(57)【要約】  本発明は、少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含むマトリックスにおいて安定化されたトロポニンタンパク質または２つのトロポニンタンパク質の複合体に関する。この安定化されたトロポニンタンパク質またはトロポニンタンパク質の複合体は、心臓タンパク質の高い濃度を呈することが予期される患者試料におけるトロポニンの血中濃度の決定のためのアッセイにおける対照標準または検量標準として使用される。このトロポニンタンパク質またはトロポニンタンパク質の複合体は、室温で少なくとも６ヶ月間安定化された状態のままである。
2008539434.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
トロポニンＩタンパク質の水溶液と、および
Ｒ１Ｏ−ＳＯ３ＭおよびＲ１（ＣＨ２Ｈ４Ｏ）ｘ−Ｏ−ＳＯ３Ｍ
（式中、Ｒ１は、約８から約２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和の分岐または非分岐アルキル基であり；ｘは、１から１０の整数であり；Ｍは、水溶性カチオンである。）
からなる群から選択される式を有する少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含むマトリックスと
を含む診断アッセイ用標準。
【請求項２】
前記水溶性カチオンが、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、トリエタノールアミン、ジエタノールアミンまたはモノエタノールアミンである、請求項１に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項３】
前記アニオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸もしくはミリスチル硫酸のナトリウム、アンモニウム、カリウム、マグネシウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンもしくはトリエタノールアミンの塩、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウム、またはラウレス硫酸のアンモニウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウムもしくはモノエタノールアミンの塩である、請求項１に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項４】
室温で少なくとも６ヶ月間安定である、請求項１に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項５】
前記マトリックスが、ブタゼラチンをさらに含む、請求項１に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項６】
前記マトリックスが、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムからなる群から選択される化合物をさらに含む、請求項１に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項７】
前記マトリックスが、ｐＨを約６．８〜約７．２の範囲内に維持するために添加されるｐＨ緩衝剤をさらに含む、請求項１に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項８】
前記アニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムである、請求項３に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項９】
前記ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムが、約０．１％から約０．２５％の濃度にある、請求項８に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項１０】
Ｒ１Ｏ−ＳＯ３ＭおよびＲ１（ＣＨ２Ｈ４Ｏ）ｘ−Ｏ−ＳＯ３Ｍ
（式中、Ｒ１は、約８から約２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和の分岐または非分岐アルキル基であり；ｘは、１から１０の整数であり；Ｍは、水溶性カチオンである。）
からなる群から選択される式を有する少なくとも１種のアニオン性界面活性剤の水溶液を調製するステップと、
トロポニンＩタンパク質を添加するステップと、および
室温で該溶液を貯蔵するステップと
を含む、水溶液中のトロポニンを安定化させる方法。
【請求項１１】
前記水溶性カチオンが、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、トリエタノールアミン、ジエタノールアミンまたはモノエタノールアミンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記アニオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸もしくはミリスチル硫酸のナトリウム、アンモニウム、カリウム、マグネシウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンもしくはトリエタノールアミンの塩、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウム、またはラウレス硫酸のアンモニウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウムもしくはモノエタノールアミンの塩である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
トロポニンＩタンパク質およびトロポニンＣタンパク質の複合体を含む水溶液と、および
Ｒ１Ｏ−ＳＯ３ＭおよびＲ１（ＣＨ２Ｈ４Ｏ）ｘ−Ｏ−ＳＯ３Ｍ
（式中、Ｒ１は、約８から約２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和の分岐または非分岐アルキル基であり；ｘは、１から１０の整数であり；Ｍは、水溶性カチオンである。）
からなる群から選択される式を有する少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含むマトリックスと
を含む診断アッセイ用標準。
【請求項１４】
前記水溶性カチオンが、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、トリエタノールアミン、ジエタノールアミンまたはモノエタノールアミンである、請求項１３に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項１５】
前記アニオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸もしくはミリスチル硫酸のナトリウム、アンモニウム、カリウム、マグネシウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンもしくはトリエタノールアミンの塩、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウム、またはラウレス硫酸のアンモニウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウムもしくはモノエタノールアミンの塩である、請求項１３に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項１６】
室温で少なくとも６ヶ月間安定である、請求項１３に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項１７】
前記マトリックスが、ブタゼラチンをさらに含む、請求項１３に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項１８】
前記マトリックスが、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムからなる群から選択される化合物をさらに含む、請求項１３に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項１９】
前記マトリックスが、ｐＨを約６．８〜約７．２の範囲内に維持するために添加されるｐＨ緩衝剤をさらに含む、請求項１３に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項２０】
前記アニオン性界面活性剤が、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムである、請求項１５に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項２１】
前記ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムが、約０．１％から約０．２５％の濃度にある、請求項２０に記載の診断アッセイ用標準。
【請求項２２】
Ｒ１Ｏ−ＳＯ３ＭおよびＲ１（ＣＨ２Ｈ４Ｏ）ｘ−Ｏ−ＳＯ３Ｍ
（式中、Ｒ１は、約８から約２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和の分岐または非分岐アルキル基であり；ｘは、１から１０の整数であり；Ｍは、水溶性カチオンである。）
からなる群から選択される式を有する少なくとも１種のアニオン性界面活性剤の水溶液を調製するステップと、
トロポニンＩタンパク質およびトロポニンＣタンパク質とを、個別にまたは単一の複合体として一緒にのいずれかで、添加するステップと、および
室温で該溶液を貯蔵するステップと
を含む、水溶液中のトロポニンを安定化させる方法。
【請求項２３】
前記水溶性カチオンが、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、トリエタノールアミン、ジエタノールアミンまたはモノエタノールアミンである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記アニオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸もしくはミリスチル硫酸のナトリウム、アンモニウム、カリウム、マグネシウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンもしくはトリエタノールアミンの塩、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウム、またはラウレス硫酸のアンモニウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウムもしくはモノエタノールアミンの塩である、請求項２２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫アッセイにおけるキャリブレータ標準および対照標準として有用な心臓トロポニンタンパク質の安定化された組成物に関する。特に、該トロポニンタンパク質を、少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む水性マトリックスにおいて安定化させる。
【背景技術】
【０００２】
トロポニン複合体は、筋収縮および弛緩のカルシウム依存性調節の一翼を担っている。３つのはっきり区別されるタンパク質、すなわちトロポニンのイソ型は、トロポニン複合体を含み、心筋および骨格筋の双方において見出すことができる。これらの３つのタンパク質は、トロポニンＩ、トロポニンＣおよびトロポニンＴと称される。心筋梗塞中に、心筋細胞は死滅し、その結果、トロポニンタンパク質を含むこれらの細胞内内容物を血流中に放出する。
【０００３】
心筋梗塞は、先進国における死亡の主な原因である。世界保健機構（ＷＨＯ）は、１９７９年に心筋梗塞を診断するための指針を作成した（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，５９：６０７−６０９（１９７９）を参照されたい）。ＷＨＯ指針では、心筋梗塞の診断は、３つの特有の判定基準の２つの発生に依ることを勧めている。この３つの判定基準は、（１）胸痛または心臓イベントの病歴、（２）心臓イベントの心電図徴候、および（３）酵素クレアチンキナーゼレベルの上昇である。
【０００４】
数百万人が、胸痛を訴えて毎年救急処置室に入り、診断的心電図を持たないため、心臓イベントの診断が困難になっている。クレアチンキナーゼの血中濃度の測定値は、血液中のこのタンパク質の上昇がまた、骨格筋損傷から生じることもあり得るので、心筋梗塞の発生に関して疑問の余地のある特異性を有する。トロポニンＩおよびトロポニンＴは、心臓のみに存在するこれらタンパク質の心臓特異的な形態が存在するため、より大きな特異性が示されている。心筋梗塞の診断のためにトロポニンＩおよびトロポニンＴはより大きな特異性を有していることから、高濃度を示すことが予期される患者の血液試料中のこれらのタンパク質の濃度を測定するための数種の免疫アッセイが開発された。トロポニンの優れた有用性を示す文献が、２０００年現在の心筋感染の定義の更新をもたらした（ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，３６：９５９−９６９（２０００）およびＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ，２１：１５０２−１５１３（２０００）において一緒に公表された。）。この更新された定義は、診断用のバイオマーカーにより大きな重きを置いている。結果として、急性、進行性または亜急性の心筋梗塞に対する判定基準は、以下：（ａ）虚血症状；（ｂ）ＥＣＧでの病理学的Ｑ波の発生；（ｃ）虚血を示すＥＣＧ変化（ＳＴの上昇または低下）；または（ｄ）冠状動脈介入（例えば、冠状動脈形成術）の少なくとも１つと共に心筋壊死の生化学マーカーの典型的な上昇および漸減（トロポニン）またはより急激な上昇および低下（ＣＫ−ＭＢ）である。
【０００５】
定量的な免疫アッセイは、検量線を画定するための検量標準および検量線の整合性を試験するための対照標準の双方の使用を必要とする。使用する標準の必須な特性の１つは、安定性、すなわち適切な貯蔵条件下で規定の期間（使用期限）にわたって免疫活性の損失が最小であることである。トロポニンＩの安定化手法としては、凍結、凍結乾燥、およびグアニジンなどの強還元剤における溶解などがある。これらの手法は、一般に、解凍または復元のために必要な追加時間、専門化した装置および特別の取り扱い手順を必要とする。さらに、トロポニンタンパク質の解凍または復元は、貯蔵寿命の限られた不安定な物質を生じることが多い。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
トロポニンタンパク質の本来的な不安定性のために、輸送および貯蔵の間に受ける可能性のある温度変化に耐性のある物質が求められている。さらに、このような安定化したトロポニンを調製する方法が求められている。本発明は、安定化したトロポニンタンパク質および該安定化したトロポニンを調製する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
１つの実施形態において、本発明は、トロポニンＩタンパク質の水溶液と、および
Ｒ１Ｏ−ＳＯ３ＭおよびＲ１（ＣＨ２Ｈ４Ｏ）ｘ−Ｏ−ＳＯ３Ｍ
（式中、Ｒ１は、約８〜約２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和の分岐または非分岐アルキル基であり；ｘは、１〜１０の整数であり；Ｍは、水溶性カチオンである。）
からなる群から選択される式を有する少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含有するマトリックスを含む診断アッセイ用標準を提供する。
【０００８】
さらなる実施形態において、この診断アッセイ用標準における該水溶性カチオンは、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、トリエタノールアミン、ジエタノールアミンまたはモノエタノールアミンである。
【０００９】
なおまたさらなる実施形態において、この診断アッセイ用標準における該アニオン性界面活性剤は、ラウリル硫酸もしくはミリスチル硫酸のナトリウム、アンモニウム、カリウム、マグネシウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンもしくはトリエタノールアミンの塩、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウム、またはラウレス硫酸のアンモニウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウムもしくはモノエタノールアミンの塩である。
【００１０】
なおまた別のさらなる実施形態において、この診断アッセイ用標準は、室温で少なくとも６ヶ月間安定である。
【００１１】
さらになおまた別のさらなる実施形態において、この診断アッセイ用標準における該マトリックスは、ブタゼラチンをさらに含む。
【００１２】
さらに別のさらなる実施形態において、この診断アッセイ用標準における該マトリックスは、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムからなる群から選択される化合物をさらに含む。
【００１３】
別の実施形態において、該診断アッセイ用標準の該マトリックスは、ｐＨを約６．８〜約７．２の範囲内に維持するために添加されるｐＨ緩衝剤をさらに含む。
【００１４】
さらなる実施形態において、該マトリックスは、アニオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムを含む。
【００１５】
さらなる実施形態において、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムがこの診断アッセイ用標準においてアニオン性界面活性剤として存在する場合、約０．１％〜約０．２５％の濃度において存在する。
【００１６】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）Ｒ１Ｏ−ＳＯ３ＭおよびＲ１（ＣＨ２Ｈ４Ｏ）ｘ−Ｏ−ＳＯ３Ｍ
（式中、Ｒ１は、約８〜約２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和の分岐または非分岐アルキル基であり；ｘは、１〜１０の整数であり；Ｍは、水溶性カチオンである。）
からなる群から選択される式を有する少なくとも１種のアニオン性界面活性剤の水溶液を調製するステップと、
（ｂ）トロポニンＩタンパク質を該水溶液に添加するステップと、および
（ｃ）室温で該溶液を貯蔵するステップと
を含む、水溶液中のトロポニンを安定化させる方法を提供する。
【００１７】
なおまた別の実施形態において、本発明は、トロポニンＩタンパク質およびトロポニンＣタンパク質の複合体の水溶液と、
Ｒ１Ｏ−ＳＯ３ＭおよびＲ１（ＣＨ２Ｈ４Ｏ）ｘ−Ｏ−ＳＯ３Ｍ
（式中、Ｒ１は、約８〜約２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和の分岐または非分岐アルキル基であり；ｘは、１〜１０の整数であり；Ｍは、水溶性カチオンである。）
からなる群から選択される式を有する少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含むマトリックスとを含む診断アッセイ用標準に関する。
【００１８】
さらなる実施形態において、この診断アッセイ用標準における水溶性カチオンは、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、トリエタノールアミン、ジエタノールアミンまたはモノエタノールアミンである。
【００１９】
なおまたさらなる実施形態において、この診断アッセイ用標準における該アニオン性界面活性剤は、ラウリル硫酸もしくはミリスチル硫酸のナトリウム、アンモニウム、カリウム、マグネシウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンもしくはトリエタノールアミンの塩、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウム、またはラウレス硫酸のアンモニウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウムもしくはモノエタノールアミンの塩である。
【００２０】
さらなる実施形態において、この診断アッセイ用標準は、室温で少なくとも６ヶ月間安定である。
【００２１】
さらになおまた別のさらなる実施形態において、この診断アッセイ用標準における該マトリックスは、ブタゼラチンをさらに含む。
【００２２】
さらに別のさらなる実施形態において、この診断アッセイ用標準における該マトリックスは、塩化ナトリウムおよびリン酸ナトリウムからなる群から選択される化合物をさらに含む。
【００２３】
別の実施形態において、この診断アッセイ用標準の該マトリックスは、ｐＨを約６．８〜約７．２の範囲内に維持するために添加されるｐＨ緩衝剤をさらに含む。
【００２４】
この診断アッセイ用標準のさらなる実施形態において、該マトリックスは、アニオン性界面活性剤としてポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムを含む。
【００２５】
さらなる実施形態において、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムがこの診断アッセイ用標準においてアニオン性界面活性剤として存在する場合、約０．１％〜約０．２５％の濃度において存在する。
【００２６】
別の実施形態において、本発明は、
（ａ）Ｒ１Ｏ−ＳＯ３ＭおよびＲ１（ＣＨ２Ｈ４Ｏ）ｘ−Ｏ−ＳＯ３Ｍ
（式中、Ｒ１は、約８〜約２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和の分岐または非分岐アルキル基であり；ｘは、１〜１０の整数であり；Ｍは、水溶性カチオンである。）
からなる群から選択される式を有する少なくとも１種のアニオン性界面活性剤の水溶液を調製するステップと、
（ｂ）トロポニンＩタンパク質およびトロポニンＣタンパク質を、個別にまたは単一の複合体として一緒のいずれかで、該水溶液に添加するステップと、および
（ｃ）室温で該溶液を貯蔵するステップと
を含む、水溶液中のトロポニンを安定化させる方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本発明は、高いトロポニン濃度を有することが疑われる患者の血液試料におけるトロポニンタンパク質の濃度を測定することを意図する免疫アッセイにおける検量標準および対照標準として有用な、少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含むマトリックスにおける安定化されたトロポニンＩタンパク質に関する。本発明はまた、少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含むマトリックスにおける安定化されたトロポニンタンパク質を調製する方法に関する。
【００２８】
本発明の該マトリックスおよび方法において使用される少なくとも１種のアニオン性界面活性剤は、
Ｒ１Ｏ−ＳＯ３ＭおよびＲ１（ＣＨ２Ｈ４Ｏ）ｘ−Ｏ−ＳＯ３Ｍ
（式中、Ｒ１は、約８〜約２４個の炭素原子を有する飽和または不飽和の分岐または非分岐アルキル基であり；ｘは、１〜１０の整数であり；Ｍは、水溶性カチオンである。）
からなる群から選択される式を有する。該水溶性カチオンは、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）、ジエタノールアミン（ＤＥＡ）またはモノエタノールアミン（ＭＥＡ）であり得る。
【００２９】
上記式を有するアニオン性界面活性剤の例としては、限定されないが、ラウリルまたはミリスチル硫酸のナトリウム、アンモニウム、カリウム、マグネシウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミンまたはトリエタノールアミンの塩（ラウリル硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸アンモニウム、ラウリル硫酸ＴＥＡ、ラウリル硫酸ＭＥＡ、ラウリル硫酸マグネシウム、ラウリル硫酸カリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸アンモニウム、ミリスチル硫酸ＤＥＡなど）、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウム、またはラウレス硫酸のアンモニウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウムもしくはモノエタノールアミンの塩（ラウレス硫酸アンモニウム、ラウレス硫酸ＭＥＡ、ラウレス硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸カリウム、ラウレス硫酸マグネシウムなど）が挙げられる。
【００３０】
トロポニンタンパク質、特に心臓トロポニンＩ（ｃＴｎＩ）は、水性環境において急速に免疫活性を失う不安定な分子である。免疫活性の安定性は、診断アッセイのためのキャリブレータまたは対照を調製するために使用される分析物として必須の特性である。本発明者らは、上記式を有するアニオン性界面活性剤が、ｃＴｎＩ分子に安定性を与えることができることを見出した。より具体的には、本発明者らは、限定されないが、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムなどの、上記式の１つを有する少なくとも１種のアニオン性界面活性剤をｃＴｎＩに添加すると、キャリブレータおよび試験アッセイ対照において使用される水性標準溶液の形成に熱安定性およびロバスト性を与えることを発見した。ロバスト性とは、トロポニンの特性の強さについて言う。ロバスト性はまた、該トロポニンが構築された方法について言い得る。
【００３１】
ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムなどの上記式を有するアニオン性界面活性剤は、トロポニンＩが高温、広い範囲のイオン強度、およびｐＨに対してロバストであることを可能にさせる安定性を付与する。上記式の１つを有するアニオン性界面活性剤は、市販されている。例えば、ラウリル硫酸ナトリウムは、Ｊａｒｃｈｅｍ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｅｗａｒｋ、ＮＪ）（以後「Ｊａｒｃｈｅｍ」と言う）からＴａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳ−３０、Ｔａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳ−９５Ｎ、Ｔａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳ−９７Ｐとして入手でき、ラウレス硫酸ナトリウムは、ＪａｒｃｈｅｍからＴａｉｎｏｌｉｎ  ＡＥＳ−２８−２Ｎ、Ｔａｉｎｏｌｉｎ  ＡＥＳ−７０−２Ｎ、Ｔａｉｎｏｌｉｎ  ＡＥＳ−７０−２ＮＣとして入手でき、ラウリル硫酸アンモニウムは、ＪａｒｃｈｅｍからＴａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳＡ−２５、Ｔａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳＡ−２８、Ｔａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳＡ−３０およびＴａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳＡ−７０として入手でき、ラウレス硫酸アンモニウムは、ＪａｒｃｈｅｍからＴａｉｎｏｌｉｎ  ＡＥＳＡ−２５、Ｔａｉｎｏｌｉｎ  ＡＥＳＡ−７０として入手でき、ラウリル硫酸ＴＥＡは、ＪａｒｃｈｅｍからＴａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳＴ−４０として入手でき、ラウリル硫酸ＭＥＡは、ＪａｒｃｈｅｍからＴａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳＭ−２８として入手でき、ラウレス硫酸ＭＥＡは、ＪａｒｃｈｅｍからＴａｉｎｏｌｉｎ  ＡＥＳＭ−２８として入手でき、ラウリル硫酸マグネシウムは、ＪａｒｃｈｅｍからＴａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳＭＧ−３０として入手でき、ラウレス硫酸マグネシウムは、ＪａｒｃｈｅｍからＴａｉｎｏｌｉｎ  ＡＥＳＭＧ−２７として入手でき、ラウリル硫酸カリウムは、ＪａｒｃｈｅｍからＴａｉｎｏｌｉｎ  Ｔａｉｎｏｌｉｎ  ＡＳＫ−３０として入手でき、ラウレス硫酸カリウムは、ＪａｒｃｈｅｍからＡＥＳＫ−２６として入手でき、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムは、Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪからＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１として入手できる。
【００３２】
上記式の１つを有するアニオン性界面活性剤は、トロポニンを含む溶液の希釈成分として使用することができ、いかなる追加的処理も必要としない。少なくとも１種の該アニオン性界面活性剤およびトロポニンタンパク質を含む該マトリックスは、ユーザーによる特別の取り扱い要件を有さず、ユーザーは該マトリックスを２〜８℃の温度または３１℃までの室温で少なくとも６ヶ月間、１年間またはそれ以上貯蔵し得る。
【００３３】
上記式を有する該アニオン性界面活性剤は、水性条件に容易に溶解できると考えられ、添加し、溶解するまで混合することができる。該マトリックスにおける少なくとも１種の該アニオン性界面活性剤の濃度範囲は、６．８〜７．２の範囲、好ましくは７．０におけるｐＨで約０．１％〜０．２５％である。
【００３４】
好ましいアニオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムである。ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムが該マトリックスにおいて使用される場合、このアニオン性界面活性剤は、ｃＴｎＩの免疫活性および単一のタンパク質分子として形成される組換えトロポニンＩ／トロポニンＣ複合体を安定化する。該組換え複合体は、例えば、ＡｘＳＹＭトロポニンＩ  ＡＤＶアッセイおよびＡＲＣＨＩＴＥＣＴトロポニンＩアッセイを用いて行われるアッセイのためのキャリブレータおよび対照の配合物において使用することができる。本発明はまた、ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムなどの少なくとも１種のアニオン性界面活性剤を含む該マトリックスがまた、複合体を形成するためにトロポニンＩおよびトロポニンＣの各々を一緒に添加することによって形成される天然もしくは組換えトロポニンＩ／トロポニンＣ複合体の免疫活性を安定化させるために使用することができることを企図する。
【００３５】
以下の実施例は、本発明をさらに説明するが、当然、決してその範囲を限定するように解釈されるべきでない。本明細書において引用される、刊行物、特許出願、および特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれるべく個々および特別に指示され、本明細書においてその全体が述べられる同じ範囲まで参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【００３６】
ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１を含むおよび含まない場合の３７℃および２〜８℃のトロポニンＩの安定化の比較
トロポニンＩ（コード６７９１１、ロット６３８２１Ｐ１０１、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を、０．１％ブタゼラチンのマトリックスにおいてｐＨ４．０、およびＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、ＮＪからロット１２Ｌ０１９）を含む０．１％ブタゼラチン（コード３５７４５、ロット７４２８１Ｐ１００、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）のマトリックスにおいてｐＨ６．８で、４０〜５０ｎｇ／ｍｌ（ＡｘＳＹＭ単位はｎｇ／ｍｌ）の最終濃度に希釈した。ブタゼラチンは、製造中のトロポニンの損失を最小とするためにタンパク質源として添加する。
【００３７】
各配合物を以下のように２〜８℃および３７℃の双方で貯蔵する。
試料Ａ  ２〜８℃で、ブタゼラチンにおけるトロポニンＩ
試料Ｂ  ３７℃で、ブタゼラチンにおけるトロポニンＩ
試料Ｃ  ２〜８℃で、０．１％ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１を含むブタゼラチンにおけるトロポニンＩ
試料Ｄ  ３７℃で、０．１％ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１を含むブタゼラチンにおけるトロポニンＩ
【００３８】
各試料におけるトロポニンＩの濃度は、ＡｘＳＹＭ計器システム（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、４５、Ｎｏ．１２、１９９９）でＡｘＳＹＭトロポニンＩ標準較正（Ｎｏ．３Ｃ２９−０１、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）を使用して０日目に作成した標準曲線を使用して測定した。次の１０日にわたり、トロポニンＩの濃度を測定し、０日目に観察された濃度と比較した。各日の残存活性％は、さまざまな時点で各試料について測定された濃度を０日目に測定された濃度で割ることによって計算した。結果を表１に表し、図１に示す。
【００３９】
【表１】
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【００４０】
０．１％ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１の０．１％ブタゼラチンを含む該マトリックスへの添加および４〜６．８のｐＨの調整は、該試料を３７℃で１０日間貯蔵した後に観察されるようなトロポニンＩの熱安定性に著しい効果がある。同様の安定性は、ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１を含み、または含まずに、２〜８℃で貯蔵した試料について観察された。
【実施例２】
【００４１】
ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１のロット間の変化の比較
ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１の供給メーカーの３ロットを分析物マトリックスの調製において使用した。全てのマトリックスは、配合：ｐＨ７．０で、０．０２５％ブタゼラチン（コード３５７４５、ロット７４２８１Ｐ１００、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ａｂｂｏｔｔ  Ｐａｒｋ、ＩＬ）、０．１７５％の選択されたＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１、２．５ｍＭのＮａＰＯ４（溶液のｐＨを維持する緩衝剤として）および０．１％のＰｒｏＣｌｉｎ３００（主な活性成分−メチルクロロイソチアゾロン）に基づいた。ＰｒｏＣｌｉｎ３００は、細菌増殖を阻害するために使用される抗菌剤である。
【００４２】
ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１の供給メーカーの３ロットは、
ロット１  コード８８９６５、ロット３９２６７Ｘ１０２（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
ロット２  コード８８９６５、ロット７４４９７Ｐ１００（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
ロット３  コード８８９６５、ロット７４４９８Ｐ１０１（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）
であった。
【００４３】
３つのマトリックス（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｒ＆Ｄ  ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓにおいて製造された）をＢｕｌｋ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ８６４、Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において製造された調製物と比較した。この調製物にロット１を０．１７５％の濃度まで添加した。マトリックスの各々を使用して心臓トロポニンＩを１５ｎｇ／ｍｌ〜２０ｎｇ／ｍｌの濃度に希釈した。試料を３つの異なる温度条件：２〜８℃、室温および４５℃で貯蔵した。各標準のトロポニンＩの濃度は、０、１、２および７日目に測定した（ＡｘＳＹＭトロポニンＩアッセイによる。）。トロポニンＩの残存活性％を求めた。結果を表２〜表７に表し、図２〜図４に示す。
【００４４】
【表２】
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【００４５】
【表３】
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【００４６】
２〜８℃で７日間貯蔵後、トロポニンＩの残存活性％は、用いるＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１のロットにより９６％〜１０５％と変化した。
【００４７】
【表４】
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【００４８】
【表５】
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【００４９】
室温で７日間貯蔵後、トロポニンＩの残存活性％は、用いるＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１のロットに関して９９％〜１０３％と変化した。
【００５０】
【表６】
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【００５１】
【表７】
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【００５２】
４５℃で７日間貯蔵後、トロポニンＩの残存活性％は、用いるＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１のロットにより９３％〜１０１％と変化した。
【実施例３】
【００５３】
キャリブレータおよび対照の安定性試験
キャリブレータは、トロポニンＩの既知の濃度を含有する標準配合物であり、アッセイにおいて使用される検量線を画定するために使用される。対照は、これもトロポニンＩの既知の濃度を含有する、標準配合物であり、アッセイの動的範囲にわたって検量線の整合性を調べるために使用した。
【００５４】
標準キャリブレータを、ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１を含有するマトリックス配合物：０．０２５％ブタゼラチン（コード３５７４５、ロット７４２８１Ｐ１０３（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ））、０．１７５％ＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１（コード８８９６５、ロット３９２６７Ｘ１０２（Ｃｏｇｎｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｈｏｂｏｋｅｎ、Ｎ．Ｊ．））、２．５ｍＭ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７での０．１％ＰｒｏＣｌｉｎ３００（Ｓｕｐｐｌｅｃｏ）、および以下のトロポニンＩ濃度：０、２．５、５．０、１５、３０および５０ｎｇ／ｍｌでのトロポニンＩ（Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＣＡ．から購入したＡｂｂｏｔｔコード６７９１１、ロット７８４８０Ｐ２００）（それぞれＡからＦと称される。）を用いて調製した。
【００５５】
同様に、３つの対照標準を、以下のトロポニンＩ濃度：
低濃度の対照：３．０ｎｇ／ｍｌ、
中濃度の対照：１０ｎｇ／ｍｌ、
高濃度の対照：３５ｎｇ／ｍｌ
で調製した。
【００５６】
標準キャリブレータおよび対照の完全セットを各々、凍結、２〜８℃、および３１℃で貯蔵した。温度３１℃は、最悪の場合の室温条件として選択した。解凍したばかりの対照を使用して、０、１、３、７および１４日目にさまざまな温度条件下で貯蔵したキャリブレータの安定性を評価した。結果を表８〜表１０に表し、図５〜図７に示した。反対に、解凍したばかりのキャリブレータを使用して、０、１、３、７および１４日目に同じ温度条件下で貯蔵されていた対照の安定性を評価した。結果を表１１〜表１３に表し、図８〜図１０に示した。さらに、さまざまな貯蔵条件で中濃度の対照の安定性を表１４および図１１に示されるように１８４日間にわたって追跡調査した。
【００５７】
【表８】
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【００５８】
【表９】
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【００５９】
【表１０】
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【００６０】
【表１１】
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【００６１】
【表１２】
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【００６２】
【表１３】
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【００６３】
【表１４】
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【００６４】
さまざまな温度条件下で貯蔵したキャリブレータの安定性を、解凍したばかりの対照を使用して１４日間にわたって評価した。１４日後のトロポニンＩの残存活性は９７〜１０６％の範囲であった。２〜８℃および３１℃で貯蔵したキャリブレータは、１４日後それぞれ、９５〜１０２％および９７〜１０２％の範囲の同様のトロポニンＩの残存活性％を示した。
【００６５】
凍結、２〜８℃および３１℃条件下で貯蔵した対照の安定性は、活性の同程度の保持率を示した。凍結対照は、１４日後に９７〜１０６％の活性を保持した。２〜８℃および３１℃で貯蔵した対照は、０日目に測定された活性に比べて１４日後に１０１〜１０９％のトロポニンＩ活性をもたらした。凍結、２〜８℃および３１℃条件下で貯蔵した中濃度の対照は、１８４日後それぞれ、９７、１０２および９３％の活性を保持した。
【００６６】
ポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムは、ＡｘＳＹＭ計器システムにおいて試料から試料へのいかなるキャリーオーバー作用も起こさないことが見出された。
【００６７】
本発明を記載する文脈における（特に次にくる請求項の文脈における）不定冠詞および定冠詞の用語ならびに同様の指示語の使用は、本明細書において特記しないまたは文脈により明らかに矛盾しない限り、単数および複数の双方に及ぶと解釈されるべきである。本明細書における値の範囲の列挙は、本明細書において特記しない限り、範囲内に入る各個別の値を個々に言う省略方法として役目を果たすことが単に意図され、各個別の値は、本明細書において個々に列挙されるように本明細書に組み込まれる。本明細書において記載される全ての方法は、本明細書において特記しないまたは文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で行うことができる。任意および全ての実施例、または本明細書において与えられる代表的な言葉（例えば、「ｓｕｃｈ  ａｓ」）の使用は、本発明をより明らかに説明することを単に意図するものであり、他に主張されない限り、本発明の範囲に限定を課すものではない。本明細書における言葉は、本発明の実施に必須であるような任意の請求項化されない要素を示すとして解釈されるべきである。
【００６８】
一部の、可能性を有する利点および目的は、本明細書において明示的に特定されているが、これは、本発明の一部の実施形態が、明示的に特定された利点および目的の全てまたは任意を与え得るものではないと理解されるべきである。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態は、本明細書において記載され、本発明を実施するために発明者らに知られたベストモードを含む。当然、これらの好ましい実施形態の変化は、先の記述を読めば当業者に明らかになる。本発明者らは、当業者が適切なものとしてこのような変化を利用することを予期するものであり、本発明が本明細書において具体的に記載される以外で実施されることを意図する。従って、本発明には、適用可能な法によって許されるような本明細書に添付された請求項に列挙された主題の全ての変更および同等物が含まれる。さらに、これらの可能な全ての変化における上記要素の任意の組み合わせが、本明細書において特記しないまたは他に文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明により包含される。
【図面の簡単な説明】
【００７０】
【図１】添加されたポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムを含むおよび含まない配合物におけるトロポニンＩの活性レベルを比較する図である。
【図２】２〜８℃での経時的な、トロポニンＩの安定性に対するＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１としてのポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムのロット間の変化を示す図である。
【図３】室温、３１℃での経時的な、トロポニンＩの安定性に対するＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１としてのポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムのロット間の変化を示す図である。
【図４】４５℃での経時的な、トロポニンＩの安定性に対するＳＴＡＮＤＡＰＯＬ（登録商標）ＥＳ−１としてのポリオキシエチレン（１）ラウリル硫酸ナトリウムのロット間の変化を示す図である。
【図５】凍結貯蔵し、解凍したばかりのキャリブレータ標準を用いて作成した検量線から計算した低、中および高濃度の対照についてトロポニンＩの残存活性％を表す図である。
【図６】２〜８℃で貯蔵したキャリブレータ標準を用いて作成した検量線から計算した低、中および高濃度の対照についてトロポニンＩの残存活性％を表す図である。
【図７】室温（３１℃）で貯蔵したキャリブレータ標準を用いて作成した検量線から計算した低、中および高濃度の対照についてトロポニンＩの残存活性％を表す図である。
【図８】凍結貯蔵した低、中および高濃度の対照についてトロポニンＩの残存活性％を表す図である。対照の濃度は、凍結貯蔵し、解凍して直ちに使用したキャリブレータ標準を用いて作成した標準曲線から計算した。
【図９】２〜８℃で貯蔵した低、中および高濃度の対照についてトロポニンＩの残存活性％を表す図である。対照の濃度は、凍結し、解凍して直ちに使用したキャリブレータ標準を用いて作成した標準曲線から計算した。
【図１０】最悪の場合の室温（３１℃）で貯蔵した低、中および高濃度の対照についてトロポニンＩの残存活性％を表す図である。対照の濃度は、凍結し、解凍して直ちに使用したキャリブレータ標準を用いて作成した標準曲線から計算した。
【図１１Ａ】２〜８℃および最悪の場合の室温（３１℃）で、連続的に凍結貯蔵した中濃度の対照についてトロポニンＩ濃度を表す図である。対照の濃度は、凍結され、解凍して直ちに使用されたキャリブレータ標準を用いて作成される標準曲線から計算された。
【図１１Ｂ】２〜８℃および最悪の場合の室温（３１℃）で、連続的に凍結貯蔵した中濃度の対照についてトロポニンＩ濃度を表す図である。対照の濃度は、凍結され、解凍して直ちに使用されたキャリブレータ標準を用いて作成される標準曲線から計算された。
【図１１Ｃ】２〜８℃および最悪の場合の室温（３１℃）で、連続的に凍結貯蔵した中濃度の対照についてトロポニンＩ濃度を表す図である。対照の濃度は、凍結され、解凍して直ちに使用されたキャリブレータ標準を用いて作成される標準曲線から計算された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【国際調査報告】
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