(57)【要約】本発明は、血栓溶解剤として有用である、標的タンパク質およびプラスミノーゲンアクチベーター、好ましくは、プラスミノーゲンアクチベーターＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と作動可能に連結している、Ｐ−セレクチンと結合する抗体を含む新規融合タンパク質に関する。これらの融合タンパク質を含む薬剤組成物、これらの融合タンパク質を血栓溶解剤として用いる方法およびこれらの融合タンパク質を合成する方法も本明細書に記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血栓溶解融合タンパク質であって、血管損傷関連生物学的構造体と結合する標的タンパク質を含み、該標的タンパク質は、プラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と作動可能に連結している、タンパク質。
【請求項２】
前記プラスミノーゲンアクチベーターが、ｔ−ＰＡ由来プラスミノーゲンアクチベーター、ＤＳＰＡ由来プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ由来プラスミノーゲンアクチベーターまたはそれらの類似体、断片、誘導体もしくは変異体からなる群から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記プラスミノーゲンアクチベーターがＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγからなる群から選択される、請求項１または２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記標的タンパク質が、活性化血小板または活性化内皮細胞の表面にあるＰ−セレクチン、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ６３、糖タンパク質１ｂａまたはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼと結合する、請求項１〜３のうちの一項に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記標的タンパク質が抗体である、請求項１〜４のうちの一項に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記抗体がＰ−セレクチンとの競合について、Ｐ−セレクチン−糖タンパク質−リガンド−１と競合しない、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記抗体が、Ｐ−セレクチンとの結合について、糖タンパク質１ｂ−ＩＸ−Ｖと競合しない、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記抗体が、白血球の、活性化血小板との接着を阻害しない、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項５に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記モノクローナル抗体が単鎖抗体、Ｆａｂ二量体抗体またはＩｇＧ抗体である、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記プラスミノーゲンアクチベーターがＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体である、請求項３〜１０のうちの一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記プラスミノーゲンアクチベーターがＤＳＰＡα２またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体である、請求項３〜１０のうちの一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記プラスミノーゲンアクチベーターがＤＳＰＡβまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体である、請求項３〜１０のうちの一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記プラスミノーゲンアクチベーターがＤＳＰＡγまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体である、請求項３〜１０のうちの一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
配列番号３〜配列番号８の群から選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質、またはそれらと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、本質的に同一の生物活性を有するいずれかのタンパク質を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
請求項１〜１５のうちの一項に記載の融合タンパク質を含む薬剤組成物であって、製薬上許容可能な賦形剤と、治療有効量の前記融合タンパク質とを含む、組成物。
【請求項１７】
血栓溶解を誘導する方法であって、請求項１〜１５のうちの一項に記載の融合タンパク質の治療有効量を、それを必要とする患者に投与する工程を包含する、方法。
【請求項１８】
前記方法が動脈血栓症、ＳＴ上昇型心筋梗塞、非ＳＴ上昇型心筋梗塞および不安定狭心症を含む急性冠動脈症候群、カテーテル誘発性血栓症、心室壁血栓、左心房血栓または人工弁血栓の溶解、ならびに深静脈血栓症、肺塞栓または急性虚血性発作を治療するためのものである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
融合タンパク質を、発作発症の３時間後より後に急性虚血性発作を患っている患者に投与する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
請求項１〜１５のうちの一項に記載の融合タンパク質を含むキット。
【請求項２１】
請求項１〜１５のうちの一項に記載の融合タンパク質成分をコードするＤＮＡ配列を含む、キット。
【請求項２２】
配列番号１のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸配列からなる融合タンパク質をコードするＤＮＡを、治療有効量の遺伝子療法ベクターと組合せて含む、遺伝子療法組成物。
【請求項２３】
Ｐ−セレクチンと結合する標的タンパク質を含む血栓溶解融合タンパク質であって、該標的タンパク質が、ＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と作動可能に連結している、キメラマウス−ヒトモノクローナル抗体である、融合タンパク質。
【請求項２４】
前記キメラマウス−ヒトモノクローナル抗体がＨｕＳＺ５１である、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記融合タンパク質が配列番号１のアミノ酸配列および配列番号２のアミノ酸配列を含む、請求項２４に記載の融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、フィブリン選択的プラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と作動可能に連結している標的タンパク質を含む、血栓溶解剤として有用である新規融合タンパク質に関する。好ましい実施形態では、標的タンパク質は活性化血小板または活性化内皮細胞の表面と結合する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
動脈血栓症は、毎年何百万人もの人に影響を及ぼす命にかかわる病気であり、損傷を受けた血管内の、無制御の血液凝固および血小板凝集によって引き起こされる。血管中に形成された過剰なフィブリンおよび血小板血餅が、血流を遮断し、このことが主要組織または臓器に虚血性障害を引き起こす。動脈血栓症、例えば、心筋梗塞を治療するための承認された治療アプローチでは、プラスミノーゲンアクチベーターを、抗血小板薬および抗凝結剤と併用する。現在用いられているプラスミノーゲンアクチベーターとしては、組織型プラスミノーゲンアクチベーター（「ｔＰＡ」）、ウロキナーゼ（「ｕＰＡ」）およびストレプトキナーゼが挙げられる。閉塞性血栓という状況においてこれらの血栓溶解剤を投与することで、フィブリン分解速度が促進され、動脈の開通性および虚血組織への血流が修復される。冠動脈血栓溶解療法は、急性心筋梗塞の患者の死亡率を低下させた（非特許文献１、非特許文献２）、非特許文献３、非特許文献４および非特許文献５を参照のこと）。現在の血栓溶解療法の主要な制限としては、出血、最も顕著な頭蓋内出血、適当な心筋再潅流を達成することができないこと、および冠動脈再閉塞が挙げられる。しかし、現在の投与計画（例えば、先行ｔＰＡ）の導入以来、冠動脈血栓溶解の速度および程度をさらに改良するため、または出血の危険性を低下させるための前進はほとんどなされていない。そのようなものとして、より新しい薬剤が必要である。
【０００３】
血栓溶解特性が改善されたプラスミノーゲンアクチベーターが開発された。ＴＮＫ−ｔＰＡは、組換えＤＮＡ技術によって作製されたｔＰＡの変種である。ＴＮＫ−ｔＰＡは、プラスミノーゲンアクチベーター阻害薬−１（「ＰＡＩ−１」）による阻害に対してより耐性であり、循環においてより長い半減期を有し、単回ボーラス注射として投与できる（非特許文献６および非特許文献７）。レテプラーゼは、クリングル２とｔＰＡのプロテアーゼドメインのみからなる非グリコシル化タンパク質である。レテプラーゼは、ｔＰＡよりも長い血漿半減期を有するが、ｔＰＡよりもフィブリン特異的でない（非特許文献８）。現在、ＴＮＫ−ｔＰＡとレテプラーゼの双方とも、臨床使用に承認されている。
【０００４】
現在の血栓溶解療法の主要な制限の１つは、出血の危険性である（非特許文献９および非特許文献１０）。血栓溶解療法で治療された患者の約５〜１０％が出血エピソードを経験する。これらの出血エピソードのうち、１０％近くは、致命的であり得る頭蓋内出血であった（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４および非特許文献１５を参照のこと）。出血は、主に、外因性プラスミノーゲンアクチベーターによる、フィブリノゲンの非特異的切断と、老化した（古い）止血性フィブリン血餅の過剰なタンパク質分解とによるものである。出血に加え、血栓溶解剤にはその他の制限もある。急性心筋梗塞を患う患者の最大２５％が、現在の血栓溶解レジメンに対して耐性である。これらの患者では、虚血心への心筋再潅流がわずかでしかない。患者の別の３０〜４０％では、療法は９０分、すなわち、虚血組織における細胞死を最小にするために重要な時間窓内に部分再灌流しか達成しない（非特許文献１６および非特許文献１７）。さらに、患者の約３０％が血栓溶解療法後に急性冠動脈再閉塞を経験する。閉塞性血栓における血小板の継続的な活性化が血栓溶解療法の失敗の大きな原因になっていると考えられている（非特許文献１８、非特許文献１９、非特許文献２０、非特許文献２１および非特許文献２２）。インビトロおよびインビボでの研究の双方において、血小板が豊富な血餅が、フィブリンが豊富で、血小板に乏しい血餅よりも血栓溶解に対してより耐性であることがわかった（非特許文献２３および非特許文献２４）。
【０００５】
Ｐ−セレクチンは、休止期血小板のα顆粒内に主に保存される約１４０ｋＤａの糖タンパク質である。Ｐ−セレクチンは、血小板活性化の際に迅速に細胞表面に移動され、そこで損傷を受けた血管壁における血小板と白血球の相互作用を促進する。活性化血小板でのＰ−セレクチンの細胞表面発現は、数時間以上は続かない（非特許文献２５、非特許文献２６および非特許文献２７）。Ｐ−セレクチンは、血小板に加え、正常な内皮細胞のＷｅｉｂｅｌ−Ｐａｌａｄｅ小体中にも存在する。Ｐ−セレクチンは、ヒスタミンおよびトロンビンによる内皮細胞の活性化の際に細胞表面に迅速に再分配される。活性化血小板は、新しく形成された血栓内の主要な細胞成分であり、活性化内皮細胞は血管損傷部位付近に豊富である。対照的に、老化した（古い）止血血栓中の主要な成分はフィブリン分子である。
【０００６】
４種のｔＰＡ様タンパク質が吸血コウモリ、ナミチスイコウモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の唾液から導かれた：ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγ（非特許文献２８および非特許文献２９）。この中で、ＤＳＰＡα１は最長のタンパク質であり、ヒトｔＰＡと構造的に最も類似している。ＤＳＰＡα１は、フィブリノゲンとフィブリンの双方を切断するその他のプラスミノーゲンアクチベーターとは異なり、フィブリンに対して高度に特異的である（非特許文献３０）。ＤＳＰＡα１は、ｔＰＡよりも数百倍高いフィブリン特異性を有する（非特許文献３０、非特許文献３１、非特許文献３２および非特許文献３３を参照のこと。血栓溶解の動物モデルでは、ＤＳＰＡα１はｔＰＡよりもより強力である（非特許文献３４、非特許文献３５および非特許文献３６）。ＤＳＰＡα１（デスモテプラーゼ）は発作の治療にむけて臨床開発中である。
【０００７】
特許文献１には、４種のＤＳＰＡタンパク質が開示されており、ＤＳＰＡα１の、血栓溶解剤としての使用を特許請求している。特許文献２には、ＤＳＰＡα２の、血栓溶解剤としての使用が開示、特許請求されている。
【０００８】
ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα２は、構造上、４種の別個のドメイン：フィブロネクチン様フィンガー（「フィンガー」）ドメイン、上皮成長因子（「ＥＧＦ」）ドメイン、クリングルドメインおよびセリンプロテアーゼドメインからなり、ＤＳＰＡβは、３腫の別個のドメイン：ＥＧＦドメイン、クリングルドメインおよびセリンプロテアーゼドメインからなり、ＤＳＰＡγは、２種の別個のドメイン：クリングルドメインおよびセリンプロテアーゼドメインからなる（非特許文献２９）。
【０００９】
構造機能分析により、フィンガードメインはＤＳＰＡα１のフィブリン依存性および選択性に貢献していることが実証されている（非特許文献３０）。ＤＳＰＡα１の、ｔＰＡ比較して高いフィブリン特異性は、ＤＳＰＡα１が１つのクリングルドメインを有するのに対し、ｔＰＡは２つのクリングルドメインを有するという事実によるものと思われる（非特許文献３２）。その他の構造機能分析により、ｔＰＡのフィブリン特異性を高めるための、例えば、シモゲントリアデ（ｃｙｍｏｇｅｎｅ  ｔｒｉａｄｅ）中の天然ｔ−ＰＡアミノ酸配列の明確な修飾が示唆されている（特許文献３）。
【特許文献１】米国特許第６，００８，０１９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，８３０，８４９号明細書
【特許文献３】欧州特許公開公報第１３０８１６６号明細書
【非特許文献１】Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．ａｎｄ  Ｌｉｊｎｅｎ，Ｈ．Ｒ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９１），Ｖｏｌ．７８，ｐｐ．３１１４−３１２４
【非特許文献２】Ｔｏｐｏｌ，Ｅ．Ｊ．，Ｐｒｏｇ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｄｉｓ．（１９９１），Ｖｏｌ．３４，ｐｐ．１６５−１７８
【非特許文献３】Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇｓ（１９９５），Ｖｏｌ．５０，ｐｐ．２９−４２
【非特許文献４】Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅ，Ｍ．ａｎｄ  Ｚｏｌｄｈｅｌｙｉ，Ｐ．，Ｄｒｕｇｓ（１９９５），Ｖｏｌ．４９，ｐｐ．８５６−８８４
【非特許文献５】Ｈｕｂｅｒ，Ｋ．ａｎｄ  Ｍａｕｒｅｒ，Ｇ．，Ｓｅｍｉｎ．Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈｅｍｏｓｔ．（１９９６），Ｖｏｌ．２２，ｐｐ．１５−２６
【非特許文献６】Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９４），Ｖｏｌ．７２，ｐｐ．９８−１０４
【非特許文献７】Ｋｅｙｔ，Ｂ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４），Ｖｏｌ．９１  ，ｐｐ．３６７０−３６７４
【非特許文献８】Ｍａｒｔｉｎ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９１），Ｖｏｌ．６６，ｐｐ．５６９−５７４
【非特許文献９】Ｒａｏ，Ａ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（１９８８），Ｖｏｌ．１１，ｐｐ．１−１１
【非特許文献１０】Ａｒｎｏｌｄ，Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（１９８９），Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．５８１−５８８
【非特許文献１１】Ｃｈｅｓｅｂｒｏ，Ｊ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｉｏｌ．Ｃｌｉｎ．（１９８８），Ｖｏｌ．６，ｐｐ．１１９−１３７
【非特許文献１２】Ｔｏｐｏｌ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（１９８７ａ），Ｖｏｌ．９，ｐｐ．１２０５−１２１３
【非特許文献１３】Ｔｏｐｏｌ，Ｅ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｏｌｌ．Ｃａｒｄｉｏｌ．（１９８７ｂ），Ｖｏｌ．９，ｐｐ．１２１４−１２１８
【非特許文献１４】ＰＲＩＭＩ  Ｔｒｉａｌ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌａｎｃｅｔ（１９８９），Ｖｏｌ．１，ｐｐ．８６３−８６８
【非特許文献１５】ＩＳＩＳ  Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐ，Ｌａｎｃｅｔ（１９９２），Ｖｏｌ．３３９，ｐｐ．７５３−７７０
【非特許文献１６】ＧＵＳＴＯ  Ａｎｇｉｏｇｒａｐｈｉｃ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９３），Ｖｏｌ．３２９，ｐｐ．１６１５−１６２２
【非特許文献１７】Ｂａｒｂａｇｅｌａｔａ，Ｎ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｈｅａｒｔ  Ｊ．（１９９７），Ｖｏｌ．１３３，ｐｐ．２７３−２８２
【非特許文献１８】Ｆａｙ，Ｗ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９４），Ｖｏｌ．８３，ｐｐ．３５１−３５６
【非特許文献１９】Ｓｔｒｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｅｒｉｏｓｃｌｅｒ．Ｔｈｒｏｍｂ．（１９９４），Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．１４５２−１４５８
【非特許文献２０】Ｔｏｒｒ−Ｂｒｏｗｎ，Ｓ．Ｒ．ａｎｄ  Ｓｏｂｅｌ，Ｂ．Ｅ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．（１９９３），Ｖｏｌ．７２，ｐｐ．４１３−４２１
【非特許文献２１】Ｊａｎｇ，Ｉ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９８９），Ｖｏｌ．７９，ｐｐ．９２０−９２８
【非特許文献２２】Ｋｕｎｉｔａｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９２），Ｖｏｌ．７９，ｐｐ．１４２０−１４２７
【非特許文献２３】Ｂｏｄｅ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９１），Ｖｏｌ．８４，ｐｐ．８０５−８１３
【非特許文献２４】Ｃｏｌｌｅｒ，Ｂ．Ｓ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．（１９９０），Ｖｏｌ．３２２，ｐｐ．３３−４２
【非特許文献２５】ＭｃＥｖｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９１），Ｖｏｌ．６５，ｐｐ．２２３−２２８
【非特許文献２６】ＭｃＥｖｅｒ，Ｒ．Ｐ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９４），Ｖｏｌ．６，ｐｐ．７５−８４
【非特許文献２７】Ｌａｓｋｙ，Ｌ．Ａ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２），Ｖｏｌ．２５８，ｐｐ．９６４−９６９
【非特許文献２８】Ｇａｒｄｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９），Ｖｏｌ．２６４，ｐｐ．１７９４７−１７９５２
【非特許文献２９】Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９１），Ｖｏｌ．１０５，ｐｐ．２２９−２３７
【非特許文献３０】Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５），Ｖｏｌ．２７０，ｐｐ．２５５９６−２５６０３
【非特許文献３１】Ｔｏｓｃｈｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８），Ｖｏｌ．２５２，ｐｐ．１０８−１１２
【非特許文献３２】Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８），Ｖｏｌ．２７３，ｐｐ．１８２９２−１８２９９
【非特許文献３３】Ｓｃｈｌｅｕｎｉｎｇ，Ｗ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９２），Ｖｏｌ．６６７，ｐｐ．３９５−４０３
【非特許文献３４】Ｇａｒｄｅｌｌ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９１），Ｖｏｌ．８４，ｐｐ．２４４−２５３
【非特許文献３５】Ｗｉｔｔ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ（１９９２），Ｖｏｌ．７９，ｐｐ．１２１３−１２１７
【非特許文献３６】Ｗｉｔｔ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ（１９９４），Ｖｏｌ．９０，ｐｐ．４２１−４２６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の要旨）
本発明は、プラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と作動可能に連結しており、血管損傷関連生物学的構造体と結合する標的タンパク質を含む、血栓溶解剤として作用する新規融合タンパク質を提供する。本発明の「血管損傷関連生物学的構造体」は、血管損傷を量または質の点から示すいずれかの生体分子または生物学的構造体である。血管損傷関連生物学的構造体の例としては、血栓形成反応の間に活性化された（「刺激された」）（例えば、トロンビンの刺激によって）、血小板または内皮細胞の表面にある表面分子がある。これらの活性化細胞の表面は、通常、非活性化血小板または内皮細胞よりも相当に高い発現レベルのこれらの表面分子を示す。このような表面分子の特定の例として、Ｐ−セレクチン（ＣＤ６２ｐ）がある。活性化内皮細胞または活性化血小板は血管損傷部位付近で豊富であり、したがって、Ｐ−セレクチンは「血管損傷関連生物学的構造体」に相当する。
【００１１】
本発明の血管損傷関連生物学的構造体のその他の例としては、リソソーム膜タンパク質（ＣＤ６３）（Ｊｏｅｒｎ  Ａ．Ｚｅｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｓｈｏｗ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ」，Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈａｅｍｏｓｔ．，Ｖｏｌ．８１，ｐ．３７３−３７７，１９９９）またはＣＤ４０Ｌ（Ｐａｔｒｉｃｋ  Ａｎｄｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，「ＣＤ４０Ｌ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｔｈｒｏｍｂｉ  ｂｙ  ａ  ｂｅｔａ３  ｉｎｔｅｇｒｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．３，ｐ．２４７−２５２，Ｍａｒｃｈ  ２００２）または糖タンパク質１ｂα（Ｊａｎｅｔｔｅ  Ｂｕｒｇｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ：「Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｘｉｍｉｔｙ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  １ｂ  ａｌｐｈａ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ−ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  Ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｐｌａｓｍａ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ」，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ．２７５，Ｎｏ．１３，ｐ．９７５８−９７６６，２０００）またはタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（Ｚａｖｅｒｉｏ  Ｒｕｇｇｅｒｉ，「Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  ｉｎ  ａｔｈｅｒｏｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ」，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．１１  ，ｐ．１２２７−１２３４，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ  ２００２）がある。
【００１２】
プラスミノーゲンアクチベーターは、いずれの種類のプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体であってもよい。一実施形態では、天然ｔ−ＰＡと比較して高いフィブリン特異性を有するか、またはクリングル２ドメインの修飾／欠失を含むプラスミノーゲンアクチベーターを用いることが好ましい。吸血コウモリ、ナミチスイコウモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）から最初に導かれたプラスミノーゲンアクチベーターデスモテプラーゼ（ＤＳＰＡ）またはその一部を用いることが特に好ましい。ＤＳＰＡは、セリンプロテアーゼドメインと、フィンガードメイン、ＥＧＦドメインおよびクリングルドメインからなる群から選択される少なくとも１種の他のドメインまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体とを含むことが好ましい。
【００１３】
本発明の血栓溶解融合タンパク質は、血管損傷関連生物学的構造体、例えば、急性動脈血栓における活性化血小板の表面を標的とし、結合し、それによって、新しく形成された血管損傷部位（例えば、血小板が豊富な血栓）に、プラスミノーゲンアクチベーターの高い局所濃度を生じ、血栓溶解剤の全身用量の減少を可能にし、それによって、古いフィブリンが豊富な血餅に対する溶解作用を最小にし、より広い治療可能比を達成する。融合タンパク質は、動脈血栓症、急性冠動脈症候群、例えば、ＳＴ上昇型心筋梗塞、非ＳＴ上昇型心筋梗塞および不安定狭心症、カテーテル誘発性血栓症、心室壁血栓、左心房血栓または人工弁血栓の溶解ならびに深静脈血栓症、肺塞栓および急性虚血性発作の治療において有用である。
【００１４】
もう１つの態様では、本発明は主題血栓溶解融合タンパク質を含む薬剤組成物を提供する。
【００１５】
もう１つの態様では、本発明は、患者に治療有効量の血栓溶解融合タンパク質を投与する工程を包含する、前記患者において血栓溶解を誘導する方法を提供する。
【００１６】
もう１つの態様では、本発明は、患者に治療有効量の血栓溶解融合タンパク質を投与する工程を包含する、前記患者において動脈血栓症、急性冠動脈症候群、例えば、ＳＴ上昇型心筋梗塞、非ＳＴ上昇型心筋梗塞および不安定狭心症、カテーテル誘発性血栓症、心室壁血栓、左心房血栓または人工弁血栓の溶解ならびに深静脈血栓症、肺塞栓および急性虚血性発作を治療および予防する方法に関する。
【００１７】
もう１つの態様では、本発明は、発作発症後３時間を越える、好ましくは６時間を越える、さらには９時間を越える患者において急性虚血性発作を治療する方法に関する。
【００１８】
さらにもう１つの態様では、本発明は、フィブリン選択的プラスミノーゲンアクチベーターと作動可能に連結している、活性化血小板の表面と結合する標的タンパク質を含むキットに関する。あるいは、本キットは、血栓溶解融合タンパク質の成分をコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００１９】
また、本発明の血栓溶解融合タンパク質を作製する組換え法および合成法の双方も開示される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
（発明の詳細な説明）
本発明の血栓溶解融合タンパク質は、プラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と作動可能に連結している血管損傷関連生物学的構造体と結合する標的タンパク質を含む。
【００２１】
（定義）
本発明の説明では、以下の用語を、以下に示されるように定義する。
【００２２】
「血管損傷関連生物学的構造体」とは、血管損傷を、その質または量のいずれかによって示す任意の生物学的構造体を意味する。
【００２３】
この損傷はかなり新鮮である、すなわち、数時間よりも古くないことが好ましい。これに関連して「構造体」とは、標的タンパク質の結合パートナーを形成し得るいずれかの分子を意味する。したがって、血管損傷関連生物学的構造体は、標的タンパク質の「標的分子」である。血管損傷関連生物学的構造体の一例として、血栓形成反応の際に活性化内皮細胞または活性化血小板の表面に移動されるＰ−セレクチンがある。活性化血小板または活性化内皮細胞は血管損傷の周辺に豊富であるため、Ｐ−セレクチンは血管損傷関連生物学的構造体である。
【００２４】
「組換えタンパク質またはポリペプチド」とは、組換えＤＮＡ技術によって作製された、すなわち、所望のタンパク質またはポリペプチドをコードする外因性組換えＤＮＡ発現構築物によって形質転換された、細胞、微生物または哺乳類から生じた、タンパク質またはポリペプチドを指す。ほとんどの細菌培養物において発現されたタンパク質またはポリペプチドは、グリカンを含まない。酵母において発現されたタンパク質またはポリペプチドは、哺乳類細胞において発現されたものとは異なるグリコシル化パターンを有し得る。用いた発現系に応じて、組換え体のグリコシル化および／またはＮ末端プロセシングは、天然タンパク質またはポリペプチドと比較して異なり得る。
【００２５】
「天然」または「天然に存在する」タンパク質またはポリペプチドとは、自然界に生じる供給源から回収されたタンパク質またはポリペプチドを指す。用語「天然ＤＳＰＡ」は、天然に存在するＤＳＰＡおよびその断片を含み、ＤＳＰＡおよびその断片の翻訳後修飾、例えば、それだけには限らないが、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、アシル化および切断を含む。
【００２６】
「融合タンパク質」は、少なくとも２つの作動可能に連結している異種コード配列の発現に起因するタンパク質である。本発明の融合タンパク質は、プラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と作動可能に連結している血管損傷関連生物学的構造体と結合する標的タンパク質を含む。
【００２７】
「標的タンパク質」とは、別のタンパク質（ポリペプチド）またはタンパク質複合体と、あるいはいずれかの他の標的分子と結合する、タンパク質またはペプチドまたはそのいずれかの類似体、断片、誘導体もしくは変異体である。本発明の標的タンパク質は、活性化血小板の表面にあるＰ−セレクチンと結合するタンパク質であることが好ましい。例えば、抗Ｐ−セレクチン抗体は、本発明の標的タンパク質である。
【００２８】
ＤＮＡまたはポリヌクレオチド「コード配列」とは、適当な制御配列の制御下に置かれると、宿主細胞において、ｍＲＮＡに転写され、ポリペプチドに翻訳される、ＤＮＡまたはポリヌクレオチド配列である。コード配列の境界は、５’Ｎ末端の開始コドンおよび３’Ｃ末端の翻訳停止コドンによって決定される。コード配列は、原核生物の配列、真核細胞ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、真核細胞ＤＮＡ由来のゲノムＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列を含み得る。転写終結配列は、通常、コード配列の３’に位置する。
【００２９】
「ＤＮＡまたはポリヌクレオチド配列」とは、デオキシリボヌクレオチド（塩基アデニン、グアニン、チミン、シトシン）のヘテロポリマーである。本発明の融合タンパク質をコードする、ＤＮＡまたはポリヌクレオチド配列は、組換えＤＮＡ発現ベクターにおいて発現され得る合成遺伝子を提供するよう、合成ｃＤＮＡ由来ＤＮＡ断片および短いオリゴヌクレオチドリンカーから構築することができる。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を論じる際には、本明細書では配列は、ｃＤＮＡの非転写鎖に沿って５’から３’方向の配列のみを示すという通常の慣例に従って記載され得る。
【００３０】
「組換え発現ベクターまたはプラスミド」とは、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを増幅するか、または発現するために用いられる、複製可能なＤＮＡベクターまたはプラスミド構築物である。発現ベクターまたはプラスミドは、ＤＮＡ制御配列およびコード配列を含む。ＤＮＡ制御配列としては、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメインおよびエンハンサーが挙げられる。本明細書において定義される組換え発現系は、調節エレメントの誘導の際に融合タンパク質を発現する。
【００３１】
「形質転換宿主細胞」とは、外来ＤＮＡで形質転換およびトランスフェクトされた細胞を指す。外来ＤＮＡは、細胞のゲノムを構成する染色体ＤＮＡに組み込まれていても、組み込まれていなくてもよい（すなわち、共有結合していても、していなくてもよい）。原核生物および酵母では、例えば、外来ＤＮＡは、エピソームエレメント、例えば、プラスミドで維持されていてもよいし、または染色体ＤＮＡに安定に組み込まれていてもよい。真核細胞に関しては、安定に形質転換された細胞とは、外来ＤＮＡが染色体複製に組み込まれるようになったものである。この安定性は、真核細胞株またはクローンの、外来ＤＮＡを含む娘細胞集団を生成する能力によって実証される。
【００３２】
「プラスミノーゲンアクチベーター」とは、不活性プラスミノーゲンを活性プラスミンに変換する、任意のタンパク質またはポリペプチド、またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体を指す。プラスミノーゲンアクチベーターの例として、ＤＳＰＡ（デスモテプラーゼ）、ｔ−ＰＡまたはウロキナーゼ（それらのいずれかの部分または修飾を含む）がある。ｔ−ＰＡ、ＤＳＰＡまたはウロキナーゼのいずれかに基づく、すべての修飾されたプラスミノーゲンアクチベーターは、それぞれ、「ｔ−ＰＡ由来プラスミノーゲンアクチベーター」、「ＤＳＰＡ由来プラスミノーゲンアクチベーター」または「ウロキナーゼ由来プラスミノーゲンアクチベーター」のいずれかとして集約される。これらの「派生」プラスミノーゲンアクチベーターは、それぞれ、ｔ−ＰＡ、ＤＳＰＡおよびウロキナーゼの天然型と本質的に対応するが、それらはタンパク質ドメインもしくはその一部に関するいくらかの欠失ならびにアミノ酸欠失または置換を保持し得る。
【００３３】
「ＤＳＰＡ」とは、吸血コウモリ、ナミチスイコウモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）に由来するプラスミノーゲンアクチベーターを指し、これは単離（および精製）されたものであっても、組換えもしくは合成によって作製されたものであってもよい。ＤＳＰＡは、成熟、分泌（プロセシング）型のＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγならびにその類似体、断片、誘導体および変異体、ならびに類似体、誘導体および変異体の断片を含む。天然ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγをコードする遺伝子は、吸血コウモリ、ナミチスイコウモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）から単離および配列決定されている（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），前掲および米国特許第６，００８，０９１号および同５，８３０，８４９号、なお、そのすべては参照により本明細書に組み込まれる）。ＤＳＰＡの４種の型はすべて、３６アミノ酸のシグナル配列を含み、これが切断除去されて成熟、分泌型ＤＳＰＡが形成される。組換え生成の際に、用いる発現系に応じて、ＤＳＰＡのＮ末端配列は、リーダー配列の不正確なプロセシングによって異なり得る。しかし、生物学的機能は影響されないままである。
【００３４】
「ＤＳＰＡドメインまたはドメイン類」とは、ＤＳＰＡの特定の機能または特徴、例えば、特徴的な三次構造ユニットと関連し得る別個のアミノ酸配列を指す。ＤＳＰＡドメインとしては、フィンガードメイン、ＥＧＦドメイン、クリングルドメインおよびセリンプロテアーゼドメインが挙げられる（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），前掲）。
【００３５】
成熟ＤＳＰＡα１は、４つの別個のドメイン：フィンガードメイン（アミノ酸６〜４３）、ＥＧＦドメイン（アミノ酸４３〜９２）、クリングルドメイン（アミノ酸９２〜１７４）およびセリンプロテアーゼドメイン（アミノ酸１７４〜４４１）で構成される、４４１アミノ酸のポリペプチドである（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），前掲）。
【００３６】
成熟ＤＳＰＡαα２は、４つの別個のドメイン：フィンガードメイン（アミノ酸６〜４３）、ＥＧＦドメイン（アミノ酸４３〜９２）、クリングルドメイン（アミノ酸９２〜１７４）およびセリンプロテアーゼドメイン（アミノ酸１７４〜４４１）で構成される、４４１アミノ酸のポリペプチドである（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），前掲）。
【００３７】
成熟ＤＳＰＡβは、３つの別個のドメイン：ＥＧＦドメイン（アミノ酸５〜４６）、クリングルドメイン（アミノ酸４６〜１２７）およびセリンプロテアーゼドメイン（アミノ酸１２７〜３９５）で構成される、３９５アミノ酸のポリペプチドである（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），前掲）。
【００３８】
成熟ＤＳＰＡγは、２つの別個のドメイン：クリングルドメイン（アミノ酸９〜９０）およびセリンプロテアーゼドメイン（アミノ酸９０〜３５８）で構成される、３５８アミノ酸のポリペプチドである（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），前掲）。
【００３９】
本発明の融合タンパク質および標的タンパク質、プラスミノーゲンアクチベーターまたはドメインに関して、用語「類似体」、「断片」、「誘導体」および「変異体」とは、以下にさらに記載される、実質的に同一の生物学的機能または活性を保持する、融合タンパク質、標的タンパク質、プラスミノーゲンアクチベーターまたはドメインの、類似体、断片、誘導体および変異体を意味する。
【００４０】
「類似体」とは、その中に本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列を含むプロポリペプチドを含む。本発明の活性融合タンパク質は、天然のインビボでのプロセスによって、または当技術分野で公知の手順、例えば、酵素的切断もしくは化学的切断によってプロ融合タンパク質分子を完成する付加的アミノ酸から切断され得る。例えば、天然ＤＳＰＡα１は、４７７アミノ酸のプロポリペプチドとして天然では発現され、次いで、これがインビボでプロセシングされて４４１アミノ酸の活性成熟ポリペプチドが放出される。
【００４１】
「断片」とは、以下にさらに記載される本明細書に開示されるインビトロアッセイにおいて示されるように、融合タンパク質、標的タンパク質またはドメイン（類）と実質的に同様に機能活性を保持する、融合タンパク質、標的タンパク質またはドメイン（類）の一部である。
【００４２】
「誘導体」は、本明細書に開示される機能を実質的に保存する融合タンパク質への任意の修飾を含み、さらなる構造および付随する機能を含み、例えば、以下にさらに記載される、より長い半減期を有するＰＥＧ化融合タンパク質、硫酸コンドロイチンの付加によって修飾されたＯ−グリコシル化融合タンパク質およびビオチン化融合タンパク質がある。
【００４３】
「実質的に同様の機能活性」および「実質的に同一の生物学的機能または活性」とは、各々、生物学的活性の程度が、各ポリペプチドの生物学的活性が同一の手順またはアッセイによって調べられる場合に、比較されているポリペプチドによって実証される生物学的活性の約３０％〜１００％以上の範囲内であることを意味する。例えば、ＤＳＰＡα１と実質的に同様の機能活性を有する融合タンパク質またはＤＳＰＡドメインとは、それぞれ、実施例５および６において記載される、触媒アッセイまたは線維素溶解アッセイにおいて試験した場合に、インビトロで発色基質を加水分解するか、または血栓を溶解する能力を実証するものである。抗Ｐ−セレクチン抗体ＳＺ５１と、実質的に同様の機能活性を有する標的タンパク質とは、実施例２、３および４において記載される結合アッセイにおいて試験した場合に、Ｐ−セレクチンと、または活性化血小板と結合するか、インビトロでＰ−セレクチン結合についてＳＺ５１と競合する能力を実証するものである。
【００４４】
２つのポリペプチド間の「類似性」は、一方のポリペプチドのアミノ酸配列およびその保存的アミノ酸置換を、第２のポリペプチドの配列と比較することによって求める。このような保存的置換としては、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．，ｅｄ．，Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ５，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９７８）およびＡｒｇｏｓ，Ｐ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８９），Ｖｏｌ．８，ｐｐ．７７９−７８５に記載されるものが挙げられる。例えば、以下の群のうち１つに属するアミノ酸は保存的変更に相当する：
−Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ：
−Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｈｒ；
−Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｐｈｅ；
−Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ；
−Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｈｉｓおよび
−Ａｓｐ、Ｇｌｕ。
【００４５】
「哺乳類」としては、ヒトおよび家畜、例えば、ネコ、イヌ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ウサギなどが挙げられる。
【００４６】
本明細書において「治療可能比」または「治療係数」とは、哺乳類において特定の望まれていない、副作用、例えば、出血時間または疾患の代理マーカーの発現を引き起こすのに必要とされる融合タンパク質の量によって除した、同哺乳類における疾患の治療において特定の効力、例えば、再灌流までの時間、再灌流期間または血栓症の予防を生じるのに必要とされる本発明の融合タンパク質の量を意味する。本発明の融合タンパク質の治療可能比または指数は、少なくとも２であるが、少なくとも５が好ましく、１０〜２０の間がより好ましい。本発明の融合タンパク質の治療可能比または指数は、そのより高い溶解効率、そのより低い出血危険性またはその両方によって高まり得る。
【００４７】
「治療有効量」とは、本発明の融合タンパク質を必要とするヒトに投与した場合に、動脈血栓症、急性冠動脈症候群、例えば、ＳＴ上昇型心筋梗塞、非ＳＴ上昇型心筋梗塞および不安定狭心症、カテーテル誘発性血栓症、心室壁血栓、左心房血栓または人工弁血栓の溶解ならびに深静脈血栓症、肺塞栓および急性虚血性発作の、以下に定義される治療を達成するのに十分である本発明の融合タンパク質の量を指す。「治療有効量」を構成する本発明の融合タンパク質の量は、融合タンパク質、治療されるヒトの状態およびその重篤度ならびに年齢に応じて変わるが、当業者ならば、自身の知識および本開示内容を考慮して慣例的に決定することができる。
【００４８】
本明細書において「治療すること」または「治療」とは、哺乳類、好ましくは、ヒトにおける、損傷を受けた血管内の、無制御の血液凝固および血小板凝集を特徴とし、過剰なフィブリンおよび血小板血餅が血管に生じ、血流を遮断し、このことが主要組織または臓器に虚血性障害を引き起こす疾患状態の治療に及び、これとしては以下が挙げられる：
（ｉ）ヒトにおいて、詳しくは、症状にかかりやすいヒトがまだ症状を有していると診断されていない場合に、症状が生じるのを防ぐこと、
（ｉｉ）症状を阻害すること、すなわち、その進行を停止させること、または
（ｉｉｉ）症状を軽減すること、すなわち、症状の退行を引き起こすこと。
【００４９】
本明細書に用いられるすべてのその他の技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって広く用いられるものと同一の意味を有する。
【００５０】
（標的タンパク質）
本発明の標的タンパク質は、かなり新鮮な血管損傷に典型的または特異的であると定義される、特定の標的分子と特異的に結合する能力を有するタンパク質またはポリペプチド（またはその一部）である（上記参照のこと）。本発明の標的タンパク質の例としては、Ｐ−セレクチンがある。次いで、標的タンパク質は、融合タンパク質を血管損傷部位、詳しくは、標的構造、例えば、標的分子を有する細胞または組織に向かわせるのに役立つ。
【００５１】
本発明の一実施形態では、標的タンパク質は、Ｐ−セレクチンと結合できる抗体である。本明細書において「抗体」とは、Ｐ−セレクチンのエピトープと結合できる、無傷の免疫グロブリン（「Ｉｇ」）分子、ならびにその断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖを含む。通常、エピトープを形成するには、少なくとも６個、９個、１０個または１２個の連続するアミノ酸が必要である。しかし、非連続アミノ酸を含むエピトープは、より多くを、例えば、少なくとも１５個、２５個または５０個のアミノ酸を必要とし得る。
【００５２】
通常、Ｐ−セレクチンと特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイにおいて用いた場合に、その他のタンパク質を用いて提供される検出シグナルよりも少なくとも５、１０または２０倍高い検出シグナルを提供する。Ｐ−セレクチンと特異的に結合する抗体は、免疫化学アッセイにおいてその他のタンパク質を検出せず、Ｐ−セレクチンを溶液から免疫沈降させ得ることが好ましい。
【００５３】
Ｐ−セレクチンを用いて哺乳類、例えば、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、サルまたはヒトを免疫化し、ポリクローナル抗体を作製することができる。必要に応じて、Ｐ−セレクチンを担体タンパク質、例えば、ウシ血清アルブミン、チログロブリンおよびキーホールリンペットヘモシアニンと結合させることができる。宿主種に応じて、種々のアジュバントを用いて免疫反応を増大させることができる。このようなアジュバントとしては、それだけには限らないが、フロイントのアジュバント、無機ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）および表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルション、キーホールリンペットヘモシアニンおよびジニトロフェノール）が挙げられる。ヒトにおいて用いられるアジュバントの中では、ＢＣＧ（バチルス・カルメット−ゲラン（ｂａｃｉｌｌｉ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびコルネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｎｙｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）が特に有用である。
【００５４】
Ｐ−セレクチンと特異的に結合するモノクローナル抗体は、培養連続細胞株による抗体分子の生成をもたらすいずれかの技術を用いて調製できる。これらの技術としては、それだけには限らないが、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５），Ｖｏｌ．２５６，ｐｐ．４９５−４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ（１９８３），Ｖｏｌ．４，ｐｐ．７２−７９）およびＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ，Ｓ．Ｐ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．７７−９６（ｅｄｓ．，Ｒｅｉｓｆｅｌｄ，Ｒ．Ａ．ａｎｄ  Ｓｅｌｌ，Ｓ．，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８５）が挙げられる。
【００５５】
さらに、「キメラ抗体」の作製のために開発された技術、適当な抗原特異性と生物活性を有する分子を得るための、マウス抗体遺伝子のヒト抗体遺伝子へのスプライシングも使用できる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４），Ｖｏｌ．８１，ｐｐ．６８５１−６８５５、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  （１９８４），Ｖｏｌ．３１２，ｐｐ．６０４−６０８およびＴａｋｅｄａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５），Ｖｏｌ．３１４，ｐｐ．４５２−４５４参照のこと）。モノクローナルおよびその他の抗体も「ヒト化」し、患者が、抗体が治療として用いられる場合にそれに対して免疫応答を開始するのを防ぐことができる。このような抗体は、融合タンパク質において直接用いられるのに十分に、配列がヒト抗体と類似したものであり得るか、またはいくつかの重要な残基の変更を必要とする場合もある。げっ歯類とヒト抗体間のアミノ酸配列の相違は、個々の残基の位置指定変異誘発によって、または全相補性決定領域のグラフティングによって、げっ歯類配列を、それらのヒト対応物で置換することによって最小にすることができる。あるいは、ヒト化抗体を、ＧＢ２１８８６３８Ｂに記載される組換え法を用いて作製できる。Ｐ−セレクチンと特異的に結合する抗体は、米国特許第５，５６５，３３２号に開示される、部分的または完全にヒト化された抗原結合部位を含み得る。
【００５６】
Ｐ−セレクチン特異的抗体を開示する目的で、この特許は参照により完全に組み込まれる。
【００５７】
あるいは、単鎖抗体の作製のために記載された技術を、当技術分野で公知の方法を用いて適合させ、Ｐ−セレクチンと特異的に結合する単鎖抗体を作製することができる。ランダムコンビナトリアルＩｇライブラリーからの鎖シャッフリングによって、関連する特異性を有するが別個のイディオタイプ組成の抗体を作製することもがきる（Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９１），Ｖｏｌ．８８，ｐｐ．１１１２０−１１１２３）。
【００５８】
単鎖抗体はまた、ＤＮＡ増幅法、例えば、ＰＣＲを用い、鋳型としてハイブリドーマｃＤＮＡを用いて構築することができる（Ｔｈｉｒｉｏｎ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｅｖ．（１９９６），Ｖｏｌ．５，ｐｐ．５０７−５１１）。単鎖抗体は単一特異性であっても二重特異性であってもよく、二価であっても四価であってもよい。四価、二重特異的単鎖抗体の構築は、例えば、Ｃｏｌｏｍａ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９１），Ｖｏｌ．１５，ｐｐ．１５９−１６３に教示されている。二価、二重特異的単鎖抗体の構築は、Ｍａｌｌｅｎｄｅｒ，Ｗ．Ｄ．ａｎｄ  Ｖｏｓｓ，Ｅ．Ｗ．Ｊｒ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４），Ｖｏｌ．２６９，ｐｐ．１９９−２０６に教示されている。
【００５９】
単鎖抗体をコードするクレオチド配列は、手動または自動化ヌクレオチド合成を用いて構築し、標準組換えＤＮＡ法を用いて発現構築物に組み込み、細胞に導入してコード配列を発現させることができる。あるいは、単鎖抗体は、例えば、繊維状ファージディスプレイ技術を用いて直接作製できる（Ｖｅｒｈａａｒ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ（１９９５），Ｖｏｌ．６１  ，ｐｐ．４９７−５０１およびＮｉｃｈｏｌｌｓ，Ｐ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９３），Ｖｏｌ．１６５，ｐｐ．８１−９１）。
【００６０】
Ｐ−セレクチンと特異的に結合する抗体は、文献に開示されるように、リンパ球集団におけるインビボでの産生を誘導することによって、またはＩｇライブラリーもしくは高度に特異的な結合試薬のパネルをスクリーニングすることによっても作製できる（Ｏｒｌａｎｄｉ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９），Ｖｏｌ．８６，ｐｐ．３８３３−３８３７およびＷｉｎｔｅｒ，Ｇ．ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１），Ｖｏｌ．３４９，ｐｐ．２９３−２９９）。
【００６１】
Ｐ−セレクチンに対する特異的結合部位を含む抗体断片は、組換えＤＮＡ技術によって作製でき、例えば、Ｆａｂ断片は、Ｆ（ａｂ‘）２断片のジスルフィド橋を還元することによって作製できる。あるいは、Ｆａｂ発現ライブラリーを構築し、所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速かつ容易な同定を可能にすることができる（Ｈｕｓｅ，Ｗ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９），Ｖｏｌ．２４６，ｐｐ．１２７５−１２８１）。
【００６２】
本発明の標的タンパク質（すなわち、抗体）は、当技術分野で周知の方法によって発現させ、精製することができる。例えば、抗体を、Ｐ−セレクチンが結合しているカラム中に通すことによってアフィニティー精製することができる。次いで、高塩濃度のバッファーを用いて、結合された抗体をカラムから溶出できる。
【００６３】
本発明の好ましい一実施形態では、標的タンパク質は、Ｊｉａｎｇｓｕ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙで開発された、マウス抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体、ＳＺ５１から導いた、キメラマウス−ヒト抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体、ＨｕＳＺ５１である。ＳＺ５１は、血小板結合およびウエスタンブロットにおいて、トロンビンによって活性化されているが、休止中の血小板の表面に存在するヒトＰ−セレクチンを特異的に認識する。トロンビン活性化ヒト血小板あたり約１１，０００の結合部位があり、抗体の親和性は約４ｎＭである（Ｗｕ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｏｕｖ．Ｒｅｖ．Ｆｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．（１９９０），Ｖｏｌ．３２，ｐｐ．２３１−２３５）。ＳＺ５１は、実験動物モデルおよびヒト患者における放射標識イメージング研究において動脈および静脈血栓を検出し、インビボにおけるその特異性を実証する（Ｗｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９９３），Ｖｏｌ．１４，ｐｐ．１０８８−１０９２）。
【００６４】
ＨｕＳＺ５１は、ＳＺ５１のＶＬおよびＶＨ領域をコードするｃＤＮＡを、ヒトＩｇκ軽鎖およびＩｇＧγ１重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡの５’にそれぞれ含む、２つの発現プラスミドを構築することによって作製した（Ｇｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．（１９９７），Ｖｏｌ．７７，ｐｐ．７５５−７５９）。ＨｕＳＺ５１は、血小板結合および免疫ブロッティング実験では、トロンビン活性化血小板の表面にあるヒトＰ−セレクチンを特異的に認識する（Ｇｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７），前掲）。
【００６５】
「抗Ｐ−セレクチン」とは、Ｐ−セレクチンと結合するモノクローナル抗体を指す。抗体は、Ｐ−セレクチンの生物活性、例えば、それだけには限らないが、Ｐ−セレクチン−糖タンパク質−リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）と結合する能力、糖タンパク質Ｉｂ−ＩＸ−Ｖ複合体と結合する能力または白血球の接着を媒介する能力を干渉する場合も干渉しない場合もある。
【００６６】
本明細書において、用語「特異的に結合する」とは、相互作用がポリペプチド上の特定の構造（すなわち、抗原決定基またはエピトープ）の存在に応じて変わる、言い換えれば、抗体がタンパク質一般とではなく特定のポリペプチド構造を認識し、結合している、抗体と標的ポリペプチドとの相互作用を指す。
【００６７】
（プラスミノーゲンアクチベーター）
プラスミノーゲンアクチベーターは、不活性プラスミノーゲンを活性プラスミンに変換する。本発明のすべてのプラスミノーゲンアクチベーターはプラスミノーゲンを活性化するが、プラスミノーゲンアクチベーターの例は、その構造組成および生物学的特性、ひいては薬理学的特性においては異なり得る。天然ｔ−ＰＡと本質的に同一の構造特性（詳しくは、ドメイン／アミノ酸配列）を有するすべてのプラスミノーゲンアクチベーターに、用語「ｔ−ＰＡ由来」プラスミノーゲンアクチベーターを用いる。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態では、プラスミノーゲンアクチベーターを、高いフィブリン特異性を特徴とする融合タンパク質の一部として用いる。これらのプラスミノーゲンアクチベーターの、プラスミンを活性化する能力は、フィブリンの存在で、天然ｔ−ＰＡと比較して６５０倍を超えて増強される。プラスミノーゲンアクチベーターを、詳しくは、ｔ−ＰＡ由来プラスミノーゲンアクチベーターをよりフィブリン特異性にするアミノ酸配列の修飾が、ＥＰ１３０８１６６Ａ１に開示されており、その開示内容は参照により完全に組み込まれる。
【００６９】
ｔ−ＰＡのフィブリン特異性を増強する好ましい変異としては、以下のｔ−ＰＡ変異が挙げられる：ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ、Ｆ３０５Ｈ、ｔ−ＰＡ／Ｒ２７５Ｅ、Ｆ３０５Ｈ、Ａ２９２Ｓ。さらに、Ａｓｐ１９４の、または相同体位置のアスパラギン酸の点変異を保持するｔ−ＰＡ変異体を用いて、フィブリンの不在下でプラスミノーゲン活性化因子の触媒的に活性なコンホメーションの安定性の低下をもたらすことができた。したがって、Ａｓｐ１９４はグルタミン酸またはアスパラギンで置換できる。その他の実施例では、プラスミノーゲンアクチベーターは、その自己融解ループ中に少なくとも１つの変異を含み、これがフィブリンの不在下でプラスミノーゲンとプラスミノーゲン活性化因子間の機能的相互作用を減少させる。自己融解ループの関連変異は、例えば、野生型ｔ−ＰＡのアミノ酸位置４２０〜４２３または相同位置にあり、これは以下のように置換できる：Ｌ４２０Ａ、Ｌ４２０Ｅ、Ｓ４２１Ｇ、Ｓ４２１Ｅ、Ｐ４２２Ａ、Ｐ４２２Ｇ、Ｐ４２２Ｅ、Ｆ４２３ＡおよびＦ４２３Ｅ。
【００７０】
さらにもう１つの実施形態では、これらのｔ−ＰＡ変異体を、プラスミンによる切断／触媒を防ぐよう修飾することができる。これらの変異（例えば、グルタミン酸置換）は、天然ｔ−ＰＡのアミノ酸位置１５または２７５に、またはそれらに相同な位置にあり得る。
【００７１】
さらに、天然ｔ−ＰＡと比較してクリングル２ドメインにおいて修飾されているｔ−ＰＡ由来のプラスミノーゲンアクチベーターを本発明に適用することができる。これらの修飾は、クリングル２またはその一部のアミノ酸置換（類）または完全欠失さえも含む。これらの修飾されたｔ−ＰＡ変異体のリジン結合部位は、プラスミノーゲンアクチベーターのリジン結合能が低下するよう修飾されていることが好ましい。好ましい修飾ｔ−ＰＡ変異体は、ＷＯ２００５／０２６３４１に開示されており、これは本明細書に完全に組み込まれる。好ましいアミノ酸置換としてはＤ２３６Ｎがある。
【００７２】
本発明のプラスミノーゲンアクチベーターは、プラスミン活性化部位にＬＨＳＴアミノ酸配列を有し得る。さらに、残存するクリングル（クリングル２の完全欠失の場合には）とそれに続くシステイン橋の間を連結する配列はアミノ酸配列ＳＫＡＴであることが好ましい。
【００７３】
本発明の特に好ましいプラスミノーゲンアクチベーターのアミノ酸配列は、図１０〜１５（配列番号３〜配列番号８）に示されている。少なくとも７０％、好ましくは８０〜９０％の同一性、特に好ましくは９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するプラスミノーゲンアクチベーターを、本発明において同様に用いることができる。
【００７４】
（ＤＳＰＡ）
上記で概説したように、１種の特に好ましい本発明のプラスミノーゲンアクチベーターとしてＤＳＰＡがある。全長ＤＳＰＡは、フィンガードメイン、ＥＧＦドメイン、クリングルドメインおよびセリンプロテアーゼドメインを含む（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），前掲）。本発明の好ましい実施形態では、融合タンパク質のＤＳＰＡ部分は、少なくともセリンプロテアーゼドメインを、好ましくは、１以上のその他のＤＳＰＡドメインと組合せて含む。
【００７５】
吸血コウモリ、ナミチスイコウモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）由来のＤＳＰＡタンパク質をコードする全長ＤＮＡ配列は、遺伝子の調製を容易にし、ＤＳＰＡペプチドをコードするＤＮＡ配列、ＤＳＰＡおよびＤＳＰＡの断片またはペプチドを含む融合タンパク質を構築する出発点として用いられる。
【００７６】
ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγの全長遺伝子は、吸血コウモリ、ナミチスイコウモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）から単離され配列決定されている（Ｋｒａｔｚｓｃｈｍａｒ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１），前掲および米国特許第６，００８，０９１号および同５，８３０，８４９号、なおそのすべては参照により本明細書に組み込まれる）。全長ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγ  ｃＤＮＡは、いくつかの方法によって調製できる。これらの遺伝子に対して特異的なオリゴヌクレオチドプローブを、公開されたｃＤＮＡ配列を用いて合成できる。例えば、吸血コウモリ、ナミチスイコウモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）の唾液腺から調製されたメッセンジャーＲＮＡは、ｃＤＮＡの調製に適した出発物質を提供する。ｃＤＮＡライブラリーを作製し、オリゴヌクレオチドプローブを用いてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法は周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照のこと）。あるいは、ｃＤＮＡライブラリーから、特異的プライマーおよびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてＤＳＰＡの全長ｃＤＮＡを調製することもできる。ＰＣＲによってｃＤＮＡ配列を単離する方法は当業者には周知である。
【００７７】
（融合タンパク質）
本発明の血栓溶解融合タンパク質は、プラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、好ましくは、活性化血小板の表面と結合する標的タンパク質を含む。特定の実施形態では、プラスミノーゲンアクチベーターは、吸血コウモリ、ナミチスイコウモリ（Ｄｅｓｍｏｄｕｓ  ｒｏｔｕｎｄｕｓ）に由来し、セリンプロテアーゼドメインと、フィンガードメイン、ＥＧＦドメインおよびクリングルドメインからなる群から選択される少なくとも１つのその他のドメインまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体とを含む。  
【００７８】
特に好ましい一実施形態では、融合タンパク質は、ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβまたはＤＳＰＡγまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンと結合する抗体またはその断片を含む。
【００７９】
本発明の融合タンパク質としては、それだけには限らないが、単鎖抗体のＣ末端部分がプラスミノーゲンアクチベーター（例えば、ＤＳＰＡ）またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体のＮ末端部分と融合しているポリペプチド、ＩｇＧ抗体のＣ末端部分がプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体のＮ末端部分と融合しているポリペプチド、Ｆａｂ抗体のＣ末端部分がプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体のＮ末端部分と融合しているポリペプチド、単鎖抗体のＮ末端部分がプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体のＣ末端部分と融合しているポリペプチド、ＩｇＧ抗体のＮ末端部分がプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体のＣ末端部分と融合しているポリペプチド、Ｆａｂ抗体のＮ末端部分がプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体のＣ末端部分と融合しているポリペプチド、２以上の単鎖抗体がプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体のＮ末端およびＣ末端部分の双方と融合しているポリペプチド、２以上のＩｇＧ抗体がプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体のＮ末端およびＣ末端部分の双方と融合しているポリペプチド、２以上のＦａｂ抗体がプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体のＮ末端およびＣ末端部分の双方と融合しているポリペプチド、２以上のプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体が単鎖抗体のＮ末端およびＣ末端部分の双方と融合しているポリペプチド、２以上のプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体がＩｇＧ抗体のＮ末端およびＣ末端部分の双方と融合しているポリペプチド、２以上のプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体がＦａｂ抗体のＮ末端およびＣ末端部分の双方と融合しているポリペプチド、１または２以上のプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体が二量体単鎖抗体のＮ末端およびＣ末端部分の双方と融合しているポリペプチドが挙げられる。
【００８０】
本発明の血栓溶解融合タンパク質としては、実施例１の融合タンパク質（配列番号１および２）、ならびに配列においてそれからの実体のない変異を有する融合タンパク質が挙げられる。「実体のない変異」とは、本発明のポリペプチドの少なくとも１種の生物学的機能、好ましくは、フィブリン選択的プラスミノーゲン活性化活性を実質的に維持する、配列、置換または欠失変異体をいずれも含む。これらの機能的等価物は、配列番号１および２の融合タンパク質に対して少なくとも約９０％の同一性を有する融合タンパク質を含み得ることが好ましく、配列番号１および２の融合タンパク質に対して少なくとも９５％の同一性がより好ましく、配列番号１および２の融合タンパク質に対して少なくとも９７％の同一性がさらにより好ましく、また、同様の生物活性を実質的に有するこのような融合タンパク質の一部を含む。しかし、本明細書においてさらに記載されるように機能的等価性を実証する、アミノ酸配列において、配列番号１および２の融合タンパク質からの実体のない変異を有する融合タンパク質はいずれも、本発明の説明に含まれる。
【００８１】
（類似体、断片、誘導体および変異体）
本発明の融合タンパク質ならびに標的タンパク質またはプラスミノーゲンアクチベーターの類似体、断片、誘導体または変異体は、（ｉ）１個以上のアミノ酸が保存アミノ酸残基または非保存アミノ酸残基で置換されているもの（保存アミノ酸残基が好ましい）であって、そのような置換されたアミノ酸残基が、遺伝暗号によってコードされるものである場合もそうでない場合もあるもの、または（ｉｉ）１個以上のアミノ酸残基が置換基を含むものまたは（ｉｉｉ）成熟融合タンパク質が別の化合物、例えば、融合タンパク質の半減期を延長させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール）と融合しているもの、または（ｉｖ）さらなるアミノ酸、例えば、リーダーもしくは分泌配列もしくは成熟融合タンパク質の精製のために用いられる配列が成熟融合タンパク質と融合しているもの、または（ｖ）ポリペプチド配列が、作用期間を延長するために、より大きなポリペプチド、すなわち、ヒトアルブミン、抗体もしくはＦｃと融合しているものであり得る。このような類似体、断片、誘導体および変異体は、本明細書における教示から当業者の範囲内にあると考えられる。
【００８２】
本発明の誘導体は、１個以上の予測される、好ましい非必須アミノ酸残基でなされた保存的アミノ酸置換（以下にさらに定義される）を含むことが好ましい。「非必須」アミノ酸残基とは、生物活性を変更せずにタンパク質の野生型配列から変更できる残基であるのに対し、「必須」アミノ酸残基は生物活性に必要である。「保存的アミノ酸置換」とは、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当技術分野では定義されている。これらのファミリーとしては、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が挙げられる。非保存的置換とは、保存アミノ酸残基に対してまたは保存タンパク質ドメイン内に存在するアミノ酸残基に対してなされるものではない。断片または生物学的に活性な部分としては、医薬として、研究試薬としてなどの使用に適したポリペプチド断片が挙げられる。断片としては、本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列と十分に類似したアミノ酸配列または本発明の融合タンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含み、そのポリペプチドの少なくとも１種の活性を示すが、本明細書に開示される全長ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含むペプチドが挙げられる。通常、生物学的に活性な部分は、そのポリペプチドの少なくとも１種の活性を有するドメインまたはモチーフを含む。ポリペプチドの生物学的に活性な部分は、例えば、５個以上のアミノ酸長であるペプチドであり得る。このような生物学的に活性な部分は、合成によってまたは組換え技術によって調製でき、本明細書に開示される手段および／または当技術分野で周知の手段によって本発明のポリペプチドの１種以上の機能的活性について評価することができる。
【００８３】
さらに、本発明の好ましい誘導体としては、別の化合物、例えば、ポリペプチドの半減期を延長させる化合物および／またはポリペプチドのあり得る免疫原性を低下させる化合物（例えば、ポリエチレングリコール、「ＰＥＧ」）と融合している成熟融合タンパク質が挙げられる。ＰＥＧを用いて、融合タンパク質の水溶性、大きさ、遅速性の腎臓クリアランスおよび免疫原性の低下を付与することができる。米国特許第６，２１４，９６６号参照のこと。ＰＥＧ化の場合には、融合タンパク質のＰＥＧとの融合は、当業者に公知のいずれの手段によって達成してもよい。例えば、ＰＥＧ化は、融合タンパク質中にシステイン変異をまず導入し、続いて、ＰＥＧマレイミドを用いる部位特異的誘導体化によって達成できる。システインは、ペプチドのＣ末端に加えることができる。例えば、Ｔｓｕｔｓｕｍｉ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２０００），Ｖｏｌ．９７，ｐｐ．８５４８−８５５３参照のこと。融合タンパク質になすことができる別の修飾は、ビオチン化を含む。特定の例では、ビオチン化され、その結果、ストレプトアビジンと容易に反応できる融合タンパク質を有することは有用であり得る。タンパク質をビオチン化する方法は当技術分野では周知である。さらに、硫酸コンドロイチンを融合タンパク質と連結してもよい。
【００８４】
本発明の融合タンパク質、標的タンパク質およびプラスミノーゲンアクチベーターの変異体は、最初の融合タンパク質、標的タンパク質およびプラスミノーゲンアクチベーターのアミノ酸配列と十分に類似のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。用語「十分に類似の」とは、第１のアミノ酸配列が、十分なまたは最少の数の、第２のアミノ酸残基と比べて同一または同等のアミノ酸残基を含み、その結果、第１および第２のアミノ酸配列が共通の構造ドメインおよび／または共通の機能活性を有することを意味する。例えば、少なくとも約４５％、好ましくは、約７５％〜９８％同一である共通の構造ドメインを含むアミノ酸配列が、本明細書において十分に類似していると定義される。変異体は、本発明の好ましい融合タンパク質のアミノ酸配列と十分に類似していることが好ましい。変異体としては、ストリンジェントな条件下で本発明のポリヌクレオチドまたはその相補体とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされる融合タンパク質の変異体を含む。このような変異体は、通常、本発明の融合タンパク質の機能活性を保持する。ポリヌクレオチドの断片のライブラリーを用いて、スクリーニングおよびそれに続く選択のために変化に富んだ断片集団を作製することができる。例えば、分子あたり約１回のみニッキングが生じる条件下でポリヌクレオチドの二本鎖ＰＣＲ断片をヌクレアーゼで処理することと、二本鎖ＤＮＡを変性させることと、ＤＮＡを再生して異なるニックの入った産物に由来するセンス／アンチセンス対を含み得る二本鎖ＤＮＡを形成することと、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することによって再形成された二本鎖から一本鎖部分を除去することと、得られた断片ライブラリーを発現ベクター中にライゲーションすることとによって断片のライブラリーを作製することができる。この方法によって、本発明の融合タンパク質のＮ末端と、種々の大きさの内部断片とをコードする発現ライブラリーを導くことができる。
【００８５】
変異体は、変異誘発のためにアミノ酸配列が異なる、融合タンパク質、ならびに標的タンパク質およびプラスミノーゲンアクチベーターを含む。実施例５および６にそれぞれ記載される触媒アッセイおよび線維素溶解アッセイを用いて、本発明の融合タンパク質またはプラスミノーゲンアクチベーターの変異体、例えば、末端切断もしくは点変異のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって、プラスミノーゲン活性化活性（フィブリン選択的であることが好ましい）を有する変異体を同定することができる。Ｐ−セレクチン結合活性を有する変異体は、実施例２、３および４に記載されるＰ−セレクチン結合アッセイを用いて、本発明の融合タンパク質または標的タンパク質の変異体、例えば、末端切断もしくは点変異のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって同定できる。
【００８６】
変異体の変化に富んだライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発によって作製でき、変化に富んだ遺伝子ライブラリーによってコードされる。変異体の変化に富んだライブラリーは、例えば、可能性ある変異体アミノ酸配列の縮重セットが、個々のポリペプチドとして、あるいは、中に配列セットを含むより長い融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのために）として発現可能であるように合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列中に酵素的にライゲートすることによって作製できる。縮重オリゴヌクレオチド配列から可能性ある変異体のライブラリーを作製するためには、使用できる種々の方法がある。自動ＤＮＡシンセサイザーにおいて、縮重遺伝子配列の化学合成を実施でき、次いで、合成遺伝子を適当な発現ベクターにライゲートする。遺伝子の縮重セットの使用により、一混合物で、可能性ある変異体配列の所望のセットをコードする配列のすべてを提供することが可能となる。縮重オリゴヌクレオチドを合成する方法は当技術分野では公知である（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９８３），Ｖｏｌ．３９，ｐ．３、Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８４ａ），Ｖｏｌ．５３，ｐｐ．３２３−３５６、Ｉｔａｋｕｒａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８４ｂ），Ｖｏｌ．９８，ｐｐ．１０５６−１０６３およびＩｋｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．（１９８３），Ｖｏｌ．１１  ，ｐｐ．４７７−４８８参照のこと）。
【００８７】
当技術分野では、点変異または末端切断によって作製したコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、および選択した能力を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が知られている。このような技術は、融合タンパク質、ならびに標的タンパク質およびプラスミノーゲンアクチベーターのコンビナトリアル変異誘発によって作製した遺伝子ライブラリーの、フィブリン選択的プラスミノーゲン活性化活性についての、またはＰ−セレクチン結合活性についての迅速なスクリーニングに適応可能である。大きな遺伝子ライブラリーをスクリーニングするためのハイスループット分析を受け入れられる、最も広く用いられている技術は、通常、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングすることと、得られたベクターのライブラリーで適当な細胞を形質転換することと、所望の活性の検出により、その産物が検出される遺伝子をコードするベクターの単離が容易になる条件下でコンビナトリアル遺伝子を発現させることとを含む。再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）、ライブラリー中の機能的変異体の頻度を高める技術を、スクリーニングアッセイと併用して所望の変異体を同定することができる。
【００８８】
（融合タンパク質の作製）
本発明の融合タンパク質は、当業者に公知のいずれかの方法によって、標的タンパク質を、プラスミノーゲンアクチベーター（類）またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と融合すること、またはそうでなければ、結合することによって作製する。２つの成分は種々の周知の化学的手順のいずれによって化学的に結合させてもよい。例えば、結合はヘテロ二機能性架橋剤、例えば、ＳＰＤＰ、カルボジイミド、グルタルアルデヒドなどによるものであり得る。
【００８９】
より好ましい実施形態では、組換え手段によって、例えば、組換えＤＮＡ技術の使用によって、本発明の標的タンパク質をＤＳＰＡドメイン（類）と融合し、標的タンパク質およびプラスミノーゲンアクチベーター（類）をコードするポリペプチドの双方をコードする核酸を作製でき、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）または哺乳類細胞などの宿主細胞においてＤＮＡ配列を発現することができる。当業者に公知のいずれかのクローニング手順によって、融合タンパク質をコードするＤＮＡを、ｃＤＮＡの形でクローニングできる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）前掲参照のこと。
【００９０】
標的タンパク質が単鎖抗体である場合には、発現されると、特異的結合活性を示すＦｖ領域をコードするＤＮＡ配列を同定すると、当業者に公知の方法によってＦｖ領域を含む融合タンパク質を調製することができる。したがって、例えば、すべて参照により組み込まれる、Ｃｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８９），Ｖｏｌ．３３９，ｐｐ．３９４−３９７、Ｂａｔｒａ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９０），Ｖｏｌ．２６５，ｐｐ．１５１９８−１５２０２、Ｂａｔｒａ，Ｊ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８９），Ｖｏｌ．８６，ｐｐ．８５４５−８５４９およびＣｈａｕｄｈａｒｙ，Ｖ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９０），Ｖｏｌ．８７，ｐｐ．１０６６−１０７０には、種々の単鎖抗体融合タンパク質の調製が記載されている。Ｆｖ領域をプラスミノーゲンアクチベーター（類）と直接融合してもよいし、リンカー配列を介して結合してもよい。リンカー配列は単に、標的部分とプラスミノーゲンアクチベーター（類）の間に空間を提供するために、またはこれらの領域が各々その最適なコンホメーションを獲得できるよう、その間の可動性を増大するために存在し得る。コネクターを含むＤＮＡ配列はまた、クローニングを容易にする配列（例えば、プライマーまたは制限部位）を提供する場合もあり、標的部分をコードする配列とプラスミノーゲンアクチベーター（類）をコードする配列の間のリーディングフレームを保存する場合もある。このようなコネクターペプチドの設計は当業者には周知である。
【００９１】
本発明では、抗Ｐ−セレクチン抗体をまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体をプラスミノーゲンアクチベーター（類）またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と連結するためにリンカー配列を用いることができる。リンカー配列はまた、単鎖抗体の重鎖および軽鎖ドメインを連結するためにも用いることができる。０〜１５個のアミノ酸のリンカー配列を使用できることは明らかである。当業者には明らかであるが、多数の異なるリンカー配列を用い、それでも、線維素溶解活性、フィブリン選択性、Ｐ−セレクチン結合活性および活性化血小板結合活性を保持する融合タンパク質をもたらすことができる。リンカー配列の修飾は、線維素溶解活性、フィブリン選択性、Ｐ−セレクチン結合活性、および／または活性化血小板結合活性の増強を最大にすることを目的としたものであり得る。
【００９２】
本発明の好ましい実施形態では、抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡα１融合タンパク質は、成熟ＤＳＡＰα１をコードするｃＤＮＡがＳＺ５１−ＶＨ−ヒトＩｇＧ１  ＣＨ３領域の３’に挿入された発現ベクターを構築することによって作製する（Ｇｕ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），前掲）。ＳＺ５１−ＶＬ−ヒト  Ｉｇκキメラタンパク質をコードする発現プラスミドを用いて、得られた発現プラスミドを同時トランスフェクトして、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１を作製した。得られた融合タンパク質ならびに軽鎖および重鎖発現プラスミドの模式図が図１に表されている。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１分子は、２つのＩｇ軽鎖および２つのＩｇ重鎖を含む。軽鎖はＳＺ５１のＶＬ領域とヒトＩｇκの定常領域とからなる。重鎖はＳＺ５１のＶＨ領域とヒトＩｇＧ１の定常領域１〜３および全長ＤＳＰＡα１からなる。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の２種のポリペプチド鎖のアミノ酸配列が図２に表されている（配列番号１および２）。
【００９３】
同様の構築物を全長ヒトｕＰＡ  ｃＤＮＡを用いて作製し、融合タンパク質、ＨｕＳＺ５１−ｕＰＡを作製した（Ｗａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂ．Ｒｅｓ．（２０００），Ｖｏｌ．９７，ｐｐ．１３３−１４１）。この場合では、アフィニティー精製したＨｕＳＺ５１−ｕＰＡが、親マウスモノクローナル抗体ＳＺ５１の、トロンビン活性化ヒト血小板との結合を阻害し、このことは抗Ｐ−セレクチン−プラスミノーゲンアクチベーター融合タンパク質はインビトロで血小板結合活性を保持し得るということを実証する（Ｗａｎ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（２０００），前掲）。
【００９４】
ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、まず、ＳＺ５１のＶＬおよびＶＨ領域コードするｃＤＮＡを、ヒトＩｇκ軽鎖およびＩｇＧ１重鎖定常領域をそれぞれ含む発現ベクターに挿入することによって作製した。軽鎖構築物、ｐＬＮＯＳＺ５１ＶＫ／Ｈｙｇｒｏは、選択マーカーハイグロマイシンを含むウイルスＣＭＶプロモーター駆動性発現プラスミドである。このプラスミドを構築するために、標準ＰＣＲ技術によってＢｓｍＩおよびＢｓｉＷＩ制限酵素認識部位でフランキングされた、ＳＺ５１のＶＬ領域をコードするＤＮＡ断片を作製し、ＢｓｍＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、プラスミドｐＬＮＯ／κ／ハイグロマイシンのＢｓｍｌおよびＢｓｉＷＩ部位の間に挿入した（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．（１９９７），Ｖｏｌ．２０４，ｐｐ．７７−８７）。得られた、ＳＺ５１−ＶＬ領域およびヒトＩｇκ定常領域からなる軽鎖構築物は図１Ｂに表されている。重鎖構築物、ｐＬＮＯＳＺ５１ＶＨ／Ｎｅｏは、選択マーカーネオマイシンを含むウイルスＣＭＶプロモーター駆動性発現プラスミドである。このプラスミドを構築するために、標準ＰＣＲ技術によって、ＢｓｍＩおよびＢｓｉＷＩ制限酵素認識部位によってフランキングされたＳＺ５１のＶＨ領域を含むＤＮＡ断片を作製し、ＢｓｍＩおよびＢｓｉＷＩで消化し、プラスミドｐＬＮＯＨ／ＩｇＧ１／ＮｅｏのＢｓｍＩおよびＢｓｉＷＩ部位の間に挿入した（Ｎｏｒｄｅｒｈａｕｇ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７），前掲）。次いで、オーバーラッピングＰＣＲによって、ＤＳＰＡα１の成熟、分泌型と直接融合している、ＩｇＧ１のＣＨ３ドメイン（ＮｓｉＩ制限酵素部位にまたがる）を含むＤＮＡ断片を作製した（ＢａｍＨＩ制限酵素部位によってフランキングされている）。得られたＰＣＲ断片をＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩで消化し、次いで、プラスミドｐＬＮＯＳＺ５１ＶＨ／ＮｅｏのＮｓｉＩおよびＢａｍＨＩ部位の間に挿入した。ＳＺ５１−ＶＨ領域、ヒトＩｇＧ１定常領域およびＤＳＰＡα１の成熟、分泌型からなる、得られたキメラ重鎖ＤＳＰＡ融合構築物、ｐＬＮＯＳＺ５１ＶＨＤＳＰＡ／Ｎｅｏが図１Ｂに表されている。
【００９５】
これらの方法を用いて、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１中のＣＨ２およびＣＨ３ドメインを欠くＨｕＳＺ５１  Ｆａｂ’−ＤＳＰＡα１および（ＮからＣ末端に）ＳＺ５１ＶＬ領域、続いて、ＳＺ５１−ＶＨ領域およびＤＳＰＡα１の成熟、分泌型を含む単鎖抗体であるｓｃＦｖＳＺ５１−ＤＳＰＡα１をはじめとするその他の抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡα１融合タンパク質発現プラスミドを作製した。同様の方法を用いて、本発明のその他の融合タンパク質発現プラスミドを作製した。
【００９６】
（融合タンパク質の発現および精製）
組換え融合タンパク質をインビトロで発現させるには、大腸菌、バキュロウイルス、酵母哺乳類細胞またはその他の発現系をはじめ、いくつかの方法がある。クローニングされた遺伝子を細菌において発現させる方法はよく知られている。
【００９７】
原核生物系において、クローニングされた遺伝子の高レベル発現を得るためには、最低で、ｍＲＮＡ転写終結に向ける強力なプロモーターを含む発現ベクターを構築することが必須である。この目的に適した調節領域の例としては、大腸菌β−グルコシダーゼ遺伝子のプロモーターおよびオペレーター領域、大腸菌トリプトファン生合成経路またはファージλ由来の左方向のプロモーターがある。大腸菌に形質転換されるＤＮＡプラスミド中に選択マーカーを含めることが有用である。このようなマーカーの例として、アンピシリン、テトラサイクリンまたはクロラムフェニコールに対する耐性を指定する遺伝子が挙げられる。
【００９８】
本発明の融合タンパク質の発現に有用な高等真核細胞系には、選択される多数の細胞系がある。哺乳類細胞株の例示的例として、それだけには限らないが、ＲＰＭＩ７９３２、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（「ＣＨＯ」）細胞株、ＷＩ３８、ＢＨＫ、ＣＯＳ−７、Ｃ１２７またはＭＤＣＫ細胞株が挙げられる。本発明において使用するのに適した細胞は、ＡＴＣＣから市販されている。例示的非哺乳類真核細胞株としては、それだけには限らないが、ヨトウガ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）およびカイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）が挙げられる。
【００９９】
翻訳後修飾、例えば、グリコシル化は、原核細胞発現系大腸菌では起こらない。さらに、複雑なジスルフィドパターンを含むタンパク質は、大腸菌において発現されるとミスフォールドされることが多い。原核生物系を用いる場合、発現されたタンパク質は、細胞の細胞質に不溶性型、いわゆる、封入体で存在し、細胞を溶解した後に可溶性画分中に見られるか、または適当な分泌シグナル配列の付加によってペリプラズム中にむけられる。発現されたタンパク質が不溶性の封入体中にある場合、通常、封入体の可溶化と、それに続く再フォールディングが必要である。
【０１００】
ｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）、ｐＫＫ２３３−２（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびｐＧＥＭ１（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）など、当業者には多数の原核細胞発現ベクターが知られており、市販されている。
【０１０１】
組換え微生物発現系においてよく用いられるプロモーターとしては、β−ラクタマーゼ（ペニシリナーゼ）およびラクトースプロモーター系（Ｃｈａｎｇ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７８），Ｖｏｌ．２７５，ｐｐ．６１７−６２４およびＧｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９７９），Ｖｏｌ．２８１，ｐｐ．５４４−５４８）、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｄ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０），Ｖｏｌ．８，ｐｐ．４０５７−４０７４）およびｔａｃプロモーター（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９），前掲）が挙げられる。もう１つの有用な細菌発現系では、λファージｐＬプロモーターおよびｃｌｔｓ８５７熱誘導性レプレッサー（Ｂｅｒｎａｒｄ，Ｈ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９７９），Ｖｏｌ．５，ｐｐ．５９−７６およびＬｏｖｅ，Ｃ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ（１９９６），Ｖｏｌ．１７６，ｐｐ．４９−５３）を用いる。組換え融合タンパク質はまた、酵母宿主、例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において発現させることができる。通常、種々の翻訳後修飾を行う能力を提供する。発現された融合タンパク質は培養上清中に分泌され得、この場合、他のタンパク質は少ししか存在せず、精製が容易になる。本発明において融合タンパク質を発現するための酵母ベクターは、特定の必要な特徴を含む。ベクターのエレメントは、通常、酵母および細菌由来であり、その双方でプラスミドが増殖することが可能である。細菌エレメントとしては、複製起点および選択マーカーが挙げられる。酵母エレメントとしては、複製起点配列、選択マーカー、プロモーターおよび転写ターミネーターが挙げられる。
【０１０２】
酵母ベクターにおける発現のために適したプロモーターとしては、ＴＲＲ１遺伝子、ＡＤＨ１またはＡＤＨＩＩ遺伝子、酸性ホスファターゼ（ＰＨ０３もしくはＰＨ０５）遺伝子、イソチトクロム遺伝子のプロモーターまたは解糖系に含まれるプロモーター、例えば、エノラーゼ、ピルビン酸キナーゼ、ヘキソキナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＤＰＨ）、３−ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、トリオースリン酸イソメラーゼおよびグルコースリン酸イソメラーゼプロモーターが挙げられる（Ｈｉｔｚｅｍａｎ，Ｒ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０），Ｖｏｌ．２５５，ｐｐ．１２０７３−１２０８０、Ｈｅｓｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．（１９６８），Ｖｏｌ．７，ｐｐ．１４９−１６７およびＨｏｌｌａｎｄ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｊ．Ｐ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９７８），Ｖｏｌ．１７，ｐｐ．４９００−４９０７）。
【０１０３】
市販の酵母ベクターとしては、ｐＹＥＳ２、ｐＰＩＣ９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｙｅｐｃ−ｐＡＤＨ２ａ、ｐＹｃＤＥ−１（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）、ＰＢＣ１０２−Ｋ２２（ＡＴＣＣ  ＃６７２５５）およびＹｐＧＸ２６５ＧＡＬ４（ＡＴＣＣ  ＃６７２３３）が挙げられる。哺乳類細胞株、例えば、それだけには限らないが、ＣＯＳ−７、Ｌ細胞、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＣＨＬ−１、ＮＳＯおよびＨＥＫ２９３を用いて本発明において組換え融合タンパク質を発現させることができる。哺乳類細胞において産生された組換えタンパク質は、通常、可溶性であり、グリコシル化されており、真正のＮ−末端を有する。哺乳類発現ベクターは、転写されないエレメント、例えば、複製起点、プロモーターおよびエンハンサーおよび５’または３’非翻訳配列、例えば、リボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、アクセプター部位およびスプライスドナーおよび転写終結配列を含み得る。哺乳類発現ベクターにおいて使用するためのプロモーターは、通常、例えば、ウイルスプロモーター、例えば、ポリオーマ、アデノウイルス、ＨＴＬＶ、シミアンウイルス４０（「ＳＶ４０」）およびヒトサイトメガロウイルス（「ＣＭＶ」）である。
【０１０４】
選択された発現系および宿主に応じて、タンパク質精製のために用いられる従来のクロマトグラフィーの種々の組合せを用いて相同組換え融合タンパク質が得られる。これらとしては、イムノアフィニティークロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィーおよびＨＰＬＣが挙げられる。発現系が融合タンパク質を増殖培地中に分泌する場合は、タンパク質は、培地から直接精製できる。融合タンパク質が分泌されない場合には、細胞溶解物から単離する。細胞破壊は、いずれかの従来法、例えば、凍結−解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊または細胞溶解剤の使用によって行うことができる。
【０１０５】
本発明の抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質は、標準的な哺乳類遺伝子発現技術および精製技術を用いて発現させ、精製した。本発明の好ましい実施形態では、哺乳類発現構築物をＣＨＯ細胞にトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞を用いる場合には、真核細胞の選択マーカーとしてネオマイシンまたはハイグロマイシンを含めることができる。
【０１０６】
キメラ軽鎖構築物、ｐＬＮＯＳＺ５１ＶＫ／Ｈｙｇｒｏおよびキメラ重鎖−ＤＳＰＡ融合構築物、ｐＬＮＯＳＺ５１ＶＨＤＳＰＡ／Ｎｅｏを、リポソーム媒介（リポフェクチン２０００）法を用いてＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクトされたＣＨＯ細胞を、ＨＡＭＳ／Ｆ−１２培地中、５００μｇ／ｍＬネオマイシンおよび６００μｇ／ｍＬハイグロマイシンを用いて選択した。１１２個の抗生物質耐性ＣＨＯクローンをピックアップし、ＥＬＩＳＡを用いてＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質の発現についてスクリーニングした。１１２個のクローンのうち６個が３ｍｇ／Ｌ〜６ｍｇ／Ｌの範囲のレベルでこのタンパク質を発現し、発現レベルは１０細胞継代を超えて維持された。３個のクローン６２、７０および８７をスケールアップ細胞培養（細胞工場）に用い、タンパク質精製のための馴化培地を作製した。
【０１０７】
ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１を分泌するＣＨＯクローンから得た馴化培地を、まず、０．２２μｍフィルターによって濾過し、次いで、１０ｋＤａ分子量カットオフメンブレン（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  Ｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍで２つのＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）を用いて１０〜２０倍に濃縮した。次いで、濃縮された物質を、５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ６．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化したプロテインＡカラムにロードした。完全にロードした時点で、カラムを１０カラム容積の同バッファーで洗浄し、５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ２．７、３００ｍＭ  ＮａＣｌを用いてタンパク質を溶出した。溶出液を、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０を用いて中和し、溶出液のｐＨを、ｐＨ５．０〜７．０の間に維持した。少量の夾雑ウシＩｇＧを排除するために、プロテインＡカラム溶出液を、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ  ５．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌで平衡化した陽イオン交換ＳＰ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌカラムにロードし、次いで、流速３ｍＬ／分で２０分かけて０．９Ｍ  ＮａＣｌまで直線勾配を用いて溶出した。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質を含んでいた第２の溶出ピークを回収した。ＳＰ−Ｆｒａｃｔｏｇｅｌカラム溶出液を、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ−３００ＨＲゲルろ過カラムを通してさらなるタンパク質精製に付し、タンパク質凝集物をいずれも排除した。
【０１０８】
これらの方法を用いて、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１においてＣＨ２およびＣＨ３ドメインを欠くＨｕＳＺ５１Ｆａｂ’−ＤＳＰＡα１および（ＮからＣ末端に）ＳＺ５１−ＶＬ領域、続いて、ＳＺ５１−ＶＨ領域およびＤＳＰＡα１の成熟、分泌型を含む単鎖抗体であるｓｃＦｖＳＺ５１−ＤＳＰＡα１をはじめとするその他の抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡα１融合タンパク質を発現させ、精製した。同様の方法を用いて、本発明のその他の融合タンパク質を発現させ精製する。
【０１０９】
（薬剤組成物）
本発明はまた、治療効果を達成するために患者に投与できる薬剤組成物を提供する。本発明の薬剤組成物は、所望の純度および製薬上有効な量を有する融合タンパク質を、生理学的に許容可能な担体と組合せることによって、投与用に調製できる
本発明の融合タンパク質は、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与またはくも膜下腔内投与用の薬剤組成物で使用できる。したがって、上記のポリペプチドは、許容可能な滅菌製薬担体、例えば、５パーセントデキストロース、乳酸リンゲル溶液、正常生理食塩水、滅菌水または静脈内注入用に設計されたその他の商業的に調製された生理学的バッファー溶液のいずれかと組合せることが好ましい。当然のことながら、担体溶液ならびに組成物の投与量および投与の選択は、被験体および個々の臨床状況に応じて変わり、標準的な医療処置によって左右される。
【０１１０】
本発明の方法に従って、これらの薬剤組成物は、被験体の血管中の過剰のフィブリンおよび血小板血餅と関連する病理学的帰結を阻害するのに有効な量で投与できる。
【０１１１】
融合タンパク質の投与は、ボーラス静脈内注射によって、持続静脈内注入によって、または両経路の組合せによってであり得る。あるいは、またはさらに、適当な賦形剤と混合した融合タンパク質を、筋肉内部位を介して循環中に取り入れることができる。
【０１１２】
本発明の組換え融合タンパク質および薬剤組成物は、非経口投与、表面投与（ｔｏｐｉｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、静脈内投与、経口投与または局所投与（ｌｏｃａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）にとって有用である。薬剤組成物は、投与方法に応じて種々の単位投与形で投与できる。例えば、単位投与形は、例えば、それだけには限らないが、錠剤、カプセル剤、散剤、溶液およびエマルションの形で投与できる。
【０１１３】
本発明の組換え融合タンパク質および薬剤組成物は、静脈内投与にとって特に有用である。投与用組成物は、通常、製薬上許容可能な担体に、好ましくは水性担体に溶解された融合タンパク質の溶液を含む。種々の水性担体、例えば、緩衝生理食塩水などを使用できる。これらの溶液は無菌であり、通常、望ましくない物質を含まない。本組成物は、従来の、周知の滅菌技術によって滅菌できる。
【０１１４】
静脈内投与にとって一般的な薬剤組成物は、当業者ならば容易に決定することができる。投与される量は、明確にタンパク質特有であり、その効力および薬物動態的特性に応じて変わる。非経口的に投与可能な組成物を調製するために実際な方法は、公知であり、当業者には明らかであり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１８ｔｈ  ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１９９０のような刊行物に、より詳細に記載されている。
【０１１５】
本融合タンパク質またはそのカクテル（すなわち、その他のタンパク質との）を含む組成物を治療的処置のために投与できる。治療的適用では、組成物は動脈血栓症を患っている患者に、障害を治癒するのに、または部分的に停止するのに十分な量で投与する。これを達成するのに適切な量は「治療有効量」として定義される。この使用のために有効な量は、疾患の重篤度および患者の健康の全身状態に応じて変わる。
【０１１６】
患者によって必要とされ、許容可能な投与量および頻度に応じて、組成物の単回投与を投与してもよいし、反復投与を投与してもよい。いずれにしても、組成物は、患者を効果的に治療するのに十分な量の本発明のタンパク質を提供しなくてはならない。一般に、製薬上許容可能な組成物は、意図される投与様式に応じて、約１％〜約９９重量％の本発明の融合タンパク質と、９９％〜１重量％の適した薬剤賦形剤または担体を含む。組成物は本発明の融合タンパク質（類）の約５％〜７５重量％であり、残りが適した薬剤賦形剤または担体であることが好ましい。
【０１１７】
本発明の融合タンパク質またはその製薬上許容可能な組成物は、治療有効量で投与し、これは種々の因子、例えば、用いられる指定の融合タンパク質の活性、融合タンパク質の代謝安定性および作用の長さ、患者の年齢、体重、全体的な健康、性別および食事、投与様式および投与時間、排出速度、薬物の組合せ、個々の疾患状態の重篤度および宿主が受けている治療に応じて変わる。一般に、治療上有効な一日用量は約０．１４ｍｇ〜約１４．３ｍｇの本発明の融合タンパク質／体重１ｋｇ／日であり、約０．７ｍｇ〜約１０ｍｇ／体重１ｋｇ／日が好ましく、約１．４ｍｇ〜約７．２ｍｇ／体重１ｋｇ／日が最も好ましい。例えば、７０ｋｇの人に投与するには、投与量範囲は約１０ｍｇ〜約１．０グラムの本発明の融合タンパク質／日であり、約５０ｍｇ〜約７００ｍｇ／日が好ましく、約１００ｍｇ〜約５００ｍｇ／日が最も好ましい。
【０１１８】
（細胞および遺伝子療法）
本発明の融合タンパク質は、「細胞療法」と呼ばれる方法による、インビボでのこのような融合タンパク質の発現によって本発明にしたがって用いることができる。したがって、例えば、細胞を、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（類）（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いて、エキソビボで操作することができ、次いで、操作された細胞を融合タンパク質で治療される予定の患者に提供する。このような方法は当技術分野では周知である。例えば、細胞を、本発明の融合タンパク質をコードするＲＮＡを含むレトロウイルス粒子の使用によって当技術分野で公知の手順によって操作することができる。
【０１１９】
本発明の融合タンパク質はまた、「遺伝子療法」と呼ばれる方法による、インビボでのこのような融合タンパク質の発現によって本発明にしたがって用いることができる。したがって、例えば、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド（類）（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を用いてウイルスを操作することができ、次いで、操作されたウイルスを融合タンパク質で治療される予定の患者に提供する。このような方法は当技術分野では公知である。例えば、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを含む、組換えアデノウイルスを、当技術分野で公知の手順によって操作することができる。
【０１２０】
細胞療法または遺伝子療法を用いる本発明の融合タンパク質の局所送達により、治療薬を標的領域、血管内皮細胞に提供することができる。
【０１２１】
インビトロおよびインビボの双方で、細胞療法および遺伝子療法方法論が考慮される。治療的可能性のある遺伝子を、規定の細胞集団に移すためのいくつかの方法が知られている。例えば、Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３），Ｖｏｌ．２６０，ｐｐ．９２６−９３２参照のこと。これらの方法としては、直接遺伝子導入（例えば、Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９０），Ｖｏｌ．２４７，ｐｐ．１４６５−１４６８参照のこと）、リポソーム媒介性ＤＮＡ移入（例えば、Ｃａｐｌｅｎ，Ｎ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．（１９９５），Ｖｏｌ．３，ｐｐ．３９−４６、Ｃｒｙｓｔａｌ，Ｒ．Ｇ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．（１９９５），Ｖｏｌ．１  ，ｐｐ．１５−１７、Ｇａｏ，Ｘ．ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，Ｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９１），Ｖｏｌ．７９，ｐｐ．２８０−２８５参照のこと）、レトロウイルス媒介性ＤＮＡ移入（例えば、Ｋａｙ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９３），Ｖｏｌ．２６２，ｐｐ．１１７−１１９、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２），Ｖｏｌ．２５６，ｐｐ．８０８−８１３参照のこと）およびＤＮＡウイルス媒介性ＤＮＡ移入が挙げられる。このようなＤＮＡウイルスとしては、アデノウイルス（好ましくは、Ａｄ２またはＡｄ５ベースのベクター）、ヘルペスウイルス（好ましくは、単純ヘルペスウイルスベースのベクター）およびパルボウイルス（好ましくは、「欠陥」または非自律性パルボウイルスベースのベクター、より好ましくは、アデノ随伴ウイルスベースのベクター、最も好ましくは、ＡＡＶ−２ベースのベクターｓ）が挙げられる。例えば、Ａｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４），Ｖｏｌ．１，ｐｐ．３６７−３８４、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第４，７９７，３６８号および参照により本明細書に組み込まれる米国特許第５，１３９，９４１号参照のこと。
【０１２２】
注目する遺伝子を移入するための個々のベクターシステムの選択は、種々の因子に応じて変わる。１つの重要な因子として、標的細胞集団の性質がある。レトロウイルスベクターは広く研究されており、いくつかの遺伝子療法適用に用いられているが、これらのベクターは、通常、非分裂細胞を感染させるのには適していない。さらに、レトロウイルスは発癌性の可能性を有する。しかし、レンチウイルスベクターの分野における最近の開発によって、これらの制限のいくつかを回避することができる。Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９６），Ｖｏｌ．２７２，ｐｐ．２６３−２６７参照のこと。
【０１２３】
上記のレトロウイルスプラスミドベクターが由来するレトロウイルスとしては、それだけには限らないが、モロニーマウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、レトロウイルス、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、テナガザル白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、アデノウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび哺乳類腫瘍ウイルスが挙げられる。
【０１２４】
アデノウイルスには、広い宿主域を有しているという利点があり、静止状態の細胞または最終分化した細胞、例えば、ニューロンまたは肝細胞に感染することができ、かつ、本質的に非発癌性であると思われる。例えば、Ａｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４），前掲参照のこと。アデノウイルスは宿主ゲノム中に組み込まれないと思われる。それらは染色体外に存在するために、挿入変異の危険が大幅に低下する。Ａｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４），前掲。
【０１２５】
アデノ随伴ウイルスは、アデノウイルスベースのベクターと同様の利点を示す。しかし、ＡＡＶは、ヒト染色体１９に対して部位特異的組込みを示す（Ａｌｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４），前掲）。
【０１２６】
好ましい実施形態では、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを、心血管疾患、例えば、それだけには限らないが、動脈血栓症、急性冠動脈症候群、例えば、ＳＴ上昇型心筋梗塞、非ＳＴ上昇型心筋梗塞および不安定狭心症、カテーテル誘発性血栓症、心室壁血栓、左心房血栓または人工弁血栓の溶解ならびに深静脈血栓症、肺塞栓および急性虚血性発作のための細胞療法または遺伝子療法に用いる。
【０１２７】
この実施形態によれば、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡを用いる細胞療法または遺伝子療法を、それを必要とする患者に、診断と同時にまたは診断の直後に提供する。
【０１２８】
当業者には理解されるであろうが、本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡまたは本発明の融合タンパク質の類似体、断片、誘導体もしくは変異体をコードするＤＮＡを含む、適した遺伝子療法ベクターはいずれも、本実施形態に従って使用できる。このようなベクターを構築する技術は公知である。例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｗ．Ｆ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８），Ｖｏｌ．３９２，ｐｐ．２５−３０およびＶｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．ａｎｄ  Ｓｏｍｉａ，Ｎ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９８），Ｖｏｌ．３８９，ｐｐ．２３９−２４２参照のこと。融合タンパク質ＤＮＡ含有ベクター（類）の、標的部位への導入は、公知の技術を用いて達成できる。
【０１２９】
細胞療法または遺伝子療法ベクターは、１種以上のプロモーターを含む。使用可能な、適したプロモーターとしては、それだけには限らないが、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ  ａｎｄ  Ｒｏｓｍａｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９８９），Ｖｏｌ．７，ｐｐ．９８０−９９０に記載されるレトロウイルスＬＴＲ、ＳＶ４０プロモーターおよびヒトＣＭＶプロモーターまたはいずれかのその他のプロモーター（例えば、細胞性プロモーター、例えば、真核細胞性プロモーター、例えば、それだけには限らないが、ヒストン、ｐｏｌ  ＩＩＩおよびβ−アクチンプロモーター）が挙げられる。使用できるその他のウイルスプロモーターとしては、それだけには限らないが、アデノウイルスプロモーター、チミジンキナーゼ（「ＴＫ」）プロモーターおよびＢ１９パルボウイルスプロモーターが挙げられる。適したプロモーターの選択は、本明細書に含まれる教示から当業者には理解される。
【０１３０】
本発明の融合タンパク質をコードする核酸配列は、適したプロモーターの制御下にある。使用可能な、適したプロモーターとしては、それだけには限らないが、アデノウイルスプロモーター、例えば、アデノウイルス主要後期プロモーターまたは異種プロモーター、例えば、ＣＭＶプロモーター、呼吸器合胞体ウイルスプロモーター、誘導プロモーター、例えば、ＭＭＴプロモーター、メタロチオネインプロモーター、熱ショックプロモーター、アルブミンプロモーター、ＡｐｏＡＩプロモーター、ヒトグロビンプロモーター、ウイルスチミジンキナーゼプロモーター、例えば、単純ヘルペスウイルスＴＫプロモーター、レトロウイルスＬＴＲ（例えば、上記の改変レトロウイルスＬＴＲ）、β−アクチンプロモーターおよびヒト成長ホルモンプロモーターが挙げられる。
【０１３１】
レトロウイルスプラスミドベクターを用いてパッケージング細胞株に形質導入し、産生細胞株を形成する。トランスフェクトされ得るパッケージング細胞の例として、それだけには限らないが、参照によりその全文が本明細書に組み込まれる、Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ．Ｄ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９０），Ｖｏｌ．１，ｐｐ．５−１４に記載される、ＰＥ５０１、ＰＡ３１７、ｐｓｉ−２、ｐｓｉ−ＡＭ、ＰＡ１２、Ｔ１９−１４Ｘ、ＶＴ−１９−１７−Ｈ２、ｐｓｉＣＲＥ、ｐｓｉＣＲＩＰ、ＧＰ＋＃−８６、ＧＰ＋ｅｎｖＡｍ１２およびＤＡＮ細胞株が挙げられる。ベクターは当技術分野で公知の手段のいずれによってパッケージング細胞に形質導入してもよい。このような手段としては、それだけには限らないが、エレクトロポレーション、リポソームの使用およびＣａＰＯ４沈殿が挙げられる。１つの代替法では、レトロウイルスプラスミドベクターをリポソーム中にカプセル化することができ、または脂質と結合させ、次いで、宿主に投与することができる。産生細胞株は、ポリペプチドをコードする核酸配列（類）を含む感染性レトロウイルスベクター粒子を作製する。次いで、このようなレトロウイルスベクター粒子を用いて、インビトロまたはインビボのいずれかで真核細胞に形質導入する。形質導入された真核細胞は、ポリペプチドをコードする核酸配列（類）を発現する。形質導入され得る真核細胞としては、それだけには限らないが、胚幹細胞、胚性癌腫細胞ならびに造血幹細胞、肝細胞、線維芽細胞、筋芽細胞、ケラチノサイト、内皮細胞および気管支上皮細胞が挙げられる。
【０１３２】
遺伝子療法への別のアプローチとして、「トランスカリオティック・セラピー（ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）」があり、これでは、患者の細胞をエキソビボで処理し、患者に再導入した後に休止中の染色体遺伝子が注目するタンパク質を産生するよう誘導する。トランスカリオティック・セラピー（ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）では、個体は活性化に必要な遺伝子の正常な補体を有していると想定している。トランスカリオティック・セラピー（ｔｒａｎｓｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ）は、新生遺伝子を活性化できる、プロモーターまたはその他の外因性調節配列を、エキソビボで患者の細胞の染色体ＤＮＡに導入する工程と、培養する工程と活性タンパク質産生細胞を選択する工程と、次いで、活性化細胞を、それらがその後十分に確立されるよう患者に再導入する工程とを含む。次いで、「遺伝子が活性化された」細胞が、注目するタンパク質をそれなりの時間、おそらくは、その患者の寿命の限り製造する。米国特許第５，６４１，６７０号および同５，７３３，７６１号には、この概念が詳細に開示されており、これは参照によりその全文が本明細書に組み込まれる。
【０１３３】
（キット）
本発明は、さらに、研究または診断目的のキットに関する。キットは、通常、本発明の融合タンパク質を含む、１種以上の容器を含む。好ましい実施形態では、キットは、融合タンパク質を、第２の分子を用いて誘導体化するのに適した形で含む容器を含む。より好ましい実施形態では、キットは配列番号１および２の融合タンパク質を含む容器を含む。本発明の組成物を、遊離形または製薬上許容可能な形で含むキットをさらに提供する。キットはその投与のための使用説明書を含み得る。本発明のキットは、本発明のいずれの方法においても使用できる。
【０１３４】
もう１つの実施形態では、キットは本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列を含み得る。これらの融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、宿主細胞へのトランスフェクションおよび宿主細胞による発現に適したプラスミド（類）中で提供されることが好ましい。このプラスミド（類）は、宿主細胞におけるＤＮＡの発現を調節するためのプロモーター（誘導プロモーターであることが多い）を含み得る。このプラスミド（類）はまた、その他のＤＮＡ配列のプラスミドへの挿入を容易にし、種々の融合タンパク質を生成するための適当な制限部位を含み得る。このプラスミド（類）はまた、コードされるタンパク質のクローニングおよび発現を容易にするための多数のその他のエレメントを含む。このようなエレメントは当業者には周知であり、これとしては、例えば、選択マーカー、開始コドン、終結コドンなどが挙げられる。
【０１３５】
（治療適応症）
血栓形成が相当な病因的役割を果たす疾患、障害または状態としては、動脈血栓症、急性冠動脈症候群、例えば、ＳＴ上昇型心筋梗塞、非ＳＴ上昇型心筋梗塞および不安定狭心症、カテーテル誘発性血栓症、心室壁血栓、左心房血栓または人工弁血栓の溶解ならびに深静脈血栓症、肺塞栓および急性虚血性発作が挙げられる。本発明の融合タンパク質は、血栓形成が病的である、これらの疾患、障害または状態のすべてにおいて有用である。有用とは、融合タンパク質が、疾患を予防するための、またはより重篤な状態へのその進行を防ぐための治療にとって有用であることを意味する。
【０１３６】
（さらに好ましい実施形態）
発明の開示において上記で示される本発明の融合タンパク質のうち、いくつかの群の融合タンパク質が特に好ましい。
【０１３７】
好ましい一実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１３８】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、いずれかの組合せのＤＳＰＡα１フィンガー、ＥＧＦおよびセリンプロテアーゼドメインまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と、機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１３９】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、いずれかの組合せのＤＳＰＡα１フィンガー、クリングルおよびセリンプロテアーゼドメインまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１４０】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、いずれかの組合せのＤＳＰＡα１フィンガーおよびセリンプロテアーゼドメインまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１４１】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合するモノクローナル抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１４２】
より好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合するキメラモノクローナル抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１４３】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合するＦａｂ二量体抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１４４】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する単鎖抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１４５】
より好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合するＨｕＳＺ５１を含む融合タンパク質に関する。
【０１４６】
もう１つのより好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と重鎖によって機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合するＨｕＳＺ５１を含む融合タンパク質に関する。
【０１４７】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と重鎖によって機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合するＨｕＳＺ５１を含む融合タンパク質の治療有効量を、それを必要とするヒトに投与する工程を包含する、動脈血栓症、急性冠動脈症候群、例えば、ＳＴ上昇型心筋梗塞、非ＳＴ上昇型心筋梗塞および不安定狭心症、カテーテル誘発性血栓症、心室壁血栓、左心房血栓または人工弁血栓の溶解ならびに深静脈血栓症、肺塞栓および急性虚血性発作を治療する方法に関する。
【０１４８】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と重鎖によって機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合するＨｕＳＺ５１を含む融合タンパク質の治療有効量を、それを必要とするヒトに投与する工程を包含する、動脈血栓症、急性冠動脈症候群、例えば、ＳＴ上昇型心筋梗塞、非ＳＴ上昇型心筋梗塞および不安定狭心症、カテーテル誘発性血栓症、心室壁血栓、左心房血栓または人工弁血栓の溶解ならびに深静脈血栓症、肺塞栓および急性虚血性発作を予防する方法に関する。好ましい実施形態では、融合タンパク質を、発作発症の３時間後より後に、急性虚血性発作を患っている患者に投与する。
【０１４９】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγからなる群から選択されるプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、活性化血小板またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１５０】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγからなる群から選択されるプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１５１】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα２またはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１５２】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡβまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１５３】
もう１つの好ましい実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡγまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１５４】
もう１つの実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγからなる群から選択されるプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、Ｆａｂ二量体抗体、Ｆａｂ単量体抗体、ＩｇＧ抗体、ＩｇＧ抗体の類似体および単鎖抗体からなる群から選択されるＰ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１５５】
もう１つの実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγからなる群から選択されるプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合する抗体を含み、その他の分子、例えば、それだけには限らないが、ポリエチレングリコール、ビオチンおよび硫酸コンドロイチンの付加によって修飾されている融合タンパク質に関する。
【０１５６】
もう１つの実施形態では、本発明は、ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα２、ＤＳＰＡβおよびＤＳＰＡγからなる群から選択されるプラスミノーゲンアクチベーターまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と機能しうる形で連結している、Ｐ−セレクチンまたはその類似体、断片、誘導体もしくは変異体と結合し、Ｐ−セレクチンとの結合についてＰ−セレクチン−糖タンパク質−リガンド−１（ＰＳＧＬ−１）と競合せず、Ｐ−セレクチンとの結合について糖タンパク質１ｂ−ＩＸ−Ｖ複合体と競合するか、または活性化血小板への白血球の接着を阻害しない抗体を含む融合タンパク質に関する。
【０１５７】
（本発明の融合タンパク質の調製）
本発明の好ましい実施形態に従う融合タンパク質を、標準組換えＤＮＡ技術、哺乳類遺伝子発現技術およびタンパク質精製技術を用いて作製した。図１Ａは、ヒトＩｇκの定常領域と融合している、抗Ｐ−セレクチン抗体のＶＬ領域からなる２つの軽鎖と、ヒトＩｇＧγ１の定常領域と融合している、抗Ｐ−セレクチン抗体のＶＨ領域からなる２つの重鎖と、吸血コウモリプラスミノーゲンアクチベーターＤＳＰＡα１の成熟、分泌型を含む、このような一融合タンパク質、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の例を表す。抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡα１融合タンパク質発現プラスミドの構築ならびに抗Ｐ−セレクチンＤＳＰＡα１融合タンパク質の発現および生成は上記に記載されている。
【０１５８】
Ｐ−セレクチンと特異的に結合するマウスモノクローナル抗体ＳＺ５１は、ｔｈｅ  Ｊｉａｎｇｓｕ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙから入手した。ＳＺ５１のＩｇＧγ重鎖およびＩｇκ軽鎖遺伝子の可変領域のＤＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋに寄託された（それぞれ、受託番号ｇｉ：４０９９２８２およびｇｉ：４０９９２８４）。上記で詳細に記載され、図１Ｂに表されるように、ＳＺ５１のＶＨ領域をコードするｃＤＮＡを発現プラスミド中、ヒトＩｇκの定常領域をコードするｃＤＮＡの５’にクローニングし、ＳＺ５１のＶＨ領域をコードするｃＤＮＡを発現プラスミド中、ヒトＩｇＧγ１の定常領域をコードするゲノムＤＮＡの５’にクローニングした。ＤＳＰＡα１の成熟、分泌型をコードするｃＤＮＡを、ＩｇＧγ１のＣＨ３ドメインの３’に挿入した。
【０１５９】
これらの発現プラスミドをＤＮＡ配列決定に付し、上記の構築物および融合タンパク質のアミノ酸配列を確認した。キメラＳＺ５１−ＶＬ−ヒトＩｇκ軽鎖（配列番号１）およびキメラＳＺ５１−ＶＨ−ヒトＩｇＧγ１−ＤＳＰＡα１重鎖（配列番号２）のアミノ酸配列はそれぞれ、図２Ａおよび２Ｂに示されている。
【０１６０】
軽鎖および重鎖発現プラスミドを、ＣＨＯ細胞に同時トランスフェクトし、抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質を発現する安定形質転換体を同定し、次いで、上記のように、選択した陽性ＣＨＯクローンの馴化培地からＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１を精製した。実施例１において記載したように、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによってＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１を分析し、その結果が図３に示されている。予想通り、精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質は、約２５０ｋＤａという見かけの分子量を有し、それぞれ、ＨｕＳＺ５１−ＶＨＣγ１〜３−ＤＳＰＡα１およびＨｕＳＺ５１−ＶＬＣκに対応する、約１０８ｋＤａと約２３ｋＤａの２つのサブユニットを含む。精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１物質中には、わずかな分解産物または不純物しか明らかでないことが、図３Ａおよび３Ｂにおけるクマシーブルー染色およびウエスタンブロッティングによってそれぞれ判断された。
【０１６１】
上記の方法を用い、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１について本明細書において例示されるように、本発明の融合タンパク質をクローニングし、発現させ、精製し、その純度および完全性について分析する。これらの方法を用い、当業者ならば、種々の抗体断片をプラスミノーゲンプラスミノーゲンアクチベーター断片と組合せ、本発明の融合タンパク質を作製できる。
【０１６２】
（本発明の融合タンパク質の試験）
本明細書において上記に記載される標準組換えＤＮＡ技術、哺乳類遺伝子発現技術およびタンパク質精製技術を用いて、本発明の融合タンパク質を、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１によって例示されるように作製し、続いて、実施例１において記載されるように、その純度および完全性について分析し、その結果が図３に示されている。本発明の融合タンパク質を、種々のインビトロアッセイで試験し、有用性、すなわち、本発明の融合タンパク質が活性化血小板と結合し、フィブリンを分解し、血栓溶解を誘導する能力を保持することを実証した。これらのアッセイは、以下の実施例２〜７に詳細に記載されており、その結果は図４〜９に示されている。
【０１６３】
精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、インビトロでＰ−セレクチンと結合する能力を、３つの方法で確認した：（１）ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、フィルターメンブレン上に固定された組換えＰ−セレクチンと結合する能力を測定するニトロセルロースフィルター結合アッセイによって、（２）ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、プラスチック上に固定されたＰ−セレクチンと結合する能力を測定するＥＬＩＳＡによって、（３）ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、プラスチック上に固定された組換えＰ−セレクチンとの結合について親モノクローナル抗体ＳＺ５１と競合する能力を測定する競合ＥＬＩＳＡによって。これらのアッセイは実施例２および３に記載されている。図４Ａは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＨｕＳＺ５１は、それらの、ニトロセルロース上に固定されたＰ−セレクチンと結合する能力において同程度であったということを示し、図４Ｂは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１はプラスチック上に固定されたＰ−セレクチンと、用量依存性様式で結合したことを示す。図５は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、用量依存性様式でＰ−セレクチンと結合してＳＺ５１と競合したことを示す。これらの結果は、ＤＳＰＡα１を、ＨｕＳＺ５１重鎖のＣ末端と連結することは、抗Ｐ−セレクチン抗体の、インビトロでＰ−セレクチンと結合する能力に悪影響を及ぼさないということを実証した。
【０１６４】
精製したＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、インビトロで活性化血小板と結合する能力を、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、プラスチック上にコーティングされた、トロンビン活性化血小板と結合する能力を測定するＥＬＩＳＡによって確認した。このアッセイは、以下の実施例４に記載されている。図６Ａは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＳＺ５１は、ヒトトロンビン活性化血小板と区別できない方法で結合したことを示し、図６Ｂは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１はイヌトロンビン活性化血小板と用量依存性様式で結合したことを示す。これらの結果は、ＤＳＰＡα１をＨｕＳＺ５１重鎖のＣ末端と連結することは、抗Ｐ−セレクチン抗体の、インビトロで活性化血小板と結合する能力に悪影響を及ぼさないということを実証した。
【０１６５】
精製ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のインビトロ触媒活性を、２つの方法で確認した：（１）ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、セリンプロテアーゼ基質の加水分解を触媒する能力を測定する発色アッセイおよび（２）ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、フィブリンを分解する能力を測定する血餅溶解アッセイ。これらのアッセイは実施例５、６および７に記載されている。図７は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１は、２種のセリンプロテアーゼ基質に対して同程度の触媒活性を示したということを示す。図８（上部パネル）は、モルベースで、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１は、フィブリン血餅溶解アッセイにおいて、フィブリンを分解するそれらの能力において区別できなかったということを示し、図８（下部パネル）は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１は、血漿血餅溶解アッセイにおけるフィブリンを分解するそれらの能力において同程度であったということを示す。図９は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１の双方とも、血小板に乏しい血漿（上部パネル）または血小板の豊富な血漿（下部パネル）を用いる血漿血餅溶解アッセイにおいてｕＰＡよりも優れていたということを示す。これらの結果は、ＤＳＰＡα１をＨｕＳＺ５１重鎖のＣ末端と連結することは、ＤＳＰＡα１の、標的基質の加水分解を触媒する能力に悪影響を及ぼさなかったということおよびＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１はインビトロで血栓溶解剤としてｕＰＡよりも優れていたということを実証する。
【０１６６】
本発明の融合タンパク質は、有用性、すなわち、本発明の融合タンパク質は、出血の危険性が対応するプラスミノーゲンアクチベーター単独よりも低い、有効な血栓溶解剤であるということを実証するために、インビボでのアッセイにおいて試験されている。このアッセイは実施例８に記載されている。
【０１６７】
以下の具体的な実施例は、本発明の実施に役立つ手引きとして提供するものであって、本発明の範囲を制限しようとするものではない。以下の調製物および実施例、抗体断片とプラスミノーゲンアクチベーター断片の組合せは、このような貢献が安定な融合タンパク質をもたらす場合のみ許容されるということは理解される。
【実施例】
【０１６８】
（実施例１）
抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット解析
精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、およびウエスタンブロッティングによって分析した。データから、精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は無傷であり、検出可能な夾雑物質を含まないということが示される。
【０１６９】
１．ＳＤＳ−ＰＡＧＥによるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の分析。精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、組換えＤＳＰＡα１およびヒトＩｇＧ１を、非還元および還元条件下、４〜１０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、クマシーブルーを用いて染色した。結果は図３Ａに示されている。非還元条件下では、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、約２５０ｋＤａという見かけの分子量を有し、還元条件下では、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、それぞれ、ＨｕＳＺ５１−ＶＨＣγ１〜３−ＤＳＰＡα１およびＨｕＳＺ５１−ＶＬＣκに相当する、約１０８ｋＤａと約２３ｋＤａの２種のサブユニットを含む。精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１物質中には、わずかな分解産物または不純物しか明らかでない。
【０１７０】
２．ウエスタンブロッティングによるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の分析。精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、組換えＤＳＰＡα１およびヒトＩｇＧ１を非還元および還元条件下、４〜１０％勾配ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離した。電気泳動後、ゲル上のタンパク質をハイボンドＥＣＬニトロセルロースメンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ）にトランスファーした。このメンブレンを、ＥＣＬブロッキング剤（Ａｍｅｒｓｈａｍ）とともに室温で１時間インキュベートし、続いて、ＰＢＳＴで３回洗浄した。次いで、このメンブレンを、ビオチン化抗ＤＳＰＡモノクローナル９Ｂ３（抗ＤＳＰＡ、１：４０００）とともにインキュベートし、続いて、さらにＨＲＰ−アビジン（１：５０００）とともにインキュベートするか、またはＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃ（ＧＡＨ−ＩｇＧ、１：７５００）とともにインキュベートした。ＥＣＬウエスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を添加した結果、標準Ｘ線フィルムで捕獲される化学発光シグナルが生じた。結果は図３Ｂに示されている。非還元条件下で、抗ＤＳＰＡにより、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１が単一種として検出される。非還元条件下で、ＧＡＨ−ＩｇＧにより、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１が単一種として検出され、還元条件下では２つの種（ＨＵＳＺ５１−ＶＨＣγ１〜３−ＤＳＰＡα１およびＨｕＳＺ５１−ＶＬＣκ）として検出される。精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１物質中には、わずかな分解産物または不純物しか明らかでない。
【０１７１】
これらの方法を用い、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１においてＣＨ２およびＣＨ３ドメインを欠くＨｕＳＺ５１Ｆａｂ’−ＤＳＰＡα１および（ＮからＣ末端に）ＳＺ５１−ＶＬ領域、続いて、ＳＺ５１−ＶＨ領域およびＤＳＰＡα１の成熟、分泌型を含む単鎖抗体であるｓｃＦｖＳＺ５１−ＤＳＰＡα１をはじめとするその他の抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡα１融合タンパク質を、純度および完全性について分析した。同様の方法が、本発明のその他の融合タンパク質を、純度および完全性について分析するために用いられる。
【０１７２】
（実施例２）
抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質の特異的ｐ−セレクチン結合活性
精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、インビトロでＰ−セレクチンと特異的に結合する能力を、ニトロセルロース結合アッセイを用いて、およびＥＬＩＳＡによって調べた。データは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は元の抗Ｐ−セレクチンモノクローナル抗体ＳＺ５１のＰ−セレクチン結合活性を保持するということを示す。
【０１７３】
１．ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、ニトロセルロースメンブレン上のＰ−セレクチンとの結合。示した量の組換え可溶性Ｐ−セレクチン（Ｒ  ＆  Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）、０、５、１０、２０または４０ｎｇを、１０ｎｇのヒトＩｇＧ１とともに、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、次いで、ニトロセルロースメンブレン上にトランスファーした。１枚のメンブレンをＨｕＳＺ５１とともにインキュベートし、第２のものはＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１とともにインキュベートした。洗浄した後、結合しているＨｕＳＺ５１またはＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１を、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦｃによって検出した。同様にＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＦｃによって検出されるヒトＩｇＧ１レーンの強度を、標準化対照として用いた。図４Ａは、ＨｕＳＺ５１およびＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、ニトロセルロースメンブレン上に固定されているＰ−セレクチンと結合するそれらの能力においては区別できないということを示す。
【０１７４】
２．ＥＬＩＳＡにおける、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のＰ−セレクチンとの結合。ウェルあたり１００μＬの組換えヒトＰ−セレクチン（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２μｇ／ｍＬ（ＰＢＳで再構成した）という最終濃度で用いて９６ウェルプレートをコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。コーティングしたプレートを洗浄溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄し、次いで、ウェルあたり２００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳで調製した５％ミルク）とともに３７℃で２時間インキュベートした。ブロッキングした後、プレートを洗浄溶液で３回洗浄し、次いで、種々の量のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ヒトＩｇＧ１またはＢＳＡを含有する１００μＬの洗浄溶液とともに３７℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄溶液で３回洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼ結合プロテインＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを洗浄溶液で４回洗浄し、次いで、１００μＬのＴＭＢ／Ｅ基質（ＺＹＭＥＤ）とともに室温で５分間インキュベートした。１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌを添加することによってペルオキシダーゼ反応を停止し、このプレートを５分以内の４５０ｎｍでの吸光度について読み取った。図４Ｂは、ヒトＩｇＧ１ではなくＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１が、プラスチック上に固定化されているＰ−セレクチンと結合できるということを示す。
【０１７５】
（実施例３）
抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質の、Ｐ−セレクチンとの競合結合
親Ｐ−セレクチン抗体、ＳＺ５１および抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のＰ−セレクチン結合親和性を比較するために、ＥＬＩＳＡベースの競合結合アッセイを設計した。９６ウェルプレートを、ウェルあたり１００μＬの組換えヒトＰ−セレクチン（Ｒ  ＆  Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を２μｇ／ｍＬという最終濃度で用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。コーティングされたプレートを、洗浄溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄し、次いで、ウェルあたり２００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳで調製した５％ミルク）とともに３７℃で２時間インキュベートした。
【０１７６】
５０μＬの段階希釈した競合物（ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１または陰性対照としてのヒトＩｇＧ１）を、０〜２００ｎＭの範囲の最終濃度で個々のウェルに加え、続いて、５０μＬのＳＺ５１（１．６ｎＭ最終）を、ブランクを除く各ウェルに添加し、次いで、このプレートを３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを洗浄溶液で３回洗浄し、次いで、二次抗体、ペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧ（ＳＡＮＴＡ  ＣＲＵＺ、＃Ｓ−２０３１）とともに３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを洗浄溶液で４回洗浄し、次いで、１００μＬのＴＭＢ／Ｅ基質（ＺＹＭＥＤ）とともに室温で５分間インキュベートした。１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌを添加することによってペルオキシダーゼ反応を停止し、このプレートを５分以内の４５０ｎｍでの吸光度について読み取った。図５に示される結果は、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１はＳＺ５１のＰ−セレクチンとの結合を用量依存性様式で阻害できるということを示し、このことは、抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質は、抗Ｐ−セレクチンマウスモノクローナル抗体と同程度または同様のＰ−セレクチン結合活性を保持するということを実証する。
【０１７７】
（実施例４）
抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質の活性化血小板結合活性
精製されたＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、インビトロでヒトまたはイヌトロンビン活性化血小板と特異的に結合する能力を、ＥＬＩＳＡによって調べた。９６ウェルプレートを、ウェルあたり１×１０６個トロンビン活性化ヒトまたはイヌ血小板を含む１００μＬの溶液を用いてコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。コーティングしたプレートを洗浄溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．４および０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０）で１回洗浄し、次いで、ウェルあたり２００μＬのブロッキング溶液（ＰＢＳで調製した５％ミルク）とともに３７℃で２時間インキュベートした。ブロッキングしたプレートを洗浄溶液で３回洗浄し、次いで、種々の量のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＳＺ５１またはヒトＩｇＧ１を含有する１００μＬの洗浄溶液とともに３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを洗浄溶液で３回洗浄し、次いで、ペルオキシダーゼ結合プロテインＬ（Ｐｉｅｒｃｅ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。このプレートを洗浄溶液で４回洗浄し、次いで、１００μＬのＴＭＢ／Ｅ基質（ＺＹＭＥＤ）とともに室温で５分間インキュベートした。１００μＬの１Ｎ  ＨＣｌを添加することによってペルオキシダーゼ反応を停止し、このプレートを５分以内の４５０ｎｍでの吸光度について読み取った。図６Ａは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＳＺ５１は、インビトロにおいてヒトトロンビン活性化血小板と特異的に結合するそれらの能力においては区別できないということを示す。図６Ｂは、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１はインビトロでイヌトロンビン活性化血小板と特異的に結合できるということを示す。
【０１７８】
（実施例５）
抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質の触媒活性
発色アッセイ（Ｂｒｉｎｇｍａｎｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５），前掲）を用いて、抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の触媒活性を、組換えＤＳＰＡα１の触媒活性と比較した。Ｓ−２２８８（Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリンジヒドロクロリド）は広範なセリプロテアーゼの発色基質である。Ｓ−２７６５（α−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリンジヒドロクロリド）は第Ｘａ因子の発色基質である。ＤＳＰＡα１のようなプラスミノーゲンアクチベーターは、これらの発色基質からｐ−ニトロアニリン（「ｐＮＡ」）基を切断する。９６ウェルプレート中に、ウェルあたり、炭酸バッファー（０．０５Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３および０．１％  Ｔｗｅｅｎ８０）、ｐＨ９．５中、１０ｎＭ  ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１または２０ｎＭ  ＤＳＰＡα１（各ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１がＤＳＰＡα１を２分子含むため等モル量）、および０．１〜０．８ｍＭ  Ｓ−２２８８またはＳ−２７６５を含有する１５０μＬという容量に反応混合物を調製する。加水分解反応を室温で進行させ、反応速度を、マイクロタイタープレートリーダーを用い、４０５ｎｍでの吸光度値の変化によって測定した。得られた値を、標準曲線を用いて［ｐＮＡ］に変換し、データをＳ−２２８８またはＳ−２７６５濃度に対してプロットした。速度パラメータＫｍ、ｋｃａｔおよびＫｍ／ｋｃａｔは、ミカエリス・メンテン方程式に従い、コンピュータプログラム（ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ  ３．０）を用いて算出した。図７に示される結果により、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１は、インビトロで同様の触媒活性を有するということが実証された。
【０１７９】
（実施例６）
抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質の線維素溶解活性
プラスミノーゲンアクチベーター、例えば、ＤＳＰＡα１は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、次いで、これがフィブリンを分解する。フィブリン分解速度は、４０５ｎｍでの吸光度値によってモニターできる（分解は吸光度値の低下を伴って進行する）。インビトロでの線維素溶解活性は、２つの血餅溶解アッセイ形式で測定した：（Ａ）プラスミノーゲンおよびフィブリノゲンを、それぞれ、酵素および基質として用いて、および（Ｂ）血漿を、酵素および基質両方の供給源として用いて。（Ａ）フィブリン血餅溶解アッセイでは、反応混合物を、９６ウェルプレート中に以下のように調製した：２０μＬのＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１（１２．５、２５および５０ｎＭ）または等モル量のＤＳＰＡα１、１０μＬのフィブリノゲン（２０ｍｇ／ｍＬ）、１μＬのプラスミノーゲン（１Ｕ／ｍＬ）、２μＬの１Ｍ  ＣａＣｌ２、６０μＬの０．０４Ｍ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび０．０１％  Ｔｗｅｅｎ８０（ｖ／ｖ）を混合した。混合物を、４μＬのトロンビン（７５Ｕ／ｍＬ）を含有する別のウェルに直ちに加えた。混合物の総容量を水で１２０μＬとした。混合した後、３７℃で４０５ｎｍでの吸光度を６０分間、毎分モニターした。データをＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈ３．０によって分析した。（Ｂ）血漿血餅溶解アッセイを、フィブリノゲンおよびプラスミノーゲンの代わりに３０μＬの再構成ヒト血漿（５１ｍｇ／ｍＬ、Ｓｉｇｍａ）を用いた以外は（Ａ）におけるように調製した。図８に示されるように、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡα１のインビトロ線維素溶解活性は、フィブリン血餅溶解アッセイにおいて区別できず（上部パネル）、血漿血餅溶解アッセイ（下部パネル）では同程度であった。
【０１８０】
（実施例７）
インビトロでの抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質の血栓溶解活性
血小板に乏しい血漿（上部パネル）または血小板が豊富な血漿（下部パネル）を用いる血餅溶解アッセイにおいてＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の血栓溶解活性を評価した。アッセイは基本的に実施例６に記載されるように実施した。血小板に乏しい血漿は、約２×１０４個の血小板／μＬを含み、血小板が豊富な血漿は約２×１０５個の血小板／μＬを含む。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα１およびｕＰＡ（Ｓｉｇｍａ）の線維素溶解活性を、血小板に乏しい血漿（上部パネル）または血小板が豊富な血漿（下部パネル）のいずれかを用いる血漿血餅溶解アッセイにおいて比較した。１ｍＬの再構成ヒト血漿中で、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα１またはｕＰＡを、Ｉ１２５標識血餅と３時間混合し、１００μＬの上清を採取して可溶性放射能を測定した。溶解パーセントは以下の通りとする：可溶性放射能／総放射能×１００％。血小板に乏しい血漿または血小板が豊富な血漿のいずれかを用いて、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のインビトロ血栓溶解活性はＤＳＰＡα１と同程度であり、ｕＰＡより優れていた。
【０１８１】
（実施例８）
インビボでの抗Ｐ−セレクチン−ＤＳＰＡ融合タンパク質の血栓溶解活性
イヌ大腿部動脈血栓溶解モデル
雄のビーグル犬（８〜１２ｋｇ）をイソフラン（２〜３％）で麻酔し、気管チューブを挿管した。左右大腿部動脈を単離し、遷音速流プローブ（２．５ＳＢ）を動脈の周囲に配置する。血液サンプリングのためおよびＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα１またはビヒクルの投与のために生理食塩水で満たしたカテーテルを左右頚静脈中に挿入する。血行動態パラメータの測定のために、Ｍｉｌｌｅｒ圧力トランスデューサーカテーテル（２Ｆｒ．）を、右上腕動脈に挿入する。切開は創傷クリップで閉じる。
【０１８２】
実験を通じて、血圧、心拍数および大腿部動脈流をモニターし、ＮＯＴＯＣＯＲＤデータ収集システムによって処理する。呼吸パターンは視覚的にモニターする。有効性のパラメータ、例えば、ＦｅＣｌ２適用後の閉塞までの時間、薬物投与後の再潅流までの時間および再潅流期間を、大腿部血流測定値から得る。薬物投与後に血管が再疎通しない動物には、再灌流時間を２４０分として記録し（全観察期間）、再灌流期間を０分として記録する。薬物投与後に大腿部血管床中に潅流された全血流は、曲線下面積（ＡＵＣ）を算出することによって求め、ベースライン値のパーセンテージとして表す。有効性の尺度として、予防血管、閉塞までの時間、再潅流の全期間および曲線下面積を算出する。
【０１８３】
左前足の４つの爪の各々を、出血時間測定に割り当てる。出血は、ネイルトリマーを用いて爪の角質を切ること（先端から約３ｍｍ）によって誘導する。傷口の出血が止まる時間を、一次出血時間として記録する。すでに凝血した爪について再出血時間をモニターし、記録する。
【０１８４】
エキソビボでのα２−抗プラスミンおよびＤＳＰＡ活性を、比色分析によって測定する。内因性α２−抗プラスミン活性は、Ｄ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−ｐ−ニトロアニリドを基質として用いて求め、活性速度論は４０５ｎｍで測定する。
【０１８５】
血行動態パラメータが安定化した後、血液（４ｍＬ）サンプルを採取し、基礎出血時間を測定する。１０％ＦｅＣｌ２に浸漬したフィルターペーパー（５×６ｍｍ）を、単離大腿部動脈に１０分間適用し、内皮を局所的に化学的に傷つける。これにより、血管内に血栓性閉塞の段階的形成が引き起こされ、大腿部動脈を完全に閉塞させる（血流＝０）。４０分という期間によって血栓を成熟させ、その後、ＤＳＰＡ投与を開始する。閉塞の２５分後に、第２の血液サンプルを採取する。閉塞の４０分後に開始して、ＤＳＰＡα１（０．１、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇ）、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１（０．３および０．７５ｍｇ／ｋｇ）またはビヒクル（１〜２ｍＬ／ｋｇ）を頚静脈中にボーラスとして注入する。薬物注入と併用して、ＦｅＣｌ２を第２の大腿部動脈に適用して、血栓形成の予防におけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１またはＤＳＰＡα１の効果を評価する。エキソビボでのα２−抗プラスミンおよびＤＳＰＡ活性について、以下の時点で、出血時間の測定を行い、血液サンプルを採取する：ベースライン、薬物投与後５、３０、６０、１２０、１８０および２４０分。
【０１８６】
このアッセイを用いると、本発明の融合タンパク質は、ＤＳＰＡα１と比較して優れた血栓溶解活性を示し、出血の危険性もより低い。
【０１８７】
（実施例９）
この実施例では、本発明の化合物を含む、代表的な経口投与用薬剤組成物の調製を例示する。
【０１８８】
【表１】
2008531023.tif 000002
上記の成分を混合し、各１００ｍｇを含むハードシェルゼラチンカプセル中に分配し、１カプセルが総一日投与量に近似する。
【０１８９】
【表２】
2008531023.tif 000003
ステアリン酸マグネシウムを除く上記の成分を混合し、水を造粒液体として用いて造粒する。次いで、製剤を乾燥させ、ステアリン酸マグネシウムと混合し、適当な打錠機を用いて錠剤に形成する。
【０１９０】
【表３】
2008531023.tif 000004
本発明の融合タンパク質をプロピレングリコール、ポリエチレングリコール４００およびポリソルベート８０に溶解する。次いで、撹拌しならが十分な量の水を加え、１００ｍＬの溶液を提供し、これを濾過し、瓶に詰める。
【０１９１】
【表４】
2008531023.tif 000005
上記の成分を融解し、混合し、濾過し、ソフト軟カプセル中に詰める。
【０１９２】
【表５】
2008531023.tif 000006
本発明の融合タンパク質を、セルロース／生理食塩水に溶解し、濾過し、使用するために瓶に詰める。
【０１９３】
（実施例１０）
この実施例は、本発明の融合タンパク質を含む、代表的な非経口投与用薬剤製剤の調製を例示する。
【０１９４】
【表６】
2008531023.tif 000007
本発明の融合タンパク質をプロピレングリコール、ポリエチレングリコール４００およびポリソルベート８０に溶解する。次いで、撹拌しながら、十分な量の０．９％生理食塩水を加え、１００ｍＬの静脈注射用溶液を提供し、これを０．２ｍメンブレンフィルターを通して濾過し、滅菌条件下でパッケージングする。
【０１９５】
（実施例１１）
この実施例は、本発明の融合タンパク質を含む、代表的な坐剤の形の薬剤組成物の調製を例示する。
【０１９６】
【表７】
2008531023.tif 000008
成分をスチームバス上で一緒に溶解し、混合し、型に注ぎ入れ、総重量２．５ｇを含む。
【０１９７】
（実施例１２）
この実施例は、本発明の融合タンパク質を含む、代表的な吹送用薬剤製剤の調製を例示する。
【０１９８】
【表８】
2008531023.tif 000009
成分を製粉し、混合し、投薬ポンプを備えた吸入器にパッケージングする
（実施例１３）
この実施例は、本発明の融合タンパク質を含む、代表的な噴霧される形の薬剤製剤の調製を例示する。
【０１９９】
【表９】
2008531023.tif 000010
本発明の融合タンパク質をエタノールに溶解し、水とブレンドする。次いで、製剤を投薬ポンプを備えたネブライザー中にパッケージングする。
【０２００】
（実施例１４）
この実施例は、本発明の融合タンパク質を含む、代表的なエアゾールの形の薬剤製剤の調製を例示する。
【０２０１】
【表１０】
2008531023.tif 000011
本発明の融合タンパク質をオレイン酸およびプロペラント中に分配する。次いで、得られた混合物を、絞り弁を取り付けたエアゾール容器中に注ぎ入れる。
【０２０２】
上記の明細書において記載されるすべての刊行物および特許は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明を、その具体的な実施形態を参照して説明したが、当業者には、種々の変法を行うことができ、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、等価物を代用できるということは理解されなければならない。さらに、特定の状態、材料、組成物、プロセス、プロセス工程または複数の工程を本発明の目的、趣旨および範囲に適合させるために多数の改変を行うことができる。すべてのこのような改変は本明細書に添付される特許請求の範囲内にあるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質および発現プラスミドの模式図である。（Ａ）Ｐ−セレクチンを標的とするＤＳＰＡ融合タンパク質。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質は、２つのＩｇ軽鎖と２つのＩｇ重鎖からなる。軽鎖は、ＳＺ５１軽鎖の可変領域（ＶＬ）と、それに続くヒトＩｇκの定常領域とからなる。重鎖は、ＳＺ５１重鎖の可変領域（ＶＨ）とそれに続くヒトＩｇＧ１の定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ならびにＤＳＰＡα１の成熟、分泌型とからなる。（Ｂ）ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１発現プラスミド。軽鎖構築物ｐＬＮＯＳＺ５１ＶＫ／Ｈｙｇｒｏ−κは、選択マーカーハイグロマイシンを含むＣＭＶプロモーター駆動性発現プラスミドである。重鎖構築物ｐＬＮＯＳＺ５１ＶＨＤＳＰＡ／Ｎｅｏは、選択マーカーネオマイシンを含むＣＭＶプロモーター駆動性発現プラスミドである。
【図２】ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のアミノ酸配列。（Ａ）ＨｕＳＺ５１−ＶＬＣκ軽鎖（配列番号１）。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質の軽鎖は、シグナルペプチド（アミノ酸１〜１９）、ＳＺ５１軽鎖の可変領域（アミノ酸２０〜１２８）およびヒトＩｇκの定常領域（アミノ酸１２９〜２３５）からなる。（Ｂ）ＨｕＳＺ５１−ＶＨＣγ１〜３−ＤＳＰＡα１重鎖（配列番号２）。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質の重鎖は、シグナルペプチド（アミノ酸１〜１９）、ＳＺ５１重鎖の可変領域（アミノ酸２０〜１３７）、ヒトＩｇＧ１の定常領域ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３（アミノ酸１３８〜４６７）およびＤＳＰＡα１の成熟、分泌型（アミノ酸４６８〜９０８）からなる。
【図３】ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロッティングによるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の解析。（Ａ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ。精製ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１融合タンパク質、組換えＤＳＰＡα１およびヒトＩｇＧ１を、非還元および還元条件下、４〜１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで分離し、次いで、クマシーブルーで染色した。（Ｂ）ウエスタンブロッティング。ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した後、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα１およびＩｇＧ１をニトロセルロースメンブレンにトランスファーした。ＤＳＰＡα１を、ビオチン化抗ＤＳＰＡモノクローナル９Ｂ３、続いてＨＲＰ−アビジンを用いる染色によって検出し、ＩｇＧ１をＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを用いル染色によって検出した。
【図４】ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、Ｐ−セレクチンとの特異的結合。（Ａ）ニトロセルロースメンブレン結合アッセイ。示された量の組換えＰ−セレクチンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、ニトロセルロースメンブレン上にトランスファーした。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１および固定化されたＰ−セレクチンとのＨｕＳＺ５１結合は、ＨＲＰ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを用いる染色によって検出した。（Ｂ）ＥＬＩＳＡ。組換えＰ−セレクチンでコーティングした９６ウェルプレートを、示した濃度のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＩｇＧ１またはＢＳＡとともにインキュベートした。Ｐ−セレクチンと結合する抗体を、Ｉｇκ軽鎖と結合するＨＲＰ結合プロテインＬを用いる染色によって検出した。
【図５】ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１は、Ｐ−セレクチンとの結合について、ＳＺ５１と競合する。ＳＺ５１およびＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１のインビトロＰ−セレクチン結合親和性を比較するために、ＥＬＩＳＡベースの競合Ｐ−セレクチン結合アッセイを用いた。組換えＰ−セレクチンでコーティングした９６ウェルプレートを、示した濃度のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１またはヒトＩｇＧ１、および固定量のＳＺ５１とともにインキュベートした。ＳＺ５１の、固定されたＰ−セレクチンとの競合結合を、ＳＺ５１と結合するが、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１と結合しないペルオキシダーゼ結合抗マウスＩｇＧとともにインキュベートすることと、続いてＴＭＢ／Ｅ基質とともにインキュベートすることによって検出した。
【図６】ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、トロンビン活性化血小板との特異的結合。（Ａ）ヒト血小板。トロンビン活性化血小板でコーティングした９６ウェルプレートを、示した濃度のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＳＺ５１またはヒトＩｇＧ１とともにインキュベートした。活性化血小板との抗体結合を、Ｉｇκ軽鎖と結合するＨＲＰ結合プロテインＬを用いる染色によって検出した。（Ｂ）イヌ血小板。トロンビン活性化血小板でコーティングした９６ウェルプレートを、示した濃度のＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１またはヒトＩｇＧ１とともにインキュベートした。活性化血小板との抗体結合を、Ｉｇκ軽鎖と結合するＨＲＰ結合プロテインＬを用いる染色によって検出した。
【図７】ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の、発色基質に対する触媒活性。Ｓ−２２８８（Ｄ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリンジヒドロクロリド）は、広い範囲のセリンプロテアーゼの発色基質である。Ｓ−２７６５（α−ベンジルオキシカルボニル−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ｐ−ニトロアニリンジヒドロクロリド）は、セリンプロテアーゼ第Ｘａ因子の発色基質である。ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１およびＤＳＰＡによる、これらの発色基質からのｐ−ニトロアニリンの加水分解を、４０５ｎｍでの吸光度の増大によって検出する。
【図８】血餅溶解アッセイにおけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の線維素溶解活性。プラスミノーゲンアクチベーター、例えば、ＤＳＰＡα１は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、これは次いで、フィブリンを分解する。４０５ｎｍでの吸光度によってモニターされるフィブリン分解速度を、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１（１２．５、２５および５０ｎＭ）について、および等モル量のＤＳＰＡα１（２５、５０および１００ｎＭ）について調べた。フィブリン血餅溶解アッセイ（上部パネル）では、フィブリノゲンおよびプラスミノーゲンをＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１またはＤＳＰＡα１と混合し、次いで、これらの混合物をトロンビンに加えた。血漿血餅溶解アッセイ（下部パネル）は、プラスミノーゲンおよびフィブリンの供給源としてヒト血漿を用いる以外は、フィブリン血餅アッセイと同様である。
【図９】血小板に乏しい血漿血餅溶解アッセイ、血小板が豊富な血漿血餅溶解アッセイにおけるＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１の血栓溶解活性。血小板に乏しい（上部パネル）または血小板が豊富な（下部パネル）血漿のいずれかを用いる、血漿血餅溶解アッセイにおいて、ＨｕＳＺ５１−ＤＳＰＡα１、ＤＳＰＡα１およびｕＰＡの線維素溶解活性を比較した。
【図１０】図１０は、配列番号３のアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１は、配列番号４のアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２は、配列番号５のアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３は、配列番号６のアミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４は、配列番号７のアミノ酸配列を示す。
【図１５】図１５は、配列番号８のアミノ酸配列を示す。
【図２】
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【図７】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図８】
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【図９】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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