(57)【要約】  医療デバイス又は宿主自体への細菌定着を処置又は防止するための装置及び方法には、ＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド（ＲＩＰ）を医療デバイスと、及び選択的に抗生物質と組み合わせることを含む。さらに、ＲＩＰを含む十分な溶液を加えてデバイス内の空間を埋めることにより感染部位又は感染の可能性のある部位に高濃度のＲＩＰを提供し、空間に血液が満たすのを防止することを含む、ロック技術においてＲＩＰが使用されればよい。このように本発明により臨床医は、医療デバイスを宿主内に留めたまま、デバイスの掃除に用いるＲＩＰ及び抗生物質の量を最大化することが可能になる。
2008534224.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外面及び内腔を有し、医療的又は科学的手順に用いられ、宿主への挿入に適した宿主挿入デバイス；及び
ある量のポリペプチドを含み、手順の前、間又は後に生じる細菌バイオフィルムの形成を防止又は処置するために前記デバイスの前記内腔内に入れられ、これによって前記内腔の細菌バイオフィルムの形成を処置し且つ防止できる医薬組成物を含む装置。
【請求項２】
前記宿主挿入デバイスが、カテーテル、ステント、内視鏡、ＩＶ、子宮内デバイス及びポートからなる群より選択される請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記宿主挿入デバイスが中心静脈カテーテルである請求項２に記載の装置。
【請求項４】
前記宿主挿入デバイスが、ヒト又は動物への挿入に適した請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記ポリペプチドがＲＩＰである請求項１に記載の装置。
【請求項６】
前記ペプチドの前記量は前記デバイスの前記内腔を完全に満たすものである請求項１に記載の装置。
【請求項７】
バイオフィルムを生成する細菌を防止又は処置する方法において使用される請求項１に記載の装置。
【請求項８】
表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌又は炭疽菌である細菌を防止又は処置する方法において使用される請求項７に記載の装置。
【請求項９】
医療的又は科学的手順に使用されるデバイス内の細菌バイオフィルムの形成を防止する方法であって、前記デバイスが外面及び内腔を有し、前記方法が
デバイスを選択するステップ；
前記デバイスにある量のポリペプチドを入れるステップ；
前記ポリペプチドを前記デバイス内に一定時間とどまらせるステップ；
前記ポリペプチドを前記デバイスから抜き出すステップ；及び
前記デバイスを洗浄するステップを含む方法。
【請求項１０】
カテーテル、ステント、内視鏡、ＩＶ、子宮内デバイス及びポートからなる群よりデバイスを選択するステップをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記手順における前記デバイスとして中心静脈カテーテルを使用するステップをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記入れるステップが、前記内腔をポリペプチドで完全に満たすことを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
前記入れるステップがシリンジの使用を含む請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ポリペプチドとしてＲＩＰを使用するステップをさらに含む請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
前記選択ステップが、前記デバイスの前記内腔を完全に満たすのに十分なＲＩＰの量を選択することを含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、前記デバイス内に最低３０分間とどまる請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、前記シリンジを用いて前記デバイスより抜き出される請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
前記デバイスが溶液で洗浄される請求項９に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶液がヘラピンである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記デバイスが、医療的又は科学的手順の前又は手順中に、動物又はヒトとすることができる宿主内に挿入される請求項９に記載の方法。
【請求項２１】
宿主及びデバイスを処置する方法であって、前記デバイスは医療的又は科学的手順において使用され、外面及び内腔を有し、前記デバイスは前記宿主内に挿入されており、前記宿主内の前記デバイスの前記内腔内においては細菌が検出されており、前記方法は、
前記宿主内の前記デバイスの完全性を維持しながら、前記細菌を処置するために前記宿主を拘束するステップ；
前記内腔にチューブを結合させるステップ；
ポリペプチドが前記内腔に流入するようにある量の前記ポリペプチドを前記チューブに入れるステップ；
前記ポリペプチドを前記デバイス内に所定時間留まらせるステップ；
前記ポリペプチドを前記デバイスから抜き出すステップ；
前記デバイスを洗浄するステップ；及び
前記宿主内の前記デバイスの完全性を損なわないように、前記デバイス及び宿主から外すステップを含む方法。
【請求項２２】
カテーテル、ステント、内視鏡、ＩＶ、子宮内デバイス及びポートからなる群よりデバイスを選択するステップをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記手順における前記デバイスとして中心静脈カテーテルを使用するステップをさらに含む請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記入れるステップが、前記内腔をポリペプチドで完全に満たすことを含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記入れるステップがシリンジの使用を含む請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドとしてＲＩＰを使用するステップをさらに含む請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
前記ポリペプチドが、前記デバイス内に最低３０分間とどまる請求項２１に記載の方法。
【請求項２８】
前記デバイスから前記ポリペプチドを抜き出す前記ステップが、シリンジを介して達成される請求項２１に記載の方法。
【請求項２９】
前記デバイスが溶液で洗浄される請求項２１に記載の方法。
【請求項３０】
前記溶液がヘラピンである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記デバイスが、動物又はヒトである宿主内に挿入されている請求項２１に記載の方法。
【請求項３２】
外面及び内腔を有し、医療的又は科学的手順に用いられ、宿主への挿入に適した宿主挿入デバイス；
前記手順の前、間又は後に生じる細菌バイオフィルムの形成を防止又は処置するために前記内腔内に入れられる、ポリペプチドを含む組成物；及び
ある量の抗生物質を含む医薬組成物であって、前記組成物が前記ポリペプチドと共に又は別々に前記内腔内に入れられ、これによって前記ポリペプチドは、前記デバイスの前記内腔又は前記宿主における細菌バイオフィルムの形成を処置又は防止することができ、前記抗生物質の組成物は、前記デバイスの前記内腔内又は前記宿主内の細菌を殺すことができる医薬組成物を含む装置。
【請求項３３】
前記宿主挿入デバイスが、カテーテル、ステント、内視鏡、ＩＶ、子宮内デバイス及びポートからなる群より選択される請求項３２に記載の装置。
【請求項３４】
前記宿主挿入デバイスが中心静脈カテーテルである請求項３３に記載の装置。
【請求項３５】
前記宿主挿入デバイスがヒト又は動物への挿入に適した請求項３４に記載の装置。
【請求項３６】
前記ポリペプチドがＲＩＰである請求項３２に記載の装置。
【請求項３７】
前記ペプチドの量が、前記デバイスの前記内腔を完全に満たすのに必要な量である請求項３２に記載の装置。
【請求項３８】
前記細菌がバイオフィルムを生成する、請求項３２に記載の装置。
【請求項３９】
表皮ブドウ球菌、黄色ブドウ球菌又は炭疽菌である前記細菌の処置において使用される請求項３９に記載の装置。
【請求項４０】
前記抗生物質が、合成的に生成されるか、又は他の微生物を殺すかあるいはその増殖を抑える能力を有する有機体により生成される任意の化学物質である請求項３２に記載の装置。
【請求項４１】
前記抗生物質が、バンコマイシン、シプロフロキサシン、ダプトマイシン及びイミペネムからなる群より選択される請求項４０に記載の装置。
【請求項４２】
前記抗生物質の量が、前記デバイスの前記内腔を完全に満たすのに必要な量である請求項３２に記載の装置。
【請求項４３】
医療的又は科学的手順において使用されるデバイス内の細菌バイオフィルムの形成を防止する方法であって、前記デバイスが外面及び内腔を有し、前記方法が
デバイスを選択するステップ；
前記デバイスにある量のポリペプチドを入れるステップ；
前記ポリペプチドを前記デバイス内に一定時間留まらせるステップ；
前記ポリペプチドを前記デバイスから抜き出すステップ；
前記デバイスを洗浄するステップ；
前記デバイスにある量の抗生物質を入れるステップ；
前記抗生物質を前記デバイス内に一定時間留まらせるステップ；
前記抗生物質を前記デバイスから抜き出すステップ；及び
前記デバイスを洗浄するステップ；を含む方法。
【請求項４４】
カテーテル、ステント、内視鏡、ＩＶ、子宮内デバイス及びポートからなる群よりデバイスを選択するステップをさらに含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記手順における前記デバイスとして中心静脈カテーテルを使用するステップをさらに含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ポリペプチドが前記内腔を完全に満たすように前記内腔に入れられる請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ポリペプチドがシリンジの使用を介して入れられる請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ポリペプチドとしてＲＩＰを使用するステップをさらに含む請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記デバイスの前記内腔を完全に満たすのに十分なＲＩＰの量を選択するステップをさらに含む請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記ポリペプチドが、前記デバイス内に最低３０分間留まる請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記ポリペプチドが、前記シリンジを用いて前記デバイスより抜き出される請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記デバイスが溶液で洗浄される請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記溶液がヘラピンである請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記デバイスが、医療的又は科学的手順の前又は手順中に、動物又はヒトとすることができる宿主内に挿入される請求項４３に記載の方法。
【請求項５５】
前記手順における前記デバイスとして中心静脈カテーテルを使用するステップをさらに含む請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
合成的に生成されるか、又は他の微生物を殺すかもしくはその増殖を抑える能力を有する有機体により生成される任意の化学物質である抗生物質を選択するステップをさらに含む請求項４３に記載の方法。
【請求項５７】
バンコマイシン、シプロフロキサシン、ダプトマイシン及びイミペネムからなる群より抗生物質を選択するステップをさらに含む請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記デバイスの前記内腔を完全に満たすのに必要な量の抗生物質で前記内腔を満たすステップをさらに含む請求項４３に記載の方法。
【請求項５９】
前記抗生物質がシリンジの使用を介して入れられる請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記抗生物質が、前記デバイス内に最低１時間留まる請求項４３に記載の方法。
【請求項６１】
前記抗生物質が、前記シリンジを用いて前記デバイスより抜き出される請求項４３に記載の方法。
【請求項６２】
宿主及びデバイスを処置する方法であって、前記デバイスは医療的又は科学的手順において使用され、外面及び内腔を有し、前記デバイスは前記宿主内に挿入されており、前記宿主内の前記デバイスの前記内腔内においては細菌が検出されており、前記方法は、
前記宿主内の前記デバイスの完全性を維持しながら、前記デバイスを安定させるために前記宿主を拘束するステップ；
前記内腔に結合され、これと連携して直接作動するチューブを固定するステップ；
ポリペプチドが前記内腔に流入するようにある量の前記ポリペプチドを前記チューブに入れるステップ；
前記ポリペプチドを前記デバイス内に所定時間留まらせるステップ；
前記ポリペプチドを前記デバイスから抜き出すステップ；
前記デバイスを洗浄するステップ；
ある量の抗生物質を前記デバイスに入れるステップ；
前記抗生物質を前記デバイス内に、ある時間留まらせるステップ；
前記抗生物質を前記デバイスから抜き出すステップ；
前記デバイスを洗浄するステップ；及び
宿主内における前記デバイスの完全性を損なわないように、前記デバイス及び前記宿主から外すステップを含む方法。
【請求項６３】
カテーテル、ステント、内視鏡、ＩＶ、子宮内デバイス及びポートからなる群よりデバイスを選択するステップをさらに含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記手順における前記デバイスとして中心静脈カテーテルを使用するステップをさらに含む請求項６４に記載の方法。
【請求項６５】
前記内腔を満たすのに必要な量のポリペプチドが前記内腔に入れられる請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記ポリペプチドがシリンジの使用を介して入れられる請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記ポリペプチドとしてＲＩＰを使用するステップをさらに含む請求項６２に記載の方法。
【請求項６８】
前記ポリペプチドが、前記デバイス内に最低３０分間留まる請求項６２に記載の方法。
【請求項６９】
前記ポリペプチドが、前記シリンジを用いて前記デバイスから抜き出される請求項６２に記載の方法。
【請求項７０】
前記デバイスが溶液で洗浄される請求項６２に記載の方法。
【請求項７１】
前記溶液がヘラピンである請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記デバイスが、動物又はヒトである宿主内に挿入されている請求項６２に記載の方法。
【請求項７３】
バンコマイシン、シプロフロキサシン、ダプトマイシン及びイミペネムからなる群より抗生物質を選択するステップをさらに含む請求項６２に記載の方法。
【請求項７４】
前記デバイスの前記内腔を完全に満たすのに必要な量の抗生物質で前記内腔を満たすステップをさらに含む請求項６２に記載の方法。
【請求項７５】
前記抗生物質がシリンジの使用を介して入れられる請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記抗生物質が、前記デバイス内に最低１時間留まる請求項６２に記載の方法。
【請求項７７】
前記抗生物質が、前記シリンジを用いて前記デバイスより抜き出される請求項６２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の説明
本特許出願は、ここで参照することにより本明細書に組み込まれる２００５年４月４日に出願された米国特許仮出願第６０／６６７，９３９号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明の技術分野は、医療デバイスの使用及び／又は移植に伴う細菌バイオフィルムの形成及び敗血症を処置及び防止する装置及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
微生物感染は、臨床診療用途及び科学実験用途の医療デバイスに共通する問題である。これらのデバイスには、インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）においても、移植前においても、微生物が定着することが多い。さらに、これらのデバイスの外科的移植では、敗血症及び／又は損傷部位における微生物定着が起きやすくなる。
【０００４】
敗血症
抗菌薬の改良及び対症療法の進歩にもかかわらず、敗血症は主要な死因にとどまっている。敗血症は、全身性炎症、循環障害及び多臓器機能障害（「ＭＯＤＳ＝ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｒｇａｎ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ」）を伴う。黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）等のグラム陽性の微生物、及びグラム陰性細菌の両者が敗血症の原因となりうる。敗血症の発生率は現在上昇中である。アンガスら（Ａｎｇｕｓ  ｅｔ  ａｌ．）、クリティカル・ケア・メディシン（Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．）２９：１３０３―１０（２００１）。グラム陰性細菌は外膜からリポ多糖体（「ＬＰＳ」）であるエンドトキシンを放出し、それが敗血症性ショックを引き起こす。これに対して、一部のグラム陽性細菌は、例えばトキシックショック症候群毒素１型（ＴＳＳＴ―Ｉ）等の細菌性スーパー抗原タンパク質ファミリーの２３から２９ｋＤａのポリペプチドであるエンテロトキシンの放出、及び発熱性エクソトキシンＡ等のエクソトキシンの放出により敗血症性ショックをもたらす。エクソトキシンは、宿主細胞の正常な代謝を妨げて宿主に有害作用を及ぼす可溶性物質であり、他方エンテロトキシンは、腸管細胞に特異的なエクソトキシンである。ド・キンプら（Ｄｅ  Ｋｉｍｐｅ  ｅｔ  ａｌ．）、プロシーディングズ・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステイツ・オブ・アメリカ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．ＵＳＡ）９２：１０３５９―６３（１９９５）；ケンガサランら（Ｋｅｎｇａｔｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ザ・ジャーナル・オブ・イクスペリメンタル・メディシン（Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．）１８８：３０５―１５（１９９８）；ルウェリンら（Ｌｌｅｗｅｌｙｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ザ・ランセット・インフェクシャス・ディジージズ（Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）２：５６―１６２（２００２）；ファン・アメルスフールトら（Ｖａｎ  Ａｍｅｒｓｆｏｏｒｔ  ｅｔ  ａｌ．）、クリニカル・マイクロバイオロジー・レビューズ（Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．）１６：３７９―４１４（２００３）。
【０００５】
クオラムセンシング及びＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド
近年の研究により、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）及び黄色ブドウ球菌を含む細菌種の病理学におけるクオラムセンシングの重要性が明らかとなった。クオラムセンシングとは、細菌集団が近隣細胞から情報を受け取って、これに適切に反応することにより微生物が宿主内で生存することを可能とする機構である。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０：４３８―４０（１９９８）；ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、セル（Ｃｅｌｌ）１１０：３０３―１４（２００２）；ヘンツァーら（Ｈｅｎｔｚｅｒ）、エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）２２：３８０３―１５（２００３）；コーレムら（Ｋｏｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．）、エフイーエムエス・マイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．）２２３：１６７―７５（２００３）。ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）においては、クオラムセンシングは、定着、播種及び病気の進行に関わる多数の毒素の産出を含む細菌の病原性に関与するタンパク質の発現を制御する。これらの病原性因子の中には、エンテロトキシン及びトキシックショック症候群毒素１型（「ＴＳＳＴ―Ｉ」）があり、これらはスーパー抗原として宿主の免疫系を過剰に刺激してサイトカインの過剰放出を引き起こし、Ｔ細胞の過剰な増殖を誘発する。
【０００６】
黄色ブドウ球菌のクオラムセンシングシステムにおいては、エフェクタクオラムセンシング分子ＲＮＡＩＩＩ活性化ペプチド（「ＲＡＰ」）が、ブドウ球菌に高度に保存されている２１ｋＤａタンパク質である「ＲＮＡＩＩＩ結合減衰タンパク質」（「ＴＲＡＰ」）をリン酸化する。ＴＲＡＰのリン酸化が、細菌付着及びＲＮＡＩＩＩという毒素合成の原因である調節ＲＮＡ分子の下流の生産を促進する。バラバン（Ｂａｌａｂａｎ）（１９９８）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７６：２６５８―６７（２００１）。ＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド（「ＲＩＰ」）と呼ばれるＲＡＰの拮抗体は、ＴＲＡＰのリン酸化を阻害して、下流における病原性因子の生産、細菌付着、バイオフィルムの形成、及びｉｎ  ｖｉｖｏ感染を強力に阻害する。
【０００７】
バイオフィルムは、細菌感染にとって非常に有効な防御を提供することが明らかになっている。特に、バイオフィルムは抗生物質への耐性が高くなることが分かっている。バイオフィルムは、抗生物質耐性のプロセスに相乗的に寄与する様々な属性を有する。これらの属性には、増殖率が低いこと、エキソポリサッカライドマトリクス、遺伝子発現の変化、最適三次元構造、及び潜在的耐性遺伝子の生産が含まれるがこれに限定されない。ドンランら（Ｄｏｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、クリニカル・マイクロバイオロジー・レビューズ（Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．）１５：１６７―１９３（２００２）；コスタートンら（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８４：１３１８―１３２２（１９９９）；及びフックスら（Ｆｕｘ  ｅｔ  ａｌ．）、トレンズ・イン・マイクロバイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）１３：３４―４０（２００５）。特にマトリクスは、微生物を抗菌療法による攻撃及び免疫系から保護する。付着細菌コミュニティによる抗菌剤に対する耐性は、持続的及び慢性的な多くの細菌感染の根本にあり、バイオフィルムの多層構造、及び浮遊細胞の細菌と比較したバイオフィルム内の細菌の固有の遺伝的特徴を含め、数多くの要因が考えられる。この現象は完全には理解されておらず、研究が盛んな分野である。
【０００８】
さらに、病院内のバイオフィルム感染を処置するために用いられる抗生物質は、抗生物質耐性があらわれる可能性だけでなく、患者が抗生物質に関連するアレルギー又は副作用をおこすリスクの増大を克服しなければならない。抗生物質の有効性は、処置時間が増加するにつれても減少する。
【０００９】
ＲＩＰは抗生物質と異なり、殺菌する代わりに細菌の細胞間コミュニケーションを阻害し、細菌を宿主防御機構に対してより弱い状態にする。バラバン（Ｂａｌａｂａｎ）（１９９８）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ペプタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２１：１３０１―１１（２０００）；ゴブら（Ｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）、ペプタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２２：１６０９―２０（２００１）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１８７：６２５―３０（２００３）；シリオーニら（Ｃｉｒｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）、サーキュレイション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）１０８：７６７―７１（２００３）；リベイロら（Ｒｉｂｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）、ペプタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２４：１８２９―３６（２００３）；ジャコメッティら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、アンティミクロビアル・エイジェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４７：１９７９―８３（２００３）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．）２３：３４０―４５（２００３）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、アンティミクロビアル・エイジェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４８：２５４４―５０（２００４）；デラクアら（Ｄｅｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１９０：３１８―２０（２００４）を参照。Ｂａｌａｂａｎらに対する米国特許第６，２９１，４３１号明細書においては、クオラムセンシングとして知られるＲＩＰによる妨害がより十分に説明されている。ＲＩＰは、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の付着及び病原性に対抗する強力な活性を示したことを含めて、非常に優れた結果をもたらした（２２―２４）。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０：４３８―４４０（１９９８）；及びバラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ）２７６：２６５８―２６６７（２００１）。
【００１０】
デバイスの細菌定着
細菌は、様々な方法を介してデバイスに定着する。例えば、宿主の皮膚の細菌が、デバイスの外面に定着しうる。あるいは、デバイスの内面を通してデバイスに細菌が定着する場合もある。例えば、カテーテル等の多くのデバイスが有する内腔は、細菌に十分な定着領域を提供する。
【００１１】
細菌は定着後、バイオフィルム構造を作り始める。特に上記のとおり、バイオフィルム内の細菌は耐性が高くなっているため、殺菌を目的とした抗生物質療法及び予防法により感染を根絶できないことが多い。さらに細菌は、メチシリン及びバンコマイシン等の抗生物質に耐性のある様々な菌株に進化しており、このことにより現在利用可能な治療的アプローチがさらに限定されてしまう。
【００１２】
通常カテーテル導入から３日以内で定着及びバイオフィルムの形成が生じうる。米国感染症学会（「ＩＤＳＡ」）によれば、カテーテル関連感染の原因として最も多く挙げられる有機体は、コアグラーゼ陰性ブドウ球菌及び黄色ブドウ球菌等のグラム陽性細菌である。カテーテル関連感染の原因となりうる他の有機体には、好気性グラム陰性桿菌及びカンジダアルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が含まれる。ＩＤＳＡは、カテーテル関連感染の処置に関する臨床ガイドラインを発表している。非トンネル型ＣＶＣ関連の菌血症の処置では、カテーテル除去と、微生物に応じて全身性抗生物質又は抗かび剤による処置が推奨されている。
【００１３】
デバイス関連の菌血症に推奨される処置は少し異なる。デバイス除去及び全身性抗生物質療法が推薦されることが多い。残念ながら新たな挿入部位を見いだすのは困難であり、費用及び時間もかかるため、新しいデバイスの挿入は必ずしも望ましいとはいえない。
【００１４】
細菌定着に対抗するため、デバイス製造業者は、様々なデバイスを抗微生物物質と結合してきた。例えば製造業者は、デバイスを抗生物質でプレコートした。マッコンネルら（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．）、クリニカル・インフェクシャス・ディジージズ（Ｃｌｉｎ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．）３７：６５―７２（２００３）；及びマーシアンテら（Ｍａｒｃｉａｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．）、アメリカン・ジャーナル・オブ・インフェクション・コントロール（Ａｍ  Ｊ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）３１：１―８（２００３）。様々な抗菌剤及び防腐剤も用いられてきた。残念ながら一部の研究者により、一部の患者のアナフィラキシー反応が報告された。ハンナンら（Ｈａｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、アニスシージア（Ａｎａｅｓｔｈｅｓｉａ）５４：８６８―８７２（１９９９）。これらの理由により、細菌が定着したデバイスのｉｎ  ｓｉｔｕの処置あるいはロック技術（別名腔内療法）が注目されるようになった。この技術は、細菌が定着した医療デバイスに、その内腔を満たすように量を選択した濃縮抗菌溶液を滴注することを伴う。この技術は、抗生物質毒性の出現率を抑えながら感染部位に高濃度で抗菌剤を提供する。
【００１５】
推奨された処置内容にもかかわらず、感染の再発率は高い。バイオフィルムの細菌は通常、浮遊性細菌の殺菌処置に用いられる抗生物質の濃度より１，０００から１，５００倍高濃度の抗生物質に耐えられる。ドンランら（Ｄｏｎｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、クリニカル・マイクロバイオロジー・レビューズ（Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ．）１５：１６７―１９３（２００２）；コスタートンら（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８４：１３１８―１３２２（１９９９）；及びフックスら（Ｆｕｘ  ｅｔ  ａｌ．）、トレンズ・イン・マイクロバイオロジー（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）１３：３４―４０（２００５）。付着細菌の検出及び破壊を目的とする様々な抗バイオフィルム戦略が熱心に研究されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、医療デバイス及び宿主自体の細菌定着を処置及び防止するための、固有、新規かつ有用な装置及び複数の方法を教示する。特にデバイス及び／又は宿主自体は、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含むレンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の菌種、又はその菌株で抗生物質に耐性のあるもの等のグラム陽性細菌による感染の危険にさらされている。他の実施形態においては、病原体はＬ．イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）及びＬ．ｍｏｎｏｃｔｏｇｅｎｅｓを含むリステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）属の菌種、ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属の菌種、エンテロコッカス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）属の菌種、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クロストリジウムａｃｅｔｏｂｔｙｌｉｃｕｍ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｔｙｌｉｃｕｍ）、及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）及びセレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）を含むバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の菌種、又はその菌株で抗生物質に耐性のあるものでよい。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
ＲＩＰを医療デバイス単独と及び／又は抗生物質と組み合わせると、細菌が激減する。基本的にＲＩＰは、細菌コミュニケーション機構の機能を妨げることにより、細菌が強力なバイオフィルムを形成する能力を限定する。これにより、細菌の毒素分泌能力が弱められる。別の実施形態としては、抗生物質も加えることによりデバイスの細菌根絶を増強してもよい。
【００１８】
本発明の別の態様は、ＲＩＰを目的のデバイス及び抗生物質と組み合わせてデバイスを救うために使用される技術に重点をおく。デバイスの開存性を維持することを目的として、デバイス及びロック溶液が使用される。ｉｎ  ｖｉｖｏの用途においては、溶液の成分がデバイスカテーテル内の空間を物理的に占有し、宿主の循環血液に適切な圧力を及ぼすことにより作用する。この方法によれば、血液がデバイスに逆流して凝固することはない。ロック技術は、特定のデバイス内の溶液の濃度を最大化する的確な方法を提供する。例えば技術者は、全身投与の約１００から１，０００倍の投与量を用いて、溶液をカテーテル等（又は内腔を有する他の任意のデバイス）の内腔に注入できる。標準ガイドラインに従って、溶液は、抗生物質でもＲＩＰでも、一定時間デバイス内に留まらなければならない。例えば一実施形態においては、ＲＩＰは３０分間デバイス内に留められればよく、その後技術者は抗生物質を１時間デバイス内に置かれればよい。しかしここでも、これらの時間測定は単に一つの実施形態を表すにすぎず、ほぼいずれの長さの時間を用いてもよいが、結果は様々であろう。
【００１９】
さらにロック技術をｉｎ  ｖｉｖｏで用いれば、臨床医は、挿入されたデバイスの完全性を損なうことなく、デバイス及び／又は宿主における細菌の処置を最大化できる。上述の通り、細菌感染を処置するために医療デバイスを除去しなければならないことが、細菌定着に関する問題の一つとなってきた。本発明は、臨床医が宿主の体内にデバイスを留めたままで、医療デバイスを洗浄するのに使用するＲＩＰ及び抗生物質の量を最大化できる方法を示す。
【００２０】
デバイス製造業者も、手順に先立って特定のデバイスにＲＩＰを注入することにより、デバイスを容易に事前処置できる。本発明の一実施形態においては、処置に先立って中心静脈カテーテル（「ＣＶＣ」）をＲＩＰと組み合わせることができる。本明細書に示される実施例から分かるように、こうすると細菌のバイオフィルム形成能力が大いに限定され、抗生物質の有効性が高められる。
【００２１】
端的に言えば本発明は、医学界及び科学界を悩ます忌むべき問題を処置及び防止する新しいアプローチを示すものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
カテーテル及びシリンジの説明
本発明のために、本発明を含む手順において使用できる代表的なＣＶＣ１０及びシリンジ５０の簡単な概観及び説明を提供する。しかし、この説明はいかなる限定も意味しない。むしろこの説明は、単に一例として提供されるにすぎず、他にも多くの種類の一般のＣＶＣ及び／又はカテーテル及びシリンジを、本明細書に記載のツールに容易に代用できる。本発明者らは、本発明の一実施形態をより詳細に説明するためにこれらの実施例を提示する。
【００２３】
図１を参照すると、概して１０に表される中心静脈カテーテルシステムが示されている。カテーテル１０は、オス又はメスでありうるフィッティング１４に終端するソースチューブ１２を含む。また、カテーテル１０は、やはりオス又はメスでありうるフィッティング１８で終わる帰還チューブ１６を有する。各チューブは、カテーテルチューブを通る液体の流れを制御するバルブ２０を含む。
【００２４】
ソースチューブ１２及び帰還チューブ１６は、それぞれ内腔２２ａ及び２２ｂを含む。ソースチューブ１２及び帰還チューブ１６はコネクタマニホールド２４内に保持され、コネクタマニホールド２４は、ソースチューブ１２及び帰還チューブ１６から離れる方向に向かって細くなり、マニホールドからの単一の出口ポイント２６で終端する。マニホールド２４（内部の仕組みは本明細書に示されていない）は、流体がソースチューブ１２及び帰還チューブ１６のそれぞれの内腔２２ａ及び２２ｂを通ってエンドポイント２６から流出してカテーテル本体２６へと流入する際に、ソースチューブ１２及び帰還チューブ１６の経路をそれぞれ確立する。カテーテル本体２６自体も内腔２８を含み、流体がこれを通過して、エンドポート３０から宿主に入り、又は宿主から出る。エンドポート３０は、ヒトの上大静脈等を含む宿主の様々な領域に流体を流入し、又はそこから引き出すことができる。
【００２５】
すべての中心静脈カテーテルに必要というわけではないが、この特定の実施形態においては、マニホールド２２はマニホールド２２の各側面上に縫合アンカ３２ａ及び３２ｂを含む。アンカ３２ａ及び３２ｂは、通常の中心静脈カテーテル術の原則にしたがってカテーテル１０を患者に縫合するために使用される。本実施形態におけるカテーテル１０のアンカ３２ａ及び３２ｂは、カテーテル１０を宿主に固定するための縫合孔３４ａ及び３４ｂも含むが、これはカテーテルの一例にすぎない。臨床医は、外科手術用テープ及び他の接着剤の使用等を含む他の手段によってカテーテルを宿主に固定することも多い。
【００２６】
図１に示されるように、フィッティング１４は流体３８を有する流体チューブ３６に結合され、好ましい実施形態における流体３８は、ＲＩＰの後ヘパリンである。フィッティング１８も流体チューブ３８を含み、臨床医はここから「リターン」を得る。換言すれば、臨床医は流体を宿主から抜き出す（例えば、上大静脈に出入りする通路が妨害されていないことを確認するために）。流体チューブ３６及び３８はそれぞれエンド４０及び４２を有し、エンド４０及び４２は一実施形態においてはメスの嵌合を有するが、従来技術において理解されているように、任意の種類の嵌合を含みうる。エンド４０及び４２は、カテーテル１０及び／又は宿主に注入され又はここから排出される流体を運び又は受けるベッセル（図示せず）と嵌合する。
【００２７】
図２には、シリンジ５０が含まれる。シリンジ５０は、ソースチューブ１２に注入するか又は帰還チューブ１８から流体を除去するために使用される。シリンジ５０は、内部壁５４及びプランジャ５６を有する円筒ハウジング５２を含む。プランジャ５６及び円筒ハウジング５２は、円筒ハウジングの最上部（図示せず）と嵌合するキャップ５８を介して結合されている。シリンジ５０は、円筒ハウジング５２内の流体の量を測定するための測定ノッチ６０も含む。プランジャ５６は、円筒ハウジング５２内に入った液体を圧縮するフラットエンド６２を有する。フラットエンド６２は、円筒ハウジング５２内で伸び、内部壁５４とともに密封する。プランジャ５６は、完全格納ポジション６４及び完全挿入ポジション６６を有する。完全挿入ポジション６６においては、プランジャ５６は、フラットエンド６２を介して、円筒ハウジング５２内の液体をシリンジチップ６８から放出する。完全格納ポジション６４においては、シリンジ５０が宿主に挿入されると、円筒ハウジング５２が液体で満たされる。
【００２８】
本発明のＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド
クオラムセンシングを阻害するＲＩＰは、細菌増殖には影響しないが、エクソトキシンの産出につながる信号伝達を妨げることにより細菌の潜在的病原性を低下させる。ＲＩＰは、ａｇｒ遺伝子座の上流活性化因子であるターゲット分子ＴＲＡＰのリン酸化を阻害することにより毒素産出を妨害する。対照的に、抗生物質及び／又は抗菌ペプチドの作用機構は一般に、殺菌である。ＲＩＰと抗生物質では作用機構が異なるので、細菌感染処置のために両者は相乗的に作用することができる。
【００２９】
ＲＩＰポリペプチドは、配列がＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦで、Ｘ１がＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾されたアミノ酸であり、Ｘ２がＫ又はＳである５つの連続したアミノ酸；又は２つの置換又は欠失により配列ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦと異なる配列で、Ｘ１がＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾されたアミノ酸であり、Ｘ２がＫ又はＳである配列を有するアミノ酸を含みうる。一実施形態においては、ＲＩＰは、Ｘ１がＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾されたアミノ酸である配列ＹＳＰＸ１ＴＮＦから成らない。そのかわりＲＩＰは、１つの置換又は欠失により配列ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦと異なる配列で、Ｘ１がＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾されたアミノ酸であり、Ｘ２がＫ又はＳである配列を有するアミノ酸を含みうる。他の様々な実施形態において、ＲＩＰは、Ｘ１がＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾されたアミノ酸であるアミノ酸配列ＹＫＰＸ１ＴＮＦ；Ｘ１がＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾されたアミノ酸であり、Ｘ２がＫ又はＳであるアミノ酸配列ＩＫＫＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦ；又はＰＣＴＮＦ、ＹＫＰＩＴＮＦ、又はＹＫＰＷＴＮＦの配列のうちの１つを含む。従って様々な実施形態において、ＲＩＰは、ポリペプチド鎖に異なる量及び種類のアミノ酸を含みうる。
【００３０】
デバイスにおけるバイオフィルム減少及び相乗的抗生物質効果
表面に付着する細菌は、細菌自身が合成した水和ポリマーマトリクスに凝集してバイオフィルムを形成する。これらの付着性コミュニティの形成及びそれら特有の抗菌剤に対する耐性が、多くの持続的及び慢性的な細菌感染の根本にある。コスタートンら（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８４：１３１８―２２（１９９９）を参照。バイオフィルムは、デバイス等の不活性表面を好んで発達するが、生体組織上にも形成できる。バイオフィルムは、一か所又は数か所でゆっくりと成長するため、バイオフィルム感染による明らかな症状が現れるのは遅いことが多い。付着細菌の細胞は、抗原を放出して抗体の産出を促進するが、抗体はバイオフィルム内の殺菌に有効でなく、周囲組織に免疫複合体による損傷を引き起こすこともある。細胞及び体液の免疫反応が優れた人であっても、宿主防御機構によりバイオフィルム感染が解決されることはほとんどない。後で更に詳細に記述するとおり、抗生物質療法はバイオフィルムから放出された浮遊細胞による症状を後退させるが、バイオフィルムを殺すことはできないのが典型である。そのため、バイオフィルム感染は、付着性の母集団を体から外科的に除去しない限り、抗生物質療法のサイクル後に症状の再発を示すのが典型的である。そのため、バイオフィルムの形成を防止すること、及び／又は既に形成されてしまった場合にはこれを減少させることが好ましい。
【００３１】
本発明の装置及び方法は、医療デバイス及び本発明の一実施形態においてはＣＶＣにおけるバイオフィルムに伴う細菌感染及び／又は疾患の処置に有用である。例えば、ＣＶＣに注入したＲＩＰの使用は、移植されたデバイスにバイオフィルムが発達するリスクを低下させる。そのうえ一実施形態においては、ロック技術を使用してＣＶＣに注入した上で抗生物質を加えることで細菌性疾患が減少する。したがってＲＩＰを含浸させたＣＶＣは、バイオフィルムを減らし、汚染デバイス及び／又は宿主を救うための抗生物質ロック技術の有効性を高める。
【実施例】
【００３２】
本発明の考えうる一実施形態においてＣＶＣを救うための抗生物質の有効性を増強させる、ＲＩＰを含浸させたＣＶＣの使用を示す一例として、以下の実施例を提供する。
【００３３】
材料及び方法
有機体：本発明者らは、黄色ブドウ球菌株Ｓｍｉｔｈ  ｄｉｆｆｕｓｅ（ＳＤ）を選択した。これは臨床的に試験された多くの黄色ブドウ球菌株と抗原的に同一のエキソ多糖類の、被包性が高く粘液を産出する菌株である。
【００３４】
抗生物質：ダプトマイシン等を含め、合成的に作られるか、又は他の微生物を殺すかもしくはその発育を阻止する能力のある有機体により作られた任意の抗生物質を使用できるが、本発明の本実施形態において、発明者らはＲＩＰを組み合わせて相乗効果を示すのに以下の抗生物質を選択した：バンコマイシン、シプロフロキサシン及びイミペネム。本発明者らは、これらの抗生物質を製造業者の推奨にしたがって希釈した。溶液は分析当日に作られたばかりか、又は８０℃で暗所に短時間保管された。分析された濃度範囲は０．２５〜１，０２４μｇ／ｍｌである。
【００３５】
合成ペプチド：ＲＩＰのアミドの形（ＹＳＰＷＴＮＦ―ＮＨ２）を合成した。その後ＲＩＰをＨＰＬＣで９９％に精製した。それを、必要な最高濃度の２０倍で蒸留水（「Ｈ２Ｏ」）に溶解した。溶液は分析当日に作られたばかりか、又は必要に応じて−８０℃で暗所に短時間保管された。
【００３６】
動物：本発明者らは、成体雄ウィスターラット（体重範囲２５０から３００ｇ）（ｎ＝１２／実験群）を使用した。動物を１２時間の明／暗サイクルの、温度（２２℃）及び湿度を一定にした個別のケージに全匹収容し、研究の間自由に固形飼料及び水を入手できるようにした。温度及び湿度が管理され、午前６時３０分及び午後６時３０分に点灯及び消灯される環境とした。
【００３７】
感受性試験のための付着性バイオフィルム形成：バイオフィルムを発達させるため、１０６ＣＦＵ／ｍＬの細菌を含む５０μＬのトリプティックソイブロス（「ＴＳＢ」）を無菌状態下で、１５０μＬのＴＳＢ―２％ブドウ糖を含む組織培養処理したポリスチレン９６―ウェルプレートの各ウェルに加えた。３７℃で２４時間培養した後、増殖培地を廃棄し、各ウェルを無菌状態下で、リン酸塩緩衝食塩水（「ＰＢＳ」）で３度洗浄して浮遊細菌を除去した。付着性バイオフィルム形成を評価するため、残りの付着した細菌を、一つのウェルにつき０．２ｍＬの９９％メタノールで固定し、１５分後、プレートを空けて乾燥させた。その後、細菌をグラム染色するため、一つのウェルにつき０．２ｍＬの２％クリスタルバイオレットでプレートを５分間染色した。水道水の下にプレートを置いて余分な染色液を洗い落とした。ステパノヴィクら（Ｓｔｅｐａｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソッズ（Ｊ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ）４０：１７５−１７９（２０００）；及びクリステンセンら（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・クリニカル・マイクロバイオロジー（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ）２２：９９６―１００６（１９８５）。プレートを風乾した。一つのウェルにつき０．２ｍＬの３３％（ｖ／ｖ）氷酢酸で付着細胞に結合した染料を可溶化した。各ウェルの光学密度（「ＯＤ」）を、ＭＲ７００  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｇｕｅｒｎｓｅｙ，ＵＫ）を用いて５７０ｎｍで光度分析的に測定し、ＯＤを表した。ＰＢＳ溶液で満たしたウェルの光学密度を測定してプレートごとにブランク（陰性対照）を測定した。マイクロタイタープレート試験のカットオフＯＤ値は、陰性対照の平均ＯＤ値＋３標準偏差として定義した。（ｉ）ＭＨブロスの総容積１０μＬに１０μｇのＲＩＰを加えて、及び（ｉｉ）加えずに各ウェルに入れて、同じ実験を二度行った。本発明の本実施形態においては、各試験をトリプリケートで行った。
【００３８】
古典的方法による感受性試験：前セクションに記載した実験（ｉ）及び（ｉｉ）の両者において、最小阻止濃度（「ＭＩＣ」）、あるいはｉｎ  ｖｉｔｒｏ検証において細菌増殖を阻害するに足りる抗生物質の最低濃度を、マイクロブロス希釈法を用いて、ミュラーヒントン（「ＭＨ」）ブロス及び５ｘ１０５ｃｆｕ／ｍＬの初期接種菌で、米国臨床研究所規格委員会により概説される手順に従って測定した。米国臨床研究所規格委員会、第５版、認可規格Ｍ７―Ａ５，Ｗａｙｎｅ，ＰＡ（２００１）。ポリスチレン９６―ウェルプレートを、大気中で３７℃で１８時間培養した。観測可能な成長が阻害された最低薬剤濃度としてＭＩＣを測定した。最小殺菌濃度（「ＭＢＣ」）、あるいは薬剤除去後に細菌を殺すに足りる抗生物質の最低濃度を、初期接種菌の９９．９％以上を減少させた各薬剤の最低濃度として測定した。さらに、細菌の抗生物質感受性に対するＲＩＰ前処理の効果を調べるために、１０μｇのＲＩＰを含む１０μＬのＭＨブロス／ウェルでプレートを３０分間前処理した後、ＭＩＣ及びＭＢＣを測定した。本発明の本実施形態においては、各実験をトリプリケートで行った。
【００３９】
付着細胞の感受性検査：本発明の本実施形態においては、付着細菌細胞について上記実験を繰り返した。バイオフィルム（前述のとおり準備）をＰＢＳで洗浄して浮遊細菌を取り除いた。その後、二倍ずつ連続希釈した抗生物質を含むＭＨブロスを、付着有機体を含むウェルに加えた。ポリスチレンプレートを、大気中で３７℃で１８時間培養した。前述のように、観測可能な細菌増殖が阻害された最低薬剤濃度としてＭＩＣを測定した。ＭＢＣを測定するため、抗生物質を含むＭＨブロスを各ウェルから除去し、抗生物質を含まないＭＨブロスに置き換えた。その後再びプレートを大気中で３７℃で１８時間培養した。薬剤除去後に細菌増殖が生じなかった各薬剤の最低濃度としてＭＢＣを測定した。１０μｇのＲＩＰを含む総容積１０μＬのＭＲブロスを各ウェルに加え、その３０分後に同じ実験を繰り返した。前記と同様、本発明の本実施形態においては、すべての実験をトリプリケートで行った。
【００４０】
動物における実験計画
接種菌の調製：脳心臓浸出物ブロスで細菌株を育てた。細菌が成長の対数増殖期にあるときに、懸濁液を１０００ｇで１５分間遠心分離し、上澄みを廃棄し、細菌を滅菌食塩水に懸濁して希釈し、濃度が約１ｘ１０１０ＣＦＵ／ｍｌになるようにした。
【００４１】
ラットの中心静脈カテーテル（ＣＶＣ）関連感染モデル：ラットにカテーテルを挿入した。簡潔にいうと、サイラスティックカテーテルを頸静脈に挿入して上大静脈まで進めた。カテーテルの近位部を皮下にトンネルし肩甲骨の間から出した。齧歯類用ジャケットを使用してカテーテルを保護するとともにカテーテルにアクセスできるようにした。ＣＶＣ留置から２４時間後に、カテーテルから血液培養を行って無菌性を確認した。ラップら（Ｒｕｐｐ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・アンティミクロビアル・ケモセラピー（Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ）４７：７０５―７０７（２００１）。ＣＶＣを介して、１．０ｘ１０６ＣＦＵの生きた黄色ブドウ球菌株Ｓｍｉｔｈ  ｄｉｆｆｕｓｅにラットを曝露した。細菌曝露から２４時間後に６匹の動物（対照群２４時間）を殺し、定量培養により細菌感染の存在を確かめた。同時に、他の群ではロック技術を開始した―ＣＶＣ内に薬剤を１時間留まらせた後、ヘパリン溶液で洗浄した。研究には、（ｉ）対照群を１つ（ＣＶＣ感染なし）、（ｉｉ）抗生物質予防投与を一切受けていない汚染群を１つ、（ｉｉｉ）ＲＩＰを含浸させたＣＶＣを受けた（ロック技術により）汚染群を１つ、及び（ｉｖ）ＲＩＰを含浸させたＣＶＣを受けた（すなわちロック技術を用いて）か、又はＲＩＰを含浸させず、付着細胞のＭＢＣに等しい濃度のシプロフロキサシン、イミペネムあるいはバンコマイシンを、０．１ｍｌの量に１．０２４ｍｇ／ｍｌで満たした（すなわちロック技術の使用による）ＣＶＣを受けた汚染群を６つ含んだ。各実験群に１２匹の動物を含んだ。
【００４２】
処置の評価：ｉｎ  ｖｉｖｏの結果を測定するため、定量的末梢血培養及びＣＶＣと周辺静脈組織の定量培養を行った。
【００４３】
実験の７日目に動物を殺した。定量的末梢血培養では、無菌経皮的胸腔穿刺により末梢血を採り、ヒツジ血液寒天培地のプレートで培養した。プレートを３７℃で４８時間培養し、ブドウ球菌株の存在を評価した。プレートあたりのコロニー形成単位（「ＣＦＵ」）の数を数えることにより微生物を定量した。カテーテル及び周辺静脈組織の定量培養においては、上大静脈内のＣＶＣの遠位先端の位置を視覚的に確認し、カテーテル及び周辺静脈組織を無菌的に除去した。外植したカテーテル／静脈組織を、１０ｍＬのＰＢＳ溶液を含むチューブ内に置き、５分間超音波分解して付着細菌を除去した。その後、１０ｍＭのナトリウムＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．２）で細菌懸濁液の系列希釈（０．１ｍＬ）を行ってキャリオーバーの影響を最小化し、各希釈溶液を血液寒天培地のプレートで培養することにより、溶液を培養した。プレートを３７℃で４８時間培養し、ブドウ球菌株の存在を評価した。両方法における検出限界は、ともに約＜１０ＣＦＵ／ｍＬであった。
【００４４】
統計的分析：図３及び４から分かるとおり、ＭＩＣ値は三つの別々の実験の幾何平均として示されている。全群における定量培養の結果は、平均値±標準偏差として示されている。クラスカル・ワリス検定を用いて、末梢血、外植ＣＶＣ及び末梢組織から得た細菌数を比較した。Ｐ値が＜０．０５である場合を有意とした。
【００４５】
結果の要約
伝統的方法による感受性試験：「ＮＣＣＬＳ」（旧臨床研究所規格委員会）により推奨されるブロス微量希釈法によると、シプロフロキサシン、イミペネム及びバンコマイシンのＭＩＣ値は、それぞれ１．００、０．５０及び１．００μｇ／ｍｌであった。ＭＢＣを測定すると全ての薬剤の値が二倍になり、感受性パターンが確認された。表１に示されるように、各ウェルに１０μＬのＲＩＰを加えてから３０分後に実験を繰り返した場合にも同様の結果が得られた。結局、ＲＩＰはその作用機構により予期されるような菌株に対する抗生物質活性を示さなかった（ＭＩＣ＞２５６ｍｇ／ｌ）。
【００４６】
付着細胞による感受性試験：バイオフィルムの生産を光度分析的に確認した。菌株の平均ＯＤ値５７０ｎｍは０．４０４±０．０２９であった。付着性の単細胞から発達したバイオフィルムは、１日後に表面積の５％±５％を覆い、７日後には５０％±３５％まで増加した。付着細菌に対する３つの抗生物質の活性は、浮遊性の増殖細胞に対する場合の半分以下だった。具体的には、付着性有機体に対するシプロフロキサシン、イミペネム及びバンコマイシンのＭＩＣ値は２．００、１．００及び２．００μｇ／ｍＬであった。これに対してＭＢＣは、すべての使用薬剤で注目すべき増加を示した（８倍）。各ウェルに１０μＬのＲＩＰを加えてから３０分後に実験を繰り返した場合には、異なるデータが得られた。実際、シプロフロキサシン、イミペネム及びバンコマイシンのＭＩＣ値は、１．００、０．５０及び１．００μｇ／ｍＬであった。この感受性パターンをＭＢＣ測定により確認したところ、表１に示されるとおり、すべての薬剤の値が二倍だけ高くなった。これらの組では粘液産生がずっと少ないことが測光法により確認されたことが興味深い（データは示されていない）。
【００４７】
Ｉｎ  ｖｉｖｏの結果：表２に示されているように、対照群に含まれる動物は全匹とも（２４時間後に殺処分）定量培養の結果が６．０ｘ１０６±１．７ｘ１０６ＣＦＵ／ｍＬとなり、ＣＶＣ感染の証拠が示された。７日目に胸腔穿刺により得た定量的末梢血培養からは、付着細胞のＭＢＣ濃度では、シプロフロキサシン、イミペネム及びバンコマイシンの発揮する抗菌活性は弱く、未処置の対照と比較して結果に有意な差はないことが明示された。これに対して他の全ての群では、等張食塩水処置群と比較して定量的血液培養に有意な減少が見られた（Ｐ＜０．０５）。ＲＩＰプラス最高濃度の抗生物質による処置群だけに感染の証拠が見られなかったことは意義深い。
【表１】
2008534224.tif 000003
【表２】
2008534224.tif 000004
【００４８】
本発明の本実施形態においては、外植したカテーテル／静脈組織で定量培養を行った際にも同様の結果が得られた。これらの条件下では、ＲＩＰ及び１，０２４μｇ／ｍＬのバンコマイシンが細菌を最も多く減少させたが（１．９ｘ１０１±０．２ｘ１０１ＣＦＵ／ｍｌ）、他の組み合わせの処置群と比較して統計学的に有意な差は見られなかった。
【００４９】
提供した実施例のまとめ
背景にて強調したように、ＣＶＣに定着する微生物は、皮膚挿入部位を起点としてデバイスの外面に沿って移動するか、又は医療従事者の手技によりハブを起点として内腔内側に沿って移動する。したがって、ブドウ球菌バイオフィルム感染の治療に推奨される方法は、感染したデバイスを除去し、綿密な抗生物質療法により患者を治療し、新しいデバイスを挿入しなおすことである。ショルら（Ｓｈｏｒｒ  ｅｔ  ａｌ．）、チェスト（Ｃｈｅｓｔ）１２４：２７５―２８５（２００３）及びラード（Ｒａａｄ），ランセット（Ｌａｎｃｅｔ）３５１：８９３―８９８（１９９８）。
【００５０】
本発明の本実施形態においては、デバイスを細菌付着から保護することにより非付着性の浮遊性細菌により良く効く抗生物質の有効性を高める方法として、クオラムセンシング阻害物質ＲＩＰを使用した。本明細書に提示された結果から、ロック技術を用いたＣＶＣ感染治療におけるＲＩＰ、バンコマイシン、シプロフロキサシン及びイミペネムの有効性が示された。結果から分かるように、抗菌剤は付着細菌に対してはほとんど活性がなかったが、ＲＩＰの存在により著しく増強された。実に全ての抗生物質のＭＩＣ及びＭＢＣが、ＲＩＰの不存在下で得られた値よりずっと低くなった。この実施例から、ＲＩＰを含浸させたＣＶＣを従来の抗生物質と組み合わせて使用すると、本発明の本実施形態に記載されているように定着率がずっと低くなることが明示された。実際、ＲＩＰと最大試験濃度のシプロフロキサシン、イミペネム及びバンコマイシンでは、対照と比較して５ｌｏｇ１０細菌数が減少し、デバイスのブドウ球菌感染の有意な減少がもたらされた。カテーテル／静脈組織の定量培養におけるこのような定着の減少は、ＲＩＰを伴って又は伴わずに行った２種類の実験で統計学的に異なった。
【００５１】
本明細書に記載したすべての刊行物及び特許は、当該刊行物及び特許を引用した文脈において特定の方法及び／又は材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれたものとする。本明細書で検討した刊行物及び特許は単に、本発明の出願日に先立ってそれらが開示されているために提供されているにすぎない。本明細書中の一切が、本発明が先願発明によってかかる刊行物又は特許に先行する権利がないことを認めるものと解釈されてはならない。さらに、提供された公開又は発行の日付は実際の日付と異なりうるため、それぞれ確認する必要がある。
【００５２】
以上の明細書において、説明のために実施例を提示して本発明の原則を教示したが、当然のことながら当業者は本明細を読めば、本発明の正確な範囲から逸脱することなく、形及び細部の様々な変更が可能であることを認識するだろう。
【図面の簡単な説明】
【００５３】
【図１】標準的なＣＶＣである。
【図２】本発明の一実施形態において、ＲＩＰをＣＶＣに注入し又はＣＶＣから除去するために使用されるシリンジである。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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