(57)【要約】【解決手段】  オールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチナールサチュラーゼの組成物、及びそれらの使用方法が提供される。【選択図】      図２３
2008518586.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
オールトランス−（１３，１４）−ジヒドロレチノールを生成する方法であって、
６５〜６８℃の４〜６ＸのＳＳＣを含む水溶液中、又は４２℃の５０％ホルムアルデヒド中、ヒトＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ｇｉ４６３２９５８７）、マウスＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０４１５９）、又はサル（マカク）ＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０７５２４）、若しくは機能的に活性なそれらの断片をコードするポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションを含む厳密な条件下で宿主細胞において異種核酸を発現させる工程を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、前記宿主細胞は哺乳類の宿主細胞である。
【請求項３】
ヒト、マウス、又はサルのオールトランスレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ、若しくは機能的に活性なそれらの断片の連続的配列を有する単離ポリペプチド。
【請求項４】
請求項３記載の単離ポリペプチドにおいて、このポリペプチドは、さらに、
ヒトオールトランスレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ｇｉ４６３２９５８７）を有するものである。
【請求項５】
単離ポリヌクレオチドであって、ヒト、マウス、又はサルのオールトランスレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ、若しくは機能的に活性なそれらの断片の連続的配列を有する単離ポリヌクレオチド。
【請求項６】
操作可能であるように連結された以下の成分を含む発現コンストラクトであって、前記成分は、転写プロモーターと、６５〜６８℃の４〜６ＸのＳＳＣを含む水溶液中、又は４２℃の５０％ホルムアルデヒド中におけるハイブリダイゼーションを含む厳密な条件下で、ヒトＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ｇｉ４６３２９５８７）、マウスＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０４１５９）、及びサル（マカク）ＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０７５２４）をコードするポリヌクレオチド、若しくは前記ポリヌクレオチドの全長の相補体とハイブリダイズするＲＥＴＳＡＴポリヌクレオチドであって、ここで、前記Ｒｅｔｓａｔポリペプチドは、前記ヒト、マウス、又はサルのポリペプチド、若しくは機能的に活性なそれらの断片の連続的アミノ酸配列を有するものであるＲＥＴＳＡＴポリヌクレオチドと、転写ターミネーターと
を有する発現コンストラクト。
【請求項７】
請求項６記載の発現コンストラクトにおいて、前記転写プロモーターは異種プロモーターである。
【請求項８】
請求項６記載の発現コンスラクトを形質転換若しくは形質移入した培養原核細胞又は真核細胞。
【請求項９】
請求項８記載の真核細胞において、前記真核細胞は哺乳類細胞である。
【請求項１０】
請求項６記載の発現コンストラクトを有するベクター。
【請求項１１】
請求項１０記載のベクターを有する単離宿主細胞。
【請求項１２】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチドを生成する方法であって、
請求項１０のベクターを形質転換又は形質移入した細胞を増殖させる工程と、
前記細胞から前記Ｒｅｔｓａｔポリペプチドを単離する工程と
を有する方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法において、
前記細胞は細菌細胞又は哺乳類細胞である。
【請求項１４】
ヒトＲｅｔｓａｔポリペプチドに結合する抗体。
【請求項１５】
請求項１４記載の抗体であって、この抗体は、
モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、短鎖抗体、重鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、又はＦｖ断片である。
【請求項１６】
真核生物のＲｅｔｓａｔポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法であって、
Ｒｅｔｓａｔポリペプチドを発現する第一の細胞に候補化合物を投与する工程と、
前記候補化合物が前記第一の細胞により生理学的変化を生じさせるか否かを測定する工程と
を有する方法。
【請求項１７】
薬学的組成物であって、
オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸、及び／若しくはオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体、及び薬学的に許容可能な担体
を有する薬学的組成物。
【請求項１８】
請求項１７記載の薬学的組成物において、この薬学的組成物は、局所的投与、経口投与、静脈内投与、眼内注射、又は眼窩周囲注射のために調製されるものである。
【請求項１９】
請求項１７記載の薬学的組成物において、
前記オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体はレチニルエステルである。
【請求項２０】
哺乳類の対象における腫瘍性疾患を治療する方法であって、
請求項３記載のポリヌクレオチドを発現する核酸コンストラクトを有する薬学的組成物を前記哺乳類の対象に投与する工程
を有する方法。
【請求項２１】
哺乳類の対象における網膜疾患又は失明を治療する方法であって、
オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸、及び／若しくはオールトランス１３，１４ジヒドロレチノイド誘導体、及び薬学的に許容可能な担体を有する薬学的組成物を前記哺乳類の対象に投与する工程
を有する方法。
【請求項２２】
哺乳類の対象における網膜疾患状態又は失明を治療する方法であって、
オールトランスレチノール、すなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ活性を前記哺乳類の対象において活性化させる化合物を前記哺乳類の対象に投与する工程
を有する方法。
【請求項２３】
哺乳類の対象における自己免疫疾患を治療する方法であって、
オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸、及び／若しくはオールトランス１３，１４−ジヒドロレチオイド誘導体、及び薬学的に許容可能な担体を有する薬学的組成物を前記哺乳類の対象に投与する工程
を有する方法。
【請求項２４】
哺乳類の対象における自己免疫疾患を治療する方法であって、
オールトランスレチノール、すなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ活性を前記哺乳類の対象において活性化させる化合物を前記哺乳類の対象に投与する工程
を有する方法。
【請求項２５】
哺乳類の対象における皮膚の疾患又は症状を治療する方法であって、
オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸、及び／若しくはオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体、及び薬学的に許容可能な担体を有する薬学的組成物を前記哺乳類の対象に投与する工程
を有する方法。
【請求項２６】
哺乳類の対象における皮膚の疾患又は症状を治療する方法であって、
オールトランスレチノールを活性化させる化合物すなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ活性を前記哺乳類対象においてを前記哺乳類の対象に投与する工程
を有する方法。
【請求項２７】
哺乳類の対象における腫瘍性疾患を治療する方法であって、
オールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ活性を腫瘍性細胞において阻害する化合物を前記哺乳類の対象に投与する工程
を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府援助の記述
本発明は、国立衛生研究所により授与された助成金Ｎｏｓ．Ｒ０３  ＥＹ０１５３９９−０１、ＥＹ０８０６１、及びＥＹ０８１２３による政府支援の下行われたものである。前記政府は、本発明において特定の権利を有している。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２００４年９月９日付で出願された米国特許出願第６０／６０９，０３８号に対して優先権を主張するものであり、その全開示はこの参照により本明細書に組み込まれるものである。
【０００３】
技術分野
本発明は、オールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼの組成物、酵素産物、及びそれらの使用方法に関するものである。
【背景技術】
【０００４】
レチノイドは、例えば脊椎動物の発達、免疫、細胞分化、及び視覚等の多くの重要な生物学的機能に必須である。オールトランスレチノールの天然誘導体及びそれらの合成類似体の両者を含むレチノイドは、幾つかの活性化合物を通じてそれらの機能を発揮する。レシチン−レチノールアシルトランスフェラーゼ（ｌｅｃｉｔｈｉｎ−ｒｅｔｉｎｏｌ  ａｃｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ：ＬＲＡＴ）によるレチノールのエステル化により、レチニルエステルが誘導され、このエステルはビタミンＡの主要な貯蔵形態であり、更に視サイクルの中間体に相当するものである。Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：３８３４〜３８４１，１９９９、Ｂａｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１０４２２〜１０４３２，２００４、Ｉｍａｎｉｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６４：３７３〜３８３，２００４。網膜色素上皮（ｒｅｔｉｎａｌ  ｐｉｇｍｅｎｔ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ：ＲＰＥ）において、オールトランスレチノールは、ある特定化されていない酵素により、直接又はエステル中間体を通じて異性化されて１１−シス−レチノールが生成し、このシス体は、視覚発色団である１１−シス−レチナールに酸化される。Ｋｕｋｓａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ４３：２９５９〜２９８１，２００３。レチナールへの可逆的酸化は、ミクロソームの短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリー（ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ：ＳＣＡＤ）であるいくつかのメンバーにより、及び場合によってはクラスＩ、ＩＩ、及びＩＶの中鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃｏｈｏｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅｓ：ＡＤＨ）により行われる。Ｃｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２５２０９〜２５２１６，２００２、Ｄｕｅｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １４３〜１４４，２０１〜２１０，２００３。レチナールデヒドロゲナーゼ（ｒｅｔｉｎａｌ  ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＲＡＬＤＨ）タイプ１、２、３、及び４によるレチナールの酸化によりレチノイン酸（ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ：ＲＡ）が生成し、このレチノイン酸は核内受容体を介して発達及び細胞分化を制御している。Ｂｈａｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６６：３０３〜３０６，１９９５、Ｐｅｎｚｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １９１：１６７〜１７２，１９９７、Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１６２８８〜１６２９３，１９９６、Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２４０：１５〜２２，１９９６、Ｍｉｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  ９７：２２７〜２３０，２０００、Ｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：９８５６〜９８６１，２００３、Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １０：９４０〜９５４，１９９６。ＲＡ−誘導性シトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２６Ａ１及びＢ１により、ＲＡが極性４−ヒドロキシ−ＲＡ、４−オキソ−ＲＡ、及び１８−ヒドロキシ−ＲＡに異化される。Ａｂｕ−Ａｂｅｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２４０９〜２４１５，１９９８、Ｆｕｊｉｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６：４１６３〜４１７３，１９９７、Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：２９９２２〜２９９２７，１９９６、Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：６４０３〜６４０８，２０００。ＲＡ同化酵素及び異化酵素が明確に局在化することが胚パターン形成に必須である。他の経路により、１４−ヒドロキシ−４，１４−レトロ−レチノール（１４−ｈｙｄｒｏｘｙ−４，１４−ｒｅｔｒｏ−ｒｅｔｉｎｏｌ：１４−ＨＲＲ）、及び無水レチノール（Ａｎｈｙｄｒｏｒｅｔｉｎｏｌ：ＡＲ）等のレトロ−レチノイドが生成し、それらの拮抗作用が細胞増殖を制御している。Ｂｕｃｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６５４〜１６５６，１９９１、Ｂｕｃｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７８：６７５〜６８０，１９９３。生物学的システムにおけるレチノイドの低い値や不安定な性質、及び解明されていないそれらの生体内変化の機構を考慮すると、本技術分野において、レチノイド代謝に関与する多く酵素を同定する必要がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、一般にオールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼの組成物及びそれらの使用方法に関する。ヒト、マウス、又はサルのオールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼの連続的配列、又は機能的に活性なそれらの断片含む単離ポリペプチドが提供される。更なる観点において、前記単離ポリペプチドは、前記ヒトオールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ｇｉ４６３２９５８７）の連続的配列を含む。前記ヒト、マウス、又はサルのオールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ、又は機能的に活性なそれらの断片の連続的配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
【０００６】
哺乳類の対象において疾病状態を治療する方法は、前記哺乳類の対象において、オールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼの活性を活性化する化合物を前記哺乳類対象に投与する工程を有する。哺乳類の対象において疾病状態を治療する方法は、オールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼの活性を前記哺乳類の対象において阻害する化合物を前記哺乳類の対象に投与する工程を有する。更なる観点において、哺乳類の対象において疾病状態を治療する方法は、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸、及び／若しくはオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を投与する工程を含む。前記疾病状態は、これに限定されないが、網膜疾患、失明、自己免疫疾患、癌、腫瘍性疾患、若しくは皮膚疾患又は状態を含む。
【０００７】
オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノールを生成する方法は、６５〜６８℃の４〜６ＸのＳＳＣを含む水溶液中、又は４２℃で５０％ホルムアルデヒド中のハイブリダイゼーションを含む厳密な条件の下において、ヒトＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ｇｉ４６３２９５８７）、マウスＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０４１５９）、又はサル（マカク）ＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０７５２４）、若しくは機能的に活性なそれらの断片をコードするポリヌクレオチドとハイブリダイズする異種の核酸を宿主細胞において発現させる工程を有し、この方法が提供される。一観点において、前記宿主細胞は、哺乳類の宿主細胞である。
【０００８】
前記ヒト、マウス、又はサルのオールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ、又は機能的に活性なそれらの断片の連続的配列を含む単離ポリペプチドが提供される。更なる観点において、前記単離ポリペプチドは、前記ヒトのオールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ｇｉ４６３２９５８７）を含む。
【０００９】
前記ヒト、マウス、又はサルのオールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ、又は機能的に活性なそれらの断片の連続的配列を含む単離ポリヌクレオチドが提供される。
【００１０】
発現コンストラクトが提供される。詳細な観点において、前記転写プロモーターは、異種プロモーターである。培養された原核細胞又は真核細胞が提供され、この細胞は、前記発現コンストラクトにより形質転換又は形質移される。更なる観点において、前記原核細胞又は真核細胞は哺乳類細胞である。
【００１１】
操作可能であるように連結された以下の要素、すなわち転写プロモーター、ＲＥＴＳＡＴポリヌクレオドであって、４〜６ＸＳＳＣを含む６５〜６８℃の水溶液中、又は４２℃の５０％ホルムアルデヒド中におけるハイブリダイゼーションを含む厳密な条件下、ヒトＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ｇｉ４６３２９５８７）、マウスＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０４１５９）、及びサル（マカク）ＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０７５２４）をコードするポリヌクレオチド、若しくは前記ポリヌクレオチドの全長の相補体とハイブリダイズするＲＥＴＳＡＴポリヌクレオチドであって、前記Ｒｅｔｓａｔポリペプチドは前記ヒト、マウス、又はサルのポリペプチド、若しくは機能的に活性なそれらの断片の連続的アミノ酸配列を有するＲＥＴＳＡＴポリヌクレオチド、及び転写ターミネーターを含む前記発現コンストラクトを含むベクターが提供される。更なる観点において、単離宿主細胞は前記ベクターを含む。Ｒｅｔｓａｔポリヌクレオチドを生成させる方法が提供され、この方法は、前記ベクターを形質転換又は形質移入した細胞を増殖させる工程と、前記細胞から前記Ｒｅｔｓａｔポリペプチドを単離する工程とを有する。詳細な観点において、前記細胞は、細菌細胞又は哺乳類細胞である。
【００１２】
ヒトＲｅｔｓａｔポリペプチドに結合する抗体が提供される。更なる観点において、前記抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、重鎖抗体、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、又はＦｖ断片である。
【００１３】
真核生物のＲｅｔｓａｔポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法は、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドを発現する第一の細胞に候補化合物を投与する工程と、前記第一細胞により前記候補化合物が生理学的変化引き起こすか否かを測定する工程とを有するものである。
【００１４】
オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸、及び／若しくはオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物が提供される。前記薬学的組成物は、例えば、局所的投与、経口投与、静脈内投与、眼内注射、又は眼窩周囲注射のために調製されることが可能である。更なる観点において、前記薬学的組成物は、前記オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体であっても良く、レチニルエステルであっても良い。
【００１５】
哺乳類対象における網膜疾患又は失明を治療する方法が提供され、この方法は、前記哺乳類対象に対して、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸、及び／若しくはオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体、及び許容可能な担体を含む薬学的組成物を投与する工程を有する。
【００１６】
哺乳類対象における網膜疾患又は失明を治療する方法が提供され、この方法は、前記哺乳類対象に対して、オールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ活性を活性化する化合物を投与する工程を有する。
【００１７】
哺乳類対象における自己免疫疾患を治療する方法が提供され、この方法は、前記哺乳類対象に対して、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸、及び／若しくはオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を投与する工程を有する。
【００１８】
哺乳類対象における自己免疫疾患を治療する方法が提供され、この方法は、前記哺乳類対象に対して、オールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ活性を活性化する化合物を投与する工程を有する。
【００１９】
哺乳類対象における皮膚疾患又は状態を治療する方法が提供され、この方法は、前記哺乳類対象に対して、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸、及び／若しくはオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体、及び薬学的に許容可能な担体を含む薬学的組成物を投与する工程を有する。
【００２０】
哺乳類対象における皮膚疾患又は状態を治療する方法が提供され、この方法は、前記哺乳類対象に対して、オールトランスレチノールすなわちオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼ活性を活性化する化合物を前記哺乳類対象に投与する工程を有する。
【００２１】
哺乳類対象における腫瘍性疾患状態を治療する方法が提供され、この方法は、オールトランスレチノール：オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールサチュラーゼの活性を腫瘍細胞において阻害する化合物を前記哺乳類対象に投与する工程を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
レチノイドは、脊椎動物の発達及び視力において重要な役割を担っている。多くのレチノイド処理酵素は、分子レベルでは依然として同定されていない。脊椎動物におけるレチノイド生化学の知識を広げるために、本発明者らは、化合物の関連群であるカロチノイドの植物代謝に関与する酵素について研究した。本発明者らは、プロリコピンをオールトランスリコピンに異性化する、最近記述された植物カロチノイドイソメラーゼ（異性化酵素）であるＣＲＴＩＳＯと著しい類似性及び推定上のフィトエン脱水素酵素ドメインを共有する脊椎動物酵素のファミリーを同定した。異種発現したマウス及び植物の酵素を比較することによって、植物ＣＲＴＩＳＯとは異なり、ＣＲＴＩＳＯ関連マウス酵素はプロリコピンに関しては不活性であることが示唆された。代わりに、前記ＣＲＴＩＳＯ関連マウス酵素は、オールトランスレチノールの１３位と１４位の二重結合を飽和させることによりオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールを産生するレチノールサチュラーゼ（ｓａｔｕｒａｓｅ）である。マウスレチノールサチュラーゼ（ＲｅｔＳａｔ）の生成物は、親化合物であるオールトランスレチノール（λｍａｘ＝３２５ｎｍ）と比較してＵＶ吸収の最大値がシフトしており（λｍａｘ＝２９０ｎｍ）、更にそのＭＳ解析（ｍ／ｚ＝２８８）は二重結合の飽和を示唆していた。この生成物はさらに、合成標準の特性と一致しておりオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールとして同定された。マウスＲｅｔＳａｔは、多くの組織（肝臓、腎臓及び腸で最大レベル）に関連し発現している膜である。オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールはまた、正常餌で維持された動物のいくつかの組織で検出された。従って、ＲｅｔＳａｔによりオールトランスレチノールをオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールに飽和することによって、未知の生物学的機能を有する新しい代謝産物が生成する。
【００２３】
ビタミンＡの代謝は高度に制御された工程であり、脊椎動物の発達、細胞分化、免疫、及び視覚に関与する重要な介在物質を生成する。レチノールサチュラーゼは、オールトランスレチノールをオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールに変換する。本発明により、レチノールからレチノイン酸への酸化、さらに酸化レチノイン酸代謝産物への酸化に関与する前記酵素がオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸の合成及び酸化にも関与するということを実証するものである。オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸は、レポーター細胞アッセイにおいてレチノイン酸受容体／レチノイドＸ受容体へテロダイマーを活性化することができるが、レチノイドＸホモダイマーは活性化できない。オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいてレチニルパルミチン酸を補充されたＬｒａｔ−／−マウスで検出された。従って、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸は、天然由来レチノイドであり、核受容体の潜在的なリガンドである。この新規代謝産物はまた、レチノール分解経路における中間体であるか、若しくは生理活性１３，１４−ジヒドロレチノイド代謝産物の合成前駆体である可能性がある。
【００２４】
本発明は、特定の方法、試薬、化合物、組成物、或いは生物システムに限定されるものではなく、当然の事ながら、変更可能であることが理解される。さらに、本明細書で用いられる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定することを意図したものではないこともまた理解される。本明細書及び添付された請求項において用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、内容が明らかに別の意味を示さない限り、複数形も含むものである。従って、例えば「細胞（ａ  ｃｅｌｌ）」の言及は、２若しくはそれ以上の組み合わせ、及びそれと同等のものを含む。
【００２５】
量、時間的な期間、及びそれらと同等なものなどの測定可能な値を言及する際に本明細書で用いられる「約」という用語は、特定の値から±２０％或いは±１０％、より好ましくは±５％、さらに好ましくは±１％、さらに一層好ましくは±０．１％の変動を含むことを意味しており、そのような変動は開示された方法を実行するのには適したものである。
【００２６】
別の意味を定義しない限り、本明細書で用いられた全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されているものと同様の意味を有する。本明細書で記載されたものと類似或いは同等のあらゆる方法及び物質は本発明の試験を実施するときに使用されることが可能であるが、好ましい物質及び方法は本明細書に記載されている。本発明を記載及び主張する場合、以下の専門用語が使用される。
【００２７】
「ＲｅｔＳａｔ遺伝子座」及び「ＲＥＴＳＡＴ遺伝子」という用語は、配列と転写及び／若しくは翻訳を調節している調節性要素とを介在しているコード配列を意味している。「ＲＥＴＳＡＴ遺伝子座」及び「ＲＥＴＳＡＴ遺伝子」という用語は、全てのＲＥＴＳＡＴの対立遺伝子変異を含む。例示的な実施形態において、前記ＲＥＴＳＡＴ遺伝子は、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ｇｉ４６３２９５８７（ヒトＲｅｔＳａｔ）、ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０４１５９（マウスＲｅｔＳａｔ）、及びＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０７５２４（サル（マカク）ＲｅｔＳａｔ）であり、それらの開示はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【００２８】
「ＲＥＴＳＡＴ核酸」という用語は、ｍＲＮＡｓ、ＤＮＡｓ、ｃＤＮＡｓ、ゲノムＤＮＡ、さらにはアンチセンス核酸、断片をコードするポリヌクレオチド、それらの誘導体や類似体を含むＲｅｔＳａｔポリペプチドをコードしている遺伝子座である、前記ＲｅｔＳａｔ遺伝子座からのポリヌクレオチドを意味している。有用な断片及び誘導体は、同じアミノ酸を選択する全ての可能なコドン、及び保存的アミノ酸置換基に基づいて選択するコドンに基づいた断片及び誘導体を含む。有用な誘導体はさらに、ヒトＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｇｉ４６３２９５８７）、マウスＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７０４１５９）、及びサル（マカク）ＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７０７５２４）の前記ＲＥＴＳＡＴ核酸と少なくとも５０％或いは少なくとも７０％のポリヌクレオチド配列同一性を有する、一般的には８０％、より一般的には９０％以上の配列同一性を有する誘導体を含む。
【００２９】
「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リン酸ジエステル結合を介して結合している多数のヌクレオチドユニット（リボヌクレオチド或いはデオキシリボヌクレオチド、若しくは関連する構造変異体）から成るポリマーに言及する。ポリヌクレオチド或いは核酸は、実質的なあらゆる長さであっても良く、一般的には約６ヌクレオチドから約１０９ヌクレオチド或いはそれ以上の長さである。ポリヌクレオチド及び核酸は、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成形態、及び混合ポリマー（センス及びアンチセンス鎖の両方）を含み、当業者には明らかなように、化学的或いは生化学的に修飾され得る若しくは非天然或いは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むことができる。そのような修飾は例えば、標識、メチル化、１若しくはそれ以上の天然由来ヌクレオチドの類似体での置換、無電荷結合（例えばメチルホスホン酸、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバミン酸及びそれらと同等のもの）などのインターヌクレオチド修飾、電荷結合（例えばホスホロチオエート、ホスホロジチオエート及びそれらと同等のもの）、懸垂（ｐｅｎｄｅｎｔ）部位（例えばポリペプチド）、干渉物質（例えばアクリジン、ソラレン及びそれらと同等のもの）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾結合（例えばアルファアノマー核酸及びそれと同等なもの）を含む。さらに、水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定された配列と結合する能力という点でポリヌクレオチドの擬態である合成分子も含まれる。そのような分子は、当業者には既知であり、例えばペプチド結合が前記分子のバックボーンにおけるリン酸結合と置換されている分子を含む。
【００３０】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、約６〜約１００ヌクレオチド或いはそれ以上の長さのポリヌクレオチドに言及する。従って、オリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドのサブセットである。オリゴヌクレオチドは、自動化オリゴヌクレオチド合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ（カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）により製造されている合成機）において製造業者によって提供された仕様書に従って合成することが可能である。
【００３１】
本明細書で用いられる「プライマー」という用語はポリヌクレオチドに言及しており、一般的にはヌクレオチドであり、酵素消化によって見られるような天然由来であるか、或いは合成的に生成されるものであり、プライマー伸長生成物が合成される条件下で使用された際にポリヌクレオチド合成の開始点として作用する。プライマーは一本鎖或いは二本鎖である。
【００３２】
「Ｒｅｔｓａｔポリペプチド」は、ＲＥＴＳＡＴ遺伝子、及びそれらの断片、誘導体或いは類似体によってコードされたポリペプチドに言及する。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸及びその同等物のポリマーに言及しており、特定の長さの前記生成物に言及している訳ではなく、つまりペプチド、オリゴヌクレオチド、及びタンパク質がポリペプチドの定義の範囲内に含まれる。「断片」とは、一般的にＲｅｔｓａｔポリペプチドの少なくとも１０近接アミノ酸、より一般的には少なくとも２０、さらに一般的には少なくとも５０近接アミノ酸を有するポリペプチドの一部を意味している。誘導体は、別の配列と比較した場合、保存的アミノ酸置換基を有するポリペプチドである。誘導体はさらに例えばグリコシル化、アセチル化、リン酸化及びそれらと同等のものを含む。「ポリペプチド」の類似体は、例えば１若しくはそれ以上のアミノ酸の類似体（例えば非天然アミノ酸及びそれと同等なもの）を含むポリペプチド、置換結合や当業者には既知の他の修飾を有するポリペプチド（天然及び非天然由来の両方）である。通常、そのようなポリペプチドは天然Ｒｅｔｓａｔアミノ酸配列に対して少なくとも約５０％同一であり、一般的には約９０％以上、より一般的には少なくとも約９５％同一である。
【００３３】
本明細書において用いられる「アミノ酸」或いは「アミノ酸残基」という用語は、以下にさらに記載したような天然由来のＬアミノ酸或いはＤアミノ酸に言及する。アミノ酸に対して一般的に使用される１及び３文字略記が本明細書において使用される（例えばＡｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，３ｄ  ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４を参照）。
【００３４】
「異種性」という用語は、別の核酸或いはポリペプチドと比較して、異なる源（例えば組織、器官或いは種）からの核酸或いはポリペプチドに言及する。
【００３５】
「単離された」という用語は、その天然細胞環境から除去された核酸或いはポリペプチドに言及する。単離された核酸は一般的に、他の細胞性核酸、ポリペプチド及び他の構成物から少なくとも部分的に精製されている。
【００３６】
「機能的に活性な」Ｒｅｔｓａｔポリペプチドという用語は、完全長（野生型）Ｒｅｔｓａｔポリペプチド（例えばオールトランスレチノールをオールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノールへ変換する）、抗原性（抗Ｒｅｔｓａｔ抗体に結合する）、免疫原性、及びそれらと同等なものに関連した１若しくはそれ以上の既知の機能的活性を示すそれらの断片、誘導体及び類似体に言及する。機能的に活性な分子は、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、それらの断片、誘導体及び類似体、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドをコードした核酸、それらの断片及び誘導体、及び抗Ｒｅｔｓａｔ抗体を含む。
【００３７】
「治療上有効な」という用語は、細胞増殖、レチノイド代謝、皮膚及び／若しくは免疫機能、及び対象（患者或いは哺乳類など）における制御を修飾するのに十分な量の分子（例えば、ＲｅｔＳａｔポリペプチド、抗ＲｅｔＳａｔ抗体、ＲＥＴＳＡＴ核酸、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸、及び１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体）に言及する。
【００３８】
２若しくはそれ以上の核酸或いはポリペプチド配列の構成において「同一」或いは「パーセント同一」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて或いは視覚的検査によって測定されたように、最大一致を比較しアライメントさせた場合、同一である、若しくはヌクレオチド或いはアミノ酸残基の特異的なパーセンテージを有する２若しくはそれ以上の配列或いはサブシーケンスに言及する。
【００３９】
２つの核酸或いはポリペプチドの構成において「実質的に同一」という用語は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて或いは視覚的検査によって測定されたように、比較し最大一致でアライメントさせた場合、少なくとも６０％、一般的には８０％、最も一般的には９０〜９５％のヌクレオチド或いはアミノ酸残基の同一を有する２若しくはそれ以上の配列或いは配列群を意味している。２つのポリペプチド配列が「実質的に同一」であるという指標は、第一のポリペプチドが第二のポリペプチドに対する抗体と免疫学的に反応性であるということである。
【００４０】
２つの核酸或いはポリペプチド配列の構成において「類似度」或いは「パーセント類似度」は、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて或いは視覚的検査によって測定されたように、比較し最大一致でアライメントさせた場合、同一若しくはアミノ酸残基或いはその保存的置換基の特定のパーセンテージを有する２若しくはそれ以上の配列或いは配列群を意味している。実施例を介して、前記第一の配列に含まれている数と同数のアミノ酸を比較した、若しくは以下に説明されたように本分野では既知であるコンピュータ類似度プログラムによってアライメントされた配列のアラインメントを比較した時、第一のアミノ酸配列が第二のアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％或いは９５％同一、若しくは保存的置換されている場合、前記第一のアミノ酸配列は、前記第二のアミノ酸配列を類似であると考えられる。
【００４１】
ポリペプチド配列の構成において「実質的に類似」という用語は、前記ポリペプチドが参照配列に対して少なくとも７０％の配列同一性、若しくは好ましくは８０％、より好ましくは参照配列に対して８５％の配列同一性、最も好ましくは約１０〜２０アミノ酸残基の比較ウィンドに対して９０％の同一性を有する配列を有することを意味している。アミノ酸配列の構成において「実質的に類似」とはさらに、アミノ断の保存的置換を含む。従って、例えば２つのペプチドが１若しくはそれ以上の保護性置換が異なる場合、ポリペプチドは第二のポリペプチドと実質的に類似である。
【００４２】
ポリペプチドについて言及する場合「保存的置換」という用語は、前記ポリペプチドの活性を実質的に変換しない前記ポリペプチドのアミノ酸組成における変化を意味している。従って、特定のアミノ酸配列の「保存的置換」は、ポリペプチド活性に重要でないアミノ酸の置換、若しくは同様の特性（例えば、酸性、塩基性、正電荷或いは負電荷、極性或いは非極性等）を有する他のアミノ酸とのアミノ酸の置換を意味しており、重要なアミノ酸の置換でさえ実質的に活性を変換しない。機能的に類似のアミノ酸を提供する保存的置換表は、当業者にはよく知られている。例えば、以下の６グループはそれぞれ、互いの保存的置換であるアミノ酸を含む。１）アラニン（Ａ）、セリン（Ｓ）、トレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リシン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）（Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４も参照のこと）。さらに、１アミノ酸或いはコード配列における少数のアミノ酸を変換、付加或いは欠損する個々の置換、欠損或いは付加もまた「保存的置換」である。
【００４３】
配列比較のために、一般的に１配列は参照配列として働き、テスト配列とそれを比較する。配列比較アルゴリズムを使用した場合、テスト及び参照配列をコンピュータに入力し、もし必要であればその次のコーディネートを指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。次に前記配列比較アルゴリズムによって、指定されたプログラムパラメータに基づいて、前記参照配列に相対的なテスト配列（群）に対するパーセント配列同一性を計算した。
【００４４】
比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２，１９８１：これはこの参照により本明細書に組み込まれる）の局所的相同アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−５３，１９７０：これはこの参照により本明細書に組み込まれる）の相同アライメントアルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４−４８，１９８８：これはこの参照により本明細書に組み込まれる）の類似性方法の研究によって、これらアルゴリズムのコンピュータ化実行（例えば、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州）、或いは視覚的検査（一般  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９を参照）によって実行され得る。
【００４５】
有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、進行性ペアワイズアライメントを用いて関連配列のグループからマルチプル配列アライメントを作成し、パーセント配列同一性を示す。これは、前記アライメントを作成するために使用されたクラスタ化関係を示す系図或いは樹状図もプロットする。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．２５：３５１−６０，１９８７：これはこの参照により本明細書に組み込まれる）の進行性アライメント方法の単純化型を使用する。使用された方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．５：１５１−５３，１９８９：これはこの参照によって本明細書に組み込まれる）によって記載された方法と類似している。前記プログラムは、３００配列までアライメントすることができ、それぞれの最長は５，０００ヌクレオチド或いはアミノ酸である。前記マルチプルアライメント手順は、２つのアライメント配列のクラスタを生成する２つの最も類似した配列のペアワイズアライメントから始める。このクラスタは次に、次の最も関連した配列或いはアライメント配列のクラスタとアライメントされる。２つの配列のクラスタは、前記２つの個別配列のペアワイズアライメントの単純伸長によってアライメントされる。最終的なアライメントは、一連の進行性ペアワイズアライメントによって達成される。プログラムは、配列比較の領域に対する特異的な配列及びそのアミノ酸或いはヌクレオチドコーディネートを指定し、及び前記プログラムパラメータを指定することによって作動される。例えば、参照配列は他のテスト配列を比較され、以下のパラメータ：初期値ｇａｐ重量（３．００）、初期値ｇａｐ長重量（０．１０）、及び加重エンドｇａｐｓを用いて、パーセント配列同一性関係を決定する。
【００４６】
パーセント配列同一性及び配列類似度を決定するのに適しているアルゴリズムの別の例はＢＬＡＳＲアルゴリズムであり、これはＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０，１９９０：これはこの参照により本明細書に組み込まれる）によって記載された。（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２６：３９８６−９０，１９９８；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２，１９９７も参照のこと：これらはこの参照によって本明細書に組み込まれる）ＢＬＡＳＴ解析を実行するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通じて公然と利用可能である。このアルゴリズムは、クエリー配列における長さＷの短ワードを同定することによる第一識別ハイスコアリング配列ペア（ＨＳＰｓ）に関連しており、これは、データベース配列において同じ長さのワードでアライメントした場合、いくつかのポジティブ値閾値スコアＴとマッチする或いは満たすものである。Ｔは、近傍ワードスコア閾値として言及される（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９０，ｓｕｐｒａ）。これら初期近傍ワードヒットは、それらを含むより長いＨＳＰｓを検索するための開始探索に対するシーズとして働く。前記ワードヒットは次に、累積アライメントスコアが増加できる範囲まで各配列に沿って両方向に延長される。各方向への前記ワードヒットの延長は、前記累積アライメントスコアが量Ｘでその最大達成値から低下した場合；１若しくはそれ以上のネガティブ−スコアリング残基アライメントの蓄積によって前記累積スコアがゼロ若しくはそれ以下に下がった場合；或いはどちらかの配列の末端に到達した場合、停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータであるＷ、Ｔ及びＸは、アライメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは初期設定として、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−９，１９９２を参照のこと：これはこの参照によって本明細書に組み込まれる）アライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝４、及び両鎖の比較を用いる。
【００４７】
パーセント配列同一性を計算するのに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似度の統計学的解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−７７，１９９３を参照のこと：これはこの参照によって本明細書に組み込まれる）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって提供される類似度の１基準は最小和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチド或いはアミノ酸配列間の適合が偶然起こる確率の指標を提供する。例えば、参照核酸とのテスト核酸の比較における前記最小和確率が約０．１以下、より一般的には約０．０１以下、最も一般的には約０．００１以下である場合、前記核酸は前記参照配列に類似すると考えられる。
【００４８】
２つの核酸配列或いはポリペプチドが実質的に同一であるという更なる指標は、以下に示したように、第一の核酸にコードされたポリペプチドが第二の核酸にコードされたポリペプチドと免疫学的に交差反応性であるということである。従って、ポリペプチドは一般的に、例えば２つのペプチドの保存的置換のみが異なる場合、第二のポリペプチドと実質的に同一である。
【００４９】
「免疫学的に交差反応性」という用語は、ポリペプチド、断片、誘導体或いは類似体が抗体のその抗原への結合を競合的に阻害することが出来ることを意味している。
【００５０】
「形質転換」或いは「形質移入」という用語は、ポリヌクレオチドの導入によってレシピエント細胞或いは微生物の遺伝子型を安定に変化させる過程を意味している。これは、前記レシピエント細胞或いは生物の表現型における変化によって検出される。「形質転換」という用語は一般的に微生物に適用され、一方「形質移入」は多細胞生物に由来する細胞におけるこの過程を言及するために使用される。
【００５１】
「試料」という用語は、組織、細胞、血漿、血清、脊髄液、リンパ液、皮膚、呼吸器、腸及び泌尿生殖器の外部切片、涙、唾液、血球細胞、毛髪、腫瘍、器官、ポリヌクレオチドを含む生体起源の他の物質などの試料、若しくはこれらいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養構成物を意味している。試料はさらに、ポリヌクレオチドの半精製或いは精製形態でもよい。試料は、ヒトなどの哺乳類、動物、或いはＲＥＴＳＡＴ遺伝子座を有する他のあらゆる生物、さらにはこれらいずれかのｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養構成物でもよい。
【００５２】
「疾患」という用語は、細胞増殖、レチノイド代謝、皮膚及び／若しくは免疫機能及び調節に関与する疾患、状態、或いは障害を意味する。そのような疾患は、例えば癌、失明、皮膚病及び状態、及び免疫障害を含む。
【００５３】
一般的に、本明細書で使用された他の命名法、及び以下に記載された細胞培養、分子遺伝学及び核酸科学及びハイブリダイゼーションの研究手順の多くは、本分野で既知であり一般的に使用されているものである（一般的にはＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９９  ｓｕｐｒａ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１を参照のこと：これらはこの参照により本明細書に組み込まれる）。標準的な技術は組換え核酸方法、ポリヌクレオチド合成、生体試料の調製、ｃＤＮＡ断片の調整、ｍＲＮＡの単離、及びそれらと同等のものに対して使用される。一般的に酵素反応及び精製工程は、製造者仕様書に従って実行した。
【００５４】
ＲＥＴＳＡＴ遺伝子
本発明は、ＲｅｔＳａｔをコードしたヌクレオチド配列に関するものである。ヒト、マウス、及びサル（マカク）ＲＥＴＳＡＴ  ＤＮＡｓが同定された。特定の実施形態において、ＲＥＴＳＡＴ核酸は、ヒトＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｇｉ４６３２９５８７）、マウスＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７０４１５９）、及びサル（マカク）ＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７０７５２４）、若しくはＲＥＴＳＡＴ遺伝子座のコード領域、或いはＲｅｔｓａｔポリペプチド（例えば、ヒトＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｇｉ４６３２９５８７）、マウスＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７０４１５９）、及びサル（マカク）ＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７０７５２４））をコードする核酸配列（例えば、オープンリーディングフレーム）を有するものである。ＲＥＴＳＡＴ核酸はさらに、ｍＲＮＡｓ、ゲノムＤＮＡ、及びＲＥＴＳＡＴ遺伝子座に対応するアンチセンス核酸を含む。ＲＥＴＳＡＴ核酸はさらに、誘導体（例えば、ヌクレオチド配列変異体）を含み、これらは同じアミノ酸、若しくは天然由来アリル変異体などのそれらの保存的アミノ酸置換に対する他の可能なコドン選択肢をコードしているものである。ヌクレオチドコード配列の縮重によって、実質的に同じアミノ断配列（例えばＲＥＴＳＡＴ遺伝子（ヒトＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ｇｉ４６３２９５８７）、マウスＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７０４１５９）、及びサル（マカク）ＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＹ７０７５２４））などの）をコードする他のＤＮＡ配列もまた、本発明の実践において使用され得る。これらは、配列内で同じ或いは機能的に同等なアミノ酸残基（例えば保存的置換）をコードする異なるコドンの置換によって変換され、その結果サイレント変化を生じる、ＲＥＴＳＡＴ遺伝子の全部或いは一部を有するヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されるものではない。
【００５５】
本発明はまた、少なくとも６近接ヌクレオチド（例えはハイブリダイズ可能な部分）のＲＥＴＳＡＴ核酸断片を提供するものであって、他の実施形態において、前記核酸は少なくとも８近接ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、２００ヌクレオチド、或いは２５０ヌクレオチドまで、若しくはより多くのＲＥＴＳＡＴ配列を有するものである。別の実施形態において、前記核酸は２００或いは２５０ヌクレオチド長より小さいものである。ＲＥＴＳＡＴ核酸は、一本鎖或いは二本鎖である。容易に明らかなように、本明細書で用いられる「Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの断片をコードした核酸」は、近接配列としてのＲｅｔｓａｔポリペプチドの他近接部分ではなく、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの引用された断片或いは部分のみをコードした核酸を言及するものであるとして解釈される。１若しくはそれ以上のＲｅｔｓａｔドメインをコードするＲＥＴＳＡＴ核酸の断片もまた提供される。
【００５６】
ＲＥＴＳＡＴ核酸はさらに、前述の配列とハイブリダイズ可能な或いは相補的な核酸を含む。特定の観点において、ＲＥＴＳＡＴ遺伝子の少なくとも１０、２５、５０、１００、２００若しくは２５０、若しくはそれ以上のヌクレオチドに相補的な配列を有する核酸を提供する。特定の実施形態において、低度、中度、或いは高度に厳密な条件下で、ＲＥＴＳＡＴ核酸（例えば配列ＩＤ番号：１の配列を有する）、若しくはＲＥＴＳＡＴ誘導体とハイブリダイズ可能な核酸が提供される。
【００５７】
実施例として、これに限定されるものではないが、低度に厳密な条件を用いた手順は以下のようなものである。すなわち、ＤＮＡを含むフィルターを、３５％ホルムアルデヒド、５ＸＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．１％ポリビリルピロリドン（ＰＶＰ）、０．１％フィコール、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡを含む溶液において４０℃で５時間前処理する。ハイブリダイゼーションは以下の変更点を加えた同じ溶液において実行する。すなわち、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．２％  ＢＳＡ、１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）硫酸デキストラン、及び５〜２０ｘ１０６ｃｐｍ３２Ｐ−標識プローブである。フィルターは４０℃で１８〜２０時間、ハイブリダイゼーション混合液においてインキュベートした後、２ＸＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ及び０．１％  ＳＤＳを含む溶液において５５℃で１．５時間洗浄する。洗浄溶液を新鮮な溶液に変え、６０℃でさらに１．５時間インキュベートする。フィルターは乾燥させ、オートラジオグラフィーに照射する。必要であれば、フィルターを６５〜６８℃で３回洗浄し、フィルムに再度照射する。使用され得る低度厳密性の他の条件は、当業者に既知である（例えば異種間ハイブリダイゼーションで使用された条件）（Ｓｈｉｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：６７８９−９２，１９８１を参照のこと）。
【００５８】
別の実施形態において、高度厳密条件下でＲＥＴＳＡＴ核酸とハイブリダイズ可能な核酸が提供される。実施例として、これに限定されるものではないが、高度に厳密な条件を用いた手順は以下のようなものである。すなわち、ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを６ＸＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％フィコール、０．０２％  ＢＳＡ、及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡから成る緩衝液において６５℃で８時間〜一晩実行する。フィルターは１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０×１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液において６５℃で４８時間ハイブリダイズする。フィルターの洗浄を２ｘＳＳＣ、０．０１％  ＰＶＰ、０．０１％フィコール、及び０．０１％  ＢＳＡを含む溶液において１時間６５℃で行う。この次にオートラジオグラフィーの前に０．１ｘＳＳＣにおいて５０℃で４５分間洗浄する。使用され得る高度に厳密な他の条件は、当業者に既知である（一般的にＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと）。
【００５９】
別の特定の実施形態において、中度に厳密な条件下におけるＲＥＴＳＡＴ核酸とハイブリダイズ可能な核酸が提供される。実施例として、これに限定されるものではないが、そのような中度に厳密ば条件下において使用される手順としては、以下のようなものである。すなわち、ＤＮＡを含むフィルターのプレハイブリダイゼーションを、６ｘＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．２％フィコール、０．０２％  ＢＳＡ及び５００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡからなる緩衝液において５５℃で８時間〜一晩実行する。フィルターは１００μｇ／ｍｌ変性サケ精子ＤＮＡ及び５〜２０ｘ１０６ｃｐｍの３２Ｐ−標識プローブを含むプレハイブリダイゼーション混合液において５５℃で２４時間ハイブリダイズする。フィルターの洗浄を２ｘＳＳＣ、０．０１％  ＰＶＰ、０．０１％フィコール、及び０．０１％  ＢＳＡを含む溶液において１時間３７℃で行う。
【００６０】
ハイブリダイゼーションを促進する様々な他の厳密な条件を使用することが可能である。例えば、６ｘＳＳＣにおいて約４５℃でハイブリダイゼーションし、次に２ｘＳＳＣにおいて５０℃で洗浄する工程及び条件もまた使用可能である。或いは、洗浄する工程における塩濃度は、５０℃の約５ｘＳＳＣという低度な厳密性から、５０℃の約２ｘＳＳＣという中程度な厳密性、さらには５０℃の約０．２ｘＳＳＣという高度な厳密性までの範囲が可能である。さらに、洗浄する工程の温度は、室温の低度の厳密な条件から、約４２℃の中程度に厳密な条件、さらには約６５℃の高度に厳密な条件まで増強することが可能である。他の条件は、これに限定されるものではないが、０．５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／７％  ＳＤＳにおいて６８℃でハイブリダイズ若しくは５０％ホルムアミド／０．２５Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）／０．２５Ｍ  ＮａＣｌ／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／７％  ＳＤＳにおいてハイブリダイズし、その後４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／５％  ＳＤＳｂにおいて５０℃で洗浄する工程、若しくは４０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４（ｐＨ７．２）／１ｍＭ  ＥＤＴＡ／１％  ＳＤＳにおいて５０℃で洗浄する工程を含む。両温度及び塩は変更され得る、若しくは代わりに一方若しくはもう一方の変数を一定にし、もう一方を変更する。
【００６１】
低度、中度、及び高度に厳密な条件は、本分野の当業者にはよく知られており、特定の核酸配列の塩基組成に基づいて、及び前記核酸配列が由来する特異的な生物に基づいて予想通りに変更されるであろう。そのような条件に関するガイダンスとしては、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（ｓｕｐｒａ）、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｓｕｐｒａ）を参照のこと。
【００６２】
ＲＥＴＳＡＴ核酸はさらに、誘導体及び類似体う含む。そのような誘導体及び類似体は少なくとも１つの修飾塩基部位を有し、この修飾塩基部位は例えば、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、４−アセチルシトシン、５−（カルボキシ−ヒドロキシルメチル）ウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノ−メチルウラシル、ジヒドロウラシル、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクエオシン（ｇａｌａｃｔｏｓｙｌｑｕｅｏｓｉｎｅ）、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−アデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、ベータ−Ｄ−マンノシルクエオシン、５’−メトキシカルボキシメチルウラシル、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ−６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシアセチル酸（ｖ）、シュードウラシル、クエオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシアセチル酸メチルエステラーゼ、ウラシル−５−オキシアセチル酸（ｖ）、５−メチル−２−チオウラシル、３−（３−アミノ−３−Ｎ−２カルボキシプロピル）ウラシル、２，６−ジアミノプリン、及びそれらと同等なものなどである。前記ＲＥＴＳＡＴ核酸はさらに、例えばアラビノ−ス、２−フルオロアラビノ−ス、キシルロース、及びヘキソースなどの少なくとも１つの修飾糖部位を有していても良い。
【００６３】
前記ＲＥＴＳＡＴ核酸はさらに、修飾リン酸バックボーンを有していても良く、この修飾リン酸バックボーンは例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロアミドチオエート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、メチルホスホン酸、アルキルホスホロトリエステル、及びホルムアセタール或いはそれの類似体などである。
【００６４】
前記ＲＥＴＳＡＴ核酸はまた、α−アノマーオリゴヌクレオチドでもあっても良い。α−アノマーオリゴヌクレオチドは相補的なＲＮＡと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、通常のβ−ユニットに反して、前記鎖はお互いに対して平行に走っているものである（例えば、Ｇａｕｔｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：６６２５−４１，１９８７を参照のこと）。
【００６５】
ＲＥＴＳＡＴ核酸誘導体或いは類似体は、当業者には既知である標準的な方法によって（例えば、商業的に利用可能な自動化ＤＮＡ合成機の使用によって）合成することが可能である。実施例として、ホスホロチオエート核酸は、Ｓｔｅｉｎら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：３２０９−２１，１９８８）の方法によって合成することができ、メチルホスホン酸核酸オリゴヌクレオチドは、制御ポアガラスポリマー支持体（Ｓａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７４４８−５１，１９８８）及びそれらと同等のものを使用することによって調整することができる。
【００６６】
ＲＥＴＳＡＴ核酸の単離に対する特定の実施形態を以下に示すが、これは例として示したものであり、限定するものではない。
【００６７】
発現クローニング（当業者において一般的に知られている技術）に対して、発現ライブラリは当業者に既知である方法によって構成される。例えば、ｍＲＮＡ（例えばヒト）を単離し、ｃＤＮＡを調整した後、宿主細胞において発現されるように発現ベクター（例えば、バクテリオファージ誘導体）に連結させて、その結果前記宿主細胞に導入される。様々なスクリーニングアッセイは、発現されたＲｅｔｓａｔポリペプチドを選択するために使用されても良い。１実施形態において、選択のために、抗−Ｒｅｔｓａｔ特異的抗体が使用可能である。
【００６８】
別の実施形態において、選択する前にゲノム或いはｃＤＮＡライブラリにおける目的の配列を増幅するために、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を使用することが可能である。例えば、ヒトＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ｇｉ４６３２９５８７）、マウスＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０４１５９）、及びサル（マカク）ＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０７５２４）から選択されるように、既知ＲＥＴＳＡＴ配列を提示しているオリゴヌクレオチドプライマーは、ＰＣＲにおいてプライマーとして使用され得る。典型的な実施形態において、前記オリゴヌクレオチドプライマーは、他の種のＲＥＴＳＡＴ間で著しく同一のＲＥＴＳＡＴ保存断片の少なくとも一部を提示している。合成オリゴヌクレオチドは、有望な目的源（ＲＮＡ或いはＤＮＡ）、一般的にはｃＤＮＡライブラリの配列から、ＰＣＲによってＰＣＲＲＥＴＳＡＴ遺伝子内の特定のオリゴヌクレオチドを増幅するためのプライマーとして使用され得る。ＰＣＲは例えば、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｃｅｔｕｓ  ｔｈｅｒｍａｌ  ｃｙｃｌｅｒ及びＴａｑポリメラーゼ（Ｇｅｎｅ  Ａｍｐ）の使用によって実行される。増幅されるＤＮＡは、ｍＲＮＡ或いはｃＤＮＡ、若しくはあらゆる真核生物種からのゲノムＤＮＡが含まれる。本分野の当業者は、ＰＣＲ反応において使用するためのいくつかの異なる変性プライマーを合成することを選択することができる。
【００６９】
ＰＣＲ反応のプライミングにおいて使用されるハイブリダイゼーション条件の厳密性を変更することも可能であり、これにより既知ＲＥＴＳＡＴヌクレオチド配列と単離される関連核酸との間のヌクレオチド配列類似度を上げる或いは下げることが可能になる。異種間ハイブリダイゼーションに対しては、低度厳密性条件が一般的に使用される。関連ＲＥＴＳＡＴ核酸断片の増幅に成功した後、その断片は分子的にクローン化され、配列決定され、完全長ｃＤＮＡ或いはゲノムクローンを単離するためのプローブとして使用され得る。これは、言い換えると、以下に記載したように、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列の決定、その発現の解析及び機能解析のためのそのポリペプチド産物の産生を可能にする。この方法において、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド及びＲｅｔｓａｔポリペプチド誘導体をコードしている付加的な遺伝子が同定され得る。
【００７０】
上述の方法は、ＲＥＴＳＡＴ核酸或いは断片のクローンを得ることができる方法の以下の一般的な説明に限定されるものではない。あらゆる真核細胞は潜在的に、ＲＥＴＳＡＴ遺伝子の分子クローニングのための核酸源として働くことができる。ＲＥＴＳＡＴをコードする核酸配列は脊椎動物源から単離することができ、前記脊椎動物源としては、例えばブタ、ウシ、ネコ、トリ、ウマ、イヌ、及びヒトなどの哺乳類源、さらには付加的な霊長類、トリ、爬虫類及び魚類及びそれらと同等物を含み、昆虫、虫、線虫、植物及びそれらと同等物をなどの無脊椎動物からの源も含む。ＤＮＡは、クローンＤＮＡ（例えばＤＮＡ「ライブラリ」など）から当業者に既知な標準的な手順によって、化学合成によって、ｃＤＮＡクローニングによって、若しくは目的の細胞から精製されたゲノムＤＮＡ或いはその断片のクローニングによって得られる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｇｌｏｖｅｒ，（ｅｄ．），ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．Ｖｏｌ．Ｉ，ＩＩ，１９８５を参照のこと）。ゲノムＤＮＡに由来するクローンは、コード領域に加えて調節領域及びイントロンＤＮＡ領域を含むことができ、ｃＤＮＡに由来したクローンは一般的にエクソン配列のみを含んでもよい。源が何であれ、前記核酸はこれら核酸の増殖のために適切なベクターへ分子的にクローンされ得る。
【００７１】
ゲノムＤＮＡからの遺伝子の分子クローニングにおいて、ＤＮＡ断片が生成し、そのいくつかはＲＥＴＳＡＴ遺伝子をコードするものである。ＤＮＡは、様々な制限酵素を用いて特定部位で切断される。或いは、ＤＮＡを断片化するためにマンガン存在下でＤＮａｓｅを用いることもできる、若しくはＤＮＡは例えば超音波処理によって物理的にせん断され得る。直線ＤＮＡ断片は次に、これに限定されるものではないが、アガロース及びポリアクリルアミドゲル電気泳動、及びカラムクロマトグラフィーを含む標準技術によってサイズに従って分離される。
【００７２】
一旦ＤＮＡ断片が生成すると、前記目的の遺伝子を含む特定の核酸の同定は、様々な方法により達成可能である。例えば、（あらゆる種の）ＲＥＴＳＡＴ遺伝子或いはその特異的ＲＮＡの一部、或いはそれらの断片を精製し、標識化することが可能である。生成したＤＮＡ断片は、標識プローブに対する核酸ハイブリダイゼーションによってスクリーニングすることが可能である（例えば、Ｂｅｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９６：１８０−０２，１９７７；Ｇｒｕｎｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｈｏｇｎｅｓｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７２：３９６１−６５，１９７５を参照のこと）。前記プローブと実質的に同一のこれらのＤＮＡ断片は、ハイブリダイズされる。制限酵素消化、及び利用可能であれば既知の制限地図に従って予想される断片サイズの比較によって、適切な断片を同定することも可能である。さらなる選択は前記遺伝子の特定に基づいて実行可能である。
【００７３】
或いは、ＲＥＴＳＡＴ核酸の存在は、その発現生成物の物理的、化学的、或いは免疫学的特性に基づいたアッセイによって検出することができる。例えば類似或いは同一な電気泳動移動、等電点電気泳動挙動、タンパク質分解地図、ＲｅｔＳａｔ活性、基質結合活性、或いはＲｅｔｓａｔポリペプチド（群）として既知の抗原性特性を有しているポリペプチドを産生するような、ｃＤＮＡクローン或いは適切なｍＲＮＡをハイブリッド選択するＤＮＡクローンが選択され得る。Ｒｅｔｓａｔポリペプチドに特異的に結合する免疫血清或いは抗体は、免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）型手順）における結合にとってクローンを合成するＲｅｔｓａｔポリペプチドを推定的に同定するために使用することが可能である。
【００７４】
ＲＥＴＳＡＴ遺伝子は、核酸ハイブリダイゼーション及びその後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳によるｍＲＮＡ選択により同定することが可能である。この手順において、ハイブリダイゼーションによって相補的ｍＲＮＡを単離するために断片が使用される。そのようなＤＮＡ断片は一般的に、別の種（例えば、ヒト、マウス及びそれらと同等物）の利用可能な精製ＲＥＴＳＡＴ  ＤＮＡを提示する。前記単離されたｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳産物の免疫沈降解析或いは機能的アッセイによって、前記ｍＲＮＡ、さらには目的の配列を含む前記相補的ＤＮＡ断片が同定される。加えて、特異的ｍＲＮＡは、細胞から単離されたポリソームの抗Ｒｅｔｓａｔポリペプチド特異的固定化抗体に対する吸収によって選択され得る。放射線標識されたＲＥＴＳＡＴ  ｃＤＮＡは、鋳型として、選択されたｍＲＮＡ（吸収されたポリソームから）を用いて合成され得る。前記放射線標識されたｍＲＮＡ或いはｃＤＮＡは次に、他のゲノムＤＮＡ間からＲＥＴＳＡＴ  ＤＮＡを同定するためのプローブとして使用することが可能である。
【００７５】
ＲＥＴＳＡＴゲノムＤＮＡを単離する工程の代替案としては、これに限定されるものではないが、前記遺伝子配列自体を既知の配列から化学的に合成する工程、若しくはＲＥＴＳＡＴポリペプチドをコードする前記ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡを作成する工程を含む。例えば、ＲＥＴＳＡＴ遺伝子のｃＤＮＡクローニングに対するＲＮＡは、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドを発現する細胞から単離され得る。他の方法も可能であり、本発明の観点内であると考えられる。
【００７６】
前記同定され単離されたＲＥＴＳＡＴ核酸は次に、適切なクローニングベクターに挿入される。当業者には既知である多数のベクター−宿主システムを使用することができる。可能なベクターは、これに限定されるものではないが、プラスミド或いは修飾ウイルスを含む。前記ベクターシステムは、宿主細胞に適合するように選択される。そのようなベクターは、これに限定されるものではないが、ラムダ誘導体などのバクテリオファージ、酵母組込み及び動原体性ベクター、２μプラスミド及びその誘導体、若しくはいくつか挙げるとｐＢＲ３２２、ｐＵＣ、ｐｃＤＮＡ３．１、或いはｐＲＳＥＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラスミド誘導体やＢｌｕｒｓｃｒｉｐｔベクター（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ）などのプラスミドを含む。ＲＥＴＳＡＴ核酸のクローニングベクターへの挿入は、例えばＤＮＡ断片を相補的な突出末端を有するクローニングベクターに連結する工程によって達成され得る。しかしながら、ＤＮＡを断片化するために使用された相補的な制限部位が前記クローニングベクターに存在しない場合は、ＤＮＡ分子の末端は酵素的に修飾され得る。代わりに、あらゆる望ましい制限エンドヌクレアーゼ部位は、ＤＮＡ末端上にヌクレオチド配列（例えばリンカー）を連結する工程によって製造され：これら連結された配列は制限エンドヌクレアーゼ認識配列をコードしている特定の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドを有することができる。代わりの方法において、切断されたベクター及びＲＥＴＳＡＴ核酸は、ホモポリマーテーリングによって修飾され得る。組換え分子は、形質転換、形質導入、感染、電気穿孔法、及びそれらと同等のものを介して宿主細胞へ導入され、前記核酸配列の多コピーが産生される。
【００７７】
代わりの方法において、ＲＥＴＳＡＴ核酸は、「ショットガン」アプローチによって、適切なクローニングベクターへの挿入の後、同定され単離される。例えばサイズ画分によるＲＥＴＳＡＴ核酸の濃縮は、前記クローニングベクターへの挿入の前に実行される。特定の実施形態において、単離されたＲＥＴＳＡＴ遺伝子、ｃＤＮＡ、或いは合成ＤＮＡ配列を取り込んだ組換えＤＮＡ分子での宿主細胞の形質転換は、前記遺伝子の複数コピーの産生を可能にする。従って、前期遺伝子は、形質転換体を増殖させ、前記形質転換体から前記組換えＤＮＡを単離することによって、もし必要であれば単離された組換えＤＮＡから挿入された遺伝子を回収することによって、大量に得ることができる。
【００７８】
ＲＥＴＳＡＴ遺伝子の発現
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、或いは機能的に活性な誘導体、類似体或いはそれらの断片をコードしているヌクレオチド配列は、適切な発現ベクター（すなわち、挿入されたポリペプチド−コード配列の転写及び翻訳に対して必要な要素を含むベクター）に挿入され得る。必要な転写及び翻訳シグナルも、天然ＲＥＴＳＡＴ遺伝子及び／若しくはそのフランキング領域から供給され得る。多様な宿主−ベクターシステムは、ポリペプチド−コード領域を発現するために使用される。これらは、これに限定されるものではないが、ウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス及びそれらと同等物）で感染された哺乳類細胞システム、ウイルス（例えばバキュロウイルス）で感染された昆虫細胞システム、酵母ベクターを含む酵母などの微生物、若しくはバクテリオファージＤＮＡ、プラスミド或いはコスミドＤＮＡで形質転換された細菌を含む。ベクターの発現要素はそれらの強度及び特異性で変更される。使用された宿主−ベクターシステムに依存して、多数の適した転写及び翻訳要素のいずれかが使用される。特定の実施形態において、ヒトＲＥＴＳＡＴ遺伝子が発現される、若しくはヒトＲｅｔｓａｔの機能的に活性な部分をコードする核酸配列が酵母或いは細菌において発現される。さらに別の実施形態において、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドのドメインを有するＲＥＴＳＡＴの断片が発現される。
【００７９】
以前に記載されたＤＮＡ断片をベクターに挿入するための方法はいずれも、適切な転写／翻訳調節シグナル及び前記ポリペプチドコード配列から成るキメラ遺伝子を有する発現ベクターを構成するために使用される。これらの方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ及び合成技術、及びｉｎ  ｖｉｖｏ組換え体（遺伝的組換え体）を含む。Ｒｅｔｓａｔポリペプチド或いは断片をコードする核酸配列の発現は、第二の核酸配列によって制御され、前記Ｒｅｔｓａｔポリペプチド或いは断片は前記組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現する。例えば、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの発現は、当業者に既知であるあらゆるプロモーター／エンハンサー要素によって調節され得る。ＲＥＴＳＡＴ遺伝子発現を調節するために使用され得るプロモーターは、これに限定されるものではないが、ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ａｎｄ  Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−１０，１９８１）、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列に含まれるプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ２２：７８７−９７，１９８０）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：１４４１−４５，１９８１）、メタロチオネイン遺伝子の調節性配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９６：３９−４２，１９８２）、ベータ−ラクタマーゼプロモーターなどの原核細胞発現ベクター（Ｖｉｌｌａ−Ｋｏｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３１，１９７８）、或いはｔａｃプロモーター（ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５，１９８３）、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓ  ＲＮＡプロモーターを含む植物発現ベクター（Ｇａｒｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．９：２８７１−８８，１９８１）、及び光合成酵素リブロース二リン酸カルボキシラーゼのプロモーター（Ｈｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１１５−２０，１９８４）、Ｇａｌ７及びＧａｌ４プロモーターなどの酵母或いは他の菌類からのプロモーター要素、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＫＧ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリンホスファターゼプロモーター、及びそれらと同等のものを含む。
【００８０】
組織特異性を示す以下の動物転写調節領域は、トランスジェニック発現動物に対して使用されており、前記調節領域は、膵腺房細胞において活性なエラスターゼＩ遺伝子調節領域（Ｓｗｉｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３８：６３９−４６，１９８４；Ｏｍｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９，１９８６；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ  ７（１  Ｓｕｐｐｌ．）：４２Ｓ−５１Ｓ，１９８７）、膵臓β細胞において活性なインスリン遺伝子調節領域（Ｈａｎａｈａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：１１５−２２，１９８５）、リンパ系細胞において活性名免疫グロブリン遺伝子調節（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３８：６４７−５８，１９８４；Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１８：５３３−８，１９８５；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−４４，１９８７）、精巣、乳房、リンパ系及びマスト細胞において活性のマウス乳癌ウイルス調節領域（Ｌｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４５：４８５−９５，１９８６）、肝臓において活性なアルブミン遺伝子調節領域（Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−７６，１９８７）、肝臓において活性なアルファ−フェトプロテイン遺伝子調節領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−４８，１９８５；Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３５：５３−５８，１９８７）、肝臓において活性なアルファ１−アンチトリプシン遺伝子調節領域（Ｋｅｌｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−７１，１９８７）、骨髄細胞において活性なベータ−グロブリン遺伝子調節領域（Ｍａｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１５：３３８−４０，１９８５；Ｋｏｌｌｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４６：８９−９４，１９８６）、脳のオリゴデンドロサイト細胞において活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子調節領域（Ｒｅａｄｈｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ４８：７０３−１２，１９８７）、骨格筋において活性なミオシン軽鎖−２遺伝子調節領域（Ｓｈａｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：２８３−８６，１９８５）、及び視床下部において活性なゴナドトロピン放出ホルモン遺伝子調節領域（Ｍａｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：１３７２−７８，１９８６）である。
【００８１】
特定の実施形態において、Ｒｅｔｓａｔ−コード核酸に操作可能であるように連結されたプロモーター、１若しくはそれ以上の複製開始点、及び任意に１若しくはそれ以上の選択可能なマーカー（例えば抗生物質耐性遺伝子）を有するベクターが使用されている。例えば、発現コンストラクトは、ｐＲＳＥＣＴ発現ベクターの制限部位へＲＥＴＳＡＴコード配列をサブクローニングすることによって作成され得る。そのようなコンストラクトは、発現したポリペプチドの親和性精製のためのヒスチジンアミノ末端フラッグ配列を有するＴ７プロモーターの制御下でＲｅｔｓａｔポリペプチドの発現を可能にする。
【００８２】
ＲＥＴＳＡＴ核酸挿入を含む発現ベクターは、当業者によく知られた一般的なアプローチによって同定され、このアプローチには、（ａ）核酸ハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在或いは非存在、及び（ｃ）挿入された配列の発現、が含まれる。第一のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入されたＲＥＴＳＡＴ核酸の存在は、挿入されたＲＥＴＳＡＴ核酸とホモログな配列を有するプローブを用いた核酸ハイブリダイゼーションによって検出され得る。第二のアプローチにおいて、前記組換えベクター／宿主システムは、ＲＥＴＳＡＴ核酸を含むベクターの挿入によって引き起こされた特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質への耐性、形質転の表現型、バキュロウイルスにおける妨害体形成、及びそれらと同等のもの）の存在或いは非存在に基づいて同定され選択され得る。例えば、ＲＥＴＳＡＴ核酸が前記ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入された場合、ＲＥＴＳＡＴ挿入を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在によって同定され得る。
【００８３】
第三のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは、組換え体によって発現されたＲｅｔｓａｔポリペプチドをアッセイすることによって同定され得る。そのようなアッセイは、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイシステムにおけるＲｅｔｓａｔポリペプチドの物理的或いは機能的な特性に基づいている。一度特定の組換えＤＮＡ分子が同定され単離されたら、当業者には既知であるいくつかの方法はそれを増幅するために使用された。適切な宿主システム及び増殖条件が確立されたら、組換え発現ベクターは増幅され、大量に調整された。以前に説明したように、使用され得る発現ベクターは、これに限定されるものではないが、以下のベクター或いはそれらの誘導体：ワクシニアウイルス或いはアデノウイルスなどのヒト或いは動物ウイルス；バキュロウイルスなどの昆虫ウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えばラムダ）、及びいくつか挙げると、プラスミド及びコスミドＤＮＡベクターを含む。
【００８４】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、若しくは遺伝子産物を望ましい特定の様式に修飾或いは処理する宿主細胞株が選択される。特定のプロモーターからの発現は、特定の誘導因子の存在下で増強されるため、遺伝的に操作されたＲｅｔｓａｔポリペプチドの発現は調節される。さらには、ポリペプチドの翻訳及び翻訳後プロセシング及び修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化）に対する特徴的で特異的なメカニズムを有する、異なる宿主細胞が使用され得る。適切な細胞株或いは宿主システムは、発現された外来性タンパク質の望ましい修飾及びプロセシングを確実にするように選択される。例えば、細菌システムにおける発現は、非グリコシル化コアタンパク質産物を産生するために使用され得る。酵母における発現は、グリコシル化産物を産生する。哺乳類細胞における発現は、哺乳類タンパク質の「野生型」グリコシル化を確実にするために使用され得る。さらに異なるベクター／宿主発現システムは、異なる程度でプロセシング反応に影響を及ぼすことができる。
【００８５】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体、及び類似体
本発明はさらに、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体、及びそれらの類似体にも関する。１観点において、本発明は、一般的にはＲｅｔｓａｔポリペプチド（ヒトＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ｇｉ４６３２９５８７）、マウスＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０４１５９）、及びサル（マカク）ＲｅｔＳａｔ（ＧｅｎＢａｎｋ  アクセッション番号  ＡＹ７０７５２４））であるＲｅｔｓａｔポリペプチドアミノ酸配列を提供する。特定の観点において、前記ポリペプチド、断片、誘導体或いはＲｅｔｓａｔポリペプチドの類似体は、動物（例えばヒト、マウス、ラット、ブタ、ウシ、イヌ、サル及びそれらと同等のもの）に由来するものである。Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体或いはそれらの類似体の産生及び使用も、本発明の範囲内である。特定の実施形態において、誘導体或いは類似体は機能的に活性である（すなわち、完全長、野生型Ｒｅｔｓａｔポリペプチドに関連した１若しくはそれ以上の機能的活性を示すことができる）。１実施例として、望ましい免疫原性或いは抗原性を有するそのような断片、誘導体或いは類似体は、例えば免疫化、Ｒｅｔｓａｔ活性の阻害及びそれらと同様のものに対する免疫アッセイにおいて使用され得る。目的の望ましいＲｅｔｓａｔ特性（例えば、オールトランスレチノールのオールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノールへの変換）を保持する或いは代わりに欠損或いは阻害する、断片、誘導体或いは類似体は、そのような特性及びその生理学的相関の誘導因子或いは阻害剤として使用され得る。特定の実施形態は、抗Ｒｅｔｓａｔ抗体によって結合され得るＲｅｔｓａｔ断片に関するものである。Ｒｅｔｓａｔの断片、誘導体或いは類似体は、これに限定されるものではないが、本明細書に記載された機能的アッセイを含む当業者には既知である手順によって望ましい活性が試験される。
【００８６】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド誘導体は、天然由来アミノ酸配列変異体、さらには、機能的活性分子を提供する１若しくはそれ以上のアミノ酸残基の置換、付加或いは欠損によって変異された変異体も含む。Ｒｅｔｓａｔポリペプチド誘導体は、これに限定されるものではないが、変異配列を含むＲｅｔｓａｔポリペプチドのアミノ酸配列全て或いは一部の一次アミノ酸配列として含む誘導体を含み、前記変異配列においては１若しくはそれ以上の機能的に同等なアミノ酸残基（例えば保存的置換）で前記配列内の残基が置換され、その結果サイレント変化が生じるものである。
【００８７】
別の観点において、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの少なくとも１０近接アミノ酸を持つＲｅｔｓａｔポリペプチドの断片を構成する或いは有するポリペプチドが提供される。他の実施形態において、前記断片は、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの少なくとも２０或いは５０近接アミノ酸から成るものである。特定の実施形態において、前記断片は３５、１００或いは２００アミノ酸以上の大きさではない。
【００８８】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの断片、誘導体或いは類似体は、これに限定されるものではないが、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド或いはそれらの断片と実質的に類似している（例えば様々な実施形態において、同じサイズのアミノ酸配列に対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、或いは９５％の同一性或いは類似性）領域を有するそれら分子を含み、これはアライメント配列を比較した場合、前記アライメントが当業者には既知であるコンピュータ配列比較／アライメントプログラムによって実行される、若しくはそのコード核酸が高度厳密性、中度厳密性、或いは低度厳密性条件（上述）下でＲＥＴＳＡＴ核酸とハイブリダイズできるものである。Ｒｅｔｓａｔポリペプチドはさらに、抗原決定基（例えば、ヒトＲｅｔｓａｔポリペプチドに特異的な抗体によって認識され得る）を持つ断片及び誘導体を有する。
【００８９】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド誘導体及び類似体は、当業者には既知である様々な方法によって産生される。それらの産生をもたらす操作は、遺伝子或いはタンパク質レベルで生じる。例えば、クローン化ＲＥＴＳＡＴ核酸は、例えば保存的置換、欠損、挿入及びそれらと同等のものを作成する工程などの、当業者には既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと）多くの戦略のいずれかによって修飾され得る。前記配列は、適切な部位を制限酵素（群）で切断され、さらに、必要ならば酵素修飾、単離及びｉｎ  ｖｉｔｒｏで連結されるものである。Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの断片、誘導体或いは類似体をコードしているＲＥＴＳＡＴ核酸の産生において、前記修飾された核酸は一般的に適切な翻訳リーディングフレームを残しており、前記リーディングフレームはＲｅｔｓａｔ断片、誘導体或いは類似体の合成を阻害する翻訳停止シグナル或いは他のシグナルによって妨害されないものである。ＲＥＴＳＡＴ核酸はさらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ或いはｉｎ  ｖｉｖｏで変異され、翻訳、開始及び／若しくは終結配列を作成及び／若しくは破壊する。前記Ｒｅｔｓａｔコード核酸もまた変異され、コード領域の変異体を作成する及び／若しくは新しい制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する、若しくは既存のものを破壊し更なるｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾を容易にする。当業者に既知である変異原性に対するあらゆる技術を使用し、この技術はこれに限定されるものではないが、化学変異原性、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的変異原性（Ｈｕｔｃｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５３：６５５１−６０，１９７８）、ＴＡＢリンカー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の使用、及びそれらと同等のものを含む。
【００９０】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド配列の操作は、ポリペプチドレベルでも行われる。本発明の範囲内に含まれるものとしては、合成（例えばｉｎ  ｖｉｖｏ或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳）の最中或いは後で差次的に修飾されたＲｅｔｓａｔポリペプチド断片、誘導体或いは類似体である。そのような修飾は、保存的置換、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知保護基／遮断基による誘導体化、タンパク質分解性切断、抗体分子或いは他の細胞性リガンドへの結合、及びそれらと同等のものを含む。あらゆる多数の化学修飾は既知の技術によって実行され、この技術としてはこれに限定されるものではないが、特異的化学切断（例えばブロモシアン）、酵素切断（例えばトリプシン、キモトリプシン、パパイン、Ｖ８プロテアーゼ、及びそれらと同様物による）、例えばＮａＢＨ４アセチル化、ホルミル化、酸化及び還元による修飾、或いはツニカマイシンの存在下での代謝性合成、及びそれらと同等のものを含む。
【００９１】
加えて、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの断片、誘導体及び類似体は、化学的に合成できる。例えば、望ましいドメインを有する若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏで望ましい活性を仲介する、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの一部に一致するペプチド或いは断片は、例えば自動化ペプチド合成機を用いる化学合成方法を使用することによって合成される。さらに、必要であれば、非古典的アミノ酸或いは化学アミノ酸類似体は、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド配列における置換或いは付加として導入され得る。非古典的アミノ酸は、これに限定されるものではないが、共通アミノ酸、アルファ−アミノイソブチル酸、４−アミノブチル酸、２−アミノブチル酸、ガンマ−アミノブチル酸、イプシロン−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、２−アミノイソブチル酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、ベータ−アラニン、セレノシステイン、フルオロ−アミノ酸、ベータ−メチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、Ｃアルファ−メチルアミノ酸、Ｎアルファ−メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体のＤ−異性体を含む。さらには、前記アミノ酸は、Ｄ（右旋性）或いはＬ（左旋性）である。
【００９２】
特定の実施形態において、Ｒｅｔｓａｔ断片或いは誘導体は、キメラ或いは融合タンパク質であり、これは異なるタンパク質のアミノ酸配列に結合したペプチドを介してそのアミノ末端或いはカルボキシル末端で連結しているＲｅｔｓａｔポリペプチド或いはそれの断片（一般的にはＲｅｔｓａｔポリペプチドの少なくともドメイン或いはモチーフ、若しくはＲｅｔｓａｔポリペプチドの少なくとも１０近接アミノ酸から成る）を有するものである。１実施形態において、そのようなキメラタンパク質は、前記タンパク質をコードしている核酸の組換え発現によって産生される。キメラ産物は、望ましいアミノ酸配列をコードしており、当業者に一般的に知られている方法によって産生されたキメラ産物を発現する適切な核酸配列を、適切なコーディングフレームにおいて互いに結合することによって作成される。代わりに、前記キメラ産物は、タンパク質合成技術によって（例えば自動化ペプチド合成機の使用によって）作成することができる。
【００９３】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、サイジングカラム、クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度を含む標準的な方法によって、若しくはタンパク質の精製に対する他の標準的な技術によって単離及び精製することができる。機能的特性は、本明細書に記載したようなあらゆる適したアッセイ、或いは当業者には既知である別のアッセイを用いて評価することができる。代わりに、一度組換えによって産生されたＲｅｔｓａｔポリペプチドを同定したら、前記ポリペプチドのアミノ酸配列は、前記組換え体に含まれるキメラ遺伝子のヌクレオチド配列から推測され得る。結果として、前記タンパク質は、当業者には既知である標準的な化学的方法によって合成される（例えば、Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１０５−１１，１９８４；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，１９８４を参照のこと）。
【００９４】
別の代替実施形態において、天然Ｒｅｔｓａｔポリペプチドは、上述した方法などの標準的な方法（例えば免疫親和性精製）によって天然源から精製される。本発明の特定の実施形態において、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドは、組換えＤＮＡ技術によって産生される、化学的合成方法によって産生される、或いは天然ポリペプチドの精製によって産生されるには関わらず、これに限定されるものではないが、ヒトＲｅｔｓａｔポリペプチド（配列ＩＤ番号：２）のアミノ酸配列の全部或いは一部を一次アミノ酸配列として含むペプチド、さらにはその断片、誘導体及び類似体を含む。
【００９５】
ＲＥＴＳＡＴ遺伝子及びポリペプチド（群）の構造
ＲＥＴＳＡＴ遺伝子及びＲｅｔｓａｔポリペプチドの構造は、当業者には既知の様々な方法によって解析される。ＲＥＴＳＡＴ遺伝子と一致しているクローンＤＮＡ或いはｃＤＮＡは、これに限定するものではないが、サザンハイブリダイゼーション（Ｈｕｎｋａｐｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１０：１０５−１１，１９８４；Ｓｔｅｗａｒｔ  ａｎｄ  Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ．，１９８４）、ノーザンハイブリダイゼーション（例えばＦｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４０９４−９８，１９８３を参照のこと）、制限エンドヌクレアーゼマッピング（一般的にはＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと）、及びＤＮＡ配列解析（例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと）を含む方法によって解析される。ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ；例えば米国特許第４，６８３，２０２号、第４，６８３，１９５号及び第４，８８９，８１８号；Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：７６５２−５６，１９８８；Ｏｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １２０：６２１−３，１９８８；Ｌｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４３：２１７−２０，１９８９を参照のこと）に続いてＲＥＴＳＡＴ特異的プローブでサザンハイブリダイゼーションを行うと、様々な細胞タイプからＤＮＡにおけるＲＥＴＳＡＴ遺伝子を検出することができる。ＰＣＲ以外の増幅方法も一般的に既知であり、使用できる。
【００９６】
１実施形態において、サザンブロットハイブリダイゼーションは、ＲＥＴＳＡＴ遺伝子座の遺伝連鎖を決定するために使用され得る。ノーザンブロットハイブリダイゼーション解析は、ＲＥＴＳＡＴ遺伝子の発現を決定するために使用され得る。発生或いは活性の様々な段階での様々な細胞タイプに対して、ＲＥＴＳＡＴ発現をテストした。サザン及びノーザンハイブリダイゼーションに対するハイブリダイゼーション条件の厳密性を操作し、使用される特異的ＲＥＴＳＡＴプローブに対して望ましい程度の配列同一性を有する核酸の検出を確実にした。これら及び当業者に一般的に知られている他の方法の改良法を使用することができる。制限エンドヌクレアーゼマッピングは、ＲＥＴＳＡＴ遺伝子の遺伝構造を大まかに決定するために使用される。制限エンドヌクレアーゼ切断によって得られた制限マップは、ＤＮＡ配列解析によって確認される。ＤＮＡ配列解析は、当業者には既知であるあらゆる技術によって実行され、これは、限定されるものではないが、Ｍａｘａｍ及びＧｉｌｂｅｒｔの方法（Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．６５：４９９−５６０，１９８０）、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ方法（Ｓａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４：５４６３−６７，１９７７）、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼの使用（Ｔａｂｏｒ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，米国特許第４，７９５，６９９号）、或いは自動ＤＮＡ配列シーケンサーの使用（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）を含む。
【００９７】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチドのアミノ酸配列は、ＤＮＡ配列から推測することによって、或いは代わりに前記タンパク質を直接シーケンスする（例えば、自動化アミノ酸シーケンサーを用いて）ことによって得られる。Ｒｅｔｓａｔポリペプチド配列はさらに、親水性解析（Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８：３８２４−２８，１９８１）によって特徴付けされる。親水性特性は、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの疎水性領域及び親水性領域、及びそのような領域をコードする遺伝子配列の一致領域を同定するために使用される。
【００９８】
二次構造解析（例えばＣｈｏｕ  ａｎｄ  Ｆａｓｍａｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：２２２−４５，１９７４）も、特異的二次構造を仮定するＲｅｔｓａｔポリペプチドの領域を同定するために実行される。操作、翻訳及び二次構造予測、オープンリーディングフレーム予測及びプロッティング、さらには配列同一性及び類似性の決定もまた、上述したような、本分野で利用可能なコンピュータソフトウェアプログラムを用いて達成される。構造解析の１つの方法もまた使用される。これらは、限定されるものではないが、Ｘ−線結晶学的技法（Ｅｎｇｓｔｏｍ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１１：７−１３，１９７４）、及びコンピュータモデリング（Ｆｌｅｔｔｅｒｉｃｋ  ａｎｄ  Ｚｏｌｌｅｒ，（ｅｄｓ．），"Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ"，Ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６；Ｂｏｒｄｏ，Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：６３９−４５，１９９３；Ｂｒｕｃｃｏｌｅｒｉ  ａｎｄ  Ｋａｒｐｕｓ，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  ２６：１３７−６８，１９８７；Ｈａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐａｃ．Ｓｙｍｐ．Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔ．１０６−１７，１９９８）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６：９５６−７０，１９９７；Ｓｔｅｍｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｚｖｅｌｅｂｉｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２６：１１６３−６６，１９９０；Ｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｏｈｅｎ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．７：７８３−９０，１９９３；及びＳｕｔｃｌｉｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１：３７７−８４，１９８７）を含む。
【００９９】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体及び類似体に対する抗体
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体及びそれらの類似体は、免疫原として使用でき、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体及びそれらの類似体などと免疫特異的に結合する抗体を産生する。そのような抗体は、これに限定されるものではないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、一本鎖抗体、重鎖抗体断片（例えばＦ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ或いは高頻度可変領域）、及びＦａｂ発現ライブラリを含む。特定の実施形態において、全体、無傷ヒトＲｅｔｓａｔポリペプチドに対するポリクローナル及び／若しくはモノクローナル抗体が産生される。別の実施形態において、ヒトＲｅｔｓａｔポリペプチドのドメインに対する抗体が産生される。別の実施形態において、親水性として同定されたヒトＲｅｔｓａｔポリペプチドの断片が、抗体産生の免疫原として使用される。
【０１００】
抗体を作成し使用する方法は、Ｈａｒｌｏｗ及びＬａｎｅ（Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９９；ここに開示されていることはこの参照によって本明細書に組み込まれる）によって一般的に開示されている。当業者には既知である様々な手順は、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体或いはそれらの誘導体に対するポリクローナル抗体を産生するために使用される。そのような抗体の産生に対して、様々な宿主動物（これに限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ラクダ、ラマ及びそれらと同等物）は、天然Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体或いは誘導体を注射することによって免疫化される。様々なアジュバンドは宿主種に依存して、免疫原性反応を増加するために使用され、このアジュバンドは、これに限定されるものではないが、Ｆｒｅｕｎｄ’ｓアジュバンド（完全或いは不完全）、水酸化アルミニウムなどのミネラルゲル、リゾレシチンなどの海面活性物質、プルロンポリオール（ｐｌｕｒｏｎｉｃ  ｐｏｌｙｏｌｓ）、ポリアニオン、ペプチド、オイル乳濁剤、キーホールカサガイヘモシアニン、ジニトロフェノール、及びＢＣＧ（カルメット・ゲラン桿菌）及びコリネバクテリウム・パルバムなどの潜在的に非常に有用なヒトアジュバンドを含む。
【０１０１】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体或いはそれらの誘導体に対するモノクローナル抗体の調整に対して、培養における連続した細胞株による抗体分子の産生を提供するあらゆる技術が使用できる。そのような技術は、例えば、Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎによって最初に開発されたハイブリドーマ技術（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−９７，１９７５を参照のこと）、さらにはトリオーマ技術（例えば、Ｈａｇｉｗａｒａ  ａｎｄ  Ｙｕａｓａ，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ４：１５−１９，１９９３を参照のこと）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２，１９８３を参照のこと）、及びヒトモノクローナル抗体を産生するためのＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６，１９８５を参照のこと）を含む。使用され得るヒト抗体は、ヒトハイブリドーマを用いて（例えば、Ｃｏｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２０２６−３０，１９８３を参照のこと）、或いはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＥＢＶウイルスでヒトＢ細胞を形質転換することによって（例えば、Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと）得ることができる。
【０１０２】
本発明に加えて、「キメラ」或いは「ヒト化」抗体（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６８５１−５，１９８４；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１２：６０４−０８，１９８４；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２−４，１９８５を参照のこと）が調整される。そのようなキメラ抗体は、適切な生物活性のヒト抗体分子からの遺伝子と共に、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドに特異的な抗体分子に対する非ヒト遺伝子をスプライシングすることによって一般的に調整される。実質的なヒト分子を産生するために、組換えＤＮＡ技術を用いて非ヒト抗体の抗原結合領域（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）、Ｆｖ或いは高頻度可変領域）をヒト抗体のフレームワークへ導入することは望ましい。そのような「キメラ」分子を産生するための方法は一般的に既知であり、例えば米国特許第４，８１６，５６７号；第４，８１６，３９７号；第５，６９３，７６２号；及び第５，７１２，１２０号；国際公開第ＷＯ８７／０２６７１号及び第ＷＯ９０／００６１６号；及び欧州公開第ＥＰ２３９４００号において記載されており、これらに開示されていることはこの参照によって本明細書に組み込まれる。代わりに、ヒトモノクローナル抗体或いはそれの一部は、Ｈｕｓｅら（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−８１，１９８９）によって説明された一般的な方法に従って、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドに特異的に結合する抗体をコードしているＤＮＡ分子に対するヒトＢ細胞ｃＤＮＡライブラリを第一スクリーニングすることによって同定される。前記ＤＮＡ分子は次に、クローニング及び増幅させ、望ましい特異性の抗体（或いは結合ドメイン）をコードする配列を得ることができる。ファージディスプレイ技術は、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体或いはそれらの誘導体に結合する抗体を選択するための別の技術を提供する（例えば、国際公開第ＷＯ９１／１７２７１号及び第ＷＯ９２／０１０４７号；及びＨｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと）。
【０１０３】
本発明の別の観点によると、一本鎖抗体の産生に対して記載された技術（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号及び第５，９６９，１０８号）は、Ｒｅｔｓａｔ−特異的一本鎖抗体を産生するために適用される。本発明の付加的な観点は、Ｆａｂ発現ライブラリ（例えば、Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  ｓｕｐｒａを参照のこと）の構成に対して記載された技術を利用し、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体或いはそれらの誘導体に対する望ましい特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の素早く且つ容易な同定を可能にするものである。
【０１０４】
免疫グロブリンも重鎖抗体となり得る。ラクダ、ヒトコブラクダ及びラマ（Ｔｙｌｏｐｏｄａ）などからの免疫グロブリンは、軽鎖なしに重鎖を有する重鎖抗体を形成することができる（例えば、Ｄｅｓｍｙｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２６２８５−９０，２００１；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎｉｔ．１２：１３１−４０，１９９９；Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４１４：５２１−２６，１９９７；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．７：１１２９−３５，１９９４；Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４８，１９９３を参照のこと、これらに開示されていることはこの参照によって本明細書に組み込まれる）。重鎖抗体の可変領域は、一般的に「ＶＨＨ」領域として言及される（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＴＩＢＳ  ２６：２３０−３５，２００１を参照のこと）。重鎖抗体のＶＨＨは一般的にＣＤＲ領域を拡張する或いは変換されており、それ自体はＣＤＲ１及び／若しくはＣＤＲ４領域を拡張していた。重鎖抗体を産生する方法は、当業者には既知である（例えば、Ａｒｂａｂｉ  Ｇｈａｈｒｏｕｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ；Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａを参照のこと）。
【０１０５】
前記分子のイディオタイプを含む抗体は、既知技術によって産生される。例えば、そのような断片は、これに限定されるものではないが、前記抗体分子のペプシン消化によって産生され得るＦ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ’）２断片のジスルフィド架橋を還元することによって産生され得るＦａｂ’断片、前記抗体分子をペプシン及び還元剤で処理することによって産生され得るＦａｂ断片、及びＦｖ断片を含む。組換えＦｖ断片もまた、例えば米国特許第５，９６５，４０５号に記載された方法を用いて真核細胞において産生され得る。
【０１０６】
抗体の産生において、望ましい抗体のスクリーニングは本分野で既知である技術（例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法））で達成される。１実施例において、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの特異的なドメインを認識する抗体は、そのドメインを含むＲｅｔｓａｔ断片に結合する産物に対して産生されたハイブリドーマをアッセイするために使用される。第一のＲｅｔｓａｔポリペプチド誘導体に特異的に結合するが、異なるＲｅｔｓａｔポリペプチドには特異的に結合しない抗体を選択するために、前記第一のＲｅｔｓａｔポリペプチドにポジティブに結合し、前記第二の異なるＲｅｔｓａｔポリペプチドに結合する抗体を欠く抗体に基づいて選択できる。
【０１０７】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチドのドメインに特異的な抗体も提供される。前述の抗体は、本発明のＲｅｔｓａｔポリペプチド配列の局在及び活性に関連する、本分野で既知である方法（例えば、画像化タンパク質、適切な生理的試料におけるそれらの測定レベル、診断方法において、及びそれらと同等のもの）において使用され得る。本発明の別の実施形態において（下記参照）、抗Ｒｅｔｓａｔ抗体及び抗原結合ドメインを含むそれらの断片は、細胞増殖を遅らせる、寛解する、或いは変換する、レチノイド代謝、皮膚及び／免疫機能及び制御に影響を及ぼす（例えば増加する或いは減少させる、若しくは変換する）ための薬剤及び組成物として使用される。
【０１０８】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体及び類似体に対する機能的アッセイ
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体及び類似体の機能的活性は、様々な方法によってアッセイされる。例えば、抗Ｒｅｔｓａｔ抗体への結合に対して、野生型Ｒｅｔｓａｔポリペプチドと結合或いは競合する能力をアッセイする場合、本分野で既知である様々な免疫アッセイが使用される。そのようなアッセイは、これに限定されるものではないが、競合性及び非競合性アッセイシステムを含み、これは、放射性免疫アッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）「サンドウィッチ」免疫アッセイ、免疫放射線アッセイ、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、ｉｎ  ｓｉｔｕ免疫アッセイ（金コロイド、酵素或いは放射線同位元素標識、及びそれらと同等物を使用する）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集アッセイ（例えばゲル凝集アッセイ、赤血球凝集アッセイ）、補体固定化アッセイ、免疫蛍光アッセイ、プロテインＡアッセイ、免疫電気泳動アッセイ、及びそれらと同等のものなどの技術を用いるものである（一般的にＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｓｕｐｒａを参照のこと）。抗体結合は、一次抗体上の標識を測定することによって検出できる。代わりに、前記一次抗体は、二次抗体或いは試薬の前記一次抗体への結合を測定することによって検出できる。前記二次抗体も直接標識され得る。免疫アッセイにおいて結合を検出するための多くの方法は、本分野で既知であり、本発明の範囲内であると考えられる。
【０１０９】
別の実施形態において、オールトランスレチノールをオールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノール（下記）へ変換するＲｅｔｓａｔポリペプチドの能力に関する。
【０１１０】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体、誘導体、及び抗体のｉｎ  ｖｉｖｏでの使用
本発明はさらに、細胞増殖、レチノイド代謝、皮膚及び／若しくは免疫機能及び制御を調節する、１若しくはそれ以上の薬剤或いはそのような薬剤を含む組成物を投与する方法を提供する。そのような薬剤は、これに限定されるものではないが、上述されたようなＲｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体及び類似体；（上述されたような）Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体及び類似体に特異的な抗体；オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノール、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノイン酸、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノイド誘導体、及びＲｅｔｓａｔポリペプチドアゴニスト及びアンタゴニストを含む。Ｒｅｔｓａｔ薬剤は、Ｒｅｔｓａｔ機能を変更することによって、癌、失明、皮膚及び免疫障害に関連する疾患を治療するために使用され得る。
【０１１１】
一般的に、種由来の薬剤或いはレシピエントと同程度の種反応性（抗体の場合）を有する種由来の薬剤を投与することは一般的である。従って、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、断片、誘導体、或いはそれらの類似体、或いはＲＥＴＳＡＴ核酸或いは断片若しくはそれらの類似体、若しくはヒトＲｅｔｓａｔポリペプチドに対する抗体は、治療上或いは予防的に有効な量でヒトに投与される。
【０１１２】
癌、失明、皮膚障害或いは病状及び／若しくは免疫障害に関連する疾患。そのような薬剤の例としては、これに限定されるものではないが、強誘導性プロモーターの制御下での抗−センスＲＥＴＳＡＴ核酸を含み、これらは特に肝臓、腎臓及び腸において活性であるものである。Ｒｅｔｓａｔ活性を減少させるために使用する他の薬剤は、抗−Ｒｅｔｓａｔ抗体、或いは以下に記載された例であるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ或いは動物モデルにおいて使用して同定された薬剤を含む。
【０１１３】
特定の実施形態において、ＲＥＴＳＡＴ機能を減少させる薬剤は、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドの上昇したレベル（正常或いは望ましいレベルに相対的に）或いは機能に関連した疾患に対して治療的（予防的を含む）に投与される。例えば、前記薬剤は、そのタイプの正常細胞と比較して、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドが過剰発現した、遺伝的に欠損、或いは生物学的に反応亢進している患者に投与され得る。さらに、本発明の薬剤は、疾患或いは障害で投与され、ここにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏ（或いはｉｎ  ｖｉｖｏ）アッセイはＲｅｔｓａｔアンタゴニスト投与の有用性を指示するものである。
【０１１４】
Ｒｅｔｓａｔポリペプチドのレベル或いは機能は、例えば患者の組織試料（生検からなど）を得て、発現されたＲＥＴＳＡＴ  ＲＮＡ或いはＲｅｔｓａｔポリペプチドのＲＮＡ或いはポリペプチドレベル、構造及び／若しくは活性に対してそれをｉｎ  ｖｉｔｒｏええアッセイすることによって検出され得る。従って、本分野では標準的な多くの方法が使用され、これは、限定されるものではないが、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドを検出及び／若しくは視覚化するための免疫アッセイ（例えば、ウェスタンブロット、免疫沈降、その後にドデシル硫酸ナトリウムゲル電気泳動（「ＳＤＳ  ＰＡＧＥ」）、免疫細胞化学、及びそれらと同等のもの）、及び／若しくはＲＥＴＳＡＴ  ｍＲＮＡを検出及び／若しくは視覚化することによってＲＥＴＳＡＴ発現を検出するためのハイブリダイゼーションアッセイ（例えば、ノーザンブロットアッセイ、ドットブロット、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、定量的逆転写酵素−ＰＣＲ、及びそれらと同等のもの）、とりわけ当業者には知られたものを含む。
【０１１５】
治療される或いは予防され得る、癌、失明、皮膚状態或いは障害、及び免疫障害に関連する疾患は、これに限定されるものではないが、急性前骨髄球白血病、皮膚科学障害、及びそれらと同等のものを含む。
【０１１６】
薬学的に許容可能な担体においてオールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノールの有効な量を含む本発明の組成物は、患者に投与される。特定の疾患の治療に有効であろうオールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノールの量は、疾患の本質に依存しており、標準的な臨床技術によって決定されるであろう。
【０１１７】
例示的な実施形態において、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノール、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノイン酸、及び１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体、及び薬学的に許容可能な担体を有する組成物は投与される。
【０１１８】
薬剤は、ヒト或いは非ヒト脊椎動物に投与される。特定の実施形態において、前記薬剤は、高齢のヒトに投与される。特定の実施形態において、前記薬剤は、他のレチノイドを約５％以下或いは約１％以下、若しくは約０．１％以下含むという点で、実質的に純粋である。他の実施形態において、薬剤の組み合わせが投与される。
【０１１９】
薬剤は、例えば経口或いは局所投与を含むあらゆる適切な手段によって目へ送達される。局所投与の機序は、例えば目薬、眼内注射、或いは眼窩周囲注射を含むことができる。眼窩周囲注射は一般的に、前記薬剤を結膜へ或いは腱（目を覆っている繊維質組織）へ注射することを含む。眼内注射は一般的にガラス体への前記薬剤の注射に関する。特定の実施形態において、前記投与は、目薬或いは経口投薬形態によってなどの非侵襲性である。
【０１２０】
薬剤は、薬学的に許容可能な溶媒及び本分野で日常的に使用されている技術を用いて投与用に処方される。溶媒は前記薬剤の溶解度に従って選択される。適切な眼科組成物は、目薬、注射或いはそれらと同等のものによってなど、目へ局所的に投与可能なものを含む。目薬の場合、前記処方は、例えば塩化ナトリウム、濃縮グリセリン及びそれらと同様物などの等張化薬剤；リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム及びそれらと同等物などの緩衝薬剤、ポリオキシエチレンソルビタンモノ−オレイン酸（ポリソルベート８０としても言及される）、ポリオキシルステアリン酸４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油及びそれらと同等物などの界面活性剤、塩化ベンザルコニウム、パラベン及びそれらと同等物などの保存剤、及び他の成分などの眼科的に適合性のある薬剤を任意に含むこともできる。保存剤は、例えば約０．００１〜約１．０％重量／容積のレベルで使用される。前記処方のｐＨは通常、眼科処方が許容できる範囲内であり、例えば約ｐＨ４〜８の範囲内である。
【０１２１】
目へ若しくは目の中への注射に対して、前記薬剤は注射グレード生理食塩水において、注射可能なリポソーム溶液の形態において、或いはそれらと同等のもので提供される。眼内及び眼窩周辺注射は、本分野の当業者には既知であり、例えばＯｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｕｒｇｅｒｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｅｄ．，Ｇ．Ｌ．Ｓｐａｅｔｈ，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ペンシルバニア州．，米国，ｐａｇｅｓ  ８５−８７，１９９０を含む多くの刊行物に記載されている。
【０１２２】
適切な経口投薬形態は、例えば錠剤、ピル、小袋、若しくはハード或いはソフトゼラチンのカプセル、メチルセルロース、或いは消化管において容易に溶解する他の適切な物質を含む。適切な非毒性固体担体も使用でき、これは例えば薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、カルボン酸マグネシウム、及びそれらと同等物を含む（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ"Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ"，１７  Ｅｄ．，Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ペンシルバニア州，１９８５を参照のこと）。
【０１２３】
前記薬剤の用量は、対象、投薬形態及びそれらと同等のものの臨床状態、条件及び年齢に依存して適切に選択される。目薬の場合、薬剤は例えば、１用量に対して約０．０１ｍｇ、約０．１ｍｇ、或いは約１ｍｇ〜約２５ｍｇ、〜約５０ｍｇ、〜約９０ｍｇで投与される。目薬は、必要であれば１日１回若しくはそれ以上の回数投与される。注射の場合、適切な用量は、例えば前記薬剤の約０．０００１ｍｇ、約０．００１ｍｇ、約０．０１ｍｇ、或いは約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇ、〜２５ｍｇ、〜約５０ｍｇ、或いは〜約９０ｍｇであり、１週間に１〜４回で投与される。他の実施形態において、約１．０〜約３０ｍｇの薬剤は、１週間に１〜３回投与される。
【０１２４】
経口投与は、一般的に約１．０〜約１０００ｍｇの範囲で１日１〜４回、或いはそれ以上の回数である。経口投与に対する例示的な用量範囲は、約１０〜約２５０ｍｇを１日１〜３回である。
【０１２５】
本発明の様々な実施形態において、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノールの徐放性を達成するような組成物を使用することは有用である。
【０１２６】
癌、失明、皮膚状態及び障害、及び免疫障害に関連する疾患は、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノール、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノイド酸及び／若しくは１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体の投与によって治療される若しくは予防される。
【０１２７】
本発明は、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノール、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノイド酸及び／若しくは１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体の有効な量を対象に投与する方法を提供する。一般的に、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノール、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノイド酸及び／若しくは１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体は、処方の前に実質的に精製される。前記対象或いは患者は、これに限定されるものではないが、ウシ、ブタ、ウシ、トリ、ネコ、イヌ、及びそれらと同等物を含む動物、及び、一般的には哺乳類、及び特定の実施形態ではヒトである。別の特定の実施形態において、前記対象は非ヒト哺乳類である。
【０１２８】
導入する方法は、これに限定されるものではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、眼内、硬膜内及び経口経路を含む。前記薬剤は、例えば注入或いはボーラス注射によって、上皮或いは粘膜皮膚裏打ち（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜）を介した吸収、及びそれらと同等のものなどのあらゆる簡便な経路によって投与され、他の機能的に活性な薬剤と共に投与される。投与は、全身的或いは局所的である。加えて、静脈内及びくも膜下腔内注射を含むあらゆる適した経路によってオールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノールを標的組織へ導入することは望ましい。
【０１２９】
特定の実施形態において、治療を必要としている領域へ前記薬剤を局所的に投与することは望ましく、この投与は例えば（これに限定されるものではないが）手術中の局所的注入、外用適用、注射（例えば眼内注射）、カテーテルの手段によって、坐薬の手段によって、或いはインプラントの手段によって達成され、このインプラントは、多孔性、非多孔性、或いはシラスティック膜などの膜、或いは線維を含むゼラチン物質である。
【０１３０】
更なる別の実施形態において、前記薬剤は放出制御システムにおいて運搬される。１実施形態において、ポンプが使用される（例えばＬａｎｇｅｒ，ｓｕｐｒａ；Ｓｅｆｔｏｎ，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｆ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．１４：２０１−４０，１９８７；Ｂｕｃｈｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ  ８８：５０７−１６，１９８０；Ｓａｕｄｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４−７９，１９８９を参照のこと）。別の実施形態において、ポリマー材料が使用される（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．，１９７４；Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎ．Ｙ．，１９８４；Ｒａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｐｅｐｐａｓ，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１，１９８３を参照のこと。さらに、Ｌｅｖｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１９０−９２，１９８５；Ｄｕｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１−５６，１９８９；Ｈｏｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５−１２，１９８９も参照のこと）。更なる別の実施形態において、放出制御システムは、治療上の標的の近接に設置されるので、全身的用量の画分のみが必要とされる（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，ｓｕｐｒａ，Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５−３８，１９８４を参照のこと）。他の放出制御システムは、例えばＬａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−３３，１９９０）による概説に議論されている。
【０１３１】
本発明は、薬学的組成物も提供する。そのような組成物は、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノール、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノイド酸及び／若しくは１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体の治療上有効な量と、薬学的に許容可能な担体とを有する。「薬学的に許容可能」という用語は、連邦或いは州政府の監督官庁によって許可されている、若しくは動物、より一般的にはヒトにおける使用に対して米国薬局方或いは他の一般的に認められている薬局方においてリストアップされていることを意味している。「担体」とは、前記薬剤が投与用に共に処方される、希釈剤、アジュバンド、賦形剤、安定剤或いは溶媒を意味している。薬学的な担体は、水及び油などの無菌溶液であり、石油、動物、野菜、或いはピーナッツ油、大豆油、ミネラルオイル、ゴマ油及びそれらと同等物の合成起源のものを含む。水は、前記薬学的組成物が静脈内に投与される場合、一般的な担体である。生理食塩水及び水性ブドウ糖及びグリセロール溶液も、液体担体、特に注射可能な溶液として使用される。適切な薬学的な賦形剤は、スターチ、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦粉、胡粉（チョーク）、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、グリセロールモノステアレート、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、及びそれらと同等のものを含む。必要であれば、前記組成物は微量の湿潤剤或いは乳化剤、若しくはｐＨ緩衝剤も含む。薬学的組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、徐放性処方、及びそれらと同等のものの形態をとることができる。前記組成物は、トリグリセリドなどの伝統的な結合剤及び担体と組み合わせた坐薬として処方され得る。
【０１３２】
経口処方は、薬学的グレードのマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロール、炭酸マグネシウム、及びそれらと同等のものを含む。例示的な実施形態において、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノールを有する経口処方は、ビタミンとして処方される。適切な薬学的な担体の例としては、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（Ｇｅｎｎａｒｏ（ｅｄ．），Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ  １９９０において記載されている。そのような組成物は、一般的には精製された形態でのオールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノールの治療上有効な量と担体の適切な量とを共に含んでおり、患者への投与に適切な処方を提供する。前記処方は、投与の形態に適合すべきである。
【０１３３】
１実施形態において、前記薬剤は、薬学的組成物をヒトへの静脈内投与に適合させるような日常的な手順に従って処方される。一般的に、静脈内投与に対する組成物は、無菌等張性水溶緩衝液における溶液である、必要であれば、前記組成物は可溶化剤も含むことができる。一般的に、前記成分は、別々に或いはユニット投薬形態に一緒に混合されて供給される。例えば、活性薬剤の量を示すアンプル或いはサケッタ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの気密的にシールされた容器において、乾燥凍結乾燥粉末或いは水分を含まない濃縮物として供給される。前記組成物が注入によって投与される場合、無菌で薬学的なグレードの水或いは生理食塩水を含む注入ボトルで調剤される。前記組成物が注射で投与される場合、注射用の無菌水或いは生理食塩水のアンプルが提供され、前記成分は投与される前に混合される。
【０１３４】
本発明の薬剤は、中性或いは塩形態として処方される。薬学的に許容可能な塩類は、塩化水素、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸及びそれらと同様のものに由来する基、及びナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノ、エタノール、ヒスチジン、プロカイン及びそれらと同等のものに由来する基などの遊離アミノ基で形成されたものを含む。
【０１３５】
前記薬剤の量は、特定の疾患或いは症状の治療に有効である量である。加えて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、最適な投薬範囲を同定することを助けるために任意に使用される。前記処方で使用される前記薬剤の正確な用量も、投与経路、及び疾患の重症度に依存するものであり、医師の判断及び各患者の状況によって決定されるべきである。静脈内投与に適切な投薬範囲は、一般的に１キログラム体重当たり約２０〜５００マイクログラムの活性薬剤である。鼻腔内投与に適切な投薬範囲は、約０．０１ｐｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重である。有効な用量は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ或いは動物モデルテストシステムからの用量反応曲線から推定される。経口投与は一般的に１０％〜９５％の活性成分を含む。
【０１３６】
本発明は、本発明の前記薬学的組成物の成分の１若しくはそれ以上で満たされた１若しくはそれ以上の容器を有する、薬学的なパック或いはキットも提供する。そのような容器と共に医薬品或いは生物学的産物の製造、使用或いは販売を制御している政府官庁によって処方された形態における通知も任意に含まれ、そのような通知はヒト投与に対する製造、使用或いは販売の政府機関による承認を示している。
【０１３７】
アゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング
ＲＥＴＳＡＴ核酸、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、及び断片、誘導体及びそれらの類似体は、ＲＥＴＳＡＴ核酸、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、及び断片、誘導体及びそれらの類似体に特異的に結合する候補化合物を検出するためのスクリーニングアッセイにおいても使用され、これらはアゴニスト或いはアンタゴニストとして使用される。アゴニスト及びアンタゴニストは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び／或いはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって同定される。そのようなアッセイは、治療上有効な薬剤、或いは薬剤開発のリード化合物としての薬剤を同定するために使用される。従って、本発明はＲＥＴＳＡＴ核酸、Ｒｅｔｓａｔポリペプチド、及び断片、誘導体及びそれらの類似体の活性或いは発現に特異的に影響を与える候補化合物を検出するためのアッセイを提供する。
【０１３８】
一般的なｉｎ  ｖｉｖｏアッセイにおいて、ＲＥＴＳＡＴ核酸を発現している組換え細胞は、ＲＥＴＳＡＴ発現に影響を与える候補化合物をスクリーニングするために使用される。ＲＥＴＳＡＴ発現に対する影響は、オールトランス（１３，１４）−ジヒドロレチノイン酸及び／若しくは１３，１４−ジヒドロレチノイド誘導体の合成或いはレベルを含む。
【０１３９】
候補化合物は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏスクリーンによっても同定される。例えば、ＲＥＴＳＡＴ核酸を発現した組換え細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイに対してＲｅｔｓａｔポリペプチドを組換え的に産生するために使用され、Ｒｅｔｓａｔポリペプチドに結合する候補化合物を同定する。候補化合物（Ｒｅｔｓａｔの推定上の結合パートナー或いは小分子など）は、結合を促す条件下でＲｅｔｓａｔポリペプチド（或いは断片、誘導体或いはそれらの類似体）と接触させ、次にＲｅｔｓａｔポリペプチドに特異的に結合する候補化合物を同定する。同様な方法はＲＥＴＳＡＴをコードする核酸、或いは断片、誘導体或いはそれらの類似体と結合する候補化合物をスクリーニングするために使用される。上述のことを実行するために使用される方法は、当業者には一般的に知られており、ランダム或いは組み合わせペプチド或いは非ペプチドライブラリなどの多様性ライブラリを含み、これらはＲｅｔｓａｔポリペプチドに特異的に結合する候補化合物に対してスクリーニングされたものである。例えば化学的に合成されたライブラリ、組換えファージディスプレイライブラリ、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳ベースライブラリなどの多くのライブラリは当業者に既知である。
【０１４０】
化学的に合成されたライブラリの例は、Ｆｏｄｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：７６７−７３，１９９１、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８４−８６，１９９１、Ｌａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：８２−８４，１９９１、Ｍｅｄｙｎｓｋｉ，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １２：７０９−１０，１９９４、Ｇａｌｌｏｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３７：１２３３−５１，１９９４、Ｏｈｌｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１０９２２−２６，１９９３、Ｅｒｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１４２２−２６，１９９４、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４１２−２１，１９９２，Ｊａｙａｗｉｃｋｒｅｍｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１６１４−１８，１９９４、Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：１１７０８−１２，１９９３、国際公開第ＷＯ９３／２０２４２号、及びＢｒｅｎｎｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３８１−８３，１９９２に記載されている。
【０１４１】
ファージディスプレイライブラリの例は、Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３８６−９０，１９９０、Ｄｅｖｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：４０４−０６，１９９０、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７１１−１８，１９９２、Ｌｅｎｓｔｒａ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．１５２：１４９−５７，１９９２、Ｋａｙ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １２８：５９−６５，１９９３、国際公開第ＷＯ９４／１８３１８号に記載されている。
【０１４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ翻訳ベースライブラリは、これに限定されるものではないが、国際公開第ＷＯ９１／０５０５８、及びＭａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２−２６，１９９４に記載されているものを含む。非ペプチドライブラリの例として、ベンゾジアゼピンライブラリ（例えばＢｕｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：４７０８−１２，１９９４を参照のこと）は使用のために適合される。ペプチドライブラリ（例えばＳｉｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：９３６７−７１，１９９２を参照のこと）も使用される。使用されるライブラリの別の例において、ペプチドにおける前記アミド官能基がパーメチル化（ｐｅｒｍｅｔｈｙｌａｔｅ）され、化学的に形質転換されたコンビナトリアルライブラリを産生しており、これらはＯｓｔｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：１１１３８−４２，１９９４によって記載されている。
【０１４３】
ライブラリのスクリーニングは、様々な共通で知られている方法のいずれかによって達成される。例えば、ペプチドライブラリのスクリーニングを開示している以下の参考文献：Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．２５１：２１５−１８，１９８９；Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ（ｓｕｐｒａ）；Ｆｏｗｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １３：４２２−２８，１９９２；Ｏｌｄｅｎｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：５３９３−９７，１９９２；Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ７６：９３３−４５，１９９４；Ｓｔａｕｄｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５７７−８０，１９８８；Ｂｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：５６４−６６，１９９２；Ｔｕｅｒｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６９８８−９２，１９９２；Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：８５０−５２，１９９２；米国特許第５，０９６，８１５号、第５，２２３，４０９号、及び第５，１９８，３４６号（全てＬａｄｎｅｒら）；Ｒｅｂａｒ  ａｎｄ  Ｐａｂｏ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：６７１−７３，１９９４；及び国際公開第ＷＯ９４／１８３１８号を参照のこと。
【０１４４】
特定の実施形態において、スクリーニングは、ライブラリメンバーと、固体相上に固定化されたＲｅｔｓａｔポリペプチド（若しくは核酸或いは誘導体）とを接触させ、前記ポリペプチド（若しくは核酸或いは誘導体）に結合したそれらのライブラリメンバーを回収することによって実行される。そのようなスクリーニングの例は、「パニング」技術と呼ばれ、Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ７３：３０５−１８，１９８８；Ｆｏｗｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（ｓｕｐｒａ）；国際公開第ＷＯ９４／１８３１８号；及び本明細書において以前参照した参考文献における例の方法によって記載されている。
【０１４５】
動物モデル
本発明は動物モデルも提供する。１実施形態において、眼、失明、皮膚状態及び障害、及び免疫障害に関連する疾患に対する動物モデルが提供される。そのような動物は最初、生物学的不活性にさせるような（一般的に抗生物質耐性遺伝子などの異種性配列の挿入によって）、その染色体におけるＲＥＴＳＡＴ遺伝子と外来性ＲＥＴＳＡＴ核酸との間の相同組換えを促進するために作成される。１観点において、相同組換えは、挿入された不活性化ＲＥＴＳＡＴ遺伝子を有するベクターによって胚性（ＥＳ）幹細胞を形質転換することによって実行され、相同組換えが起こり、前記ＥＳ細胞を胚盤胞へ注入し、育成母へ前記胚盤胞を移植し、キメラ動物（「ノックアウト動物」）が誕生し、そこではＲＥＴＳＡＴ遺伝子が不活性化されているものである（Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２８８−９２（１９８９））。前記キメラ動物を繁殖させ、更なるノックアウトマウスを産生する。そのような動物は、マウス、ラット、ハムスター、ヒツジ、ブタ、ウシ、及びそれらと同等のものであり、一般的には非ヒト哺乳類である。特定の実施形態において、ノックアウトマウスが産生される、ノックアウト動物は、眼、失明、皮膚状態及び障害、及び免疫障害に関連した疾患は発生すると予測されている、若しくは発生しやすいものであり、テスト候補化合物をスクリーニングするのに有用である。
【０１４６】
本発明の異なる実施形態において、機能的ＲＥＴＳＡＴ遺伝子が取り込まれ発現しているトランスジェニック動物は、眼、失明、皮膚状態及び障害、及び免疫障害に関連した疾患の動物モデルとして使用された。トランスジェニック動物は、眼、失明、皮膚状態及び障害、及び免疫障害に関連した疾患は発生すると予測されている、若しくは発生しやすいものであり、従ってそのような疾患の動物モデルとして使用される（例えば、テスト候補化合物をスクリーニングするため）。
【０１４７】
以下の実施例は、本発明の様々な観点を説明するためだけに提供されたものであり、本発明をいかなる方法によっても制限すると解釈されるものではない。  
実施例１
【０１４８】
重要な生物学的機能に必須のレチノイド
レチノイドは、発生、免疫、細胞分化、及び脊椎動物の視覚などの多くの重要な生物学的機能に必須である。オールトランスレチノールの天然誘導体及びそれらの合成類似体の両者を含むレチノイドは、いくつかの活性化合物を介してその機能を発揮する。レシチン−レチノールアシルトランスフェラーゼ（ＬＲＡＴ）によるレチノールのエステル化は、レチニルエステルをもたらし、それはビタミンＡの主要な貯蔵形態と視覚サイクルの中間体との両者を示す（Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：３８３４−３８４１，１９９９；Ｂａｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１０４２２−１０４３２，２００４；Ｉｍａｎｉｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６４：３７３−３８３，２００４）。網膜色素上皮（ＲＰＥ）において、未確認の酵素は、直接的に若しくは酸化されて視覚の発色団である１１−ｃｉｓ−レチナールになり得る１１−ｃｉｓ−レチノールを生成するエステル中間体を介してのどちらかで、オールトランスレチノールの異性化を行う（Ｋｕｋｓａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ４３：２９５９−２９８１，２００３）。レチナールに対する可逆的酸化は、ミクロソームの一部である短鎖アルコールデヒドロゲナーゼファミリー（ＳＣＡＤ）によって、あるいはクラスＩ、ＩＩ、及びＩＶの中鎖アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）によって行われる（Ｃｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２５２０９−２５２１６，２００２；Ｄｕｅｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １４３−１４４，２０１−２１０，２００）。レチナールデヒドロゲナーゼ（ＲＡＬＤＨ）タイプ１、２、３、及び４によるレチナールの酸化は、レチノイン酸（ＲＡ）を生成し、それは核内受容体を介した発生及び細胞分化を制御する（Ｂｈａｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １６６：３０３−３０６，１９９５；Ｐｅｎｚｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  １９１：１６７−１７２，１９９７；Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１６２８８−１６２９３，１９９６；Ｚｈａｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２４０：１５−２２，１９９６；Ｍｉｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ  Ｄｅｖ  ９７：２２７−２３０，２０００；Ｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：９８５６−９８６１，２００３；Ｃｈａｍｂｏｎ，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １０：９４０−９５４，１９９６）。ＲＡ−誘導性のチトクロムＰ４５０酵素であるＣＹＰ２６Ａ１及びＢ１は、極性の４−ヒドロキシ−ＲＡ、４−オキソ−ＲＡ、及び１８−ヒドロキシ−ＲＡへのＲＡの異化を行う（Ａｂｕ−Ａｂｅｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：２４０９−２４１５，１９９８；Ｆｕｊｉｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６：４１６３−４１７３，１９９７；Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：２９９２２−２９９２７，１９９６；Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：６４０３−６４０８，２０００）。ＲＡ同化酵素及び異化酵素の特異的局在は、胚のパターン形成に必須である。他の経路によって、拮抗作用が細胞増殖を制御する１４−ヒドロキシ−４，１４���レトロ−レチノール（１４−ＨＲＲ）及び無水レチノール（ＡＲ）などのレトロレチノイドが生成される（Ｂｕｃｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４：１６５４−１６５６，１９９１；Ｂｕｃｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７８：６７５−６８０，１９９３）。生体システムにおけるレチノイドの低レベル及び不安定な性質、及びそれらの生体内変化の機構が完全に理解されていないことを考慮すると、レチノイド代謝に関与する酵素の多くは、まだ発見されていない。
【０１４９】
食事による供与源に加えて、レチノイドは、α−及びβ−カロチン並びにクリプトキサンチンなどのＣ４０プロビタミンＡカロチノイドの切断から生じ、オールトランスレチノールに変換されるレチナールを産生する。プロビタミンＡカロチノイドも、組織、血清及び脊椎動物の卵黄においてレチノイドの主要な貯蔵形態を表す。動物のβ−カロチン代謝に関与する以下の２つの酵素のみが同定されている：β−カロチンを対称に切断しレチナールを産生するβ，β−カロチン−１５，１５’−モノオキシゲナーゼ（ＢＣＯ−Ｉ）、及び非対称に切断しβ−イオノン及びβ−アポ−１０’−カロテナールを生成するβ，β−カロチン−９’，１０’−オキシゲナーゼ（ＢＣＯ−ＩＩ）（ｖｏｎ  Ｌｉｎｔｉｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１１３０−１１３５，２００１；Ｋｉｅｆｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１４１１０−１４１１６，２００１）。ＢＣＯ−Ｉ及びＩＩは、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｉｓ）由来の９−ｃｉｓ−ネオキサンチン開裂酵素であるＶＰ１４、及び植物由来の他のカロチノイド開裂酵素と配列相同性を有する（Ｇｉｕｌｉａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ８：１４５−１４９，２００３に概説されている）。ＢＣＯ−Ｉは、ＶＰ１４との相同性に基づいて、ハエにおいて最初に同定され、後にマウス及びヒトからクローンニングされた（ｖｏｎ  Ｌｉｎｔｉｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９８：１１３０−１１３５，２００１；Ｒｅｄｍｏｎｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：６５６０−６５６５，２００１；Ｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ７２：１９３−２０２，２００１）。その他に、レチノイドのより限られた食事による供与源は、オールトランスレチニルエステル及び遊離オールトランスレチノールである。β−カロチン、レチナール、及びレチノイン酸に加えて、動物組織はまた、霊長類斑におけるルテイン及びゼアキサンチン、並びに血清及び大部分の組織におけるリコピンなど、相当量の非プロビタミンＡのカロチノイドを保有する。開裂されていないβ−カロチンと同様に、非プロビタミンＡのカロチノイドは、癌、黄斑変性症、及び心疾患の予防に関連する（Ｓｎｏｄｄｅｒｌｙ，Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ６２：１４４８Ｓ−１４６１Ｓ，１９９５、及びＦｒａｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｇ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ４３：２２８−２６５，２００４に概説される）。このように関心を持たれているにも関わらず、前記代謝及び動物におけるカロチノイドの生理学に関与する酵素の分子同定が待たれている。
【０１５０】
強力な遺伝的アプローチ及び容易に同定可能な表現型は、植物及び細菌におけるカロチノイド合成の生化学的経路の発見を助けた。これらの酵素は、脊椎動物のカロチノイド若しくはレチノイド酵素を見つけるためのモデルとして役立つ可能性がある。最近、植物及びシアノバクテリアシネコシスティス（図２１）におけるオールトランスリコピンへの７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピン（プロリコピンとしても既知）の異性化に関与する酵素が同定された（Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：３２１−３３２，２００２；Ｉｓａａｃｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：３３３−３４２，２００２；Ｂｒｅｉｔｅｎｂａｃｈ，ｅｔ  ａｌ．Ｚ  Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ［Ｃ］５６：９１５−９１７，２００１；Ｍａｓａｍｏｔｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ４２：１３９８−１４０２，２００１；Ｇｉｕｌｉａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ７：４２７−４２９，２００２）。図２１に、植物及びシアノバクテリアのＣＲＴＩＳＯによる触媒反応を示す。トマトＣＲＴＩＳＯ突然変異体は、７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンの蓄積に起因して、それらのタンジェリン表現型で有名である（Ｚｅｃｈｍｅｉｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２１：４６８−４７４，１９４１）。ＣＲＴＩＳＯ酵素のタンパク質配列は、オールトランスリコピンへのフィトエンの直接変化を触媒する酵素である非光合成細菌由来のＣｒｔＩと相同性を有する（Ｇｉｕｌｉａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６１：１２９２５−１２９２９，１９８６）。それはまた、植物由来のフィトエンデサチュラーゼであるＰｄｓと、ζ−カロチンデサチュラーゼ若しくはＺｄｓとへの類似性を生み出し、それらは、フィトエンから７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンへの４つの不飽和化の工程間に、各々２つの二重結合を導入する（Ｐｄｓによる１１，１１’でのｔｒａｎｓ−Ｈの脱離、及びＺｄｓによる７，７’でのｃｉｓ−Ｈの脱離）（Ｓａｎｄｍａｎｎ，Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉａ  Ｐｌａｎｔａｒｕｍ  １１  ６：４３１−４４０，２００２に概説される）。
【０１５１】
本発明者らは、植物のＣＲＴＩＳＯのタンパク質配列を使用して相同性タンパク質を調べ、脊椎動物及び無脊椎動物からの発現配列タグ（ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔａｇｓ：ＥＳＴｓ）及び転写産物の推定上の翻訳によって予測される、少数の仮説タンパク質に類似点を発見した。形質移入細胞におけるマウスＣＲＴＩＳＯ様タンパク質の発現によって、それが１３−１４の二重結合でオールトランスレチノールの飽和を触媒することが明らかになり、従って、マウスＣＲＴＩＳＯ様タンパク質は、ＲｅｔＳａｔとされた。これは、トマトＣＲＴＩＳＯとは対照的であり、トマトＣＲＴＩＳＯは、リコピンのｃｉｓ−ｔｒａｎｓ異性化を触媒し、オールトランスレチノールに対してサチュラーゼ活性を有さない。さらに、飽和産物であるオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールは、正常レベルのビタミンＡを含む食餌で維持される動物のいくつかの組織において検出される。  
実施例２
【０１５２】
材料及び方法
マウス及びサルＲｅｔＳａｔ及びトマトＣＲＴＩＳＯのクローニング、及び誘導性発現を伴う安定した細胞株の生成。ＲＰＥをＣ５７／ＢＬ６マウス若しくはマカクカニクイザル（カニクイザル）から顕微切断した。製造業者の手順に従って、マウス若しくはサルのＲＰＥからのＲＮＡ及び成熟した赤トマトからのＲＮＡを、ＭｉｃｒｏＡｑｕｅｏｕｓ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）を使用して単離し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）とオリゴ（ｄＴ）プライマーとを使用して逆転写した。マウスＲｅｔＳａｔのｃＤＮＡを、Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｐｆｕ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）と、５’−ＡＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’（フォワード）（配列ＩＤ番号：１）及び５’−ＴＣＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＣＧＧＡＣＴＡＣＡＴＣ−３’（リバース）（配列ＩＤ番号：２）のプライマーとを使用して増幅し、サルＲｅｔＳａｔを５’−ＣＡＧＴＣＧＧＡＧＣＴＧＴＣＣＣＡＴＴＴＡＣＣ−３’（フォワード）（配列ＩＤ番号：３）及び５’−ＡＡＡＴＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＧＡＴＧ−３’（リバース）（配列ＩＤ番号：４）のプライマーで増幅し、トマトＣＲＴＩＳＯを５’−ＣＴＴＴＣＣＡＧＧＧＡＧＣＣＣＡＡＡＡＴ−３’（フォワード）（配列ＩＤ番号：５）及び５’−ＡＣＡＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＧＴＧＴＣＣＴＴ−３’（リバース）（配列ＩＤ番号：６）のプライマーを使用して増幅した。マウスＲｅｔＳａｔの発現のために、ｃＤＮＡを
５’−ＣＣＴＣＴＡＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＧＧＡＴＣＡＣＴＧＣＴＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧ−３’（フォワード）（配列ＩＤ番号：７）及び
５’−ＡＣＴＡＧＴＣＴＡＣＡＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧＣＣＴＴＧＡＣＣＴＴＴＧＡ−３’（リバース）（配列ＩＤ番号：８）のプライマーによって増幅し、テトラサイクリン誘導性の真核細胞発現ベクターであるｐＣＤＮＡ４／ＴＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にＸｂａＩ／ＳｐｅＩを使用してクローニングすると共に、トマトＣＲＴＩＳＯを
５’−ＴＣＴＡＧＡＡＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＴＡＧＡＣＡＡＡＡＧＡＧＴＧＧＡ−３’（フォワード）（配列ＩＤ番号：９）及び５’−ＡＣＡＴＣＴＡＧＡＴＡＴＣＡＴＧＣＴＡＧＴＧＴＣＣＴＴ−３’（リバース）（配列ＩＤ番号：１０）のプライマーを使用して増幅し、ｐＣＤＮＡ４／ＴＯのＸｂａＩ部位にクローニングした。Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ博士（ＭＩＴ、Ｂｏｓｔｏｎ、マサチューセッツ州）から寄贈されたＮ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ−陰性ＨＥＫ２９３Ｓ細胞に、ｔｅｔＲ−発現プラスミドであるｐＣＤＮＡ６−ＴＲ（ｂｌａＲ）を形質移入し、ブラストサイジン耐性のあるコロニーを選択し、クローニングした。ＨＥＫ−Ｋｈｏｒａｎａ（ＨＥＫＫ）と称されるＨＥＫ−２９３Ｓの安定したｔｅｔＲ−発現クローンに、その後、マウスＲｅｔＳａｔ若しくはトマトＣＲＴＩＳＯのどちらかのｃＤＮＡを含むｐＣＤＮＡ４／ＴＯ（ｚｅｏＲ）を形質移入し、ｚｅｏｃｉｎで選択した。ｚｅｏｃｉｎ耐性クローンの全てを貯蔵し、活性アッセイに使用した。細胞をＤＭＥＭ、１０％ウシ胎仔血清にｚｅｏｃｉｎ及びブラストサイジン抗生物質を加えたもので培養し、３７℃、５％ＣＯ２、及び１００％湿度で維持した。
【０１５３】
ＨＥＫＫ細胞におけるＬＲＡＴタンパク質の誘導発現。他に記載されているように、マウスＬｒａｔのｃＤＮＡをクローニングした。Ｌｒａｔを発現させるために、コード領域を５’−ＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＡＧＡＡＣＣＣＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＧＣＴ−３’（配列ＩＤ番号：１１）及びＡＣＡＴＡＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＴＧＴＧＧＡＣＴＧ（配列ＩＤ番号：１２）のプライマーを使用して増幅した。そのＰＣＲ産物をｐＣＲ−Ｂｌｕｎｔ  ＩＩ−ＴＯＰＯ  ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に連結し、その後、ｐＣＤＮＡ４／ＴＯのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングした。ＴｅｔＲ−発現ＨＥＫＫ細胞にｐＣＤＮＡ４／ＴＯ−Ｌｒａｔコンストラクトを形質移入し、ｚｅｏｃｉｎで選択した。他に記載される抗ＬＲＡＴモノクローナル抗体を使用して、安定したクローンをＬｒａｔタンパク質の発現のために確認した（２）。
【０１５４】
細菌で発現した、Ｈｉｓタグ化したマウスＲｅｔＳａｔ断片、ポリクローナル抗体、及びモノクローナル抗体産物の精製。マウスＲｅｔＳａｔのｃＤＮＡ（１４８ＭＡＳＰＦ…ＭＴＡＬＶＰＭ４６５ポリペチド断片をコードする）のヌクレオチド４４０〜１３９１に対応するＲｅｔＳａｔのｃＤＮＡのＮｃｏＩ断片を、誘導性の細菌発現ベクターであるｐＥＴ３０Ｂ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のＮｃｏＩ部位にクローニングした。これは、アミノ及びカルボキシルの両末端にヘキサ−ヒスチジンタグでタグ付けされた組換えタンパク質をもたらした。そのプラスミドを、ＢＬ−２１ＲＰ細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に形質転換し、発現をＩＰＴＧで誘導した。マウスＲｅｔＳａｔタンパク質（４０ｋＤａ）の二重（Ｈｉｓ）６−タグ化断片を、製造業者の手順（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、カリフォルニア州）を使用してＮｉ−ＮＴＡ親和性によって精製した。その精製したタンパク質をゲル電気泳動によって分析した。ｉｎ−ｇｅｌ（ゲル内）トリプシン消化に続いて、組換えＲｅｔＳａｔ断片の同一性を確認するために、溶出したトリプシンペプチドをＬＣ／ＭＳでミクロシークエンスすることによって分析した。前記精製したタンパク質を、前述のようにマウスに免疫性を与えるために使用し、従来方法によってモノクローナル抗体を産生した（Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：４５５３７−４５５４６，２００２；Ａｄａｍｕｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  ２５：１１４１−１１４６，１９８９）。ウサギポリクローナル抗血清をＣｏｃａｌｉｃｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｒｅａｍｓｔｏｗｎ、ペンシルベニア州）と共同で産生した。その血清及びモノクローナル抗体は、ＲｅｔＳａｔの非形質移入細胞と比較し、ＲｅｔＳａｔ形質移入細胞の免疫細胞化学及び免疫ブロッティングによってそれらの特異性を試験した。製造業者の手順でＨｉＴＲＡＰ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇ  ＨＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州）を用いて、抗ＲｅｔＳａｔ  ＩｇＧをＲｅｔＳａｔ産生ハイブリドーマ細胞の腹水の上清から精製した。製造業者の手順に従って、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、精製した抗体を蛍光プローブに連結した。
【０１５５】
マウスＲｅｔＳａｔ転写産物のノーザンブロット分析。ノーザンブロット分析を、製造業者の手順に従って、レーン（ＦｉｒｓｔＣｈｏｉｃｅ  Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｂｌｏｔ  Ｍｏｕｓｅ  Ｂｌｏｔ  Ｉ、Ａｍｂｉｏｎ）につき、様々なマウスの組織からの２μｇのｐｏｌｙ（Ａ）ＲＮＡを含む、予め作られた市販のブロットを使用して行った。製造業者の手順に従って、［α３２Ｐ］−放射性同位元素で標識されたプローブを、５’−ＴＣＴＧＧＣＴＣＴＴＣＴＣＴＧＡＡＣＧＧＡＣＴＡＣＡＴＣ−３’リバースプライマー及びＡｍｂｉｏｎのＳｔｒｉｐ−ＥＺ  ｐｒｏｂｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｋｉｔを使用して、マウスＲｅｔＳａｔのｃＤＮＡのｒｕｎ−ｏｆｆ  ＰＣＲによって作製した。或いは、放射性同位元素でラベルされたアンチセンスのマウスβ−アクチンプローブを、Ｔ７プライマー及びｐＴＲＩａｍｐ１８  β−ａｃｔｉｎ  ｔｅｍｐｌａｔｅ（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して作製した。
【０１５６】
マウスＲｅｔＳａｔの免疫ブロッティング及び免疫組織化学分析。ＲｅｔＳａｔの膜結合性を定めるために、マウスの肝臓を、２５０ｍＭのスクロース、５ｍＭのジチオトレイトール、及び１×プロテアーゼ阻害反応混液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０にｄｏｕｎｃｅｒを使用してホモジナイズした。核及び細胞外マトリクスを、３０分間、２０，０００ｇの遠心分離によって沈殿させ、不要物を捨てた。高速細胞質上清及び核膜の後に生じる沈殿は、９０分間、１４５，０００ｇの遠心分離によって分離させた。核膜の後に生じる沈殿は、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、及び１０μＭのＰＭＳＦを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０にホモジナイズさせた。タンパク質濃度を、細胞溶解物の全体、高速細胞質上清、及び核膜の後の画分で、ブラッドフォードアッセイを用いて測定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２：２４８−２５４，１９７６）。等量のタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、抗ＲｅｔＳａｔモノクローナル抗体及び１／１０４ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）の１／１０００希釈液で染色した。ＲｅｔＳａｔの組織特異的発現を調べるために、様々なマウスの組織を解剖し、ｄｏｕｎｃｅｒを用いて、１０ｍＭの２−メルカプトエタノール及び１０μＭのＰＭＳＦを含む１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０でホモジナイズさせた。前記膜は、３０分間、１２，０００ｇで遠心分離によって沈殿させた。タンパク質濃度はブラッドフォードアッセイを用いて測定した（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２：２４８−２５４，１９７６）。各々の組織の前記膜画分からの等量のタンパク質（１０μｇ）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離させ、ウサギ抗ＲｅｔＳａｔポリクローナル抗血清及びアルカリホスファターゼ−結合１／１０４ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｆｃ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）二次抗体の１／１０００希釈液の免疫ブロッティングによって染色した。マウスモノクローナル抗ＲｅｔＳａｔは、ポリクローナル抗血清として分析された組織において同じ反応性を示した。形質移入していないＨＥＫＫ若しくはＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ細胞は、ｇｌａｓｓ  ｂｏｔｔｏｍ  ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  ｄｉｓｈ（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．、Ａｓｈｌａｎｄ、マサチューセッツ州）上のダルベッコ変法イーグル培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。ＲｅｔＳａｔの発現を１μｇ／ｍｌテトラサイクリンを添加することによって誘導した。４８時間後に細胞を回収し、ＰＢＳ（１３６ｍＭのＮａＣｌ、１１．４ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）中の４％パラホルムアルデヒド（Ｆｉｓｈｅｒ、Ｈａｍｐｔｏｎ、ニューハンプシャー州）で１０分間固定し、ＰＢＳで洗浄した。非特異的なラベルを防ぐために、前記細胞を室温で１５分間、ＰＢＳＴ（１３６ｍＭのＮａＣｌ、１１．４ｍＭのリン酸ナトリウム、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ｐＨ７．４）中の１．５％正常ヤギ血清（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ．，Ｉｎｃ．、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、カリフォルニア州）で培養した。前記���胞は、ＰＢＳＴで希釈したＡｌｅｘａ  ４８８−結合抗ＲｅｔＳａｔモノクローナルＩｇＧ中において４℃で一晩培養した。その切片をＰＢＳＴですすぎ、光退色を遅らせるために、９０％グリセリン中の５０μｌの２％１，４−ジアザビシクロ−［２．２．２］オクタン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）にマウントした。共焦点画像のために、前記細胞を、Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０レーザー走査型顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ニューヨーク州）で分析した。
【０１５７】
レチノール異性体の精製及びレチノイドのＨＰＬＣ分析。レチノイドに関連する全ての手順を、特に明記しない限り暗赤色灯の下で行った。レチノイドを、−８０℃、アルゴン下でＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに貯蔵した。全てのレチノール及びレチナール基質を、ダイオードアレイ検出器及びＨＰ  Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎ  Ａ．０８．０３  ｓｏｆｔｗａｒｅを有するＨＰ１１００  ＨＰＬＣを使用して、１．４ｍｌ／ｍｉｎの流速で、１０％酢酸エチル／９０％ヘキサンで順相ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ−Ｓｉ、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、カリフォルニア州）で精製した。オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールのために、本発明者らは、２９０ｎｍで吸光係数ε＝１６，５００を用いた。以下の吸光係数を、レチノイド（Ｍ−１・ｃｍ−１中）に使用した：オールトランスｒｅｔｉｎｏｌ、３２５ｎｍでε＝５１，７７０；９−ｃｉｓ−レチノール、３２３ｎｍでε＝４２，３００；１１−ｃｉｓ−レチノール、３１８ｎｍでε＝３４，３２０；１３−ｃｉｓ−レチノール、３２８ｎｍでε＝４８，３０５；オールトランスレチナール、ヘキサン中に３６８ｎｍでε＝４８，０００；及びオールトランスレチノイン酸、エタノール中に３５０ｎｍでε＝４５，３００。Ｇａｒｗｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  ３１６：３１３−３２４，２０００。レチノイン酸をエタノールに溶かし、７０％アセトニトリル、２９％水、１％氷酢酸、流速１．４ｍｌ／ｍｉｎの均一濃度の移動層を有する逆相ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩ（Ｚｏｒｂａｘ  ＯＤＳ、５μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、カリフォルニア州）によって分析した。
【０１５８】
７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンの精製及びカロチノイドの逆相ＨＰＬＣ分析。カロチノイドの抽出及び分析は、暗赤色灯の下で行った。１ｇのタンジェリントマトの果実を３回凍結融解し、２ｍｌのＰＢＳ、２ｍｌのエタノール、及び６ｍｌのヘキサンでｄｏｕｎｃｅｒを用いて抽出した。有機相を乾燥させ、エタノール／テトラヒドロフラン（９：１）に再懸濁し、７５％ｔｅｒｔ―ブチルメチルエーテル／２５％メタノールの移動層及び流速１ｍｌ／ｍｉｎを有する逆相ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉ（Ｐｒｏｎｔｏｓｉｌ、２００−３−Ｃ３０、３μｍ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、Ｂｉｓｃｈｏｆｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、Ｌｅｏｎｂｅｒｇ、ドイツ）で分析した。７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンから成る抽出物の９０％以上を、以下の特性を有するヘキサンの発表されたＵＶ／ＶＩＳ吸収スペクトルに基づいて同定した：ｓｈｏｕｌｄｅｒ  ａｔ  λ＝４１７ｎｍ，ε＝９０，０００Ｍ−１ｃｍ−１，λｍａｘ＝４３７ｎｍ，ε＝１０５，０００Ｍ−１ｃｍ−１，ｓｈｏｕｌｄｅｒ  ａｔ  λ＝４６１ｎｍ，ε＝７０，０００Ｍ−１ｃｍ−１。Ｂｒａｄｆｏｒｄ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ７２：２４８−２５４，１９７６。
【０１５９】
ＲｅｔＳａｔの酵素アッセイ及びＣＲＴＩＳＯ触媒反応。酵素アッセイのために、細胞を６ウェルプレートに播種し、ＲｅｔＳａｔの若しくはＣＲＴＩＳＯの発現を分析の４８時間前に１μｇ／ｍｌテトラサイクリンで誘導した。基質の調製及び添加を暗赤色灯の下で行った。レチノイド基質を上記のようにＨＰＬＣによって精製し、最終濃度が４ｍＭになるようにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶かした。タンジェリントマトの有機抽出物をアルゴン流下で乾燥させ、ＤＭＦに再懸濁した。前記基質を最終濃度が４０μＭになるように３００μｌの完全培地（テトラサイクリン１μｇ／ｍｌ）に希釈し、細胞に添加し、５％ＣＯ２、湿度１００％、３７℃、暗下で一晩培養した。培地及び細胞を剥離させ、等量のメタノールに混合した。レチノール及びジヒドロレチノールの分析のために、前記メタノール：水の混合液を２容量分のヘキサンで抽出し、その後、有機相を乾燥させ、ヘキサンに再懸濁し、順相ＨＰＬＣで分析した。レチナール及びジヒドロレチナールの分析を、１２．５ｍＭヒドロキシルアミンを有する前記メタノール：水の混合液の処理によって行い、続けて、有機抽出及び順相ＨＰＬＣを行った。カロチノイド分析のために、前記有機相を乾燥させ、エタノール／テトラヒドロフラン（９：１）に再懸濁し、逆相ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉで分析した。レチノイン酸分析のために、１：１のメタノール：水の混合液を０．１体積分の１２ＮのＨＣｌで酸性化させ、等体積のクロロホルムで抽出し、乾燥させ、エタノールで再懸濁し、逆相ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＩＩで分析した。
【０１６０】
オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの化学合成。全ての試薬をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ若しくはＦｌｕｋａから購入し、さらに精製することなく使用した。溶媒を使用前に標準の手順で乾燥させた。レチノイドに関する全ての操作を、特に明記しない限り暗赤色灯の下で行った。エチルｔｒａｎｓ−β−イオニリデンアセテートを生じさせるために、β−イオノンは、ＮａＨの存在下で無水ＴＨＦの中でトリエチルホスホノアセテートを用いて濃縮した。このエステルを、その後、ＬｉＡｌＨ４で還元してアルコールにし、トリフェニルホスフィン臭化水素酸塩で一晩反応させ、Ｗｉｔｔｉｇ塩を生じさせた。エチル４−オキソ−３−クロトン酸メチルは、触媒としてＣ上の１０％Ｐｄを使用して、Ｈ２でメタノールにおいて水素化し、エチル４−オキソ−３−酪酸メチルを生じ、その後そのエチル４−オキソ−３−酪酸メチルを、１８−ｃｒｏｗｎ−６の存在下で、無水ＣＨ２Ｃｌ２の塩基としてｔ−ＢｕＯＫを使用しＷｉｔｔｉｇ塩と反応させた。得られたエチル１１−ｃｉｓ−及びオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノエートの混合液を、ＬｉＡｌＨ４で還元して１３，１４−ジヒドロレチノールにし、オールトランス異性体を、ヘキサンの５％酢酸エチルを使用したシリカゲルのフラッシュクロマトグラフィによって、１１−ｃｉｓ−から分離した。内部標準としてＣＤＣｌ３を用いて、ＮＭＲデータをＢｒｕｋｅｒ５００ＭＨｚスペクトロメータで記録した。合成オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの１Ｈ−ＮＭＲ分析：ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３，δ，ｐｐｍ）６．４１（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１２，Ｊ１１．３，１４．７５Ｈｚ），６．１０−６．１２（ｍ，３Ｈ，Ｈ−７，Ｈ−８，Ｈ−１０，Ｊ１５．７Ｈｚ），５．６（ｄｄ，１Ｈ，Ｈ−１１，Ｊ８．３４，１４．９５Ｈｚ），３．６７（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−１５），２．４１（ｍ，１Ｈ，Ｈ−１３，Ｊ６．７Ｈｚ），１．９６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−１４），１．９０（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−９），１．６９（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３−５），１．４６（ｍ，２Ｈ，ＣＨ２−２），１．６（ｍ，４Ｈ，ＣＨ２−３，ＣＨ２−４），１．０６（ｄ，３Ｈ，ＣＨ３−１３，Ｊ６．７Ｈｚ），１．００（ｓ，６Ｈ，２×ＣＨ３−１）。
【０１６１】
オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの異性化及びＥＩ−ＭＳ分析。等量（ＵＶ吸収による）の合成化合物及び生合成化合物をエタノールに再懸濁し、３０分間日光に晒し、続いて、等体積の水と２体積分のヘキサンとを添加した。その化合物を抽出し、有機相を乾燥させ、ヘキサンに再懸濁し、異性体の混合液を順相ＨＰＬＣで分析した。ＭＳ分析のために、未知の生合成代謝産物と化学的に合成されたオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールとを、順相ＨＰＬＣによって精製し、ＪＥＯＬ  ＨＸ−１１０  ｄｉｒｅｃｔ  ｐｒｏｂｅ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｅｒを用いてＥＩ−ＭＳ分析によって分析した。両試料のフラグメンテーションパターンにおける一部のイオンは、２８８［Ｍ］＋，２７３［Ｍ−ＣＨ３］＋，２４３［Ｍ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ］＋，２１５［Ｍ−ＣＨ（Ｍｅ）（ＣＨ２）２ＯＨ］＋，２０２，１８７，１５９であった。スペクトルは、操作することなく示した。
【０１６２】
ホモジナイズした細胞のサチュラーゼ活性の酵素アッセイ。細胞を１０ｍＭのジチオトレイトール及び０．３２Ｍのスクロースを含む１５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０でホモジナイズした。細胞の１つのアリコートを、ネガティブコントロールとして９５℃で１０分間煮沸した。２００μｌの細胞アリコートに最終濃度１ｍＭのＡＴＰ及び４０μＭのオールトランスレチノールを添加した。一部のアリコートにまた、反応のレドックス状態を再生させるために、０．４ｍＭのＮＡＤＨ若しくは０．４ｍＭのＮＡＤＰＨを添加した。細胞ホモジネートを、暗下で１時間、３７℃で振盪しながらレチノール基質で培養した。これに続いて、等体積のメタノールと２体積分のヘキサンでレチノイドの抽出を行った。有機相を乾燥させ、ヘキサンに再懸濁し、その後、順相ＨＰＬＣで分析した。
【０１６３】
オールトランスレチノール及びオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールのエステル化アッセイ。ＨＥＫＫ−ＬＲＡＴ細胞を、ｄｏｕｎｃｅｒを用いて２５０ｍＭスクロース、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌでホモジナイズした。ＲＰＥミクロソームを前述のように調製した。Ｓｔｅｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：８５７７−８５８５，１９９９。ＤＭＦ中の１ｍＭストックの２μＬの基質溶液を、２０μＬの１０％ＢＳＡ及び２０μＬのＵＶ処理したＲＰＥミクロソーム若しくはＨＥＫＫ−ＬＲＡＴ細胞の１００μＬの膜ホモジネートを含む１．５ｍｌエッペンドルフチューブに加え、１０ｍＭのＢＴＰ（ｐＨ７．５）緩衝液を総体積が２００μＬになるように加えた。その反応を３７℃で１０分間培養させた。レチノイドを３００μＬのメタノール及び３００μＬのヘキサンによって抽出した。その後、レチニルエステルを分離するために、最初にヘキサンの０．５％酢酸エチルを１０分間使用し、その後、レチノールを分離するために、さらに１０分間、ヘキサンの２０％酢酸エチルを使用して、１００μＬのヘキサン抽出物を順相ＨＰＬＣによって分析した。溶出を２９０ｎｍ及び３２５ｎｍで測定した。  
実施例４
【０１６４】
マウス及びサルにおけるＣＲＴＩＳＯ様タンパク質のｃＤＮＡのクローニング
トマト及びシロイヌナズナのＣＲＴＩＳＯのタンパク質配列は、他の生物種における同様のタンパク質を捜すために使用した。本発明者らは、細菌、古細菌、及び菌類のフィトエンデヒドロゲナーゼから、他の植物及び高等真核生物の他のフィトエンデヒドロゲナーゼ及びＣＲＴＩＳＯ様タンパク質まで、いくつかの門のタンパク質の全長に亘って、広範囲に及ぶ相同性を共有するタンパク質を発見した。高度に保存されたタンパク質のファミリーは、多くの脊索動物種で見られたが非脊索動物では見られなかった。尾索動物であるユウレイボヤ及びＣｉｏｎａ  ｓａｖｉｇｎｙｉ等の無脊椎動物と同様に、この脊索動物のＣＲＴＩＳＯ様タンパク質ファミリーは、ヒト、マウス、ラット、ニワトリ、及びゼブラフィッシュ並びにフグ（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｉｐｒｅｓ及びＴｅｔｒａｏｄｏｎ  ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ）等の脊椎動物にメンバーを有する。ＣＲＴＩＳＯ様ホヤタンパク質は、多くの保存された残基を、関連する脊椎動物のタンパク質と共有するということが、利用できるホヤのゲノム配列（ヒトとの比較で４１％の同一残基を含む、６３％の保存された置換）の翻訳で判断された。トマト、シロイヌナズナ、及びシアノバクテリアシネコシスティスｓｐ．（株ＰＣＣ  ６８０３）のＣＲＴＩＳＯに対する、ヒト、サル、マウス、及びラットのタンパク質配列のアライメントを図１Ａに表す。脊椎動物のＣＲＴＩＳＯ様タンパク質を、この酵素に観察される触媒活性の後にＲｅｔＳａｔと名付けた（以下の欄を参照）。近隣結合アルゴリズムに基づく系統発生的デンドグラムは、単系統のように見え（図１Ｂ）、脊椎動物に見られる前記タンパク質は、植物のＣＲＴＩＳＯ（２５〜２７％の同一残基を含む４１〜４３％の保存された置換）と関連することを指し示す。このように、植物のＣＲＴＩＳＯ及び脊椎動物のＲｅｔＳａｔの先祖の一員は、植物及び動物界が分岐する前に現れた。マウス、ヒト、及びラットのＲｅｔＳａｔタンパク質が、それらの配列を通して広範囲に及ぶ相同性を共有するだけではく、それらのタンパク質をコードする遺伝子は、整列したタンパク質配列の同一の場所でイントロンが途切れるように、同一のエキソン−イントロン配列を有する。ヒト遺伝子は、第２染色体のマイナス鎖上に、１２ｋｂｐのゲノムＤＮＡ及び１１のエキソンを含む（図１Ｃ）。翻訳された配列の理論上のマス計算に基づくと、ヒトＲｅｔＳａｔタンパク質（受入番号ｇｉ３１３７７７４７）の３ｋｂｐのｃＤＮＡは、６５ｋＤａのタンパク質をコードする。スプライス受容部位に介在することなく、翻訳開始部位であろう部位の５４ｂｐ上流にインフレームの終止コドンがあり、それはｃＤＮＡの５’−末端がタンパク質のアミノ末端に一致することを指し示す。
【０１６５】
フィトエンデサチュラーゼと同様に、ＦＡＤ−結合哺乳類物モノアミンオキシダーゼ及びプロトポルフィリノーゲンオキシダーゼを含むタンパク質スーパーファミリーにおいても観察される推定ジヌクレオチド−結合ドメインは、ＲｅｔＳａｔのＮ末端部分に位置する。Ｗｉｅｒｅｎｇａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８７：１０１−１０７，１９８６；Ｄａｉｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３：１３６５８−１３６６２，１９９８。他の推定上の特徴は、小胞体（ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ：ＥＲ）の膜への新生タンパク質を標的とする標準的なシグナル配列である。Ｂｌｏｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｍｐ  Ｓｏｃ  Ｅｘｐ  Ｂｉｏｌ  ３３：９−３６，１９７９。残基５６８〜５８８の疎水性の範囲は、膜貫通領域である可能性が最も高い。
【０１６６】
マウスのｃＤＮＡ及びマカクザルＲｅｔＳａｔのオーソロガスタンパク質を、網膜及びＲＰＥのＲＮＡを逆転写してクローニングした。いくつかの独立したクローンの配列決定によって、配列が確認されることを保証した。提出したマウスＲｅｔＳａｔのｃＤＮＡの配列（ＡＹ７０４１５９）は、データベースで利用できる配列（ｇｉ１８４８３２５２）と異なる５塩基を有し、そのうちの２塩基は、アミノ酸変化をもたらす。過去の研究において、ラットＲｅｔＳａｔの発現及び他の遺伝子産物は、ラット乳腺腺癌において下方制御されると確認され、ラットｃＤＮＡは、ラット乳腺腫瘍−７（ｒａｔ  ｍａｍｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒ−７：ＲＭＴ−７）と仮に指定された（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２０：７７１０−７７２１，２００１）。酵素の更なる生化学的性質は、実行されなかった。我々がＧｅｎＢａｎｋに寄託したマウスＲｅｔＳａｔ（ＡＹ７０４１５９）の配列は、複数のＥＳＴ配列と完全に一致し、それは前記データベースで現在利用できる配列よりヒトＲｅｔＳａｔと似ている。サルＲｅｔＳａｔタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋ寄託ＡＹ７０７５２４）は、９７％の保存された置換を有し、前記データベースで利用できるヒトタンパク質配列と９４％の同一残基を含む（ｇｉ４６３２９５８７）。  
実施例５
【０１６７】
マウスＲｅｔＳａｔタンパク質の組織分布及び細胞内局在の性質決定
マウスＲｅｔＳａｔの発現は、放射性同位元素でラベルされたアンチセンスＲｅｔＳａｔプローブと、様々な組織からの等量のＲＮＡを含む市販の予め作られたブロットとを用いて、ノーザンブロット分析によって分析した。ＲｅｔＳａｔのｍＲＮＡは、試験した組織の中では、肝臓及び腎臓で主に発現した２２００ｂｐの転写産物として現れる（図１Ｄａ、最上部のパネル）。本発明者らはまた、前記ブロット上のＲＮＡの質を検査するために、同じ組織の２１００ｂｐの筋肉ではないβ−アクチンｍＲＮＡの発現を分析した（図１Ｄａ、下のパネル）。Ａｌｏｎｓｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｅｖｏｌ  ２３：１１−２２，１９８６。検出されたアクチンのレベルに基づくと、脾臓及び肺組織からのＲＮＡの量は多く存在する。これにもかかわらず、ＲｅｔＳａｔのｍＲＮＡは、図１Ｄ（ａ）の上のパネルにおいて、脾臓及び肺に対応するレーンで検出することができなく、一方で、前記ブロットの同じ暴露（３０分）で、腎臓及び肝臓では明らかに存在する。Ｒｅｔｓａｔの非常に低いレベルは、腎臓及び肝臓の近傍における他の組織において、前記ブロットのより長い暴露（５時間）後にのみ検出可能であった。これは、ＲｅｔＳａｔが腎臓及び肝臓において主に発現し、分析した他の多くの組織においては非常に低いレベルであることを指し示すＲＴ−ＰＣＲによって確かめられた。ウサギのポリクローナル抗血清及びモノクローナル抗体を、組換えマウスＲｅｔＳａｔに対して調製した。マウス及びウサギの両方の免疫原のために、細菌で発現された、マウスＲｅｔＳａｔタンパク質の断片を抗原として使用した。結果として関連するタンパク質と交差反応する可能性のある推定ジヌクレオチド−結合ドメインを除去するように、組換えタンパク質断片を選択した。Ｋｈｏｒａｎａ博士から入手したグリコシル化不完全ＨＥＫ細胞であるＨＥＫＫに、テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ：Ｔｅｔ）誘導性プロモーターの制御下で、ｔｅｔＲ遺伝子及びマウスＲｅｔＳａｔのｃＤＮＡを形質移入した。Ｒｅｅｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９９：１３４１９−１３４２４，２００２。形質移入細胞の安定したクローンを選択し、貯蔵し、更なる分析に使用した。これらの細胞をＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔと指定した。ポリクローナル抗体（図１Ｄｂ）及びモノクローナル抗体（図２Ｄ）の両方は、マウスＲｅｔＳａｔタンパク質の予測された質量と同様で、且つＴｅｔ誘導性ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ細胞で検出されたタンパク質の質量と同一の、７０ｋＤａの特異的タンパク質と反応した。いくつかの組織からの等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＲｅｔＳａｔポリクローナル抗体でのイムノブロッティングによって分析した。ＲｅｔＳａｔタンパク質は、多くの組織において検出され、肝臓、腎臓、及び小腸（図１Ｄｂ）において最も高い発現が見られた。この発現パターンはまた、モノクローナル抗ＲｅｔＳａｔ抗体でのイムノブロッティングによって確かめられた。
【０１６８】
図１は、植物及びシアノバクテリアのＣＲＴＩＳＯに類似する脊椎動物のタンパク質の検証を示すものである。（Ａ）ヒトＲｅｔＳａｔ（ＲｅｔＳａｔ  Ｈｏｍ−ｇｉ４６３２９５８７）の配列比較、マカクザルＲｅｔＳａｔ（ＲｅｔＳａｔ  Ｍａｑ−ＡＹ７０７５２４提出配列）マウスＲｅｔＳａｔ（ＲｅｔＳａｔ  Ｍｕｓ−ＡＹ７０４１５９提出配列）、及びトマトＣＲＴＩＳＯ（ＣＲＴＩＳＯ  Ｌｙｃ−ｇｉ１９５５０４３７）、シロイヌナズナＣＲＴＩＳＯ（ＣＲＴＩＳＯ  Ａｒａ−ｇｉ４２５６１７６４）、及びシアノバクテリアＣＲＴＩＳＯ（ＣＲＴＩＳＯ  Ｓｙｎ−ｇｉ１６３３１９９９）を有するラットＲｅｔＳａｔ（ＲｅｔＳａｔ  Ｒａｔ−ｇｉ３４８５５９００）。黒地に白文字は、同一の残基を表す。灰色地に白文字は、分析した生物種の１種を除いてすべてにおいて保存された置換を表すと共に、薄い灰色地に黒文字は、分析した７種のうち４種において保存された置換を指し示す。点線は、アランメントを引き延ばすために導入したギャップを表す。前記アランメントは、ギャップペナルティーを有するｐｒｏｇｒａｍ  Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅ及びｍａｔｒｉｘ  ＢＬＯＳＵＭ６２  ｗｉｔｈ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ：ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ−１１，ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ−１を使用して形成した。前記シグナルペプチド及び推定ジヌクレオチド結合モチーフ等の配列に基づく予測が指し示される。Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９，１９９２。ＣＲＴＩＳＯ様酵素の系統樹を、進化距離を指し示す数と共にＣｌｕｓｔａｌＷ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ−ｊｏｉｎｉｎｇ  ｄｉｓｔａｎｃｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍを使用して形成した（Ｂ）。Ｓａｉｔｏｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｅｖｏｌ  ４：４０６−４２５，１９８７。ヒトＲｅｔＳａｔとの類似パーセントを遺伝子名の傍に括弧で示した。（Ｃ）第２染色体８５，５５６，１９５から８５，５４３，７５４までのマイナス鎖上に見られるヒトＲｅｔｓａｔ遺伝子構造。番号付けしたブラックボックスはエキソンを指し示し、ホワイトボックスは非翻訳領域を指し示し、ラインはイントロンを表す。各々のイントロンの長さは、ｋｂｐで示す。翻訳の開始（ＡＴＧ）及び停止も指し示す。（Ｄ）マウスＲｅｔＳａｔの組織分布。（ａ）様々なマウス組織（上部パネル）におけるマウスＲｅｔＳａｔ発現のノーザンブロット分析は、マウスＲｅｔＳａｔが分析した組織の中では肝臓及び腎臓において主に発現することを指し示す。対照のハイブリダイゼーションは、筋肉ではないβ−アクチン（下部パネル）に対するアンチセンスプローブを用いて、同じブロットを取り除き、再プローブすることによって行われた。検出された転写産物の大きさをパネルの右側に示す。レーンにつき１０μｇのタンパク質を含む様々なマウス組織の溶解物を、ウサギポリクローナル抗マウスＲｅｔＳａｔ血清を使用して免疫ブロッティングにさらした（ｂ）。ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔでラベルされたレーンは、１μｇの総装填タンパク質に対応する、Ｔｅｔ−誘導性のＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ細胞の溶解物からのマウスＲｅｔＳａｔタンパク質の免疫反応性を示す。ウサギポリクローナル抗体若しくはマウスモノクローナル抗体のどちらかによって免疫ブロッティングされた形質移入していない細胞の溶解物では、免疫反応性のバンドはない。マウスＲｅｔＳａｔの見かけの分子量は７０ｋＤａであり、パネルの右側に示す。
【０１６９】
マウスＲｅｔＳａｔタンパク質の細胞内局在を、抗ＲｅｔＳａｔモノクローナル抗体を用いた免疫細胞化学によって研究した。最初に、Ｔｅｔ−誘導性ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ細胞及び形質移入していない細胞を染色することによって、前記抗体の特異性を試験し、それは前記抗体では反応を示さなかった（図２Ａ及びＢ）。ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ細胞の染色は、核周辺膜及び小胞体膜の染色に一致し、マウスＲｅｔＳａｔは形質移入細胞の小胞体区画に標的とされることを指し示す（図２Ｃ）。細胞膜若しくは原形質膜は染色されない。細胞下画分は、ＲｅｔＳａｔがモノクローナル抗体でのマウス肝細胞の細胞質性上清の免疫ブロッティングによって検出できない膜結合タンパク質であることを立証した（図２Ｄ）。７０ｋＤａの見かけの分子量を伴って移動するタンパク質は、肝臓のミクロゾーム膜及びＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ溶解物の両方において見られる（図２Ｄ）。このタンパク質は、ＲｅｔＳａｔモノクローナル抗体若しくはポリクローナル抗ＲｅｔＳａｔ抗血清のどちらかを用いた、形質移入していない細胞の溶解物にはなかった。
【０１７０】
図２に形質移入細胞におけるマウスＲｅｔＳａｔの細胞内局在を示す。抗マウス−ＲｅｔＳａｔモノクローナル抗体を、Ｔｅｔ−誘導性ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔの形質移入細胞（Ａ）及び形質移入していない細胞（Ｂ）を染色するために使用した。より高倍率で分析した、抗ＲｅｔＳａｔモノクローナル抗体で染色したＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ細胞は、形質移入細胞におけるＲｅｔＳａｔの核周辺膜及び網状膜局在を示す（Ｃ）。スケールバーは、２０μｍを表す。（Ｄ）マウス肝細胞におけるＲｅｔＳａｔタンパク質の細胞内分析。マウス肝細胞の細胞質上清、核の後の膜画分、及び全細胞溶解物からの等量のタンパク質の免疫ブロッティングは、ＲｅｔＳａｔタンパク質が膜結合性であることを指し示す。７０ｋＤａの見かけの分子量を有するタンパク質の免疫反応性のバンドは、マウスＲｅｔＳａｔタンパク質と同定され、Ｔｅｔ−誘導性ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ細胞の溶解物におけるその存在によって確かめられた。前記ブロットを抗マウスＲｅｔＳａｔモノクローナル抗体でプローブした。  
実施例６
【０１７１】
トマトＣＲＴＩＳＯ及びマウスＲｅｔＳａｔは、異なる酵素活性を示す
トマトＣＲＴＩＳＯを、新しい赤いトマト果実の皮及び果肉から単離されたＲＮＡからクローニングした。トマトＣＲＴＩＳＯを、誘導性プロモーターの制御下でＨＥＫＫ細胞において発現させた。トマトＣＲＴＩＳＯの天然の基質である７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンを、７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンを蓄積するタンジェリントマトの有機抽出によって単離した。Ｚｅｃｈｍｅｉｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２１：４６８−４７４，１９４１。タンジェリントマト抽出物は、大部分が７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンから成る（９０％超）ということが、発表されたスペクトルと一致する主なピークの逆相ＨＰＬＣ分析及びＵＶ吸収スペクトルによって決定された。（ピークＳ、図３Ａａ）。７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンは、オールトランスリコピンの４７５ｎｍのλｍａｘと比較すると、シフトした４４０ｎｍの吸収最大値λｍａｘを示し、明確なＵＶ吸収スペクトルを有する。Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ７５：１８４８−１８６５，１９９２。形質移入していないＨＥＫＫ、ＲｅｔＳａｔ−、及びＣＲＴＩＳＯ−発現細胞を、７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンの存在下で暗下で培養した（図３Ａ）。その反応の産物を、逆相ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉで分析した。形質移入していない細胞若しくはＲｅｔＳａｔ−発現細胞のどちらかから溶出したカロチノイドの分析結果には違いが見られなかった（図３Ａのａ及びｂ）。予想通り、ＣＲＴＩＳＯ発現細胞は、４７５ｎｍのλｍａｘで（図３ＡｃのＰ）、基質である７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピン（図３ＡｃのＳ）をオールトランスリコピンに変えた。オールトランスリコピンを、Ｋｕｒｔ  Ｂｅｒｎｈａｒｄ博士（ＣａｒｏｔｅＮａｔｕｒｅ  ＧｍｂＨ、スイスＬｕｐｓｉｎｇｅｎ）及びＲｅｇｉｎａ  Ｇｏｒａｌｃｚｙｋ博士（Ｒｏｃｈｅ  Ｖｉｔａｍｉｎｓ  Ｌｔｄ．、スイスＢａｓｅｌ）から寄贈された利用可能な標準を有する、その吸収スペクトル及び共溶出に基づいて特定した。ＣＲＴＩＳＯはまた、図３Ａの化合物ラベル１への、７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンの変化を触媒し、本発明者らは、その吸収スペクトルに基づいて、７，９ｄｉ−ｃｉｓ−リコピン異性体と仮に特定した。Ｈｅｎｇａｒｔｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｅｌｖｅｔｉｃａ  Ｃｈｉｍｉｃａ  Ａｃｔａ  ７５：１８４８−１８６５，１９９２。この観測は、ＣＲＴＩＳＯの二段階の反応機構を示唆し、それは、第一のカロチノイドの末端における両方のｃｉｓ結合が異性化され、その後、もう一方のカロチノイドにおける両方のｃｉｓ結合が異性化されるものである。この化合物はまた、元のトマト抽出物に存在し、（ピーク１、図３Ａのａ及びｂ）他の調査者によって報告されるように、熱若しくは光誘発異性化は、７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンを、より遅い速度で７Ｚ，９Ｚ−ｄｉ−ｃｉｓ異性体に変換させ得る。（ａｒｔｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．���ｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２５９：３９６−４０３，１９９９）。
【０１７２】
様々なカロチノイド及びレチノイドの基質における本発明者らの分析は、本発明者らがオールトランスレチノールの存在下でＲｅｔＳａｔの活性を調査することをもたらした。前記反応の産物が順相ＨＰＬＣによって分析されるとき、オールトランスレチノール（ピークＳ、図３Ｂ）と共に暗下で培養されたＲｅｔＳａｔ発現細胞が、それをλｍａｘが２９０ｎｍ（ピークＰ、図３Ｂｂ）である極性の小さい化合物に変換することに、本発明者らは注目した。そのピークは、形質移入していないＣＲＴＩＳＯ発現細胞にはなかった。一晩培養する間に発生したレチノール（ピーク２、３、及び４、図３Ｂ）のシス異性体は、バックグラウンドに関係なく全ての細胞にあった。浅色移動されたＵＶ吸収の最大値２９０ｎｍに基づいて、本発明者らは、新しい化合物は、３２５ｎｍのλｍａｘを示す親化合物であるレチノールと比較して、１つ少ない二重結合を有すると推論した。文献調査によると、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチナールが２８９ｎｍで最大吸収を示すことを指し示す（Ｙａｎ，ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：２９６６８−２９６７０，１９９５）。未知化合物がオールトランス１３、１４−ジヒドロレチノールであるという仮説を証明するために、それを図２２に図示するように化学的に合成し、ＨＰＬＣによって精製し、１Ｈ−ＮＭＲスペクトルによって特徴付けた。図２２にオールトランス１３、１４−ジヒドロレチノールの合成を示す。ａ）（ＥｔＯ）２Ｐ（Ｏ）ＣＨ２ＣＯＯＥｔ．ＮａＨ，ＴＨＦ，ｒｔ，２４時間；ｂ）ＬｉＡｌＨ４，Ｅｔ２Ｏ，０℃，３０分；ｃ）Ｐｈ３Ｐ．ＨＢｒ，ＭｅＯＨ，ｒｔ，２４時間；ｄ）Ｈ２（バー），ＭｅＯＨ，Ｐｄ／Ｃ，ｒｔ，２４時間；ｅ）ｔｅｒｔ−ＢｕＯＫ，１８−ｃｒｏｗｎ−６，ＣＨ２Ｃｌ２，室温〜−７８℃〜室温，１２時間。ＲｅｔＳａｔ発現細胞によって産生される未知化合物を、順相ＨＰＬＣからの適切な画分を集めることによって精製した。未知の生合成化合物及び合成オールトランス１３、１４−ジヒドロレチノールの純度を、順相ＨＰＬＣによって分析した（図４Ａのａ及びｂ）。精製した未知化合物の量では、本発明者らは、その１Ｈ−ＮＭＲ分析を行うことができなかった。しかし、結合した場合に１つのピークとして共に溶出されるように、オールトランス１３、１４−ジヒドロレチノール及び未知化合物は、順相ＨＰＬＣにおいて、クロマトグラフィーの同じ特性を示す（図４Ａｃ）。その２つの化合物は、同一のＵＶ吸収スペクトル（図４Ｂ）を有し、等量の２つの化合物における光誘発性異性化は、溶出特性及び溶出の強度（図４Ｃ）の両方が同一の一連のシス異性体を生成する。合成オールトランス１３、１４−ジヒドロレチノール及び抽出された化合物のアセチル化は、順相ＨＰＬＣにおいて共に溶出するエステル化合物を産生した（図示せず）。さらに重要なことに、ＭＳ分析は、生合成化合物が、親化合物の質量から２ダルトンの増加である２８８のｍ／ｚ質量のオールトランスレチノール（ｍ／ｚ＝２８６）を有することを明らかにした（図４Ｄａ、挿入図）。この観察された質量は、合成オールトランス１３、１４−ジヒドロレチノールの質量と同じものである（図４Ｄｂ、挿入図）。合成化���物及び生合成化合物の両方のＭＳフラグメンテーションパターンは、同一である（図４Ｄのａ及びｂ）。Ｃ１３が１３，１４−ジヒドロレチノールのキラル中心になるため、更なるＮＭＲ分析が、生合成化合物の絶対配置を決めるのに必要である。これらの所見は、本発明者らに、図２３に図示するように、ＲｅｔＳａｔがオールトランスレチノールの１３−１４の二重結合の飽和反応を触媒することを提示した。図２３に、オールトランスレチノールをオールトランス１３、１４−ジヒドロレチノールに変換するＲｅｔＳａｔによって触媒される反応を示す。
【０１７３】
図３に、形質移入細胞のトマトＣＲＴＩＳＯ及びマウスＲｅｔＳａｔの酵素活性を示す。（Ａ）オールトランスリコピンへの７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピンの変換におけるトマトＣＲＴＩＳＯ及びマウスＲｅｔＳａｔの効果の分析。抽出され、オールトランスリコピン産物（Ｐ）への７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピン基質（Ｓ）の変換のための、逆相ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｉによって分析された７Ｚ，９Ｚ，９’Ｚ，７’Ｚ−ｔｅｔｒａ−ｃｉｓ−リコピン基質（Ｓ）と共に細胞を培養した。その分析は、前記変換は、トマトＣＲＴＩＳＯ  （ｃ）を発現している細胞では起こるが、形質移入していない細胞（ａ）若しくはＲｅｔＳａｔ発現細胞（ｂ）では起こらないことを指し示す。吸収スペクトルが７，９ｄｉ−ｃｉｓ−リコピンと一致する化合物は、全ての細胞において及びＣＲＴＩＳＯ発現細胞においてはより強く観察された（Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：３８３４−３８４１，１９９９によって指し示される）。（Ｂ）新しい産物へのオールトランスレチノールの変換におけるトマトＣＲＴＩＳＯ及びマウスＲｅｔＳａｔの効果の分析。抽出され、最大吸収ピークが２９０ｎｍである新規な産物（Ｐ）へのＳの変換のための順相ＨＰＬＣによって分析されるオールトランスレチノール基質（Ｓ）と共に細胞を培養した。その分析は、前記変換は、マウスＲｅｔＳａｔ（ｂ）を発現している細胞では起こるが、形質移入していない細胞（ａ）若しくはＣＲＴＩＳＯ発現細胞（ｃ）では起こらないことを指し示す。１３−ｃｉｓ−レチノール、９，１３−ｄｉ−ｃｉｓ−レチノール、及び９−ｃｉｓ−レチノールと一致する吸収スペクトルを有する更なるピークは、バックグラウンドに関係なく全ての細胞において観察され、おそらくは熱の異性化の結果である（Ｂａｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１０４２２−１０４３２，２００４；Ｉｍａｎｉｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６４：３７３−３８３，２００４；Ｋｕｋｓａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ４３：２９５９−２９８１，２００３）。その実験を二つ組の試料で繰り返し行った。
【０１７４】
図４は、マウスＲｅｔＳａｔによるオールトランスレチノールの変換の生合成産物の同定を示すものである。ＨＰＬＣで精製された、ＲｅｔＳａｔ反応の生合成産物を、順相ＨＰＬＣでのその溶出特性について１３，１４−ジヒドロレチノールと比較した（Ａ）。オールトランス１３、１４−ジヒドロレチノール（ａ）及び生合成産物（ｂ）の保持時間は同じであり、２つの化合物を混合したときは、１つのピークとして共に溶出する。２つの化合物の吸収スペクトルは、２９０ｎｍで最大吸収となり、同じである（Ｂ）。オールトランス１３、１４−ジヒドロレチノール及び生合成化合物は、光誘発性異性化に続いて、同じパターンの異性体を生成する（Ｃ）。生合成産物（ａ）及びオールトランス１３、１４−ジヒドロレチノール（ｂ）の電子衝突ＭＳ分析は、それらが、レチノールに２Ｈを加えたもの（Ｄ）と一致する２８８ｍ／ｚの同じ質量を有することを示す。基準ピークを、挿入図に示す。生合成化合物（ａ）及びオールトランス１３、１４−ジヒドロレチノール化合物（ｂ）のＭＳフラグメンテーションパターンは、それらが同じ質量及び相対強度のイオンを生成することを示す。  
実施例７
【０１７５】
マウスＲｅｔＳａｔの基質選択性
前記ＲｅｔＳａｔの基質特異性を精製したレチノール異性体を用いて調べた。ＲｅｔＳａｔ発現性細胞を前記異種のレチノール異性体と共に一晩培養した。前記異性体は、順相ＨＰＬＣ分析により確認した場合、添加時点においては９５％以上純粋であった。しかしながら、一晩のインキュベーションの期間において、レチノールのシス−異性体はトランス異性体に変換され、その後、他のシス−レチノール異性体に戻り、これにより結果の解釈が複雑になった。オールトランスレチノールは、生成したオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの量（ピーク２、上部左）及び使用したオールトランスレチノール（ピーク４、図５、実線−灰色及び破線−黒トレースは形質移入されていないＲｅｔＳａｔ発現性細胞をそれぞれ表す）の量に基づくと、ＲｅｔＳａｔに対してかなり良い基質であった。全反応においてオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール生成物のみが形成され、シス異性体は全く検出されなかった。シス−レチノール異性体を用いた全アッセイにおいて、生成したオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの量は、前記反応において存在し且つ利用したオールトランスレチノールの量に相関する。その一方で、シス−レチノール基質の量は、ＲｅｒＳａｔ発現性（破線−黒トレース）又は形質移入していない細胞の一方において同一のままであった。この事実に基づくと、オールトランスレチノールは、ＲｅｔＳａｔに対して好ましい基質のようであった。シス−レチノール異性体と共に培養した細胞において見出された前記オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールは、前記シス−レチノール基質の自発的異性化に起因するオールトランスレチノールから生成されたものであった。
【０１７６】
図５は、マウスＲｅｔＳａｔの基質の異性体について示したものである。Ｔｅｔ−誘導性ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ細胞をレチノールの純粋な異性体と共に（ＨＰＬＣによる９５％を超える純度、培養前にアッセイした）一晩培養した。培養後、レチノイドを溶出し、順相ＨＰＬＣにより分析した。１３，１４−ジヒドロレチノールのほとんどの異性体の最大吸収が、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの最大波長である２９０ｎｍから５ｎｍ未満の相違があったため、１３，１４−ジヒドロレチノール異性体の生成を２９０ｎｍでモニターした（図示せず）。各パネルにおいて、矢印は、組織培養における一晩の培養の間に熱異性化により生成する前記基質を更なるレチノール異性体と区別するために調べた前記基質を指し示す。数は、吸収スペクトル、及び高純度の標準、具体的には、１３−シス−レチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール、９−シス−レチノール、オールトランスマインスレチノール、９，１３−ジ−シス−レチノール、及び１１−シス−レチノールの高純度の標準との比較に基づいて溶出したピークの同一性を指し示す。Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：３８３４〜３８４１，１９９９；Ｂａｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１０４２２〜１０４３２，  ２００４；  Ｉｍａｎｉｓｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６４：３７３〜３８３，２００４；Ｋｕｋｓａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ４３：２９５９〜２９８１，２００３；Ｃｈｏｕ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：２５２０９〜２５２１６，２００２；Ｄｕｅｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ  １４３〜１４４，２０１〜２１０，２００３。１３，１４−ジヒドロレチノールの異性体は、前記オールトランス異性体以外は全く検出されなかった。右下のパネルにおける保持時間は溶媒システムの変動のために、徐々に長くなっている。この実験は３回繰り返し行った。
【０１７７】
我々はまた、レチナール又はレチノイン酸がＲｅｔＳａｔにより飽和され、相当する１３，１４−ジヒドロレチナール又は１３，１４−ジヒドロレチノイン酸になるか否かを調べた。レチナール−オキシムの殆ど検出できない値及びレチノールの出現（ピーク３  図６Ａ）から明らかなように、レチナールは細胞との培養によりレチノールにほぼ完全に還元された。Ｒｅｔｓａｔ発現性細胞において、オールトランスレチノールをその後容易にオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール（図２、図６Ａ）に変換した。合成した１３，１４−ジヒドロレチナール−オキシム誘導体（波長最大値＝２９０ｎｍ）を同一のＨＰＬＣシステムで調べ、生成物溶出条件を確立した（図６Ｂ及び挿入図のスペクトル）。しかしながら、ジヒドロレチナール−オキシムは、レチナールで培養したＲｅｔＳａｔ発現性細胞中に全く検出されなかった（６〜８分の溶出時間  図６Ａ）。培養した細胞中でレチナールをレチノールに急激に変換した場合、ＲｅｔＳａｔの基質であることを決定的に確立することは可能ではなかった。
【０１７８】
図６は、オールトランスレチナールに対するＲｅｔＳａｔ活性について示す。（Ａ）ＲｅｔＳａｔ発現性細胞におけるレチナール変換の分析。Ｔｅｔ−誘導性ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ又は形質移入していない細胞を純度の高いオールトランスレチナール（ＨＰＬＣによると>９９％の純度、培養前にアッセイした）を一晩培養した。培養後、ヒドロキシルアミンでレチナールを誘導体化し、溶出し、順相ＨＰＬＣにより分析した。１３，１４−ジヒドロレチナールのシン及びアンチ−オキシムの存在を２９０ｎｍでモニターした（注入後６〜８分後と予想）。ピーク数は、１３−シス−レチノール、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール及びオールトランスレチノールを表す。Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：３８３４〜３８４１，１９９９；Ｂａｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１０４２２〜１０４３２，２００４；Ｋｕｋｓａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ４３：２９５９〜２９８１，２００３。（Ｂ）ヒドロキシアミンを用いて誘導化した１３，１４−ジヒドロレチナールの合成の基準を生成物溶出プロファイルを確立するため順相のＨＰＬＣにより調べた。挿入図は、１３，１４−ジヒドロレチナール−オキシムの異種の異性体の図を示す。
【０１７９】
レチノイン酸での細胞培養によれば、ＲｅｔＳａｔによる飽和のための基質ではないことが示唆される（図７Ａ）。合成した１３−１４−ジヒドロレチノイン酸基準をそれらの溶出条件を確立するために調べた（図７Ｂ）。１３−シスレチノイン酸（ピーク１、図７Ａ）は、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイン酸（ピーク７、図７Ｂ）と共溶出するが、前記２つの化合物の吸収スペクトル（図７Ａ及びＢ挿入図）は、異なり、それにより我々は１３，１４−ジヒドロレチノイン酸はレチノイン酸で培養されたＲｅｔＳａｔ発現性細胞中で検出され得ないと結論できる。
【０１８０】
図７は、オールトランスレチノイン酸に対するＲｅｔＳａｔ活性を示す。（Ａ）ＲｅｔＳａｔ発現性細胞中のレチノイン酸変換の分析。Ｔｅｔ−誘導性ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ又は形質移入していない細胞を純度の高いオールトランスレチノイン酸（ＨＰＬＣによる>９０％の純度、培養の前にアッセイした）を一晩培養した。培養後、レチノイン酸を溶出し、逆相ＨＰＬＣシステムＩＩにより分析した。１３，１４−ジヒドロレチノイン酸異性体の存在を２９０ｎｍでモニターした（注入後２５〜３０分と予想）。ピーク数は、１３−シス−レチノイン酸、９，１３−ジ−レチノイン酸、９−シス−レチノイン酸及びオールトランスレチノイン酸を表す。Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：３８３４〜３８４１，１９９９；Ｂａｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１０４２２〜１０４３２，２００４；Ｋｕｋｓａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ４３：２９５９〜２９８１，２００３；Ｉｍａｎｉｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １６４：３７３〜３８３，２００４。（Ｂ）１３，１４−ジヒドロレチノイン酸の合成の基準の異性の混合物を生成物溶出プロファイルを確立するために逆相ＨＰＬＣシステムＩＩにより調べた。挿入図は、１３，１４−ジヒドロレチノイン酸の異種の異性体のスペクトルを示す。星印（＊）は、無関係な化合物を示す。この実験を三つ組で行い、繰り返し行った。
【０１８１】
熱異性化を回避するために、前記基質を、更なる共同因子を伴う或いは伴わないホモジナイズしたミクロソームＲｅｔＳａｔ膜中で調べた。ＲｅｔＳａｔ発現性細胞由来の膜ホモジネートをオールトランスレチノールで培養し、その反応の生成物を順相ＨＰＬＣにより調べた。図８の実線−黒トレースのラベル２と付したその溶出ピークにより示唆されるように、生成したオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールは、ほとんどなかった。還元したジヌクレオチド共同因子であるＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの添加は、前記反応の収量に何ら影響がなかった。対照に関しては、形質移入していない細胞（灰色トレース）由来の膜、及びＲｅｔＳａｔ発現性細胞（破線−黒トレース）由来の膜は、何ら活性を示さなかった。細胞をホモジナイズすると、酸化還元状態に影響が及ぶこと或いは重要な共同因子の喪失によりＲｅｔＳａｔの活性が破壊された。インビトロＲｅｔＳａｔの低活性は、ＣＲＴＩＳＯ及びフィトエンデサチュラーゼの十分な不安定性を考慮すると、驚きではない。Ｐａｒｋ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  １４：３２１〜３３２，２００２；Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ４９：５５７〜５８３，１９９８。
【０１８２】
図８は、ホモジナイズした細胞中のＲｅｔＳａｔ活性を示す。形質移入していない細胞（実線−灰色トレース）又はＴｅｔ−誘導性ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ細胞（実線−黒トレース）をホモジナイズし、オールトランスレチノール基質で培養し、引き続きレチノイド溶出、順相ＨＰＬＣ分析を行った。その溶出プロファイルを２９０ｎｍでオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールに関してモニターした。対照サンプル（破線−黒トレース）において、ＨＥＫＫ−ＲｅｔＳａｔ細胞由来の細胞ホモジネートを基質での培養の前に、１０分間９５℃で煮沸した。０．４ｍＭのＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨの添加は、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの収率に何ら影響を与えなかった。この実験を２つ組で行った。  
実施例８
【０１８３】
オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールは正常食事で維持された動物のいくつかの組織において検出される
肝臓及び腎臓などの主要な器官におけるＲｅｔｓａｔが存在によって、本発明者らはオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールが組織内に検出されるかどうかを検討した。オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイドは、マウス肝臓及び腎臓、及びウシ網膜及びＲＰＥの順相ＨＰＬＣ解析によって容易に検出された（図９）。オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノイドは、そのＵＶ吸収スペクトル及びクロマトグラフィー保持時間（その用量はそれらの合成化合物にマッチした）に基づいて認識した。１３−ｃｉｓ−レチノール（ピーク１）、９，１３−ジ−ｃｉｓ−レチノール（ピーク２）、オールトランスレチノール（ピーク３）、及び１１−ｃｉｓ−レチノール（ピーク４）（図９）などのレチノール異性体は、利用可能な標準及びＵＶ吸収極大に基づいて検出し認識した。本発明者らは、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールは微量ではあるが、正常の食事（ビタミンＡを添加されていない）で維持された動物からのテストされた多くの組織において容易に検出可能なレチノイドであるという結論を得た。
【０１８４】
図９は、様々な組織におけるオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの同定を示している。レチノイドは、マウス肝臓（０．３ｇ、上部左パネル）、腎臓（０．２ｇ、上部右パネル）、ウシ網膜（０．２ｇ、下部左パネル）及びＲＰＥ（０．２ｇ。下部右パネル）から抽出し、順相ＨＰＬＣによってテストした。１３，１４−ジヒドロレチノールの溶出は２９０ｎｍでモニタリングした。この保持時間及び吸収スペクトルに基づいて、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールに一致するピークは、テストした全ての組織において同定され、順相ＨＰＬＣ上で１３−ｃｉｓ−レチノール（１）と９，１３−ジ−ｃｉｓ−レチノール（２）の間のそれを溶出した。オールトランスレチノール（３）及び１１−ｃｉｓ−レチノール（４、ウシ網膜及びＲＰＥ）に一致する他のピークも同定した。この実験は異なる動物の組織から二つ組で実行した。オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの収率は、ＨＰＬＣ解析の前の抽出物のけん化よりもわずかに高かった（<１０％）。  
実施例９
【０１８５】
ＲＰＥミクロソーム及びＨＥＫＫ−ＬＲＡＴ細胞におけるオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールのエステル化
ＬＲＡＴは、オールトランスレチノールをオールトランスレチニルエステルへ変換し、それによりその利用可能性及び吸収をコントロールしている（Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４：３８３４−３８４１，１９９９；Ｂａｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：１０４２２−１０４３２，２００４）。オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの代謝をより理解するために、本発明者らは、ＲＰＥに存在する、若しくは以前に公開された手順（Ｋｕｋｓａ，ｅｔ  ａｌ．Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓ  ４３：２９５９−２９８１，２００３）に従って形質移入された細胞において発現されるＬＲＡＴによってエステル化するかどうかアッセイした。本発明者らは、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールは、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチニルエステルに変換されることによって、オールトランスレチノールと同程度にＬＲＡＴのよい基質であることを発見した（図１０）。これは、両生類ＲＰＥによるオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールのエステル化と一致していた（Ｌａｗ，ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １１０：５９１５−５９１７，１９８８）。これにより、本発明者らは、エステル化はオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールに対する代謝／貯蔵経路であると結論付け、これはｉｎ  ｖｉｖｏで確証されるべきである。
【０１８６】
図１０はＬＲＡＴ活性を示したものである。２ナノモルのレチノールをＲＰＥミクロソーム及びホモジナイズしたＨＥＫＫ−ＬＲＡＴ細胞と１０分間インキュベートした。エステルの産生は、３２５ｎｍ（オールトランスレチノール（黒色棒））及び２９０ｎｍ（オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール（灰色棒））で吸収を測定するＨＰＬＣによって測定した。タンパク質濃度は同等化しなかった。１０分間９５℃で煮沸したタンパク質での対照では活性は観察されなかった。実験は三つ組で実行した。  
実施例１０
【０１８７】
Ｒｅｔｓａｔはオールトランスレチノールの１３−１４二重結合の飽和を触媒する
この報告で示された発見は、本発明者らがビタミンＡの代謝における新規で潜在的に重要な経路を発見したことを意味していた。新規酵素であるＲｅｔｓａｔは、新しい活性、すなわちオールトランスレチノールの１３−１４二重結合の飽和を触媒する。Ｒｅｔｓａｔ反応の産生物であるオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールは、最初ｉｎ  ｖｉｖｏで検出された。前記オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノール代謝産物は生理活性物質である、若しくは他の生理活性化合物を導く可能性があり、或いは、代謝経路の一部である可能性があった。Ｒｅｔｓａｔの活性を変えるその酵素及び反応は現在同定されているため、本発明者らはその役割及びｉｎ  ｖｉｖｏでのオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの役割を研究した。
【０１８８】
脊椎動物（１３，１４）−オールトランスレチノールサチュラーゼ（ｓａｔｕｒａｓｅ）：古代酵素。Ｒｅｔｓａｔに加えて、レチノイドプロセシングに関与する酵素、例えばＲＡＬＤＨやＣＹＰ２６、及び他のレチノイン酸受容体（ＲＡＲ）は、原始的脊索動物、ホヤ類Ｃｉｏｎａｉｎ  ｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ及びＣｉｏｎａ  ｓａｖｉｇｎｙｉのドラフトゲノム配列の翻訳において見出すことができる（Ｄｅｈａｌ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：２１５７−２１６７，２００２）。ホヤ類オタマジャクシ−幼生は、脊索及び背部管神経索（脊椎動物オタマジャクシと類似）を含み、脊索動物祖先の優れた近似であると考えられている。脊索動物におけるボディープランを構築する体軸の獲得はＲＡ及び発生を制御するその核内受容体の革新と一致している。ＲＡＲｓは非脊索動物においては発見されなかった（Ｆｕｊｉｗａｒａ，ｅｔ  ａｌ．Ｚｏｏｌｏｇ  Ｓｃｉ  ２０：８０９―８１８，２００３）。推定上のホヤ類Ｒｅｔｓａｔの同定によって、レチノールの１３−１４二重結合の飽和で始まる経路の潜在的な重要性が強調された。レチノイド代謝が進化したように、脊椎動物代謝では、新規機能を有する新しい代謝産物を創造するために、存在する酵素、可能性としては古代フィトエンデヒドロゲナーゼを改変した。
【０１８９】
カロチノイド及びレチノイド修飾酵素は、それらの基質の高度に関連した特性によって決定された多くの特徴を共有している。植物からの９−ｃｉｓ−ネオキサチン切断酵素であるＶＰ１４は、ハエからのβ，β−カロチン−オキシゲナーゼＢＣＯ−Ｉ及び−ＩＩであるｎｉｎａＢ（及び脊椎動物から）と類似している（Ｇｉｕｌｉａｎｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉ  ８：１４５−１４９，２００３）。カロチノイド切断酵素に関連する別の脊椎動物タンパク質はＲＰＥ６５であり、これは視覚サイクルの重要な工程である１１−ｃｉｓ−レチノールの産生に対して重要なものである（Ｒｅｄｍｏｎｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０：３４４−３５１，１９９８）。レチニルエステルと結合することが示されたが、触媒的役割もその原因ではなかったので、ＲＰＥ６５の機能は明らかではない（Ｍａｔａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：６３５−６４３，２００４）。脊椎動物において、Ｐ４５０酵素であるＣＹＰ２６Ａ１及びＢ１はレチノイン酸（ジテルペノイド）をヒドロキシル化された代謝産物へ変換する（Ｆｕｊｉｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  １６：４１６３−４１７３，１９９７；Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９７：６４０３−６４０８，２０００）。植物からの非常に関連したＰ４５０酵素は、アブシジン酸、植物生活環を制御するセスキテルペンホルモン、及びタキソール（植物ジテルペノイド）をヒドロキシル化する（Ｓａｉｔｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １３４：１４３９−１４４９，２００４；Ｋｕｓｈｉｒｏ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２３：１６４７−１６５６，２００４）。この活性に基づいて、Ｒｅｔｓａｔは、カロチノイドデサチュラーゼ（フィトエンデサチュラーゼＰｄｓ、Ｚｄｓ及びＣｒｔＩ）に関連するレチノイド−サチュラーゼであり、一次アミノ酸配列はカロチノイド異性化酵素であるＣＲＴＩＳＯに関連するものである。  
実施例１１
【０１９０】
Ｒｅｔｓａｔ酵素の構造解析
脊椎Ｒｅｔｓａｔファミリータンパク質の配列解析によって、以下のジヌクレオチド結合モチーフ：Ｕ４Ｇ（Ｇ／Ａ）ＧＵＸＧＬ（Ｘ２）（Ａ／Ｓ）（Ｘ２）Ｌ（Ｘ６−１２）ＵＸ（Ｌ／Ｖ）ＵＥ（Ｘ４）ＵＧＧ（Ｘ９−１３）（Ｇ／Ｖ）（Ｘ３）（Ｄ／Ｅ）ＸＧが明らかになり、ここではＵは疎水性残基でありＸはあらゆる残基である（Ｗｉｅｒｅｎｇａ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １８７：１０１−１０７，１９８６；Ｂｕｅｈｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ８２：５６３−５８５，１９７４）。このモチーフを有する多くのタンパク質は、モノアミン酸化酵素、プロトポルフィリノーゲン酸化酵素、及び多くのフィトエンデヒドロゲナーゼを含み、ＦＡＤ及び他のものによって、若しくはＮＡＤ或いはＮＡＤＰによって刺激されることが示された（Ｒａｉｓｉｇ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１９：５５９−５６４，１９９６；Ａｌ−Ｂａｂｉｌｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｌａｎｔ  Ｊ  ９：６０１−６１２，１９９６；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ  １０：１７５−１７９，１９９７）。Ｒｅｔｓａｔの配列における推定上のジヌクレオチド結合モチーフの存在は、二重結合の飽和は還元補助因子（ＮＡＤ（Ｐ）Ｈ或いはＦＡＤＨ２）からの水素化物（Ｈ−）イオン及び溶液からのプロトンの転移を介して行われるということ主張するものとなる。これは、ホモジナイズされた細胞、すなわち酸化還元状態が変わっている細胞におけるＲｅｔｓａｔの不安定な性質を説明するものである。
【０１９１】
本発明者らは、マウスＲｅｔｓａｔが膜関連性であり形質転換細胞のＥＲ区画に局在しているように見えることを示した。切断可能なシグナル配列はタンパク質アミノ末端で容易に同定され、これはこのタンパク質がＥＲ膜を標的としていることを示唆している。加えて、５６８から５８８残基までの疎水性アミノ酸の伸長は、膜貫通ドメインの強力な候補である。  
実施例１２
【０１９２】
生物学的システムにおける１３，１４−ジヒドロレチノール
例えば９−ｃｉｓ−１３，１４−ジヒドロレチノイン酸及びそのタウリン共役型である９−ｃｉｓ−ｏｘｏ−１３，１４−ジヒドロレチノイン酸などの飽和１３−１４二重結合を有するレチノイドは、それぞれ９−ｃｉｓ−レチノイン酸或いはレチニルパルミチン酸を補充された動物において以前に同定されている（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ  ２４：２９３−３０２，１９９６；Ｓｃｈｍｉｄｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １５８３：２３７−２５１，２００２）。別の飽和オールトランス１３，１４−ジヒドロキシ−レチノールは、レチノール処理されたリンパ芽球腫５／２細胞において検出され、リンパ球の増殖を支持することが示された（Ｄｅｒｇｕｉｎｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７０：１８８７５−１８８８０，１９９５）。Ｒｅｔｓａｔ触媒性飽和反応は、基質としてはオールトランスレチノールが好ましく、これはオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの特異的合成を導くものである。本明細書において本発明者らは、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールが非補充動物において検出可能であることを示した（図９）。正常食餌で維持された或いは生理学的レベルの標識前駆体を受けている動物においてｉｎ  ｖｉｖｏで代謝産物の存在を示すことが好ましい。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのこのレチノイドの最初の報告である。将来の研究では、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールが生物活性を有するかどうか、或いは他の活性化合物へ代謝されたものなのかどうかを調べる予定である。オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールがオールトランスレチノールの分解産物であることは可能であるが、レチノール及びレチノイン酸は酸化を介して極性代謝産物へ分解するので、本発明者らは、これは起こりそうもないと見出した。レチノールの代謝に関与しているが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの正確な役割は未だ確立されていない。  
実施例１３
【０１９３】
植物及び脊椎動物酵素の間の関係：生産的経路の発見
カロチノイド及びレチノイドは、生物学において重要な役割を果たしている。それらのユニークな光吸収性特性によって、カロチノイドは光合成及び光保護を仲介することができ、レチノイドは視覚発色団を形成することができる。アブシシン酸及びレチノイン酸で見られるように、代謝産物を介してそれらは遺伝子発現も制御することができる。カロチノイドの唯一の天然源（それ故レチノイドも）は、植物及び光合成細菌である。脊椎動物はカロチノイド或いはレチノイドを合成しないにも関わらず、脊椎動物はそれらを形質転換することができ、ユニークな一連の代謝産物を産生する。カロチノイド及びレチノイドプロセシングに関連する脊椎動物酵素は、恐らく既存のテルペノイド修飾酵素の基質スイッチングによって、若しくは動物、植物及び光合成細菌の共通の祖先から受け継がれた祖先遺伝子を再活性化することによって、展したのであろう。植物及び脊椎動物酵素の間の関係を研究することは、生産的経路の発見になるであろう。カロチノイド及びレチノイド生化学の両方において、２つのフィールドのクロス受精を介して新しいレベルの理解を得ることができる。  
実施例１４
【０１９４】
材料及び方法
ｉｎ  ｖｉｖｏでのレチノイドの代謝
全ての動物実験は、ワシントン大学によって許可された手順を使用しており、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｅｎｔｈａｎａｓｉａの推奨及びＡｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  Ｖｉｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙの推奨と一致している。動物は１２時間明−１２時間暗サイクルで維持した。全ての操作は薄暗い赤色光或いは赤外光（>５６０ｎｍ）下で行った。ほとんどの実験は、６〜１２週齢マウスを使用した。Ｌｒａｔ−／−マウスは以前に記載されたように遺伝子型を同定した（Ｂａｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０４２２−１０４３２，２００４）。動物は、経口的な経管栄養の１時間前まで調節固形飼料食餌で維持した。適切な量のオールトランスＲＯＬパルミチン酸、オールトランスＤＲＯＬ、或いはオールトランスＲＡを野菜油に溶解し、解析の３時間前に経口的な経管栄養によって投与した。
【０１９５】
レチノイドの解析
レチノイド経管栄養したマウス或いは未処理マウスからの肝臓（１ｇ）を２ｍｌの１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ及び１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）において３０秒、Ｐｏｌｙｔｒｏｎホモジナイザーを用いてホモジナイズした。１０μｌの５Ｍ  ＮａＯＨを３ｍｌのエタノール抽出液に添加し、非極性レチノイドを５ｍｌのヘキサンを用いて抽出した。その抽出を繰り返し、有機相を混合し、順相カラムを用いた順相ＨＰＬＣ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  Ｓｉ  ５μｌ、４．６ｘ２５０ｍｍ）によってテストした。その溶出条件は、流速１．４ｍｌ／分で２５分、２０℃でのヘキサン（ｖ／ｖ）における１０％酢酸エチルの均一濃度溶媒システムであり、これはそれぞれ非極性レチノイド及び１３，１４−ジヒドロレチノイドに対して３２５ｎｍ及び２９０ｎｍで検出した。水相は４０μｌの１２Ｎ  ＨＣｌで酸性化し、極性レチノイドを５ｍｌのヘキサンで抽出した。その抽出を繰り返し、前記極性レチノイド抽出物の有機相を混合し、乾燥させ、８０％のＣＨ３ＣＮ、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、１％アセチル酸で構成された溶媒に再懸濁し、逆相ＨＰＬＣによってテストした。組織からの極性レチノイドの解析は、狭穿孔（ｎａｒｒｏｗｂｏｒｅ）、１２０Å、５μｍ、２．１ｘ２５０ｍｍ、Ｄｅｎａｌｉ  Ｃ１８カラム（Ｇｒａｃｅ−Ｖｙｄａｃ，Ｈｅｓｐｅｒｉａ，ＣＡ）を用いた逆相ＨＰＬＣによって実行した。溶媒システムは、バッファーＡ（８０％メタノール、２０％  ３６ｍＭ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．７アセチル酸で調整））、及びバッファーＢ（１００％メタノール）から成る。ＨＰＬＣ溶出条件は０．３ｍｌ／分、１００％バッファーＡで４０分、１００％バッファーＢで１０分、及びバッファーＡにおける平衡で１０分であった。ＲＡ及びＤＲＡの溶出プロファイルは、それぞれ３５０ｎｍ及び２９０ｎｍにセットしたオンラインダイオードアレイ検出器を用いてモニターした。そのピークはそれらのＵＶ可視スペクトル及び／若しくは合成或いは商業的に利用可能な基準での共溶出に基づいて同定した。吸光度の測定領域は、既知量のオールトランスＲＡ或いはａｌｌ−ｔｒａｎｓＲＰＬ（Ｓｉｇｍａ）及びオールトランスＤＲＯＬ或いはオールトランスＤＲＡ（合成標準）を用いたＨＰＬＣカラムの較正に基づいて、ピコモルへ変換した。抽出効率は、［３Ｈ］ＲＡ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）で組織試料をスパイクし、ＨＰＬＣカラムから回収した放射能をモニタリングすることによってモニターした。肝臓試料の場合において、抽出効率は９５％或いはそれ以上であった。合成レチノイド及びＨＰＬＣで精製された天然レチノイドの質量分析解析は、ＫｒａｔｏｓプロファイルＨＶ−３ダイレクトプローブ質量分析器を用いて実行した。
【０１９６】
１３，１４−ジヒドロレチノイドの合成及び解析
合成スキームは図１７に示した。β−イオノン（Ｉ）はまず、ＣＣｌ４におけるＮ−ブロモサクシニミドでブロモ化し、ヘキサメチルホスホラミドにおけるアセトキシル基での臭素の置換を行った。イオノンのエステル酢酸は、メタノール：水におけるＫ２ＣＯ３で加水分解し、次にヒドロキシル基をテトラ−ブチルジメチルシリル基で保護した。シリル化された４−ヒドロキシ−イオノン（ＩＩ）は、トリエチルホスホノアセテートによってＨｏｒｎｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ条件下で凝縮させ、シリル−保護性エチル４−ヒドロキシ−β−イオニリデンアセテートのエステルは、ＬｉＡｌＨ４でアルコールへ還元した。アルコールはＮ，Ｎ−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下において無水酢酸でアセチル化し、シリル基をテトラブチルアンモニウムフルオライドによって除去し、アルコールをＭｎＯ２によってケトン基へ酸化し、１５−アセトキシ−４−オキソ−β−イオニリデンエタノール（ＩＩＩ）が生じた。次にエステル（ＩＩＩ）を加水分解し、ヒドロキシル基をエーテルにおいてＰＢｒ３でブロモ化した。その臭化物をＰＰｈ３と反応させ、Ｗｉｔｔｉｇ塩（ＩＶ）を生じさせ、さらに以前に記載した条件下においてエチル４−オキソ−３−メチルブチレートで濃縮し、主要化合物としてオールトランスを有するエチル１３，１４−ジヒドロ−４−オキソレチノエートアイソマー（Ｖ）の混合物を得た（Ｍｏｉｓｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０２３０−５０２４２，２００４）。前記アイソマーは、順相ＨＰＬＣによって分離し（ＨＰ１１００，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｕｌｔｒａｓｐｈｅｒｅ  Ｓｉ  ５μ，１０ｘ２５０ｍｍ，５％エチル酢酸：ヘキサン、及び３２５ｎｍで検出）、それらのＵＶ、質量、及びＮＭＲスペクトルによって特徴付けを行った。ＮＭＲデータは、内部標準としてＣＤＣｌ３を用いたＢｒｕｋｅｒ  ５００−ＭＨｚ分光計上に記録し、それらの化学的シフト値は表１に記載した。溶出の順番は以下の通りである：９，１１−ジ−ｃｉｓ−、オールトランス、９−ｃｉｓ、１１−ｃｉｓ−１３，１４−ジヒドロ−４−オキソレチノエート。遊離レチノイン酸（ＩＶ）を得るために、エチルエステルをエタノール：Ｈ２ＯにおいてＮａＯＨで加水分解した。１３，１４−ジヒドロ−ＲＡＬ（ＤＲＡＬ）を得るために、以前調製したエチル１３，１４−ジヒドロレチノエートを−７８℃にてジイソブチルアルミニウム水素化物で還元した。オールトランス４−オキソ−ＤＲＡは、以下のＵＶ−可視吸収スペクトル；エタノールにおいてλｍａｘ＝３２８ｎｍでλ＝２５６ｎｍでショルダー、ヘキサンにおいてλｍａｘ＝３１４ｎｍでλ＝２５２ｎｍでショルダー、を有する。
【０１９７】
クローニング及び発現コンストラクト
総胚及び肝臓ＲＮＡをＡｍｂｉｏｎ（Ａｕｓｔｉｎ、テキサス州）から入手し、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）及びオリゴ（ｄＴ）プライマーを用いて取扱説明書の手順に従って逆転写を行った。胚ｃＤＮＡを特異的遺伝子のｃＤＮＡを増幅するために使用し、その際、Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）及び以下のプライマー：
ＲＡＬＤＨ１；フォワード５’−ＣＡＣＣＧＣＡＡＴＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＣ、及びリバース５’−ＧＣＴＧＧＣＴＴＣＴＴＴＡＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣ；
ＲＡＬＤＨ３；フォワード５’−ＣＡＣＣＴＧＣＧＡＡＣＣＡＧＴＴＡＴＧＧＣＴＡＣＣ、及びリバース５’−ＧＣＣＴＧＴＴＣＣＴＣＡＧＧＧＧＴＴＣＴＴ；
ＣＹＰ２６Ｂ１；フォワード５’−ＣＡＣＣＡＡＧＣＧＧＣＴＧＣＣＡＡＣＡＴＧＣ、及びリバース５’−ＧＣＴＧＡＧＡＣＣＡＧＡＧＴＧＡＧＧＣＴＡ；及び
ＣＹＰ２６Ｃ１；フォワード５’−ＣＡＣＣＣＡＴＴＣＴＣＧＣＣＡＴＧＡＴＴＴＣＣＴ、及びリバース５’−ＣＣＡＡＧＧＣＴＡＧＡＧＡＡＧＣＡＡＣＧ、を使用した。ＲＡＬＤＨ２（ＭＧＣ：７６７７２，ＩＭＡＧＥ：３０４７１３２５）、ＲＡＬＤＨ４（ＭＧＣ：４６９７７，ＩＭＡＧＥ：４２２３０５９）、及びＣＹＰ２６Ａ１（ＭＧＣ：１３８６０，ＩＭＡＧＥ：４２１０８９３）ｍＲＮＡの完全長ｃＤＮＡは、Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＭＧＣ：哺乳類遺伝子コレクション）から入手した。これらのクローンを鋳型として使用しそれぞれのｃＤＮＡｓを増幅した。その際、Ｈｏｔｓｔａｒｔ  Ｔｕｒｂｏ  Ｐｆｕポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、カリフォルニア州）及び以下のプライマー：
ＲＡＬＤＨ２，フォワード５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＣＣＴＣＧＣＴＧＣＡＧＣＴＣＣＴＧＣ、及びリバース５’−ＧＧＡＧＴＴＣＴＴＣＴＧＧＧＧＧＡＴＣＴＴＣＡ；
ＲＡＬＤＨ４，フォワード５’−ＣＡＣＣＴＧＴＡＣＡＣＡＧＡＧＧＧＣＡＣＴＴＴＣＣ、及びリバース５’−ＧＴＡＴＴＴＡＡＴＧＧＴＡＡＴＧＧＴＴＴＴＴＡＴＴＴＣＡＧＴＡＡＡＧ；及び
ＣＹＰ２６Ａ１，フォワード５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＧＧＣＴＣＣＣＧＧＣＧＣＴＧＣＴ、及びリバース５’−ＧＡＴＡＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＴＧＧＧＴＡＡＡＴ、を使用した。ＲＡＬＤＨ１、−２、−３及び−４、及びＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１及び−Ｃ１に対するｃＤＮＡは、ＣＭＶプロモーターの制御下でｐｃＤＮＡ３．１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯベクターにクローン化し、Ｃ−末端Ｖ５エピトープペプチド（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）及びＨｉｓ６タグ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を融合させた組換えタンパク質を発現した。前記発現コンストラクトの両鎖は配列決定し、変異が存在しないことを確かめた。
【０１９８】
マウスＲＸＲ−αは、逆転写したマウス肝臓ｃＤＮＡからプライマー；５’−ＧＧＧＣＡＴＧＡＧＴＴＡＧＴＣＧＣＡＧＡ及び５’−ＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＡを用いてクローニングした。ＲＸＲ−αオープンリーディングフレームは次に、ＣＭＶプロモーターの制御下でプライマー；５’−ＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＣＡＡＡＣＡＴＴＴＣＣＴ及び５’−ＡＧＣＴＧＡＧＣＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣを用いて、ＡｐｃＤＮＡ３．１  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ  ＴＯＰＯベクターにサブクローニングした。ＲＸＲ（２）半透明レポーターベクター（Ｐａｎｏｍｉｃｓ，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州）からのＲＸＲＥは、５’−ＣＴＣＡＡＣＣＣＴＡＴＣＴＣＧＧＴＣＴＡＴＴＣＴ及び５’−ＡＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＴＴＡＴＡＴＡＣＣＣＡを用いて増幅し、最小プロモーター及びｐＢＬＵＥ−ＴＯＰＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のβ−ガラクトシダーゼオープンリーディングフレームの上流にクローン化し、ｐＲＸＲＥ−ＢＬＵＥ発現コンストラクトを作成した。このコンストラクトは、β−ガラクトシダーゼの上流に５連続ＤＲ１成分を配置し、その発現はＲＸＲの活性化及びＲＸＲホモダイマーの形成に依存するものである。全コンストラクトの両鎖を配列決定し、変異が存在しないことを確認した。
【０１９９】
肝臓アルコールデヒドロゲナーゼを用いたオールトランスＲＯＬ及びオールトランスＤＲＯＬの酸化
ウマ肝臓ＡＤＨ（ＥＣ１．１．１．１［ＥＣ］）は、Ｓｉｇｍａから入手し、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）において５ユニット／ｍｌ（８．６ｍｇ／ｍｌ）の濃度に溶解した。ＮＡＤ及びＮＡＤＰを各１０ｍＭの濃度で共に混合した（１：１）。基質溶液である２μｌの２ｍＭストックのオールトランスＲＯＬ或いはオールトランスＤＲＯＬ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドにおける）を、２０μｌの１０％ウシ血清アルブミン、２０μｌのＡＤＨ、２μｌの補助因子混合物、及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）を含有する１．５ｍｌのエッペンドルフチューブへ総容積２００μｌまで添加した。前記溶液を３７℃で６０分インキュベートし、その後５０μｌの０．８Ｍ  ＮＨ２ＯＨ溶液（ｐＨ７．０）を添加し、３００μｌのメタノールを添加し、室温で１５分置き、３００μｌのヘキサンで抽出した。有機相を乾燥させ、組織試料から抽出された非極性レチノイドの解析において記載したように順相ＨＰＬＣによって解析した。非酵素的反応に対する対照として、補助因子を含む或いは含まない煮沸タンパク質（９０℃で５分）を使用した。
【０２００】
ＲＡＬＤＨ酸化アッセイ
Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ−陰性ＨＥＫ−２９３Ｓ細胞は、Ｇ．Ｋｈｏｒａｎａ博士（Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｓｔｏｎ）より寄贈され、ダルベッコ変法イーグル培地、１０％ウシ胎仔血清において培養し、３７℃、５％ＣＯ２、１００％湿度で維持した（Ｒｅｅｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１３４１９−１３４２４，２００２）。ＲＡＬＤＨ酵素アッセイに対して、細胞は、取扱説明書の手順に従って、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いてＲＡＬＤＨ１、−２、−３、或いは−４発現コンストラクトで一過性に形質移入させた。形質移入４８時間後、前記細胞を剥離させ回収し、遠心分離を行った。細胞ペレットは、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ及び１０ｍＭリン酸（ｐＨ７．４）で洗浄し、２５０ｍＭスクロースを含有する５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．０）に再懸濁し、Ｄｏｕｎｃｅホモジナイザーを活用してホモジナイズした。補助因子を５ｍＭ  ＮＡＤ、５ｍＭ  ＮＡＤＰ及び１ｍＭ  ＡＴＰの最終濃度へ添加した。一定量の細胞溶解液を９５℃で１０分間煮沸し、非酵素的反応に対する対照を提供した。オールトランスＲＡＬの形態或いはＤＲＡＬの異性体の混合物における基質は、前記細胞溶解液へ６０μＭの最終濃度で添加した。前記反応は３７℃で２時間振盪しながら進め、２容量のＣＨ３ＣＮの添加によって停止させた。試料は室温で３０分、１００ｍＭのＮＨ２ＯＨ（１Ｍ（ｐＨ７．０）の新鮮に作成したストックからの最終濃度）で処理し、１２，０００ｘｇで１０分遠心分離した。透明な上清を０．１容量の０．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．０）で酸性化し、８０％ＣＨ３ＣＮ、１０ｍＭ酢酸アンモニウム、１％アセチル酸の均一濃度移動相Ａを有し，流速１．６ｍｌ／分で１５分保った逆相ＨＰＬＣシステム（Ｚｏｒｂａｘ  ＯＤＳ，５μｍ、４．６ｘ２５０ｍｍ；Ａｇｉｌｅｎｔ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，カリフォルニア州）でテストした。各ランの後、カラムは混合液Ｂ（６０％  ｔｅｒｔ−ブチルメチルエーテル、４０％  メタノール）で１０分間、１．６ｍｌ／分で洗浄し、相Ａにおける再平衡を行った。ＲＡ及びＤＲＡ異性体の溶出は、それぞれ３４０及び２９０ｎｍでモニターした。ピークはそれらのスペクトル及び標準との共溶出に基づいて同定した。細胞溶解液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び抗Ｖ５エピトープモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＶ５エピトープ標識組換えタンパク質の免疫ブロットによって、ＲＡＬＤＨ１〜４の発現をテストした。
【０２０１】
ＣＹＰ２６Ａ１酸化アッセイ
Ｎ−アセチルグルコ明ミニルトランスフェラーゼＩ−陰性ＨＥＫ−２９３Ｓ細胞は、取扱い説明書の手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＣＭＶプロモーターの制御下においてＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１及び−Ｃ１のｃＤＮＡｓで一過性に形質移入させた。２４時間後、形質移入細胞は１２ウェルプレートへ分配し、各アッセイウェルにおいて同じ数の形質移入細胞が入っているか確かめた。オールトランスＲＡ或いはオールトランスＤＲＡは、完全培地において０．１ｍＭ最終濃度で細胞単層へ添加し、４時間インキュベートした。培地及び細胞は剥離によって回収し、タンパク質は勢いよくボルテックスすることによって等量のＣＨ３ＣＮで沈殿させ、１２，０００ｘｇで１０分遠心分離した。ＲＡ解析に対して、透明な上清は０．１容量の０．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．０）で酸性化し、ＲＡＬＤＨアッセイで記載されたような逆相ＨＰＬＣによってテストした。オールトランスＲＡ、オールトランスＤＲＡ、及びそれらの酸化代謝産物の溶出液は、３４０及び２９０ｎｍでモニターした。ピークはそれらのスペクトル及び標準との共溶出に基づいて同定した。細胞溶解液は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び抗Ｖ５エピトープモノクローナル抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いたＶ５エピトープ標識組換えタンパク質の免疫ブロットによって、ＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１、及び−Ｃ１の発現に対してテストした。
【０２０２】
ＲＰＥにおけるＤＲＡへのＤＲＯＬの変換
ＵＶ処理ＲＰＥミクロソームは以前記載されたように調製した（Ｓｔｅｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：８５７７−８５８５，１９９９）。２０μｌのＵＶ処理ＲＰＥミクロソーム（３ｍｇ／ｍｌ）は、２０μＭ  ＤＲＯＬ或いはＲＯＬ基質、１％ウシ血清アルブミン、及び５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．８）と混合させ、各５０μＭのＮＡＤ及びＮＡＤＰ補助因子を含む或いは含まないで、３７℃で６０分インキュベートした。反応を停止するために、タンパク質は等量のＣＨ３ＣＮと混合することによって沈殿させ、高速遠心分離を行った。透明な上清は、０．１容量の０．５Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ４．０）で酸性化し、ＲＡＬＤＨアッセイで記載したような逆相ＨＰＬＣによってテストした。煮沸ＲＰＥ膜対照は、ＤＲＯＬの非酵素的変換をアッセイするために使用した。オールトランスＤＲＯＬ代謝産物の溶出液は２９０ｎｍでモニターした。
【０２０３】
ＲＡＲＥ及びＲＸＲＥ活性化アッセイ
ＲＡＲＥレポーター細胞株Ｆ９−ＲＡＲＥ−ｌａｃＺ（ＳＩＬ１５−ＲＡ）は、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｗａｇｎｅｒ博士（Ｓｔａｔｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｄｏｗｎｓｔａｔｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）及びＰｅｔｅｒ  ＭｃＣａｆｆｅｒｙ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ，Ｅ．Ｋ．Ｓｈｒｉｖｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）から寄贈された。ＲＡ反応性Ｆ９細胞株は、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子の上流に配置された、ヒトレチノイン酸受容体−β遺伝子（ＲＡＲ−β）に由来したＲＡＲＥのレポーターコンストラクトで形質移入した（Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂ．）１１６：５５−６６，１９９２）。細胞は、Ｎ−３添加物及び抗菌剤を含有したＬ１５−ＣＯ２培地で増殖させた。細胞は、３７℃で１００％湿度の暗所で２４時間、指示された濃度でエタノールに溶解されたオールトランスＲＡ或いはオールトランスＤＲＡで刺激し、溶解し、−ガラクトシダーゼ酵素アッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を用いて−ガラクトシダーゼの発現をアッセイした。ＲＸＲＥ活性化アッセイに対しては、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ−陰性ＨＥＫ−２９３Ｓ細胞は、取扱い説明書の手順に従ってリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＲＸＲ−発現コンストラクトを含む或いは含まないｐＲＸＲＥ−ＢＬＵＥレポーターコンストラクトで形質移入させた。２４時間後、細胞は２４ウェルプレートへ分配し、各アッセイウェルにおいて同じ数の形質移入細胞が入っているか確かめた。細胞は適切な濃度のオールトランスＲＡ、９−ｃｉｓ−ＲＡ、或いはオールトランスＤＲＡで刺激した。４８時間後、β−ガラクトシダーゼの発現を上述したようにアッセイした。  
実施例１５
【０２０４】
オールトランスＲＯＬパルミチン酸で経管栄養されたＬｒａｔ−／−マウスの肝臓におけるオールトランスＤＲＯＬ及びその代謝産物の同定
哺乳類におけるＲＯＬ吸収は、エステル化及び加水分解サイクルによって動かされている活性な工程である。ＲＯＬのエステル化は、ＬＲＡＴ酵素によって主に実行されている（Ｒｕｉｚ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３８３４−３８４１，１９９９）。ＬＲＡＴの非存在下で、ＲＯＬ及びＲＯＬエステルとの間の平衡は、遊離ＲＯＬに都合よくシフトする。ＬＲＡＴ発現のマウス欠損（Ｌｒａｔ−／−）マウスは、それらのＲＯＬ取り込み及び貯蔵能力が著しく損なわれている（Ｂａｔｔｅｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：１０４２２−１０４３２，２００４）。一方、野生型マウスはほとんどの消化ＲＯＬをエステルに変換し、循環及び代謝からＲＯＬを捕獲する。従って、本発明者らは、Ｌｒａｔ−／−マウスにおける１３，１４−ジヒドロレチノイド代謝産物へのオールトランスＲＯＬの飽和及び酸化を研究することにした。
【０２０５】
それらの類似した化学的特性を考えると、オールトランスＤＲＯＬ及びオールトランスＲＯＬが代謝経路と平行していることは驚くことではない。Ｌｒａｔ−／−マウスの２つの異なる群は、１０６ユニットのオールトランスＲＯＬパルミチン酸／ｋｇ体重、若しくは１０５ユニットのオールトランスＲＯＬパルミチン酸／ｋｇ体重を投与し、それらの肝臓は、経管栄養３時間後で極性及び非極性レチノイド代謝産物をテストした。極性肝臓レチノイドの逆相ＨＰＬＣ解析によって、オールトランスＲＡ（図１１、Ａ及びＢ、ピーク５）及びオールトランスＤＲＡ（図１１、Ａ及びＢ、ピーク４）、さらにはｃｉｓ−ＤＲＡ異性体（図１１、Ａ及びＢ、ピーク２）の存在が示された。本発明者らはさらに、別の極性ＤＲＯＬ代謝産物も観察し、それは逆相ＨＰＬＣにおいてオールトランスＤＲＡよりも早く溶出され（図１１、Ａ及びＢ、ピーク１）、オールトランスＤＲＡ標準と同じ吸収スペクトルを有した（図１１Ｅ）。この代謝産物は化学的に特徴付けされていないが、その極性特性に基づいて、タウリン或いはグルクロニドＤＲＡ共役体を示す可能性があった。合成オールトランスＤＲＡ及び肝臓から単離されたオールトランスＤＲＡのスペクトル及び溶出特性は一致した（図１１Ｅ）。オールトランスＤＲＡは以前公開された手順に従って合成し、１Ｈ  ＮＭＲによって特徴付けした（表Ｉ）（Ｍｏｉｓｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０２３０−５０２４２，２００４）。
【０２０６】
【表１】
2008518586.tif 000003
【０２０７】
本発明者らは、非極性肝臓レチノイド代謝産物を順相ＨＰＬＣによってテストした。ＲＯＬパルミチン酸での経管栄養３時間後、テストするマウスの肝臓は高レベルのオールトランスＲＯＬを含む（図１１、Ｃ及びＤ、ピーク１１）一方、オールトランスＤＲＯＬ（図１１、Ｃ及びＤ、ピーク８）は２８０〜３３０倍低いレベルで見出された（表ＩＩ）。オールトランスＤＲＯＬの吸収スペクトル及び溶出特性は、公開された手順に従って調製された合成標準と一致しており、１Ｈ  ＮＭＲによって特徴付けした（図１１、Ｃ、Ｄ及びＧ、表Ｉ）（Ｍｏｉｓｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０２３０−５０２４２，２００４）。
【０２０８】
【表２】
2008518586.tif 000004
【０２０９】
ＤＲＯＬより高レベルで存在した別の非極性１３，１４−ジヒドロレチノイド代謝産物（図１１、Ｃ及びＤ、ピーク６）は、オールトランスＲＯＬパルミチン酸で経管栄養されたマウスの肝臓において同定された。この化合物のスペクトルもオールトランスＤＲＯＬのスペクトルの一致した（図１１Ｇ）。前記化合物はｃｉｓ−ＤＲＯＬ異性体と共に共溶出せず、ｃｉｓ−ＤＲＯＬ異性体とは異なるＵＶ−可視吸収最大値を有している。本発明者らは前記化合物をエステル化することができ、ここではＮＨ２ＯＨ処理はその溶出特性に対して何の影響も及ぼさなかった。従って、本発明者らは、ピーク６として溶出される前記化合物の機能基はアルコールであると結論付けた（図１１、Ｃ及びＤ）。ピーク６に一致する回収した画分の電子衝突質量分析解析によって、２７４のｍ／ｚを有する化合物の存在が示された（図１１Ｆ）。これは、ピーク６は鎖短縮型Ｃ１９−ＲＯＬ誘導体が含まれる可能性を示唆するものである（Ｃ１９Ｈ３０Ｏ、ｍ／ｚ＝２７４、図２４に記載されている）。
【０２１０】
図１１は、Ｌｒａｔ−／−マウスの肝臓におけるオールトランスＲＯＬパルミチン酸の代謝の解析を示しているものである。Ａ〜Ｄ、オールトランスＲＯＬパルミチン酸で経管栄養したＬｒａｔ−／−マウスの肝臓からの極性及び非極性レチノイドのＨＰＬＣ解析。マウスは、Ａ及びＣでは、１０６ユニット／ｋｇ体重の高用量でのオールトランスＲＯＬパルミチン酸で経管栄養したものであり（１０ＸＲＰとして示されている、ｎ＝３）、Ｂ及びＤでは、１０５ユニット／ｋｇ体重の低用量でのオールトランスＲＯＬパルミチン酸で経管栄養したものである（１ＸＲＰとして示されている、ｎ＝３）。経管栄養３時間後、肝臓からの極性及び非極性レチノイドを抽出した、前記レチノイドは、狭穿孔（ｎａｒｒｏｗｂｏｒｅ）カラムシステム（Ａ及びＢ）に対する逆相ＨＰＬＣによって解析し、前記非極性レチノイドは順相ＨＰＬＣによって解析した（Ｃ及びＤ）。化合物は確証標準の溶出特性及び吸収スペクトルとの比較に基づいて同定した。Ｅ、ピーク４のスペクトルは、オールトランスＤＲＡ標準のスペクトルと一致し、共溶出もする。逆相ＨＰＬＣによってオールトランスＤＲＡより早く溶出する別の化合物（ピーク１）の吸収スペクトルも、オールトランスＤＲＡのスペクトルと対応する。Ｆ、Ｃ及びＤにおいてピーク６として溶出される化合物の電子衝突質量分析解析によって、それは２７４及び２６０のｍ／ｚを有する化合物の可能な混合物であることが示された。Ｇ、ピーク６として溶出された化合物は、生物学的オールトランスＤＲＯＬ（ピーク８）の１つ及び合成オールトランスＤＲＯＬの１つと同一のＵＶ−可視吸収特性を示す。オールトランスＲＡの溶出液は３６０ｎｍでモニターし、オールトランスＲＯＬは３２５ｎｍであり、オールトランスＤＲＯＬ及びオールトランスＤＲＡは２９０ｎｍでモニターした。２９０ｎｍでの吸収のみが、単純化のために本明細書に示されている。抽出効率は９５％以上であり、［３Ｈ］ＲＡでサンプルをスパイクし、ＲＡピークに関与する放射能を測定することに基づいて計算した。溶出時間、吸収スペクトル、及び確証標準との比較に基づいて、ピークは、以下の化合物として同定された：ピーク２はｃｉｓ−ＤＲＡ；ピーク３は１３−ｃｉｓ−ＲＡ；ピーク４はオールトランスＤＲＡ；ピーク５はオールトランスＲＡ；ピーク６はＣ１９−ＲＯＬ誘導体；ピーク７は１３−ｃｉｓ−ＲＯＬ；ピーク８はオールトランスＤＲＯＬ；ピーク９は９，１３−ジ−ｃｉｓ−ＲＯＬ；ピーク１０は９−ｃｉｓ−ＲＯＬ；及びピーク１１はオールトランスＲＯＬである。
【０２１１】
図２４は、オールトランスＲＯＬ及びオールトランスＤＲＯＬの代謝を示したものである。ＲｅｔｓａｔはオールトランスＲＯＬ及びオールトランスＤＲＯＬを飽和し、それはＬＲＡＴによってエステル化されることが以前に示されていた。本明細書において本発明者らは、ＤＲＯＬの酸化的代謝がＲＯＬの代謝に著しく従うことを示す証拠を示す。例えばＳＤＲ及びＡＤＨなどの広域スペクトル酵素は、オールトランスＤＲＯＬのオールトランスＤＲＡＬへの可逆的酸化を実行する。ＲＡＬＤＨ１、−２、−３及び−４は、オールトランスＤＲＡＬをオールトランスＤＲＡへ酸化する。チトクロムＰ４５０控訴のいくつかのメンバーであるＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１及び−Ｃ１は、オールトランスＤＲＡをオールトランス４−オキソ−ＤＲＡへ酸化し、これはｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎｖｉｔｒｏで同定されるものである。別の酸化オールトランスＤＲＡ代謝産物（記載されていないが）は、オールトランス４−ヒドロキシ−ＤＲＡ、オールトランス５，６−エポキシ−ＤＲＡ、オールトランス５，８−エポキシ−ＤＲＡ、オールトランス１８−ヒドロキシ−ＤＲＡとなる可能性がある。短鎖代謝産物Ｃ１９−ＲＯＬの可能な化学的構造は本明細書に示された。その合成経路は、オールトランスＲＡから脱炭酸化によって及び／若しくはオールトランスＤＲＡからα−酸化を介して進行する可能性がある。
【０２１２】
Ｌｒａｔ−／−マウスの合成オールトランスＤＲＯＬでの経管栄養の後、本発明者らは著しいレベルのオールトランスＤＲＡ及びオールトランス４−オキソ−ＤＲＡを観察した。これらは、それらのクロマトグラフィー特性、ｍ／ｚ、及び吸収スペクトルに基づいて同定し、これは合成標準のそれらと一致した（図１８Ａ及び挿入図スペクトル）。オールトランス４−オキソ−ＤＲＡは、図１７に記載されたスキームに従って合成し、１Ｈ  ＮＭＲによって特徴付けした（表Ｉ）。ＤＲＯＬで経管栄養したマウスの肝臓も、低レベルのＣ１９−ＲＯＬが含まれていることを見出した（図１８Ｂ、ピーク４、及び挿入図スペクトル）。これは、オールトランスＲＯＬパルミチン酸を経管栄養されたマウスにおいて観察された高レベルのＣ１９−ＲＯＬとは対照的である。
【０２１３】
図１７は、化合物オールトランス４−オキソ−ＤＲＡ（ＶＩ）が［１Ｈ］−ＮＭＲによって特徴付けされたことを示したものである。４−オキソ−ＤＲＡ及び４−ヒドロキシ−ＤＲＡの調製に対する合成スキーム：ａ、ＮＢＳ、（）
（ＰｈＣＯＯ）２、ＣＣｌ４、還流、２０分；ｂ、ＫＯＡｃ、ＨＭＰＡ、室温、２４時間；ｃ、Ｋ２ＣＯ３、ＭｅＯＨ：Ｈ２Ｏ、室温、６時間；ｄ、ＴＢＤＭＳ−Ｃｌ、ＣＨ２Ｃｌ２、ＤＭＡＰ、室温、１８時間；ｅ、（ＥｔＯ）２Ｐ（Ｏ）ＣＨ２ＣＯＯＥｔ、ＮａＨ、ＴＨＦ、還流、２４時間；ｆ、ＬｉＡｌＨ４、Ｅｔ２Ｏ、０℃、３０分；ｇ、Ａｃ２Ｏ、ＤＭＡＰ、ＣＨ２Ｃｌ２、室温、２時間；ｈ、ＴＢＡＦ、ＴＨＦ、室温、１６時間；ｉ、ＭｎＯ２、ＣＨ２Ｃｌ２、室温、２４時間；ｊ、ＰＢｒ３、Ｐｙ、Ｅｔ２Ｏ、−２０℃、１時間；ｋ、ＰＰｈ３、トルエン、室温、２４時間；ｌ、ｔ−ＢｕＯ−Ｋ＋、１８−ｃｒｏｗｎ−６、ＣＨ２Ｃｌ２、−７８℃〜室温、６時間；ｍ、５Ｍ  ＮａＯＨ、ＥｔＯＨ／Ｈ２Ｏ、３７℃、１時間；ｎ、ＮａＢＨ４、ＥｔＯＨ、０℃、３０分。
【０２１４】
図１８は、Ｌｒａｔ−／−マウスの肝臓におけるオールトランスＤＲＯＬの代謝産物の解析を示したものである。オールトランスＤＲＯＬで経管栄養されたＬｒａｔ−／−マウスの肝臓からの極性及び非極性レチノイドのＨＰＬＣ解析（ｎ＝３）。Ｌｒａｔ−／−マウスをオールトランスＤＲＯＬで経管栄養した３時間後、極性及び非極性レチノイドを抽出し、逆相ＨＰＬＣ（Ａ、黒破線クロマトグラム）或いは順相ＨＰＬＣ（Ｂ、黒破線クロマトグラム）で解析した。合成標準オールトランス４−オキソ−ＤＲＡ、オールトランスＤＲＡ、及びオールトランスＲＡは、逆相ＨＰＬＣ（Ａ、上部クロマトグラム、灰色破線）でテストした。非経管栄養のＬｒａｔ−／−マウス対照から単離された肝臓レチノイドもテストした（Ａ及びＢ灰色実線クロマトグラム）。（Ｂ）クロマトグラムの７〜１２分領域は、ピーク４を表すように展開し、Ｃ１９−ＲＯＬに帰した。ピーク３は、電子衝突質量分析によって決定されたように、オールトランスＤＲＯＬ−デカン酸（ｍ／ｚ＝４４２）及びオールトランスＤＲＯＬ−パルミチン酸（ｍ／ｚ＝５２６）を含むエステル化合物の混合物から構成されていた。以下の化合物は、それらの溶出特性、吸収スペクトル、及び合成標準との比較に基づいて同定された：（１）、オールトランス４−オキソ−ＤＲＡ、及び（Ａ）挿入図スペクトル；（２）、オールトランスＤＲＡ；（３）、オールトランスＤＲＯＬエステル；（４）、Ｃ１９−ＲＯＬ、及び（Ｂ）挿入図スペクトル；（５）オールトランスＤＲＯＬ。同定されなかった化合物は、星印（＊）で示した。
【０２１５】
ラットは外因的に投与された９−ｃｉｓ−ＲＡを９−ｃｉｓ−ＤＲＡ及びそのタウリン共役体へ変換できることが以前報告されていた（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２４：２９３−３０２，１９９６）。これは、別の経路がＣＲＡの１３−１４結合の飽和に関与し、ＤＲＡを産生することを示唆するものである。現在の研究において、本発明者らは、経管栄養３時間後でのオールトランスＲＡで経管栄養したＬｒａｔ−／−の肝臓におけるオールトランスＤＲＡ或いはオールトランス４−オキソ−ＤＲＡ形成の証拠は見出せなかった（図１９）。２５７ｎｍの最大吸収を有するオールトランスＤＲＡ（図１９、＊でマークされている）とは異なる化合物が、オールトランスＤＲＡの予想溶出時間より前に溶出された。これは、１３，１４−ジヒドロレチノイド代謝産物は、ＲｅｔｓａｔによるオールトランスＲＯＬの飽和後のオールトランスＤＲＯＬにのみ由来することを示唆しており、ビタミンＡ代謝産物のこの分岐でのＲｅｔｓａｔが担う重要な役割を強調するものである。本発明者らは、経管栄養３時間後でのオールトランスＲＡで経管栄養したＬｒａｔ−／−マウスの肝臓におけるＣ１９−ＲＯＬの証拠も見出せなかった。
【０２１６】
図１９は、Ｌｒａｔ−／−マウスの肝臓におけるオールトランスＲＡの代謝産物の解析を示している。オールトランスＲＡでの経管栄養３時間後のＬｒａｔ−／−マウスの肝臓からの極性レチノイドの逆相ＨＰＬＣ解析（黒破線クロマトグラム）。合成標準オールトランス４−オキソ−ＤＲＡ、オールトランスＤＲＡ、及びオールトランスＲＡを逆相ＨＰＬＣでテストした（上部クロマトグラム、灰色破線）。非経管栄養Ｌｒａｔ−／−マウス対照から単離した肝臓レチノイドもテストした（灰色実線）。同定されなかった化合物は、星印（＊）で示した。
【０２１７】
オールトランスＲＡ、オールトランスＤＲＡ、及び図１１、Ａ及びＢにおけるピーク１、及びＣ及びＤにおけるピーク６として溶出された化合物のレベルは、表ＩＩに示し、これは消化されたＲＯＬパルミチン酸の異なる開始レベルを反映したものである。オールトランスＤＲＡのレベルはオールトランスＲＡと比べてより低く（３０〜５０倍）であり、Ｒｅｔｓａｔによる飽和が制限肯定であることを示しているものである。オールトランスＲＯＬと比較して低レベルのオールトランスＤＲＯＬもまた、この説明を支持するものである。より短い鎖への若しくは他のより酸化された代謝産物への更なる加工のため、オールトランスＤＲＯＬ及びオールトランスＤＲＡのレベルもまた低くなる可能性がある。  
実施例１６
【０２１８】
オールトランスＤＲＯＬのオールトランスＤＲＡへの代謝経路の特徴付け
オールトランスＤＲＡがオールトランスＤＲＯＬの代謝産物としてｉｎ  ｖｉｖｏで検出されたことより、本発明者らは再構成された酵素システムを用いて合成の可能な様式をテストすることにした。オールトランスＤＲＯＬを一致するアルデヒドオールトランスＤＲＡＬへ酸化するために、本発明者らはウマ肝臓（ＥＣ１．１．１．１［ＥＣ］）から精製されたＡＤＨを使用し、これは一級及び二級アルコールの両方に対して活性である。オールトランスＤＲＯＬ及びオールトランスＲＯＬを、精製された酵素及び適切な補助因子と共にインキュベートした。反応後、試料をＮＨ２ＯＨで処理し、有機相へ抽出し、順相ＨＰＬでテストした。オールトランスＲＡＬ或いはオールトランスＤＲＡＬオキシムは、合成標準と比較することによって同定した（Ｍｏｉｓｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０２３０−５０２４２，２００４）。ＡＤＨは、ＮＡＤ及びＮＡＤＰ補助因子の存在下でオールトランスＲＯＬからオールトランスＲＡＬへの変換、及びオールトランスＤＲＯＬからオールトランスＤＲＡＬへの変換を効果的に実行したが（図１２、Ａ及びＢ）、非存在下では実行しなかった。煮沸酵素は基質に対するあらゆる活性を示さなかった。次に、光受容体特異性ＲＤＨ（ｐｒＲＤＨ）及びＲＤＨ１２の、オールトランスＤＲＯＬからオールトランスＤＲＡＬへの酸化を触媒する能力をテストした。ｐｒＲＤＨ及びＲＤＨ１２の両方は、オールトランスＲＯＬからＲＲＡＬへの変換においては活性であったが、オールトランスＤＲＯＬからオールトランスＤＲＡＬへの変換における活性は低かった（データは示さず）。
【０２１９】
図１３は、オールトランスＲＯＬ及びオールトランスＤＲＯＬのそれぞれのアルデヒドへの酸化を示したものである。精製ＡＤＨ（Ｓｉｇｍａ）は、ＮＡＤ及びＮＡＤＰの存在下でオールトランスＤＲＯＬのオールトランスＤＲＡＬ（Ａ）への及びオールトランスＲＯＬのオールトランスＲＡＬ（Ｂ）への酸化を触媒した。煮沸酵素を用いた対照反応はネガティブであり、この変換は酵素的であることを示した。レチノイドを抽出し、順相ＨＰＬＣで解析した。前記反応の産物は、シン−及び抗−オールトランスＤＲＡＬオキシム（Ａ）及びシン−及び抗−オールトランスＲＡＬオキシム（Ｂ）であった。この実験は三つ組で実行し、繰り返し行った。
【０２２０】
オールトランスＤＲＡＬのＤＲＡへの変換はＲＡＬＤＨ酵素によって仲介される。マウスＲＡＬＤＨ１〜４  ｃＤＮＡをクローン化し、それらのＣ末端でＶ５エピトープ及びＨｉｓ６伸長を含むタグと融合した。グリコシル化欠損ＨＥＫ−２９３Ｓ細胞は、ＣＭＶプロモーターの制御下でＲＡＬＤＨ１、−２、−３及び−４のタグ化コンストラクトで一過性に形質移入した。これらの細胞は再現性があり、組換えタンパク質の高レベルの発現が可能である（Ｒｅｅｖｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９：１３４１９−１３４２４，２００２）。形質移入細胞の細胞ホモジネートにＮＡＤ、ＮＡＤＰ及びＡＴＰ補助因子、及びオールトランスＲＡＬ或いはオールトランスＤＲＡＬ基質を添加した。ＲＡＬＤＨ２及び−３の両方は、オールトランスＲＡＬ及びオールトランスＤＲＡをそれぞれオールトランスＲＡ及びオールトランスＤＲＡへ効率よく変換した（図１３、Ａ及びＢ）。産物であるオールトランスＲＡ及びオールトランスＤＲＡは、その溶出時間、吸収スペクトル、及び確証標準との比較に基づいて同定した（図１３Ａ、ピーク１、及び１３Ｂ、ピーク６、及び挿入図スペクトル）。他のｃｉｓ−ＤＲＡ異性体も、合成混合物の存在下でｃｉｓ−ＤＲＡＬ異性体の酸化の結果として産生された。形質移入細胞ホモジネートにおける組換えタンパク質の発現レベルは、Ｖ５−タグ化ＲＡＬＤＨタンパク質の存在に対する抗−Ｖ５モノクローナル抗体を用いて免疫ブロットによって評価した。これは、図１３においてＲＡＬＤＨ２−Ｖ５−Ｈｉｓ６を示していた（上部右パネル）。免疫反応性晩後の強度に基づいて、ＲＡＬＤＨ１、−２、−３或いは−４の同様な発現レベルが形質移入細胞において達成された。ＲＡＬＤＨ−１及びＲＡＬＤＨ−４形質移入細胞のホモジネートは、オールトランスＲＡＬ或いはオールトランスＤＲＡＬの酸化における有効性は低く、これは、Ｃ末端タグの結果、他のものと比べいくつかのアイソザイムに影響を及ぼした可能性がある。代わりに、いくつかのアイソザイムは、マウスＲＡＬＤＨ２（オールトランスＲＡＬに対するＫｍ＝１１．６μＭ）（３１，３２）で見られるように他のものより活性である可能性がある。非形質移入細胞もまた、オールトランスＲＡＬ及びオールトランスＤＲＡＬの両方に対して著しい活性を示し（図１３、灰色線クロマトグラム）、これはＨＥＫ２９３Ｓ細胞における内因性ＲＡＬＤＨ活性を示唆するものである。
【０２２１】
図１３は、オールトランスＲＡＬ及びオールトランスＤＲＡＬのそれぞれオールトランスＲＡ及びオールトランスＤＲＡへの酸化を示したものである。細胞は、そのＣ末端でＶ５−Ｈｉｓ６タグが融合されたＲＡＬＤＨ２のｃＤＮＡを有するベクターで一過性に形質移入した。ＲＡＬＤＨ２−Ｖ５−Ｈｉｓ６タグ化タンパク質の発現は、抗−Ｖ５モノクローナル抗体での免疫ブロットによって確認し、右側の上部パネルにおけるＲａｌｄｈ２標識のラインに示されている。ＨＥＫ−ＲＡＬＤＨ２細胞（黒実線グラフ）或いは非形質移入対照細胞（灰色実線グラフ）の細胞ホモジネートは、オールトランスＲＡＬ（Ａ）或いはオールトランスＤＲＡＬ（Ｂ）とインキュベートした。煮沸対照細胞（黒破線グラフ）は、同条件下で基質とインキュベートした。レチノイドを抽出し、「方法及び材料」において記載したように逆相ＨＰＬＣで解析した。反応の産物は、その吸収スペクトル及び可能な標準との共溶出に基づいて同定した。これらは、以下の通りである：ピーク１、オールトランスＲＡ；ピーク２及び３、それぞれシン−及び抗−ＲＡＬオキシム；ピーク４及び５、ＤＲＡのｃｉｓ−異性体；ピーク６、オールトランスＤＲＡ；ピーク７〜１０，ＤＲＡＬのいくつかの異性体のシン−及び抗−オキシム；ピーク１１、オールトランスＤＲＯＬ。ピーク１（ＲＡとして同定）及びピーク６（ＤＲＡとして同定）のＵＶ−可視吸収スペクトルはそれぞれ、右の真中及び下のパネルに示してある。実験は二つ組で実行し、３回繰り返した。Ｃ末端でＶ５−Ｈｉｓ６タグでタグ化されたＡＬＤｈ３で形質移入された細胞でも同様な結果が得られた。  
実施例１７
【０２２２】
オールトランスＤＲＡの酸化
ＲＡのレベルは、空間的及び時間的な制御合成及び分解の両方によって厳しく制御されている。ＲＡ異化は、チトクロムＰ４５０酵素であるＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１、及び−Ｃ１によって実行される。ＤＲＡも同様な方法で異化されるのかどうか検討することは重要である。ＨＥＫ−２９３Ｓ細胞は、そのＣ末端にＶ５エピトープ及びＨｉｓ６伸長が融合されたＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１、及び−Ｃ１の発現コンストラクトで形質移入した。形質移入細胞及び非形質移入細胞は、オールトランスＲＡ或いはオールトランスＤＲＡ基質と培養でインキュベートした。なぜなら、ＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１、及び−Ｃ１活性は細胞のホモジナイゼーションによって不利に影響を受けるからである。オールトランスＲＡ及びオールトランスＤＲＡの酸化代謝産物は、ＣＹＰ２６Ａ１−形質移入細胞に存在したが、非形質移入細胞には存在しなかった（図１４、Ａ及びＢ）これらの代謝産物はオールトランス４−オキソ−（Ｄ）ＲＡ、オールトランス４−ヒドロキシ−（Ｄ）ＲＡ、オールトランス５，８−エポキシ−（Ｄ）ＲＡ、及びオールトランス１８−ヒドロキシ−（Ｄ）ＲＡを含むことができ、注入スパイクのすぐ後に溶出される極性化合物として同定された（図１４、Ａ及びＢ、ピーク１及び２、及びピーク７〜９、及び挿入図スペクトル）。酸化オールトランスＤＲＡ化合物の１つは、合成標準の溶出特性及び吸収スペクトルと一致したため、オールトランス４−オキソ−ＤＲＡとして同定された（図１４、下部右、挿入パネル）。形質移入細胞において発現したタグ化酵素のレベルは、形質移入細胞溶解液のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析、その後、抗−Ｖ５−モノクローナル抗体を用いた免疫ブロットを行うことによってアッセイした（図１４、上部右パネル）。形質移入細胞におけるＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１、及び−Ｃ１の発現レベルは類似しており、全ての３控訴はオールトランスＲＡ及びオールトランスＤＲＡの極性代謝産物への酸化を効率的に実行した。
【０２２３】
図１４は、オールトランスＲＡ及びオールトランスＤＲＡの酸化を示したものである。ＲＡ及びＤＲＡの代謝は、非形質移入細胞、或いはＣＹＰ２６Ａ１で形質移入された細胞で実験した。形質移入細胞におけるＣＹＰ２６Ａ１−Ｖ５−Ｈｉｓ６タグ化タンパク質の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗−Ｖ５−モノクローナル抗体での免疫ブロットによって実験し、上部パネルの右のＣＹＰ２６Ａ１標識ラインにおいて示されている。形質移入ＨＥＫ−ＣＹＰ２６Ａ１細胞（黒破線グラフ）或いは非形質移入対照細胞（灰色実線グラフ）は、ＲＡ（Ａ）或いはＤＲＡ（Ｂ）とインキュベートした。レチノイドを抽出し、「方法及び材料」において記載したように逆相ＨＰＬＣで解析した。酸化ＲＡ代謝産物のスペクトルであるピーク１及び２（右上部挿入パネル）は、それぞれオールトランス４−ヒドロキシ−ＲＡ及びオールトランス４−オキソ−ＲＡのものと類似していた。ピーク３〜５はＲＡのｃｉｓ−異性体であり；ピーク６はオールトランスＲＡである。ピーク７及び９は酸化ＤＲＡ代謝産物を示し、最大λ＝２９０ｎｍを有し、これは右の真中挿入パネルに示されている。ピーク８はオールトランス４−オキソＤＲＡと一致しており、これはその吸収スペクトル及び溶出時間に基づいている（吸収スペクトルは右の下部挿入パネルに示されている）。ピーク１０及び１１はそれぞれ、ｃｉｓ−及びオールトランスＤＲＡを示している。この実験は二つ組で実行し、３回繰り返した。ＣＹＰ２６Ｂ１及び−Ｃ１で形質移入した細胞でも同様な結果が得られた。  
実施例１８
【０２２４】
ＲＰＥにおけるオールトランスＤＲＯＬのオールトランスＤＲＡへの変換
レチノイド代謝は、多くの胚及び生体組織において起こる。従って、オールトランスＤＲＡ合成の全体経路が組織抽出物で再構成されるかどうかを決定することは重要である。オールトランスＤＲＯＬ（図２０、ピーク２）は、ジヌクレオチド補助因子であるＮＡＤ及びＮＡＤＰの存在下で、ＲＰＥ細胞から調製されたミクロソームによってオールトランスＤＲＡ（図２０．ピーク１）を効果的に変換した。オールトランスＤＲＡは、合成オールトランスＤＲＡとの比較におけるその溶出特性及び吸収スペクトルに基づいて同定された（図２０、及び挿入図スペクトル）。ＲＰＥミクロソームもさらに、オールトランスＲＯＬのオールトランスＲＡへの変換を触媒し（結果は示さず）、これは生体ＲＰＥがオールトランスＲＡ、オールトランスＤＲＡ合成部位を活性化することを示唆している。ＲＰＥにおける主なＲＯＬ酸化活性は、ＳＤＲファミリー酵素によって触媒される。ＲＰＥにおけるオールトランスＤＲＯＬのオールトランスＤＲＡへの効果的な変換は、オールトランスＤＲＯＬをオールトランスＤＲＡＬへ変換できるＳＤＲ酵素の存在を支持するものである。ＲＰＥからの既知ＳＤＲ酵素のオールトランスＤＲＯＬに関する基質特異性を検討するための更なる研究が必要とされている。
【０２２５】
図２０は、ＲＰＥミクロソームによるオールトランスＤＲＯＬのオールトランスＤＲＡへの変換を示している。ＲＰＥミクロソームは、ジヌクレオチド補助因子ＮＥＤ及びＮＡＤＰの存在下或いは非存在下で、オールトランスＤＲＯＬとインキュベートした。対照として、本発明者らは煮沸ＲＰＥミクロソームを、ジヌクレオチド補助因子ＮＥＤ及びＮＡＤＰの存在下でオールトランスＤＲＯＬとインキュベートした（灰色実線）。タンパク質は等量のＣＨ３ＣＮと高速遠心分離を用いて沈殿させた。上清を逆相ＨＰＬＣシステムに注入し、オールトランスＤＲＯＬ代謝産物の溶出を２９０ｎｍでモニターした。ピーク２（ＤＲＯＬ）はピーク１へ変換され、これは確証標準との共溶出に基づいてオールトランスＤＲＡとして同定された（黒破線クロマトグラム）。（Ｂ）ピーク１及びオールトランスＤＲＡ標準のスペクトルは、挿入パネルに示した。実験は三つ組で実行し、繰り返した。
【０２２６】
既知オールトランスＲＯＬ酸化経路及び本明細書にある結果に基づいて、本発明者らは、オールトランスＲＯＬのオールトランスＤＲＯＬへの飽和に続いて、オールトランスＤＲＯＬはオールトランスＤＲＡへ酸化され、後にオールトランスＤＲＡ及びオールトランスＤＲＡの可能な他の酸化代謝産物へ酸化されると提唱した。本発明者らは、ＲＯＬのＲＡへの酸化に関与する同じ酵素もまた、図２４に示したように、ＤＲＯＬのＤＲＡへの酸化に関与することを示した。オールトランスＤＲＯＬ及び他のより酸化された代謝産物は天然に生じ、ビタミンＡの代謝における新規及び潜在的に重要な経路を示した。この仮説は、オールトランスＲＯＬパルミチン酸を経管栄養されたＬｒａｔ−／−マウスオールトランスＤＲＯＬ及びオールトランスＤＲＡの明白な同定によって支持される。  
実施例１９
【０２２７】
オールトランスＤＲＡのトランス活性化化活性の特徴化
ＲＡＲ結合性オールトランスＲＡ、及びＲＡＲ又はＲＸＲ結合性９−シス−ＲＡは、ＲＡ応答性要素（ＲＡ−ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ：ＲＡＲＥ）配列を含む遺伝子発現をそれらのプロモーター領域内で制御し得る。ＲＡＲＥ要素は、１〜５個のヌクレオチドにより分離されたカノニカル配列ＰｕＧ（Ｇ／Ｔ）ＴＣＡのダイレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔ  ｒｅｐｅａｔｓ：ＤＲ）から成る。活性化されたＲＡＲ／ＲＸＲへテロダイマーは、ＲＡＲ遺伝子を含む多くの遺伝子のプロモーター領域中で発見された、５個のヌクレオチド（ＤＲ  ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｆｉｖｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ＤＲ５）により分離されたＤＲから成るＲＡＲＥと関連し得る。Ｓｕｃｏｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：５３９２〜５３９６，１９９０。
【０２２８】
我々はまた、ＤＲ５ＲＡＲＥ−レポーター細胞株を使用したＲＡＲ活性化を通じたＤＲＡが制御し得るかどうかを研究した。Ｆ９テラトカルシノーマ細胞株は、内因性ＲＡＲ及びＲＸＲを発現させ、ＲＡの影響に非常に敏感である。この細胞株は、最小プロモーター及び上流のＤＲ５要素の制御下でｌａｃＺを用いて形質移入された。Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂ．）１１６：５５〜６６，１９９２。Ｆ９−ＲＡＲＥ−ｌａｃＺ細胞を２４時間異なる量のオールトランスＲＡ又はオールトランスＤＲＡで処理し、その後、前記細胞を回収し、β−ガラクトシダーゼ活性をＸ−ｇａｌ染色（図１５、上部パネル）により評価した。ＤＲ５−誘導性β−ガラクトシダーゼ発現のオールトランスＤＲＡトランス活性化をＲＡにより生成される等価な影響よりも高濃度で観察した。オールトランスＲＡ及びオールトランスＤＲＡ誘導活性を可溶な基質である、オルト−ニトロフェニル−Ｄ−ガラクトピラノシドを使用して定量化した。無色の基質をβ−ガラクトシダーゼで切断し、分光光度計を用いて４２０ｎｍでその吸光度を測定した（図１５）黄色のオルト−ニトロフェノールにした。ＤＲ５要素のオールトランスＤＲＡ誘導は、オールトランスＲＡの誘導よりもかなり非効率である。１０−９ＭのオールトランスＲＡを有するＤＲ５レポーター細胞の誘導は、１０−７ＭのオールトランスＤＲＡで得られた誘導と同規模の大きさを有していた。投与量−応答曲線の線形部分を測定したその応答は、ＤＲ５−応答要素を活性化することにおいて、オールトランスＤＲＡが約１００倍非効果的であると示した。
【０２２９】
図１５は、Ｆ９−ＲＡＲＥ−ｌａｃＺレポーターの細胞株のＲＡ及びＤＲＡへの応答について示す。Ｆ９−ＲＡＲＥ−ｌａｃＺ細胞は、内因性ＲＡＲ及びＲＸＲを発現させ、最小プロモーター及びＤＲ５要素の制御下でｌａｃＺのコンストラクトで形質移入した。Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂ．）１１６：５５−６６，１９９２。Ｆ９−ＲＡＲＥ−ｌａｃＺ細胞を異なる投与量のオールトランスＲＡ又はオールトランスＤＲＡで２４時間処理した。ＲＡＲＥ−駆動性ｌａｃＺ遺伝子は、Ｘ−ｇａｌを、光学顕微鏡法（上部パネル）で応答細胞において可視化した不溶性青色生成物に加水分解するβ−ガラクトシダーゼを生成する。選択的に、その細胞集団の応答を、前記オルト−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド基質を使用して前記β−ガラクトシダーゼ活性を測定することにより定量化した。前記無色の基質をβ−ガラクトシダーゼにより加水分解し、分光光度計（下部、棒グラフ）吸光度を４２０ｎｍで測定した可溶の黄色のオルト−ニトロフェノールにした。バックグランドの刺激していない細胞におけるβ−ガラクトシダーゼ活性バックグランドを破線で示している。
【０２３０】
ＲＸＲホモダイマーを９−シス−ＲＡ、フィタン酸、ドコサへキサン酸、及び他の不飽和脂肪酸によって活性化し得る。Ｈｅｙｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６８：３９７〜４０６，１９９２；Ｌｅｍｏｔｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２３６：３２８〜３３３，１９９６；ｄｅ  Ｕｒｑｕｉｚａ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：２１４０〜２１４４，２０００；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．４２０：１８５〜１９３，２００３。ＲＸＲホモダイマーは、単一の塩基対により分離した、ＣＲＢＰ  ＩＩプロモーター中で見出される六量体モチーフのＤＲ１成分に結合し得る。Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  ６６：５５５〜５６１，１９９１。我々は、ｐＲＸＲＥ−ＢＬＵＥと名づけた、最小プロモーター及び５つの連続する上流ＤＲ１成分の対照の下で、ｌａｃＺのコンストラクトを有するＨＥＫ−２９３Ｓ細胞を使用して、ＤＲ１−レポーター細胞アッセイに基づきＲＸＲの活性化を研究した。ＨＥＫ−２９３Ｓ細胞は、内因性ＲＸＲをほとんど発現しないために、内因性ＲＸＲの欠失中で９−ｃｉｓ−ＲＡによるＤＲ１成分の誘導は全くない（図１６、下部グラフ）。従って、我々は、マウスＲＸＲ−αをクローンし、我々がｐＲＸＲＥ−ＢＬＵＥＨで共形質移入した、ＥＫ−２９３Ｓ細胞中のＣＭＶプロモーターの対照下でそれを発現させた。我々のアッセイにおいて、オールトランスＤＲＡが、非常に弱い活性剤である一方で、ＲＸＲ９−ｃｉｓ−ＲＡは、ＲＸＲ−媒体された転写を活性化した（図１６、上部グラフ）。オールトランスＲＡは、ＲＸＲに結合しないが、我々は、オールトランスＲＡの添加がまた、オールトランスＤＲＡと比較して、ＲＸＲホモダイマーのロバスト誘導をもたらすことを見出した。この結果は、一晩インキュベーション中の９−シス−ＲＡへのオールトランスＲＡ異性化の結末であり得るであろう。
【０２３１】
図１６は、オールトランスＤＲＡ、オールトランスＲＡ、及び９−シス−ＲＡによるＤＲ１成分の活性化について示す。ＨＥＫ−２９３Ｓ細胞をｌａｃＺのコンストラクトで最小プロモーター及び５つの連続する上流のＤＲ１成分の対照下で形質移入した。上部に関しては、ＨＥＫ−２９３Ｓ細胞をＤＲ１−レポーターコンストラクトとマウスＲＸＲ−αの両方でＣＭＶプロモーターの対照の下で共形質移入した。前記細胞をその後４８時間、オールトランスＲＡ、９−シス−ＲＡ、又はオールトランスＤＲＡの示唆されたレベルで処理した。前記細胞を回収し、"Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ"の下、β−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。下部に関しては、ＤＲ１−レポーター形質移入した細胞を、４８時間ＲＸＲの欠失下で異なる投与量のオールトランスＲＡ、９−シス−ＲＡ、又はオールトランスＤＲＡで処理した。刺激していない細胞中のβ−ガラクトシダーゼ活性バックグランドを、上部と下部との両者のグラフで破線により示す。前記細胞を回収し、"Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ"で記載したようにβ−ガラクトシダーゼ活性をアッセイした。本実験を２度繰り返し、同様の結果を得た。  
実施例２０
【０２３２】
オールトランスＤＲＡ及び他の１３，１４−ジヒドロレチノイド代謝産物の同定
本発明において、本発明者らはＲＯＬパルミチン酸で経管栄養したＬｒａｔ−／−マウスの組織において、オールトランスＤＲＡ及び他の１３，１４−ジヒドロレチノイド代謝産物を同定し、さらにオールトランスＤＲＡはレポーター細胞アッセイにおいて遺伝子発現を制御することができることを示した。オールトランスＤＲＡは、Ｆ９ＲＡＲＥ−ｌａｃＺ細胞においてＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマーを活性化することによって、ＤＲ５−ＲＡＲＥレポーター遺伝子の発現を刺激した。オールトランスＤＲＡは、ＤＲ１−ｌａｃＺレポーターコンストラクト及びマウスＲＸＲ−αを同時導入したＨＥＫ−２９３Ｓ細胞においてＲＸＲホモダイマーは活性化しなかった。Ｒｅｔｓａｔの産物としてのオールトランスＤＲＯＬの同定に関する以前の報告と組み合わせると、本発明は、オールトランスＲＯｌからのオールトランスＤＲＡの形成に関与する酵素的経路を特徴付けした（Ｍｏｉｓｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：５０２３０−５０２４２，２００４）。ＲｅｔＳａｔによるオールトランスＲＯＬのＣ１３−１４結合の飽和によって、オールトランスＤＲＯＬが産生され、これはＡＤＨ−１によって、及び場合によってはＲＰＥに含まれるＳＤＲファミリーＲＤＨによって、一致するレチナルデヒド（ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ）であるオールトランスＤＲＡＬへ酸化される。オールトランスＤＲＡＬは、ＲＡＬＤＨ１−４によってオールトランスＤＲＡへ酸化される。オールトランスＤＲＡは、オールトランスＤＲＯＬで経管栄養されたマウスにおいて、チトクロムＰ４５０酵素ＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１及び−Ｃ１によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで、オールトランス４−オキソ−ＤＲＡへ酸化され、これはその分解の有力な経路を示唆するものである（図２４）。マウス組織から単離された基質及び反応産物や代謝産物の全ては、それらのＵＶ−可視吸収スペクトル及びクロマトグラフィー特性をＮＭＲ及び質量分析によって特徴付けされた確証合成標準と比較することによって同定した。以前に９−ｃｉｓ−ＲＡから９−ｃｉｓ−ＤＲＡへの変換を報告したレポートとは正反対に、本発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのオールトランスＲＡのオールトランスＤＲＡへの変換に関する証拠は見出せなかった（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２４：２９３−３０２，１９９６）。従って、オールトランスＤＲＡは、オールトランスＤＲＯＬの酸化のみに由来し、ＲｅｔＳａｔは、オールトランスＤＲＡ形成の重要な工程を触媒することに関与する唯一の既知酵素である、これらの発見は、ＲｅｔＳａｔによるオールトランスＲＯＬの飽和は活性であり、ｉｎ  ｖｉｖｏでのレチノイドの代謝において多分重要な工程であると示唆するものである。
【０２３３】
オールトランスＤＲＡの合成及び分解
ＡＤＨ及びＳＤＲファミリーの多く及びＲＡＬＤＨｓのいくつかは、網膜及びＲＰＥにおいて発現されている（Ｍｉｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．９７：２２７−２３０，２０００；Ｈａｅｓｅｌｅｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１６：３７２−３８３，２０００；Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２２２：４６０−４７０，２０００；Ｍｉｃ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２３１：２７０−２７７，２００４；Ｆｉｓｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｙｔｏｌ．２８：５９７−６０９，１９９９；Ｍｅｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１２７：１３５−１４８，２００１）。本発明者らは最近の研究において、オールトランスＤＲＯＬのオールトランスＤＲＡへの変換の経路の存在、及びそれはＲＰＥミクロソームにおいて効率的であることを示した（図２０）。これは、オールトランスＤＲＡ合成はオールトランスＲＡ合成が生じるのと同じ組織において生じ、オールトランスＤＲＡは異なる組織において濃度勾配を有していることを意味している。この勾配は、合成及び触媒酵素の有効性、さらには一次基質（すなわちオールトランスＤＲＯＬ）の有用性によって決定されるであろう。
【０２３４】
ＲＡ生物学的利用能は、その生合成と触媒との間のバランスによって厳密に制御されている（Ｎｉｅｄｅｒｒｅｉｔｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３１：８４−８８，２００２）。チトクロムＰ４５０−型酵素は、偏在的に発現されているＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１及び−Ｃ１を含み、これはＲＡを４−ＯＨ−ＲＡ、４−オキソ−ＲＡ，１８−ＯＨ−ＲＡ及び５，８−エポキシ−ＲＡへ酸化している（Ｆｕｊｉｉ，ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１６：４１６３−４１７３，１９９７；Ｗｈｉｔｅ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１８５３８−１８５４１，１９９７；Ｔａｉｍｉ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：７７−８５，２００４；ＭａｃＬｅａｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｃｈ．Ｄｅｖ．１０７：１９５−２０１，２００１）。従って、ＣＹＰ２６酵素は、ＲＮＡの空間的及び時間的レベルを制限することに関与しており、ＡＤＨ、ＳＤＲ、及びＲＡＬＤＨと連携して、ＲＯＬの栄養上レベルにおける周期的変動から保護するためのＲＡの望ましいレベルを監視するものである。本明細書に示したようにＣＹＰ２６ＣＹＰ２６Ａ１、−Ｂ１及び−Ｃ１酵素は、オールトランスＤＲＡも代謝する。これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＤＲＡの時間的及び空間的勾配にも寄与する。
【０２３５】
鎖短縮（ｃｈａｉｎ−ｓｈｏｒｔｅｎｅｄ）ＲＯＬ代謝産物の同定
本発明において、本発明者らは、アルコール保護基を含み、Ｃ１３−１４結合で飽和されＣ１５で鎖短縮を受けたＲＯＬ代謝産物の同定を提供する。鎖短縮ＲＯ代謝産物は、放射性１４Ｃ−標識ＲＡ或いはオールトランスＲＯＬの運命を追跡した初期研究において記載されていた（Ｗｏｌｆ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．７９：１２０８−１２１２，１９５７；Ｒｏｂｅｒｔｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．９：５０１−５０８，１９６８．Ｙａｇｉｓｈｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０３：４１１−４１２，１９６４）。それらの合成に対する１つの可能な経路は、以前に他者によって示唆されてように、オールトランスＤＲＡのα−酸化を介するものであった（Ｓｈｉｒｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｐｏｓ．２４：２９３−３０２，１９９６）。Ｃ１９−ＲＯＬ代謝産物は、オールトランスＤＲＡのα−酸化の間に産生された還元Ｃ１９−アルデヒド中間体の産物である可能性があった（フィタン酸分解経路のｐｒｉｓｔａｎａｌ中間体と同等）。オールトランスＲＯＬパルミチン酸で経管栄養したマウスにおいて観察されたレベルと比較して、低量のＣ１９−ＲＯＬのみがオールトランスＤＲＯＬが添加されたＬｒａｔ−／−マウスにおいて観察された。この矛盾は、内在性オールトランスＲＯＬは、経管栄養によって投与されたオールトランスＤＲＯＬとは異なるレパートリーの酵素へのアクセスを有するという事実によって説明される。Ｃ１９−ＲＯＬの合成の限局的な経路は、この経路の特異的酵素を欠損したノックアウト動物モデルを用いることによって確立された。
【０２３６】
脊椎動物生理学における１３，１４−ジヒドロレチノイドの潜在的役割
レチノイド代謝に関与する特異的酵素を欠損したマウスを用いる実験に基づいて、ＡＤＨ１及びＲＡＬＤＨ１は、ＲＯＬの薬理学的用量に対応する保護メカニズムに関与することを示した。Ａｄｈ−／−及びＲａｌｄｈ１−／−マウスは、それらの野生型対応物と比較して、ＲＯＬ−誘導毒性に対してより感受性を有していた（Ｍｏｌｏｔｋｏｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３６０８５−３６０９０，２００３；Ｍｏｌｏｔｋｏｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３８３：２９５−３０２，２００４）。ＲＯＬのＲＡへの変換は食餌性ＲＯＬの過剰レベルから保護することが提示された。このアイディアは、よく知られたＲＡの毒性効果を考慮すれば直感に反するものである。本明細書において本発明者らは、ＡＤＨ１及びＲＡＬＤＨ１はＤＲＡへのＤＲＯＬ酸化にも関与しており、オールトランスＤＲＡは、ａｌｌ−ｔｒａｎｓ或いは９−ｃｉｓ−ＲＡと比較して、ＲＡＲ−或いはＲＸＲ−仲介性転写の弱いアクチベーターであることを示した。従って、オールトランスＲＯＬのＣ１３−１４結合の飽和は、分解経路の第一工程であり、これはオールトランスＲＯＬの薬理学的用量からの保護を提供し、ＲＡの形成を回避するものである。本発明者らの発見は、肝臓ＤＲＯＬ及びＤＲＯＬ代謝産物の混合量は、１０６  ＩＵ  ＲＯＬパルミチン酸／ｋｇ体重での経管栄養３時間後での肝臓オールトランスＲＡの量の１／３以下であることを示した。これは、ＲｅｔＳａｔによる飽和はこの代謝経路において律速反応であることが示唆された。
【０２３７】
別の可能性としては、ＲｅｔＳａｔ活性は、新規生理活性１３，１４−ジヒドロレチノイドの産生を導くというものである。本発明者らは、ＲＡＲ／ＲＸＲヘテロダイマー−仲介性転写のアクチベータ−としてオールトランスＤＲＡを同定した。オールトランスＤＲＡの組織濃度及びトランス活性化特性は、オールトランスＲＡと比べて両方とも低かった。オールトランスＤＲＡ及び他のＤＲＯＬ代謝産物は特定の生理学環境において重要なトランス活性化活性を有することも可能である。１３，１４−ジヒドロレチノイドリガンドの局所的濃度は、受容体或いは結合タンパク質によって捕獲された結果としてより高いレベルに達する可能性がある。局所的濃度及び結合親和性が十分であると考えると、オールトランスＤＲＡはＲＡＲ或いは場合によっては他の核酸レセプターに対する重要な内在性リガンドである可能性があった。ＲＡの形成において特異的に作用すると考えられていた同じ酵素もＤＲＡの形成にも関与しているという発見は、これらの酵素を欠損したノックアウト動物モデルの表現型をＲＡで回復する試みにおいて考慮されたものである。そのような実施例の１つにおいて、Ｒａｌｄｈ２−／−マウス胚は、母性ＲＡ添加によっては完全に回復せず、出生前に致死であった（Ｎｉｅｄｅｒｒｅｉｔｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（Ｃａｍｂ．）１３０：２５２５−２５３４，２００３）。ＲＡに加えて、１３，１４−ジヒドロレチノイドを含む他のレチノイド代謝産物が、Ｒａｌｄｈ２−／−胚の完全な回復に対して必要かどうかを推測することは興味深いことである。オールトランスＤＲＡ代謝産物の同定は、この過程の最初の工程であり、遺伝子発現を調節する際のＤＲＡ及び他のＤＲＯＬ代謝産物の生理学的役割を確立するために更なる研究が必要であった。
【０２３８】
要約において、本発明者らは内在性生理活性レチノイドの新しいクラスを導く、ビタミンＡに対する新しい代謝経路を記載した。本発明者らは、オールトランスＤＲＯＬへのオールトランスＲＯＬ飽和、それに続くオールトランスＤＲＡへの酸化はｉｎ  ｖｉｖｏで生じることを示した。オールトランスＤＲＡは、ＲＡＲの結合によってレポーター遺伝子の転写を活性化することができるが、ＲＸＲの結合ではできなかった。オールトランスＤＲＯＬの酸化経路は、オールトランスＲＯＬの酸化経路と同じ酵素を使用する。本発明者らは、これらの以前には未知であった代謝産物は脊椎動物生理学におけるレチノイドの重要な機能をより理解することを助けると予想した。
【０２３９】
使用した略語としては：ＲＯＬ、レチノール；ＲＯＬパルミチン酸、レチニルパルミチン酸；ＡＤＨ、中鎖アルコールデヒドロゲナーゼ；９−ｃｉｓ−ＤＲＡ、９−ｃｉｓ−１３，１４−ジヒドロレチノイン酸；Ｃ１９−ＲＯＬ、（３Ｅ，５Ｅ，７Ｅ）−２，６−ジメチル−８−（２，６，６−トリメチルシクロヘキサン−１−エニル）オクタ−３，５，７−トリエン−１−オール；ＤＲＡＬ、１３，１４−ジヒドロレチナルデヒド；ＤＲＯＬ、１３，１４−ジヒドロレチノール；ＬＲＡＴ、レシチン：レチノールアシルトランスフェラーゼ；ＲＡ、レチノイン酸；ＲＡＬ、レチナルデヒド（ｒｅｔｉｎａｌｄｅｈｙｄｅ）；ＲＡＬＤＨ、ＲＡＬデヒドロゲナーゼ；ＲＡＲ、レチノイン酸受容体；ＲｅｔＳａｔ、オールトランスＲＯＬ：オールトランスＤＲＯＬサチュラーゼ；ＲＸＲ、レチノイドＸ受容体；ＳＤＲ、短鎖デヒドロゲナーゼ／レダクターゼ；ＲＡＲＥ、ＲＡＲ成分；ＲＸＲＥ、ＲＸＲ成分；ＣＭＶ、サイトメガロウイルス；ＨＰＬＣ、高速液体クロマトグラフィー；ＭＧＣ、哺乳類遺伝子コレクション；ＤＲ、直接反復配列；Ｘ−ｇａｌ、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル（ｉｎｄｏｌｙｌ）−−Ｄ−ガラクトピラノシド、である。
【０２４０】
本明細書において引用した全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物或いは特許出願のそれぞれが本明細書における参照によって取り込まれると特定に個別に示されたように、この参照によってその全体が本明細書に組み込まれるものである。
【０２４１】
前述の発明は、明快な理解を目的とするための記載及び実施例によって詳しく記載されたが、本分野の当業者は、添付の請求項の観点或いは範囲から逸脱することなく特定の変更及び修飾をそれらに行うことは、本発明の教示の観点内であることを容易に理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】図１は、植物及びシアノバクテリアＣＲＴＩＳＯに対する類似性を有する脊椎動物タンパク質の同定について示したものである。
【図２】図２は、形質移入細胞におけるマウスＲｅｔＳａｔの細胞内局在性について示したものである。
【図３】図３は、形質移入細胞におけるトマトＣＲＴＩＳＯ及びマウスＲｅｔＳａｔの酵素活性について示したものである。
【図４】図４は、マウスＲｅｔＳａｔによるオールトランスレチノールの変換の生合成産物の同定について示したものである。
【図５】図５は、マウスＲｅｔＳａｔの基質の異性体について示したものである。
【図６】図６は、オールトランスレチナールに対するＲｅｔＳａｔ活性について示したものである。
【図７】図７は、オールトランスレチノイン酸に対するＲｅｔＳａｔ活性について示したものである。
【図８】図８は、ホモジナイズされた細胞におけるＲｅｔＳａｔ活性について示したものである。
【図９】図９は、種々の組織におけるオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの同定について示したものである。
【図１０】図１０は、ＬＲＡＴ活性について示したものである。
【図１１】図１１は、Ｌｒａｔ−／−マウス肝臓におけるオールトランスＲＯＬパルミチン酸塩の代謝の分析について示したものである。
【図１２】図１２は、オールトランスＲＯＬ及びオールトランスＤＲＯＬのアルデヒドへの酸化について示したものである。
【図１３】図１３は、オールトランスＲＡＬ及びオールトランスＤＲＡＬのオールトランスＲＡ及びオールトランスＤＲＡへの酸化について示したものである。
【図１４】図１４は、オールトランスＲＡ及びオールトランスＤＲＡの酸化について示したものである。
【図１５】図１５は、Ｆ９−ＲＡＲＥ−ｌａｃＺレポーター細胞のＲＡ及びＤＲＡに対する応答について示したものである。
【図１６】図１６は、オールトランスＤＲＡ、オールトランスＲＡ、及び９−シス−ＲＡによるＤＲ１成分の活性化について示したものである。
【図１７】図１７は、［１Ｈ］−ＮＭＲにより特徴付けされたオールトランス４−オキソ−ＤＲＡ（ＶＩ）の化合物について示したものである。
【図１８】図１８は、Ｌｒａｔ−／−マウス肝臓におけるオールトランスＤＲＯＬの代謝分析について示したものである。
【図１９】図１９は、Ｌｒａｔ−／−マウス肝臓におけるオールトランスＲＡの代謝分析について示したものである。
【図２０】図２０は、ＲＰＥによるオールトランスＤＲＯＬのオールトランスＤＲＡへの変換について示したものである。
【図２１】図２１は、植物及びシアノバクテリアＣＲＴＩＳＯによる触媒反応について示したものである。
【図２２】図２２は、オールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールの合成について示したものである。
【図２３】図２３は、ＲｅｔＳａｔによる触媒化された、オールトランスレチノールのオールトランス１３，１４−ジヒドロレチノールへの変換反応について示したものである。
【図２４】図２４は、オールトランスＲＯＬ及びオールトランスＤＲＯＬの代謝について示したものである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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