(57)【要約】本開示は、転移性疾患の診断指標としてテロメアの機能不全の兆候を検出するための組成物および方法に向けられる。より詳細には、癌細胞または前癌細胞に対する早期診断試験として、ＴＲＫ２タンパクの発現上昇を検出するため、あるいは、テロメア融合の存在を検出するために、サンプルを分析する診断試薬および方法が提供される。一つの実施態様では、本開示の方法は、個人における乳癌の存在を診断するか、または、乳癌のリスクを評価するために用いられる。【選択図】図４
2008537475.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
テロメア融合の存在について生物サンプルをスクリーニングするためのキットであって、
配列番号１９の配列を含むＰＣＲプライマー、および、
ＰＣＲ反応を実行するための試薬、
を含むキット。
【請求項２】
前記ＰＣＲプライマーが、前記配列番号１９の配列の５′末端に共有結合されている制限酵素認識配列をさらに含むことを特徴とする、請求項１のキット。
【請求項３】
前記ＰＣＲプライマーが、一般式Ｘ−Ｙ−（Ｚ）ｎで表される配列を含み、
前式において、
Ｘは、配列番号４４の配列を表し、
Ｙは、制限酵素認識配列を表し、
Ｚは、配列番号１９の配列を表し、かつ、
ｎは、１−６の範囲から選ばれる整数である、
ことを特徴とする、請求項１のキット。
【請求項４】
前記ｎが、２または３であることを特徴とする、請求項３のキット。
【請求項５】
前記ＰＣＲプライマーが、配列番号２１から成ることを特徴とする、請求項１のキット。
【請求項６】
前記試薬が、熱安定性ポリメラーゼを含むことを特徴とする、請求項１のキット。
【請求項７】
配列番号１９、および、配列番号１９の５′末端に共有結合されている制限酵素認識配列、を含む精製核酸配列。
【請求項８】
前記配列が、配列番号２０の配列を含むことを特徴とする、請求項７の核酸配列。
【請求項９】
生物サンプルにおいてテロメア融合を検出する方法であって、
テロメア特異的ＰＣＲプライマーに、該生物サンプルから単離された細胞ＤＮＡを接触させて反応基質を形成する工程、
該反応基質に対してＰＣＲ増幅反応を実行する工程、および、
増幅産物の存在を検出する工程、
を含み、該増幅産物の検出が、テロメア融合の存在を示すことを特徴とする方法。
【請求項１０】
前記テロメア特異的ＰＣＲプライマーが、配列番号１９の配列を含むことを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１１】
前記テロメア特異的ＰＣＲプライマーが、配列番号１９の配列の５′末端に共有結合されている制限酵素認識配列を含むことを特徴とする、請求項１０の方法。
【請求項１２】
前記テロメア特異的ＰＣＲプライマーが、一般式Ｘ−Ｙ−（Ｚ）ｎで表される配列を含み、
前式において、
Ｘは、配列番号４４の配列を表し、
Ｙは、制限酵素認識配列を表し、
Ｚは、配列番号１９の配列を表し、かつ、
ｎは、２−６の範囲から選ばれる整数である、
ことを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１３】
前記テロメア特異的ＰＣＲプライマーが、配列番号２１から成ることを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１４】
前記生物サンプルが、ヒトの乳房組織を含むことを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１５】
前記ＰＣＲ増幅反応が、患者の細胞から精製されたＤＮＡに対して実行されることを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１６】
前記ＰＣＲ増幅反応が、患者から得られた組織切片に対しｉｎ  ｓｉｔｕにて実行されることを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１７】
患者から採取された組織サンプルにおいてＴＲＫ２の異常発現を検出する方法であって、
ＴＲＫ２に特異的に結合するリガンドに、該患者組織のタンパクを接触させる工程、
リガンド−ＴＲＫ２複合体を検出する工程、および、
ＴＲＫ２タンパクの発現を、正常細胞のものと比較して、該組織サンプルにおけるＴＲＫ２の異常発現を検出する工程、
を含む方法。
【請求項１８】
前記リガンドが、抗体であることを特徴とする、請求項１７の方法。
【請求項１９】
前記患者組織のタンパクを抗体に接触させる工程が、前記組織サンプルから全タンパクを単離する工程と、該単離されたタンパクを前記抗体に接触させる工程、を含み、かつ、前記検出工程が、該タンパクに特異的に結合した抗体の量を定量する工程、を含むことを特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２０】
前記患者組織のタンパクを抗体に接触させる工程が、前記組織サンプルの切片を調製する工程、および、該組織切片を、標識された該抗体とインキュベートする工程、を含み、かつ、前記検出工程が、特異的に結合した抗体の細胞分布を観察する工程、を含むことを特徴とする、請求項１８の方法。
【請求項２１】
腫瘍性細胞と関連するテロメア融合を検出するための核酸プローブであって、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、および、配列番号５８、から成るグループから選ばれる一つの核酸配列を含み、かつ、該選ばれた核酸配列は、レポーターマーカーによって標識されることを特徴とするプローブ。
【請求項２２】
腫瘍性細胞と関連するテロメア融合を検出する方法であって、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、および、配列番号５８、から成るグループから選ばれる一つの核酸配列に、生物サンプルの核酸配列を接触させる工程を含み、かつ、該選ばれた核酸配列は、レポーターマーカーによって標識されることを特徴とする方法。
【請求項２３】
前記生物サンプルの核酸配列が、前記標識された核酸配列と接触させられる前に、前記生物サンプルから精製されることを特徴とする、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記生物サンプルが、切片状に薄切され、該薄切されたサンプルが、前記標識された核酸配列に接触させられることを特徴とする、請求項２２の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ゲノム不安定性は、腫瘍発生においてもっとも早期に起きることが知られている、腫瘍性変化の一つである。最近のいくつかの報告によって、テロメア維持における欠陥が、癌の発症、より詳細には、乳癌の発症において重要な役割を演じていることが示されている。テロメアは、染色体末端の融合を阻止し、ＤＮＡ末端の複製を可能とする保護キャップとして働く、特殊なＤＮＡ／タンパク構造である。細胞が分裂するにつれて、テロメアの長さは臨界長に達するまで縮小し、臨界長に達すると、細胞は分裂を停止する。
【０００２】
テロメラーゼは、逆転写触媒サブユニット（ｈＴＥＲＴ）と、いくつかの必須の機能のうちでも特に（Ｔ２ＡＧ３）繰り返し配列のために鋳型を供給するという機能を有するＲＮＡ（ｈＴＥＲ）とから成る、リボ核タンパク質複合体である。多くの体細胞では、テロメラーゼは欠如するか、または大きく減少するため、各細胞サイクル毎に、テロメアが次第に短縮し、それがテロメア機能の消失にいたる場合がある。テロメラーゼは、乳癌進行の早期に活性化され、非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）に存在する。注目すべきことに、テロメラーゼは、ｈＴＥＲＴ−特異的陰性転写調節因子の消失を含む、複雑な過程を通じて腫瘍の９５％以上において活性化される。これは、ゲノム不安定性およびｈＴＥＲＴ特異的陽性転写活性化因子という、より早期の事象によって引き起こされるものと考えられる。従って、ｈＴＥＲＴ活性化は、大抵の癌に起こることが知られる、もっとも高頻度の遺伝子調節性変化であり、恐らく極めて有用なマーカーとなる可能性を持つ。しかしながら、癌細胞または前癌細胞のさらに早い検出を実現する可能性のある、もっと早期の腫瘍発生関連事象があるようである。
【０００３】
哺乳類テロメア維持のための必須成分は、テロメアＤＮＡ長の、適切な組織特異的調節を含む。しかしながら、それと同じぐらい重要なのが、タンパク性テロメアキャップの正常な調節を、その独自の組織および発達の複雑性と共に、維持しなければならないことである。テロメア関連タンパク、例えば、ＴＲＦ１およびＴＲＦ２は、テロメアＤＮＡに直接に結合することが可能であり、あるいは、テロメア繰り返し配列結合タンパクとの相互作用を介してテロメアに局在することが可能である。テロメア関連タンパクと、テロメアＤＮＡとの間の相互作用、および、テロメラーゼによるテロメア繰り返し配列の合成は、発達および細胞サイクルを通じてテロメア長およびキャップ機能を維持するために必須である。さらにもう一層の複雑性を付加するものとして、ヒトのテロメアは、３′Ｇ高頻度−１本鎖オーバーハングを末端に有している。この１本鎖オーバーハングは、数百ヌクレオチドから成り、テロメア繰り返し配列の一方の鎖を移動させ、それ自身の相補配列にハイブリダイズすることが可能である。このようにして得られる、ｔ−ループと呼ばれる大きな二重ループ構造は、この折り畳まれたＤＮＡと、関連するタンパク、特にＴＲＦ２を含む。ＴＲＦ２は、ｔ−ループの接合部に結合すると考えられている。
【０００４】
いくつかの研究によって、ＴＲＦ１およびＴＲＦ２の野生型、および、優勢陰性対立遺伝子の人工的な過剰発現は、それぞれ、テロメアＤＮＡの漸進的な短縮および伸長をもたらすことが報告されている（例えば、Smogorzewska and de Lange, (2004) Curr Biol, 12, 1635-44を参照）。テロメア関連タンパクの完全な欠損は、一般に、テロメアＤＮＡ長の短縮およびキャップ機能の消失をもたらし、これらはテロメア融合の蓄積を招く(Ferreira et al.,(2004) Mol.Cell. Jan 16;13(1):7-18; Smogorzewska and de Lange, 2004)。
【０００５】
臨界的に短くなったテロメアＤＮＡ、またはその他のテロメア維持の欠陥によって引き起こされるテロメア機能不全は、乳癌の進行時に見られるゲノム不安定性をもたらす早期事象の可能性がある（Artandi and DePinho,(2000) Nat Med. Aug;6(8):852-5）。マウスにおいて、テロメラーゼ活性の阻害または発現上昇によって誘発されたテロメア機能不全は、高レベルの乳房腺癌、および、これらのマウスの系統株には通常では観察されない、他の上皮癌の発生を招いた。さらに、正常なヒトの乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）は、自然発生的に老化を免れ、テロメア融合のようなゲノム変化を獲得する。機能的テロメアキャップによる、染色体の末端対末端融合の阻止、および、テロメアＤＮＡ複製の調節は、ゲノムの完全性の維持において決定的に重要な成分である。テロメアキャップ機能の喪失は、染色体の末端同士が融合することを許してしまうので、破断−融合−架橋サイクルの原因となり、ゲノム不安定性をもたらす。
【０００６】
テロメア長は、組織において簡単に定量することが可能であるが、テロメア短縮は、必ずしもテロメア機能の消失を示すわけではなく、テロメア機能不全は、テロメアＤＮＡの短縮無しでも起こり得る。従って、本開示の方法は、乳癌発生時におけるテロメア機能の消失を検査すること、および、癌細胞または前癌細胞の早期診断として、そのような消失を検出することを可能とする。ヒト乳癌発生におけるテロメア機能不全の関与の程度はこれまで報告されていない。
【発明の開示】
【０００７】
本開示は、癌の早期検出のための診断試薬および方法に向けられる。さらに詳細には、本開示は、癌細胞または前癌細胞の存在を評価するためにサンプルを分析する方法に向けられる。一つの実施態様では、本開示の方法は、乳癌について、その存在を診断するか、またはリスクを評価するために用いられる。
【０００８】
一つの実施態様によれば、癌細胞または前癌細胞の存在を示す診断指標として、生物サンプルにおいてテロメア融合を検出する方法が提供される。この方法は、テロメア特異的ＰＣＲプライマーに、生物サンプルから単離された細胞ＤＮＡを接触させて反応基質を形成すること、および、該反応基質に対してＰＣＲ増幅反応を実行すること、を含む。生物サンプルは、患者細胞から精製したＤＮＡであってもよいし、あるいは、生物サンプルは、患者から得た細胞または組織サンプルの薄切切片であってもよい。ＰＣＲ増幅を実行した後、サンプルは、増幅産物の有無についてスクリーニングされる。このスクリーニングにおいて、増幅産物が検出された場合、それはテロメア融合の存在を示し、従って、その患者の組織における癌細胞または前癌細胞の存在を診断することになる。
【０００９】
もう一つの実施態様では、テロメア融合の有無について生物サンプルをスクリーニングするためのキットが提供される。より詳細には、本キットは、テロメア特異的ＰＣＲプライマーを含む。一つの実施態様では、単離されたＰＣＲプライマーは、配列番号１９の配列を含む。キットはさらに、ＰＣＲ反応を実行するための、または、ＰＣＲ反応によって生産される増幅産物を検出するための、１種以上の試薬を備えてもよい。一つの実施態様では、ＰＣＲプライマーは、一般式Ｘ−Ｙ−（Ｚ）ｎで表される配列を含む。前式において、Ｘは、６個のヌクレオチドの配列を表し、Ｙは、制限酵素の認識配列を表し、Ｚは、配列番号１９の配列を表し、かつ、ｎは、１−６の範囲から選ばれる整数である。
【００１０】
もう一つの実施態様では、癌細胞または前癌細胞の存在を示す診断指標として、患者の細胞におけるＴＲＫ２の異常発現を検出する方法が提供される。本方法は、ＴＲＫ２に特異的に結合するリガンドに、患者組織のタンパクを接触させること、特異的リガンド−ＴＲＫ２複合体を検出すること、および、患者組織におけるＴＲＫ２タンパクの発現を正常細胞のものと比較して、組織サンプルにおけるＴＲＫ２の異常発現を検出すること、を含む。一つの実施態様では、リガンドは、ＴＲＫ２に対して特異的なモノクロナール抗体であり、異常発現は、存在するＴＲＫ２タンパク量の著明な上昇および／またはＴＲＫ２タンパクの細胞位置の著明な変化であってもよい。
【００１１】
さらに別の実施態様では、腫瘍性細胞と関連するテロメア融合を検出する方法であって、テロメア特異的核酸プローブを利用する方法が提供される。一つの実施態様では、プローブは、下記の配列、すなわち、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、配列番号５８の内の一つ、または二つ以上の組み合わせを含む組成物を含む。
【００１２】
（関連出願）
本出願は、米国特許法第119(e)条の下に、２００５年２月１８日出願の、仮出願番号第60/654,320号に対する優先権を主張する。なお、該出願の開示を参照することにより本出願に含める。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
＜定義＞
本発明を説明し、その特許を請求するに当たり、下記の用語が、以下に記載される定義に従って用いられる。
本明細書で用いる「製薬学的に受容可能な担体」という用語は、標準的な製薬学的担体、例えば、リン酸バッファー生食液、水、乳剤、例えば、水中油または油中水・乳剤、および各種湿潤剤、のいずれかを含む。本用語はまた、ヒトを含む動物に対する使用が米国連邦政府の統制当局によって承認された、または、米国薬局方に挙げられた、薬剤の内から任意に選ばれるものを含む。
【００１４】
本明細書で用いる「単離された」という用語は、物質の元の環境（例えば、物質が天然のものであるならば、天然の環境）から取り出された物質を指す。例えば、生きている動物の体内に存在する天然のポリヌクレオチドは単離されていないが、同じポリヌクレオチドで、天然の系において共存する物質の内のいくつか、または全てから分離されたポリヌクレオチドは、単離されている。
【００１５】
本明細書で用いる「精製された」という用語、および類似の用語は、分子または化合物であって、通常、生の、または天然の環境では、該分子または化合物と関連する汚染物質を実質的に含まない形状へと分子または化合物を単離することに関連する。
【００１６】
本明細書で用いる用語「プライマー」は、精製された制限消化産物の中などに、天然に見られるものであれ、合成的に生産されたものであれ、核酸鎖に対して相補的なプライマー伸長産物の合成が誘発される条件下（すなわち、適切な温度およびｐＨにおいて、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼのような誘発剤の存在する条件下）に置かれた場合、合成の起点として活動することが可能なオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、最大の増幅効率のためには１本鎖であることが好ましいが、それとは別に２本鎖であってもよい。２本鎖の場合、プライマーは、先ず、伸長産物の調製に使用する前に、それらの鎖が別々になるよう処理される。
【００１７】
「熱安定性ポリメラーゼ」という用語は、熱に安定なポリメラーゼ酵素を指す。すなわち、該酵素は、鋳型に対して相補的なプライマー伸長産物の形成を触媒するが、２本鎖鋳型核酸の変性をもたらすのに必要な時間高温に曝されても、不可逆的に変性することがない。一般に、合成は、各プライマーの３′末端において始まり、鋳型鎖にそって５′から３′方向に進む。これまでに、Thermus flavus，T.ruber，T.thermophilus，T.aquaticus，T.lacteus，T.rubens，Bacillus stearothermophilusおよびMethanothermus fervidusから熱安定性ポリメラーゼが単離されている。それでもなお、熱安定性でないポリメラーゼでも、該酵素が補充される限り、ＰＣＲアッセイに使用することが可能である。
【００１８】
本明細書で用いる「抗体」という用語は、ポリクロナール抗体、またはモノクロナール抗体、または、その結合性断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ断片を指す。
【００１９】
本明細書で用いる「標識」という用語は、検出可能な（好ましくは定量可能な）「信号」を供給するのに使用が可能であり、かつ、核酸またはタンパクに付着させることが可能な任意の原子または分子を指す。標識は、蛍光、放射能、比色、質量測定、Ｘ線回折または吸収、磁気、酵素活性等によって検出可能な「信号」を供給してもよい。
【００２０】
本明細書で用いる「制限酵素」という用語は、制限酵素認識部位内の特異的部位において、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のフォスフォジエステル結合を切断する酵素（すなわち、「ＩＩ型制限酵素」）を指す。
【００２１】
「制限酵素認識配列」という用語は、制限酵素によって切断のための標的部位とされる核酸配列を指す。
【００２２】
本明細書で用いる「腫瘍性細胞」という用語は、異常な新生増殖をもたらす細胞を指す。
【００２３】
本明細書で用いる「腫瘍」という用語は、悪性であれ良性であれ、過剰な細胞分裂によってもたらされる細胞の異常な集塊または集団、および全ての前癌および癌状態の、細胞および組織を指す。「腫瘍」はさらに、２個以上の腫瘍性細胞と定義される。
【００２４】
「悪性細胞／腫瘍」は、無統制な細胞増殖という点に加えて、それらの細胞／腫瘍が周囲組織に侵入し、さらに転移するという点でも、良性細胞／腫瘍とは区別される。癌細胞は、悪性の形質転換を経た細胞である。
【００２５】
本明細書で用いる「腫瘍性疾患」という用語は、細胞の、無統制で、異常な増殖によって特徴づけられる病態を指す。腫瘍性疾患は癌を含む。
【００２６】
＜実施態様＞
本発明は、テロメア機能不全が、早期の悪性病巣に観察されるゲノム不安定性の背後に控える原動力であるという前提に基づく。テロメア機能不全仮説は、正常な前駆細胞の僅かなサブセットにおいて、テロメアキャップが破壊され、これがテロメア融合を招き、破壊−融合−架橋サイクルを介して最終的にゲノム不安定性をもたらす（図４）とする。従って、ゲノムの完全性の消失は、遺伝子（ＴＥＲＴ、すなわちテロメラーゼの触媒成分、を含む）の調節不良を招き、これが最終的に腫瘍発生をもたらす。
【００２７】
本開示の一つの態様は、転移性疾患の診断指標として、テロメア機能不全の兆候を検出するための組成物および方法に向けられる。さらに詳細には、一つの実施態様によれば、生物サンプルの細胞においてテロメア融合産物の存在を検出するための方法が提供される。このようなテロメア融合は、癌細胞または前癌細胞と関連づけられてきたので、腫瘍性疾患の早期診断マーカーとして役立つ。
【００２８】
一つの実施態様によれば、生物サンプルの細胞においてテロメア融合を検出する方法は、生物サンプル中に存在する任意のテロメア融合産物を特異的に増幅するために、標準的ＰＣＲ反応を用いることを含む。一つの実施態様では、生物サンプルは、患者の組織から単離された核酸配列を表し、さらに詳細には、一つの実施態様では、患者はヒトである。組織は、血液サンプルを含んでもよいし、あるいは、患者から回収した、固体組織のバイオプシーサンプルを含んでもよい。一つの実施態様では、生物サンプルは、ヒトの乳房組織を表す。テロメア融合の特異的増幅は、テロメア特異的ＰＣＲプライマー、および適切な反応条件を用いることによって実現される。テロメア融合産物が欠如する場合、本明細書で開示するテロメア特異的ＰＣＲプライマーを用いることでＰＣＲ反応がアンプリコンを生じることはない。
【００２９】
一つの実施態様によれば、テロメア融合産物を増幅するための、テロメア特異的プライマーとして動作することが可能な、核酸配列が提供される。一つの実施態様では、テロメア特異的ＰＣＲプライマーは、配列番号１９の配列を含む。一つの実施態様では、プライマーは、配列番号１９の約１〜６回の間の任意の回数の繰り返し配列から成る、タンデム配列を含む。一つの実施態様では、プライマーは、配列番号１９の２から３回の繰り返しタンデム配列を含み、一つの実施態様では、プライマーは、配列番号２０を含む。
【００３０】
このテロメア特異的ＰＣＲプライマーにはさらに、増幅されたテロメア融合領域のクローニングを助けるために制限酵素認識配列が設けられてもよい。一つの実施態様によれば、配列番号１９と、配列番号１９の５′末端に共有的されている制限酵素認識配列とを含む、精製核酸配列が提供される。一つの実施態様では、テロメア特異的ＰＣＲプライマーは、一般式Ｘ−Ｙ−（Ｚ）ｎで表される配列を含む。前式において、Ｘは配列ＮＮＮＮＮＮ（配列番号４５）を表し、一つの実施態様では、Ｘは配列ＧＧＧＮＮＮ（配列番号４４）を表し、ここに、Ｎは、４種の標準的ヌクレオチド（グアノシン、シチジン、チミジン、またはアデノシン）の内の任意の１種を表し、Ｙは、制限酵素認識配列を表し、Ｚは、配列番号１９の配列を表し、かつ、  ｎは、１−６の範囲から選ばれる整数である。一つの実施態様では、ｎは、２から４、または２から３の範囲から選ばれる整数である。一つの実施態様では、ｎは３である。一つの実施態様では、制限酵素認識配列は、６個のヌクレオチドから成る認識配列を含む。一つの実施態様では、制限酵素認識配列は、ＥｃｏＲＩ，ＢａｍＨＩ，ＨｉｎｄＩＩＩ，ＰｓｔＩ，ＫｐｎＩ，ＰｖｕＩＩ，ＡｐａＩ，ＨｐａＩ，ＳａｌＩ，ＣｌａＩ，ＸｂａＩ，ＢｇｌＩＩから成るグループから選ばれる酵素の認識配列である。一つの実施態様では、制限酵素認識配列は、ＥｃｏＲＩの認識部位である。一つの実施態様では、テロメア特異的ＰＣＲプライマーは、配列ＧＧＧＮＮＮＧＡＡＴＴＣ（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（配列番号２１、配列番号４０、および配列番号４１）を含む。該配列において、ｎは、１−３の範囲から選ばれる整数であり、かつ、配列は、制限酵素ＥｃｏＲＩの認識配列を含む。さらに別の実施態様では、ＰＣＲは、配列番号２１から成る。
【００３１】
一つの実施態様によれば、細胞集団においてテロメア融合の存在を検出する方法であって、ＰＣＲ反応と、本明細書で開示されるテロメア特異的プライマーを用いる方法が提供される。本方法は、テロメア特異的プライマーに生物サンプルを接触させること、ＰＣＲ増幅反応を実行すること、および、サンプルをスクリーニングして、増幅産物の存在を検出すること、を含む。一つの実施態様によれば、生物サンプルは、哺乳類細胞から回収した全体ＤＮＡ、または核ＤＮＡを含む。別の実施態様では、生物サンプルは、哺乳類細胞／組織の薄切切片を含む。
【００３２】
生物サンプルの細胞ＤＮＡを、ＰＣＲプライマーが、標的ＤＮＡの相補鎖に結合し、反応基質を形成することを可能とする条件下に、テロメア特異的ＰＣＲプライマーに接触させる。次に、適切なバッファーおよびポリメラーゼ酵素を、この反応基質に加え、当業者に既知の標準技術を用いてＰＣＲ増幅反応を実行する。好都合にも、テロメア融合の対称性のために、テロメア融合の増幅のためには、単一のＰＣＲプライマーしか必要とされない（図５参照）。テロメア融合が欠如する場合、ＤＮＡ増幅は起こらない。一つの実施態様では、使用されるＰＣＲプライマーは、配列番号１９の配列を含み、さらに詳細には、一つの実施態様では、プライマーは、一般式Ｘ−Ｙ−（Ｚ）ｎで表される配列を含む。前式において、Ｘは、６個のヌクレオチドから成る核酸配列を表し、Ｙは、制限酵素認識配列を表し、Ｚは配列番号１９の配列を表し、かつ、ｎは、１−６の範囲から選ばれる整数である。一つの実施態様では、ｎは、１から３、または２から３の範囲から選ばれる整数であり、Ｘは、ＧＧＧＮＮＮ（配列番号４４）であって、Ｎは、４種の標準ヌクレオチド（グアノシン、シチジン、チミジン、またはアデノシン）の内の任意の一つを表す。
【００３３】
ＰＣＲ増幅反応の終了後、サンプルを、増幅産物の有無についてスクリーニングする。増幅産物の検出は、核酸配列の有無を検出するために用いられる既知の技術から選ばれる任意のものを用いて実行することが可能である。一つの実施態様によれば、ＰＣＲプライマーは、検出可能なマーカーによって標識され、ＰＣＲアンプリコンの生産は、元のＰＣＲプライマーよりもサイズの大きな標識核酸増幅産物の検出に基づいて、検出される。それとは別に、一つの実施態様では、ＰＣＲプライマーが標識されるのではなく、ＤＮＡインターカレート剤（例えば、臭化エチジウム）、または、標識された、あるいはＤＮＡに結合すると信号を発する、他のＤＮＡ結合性実体を用いることによって、増幅産物が検出される。さらに別の例として、増幅産物を検出するために、当業者には既知の、標準的なサザーンブロッティング技術の使用が挙げられる。増幅産物（元のプライマーよりもサイズの大きいＤＮＡセグメント）の検出は、元の生物サンプルの細胞におけるテロメア融合の存在を示す。一つの実施態様によれば、増幅された配列は、検出されたテロメア融合に関する情報をさらに得るために、クローン化し、配列決定することが可能である。
【００３４】
分析のために選ばれる組織は、哺乳類組織であればいずれのものであってもよく、一つの実施態様では、ヒトのものであればどの組織であってもよい。一つの実施態様では、組織は、ヒトから回収したバイオプシーサンプルを表し、一つの実施態様では、サンプルは、ヒト女性の乳房組織である。一つの実施態様では、核酸配列が、先ず、生物サンプルの細胞から単離される。さらに詳細には、全体ＤＮＡを含むＤＮＡが、または一つの実施態様では、ゲノムＤＮＡが、細胞から単離される。次に、この単離されたＤＮＡは、テロメア特異的ＰＣＲプライマーに接触させられ、ＰＣＲ増幅反応が実行される。別の実施態様では、ＰＣＲ反応を、生物組織サンプルの薄切切片において、ｉｎ  ｓｉｔｕにて実行することも可能である。ｉｎ  ｓｉｔｕ反応は、組織サンプルの細胞におけるテロメア融合の程度を示すという利点を提供するので、予後情報を与えるばかりでなく、治療戦略を定めるのにも役立つ可能性がある。
【００３５】
実施例３に記載されるように、本開示は、既知のパーセントのテロメア融合を含む細胞から単離されたＤＮＡ中に存在する、テロメア−テロメア融合を特異的に増幅するために、ＰＣＲに基づく方法論の使用が可能であることを実証した。これらのテロメア融合ＰＣＲ産物をクローン化し、配列決定して、融合接合部配列におけるＤＮＡ配列を求めた。表１は、ＢＪ包皮線維芽細胞（ＢＪ  ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７細胞）から単離された融合接合部配列を表し、一方、表２および３は、ヒト乳房腫瘍組織から単離された融合接合部配列を表す。表２は、クラスＩ乳房腫瘍組織の融合接合部から得られた融合配列を表しており、融合接合部配列は、単一の、既知の脆弱部位と関連する。表３は、クラスＩＩ乳房腫瘍組織融合接合部から得られた融合配列を表しており、融合接合部配列は、それぞれが、独立の既知の脆弱部位と関連する、２個の配列領域（ＡとＢ）を表す。
【００３６】
表１、２、および３に開示されるテロメア融合は、自然のままの核酸配列同士の独特の組み合わせを表す。従って、これらの配列に対して特異的な核酸プローブは、細胞におけるテロメア融合の存在を検出するためのマーカーとして有用である可能性がある。一つの実施態様によれば、テロメア融合産物を検出するための組成物であって、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、および配列番号５８から成るグループから選ばれる、標識核酸配列を含む組成物が提供される。一つの実施態様によれば、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７、および配列番号５８から成るグループから選ばれる、２個以上の核酸配列を含む組成物が、そのような配列（または、その相補配列）の細胞集団における存在を検出するためのプローブとして使用される。患者から回収した生物サンプルにおける、配列番号２２−３９の内の１個以上の配列の検出は、癌細胞または前癌細胞の存在に対する診断をもたらすことが期待される。
【００３７】
〔表１〕
2008537475.tif 000003
2008537475.tif 000004
【００３８】
〔表２〕
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【００３９】
〔表３〕
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【００４０】
本開示のもう一つの態様は、ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）、乳房腫瘍由来細胞系統、および乳房腫瘍組織を不死化することによって、テロメア結合タンパクＴＲＦ２の目覚しい発現上昇（約２５倍）が実現される、という発見に向けられる（図２Ｄ、３Ａ、および３Ｂ）。ＴＲＦ２は、テロメアＤＮＡに直接結合し、ｔ−ループ接合部に局在する、決定的に重要なテロメアキャッピングタンパクである（Griffith et al., (1999) Cell 97:503-14）。
【００４１】
活発に増殖する有限寿命を持つＨＭＥＣ系統、および不死化されたＨＭＥＣ系統から採取したタンパク分解物（図１Ａ参照）を、テロメア関連タンパクＴＲＦ２、ＴＩＮ２、ｈＲＡＰ１、およびＴＲＦ１の発現について調べた。ＴＲＦ２に対する特異的モノクロナール抗体をプローブとして全体細胞タンパクの免疫ブロットを行ったところ、４種の独立に得られた不死化ＨＭＥＣ系統（１８４Ａ１、１８４ＡＡ２、１８４ＡＡ３、および１８４ＡＡ４）が、それらの前駆体で、発癌物質処理した寿命延長株である、１８４Ａａに比べ、著明に高レベルの６５／６９ｋＤ  ＴＲＦ２の二重体を示すことが明らかにされた。独立の、発癌物質処理延長寿命系統株１８４Ｂｅから得られた、５番目の不死化ＨＭＥＣ系統１８４Ｂ５も、同じパターンを示した。一方、テロメア関連タンパク、Ｔｉｎ２、ｈＲａｐ１、およびＴＲＦ１のレベルは、同じ培養体においてほとんど差を示さなかった。
【００４２】
ＴＲＦ２  ｍＲＮＡのレベルは、初代ＨＭＥＣおよび不死化ＨＭＥＣの両方において比較的類似のレベルに維持されていたが、転写後レベルでは、ＴＲＦ２の発現上昇が見られた。目覚しいＴＲＦ２発現上昇（２５倍以上）は、試験した腫瘍由来細胞系統のうちの６７％（合計２４の内の１６）においても見られた。要約すると、本試験で報告される結果は、不死化ＨＭＥＣ、腫瘍由来細胞系統の大多数（２４の内の１７）、および乳房腫瘍組織において、目覚しいＴＲＦ２レベルの発現上昇が見られることを示す。ＴＲＦ２の発現上昇は、テロメア危機の早期事象を克服するための補償機構の可能性を示すと考えられるので、これは、テロメアの機能不全が、ヒト乳癌において起こる可能性のあることを示す最初の証拠である。従って、乳房組織におけるＴＲＦ２の発現上昇を検出する方法は、癌の早期検出のためには重要な臨床的応用を有する。従って、本発明のさらに別の実施態様は、組織サンプルの細胞におけるＴＲＦ２の、正常細胞と比べた場合の有意な上昇を検出する方法であって、該組織サンプルにおいて癌細胞および前癌細胞の存在のための診断アッセイを実現する方法に関する。
【００４３】
一般の乳房腫瘍細胞系統のＴＲＦ２レベルを、有限寿命のＨＭＥＣのレベルと比較することによって、ＴＲＦ２レベルの上昇とガンの間の相関が明らかになった。ランダムに細胞周期を繰り返す細胞からタンパク分解物を調製し、実施例１に記載する通りの免疫ブロット法によって分析した。調べた１５系統の内１１系統において、コントロールの１８４個の細胞に比べ、乳房腫瘍細胞系統において、ＴＲＦ２レベルが、少なくとも２倍高いことが判明した。これは、ＴＲＦ２レベルの上昇が、乳房腫瘍細胞系統において高頻度に見られる事象であることを示す（図２参照）。
【００４４】
一つの実施態様では、患者の組織においてＴＲＫ２の異常発現を検出する方法が提供される。本方法は、ＴＲＫ２に特異的に結合する標識リガンド（例えば、ＴＲＫ２特異的抗体）に、患者の組織のタンパクを接触させること、次に、患者の組織において検出されたＴＲＫ２タンパクの相対的なレベルを、「正常細胞」を表すコントロールサンプルのＴＲＫ２タンパクのレベルと比較すること、を含む。患者組織のタンパクは、組織の薄切切片を用いてｉｎ  ｓｉｔｕにて接触させてもよいし、あるいは、タンパクを先ず細胞から単離し、次に接触させてもよい（例えば、ウェスタンブロット分析によって）。コントロールサンプルとは、患者から採取した第２サンプルから単離した正常細胞であってもよいし、あるいは、別の個人から入手したサンプル（または、複数サンプルの混合物）であってもよい。さらに詳細には、一つの実施態様によれば、試験組織およびコントロール組織の両方とも、類似の供給源から採取される。一つの実施態様では、組織は、ヒトの女性の乳房組織である。一つの実施態様では、試験サンプルにおいて検出されるＴＲＫ２の量は、診断を定めるために、正常組織において検出されるＴＲＫ２レベルと比較される。それとは別に、試験サンプルにおいて検出されるＴＲＫ２の量は、診断を定めるために、既知の、癌および前癌組織サンプルにおいて検出されるＴＲＫ２レベルと比較される。もう一つの実施態様では、試験サンプルにおいて検出されるＴＲＫ２の量は、診断を下す前に、正常および癌細胞におけるＴＲＫ２レベルと比較される。一つの実施態様では、比較は、ＴＲＫ２に対して特異的な抗体による標準的な免疫アッセイ技術を用いて行われる。一つの実施態様では、比較は、ウェスタンブロット分析によって行われる。試験サンプルにおいて、ＴＲＫ２タンパクのレベルがコントロールサンプルの細胞に対して統計的に有意に高い場合、それは、癌または前癌状態であることを示す。
【００４５】
本出願人等はさらに、癌または前癌細胞は、ＴＲＦ２の細胞内局在においても変化を見せることを観察した。不死化ＨＭＥＣ、およびＴＲＦ２レベルの上昇を見せる腫瘍由来細胞系統について免疫蛍光実験を行ったところ、ＴＲＦ２は、初代細胞に見られる、正常なテロメアの点状パターンと違って、核全体に渡って認められることが示された。組織におけるテロメアタンパクの、免疫蛍光による共局在実験は下記のようにして行った。細胞を、４−ウェルチェンバースライドの上で育成し、４％ホルマリンで固定した。スライドをＴＲＦ２およびＴＩＮ２特異的抗体と５μｇ／ｍｌの濃度でインキュベートし、次に、ＴＲＦ２に対するテキサスレッド結合抗マウスＩｇＧ（赤）、およびＴＩＮ２に対するＦＩＴＣ結合抗ウサギＩｇＧ抗体（緑）とインキュベートした。重ね合わせ画像において、ＤＮＡをＤＡＰＩ（青）で染色した。染色された細胞は、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＢＸ５１落射蛍光顕微鏡を用いて可視化した。免疫蛍光の共局在を調べたところ、ＴＲＦ２染色部の重要部分（緑）は、Ｔｉｎ２染色部（赤）と同じ場所に共局在し、正常テロメアタンパク染色において典型的に見られる、黄色の点状染色パターンを形成することが示された。組織におけるほとんど全てのＴｉｎ２染色が、典型的なテロメア点状パターンを形成した。さらに、侵襲性細胞の大多数が、テロメアに局在しない、特異的なＴＲＦ２の染色を示したが、これはＴＲＦ２がＴｉｎ２と共存しないためである。従って、これらの実験におけるＴＲＦ２およびＴｉｎ２染色はきわめて特異的であった。
【００４６】
従って、本発明の一つの態様は、正常細胞と比較した場合の、組織サンプルの細胞中に存在するＴＲＦ２の分布に基づく、癌細胞および前癌細胞の診断方法に向けられる。一つの実施態様では、細胞は、患者の組織（例えば、乳房組織）から単離され、一つの実施態様では、細胞が、患者のバイオプシーサンプルから単離される。一つの実施態様では、免疫アッセイが、バイオプシーサンプルから調製された組織の薄切切片において行われ、正常な乳房組織の切片において得られた染色と比較される。
【００４７】
本開示の一つの実施態様はまた、ＴＲＦ２に特異的に結合する抗体にも向けられる。一つの実施態様では、抗体は、ＴＲＦ２のリン酸化形態に対し特異的である。さらに別の実施態様では、抗体はモノクロナール抗体である。
【００４８】
本開示に使用される抗体またはプローブは、いずれも、検出可能な信号を生成する「レポーター分子」によって標識されることが考えられる。そのような標識として、例えば、蛍光システム、酵素システム（例えば、ＥＬＩＳＡや、酵素による組織化学アッセイ）、放射性システム、および発光システムが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。本発明は、何か特定の検出システムまたは標識に限定されることを意図するものではない。
【００４９】
もう一つの実施態様では、本開示のテロメア特異的ＰＣＲ増幅反応を実行するためのキットが提供される。このキットは、生物サンプルに存在するテロメア融合を検出、分析するために使用できる。一つの実施態様によれば、本キットは、テロメア融合配列に特異的に結合し、増幅するＰＣＲプライマーを含む。本キットはさらに、ＰＣＲ増幅を実行するための、案内資料、補足試薬、および、ディスポーザブル実験用品を備えてもよい。
【００５０】
一つの実施態様によれば、テロメア特異的ＰＣＲプライマーは、配列ＴＴＡＧＧＧ（配列番号１９）、または、その複数、例えば、（ＴＴＡＧＧＧ）３（配列番号２０）を含む。さらに別の実施態様では、ＰＣＲプライマーは、配列（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ（配列番号１９、配列番号４２、および配列番号２０）、および、（ＴＴＡＧＧＧ）ｎ配列の５′末端に結合する制限酵素認識配列を含む。なお前式において、ｎは、１から３の範囲から選ばれる整数である。一つの実施態様では、ＰＣＲプライマーは、一般式Ｘ−Ｙ−（Ｚ）ｎで表される配列を含む。前式において、Ｘは配列ＧＧＧＮＮＮ（配列番号４４）を表し、Ｙは、制限酵素認識配列を表し、Ｚは、配列番号１９の配列を表し、かつ、ｎは、１−６の範囲から選ばれる整数であるか、または、もう一つの実施態様では、ｎは、１−３の範囲から選ばれる整数である。一つの実施態様では、キットは、配列番号２１から成るＰＣＲプライマーを備える。
【００５１】
本キットの試薬は、バッファーおよび／またはポリメラーゼ酵素を含んでもよい。一つの実施態様では、本キットは、熱安定性ポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼを含んでもよい。もう一つの実施態様では、本キットに備えられるＰＣＲプライマーは標識されるか、あるいは、ＰＣＲプライマーを標識するか、または、反応の増幅産物を検出するための、試薬が備えられる。検出試薬としては、例えば、テロメア特異的配列、例えば、配列番号１９の配列に結合する、ＤＮＡ結合性色素および標識プローブが挙げられる。核酸およびその他の試薬は、各種の容器、例えば、バイアル、チューブ、瓶等に包装されてよい。他の試薬、例えば、陽性コントロールサンプル、陰性コントロールサンプル、バッファー等が、別々の容器に入れられてキットに備えられてもよい。
【実施例】
【００５２】
〔実施例１〕
＜不死化ＨＭＥＣ系統は、ＴＲＦ２タンパクの発現上昇を示す＞
ランダムに細胞周期を繰り返すＨＭＥＣの準集密化した培養体から、２Ｘ  ＳＤＳサンプルバッファーで細胞を溶解することによって、全細胞分解物を調製した。５０μｇのタンパクサンプルを、ポリアクリルアミド勾配ゲル上に展開分離し、ナイロン膜上にエレクトロブロットし、ＴＲＦ２に対する抗体（ＩＭＧ−１２４；Imgenex、サンディエゴ、カリフォルニア州、もしくは、ＳＣ−９１４３；Santa Cruz Biotech.，サンタクルス、カリフォルニア州）、または、ＴＩＮ２に対する抗体（J.Campisi，ＬＢＮＬの恵与による）をプローブとして用いて調べた。ゲル負荷の等価性およびブロット効率は、ブロットを、Ｐｏｎｃｅａｕ  Ｓ（Helena Labs，バーモント、テキサス州）で染色することによって、および／または、ベータアクチンに対する抗体をプローブとして用いることによって求めた。１８４Ａ１細胞を、早期の、転換前継代において採取した。この段階では、低度の、または無視できるほどのテロメラーゼ活性しか認められない。全細胞タンパクの免疫ブロットを、ＴＲＦ２抗体をプローブとして用いて調べたところ、４種の、独立して得られた不死化ＨＭＥＣ系統（１８４Ａ１，１８４ＡＡ２，１８４ＡＡ３，および１８４ＡＡ４）において、それらの前駆体で、発癌物質処理した延長寿命株である１８４Ａａと比べ、６５／６９ｋＤ  ＴＲＦ２二重体のレベルが著明に増加することが示された。
【００５３】
免疫ブロットはさらに、有限寿命・選択後１８４および発癌物質処理・寿命延長株１８４Ａａ  ＨＭＥＣに比べ、成長停止（Ｇ０）期を始め、活発に細胞周期を繰り返す不死化系統１８４Ａ１においてもＴＲＦ２タンパクが発現上昇されることを示した。１８４Ａ１  １４ｐ細胞は、転換前の細胞型であって、よく増殖し、一方、１８４Ａ１  １９ｐ細胞は、転換過程を開始しており、増殖は低調である。細胞は、記載されるように（Stampfer et al.,(1993). Exp.Cell Res., 208, 175-188）、増殖を停止した。テロメア関連タンパクＴＩＮ２およびＲＡＰ１の相対的レベルを、抗ｈＲＡＰ（ＩＭＧ−２７２；Imgenex）抗体、または、抗ＴＩＮ２抗体を用いて分析した。さらに、２種の、有限寿命・選択後ＨＭＥＣ（１８４および１６１）、２種の、発癌物質処理・寿命延長株ＨＭＥＣ（１８４Ｂｅおよび１８４Ａａ）、および、１種の、完全不死化ＨＭＥＣ（１８４Ａ１）、ならびに、２種の、ヒト乳房腫瘍細胞系統（ＭＤＡ４６８およびＴ４７Ｄ）、のそれぞれについて免疫ブロットを行い、ＴＲＦ２タンパクの相対レベルの比較を行った。ＴＲＦ２は、比較的長く暴露すると、寿命延長培養体の細胞分解物からも検出が可能であった。
【００５４】
既述の通りに（Nijjar et al.,(1999),Cancer Res.,59,5112-5118）、サンプル当たり１０μｇの全体ＲＮＡを用いてノーザンブロットを調製した。このブロットを、３２Ｐで標識した、１２００−ｂｐ  ＥｃｏＲＩ：ＸｈｏＩ  ＴＲＦ２  ｃＤＮＡプローブに対してハイブリダイズさせた。ＴＲＦ２信号を、リン酸画像記録装置を用いて測定し、ＴＲＦ２−特異的信号の定量的比較を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアプログラムを用いて行った。主要ＴＲＦ２転写体の信号強度を、臭化エチジウム染色１８Ｓ  ｒＲＮＡの信号強度で割った比を測定した。前述のＨＭＥＣを始め、３種のヒト乳房腫瘍細胞系統（ＭＤＡ４３６，ＭＤＡ４６８、およびＨｓ５７８Ｔ）におけるＴＲＦ２  ｍＲＮＡの相対的レベルを比較するノーザンブロットを行った。このノーザンブロットデータから、ＴＲＦ２  ｍＲＮＡレベルは、初代ＨＭＥＣと不死化ＨＭＥＣの両方において比較的同一レベルに留まるのに対し、転写後レベルにおいては、ＴＲＦ２の発現上昇が起こることが示された。
【００５５】
試験した腫瘍由来細胞系統の６７％（合計２４の内の１６）においても、目覚しいＴＲＦ２発現上昇（２５倍以上の増加）が見られた。要約すると、本開示に報告される結果から、不死化ＨＭＥＣ、および腫瘍由来細胞系統の大部分（２４の内の１７）において、ＴＲＦ２レベルの目覚しい発現上昇のあることが示される。さらに、ＴＲＦ２レベルは、乳房腫瘍由来細胞系統においても高いことが観察された。乳房腫瘍由来細胞系統から単離されたタンパクサンプルを、腫瘍由来細胞系統に関して前述したのと同様に、免疫ブロットによって分析した。免疫ブロットデータの定量化を図２に示す。ＴＲＦ２バンドの信号強度を、コントロールバンドのもので割り、１８４のレベルに対する相対値としてプロットした。
【００５６】
〔実施例２〕
＜ヒトの不死化転換・乳房腫瘍由来細胞における、テロメア関連タンパクＴＲＦ２の蓄積および局在変化＞
テロメア、すなわち、真核細胞染色体の末端にキャップとして被さる核タンパク構造は、染色体の完全性維持になくてはならないものである。ＴＴＡＧＧＧ（配列番号１９）から構成されるＤＮＡ繰り返し配列は、タンパク複合体と結合し、これらの特殊構造が、核外の攻撃および融合から染色体末端を保護する。テロメアＤＮＡを維持する特別な酵素であるテロメラーゼの不存在下では、「末端複製問題」のため、テロメアは、連続的細胞分裂に伴って侵食される。テロメアの侵食が臨界に達すると、続いて起こるテロメアの機能不全がゲノム不安定性を引き起こし、これが、増殖抑制または細胞死を招く。正常な状況下では、ヒト細胞におけるテロメラーゼ抑制によって与えられる有限な寿命が、単一細胞系統に蓄積する突然変異数を制限し、腫瘍発生に対する厳しい障壁となる。
【００５７】
テロメア繰り返し配列に対する、ＴＲＦ１およびＴＲＦ２タンパク、並びにそれらと相互作用を持つパートナーの結合は、直線的な染色体末端を、Ｇ鎖がテロメアの２本鎖部分に侵入する、保護的なｔ−ループ構造へと再構成すると考えられている。３′オーバーハング近くでのＴＲＦ２結合は、ｔ−ループの形成と安定性にとって不可欠と考えられている。ＴＲＦ２の優勢陰性形の過剰発現による、ＴＲＦ２機能の干渉は、テロメアの機能不全、ゲノム不安定性、および、老化に特有の特徴を伴う、活発な増殖の停止をもたらす。一方、人工的に過剰発現されたＴＲＦ２が、老化を遅らせることが報告されている。
【００５８】
正常乳房組織から単離培養されたＨＭＥＣは、有限な寿命、低いか、検出不能のテロメア活性、および、継代と共に進むテロメア長の減少を示す（Stampfer & Yaswen, (2003) Cancer Lett, 194, 199-208）。ＨＭＥＣは、最初のＲＢ−介在の、ｐ１６発現低下を伴うテロメア長非依存性の増殖停止（静止期）を自発的に克服することがある。このとき得られるｐ５３（＋）・ｐ１６（−）選択後ＨＭＥＣは、その末端制限断片（ＴＲＦ）の平均長が約５ｋｂになると、正味の増殖を止める。細胞がこの第２の増殖障壁に近づくと、テロメアの機能不全が、広範な染色体異常、特に、テロメア融合、および分裂欠陥の存在によって裏付けられる。ｐ５３（＋）培養体では、大抵の細胞が、生きながら細胞周期の全ての相において停止する、アゴネサンス（agonescence）と呼ばれる増殖停止を続ける。ｐ５３が不活性化されると、集団は、危機に典型的な集団細胞死を示す。稀なｐ５３（＋）およびｐ５３（−）の不死化されたＨＭＥＣ細胞系統が、化学的発癌物質に対する暴露、ｃ−ｍｙｃまたはＺＮＦ２１７発癌遺伝子の過剰発現、および／または、優勢陰性ｐ５３遺伝子抑制要素ＧＳＥ２２出現、のそれぞれの後に得られていた（図１Ａ）。驚くべきことに、新規の不死化ｐ５３（＋）細胞系統は、最初、極めて低いかまたは検出不能なテロメラーゼ活性しか示さなかったが、分裂し続け、その間、平均ＴＲＦ長の短縮は次第に増した。平均ＴＲＦ長が極端に短くなると（＜３ｋｂ）、増殖は遅くなり、不均一になる。続いて、転換と呼ばれる長期の過程が起こり、その間に、テロメラーゼ活性および増殖能力は徐々に増す。これに対して、新規の不死化ｐ５３（−）細胞系統は、速やかにテロメラーゼ活性を示す（Stampfer & Yaswen,(2003) Cancer Lett, 194, 199-208）。
【００５９】
最近の研究によって、ｐ５３は、新規の不死化された細胞系統において、テロメラーゼの触媒サブユニットである、内因性ｈＴＥＲＴの発現を抑制することが可能であることが示された。この抑制は、転換過程の間に解除される。テロメラーゼ活性は、転換が起きるまで極めて低いレベルに留まったままであるが、この低い活性が、アゴネサンス状態にある細胞と違って、新規の不死化ｐ５３（＋）系統が、大きな染色体不安定性を示すこともなく分裂し続けるという所見の原因となっている可能性がある。
【００６０】
＜ＴＲＦ２タンパクレベルは、不死化転換ＨＭＥＣにおいて大きな増加を見る＞
活発に増殖する、有限寿命ＨＭＥＣ系統および不死化されたＨＭＥＣ系統から採取されたタンパク分解物を、テロメラーゼ関連タンパク、ＴＲＦ２、ＴＩＮ２、ｈＲＡＰ１、およびＴＲＦ１の発現について調べた。１８４Ａ１＊に附記されるアステリスクは、これらの細胞が、低いか無視できるテロメラーゼ活性しか示さない、早期の、転換前継代において採取されたものであることを示す。ＴＲＦ２に対して特異的なモノクロナール抗体をプローブとして、全細胞タンパクの免疫ブロットを行ったところ、４種の、独立に得られた不死化ＨＭＥＣ系統（１８４Ａ１，１８４ＡＡ２，１８４ＡＡ３、および１８４ＡＡ４）は、それらの前駆体で、発癌物質処理した寿命延長株である１８４Ａａと比べると、６５／６９ｋＤ  ＴＲＦ２二重体レベルの著明な上昇を示した（図１Ｂ）。独立した、発癌物質処理・寿命延長株１８４Ｂｅから得られた、５番目の不死化ＨＭＥＣ系統１８４Ｂ５も同じパターンを示した。一方、テロメラーゼ関連タンパク、Ｔｉｎ２、ｈＲａｐ１、およびＴＲＦ１のレベルは、同じ培養体においてほとんど差を示さなかった。不死化系統において観察されるＴＲＦ２タンパクの正規化レベルは、１８４Ａａ前駆体株におけるレベルに対し１０−１５倍の範囲にあった。
【００６１】
興味あることに、低いかまたは検出不能のテロメラーゼ活性しか持たない、新規の、不死化された転換前の１８４Ａ１系統は、中間レベルのＴＲＦ２タンパクを示した。細胞が、活発に細胞周期を繰り返しているか、または、ＥＧＦＲ情報伝達系の遮断によってＧ０で停止されているかとは無関係に、ＴＲＦ２は、不死化された細胞においてより高かった。ＴＲＦ２タンパクのレベルは、独立に得られた、有限寿命株１８４および１６１において、また、延長寿命株１８４Ｂｅおよび１８４Ａａにおいても、ほぼ等価であった。もう一つのＴＲＦ２ポリクロナール抗体も同じ結果をもたらした。
【００６２】
放射線被爆およびエトポシドによって誘発されるＤＮＡ傷害は、ヒトの骨髄前駆細胞ＨＬ６０細胞において、ＴＲＦ２  ｍＲＮＡの一過性の蓄積を誘発することが報告されている。不死化ＨＭＥＣにおいて観察されたＴＲＦ２タンパクレベルの増加が、ＴＲＦ２転写レベルの増加と相関するかどうかを決めるために、増殖するＨＭＥＣ培養体から得られた全体ＲＮＡに対しノーザンブロット分析を行った。ＴＲＦ２タンパクレベルで検出された大きな相違とは違って、ＴＲＦ２  ｍＲＮＡレベルにおける差はかなり小さく、タンパクレベルにおける差と相関しなかった。ｍＲＮＡ差とタンパク差との間に一致が見られなかったことは、ＴＲＦ２タンパク量の転写後調節における変動が、有限寿命ＨＭＥＣと不死化ＨＭＥＣの間に存在することが示唆される。シクロヘキサミドを用いて新たなタンパク合成を抑制したところ、ＴＲＦ２タンパクの半減期は、有限寿命１８４ＨＭＥＣと、完全不死化１８４Ａ１ＨＭＥＣの両方において１２時間よりも長いことが示された。この実験は、タンパクの安定性に差があることを排除しないものの、ＴＲＦ２のレベルは、正常な条件下においても、急速な代謝回転によって調節されているわけではないことを示した。従って、ＴＲＦ２タンパクの蓄積の差は、単純な安定性の差とは考えにくく、合成、修飾、および／または、区画化の変化による可能性がより高いと考えられる。
【００６３】
＜不死化因子またはテロメア機能不全それ自体は直接ＴＲＦ２レベルに影響しない＞
不死化因子による処理それ自体が、ＴＲＦ２の発現上昇を引き起こすのに十分であるかどうかを決めるために、下記の実験を行った。４種の異なる不死化剤（化学的発癌物質であるベンゾ（ア）ピレン、ｐ５３機能の優勢陰性阻害剤であるＧＳＥ２２［Ossovskaya et al.,(1996),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,10309-10314］、ｃ−ｍｙｃ発癌遺伝子、またはＺＮＦ２１７発癌遺伝子の、レトロウィルスによる導入）によって処理した有限寿命細胞を、これらの薬剤に対する暴露後の培養体から得られた不死化細胞系統と比較した。１８４ＨＭＥＣ、発癌物質処理・寿命延長株１８４ＡａＨＭＥＣ、および不死化ＨＭＥＣについて、優勢陰性ｐ５３遺伝子抑制要素（ＧＳＥ−２２）、発癌遺伝子ｃ−ｍｙｃ、または発癌遺伝子ＺＮＦ２１７による形質導入を行い、選択後における全ＴＲＦ２タンパクを定量するために、免疫ブロットを行った。
【００６４】
全てのケースにおいて、暴露されない有限寿命ＨＭＥＣにおいて見られる低レベルのＴＲＦ２発現は、上記不死化薬剤に暴露された、有限寿命培養体でも著明に増加しなかった。一方、不死化された細胞系統では、ＴＲＦ２タンパクレベルは増加した。ＴＲＦ２レベルはまた、アゴネサンスに達した培養体では著明に増加しなかった。アゴネサンスは、テロメア機能不全、末端対末端癒合、およびゲノム不安定性と関連するので、この結果は、ＨＭＥＣにおけるＴＲＦ２タンパクレベルは、テロメア機能不全のみに反応して安定に上昇するものではないことを示す。
【００６５】
＜外部から導入されたｈＴＥＲＴの発現は、ＴＲＦ２レベルの増加をもたらさない＞
不死化１８４Ａ１系統において、完全な不死への転換の際に、内因性ｈＴＥＲＴの発現、およびテロメラーゼ活性が、ゆっくりと増すことが示された（Stampfer et al. (2003) Oncogene, 22, 5238-5251）。外因性ｈＴＥＲＴを、選択後の有限寿命１８４ＨＭＥＣ、または不死化１８４Ａ１ＨＭＥＣの中に形質導入すると（転換の前、最中、および後）、テロメア活性の急激な上昇、テロメア伸長、および不死化された寿命の獲得がもたらされた（Stampfer et al.,(2001) Natl.Acad.Sci.USA., 98, 4498-4503）。ＴＲＦ２発現の増加が、ｈＴＥＲＴ発現の結果かどうかを直接決めるために、ｈＴＥＲＴを形質導入した１８４および１８４Ａ１培養体を、ＴＲＦ２発現について定量した。ＴＲＦ２レベルは、ｈＴＥＲＴ形質導入によって不死化された１８４ＨＭＥＣでは上昇しなかった。ＴＲＦ２レベルはまた、転換前にｈＴＥＲＴを形質導入させた（これは、転換に関連する、遅く不均一な成長相を回避するための操作である）継代早期の１８４Ａ１系統でも、低いままであった。転換中または、完全に不死化された表現型となるまで転換した後にｈＴＥＲＴを形質導入した１８４Ａ１細胞におけるＴＲＦ２レベルは、形質導入時のレベルと一致し、添加したｈＴＥＲＴの存在によって影響されないように見えた。従って、外部から導入されたｈＴＥＲＴの過剰発現は、ＴＲＦ２タンパクのレベルに影響を与えなかった。
【００６６】
＜ＴＲＦ２レベルは、多くの乳房腫瘍由来細胞系統において上昇する＞
ＴＲＦ２上昇の関与をヒト乳癌と相関させるために、一般的な乳房腫瘍細胞系統におけるＴＲＦ２レベルを、有限寿命ＨＭＥＣにおけるレベルと比較した（図２）。ランダムに細胞周期を繰り返す細胞からタンパク分解物を調製し、免疫ブロット法によって分析した。ＴＲＦ２レベルは、乳房腫瘍細胞系統の方が、調べた１５系統の内１１系統において、コントロール１８４細胞よりも少なくとも２倍高いことが判明した。これは、ＴＲＦ２レベルの上昇が、乳房腫瘍細胞系統において頻発する事象であることを示す。これらの腫瘍細胞系統におけるＴＲＦ２タンパクのレベルは、同じ細胞系統から得られたｍＲＮＡの相対的レベルと相関しなかった。
【００６７】
＜外部から導入されたＴＲＦ２は、選択後ＨＭＥＣの増殖寿命に影響を及ぼす＞
ＴＲＦ２は、ヒトの２倍体線維芽細胞において人工的に過剰発現させると、ＡＴＭキナーゼに結合し、細胞反応を抑えてゲノム全体に広がるＤＮＡ傷害をもたらすことが報告されている（Karlseder et al., (2004) PLos Biol, 2, E240）。選択後ＨＭＥＣの増殖および不死化に対する、ＴＲＦ２発現上昇の結果を直接求めるために、ＣＭＶプロモータの調節下にあるＴＲＦ２遺伝子のさらに新たなコピーを、レトロウィルスを使って、単独で、または、優勢陰性ｐ５３要素であるＧＳＥ２２と共に、１８４ＨＭＥＣに導入した。
【００６８】
ＴＲＦ２をレトロウィルスベクターｐＢａｂｅ（Morgenstern & Land, (1990) Nucl. Acids Res., 18, 3587-3596）にサブクローン化してＬＴＲ駆動発現をさせるため、全オープンリーディングフレームを含む１５００ｂｐのｃＤＮＡを、ｐＬＰＣ．ＴＲＦ２ベクターからＢａｍＨＩ：ＥｃｏＲＩによって切り出し、ｐＢａｂｅ．ＰｕのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位の中にサブクローン化した。他のレトロウィルスの由来も既に記載されている。選択後の１８４ＨＭＥＣに対して、ＴＲＦ２、または空のベクター（ＣＯＮ）をコードするレトロウィルスを、それぞれ、それ単独で、またはｐ５３機能の優勢陰性抑制因子（ＧＳＥ）を含むレトロウィルスと共に形質導入し、０．５μｇ／ｍｌのプロマイシンにて選択した。形質導入細胞を、選択薬剤の存在下に集密状態となるまで育成し、６０ｍｍ皿当たり１ｘ１０５の固定密度で三倍に再プレートした。各継代培養体において採取された細胞の全数を計算し、継代当たりの累積集団倍加数（ＰＤ）を、方程式  ＰＤ＝（Ａ／Ｂ）／ｌｏｇ２を用いて求めた。前式においてＡは、採取された細胞数で、Ｂは、プレートした細胞数で、プレート効率について補正はしなかった。実験は、培養体が３週間以内に集密状態を実現することができなくなった時点で停止した。各実験は３回繰り返し、各例について、一つの実験から得られた代表的データを示す。
【００６９】
ＴＲＦ２タンパクの高い発現レベルが免疫ブロット法によって確かめられた。アゴネサンス前の、累積集団倍加（ＰＤ）の数は、コントロールと比較すると、ＴＲＦ２を形質導入した選択後１８４において僅かに増加した（図３Ａ）。これは、ヒトの２倍体線維芽細胞について以前に報告された結果（Karlseder et al., 2002, Science, 295, 2446-9）とよく似ている。同様の結果が、もう一つのベクターを用いても得られた。このベクターでは、不死化された細胞系統において観察される内在性のレベルとより一致した、比較的低いＴＲＦ２レベルを実現するために、ＴＲＦ２の発現は、ＣＭＶプロモータの代わりにレトロウィルスのＬＴＲによって駆動されている。
【００７０】
ＴＲＦ２は、保護的ｔ−ループ構造の必要不可欠な安定化成分であるから、ＴＲＦ２の発現上昇は、テロメアが比較的に短い場合に、安定性を増加させる可能性がある。過剰に発現したＴＲＦ２は、テロメア末端にさらに新たな保護を加えることによってテロメア機能不全を先延ばしする可能性がある（すなわち、テロメア機能不全、およびｐ５３−依存性増殖停止の信号をもたらすのに、さらに新たな侵食が必要になる可能性がある）。一方、ＴＲＦ２の、１８４−ＧＳＥ２２細胞に対する形質導入は、得られた累積ＰＤ数に影響を及ぼさなかった（図３Ｂ）。ＴＲＦ２の過剰発現が、ｐ５３を冒された細胞における累積ＰＤをさらに増すことができないというこの現象は、線維芽細胞でも報告されている（Karlseder et al., 2002) Science, 295, 2446-9。このデータは、ＴＲＦ２の過剰発現によって与えられるテロメア保護の増大は、短命であり、最終的に危機をもたらすｐ５３−依存性事象を妨げないことを示唆する。
【００７１】
＜ＴＲＦ２の局在は、不死化ＨＭＥＣおよび乳房腫瘍細胞系統において異常である＞
抗ＴＲＦ２抗体を用いた間接免疫蛍光実験によって、全ての、間期にある選択後１８４ＨＭＥＣにおいて、ＨｅＬａ細胞において最初に報告されたように、点状の核パターンが見られることが明らかになった。しかしながら、不死化ＨＭＥＣでは、ＴＲＦ２免疫蛍光は、量においても、局在においても均一ではなかった。１８４Ａ１および１８４ＡＡ２の両ＨＭＥＣとも、核のサイズ、およびＴＲＦ２タンパク発現レベルにおいて、なだらかな変化を示した。比較的小さい核を持つ細胞は、有限寿命細胞に認められるものとよく似た、ＴＲＦ２の量および点状分布を示し、該分布においてＴＲＦ２は、Ｔｉｎ２と共局在した。しかし、比較的大きい核を持つ細胞は、それに対応する高レベルのＴＲＦ２を核全体に広く分布させた（ただし、ＴＲＦ２の一部は、Ｔｉｎ２との共局在を保持していた）。中間の特徴を持つ、小から大へなだらかに変化する細胞も観察された。Ｔｉｎ２のレベルおよび局在は、核のサイズによらず、またはＴＲＦ２レベルおよび局在における差によらず、有限寿命ＨＭＥＣおよび不死化ＨＭＥＣの間で近似していた。免疫ブロットにおいて高レベルのＴＲＦ２を持つ、腫瘍細胞系統Ｔ７４ＤおよびＢＴ４７４では、ほぼ全ての細胞において、ＴＲＦ２は、核全体に均一に分散していた。これは、細胞周期状態に対する依存性の欠如を示す。免疫ブロットにおいて低レベルのＴＲＦ２を示す、上記と対照的な腫瘍細胞系統ＭＤＡ４３５は、有限寿命ＨＭＥＣに典型的に見られる点状パターンのＴＲＦ２を示した。上記実験に使用されたＴＲＦ２抗体は、共にほぼ同じ結果を与えた。
【００７２】
＜ＴＲＦ２タンパク量は、一部の異常乳房組織において増加する＞
最初の免疫組織化学的実験は、USF Cancer Center Tissue Core and the Breast Oncology Programによって提供された、薄切され、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された、ヒトの乳房組織を用いて行った。２種の異なる抗ＴＲＦ２モノクロナール抗体調製品を用いて行なった、これらの実験から、ＤＣＩＳおよび侵襲性乳癌のいくつかの領域の上皮細胞核が、明らかに陽性に染まった。これらの切片における、支質および正常な管上皮細胞の染色は目だって弱かった。
【００７３】
不死化ＨＭＥＣにおける内因性ＴＲＦ２の発現上昇をもたらす機構はいまだ不明のままであるが、ｍＲＮＡレベルが影響されないことから、翻訳後修飾および／またはタンパク相互作用の変化が関与していると考えられる。Blackburn（(2000), Nature, 408, 53-56）は、テロメアは、相互に交換可能な二つの状態、すなわち、開放的で接近可能な形態、および閉鎖的で保護された形態、において存在するとするモデルを提案した。ＴＴＡＧＧＧ（配列番号１９）繰り返し配列に対するＴＲＦ２の結合は、閉鎖的保護形態の形成を促進することが、証拠から示唆される。侵食されたテロメアの短縮が臨界に達すると、１本以上の染色体における末端が、ＴＲＦ２と安定に結合するのに十分なＴＴＡＧＧＧ（配列番号１９）の繰り返し配列を欠くため、保護的ｔ−ループ構造の形成が制限され、３′オーバーハングの消失／変性がもたらされる。ＤＮＡ２本鎖切断の認識および修復に与るタンパクが、未保護のテロメア構造の持続的な存在に対する、細胞性反応に参加している可能性がある。通常、そのような構造は、関連する修復経路、例えば、ＤＮＡリガーゼＩＶ−依存性の、未保護テロメアの非相同末端接合、を進むことによって修復される。
【００７４】
ＴＲＦ２は、２本鎖切断の認識および修復に与るいくつかのタンパク、例えば、Ｒａｄ５０−ＭＲＥ１１−ＮＢＳ１複合体やＡＴＭを始め、ＲｅｃＱヘリカーゼであるＷＲＮおよびＢＬＭなどに結合することが報告されている。これらのタンパクは、ＴＲＦ２タンパクと相互作用し、同タンパクを安定化または不安定化することによって、特定のテロメア構造に反応していると考えられる。一方、ある場合には、分子欠陥が中間体の分解を抑制し、ＴＲＦ２タンパクの蓄積をもたらすことも考えられる。それとは別に、不死化への道を経過しつつあるＨＭＥＣにおける分子欠陥が、テロメアの機能不全とは無関係にＴＲＦ２タンパクの発現上昇をもたらすことも考えられる。いくつかの不死化細胞および腫瘍由来細胞における、過剰発現されたＴＲＦ２の核全体に広がって分散した分布は、これらの細胞においては必ずしも全てのＴＲＦ２がテロメアと関連するものではないことを示す。
【００７５】
〔実施例３〕
＜癌の診断マーカーとしてのテロメア融合の使用＞
テロメア機能不全は、早期の乳房病巣に観察されるゲノム不安定性の原因となる、最重要の駆動力の一つである。本出願人によって提案されるように、テロメアキャップは、正常の乳房上皮細胞の内の一部において破壊されていると考えられる。このテロメア機能の消失は、次にテロメア融合をもたらし、その後の細胞周期において、破壊−融合−架橋サイクルを通じてゲノム不安定性を引き起こす。テロメア機能不全は、テロメア関連タンパクレベルの変化、必要不可欠のテロメア関連タンパク同士の相互作用の破壊、テロメア関連タンパク修飾（例えば、リン酸化）の調整欠損、組織特異的テロメアＤＮＡ臨界長の消失、および、テロメア融合の蓄積によって示されるようである。従って、ゲノム完全性の消失は、増殖調節に与る遺伝子（テロメラーゼの触媒成分であるｈＴＥＲＴを含む）の調節不良をもたらし、最終的に腫瘍発生を招く。
【００７６】
最近のいくつかの報告は、テロメア維持の欠陥が、ゲノムの不安定性を誘発し、これが最終的に乳癌およびその他の癌の発症をもたらすとする理論を支持する。しかしながら、現在のところ組織においてテロメア機能不全を検出する方法論に限界があるため、ヒト乳癌（およびその他の癌）におけるテロメア機能不全の程度は未だに直接的には定量されていない。テロメア長は、組織において簡単に定量することが可能であるが、テロメア短縮は必ずしもテロメア機能の喪失を示すことにはならず、かつ、テロメアＤＮＡの短縮無しでもテロメアの機能不全は起こり得る。そこで、本開示は、乳房腫瘍発生時におけるテロメア機能の消失を調べるための試薬および方法を提供する。
【００７７】
現在の方法論の限界を克服し、乳房腫瘍発生時におけるテロメア機能不全の程度を直接定量するために、二つの新規アッセイを開発した。すなわち、１）細胞系統および組織においてテロメア融合を検出するアッセイ、および、２）組織切片においてテロメア関連タンパクの局在を調べるアッセイである。
【００７８】
＜材料および方法＞
［細胞培養体］
以下の実験において、ＢＪ包皮線維芽細胞の二つの系統、すなわち、ＢＪおよびＢＪ  ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７細胞を用いた。ＢＪ細胞は、集団倍加数（ＰＤ）が５０であり、検出可能なレベルのテロメア融合を含まない、初代細胞系統のコントロールとなる。ＢＪ  ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７細胞は、ＰＤが８５で、テロメア融合を持つ細胞を相当数、中期拡散による定量では約３５％も含む。各細胞からゲノムＤＮＡを単離し、ＰＣＲ反応において鋳型として使用するため、４塩基切断制限酵素ＲｓａＩおよびＨｉｎｆＩで消化し、サンプル調製品から非テロメアＤＮＡを除去した。さらに、テロメア融合を含まない（早期の継代）、および、テロメア融合を含む（後期の継代）、有限寿命の、ヒト乳房上皮細胞を用いた。
【００７９】
［ＰＣＲプライマーおよび反応条件］
融合接合部のＰＣＲプライマーの配列は、５’−ＧＧＧＮＮＮＧＡＡＴＴＣ（ＴＴＡＧＧＧ）３−３’（配列番号２１）である。テロメア−テロメア連結の間の融合接合部末端における５′から３′へのＤＮＡ鎖の維持は、この１本のプライマーを用いたＰＣＲによってテロメア−テロメア接合部を増幅することを可能とする筈である（図５参照）。本開示において報告される結果によって、これが実際に起こることが確認され、テロメア融合を含むＢＪ線維芽細胞から特異的産物を増幅する条件が定められた。ＰＣＲ産物のクローニングをやり易くするため、プライマーの５′末端にＥｃｏＲＩ部位を導入した。用いた反応条件は下記の通り：最初の変性（９４℃で２分）、３２−３５サイクル、（９４℃で３０秒、６３℃で１分アニーリング、７２℃で２分）、および、最後の伸長ステップ（７２℃で５分）。
【００８０】
［サザーンブロッティング］
特異的テロメア染色体領域が増幅されているかどうかを決めるために、ＰＣＲ産物を０．８％アガロースゲルで泳動し、Ｈｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜にブロットし、４２℃で２時間［ＴＴＡＧＧＧ］４プローブ（配列番号４３、［ガンマ３２Ｐ］ＡＴＰを用いたキナーゼ反応によって標識）とハイブリダイズさせた。この膜に３時間リン酸スクリーンを暴露し、画像を、リン酸画像記録装置（Amersham）によって検出した。図６に一例を示す。同図において、テロメア産物は、テロメア融合を含むＢＪ線維芽細胞にだけ見られ、テロメア融合を含まない早期継代のＢＪ線維芽細胞には見られない。
【００８１】
［クローニングおよび配列決定］
ＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩで消化し、ＥｃｏＲＩで切断したｐＢｌｕｓｃｒｉｐｔプラスミド中にクローン化した。組み換えプラスミドを、コロニーハイブリダイゼーションによってスクリーニングし、テロメアＤＮＡを特異的に含むクローンを選び出した。挿入断片の配列決定は、自動式ＤＮＡシークェンサー（テロメア融合配列の例については付属の表１を参照）を用いて実行した。
【００８２】
＜乳房腫瘍組織を用いたテロメア融合の検出＞
ＢＪ線維芽細胞で用いたのと同じ方法を用い、融合接合部プライマーによってＰＣＲを実行するため、正常および乳房腫瘍からＤＮＡを単離する。乳房腫瘍組織からテロメア融合を特異的に増幅するためのＰＣＲ条件を開発する。テロメア融合を含む後期継代のＢＪ線維芽細胞、およびＨＭＥＣを、融合を含まない陰性コントロールとしての早期継代細胞と共に、中期拡散を作成するのに使用され、全体細胞が、融合テロメア−テロメア連結染色体接合部のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ増幅を実行するために、チェンバースライドに固定される。中期拡散および全体細胞は、ＦＩＴＣ標識「融合プライマー」によるｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲのために、チェンバースライドの上に調製される。最終的には、乳房腫瘍組織切片を用いて、融合がサンプル中で起こっているかどうかを決めることが期待される。
【００８３】
一つの仮説は、テロメアの機能不全が、早期の悪性病巣に観察されるゲノム不安定性の背後にある最重要の駆動力と想定する（図４参照）。このテロメア機能不全仮説は、テロメアキャッピングが正常の前駆細胞の一部において破壊される、とする。このキャッピング機能の消失は、次にテロメア融合をもたらし、破壊−融合−架橋サイクルを通じてゲノム不安定性を引き起こす（図４および８）。その結果、ゲノムの完全性の消失は、増殖調節に与る遺伝子（ＴＥＲＴ−テロメラーゼの触媒成分を含む）の調節不良をもたらし、最終的に腫瘍発生を招く。テロメアの機能不全は、テロメアＤＮＡの異常な長さによって、および／または、たとえテロメアＤＮＡ長に変化が無くても、必要不可欠なテロメア関連タンパクの機能の消失によっても誘発される。
【００８４】
従って、テロメア短縮は、テロメア機能不全の一つの重要な原因と考えられるが、それは、癌におけるテロメア機能不全の唯一の原因ではないかも知れない。テロメア関連タンパクの調節および修飾における欠陥も、癌におけるテロメア機能不全において重要な役割を演じている可能性がある。ｐ５３突然変異マウス背景においてテロメラーゼＲＮＡ成分（ｍＴＥＲ）に欠損を設けることによって、テロメア機能不全を実験的に誘発すると、このマウス株では通常見られない、乳房腺癌および上皮癌が高レベルに観察された（Artandi et al.,(2000) Nature Aug 10; 406 (6976):641-5）。さらに、この著者等は、トランスジェニックマウスにおいて、テロメラーゼの構成的発現上昇が、乳腺癌の自発的発生と相関することを発見した。これは、テロメラーゼ発現は、悪性に向かうを増すことなく、治療目的のためにヒト細胞を不死化するために安全に使用が可能であるとする考えに疑問を投げかけるものである。
【００８５】
＜テロメア融合の分析および検出＞
テロメア機能不全仮説を直接検証するために、哺乳類細胞における末端対末端のテロメア融合を検出し、クローン化し、配列決定するための、独自のＰＣＲ依存法を開発した。テロメア機能不全にとって、テロメア融合が決定的指標マークであるので、本明細書に開示されるＰＣＲ依存法は、癌関連用途のために独自の分析および診断ツールを提供する。さらに、本分析は、この特異的破壊−融合−架橋サイクルの機構の可能性を探るための重要な手がかりを提供した。
【００８６】
以下の実験を行うのに、最初、ＢＪ包皮線維芽細胞の二つの系統、すなわち、ＢＪおよびＢＪ  ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７細胞を用いた。ＢＪ細胞は、集団倍加数（ＰＤ）が５０であり、検出可能なレベルのテロメア融合を含まない、初代細胞系統のコントロールとなる。ＢＪ  ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７細胞は、ＰＤが８５で、テロメア融合を持つ細胞を相当数、中期拡散による定量では約３５％も含む。系統的予備実験を通じて、特異的プライマー配列が経験的に決められ、これによって、非特異的ゲノム背景信号が除去された。テロメア融合接合部を検出し、クローンするためのＰＣＲ法の原理を図５に示す。２本の染色体同士の末端対末端融合部の詳細が、該テロメア融合接合部の増幅のために使用されるＰＣＲプライマーと共に示される。
【００８７】
テロメア融合を含むＢＪ  ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７線維芽細胞から得られる産物のみを増幅する特異的ＰＣＲ条件を定め、増幅断片をサザーンハイブリダイゼーションによって検出した（図６を参照）。強い分散した信号が、図６のレーン２、６、および１０のＢＪ  ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７系統（テロメア融合陽性系統）だけに認められる。現在、我々は、ＢＪ  ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７細胞系統からほぼ３０個のテロメア融合接合部をクローン化し、その配列を決定している。
【００８８】
増幅されたＤＮＡはクローンされ、コロニーを、テロメアプローブによるコロニーハイブリダイゼーション技術によって分析した。クローンされた融合接合部が単離され、配列決定された。クローンは、様々のサイズのテロメア繰り返し配列を含んでいたが、興味あることに、これまでに調べた全てのクローンにおいて、非テロメアＤＮＡの断片（２３−１９４ｂｐ）が、テロメア対テロメア融合部の間に挿入されていた（図７）。重要なことは、テロメア融合部位に挿入された非テロメアＤＮＡは、配列決定された４０クローンの内３７クローンにおいて、従来特定された脆弱染色体部位と一致したことである。これは、これらの配列が、体内で起こる真正の融合接合部であって、ＰＣＲおよび／またはクローニングによるアーチファクトではないという考えを支持する。予想に反して、４０を超える融合接合部を調べても、テロメア−テロメアの直接接合部が見出されない。さらに、この分析から、接合染色体のＧ−高頻度鎖が、Ｃ−高頻度鎖に対し、５′から３′ＤＮＡ鎖の方向性を維持しながら共有結合することが示され、これは、テロメア融合が形成されるためには、複数回の破壊−融合−架橋サイクルが起こっていることを示唆する（図８に示される、提案された作業モデルを参照されたい）。
【００８９】
テロメア融合を含まない（早期継代）、または、テロメア融合を含む（後期継代）、有限寿命のヒト乳腺上皮細胞の融合接合部配列についても現在調査中である。テロメア融合を含む後期継代ＨＭＥＣから得られた６個のクローンで、その配列が決定されたが、ＨＭＥＣに認められた融合接合部も、テロメア融合接合部の中に、同じ脆弱部位断片ＤＮＡを含んでいた（図７）。一つの乳房腫瘍サンプル（腺管および小葉癌）から得られた５個のテロメア融合部をさらにクローン化し、配列決定した。結果は、テロメアの機能不全は、乳房腫瘍発生時に実際に起こることを強く示唆する。これらのクローンの内２個は、脆弱部位４ｐ１６からの１０４ヌクレオチド断片を含み、３クローンは、脆弱部位１２ｑ２４．３からの１１３ヌクレオチド断片を含んでいた（図７）。注目すべきことに、テロメア融合を含むことが知られる細胞培養系統（ＢＪ  Ｅ６／Ｅ７および不死化ＨＭＥＣ）において、同じ脆弱部位断片が認められた（図７）。重要なことであるが、ここに開示の方法によって定量したところ、対応する正常乳房組織はテロメア融合を含んでいなかった。
【００９０】
＜乳房腫瘍組織を用いたテロメア融合の検出と分析＞
乳癌の様々な段階における乳房腫瘍組織を、対応する正常組織と共に、インディアナ大学組織採取中心施設（Indiana University Tissue Procurement Core Facility）から採取した。下記のタイプのそれぞれについて約６０個の乳房組織サンプルを、テロメア融合の有無について調べた。すなわち、１）癌診断の無い正常組織、２）癌診断の有る対応する正常組織、３）通常の腺管過形成（ＵＤＨ）、４）非典型的腺管過形成（ＡＤＨ）、５）線維腺腫、６）非浸潤性小葉癌（ＬＣＩＳ）、７）非浸潤性乳管癌（ＤＣＩＳ）、８）侵襲的腺管癌、９）侵襲的化生性癌、および、１０）小葉および腺管癌、である。各組織サンプルから、組織の一部（約２５ｍｇ）を分取し、ＤＮｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いてゲノムＤＮＡを単離する。線維芽細胞およびＨＭＥＣについて、および予備実験セクションＣ．４．において前述したように、、組織から得られたＤＮＡサンプルをＰＣＲを実行するために用いる。乳房腫瘍組織からテロメア融合を特異的に増幅するためにＰＣＲ条件を最適化する。
【００９１】
＜非ＰＣＲ依存法を用いるテロメア融合の検出＞
前述のＰＣＲ依存増幅法で得られた結果を確かめるために、代替として、ＰＣＲに依存しない手法を用いる。テロメア融合接合部内の配列に関して以前に得られた情報を、融合染色体の分析用プローブを生成するために用いることができる。この実験において特定された、もっとも可能性が高く一般的な脆弱部位を、プローブとして用いる。標的細胞／乳房腫瘍組織からゲノムＤＮＡを単離し、プローブ内には切断部位を持たない、少なくとも５種の制限酵素を選んで、そのゲノムＤＮＡを消化する。各サンプルから得られた約３０μｇの制限消化ＤＮＡを、０．８％のアガロースゲルで泳動し、膜に転送し、テロメア融合接合部の中に認められる脆弱部位断片配列（例えば、１２ｑ２４および４ｐ１６断片）から成る、個々の高度に特異的活性を持つプローブにハイブリダイズさせる。
【００９２】
＜テロメア融合の相対的蓄積を定量するための、リアルタイムＰＣＲ法＞
各種組織サンプル間においてテロメア融合率を測定するために、前述のものと同じテロメアプライマー（５’ＧＧＧＮＮＮＧＡＡＴＴＣ（ＴＴＡＧＧＧ）３−３’（配列番号２１））による半定量的ＰＣＲ法を用いる。ｄｓＤＮＡの蓄積を定量するために、介在性蛍光色素ＳＹＢＲを用いる。陽性コントロール標準として、左と右の融合接合部において１５個のテロメア繰り返し配列を有することでテロメア融合を模倣し、さらに、テロメア対テロメア接合部に、改変版のｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのマルチクローニング部位（１１５ｂｐ）を有するものを構築する。さらに、陰性コントロール（例えば、融合テロメアＤＮＡを含まない、１１個のテロメア繰り返し配列を抱える直線的ｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙベクター）を用いて、特異的ＰＣＲ条件を決める。先ず、陽性および陰性コントロールを用いてＰＣＲ条件（鋳型、プライマー、およびプローブの濃度、アニーリング温度その他）を最適化する。既知のパーセントの融合を持つ細胞系統および乳房腫瘍組織から得られたゲノムＤＮＡ調製品と、コントロールＤＮＡを混合する。既知パーセントの融合を持つゲノム調製品、対、Ｃｔ（Ｃｔ＝閾値サイクル数であって、ＰＣＲ増幅グラフの全てが直線範囲に入る、ＰＣＲサイクルの任意の数である）を用いて標準曲線を構築する。サンプルからのＣｔ値をプロットして癒合の数を定める。
【００９３】
＜ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲによる、乳房腫瘍組織切片におけるテロメア融合の局在＞
単離されたゲノムＤＮＡをテロメア融合に関して分析することは、テロメアの機能不全に関する高度の関連情報を与え続けてくれる重要な方法である。しかしながら、このような分析は、複雑な、不均一な乳房組織においてテロメア機能不全（すなわち、テロメア融合）を含む特定の細胞タイプに関し情報を与えることはできず、また、不均一組織サンプルにおいてテロメア融合頻度を計算する可能性を探ることも難しい。さらに、テロメア融合は、乳房腫瘍発生において比較的稀にしか起こらない可能性もある。従って、組織の薄切切片の分析では擬似陰性の結果を招く可能性もある。この可能性に対処するために、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法を改良して、ホールマウント／厚切り切片組織による、新規なｉｎ  ｓｉｔｕ  ＲＴ−ＰＣＲ法とする。
【００９４】
融合接合部プライマー５’−ＧＧＧＮＮＮＧＡＡＴＴＣ（ＴＴＡＧＧＧ）３−３’（配列番号２１）によって定められるテロメア融合接合部ＤＮＡを特異的に増幅するためのＰＣＲ条件を、実験室で検討決定した。プライマーはＣｙ５で標識し、後述のｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法に用いる。先ず、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲを用いて、中期拡散／ＦＩＳＨ分析によって定量した既知パーセントの融合を含む、ＢＪ  Ｅ６／Ｅ７およびＨＭＥＣの両継代細胞においてテロメア融合を検出する。特異的条件の下では、核の陽性蛍光スポットは、染色体中期拡散およびＦＩＳＨ分析という標準法を用いて定量されたテロメア融合率と同じパーセントで（このｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ法を用いて）検出される筈である。例えば、中期／ＦＩＳＨ分析によって定量された３０％のテロメア融合率を持つ細胞系統は、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ融合法によっても同じパーセント（３０％）の核スポットを示す筈である。ＢＪ（ＰＤが５０）および、初代の早期継代ＨＭＥＣは、非特異的ＰＣＲ増幅において決定的な陰性コントロールとして役立つ。乳房腫瘍組織におけるテロメア融合の検出にも同じ方法論が適用される。
【００９５】
テロメア融合接合部に対して特異的なプライマーが設計され、このプライマーセットによって適正に増幅されるための様々な条件が、溶液使用ＰＣＲアッセイによって確立された。プライマーには、合成時に、メーカー（Applied Biosystems）によって、その５′末端にＣｙ５標識が付着された。テロメア融合接合部をコードする領域を増幅するためのプライマーの特異性は、アンプリコンの直接的配列決定によって求めた。ＢＪ包皮線維芽細胞系統、ＨＭＥＣ、または乳房腫瘍組織サンプルを、４％パラフォルムアルデヒド−１５％スクロース溶液に４℃で一晩置いて固定し、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲで処理するまで−８０℃で保存する。スライドを、１０５−１１０℃で１０秒間インキュベートする。パラフォルムアルデヒド固定バイオプシー／細胞拡散体のプロテアーゼ消化の最適条件を決める。プロテイナーゼＫによる消化が不十分であると、酵素は、ゲノムＤＮＡに達することができない。プロテイナーゼＫの消化条件は、段階濃度の酵素を用い、３７℃で一定時間消化を行うことによって標準化する。細胞の構造を変えない、最高の酵素濃度を用いる。塩胡椒状の点の出現が、最適消化を示す徴である。この段階で、スライドを１１０℃で２分間インキュベートして消化を停止させる。さらに、様々なサンプルを、上記固定濃度のプロテイナーゼＫを、３７℃にてそれぞれ時間を変えて消化することによって、消化の最適化を追加実行する。消化は、１１０℃で２分間インキュベートして停止させる。この後、ＧＡＰＤＨまたはβ−アクチンのような任意のハウスキーピングプライマーを用いてｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲを実行する。最大数の核において最強の信号を与える消化時間が最適消化時間である。
【００９６】
酵素消化を標準化した後、ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲを実行する。ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲの後、増幅産物の細胞内局在を定めるために、サンプルをヘマトキシリンで対比染色する。サンプルは、ＡｒおよびＨｅ／Ｎｅレーザーを備えたＺｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡によって視像化する。サンプルは６３３ｎｍで励起し、光路に６５０ｎｍ発射フィルターを置いて画像を収集する。画像は全て、増幅および暗視野レベル用に標準化されたレーザー強度および光増倍管設定を用いて収集される。全ての画像は、Adobe Photoshopによって処理される。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】図１Ａおよび１Ｂは、ＴＲＦ２タンパクが、不死化された形質転換ヒト乳腺上皮細胞（ＨＭＥＣ）において、著明に増加することを示すデータを提供する。図１Ａは、不死化ＨＭＥＣ系統の発生を示す模式図である。化学的発癌物質ベンゾ（ア）ピレン［Ｂ（ａ）Ｐ］に暴露された１８４ＨＭＥＣの初代培養体は、ｐ１６発現を欠く、寿命の延びた培養体を生成した。長寿体１８４Ａａまたは１８４Ｂｅから、稀な不死化された系統が、自発的に、挿入による突然変異発生、ｐ５３機能の不活性化、および／または、乳癌関連発癌遺伝子ＺＮＦ２１７の形質導入、のいずれかの後に出現した。稀な不死化された形質転換系統が、乳癌関連発癌遺伝子ｃ−ｍｙｃの形質導入の後に、非暴露で選択後のｐ１６（−）１８４ＨＭＥＣから出現した。これ以上の詳細については、本文およびウェブサイト（www.lbl.gov/~mrgs/mindex.html）を参照されたい。図１Ｂは、それぞれ独立に得られた不死化ＨＭＥＣ系統における、ＴＲＦ２タンパクの発現上昇を示す免疫ブロットデータの定量化を表す。ＴＲＦ２およびＴＩＮ２バンドのピクセル濃度を、コントロールバンドの濃度で割り、１８４Ａａにおけるレベルに対する相対値としてプロットした。
【図２】図２は、乳房腫瘍由来細胞系統から単離されたタンパクサンプルに、抗ＴＲＦ２抗体をプローブとして用いて免疫ブロットを行って得たデータを表す、棒グラフである。ＴＲＦ２バンドの信号強度を、コントロールバンドの強度で割り、１８４細胞におけるレベルに対する相対値としてプロットした。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、死滅／危機の前に実現される、累積的集団倍加に対する、外部導入ＴＲＦ２遺伝子の作用を示す。形質導入細胞を、選択的薬剤の存在下に集密状態となるまで育成し、６０ｍｍ皿当たり１ｘ１０５の固定密度で三倍に再プレートした。各継代培養体において採取された細胞の全数を計算し、継代当たりの累積集団倍加数（ＰＤ）を、方程式  ＰＤ＝（Ａ／Ｂ）／ｌｏｇ２  を用いて求めた。前式において、Ａは採取された細胞数であり、Ｂはプレートした細胞数で、プレート効率について補正はしなかった。実験は、培養体が３週間以内に集密状態を実現することができなくなった時点で停止した。各実験は３回繰り返し、各例について、一つの実験から得られた代表的データを示す。
【図４】図４は、二つの染色体の間のテロメア融合を招き、ゲノム不安定性をもたらす事象の模式図である。第１の段階は、脱キャップ事象であり、次いで、二つのキャップの取れた染色体の間での融合が起こる。
【図５】図５は、融合接合部の模式図で、テロメア融合接合部のＰＣＲ増幅を可能とする、テロメア特異的プラマー同士の結合を示す。Ｎｎは、増幅反応の特異性を最適化するためにＰＣＲプライマーの５′末端に加えられた核酸の、変動可能な数を表しており、ここでｎは１−６の範囲から選択される整数である。
【図６】図６は、テロメア特異的プライマー、および、それぞれ、陽性コントロール、陰性コントロール、ＢＪ細胞から単離されたＤＮＡ、およびＢＪ  ＨＶＰ  Ｅ６／Ｅ７細胞から単離されたＤＮＡ、を含む鋳型を用いて得たＰＣＲ産物の、サザーンブロットを示す。ブロットは、表示の、３種のアニーリング温度において、３２Ｐ標識（ＴＴＡＧＧＧ）４オリゴヌクレオチドプローブ（配列番号４３）をプローブとして用いて調べた。
【図７】図７は、ＢＪ  ＨＶＰ  Ｅ６／Ｅ７細胞からクローン化したテロメア融合接合部の配列分析の結果を表す。クローンは、様々のサイズのテロメア繰り返し配列を含み、非テロメアＤＮＡ（２３−１９４ｂｐ）の断片が、これまで調べた全てのクローンにおいて、テロメア−テロメア融合部の間に挿入されていた。テロメア融合部位に挿入された非テロメアＤＮＡは、配列決定された４０クローンの内３７クローンにおいて、従来特定された脆弱染色体部位と一致した。ゴシック体で示した、染色体脆弱部位は、乳房腫瘍組織サンプルからクローンされ、配列決定されたテロメア融合部を表す。
【図８】図８は、内部に脆弱部位断片を持つ、テロメア融合接合部の生成のためのモデルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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