(57)【要約】  本発明は、第一節又は第二節以上の葉節点の分裂組織細胞を標的組織として利用して、アグロバクテリウム媒介形質転換及びその後の形質転換細胞の全植物体への再生により、ダイズ（グリシン・マックス）植物のゲノムへＤＮＡを組み込むための改良された方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニックダイズ植物の作製方法であって、以下のステップ：
（ａ）ダイズ幼苗の第一節又は第二節以上の葉節点の腋生分裂組織を準備するステップ、
（ｂ）該腋生分裂組織を、農学的に有用な形質についての少なくとも１つの植物発現カセットと任意により１以上の選択マーカー遺伝子を含むトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウムと共存培養するステップ、
（ｃ）該共存培養した腋生分裂組織を、以下：
（ｉ）該腋生分裂組織からの新たなシュート誘導を誘導するのに好適な濃度の少なくとも１つの植物成長因子、並びに
（ｉｉ）任意により、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織若しくは植物体の同定及び／若しくは選択を可能にする１以上の選択化合物、並びに／又は
（ｉｉｉ）任意により、アグロバクテリウム増殖を抑制するのに好適な１以上の抗生物質
を含むシュート誘導培地に移し、シュートが誘導され発育するまで上記共存培養した腋生分裂組織を培養し、該シュートを単離するステップ、並びに
（ｄ）該単離したシュートを発根培地に移し、該シュートが根を形成するまで該発根培地で該シュートを栽培し、さらにそのようにして誘導された、農学的に有用な形質についての少なくとも１つの植物発現カセットと任意により少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含むＴ−ＤＮＡが挿入されたゲノムを有する小植物体を、成熟植物まで再生するステップ
を含む方法。
【請求項２】
以下のステップ：
（ａ１）共存培養の前、その間又はその直後に外植片を傷つけるステップ、
（ｂ１）ステップ（ｂ）の後の共存培養した腋生分裂組織を、アグロバクテリウム増殖の抑制に好適な少なくとも１つの抗生物質及び任意により少なくとも１つの植物成長因子を含む培地に移すステップであって、該培地は、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
（ｂ２）ステップ（ｂ）及び任意によりステップ（ｂ１）の後の腋生分裂組織を、少なくとも１つの植物成長因子を含むシュート誘導培地（ＳＩＭ）においてさらにインキュベートするステップであって、該シュート誘導培地は、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
（ｃ１）ステップ（ｃ）の後のシュートを、以下：
（ｉ）シュートが伸長するのに好適な濃度の少なくとも１つの植物成長因子、及び
（ｉｉ）任意により、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする１以上の選択化合物
を含むシュート伸長培地に移し、該移したシュートを、少なくとも約２ｃｍの長さに伸長するまで該シュート伸長培地で栽培するステップ
からなる群より選択される１以上の追加ステップをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
第一節又は第二節以上の節の腋生分裂組織が、以下：
（ａ）実質的に幼苗全体として準備される幼苗腋生分裂組織、及び
（ｂ）腋生分裂組織が葉の葉柄に付いて残るように、第一葉又は第二葉以上の葉を切開することにより準備される葉腋分裂組織、及び
（ｃ）増殖させた腋生分裂組織
からなる群より選択される形態で準備される、請求項１又は２記載の方法。
【請求項４】
実質的に幼苗全体が、以下：
（ａ）幼苗全体、
（ｂ）根を取り除いた幼苗、
（ｃ）１又は両方の子葉を取り除いた幼苗、
（ｄ）根及び１又は両方の子葉を取り除いた幼苗、
（ｅ）根、両方の子葉及び上胚軸の一部を取り除き、上胚軸の一部に付いている腋生分裂組織が残っている幼苗
からなる材料群より選択される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
ダイズ幼苗を外植片作製の約４〜１０日前に発芽させる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つのステップの培地がサイトカイニンを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
サイトカイニンが、約１μＭ〜約１０μＭの濃度の６−ベンジルアミノプリンである、請求項６記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｃ）及び／又は（ｃ１）の少なくとも１つのステップの培地、好ましくは少なくともステップ（ｂ）及び（ｃ１）の培地が、約０．１μＭ〜約２μＭジベレリン酸（ＧＡ３）を含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）及び（ｃ）の少なくとも１つのステップの培地が少なくとも１つのチオール化合物を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
チオール化合物が、約１ｍＭ〜１０ｍＭの濃度のＬ−システイン、約０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度のジチオトレイトール、及び／又は０．１ｍＭ〜５ｍＭの濃度のチオ硫酸ナトリウム（sodium thiolsulfate）である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｃ１）及び／又は（ｄ）の少なくとも１つのステップの培地が、約０．０１ｍｇ／ｌ〜約１μＭ  ｍｇ／ｌインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び／又は約０．１μＭ〜約４μＭジベレリン酸（ＧＡ３）、及び／又は約０．５μＭ〜約６μＭゼアチンリボシド酸を含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
アグロバクテリウムが、アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスの安全化菌株を含む群より選択される菌株である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
アグロバクテリウム菌株がアグロバクテリウム・リゾゲネスの安全化Ｋ５９９株である、請求項１２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、第一節又は第二節以上の葉節点の分裂組織細胞を標的組織として利用して、アグロバクテリウム媒介形質転換及びその後の形質転換細胞の全植物体への再生により、ダイズ（グリシン・マックス）植物のゲノムへＤＮＡを組み込むための改良された方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ダイズ（グリシン・マックス）は、マメ科（Fabaceae（Leguminosae））ファミリーに属する。この植物ファミリーは、その種子がマメ鞘（鞘）内で担持されるという特徴を持つ。ダイズは中国が起源であると考えられている。ダイズの野生型は天然ではツル植物であり、おそらくこれがダイスが初めて乾草作物としてアメリカに持ち込まれた主な理由である。中国、満州、韓国及び日本からの持込は、アメリカ用に品種開発をするために重要であった。より直立した成長、負荷の低減及び種子サイズの増大等の農業形質を改良するための近年の品種改良の試みは、ダイズを世界的に重要な作物にまで開発するための主な責任を負ってきた。穀物用に収穫される作物の耕地面積及び割合は着実に増え、今日、ダイズは世界的に主要な産物である。
【０００３】
栽培ダイズは、世界を通じて相当の商品価値を持つ。世界中で５０００万ヘクタール以上が１００メートルトンを超えるダイズの年間作物量を生産するのに使用されており、推定額は２００億ドルを超える。従って、この作物の量及び質を改良するのに有用な科学的方法の開発は商業的関心からも大きな意義を持つ。
【０００４】
ダイズは、タンパク質、油、調味料及び化学原料の供与源として広く使用されている。栽培ダイズ種の質を改良するために、従来の植物品種改良により意義のある試みがなされており、いくつかの大成功が報告されている。しかし、従来の植物品種改良の方法は、一のダイズ品種から別の品種への遺伝子及び形質の移動に限定されていた。
【０００５】
近年の生物工学的研究及び開発により、植物遺伝子操作による農産物の改良のための有用な技術が提供されている。植物遺伝子工学は、１又は複数の所望の遺伝子を作物植物の遺伝性生殖細胞に導入して、これらの遺伝子を現代農業で使用されている選良品種中に又はその品種に組み込むことを含む。遺伝子導入技術により、病害抵抗性及び除草剤耐性が改良され、栄養価が高まった新しいクラスの選良作物品種の開発が可能となる。高速マイクロプロジェクション、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、直接ＤＮＡ取り込み、及びアグロバクテリウム媒介遺伝子形質転換を含む、遺伝子を植物組織に導入するための様々な方法が開発されている。
【０００６】
アグロバクテリウム媒介遺伝子形質転換は、植物において最も広く使用されている遺伝子導入技術である。この技術は、土壌細菌アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）の病原性を利用する。アグロバクテリウム・ツメファシエンスは、Ｔ−ＤＮＡと呼ばれるそのＤＮＡの一部を植物細胞のゲノムに導入し、それらの細胞を細菌の栄養摂取に有用な代謝産物を産生するように誘導する能力を自然に有する。アグロバクテリウム媒介形質転換は、アグロバクテリウムのＴ−ＤＮＡを外来遺伝子のセットと置き換えて、この細菌を、外来遺伝子を植物細胞のゲノムに導入可能なベクターにすることによって、この概念を利用している。典型的に、植物細胞に導入される外来遺伝子構築物は、化学選択化合物に対する耐性を植物細胞に付与する選択可能マーカーと結合した、植物の生殖細胞に導入されることが望ましい特定の目的遺伝子を含む。典型的に、アグロバクテリウム媒介遺伝子導入は、カルス細胞として知られる、組織培養で培養された未分化細胞に対して行われるか、あるいは葉若しくは茎由来の分化植物細胞に対して導入が行われ、これをその後未分化カルス培養物になるように誘導する。
【０００７】
外来遺伝子をダイズ種に導入する方法の開発により、ダイズに付与することのできる形質の範囲が大いに向上した。ダイズへの有用な遺伝子導入系を得るために、いくつかの障害を克服しなければならない。これらとしては、標的組織の全植物体への再生の最適化、ダイズ細胞とアグロバクテリウム細胞との共存培養のための条件の確定（例えば、時間、細菌濃度及び培地）、並びに適切な選択プロトコールの確立が挙げられる。
【０００８】
しかし、パーティクルボンバードメント、エレクトロポレーション、又はアグロバクテリウム媒介送達を使用したダイズへのＤＮＡ送達は困難であることが分かっている。これは、一部には、ダイズにおいて全能性を有することが分かっている細胞が少数であることによるものである（Trickら(1997) Plant Tissue Cult Biotechnol 3:9-26）。ＤＮＡ送達のためにアグロバクテリウム・ツメファシエンスを用いる方法は、ダイズ外植片とアグロバクテリウムとのあらゆる不適合を克服しなければならないというさらなる問題を抱えている。常套的に使用されている２つの方法は、子葉節の腋生分裂組織を標的とするアグロバクテリウムを用いる方法（Hincheeら(1988) Bio/Technology 6:915-922）、及び成熟接合胚のパーティクルボンバードメントを用いる方法（Finer及びMcMullen(1991) In Vitro Cell Dev Biol 27P:175-182）である。
【０００９】
体細胞胚発生に基づく方法が記載されている。すなわち、高レベルの２，４−Ｄ（４０ｍｇ／Ｌ）に外植片を置くことによりダイズ未熟子葉から胚を誘導し、その後胚発生組織を誘導培地（Finer (1988) Plant Cell Rep 7:238-241）又は液体懸濁培養液（Finer及びNagasawa (1988) Plant Cell Tissue Organ Cult 15:125-136）において増殖させる。
【００１０】
接合性未熟子葉のアグロバクテリウム媒介形質転換に基づく方法がさらに記載されている（Parrottら(1989) Plant Cell Rep 7:615-617；Yanら(2000) Plant Cell Rep 19:1090-1097；Koら(2003) Theor Appl Genet 107:439-447）。しかし、Parrottらでは、作製された３つの植物は多細胞起源のキメラであり、導入遺伝子を次世代に伝達しなかった。Yanら(2000) Plant Cell Rep 19:1090-1097は、０．０３％の低い形質転換頻度を報告している。作製された植物は導入遺伝子を次世代に伝達したが、これはおそらく形質転換された一次胚が二次胚の作製のために継続的に選択され、非キメラ植物を生じるためと思われる。最近、Koら(2003) Theor Appl Genet 107:439-447は、１．７％の形質転換頻度でのトランスジェニック植物の回収を報告しているが、この方法は、胚発生を促進するために機能的ＴＲ−ＤＮＡ配列を有する部分的に安全化された（発癌性）アグロバクテリウムｐＫＹＲＴ株の使用に依存している（Koら(2004) Planta 218:536-541）。これらの方法は、未熟子葉を標的組織として使用し、その後固体培地上で増殖及び選択を行う。
【００１１】
ダイズ形質転換のための他の方法は、増殖性胚発生培養物のパーティクルボンバードメント形質転換に基づいている。稔性トランスジェニックダイズ植物が、パーティクルボンバードメントを用いて作製されている（Finer及びMcMullen(1991) In Vitro Cell Dev Biol 27P:175-182；Satoら(1993) Plant Cell Rep 12:408-413；Parrottら(1994) In Vitro Cell Dev Biol 30P:144-149；Hadiら(1996) Plant Cell Rep 15:500-505；Stewartら(1995) Plant Physiol 112:121-129；Maughanら(1999) In Vitro Cell Dev Biol-Plant 35:334-349）。これらの方法においては、液体及び固体培地の両方に由来する増殖性胚発生培養物をパーティクルボンバードメントに使用し、固体又は液体培地上にある間に即時に選択が行われる。
【００１２】
胚発生培養に基づく上記方法は、以下の欠点を１つ以上有する：
１．胚発生培養物の樹立及び胚発生の誘導のための未熟子葉を供給するために、温室で成長させた植物を継続的に供給する必要があること。
【００１３】
２．マイクロプロジェクタイルボンバードメントの場合は、ボンバードメントの前に固体又は液体培地上で少なくとも９０日間にわたり体細胞胚の誘導を行う。ボンバードメント後、胚を選択培地に移し最長４週間又は胚が伸長するまで置く。生存している胚発生クラスターを成熟培地に移し、最低４週間置く。その後成熟胚を２〜７日間かけて乾燥させ、発芽培地上に３〜４週間播く。胚がシュート及び根を発育した後、それらをマゼンタボックスに移し２〜３週間おいた後、温室に移す。このプロセスは約９ヶ月から１年間かかる。
【００１４】
３．アグロバクテリウム感染の場合、未熟子葉を標的材料として使うことで、時間が３ヶ月短縮される。しかし、非キメラ植物を作製するためには、成熟胚を乾燥させて小植物体の発芽を誘導する前に、トランスジェニック一次胚から二次胚を作製する必要がある。
【００１５】
４．体細胞胚発生及びパーティクルボンバードメントの不稔性が問題である（Samoylovら(1998) Plant Cell Rep 18:49-54）。これは主に培養時間の長さによるものである（上記参照）。
【００１６】
５．体細胞胚の誘導及び増殖性胚発生培養物の形成は、遺伝子型に大きく依存する（Baileyら(1993) In Vitro Cell Dev Biol 29P:102-108；Baileyら(1993) Crop Sci 34:514-519；Simmonds及びDonaldson(2000) Plant Cell Rep 19:485-490）。
【００１７】
ダイズ形質転換の他の方法は、胚軸を標的組織として利用する。未熟胚軸のパーティクルボンバードメント形質転換の方法が開示されている（McCabeら(1988) Bio/Technology 6:923-926；Aragaoら(2000) Theor Appl Genet 101:1-6）。成熟不稔性種子の胚を切り出し、第一葉を取り除いて頂端分裂組織を露出させる。頂端分裂組織のボンバードメント後、外植片をシュート誘導培地に一晩移し、伸長シュートが出る前に外植片を回収／選択培地に２週間移す。３〜４週間後さらなるシュートが再生する。合計５〜７のシュートが再生し、Aragaoら(2000)では、これらのシュートの１０％のみが伸長した。形質転換効率は０．１〜２０．１％である。このグループはａｈａｓ（アセトヒドロキシ酸シンターゼ）をトランスジェニック細胞の選択に使用したが、McCabeら(1988) Bio/Technology 6:923-926のプロトコールでは選択を適用していない。未熟胚軸のアグロバクテリウム媒介形質転換はさらに、１〜３％の形質転換効率でＵＳ２００３００４６７３３及び米国特許第６，３８４，３０１号に記載されている。プロトコールは上述のものと同様であるが、ボンバードメントの代わりにアグロバクテリウムを適用し、共存培養ステップを含んでいる。また、種子をホルモンで前処理することが記載されている。
【００１８】
子葉節の形質転換に関する他の方法は、例えばパーティクルボンバードメントによるものである（米国特許第５，３２２，７８３号）。子葉節は、水分吸収した種子から分裂組織を切除し、サイトカイニンで１日間前処理し、さらに１日間スクロース培地上で前培養した後に標的とされる。この特許では、形質転換植物は示されていない。おそらく、この方法では、細胞をパーティクルボンバードメントのために利用することが困難であると考えられる。形質転換植物は、子葉節のアグロバクテリウム・ツメファシエンス感染を利用することにより報告されている（Hincheeら(1988) Bio/Technology 6:915-922；Zhangら(1999) Plant Cell Tissue Organ Cult 56:37-46；Olhoft及びSomers(2001) Plant Cell Rep 20:706-711；Olhoftら(2003) Planta 216:723-735）。外植片を、５日齢の幼苗から調製し、アグロバクテリウム・ツメファシエンスに曝露する。共存培養の後、シュートを４週間にわたり選択条件下で誘導する。形質転換したシュートの伸長は、伸長培地上で早ければ４〜６週間で開始し、６ヶ月間続く。形質転換したシュートは、発根培地上で５〜７日間かけて発根させてから、温室に移す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
ダイズの形質転換に関連する問題のいくつかは当該分野で記載されている方法により克服されているが、それでもなお、これまでに公知の方法は全て低度から中度の形質転換（特に再生）効率しかないため改良の必要が有意にある。アグロバクテリウム媒介形質転換法の分野において有意な進歩はあったが、ダイズ植物の形質転換のためのこのような方法の容易性、迅速性及び効率を促進する改良された方法の必要性は残ったままである。従って、本発明の目的は、トランスジェニックダイズ植物の作出プロセスにおいて全体的な効率がより高い改良された方法を提供することである。この目的は本発明により解決される。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明は、主に第一節の葉節点、第二節以上の他の全ての葉節点に位置する分裂組織細胞へのＴ−ＤＮＡ送達、及び成熟トランスジェニック植物への再生のために、アグロバクテリウム（アグロバクテリウム・ツメファシエンスを含む）を使用する。これらの標的組織には、幼苗段階でアグロバクテリウムを直接感染させる。
【００２１】
従って、本発明の第１の実施形態は、トランスジェニックダイズ植物の作製方法であって：
（ａ）ダイズ幼苗の第一節又は第二節以上の葉節点の腋生分裂組織を準備するステップ、
（ｂ）該腋生分裂組織を、農学的に有用な形質についての少なくとも１つの植物発現カセットと任意により１以上の選択マーカー遺伝子を含むトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウムと共存培養するステップ、
（ｃ）該共存培養した腋生分裂組織を、以下：
（ｉ）該腋生分裂組織からの新たなシュート誘導を誘導するのに好適な濃度の少なくとも１つの植物成長因子、及び
（ｉｉ）任意により、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織若しくは植物体の同定及び／若しくは選択を可能にする１以上の選択化合物、及び／又は
（ｉｉｉ）任意により、アグロバクテリウム増殖を抑制するのに好適な１以上の抗生物質
を含むシュート誘導培地に移し、シュートが誘導され発育するまで上記共存培養した腋生分裂組織を培養し、該シュートを単離するステップ、並びに
（ｄ）該単離したシュートを発根培地に移し、該シュートが根を形成するまで該発根培地で該シュートを栽培し、さらにそのようにして誘導された、農学的に有用な形質についての少なくとも１つの植物発現カセットと任意により少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含むＴ−ＤＮＡが挿入されたゲノムを有する小植物体を、成熟植物まで再生するステップ、
を含む方法に関する。
【００２２】
本発明の方法は、以下のステップ：
（ａ１）共存培養の前、その間又はその直後に外植片を傷つけるステップ、
（ｂ１）ステップ（ｂ）の後の共存培養した腋生分裂組織を、アグロバクテリウム増殖の抑制に好適な少なくとも１つの抗生物質及び任意により少なくとも１つの植物成長因子を含む培地に移すステップであって、該培地は、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
（ｂ２）ステップ（ｂ）及び任意によりステップ（ｂ１）の後の腋生分裂組織を、少なくとも１つの植物成長因子を含むシュート誘導培地（ＳＩＭ）においてさらにインキュベートするステップであって、該シュート誘導培地は、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
（ｃ１）ステップ（ｃ）の後のシュートを、以下：
（ｉ）シュートが伸長するのに好適な濃度の少なくとも１つの植物成長因子、及び
（ｉｉ）任意により、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする１以上の選択化合物
を含むシュート伸長培地に移し、該移したシュートを、少なくとも約２ｃｍの長さに伸長するまで該シュート伸長培地で栽培するステップ、
からなる群より選択される１以上の追加ステップを含むことが好ましい。
【００２３】
第一節又は第二節以上の節の腋生分裂組織は、様々な形態で提供され得る。
【００２４】
（ａ）方法Ａ：幼苗腋生分裂組織：幼苗全体又はその実質的な部分（根を欠損する幼苗、又は１若しくは両方の子葉を欠損する幼苗等）が利用でき、アグロバクテリウムを接種し、シュート誘導培地（ＳＩＭ）に置く。実質的に幼苗全体とは以下の材料からなる群より選択されることが好ましい。すなわち、
（ｉ）幼苗全体、
（ｉｉ）根を取り除いた幼苗、
（ｉｉｉ）１又は両方の子葉を取り除いた幼苗、
（ｉｖ）根、及び１又は両方の子葉を取り除いた幼苗、並びに
（ｖ）根、両方の子葉及び上胚軸の一部を取り除き、上胚軸の一部に付いている腋生分裂組織が残っている幼苗。
【００２５】
（ｂ）方法Ｂ：葉腋分裂組織：腋生分裂組織が葉の葉柄に付いて残るように第一葉又は第二葉以上の葉を切開し、アグロバクテリウム溶液に浸し、共存培養培地において共存培養し、シュート誘導培地（ＳＩＭ）に置く。
【００２６】
（ｃ）方法Ｃ：増殖させた腋生分裂組織：発芽した（好ましくは約）７日齢の各幼苗から、胚軸及び子葉の１つと半分又は両方の一部を取り除く。次いで、幼苗を増殖培地上に２〜４週間置く。１つのシュートを主要頂芽の成長から得、場合により１つを子葉節における各腋芽からの成長より得る。各シュートは約７ｃｍの長さで成長し、短い節間を３〜６つ含み、そこから外植片が得られる（図３Ａ）。第一節〜第四節の葉節点から腋生節（axillary node）を切除できる。各幼苗から平均３〜４の外植片が得られる。
【００２７】
上で明記した供与源（方法Ａ、Ｂ、Ｃ）以外に、他の供与源も腋生分裂組織に適している可能性がある。これらの供与源は、例えば、上胚軸及び第一葉節のみ等、ダイズ幼苗からのより限定された外植片であり得る。明らかに、このような限定された（すなわち小さい）外植片は、第一節からだけでなく、それより上の節（例えば、第二節以上の節）からも得られる。
【００２８】
腋生分裂組織外植片作製の供与源をもたらすダイズ幼苗は、外植片を作製する前に約４〜１０日間かけて発芽させることが好ましい。本発明は、アグロバクテリウム媒介形質転換をダイズ幼苗の第一節又は第二節以上の葉節点の腋生分裂組織細胞に対して直接用いてダイズの生殖細胞形質転換を行う新規かつ効率的な方法を提供する。形質転換された腋生分裂組織細胞から直接的にシュートを誘導することにより、生殖細胞トランスジェニック植物が生じる。全体的なプロセスは迅速かつ効率的である。本発明の特筆すべき特徴の１つは、ダイズ種子の前処理期間の短縮により、生存外植片のシュートの生成が改善され、温室に移すことが可能な植物を作製するのにかかる時間が短縮した。また、時間の短縮及び材料の低減により、使用者にとって経済的に有益な系が提供される。本発明は、（特に再生ステップにおいて）品種（cultivar）に高度に依存することが当該分野において知られているカルス培養のステップを必要としない。その結果、腋生分裂組織細胞は全てのダイズ品種に存在し事実上全てが同様の再生能力を有するため、本発明の方法は、あらゆるダイズ変種及び品種に対して使用できる。
【００２９】
様々なアグロバクテリウム菌株が利用できる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネス（Agrobacterium rhizogenes）の菌株を用いることができる。好適な実施形態では、「安全化（disarmed）」株（すなわち、腫瘍又は毛根表現型誘導遺伝子が欠失されたもの）が利用される。特に好適なアグロバクテリウム・リゾゲネス株は、安全化アグロバクテリウム・リゾゲネスＫ５９９株又はその誘導株である。このような株は、２００４年９月２日に出願された米国仮出願第６０／６０６７８９号に記載されている（参照により本明細書に全体的に援用する）。
【００３０】
本発明の好適な実施形態では、腋生分裂組織を、アグロバクテリウムでの接種の前に傷つける。
【００３１】
別の好適な実施形態では、ステップ（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つのステップの培地は、サイトカイニン（例えば、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）等）を含む。濃度は、約１μＭ〜約１０μＭ  ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）であることが好ましい。
【００３２】
さらに、ステップ（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｃ）及び／又は（ｃ１）の少なくとも１つのステップ、好ましくは少なくともステップ（ｂ）及び（ｃ１）の培地は、約０．１μＭ〜約２μＭジベレリン酸（ＧＡ３）を含むことが特に好ましい。
【００３３】
別の好適な実施形態では、ステップ（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）及び（ｃ）の少なくとも１つのステップ、好ましくは少なくともステップ（ｂ）の培地は、少なくとも１つのチオール化合物（好ましくはチオ硫酸ナトリウム、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びシステインからなる群より選択される）を含む。濃度は約１ｍＭ〜１０ｍＭのＬ−システイン、０．１ｍＭ〜５ｍＭ  ＤＴＴ、及び／又は０．１ｍＭ〜５ｍＭチオ硫酸ナトリウムであることが好ましい。
【００３４】
本発明の別の好適な実施形態では、ステップ（ｃ１）及び／又は（ｄ）の少なくとも１つのステップの培地は、約０．０１ｍｇ／ｌ〜約１μＭ  ｍｇ／ｌインドール酢酸（ＩＡＡ）、及び／又は約０．１μＭ〜約４μＭジベレリン酸（ＧＡ３）、及び／又は約０．５μＭ〜約６μＭゼアチンリボシド酸を含む。
【００３５】
本発明のその他の目的、利点及び特徴は、以下の説明から明らかになろう。
【００３６】
全般的な定義
略語：
ＢＡＰ：６−ベンジルアミノプリン；２，４−Ｄ：２，４−ジクロロフェノキシ酢酸；ＭＳ：ムラシゲ・スクーグ培地（Murashige T及びSkoog F(1962) Physiol. Plant. 15, 472-497）；ＮＡＡ：１−ナフタレン酢酸；ＭＥＳ：２−（Ｎ−モルホリノ−エタンスルホン酸；ＩＡＡ：インドール酢酸；ＩＢＡ：インドール酪酸；Ｋａｎ：硫酸カナマイシン；ＧＡ３：ジベレリン酸；ＴｉｍｅｎｔｉｎＴＭ：チカルシリン二ナトリウム（ticarcillin disodium）／クラブラン酸カリウム）。
【００３７】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、細胞系、植物種又は属、構築物及び試薬に限定されないことが理解されよう。また、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的のためだけのものであり、本発明の範囲を限定する意図はなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲のみにより限定されることが理解されよう。本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用する単数形の「不定冠詞（a）」、「及び／並びに（and）」、及び「定冠詞（the）」は、特に明記しない限り複数形も含むことに留意されたい。従って、例えば、「ベクター」への言及は、１つ以上のベクターを指し、当業者に公知の等価物を含み、その他も同様である。
【００３８】
本明細書において用いられる「約」という用語は、およそ、おおよそ、大体、又は辺りを意味する。「約」という用語が数値域と併用される場合、記載の数値の上下にその境界を広げることによって範囲が変更する。全般的に、本明細書で用いられる「約」という用語は、表記の数値を、その値の２０％、好ましくは１０％、より好ましくは５％の上下（高低）変動を含むように上下に変更する。
【００３９】
本明細書で使用する「若しくは／又は（or）」という用語は、特定の一覧の任意の１メンバーを意味し、その一覧のメンバーの任意の組合せも含む。
【００４０】
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、それらのポリマー又はハイブリッド（一本鎖又は二本鎖、センス又はアンチセンスのいずれかの形態）を指す。特に明記しない限り、特定の核酸配列は、明確に表記する配列と共に、保存的に改変されたその変異体（例えば、縮重コドン置換物）、及び相補配列も暗に包含する。「核酸」という用語は、本明細書において、「遺伝子」、「ｃＤＮＡ」、「ｍＲＮＡ」、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」と互換的に使用される。
【００４１】
本明細書で使用する「核酸配列」という表現は、ヌクレオチドを表す略語、文字、符号又は言葉の連続したリストを指す。一実施形態では、核酸は、比較的短い（通常、１００ヌクレオチド長未満の）核酸である「プローブ」であり得る。核酸プローブは約５０ヌクレオチド長から約１０ヌクレオチド長である場合が多い。核酸の「標的領域」は、対象となる部分と同定された核酸の部分である。核酸の「コード領域」は、適切な調節配列の制御下におかれた場合に、配列特異的に転写及び翻訳されて特定のポリペプチド又はタンパク質が生成される核酸の部分である。コード領域は、このようなポリペプチド又はタンパク質をコードするという。
【００４２】
「アンチセンス」という用語は、標的配列に相補的な配列を有する核酸を意味すると理解される（例えば、標的配列とのハイブリダイゼーションによりその発現が妨害され始めると考えられるメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列）。
【００４３】
「センス」という用語は、標的配列と相同又は同一である配列を有する核酸を意味すると理解される（例えば、タンパク質転写因子に結合し、所与の遺伝子の発現に関与する配列）。好適な実施形態においては、核酸は、目的の遺伝子、及び該目的の遺伝子の発現を可能にするエレメントを含む。
【００４４】
「遺伝子」という用語は、何らかの方法でポリペプチドの発現を調節可能な適切な調節配列と機能的に結合したコード領域を指す。遺伝子は、コード領域（オープンリーディングフレーム、ＯＲＦ）の前（上流）及び後（下流）にあるＤＮＡの非翻訳調節領域（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー等）、並びに適用可能な場合には個々のコード領域（すなわちエキソン）の間に介在配列（すなわちイントロン）を含む。
【００４５】
本明細書で使用する「コード領域」という用語は、構造遺伝子に関して使われた場合には、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果生じる新生ポリペプチドにおいて見とめられるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。コード領域は、真核生物では、開始メチオニンをコードする塩基トリプレット「ＡＴＧ」により５’側を、及び終止コドンを特定する３つのトリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）の１つにより３’側を挟まれる。イントロンの含有に加えて、遺伝子のゲノム形態は、ＲＮＡ転写産物上に存在する配列の５’側及び３’側の両末端に位置する配列も含む。これらの配列は、「フランキング」配列又は領域と称される（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写産物上に存在する非翻訳配列の５’又は３’側に位置する）。５’側フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するか又は影響を及ぼすプロモーター及びエンハンサー等の調節配列を含み得る。３’側フランキング領域は、転写の終止、転写後切断及びポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【００４６】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、「オリゴペプチド」、「ポリペプチド」、「遺伝子産物」、「発現産物」及び「タンパク質」という用語は、本明細書において連続したアミノ酸残基のポリマー又はオリゴマーを指すために互換的に使用される。
【００４７】
本明細書で使用する「単離された」という用語は、ある物質がその元来の環境から取り出されていることを意味する。例えば、生きた動物に存在する天然型ポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されていないが、自然系において共存する物質の一部又は全てから分離された同じポリヌクレオチド又はポリペプチドは単離されたという。
【００４８】
このようなポリヌクレオチドはベクターの一部であってよく、及び／又はこのようなポリヌクレオチド若しくはポリペプチドは組成物の一部であってもよく、このようなベクター又は組成物が元来の環境の一部とはならないように単離され得る。
【００４９】
「野生型」、「天然型」又は「天然由来」という用語は、生物、ポリペプチド又は核酸配列に関して、該生物が天然のものであること、又は変化、変異若しくは人為的に操作されていない少なくとも１つの天然の生物に存在することを意味する。
【００５０】
本明細書で（例えば、ダイズ細胞又は植物に関して）使用する「トランスジェニック」又は「組換え」という用語は、外因性遺伝子又はＤＮＡ配列、例えば限定されるものではないが、通常ではおそらく存在しない遺伝子若しくはＤＮＡ配列、所与の細胞型において通常では転写及び翻訳（「発現」）されない遺伝子、又は非形質転換細胞及び／若しくは植物に導入することが望ましい任意の他の遺伝子若しくはＤＮＡ配列（例えば、非形質転換細胞及び／又は植物に通常存在するが、発現の改変が望ましい遺伝子等）などを取り込んだ細胞及び／又は植物を指すことを意図する。本明細書において核酸に関して使用する「組換え」という用語は、核酸が、自然環境においては隣接しない核酸と共有結合及び隣接していることを意味することが好ましい。「組換え」ポリペプチド又はタンパク質は、組換えＤＮＡ技術により作製される（すなわち、所望のポリペプチド又はタンパク質をコードする外因性組換えＤＮＡ構築物により形質転換された細胞から作製される）ポリペプチド又はタンパク質を指す。組換え核酸及びポリペプチドはまた、自然ではそのように存在しないが改変、変化、変異又は人為的に操作された分子も含み得る。
【００５１】
「組換えポリペプチド」は、天然型ポリペプチドと、少なくとも１つのアミノ酸残基により配列が異なる非天然型ポリペプチドである。このような組換えポリペプチド及び／又は核酸を生成するための好ましい方法としては、特異的又は非特異的突然変異誘導、ＤＮＡシャフリング、又は再帰的組換え（recursive recombination）の他の方法が挙げられる。
【００５２】
「異種核酸配列」又は「異種ＤＮＡ」という用語は、自然界ではライゲートしていないか、又は自然界では異なる位置においてライゲートしている核酸配列にライゲートしたヌクレオチド配列を指すために互換的に使用される。異種ＤＮＡは、導入先の細胞に対して内因性ではなく、別の細胞から得られるものである。一般的に、必ずしもそうではないが、このような異種ＤＮＡは、それが発現される先の細胞により通常は生成されないＲＮＡ及びタンパク質をコードする。
【００５３】
本明細書で使用する「形質転換の効率」又は「形質転換の頻度」とは、標準的な（すなわち、外来ＤＮＡと接触させる細胞の量、送達ＤＮＡの量、ＤＮＡ送達の種類及び条件、全般的な培養条件等に関して標準化又は正規化された）実験条件下で回収される形質転換された細胞（又は個々の形質転換細胞から成長したトランスジェニック生物）の数により測定できる。例えば、単離した葉柄を形質転換の出発材料として使用した場合、形質転換の頻度は、接種した葉柄当たりに得られるトランスジェニックシュート（又は得られる植物系統）の数として表すことができる。
【００５４】
「（単数形の）細胞」という用語は、単一の細胞を指す。「（複数形の）細胞」という用語は、細胞の集合を指す。集合は、１つの細胞型を含む純粋な集合であり得る。同様に、集合は２つ以上の細胞型を含み得る。本発明では、細胞の集合が含み得る細胞型の数は限定されない。細胞は同調していても同調していなくてもよいが、好ましくは細胞は同調している。
【００５５】
「染色体ＤＮＡ」又は「染色体ＤＮＡ配列」という用語は、細胞周期状態とは無関係に細胞核のゲノムＤＮＡであると理解される。従って、染色体ＤＮＡは、染色体又は染色分体において編成され、凝縮（condense）又はほどかれた状態（uncoil）であり得る。染色体ＤＮＡへの挿入は、当該分野で公知の様々な方法（例えば、ＰＣＲ分析、サザンブロット分析、蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、及びｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ）により実証及び分析することができる。
【００５６】
本明細書で使用する「構造遺伝子」という用語は、ｍＲＮＡに転写されて、その後特定のポリペプチドに特有のアミノ酸配列に翻訳されるＤＮＡ配列を意味することを意図する。
【００５７】
「発現」という用語は、遺伝子産物の生合成を指す。例えば、構造遺伝子の場合、発現は構造遺伝子のｍＲＮＡへの転写、及び任意にその後１つ以上のポリペプチドへのｍＲＮＡの翻訳を伴う。
【００５８】
本明細書で使用する「発現カセット」又は「発現構築物」という用語は、プロモーター配列、並びに任意により該核酸配列の発現を促進する追加のエレメント（例えば、ターミネーター及び／又はポリアデニル化配列等）と機能的に連結された発現対象の核酸配列の組合せを意味することを意図する。
【００５９】
本明細書で使用する「プロモーター」という用語は、ＤＮＡ配列（例えば、構造遺伝子）の転写を指令するＤＮＡ配列を意味することを意図する。典型的に、プロモーターは、遺伝子の５’側領域に、構造遺伝子の転写開始部位近くに配置されている。プロモーターが誘導性プロモーターである場合、誘導因子に応答して転写率は高くなる。対照的に、プロモーターが構成的プロモーターである場合、転写率は誘導因子によって調節されない。また、プロモーターは、葉、根又は分裂組織等の特定の組織型の関連するコード領域を転写することのみに活性を有するように組織特異的又は組織選択的に調節され得る。
【００６０】
「機能的な結合」又は「機能的に結合した」という用語は、例えば、調節エレメント（例えば、プロモーター）と、発現対象の核酸配列（及び適切な場合にはさらなる調節エレメント（例えば、ターミネーター等））とが、各調節エレメントがその意図する機能を発揮して、該核酸配列の発現を可能にする、改変する、促進する又は影響を及ぼすように順次的に配置されることを意味すると理解される。発現は、センス又はアンチセンスＲＮＡに対する核酸配列の配置に依存して生じ得る。この意味においては、化学的な意味での直接的な結合は必ずしも必要ではない。例えばエンハンサー配列等の遺伝子制御配列は、離れた位置から又は実際に他のＤＮＡ分子から、標的配列に対してそれらの機能を発揮することもできる。好ましい配置は、組換え発現させる核酸配列がプロモーターとして作用する配列の後ろに位置し、２つの配列が互いと共有結合しているものである。プロモーター配列と、組換え発現させる核酸配列との距離は、好ましくは２００塩基対未満、特に好ましくは１００塩基対未満、非常に好ましくは５０塩基対未満である。機能的な結合及び発現カセットは、記載されている常套的な組換え及びクローニング技術により作製できる（例えば、Ausubel FMら (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience；Maniatis T, Fritsch EF及びSambrook J(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第二版, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor(NY)；Gelvinら(編)(1990) Plant Molecular Biology Manual；Kluwer Academic Publisher, Dordrecht, The Netherlands；Silhavy TJ, Berman ML及びEnquist LW(1984) Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor(NY)）。しかし、例えば制限酵素のための特定の切断部位とのリンカーとして又はシグナルペプチドとして作用するさらなる配列を、２つの配列の間に配置させることもできる。配列の挿入もまた、融合タンパク質の発現を生じ得る。プロモーターと発現対象の核酸配列との連結から構成される発現カセットは、ベクター組込み形態で存在し、例えば形質転換により植物ゲノムに挿入されることが好ましい。
【００６１】
「形質転換」という用語は、好ましくは染色体組込み、及び減数分裂を介して安定した遺伝率を生じる、植物細胞への遺伝子物質の導入を含む。形質転換はまた、減数分裂安定性に対して可変的な性質を示し得る染色体外（epichromosomal）複製及び遺伝子発現を伴う、植物ウイルスベクターの形態での植物細胞への遺伝子物質の導入も含む。
【００６２】
「分裂組織（meristem）」又は「分裂組織細胞」又は「分裂組織（meristematic tissue）」という用語は、互換的に使用でき、茎又は根の先端で見とめられるような、継続的に分裂して新しい細胞を形成する未分化植物組織を意味することを意図し得る。
【００６３】
「節」又は「葉節点」という用語は、葉が付いているか又は付いていた茎上の点を意味することを意図する。「節間」という用語は、茎上の２つの節の間の領域又は部分を意味することを意図する。
【００６４】
「葉柄（petiole）」という用語は、葉と茎とをつなげる柄を意味することを意図し、葉の柄（leaf-stalk）とも呼ばれる。
【００６５】
「腋芽」という用語は、茎又は枝に沿ってある、場合によっては保護鱗片（protective scale）に囲まれ、未発達の芽、葉又は花を含む、側芽とも呼ばれる小さい隆起を意味することを意図する。
【００６６】
「胚軸」という用語は、子葉（双葉）と根との間にある茎の部分を意味することを意図する。
【００６７】
「葉腋」という用語は、葉とそれを有する茎との間の角を意味することを意図する。腋芽は葉腋において生じる。
【００６８】
「子葉」という用語は、発芽の際に種子内に残るか又は出現して大きくなり緑になる種子植物の胚の葉を意味することを意図する。双葉とも呼ばれる。ダイズ種子は、子葉又は双葉である２つの種子半体（seed halves）から構成される。２つの子葉は、幼苗が確立するまでそれに栄養分を与える食物及び栄養の蓄えを含む。発生中の鞘中では子葉の色は緑であるが、現存の穀物品種では植物が成熟するにつれて黄色に変化する。胚軸は子葉の間に位置し、珠孔に最も近い端部付近に付いている。
【００６９】
発芽プロセスは、種子が好適な環境（正しい温度、水及び酸素を含む）に曝された場合に開始される。幼根は、ダイズ発芽プロセスにおいて、通常一番最初に種皮を破る器官である。これは、ダイズ植物の一次根に発育する。幼根は、種皮から現れた後、主に下に向かって育ち、主根に発達する。側枝根（lateral branch root）は主根から発達する。ダイズ種子が発芽プロセスを開始した後は、下胚軸［幼根（若い一次根）と子葉との間の茎の一部］が伸長し、膨らんだ子葉を土の表面に向かって引っ張る。種皮は通常、子葉が土から現れる頃には抜け落ちている。子葉が現れて間もなく、胚軸は伸長を停止し、屈曲部（胚軸（hypocotyledonary）アーチ）がまっすぐになる。次いで、子葉が分裂し、上胚軸が露出し、成長し始める。上胚軸は、最初は２つの単小葉（１枚の小葉しかない葉）と、それらの間に位置する成長点から構成される。ダイズ植物の地上成長は上胚軸から始まる。
【００７０】
上胚軸から発育する茎は、植物の主要な支持及び輸送（translocating）構造である。主茎の節は速く形成し、全ての節の形成にたった４〜５週間しか要さない。節は、主茎からの葉又は枝の存在により識別することができる。節間（節の間の領域）の長さは遺伝的に制御されているが、光、水、栄養及び他の環境要因によっても改変され得る。腋芽からの分枝は、主茎先端がそれ以上芽の発育を抑制できなくなった場合に生じる。
【００７１】
主茎の子葉節及び第二節以外においては、ダイズ植物は、節のそれぞれにおいて、茎のそれぞれの側に交互に付いた単一の三小葉の葉（３枚の小葉を有する葉）を有する。２枚の単小葉の葉（葉柄及び単一の小葉から構成される）は、第二節において互いと対向して付いている。第１の三小葉の葉は第三節に付いている。葉柄は、葉を主茎又は枝につなげる。一対の槍形（lance-shaped）の変形葉（托葉）は、葉柄−茎接合部にある葉柄の基部に位置する。葉柄の基部及び各小葉の基部において、葉枕と呼ばれる細胞の大集団が存在する。葉枕の相対的膨張（turgidity）（水分含有量）の変化は、小葉と葉柄との間で異なる角度を形成する。
【００７２】
各葉腋（茎と枝又は葉との接合部）において、腋芽が存在する。この芽は、環境に応じて、枝や花房に発達するか又は発達に失敗し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
本発明は、様々な変種のダイズ（グリシン・マックス）の直接的な生殖細胞系遺伝子形質転換の方法である。この方法は、発芽ダイズの第一節又は第二節以上の節の腋生分裂組織における個々のダイズ細胞へのアグロバクテリウム媒介遺伝子送達に基づいている。その後、形質転換された細胞をシュートを形成するように誘導するが、これは高頻度で生殖細胞系ダイズ形質転換体であり、性的に成熟しかつ稔性のトランスジェニックダイズ植物体に栽培することができる。この方法は、カルス培養期間を伴わないため、種子からトランスジェニック種子までの全体的なプロセスの時間が著しく短くなる。
【００７４】
従って、本発明の第１の実施形態は、トランスジェニックダイズ植物の作製方法であって、
（ａ）ダイズ幼苗の第一節又は第二節以上の葉節点の腋生分裂組織を準備するステップ、
（ｂ）該腋生分裂組織を、農学的に有用な形質についての少なくとも１つの植物発現カセットと任意により１以上の選択マーカー遺伝子を含むトランスジェニックＴ−ＤＮＡを含むアグロバクテリウムと共存培養するステップ、
（ｃ）該共存培養した腋生分裂組織を、以下：
（ｉ）該腋生分裂組織からの新たなシュート誘導を誘導するのに好適な濃度の少なくとも１つの植物成長因子、並びに
（ｉｉ）任意により、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織若しくは植物体の同定及び／若しくは選択を可能にする１以上の選択化合物、並びに／又は
（ｉｉｉ）任意により、アグロバクテリウム増殖を抑制するのに好適な１以上の抗生物質
を含むシュート誘導培地に移し、シュートが誘導され発育するまで上記共存培養した腋生分裂組織を培養し、該シュートを単離するステップ、
（ｄ）該単離したシュートを発根培地に移し、該シュートが根を形成するまで該発根培地で該シュートを栽培し、さらにそのようにして誘導された、農学的に有用な形質についての少なくとも１つの植物発現カセットと任意により少なくとも１つの選択マーカー遺伝子を含むＴ−ＤＮＡが挿入されたゲノムを有する小植物体を、成熟植物まで再生するステップ、
を含む方法に関する。
【００７５】
本明細書に記載の方法は、第一節又は第二節以上の葉節点の腋生分裂組織における成長中の細胞へのアグロバクテリウム媒介遺伝子送達に基づく。本明細書に記載の方法は、カルス又は増殖期間を利用しない。その代わりに、アグロバクテリウム媒介遺伝子送達は、ダイズ幼苗の第一節又は第二節以上の節の腋生分裂組織の中の細胞に対して行われる。腋生分裂組織は、完全幼苗に含まれているときにアグロバクテリウムを接種されるか、又は外植片（例えば、切り出した葉柄若しくは葉）に付いているものであってもよい。その後、腋生分裂組織領域を、直接的にシュート形成を誘導するためにホルモンの存在下で培養する。選択マーカー（例えば、除草剤ホスフィノトリシン又はＤ−アミノ酸（例えばＤ−アラニン又はＤ−セリン等））の存在下で分裂組織を培養することが好ましい。このステップの結果、ダイズシュートの形成が誘導され、これは、形質転換された分裂組織細胞を含む小さい細胞クラスターから生じる。この方法に必要とされる時間は、他のアグロバクテリウム媒介形質転換プロトコールと比べて大幅に短縮される。実行可能な表現型について陽性を示すダイズシュートは、手順の開始から４〜６週間で回収できる。全体的なＴ０（一次形質転換）植物ライフサイクルは、ダイズ植物が温室において成熟するまで成育するのに必要な最低期間より大幅に長くない。
【００７６】
本発明の方法は、従来技術で記載されている方法と比べて１つ以上の利点を提供する。
【００７７】
（１）腋生分裂組織方法については、約４〜１０日齢、好ましくは約７日齢の発芽幼苗が必要となる。本発明の方法を使用すれば、胚発生培養に比べて培養物を樹立するための手順が簡素化される。
【００７８】
（２）本方法は時間効率的である。腋生分裂組織方法に基づく本発明の方法は、アグロバクテリウム感染後約２週間以内に新たなシュートを生成し、アグロバクテリウム感染の約３週間以内にトランスジェニックシュート原基が検出できる。アグロバクテリウム感染後の腋生分裂組織形質転換のプロセスは、シュート誘導培地上で３〜４週間、シュート伸長培地上で最短で２〜４週間、及び発根培地上で７日間である。
【００７９】
（３）アグロバクテリウム媒介方法を用いて作製される植物は、パーティクルボンバードメントに比べて、ゲノムへの導入ＤＮＡの複数コピー又は断片化コピーの組込みに関連する問題が少ない（Hadiら(1996) Plant Cell Rep 15:500-505；Trickら (1997) Plant Tissue Cult Biotechnol 3:9-26）。
【００８０】
（４）本発明の方法は、遺伝子型及び品種に高度に依存する。腋生分裂組織の発育は、幅広い遺伝子型において生じ易い。このプロセスにおけるダイズ組織操作は、従来の粒子媒介形質転換方法のものと類似しており、これは試験された全ての選良ダイズ変種に適用可能であることが証明されている。この方法は、選良ダイズ品種への直接的な遺伝子形質転換のために同等に適用され、従って、変種間の広範囲な異種交配の必要性が潜在的に回避できる。
【００８１】
（５）胚軸形質転換に基づく方法は、外植片当たり３〜７のシュートしか提供しない。腋生分裂組織形質転換に基づく本発明の方法の時間は、植物作製と同様である。利点は、複数のトランスジェニックシュートを生じて（培養物から温室への可能性を高める）、トランスジェニック細胞がシュート伸長のために選択される可能性を高める、多数（数百から数千）のシュート原基の増殖である。
【００８２】
（６）腋生分裂組織形質転換に基づく本発明の方法は、シュート誘導培地上で形成されるカルス／シュートパッド（callus/shoot pad）の組織量（tissue mass）が子葉節に比べて小さいため、より選択し易い。選択化合物の取込みに関与する下胚軸及び／又は上胚軸は、より硬く組織化された子葉と比べて改善された取込み特性を提供すると思われる。
【００８３】
（７）葉外植片及び増殖させた外植片の組織サイズが小さいため、本発明の方法は、培養プロセスほど培地、材料及び空間を必要としない。子葉節の場合には１プレートにつき５つの外植片しか培養できないが、増殖外植片及び葉外植片の場合には単一のプレート上で２０まで培養することができる。
【００８４】
（８）増殖させた腋生分裂組織に基づく変種については、豊富な標的材料（すなわち、複数の外植片）が、３〜４週齢の増殖小植物体に由来する材料から得られるというさらなる利点がある。１つのシュートは、主要な頂芽の成長から誘導され、場合により子葉節にある各腋芽から成長する。各シュートは、約７ｃｍの長さまで成長し、３〜６の短い節間を含み、外植片を得ることができる。小さいサイズの外植片は、アグロバクテリウム感染、選択及び再生において影響を受け易く、増殖させた腋生分裂組織は、驚くべきことに再生能が高いことが証明され、中間のカルス期無しに植物を作製する。小さいサイズの外植片及びシュートの活発な成長は、現在の形質転換法においては問題となっている形質転換細胞の選択に都合がよい。
【００８５】
形質転換プロセスのための出発材料はダイズ種子である。種子は、最初に滅菌し、任意により浸漬させて柔軟にする。種子を約３分間水吸収させた後、最長２時間かけて柔軟化させる。次に、種子を発芽培地上におき、約４〜１０日間、好ましくは約５〜８日間、最も好ましくは約７日間かけて発芽させる。上胚軸はこの時点で、増殖腋生分裂組織及び葉腋分裂組織方法については約０．５ｃｍであり、幼苗腋生分裂組織方法については概して０．５〜２ｃｍであることが好ましい。発芽は、高光条件（＞１００μＭｍ−２ｓ−１）下で２５℃にて行うことが好ましい。
【００８６】
アグロバクテリウム媒介形質転換のために用いられる標的組織は、第一節又は第二節以上の葉節点に含まれる腋生分裂組織である。第一葉節点は、根から葉の方向に向かって、子葉節(すなわち、子葉が付くか又は付いている茎上にある点)の直後にある節(すなわち、葉が付いているか又は付いていた茎上にある点)である。それより上の葉節点は、第一葉節点に続く全ての葉節点、例えば、第二節、第三節、第四節の葉節点等である。第一葉節点の腋生分裂組織が好ましい。
【００８７】
第一節又は第二節以上の節の腋生分裂組織は、後で行うアグロバクテリウム共存培養ステップにおいて様々な形態で提供及び使用され得る。
【００８８】
（ａ）方法Ａ：幼苗腋生分裂組織：幼苗全体又はその実質的な部分（根を欠損する幼苗、又は１若しくは両方の子葉を欠損する幼苗等）が利用でき、アグロバクテリウムを接種し、シュート誘導培地（ＳＩＭ）におくことができる。実質的に幼苗全体とは以下の材料からなる群より選択されることが好ましい。すなわち、
（ｉ）幼苗全体、
（ｉｉ）根を取り除いた幼苗、
（ｉｉｉ）１又は両方の子葉を取り除いた幼苗、
（ｉｖ）根、及び１又は両方の子葉を取り除いた幼苗、並びに
（ｖ）根、両方の子葉及び上胚軸の一部を取り除き、上胚軸の一部に付いている腋生分裂組織が残っている幼苗。
【００８９】
（ｂ）方法Ｂ：葉腋分裂組織：腋生分裂組織が葉の葉柄に付いて残るように第一葉又は第二葉以上の葉を切開し、アグロバクテリウム溶液に浸し（接種し）、共存培養培地において共存培養し、シュート誘導培地（ＳＩＭ）に置く。小さいサイズの外植片及びシュートの活発な成長は、現在の形質転換法においては問題となっている形質転換細胞の選択に都合がよい。
【００９０】
（ｃ）方法Ｃ：増殖させた腋生分裂組織：発芽した（好ましくは約）７日齢の各幼苗から、胚軸及び子葉の１つと半分又は両方の一部を取り除く。次いで、幼苗を増殖培地上に２〜４週間置く。幼苗は、分枝状のシュートを生成し、そこから外植片が得られる（図３Ａ）。第一節〜第四節の葉節点の腋生節を切除できる。各幼苗から平均３〜４の外植片が得られる。
【００９１】
上で明記した供与源（方法Ａ、Ｂ、Ｃ）以外に、他の供与源も腋生分裂組織に適している可能性がある。これらの供与源は、例えば、上胚軸及び第一葉節のみ等、ダイズ幼苗からのより限定された外植片であり得る。明らかに、このような限定された（すなわち小さい）外植片は、第一節からだけでなく、より上の節（例えば、第二節以上の節）からも得られる。
【００９２】
本発明の方法は、以下からなる群より選択される１以上の追加のステップを含むことが好ましい。すなわち、
（ａ１）共存培養の前、その間又はその直後に外植片を傷つけるステップ、
（ｂ１）ステップ（ｂ）の後の共存培養した腋生分裂組織を、アグロバクテリウム増殖の抑制に好適な少なくとも１つの抗生物質及び任意により少なくとも１つの植物成長因子を含む培地に移すステップであって、該培地は、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
（ｂ２）ステップ（ｂ）及び任意によりステップ（ｂ１）の後の腋生分裂組織を、少なくとも１つの植物成長因子を含むシュート誘導培地（ＳＩＭ）においてさらにインキュベートするステップであって、該シュート誘導培地は、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ、
（ｃ１）ステップ（ｃ）の後のシュートを、以下：
（ｉ）シュートが伸長するのに好適な濃度の少なくとも１つの植物成長因子、及び
（ｉｉ）任意により、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、組織又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする１以上の選択化合物
を含むシュート伸長培地に移し、該移したシュートを、少なくとも約２ｃｍの長さに伸長するまで該シュート伸長培地で栽培するステップ。
【００９３】
本発明の好適な実施形態では、腋生分裂組織を傷つける（ステップ（ａ１））。創傷は、本発明の方法に対して少なくとも２つの向上効果を有すると思われる。すなわち、
（ｉ）創傷は、アグロバクテリウム感染及び遺伝子導入効率を促進する、
（ｉｉ）創傷は、おそらく分裂組織接合を破壊し、外植片組織から発育するシュートの数を有意に増やすことにより、新たなシュート誘導の効率を促進する。
【００９４】
創傷は、アグロバクテリウムによる接種（共存培養）の前、接種の間、又は接種の後に行うことができる。両方の有益な効果を得るために、創傷は、好ましくは共存培養の前又はその間、より好ましくは共存培養の前に行う。多くの創傷方法が使用でき、例えば、切断、摩擦、穿通、穴あけ、微粒子若しくは加圧流体での貫通、プラズマ創傷、高圧加圧、又は超音波処理が挙げられる。創傷は、メス、ハサミ、針、研磨物、エアブラシ、粒子、電子遺伝子銃、又は音波等（ただし、これらに限定されない）の物を用いて行うことができる。共存培養ステップの効率を向上させるための別の代替例は減圧浸潤法である（Bechtoldら(1998) Meth. Mol. Biol. 82, 259-266；Trieuら(2000) The Plant Journal 22(6), 531-541）。
【００９５】
Ｔ−ＤＮＡは、アグロバクテリウム媒介ＤＮＡ導入によりダイズに導入される。本明細書で使用する「アグロバクテリウム」という用語は、アグロバクテリウムファミリーの全ての種（アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスを含む）を意味する。形質転換は、アグロバクテリウム・ツメファシエンス又はアグロバクテリウム・リゾゲネスの菌株を用いて実現されることが好ましい。アグロバクテリウム媒介ＤＮＡ導入による植物形質転換の原理は、当該分野で周知である（Horsch RBら(1985) Science 225:1229pp）。
【００９６】
アグロバクテリウム菌株は、少なくとも１つの選択マーカー遺伝子と、任意により農学的に有用な形質についての追加の植物発現カセットを含むＴ−ＤＮＡを含むＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）を有しうる。アグロバクテリウム媒介導入の結果、該Ｔ−ＤＮＡは通常、形質転換及び再生の後には、植物組織の全て又は実質的に全ての細胞に存在することになる。
【００９７】
アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びＡ．リゾゲネスは、植物細胞を遺伝的に形質転換させる植物病原性土壌菌である。Ａ．ツメファシエンス及びＡ．リゾゲネスそれぞれのＴｉプラスミド及びＲｉプラスミドは、植物の遺伝子形質転換に関与する遺伝子を含んでいる（Kado(1991) Crit Rev Plant Sci 10:1）。ベクターは、アグロバクテリウムＴｉ又はＲｉプラスミドに基づき、植物ゲノムへのＤＮＡ導入の天然の系を利用する。この高度に発達した寄生物（parasitism）の一部として、アグロバクテリウムは、そのゲノム情報の所定の部分（左境界及び右境界と呼ばれる約２５ｂｐの繰返し配列に挟まれるＴ−ＤＮＡ）を植物細胞の染色体ＤＮＡに導入する（Zupanら(2000) Plant J 23(1):11-28）。いわゆるｖｉｒ遺伝子（元来のＴｉプラスミドの一部）の共同作用により、このＤＮＡ導入が媒介される。その天然の系を利用するために、元来ある腫瘍誘導遺伝子を欠損するＴｉプラスミド（「安全化ベクター」）が開発された。さらなる改良において、いわゆる「バイナリーベクター系」は、Ｔ−ＤＮＡを、シャトルベクターに組み込むことによって、Ｔｉプラスミドの他の機能的エレメント（例えば、ｖｉｒ遺伝子）から物理的に分離し、扱い易くした（ＥＰ−Ａ  １２０  ５１６；米国特許第４，９４０，８３８号）。これらのバイナリーベクターは、（安全化Ｔ−ＤＮＡ及びその境界配列以外に）アグロバクテリウム及び大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の両方における複製のための原核生物配列を含む。アグロバクテリウム媒介形質転換の利点は、一般的に、境界に挟まれるＤＮＡだけがゲノムに移入され、１コピーのみが優先的に挿入されることである。アグロバクテリウムベクター系及びアグロバクテリウム媒介遺伝子導入方法の説明は当該分野で公知である（Gruberら (1993) "Vectors for Plant Transformation", METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY;pp.89-119に掲載；Mikiら (1993) "Procedures for Introducing Foreign DNA into Plants", METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY;pp.67-88に掲載；Moloneyら (1989) Plant Cell Reports 8:238）。
【００９８】
従って、アグロバクテリウム媒介形質転換のために、遺伝的構成（例えば、発現カセットなど）を特定のプラスミド（シャトルベクター若しくは中間ベクター、又はバイナリーベクターのいずれか）に組み入れる。Ｔｉ又はＲｉプラスミドを形質転換に使用する場合、Ｔｉ又はＲｉプラスミドＴ−ＤＮＡの少なくとも右側の境界（ただし、ほとんどの場合右側及び左側の境界）を、フランキング領域の形態で導入しようとする発現カセットに結合させる。バイナリーベクターを使用することが好ましい。バイナリーベクターは、大腸菌及びアグロバクテリウムの両方での複製が可能である。これらは、選択マーカー遺伝子、及びリンカー又はポリリンカー（例えば導入する発現カセットの挿入のため）を、右側及び左側Ｔ−ＤＮＡ境界配列に挟まれるように含みうる。バイナリーベクターは、直接アグロバクテリウムに導入され得る（Holstersら(1978) Mol Gen Genet 163:181-187）。選択マーカー遺伝子は、形質転換されたアグロバクテリウムの選択を可能にし、例えば、カナマイシンに対する耐性を付与するｎｐｔＩＩＩ遺伝子である。この場合には宿主生物として機能するアグロバクテリウムは、ｖｉｒ領域を有するプラスミドをすでに含んでいる必要がある。後者は、Ｔ−ＤＮＡを植物細胞に導入するために必要とされる。このように形質転換されたアグロバクテリウムは、植物細胞を形質転換するために使用できる。植物細胞を形質転換するためにＴ−ＤＮＡを使用することは、集中的に研究及び記載されている（ＥＰ１２０  ５１６；Hoekema(1985) The Binary Plant Vector System, Offsetdrukkerij Kanters B.V., Alblasserdam, Chapter Vに掲載；Anら(1985) EMBO J 4:277-287）。
【００９９】
一般的なバイナリーベクターは、Ｐ型プラスミドＲＫ２から誘導されるｐＲＫ２５２（Bevanら (1984) Nucl Acid Res 12:8711-8720）又はｐＴＪＳ７５（Watsonら(1985) EMBO J 4(2):277-284）等の「宿主範囲の広い」プラスミドに基づいている。これらのベクターのほとんどは、ｐＢＩＮ１９の誘導体である（Bevanら (1984) Nucl Acid Res 12:8711-8720）。様々なバイナリーベクターが公知であり、それらの一部は、例えばｐＢＩ１０１．２又はｐＢＩＮ１９（Clontech Laboratories, Inc. USA）等、市販されている。さらなるベクターが、大きさ及び扱い易さに関して改良されている（例えば、ｐＰＺＰ；Hajdukiewiczら(1994) Plant Mol Biol 25:989-994）。改良型ベクター系は、ＷＯ０２／００９００号にも記載されている。
【０１００】
様々なアグロバクテリウム菌株を用いることができる。アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びアグロバクテリウム・リゾゲネスの菌株の両方が使用できる。好適な実施形態では、「安全化」株（すなわち、腫瘍又は毛根表現型誘導遺伝子が欠失したもの）が利用される。特に好ましいアグロバクテリウム・リゾゲネス菌株は、安全化アグロバクテリウム・リゾゲネスＫ５９９株である。かかる菌株は、２００４年９月２日に出願された米国仮出願第６０／６０６７８９号（参照により全体的に本明細書に援用する）に記載されている。本発明の方法において採用される好ましいアグロバクテリウム菌株としては、オクトピン株（例えばＬＢＡ４４０４）又はアグロピン株（例えばＥＨＡ１０１又はＥＨＡ１０５）が挙げられるがこれらに限定されない。ＤＮＡ導入のためのＡ．ツメファシエンスの適切な菌株は、例えば、ＥＨＡ１０１［ｐＥＨＡ１０１］（Hoodら(1986) J Bacteriol 168:1291-1301）、ＥＨＡ１０５［ｐＥＨＡ１０５］（Li (1992) Plant Mol Biol 20:1037-1048）、ＬＢＡ４４０４［ｐＡＬ４４０４］（Hoekemaら(1983) Nature 303:179-181）、Ｃ５８Ｃ１［ｐＭＰ９０］（Koncz及びSchell(1986) Mol Gen Genet 204:383-396）、及びＣ５８Ｃ１［ｐＧＶ２２６０］（Deblaereら(1985) Nucl Acids Res 13:4777-4788）である。他の適切な菌株はアグロバクテリウム・ツメファシエンスＣ５８、ノパリン株である。他の適切な菌株はＡ．ツメファシエンスＣ５８Ｃ１（Van Laerebekeら(1974) Nature 252, 169-170）、Ａ１３６（Watsonら(1975) J. Bacteriol 123, 255-264）、又はＬＢＡ４０１１（Klapwijkら(1980) J. Bacteriol., 141, 128-136）である。アグロバクテリウム菌株は、オクトピン型Ｔｉプラスミド、好ましくは安全化されたもの（ｐＡＬ４４０４等）を含み得る。一般的に、オクトピン型Ｔｉプラスミド又はヘルパープラスミドを用いる場合、ｖｉｒＦ遺伝子が欠失又は不活性化されることが好ましい（Jarchowら(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10426-10430）。さらなる適切な菌株は、Ｃ５８Ｃ１［ｐＧＶ２２６０］及びＣ５８Ｃ１［ｐＭＰ９０］である。Ｃ５８Ｃ１株［ｐＧＶ２２６０］は「オクトピン型」株であり、Ｃ５８Ｃ１［ｐＭＰ９０］は「ノパリン型」株である。両方の遺伝的バックグラウンドは、アグロバクテリウムＣ５８株である。Ｃ５８は、ＧＶ３１０１株の遺伝的バックグラウンドでもある。
【０１０１】
本発明の方法はまた、特定のアグロバクテリウム菌株（変異型又はキメラｖｉｒＡ又はｖｉｒＧ遺伝子の存在によりｖｉｒ遺伝子発現及び／又はその誘導が改変されたアグロバクテリウム菌株等）と組み合わせて、形質転換効率をさらに高めるために使用できる（例えば、Hansenら(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:7603-7607；Chen及びWinans(1991) J. Bacteriol. 173;1139-1144；Scheeren-Grootら(1994) J. Bacteriol 176:6418-6426）。可能性のあるのは、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株（例えば、ＬＢＡ４４０４；Hieiら(1994) Plant J 6:271-282)と、超毒（super-virulent）プラスミド（例えば、ｐＴＯＫ２４６に基づくベクター；Ishida Yら(1996) Nature Biotech 745-750）、いわゆる超毒菌株との組み合わせである。超毒菌株の一例は、スクシナムオパイン（succinamopine）ＥＨＡ１０５株である。
【０１０２】
バイナリーベクター又は他の任意のベクターは、一般的なＤＮＡ組換え技術により改変され、大腸菌において複製され、アグロバクテリウムに（例えば、エレクトロポレーション又は他の形質転換技術により）導入できる（Mozo及びHooykaas(1991) Plant Mol Biol 16:917-918）。
【０１０３】
アグロバクテリウムは、当該分野で公知の手法により増殖させ、使用される。ベクターを含むアグロバクテリウム菌株は、例えば、適切な抗生物質（例えば、５０ｍｇ／ｌスペクチノマイシン）を添加したＹＥＰ培地上で３日間培養することができる（実施例２を参照）。細菌を、ループを用いて固体培地から回収し、再懸濁する。本発明の好適な実施形態では、アグロバクテリウム培養は、−８０℃に冷凍したアリコートを用いて開始する。様々なダイズ腋生分裂組織外植片の組織に対するアグロバクテリウム処理のために、細菌を共存培養培地（ＣＣＭ）に再懸濁することが好ましい。
【０１０４】
感染及び共存培養に使用するアグロバクテリウムの濃度は、異なる必要があるかもしれない。従って、一般的に、ＯＤ６００が０．１〜３．０のアグロバクテリウム濃度範囲、及び数時間から７日間の共存培養期間範囲が使用できる。様々な腋生分裂組織外植片のために、以下のアグロバクテリウム懸濁液濃度が採用されることが好ましい：
（ａ）方法Ａ（幼苗腋生分裂組織）：ＯＤ６００＝約０．５〜約３、好ましくはＯＤ６００＝約１〜２
（ｂ）方法Ｂ（葉腋分裂組織）：ＯＤ６００＝約０．１〜約１、好ましくはＯＤ６００＝約０．１２５〜０．５
（ｃ）方法Ｃ（増殖させた腋生分裂組織）：ＯＤ６００＝約０．２〜約１．５、好ましくはＯＤ６００＝約０．５〜０．８。
【０１０５】
アグロバクテリウムと様々なダイズ腋生分裂組織外植片の組織との共存培養は、一般的に、アグロバクテリウム・ツメファシエンス菌株の場合には約１〜約６日間、好ましくは約３〜約５日間、アグロバクテリウム・リゾゲネス菌株の場合には約２〜約３日間行われる。
【０１０６】
次いで、外植片にアグロバクテリウム培養物を、数分間から数時間、典型的に約１０分間〜３時間、好ましくは約０．５時間〜１時間かけて接種する。余分な培地は捨て、アグロバクテリウムを分裂組織と、数日間、典型的に３〜５日間にわたり暗室で共存培養させる。このステップの間、アグロバクテリウムは、外来遺伝子構築物を、ダイズ腋生分裂組織中の一部の細胞に導入する。通常、このステップの間、選択化合物は存在しない。
【０１０７】
必須ではないが、アグロバクテリウム共存培養の前又はその間に、培地において１以上のフェノール化合物を使用することが可能である。本発明の範囲内で適した「植物フェノール化合物」又は「植物フェノール成分」は、陽性の走化性反応を誘導可能な単離された置換型（substituted）フェノール分子、特に、Ｔｉプラスミドを含むアグロバクテリウム・エスピー（特にＴｉ−プラスミドを含むアグロバクテリウム・ツメファシエンス）において高いｖｉｒ遺伝子発現を誘導可能なものである。好ましいのは、アセトシリンゴンである。さらに、浸透保護剤（osmoprotectant）（例えば、好ましくは約７００ｍｇ／Ｌの濃度のＬ−プロリン、若しくはベタイン）、植物ホルモン（とりわけＮＡＡ）、オパイン又は糖類等の特定の化合物は、植物フェノール化合物と組み合わせて添加された場合には相乗的に作用することが期待される。植物フェノール化合物、特にアセトシリンゴンが、様々なダイズ腋生分裂組織外植片をアグロバクテリウムに（例えば、数時間から１日）接触させる前に、培地に添加することができる。培地中の植物フェノール化合物の可能な濃度は、約２５μＭ〜７００μＭである。アグロバクテリウム・ツメファシエンスに特に適した誘導条件は記載されている（Vernadeら(1988) J.Bacteriol. 170:5822-5829）。アグロバクテリウムでの形質転換の効率は、当該分野で公知の多数の他の方法、例えば、減圧浸潤法（ＷＯ００／５８４８４号）、ヒートショック及び／又は遠心分離、硝酸銀の添加、超音波処理等により向上させることができる。
【０１０８】
植物防御応答（フェノール酸化等）により組織壊死を低下させることができる抗酸化剤（例えば、ジチオトレイトール）又はチオール化合物（例えば、Ｌ−システイン、Olhoft PM及びDA Somers(2001) Plants Cell Reports 20:706-711；ＵＳ２００１０３４８８８）の共存培養培地への添加により、アグロバクテリウム媒介形質転換の効率がさらに向上し得る。
【０１０９】
上記細菌との共存培養の後（例えば、洗浄ステップによる）。共存培養ステップの後に採用される培地（例えば、ステップ（ｂ１）、（ｃ）及び／又は（ｃ１）で採用される培地）は、殺菌剤（抗生物質）を含むことが好ましい。このステップは、非形質転換細胞の成長を停止させるか又は少なくとも遅らせ、残ったアグロバクテリウム細胞を死滅させる。従って、本発明の方法は、以下のステップを含むことが好ましい。すなわち、
（ｂ１）ステップ（ｂ）の後の共存培養した腋生分裂組織を、アグロバクテリウム増殖の抑制に好適な少なくとも１つの抗生物質及び任意により少なくとも１つの植物成長因子を含む培地に移すステップであって、該培地は、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ。
【０１１０】
採用するのに好ましい抗生物質は、例えば、カルベニシリン（５００ｍｇ／Ｌ若しくは好ましくは１００ｍｇ／Ｌ）、又はＴｉｍｅｎｔｉｎＴＭ（GlaxoSmithKline；約２５０〜５００ｍｇ／Ｌの濃度で使用されることが好ましい；ＴｉｍｅｎｔｉｎＴＭは、チカルシリン二ナトリウム（ticarcillin disodium）及びクラブラン酸カリウムの混合物である；０．８ｇ  ＴｉｍｅｎｔｉｎＴＭは５０ｍｇクラブラン酸及び７５０ｍｇチカルシリンを含む。化学的には、チカルシリン二ナトリウムは、Ｎ−（２−カルボキシ−３，３−ジメチル−７−オキソ−４−チア−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプト−６−イル）−３−チオ−フェンマロンアミノ酸二ナトリウム塩）である。化学的に、クラブラン酸カリウムは、カリウム（Ｚ）−（２Ｒ，５Ｒ）−３−（２−ヒドロキシエチリデン）−７−オキソ−４−オキサ−１−アザビシクロ［３．２．０］ヘプタン−２−カルボキシレート）である。
【０１１１】
共存培養ステップの後、共存培養した外植片を、少なくとも１つの植物成長因子を含むシュート誘導培地上でインキュベートする。このシュート誘導培地上でのインキュベーションは、共存培養ステップ直後（すなわち、アグロバクテリウム増殖を抑制するステップ（ｂ１）と並行して）、又はステップ（ｂ１）（アグロバクテリウム増殖の抑制）及び／若しくは（ｂ２）（選択化合物を用いない再生；以下参照）等の他の中間ステップの後に開始することができる。
【０１１２】
これらの培地は、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に植物細胞の同定及び／又は選択を可能にする少なくとも１つの化合物（例えば、選択化合物）をさらに含み得る。しかし、外植片を、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする選択化合物を欠損する培地上での共存培養ステップ（ｂ）の後に約４〜約７日間の特定の時間にわたりインキュベートすることが好ましい。上記選択化合物に対する信頼できる耐性レベルの確立は、選択化合物による形質転換細胞及び組織に対する意図しない損傷を防ぐためにいくらかの時間を必要とする。従って、本発明の方法は、共存培養と選択との間に選択化合物を用いないで行われるステップを含み得る。このステップは、ステップ（ｂ１）及び／又は特定の追加のステップであり得る：
（ｂ２）ステップ（ｂ）及び任意によりステップ（ｂ１）の後の腋生分裂組織を、少なくとも１つの植物成長因子を含むシュート誘導培地（ＳＩＭ）においてさらにインキュベートするステップであって、該シュート誘導培地は、ステップ（ｂ）の選択マーカー遺伝子と組み合わせた場合に該選択マーカー遺伝子を含む植物細胞、器官又は植物体の同定及び／又は選択を可能にする選択化合物を欠損することが好ましい、上記ステップ。
【０１１３】
本発明の方法においてシュート誘導（及び／又はシュート伸長）のために採用する培地は、任意により、例えばサイトカイニン化合物（例えば、６−ベンジルアミノプリン）及び／又はオーキシン化合物（例えば、２，４−Ｄ）等の１つ以上の植物成長調節因子をさらに含んでもよい。本明細書で使用する「植物成長調節因子」（ＰＧＲ）という用語は、植物成長及び発達を調節しうる天然又は合成（天然ではない）の化合物を意味する。ＰＧＲは、単独で、又は互いと若しくは他の化合物（例えば、糖類、アミノ酸）と調和して作用し得る。「オーキシン」又は「オーキシン化合物」という用語は、細胞伸長及び分裂、管組織の分化、果実発達、不定根の形成、エチレンの生成を刺激し、高濃度では脱分化（カルス形成）を誘導する化合物を含む。最も一般的な天然型オーキシンは、根及び茎に極方向に輸送されるインドール酢酸（ＩＡＡ）である。合成オーキシンは、現代の農業において広範囲に使用されている。合成オーキシン化合物としては、インドール−３−酪酸（ＩＢＡ）、ナフチル酢酸（ＮＡＡ）、及び２，４−ジクロロフェノキシ酢酸（２，４−Ｄ）が挙げられる。シュート形成を誘導する化合物としては、ＩＡＡ、ＮＡＡ、ＩＢＡ、サイトカイニン、オーキシン、カイネチン、グリホセート及びチアジアズロン（thiadiazuron）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１４】
「サイトカイニン」又は「サイトカイニン化合物」という用語は、細胞分裂、子葉の拡張、及び側芽の成長を刺激する化合物を含む。これらは、分離した葉の老化を遅らせ、オーキシン（例えば、ＩＡＡ）と組み合わさって、根及びシュートの形成に影響を及ぼし得る。サイトカイニン化合物は、例えば、６−イソペンテニルアデニン（ＩＰＡ）及び６−ベンジルアデニン／６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）を含む。
【０１１５】
別の好適な実施形態では、ステップ（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つのステップの培地は、サイトカイニン（例えば、６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）等）を含む。濃度は、約１μＭ〜約１０μＭ  ６−ベンジルアミノプリン（ＢＡＰ）であることが好ましい。シュート誘導培地のためには、約１〜約３μＭのＢＡＰ濃度が好ましい。ＢＡＰ濃度は、５μＭを超えないことが好ましい。
【０１１６】
さらに、ステップ（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）、（ｃ）及び／又は（ｃ１）の少なくとも１つのステップ、好ましくは少なくともステップ（ｂ）及び（ｃ１）の培地は、約０．１μＭ〜約２μＭジベレリン酸（ＧＡ３）を含むことが特に好ましい。
【０１１７】
別の好適な実施形態では、ステップ（ｂ）、（ｂ１）、（ｂ２）及び／又は（ｃ）の少なくとも１つのステップの培地は、好ましくはチオ硫酸ナトリウム、ジチオトレイトール（ＤＴＴ）及びシステインからなる群より選択される少なくとも１つのチオール化合物を含む。濃度は、約１ｍＭ〜１０ｍＭのＬ−システイン、０．１ｍＭ〜５ｍＭ  ＤＴＴ、及び／又は０．１ｍＭ〜５ｍＭチオ硫酸ナトリウムであることが好ましい。
【０１１８】
外植片を、上記シュート誘導培地上で、シュートが発育するまでインキュベートする。形成されるシュート原基は、通常、０．３ｃｍの長さもない。シュート原基の形成は、シュート誘導培地上で約１週間で始まり、平均で、このようなシュート開始は、約３〜４週間続いて、最大の大きさに到達する。従って、共存培養した外植片を、上記シュート誘導培地上で約２〜６週間、好ましくは約３〜４週間インキュベートする。
【０１１９】
アグロバクテリウム媒介技術は、典型的に、標的組織中の限定された数の細胞への遺伝子送達を生じ得る。従って、本発明の好適な実施形態では、選択化合物を形質転換後に適用して、標的組織中の形質転換されていない全ての細胞を殺すか、又は選択的優位性によって形質転換細胞を同定する。培養の長さは、部分的に、非形質転換細胞に対する選択化合物の毒性に依存する。上記選択又はスクリーニングに使用する選択マーカー遺伝子及び対応する選択化合物は、抗生物質、除草剤、又はＤ−アミノ酸等の多様な周知の選択化合物のいずれでもあり得る（詳細については以下参照）。この培養ステップの長さは可変的であり（選択化合物及びその濃度、選択マーカー遺伝子に依存する）、１日から約１８０日間にわたる。
【０１２０】
選択及び／又はスクリーニング可能なマーカー遺伝子の挿入は、本発明の方法の範囲内に含まれる。これは、例えば、除草剤耐性形質としてその後の用途のために好都合であり得る。多様な選択マーカー遺伝子及び対応する選択化合物が、当該分野で公知である。さらに、リポーター遺伝子を用いて可視的なスクリーニングを行うことができ、これは（リポーター遺伝子の種類に応じて）選択化合物として基質の添加を必要とするか又は必要としない。
【０１２１】
様々な時間スキームが、様々な選択マーカー遺伝子のために採用できる。（例えば、除草剤又はＤ−アミノ酸に対する）耐性遺伝子の場合、選択は通常、シュート開始の間、つまり約４週間以上、シュート伸長まで少なくとも４週間にわたり行われる。このような選択スキームは、カナマイシンを含む全ての選択手法に適用され得る。発根を含む再生スキーム全体にわたり選択を維持することも（はっきりと好ましいというわけではないが）さらに可能である。
【０１２２】
例えば、カナマイシン耐性遺伝子（ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、ＮＰＴＩＩ）を選択マーカーとする場合、カナマイシンは約３〜２００ｍｇ／ｌの濃度で培地に含まれ得る。選択のための典型的な濃度は５〜５０ｍｇ／ｌである。組織はこの培地上で、約１〜約４週間、好ましくは約７日間にわたり、シュートが発育するまで成長させる。シュートの形成は、処理及び共存培養条件に応じて約１〜約２週間で開始する。
【０１２３】
例えば、ホスフィノトリシン耐性遺伝子（ｂａｒ）を選択マーカーとする場合、ホスフィノトリシンは約１〜５０ｍｇ／ｌの濃度で培地に含まれ得る。選択のための典型的な濃度は約１〜約１５ｍｇ／ｌである。組織はこの培地上で、約１〜約４週間、好ましくは約７日間にわたり、シュートが発育するまで成長させる。シュートの形成は、処理及び共存培養条件に応じて約１〜２週間で開始する。
【０１２４】
例えば、ｄａｏ１遺伝子を選択マーカーとする場合、Ｄ−セリン又はＤ−アラニンが約３〜１００ｍＭの濃度で培地に含まれ得る。約１０〜約７０ｍＭ（又は約１〜約７．５ｇ／Ｌ）のＤ−セリン濃度が使用されることが好ましい。選択のための典型的な濃度は約１０ｍＭ〜約５０ｍＭ（又は約１〜５．３ｇ／ｌ）である。組織はこの培地上で、約１〜約４週間、好ましくは約７日間にわたり、シュートが発育するまで成長させる。シュートの形成は、処理及び共存培養条件に応じて約１〜約２週間で開始する。
【０１２５】
好適な実施形態では、形質転換前に形成された全てのシュートが、共存培養後約２週間までに除去されて、分裂組織からの新しい成長を刺激する。これにより、一次形質転換体におけるキメラ現象が低減し、トランスジェニック分裂組織細胞の増殖が高まる。この間、外植片を、より小さい切片に切断（すなわち、上胚軸を切断することにより外植片から節を分離）してもよいし又はしなくてもよい。
【０１２６】
（好ましくは選択を用いる）ＳＩＭ培地上で２〜４週間後（又はシュートの塊が形成されるまで）、外植片を、（シュート原基の）シュート伸長を刺激するシュート伸長（ＳＥＭ）培地に移す。この培地は、選択化合物を含んでいても又はいなくてもよいが、選択化合物を含むことが好ましい。伸長するシュートの頻度及び長さは、ＳＩＭ中のホルモンレベル、特にＢＡＰに影響される（実施例９）。
【０１２７】
本発明の別の好適な実施形態では、ステップ（ｃ１）及び／又は（ｄ）の少なくとも１つのステップの培地は、約０．０１ｍｇ／ｌ（０．０５７Ｍ）〜約１ｍｇ／ｌ（５．７μＭ）インドール酢酸（ＩＡＡ）、及び／又は約０．１μＭ〜約４μＭジベレリン酸（ＧＡ３）、及び／又は約０．５μＭ〜約６μＭトランスゼアチンリボシド酸を含む。
【０１２８】
２〜３週間ごとに、死滅した組織を注意深く除去した後に、外植片を新鮮なＳＥＭ培地（選択化合物を含むことが好ましい）に移すことが好ましい。外植片はまとまり、細かく断片化することなく、多少なりとも健康のままである。外植片が死滅するか又はシュートが伸長するまで、外植片の移動を続ける。
【０１２９】
伸長したシュートは、シュート伸長培地に移して約４〜８週間後に回収の状態になる。表現型の規則性及び健康についてシュートを評価し、伸長した茎（約１インチ又は２ｃｍ）及び完全な三小葉形成を有するシュートのみを回収する。
【０１３０】
回収したシュートを、発根培地上において、根形成を誘導する。根形成は、約１〜４週間かかり、その後植物を土壌に移して、完全に成熟するまで成長させることができる。発根培地はまた（はっきりと好ましいわけではないが）選択化合物を含み得る。好ましくは、伸長した（３ｃｍを上回る長さの）シュートを取り除き、発根培地（ＲＭ）に約１週間（方法Ｂ）又は品種に応じて約２〜４週間（方法Ｃ）置くと、根が形成し始める。根を有する外植片の場合、土壌に直接移す。発根したシュートを土壌に移し、成育チャンバー内で２〜３週間かけて頑強にした後に、温室に移す。この方法を用いて得られる再生植物は、稔性で、１植物当たり平均５００の種子を生成した。
【０１３１】
この技術により作製されたＴ０植物は、トランスジェニック植物であり、相応な収率で定期的に回収された。方法Ｃの場合、増殖腋生分裂組織プロトコールを用いたダイズ小植物体の平均再生時間は、外植片接種から１４週間である。従って、この方法は、稔性で健康なダイズ植物をもたらす再生の時間が速い。
【０１３２】
マーカー遺伝子を発現する形質転換された植物材料（例えば、細胞、組織又は小植物体）は、非形質転換野生型組織の成長を抑制するある濃度の対応の選択化合物（例えば、抗生物質又は除草剤）の存在下で発育可能である。得られる植物は、従来の様式で育種及び雑種交配できる。２世代以上を育てて、ゲノム組込みが確実に安定かつ遺伝性であるようにする。
【０１３３】
本発明の他の重要な態様は、開示している方法により調製されたトランスジェニック植物の子孫、そのような子孫から誘導される細胞、及びそのような子孫から得られる種子を含む。
【０１３４】
本発明のＴ−ＤＮＡの構成
他のアグロバクテリウム媒介方法と同様に、ダイズゲノムに挿入される外来遺伝的構築物又は導入遺伝子は、組換えＤＮＡ操作の通常の技術によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで作製される。次いで、遺伝的構築物をアグロバクテリウム菌株に形質転換し、ダイズ細胞に送達する。アグロバクテリウムは非発癌性であり、このような菌株のいくつかは現在広く利用可能である。
【０１３５】
標的ダイズ植物のゲノムに挿入されるＴ−ＤＮＡは、例えば選択マーカー遺伝子、形質遺伝子、アンチセンスＲＮＡ又は二本鎖ＲＮＡの発現を促進し得る、少なくとも１つの発現カセットを含むことが好ましい。この発現カセットは、発現されると形質転換植物に都合のよい表現型を付与する核酸配列と機能的に結合した形で植物細胞において機能的なプロモーター配列を含むことが好ましい。当業者は、この目的のため（例えば食物及び飼料の品質を高めるため、化学品、精密化学品又は医薬品を製造するため（例えば、ビタミン、油、炭水化物；Dunwell(2000) J Exp Bot 51 Spec No:487-96）、除草剤に対する耐性を付与するか又は雄性不稔を付与するため）に利用できる多数の配列を承知している。さらに、成長、収率、及び非生物又は生物ストレス因子（例えば、真菌、ウイルス又は昆虫）に対する抵抗性が向上され得る。都合の良い性質は、例えば、対応するアンチセンス（Sheehyら(1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:8805-8809；米国特許第４，８０１，３４０号；Mol JNら(1990) FEBS Lett 268(2):427-430）又は二本鎖ＲＮＡ（Matzke MAら(2000) Plant Mol Biol 43:401-415；Fire A.ら(1998) Nature 391:806-811；Waterhouse PMら(1998) Proc Natl Acad Sci USA 95:13959-13964；ＷＯ９９／３２６１９号；ＷＯ９９／５３０５０号；ＷＯ００／６８３７４号；ＷＯ００／４４９１４号；ＷＯ００／４４８９５号；ＷＯ００／４９０３５号；ＷＯ００／６３３６４号）を発現させることによって、タンパク質を過剰発現させるか、又は内因性タンパク質の発現を低減させることにより付与され得る。
【０１３６】
植物における発現のためには、植物特異的プロモーターが好ましい。「植物特異的プロモーター」という用語は、原則として、植物又は植物の部分、植物細胞、植物組織若しくは植物培養物において、遺伝子（特に外来遺伝子）の発現を支配可能な任意のプロモーターを意味すると理解される。この目的のために、発現は、例えば、構成的、誘導性、又は発育依存性であり得る。以下のものが好ましい。
【０１３７】
（ａ）構成的プロモーター
「構成的」プロモーターは、植物発育の実質的な期間にわたり（好ましくは植物発育中常時）、多数の（好ましくは全ての）組織における発現を確実にするプロモーターを指す。植物プロモーター、又は植物ウイルスに由来するプロモーターが特に好ましく使用される。ＣａＭＶ（カリフラワーモザイクウイルス）３５Ｓ転写産物のプロモーター（Franckら(1980) Cell 21:285-294；Shewmakerら(1985) Virology 140:281-288；Gardnerら(1986) Plant Mol Biol 6:211-228；Odellら(1985) Nature 313:810-812）、又は１９Ｓ  ＣａＭＶプロモーター（米国特許第５，３５２，６０５号；ＷＯ８４／０２９１３号；Benfeyら(1989) EMBO J 8:2195-2202）が特に好ましい。別の好適な構成的プロモーターは、イネアクチンプロモーター（McElroyら(1990) Plant Cell 2:163-171）、ルビスコ小サブユニット（ＳＳＵ）プロモーター（米国特許第４，９６２，０２８号）、レグミンＢプロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ０３６７７）、アグロバクテリウム由来ノパリンシンターゼプロモーター、ＴＲデュアルプロモーター、アグロバクテリウム由来ＯＣＳ（オクトピンシンターゼ）プロモーター、ユビキチンプロモーター（Holtorfら(1995) Plant Mol Biol 29:637-649）、ユビキチン１プロモーター（Christensenら(1989) Plant Mol. Biol. 12:619-632；Christensenら(1992) Plant Mol Biol 18:675-689；Bruceら(1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:9692-9696）、Ｓｍａｓプロモーター、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼプロモーター（米国特許第５，６８３，４３９号）、液胞ＡＴＰアーゼサブユニットプロモーター、ｐＥＭＵプロモーター（Last DIら(1991) Theor. Appl. Genet. 81, 581-588）；ＭＡＳプロモーター（Veltenら(1984) EMBO J. 3(12):2723-2730）、及びトウモロコシＨ３ヒストンプロモーター（Lepetitら(1992) Mol Gen Genet 231:276-285；Atanassovaら(1992) Plant J 2(3):291-300）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）ニトリラーゼ−１遺伝子プロモーター（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ３８８４６、ヌクレオチド３８６２〜５３２５又は５３４２）、又はコムギ由来の高プロリンタンパク質のプロモーター（ＷＯ９１／１３９９１号）、植物において構成的発現される遺伝子のさらなるプロモーターである。
【０１３８】
（ｂ）組織特異的又は組織選択的プロモーター
さらに好ましいのは、種子に対して特異性を有するプロモーターであり、例えば、ファセオリンプロモーター（米国特許第５，５０４，２００号；Bustosら(1989) Plant Cell 1(9):839-53；Muraiら, Science 23:476-482(1983)；Sengupta-Gopalanら(1985) Proc. Natl Acad. Sci. USA 82:3320-3324）、２Ｓアルブミン遺伝子プロモーター（Joseffsonら(1987) J Biol Chem 262:12196-12201）、レグミンプロモーター（Shirsatら(1989) Mol Gen Genet 215:326-331）、ＵＳＰ（未知種子タンパク質）プロモーター（Baumleinら(1991a) Mol Gen Genet 225(3):459-467）、ナピン遺伝子プロモーター（米国特許第５，６０８，１５２号；Stalbergら(1996) Planta 199:515-519）、スクロース結合タンパク質のプロモーター（ＷＯ００／２６３８８号）、又はレグミンＢ４プロモーター（ＬｅＢ４；Baumleinら(1991b) Mol Gen Genet 225:121-128；Beckerら(1992) Plant Mol. Biol. 20:49）、シロイヌナズナ（Arabidopsis）オレオシンプロモーター（ＷＯ９８／４５４６１号）、及びアブラナ（Brassica）Ｂｃｅ４プロモーター（ＷＯ９１／１３９８０号）等である。さらに好ましいのは、葉特異的及び光誘導性プロモーター、例えばｃａｂ又はルビスコ由来のもの等（Simpsonら(1985) EMBO J 4:2723-2729；Timkoら(1985) Nature 318:579-582）；葯特異的プロモーター、例えばＬＡＴ５２に由来するもの等（Twellら(1989b) Mol Gen Genet 217:240-245）；花粉特異的プロモーター、例えばＺｍｌ３に由来するもの等（Guerreroら(1993) Mol Gen Genet 224:161-168）；及び小胞子選択的プロモーター、例えばａｐｇに由来するもの等（Twellら(1983) Sex. Plant Reprod. 6:217-224）である。
【０１３９】
（ｃ）化学誘導性プロモーター
発現カセットはまた、化学誘導性プロモーター（概要文献：Gatzら(1997) Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 48:89-108）を含んでもよく、これにより植物中の外因性遺伝子の発現が特定の時点に制御できる。例えば、ＰＲＰ１プロモーター（Wardら(1993) Plant Mol Biol 22:361-366）、サリチル酸誘導性プロモーター（ＷＯ９５／１９４４３号）、ベンゼンスルホンアミド誘導性プロモーター（ＥＰ０  ３８８  １８６）、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Gatzら(1991) Mol Gen Genetics 227:229-237；Gatzら(1992) Plant J 2:397-404）、アブシジン酸誘導性プロモーター（ＥＰ０  ３３５  ５２８）、又はエタノール−シクロヘキサノン誘導性プロモーター（ＷＯ９３／２１３３４号）等のプロモーターも同様に使用できる。同じく適しているのは、グルタチオン−ＳトランスフェラーゼイソフォームＩＩ遺伝子のプロモーター（ＧＳＴ−ＩＩ−２７）であり、これは例えばＮ，Ｎ−ジアリル−２，２−ジクロロアセトアミド（ＷＯ９３／０１２９４号）等の外因的に適用される安全化剤により活性化することができ、単子葉及び双子葉の両方の多数の組織において作用可能である。本発明で利用可能な誘導性プロモーターの更なる例としては、銅に応答するＡＣＥ１系に由来するもの（Mettら(1993) Proc Natl Acad Sci USA 90:4567-4571）；又はベンゼンスルホンアミド除草剤安全化剤に応答するトウモロコシ由来のＩｎ２プロモーター（Hersheyら(1991) Mol Gen Genetics 227:229-237；Gatzら(1994) Mol Gen Genetics 243:32-38）が挙げられる。通常は植物が応答しない誘導剤に応答するプロモーターを利用することができる。誘導性プロモーターの例は、ステロイドホルモン遺伝子由来の誘導性プロモーターであり、この転写活性は糖質コルチコステロイドホルモンにより誘導される（Schenaら(1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:10421）。
【０１４０】
特に好ましいのは構成的プロモーターである。さらに、プロモーターは、発現対象の核酸配列と機能的に結合して、更なる植物組織又は他の生物（例えば、大腸菌等）における発現を可能にするものでありうる。適切な植物プロモーターは、原則として、上記プロモーター全てである。
【０１４１】
遺伝エレメント及び／又は発現カセットは、プロモーターに加えてさらなる遺伝子制御配列を含み得る。「遺伝子制御配列」という用語は、広い意味で理解されるものであり、本発明の発現カセットの実現化又は機能に効果を有する配列を全て指す。例えば、遺伝子制御配列は、原核生物又は真核生物における転写及び翻訳を改変する。本発明の発現カセットは、組換え発現させようとする対象の核酸配列の５’側上流かつターミネーター配列の３’側下流において、植物において機能的なプロモーターを追加の遺伝子制御配列として、そして適切であればさらなる従来の調節エレメントを包含することが好ましい（いずれの場合も組換え発現させようとする核酸配列と機能的に結合している）。
【０１４２】
遺伝子制御配列はさらに、例えばアクチン−１イントロン又はＡｄｈ１−Ｓイントロン１、２及び６等、遺伝子の５’非翻訳領域、イントロン又は非コード３’領域をも含む（概要文献：The Maize Handbook, Chapter 116, Freeling及びWalbot編, Springer, New York (1994)）。これらは、遺伝子発現の調節において重要な役割を果たし得ることが実証されている。従って、５’非翻訳配列が、異種遺伝子の一過性発現を増強できることが実証されている。例示することができる翻訳エンハンサーの例としては、タバコモザイクウイルス５’リーダー配列（Gallieら(1987) Nucl Acids Res 15:8693-8711）等がある。さらに、これらは組織特異性を促進し得る（Rouster Jら(1988) Plant J 15:435-440）。
【０１４３】
発現カセットは、核酸配列の組換え発現を増大することができる、プロモーターと機能的に結合した１つ以上のエンハンサー配列を都合よく含み得る。追加の都合の良い配列、例えばさらなる調節エレメント又はターミネーター等も、組換え発現しようとする核酸配列の３’末端に挿入され得る。制御配列として好適なポリアデニル化シグナルは、植物ポリアデニル化シグナル、好ましくはアグロバクテリウム・ツメファシエンスからのＴ−ＤＮＡポリアデニル化シグナルに本質的に対応するもの、特にＯＣＳ（オクトピンシンターゼ）ターミネーター及びＮＯＳ（ノパリンシンターゼ）ターミネーターである。
【０１４４】
制御配列は、挿入配列をゲノムから除去させるものとしてさらに理解される。ｃｒｅ／ｌｏｘに基づく方法（Sauer(1998) Methods 14(4):381-92；Odellら(1990) Mol Gen Genet 223:369-378；Dale及びOw(1991) Proc Natl Acad Sci USA 88:10558-10562）、ＦＬＰ／ＦＲＴ（Lysnik (1993) Nucl Acid Res 21:969-975）、又はＡｃ／Ｄｓ系（Waderら(1987) TOMATO TECHNOLOGY 189-198(Alan R. Liss, Inc.）；米国特許第５，２２５，３４１号；Bakerら(1987)EMBO J 6:1547-1554；Lawsonら(1994) Mol Gen Genet 245:608-615）は、宿主生物のゲノムからの特定のＤＮＡ配列の除去、適当な場合には組織特異的及び／又は誘導可能な除去を可能にする。制御配列は、この目的においては、その後の（例えば、ｃｒｅリコンビナーゼによる）除去を可能にする特異的なフランキング配列（例えば、ｌｏｘ配列）を意味し得る。
【０１４５】
本発明の遺伝エレメント及び／又は発現カセットは、さらなる機能的エレメントを含み得る。機能的エレメントという用語は、広い意味で理解されるべきであり、本発明による遺伝エレメント、発現カセット又は組換え生物の作製、増幅又は機能に対して影響を有する全てのエレメントを含む。機能的エレメントは、例えば、以下を含み得る（ただし、これらに限定されない。
【０１４６】
１．選択マーカー遺伝子
選択マーカー遺伝子は、形質転換が成功した細胞又は相同組換え細胞を選択及び分離するのに有用である。本発明の方法においては、一方のマーカーを原核宿主における選択のために採用し、他方のマーカーを真核宿主（特に植物種宿主）における選択のために採用することが好ましい。マーカーは、抗生物質、毒素、重金属等の殺生物剤に対する防御であってもよいし、又は相補（complementation）により機能して、栄養要求性宿主に原栄養（prototrophy）を与えるものであってもよい。植物のための好ましい選択マーカー遺伝子としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１４７】
１．１  陰性選択マーカー
陰性選択マーカーは、代謝阻害剤（例えば、２−デオキシグルコース−６−リン酸、ＷＯ９８／４５４５６号）、抗生物質（例えば、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、若しくはハイグロマイシン）、又は除草剤（例えば、ホスフィノトリシン若しくはグリホセート）等の殺生物性化合物に対する耐性を付与する。特に好ましい陰性選択マーカーは、除草剤に対する耐性を付与するものである。例示することができる例は以下のとおりである：
−ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ；ＢｉａｌｏｐｈｏｓＴＭ耐性とも呼ばれる；ｂａｒ；De Blockら(1987) Plant Physiol 91:694-701；ＥＰ  ０  ３３３  ０３３；米国特許第４，９７５，３７４号）、
−グリホセートＴＭ（Ｎ−（ホスホノメチル）グリシン）に対する耐性を付与する、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ；米国特許第５，６３３，４３５号）又はグリホセート酸化還元酵素遺伝子（米国特許第５，４６３，１７５号）（Shahら(1986) Science 233:478）、
−グリホセートＴＭ分解酵素（グリホセートＴＭ酸化還元酵素；ｇｏｘ）、
−ＤａｌａｐｏｎＴＭ不活性化脱ハロゲン酵素（ｄｅｈ）、
−スルホニル尿素及びイミダゾリノン不活性化アセト乳酸シンターゼ（例えば、Ｓ４及び／又はＨｒａ突然変異を有するＡＬＳ突然変異体）、
−ブロモキシニルＴＭ分解ニトリラーゼ（ｂｘｎ）、
−例えばネオマイシンホスホトランスフェラーゼをコードするカナマイシン又はＧ４１８耐性遺伝子（ＮＰＴＩＩ；ＮＰＴＩ）（Fraleyら(1983) Proc Natl Acad Sci USA 80:4803）（これらは、抗生物質カナマイシン、並びに関連抗生物質であるネオマイシン、パロモマイシン、ゲンタマイシン及びＧ４１８に対する耐性を付与する酵素を発現する）、
−２−デスオキシグルコースに対する耐性を付与する２−デオキシグルコース−６−リン酸ホスファターゼ（ＤＯＧＲ１遺伝子産物；ＷＯ９８／４５４５６号；ＥＰ０  ８０７  ８３６）（Randez-Gilら(1995)Yeast 11:1233-1240）、
−ハイグロマイシンに対する耐性を媒介するハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）（Vanden Elzenら(1985) Plant Mol Biol. 5:299）、
−ジヒドロ葉酸還元酵素（Eichholtzら(1987)Somatic Cell and Molecular Genetics 13:67-76）。
【０１４８】
抗生物質に対する耐性を付与する細菌由来の追加の陰性選択マーカー遺伝子としては、抗生物質スペクチノマイシンに対する耐性を付与するａａｄＡ遺伝子、ゲンタマイシンアセチルトランスフェラーゼ、ストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）、アミノグリコシド−３−アデニルトランスフェラーゼ、及びブレオマイシン耐性決定基が挙げられる（Hayfordら(1988) Plant Physiol. 86:1216；Jonesら(1987) Mol. Gen. Genet., 210:86；Svabら(1990) Plant Mol. Biol. 14:197；Hilleら(1986) Plant Mol. Biol. 7:171）。
【０１４９】
特に好ましいのは、Ｄ−アミノ酸（例えば、Ｄ−アラニン及びＤ−セリン）によって現れる毒性作用に対する耐性を付与する陰性選択マーカーである（ＷＯ０３／０６０１３３）。この関連で陰性選択マーカーとして特に好ましいのは、酵母ロドトルラ・グラシリス（Rhodotorula gracilis）（ロドスポリジウム・トルロイデス（Rhodosporidium toruloides））由来のｄａｏＩ遺伝子（ＥＣ：１．４．３．３：ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｕ６００６６）、及び大腸菌遺伝子ｄｓｄＡ（Ｄ−セリンデヒドラターゼ（Ｄ−セリンデアミナーゼ［ＥＣ：４．３．１．１８；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：Ｊ０１６０３］））である。
【０１５０】
１．２  陽性選択マーカー
陽性選択マーカーは、非形質転換のものと比べて、形質転換された植物に成長的利点を付与する。アグロバクテリウム・ツメファシエンス由来のイソペンテニルトランスフェラーゼ（株：ＰＯ２２；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号：ＡＢ０２５１０９）等の遺伝子は、サイトカイニン生合成の主要な酵素として、（例えば、サイトカイニンを含まない培地上での選択により）形質転換された植物の再生を促す。対応する選択方法は記載されている（Ebinumaら(2000) Proc Natl Acad Sci USA 94:2117-2121；Ebinumaら(2000) Selection of Marker-free transgenic plants using the oncogenes (ipt, rol A, B, C) of Agrobacterium as selectable markers, Molecular Biology of Woody Plant, Kluwer Academic Publishersに掲載）。非形質転換のものと比べて、形質転換された植物に成長的利点を付与する追加的な陽性選択マーカーは、例えばＥＰ−Ａ  ０  ６０１  ０９２に記載されている。成長刺激選択マーカーとしては、βグルクロニダーゼ（例えば、サイトカイニングルクロニドとの組合せ）、マンノース−６−リン酸イソメラーゼ（マンノースとの組合せ）、ＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼ（例えば、ガラクトースとの組合せ）があり（ただし、これらに限定されない）、マンノース−６−リン酸イソメラーゼとマンノースとの組合せが特に好ましい。
【０１５１】
１．３  対抗（ｃｏｕｎｔｅｒ）選択マーカー
対抗選択マーカーは、該マーカーを含む特定の欠失配列を有する生物を選択するのに特に適している（Koprekら(1999) Plant J 19:719-726）。陰性選択マーカーの例としては、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、シトシンデアミナーゼ（Gleaveら(1999) Plant Mol Biol. 40(2):223-35；Pereraら(1993) Plant Mol. Biol 23:793-799；Stougaard(1993) Plant J 3:755-761）、シトクロムＰ４５０タンパク質（Koprekら(1999) Plant J 19:719-726）、ハロアルカン脱ハロゲン酵素（Naested(1999) Plant J 18:571-576）、ｉａａＨ遺伝子産物（Sundaresanら 1995）、シトシンデアミナーゼｃｏｄＡ（Schlaman及びHooykaas(1997) Plant J 11:1377-1385）、又はｔｍｓ２遺伝子産物（Fedoroff及びSmith(1993)Plant J 3:273-289）が挙げられる。
【０１５２】
２．レポーター遺伝子
さらに、選択マーカー遺伝子という用語は、形質転換された細胞又は生物の同定及び／又は選択を可能にする他の遺伝子、例えばそのような形質転換された細胞の可視的なスクリーニング及び同定を（植物毒性化合物を適用することなく）可能にするレポーター遺伝子などをさらに含み得る。上記レポーター遺伝子の一部は、同定のための基質の添加を必要としうるが（ＧＵＳ遺伝子等）、その他はそのような基質がなくても機能する（ＧＦＰ等）。
【０１５３】
レポーター遺伝子は、容易に定量可能なタンパク質をコードし、それらの色又は酵素活性を介して、形質転換有効性、発現の部位、又は発現時間の評価を可能にする。この目的のために特にとても好ましいのは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）（Sheenら(1995) Plant J 8(5):777-784；Haseloffら(1997) Proc Natl Acad Sci USA 94(6):2122-2127；Reichelら(1996) Proc Natl Acad Sci USA 93(12):5888-5893；Tianら(1997) Plant Cell Rep 16:267-271；ＷＯ９７／４１２２８号；Chuiら(1996) Curr Biol 6:325-330；Leffelら(1997) Biotechniques 23(5):912-8）、サンゴ礁タンパク質（Wenckら(2003) Plant Cell Reporter 22:241-251）、クロラムフェニコールトランスフェラーゼ、ルシフェラーゼ（Owら(1986) Science 234:856-859；Millarら(1992) Plant Mol Biol Rep 10:324-414）、エクオリン遺伝子（Prasherら(1985) Biochem Biophys Res Commun 126(3):1259-1268）、β−ガラクトシダーゼ、Ｒ遺伝子座の遺伝子（植物組織中でのアントシアニン色素（赤色）の生成を調節することで、さらなる補助的物質又は発色基質を添加すること無しにプロモーター活性の直接的な分析を可能にするタンパク質をコードする）（Dellaportaら(1988):Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18th Stadler Genetics Symposium, 11:263-282に掲載；Ludwigら(1990) Science 247:449）等のレポータータンパク質（Schenborn, Groskreutz (1999) Mol Biotechnol 13(1):29-44）をコードする遺伝子であり、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）が特にとても好ましい（Jefferson(1987b) Plant Mol. Bio. Rep., 5:387-405；Jeffersonら(1987a) EMBO J 6:3901-3907）。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現は、組織と５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロン酸とのインキュベーションの際の青い色により検出され、細菌ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）発現は発光により検出され、ホタルルシフェラーゼ（ＬＵＣ）発現はルシフェリンとのインキュベーション後の発光により検出され、ガラクトシダーゼ発現は組織を５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシドで染色した後の明るい青色により検出される。レポーター遺伝子はまた、抗生物質耐性マーカーの代替物として、スコア可能なマーカーとしても用いることができる。このようなマーカーは、導入遺伝子の発現の存在を検出するため又は発現レベルを測定するために使用される。遺伝子的に改変された細胞を同定又は標識するために植物においてスコア可能なマーカーを使用するのは、細胞の改変効率が高い場合にのみうまく作用する。
【０１５４】
３．例えば大腸菌における本発明の発現カセット又はベクターの増幅を確実にする複製起点
例示することができる例は、ＯＲＩ（ＤＮＡ複製起点）、ｐＢＲ３２２  ｏｒｉ又はＰ１５Ａ  ｏｒｉである（Maniatis 1989）。大腸菌において機能的な複製系のさらなる例は、ＣｏｌＥ１、ｐＳＣ１０１、ｐＡＣＹＣ１８４等である。大腸菌複製系に加えて又はその代わりに、Ｐ−１不適合プラスミドの複製系（例えば、ｐＲＫ２９０）等の宿主範囲の広い複製系が採用できる。これらのプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡを植物種宿主に導入するための毒性（armed）及び安全化Ｔｉ−プラスミドで特に有効である。
【０１５５】
４．例えば、Ｔ−ＤＮＡ又はｖｉｒ領域の右側及び／又は任意により左側の境界配列等のアグロバクテリウム媒介植物形質転換に必要なエレメント。
【０１５６】
本明細書で開示する及び特許請求の範囲に記載する組成物及び方法は全て、本開示を踏まえて過度の実験を必要とせずに構成及び実行できる。本発明の組成物及び方法は、好適な実施形態について記載してきたが、当業者には、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の組成物、方法、方法のステップ、又は方法のステップの順序に変更を加えることが可能であることが明らかであろう。さらには、化学的かつ生理学的に関連する特定の物質が、本明細書に記載の物質に置き換わることができ、同じ又は同様の結果が得られることが明らかであろう。当業者に明らかなこのような同様の代替及び変更は、添付の特許請求の範囲に定義される本発明の精神、範囲及び概念の内にあるとみなされる。本明細書中で言及する全ての刊行物及び特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の技術レベルを示す。全ての刊行物及び特許出願は、個々の刊行物又は特許出願を具体的かつ個別に参照により本明細書に援用するのと同じ意味合いで、参照により本明細書に援用する。
【０１５７】
実施例
特に明記しない限り、全ての化学物質はMallinckrodt Baker, Inc.（Phillipsburg, NJ, USA）、Phytotechnology Laboratories（Shawnee Mission, KS, USA）、EMD Chemicals, Inc.（Gibbstown, NJ, USA）、及びSigma（St. Louis, MO, USA）から入手した。
【０１５８】
Ａ．培地中で使用するストック
１．Ｂ５主要塩（major salts）
ａ．  ０．２５Ｍ  ＫＮＯ３（硝酸カリウム）
ｂ．  ０．０１Ｍ  ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ（塩化カルシウム）
ｃ．  ０．０１Ｍ  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（硫酸マグネシウム）
ｄ．  ０．０１Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４（硫酸アンモニウム）
ｅ．  ０．０１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４＊Ｈ２Ｏ（リン酸ナトリウム）。
【０１５９】
２．Ｂ５副次塩（minor salts）
ａ．  ５ｍＭ  Ｈ３ＢＯ３（ホウ酸）
ｂ．  １０ｍＭ  ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（硫酸マンガン）
ｃ．  ０．７ｍＭ  ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（硫酸亜鉛）
ｄ．  ０．４５ｍＭ  Ｋｌ（ヨウ化カリウム）
ｅ．  ０．１ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（モリブデン酸）
ｆ．  ０．０１ｍＭ  ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（硫酸銅）
ｇ．  ０．０１ｍＭ  ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（塩化コバルト）。
【０１６０】
３．Ｂ５ビタミン
ａ．  ０．０５５Ｍ  Ｍｙｏ−イノシトール
ｂ．  ０．８ｍＭ  ニコチン酸
ｃ．  ０．５ｍＭ  ピリドキシン−ＨＣｌ
ｄ．  ３ｍＭ  チアミン−ＨＣｌ。
【０１６１】
４．ＭＳ主要塩
ａ．  ０．２Ｍ  ＮＨ４ＮＯ３（硝酸アンモニウム）
ｂ．  ０．２Ｍ  ＫＮＯ３（硝酸カリウム）
ｃ．  ３０ｍＭ  ＣａＣｌ２＊２Ｈ２Ｏ（塩化カルシウム）
ｄ．  １５ｍＭ  ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（硫酸マグネシウム）
ｅ．  １２．５ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４（リン酸カリウム）。
【０１６２】
５．ＭＳ副次塩
ａ．  １０ｍＭ  Ｈ３ＢＯ３（ホウ酸）
ｂ．  １３ｍＭ  ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（硫酸マンガン）
ｃ．  ３ｍＭ  ＺｎＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（硫酸亜鉛）
ｄ．  ０．５ｍＭ  ＫＩ（ヨウ化カリウム）
ｅ．  ０．１ｍＭ  Ｎａ２ＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（モリブデン酸）
ｆ．  ０．０１ｍＭ  ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（硫酸銅）
ｇ．  ０．０１ｍＭ  ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（塩化コバルト）。
【０１６３】
６．ＭＳＩＩＩ鉄
ａ．  １０ｍＭ  ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（硫酸第一鉄）
ｂ．  １０ｍＭ  Ｃ１０Ｈ１４Ｏ８Ｎａ２Ｎ２＊２Ｈ２Ｏ（ＮａＥＤＴＡ）。
【０１６４】
Ｂ．培地の組成
特に以下に明記しない限り、培地は、本発明の方法のための３つの好適な外植片組織全てに採用できる。３つの方法は以下の通り省略する：
ａ）方法Ａ：幼苗腋生分裂組織−幼苗全体を用いる
ｂ）方法Ｂ：葉腋分裂組織−腋生分裂組織が葉の葉柄に付いたままとなるように、第一葉又は第二葉以上の葉を切る
ｃ）方法Ｃ：増殖させた腋生分裂組織（詳細については上記及び以下を参照）。
【０１６５】
１．２５×１００ｍｍペトリ皿又はＰｌａｎｔｃｏｎＴＭ（Sigma）培養ボックスに入った発芽培地ＧＭ（固体）：
ａ．１×Ｂ５主要塩、
ｂ．１×Ｂ５副次塩、
ｃ．１×ＭＳＩＩＩ鉄、
ｄ．２％スクロース、
ｅ．１×Ｂ５ビタミン、
ｆ．５ｕＭ  ＢＡＰ（任意）、
ｇ．０．８％精製寒天（Sigma）；
ｈ．ｐＨ５．８。
【０１６６】
２．エルレンマイヤーフラスコ又は１５×１００ｍｍペトリ皿に入ったＹＥＰ培地（固体及び液体）：
ａ．１０ｇＬバクトペプトン（Difco; Becton Dickinson & Co., Cockeysville, MD, USA）、
ｂ．５ｇ／Ｌ  酵母抽出物（Difco）、
ｃ．５ｇ／Ｌ  ＮａＣｌ、
ｄ．選択に適した抗生物質、
ｅ．１．２％粒状寒天（Difco）固体のみ；
ｆ．ｐＨ７．０。
【０１６７】
３．２５×１００ｍｍペトリ皿に入った増殖培地ＭＯＤＰＲＯＰ（固体）：（方法Ｃ）
ａ．１×ＭＳ主要塩、
ｂ．１×ＭＳ副次塩、
ｃ．１×ＭＳＩＩＩ鉄、
ｄ．１×Ｂ５ビタミン、
ｅ．３％スクロース、
ｆ．０．２２〜１．１２ｍｇ／Ｌ（１μＭ〜５μＭ）ＢＡＰ（好ましく約１μＭ）、
ｇ．０．８％精製寒天（Sigma）；
ｈ．ｐＨ５．８。
【０１６８】
４．共存培養培地ＣＣＭ（液体）：
ａ．１／１０×Ｂ５主要塩、
ｂ．１／１０×Ｂ５副次塩、
ｃ．１／１０×ＭＳＩＩＩ鉄、
ｄ．１×Ｂ５ビタミン、
ｅ．３％スクロース、
ｆ．２０ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ；ＭＷ＝２１３．２６ｇ／Ｍｏｌ）、
ｇ．２００μＭアセトシリンゴン（ＡＳ）、
ｈ．０．７２μＭ〜１．４４μＭ  ＧＡ３（ジベレリン酸；ＭＷ＝３４６．３８ｇ／Ｍｏｌ）、
ｉ．ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン；ＭＷ＝２２５．２５ｇ／ｍｏｌ）：７．５μＭ、
ｊ．方法Ｃのみ：４００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（３．３ｍＭ）（Sigma）；
ｋ．ｐＨ５．４。
【０１６９】
５．１５×１００ｍｍペトリ皿に入った共存培養培地ＣＣＭ（固体）：
ａ．１／１０×Ｂ５主要塩、
ｂ．１／１０×Ｂ５副次塩、
ｃ．１／１０×ＭＳＩＩＩ鉄、
ｄ．１×Ｂ５ビタミン、
ｅ．３％スクロース、
ｆ．２０ｍＭ  ２−［Ｎ−モルホリノ］エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、
ｇ．２００μＭアセトシリンゴン（ＡＳ）、
ｈ．０．７２μＭ〜１．４４μＭ  ＧＡ３（ジベレリン酸；ＭＷ＝３４６．３８ｇ／Ｍｏｌ）、
ｉ．ＢＡＰ（６−ベンジルアミノプリン；ＭＷ＝２２５．２５ｇ／ｍｏｌ）：７．５μＭ、
ｊ．チオール化合物、
（ｉ）１００〜１０００ｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（ＭＷ＝１２１．１６ｇ／Ｍｏｌ；Sigma）；好ましくは：方法Ｂ及びＣ：４００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（３．３ｍＭ）；方法Ａ：１ｇ／ｌ（８．２５ｍＭ）Ｌ−システイン、
（ｉｉ）０〜１ｍＭ又は１５４．２ｍｇ／Ｌ  ＤＴＴ（Fisher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA）、
（ｉｉｉ）０〜１ｍＭチオ硫酸ナトリウム無水物（１５８．１ｍｇ／Ｌ）又はチオ硫酸ナトリウム五水和物２４５ｍｇ／Ｌ（Mallinckrodt, Paris, KY, USA）、方法Ａ：１ｍＭジチオトレイトール、１ｍＭチオ硫酸ナトリウム、
ｋ．０．５％精製寒天；
ｌ．ｐＨ５．４。
【０１７０】
６．洗浄培地Ｍｏｄｗａｓｈ（液体）：（方法Ｃ）
ａ．１×Ｂ５主要塩、
ｂ．１×Ｂ５副次塩、
ｃ．１×ＭＳＩＩＩ鉄、
ｄ．３％スクロース、
ｅ．１×Ｂ５ビタミン、
ｆ．３０ｍＭ  ＭＥＳ、
ｇ．３５０ｍｇ／Ｌ  ＴｉｍｅｎｔｉｎＴＭ；
ｈ．ｐＨ５．６。
【０１７１】
６．シュート誘導培地ＳＩＭ（液体）：（方法Ａ及びＢ）
ａ．１×Ｂ５主要塩、
ｂ．１×Ｂ５副次塩、
ｃ．１×ＭＳＩＩＩ鉄、
ｄ．１×Ｂ５ビタミン、
ｅ．３％スクロース、
ｆ．３ｍＭ  ＭＥＳ、
ｇ．２．５μＭ  ＢＡＰ（方法Ｂ）、１μＭ〜７．５μＭ（好ましくは１μＭ）ＢＡＰ（方法Ａ）、
ｈ．５μＭカイネチン（方法Ｂのみ）、
ｉ．２５０ｍｇ／Ｌ  ＴｉｍｅｎｔｉｎＴＭ、
ｊ．０．８％精製寒天；
ｋ．ｐＨ５．６。
【０１７２】
５．２０×１００ｍｍペトリ皿に入ったシュート誘導培地ＳＩＭ（固体）：
ａ．１×Ｂ５主要塩、
ｂ．１×Ｂ５副次塩、
ｃ．１×ＭＳＩＩＩ鉄、
ｄ．１×Ｂ５ビタミン、
ｅ．３％スクロース、
ｆ．３ｍＭ  ＭＥＳ、
ｇ．１μＭ〜７．５μＭ（好ましくは約１μＭ）ＢＡＰ（方法Ａ）；２．５μＭ  ＢＡＰ（方法Ｂ）、５．０μＭ  ＢＡＰ（方法Ｃ）、
ｈ．５μＭカイネチン（方法Ａ及びＢのみ）、
ｉ．２５０ｍｇ／Ｌ  ＴｉｍｅｎｔｉｎＴＭ、
ｊ．適切であれば選択化合物、
ｋ．０．８％精製寒天；
ｌ．ｐＨ５．６。
【０１７３】
７．２０×１００ｍｍペトリ皿に入ったシュート伸長培地ＳＥＭ（固体）：
ａ．１×ＭＳ主要塩、
ｂ．１×ＭＳ副次塩、
ｃ．１×ＭＳＩＩＩ鉄、
ｄ．１×Ｂ５ビタミン、
ｅ．３％スクロース、
ｆ．３ｍＭ  ＭＥＳ、
ｇ．５０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−アスパラギン（０．３７８ｍＭ）、
ｈ．１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ピログルタミン酸（０．７７５ｍＭ）、
ｉ．０．１ｍｇ／Ｌ  ＩＡＡ（０．５７μＭ）、
ｊ．０．５ｍｇ／Ｌ  ＧＡ３（１．４４μＭ）、
ｋ．１ｍｇ／Ｌトランスゼアチンリボシド（２．８５μＭ）、
ｌ．２５０ｍｇ／Ｌ  ＴｉｍｅｎｔｉｎＴＭ、
ｍ．適切であれば選択化合物、
ｎ．０．８％精製寒天；
ｏ．ｐＨ５．６。
【０１７４】
７．２５×１００ｍｍ  ＰＹＲＥＸ培養管（Corning Inc., New York, NY, USA）に入った発根培地ＲＭ（固体）：
ａ．１／２×Ｂ５主要塩、
ｂ．１／２×Ｂ５副次塩、
ｃ．１×ＭＳＩＩＩ鉄、
ｄ．２％スクロース、
ｅ．３ｍＭ  ＭＥＳ、
ｆ．１ｍｇ／Ｌ（５μＭ）インドール−ブチル酸（ＩＢＡ，ＭＷ＝２０３．２４ｇ／Ｍｏｌ）（方法Ａ及びＢ）、５μＭ〜１２．５μＭ（好ましくは約５μＭ）ＩＢＡ（方法Ｃ）、
ｇ．０．８％精製寒天；方法Ｃのみ：２５０ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ；
ｈ．ｐＨ５．６。
【実施例１】
【０１７５】
ダイズ種子の滅菌及び発芽
本発明の方法においては、実質的にあらゆるダイズ変種のあらゆる種子を用いることができる。種々のダイズ品種（Ｊａｃｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２及びＲｅｓｎｉｋを含む）がダイズ形質転換に好適である。ダイズ種子は、ぴったり閉まる蓋を有するデシケーター中で３．５ｍｌの１２Ｎ  ＨＣｌを１００ｍｌの漂白剤（５．２５％次亜塩素酸ナトリウム）に滴下することにより発生する塩素ガスを用いてチャンバー内で滅菌した。チャンバー内で２４〜４８時間後、種子を取り出し、約１８〜２０の種子を２５×１００ｍｍペトリ皿において５μＭ  ６−ベンジル−アミノプリン（ＢＡＰ）を含む又は含まない固形ＧＭ培地上に播く。ＢＡＰを用いない場合の幼苗はより長く伸長し、根が発達するが、特に二次根及び側根の形成が生じる。ＢＡＰは、低く頑丈な幼苗の形成により幼苗を強化する。
【０１７６】
明条件（＞１００μＭ／ｍ２ｓ）下で２５℃にて成長させた７日齢幼苗を３種の外植片のための外植片材料に用いる（図２）。このとき、種皮が割れ、単葉の葉を有する上胚軸が少なくとも子葉の長さまで成長している。子葉節組織を回避するため、上胚軸は少なくとも０．５ｃｍである必要がある（ダイズ品種及び種地は発育時期が多様であるため、発芽段階の説明は特定の発芽時間よりも正確である）。
【０１７７】
方法Ｃについては、各幼苗から、胚軸と、両方の子葉の一方及び半分又は一部を取り除く。続いて幼苗を２〜４週間にわたり増殖培地（propagating medium）上に置く。幼苗はいくつかの分枝シュートを生じ、そこから外植片を得る（図３Ａ）。外植片の大部分は頂芽から成長する小植物体に由来する。これらの外植片を標的組織として用いることが好ましい。
【０１７８】
このようにして、幼苗を、幼苗全体（方法Ａ）又は葉外植片（方法Ｂ）の接種について形質転換の準備を整える（図５及び８）。
【実施例２】
【０１７９】
アグロバクテリウムの増殖及び培養液の調製
アグロバクテリウム培養液は、所望のバイナリーベクターを有するアグロバクテリウム（例えばＡ．ツメファシエンス又はＡ．リゾゲネス）を固形ＹＥＰ成長培地（growth medium）上に画線し、コロニーが出現するまで（約２日間）２５℃にてインキュベートすることにより調製する。Ｔｉ又はＲｉプラスミドに存在する選択マーカー遺伝子、バイナリーベクター及び細菌染色体に応じて、異なる選択化合物をＹＥＰ固形及び液体培地におけるＡ．ツメファシエンス及びリゾゲネス選択のために用いうる。種々のアグロバクテリウム菌株を形質転換法に用いることができる（上記及び下記実施例７参照）。
【０１８０】
約２日後、単一コロニーを（滅菌楊枝を用いて）拾い、５０ｍｌの液体ＹＥＰに抗生物質を接種し、１７５ｒｐｍ（２５℃）でＯＤ６００が０．８〜１．０に達するまで（約２日）振とうする。形質転換用の加工グリセロールストック（１５％）を調製し、１ｍｌのアグロバクテリウムストックを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに分注した後、−８０℃で保存する。
【０１８１】
外植片接種の前日に、５００ｍｌエーレンマイヤーフラスコにおいて２００ｍｌのＹＥＰに５μｌ〜３ｍｌの加工アグロバクテリウムストックを接種する。フラスコを一晩２５℃にてＯＤ６００が０．８〜１．０となるまで振とうする。ダイズ外植片を調製する前に、アグロバクテリウムを５，５００×ｇで２０℃にて１０分間遠心することによりペレットにする。そのペレットを液体ＣＣＭ中に所望の密度（ＯＤ６０００．５〜０．８）で再懸濁し、使用前に室温で少なくとも３０分間放置する。
【実施例３】
【０１８２】
外植片の調製及び共存培養（接種）
３．１  方法Ａ：形質転換当日における外植片の調製
この時点の幼苗は、上胚軸が少なくとも０．５ｃｍ伸長しているが、一般的には０．５〜２ｃｍである。長さが最大４ｃｍまで伸長した上胚軸を用いることができる。続いて、外植片を、以下を用いて調製する：
（ｉ）ある程度の根を有する又は有しない
（ｉｉ）部分的、一方又は両方の子葉を有する。既に形成された葉は頂端分裂組織を含めて全て取り除き、最初の葉群に位置する節を、鋭いメスを用いていくつか切り込みを入れて損傷させる（図５参照）。
【０１８３】
節におけるこの切り込みは、アグロバクテリウム感染を誘導するだけではなく、腋生分裂組織細胞を分布させ、既に形成されたシュートに損傷を与える。損傷及び調製の後、外植片をペトリ皿中に取り、続いてＣＣＭ／アグロバクテリウム液体混合物と共に３０分間共存培養する。次に、外植片を液体培地から取り出し、固形共存培養培地を含む１５×１００ｍｍペトリ皿上の滅菌ろ紙の上に置く。損傷した標的組織は、それらが培地と直接接触するように配置する。
【０１８４】
３．２  方法Ａの変法：上胚軸外植片の調製
４〜８日齢の幼苗から調製したダイズ上胚軸部分を再生及び形質転換のための外植片として用いた。ダイズ品種Ｌ００１０６ＣＮ、９３−４１１３１及びＪａｃｋの種子を、サイトカイニンを含む又は含まない１／１０ＭＳ塩又は同様の組成の培地において４〜８日かけて発芽させた。上胚軸外植片は、茎部から子葉節及び茎節を除去することにより調製した。上胚軸を２〜５の部分に切断した。腋生分裂組織を含む第一節又は第二節以上の節に付いた部分が特に好ましい。
【０１８５】
外植片をアグロバクテリウム感染に用いた。ＧＵＳマーカー遺伝子及びＡＨＡＳ、ｂａｒ又はｄｓｄＡ選択マーカー遺伝子を有するプラスミドを保持するアグロバクテリウムＡＧＬ１を、適当な抗生物質を含むＬＢ培地中で一晩培養し、回収し、アセトシリンゴンを含む接種培地に再懸濁した。新たに調製した上胚軸部分をアグロバクテリウム懸濁液に３０〜６０分間浸漬した後、外植片を滅菌ろ紙でふき取って乾燥させた。続いて接種した外植片を、Ｌ−システイン及びＴＴＤ、並びにＴ−ＤＮＡ送達を増強するための他の化学物質（アセトシリンゴンなど）を含む共存培養培地において２〜４日間培養した。次に、感染した上胚軸外植片を、イマザピル（ＡＨＡＳ遺伝子のため）、グルホシネート（ｂａｒ遺伝子のため）又はＤ−セリン（ｄｓｄＡ遺伝子のため）などの選択薬物を含むシュート誘導培地に置いた。再生したシュートを選択薬物を含む伸長培地上で継代培養した。
【０１８６】
トランスジェニック植物の再生のために、次に上記部分をシュート誘導のためのサイトカイニン（ＢＡＰ、ＴＤＺ及び／又はカイネチンなど）を含む培地において培養した。４〜８週間後、培養した組織を、シュート伸長のための低濃度のサイトカイニンを含む培地に移した。伸長したシュートを、根発達及び植物発育のためのオーキシンを含む培地に移した。複数のシュートが再生した。
【０１８７】
強いＧＵＳ発現を示す多くの安定に形質転換された部分を回収した。上胚軸外植片からダイズ植物が再生した。効率的なＴ−ＤＮＡ送達及び安定に形質転換された部分が証明された。
【０１８８】
３．３  方法Ｂ：葉外植片
葉外植片の調製の詳細を図８に示す。最初に、子葉を胚軸から取り出す。子葉をそれぞれ分離し、上胚軸を除去する。薄膜、葉柄及び托葉からなる第一葉を、腋生分裂組織が外植片に含まれるように托葉の基部で注意深く切断して上胚軸から取り出す。外植片を傷付け、かつ新たなシュート形成を刺激するために、予め形成されているシュートを全て取り除き、托葉の間の領域を鋭いメスで３〜５回切断する。
【０１８９】
外植片の調製の直後に、外植片をアグロバクテリウム懸濁液に完全に浸漬するか又は傷付けた葉柄の末端をアグロバクテリウム懸濁液に浸した。接種後、外植片を滅菌ろ紙でぬぐって過剰のアグロバクテリウム培養液を取り除き、損傷側を有する外植片を、固形ＣＣＭ培地に載せた７ｃｍの円形Ｗｈａｔｍａｎろ紙と接触させる（上記参照）。このろ紙はダイズ外植片におけるＡ．ツメファシエンスの過剰増殖を防止する。５つの皿をＰａｒａｆｉｌｍＴＭ「Ｍ」（American National Can, Chicago, Illinois, USA）で包み、２５℃にて暗条件又は明条件にて３〜５日間インキュベートする。
【０１９０】
３．４  方法Ｃ：増殖させた腋生分裂組織
増殖腋生分裂組織外植片の調製は図３（Ｂ〜Ｅ）に詳細に示す。増殖させた３〜４週齢の小植物体を用いて、腋生分裂組織外植片を第一節から第四節まで調製しうる。各幼苗から平均３〜４の外植片が得られる。節間の腋生節より０．５〜１．０ｃｍ下を切断し、外植片から葉柄及び葉を取り除くことにより、小植物体から外植片を調製する。腋生分裂組織が存在する先端を外科用メスで切断することにより、新たなシュート成長（shoot growth）を誘導し、標的細胞がアグロバクテリウムへと接触可能なようにした。従って、０．５ｃｍの外植片は茎と芽を含む。
【０１９１】
切断直後に外植片をアグロバクテリウム懸濁液に２０〜３０分間入れる。接種後、外植片を滅菌ろ紙でぬぐって過剰なアグロバクテリウム培養液を取り除き、その後、アグロバクテリウム菌株に応じて、固形ＣＣＭ中にほぼ完全に浸漬させるか、又は固形ＣＣＭを積層した７ｃｍの円形ろ紙の上に置く。このろ紙はダイズ外植片におけるアグロバクテリウムの過剰増殖を防止する。皿をＰａｒａｆｉｌｍＴＭ「Ｍ」（American National Can, Chicago, Illinois, USA）で包み、２５℃にて暗条件にて２〜３日間インキュベートする。
【実施例４】
【０１９２】
シュート誘導
２５℃にて暗条件下で３〜５日間共存培養した後、外植片を液体ＳＩＭ培地（過剰のアグロバクテリウムを除去するため）又はＭｏｄｗａｓｈ培地（方法Ｃ）ですすぎ、滅菌ろ紙でぬぐって乾燥させた（特に薄膜への損傷を防ぐため）後、固形ＳＩＭ培地に入れる。約５の外植片（方法Ａ）又は１０〜２０の外植片（方法Ｂ及びＣ）を、標的組織が培地と直接接触するように配置した。最初の２週間では、外植片を選択培地を用いて又は用いないで培養することができる。好ましくは、外植片を１週間にわたり選択を行わないＳＩＭに移す。
【０１９３】
葉外植片（方法Ｂ）については、外植片を、培地の表面に対し垂直となり、葉柄が培地内に埋め込まれ、薄膜は培地の外となるように培地に配置する必要がある。
【０１９４】
増殖させた腋生分裂組織（方法Ｃ）については、外植片を、培地の表面に対し平行となり（求底性）、外植片が部分的に培地内に埋め込まれるように培地に配置する。
【０１９５】
皿をＳｃｏｔｃｈ３９４通気テープ（3M, St. Paul, Minnesota, USA）で包み、平均２５℃の温度で７０〜１００μＥ／ｍ２ｓで１８時間明／６時間暗の周期にて２週間にわたり成育チャンバー（growth chamber）に配置する。種々の光強度及び波長、選択手法、並びにＳＩＭをこの外植片について試験した（実施例９）。外植片は、新たなシュート成長が標的領域（例えば、上胚軸より上にある第一節における腋生分裂組織）において生じるまで、選択あり又はなしのＳＩＭ培地上に残るだろう。この時点で新たな培地への移動を行ってもよい。約１週間後に、外植片を、選択あり又はなしのＳＩＭから選択ありのＳＩＭへと移す。この時点で、種々のＳＩＭにおける葉外植片の葉柄の基部に（方法Ｂ、図９）、幼苗外植片の第一節に（方法Ａ、図７）、そして増殖させた外植片の腋生節に（方法Ｃ、図４）、顕著な新たなシュートが発育する。
【０１９６】
好ましくは、形質転換前に形成される全てのシュートを共存培養後２週間までに取り除き、分裂組織からの新たな成長を刺激する。これにより、一次形質転換体におけるキメラ現象が低減し、トランスジェニック分裂組織細胞の増幅が高まることになる。この時点において、外植片は、より小さな切片へと切断してもよいし又はしなくてもよい（すなわち、上胚軸の切断により外植片から節を分離する）。
【実施例５】
【０１９７】
シュート伸長
ＳＩＭ培地（好ましくは選択あり）で２〜４週間（又はシュートの塊が形成されるまで）後、外植片を、シュート原基のシュート伸長を誘導しうるＳＥＭ培地に移す。この培地は、選択化合物を含んでもよいし又は含まなくてもよい。伸長するシュートの頻度及び長さは、ＳＩＭ中のホルモンレベル、特にＢＡＰによって影響を受ける（実施例９）。
【０１９８】
２〜３週間毎に、死滅組織を注意深く除去した後に外植片を新たなＳＥＭ培地（好ましくは選択を含む）に移す。外植片は、一緒に保持される必要があり、切片に断片化されず、ある程度健常のままである。外植片は、外植片が死滅するか又はシュートを伸長するまで移動を継続する。３ｃｍを超えて伸長したシュートを取り出し、ＲＭ培地に、約１週間（方法Ａ及びＢ）、又は品種に応じて約２〜４週間（方法Ｃ）にわたり配置し、その時点で根が生成し始める。根を有する外植片の場合には、直接土壌に移す。発根したシュートは土壌に移し、成育チャンバーにおいて２〜３週間かけて頑強にした後、温室に移す。この方法を用いて得られる再生植物は生殖能力を有し、植物当たり平均５００個の種子を産生する。
【０１９９】
アグロバクテリウム・ツメファシエンスとの共存培養の５日後の一過性ＧＵＳ発現は、幼苗の腋生分裂組織外植片において広範囲に及び、特に外植片調製過程の損傷領域にあらわれる（方法Ａ、図６、１０）。外植片を選択を行わないシュート誘導培地に入れ、シュート誘導及び再生に対して第一節がどのように応答するかを観察した。ここまでは、７０％を超える外植片がこの領域において新たなシュートを形成した（図７）。ＧＵＳ遺伝子の発現は、ＳＩＭ上で１４日後も安定であり、このことはＴ−ＤＮＡのダイズゲノムへの組込みを示している。さらに、予備実験によって、ＳＩＭ上で３週間後にＧＵＳ陽性シュート形成が生じるという結果が得られた（図７）。
【０２００】
方法Ｃについては、増殖させた腋生分裂組織のプロトコールを用いた場合のダイズ小植物体の平均再生時間は、外植片接種から１４時間である。従って、この方法は、生殖能力のある健常なダイズ植物を得るために再生時間が短いものである。
【実施例６】
【０２０１】
葉外植片におけるシュート再生についての遺伝子型のスクリーニング
種子及び外植片を上述のように調製した。合計１７の異なる品種（Ｓｏｙｇｅｎｅｔｉｃｓから９種及びＤａｉｒｙｌａｎｄから８種）を、５μＭカイネチン及び２．５μＭ  ＢＡＰを含むＳＩＭ上での２週間の後にシュート誘導及び再生についてスクリーニングした。ＧＭ上で８日の後、６種の異なる品種について２０の葉外植片を調製した。１皿当たり１０の外植片として外植片をすぐにＳＩＭ培地上に入れた。実験は３回反復実施した。外植片を、カルス／シュートパッドを形成した外植片の割合について３週間目に評価した。全ての品種が高い割合でカルス／シュートパッドを誘導した。それは、３週間後にシュートパッドを形成する全ての外植片の８５％〜１００％であった。これらの品種は、再生率が９５％を超えた。このことは、葉外植片の葉柄でのカルス／シュートパッドの再生は、この実験に用いたダイズ品種について独立性が高いことを示している。全ての品種が、調製した外植片の８５％を超えてカルス／シュートパッドを発育し、一部の品種は全ての反復実験において全ての外植片でカルス／シュートパッドを発育した。
【実施例７】
【０２０２】
葉外植片におけるＡ．ツメファシエンス及びＡ．リゾゲネスの感染能の評価
ダイズのアグロバクテリウム感染への感受性は、強力なダイズ形質転換系の開発において最も重要なステップの１つである。外植片の切除及び調製時における遺伝子型、発育段階、ホルモンバランス及び環境条件は全て、アグロバクテリウムが特定のダイズ組織に感染する能力に影響を及ぼす。Ａ．ツメファシエンスＡＧＬ１株を用いて、子葉節における腋生分裂組織細胞を標的とすることによりダイズ形質転換の成功が収められている（Olhoft及びSomers (2001) Plants Cell Reports 20:706-711）。Ａ．リゾゲネスＫ５９９株は、毛状根形成の誘導に非常に有効であり、感染子葉の５４〜９５％が種々のダイズ品種から毛状根を発育したことが示されている（Choら(2000) Planta 210:195-204）。この研究には、新しい安全化形態のＡ．リゾゲネスＫ５９９株が使用されていた。本研究においては、Ａ．ツメファシエンス及びリゾゲネスが葉外植片に感染する能力を、一過性ＧＵＳ発現の分析によって評価した。
【０２０３】
２種のアグロバクテリウム株を用いた。すなわち、ＡＧＬ０の誘導株であるＡ．ツメファシエンスＡＧＬ１株（ｒｅｃＡ：：ｂｌａ  ｐＴＩＢｏ５４２ΔＭｏｐ＋ＣＢＲ）（Lazo (1991) Bio/Technology 9:963-967）、及びＡ．リゾゲネスＫ５９９株の安全化株（ＳＨＡ０１６）（ｐＲｉ２６５９）ＴｅｔＲ  ＮＣＰＰＢ  ２６５９（BASF Plant Sciences LLC, 2004）である。両方のアグロバクテリウム株が、強化型ｍａｓプロモーター（ＳｕｐｅｒＰ：ｐＩＶ２ＧＵＳ：ｎｏｓＴ）の制御下にｕｉｄＡ遺伝子を有するバイナリーベクターｐＢＰＳＭＭ１９２ｂを含んだ。外植片接種の前日に、一晩培養物を以下の通り調製した。すなわち、枝付き三角フラスコにおいて適当な抗生物質を含む３０ｍｌのＹＥＰ液体培地に１０〜８０μｌのアグロバクテリウムワーキングストックを接種し、１５０ｒｐｍにて２８℃で１０〜１２時間にわたりオービットシェイカーで振とうした。培養物のＯＤ６００が０．５〜０．８に達した後、５０ｍｌファルコンチューブにおいて３，５００ｒｐｍにて１０分間遠心することにより細胞をペレット化した。細胞を液体ＣＣＭに再懸濁した。
【０２０４】
ダイズ品種（例えばＪａｃｋ）の種子を滅菌し、上述したように幼苗を発芽させた。葉外植片を調製し、アグロバクテリウム／ＣＣＭ懸濁液中に１０〜２０秒間浸漬させ、滅菌ろ紙でぬぐって乾燥させ、４００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（３．３ｍＭ）を含む固形ＣＣＭ上のろ紙の上部に配置した。２日間共存培養した後、葉外植片を液体ＳＩＭですすぎ、続いて２．５μＭ  ＢＡＰ及び５．０μＭカイネチンを含む固形ＳＩＭ上に３日間置いた。この時間の後、一過性ＧＵＳ発現を外植片組織において評価した。２つの実験を実施した。最初の実験では、合計３０の外植片を用いて２回の反復実験を準備し、それにＡＧＬ１を接種した。２つ目の実験では、反復は１回であり、４０の外植片にＡＧＬ１又はＳＨＡ０１６を接種し、接種の５日後にＧＵＳ発現についてアッセイした。
【０２０５】
最初の実験は、ＡＧＬ１が葉外植片に感染する能力を評価した。全ての組織を接種の５日後に一過性発現についてＧＵＳ染色した。外植片の６０％は、腋生分裂組織が位置している葉柄の切断端においてＧＵＳ（＋）巣を有した（表１）。さらに、薄膜を含む外植片の他の領域もまたＧＵＳ＋巣を示した。
【表１】
2008501327.tif 000002
【０２０６】
２つ目の実験においては、Ａ．ツメファシエンスＡＧＬ１株及び安全化Ａ．リゾゲネスＫ５９９株（ＳＨＡ０１６）の両方が、Ｔ−ＤＮＡの葉外植片の葉柄への移入に成功した。ＡＧＬ１を感染させた外植片の４０％が標的領域においてＧＵＳ（＋）巣を示したが、ＳＨＡ０１６は標的領域の４％においてＧＵＳ（＋）巣を示した（表２）。ＳＨＡ０１６を感染させた外植片における一過性ＧＵＳ発現の低減は、主に共存培養過程の組織死の結果であった。
【表２】
2008501327.tif 000003
【０２０７】
これらの結果は、安全化アグロバクテリウム・ツメファシエンス及びリゾゲネスの菌株が、葉外植片における標的領域における細胞又はその付近に位置する細胞にＴ−ＤＮＡを首尾よく送達する能力を示している。
【実施例８】
【０２０８】
外植片の再生及びアグロバクテリウム感染についての共存培養条件の最適化
アグロバクテリウム媒介形質転換法において、共存培養条件の最適化はトランスジェニック植物取得の際の大きな要因である。好適なアグロバクテリウム増殖条件と植物の健常な成育条件のバランスが一致する必要がある。試験対象の一般的な条件としては、光条件、インキュベーションの長さ、温度、アグロバクテリウム細胞密度、及び培地成分が挙げられる。本研究では、光条件、チオール化合物のＣＣＭへの添加（Olhoft及びSomers (2001) Plants Cell Reports 20:706-711）、インキュベーション日数、及び接種方法について全て検討する。
【０２０９】
両方の実験において、ダイズ品種（例えばＪａｃｋ）及びバイナリープラスミドｐＢＰＳＥＷ００８（配列番号１）を含むアグロバクテリウム・ツメファシエンスＡＧＬ１株を用いた。バイナリープラスミドは、ｎｏｓＰ−ｂａｒ−ｎｏｓＴ及びｐＵＢＩ−ｇｕｓＩＮＴ−ｎｏｓＴを含む。前述のように葉外植片及びアグロバクテリウムを調製した。全ての実験に用いた最終的なアグロバクテリウムのＯＤ６００は０．５とした。最初の実験においては、以下の条件について２回の反復実験で試験を行った：
（１）５種のチオールの組み合わせの１つをＣＣＭに添加する（チオールなし、１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（０．８２５ｍＭ）、４００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（３．３ｍＭ）、１０００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（８．２５ｍＭ）、又は１ｍＭチオ硫酸ナトリウム＋１ｍＭ  ＤＴＴ＋１０００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（８．２５ｍＭ））、
（２）２５℃にて、３日、４日又は５日の共存培養、並びに
（３）暗条件、又は１６時間明／８時間暗の光周期で１００μＥ／ｍ２ｓ白色光下でインキュベーションする。
【０２１０】
各実験のために１０の外植片を調製した。外植片はＳＩＭ培地上で２週間成長させ、その後の時点でカルス／シュートパッドを発育する外植片の割合を記録した。
【０２１１】
２つ目の実験においては、外植片を調製した後、全ての葉外植片を５日間共存培養し、外植片全体をアグロバクテリウム／ＣＣＭ懸濁液中に１０分間浸漬するか又は外植片の切断葉柄端を浸す以外は、上記の実験を行った。１０の外植片を処理毎に全体を浸漬させ、４の外植片の端を処理毎に浸した。全ての外植片を共存培養直後にＧＵＳ染色した。
【０２１２】
実験１において、カルス／シュートパッドの再生は、ＣＣＭ中のＬ−システインのレベルによって有意な影響を受けたが、共存培養の光条件又はインキュベーションの日数によっては影響を受けなかった（図１４参照）。チオール化合物を含まないＣＣＭ又は１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（０．８２５ｍＭ）を含むＣＣＭで共存培養した外植片の８０〜１００％は、試験した他の要因に関係なく、葉柄上にカルス／シュートパッドを発育した。しかしながら、４００ｍｇ／Ｌ（３．３ｍＭ）を超えるＬ−システインレベルでは、一貫した結果として薄膜及び葉柄の切断端の漂白によって観察された組織死となった。実験２においては、異なる共存培養条件での外植片におけるＧＵＳ染色によって、４００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（３．３ｍＭ）を超えるチオール条件でのＣＣＭが最適なＴ−ＤＮＡ送達にとって好ましいことが明らかとなった（表３参照）。
【表３】
2008501327.tif 000004
【０２１３】
１０００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システインに供した外植片は有意な漂白を受けたため、これらの外植片上にはＧＵＳ（＋）巣がより少なく観察されたことを説明している。この予備実験はまた、光条件がダイズ細胞へのＴ−ＤＮＡ送達には大きな役割を果たしていないことを示唆している。
【０２１４】
この一連の実験において再生及びＧＵＳ一過性発現の両方に影響を及ぼす主な処理は、ＣＣＭへのチオール化合物の添加であった。試験した他の共存培養条件は、これらの実験で用いた数では再生又はＧＵＳ一過性発現に大きな影響を及ぼさなかった。従って、Ｌ−システインの最適濃度は４００ｍｇ／Ｌ又は３．３ｍＭであることがわかった。
【実施例９】
【０２１５】
葉外植片からのシュートの再生に対するシュート開始培地（ＳＩＭ）の影響
塩、ホルモン、及び光質を含む培養条件は全て植物における再生に対する植物の応答に影響を及ぼす。葉外植片におけるシュートの開始及び再生に対するシュート誘導の過程における無機塩及びホルモンの影響を比較する試験は、キマメ（pigeonpea）で行われている（Dayalら(2003) Plant Cell Rep. 21:1072-1079）。この一連の実験においては、無機塩ＭＳ及びＢ５、サイトカイニンであるＢＡＰ及びカイネチンのレベル、並びに種々の光質について、これらの要因が、葉外植片におけるシュート形成及び伸長にどのように影響を及ぼすかを観察するために試験した。
【０２１６】
葉外植片は、上述したようにＳｏｙｇｅｎｅｔｉｃｓ品種３１（９３−４１１３１）からの７日齢幼苗から調製した。外植片を、ＭＳ塩又はＢ５塩のいずれかと、カイネチン及びＢＡＰの８つの組み合わせのうち１つを含む１６の異なるＳＩＭ培地（基本培地：Ｂ５塩又はＭＳ塩、Ｂ５ビタミン、ＭＳ  ＩＩＩ鉄、３ｍＭ  ＭＥＳ、３％スクロース、０．８％精製寒天、及び２５０〜５００ｍｇ／Ｌ  Ｔｉｍｅｎｔｉｎ）に無作為に配置した。
【表４】
2008501327.tif 000005
【０２１７】
実験１において、各反復実験当たり１６０の外植片を調製し（詳細は上述の通り）、１０の外植片を無作為に１６の異なるＳＩＭ処理のそれぞれに播いて、３回の反復実験を行った。１人の研究者が３回の反復実験全てを準備した。外植片をＳＩＭ上で２週間成長させた後、反復実験２から５つの外植片と反復実験３から５つの外植片をＳＥＭ［１×ＭＳ主要塩、１×ＭＳ副次塩、１×ＭＳＩＩＩ鉄、１×Ｂ５ビタミン、３％スクロース、３ｍＭ  ＭＥＳ、５０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−アスパラギン（０．３７８ｍＭ）、１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−ピログルタミン酸（０．７７５ｍＭ）、０．１ｍｇ／ｌ  ＩＡＡ（０．５７μＭ）、０．５ｍｇ／ｌ  ＧＡ３（１．４４μＭ）、１ｍｇ／ｌ  ＺＲ（２．８５μＭ）、２５０〜５００ｍｇ／Ｌチカルシリン、０．８％精製寒天；ｐＨ５．６］に移して、シュート伸長を誘導した。この実験における外植片は、平均温度２５℃で、白色電球を用いて１００μＥ／ｍ２ｓを超える光強度で１８時間明／６時間暗周期の下でパーシバルチャンバーにおいて成長させた。実験２は、外植片を３人の異なる研究者が調製する３回の反復実験から構成された。各研究者は、１６０の外植片を切断し、１０の外植片を１６の処理それぞれに無作為に配置した。外植片をそれぞれのＳＩＭにおいて２週間成長させた後、全ての外植片をＳＥＭに移した。外植片は、白色ランプ及びＧｒｏＬｕｘランプの構成で６７μＥ／ｍ２ｓを超える光強度にて１６時間明／８時間暗の光周期で成育チャンバーにおいて成長させた。
【０２１８】
ＳＩＭでの成長の２週間後にカルス／シュートパッドを含む外植片の数を記録した。この時点で、両方の実験について、各研究者が、カルス／シュートパッドの発育から観察されるようにＳＩＭ培地に対する外植片の最良の応答の主観的解析を行った。シュート伸長に対するＳＩＭの影響もまたＳＥＭにおいて１８日後及び３６日後に測定した。外植片は、外植片当たりの有意に伸長したシュートの平均数、及び各外植片について最大シュートの平均長について評価した。
【０２１９】
各処理について、シュート原基又は器官形成性カルスの形態の腋生細胞の増殖を示す外植片の数を数えた。２つの実験における全ての反復実験において、平均して、外植片の９８．６％が、腋生細胞が葉柄に含まれるように切断したものだった（表５）。
【表５】
2008501327.tif 000006
【０２２０】
処理間で、特にＢ５塩及びＭＳ塩の基礎培地の間で、カルス／シュートパッド発育に明らかな差異があった。ＭＳ上で成長させた外植片は、深緑色の有意なカルス成長を示したが、Ｂ５上で成長させた外植片は、有意ではないカルス成長を示す淡緑色のシュート原基を主に生じた。ＳＩＭ上で２週間後、各研究者は、最大で最も健常なシュートパッド発育について最良の培地を選択した。外植片でのシュート原基の誘導に最良の培地は、実験１における反復実験２及び３と実験２における３つ全ての反復実験において、３人の研究者全ての観察結果を考慮して選択した。最良の培地は「１」と評価した。いずれの研究者によっても選択されなかった処理はダッシュ記号（−）で示した（表６参照）。
【表６】
2008501327.tif 000007
【０２２１】
この主観解析から、低濃度のＢＡＰを含むＳＩＭ（特にＣ２Ｂ、Ｃ３Ｂ、Ｃ３Ｍ）における外植片が、２週間後により大きくより健常なカルス／シュートパッドを発育した。さらに、Ｂ５塩において成長させた外植片もまた外植片でのシュート誘導において良好に応答した。この研究で用いた光の強度及び波長は、ＳＩＭでの２週間後におけるカルス／シュートパッドの形成に影響を及ぼさなかった。
【０２２２】
外植片当たりの最大シュートの長さ及び外植片当たりの伸長シュートの平均数に対するＳＩＭ中のホルモンの影響は、シュート伸長培地における１８日後の２つの実験でも類似していた（図１２Ａ、Ｂ）。両方の実験において、ＢＡＰレベルが高くなると、伸長開始するシュートの数が増大する傾向があった。しかし、これらのシュートは一般的には伸長しなかった。最大シュートの長さは、光波長の混合及び低光強度を用いた実験２において、ＢＡＰが培地に存在した場合には全体的にはるかに短く、ＢＡＰが培地中に存在しない場合には長かった（図１２Ａ）。ＳＩＭ培地中のＢＡＰ濃度は、外植片当たりのシュート数にわずかに影響を及ぼしたが、最大シュートの長さほど有意ではなかった。代わりに、任意の濃度のＢＡＰを含むＢ５基礎培地において広いスペクトルの低光条件下で成長させた外植片は、他の条件及び処理よりも、外植片あたりのシュートが多くなる傾向にあった（図１２Ｂ）。これらの外植片におけるシュート伸長の傾向は、ＳＥＭ上での３６日後には処理毎に有意な変化はなかったが、全ての処理について、外植片当たりの最大シュートの平均長は予想通り増大した（図１３Ｃ）。理想的なＳＩＭは、外植片当たり多数の伸長シュートをもたらし、そしてこれらのシュートを迅速かつ頑強に伸長させるだろう。これらの結果から、シュート伸長を促進するための最良のＳＩＭは、ＢＡＰを含まない又はＢＡＰを低レベルで含む培地、例えばＣ２Ｍ、Ｃ４Ｍ、Ｃ８Ｍ、Ｃ１Ｂ、Ｃ４Ｂ及びＣ８Ｂと、実験１のように高光条件である。
【０２２３】
種々のシュート誘導培地を試験し、葉外植片におけるシュート形成及び再生に対するその影響を測定した。試験対象の処理と共にＭＳ無機塩上で栽培した外植片は、多量の暗緑色だが壊れやすいカルスを成長させたが、Ｂ５無機塩上の外植片は、カルス成長がほどんどない淡色のシュートを形成した。低レベルのＢＡＰ、Ｂ５塩を含む培地、及び両方の光計画が、ＳＩＭにおいて２週間後に葉外植片に健常かつ大きなシュートパッドを形成するのに最も好適な条件であった。光レベルはＳＥＭにおいて１８日後に外植片におけるシュート伸長及び形成に有意に影響を及ぼさず、広いスペクトルであるが低い光レベルでＢＡＰ上で栽培した外植片は、外植片当たりの伸長シュートがより多かったが、これらのシュートは試験した他の条件よりも一般的に短かった。従って、シュート誘導過程で低レベルのＢＡＰ及びＢ５無機塩と全体にわたる高光条件において栽培した葉外植片は、大きなサイズに伸長した、外植片当たり多数のシュートを迅速に生成する大きく健常なカルス／シュートパッドの形成の点で、再生にとって最良であった。
【実施例１０】
【０２２４】
増殖腋生分裂組織外植片のための２つの異なるドナー材料の評価
温室ドナー植物及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ成育植物から得られる外植片材料の比較を、各外植片からのシュート再生を測定することにより行った。外植片材料は、第一節〜第四節からの基部節間組織が付いた増殖腋生分裂組織からなるものとした。
【０２２５】
試験した成長条件の両方で品種Ｊａｃｋを用いた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏドナー材料については、滅菌種子を１／２  ＭＳ塩及び２％スクロース、ｐＨ５．７を含むＰｌａｎｔｃｏｎＴＭ（ＳＩＧＭＡ）に播いた。幼苗を２５℃にて、１６／８時間（明／暗）光周期で、４０〜７０μＭｍ−２ｓ−１の光強度で維持した。温室ドナー植物については、種子をＭｅｔｒｏｍｉｘＴＭに播き、温室内で２５℃にて１６時間の光周期で成長させた。３週間後に温室の組織を植物から切除した。温室材料については、組織を、５％Ｔｗｅｅｎ２０を含有する溶液に浸漬し、続いて７０％（ｖ／ｖ）エタノール中に２分間浸漬した後、３．５％（ｖ／ｖ）次亜塩素酸ナトリウム溶液中で１０分間洗浄し、最後に滅菌水で３回すすぐことによって表面を滅菌した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏドナー材料については、さらなる滅菌は必要なかった。腋生分裂組織の外植片を、５μＭ  ＢＡＰ又は２ｍｇ／Ｌ（９．１μＭ）ＴＤＺのいずれかを添加した最大限のＭＳ塩及びＢ５Ｇａｍｂｏｒｇビタミンを含むシュート開始培地に求底性で配置した。シュート誘導培地での３週間後に外植片当たり０．３ｍｍを超えるシュートの数を計数することにより、評価を行った。
【０２２６】
両方のドナー植物（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及び温室）からの腋生分裂組織を含有する外植片は、ＢＡＰ又はＴＤＺのいずれかにより複数のシュート誘導に対し陽性反応を示した（表７）。より高い再生能はｉｎ  ｖｉｔｒｏ成育ドナー材料からの腋生分裂組織外植片で観察された。使用したサイトカイニンのうち、ＢＡＰはＴＤＺよりも高いシュート誘導能を示した。両方のドナー材料から、ＴＤＺ上で培養した外植片は大量のカルスと小さなシュートを発生した。温室成育植物に由来する外植片には汚染の問題もあった。
【表７】
2008501327.tif 000008
【０２２７】
増殖させた腋生分裂組織の形質転換法のための外植片材料は、これがｉｎ  ｖｉｔｒｏ成育植物に由来し、シュート誘導時にＢＡＰに暴露された場合に最高のシュート誘導能を示した。
【実施例１１】
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ成育植物からの外植片に対するシュート誘導能に影響を及ぼす因子
１１．１．ダイズの腋生分裂組織の再生能に対する培養容器の種類の影響
異なる培養容器がｉｎ  ｖｉｔｒｏ小植物体から得られた腋生分裂組織外植片の再生に影響を及ぼすか否かを確認するために評価を行った。Wrightら(1987)は、同じ環境成育条件下でプラスチック製ペトリ皿又はガラス製培養管において培養したダイズ組織がシュート再生及び表現型発現に差異を生じることを示した。
【０２２９】
品種Ｊａｃｋの種子を、最初に７０％（ｖ／ｖ）エタノールで６分間洗浄することにより表面滅菌した。続いて種子を２５％市販漂白剤（ＮａＯＣｌ）及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液に浸漬し、２００ｒｐｍで２０分間攪拌した。種子を滅菌再蒸留水で４回すすいだ。１６／８時間（明／暗）の光周期で光（４０〜７０μＭｍ−２ｓ−１）をあてて発芽を行った。滅菌種子を、発芽培地を含む３つの異なる培養容器、すなわち（１）ペトリ皿（１５０×２０ｍｍ）、（２）連結マゼンタボックス、及び（３）ＰｌａｎｔｃｏｎＴＭ（SIGMA）に分配した。発芽培地において３週間後、腋生分裂組織外植片を上述の通り調製し、続いて５μＭ  ＢＡＰを含むように修正した最大限のＭＳ塩及びＢ５Ｇａｍｂｏｒｇビタミンを含むシュート開始培地に求底性に配置した。シュート誘導において４週間後に、外植片当たり３ｍｍを超えるシュートの平均数を測定することで再生能を評価した。
【０２３０】
３つの異なる培養容器において発芽した小植物体からの腋生分裂組織外植片は、異なる再生能を有する。最大の再生能はプラスチック製ペトリ皿において発芽させた腋生分裂組織外植片において観察され、連結マゼンタボックスで発芽させた種子では外植片当たり平均０．３のシュートが、プラスチック製ペトリ皿では平均０．８１のシュートが、Ｐｌａｎｔｃｏｎでは平均０．１のシュートが発育した。さらに、連結マゼンタ及びＰｌａｎｔｃｏｎＴＭ（SIGMA）に由来する外植片は、おそらくリグニン含量の増大のために小植物体から取り出し、傷付けることがより困難であった。
【０２３１】
１１．２．増殖させた腋生分裂組織におけるシュート開始に対する発芽培地及び／又はシュート開始培地におけるＢＡＰ濃度の影響
理想的なドナー植物は、再生能が高い腋生分裂組織外植片を生成し、小植物体当たり多数の外植片を生じる能力を有している必要がある。種子をホルモン不含培地において成育させ、直接外植片材料に用いた場合には、腋生分裂組織外植片をほとんど調製することができないことが観察された。さらに、これらの容器における多数の根の成長のために小植物体形成のための部屋及び栄養物質が非常に限定された。従って、増殖ステップの付加、及び発芽培地へのＢＡＰの添加後に根の成長を低減してシュートを再生する外植片の能力を試験した。ＢＡＰがシュートの再生能力に影響を及ぼすことも知られているため、発芽及び増殖を通じて複数の濃度のＢＡＰに暴露した外植片の再生能を測定するための実験を設計した。
【０２３２】
上述の通り、ＢＡＰ濃度０、０．３６、１．２５、２．５又は５μＭを用いて種子を発芽させた。７日後、根、胚軸及び１枚の子葉を取り除き、残りの組織をペトリ皿（１５０×２０ｍｍ）に注ぎ入れた増殖培地（ＭＳ塩、３％スクロース、Ｂ５ビタミン、０．８％ｐｈｙｔａｇａｒ、及び適量のＢＡＰ）に入れた。各ＢＡＰ濃度からの幼苗を増殖の間に５つの全ての濃度に移した。４週間後、腋生分裂組織外植片を調製し、１００×２０ｍｍ皿におけるシュート誘導培地（ＭＳ塩、３％スクロース、Ｂ５ビタミン、５μＭ  ＢＡＰ、０．８％ｐｈｙｔａｇａｒ）に移した。１週間後、材料を伸長培地（ＭＳ塩、３％スクロース、Ｂ５ビタミン、０．３６μＭ  ＢＡＰ、０．８％ｐｈｙｔａｇａｒ）に移して４週間おいた後、シュート伸長（０．３ｍｍを超えるシュート）について評価した。
【０２３３】
外植片調製の前に根を除去し、増殖培地に小植物体を置くことによって、増殖した小植物体当たり外植片をより多く調製することができ、平均４〜６の腋生分裂組織外植片を得た。さらに、追加の切除ステップ及び増殖ステップは外植片のシュート誘導能に影響を及ぼさなかった。発芽培地へのＢＡＰの添加もまた、特に２．５μＭの濃度において伸長シュートを生成する外植片の割合（％）を増大させる傾向にあった（図１５、灰色のバー）。腋生分裂組織プロトコールの増殖期の過程で高濃度のＢＡＰと接触させた外植片は、ＢＡＰと接触させない外植片よりもあまり伸長していないシュートを生成するという全般的傾向が観察された（図１５参照）。
【０２３４】
発芽培地へのＢＡＰ（０．３６〜５μＭ）の添加は、シュート再生に悪影響を及ぼすことはなかった。それよりも、２．５μＭ  ＢＡＰにおいて発芽した種子においてはシュート再生の増大の全般的傾向が観察された。増殖培地におけるＢＡＰレベルの増大は、外植片におけるシュート再生に悪影響を及ぼした。
【０２３５】
１１．３．増殖させた腋生分裂組織外植片の発芽、増殖及びシュート誘導についての、２つの無機塩（ＭＳ及びＢ５）の影響の評価
培養培地中の塩の組成は、ダイズ植物の健康及び発育に非常に重要である。発芽、増殖及びシュート誘導の過程でＭＳ無機塩又はＢ５無機塩から構成される培地上で成長させた場合に、シュートを開始する外植片の能力の応答を比較するために実験を行った（比較については上記［Ａ］の部分を参照）。３つの異なる品種、すなわちＪａｃｋ、Ｗｅｓｔａｇ９７及びＬ００１０６ＣＮを再生試験に用いた。種子の滅菌、増殖及びシュート誘導は上述の通り実施した。無機塩に加えて、３つの培地全てに５μＭ  ＢＡＰを添加した。２回反復実験を行った。シュート開始能に対する無機塩の影響は品種に依存的であった。無機塩をＭＳからＢ５に変更したところ、品種Ｌ００１０６ＣＮ及びＪａｃｋについては外植片当たりのシュート数が増大した（表８）。品種Ｗｅｓｔａｇ９７を用いた場合には、ＭＳ又はＢ５塩で培養した外植片におけるシュート形成に有意な差は見い出されなかった。
【表８】
2008501327.tif 000009
【０２３６】
培地中の無機塩の変更により、ダイズＰＡＭの外植片におけるシュートの開始に影響があった。Ｊａｃｋ及びＷｅｓｔａｇ９７品種については、発芽培地、増殖培地及びシュート誘導培地中のＢ５無機塩によって、外植片当たりの生成したシュートの数が有意に増大した。
【実施例１２】
【０２３７】
増殖させた腋生分裂組織外植片を用いた種々の公共ダイズ品種の再生能の評価
種々のダイズ品種の再生能の評価は、強力なダイズ形質転換及び再生系の開発にとって重要な要素である。再生能が高い系統の同定によって、それらの起源に応じて形質の発達がよりフレキシブルとなる。２つの実験に用いた品種は、３のＵＳ変種、６のカナダ変種、及び２７のＳｏｙｇｅｎｅｔｉｃｓ品種とした。この最初の評価に含まれる品種は、ＵＳダイズ公共系統からのＪａｃｋ、Ｒｅｓｎｉｋ、Ｗｉｌｌｉａｍｓ８２と、University of Guelph OAC（Ontario Agricultural College）からのＲＣＡＴ  Ｓｔａｐｌｅｓ、Ｗｅｓｔａｇ９７、ＲＣＡＴ  Ｂｏｂｃａｔ、ＯＡＣ  Ｐｒｕｄｅｎｃｅ、ＯＡＣ  Ｗｏｏｄｓｔｏｃｋ、ＯＡＣ９９０８であった。７０％（ｖ／ｖ）エタノールに６分間暴露することにより種子の表面を滅菌した。続いて、種子を２５％市販漂白剤（ＮａＯＣｌ）及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液に浸漬し、２００ｒｐｍで２０分間振とうした。種子を滅菌再蒸留水で４回すすいだ。５〜７日間かけて暗条件下で発芽を行った。発芽後、根及び各子葉の半分を取り除き、残りの組織を５μＭ  ＢＡを含むＭＳＢ５培地で増殖させた。２５℃にて４０〜７０μＭｍ−２ｓ−１の光強度で１６／８時間（明／暗）の光周期の成育チャンバー条件に皿を置いた。３週間後、腋生分裂組織外植片を実施例３．３に記載のように調製し、次に最大濃度のＭＳ塩、Ｂ５Ｇａｍｂｏｒｇビタミン及び５μＭ  ＢＡを含むシュート開始培地に求底性に配置した。４週間後に、増殖腋生分裂組織外植片当たりの０．３ｍｍを超えるシュートの総数の評価を行った。
【０２３８】
上述のように種子及び外植片を調製した。評価には完全に無作為化された設計を用いた。２回の反復実験を行って、２人の異なる研究者が外植片を調製した。品種当たり合計４０の増殖腋生分裂組織を評価に用いた。増殖腋生分裂組織当たり０．３ｍｍを超えるシュートの総数をシュート誘導での４週間の後に実施し、本評価で研究した主な変数とした。一元配置分散分析を行った。最小二乗平均及びデータを、ＰＲＯＣ  ＧＬＭ（SAS Institute, Cary, NC）を用いて分析した。Ｊａｃｋを対照として用いて複数の平均比較についてダネット−スウ検定（Ｐ＞０．０５における）を用いた。剰余の分析もまた行って、分析の仮定が一致するかどうかを確認した。
【０２３９】
３つのＵＳ変種及び６つのカナダ変種について増殖させた外植片当たりのシュートの平均数を表９に示す。試験した７品種のうち、５つが複数のシュート誘導に対して応答した。Ｗｅｓｔａｇ９７品種は、外植片当たりのシュートをＪａｃｋよりも多く発育させた。異なる成熟群からのいくつかのダイズ品種、特にＷｅｓｔａｇ９７は、複数のシュートを多数生成することが可能であった。この形質転換法は、広範なダイズ品種に好適でありうる。
【表９】
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【実施例１３】
【０２４０】
共存培養条件
１３．１  Ｌ−システイン効果
Olhoft及びSomers (2001)（Plants Cell Reports 20:706-711）は、共存培養培地へのチオール化合物（Ｌ−システイン、チオ硫酸ナトリウム及びジチオトレイトール（dithiolthreitol））の添加によって、アグロバクテリウム媒介子葉節形質転換法を用いた場合にダイズ品種Ｂｅｒｔの一過性かつ安定な形質転換が増強されたことを示している（Olhoftら(2003) Planta 216:723-735も参照）。従って、固形共存培養培地へのＬ−システインの添加によって、増殖させた腋生分裂組織外植片へのＴ−ＤＮＡ送達及び組込みが増大することが可能か否かを評価するための実験を設計した。
【０２４１】
外植片調製：
Ｊａｃｋ変種の種子を、７０％エタノールに６分間暴露し、続いて２５％市販漂白剤（ＮａＯＣｌ）及び０．１％Ｔｗｅｅｎ２０を含む溶液に浸漬し、２００ｒｐｍで２０分攪拌することにより表面滅菌した。種子を滅菌水で４回すすいだ。２５℃にて暗条件下で７日間かけて発芽を行った。根及び両方の子葉の半分を７日齢幼苗から取り出し、１５０×２０ｍｍペトリ皿上の増殖培地に埋め込んだ。皿をＰａｒａｆｉｌｍＴＭで包埋し、２５℃にて明条件で２〜５週間培養室に置いた。
【０２４２】
Ａ．ツメファシエンスの調製及び外植片への接種：
バイナリーベクターｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ［ＬＢ−ｐＳｕｐｅｒ−ｇｕｓＩＮＴ−ＮＯＳｔ：：ＡｔＡｈａｓｔ−ＡｔＡｈａｓ−ｐＡｔＡｈａｓ−ＲＢ］（配列番号２）を有するＡ．ツメファシエンスＡＧＬ１株を用いた。単一のコロニーを適当な抗生物質を含む２５〜３０ｍｌのＬＢ培地への接種に用いた。フラスコを２８℃にて２４〜３６時間にわたりオービットシェイカー（２２０ｒｐｍ）で振とうしたところ、ＯＤ６００が０．８〜１．０に達した。３５００ｒｐｍにて８〜１０分遠心することによりアグロバクテリウムをペレットにした。細菌細胞を２００μＭアセトシリンゴンを含む液体共存培養培地に再懸濁した。切断後すぐに増殖腋生分裂組織外植片をＡ．ツメファシエンス懸濁液に浸漬し、３０分間放置した。続いて、感染した組織を真空チャンバー（２５〜３０ｍｍＨｇ）に５分間移すか、又は共存培養培地上に直接置いた。培養培地に移す前に、外植片を滅菌ろ紙でぬぐって乾燥させた。固形共存培養培地への０、４００又は８００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システインの添加（それぞれ０、３．３又は６．６ｍＭ）の処理について試験した。２５℃にて暗条件で３日間にわたり共存培養を実施した。減圧浸潤によって、システインを添加せずに行ったプロトコールにおける形質転換効率が増大したが、システインを添加して行ったプロトコールには有意な影響はなかった。
【０２４３】
ＧＵＳ組織化学的アッセイ：
Ａ．ツメファシエンスＡＧＬ１株を感染させた増殖腋生分裂組織外植片を３日後に共存培養培地から取り出し、３７℃で一晩かけてＧＵＳで染色した。残りの外植片は５００ｍｇ／Ｌ  ＴｉｍｅｎｔｉｎＴＭを含有するシュート誘導培地に移した。ＧＵＳ組織化学的アッセイはまた接種の１０日及び４５日後に実施した。
【０２４４】
結果：
３日間の共存培養後、ＧＵＳ＋巣を有する外植片の頻度は、２．５％から、固形共存培養培地への８００ｍｇ／Ｌ（６．６ｍＭ）又は４００ｍｇ／Ｌ（３．３ｍＭ）Ｌ−システインの添加によりそれぞれ４５％及び６３％に増大した。Ｌ−システインに暴露した外植片は、Ｌ−システインに暴露していない外植片よりも褐変及び組織壊死が少なかった。ＧＵＳ染色の増大はまた共存培養の１０日及び４５日後にも観察された（表１０）。
【表１０】
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【０２４５】
チオール化合物、すなわちＬ−システインを固形共存培養培地に添加することは、Ｔ−ＤＮＡ送達及び組込み、並びに共存培養中及び共存培養後の増殖分裂組織外植片の生存力に対して有益な効果を有する。
【０２４６】
１３．２  Ａ．ツメファシエンス株及びバイナリーベクターの比較
効率的なＴ−ＤＮＡ送達及び組込みを可能にするＡ．ツメファシエンス株とバイナリーベクターとの最良の組み合わせを見い出すことが望ましい。Ａ．ツメファシエンスの３つの菌株を、２つのダイズ品種Ｊａｃｋ及びＬ００１０６ＣＮの増殖腋生分裂組織外植片に感染する能力について比較した。さらに、３つの異なるバイナリーベクターの１つを保持するＡ．ツメファシエンスＡＧＬ１株の感染能を試験する第２の実験を実施した。
【０２４７】
種子の発芽、増殖、Ａ．ツメファシエンス及び腋生分裂組織外植片の調製、並びに接種は既に記載した通りに実施した。最初の実験においては、バイナリーベクターｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ（配列番号２）を含有するＡ．ツメファシエンスの３つの菌株、すなわちＭＰ９０株、ＬＢＡ４４０４株及びＡＧＬ１株を比較した。３つのＡ．ツメファシエンス菌株を感染させた増殖腋生分裂組織を、３日後に共存培養培地から取り出し、接種の１０日後にＧＵＳ染色を行った。
【０２４８】
別の実験において、バイナリーベクターｐＢＰＳＬＭ００３［ＬＢ−ＯＣＳｔ−ｂａｒ−ｐＭＡＳ：：ｐＳｕｐｅｒ−ｇｕｓＩＮＴ−ＮＯＳｔ−ＲＢ］（配列番号３）、ｐＢＰＳＭＭ１９２ａ［ＬＢ−ＮＯＳｔ−ｇｕｓＩＮＴ−ｐＳｕｐｅｒ：：ＡｔＡｈａｓｔ−ＡｔＡｈａｓ−ｐＡｔＡｈａｓ−ＲＢ］、又はｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ［ＬＢ−ｐＳｕｐｅｒ−ｇｕｓＩＮＴ−ＮＯＳｔ：：ＡｔＡｈａｓｔ−ＡｔＡｈａｓ−ｐＡｔＡｈａｓ−ＲＢ］（配列番号２）を含有するアグロバクテリウムＡＧＬ１株の感染の１０日後に、品種Ｌ００１０６ＣＮからの外植片においてＧＵＳ発現を評価した。ｐＢＰＳＬＭ００３の骨格配列（配列番号３）はｐＢＰＳＭＭ１９２ａ及びｂの骨格配列（配列番号２）とは異なっている。ベクターｐＢＰＳＭＭ１９２ａ［ＬＢ−ＮＯＳｔ−ｇｕｓＩＮＴ−ｐＳｕｐｅｒ：：ＡｔＡｈａｓｔ−ＡｔＡｈａｓ−ｐＡｔＡｈａｓ−ＲＢ］は、ベクターｐＢＰＳＭＭ１９２ｂ（配列番号２）とは、ｐＳｕｐｅｒ−ｇｕｓＩＮＴ−ＮＯＳｔ発現カセットの配向とは逆配向である点で区別される。
【０２４９】
外植片は、固形共存培養培地において４００ｍｇ／Ｌ（３．３ｍＭ）Ｌ−システインと共に又はそれなしで共存培養した外植片におけるＧＵＳ発現についても評価した。各処理について、各反復実験（本実験では合計２回の反復実験を行った）のために２０の外植片を調製した。ＧＵＳ発現は最初の感染の１０日後に評価した。
【０２５０】
標的領域におけるＧＵＳ＋巣の数を１０日齢の外植片において数えた。品種Ｊａｃｋについては、ＬＢＡ４４０４を接種した外植片がＧＵＳ＋領域の最高頻度（６０％）を示し、ＡＧＬ１及びＭＰ９０がそれに続いた。品種Ｌ００１０６ＣＮからの外植片は、ＡＧＬ１株を接種した場合にＧＵＳ＋領域の最高頻度（５５％）を示した。ＭＰ９０株は、感染可能であったが、両方の品種においてＧＵＳ陽性領域の最低頻度を示した（図１６参照）。
【０２５１】
本研究では、ｇｕｓＡを駆動するスーパープロモーターを有する種々の構築物を、Ｔ−ＤＮＡに対する遺伝子の配向又は骨格配列が接種された外植片におけるＧＵＳ発現に影響を及ぼすか否かを判定するために試験した。３つのバイナリーベクターのうち１つを含有するＡＧＬ１と共存培養した外植片の平均頻度を表１１に示す。用いたバイナリーベクターの種類、及び外植片の標的組織におけるＧＵＳ発現のレベルに有意な影響はなかった。しかしながら、４００ｍｇ／Ｌ又は３．３ｍＭ  Ｌ−システインと共存培養した外植片においては、ＧＵＳ発現における有意な増大が明らかである。
【表１１】
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【０２５２】
この形質転換法で用いられる外植片は種々のアグロバクテリウム菌株、特にＬＢＡ４４０４株及びＡＧＬ１株を用いた感染に感受性を示す。Ｌ−システインは、バイナリーベクターの配向又は骨格配列よりもＴ−ＤＮＡ送達に対して大きな影響を及ぼしたことが見出された。
【実施例１４】
【０２５３】
増殖腋生分裂組織法における再生プロセス
強力なダイズ形質転換系には、組織培養に制限時間のある迅速な再生があり、それによりソマクローナル変異に関連する問題が低減する。
【０２５４】
増殖腋生分裂組織法について上記の通り概説した形質転換法を用いた場合、アグロバクテリウム接種から温室における植物の確立までの平均再生時間は約１００日であった。シュート誘導ステップを第０日とした場合、伸長したシュートは、平均５７〜６５日で得られ、続いて根の発生及び温室への移動には３〜４週間の期間であった（図１７）。アグロバクテリウム接種から温室での樹立まで記載されている形質転換法は、平均約１３０日である。
【図面の簡単な説明】
【０２５５】
【図１】Ｖ２期のダイズ植物の図解。子葉、単小葉、及びその上の三小葉の位置を示す。腋芽は、子葉と上胚軸との接合部、及び各葉柄と上胚軸との接合部において見とめられる。
【図２】発芽の約７日後の品種Ｊａｃｋの発芽ダイズ。
【図３】増殖させた腋生分裂組織外植片を用いたダイズ形質転換方法；外植片調製物。７日齢の幼苗を使用して、根及び子葉の一部を除去し、５μＭ  ＢＡＰを含む増殖培地に置いて、増殖外植片を作製する（Ａ）。外植片は、元のダイズ幼苗から発育した新しい小植物体から調製する（Ｂ）。増殖培地上で２〜３週間後（Ｃ）、節間上の腋生節（Ｄ）の０．５〜１．０ｃｍ下を切断して腋生分裂組織外植片を小植物体から調製し、腋生分裂組織が存在する先端をメスで切断して新しいシュート成長を誘導し、標的細胞をアグロバクテリウムと接触可能にする（Ｅ）。
【図４】増殖させた腋生分裂組織外植片を用いたダイズ形質転換方法；シュート再生。３日間の共存培養の後、外植片をシュート誘導培地に３５日間置くと、大きいカルス／シュートパッドが形成される（Ａ、Ｂ）。ＧＵＳ陽性シュートが、シュート誘導培地で４週間後に見とめられた（Ｃ）。その後、複数のシュートを有する外植片を、シュート伸長培地に移して、平均５７〜６５日間おいた。これらの外植片上の伸長中のシュート（Ｄ）を取り、発根培地上に１〜２週間置いて根を発達させ、成育チャンバー中に２〜３週間おいて頑強にした後に、温室に移す（Ｅ）。
【図５】幼苗腋生分裂組織に基づく方法。７日齢の幼苗（図５−１）を、単一の子葉、根（任意）、第二節上の上胚軸（単小葉節）、及び単小葉を取り除いて、形質転換のために調製する。この外植片を、アグロバクテリウムと５日間共存培養させてから、シュート誘導培地に置く。シュート誘導培地上で１週間の調製した外植片の一例を示す（図５−２）。
【図６】チオール化合物を添加した固体共存培養培地上でのアグロバクテリウム・ツメファシエンスとの共存培養後の幼苗腋生分裂組織外植片における一過性発現。
【図７】シュート開始培地上で２週間後の幼苗外植片上の第一節における新しいシュート生成を上部パネルに示す。幼苗外植片上で発達しているＧＵＳ陽性シュート原基を下部左側パネルに示す。シュート開始培地上で４週間後、外植片をシュート伸長培地に移し、移してから４週間後にシュートが伸長し始める（下部右側パネル）。
【図８】葉腋分裂組織外植片の調製。子葉及び上胚軸組織を、子葉節の２〜４ｍｍ下の下胚軸から除去する（１）。葉外植片を利用するために、１枚の子葉を取り（２）、その後子葉節の上で上胚軸を切断する（３）。上胚軸を二等分して、２つの対称的な葉外植片を単離する（４）。腋生分裂組織細胞から新しいシュート生成を誘導するために、全ての予め形成されたシュートを葉柄の端部において注意深く取り（５）、腋生分裂組織細胞がある托葉の間の領域を鋭いメスで３〜５回切る（６）。
【図９】シュート誘導で２週間後の葉腋分裂組織外植片上の葉柄の基部で生じる新しいシュート生成を上部パネルに示す。３〜４週間後、外植片をシュート伸長培地に移し、そこではたった１８〜３６日後に有意な伸長がはっきりとわかる（下部パネル）。
【図１０】アグロバクテリウムと５日間共存培養させた後の幼苗腋生分裂組織外植片上での一過性ＧＵＳ発現。
【図１１】シュート誘導培地上で４週間後の幼苗腋生分裂組織外植片上での安定したＧＵＳ発現。新しく形成したシュート原基及び大きいシュートが、ＧＵＳ陽性部分と共に示されている。
【図１２】シュート伸長培地上で１８日間培養された葉外植片について、外植片当たりの最大シュートの長さ（Ａ）及び外植片当たりの伸長シュート数（Ｂ）に対する、シュート開始培地中の様々な濃度のカイネチン及びＢＡＰの影響。
【図１３】シュート伸長培地上で３６日間培養された葉外植片について、外植片当たりの最大シュートの長さ及び外植片当たりの伸長シュート数に対する、シュート開始培地中の様々な濃度のカイネチン及びＢＡＰの影響。
【図１４】Ａ．ツメファシエンスＡＧＬ１／ｐＢＰＳＥＷ００８株及び様々な共存培養条件で接種した後にカルスシュートパッドを発育した、ＳＩＭ上で２週間後の葉外植片の割合（％）（２回反復試験）。（０＝０ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン；１００＝１００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（０．８２５ｍＭ）；４００＝４００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（３．３ｍＭ）；１０００＝１０００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（８．２５ｍＭ）；ＮＤＣ＝１ｍＭチオ硫酸ナトリウム、１ｍＭ  ＤＴＴ、１０００ｍｇ／Ｌ  Ｌ−システイン（８．２５ｍＭ））。
【図１５】増殖させた腋生分裂組織外植片と、ＧＭ及び増殖培地中のＢＡＰに対する応答との表。発芽及び増殖中に様々なＢＡＰ濃度に曝された場合の、伸長培地上で４週間後に伸長したシュートを生成した外植片の割合（％）。
【図１６】品種Ｊａｃｋ及びＬ００１０６ＣＮのＰＡＭ外植片を感染させる、３つの異なるＡ．ツメファシエンス菌株の感染能の評価。ＧＵＳ＋巣が標的組織にある外植片の数を、感染１０日後に数えた。
【図１７】増殖させた腋生分裂組織方法を用いたダイズ形質転換プロセス。７日齢幼苗（Ａ）を使用して、根及び子葉の一部を取り、５μＭ  ＢＡＰ含有増殖培地上に置いて、増殖させた小植物体を作製する。２〜３週間後（Ｂ）、付いている葉を除去し、節の領域を露出させ（Ｃ）、アグロバクテリウムと３日間共存培養し、シュート誘導培地に３５日間置くことで（Ｄ）、小植物体から腋生分裂組織外植片を調製する。次いで、複数のシュート外植片（Ｅ、Ｆ）をシュート伸長培地に移し、そこで平均で５７〜６５日間そのままにする。これらの外植片上の伸長シュート（Ｇ）を取り、発根培地に１〜２週間置いて、根を発達させ（Ｈ）、成育チャンバー中で２〜３週間かけて頑強にした後、温室に移す（Ｉ）。
【配列表フリーテキスト】
【０２５６】
配列番号１：ベクターｐＢＰＳＥＷ００８をコードするヌクレオチド配列
［ＬＢ−ｐＮＯＳ−ｂａｒ−ＮＯＳｔ−：：ｐＰｃＵＢＩ−ｇｕｓＩＮＴ−ＮＯＳｔ−ＲＢ］
配列番号２：ベクターｐＢＰＳＭＭ１９２ｂをコードするヌクレオチド配列
［ＬＢ−ｐＳｕｐｅｒ−ｇｕｓＩＮＴ−ＮＯＳｔ：：ＡｔＡｈａｓｔ−ＡｔＡｈａｓ−ｐＡｔＡｈａｓ−ＲＢ］
配列番号３：ベクターｐＢＰＳＬＭ００３をコードするヌクレオチド配列
［ＬＢ−ＯＣＳｔ−ｂａｒ−ｐＭＡＳ：：ｐＳｕｐｅｒ−ｇｕｓＩＮＴ−ＮＯＳｔ−ＲＢ］。
【図１】
2008501327.tif 000013
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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