(57)【要約】  神経の運命へ向かいかつ非神経の運命から離れる分化が、ＥＳ細胞でのＮｏｔｃｈシグナリングの活性化および次いで神経分化プロトコールへ細胞を移すことによって促進される。神経分化のための培地は、Ｎｏｔｃｈアクチベーター、例えば、密集し得るＮｏｔｃｈリガンドを含む。遺伝子操作がＮｏｔｃｈ活性化のための培地添加物の代替として用いられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
神経の運命への多分化能性細胞または多能性細胞の分化促進におけるＮｏｔｃｈ活性化の使用。
【請求項２】
前記細胞が、多能性である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記多能性細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記細胞が、齧歯動物または霊長動物の細胞である、請求項１、２、または３に記載の使用。
【請求項５】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
Ｎｏｔｃｈ活性化が、さらに、前記多分化能性細胞または多能性細胞から得られる神経前駆細胞または神経幹細胞の、最終分化神経細胞への分化を抑制するために用いられる、請求項１から５のいずれかの項に記載の使用。
【請求項７】
神経細胞に富む培養物を得る方法であって、
（ａ）神経または非神経のいずれかの運命へ関係づけられた子孫を形成する可能性を有する多分化能性細胞または多能性細胞を含む培養物を提供する工程；および
（ｂ）該細胞でＮｏｔｃｈシグナリングを活性化する工程
を含む、方法。
【請求項８】
前記活性化工程が、ＮｏｔｃｈレセプターまたはＮｏｔｃｈレセプターの活性化形態を細胞で発現させる工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態が、Ｎｏｔｃｈレセプターの細胞内ドメインを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記活性化工程が、Ｎｏｔｃｈリガンドを培養培地へ添加する工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、前記Ｎｏｔｃｈリガンドが、タグを含み、そして該方法が、２つのこのようなタグに結合する分子を前記培養培地へ添加する工程をさらに含む、方法。
【請求項１２】
前記活性化工程が、Ｎｏｔｃｈシグナリングの下流のエフェクターを前記細胞で発現させる工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記活性化工程が、Ｎｏｔｃｈシグナリングの下流のエフェクターおよびトランスダクションドメインを含む組成物を培養培地へ添加する工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１４】
前記エフェクターが、Ｈｅｓ転写因子およびＨｅｙ転写因子から選択される、請求項１２または１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記活性化工程が、Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態およびトランスダクションドメインを含む組成物を培養培地へ添加する工程を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１６】
前記活性化工程の前に、同時に、あるいは後に、神経の運命への分化を誘導する工程をさらに含む、請求項７から１５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項１７】
前記誘導工程が、前記細胞が培養されている培地から血清を除去する工程、血清を含まない培地へ該細胞を移す工程、該細胞が培養されている培地へ神経特異化を促進する因子を添加する工程、または神経特異化を促進する因子を含む培地へ該細胞を移す工程を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記誘導工程が、単層培養物へ前記細胞を移す工程を含む、請求項１６または１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記神経細胞を純化する工程をさらに含む、請求項７から１８のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２０】
前記純化工程が、Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化工程を維持する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記純化工程が、選択マーカーを前記神経前駆細胞で発現させる工程および該マーカーを発現する細胞を選択する工程を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記多分化能性細胞または多能性細胞に非許容である培地中で前記細胞を培養する工程を含む、請求項７から２１のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞が、多能性細胞である、請求項７から２２のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２４】
前記多能性細胞が、ＥＳ細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化する工程の後に、多能性細胞に非許容である培地中で前記細胞を培養する工程を含む、請求項２３または２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が、齧歯動物または霊長動物の細胞である、請求項７から２５のいずれかの項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
細胞でＮｏｔｃｈシグナリングを活性化する工程を含む、培養物中の神経前駆細胞の密度を増大させる方法。
【請求項２９】
前記細胞が、ヒト細胞である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態およびトランスダクションドメインを含む、組成物。
【請求項３１】
前記Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態が、Ｎｏｔｃｈレセプターの細胞内ドメインを含む、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの下流のエフェクターおよびトランスダクションドメインを含む、組成物。
【請求項３３】
前記エフェクターが、Ｈｅｓ転写因子またはＨｅｙ転写因子である、請求項３２に記載の組成物。
【請求項３４】
ｔａｔペプチドを含む、請求項３０から３３のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項３５】
ボツリヌス毒素由来のトランスロケーションドメインを含む、請求項３０から３３のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項３６】
アンテナペディア由来のトランスロケーションドメインを含む、請求項３０から３３のいずれかの項に記載の組成物。
【請求項３７】
Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態およびトランスダクションドメインの融合タンパク質。
【請求項３８】
Ｎｏｔｃｈシグナリングの下流のエフェクターおよびトランスダクションドメインの融合タンパク質
【請求項３９】
請求項３７または３８に記載の融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列。
【請求項４０】
請求項３９に記載のヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項４１】
多能性細胞および神経細胞で活性であるプロモーターを含む、請求項４０に記載のベクター。
【請求項４２】
請求項３０から３６のいずれかの項に記載の組成物、または請求項３７または３８に記載の融合タンパク質を含む、神経細胞の培養のための培地。
【請求項４３】
前記培地が、多分化能性細胞に非許容である、請求項４２に記載の培地。
【請求項４４】
前記培地が、多能性細胞に非許容である、請求項４２に記載の培地。
【請求項４５】
Ｎｏｔｃｈシグナリングが活性化されている多能性細胞。
【請求項４６】
請求項４５に記載のＥＳ細胞。
【請求項４７】
請求項４５または４６に記載のマウス細胞。
【請求項４８】
請求項４５または４６に記載のヒト細胞。
【請求項４９】
Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインを含むペプチドを発現するように設計された多能性細胞。
【請求項５０】
請求項４９に記載のＥＳ細胞。
【請求項５１】
請求項４９または５０に記載のマウス細胞。
【請求項５２】
請求項４９または５０に記載のヒト細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、方向づけられた神経分化に関する。特に、本発明は、多能性細胞の、神経の運命への分化を促進すること、非神経の運命への分化を減少させること、および神経細胞の培養物を維持すること、ならびにそのための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞研究における重要な目的は、胚性幹（ＥＳ）細胞を神経系統へ確実に変換することである。このことは２つの理由から重要である：神経特異化の機構をよりよく理解すること、および神経細胞および組織を、例えば、再生医療のために、非神経細胞による最小の汚染で提供すること。
【０００３】
この目的への最近の進歩は、ＥＳ細胞の大部分が神経前駆体になる培養条件の同定を伴ってきた（Ｙｉｎｇら，２００３ｂ）。これらの培養条件の２つの中心の特徴は、ＥＳおよび神経の両方の細胞の生存を支持すること、およびＥＳ細胞の神経特異化の重要なインヒビターである（そして血清によって提供され得る）外因性ＢＭＰのソースを欠くことである（Ｙｉｎｇら，２００３ａ）。
【０００４】
しかし、これらの最適化された培養条件下でさえ、２０％から４０％の細胞は神経特異化に抵抗する：これらの約半分は非神経系統へ分化し、一方では、他は未分化のＥＳ細胞として残る。
【０００５】
Ｎｏｔｃｈシグナリングは、隣接する細胞間のシグナリングを媒介することによって、分化の決定を調節することが、多くの異なる組織において知られている（Ｌａｉ，２００４）。ＮｏｔｃｈレセプターおよびリガンドはＥＳ細胞で発現するが、この場合のそれらの機能はこれまで知られていない。Ｎｏｔｃｈリガンドは、Ｄｅｌｔａ（Ｄｅｌｔａ１，３および４）およびＪａｇｇｅｄ（Ｊａｇｇｅｄは時々Ｓｅｒｒａｔｅとも呼ばれ、そして２つの形態、Ｊａｇｇｅｄ１およびＪａｇｇｅｄ２が同定されている）と呼ばれる２つの密接に関連したファミリーのメンバーを含む。それらはすべて細胞表面に位置する膜貫通タンパク質であり、そして隣接する細胞上のＮｏｔｃｈレセプターに結合しそしてこれを活性化する。
【０００６】
系統が関係づけられた細胞に対するＮｏｔｃｈの作用は一般に分化を阻害することであることが知られている。したがって、ＥＳ細胞は、Ｎｏｔｃｈがその標的遺伝子の転写を活性化するために必要とされ、そしてすべての４つのＮｏｔｃｈレセプターの活性を媒介すると考えられている、コアクチベーターであるＲＢＰＪｋの標的された欠失を伴って作成された（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，２００３）。これらのＥＳ細胞は中胚葉系統へうまく分化させられた−この研究の焦点は、心筋細胞へ向かいかつ他の中胚葉系統から離れる、ＥＳ由来の中胚葉のその後の分化の傾向を明らかにすることであった。
【０００７】
別の研究では、ＲＢＰＪｋ欠損ＥＳ細胞が神経球を生成し得た（Ｈｉｔｏｓｈｉら，２００２）。残念ながら、神経球培養物は非常に選択的であり、神経特異化の全体の割合に対するいかなる定量的効果についても結論づけることは困難である。
【０００８】
Ｎｏｔｃｈは、組織においてもまた研究されてきた；例えば、Ｎｏｔｃｈリガンド−Ｆｃ融合物を細胞培養培地へ添加し、そして次いで、Ｎｏｔｃｈリガンドを密集させるために抗Ｆｃ抗体を添加することによって、神経細胞でＮｏｔｃｈシグナリングを活性化する試みが知られている。しかし、これらの研究は多能性細胞に対するＮｏｔｃｈシグナリングの効果とは関連しない。
【０００９】
ＥＳ細胞から分化した細胞の純粋な集団、例えば純粋な神経細胞系統を得ることが望まれ、そしてＥＳ細胞から神経幹細胞（ＮＳＣ）を作成するためのプロトコールが存在する。たとえそうでも、数日の培養が必要とされる。これを減少させることが望まれる。
【００１０】
たとえＮＳＣが得られる場合でも、その培養物は多くの混入非神経細胞をなお含む。さらに、多くのＮＳＣが分化し、より少ししかおよびほとんど均一な培養をもたらさない。さらなる培養の制御、例えば、このように望まれるまでさらなる分化を阻害することは有利である。
【００１１】
神経細胞の培養の現存する方法に伴う別の問題は、細胞が培養条件の小さな変化に影響されやすいことである。細胞の生存は、例えばプレーティング密度の変化によってしばしば不利に影響を受ける。
【００１２】
ＥＳ細胞、特にヒトＥＳ細胞から神経の子孫を誘導する試みに伴うさらなる問題は、高密度での培養が神経の誘導を抑制する傾向があることであり、したがって、たとえより低い細胞密度が減少した細胞の生存をもたらし得ても、いかなる神経の誘導も低い細胞密度でそして結果として低い収率でのみ行われ得る。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明の目的は、多能性細胞、特にＥＳ細胞の培養物を神経の運命へ分化させる傾向を改良すること、そして好ましくはできる限り１００％に近い割合で変換を達成することである。
【００１４】
本発明の特定の実施態様のさらなる目的は、細胞にずっと最終分化を強いることなく神経幹細胞の運命への分化を促進することであり、例えば初期分化後の神経幹細胞の段階で細胞を維持することが望まれる。
【００１５】
本発明の特定の実施態様の別の目的は、神経細胞へのマウスおよびヒトの両方、および他の起源のＥＳ細胞の変換を高密度で可能にすることである。
【００１６】
本発明の特定の実施態様のよりさらなる目的は、神経細胞培養物をよりロバスト性にし、細胞の生存を強め、そして培養条件の変化の影響を減少させることである。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明において、神経特異化は、Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化によって促進される。したがって、増大したＮｏｔｃｈシグナリングは、例えばＥＳまたは他の多能性細胞の培養の間にＢＭＰおよび／または血清の除去の後、多能性細胞培養物を神経細胞の培養物へ変換するために用いられ得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
本発明の第１の局面は、神経の運命への多分化能性細胞または多能性細胞の分化促進におけるＮｏｔｃｈ活性化の使用を提供する。細胞は、好ましくは多能性幹細胞、特に胚性幹（ＥＳ）細胞である。
【００１９】
発明者らは、ＥＳ細胞が、Ｎｏｔｃｈシグナリングによって、非神経細胞の生産が減少した分化に偏り得ることを見出した。これにより、混入細胞が減少したより純粋な神経細胞培養物を得る。
【００２０】
Ｎｏｔｃｈシグナリングを活性化するために、１つの選択肢は、構成的にまたは可逆的に、Ｎｏｔｃｈの活性化形態、例えばＮｏｔｃｈの細胞内ドメインを発現させることである。下記の実施例において、Ｎｏｔｃｈを活性化形態で異所性発現させ、そしてこれが、たとえ高い細胞密度でも、培養物中の神経特異化を促進することを見出した。
【００２１】
本発明の第２の局面は、最終分化神経細胞、すなわちニューロンおよびグリアへの神経前駆細胞または神経幹細胞の分化抑制におけるＮｏｔｃｈ活性化の使用を提供する。最終分化細胞への神経前駆体の分化を防ぎまたは少なくとも遅らせるために、発明者らは、神経細胞培養物中にＮｏｔｃｈの活性化を用いた。これは、前駆体段階で神経細胞培養物を維持し、さらなる純化が、例えば、所望の最終分化細胞への分化を積極的に促進する前に行われることを可能にする。結果として、培養物およびその純度の制御が改良される。
【００２２】
本発明は、一般に、齧歯動物および霊長動物の細胞を含む、動物細胞への適用にある。特別の実施態様において、本発明はマウスまたはヒトの神経細胞を培養するために行われる。
【００２３】
本発明は、神経細胞または神経前駆細胞を含み、そして好ましくは非神経細胞を含まないまたは実質的に含まない、培養物を得るために細胞を培養する方法もまた提供する。
【００２４】
１つのこのような、神経前駆細胞に富む培養物を得る方法は、
（ａ）神経または非神経のいずれかの運命へ関係づけられた子孫を形成する可能性を有する多分化能性細胞または多能性細胞を含む培養物を提供する工程；および
（ｂ）該細胞でＮｏｔｃｈシグナリングを活性化する工程
を含む。
【００２５】
Ｎｏｔｃｈを活性化する工程は、分化を神経の運命へ方向づける唯一の手段としてか、あるいは神経特異化を刺激することが知られている因子の添加のような他の手段と組み合わせて、培養物中の神経特異化を増大させることがわかっている。
【００２６】
Ｎｏｔｃｈとは、その名前の膜貫通タンパク質をいい、これは現在、４メンバーのファミリーであることが知られており、このファミリーは、様々な同定されたリガンドに対するレセプターとして作用し、そして側抑制を介して細胞の運命の選択を媒介することが報告された。「Ｎｏｔｃｈ」および「Ｎｏｔｃｈレセプター」という用語は、文脈に応じて同じ意味を有してもよい。リガンドの結合はタンパク質の切断をもたらし、これは、Ｎｏｔｃｈの活性化形態、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインおよびＮｏｔｃｈレセプターの活性化形態と様々に呼ばれる、Ｎｏｔｃｈの細胞内の活性化形態を生じる。細胞内ドメインはＲＢＰｊｋ（ＣＢＰとしてもまた知られている）と複合体を形成し、そして複合体は核内でＤＮＡに結合し、そしてＮｏｔｃｈの標的遺伝子の転写を活性化する。ＮｏｔｃｈシグナリングおよびＮｏｔｃｈの活性化ならびにＮｏｔｃｈシグナリングの活性化とは、Ｎｏｔｃｈの活性化形態によってインビボで媒介される１以上のシグナリング経路の活性化をいい、したがって、標的遺伝子および／または他の下流のエフェクターの増大した転写をいう。
【００２７】
したがって、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、Ｎｏｔｃｈレセプターの細胞内ドメインのようなＮｏｔｃｈレセプターの活性化形態を多分化能性細胞または多能性細胞で発現させることによって活性化され得る。発明者らが行った実施例において、この活性化は、レセプターの活性化形態をコードするベクターを用いて遺伝子操作で得られた。
【００２８】
Ｎｏｔｃｈシグナリングは、Ｎｏｔｃｈリガンド、すなわち細胞表面のＮｏｔｃｈレセプターに結合するリガンドを培養培地へ添加することによってもまた活性化され得る。このアプローチは、細胞の遺伝子操作を回避し、そして簡単かつ迅速に調節および制御され得るため、他よりも好適であり得る。
【００２９】
以下の実施例で用いられそしてそこにより詳細に記載される好ましいＮｏｔｃｈリガンドは、リガンドに固有か、あるいは例えば、融合タンパク質中で付加されるいずれかのタグをさらに含み、そしてタグは、さらなる培地成分、すなわち密集分子によって結合され得る。密集分子は２以上のタグに結合し、したがって、２以上のリガンドを互いにごく近くに保持する。タグは抗体が結合するペプチド配列のような密集エピトープとも呼ばれ得る。
【００３０】
したがって、本発明の好ましい方法は、タグ付けされたリガンドおよび密集分子を培養培地へ添加する工程をさらに含む。使用において、密集分子は２以上のタグに結合し、そしてリガンドを一緒に保持する。リガンドは培養物中の細胞の表面のＮｏｔｃｈレセプターに結合し、そして結果としてＮｏｔｃｈレセプターは一緒に密接に保持され、または細胞表面上で密集する。
【００３１】
この密集はＮｏｔｃｈシグナリングの活性化の一部であり、そしてＮｏｔｃｈリガンドは、Ｎｏｔｃｈをうまく活性化するためには細胞膜に付着させる必要があり得ると考えられている−Ｎｏｔｃｈリガンドの特別に設計された可溶性形態を用いるいくつかの試みは、効果を有しないか、あるいはＮｏｔｃｈシグナリングを活性化するよりもむしろ阻害する。リガンドは一緒に密集する場合にのみ活性であり得、そしてその密集は細胞膜におけるそれらの局在によって促進される。したがって、細胞の形質膜を横切らない可溶性リガンドを用いるＮｏｔｃｈ活性化を達成するために、可溶性リガンドは、２以上のリガンド上のタグに結合し、そのため、密集分子（Ｎｏｔｃｈリガンド）２複合体を形成し、そしてＮｏｔｃｈリガンドを密集させる、別々の密集分子によって結合されるタグと組み合わされ得る。例えば、ＮｏｔｃｈリガンドとＦｃ配列との融合タンパク質は、タグ付けされたリガンドとして効果的であることがわかった。詳細には、ＵＣＬＡのＧｅｒｒｙ  Ｗｅｉｎｍａｓｔｅｒの研究室のＣａｒｏｌ  Ｈｉｃｋｓは、Ｆｃ分子と融合したＤｅｌｔａまたはＪａｇｇｅｄを有する融合タンパク質を設計した。密集は抗Ｆｃ抗体を添加することによって開始される。Ｄｅｌｔａ−ＦｃまたはＪａｇｇｅｄ−Ｆｃあるいは他のタグ付けされたリガンドは、Ｆｃ抗体と一緒に培養培地へ添加される。別の選択肢は多価形態のリガンドを提供することであり、したがって、１つのリガンドは２以上のレセプターに結合し、そしてレセプターを密集させる。Ｍｏｒｒｉｓｏｎら（Cell, 101巻, 2000年5月26日, 499-510頁）においては、Ｎｏｔｃｈシグナリングは密集分子と融合した可溶性リガンドを用いて活性化された。Ｈｕら（Cell, 115巻, 2004年10月17日, 163-175頁）においては、ＮｏｔｃｈシグナリングはＦ３をリガンドとして用いて活性化された。他の公知のＮｏｔｃｈリガンドはＣｏｎｔａｃｔｉｎ、Ｌａｇ２およびＳｅｒｒａｔｅ（Ｊａｇｇｅｄの別の用語）である。
【００３２】
多すぎる量のリガンドおよび／または抗体が用いられる場合、可溶性の密集したＦｃリガンドは異なる効果を有し得る−なぜなら、過剰はＮｏｔｃｈシグナリングの拮抗作用をもたらし得るからである。Ｆｃ−リガンドの効果は、特に用いられる抗Ｆｃ抗体の濃度に依存し得る：多すぎる抗体（特大の密集を生じると考えられる）は、アゴニストの効果よりもむしろアンタゴニストの効果を生じる無抗体（無密集）と同じ効果を有する。Hicks C, Ladi E, Lindsell C, Hsieh JJ, Hayward SD, Collazo A, Weinmaster G.「A secreted Delta1-Fc fusion protein functions both as an activatorおよびinhibitor of Notch1 signalling.」J Neurosci Res. 2002年6月15日; 68(6): 655-67を参照のこと。このことはよく知られており、そして記述されているため、当業者が、Ｎｏｔｃｈ活性化のみが得られることを確実にするために過剰の量の密集分子を回避することは簡単である。
【００３３】
Ｎｏｔｃｈシグナリングは、Ｎｏｔｃｈシグナリングの１以上の下流のエフェクターを発現させることによってもまた活性化され得る。例えば、Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインによって直接的または間接的に標的化された遺伝子産物を異所性発現させ得る。したがって、例えば、Ｎｏｔｃｈシグナリングは、ＨｅｓまたはＨｅｙ転写因子の活性を増大させるＨｅｓまたはＨｅｙ遺伝子の発現によって達成され得る。Ｎｏｔｃｈ活性化は、ＨｅｓおよびＨｅｙ遺伝子の下流の標的の増大した活性によって達成され得る。Ｎｏｔｃｈ活性化は、J. Biological Chemistry, 278巻, 45号, 2004年11月7日発行, 44808-44815頁に記載のように、Ｓａｋａｍｏｔｏらによって、Ｈｅｙ遺伝子を発現させることによって行われた。一般に、この発現は、異なる範囲のベクター、例えばトランスフェクションベクターを用いて、あるいはウイルスベクター（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス）を用いて達成され得る。
【００３４】
Ｎｏｔｃｈエフェクターはまた、Ｎｏｔｃｈエフェクターが細胞の形質膜を横切るのを可能にするトランスダクションドメインを含み、またはこれに結合され得る。このような実施態様において、トランスダクションドメインは、エフェクターが形質膜を横切り、そして培養培地から細胞に入るのを可能にする。エフェクターおよびドメインのさらなる詳細を以下に示す。
【００３５】
Ｎｏｔｃｈシグナリングは、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現する細胞、例えばＤｅｌｔａまたはＪａｇｇｅｄを発現するフィーダー細胞との共培養によってもまた活性化され得る。細胞は、Ｎｏｔｃｈリガンドを発現するように設計され、そして次いでこの目的のために用いられ得る。
【００３６】
Ｎｏｔｃｈシグナリングは、細胞培養に用いられる器具の一部をＮｏｔｃｈリガンドでコーティングすることによってもまた達成され得る。例えば、培養プレートまたはディッシュ、あるいは培養物中にあるビーズは、その表面に付与されるＮｏｔｃｈリガンドを有し得る。
【００３７】
Ｎｏｔｃｈアクチベーターを細胞で発現させる本発明の実施態様において、この発現は構成的または条件的であり得る。発現は、リコンビナーゼタンパク質、例えば、Ｃｒｅ−Ｌｏｘ系を用いて制御され得る。
【００３８】
Ｎｏｔｃｈの活性化は、上述のように、神経特異化を促進するために他の工程と共に行われ得る。Ｎｏｔｃｈ活性化の前に、Ｎｏｔｃｈ活性化と同時に、あるいはＮｏｔｃｈ活性化の後に、細胞は神経の運命へ分化するように誘導され得る。
【００３９】
この誘導は、細胞が培養されている培地中の変化によって達成され得る。１つの実施例では、誘導工程は、細胞が培養されている培地から血清を除去する工程、または血清を含まない培地へ細胞を移す工程を含む。
【００４０】
誘導は、外因性因子の添加または除去によって達成され得る。１つの実施例では、誘導工程は、細胞が培養されている培地へ神経特異化を促進する因子を添加する工程、またはこのような因子を含む培地へ細胞を移す工程を含む。適切な因子としては、レチノイン酸、およびＢＭＰアンタゴニスト（例えば、ノギン）が挙げられる。
【００４１】
誘導は、培養物の物理的性質の変化によって達成され得る。例えば、誘導工程は、単層培養物へ細胞を移す工程、無血清培養物へ細胞を移す工程、および／またはＰＡ６フィーダー層上にプレーティングする工程を含み得る。
【００４２】
一旦、神経特異化が開始されると、神経細胞の割合をさらに増加させるように、得られる培養物を純化する工程を経ることが好ましい。したがって、Ｎｏｔｃｈシグナリングは神経前駆体の分化を防ぐまたは減少させることもまたわかったため、Ｎｏｔｃｈ活性化の別の特性は、本発明に利用され得る。Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化を維持することによって、細胞はより長い期間に亘り神経前駆体として維持され得る。Ｎｏｔｃｈ活性化の維持は、Ｎｏｔｃｈリガンドを培地中に維持し続けることまたはＮｏｔｃｈアクチベーターを発現させ続けることによって達成され得る。
【００４３】
神経細胞の割合のさらなる改良は、非神経細胞の除去によって適切に行われる。特に、分化しなかった多分化能性細胞または多能性細胞が除去される必要があり得る。１つの方法は、多分化能性細胞または多能性細胞に非許容である培地または培養条件で細胞を培養すること、またはこのような培地または培養条件へ細胞を移すことである。このように、Ｎｏｔｃｈシグナリングは神経特異化を促進し、そして非許容条件は出発の多分化能性細胞または多能性細胞を除去する。
【００４４】
一般に、ＬＩＦの不在は、マウス多能性細胞に非許容である。培養物への還元剤の添加もまた、一般的に、多能性細胞に非許容である−例えば、メルカプトエタノールが培養培地へ添加され得る。細胞がより低い密度でリプレーティングされる場合、これはオートクリンＬＩＦのレベルを低下させ、そしてこれもまた多能性細胞の生存に非許容である。
【００４５】
培養物は、あるいはまたはさらに、選択マーカーの所望の神経細胞での優先的な発現を用いて改良され得る。細胞を純化する方法は、選択マーカーを神経前駆細胞で発現させる工程、およびマーカーを発現する細胞を選択する工程を含む。選択マーカーは、抗生物質が、非神経細胞の培養物を枯渇させるために選択的に用いられ得る場合には、抗生物質への耐性をコードし得、あるいはマーカーに対する抗体またはＦＡＣＳが用いられ得る場合には、細胞表面マーカーまたは蛍光タンパク質をコードし得る。他の選択の方策が知られており、そして、例えばＥＰ０６９５３５１に記載されている。
【００４６】
本発明の他の局面においては、本方法に用いられる細胞は、適切には多能性細胞、特にＥＳ細胞であり、そして別々に齧歯動物または霊長動物の細胞、特にマウスまたはヒトの細胞であり得る。得られる細胞が、ヒト多能性細胞から得られるヒト神経細胞または神経前駆細胞であることが特に好ましい。
【００４７】
本発明内での操作の実施例において、ＥＳ細胞をＮｏｔｃｈシグナリングの存在下で分化させ、ＥＳ（すなわち、分化しなかった細胞）およびＮＳ細胞の混合培養物を得た。約９０％のＮＳの割合であり、このうち６０％が放射状グリア細胞および３０％がｓｏｘ１陽性であった。次いで、この混合培養物を、ＥＳ細胞の増殖または自己再生を支持しない培地へ移した。
【００４８】
したがって、本発明は、培養物中の多能性細胞の分化の制御を改良するためにＮｏｔｃｈシグナリングを用いる。１つのアプローチは、活性化Ｎｏｔｃｈレセプターを発現させることである。別のアプローチは、細胞表面レセプターに対するリガンドを用いる。さらなるアプローチは、細胞の上または外側で結合し、そして細胞の内側でＮｏｔｃｈを活性化する１以上のリガンドを培養培地へ単に添加することである。現在公知のほとんどのリガンドは、分泌される可溶性タンパク質として正常に機能せず、そのため、これらのリガンドは、好ましくは、トランスダクションドメイン、例えば、ｔａｔペプチドと融合したＮｏｔｃｈ細胞内ドメインの可溶性型と組み合わされ、このドメインは、培養培地へ添加される場合、細胞の形質膜を横切り得る。これは、内因性Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化／切断の必要性を回避する。このアプローチは、ｃｒｅリコンビナーゼおよびＨｏｘＢ４と一緒にうまく用いられた。そして、血清（これは、膜を横切るｔａｔ融合タンパク質トランスロケーションを阻害し得る）が存在しない本発明の神経誘導系によく適している。Ｈｅｓ５の過剰発現は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインの過剰発現と同様の効果を示し、したがって、本発明の別の特定の実施態様は、ｔａｔ−Ｈｅｓ５融合物であり、そしてこれは、別の培地添加物である。Ｈｅｓ５は、過剰発現した場合、Ｎｏｔｃｈと同様の効果を有する。Ｎｏｔｃｈ活性化における使用に適切な他のリガンドとしては、一般的に、Ｈｅｓファミリー（例えば、Ｈｅｓ１、Ｈｅｓ５、Ｈｅｓ６）およびＨｅｙ遺伝子が挙げられる。
【００４９】
以下に詳細に記載する実施例において、発明者らは、Ｎｏｔｃｈが、増殖条件下（ＬＩＦ＋血清）で胚性幹細胞の自己再生を妨げないが、ＬＩＦ＋血清の除去の後に神経系統への特異化へ細胞を偏らせることを示すために、機能獲得のアプローチを用いた。Ｎｏｔｃｈの活性化形態の構成的発現は、非神経系統への分化をブロックする一方、迅速かつ同調的な神経特異化をもたらした。さらに、活性化Ｎｏｔｃｈは、ＥＳ由来細胞の最終分化をもたらさなかったが、むしろ、神経前駆体としてのそれらの増殖を可能にした。
【００５０】
発明者らのデータは、Ｎｏｔｃｈシグナリングが、標準的な神経分化プロトコールの間に細胞のサブセットによってのみ受容される神経特異化のための制限必要条件であり得ることを示唆する。本発明によれば、Ｎｏｔｃｈシグナルを受容する細胞の数を増加させることは、ＥＳ細胞または神経前駆体のいずれかとして細胞を増殖させる能力を損なうことなく、神経特異化プロトコールの効率を改良する。
【００５１】
本発明は、Ｎｏｔｃｈシグナリング経路を活性化する遺伝的および非遺伝的手段の両方を用いた。Ｄｅｌｔａ−Ｆｃ、Ｊａｇｇｅｄ−Ｆｃおよびコンタクチン−Ｆｃもまた、活性化Ｎｏｔｃｈ（ＮｏｔｃｈＩＣ）を異所性発現する場合に見られる効果を模倣して、Ｎｏｔｃｈを活性化するために用いられ得る。遺伝子操作に頼ることを回避するという利点があり、そして発明者らは、非遺伝的技術が将来有利であると考える。
【００５２】
以下でより詳細に記載する実施例において、発明者らは、Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態を異所性発現させた。構成的に活性なＮｏｔｃｈを用いて、ＥＳ細胞は、ＥＳ細胞として培養物中に維持され得るが、非神経細胞への変換は減少した。次いで、Ｎｏｔｃｈを発現させ続けたまま、分化のために、培地がＬＩＦ＋ＢＭＰまたはＬＩＦ＋血清からＮ２Ｂ２７ベースの培地へ変更される場合には、細胞は、以前よりも迅速にかつ高い％で神経細胞へ変換する。細胞はｓｏｘ１陽性、および次いでＢＬＢＰ陽性になり、そして数週間ＢＬＢＰ陽性細胞として保持され得る。増殖しない何らかのニューロンが得られる。ＢＭＰが添加される場合、非神経の分化はない（しかし、ＢＭＰはこれまで非神経を分化させると期待されてきた）。
【００５３】
本発明はそれと共に多くの好都合をもたらす。神経細胞の割合が増加しおよび非神経細胞の割合が減少する。混入する細胞は、まさにＥＳ細胞である傾向があり、これらは、非ＥＳ支持培地への移し替え、または非ＥＳ許容的条件および／または培地を採用することによって除去され得る。発明者らは、さらに、Ｎｏｔｃｈシグナリングの活性化が、遺伝子操作および外部リガンドの両方を用いて行うことが簡単であることを見出した。
【００５４】
Ｎｏｔｃｈ活性化は、ＥＳ細胞の自己再生および増殖に対する有害な影響を有しないことがわかった。これは、Ｎｏｔｃｈが活性化される多能性細胞が以前のように培養され得、そして次いで分化するように誘導される場合、非神経細胞による所望の神経培養物の汚染を減少させるためにＮｏｔｃｈ活性化が用いられるため、好都合である。
【００５５】
増大した細胞密度が達成され得、そして培養物はよりロバスト性であることがわかった。
【００５６】
本発明のさらなる局面は、培地添加物、培地およびヌクレオチドならびに一定の添加物をコードするベクターを提供する。
【００５７】
本発明のヌクレオチド配列は、Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態をコードする。Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態は、好ましくは、Ｎｏｔｃｈレセプターの細胞内ドメインを含む。この配列は、外部リガンドを用いることなくＮｏｔｃｈシグナリングを提供するために用いられ得、そして連続的なＮｏｔｃｈシグナリングを提供するように可逆的または構成的に細胞で発現され得る。好ましくはまた、Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態はＮｏｔｃｈレセプターの細胞外ドメインを欠く。
【００５８】
本発明のベクターは、このヌクレオチド配列を含む。以下の実施例で用いられる本発明の実施態様のベクターは、Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態を多能性細胞および神経細胞で発現するプロモーターを含む。ベクターは、活性化レセプターを発現するように、細胞、例えば、多能性細胞を形質転換するために用いられる。
【００５９】
本発明のさらなるヌクレオチド配列は、Ｎｏｔｃｈシグナリングの下流のエフェクターをコードする。エフェクターは、好ましくは、ＨｅｓおよびＨｅｙ転写因子から選択される。この配列はまた、外部リガンドを用いることなくＮｏｔｃｈシグナリングを提供するために用いられ得、そして連続的なＮｏｔｃｈシグナリングを提供するように可逆的または構成的に細胞で発現され得る。
【００６０】
本発明のさらなるベクターは、このヌクレオチド配列を含む。以下の実施例で用いられる本発明の実施態様のベクターは、エフェクターを多能性細胞および神経細胞で発現するプロモーターを含む。ベクターは、エフェクターを発現するように、細胞、例えば、多能性細胞を形質転換するために用いられる。
【００６１】
本発明はまた、Ｎｏｔｃｈシグナリングの下流のエフェクターまたはＮｏｔｃｈレセプターの活性化形態、およびトランスダクションドメインを含む組成物を提供する。この組成物は、Ｎｏｔｃｈシグナリングのアクチベーターを提供するように培養培地へ添加されるか、または含まれ得る。Ｎｏｔｃｈレセプターの活性化形態は、代表的にはＮｏｔｃｈレセプターの細胞内ドメインを含む。
【００６２】
トランスダクションドメインは、組成物が細胞に入るのを可能にする。多くの適切なトランスダクションドメインが、当該技術分野において知られており、そしてトランスダクションドメインまたはトランスロケーションドメインとは、タンパク質のドメインまたはフラグメントをいい、これは、それ自身および／または他のタンパク質および物質が膜または脂質二重層を横切る輸送をもたらし、そして天然のドメインならびにこの結合機能を保持するフラグメント変異体および誘導体を含む。後者の膜は、レセプター媒介エンドサイトーシスの過程の間にトランスロケーションが生じるエンドソームの膜であり得る。トランスロケーションドメインは、低いｐＨで脂質膜に測定可能な細孔を形成し得るという特性によってしばしば同定され得る（Shone et al. (1987) Eur J. Biochem. 167, 175-180が適切な試験を記載している）。したがって、トランスロケーションドメインの後者の特性は、本発明の構築物内でトランスロケーションドメインとして機能し得る他のタンパク質ドメインを同定するために用いられ得る。細菌の神経毒素由来のトランスロケーションドメインの例は以下の通りである：
Ａ型ボツリヌス神経毒素−アミノ酸残基（４４９〜８７１）
Ｂ型ボツリヌス神経毒素−アミノ酸残基（４４１〜８５８）
Ｃ型ボツリヌス神経毒素−アミノ酸残基（４４２〜８６６）
Ｄ型ボツリヌス神経毒素−アミノ酸残基（４４６〜８６２）
Ｅ型ボツリヌス神経毒素−アミノ酸残基（４２３〜８４５）
Ｆ型ボツリヌス神経毒素−アミノ酸残基（４４０〜８６４）
Ｇ型ボツリヌス神経毒素−アミノ酸残基（４４２〜８６３）
破傷風神経毒素        −アミノ酸残基（４５８〜８７９）
【００６３】
他の適切なトランスロケーションドメインは、ＴＡＴ（例えばＨＩＶ−１由来）およびペネトラチンであり、これは、共有結合されたペプチドを内部に取り入れ、および核にそれらを運搬し、またはそれらが運搬されることを可能にするアミノ酸の短い配列である。さらに適切なドメインは、アンテナペディアなどの誘導体であるＶＰ２２のようなタンパク質トランスダクションドメインと呼ばれ、Ｗａｄｉａら（２００２）に記載されている。これらのドメインは、ＮｏｔｃｈリガンドまたはＮｏｔｃｈレセプターの活性化形態に、例えば、チオール官能基を介して化学的に結合され得、または両方の構成成分を含む融合物が発現され得る。結合された分子、融合物およびこれを含む組成物は本発明の他の局面を形成する。これらは、例えば、ＮｏｔｃｈリガンドまたはＮｏｔｃｈレセプターの活性化形態で細胞をトランスフェクトすることの代替として培養培地への添加物として用いられ得る。
【００６４】
トランスロケーションドメインとの関連での「トランスロケーション」とは、細胞表面への結合の後に生じる内在化事象を意味する。これらの事象は、細胞のサイトゾルへの物質の輸送をもたらす。
【００６５】
したがって、ＥＳ細胞へのＮｏｔｃｈエフェクターまたはＮｏｔｃｈレセプターの活性化形態の送達のための組成物は、
ＮｏｔｃｈエフェクターまたはＮｏｔｃｈレセプターの活性化形態、および
ＮｏｔｃｈエフェクターまたはＮｏｔｃｈレセプターの活性化形態をＥＳ細胞内へトランスロケートするトランスロケーションドメイン：
を含む。
【００６６】
トランスロケーションドメインはまた、（１）ジフテリア毒素のＨＮドメイン、（２）ジフテリア毒素のＨＮドメインのトランスロケーション活性を実質的に保持する（１）のフラグメントまたは誘導体、（３）膜融合性ペプチド、（４）膜破壊ペプチド、および（５）（３）および（４）のトランスロケーションフラグメントおよび誘導体から選択され得る。
【００６７】
さらに、本発明の融合タンパク質をコードする単離されたヌクレオチドおよびこれらのヌクレオチドを含むベクターが、本発明により提供される。
【００６８】
神経細胞の培養のための本発明の培地は、培地中の細胞でＮｏｔｃｈシグナリングを活性化する構成成分を含む。
【００６９】
培地は、Ｎｏｔｃｈリガンドを含み得、これは多価のＮｏｔｃｈリガンドであり得、そしてそれ自身上でＮｏｔｃｈレセプターを密集させることができる。培地は、Ｎｏｔｃｈリガンド−タグ融合タンパク質および２以上のこのような融合タンパク質に結合する密集分子を含み得る。培地は、Ｎｏｔｃｈレセプターの細胞内ドメインのような活性化Ｎｏｔｃｈレセプター、または必要に応じて上記のようなトランスダクションドメインに結合されたＮｏｔｃｈエフェクターを含み得る。
【００７０】
本発明のさらなる培地は、多分化能性細胞または多能性細胞に非許容であり得る。この培地は、神経細胞へ分化しなかった細胞の培養物をさらに枯渇させるために用いられ得る。好ましい培地は、多能性細胞に非許容である。
【００７１】
本発明のよりさらなる局面は、培養物中の細胞の密度を増大させるように神経細胞の培養方法を提供し、該方法は細胞でＮｏｔｃｈシグナリングを活性化する工程を含む。Ｎｏｔｃｈ活性化は、本発明のすべての他の局面について記載されるように行われ得る。発明者らは、Ｎｏｔｃｈ活性化の不在下では、神経誘導が１０４細胞／ｃｍ２の細胞密度で低下するが、本発明と一致するＮｏｔｃｈ活性化の存在下では、神経誘導は５×１０４細胞／ｃｍ２の密度でうまく達成され得、そして得られた培養物が培養条件の小さな変化により抵抗性であり、したがって、よりロバスト性である培養物とみなされることを見出した。
【００７２】
本発明の別の局面は、細胞を自己再生状態で維持するように、多能性細胞、好ましくはＥＳ細胞の培養方法を提供し、該方法は、ＢＭＰレセプターのアゴニストを含む培地中でおよびＮｏｔｃｈ活性化の存在下で細胞を培養する工程を含む。ＢＭＰアゴニストは、適切にはＢＭＰ２およびＢＭＰ４である。Ｎｏｔｃｈ活性化は、好ましくは本発明の他の局面について本明細書に記載の通りである。
【００７３】
本発明のよりさらなる局面は、Ｎｏｔｃｈシグナリングが本発明のいずれかの実施態様によって活性化されている多能性細胞を提供する。細胞は、好ましくはマウスまたはヒトの細胞、および好ましくはＥＳ細胞である。本発明のこの局面の特定の実施態様は、Ｎｏｔｃｈ細胞内ドメインを含むペプチドを発現するように設計されたＥＳ細胞である。
【００７４】
本発明は、ここで、特定の実施例において記載され、図によって示される。
【００７５】
図１は、他に記載がない限り、ＬＩＦ＋血清中に維持されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ  ＥＳ細胞を示す。
【００７６】
図２〜９は、単層分化条件下で培養されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞、およびこれらの培養物の解析の結果を示す。
【００７７】
図１０は、フィーダー細胞上でまたは単層分化条件下で培養されたヒトＥＳ細胞、およびこれらの培養物の解析の結果を示す。
【００７８】
より詳細には：
図１は、他に記載がない限り、ＬＩＦ＋血清中に維持されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ  ＥＳ細胞を示す。（Ａ〜Ｄ）位相差下に示されたまたは示されるようにマーカーについて染色されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞のコロニー。Ｅ：Ｓｏｘ１−ＧＦＰの発現について１２継代をＦＡＣＳによって解析したＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールのＥＳ細胞の集団。Ｆ：ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＤ２の発現について１２継代をＦＡＣＳによって解析したＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールのＥＳ細胞の集団。Ｇ：ＬＩＦ＋血清中で培養されたＮｏｔｃｈＩＣ細胞（ＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞）および神経マーカーについての陽性コントロールとしてのＥ１３．５胚神経組織のＲＴ−ＰＣＲ解析。
【００７９】
図２は、単層分化条件下で培養されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を示す。Ａ：４８時間後のｓｏｘ１−ＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳプロフィール。Ｂ：三つ組培養物からの種々の時点でのｓｏｘ１−ＧＦＰ陽性細胞の割合のＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフ。Ｃ〜Ｈ：位相差で示されたまたは示されるようにマーカーについて染色された、単層分化の７２時間での無処置の培養物。Ｉ：増殖曲線は、三つ組培養物中の種々の時点での細胞の総数を示す。Ｊ：５日後のｓｏｘ１−ＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳプロフィール。
【００８０】
図３は、単層分化条件下で培養されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を示す。Ａ：種々の時点でのｓｏｘ１−ＧＦＰ陽性細胞の割合のＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフ。Ｂ〜Ｇ：位相差で示されたまたは示されるようにマーカーについて染色された種々の時点での無処置の培養物。Ｈ：単層分化の間のＢＬＢＰについての定量的ＰＣＲ。Ｉ：ｓｏｘ１−ＧＦＰ陽性神経上皮前駆体および次いでＢＬＢＰ＋の放射状グリア神経前駆体へのＥＳ細胞の移行を示す概略図。
【００８１】
図４は、単層分化条件下で培養され、そしてＯｃｔ４（赤）について染色されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を示し、神経前駆体の両方の型を一緒に示すために、ＢＬＢＰとＧＦＰ（緑）との組み合わせと一緒にＥＳ細胞を示す。
【００８２】
図５では、Ａ、Ｃ、Ｄは、位相差で示されたまたは示されるようにマーカーについて染色された、単層分化の７日目の無処置の培養物である。Ｂ：単層分化の７日後にゼラチン上にリプレーティングされ、血清不在下でさらに７日間、次いで血清および１００ユニット／ｍｌのＬＩＦの存在下で最終の７日間培養され、位相差で示されたまたはＧＦＡＰについて染色された細胞。Ｆ〜Ｋ：単層分化の７日後にラミニン上にリプレーティングされ、そしてさらに５日間（Ｆ、Ｇ、Ｈ：全１２日）、１６日間（Ｊ：全２４日）または２１日間（Ｋ：全２８日）培養され、次いで固定され、そして示されるようにマーカーについて染色された細胞。
【００８３】
図６は、４μＭのガンマセクレターゼインヒビターまたは等価量のＤＭＳＯ希釈液に曝露された４６Ｃ細胞またはＮｏｔｃｈＩＣ細胞の単層分化の後のｓｏｘ１−ＧＦＰ細胞の割合（Ａ）または無処置の培養物内のＧＦＰ発現（Ｂ、Ｃ）を示す。
【００８４】
図７は、単層分化の間のＦＧＦ５についての定量的ＰＣＲを示す。
【００８５】
図８は、中程度の（１０４細胞／ｃｍ２）またはより高い（３×１０４細胞／ｃｍ２）密度でのＮｏｔｃｈＩＣ細胞または親コントロール細胞の単層培養後のｓｏｘ１陽性細胞の割合を示すＦＡＣＳプロットを示す。
【００８６】
図９は、ＮｏｔｃｈＩＣ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を４μＭのＰＤ化合物、ＳＵ化合物の存在下で、またはＤＭＳＯ希釈液（「インヒビターなし」）の等価濃度で３日間培養した場合の結果、および３日目にＦＡＣＳによって解析したｓｏｘ１−ＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。未分化のＥＳ細胞を可視化するために、無処置の培養物を５日目にＯｃｔ４について染色した。
【００８７】
図１０は、ＧＦＰのみ（ＯＰ９ＥＶ）またはＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ１（ＯＰ９Ｄ１１）のいずれかを発現するＯＰ９フィーダー細胞上にγ−セクレターゼインヒビターと一緒に（「＋インヒビター」と示される）プレーティングされ、７日間培養され、そして示されるようにマーカーについて染色された、ヒトＥＳ細胞を示す（Ａ〜Ｉ）。（Ａ）細胞の形態を示すためのより高い倍率の写真。（Ｊ、Ｋ）Ｐａｘ６免疫染色の定量（４実験から示された平均および標準偏差）。（Ｌ〜Ｓ）γ−セクレターゼインヒビター（「インヒビター」）またはＤＭＳＯ媒体の存在下の単層分化条件下で増殖し、そして示されるようにＰａｘ６、Ｓｏｘ１またはＴＲＡ１／８１について染色された、ヒトＥＳ細胞。Ｔは、Ｐａｘ６免疫染色の定量（４実験からの平均および標準偏差）を示す。
【００８８】
本発明の特定の実施態様は、１以上の以下の配列を提供しまたは用い、これらは、それらの配列番号によって本明細書に参照される：
配列番号    説明
１          Ｎｏｔｃｈ全長ＤＮＡ
２          Ｎｏｔｃｈ全長アミノ酸
３          Ｎｏｔｃｈ細胞内ＤＮＡ
４          Ｎｏｔｃｈ細胞内アミノ酸
５          Ｈｅｙ１ＤＮＡ
６          Ｈｅｙ１アミノ酸
７          Ｈｅｙ２ＤＮＡ
８          Ｈｅｙ２アミノ酸
９          Ｈｅｓ１ＤＮＡ
１０        Ｈｅｓ１アミノ酸
１１        Ｈｅｓ３ＤＮＡ
１２        Ｈｅｓ３アミノ酸
１３        Ｈｅｓ５ＤＮＡ
１４        Ｈｅｓ５アミノ酸
１５        Ｈｅｓ６ＤＮＡ
１６        Ｈｅｓ６アミノ酸
１７        ＮｏｔｃｈＩＣ−ｔａｔの融合物
１８        ＮｏｔｃｈＩＣ−アンテナペディア由来のタンパク質トランスダクションドメインの融合物
１９        ｔａｔ−Ｈｅｙ２の融合物
２０        ｔａｔ−Ｈｅｓ５の融合物
【実施例】
【００８９】
材料および方法
４６Ｃ  ＥＳ細胞へのＮｏｔｃｈＩＣの標的化
本発明の標的化構築物は、ＲＯＳＡ遺伝子座へ標的化するために以前用いられた同様の構築物を基礎とした。それは、ｌｏｘＰ部位に隣接したｐｇｋ−ｎｅｏカセット、続いてＮｏｔｃｈＩＣの細胞内ドメインのコード配列（Ｋｏｐａｎら，１９９４）、続いて内部リボソーム進入部位、続いてヒト細胞表面分子ＣＤ２のコード配列を含む。この構築物は、エレクトロポレーションによって４６Ｃ  ＥＳ細胞（Ｙｉｎｇら，２００３ｂ）へトランスフェクトされ、そしてクローンをＧ４１８選択下で増殖させた。正しく標的化されたクローンを、ＥｃｏＲＶによる消化後サザンブロッティングによって同定した。ＤＮＡは１１ｋｂのバンドを示し、一方では、標的化されなかった野生型の細胞は３．８ｋｂのフラグメントを示す。標的化された細胞のクローンを、ｐＣＡＧプロモーターの制御下でＣＲＥを含むプラスミドでトランスフェクトした。
【００９０】
ＥＳ細胞培養
ＥＳ細胞を、ゼラチンコーティングされた組織培養フラスコ上、２−メルカプトエタノール、非必須アミノ酸、炭酸水素ナトリウム、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）および１００ユニット／ｍｌのＬＩＦを補充したＧＭＥＭ中に維持した（Ｓｍｉｔｈ，１９９１）。
【００９１】
単層分化
これは、Ｙｉｎｇら（２００３ｂ）に詳細に記載の通りである。簡潔には、ＥＳ細胞を洗浄して、血清のすべての痕跡を除去し、そして次いでゼラチンコーティングされた組織培養プラスチック上にＮ２Ｂ２７無血清培地中１×１０４細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングした。Ｎ２Ｂ２７は、１：１比のＤＭ／Ｆ１２、および（Ｙｉｎｇら（２００３ｂ）に記載のように自家製の）０．５％Ｎ２、０．５％Ｂ２７（Ｇｉｂｃｏ）および２−メルカプトエタノールを補充した神経基本培地からなる。培地を２日ごとに交換した。
【００９２】
いくつかの実験において、１００ユニット／ｍｌのＬＩＦおよび１０％ＦＣＳを培養培地に補充した。ＭＡＰＫインヒビターのＰＤ１８４３５２（Ｄｕｎｄｅｅ大学のＰ．Ｃｏｈｅｎの寄贈）を４μＭの濃度で用いた。ガンマセクレターゼインヒビター（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、カタログ番号５６５７７１）を４μＭの濃度で用いた。これらのインヒビターは、いずれも実験の時間経過に亘っていかなる明らかな毒性効果もなかった。
【００９３】
免疫蛍光法
細胞は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、そしてブロッキングバッファー（ＰＢＳ、２％ヤギ血清および０．１％トリトン）中で３０分間インキュベートした。一次抗体をブロッキングバッファーで希釈し、そして室温で１時間アプライした。ＰＢＳでの３回の洗浄後、Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒｏｐｈｏｒｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）に結合した二次抗体をブロッキングバッファーで１：１０００に希釈し、そして室温で１時間アプライした。細胞を、少なくとも３回ＰＢＳで洗浄し、そしてＯｌｙｍｐｕｓ倒立蛍光顕微鏡で可視化した。
【００９４】
細胞を数える実験において、ＤＡＰＩで核を対比染色し、そして培養物あたり少なくとも１０００細胞を３つの別々の培養物から数え、そして平均をとった。
【００９５】
一次抗体を、以下のソースから得た：
ヒトＣＤ２（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；Ｏｃｔ４（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）；ＧＦＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）；ネスチン（ＤＳＨＢ）；ＢＬＢＰ（寄贈）；ニューロンベータ−IIIチューブリン（Ｃｏｖａｎｃｅ）；ＧＦＡＰ（Ｓｉｇｍａ）；Ｏ４（ＤＳＨＢ）；ＲＣ２（ＤＳＨＢ）。Developmental Studies Hybridoma Bankから得た抗体を、ＮＩＣＨＤの援助下で開発し、そしてThe University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242によって維持した。
【００９６】
ヒトＥＳ細胞の培養および分化
未分化ヒトＥＳ細胞を、ＬＩＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＢＭＰ−４（３ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Minneapolis, Minnesota, United States））、およびｂＦＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を補充した所定の培地Ｎ２Ｂ２７中でヒト包皮線維芽細胞（ＡＴＣＣ（Manassas, Virginia, United States））の層上に維持した。細胞を、コラゲナーゼIV（１ｍｇ／ｍｌ）を用いて毎週１：２の分割比で継代した。フィーダーなしの神経分化を、マウス細胞のために用いられ、以下のようにヒトＥＳ細胞に適するように改変された単層プロトコールに従って行った：５０％コンフルエンスに達する細胞を、コラゲナーゼIV中で１５分間インキュベートし、ＰＢＳで１回洗浄し、そしてｂＦＧＦ（ＦＧＦ培地、ＬＩＦなし、ＢＭＰ４なし）を補充したＮ２Ｂ２７培地中でガラスビーズを用いて剥離させた。次いで、細胞を、ゼラチンコーティングしたフラスコ中の同じ培地中で４時間インキュベートし、フィーダー細胞を差次的に付着させた。最後に、ＥＳ懸濁液を、マトリゲル（低増殖因子Ｍａｔｒｉｇｅｌ，１：２０；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ（San Diego, California, United States））でプレコーティングした培養ディッシュに１：１比でプレーティングした。示した場合、γ−セクレターゼインヒビター（４μＭ）を、フィーダー除去工程の開始から添加し、そして次いで培地を交換した場合は１日おきに添加した。ＯＰ−９細胞との共培養のために、上記のようにｈＥＳ細胞をコラゲナーゼで処理し、そして次いで手作業で剥離させてヒト線維芽細胞の持ち越し汚染を回避した。次いで細胞を、（Ａ．Ｃｕｍａｎｏの好意により提供された）γ線照射したＯＰ９−ＥＶまたはＯＰ９−Ｄ１１ストローマ細胞の層上にＦＧＦ培地中で直接プレーティングした。マトリゲルを用いて、無血清培地中のＯＰ９の生存を促進した。γ−セクレターゼインヒビターを、プレーティングの際に添加し、そして次いで培地を交換した場合には１日おきに添加した。
【００９７】
ヒトＥＳ細胞の神経分化の定量
免疫細胞化学のために細胞を処理し、そして以下のように神経分化を定量した。ＯＰ９共培養実験について、ＰＡＸ−６陽性細胞を有するコロニーの数を数え、そしてウェル中のコロニーの総数に対して標準化した。すべての実験（フィーダーなしおよびＯＰ９依存的分化）について、速度画像解析ソフトウェア（Ｉｍｐｒｏｖｉｓｉｏｎ（Lexington, Massachusetts, United States））を用いて、分化の程度を定量した。簡潔には、ソフトウェアを用いて、ウェル（フィーダーなし実験）またはＰＡＸ−６陽性核によって覆われた各コロニー（ＯＰ９実験）の面積を計算した。次いで値を、ＤＡＰＩ染色を用いて、細胞またはコロニーによって覆われた面積に対して標準化した。すべての実験を、条件あたり４ウェルで少なくとも３回繰り返した。
【００９８】
実施例１−１
ＥＳ細胞および初期神経前駆体はＮｏｔｃｈレセプターおよびリガンドを発現する
ＲＴ−ＰＣＲを用いて、Ｎｏｔｃｈ１およびＪａｇｇｅｄ２がＥＳ細胞およびそれらの最も初期の神経誘導体で発現することを確認した。
【００９９】
実施例１−２
ＮｏｔｃｈＩＣを構成的に発現する４６Ｃ細胞の作成
Ｎｏｔｃｈの細胞内ドメインをコードする配列（Ｋｏｐａｎら，１９９４）が、ｌｏｘＰが導入された停止−ｐｇｋ−ｎｅｏカセットに続き、そしてＩＲＥＳ−ヒトＣＤ２をコードする配列に先行する標的化構築物を作成した。ヒトＣＤ２はマウス細胞に対する表現型効果を有しない細胞表面分子であり、ＮｏｔｃｈＩＣの異所性発現を示すためのタグとして本発明で用いられる。この構築物を、４６Ｃ細胞のＲＯＳＡ遺伝子座へ標的化した。４６Ｃ細胞は、初期神経マーカーｓｏｘ１の一方の対立遺伝子へ標的化されたＧＦＰのコード配列を含み、したがって、神経誘導をモニターするための簡便な実験系として作用するＥＳ細胞の系である（Ｓｔａｖｒｉｄｉｓ，２００３＃２２１）。
【０１００】
ＮｏｔｃｈＩＣ−標的化ＥＳ細胞のクローン系を、停止コドンを切除し、そしてＮｏｔｃｈＩＣ−ＩＲＥＳ−ＣＤ２の構成的転写を活性化するために、ＣＲＥでトランスフェクトした。うまく欠失した集団（「ＮｏｔｃｈＩＣ細胞」と命名した）を、ＣＤ２の発現に基づいてＦＡＣＳによって欠失しなかった集団から分離した。欠失しなかった集団を、コントロールとして用い、そしてこれらを、「欠失しなかったコントロール」と呼ぶ。（ＮｏｔｃｈＩＣで標的化されなかった）親４６Ｃ細胞を、第２のコントロール集団として用い、そしてこれらを、「親４６Ｃコントロール」と呼ぶ。両方のコントロール集団はすべての実験において同様の結果を示した。
【０１０１】
実施例１−３
ＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞はコントロールのＥＳ細胞と区別がつかない
ＮｏｔｃｈＩＣ細胞は、未分化増殖ＥＳ細胞を維持するための標準培養条件下（ＬＩＦおよび血清）で、欠失しなかったコントロールまたは親４６ＣコントロールのＥＳ細胞のいずれかと比較して、増殖速度または形態の違いを示さなかった。それらは、２０を超える継代に亘ってかなりの速度で増殖し（データを示さず）、未分化ＥＳ細胞のマーカーを発現し、そして分化のマーカーを欠いた（図１およびデータを示さず）。
【０１０２】
実施例２−１
ＮｏｔｃｈＩＣ細胞の集団は、コントロールよりもより迅速かつ均一に神経特異化を受ける
次いで、神経特異化に対するＮｏｔｃｈＩＣの効果を試験した。外因性増殖因子の不在下での付着単層培養を基礎とする神経分化プロトコール（ＹｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ，２００３）へＮｏｔｃｈＩＣまたはコントロールのＥＳ細胞を移した。細胞を脱凝集し、そして単層分化の間１２時間ごとにｓｏｘ１−ＧＦＰの発現についてＦＡＣＳによって解析した。コントロールのＥＳ細胞は、徐々にｓｏｘ１−ＧＦＰ＋の細胞を生成する：２４時間後に２％未満が検出され得、そして４８時間後には１１±１％のみであった。対照的に、ＮｏｔｃｈＩＣ培養物は、ほんの２４時間後には、９±１％のｓｏｘ１−ＧＦＰ＋の細胞を含み、２日目までに３２±３％まで増加した（図２Ａ、Ｂ）。
【０１０３】
ｓｏｘ１−ＧＦＰ＋の細胞の分布もまた、倒立蛍光顕微鏡を用いて無処置の単層分化培養物においてモニターした。コントロールのＥＳ細胞の培養物は、ＧＦＰ陰性細胞と共に散在するＧＦＰ陽性細胞を「塩と胡椒」のパターンで含む（図２Ｃ、Ｅ）。ＮｏｔｃｈＩＣの培養物では、ＧＦＰ＋の細胞の分布はより均一である（図２Ｄ、Ｆ）。細胞間のＧＦＰ強度の可変性の違いもある：ＮｏｔｃｈＩＣ細胞は、弱いＧＦＰ発現を均一に有するが、コントロールの培養物は、明るいＧＦＰ細胞と薄暗いＧＦＰ細胞との混合物を含む（図２Ｅ、Ｆ：ＦＡＣＳプロフィールＪも参照のこと）。別の初期神経マーカーであるネスチンについての染色は、神経系統へのＮｏｔｃｈＩＣ細胞の進入と一致していた（図２Ｇ、Ｈ）。
【０１０４】
ＦＧＦ５は、原始外胚葉のマーカーであり、神経組織への多能性ＥＳ細胞の分化の中間段階で一過性に発現する。コントロールのＥＳ細胞は、単層分化の最初の数日に亘って増大レベルでＦＧＦ５を獲得し、その後、Ｓｏｘ１の発現が増大するにつれて低下する（図７）。対照的に、ＮｏｔｃｈＩＣ過剰発現ＥＳ細胞は、ちょうど２４時間の分化後に高いＦＧＦ５の発現の最大ピークを有し、これらの細胞でのｓｏｘ１の迅速な誘導を保持する（図７）。このデータはまた、ＮｏｔｃｈＩＣが、神経系統へのＥＳ細胞の移行を促進することを示す。
【０１０５】
実施例２−２
ＮｏｔｃｈＩＣは、増殖を増大させない
ＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞の単層分化の間の初期に出現するｓｏｘ１−ＧＦＰ＋の細胞の高い割合は、ｓｏｘ１＋の神経細胞へのＥＳ細胞の変換速度の増大によって説明され得た。あるいは、ＮｏｔｃｈＩＣが、神経特異化に影響を及ぼさないが、代わりに、神経細胞の増殖速度を増大させることが説明され得た。コントロールのＥＳ細胞集団の神経特異化の開始前の、ほんの２４時間後にさえ著しい数のｓｏｘ１−ＧＦＰ＋の細胞があることから、第２の可能性は見込みがないと考えられる（図２Ｂ）。さらに、ＮｏｔｃｈＩＣおよびコントロール集団の増殖速度は、実験の経過の間、区別がつかない（図２Ｉ）。
【０１０６】
実施例２−３
ＮｏｔｃｈＩＣは、ＥＳ細胞の神経特異化に対する高い細胞密度の阻害効果を克服する
単層分化の間の正常なＥＳ細胞の神経誘導は、細胞密度の少しの増大によってさえ強く阻害される（図８）。ＮｏｔｃｈＩＣ細胞が、神経分化に対する細胞密度の増大の阻害効果に抵抗性であることがわかった。
【０１０７】
実施例２−４
ＮｏｔｃｈＩＣは、神経特異化におけるＦＧＦシグナリングのための必要条件を迂回しない
神経前駆体へのＥＳ細胞の分化は、外因性増殖因子を必要としないが、おそらくオートクリンＦＧＦ４（ＹｉｎｇおよびＳｍｉｔｈ，２００３）によって提供されるＦＧＦシグナリングに依存する。ＮｏｔｃｈＩＣが、この必要条件を迂回しないこと：ＭＡＰＫインヒビター：ＰＤ１８４３５２およびＦＧＦＲインヒビターのＳＵ５４０２が、両方ともＮｏｔｃｈＩＣ細胞でのｓｏｘ１の誘導をブロックし得たことがわかった（図９）。
【０１０８】
実施例３−１
Ｓｏｘ１の誘導の後にＢＬＢＰの誘導が迅速に続く
Ｓｏｘ１−ＧＦＰは、ＮｏｔｃｈＩＣ細胞の単層分化の間、一過性にのみ発現する。各個々の細胞内のｓｏｘ１−ＧＦＰの強度は、コントロールの細胞と比較して、高いレベルまで蓄積しない（図２：ＥおよびＦを比較のこと；図２Ｊもまた）。一方、全体としてのＮｏｔｃｈＩＣ集団内の発現は、３日目までにプラトーに達し、そして以後すぐに低下し始める（図３Ａ）。
【０１０９】
４日目と６日目との間に、ＮｏｔｃｈＩＣ細胞の大多数は、著しい形態変化を受けて双極性になる（図３Ｃ）。コントロールのＥＳ細胞は、この時点では、この双極形態をほんのまれに生じる（図３Ｆ）。これらの双極細胞は、ＢＬＢＰ（図３Ｃ、Ｄ）およびＲＣ２（示さず）を発現する。さらに、ＢＬＢＰの発現は、いかなる明白な形態変化にも先行し、単層分化の３日目と同じくらい初期に出現することがわかった（図３Ａ）。５日目までに、コントロール細胞の５％未満と比較して、少なくとも５０％のＮｏｔｃｈＩＣ細胞がＢＬＢＰを発現する。この時点では、ニューロン（ＴＵＪ１免疫染色）、星状膠細胞（ＧＦＡＰ免疫染色）または乏突起膠細胞（Ｏ４免疫染色）への最終分化は、ほとんどまたは全くなかった（データを示さず）。
【０１１０】
ＢＬＢＰが、単層分化の最初の数日の間にＮｏｔｃｈＩＣ細胞で迅速に誘導されるが、コントロール培養物では、最初の５日間検出不能のままであることを、定量的ＰＣＲにより確認した（図３Ｈ）。
【０１１１】
ＢＬＢＰ陽性ＲＣ２陽性放射状グリアは、インビボでは、ｓｏｘ１陽性神経上皮細胞の子孫である。用語グリアは誤解されやすい：これらの細胞は、インビボでは、ニューロンおよびグリアの両方の主要なソースであり、そして分化したグリア細胞よりもむしろ神経前駆体と考えられるべきである。ＥＳ由来神経細胞は、それらのインビボの対応物を模倣し、時間とともに初期のｓｏｘ１陽性前駆体からより後期のＢＬＢＰ陽性前駆体へ進行する（Ｃｏｎｔｉ，Ｐｏｌｌａｒｄら：（Ｂｉｂｅｌら，２００４）：図３、Ｅ、Ｆ、Ｇも参照のこと）。これらの以前の報告と一致して、ここで、ＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ由来初期神経細胞が、ＢＬＢＰ＋／神経前駆体へ迅速に形質転換することを見出し、そしてこれは、ｓｏｘ１−ＧＦＰ細胞の数が単層分化において３日を超えて増加し続けない理由を説明する。
【０１１２】
ＢＬＢＰがアップレギュレートされるにつれて、Ｓｏｘ１−ＧＦＰの発現はダウンレギュレートされ、そのため、２つのマーカーは、一般に相互排他的である（しかし、おそらくＧＦＰタンパク質の永続のため、最も初期のＢＬＢＰ＋の細胞は弱いレベルのＧＦＰを時々共発現する：データを示さず）。したがって、５日目の単層における神経前駆体の総数は、ｓｏｘ１  ＧＦＰ＋の細胞の数（約３０％）を形態的に成熟したＢＬＢＰ＋の細胞の数（５０％超）に足すことによって推定され、合計８０％を超える神経細胞になり得る。
【０１１３】
図４は、すべての神経前駆体を一緒に可視化するために、ＢＬＢＰおよびＳｏｘ１−ＧＦＰの両方について緑に染色し、未分化のＥＳ細胞を示すためにＯｃｔ４について赤に対比染色した、代表的な培養物を示す。ＮｏｔｃｈＩＣの培養物では、細胞の大多数は３日目までに神経マーカーを発現し（図４Ａ）、神経分化に抵抗する細胞のみが未分化のＥＳ細胞の少数の亜集団である（おそらくオートクリンＬＩＦシグナリングのため）。さらに３日の分化の後もなお、実際にすべての細胞が、神経またはＥＳのいずれかのマーカーの発現によって説明され得る場合がある（図４Ｃ）。これは、神経およびＥＳの両方の細胞マーカーを欠く細胞を１５〜３０％含み、そして６日目までに非神経分化細胞型の形態を有するコントロール培養物と対照的である（図４Ｂ、Ｄ）。これらの観察により、神経前駆体へのＥＳ細胞の迅速かつ比較的均一な変換をさらに確認する。それらはまた、Ｎｏｔｃｈが神経系統を支持しかつ非神経の系統から離れるように分化を偏らせることを示す。
【０１１４】
実施例４
ＮｏｔｃｈＩＣは、神経前駆体の迅速な最終分化を促進するよりもむしろそれらの維持を可能にする
Ｎｏｔｃｈシグナリング経路は、機能獲得の実験を行う状況に応じて、神経幹細胞の自己再生を促進すること（Ｏｈｔｓｕｋａら，２００１）または星状膠細胞へのそれらの分化を促進する（Ｔａｎｉｇａｋｉら，２００１）ことのいずれかが報告されている。単層分化培養物において、ＮｏｔｃｈＩＣ細胞の大多数は、ＢＬＢＰ＋ネスチン＋ＲＣ２＋の神経前駆体として少なくとも２〜３週間存続する（図５Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｊ）（それらは、外因性増殖因子の不在下では、これほど長くは生存しない）。細胞の亜集団は、第２週の培養の間に神経へ分化する（図５Ａ、Ｈ）が、これらのニューロンは、未分化のＢＬＢＰ＋の細胞に数が劣る（図５Ｃ、Ｄ、Ｆ〜Ｈ）。星状膠細胞の分化は、最初の２週の間には非常にまれにのみ生じる（＜１％：データを示さず）。星状膠細胞は、無血清培養の第３週の間に出現し始めるが、少数のままである（図５Ｋ）。乏突起膠細胞は、少しも検出されなかった。本発明の培養系では、ＮｏｔｃｈＩＣは、星状膠細胞またはあらゆる他の最終分化細胞型への迅速な分化をもたらさなかったが、むしろ神経前駆体の増殖を可能にした。
【０１１５】
実施例５
ＮｏｔｃｈＩＣの神経前駆体は、血清への曝露により星状膠細胞へ効率的に分化し得る
ほとんどのＮｏｔｃｈＩＣ神経前駆体が、第２週の間にニューロンへ分化するか、あるいは他に少なくとも３週間未分化のままであるかのいずれかの観察は、これらの細胞が顕著なグリアおよびニューロンの可能性を有するかどうかという問題を提起する。
【０１１６】
この問題に応答するために、後期神経前駆体からの星状膠細胞の分化の強力なインデューサーであるＬＩＦおよび血清で細胞を処理した。ＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ由来神経前駆体は、正常なＥＳ由来神経細胞（または初期胚性神経細胞）のように（および同様に）、それらの最初の１０〜１４日の間、ＬＩＦまたは血清のこの効果に抵抗性のままである。しかし、それらは、１４日後に血清を含む培地へ移される場合には、その後の４日に亘ってＧＦＡＰ陽性星状膠細胞へ効率的に（＞７０％）分化する（図５Ｂ）。
【０１１７】
ＮｏｔｃｈＩＣ−ＥＳ由来細胞が、無血清培養の最初の１０日の間に、著しい数のニューロンを生成し得、そしてまた、３週の培養および血清への曝露の後、高い効率で星状膠細胞へ分化し得ることの観察により、それらが神経前駆体であることを確認する。
【０１１８】
実施例６
ＥＳ細胞のＮｏｔｃｈＩＣおよび神経特異化
Ｎｏｔｃｈをインビボで活性化する重要な工程は、細胞内ドメインを遊離するためのガンマセクレターゼによるその切断である。ガンマセクレターゼインヒビターは、Ｎｏｔｃｈの活性の効果的なインヒビターである。これらのインヒビターに伴う１つの問題は、それらはＮｏｔｃｈに特異的でないことである：それらは、ガンマセクレターゼによる他の分子の切断もまた阻害する。本発明の実験においては、インヒビターのあらゆる非Ｎｏｔｃｈ特異的効果についてもＮｏｔｃｈＩＣ細胞を陰性コントロールとして用い得る；これらの細胞は、予め切断されたＮｏｔｃｈＩＣフラグメントを既に含むため、Ｎｏｔｃｈ切断に対するガンマセクレターゼインヒビターの効果に対して免疫があり、一方では、インヒビターのいかなる非Ｎｏｔｃｈ特異的効果に対しても脆弱なままである。
【０１１９】
ガンマセクレターゼインヒビターは、単層分化の間にｓｏｘ１の誘導を著しく低下させ得る。これは、Ｎｏｔｃｈ経路に対する特異的効果であると思われる。なぜなら、Ｎｏｔｃｈの構成的活性化形態を発現する細胞からは、ｓｏｘ１の誘導に対する顕著な効果がないからである（図６）。
【０１２０】
Ｔｉｍ  Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ（ＧＳＦ、Ｍｕｎｉｃｈ）から得た、Ｎｏｔｃｈシグナリングの重要な下流のメディエーターＲＢＰＪｋ（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒら，２００３）を欠く変異ＥＳ細胞を用いる、代替の機能喪失のアプローチは、それらが神経細胞へ分化できないかどうか、そしてその場合、ＲＢＰＪｋプラスミドのトランスフェクションによってこれが救出され得るかどうかを試験することである。
【０１２１】
実施例７
Ｎｏｔｃｈは、ヒトＥＳ細胞において神経特異化を促進する
発明者らは、神経分化におけるＮｏｔｃｈの役割がヒトＥＳ（ｈＥＳ）細胞で保存されるかどうかを検討した。発明者らは、ＮｏｔｃｈリガンドのＪａｇｇｅｄ１、Ｊａｇｇｅｄ２、Ｄｅｌｔａ１、およびＤｅｌｔａ３が、すべてヒトＥＳ細胞で容易にＲＴ−ＰＣＲによって検出され得ることを最初に確認した（図Ｓ７）。フィーダー細胞でのＮｏｔｃｈリガンドの異所性発現は、他の細胞型でＮｏｔｃｈを活性化することが示され、したがって、この方策をｈＥＳ細胞に用いることに決定した。
【０１２２】
レトロウイルス導入によってＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ１をＧＦＰと一緒に安定に発現するＯＰ９細胞（ＯＰ９−Ｄｅｌｔａ１）を用いた。コントロールのＯＰ９フィーダー細胞は、ＧＦＰのみのレトロウイルスを導入した（ＯＰ９−ＥＶ）。ｂＦＧＦを含むがＬＩＦまたはＢＭＰ４を含まない無血清培地中のＯＰ９−ＥＶフィーダー層上にｈＥＳ細胞をプレーティングした場合、細胞の大多数は１週後にＥＳ様形態を維持した。対照的に、同じ培地中のＯＰ９−Ｄｌ１フィーダー上に細胞をプレーティングした場合、それらがＧＦＰ＋のＯＰ９−Ｄｌ１フィーダー細胞と接触するコロニーの縁は、第１週内に形態変化を受けた（図１０）。それらは、かろうじて識別可能な核を伴って緻密におよび細長くなった（図１０Ａ、点線の間の領域）。抗体染色により、これらの細胞がＥＳマーカーＴＲＡ１／６０およびＴＲＡ１／８１について陰性であり（未発表データ）、そしてＳｏｘ１、ネスチン、およびＰａｘ６について陽性であることを確認した（図１０Ｂ、１０Ｃ、および未発表データ）。ヒトＥＳ細胞では、Ｐａｘ６は神経分化の最も初期の公知のマーカーであり、Ｓｏｘ１が発現し始める前の数日に出現する。画像解析ソフトウェアを用いて、このマーカーの定量を行った。これにより、Ｐａｘ６＋のコロニー（１０を超えるＰａｘ６＋の細胞を含むコロニー）の数、およびＯＰ９−ＥＶコロニーと比較してＯＰ９−Ｄｌ１に支持された培養物中のこれらの各コロニー内のＰａｘ６＋である面積の両方に顕著な増加を確認した（図１０Ｄ〜１０Ｇ、１０Ｊ、および１０Ｋ、ｐ＜０．０１）。神経分化に対するＯＰ９−Ｄｌ１フィーダーの正の効果は、特異的にＮｏｔｃｈシグナリングの活性化によると思われた。なぜなら、それはガンマセクレターゼインヒビターを添加することによってブロックされ得たからである（図１０Ｈ〜１０Ｋ、ｐ＜０．０１）。Ｄｅｌｔａ１またはγ−セクレターゼインヒビターへの曝露はいずれも、細胞数または生存率に対するいかなる識別可能な効果も有さなかった。
【０１２３】
内因性のＮｏｔｃｈシグナリングがｈＥＳ細胞での神経分化に必要とされるかどうかを試験し続けた。これらの実験のために、マウスＥＳ細胞についてのものから適合した単層神経分化プロトコールを用いた。簡潔には、フィーダーから、そして外因性ＬＩＦおよびＢＭＰ４からｈＥＳを取り出し、そしてＦＧＦのみの無血清培地中のマトリゲル上にプレーティングした。これらの条件下で、代表的には約６０％の培養面積がＥＳ細胞のマーカーＴＲＡ１／８１の発現を失い、神経の形態をとり、そして１週後にＳｏｘ１＋Ｐａｘ６＋になる（図１０Ｌ、１０Ｍ、１０Ｐ、１０Ｒ、および１０Ｔ）。対照的に、γ−セクレターゼインヒビターの存在下では、培養物内のＰａｘ６＋の領域の出現は顕著に減少し（図１０Ｍ、１０Ｏ、１０Ｑ、１０Ｓ、および１０Ｔ、ｐ＜０．５）、対応して未分化のＴＲＡ１／８１＋のＥＳ細胞の持続が増大する（図１０Ｏ）。γ−セクレターゼインヒビターは、細胞の生存率または細胞数に対する明らかな効果を有さず、そして処理された細胞の大多数は、健常なｈＥＳ様形態を保持した（図１０Ｍ）。
【０１２４】
これらのデータは、ＮｏｔｃｈがヒトＥＳ細胞で神経分化を促進することを示す。
【０１２５】
実施例８
ＮｏｔｃｈＩＣは、非神経分化を抑制する
単層分化の６日目の内胚葉および中胚葉のマーカーの発現を測定するために定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。いくつかの非神経マーカーを親細胞試料中に容易に検出し、Ｒ２６ＮｏｔｃｈＩＣ細胞でのかろうじて検出可能な発現レベルと著しく対照的であった。これらの観察は、Ｎｏｔｃｈは神経系統への進入を促進するのみでなく、同時に非神経への関係づけを抑制することも示す。
【０１２６】
Ｒ２６−ＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞はまた、バッチ試験した血清の存在下のコラーゲンIV上の単層培養に基づく誘導分化プロトコール下で試験した場合、中胚葉の分化の著しい減少を示した。
【０１２７】
参考文献
Bain, G., Ray, W. J., Yao, M.,およびGottlieb, D. I. (1996). Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun 223, 691-4.
Bibel, M., Richter, J., Schrenk, K., Tucker, K. L., Staiger, V., Korte, M., Goetz, M.,およびBarde, Y. A. (2004). Differentiation of mouse embryonic stem cells into a defined neuronal lineage. Nat Neurosci 7, 1003-9.
Gaiano, N., Nye, J. S.,およびFishell, G. (2000). Radial glial identity is promoted by Notch1 signalling in the murine forebrain. Neuron 26, 395-404.
Hitoshi, S., Alexson, T., Tropepe, V., Donoviel, D., Elia, A. J., Nye, J. S., Conlon, R. A., Mak, T. W., Bernstein, A.,およびvan der Kooy, D. (2002). Notch pathway molecules are essential for the maintenance, but not the generation, of mammalian neural stem cells. Genes Dev 16, 846-58.
Kopan, R., Nye, J. S.,およびWeintraub, H. (1994). The intracellular domain of mouse Notch: a constitutively activated repressor of myogenesis directed at the basic helix-loop-helix region of MyoD. Development 120, 2385-96.
Lai, E. C. (2004). Notch signalling: control of cell communication and cell fate. Development 131, 965-73.
Li, Y.,およびBaker, N. E. (2001). Proneural enhancement by Notch overcomes Suppressor-of-Hairless repressor function in the developing Drosophila eye. Curr Biol 11, 330-8.
Morrison, S. J., Perez, S. E., Qiao, Z., Verdi, J. M., Hicks, C, Weinmaster, G.,およびAnderson, D. J. (2000). Transient Notch activation initiates an irreversible switch from neurogenesis to gliogenesis by neural crest stem cells. Cell 101, 499-510.
Nakamura, Y., Sakakibara, S,, Miyata, T., Ogawa, M., Shimazaki, T., Weiss, S., Kageyama, R.,およびOkano, H. (2000). The bHLH gene hes1 as a repressor of the neuronal commitment of CNS stem cells. J Neurosci 20, 283-93.
Ohtsuka, T., Sakamoto, M., Guillemot, F.,およびKageyama, R. (2001). Roles of the basic helix-loop-helix genes Hes1 and Hes5 in expansion of neural stem cells of the developing brain. J Biol Chem 276, 30467-74.
Schroeder, T., Fraser, S. T., Ogawa, M., Nishikawa, S., Oka, C, Bornkamm, G. W., Honjo, T.,およびJust, U. (2003). Recombination signal sequence-binding protein Jkappa alters mesodermal cell fate decisions by suppressing cardiomyogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 100, 4018-23.
Smith, A. G. (1991). Culture and differentiation of embryonic stem cells. J. Tiss. Cult. Meth 13, 89-94.
Tanigaki, K., Nogaki, F., Takahashi, J., Tashiro, K., Kurooka, H.,およびHonjo, T. (2001). Notch1 and Notch3 instructively restrict bFGF-responsive multipotent neural progenitor cells to an astroglial fate. Neuron 29, 45-55.
Ying, Q. L., Nichols, J., Chambers, L,およびSmith, A. (2003a). BMP induction of Id proteins suppresses differentiation and sustains embryonic stem cell self-renewal in collaboration with STAT3. Cell 115, 281-92.
Ying, Q. L.,およびSmith, A. G. (2003). Defined conditions for neural commitment and differentiation. Methods Enzymol 365, 327-41.
Ying, Q. L., Stavridis, M., Griffiths, D., Li, M.,およびSmith, A. (2003b). Conversion of embryonic stem cells into neuroectodermal precursors in adherent monoculture. Nat Biotechnol 21, 183-6.
【０１２８】
したがって、本発明は、多能性細胞培養物の神経へ方向づけられた分化、およびそのための方法および組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０１２９】
【図１−１】他に記載がない限り、ＬＩＦ＋血清中に維持されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ  ＥＳ細胞を示す。（Ａ〜Ｄ）位相差下に示されたまたは示されるようにマーカーについて染色されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞のコロニー。Ｅ：Ｓｏｘ１−ＧＦＰの発現について１２継代をＦＡＣＳによって解析したＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールのＥＳ細胞の集団。
【図１−２】他に記載がない限り、ＬＩＦ＋血清中に維持されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ  ＥＳ細胞を示す。Ｆ：ＮｏｔｃｈＩＣ−ＣＤ２の発現について１２継代をＦＡＣＳによって解析したＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールのＥＳ細胞の集団。Ｇ：ＬＩＦ＋血清中で培養されたＮｏｔｃｈＩＣ細胞（ＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞）および神経マーカーについての陽性コントロールとしてのＥ１３．５胚神経組織のＲＴ−ＰＣＲ解析。
【図２−１】単層分化条件下で培養されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を示す。Ａ：４８時間後のｓｏｘ１−ＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳプロフィール。Ｂ：三つ組培養物からの種々の時点でのｓｏｘ１−ＧＦＰ陽性細胞の割合のＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフ。
【図２−２】単層分化条件下で培養されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を示す。Ｃ〜Ｈ：位相差で示されたまたは示されるようにマーカーについて染色された、単層分化の７２時間での無処置の培養物。
【図２−３】単層分化条件下で培養されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を示す。Ｉ：増殖曲線は、三つ組培養物中の種々の時点での細胞の総数を示す。Ｊ：５日後のｓｏｘ１−ＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳプロフィール。
【図３−１】単層分化条件下で培養されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を示す。Ａ：種々の時点でのｓｏｘ１−ＧＦＰ陽性細胞の割合のＦＡＣＳ解析の結果を示すグラフ。Ｈ：単層分化の間のＢＬＢＰについての定量的ＰＣＲ。Ｉ：ｓｏｘ１−ＧＦＰ陽性神経上皮前駆体および次いでＢＬＢＰ＋の放射状グリア神経前駆体へのＥＳ細胞の移行を示す概略図。
【図３−２】単層分化条件下で培養されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を示す。Ｂ〜Ｇ：位相差で示されたまたは示されるようにマーカーについて染色された種々の時点での無処置の培養物。
【図４】単層分化条件下で培養され、そしてＯｃｔ４（赤）について染色されたＮｏｔｃｈＩＣ  ＥＳ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を示し、神経前駆体の両方の型を一緒に示すために、ＢＬＢＰとＧＦＰ（緑）との組み合わせと一緒にＥＳ細胞を示す。
【図５−１】Ａは、位相差で示されたまたは示されるようにマーカーについて染色された、単層分化の７日目の無処置の培養物である。Ｂ：単層分化の７日後にゼラチン上にリプレーティングされ、血清不在下でさらに７日間、次いで血清および１００ユニット／ｍｌのＬＩＦの存在下で最終の７日間培養され、位相差で示されたまたはＧＦＡＰについて染色された細胞。
【図５−２】Ｃ、Ｄは、位相差で示されたまたは示されるようにマーカーについて染色された、単層分化の７日目の無処置の培養物である。
【図５−３】Ｆ〜Ｋ：単層分化の７日後にラミニン上にリプレーティングされ、そしてさらに５日間（Ｆ、Ｇ、Ｈ：全１２日）、１６日間（Ｊ：全２４日）または２１日間（Ｋ：全２８日）培養され、次いで固定され、そして示されるようにマーカーについて染色された細胞。
【図６】４μＭのガンマセクレターゼインヒビターまたは等価量のＤＭＳＯ希釈液に曝露された４６Ｃ細胞またはＮｏｔｃｈＩＣ細胞の単層分化の後のｓｏｘ１−ＧＦＰ細胞の割合（Ａ）または無処置の培養物内のＧＦＰ発現（Ｂ、Ｃ）を示す。
【図７】単層分化の間のＦＧＦ５についての定量的ＰＣＲを示す。
【図８】中程度の（１０４細胞／ｃｍ２）またはより高い（３×１０４細胞／ｃｍ２）密度でのＮｏｔｃｈＩＣ細胞または親コントロール細胞の単層培養後のｓｏｘ１陽性細胞の割合を示すＦＡＣＳプロットを示す。
【図９】ＮｏｔｃｈＩＣ細胞または親コントロールの４６Ｃ細胞を４μＭのＰＤ化合物、ＳＵ化合物の存在下で、またはＤＭＳＯ希釈液（「インヒビターなし」）の等価濃度で３日間培養した場合の結果、および３日目にＦＡＣＳによって解析したｓｏｘ１−ＧＦＰ陽性細胞の割合を示す。未分化のＥＳ細胞を可視化するために、無処置の培養物を５日目にＯｃｔ４について染色した。
【図１０−１】ＧＦＰのみ（ＯＰ９ＥＶ）またはＮｏｔｃｈリガンドＤｅｌｔａ１（ＯＰ９Ｄ１１）のいずれかを発現するＯＰ９フィーダー細胞上にγ−セクレターゼインヒビターと一緒に（「＋インヒビター」と示される）プレーティングされ、７日間培養され、そして示されるようにマーカーについて染色された、ヒトＥＳ細胞を示す（Ａ〜Ｉ）。（Ａ）細胞の形態を示すためのより高い倍率の写真。
【図１０−２】（Ｌ〜Ｓ）γ−セクレターゼインヒビター（「インヒビター」）またはＤＭＳＯ媒体の存在下の単層分化条件下で増殖し、そして示されるようにＰａｘ６、Ｓｏｘ１またはＴＲＡ１／８１について染色された、ヒトＥＳ細胞。
【図１０−３】（Ｊ、Ｋ）Ｐａｘ６免疫染色の定量（４実験から示された平均および標準偏差）。Ｔは、Ｐａｘ６免疫染色の定量（４実験からの平均および標準偏差）を示す。
【図１−１】
2008532509.tif 000002
【図１−２】
2008532509.tif 000003
【図２−１】
2008532509.tif 000004
【図２−２】
2008532509.tif 000005
【図２−３】
2008532509.tif 000006
【図３−１】
2008532509.tif 000007
【図３−２】
2008532509.tif 000008
【図４】
2008532509.tif 000009
【図５−１】
2008532509.tif 000010
【図５−２】
2008532509.tif 000011
【図５−３】
2008532509.tif 000012
【図６】
2008532509.tif 000013
【図７】
2008532509.tif 000014
【図８】
2008532509.tif 000015
【図９】
2008532509.tif 000016
【図１０−１】
2008532509.tif 000017
【図１０−２】
2008532509.tif 000018
【図１０−３】
2008532509.tif 000019
【配列表】
2008532509000001.xml
【国際調査報告】
2008532509.tif 000080
2008532509.tif 000081
2008532509.tif 000082
2008532509.tif 000083