(57)【要約】ダプトマイシンは、バイオフィルムの処理（特に、Ｓ．エピデルミディスに感染したカテーテルに対する中心静脈カテーテルの救済）に用いることができる。ダプトマイシンを用いたカテーテルの救済は、迅速な殺菌性、静止期細菌に対する活性、バイオフィルムへの浸透および活性を示す。本発明は、ダプトマイシンに関与するバイオフィルム処理またはカテーテル救済に有用な製剤、方法、および製品を提供する。特定の製剤は、バイオフィルムの細菌に対して迅速な殺菌曲線を有するラクトリンゲル溶液中のダプトマイシンを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトリンゲル液中のダプトマイシンおよび抗凝固剤を含む、カテーテルのバイオフィルムを処理するためのダプトマイシン製剤。
【請求項２】
前記溶液中のダプトマイシンが少なくとも１ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のダプトマイシン製剤。
【請求項３】
前記溶液中のダプトマイシンが少なくとも５ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のダプトマイシン製剤。
【請求項４】
前記溶液中のダプトマイシンが少なくとも１０ｍｇ／ｍＬである、請求項１に記載のダプトマイシン製剤。
【請求項５】
前記抗凝固剤がカルシウムと結合しない、請求項１に記載のダプトマイシン製剤。
【請求項６】
カテーテルのバイオフィルムのレベルを減少させるための方法であって、ラクトリンゲル液中のダプトマイシンの溶液をカテーテルに提供し、これによりカテーテルのバイオフィルムのレベルを減少させることを含む、方法。
【請求項７】
前記溶液が少なくとも３０分間提供される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオフィルムが検出不能なレベルまで減少する、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記バイオフィルムが減少し、再発しない、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶液が１日１回投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記溶液が１日２回投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記溶液が少なくとも１日４回投与される、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記溶液中のダプトマイシンの濃度が少なくとも１ｍｇ／ｍＬである、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記溶液中のダプトマイシンの濃度が少なくとも５ｍｇ／ｍＬである、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
バイオフィルムを処置するのに十分な量のダプトマイシンを有するラクトリンゲル液を含む、カテーテルのバイオフィルムを処理するためのキット。
【請求項１６】
カルシウムおよび抗凝固剤を含む溶液中のダプトマイシンを含む、カテーテルのバイオフィルムを処理するためのダプトマイシン製剤。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）は、長期治療を必要とする場合がある状態、例えば疼痛、感染もしくは癌を治療するためのまたは栄養分を供給するための薬剤を患者に提供するために用いられている。中心静脈カテーテルは、皮膚表面に近い静脈内に薬剤を輸送する静脈内（ＩＶ）カテーテルよりも長期に留置することができる。バイオフィルムは、ＣＶＣに発生する場合があり、ＣＶＣの表面上およびこの中で細菌、例えばＳ．エピデルミディス（Ｓ．  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の蓄積を含む。バイオフィルムは、処理することが困難である。これは、細菌の中には静止期にある細菌もいて、および／またはバイオフィルムは侵透することが困難である場合があるからである。
【発明の開示】
【０００２】
発明の要旨
バイオフィルム処理（特に、Ｓ．エピデルミディスに感染したカテーテルに対する中心静脈カテーテルの救出（ｓａｌｖａｇｅ））は、ダプトマイシンで行うことができる。ダプトマイシンを用いたカテーテルの救出は、迅速な殺菌性、静止期の細菌に対する活性、およびバイオフィルムへの侵透および活性を含んでいよう。本発明は、ダプトマイシンを伴うバイオフィルム処理またはカテーテル救出に有用な製剤、方法、および製品を提供する。特定の製剤は、ラクトリンゲル液中にダプトマイシンを含む。
【０００３】
発明の詳細な説明
インビボモデルの概説
Ｓ．エピデルミディスのグリコカリックス（ｇｌｙｃｏｃａｌｙｘ）を産生する臨床分離株を用いて、ＣＶＣ感染のラットモデルを確立した。感染したカテーテルを通した採血によって、および剖検で末梢組織における細菌総量の測定によって感染を観測した。治療のシミュレーションでのダプトマイシン（５ｍｇ／ｍｌで３０分の注入）は、一時的に、検出不能なレベルまでカテーテル感染を減少させたが、感染の再起はよく見られた。ロック療法のシミュレーションでのダプトマイシン（５ｍｇ／ｍｌで１８時間ロック）は、治療的であり、再起を防止した。このモデルでのバンコマイシン（ロック療法での治療的である）はまた、臨床データは非常に制限されているが、認められている臨床経験とは反対に高レベルの有効性を有していた。
【実施例】
【０００４】
（本発明の特定の実施例）
Ａ．ＣＶＣ感染のラットモデル
頸静脈にカテーテルが挿入された雄性スプラーグ・ドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ）ラット（約２５０ｇ）をこれらの試験に用いた。ラットのカテーテル（ポリウレタン製チューブ、内径０．０２５インチ）にＳ．エピデルミディスの培養物を５×１０８ＣＦＵ／ｍｌで接種した。カテーテル全量は、約４０μｌである。接種後１時間で、カテーテルをヘパリン処理した生理食塩水で洗い流し、毎日の洗浄によって維持した。カテーテルの感染は、毎日、採血を平板培養し、定量することによって監視した。
【０００５】
ダプトマイシン、バンコマイシンおよびナフシリンを治療に用いた。２種類の投与計画を用いた。第１は、全４日間、１日１回の３０分間の輸液ラインでダプトマイシンを５ｍｇ／ｍｌで投与する臨床注入を模倣し、毎日２回の６０分間の５ｍｇ／ｍｌでのバンコマイシンと比較した。第２の処方計画は、５ｍｇ／ｍｌでのダプトマイシンまたはバンコマイシンの１８時間曝露を用いた抗生物質のロック療法を模倣し、３日間毎日ヘパリン処理した生理食塩水で洗浄した。両方の処方計画では、動物は、皮下経路によって適切な抗生物質を非経口的に投与され、生体全体への曝露を模倣した（５ｍｇ／ｍｌで輸液ラインを介した正確な投薬量を投与することが不可能であったためである。）。大半の試行は、治療期間を必要とし、生き残った細菌コロニーが原因となる感染の再発を監視するための抗生物質療法を行わない期間があった。
【０００６】
感染レベルは、感染したカテーテルを通した毎日の採血によって観測した。最終の摘出については、最終の採血がなされ、次に、洗浄したカテーテルが摘出され、超音波、ボルテックスおよび平板培養によって生き残った細菌について分析した。大静脈、心臓、肺、腎臓および脾臓を、無菌的な摘出、均質化および平板培養によって潜在的な移転性感染部位として分析した。
【０００７】
ラットモデルにおけるＣＶＣ救出結果
Ｓ．エピデルミディスのいくつかの異なる分離株をＣＶＣモデルで試験した。分離株１３１５および１３１８が、カテーテルの感染および抗生物質の感受性に基づいてさらに試験するために選ばれた。
【０００８】
【表１】
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【０００９】
【表２】
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【００１０】
図１は、感染したカテーテルを通した採血によって観察された、安定なＣＶＣ感染が、接種後の第１日から第８日を通じて、５から６ｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍｌで維持されていたことを示す。ＣＶＣ採血カウント［黒塗りシンボル］は、摘出したカテーテル［白抜きシンボル］から回収したカウントと類似していた。第５から７日の採血後に与えられた３０分間のダプトマイシン（ラクトリンゲル中）の顕著な効果は、採血および摘出したカテーテルのＣＦＵカウント［第６から８日］の両方によって示された。
【００１１】
図２は、採血によって、および摘出したカテーテルの超音波によって回復したＣＦＵにおいて良好な相関があることを示す（Ｒ２＝０．８１）。
【００１２】
図３は、ＣＶＣ感染に対するダプトマイシン注入療法の有効性を示す。ダプトマイシン（白抜き三角、白抜き菱形）は日に１回投与され、バンコマイシン（黒塗り菱形）は日に２回投与され、両者は、治療３日後（第８日）、検出不能なレベルまでカテーテル感染を最大に減少させた。摘出したカテーテル（第９日）は、採血と同様のＣＦＵカウントを示した。生理食塩水で処理したＣＶＣ感染は、感染経路を通じて＞１×１０５ＣＦＵ／ｍｌの血液を生じた。
【００１３】
図４は、転移性感染におけるダプトマイシンおよびバンコマイシン注入療法の有効性を示す。生理食塩水で処理したＣＶＣ感染は、カテーテル先端への近接に比例して転移性感染を示した。大静脈、より少ない程度に肺および心臓組織の全ては、Ｓ．エピデルミディスの回復可能なＣＦＵを示した。脾臓および腎臓は、ＣＦＵをほとんどない示さないかまたは全く示さなかった。ダプトマイシンおよびバンコマイシン療法（図３としての同じシンボルキー）の両方は、いずれの部位でも非常に少ない転移性感染を示した。
【００１４】
図５は、ＣＶＣ感染の再発予防におけるダプトマイシン（生理食塩水およびラクトリンゲル注入）およびバンコマイシンの有効性を記録する。生理食塩水［白抜き菱形］またはリンゲル［黒塗り菱形］中のダプトマイシン（３０分間の投薬、１日１回、第５から８日）は、第９日までに検出不能なレベルまで感染を減少させた。ｄＨ２Ｏ中のバンコマイシン（６０分間の投薬、１日２回、第５から８日）（白抜き三角）は、第８日までに陰性の採血培養物を生じた。抗生物質を含まないヘパリン洗浄の６日後（第１５日）、ダプトマイシン−生理食塩水で処置した動物のうち３／６は、カテーテルを通した陽性採血を生じた。ダプトマイシン−ラクトリンゲルグループに関しては、たった１／６が、陽性採血を生じた。摘出したカテーテルは、ダプトマイシン−生理食塩水グループの５／６、およびダプトマイシン−リンゲルグループの３／６において、陽性なＳ．エピデルミディスＣＦＵを生じた。バンコマイシンで処置した動物は、第１５日で、０／６の陽性採血および２／６の陽性カテーテルを生じた。ラクトリンゲル中のダプトマイシンは、応答速度に関して生理食塩水中のダプトマイシンより優っており、有効性を維持していた。
【００１５】
図６は、ＣＶＣ感染におけるロック療法（１８時間曝露ＱＤ×３）の有効性を示す。ロック療法（第５、６および７日）によって与えられた３種の抗生物質は、全て一時的に浄化された採血をもたらした（第８日）。抗生物質を含まないヘパリン洗浄の７日後、全ナフシリン処置した動物は、陽性カテーテルを生じた。ダプトマイシン処置した動物については、０／６が陽性採血を示し、摘出時に１／６が陽性カテーテル（低い感染レベル）を示した。バンコマイシン処置した動物は、陽性の採血およびカテーテルを示さなかった。
【００１６】
図７は、移転性感染におけるロック療法の有効性を示す。バンコマイシンおよびダプトマイシンのロック療法はともに、ＳＣ投薬と組み合わせて、浄化し、転移性感染の再発を防止した。ナフシリン処置した動物はかなりの割合で、複数の部位で陽性の転移性感染を示した。
【００１７】
ＣＶＣ感染およびカテーテルの得られたバイオフィルムの性質は、組織病理学を通じて決定された。組織病理学のデータは、下記のように要約することができる。
【００１８】
１．移植後８日、ラットの中心静脈カテーテルモデルは、カテーテルの内腔面において細菌コロニーの有無を問わずに局所的なバイオフィルムを発生する。この時点で、バイオフィルの厚さは、７から１５ミクロンで変化する。
【００１９】
２．移植後１２日、内腔面のバイオフィルムを形成する原線維は、より密集され、より組織化されているように見え、バイオフィルム層は僅かに厚くなっている（最大２５ミクロン）。
【００２０】
３．生理食塩水の陰性対照では、細菌コロニーが、バイオフィルムに存在し、グラム陽性菌として同定された。
【００２１】
４．カテーテルを介した５ｍｇ／ｍＬのダプトマイシン処理は、バイオフィルム形成を防止しなかったが、バイオフィルムのグラム陽性菌コロニーの成長および存在を妨げた。しかしながら、球菌様のグラム陽性の個々の円形構造体があった。
【００２２】
５．カテーテルを通した５ｍｇ／ｍＬのバンコマイシン処理は、バイオフィルム形成を防止せず、またはバイオフィルムのグラム陽性菌コロニーの成長および存在を完全には妨げなかった。
【００２３】
図８は、カテーテル先端および大静脈の周辺組織でのＣＶＣ感染の写真を示す。
【００２４】
感染後第８日で、バイオフィルムが、留置カテーテルの大部分の内腔面に存在していた。これらのバイオフィルムは、表面に強く付着していた。これらのバイオフィルムは、数が変化する好塩基性顆粒状細菌コロニーと混ざって、好酸性の線維状から顆粒状の材料から構成されていた。グラム菌株は、グラム陽性菌である細菌コロニーであることが判明した。また、グラム染色した断面は、黄色がかった色から金色の線維組織としてバイオフィルムを着色し、＜５から２５ミクロンまで変化する。最後に、内皮表面は、軽度の過形成、および内皮下の線維性肥厚を示した。感染後第８日でのバイオフィルムの出現を示す図９を参照されたい。
【００２５】
未処理のラットでの移植後第１２日で、前回と同じく、バイオフィルムは、留置カテーテルの内腔面に存在する傾向にあり、厚さは５から２５ミクロン、数が変化する好塩基性顆粒状細菌コロニー（グラム菌株であると判明した）を含んでいた。しかしながら、前回とは対照的に、内腔のタンパク円柱（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃａｓｔ）の焦点部分は、より組織化されているように見え、無数の青みがかった細菌コロニーを含んでいた。感染後第１２日でのバイオフィルムの出現を示す図１０を参照されたい。図１０に示されるように、インビボでの細菌バイオフィルムに対するそれぞれ３０分および６０分の点滴注入によるダプトマイシンおよびバンコマイシンの有効性の組織病理学的証拠を調査した。ラットＡ１は負の対照として用い、生理食塩水（カテーテルを介した２ｍＬ／ｋｇ  ＳＣ＋生理食塩水）を受け；ラットＡ６は、低い投薬量のダプトマイシン（カテーテルを介した１０ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ＋５ｍｇ／ｍＬ）を受け；ラットＡ１２は、高い投薬量のダプトマイシン（カテーテルを介した３３ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ＋５ｍｇ／ｍＬ）を受け；ラットＡ１７は、バンコマイシン（カテーテルを介した５０ｍｇ／ｋｇ  ＳＣ＋５ｍｇ／ｍＬ）を受けた。４匹のラットの組織を評価した。下記の図１１は、４匹全てのラットに関する所見で構成されている。
【００２６】
図１１は、注入療法の４日後のダプトマイシンおよびバンコマイシンの有効性の組織病理学的証拠を提供する。図１１では、左から右へ、画像は、それぞれラットＡ１、Ａ６、Ａ１２、およびＡ１７のＣＶＣ組織を示す。上段の画像は、全てＨ＆Ｅ染色され、下段の画像は、全てグラム染色である。実際の細菌コロニー（赤および青の矢印）を含むバイオフィルムは、生理食塩水で処理したラット（Ａ１）およびバンコマイシンで処理したラット（Ａ１７）にのみ同定された。ラット＃Ａ１２は、高い投薬量のダプトマイシンを受けているが、ピンポイントの大きさの青色に染色した円形構造物（グラム染色）を有する焦点を示した。これらの円形構造体は、細胞膜を包囲するかまたは取り囲んでいた。これらの円形の物体は、細菌コロニーであるとは解明されていない。
【００２７】
（実施例２）
静止期細菌のインビトロモデル
静止期細菌における抗菌化合物の殺菌活性の影響を評価した。Ｓ．エピデルミディスおよびＳ．アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の培養物は、静止期（＞１×１０９）まで成長させ、遠心分離し、２回洗浄し、次に、生理食塩水またはラクトリンゲル液に再懸濁させた。５ｍｇ／ｍｌのダプトマイシンまたはバンコマイシンのいずれかを用いて培養物を処理し、生菌の減少を２４時間中測定し、殺菌動力学を測定した。
【００２８】
生理食塩水では、ダプトマイシンおよびバンコマイシンのいずれも、Ｓ．エピデルミディスの静止期培養物に対して殺菌活性がなかった。図１２を参照されたい。
【００２９】
図１３は、静止期のＳ．エピデルミディスに対するラクトリンゲル中の５ｍｇ／ｍｌのダプトマイシンおよびバンコマイシンの活性を比較する。ラクトリンゲルでは、ダプトマイシンは、Ｓ．エピデルミディスの静止期培養物に対して迅速に殺菌性であった。これに関する１つの可能な説明としては、ラクトリンゲル液は、生理学的濃度のカルシウムを提供するということである。バンコマイシンはラクトリンゲルでは殺菌活性がなかった。
【００３０】
（実施例３）
バイオフィルムのインビトロモデル（Ｒ．Ｐａｔｅｌら、２００５）
メチシリン耐性凝固的陰性ブドウ球菌のバイオフィルムを、ガラス製試験管中で２４時間、約１０５細胞／ｃｍ２まで成長させ、浮遊細菌を洗い流し、抗菌剤を含むミューラー・ヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ）ブロス（ダプトマイシン試験では５０ｍｇ／ｍＬまでカルシウムを補給した）を試験管に添加した。試験した抗菌剤の濃度は、６４から１μｇ／ｍＬまで２倍希釈したダプトマイシン、リファンピン、またはダプトマイシン＋０．５μｇ／ｍＬのリファンピンであった。検査体は、大気中で３７℃で一晩温置した。リンスしたバイオフィルム中の細胞密度は、抗菌剤の添加前および温置後に測定した。抗菌剤を用いた温置後の細菌密度の変化を測定し、バイオフィルムの細菌の９９．９％を殺菌した抗菌剤の最低濃度として表した。リファンピンを含む検査体から回復した細菌は、リファンピン感受性について試験した。
【００３１】
インビトロでの細菌活性は、≦３２μｇ／ｍＬのダプトマイシンを用いた３０のうち２７個の分離株において、メチシリン耐性凝固的陰性ブドウ球菌のバイオフィルムに対するダプトマイシンについて観察した。リファンピン耐性の出現は、リファンピンへの曝露後に、２７のうち５個の分離株において検出され、ダプトマイシン＋０．５μｇ／ｍＬのリファンピンへの曝露後に、２７のうち６個の分離株において検出された；ダプトマイシンは、ＭＲＣＮＳバイオフィルムにおいてリファンピン耐性の出現を防げなった。
【００３２】
【表３】
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【００３３】
結論
インビトロでは、ダプトマイシンは、静止期のＳ．エピデルミディスに対して細菌性であり、バンコマイシンは細菌性ではなかった。
【００３４】
ラットの中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）では、Ｓ．エピデルミディスで発生したバイオフィルムモデルは、ラットの右心房内に伸長する頸部カテーテルにおいて確かめられた安定な感染を提供した。カテーテルのバイオフィルム（厚さ２５μｍ）は、組織病理学的に観察された。感染したカテーテルを通した採血による重度感染（１０５ＣＦＵ／ｍｌ）が見られ、より低い感染密度は血液および臓器（しかし、カテーテル先端に最も近いところで高く、例えば、大静脈、心臓、肺）において観察された。感染したＣＶＣを通した採血は、感染レベルと相関した。
【００３５】
カテーテルに染み込ませた５ｍｇ／ｍｌ（臨床的な輸液濃度）のダプトマイシンは、治療的に効果があった。より短期（３０分間）の曝露（５ｍｇ／ｍＬ、ＱＤ×４）で、バイオフィルムを検出不能なレベルまで減少させが、感染の再起が一般的であった。より長期のロック療法（１８時間）曝露（５ｍｇ／ｍＬ、ＱＤ×４）は、バイオフィルムを検出不能なレベルまで減少させ、感染の再起を大幅に防いだ。ラクトリンゲル（カルシウムを含む）に染み込ませたダプトマイシンは、生理食塩水に染み込ませたダプトマイシンと比較して、顕著に優れた効果を提示した。
【００３６】
バンコマイシンは、このモデルでは、インビトロでの静止期のＳ．エピデルミディスに対して（リンゲル中のダプトマイシンと）同等に効果的であったが、ダプトマイシンはラクトリンゲル中で殺菌性であり、バンコマイシンは殺菌性ではなかった。最後に、インビトロにおいて、メチシリン耐性凝固的耐性ブドウ球菌のバイオフィルムに対して、ダプトマイシンは、リファンピンよりも低濃度で殺菌性であった。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】カテーテル感染の安定性、およびダプトマイシン処置の短期間の効果、およびＣＶＣ採血と摘出したＣＶＣ（ＣＦＵ／ｍｌ）カウントの相関を示す。
【図２】採血によって測定したＣＦＵと摘出したカテーテルからのＣＦＵとの間の相関を示す。
【図３】ＣＶＣ感染に対するダプトマイシンおよびバンコマイシンの有効性を比較する（３０または６０分の注入、第６から９日）。
【図４】転移性感染に対するダプトマイシンおよびバンコマイシン注入療法の有効性を比較する。
【図５】ＣＶＣ感染の再発防止におけるダプトマイシン（生理食塩水およびリンゲル注入）およびバンコマイシンの有効性を比較する。
【図６】ＣＶＣ感染におけるロック療法（１８時間曝露ＱＤ×３）の有効性を比較する。
【図７】転移性感染におけるロック療法の有効性を示す。
【図８】カテーテル先端および大静脈の周辺組織でのＣＶＣ感染の観察を示す。
【図９】感染後第８日のバイオフィルムの出現を示す。
【図１０】感染後第１２日のバイオフィルムの出現を示す。
【図１１】注入療法の４日後、ダプトマイシンおよびバンコマイシンの有効性の組織病理学的証拠を比較する。
【図１２】静止期のＳ．エピデルミディスに対する生理食塩水中の５ｍｇ／ｍｌダプトマイシンおよびバンコマイシンの活性を比較する。
【図１３】静止期のＳ．エピデルミディスに対するラクトリンゲル中の５ｍｇ／ｍｌダプトマイシンおよびバンコマイシンの相対活性を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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