(57)【要約】  本発明は、ヒト成長ホルモンをコードする配列番号３を有する新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラに関する。本発明は、ヒト胎盤および下垂体ＲＮＡのｃＤＮＡアイソフォームから新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを得る方法であって、遺伝子特異的プライマーを使用する逆転写によりｃＤＮＡアイソフォームを増幅し、増幅されたｃＤＮＡアイソフォームをクローニングし、クローニングされたｃＤＮＡアイソフォームを特異的制限エンドヌクレアーゼ部位で消化し、次いで消化されたｃＤＮＡアイソフォームｈＧＨ−Ｖ断片特異的領域をｈＧＨ−Ｎ断片で置き換えて、ｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを得る方法にも関する。更に新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラは配列番号５を有する断片を含有する発現可能な構築物を得るためのテンプレートとして使用されて、成熟ヒト成長ホルモンを産生する。
2008503233.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３に示されたｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラ。
【請求項２】
ｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラによりコードされた配列番号１４に示されたアミノ酸配列。
【請求項３】
配列番号３に示されたキメラｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドベクター。
【請求項４】
配列番号５に示されたキメラ由来の成熟ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド発現ベクターｐＡＢＧＨ２。
【請求項５】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列番号３の新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを得る方法であって、
ａ）ヒト胎盤及び下垂体からトータルＲＮＡを単離し、
ｂ）工程ａ）のそれぞれのｃＤＮＡアイソフォーム、ヒト胎盤ＲＮＡからのｈＧＨ−Ｖ及び下垂体ＲＮＡからのｈＧＨ−Ｎを、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９から選ばれた遺伝子特異的プライマーを使用する逆転写により増幅し、
ｃ）工程ｂ）の増幅されたｃＤＮＡアイソフォームｈＧＨ−Ｖ及びｈＧＨ−Ｎをクローニングし、
ｄ）工程ｃ）のクローニングされたｃＤＮＡアイソフォームの両方の制限エンドヌクレアーゼマップをそれらのインフレーム翻訳されたＯＲＦ配列に従って比較し、
ｅ）工程ｃ）のクローニングされたｃＤＮＡアイソフォームを特異的制限エンドヌクレアーゼ部位で消化し、
ｆ）工程（ｅ）の消化されたｃＤＮＡアイソフォームにおいて、ｈＧＨ−Ｖ断片特異的領域を、特異的制限エンドヌクレアーゼ部位においてライゲーションによりｈＧＨ−Ｎ断片で置き換えて、ｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを得、そして
ｇ）配列番号３に示されたｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを適当なプラスミドベクターにおいてクローニングする、
工程を含む方法。
【請求項６】
ｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラの所望の特定の組み合わせが、配列番号３に示された１〜６２ｂｐ、６３〜５８７ｂｐ及び５８８〜７２８ｂｐである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
工程（ｅ）において、特異的制限エンドヌクレアーゼが、ＢｓｅＭＩ、ＡａｔＩＩ、ＥｃｏＮＩ、ＰｌｅＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｈｅＩ、Ｓｍ１Ｉ及びＳｍａＩから選ばれる、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラが配列番号５に示された成熟したｈＧＨ  ｃＤＮＡを生成する、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子特異的プライマーを使用するｃＤＮＡ増幅により配列番号５を生成させる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
遺伝子特異的プライマーが、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２から選ばれる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
キメラ由来の配列番号５の発現可能な構築物が非ＧＣリッチ配列のストレッチと連結されている、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
非ＧＣリッチ配列のストレッチと連結されたキメラ由来の配列番号５の配列が重複されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項４に記載のプラスミド発現ベクターｐＡＢＧＨ２を有するＥ．ｃｏｌｉに由来する組換え細胞。
【請求項１４】
請求項１に記載の配列番号３に示されたキメラｃＤＮＡ配列を含有するプラスミドベクターを有するＥ．ｃｏｌｉに由来する組換え細胞。
【請求項１５】
合成ヒト成長ホルモンの製造方法であって、
ａ）請求項４に記載のプラスミド発現ベクターｐＡＢＧＨ２を有する組換え細胞を適当な培養培地中で成育させ、そして
ｂ）該合成ヒト成長ホルモンを該組換え細胞の培養培地から既知の方法により回収する、
工程を含む方法。
【請求項１６】
組換え細胞がＥ．ｃｏｌｉ、酵母、ＣＨＯからなる群、好ましくはＥ．ｃｏｌｉから誘導される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
プラスミド発現ベクターｐＡＢＧＨ２が、キメラ由来の配列番号５の２つのコピーを含有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
キメラ由来の配列番号５を含有するプラスミド発現ベクターｐＡＢＧＨ２が、非ＧＣリッチ配列のストレッチと連結されている、請求項１５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、主として、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）をコードする配列番号３に示された新規なｈＧＨ−ＮＶ ｃＤＮＡキメラおよび該新規なキメラの製造方法に関する。更に、本発明は、成熟したヒト成長ホルモンを産生するための発現可能な構築物を得るためのｈＧＨ−ＮＶ ｃＤＮＡキメラの使用に関する。
【０００２】
背景技術
ＤＮＡアイソフォームおよび遺伝子クラスター
成長ホルモン（ＧＨ、ソマトトロピン）の哺乳動物遺伝子座は、進化においてきわめて最近（おそらく１千万年前）、５つの高度に配列保存された遺伝子（類人猿およびヒトにおける如く）のクラスターに拡大した。げっ歯類および有蹄類においては、相同な遺伝子座はそれぞれのソマトトロピンの遺伝子だけを含有するのに対して、ヒトでは、この遺伝子座は、追加の4つの遺伝子を有する（Fiddes et al, 1979; Seeburg, 1982）。ヒト成長ホルモン遺伝子クラスターの構造は、ＤＮＡの７８ｋｂ領域にわたって決定された。全体の遺伝子クラスターは、ヒト染色体１７の長腕にバンドｑ２２〜ｑ２４に位置している（George et al., 1981）。ここに報告された６６，４９５ｂｐのＤＮＡ配列（各々、５つのエクソンと４つのイントロンからなる、5つの遺伝子の配列を含む）は、全体のヒト染色体１７の約０．１％を表す。それは、２つの重なり合う組換えコスミドで単離され(Barsh et al., 1983)、そして制限分析と位置および転写配向に関して特徴付けられた。
【０００３】
すべて同じ転写配向において、３つの絨毛性ソマトマンモトロピン遺伝子で散在させられた２つの成長ホルモン遺伝子がある。成長ホルモンスーパーファミリーのこれらの遺伝子クラスター（５’から３’へ：ｈＧＨ−Ｎ、ｈＣＳ−Ｌ、ｈＣＳ−Ａ、ｈＧＨ−Ｖ、ｈＣＳ−Ｂ）は、同じ転写方向を示し、そしてＡｌｕ型の４８の散在した中央反復配列エレメントを含有する長さ６〜１３ｋｂの遺伝子間領域により分離されている（Chen et al., 1989,Seeburg, 1982）。これらの中でもそれらの３つはトランケーションされている。同じ転写配向でアラインされた遺伝子（５’から３’へ：ｈＧＨ−Ｎ、ｈＣＳ−Ｌ、ｈＣＳ−Ａ、ｈＧＨ−Ｖ、ｈＣＳ−Ｂ）を示し、そして４８の散在した中央反復配列エレメントを含有する長さ６〜１３ｋｂの遺伝子間領域により分離されているすタンデムで成長ホルモンスーパーファミリーの遺伝子クラスターマップを示す。ｈＧＨおよびｈＣＳの遺伝子は染色体１７上のバンドｑ２２〜ｑ２４において一緒にクラスター化されているが、プロラクチン遺伝子は、染色体６に位置している。それらの隣接したフランキング領域を含むすべての５つの遺伝子は、配列決定され、そして全体にわたり保存されている（９１〜９９％）。
【０００４】
ヒト染色体成長ホルモン遺伝子座は、約６６．５ｋｂにわたっており、そして全体が配列決定されてその生物学および進化の分析のためのフレームワークを与える（Chen et al., 1989; Seeburg, et al.,1982; Lewis et al., 1980; Hirt et al., 1987）。ｈＧＨ−Ｎ遺伝子は、下垂体においてもっぱら転写され、これに対して、他の４つの遺伝子（ｈＣＳ−Ｌ、ｈＣＳ−Ａ、ｈＧＨ−Ｖ、ｈＣＳ−Ｂ）は、各遺伝子に特徴的なレベルで胎盤組織においてのみ発現される（Hennen, et al., 1985; Macleod, et al., 1991; Frankenne, et al., 1990）。広範な構造的情報は、単一の先祖の成長ホルモン様前駆遺伝子から染色体１７上の現在の５つの遺伝子配列へと、ｈＧＨ遺伝子座の分子進化における主要な段階の再構成を可能とする。
【０００５】
ディファレンシャルアイソフォーム発現
遺伝子の配列の分析および５つの遺伝子クラスター全体にわたって散在した少なくとも3つの異なるクラスの重複ユニット(duplication units)の同定は、該クラスターはきわめて最近進化したことおよび遺伝子重複の機構は、Ａｌｕファミリーの中央反復エレメント間の相同性であるが同じではない交換を包含することを示唆する。
【０００６】
これらの遺伝子のグループは、それらの５’フランキング配列およびコード配列全体にわたり高度に相同性であるが、それらの３’フランキング領域において相違し(diverge)、これは構造配列およびフランキング配列においてこれほど類似している遺伝子が、いかにしてこれほどディファレンシャルに(differentially)調節されうるかというパラドックスを掲げる。高い配列同一性にもかかわらず、これらの遺伝子は、ディファレンシャルホルモン制御下に２つの異なる組織で選択的に発現される(Perks et al., 1989)。ｈＧＨ−Ｎ遺伝子は、下垂体において活性なクロマチンコンホーメーションにあり、これは下垂体前葉の成長ホルモン産生細胞においてのみ転写されるが、これに対して絨毛性ソマトマンモトロピン遺伝子の少なくとも１つは胎盤栄養芽層にある。
【０００７】
ＲＮＡスプライシングプロセスの第一段階は、３’スプライス部位およびそのポリピリミジントラクトの選択であり、３’スプライス接合部へのその距離により主として決定されるイントロン分岐点部位と因子（１つまたは複数）の会合により伴われる。かくして、スプライス部位の選択は、スプライシングの一般的機構および選択的プロセシングの特別の場合の両方において重要なエレメントであることは明らかなようだ。これは、選択的ＲＮＡプロセシングが、選択的ドナー部位の使用よりも選択的受容部位の使用をばしば伴う（それはｈＧＨ  ｍＲＮＡで起こるのだが）という観察と一致している。細胞型依存性スプライス変異体およびその安定性は、転写物の遺伝子座を規定する。
【０００８】
ＧＨ／ＰＬ遺伝子転写は、ヒト個体発生期間中器官特異的方式で制御され：ＧＨ−Ｖ、ＰＬ−Ａ、ＰＬ−ＢおよびＰＬ−Ｌ遺伝子は、胎盤において転写活性であり（Seeburg et al, 1982）、これに対して、生後下垂体由来のｈＧＨ−Ｎは支配的内分泌活性ＧＨとなる(Selby et al., 1984)。ｈＧＨ−Ｎと対照的に、胎盤ｈＧＨ−Ｖは、妊娠期間中シンシチウム栄養芽層において人生の最初の数ヶ月の間に合成されるが、成長、発達および代謝のためのその機能は明らかではない(Hennen et al., 1985; Cooke et al., 1988)。胎盤により分泌された妊娠ポリペプチドホルモン、ｈＧＨ−Ｖおよび胎盤ラクトゲンの中でも、ｈＧＨ−Ｖ分泌のみは、グルコースによりモジュレーションされ、これは、妊娠期間中このホルモンのための代謝的に重要な役割を示唆している(Seeburg et al, 1982; Patel et al., 1995)。全胎盤ＧＨ／ＰＬｍＲＮＡｓの大部分は、ＰＬ−ＡおよびＰＬ−Ｂ遺伝子に由来し(９５〜９９％)、そして1〜４．２％のみがＧＨ−Ｖ遺伝子産物をコードする(Chen et al., 1989; Macleod et al., 1991; Lytras et al., 1994)。
【０００９】
ＧＨ−Ｖ遺伝子のイントロンＤを省くまたは含む２つの選択的にプロセシングされたｍＲＮＡｓ(Untergasser, G. et al., 1998)は、シンシチウム栄養芽層により発現されて、分泌された（２２Ｋ，１９１ａａ）、または多分膜に会合した（２６Ｋ，２３０ａａ）タンパク質(Cooke et al., 1988)をもたらす。別名胎盤ｈＧＨと呼ばれる分泌されたｈＧＨ−Ｖ、ソマタゲンは、妊娠した婦人の血清中に検出することができ、そして妊娠の第３の３ヶ月間まで支配的な血清ｈＧＨとなる(Hennen et al., 1985; Cooke et al., 1988)。この情報は、我々が１つのアイソフォーム（ｈＧＨ−Ｖ）から他のアイソフォーム（ｈＧＨ−Ｎ）への新規なｃＤＮＡウォークを理解するのを助けた。これらの２つの間のｃＤＮＡ配列類似性および制限酵素マップパターンは、この新規な発明のためのプラットフォームとして採用された。
【００１０】
下垂体由来の成長ホルモンおよび胎盤由来の成長ホルモンの両方共、任意の分泌シグナリング配列を伴って、または伴わずにプロセシングされた成熟ＧＨタンパク質の形態で産生され、それは、それぞれ、Ｅ．ｃｏｌｉの細胞膜周辺腔または可溶性画分に蓄積される(Hsiung et al., 1986; Chang et al., 1987; Martial et al., 1979; Gray et al., 1988 and Joly et al., 1998)。ｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡは２０，０００ダルトンの分子量のタンパク質をコードするが(Ucida et al., 1997; Honjo et al., 1996; Igout et al., 1988 and 1993; Frankenne et al., 1990)、これに対して、成長ホルモンは、１９１アミノ酸から構成され、そして２１，５００ダルトンの分子量を有し、そして下垂体こびと症、小児科慢性腎臓不全の処置のために使用される(Mukhija et al., 1995; Grandi, 1991)。ｈＧＨは注目すべき活性、例えば、免疫促進活性または脂肪分解刺激活性ならびに成長促進活性を有することが最近見出された。より広い適用が将来大いに期待される。
【００１１】
一次ｈＧＨ−Ｎ遺伝子転写産物の選択的スプライシングは、ｈＧＨ（２２kD形態）およびｈＧＨ−Ｎ遺伝子転写物のエクソンＩＩＩから１５コドン欠失したソマトトロピン変異体（２０kD形態）をそれぞれコードする(DeNoto et al., 1981)２つのｍＲＮＡ種を発生させる(Singh et al., 1974; Lewis  et al., 1978)。このような選択的スプライシングは、ｈＣＳ遺伝子ＲＮＡｓについて報告されていない。異なるエクソンＩＩＩ構造を有するｈＣＳ−Ｌ遺伝子ｍＲＮＡを除いて、全てのｍＲＮＡｓについて完全なコドン共直線性(codon colinearity)が存在する。
【００１２】
すべての５つのｍＲＮＡｓは長さが約２００のアミノ酸のポリペプチドを特定し、そのＮ末端２６残基はシグナル配列として機能する。ｈＣＳ−ＡおよびｈＣＳ−Ｂ遺伝子間に位置するｈＧＨ−Ｖ遺伝子は、ｈＧＨ−Ｎと比較して１３の位置でＧＨとは異なるポリペプチドをコードするが(Seeburg, 1982)、ｈＧＨは２８残基においてｈＣＳとは異なる。ｈＣＳ−Ｌ  ＤＮＡ配列は、その第２イントロンの５’コンセンサススプライス供与部位において点突然変異を示し(Hirt et al., 1987)、スプライシングはこの位置では起こらない可能性があることを示唆する。かくして、ｈＣＳ−Ｌ遺伝子は、安定なＲＮＡまたはタンパク質産物を生じないかも知れない。仮想的ｈＣＳ−Ｌタンパク質は、密接に関連したｈＣＳよりも１８アミノ酸残基短く、そして他のポリペプチドに対する相同性を持たない６残基のストレッチを含有し、ｈＧＨとの７５％だけの配列同一性を含有する。これらの５つの遺伝子の転写物の空間分布は、転写のレベルで調節されることができ、またはｈＧＨ遺伝子座のクロマチン構造に反映されているとおりの両位置に基づいて調節されることができ、そして個々の遺伝子のまわりの配列特異的調節エレメントは、遺伝子発現の観察された組織特異的パターンの原因でありうる。
【００１３】
真核生物コドン使用頻度対分化
遺伝子のＤＮＡは、いくつかの構造的に隔離された領域(secluded regions)、即ち、調節のための領域および完全長タンパク質コード化オープンリーディグフレームを含む。酵素「ＲＮＡポリメラーゼ」は、活性化され、制御領域（「プロモーター」と呼ばれる）において結合し、構造遺伝子に沿って滑り、そしてコードされた情報を、いくつかの他の機能的アクセサリーの助けをかりて転写して、スプライシングされたプレメッセンジャーリボ核酸（ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）の大まかなドラフトとし、次いでその最終的にプロセシングされたメッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）とする。次いで、このｍＲＮＡメッセージは、各翻訳可能なアミノ酸のためのトリプレットコードの形態でリボソームにおいて翻訳され、その場合にタンパク質の翻訳は開始シグナル（最も普通にはＡＴＧ）により始まり、そして停止シグナル（普通はＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）まで進行する。
【００１４】
上記したとおり、ＤＮＡ内の遺伝子コードは、アミノ酸により規定され、それは、トリプレットまたは「コドン」（Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃからの３つの隣接したヌクレオチド）により特定され、そこではいかなるタンパク質においても各特定のアミノ酸の第３のヌクレオチドは変わることがある。遺伝子コードに従えば、特定のアミノ酸のための第３アミノ酸を使用することの優先性は、原核生物と真核生物とでは変わり、これは種々の生物のコドン使用頻度(codon usage)の「縮重」を規定する（表１）。コドン使用頻度の百分率およびそれらの生起の頻度は、Ausubel,F.M. et al.(1987)に明白に示されている。ここでは、我々は、表１において生物間のアミノ酸の使用頻度の変動性およびそれらの生起の頻度の変動性を示した(Ausubel,F.M. et al.(1987) 。この知識は、組換え技術において異種システムでの関心のあるタンパク質の発現の大変な助けとなり、組換え技術ではヌクレオチドはＤＮＡレベルでトリプレット内で変わることができて、いかなる異物タンパク質発現の収率も改善することができる。可能性がある配列のこれらの領域のキメラｈＧＨ同定の我々の分析では多分貧弱な異種発現をもたらす。我々は、ｈＧＨ−Ｎ配列及びその対立遺伝子コドン使用の差を利用して、適当なコドン使用で修飾することにより、Ｅ．ｃｏｌｉ、酵母、昆虫、ＣＨＯ等のような種々の生物においてヒト成長ホルモンを発現するのに大いなる支援となりうる発現クローンを思いついた。
【００１５】
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）遺伝子の完全な配列及び配列内のｈＧＨ  ｍＲＮＡの成熟した５’端部の位置は、DeNoto F.M. et al., 1981により決定された。この配列とクローニングされたｈＧＨ  ｃＤＮＡの配列との比較は、この遺伝子が４つの介在配列により中断されていることを示す。Ｓ１マッピングは、これらの介在配列の１つは２つの異なる３’スプライス部位を有することを示す。これらの選択的スプライシング経路は、異なるサイズのｈＧＨペプチドを発生させる、これは正常な下垂体において見出される。ｈＧＨ  ｍＲＮＡの５’端部付近の配列とヒト糖タンパク質ホルモンのαサブユニットの同様な領域との比較は、これらの他の点では無関係のペプチドホルモン間の相同性の予期しなかった領域を示す。
【００１６】
選択的ＲＮＡスプライシングの機構は、通常、タンパク質多様性の発生に関与している。介在配列Ｂの正常な３’部位から４５ｂｐ下流に位置した１つの選択的３’部位におけるスプライシングは、正常な下垂体で低いレベルで見出された１つのより小さいｈＧＨペプチドのためのｍＲＮＡを発生させる可能性がある。成熟ｍＲＮＡの５’端部の位置は、Ｓ１マッピングを使用して位置決めされた。Ｓ１ヌクレアーゼ分析は、多数のＲＮＡｓの存在の証拠を与える。ｈＧＨ遺伝子は、選択的経路におけるＲＮＡスプライシングの正確度及びスプライス部位選択の調節に関するいくらかの未解決の問題にアプローチするための良好なシステムでありうる。転写の開始に関与していると考えられるシグナル配列ＴＡＴＡＡＡは、成熟ｍＲＮＡの５’端部から約２５ｂｐ上流に見出される。保存された配列は、ポリＡがｍＲＮＡに付加されている配列の付近の遺伝子においても見いだされた。驚くべきことに、ｈＧＨ及び他の点では無関係なヒト糖タンパク質ホルモンのαサブユニットのｍＲＮＡ’ｓの５’非翻訳領域に相同性の領域がある。我々の研究は、更により良好な発現のためのキメラｈＧＨのｍＲＮＡ二次構造における微妙な差をもたらすことを目的とする。Ｓｏｎｏｎｉｃｋ（１９８５）は、スプライス部位選択に対するＲＮＡ二次構造の影響が存在することを提唱した。彼は、しばしば使用されるスプライス部位は、ヘアピンループにおいて隔離されるとき随意となることを示した。かれらの観察に従えば、ｈＧＨ前駆体ｍＲＮＡの選択的スプライシング部位の領域に局所的二次構造があり、大きなヘアピン構造は２２ｋ及び２０ｋ受容部位の両方をトラップしそしてスプライス部位の分岐点配列もトラップする。安定な構造は、２２ｋ及び２０ｋスプライス部位をループアウトすることによりそして特異的スプライス部位をもたらすラリアット形成を妨害することにより、選択的受容部位におけるジャンプスプライスを促進するであろう。
【００１７】
多くのイントロンにおいて、コンピュータによる研究は、３’スプライシング切断部位から座標−６０と−２１との間によく保存された領域を示した。このボックスは、受容スプライス部位認識及びラリアット形成に影響を与える追加のエレメントを有する(Leocomte et al., 1987)。ヒト下垂体ＲＮＡのＳ１マッピング分析は、一次転写物の第２イントロンにおける選択的受容部位に由来する少なくとも４つの異なるｈＧＨ  ｍＲＮＡｓの存在を確証する。ｈＧＨ遺伝子配列に関して分析を行って、この位置でのみ起こる選択的スプライシングの高い頻度を説明する。ｈＧＨ遺伝子の４つのイントロンのうち３つは受容スプライス部位から上流の領域に「ＣＴＴＧ」ボックスを含有する（イントロンＡ、Ｂ及びＤ）。しかしながら、「ＣＴＴＧ」ボックスは、イントロンＣには見出されずそして２０Ｋ選択的スプライシング部位から上流に見出されなかった。多くのイントロンについて、「ＣＴＴＧ」ボックスを含有する領域とＵ２ｓｎＲＮＡの第１ループの５’端部との間の良好な相補性は、ＲＮＡ−ＲＮＡ塩基対形成によりスプライス部位を特定する分岐点選択において役割を演じうることが報告された。ｈＧＨにおけるタンパク質多様性の発生は、多分、それがＲＮＡ二次構造のそれらの差によるものでありそしてコドン使用頻度は好ましい宿主において異なる発現のレベルを有することと関係がある。
【００１８】
キメラの構築及び工業的原理
クローニングにおいて使用されるべき組換えベクターの構築は、融合タグペプチド配列及びプロテアーゼ切断部位をコードする配列にその５’末端で融合された、関心のある成熟タンパク質、例えば成熟ｈＧＨをコードするヌクレオチド配列を含有するハイブリッドプラスミドの構築を含む。かくして、ハイブリッドプラスミドは、実験室規模及び近年では大きな規模でその潜在的用途を作り出したキメラＤＮＡ構築物を作成することにより異種性とされる。組換え技術において関心のある遺伝子を有するキメラの構築の概念は、発現及び精製工程の収率を促進する。両方の面の成功率は選択された融合ペプチドの選択に依存する。
【００１９】
固定化された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）は、組換えタンパク質の精製のために最も広く使用される技術である。タンパク質のアミノ末端またはカルボキシル末端のＨｉｓタグのエンジニアリングは、固定化された金属イオン、例えば、Ｎｉ２+、Ｃｏ２+、Ｚｎ２+、Ｃｕ２+及びＦｅ２+への組換えタンパク質の選択的吸収を可能とする。これらの技術は、標的タンパク質の選択的精製を与える(Mukhija et al 1995; Shin et al., 1998; WO 9115589)。ヒスチジンまたはリシンまたはアルギニンを含む塩基性アミノ酸残基の使用は、本発明が有効に実施されることを可能とする。
【００２０】
全体として、キメラ構築物を作成する際の選択及び適用は、パイロット規模及び工業的バックグラウンドの大規模での産物収率の百分率を支援する。プロテアーゼ切断部位（例えば、トロンビン、因子Ｖ、因子Ｘａ、エテロキナーゼのようなセリンプロテアーゼ部位）をアフィニティータグ（ＨｉｓタグまたはＧＳＴタグ）のすぐ後に保つことは、キメラ構築においてよく使用され、その場合発現した異種タンパク質はカラムでまたはカラムの外側でタグから容易に切断除去されそして天然に存在するｈＧＨの配列を有する関心のあるタンパク質が単離される。アフィニティークロマトグラフィー技術の選択は、精製においてより少数の工程を有する工業的目的の任意の大バッチ精製を取り扱うのを助けそして関心のある最終産物の損失を減少させ、かくして全プロセスを費用効果性にする。
【００２１】
ｈＧＨのクローニングの歴史
ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、ヒト下垂体において分泌される。その成熟形態では、それは１９１アミノ酸からなり、約２１，５００の分子量を有し、かくしてインシュリンの３倍よりも大きい。組換えＤＮＡ技術の出現までは、限られたソース、即ち、ヒト死体の下垂体からの骨の折れる抽出によってのみ、ｈＧＨを得ることができた。結果としてこの物質の不足は、たとえそれが火傷、傷の治癒、栄養失調、骨癒着、びまん性胃出血および偽関節症の処置において有効であることが提唱されたとしても、下垂体機能低下こびと症の処置にその用途を限定してきた。実際、利用可能な評価は、組織から入手可能なｈＧＨの量は、下垂体機能低下こびと症の被害者の約５０％にかろうじて使えるということである。かくして、ｈＧＨは他の用途には利用できない。この故に、ｈＧＨのクローニング及び特にＥ．ｃｏｌｉにおける産生のための組換えＤＮＡ技術を利用することが必要である。複合異種ポリペプチドのための微生物宿主としてのＥ．ｃｏｌｉの使用は、今や微生物宿主において十分に確立されている。最初に、ｈＧＨは、下垂体機能低下こびと症およびｈＧＨが有効な他の状態（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ  Ｎｏ．４３４２，８３２）を処置するのに十分な良好な量で、組換え宿主細胞、特にＥ．ｃｏｌｉにおいて産生されうることが示された。Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ  Ｎｏ．４，３４２，８３２の方法により発現されたｈＧＨは、治療用途に使用することができる産物をもたらした。後に、Ｅ．ｃｏｌｉでの（ＢａｃｉｌｌｕｓおよびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓにおいても）ｈＧＨ発現のためのベクター構築物を発生させる種々の修飾がなされた。これまで、Ｅ．ｃｏｌｉで発生させた組換えｈＧＨは患者により満足に受け入れられた。何故ならば、それはいかなる免疫反応も与えないからである。これは糖タンパク質ではないので、Ｅ．ｃｏｌｉは、ｈＧＨを発現させるための最も適当な宿主である。
【００２２】
Ｅ．ｃｏｌｉ宿主系における発現の部位及び発現の収率を制御しそして発現されたタンパク質のレベルでクローニング工程中の二次構造形成を制御するための特異的調節エレメントを有するベクター構築物を作成しようとする試みがなされた（Tokunaga et al., 1985）。ｈＧＨが、例えば、細胞内で細胞周辺腔において封入体としてまたは細胞から外の分泌タンパク質として、例えば、封入体としての細胞内でｈＧＨが発現された３つの方法がある(Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ  Ｎｏ．４７７５５４６５)。
【００２３】
Ｅ．ｃｏｌｉの細胞周辺腔への２２kDｈＧＨの分泌が報告された(Gray et al. 1985, 247-254; Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ  Ｎｏ．５２７９９４７)。細胞周辺腔は、Ｅ．ｃｏｌｉを含むグラム陰性菌の内膜と外膜との間の空間を指す。グラム陰性菌では、シグナル配列を含有する前駆体タンパク質は、膜透過のために必要でありそして内膜を通過すると、分泌シグナルは切り取られる。次いでタンパク質は、その分泌シグナルを失うことにより成熟タンパク質にプロセシングされる。我々の実験室に特有なｈＧＨクローニングの我々のストラテジーを計画するのを助けたこれまでに報告された（リストは下記される）いくつかのクローニング特許がある。
【００２４】
最近、細胞内ヒト成長ホルモンをｈＧＨの遺伝子が宿主としての微生物において発現される組換えＤＮＡ技術によって、細胞外で産生することまたは細胞周辺腔において産生することが可能となった（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ  Ｎｏ．５０４７３３３、４７５５４６５、４６０４３５９および４６０１９８０）。
【００２５】
種々の酵素、例えば、因子Ｘａ、エンテロキナーゼ、レニンまたは特定の化学品、例えば、ＣＮＢｒによるｉｎ  ｓｉｔｕ翻訳後修飾も、成熟ｈＧＨがそのキメラタンパク質部分からまたはその延長されたＮ末端部分から単離される場合に注目されてきた他の分野であった。これは、宿主タンパク質の残部から適切なクロマトグラフィー技術による全タンパク質のその容易な分離及び精製を可能とする。精製されたｈＧＨの純度プロフィルはｉｎ  ｓｉｔｕ翻訳後修飾の選択に直接依存することができる。
【００２６】
本明細書に開示された本発明にきわめて近い先行技術はない。幾分関係がある特許先行技術の教示を下記に要約した。
【００２７】
ＵＳ３８５３８３２において、この特許は、合成ヒト成長促進物質を産生する方法を請求しておりそして本発明の発明観点とは関係がない。それは１８８アミノ酸のポリペプチドを取り扱っているが、これに対してｈＧＨは１９１アミノ酸を有する。それは、スルフヒドリル基の導入、酸化を教示し、そしてそれらの位置に関して語っている。本発明は、ｃＤＮＡのクローニングによりｈＧＨを産生する新規なアプローチに関する。ＵＳ５９５５３４６は、ヒトプロラクチンの変異体をコードするヌクレオチド配列を取り扱う。唯一の類似性は、それがタンパク質を取り扱っているということである。
【００２８】
ＵＳ４４４６２３５は、所望のポリペプチドをコードするｃＤＮＡを得る方法を教示しそしてクローニンされたゲノムＤＮＡをプロービングしてゲノム断片を得ることを含みそしてＣＯＳ細胞ベクターを使用する。ゆえに、それは、本発明により教示されるものを教示していない。
【００２９】
ＵＳ４６６５１６０は、ｈＧＨ−Ｖ上に存在するアミノ酸の配列を請求し、そして本発明の新規であるｃＤＮＡのクローニングまたはアイソフォーム由来のキメラもしくは新規なウォークの使用を教示していない。本発明は、ｈＧＨ−ＮＶからのｈＧＨの産生に関する。
【００３０】
ＵＳ４６７０３９３は、挿入されたＤＮＡ配列を含む複製可能なクローンビヒクルを請求しておりそしてアミノ酸の配列をリストしているが、これに対して、本発明は、キメラの概念を始めて利用している新規な技術によるｈＧＨの産生に関する。ＵＳ５８４９５３５は、ｈＧＨの変異体を請求しており、それ故、それは本発明を教示していない。ＵＳ５５９７７０９も、ｈＧＨ−Ｖに主として集中しているが、本発明と違って下垂体由来のｈＧＨ−Ｎに集中していない、野生型ｈＧＨからの組換えＤＮＡ技術によりヒト成長ホルモン変異体を産生する方法を請求している。ＧＢ２０５５３８２Ａは、ｈＧＨの合成における下垂体ホルモン断片の使用を教示する。それは、天然に存在する部分及び合成部分を組み合わせて、バクテリア発現システムを使用してｈＧＨを得ることを教示する。それは、本発明である２つのアイソフォームのキメラのクローニングとは古典的に異なっている。それは、異なるクローニングビヒクル及びクローニングベクターに関して語っている。
【００３１】
ＵＳ５４９６７１３は、分泌産生方法に相当する細胞周辺腔においてｈＧＨを産生する方法を教示する。本発明は、細胞内で十分に壁の内側での産生の方法を取り扱っており、それ故基本的に異なる。ＵＳ５７８９１９９も、バクテリア細胞周辺腔において異種ポリペプチドを産生するための技術を教示する。ＵＳ５０４７３３３は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ細胞中で天然に存在するｈＧＨを産生する方法を教示し、それ故、それは本発明とは異なっている。本発明において使用される技術は新規であり、そして使用された宿主細胞はＢａｃｉｌｌｕｓではなく、そして本発明の概念はＵＳ０４７３３３とは異なる。
【００３２】
ＵＳ４８５９６００は、ｈＧＨを含有する組換え原核生物宿主細胞を作成することを請求しており、該ｈＧＨのアミノ酸配列が天然に存在するｈＧＨのアミノ酸配列からなり、該ｈＧＨはそのネイティブ環境と関連した他のタンパク質を含まず、そして外来のＮ末端メチオニンを有する成熟ｈＧＨを含まず、そして前記組換え原核生物宿主により産生された。ＵＳ５６１８６９７は、ｈＧＨを産生する方法を教示しており、該方法では、構築物は、より容易な下流のプロセスのための負に帯電したアミノ酸配列を有するアミノ末端延長部を含有する。
【００３３】
ＵＳ４６０１９８０は、主として産生されたポリペプチドを得るための下流の方法に関して語っており、それ故本発明の課題ではない発酵及び精製の観点を取り扱う。
【００３４】
ＵＳ４７５５４６５及びいくつかの他の特許は、Ｎ末端におけるメチオニンの存在の観点及びその利点を教示し、示し、そして記載しており、本発明を教示していない。ＵＳ５６３３３５２は、下垂体由来のｈＧＨからのｈＧＨの生合成に関与する工程を示している。変化した結合性質を有するネイティブヒト成長ホルモンの変異体は、アミノ酸の組を置換することによりＵＳ５６８８６６６に示された。
【００３５】
ＵＳ５６３５６０４は、Ｘが少なくとも２つのアミノ酸を有する帯電したアミノ酸配列でありそしてＸのＮ末端アミノ酸がＬｙｓ及びＡｒｇ以外の負に帯電したアミノ酸である、実質的に純粋なアミノ末端の延長されたｈＧＨを示す。
【００３６】
ＵＳ６４３６６７４／ＥＰ０９７４６５４は、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａにおける有効なクローニング法に関して教示しており、この方法では、ヒト成長ホルモンは、分泌シグナルペプチドを使用して細胞周辺腔に標的化される。好ましい方法は、この発明によれば分泌性である。何故ならば、単離及び精製は発明者により述べられたとおり細胞周辺腔における不純タンパク質の低いレベルにより容易にされるからである。
【００３７】
ＥＰ０５８７４２７において、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓからの新規な中性プロテアーゼを使用した２０ＫｈＧＨを産生する方法が記載されている。この方法は、このｈＧＨがバクテリア細胞周辺腔に分泌される、分泌性である。他の特許ＪＰ６１２２４９８８は、２０ＫｈＧＨｃＤＮＡの増幅のためのＥ．ｃｏｌｉの組換えプラスミドに関して述べている。対照的に、ＪＰ６１２０２６８９は、ヒト下垂体組織からの成長ホルモンの抽出プロセス及びそのその後のプロセスを述べている。
【００３８】
ＥＰ０４８９７１１は、天然に存在するｈＧＨのアミノ酸配列を有するｈＧＨを産生するための方法を記載している。この方法は、産生された最初のポリペプチドのＮ末端におけるＭｅｔの存在により特徴付けられる。
【００３９】
上記した引例は、分泌プロセスに関するか、またはメチオニンで特徴付けられたより大きなポリペプチド、またはｈＧＨを産生するためのヒト下垂体ｃＤＮＡアイソフォーム及びヒト胎盤ｃＤＮＡアイソフォームの使用に関する。しかしながら、これらの文献のいずれも、ヒト胎盤及び下垂体ｈＧＨ  ｃＤＮＡアイソフォームを使用してｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを誘導して、更に非ＧＣリッチ配列のストレッチと二重に連結されているキメラ由来の配列番号５の発現可能な構築物を得て、次に、ｈＧＨ−Ｎ（野生型）よりも良好な転写物二次ストレッチを伴う、アミノ酸配列において下垂体ｈＧＨと同一の２２ＫｈＧＨを産生する技術を記載していない。独特の構築物及び成熟ｈＧＨのより良好な発現は本発明の発明的ステツプである。
【００４０】
発明の目的
本発明の目的は、ヒト成長ホルモンをコードする配列番号３に示された新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを提供することである。
【００４１】
本発明の他の目的は、新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを含有するプラスミドベクターｐＧＥＨＮＶを提供することである。
【００４２】
本発明の更に他の目的は、組換えプラスミドベクターを含有する組換えＥ．ｃｏｌｉを提供することである。
【００４３】
本発明の更に他の目的は、非ＧＣリッチ配列のストレッチと二重に連結されたキメラ由来の配列番号５の発現可能な構築物を提供することである。
【００４４】
本発明の更に他の目的は、プラスミド発現ベクターｐＡＢＧＨ２を含有する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞を提供することである。
【００４５】
本発明の他の目的は、新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラの製造方法を提供することである。
【００４６】
本発明の要約
本発明は、主として、下垂体及び胎盤ＲＮＡから得られた２つの異なるｃＤＮＡアイソフォームに由来するヒト成長ホルモンをコードする配列番号３に示された新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラに関するものであり、そして本発明は、遺伝子特異的プライマーを使用する逆転写により増幅し、増幅したｃＤＮＡアイソフォームをクローニングし、クローニングされたｃＤＮＡアイソフォームを特異的制限エンドヌクレアーゼ部位で消化し、次いで消化されたｃＤＮＡアイソフォームにおいてｈＧＨ−Ｖ断片特異的領域をｈＧＨ−Ｎ断片により置き換えてｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを得る工程を含む、該新規なキメラを得る方法にも関する。更に、本発明は、成熟ヒト成長ホルモンを産生するための発現可能な構築物を得るためのｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラの使用に関する。
【００４７】
本発明の目的及び利点を得ることができる方法は、詳しい説明及び添付図面から更に十分に明らかとなる。
【００４８】
本発明の詳しい説明
本発明の好ましい態様
従って、本発明は、配列番号３に示された新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラに関する。
【００４９】
本発明の態様は、配列番号３を含有するプラスミドベクターｐＧＥＨＮＶを提供する。
【００５０】
本発明の他の態様は、配列番号３を含むプラスミドベクターｐＧＥＨＮＶを含有する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞を提供する。
【００５１】
本発明の態様は、ヒト成長ホルモンをコードする新規なｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを得る方法であって、
ａ）ヒト胎盤及び下垂体からトータルＲＮＡを単離し、
ｂ）工程ａ）のそれぞれのｃＤＮＡアイソフォーム、ヒト胎盤ＲＮＡからのｈＧＨ−Ｖ及び下垂体ＲＮＡからのｈＧＨ−Ｎを、配列番号６、配列番号７、配列番号８及び配列番号９から選ばれた遺伝子特異的プライマーを使用する逆転写により増幅し、
ｃ）工程ｂ）の増幅されたｃＤＮＡアイソフォームｈＧＨ−Ｖ及びｈＧＨ−Ｎをクローニングし、
ｄ）工程ｃ）のクローニングされたｃＤＮＡアイソフォームの両方の制限エンドヌクレアーゼマップをそれらのインフレーム翻訳されたＯＲＦ配列に従って比較し、
ｅ）工程ｃ）のクローニングされたｃＤＮＡアイソフォームを特異的制限エンドヌクレアーゼ部位で消化し、
ｆ）工程（ｅ）の消化されたｃＤＮＡアイソフォームにおいて、ｈＧＨ−Ｖ断片特異的領域を特異的制限エンドヌクレアーゼ部位（工程（ｅ）で述べた）においてｈＧＨ−Ｎ断片によりライゲーションによって置き換えて、所望の特異的組み合わせのｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラを得、そして
ｇ）配列番号３に示されたｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラをクローニングする、
工程を含む方法に関する。
【００５２】
本発明の他の態様では、アイソフォームからの部分を、より良好なコドン使用頻度のためのｈＧＨのｃＤＮＡ断片テンプレートを開発するために特定的に組み合わせる。
【００５３】
本発明の更に他の態様は、配列番号３に示された１〜６２ｂｐ、６３〜５８７ｂｐ及び５８８〜７２８ｂｐである所望の特定の組み合わせのｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラの使用を提供する。
【００５４】
本発明の更に他の態様は、ＢｓｅＭＩ、ＡａｔＩＩ、ＥｃｏＮＩ、ＰｌｅＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｈｅＩ、Ｓｍ１Ｉ及びＳｍａＩから選ばれる制限エンドヌクレアーゼの使用を提供する。
【００５５】
本発明のなお更に他の態様は、新規なｈＧＨ−ＮＶｃＤＮＡキメラから配列番号５に示された成熟したｈＧＨ  ｃＤＮＡを生成する。
【００５６】
本発明の態様は、遺伝子特異的プライマーを使用するｃＤＮＡ増幅により生成させた配列番号５の配列を提供する。
【００５７】
本発明の他の態様は、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１および配列番号２２から選ばれた遺伝子特異的プライマーの使用を提供する。
【００５８】
本発明のなお他の態様は、非ＧＣリッチ配列のストレッチと連結されているキメラ由来の配列番号５の発現可能な構築物を提供する。
【００５９】
本発明の更に他の態様は、非ＧＣリッチ配列のストレッチと連結されているキメラ由来の配列番号５の配列を複製する。
【００６０】
本発明の更に他の態様は、配列番号５に示されたキメラ由来の成熟ｃＤＮＡ配列を含有するプラスミド発現ベクターｐＡＢＧＨ２を提供する。
【００６１】
本発明の更に他の態様は、成熟ヒト成長ホルモンの産生のためのプラスミドｐＡＢＧＨ２を含有する組換えＥ．ｃｏｌｉ細胞を提供する。
【００６２】
クローニング方法の意義および困難
Ａ．胎盤ｍＲＮＡおよび組織の入手可能性
驚くべきことに、我々は、端から端まで発現されてグラム陰性菌においてプレｈＧＨを与えるｈＧＨのための遺伝子（即ち、成熟タンパク質の１９１のアミノ酸およびそのシグナルペプチドの２６のアミノ酸をコードする遺伝子）は、胎盤対応物のプレｈＧＨに長さにおいて同様であることを見出した。
【００６３】
成長ホルモンは、前駆体の形態で合成され、次いでこれは個体の寿命全体にわたって下垂体の前葉において産生されそして成熟前の期間は大量に産生され、そして一旦プロセシングされると、細胞から分泌される。
【００６４】
数年前までは、このホルモンの唯一のソースは、死体の下垂体であったが、それは複雑で費用のかかる方法により低収率で抽出された。
【００６５】
この故に、我々の本発明は、本質的に極めて支援的であり、本発明では、胎盤ｍＲＮＡおよび下垂体ｍＲＮＡがｈＧＨ−Ｎ類似ｈＧＨ−ＮＶのクローニングプロセスの出発点である。５つのｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡｓは、高度に相同性のヒト成長ホルモンおよびヒト絨毛性ソマトマンモトロピン遺伝子転写物のパターンに類似したパターンにおいてスプライシングされそしてプロセシングされたｍＲＮＡｓを表す（Cooke et al., 1988）。更に、単離期間中の胎盤ｍＲＮＡの安定性も考慮されるべきである。クローニングプロセスは、最終構築物におけるコドン使用頻度のためのショッピングのある程度の自由を与える。ｈＧＨ−ＮＶにおけるｈＧＨ−Ｖの部分は、ｈＧＨ−Ｎよりも良好なｍＲＮＡ二次構造を与えることを目的とした（図３）。
【００６６】
Ｂ．胎盤ｃＤＮＡ構築物のクローニング
我々はｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡのクローニングを介するｈＧＨ−Ｎ類似アイソフォームのクローニングを、これらの遺伝子がディファレンシャルなホルモン制御下に２つの異なる組織において選択的に発現されるという事実(Parks et al., 1989)にもかかわらず、初めて試みた。ｈＧＨ−Ｎ遺伝子は、下垂体前葉の成長ホルモン分泌細胞(somatotrophic cells)においてのみ転写され、そして、ｈＣＳ−ＡおよびｈＣＳ−Ｂ遺伝子は胎盤栄養芽層においてのみ転写される。一次ｈＧＨ−Ｎ遺伝子転写産物の選択的スプライシング(DeNoto et al., 1981)は、それぞれ、ヒトＧＨ（２２Ｋ形態）およびｈＧＨからアミノ酸残基が欠失した(Singh et al., 1974)、ソマトトロピン変異体（２０Ｋ形態）をコードする２つのｍＲＮＡ種を生成する。
【００６７】
Ｃ．基本的相同性
本発明は、主として、同じ染色体遺伝子座におけるヒト成長ホルモンの変異体、特にｈＧＨ変異体タンパク質をコードしそして４〜５の介在遺伝子を含有する代表的遺伝子の存在に基づいている。我々は、ｈＧＨアイソフォーム、例えば、ｈＧＨ−Ｖ，ｈＣＳのクローニングによりｃＤＮＡをクローニングするための独特な選択を行った。
【００６８】
クローニングのための出発物質としてのｍＲＮＡアイソフォームの使用および純粋な形態を得るための適切な酵素的マッチ部位の使用および高い収率のためのＯＲＦの適当な操作。
【００６９】
クローニングのための２つのアイソフォームの完全長ｃＤＮＡ間でシャッフルするストラテジーおよび標的ｃＤＮＡにおける特定のアミノ酸のゆらぎ配列(wobble sequence)の変化を導入することは本発明の新規性である。
【００７０】
高収率の精製された産物のための発現可能なプラスミドにおけるコード領域のタンデムカセットをクローニングする組換え方法（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ  Ｎｏｓ．５９５５３２３；５２７９９４７；４８５９７６５）も報告された。
【００７１】
合成ｃＤＮＡの構築
この目的は、２６ａａシグナル配列を有するｈＧＨ−ＮＶ（ｈＧＨ−ＶアイソフォームからのｈＧＨ−Ｎ類似体、図５）のキメラの選択の全ての可能な組み合わせから、完全長キメラを、より良好な、プロモーター制御されたＥ．ｃｏｌｉ発現系中に有することであった。このクローンは、完全長キメラＯＲＦから、導入された真の制限酵素部位による２つのアミノ酸のゆらぎ配列の独特な変化により、その合成形態の成熟ＯＲＦに切り替えるためのテンプレートとして使用された。
【００７２】
バクテリアでは、誘導性プロモーター−リボソーム結合部位（ｒｂｓ）発現エレメントが、一般に、高レベル異種遺伝子発現のために利用される。該プロモーター−ｒｂｓ発現エレメントを有しそして異種タンパク質の直接高レベル発現のための遺伝子情報、関心のある遺伝子のＯＲＦ、をコードするプラスミドは、これらの上記した調節エレメントの制御下に構築されうる。更に、発現ベクター系は、該組換え微生物によってバクテリアで産生される異種タンパク質の望ましく、そしてより容易な精製システムを提供するために、成熟ｃＤＮＡ配列の直ぐ後にアフィニティータグおよび特異的切断部位も含んでいる。
【００７３】
ｃＤＮＡインサートの発現は、誘導性ａｒａＣプロモーターの制御下にあり、ベクターのＮｃｏＩ部位のＡＴＧコドンおよびエンテロキナーゼ特異的切断部位による融合タンパク質の切断で出発する（図５ａ、５ｂ）。組換えプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉＴＯＰ１０を形質転換するのに使用されそしてアンピシリン耐性コロニーとして選ばれた。タンパク質の誘導は、バクテリア成長の対数期において培地へのＬ−アラビノースの添加により行われそして６時間続けられた。検出可能な融合タンパク質は、特異的酵素切断部位で切断されそして天然の生物学的活性を有する正しい分子量サイズを示した。ヒトソマトスタチン、プレプロインスリン、プロインスリン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖またはウシもしくはヒト成長ホルモン、ＬＨ、ＡＣＴＨおよび膵臓ポリペプチドをコードするＤＮＡ、微生物ゲノムにより好まれる大多数のコドンを、微生物における発現のためのプラスミドに挿入した。
【００７４】
ヒト胎盤ｍＲＮＡの単離
標準方法によりチオシアン酸グアニジウム法を使用して、トータルＲＮＡをヒト胎盤から単離した(Ausuble et al., 1987)。ポリ（Ａ+）ＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）セルロースでのアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ’プロトコール（Ｃａｔ．＃Ｚ５１１１０）により記載されたとおりに均質化されたトータルＲＮＡから、オリゴ（ｄＴ）セルロースアフィニティークロマトグラフィーによりｍＲＮＡを分離した。次いで、この得られるｍＲＮＡを使用して、ＡＭＶ転写酵素の支援により、標準化された方法を使用して、第１鎖を発生させた。鎖間の非特異的相互作用は、ＲＮアーゼＨおよびＲＮアーゼＡを使用して減少させ、続いてフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールおよび７０％エタノール洗浄を使用して第１鎖ＤＮＡ（２０ng/μl）を精製した。
【００７５】
「ＲＮＡｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｃａｔ．＃Ｚ５１１１０）を使用することによりヒト胎盤からトータルＲＮＡを単離した。約２gmsの組織を各回プロセシングした。トータルＲＮＡペレットを１mlのヌクレアーゼを含まない水に再懸濁させそして−７０℃で貯蔵した。トータルＲＮＡ濃度は約４μg/μlであった。トータルＲＮＡからオリゴ（ｄＴ）８〜１２およびオリゴ（ｄＴ）１０ビーズの支援によりポリアデニル化ＲＮＡをプールした。トータルＲＮＡ１μgを各反応のために使用した。ポリアデニル化ＲＮＡを、４２℃で１時間ＡＭＶ逆転写酵素を使用して一本鎖第１鎖相補性ＤＮＡに逆転写した。第１鎖ｃＤＮＡの最適濃度は２０ng/μlの範囲にあった。
【００７６】
ｃＤＮＡの合成およびクローニング
オリゴ（ｄＴ）８〜１２ビーズを使用して、安定なポリ（Ａ+）ＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ）を精製しそして選択し、これを使用して逆転写のためにプライミングして、標準ＲＴ−ＰＣＲ技術に従って第１鎖ｃＤＮＡを生成させた（図１、２、５ａ）。
【００７７】
逆転写および第１鎖合成：
逆転写反応のために、１．０ugＲＮＡ／ｍＲＮＡ、０．５ugプライマー（オリゴｄＴ）、ヌクレアーゼを含まない水を用意しそして７０℃で５分間加熱し、次いで氷上で５分間冷却する。５秒間ミクロヒュージして物質を沈降させる。次いで、順次に、ヌクレアーゼを含まない水、ＲＴ緩衝剤（５Ｘ）、ｄＮＴＰｍｉｘ（１２．５mM）、リボヌクレアーゼ阻害剤（４０U/ulの１：２希釈）およびピロリン酸ナトリウム（４０mM、４mM最終濃度）を加え、穏やかに混合し、次いで混合物を４２℃で２分間予備加温し、次いでＡＭＶ逆転写酵素（ＲＴ）（１０U/ul）を加える。穏やかによく混合し、次いで４２℃で１．０時間放置し（ＲＴ反応）、次いで７５℃で１０分加熱する（ＲＴの不活性化）。１．０単位のＲＮアーゼＡ／管を加えそして２５℃で３０分間インキュベーションする。次いで、ＲＮアーゼＨ０．５単位を各反応管に加えそして３７℃で３０分間インキュベーションする。
【００７８】
次に、第１鎖ｃＤＮＡを清浄するために、Ｔｒｉｓ−Ｃｌ／１．０mMＥＤＴＡ（ｐＨ５〜７．５）を加える。次いで、緩衝化されたフェノール（ｐＨ５〜８．０）−クロロホルム−イソアミルアルコールを加え、ボルテックスしそしてミクロフュージ遠心において〜１４，０００ｒｐｍで回転させる。水性相を新鮮な管に移しそして３M酢酸ナトリウム（ｐＨ３〜７）を加え、よく混合する。次いで冷却した１００％ＥｔＯＨを加えそして−７０℃で放置し、次いで〜１４，０００ｒｐｍで５分間回転させる。４℃で５分間１４，０００ｒｐｍで回転させることによりペレットをＥｔＯＨで洗浄する。次いでヌクレアーゼを含まない水に再懸濁させた。
【００７９】
Ｔａｑポリメラーゼを使用して標準ＰＣＲ増幅を行って、二本鎖ｃＤＮＡを作成し、次いで関心のある遺伝子を選択された適当なベクターにクローニングする。ここでは、すべての成分、例えば、緩衝剤、プライマー、第１鎖ｃＤＮＡ、２mMｄＮＴＰ、酵素を混合し、そして９４℃で１分間熱サイクラー中で加熱して変性する。プライマーのＴｍより２〜4℃下でアニーリングし、次いで７２℃で伸張させる。総計４５サイクルを行って増幅する。次いで必要に応じて０．８％〜２％アガロースゲル上でＰＣＲ反応を行う。
【００８０】
Ｔａｑポリメラーゼを使用することにより標準ＰＣＲ増幅技術に従うことにより二本鎖ｃＤＮＡを合成する。次いで関心のあるこの断片を、直接ｐＵＣ−１８をベースとするＴＡ−クローニングベクターにクローニングした。バクテリア株ＪＭ１０９を選んで更なる研究のための形質転換体を発生させた。
【００８１】
クローニング技術
両側にアデニンを有するＰＣＲＴａｑポリメラーゼ増幅された二本鎖断片のクローニングおよび構築を、ＴＡ−クローニングベクターに直接行った（図２、5）。ｈＧＨ−Ｖのポリアデニル化ｍＲＮＡを、胎盤組織および下垂体組織から調製した。総計１００ngの第１鎖ｃＤＮＡを５μgのこのトータルＲＮＡから調製した。第１鎖２０ngを、遺伝子特異的プライマー、即ち、プライマーＡ（配列番号６）、プライマーＢ（配列番号７）、プライマーＣ（配列番号８）、プライマーＤ（配列番号９）をアニーリングするためのテンプレートとして使用して、６９４ｂｐ（配列番号１）ｈＧＨ−Ｖ断片および７２３ｂｐ（配列番号２）ｈＧＨ−Ｎ断片を増幅させた。５’末端および３’末端の両方にＡテイルを有するこれらの二本鎖断片を、Ｅ．ｃｏｌｉＴ４ＤＮＡリガーゼの存在下にｐＵＣ−１８をベースとするクローニングベクターに直接クローニングして、ｐＧＥＨＶおよびｐＧＥＨＮ構築物を得た。これらのクローンを更にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩで二重消化することにより別々にチェックした。更に、制限酵素マップ分析をＮｃｏＩ／ＲｓａＩ、ＢｓｔＸＩ、ＥｃｏＲＩ／ＳｍｌＩ、ＳｍａＩ、ＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩ、ＨｇａＩを使用して行い、これによりｃＤＮＡ  ＰＣＲ断片の忠実度を決定した。
【００８２】
ｈＧＨ−Ｖプラスミド構築物からｈＧＨ−Ｎプラスミド構築物へのウォーキングおよび可能なテンプレートキメラｃＤＮＡ構築物を作成すること
ｈＧＨキメラ構築物を作成する際に、ｈＧＨ−Ｖ（配列番号１）およびｈＧＨ−Ｎ（配列番号２）を、それぞれ、胎盤および胎児下垂体からクローニングベクターに別々にクローニングした。この後、いくつかの制限酵素を使用してｈＧＨ−Ｖ断片の特定の領域をＥ．ｃｏｌｉ−ａｂｌｅなｈＧＨ−Ｎにより置き換えて、合成ｈＧＨ−ＮＶ（配列番号３）を得た（図１、４，５ａ）。
【００８３】
両ｃＤＮＡの完全な制限分析を、独特の制限酵素を使用して行った。両クローンの制限酵素マップを比較し（図４）そして分析して、独特のストラテジーを選択して、制限酵素消化を使用してある領域においてｈＧＨ−ＶをｈＧＨ−Ｎで置き換えた。ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＡａｔＩＩおよびＳｍｌＩは、ｈＧＨ  ＮＶのキメラを作成するのに使用された酵素であり、ｈＧＨ−ＮＶのキメラを作成する際にプライマーがないかまたはＰＣＲ増幅を行って突然変異を回避した。ｈＧＨ−ＮおよびｈＧＨ−Ｖ断片の両方に対して制限酵素消化のみを行って、ｈＧＨ−Ｎ  ｃＤＮＡでＡａｔＩＩおよびＳｍｌＩｈＧＨ−Ｖ５２５ｂｐｃＤＮＡ断片部分をシャッフルさせた。７２８ｂｐのｈＧＨ−ＮＶキメラ（配列番号３）の最終構築物をｐＵＣ−１８をベースとするベクターにおいてＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ酵素部位内に作成した。
【００８４】
ｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡを使用する修飾された形態のｈＧＨ−Ｎのクローニングは、より良好なＥ．ｃｏｌｉ発現のためであった。その目的で、胎盤からのｈＧＨ−Ｖ（配列番号１）および胎児下垂体からのｈＧＨ−Ｎ（配列番号２）を、ｐＵＣ−１８ＴＡクローニングベクターに前もってクローニングし、次いでテンプレートとして、キメラ（配列番号３）を使用して、ｈＧＨ−ＮＶ成熟ｃＤＮＡをアラビノース誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターに、エンテロキナーゼ切断部位の直ぐ後にサブクローニングした（図５ａ、ｂ）。
【００８５】
ｐＢＡＤ−ＨｉｓＡ発現ベクターへのｈＧＨ−ＮＶ成熟断片（５９１ｂｐ、配列番号４）のクローニングを、５９１ｂｐ（配列番号４）の予測されたＰＣＲ産物を与える遺伝子特異的プライマーによる２６アミノ酸配列を除くｈＧＨ−ＮＶキメラ（７２８ｂｐ、配列番号３）の成熟ペプチド部分に対するＰＣＲ増幅により行った。５９１ｂｐ成熟ｈＧＨ−ＮＶ断片の増幅のために、プライマーＥ（配列番号１２）およびプライマーＦ（配列番号１３）をＰＣＲ増幅のために使用した。５９１ｂｐ成熟ｈＧＨ−ＮＶ断片を増幅するための遺伝子特異的プライマー対（プライマーＥおよびＦ）、プライマーＥ（配列番号１２）およびプライマーＦ（配列番号１３）は図５に示される。ベクター部分は、プライマー対、プライマーＱ（配列番号１５）およびプライマーＲ（配列番号１６）により、プラスミド（ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から増幅されて、３５７ｂｐ断片を生じた。
【００８６】
ｈＧＨ−ＶにおいてｈＧＨ−Ｎとのアミノ酸の差（総計13）を有することの利点が考慮されたが、その場合に、これらのアミノ酸がｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡストレッチで置き換えられるような方法でｈＧＨ−Ｖクローンに対する変化がなされる。結果として、これらの変化も、その発現効率に注意を集中しながら、Ｅ．ｃｏｌｉ−ａｂｌｅな修飾されたｈＧＨ  ｃＤＮＡ産物を生じさせた。ｈＧＨ−ＮＶ断片の選択は、コドン使用およびＲＮＡ二次構造原理に基づいている。最終ｈＧＨ−ＮＶキメラ構築物（７２８ｂｐ、配列番号３）において、２６アミノ酸シグナルペプチドのうち最初の８アミノ酸は、ｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡからのものであり、第３のアミノ酸において、アラニンはｈＧＨ−Ｎ第３アミノ酸とは異なる。９〜１９２アミノ酸はｈＧＨ−Ｎ  ｃＤＮＡから取り入れられそして１９３〜２１８アミノ酸は再びｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡから取り入れられる。
【００８７】
ここで、我々は、配列番号１を含有する先のｐＧＥＨＶおよび配列番号２の完全長ｃＤＮＡクローンを含有するｐＧＥＨＮを採用し、そして独特の制限酵素で別々に消化してｈＧＨ−Ｖ断片の特定の領域をＥ．ｃｏｌｉ−ａｂｌｅなｈＧＨ−Ｎ部分で置き換えた。次いで、最終ｈＧＨ−ＮＶキメラをＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ制限酵素部位の間にｐＵＣ−１８をベースとするＴＡクローニングベクター、ｐＧＥＨＮＶにクローニングバックした。制限分析を行って、ｐＵＣに基づくＴＡクローニングベクター内にライゲーションされたｈＧＨ−ＮＶキメラを確かめた。
【００８８】
更なる修飾のために、ｈＧＨ−ＮＶキメラ構築物（ｐＧＥＨＮＶ）を、同様なアミノ酸のための修飾されたゆらぎ配列を有しそして独特のＲＥ部位（ＢｓｒＧＩ）を付加されているが、下垂体形態のｈＧＨ（ｐＡＢＧＨ１）と同様な配列の残部を保っているｃＤＮＡの生成のためのテンプレートとして使用した。最後に、修飾された形態の成熟ｈＧＨ  ＯＲＦ（独特の制限部位、ＢｓｒＧＩが導入された）を、アラビノース誘導性Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベクターに、ＥＫ切断部位のすぐ後にクローニングし、その長さは約５７９ｂｐ、（配列番号５）、ｈＧＨクローン＃１（ｐＡＢＧＨ１）（図５ｂ）であり、プライマーＥ（配列番号１２）およびプライマーＦ（配列番号１３）が使用された。元の下垂体ｃＤＮＡ発現との比較のために、胎児下垂体からのトータルＲＮＡを使用して増幅させそしてＥＫ切断部位のすぐ後にａｒａ誘導性ベクターにクローニングされたＰＣＲ産物、これは５７９ｂｐ合成品（配列番号５、図８）と比較してｈＧＨの劣ったタンパク質発現レベルを示した。ｈＧＨ−ＮＶキメラに由来するこのｃＤＮＡ配列が採用され、縮重に従うコドン使用の選択が、発現効率を増加させるためＥ．ｃｏｌｉにおいて維持された。我々が両クローンにおけるｈＧＨ発現のレベルを見た結果として、その差はあまり多くはないとしても（図８）、例えばｈＧＨ−Ｖ（配列番号１）からｈＧＨ−Ｎ（配列番号２）に、最終的にｈＧＨ−ＮＶキメラ（配列番号３）にすることは、少数のＥ．ｃｏｌｉ−ａｂｌｅなコドンを導入し、そして制限部位（ＢｓｒＧＩ）導入は、クローニング工程期間中配列番号１７〜２２のプライマーＪ〜Ｏを使用してアミノ酸の第３コドンも変えた（配列番号５）（図５ｂ）。
【００８９】
ｈＧＨ−ＮＶキメラ構築物の作成の詳細
トータルＲＮＡ抽出のための元の組織ソースは、ｈＧＨ−Ｎのためにはヒト胎児下垂体組織から、そしてｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡ合成のためにはヒト胎盤から採取された。ｈＧＨ−Ｎ（７２３ｂｐ、配列番号２）およびｈＧＨ−Ｖ（６９４ｂｐ、配列番号１）ｃＤＮＡの予測されたＲＴ−ＰＣＲ増幅されたｃＤＮＡ産物をｐＵＣ−１８をベースとするベクターにおいてＴＡライゲーションした（図５ａ）。両ｃＤＮＡの完全な制限分析を、独特の制限酵素を使用して行った（図４）。
【００９０】
工程Ｉ．  ｈＧＨ−ＮＶキメラｃＤＮＡ形態の作成において、ｈＧＨ−ＶのｐＵＣ−１８をベースとするクローン（＃６および＃２５）を、ｐＵＣ−１８をベースとするベクターの独特の部位でありそしてｈＧＨ−Ｖ６９４ｂｐ断片（配列番号１）内には存在しないＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで二重消化する。ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化された７２０ｂｐ断片（配列番号３上に同定する）をゲル精製して５’末端（５５ｂｐ）および３’末端（１３９ｂｐ）を単離した。ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ消化された開いたｐＵＣ−１８をベースとするベクター（ｐＧＥＨＮＶ、２９４１ｂｐ）も後のクローニングのために精製した（図５ａ、ｂ）
【００９１】
工程ＩＩ．  ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ二重消化された７２０ｂｐゲル精製された断片を、再びＡａｔＩＩ／ＳｍｌＩで消化して、中央の５２５ｂｐＡａｔＩＩ／ＳｍｌＩ断片から５５ｂｐの５’末端断片および１３９ｂｐの３’末端断片の１３９ｂｐを単離した。この５２５ｂｐｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡ断片を、ＡａｔＩＩ／ＳｍｌＩ５２５ｂｐｈＧＨ−Ｎ断片で置き換え、それによりヒト下垂体単離されたｈＧＨ−Ｎからヒト胎盤ｈＧＨ−Ｖにおける１３アミノ酸の差が変わった。ｈＧＨ−Ｖは２６アミノ酸のうち２つのアミノ酸（第３番目および第１９番目）においてｈＧＨ−Ｎシグナル配列と異なるが、これに対してｈＧＨ−ＮＶシグナル配列では、第３番目のアミノ酸はｈＧＨ−Ｖとマッチするが、第１９番目のアミノ酸はｈＧＨ−Ｎとマッチする。１６５アミノ酸のうち、成熟ペプチドを含むｈＧＨ−ＮＶの１４０アミノ酸はｈＧＨ−Ｎ配列とマッチしているが、そこではｈＧＨ−Ｎは大抵ｈＧＨ−Ｖと異なる。最後の２５アミノ酸は再び、ｈＧＨ−Ｖ配列とマッチしている。この工程で、一夜４℃でライゲーション反応を行って、５５ｂｐおよび１３９ｂｐ断片をそれらの対応する制限部位（図４）でＴ４ＤＮＡリガーゼの助けにより付着末端とライゲーションした。
【００９２】
両クローンの比較制限酵素マップは、制限酵素消化（ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＡａｔＩＩおよびＳｍｌＩ）を使用してある領域でｈＧＨ−ＶをｈＧＨ−ＮＶで置き換えるための独特なストラテジーを選び、完全長の７２８ｂｐのライゲーションされたｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡ断片（配列番号３）を示した。
【００９３】
遺伝子特異的プライマー対によるｈＧＨ−ＮＶｃＤＮＡの成熟ペプチド部分のＰＣＲ増幅は、５９１ｂｐ（配列番号４、図５ｂ）の予測されたＰＣＲ産物を与えた。５９１ｂｐ成熟ｈＧＨ−ＮＶ断片の増幅のための遺伝子特異的プライマー対（プライマーＥおよびＦ）、プライマーＥ（配列番号１２）およびプライマーＦ（配列番号１３）が図５に示される。ベクター部分をプライマー対、プライマーＱ（配列番号１５）およびプライマーＲ（配列番号１６）により、プラスミド（ｐＢＡＤ−ＨｉｓＡ）から増幅して３５７ｂｐ断片を生じさせた。プライマーＥは、第１アミノ酸（ＴＴＣ）、フェニルアラニンから外れて、成熟ｈＧＨ  ＴＣの開始（配列番号３で１１９におけるプライマーＥ）が第１ヌクレオチドとして選ばれるような方式で選ばれた。プライマーＦは、配列番号３で６８１〜６９４で選ばれ、そこでヌクレオチドの残部は、クローニングのためのＸｈｏＩ制限部位を含むａｒａ誘導性ベクターに基づいて選ばれた。５９１ｂｐ配列は下記に示され、この配列ではプライマーの部分はボックス内に規定される：
【００９４】
【表１】
2008503233.tif 000003
【００９５】
ＮｃｏＩ／Ｅｃｏ２４Ｉ、ＮｈｅＩ／ＥｈｅＩ、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ、ＢｓｈＴＩ／ＸｈｏＩ／ＢｓｔＸＩ、ＢｓｈＴＩ／ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ、によるｐＢＡＤ／ＨｉｓＡのｈＧＨ−ＮＶ成熟クローンの制限酵素消化は、正確な断片サイズも与えた。上記クローンおよびＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩ消化されたゲル精製された断片におけるＮｃｏＩ／Ｂｓｈ１２３６Ｉ、ＮｃｏＩ／ＰｌｅＩ、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ、ＮｃｏＩ／ＢｓｔＸＩ、ＮｃｏＩ／ＥｈｅＩ、ＮｃｏＩ／ＢｇｌＩＩ、ＮｃｏＩ／Ｅｃｏ５７Ｉ、ＰｌｅＩ／ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ／ＰｓｔＩ／ＥｈｅＩ、Ｂｓｈ１２３６Ｉ／ＢｇｌＩＩによる更なる分析。
【００９６】
アラビノース誘導性ｈＧＨクローンの独特の構築物の作成
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｈＧＨタンパク質発現の最適化のために、プロモーター−インサート−ターミネーター配列を含有する全カセットの多量体化を試みて、同様な発現ベクターにクローニングする。この修飾を達成するために、５％の全Ｅ．ｃｏｌｉ発現を示したｈＧＨクローン＃１、ｐＡＢＧＨ１（ｈＧＨ−ＮＶ由来の合成単一ｈＧＨインサート、図５ａ）を、テンプレートプラスミドとして採用した。
【００９７】
ｈＧＨクローン＃１（ｐＡＢＧＨ１）を、ＢｓｈＴＩ／ＥｃｏＲＩ（それぞれ、７４および９７７における独特の部位）で消化しそして両消化された断片、３７１７ｂｐ（断片１）および９０３ｂｐ断片（断片２）を別々に精製する。ｐＡＢＧＨ１ＤＮＡをＡｃｃＩ（３５０、１４４７，３４１２における部位）およびＥｃｏＲＩ（９７７における部位）で消化し、それにより６２７ｂｐ、４７０ｂｐ、１５５８ｂｐおよび１９６５ｂｐを生じる。次いで４７０ｂｐ断片（断片３）を精製する。ＡｃｃＩ（上記した部位）およびＢｓｈＴＩ（７４における部位）によりｐＡＢＧＨ１  ＤＮＡの他の消化を行い、それにより２７６ｂｐ、１０９７ｂｐ、１２８２ｂｐおよび１９６５ｂｐを生じる。次いで１２８２ｂｐ断片（断片４）を精製する。全てのライゲーション反応を室温で１時間、次いで４℃で一夜インキュベーションした。
【００９８】
断片２および断片３をライゲーションして、１３７３ｂｐ（断片５）を得る。次いで断片５を断片１とライゲーションして、５０９０ｂｐ断片（断片６）を得る。次いで断片４および断片２を別にライゲーションして２１８５ｂｐ断片（断片７）を達成する。最後に、断片６および７をライゲーションし、それによりｈＧＨクローン＃１（ｐＡＢＧＨ１、４６２０ｂｐ）のｈＧＨクローン＃２（ｐＡＢＧＨ２、７２７５ｂｐ）への修飾を完了させるであろう。ポジティブクローンを、ＤＮＡ抽出および独特の部位、例えば、７２７５ｂｐ断片の線状化されたｐＡＢＧＨ２を得るためにＰｖｕＩでの制限酵素分析および二重制限部位、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＢｓｈＴＩによる制限酵素分析により分析した。インサートの正確な長さは２６５５ｂｐであり、これを、二重化し(duplicated)そしてＥＫ切断部位のすぐ後にａｒａ誘導性発現ベクターにタンデムカセットとして挿入した。カセットの更なる確認のために、ＮｃｏＩまたはＢｓｈＴＩ消化後、２つの断片２６５５ｂｐおよび４６２０ｂｐに関して配列決定することにより分析を行った。ｐＡＢＧＨ２クローンの作成におけるこの試みは、ｈＧＨ発現のレベルに関して殆ど２倍の増加により直ちに反映された（図８）。
【００９９】
更により高いレベルのｈＧＨ発現のためにａｒａ誘導性ベクターにおいてカセットの数を増加させる試みをした。ｐＡＢＧＨ２構築物を作成した後、余分のカセットの付加は安定なプラスミドとしてのプラスミドを作成できなかった。２継体の同じ培養の後に、ｐＡＢＧＨ３、第３インサートカセットは失われ、これは配列決定しそして確認された。ｐＡＢＧＨ２が唯一の安定なプラスミドであり、これは２年後ですら発酵槽成育培養においても安定性を示した。
【０１００】
発酵槽で成育した細胞培養物からの成熟ｈＧＨの精製
発酵槽からの誘導された細胞培養物をライセート物質のソースとして使用し、その場合に組換えｈＧＨが可溶性Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質と共に得られた。
【０１０１】
組換えｈＧＨ（ｐＡＢＧＨ１およびｐＡＢＧＨ２発現クローンからの）の精製は、いくつかの独特の工程により達成され、それについて図６および図８の対応するウエスタンブロットにより示された。精製されたｈＧＨを生物学的活性について試験したところ、それはＮｏｖａｇｅｎからの市販のＮｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ標準と比べて高い効能を示した（図７）。
【０１０２】
成長ホルモンの生物活性
精製されたｈＧＨを市販のｈＧＨ（ＮｏｖａｇｅｎからのＮｏｒｄｉｔｒｏｐｉｎ）と共に試験してその生物活性をチェックした。ＧＨ生物活性は、刺激または抑制原理が血清において比較標準と同じであると仮定して、既知の標準により誘導される標的組織応答と同等な標的組織応答である。リンパ腫細胞は、催乳活性について知られているヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を含む乳腺刺激ホルモンに特異的に応答することはかなり前に知られている。ｈＧＨバイオアッセイに使用された方法は、少し改変を加えたＴａｎａｋａの方法(Tanaka et al., 1980, Ealey et al. 1995)に従った。寄贈品として得られたＮｂ−２、ラットリンパ腫細胞系をｈＧＨの生物学的活性をチェックするために使用した。Ｎｂ−２細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および１０％ウマ血清（ＨＳ）を含有するＲＰＭＩ中にルーチンに維持した。バイオアッセイの２４時間前に、細胞を、静止培地(quiescent medium)、１％ＦＢＳおよび１０％ウマ血清を含有するＲＰＭＩ１６４０中に維持した。アッセイの時点で、細胞を洗浄し、計数し、そして平板培養培地、ＲＰＭＩ＋１０％ウマ血清を使用して細胞密度を１×１０５個の細胞／mlに調節した。平板培養細胞密度は、２４ウエルプレートで１×１０５個の細胞／ml／ウエルであった。異なる濃度の標準および本発明の新規な方法により産生されたｈＧＨを細胞に加えそして３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で２４、４８、および７２時間インキュベーションした。細胞を２４、４８および７２時間ごとに血球計数器を使用して計数した。
【０１０３】
時間の関数として細胞数の用量依存性増加があったことは、表２およびヒストグラム（図８）から明らかである。最大細胞増殖は７２時間後に得られた。本発明の新規な方法により産生された成長ホルモンの生物活性は、成長ホルモン標準の参照標準に匹敵しそして再現可能であった。表２のデータは、少なくとも４つの実験の代表値である。
【０１０４】
下記の実施例を説明のみの目的で提供するが、本発明の範囲を限定するものとみなすべきではない。
【０１０５】
実施例１
関心のあるｃＤＮＡへの突然変異誘発によるクローニング
独特の制限酵素部位（１つまたは複数）の導入またはＯＲＦ領域におけるコドンレベルでの変化を遺伝子特異的プライマー（１つまたは複数）の合成期間中に行った。例えば、ｃＤＮＡでのこの修飾、突然変異それ自体を、テンプレートとしてｈＧＨ−ＶおよびｈＧＨ−Ｎの公表されたｃＤＮＡ配列を使用して、ヒト成長ホルモンに導入した。ｈＧＨ−Ｖ    ｃＤＮＡの配列は、例として下記に示されるが、下記において、強調されたボックスで囲まれた領域は、６９４ｂｐｈＧＨ−Ｖ断片（配列番号１）のＰＣＲ増幅のための、上部（プライマーＡ、配列番号６）ＰＣＲプライマーの部位および下部ＰＣＲプライマー（プライマーＢ、配列番号７）選択部位を規定している。ここで、プライマー対の位置は、胎盤第１鎖からの６９４ｂｐｈＧＨ−Ｖ断片（配列番号１）を増幅することが示される。ＡＴＧの開始および終結コドン、ＴＡＧは同じ配列領域内で異なる色で強調されている。
【０１０６】
【表２】
2008503233.tif 000004
【０１０７】
予測された産物長さ６９４ｂｐ（配列番号１）
ＰＣＲ増幅期間中、ｃＤＮＡの５’末端および３’末端における適切な部位内の制限酵素部位の導入が可能であった。これらの変化は、特異的発現ベクターへのクローニングのために更に利用された。コード領域、例えば、推定ｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡに影響を与えない完全長ｃＤＮＡ内のこれらの突然変異は、なかでも遺伝子特異的プライマー対（プライマーＣおよびＤ；配列番号８および９、表３）を使用して増幅された。
【０１０８】
【表３】
2008503233.tif 000005
【０１０９】
実施例２
遺伝子座の制限酵素分析による推定クローンの実証
約７２３ｂｐ（ｈＧＨ−Ｎ、配列番号２）または６９４ｂｐ（ｈＧＨ−Ｖ、配列番号１）のＤＮＡ断片が、２０μl全反応セットアップにおいて制限エンドヌクレアーゼＳａｌＩおよびＸｈｏＩによりｐＵＣ−１８をベースとするクローンを二重消化することにより得られた。反応サンプルを、１％アガロースゲルで処理してＭＢＩ、ゲル抽出キット、Ｃａｔ．＃Ｋ０５１３を使用することにより関心のあるバンドを精製した。次いで、得られた２〜３μlの精製された断片を、組合せのまたは単一の６〜７の特徴的カッター（酵素濃度は通常１０U/μlであった）、例えば、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ、ＫｐｎＩ／ＢａｍＨＩ、ＢｓｒＤＩ／ＳｐｅＩ、ＢｇｌＩＩ／ＢａｍＨＩ、ＮｃｏＩ／ＨｇａＩ、ＮｃｏＩ／ＲｓａＩおよびＥｃｏＲＩ／ＢｇｌＩＩで消化することによりその制限エンドヌクレアーゼマップについて分析した。消化されたサンプルを処理した後アガロースゲルでの分析の前にこれらの制限エンドヌクレアーゼ酵素消化から、近似的断片サイズを評価した。制限エンドヌクレアーゼ酵素消化もチェックして、我々の関心のあるインサートを含有するバクテリアクローンの有効性に関して確かめた。ここで、制限エンドヌクレアーゼ酵素消化は、ベクター酵素部位からのインサートの距離がマツピングされそして５’から３’への方向のインサートの配向がわかるように、例えば、ＰｖｕＩ、ＳａｌＩ／ＥｃｏＲＩ、Ｃｆｒ１０Ｉ、ＡｐａＬＩ、ＢｓｈＴＩ、ＡｖａＩ、ＳｓｐＩ、ＡｃｃＩ等から選ばれる。
【０１１０】
実施例３
第１鎖の作成およびコドン使用
本発明において、我々の関心は、胎盤からのｈＧＨ−Ｖおよび下垂体からのｈＧＨ−Ｎの、オリゴｄＴ  ＲＴ−ＰＣＲによるＥ．ｃｏｌｉＴＡクローニングベクターへのクローニングにある。ｈＧＨ−Ｖをクローニングするために、トータルＲＮＡをヒト胎盤から抽出した。遺伝子特異的上流および下流プライマーをｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡ配列にしたがってデザインする(Chen et al., 1989)。ｍＲＮＡ生成のためのオリゴｄＴ（８＋１２）プライマーを使用するオリゴｄＴ（８＋１２）およびオリゴｄＴ１０精製されたｍＲＮＡでＲＴ−ＰＣＲを行い、次いで第１鎖ｃＤＮＡを合成した。ＲＴ反応によるＡＭＶ転写酵素の助けによる第１鎖ｃＤＮＡ合成のためにプールされたｍＲＮＡが使用された。第１鎖品質は、コントロールとして標準ハウスキーピング遺伝子、例えば、βアクチン遺伝子を増幅することにより確かめられた。ＰＣＲ増幅された６９４ｂｐ推定ｈＧＨ−Ｖ断片（配列番号１）を、ｐＵＣ−１８をベースとするベクターへのＴＡクローニングにより直接クローニングする。すべてのポジティブクローンは、制限分析（ＡａｔＩＩ、ＢｓｔＸＩ、ＮｃｏＩ、ＮｏｔＩ、ＰｓｔＩを使用して）を受けて、断片の有効性およびベクター内の断片の配向をチェックされた。結果はｈＧＨ−Ｖ  ｃＤＮＡとして６９４ｂｐ断片（配列番号１）の有効性を確証する。
【０１１１】
上記と同じ方法に従って胎児下垂体ｍＲＮＡを使用して、ｈＧＨ−Ｎ  ｃＤＮＡ断片も生成させた。４つの独立したＲＴ−ＰＣＲ増幅された推定７２３ｂｐｈＧＨ−Ｎ断片（配列番号２）を、ｐＵＣ−１８をベースとするベクター（ｐＧＥＨＮ）へのＴＡクローニングにより直接クローニングする。ヒトｈＧＨ−Ｎ  ｃＤＮＡマップからの８つの独特の制限酵素を使用して、クローニングされた断片の有効性をチェックしたところ、胎児下垂体および脳からの７２３ｂｐＲＴ−ＰＣＲ産物（配列番号２）は、両方とも推定ｈＧＨ−Ｎ  ｃＤＮＡであることを示した。
【０１１２】
ｈＧＨ−Ｎは、Ｅ．ｃｏｌｉコドン縮重に従うコドン最適化について分析されたので、、領域の大部分がコドン使用に類似していることを示す(Gray et al., 1988; U.S. Pat No. 4604359)。好ましい態様では、成熟ＯＲＦにおける２つのアミノ酸のみがそれらのゆらぎ配列において操作され、これは独特の制限部位を創り出した。
【０１１３】
実施例４
配列決定による分析
構築物は、実験室で改変された普通の配列決定プロトコールを使用して配列決定された。  配列決定されるべきＤＮＡ、ＰＣＲ産物またはプラスミド構築物は、カラムをとおしてまたはKraft et al. 1988に記載のＰＥＧ沈殿により精製された。精製後に、５０ng〜５００ngの範囲のサンプルＤＮＡが配列決定のために与えられた。サイクルシーケンシング反応は、１０μlまたは２０μlの最終容積において構成される。各反応について、４μlまたは８μlターミネーターレディーリアクションミックス(terminator ready reaction mix)をＤＮＡテンプレートに加える。このレディーリアクションミックスは、予備混合されたｄＮＴＰｓ、ダイターミネーター、ａｍｐｌｉＴａｑＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２および緩衝剤を有する。１μlのプライマーを添加（５ピコモル／μl）し、管を熱サイクラーにおいてサイクルシーケンシングに供する（２５サイクルの９４℃、１０秒、５秒間５０℃および４分間６０℃）。
【０１１４】
ＰＣＲ産物を２．７M酢酸ナトリウム（ｐＨ４．６）およびエタノールで沈殿させ、７０％エタノールで２回洗浄し、そして最終ＤＮＡペレットをホルムアミド中に再懸濁させた。次いでサンプルを自動化シーケンス（ＡＢＩ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙからの３１０  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒ）において分析した。
【０１１５】
実施例５
キメラｃＤＮＡの構築
我々のストラテジーでは、ｈＧＨ−ＶとｈＧＨ−Ｎ間のアミノ酸の差（総計１３）が考慮された。この場合にこれらのアミノ酸がｈＧＨ−Ｎ  ｃＤＮＡストレッチで置き換えられるような方法でｈＧＨ−Ｖクローンに対して変更を行い、その結果としてＥ．ｃｏｌｉ−ａｂｌｅに修飾されたｈＧＨ  ｃＤＮＡ産物が作成された。我々は、ｐＵＣ−１８をベースとするベクターにおいて前もってクローニングされたｈＧＨ−ＶおよびｈＧＨ−Ｎ  ｃＤＮＡを採用した。これらのクローン（ｐＧＥＨＶおよびｐＧＥＨＮ）を独特の制限酵素で別々に消化して、ｈＧＨ−Ｖ断片の特定の領域をＥ．ｃｏｌｉ−ａｂｌｅなｈＧＨ−Ｎ部分または合成構築物で置き換える。次いで、制限酵素を使用して最終ｈＧＨ−ＮＶキメラをクローニングし、消化された断片を互いにライゲーションしてＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位の間にＴＡクローニングベクターにライゲーションバックする。制限分析を行って、同じｐＵＣ−１８をベースとするＴＡクローニングベクター内のライゲーションされたｈＧＨ−ＮＶキメラを確認した（Yanisch-Perron et al., 1985）。
【０１１６】
ｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラのクローニングを、ＮｃｏＩ／ＮｏｔＩ部位でｐＵＣ−１８をベースとするクローニングベクターｐＧＥＨＮＶに対して（図５ａ）、およびｐＢＡＤプロモーター（または同様なプロモーター）（ｐＢＡＤ／ＨｉｓＡ）制御されたＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターに行い、そしてＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉ株をそれにより形質転換した。反応混合物を一夜４℃〜１４℃で１６時間インキュベーションすることにより、ライゲーション反応を行った。形質転換体の数を増加させるために、ライゲーション反応混合物をこの方式でインキュベーションすることが必要であつた。形質転換のために、レギュラープロトコールに従い、その場合にインキュベーションの後に、100μl〜200μl形質転換混合物を、５０μg/μlのアンピシリンを存在させて、２ＸＹＴ寒天プレート上に広げた。プレート当たり５０〜７０より多くのコロニーが存在し；コントロールプレートは線状化されたベクターを使用してセットされた。ＤＮＡ抽出を、上記したアルカリ性溶解法の助けでミニプレップＤＮＡ抽出に従うことにより行った。推定ポジティブクローンが達成された後、ＮｃｏＩ／Ｅｃｏ２４Ｉ、ＮｈｅＩ／ＥｈｅＩ、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩ、ＢｓｈＴＩ／ＸｈｏＩ／ＢｓｔＸＩ、ＢｓｈＴＩ／ＸｈｏＩ、ＮｃｏＩ／ＥｃｏＲＩにより完全な制限分析を行った。これらはインサート制限マップをチェックするのに使用された。
【０１１７】
Ｅ．ｃｏｌｉにおけるｈＧＨ−ＮＶ発現をチェックするために、我々は、キメラｃＤＮＡをｐＢＡＤ／ＨｉｓＡ発現ベクターにクローニングすることを試みた。出願人は、２６アミノ酸、分泌シグナルペプチドを除く成熟ペプチド領域を表すｃＤＮＡの部分のみのクローニングに興味がある。それを達成するために、成熟ペプチド領域の開始（プライマーＥ、配列番号１２）および停止（プライマーＦ、配列番号１３）において遺伝子特異的プライマー対を作成する。同時にベクター断片のベクタープライマー対（プライマーＱおよびＲ；配列番号１７および１８）内の因子ＶＩＩＩａおよび／またはＥＫ切断部位のすぐ後に成熟ｈＧＨ−ＮＶをクローニングするために、成熟ｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡがＴ−Ａクローニング法によりベクター断片部分と固定される(get locked in)ようにデザインされる。この独特のストラテジーを使用して、出願人はｐＢＡＤ／ＨｉｓＡ発現ベクター（または同様なベクター）におけるｈＧＨ−ＮＶの７つのポジティブクローンを達成した。
【０１１８】
ＴＯＰ１０Ｅ．ｃｏｌｉ発現可能な株（または同様な株）からの６つの成熟キメラクローンのうちの２つに関する広範な制限分析により、これらのクローンはＴ−Ａライゲーションによりベクター上で右配向でライゲーションされている推定ｈＧＨ−ＮＶ成熟ｃＤＮＡクローンであることを確証した。ｈＧＨ−ＮＶ（配列番号３）配列は、コドン使用、1つの追加の制限部位およびｍＲＮＡ二次構造においてｈＧＨ−Ｎ配列とは異なり（図３および４）そして合成ｈＧＨ−ＮＶはソマトトロピンと同じタンパク質配列を与える（図２）ことがわかる。
【０１１９】
実施例６
多重カセットの作成
調節領域をタンデム方式で含むコードドメインの多重カセットを挿入するために、独特のストラテジーを採用した。これは、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて組換えｈＧＨ−ＮＶ由来のヒト成長ホルモン発現のレベルを増加させるのを助け、このＥ．ｃｏｌｉはその発現レベルにおける有望な差を明白に示している（図８）。ここで、総計として７２７５ｂｐのアラビノース誘導性（または同様な誘導系）発現ベクター（ｐＡＢＧＨ２）への多重カセットのクローニング。
【０１２０】
この試みにおいて、我々の興味は、Ｅ．ｃｏｌｉにおける高レベル発現のための誘導性発現ベクター中の二重カセットの形態のｈＧＨ成熟ｃＤＮＡのクローニングにある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥで正しい分子量タンパク質バンドを示した発現されたタンパク質に関して完全な分析を行い、そしてウエスタンブロット、Ｎ末端アミノ酸配列決定およびプロテアーゼ切断マッピング（未公開データ）により更に確認した。先のクローンは５％の全Ｅ．ｃｏｌｉタンパク質発現しか示さなかったので、我々は、ｈＧＨクローン＃１（ｐＡＢＧＨ１）を修飾することに集中した。我々は、ライゲーションおよびクローニングのストラテジーを適用することにより少なくとも８つのこのようなポジティブクローンを達成した。この独特なクローンは、プロモーター−ｈＧＨインサート−ターミネーターカセットの多重コピーからなる。ポジティブクローンの確認は、制限酵素分析のいくつかの組合せにより行われた。迅速誘導実験、それに続くＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分析は、先のｈＧＨクローン＃１（ｐＡＢＧＨ１）よりも高いレベルに達した発現レベルを示す。より良好なレベルの発現を達成するために、種々の誘導物質で最適化された培地中で誘導を行った。
【０１２１】
ポジティブクローンに関して完全な制限分析を行った。ポジティブを選択するための我々のスクリーニング方法としてミニプレップＤＮＡでのＰｖｕＩ消化を採用した。
【０１２２】
ｈＧＨクローン＃１（ｐＡＢＧＨ１）からのマキシプレップＤＮＡをＡｃｃＩ／ＢｓｈＴＩ、ＢｓｈＴＩ／ＥｃｏＲＩおよびＡｃｃＩ／ＥｃｏＲＩで消化して、それぞれ、１９６５ｂｐ、１２８２ｂｐ、９０３ｂｐ、３７１７ｂｐおよび４７０ｂｐＤＮＡ断片を得た。３７℃で２時間の消化の後に、消化されたサンプルを１．２％アガロースゲルで処理しそして上記したバンドをライゲーションのために精製した。
【０１２３】
制限酵素消化された（ｐＡＢＧＨ１）マキシプレップＤＮＡは、関心のあるゲル精製された断片を示す。ＡｃｃＩ／ＢｓｈＴＩで二重消化されたｐＡＢＧＨ１クローンは、１９６５ｂｐおよび１２８２ｂｐの関心のあるＤＮＡ断片を示し、ＢｓｈＴＩＩ／ＥｃｏＲＩで二重消化されたｐＡＢＧＨ１は精製された９０３ｂｐの消化された断片、ＡｃｃＩ／ＥｃｏＲＩで二重消化されたｐＡＢＧＨ１クローンを示す。関心のある４７０ｂｐおよび１９６５ｂｐの精製されたバンドはライゲーションされるであろう。
【０１２４】
これらの３つのＤＮＡ断片は、一つが他方の後にくるようにライゲーションされ、これは、調節ｈＧＨ  ｃＤＮＡインサート、および３’下流ターミネーター領域を含有する。この全体の２６５５ｂｐカセットは、１９６５ｂｐ断片とライゲーションされることにより最終的に環状化される。プラスミド構築物の全長は、７２７５ｂｐ（配列番号１８、図５ｂ）となり、ここでインサートサイズは２６５５ｂｐであり。これは、タンデムで配列された二重化されたカセットとして挿入される。
【０１２５】
すべての配列番号は表３に従って要約される。
【０１２６】
実験室規模での産生
アラビノース誘導性発現ベクターへのｈＧＨ−ＮＶの多重カセットをクローニングする目的は、後の工程での産生の発現レベルを増加させることであった。この目的は少なくとも１Ｌスケールで成功し、生成する４〜５g/LｈＧＨ（またはそれより高い）は、適切な発酵条件で産生された。単一合成ｈＧＨにおけるタンパク質発現レベルと比較して、二重化カセットは図８に示された。
【０１２７】
【表４】
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【０１２８】
【表５】
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【０１２９】
本発明の主要な利点
１．原核細胞においてより良好なコドン使用のための２つのアイソフォーム、即ち、ｈＧＨ−ＶおよびｈＧＨ−Ｎから産生された新規なキメラ。
２．ｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラは部位特異的突然変異誘発を使用しないで得られる。
３．ヘルパーベクターを使用せずそしてタンパク質配列を損なうことなく修飾されたコドン使用の故により良好な発現。
４．ｈＧＨの発現の高められたレベルは、ベクターからのその調節エレメントと共にｈＧＨ−ＮＶ  ｃＤＮＡキメラに由来する発現可能な構築物の二重化により可能である。
【０１３０】
【表６】
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【０１３１】
【表７】
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【０１３２】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】ｈＧＨ−ＮＶキメラ構築物と比較してｈＧＨアイソフォームｈＧＨ−Ｖ及びｈＧＨ−ＮのｃＤＮＡ配列を示す。
【図２】ｈＧＨ−Ｖ（配列番号１０）、ｈＧＨ−Ｎ（配列番号１１）及びｈＧＨ−ＮＶ（配列番号１４）のアミノ酸比較を示す。
【図３】ｈＧＨ−Ｎ及びｈＧＨ−ＮＶ配列に基づく折りたたまれたＲＮＡ二次構造の比較を示す。両者（ｈＧＨ−Ｎ及びｈＧＨ−ＮＶ  ＯＲＦ  Ｓｅｑ）の最小エネルギーは匹敵するけれども、それらは、その配列差によりそれらのＲＮＡ二次構造において顕著に異なる。
【図４】キメラｈＧＨ−ＮＶを産生するためのｈＧＨ−Ｎ及びｈＧＨ−Ｖの制限酵素部位の略図を示す。
【図５ａ】ｈＧＨ−ＮＶキメラ（配列番号３）を作成しそしてクローニングしてｐＧＥＨＮＶプラスミドを得ることに関与した工程のシーケンスの略図を示す。
【図５ｂ】プラスミドクローンｐＡＢＧＨ１を構築するためのａｒａ誘導性ベクターへのキメラｈＧＨのクローニングストラテジーのフローチャートを示す。
【図６】抗ｈＧＨ抗体を使用するウエスタンによる発酵槽で成育させたライセートからＨｉｓタグ付ｈＧＨ及び次いでｈＧＨの純粋な形態を達成することに関与した工程を示す。
【図７】市販のノルジトロピンに比べて組換えｈＧＨの生物活性のレベルを示す。
【図８】クーマシーで染色したゲルにおけるアラビノースで誘導された発現によりｈＧＨ＃１（ｐＡＢＧＨ１）及びｈＧＨ＃２（ｐＡＢＧＨ２）クローン間のｈＧＨ発現レベルの差を示す。誘導されなかったクローンはコントロールとして採用された。  ここで、ｐＡＢＧＨ１’は、下垂体ｃＤＮＡ由来のｈＧＨ（Chen et al., 1989, レーン５及び６）クローンを指し、ｐＡＢＧＨ１（レーン７及び８）はキメラｈＧＨ−ＮＶ由来の合成ｈＧＨクローンを指し、そしてｐＡＢＧＨ２（レーン３及び４）は二重の後のインサートを指す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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