はそれと類似のものにより結合され、数モノマー単位、例えば３−４から数１０モノマー単位までの範囲のサイズのオリゴヌクレオチドを形成する。ホスホジエステル結合の類似物には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホラニリデート、ホスホラミデートなどがある。ホスホロチオエート、ホスホラミデート、及び非天然の骨格をもたらすこのような同様の群などの代替的な化学物質は、生じたオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション効率は有害な影響を与えないことを前提にして用いることができる。オリゴヌクレオチドは例えばＯｚａｋｉらのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０：５２０５−５２１４（１９９２）、ＡｇｒａｗａｌらのＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１８：５４１９−５４２３（１９９０）などの多くのアプローチによって合成することができる。
【００１７】
「相補的な」又は「相補性」という用語は、塩基対合によるポリヌクレオチドの天然の結合を指称する。例えば、配列５’−ＡＧＴ−３’は相補的配列３’−ＴＣＡ−５’に結合する。２つの単鎖分子間の相補性は、一定の核酸のみが結合し、二本鎖を形成する場合、「部分的」であると考えられる。また単鎖分子間にすべての相補性が存在するような場合、相補性は「完全」であると考えられる。核酸鎖間の相補性の程度は核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率及び長さに重大な影響を与える。
【００１８】
核酸「二重鎖」は、ある鎖の３’末端が反対側の鎖の５’末端に定置し結合している逆平行の複合体を形成するＤＮＡ又はＲＮＡの相補的な鎖の塩基対合により形成される。この塩基対合はまた、使用可能なデオキシイノシン、２−アミノプリン基を有するヌクレオシドなどの「ヌクレオシド類似物」の対形成を含む。ここで用いたように「ヌクレオシド」は、例えばＫｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ．２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）などに記載されたような２’−デオキシ及び２’−ヒドロキシル体などの天然のヌクレオシドを含む。ヌクレオシドに関して「類似物」は、例えばＳｃｈｅｉｔ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）、Ｕｈｌｍａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３−５８４（１９９０）などに記述されたように特異的なハイブリダイゼーションを行うことができる改変された塩基部分及び／又は改変された糖部分を有する合成ヌクレオシドを含む。このような類似物には結合特性を高め、縮重を低減し、特異性を高めるように設計された合成ヌクレオシドを含む。
【００１９】
「ハイブリダイズする」又は「ハイブリダイゼーション」という用語には、少なくとも２つの相補的な核酸配列が存在する場合に、それらが塩基対合を通じて二重鎖構造を形成するような条件下での少なくとも２つの核酸配列の混合も含めることも意図される。
【００２０】
本発明は分析物のアッセイシステムを目的にしている。アッセイシステムは６対以上の相補的なオリゴヌクレオチドを含む。相補的なオリゴヌクレオチドの各対は、第一オリゴヌクレオチドと第二オリゴヌクレオチドを含む。あるオリゴヌクレオチド対の第一オリゴヌクレオチドは、固体支持体に固定されている。分析物結合剤をオリゴヌクレオチド対の第二オリゴヌクレオチドに付着させる。好ましい実施形態においては、各対の第二オリゴヌクレオチドに結合した異なる分析物結合剤があり、それぞれの異なる分析物結合剤は、１つまたは複数のサンプル内の異なる分析物に対して特異性を有する。
【００２１】
本発明のオリゴヌクレオチドは、異なるオリゴヌクレオチド対に由来するオリゴヌクレオチドのクロスハイブリダイゼーションを最小にする配列を有するものが選択される。相補的なオリゴヌクレオチドの各対は典型的に、ヌクレオチド総数が同じか、ヌクレオチドが４個以下異なるオリゴヌクレオチドか、さらに典型的には、ヌクレオチドが２個以下異なるオリゴヌクレオチドである。各オリゴヌクレオチドのグアニンとシトシンの含有量、合わせて「ＧＣ含有量」は、典型的には、約３５％から約６５％の間であり、より典型的には、各オリゴヌクレオチドのＧＣ含有量は約４０％から約６０％の間である。
【００２２】
本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１から配列番号２６６及びその改変物と一部分を含む。ここで配列番号１は配列番号２に対して相補的であり、配列番号３は配列番号４に対して相補的、配列番号５は配列番号６に対して相補的、以下同様である。配列番号１〜２６６で表されるオリゴヌクレオチドを表Ｉに示した。
【００２３】
上記配列の一部を含むオリゴヌクレオチドは典型的な場合、配列番号１〜２６６から１５個以上の連続するヌクレオチドを有する配列、配列番号１〜２６６から１６個以上の連続するヌクレオチドを有する配列、配列番号１〜２６６から１７個以上の連続するヌクレオチドを有する配列、配列番号１〜２６６から１８個以上の連続するヌクレオチドを有する配列、配列番号１〜２６６から１９個以上の連続するヌクレオチドを有する配列、又は配列番号１〜２６６に従う配列からなる群から選択される。連続するヌクレオチドは、ポリヌクレオチド鎖においてホスホジエステル結合によって、典型的には、一緒に直接的に結合されているヌクレオチドである。配列番号１〜２６６におけるオリゴヌクレオチドの一部は、例えば、反応条件又は温度を変更するために望ましいと考えられる。一部は配列番号１〜２６６におけるオリゴヌクレオチドの３’末端又は５’末端から１つ又は複数のヌクレオチドを取り去ることによって選択できる。
【００２４】
あるいは、オリゴヌクレオチドは配列番号１〜２６６に従った配列のいずれかのヌクレオチドにおいて１つのヌクレオチド変異を有する配列、配列番号１〜２６６に従った配列のいずれかの２個以下のヌクレオチドにおいて２個以下のヌクレオチド変異を有するオリゴヌクレオチド、配列番号１〜２６６に従った配列のいずれかの３個以下のヌクレオチドにおいて３個以下のヌクレオチド変異を有するオリゴヌクレオチド、配列番号１〜２６６に従った配列のいずれかの４個以下のヌクレオチドにおいて４個以下のヌクレオチド変異を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択する。
【００２５】
本発明に従ったアッセイシステムは代替的に、配列番号１〜２６６に従った１つ又は複数のオリゴヌクレオチド対、又はここに記載したそれらの変異種；配列番号１〜２６６に従った６個以上のオリゴヌクレオチド対、又はここに記載したそれらの変異種；配列番号１〜２６６に従った１２個以上のオリゴヌクレオチド対、又はここに記載したそれらの変異種；配列番号１〜２６６に従った２４個以上のオリゴヌクレオチド対、又はここに記載したそれらの変異種；配列番号１〜２６６に従った４８個以上のオリゴヌクレオチド対、又はここに記載したそれらの変異種；配列番号１〜２６６に従った９６個以上のオリゴヌクレオチド対、又はここに記載したそれらの変異種；配列番号１〜２６６に従ったすべてのオリゴヌクレオチド対、又はここに記載したそれらの変異種を用いる。
【００２６】
ある特定の実施形態において、本発明は４８対から５２対の相補的なオリゴヌクレオチドを含む分析物用のアッセイシステムである。相補的なオリゴヌクレオチドのそれぞれの対は、第一オリゴヌクレオチド及び第二オリゴヌクレオチドを含み、第一オリゴヌクレオチドは固体支持体に固定され、第二オリゴヌクレオチドはそれに付着した分析物結合剤を含む。オリゴヌクレオチドは配列番号１〜２６６からなる群から選択される。
【００２７】
第一オリゴヌクレオチドとして配列番号１〜２６６から選択したそれぞれのオリゴヌクレオチドに対して、配列番号１〜２６６中のそれぞれの相補的なオリゴヌクレオチドを第二オリゴヌクレオチドから選択する。好ましくは、すべての第一ヌクレオチドを配列番号１〜２６６中の奇数の配列から選択するか、又はすべての第一ヌクレオチドを配列番号１〜２６６中の偶数の配列から選択することである。初めに説明した通り、選択したオリゴヌクレオチドではなく、むしろ選択したオリゴヌクレオチドの一部及び改変物を用いることができる。配列番号１〜２６６中の全セット２６６オリゴヌクレオチドをはじめ、可変数のオリゴヌクレオチドを所定のアッセイに用いうることは当業者には理解可能な事柄である。
【００２８】
４８個以上の分析物について所定のサンプルをアッセイする能力は、時間と費用を同時に節約し、限界のあるサンプルの優れた分析を可能にする。４８個の分析物に対するアッセイは、典型的には１２個の分析物に対するアッセイと同時になすことができ、それにより処理能力が４因子上昇する。典型的には試薬容量は、アッセイが１２個の分析物の場合と４８個の分析物の場合とで同じである。したがって、４８個の分析物アッセイは決められた分析物あたりの試薬コストが低い。さらに、同量のサンプルは典型的にはより限定的なアッセイの場合と同じく４８個の分析物のアッセイに用いることができるので、４８個の分析物アッセイはわずかな量のサンプルのみが利用できる場合により詳細な分析を可能にする。
【００２９】
いくつかの実施形態においては、オリゴヌクレオチドは配列番号１〜２６６に従う配列又はその一部を有するオリゴヌクレオチドに共有結合する１つ又は複数のリンカー分子又はリンカー核酸配列を含む。リンカー分子又はリンカー核酸配列は、典型的にはオリゴヌクレオチドの５’末端又は３’末端にあり、したがって対の他のオリゴヌクレオチドと塩基対をなすオリゴヌクレオチドの領域を超えて延長する。リンカー分子又はリンカー核酸配列は、存在する場合、典型的には対の第一オリゴヌクレオチドを分析物結合剤に結合、付着させ、又は対の第二オリゴヌクレオチドを固体支持体に結合する。リンカー分子又はリンカー核酸配列は、異なるオリゴヌクレオチド鎖に対する逐次ハイブリダイゼーションにより生成されるオリゴヌクレオチド複合体の一部になることができる。該異なるオリゴヌクレオチド鎖の中で、該オリゴヌクレオチド複合体の１つはこれらのオリゴヌクレオチド中の相補的な領域を経由する分析物結合剤である。
【００３０】
オリゴヌクレオチドを種々の固体支持体に付着させる技術は、Ｍａｔｓｏｎ，Ｒら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  Ｐｏｌｙｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２２４，１１０−１１６（１９９５）、Ｍｉｌｔｏｎ，Ｒら、米国特許６，１４６，８３３号、Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，”ｐａｇｅｓ  ６４−６７（１９９２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．）などに記載されている通り、当業者に既知である。オリゴヌクレオチドを蛋白質及び抗体に付着させる技術は、Ｒｅｄｄｙら、米国特許５，６４８，２１３号などに記載されている通り、当業者に既知である。その他の特異的なオリゴヌクレオチド付着化学はＳｈｉらの米国特許６，１３６，９６２号及び米国特許６，３８７，６２６号に記載されている。ここでは未改変の核酸分子がシランつきの固体支持体に付着している。これらの全ての文書の内容をここに参照して本書に加える。
【００３１】
ハイブリダイゼーション反応条件は、それぞれのオリゴヌクレオチドが、アッセイシステムからのオリゴヌクレオチドの混合物においてその相補的対形成したオリゴヌクレオチドのみにハイブリダイズするように予め選択することが好ましい。ここに引用したように、相補的対形成したオリゴヌクレオチドのみにハイブリダイズすることは、クロスハイブリダイゼーションが約１０％を超えないことを意味する。このオリゴヌクレオチドのセットにつき設計された最適の反応条件下で、異なる対については、クロスハイブリダイゼーションが約５％を超えないことが好ましく、約３％を超えないことがより好ましく、１％を超えないことがさらに好ましい。例えば、最適の条件は、ＭＥＳバッファー中の８５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む反応混合物において約３７℃から約４５℃の範囲の温度において、約１時間から２時間の培養を含むと考えられる。これらの条件下で本発明のオリゴヌクレオチド対は、クロスハイブリダイゼーションが約３％を超えない、好ましくはクロスハイブリダイゼーションが１％を超えない状態でハイブリダイズする。
【００３２】
オリゴヌクレオチド対間のクロスハイブリダイゼーションは、異なる対からのオリゴヌクレオチドが非常に低い相補性のレベルを有するヌクレオチド配列を選択することによって最小となる場合がある。さらに異なる対のオリゴヌクレオチドは、ギャップの導入、又は対形成したオリゴヌクレオチドとの塩基対合を受けない少なくともいくつかのヌクレオチドを含むループの形成など、オリゴヌクレオチドの１つの整列が他方の側に移動する場合に、相補性が非常に低くなることが好ましい。
【００３３】
クロスハイブリダイゼーションは配列番号１〜２６６から選択した単一の蛍光標識をつけた第二オリゴヌクレオチド、及び固体支持体に付着した配列番号１〜２６６から選択した異なる複数の第一オリゴヌクレオチドを用いてアッセイシステムにおいて試験する。配列番号１〜２６６から選択した異なる複数の第一オリゴヌクレオチドのうちの１つは選択した第二オリゴヌクレオチドに対して相補的である。アッセイは比較的に高い単一の分析物の濃度（そのアッセイシステムにつき最高の測定量に近い濃度）を用いて実施し、クロスハイブリダイゼーションは、アッセイにおけるいずれかの非相補的な第一オリゴヌクレオチド位置からの信号として検出した。クロスハイブリダイゼーションは、相補的、及び非相補的な第一オリゴヌクレオチドが付着した固体支持体上で検出され、蛍光標識した第二オリゴヌクレオチドに相補的な第一オリゴヌクレオチドから検出された量の百分率として示された蛍光量を評価することによって定量化される。それぞれの第二オリゴヌクレオチドは個別に試験した。所定の多重性のレベル及び特別のハイブリダイゼーション状態につき所望の数のオリゴヌクレオチド対のセットを選ぶことができる。
【００３４】
オリゴヌクレオチドの生成法
本発明はさらに、アッセイシステムの使用に適した相補的オリゴヌクレオチド対に対する核酸配列を生成する方法も含んでいる。最初のステップは、オリゴヌクレオチドの所望の長さを決定することである。長さは典型的には反応条件及び特定のアッセイに必要な異なるオリゴヌクレオチドの数によって決定される。例えば、好ましいオリゴヌクレオチドは約１２個のヌクレオチドから約２４個までのヌクレオチドを有することができ、約１６個から約２２個のヌクレオチドがより好ましく、さらに約１８個から約２０個のヌクレオチドが一層好ましい。配列番号１〜２６６のオリゴヌクレオチドはすべて２０個のヌクレオチドを有する。代替的に、予め選択した長さを有するオリゴヌクレオチドのすべての順列を考えることができる。必要な場合、別のヌクレオチドを加え、すべての順列を再び考え、所望のクライテリアを満たすセットが生成されるまでプロセスを繰り返す。
【００３５】
図１は、本発明の一実施形態に従ってオリゴヌクレオチドのセットを生成するステップを示したフローチャートである。ボックス１０に示した通り、オリゴヌクレオチドを分析のために取得し、又は生成した。オリゴヌクレオチドは分析するためのオリゴヌクレオチドのファイルから得ることができる。代替的に、分析セットを形成するために、オリゴヌクレオチドの３’末端に単一のオリゴヌクレオチドを加えることによりオリゴヌクレオチドを体系的に生成することができる。これにより、得られた分析セットのオリゴヌクレオチドを評価する。
【００３６】
ボックス１２に示した通り、ヒトゲノムの全体に存在することが知られている反復配列についてオリゴヌクレオチドを比較する。このような反復配列が開放されているソーステーブルとして、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌｅ．ｏｒｇ／のＥｎｓｅｍｂｌｅなど複数のソースが存在する。それぞれのオリゴヌクレオチドの分析は、同時にヌクレオチドに沿って予め決定していた数の塩基の「ウィンドウ」を滑らせながら、ウィンドウ内のヌクレオチドを分析することによって、オリゴヌクレオチドの一部を考察して行う。一実施形態において、「ウィンドウ」の長さは８塩基である。ウィンドウよりも長さが短いオリゴヌクレオチドは、ヒトゲノム全体に存在することが知られている反復配列とは比較しない。
【００３７】
「ヒトゲノム反復」（ＨＧ）スコアをそれぞれのオリゴヌクレオチド配列につき割当てる。オリゴヌクレオチドには、所定のウィンドウの配列が反復テーブルに現れる頻度に関連するスコアを与える。ウィンドウはオリゴヌクレオチドの長さが分析されるまで、同時にオリゴヌクレオチドの１塩基に沿って移動する。一実施形態において、マッチの数はウィンドウがオリゴヌクレオチドの長さに従って移動するにつれて加算される。必要に応じて、スコアにはヒトゲノム反復のオリゴヌクレオチドの３’末端との近接性に基づいて重みをつけることができる。また必要に応じて既知の反復配列と余りにも多くのマッチを有するオリゴヌクレオチドは除去してもよい。
【００３８】
ボックス１４に示した通り、オリゴヌクレオチドを連続する自己相補性フィルターを用いて自己認識につき分析する。オリゴヌクレオチドを連続する塩基マッチを検出するために逆相補性について比較する。もし連続するマッチの数が予め決定した数を超える場合は、オリゴヌクレオチドをそのセットから除去する。例えば、約３個から約８個までの連続する自己相補的ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは除去してもよい。配列番号１〜２６６のオリゴヌクレオチドはわずかに３個の連続する自己相補的ヌクレオチドを有するだけである。短すぎて自ら折り曲がれないオリゴヌクレオチド、又は自らとハイブリダイズして二量体を形成することができないオリゴヌクレオチドは、自己認識について選別（ｆｉｌｔｅｒ）されない。
【００３９】
ボックス１６に示した通り、オリゴヌクレオチドを単純な反復について選別する。連続する同一ヌクレオチドを予め決定した数よりも多く有するオリゴヌクレオチドは除去する。例えば３個以上の連続する同一ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドは廃棄することができる。配列番号１〜２６６のオリゴヌクレオチドはすべて最大３個の連続する同一ヌクレオチドを有する。必要に応じて、予め定めた回数以上反復する予め定めた長さの配列を有するオリゴヌクレオチドを除去するためにオリゴヌクレオチドを選別する。例えば、２回以上反復する６個以上のヌクレオチドを有する配列を有するオリゴヌクレオチドは、除去することができる。この型の選別は、相補的なオリゴヌクレオチドが間違った場所でハイブリダイズするのを防ぐために望ましい。
【００４０】
ボックス１８に示した通り、オリゴヌクレオチドを連続するプリンに基づいて選別する。連続するプリンは、結合したオリゴヌクレオチドの融点温度に影響を与える。それぞれのオリゴヌクレオチドをオリゴヌクレオチドの第一次構造中の連続するプリン塩基の数を決定するために分析する。予め定めた数を超える連続するプリンを有するオリゴヌクレオチドは除去できる。配列番号１〜２６６のオリゴヌクレオチドは６個以下の連続するなプリンを有する。
【００４１】
ボックス２０に示した通り、オリゴヌクレオチドは、それぞれのオリゴヌクレオチドのＧｉｂｂｓ自由エネルギー（ΔＧ）を算出することによってループ形成の安定性について選別することもできる。Ｇｉｂｂｓ自由エネルギーの算出に関する情報は例えば、Ｂｒｅｓｌａｕｅｒら、“Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ＤＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｂａｓｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，３７４６−３７５０（１９８０）；Ｆｒｅｉｅｒら、“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｆｒｅｅ−ｅｎｅｒｇｙ  ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｄｕｐｌｅｘ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ，”  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，９３７３―９３７７（１９８６）；Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ．（１９９３）“Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ：Ｔｈｅ  Ｓｔｕｄｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｎｅａｒｅｓｔ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ”  Ｋｏｎａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ（Ｋｏｂｅ，Ｊａｐａｎ）  ３３，６１−６７（１９９３）；ＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ｊ  Ｊｒ，Ｈｉｃｋｓ  Ｄ．“Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｍｏｔｉｆｓ．”  Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃ．３３，４１５−４０（２００４）；およびＳａｎｔａＬｕｃｉａ  Ｊ  Ｊｒら、“Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＧＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｌｏｏｐｓ．”  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２９，８８１３−９（１９９０）に記載されている。これらの全ての文献の全内容をそのままここに加える。
【００４２】
必要に応じてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔ，８６８５  ＵＳ  Ｈｉｇｈｗａｙ  ２４，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ  ８０８０９−１３３３より入手できるＯｌｉｇｏ  ６．０及びＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ，１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１５より入手できるＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ６．０のようなコンピュータアルゴリズムを潜在的に問題のある二次的構造、又は自己相補性に対しそれぞれ保持された配列を分析するために用いることができる。重大な予測可能な二次構造又は自己相補的構造を有するオリゴヌクレオチドは除去される。配列番号１〜２６６のそれぞれのオリゴヌクレオチドは少なくとも約−１．３ｋｃａｌ／ｍｏｌのループΔＧエネルギーを有する。
【００４３】
次に、上記の判定基準を満たし、所望の長さを有する分析されたそれぞれのオリゴヌクレオチドをアウトプットセットのすべての分析したオリゴヌクレオチドと比較する。オリゴヌクレオチドが体系的に生成されており、分析されるオリゴヌクレオチドの長さが所望の長さよりも短い場合、そのオリゴヌクレオチドを分析セットに戻す。
【００４４】
ボックス２２に示した通り、オリゴヌクレオチドをセット内の相同性について選別する。５’から３’の方向の連続するヌクレオチドのマッチにつき、オリゴヌクレオチドをアウトプットセットの他のオリゴヌクレオチドと比較する、例えば、分析しているオリゴヌクレオチドがアウトプットセットの別のオリゴヌクレオチドとマッチする７個以上の連続するヌクレオチドを有する場合、そのオリゴヌクレオチドは除去してもよい。配列番号１〜２６６のいずれのオリゴヌクレオチドも配列番号１〜２６６の他のすべてのオリゴヌクレオチドとマッチする１３個以上のヌクレオチドを有していない。
【００４５】
ボックス２４に示した通り、オリゴヌクレオチドをセット内の相補性について選別する。オリゴヌクレオチドをアウトプットセットの他のオリゴヌクレオチドの逆相補体と連続するヌクレオチドマッチにつき比較する。例えば、オリゴヌクレオチドが他のすべてのオリゴヌクレオチドの相補体とマッチする７個以上の連続するヌクレオチドを有する場合、そのオリゴヌクレオチドは除去してもよい。配列番号１〜２６６のいずれのオリゴヌクレオチドも配列番号１〜２６６の他のすべてのオリゴヌクレオチドの相補体とマッチする１３個以上ヌクレオチドを有していない。
【００４６】
ボックス２６に示した通り、またオリゴヌクレオチドによって形成可能なオリゴヌクレオチドの相互作用に対して最も安定したオリゴヌクレオチドの評価によって示されている通り、オリゴヌクレオチドは自らと結合する可能性があるかどうか、又はセット内の別のオリゴヌクレオチドと結合する可能性があるかどうかに基づいて選別する。オリゴヌクレオチドの相互作用に対するこれらのそれぞれのオリゴヌクレオチドの安定性はそれぞれのオリゴヌクレオチドに対するＧｉｂｂｓ自由エネルギー計算（ΔＧ）によって決定される。必要に応じてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔ，８６８５  ＵＳ  Ｈｉｇｈｗａｙ  ２４，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ  ８０８０９−１３３３より入手できるＯｌｉｇｏ  ６．０及びＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ，１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１５より入手できるＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ６．０などのコンピュータアルゴリズムをこれらの計算に用いることができる。オリゴヌクレオチドの相互作用に対して最も安定したオリゴヌクレオチドが、予め決めた最低の二量体エネルギーパラメータよりも低い場合は、そのオリゴヌクレオチドは除去する。典型的に、最低の二量体エネルギーパラメータは、オリゴヌクレオチド内の塩基の数、及びオリゴヌクレオチドを用いるアッセイの反応状態に基づいて決定される。配列番号１〜２６６のそれぞれのオリゴヌクレオチドは１Ｍ塩、４２℃で少なくとも−１０．４ｋｃａｌ／モルの二量体ΔＧエネルギーを有する。
【００４７】
ボックス２８に示した通り、オリゴヌクレオチドを用いることを予定しているアッセイに対して望ましくない特性を有するオリゴヌクレオチドを除くために、オリゴヌクレオチドをフィルター通過させる。オリゴヌクレオチドを用いることを予定しているアッセイに対してＴｍが予め決めた範囲内であることを保証するためにオリゴヌクレオチドのＴｍを評価する。必要に応じてＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｉｎｓｉｇｈｔ，８６８５  ＵＳ  Ｈｉｇｈｗａｙ  ２４，Ｃａｓｃａｄｅ，ＣＯ  ８０８０９−１３３３より入手できるＯｌｉｇｏ  ６．０及びＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ，１２２８  Ｓ．Ｐａｒｋ  Ｓｔ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ５３７１５より入手で出来るＬａｓｅｒｇｅｎｅ  ６．０などのコンピュータアルゴリズムをこれらの計算に用いることができる。予め決めた範囲外のＴｍを有するオリゴヌクレオチドは除去する。配列番号１〜２６６のオリゴヌクレオチドは、すべて１Ｍ塩で約５４℃から約７５℃のＴｍを有する。
【００４８】
ボックス３０に示した通り、上記のフィルターをすべて通過するオリゴヌクレオチドをアウトプットセットに加える。一度、新しいオリゴヌクレオチドをアウトプットセットに加えると、セットが所望の数のオリゴヌクレオチドになっているかどうかを見るためにアウトプットセット中のオリゴヌクレオチドの総数をチェックする。もしセットが依然として十分に大きくない場合、潜在的なオリゴヌクレオチドの別のセットを分析する。このプロセスはアウトプットセットが所望の数のオリゴヌクレオチドに達するまで続ける。例えばプロセスは、少なくとも１２、２４、４８、９６、１９２、２６６個以上のオリゴヌクレオチドのアウトプットセットが生成されるまで繰り返されるだろう。
【００４９】
必要に応じて、一度アウトプットセットが所望の数のオリゴヌクレオチドに達すると、アウトプットセットのそれぞれのオリゴヌクレオチドは、セットの中の他のオリゴヌクレオチドに関連して特徴付けられる。それぞれのオリゴヌクレオチドは相同性スコアを作るために、相同性につきアウトプットセットの他のそれぞれのオリゴヌクレオチドと比較することができる。一実施形態において、スコアはアウトプットセットの最も近いマッチングオリゴヌクレオチドと同一位置にある同一ヌクレオチドの数に基づいて、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数の百分率として算出される。必要に応じて、同様にオリゴヌクレオチドは相同性に基づいて選別することができる。例えば、他のすべてのオリゴヌクレオチドに対して約６０％を超える相同性を有するオリゴヌクレオチドは除去することができる。
【００５０】
それぞれのオリゴヌクレオチドは、相補性スコアを求めるのと同じ方法で、アウトプットセット中の他のオリゴヌクレオチドの逆相補体と比較することができる。必要に応じて、同じようにオリゴヌクレオチドは相同性に基づいて選別することができる。例えば、他のすべてのオリゴヌクレオチドの逆相補体に対して約６０％を超える相同性を有するオリゴヌクレオチドは除去することができる。
【００５１】
必要に応じて、アウトプットセットのそれぞれのオリゴヌクレオチドの配列は、それぞれのヒトゲノム反復スコア、相同性スコア、相補性スコア、及びＴｍと共に、ユーザが検討できるようにファイル又はデータベースに出力する。必要に応じてアウトセット中のオリゴヌクレオチドは１つ又は複数のヒトゲノム反復スコア、相同性スコア、相補性スコア及びＴｍに基づいて選別できる。
【００５２】
当業者は、ボックス１２から２８で実施されたステップが異なる配列で実施でき、ここで提示された配列は説明のためであることを認識するであろう。上記のオリゴヌクレオチドを生成する方法はコンピュータ化し、ソフトウェア、ファームウェア、ハードウェア、又はそれらの組合せを作り出すために標準プログラミング及び／又は工学技術を用いた製造の方法、装置、システム、又は物件として実施できることが好ましい。ここに用いた「製造物件」という用語は、インターネットを含むコンピュータで読取可能な機器、担体、又は媒体からアクセス可能なコンピュータプログラムを網羅することを意図する。
【００５３】
適用
本発明の可能な適用の１つとして、配列番号１〜２６６のオリゴヌクレオチドは一塩基多型（ＳＮＰ）検出システムに用いられる。一実施形態において、少なくとも４８の異なる第一オリゴヌクレオチドを配列番号１〜２６６から選択し、付着化学でアッセイマイクロタイタウェルの底に固定する。第一オリゴヌクレオチドに対して相補的な第二オリゴヌクレオチドも配列番号１〜２６６から選択する。第二オリゴヌクレオチドは単一の塩基伸張反応に対する伸張プライマーとして機能する長いオリゴヌクレオチドの一部である。伸張プライマーの他の部分は、アッセイを実施している一塩基多型（ＳＮＰ）に特異的であり、一塩基多型近傍の配列を含む。
【００５４】
アッセイは一塩基多型を含むゲノムＤＮＡ領域を増幅し、得られた単位複製配列に対する伸張プライマーをハイブリダイズし、一塩基多型の代替的な塩基を表す蛍光標識した伸張ターミネーターとの伸張反応を行う。次に作成されたタグ付き伸張をアッセイマイクロタイタウェルに加え、第一オリゴヌクレオチドをハイブリダイズできるようにした。ウェルは洗浄し、蛍光リーダーで読んだ。蛍光を読むことによりＳＮＰの遺伝子型を検出できる。
【００５５】
配列番号１〜２６６のオリゴヌクレオチドと共に用いることができる一塩基多型の存在の有無を決定する模範的なシステムは、米国特許６，７２０，１４３号に記載されており、その全内容を参照してここに加える。固体支持体はフロー血球計算器などのリーダーを用いてサイズ毎に、及び蛍光毎に光学的に定義できる粒子やビーズでよい。当業者は、配列番号１〜２６６のオリゴヌクレオチドがＴｈｉｒｄ  ＷａｖｅＴＭ（Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｗｔ．ｃｏｍ．）より市販されているようなその他のＳＮＰアッセイにおいて用いることができることを認識できるだろう。
【００５６】
分析物結合剤は典型的には、興味深い分析物と特異的に結合できるオリゴヌクレオチド鎖、蛋白質又はポリペプチドを含む。分析物結合剤は異なるオリゴヌクレオチド鎖に対して逐次的なハイブリダイゼーションにより生成されるオリゴヌクレオチド鎖又はオリゴヌクレオチド複合体であり、その１つがオリゴヌクレオチド中の相補的な領域を経由する分析物結合剤であることが望ましい。分析物結合剤の他の例は、分析物又はその抗原結合フラグメント（例えばＦａｂ’，Ｆ（ａｂ’）２）に対するモノクロナール抗体又はポリクロナール抗体である。抗体又はその抗原結合フラグメントには、更に抗体のキメラ、ヒト化、組換え型、及びその他の形体などが含まれることが理解される。分析物結合剤には標的分析物に特異的に結合する多様な免疫反応物（例えば、組み換えＤＮＡ技法を用いて生成されるもの）の類似物及び変異体がすべて含まれる。
【００５７】
また本発明の範囲内として予期されるものは、例えば受容体蛋白質又はそのフラグメント、及び分析物リガンド、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチド結合対、ポリヌクレオチドと蛋白質の結合対、脂質と蛋白質の結合対、酵素と酵素の結合対、酵素と担体の結合対、酵素と阻害剤の結合対、酵素と代謝産物質との結合対、炭水化物と蛋白質の結合対、炭水化物とレクチンの結合対、蛋白質と薬物の結合対、抗体と細胞受容体の結合対などの他の特異的な蛋白質ベース、ペプチドベース、核酸ベース、炭水化物ベース、脂質ベース、又は細胞ベースの結合システムの使用を通じて実施できる抗体の抗原への結合に相当する特異的な結合対の形成である。さらに本発明の範囲内として予期されるものは、選択的に興味深い分析物に結合する化学物質ベースの分子受容体システムである。
【００５８】
いくつかの実施形態においては、固体支持体は、異なるオリゴヌクレオチドのそれぞれが、実質的に平面の予め定義された異なる領域に付着する平面である。固体支持体は典型的には、顕微鏡の平面スライド、ニトロセルロース製、ナイロン製、ＰＶＤＦ製の可撓性の膜、ガラス製、ポリスチレン製、ポリプロピレン製、ポリカーボネート製のマイクロウェルプレートなどを含むが、これに限定されないマイクロアレイ担体を含む。
【００５９】
代替的な実施形態においては、固体支持体はビーズ、粒子、微粒子、磁気粒子などであるが、ビーズ、粒子、微粒子などの用語は、ここでは同義的に用いている。典型的なビーズはポリスチレン製であり、他のポリマー材料を含む場合がある。粒子の表面は、活性のある化学物質群を含む場合がある。ビーズは典型的には約０．０４μｍから約１００μｍの範囲の直径である。粒子は強磁性体特性を有するものでもよい。本発明の一実施形態では、ビーズのサイズは約１μｍから約２０μｍである。ビーズを準備するために用いる材料および方法は、当業者に既知である。粒子は注入成形後にビオチン−ストレプトアビジン、オリゴヌクレオチド、蛋白質、又はペプチドなどの生体分子架橋による標準的な表面化学により粒子表面に付着した蛍光染料により特徴づけることができる。粒子はまた、所望の蛍光体の存在下で、膨潤／収縮プロセスを用いて標識を付けることができる。量子ドットなどの蛍光粒子は標準的な蛍光染料の代替物で、当業者に既知のリガンド架橋によって粒子表面に付着することもできる。検出部分として用いることができる蛍光体及び蛍光染料は当業者に既知である。
【００６０】
分析物は直接アッセイ又は競合アッセイによって検出することができる。検出法としては、反応溶液中の標識付き単鎖核酸を固体支持体上で捕獲するための単一標識をしたオリゴヌクレオチドの結合又は逐次的なハイブリダイゼーションがある。他の検出法としては、第二抗体（それは検出抗体とも呼ばれる）の使用がある。第二抗体にはそこに付着する検出部分がある。追加的な適切な検出部分には、例えば酵素ベース検出用の担体、放射線標識などがある。結合した分析物を検出する代替的な方法は、発明の範囲内にあると想定され、直接免疫アッセイ、競合的免疫アッセイ、ＴｈｉｒｄＷａｖｅ  ＳＮＰ検出法、遺伝子発現アッセイ、及び細胞ベースアッセイなどを含むがこれに限定されない。典型的には、アッセイは約２０℃から約５５℃の範囲の温度で行われる。
【００６１】
典型的には、アッセイシステムによって検出される分析物は、抗体及び抗体の結合フラグメント、ホルモン、レクチン、受容体、ステロイド、細胞表面の抗原、サイトカイン、ウイルス抗原、細菌性抗原、乱用薬物などを含むが、これに限定されないゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチド又は蛋白質、炭水化物、リガンド、核酸、脂質からなる群から選択される。ある好ましい実施形態では、アッセイシステムは１つ又は複数の特異的な分析物の検出用キットという形で提供される。
【００６２】
代替的な実施形態においては、分析物は細胞表面のマーカーでもよい。免疫化学的サンドイッチアッセイの同じ全体的な実験設計は、当業者に既知の通り、抗体を用いて興味深い細胞を捕獲することにより、一定の細胞表面マーカーを表現する一定の細胞の型又は細胞の存在を検出するように一部変更することができる。
【００６３】
【表１−１】
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【００６４】
【表１−２】
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【００６５】
【表１−３】
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【００６６】
【表１−４】
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【００６７】
【表１−５】
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【００６８】
【表１−６】
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【００６９】
【表１−７】
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【００７０】
【表１−８】
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【００７１】
【表１−９】
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。
【００７２】
上記のように発明を記述したが、多数の変更及び適応は、上記に説明しそして添付の特許請求の範囲によって記述した通り、本発明の範囲及び公正な意味を逸脱することなく行うことができることは明らかである。
【００７３】
本発明をその好ましい一定のバージョンを参照とともに相当に詳細に記述したが、他のバージョンも可能である。従って添付の特許請求の範囲の精神及び範囲はここに記述した好ましいバージョンの記述に限定されるものではない。
【００７４】
特許請求の範囲、要約、及び図面を含む、明細書に開示されたすべての特徴、及び開示されたいかなる方法又はプロセスのすべてのステップは、少なくともこのような特徴及び／又はステップが相互に排他的な組合せを除いて、いずれかの組合せとして組合せることができる。特許請求の範囲、要約、及び図面を含む、明細書に開示されたそれぞれの特徴は、他に明示に記載がない限り、同じ、同等の、又は同様の目的となる代替的な特徴によって置き換えることができる。したがって、他に明示に記載がない限り、開示されたそれぞれの特徴は同等の又は同様の特徴の一般的系列の一例にすぎない。
【００７５】
所定の機能を実施するための「手段」又は所定の機能を実施するための「ステップ」を明示的に記載していない。特許請求の範囲の要素は、米国特許法第１１２条に明記されているように「手段」又は「ステップ」項として解釈するべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、本発明の実施形態によるオリゴヌクレオチドセットの生成法のステップを示したフローチャートである。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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