(57)【要約】髄膜炎Ａ型ワクチンに有用なオリゴ糖は、タンパク質に結合することができ、第一単位のＣ−６を第二単位のＣ−１に連結する１，６−結合を介して、第二マンノース単位に連結する、Ｃ−１でα−配置にスペーサーを持つ第一マンノース単位を含み、該１，６−結合はホスホネートを含む。そのような化合物、類似化合物、またはその中間体を製造する関連方法も開示する。該化合物は、安定化されたリン含有結合、好ましくはホスホネート結合を含むオリゴ糖である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一マンノース単位と第二マンノース単位とを含むオリゴ糖であって、第一マンノース単位は、Ｃ−１においてアルファ配置でスペーサー部分を含み、スペーサーは、タンパク質に複合することができ、第一マンノース単位は、第一単位のＣ−６を第二単位のＣ−１に連結する１，６−結合を介して第二マンノース単位に連結し、１，６−結合は、ホスホネートを含むオリゴ糖。
【請求項２】
１，６−結合が、アルファ配置においてである、請求項１に記載のオリゴ糖。
【請求項３】
第一マンノース単位は、２−デオキシ−２−アザ置換マンノース誘導体である、請求項１または２に記載のオリゴ糖。
【請求項４】
第二マンノース単位は、２−デオキシ−２−アザ置換マンノース誘導体である、請求項１〜３のいずれかに記載のオリゴ糖。
【請求項５】
少なくとも３個のマンノース単位を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のオリゴ糖。
【請求項６】
１，６−結合は、［第二マンノース単位のＣ−１］−ＣＨ２−Ｐ−Ｏ−［第一マンノース単位のＣ−６］の形態である、請求項１〜５のいずれかに記載のオリゴ糖。
【請求項７】
存在する各２−アザ置換基は、ＮＨ２、ＮＨＡｃおよびＮ３から選択される、請求項１〜６のいずれかに記載のオリゴ糖。
【請求項８】
第三マンノース単位が、リンを含む結合によって第二マンノース単位に連結され、結合は、第二マンノース単位のＣ−６を第三マンノース単位のＣ−１に連結する、請求項１〜７のいずれかに記載のオリゴ糖。
【請求項９】
第二マンノース単位のＣ−６を第三マンノース単位のＣ−１に連結する結合は、ホスホネートを含む、請求項８に記載のオリゴ糖。
【請求項１０】
オリゴ糖は、式：
【化１】
2008540398.tif 000073
（式中、各Ａｚは、ＮＨ２、ＮＨＡｃおよびＮ３から独立して選択され；
Ｚは、スペーサー部分であって、タンパク質に複合することができ、保護された形または保護されなくてもよく、あるいは、タンパク質に複合してよいスペーサー部分を示し；
各Ｒ１は、独立して、Ｈ、または場合によっては置換されたＣ１−Ｃ６アルキル、あるいはＭ（ここでＭはカチオンを示す）であり；
Ｘは、ＯまたはＣＨ２であり；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ａｃ、Ｂｎおよび他の保護基からなる群から選択され；および
Ｒ６は、Ｈ、保護基、ホスフェート、または追加のサッカライド単位への結合を示す）である、請求項８または９記載のオリゴ糖。
【請求項１１】
さらに、アルファ−配置において第一マンノース単位のＣ−１にあるスペーサー部分を介してオリゴ糖に複合するタンパク質を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載のオリゴ糖。
【請求項１２】
タンパク質は、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌外毒素（ｒΕＰＡ）あるいは破傷風トキソイドから選択される不活性細菌毒素であり、またはタンパク質はＣＲＭ１９７である、請求項１１に記載のオリゴ糖。
【請求項１３】
スペーサー部分は、ヒドロキシルまたはアミンを含み、どちらも、場合によっては保護され、または場合によってはタンパク質に複合されている、請求項１〜１２のいずれかに記載のオリゴ糖。
【請求項１４】
Ｒ３は、アシル基であり、Ｒ４はＨである、請求項１〜１３のいずれかに記載のオリゴ糖。
【請求項１５】
式：
【化２】
2008540398.tif 000074
（式中、各Ａｚは、アザ置換基を示し；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈまたは保護基を示し；
Ｒ６は、Ｈ、保護基、または他のサッカライド単位に結合するリンカーを示し；
ＷおよびＸの１つはＯであり、ＷおよびＸのもう１つはＣＨ２であり；
ｎは１または２であり；
Ｙｎは、ｎが１の場合、ＯＲであり、ｎが２の場合、１個のＹは＝Ｏであり、もう１つのＹはＯＲ
（ここで、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ６−Ｃ１２アリールあるいはＣ６−Ｃ１２アリールアルキルであり、またはＲはＭであり、Ｍがカチオンである）であり；
Ｚは、ＯＲ’、ＳＲ’またはＮＲ’２（ここで、各Ｒ’は、独立して、Ｈ、場合によっては置換されたアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアシル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル基である）であり；あるいは
Ｚは、他のサッカライド単位に、またはタンパク質に複合するスペーサー部分に結合するリンカーを示す）を含む、請求項１記載のオリゴ糖。
【請求項１６】
タンパク質は、アミド結合またはエステル結合を介してオリゴ糖に複合されている、請求項１５に記載のオリゴ糖。
【請求項１７】
ＷはＣＨ２であり、ＸはＯであり、ＡｚはＮＨＡｃであり、ｎは２である、請求項１５に記載のオリゴ糖。
【請求項１８】
ＲはＭであり、Ｚは−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは２〜６である）を含む、請求項１５〜１７のいずれかに記載のオリゴ糖。
【請求項１９】
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨまたはＡｃである、請求項１５〜１８のいずれかに記載のオリゴ糖。
【請求項２０】
オリゴ糖を製造する方法であって、少なくとも１つのアザ置換マンノース単位を含む第一部分を、ホスホネートを含む１，６−結合を介して、少なくとも１つのアザ置換マンノース単位を含む第二部分に結合するステップを含み、第一部分は、スペーサー部分を含み、スペーサー部分を、アルファ−配置のマンノース単位のＣ−１に結合させる方法。
【請求項２１】
ミツノブ反応を使用して、第一部分のマンノース単位のＣ−６を、第二部分のマンノース単位のＣ−１に結合させる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
１，６−結合は、１，６−アルファ結合である、請求項２０〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
結合Ｎ−置換マンノース単位は、式（１）：
【化３】
2008540398.tif 000075
（式中、各Ａｚは、アザ置換基を示し；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈまたは保護基を示し；
Ｒ６は、Ｈ、保護基、または別のサッカライド単位に結合されたリンカーを示し；
ＷおよびＸの１つはＯであり、ＷおよびＸのもう１つはＣＨ２であり；
ｎは１または２であり；
Ｙｎは、ｎが１の場合、ＯＲであり、ｎが２の場合、１個のＹは＝Ｏであり、もう１つのＹはＯＲ
（ここで、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ６−Ｃ１２アリールあるいはＣ６−Ｃ１２アリールアルキルであり、またはＲはＭであり、Ｍが１価のカチオンである）であり；
Ｚは、タンパク質に複合され得る部分を示し、これは保護体であってよい）を含む、請求項２０〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
ＸはＣＨ２であり、ＷはＯである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
マンノース単位上の少なくとも１つのアザ置換基は、アジド（Ｎ３）置換基の還元によって得られるアミンまたは置換アミンである、請求項２０〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
アミンまたは置換アミンは、マンノース単位上の２位にある、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ｚまたはアノマー中心でのスペーサー部分は、アミン−置換アルコキシ基を含む、請求項２０〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
さらに、式（１）中のＯＲ６の酸素と追加のサッカライドとの間に結合を形成することにより、第二マンノース単位を追加のサッカライドに結合させることを含む、請求項２０〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
追加のサッカライドは、少なくとも１つのマンノース単位を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
追加のサッカライドは、１，６−アルファ−結合を介して、第二マンノース単位に結合されている、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
Ｒ６はＨまたはＡｃであり、存在する各マンノース単位のアノマー中心は、アルファ配置にある、請求項２８〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
アルファ−結合されたマンノース単位のオリゴ糖の合成方法であって、式（２）：
【化４】
2008540398.tif 000076
（式中、Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ６アシルまたはＨであり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、ＡｚおよびＺは請求項１５で規定するとおりである）を含むマンノース単位を、式（３）
【化５】
2008540398.tif 000077
（式中、Ｒｘは、Ｃ１−Ｃ６アシル基を示し、Ｍは、Ｈまたはカチオンを示す）の延長モノマーとミツノブ反応条件下で化合させ、１，６−アルファ結合によって連結される２−アザ置換マンノース単位を少なくとも２個含むオリゴ糖を得るステップを含む方法。
【請求項３３】
ミツノブ反応条件を長時間保ち、これによって、式（４）
【化６】
2008540398.tif 000078
（式中、ｐは１〜２０の整数である）のオリゴ糖を得る、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
各Ａｚは、ＮＨＡｃまたはＮ３を示す、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
ｐは１〜５である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
ｐは２〜１０である、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３７】
さらに、オリゴ糖をタンパク質に複合するステップを含む、請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
タンパク質は、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌外毒素（ｒΕＰＡ）または破傷風トキソイドから選択される不活性細菌毒素である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
タンパク質はＣＲＭ１９７である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
請求項３２〜３６のいずれかに記載の方法によって製造されるオリゴ糖。
【請求項４１】
請求項３２〜３９のいずれかに記載の方法によって製造される免疫原性化合物。
【請求項４２】
請求項１〜１６のいずれかまたは４０に記載のオリゴ糖であって、有効量の髄膜炎Ａ型ワクチン成分を対象に投与することによって免疫原性応答を与えるステップを含む方法において使用するためのオリゴ糖。
【請求項４３】
請求項１〜１６のいずれかまたは４０に記載の少なくとも１種のオリゴ糖と、少なくとも１種の医薬的に許容可能な賦形剤とを含む医薬組成物。
【請求項４４】
請求項１〜１９のいずれか、または４０または４１の化合物を少なくとも１種含む免疫原性組成物。
【請求項４５】
請求項１〜１９のいずれか、または４０または４１の化合物を少なくとも１種含む髄膜炎Ａ型ワクチン。
【請求項４６】
タンパク質に複合されたオリゴ糖を含む、請求項４５に記載の髄膜炎Ａ型ワクチン。
【請求項４７】
免疫原性オリゴ糖の製造に有用なマンノース誘導体を製造する方法であって、
式（２）：
【化７】
2008540398.tif 000079
の化合物を求電子物質で環化し、式（３）：
【化８】
2008540398.tif 000080
（ここで、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立してＨまたは保護基であり、Ｅｌは、求電子物質から誘導される残基を示す）を形成するステップを含む方法。
【請求項４８】
さらに、Ｅｌをリン基で置き換えるステップを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
さらに、式（２）または式（３）中のＯＲ２をアジドで置き換えるステップを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
置き換えるステップは、ミツノブ反応を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ミツノブ反応は、アジド源として、ホスホリルアジドを使用する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノースを製造する改良方法であって、
１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アシルグルコピラノース誘導体の２位でトリフレートを形成するステップと、
トリフレートをアジド求核剤で置き換えるステップと
を含み、改良として、生成物の単離および精製の間、粗反応混合物の湿気への暴露を最小限にすることを含む方法。
【請求項５３】
髄膜炎Ａ型に対する保護抗体を誘発し得る免疫原性組成物であって、安定化されたリン含有結合を介して互いに共有結合する少なくとも２個のサッカライド単位を有するオリゴ糖を含む組成物。
【請求項５４】
オリゴ糖は、安定化されたリン含有結合を介して互いに共有結合する少なくとも２種のマンノース単位を含む、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
オリゴ糖は、タンパク質に複合されている、請求項５３〜５４のいずれかに記載の組成物。
【請求項５６】
タンパク質は、アルブミンではない、請求項５５記載の組成物。
【請求項５７】
少なくとも２種の異なるオリゴ糖部分を含む、請求項５３〜５５のいずれかに記載の組成物。
【請求項５８】
安定化されたリン含有結合はホスホネートである、請求項５３〜５７のいずれかに記載の組成物。
【請求項５９】
ホスホネート結合は、ミツノブ反応によって形成された１，６−結合を含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
少なくとも２種の髄膜炎菌性免疫型に特異的である少なくとも２種の異なるオリゴ糖を含む、請求項５７記載の組成物。
【請求項６１】
さらに、肺炎球菌抗原を含む、請求項５３〜５９のいずれかに記載の組成物。
【請求項６２】
肺炎球菌抗原はポリサッカライドを含む、請求項６１記載の組成物。
【請求項６３】
ポリサッカライドは、タンパク質に複合している、請求項６２記載の組成物。
【請求項６４】
さらに、髄膜炎血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの少なくとも１種に由来する抗原（単数または複数）を含む、請求項５３〜６３のいずれかに記載の組成物。
【請求項６５】
抗原は、髄膜炎血清型Ｃ、Ｗ１３５またはＹから誘導される、請求項６４記載の組成物。
【請求項６６】
さらに、アジュバントを含む、請求項５３〜６５のいずれかに記載の組成物。
【請求項６７】
アジュバントはミョウバンである、請求項６６記載の組成物。
【請求項６８】
オリゴ糖は、ジカルボン酸またはその誘導体を含む二官能性試薬を介してタンパク質に複合されている、請求項６３〜６７のいずれかに記載の組成物。
【請求項６９】
ジカルボン酸は、アジピン酸、スベリン酸またはその誘導体を含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
二官能性試薬は、スクアレートを含む、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７１】
少なくとも１つのマンノース単位は、そのアノマー中心にアルファ−結合スペーサー部分を含む、請求項５３〜７０のいずれかに記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年５月６日に出願された米国出願番号６０／６７８，２８９号の利益を主張する。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、髄膜炎Ａ型ワクチンに有用な化合物に関する。より詳しくは、該化合物は、安定化されたリン含有結合、好ましくはホスホネート結合を含むオリゴ糖である。化合物は、マンノース単位を含むのがさらに好ましく、また、マンノース単位のＣ−１に、アルファ配置でスペーサーを含んでもよい。また、本発明は、オリゴ糖を製造する方法、およびマンノース含有化合物および中間体を製造する改良方法も含む。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
髄膜炎は、脳および脊髄を取り囲む薄い内層である髄膜の感染症である。数種の細菌が、髄膜炎を起こすことができ、髄膜炎菌は、最も重要なものの１つである。他の菌として、肺炎球菌およびＢ型インフルエンザ菌がある。髄膜炎菌の数種のサブグループがあり、これらは細菌を取り囲む莢膜ポリサッカライドの構造によって識別される。
【０００４】
髄膜炎は、ウィルスおよび細菌の両方によって引き起こされる。髄膜炎を引き起こす細菌の主な２種のタイプは、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）および髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）である。インフルエンザ菌の場合、１つの血清型、Ｂ型だけが重要であるが、髄膜炎菌は１２の血清型が同定され、そのうちのＡ型、Ｂ型、Ｃ型およびＷ１３５型が、流行を起こすことが知られている。種々の血清型は、異なる地理的有病率を持ち、たとえば、Ｂ型およびＣ型は、ヨーロッパおよび北アメリカで優勢であり、Ａ型はアフリカおよび南アメリカで優勢である。血清型分類は、細菌を取り囲む莢膜ポリサッカライド（ＣＰＳ）の構造および抗原性に基づき、また、ＣＰＳは、細菌に対するワクチンとして使用することもできる。とりわけ、効率的なワクチン（糖複合体ワクチン）は、サッカライドを、キャリアタンパク質に結合することにより、製造することができる。非特許文献１を参照のこと。これは参照により、本明細書に組み込まれる。これらの糖複合体は、記憶およびさらに小児に影響を持つＴ細胞依存性免疫応答を誘発し、一方複合していないＣＰＳは、一般的に、大人における記憶効果または乳児における実質的な免疫原性のどちらかを提供することができない。Ａ型ワクチンの開発は、ＣＰＳの一部であるアノマーリン酸ジエステル結合特有の不安定性のため、とりわけ困難であると考えられてきた。Ａ型の繰返し単位は、リン酸ジエステル架橋を介して１→６結合されたモノサッカライド、２−アセタミド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノース（図１）である。天然のポリサッカライドは、３−ＯＨが約８０％の範囲までアセチル化されている。このアセチル化の免疫学的な重要性は、完全には研究されていないが、それほど重要ではないという示唆がある。
【０００５】
髄膜炎菌血清型Ａ型は、主に、アフリカの一部、いわゆる髄膜炎ベルトと言われるサハラ砂漠の南部で、髄膜炎の集団発生を引き起こす。髄膜炎ベルトでは、１９７０年〜１９９２年の間に、推定される事例は、約８００，０００件であった。非特許文献１を参照のこと。髄膜炎の集団発生は、その地域にとって破壊的であるため、有効なワクチンが早急に必要とされる。１９６０年代および７０年代に、ＷＨＯによって実施された天然痘に対する努力に類似した努力と組合せた、良好なワクチンの開発によって、髄膜炎菌血清型Ａ型によって引き起こされる髄膜炎を根絶することを望むことは当然である。ワクチン接種は、抗生物質による治療および他の治療に比べて、コスト的にはるかに効果的な病気をコントロールする方法であり、コストは、開発途上国では、特に重要である。
【０００６】
細菌上のポリサッカライド被膜、その莢膜ポリサッカライドから製造されるワクチンは、大人には有効である。このポリサッカライドへ曝すことにより、大人では、髄膜炎菌により引き起こされる髄膜炎から身を守る免疫原性応答が発現する。しかし、そのようなワクチンに伴う大きな限界は、約２歳を下回る子供の免疫システムは、殆どのポリサッカライド抗原に対して応答しないということである。残念ながら、これは、細菌性髄膜炎の最も大きなリスクのある年代の群である。したがって、ポリサッカライドワクチンは、若年小児には役に立たない。さらに、年長の小児および大人にさえ、これらのワクチンは、短期間の免疫力しか引き起こさない。保護はただちに減少し、一般的に、ワクチン接種後、約２年までにはなくなってしまう。
【０００７】
髄膜炎菌ＣＰＳのようなポリサッカライドは、Ｔ細胞依存性抗原であり、これらは、Ｔ細胞（胸腺由来細胞）の関与なしで免疫応答を提供できることを意味する。この応答は、免疫学的な記憶、ＩｇＭからＩｇＧへのクラススイッチ、および親和性成熟などのＴ細胞依存性免疫応答を特徴づけるいくつかの重要な特性を欠いている。しかし、ポリサッカライド部分が、キャリアタンパク質に連結する場合、記憶効果を作り出す細胞性免疫応答を誘発し、また、若年小児に保護を提供する。キャリアタンパク質に結合されたそのようなポリサッカライドは、糖複合体と言われることが多く、特に、ワクチンとして有益である。
【０００８】
糖複合体ワクチンは、それらの製造が、ポリサッカライド抗原または他のグリコシド抗原のキャリアタンパク質への複合を含むので、そう呼ばれる。糖複合体ワクチン中のサッカライド部分は、通常、官能化された細菌性ＣＰＳであるが、これはまた合成することもできる。合成炭水化物構造体は、天然の供給源からの炭水化物を基にしたものより、数々の潜在的な利点を有する。天然由来の炭水化物は、不均一な混合物であり、少量の天然の不純物および混入物を含み得る。対照的に、合成炭水化物は、制御された方法で、バッチ間変動がほとんどあるいは全くない、均一な単一化合物を製造することができる。合成構造体の他の利点は、天然の物質では行うことが困難なあるいは不可能な、炭水化物部分の誘導化または変性のための官能基を含むように製造することができることである。キャリアタンパク質は、免疫原性の変調において、重要なファクターである。種々のキャリアが、複合に使用されてきており、ヒトへの使用が認可されている、ジフテリア毒や破傷風毒のような強い免疫原性タンパク質の無毒化された変種を使用して、最高の結果が達成されてきている。特許文献１を参照のこと。また、患者がすでに特定のキャリアタンパク質で免疫化されている場合、免疫システムがより効果的に反応することも示されている。
【０００９】
糖複合体ワクチンは、通常、細菌の天然の莢膜ポリサッカライド構造体を適切なキャリアタンパク質に複合することによって製造する。しかし、髄膜炎菌を封入するポリサッカライドの特性によるアプローチには問題が存在する。そのリン酸ジエステル結合は、タンパク質に対するポリサッカライドの結合に必要な条件下では、分解する可能性があり、製造後でも、天然ＣＰＳの糖複合体は、保存の間に分解する傾向がある。
【００１０】
リン酸ジエステルは、普通、きわめて安定であるが、髄膜炎菌の莢膜ポリサッカライド中では、リン酸ジエステルが炭水化物残基のアノマー中心に結合している。そのため、リン酸ジエステルの１つの酸素もアセタール結合の一部であり、それが、酸または金属イオンなどの求電子物質によって触媒された加水分解的開裂を受けやすくする。この結合の開裂がポリサッカライドを分解してより小さな片にする。残念なことに、糖複合体を形成するために必要な操作の間、またはワクチン形成においてさえ、髄膜炎菌Ａ型のＣＰＳは、そのような分解の対象であり、この特定のＣＰＳを含む効果的なワクチンを作り、保存することを難しくしている。
【００１１】
より安定なリン酸ジエステル結合を作る１つの方法は、リンとアノマー酸素との間の酸素を除き、その結合の部分を、もはや求電子的加水分解による開裂を受けにくくなるようにすることである。アノマー中心の環外酸素は、等配電子の炭素原子（ＣＨ２）で置き換えることによって、リン酸ジエステルをＣ−ホスホネート類縁体に変換することができる。これで、抗原性ポリサッカライドの安定化された変種を製造できるはずである。このアプローチに向けた研究が、最近公表された。非特許文献２。しかし、研究者らは、それらの化合物の活性を検査せず、あるいは、複数のマンノース単位のオリゴマーは発見しなかった。さらに、それらの合成アプローチは、オリゴ糖をタンパク質に結合しようとする位置でのベータアノマーしか提供せず、一方髄膜炎菌の天然ＣＰＳは、アルファ結合しか含まない。したがって、マンノース単位間に安定化された結合を持つ、アルファ結合された糖複合体およびそれらの合成方法が依然として必要とされている。
【００１２】
他のアプローチは、アノマー酸素での電子密度を減少させるために、近くの置換基からの誘起効果を使用してリン酸ジエステル結合を安定化させることであるが、これも、予期される求電子性分解機構は遅いようである。置換基の電子求引特性は保つことができるが、オリゴ糖を構成し、また恐らくそれをタンパク質に複合して、一度取り除くと、分子は、もはや分解条件に曝す必要がない。
【特許文献１】米国特許第４，３５４，１７０号明細書
【非特許文献１】Ｐｌｏｔｋｉｎ，Ｓ．Ａ．およびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ，Ｗ．Ａ．，Ｖａｃｃｉｎｅｓ，第４編，Ｓａｕｎｄｅｒｓ，（２００４）ｐ９５９−９８７
【非特許文献２】Ｔｏｒｒｅｓ−Ｓａｎｃｈｅｚ，Ｍ．Ｌら，Ｓｙｎｌｅｔｔ（２００５）７：１１４７−１１５１
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、これらのアプローチのそれぞれおよびこれらの組合せを含む。したがって、本発明の一態様は、ワクチン開発のために必要とされる、髄膜炎菌Ａ型莢膜ポリサッカライドの繰返し単位のオリゴマー形態のＣ−ホスホネート類縁体の効率的な合成法を提供する。Ｂｕｎｄｌｅ，Ｄ．Ｒ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．（１９７４）２４９：２２７５−２２８１を参照のこと。特に本発明は、本発明のオリゴ糖をタンパク質に複合して糖複合体ワクチンを作ることができるスペーサー部分を導入する方法を提供し、アルファアノマー配置のスペーサー部分を調整する。図２は、この中心に所望のアルファ配置を有する化合物と、ベータ配置を配置を有する化合物とを示す。標的生物の天然ＣＰＳは、マンノース単位の完全にアルファ結合されたオリゴマーであるので、合成免疫原においては、同じα結合された配置を提供するのがとりわけ望ましい。たとえ、糖複合体中の合成オリゴマー部分内のマンノース単位間の結合の全てがα配置であるとしても、糖複合体のオリゴ糖部分が約１０個未満のマンノース単位を含む場合、オリゴ糖がタンパク質に結合される中心の配置が、特に、免疫原性効果に影響を及ぼし得る。
【００１４】
したがって、本発明は、そのような化合物およびこれらの化合物を製造する方法を提供する。重要なカップリングステップは、Ｃ−ホスホネートモノエステルおよびミツノブ条件を使用して実施されることが多い。サイズが天然ＣＰＳに匹敵するポリサッカライドを製造することは実行不可能かもしれないが、それは必ずしも必要ではない。すなわち、オリゴ糖でさえ、その長さの数個のマンノース単位だけが、免疫応答を誘発することができる。また、合成オリゴ糖は、インビボでの選択的結合メカニズムおよび増強された安定性の利点を提供し、これらはどちらもインビボでの免疫原性の有効性を強化するはずである。
【００１５】
本発明の別の態様は、リン酸ジエステル結合、天然莢膜ポリサッカライド中に存在する結合を使用することができるように、マンノース単位を安定化させる方法を提供する。これは、オリゴ糖のタンパク質複合体の製造を容易にする安定性を提供する化合物および方法を含む。安定化は、ポリサッカライド中の少なくとも１個のマンノース単位のＣ−２にある電子求引基、アジドによって提供され、これは、タンパク質に複合できるように、ポリサッカライドの安定性を増す。複合後は、安定化は重要でなくなり、その時点で、アジドは、概して、アミンに還元され、アシル化され、髄膜炎菌Ａ型莢膜ポリサッカライド中の繰返しマンノース単位の一部である２−アセチルアミノ基を与える。
【００１６】
必要に応じて、２つの安定化方法を混ぜることも可能であり、したがって、本発明のオリゴ糖は、ホスホネート結合マンノース単位と組合せて、隣接するアノマー中心でリン酸ジエステルにより結合するアジド含有マンノース単位を含んでよい。この組合せは、ホスホネートの配向性に依って更なる安定化をもたらし得、あるいは収率の増加などの利点をもたらし得、アセチルアミン置換基が引き起こし得る合併症を回避することができる。
【００１７】
他の態様では、本発明は、これらの化合物のための重要な前駆体を合成する方法、これらを含む医薬組成物、および医薬品製造のためにこれらを使用する方法を提供する。該化合物、組成物および医薬品は、典型的にはヒトである対象において、免疫原性応答を誘発するように、対象に投与することができる。
【００１８】
（発明の開示）
本発明は、ポリサッカライドまたはオリゴ糖を含む免疫原性化合物およびこれらの化合物を製造する方法、ならびに、髄膜炎菌Ａ型細菌による感染症に対する保護を提供するワクチンとして、これらを使用する方法を提供する。該方法は、１，６−結合を介して連結される少なくとも２個のマンノース単位を含むオリゴ糖の製造を可能にする。この結合は、しばしば、１，６−アルファ結合であり、マンノース単位は、１個以上のマンノース単位上に２−ＮＨＡｃまたは２−Ｎ３を有する基などのＮ−置換マンノース基である場合もある。結合は、種々の形をとり得るが、ホスホネートまたはリン酸を含むことが多い。いくつかの実施形態では、オリゴ糖は、連続して結合された少なくとも３個のマンノース単位を含み、それぞれが、典型的にはＮ置換されている。化合物は、マンノース単位をどのような数で含んでもよいが、好ましい実施形態では、分子のオリゴ糖部分の分子量は、２０００を下回る。したがって、本発明の化合物は、連続して結合された約２〜１０個、好ましくは３〜１０個のマンノース単位を含むのが好ましい。
【００１９】
糖複合体の形態がワクチン接種の目的のためにさらにいっそう効果的な免疫原であるため、本発明の化合物は、タンパク質に結合されるように適合される。すなわち、これらは、幼児において免疫原性応答を誘発し、ワクチン接種の有効性を長引かせる記憶効果を提供する細胞応答を誘発する。したがって、化合物は、マンノース単位の鎖中の第一マンノース単位に結合するスペーサー部分を含む。スペーサー単位は、オリゴ糖をタンパク質に複合する手段を提供するように、あるいは末端サッカライド単位をキャップする手段を提供するように特異的に設計され、たとえば、鎖延長／変性反応を助長するために非反応性である。典型的には、このスペーサー部分は、タンパク質キャリア上の相補的な基とカップリングするために、アミン基、カルボキシレート基またはヒドロキシル基を有するが、タンパク質にオリゴ糖を複合する方法を提供するための当該分野で公知の他の基も含む。あるいは、該スペーサー部分は、アルキル基、アリール基またはアシル基などの保護基またはキャップ基、さらに当該分野でよく知られたおよび／または本明細書で開示された他のものを有する。本発明の化合物において、このスペーサー部分は、髄膜炎菌の天然ＣＰＳ中の結合と最もよく類似するように、および、たとえ本発明の短いオリゴ糖においてさえ、所望の免疫原性効果を妨げないように、アルファ配置にある。
【００２０】
本発明の化合物は、しばしば、式（１）：
【００２１】
【化９】
2008540398.tif 000002
（式中、各Ａｚは、アザ置換基を示し；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈまたは保護基を示し；
Ｒ６は、Ｈ、保護基、または他のサッカライド単位に結合するリンカーを示し；
ＷおよびＸの１つはＯであり、ＷおよびＸのもう１つはＣＨ２であり；
ｎは１または２であり；
Ｙｎは、ｎが１の場合、ＯＲであり、ｎが２の場合、１個のＹは＝Ｏであり、もう１つのＹはＯＲ
（ここで、Ｍがカチオンの場合、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ６−Ｃ１２アリールあるいはＣ６−Ｃ１２アリールアルキルであり、またはＲはＭである）であり；
Ｚは、ＯＲ’、ＳＲ’またはＮＲ’２（ここで、各Ｒ’は、独立して、Ｈ、場合によっては置換されたアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアシル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル基である）であり；あるいは
Ｚは、他のサッカライド単位に、またはタンパク質に複合するスペーサー部分に結合するリンカーを示す）で示される構造を含む。
【００２２】
これらの化合物では、ＸはＯであり、ＷはＣＨ２であり、Ａｚは、Ｎ３、ＮＨ２またはＮＨＡｃであり、ｎは２であることが多い。
【００２３】
本発明の化合物は、一部、当該分野で公知の方法によって合成されるが、これらの分子を形成するいくつかの新規な方法も本発明の一部である。たとえば、式（１）の化合物中の１，６−アルファ結合は、本明細書で記載するミツノブ反応で造ることができる。また、ＡｚなどのＮ−置換基は、本明細書で提供する方法によって、アジドとして挿入することができ、次いで還元して、式（１）で示されるような、しばしばマンノース単位の２位の位置にあるアミンまたは置換アミンを得ることができる。典型的なアジドの還元方法として、接触水素化およびホウ素還元が挙げられ、典型的には、触媒量のニッケル塩を使用する。
【００２４】
また、本発明は、本明細書で記載するオリゴ糖を組み立てるためのホスホネート置換マンノース単位を製造する方法も提供する。たとえば、グルコースから得られる式（２）の化合物を、式（１）（式中、ＷはＣＨ２であり、ＸはＯである）で示される、１，６−アルファ結合を含むホスホネートを形成するのに有用なホスホネートエステルの前駆体に変換することができる。該方法は、式（２）：
【００２５】
【化１０】
2008540398.tif 000003
の化合物を、求電子物質で環化し、式（３）：
【００２６】
【化１１】
2008540398.tif 000004
（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立してＨまたは保護基であり、Ｅｌは、求電子物質から誘導される残基を示す）を形成するステップを含む。
【００２７】
求電子物質、Ｅｌの残基は、炭素に結合して残っている、環化開始に使用された求電子試薬の一部である。次いで、Ｅｌは、本明細書に記載する方法によって、直接または間接的に、ホスホネート基などのリン含有基によって置き換えることができる。これは、Ｎ置換マンノース単位よりグルコース誘導体を提供し、すなわち、Ｃ−２で不都合な立体化学構造を有するため、本発明は、さらに、ＯＲ２の酸素の活性化形態をアジドで置き換えることによって、式（２）または式（３）中のＯＲ２を、適切な立体化学構造を有するＡｚ基に変換する方法も提供する。該方法は、典型的にはアジド源としてホスホリルアジドを使用するミツノブ反応を含む。
【００２８】
また、本発明は、２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノースを製造する方法であって、１，３，４，６−テトラ保護グルコピラノース誘導体の２位にトリフレーを形成するステップと、該トリフレートをアジド求核物質で置き換えるステップとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、１，３，４，６−テトラ保護グルコース誘導体は、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アシルグルコピラノースであって、これは容易に入手し得る。たとえば、Ｈｅｌｆｅｒｉｃｈ，Ｂ．ら，Ｂｅｒ．Ｄｔｓｃｈ  Ｃｈｅｍ．Ｇｅｓ．（１９６２）９５：２６０４−２６１１を参照のこと。１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチルグルコピラノースが好ましい場合がある。
【００２９】
本明細書で記載する化合物およびオリゴ糖を含む組成物の免疫原性活性は、オリゴ糖をタンパク質に複合することによって、強化されることが多い。したがって、多くの実施形態において、本発明は、鎖中の第一マンノース単位のＣ−１炭素に結合するスペーサー部分を介して、オリゴ糖をタンパク質に複合することを含む。いくつかの実施形態では、タンパク質は、ヒトにおける免疫原性応答を高める能力のために選択されるものであり、ジフテリアおよび破傷風からの無毒化されたトキソイドが使用されることが多い。したがって、本発明の化合物は、しばしば、式（１）中のＺであってよい、またはマンノース単位上の有効なヒドロキシル基またはＮ−置換基に結合してよい、タンパク質への結合を容易にするスペーサー部分を含む。典型的には、タンパク質にＺを介して連結され、したがって、Ｚは、タンパク質へ複合し得るスペーサー部分となることが多い。本発明の化合物の多くにおいて、Ｚは保護形態である。適切な保護基は、Ｚの正確な性質および選択に依るが、そのような保護基の使用は、当業者が行う範囲内である。そのような保護基の例およびそれらの使用の詳細は、たとえば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．およびＷｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２編（１９９１）にある。同様に、本発明は、オリゴ糖をタンパク質に連結するＺを使用し、免疫原性組成物を製造する方法を提供する。
【００３０】
また、本発明は、本発明のオリゴ糖を含むワクチン組成物であって、哺乳類における免疫原性応答を誘発するのに有用な組成物を提供する。典型的な哺乳類は、髄膜炎菌がヒトにおいてのみ病原性があると考えられるので、ヒト対象であり、他の哺乳類でも免疫応答を誘発することは評価され、抗体などの免疫成分を提供するために使用することができる。したがって、本発明は、免疫原性組成物、およびこれらを哺乳類における免疫原生応答を誘発するために使用する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
一態様では、本発明は、第一マンノース単位と第二マンノース単位とを含むオリゴ糖であって、第一マンノース単位はＣ−１でアルファ配置におけるスペーサーを含むオリゴ糖を提供する。このスペーサーは、タンパク質に複合することができ、第一マンノース単位は、第一単位のＣ−６を第二マンノース単位のＣ−１に連結する１，６−結合を介して第二マンノース単位に連結する。１，６−結合は、いくつかの実施形態では、ホスホネートを含む。いくつかの実施形態では、１，６−結合はアルファ配置にある。これらの実施形態のいくつかでは、第一マンノース単位は、２−デオキシ−２−アザ置換マンノース誘導体であり、実施形態のいくつかでは、第二マンノース単位は、２−デオキシ−２−アザ置換マンノース誘導体である。ある実施形態では、これらの２−アザ置換マンノース単位が、２個、３個、またはそれ以上含まれる。
【００３２】
本発明の実施形態のいくつかでは、１，６−結合は、［第二マンノース単位のＣ−１］−ＣＨ２−Ｐ−Ｏ−［第一マンノース単位のＣ−６］の形態、すなわち、ホスホネート炭素が第二マンノース単位のＣ−１に連結し、ホスホネートエステル酸素が第一マンノース単位のＣ−６に結合する。これらのマンノース単位は場合によっては保護されており、多くの実施形態で、これら２つのマンノース単位の１つまたは両方は、ＮＨ２、ＮＨＡｃおよびＮ３から選択される２−アザ置換基を含む。これらの実施形態で、第三マンノース単位が含まれる場合、それはリンを含み、第二マンノース単位のＣ−６を第三マンノース単位のＣ−１に連結する結合によって、第二マンノースに連結される場合がある。この結合は、しばしば、ホスホネートエステル結合を介して第二マンノース単位に、およびホスホネートのＰ−Ｃ結合を介して第三マンノース単位に並ぶホスホネートを含む。
【００３３】
他の態様では、本発明は、式（１）：
【００３４】
【化１２】
2008540398.tif 000005
（式中、各Ａｚは、アザ置換基を示し；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈまたは保護基を示し；
Ｒ６は、Ｈ、保護基、または他のサッカライド単位に結合するリンカーを示し；
ＷおよびＸの１つはＯであり、ＷおよびＸのもう１つはＣＨ２であり；
ｎは１または２であり；
Ｙｎは、ｎが１の場合、ＯＲであり、ｎが２の場合、１個のＹは＝Ｏであり、もう１つのＹはＯＲ
（ここで、Ｍがカチオンの場合、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ６−Ｃ１２アリールあるいはＣ６−Ｃ１２アリールアルキルであり、またはＲはＭである）であり；
Ｚは、ＯＲ’、ＳＲ’またはＮＲ’２（ここで、各Ｒ’は、独立して、Ｈ、場合によっては置換されたアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアシル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル基である）であり；あるいは
Ｚは、他のサッカライド単位に、またはタンパク質に複合するスペーサー部分に結合するリンカーを示す）のオリゴ糖を提供する。
【００３５】
いくつかの実施形態では、式（１）を含む化合物は、アミドまたはエステル結合を介して、タンパク質に複合する。式（１）の化合物では、ＷはＣＨ２でありＸはＯであることが多く、そのような実施形態の多くでは、ＡｚはＮＨＡｃであり、ｎは２である。また、この態様の多くの実施形態において、ＲはＭであり、Ｚは、−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−（式中、ｎは２〜６である）を含む。式（１）に基づくこれらの化合物の実施形態において、Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、ＨまたはＡｃである。Ｒ３はＡｃであることが多く、場合によっては、Ｒ３およびＲ４は、共に、ＨまたはＡｃである。
【００３６】
他の態様では、本発明は、オリゴ糖を製造する方法であって、少なくとも１個のアザ置換マンノース単位を含む第一部分を、ホスホネートを含む１，６−結合を介して、少なくとも１個のアザ置換マンノース単位を含む第二部分に結合するステップを含む方法を提供する。これらの実施形態における第一部分は、スペーサー部分を含むことが多く、スペーサー部分は、アルファ配置で、マンノース単位のＣ−１に結合されている。これらの方法のいくつかの実施形態では、ミツノブ反応を使用して、第一部分のマンノース単位のＣ−６を、第二部分のマンノース単位のＣ−１に結合する。これらの方法の実施形態の多くで、１，６−結合は、１，６−アルファ結合である。
【００３７】
これらの態様のいくつかでは、結合アザ置換マンノース単位は、式（１）：
【００３８】
【化１３】
2008540398.tif 000006
（式中、各Ａｚは、アザ置換基を示し；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈまたは保護基を示し；
Ｒ６は、Ｈ、保護基、または他のサッカライド単位に結合されたリンカーを示し；
ＷおよびＸの１つはＯであり、ＷおよびＸのもう１つはＣＨ２であり；
ｎは１または２であり；
Ｙｎは、ｎが１の場合、ＯＲであり、ｎが２の場合、１個のＹは＝Ｏであり、もう１つのＹはＯＲ
（ここで、Ｍが１価のカチオンの場合、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ６−Ｃ１２アリールあるいはＣ６−Ｃ１２アリールアルキル、またはＲはＭである）であり；
Ｚは、タンパク質に複合され得る部分を示し、これは保護体であってもよい）を含む。
【００３９】
該方法のいくつかの実施形態では、式（１）を含む化合物において、ＸはＣＨ２であり、ＷはＯである。これらの実施形態では、マンノース単位上の少なくとも１個のアザ置換基は、しばしば、アミン、またはアジド（Ｎ３）置換基の還元によって得られる置換アミンである。好ましい実施形態では、アミンまたは置換アミンは、マンノース単位の２位にある。これらの方法のいくつかの実施形態では、オリゴ糖は、式（１）の化合物でＺであり得るスペーサー部分を、マンノース単位のアノマー中心に含む。このスペーサー単位は、場合によっては保護体であるアミン置換アルコキシ基を含んでよい。たとえば、それは、式：−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ−ＰＧ（式中、ＰＧは、Ｈまたは保護基を示し；保護基は、メトキシカルボニル、ｔ−ブトキシカルボニルまたはベンジルオキシカルボニルなどのアルコキシカルボニルであることが多い）で表される単位であってよい。したがって、ＮＨ−ＰＧは、カルバメート基であることが多い。
【００４０】
これらの方法のいくつかの実施形態では、方法は、さらに、式（１）中のＯＲ６の酸素と追加のサッカライドとの間に結合を形成することによって、第二マンノース単位を追加のサッカライドに結合するステップを含む。このサッカライドは、マンノース単位であり、またはマンノース単位を含むものであってよく、多くの実施形態では、追加のサッカライドは、１，６−アルファ結合を介して、第二マンノース単位に結合する。これらの実施形態において、Ｒ６はＨまたはＡｃである場合が多く、各マンノース単位のアノマー中心は、アルファ配置であり、髄膜炎菌の天然ＣＰＳに最もよく類似する。
【００４１】
他の態様では、（１’）：
【００４２】
【化１４】
2008540398.tif 000007
（式中、各Ａｚは、独立して、ＮＨ２、ＮＨＡｃおよびＮ３から選択され；
Ｚは、タンパク質に複合することができ、保護体でも非保護体でもよく、およびタンパク質に複合していてよいスペーサー部分を示し；
各Ｒ１は、独立して、Ｈ、場合によっては置換されているＣ１−Ｃ６アルキル、またはＭ（ここで、Ｍはカチオンを示す）であり；
Ｘは、ＯまたはＣＨ２であり；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈ、Ａｃ、Ｂｎおよび他の保護基からなる群から選択され；
Ｒ６は、Ｈ、保護基、ホスフェート、または追加のサッカライド単位への結合基である）のオリゴ糖を提供する。
【００４３】
本発明のこの態様では、いくつかの実施形態で、第一マンノース単位のＣ−１で、アルファ配置にあるスペーサー部分を介して、オリゴ糖に複合するタンパク質が含まれる。タンパク質は、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌外毒素（ｒＥＰＡ）または破傷風トキソイドから選択される不活性細菌毒素であり、またはタンパク質はＣＲＭ１９７である場合もある。これらの実施形態におけるタンパク質は、ヒドロキシルまたはアミンを含み、これらのどちらも場合によっては保護され、あるいは場合によってはタンパク質に複合されていてもよいスペーサー部分を介して、式（１）のオリゴ糖に結合されていてよい。この態様のいくつかの実施形態では、Ｒ３はアシル基であり、Ｒ４はＨである。また、代わりのあるいは好ましい式（１）の実施形態は、式（１’）にも適用される。
【００４４】
ある態様では、本発明は、アルファ結合マンノース単位のオリゴ糖を合成する方法であって、式（２）：
【００４５】
【化１５】
2008540398.tif 000008
（式中、Ｒ６は、Ｃ１−Ｃ６アシルまたはＨであり、Ｒ１、Ｒ３、Ｒ４、ＡｚおよびＺは請求項１５で規定するとおりである）を含むマンノース単位を、式（３）：
【００４６】
【化１６】
2008540398.tif 000009
（式中、Ｒｘは、Ｃ１−Ｃ６アシル基を示し、Ｍは、Ｈまたはカチオンを示す）の延長モノマーと、ミツノブ反応条件下で化合させ、１，６−アルファ結合によって連結される２−アザ置換マンノース単位を少なくとも２個含むオリゴ糖を得るステップを含む方法を提供する。この方法のいくつかの実施形態では、ミツノブ条件は、ジイソプロピルアゾジカルボキシレート（ＤＩＡＤ）またはジエチルアゾジカルボキシレート（ＤＥＡＤ）のどちらか、およびトリフェニルホスフィンまたはトリス（ｐ−クロロフェニル）ホスフィンなどの置換トリフェニルホスフィンのどちらかを使用することを含む。いくつかの実施形態では、ＤＩＡＤおよびトリス（ｐ−クロロフェニル）ホスフィンを使用し、トリエチルアミンを過剰量使用する。ある実施形態では、ミツノブ反応条件を、長時間保ち、生成物は、式（４）：
【００４７】
【化１７】
2008540398.tif 000010
（式中、ｐは１〜２０の整数である）のオリゴ糖である。
【００４８】
これらの実施形態の多くでは、各Ａｚは、ＮＨＡｃまたはＮ３を示す。これらの実施形態のいくつかでは、ｐは１〜１０であり、他のものでは、ｐは約１〜５、あるいはｐは２〜４である。これらの実施形態のあるものでは、本発明の方法は、さらに、式（４）のオリゴ糖をタンパク質に複合する方法を含む。場合によっては、これは、そのようなタンパク質に複合し得るものから選択されるスペーサー部分であることが多い、Ｚを介して行われる。これらの実施形態のあるものでは、タンパク質は、ジフテリアトキソイド、百日咳トキソイド、大腸菌ＬＴ、大腸菌ＳＴ、緑膿菌外毒素（ｒＥＰＡ）または破傷風トキソイドから選択される不活性細菌毒素である。他の実施形態では、タンパク質はＣＲＭ１９７である。
【００４９】
他の態様では、本発明は、前記方法によって製造されるオリゴ糖を提供する。これらの方法によって製造されるオリゴ糖化合物は免疫原性化合物であり、典型的には、治療される哺乳類において免疫原性応答を誘発し、髄膜炎菌によって引き起こされた感染症に対する少なくとも部分的な免疫性を提供する。
【００５０】
さらに他の態様では、本発明は、典型的には、哺乳類に投与することにより、免疫原性応答を誘発するための、本発明の任意のオリゴ糖化合物を使用する方法を提供する。多くの実施形態において、これらの化合物は、髄膜炎菌Ａ型ワクチン成分として使用され、したがって、該方法は、しばしば、有効量のワクチン成分を対象に投与し、それによって免疫原性応答を付与することを含む。免疫原性応答は、対象において、髄膜炎Ａ型によって引き起こされる髄膜炎に対する、少なくとも部分的な抵抗または免疫性を付与する。
【００５１】
また、本発明は、少なくとも１種の医薬的に許容可能な賦形剤と混合した、少なくとも１種の本発明のオリゴ糖を含む、免疫原性である医薬組成物を提供する。すなわち、いくつかの実施形態では、これらの組成物は、本発明の任意の化合物を含む髄膜炎Ａ型ワクチンを含むワクチンである。多くの実施形態で、該ワクチンは、少なくとも１種のタンパク質に複合されたオリゴ糖を含む。
【００５２】
さらに他の態様で、本発明は、本発明のものを含む免疫原性オリゴ糖の製造において有用なマンノース誘導体を製造する方法を提供する。これらの方法は、式（２）：
【００５３】
【化１８】
2008540398.tif 000011
の化合物を求電子物質によって環化し、式（３）：
【００５４】
【化１９】
2008540398.tif 000012
の化合物を形成する（式中、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して、Ｈまたは保護基であり、Ｅｌは、求電子物質由来の残基を示す）ことを含む。
【００５５】
ある実施形態では、該方法は、Ｅｌをリン基で置き換えるステップを含む付加的なステップを含む。典型的なリン基はホスホネートである。また、いくつかの実施形態では、本発明は、式（２）または式（３）の化合物中のＯＲ２とアジドとのための方法も提供する。好ましい実施形態では、ＯＲ２の置き換えは、ミツノブ反応を含む。そのような実施形態のいくつかでは、ホスホリルアジドがミツノブ反応のためのアジドを提供する。
【００５６】
さらに他の態様では、本発明は、２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノースの製造のための改良方法であって、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アシルグルコピラノース誘導体の２位にトリフレートを形成するステップと、該トリフレートをアジド求核剤で置き換えるステップとを含む改良方法を提供する。
【００５７】
そのような化合物を製造するための他の方法を使用してよく、本発明の改良方法は、生成物の検査および単離の間、生成物の湿気への暴露を最小限にするための事前措置を提供する。これは、たとえば、Ｐｏｐｅｌｏｖａら，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．（２００５）３４０：１６１−１６６の公知の方法を越えて、大きく向上した収率を得る結果となった。好ましい実施形態では、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アシルグルコピラノース誘導体は、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチルグルコピラノースであり、生成物は、２−アジド−１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アシルマンノピラノースである。
【００５８】
他の態様では、本発明は、髄膜炎Ａ型に対する保護抗体を誘発し得る免疫原性組成物であって、典型的には、安定化されたリン含有結合を介して互いに共有結合するマンノース単位である、少なくとも２個のサッカライド単位を有するオリゴ糖を含む組成物を提供する。そのような実施形態の多くにおいて、マンノース単位であってよい少なくとも１個のサッカライド単位は、そのアノマー中心でアルファ結合スペーサー部分を含む。安定化されたリン含有結合は、ホスホネートを含み得る。ある実施形態では、これらのオリゴ糖は、安定化されたリン含有結合を介して、互いに共有結合した少なくとも２個のマンノース単位を含む。多くの実施形態では、オリゴ糖は、タンパク質に複合されている。適切なキャリアタンパク質として先に記載したタンパク質などの多くのタンパク質を使用することができるが、好ましい実施形態では、タンパク質はアルブミンではない。いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、少なくとも２種の異なるオリゴ糖部分を含む。実施形態の多くにおいて、２個のサッカライドの間の安定化されたリン含有結合は、ホスホネートを含む。多くのそのような実施形態において、該ホスホネート結合は、ミツノブ反応によって形成された１，６−結合であり、ある実施形態では、先に記載したいずれかの組成物のオリゴ糖は、そのアノマー中心でアルファ結合スペーサー部分を含む少なくとも１つのマンノース単位を含む。
【００５９】
本発明の免疫原性組成物のいくつかにおいて、組成物は、少なくとも２種の髄膜炎菌性免疫型に特異的な少なくとも２種の異なるオリゴ糖をを含む。また、組成物は、他の抗原性化合物を含んでもよく、いくつかの実施形態では、組成物は、さらに、肺炎球菌抗原を含む。この抗原は、いくつかの実施形態ではポリサッカライドであり、これらの実施形態の多くでは、ポリサッカライドはタンパク質に複合する。
【００６０】
いくつかの実施形態では、本発明の組成物は、また、髄膜炎の血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５またはＹに由来する少なくとも１種の抗原も含む。いくつかの好ましい実施形態では、この抗原は、髄膜炎血清型Ｃ、Ｗ１３５またはＹに由来する。本発明の組成物は、さらに、アジュバントを含むことが多く、実施形態のいくつかでは、アジュバントはミョウバンである。
【００６１】
本発明の多くの組成物では、オリゴ糖成分は、ジカルボン酸またはその誘導体を含む２価の試薬を介してタンパク質に複合する。多くの実施形態において、このジカルボン酸は、アジピン酸、スベリン酸またはこれらの誘導体を含む。他の実施形態では、２価の試薬は、スクアレートを含む。
【００６２】
本発明の範囲内のホスホネート結合化合物の製造は、どちらかがマンノース単位と呼ばれる適切に変性されたマンノピラノース環である、受容体モノマーおよび延長モノマーを製造することによって、達成することができる。延長モノマーを、ホスホネート結合を介して受容体に結合し、ジサッカライドを造る。延長モノマーは、そのＣ６ヒドロキシルが、選択的に脱保護されるように処理することができ、したがって、より長いオリゴ糖が望まれる場合は、ダイマーサッカライド中の延長モノマーは、受容体となることができる。それは、Ｃ３およびＣ４ヒドロキシルを脱保護することなく脱保護することができるので、Ｃ６ヒドロキシルは、別の延長モノマーのホスホネーに結合することができる。この方法は、必要に応じて何回も繰り返し、所望の長さのオリゴ糖を得ることができる。
【００６３】
図３は、いかにして、受容体モノマーおよび延長モノマーを結合させ、２個のマンノース単位を持つオリゴ糖（すなわち、ジサッカライド）を形成するか、およびいかにしてこのジサッカライドが、Ｃ６ヒドロキシルの脱保護およびそれに続く別の延長モノマーの結合によって、さらに延長し得るかについて示す。場合によっては、受容体モノマーは、取り扱いおよび単離を容易にするために、切断可能なリンカーによって固体支持体に結合されていてよい。その場合、オリゴ糖は、延長プロセスの複数の繰返しの間、固体支持体に結合したままでいることができ、最終的に切断され、所望の長さの比較的純粋なオリゴ糖生成物を放出することができる。スペーサー部分Ｚは、合成の間、オリゴ糖を固体支持体に結合するために使用され、次いで、場合によっては変性され、オリゴ糖をタンパク質に複合するために、使用される場合もある。
【００６４】
本発明は、２個以上の変性マンノース単位を含む免疫原性オリゴ糖、ならびにより長いオリゴ糖またはポリサッカライド分子を製造する方法、およびオリゴ糖および／またはポリサッカライドを、これらをタンパク質に複合することによって、より免疫原性な物質にする方法を提供する。マンノース単位は、マンノース環の塩基性構造を持つが、少なくともいくつかの構造は変性されている、ピラノース環である。多くの実施形態において、本発明は、ここで使用されているように、マンノースのヒドロキシル基の１つの代わりに、窒素原子または他のヘテロ原子が環を形成する炭素に結合している少なくとも１個の置換基を含み、そのような置換環も、ピラノース環上の置換基の配列が、マンノース上の立体中心の配列と同じ相対立体化学を有する限り、マンノース単位であると考えられる。ここで、マンノース配置は、Ｃ−１での立体化学を規定していないことに注意すべきである。Ｃ−１は、マンノース単位におけるアノマー中心であり、アルファ配置でもベータ配置でも取り得る。したがって、マンノース単位は、マンノースヒドロキシルの中の１つの代わりに結合したＣ、ＮまたはＳ原子を有することができ、またはそのような変性を複数有することができる。Ｄ−マンノースに関する構造および炭素原子の番号付けについで参考のために、ここに示す。
【００６５】
【化２０】
2008540398.tif 000013
本発明の方法は、Ｄ−マンノースまたはＬ−マンノースのいずれかの絶対立体化学を有するマンノース単位とともに使用され、多くの実施形態において、絶対立体化学は、Ｄ−マンノースのものである。しかし、本発明のオリゴ糖は、Ｌ−マンノース配置を有するマンノース単位を１個以上含有することができる。もちろん、これは、たとえば、本明細書で記載のように、少なくとも２個のマンノース単位を含む限り、追加のサッカライドまたはペプチド部分に結合することもできる。
【００６６】
本発明のオリゴ糖は、共に結合する少なくとも２個のピラノース環を含み、環を２個だけ含む場合、該分子は、ダイマーとして記載することができ、３つが順番に結合する場合は、トリマーと記載することができ、４つに関しても同じである。しかし、本明細書で使用される一般的な用語オリゴ糖は、これらのより小さな実施形態と同時に、３個以上、５個以上、７個以上、１０個以上、１５個以上、２０個以上、２５個以上が順番に並ぶ、より長いポリマーの変種も含む。約５個以上のサッカライド環を有する変種を、本明細書では、ポリサッカライドという場合もある。多くの実施形態において、オリゴ糖は、少なくとも３個のマンノース単位を含む。
【００６７】
含まれるマンノース単位の数にかかわりなく、オリゴ糖が他の分子特徴と結びつき、マンノース単位が種々の基で置換されることが望まれる場合があり、オリゴ糖は、１以上のマンノース単位、典型的には、末端マンノース単位の１つを介して別の部分に結合していてよい。いくつかの実施形態では、オリゴ糖をタンパク質に結合することに効果があり、これらの糖複合体は、具体的に本発明の範囲内に入る。典型的には、糖複合体は、オリゴ糖中の第一マンノースのＣ−１で結合されたスペーサー部分上の官能基に目的のタンパク質が複合することにより形成され、該スペーサー部分は、アルファ配置にある。多くの実施形態では、保護基あるいはマンノース単位上の１個以上のヘテロ原子置換基の他の官能基に結合することが望ましい。ある好ましい実施形態では、ヘテロ原子置換基は、ＯＨ、ＯＡｃ、ＮＨ２、Ｎ３、ＮＨＡｃ、および保護基またはタンパク質に連結されているＯ、ＮまたはＳから選択される。
【００６８】
マンノース単位は、典型的には、１，６−結合によって連結されている。１，６−結合は、第二マンノース単位のＣ−１炭素、アノマー中心が、妨害サッカライド環を含まない結合によって、直接または間接的に第一マンノース単位のＣ−６炭素に連結することを意味する。２つのマンノース単位間の典型的な結合は、少なくとも２個の原子、一般的には２個以上の炭素ではない原子を、マンノース単位炭素原子の間に含む。多くの実施形態において、結合は、一般的形態：
【００６９】
【化２１】
2008540398.tif 000014
（式中、Ｄ、ＥおよびＦは、それぞれ、Ｏ、Ｎ、Ｓ、ＳｉおよびＰから選択されるヘテロ原子であり、それぞれのテトラヒドロピラン環は、マンノース単位の環を示す）で表される。いくつかの実施形態では、Ｅは、リン原子を示し、これは、ホスフェートまたはホスホネートの酸化形態をしていることが多い。典型的には、この式中のＤおよびＦの少なくとも１つは、酸素（Ｏ）であり、いくつかの実施形態では、ＤもＦも酸素である。特定の実施形態では、Ｄ−Ｅ−ＦがＯ−Ｐ（Ｏ）−Ｏ、Ｃ−Ｐ（Ｏ）−ＯまたＯ−Ｐ（Ｏ）−Ｃであるものが含まれる。Ｄ−Ｅ−Ｆは、−ＣＨ２−Ｐ（Ｏ）−Ｏ−を含む結合であるのが好ましい場合がある。
【００７０】
いくつかの実施形態では、隣接するマンノース単位間の結合は、１，６−アルファ（１，６−α）結合である。マンノース単位に関して、１，６−アルファ結合は、マンノースのアノマー中心炭素に対応するＣ−１での非Ｈ置換基が、Ｃ−２での非Ｈ置換基に対して「アンチ」（ａｎｔｉ）相対的な立体化学関係にあることを意味する。あるいは、オリゴ糖における２個以上のマンノース単位は、ベータ結合を介して結合していてよい（マンノース中のＣ−２置換基に対し、アノマー中心「シン」（ｓｙｎ）で結合を有する配置を、ベータ結合という）。しかし、典型的には、化合物は、結合それ自身の性質にかかわらず、アルファ関係で一緒に結合する。
【００７１】
以下の構造は、アルファ結合およびベータ結合の間の向きの違いを示したものである。
【００７２】
【化２２】
2008540398.tif 000015
本発明の多くの実施形態では、アザ置換マンノース単位が含まれ、これは、少なくとも１つのマンノースヒドロキシルが置換基で置き換えられたものを意味し、本明細書では、「アザ」置換基という。これは、少なくともマンノース単位に直接結合された原子が窒素である置換基である。アザ置換基として、アルキル化およびジアルキル化アミン、ならびにアシル化およびジアシル化アミン（ここで、アシル基としては、ベンジルオキシカルボニルおよびメトキシカルボニルなどのヘテロアシルを含み、そのようなアシル基としてアセチル、ホルミルおよびベンゾイルがある）を含む、種々の置換アミンが挙げられる。アザ置換基の他の実施形態としては、ＮＯ２およびＮ３が挙げられる。本発明のアザ置換マンノース単位のいくつかの実施形態では、マンノース環のＣ−２でのアザ置換基があり、好ましい実施形態では、マンノース単位上のアザ置換基がＮＨ２、Ｎ３またはＮＨＡｃである化合物および方法が含まれる。
【００７３】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の化合物および方法は、式（１）：
【００７４】
【化２３】
2008540398.tif 000016
（式中、各Ａｚは、アザ置換基を示し；
Ｒ３およびＲ４は、それぞれ独立して、Ｈまたは保護基を示し；
Ｒ６は、Ｈ、保護基、または他のサッカライド単位に結合するリンカーを示し；
ＷおよびＸの１つはＯであり、ＷおよびＸのもう１つはＣＨ２であり；
ｎは１または２であり；
Ｙｎは、ｎが１の場合、ＯＲであり、ｎが２の場合、１個のＹは＝Ｏであり、もう１つのＹはＯＲ
（ここで、Ｍがカチオンの場合、ＲはＨ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ６−Ｃ１２アリールあるいはＣ６−Ｃ１２アリールアルキルであり、またはＲはＭである）であり；
Ｚは、ＯＲ’、ＳＲ’、ＮＲ’２またはハロ（ここで、各Ｒ’は、独立して、Ｈ、場合によっては置換されたアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアシル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル基である）であり；あるいは
Ｚは、他のサッカライド単位に、またはタンパク質に複合するスペーサー部分に結合するリンカーを示す）の部分を含む。
【００７５】
好ましいアザ置換基は、窒素原子が、直接、マンノース単位に結合する基である。そのような置換基の例として、Ｎ３、ＮＨ２、ＮＨ−アルキル、ＮＨ−アシル、ＮＨ−アリールなどが挙げられる。これらの置換基中の各Ｎは、場合によっては、アルキル、アリールおよびアシル（ここで、アルキル、アシルおよびアリールは、それぞれ、場合によっては置換されている）から選択される１個または２個の基を含み得る。
【００７６】
ヒドロキシル基、アミン基およびスルフヒドリル基に関して、用語「保護された」または「保護基」は、当業者に公知の保護基を用いて、望ましくない反応から保護されたこれらの官能基の形態を言い、たとえば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓに記載されているものが挙げられ、これらは、そこに記載されている方法を使用して、付加したり、除去したりすることができる。保護されたヒドロキシル基の例として、ＴＢＤＭＳやＴＢＳなどのシリルエーテル類、たとえば、ヒドロキシル基を、ｔ−ブチルジメチル−クロロシラン、トリメチルクロロシラン、トリイソプロピルクロロシランおよびトリエチルクロロシラン（これらに限定されない）などの試薬と反応させて得られたもの；置換メチルおよびエチルエーテル類、たとえば、メトキシメチルエーテル、メチルチオメチルエーテル、ベンジルオキシメチルエーテル、ｔ−ブトキシメチルエーテル、２−メトキシエトキシメチルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル、１−エトキシエチルエーテル、アリルエーテル、およびベンジルエーテル（これらに限定されない）；エステル類、たとえば、ベンゾイル、ベンゾイルホルメート、ホルメート、アセテート、トリクロロアセテート、およびトリフルオロアセテート（これらに限定されない）が挙げられるが、これらに限定されない。保護されたアミンの例として、ベンジルまたはジベンジルアミド類、たとえば、ホルムアミド、アセトアミド、トリフルオロアセトアミドおよびベンズアミド；イミド類、たとえば、フタルイミドおよびチリオスクシンイミド；およびその他が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アルコールのための保護基は、ベンジル基またはアセチル基であり、本明細書において、アミンのための典型的な保護基は、アセチルまたはベンジル、あるいはｔ−ブチルカルバメートである。
【００７７】
本明細書で使用される「保護基」は、ヘテロ原子であるＮ、ＯおよびＳのための保護基として当該分野で認識されているものが含まれ、これらは、たとえば、Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．およびＷｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．による参考書，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第２編，Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）に記載されており、該文献は、参考により本明細書に組み込まれる。アセチル（Ａｃ）は、そのような保護基の１つであり、髄膜炎菌の天然のＣＰＳは、しばしば、特にＣ−３で、アセチル化されているので、本発明のいくつかの実施形態では、１以上の保護基はＡｃであり、いくつかの好ましい実施形態では、少なくとも１つのマンノース単位上のＲ３は、Ａｃを示す。
【００７８】
これらの化合物のあるものは、ＸおよびＷの１つがＣＨ２であり、他の１つがＯであり、たとえば、いくつかの実施形態では、ＸおよびＷは両方Ｏであり、他では、ＷはＣＨ２であり、ＸはＯである。オリゴマーであり、３個以上のマンノース単位を含む本発明の任意の化合物の範囲内で、結合の異なる実施形態が存在してよく、したがって、ホスホネートを含む結合によって一緒に結合された２個のマンノース単位は、本発明を逸脱しない限り、リン酸ジエステル結合を介して第三マンノース単位に結合していてよい。
【００７９】
本発明のオリゴ糖を、別の分子、典型的にはタンパク質に複合することが望ましいことが多い。そのような方法で作られた複合体は、本発明の範囲内である。したがって、サッカライドのタンパク質への複合は、しばしば、反応性二官能性分子をタンパク質に加え、誘導体化タンパク質をサッカライドに曝すことによって達成され、そうすることで、サッカライドは、二官能性試薬によってもたらされたリンカーを介して共有結合し始め、これは、しばしば、サッカライドのヒドロキシル基の１つに結合する。しかし、本発明の化合物のコントロールされた合成において、オリゴ糖をタンパク質に複合するために、特異的に設計されたスペーサー部分を含めることは特に好都合である。そのようなスペーサー部分を、オリゴ糖中のマンノース単位のいずれか１つに結合することができるが、典型的には、末端マンノース単位上であり、最初の「受容体」モノマー、または最後の「延長」モノマーである。それは、受容体のＣ−１または延長モノマーのＣ−６においてであることが多く、式（１）の化合物において、Ｚで示される基、またはＲ６で示される基であってよい。
【００８０】
オリゴ糖をタンパク質へ複合するためのスペーサー部分は、オリゴ糖の免疫原性エピトークを、より利用可能に、したがってより効果的にするために、多原子スペーサー部分を含んでよい。あるいは、たとえば、式（１）で示される化合物中のＺは、Ｏ、Ｎ、またはＳなどの単一の原子であってよく、およびオリゴ糖とタンパク質との間に、オリゴ糖およびキャリアタンパク質を一緒に結合するために使用される２価の試薬によって、隙間を設けてよい。本発明の糖複合体において使用に適する２価の試薬として、当業界で公知のものが挙げられる。例として、ジカルボン酸、たとえば、マロン酸、スクシン酸、アジピン酸およびスベリン酸、これらの活性化された変種、およびスクアリン酸誘導体が挙げられる。これらのタイプの試薬は、特に、スペーサー部分がタンパク質へのアミンを含む化合物を結合するために有用である。
【００８１】
いくつかの実施形態では、場合によっては単一原子であってもよく、あるいはずっと長くてもよいが、スペーサー部分の長さは、少なくとも２個または３個の原子であり、１例は、式（１）（式中、Ｚは、２−アミノエトキシ基を示す）の化合物である。２−アミノエトキシ基またはその同族体を、延長モノマーの前に、受容体モノマーに導入してよく、場合によっては、後続の反応に参加しないように、保護された形態で導入してもよい。スペーサー部分は、オリゴ糖をタンパク質に結合するために使用することができる少なくとも１つの官能基を含まなければならず、典型的には、この目的のために、ヘテロ原子、Ｎ、ＯまたはＳを含むが、他の基、たとえば、ディールス−アルダー反応による結合のために、ジエンまたはジエノフィル、または、エステルまたはアミドを介して、タンパク質をオリゴ糖に複合するためにカルボキシレート基も意図される。先に検討した２−アミノエトキシ基などの多くの実施形態において、この目的のために、スペーサー部分は窒素を含み、該窒素は、それが導入され、オリゴ糖が構成される間、保護されてもよいが、オリゴ糖が構成された後、オリゴ糖を破壊しない条件下で、選択的に脱保護することができる。次いで、スペーサー部分のアミンは、たとえば２価の試薬で、容易にアシル化またはアルキル化され、もう一方の末端も同じようにタンパク質に結合する。結合の順番、すなわち、糖複合体のどの構成要素が先ず２価の試薬に結合するのかは重要ではなく、実施者の判断によって決定される。ある典型的な、しかし限定ではないスペーサー基の例として、−Ｈｅｔ−（ＣＨ２）ｎ−Ａ、−Ｈｅｔ−Ｐｈ−Ａ、−Ｈｅｔ−（ＣＨ２）ｎ−Ｐｈ−（ＣＨ２）ｎ−Ａ（式中、各Ｈｅｔは、ヘテロ原子、通常、Ｏ、ＳまたはＮを示し、各Ｐｈは、場合によっては置換されているフェニル基を示し、各ｎは、１〜１０の整数を示し、Ａは、官能基またはその残基であって、スペーサーをタンパク質に結合し得るまたは結合する基を示し、たとえば、Ｎ、Ｏ、Ｓ、エステル、アミド、他のカルボキシル含有基、ジエン、またはジエノフィルである）、およびこれらの置換体が挙げられる。該スペーサーは、ＯＲ’、ＳＲ’またはＮＲ’２（式中、Ｒ’は、独立して、Ｈまたは場合によっては置換されているアルキル、アシル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアシル、ヘテロアリールまたはヘテロアリールアルキル基であり、さらにＡを含んでよい）を含むことが好ましい。
【００８２】
式（１）中のＭは、Ｌｉ、Ｎａ、ＫおよびＣｓから選択されるアルカリ金属カチオン、またはアンモニウム塩：ＮＲ４＋（式中、各Ｒは、独立して、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６ヘテロアルキルである）を示し得る。あるいは、任意の他の医薬的に許容可能なカチオン性種、たとえば、ＭｇＸまたはＣａＸ（式中、Ｘは、ハロ、ヒドロキシル、アセトキシ、トリフルオロアセトキシ、ビスルフェート、ビカルボネートまたは任意の他の適切な種を示す）を示すことができる。いくつかの実施形態では、Ｍは、２価のカチオンであり、式（１）の２つの分子によって共有されている。
【００８３】
本発明の方法は、本発明の範囲内のオリゴ糖化合物を合成する方法を提供する。該方法として、たとえば、所望の様式で、２個のマンノース単位を一緒に結合する方法、たとえば、２個のマンノース単位の間に１，６−アルファ結合を形成することによる方法が挙げられる。１，６−アルファ結合が、リン酸または式（１）（式中、ＸはＯ）の化合物などのホスホネートである場合、該結合は、ミツノブ反応によって造ることができる。ミツノブ反応は、たとえば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｄ．Ａ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）５７：６３３１−６３３５に記載され、アルコールを、アゾジカルボキシレート（たとえば、ＤＥＡＤまたはＤＩＡＤ）などの試薬と、ホスフィン（たとえば、トリフェニルホスフィンまたはトリス（ｐ−クロロフェニル）ホスフィン）とで活性化し、次いで、活性化されたＯを求核性化学種で置き換えることとを含む。式（１）（式中、ＸはＯ）の化合物の場合、求核試薬は、通常、Ｐ−Ｏ−種、典型的には、ホスホネートまたはリン酸アニオンである。本発明の他の態様では、ミツノブ反応を使用して、アザ置換基をサッカライド基に導入する。この場合、条件は、求核試薬がアジドであることを除いて類似しており、アジドは、アジドアニオンとして、またはトリアルキルシリルアジドあるいはホスホリルアジドとして供給してよい。
【００８４】
また、本発明の方法は、式（１）の化合物などの化合物のマンノース単位上にＮ−置換基（アザ置換基）を導入し、変性する方法も提供する。したがって、いくつかの実施形態では、該方法は、正しい立体化学を有するマンノース単位にアザ置換基を導入する方法を提供する。１つのそのような方法は、ピラノース環上のＣ−２ヒドロキシルを、Ｎ−置換基、典型的にはＮ３で置き換えることを含む。これは、求核置換反応で導入することができるが、いくつかの実施形態では、アゾジカルボキシレート（たとえば、ＤＥＡＤまたはＤＩＡＤ）などの活性化基を補助として、ミツノブ型反応によって挿入することができる。このミツノブ反応のための求核試薬は、ジフェニルホスホリルアジドなどのホスホリルアジドによって提供することができる。この反応において、本発明によって提供される特別の改良点には、アザ置換基源としてホスホリルアジドを使用することと、生成物の分解を避けるため実質的に水のない作業条件を導入することとが含まれる。ここで記載する条件の下、マンノース単位の２−アジド誘導体の収率は、従来技術の方法を越えて、相当向上する。
【００８５】
いくつかの好ましい実施形態では、本発明のオリゴ糖の少なくとも１個のマンノース単位は、アミンまたはアシル化されたアミンを含むアザ置換マンノースであって、これは、マンノース単位のＣ−２にあることが多い。本発明の方法のいくつかの実施形態では、アザ置換基がＮ３として導入され、これを還元してアミンとすることができ、該アミンを、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓの本に記載された条件などの条件下、先に参照した保護基上でアシル化することができる。アジド（Ｎ３）のＮＨ２への還元は、ニッケルボロハイドライドを使用するなどの典型的な方法で容易に達成され、ニッケルボロハイドライドは、本明細書で記載するように、塩化ニッケル６水和物およびボロハイドレイドナトリウムからインサイチュで生成することができる。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本発明は、オリゴ糖およびオリゴ糖を製造する方法を提供し、ここで、オリゴ糖は、アザ置換マンノース単位の繰返し系列を含む。多くの実施形態では、マンノース単位のそれぞれが、アザ置換基、典型的にはＮ３、ＮＨ２またはＮＨＡｃを、各マンノース単位のＣ−２に有し、たとえば、式（１）の化合物において、ＡｚはＮ３、ＮＨ２またはＮＨＡｃである。場合によっては、マンノース単位の少なくとも２個の間の結合は、ホスホネート結合であり、該結合は、１，６−アルファ結合であってよく、たとえば、式（１）（式中、ＷはＣＨ２であり、ＸはＯである）の化合物におけるものが挙げられる。リン酸またはホスホネートを含む１，６−アルファ結合、たとえば、式（１）（式中、Ｗは、ＣＨ２またはＯのどちらかであり、ＸはＯである）の化合物は、先に記載したミツノブ反応によって形成することができる。先に参照した、Ｃａｍｐｂｅｌｌによって記載された変更条件の下でミツノブ反応を行うのが好ましい。
【００８７】
別の態様では、本発明は、先に記載したオリゴ糖の合成に有用な、あるサッカライド分子を製造するための改良方法を提供する。したがって、本発明は、あるホスホネート置換モノサッカライドを合成する方法を提供する。たとえば、グルコースから得られる式（２）の化合物を、式（１）（式中、ＷはＣＨ２であり、ＸはＯである）に示されるホスホネート含有１，６−アルファ結合を形成するために有用なホスホネートエステルのための前駆体に変換することができる。該方法は、式（２）：
【００８８】
【化２４】
2008540398.tif 000017
の化合物を求電子物質で環化して、式（３）：
【００８９】
【化２５】
2008540398.tif 000018
（ここで、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ６は、それぞれ独立して、Ｈまたは保護基であり、Ｅｌは、求電子物質の残基を示す）の化合物を形成することを含む。
【００９０】
環化を実施するために使用される求電子試薬は、水銀塩であってよく、この場合、式（３）の化合物に環化した後、求電子試薬の残基は、典型的には、−ＨｇＸ（式中、Ｘは、ハロまたはアセトキシなどである）である。水銀は、ヨウ素による処理で置き換えることができ、式（３）（式中、ＥｌはＩ）の化合物を与える。次いで、ヨウ化物を、リン求核試薬で置き換えることができ、たとえば、トリアルキルフォスフェイトによる処理で、直接ヨウ化物を置き換え、ジアルキルホスホネートを生成する。また、環化を行うために、他の求電子試薬を使用してもよく、たとえば、ハロ環化が知られており、Ｅｌとしてハライドが直接提供され、これが置き換えられる。同様に、オレフィンを正しい立体化学でエポキシ化できる方法を使用して、エポキシドの開環によって、ピラノース環、および式（３）（式中、ＥｌはＯＨである）の化合物を得ることができる。次いで、ＯＨを、ハライドまたは置き換え可能なスルホネート、たとえば、トリフレート、トシレートまたはメシレートに変換することができ、先に記載したように、リンを亜リン酸トリエチルで導入することができ、あるいは、亜リン酸ジエチルのナトリウムアニオンなどのアニオン性Ｐ種を使用して、直接求核置換反応によって導入することができる。
【００９１】
これは、Ｎ置換マンノース単位というより式（３）のグルコース誘導体を提供する。したがって、本発明は、さらに、式（２）または式（３）中のＯＲ２を、所望の「軸線」方向を有するアザ置換基に変換する方法を提供する。この窒素置換基の導入は、式（３）の化合物を活性化剤と反応させ、化合物（ここで、Ｒ２は、置き換え可能な基）、たとえば、トリフレート、トシレートまたはメシレートを形成することによって達成されることが多い。（２）におけるこのような置き換えは、アリル転移を起こす結果となるので、この転換は、しばしば式（３）の化合物において行われる。この反応は、通常の求核置換によって行うことができるが、本発明の一実施形態では、ＯＲ２のアザ置換基によるこの置き換えを、ミツノブ反応を使用して行う。好ましい実施形態では、ミツノブ反応は、アザ置換基源として、ホスホリルアジドを使用する。したがって、該反応は、（２）などの簡単に入手可能なグルコース誘導化合物を、２−デオキシ−２−アザ置換マンノース誘導体（ここで、２−アザ−置換基はアジドである）に変換する非常に効率的な方法を提供する。次いで、該アジドを、ニッケルボロハイドレイドで処理するなど、還元してアミンとすることができ、該アミンを所望により官能化または保護することができる。本発明の多くの実施形態において、アミンを直ちに保護基でアシル化する。保護基は、保護基として作用することができ、髄膜炎菌のＣＰＳのマンノース単位中にあるので、アセチル（Ａｃ）であることが多い。
【００９２】
別の態様では、本発明は、保護された形態の２−アザ置換マンノース誘導体を製造する非常に改良された方法を提供する。該方法は、他の方法で保護されたグルコピラノース環の２−ヒドロキシル基を、２−ヒドロキシルの変換によって置き換え、トリフレートとすることと、次いで、該トリフレートをアジドで置き換えることとを含む。求核置換により中心が反転され、グルコピラノースをマンノピラノースに変換する。この置き換えそれ自身は報告されているが、標準的な条件を使用し、非常に低い単離収率で行われている。本発明では、反応処理を、実質的に水のない状態で行う限り、簡単に入手できる１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アシルグルコピラノースを使用して所望の生成物を高収率で得ることができることを発見した。したがって、ＤＭＦまたはＮＭＰなどの極性非プロトン性溶剤中で、トリフレートをアジドアニオンによって置き換え、通常の水性／有機抽出処理を使用するというのではなく、溶剤および塩の殆どを除去し、クロマトグラフィーカラムに直接供する前に、反応混合物を部分的に濃縮してよい。このような非水性処理を使用することによって、生成物をカラムから高い収率で溶離することができる。
【００９３】
本発明のある化合物を製造する方法を以下にさらに詳細に記載する。
【００９４】
出発モノマー受容体、以下に示す化合物ＸＩＶの一実施形態は、Ｂｅｒｋｉｎ，Ａ．ら，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．（２００２）８：４４２４−４４３３に記載されている。別法として、以下の手順を使用してよい。
【００９５】
【化２６】
2008540398.tif 000019
ジベンジル保護化合物をアノマー中心でスペーサーを導入するために使用した場合、アノマーの約１：１混合物を得た。代わりに、ベンジルエーテルをアセテートエステルで置き換えた場合、ベータアノマーは微量しか得られず、所望のアルファアノマーの単離収率は８６％という結果を得た。したがって、該方法は、しばしば、オリゴ糖をキャリアタンパク質に連結するスペーサーが結合するこの中心で、所望のアルファ配置を造り出す効率的な方法を提供する。アルファ配置は、標的生物の天然のＣＰＳの全アルファ骨格と最もよく調和するため、望ましい。また、ベータアノマーは、エチルチオ−グリコシド置換ステップにおいて、殆ど反応性がないことも発見した。しかし、アセテート類は、後の段階で困難を引き起こす場合があるので、いくつかの実施形態では、このステップではベンジルエーテル類を利用した。完全に保護された２−アザマンノース中間体のアジド基を、ＮａＢＨ４／ｃａｔ．ＮｉＣｌ２−６Ｈ２Ｏを再び使用してアミンに還元し、該アミンを無水酢酸でアセチル化して両ステップで８５％の収率を得た。最後に、シリルエーテルをＴＢＡＦで除去し、出発構成単位受容体を９９％の収率で得た。
【００９６】
所望の延長モノマーの好都合な合成法を、以下のスキーム１〜３に示す。これは、例えば、異なる保護基を有する延長モノマーを製造することを可能にする。
【００９７】
【化２７】
2008540398.tif 000020
化合物Ｉを得、アノマーの混合物として使用した。これは、グルコースから７ステップで得た。これを、たとえば、メチルブロモトリフェニルホスフィンを使用して、ウィッティヒ反応によって延長し、９１％の収率でアルケンを得た。Ｄ−アラビノースからのこのアルケンの別の製造法では、ジビニル亜鉛の付加を含む２炭素延長を使用した。化合物ＩＩの水銀環化により、アルファ−Ｃ−グリコシドを排他的に得た。一方、対応するテトラ−Ｏ−ベンジル保護アルケンは、アノマーの混合物を得る。このような化学種を環化する代わりの方法、たとえば、ハロエーテル化反応およびエポキシ化／求電子開環反応を使用してよい。酢酸水銀化合物を、対応する塩化水銀誘導体に変換し、これを単離した。続いて、塩化水銀をヨウ素で置き換え、Ｉ２で処理することにより高収率を得た。
【００９８】
【化２８】
2008540398.tif 000021
次のステップで環状リン酸の形成を避けるため、Ｃ２ヒドロキシル基を、先ず、シリルエーテルとして保護した。Ｃ−ホスホネートＶＩＩを、第一ヨウ化物Ｖを亜リン酸トリエチルで処理することにより得て、ＶＩを７７％の収率で得た。続けて、シリルエーテルを、フッ化テトラブチルアンモニウム（ＴＢＡＦ）を使用して、Ｃ２ヒドロキシルから開裂した。収率は９９％であった。
【００９９】
スキーム３に示すように、軸方向のアセタミド基を、アジドを使用する置換反応によって導入し、次いでアセチル化を行った。置換によってＣ−２中心が反転し、天然の莢膜ポリサッカライドに見られる、Ｃ−２アセタミド置換基の軸方向を付与した。このアジドは、Ｃ−２ヒドロキシルのトリフレートを生成し、これをアジドアニオンで置き換えることにより、低収率で導入された。しかし、ミツノブ条件およびアジド源として、ジフェニルホスホリルアジド（ＤＰＰＡ）を用いることにより、アジド誘導体ＩＸを高収率（８６％）で得た。選択的に脱離し得る保護基をＯ−６に導入するため、標準的な酢化条件を使用して、ＶＩＩＩの第一ベンジルエーテルを酢酸エステルで置き換え、収率は８４％であった。このステップは省くことができ、その場合、ベンジルエーテルの全てが一度に開裂できた。酢化を省くことは合成の短縮になるが、さらなる延長または他の官能化のために、Ｃ−６ヒドロキシルを使用することをより困難にする。しかし、延長ステップの後、ベンジルをアセチルで交換することも可能である。酢化反応は、無水酢酸および酢酸の混合物（１／１）を硫酸とともに使用した場合、より良好に作用した。塩化ニッケル６水和塩の存在下、アジドをボロハイドレイドナトリウムで還元し、得られたアミンを無水酢酸でアセチル化し化合物Ｘを収率６９％で得た。
【０１００】
スキーム３は、２−アザマンノース単位である本発明の範囲内の延長モノマーの完成を示す。Ｃ−ホスホネートモノマー延長の構成のために、公表されているアプローチの変性種を使用した。Ｃａｓｅｒｏ，Ｆ．，ら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）６１：３４２８−３４３２を参照のこと。前駆体ＶＩの脱シリル化で２−ＯＨ化合物ＶＩＩを得た後、ミツノブ条件を使用してアジドの置換を行い、２−アジド−２−デオキシ−モノピラノシドＶＩＩＩ（８６％）を得た。後に６−Ｏ延長を可能にする、オルトゴナル保護基を酢化により導入し、６−Ｏ−アセテートＩＸ（８４％）を得た。アジド還元、次いでアセチル化を行いＸ（７６％）を得、これから、エチルエステル類を除去して、遊離ホスホン酸を有する延長モノマーＸＩを得た。多くの実施形態に関して、ホスホン酸のモノエステルをカップリングし、生成物がホスホネートエステルとして保護された状態を残しておくのが好ましい。これらの化合物は、以下に示すように、ＸＩからＸＩＩＩへの変換を２ステップで行って製造することができる。もしより長いオリゴ糖が望まれる場合、アジドの全てを還元し、同時に得られたアミンをアセチル化できるように、追加のマンノース単位が導入されるまでアジド還元を延期することができることに留意すべきである。
【０１０１】
【化２９】
2008540398.tif 000022
前記スキーム３に示すように、オリゴ糖を構成した後、除去を促進するために、ホスホン酸誘導体上のエチル保護基をメチルで置き換えた。結合ジサッカライドが形成すれば、該結合は、エチルホスホネートの開裂に必要な条件下で比較的不安定である。したがって、ブロモトリメチルシラン（ＴＭＳＢｒ）を使用する処理によって、エチル基を定量的に除去し、酢酸およびトリメチルオルソアセテートを使用して、ホスホン酸生成物をその対応するジメチルホスホネートに収率８４％で変換した。この反応は、アセチル化反応が持続する反応時間の間、副反応と競合するために注意深くモニターしなければならなかった。ジメチルホスホネートを、トリエチルアミン（ＴＥＡ）およびフェニルメルカプタンで処理することで、モノメチルホスホネートＸＩＩＩを収率８２％で効率的に得た。
【０１０２】
スキーム４は、２個のマンノース単位の間にホスホネート−結合を造るためのカップリング反応を示す。ＤＣＣもミツノブ条件も、５０〜７０％の範囲の収率で、ホスホネートを受容体モノマーのようなアルコールにカップリングすることは報告されてきた。Ｐｏｚｓｇａｙら（Ａ．Ｂｅｒｋｉｎ，Ｂ．Ｃｏｘｏｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｐｏｚｓｇａｙ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，２００２，８，４４２４を参照のこと）。しかし、受容体がすでにホスホネートを含む場合、収率は急激に低下し、所望のトリマー、テトラマーまたは他のより長いポリサッカライドを提供する条件の能力を限定する可能性があった。本件における、Ｐｈ３ＰおよびＤＩＡＤを使用するミツノブ条件で、ＸＶは良好な収率（４７％）を得た。しかし、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）５７：６３３１−６３３５に記載されているように、ミツノブ条件の変形法を使用することにより、実質的により良好な収率が実現した。トリス（４−クロロフェニル）ホスフィンおよび大過剰のトリエチルアミンを使用する、Ｃａｍｐｂｅｌｌに記載の条件により、ＸＶを収率８８％で得た。弱求核性ホスホネートアニオンと競合し得る他の求核化学種を排除する対策を講じた場合、この反応における最高の収率が得られる。
【０１０３】
【化３０】
2008540398.tif 000023
前記ミツノブ条件を使用すると、トリマー形成における収率が、ダイマー形成における収率に匹敵し、かつそれを超えることがわかった。ダイマーＸＶを、アセチル化によって新しい受容体（→ＸＶＩ）に変形させた。次いで、変性ミツノブ反応をＸＶＩとＸＩＩＩとの間で行い、トリマーＸＶＩＩを収率９２％で得た。ＭＳおよびＮＭＲによる生成物の同定により、リンのキラリティの結果の得られるジアステレオマー異性体ホスホネートのため、後者は部分的に複合体であることが実証された。化合物ＸＶＩＩをアセチル化し、新しい受容体ＸＶＩＩＩを造り、これを別の延長モノマーに結合することができる。この工程およびこれに続くメチルリン酸エステルの除去後、リン中心のキラリティを破壊した。化合物ＸＩＸに関するＮＭＲデータは、リンジアステレオマーが存在しないことを反映していた。
【０１０４】
【化３１】
2008540398.tif 000024
また、いくらか過剰のＸＩＩＩの存在下で、受容体ＸＩＶおよび延長モノマーＸＩＩＩの混合物をミツノブ条件に曝すことを延ばすことによって、より長いモノマーが得られることもわかった。したがって、該反応条件下で、導入された延長モノマーからのＣ−６アセチル基の開裂がインサイチュで、ある速度で起こり、これによって、新しい受容体分子が得られる。したがって、たとえば、ＸＶＩのＸＶＩへの変換が、長時間ミツノブ反応に曝し、そのような条件下、過剰のＸＩＩＩの存在下などである程度まで起こり、高オリゴマーを製造する。したがって、この反応は、段階的な脱保護／単離プロセスを必要とせずに、複数のマンノース単位を保護された形態で含むオリゴマーを製造する方法を提供し、複数のサイズの分布を持つ、本発明の免疫原性オリゴ糖の合成を可能にする。いくつかの実施形態では、これにより、少量のより長いオリゴマーを持つ、第一テトラおよびペンタマンノースオリゴ糖が得られることが示されている。したがって、本発明内のより長いオリゴマー化合物を合成する高効率的な方法が提供される。
【０１０５】
また、本発明は、スキーム５で図示するような、容易に入手し得る前駆体、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−グルコピラノースから、２−アジド−２−デオキシ−Ｄ−マンノピラノースを簡便かつ改良に合成する方法も提供する。この中間体は、本発明の多くのマンノース単位の合成に有用である。
【０１０６】
【化３２】
2008540398.tif 000025
保護された２−アジドマンノース化合物を合成する試みとして、無水トリフルオロメタンスルホン酸を使用して、１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチルグルコピラノースを２−Ｏ−トリフレートに変換し、該トリフレートをＮａＮ３で処理した。ＴＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ｍｓによれば、２−アジド生成物を高収率で形成するが、それは、典型的な水性処理の間に実質的に分解され、単離収率は２０％でしかなかった。しかし、水を使用しないで反応を行った場合、収率は急激に改良される。したがって、置換用溶剤として使用されるＤＭＦのほとんどを減圧下で除去し、残渣を、乾燥トルエン中で予備乾燥させたシリカのスラリーを含む乾燥カラムに移した。トルエン中で酢酸エチルの濃度を挙げる勾配を用いて、生成物を溶離した。精製された生成物は比較的安定であった。１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチルグルコピラノース出発物質は、グルコースからワンポットシステムで簡単に大量合成されるが、中間体トリフレートは、標準の条件を使用して収率９７％で得た。記載された反転からの単離収率は、どれくらい水をなくす処理であるかに強く依存し、先に記載したように、予備乾燥したガラス機器および予備乾燥したシリカを使用することにより水を排除することが、適正な収率を得るために必要である。処理の間およびシリカゲルクロマトグラフの間、水分への暴露を最小限にすることによって、６０％またはそれ以上の再現性収率を得た。
【０１０７】
テトラアセテート生成物は、保存中、いくらか分解する傾向を示す。しかし、いったん、ＥｔＳＨ／ＢＦ３−Ｅｔ２Ｏを用いる処理によってその１−エチルチオグリコシドに変換すれば、それは非常に安定性があった。次に、スキーム６に示すように、アルコキシドで処理し、アセテート基を除去し、第一ヒドロキシルをｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＳ）基で選択的に保護した。２個の第二ヒドロキシルをベンジルエステルとして保護したが、種々の異なる保護基をここおよびこの方法全体の多くのステップにおいて使用することができる。次いで、−ＳＥｔ基をリンカーで置換えた。これは、最終的なオリゴ糖をタンパク質に複合するために使用することができる。あるいは、オリゴ糖が構成されているが、受容体モノマーを固体支持体に結合させるために使用することもできる。この場合、保護されたアミノエチル基をアノマー位置で導入したが、オリゴ糖を複合するのに適切な多種多様な結合基を使用してもよく、当業者であれば、他のものを容易に選択し使用することができる。
【０１０８】
【化３３】
2008540398.tif 000026
ダイマーは、さらに延長することなく、免疫原として使用することができ、より長いオリゴマーを製造し、使用することができる。ダイマーおよびトリマーの両方に関して、Ｃ６のアセチル基を標準の加水分解によって除去する。１，８−ジアザ−７−ビシクロ［５．４．０］ウンデセン（ＤＢＵ）を塩基として、フェニルメルカプタンとともに使用して、ホスホネートのメチルエステルを開裂し、求核脱メチル化を実行した。次いで、標準の還元水素化によって、触媒として活性炭上のパラジウムを使用して、ベンジルエーテルを、ベンジルオキシカルボニルとともに開裂した。反応を完成させるために、水性ＨＣｌを加えて、得られるアミンをプロトン化して塩化物を形成した。これは、触媒を汚染する傾向が減らされている。
【０１０９】
本発明のオリゴ糖は、哺乳類に投与して免疫原性応答を誘発することができ、これらは、先に記載したように、典型的には少なくとも部分的に脱保護した後、使用してよい。また、これらを部分的または全体的にアセチル化し、誘発された免疫応答のスペクトルを広げてもよい。対象生物のＣＰＳは、Ｃ−３ヒドロキシル上で実質的にアセチル化され、したがって、本発明の方法の柔軟性により、部分的または全体的に、Ｃ−３ヒドロキシルでアセチル化された、１個以上のアセチル基を含む化合物を製造する、特に、ダイマー、トリマー、高オリゴマーまたはこれらの混合物を製造することが可能になる。
【０１１０】
リン酸ジエステルを安定化するホスホネート結合の使用に代えて、あるいは使用に加えて、先に記載したように、合成操作まで、および場合によってはオリゴ糖をタンパク質に複合するステップの間、Ｃ−２−アザ置換基として、アジド基を導入することによって、有用な程度までリン酸ジエステルを安定化することが可能である。この安定化は誘導的であるが、中間体の動作安定性を、対応するＮＨＡｃ化合物の安定性を超えて改良するには適切である。ひとたび該アジドがその目的を果たせば、それは、ニッケルボロハイドレイドで還元され、無水酢酸または本明細書で記載した類似のアシル化剤でアセチル化され得る。したがって、先に記載したように、本発明のオリゴマー化合物は、リン酸ジエステル結合をある程度導入し得、リン酸ジエステルは、典型的な方法および明細書で記載した方法で導入され得る。
【０１１１】
アセテートを持つあるいは持たない分子両方を得る選択を取るために、スキーム７に示すように、保護基の手法は持続的な保護基としてアセテートに基づいた。アノマーリン酸ジエステル結合を安定化するために、アジドをアセタミド基の前駆体としてできるだけ用いて合成した。アジドの電子求引特性および関与効果の欠如によって結合は強く保護される。そして、６−ＯＨ用の仮の保護基としてジメトキシトリチルを使用することに伴う最初の問題の後、我々は、ＴＢＤＭＳ（ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル、ＴＢＳと言われる場合もある）を使用した。ＴＢＤＭＳエーテル類は、アセチル移動または易動性リン酸ジエステル結合の開裂によって、最小の問題を有して良好な収率で切り取られた。先のＣ−ホスホネート合成において、ＴＢＤＭＳエーテルの脱保護に効果的に用いられたＴＢＡＦは、アセチル移動により使用することができず、ＴＲＥＡＴ−ＨＦを使用した場合、いくぶん遅く（特に２位にアジドを持つ場合）、しかし信頼性はあった。
【０１１２】
【化３４】
2008540398.tif 000027
効率的なモジュラー合成に関して、３個のモノサッカライド構成単位、出発モノマー６−ＯＨ受容体を備えるスペーサー、仮の６−ＯＨ保護を持つアルファ−Ｈ−ホスホネート延長モノマー（ドナー１）および第一位置でホスホリル化された終端アルファ−Ｈ−ホスホネートモノマー（ドナー２）を必要とした。アミデート化学を使用した、ポスト結合でのＣ−６ヒドロキシルの変性の試みが成功しなかったので、本明細書でトリマーオリゴ糖として例示した、Ｃ−６でリン酸を持つ標的分子を達成するために、ジベンジル保護リン酸を含むドナーを使用した。
【０１１３】
合成を簡素化するために、前記スキーム７に示すように、全３単位を、同じ前駆体、ＸＸＶＩＩＩから合成した。出発物質を従来の方法を使用して合成した。受容体を造るため、ベンジルオキシカルボニル保護エタノールアミンスペーサーを収率８６％でカップリングし、ＴＢＤＭＳエーテルをＴＲＥＡＴ−ＨＦを用いて除去し、受容体ＸＸＩＸを収率９７％で得た。
【０１１４】
ドナー１を、促進剤としてＮＩＳ、および受容体として水を用い、−２０℃で、チオグリコシドをグリコシル化によって加水分解して合成した。所望のアルファアノマーを収率８２％で排他的に得た。反応を室温で行うと、ベータ体が高い割合で形成する。次いで、この化合物を、ＰＣｌ３／イミダゾールを用いてホスホニル化し、ＸＸＸを収率９７％で得た。したがって、本発明は、アルファアノマーを、低温、たとえば、室温未満、好ましくは０℃未満、より好ましくは−２０℃以下などの−１０℃未満で製造することを含む。
【０１１５】
リン酸ジエステル結合を介して本発明のオリゴ糖に結合されたマンノース単位を付加するのに有用な、Ｈ−ホスホネートを持つドナーマンノース単位を合成するために、ＴＢＤＭＳエーテルを収率７５％で開裂し、該ヒドロキシルを、アミデート化学を用いてホスホリル化し、Ｃ−６でベンジル保護されたリン酸を得た（６７％）。エチルチオグリコシドを、水にカップリングすることによってドナー１の製法と同じ方法で加水分解し（７９％）、次いで、ホスホニル化してＨ−ホスホネートドナーマンノース単位ＸＸＸＩを収率９２％で得た。
【０１１６】
延長モノマーの受容体へのカップリングは、以下のスキーム８に示すように、従来のＨ−ホスホネート化学を用いて、ピバロイルクロライド促進縮合で行った。Ｈ−ホスホネートジエステルを元素状ヨウ素および水を用いて酸化し、リン酸ジエステルを得た。ダイマーは良好な収率（９６％）で得られた。
【０１１７】
【化３５】
2008540398.tif 000028
トリサッカライドに対する延長は、Ｃ−６ヒドロキシルのＴＲＥＡＴ−ＨＦによる脱保護および延長モノマーの追加の反復によって達成され、ホスホネート結合構成に関して前記スキームにおいて例示された手法とここでの保護基の手法との適合性は、所与のオリゴ糖で混合するまたは組合せるべき結合の２つのタイプを可能にする。ここでの例は、ドナー分子ＸＸＸおよびＸＸＸＩに関する延長を示し、最後のマンノース単位上のＣ−６ヒドロキシルまたは同じ位置のＣ−６Ｏ−リン酸のいずれかを持つ三量体オリゴ糖を提供する。
【０１１８】
【化３６】
2008540398.tif 000029
（式中、Ｒは、ＯＨまたはリン酸ベンジルである。）
トリサッカライドを得るため、ジサッカライド上のＴＢＤＭＳエーテルを、ＴＲＥＡＴ−ＨＦを再び使用して収率９１％で除去した。続けて、２つのドナーを、ジサッカライドへのカップリングに使用した条件と同じ条件を使用してカップリングし、２種のトリサッカライドを、それぞれ、収率６２％および５９％で形成した。第二あるいは続きのカップリングの間に得られた収率は、Ｐｏｚｓｇａｙら（Ａ．Ｂｅｒｋｉｎ，Ｂ．Ｃｏｘｏｎ  ａｎｄ  Ｖ．Ｐｏｚｓｇａｙ，Ｃｈｅｍ．Ｅｕｒ．Ｊ．，２００２，８，４４２４を参照のこと）によって観察されたように、第一カップリングステップで得られた収率より低かった。したがって、好ましい実施形態では、オリゴ糖中の隣接するマンノース単位間の少なくともいくつかの結合は、典型的には、リン酸ジエステルの代わりにホスホネートを含む。
【０１１９】
また、本発明のオリゴマーの両形態上のアジドは、Ｒ’あるいはそれと同等の位置で、保護体で追加のホスフェート、たとえば、ホスホネートオリゴマーのダイマーおよびトリマー中のＲ６基を含む。これは、天然ＣＰＳ中の末端マンノース単位はホスホリル化されていてよく、かつ対応ホスホリル基はジベンジルリン酸エステルとして従来の化学を使用して導入することができるので、任意に導入される。次いで、ベンジル基は、たとえば、Ｃ−３および／またはＣ−４でベンジルエーテルとともに、または第一マンノース単位の１位のスペーサー部分のアミン基を保護するために使用してもよい、ベンジルオキシカルボニル基の還元的開裂に伴って除去することができる。ベンジルホスホネートは、オリゴマーを製造するために必要な他の反応を妨害しない。たとえば、この基を含むある化合物におけるアジドを、ボロハイドレイドナトリウムおよび触媒量の塩化ニッケル６水和物を使用して、効率的に還元してアミンとし、得られたアミンを無水酢酸でアセチル化し、対応するアミノアシル誘導体を得た。この反応は、トリマーリン酸ジエステル結合化合物中のマンノース単位上の末端基がＯＴＢＤＭＳである場合、収率８９％で進み、末端基がリン酸ジベンジルである場合、収率は６４％であった。
【０１２０】
【化３７】
2008540398.tif 000030
２個のトリサッカライドは異なる順番で脱保護した。標的分子１および２を達成するため、先ず、Ｚ基を、還元的水素化を使用して脱保護した（８３％）。還元的水素化の間のリン酸ジエステル結合の分解に伴う問題を避けるため、塩基性イオン交換樹脂を混合物に加えると良好な結果が得られた。ＴＲＥＡＴ−ＨＦを再び使用してＴＢＤＭＳエーテルを除去し、１を収率８５％で得た。アセテートを標準的なナトリウムメトキシド／メタノール条件下で開裂した。標的分子３に関して、Ｚを先の１の脱保護と同じ方法で除去し（８５％）、４を得、還元的水素化（６４％）の前にアセテートを除去した（８０％）。
【０１２１】
また、前記スキームで記載した方法は、Ｃ−ホスホネートを有する化合物、たとえば、本明細書に記載された式（１）または（１’）の化合物を製造するために使用してもよい。
【０１２２】
抗原としての化合物の用途
前記方法によって製造されたオリゴ糖は免疫原性であり、ワクチンのように、髄膜炎菌による感染症に効く免疫応答を誘発するのに有用である。特に、前記式（１）で示される構造を有するオリゴ糖は、哺乳類に投与された時、免疫原性応答を誘発することができ、したがって、式（１）のオリゴ糖を含む組成物を投与することは、抗体の形成を誘発するおよび／または免疫原性応答を付与し、髄膜炎菌Ａ型による感染症に対する少なくとも部分的な抵抗または部分的な免疫を付与するのに有用である。抗体および／または免疫原性応答は、髄膜炎菌Ａ型による感染症に対する保護を付与する。式（１）の部分、特に、式中、ＷがＣＨ２またはＯであり、ＸがＯであり、ＡｚがＮＨＡｃである部分を含む化合物は、式（４）の化合物のようにワクチン成分として有用である。
【０１２３】
これらの化合物は、タンパク質に複合される場合に特に有用であり、場合によっては、式（１）のＺ基を、式（１）のオリゴ糖をタンパク質に結合するために使用してよい。同様に、式の他の化合物においても、本発明のオリゴ糖中の第一マンノース単位のＣ−１での対応する基は、その免疫原性特性を向上させるために、化合物をキャリアタンパク質に複合させるために使用され得る部分であってよい。しかし、Ｚを介する結合の選択肢にもかかわらず、本発明の化合物および式（１）または式（４）の構造を含む特異的な化合物は、他の方法によって、たとえば、１以上のヒドロキシル基を介して、または１個のマンノース単位上の１個のアセチルアミンのアセチル基の代わりに結合するアシル基を介して、キャリアタンパク質に結合することができる。このような代わりの複合メカニズムは、オリゴ糖のＣ−１（アノマー）中心が所望のアルファ配置に残る限り、本発明の範囲内である。そのようなオリゴ糖は、マンノース単位間に少なくとも１個のホスホネート結合を含むのが好ましい。
【０１２４】
したがって、一態様では、本発明は、本明細書に記載するような免疫原性オリゴ糖を、活性成分として免疫原性的に有効な量含むワクチンに関する。オリゴ糖（複数を含む）を、ヒトを含むホストに、単独で、あるいはタンパク質、あるいはマンノース単位または他のサッカライドのホモポリマーまたはヘテロポリマーなどのキャリアに結合して導入してよい。いくつかの実施形態では、それらは、糖複合体として使用され、オリゴ糖が複合するタンパク質は、その能力に関し、オリゴ糖抗原に対する免疫原性応答を強化するように選択される。治療されるべき哺乳類における免疫応答を誘発しているタンパク質が好ましい場合もある。糖複合体は、免疫学的な活性が向上しているという利点があり、ウィルスまたは腫瘍細胞の異なる抗原決定因子と反応する抗体および／またはＣＴＬを誘発する付加的な能力も持つ。
【０１２５】
本発明の免疫原性組成物は、本発明の化合物を少なくとも１種含み、場合によっては、そのような化合物を複数含んでよい。したがって、本発明の化合物を２種以上混合し、誘発される免疫原性応答の幅を広げるのが望ましい場合もある。たとえば、標的生物のＣＰＳは、この位置で全部ではなく部分的にアセチル化されているので、化合物（Ｒ３はＨである）を化合物（Ｒ３はＡｃである）と組合せるのが望ましい場合が多い。したがって、いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、少なくとも２種の、場合によっては３種以上のそのような免疫原性化合物および／またはそのような化合物のタンパク質複合体を含む。
【０１２６】
同様に、キャリアタンパク質は、免疫原性応答に影響を与えてよく、糖複合体として供給された時、１種以上の本発明の化合物による哺乳類の治療の結果得られる、抗体の正確な性質に影響を及ぼしてよい。したがって、本発明は、複数のキャリアタンパク質（それらが２種以上のオリゴ糖を含もうと含むまいと）を含む組成物を含む。
【０１２７】
有用なキャリアタンパク質は当該分野でよく知られており、たとえば、チログロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風トキソイド、ジフテリアトキソイド、ポリ（リシン：グルタミン酸）などのポリアミノ酸、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウィルスコアタイプタンパク質、Ｂ型肝炎ウィルス組換えワクチンなどが挙げられる。細菌外膜タンパク質、たとえば、外膜複合体ｃ（ＯＭＰＣ）、ポーリン、トランスゲリン結合タンパク質、肺剥離、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、または肺炎球菌接着タンパク質（ＰｓａＡ）を使用することもできる。他のタンパク質、たとえば、オバルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）またはツベルクリンの精製タンパク質誘導体（ＰＰＤ）も、キャリアタンパク質として使用してもよい。キャリアタンパク質は、毒性がなく、反応原性でなく、十分な量および純度で入手可能なタンパク質が好ましい。
【０１２８】
キャリアタンパク質は、標準的な複合手段が実行可能であるべきである。本発明の好ましい実施形態では、コリネバクテリアジフテリアの培地から精製され、フォルムアルデヒドを使用して化学的に無毒化されたジフテリア毒をキャリアタンパク質として使用する。他の実施形態では、ＣＲＭｌ９７が使用された。
【０１２９】
オリゴ糖をキャリアタンパク質に結合する方法は、通常のものであり、当業者であれば、従来の方法を使用して本発明の化合物を含む糖複合体を造ることができる。指針は多くの刊行物から入手可能で、たとえば、米国特許第４，３５６，１７０号、第４，６１９，８２８号、第５，１５３，３１２号、第５，４２２，４２７号および第５，４４５，８１７号が挙げられる。
【０１３０】
このような一実施形態では、２−アミノエトキシを、第一マンノース単位のＣ−１で、スペーサー部分およびリン酸ジエステル結合として、スベリン酸またはスクアレートのいずれかを、スペーサー部分をキャリアタンパク質に連結する２価の試薬として、およびＣＲＭ１９７をキャリアタンパク質として、糖複合体を製造した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光分析によれば、これらは、平均して、キャリアタンパク質分子１個当たり、含まれる約５個のオリゴ糖分子を複合する。しかし、オリゴ糖：キャリアタンパク質比は、モル比で、約０．１〜約１であるのが望ましい場合が多く、キャリアタンパク質が利用されているかどうかにかかわらず、約１〜３０：１または約１〜１０：１のモル比も本発明の範囲内である。キャリアタンパク質に対するオリゴ糖の比も、２つの間の重量比として特徴づけられ、約１：１〜１：５００の比が好ましい場合が多い。正確な比は、タンパク質とオリゴ糖との分子量の比に依存し、小さなオリゴ糖に関しては、１：５〜１：２００の重量比が使用される場合がある。
【０１３１】
莢膜ポリサッカライドをキャリアタンパク質に複合した後、ポリサッカライド−タンパク質複合体を、種々の技術によって精製（ポリサッカライド−タンパク質結合体の量に関して濃縮されている）してよい。精製ステップの１つの目的は、ポリサッカライド−タンパク質複合体から結合していないポリサッカライドを除去することである。硫酸アンモニウムの存在下での限外ろ過を含む精製方法の１つが、米国特許第６，１４６，９０２号に記載されている。あるいは、特に、ゲル排除クロマトフラフィー、濃度勾配遠心分離法、疎水性相互作用クロマトフラフィーまたは硫酸アンモニウム分画を始めとする、さまざまな標準的な技術によって、未反応タンパク質およびポリサッカライドから複合体を精製して取り出すことができる。たとえば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｐ．Ｗ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８６）１３７：１１８１−１１８６を参照のこと。また、Ｊｅｎｎｉｎｇｓ，Ｈ．Ｊ．ら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９８１）１２７：１０１１−１０１８も参照のこと。
【０１３２】
本発明のワクチンは、本発明の免疫原性化合物を少なくとも１種含み、また、生理学的に耐容性のある（許容可能な）希釈剤、たとえば、水、リン酸緩衝生理食塩水、または生理食塩水を含むことができ、さらに、典型的にはアジュバントを含む。米国特許第６，８６９，６０７号には、タンパク質複合免疫原に関する非イオン性アジュバントが記載され、他の適切なアジュバントについて検討している。該公報は、そのようなアジュバントの記載に関し、参照によって組み入れられる。不完全フォロインドアジュバント、アルミニウムホスフェート、アルミニウム水酸化物またはミョウバン、アルミニウム硫酸塩、アルミニウムホスフェート、およびこれらの組合せなどの物質も、アジュバントとして当該分野でよく知られた物質である。また、ＢＡＹ、ＤＣ−コレステロール、ｐｃｐｐ、モノホスホリルリピドＡ、ＣｐＧ、ＱＳ−２１、コレラ毒、およびホルミルメチオニルペプチド、さらにＭＦ５９、ＳＡＦ、スクアラン、ツウィーン、ブルロニックブロックポリマーＬ１２１のような乳液製剤、およびモノホスホリルリピドＡ、トレハロースジミコレートおよび細胞壁骨格などの成分も有用である。ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、インターフェロンおよび腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）などのサイトカインも含まれる。本発明のいくつかの好ましい実施形態では、ミョウバンをアジュバントとして使用する。
【０１３３】
本明細書で記載するように、注射、エアロゾル、経口、経皮またはその他の経路による、組成物を使用する免疫化の際、ホストの免疫システムが、所望の抗原に特異的な大量のＣＴＬを造り出すことによって、ワクチンに応答し、後で、ホストは、髄膜炎菌病原菌による感染症に対し、免疫を持つようになる。
【０１３４】
本発明のワクチンおよび医薬組成物は、非経口、表面、経口または局所投与が意図される。これらは、非経口的、たとえば、静脈内に、皮下に、皮内に、または筋肉内に投与するのが好ましい。したがって、本発明は、非経口投与用の組成物であって、許容可能なキャリア、好ましくは第一水性キャリアに溶解された、または懸濁された免疫原性部分の溶液を含む組成物を提供する。種々の水性キャリアを使用してよく、たとえば、水、緩衝水、０．８％生理食塩水、０．３％グリシン、ヒアルロン酸などが挙げられる。これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌してもよいし、あるいは滅菌フィルタでろ過してもよい。得られた水溶液は、使用のために、そのまま包装しても、凍結乾燥してもよい。凍結乾燥製剤は、投与の前に滅菌溶液と合わせる。組成物は、生理的条件に近づけるため、必要に応じて、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、浸透圧調整剤、湿潤剤などの医薬的に許容可能な補助剤を含んでよく、たとえば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノオレエート、トリエタノールアミンオレエートなどが挙げられる。そのような医薬組成物の製剤は当該分野において通常の技術の範囲内であり、標準的な参考書、たとえば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，最新版（これは参照により本明細書に組み入れられる）によって手引きされている。
【０１３５】
好ましい実施形態では、実質的に水性混合物の式（１）または式（４）の少なくとも１つの部分を含むワクチン組成物は、滅菌された、発熱物質を含まない緩衝化生理食塩水またはホスフェート含有溶液として製剤化され、これは、防腐剤を含んでもよく、あるいは防腐剤を含まなくてもよい。適切な防腐剤として、たとえば、ベンジルアルコール、パラベン、チメロサール、クロロブタノールおよびベンザルコニウムクロライドが挙げられる。溶液は、適正な等張であるのが好ましく、その等張性は、四酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、プロピレングリコール、およびリン酸ナトリウムなどの薬剤で調整されていてよい。
【０１３６】
医薬製剤中の本発明の免疫原性オリゴ糖の濃度は広く変化し得る。すなわち、重量％で、約０．１％未満から、通常約約０．１％またはそれ以上から２０％〜５０％またはそれ以上であり、液体量、粘度などにより、および選択される投与の特定のモードに従って先ず選択される。化合物および組成物のヒト単位投与剤形は、典型的には、許容可能なキャリア、好ましくは水性キャリアのヒト単位用量を含む医薬組成物中に含まれ、そのような組成物がヒトへの投与のために使用されることが当業者に知られ、また、治療すべき特定の対象のために一般的に理解されている原則に従って調整した流体容量で投与される。したがって、一実施形態では、本発明は、水溶液の適切な量、たとえば、０．１〜３ｍｌ、好ましくは０．２〜２ｍＬの本発明のワクチン成分の単位用量を提供する。
【０１３７】
また、本発明の免疫原は、特定の組織、たとえば、リンパ系組織で免疫原を濃縮し、あるいはそれらの活性または送達特性を強化する役目を果たすリポソームによって投与してもよい。リポソームを製造するには、種々の方法が入手可能であり、たとえば、Ｓｚｏｋａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．（１９８０）９：４６７，米国特許第４，２３５，８７１号、第４，５０１，７２８号および第５，０１９，３６９号に記載されている。
【０１３８】
固形組成物に関しては、従来の毒性のない固形キャリアを使用してよく、たとえば、マンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、サッカロース、炭酸マグネシウムの医薬品等級品などが挙げられる。経口投与に関しては、医薬的に許容可能な毒性のない組成物を、普通使用される任意の賦形剤、たとえば、先に挙げたキャリア、および単位投薬量の活性成分、すなわち、１種以上の本発明の化合物（これはタンパク質に複合しているものも複合していないものも）と混和することにより形成する。
【０１３９】
エアロゾル投与に関しては、界面活性剤および推進剤とともに、免疫原性化合物を微粉砕した形態で供給するのが好ましい。もちろん、界面活性剤は、毒性がないものでなければならず、推進剤に溶解するのが好ましい。そのような薬剤の代表的なものとして、６〜２２個の炭素原子を含む脂肪族のエステル類または部分エステル類、たとえば、カプロン酸、オクタン酸、ラウリン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレイン酸、オレステリン酸およびオレイン酸の脂肪族多価アルコールまたはその環状無水物とのエステルが挙げられる。混合エステル類、たとえば、混合または天然グリセリドを使用してよい。界面活性剤は、組成物の０．１％〜２０重量％、好ましくは、０．２５〜５％を構成する。組成物のバランスは、普通に推進される。キャリアも、所望により、たとえば、鼻腔内送達用にレクチンと同様に含まれていてよい。
【０１４０】
この用途に効果的な量は、たとえば、オリゴ糖組成物（タンパク質に複合するものも、しないものも）、投与の方法、患者の体重、一般的な健康状態、処方医師の判断に依るが、最初の免疫化（すなわち、予防投与用）のための一般的な範囲は、７０ｋｇの患者に対して、ペプチド、約１．０μｇ〜約５，０００μｇ（たとえば、１．０μｇ、１．５μｇ、２．０μｇ、２．５μｇ、３．０μｇ、３．５μｇ、４．０μｇ、４．５μｇ、５．０μｇ、７．５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、１７．５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、７５０μｇ、１，０００μｇ、１，５００μｇ、２，０００μｇ、２，５００μｇ、３，０００μｇ、３，５００μｇ、４，０００μｇ、４，５００μｇまたは５，０００μｇ）である。対象に投与される実際の用量は、対象の体重の１ｋｇ当たりの適正な量に従って決定されることが多い。たとえば、有効量は、約０．１〜５μｇ／ｋｇ体重である。
【０１４１】
患者の応答および患者の血液中の特異的なＴ細胞活性を測定することによる条件に応じて、場合によっては、数週間から数ヶ月にわたる追加のレジメンに従って、第一投与量は、約１．０μｇ〜約１，０００μｇのペプチド（たとえば、１．０μｇ、２．０μｇ、２．５μｇ、３．０μｇ、３．５μｇ、４．０μｇ、４．５μｇ、５．０μｇ、７．５μｇ、１０μｇ、１２．５μｇ、１５μｇ、１７．５μｇ、２０μｇ、２５μｇ、３０μｇ、３５μｇ、４０μｇ、４５μｇ、５０μｇ、７５μｇ、１００μｇ、２５０μｇ、５００μｇ、７５０μｇ、１，０００μｇ、１，５００μｇ、２，０００μｇ、２，５００μｇ、３，０００μｇ、３，５００μｇ、４，０００μｇ、４，５００μｇまたは５，０００μｇ）の追加の投与を行ってよい。
【０１４２】
本発明の化合物を含む免疫原性組成物は、ヒト成人への使用にも子供への使用にも適していて、いくつかの実施形態では、髄膜炎菌によって引き起される髄膜炎をもたらすリスクのある若年小児に投与される。場合によっては、そのような組成物を、他の医薬的に活性な物質と組合せて投与してよく、しばしば、幼児ワクチン接種プログラムの一部として、他のワクチンと組合せて投与される。投与用の組成物は、他の髄膜炎病原菌に対しても保護を付与する免疫応答を誘発する糖複合体などの他のタイプの免疫原性化合物を効果的に含む。したがって、いくつかの実施形態では、本発明のワクチン組成物は、別の髄膜炎血清型に、典型的には血清型Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｗ１３５およびＹの少なくとも１種に由来する少なくとも１種の抗原を含む。好ましい実施形態は、血清型Ｃ、ＹおよびＷ１３５の少なくとも１種、しばしば２種または全てに対する抗原を、少なくとも１種、場合によっては２種以上の本発明のオリゴ糖を含む化合物と組合せて含むことが多い。
【実施例】
【０１４３】
以下の実施例は、本発明のある実施形態を説明するものであり、決してその範囲を限定するものではない。例示した反応および処方の別の変法が当業者に明らかになり、それもまた本発明の範囲内である。たとえば、工程の順番の変更または保護基手法の変形は、しばしば、当業者によってなされる代表的な選択選択肢が選ばれる。以下の項目中の化合物のナンバリングは、先に挙げた反応スキームにおける化合物のナンバリングに対応しておらず、読者の便宜のために提供する。
【０１４４】
一般的方法
ＴＬＣを、可視化のために、ＡＭＣ（モリブデン酸アンモニウム−硫酸セリウム（ＩＶ）−１０％硫酸１００ｇ：２ｇ：２Ｌ）、または８％Ｈ２ＳＯ４を使用して、Ｍｅｒｃｋプレコート６０Ｆ２５４プレート上で行った。カラムクロマトグラフィーは、シリカゲル（０．０４０〜０．０６３ｍｍ、Ａｍｉｃｏｎ）または逆相ゲル（Ｃ１８  ６０Ａ  ４０〜６３μｍ）で行った。ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（外部Ｍｅ４Ｓｉ、δ＝０．００）またはＤ２Ｏ（内部アセトン１３Ｃδ＝３０．８９、１Ｈ＝２．２２）中、２５℃で、Ｖａｒｉａｎ３００ＭＨｚまたは４００ＭＨｚ装置で記録した。有機溶液は、減圧下、３０℃で濃縮した。
【０１４５】
（実施例１）
【０１４６】
【化３８】
2008540398.tif 000031
ジエチルＣ−（３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−グルコピラノシル）メタンホスホネート（２）
ＴＢＡＦ（２．６ｇ、１．３当量）を、ジエチルＣ−（２−Ｏ−ｔｅｒｔブチルジメチルシリル−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−グルコピラノシル）メタンホスホネート（１、５．３６ｇ、７．７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１５０ｍＬ）溶液に加えた。２０分後、溶剤を減圧下で除去し、生成物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、２（４．４４ｇ、７．６ｍｍｏｌ、９９％）を得た。
【０１４７】
ジエチルＣ−（２−アジド−３，４，６−トリ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート（３）。ＤＩＡＤ（２．４ｍＬ、１２．４ｍｍｏｌ）を、冷却（−５℃）した、Ｐｈ３Ｐ（３．１ｇ、１１．７ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５０ｍＬ）溶液に滴下した。３０分後、２（５．５７ｇ、９．５ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２０ｍＬ）溶液を加えた。さらに１０分後、ジフェニルリン酸アジド（ＤＰＰＡ；２．４ｍＬ、１１．３１ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温にした。一晩撹拌した後、溶剤を蒸発させ、残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、３（５．０ｇ、８．２ｍｍｏｌ，８６％）を無色油状物として得た。
【０１４８】
【化３９】
2008540398.tif 000032
ジエチルＣ−（６−Ｏ−アセチル−２−アジド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート（４）。化合物３（３．２ｇ、５．２ｍｍｏｌ）を、ＨＯＡｃ／Ａｃ２Ｏ（１：１，３２ｍＬ）に溶解した。Ａｃ２Ｏ中の１％Ｈ２ＳＯ４を１０滴加えた。一晩撹拌した後、混合物を氷およびＣＨ２Ｃｌ２を含む分液漏斗に注ぎ入れた。有機相を分離し、シリカのプラグを通してろ過し、濃縮した。残渣をカラムクロマトグラフィーで精製し、４（２．４８ｇ、４．４ｍｍｏｌ、８４％）を得た。
【０１４９】
【化４０】
2008540398.tif 000033
ジエチルＣ−（６−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート（５）。４（２．５０ｇ、４．４５ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１２５ｍＬ）溶液を撹拌しながら、これに触媒量のＮｉＣｌ２×６Ｈ２Ｏを加え、次いで出発物質がＴＬＣ（システム）で観察されなくなるまで、ＮａＢＨ４（合計０．３４ｇ、８．９ｍｍｏｌ）を１０分ごとに分けて加えた。５０分後、Ａｃ２Ｏ（３ｍＬ）を加え、反応混合物をトルエンで希釈し、シリカのプラグを通してろ過し、濃縮した。残渣をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、５（１．９５ｇ、３．４ｍｍｏｌ、７６％）を得た。
【０１５０】
【化４１】
2008540398.tif 000034
ジメチルＣ−（６−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート（７）。５（０．２５ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）の乾燥ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）溶液に、ブロモトリメチルシラン（０．２８ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ、５当量）を室温で加えた。添加が完了した後、混合物を室温で１時間撹拌した。溶液を０℃に冷却し、Ｅｔ３Ｎ（１ｍＬ）を加え、次いで（１ｍＬ）を加えた。１０分後、溶剤を減圧下で除去し、残渣を、ＲＰ−クロマトグラフィー（水−水／ＭｅＯＨ１：１）で脱塩した。生成物Ｃ−（６−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート（６）を、さらに精製することなくメチル化した。上に記載した反応で得た生成物に、ＡｃＯＨ（５．５ｍＬ）およびオルト酢酸トリメチル（１１．５ｍＬ）を加えた。混合物を還流温度で３０分加熱し、次いで濃縮した。残渣を、シリカゲルクロマトグラフィーで精製し、７（０．２０ｇ、０．３６ｍｍｏｌ、８４％、２ステップより多い）を得た。（反応は、注意深くモニターしなければならず、反応が完了したとき正確に停止しなければならない。でなければ、結果は、所望の生成物と６−ＯＡｃが脱保護された生成物との混合物になる。）
【０１５１】
【化４２】
2008540398.tif 000035
メチルＣ−（６−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート（８）。７（１．３５ｇ、２．４６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（２ｍＬ）溶液に、チオフェノール（１．０ｍＬ、９．８３ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２．０ｍＬ、１４．７ｍｍｏｌ）を加えた。４８時間後、反応混合物を直接シリカゲルカラムに置き、最初にトルエンで、次いで１．５％のＴＥＡを含むＣＨＣｌ３ＭｅＯＨ、９：１で溶離し、８（１．２８ｇ、２．０１ｍｍｏｌ、８２％）を得た。
【０１５２】
【化４３】
2008540398.tif 000036
以下のスキームは、実施例１および実施例２〜６の後段に適用する。
【０１５３】
【化４４】
2008540398.tif 000037
２−カルボキシベンジルアミドエチル６−Ｏ−［メチルＣ−（６−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート］−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（１０）。８（５０ｍｇ、０．０９３ｍｍｏｌ）、トリス（４−クロロフェニル）ホスフィン（３８ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）、２−カルボキシベンジルアミドエチル２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（９，４２ｍｇ、０．０７２ｍｍｏｌ）、Ｅｔ３Ｎ（０．０５０ｍＬ、０．３６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ＤＩＡＤ（０．０２１ｍＬ、１０．４ｍｍｏｌ）を加えた。４５分後、溶剤を減圧下で除去し、残渣をシリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次いでＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ９：１）で、次いでさらにＬＨ−２０ゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ４：１）で精製し、生成物１０（７０．１ｍｇ、０．０６４ｍｍｏｌ、８８％）をジアステレオマー混合物として得た。
【０１５４】
（実施例２）
２−カルボキシベンジルアミドエチル６−Ｏ−［メチルＣ−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート］−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（１１）。１０（７３ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２ｍＬ）溶液に、ＭｅＯＨに溶解したＫＯＨの原液からのＫＯＨ（７．４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）を加えた。２５分後、反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、シリカのプラグを通してろ過し、溶剤を減圧下で除去した。残渣を、ＬＨ−２０ゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ４：１）で精製し、１１（７０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ、１００％）を得た。
【０１５５】
（実施例３）
２−カルボキシベンジルアミドエチル６−Ｏ−［メチルＣ−（６−Ｏ−［メチルＣ−（６−Ｏ−アセチル−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート］−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート］−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（１２）。８（２７ｍｇ、０．０５１ｍｍｏｌ）、トリス（４−クロロフェニル）ホスフィン（１９ｍｇ、０．０５２ｍｍｏｌ）、１１（３８ｍｇ、０．０３６ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（０．０２５ｍＬ、０．１８ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（０．５ｍＬ）溶液に、ＤＩＡＤ（０．０１０ｍＬ、０．０５２ｍｍｏｌ）を加えた。４０分後、反応混合物を濃縮し、シリカゲルクロマトグラフィー（ＥｔＯＡｃ、次いでＣＨＣｌ３ＭｅＯＨ９：１）で精製した。生成物を、さらに、ＬＨ−２０ゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ４：１）で精製し、１２（５２ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ、９２％）を得た。
【０１５６】
（実施例４）
２−カルボキシベンジルアミドエチル６−Ｏ−［メチルＣ−（６−Ｏ−［メチルＣ−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）ホスホネート］−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）ホスホネート］−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（１４）。１２（６７ｍｇ、０．０４３ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２ｍｌ）溶液に、ＭｅＯＨに溶解したＫＯＨの原液からのＫＯＨ（４．７ｍｇ、０．０８５ｍｍｏｌ、２当量）を加えた。２５分後、反応混合物をＤＣＭで希釈し、シリカのプラグを通してろ過し、溶剤を減圧下で除去した。残渣をＬＨ−２０ゲルカラム（ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ４：１）で精製し、１３（６５ｍｇ、０．０４２ｍｍｏｌ、１００％）を得た。１３（３６ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（０．５ｍｌ）溶液に、チオフェノール（０．０９６ｍｌ、０．９４ｍｍｏｌ、４０当量）およびＤＢＵ（０．０７０ｍｌ、０．４７ｍｍｏｌ、２０当量）を加えた。２．５時間後、溶剤を減圧下で除去し、生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン、次いでＣＨＣｌ３／Ｍｅ０Ｈ９：１＋１．５％ＴＥＡ）で精製した。残渣をさらに、ＬＨ−２０ゲルカラム（ＭｅＯＨ＋１．５％ＴＥＡ）で精製し、１４（３０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ、７５％）を得た。
【０１５７】
【化４５】
2008540398.tif 000038
（実施例５）
２−アミノエチル６−Ｏ−［Ｃ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノマンノピラノシル）メタンホスホネート］−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（１５）。１１（３５．１ｍｇ、０．０３３ｍｍｏｌ）のアセトニトリル（０．５ｍｌ）溶液に、チオフェノール（０．０６６ｍｌ、０．６４ｍｍｏｌ、２０当量）およびＤＢＵ（０．０４８ｍｌ、０．３２ｍｍｏｌ、１０当量）を加えた。２時間後、溶剤を減圧下で除去し、生成物をシリカゲルクロマトグラフィー（トルエン、次いでＣＨＣｌ３／ＭｅＯＨ２０：１＋１．５％ＴＥＡ）で精製した。生成物をさらに、ＬＨ−２０ゲルカラム（ＭｅＯＨ１．５％ＴＥＡ）で精製し、２−（ベンジルオキシカルボニル）アミノエチル６−Ｏ−［Ｃ−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート］−２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−ベンジル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（３０ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ、７９％）を得た。
【０１５８】
【化４６】
2008540398.tif 000039
この生成物（１０ｍｇ）のＥｔＯＨ（４ｍｌ）溶液に、ＨＣｌ水溶液（０．１Ｍ、０．２５ｍｌ）を、次いで触媒量の炭素上Ｐｄを加えた。１００ｐｓｉの水素雰囲気下、一晩撹拌した後、溶液を酢酸ナトリウムで中和した。反応混合物を、逆相シリカゲルのプラグおよび３１Ｐ  ＮＭＲで精製すると、出発物質の単一生成物への完全な変換を示した。これをさらに、Ｐ２−バイオゲルカラムで精製し、凍結乾燥後、１５（１００％）を得た。
【０１５９】
【化４７】
2008540398.tif 000040
（実施例６）
２−アミノエチル６−Ｏ−［Ｃ−（６−Ｏ−［Ｃ−（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート］−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル）メタンホスホネート］−２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（１６）。１４（１２ｍｇ）のＥｔＯＨ（４ｍｌ）溶液に、ＨＣｌ類溶液（０．１Ｍ、０．２５ｍｌ）を、次いで触媒量の炭素上Ｐｄを加えた。１００ｐｓｉの水素雰囲気下で一晩撹拌した後、溶液を酢酸ナトリウムで中和した。反応混合物を逆相シリカゲルのプラグおよび３１Ｐ  ＮＭＲで精製すると、出発物質の単一生成物への完全な変換を示した。これをさらに、Ｐ２−バイオゲルカラムで精製し、１６を得た（１００％）。
【０１６０】
【化４８】
2008540398.tif 000041
（実施例７ａ）
【０１６１】
【化４９】
2008540398.tif 000042
エチル３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド（２２）。１，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（２１）（５．０４ｇ、１３．５ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）溶液に、ＥｔＳＨ（１．６ｍＬ、２１．６ｍｍｏｌ）およびＭＳ（４Å）を加えた。混合物を、アルゴン下、室温で３０分撹拌した。次いで、ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解したＢＦ３−エーテラート（４．８ｍＬ、３８．１ｍｍｏｌ）を１時間かけて加えた。７時間後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、飽和ＮａＨＣＯ３で洗浄し、ろ過（シリカ）し、濃縮した。クロマトグラフィー（１：０→１：１、トルエン−ＥｔＯＡｃ）によって、２２（３．４６ｇ、９．２２ｍｍｏｌ、６８％）を得た。
【０１６２】
【化５０】
2008540398.tif 000043
エチル３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−６−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−デオキシ−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド（２３）。２２（３．７１ｇ、９．８８ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（３０ｍＬ）溶液に、ＮａＯＭｅ（１Ｍ）を加えた。１時間後、混合物をＡｃＯＨで中和し、濃縮した。乾燥残渣をピリジン（１５ｍＬ）に溶解し、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（１．９４ｇ、１２．８７ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩撹拌した。無水酢酸でアセチル化し、トルエンで希釈し、ろ過（シリカ）し、濃縮し、クロマトグラフィー（１：０→１：１トルエン−ＥｔＯＡｃ）で精製して、２３（４．３５７ｇ、９．７３ｍｍｏｌ、９９％）を得た。［α］Ｄ＋１０９°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１６３】
【化５１】
2008540398.tif 000044
【０１６４】
【化５２】
2008540398.tif 000045
３，４−ジ−Ｏ−アセチル−アジド−６−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（２６）。ＮＩＳ（３９４ｍｇ、１．７５ｍｍｏｌ）およびＡｇＯＴｆ（触媒）を２３（６５３ｍｇ、１．４６ｍｍｏｌ）の湿潤ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）溶液に加えた。反応混合物を−２０℃で３０分撹拌した。ＣＨ２Ｃｌ２を加え、混合物をＮａ２Ｓ２Ｏ３（１０％）で洗浄し、ろ過（シリカ）し、濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（１：０→１：１トルエン−ＥｔＯＡｃ）で精製し、２６（４８７ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ、８２％）を得た。
【０１６５】
【化５３】
2008540398.tif 000046
３，４−ジ−Ｏ−アセチル−１−アジド−６−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシル水素−ホスホネート・トリエチルアンモニウム塩（２７）。イミダゾール（９１５ｍｇ、１３．４５ｍｍｏｌ）、ＰＣｌ３（３３５μＬ、３．８４ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（２．０ｍＬ、１４．３５ｍｍｏｌ）の混合物を、ＭｅＣＮ（２５ｍＬ）中、０℃で３０分撹拌した。化合物２６（３８８ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（２５ｍＬ）溶液を０℃で３０分かけて加えた。次いで、反応混合物を室温で１０分撹拌し、ＴＥＡＢ（０．５Ｍ）でクエンチし、濃縮した。残渣を希釈（ＣＨＣＩ３）し、ＴＥＡＢ（０．５Ｍ）で洗浄し、ろ過（綿）し、濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（１：０→１０：１ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ＋１．０％Ｅｔ３Ｎ）に供し、２７（４９９ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ、９７％）を得た。［α］Ｄ＋６７°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１６６】
【化５４】
2008540398.tif 000047
（実施例７ｂ）
２−（ベンジルオキシカルボニル）アミノエチル３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−６−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（２４）。化合物２３（５２７ｇ、１．１８ｍｍｏｌ）を、ＭＳ（４Å）を含むＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解した。ベンジルＮ−（２−ヒドロキシエチル）カルバメート（３００ｍｇ、１．５４ｍｍｏｌ）を、加え、混合物をアルゴン下−２０℃で３０分撹拌し、次いで、ＮＩＳ（３４５ｍｇ、１．５３ｍｍｏｌ）およびＡｇＯＴｆ（触媒）を加えた。３０分後、反応混合物をＥｔ３Ｎで中和し、ＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１０％）で洗浄し、ろ過（シリカ）し、濃縮した。クロマトグラフィー（１：０→１：１トルエン−ＥｔＯＡｃ）により、２４（５９５ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ、８６％）を得た。［α］Ｄ＋４６°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１６７】
【化５５】
2008540398.tif 000048
２−（ベンジルオキシカルボニル）アミノエチル３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド（２５）。化合物２４（５７５ｍｇ、０．９９ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、ＴＲＥＡＴ−ＨＦ（０．８１ｍＬ、４．９７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をアルゴン下室温で一晩撹拌した。濃縮およびクロマトグラフィー（２：１→０：１トルエン−ＥｔＯＡｃ）により、２５（４４８ｍｇ、０．９６ｍｍｏｌ、９７％）を得た。［α］Ｄ＋６０°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１６８】
【化５６】
2008540398.tif 000049
（実施例７ｃ）
（３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−６−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−（ベンジルオキシカルボニル）アミノエチル３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）トリエチルアンモニウム塩（２８）。２５（３２５ｍｇ、０．６０ｍｍｏｌ）および２７（２１７ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）の混合物を、ピリジン（３ｍＬ）に溶解した。ピバロイルクロライド（１４４μＬ、１．１８ｍｍｏｌ）を加え、混合物をアルゴン下室温で１時間撹拌した。反応混合物を−４０℃に冷却し、Ｉ２（１４３ｍｇ、０．５６ｍｍｏｌ）のピリジン−Ｈ２Ｏ（３ｍＬ、４９：１）溶液を加えた。０℃で酸化を完了し、混合物をＣＨＣｌ３で希釈し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１０％）および冷ＴＥＡＢ（０．５Ｍ）で洗浄した。ろ過（綿）、濃縮、およびクロマトグラフィー（１：０→１０：１、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）により、２８（４６９ｍｇ、０．４５ｍｍｏｌ、９６％）を得た。［α］Ｄ＋５２°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１６９】
【化５７】
2008540398.tif 000050
（実施例７ｄ）
（３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−（ベンジルオキシカルボニル）アミノエチル３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）トリエチルアンモニウム塩（２９）。化合物２８（４７２ｍｇ、０．４６ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１０ｍＬ）に溶解し、ＴＲＥＡＴ−ＨＦ（３７２μＬ、２．２８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２４時間撹拌し、次いで濃縮、シリカゲル（１：０→５：１、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）上での精製を行い、２９（３９０ｍｇ、０．４２ｍｍｏｌ、９１％）を得た。［α］Ｄ＋３４°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１７０】
【化５８】
2008540398.tif 000051
以下のスキームは、実施例８〜１２に適用する。
【０１７１】
【化５９】
2008540398.tif 000052
（実施例７）
（３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−６−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−（ベンジルオキシカルボニル）アミノエチル３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）ビス−トリエチルアンモニウム塩（３０）。２７（２７３ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）および２９（３５７ｍｇ、０．３９ｍｍｏｌ）の混合物に、ピリジン（３ｍＬ）中、塩化ピバロイル（１１９μＬ、０．９７ｍｍｏｌ）を加えた。２時間後、混合物を−４０℃に冷却し、Ｉ２（１１９ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）のピリジン−Ｈ２Ｏ（３ｍＬ、４９：１）溶液を加えた。温度が−１０℃に達した時、混合物をＣＨＣｌ３で希釈した。Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１０％）、冷ＴＥＡＢ（０．５Ｍ）による抽出、ろ過（綿）およびクロマトグラフィー（ｌ：０→５：１ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって、３０（３５１ｍｇ、０．２４ｍｍｏｌ、６２％）を得た。［α］Ｄ＋６８°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１７２】
【化６０】
2008540398.tif 000053
（実施例８）
（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−（ベンジルオキシカルボニル）アミノエチル２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）ビス−トリエチルアンモニウム塩（３１）。化合物３０（８３ｍｇ、０．０５６ｍｍｏｌ）をＭｅＯＨ（３ｍＬ）に溶解し、ＮｉＣｌ２（Ｈ２Ｏ）６を加えた（触媒）。少量のＮａＢＨ４を０℃で１時間かけて加えることによって、還元を行った。次いで、混合物を無水酢酸に供し、次いで、希釈（ＭｅＯＨ）および濃縮を行った。残渣を、シリカゲル（１：０→５：１、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）およびＬＨ−２０ゲル（ＭｅＯＨ＋１．５％Ｅｔ３Ｎ）で精製し、化合物３１（７６ｍｇ、０．０５０ｍｍｏｌ、８９％）を得た。［α］Ｄ＋６３°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１７３】
【化６１】
2008540398.tif 000054
（実施例９）
２−アミノエチル−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−６−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）ビス−トリエチルアンモニウム塩（３２）。化合物３１（３７ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（１．５ｍＬ）溶液に、アンバーライトＩＲ−４５（ＯＨ−）樹脂（４０ｍｇ）および活性炭上のバラジウムを加えた。混合物を、１００ｐｓｉで一晩水素分解し、希釈（ＭｅＯＨ）し、遠心分離し、濃縮した。逆相ゲル（１：０→０：１、Ｈ２Ｏ−ＭｅＯＨ）上で精製し、３２（２８ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ、８３％）を得た。［α］Ｄ＋６０°（ｃ１．０、ＭｅＯＨ）；
【０１７４】
【化６２】
2008540398.tif 000055
（実施例１０）
２−アミノエチル（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）ビス−トリエチルアンモニウム塩（３３）。ＴＲＥＡＴ−ＨＦ（１７μＬ、０．１０ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（１．５ｍＬ）溶液を、Ｅｔ３Ｎ（１７μＬ、０．１２ｍｍｏｌ）で処理した。この溶液を、化合物３２（２８ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）に加えた。室温で３０分撹拌した後、混合物を濃縮し、逆相ゲル（１：０→０：１、Ｈ２Ｏ−ＭｅＯＨ）で精製し、３３（２２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ、８５％）を得た。［α］Ｄ＋４５°（ｃ１．０、ＭｅＯＨ）；
【０１７５】
【化６３】
2008540398.tif 000056
（実施例１１）
２−アミノエチル（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）ビス−トリエチルアンモニウム塩（３４）。化合物３３（２２ｍｇ、０．０１７ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（１ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＭｅ（１Ｍ）を加えた。３０分後、混合物を濃縮し、残渣を逆相ゲル（Ｈ２Ｏ→ＭｅＯＨ）で精製した。生成物を含む画分を凍結乾燥し、３４（１４ｍｇ、０．０１６ｍｍｏｌ、９４％）を得た。［α］Ｄ＋１２．４°（ｃ０．５、ＭｅＯＨ）；
【０１７６】
【化６４】
2008540398.tif 000057
（実施例１３ａ）
【０１７７】
【化６５】
2008540398.tif 000058
エチル３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド（３５）。ＴＨＦ（６ｍＬ）に溶解された化合物２３（３０５ｍｇ、０．６８ｍｍｏｌ）に、ＴＲＥＡＴ−ＨＦ（０．５５ｍｌ、３．３８ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で一晩撹拌した。濃縮およびクロマトグラフィー（１０：１→０：１、トルエン−ＥｔＯＡｃ）により３５（１７１ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ、７５％）を得た。
【化６６】
2008540398.tif 000059
（実施例１３ｂ）
エチル３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−６−Ｏ−ジベンジルホスフェート−１−チオ−α−Ｄ−マンノピラノシド（３６）。ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解された化合物３５（１７１ｍｇ、０．５１ｍｍｏｌ）に、テトラゾール（１２５ｍｇ、１．７８ｍｍｏｌ）およびＮ−Ｎ−ジイソプロピルホスホルアミデート（２６４μＬ、０．７６ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で３０分撹拌した。ｍＣＰＢＡ（１７６ｍｇ、１．０２ｍｍｏｌ）を０℃で加え、撹拌を３０分続けた。混合物を希釈（ＣＨ２Ｃｌ２）し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１０％）およびＮａＨＣＯ３で洗浄した。ろ過（Ｎａ２ＳＯ４）、濃縮およびクロマトグラフィー（１０：１→２：１、トルエン−ＥｔＯＡｃ）により３６（２００ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、６７％）を得た。［α］Ｄ＋９２°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１７８】
【化６７】
2008540398.tif 000060
（実施例１３ｃ）
３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−６−Ｏ−ジベンジルホスフェート−α−Ｄ−マンノピラノシド（３７）。化合物３６（２８１ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）を湿潤ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）に溶解し、−２０℃に冷却した。ＮＩＳ（１３７ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）およびＡｇＯＴｆ（触媒）を加え、混合物を−２０℃で３０分撹拌した。混合物を希釈（ＣＨ２Ｃｌ２）し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１０％）で洗浄し、ろ過（Ｎａ２ＳＯ４）し、濃縮した。クロマトグラフィー（２：１→０：１、トルエン−ＥｔＯＡｃ）により、１７（２０１ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ、７９％）を得た。
【０１７９】
【化６８】
2008540398.tif 000061
（実施例１３ｄ）
３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−６−Ｏ−ジベンジルホスフェート−α−Ｄ−マンノピラノシル−水素−ホスホネート・トリエチルアンモニウム塩（３８）。イミダゾール（３４９ｍｇ、５．１３ｍｍｏｌ）、ＰＣｌ３（１２８μＬ、１．４７ｍｍｏｌ）およびＥｔ３Ｎ（７６５μＬ、５．４９ｍｍｏｌ）の混合物をＭｅＣＮ（１０ｍＬ）中、０℃で３０分撹拌した。化合物３７（２０１ｍｇ、０．３７ｍｍｏｌ）のＭｅＣＮ（１０ｍＬ）溶液を０℃で３０分かけて加えた。次いで、反応混合物を室温で１０分撹拌し、ＴＥＡＢ（０．５Ｍ）でクエンチし、濃縮した。残渣を希釈（ＣＨＣｌ３）し、ＴＥＡＢ（０．５Ｍ）で洗浄し、ろ過（綿）し、濃縮した。残渣をクロマトグラフィー（１：０→１０：１、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ＋１．０％Ｅｔ３Ｎ）に供し、３８（２４３ｍｇ、０．３４ｍｍｏｌ、９２％）を得た。［α］Ｄ＋５５°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１８０】
【化６９】
2008540398.tif 000062
以下のスキームは、実施例１３ｅおよび１４〜１７に適用する。
【０１８１】
【化７０】
2008540398.tif 000063
（実施例１３ｅ）
２−（ベンジルオキシカルボニル）アミノエチル（３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−６−Ｏ−ジベンジルホスフェート−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）ビス−トリエチルアンモニウム塩（３９）。３８（９６ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）および２９（１０３ｍｇ、０．１１ｍｍｏｌ）の混合物をピリジン（３ｍＬ）に溶解した。ピバロイルクロライド（３４μＬ、０．２８ｍｍｏｌ）を加え、混合物をアルゴン下室温で２時間撹拌した。混合物を−４０℃に冷却し、Ｉ２（３４ｍｇ、０．１３ｍｍｏｌ）のピリジン−Ｈ２Ｏ（３ｍＬ、４９：１）溶液を加えた。酸化を−１０℃で完了し、混合物をＣＨＣｌ３で希釈し、Ｎａ２Ｓ２Ｏ３（１０％）および冷ＴＥＡＢ（０．５Ｍ）で洗浄した。ろ過（綿）、濃縮およびクロマトグラフィー（１：０→５：１、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）によって、３９（１０６ｍｇ、０．０６５ｍｍｏｌ、５９％）を得た。［α］Ｄ＋８０°（ｃ１．０、ＣＨＣｌ３）；
【０１８２】
【化７１】
2008540398.tif 000064
（実施例１２）
２−（ベンジルオキシカルボニル）アミノエチル（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−６−Ｏ−ジベンジルホスフェート−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）ビス−トリエチルアンモニウム塩（４０）。化合物３９（７６ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）に溶解し、ＮｉＣｌ２（Ｈ２Ｏ）６を加えた（触媒）。少量のＮａＢＨ４を０℃で３０分かけて加えることにより、還元を行った。次いで、混合物を無水酢酸に供し、次いで、希釈（ＭｅＯＨ）および濃縮を行った。残渣を、シリカゲル（１：０→５：１、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ＋０．５％Ｅｔ３Ｎ）およびＬＨ−２０ゲル（ＭｅＯＨ＋１．５％Ｅｔ３Ｎ）で精製し、化合物４０（５０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ、６４％）を得た。
【０１８３】
【化７２】
2008540398.tif 000065
（実施例１３）
２−アミノエチル（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−６−Ｏ−ホスフェート−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−３，４−ジ−Ｏ−アセチル−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）トリス−トリエチルアンモニウム塩（４１）。化合物４０（４６ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）のＭｅＯＨ（２ｍＬ）溶液に、アンバーライトＩＲ−４５（ＯＨ−）樹脂（４６ｍｇ）および活性炭上のバラジウムを加えた。混合物を１００ｐｓｉで一晩水素分解し、希釈（ＭｅＯＨ）し、遠心分離し、濃縮した。逆相ゲル（１：０→０：１、Ｈ２Ｏ−ＭｅＯＨ）による精製により、４１（３４ｍｇ、０．０２３ｍｍｏｌ、８５％）を得た。［α］Ｄ＋４３°（ｃ１．０、ＭｅＯＨ）；
【０１８４】
【化７３】
2008540398.tif 000066
（実施例１４）
２−（ベンジルオキシカルボニル）アミノエチル（２−アセトアミド−２−アジド−２−デオキシ−６−Ｏ−ジベンジルホスフェート−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）ビス−ナトリウム塩（４２）。化合物４０（５０ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（３ｍＬ）に溶解し、ＮａＯＭｅ（１Ｍ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。濃縮および逆相ゲル（１：０→０：１、Ｈ２Ｏ−ＭｅＯＨ）による精製によって、４２（３０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ、８０％）を得た。
【０１８５】
【化７４】
2008540398.tif 000067
（実施例１５）
２−アミノエチル（２−アセトアミド−２−アジド−２−デオキシ−６−Ｏ−ホフフェート−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシルホスフェート）−（１→６）−（２−アセトアミド−２−アジド−２−デオキシ−α−Ｄ−マンノピラノシド）トリス−ナトリウム塩（４３）。化合物４２（３０ｍｇ、０．０２４ｍｍｏｌ）を、ＭｅＯＨ（２ｍＬ）に溶解した。アンバーライＩＲ−４５（ＯＨ−）樹脂（３０ｍｇ）および活性炭上のバラジウムを加えた。混合物を１００ｐｓｉで一晩水素分解し、希釈（ＭｅＯＨ）し、遠心分離し、濃縮した。逆相ゲル（１：０→０：１、Ｈ２Ｏ−ＭｅＯＨ）による精製により、４３（１５ｍｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、６４％）を得た。［α］Ｄ＋１３．６°（ｃ０．５、ＭｅＯＨ）；
【０１８６】
【化７５】
2008540398.tif 000068
（実施例１６）
免疫原性に関して、ホスホジエステルに代えたＣ−ホスホネートの影響およびＭｅｎＡサッカライドの安定性を調べるために、髄膜炎菌Ａグループポリサッカライドの繰返し単位のトリマーに類似の合成オリゴ糖を合成し、キャリアタンパク質ＣＲＭ１９７に複合した。該グリコ複合体を、マウスで物理化学的特性および免疫原性を確認するために分析した。複合体の構造は以下のとおりである。
【０１８７】
【化７６】
2008540398.tif 000069
この化合物は、非アセチル化および非−ホスホリル化塩基分子において、モノサッカライドを結合するホスホジエステルをＣ−ホスホネート基に置き換えて得た。
【０１８８】
ａ）ＣＲＭ−ＭｅｎＡ合成糖複合体の物理化学的特性
複合体は、サッカライド、タンパク質、未結合（遊離）サッカライドの含量に関して特徴付けた。さらに、特異的な抗ＭｅｎＡ抗体に対するＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロットを行った。
【０１８９】
サッカライドおよびタンパク質濃度
総リンおよびタンパク質の含有量に関して、凍結乾燥された生成物を生理食塩水で再構成し（最終濃度＝０．８ｍｇ／ｍｌ）、比色定量テストによってアッセイした（ＭｉｃｒｏＢＣＡアッセイ）。次いで、リン含有量を、適正な変換因数を用いて、総サッカライド含有量に変換した。
【０１９０】
複合体の保存中に、いくらかの沈殿物が生成したので、濃リン酸緩衝液（リン酸Ｎａ、１００ｍＭ、ｐＨ７．５）を加え、最終濃度を１０ｍＭとした。次いで、希釈比を考慮して、濃度を再計算した。リン酸緩衝液で希釈した後の複合体の総サッカライド含有量は、９７．１０μｇ／ｍｌであり、タンパク質含有量は、２１５．６３μｇ／ｍｌであった。
【０１９１】
ｂ）マウスにおける免疫原性
合成オリゴ糖を有する複合体の免疫原性を、ＥＬＩＳＡおよび殺菌アッセイで分析した。ＢＡＬＢ／ｃマウス（８匹／グループ）を、アジュバントとしてリン酸アルミニウムを使用して、および使用せずに処方した、精製糖複合体で免疫化した。表１に示す、免疫化プロトコルは、０日目、１４日目および２８日目の３回の投与（各２００ｎｇ）を含み、最終出血は４２日目であった。ポスト１、ポスト２およびポスト３投与血清を分析し、特異的全ＩｇＧおよび対応する抗体機能活性を決定した。ＭｅｎＡ−ＣＲＭ２０１１は、野生型のＭｅｎＡ複合体である。
【０１９２】
【化７７】
2008540398.tif 000070
ＥＬＩＳＡアッセイ
マウス血清におけるＩｇＧ抗体応答の特異的定量に関し、血清をＥＬＩＳＡアッセイで分析した。Ａ型、Ｃ型、Ｗ１３５型およびＹ型ポリサッカライド抗原（ＭｅｎＡ、ＭｅｎＣ、ＭｅｎＷ、ＭｅｎＹ）に対する全ＩｇＧ力価を線形回帰曲線によって計算し、ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ（ＥＵ／ｍｌ）として表した。血清力価は、標準血清の滴定曲線に対する比較から得た。
【０１９３】
マイクロタイタープレートを、ｐＨ７．４のＰＢＳ中の莢膜ポリサッカライドとメチル化ヒト血清アルブミン（最終濃度がそれぞれ５．０μｇ／ｍｌ）との混合物で塗布した。プレートをシールし、２°〜８℃で一晩培養し、次いで洗浄し、ｐＨ７．４のＰＢＳ中、５％ウシ胎児血清を阻害剤として含む緩衝液で飽和した。室温で１時間培養した後、プレートを洗浄し、希釈した試験血清を列１のウェルに加えた。血清を２倍段階希釈法で滴定曲線によって分析した。２°〜８℃で一晩培養した後、プレートを洗浄し、アルカリホスファターゼに複合したヤギ抗マウス抗体複合体を、飽和緩衝液中、１：２０００に希釈し、前記プレートに加えた。二次抗体を、３７℃で２時間培養し、洗浄した後、プレートに色素基質溶液（１Ｍのジエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．８）中、１ｍｇ／ｍｌのｐ−ニトロフェニルホスフェート、０．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０２％のＮａＮ３）を加えた。反応物を室温で３０分培養し、吸光度値を波長４０５〜６２０ｎｍで読んだ。
【０１９４】
標準の吸光度値より優れた第一点の吸光度値での血清を、より高い初回希釈を使用して、再度試験した。
【０１９５】
負の抗体応答をもつマウス（希釈１：１００で、０．３００より低い第一点のＯＤ値）を、２ＥＵ／ｍｌの力価とし、「非応答」に分類した。
【０１９６】
血清殺菌抗体（ＳＢＡｂ）アッセイ
ワクチン免疫化により誘発された機能性抗体を、インビトロでの髄膜炎菌の補体媒介性溶解を測定することによって分析した（Ｇｏｌｄｓｃｈｎｅｉｄｅｒら、１９６９）。新生児ウサギの補体の市販のロットを、補体源として使用した（Ｐｅｌｆｒｅｅｚｅロット番号０９９５８）。
【０１９７】
アッセイプロトコルは、０．２５％のグルコースを添加した、ミューラー・ヒントン・ブロス（Ｄｉｆｃｏ）における試験株の接種剤に基づき、チョコレート寒天上で成長した、単離されたコロニーから出発した。細菌培養物を３７℃、５％ＣＯ２で培養し、細菌が、指数増殖初期（Ｏ．Ｄ．６０００．２２０〜０．２４０）に達したとき、成長を止めた。培養物を、Ｇｅｙバランス塩溶液中、１％ＢＳＡで、１０−４コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍｌまで希釈し、熱不活性化試験血清プールおよび新生児ウサギ補体の存在下、３７℃、５％ＣＯ２で１時間培養した。培養前（Ｔ０）および培養から１時間後（Ｔ１）、反応混合物をミューラー−ヒントン寒天（Ｄｉｆｃｏ）上で平板培養した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で一晩培養し、Ｔ０およびＴ１に対応するＣＦＵ／ｍｌを計測した。
【０１９８】
血清殺菌抗体力価を、５０％の細菌を殺す、相反的血清希釈として表した。
【０１９９】
結果
物理化学的特性
物理化学的分析の結果は、複合体のグリコシル化度が非常に低いことを示す。また、低い複合度は、ウェスタンブロットで得られた低いシグナルによっても、および複合体とＣＲＭリファレンスとの間のＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてわかったわずかな差によっても示されている。複合条件および複合体の精製は最適であり得る。
【０２００】
ＥＬＩＳＡ結果
得られた結果を表２および図４に示す。各単一動物からのＥＬＩＳＡ力価を測定し、ＥＬＩＳＡ単位／ｍｌ（ＥＵ／ｍｌ）で表す。各グリコ複合体に対する特異的抗体応答を、対応する免疫化グループの幾何学的平均力価（ＧＭＴ）として計算した。
【０２０１】
ポスト２投与血清は、アジュバントとともに処方された合成複合体において低い力価を示し、アジュバントなしで処理された免疫化グループでは任意の力価を示した。
【０２０２】
複合体は、ミョウバンがあってもなくても、どのような力価も示さなかった。
【０２０３】
予測したように、アジュバントとともに、およびなしで処理したコントロールグループは、高い応答を示した。
【０２０４】
【化７８】
2008540398.tif 000071
ＳＢＡｂアッセイ結果
血清殺菌力価を、各免疫化グループから製造した血清プールで測定した。殺菌力価は、Ｔ０で測定したコントロールＣＦＵ／ｍｌに比較して、反応混合物のＣＦＵ／ｍｌにおいて５０％減少させる結果となる相反的血清希釈として表す。殺菌価は、血清群Ａ株Ｆ８２３８に対して測定した。ＳＢＡｂ抗体力価を、表３（ＭｅｎＡ−ＣＲＭは、野生型コントロールである）に報告する。
【０２０５】
【化７９】
2008540398.tif 000072
結論
複合体を製造し、物理化学的、免疫化学的および免疫学的特性について分析した。
【０２０６】
物理化学的および免疫化学的分析では、両方とも、複合体のグリコシル化度を示した。
【０２０７】
コントロールグループでは、アジュバントがあってもなくても、免疫化に応答して、高い力価であった。
【０２０８】
ポスト３血清プールの力価は、ポスト２投与血清と比較して増加していた。ミョウバンを使用せず合成複合体で処理したグループでは、力価は測定不可能で、アジュバントを用いた複合体で免疫化したものは、力価は測定可能であったが低かった。
【０２０９】
オリゴ複合体で実施したコントロール免疫化の力価は、非常に高かった。
【０２１０】
該結果により、合成ＭｅｎＡオリゴ糖を複合したタンパク質キャリアＣＲＭ１９７は、マウスにおいて免疫原性であるという証拠を得る。複合体は、天然のホスホジエステル結合より、非常に安定であるＣ−ホスホネート結合を有する。ある免疫原性が検出されたという事実は、将来有望である。
【０２１１】
先に記載した実施例は、本発明を説明するために提供されたものであって、その範囲を限定するものでないことは理解されるであろう。当業者に理解されるように、開示された要素の種々の変更および組合せが実行可能であり、これらもまた、本発明の範囲内である。たとえば、アミンおよびヒドロキシル基用の豊富な保護基がよく知られており、本発明の精神を逸脱しない限り、これらの多くは、本明細書で具体的に挙げたものの代わりに使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１】髄膜炎菌Ａ型の莢膜ポリサッカライドの構造を示す。
【図２】オリゴ糖がタンパク質に複合し、免疫原性を増強する中心でのアルファおよびベータアノマーを図示する。
【図３】合成オリゴ糖のモジュラー組立て手法を示す。
【図４】異なるワクチン用量での、合成糖複合体およびコントロールオリゴ糖複合体によって誘発される特異的抗体応答間の関係を示す。
【図１】
2008540398.tif 000081
【図２】
2008540398.tif 000082
【図３】
2008540398.tif 000083
【図４】
2008540398.tif 000084
【国際調査報告】
2008540398.tif 000085
2008540398.tif 000086
2008540398.tif 000087
2008540398.tif 000088
2008540398.tif 000089