(57)【要約】  癌に対する個体の感受性は、放射線のような変異原性作用因子に対する個体の細胞の応答に基づいて評価される。成長抑制マーカーのレベルは、個体細胞が変異原性作用因子へ暴露される前及び暴露された後に測定される。変異原性作用因子の結果としての癌に対する個体の感受性は、成長抑制マーカーが上記作用因子への暴露により誘導される度合いに相関する。個体においてビタミン又は食品抽出物のような化合物の癌予防効果を評価する方法も開示される。個体由来の細胞を、少なくとも１つの化合物とともにｉｎ  ｖｉｔｒｏでインキュベートするか、又は化合物を個体へ直接投与して、その後、インキュベートされた細胞並びにインキュベートされていない細胞の一部を、電離放射線のような変異原性作用因子に暴露する。続いて、化合物とともにインキュベートされ、かつ変異原性作用因子に暴露された細胞における成長抑制マーカーのレベルを、上記作用因子に暴露されたインキュベートされていない細胞におけるレベルと比較する。化合物の癌予防効果は、インキュベートされた細胞においてマーカーのレベルがより高いことと相関する。
2008503206.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体において癌に対する感受性を決定する方法であって、
前記個体の細胞を、変異原性刺激剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露すること、
前記個体の暴露された細胞及び暴露されていない細胞において、成長抑制マーカーのレベルを測定すること、並びに
前記暴露された細胞及び暴露されていない細胞におけるマーカーレベルの差に基づいて、前記個体の癌に対する感受性を決定すること
を含む方法。
【請求項２】
前記細胞は前記個体の全血に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
測定されるレベルは、ｍＲＮＡのレベルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記個体はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記成長抑制マーカーは細胞分裂抑制マーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記細胞分裂抑制マーカーはｐ２１である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記成長抑制マーカーは細胞破壊マーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞破壊マーカーはＢＡＸである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異原性刺激剤は電離放射線である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記癌に対する感受性は、前記成長抑制マーカーのレベルが暴露後に大きく増大する場合に、減少すると決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記癌に対する感受性は、前記成長抑制マーカーのレベルが暴露後に増大しない、あるいはわずかしか増大しない場合に、増大すると決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
複数の成長抑制マーカーのレベルが測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記複数の成長抑制マーカーは、少なくとも１つの細胞分裂抑制マーカー及び少なくとも１つの細胞破壊マーカーを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞分裂抑制マーカーはｐ２１であり、前記細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
個体において癌に対する感受性を決定する方法であって、
前記個体の種に属する複数の個体に由来する細胞において、細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで変異原性刺激剤に暴露した後の成長抑制マーカーのレベルの平均ベースライン測定値を得ること、
前記個体の細胞を、変異原性刺激剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露すること、
前記細胞において、成長抑制マーカーの暴露後のレベルを測定すること、及び
癌に対する前記個体の感受性を決定すること
を含み、前記平均ベースライン測定値に比べて高いレベルは癌の危険性がより低いことを
示し、前記平均ベースライン測定値に比べて低いレベルは癌の危険性がより高いことを示すことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記細胞は前記個体の全血に由来する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記測定されるレベルは、ｍＲＮＡのレベルである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記個体はヒトである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記成長抑制マーカーは細胞分裂抑制マーカーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記細胞分裂抑制マーカーはｐ２１である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記成長抑制マーカーは細胞破壊マーカーである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞破壊マーカーはＢＡＸである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記変異原性刺激剤は電離放射線である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
複数の成長抑制マーカーのレベルが測定される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記複数の成長抑制マーカーは、少なくとも１つの細胞分裂抑制マーカー及び少なくとも１つの細胞破壊マーカーを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞分裂抑制マーカーはｐ２１であり、前記細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
個体における癌予防効果のための化合物をスクリーニングする方法であって、
前記個体の細胞を化合物とともにインキュベートすること、
前記個体のインキュベートされた細胞及びインキュベートされていない細胞を、変異原性刺激剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露すること、
前記個体の暴露された細胞、及びインキュベートされておらず、かつ暴露されていない細胞において、成長抑制マーカーのレベルを測定すること、並びに
前記インキュベートされた細胞及びインキュベートされていない細胞における暴露後の前記成長抑制マーカーのレベルの差に基づいて、癌予防効果を有する化合物を同定すること
を含む方法。
【請求項３０】
前記成長抑制マーカーのレベルは、変異原性刺激剤に暴露されていないインキュベートされた細胞において測定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞は前記個体の全血に由来する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記測定されるレベルはｍＲＮＡのレベルである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記個体はヒトである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記成長抑制マーカーは細胞分裂抑制マーカーである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞分裂抑制マーカーはｐ２１である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記成長抑制マーカーは細胞破壊マーカーである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞破壊マーカーはＢＡＸである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記変異原性刺激剤は、電離放射線である、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
複数の成長抑制マーカーのレベルが測定される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
前記複数の成長抑制マーカーは、少なくとも１つの細胞分裂抑制マーカー及び少なくとも１つの細胞破壊マーカーを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞分裂抑制マーカーはｐ２１であり、前記細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記成長抑制マーカーの暴露後のレベルを、インキュベートされた細胞において、インキュベートされていない細胞に比べてより大きく増大させる化合物が、癌予防効果を有すると同定されることを特徴とする、請求項２９に記載の方法。
【請求項４４】
インキュベートされた暴露されていない細胞において、前記成長抑制マーカーのレベルを、インキュベートされておらず、かつ暴露されていない細胞と比較して全くあるいはわずかしか増大させず、かつ、インキュベートされた細胞において、前記成長抑制マーカーの暴露後のレベルをインキュベートされていない細胞に比べてより大きく増大させる化合物が、副作用の危険性がより低い癌予防効果を有すると同定されることを特徴とする、請求項３０に記載の方法。
【請求項４５】
個体において癌予防に効果的な化合物を決定する方法であって、
前記個体から細胞を取り出すこと、
前記個体へ少なくとも１つの化合物を投与すること、
前記化合物の投与後に前記個体から細胞を取り出すこと、
投与前及び後に取り出された前記細胞を、変異原性刺激剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露すること、
投与前に取り出された暴露された細胞及び暴露されていない細胞において、成長抑制マーカーのレベルを測定すること、並びに
投与前及び後に取り出された細胞において、前記成長抑制マーカーのレベルの暴露後の差に基づいて、前記化合物の癌予防効果を決定すること
を含む方法。
【請求項４６】
前記成長抑制マーカーのレベルは、変異原性刺激剤に暴露されていない投与後に取り出された細胞において測定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞は前記個体の全血に由来する、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記測定されるレベルはｍＲＮＡのレベルである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
前記個体はヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
前記成長抑制マーカーは細胞分裂抑制マーカーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞分裂抑制マーカーはｐ２１である、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記成長抑制マーカーは細胞破壊マーカーである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５３】
前記細胞破壊マーカーはＢＡＸである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記変異原性刺激剤は電離放射線である、請求項４５に記載の方法。
【請求項５６】
複数の成長抑制マーカーのレベルが測定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５７】
前記複数の成長抑制マーカーは、少なくとも１つの細胞分裂抑制マーカー及び少なくとも１つの細胞破壊マーカーを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記細胞分裂抑制マーカーはｐ２１であり、前記細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
投与後に取り出された細胞において、前記成長抑制マーカーの暴露後のレベルを投与前に取り出された細胞と比較してより大きく増大させる化合物が、癌予防効果を有すると同定される、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
投与後の暴露されていない細胞において、投与前の暴露されていない細胞と比較して前記成長抑制マーカーのレベルを全くあるいはわずかしか増大させず、かつ、投与後に取り出された細胞において、前記成長抑制マーカーの暴露後のレベルを投与前に取り出された細胞に比べてより大きく増大させる化合物が、副作用の危険性がより低い癌予防効果を有すると同定される、請求項４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、個体において癌に対する感受性を測定する方法に関する。本発明はさらに、個体において癌予防効果のための化合物をスクリーニングする方法に関する。
【０００２】
［関連出願］
本出願は、１１９条（ｅ）の下、２００４年５月２５日に出願された仮出願第６０／５７４，２４８号からの優先権を主張した非仮出願である。
【背景技術】
【０００３】
癌は、ＤＮＡ損傷作用因子への身体の暴露による、体細胞におけるＤＮＡ突然変異の結果として発生する可能性がある。かかる作用因子としては、放射線、化学物質、食品及びフリーラジカルが挙げられる。ほとんどのＤＮＡ損傷は、適切な細胞応答により修正されるが、重要なゲノム部位での多重的なＤＮＡ損傷の蓄積が癌を招く可能性がある。したがって、癌感受性は、各個体におけるＤＮＡ損傷と、対応する細胞応答との間の平衡に依存する。ＤＮＡ損傷応答障害は、毛細血管拡張性運動失調のような稀な疾患において高頻度で癌を誘導することが知られている。
【発明の開示】
【０００４】
個体において癌に対する感受性を決定する方法の一実施形態においては、個体の細胞を、変異原性刺激剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露し、その個体の暴露された細胞及び暴露されていない細胞において、成長抑制マーカーのレベルを測定し、かつ暴露された細胞及び暴露されていない細胞におけるマーカーのレベルの差に基づいて、癌に対する個体の感受性を決定する。
【０００５】
本実施の形態の一態様において、細胞は、個体の全血に由来する。本実施の形態のさらなる態様において、測定されるレベルは、ｍＲＮＡのレベルである。本実施の形態のさらなる態様において、個体はヒトである。本実施の形態のさらなる態様において、成長抑制マーカーは、細胞分裂抑制マーカーである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞分裂抑制マーカーはｐ２１である。本実施の形態のさらなる態様において、成長抑制マーカーは、細胞破壊マーカーである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞破壊マーカーはＢＡＸである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである。
【０００６】
本実施の形態のさらなる態様において、変異原性刺激剤は、電離放射線である。本実施の形態のさらなる態様において、癌に対する感受性は、成長抑制マーカーのレベルが暴露後に大きく増大する場合に、減少すると決定される。本実施の形態のさらなる態様において、癌に対する感受性は、成長抑制マーカーのレベルが暴露後に増大しないあるいはわずかしか増大しない場合に、増大すると決定される。
【０００７】
本実施の形態のさらなる態様において、複数の成長抑制マーカーのレベルが測定される。本実施の形態のさらなる態様において、複数の成長抑制マーカーは、少なくとも１つの細胞分裂抑制マーカー及び少なくとも１つの細胞破壊マーカーを包含する。本実施の形態のさらなる態様において、細胞分裂抑制マーカーはｐ２１であり、細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである。
【０００８】
個体において癌に対する感受性を決定する方法の別の実施の形態においては、当該個体の種に属する複数の個体から、細胞における成長抑制マーカーのレベルの平均ベースライ
ン測定値を、該細胞を変異原性刺激剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露した後に取得し、当該個体の細胞を変異原性刺激剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露し、暴露後に、該細胞における成長抑制マーカーのレベルを測定し、そして、癌に対する個体の感受性を決定する。ここで、前記平均ベースライン測定値よりも高いレベルは、癌の危険性がより低いことを示し、前記平均ベースライン測定値よりも低いレベルは、癌の危険性がより高いことを示す。
【０００９】
本実施の形態の一態様において、細胞は、個体の全血に由来する。本実施の形態のさらなる態様において、測定されるレベルはｍＲＮＡのレベルである。本実施の形態のさらなる態様において、個体はヒトである。本実施の形態のさらなる態様において、成長抑制マーカーは、細胞分裂抑制マーカーである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞分裂抑制マーカーはｐ２１である。本実施の形態のさらなる態様において、成長抑制マーカーは、細胞破壊マーカーである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞破壊マーカーはＢＡＸである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである。
【００１０】
本実施の形態のさらなる態様において、変異原性刺激剤は、電離放射線である。本実施の形態のさらなる態様において、複数の成長抑制マーカーのレベルが測定される。本実施の形態のさらなる態様において、複数の成長抑制マーカーは、少なくとも１つの細胞分裂抑制マーカー及び少なくとも１つの細胞破壊マーカーを包含する。本実施の形態のさらなる態様において、細胞分裂抑制マーカーはｐ２１であり、細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである。
【００１１】
個体における癌予防効果のための化合物をスクリーニングする方法の一実施形態においては、個体の細胞を化合物とともにインキュベートし、その個体のインキュベートされた細胞及びインキュベートされていない細胞を変異原性刺激剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露し、その個体の暴露された細胞、及びインキュベートされておらず、かつ暴露されていない細胞において、成長抑制マーカーのレベルを測定し、インキュベートされた細胞及びインキュベートされていない細胞における、暴露後の成長抑制マーカーのレベルの差に基づいて、癌予防効果を有する化合物を同定する。本実施の形態の一態様においては、成長抑制マーカーのレベルは、変異原性刺激剤に暴露されていないインキュベートされた細胞において測定される。
【００１２】
本実施の形態のさらなる態様において、細胞は、個体の全血に由来する。本実施の形態のさらなる態様において、測定されるレベルはｍＲＮＡのレベルである。本実施の形態のさらなる態様において、個体はヒトである。本実施の形態のさらなる態様において、成長抑制マーカーは、細胞分裂抑制マーカーである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞分裂抑制マーカーはｐ２１である。本実施の形態のさらなる態様において、成長抑制マーカーは、細胞破壊マーカーである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞破壊マーカーはＢＡＸである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである。本実施の形態のさらなる態様において、変異原性刺激剤は、電離放射線である。本実施の形態のさらなる態様において、複数の成長抑制マーカーのレベルが測定される。本実施の形態のさらなる態様において、複数の成長抑制マーカーは、少なくとも１つの細胞分裂抑制マーカー及び少なくとも１つの細胞破壊マーカーを包含する。本実施の形態のさらなる態様において、細胞分裂抑制マーカーはｐ２１であり、細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである。
【００１３】
本実施の形態のさらなる態様においては、インキュベートされた細胞において、成長抑制マーカーの暴露後のレベルを、インキュベートされていない細胞に比べてより大きく増大させる化合物が、癌予防効果を有すると同定される。本実施の形態のさらなる態様においては、インキュベートされた暴露されていない細胞において、成長抑制マーカーのレベ
ルを、インキュベートされておらず、かつ暴露されていない細胞と比較して全くあるいはわずかしか増大させず、かつ、インキュベートされた細胞において、成長抑制マーカーの暴露後のレベルをインキュベートされていない細胞に比べてより大きく増大させる化合物が、副作用の危険性がより低い癌予防効果を有すると同定される。
【００１４】
個体において癌予防に効果的な化合物を決定する方法の別の実施の形態においては、個体から細胞を取り出し、当該個体へ少なくとも１つの化合物を投与し、化合物の投与後に個体から細胞を取り出し、投与前及び後に取り出された細胞を、変異原性刺激剤にｉｎ  ｖｉｔｒｏで暴露し、投与前に取り出された暴露された細胞及び暴露されていない細胞において成長抑制マーカーのレベルを測定し、投与前及び後に取り出された細胞における成長抑制マーカーのレベルの暴露後の差に基づいて、化合物の癌予防効果を決定する。本実施の形態の一態様において、成長抑制マーカーのレベルは、投与後に取り出された変異原性刺激剤に暴露されていない細胞において測定される。
【００１５】
本実施の形態のさらなる態様において、細胞は個体の全血に由来する。本実施の形態のさらなる態様において、測定されるレベルはｍＲＮＡのレベルである。本実施の形態のさらなる態様において、個体はヒトである。本実施の形態のさらなる態様において、成長抑制マーカーは、細胞分裂抑制マーカーである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞分裂抑制マーカーはｐ２１である。本実施の形態のさらなる態様において、成長抑制マーカーは、細胞破壊マーカーである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞破壊マーカーはＢＡＸである。本実施の形態のさらなる態様において、細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである。
【００１６】
本実施の形態のさらなる態様において、変異原性刺激剤は電離放射線である。本実施の形態のさらなる態様において、複数の成長抑制マーカーのレベルが測定される。本実施の形態のさらなる態様において、複数の成長抑制マーカーは、少なくとも１つの細胞分裂抑制マーカー及び少なくとも１つの細胞破壊マーカーを包含する。本実施の形態のさらなる態様において、細胞分裂抑制マーカーはｐ２１であり、細胞破壊マーカーはＰＵＭＡである。
【００１７】
本実施の形態のさらなる態様においては、投与前に取り出された細胞よりも投与後に取り出された細胞において成長抑制マーカーの暴露後のレベルをより大きく増大させる化合物が、癌予防効果を有すると同定される。本実施の形態のさらなる態様においては、投与後の暴露されていない細胞において、成長抑制マーカーのレベルを投与前の暴露されていない細胞と比較して全くあるいはわずかしか増大させず、かつ、投与後に取り出された細胞において、成長抑制マーカーの暴露後のレベルを投与前に取り出された細胞に比べてより大きく増大させる化合物は、副作用の危険性がより低い癌予防効果を有すると同定される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
いかなる特定の理論により拘束されることも望まないが、本発明者らは、癌を発症する危険性が、ＤＮＡ損傷に対する変更された応答に起因し得ると考える。さらに、ＤＮＡ損傷に対する応答の改善は、癌に対する防御能力の増大を示し得る。したがって、本発明の一態様は、個体の細胞に対するＤＮＡ損傷の影響に基づいて、特定の個体において、癌感受性を測定する方法及び化合物の癌予防効果を評価する方法に関する。この方法の一実施形態は、全血細胞のような細胞におけるマーカーｍＲＮＡのレベルの測定に依存する。この目的に適したｍＲＮＡレベルの測定を遂行する方法は、米国特許出願公開第２００４／０２６５８６４号（これは、参照により本明細書に援用される）に開示されていた。本発明で使用されるｍＲＮＡ測定方法は、以下の通りに要約され得る。
【００１９】
全血におけるｍＲＮＡの測定
開示される方法において使用されるｍＲＮＡ測定プロトコルは、より大量の未調製の全血の分析を可能にし、専ら白血球に由来するｍＲＮＡを分析する効率的な手段を提供し、ｒＲＮＡ及びｔＲＮＡを除去し、安定したｍＲＮＡ回収を提供し、容易に自動化に適合できる。リアルタイムＰＣＲを使用した絶対的な定量化及び２０〜２５％の範囲の変動係数を有する優れた再現性を含む、高感度定量化システムが提供される。
【００２０】
上記アッセイ手順は、１）フィルタープレート上での白血球の単離及び溶解、２）ｍＲＮＡの単離、逆方向プライマーとのハイブリッド形成、及びオリゴ（ｄＴ）が固定化されたマイクロプレートにおけるｃＤＮＡ合成、並びに３）リアルタイム定量的ＰＣＲ、の３つの主要な工程から構成される。簡潔に述べると、フィルタープレートは、回収プレート上に配置され、５ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．４）１５０μＬを添加してフィルタ膜を湿潤させる。フィルタープレートから溶液を除去するため、１２０×ｇ、４℃で１分間遠心分離し、その後に、十分混合した血液サンプル５０μＬを各ウェルに添加して、直ちに１２０×ｇ、４℃で２分間遠心分離した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３００μＬを加えて２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離して、各ウェルを一度洗浄する。その後、１％の２−メルカプトエタノール(Bio Rad)、０．５ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ(Pierce)、０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ(5 Prime Eppendorf/Brinkmann)、０．１ｍｇ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡ(Sigma)、それぞれ１０ｍｍｏｌ／Ｌの特異的逆方向プライマー及び１０7分子／ｍＬの内部標準としての合成ＲＮＡ３４を追加したストック溶解緩衝液６０μＬをフィルタープレートに添加した後、３７℃で１０分間インキュベートする。その後、フィルタープレートをオリゴ（ｄＴ）を固定化したマイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture）上へ配置し、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離する。４℃で一晩保存した後、マイクロプレートを溶解緩衝液（他成分を加えないもの）１００μＬで３回、その後洗浄緩衝液（０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ）１５０μＬで３回、４℃で洗浄する。ｃＤＮＡは、１×ＲＴ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ2、ジチオスレイトールなし）、それぞれ１．２５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素(Promega)を含有する緩衝液（プライマーなし）３０μＬを添加し、３７℃で２時間インキュベートすることにより、各ウェル中で直接合成される。得られたｃＤＮＡ４μＬを３８４ウェルＰＣＲプレートへ直接移し、そこにＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス(Applied Biosystems)５μＬ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μｍｏｌ／Ｌの順方向及び逆方向プライマー、及び３〜６μｍｏｌ／ＬのＴａｑＭａｎプローブ）１μＬを添加して、９５℃で１０分間を１サイクル、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び６０℃で１分間、を４５サイクル用いて、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ(Applied Biosystems)でＰＣＲを実施する。各遺伝子は別個のウェルで増幅される。ある特定量のＰＣＲ産物（蛍光）を生成するためのＰＣＲのサイクルであるサイクル閾値（Ｃｔ）は、解析用ソフトウェア（ＳＤＳ、Applied Biosystems）を用いて測定される。ＰＣＲはまた、ｉＣｙｃｌｅｒ(BioRad)を用いて、ＧｅｎｅＰｌａｔｅ中で直接実施することができる。
【００２１】
簡素で再現性があり、かつハイスループットな、全血からのｍＲＮＡ定量法が使用される。迅速なプロトコルは、採血後にｍＲＮＡの二次的な誘導又は分解を最低限に抑え、９６ウェルフィルタプレート又はマイクロプレートの使用により、９６個のサンプルの同時操作が可能となる。手順中の操作が最小限であることから、定量化の手段としてＰＣＲを使用する場合でさえ、３０％未満の変動係数（ＣＶ）を伴う非常にわずかなサンプル間偏差しか生じない。
【００２２】
この実施形態では、フィルタープレートは以下の通りに調製され得る。グラスファイバ
ー膜又は白血球フィルター膜のいずれかを使用して、白血球を捕獲することができる。アッセイを単純化するために、マルチウェルフィルタプレートが、グラスファイバー膜又は白血球フィルター膜を使用して構築され、複数の全血検体の同時処理を可能にする。白血球を捕獲するためのフィルターの例は、米国特許第４，９２５，５７２号及び第４，８８０，５４８号（これらの開示は、参照により本明細書に援用される）に開示されている。これらの参照文献は概して、血液製剤又は濃縮血小板中の白血球の除去のための装置を開示している。血液製剤とともに使用するための米国特許第４，９２５，５７２号に開示される装置は、針状繊維質の不織布のようなゲルの除去のための手段を含む上流の多孔質要素、２層又は３層のメルトブローン織布のような微小凝集体の除去のための手段を含む少なくとも１つの中間多孔質要素、並びに相対的により小さな直径を有する繊維の織布の多層のような、吸着及び濾過の両方による白血球の除去のための手段を含む下流要素を含み、好ましくはそれらの要素のうち少なくとも１つの要素は、臨界湿潤表面張力が５３ダイン／ｃｍを上回るように改良されている。濃縮血小板とともに使用するための米国特許第４，８８０，５４８号に開示される装置は、少なくとも約９０ダイン／ｃｍの臨界湿潤表面張力を有する改変多孔質繊維状媒体を含む。当該特許はまた、多孔質媒体に濃縮血小板を通すことを含む濃縮血小板中の白血球含有量を減少させる方法について開示している。
【００２３】
繊維表面上への白血球の吸着は、白血球除去のメカニズムとして一般的に受け入れられている。一定の重量の繊維の表面積は、繊維の直径に反比例するため、より微細な繊維では容量はより大きくなること、及び所望の性能を達成するのに必要な繊維の、重量により測定される場合の量は、使用する繊維の直径がより小さい場合にはより少ないことが予測できる。ポリエステル、ポリアミド及びアクリルを含む、多数の一般的に使用される繊維は、グラフティングに必要なレベルのγ放射線による分解に対して適度な抵抗性を有し、且つ利用可能なモノマーと反応し得る構造であるため、放射線グラフティングに適している。ＰＢＴは、本発明の製品の開発に使用される主要な樹脂となっており、実施例中で使用される樹脂である。しかしながら、繊維に分解することができ、１．５マイクロメートルあるいはそれ以下の小径の繊維を有するマット又は織布として集めることができる他の樹脂が見出されるかもしれず、また、そのような生成物は、それらの臨界湿潤表面張力を必要に応じて最適範囲に調節することで、同等の効率を有するにもかかわらず、より小型の白血球の除去装置の製造に十分適しているかもしれないことには留意すべきである。同様に、適切に処理したグラスファイバーは、有効な装置を作製するのに使用可能であり得る。ＣＤ４  ｍＲＮＡの吸収は、ＰＢＴ系のフィルターを使用した場合、グラスファイバー系のフィルターに比べて最大４倍効率的である。１つの好ましい実施形態では、全血から捕獲される白血球の量を増加するように、複数のフィルター膜を集めて層状にする。別の好ましい実施形態では、フィルタープレートは、プラスチック接着テープ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ２２３−９４４４）を用いて密封され、テープを切り取って、所望の数のウェルを使用できるようにする。別の好ましい実施形態では、サンプルが添加される各ウェルは、低張緩衝液（５ｍＭのトリス２００μＬ（ｐＨ７．４））で洗浄される。
【００２４】
上記方法は好ましくは、血液を回収すること、マルチウェルフィルタプレートへ血液を添加すること、並びに赤血球及び他の非白血球構成成分の除去を包含する。１つの好ましい実施形態では、全血は、抗凝固剤を含有する血液収集管へ採取することができ、白血球濾過の効率を増大させる。抗凝固剤であるヘパリンは、白血球濾過の効率を増大させるのに特に有効である。ＡＣＤ及びＥＤＴＡのような他の抗凝固剤を使用しても良いが、得られるｍＲＮＡ測定におけるシグナル強度は弱まるかもしれない。１つの好ましい実施形態では、血液サンプルは凍結してもよく、これにより、ｍＲＮＡを破壊するＲＮＡ分解酵素の幾つかが除去される。ウェルは、低張緩衝液で洗浄してもよい。血液は、いったんフィルタープレート上の所望の数のウェルへ添加されると、フィルター膜を通って濾過される。濾過は、遠心分離、真空吸引又は正圧のような当業者に既知の任意の技法を通じて達成され得る。
【００２５】
上記方法は、細胞溶解及びｍＲＮＡ捕獲ゾーン内に固定化されたオリゴ（ｄＴ）へのｍＲＮＡのハイブリッド形成を包含する。溶解緩衝液は、フィルタープレートウェルへ添加され（４０μＬ／ウェル）、インキュベーションにより（室温で２０分間）、捕捉された白血球からｍＲＮＡを放出させる。１つの好ましい実施形態では、マルチウェルフィルタープレートは、プラスチックバッグ中に密封されて、遠心分離される（ＩＥＣ  ＭｕｌｔｉＲＦ、２，０００ｒｐｍ、４℃で、１分間）。その後、溶解緩衝液を再び添加して（２０μＬ／ウェル）、続いて遠心分離を行う（ＩＥＣ  ＭｕｌｔｉＲＦ、３，０００ｒｐｍ、４℃で５分間）。その後、マルチウェルフィルタプレートを遠心分離機から取り出して、インキュベートする（室温で２時間）。
【００２６】
好ましい実施形態によれば、溶解緩衝液は、界面活性剤、塩、ｐＨ緩衝液、グアニジンチオシアネート及びプロテイナーゼＫを含む。
【００２７】
溶解緩衝液の好ましい実施形態は、少なくとも１つの界面活性剤を含有するが、２つ以上の界面活性剤を含有してもよい。当業者は、様々なタイプの細胞に関して種々の膜の様々な溶解レベルを達成するために、種々の強度を持つ界面活性剤の濃度の種々の組合せを利用し得る。例えば、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０は、Ｎ−ラウロサルコシンよりも弱い界面活性剤であるが、一実施形態では、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０のみで細胞膜を溶解するのに十分かもしれない。他の実施形態では、Ｎ−ラウロサルコシンのような強力な界面活性剤を、１又はそれ以上の弱い界面活性剤と併用して、核膜の溶解を最適化することができる。界面活性剤は、少なくとも細胞の細胞膜を溶解するのに十分であることが好ましい。別の好ましい実施形態では、相当量のｍＲＮＡが細胞の核中に存在するため、細胞の核膜を溶解するのに十分な界面活性剤が含まれる。ある状況では、細胞質ｍＲＮＡのみを測定することが望ましく、その一方、他の状況では、細胞質及び核中のｍＲＮＡを測定することが望ましい場合がある。
【００２８】
溶解緩衝液の強力な界面活性剤としては、好ましくはＮ−ラウロイルサルコシン、Ｓ．Ｄ．Ｓ．、デオキシコール酸ナトリウム及びヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロミドが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
弱い界面活性剤としては、ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０、Ｎ−デカノイル−Ｎ−メチルグルカミン、オクチル−β−Ｄ−グルコピラノシド、又は当業者に既知の他の界面活性剤が挙げられる。０．０５〜２％の界面活性剤が溶解緩衝液中で使用され得る。１つの特に好ましい実施形態の溶解緩衝液は、０．５％のＮ−ラウロイルサルコシンを含む。溶解緩衝液の別の好ましい実施形態は、０．１〜２％のＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０を含有する。特に好ましい実施形態では、０．１％のＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０を含有する。
【００３０】
塩とキレート剤の組合せもまた、溶解剤として役立ち得る。例えば、７５μＭのＮａＣｌ及び２４μＭのＮａ−ＥＤＴＡが、溶解剤として役立ち得る。溶解剤の実施形態には、当業者に既知の他の溶解剤が包含され得る。
【００３１】
溶解緩衝液の塩は、ｍＲＮＡ−オリゴ（ｄＴ）ハイブリッド形成剤として作用する。塩は好ましくは、当業者により測定可能なように、４×ＳＳＣのストリンジェンシー（相補的ＤＮＡ配列がハイブリッド形成する厳密さ）を超過しないストリンジェンシーを有することが好ましい。他の実施形態の溶解緩衝液は、ＮａＣｌ又は当業者に既知の他の塩を包含する。
【００３２】
溶解緩衝液ストックのｐＨ緩衝液は、好ましくはｐＨを７．０〜８．０に保つ。一実施形態は、１ｍＭ〜１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含む。特に好ましい実施
形態では、ｐＨ緩衝液は、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ７．４）を含む。別の好ましい実施形態の溶解緩衝液は、当業者にとって既知のｐＨ緩衝液を含み、たとえば、０．０３％のＨ2Ｏ2を含有する０．１Ｍのクエン酸塩−リン酸塩（ｐＨ５．０）が挙げられる。
【００３３】
溶解緩衝液の特に好ましい実施形態によれば、グアニジンチオシアネートは、ＲＮＡ分解酵素不活性化剤として役立つ。グアニジンチオシアネートは、従来技術においては、十分に有効ではない濃度で一般に使用されてきたことを本発明者らは発見した。したがって、グアニジンチオシアネートの濃度は、１．４Ｍを上回ることが好ましい。１０Ｍもの高濃度、より好ましくは２Ｍ以下のグアニジンチオシアネート濃度が使用できる。しかしながら、１．７Ｍ以上の濃度では、溶解緩衝液の効率が低下する。したがって、好ましい実施形態では、約１．４〜約１．７５Ｍのグアニジンチオシアネートを使用する。１つの好ましい実施形態は、１．７〜１．８Ｍのグアニジンチオシアネートを含む。使用時の溶解緩衝液は、グアニジンチオシアネートが特定の濃度（１．７９１Ｍ）になるようにストックから調製することができる。他の試薬が溶解緩衝液に添加されるため、グアニジンチオシアネートの濃度は低下する。溶解緩衝液は好ましくは、約１．６〜約１．７Ｍの濃度のグアニジンチオシアネートを含む。
【００３４】
特定の好ましい実施形態はさらに、ＲＮＡ分解酵素不活性化剤として、２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む。溶解緩衝液の１つの好ましい実施形態は、２００μｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む。別の好ましい実施形態は、２００μｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む。別の好ましい実施形態は、２００μｇ／ｍｌ〜５００μｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫを含む。ドデシル硫酸ナトリウムもまた、ＲＮＡ分解酵素不活性化剤として役立ち得る。別の実施形態は、ＲＮＡ分解酵素不活性化剤として０．１〜１０％の２−メルカプトエタノールを包含する。１つの特に好ましい実施形態は、１％の２−メルカプトエタノールを含む。他の実施形態のＲＮＡ分解酵素不活性化剤は、好ましくは、ＲＮＡ分解酵素中のジスルフィド結合を還元する当業者に既知の物質を包含する。
【００３５】
溶解緩衝液の好ましい実施形態は、Ｍｇ2+及びＣａ2+をキレートするキレート剤をさらに含む。１つの好ましい実施形態は、０．１ｍＭ〜５ｍＭのＥＤＴＡを含む。特に好ましい実施形態は、１ｍＭのＥＤＴＡを含む。他の好ましい実施形態の溶解緩衝液ストックは、例えばＥＤＴＭＰ、２，３−ジメルカプトプロパノール及びＥＧＴＡを含む当業者に既知のキレート剤（これらに限定されない）を含有する。
【００３６】
好ましい実施形態の溶解緩衝液は、ｔＲＮＡを含んでもよい。ｔＲＮＡは、様々な供給源に由来し得るものであり、血液由来のＤＮＡ及びＲＮＡのフィルタープレートへの非特異的吸収を阻害するために含まれる。さらに、ｔＲＮＡの存在により、血液由来のＲＮＡの分解が防止される。１つの好ましい実施形態では、使用時の溶解緩衝液のｔＲＮＡは、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌのＥ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡを含む。他の実施形態は、当業者に既知の任意の供給源に由来するｔＲＮＡを含んでも良い。
【００３７】
好ましい実施形態の溶解緩衝液は、多種多様な供給源由来のＤＮＡを含んでいてもよく、これはフィルタープレートへの血液由来のＤＮＡ及びＲＮＡの非特異的吸収を阻害するために添加される。使用時の溶解緩衝液のＤＮＡは、好ましくは、０．１〜１０ｍｇ／ｍｌの超音波処理したサケ精子ＤＮＡを含む。他の実施形態では、他の生物由来のＤＮＡが使用され得る。
【００３８】
特に好ましい実施形態の溶解緩衝液は、元のサンプル中の標的ｍＲＮＡの明確な量を算出するために、スパイクされた対照ＲＮＡを包含してもよい。本発明の具体化前には、研究機関間の変動及び標準化の欠如により、ある実験の結果を他の実験の結果と比較するこ
とは困難であった。しかしながら、本発明の好ましい実施形態では、標的ｍＲＮＡの明確な量は、各サンプルにおいて、ＴａｑＭａｎ又は他のＰＣＲアッセイにより得られる値を、スパイクされた対照ＲＮＡの用量の回収割合によって除算することにより決定することができる。
【００３９】
溶解緩衝液の好ましい実施形態は、１ウェル当たり１０〜１ｅ10コピー、より好ましくは１ｅ5〜１ｅ10コピーのスパイクされたＲＮＡを包含する。好ましい実施形態では、使用される対照ＲＮＡの量は、少なくとも検出されるのに十分であるが、定量化される標的ｍＲＮＡの量を著しく妨害するほど多くはない。好ましい実施形態では、溶解緩衝液に添加される対照ＲＮＡは、ポリ（Ａ）+ＲＮＡである。試験されるサンプルがヒト血液である特に好ましい実施形態では、対照ＲＮＡは、ヒト血液中に存在するＲＮＡと相同ではない。幾つかの好ましい実施形態では、対照ＲＮＡの配列は、標的ｍＲＮＡに対して９０％未満の相同性であるか、又は標的ｍＲＮＡと１０％を上回る長さの差を有する。他の好ましい実施形態では、対照ＲＮＡの配列は、標的ｍＲＮＡに対して８５％未満の相同性であるか、又は標的ｍＲＮＡと５％を上回る長さの差を有する。さらなる実施形態では、対照ＲＮＡの配列は、標的ｍＲＮＡに対して７５％未満の相同性であるか、又は標的ｍＲＮＡと２％を上回る長さの差を有する。別の実施形態では、対照ＲＮＡの配列は、標的ｍＲＮＡに対して６５％未満の相同性であるか、又は標的ｍＲＮＡと１％を上回る長さの差を有する。一実施形態では、対照ＲＮＡは好ましくは、ＰＣＲを用いて鋳型オリゴヌクレオチドを増幅させることにより作製され得る。したがって、順方向プライマー（配列番号３、４、７及び１）、逆方向プライマー（配列番号２及び８）、及びＴａｑＭａｎプローブ（ＦＡＭ−配列番号６−ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ−配列番号９−ＴＡＭＲＡ、及びＦＡＭ−配列番号５−ＴＡＭＲＡ）を使用して、様々な対照ＲＮＡオリゴヌクレオチドを増幅させることができる。別の実施形態は、定量される複数の異なる標的ｍＲＮＡの使用を包含する。さらなる実施形態は、複数の対照ＲＮＡを使用することを包含する。
【００４０】
本願の方法は、ｍＲＮＡの定量化を包含し、好ましい実施形態では、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ合成及びＰＣＲを使用したｃＤＮＡの増幅を伴う。１つの好ましい実施形態では、マルチウェルフィルタプレートは、溶解緩衝液（１５０μＬ／ウェル×３回、手動）及び洗浄緩衝液（１５０μＬ／ウェル×３回、手動又はＢｉｏＴｅｋ  ＃Ｇ４）で洗浄される。その後、ｃＤＮＡ合成緩衝液が、マルチウェルフィルタプレートへ添加される（４０μＬ／ウェル、手動又はＩ＆Ｊ  ＃６）。Ａｘｙｍａｔ(Ａｍｇｅｎ  ＡＭ−９６−ＰＣＲ-ＲＤ)をマルチウェルフィルタプレート上へ配置することができ、次いでこれをヒートブロック（３７℃、ＶＷＲ）上へ配置し、インキュベートする（９０分超）。その後、マルチウェルフィルタプレートは、遠心分離され得る（２，０００ｒｐｍ、４℃で１分間）。ＰＣＲプライマーを３８４ウェルＰＣＲプレートへ添加して、ｃＤＮＡをマルチウェルフィルタプレートから３８４ウェルＰＣＲプレートへ移す。ＰＣＲプレートは遠心分離され（２，０００ｒｐｍ、４℃で１分間）、リアルタイムＰＣＲが開始される（ＴａｑＭａｎ／ＳＹＢＥＲ）。
【００４１】
別の好ましい実施形態は、ｍＲＮＡハイブリッド形成中又はｃＤＮＡ合成中における特異的アンチセンスプライマーの適用を含む。ｃＤＮＡの合成前に過剰のアンチセンスプライマーが除去されてキャリーオーバー効果が回避され得るように、プライマーはｍＲＮＡハイブリッドの形成中に添加されることが好ましい。オリゴ（ｄＴ）及び特異的プライマー（ＮＮＮＮ）は、同時にポリ−Ａ  ＲＮＡ上の種々の位置でｃＤＮＡ合成をプライミングする。特異的プライマー（ＮＮＮＮ）及びオリゴ（ｄＴ）は、増幅の間にｃＤＮＡの形成を引き起こす。特異的プライマー由来のｃＤＮＡが、９５℃で２分間各ウェルを加熱することによりＧｅｎｅＰｌａｔｅから除去される場合でさえ、熱変性プロセスから得られる特異的ＣＤ４  ｃＤＮＡの量（ＴａｑＭａｎ定量的ＰＣＲを用いて）は、非加熱の陰性対照から得られる量に類似している。何らの説明又は理論によって拘束されることも望ま
ないが、かかる結果に関する１つの考え得る説明は、オリゴ（ｄＴ）由来のｃＤＮＡが、増幅の間にプライマー由来のｃＤＮＡを置き換え得ることである。これは、熱変性プロセスが完全に排除されるため、特に利便性が高い。さらに、異なる標的に関する複数のアンチセンスプライマーを添加することにより、各遺伝子は、ｃＤＮＡの一部から増幅させることができ、ＧｅｎｅＰｌａｔｅ中のオリゴ（ｄＴ）由来のｃＤＮＡは、将来的な使用のために保存することができる。
【００４２】
別の好ましい実施形態は、全血からのｍＲＮＡのハイスループットな定量化のための装置を包含する。上記装置は、複数のサンプル送達ウェル、サンプル送達ウェルの真下にある白血球捕獲フィルター、及びフィルターの下にあるｍＲＮＡ捕獲ゾーンを含有するマルチウェルフィルタープレートを包含し、ｍＲＮＡ捕獲ゾーンのウェル中には固定化されたオリゴ（ｄＴ）が含まれる。白血球収集の効率を増大させるために、幾つかの濾過膜をあつめて層状にすることができる。
【００４３】
多くの従来の増幅技術を、この測定方法と併用することができるが、本発明の１つの特に好ましい実施形態は、全血由来のＲＮＡ及び対照ＲＮＡを用いてリアルタイム定量的ＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）を実施することを含む。Hollandら（PNAS 88: 7276-7280 (1991)）は、Ｔａｑｍａｎアッセイとして知られるアッセイについて記載している。Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エクソヌクレアーゼ活性は、増幅に付随して特異的な検出可能なシグナルを発生させるために、ポリメラーゼ連鎖反応産物検出システムで用いられる。３’末端は伸長不可能であり、５’末端が標識され、かつ標的配列内でハイブリッド形成するように設計されたオリゴヌクレオチドプローブが、ポリメラーゼ連鎖反応アッセイへ導入される。増幅の過程中のポリメラーゼ連鎖反応産物鎖の１つへのプローブのアニーリングにより、エキソヌクレアーゼ活性に適した基質が生成される。増幅中に、Ｔａｑポリメラーゼの５’→３’エキソヌクレアーゼ活性は、未分解プローブと区別され得る、より小さなフラグメントへプローブを分解する。上記アッセイは、高感度且つ特異的であり、より煩雑な検出方法を大幅に改善するものである。このようなアッセイの一種はまた、米国特許第５，２１０，０１５号においてGelfandらに記載されている。上記特許は、（ａ）標的核酸の領域に相補的な配列を含む少なくとも１つの標識オリゴヌクレオチドを、サンプルを含有するＰＣＲアッセイに提供すること（ここで、標識オリゴヌクレオチドは、工程（ｂ）のオリゴヌクレオチドプライマーが結合する標的核酸配列の内部にアニーリングする）、（ｂ）一組のオリゴヌクレオチドプライマーを提供すること（ここで、第１のプライマーは、標的核酸配列の一方の鎖中の領域に相補的な配列を含有して、相補的ＤＮＡ鎖の合成をプライミングし、第２のプライマーは、標的核酸配列の第２の鎖中の領域に相補的な配列を含有し、相補的ＤＮＡ鎖の合成をプライミングし、また各オリゴヌクレオチドプライマーは、同じ核酸鎖にアニーリングする任意の標識オリゴヌクレオチドの上流でその相補的鋳型にアニーリングするよう選択される）、（ｃ）（ｉ）標的領域内に含まれる鋳型核酸配列へのプライマー及び標識オリゴヌクレオチドのアニーリング並びに（ｉｉ）プライマーの伸長、からなるＰＣＲの繰り返し工程に許容的である条件下で、鋳型依存性重合剤として５’から３’ヌクレアーゼ活性を有する核酸ポリメラーゼを使用して標的核酸配列を増幅すること（ここで、上記核酸ポリメラーゼは、プライマー伸長産物を合成する一方で、核酸ポリメラーゼの５’から３’ヌクレアーゼ活性は、同時に標識オリゴヌクレオチド及びその相補的鋳型核酸配列を含むアニーリングされた二重鎖から標識フラグメントを放出し、それにより検出可能な標識フラグメントを作り出す）、及び（ｄ）標識フラグメントの放出を検出及び／又は測定してサンプル中の標的配列の存在又は非存在を決定すること、を含む方法を開示している。Gelfandらに対する米国特許第５，２１０，０１５号、及びHollandら（PNAS 88:7276-7280 (1991)）は、参照により本明細書に援用される。
【００４４】
さらに、Fisherらに対する米国特許第５，４９１，０６３号は、Ｔａｑｍａｎ型アッセ
イを提供する。Fisherらの方法は、発光標識を用いて標識した一本鎖オリゴヌクレオチドプローブの切断をもたらす反応を提供し、その反応は、標識と相互作用して標識の発光を改変するＤＮＡ結合化合物の存在下で実施される。上記方法は、プローブの分解に起因する標識プローブの発光の変化を利用する。上記方法は、一般的に、オリゴヌクレオチドプローブの切断をもたらす反応を利用するアッセイ、特にハイブリッド形成したプローブが、プライマーの伸長に付随して切断される均質な増幅／検出アッセイに適用可能である。増幅された標的の蓄積の検出及び標的配列の配列特異的な検出を同時に可能にする均質増幅／検出アッセイが提供される。Fisherらに対する米国特許第５，４９１，０６３号は、参照により本明細書に援用される。
【００４５】
ＴａｑＭａｎ検出アッセイは、伝統的なＰＣＲアッセイを上回る幾つかの利点を提供する。第一に、ＴａｑＭａｎアッセイは、標的配列中に存在する内部のオリゴヌクレオチド配列のハイブリッド形成とＰＣＲの感度とを組み合わせる。ＰＣＲ後に、サンプルは、アガロースゲル上で分離させる必要はなく、続くＰＣＲ産物の同一性を確認するのに必要であるサザンブロットやハイブリッド形成工程が排除される。これらのさらなるＰＣＲ後の確認工程は、正確な同定のためにはたやすく数日余計にかかる可能性がある。ＴａｑＭａｎシステムを使用すると、アッセイは２．５時間以内に完了する。さらに、当該アッセイプロセスに関連する手順は、効率的且つ相互汚染なしで多数のサンプルの取り扱いを可能とし、したがって、ロボットサンプリングに適応可能である。結果として、多数の試験サンプルは、ＴａｑＭａｎアッセイを使用して、非常に短期間で処理され得る。ＴａｑＭａｎシステムの別の利点は、多重化の可能性である。異なる蛍光レポーター色素を使用してプローブを構築することができるため、幾つかの異なるＨＩＶの系を、同じＰＣＲ反応で組み合わせることができ、それにより、試験がそれぞれ個別に実施された場合に被るであろう労働コストを低減させる。迅速かつ確実なデータという長所は、労働力及びコスト効率とともに、本発明の特異的プライマーを利用するＴａｑＭａｎ検出システムを、ＨＩＶの存在をモニタリングするための非常に有益なシステムにする。
【００４６】
他のリアルタイムＰＣＲの形式もまた使用できる。１つの方式は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎのようなインターカレート色素を用いる。この色素は、二本鎖ＤＮＡに結合すると強力な蛍光シグナルを発し、このシグナルにより、増幅ＤＮＡの定量化が可能となる。この方式では、配列特異的な増幅のモニタリングはできないが、標識プローブなしで増幅ＤＮＡの直接的な定量化が可能である（例えば、Ponchelら(2003) ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ  Ｉ蛍光に基づくリアルタイムＰＣＲ：遺伝子再構成、遺伝子増幅及びミクロ遺伝子欠失の相対的な定量化のためのＴａｑＭａｎアッセイに対する代替法(Real-time PCR based on SYBR-Green I fluorescence: An alternative to the TaqMan assay for a relative quantification of gene rearrangements, gene amplifications and micro gene deletions). BMC Biotechnology 3:18)。他のそのような蛍光色素で同様に使用され得るものに、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ、ＹＯ−ＰＲＯ色素及びＹｏ  Ｙｏ色素がある。
【００４７】
使用され得る別のリアルタイムＰＣＲの形式は、単位複製配列(amplicon)にハイブリダイズして、蛍光シグナルを発生するレポータープローブを使用する。ハイブリッド形成事象は、プローブ上のレポーター部分とクエンチャー部分を引き離すか、あるいはそれらをより接近させる。プローブ自体は分解されず、レポーター蛍光シグナル自体は、反応中には蓄積されない。ＰＣＲの間の産物の蓄積は、プローブが単位複製配列へハイブリダイズする際のレポーター蛍光シグナルの増加によりモニタリングされる。このカテゴリーに属する形式としては、分子指標（Sanjay, T and Russell, K (1996) 分子指標：ハイブリッド形成時に蛍光を発するプローブ(Molecular Beacons: Probes that Fluoresce upon Hybridization). Nature Biotech. Vol. 14, March, pp303-308）、二重ハイブリッドプローブ（Cardulloら(1988) 無放射蛍光共鳴エネルギー移動による核酸ハイブリッドの検出(Detection of nucleic acid hybridization by nonradiative fluorescence resonance ene
rgy transfer). PNAS USA 85:8790-8794）、Ｓｕｎｒｉｓｅ又はＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒ（Nazarenkoら(1997) エネルギー移動に基づくＤＮＡの増幅及び検出のための閉管方式(A closed tube format for amplification and detection of DNA based on energy transfer). Nucleic Acid Res. 25:2516-2521）及びＳｃｏｒｐｉｏｎ（Whitcombeら(1999) 自己消光性プロービング単位複製配列及び蛍光を使用したＰＣＲ産物の検出(Detection of PCR products using self quenching probing amplicons and fluorescence). Nature Biotech. 17:804-807）リアルタイムＰＣＲアッセイが挙げられる。
【００４８】
同様に使用され得る別のリアルタイムＰＣＲの形式は、いわゆる「Ｐｏｌｉｃｅｍａｎ」システムである。このシステムでは、プライマーは、蛍光部分（例えば、ＦＡＭ）、及びプライマーの３’末端で少なくとも１つのヌクレオチド塩基に共有結合される蛍光部分の蛍光を消光することが可能なクエンチャー部分（例えば、ＴＡＭＲＡ）を含む。３’末端で、プライマーは、少なくとも１つのミスマッチ塩基を有し、したがって、当該塩基（単数又は複数）位置において核酸サンプルを相補しない。鋳型核酸配列は、Ｐｆｕ酵素のような３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼを用いたＰＣＲにより増幅されて、ＰＣＲ産物を生成する。クエンチャー部分を結合したミスマッチ塩基（複数可）は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によりＰＣＲ産物の３’末端から切断される。共有結合したクエンチャー部分を有するミスマッチ塩基がポリメラーゼにより切断される場合、したがって蛍光部分に対する消光効果を除去する場合に生じる蛍光は、ＰＣＲ中に少なくとも１つの時点で検出及び／又は定量化される。バックグラウンドを超える蛍光は、合成された核酸サンプルの存在を示す。このＰＣＲの形式は、米国特許出願第１０／３０９，６９１号（これは、参照により本明細書に援用される）に詳述されている。
【００４９】
好ましい実施形態では、様々なｍＲＮＡは、単に各標的に対するプライマー及びプローブを変化させることにより定量することができる。ヘパリンは、最大の生物活性に対して重要な因子である細胞外Ｃａ++を維持するため、白血球を単離せずに全血中で薬物作用を分析することができる。
【００５０】
本発明の好ましい実施形態では、既知量のスパイクされた標準ＲＮＡを使用することにより特定のサンプルの全効率を測定する能力は、実施形態が用量非依存的かつ配列非依存的であることに由来する。既知量の対照ＲＮＡの使用により、ＰＣＲ測定値を元のサンプル中の標的ｍＲＮＡの量へ換算することが可能となる。
【００５１】
別の好ましい実施形態は、全血からのｍＲＮＡのハイスループットな定量化のためのキットを包含する。当該キットは、全血からのｍＲＮＡのハイスループットな定量化のための装置、ヘパリン含有血液回収管、低張緩衝液及び溶解緩衝液を包含する。
【００５２】
別の好ましい実施形態は、血液サンプル、低張緩衝液及び溶解緩衝液を装置に添加するためのロボット、自動真空アスピレータ及び遠心分離機、並びに自動ＰＣＲ機械を含む、全血中のｍＲＮＡのハイスループットな定量を実施するための完全自動システムを包含する。
【００５３】
開示される癌感受性を測定する方法はまた、上述の方法以外のｍＲＮＡを測定する他の方法を使用してもよい。使用され得る他の方法としては、例えば、ノーザンブロット分析法、ＲＮＡ分解酵素保護法、溶液ハイブリッド形成法、半定量的ＲＴ−ＰＣＲ及びｉｎ  ｓｉｔｕハイブリッド形成が挙げられる。
【００５４】
さらに、全血に由来する細胞以外の細胞もまた使用され得る。例えば、他の組織に由来する細胞（例えば、線維芽細胞）の懸濁液も使用され得る。
【００５５】
癌感受性の測定
本発明の方法は、個体の全血において成長抑制マーカーのレベルを測定する。好ましい実施形態では、測定されるマーカーのレベルは、ｍＲＮＡのレベルである。しかしながら、マーカーのレベルはまた、例えば該個体の細胞中に存在するマーカータンパク質のレベルを測定することなどにより、当業者に既知の他の方法で評価されてもよい。本出願で使用される場合、「個体」は、ヒトを含む任意の種の動物であり得る。さらに、本出願で使用される場合、「成長抑制」ｍＲＮＡは、細胞増殖を停止させる細胞破壊ｍＲＮＡ、及び細胞を死滅させる細胞破壊ｍＲＮＡの両方を包含する。以下の実施例では、変異原刺激後の成長抑制ｍＲＮＡのレベルのより大きな増大は癌の危険性がより低いことを示すのに対して、減少は、癌の危険性がより高いことを示す。しかしながら、他のマーカーは反対のパターンを示すかもしれない。すなわち、変異原刺激後のｍＲＮＡのレベルの大きな減少が癌の危険性がより低いことを示すのに対して、増加は癌の危険性がより高いことを示すということもあろう。
【００５６】
本発明の方法を使用する場合、癌に対する個体の感受性の測定は、電離放射線のような変異原性刺激剤への暴露に起因する細胞分裂抑制マーカーｍＲＮＡの増加と関連付けられる。刺激に応答するマーカーｍＲＮＡの増加が大きいほど、その個体は、癌を生じ得るＤＮＡ損傷の蓄積に対してより影響を受けにくくなる。しかしながら、個体が、変異原性刺激への暴露に応答して、マーカーｍＲＮＡをほとんど又は全く誘導しない場合、増殖細胞中にＤＮＡ損傷が蓄積して、結果的に癌の発症をもたらす可能性が高くなるだろう。
【００５７】
以下の実施例では、変異原性刺激への暴露前及び後に直接的に個体中のマーカーｍＲＮＡレベルの変化を測定する好ましいプロトコルを使用している。しかしながら、同じ種に属する複数の個体に由来する暴露されていない細胞中のマーカーｍＲＮＡのレベルの平均ベースライン測定値を得て、個体の細胞中の暴露後のマーカーｍＲＮＡのレベルを、平均ベースライン測定値と比較して、マーカーｍＲＮＡレベルの変化を測定することも可能である。これは、個体の癌感受性を決定するために１つのｍＲＮＡレベルを測定するだけで済むという利点を有する。平均ベースライン測定値は、好ましくは少なくとも１０個体からのマーカーｍＲＮＡ測定値に基づいて得られる。平均ベースライン測定値は、より好ましくは少なくとも２５個体からのマーカーｍＲＮＡ測定値に基づいて得られる。平均ベースライン測定値は、最も好ましくは少なくとも５０個体からのマーカーｍＲＮＡ測定値に基づいて得られる。
【００５８】
多種多様の変異原性刺激剤が、本発明の方法で使用され得る。かかる変異原性刺激剤としては、例えば、熱、ＵＶ照射又は電離放射線（例えば、Ｘ線若しくはγ線）のような物理的作用因子が挙げられ得る。変異原性刺激剤はまた、塩基類縁体（例えば、ブロモウラシル及びアミノプリン）、塩基構造及び塩基対形成特性を改変する作用物質（例えば、亜硝酸、ニトロソグアニジン、メタンスルホン酸エチル及びメタンスルホン酸メチル）、インターカレート剤（例えば、アクリジンオレンジ、プロフラビン及び臭化エチジウム）、構造改変剤（例えば、ＮＡＡＡＦ、ソラレン及び過酸化物）及び抗腫瘍薬（例えば、ブレオマイシン及びエトポシド（ＶＰ−１６））を含む化学的作用因子であってもよい。レトロウイルスのような転位因子の使用もまた意図される。
【００５９】
ｐ２１、ｐ２７Kip1及びｐ１６／ｐ１５INK4のような幾つかの細胞分裂抑制マーカーが既知である。ｐ２１は、ＤＮＡ損傷に応答して細胞増殖を停止させることが既知であるため、実施例では放射線誘導性細胞停止に対する細胞分裂抑制マーカーとしてｐ２１を使用した。しかしながら、ｐ２７Kip1及びｐ１６／ｐ１５INK4のような当業者に既知の他の細胞分裂抑制マーカーｍＲＮＡを測定してもよい。
【００６０】
同様に、実施例では、強力なアポトーシス促進効果を有することが知られている細胞破
壊マーカーＢＡＸ及びＰＵＭＡが測定された。米国仮特許出願第６０／６５３，５５７号（参照により本明細書に援用される）に開示されるように、ＰＵＭＡは、ヒト血液中で主要なアポトーシス促進性ｍＲＮＡであることが、本発明者らにより決定された。しかしながら、Ｂａｋ、Ｂｏｋ、Ｂｃｌ−ＸＳ、Ｂｉｄ、Ｂａｄ、Ｂｉｋ、Ｂｉｍ及びＮＯＸＡのような当業者に既知の他の細胞破壊マーカーｍＲＮＡが測定されてもよい。
【実施例】
【００６１】
＜実施例１＞
この実施例で用いるｍＲＮＡレベルを測定するためのプロトコルは以下の通りであった。アッセイ手順は、１）フィルタープレート上での白血球単離及び溶解、２）ｍＲＮＡ単離、逆方向プライマーハイブリッド形成及びオリゴ（ｄＴ）固定されたマイクロプレートにおけるｃＤＮＡ合成、並びに３）リアルタイム定量的ＰＣＲ、の３つの主要な工程から構成される。簡潔に述べると、フィルタープレートを回収プレート上に配置し、５ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．４）１５０μＬを添加して、フィルタ膜を湿潤させた。フィルタープレートから溶液を除去するため１２０×ｇ、４℃で１分間遠心分離し、その後に、十分混合した血液サンプル５０μＬを各ウェルに添加して、直ちに１２０×ｇ、４℃で２分間遠心分離した後、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）３００μＬを加えて２，０００×ｇ、４℃、５分間の遠心分離することにより、各ウェルを一度洗浄した。その後、１％の２−メルカプトエタノール(Bio Rad)、０．５ｍｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫ(Pierce)、０．１ｍｇ／ｍＬのサケ精子ＤＮＡ(5 Prime Eppendorf/Brinkmann)、０．１ｍｇ／ｍＬのＥ．ｃｏｌｉ  ｔＲＮＡ(Sigma)、それぞれ１０ｍｍｏｌ／Ｌの特異的逆方向プライマー及び１０7分子／ｍＬの内部標準としての合成ＲＮＡ３４を追加したストック溶解緩衝液（下記を参照）６０μＬをフィルタープレートに適用した後、３７℃で１０分間インキュベートした。その後、フィルタープレートをオリゴ（ｄＴ）を固定化したマイクロプレート（ＧｅｎｅＰｌａｔｅ、RNAture）上に配置して、２，０００×ｇ、４℃で５分間遠心分離した。４℃で一晩保存した後、マイクロプレートを溶解緩衝液（他の成分を添加していないもの）１００μＬで３回、その後洗浄緩衝液（０．５ｍｏｌ／ＬのＮａＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス（ｐＨ７．４）、１ｍｍｏｌ／ＬのＥＤＴＡ）１５０μＬで３回、４℃で洗浄した。ｃＤＮＡは、１×ＲＴ緩衝液（５０ｍｍｏｌ／ＬのＫＣｌ、１０ｍｍｏｌ／Ｌのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５．５ｍｍｏｌ／ＬのＭｇＣｌ2、ジチオスレイトールなし）、それぞれ１．２５ｍｍｏｌ／ＬのｄＮＴＰ、４ユニットのｒＲＮａｓｉｎ、及び８０ユニットのＭＭＬＶ逆転写酵素(Promega)を含有する緩衝液（プライマーなし）３０μＬを添加し、３７℃で２時間インキュベートすることにより、各ウェル中で直接合成された。得られたｃＤＮＡ４μＬを３８４ウェルＰＣＲプレートへ直接移して、そこにＴａｑＭａｎユニバーサルマスターミックス(Applied Biosystems)５μＬ及びオリゴヌクレオチドカクテル（それぞれ１５μｍｏｌ／Ｌの順方向及び逆方向プライマー、及び３〜６μｍｏｌ／ＬのＴａｑＭａｎプローブ）１μＬを添加して、９５℃で１０分間を１サイクル、続いて９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、及び６０℃で１分間の４５サイクルを用いて、ＰＲＩＳＭ  ７９００ＨＴ(Applied Biosystems)によりＰＣＲを実施した。各遺伝子は別個のウェルで増幅させた。ある特定量のＰＣＲ産物（蛍光）を生成するためのＰＣＲのサイクルであるサイクル閾値（Ｃｔ）は、解析用ソフトウェア（ＳＤＳ、Applied Biosystems）を用いて測定された。ＰＣＲはまた、ｉＣｙｃｌｅｒ(BioRad)を用いて、ＧｅｎｅＰｌａｔｅ中で直接実施された。
【００６２】
溶解緩衝液ストック
０．５％  Ｎ−ラウロイルサルコシン
４×ＳＳＣ
１０ｍＭ  トリスＨＣｌ、ｐＨ７．４
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
０．１％  ＩＧＥＰＡＬ  ＣＡ−６３０
１．７９１Ｍ  グアニジンチオシアネート
【００６３】
ｐ２１  ｍＲＮＡの測定は、様々な線量の電離放射線に対する暴露前及び後の両方で実施された。結果を図１に示す。この結果は、ヘパリン処理した全血をｉｎ  ｖｉｔｒｏで電離放射線に暴露した場合に、ｐ２１  ｍＲＮＡが線量依存的な様式で誘導されたことを明らかにしている。発現は、放射線暴露後２時間という早い段階で最高になった。さらに、図２に示すように、２つの独立した悪性癌及び１つの独立した良性腫瘍を発症した癌患者を、同じプロトコルを使用して試験した場合、ｐ２１  ｍＲＮＡの誘導は非常に低かった（白丸）。
【００６４】
＜実施例２＞
上記と同じプロトコルを使用して、細胞破壊マーカーであるＢＡＸのｍＲＮＡレベルを測定した。ＢＡＸ  ｍＲＮＡが、アポトーシスの初期段階で誘導されるため、ＢＡＸは、細胞破壊マーカーであるとみなされる。図３に示すように、実施例１の癌患者は、１０Ｇｙの放射線による刺激時に、ＢＡＸ  ｍＲＮＡの減少を示したのに対して、試験した健常な成人の大部分が、放射線刺激後にＢＡＸ  ｍＲＮＡの増大を示した。
【００６５】
図２及び図３を組み合わせ、また、より多くの健常な成体のデータが追加されると（図４）、癌患者は、ｐ２１及びＢＡＸの両方に対して乏しい応答を示した。図４では、４つのデータ点（黒菱形）及び２つのデータ点（黒三角）は、異なる日に試験した同じ個体に由来する。１人の健常な成人は、乏しいＢＡＸ応答を示したが、これは、高いｐ２１応答により相殺された（図４、小さい矢印）。同様に、乏しいｐ２１応答を示す１人の健常な成人は、相殺する高いＢＡＸ応答を示した（図４、大きい矢印）。したがって、癌感受性又は癌危険性は、細胞分裂抑制（ｐ２１）及び細胞破壊（ＢＡＸ）マーカー遺伝子の両方の応答により確認され得る。
【００６６】
＜実施例３＞
上記と同じプロトコルを使用して、細胞破壊マーカーであるＰＵＭＡのｍＲＮＡレベルを測定した。ヒト血液中において、ＰＵＭＡ  ｍＲＮＡは、ＢＡＸファミリーの遺伝子の中で最大のアポトーシス促進効果を有することが見出されている。１０Ｇｙの放射線で刺激した癌患者の血液は、乏しいＰＵＭＡ応答を示した一方で、試験した健常な成人の大部分が、放射線刺激後にＰＵＭＡ  ｍＲＮＡの増大を示した。
【００６７】
個体における癌予防効果のための化合物をアッセイする方法
興味深いことに、図４の値は、同じ個体（黒菱形、黒三角）内で一定ではなく、時間とともに変動した。これは、癌危険性（ＤＮＡ損傷応答）が改変され得ることを示す。したがって、この試験は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏで候補化合物とともに全血をインキュベートすることにより、各個体に関して癌予防レジメンを同定するのに適用可能であり得る。
【００６８】
図５は、個体に対する、癌予防に関する薬物スクリーニングの結果を示す。第一に、ヘパリン処理した全血を、様々な栄養補助食品とともに３７℃で１時間インキュベートした（各化合物に関して２つのチューブ）。その後、１つのチューブを１Ｇｙの電離放射線へ暴露した後、両方のチューブを３７℃でもう２時間インキュベートした。ｐ２１  ｍＲＮＡは、上述のように定量化した。図５に示すように、最左のデータ点の組は、補助食品なしで得られ（表示（−））、放射線誘導性ｐ２１誘導が確認され、図１〜３の結果と類似していた。図５では、各データ点は、１Ｇｙ放射線あり（黒丸）又はなし（白丸）でのｐ２１  ｍＲＮＡの平均値±標準偏差である。栄養補助食品は、それぞれビタミンＡ（１０μＭ）、Ｃ（１０μｇ／ｍＬ）、Ｄ（１００ｎＭ）及びＥ（１：１０００）、エピガロカテキン（ＥＧＣ、緑茶抽出物）（１０μＭ）、γ−リノール酸（γＬＡ）（１０μｇ／ｍ
Ｌ）、ゲニステイン（Ｇｅｎ、ダイズ抽出物）（１０μＭ）、クルクミン（Ｃｕｒ、スパイス）（１μＭ）、ケルセチン（Ｑｕｅ、植物性フラボノイド）（１００ｎＭ）、ハラタケ属(Agaricus)（Ａｇａ、マッシュルーム抽出物）（１：１００）、プロポリス（Ｐｒｏ、蜂の巣抽出物）（１：１０００）、シメマコブ(Shimemakobu)（Ｓｈｉ、マッシュルーム抽出物）（３０ｍｇ／ｍＬを一口）、及びアルコキシグリセロール（Ａｌｋｏｘｙ、サメ抽出物）（１：１００）である。丸で囲んだデータ点は、ｐ＜０．０５を示す。
【００６９】
興味深いことに、幾つかの栄養補助食品（例えば、エピガロカテキン没食子酸塩（緑茶抽出物）は、放射線誘導性ｐ２１発現を著しく増強したのに対して、エピガロカテキン没食子酸塩は、対照血液（放射線なし）ではｐ２１レベルのいかなる変化も示さなかった。γ−リノール酸及びクルクミン（スパイス）もまた、放射線誘導性ｐ２１発現を増強したが、これらの化合物はまた、バックグラウンドｐ２１レベルも増大させた。バックグラウンドｍＲＮＡ発現の増大は、幾らかの副作用又は毒性を示し得る。バックグラウンドマーカーｍＲＮＡ発現のわずかではない増大を示す化合物は、かかる副作用を示し得る。本明細書中で使用する場合、ｍＲＮＡ発現の「わずかな」又は「弱い」増大は、好ましくは発現レベルの４００％未満の増大、より好ましくは発現レベルの２００％未満の増大、さらに好ましくは発現レベルの１００％未満の増大、最も好ましくは発現レベルの５０％未満の増大である。より大きな増大は、「強大な」増大であると決定される。これらのデータにより、これらの栄養補助食品の幾つかが、ＤＮＡ損傷応答を増大させ、癌予防を示し得ることが示される。
【００７０】
また、上述のように成長抑制マーカーを測定する前に個体へ化合物を投与することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでこれらの化合物をスクリーニングすることが可能である。投与は、経口又は静脈内のような当業者に既知の任意の様式で実施され得る。適切な投与量は、投与される化合物に応じて様々であり、当業者に既知の標準的な投薬レジメンに従って確定され得る。
【００７１】
抽出物である上記化合物はさらに、それらの活性構成成分を同定するのに試験され得る。このことは、癌予防効果を増強すると期待され、また任意の副作用又は毒性を低減し得る。
【００７２】
単一の個体に由来した図５の結果に示されるように、癌の発症を防御する個体の能力を増強するために、その個体にとって適切な化合物を同定することが可能である。換言すると、個体に適応させた癌予防プロトコルを開発することが可能である。
【００７３】
さらに、ある特定の化合物が、多くの他の個体において類似の結果を示す場合、これらの化合物は、一般的な癌予防効果を有すると仮定することができ、癌の危険性を低減するために一般社会により使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】ヘパリン処置した全血における放射線誘導性ｐ２１誘導を示す図である。
【図２】健常な成人（黒丸）及び癌患者（白丸）における放射線誘導性ｐ２１誘導を示す図である。
【図３】健常な成人（黒丸）及び癌患者（白丸）における放射線誘導性ＢＡＸ誘導を示す図である。
【図４】健常な成人（黒丸、黒菱形、黒三角）及び癌患者（白丸）における放射線誘導性ｐ２１並びにＢＡＸ誘導を示す図である。
【図５】様々な栄養補助食品による放射線誘導性ｐ２１の低減を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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