(57)【要約】  本発明は、二つのステップ：細胞増殖及び赤血球分化が成長因子の存在下で誘導される培養培地中での第一ステップ、そして実質的にエリスロポエチン(ＥＰＯ)を伴わない微小環境の再構成をモデリングする第二ステップで、増幅し、そして造血幹細胞を脱核赤血球に分化させる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
脱核赤血球を生産するin vitro方法であって、以下のステップ：
ａ)  少なくとも１の造血成長因子を含む培養培地中で造血幹細胞を培養し、
ｂ)  得られた細胞を、実質的にエリスロポエチン(ＥＰＯ)の非存在下で支持細胞と接触させて培養する
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記ステップａ)及びステップｂ)の間に追加の中間ステップ：
ａ')  ステップａ)において得られた細胞を、少なくとも１の造血成長因子を含む培養培地中で、支持細胞と接触させて培養する
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ステップａ')中の培養培地がエリスロポエチンを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が、全ての造血成長因子の非存在下でステップｂ)に従って培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記支持細胞が、骨髄微小環境である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記支持細胞が、間質細胞又は間葉幹細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記支持細胞が、遺伝子改変された細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ステップａ)において培養された造血幹細胞が、遺伝子改変細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞が、関心の外来ヌクレオチド配列を発現できる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記関心配列が、ヘモグロビン抗原をコードする、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップａ)の成長因子が、ＳＣＦ、ＦＬＴ-３リガンド、ＩＬ３、ＩＬ６、ＥＰＯ、及びＭＧＤＦからなる群から選ばれるか、又はそれらの混合である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ステップａ)の培養培地が、ＳＣＦ、ＩＬ３、及びエリスロポエチンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
ステップａ)が６〜１５日間続けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ステップａ)が６〜１０日間続けられる、請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
ステップａ')が２〜５日間続けられる、請求項２に記載の方法。
【請求項１６】
ステップｂ)が２〜１４日間続けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップｂ)が網状赤血球が得られるまで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
ステップｂ)が成熟赤血球が得られるまで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が以下のステップ：
ａ)  ＳＣＦ、ＩＬ-３、及びエリスロポエチンを含む培養培地中で造血幹細胞を８日間培養し、
ａ')  ステップａ)において得られた細胞を、エリスロポエチンを含む培養培地中で、かつ間質細胞系列と接触させて３日間培養し、
ｂ)  ステップａ')において得られた細胞を、さらに間質細胞と接触させて、全ての成長因子の非存在下で４日間培養し、それにより網状赤血球を得るか、又は７日間培養し、それにより成熟赤血球細胞を得る、
を含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、赤血球細胞の生産方法に関し、より具体的に、脱核赤血球の大量かつ選択的生産のためのin vitro方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト赤血球細胞(ＲＢＣ)の主要な特徴のうちの一つは、核がないにもかかわらず長期間の寿命(１２０日間)を有する唯一の細胞であるという点である。脱核のメカニズムは推測されていた(Bessis, 1958 ; Lichtman, 1981 ; Qiuら, 1995)が、ex vivoにおけるＲＢＣの大量生成を許容する実験条件がなかったために、正式に確立されていなかった。
【０００３】
成人において、in vivoにおける造血は、骨髄に位置する動的産生プロセス(dynamic production process)からもたらされ、当該プロセスはピラミッド型の細胞ヒエラルキーに従って少数の造血幹細胞(ＨＳＣ)から開始され(Stem Cell (SC)、 progenitor and maturation compartments) (Ogawa, 1993) 、そして微小環境と密接に関わって実行される(Lemischka, 1997 ; Friedenstein, 1977 ;Verfaillie, 1993)。in vitroの赤血球生成微小環境がin vitroで開発され、造血と接着細胞との間における接触の重要性を示した。(Ohnedaら、1997 ; Yanai. ら、1997 ; Hanspalら、1994 ; Hanspalら、1998))。さらに、赤血球増殖は、幹細胞因子(ＳＣＦ)、インターロイキン(ＩＬ３)、及びエリスロポエチン(ＥＰＯ)により積極的に制御されていることが知られている(Zermatiら、2000 ; Satoら、2000 ; Dolznigら、2002)。
【０００４】
ほぼ完全な赤血球分化を得ることは一見簡単である(Fibachら, 1989 ; Wada ら, 1990 ; Panzenbockら, 1998 ; Freyssinierら, 1999)が、それにもかかわらず、これらの文献データーは、提案された様々な培養方法の最終段階に達した際に、最終成熟を伴わずに重要な細胞増殖することを示す(Suiら, 1996 ; von Lindernら, 1999)か、又は約半数の細胞において脱核を示すが、増殖レベルが低いということを示す(Malik et al., 1998)。赤芽細胞の大量増殖及び全ての脱核の両方を得ることを許容する一連のex vivo条件は、未だ報告されていない(Malikら、1998)。
【０００５】
間質細胞を含まない(stroma free)調整培地中で臍帯血(ＣＢ)由来のＨＳＣを増殖させる方法は、成長因子を連続添加することに基づき記載された(Neildez-Nguyenら、2002)。当該プロトコルは、ＣＤ３４+細胞から開始し、脱核細胞への成熟を達成することが未だできない純粋な赤血球前駆細胞を大量産生することを可能にする。
【０００６】
輸液用の赤血球前駆細胞を産生することについての関心は、 L. Douay, 2003,により総説された。
【発明の開示】
【０００７】
本発明者は、以下の２つのステップ：
成長因子の存在下で細胞増殖及び赤血球増殖を誘導する、培養培地中での第一ステップ、そして、
好ましくは造血成長因子を含まない微小環境の再構成をモデリングする、第二ステップ
で造血幹細胞を増殖させ、そして造血幹細胞を脱核赤血球へと分化させるプロトコルを設計した。場合により、当該培養方法は、微小環境及び造血成長因子の両方の存在下における中間ステップを含んでもよい。
【０００８】
本発明者は、本培養方法が、ＣＤ３４+ＳＣｓ/前駆細胞を大量増殖させ、そしてそれらを機能的に完全に成熟したＲＢＣへと完全に分化させることの両方を許容するということを示した。ここで当該成熟ＲＢＣは、ヒト末梢血由来のＲＢＣと同様にＮＯＤ/ＳＣＩＤマウスにおいてin vivoで生存した。
【０００９】
成熟ＲＢＣは、成熟しかつ機能を発揮する天然ＲＢＣの特徴の全てを有する。
それゆえ、本方法は、臨床輸血用の成熟赤血球の大量生産に特に有用である。
【００１０】
本発明はこうして、脱核赤血球(網状赤血球及び成熟赤血球細胞を含む)を産生するためのin vitro方法であって、当該方法は以下のステップ：
ａ)少なくとも１つの造血成長因子を含む培養培地中で造血幹細胞を培養し、
ｂ)そのようにして得られた細胞を、実質的にＥＰＯの非存在下で支持細胞と接触させて培養するステップ
を含む方法を提供する。 
【００１１】
場合により、当該方法は、ステップａ)及びステップｂ)の間において更なる中間ステップ：
ａ')  ステップａ)において取得される細胞を、少なくとも１の造血成長因子を含む培養培地中で支持細胞と接触させて培養する
を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
開始細胞
開始細胞は、任意の起源由来である造血幹細胞である。開始細胞は、好ましくはヒト起源である。造血幹細胞は、患者から取得されることもある。開始細胞は、任意の生物学的サンプル、例えば血液、例えば末梢血、骨髄、臍帯血、又は胎児肝臓から調製されうる。例えば、血液サンプルは、Ｇ-ＣＳＦ[白血球搬出法(Leukapheresis)(ＬＫ)]で動員された通常の末梢血又は動員されていない通常の末梢血(ＰＢ)であってもよい。造血幹細胞は、造血幹細胞表面抗原(例えば、ＣＤ３４)に結合する市販の抗体を用い、当業者に周知の方法を用いて単離されうる。例えば、当該抗体は、磁性ビーズに結合され、そして免疫学的方法が、所望の細胞型を回収するために利用される。好ましくは、造血幹細胞は、ＣＤ３４+細胞の形態である。実際、ＣＤ３４は、Baum ら、(1992)及びMorrisonら、(1995)に記載されるように、造血幹細胞の標準マーカーである。ＣＤ３４+細胞の分離は、多くの様々な方法により達成されうる。最も広く使用されるものは、固体支持体上に固定された抗-ＣＤ３４-抗体(Cellpro,  Baxter, Myltenyi)に当該細胞を結合させることに基づく陽性免疫学的選別である。他の選別方法は、細胞系列特異的細胞表面抗原の発現に基づいてＣＤ３４+細胞から、ＣＤ３４を発現しない細胞の全てを単離するネガティブ選別を含む。或いは、ステップ ａ)において培養される造血幹細胞は、肺性幹細胞からex vivoで産生されることもある(例えば、WO 01/34776 ; US 6,613,568を参照のこと)。
【００１３】
ステップａ)において培養される造血幹細胞及びステップａ)から得られる細胞は、遺伝的に改変された細胞でありうる。当該細胞は、例えば相同組換えによる遺伝子サイレンシングにかけられうる。このことは、当該細胞がもはや内在遺伝子を発現できないこと、または当該遺伝子又はその断片が欠失、つまり「ノックアウト」されることを意味する。遺伝子サイレンシングは、サイレンシングされた遺伝子の機能の研究において特に有用である。造血細胞は、当該造血細胞から血液型の抗原を発現しないように遺伝的に改変されてもよい。或いは、造血細胞は、例えば組換え発現ベクターを用いて遺伝物質を細胞内へ取り込ませることにより遺伝的に改変されてもよい。造血細胞は、関心の外来性ヌクレオチド配列を発現可能であってもよい。例として、関心配列は、ヘモグロビン抗原をコードしてもよい。造血細胞へ導入するための遺伝物質の他の例は、造血幹細胞の維持、組織発達、リモデリング、修復、又は細胞外遺伝子産物のin vivo産生において役割を有する遺伝子産物を発現させる遺伝物質を含む。遺伝的に改変された造血系細胞を使用することにより、脱核細胞の産生が許容される。当該脱核細胞は、当然のことながらもはや分裂できず、そして有限の寿命の間、治療上関心のある特定の表面タンパク質を発現するように遺伝的に改変されものでる。
【００１４】
培養培地
細胞は、好ましくは液体形態である培養培地内で培養される。
本発明において有用である培養培地は、造血細胞を培養するために当業者に知られている任意の培養培地でありうる。例えば、培養培地は、好ましくはヒト又はウシ胎児血清の添加を伴うＲＰＭＩ、ＩｓｃｏｖｅのＭＤＭ又はＤＭＥＭ、ＴＣ１９９、Ｘ-ＶＩＶＯ-１０でありうる。血清又は血漿は、１〜５０％の濃度で加えられうる。しかしながら、好ましくは無血清培地である。
【００１５】
最も好ましい実施態様では、当該細胞は、１％脱イオン化ウシ血清アルブミン(BSA)又はヒト血清アルブミン(ＨＳＡ)、１２０μｇ／ｍｌの鉄飽和ヒトトランスフェリン、９００ｎｇ／ｍｌの硫酸鉄、９０ｎｇ／ｍｌの硝酸鉄、及び１０μｇ／ｍｌインスリンを添加された改変無血清培地(Kobari et al. 2000 ; Giarratana et al. 2000)中で培養される。
【００１６】
ステップ(ｂ)及び (ａ')の培養培地は、造血成長因子を含む。当該成長因子は、いずれかの又は全てのインターロイキン(ＩＬ-１〜ＩＬ-１６)、インターフェロン(ＩＦＮ-α、β、及びγ)、エリスロポエチン(ＥＰＯ)、幹細胞因子(ＳＣＦ)、インスリン様成長因子、線維芽細胞増殖因子、血小板由来成長因子、腫瘍増殖因子、腫瘍壊死因子α、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ-ＣＳＦ)、顆粒球−マクロファージ・コロニー刺激因子(ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージ・コロニー刺激因子(Ｍ−ＣＳＦ）、ｆｉｎｓ様チロシンキナーゼ-３リガンド(Ｆｌｔ３-リガンド)、並びにＥＧＦ(上皮成長因子)、ＶＥＧＦ(血管内皮成長因子)、ＬＩＦ(白血病抑制因子)を含む。トロンボポエチン(ＴＰＯ)又はＭＧＤＦ(肥満細胞増殖由来因子)が使用されてもよい。これらの成長因子の多くは市販されている。最も一般的に使用される増殖因子の混合物は、Ｇ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＳＣＦ、ＩＬ-１、ＩＬ-３、及びＩＬ-６を含む。使用される成長因子の大部分は、組換えＤＮＡ技術により産生され、そして様々な程度に精製される。幾つかの成長因子は、標準生化学的技術により、腫瘍細胞系列の培養培地から精製される。広く使用される成長因子は、ＰＩＸＹ３２１であり、ＰＩＸＹ３２１は、組換え技術により産生され、そしてＧＭ-ＣＳＦ及びＩＬ-３活性の両方を示す。
【００１７】
ステップ(ａ)の培養培地は、好ましくはＳＣＦ又はＦＬＴ-３リガンドを含む。ステップａ)において使用される増殖因子は、ＩＬ３、ＩＬ６、ＥＰＯ、及びＭＧＤＦからなる群から選ばれるか、又はそれらの混合物でありうる。成長因子の組合せは、ステップａ)を通して変化しうる。例えば、ステップａ)は、８日間ＳＣＦ+ＥＰＯ+ＩＬ３で始め、続いて３日間ＳＣＦ+ＥＰＯを続ける。有利なことに、ステップ(ａ)の成長因子は、エリスロポエチンである。好ましい実施態様では、ステップａ)の培養培地は、ＳＣＦ、ＩＬ３、及びエリスロポエチンを含む。
【００１８】
培養物に使用される成長因子の量は、当該因子調製品の活性及び使用される成長因子の組合せに依存する。典型的に、濃度は、０.５〜５００ｎｇ/ｍｌの範囲である。各成長因子の最適濃度は、幾つかの成長因子が他の成長因子と相乗的に作用するので、個別の培養条件に対して決定されなければならない。
【００１９】
好ましい実施態様では、ステップａ')において使用される培養培地は、ステップａ)において使用される培養培地と同じである。好ましくは、ステップａ')において使用される成長因子は、ステップ ａ)において使用される成長因子と同じであるが、これは義務的なものではない。
【００２０】
ステップａ')の培養培地は、好ましくはエリスロポエチンを含む。好ましくはエリスロポエチンは、ステップａ')において使用される唯一の成長因子である。ステップａ')の関心は、ステップａ)から得られた細胞の分化ステージに左右される。実際、ＥＰＯは培養細胞中に存在する前駆細胞増殖に働きかける。
【００２１】
エリスロポエチンは次に、次のステップｂ)で取り除かれる。ステップｂ)では、細胞は実質的にＥＰＯの不存在下で培養される。ＥＰＯを取り除くことは、最終的な分化を促進する。好ましくはステップｂ)において、当該細胞を全ての造血成長因子の不存在下で、最も好ましくは、全ての成長因子の不存在下で培養する。
【００２２】
支持細胞
当該プロトコルのステップｂ)又はステップａ')において、細胞を支持細胞と接触させる。当該ステップは、固体支持体へ接着しているか又は懸濁液中に存在している細胞を用いて行われうる。
【００２３】
これらの支持細胞の目的は、造血幹細胞の増殖を支持する細胞から形成される本来の骨髄微小環境(Lichtman、1981)を真似することである。
【００２４】
本発明の文脈では、支持細胞は、in vitroにおいて造血細胞の増殖を助け、そしてその脱核赤血球への成長を助ける細胞である。
これらの支持細胞は、胚、胎児、又は任意の結合組織(conjunctive tissue)に由来する。
好ましくは、支持細胞は、骨髄微小環境に由来する。
【００２５】
特に、本発明の方法は、本来の骨髄微小環境から得られた標本を利用するか、又は再構成された骨髄微小環境を利用する。
好ましい実施態様では、WO99/64566において記載される様に、支持細胞は、間質細胞であるか、又は間葉細胞である。
間質細胞は、好ましくは、骨髄細胞又は胚性卵黄細胞に由来する。
マウス間質細胞又は間葉幹細胞は、本目的のために使用されてもよい。しかしながら、霊長類及び他の哺乳動物細胞、例えばヒト間質細胞又は間葉細胞はより適している。
【００２６】
「間質細胞」という用語は、骨髄における非造血細胞、並びにマクロファージを指す。
間質細胞は、内皮細胞、無紋血管細胞(線維芽細胞)、含脂肪細胞、及びマクロファージを含む。
間質細胞は、間葉幹細胞に由来する。
【００２７】
従って、哺乳動物、例えばヒト組織から間葉幹細胞(ＭＳＣ)又は間質細胞を回収するために有用である任意の方法が、主に間葉幹細胞又は間質細胞を含む細胞集合をもたらすために利用されうる。一の態様では、ヒト間葉幹細胞又は間質細胞を単離する方法は、以下の：間葉幹細胞又は間質細胞を含む組織標本を準備し；例えば密度勾配遠心により、当該標本から間葉幹細胞又は間質細胞を単離し；分化をさせることなく間葉幹細胞又は間質細胞を刺激する因子を含み、かつ培養液において間葉幹細胞又は間質細胞の培養における支持体表面への選択的接着を許容する培地に単離された細胞を添加し；標本-培地混合物を培養し；そして支持体表面から接着していない物質を取り除き、間葉幹細胞又は間質細胞の単離された集合をもたらすステップを含む。
【００２８】
ＭＳＣの間接濃縮は、特にPittenger,1999に記載された。ＭＳＣを精製するための他の具体的な方法が開示された。当該方法は、特異的な膜マーカー、例えばＣＤ４９ａ(Deschaseaux, 2000)及びStro１(Simmons,1991)を発現する細胞を濃縮することにより選択されうる。
【００２９】
ＣＤ４５及びＧｌｙｃｏＡマーカー(Ｒｅｙｅｓ, 2001)のネガティブ選別に基づいて、ネガティブ選別が考慮されることもある。
【００３０】
具体的な実施態様では、支持細胞は、遺伝的に改変された細胞、例えば成長因子及び細胞の接着を促進する因子をコードする外来性遺伝子を発現する支持細胞である。
【００３１】
好ましくは、支持細胞及びステップａ)から得られる細胞は、ステップｂ)及び場合によりステップａ')において、当該支持細胞が支持体表面に接着するか又は接着しないような適切な培養条件下でともに培養される。支持細胞は、支持体表面に１ｃｍ2あたり２００〜５×１０5個の範囲、好ましくは１ｃｍ2あたり１０3〜約１０5個の範囲の密度で蒔かれる。
【００３２】
好ましくは、表面に付着する支持細胞の場合、支持細胞はコンフルエントに達した際に共培養に使用される。通常、コンフルエントは、１ｃｍ2あたり２００００〜約８００００細胞で達成され、そして好ましい実施態様では、コンフルエントは、１ｃｍ2あたり約４００００細胞で達成される。こうして造血幹細胞(ＨＳＣ）は、好ましくは１ｃｍ2あたり約２００〜４００００細胞の範囲の細胞密度で存在する。ステップａ)から得られる細胞は、好ましくは１ｃｍ2あたり約１０3〜約２×１０6細胞の範囲内の細胞密度で存在する。
【００３３】
支持細胞が支持体表面に接着せず、そして懸濁液の状態である場合、支持細胞は一般的に１ミリリットルあたり２００００〜約２.５×１０6個の細胞の範囲の濃度で懸濁される。造血幹細胞は、１ミリリットルあたり１０3〜約２×１０5細胞の範囲の密度で懸濁され、そしてステップａ）から得られる細胞は、１ｍｌあたり５０００〜約１０7細胞の範囲の密度で懸濁される。
【００３４】
支持細胞、例えば微小環境、が存在せずかつ成長因子のみが存在する場合、最終成熟、つまり脱核、が特異的に達成されないということが発明者により観察された。
【００３５】
プロトコル
造血細胞数が増加する期間は、少なくとも一部において、細胞型及び使用される特定野培養容器の関数である。当業者に知られる通常の方法は、培養物中の細胞数を、培養細胞のインキュベーション時間の関数として決定するために使用することができる。典型的に、増殖(細胞数の増加)は、血球計数器又は細胞計数器を用いてある色素の取り込みを計測するか、又はヘマトクリット値を測定することにより、細胞数を計数することによって計測される。こうして、細胞培養インキュベーション期間の長さは変化し、そして所望される増殖度に依存する。
【００３６】
一般的に、液体培養における増殖は、インキュベーションの開始からの細胞総数の増加により及び／又はＣＤ３４+細胞の割合(％)を測定することにより評価される。
ステップａ)は、約６日〜約１５日以上、例えば約２８日目まで続けられることもある。ステップｂ)は、約２日〜約１４日続けられることもある。
当該方法が３個のステップａ)、ａ')、ｂ)を含む場合、ステップの期間は、およそ以下のとおりであろう：
ステップａ)は６〜１０又は１１日間、好ましくは約８日間続けられる。ステップａ')は、２〜５日間、好ましくは約３日間続けられることもある。ステップｂ)は、２日〜１４日間続けられる。
【００３７】
当該方法が２個のステップａ)及びｂ)を含み、そしてステップａ')が行われない場合、これらのステップの期間はおよそ以下のとおりである：
ステップａ)は７〜１５日間、好ましくは約１１日間続けられる。ステップｂ)は２〜１４日間続けられる。
【００３８】
本発明の任意の実施態様では、培養ステップｂ)は、網状赤血球が得られるまで行われる。網状赤血球は、一般的に培養ステップｂ)の４日後に生じる。成熟赤血球細胞が得られるまで待つことが好ましい。その場合、ステップｂ)は、成熟赤血球細胞が得られるまで行われ、成熟赤血球細胞は一般的に培養ステップｂ)の７日後に生じる。
【００３９】
増殖後、細胞を回収し、そして洗浄し、そして患者へ輸液する前に、好ましくはろ過して白血球を取り除く。
【００４０】
具体的な実施態様では、本発明の方法は、以下のステップ：
ａ)ＳＣＦ、ＩＬ-３、及びエリスロポエチン(ＥＰＯ)を含む培養培地中で造血幹細胞を８日間培養し、場合によりさらに３日間ＳＣＦ及びＥＰＯを含む培地中で培養し；
ａ')ステップａ)において得られた細胞を、ＥＰＯを含む培養培地中で、場合により同じ培養培地のまま、そして間質細胞系列と接触させて、３日間培養し；
ｂ)ステップａ')において得られた細胞を、間質細胞系列と接触させたままで、全ての成長因子の不存在下で４日間培養し、それにより網状赤血球を取得し、又は７日間培養し、それにより成熟赤血球を得る
を含む。
【００４１】
本発明の方法は、脱核赤血球の均一な集合を大量生産することを許容する。
有望な細胞生成物(potential cell yield)は、輸液についての臨床要件に適合する。標準ＲＢＣ濃縮物は、約２×１０12細胞を含む。臍帯血ユニットは、２〜５×１０6ＣＤ３４+細胞を含み、そしてＧ-ＣＳＦなどの成長因子で動員した後に行う白血球搬出法は、体重１ｋｇあたり４〜８×１０6ＣＤ３４+細胞を通常提供する。一方増幅レベルは、それぞれ１０5及び３×１０4倍であり、又は（ステップａの期間が１１日間である場合）１０6及び１×１０5倍であり、約６５％〜約９５％の範囲の脱核割合であった。全ての前出のパラメーターを考慮に入れると、幾つかのＲＢＣ濃縮物の同等物が、１のドナーからこの方法で産生されうるということが明らかであろう。
【００４２】
供給及び感染安全性の点における輸液についての関心(当該方法は、１のドナー及び／又は自己輸血患者に由来する数ユニットを簡単に産生することを可能にする)とは別に、本発明の方法は、輸液有効性に関しても利益がある。ドナーから得られたＲＢＣの平均半減期が、様々な日齢の細胞が同時に存在するため２８日である一方、本発明の方法は、１２０日に近い寿命を有する均一な日齢の細胞集合の輸液を可能にする。このことは、必要とされる輸液回数を低減するであろう。
【００４３】
本発明はさらに、以下の実施例及び図面により例示される。これらの実施例及び図面は本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１：マウス細胞系列ＭＳ５を骨髄環境として用いた成熟ＲＢＣの産生
材料と方法
細胞培養
通常の骨髄(ＢＭ)、Ｇ-ＣＳＦで動員された通常の末梢血又は動員されていない末梢血(ＰＢ) [白血球搬出法(ＬＫ)]、及び通常の臨月出産からの臍帯血(ＣＢ)を、インフォームドコンセントを行って取得した。ＣＤ３４+細胞は、Ｍｉｎｉ-ＭＡＣＳカラム(Miltenyi Biotech, Bergisch Glodbach, Germany)を用いた超磁性マイクロビーズ選別により単離した(純度９４±３％超)。
【００４５】
Ａ.１％脱イオン化ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)、１２０μｇ／ｍｌの鉄飽和ヒトトランスフェリン、９００ｎｇ／ｍｌの硫酸鉄、９０ｎｇ／ｍｌの硝酸鉄、及び１０μｇ／ｍｌのインスリン(これら全てをSigma, Franceから得た)を添加した改変無血清培地(Kobariら、2000； Giarratanaら、2000)中で細胞を培養した。
【００４６】
細胞培養培地の別の例は、Ｉｓｃｏｖｅ改変ダルベッコ培地(IMDM, Biochrom,商品番号Ｆ０４６５)であった。以下の表(表１)は、培地１００ｍｌについての全ての内容物の例である。
【００４７】
【表１】
2008501333.tif 000002
【００４８】
増殖方法は３のステップから構成される。
第一のステップ(０〜８日目)では、１０4個／ｍｌのＣＤ３４+細胞を、１０-6Ｍヒドロコルチソン(ＯＨＣ)(Sigma)、１００ｎｇ／ｍｌ幹細胞因子(SCF、Amgen, Thousand Oaks, CA, USA)、５ｎｇ／ｍｌのＩＬ３(R&D Systems, Abingdon, UK)、及び３ＩＵ／ｍｌのＥｐｏ(Eprex, Janssen-Cilag, Issy-les-Moulineaux, France)の存在下で培養した。４日目において、１体積の細胞培養物を、ＯＨＣ、ＳＣＦ、ＩＬ３、及びＥｐｏを含む新たな培地４体積中に希釈した。
【００４９】
第二ステップ(８〜１１日目)では、細胞を、(ＣＢ、ＬＫ、ＢＭ、及びＰＢ細胞についてそれぞれ)５×１０4、１０5、２×１０5、又は３×１０5個／ｍｌで再懸濁し、そしてＥｐｏを加えた新たな培地中でＭＳ-５間質細胞上で共培養した。
【００５０】
第三ステップ(１１日目以降)、サイトカインを伴わない新たな培地中で間質細胞(ＭＳ５)上で当該細胞を培養した。培養物を５％ＣＯ2を含む空気内で３７℃にて維持した。(プロトコルＡについて）培養物をその開始時から１５日以上維持した場合、好ましくは細胞を洗浄し、５〜６×１０6個／ｍｌで再懸濁し、そして新たな間質細胞層上で共培養した。この培養ステップの間、５〜２０％ヒトＡＢ血清を培地に添加することは、培養された赤血球細胞(ｃＲＢＣ)の保存を許容する。細胞は、形態学的分析のためにMay-Grunwald-Giemsa試薬で染色し、一方、脱核細胞を、ＸＥ２１００ａｕｔｏｍａｔ(Sysmex、Roche Diagnostics, Basel, Switzerland)を用いてＭＣＶ(ｆＬ)、ＭＣＨＣ(％)、及びＭＣＨ(ｐｇ／細胞)を含む標準的な血液に関する数値についてモニターした。
【００５１】
Ｂ.以下のステップを含む代わりのプロトコルを用いた：
第一ステップ：既に記載された第１ステップの培養(プロトコルＡ)を３日間(１１日目まで)延長する。この場合、８日目の細胞を回収し、洗浄し、そして(ＣＢ、ＬＫ、ＢＭ、及びＰＢ細胞についてそれぞれ)５×１０4、１０5、２×１０5、又は３×１０5個／ｍｌでＳＣＦ及びＥｐｏを含む新たな培地中に再懸濁した。
第二ステップ：  既に記載された培養の第二ステップ(プロトコルＡ)から３日間遅らせる。通常１１〜１４日目である。(通常プロトコルＡの８日目の細胞ではなく、プロトコルＢの１１日目の)細胞を、(ＣＢ、ＬＫ、ＢＭ、及びＰＢ細胞についてそれぞれ)１０5、２×１０5、３〜４×１０5、又は４〜６×１０5個／ｍｌで再懸濁し、そしてＥｐｏを加えた新たな培地中でＭＳ-５間質細胞系列上で共培養した。細胞を通常１４日目で洗浄して、因子及び代謝産物を取り除いた。
第三ステップ：  既に記載された培養の第三ステップ(プロトコルＡ)から４日間遅らせる。通常１４〜１８日目である。培養物が開始から１８日間(プロトコルＢについて)を超えて維持される場合、細胞を好ましくは洗浄し、５〜６×１０6個／ｍｌで再懸濁し、そして新たな間質細胞層上で共培養した。この培養ステップの間、５〜２０％ヒトＡＢ血清を培地へと加えることは、培養された赤血球細胞(ｃＲＢＣ)の保存を許容する。
【００５２】
使用されうる成分の例として詳細をさらに以下に記載する(表１を参照のこと）。
ペニシリン及びストレプトマイシン：ストック溶液は、５０００Ｕ／ｍｌのペニシリンと５０００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンの混合液である。
イノシトール：２０ｍｇの粉末イノシトール(室温保存)を５ｍｌのＩＭＤＭ中に溶解し、そして４℃で最大一週間貯蔵できる。
葉酸：２０ｍｇの粉末葉酸(室温保存）を２０ｍｌの予め暖められたＩＭＤＭ中に溶解し、そして４℃で一週間貯蔵できる。使用前に溶液を予め温めることが好ましい。
モノチオグリセロール：１０μｌの１１.５６Ｍストック溶液(Sigma、１１.５６M、ｄ＝１.２５、純度９８％、ＭＷ=１０８.１６)を７１２μｌのＩＭＤＭ中に溶解する。モノチオグリセロールの０.１６Ｍ溶液を得る。
【００５３】
ホロ-トランスフェリン：トランスフェリン１グラムあたり１２００〜１６００μｇの鉄で飽和されたホロ-トランスフェリン(Sigma)を、１５０ｍＭ・ＮａＣｌ、０.８ｍＭ・Ｎａ2ＨＰＯ4、０.２ｍＭ・ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ７.５の溶液中に１５ｍｇ/ｍｌで溶解し；１０ｍｌの当該溶液に、３４０μｌのＦｅＣｌ3１０ｍＭを含む１ｍＭ・ＨＣｌ溶液を加えた。溶液を滅菌ろ過(０.２μｍ)し、そして４℃で貯蔵する。
【００５４】
インスリン：粉末インスリン(-２０℃で貯蔵)を５ｍＭ・ＨＣｌ中に１ｍｇ/ｍｌで溶解する。当該溶液を-２０℃で貯蔵する。
硝酸鉄：塩複合体の形成を避けるために、最初に硝酸鉄粉末を１.８ｍｇ/ｍｌで蒸留水に溶解することができる。この第一溶液をＩＭＤＭで１/１００に希釈し(第二溶液、０.０１８ｍｇ/ｍｌ)、そして４℃で貯蔵する。
【００５５】
硫酸鉄：塩複合体の形成を避けるために、最初に硫酸鉄を１８ｍｇ/ｍｌで蒸留水中に溶解する。この第一溶液をＩＭＤＭで１/１００に希釈し(第二溶液、０.１８ｍｇ/ｍｌ)、そして４℃で貯蔵する。
【００５６】
ヒドロコルチソン：培養の第一ステップの間、ヒドロコルチソン(ＯＨＣ)を加えてもよい(終濃度１０-6Ｍ)。２０ｍｇのヒドロコルチソン塩(Sigma ref H2270, MW=４８４.５、-２０℃貯蔵)を４.１２ｍｌのＩＭＤＭ中に溶解し、次に同じ培地で１/１００に希釈し１０-4Ｍ溶液を生成する。当該溶液を０.２２μｍのフィルターを通してろ過し、そして+４℃で１週間貯蔵することができる。１ｍｌの１０-4Ｍ・ＯＨＣ溶液を１００ｍｌの最終培養培地に加える。
【００５７】
間質細胞
ＭＳ-５を接着層として使用する。
ＭＳ-５間質細胞系列を、リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシド、並びにＧｌｕｔａｍａｘ(Invitrogen, ref32571-028)を含み、そして１０％胎児ウシ血清(ＦＣＳ)を添加されたαＭＥＭ培地中で増殖させる。
【００５８】
コンフルエントになった後に、３７℃でトリプシン-ＥＤＴＡ １×(Invitrogen, ref２５３００-５４)により７〜１０分処理したのちに接着細胞を回収した。１０6細胞/ｃｍ2を通常回収する。細胞の剥離を倒立顕微鏡のもとで制御する。２５ｃｍ2フラスコあたり０.５ｍｌ・ＦＣＳを加えることにより反応を止める。細胞を洗浄し、そしてαＭＥＭ+ｇｌｕｔａｍａｘ+１０％ＦＣＳ培地中に４０００細胞/ｃｍ2で再び蒔いた。細胞を３７℃、５％ＣＯ2下でインキュベーションする。接着は通常１週間の後に達成される。
【００５９】
通常、赤血球細胞と共培養するために、ＭＳ-５をトリプシン処理後２週間以内に使用する。
【００６０】
半固体培養アッセイ
ＢＦＵ-Ｅ、ＣＦＵ-Ｅ、及びＣＦＵ-ＧＭ前駆細胞を、Giarratana, M. C.ら、(1998)に前に記載されるように、５％ＣＯ2を含む空気中で３７℃にてインキュベーションされたメチルセルロース培養物中でアッセイした。
【００６１】
フローサイトメトリー
細胞を標識未結合抗体、又はフルオレセイン・イソチオシアネート(ＦＩＴＣ)結合抗体、又はフィコエリトリン(ＰＥ)結合抗体で標識した。ＣＤ７１についての抗体(Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ, ＣＡ)並びにＣＤ４５及びＣＤ３４に対する抗体(Immunotech, Marseilles, France)を表現型検査に使用し、そして細胞を生きている核酸についての色素ＬＤＳ-７５１で染色した。分析を、ＦＡＣＳＣaliburフローサイトメーター(Becton Dickinson)上で、Cell Questソフトウェアを用いて行った。
【００６２】
変形能計測
１５日目の培養物から得られた網状赤血球を、白血球除去フィルター(Leucolab LcG2, Macopharma, Tourcoing, France)を通過させることにより有核細胞から分離し、そしてエクタサイトメトリー(ektacytometry)、レーザー回折法により脱核細胞を試験した。エクタサイトメーター(ektacytometer)(Technicon, Bayer Corp.)において、４％ポリビニルピロリドン溶液中に懸濁された細胞を、浸透圧増加勾配(６０〜４５０ｍｏｓＭ)に暴露し、そしてそのレーザー回折パターンの変化を記録する。光度測定法は、変形能指数(ＤＩ)と名付けられるシグナルをもたらす。ＤＩ曲線の分析は、一定にかけられた１７０ｄｙｎｅｓ/ｃｍ2のせん断応力(shear stress)における浸透圧の関数として、細胞膜の動的な変形能を計測することを提供する。ＤＩの最大値として定量されるＤＩmaxは、通常生理学的に適切な浸透圧で達成され、赤血球の平均表面積に関連する。
【００６３】
グルコース-６-ホスフェート・デヒドロゲナーゼ、及びピルビン酸キナーゼ活性
白血球を除いた後に得られる赤血球にジギトニン(０.２％)を加え、そしてDrabkin試薬を用いて、分光光度法によりヘモグロビンを定量した。Synchron CX4 Beckman光度計並びにRandox Laboratories(Crumlin, UK)及びRoche Diagnosticsのそれぞれから販売される試薬を用いて、３４０ｎｍでＮＡＤＰＨ吸光の増加率を計測することによりＧ６ＰＤ及びＰＫ活性を測定した。結果をヘモグロビン１グラムあたりのユニットで表した。
【００６４】
ヘモグロビン分析
様々なＨｂ分画の割合を、Bio-Rad VariantII Hb分析器(Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)を用いてＣＥ-ＨＰＬＣを行うことにより計測した。グロビン鎖の組成を、ＲＰ-ＨＰＬＣにより、以前に記載されたように測定した(Pic, Ducrocqら、1994 ; Papassotiriou, Ducrocqら、 1998)。
【００６５】
機能特性
メトヘモグロビン分画を、近紫外領域(３５０〜４５０ｎｍ)で分光光度的に測定した。サンプルを純粋なＣＯ下で平衡化し、そして終濃度２００μＭのシアン化カリウムをヘモグロビンの緩衝溶液に加えた。標準に対する総ヘム濃度は、２００μＭの亜ジチオン酸カリウムの添加後に、４２０ｎｍにおけるＣＯスペクトルの最大吸収から計算された。
【００６６】
ヘモグロビンの結合特性を、１ｍｍ光学キュベット中での閃光光分解により試験した。簡潔に記載すると、細胞内ヘモグロビン四量体へのＣＯの再結合の反応速度論は、Ｍａｒｄｅｎら(１９８８)において以前記載されるように、５３２ｎｍにて１０ｎｓパルスで閃光光分解した後に、４３６ｎｍで分析された。
【００６７】
ＮＯＤ/ＳＣＩＤマウスモデルにおける検証
全ての実験及び方法は、動物実験についてのフランスの農業省の基準(1987)に沿って行った。ＮＯＤ/ＳＣＩＤ-ＬｔＳｚ-ｓｃｉｄ/ｓｃｉｄ(ＮＯＤ／ＳＣＩＤ)マウスを滅菌条件で飼育した。細胞注射前に137Ｃｓ源(２.１１５Ｇｙ/ｍｉｎ)からの２.５グレイを亜致死的に６〜８週齢のマウスに照射した。細網内皮系を飽和させるために、ヒトＯ型ＲＢＣを腹腔内に注射した (マウス一匹あたりi.ｐ.４〜５×１０9細胞)。２４時間後、１９日目の培養物からin vitroで生成させたＲＢＣ(マウス一匹あたり４〜５×１０9細胞)であって、洗浄され、そしてＣＦＳＥ(Lyonsら、(1994))で標識されたＲＢＣをマウスにｉ.ｐ.で注射した。対照は、同じ条件下でヘパリン化された末梢血を与えられた。各実験群において３匹の動物を使用した。ヒトＲＢＣの排除を、後眼窩静脈穿刺により様々な時間で各マウスから採取されたヘパリン化血液の５μｌサンプルにおいてフローサイトメトリーによりＣＦＳＥ標識細胞を追跡することにより測定した。各群において、マウス血液中のＣＦＳＥ標識細胞の割合から回帰線を作成した。
【００６８】
結果
赤血球細胞の大量増殖
細胞を調整無血清培地中で、成長因子の組合せの存在下で、そしてマウス間質細胞系列ＭＳ５上で共培養することで増幅した。当該細胞系列ＭＳ５は、in vivoにおいて存在する微小環境を模倣する微小環境をex vivoで作り出す(Suzuki, 1992)。骨髄(ＢＭ)又は末梢血(ＰＢ)由来のＣＤ３４+細胞について１６５００倍(９２００〜２５５００倍)、Ｇ-ＣＳＦで動員した後に白血球搬出法により得られるＣＤ３４+細胞について３１２００倍(２３７００〜３４０００倍)、そして臍帯血に由来するＣＤ３４+細胞について１４００００倍(９３０００〜２７７０００倍)の平均細胞増幅におけるプラトーを１５日目に得ることができる(図１Ａ)。
【００６９】
赤血球細胞系列への傾向は、８日目に形態学的に明らかであった(９５〜９８％の赤芽細胞)。続く最終分化は早くおこり、脱核細胞の割合は１１日目では１〜５％であり、そして１５日目には６５〜８０％になる(図１Ｂ)。この段階で、９８±１％の細胞が、平均細胞体積(ＭＣＶ)１３０±５μｍ3、平均赤血球ヘモグロビン濃度(ＭＣＨＣ)１８±１％、及び平均赤血球ヘモグロビン(ＭＣＨ)２３±１ｐｇを有する網状赤血球(図２Ｂ)であった。
【００７０】
網状赤血球の成熟ＲＢＣへの分化は、核物質の消失及びトランスフェリン受容体ＣＤ７１の発現の進行性消失及びレーザースチリル色素での染色により示されるように、１５日目〜１８日目にかけて継続した。この段階では、９０〜１００％の細胞が脱核した(図２Ａ)。これらの赤血球は、天然のＲＢＣの特徴に近い特徴、つまり、１１３±３ｆＬのＭＣＶ、３３±２ｐｇのＭＣＨ、及び２９±２％のＭＣＨＣを示した。１５日目に対する１８日目の細胞収率は７７±５％であり、１８±４％の平均網状赤血球含量であった。共焦点顕微鏡により観察される成熟の異なる形態学的段階は、図３に示される。当該純粋な赤血球系細胞の大量分化は、赤血球前駆細胞(ＢＦＵ-Ｅ及びＣＦＵ-Ｅ)の増殖を標的誘導することに原因があり、８日目及び１１日目において急速に消失する顆粒球-マクロファージ前駆細胞(ＣＦＵ−ＧＭ）の減少に原因がある。
【００７１】
これらの培養条件は、その結果(ｉ)液体培地中における最初の８日間の間、ＳＣＦ及びＩＬ３の存在下で始原ＨＳＣの強力な増殖を誘導し、そして排他的な赤血球分化がＥｐｏにより標的誘導され、(ｉｉ)第二ステップの３日間の間、微小化環境と単一の成長因子Ｅｐｏの組合せ効果を通して、高レベルの増殖を維持して最終成熟を開始し、そして(ｉｉｉ)微小環境のみの存在下で細胞分化及び最終脱核を完了することを許容する。
【００７２】
機能性の網状赤血球及び赤血球
ex vivoで生成された網状赤血球及びＲＢＣは、ヘモグロビン１グラムあたり４２±１.４ユニットのグルコース-６-ホスフェート・デヒドロゲナーゼ(Ｇ６ＰＤ)含量及び８３±１.８ユニットのピルビン酸キナーゼ(ＰＫ)含量を有し、均一な性質及び生成された若い細胞集合に一致するものであった(Ｊａｎｓｅｎら、１９８５)。これにより、グルタチオンを低減し、ＡＴＰレベルを維持し、そうしてヘモグロビンの親和性を低減する２,３-ジホスホグリセレート(２,３-ＤＰＧ)の増加を避けることができるといことが示唆される。これらの網状赤血球及びＲＢＣの変形能は、エクタサイトメトリーにより評価されると、天然の赤血球の変形能に匹敵するものであった(図４)(Ｃｙｎｏｂｅｒら、１９９６)。
【００７３】
in vitroにおいて生成されるＲＢＣのヘモグロビンの機能は、閃光光分解により研究された。異なるサブユニット間の協調が観察され、四量体ヘモグロビンのアロステリック挙動特徴を確認する。当該分子は、天然のヘモグロビンについて予期されるように酸素を固定及び放出できた。メトヘモグロビン(Ｍｅｔ-Ｈｂ)は、分析サンプルにおいて検出されなかった。これは、ｃＲＢＣが酵素学的にＨｂ酸化を逆行できるということを示唆した。
【００７４】
培養ヒトＲＢＣのin vivoにおける結末
in vivoでの発生を追跡するために、白血球搬送法から生成されるＣＦＳＥ標識網状赤血球を、ＮＯＤ-ＳＣＩＤマウスに腹腔内注射した。注射後、ｃＲＢＣは天然ＲＢＣと同程度まで血液循環系内に存続した：ＣＦＳＥ+細胞は、輸液された動物の両群において３日間検出された。ＣＦＳＥ+／ＬＤＳ-細胞の外見により示されるように、輸液された網状赤血球は、in vivoにおいてＲＢＣに完全に成熟した(図６)：それぞれ１日目、２日目、及び３日目において３６％、７３％、及び９６％が成熟ＲＢＣであり、これはin vitroで得られた結果に沿うものであった。ＲｈＤ抗原表面発現は、ヒト起源のＣＦＳＥ+細胞を確認した。
【００７５】
赤血球の最終成熟におけるex vivo微小環境の影響
微小環境がなく、そして成長因子のみが存在する状態で、細胞増殖及び赤血球分化能は変わらなかった(１５日目において５.６×１０5倍の増幅、９９％の赤血球)。しかしながら、実質的に最終的な成熟、つまり脱核は達成されなかった(２±１％)。こうして、接着細胞と非接着細胞とのあいだに０.４５μｍのトランスウォールを配置することは、脱核を全て防止し、そして次なる細胞溶解を誘導した。
【００７６】
さらに、赤血球前駆細胞(ＣＦＵ-Ｅ、ＢＦＵ-Ｅ)の生成動態により、間質細胞が存在しないことが最終分化を助けないということが確認された。これらの前駆細胞の１１日目における数が、ＭＳ５細胞上での共培養した際よりも２０〜７００倍多かったためである。
【００７７】
ヘモグロビンの合成研究：
合成されたヘモグロビンの性質がＣＤ３４+細胞の起源及び培養条件の両方に依存するということを本発明者は観察した。ＰＢ又は成人ＢＭに由来するｃＲＢＣは、ヘモグロビンＡ(ＨｂＡ)(それぞれ９４±１.７％及び９５％±０.６％)と類似のモジュレーションであるヘモグロビンＦ(ＨｂＦ)(γＡ：γＧの比はそれぞれ５３：４７及び５２：４８である)を含む。ＣＢに由来するＣＤ３４+細胞から得たｃＲＢＣは、実質的に胎児のヘモグロビン(６４±１３％)と部分的なモジュレーションであるＨｂＦ (γＡ：γＧの平均比は５９：４１である) とを含み、ＣＢサンプル中の８０±７％のＨｂＦから開始した。これらの観察は、Ｆ細胞から非Ｆ細胞へのex vivo変換が生じた可能性を反映する。以前の研究(Neildez-Nguyenら、2002)において、微小環境が存在しない条件で１０日間培養した後に得られた赤芽細胞始原細胞／前駆細胞が、ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスに注射した後にin vivoにおいて機能型ＨｂＡ(９６％）と、完全なモジュレーションであるＨｂＦ (γＡ：γＧの比は３５：６５である) とを含む成熟ＲＢＣを生じさせることが分かったので、ｃＲＢＣによるＨｂＦのｅｘ ｖｉｖｏ合成は、培養条件と県警を有する。重篤な異常血色素症(鎌状赤血球貧血症、β-サラセミア)を患う患者においてＨｂＦの発現を刺激することは、本明細書において取り扱われうる興味あるex vivo治療アプローチである。
【００７８】
実施例２：間葉細胞を骨髄環境として用いた成熟ＲＢＣの生産
ＭＳ５間質細胞を間葉間質細胞(MSC、Prockop D. J, 1997)に置き換えて、実施例１のプロトコルを繰り返した。
【００７９】
間質細胞の選別及び増殖：
間葉間質細胞(ＭＳＣ)を通常の成人骨髄全体から樹立した。
第一ステップ、間葉間質細胞の選別：
リボヌクレオシド及びデオキシリボヌクレオシドを含まず、そしてＧｌｕｔａｍａｘ(Invitrogen, ref32561-029 Paisley, Scotland)を含み、そして１０％ウシ胎児血清(ＦＣＳ)±１ｎｇ／ｍｌβＦＧＦを添加したαＭＥＭ培地中に細胞を５００００細胞／ｃｍ2で蒔いた。３〜５日後、非接着細胞を取り除く。接着細胞をコンフルエントになるまで週二回培地交換する(約１０〜２０日)。第一ステップの終わりにおいて、間質細胞は、その接着性質のため骨髄細胞の全体から高度に選別されるということが考慮される。
【００８０】
第二ステップ、間葉間質細胞の増殖：
接着細胞は、室温にてトリプシン-ＥＤＴＡ１×で５〜６分処理した後に回収する。細胞の剥離を、倒立顕微鏡下で制御する。２５ｃｍ2フラスコあたり０.５ｍｌＦＣＳを加えることにより反応を止める。細胞を洗浄し、そして１０％ＦＣＳ±βＦＧＦを加えられた新たな培地中で１０００〜３０００細胞／ｃｍ2で蒔く。細胞をコンフルエントになるまで週一回又は二回培地交換する。コンフルエントになるまで細胞を３７℃５％ＣＯ2下でインキュベーションする。接着ＭＳＣを増殖させ、そして第二ステップの後から少なくとも２回の連続継代を通して精製した。
【００８１】
細胞培養の結果：
以下のプロトコル：ステップａ)８日間、ステップ ａ')３日間、及びステップｂ)４日間に従って、骨髄(ＢＭ)又は末梢血(ＰＢ)由来のＣＤ３４+細胞について１３１００倍(８０００〜２３０００倍)の平均細胞増殖、及び臍帯血(ＣＢ)に由来するＣＤ３４+について５７３００倍(３２０００〜７３０００倍)の平均細胞増殖のプラトーを１５日目に得ることが可能である。
赤血球細胞系列への傾向及びＲＢＣへの最終成熟は、ＭＳ-５層上で観察されたものに正確に類似した。
【００８２】
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【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１Ａ】赤血球細胞の大量増殖。臍帯血(ＣＢ)、骨髄(ＢＭ)、末梢血(ＰＢ)、又は白血球搬出法(ＬＫ)に由来するヒトＣＤ３４+細胞を、三層プロトコル(実施例１の材料と方法を参照のこと)にしたがって、マウス起源の間質細胞(ＭＳ５)の層上で液体培地中で培養し、そして生存している非接着性の細胞の総数を時間を変えて測定した。７ユニットのＣＢ、５ユニットのＢＭ、１ユニットのＰＢ、及び３ユニットのＧ-ＣＳＦで動員された白血球搬出法から得た培養物についての平均値を示す。
【図１Ｂ】Ｍａｙ-Ｇｒｕｎｗａｌｄ-Ｇｉｅｍｓａ染色後の０、８、１１、１５、及び１８日目の培養物における細胞の写真。
【図１Ｃ】半固体培養物中の前駆細胞の数。ＣＢ培養物由来の細胞を用いた４の独立した実験における赤血球前駆細胞(ＣＦＵ-Ｅ、ＢＦＵ-Ｅ)及び顆粒球-マクロファージ前駆細胞(ＣＦＵ-ＧＭ)についての(蒔いた細胞１０4個あたりの）平均数である。様々な時間点において、前駆細胞の評価のために、非接着細胞の一定分量をＳＣＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ-３、及びＥｐｏの存在下でメチルセルロース中で増殖させた。
【図２Ａ】網状赤血球のＲＢＣへの成熟。ＢＭ培養物から得たサンプルを用いた１の代表的な実験の１５日目〜１８日目における、レーザースチリル色素(ＬＤＳ)で染色されたトランスフェリン受容体(ＣＤ７１)の発現についてのＦＡＣＳ分析。
【図２Ｂ】１５日目と１８日目においてCresyl Brilliant Blueで染色された網状赤血球の写真(倍率×５００)。１５日目では、６５％の細胞が脱核しておりその９８％が網状赤血球であった。１８日目では、１００％の細胞が脱核しており、そして８２％がＲＢＣであった。
【図３】共焦点顕微鏡画像。in vitroで生成された脱核細胞を、ＣＦＳＥ(カルボキシフルオレセイン・ジアセテート・スクシンイミジル・エステル、細胞内巨大分子と共有結合を形成する)で標識し、そして共焦点レーザー走査顕微鏡(倍率×４００)により分析した。成熟の様々なステージを示す。上段：特徴的なしわの寄った外見を有する未成熟な網状赤血球。中段：成熟網状赤血球、カップ型細胞。下段：成熟赤血球、両凹面円盤に近い。図は：外形図(Ａ)、正面図(Ｂ)、及び側面図(Ｃ)である。
【図４】変形能プロファイル。脱核赤血球の伸張を計測するために浸透圧勾配におけるエクタサイトメトリー(Ｅｋｔａｃｙｔｏｍｅｔｒｙ)を使用した。曲線は等張培地における最大変形指数(ＩＤｍａｘ)を規定する。ＩＤｍａｘは、分析された細胞型の全てについて、対照と同じ範囲であり(０.４１〜０.５３)、変形について等しい能力を示す。ＳＣ前駆細胞由来の網状赤血球(Ａ)及びＳＣ前駆細胞由来のＲＢＣ(Ｂ)の代表的な曲線を生来のＲＢＣ(Ｃ)についての曲線に比較する。
【図５】ヘモグロビンのＣＯ再結合反応速度論。１８日目の培養物からex vivoで得られたＲＢＣのヘモグロビン含有物の閃光光分解後のＣＯ再結合(灰色曲線)を、新鮮なＲＢＣ懸濁液由来のヘモグロビンの閃光光分解後のＣＯ再結合(黒色曲線)に比較した。２個のサンプルは、類似の結合性及びアロステリック特性を示す。光解離収率が低下すると、Ｔ状態分子の存在のため遅いＣＯ再結合段階が減少する。
【図６】フローサイトメトリーによるＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスモデル中のＣＦＳＥ標識ｃＲＢＣの追跡。一の代表的な実験を示す。(Ａ)：ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスの末梢血、由来の細胞におけるＣＦＳＥ／ＬＤＳマーカーの発現のキネティクス。ｘ軸：ＣＦＳＥ検出量；ｙ軸：ＬＤＳの検出量を示す。(Ｂ)３日目において、細胞をＰＥ-抗ＲｈＤ抗体(色つきのヒストグラム)又はその対照アイソタイプ(無色のヒストグラム)で共標識された。結果を、ＣＦＳＥ+細胞内のＲｈ割合について示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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