(57)【要約】本発明はアポゴシポロン化合物ならびにその塩およびプロドラッグに関する。アポゴシポロンはBcl-2ファミリー蛋白質の阻害剤として機能する。本発明はまた、過剰増殖性細胞増殖を阻害するため、細胞におけるアポトーシスを誘導するため、およびアポトーシス細胞死誘導に対して細胞を感作するためのアポゴシポロンの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の式I
2008531465.tif 000026
を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
【請求項２】
(-)-アポゴシポロン(apogossypolone)、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグである、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
(+)-アポゴシポロン、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグである、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
以下の式VIII
2008531465.tif 000027
を有する化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ。
【請求項５】
請求項1記載の化合物および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物。
【請求項６】
以下の段階を含む、アポゴシポロンの調製方法：
（a）ゴシポールを脱カルボニル化して、以下の式IIの化合物
2008531465.tif 000028
を生じる段階；
（b）式IIの化合物のヒドロキシ基を保護して、Pが保護基である以下の式IIIの化合物
2008531465.tif 000029
を生じる段階；
（c）式IIIの化合物を酸化して、以下の式IVの化合物
2008531465.tif 000030
を生じる段階;および、
（d）式IVの化合物を脱保護してアポゴシポロンを生じる段階。
【請求項７】
Pが保護基である、以下の式IVの化合物
2008531465.tif 000031
を脱保護してアポゴシポロンを生じる段階を含む、アポゴシポロンの調製方法。
【請求項８】
細胞を請求項1記載の化合物と接触させる段階を含む、細胞におけるアポトーシスの誘導方法。
【請求項９】
細胞を請求項1記載の化合物と接触させる段階を含む、細胞をアポトーシス誘導因子に対して感受性にする方法。
【請求項１０】
細胞をアポトーシス誘導因子と接触させる段階をさらに含む、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
アポトーシス誘導因子が化学療法薬である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
アポトーシス誘導因子が放射線である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
動物に請求項1記載の化合物の治療的有効量を投与する段階を含む、動物においてアポトーシス誘導に応答する疾患を治療、寛解、または予防する方法。
【請求項１４】
動物にアポトーシス誘導因子を投与する段階をさらに含む、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
アポトーシス誘導因子が化学療法薬である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
アポトーシス誘導因子が放射線である、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
アポトーシス誘導に応答する疾患が過剰増殖性疾患である、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
過剰増殖性疾患が癌である、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
請求項1記載の化合物がアポトーシス誘導因子の前に投与される、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
請求項1記載の化合物がアポトーシス誘導因子と同時に投与される、請求項14記載の方法。
【請求項２１】
請求項1記載の化合物がアポトーシス誘導因子の後に投与される、請求項14記載の方法。
【請求項２２】
動物に請求項1記載の化合物の治療的有効量を投与する段階を含む、動物において過剰増殖性疾患を治療、寛解、または予防する方法。
【請求項２３】
過剰増殖性疾患が癌である、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
動物にアポトーシス誘導因子を投与する段階をさらに含む、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
アポトーシス誘導因子が化学療法薬である、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
アポトーシス誘導因子が放射線である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
請求項1記載の化合物を含むキット。
【請求項２８】
アポトーシス誘導因子をさらに含む、請求項27記載のキット。
【請求項２９】
アポトーシス誘導因子が化学療法薬である、請求項27記載のキット。
【請求項３０】
化合物を動物に投与するための説明書をさらに含む、請求項27記載のキット。
【請求項３１】
説明書が過剰増殖性疾患を有する動物に化合物を投与するためのものである、請求項30記載のキット。
【請求項３２】
過剰増殖性疾患が癌である、請求項31記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医化学分野に属する。特に、本発明はアポゴシポロン(apogossypolone)化合物ならびにその塩およびプロドラッグに関する。アポゴシポロンはBcl-2ファミリー蛋白質の阻害剤として機能する。本発明はまた、過剰増殖性細胞増殖を阻害するための、細胞においてアポトーシスを誘導するための、および、アポトーシス細胞死の誘導に対し細胞を感作するためのアポゴシポロンの使用に関する。
【０００２】
関連技術
高悪性度癌細胞表現型は、細胞内シグナル伝達経路の調節解除に至る様々な遺伝子変化およびエピジェネティック変化の結果である(Ponder, Nature 411:336(2001)(非特許文献1))。しかしながら、全ての癌細胞に共通しているのは、アポトーシスプログラムを実行できないことであり、正常なアポトーシス機構の欠陥のために適当なアポトーシスが欠如することが癌の顕著な特徴である(Lowe et al., Carcinogenesis 21:485 (2000)(非特許文献2))。化学療法薬、放射線、および免疫療法を含む現在の癌治療のほとんどが、癌細胞において間接的にアポトーシスを誘導することにより功を奏している。このように癌細胞が、正常なアポトーシス機構の欠陥のためにアポトーシスプログラムを実行できないのは、しばしば、化学療法、放射線、または免疫療法により誘導されるアポトーシスに対する抵抗性が増加することと関連する。異なる起源由来のヒトの癌の、アポトーシス欠陥による現在の治療プロトコルに対する原発性または獲得抵抗性は、現在の癌治療において重要な問題である(Lowe et al., Carcinogenesis 21:485 (2000)(非特許文献2);Nicholson, Nature 407:810(2000)(非特許文献3))。したがって、癌患者の生存率および生活の質を改善するための新規分子標的-特異的抗癌治療の設計および開発に向けた現在および将来の努力は、特異的にアポトーシスに対する癌細胞抵抗性を標的とする戦略を含まなければならない。この点に関し、癌細胞のアポトーシスを直接阻害する際に中心的役割を果たす重要な負の調節因子を標的とするのは、新規抗癌剤設計に対し非常に有望な治療戦略を示す。
【０００３】
2つのクラスのアポトーシスの負の中心的調節因子が同定されている。第1のクラスの調節因子は、アポトーシス蛋白質の阻害剤(IAP)である(Deveraux et al., Genes Dev. 13:239(1999)(非特許文献4); Salvesen et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3:401(2002)(非特許文献5))。IAP蛋白質は、癌細胞における化学療法薬、放射線、および免疫療法を含む様々なアポトーシス刺激により誘導されるアポトーシスを強く抑制する。
【０００４】
第2のクラスのアポトーシスの負の中心的調節因子は、Bcl-2ファミリーの蛋白質である（Adams et al., Science 281:1322(1998)(非特許文献6); Reed, Adv. Pharmacol. 41:501(1997)(非特許文献7); Reed et al., J. Cell. Biochem. 60:23(1996)(非特許文献8)）。Bcl-2はファミリーの当初メンバーであり、腫瘍遺伝子の産物として最初に単離された。Bcl-2ファミリーは現在、Bcl-2およびBcl-xLなどの抗アポトーシス分子およびBax、Bak、Bid、およびBadなどのアポトーシス促進性分子の両方を含む。Bcl-2およびBcl-xLは、Bcl-2の過剰発現に至る染色体転座(t14、18)により引き起こされる非ホジキンリンパ腫を含む、多くの型のヒト癌(例えば、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌など)において過剰発現される。このことは、癌細胞または前癌細胞として規定し、同時に、アポトーシス経路を実行させる他の細胞の乱れから生存するために、多くの癌細胞型がBcl-2および/またはBcl-xLの上昇したレベルに依存することが示唆される。また、Bcl-2ファミリー蛋白質の発現の増加は、様々な様式で腫瘍細胞における細胞死を誘導するように作用する癌治療剤および放射線への抵抗性の発現の根拠として認識されている。
【０００５】
Bcl-2およびBcl-xLは、腫瘍細胞の遊走および浸潤、したがって、転移において重要な役割を果たすと考えられる（Amberger et al, Cancer Res. 58:149(1998)(非特許文献9); Wick et al., FEBS Lett, 440:419(1998)(非特許文献10); Mohanam et al., Cancer Res. 53:4143(1993)(非特許文献11); Pedersen et al., Cancer Res., 53:5158(1993)(非特許文献12)）。Bcl-2ファミリー蛋白質は、腫瘍細胞に、新しい非許容環境(例えば、転移部位)で生存するための機構を提供し、臨床的転移癌伝播の器官特異的パターンに寄与すると考えられる（Rubio, Lab Invest. 81:725(2001)(非特許文献13); Fernandez et al., Cell Death Differ. 7:350(2000)(非特許文献14))。Bcl-2および/またはBcl-xLなどの抗アポトーシス蛋白質もまた、例えば、細胞表面インテグリンの調節を介して、細胞-細胞相互作用を調節すると考えられる（Reed, Nature 387:773(1997)(非特許文献15);Frisch et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:701(1997)(非特許文献16); Del Bufalo et al., FASEB J. 11:947(1997)(非特許文献17)）。
【０００６】
癌細胞感受性を回復させ、癌細胞のアポトーシスに対する耐性を克服するように、癌中のBcl-2およびBcl-xLを標的とするための治療戦略が広く概説されている(Adams et al., Science 281:1322(1998)(非特許文献6); Reed, Adv. Pharmacol. 41:501(1997)(非特許文献7); Reed et al., J. Cell. Biochem. 60:23(1996)(非特許文献8))。現在、Bcl-2アンチセンス療法が、固形および非固形腫瘍の治療のためのいくつかの第III相臨床試験中である。
【０００７】
ゴシポールは粗綿実油由来の天然の複ビフェノール化合物である(Gossypium sp.)。男性用避妊薬としてのゴシポールのヒト試験により、これらの化合物の長期投与の安全性が証明されている(Wu, Drugs 38:333(1989)(非特許文献18))。より最近では、ゴシポールはいくらかの抗増殖性効果を有することが示されている(Flack et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:1019(1993)(非特許文献19); Bushunow et al., J. Neuro-Oncol. 43:79,(1999)(非特許文献20); Van Poznak et al, Breast Cancer Res. Treat. 66:239 (2001)(非特許文献21))。(-)-ゴシポールおよびその誘導体は最近、Bcl-2およびBcl-xLの強力な阻害剤であること、強い抗癌活性を有することが示されている(米国特許出願第2003/0008924(特許文献1))。
【０００８】
【特許文献１】米国特許出願第2003/0008924
【非特許文献１】Ponder, Nature 411:336(2001)
【非特許文献２】Lowe et al., Carcinogenesis 21:485 (2000)
【非特許文献３】Nicholson, Nature 407:810(2000)
【非特許文献４】Deveraux et al., Genes Dev. 13:239(1999)
【非特許文献５】Salvesen et al., Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 3:401(2002)
【非特許文献６】Adams et al., Science 281:1322(1998)
【非特許文献７】Reed, Adv. Pharmacol. 41:501(1997)
【非特許文献８】Reed et al., J. Cell. Biochem. 60:23(1996)
【非特許文献９】Amberger et al, Cancer Res. 58:149(1998)
【非特許文献１０】Wick et al., FEBS Lett, 440:419(1998)
【非特許文献１１】Mohanam et al., Cancer Res. 53:4143(1993)
【非特許文献１２】Pedersen et al., Cancer Res., 53:5158(1993)
【非特許文献１３】Rubio, Lab Invest. 81:725(2001)
【非特許文献１４】Fernandez et al., Cell Death Differ. 7:350(2000)
【非特許文献１５】Reed, Nature 387:773(1997)
【非特許文献１６】Frisch et al., Curr. Opin. Cell Biol. 9:701(1997)
【非特許文献１７】Del Bufalo et al., FASEB J. 11:947(1997)
【非特許文献１８】Wu, Drugs 38:333(1989)
【非特許文献１９】Flack et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 76:1019(1993)
【非特許文献２０】Bushunow et al., J. Neuro-Oncol. 43:79,(1999)
【非特許文献２１】Van Poznak et al, Breast Cancer Res. Treat. 66:239 (2001)
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
癌細胞またはそれらの支持細胞が、遺伝子病変またはアポトーシス誘導物質(例えば抗癌剤および放射線)への曝露に応じてアポトーシスを受けることができないことが、癌の発病および進行において重要な要因であることは、一般に認められている。癌細胞またはそれらの支持細胞(例えば、腫瘍血管系における新生血管細胞)におけるアポトーシスの誘導は、今日、市場に出回っている、または実用の、有効な癌治療薬または放射線治療の実質的に全てに対する共通の作用機構であると考えられる。細胞がアポトーシスを受けることができない1つの理由は、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の発現および蓄積の増加である。
【００１０】
本発明は、癌を患う動物を、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の機能を阻害する治療的有効量の薬剤（例えば小分子）に曝露すると、癌細胞または支持細胞が完全に殺され(生存し続ける細胞は、1つまたは複数のBcl-2ファミリー蛋白質の過活性に依存する)、および/またはそのような細胞が、癌治療薬または放射線治療の細胞死誘導活性により感受性の高い群となることを考慮する。本発明は、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質機能に依存する癌細胞の過剰増殖性を阻害する（例えばアポトーシスを誘導する）単剤投与治療として投与された場合、または、癌細胞または支持細胞のアポトーシスプログラムを実行する割合が、癌治療薬または放射線治療のみで治療した動物における対応する細胞の割合に比べて大きくなるように、他の細胞死誘導癌治療薬または放射線治療との時間的関係において投与された場合に、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の阻害剤が複数の癌型の治療のための満たされていない要求を満たすことを考慮する。
【００１１】
本発明の特定の態様において、治療的有効量の本発明の化合物、および抗癌剤または照射線の過程による動物の併用治療では、そのような動物において、化合物または抗癌剤/放射線のみで治療した動物に比べ、より大きな腫瘍応答および臨床利益が得られる。言い換えれば、化合物は抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質を発現する細胞全てのアポトーシス閾値を低下させるので、抗癌剤/放射線のアポトーシス誘導活性に応答してアポトーシスプログラムをうまく実行する細胞の割合が増加する。また、本発明の化合物により、より低用量の、そのためより毒性が低く、より許容される抗癌剤および/または放射線の投与で、抗癌剤/放射線のみの従来用量と同じ腫瘍応答/臨床利益が得られうる。認可された全ての抗癌剤および放射線治療に対する用量は公知であるので、本発明は、それらの、本発明の化合物との様々な組み合わせを企図する。また、本発明の化合物は、少なくとも部分的には、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質を阻害することにより作用するので、癌細胞および支持細胞を治療的有効量の化合物に曝露すると、抗癌剤または放射線療法に応答してアポトーシスプログラムを実行する細胞の試みと時間的に適合する。このように、いくつかの態様では、本発明の組成物を一定の時間的関係に関連して投与すると、特に有効な治療行為が得られる。
【００１２】
本発明は、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の活性を阻害し、細胞の過剰増殖を阻害し、細胞におけるアポトーシスを誘導し、細胞のアポトーシス誘導因子に対する感度を増大させるのに有用なアポゴシポロン(式I)、または薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグに関する。
2008531465.tif 000002
【００１３】
本発明の化合物は、アポトーシス細胞死の誘導に応答する疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患を含む、アポトーシスの調節不全により特徴づけられる疾患の治療、寛解、または予防に有用である。特定の態様において、本化合物を使用して、癌治療に対する耐性(例えば、化学耐性、放射線耐性、ホルモン耐性など)により特徴づけられる癌を治療、寛解、または予防することができる。他の態様では、本化合物を使用して転移癌を治療、寛解、または予防することができる。別の態様では、本化合物を使用して、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の過剰発現により特徴づけられる過剰増殖性疾患を治療することができる。
【００１４】
ゴシポールおよびアポゴシポロンに関連する他の化合物は、アポトーシス細胞死の誘導に応答する疾患、例えば、癌などの過剰増殖性疾患を含むアポトーシスの調節不全により特徴づけられる疾患の治療、寛解、または予防に有用であり得る。そのような化合物には、ゴシポール酸(gossypolic acid)(式V)およびゴシポロン酸(gossypolonic acid)(式VI)、またはそれらの薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグが含まれる。
2008531465.tif 000003
【００１５】
本発明は、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを、細胞の過剰増殖を阻害するか、細胞におけるアポトーシスを誘導するか、またはアポトーシス誘導因子に対して細胞を感作する治療的有効量で含む薬学的組成物を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含むキットを提供する。キットは、動物に化合物を投与するための説明書、および/または他の治療薬、例えば抗癌剤を任意に含んでもよい。
【００１７】
本発明はまた、本発明の化合物、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを製造する方法も提供する。さらにアポゴシポロン合成の中間体として有用な化合物も提供する。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の阻害剤として機能するアポゴシポロン、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグに関する。抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質を阻害することにより、アポゴシポロンは細胞の過剰増殖を阻害し、細胞をアポトーシス誘導因子に対し感作し、場合によってはそれ自体がアポトーシスを誘導する。そのため、本発明は、細胞をアポゴシポロンもしくは塩またはそれらのプロドラッグと単独で、またはアポトーシス誘導因子と組み合わせて接触させる段階を含む、細胞の過剰増殖を阻害する方法、細胞をアポトーシス誘導因子に対し感作する方法、および細胞におけるアポトーシスを誘導する方法に関する。本発明はさらに、アポゴシポロン、またはその塩もしくはプロドラッグ、およびアポトーシス誘導因子を動物に投与する段階を含む、動物においてアポトーシスの誘導に応答する疾患を治療、寛解、または予防する方法に関する。そのような疾患としては、アポトーシスの調節不全により特徴づけられる疾患、および抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の過剰発現により特徴づけられる疾患が挙げられる。
【００１９】
本発明のさらなる局面は、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の阻害剤としても機能し、かつ本発明の実施に使用され得る、ゴシポールまたはアポゴシポロンに関連した化合物に関する。そのような化合物には、ゴシポール酸およびゴシポロン酸、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグが含まれる。
【００２０】
本明細書で使用されるように、「Bcl-2ファミリー蛋白質」という用語は、Bcl-2、Bcl-xL、Mcl-1、A1/BFL-1、BOO-DIVA、Bcl-w、Bcl-6、Bcl-8、およびBcl-yを含むがそれらに限定されないBcl-2ファミリーの抗アポトーシスメンバー、ならびにBak、Bax、Bad、tBid、Hrk、Bim、Bmf、を含むがそれらに限定されないBcl-2ファミリーのアポトーシス促進性メンバーの両方、ならびにアポゴシポロン化合物により調節される他のBcl-2相同領域3(BH3)を含む蛋白質を示す。
【００２１】
本明細書で使用されるように、「抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の過剰発現」という用語は、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質をコードする基礎レベルのmRNAを発現するまたは基礎レベルの抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質を有する同様の対応する非病的細胞に比べた、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質をコードするmRNAのレベルの上昇(例えば、異常レベル)、および/または細胞における抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質のレベルの上昇を示す。細胞中の、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質をコードするmRNAのレベルまたは抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質のレベルを検出するための方法としては、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質抗体を使用するウエスタンブロッティング、免疫組織化学法、および核酸増幅または直接RNA検出の方法が挙げられるが、それらに限定されない。抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質を過剰発現していることを決定するには、細胞中の抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の絶対レベル、そのような分子内での、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の他のアポトーシス促進性シグナル伝達分子(例えば、アポトーシス促進性Bcl-2ファミリー蛋白質)に対する抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の相対レベルが同じくらい重要である。これらの2つの均衡が、仮に抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質のレベルがないとして、アポトーシス促進性シグナル伝達分子が細胞にアポトーシスを実行させ、死滅させるのに十分である場合、そのような細胞は、その生存については抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質に依存する。そのような細胞では、阻害有効量の抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質阻害剤に曝露することは、細胞にアポトーシスプログラムを実行させ、死滅させるのに十分である。このように「抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の過剰発現」という用語は、また、相対レベルのアポトーシス促進性シグナルおよび抗アポトーシスシグナルの相対レベルにより、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の機能を阻害する阻害有効量の化合物に応答してアポトーシスを受ける細胞を指す。
【００２２】
本明細書で使用されるように、「抗癌剤」および「抗癌薬」という用語は、(例えば、哺乳類における)癌などの過剰増殖性疾患の治療において使用される、任意の治療薬(例えば、化学治療化合物および/または分子治療化合物)、放射線治療、または外科的処置を示す。
【００２３】
本明細書で使用されるように、「プロドラッグ」という用語は、遊離、またはプロドラッグを活性薬剤に(例えば、酵素的、機械的、または電磁気的に)転換するための、標的生理システム内での(例えば、自発的、または酵素のどちらかによる)生体内変化を必要とする親「薬剤」分子の薬理学的に不活性な誘導体を示す。プロドラッグは、安定性、毒性、特異性の欠如、または制限された生物学的利用能に関連する問題を克服するように設計されている。例示的なプロドラッグは、活性な薬剤分子自体および化学的マスキング基(chemical masking group)(例えば可逆的に薬剤の活性を抑制する基)を含む。いくつかの好ましいプロドラッグは、代謝条件下で開裂可能な基を有する化合物の変形物または誘導体である。例示的なプロドラッグは、生理学的条件下で加溶媒分解を受ける際、または酵素分解もしくは他の生化学的形質転換(例えばリン酸化、水素化、脱水素、グリコシル化)を受ける際に、インビボまたはインビトロで薬学的に活性になる。プロドラッグは多くの場合、哺乳類生物において、溶解性、組織適合性、または遅延放出性の利点を提供する。(例えば、Bundgard, Design of Prodrugs, pp. 7-9, 21-24, Elsevier, Amsterdam (1985); and Silverman, The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action, pp. 352-401, Academic Press, San Diego, CA (1992)を参照されたい)。一般的なプロドラッグは、アポゴシポロンのヒドロキシル基と適切なカルボン酸(例えば酢酸のような低級カルボン酸)との反応によって調製されるエステル、およびアポゴシポロンのケトン基とアミン(例えば低級の第一級または第二級アルキルアミン)との反応によって調製されるイミンのような酸誘導体を含む。
【００２４】
本明細書で使用されるように、「薬学的に許容される塩」という用語は、標的動物(例えば哺乳類)において生理的に許容される本発明の化合物の(例えば、酸または塩基との反応によって得られる)任意の塩を示す。本発明の化合物の塩は、無機塩基または有機塩基由来であってもよい。塩基の例にはアルカリ金属(例えばナトリウムおよびリチウム)水酸化物、アルカリ土類金属(例えばマグネシウム)水酸化物、アンモニア、およびWがC1-4アルキルである式 NW4+の化合物などを含むが、これらに限定されない。
【００２５】
治療用途のために、本発明の化合物の塩は薬学的に許容されることが企図される。しかしながら、薬学的に許容されない酸および塩基の塩もまた、例えば、薬学的に許容される化合物の調製または精製において使用を見い出し得る。
【００２６】
本明細書で使用されるように、「治療的有効量」とは、疾患の1つまたは複数の症状が寛解する、または疾患の進行を予防する、疾患の退行を引き起こすのに十分な治療薬の量を示す。例えば、癌の治療に関しては、治療的有効量は好ましくは、少なくとも5%、好ましくは少なくとも10%、少なくとも15%、少なくとも20%、少なくとも25%、少なくとも30%、少なくとも35%、少なくとも40%、少なくとも45%、少なくとも50%、少なくとも55%、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%または少なくとも100%、腫瘍増殖速度を減少させる、腫瘤を減少させる、移転数を減少させる、腫瘍進行時間を増加させる、または生存時間を増加させる治療薬の量を示す。
【００２７】
本明細書で使用されるように、「感作する」および「感作」という用語は、第1の薬剤(例えば、化学式Iの化合物)の投与により、動物または動物中の細胞の第2の薬剤の生物学的効果(例えば、細胞成長、増殖、浸潤、血管形成、またはアポトーシスを含むがそれらに限定されない細胞機能の局面の促進または遅延)に対する感受性または応答性を増大させることを示す。第1の薬剤の標的細胞への感作効果は、第2の薬剤を投与した時に観察される、第1の薬剤の投与の有無による目的とする生物学的効果(例えば、細胞成長、増殖、浸潤、血管形成、またはアポトーシスを含むがそれらに限定されない細胞機能の局面の促進または遅延)の差として測定することができる。感作細胞の応答は、第1の薬剤がない場合の応答に対し、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも150%、少なくとも200%、少なくとも350%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%、少なくとも450%、または少なくとも500%、増加させることができる。
【００２８】
本明細書で使用されるように、「アポトーシスの調節不全」という用語は、細胞がアポトーシスにより細胞死を受ける能力(例えば素因)の全ての異常を示す。アポトーシスの調節不全は、例えば、自己免疫疾患(例えば、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、移植片対宿主病、重症筋無力症、またはシェーグレン症候群)、慢性炎症状態(例えば、乾癬、喘息またはクローン病)、過剰増殖性疾患(例えば、腫瘍、B細胞リンパ腫、またはT細胞リンパ腫)、ウイルス感染（例えば、ヘルペス、パピローマ、またはHIV）、ならびに骨関節炎およびアテローム性動脈硬化症などの他の状態を含む、様々な状態と関連し、または様々な状態により誘導される。調節不全がウイルス感染により誘導され、ウイルス感染と関連する場合、ウイルス感染は、調節不全が生じた時、または観察された時に検出可能である場合もあり、そうでない場合もあることに注意すべきである。すなわち、ウイルスにより誘発された調節不全は、ウイルス感染の症状が消えた後でさえも起きる可能性がある。
【００２９】
本明細書で使用されるように、「過剰増殖性疾患」という用語は、動物中の増殖細胞の局所群が、正常な成長の通常の制限により支配されない任意の状態を示す。過剰増殖性疾患の例としては、腫瘍、新生物、リンパ腫などが挙げられる。新生物は、浸潤または転移を受けなければ良性であり、どちらか受けると悪性となると言われている。「転移」細胞は、細胞が隣の身体構造に浸潤し、破壊することができることを意味する。過形成は、構造または機能に有意の変化のない、組織または器官中の細胞数の増加が関与する細胞増殖形態である。異形成は、完全に分化した細胞の1つの型が分化した細胞の別の型にとって代わる制御された細胞成長の型である。
【００３０】
活性化リンパ細胞の病的増殖により、しばしば自己免疫疾患または慢性炎症状態となる。本明細書で使用されるように、「自己免疫疾患」という用語は、生物が、生物自身の分子、細胞または組織を認識する抗体または免疫細胞を産生する任意の状態を示す。自己免疫疾患の非制限的な例としては、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、バーガー病またはIgA腎症、セリアック病、慢性疲労症候群、クローン病、皮膚筋炎、線維筋痛、移植片対宿主病、グレーブス病、橋本病、特発性血小板減少性紫斑病、扁平苔癬、多発性硬化症、重症筋無力症、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、強皮症、シェーグレン症候群、全身性エリテマトーデス、I型糖尿病、潰瘍性大腸炎、白斑などが挙げられる。
【００３１】
本明細書で使用されるように、「新生物疾患」という用語は、良性(非癌性)または悪性(癌性)である細胞の任意の異常増殖を示す。
【００３２】
本明細書で使用されるように、「抗新生物薬」という用語は、標的(例えば悪性)新生物の増殖、成長、または拡散を遅延させる任意の化合物を示す。
【００３３】
本明細書で使用されるように、「予防する」、「予防の」および「予防」という用語は、動物における病的細胞(例えば、過剰増殖性または新生物細胞)の発生の減少を示す。予防は完全であってもよく、例えば、被験体において病的細胞が完全に存在しない。予防はまた、部分的であってもよく、そのため、被験体における病的細胞の発生率は、本発明無しでの発生率より低い。
【００３４】
本明細書で使用されるように、「相乗」という用語は、アポゴシポロンおよび第2の薬剤を共に(例えば、同時にまたは順に)投与した際に得られる、アポゴシポロンおよび第2の薬剤を単独で投与したときに得られる効果の和よりも大きな効果を示す。相乗効果により、アポゴシポロンおよび/または第2の薬剤の投与量を低下させることができ、または同じ用量でより大きな効果が得られる。得られる相乗効果は、アポゴシポロンおよび第2の薬剤を単独で投与したときに得られる効果の和よりも少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも30%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも100%、少なくとも125%、少なくとも150%、少なくとも175%、少なくとも200%、少なくとも250%、少なくとも300%、少なくとも350%、少なくとも400%、または少なくとも500%高くすることができる。例えば、癌の治療に関しては、相乗効果は、腫瘍増殖速度の減少、腫瘤の減少、転移数の減少、腫瘍進行時間の増加、または生存時間の増加とすることができる。本願明細書に記載されているように、アポゴシポロン化合物および抗癌剤が別々に投与される場合、腫瘍塊の退縮は生じさせず、多くの場合腫瘍細胞増殖を阻害するのみである。本発明に従って、実際の腫瘍塊の退縮を生じさせるために、アポゴシポロン化合物および抗癌剤の投与を用いる。アポゴシポロンと抗癌剤の同時投与により、対象への任意の実質的な毒性を回避するとともに、癌を有効に処置するような、アポゴシポロンおよび/または抗癌剤のより低用量の使用が可能となり得る。
【００３５】
本発明の抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の阻害剤は、アポゴシポロン(式I)、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む。
2008531465.tif 000004
【００３６】
本発明の抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の他の阻害剤は、ゴシポール酸(式V)およびゴシポロン酸(式VI)、またはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを含む。
2008531465.tif 000005
【００３７】
本発明の化合物のいくつかは、光学異性体、例えば(+)-アポゴシポロン、(-)-アポゴシポロン、(+)-ゴシポール酸、(-)-ゴシポール酸、(+)-ゴシポロン酸、および(-)-ゴシポロン酸を含む立体異性体として存在し得る。好ましくは、(+)-アポゴシポロン、(-)-アポゴシポロン、(+)-ゴシポール酸、(-)-ゴシポール酸、(+)-ゴシポロン酸、および(-)-ゴシポロン酸は、それぞれ1%〜100%の鏡像異性体過剰率を有する。1つの態様において、(+)-アポゴシポロン、(-)-アポゴシポロン、(+)-ゴシポール酸、(-)-ゴシポール酸、(+)-ゴシポロン酸、および(-)-ゴシポロン酸は、それぞれ少なくとも10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、または100%の鏡像異性体過剰率を有する。本発明は、全ての立体異性体、ならびにこのような立体異性体のラセミ混合物および当業者に周知の方法に従って分離し得る個々の鏡像異性体の両方を含む。
【００３８】
本発明の化合物は、当業者に公知の方法を用いて、実施例に開示されているように調製することができる。1つの態様において、アポゴシポロンは、スキームIに示す方法によってゴシポールから合成され、ここでPは保護基である。他の態様において、キラルHPLCカラムを使用して、(±)-アポゴシポロンを(+)および(-)鏡像異性体へと分離することができる。
スキーム1
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【００３９】
1つの態様において、スキームIIに示す方法により、ゴシポールからゴシポロン酸が合成される。
2008531465.tif 000007
【００４０】
本発明はまた、以下の段階を含むアポゴシポロンの調製方法に関する。
（a）ゴシポールを脱カルボニル化して、以下の式IIの化合物
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を生じる段階；
（b）式IIの化合物のヒドロキシル基を保護して、Pが保護基である以下の式IIIの化合物
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を生じる段階；
（c）式IIIの化合物を酸化して、以下の式IVの化合物
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を生じる段階；および、
（d）式IVの化合物を脱保護して、アポゴシポロンを生じる段階。
【００４１】
塩基性条件下で、溶媒中でゴシポールを加熱することにより、ゴシポールを脱カルボニル化することができる。ゴシポールはまた、BF3/Et20の存在下でHSCH2CH2SHと反応させることによって脱カルボニル化することもできる。例えばゴシポールは、NaOHまたはKOH水溶液中で、約40〜150℃で、より好ましくは約85℃で加熱してもよい。この反応は、好ましくは不活性雰囲気下(例えば、アルゴンまたは窒素)で行われる。
【００４２】
保護基「P」は、低級のアルカノイル、アラルカノイル(aralkanoyl)、ベンゾイル、およびアルキル/アリールシリル基、例えばt-ブチルジメチルシリル基などの任意の適切な保護基を含む。アルカノイル基の例には、アセチル、プロピオニル、t-ブタノイルなどが含まれる。アラルカノイル基の例には、フェニルアセチルおよび1-フェニル-1-メチルアセチル基が含まれる。
【００４３】
式IIIのヒドロキシ保護化合物は、式IIの化合物を、対応するアルカン酸、アラルカン酸(aralkanoic acid)、または安息香酸の無水物または酸ハロゲン化物のような適切な試薬と反応させることによって調製することができる。保護基がアルキルまたはアルキル/アリールシリル基である場合、対応するシリルクロライド試薬を使用することができる。反応は、適切な非プロトン性溶媒中、N,N'-ジイソプロピルエチルアミン、ピリジン、またはジメチルアミノピリジンのような有機塩基の存在下で、大気温度で最高12時間行われる。
【００４４】
式IVの化合物は、過ヨウ素酸または酸化クロム(VI)などの適切な酸化試薬を用いて、ジオキサン、アセトニトリル、または酢酸などの適切な溶媒中で約40〜150℃、好ましくは約80〜120℃で10〜600分間、式IIIの化合物を酸化することによって調製することができる。式IVの化合物の分離は、抽出およびクロマトグラフィーなどの任意の従来法によって達成し得る。
【００４５】
次に式IVの化合物の保護基を除去することにより、アポゴシポロンを調製することができる。保護基がアルカノイル、アラルカノイル、またはベンゾイル基である場合、式IVの化合物を適切な溶媒中で塩基と反応させることにより、それらを除去することができる。塩基の例には、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウム、ならびに水酸化リチウム、水酸化ナトリウム、および水酸化カリウムが含まれ、適切な溶媒には、ジオキサンなどのエーテル、ならびにジメチルホルムアミドおよびジメチルスルホキシドなどの非プロトン性極性溶媒が含まれる。次にアポゴシポロンを酸性化し、抽出によって分離し、結晶化/再結晶化によって精製して精製アポゴシポロンを生じさせる。
【００４６】
本発明はまた、式II、III、およびIVの化合物を含む、アポゴシポロン合成の中間体として有用な化合物に関する。
【００４７】
本発明の重要な局面は、アポゴシポロンが、ゴシポールと同様に、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質に結合し、阻害するということである。しかしながら、アポゴシポロンは、より強く結合し、ラセミ体のゴシポールよりも強力な阻害剤である。このように、アポゴシポロンまたはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグは、過剰増殖を阻害し、アポトーシスを誘導し、アポトーシス誘導シグナルに応答するアポトーシスの誘導を増強する。これらの化合物が、誘導物質に対し耐性のある細胞を含む細胞を、アポトーシス誘導物質に対し感作することも企図される。本発明の抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質阻害剤を使用して、アポトーシスの誘導により治療、寛解、または予防することができる任意の疾患においてアポトーシスを誘導することができる。このように、本発明は、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の過剰発現により特徴づけられる動物を標的とするための組成物および方法を提供する。いくかの態様では、細胞(例えば、癌細胞)は、非病的試料(例えば、非癌性細胞)に比べ、1または複数の抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の上昇した発現レベルを示す。別の態様では、細胞は、阻害有効量のアポゴシポロンに応答するアポトーシスプログラムおよび死を実行することにより、抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の上昇した発現レベルを戦略上示す。そのような応答は、少なくとも部分的には、そのような細胞における、生存のための抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質機能への依存性により生じる。
【００４８】
いくつかの態様では、本発明の組成物および方法を使用して、動物(例えば、ヒトおよび獣医学的動物を含むがそれらに限定されない哺乳類被験体)における罹患細胞、組織、器官、または病的状態および/または疾患状態を治療する。この点に関し、様々な疾患および病状が、本発明の方法および組成物を使用した治療または予防に適している。これら疾患および状態の非制限的な例示的リストとしては、乳癌、前立腺癌、リンパ腫、皮膚癌、膵癌、結腸癌、メラノーマ、悪性メラノーマ、卵巣癌、脳腫瘍、原発性脳腫瘍、頭頸部癌、神経膠腫、グリア芽腫、肝癌、膀胱癌、非小細胞肺癌、頭部または頸部癌腫、乳癌腫、卵巣癌腫、肺癌腫、小細胞肺癌腫、ウイルムス腫瘍、子宮頸癌、睾丸癌、膀胱癌腫、膵癌腫、胃癌、結腸癌腫、前立腺癌腫、泌尿生殖器癌、甲状腺癌、食道癌、骨髄腫、多発性骨髄腫、副腎癌、腎細胞癌、子宮内膜癌、副腎皮質癌、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド癌、絨毛癌、菌状息肉腫、悪性高カルシウム血症、子宮頸部過形成、白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性顆粒球性白血病、急性顆粒球性白血病、ヘアリー細胞白血病、神経芽細胞腫、黄紋筋肉腫、カポジ肉腫、真性赤血球増加症、本態性血小板血症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、軟部組織肉腫、骨原性肉腫、原発性マクログロブリン血症、および網膜芽腫など、TおよびB細胞媒介自己免疫疾患、炎症性疾患、感染、過剰増殖性疾患、AIDS、変性状態、血管疾患、などが挙げられるが、それらに限定されない。いくつかの態様では、治療される癌細胞は転移性である。別の態様では、治療される癌細胞は抗癌剤耐性である。
【００４９】
いくつかの態様では、本発明の組成物および方法を用いた治療に適した感染としては、ウイルス、細菌、真菌、マイコプラズマ、プリオンなどにより引き起こされる感染が挙げられるが、それらに限定されない。
【００５０】
本発明のいくつかの態様は、有効量のアポゴシポロンおよび少なくとも1つの追加の治療薬(化学療法薬、抗新生物薬、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、および抗炎症剤を含むが、それらに限定されない)および/または治療技術(例えば、外科的処置、および/または放射線療法)を投与するための方法を提供する。いくつかの態様では、アポゴシポロンおよび1または複数の治療薬を組み合わせると、いずれかの化合物を単独で投与した場合に比べより大きな効果が得られることが期待される。別の態様では、アポゴシポロンおよび1または複数の治療薬を組み合わせると、いずれか1つを単独で投与した場合に比べ相乗効果(すなわち、それらの効果の和を超える)が得られると予測される。
【００５１】
本発明の方法において使用するために、多くの適した抗癌剤が企図されている。実際、本発明は、下記のような多くの抗癌剤の投与を企図しているが、それらに限定されない:アポトーシスを誘導する薬剤;ポリヌクレオチド(例えば、アンチセンス、リボザイム、siRNA);ポリペプチド(例えば、酵素および抗体);生物学的模倣薬(例えば、ゴシポールまたはBH3模倣薬);BaxなどのBcl-2ファミリー蛋白質と結合する(例えば、オリゴマー化または錯化する)薬剤;アルカロイド;アルキル化剤;抗腫瘍抗生剤;代謝拮抗剤;ホルモン;白金化合物;モノクローナルまたはポリクローナル抗体(例えば、抗癌剤、トキシン、デフェンシンとコンジュゲートした抗体);トキシン;放射性核種;生物反応修飾物質(例えば、インターフェロン(例えば、IFN-α)およびインターロイキン(例えば、IL-2));養子免疫療法剤;造血成長因子;腫瘍細胞分化を誘導する薬剤(例えば、全トランスレチノイン酸);遺伝子療法剤(例えば、アンチセンス療法剤およびヌクレオチド);腫瘍ワクチン;血管形成阻害剤;プロテオソーム阻害剤;NF-κBモジュレータ;抗CDK化合物;HDAC阻害剤;など。開示した化合物との同時投与に適した化学療法化合物および抗癌療法の多くの他の例は、当業者に公知である。
【００５２】
好ましい態様では、抗癌剤はアポトーシスを誘導または刺激する薬剤を含む。アポトーシスを誘導する薬剤としては下記が挙げられるが、それらに限定されない:放射線(例えば、X線、γ線、UV);キナーゼ阻害剤(例えば、上皮増殖因子受容体(EGFR)キナーゼ阻害剤、血管成長因子受容体(VGFR)キナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖因子受容体(FGFR)キナーゼ阻害剤、血小板由来増殖因子受容体(PDGFR)キナーゼ阻害剤、およびBcr-Ablキナーゼ阻害剤(例えばGLEEVEC));アンチセンス分子;抗体(例えば、HERCEPTIN、RITUXAN、ZEVALIN、およびAVASTIN);抗エストロゲン薬(例えば、ラロキシフェンおよびタモキシフェン);抗アンドロゲン薬(例えば、フルタミド、ビカルタミド、フィナステリド、アミノグルテタミド、ケトコナゾール、およびコルチコステロイド);シクロオキシゲナーゼ2(COX-2)阻害剤(例えば、セレコキシブ、メロキシカム、NS-398、および非ステロイド性抗炎症剤);抗炎症薬(例えば、ブタゾリジン、DECADRON、DELTASONE、デキサメタゾン、デキサメタゾンインテンソール、DEXONE、HEXADROL、ヒドロキシクロロキン、METICORTEN、ORADEXON、ORASONE、オキシフェンブタゾン、PEDIAPRED、フェニルブタゾン、PLAQUENIL、プレニソロン、プレドニソン、PRELONE、およびTANDEARIL);および癌化学療法薬(例えば、イリノテカン(CAMPTOSAR)、CPT-11、フルダラビン(FLUDARA)、ダカルバジン、デキサメタゾン、ミトキサントロン、MYLOTARG、VP-16、シスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチン、5-FU、ドキソルビシン、ゲムシタビン、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、ベバシズマブ、TAXOTEREまたはTAXOL);細胞シグナル伝達分子;セラミドおよびサイトカイン;スタウロスポリン、など。
【００５３】
さらに別の態様では、本発明の組成物および方法は、式Iの化合物および、アルキル化剤、代謝拮抗剤、および天然産物(例えば、ハーブおよび他の植物および/または動物由来化合物)から選択された少なくとも1つの抗過剰増殖薬または抗新生物薬を提供する。
【００５４】
本発明の組成物および方法において使用するのに適したアルキル化剤としては、下記が挙げられるが、それらに限定されない:1)ナイトロジェンマスタード(例えば、メクロレタミン、シクロホスファミド、イフォスファミド、メルファラン(L-サクロリシン)およびクロラムブシル);2)エチレンイミンおよびメチルメラミン(例えば、ヘキサメチルメラミンおよびチオテパ);3)アルキルスルホネート(例えば、ブスルファン);4)ニトロソ尿素(例えば、カルムスチン(BCNU));ロムスチン(CCNU);セムスチン(メチル-CCNU);およびストレプトゾシン(ストレプトゾトシン);および5)トリアゼン(例えば、デカルバジン(ジメチルトリアゼノイミド-アゾレカルボキサミド)。
【００５５】
いくつかの態様では、本発明の組成物および方法で使用するのに適した代謝拮抗剤としては下記が挙げられるが、それらに限定されない:葉酸類似体(例えば、メトトレキセート(アメトプテリン));2)ピリミジン類似体(例えば、フルオロウラシル(5-フルオロウラシル)、フロクスウリジン(フルオロード-オキシウリジン)、およびシタラビン(シトシンアラビノシド));および3)プリン類似体(例えば、メルカプトプリン(6-メルカプトプリン)、チオグアニン(6-チオグアニン)、およびペントスタチン(2'-デオキシコホルマイシン)。
【００５６】
さらに別の態様では、本発明の組成物および方法において使用するのに適した化学療法薬としては下記が挙げられるが、それらに限定されない:ビンカアルカロイド(例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン);2)エピポドフィロトキシン(例えば、エトポシドおよびテニポシド);3)抗生物質(例えば、ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、ダウノルビシン(ダウノマイシン;ルビドマイシン)、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン(ミトラマイシン)、およびミトマイシン(ミトマイシンC);4)酵素(例えば、L-アスパラギナーゼ);5)生物反応修飾物質(例えば、インターフェロン-α);6)白金配位錯体(例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン);7)アントラセンジオン(例えば、ミトキサントロン);8)置換尿素(例えば、ヒドロキシ尿素);9)メチルヒドラジン誘導体(例えば、プロカルバジン(N-メチルヒドラジン));10)副腎皮質抑制剤(例えば、ミトタン(o,p'-DDD)およびアミノグルテチミド);11)副腎皮質ステロイド(例えば、プレドニソン);12)プロゲスチン(例えば、カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール);13)エストロゲン(例えば、ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオール);14)抗エストロゲン薬(例えば、タモキシフェン);15)アンドロゲン(例えば、プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロン);16)抗アンドロゲン薬(例えば、フルタミド);および17)ゴナドトロピン放出ホルモン類似体(例えば、ロイプロリド)。
【００５７】
癌治療の状況において通常使用される任意の腫瘍退縮性薬は、本発明の組成物および方法においても使用される。例えば、米国食品医薬品局（U.S. Food and Drug Administration）は、米国で使用することが認可された腫瘍退縮性薬の処方を維持している。U.S.F.D.Aに対する国際的な同等機関は同様の処方を維持する。表1は、米国において使用が認可されている例示的な抗新生物薬のリストを示したものである。当業者ではれば、米国で認可された化学療法薬全てで必要とされる「製品ラベル」は、例示的な薬剤に対する、認可された表示、用量情報、毒性データなどを記述していることを認識すると思われる。
【００５８】
【表１】
2008531465.tif 000011
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2008531465.tif 000017
【００５９】
抗癌剤には、抗癌活性を有することが確認されているが、現在はアメリカ食品医薬品局または他の相当する機関の承認を得られていないかまたは新たな用途に関する評価を受けている化合物をさらに含む。例としては、3-AP、12-O-テトラデカノイルホルボール-13-アセタート、17AAG、852A、ABI-007、ABR-217620、ABT-751、ADI-PEG20、AE-941、AG-013736、AGRO100、アラノシン、AMG706、抗体G250、アンチネオプラストン（antineoplaston）、AP23573、アパジコン(apaziquone)、APC8015、アチプリモド(atiprimod)、ATN-161、アトラセンテン(atrasenten)、アザシチジン、BB-10901、BCX-1777、ベバシズマブ、BG00001、ビカルタミド、BMS247550、ボルテゾミブ、ブリオスタチン-1、ブセレリン、カルシトリオール、CCI-779、CDB-2914、セフィキシム、セツキシマブ、CG0070、シレンジチド(cilengitide)、クロファラビン、コンブレタスタチンA4ホスファート、CP-675,206、CP-724,714、CpG7909、クルクミン、デシタビン、DENSPM、ドキセルカルシフェロール(doxercalciferol)、E7070、E7389、エクテイナシジン(ecteinascidin)743、エファプロキシラル、エフロルニチン、EKB-569、エンザスタウリン(enzastaurin)、エルロチニブ、エクジスリンド(exisulind)、フェンレチニド(fenretinide)、フラボピリドール(flavopiridol)、フルダラビン、フルタミド、フォテムスチン、FR901228、G17DT、ガリキシマブ、ゲフィチニブ、ゲニステイン、グルフォスファミド(glufosfamide)、GTI-2040、ヒストレリン、HKI-272、ホモハリントニン(homoharringtonine)、HSPPC-96、hu14.18-インターロイキン-2融合蛋白質、HuMax-CD4、イロプロスト、イミキモド、インフリキシマブ、インターロイキン-12、IPI-504、イロフルベン、イクサベピロン(ixabepilone)、ラパチニブ、レナリドマイド、レスタウルチニブ、ロイプロリド、LMB-9免疫毒素、ロナファルニブ(lonafarnib)、ルニリキシマブ(luniliximab)、マホスファミド(mafosfamide)、MB07133、MDX-010、MLN2704、モノクローナル抗体3F8、モノクローナル抗体J591、モテクサフィン(motexafin)、MS-275、MVA-MUC1-IL2、ニルタミド、ニトロカンプトテシン、ノラトレキセドジヒドロクロライド(nolatrexed dihydrochloride)、ノルバデックス(nolvadex)、NS-9、O6-ベンジルグアニン、オブリメルセンナトリウム(oblimersen sodium)、ONYX-015、オレゴボマブ、OSI-774、パニツムマブ(panitumumab)、パラプラチン(paraplatin)、PD-0325901、ペメトレキセド、PHY906、ピオグリタゾン、ピルフェニドン、ピクサントロン、PS-341、PSC833、PXD101、ピラゾロアクリジン、R115777、RAD001、ランピルナーゼ(ranpirnase)、レベッカマイシン(rebeccamycin)類縁体、rhuアンジオスタチン蛋白質、rhuMab2C4、ロシグリタゾン、ルビテカン(rubitecan)、S-1、S-8184、サトラプラチン(satraplatin)、SB-、15992、SGN-0010、SGN-40、ソラフェニブ、SR31747A、ST1571、SU011248、スベロイルアニリドヒドロキサム酸(suberoylanilide hydroxamic acid)、スラミン、タラボスタット(talabostat)、タラムパネル(talampanel)、タリキダール(tariquidar)、テムシロリムス(temsirolimus)、TGFa-PE38免疫毒素、サリドマイド、チマルファシン(thymalfasin)、チピファルニブ(tipifarnib)、チラパザミン、TLK286、トラベクテジン、トリメトレキセートグルクロナート(trimetrexate glucuronate)、TroVax、UCN-1、バルプロ酸、ビンフルニン(vinflunine)、VNP40101M、ボロシキシマブ(volociximab)、ボリノスタット(vorinostat)、VX-680、ZD1839、ZD6474、ジルートン（zileuton）、およびゾスキダールトリヒドロクロライド(zosuquidar trihydrochloride)が含まれるがこれらに限定されない。
【００６０】
本発明の化合物と共に投与するための好ましい従来の抗癌剤としては、アドリアマイシン、5-フルオロウラシル、エトポシド、カンプトテシン、アクチノマイシンD、ミトマイシンC、シスプラチン、ドセタキセル、ゲミシタビン、カルボプラチン、オキサリプラチン、ボルテゾミブ、ゲフィチニブ、およびベバシズマブが含まれるが、それらに限定されない。これらの薬剤は、併用療法組成物において、キットにおいて、または免疫治療薬と組み合わせてなどで、調製することができ、単独で使用することができる。
【００６１】
抗癌剤および他の治療薬のより詳細な説明については、当業者は、Physician's Desk Referenece、ならびに、GoodmanおよびGilmanによる“Pharmaceutical Basis of Therapeutics”ninth edition, Eds. Hardman et al., 1996を含むがそれらに限定されないかなりの数の指示マニュアルを参照する。
【００６２】
本発明は、アポゴシポロンまたはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグを放射線療法と共に投与するための方法を提供する。本発明は、治療線量の放射線を動物に送達させるのに使用する型、量、または送達および投与システムにより限定されない。例えば、動物は光子照射療法、粒子線放射療法、他の型の放射線療法、およびそれらの組み合わせを受けてもよい。いくつかの態様では、放射線は、線形加速器を用いて動物に送達させる。さらに別の態様では、放射線はγナイフを用いて送達される。
【００６３】
放射線源は、動物の外部または内部に存在させてもよい。外部放射線療法が最も一般的であり、高エネルギー放射線ビームを、例えば線形加速器を用い皮膚を介して腫瘍部位に誘導する段階を含む。放射線ビームを腫瘍部位に局在化する間、正常な健康な組織の曝露を避けることはほとんど不可能である。しかしながら、外部放射線は、通常患者に許容される。内部放射線療法では、癌細胞を特異的に標的とする送達システムの使用(例えば、癌細胞結合リガンドに結合させた粒子の使用)を含む、放射線放出源、例えば、ビーズ、ワイヤ、ペレット、カプセル、粒子などを、体内、または腫瘍部位の近くに移植する段階が必要である。そのようなインプラントは治療後除去することができ、または体内に不活性なまま残すことができる。内部放射線療法の型としては、近接照射療法、組織内照射、腔内照射、放射免疫療法などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
動物は任意で、放射線増感剤(例えば、メトロニダゾール、ミソニダゾール、動脈内Budr、静脈内インドデオキシウリジン(IudR)、ニトロイミダゾール、5-置換-4-ニトロイミダゾール、2H-イソインドールジオン、[[(2-ブロモエチル)-アミノ]メチル]-ニトロ-1H-イミダゾール-1-エタノール、ニトロアニリン誘導体、DNA-親和性低酸素選択的細胞毒、ハロゲン化DNAリガンド、1,2,4-ベンゾトリアジンオキシド、2-ニトロイミダゾール誘導体、フッ素含有ニトロアゾール誘導体、ベンズアミド、ニコチンアミド、アクリジン-インターカレーター、5-チオトレトラゾール誘導体、3-ニトロ-1,2,4-トリアゾール、4,5-ジニトロイミダゾール誘導体、ヒドロキシル化テキサフリン、シスプラチン、ミトマイシン、チリパザミン、ニトロソ尿素、メルカプトプリン、メトトレキセート、フルオロウラシル、ブレオマイシン、ビンクリスチン、カルボプラチン、エピルビシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンデシン、エトポシド、パクリタキセル、熱(温熱療法)、など)、放射線防護薬(例えば、システアミン、アミノアルキルジヒドロジェンホスホロチオエート、アミホスチン(WR 2721)、IL-1、IL-6など)を摂取してもよい。放射線増感剤は、腫瘍細胞の死滅を増強する。放射線防護薬は、健全な組織を放射線の有害な影響から防護する。
【００６５】
許容できない負の副作用がなく、放射線量が患者により許容される限り、任意の型の放射線を患者に照射することができる。放射線療法の適した型としては、例えば、イオン化(電磁)放射線療法(例えば、X線またはγ線)または粒子ビーム放射線療法(例えば、高線形エネルギー放射線)が挙げられる。イオン化放射線は、イオン化、すなわち電子の獲得または損失を引き起こすのに十分なエネルギーを有する粒子または光子を含む放射線として規定される(例えば、U.S. 5,770,581に記述、全体が参照により本明細書に組み入れられる)。放射線の効果は、臨床医により少なくとも部分的に制御することができる。放射線量は、標的細胞曝露を最大とし、毒性を減少させるために、好ましくは分割される。
【００６６】
動物に照射した放射線の総線量は好ましくは約.01Gray(Gy)〜約100Gyである。より好ましくは、約10Gy〜約65Gy(例えば約15Gy、20Gy、25Gy、30Gy、35Gy、40Gy、45Gy、50Gy、55Gy、または60Gy)が治療過程にわたり照射される。いくつかの態様では、1日の過程にわたり完全な放射線量を照射することができるが、総線量は分割し、数日にわたり照射することが理想的である。望ましくは、放射線療法は、少なくとも約3日、例えば、少なくとも5、7、10、14、17、21、25、28、32、35、38、42、46、52または56日(約1〜8週)の過程にわたり実施される。したがって、放射線の1日量は、約1〜5Gy(例えば、約1Gy、1.5Gy、1.8Gy、2Gy、2.5Gy、2.8Gy、3Gy、3.2Gy、3.5Gy、3.8Gy、4Gy、4.2Gy、または4.5Gy)、好ましくは1〜2Gy(例えば、1.5〜2Gy)を含んでもよい。1日の放射線量は標的細胞の破壊を誘導するのに十分であるべきである。一定期間にわたり引き延ばす場合、放射線は好ましくは毎日照射されず、これにより動物は休息することができ、治療の効果が実現される。例えば、放射線は、治療の各1週間の間、5日間連続して照射されるが、2日間連続して照射されないのが望ましく、これにより、1週間につき2日間の休憩が得られる。しかしながら、動物の反応性および任意の可能性のある副作用によっては、放射線を1日/週、2日/週、3日/週、4日/週、5日/週、6日/週、または全7日/週照射することができる。放射線療法は治療期間中のいずれの時点でも開始することができる。好ましくは、放射線は第1週または第2週に開始し、治療期間の残りの期間中照射する。例えば、固形腫瘍を治療するためには、例えば、6週間の治療期間の1〜6または2〜6週、放射線を照射する。または、放射線は5週間の治療期間の1〜5または2〜5週照射する。しかしながら、これらの例示的な放射線療法実施スケジュールは本発明を制限するものではない。
【００６７】
抗菌治療薬もまた、本発明における治療薬として使用してもよい。細菌を死滅させ、その機能を阻害し、またはそうでなければ弱毒化することができる任意の薬剤、ならびにそのような活性を有するように企図された任意の薬剤を使用してもよい。抗菌剤としては、単独または組み合わせて使用される、天然および合成抗生物質、抗体、阻害蛋白質(例えば、デフェンシン)、アンチセンス核酸、膜破壊剤などが挙げられるが、それらに限定されない。実際、任意の型の抗菌剤を使用してもよく、抗菌剤、抗ウイルス剤、抗真菌剤、などが挙げられるが、それらに限定されない。
【００６８】
本発明のいくつかの態様では、アポゴシポロンまたはその薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグといった抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質阻害剤、および、1または複数の治療薬もしくは抗癌剤を動物に、1または複数の下記条件下で投与する:異なる周期性、異なる期間、異なる濃度、異なる投与経路、など。いくつかの態様では、アポゴシポロンは治療薬または抗癌剤の前、例えば、治療薬または抗癌剤の投与の0.5、1、2、3、4、5、10、12、もしくは18時間、1、2、3、4、5、もしくは6日、または1、2、3、もしくは4週前に投与する。いくつかの態様では、アポゴシポロンは治療薬または抗癌剤の後、例えば、治療薬または抗癌剤の投与の0.5、1、2、3、4、5、10、12、もしくは18時間、1、2、3、4、5、もしくは6日、または1、2、3、もしくは4週後に投与する。いくつかの態様では、アポゴシポロン、またはその塩もしくはプロドラッグ、および治療薬または抗癌剤を同時に、しかしながら異なるスケジュールで投与し、例えば、アポゴシポロン、またはその塩もしくはプロドラッグは毎日投与するが、治療薬または抗癌剤は1週間に1度、2週間に1度、3週間に1度、または4週間に1度投与する。別の態様では、アポゴシポロン、またはその塩もしくはプロドラッグは1週間に1度投与するが、治療薬または抗癌剤は毎日、1週間に1度、2週間に1度、3週間に1度、または4週間に1度投与する。
【００６９】
細胞の化合物の取り込みを増強するために、本発明の化合物を担体分子に結合してもよい。そのような担体分子の例としては、Fulda et al., Nature Med. 8:808 (2002), Arnt et al., J. Biol. Chem. 277:44236 (2002), and Yang et al., Cancer Res. 63:831 (2003)に記載される担体ペプチドなどの担体ペプチド、フソジェニック(fusogenic)ペプチド(例えば米国特許第5,965,404号を参照されたい)、ならびに、ウイルスおよび空のキャプシドやウイルス血球凝集素などのウイルスの要素(例えば米国特許第5,547,932号を参照されたい)が含まれる。他の担体分子は、アシアロ糖蛋白質(アシアロ糖蛋白質受容体と結合する；米国特許第5,166,320号を参照されたい)などの細胞表面の受容体に対するリガンド、およびT細胞に特異的な抗体、例えば抗CD4抗体(米国特許第5,693,509号を参照されたい)などの細胞表面の受容体に対する抗体を含む。
【００７０】
本発明の範囲内にある組成物は、本発明の化合物が、その所期の目的を達成するのに有効な量で含まれる全ての組成物を含む。個人の要求は様々であるが、各成分の有効量の最適範囲の決定は当技術の範囲内である。典型的には、化合物を哺乳類、例えばヒトに、一日当り、アポトーシスの誘導に応答する疾患を治療する哺乳類の体重当り、0.0025〜50mg/kgの用量で、または等量の薬学的に許容されるその塩を経口投与してもよい。好ましくは、約0.01〜約10mg/kgを経口投与して、そのような疾患を治療、寛解または予防する。筋内注射では、用量は一般に経口用量の約2分の1である。例えば、適した筋内用量は約0.0025〜約25mg/kg、最も好ましくは約0.01〜約5mg/kgである。
【００７１】
単位経口用量は、約0.01〜約50mg、好ましくは約0.1〜約10mgの化合物を含んでもよい。単位用量は一日に1または複数回、各々が約0.1〜約10mg、便宜的には約0.25〜50mgの化合物またはその溶媒和物を含む1または複数の錠剤もしくはカプセルとして投与してもよい。
【００７２】
局所用製剤中には、化合物は約0.01〜100mg/gの担体の濃度で存在してもよい。好ましい態様では、化合物は約0.07〜1.0mg/ml、より好ましくは約0.1〜0.5mg/ml、最も好ましくは約0.4mg/mlの濃度で存在する。
【００７３】
アポゴシポロンまたはその塩もしくはプロドラッグ、または抗アポトーシスBcl-2ファミリー蛋白質の他の阻害剤を生の化学薬品として投与する他に、薬学的に使用することができる調製物に化合物を加工するのを容易にする賦形剤および佐剤を含む適した薬学的に許容される担体を含む薬学的調製物の一部として、本発明の化合物を投与してもよい。好ましくは、調製物、特に経口または局所投与することができ、好ましい型の投与のために使用することができる調製物、例えば錠剤、糖衣錠、持続放出ロゼンジおよびカプセル、口内洗浄剤および洗口剤、ゲル、懸濁液、ヘアリンス、ヘアジェル、シャンプー、ならびに直腸投与可能な調製物、例えば坐薬、ならびに注射により、局所または経口投与するために適した溶液は約0.01〜99%、好ましくは約0.25〜75%の活性化合物を賦形剤と共に含む。
【００７４】
本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物の有用な効果を受ける可能性がある任意の動物に投与してもよい。そのような動物のうちの第1は哺乳類、例えばヒトであるが、本発明はそのように限定されるものではない。他の動物としては獣医学的動物が挙げられる(ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコなど)。
【００７５】
化合物およびその薬学的組成物は、所期の目的を達成する任意の手段により投与してもよい。例えば、投与は非経口、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、経皮、口腔内、くも膜下、頭蓋内、鼻内、または局所経路により実施してもよい。その代わりに、または同時に、投与は経口経路により実施してもよい。投与用量はレシピエントの年齢、健康、および体重、もしあれば同時治療の種類、治療頻度、および所望の効果の性質に依存する。
【００７６】
本発明の薬学的調製物は、それ自体公知の様式で、例えば、従来の混合、顆粒化、糖衣錠製造、溶解、または凍結乾燥法により製造される。このように、経口用の薬学的調製物は、活性化合物を固体賦形剤と混合し、任意で、得られた混合物を顆粒化し、所望または必要であれば、適した佐剤を添加した後、顆粒混合物を処理して、錠剤または糖衣錠コアを提供することにより得ることができる。
【００７７】
特に、適した賦形剤は、単糖類などの充填材、例えば乳糖またはショ糖、マンニトールまたはソルビトール、セルロース調製物および/またはリン酸カルシウム、例えばリン酸三カルシウムまたはリン酸水素カルシウム、ならびに、例えば、トウモロコシデンプン、小麦デンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプンを使用するデンプンペースト、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、および/またはポリビニルピロリドンなどの結合剤である。所望であれば、上記デンプンおよびカルボキシメチル-デンプン、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤を添加してもよい。佐剤は、とりわけ、流量調整剤および潤滑剤、例えば、シリカ、タルク、ステアリン酸もしくはその塩、例えばステアリン酸マグネシウムもしくはステアリン酸カルシウム、および/またはポリエチレングリコールである。糖衣錠コアには、所望であれば、胃液に耐性のある適したコーティングを提供する。この目的のために、濃単糖類溶液を使用してもよく、これは任意でアラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー溶液および適した有機溶媒または溶媒混合物を含んでもよい。胃液に対し耐性のあるコーティングを製造するために、適したセルロース調製物、例えばアセチルセルロースフタレートまたはヒドロキシプロピルメチル-セルロースフタレートの溶液を使用する。染料または顔料を錠剤または糖衣錠コーティングに、例えば、識別のために、または活性化合物用量の組み合わせを特徴づけるために添加してもよい。
【００７８】
経口で使用することができる別の薬学的調製物としては、ゼラチン製の押し込み型カプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールなどの可塑剤で製造されたソフト密閉カプセルが挙げられる。押し込み型カプセルは、乳糖などの充填材、デンプンなどの結合剤、および/またはタルクもしくはステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤、および任意で、安定化剤と混合してもよい顆粒形態の活性化合物を含むことができる。ソフトカプセル中では、活性化合物は好ましくは適した液体、例えば脂肪油、または流動パラフィン中に溶解し、または懸濁させる。さらに、安定化剤を添加してもよい。
【００７９】
経直腸的に使用することができる可能のある薬学的調製物としては、例えば、1または複数の活性化合物と坐薬基剤の組み合わせから構成される坐薬が挙げられる。適した坐薬基剤は、例えば、天然または合成トリグリセリド、またはパラフィン炭化水素である。さらに、活性化合物と基剤の組み合わせから構成されるゼラチン直腸カプセルを使用することもできる。可能な基剤材料としては、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、またはパラフィン炭化水素が挙げられる。
【００８０】
非経口投与のために適した製剤としては、水溶性形態の活性化合物、例えば水溶性塩の水溶液およびアルカリ溶液が挙げられる。さらに、適当な油性注射懸濁液として、活性化合物の懸濁液を投与してもよい。適した親油性溶媒または媒質としては、脂肪油、例えば、ゴマ油、または合成脂肪油エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドまたはポリエチレングリコール-400が挙げられる。水性注射懸濁液は、懸濁液の粘度を増加させる物質を含んでもよく、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および/またはデキストランが挙げられる。任意で、懸濁液はまた安定化剤を含んでもよい。
【００８１】
本発明の局所用組成物は、好ましくは、適当な担体を選択することにより、オイル、クリーム、ローション、軟膏などとして製剤化する。適した担体としては植物油または鉱物油、白色ワセリン(白色ソフトパラフィン)、分枝鎖脂肪または油、獣脂および高分子量アルコール(C12を超える)が挙げられる。好ましい担体は、活性成分が溶解可能なものである。乳化剤、安定化剤、湿潤剤および抗酸化剤、ならびに色または香味を付与する薬剤もまた、所望であれば含有させてもよい。さらに、経皮透過増強剤をこれらの局所製剤において使用することができる。そのような増強剤の例は、米国特許第3,989,816号および同第4,444,762号において見いだすことができる。
【００８２】
クリームは好ましくは、少量のアーモンド油などの油に溶解させた活性成分が混合された、鉱物油、自己乳化蜜蝋および水の混合物から製剤化される。そのようなクリームの典型的な例は、約40部の水、約20部の蜜蝋、約40部の鉱物油および約1部のアーモンド油を含むものである。
【００８３】
軟膏は、温かいソフトパラフィンを添加したアーモンド油などの植物油中の活性成分の溶液を混合し、混合物を冷却することにより製剤化してもよい。そのような軟膏の典型的な例は、約30重量%のアーモンド油および約70重量%の白色ソフトパラフィンを含むものである。
【００８４】
ローションは、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどの適した高分子量アルコールに活性成分を溶解することにより便宜的に調製してもよい。
【００８５】
下記実施例は本発明の方法および組成物の例示であり、それらを限定するものではない。臨床治療で通常見られ、当業者に明らかな様々な条件およびパラメータの他の適した変更および適合は、本発明の精神および範囲内にある。
【００８６】
実施例1
蛍光偏光結合アッセイ
Bcl-2およびBcl-xLのための、蛍光偏光(FP)を用いた結合アッセイを開発し、組換えヒトBcl-2およびBcl-xL蛋白質、6-カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(FAM)で標識されたBid BH3ペプチド、ならびに6-(フルオレセイン-5(6)-カルボキサミド)ヘキサン酸(Flu)で標識されたBak BH3ペプチドを用いて最適化した。FPを用いた結合アッセイは、阻害剤が、Bcl-2またはBcl-xL蛋白質から、それぞれBid-FAMまたはBak-Fluペプチドを置換する能力を測定する。DMSO中の被験化合物の段階希釈を用いて用量依存的な結合実験が行われた。Bcl-2結合アッセイには、阻害剤試料5μl、および、アッセイ緩衝液(100mMリン酸カリウム、pH7.5；100μg/mlウシγグロブリン； 0.02% アジ化ナトリウム、Invitrogen, Life Technologiesから購入)中でBid-FAMペプチド(10nM)とプレインキュベートした組換えHis融合可溶性Bcl-2蛋白質(120nM)を、Dynex96穴、黒色、丸底プレート(Fisher Scientific)に添加し、最終容積125μlを生じた。全15個の異なる濃度の阻害剤を典型的に使用して、非線形最小二乗法を用いたプロット、およびGraphPad Prism(登録商標)ソフトウェアを用いて実施した曲線のあてはめからIC5O値を決定した。3〜4時間インキュベートした後、ULTRA READER (Tecan U.S. Inc., Research Triangle Park, NC)を使用して分極値を測定した。Ki値は、Bid-FAMペプチドのBcl-2に対するKd値、測定されたIC50値、ならびに蛋白質およびBid-FAMの濃度に基づいて、改変されたCheng-Prusoff式を用いて算出された。Bcl-xL結合アッセイには、Hisタグと融合し、C末端疎水性尾部を有しない組換えヒトBcl-xL、およびBak-Fluペプチドを使用した。60nMのBcl-xLおよび5nMのBak-Fluペプチドをアッセイ緩衝液(50nM トリス-ビス、pH7.4；0.01%ウシγグロブリン)中で用いた以外は、Bcl-2アッセイと同様の方法でBcl-xLアッセイを実施した。陽性対照として非標識BidおよびBakペプチド、(-)-ゴシポール、ならびにアポゴシポロンを用いた。陰性対照としてゴシポールの不活性類似体を用いた。
【００８７】
実施例2
ゴシポール類似体の設計
(-)-ゴシポールはBH3結合溝でBcl-2およびBcl-xLに結合すること、ならびに有意な抗癌活性を有することが示されている(米国特許出願第2003/0008924号)。(-)-ゴシポールは構造中に2つの反応性アルデヒド基を含む。これらの2つの反応基は、蛋白質中のリジン残基とシッフ塩基を形成し、動物およびヒトにおけるゴシポールの毒性はこれに起因している。この毒性は軽いとはいえ、患者に与えられる極量を制限している。毒性が低くかつBcl-2とより強固に結合するゴシポール類似体を同定するために多くの取り組みがなされた。
【００８８】
アルデヒド基と、Bcl-2およびBcl-xLにおけるアルギニン残基(それぞれArg-139およびArg-141)との間の相互作用を維持するために、2つの類似体、すなわちゴシポール酸(V)およびゴシポロン酸(VI)が設計された。これら2つの化合物はそれぞれ120nMおよび280nMのKi値を有する、すなわち(-)-ゴシポールよりもわずかにより有効であることが明らかとなった。しかしながら、これらの化合物の2つの酸性基は生理条件(pH＝7.4)では負に帯電しており、細胞内に入ることを妨げている。PC-3細胞における細胞増殖阻害アッセイにおいて、両化合物は10μMを上回るIC50値を有する。
2008531465.tif 000018
【００８９】
ゴシポール酸およびゴシポロン酸のより低い細胞透過性を克服するために、ゴシポールの2つのアルデヒド基が完全に除去されたさらなる2つの化合物、アポゴシポール(apogossypol)(VII)およびアポゴシポロン(I) を設計し、合成した。アポゴシポールおよびアポゴシポロンは、それぞれ200nMと76nMのKi値を有すると決定された。アポゴシポロンのBcl-2に対する結合曲線を図1に示す。アポゴシポロンのBcl-xLに対するKi値は1.27μMと決定された(図1)。従って、アポゴシポロンは有効な小分子阻害剤であることを示している。
2008531465.tif 000019
【００９０】
実施例3
アポゴシポロンの細胞増殖阻害活性
PC-3およびLnCap前立腺癌細胞株における細胞増殖阻害活性について、(-)-ゴシポール、アポゴシポール、およびアポゴシポロンの直接比較を行った。PC-3細胞株における細胞増殖阻害の4〜6日のMTTアッセイにおいて、3〜5回の個別の実験において、アポゴシポールは(-)-ゴシポールと同程度有効であったが、アポゴシポロン(IC50＝2.2μM)は(-)-ゴシポール(IC50＝6.5μM)よりも一貫して3〜4倍有効であった。LnCap細胞株(アポゴシポロンIC50＝1.3μM、(-)-ゴシポールIC50＝4.7μM)でも同様の結果が見出された。しかしながら、アポゴシポールは非常に不安定であり、たとえ試料が-20℃、窒素下に保存されていても、1週間以内に急速に分解した。対照的に、アポゴシポロンは非常に安定であり、窒素による保護なしで室温で数週間保存した場合でも分解は検出されなかった。
【００９１】
MDA-MB-231(サブクローン2LMP)、T47D、およびMDA-MB-435乳癌細胞株を用いて、さらなる細胞増殖阻害調査を実施した。ラセミ体のゴシポール、アポゴシポール、アポゴシポロン、(+)-アポゴシポール、(-)-アポゴシポール、およびテトラアセチルアポゴシポロン(式VIII)を上記のように試験した。結果の概要を表2に示す。MDA-MB-231細胞株において、アポゴシポールはゴシポールよりも約5倍有効であり、アポゴシポロンはゴシポールよりも約9倍有効であった(図2)。T47D細胞株において、アポゴシポールはゴシポールよりも約2.5倍有効であり、アポゴシポロンはゴシポールよりも約2倍有効であった(図3)。MDA-MB-435細胞株において、アポゴシポールはゴシポールよりも約3倍有効であり、アポゴシポロンはゴシポールよりも約2倍有効であった(図4)。 
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【００９２】
【表２】
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【００９３】
実施例4
アポゴシポロンの毒性
本発明の開発の間、動物およびヒトにおけるゴシポールの主な毒性は2つの反応性アルデヒド基に関連し、これらのアルデヒドの除去により毒性が有意に低下するはずであると考えられた。この予想を確かめるために、2つの異なる投与経路(経口および静脈内)を用いて、マウスでアポゴシポロンおよび(-)-ゴシポールの最大耐量(MTD)を評価した。経口投与(経口胃管栄養5日/週)では、アポゴシポロンのMTDは240mg/kgを上回り、(-)-ゴシポールのMTDは約50mg/kgであった。静脈内投与(1日おき、3日/週)では、アポゴシポロンのMTDは約80mg/kgであり、(-)-ゴシポールのMTDは約10mg/kgであった。両方の投与経路において、アポゴシポロンのMTDは(-)-ゴシポールよりも8倍優れていた。したがって、アポゴシポロンはマウスで良好な耐容性を示し、(-)-ゴシポールよりも大幅に毒性が低い。
【００９４】
実施例5
アポゴシポロンの抗腫瘍活性
ヌードマウスのPC-3異種移植モデルを用いてアポゴシポロンのインビボでの調査を行い、アポゴシポロン単独で、またはX線照射と組み合わせて抗腫瘍活性を評価した。確立したPC-3異種移植(150mm3のサイズ)を有するヌードマウスを、（1）アポゴシポロン200mg/kg、経口的、1日4回、5×4週；（2）動物の体を遮蔽して、2Gyの用量を1日4回、5×3週、合計30Gyを腫瘍のみに対してX線を部分照射；および（3）アポゴシポロンおよび放射線の組み合わせで処理した。
【００９５】
図5に示すように、アポゴシポロン単独では腫瘍に対して限られた効果を有した。しかしながら、アポゴシポロンは放射線を介した腫瘍阻害を有意に増強した(P＜0.0001、二元配置の分散分析（ANOVA）、n＝10)。より有意に、アポゴシポロンに放射線を加えた処理では、57日目に10の腫瘍のうちの7つにおいて完全な腫瘍の退縮が達成されたのに対し、どちらかの処理単独では10のうち完全な退縮は0という結果であった。このデータは、アポゴシポロンが有効な放射線増感剤であることを示し、これにより進行性のホルモン抵抗性前立腺癌および他の疾患の治療薬としての使用が見出される。
【００９６】
実施例6
アポゴシポロンの合成
上記スキームIに示すように、ゴシポール酢酸から(±)-アポゴシポロンを調製した。
【００９７】
(±)-5,5'-ジイソプロピル-3,3'-ジメチル-[2,2']ビナフタレニル-1,6,7,1',6',7'-ヘキサオール(II)
ゴシポール酢酸(6.0g、10.4mmol)を、40%の水酸化ナトリウム水溶液(40ml)中、85℃、窒素雰囲気下で2時間加熱した。反応混合物を、濃硫酸を含む氷上に注いだ。生じた沈殿をエーテルで抽出し、合わせた抽出物を水で洗浄し、乾燥し、減圧濃縮して粗生成物IIを産生し、さらに精製することなく直接次の工程に用いた。
【００９８】
酢酸1,7,1',6',7'-ペンタアセトキシ-5,5'-ジイソプロピル-3,3'-ジメチル-[2,2']ビナフタレニル-6-イルエステル(III)
無水酢酸(7.8ml、83.2mmol)を、ジクロロメタン(100ml)中の粗生成物IIの溶液に添加し、続いてN,N'-ジイソプロピルエチルアミン(14.5ml、83.2mmol)を添加した。反応混合物を室温で12時間撹拌した。水を添加して反応を停止させた。クロロホルムを添加し、層を分離して、水相をクロロホルムで2回抽出した。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、乾燥し、減圧濃縮した。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(2%アセトン/クロロホルム)により、6.1gのIIIが淡黄色固体として、2工程で収率82%で得られた。
【００９９】
酢酸6,6',7'-トリアセトキシ-5,5'-ジイソプロピル-3,3'-ジメチル-1,4,1',4'-テトラオキソ-1,4,1',4'-テトラヒドロ-[2,2']ビナフタレニル-7-イルエステル(IV)
過ヨウ素酸(20g、87.7mmol)を、ジオキサン(30ml)中のIII(2.0g、2.8mmol)の溶液に添加し、反応混合物を95℃で15分間攪拌した。砕いた氷を添加して反応を停止させた。酢酸エチルを添加し、層を分離させ、水相を酢酸エチルで2回抽出した。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、乾燥し、減圧濃縮した。フラッシュシリカゲルカラムクロマトグラフィー(2%アセトン/クロロホルム)により、0.65gのIVが鮮黄色固体として、収率35%で得られた。
【０１００】
6,7,6',7'-テトラヒドロキシ-5,5'-ジイソプロピル-3,3'-ジメチル-[2,2']ビナフタレニル-1,4,1',4'-テトラオン,アポゴシポロン(I)
10%の炭酸カリウム溶液(10ml)をジオキサン(15ml)中のIV(0.6g、0.91mmol)の溶液に添加し、反応混合物を70℃で5時間攪拌した。冷却後、溶液に4MのHClを添加し、pHを5に調整した。酢酸エチルを添加し、層を分離させ、水相を酢酸エチルで2回抽出した。合わせた抽出物をブラインで洗浄し、乾燥し、減圧濃縮した。酢酸エチル/ヘキサンからの再結晶化により、0.44gのアポゴシポロン(I)が黄褐色固体として、収率98%で得られた。
【０１０１】
実施例7
ゴシポロン酸の合成
報告された方法(Rogers et al., J. Am. Chem. Soc. 60:2170 (1938))によって、上記スキームIIIのように(±)-ゴシポロン酸をゴシポール酢酸から調製した。ラセミ体のゴシポールを、ジメチル硫酸を用いてメタノールおよび水酸化カリウムの存在下で、ヘキサメチルエーテルへと変換した。ヘキサメチルエーテルを、希硝酸によりゴシポロン酸テトラメチルエーテルへと酸化した。炭酸カリウム存在下でアセトンを還流してジメチル硫酸によりメチルエステルを得た。合計6つのメチル基を、ジクロロメタン中、-20℃で三臭化ホウ素により除去し、続いて希釈した酢酸水溶液で処理し、ゴシポロン酸を黄色固体として生じた。
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【０１０２】
実施例8
Mcl-1蛋白質の蛍光偏光結合アッセイ
【０１０３】
ヒトMcl-1蛋白質の発現および精製
ヒトMcl-1cDNAをOrigene社から購入した。アミノ酸171〜327位をコードする断片を、以下のオリゴヌクレオチド
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および、
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を用いて、BamHIおよびEcoRI部位によりpHis-TEVベクター(改変pETベクター)へとクローン化した。N末端に8×Hisタグを有するMcl-1のアミノ酸171〜327位の蛋白質を、大腸菌(E.coli)BL21(DE3)細胞で産生させた。細胞を、抗生物質を含む2×YT中、37℃で、OD600の密度が0.6まで生育させた。0.4mM IPTG、37℃、4時間で蛋白質の発現を誘導した。500mM NaCl、0.1% bME、および40μlロイペプチン/アプロチニンを含む、50mMトリス、pH8.0の緩衝液中で細胞を溶解させた。Mcl-1のアミノ酸171〜327位の蛋白質は、Ni-NTA樹脂(QIAGEN)を用い、製造業者の説明書に従って可溶性画分から精製した。25mMトリスpH8.0の緩衝液中で、Source Q15カラム(樹脂およびカラムはAmersham Biosciences社)によりNaCl勾配を用いて蛋白質をさらに精製した。精製した蛋白質を一定量に分け、25%グリセロール存在下で、-80℃で保存した。
【０１０４】
蛍光偏光結合アッセイ
感度がよく定量的なインビトロ蛍光偏光(FP)を用いた結合アッセイを最適化し、Bcl-2ファミリー蛋白質のメンバーであるMcl-1蛋白質に対する、アポゴシポロンのインビトロ結合親和性を測定するために使用した。
【０１０５】
インビトロMcl-1結合アッセイ
FPを用いた方法を確立し、最適化して、アポゴシポロンのMcl-1蛋白質に対する結合親和性を試験した。本アッセイでは、6-カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル(FAM)でN末端が標識された21残基のBid BH3ペプチド
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を、蛍光タグ(Flu-Bid-21)として使用した。1nMの一定濃度のプローブを用い、予想される蛋白質-プローブ対のKdを有意に上回って増加していく濃度のMcl-1蛋白質で滴定することによって、Flu-Bid-21プローブとMcl-1蛋白質との複合体の解離定数(Kd)を測定した。図6は、一定のプローブ濃度において、Mcl-1蛋白質濃度が0μMから2μMまで変化する飽和実験に対する単一部位の結合モデルにフィットする非線形最小二乗法を示す。蛍光プローブであるFlu-Bid-21は、Mcl-1蛋白質に対して高い結合親和性を示し、Kd＝0.83nMおよびΔmPの動的領域＝122mP(ΔmP＝結合ペプチドのmP-遊離ペプチドのmP)であった。プローブ濃度が減少した場合のKd値変化の可能性を調べた。原理上は、プローブ濃度が真のKd値を上回る場合、より高いプローブ濃度によってより高い見かけのKd値がもたらされる(Kenakin, Pharmacological Analysis of Drug-Receptor Interaction, Lippincott-Raven, Philadelphia(1997))。プローブFlu-Bid-21の4つの濃度(5、2.5、1、および0.5nM)で、蛍光プローブに対する見かけのKd値、それぞれ1.32、1.05、0.83、および0.70nMが得られた(図6)。従ってこれらの結果から、それぞれ4つの濃度で得られたプローブに対する見かけのKd値は真のKd値にほぼ等しいことが示された。アッセイの特異性は、Mcl-1に対する標識Flu-Bid 21merの結合を、Ki＝5.7±1.1nMを有する非標識Bid 21merペプチドで競争的置換することによって確かめられ、これは測定されたKdと良く一致した(図7)。
【０１０６】
DMSO中の被験化合物の段階希釈を用いて、用量依存的な競合結合実験を行った。被験試料の5μl試料、ならびにアッセイ緩衝液(100mMリン酸カリウム、pH7.5；100μg/mlウシγグロブリン；0.02%アジ化ナトリウム、Invitrogen(商標)Life Technologyから購入)中でプレインキュベートしたMcl-1蛋白質(5nM)およびFlu-Bid 21merペプチド(1nM)を、Dynex96穴、黒色、丸底プレート(Fisher Scientific)に添加し、最終容積を125μlとした。それぞれのアッセイには、対照としてMcl-1蛋白質およびFlu-Bid-21merペプチド(0%阻害に相当)、ならびにFlu-Bid-21merペプチドのみ(100%阻害に相当)を含む。偏光値は、インキュベーション3時間後にULTRA READER(Tecan U.S. Inc., Research Triangle Park, NC)を使用して測定した。非線形最小二乗法を用いたプロットから、IC50値、すなわち結合ペプチドの50%が置換される阻害剤濃度を決定した。GRAPHPAD PRISMソフトウェア(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA)を使用して曲線のあてはめを行った。競合結合アッセイにおける過剰な蛋白質の影響を含む、本発明者らが開発した以下のFPアッセイ用の式を用いてKi値を算出した。
Ki＝[I] 50/([L]50/Kd+[P]0/Kd+1)
式中、[I] 50は50%阻害時の遊離の阻害剤の濃度を指し、[L]50は50%阻害時の遊離の標識プローブの濃度であり、[P]0は0%阻害時の遊離の蛋白質の濃度であり、Kdは蛋白質-リガンド複合体の解離定数である。この式は競合結合アッセイの基本原理から導かれ、また阻害剤のKi値を正確に計算するこの新たな式に必要な全てのパラメーターの解も導き出された(Nikolovska-Coleska et al., Anal. Biochem. 332:261(2004))。
【０１０７】
FPを用いたアッセイを使用して、アポゴシポロンの結合親和性を測定した。アポゴシポロンのMcl-1に対するKi値は0.051±0.02μMと測定され、結合曲線を図7に示す。ゴシポール類似体としてのアポゴシポロンは、(-)-ゴシポールのKi＝0.18±0.01と比べて3.5倍優れた結合親和性を示す(図7)。
【０１０８】
以上、本発明について詳細に記述してきたが、当業者であれば、本発明またはその任意の態様の範囲に影響することなく、条件、製剤化、および他のパラメータの広く、等価な範囲内で同一のことを実施することができることは理解されると思われる。本明細書で引用した特許、特許出願および出版物は全て、参照により完全に本明細書に組み入れられる。 
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】アポゴシポロンのBcl-2およびBcl-xLへの結合を示す。
【図２】ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231(サブクローン2LMP)細胞における、アポゴシポロンおよび他のゴシポール誘導体による細胞増殖阻害を示す。
【図３】ヒト乳癌細胞株T47D細胞における、アポゴシポロンおよび他のゴシポール誘導体による細胞増殖阻害を示す。
【図４】ヒト乳癌細胞株MDA-435細胞における、アポゴシポロンおよび他のゴシポール誘導体による細胞増殖阻害を示す。
【図５】ヒト前立腺癌細胞株PC-3異種移植ヌードマウスモデルにおける、アポゴシポロンおよびX線照射による腫瘍増殖阻害を示す。
【図６】異なる濃度のFlu-Bid-21merペプチドの、Mcl-1蛋白質に対する結合等温線(binding isotherm)を示す。
【図７】蛍光偏光を用いた結合アッセイを使用して測定された、非標識BID 21merペプチド、アポゴシポロン、および(-)-ゴシポールの、Mcl-1に対する競合結合曲線を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年10月15日(2007.10.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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