(57)【要約】  本発明は、１以上の移植片拒絶反応抑制性化合物を哺乳動物に投与することを含み、少なくとも１つの化合物が、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体を含む、哺乳動物において移植片拒絶反応を抑制する組成物及び方法を提供する。本発明はまた、ＳＰＥＸポリペプチドを発現するリンパ球でのＳＰＥＸポリペプチドの発現を低下させる方法を提供する。本発明はさらに、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応し、移植片拒絶反応を抑制する抗体を同定する方法を提供する。本発明はさらに、リンパ球をＳＰＥＸ受容体のアゴニスト抗体と接触させることを含む、前活性化リンパ球の増殖を阻害する方法、リンパ球によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）発現を阻害する方法、及びリンパ球によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体（ＣＤ２５）発現を阻害する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
移植片拒絶反応を、この必要がある哺乳動物において抑制する方法であって、
前記哺乳動物に治療有効量の抗体を投与することを含み、ここで、前記抗体は脾臓発現（ＳＰＥＸ）ポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応し、それによって前記移植拒絶反応を抑制するものである、方法。
【請求項２】
移植片が同種異系移植片である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記移植片が皮膚移植片である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記移植片が組織移植片である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記移植片が器官移植片である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記移植片が骨髄移植片である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
第二の移植片拒絶反応抑制剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記第二移植片拒絶反応抑制剤が、シクロスポリン、ラパマイシン、ＦＫ５０６、コルチコステロイド又はインターロイキン（ＩＬ）−２受容体と免疫反応する抗体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体又はこの結合フラグメントを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメインと免疫反応する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体が配列番号３、１２、１３、４５、５４、５５、８５、８６又は８８と免疫反応する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体が配列番号１７、１８、５９又は６０と免疫反応しない、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記哺乳動物がマウスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記哺乳動物がヒトであり、前記抗ＳＰＥＸ抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＰＥＸポリペプチドの前記細胞外ドメインが、基本的に配列番号５５から成るポリペプチドの６個以上の連続アミノ酸を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
脾臓発現（ＳＰＥＸ）ポリペプチドを発現するリンパ球上のＳＰＥＸポリペプチドの発現を減少する方法であって、前記リンパ球を前記ＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応する抗ＳＰＥＸ抗体と接触させ、それによって前記リンパ球上の前記ＳＰＥＸポリペプチドの発現を減少する、方法。
【請求項２０】
前記抗ＳＰＥＸ抗体がモノクローナル抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗ＳＰＥＸ抗体が、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと特異的に免疫反応する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記抗ＳＰＥＸ抗体が、前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗ＳＰＥＸ抗体が、ＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメインと免疫反応する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗ＳＰＥＸ抗体が、前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗ＳＰＥＸ抗体が、配列番号３、１２、１３、４５、５４、５５、８５、８６又は８８と免疫反応する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗ＳＰＥＸ抗体が、配列番号１７、１８、５９又は６０と免疫反応しない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
移植片拒絶反応を、この必要がある哺乳動物において抑制する抗体を同定する方法であって、
ａ）脾臓発現（ＳＰＥＸ）ポリペプチドの細胞外ドメインのエピトープを含むアミノ酸配列を提供すること（前記エピトープは少なくとも6アミノ酸長である）、
ｂ）前記アミノ酸配列に対する抗体を作製すること、および
ｃ）移植片拒絶反応のモデルにおいて前記抗体をスクリーニングし、それによって前記移植片拒絶反応を抑制する前記抗体を同定すること
を含む、方法。
【請求項２８】
移植片拒絶反応の前記哺乳動物モデルが、マウス受容個体における同種異系皮膚移植片を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＳＰＥＸポリペプチドの前記細胞外ドメインが、配列番号３、１２、１３、４５、５４、５５、８５、８６又は８８を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＳＰＥＸポリペプチドの前記細胞外ドメインが配列番号３を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ＳＰＥＸポリペプチドの前記細胞外ドメインが配列番号１３を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
移植片拒絶反応を、この必要がある哺乳動物において抑制する方法であって、
前記哺乳動物に治療有効量の抗体を投与することを含み、ここで、前記抗体は本質的に脾臓発現（ＳＰＥＸ）ポリペプチドの細胞外ドメインからなるアミノ酸配列と免疫反応し、それによって前記移植片拒絶反応を抑制するものである、方法。
【請求項３３】
移植片拒絶反応を、この必要がある哺乳動物において抑制する方法であって、
前記哺乳動物に治療有効量の抗体を投与することを含み、ここで、前記抗体は本質的に配列番号１２からなるアミノ酸配列と免疫反応し、それによって前記移植片拒絶反応を抑制するものである、方法。
【請求項３４】
移植片拒絶反応を、この必要がある哺乳動物において抑制する方法であって、
前記哺乳動物に治療有効量の抗体を投与することを含み、ここで、前記抗体は本質的に脾臓発現（ＳＰＥＸ）ポリペプチドの免疫グロブリン様ドメインからなるアミノ酸配列と免疫反応し、それによって前記移植片拒絶反応を抑制するものである、方法。
【請求項３５】
移植片拒絶反応を、この必要がある哺乳動物において抑制する方法であって、
前記哺乳動物に治療有効量の抗体を投与することを含み、ここで、前記抗体は本質的に配列番号３からなるアミノ酸配列と免疫反応し、それによって前記移植片拒絶反応を抑制するものである、方法。
【請求項３６】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドを活性化する、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＳＰＥＸポリペプチドがリンパ球上で発現される、請求項１に記載の方法。
【請求項３８】
前記抗体が、前記リンパ球上で発現される前記ＳＰＥＸポリペプチドを活性化する、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記リンパ球がＴ細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
前記リンパ球がＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４１】
前記リンパ球がＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４２】
前記リンパ球がＢ細胞を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項４３】
脾臓発現ポリペプチド（ＳＰＥＸポリペプチド）を発現するリンパ球によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を阻害する方法であって、前記リンパ球を前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させることを含む、方法。
【請求項４４】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドを活性化する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗体がモノクローナル抗体又はこの結合フラグメントを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメインと免疫反応する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記抗体が配列番号３、１２、１３、４５、５４、５５、８５、８６又は８８と免疫反応する、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が配列番号１７、１８、５９又は６０と免疫反応しない、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記リンパ球がＴ細胞を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記リンパ球がＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記リンパ球がＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５４】
脾臓発現ポリペプチド（ＳＰＥＸポリペプチド）を発現するリンパ球によるインターロイキン−２受容体（ＣＤ２５）発現を阻害する方法であって、前記リンパ球を前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させることを含む、方法。
【請求項５５】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドを活性化する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記抗体がモノクローナル抗体又はこの結合フラグメントを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメインと免疫反応する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗体が配列番号３、１２、１３、４５、５４、５５、８５、８６又は８８と免疫反応する、請求項５４に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗体が配列番号１７、１８、５９又は６０と免疫反応しない、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記リンパ球がＴ細胞を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６３】
前記リンパ球がＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
前記リンパ球がＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６５】
脾臓発現ポリペプチド（ＳＰＥＸ）ポリペプチドを発現するリンパ球の増殖を阻害する方法であって、前記リンパ球を前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させることを含む、方法。
【請求項６６】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドを活性化する、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗体がモノクローナル抗体又はこの結合フラグメントを含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項６８】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない、請求項６５に記載の方法。
【請求項６９】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメインと免疫反応する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７０】
前記抗体が前記ＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗体が配列番号３、１２、１３、４５、５４、５５、８５、８６又は８８と免疫反応する、請求項６５に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗体が配列番号１７、１８、５９又は６０と免疫反応しない、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記リンパ球がＴ細胞を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７４】
前記リンパ球がＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、請求項６５に記載の方法。
【請求項７５】
前記リンパ球がＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、請求項６５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は移植片拒絶反応に関する。特に、本発明は、移植片拒絶反応を抑制するために有用な方法及び組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
移植後の移植片拒絶反応の治療のための現在の戦略は、典型的にはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、ラパマイシン、ＦＫ５０６、コルチコステロイド及びインターロイキン（ＩＬ）−２受容体に対する抗体などの免疫抑制剤の使用を含む。これらの薬剤は、典型的には長期間にわたって服用され、リンパ球の全体的減少を生じさせ、重篤な感染、腎毒性及び癌の危険度を上昇させる。さらに、一部の患者は、移植片拒絶反応を抑制するために十分なこれらの免疫抑制剤の用量を耐容することができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
求められているのは、移植片拒絶反応の付加的な抑制剤、特に抑制剤を摂取する個体からリンパ球を全体的に減少させないものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の１つの実施形態は、ここでは「脾臓発現（ＳＰＥＸ）ポリペプチド」と称するポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体の治療有効量をこの必要のある哺乳動物に投与することを含む、この必要のある哺乳動物において移植片拒絶反応を抑制する方法を提供する。ある実施形態では、本発明の方法は、１以上の付加的な移植片拒絶反応抑制剤を哺乳動物に投与することをさらに含む。付加的な移植片拒絶反応抑制剤の例は、ＣｓＡ、ラパマイシン、ＦＫ５０６、コルチコステロイド及びＩＬ−２受容体に対する抗体を含む。
【０００５】
移植片拒絶反応の抑制において本発明の抗ＳＰＥＸ抗体を使用することの１つの利点は、移植片受容個体を含む、哺乳動物への抗ＳＰＥＸ抗体の投与が、哺乳動物においてリンパ球を全体的に減少させないことである。従って、本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体の治療有効量をこの必要のある哺乳動物に投与することを含み、及び抗体の投与が哺乳動物における総ＣＤ４＋Ｔ細胞数、総ＣＤ８＋Ｔ細胞数又は総Ｂ細胞数を有意に減少させない、この必要のある哺乳動物において移植片拒絶反応を抑制する方法を提供する。
【０００６】
本発明の１つの実施形態は、脾臓発現（ＳＰＥＸ）ポリペプチドを発現するリンパ球を、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗ＳＰＥＸ抗体と接触させ、これによってリンパ球上のＳＰＥＸポリペプチドの発現を低下させることを含む、ＳＰＥＸポリペプチドを発現するリンパ球でのＳＰＥＸポリペプチドの発現を低下させる方法を提供する。
【０００７】
本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインのエピトープを含み、前記エピトープが少なくとも６アミノ酸の長さであるアミノ酸配列を提供すること；前記アミノ酸配列に対する抗体を作製すること；及び移植片拒絶反応のモデルにおいて前記抗体をスクリーニングし、これによって前記移植片拒絶反応を抑制する前記抗体を特定すること、を含む、この必要のある哺乳動物において移植片拒絶反応を抑制する抗体を特定する方法を提供する。
【０００８】
本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチド受容体（例えば配列番号２０又は配列番号６２）を発現する活性化リンパ球を、ＳＰＥＸポリペプチド受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させること（ＳＰＥＸ受容体の接触（ｅｎｇａｇｅｍｅｎｔ）と活性化）を含む、前記活性化リンパ球によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を阻害する方法を提供する。
【０００９】
本発明の１つの実施形態は、脾臓発現ポリペプチド（ＳＰＥＸポリペプチド）受容体を発現する活性化リンパ球を、ＳＰＥＸポリペプチド受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させることを含む、前記活性化リンパ球によるインターロイキン−２受容体（ＣＤ２５）発現を阻害する方法を提供する。
【００１０】
本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチド受容体を発現するあらかじめ活性化したリンパ球を、ＳＰＥＸポリペプチド受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させることを含む、あらかじめ活性化したリンパ球の増殖を阻害する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
発明者は、一部には、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体が、移植片拒絶反応を抑制し、リンパ球でのＳＰＥＸポリペプチドの発現を低下させるために有用であることを発見した。発明者はさらに、一部には、移植片拒絶反応を抑制し、リンパ球でのＳＰＥＸの発現を低下させる抗体を特定する方法を発見した。
【００１２】
１．定義
ここで使用する、「同系」という用語は、遺伝学的に同一であるか又は密接に関連する生物、細胞、組織、器官等を指す。
【００１３】
ここで使用する、「同系皮膚移植片」という用語は、皮膚移植片についての宿主及び皮膚移植片のソースが、遺伝学的に同一であるか又は移植片と宿主が抗原性に（ａｎｔｉｇｅｎｅｉｃａｌｌｙ）免疫反応しないように十分に密接に関連する個体である、皮膚移植片を指す。
【００１４】
ここで使用する、「同種異系」という用語は、同じ種の個体からであるか又は同じ種の個体に由来するが、遺伝学的にお互いに異なる生物、細胞、組織、器官等を指す。
【００１５】
ここで使用する、「異種移植片」という用語は、提供個体と受容個体が異なる種である移植片を指す。
【００１６】
ここで使用する、「同種異系皮膚移植片」という用語は、皮膚移植片についての宿主及び皮膚移植片のソースが、移植片と宿主が抗原性に免疫反応するように遺伝学的に十分に異なる同じ種の個体である、皮膚移植片を指す。同種異系移植片は、移植片拒絶反応を抑制する介入措置が存在しないときには拒絶される。
【００１７】
ここで使用する、「移植片拒絶反応」という用語は、移植片の受容個体上又は受容個体内での、移植された細胞、組織、器官等の部分的又は完全な破壊を指す。
【００１８】
ここで使用する、「宿主」という用語は、移植される細胞、組織、器官等の受容個体である生物（好ましくは、生物は哺乳動物である）、組織、器官等を指す。「宿主」と「受容個体」という用語は、移植宿主又は受容個体を指すとき、ここでは交換可能に使用される。
【００１９】
ここで使用する、「リンパ球を全体的に減少させる」という用語は、対照動物（免疫抑制剤を摂取していない）における対応リンパ球数と比較して、哺乳動物への免疫抑制剤の投与によるＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球又はＢリンパ球の総数の５０％以上の減少を指す。リンパ球数の測定は、典型的には血液、血清又は血漿試料を用いて実施される。「リンパ球を全体的に減少させ」ない免疫抑制剤は、哺乳動物への免疫抑制剤の投与が、ＣＤ４＋Ｔリンパ球、ＣＤ８＋Ｔリンパ球及びＢリンパ球の総数の５０％以上が維持される（好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに一層好ましくは１００％以上が維持される）結果をもたらす薬剤を指す。
【００２０】
ここで使用する、「移植片拒絶反応を抑制するための治療有効量」は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体について、移植片受容個体に投与したとき、長期間にわたって移植片の拒絶反応を部分的に又は完全に抑制する抗体の量を指す。抗体（及び場合により、第二移植片拒絶反応抑制剤）は、移植の前、移植の間及び／又は移植後に投与することができる。
【００２１】
ここで使用する、「可溶性異種ポリペプチド」は、配列についてＳＰＥＸポリペプチドとは異なり（これは非ＳＰＥＸポリペプチドである）、及びＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインよりも水溶液により可溶性であるポリペプチドである。
【００２２】
ここで使用する、「単離された」及び「精製された」という用語は、交換可能に使用され、特定対象化合物が、内毒素などの毒性物質を含む不純物を含有しない又は基本的に含有しないように他の汚染物質から分離されていることを意味する。「精製された」の意味は、ここでは、しばしば有効成分（例えばＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応するモノクローナル抗体）と組み合わせることが望ましく、不純物とはみなされない溶質、賦形剤、安定剤、緩衝剤、塩、酸、酸性塩、医薬的に許容される担体は考慮しない。
【００２３】
２．ＳＰＥＸ
ＳＰＥＸの発見は、どちらも参照してここに組み込まれる、２００４年４月２３日出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．１０／８３１，６２２及び２００３年４月３０日出願のＵ．Ｓ．Ｓｅｒｉａｌ  Ｎｏ．０６／４６７，２０６に述べられている。ＳＰＥＸは、参照してここに組み込まれる、公表文献、Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００３，  ４（７）：６７０−６７９）において記述された。Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙの論文の中では、ＳＰＥＸはＢ及びＴリンパ球アテニュエイター（ＢＴＬＡ）と称されている。
【００２４】
ＳＰＥＸ  ｍＲＮＡ及びポリペプチドは、Ｂ及びＴリンパ球を含むリンパ球、ナイーブＢ及びＴリンパ球、胸腺細胞、活性化Ｂ及びＴリンパ球、脾マクロファージ、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び成熟骨髄由来樹状細胞によって発現される（例えば参照してここに組み込まれる、Ｈａｎら（２００４）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １７２：５９３１−５９３９参照）。ＳＰＥＸポリペプチドは、細胞膜で発現することが認められる多ドメインタンパク質である。ＳＰＥＸポリペプチドは、細胞外ドメイン、ポリペプチドを細胞膜に固定すると考えられる単一膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインを含む。ＳＰＥＸポリペプチドはＢ７ｘリガンド（Ｂ７−Ｈ４及びＢ７Ｓ１としても知られる）についての受容体である。ＳＰＥＸ細胞外ドメインは免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを含み、細胞内ドメインは３個のチロシンベースのシグナル伝達モチーフを含む。チロシンベースのシグナル伝達モチーフは、ここでは、例えばリンパ球の活性化を阻害する又は負に調節すると考えられる抑制性シグナル伝達モチーフであると考えられる。ＳＰＥＸは、免疫グロブリンスーパーファミリーのＩ型受容体リンタンパク質であると考えられる。マウス及びヒトＳＰＥＸポリペプチドの図式的表示を図１に示す。
【００２５】
ＳＰＥＸ欠損マウスは、見かけ上はリンパ球の発生上の欠陥を示さない；しかし、ＳＰＥＸ欠損マウスからのＴ細胞は、Ｔ細胞活性化の抗ＣＤ３抗体刺激に対して過応答性である。一部この所見に基づき、ＳＰＥＸはリンパ球の活性化、増殖及び機能の負の調節因子であると考えられる。
【００２６】
３．移植片拒絶反応の抑制
発明者は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体が、移植片拒絶反応のマウスモデルにおいて移植片拒絶反応を抑制するという驚くべき発見を行った。従って、本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体の移植片拒絶反応抑制量をこの必要のある哺乳動物に投与することを含む、この必要のある哺乳動物において移植片拒絶反応を抑制する方法を提供する。
【００２７】
Ａ．ＳＰＥＸ細胞外ドメイン
上記で論じたように、本発明は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体が移植片拒絶反応を抑制することを提供する。従って、本発明は、例えば移植片拒絶反応を抑制する抗体の製造において有用なＳＰＥＸポリペプチド及び、例えば前記ＳＰＥＸポリペプチドの製造において有用なＳＰＥＸポリヌクレオチドを提供する。いかなるＳＰＥＸポリペプチドも、抗ＳＰＥＸ抗体の製造のための免疫原として有用である。好ましいＳＰＥＸポリペプチドは、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインの少なくとも６個の連続アミノ酸を含む（又は基本的に前記アミノ酸から成る）。極めて好ましいＳＰＥＸポリペプチドは、ＳＰＥＸタンパク質のＩｇ様ドメイン（例えば配列番号３（ヒト）、４５（マウス）又は８８（マウス、対立遺伝子ｂ、下記参照）参照）を含む（又は基本的に前記Ｉｇ様ドメインから成る）。Ｉｇ様ドメインは、本発明における使用のための抗ＳＰＥＸ抗体を製造するための抗原として極めて好ましい。
【００２８】
本発明のある実施形態は、マウス、ヒト（好ましい）又は他の哺乳動物起源のＳＰＥＸポリペプチドを提供する。ヒトＳＰＥＸ（ｈＳＰＥＸ）及びマウスＳＰＥＸ（ｍＳＰＥＸ）のポリペプチド及び対応するポリヌクレオチド配列の例を、配列アイデンティファイアーと共に、図２Ａ−Ｄにおいて図式的に示す。ｍＳＰＥＸの対立遺伝子も開示し、ここではｍＳＰＥＸｂと称する（ｍＳＰＥＸｂの細胞外部分だけを配列決定した）。ｍＳＰＥＸｂのプロセシングされない細胞外ドメインの一例を配列番号８５（シグナル配列を含む）に示す。ｍＳＰＥＸｂのプロセシングされた細胞外ドメインの一例を配列番号８６（シグナル配列を伴わない）に示す。ｍＳＰＥＸｂの好ましいＩｇ様ドメインを配列番号８８に示す。
【００２９】
ここで使用する、ＳＰＥＸポリペプチドの極めて好ましい細胞外ドメインは、配列番号１、２、３、４、１２又は１３（ｈＳＰＥＸより）を含む（又は基本的に前記配列から成る）。ＳＰＥＸポリペプチドの好ましい細胞外ドメインは、配列番号４３、４４、４５、４６、５４又は５５（ｍＳＰＥＸより）又は配列番号８５、８６又は８６（ｍＳＰＥＸｂより）を含む（又は基本的に前記配列から成る）。さらに一層極めて好ましいＳＰＥＸポリペプチドは、配列番号３に示すヒトＳＰＥＸのＩｇ様ドメインを含む（又は基本的に前記Ｉｇ様ドメインから成る）。
【００３０】
一般に、６以上の連続アミノ酸残基を含むポリペプチドは免疫応答を惹起することができる。従って、ある実施形態は、ＳＰＥＸ細胞外ドメインの６個の連続アミノ酸を含む（又は基本的に前記アミノ酸から成る）アミノ酸配列（例えば配列番号１３、５５又は８５）を提供する。典型的には、ＳＰＥＸポリペプチド内の連続アミノ酸残基の数が増えることはペプチドに対する免疫原性応答を増強する。従って、ある実施形態は、より好ましくなっていく順序で、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインの６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９又は４０個以上の連続アミノ酸を含むＳＰＥＸ免疫原を提供する。場合により、ＳＰＥＸ免疫原は、ＳＰＥＸポリペプチドの６−９、１０−１９、２０−２９、３０−３９又は４０−５０個の連続アミノ酸を含む。
【００３１】
本発明の１つの実施形態は、可溶性異種ポリペプチドと作動可能に連結されたＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインを含む「ＳＰＥＸ融合ポリペプチド」を提供する。好ましい可溶性異種ポリペプチドは、ヒトＩｇＧ１の定常領域、より好ましくはヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む。１つの実施形態では、溶解度促進性異種ポリペプチドは配列番号９７を含む。もう１つの実施形態は、ヒトＩｇＧ１の定常領域、好ましくはヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む異種ポリペプチドに作動可能に連結された、配列番号３、配列番号４５、配列番号８８、配列番号１２、配列番号５４又は配列番号８６に示すＳＰＥＸポリペプチドを含むポリペプチドを提供する。プロテインＡはＩｇＧ１の定常領域に高い親和性で結合する。従って、ＳＰＥＸ−ヒトＩｇＧ１融合物は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。
【００３２】
Ｉ．ＳＰＥＸポリペプチドの製造
本開示に照らして、本発明のＳＰＥＸポリペプチドは、ポリペプチドを作製するための当分野において周知の様々な手法を用いて作製できる。例えばＳＰＥＸポリペプチドは、天然ソース（例えばリンパ球又は脾又は胸腺組織）からの精製によって製造できる。もう１つの例では、ＳＰＥＸポリペプチドは、細菌（例えばＫ１２）、真核生物、酵母、昆虫、植物、哺乳動物、チャイニーズハムスター（例えばＣＨＯ）、マウス及びヒト細胞を含む宿主細胞における、ＳＰＥＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現を通して（例えば組換えＳＰＥＸ発現系の導入を用いて）製造することができる。有用なＳＰＥＸポリヌクレオチドの配列アイデンティファイアーの例については図２Ｂ及び２Ｄ参照。さらにもう１つの例では、ＳＰＥＸポリペプチドは新規合成法を用いて製造される。ここで有用なＳＰＥＸポリペプチド（好ましくはこの細胞外ドメイン）の配列アイデンティファイアーの例については図２Ａ及び２Ｃ（及び配列番号８５−８８）参照。
【００３３】
好ましい実施形態では、ＳＰＥＸポリペプチドは、タンパク質の分離及び精製のための当分野で公知の方法を用いて精製される。例えば本発明に照らして、当業者は、アフィニティー分離を通してこの特定フラグメント及びドメインを含むＳＰＥＸポリペプチドを単離する又は精製するためにここで開示する抗ＳＰＥＸ抗体を使用することができる。上述したＳＰＥＸ融合ポリペプチドについては、プロテインＡはＩｇＧ１の定常領域に高親和性で結合する。従って、ＳＰＥＸ−ヒトＩｇＧ１融合物は、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。融合ポリペプチドは、好ましくは組換えＤＮＡ手法、ポリペプチド発現及び当分野で周知の精製手法を用いて作製される。好ましい「作動可能な連結」は、ペプチド結合を含む。又は、可溶性異種ポリペプチドは、この組成物及び使用が当分野において周知である、化学的架橋剤を用いてＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインに作動可能に連結することができる。
【００３４】
ＳＰＥＸポリペプチドの製造のための有用なアミノ酸残基（及びヌクレオチド残基）の例は、参照してここに組み込まれる、「工業所有権情報及び文献に関する世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）ハンドブック」の、付属２の表１−６を含む、「基準ＳＴ．２５：特許出願におけるヌクレオチド及びアミノ酸配列表の提示のための基準（１９９８）」（ここでは「１９９８年のＷＩＰＯ基準ＳＴ．２５」と称する）に示されている。
【００３５】
Ｂ．ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体
本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体を提供する。本発明の抗体は、例えばリンパ球のＳＰＥＸ発現を低下させるため及び移植片拒絶反応を抑制するために有用である。「抗体」という用語は、無傷抗体分子及び／又は抗体分子の免疫学的に活性な部分又はフラグメントを含む、いかなる形態の抗体も包含することが意図されている。抗体及びこの活性フラグメントは当分野において周知である（例えばＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ポリクローナル、モノクローナル、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ｖ）、一本鎖抗体（ＳＣＡ）、一本鎖Ｆａｂ、ヒト化、ハイブリッド等の抗体）。抗体は単離されていることが好ましい。また、抗体は、組換え、キメラ又はさもなければ非天然に生じる抗体を含むことが好ましい。ある実施形態では、抗体は多価（２以上のエピトープ結合部位を含む）、例えば二価抗体である。好ましい抗体は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する、抗ＳＰＥＸモノクローナル抗体、好ましくはヒト又はヒト化抗ＳＰＥＸモノクローナル抗体である。
【００３６】
Ｉ．抗体の製造
特定抗原に対する抗体を製造する方法は当分野において周知である。本発明は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗ＳＰＥＸ抗体の製造のために有用なＳＰＥＸ抗原（すなわち免疫原）を提供する。従って、本開示に照らして、当業者は、本発明において有用な抗ＳＰＥＸ抗体を製造することができる。抗体は一般に、例えば動物において（例えばウサギ、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウシ）；細胞、主として細胞培養において（例えば細菌、植物、藻類、昆虫、哺乳動物、マウス、ハイブリドーマ及びヒト細胞）；ファージディスプレイによって；及び抗体骨格ベクターへのエピトープクローニングと様々な細胞型（例えば細菌、植物、藻類、昆虫、哺乳動物、マウス及びヒト）のいずれかへの遺伝子導入によって、製造される。
【００３７】
４．医薬組成物
本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体を含有する「ＳＰＥＸ医薬組成物」を提供し、前記抗体は移植片拒絶反応を抑制することができ、前記抗体は移植片拒絶反応を抑制するために治療上有効な量である。ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応し、移植片拒絶反応を抑制することができる好ましい抗体は、ｍＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメイン（例えば配列番号５５）と免疫反応するＰＪ１９．１である。
【００３８】
好ましいＳＰＥＸ医薬組成物は、夾雑物を最小限に抑えるように製造される。好ましいＳＰＥＸ医薬組成物はまた、組成物が投与される受容個体におけるアレルギー及び中毒反応を最小限に抑えるように製造される。１つの実施形態では、ＳＰＥＸ医薬組成物は発熱物質（例えば内毒素）を含まない又は基本的に発熱物質を含まないことが好ましい。
【００３９】
好ましい実施形態では、ＳＰＥＸ医薬組成物は第二の移植片拒絶反応抑制剤（抗ＳＰＥＸ抗体に加えての１以上の移植片拒絶反応抑制剤を意味する）をさらに含む。好ましい第二移植片拒絶反応抑制剤は、ＣｓＡ、ラパマイシン、ＦＫ５０６、コルチコステロイド及びＩＬ−２受容体と免疫反応する抗体を含むが、これらに限定されない。
【００４０】
Ａ．医薬組成物の製造
本発明に照らして、ＳＰＥＸ医薬組成物（ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体を含有する）は、当分野において公知である何らかの方法で（例えば従来の混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、乳化、被包、封入、凍結乾燥又は懸濁工程を含む）製造し得る。製造は、適正製造基準、当分野で公知の手順及び規制に従うことが好ましい。
【００４１】
ある実施形態では、ＳＰＥＸ医薬組成物は、医薬的に許容される担体、賦形剤、助剤、防腐剤又は他の成分（ここでは集合的に「医薬的に許容される担体」と称する）をさらに含むように製造される。「担体」という用語は、ここでは「医薬的に許容される担体」を指す。好ましくは、医薬的に許容される担体はヒト又は非ヒト哺乳動物への投与に適する。医薬組成物の製剤及び投与のための手法に関するさらなる詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ）の最新版に認められる。
【００４２】
液体担体は、好ましくは生理的に適合性の緩衝液（例えばハンクス液、リンガー液又は生理緩衝食塩水）中の、水溶液を含み得る。液体担体はまた、非水性及び油性の懸濁液を含む。適切な親油性溶媒又は媒質は、脂肪油（例えばゴマ油、合成脂肪酸エステル、オレイン酸エチル、トリグリセリド又はリポソーム）を含み得る。有用なリポソームは、陽イオン性リポソーム、陰イオン性リポソーム及び中性電荷密度を有するリポソームを含む。増粘剤が含まれ得る（例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール又はデキストラン）。安定剤、接着剤又は溶解度を高める物質も含まれ得る。付加的な不活性成分は、アラビアゴム、シロップ、ラノリン又はデンプンのいずれか又は全部を含み得る。使用し得るもう１つの賦形剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。ＰＥＧは、製剤と混合し得るか又は抗ＳＰＥＸ抗体分子自体に結合することができる。ＰＥＧは、例えば脱水剤又は濃縮剤として有用であり得る。従って、担体は水性、非水性（疎水性）又は両親媒性であり得る。徐放性及び／又は持続放出性担体及びこの医薬製剤は当分野において公知であり、本開示に照らして、ここでの実施形態において使用することができる。
【００４３】
ＳＰＥＸ医薬組成物は塩として提供してもよく、酸（例えば塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸等）で形成することができる。他の実施形態では、ＳＰＥＸ医薬組成物は、好ましくは使用前に緩衝液と混合される、凍結乾燥粉末であり得る。
【００４４】
Ｂ．医薬組成物の投与
本発明のある実施形態では、ＳＰＥＸ医薬組成物（ＳＰＥＸ細胞外ドメインと免疫反応する抗体を含有する）は、移植片拒絶反応のための治療を必要とする患者に投与される。本発明に包含される医薬組成物は、経口、静脈内、筋肉内、鼻、気管内、関節内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内、経皮、皮下、腹腔内、鼻内、腫瘍内、腸内、局所、舌下、膣又は直腸投与経路を含むがこれらに限定されない、何らかの所望経路によって投与し得る。本発明に照らして、当業者は、患者にＳＰＥＸ医薬組成物を投与するための適切な経路を選択することができる。
【００４５】
投与経路のために考慮される因子は、移植の位置及び患者の状態を含み得る。やはり、本発明に照らして、当業者は、担体、賦形剤、助剤、不活性成分等を含有する製剤を含む、特定投与経路のために望ましい適切なＳＰＥＸ医薬組成物を選択することができる。
【００４６】
投与方法は、注射、注入、カテーテルによる投与、微量注入、粒子媒介性（バイオリスティック）移入、挿管、吸入、経口摂取、マトリックスからの拡散等を含むが、これらに限定されない。一例では、ＳＰＥＸ医薬組成物は、移植器官又は組織の求心性血液供給中に組成物を注射することによって投与し得る。ＳＰＥＸ医薬組成物を投与する好ましい方法は腹腔内注射を含む。
【００４７】
Ｃ．医薬組成物の用量
本発明における使用に適する医薬組成物は、有効量又は具現される目的を達成するための用量（例えば移植片を有する又は移植片を必要とする患者を治療するときに）の、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体を含む。本発明及び当分野の知識に照らして、有効用量の決定は十分に当業者の能力の範囲内である。
【００４８】
治療有効量又は範囲は、最初に細胞培養アッセイ又は動物モデルにおいて；通常はマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ブタ又は非ヒト霊長動物において推定することができる。動物モデルはまた、好ましい濃度範囲及び投与経路を決定するためにも使用し得る。次にこのような情報を使用して、ヒトにおける好ましい用量及び投与経路を選択することができる。マウス皮膚移植片を含む好ましい動物モデルを以下で述べる。
【００４９】
治療効果及び毒性は、細胞培養、実験動物又は他の移植モデル系における標準製薬手順によって測定し得る。例えばＥＤ５０（個体群の５０％において治療上有効な量）及びＬＤ５０（個体群の５０％を死に至らせる用量）をモデル系において測定することができる。毒性と治療効果の間の用量比が治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表わし得る。大きな治療指数を示すＳＰＥＸ医薬組成物が好ましい。ＳＰＥＸ医薬組成物は、場合により治療指数を増強する又は高めるために第二移植片拒絶反応抑制剤の使用を含む。モデル系から得られたデータが、ヒトでの使用のための用量範囲を決定するときに使用される。このような組成物に含まれる用量は、好ましくは、低毒性の、又はより好ましくは基本的に毒性を伴わない、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。１つの実施形態では、ＳＰＥＸ医薬組成物は、治療上有効なＥＤ５０を含む、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体の用量を含有する。本ＳＰＥＸ医薬組成物は、患者の相対的条件及び移植片拒絶反応阻害剤による治療に対して患者が有する必要性を考慮に入れた後、ＳＰＥＸ医薬組成物を患者（ヒト又は、場合により、非ヒト哺乳動物）に投与するために許容される毒性又はＬＤ５０を含むことがより好ましい。従って、患者において使用されるＳＰＥＸ医薬組成物の用量は、好ましくは、治療を必要とする患者に関連する因子に照らして、医師によって決定される。
【００５０】
用量及び投与は、活性成分の十分なレベル（例えば循環及び／又は局所濃度）を提供するように又は所望作用を維持するように調整される。考慮し得る因子は、疾患状態の重症度、被験者の全体的健康状態、年齢、体重、性別、食事、投与の時間及び頻度、薬剤の組合せ、反応感受性、治療に対する耐容性、及び治療に対する応答を含む。一般に、ＳＰＥＸ医薬組成物は、例えば１日１回、１日おきに、３−４日おきに、毎週、２週間に１回、月に１回、数ヶ月ごとに１回、又は年に１回投与し得る。
【００５１】
投与用量は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体の、例えば投与当り０．１ｍｇ／ｋｇ−２０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは投与当り２．５ｍｇ／ｋｇ−２０ｍｇ／ｋｇを含む。
【００５２】
５．ＳＰＥＸポリペプチドのリンパ球発現の低下
本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチドを発現するリンパ球を、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗ＳＰＥＸ抗体と接触させ、これによってリンパ球の表面でのＳＰＥＸポリペプチドの下方調節を導くことを含む、ＳＰＥＸポリペプチドを発現するリンパ球でのＳＰＥＸポリペプチドの発現を低下させる方法を提供する。
【００５３】
好ましいリンパ球は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞を含むが、これらに限定されない。好ましい抗体はモノクローナル抗体である。また、本発明の抗体はヒト又はヒト化抗体であることが好ましい。本発明の抗体は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応し（抗体は、Ｉｇ様ドメインと免疫反応することが特に好ましい）、及び場合により、抗体は細胞内ドメイン及び／又はＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない。ある実施形態では、本発明の抗体は、配列番号３、１２、１３、４５、５４、５５、８５、８６又は８８と免疫反応し、及び場合により、配列番号１７、１８、５９又は６０と免疫反応しない。
【００５４】
６．移植片拒絶反応を抑制する抗体の同定
本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインのエピトープを含み、前記エピトープが少なくとも６アミノ酸の長さであるアミノ酸配列を提供すること；前記アミノ酸配列に対する抗体を作製すること；及び移植片拒絶反応を抑制する抗体を特定するために移植片拒絶反応のモデルにおいて前記抗体をスクリーニングすること、を含む、哺乳動物において移植片拒絶反応を抑制する抗体を同定する方法を提供する。
【００５５】
Ａ．移植片拒絶反応の哺乳動物モデル
膵島移植、角膜移植、骨髄移植、幹細胞移植、皮膚移植片移植、骨格筋移植、大動脈及び大動脈弁移植、及び心臓、肺、心肺、腎臓、肝臓、膵臓及び小腸移植を含むがこれらに限定されない血管化器官移植を含むが、これらに限定されない、数多くの細胞、組織及び器官型の移植のための手法が当業者に周知である（例えばＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｉｎ  Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍａｌｓ  （１９９５）Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ  Ｔ＆Ｆ  ＳＴＭ，４９４ページ参照）。本発明は特定種の移植に限定されない。
【００５６】
一般に、非同系提供個体と受容個体の間の移植は、移植片拒絶反応抑制剤の不在下では、移植細胞、組織又は器官の部分的又は完全な、典型的には進行性の、破壊によって特徴付けられる移植片拒絶反応を生じさせる。従って、いかなる非同系（例えば同種異系又は異種）移植も、ここでは移植片拒絶反応のモデル系として有用である。移植片拒絶反応抑制の好ましいモデル系は、マウス同種異系皮膚移植片を含む。
【００５７】
１つの実施形態では、非同系移植を２つの群の哺乳動物について実施し、最初の群は移植片拒絶反応抑制剤で処置せず（対照群）、２番目の群は、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体を含有するＳＰＥＸ医薬組成物で処置する。移植の経過を移植片拒絶反応（移植片の破壊）のパーセンテージについて経時的に観測する。未処置対照に比べて処置群において、例えば移植片拒絶反応のパーセンテージが低下する又は所与の期間排除される場合又は移植片が所与の量の移植片拒絶反応についてより長期間生存する場合、抗ＳＰＥＸ抗体は移植片拒絶反応を抑制することができる。
【００５８】
もう１つの実施形態では、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体と第二移植片拒絶反応抑制剤を最初の群の哺乳動物に投与し、第二移植片拒絶反応抑制剤を２番目の群の哺乳動物に投与する（第二抑制剤は抗ＳＰＥＸ抗体ではない）。本実施形態は、例えば移植片拒絶反応の抑制における抗ＳＰＥＸ抗体と第二抑制剤の相乗作用の検出を可能にする。
【００５９】
７．リンパ球のインターロイキン−２分泌の阻害
活性化リンパ球上のＳＰＥＸ受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗体が、活性化リンパ球によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を阻害することは、本発明の発見である（例えば実施例１１及び図６Ａ参照）。リンパ球は、例えばリンパ球をＣＤ３（αＣＤ３）に対する抗体と接触させることによって活性化することができる。従って、本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチド受容体（例えば配列番号２０又は配列番号６２）を発現するリンパ球を、ＳＰＥＸポリペプチド受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させること（ＳＰＥＸ受容体接触）を含む、活性化リンパ球によるＩＬ−２分泌を阻害する方法を提供する。好ましくは、抗体はリンパ球上のＳＰＥＸ受容体のアゴニストを含み、従って、ＳＰＥＸ受容体の活性化を刺激する。ＳＰＥＸ受容体は、好ましくはリンパ球増殖及びＩＬ−２分泌の負の調節因子を含み、従って、活性化リンパ球によるＩＬ−２分泌の阻害のための作用機構を提供する。
【００６０】
好ましい抗体は、モノクローナル抗体又はこの結合（活性）フラグメントを含む。好ましくは、抗体はＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない。１つの実施形態では、抗体はＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメイン（例えば配列番号３、配列番号４５又は配列番号８８）と免疫反応し、より好ましくはＳＰＥＸポリペプチドの細胞内ドメインと免疫反応しない。１つの実施形態では、抗体は、配列番号３、１２、１３、４５、５４、５５、８５、８６又は８８から選択される配列と免疫反応する。１つの実施形態では、抗体は、配列番号１７、１８、５９又は６０から選択される配列と免疫反応しない。１つの実施形態では、抗体は、配列番号３、１２、１３、４５、５４、５５、８５、８６又は８８から選択される配列と免疫反応するが、配列番号１７、１８、５９又は６０から選択される配列と免疫反応しない。１つの実施形態では、リンパ球は、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞の１つを含む。
【００６１】
また、Ｔ細胞をＳＰＥＸ受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させた（これによってリンパ球によるＩＬ−２分泌を阻害した）後、ＩＬ−２をＴ細胞に添加することにより、活性化Ｔ細胞において通常認められる増殖が完全には回復されなかったことは、本発明の１つの実施形態である（例えば実施例１１及び図６Ｂ参照）。
【００６２】
８．リンパ球のインターロイキン−２受容体発現の阻害
活性化リンパ球上のＳＰＥＸポリペプチド受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗体が、活性化リンパ球によるインターロイキン−２（ＩＬ−２）受容体（ＣＤ２５）発現を阻害することは、本発明の発見である（例えば実施例１１及び図６Ｃ参照）。従って、本発明の１つの実施形態は、脾発現ポリペプチド（ＳＰＥＸポリペプチド）受容体を発現する活性化リンパ球を、ＳＰＥＸポリペプチド受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させることを含む、前記活性化リンパ球によるインターロイキン−２受容体（ＣＤ２５）発現を阻害する方法を提供する。抗体はＳＰＥＸポリペプチド受容体を活性化することが好ましい。好ましい抗体、ＳＰＥＸポリペプチド及びリンパ球は上記７章に述べられている。
【００６３】
９．既に活性化したリンパ球の増殖の阻害
リンパ球が、抗ＳＰＥＸ抗体と接触させる前に増殖について活性化している場合でも、リンパ球をＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させることがリンパ球の増殖を阻害することは、本発明の発見である（例えば実施例１１及び図８参照）。従って、本発明の１つの実施形態は、ＳＰＥＸポリペプチド受容体を発現する活性化リンパ球を、前記ＳＰＥＸポリペプチド受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗体と接触させることを含む、ＳＰＥＸポリペプチド受容体を発現する活性化リンパ球の増殖を阻害する方法を提供する。抗体はＳＰＥＸポリペプチド受容体を活性化することが好ましい。好ましい抗体、ＳＰＥＸポリペプチド及びリンパ球は上記７章に述べられている。
【００６４】
以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明を限定することを意図しない。
【実施例】
【００６５】
１．  ｍＳＰＥＸの特定とクローニング
正の選択は、未熟胸腺細胞が、胸腺支質によって発現されるＭＨＣ／自己ペプチド複合体のＴ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）認識の結果として成熟シグナルを受け取る発生過程である。低濃度の薬理学的活性化因子、ホルボールエステル（例えばＰＭＡ）及び／又はイオノマイシンへの未熟胸腺細胞の暴露は、インビトロで二重陽性（ＤＰ）胸腺細胞の生存と分化を誘導し、インビボでの胸腺細胞の正の選択の許容されるモデル系を提供する。
【００６６】
核酸マイクロアレイを使用して、発明者は、非刺激胸腺細胞と比較して胸腺細胞の正の選択の間の核酸発現の変化を特定した。ＴＣＲα鎖欠損胸腺細胞（マウス）を、それぞれ活性化及び非活性化胸腺細胞を与える０．２ｎｇ／ｍｌ  ＰＭＡ及び０．２ｍｇ／ｍｌイオノマイシンの存在下又は不在下に培地中で培養した。ＴＣＲα鎖欠損胸腺細胞は、遺伝的突然変異のために発生のＤＰ段階でブロックされる。これらの細胞における遺伝子発現は、刺激後、発生中の胸腺細胞の特徴を示す。細胞を６時間インキュベートした後、ＲＮｅａｓｙ  ＲＮＡ及びＯｌｉｇｏｔｅｘ  ｍＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてポリＡ＋ＲＮＡを単離した。ポリＡ＋ＲＮＡを、Ｍｏｕｓｅ  １．０２  Ａｒｒａｙを製造者の指示に従って使用して（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）比較ｃＤＮＡアレイ分析に供した。マイクロアレイのシグナル解析は、ＧＥＭＴｏｏｌｓ解析ソフトウエア（Ｉｎｃｙｔｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）を用いて実施した。
【００６７】
発明者は、非刺激胸腺細胞と比較した刺激胸腺細胞における配列の発現の割合に基づき、さらなる試験のために２個の配列を選択した。発現の割合は、それぞれＭｏｕｓｅ  Ａｒｒａｙ上に含まれる、ＥＳＴ  ＡＡ１８４１８９及びＡＡ１７７３０２への各々の標識ｃＤＮＡのハイブリダイゼーションの基準化シグナルから測定した。刺激胸腺細胞における各々の配列の発現は、それぞれＥＳＴ  ＡＡ１８４１８９及びＥＳＴ  ＡＡ１７７３０２にハイブリダイズする配列について９．１倍及び６．６倍高かった。Ｍｏｕｓｅ  １．０２  Ａｒｒａｙ上のこれらのＥＳＴは、Ｓｏａｒｅｓマウス３ＮｂＭＳライブラリーと呼ばれるマウスライブラリーを起源とし、前記マウスライブラリーは４週齢Ｃ５７ＢＬ／６Ｊマウスの脾臓に由来した。
【００６８】
発明者は、ＥＳＴの配列をマウス核酸配列のデータベースと比較するために（各々のＥＳＴはマウス配列データベース内の共通配列に対応する）ＢＬＡＳＴソフトウエア（ＮＣＢＩ）を用いてＥＳＴ  ＡＡ１８４１８９及びＡＡ１７７３０２が連鎖していると判定した。従って、ＥＳＴ  ＡＡ１８４１８９及びＡＡ１７７３０２はより完全な核酸の一部であると判定される。最も５’側のＥＳＴ（５’−ｍｏｓｔ  ＥＳＴ）（ＡＡ１７７３０２）を使用して、発明者は、刺激胸腺細胞から作製したｃＤＮＡを反応における鋳型として用いるｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）（ＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって完全長遺伝子をクローン化した。
【００６９】
本発明の遺伝子を、ここではマウス脾臓発現遺伝子（ｍＳＰＥＸ遺伝子）と称する。例示的なｍＳＰＥＸ核酸を配列番号１０５に示しており、これは配列番号８４に示すコード領域を含む。ＧｅｎＢａｎｋのＢＬＡＳＴ検索は、ＳＰＥＸ  ｃＤＮＡが新規タンパク質をコードすることを明らかにする。ｍＳＰＥＸ核酸によってコードされる例示的なｍＳＰＥＸポリペプチドを配列番号６３に示す。シグナル配列（例えば配列番号４３）は、典型的には配列番号６２に示す例示的成熟ｍＳＰＥＸポリペプチドを形成する細胞プロセシングの間に切断される。ｍＳＰＥＸポリペプチドとタンパク質データベース（ＮＣＢＩ）のＰｆａｍファミリーの間の配列比較を用いて、発明者は、ポリペプチドの予測された細胞外部分に免疫グロブリン様ドメインを特定した。しかしながら、発明者は、ＳＰＥＸがスーパーファミリー成員を含むいかなる特定免疫グロブリンにも密接な相同性を持たないことを認めた。
【００７０】
２．  ｈＳＰＥＸ  ｃＤＮＡの特定とクローニング
ＧｅｎＢａｎｋデータベース内のヒト配列に対するｍＳＰＥＸ配列の配列比較を用いて、発明者は、ヒトＥＳＴ  ＡＩ７９２９５２及びＡＡ９３１１２２がｍＳＰＥＸポリペプチドと整列すること及びヒトＥＳＴがＧｅｎＢａｎｋデータベース内の１個のヒトクローンに対応すると判定した。ヒトクローンを含む細菌穿刺培養（ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｓｔａｂ）（ＡＩ７９２９５２）並びに数多くの夾雑クローンをＩＭＡＧＥ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ，ＣＡ）より購入した。ｍＳＰＥＸに相同なヒト遺伝子配列を穿刺培養から精製し、サブクローニングして、配列決定した。例示的なｈＳＰＥＸ核酸配列を配列番号１０４に示しており、これは配列番号４２に示すコード領域を含む。ｈＳＰＥＸ核酸によってコードされる例示的なｈＳＰＥＸポリペプチドを配列番号２１に示す。シグナル配列（例えば配列番号１）は、典型的には配列番号２０に示す例示的成熟ｈＳＰＥＸポリペプチドを形成するｈＳＰＥＸタンパク質の細胞プロセシングの間に切断される。
【００７１】
３．  ラット抗ｍＳＰＥＸモノクローナル抗体の作製
ここではｐ−ｍＳＰＥＸ−Ｉｇと称する、ｍＳＰＥＸ細胞外ドメインをコードするコード領域及びヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含む単離発現ベクターを製造した。ｐ−ｍＳＰＥＸ−Ｉｇベクターを培養中の２９３細胞にトランスフェクトする。ｐ−ｍＳＰＥＸ−Ｉｇトランスフェクト２９３細胞は、抗ヒトＩｇＧ１抗体でプローブするウエスタンブロット法によって評価したときｍＳＰＥＸ−Ｉｇ融合タンパク質（配列番号９９）を発現し、分泌する。ｍＳＰＥＸ−Ｉｇ融合タンパク質を、トランスフェクト２９３細胞の上清からプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製する。
【００７２】
ラットを、モノクローナル抗体を作製するために尾の基部においてＣＦＡに乳化した精製組換えｍＳＰＥＸ−Ｉｇで免疫する。所与の抗原に対する、モノクローナル抗体を含む抗体の作製のための手順及び手法は当分野において周知である。２週間後に内側回腸リンパ節を採取し、標準方法によってＹＢ２／０細胞と融合する。このようにして作製した抗体を、細胞表面ｍＳＰＥＸ−ＹＦＰ融合タンパク質（ＹＦＰはイエロー蛍光タンパク質の略語である）を発現するようにトランスフェクトしたＤＰＫ及び２９３細胞を用いて、ＦＡＣＳによってｍＳＰＥＸとの免疫反応性についてスクリーニングする。スクリーニング手順のために使用するＤＰＫ及び２９３細胞は、ｍＳＰＥＸ遺伝子挿入物をｐＥＹＥＰ−Ｎ１ベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングすることから作製される単離発現ベクターでトランスフェクトする。ｐＥＹＥＰ−Ｎ１ベクターはＹＦＰタグを提供し、ｐＥＹＥＰ−Ｎ１からのｍＳＰＥＸ挿入物の発現は、ＹＦＰタグに作動可能に連結されたｍＳＰＥＸポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を生じさせる。
【００７３】
ｍＳＰＥＸの細胞外ドメインと特異的に免疫反応する１以上のモノクローナル抗体がスクリーニング工程において特定されるまで、スクリーニングを継続する。ＹＦＰタグは、トランスフェクト細胞が細胞表面でｍＳＰＥＸ−ＹＦＰ融合タンパク質を発現することの確認を可能にし、細胞抗体結合の相対レベルをｍＳＰＥＸ−ＹＦＰ融合タンパク質発現に相関させることを可能にする。３つのハイブリドーマ：ＰＫ３、ＰＫ１８及びＰＫ２３が１回目のスクリーニング工程から得られる。ハイブリドーマを場合により再クローニングし、標準方法を用いて抗体を精製する。
【００７４】
４．  ラット抗ｈＳＰＥＸモノクローナル抗体の製造
ｈＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応するモノクローナル抗体を、１）ｈＳＰＥＸ細胞外ドメイン（ＳＰＥＸシグナル配列を含む）及びヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むｐ−ｈＳＰＥＸ−Ｉｇ発現ベクターを製造し、ラットにおいてモノクローナル抗体を作製するために使用すること及び２）ｈＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインをコードするｈＳＰＥＸポリヌクレオチドをｐＥＹＥＰ−Ｎ１ベクターにクローニングし、上記で開示したＦＡＣＳ−ＹＦＰ手順を用いてモノクローナル抗体をスクリーニングするためにＤＰＫ及び２９３細胞において発現させることを除いて、実施例３で開示した方法を用いて作製する。生産されるモノクローナル抗体は、ｈＳＰＥＸの細胞外ドメインと特異的に免疫反応する。
【００７５】
５．  マウス抗ｈＳＰＥＸモノクローナル抗体の製造
マウスＳＰＥＸについて公知の複数の対立遺伝子が存在するので（ｍＳＰＥＸ及びｍＳＰＥＸｂ）、自己寛容に遭遇することなくマウス宿主においてマウス抗マウスＳＰＥＸ抗体を惹起することが可能である。ｍＳＰＥＸに対するマウスモノクローナル抗体を惹起するために、ｐ−ｍＳＰＥＸ−Ｉｇ融合物のためのマウスＳＰＥＸ遺伝子がＣ５７ＢＬ６マウス（ｍＳＰＥＸ対立遺伝子を有する）に由来し、免疫をＢＡＬＢ／ｃマウス（ｍＳＰＥＸｂ対立遺伝子を有する）において実施することを除いて、実施例３の手順に従った。ＰＪ１９．１及びＰＪ１９６を含むがこれらに限定されない、ｍＳＰＥＸの細胞外ドメインと免疫反応する多くの抗ｍＳＰＥＸ抗体が１回目のスクリーニング工程で生産された。
【００７６】
６．  マウス抗ｈＳＰＥＸモノクローナル抗体の製造
ｈＳＰＥＸの細胞外ドメインと免疫反応するモノクローナル抗体を惹起するために、ラットの代わりにマウスをｈＳＰＥＸ−Ｉｇ融合ポリペプチド（配列番号９８）で免疫することを除いて、実施例４の手順に従う。生産されるモノクローナル抗体は、ｈＳＰＥＸの細胞外ドメインと特異的に免疫反応する。
【００７７】
７．  移植片拒絶反応の抑制
ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体を投与することは移植片拒絶反応を抑制することが測定される。Ｂ６マウス（ｍＳＰＥＸ対立遺伝子を有するが、ｍＳＰＥＸｂ対立遺伝子を持たない）に、−１、１、４及び６日目（皮膚移植片の移植日に対して）モノクローナル抗体ＰＪ１９．１（ｍＳＰＥＸの細胞外ドメインと免疫反応すると免疫反応するが、ｍＳＰＥＸｂとは免疫反応しない）５００μｇを腹腔内注射する。年齢及び性別が適合するマウス群に生理緩衝食塩水（ＰＢＳ）又は（平行実験において）マウスＩｇＧの注射を行った。個々のマウスに、０日目に同系Ｂ６及び同種異系ＢＡＬＢ／ｃ皮膚移植片を移植した。皮膚移植片のこの特定系統の組合せは、移植耐性の誘導に対して高度に抵抗性である。従って、この系での移植抑制剤による移植耐性の誘導（すなわち移植片拒絶反応の抑制）は極めて重要である。注目すべき点として、ＰＪ１９．１抗体はＢ６移植変受容個体においてｍＳＰＥＸの細胞外ドメインと免疫反応するが、ＢＡＬＢ／ｃ提供個体からの同種異系皮膚移植片ではｍＳＰＥＸｂの細胞外ドメインと免疫反応しない。
【００７８】
総移植片のパーセンテージ（移植片表面積のパーセンテージ）としての移植片拒絶反応を、７日目から１６日目まで毎日写真を撮影して観測した。移植片拒絶反応の日は、９０％以上の組織破壊の日として判定した。図３に示すように、実験の経過中に（合計１６日間）同系皮膚移植片の拒絶反応は認められなかった。同じく図３に示すように、同種異系移植片（同種異系皮膚移植片）は、９日目に示されている対照マウス（ＰＢＳ注射）では拒絶されたが、同種異系移植片の拒絶反応は、上述したように及び１３日目に示されているＰＪ１９．１モノクローナル抗体で処置したマウスでは抑制された。
【００７９】
図４は、２つの群のマウスについての日数に対する、生存移植片を有する実験及び対照群（以下参照）のマウスのパーセンテージの描画を提供する。最初の群の５匹のマウスは、上述したように、各々のマウスが同系及び同種異系皮膚移植片を移植された日に対して−１、１、４及び６日目にＰＢＳを投与された（対照群）。２番目の群の４匹のマウスは各々、各々のマウスが同系及び同種異系皮膚移植片を移植された日に対して−１、１、４及び６日目にモノクローナル抗体ＰＪ１９．１の５００μｇを投与された（実験群）。最後の移植片が拒絶されるまで毎日皮膚移植片の写真を撮影した。生存同種異系皮膚移植片を有する動物の数をパーセンテージベースで記録し、皮膚移植片移植後の日数に対して描画した。図４に示すように、対照ＰＢＳ処置マウスにおける同種異系移植片の拒絶反応（９０％以上の破壊）についての平均時間は１０日目（中央値）であり、一方ＰＪ１９．１処置マウスにおいて同種異系移植片の拒絶反応の平均時間は、抗体の最後の注射後７日目に当る１３．５日目（中央値）まで抑制された。生存率はカプラン−マイヤー法を用いて決定した。生存曲線の比較は、ＰＲＩＳＭ４ソフトウエア（統計ソフトウエア）によって提供されるログランク検定を用いて実施した。平均生存率もＰＲＩＳＭ４ソフトウエアを用いて算定される。拒絶反応までの平均時間に関する対照とＰＪ１９．１処置マウスの間の差は、０．００５１のｐ値で極めて有意である。移植後６日目を越えてＰＪ１９．１モノクローナル抗体による処置を継続することは（例えば毎日又は１日おきの投与）、同種異系拒絶反応の持続的な抑制をもたらし得ると考えられる。
【００８０】
８．  抗ＳＰＥＸ抗体はリンパ球を全体的に減少させない
ＰＢＳ及びＰＪ１９．１処置マウスを皮膚移植の１５日後（抗体の最後の注射の９日後）に犠牲死させ、各々の群の動物において脾細胞を総Ｂ、ＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞数について分析することを除いて、実施例７を反復する。図５に示すように、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ及びＢ細胞の頻度及び数は（データは示していない）、対照（ＰＢＳ）及びＰＪ１９．１抗体処置マウスにおいて同様である。従って、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する抗体の投与は、ＣＤ４＋Ｔ、ＣＤ８＋Ｔ又はＢ細胞のリンパ球群を全体的に減少させない。
【００８１】
９．  抗ＳＰＥＸ抗体はリンパ球のＳＰＥＸ発現を下方調節する
上記実施例８からのＢ、ＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の試料を（試料は対照マウスとＰＪ１９．１処置マウスから別々に収集する）、インビトロでＰＪ１９６（ＳＰＥＸの細胞外ドメインと免疫反応する）及び二次抗体（ＰＪ１９．１及びＰＪ１９６モノクローナル抗体の両方と免疫反応する）で染色する。データは示していないが、１）ＰＪ１９．１処置マウスにおいてＢ、ＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞の全体的減少は存在しないこと、２）Ｂ、ＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＪ１９．１で処置したマウスではインビボでＰＪ１９．１抗体によってコートされること、及び３）ＳＰＥＸの総細胞表面発現は、ＰＢＳ又はＩｇＧ処置マウスと比較してＰＪ１９．１処置マウスではＢ、ＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞上で低下することが認められる。従って、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応するモノクローナル抗体を投与することは、Ｂ、ＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含むリンパ球の表面でのＳＰＥＸの発現を低下させる。
【００８２】
１０．  抗体免疫反応性にとって重要なＳＰＥＸの細胞外ドメイン内のアミノ酸残基の特定
実施例１０は、ＰＫ１８、ＰＫ３、ＰＪ１９６及びＰＪ１９．１抗体の免疫反応性にとって重要なｍＳＰＥＸの細胞外ドメイン内のアミノ酸残基の、必ずしも全部ではないが、一部を開示する。
【００８３】
ＰＫ１８、ＰＫ３、ＰＪ１９６及びＰＪ１９．１抗体は、各々マウスＳＰＥＸのｍＳＰＥＸ対立遺伝子に対して惹起され、ｍＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応するが、ｍＳＰＥＸｂポリペプチドとは免疫反応しない。以下の表１に示すように１１個のアミノ酸残基位置で、ｍＳＰＥＸｂ対立遺伝子と比較してｍＳＰＥＸ対立遺伝子の細胞外ドメインのアミノ酸配列に相違がある。突然変異型ｍＳＰＥＸポリペプチドは、ｍＳＰＥＸポリペプチドが、ｍＳＰＥＸとｍＳＰＥＸｂポリペプチドの間で相違がある各々の残基で（以下の表１参照）ｍＳＰＥＸｂ配列からの置換を有して生産されるように、ｍＳＰＥＸポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを独立して突然変異させることによって生産される。突然変異は、両方が共にＴ４５Ｎ／Ｔ４７Ｋ二重突然変異体を形成して突然変異したアミノ酸残基位置４５及び４７を除いて、独立して起こった。
【００８４】
【表１】
2008524116.tif 000002
【００８５】
残基位置５２、５５、６３、７４、８５、９１及び１０２は、ｍＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメインに含まれる。
【００８６】
それぞれｍＳＰＥＸとｍＳＰＥＸｂポリペプチドの細胞外ドメインの間で異なるアミノ酸のいずれが、ｍＳＰＥＸポリペプチドと各々の抗体の免疫反応性にとって重要であるかを明らかにするために、突然変異型ｍＳＰＥＸポリペプチドをＰＫ１８、ＰＫ３、ＰＪ１９６及びＰＪ１９．１抗体の各々の結合の変化について分析する。
【００８７】
ジャーカットＴ細胞（ヒト起源の細胞系統）を、電気穿孔法により、ｍＳＰＥＸ突然変異体のカルボキシ末端でイエロー蛍光タンパク質（ＹＦＰ）と融合した、各々のｍＳＰＥＸ突然変異型ポリペプチド（上記表１参照）をコードするポリヌクレオチド構築物でトランスフェクトする。対照トランスフェクションも同様に、野生型ｍＳＰＥＸ−ＹＦＰ融合ポリヌクレオチドで実施する。各々の構築物（各々の突然変異型ｍＳＰＥＸ−ＹＦＰ又は野生型ｍＳＰＥＸ−ＹＦＰ）を含むトランスフェクト細胞をアリコートに分け、次に抗ＳＰＥＸ抗体と反応させて（別々のアリコートにおいてＰＫ１８、ＰＫ３、ＰＪ１９６又はＰＪ１９．１と反応させる）、次いで全ての試料を二次抗体と反応させる。二次抗体は、フローサイトメトリー分析による検出のためにＰＥフルオロクロム（ここではＦＬ２）に結合する。
【００８８】
従って、各々のアリコートが野生型ｍＳＰＥＸ又は上記表１に列記する突然変異型ｍＳＰＥＸポリペプチドの１つをジャーカットＴ細胞の表面で発現する、細胞のアリコートを生産し、これらの各々のアリコートを別々にＰＫ１８、ＰＫ３、ＰＪ１９６又はＰＪ１９．１と反応させる。狭い範囲のＹＦＰ＋細胞（フルオロクロム１陽性又はＦＬ１＋）上で細胞を電子的にゲーティングし、次いでＦＬ２蛍光の量を測定することによってＦＡＣＳ分析を実施する。ジャーカットＴ細胞を発現する各々の所与のｍＳＰＥＸポリペプチドと免疫反応する所与の一次抗体（ＰＫ１８、ＰＫ３、ＰＪ１９６又はＰＪ１９．１）についてのＦＬ２蛍光の量の低下は、このｍＳＰＥＸポリペプチド内の野生型残基が抗体と特異的に免疫反応するエピトープの部分であることを指示する。上述した実験の結果を以下の表２に示す。
【００８９】
【表２】
2008524116.tif 000003
【００９０】
表２において、マイナス（−）記号は、ｍＳＰＥＸの細胞外ドメイン内のそれぞれのアミノ酸位置の突然変異が突然変異型ｍＳＰＥＸについての抗体の結合を低下させないことを示し、プラス（＋）記号は、野生型ＳＰＥＸと比較したときｍＳＰＥＸの細胞外ドメイン内のそれぞれのアミノ酸位置で突然変異したｍＳＰＥＸについての各々の抗体の結合の任意の規模（最も低い（＋）から最も大きい（＋＋＋）まで）の低下を示す。
【００９１】
上記表２に示すデータに基づき、ＰＫ３免疫親和性エピトープは残基４５／４７及び５５を含み；ＰＫ１８免疫親和性エピトープは残基４１、４５／４７及び８５を含み；ＰＪ１９．１免疫親和性エピトープは残基８５及び９１を含み；及びＰＪ１９６免疫親和性エピトープは残基４１及び４５／４７を含むことが認められる。表２に示すデータはまた、ｍＳＰＥＸの残基８５及び９１が、移植片拒絶反応を抑制することがここで明らかにされる抗体ＰＪ１９．１によって結合されるエピトープの部分であることを示唆する。好ましい実施形態では、ＳＰＥＸポリペプチドの細胞外ドメインに結合する抗体は、移植片拒絶反応を抑制する。もう１つの好ましい実施形態では、ｍＳＰＥＸポリペプチド内の残基８５及び９１（又はｈＳＰＥＸポリペプチド内の対応する残基）を含むエピトープと免疫反応する抗体は、移植片拒絶反応を抑制する。さらにもう１つの好ましい実施形態では、ＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメインと免疫反応する抗体は、移植片拒絶反応を抑制する。さらなる好ましい実施形態では、ＳＰＥＸポリペプチドのＩｇ様ドメイン（例えば配列番号３、４５又は８８（最も好ましくは配列番号３））と免疫反応するが、ＳＰＥＸポリペプチドの非Ｉｇ様ドメイン（例えば配列番号１、２、４、５、６、７、８、９、１０、１１、４３、４４、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２又は５３（最も好ましくは配列番号１、２又は４））とは免疫反応しない抗体は、移植片拒絶反応を抑制する。さらなる好ましい実施形態では、基本的にＳＰＥＸ  Ｉｇ様ドメインから成る（例えば基本的に配列番号３、４５又は８８（最も好ましくは配列番号３）から成る）アミノ酸配列と免疫反応する抗体は、移植片拒絶反応を抑制する。さらにもう１つの好ましい実施形態では、ＰＪ１９．１のエピトープ結合パターンを含む抗体は、移植片拒絶反応を抑制する。
【００９２】
１１．  ＩＬ−２分泌及びＣＤ２５発現の阻害
Ａ．Ｔ細胞の作製
脾臓又はリンパ節からのＴ細胞を、抗Ｂ２２０（クローン：ＲＡ３−６Ｂ２、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、抗ＡｂクラスＩＩ  ＭＨＣ（クローン：Ｙ３Ｐ）抗体及び抗ラットＩｇＧ磁気ビーズ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて負の選択によって富化した。全ての培養実験は、１０％熱不活化ウシ胎仔血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、ペニシリン／ストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）、２００ｍＭグルタミン及び５０μＭ  ２−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含むクリック培地（Ｉｒｖｉｎｅ，Ｓａｎｔａ  Ａｎａ，ＣＡ）において実施した。細胞は、５％ＣＯ２中３７℃の標準条件下で培養した。
【００９３】
Ｂ．Ｔ細胞活性化
合計１×１０６Ｔ細胞／ｍｌを、それぞれ、１：１比の、指示されている合計Ｉｇ濃度のラットＩｇＧ（ＪａｃｋｓｏｎｌｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）、ＰＫ１８又はＰＪ１９．１と組み合わせた抗ＣＤ３（クローン１４５−２Ｃ１１、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で被覆した、９６穴又は２４穴平底プレートにおいて１００μｌ又は１ｍｌ中で培養した。
【００９４】
Ｃ．トリチウム化チミジン増殖試験
［３Ｈ］チミジン増殖試験のために、Ｔ細胞を９６穴プレートにおいて合計７２時間培養し、最後の１６時間は１μＣｉ／穴の［３Ｈ］チミジン（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）でパルスした。細胞をガラス繊維フィルター（Ｂｒａｎｄｅｌ  Ｉｎｃ．，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＡ）上に採集し、［３Ｈ］チミジン取込みを定量した。
【００９５】
Ｄ．ＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ
培養上清を、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した標準サンドイッチＥＬＩＳＡを用いてマウスＩＬ−２について検定した。Ｍａｘｉｓｏｒｂプレート（Ｎｕｎｃ，Ｒｏｓｋｉｌｄｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）を抗ＩＬ−２モノクローナル抗体（ｍＡＢ）（クローン：ＪＥＳ６−１Ａ１２）で被覆し、対応するビオチニル化ｍＡＢを用いて検出を実施した。ストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ及びテトラメチルベンジジンを基質として使用してプレートを展開した。プレートを４５０ｎｍのプレートリーダーで読み取り、Ｓｏｆｔｍａｘソフトウエアを用いてデータを解析した（リーダーとソフトウエアは、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡより）。アッセイを組換えマウスＩＬ−２で標準化し、検出は１から１，０００ｐｇ／ｍｌの範囲であった。
【００９６】
Ｅ．活性化リンパ球によるＩＬ−２分泌の阻害
培養中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の上清を、ラットＩｇＧ又はＰＫ１８の存在下での抗ＣＤ３によるＴ細胞の刺激（活性化）の１６時間後に収集し、ＩＬ−２分泌（上清中のＩＬ−２の量）について分析した。結果を図６Ａに示す。ＰＫ１８抗体は、活性化リンパ球によるＩＬ−２分泌の８０倍の低下を生じさせた。
【００９７】
Ｆ．抗ＳＰＥＸ阻害リンパ球へのＩＬ−２の添加は活性化リンパ球の増殖を完全には救済しない
図６ＡにおけるようにＰＫ１８の存在か又は不在下でＴ細胞を刺激し、一部の培養には指示濃度の組換えマウスＩＬ−２（８００ｐｇ／ｍｌ及び８０ｐｇ／ｍｌ  ＩＬ−２）を添加した。外因性組換えＩＬ−２の添加は、リンパ球を、ＳＰＥＸシグナル伝達を活性化する抗ＳＰＥＸ抗体（例えばＰＫ１８）と共にインキュベートすることによって課せられるリンパ球増殖の阻害を完全には救済しなかった（例えば図６Ｂ参照）。これは、リンパ球上のＳＰＥＸ受容体をＳＰＥＸ受容体の抗体アゴニストと接触させることは、生理的濃度及び生理的濃度以上の濃度のＩＬ−２の存在下でさえもリンパ球の増殖を阻害したことを明らかにする。
【００９８】
Ｇ．抗ＳＰＥＸ抗体アゴニストと接触させたリンパ球へのＩＬ−２の添加はリンパ球によるＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）発現を完全には救済しない
ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞をＰＫ１８及び「低濃度ＩＬ−２」（８０ｐｇ／ｍｌ）又は「高濃度ＩＬ−２」（８００ｐｇ／ｍｌ）の存在下で刺激し、ＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）の発現をＦＡＣＳ分析によって測定した（例えば図６Ｃ参照）。ＣＤ２５発現は、通常ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ２５発現を刺激する生理的濃度及び生理的濃度以上の濃度のＩＬ−２の存在下でさえも、ＳＰＥＸ受容体抗体アゴニストによって阻害されることが測定された。ＣＤ２５発現の阻害は、ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞においてより大きいことが認められ、この阻害は、ＣＤ８＋Ｔ細胞と比較してＣＤ４＋Ｔ細胞でのＳＰＥＸ受容体のより大きな発現と正に相関する。
【００９９】
Ｈ．ＩＬ−２生産はＳＰＥＸ抗体アゴニストによって抑制されるが、ＣＤ６９誘導は抑制されない
増殖の誘導は、Ｔ細胞活性化に続く比較的後発性の事象である。ＳＰＥＸ受容体抗体アゴニスト（この実施例ではＰＫ１８）が、ＩＬ−２分泌に加えてＴＣＲ認識によって媒介される付加的なシグナルをブロックするかどうかを判定するため、Ｔ細胞上のＣＤ６９発現の誘導を測定した。ＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ６９発現の誘導はＰＫ１８によって阻害されなかった（例えば図７参照）。これに対し、ＰＫ１８はＣＤ４＋Ｔ及びＣＤ８＋Ｔ細胞での続くＣＤ２５発現を阻害した（例えば図７参照）。ＰＫ１８によるＣＤ２５の阻害は、ＰＫ１８が媒介する増殖阻害に対するＣＤ４＋Ｔ細胞のより大きな感受性と一致して、ＣＤ８＋Ｔ細胞よりもＣＤ４＋Ｔ細胞上でより大きかった。
【０１００】
Ｉ．ＳＰＥＸ受容体の活性化は予備活性化Ｔ細胞の増殖を阻害した
ＣＤ６９発現の誘導がＰＫ１８によって阻害されないという上記実施例１１Ｈのデータは、ＳＰＥＸシグナル伝達による増殖の阻害がＴ細胞の活性化における比較的後期の事象であることを示唆する。これをさらに試験するため、単離ナイーブ（非活性化）Ｔ細胞（富化ソースとしてＡＮＤ  ＴＣＲ−Ｔｇマウスを使用する）をプレート結合抗ＣＤ３で一晩刺激し、次いでＰＫ１８又はラットＩｇＧ（陰性対照）と組み合わせた追加抗ＣＤ３で被覆した新鮮プレートに移した。意外にも、ＰＫ１８は、全培養期間中ＰＫ１８に暴露した細胞について認められる増殖阻害と同程度の大きさで、抗ＣＤ３による一晩の初期活性化後もＣＤ４＋Ｔ細胞増殖を阻害することができた（例えば図８参照）。
【０１０１】
上記実施例を参照して本発明を説明したが、修正及び変法は本発明の精神及び範囲内に包含されることが了解される。従って、本発明は特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は、細胞外、膜貫通（斜線で陰影を付けている）及び細胞内ドメイン（表示されている通り）を有する実質的に完全長のマウス及びヒトＳＰＥＸポリペプチド（それぞれｍＳＰＥＸ及びｈＳＰＥＸ）の図式を示す。細胞外ドメインは各々免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメイン（横線で陰影を付けている）を含み、場合により切断可能なシグナル配列（破線を付した領域）を有しており、矢印は切断部位を指し示す。シグナル配列は、成熟ＳＰＥＸポリペプチドを生産するために翻訳後プロセシングの間に切断される。細胞内ドメインは各々３個のチロシンベースのモチーフ（縦線で陰影を付けている）を含む。各々のチロシンベースのドメインは、次にはチロシンアミノ酸残基（Ｙ、Ｙはチロシンについての１文字表記である）を含む。示されている実施形態は、チロシンが場合によりリン酸化され得ることを表わす（○を付けたＰ）。生体膜におけるＳＰＥＸポリペプチドの相対位置を示す。小さな点を付けた領域は、一定の機能性ドメインの間の各々のポリペプチドの部分を指示する。
【図２Ａ】図２Ａは、選択ｈＳＰＥＸポリペプチドと各々の選択ポリペプチドについてのそれぞれの配列アイデンティファイアーの間の対応の実施形態を示す概略図を提供する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、選択ｈＳＰＥＸポリヌクレオチドと各々の選択ポリヌクレオチドについてのそれぞれの配列アイデンティファイアーの間の対応の実施形態を示す概略図を提供する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、選択ｍＳＰＥＸポリペプチドと各々の選択ポリペプチドについてのそれぞれの配列アイデンティファイアーの間の対応の、ある実施形態を示す概略図を提供する。
【図２Ｄ】図２Ｄは、選択ｍＳＰＥＸポリヌクレオチドと各々の選択ポリヌクレオチドについてのそれぞれの配列アイデンティファイアーの間の対応の、ある実施形態を示す概略図を提供する。
【図３】図３は、実施例７で述べるように、移植後９日目の対照マウス（左側パネル）及び移植後１３日目のＰＪ１９．１モノクローナル抗体処置マウス（右側パネル）での同系及び同種異系皮膚移植片を示す。対照マウスは、皮膚移植片の移植の−１、１、４及び６日目にＰＢＳを注射した。ＰＪ１９．１モノクローナル抗体処置マウスは、皮膚移植片の移植の−１、１、４及び６日目に抗体５００μｇをｉ．ｐ．（腹腔内）注射した。ＰＪ１９．１モノクローナル抗体は、マウスＳＰＥＸ（ｍＳＰＥＸ）ポリペプチドの細胞外ドメインと免疫反応する。対照マウスは、９日目までに同種異系移植片を拒絶したが、同系移植片は維持した。ＰＪ１９．１処置マウスは、１３日目に同系及び同種異系皮膚移植片の両方を維持している。
【図４】図４は、実施例７で述べるように、移植片拒絶反応についてのモデル系として使用した同種異系皮膚移植片についての皮膚移植片生存曲線を示す。対照マウス（四角記号）は、０日目に同系（データは示していない）及び同種異系皮膚移植片を移植され、−１、１、４及び６日目にＰＢＳ注射を受けた。ＰＪ１９．１モノクローナル抗体処置マウス（菱形記号）は、０日目に同系（データは示していない）及び同種異系皮膚移植片を移植され、−１、１、４及び６日目にＰＪ１９．１モノクローナル抗体５００μｇのｉ．ｐ．注射を受けた。生存皮膚移植片を有するマウスのパーセンテージを、皮膚移植片の移植後の日数に対して描画している。対照群は５匹のマウス及びＰＪ１９．１抗体処置群は４匹のマウスである。
【図５】図５は、実施例８で述べるように、対照マウス（左側パネル）及びＰＪ１９．１モノクローナル抗体処置マウス（右側パネル）からの脾細胞数を示す。脾細胞をＣＤ４、ＣＤ８及びＳＰＥＸについて３色で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。ＣＤ４＋Ｔ細胞の各々１個を表わす点を各々のパネルの左上四分円内に示し、ＣＥ８＋Ｔ細胞の表示を各々のパネルの右下四分円内に示し、Ｂ細胞の表示（ＣＤ４陰性及びＣＤ８陰性細胞）を各々のパネルの左下四分円内に示す。各々の四分円内の数字は、試料中の各々の細胞型のパーセンテージを示す。ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞群の数は、対照マウスと比較してＰＪ１９．１モノクローナル抗体処置マウスにおいて有意に上昇又は低下していない。
【図６Ａ】図６Ａは、リンパ球からのインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌へのＳＰＥＸ受容体接触（リンパ球上のＳＰＥＸ受容体をＳＰＥＸ受容体の細胞外ドメインと免疫反応する抗体に接触させること）の作用を示す。ラットＩｇＧ又はＰＫ１８の存在下で抗ＣＤ３によるＴ細胞の刺激（活性化）後１６時間目に、培養中のＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の上清を収集し、ＩＬ−２分泌（上清中のＩＬ−２の量）について分析した。
【図６Ｂ】図６Ｂは、細胞培養に８００ｐｇ／ｍｌ及び８０ｐｇ／ｍｌのＩＬ−２を添加して（又は添加せずに）、ＳＰＥＸ受容体認識に暴露したＴリンパ球の増殖への作用を示す。Ｔ細胞を、一部の培養では表示濃度の組換えマウスＩＬ−２を添加して、図６ＡにおけるようにＰＫ１８の存在下又は不在下で刺激した。
【図６Ｃ】図６Ｃは、組換えマウスＩＬ−２（８００ｐｇ／ｍｌ、高ＩＬ−２；８０ｐｇ／ｍｌ、低ＩＬ−２）を添加して、ラットＩｇＧと抗ＣＤ３（灰色で塗りつぶしたヒストグラム）又はＰＫ１８と抗ＣＤ３（太い線）で処置したＴ細胞上のＩＬ−２受容体（ＣＤ２５）発現への作用を示す。培養の２日目に、細胞を採集し、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のゲート個体群をＣＤ２５の発現についてフローサイトメトリーによって分析した。３回のうちの１つの代表的実験を図に示す。
【図７】図７は、抗ＳＰＥＸ抗体とのＳＰＥＸ受容体接触は、リンパ球におけるＣＤ２５の発現を阻害するが、ＣＤ６９の発現は阻害しないことを示す。Ｔ細胞を、抗ＣＤ３とラットＩｇＧ（灰色で塗りつぶしたヒストグラム）又は抗ＣＤ３とＰＫ１８（太い線）で刺激（活性化）した。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞のゲート個体群での、それぞれ１６又は４８時間の培養後のＣＤ６９又はＣＤ２５の発現を示す。実験は３回反復した。
【図８】図８は、前活性化Ｔ細胞の増殖が二次ＳＰＥＸシグナル（活性化）によってブロックされ得ることを示す。ＡＮＤ−ＴＣＲ  Ｔｇマウスから単離したＣＤ４＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３の滴定で一晩刺激して、表示濃度の抗ＣＤ３とラットＩｇＧ（全て１０μｇ／ｍｌ、黒い丸）又は抗ＣＤ３とＰＫ１８（白い丸）で被覆した新しいプレートに移した。対照は、抗ＣＤ３とラットＩｇＧ（黒い四角）又は抗ＣＤ３とＰＫ１８（白い四角）の存在下で培養して、新しいプレートに移さなかったＣＤ４＋Ｔ細胞であった。データは、３つの培養の［３Ｈ］チミジン組込みの平均値（＋／−ＳＤ）から単独培養したＴ細胞のｃｐｍ（＞１，０００ｃｐｍ）を差し引いて表示した。実験は２回反復した。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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