(57)【要約】  生物学的材料の分離方法であって、式（式中、Ｂは、−ＮＲ1−又は−Ｏ−からなる群からの１、２又は３員で中断されてもよく、かつ非置換又はヒドロキシル、スルホ、スルファト、シアノ若しくはカルボキシルで置換されたＣ2〜Ｃ12アルキレン基であり、Ｒ1は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルであるか、あるいはＢは、非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、スルホ、ハロゲン若しくはカルボキシルで置換された、Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン基、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン−Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン基若しくはＣ1〜Ｃ4アルキレン−Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン−Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基、又は非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ4アルカノイルアミノ、スルホ、ハロゲン若しくはカルボキシルで置換された、フェニレン基、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン−フェニレン基若しくはＣ1〜Ｃ4アルキレン−フェニレン−Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基であり、Ｖは、式で示される非繊維反応性置換基又は繊維反応性置換基であり、ここでＲ2は、水素又は非置換若しくは置換されたＣ1〜Ｃ4アルキル又は基であり、Ｒ3は、水素、ヒドロキシ、スルホ、スルファト、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシカルボニル、Ｃ1〜Ｃ4−アルカノイルオキシ、カルバモイル又は−ＳＯ2−Ｙ基であり、Ｒ4は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルであり、ａｌｋ及びａｌｋ1は各々、互いに独立して、直鎖状又は分岐状のＣ1〜Ｃ6アルキレンであり、アリーレンは、非置換又はスルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ若しくはハロゲンで置換された、フェニレン又はナフチレン基であり、Ｙは、ビニル又は−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｕ基であり、かつＵは、脱離基であり、Ｙ1は、−ＣＨ（Ｈａｌ）−ＣＨ2（Ｈａｌ）又は−Ｃ（Ｈａｌ）＝ＣＨ2基であり、ここでＨａｌは、塩素又は臭素であり、Ｗは、−ＳＯ2−ＮＲ4−、−ＣＯＮＲ4−又は−ＮＲ4ＣＯ−基であり、ここでＲ4は、上記に定義したとおりであり、Ｑは、−Ｏ−又は−ＮＲ4−基であり、ここでＲ4は、上記に定義したとおりであり、そしてｎは、数０又は１であり、Ｘは、ハロゲンであり、そしてｋ及びｍは各々、互いに独立して、数０又は１であり、かつｋ＋ｍの合計は、１又は２である）で示される化合物と、上記式（１）で示される化合物の反応性基と反応して、共有結合を形成可能な基を有する基質との反応生成物を含む吸着剤が使用される（ただし、Ｑが、スルホ又はカルボキシである式で示される化合物を含む吸着剤は除外される）方法は、染料リガンドアフィニティークロマトグラフィーにおいてスクリーニングに使用できる様々な染料リガンド構造を提供する。
2008539280.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的材料の分離方法であって、
式：
【化１】
2008539280.tif 000042
（式中、
Ｂは、−ＮＲ1−又は−Ｏ−からなる群からの１、２又は３員で中断されてもよく、かつ非置換又はヒドロキシル、スルホ、スルファト、シアノ若しくはカルボキシルで置換されたＣ2〜Ｃ12アルキレン基であり、
Ｒ1は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルであるか、あるいは
Ｂは、非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、スルホ、ハロゲン若しくはカルボキシルで置換された、Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン基、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン−Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン基若しくはＣ1〜Ｃ4アルキレン−Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン−Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基、又は非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ4アルカノイルアミノ、スルホ、ハロゲン若しくはカルボキシルで置換された、フェニレン基、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン−フェニレン基若しくはＣ1〜Ｃ4アルキレン−フェニレン−Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基であり、
Ｖは、
式：
【化２】
2008539280.tif 000043
で示される非繊維反応性置換基又は繊維反応性置換基であり、
ここで
Ｒ2は、水素又は非置換若しくは置換されたＣ1〜Ｃ4アルキル又は
式：
【化３】
2008539280.tif 000044
基であり、
Ｒ3は、水素、ヒドロキシ、スルホ、スルファト、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシカルボニル、Ｃ1〜Ｃ4−アルカノイルオキシ、カルバモイル又は−ＳＯ2−Ｙ基であり、
Ｒ4は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルであり、
ａｌｋ及びａｌｋ1は各々、互いに独立して、直鎖状又は分岐状のＣ1〜Ｃ6アルキレンであり、
アリーレンは、非置換又はスルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ若しくはハロゲンで置換された、フェニレン又はナフチレン基であり、
Ｙは、ビニル又は−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｕ基であり、かつＵは、脱離基であり、
Ｙ1は、−ＣＨ（Ｈａｌ）−ＣＨ2（Ｈａｌ）又は−Ｃ（Ｈａｌ）＝ＣＨ2基であり、ここでＨａｌは、塩素又は臭素であり、
Ｗは、−ＳＯ2−ＮＲ4−、−ＣＯＮＲ4−又は−ＮＲ4ＣＯ−基であり、ここでＲ4は、上記に定義したとおりであり、
Ｑは、−Ｏ−又は−ＮＲ4−基であり、ここでＲ4は、上記に定義したとおりであり、そして
ｎは、数０又は１であり、
Ｘは、ハロゲンであり、そして
ｋ及びｍは各々、互いに独立して、数０又は１であり、かつｋ＋ｍの合計は、１又は２である）
で示される化合物と、上記式（１）で示される化合物の反応性基と反応して共有結合を形成可能な基を有する基質との反応生成物を含む吸着剤が使用されるが、
ただし、
式：
【化４】
2008539280.tif 000045
（式中、
Ｑは、スルホ又はカルボキシである）
で示される化合物を含む吸着剤は除外される、方法。
【請求項２】
式（１）で示される化合物が、
式：
【化５】
2008539280.tif 000046
（式中、
Ｂは、Ｃ2〜Ｃ6アルキレン基、非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキルで置換されたメチレン−シクロヘキシレン基、又は非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、ハロゲン若しくはスルホで置換された、フェニレン若しくはメチレン−フェニレン−メチレン基であり、
Ｖは、アミノ、非置換又はアルキル部分においてヒドロキシ、スルファト若しくはスルホで置換され、かつ非中断又は−Ｏ−基で中断された、Ｎ−モノ−若しくはＮ，Ｎ−ジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、モルホリノ、非置換若しくはフェニル環においてスルホ、カルボキシ、塩素、アセチルアミノ、メチル若しくはメトキシで置換された、フェニルアミノ若しくはＮ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル−Ｎ−フェニルアミノ、又は非置換若しくは１〜３個のスルホ基で置換されたナフチルアミノであるか、あるいは
Ｖは、
式：
【化６】
2008539280.tif 000047
で示される基である）
で示される化合物に対応する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
Ｂが、
下記：
【化７】
2008539280.tif 000048
基であり、
Ｖが、β−ヒドロキシエチルアミノ、２−（β−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−β−ヒドロキシエチルアミノ、β−スルホエチルアミノ、モルホリノ、２−、３−若しくは４−スルホフェニルアミノ、１−スルホナフタ−２−イル−アミノ若しくは３，７−ジスルホナフタ−２−イル−アミノに対応するか、あるいは
Ｖは、請求項２に定義した式（２ｃ’）若しくは（２ｄ’）基である、請求項２記載の方法。
【請求項４】
基質が、炭水化物又は修飾炭水化物、好ましくはアガロース、架橋アガロース、デキストロース、デキストラン又はそれらの修飾体である、請求項１〜３のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
生物学的材料を分離するための吸着剤であって、
式：
【化８】
2008539280.tif 000049
（式中、
Ｂは、−ＮＲ1−又は−Ｏ−からなる群からの１、２又は３員で中断されてもよく、かつ非置換又はヒドロキシル、スルホ、スルファト、シアノ若しくはカルボキシルで置換されたＣ2〜Ｃ12アルキレン基であり、
Ｒ1は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルであるか、あるいは
Ｂは、非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、スルホ、ハロゲン若しくはカルボキシルで置換された、Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン基、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン−Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン基若しくはＣ1〜Ｃ4アルキレン−Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン−Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基であるか、又は非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ4アルカノイルアミノ、スルホ、ハロゲン若しくはカルボキシルで置換された、フェニレン基、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン−フェニレン基若しくはＣ1〜Ｃ4アルキレン−フェニレン−Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基であり、
Ｖは、
式：
【化９】
2008539280.tif 000050
で示される非繊維反応性置換基又は繊維反応性置換基であり、
ここで
Ｒ2は、水素又は非置換若しくは置換されたＣ1〜Ｃ4アルキル又は
下記：
【化１０】
2008539280.tif 000051
基であり、
Ｒ3は、水素、ヒドロキシ、スルホ、スルファト、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシカルボニル、Ｃ1〜Ｃ4−アルカノイルオキシ、カルバモイル又は−ＳＯ2−Ｙ基であり、
Ｒ4は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルであり、
ａｌｋ及びａｌｋ1は各々、互いに独立して、直鎖状又は分岐状のＣ1〜Ｃ6アルキレンであり、
アリーレンは、非置換又はスルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ若しくはハロゲンで置換された、フェニレン又はナフチレン基であり、
Ｙは、ビニル又は−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｕ基であり、かつＵは、脱離基であり、
Ｙ1は、−ＣＨ（Ｈａｌ）−ＣＨ2（Ｈａｌ）又は−Ｃ（Ｈａｌ）＝ＣＨ2基であり、ここでＨａｌは、塩素又は臭素であり、
Ｗは、−ＳＯ2−ＮＲ4−、−ＣＯＮＲ4−又は−ＮＲ4ＣＯ−基であり、ここでＲ4は、上記に定義したとおりであり、
Ｑは、−Ｏ−又は−ＮＲ4−基であり、ここでＲ4は、上記に定義したとおりであり、そして
ｎは、数０又は１であり、
Ｘは、ハロゲンであり、そして
ｋ及びｍは各々、互いに独立して、数０又は１であり、かつｋ＋ｍの合計は、１又は２である）
で示される化合物と、
上記式（１）で示される化合物の反応性基と反応して共有結合を形成可能な基を有する基質との反応生成物を含むが、
ただし、
式：
【化１１】
2008539280.tif 000052
（式中、
Ｑは、スルホ又はカルボキシである）
で示される化合物を含む吸着剤は除外される、吸着剤。
【請求項６】
請求項５記載の吸着剤の製造方法であって、
式：
【化１２】
2008539280.tif 000053
〔式中、
Ｂは、−ＮＲ1−又は−Ｏ−からなる群からの１、２又は３員で中断されてもよく、かつ非置換又はヒドロキシル、スルホ、スルファト、シアノ若しくはカルボキシルで置換されたＣ2〜Ｃ12アルキレン基であり、
Ｒ1は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルであるか、あるいは
Ｂは、非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、スルホ、ハロゲン若しくはカルボキシルで置換された、Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン基、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン−Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン基若しくはＣ1〜Ｃ4アルキレン−Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン−Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基、又は非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ4アルカノイルアミノ、スルホ、ハロゲン若しくはカルボキシルで置換された、フェニレン基、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン−フェニレン基若しくはＣ1〜Ｃ4アルキレン−フェニレン−Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基であり、
Ｖは、
式：
【化１３】
2008539280.tif 000054
で示される非繊維反応性置換基又は繊維反応性置換基であり、
ここで
Ｒ2は、水素又は非置換若しくは置換されたＣ1〜Ｃ4アルキル又は
下記：
【化１４】
2008539280.tif 000055
基であり、
Ｒ3は、水素、ヒドロキシ、スルホ、スルファト、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシカルボニル、Ｃ1〜Ｃ4−アルカノイルオキシ、カルバモイル又は−ＳＯ2−Ｙ基であり、
Ｒ4は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルであり、
ａｌｋ及びａｌｋ1は各々、互いに独立して、直鎖状又は分岐状のＣ1〜Ｃ6アルキレンであり、
アリーレンは、非置換又はスルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ若しくはハロゲンで置換された、フェニレン又はナフチレン基であり、
Ｙは、ビニル又は−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｕ基であり、かつＵは、脱離基であり、
Ｙ1は、−ＣＨ（Ｈａｌ）−ＣＨ2（Ｈａｌ）又は−Ｃ（Ｈａｌ）＝ＣＨ2基であり、ここでＨａｌは、塩素又は臭素であり、
Ｗは、−ＳＯ2−ＮＲ4−、−ＣＯＮＲ4−又は−ＮＲ4ＣＯ−基であり、ここでＲ4は、上記に定義したとおりであり、
Ｑは、−Ｏ−又は−ＮＲ4−基であり、ここでＲ4は、上記に定義したとおりであり、そして
ｎは、数０又は１であり、
Ｘは、ハロゲンであり、そして
ｋ及びｍは各々、互いに独立して、数０又は１であり、かつｋ＋ｍの合計は、１又は２であるが、
ただし、
式：
【化１５】
2008539280.tif 000056
（式中、
Ｑは、スルホ又はカルボキシである）
で示される化合物は除く〕で示される化合物と、前記式（１）で示される化合物の反応性基と反応して共有結合を形成可能な基を有する基質とを、酸結合剤の存在下で反応させることを含む、方法。
【請求項７】
式：
【化１６】
2008539280.tif 000057
（式中、
Ｖ1は、β−ヒドロキシエチルアミノ、２−（β−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ又はモルホリノであり、
Ｖ2及びＶ3は各々、互いに独立して、β−ヒドロキシエチルアミノ、２−（β−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−β−ヒドロキシエチルアミノ又はモルホリノであり、
ｑは、数０、１、２又は３である）
で示される化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アントラキノン染料リガンドを含む吸着剤を使用した、生物学的材料の分離及び精製方法、吸着剤の製造方法、並びに吸着剤に関するものである。
【０００２】
反応性染料は、確立した製品であり、繊維産業において、例えば綿又はビスコース等のセルロース繊維の着色に広く使用されている。このような反応性染料の分子は、連結された２個の単位から構成されると考えることができ、その各々は、異なる機能を有する。単位の一方は、発色団であり、その機能は、繊維に所望の色及び他の着色特性を付与することである。単位の他方は、繊維反応性基であり、これは、確立された適用条件下で、セルロースと化学的に反応して、染料分子を繊維に対して共有結合させ、洗濯工程に高い耐性を有する染色材料を生成する。
【０００３】
反応性染料は、当初、セルロース繊維材料の染色及び印刷で直面した所定の問題を解決するために開発されたが、ここ数年、それらが繊維染色分野以外に利用される特性を所有することが見出された。
【０００４】
例えば、米国特許第４，０１６，１４９号及び米国特許第４，５４６，１６１号より、これらの染料を、同様の技術により、炭水化物基質、例えばアガロース、デキストロース、デキストラン等に由来するポリマー及びコポリマーに結合し得ることが公知である。これら炭水化物基質と、所定の商業的に入手可能な反応性染料との反応生成物は、所定のタンパク性材料のクロマトグラフィーによる分離又は精製のための吸着剤として、アフィニティークロマトグラフィーにて使用されている。タンパク質又は酵素分離のためのリガンドとして使用されている、商業的な繊維染料には、モノクロロトリアゾン部分を含む、所定の青色アントラキノン染料、例えばC.I. Reactive Blue 2（チバクロンブルー（Cibacron Blue）３ＧＡ）、C.I. Reactive Blue 5及びC.I. Reactive Blue 49がある。
【０００５】
アフィニティークロマトグラフィーは、吸着剤の固定相上のリガンドに対するタンパク質又は酵素の親和性の差異に基づき、例えばＷＯ  ２００４０５２８７０に記載されているように、生物医薬品及び診断のような高性能用途において非常に重要であることが益々証明されている。相互作用の性質は、水素結合、静電気力、好適な形状から生じるスタッキング、又はリガンド−標的関係を促進する任意の他の局面であり得る。リガンド−標的相互作用は、付随する他の分子を混合物から除去し得る一方、リガンド−標的複合体を無傷で維持するように、即ち、リガンドに親和性を有するタンパク質が、マトリクスに結合する一方、親和性を有さない他の分子は押し流されるように、十分に強力である必要がある。結合したタンパク質は、例えば、P. D. G. Dean, W.S. Johnson and F.A. Middle (Ed),Affinity Chromatography: A Practical Approach, 1982に記載されているように、変動するｐＨ、イオン強度及び緩衝液の条件下で、選択的に溶出され得る。タンパク質混合物は、振とう又は吸着剤を伴うカラムを通過させることによって、分離に付され得る。
【０００６】
アフィニティークロマトグラフィーは、血漿画分からタンパク質を細かくかつ急速に捕捉することから、血液分画に有利であることが見出されている。アフィニティークロマトグラフィーは、古典的なエタノール分画及び／又はイオン交換クロマトグラフィーにより予め精製された血漿画分に適用される。アフィニティークロマトグラフィーは、例えばT.Burnouf 及び M.Radosevich, J. Biochem. Biophys. Methods, 2001, 49, 575より公知の第ＶＩＩＩ因子、ＩＸ因子、フォンウィルブランド因子、タンパク質Ｃ及びアンチトロンビンＩＩＩの濃縮物のような、様々な血漿製品の工業生産に使用されている。
【０００７】
チバクロンブルー３ＧＡは、その様々なタンパク質及び酵素との相互作用に関して、深く研究されている。例えば、S.Subramanian, CRC Critical Rev. Biochem., 1984, 16, 169に記載されているように、染料は、ＮＡＤ＋部分を模倣し、それゆえこの部位を認識するタンパク質及び酵素と相互作用することが観察されている。例えばM. Allary, J. Saint-Blancard, E. Boschetti and P. Girot, Bioseparation, 1991 , 2, 167より公知であるように、アルブミンは、固定化チバクロンブルー３ＧＡを用いて、大規模で首尾良く精製されている。例えば、E.Gianazza and P.Arnaud, Biochem. J., 1982, 201, 129に記載されているように、ｐＨ勾配によるチバクロンブルー３ＧＡ固定化架橋アガロースビーズを用いたアフィニティークロマトグラフィーにより、２７種の血漿タンパク質の分画が実施されている。ブルーセファロース（アガロース上に固定化されたチバクロンブルー３ＧＡ）上でのセリンプロテアーゼの精製も報告されていている。例えば、C. Koch, L. Borg, K. Skjodt 及び G. Hoven, J. Chromatogr. B., 1998, 718, 41より、セリンプロテアーゼとブルーセファロースとの相互作用は、酵素の活性部位に関与することが知られている。
【０００８】
例えば、C.R. Lowe, A.R. Lowe and G. Gupta, J. Biochem. Biophys. Methods、 2001 , 49, 561に記載されているように、ファージ技術、及びコンピュータによる人工的リガンドの設計のようなバイオテクノロジーの進歩は、タンパク質精製におけるアフィニティークロマトグラフィーの適用に、更なる発展をもたらした。従来から使用されているヘパリン、ゼラチン、タンパク質Ａ及びタンパク質Ｃのようなバイオリガンドに加えて、様々なオーダーメードの合成リガンドが提供され、血漿タンパク質の生産性を向上させている。
【０００９】
人工リガンド技術を工業的タンパク質精製に適用することは、それ以上促進されておらず、主にチバクロンブルー３ＧＡの使用に限定されている。アフィニティークロマトグラフィーの原理は分子認識の現象に基づくため、リガンドの構造的変化は、タンパク質−染料相互作用の安定化又は不安定化のいずれかにて重要な役割を果たす。例えばN. Lindner, R. Jeffcoat, C. Lowe, J. Chromatogr. 1989, 473, 227及びY.D. Clonis, N. E. Labrou, V. Kotsira, C. Mazitsos, S. Melissis, G. Gogolas, J. Chromatogr. A, 2000, 891, 33を参照されたい。例えばN. E. Labrou, E. Eliopoulos, Y.D. Clonis, Biochem J., 1996, 315, 695に記載されているように、三元複合体内での二次相互作用も、特定のタンパク質に対する親和性を示す意味深い効果を有し得る。
【００１０】
したがって、容易に合成できる染料リガンド吸着剤を提供して、様々な分離又は精製上の問題を解決し、かつ信頼できるタンパク質精製の方法の範囲を広げる必要がある。
【００１１】
本発明は、吸着剤を使用した生物学的材料の分離方法に関し、該方法は、
式：
【００１２】
【化１７】
2008539280.tif 000003
【００１３】
（式中、
Ｂは、−ＮＲ1−又は−Ｏ−からなる群からの１、２又は３員で中断されてもよく、かつ非置換又はヒドロキシル、スルホ、スルファト、シアノ若しくはカルボキシルで置換されたＣ2〜Ｃ12アルキレン基であり、
Ｒ1は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルであるか、あるいは
Ｂは、非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、スルホ、ハロゲン若しくはカルボキシルで置換された、Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン基、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン−Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン基若しくはＣ1〜Ｃ4アルキレン−Ｃ5〜Ｃ9シクロアルキレン−Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基、又は非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、Ｃ2〜Ｃ4アルカノイルアミノ、スルホ、ハロゲン若しくはカルボキシルで置換された、フェニレン基、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン−フェニレン基若しくはＣ1〜Ｃ4アルキレン−フェニレン−Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基であり、
Ｖは、式：
【００１４】
【化１８】
2008539280.tif 000004
【００１５】
で示される非繊維反応性置換基又は繊維反応性置換基であり、
ここで
Ｒ2は、水素又は非置換若しくは置換されたＣ1〜Ｃ4アルキル又は
下記：
【００１６】
【化１９】
2008539280.tif 000005
【００１７】
基であり、
Ｒ3は、水素、ヒドロキシ、スルホ、スルファト、カルボキシ、シアノ、ハロゲン、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシカルボニル、Ｃ1〜Ｃ4−アルカノイルオキシ、カルバモイル又は−ＳＯ2−Ｙ基であり、
Ｒ4は、水素又はＣ1〜Ｃ4アルキルであり、
ａｌｋ及びａｌｋ1は各々、互いに独立して、直鎖状又は分岐状のＣ1〜Ｃ6アルキレンであり、
アリーレンは、非置換又はスルホ、カルボキシ、ヒドロキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ若しくはハロゲンで置換された、フェニレン又はナフチレン基であり、
Ｙは、ビニル又は−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｕ基であり、かつＵは、脱離基であり、
Ｙ1は、−ＣＨ（Ｈａｌ）−ＣＨ2（Ｈａｌ）又は−Ｃ（Ｈａｌ）＝ＣＨ2基であり、ここでＨａｌは、塩素又は臭素であり、
Ｗは、−ＳＯ2−ＮＲ4−、−ＣＯＮＲ4−又は−ＮＲ4ＣＯ−基であり、ここでＲ4は、上記に定義したとおりであり、
Ｑは、−Ｏ−又は−ＮＲ4−基であり、ここでＲ4は、上記に定義したとおりであり、そして
ｎは、数０又は１であり、
Ｘは、ハロゲンであり、そして
ｋ及びｍは各々、互いに独立して、数０又は１であり、かつｋ＋ｍの合計は、１又は２である）
で示される化合物と、上記式（１）で示される化合物の反応性基と反応して共有結合を形成可能な基を有する基質との反応生成物を含むが、
ただし、
式：
【００１８】
【化２０】
2008539280.tif 000006
【００１９】
（式中、
Ｑは、スルホ又はカルボキシである）
で示される化合物を含む吸着剤は除外される。
【００２０】
Ｂ基のＣ1〜Ｃ4アルキルとして、例えば、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル又はイソブチル、好ましくはメチル又はエチル、とくにメチルが考慮される。
【００２１】
Ｂ基のＣ1〜Ｃ4アルコキシとして、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、sec−ブトキシ、tert−ブトキシ及びイソブトキシ、好ましくはメトキシ又はエトキシ、特にメトキシが考慮される。
【００２２】
Ｂ基のハロゲンとして、例えば、フッ素、塩素及び臭素、好ましくは塩素又は臭素、特に塩素が考慮される。
【００２３】
Ｂ基のＣ2〜Ｃ4アルカノイルアミノとして、例えば、アセチルアミノ又はプロピオニルアミノ、好ましくはアセチルアミノが考慮される。
【００２４】
Ｒ1は、水素又はメチルが好ましい。
【００２５】
アルキレン基Ｂは、１、２又は３員の−Ｏ−で中断されてもよく、かつ非置換又はヒドロキシル若しくはスルファトで置換されたＣ2〜Ｃ6アルキレン基が好ましい。非置換基、特に、
式：
【００２６】
【化２１】
2008539280.tif 000007
【００２７】
で示される基が好ましい。式−（ＣＨ2）3−及び−ＣＨ2−Ｃ（ＣＨ3）2−ＣＨ2−基が、特に興味深い。
【００２８】
好ましいシクロアルキレン含有基Ｂは、特に非置換又はＣ1〜Ｃ4アルキルで置換された、対応するシクロヘキシレン含有基である。非置換又はＣ1〜Ｃ4アルキル置換された、シクロヘキシレン基又はメチレン−シクロヘキシレン基、特に非置換又はＣ1〜Ｃ4アルキルで置換されたメチレン−シクロヘキシレン基が、本明細書において好ましい。
【００２９】
好ましいフェニレン含有基Ｂは、非置換又はＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、ハロゲン若しくはスルホで置換された、対応する基である。非置換又はＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、ハロゲン若しくはスルホで置換された、フェニレン又はメチレン−フェニレン−メチレンが、特に好ましい。特に好ましい基は、
式：
【００３０】
【化２２】
2008539280.tif 000008
【００３１】
で示される基である。
【００３２】
Ｂは、１、２又は３員の−Ｏ−で中断されてもよく、かつ非置換若しくはヒドロキシル若しくはスルファトで置換されたＣ2〜Ｃ6アルキレン基、又は非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキルで置換された、シクロヘキシレン基若しくはメチレン−シクロヘキシレン基、又は非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、ハロゲン若しくはスルホで置換された、フェニレン若しくはメチレン−フェニレン−メチレン基が好ましい。
【００３３】
Ｂは、Ｃ2〜Ｃ6アルキレン基、非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキルで置換されたメチレン−シクロヘキシレン基、又は非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、ハロゲン若しくはスルホで置換された、フェニレン若しくはメチレン−フェニレン−メチレン基が、特に好ましい。
【００３４】
Ｂは、
下記：
【００３５】
【化２３】
2008539280.tif 000009
【００３６】
が、特に好ましい。
【００３７】
Ｒ2及びＲ4のＣ1〜Ｃ4アルキルとして、各々、互いに独立して、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、sec−ブチル、tert−ブチル及びイソブチル、好ましくはメチル及びエチル、特にメチルが考慮される。言及したＲ2基は、非置換であるか、又は例えばハロゲン、ヒドロキシ、シアノ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシカルボニル、カルボキシ、スルファモイル、スルホ若しくはスルファトで置換され、好ましくはヒドロキシ、スルホ、スルファト、カルボキシ又はシアノで置換される。非置換基が好ましい。
【００３８】
Ｙが、−ＣＨ2−ＣＨ2−Ｕ基のとき、脱離基Ｕは、例えば、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｆ、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＳＳＯ3Ｈ、−ＯＣＯ−ＣＨ3、ＯＰＯ3Ｈ2、−ＯＣＯ−Ｃ6Ｈ5、ＯＳＯ2−Ｃ1〜Ｃ4アルキル又は−ＯＳＯ2−Ｎ（Ｃ1〜Ｃ4アルキル）2であり得る。Ｕは、式−Ｃｌ、−ＯＳＯ3Ｈ、−ＳＳＯ3Ｈ、−ＯＣＯ−ＣＨ3、−ＯＣＯ−Ｃ6Ｈ5又は−ＯＰＯ3Ｈ2基が好ましく、特に−Ｃｌ又は−ＯＳＯ3Ｈ基、また特に−ＯＳＯ3Ｈ基が好ましい。
【００３９】
Ｙは、ビニル、β−クロロエチル、β−スルファトエチル、β−チオスルファトエチル、β−アセトキシエチル、β−フェノキシエチル又はβ−ホスファトエチルが好ましく、特にβ−クロロエチル、β−スルファトエチル又はビニルが好ましく、また特にβ−スルファトエチル又はビニルが好ましく、極めて特にビニルが好ましい。
【００４０】
Ｈａｌは、臭素が好ましい。
【００４１】
ａｌｋ及びａｌｋ1は、各々、互いに独立して、例えば、メチレン、１，２−エチレン、１，３−プロピレン、１，４−ブチレン、１，５−ペンチレン、１，６−ヘキシレン又はそれらの分岐異性体である。ａｌｋ及びａｌｋ1は、各々、互いに独立して、Ｃ1〜Ｃ4アルキレン基、特にエチレン又はプロピレン基が好ましい。
【００４２】
アリーレンの好ましい意味は、非置換又はスルホ、メチル若しくはメトキシで置換された、１，３−又は１，４−フェニレン基であり、特に非置換１，３−又は１，４−フェニレン基である。
【００４３】
Ｒ2は、水素、Ｃ1〜Ｃ4アルキル又は
式：
【００４４】
【化２４】
2008539280.tif 000010
【００４５】
で示される基が好ましく、
ここで、Ｒ3、Ｙ及びａｌｋは、各々の場合において、上記に定義したとおりであり、上記に示す好ましい意味を有する。Ｒ2は、特に水素、メチル又はエチルであり、極めて特に水素である。
【００４６】
Ｒ3は、水素が好ましい。
【００４７】
Ｒ4は、水素、メチル又はエチルが好ましく、特に水素が好ましい。
【００４８】
変数Ｑは、−ＮＨ−又は−Ｏ−が好ましく、特に−Ｏ−が好ましい。
【００４９】
Ｗは、式−ＣＯＮＨ−又は−ＮＨＣＯ−で示される基が好ましく、特に式−ＣＯＮＨ−で示される基が好ましい。
【００５０】
変数ｎは、数０が好ましい。
【００５１】
好ましい式（２ａ）〜式（２ｆ）の繊維反応性置換基Ｖは、Ｒ2及びＲ3が、各々、水素、Ｒ4が、水素、メチル又はエチル、Ｑが、−ＮＨ−又は−Ｏ−基、Ｗが、−ＣＯＮＨ−基、ａｌｋ及びａｌｋ1が、各々、互いに独立して、エチレン又はプロピレン、アリーレンが、非置換又はメチル、メトキシ若しくはスルホで置換されたフェニレン、Ｙが、ビニル、β−クロロエチル又はβ−スルファトエチル、特にビニル又はβ−スルファトエチル、極めて特にビニル、Ｙ1が、−ＣＨＢｒ−ＣＨ2Ｂｒ又は−ＣＢｒ＝ＣＨ2、そしてｎが、数０である基であり；これらの置換基の中でも、式（２ｃ）及び（２ｄ）で示される基が特に好ましい。
【００５２】
Ｖが、繊維反応性置換基の意味を有する場合、Ｖは、
式：
【００５３】
【化２５】
2008539280.tif 000011
【００５４】
特に（２ｃ’）で示される基であることが、極めて特に好ましく、ここでＹは、上記に定義したとおりであり、上記に示した好ましい意味を有する。
【００５５】
式（２ｃ’）の基において、窒素原子は、水素の代わりに、メチル又はエチルで置換されてもよい。
【００５６】
Ｖが非繊維反応性置換基の場合、これは例えば、ヒドロキシ；Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ；非置換又はヒドロキシ、カルボキシ若しくはスルホで置換されたＣ1〜Ｃ4アルキルチオ；アミノ；Ｃ1〜Ｃ8アルキルでモノ又はジ置換されたアミノ（ここでアルキルは、非置換又は例えば、スルホ、スルファト、ヒドロキシ、カルボキシ若しくはフェニル、特にスルホ若しくはヒドロキシで更に置換され、かつ非中断又は−Ｏ−基で中断されている）；非置換又はＣ1〜Ｃ4アルキルで置換されたシクロヘキシルアミノ；モルホリノ；Ｎ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル−Ｎ−フェニルアミノ又はフェニルアミノ若しくはナフチルアミノ（ここでフェニル若しくはナフチルは非置換又は例えば、Ｃ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、カルボキシ、スルホ若しくはハロゲンで置換されている）であり得る。
【００５７】
適切な非繊維反応性置換基Ｖの例は、アミノ、メチルアミノ、エチルアミノ、β−ヒドロキシエチルアミノ、２−（β−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−β−ヒドロキシエチルアミノ、β−スルホエチルアミノ、シクロヘキシルアミノ、モルホリノ、ｏ−、ｍ−又はｐ−クロロフェニルアミノ、ｏ−、ｍ−又はｐ−メチルフェニルアミノ、ｏ−、ｍ−又はｐ−メトキシフェニルアミノ、ｏ−、ｍ−又はｐ−スルホフェニルアミノ、ジスルホフェニルアミノ、ｏ−カルボキシフェニルアミノ、１−又は２−ナフチルアミノ、１−スルホ−２−ナフチルアミノ、４，８−ジスルホ−２−ナフチルアミノ、Ｎ−エチル−Ｎ−フェニルアミノ、Ｎ−メチル−Ｎ−フェニルアミノ、メトキシ、エトキシ、ｎ−又はイソ−プロポキシ及びヒドロキシである。
【００５８】
非繊維反応性基として、ヒドロキシ；Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ；非置換若しくはヒドロキシ、カルボキシ若しくはスルホで置換されたＣ1〜Ｃ4アルキルチオ；アミノ；Ｎ−モノ−若しくはＮ，Ｎ−ジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ（ここでアルキル部分は、非置換若しくはヒドロキシ、スルファト若しくはスルホで置換され、かつ非中断若しくは−Ｏ−基で中断されている）；モルホリノ；フェニルアミノ若しくはＮ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル−Ｎ−フェニルアミノ（ここで各フェニル環は、非置換若しくはスルホ、カルボキシ、塩素、アセチルアミノ、メチル若しくはメトキシで置換され、またアルキルは、非置換若しくはヒドロキシ、スルホ若しくはスルファトで置換されている）；又は非置換若しくは１〜３個のスルホ基で置換されたナフチルアミノを意味するＶが好ましい。
【００５９】
非繊維反応性基として、アミノ；アルキル部分が非置換若しくはヒドロキシ、スルファト若しくはスルホで置換され、かつ非中断若しくは−Ｏ−基で中断された、Ｎ−モノ−若しくはＮ，Ｎ−ジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ；モルホリノ：フェニル環が非置換若しくはスルホ、カルボキシ、塩素、アセチルアミノ、メチル若しくはメトキシで置換された、フェニルアミノ若しくはＮ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル−Ｎ−フェニルアミノ；又は非置換若しくは１〜３個のスルホ基で置換されたナフチルアミノに対応するＶが特に好ましい。
【００６０】
特に重要な非繊維反応性基Ｖは、β−ヒドロキシエチルアミノ、２−（β−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−β−ヒドロキシエチルアミノ、β−スルホエチルアミノ、モルホリノ、２−、３−若しくは４−スルホフェニルアミノ、１−スルホナフト−２−イル−アミノ又は３，７−ジスルホナフト−２−イル−アミノである。
【００６１】
ｋは、数０が好ましい。
【００６２】
ｍは、数１が好ましい。
【００６３】
Ｘは、例えば、フッ素、塩素又は臭素であり、好ましくはフッ素又は塩素であり、特に塩素が好ましい。
【００６４】
本発明の好ましい実施態様において、式（１）の化合物は、
式：
【００６５】
【化２６】
2008539280.tif 000012
【００６６】
（式中、
Ｂは、Ｃ2〜Ｃ6アルキレン基、非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキルで置換されたメチレン−シクロヘキシレン基、又は非置換若しくはＣ1〜Ｃ4アルキル、Ｃ1〜Ｃ4アルコキシ、ハロゲン若しくはスルホで置換された、フェニレン若しくはメチレン−フェニレン−メチレン基であり、
Ｖは、アミノ、非置換又はアルキル部分においてヒドロキシ、スルファト若しくはスルホで置換され、かつ非中断又は−Ｏ−基で中断された、Ｎ−モノ−若しくはＮ，Ｎ−ジ−Ｃ1〜Ｃ4アルキルアミノ、モルホリノ、非置換若しくはフェニル環においてスルホ、カルボキシ、塩素、アセチルアミノ、メチル若しくはメトキシで置換された、フェニルアミノ若しくはＮ−Ｃ1〜Ｃ4アルキル−Ｎ−フェニルアミノ、又は非置換若しくは１〜３個のスルホ基で置換されたナフチルアミノであるか、あるいは
Ｖは、上記に定義した式（２ｃ’）又は（２ｄ’）基である）で示される化合物に対応する。
【００６７】
本発明の特に好ましい実施態様において、式（１）の化合物は、
Ｂが
下記：
【００６８】
【化２７】
2008539280.tif 000013
【００６９】
基である、上記の式（１ａ）で示される化合物に対応する。
【００７０】
Ｖは、β−ヒドロキシエチルアミノ、２−（β−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−β−ヒドロキシエチルアミノ、β−スルホエチルアミノ、モルホリノ、２−、３−若しくは４−スルホフェニルアミノ、１−スルホナフト−２−イル−アミノ又は３，７−ジスルホナフト−２−イル−アミノに対応するか、あるいは
Ｖは、上記に定義した式（２ｃ’）若しくは（２ｄ’）基である。
【００７１】
式（１）の化合物の構造的変更は、特定の分離又は精製上の問題を解決し得る。
【００７２】
本発明に従って適用される吸着剤の調製に使用される基質又はマトリクスは、実質的に水不溶性であり得る。上記基質の例として、例えばポリアクリルアミド又はヒドロキシアルキルメタクリレート等のアクリルポリマー、及びこれら材料のコポリマー、ジルコニア、チタニア若しくはアルミナ等の金属酸化物、シリカ又は多孔質ガラスが挙げられるが、好ましい水不溶性固体担体は、式（１）の化合物が反応性基を介して結合され得る、複数の水酸基を有するポリマー基質である。特に適切な基質は、炭水化物及び修飾炭水化物である。適切な炭水化物基質の例は、アガロース、架橋アガロース、デキストロース、デキストラン及びそれらの修飾体であり、例えば「セファロース（sepharose）」及び「セファデックス（sephadex）」ゲル（「セファロース」及び「セファデックス」はGE Healthcareの商標である）として入手可能であり、ＧＢ  １，５４０，１６５に記載されている。他のポリマー基質は、ポリアミドである。特に好ましい基質は、アガロース及び架橋アガロースである。
【００７３】
本発明に従って適用される吸着剤は、標準的な方法により、例えば、式（１）の化合物を、例えばアルカリ金属水酸化物又は炭酸塩、例えば水酸化ナトリウム又は炭酸ナトリウム等の酸結合剤の存在下、上記式（１）の化合物の反応性基と反応して共有結合を形成可能な基を有する基質、例えば炭水化物基質と反応させることにより調製され、ここで変数は、上記に示したように定義され、かつ好ましい変数は、上記に定義されている。
【００７４】
このような吸着剤、及びそれらを含有するクロマトグラフィーカラムの製造方法は、例えば、米国特許第４，０１６，１４９号及び米国特許第４，５４６，１６１号に詳細に記述されている。これらの文献は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００７５】
既に示したように、基質又はマトリクス、例えばアガロース、架橋アガロース、デキストロース又はデキストランは、様々な長さのスペーサーを、該スペーサーに対して式（１）の化合物を共有結合させる前に導入することによって、更に修飾され得る。スペーサーは、染料リガンドに対するアクセスを改善することから、染料リガンドと精製するべきタンパク性材料との相互作用を増大させ、それにより吸着剤の選択性及び効率を向上させ得る。
【００７６】
スペーサーの導入は、アルカリ金属水酸化物又は炭酸塩、例えば水酸化ナトリウム又は炭酸ナトリウム等の酸結合剤の存在下、基質をエピクロルヒドリンで処理し、続いて例えば２０〜８０℃、好ましくは２０〜５０℃の適切な温度下で、ポリアミンで処理することにより実施される。
【００７７】
スペーサーの導入に適切なポリアミン化合物は、芳香族ポリアミン、脂肪族ポリアミン及び非環式ポリアミンからなる群より選択され得る。典型的な例は、ポリビニルアミン、ポリビニルイミン、１，２−エチレンジアミン、ヒドラジン、ヒドラジン−２−ビス−（３−アミノプロピル）−アミン、１，４−ジアミノシクロヘキサン、３−アミノ−１−メチルアミノプロパン、Ｎ−ヒドロキシエチルエチレンジアミン、Ｎ−メチル−ビス−（３−アミノプロピル）−アミン、テトラエチレンジアミン、１，４−ジアミノブタン、１，６−ヘキサメチレンジアミン、１，８−ジアミノオクタン、１−アミノエチル−１，２−エチレンジアミン、ジエチレントリアミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、フェニレンジアミン、トルイレンジアミン、２，４，６−トリアミノトルエン−三塩酸塩、１，３，６−トリアミノナフタレン、イソホロンジアミン、キシレンジアミン、水素化キシレンジアミン、４，４’−ジ−ジアミノフェニルメタン、水素化４，４’−ジアミノジフェニルメタン、及びこれらポリアミンモノマーの誘導体を含む。
脂肪族及び／又は非環式ポリアミンが好ましい。特に、脂肪族及び／又は非環式ジアミンが好ましい。特に、１，４−ジアミノブタン、１，６−ヘキサメチレンジアミン及び１，８−ジアミノオクタンを挙げることができる。ポリアミンは、個別に又は少なくとも２種のポリアミンの混合物として使用され得る。
【００７８】
生物学的材料は、本発明の方法で使用する式（１）の化合物に特異的に結合する、任意の材料、例えばペプチド、ポリペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、ステロイド、脂質、ホルモンであり得る。しかしながら、一般に、生物学的物質又は関連物質は、酵素、タンパク質又はポリペプチド、例えばアルブミン、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、グリセロキナーゼ、ヘキソキナーゼ又はウロキナーゼ等のキナーゼ、制限エンドヌクレアーゼ又はリボヌクレアーゼ等のヌクレアーゼ、グリセロアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、肝臓アルコールデヒドロゲナーゼ又はグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ等のデヒドロゲナーゼ、シンセターゼ、ＤＮＡ又はＲＮＡ結合タンパク質及び受容体であろう。
【００７９】
固体担体に結合した式（１）の化合物を含む吸着剤は、クロマトグラフィー分離目的のためのカラム形態、又は膜分離フォーマットでの分離の実施を可能にする膜形態であり得る。
【００８０】
本発明による分離又は精製方法は、式（１）の化合物を含む吸着剤の存在下、適切なｐＨ及びイオン強度の水性環境内で、生物学的材料を処理、例えば振とうし、例えば濾過により吸着剤を分離し、ｐＨ及びイオン強度を適切に変更して、結合したタンパク質を吸着剤から溶出することによっても実施し得る。
【００８１】
本発明による分離又は精製方法は：
（ａ）生物学的材料を含有する混合物を、クロマトグラフィーカラム上に保持された式（１）の化合物を含む吸着剤と接触させる接触相、
（ｂ）内部に洗浄溶液を通過させて、式（１）の化合物を含む吸着剤から未結合種を除去する洗浄相、及び
（ｃ）式（１）の化合物を含む吸着剤に溶出溶液を通過させて、拘束された所望の生物学的材料をカラムから回収する溶出相、を含むアフィニティークロマトグラフィーにより実施されることが有利である。
【００８２】
結合材料、洗浄溶液及び溶出溶液を注意深く選択することにより、生物学的材料の複雑な混合物の一ステップ精製を達成し得る。
【００８３】
本発明の別の実施態様によれば、上記に定義した式（１）の化合物と、前記式（１）の化合物の反応性基と反応して共有結合を形成可能な基を有する基質との付加化合物を含む吸着剤を提供し、ここで変数は、上記に示したように定義され、かつ好ましい変数は、上記に定義されている。
【００８４】
本発明による吸着剤は、非常に純粋な材料であり、いかなる染料浸出挙動がなく、またマトリクス上に様々なレベルの染料リガンド濃度を含む。更に、本発明による吸着剤は、化学的及び熱的に安定であり、高い選択性を有し、染料リガンドアフィニティークロマトグラフィーにおけるスクリーニングに使用できる、多様な染料リガンド構造を提供する。
【００８５】
スクリーニングに使用できる染料構造の幅は、染料リガンドアフィニティークロマトグラフィーにおける相当の進歩である。また、これら構造変更体との相互作用は、タンパク質の活性部位に関与し得（T.Burnouf, H. Goubran, M. Radosevich, J. Chromatogr. B, 1998, 715, 65）、あるいは相互作用は、タンパク質の他の箇所で起こり得る（B.M.Hayden and P.C.Engel, Eur. J. Biochem., 2001 , 268, 1173）。そのような吸着剤の組み合わせによる両方の結合モードの可能性は、興味あるほぼ全タンパク質のタンパク質精製プロトコールの開発において、それらを価値ある資源とする。
【００８６】
本発明に使用される染料リガンドの一部は、新規である。したがって、本発明は、
式：
【００８７】
【化２８】
2008539280.tif 000014
【００８８】
（式中、
Ｖ1は、β−ヒドロキシエチルアミノ、２−（β−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ又はモルホリノであり、
Ｖ2及びＶ3は各々、互いに独立して、β−ヒドロキシエチルアミノ、２−（β−ヒドロキシエトキシ）エチルアミノ、Ｎ，Ｎ−ジ−β−ヒドロキシエチルアミノ又はモルホリノであり、そして
ｑは、数０、１、２又は３であり、好ましくは０又は３である）で示される化合物にも関する。
【００８９】
式：
【００９０】
【化２９】
2008539280.tif 000015
2008539280.tif 000016
2008539280.tif 000017
2008539280.tif 000018
【００９１】
で示される化合物が好ましい。
【００９２】
染料リガンドは、当該技術分野にて周知の手順と同様に調製し得る。
【００９３】
以下の実施例は、本発明を解説する役割を有する。温度は、摂氏で表す。別に示さない限り、部は重量部であり、百分率は重量百分率である。重量部は、キログラム対リットルの比において、容積部に関連する。
【００９４】
染料リガンドの調製
実施例１：
（ａ）塩化シアヌル２０．１７部を、水１００部及び氷１００部中に分散する。２−アミノベンゼンスルホン酸１９．２６部を、水酸化ナトリウムと共に水７０部に中性にて溶解する。このように得られた中性溶液を、上記の塩化シアヌル分散液に一度に加え、水酸化ナトリウム水溶液（３０％）を用いてｐＨ値を３にて１時間保持する。次に、水酸化ナトリウム水溶液（３０％）を滴加して、ｐＨ値を段階的に６迄上昇させ、数時間保持する。温度を０〜５℃で数時間保つ。
【００９５】
（ｂ）
式：
【００９６】
【化３０】
2008539280.tif 000019
【００９７】
に対応する遊離酸形態の化合物４０．３５部を、水２００部に溶解し、ステップ（ａ）により得られた溶液に一度に加える。水酸化ナトリウム水溶液（３０％）を加えてｐＨ値を直ちに８．４〜８．６に上昇させ、温度を２０℃に上昇させる。これらの条件を数時間維持する。反応混合物を中和し、透析により無機塩を除外し、蒸発により濃縮する。生成物を乾燥し、
式：
【００９８】
【化３１】
2008539280.tif 000020
【００９９】
に対応する遊離酸形態の化合物９４．３ｇを収集する。
【０１００】
実施例２：
（ａ）塩化シアヌル１９．３６部を、水５０部及び氷６０部中に分散する。
式：
【０１０１】
【化３２】
2008539280.tif 000021
【０１０２】
に対応する遊離酸形態の化合物４８．９５部を、水酸化ナトリウムと共に水３５０部に中性にて溶解する。このように得られた中性溶液を、上記の塩化シアヌル分散液に２０分間以内で加える一方、水酸化ナトリウム水溶液（３０％）を滴加してｐＨ値を５に保持する。反応混合物をｐＨ６に保ち、温度を０〜２℃で数時間保持する。
【０１０３】
（ｂ）ステップ（ａ）により得られた溶液に、モルホリン９．５８部を加える。水酸化ナトリウム水溶液（３０％）を加えてｐＨ値を直ちに９まで上昇させ、温度を６０℃に上昇させる。これらの条件を数時間維持する。反応混合物を中和し、透析により無機塩を除外し、蒸発により濃縮する。生成物を乾燥し、
式：
【０１０４】
【化３３】
2008539280.tif 000022
【０１０５】
に対応する遊離酸形態の化合物９３．１ｇを回収する。
【０１０６】
実施例３：
（ａ）塩化シアヌル１２．９部を、水５０部及び氷５０部中に分散する。
式：
【０１０７】
【化３４】
2008539280.tif 000023
【０１０８】
に対応する遊離酸形態の化合物３８．４２部を、水酸化ナトリウムと共に水３６５部に中性にて溶解する。このように得られた中性溶液を、上記の塩化シアヌル分散液に１０分間以内で加える一方、水酸化ナトリウム水溶液（３０％）を滴加してｐＨ値を５に保持する。反応混合物をｐＨ５で保持し、温度を０℃で数時間保持する。
【０１０９】
（ｂ）ステップ（ａ）により得られた溶液に、エタノールアミン４．７０部を加える。ソーダ水溶液（２０％）を加えてｐＨ値を直ちに９に上昇させ、温度を５０℃に上昇させる。これらの条件を数時間維持する。
【０１１０】
（ｃ）反応混合物１７５０部に、塩化ナトリウム３５部を加える。３０分後、懸濁液を濾過し、乾燥する。
式：
【０１１１】
【化３５】
2008539280.tif 000024
【０１１２】
に対応する遊離酸形態の化合物４４部を回収する。
【０１１３】
実施例４：
（ａ）塩化シアヌル１９．３６部を、水５０部及び氷６０部中に分散する。
式：
【０１１４】
【化３６】
2008539280.tif 000025
【０１１５】
に対応する遊離酸形態の化合物４８．９５部を、水酸化ナトリウムと共に水５００部に中性にて溶解する。このように得られた中性溶液を、上記の塩化シアヌル分散液に４５分間以内で加える一方、水酸化ナトリウム水溶液（３０％）を滴加してｐＨ値を５に保持する。反応混合物をｐＨ５で保持し、温度を０℃にて数時間保持する。
【０１１６】
（ｂ）ステップ（ａ）により得られた溶液に、エタノールアミン６．７２部を加える。ソーダ水溶液（２０％）を加えてｐＨ値を直ちに８．５に上昇させ、温度を４０℃に上昇させる。これらの条件を数時間維持する。
【０１１７】
（ｃ）反応混合物２０００部に、塩化ナトリウム１５０部を加える。３０分後、懸濁液を濾過し、乾燥する。
式：
【０１１８】
【化３７】
2008539280.tif 000026
【０１１９】
に対応する遊離酸形態の化合物８８部を回収する。
【０１２０】
実施例５：
（ａ）塩化シアヌル７．７５部を、水３０部及び氷４０部中に分散する。
式：
【０１２１】
【化３８】
2008539280.tif 000027
【０１２２】
に対応する遊離酸形態の化合物１９．５８部を、水酸化ナトリウムと共に水２００部に中性にて溶解する。このように得られた中性溶液を、上記の塩化シアヌル分散液に４５分間以内で加える一方、水酸化ナトリウム水溶液（３０％）を滴加してｐＨ値を５に保持する。反応混合物をｐＨ５で保持し、温度を０℃にて数時間保持する。
【０１２３】
（ｂ）予めソーダ水溶液（２０％）と共にｐＨ５にて溶解した、
式：
【０１２４】
【化３９】
2008539280.tif 000028
【０１２５】
に対応する遊離酸形態の化合物１３．６１部を、ステップ（ａ）により得られた溶液に加える。ソーダ水溶液（２０％）を加えてｐＨ値を直ちに７に上昇させ、温度を２０℃に上昇させる。これらの条件を一晩維持する。生成物を乾燥する。
【０１２６】
（ｃ）（ｂ）により得られた乾燥生成物９６．８部を、塩化ナトリウム溶液（５％）３５０部でスラリー化する。次に、塩化ナトリウム１７．５部を２回、及びアセトン１００部を２回に分けて加える。懸濁液を３０分間撹拌し、濾過し、乾燥する。
式：
【０１２７】
【化４０】
2008539280.tif 000029
【０１２８】
に対応する遊離酸形態の化合物７６．５６部を回収する。
【０１２９】
実施例６〜２５：
実施例１〜５に記載した方法と類似した方法で、
式：
【０１３０】
【化４１】
2008539280.tif 000030
2008539280.tif 000031
2008539280.tif 000032
2008539280.tif 000033
2008539280.tif 000034
【０１３１】
で示される染料リガンドを得ることができる。
【０１３２】
吸着剤の調製
実施例２６（直接固定化による吸着剤合成のための一般的プロトコール）：
アガロースゲル（６％架橋［ＣＬ］、３ｇ）を水（７０ml）で洗浄し、染料リガンド（３０〜６０μmol）の水（３〜９ml）溶液に加える。混合物を５分間振とうし、２２０ｇ／ｌの塩化ナトリウム溶液（０．６ml）を加える。更に３０分間振とうした後、上記懸濁液に炭酸ナトリウム（１．５ｇ）をゆっくり加え、１８０rpmにて６０℃で２〜１６時間穏やかに振とうする。混合物を冷まし、濾過し、固体を、水（３００ml）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（１５０ml）、１：１  ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ−水（３０ml）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（１５０ml）、各々ｐＨ３、ｐＨ９の緩衝液（９０ml）及び水（３００ml）で連続的に洗浄する。水分を除去した吸着剤を、２０％ｖ／ｖメタノール中にて４℃で保管する。
【０１３３】
差分解析（濾液中の未反応染料）又はゲル解析を用いて、以下の手順に従って、染料リガンド密度を計算した。
【０１３４】
吸着剤（０．１ｇ、濾過時の湿潤重量）を６Ｍ  ＨＣｌ（２５ml）中に４０℃で１時間分解し、既知量の染料リガンドを含む標準溶液を用いて、ＨＣｌ分解物の吸光度（λmaxでの）から、吸着剤のリガンド密度を概算する。
【０１３５】
ある場合に、ＮａＯＨを炭酸ナトリウムの代わりに塩基として使用し、時間も変更する。
【０１３６】
結果を、表１に示す。
【０１３７】
【表１】
2008539280.tif 000035
【０１３８】
実施例２７（直接固定化による吸着剤合成のためのプロトコール）：
アガロースゲル（６％架橋、３ｇ）を水（７０ml）で洗浄し、
式：
【０１３９】
【化４２】
2008539280.tif 000036
【０１４０】
で示される染料リガンド（０．０４６５ｇ、６０μmol）の水（３ml）溶液に加える。混合物を５分間振とうし、２２０ｇ／ｌの塩化ナトリウム溶液（０．６ml）を加える。更に３０分間振とうした後、上記懸濁液に炭酸ナトリウム（１．５ｇ）をゆっくり加え、１８０rpmにて６０℃で２時間穏やかに振とうする。混合物を冷まし、濾過し、固体を、水（３００ml）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（１５０ml）、１：１  ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ−水（３０ml）、１Ｍ塩化ナトリウム水溶液（１５０ml）、各々ｐＨ３、ｐＨ９の緩衝液（９０ml）及び水（３００ml）で連続的に洗浄する。水分を除去した吸着剤を、２０％ｖ／ｖメタノール中にて４℃で保管する。
【０１４１】
吸着剤（０．１ｇ、濾過時の湿潤重量）を６Ｍ  ＨＣｌ（２５ml）中に４０℃で１時間分解し、８．０μmol／ｇの水分を除去したゲルとしてのＨＣｌ分解物の吸光度（λmaxでの）から、吸着剤のリガンド密度を概算する。
【０１４２】
実施例２７は、例示を目的としたものである。式（２０１）の染料リガンドは、本発明による一般式（１）の範囲から除外される。
【０１４３】
実施例２８（スペーサーによる吸着剤合成のための一般的プロトコール）：
アガロースゲル（６％架橋、１４ｇ）を水（３００ml）で洗浄し、直ちに適切なＲＢ又はコニカルフラスコ内で水（５６ml）中に懸濁する。エピクロルヒドリン（６．７２〜２５．２mmol）を加えた後、等量のＮａＯＨ（６．７２〜２５．２mmol）を加え、反応塊を１５０rpmにて２７℃で３時間振とうする。次に、懸濁液を濾過し、水（８５０ml）で徹底的に洗浄し、水分を除去して、エポキシ活性化アガロースを得る。
【０１４４】
エポキシ活性化アガロース（１３ｇ）を１，６−ジアミノアルカン（６．２４〜９．３６mmol）の水（５２ml）溶液に加える。反応混合物を２７℃又は４５℃で４時間振とうし、濾過する。得られたアミノ官能基化ゲルを水（７５０ml）で徹底的に洗浄し、水分を除去する。
【０１４５】
アミノ官能基化アガロース（４ｇ）を染料リガンド（８０μmol）の水（１６ml）溶液中に懸濁させ、混合物を１５０rpmにて２７℃で１６時間振とうする。懸濁液を濾過し、過剰の染料リガンドを水（２５０ml）、１Ｍ  ＮａＣｌ（１００〜２００ml）、１：１  ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ−水（６０〜８０ml）、１Ｍ  ＮａＣｌ（１００〜２００ml）及び最後に水（２５０ml）で洗浄除去する。水分を除去した吸着剤を２０％ｖ／ｖメタノール中にて４℃で保管する。
【０１４６】
差分解析（濾液中の未反応染料）又はゲル解析を用いて、以下の手順に従って、染料リガンド密度を計算した。
【０１４７】
吸着剤（０．１ｇ、濾過時の湿潤重量）を６Ｍ  ＨＣｌ（２５ml）中に４０℃で１時間分解し、既知量の染料リガンドを含む標準溶液を用いて、ＨＣｌ分解物の吸光度（λmaxでの）から、吸着剤のリガンド密度を概算する。
【０１４８】
結果を、表２及び表３に示す。
【０１４９】
【表２】
2008539280.tif 000037
【０１５０】
【表３】
2008539280.tif 000038
【０１５１】
実施例２９（スペーサーによる吸着剤合成のためのプロトコール）：
アガロースゲル（６％架橋、１４ｇ）を水（３００ml）で洗浄し、直ちに１００ml  ＲＢフラスコ内で水（５６ml）中に懸濁する。エピクロルヒドリン（０．６２１６ｇ、６．７２mmol）を加えた後、ＮａＯＨ（０．２６８ｇ、６．７２mmol）を加え、反応混合物を１５０rpmにて２７℃で３時間振とうする。次に、懸濁液を濾過し、水（８５０ml）で徹底的に洗浄し、排水して、エポキシ活性化アガロースを得る。
【０１５２】
エポキシ活性化アガロース（１３ｇ）を１，６−ジアミノヘキサン（０．７６１２ｇ、６．５６mmol）の水（５２ml）溶液に加える。反応混合物を２７℃で４時間振とうし、濾過する。得られたアミノ官能基化ゲルを水（７５０ml）で徹底的に洗浄し、水分を除去する。      
【０１５３】
アミノ官能基化アガロース（４ｇ）を式（１０６）の染料リガンド（０．０５３７ｇ、８１．１μmol）の水（１６ml）溶液中に懸濁させ、反応混合物を１５０rpmにて２７℃で１６時間振とうする。反応混合物を濾過し、過剰の染料リガンドを水（２５０ml）、１Ｍ  ＮａＣｌ（１００ml）、１：１  ｖ／ｖ  ＤＭＳＯ−水（６０ml）、１Ｍ  ＮａＣｌ（１００ml）及び最後に水（２５０ml）で洗浄除去する。水分を除去した吸着剤を２０％ｖ／ｖメタノール中にて４℃で保管する。
【０１５４】
吸着剤（０．１ｇ、濾過時の湿潤重量）を、６Ｍ  ＨＣｌ（２５ml）中で４０℃にて１時間分解し、３．０μmol／ｇの水分を除去したゲルとしてのＨＣｌ分解物の吸光度（λmaxでの）から、吸着剤のリガンド密度を概算する。
【０１５５】
生物学的材料の精製：
吸着剤のタンパク質精製における有効性を測定する試験は、主として２クラスの酵素を用いて行う。代表的なオキシドレダクターゼ及びヒドロラーゼクラスの酵素を使用して、吸着剤の有効性を評価する。これらタンパク質の例は、ラッカーゼ、ＮＡＤＰ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＮＡＤＰ−ＧＤＨ）（S.Noor and N.S.Punekar, Microbiology, 2005, 151 , 1409）、アルギナーゼ及びトリプシンを含んでいた。トリプシンを除き、他の全酵素は、真菌を起源とする。
【０１５６】
全吸着剤のスクリーニングは、バッチ結合及び溶出モードで実施する。構造的多様性を有する吸着剤は選択的であり、試験する異なるタンパク質間を明確に区別する。例えば、一組の平衡条件下で、ＮＡＤＰ−ＧＤＨは、ＢＳ−２１２及びＢＳ−２１３に対して選択的に結合される。これらの一つを精製の大規模化に使用し得る。しかしながら、このＮＡＤＰ−ＧＤＨは、広範に使用されているトリアゾン染料チバクロンブルー３ＧＡに結合しない（S.Subramanian, CRC Critical Rev. Biochem., 1984, 16, 169）。
【０１５７】
【表４】
2008539280.tif 000039
【０１５８】
【表５】
2008539280.tif 000040
【０１５９】
【表６】
2008539280.tif 000041
【０１６０】
実施例３０：
一般的手順（Aspergillus terreus ＮＡＤＰ−グルタミン酸デヒドロゲナーゼ）：
真菌を最小培地（窒素源として硝酸塩を含む）上で、対数増殖中期（mid log phase）まで増殖させ、濾過して菌糸体を回収する。これら細胞からの粗ＮＡＤＰ−ＧＤＨ抽出物を、ｐＨ７．５の抽出緩衝液（１００mMホスフェート、１mM  ＰＭＳＦ、１mM  ＥＤＴＡ、４mM  ２−メルカプトエタノール）中で調製する。３０〜７０％硫酸アンモニウム画分をＧ−２５マトリクス上で脱塩し、アッセイに使用する。活性を３４０nmにおいてＮＡＤＰＨの連続的酸化により監視する。活性１単位（Ｕ）は、１ml標準アッセイにおいて、１分毎に酸化されたＮＡＤＰＨ  １μmolとして定義する。全結合試験において、ＮＡＤＰ−ＧＤＨサンプル約１００mUを、アフィニティー樹脂上に適用する。
【０１６１】
マイクロフュージチューブ（Microfuge tube）バッチモード：１．５mlエッペンドルフ管内で、吸着剤（０．３ml、充填容積）をｐＨ７．５のクロマトグラフィー緩衝液（２０mMホスフェート、１mM  ＥＤＴＡ、４mM  ２−メルカプトエタノール）で平衡化する。このマトリクス上に粗ＮＡＤＰ−ＧＤＨサンプル（約１００μl中〜１００mU）を適用し、氷上で１５分間インキュベートする。未結合画分を、遠心分離（１０００rpmで２分間）により上清として回収する。マトリクスを、同じ緩衝液０．５mlで２回洗浄する。結合したタンパク質を、遠心分離により、同じ緩衝液中の、最初に０．３Ｍ  ＫＣｌ、後に０．５Ｍ  ＫＣｌを用いて２回溶出（毎回０．４ml）する。全インキュベーションをインキュベーション時間１０分で、また全操作を冷却マイクロフュージで実施する。
【０１６２】
吸着剤は、試験した３つの酵素活性に関して、異なる結合／溶出パターンを示す。これらは、異なる結合により異なるタンパク質を区別できる親和性の範囲を提供する。
【０１６３】
実施例３１：
一般的手順（Aspergillus nigerラッカーゼ）：
粗ラッカーゼタンパク質を、２０mMリン酸緩衝液中の分生子形成（conidiating）A.niger菌糸体から単離する。３０〜８０％硫酸アンモニウム画分をＧ−２５マトリクス上で脱塩し、アッセイに使用する。活性を４３６nmにおいてＡＢＴＳの連続的酸化により監視する。活性１単位（Ｕ）は、１ml標準アッセイにおいて、１分毎に酸化されたＡＢＴＳ  １μmolとして定義する。全結合試験において、ラッカーゼサンプル約５mUをアフィニティー樹脂上に適用する。
【０１６４】
（ａ）マイクロスピンカラムモード：アフィニティー樹脂（０．２５ml、充填容積）をマイクロスピンカラム内で２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて平衡化する。このマトリクス上に粗ラッカーゼサンプル（約１００μl中〜５mU）を適用し、氷上で１５分間インキュベートする。未結合画分を、遠心分離（１０００rpmで２分間）により回収する。マトリクスを更にリン酸緩衝液０．３mlで洗浄する。結合したタンパク質を、遠心分離により、同じ緩衝液中の０．６Ｍ  ＫＣｌ用いて２回溶出（毎回０．３ml）する。
【０１６５】
（ｂ）マイクロフュージチューブバッチモード：吸着剤（０．３ml、充填容積）を１．５mlエッペンドルフ管内で２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）を用いて平衡化する。このマトリクス上に粗ラッカーゼサンプル（約１００μl中〜５mU）を適用し、氷上で１５分間インキュベートする。未結合画分を、遠心分離（２分間で１０００rpm）により上清として回収する。マトリクスをリン酸緩衝液０．５mlで２回洗浄する。結合したタンパク質を、遠心分離により、同じ緩衝液中の０．６Ｍ  ＫＣｌを用いて２回（毎回０．４ml）溶出する。全インキュベーションをインキュベーション時間１０分で、また全操作を冷却マイクロフュージで実施する。
【０１６６】
実施例３２：
一般的手順（Aspergillus niger アルギナーゼ）：
真菌を最小培地（単独窒素源としてアルギニンを含む）上で、対数増殖中期まで増殖させ、濾過して菌糸体を回収する。これら細胞からの粗アルギナーゼ抽出物を、ｐＨ７．５の抽出緩衝液（２００mMイミダゾールＨＣｌ、１mM  ＰＭＳＦ、１２mM  ＭｎＳＯ4、２mM  ２−メルカプトエタノール）中で調製する。酵素をＤＥＡＥカラム上で濃縮して、活性画分をプールし、７０％硫酸アンモニウムに加えて、酵素活性を引き起こす。このペレットを、ｐＨ７．５の緩衝液（２５mM  Ｈｅｐｅｓ−ＮａＯＨ、１．２mM  ＭｎＳＯ4、２mM  ２−メルカプトエタノール、２０％グリセロール）に溶解する。このサンプルを、ｐＨ７．５の緩衝液（２５mMイミダゾールＨＣｌ、１．２mM  ＭｎＳＯ4、２mM  ２−メルカプトエタノール）中で希釈して、アッセイに使用する。活性をArchibald法により、尿素の見積もりに関して監視する（４７８nmにて）。標準アッセイにおいて、活性１単位（Ｕ）は、１分毎に形成された尿素１μmolとして定義する。全結合試験において、アルギナーゼサンプル約３００mUをアフィニティー樹脂上に適用する。
【０１６７】
マイクロフュージチューブバッチモード：１．５mlエッペンドルフ管内で、吸着剤（０．３ml、充填容積）をｐＨ７．５のクロマトグラフィー緩衝液（２５mMイミダゾールＨＣｌ、１．２mM  ＭｎＳＯ4、２mM  ２−メルカプトエタノール）で平衡化する。このマトリクス上に粗アルギナーゼサンプル（約１００μl中〜３００mU）を適用し、氷上で１５分間インキュベートする。未結合画分を、遠心分離（２分間で１０００rpm）により上清として回収する。マトリクスを、同じ緩衝液０．５mlで２回洗浄する。結合したタンパク質を、遠心分離により、同じ緩衝液中の０．５Ｍ  ＫＣｌを用いて２回溶出（毎回０．４ml）する。全インキュベーションをインキュベーション時間１０分で、また全操作を冷却マイクロフュージで実施する。
【０１６８】
実施例３３：
ＢＳ−２１２吸着剤を使用したＮＡＤＰ−ＧＤＨ（A.terreus）の精製：
真菌を最小培地（窒素源として硝酸塩を含む）上で、対数増殖中期まで増殖させ、濾過して菌糸体を回収する。これらの細胞からの粗ＮＡＤＰ−ＧＤＨ抽出物を、ｐＨ７．５の抽出緩衝液Ａ（１００ｍＭホスフェート、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ及び４ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）中で調製する。３０〜７０％硫酸アンモニウム画分を、１mM  ＥＤＴＡ及び４mM  ２−メルカプトエタノールを含む２０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ｂ）で平衡化したＧ−２５マトリクス（ベッド容積２０ml）上で脱塩する。この脱塩タンパク質を流速１０ml／時間で２０ml  ＢＳ−２１２カラム上に負荷する。カラムを緩衝液Ｂ１００mlにより流速１２ml／時間で洗浄する。
【０１６９】
緩衝液Ｂ中の０〜０．３Ｍ  ＫＣｌ（２０ml＋２０ml）の直線勾配を用いて、結合したタンパク質を溶出する。溶出のために、流速１８ml／時間を保持し、画分（各１．５ml）を回収する。以前に述べたように、ＮＡＤＰ−ＧＤＨ活性は、３４０nmにおける吸収の変化を追跡して測定する。反応容積１．０mlで実施された還元的アミノ化アッセイは、ｐＨ８．０の１００mM  トリスＨＣｌ、１０mM  ＮＨ４Ｃｌ、１０mM  ２−オキソグルタル酸及び０．１mM  ＮＡＤＰＨを含んでいた。
【０１７０】
結果：負荷した１０単位のＮＡＤＰ−ＧＤＨ活性のうち、未結合で、又は洗浄画分中で回収されたものは存在しなかった。殆どの活性が結合し、上記のＫＣｌ勾配を用いて溶出できた（９．５単位）。この溶出プロファイルを、図１に示す。この単一ステップで達成された吸着剤を使用した精製は、負荷したサンプル及びピーク画分の天然ＰＡＧＥにより監視した。図２に、このゲルの写真を示す。ＢＳ−２１２吸着剤は、Aspergillus ＮＡＤＰ−ＧＤＨタンパク質（図２の矢印で示す）を実質的に濃縮することができた。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１】ＫＣｌ勾配を用いた、ＢＳ−２１２カラムからのA. terreus ＮＡＤＰ−ＧＤＨの溶出プロファイルである。
【図２】A. terreus ＮＡＤＰ−ＧＤＨの天然ＰＡＧＥ（７．５％）である：レーン１−脱塩した硫酸アンモニウム（３０〜７０％）画分；レーン２−ＢＳ−２１２カラムからのピークタンパク質画分（図１）（矢印は、ＮＡＤＰ−ＧＤＨタンパク質の位置を示す）。
【図１】
2008539280.tif 000058
【図２】
2008539280.tif 000059
【国際調査報告】
2008539280.tif 000060
2008539280.tif 000061