(57)【要約】  本発明は、ｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節する試験化合物能力を同定する方法を提供し、該方法は：ｉ．ｐ７５ＮＴＲ（配列番号２）もしくはその細胞死誘導フラグメントをコードするベクターで真核細胞の懸濁液をトランスフェクションすること、ｉｉ．試験する化合物と該細胞を接触させること、およびｉｉｉ．該細胞におけるアポトーシス応答を決定すること（ここで、該試験化合物の不在下でのアポトーシス応答と比較した該試験化合物の存在下でのアポトーシス応答の改変は、ｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節する該試験化合物の能力の指標である）を含んでなる。本発明のこの方法において、真核細胞の懸濁液は、０．４〜３．０ｘ１０４細胞／１００μｌの細胞密度で使用されそして６〜１のＤＮＡに対するトランスフェクション試薬の比率で、特に４の比率で脂質ベースのトランスフェクション試薬の存在下でトランスフェクションされるＨｅｋ２９３Ｔ細胞からなる。１０ｍｌの最終トランスフェクションミックス当たりで表されるトランスフェクション試薬の量は８．０〜１２．０μｌの範囲においてであり、そしてＤＮＡの量は２．０〜３．５μｇの範囲においてである。本発明の方法における細胞のアポトーシス応答は、当該技術分野で既知である方法を用いて決定される。特にアネキシンＶもしくは核染色を用いる。好ましい態様において、アポトーシス応答はアネキシン−Ｖ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８およびヘキスト３３３４２を用いて決定される。上記に使用するようなｐ７５ＮＴＲ細胞死誘導フラグメントは、ｐ７５  Ｃｈｏｐｐｅｒドメイン（配列番号１０）を含んでなり、そして特にｐ７５＿ＩＣＤ（配列番号４）、ｐ７５＿ＣＤ（配列番号６）もしくはｐ７５＿ＴＮＦ（配列番号８）からなる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉ．ｐ７５ＮＴＲもしくはその細胞死誘導フラグメントをコードするベクターで真核細胞の懸濁液をトランスフェクションし、
ｉｉ．該細胞を試験すべき化合物と接触させ、そして
ｉｉｉ．該細胞におけるアポトーシス応答を決定し、ここで、該試験化合物の不在下でのアポトーシス応答と比較した該試験化合物の存在下でのアポトーシス応答の改変は、ｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節する該試験化合物の能力の指標である
ことを含んでなるｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節する試験化合物能力の同定方法。
【請求項２】
真核細胞の懸濁液がＣＨＯ細胞、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ−５Ｙ細胞、感覚後根神経節ニューロン、シュワン細胞、ヒト黒色腫細胞系Ａ８７５、ラットＰＣ１２細胞およびＨｅｋ２９３Ｔ細胞よりなる群から選択され、特にＨｅｋ２９３Ｔ細胞である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｐ７５ＮＴＲ受容体がラット受容体（配列番号：２）もしくはその哺乳類オーソログである請求項１に記載の方法。
【請求項４】
細胞死誘導フラグメントが配列番号：１０、配列番号：４、配列番号：６もしくは配列番号：８と少なくとも７０％の配列同一性を有するポリペプチドから選択される請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ｐ７５ＮＴＲ細胞死誘導フラグメントがｐ７５  Ｃｈｏｐｐｅｒドメイン（配列番号１０）を含んでなり、そして特にｐ７５＿ＩＣＤ（配列番号４）、ｐ７５＿ＣＤ（配列番号６）もしくはｐ７５＿ＴＮＦ（配列番号８）からなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アポトーシス応答を細胞収縮、細胞質凝縮、クロマチン分離、核凝縮、膜ブレッディング（ｂｌｅｄｄｉｎｇ）、膜結合型アポトーシス小体の形成、ＤＮＡラダー形成、アネキシン結合およびミトコンドリア膜電位の喪失よりなる群から選択される形態学的および／もしくは生化学的変化を用いて決定する請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アポトーシス応答をアネキシンＶもしくは核染色を用いて決定する請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アポトーシス応答を蛍光標識されたアネキシンＶ、特にアネキシン−Ｖ−Ａlｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８を用いて決定する請求項５に記載の方法。
【請求項９】
アポトーシス応答をアネキシンＶおよび核染色を用いて決定する請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
ＤＮＡに対するトランスフェクション試薬の比率が６〜１の範囲内にあることを特徴とする脂質ベースのトランスフェクション試薬の存在下で細胞の懸濁液がトランスフェクションされる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
細胞密度が０．４〜３．０ｘ１０４細胞／１００μｌの範囲内にあることをさらに特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
脂質ベースのトランスフェクション試薬がリポフェクトアミン、ＤＭＲＩＥ−ＣもしくはＥｆｆｅｃｔｅｎｅから選択され、特に４のリポフェクトアミン対ＤＮＡの比率で使用
するリポフェクトアミンである請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はアポトーシススクリーニング方法の分野に関し、そして被験体においてアポトーシスを防ぐ、特に神経変性疾患の場合にアポトーシスを防ぐ能力についての試験化合物のスクリーニングのためのアッセイおよびキットを提供する。該アッセイおよびキットは、ｐ７５ニューロトロフィン受容体もしくはその神経細胞死誘導フラグメントでトランスフェクションされた細胞懸濁液におけるアポトーシスマーカーと細胞死の同時測定が、神経細胞死の防止における化合物の潜在能力を予測するために利用することができ、従って、神経変性疾患の処置において有用であり得るという発見に基づく。本発明は、化合物ライブラリーのハイスループットスクリーニングにおいて特に都合のよい用途を見出す。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＲＦ）ファミリーのメンバー、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）は、成長因子のニューロトロフィンファミリー（脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン−３およびニューロトロフィン−４／５）に同様の親和性で結合する７５ｋＤａの細胞表面受容体糖タンパク質である。それは神経成長因子（ＮＧＦ）に記述された最初の受容体であり、そして高親和性ニューロトロフィン受容体複合体の形成によりチロシンキナーゼ受容体（Ｔｒｋ）シグナル伝達を促進することが示された。ｐ７５ＮＴＲと対照的に、Ｔｒｋ受容体ファミリーは様々な特異性でニューロトロフィンに結合し、細胞生存および突起成長をもたらす。
【０００３】
ｐ７５ＮＴＲシグナル伝達に明確な機能を与えることはまだ議論の余地があるが、ｐ７５ＮＴＲは様々な神経および非神経細胞タイプにおいてカスパーゼに媒介される、すなわちミトコンドリアに媒介されるアポトーシス経路を開始できるという仮説を裏付けるかなりの証拠がある。腫瘍細胞における腫瘍および転移抑制因子としての可能な役割は、ヒト前立腺癌細胞の増殖および神経成長因子に媒介される転移を抑制するｐ７５ＮＴＲの能力において、そしてヒト癌細胞系Ｔ２４の細胞生存、増殖および成長へのｐ７５ＮＴＲ発現の効果において最近示された。神経細胞死誘導因子としてのｐ７５ＮＴＲの役割を裏付ける証拠は、脳由来神経栄養因子および／もしくはＮＧＦでの例えば発生中のニワトリ網膜もしくは培養した交感神経ニューロンおよび固有受容ニューロンのような様々な神経細胞タイプの処置の際の増加した細胞死をｐ７５ＮＴＲ抗体の利用により防止できる実験に基づく。
【０００４】
ｐ７５ＮＴＲは、システインに富む細胞外ドメイン（ｅｘｔｏｄｏｍａｉｎ）およびデスドメインとして知られている細胞質配列の両方において他のＴＮＲＦファミリーメンバーに配列類似性を有する。ｐ７５ＮＴＲにおけるデスドメインの存在にもかかわらず、この領域は細胞死を促進するｐ７５ＮＴＲの能力を媒介しないという蓄積する証拠がある。ＴＮＲＦデスドメインとは異なり、ｐ７５ＮＴＲのデスドメインは他のデスドメイン含有タンパク質と相互作用せず、溶液中で自発的にマルチマー化せず、そして同じように機能しない。実際、デスドメイン配列の欠失はｐ７５ＮＴＲの致死能力に影響がないことが最近示された。デスドメインの代わりに、ｐ７５ＮＴＲの細胞質膜近傍領域は神経細胞死を開始するために必要且つ十分であることが見出されている。この領域は「Ｃｈｏｐｐｅｒ」と命名され、そして脂質アンカーにより原形質膜に結合した場合にのみアポトーシス細胞死を誘導することが示された。
【０００５】
アポトーシスもしくはプログラム細胞死は、胚形成、形態形成および細胞再生中に異なる組織において細胞を除去するための生理学的機序である。アポトーシスは、細胞損傷の
進行したそして不可逆的段階で介入する遺伝的に制御された機序である。従って、アポトーシスは脳卒中、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、癲癇、脊髄損傷（ＳＣＩ）、多発性硬化症（ＭＳ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）および他の神経変性疾患のようなＣＮＳの主要疾患のいくつかで起こる神経細胞死において重要な役割を果たすことが確立している（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００６】
上記のことに加えて、大量のアポトーシスが記録された脳および心臓領域における虚血後のｐ７５ＮＴＲの増加した発現が多数の研究により示される。これらの結果は、ｐ７５ＮＴＲが虚血後アポトーシスによる神経細胞死において重要な役割を果たし得ることを示唆する（非特許文献６）。
【０００７】
ｐ７５ＮＴＲ受容体はまた、プリオンおよびβ−アミロイドペプチドの細胞シグナル伝達相手としても記述され（非特許文献７）、従って、これらの成分の神経毒性作用に関与している。これらの結果は、ｐ７５ＮＴＲがプリオン病、すなわち感染性海綿状脳症（ＴＳＥ）およびアルツハイマー病において認められる神経細胞死において重要な役割を果たすという仮説を裏付ける。
【０００８】
最近の研究は、ミエリン抑制成分、すなわち、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、Ｎｏｇｏおよび乏突起膠細胞−ミエリン糖タンパク質（Ｏｍｇｐ）のシグナル伝達経路におけるコレセプターとしてのｐ７５ＮＴＲ受容体の役割を提供する。これらのタンパク質は全て、軸索に直接隣接する乏突起膠細胞の膜に局在し、そして共通の受容体、Ｎｏｇｏ６６受容体（ＮｇＲ）に結合することにより神経細胞成長を抑制する。ＮｇＲは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーを用いて細胞表面に連結されるが、細胞内シグナル伝達ドメインを欠き、従って、シグナル伝達相手としてｐ７５ＮＴＲを必要とする。ＮｇＲシグナル伝達複合体の破壊は、ＭＡＧの抑制作用を妨げることが見出された。従って、ＮｇＲのコレセプターとして、ｐ７５ＮＴＲは、神経細胞発生（ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ）およびアポトーシスを調節するためだけでなく、ミエリン関連因子により誘導される軸索再生の抑制を調節するためにも中心的存在として現在浮上し、そしてそのようなものとして神経細胞再生を促進するために治療標的を提供する。
【０００９】
ｐ７５ＮＴＲの主要な役割はＣＮＳ関連であるが、いくつかの最近の研究は、アテローム性動脈硬化症により引き起こされる損傷で付随するアポトーシスとともにニューロトロフィンおよびｐ７５ＮＴＲの増加した発現を示す。さらに、ｐ７５ＮＴＲ遺伝子座におけるエキソンＩＩＩの選択的スプライシングに起因するｐ７５ＮＴＲの短いバリアントについて、ｐ７５ＮＴＲの欠如が部分的周産期致死性および血管系の障害を包含する重度の表現型をもたらすことがトランスジェニックマウスにおいて示された。血管形成におけるニューロトロフィンおよびＴｒｋ受容体の関与は以前に示されており；全てのニューロトロフィンはＥ１３以降大動脈の中膜（ｔｕｎｉｃ  ｍｅｄｉａ）の形成において検出される。ＴｒｋＢおよびＴｒｋＣは、ｐ７５ＮＴＲのものと逆の発現パターンで発生中の大動脈において発現され、そして重度の心臓奇形がＮＴ３においてそしてＴｒｋＣ突然変異体マウスにおいて認められている。従って、現在ではｐ７５ＮＴＲを包含するニューロトロフィン受容体は血管の形成において必須であると思われる。これらの結果は全て、例えば、アテローム性動脈硬化症、先天性およびリウマチ性心疾患、ならびに血管炎症のような血管病変におけるｐ７５ＮＴＲの主要な役割を示唆する。
【００１０】
重要な治療標的としてのｐ７５ＮＴＲの認識にもかかわらず、現在のスクリーニング方法は、非特許文献８により記述されているようなｐ７５ＮＴＲ発現細胞の細胞膜調製物および放射性標識されたＮＧＦを用いる競合的結合アッセイにおけるかもしくは非特許文献
９により記述されているようなｐ７５ＮＴＲ発現細胞におけるＮＧＦ誘導性アポトーシスへの試験される化合物の効果を測定することによるｐ７５ＮＴＲのそのリガンドＮＧＦとの相互作用に依存する。いずれの方法も、使用するリガンドにかかわりなくｐ７５ＮＴＲシグナル伝達への試験化合物の効果を調べる可能性を与えない。
【００１１】
ｐ７５ＮＴＲシグナル伝達活性を調節する化合物を同定するための現在のインビトロスクリーニングは、ｐ７５ＮＴＲまたはＮＧＦもしくは白血病抑制因子（ＬＩＦ）での誘導の際にアポトーシス細胞死を誘導する能力を保持するｐ７５ＮＴＲの截頭形態（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｆｏｒｍｓ）をコードするＤＮＡ構築物を用いる、感覚ニューロン、ラットＰＣ１２細胞、２９３Ｔ細胞および野生型シュワン細胞の接着細胞培養物の一時的トランスフェクションに基づく（例えば、非特許文献１０を参照）。
【００１２】
創薬の現在の方法は、一般に、特定の標的に対する所望の活性を有する少数の化合物を同定するために何万もしくは何十万の化合物の生物学的活性を評価すること、すなわち、ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）を伴う。典型的なＨＴＳ関連スクリーニング形態において、アッセイは９６、３８４もしくは１５３６ウェルプレートのようなマルチウェルマイクロプレートにおいて行われ、原料物質の入手可能性を包含する行われるアッセイの設定にある種の制約を加える。ＨＴＳ関連スクリーニングは、好ましくは、再現可能なそして信頼性があるアウトプットで、短いサイクル時間を必要とする、アッセイにおいて試験される化合物の各々について単一測定で室温で行われる。
【００１３】
本発明は、ＨＴＳスクリーニング形態で行うことができそして例えばＨｅｋ２９３Ｔ細胞のような真核細胞に適用可能な特定のトランスフェクション方法に基づくｐ７５ＮＴＲシグナル伝達アッセイの開発を記述する。
【００１４】
【非特許文献１】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献２】Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．２０００
【非特許文献３】Ｌｏｗｒｙ  ｅｔ  ａｌ．２００１
【非特許文献４】Ｓｅｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．１９９９
【非特許文献５】Ｄｏｗｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．１９９９
【非特許文献６】Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，２０００，２０，９０９６−９１０３
【非特許文献７】Ｄｅｌｌａ−Ｂｉａｎｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００１，２７６，３８９２９−３８９３３
【非特許文献８】Ｗｅｓｋａｍｐ，Ｎｅｕｒｏｎ，１９９１，６，６４９−６６３
【非特許文献９】Ｔａｂａｓｓｕｍ，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，２００３，１０５，４７−５２
【非特許文献１０】Ｃｏｕｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２０００，２７５，３０５３７−３０５４５
【発明の開示】
【００１５】
発明の要約
本発明は、
−この方法は、例えばＮＧＦ、ＬＩＦもしくはニュートロフィン（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｎｓ）のようなｐ７５ＮＴＲリガンドでの誘導を必要しないこと、および
−この方法は、マルチウェルマイクロプレートの全体にわたる再現可能なそして均質なトランスフェクション効果を得るために容易なスケールアップおよびバッチ調製を可能にする細胞懸濁液のトランスフェクションによってＨＴＳスクリーニング形態において適用可能であること
を特徴とするｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節する試験化合物能力を同定する方法
を提供する。
【００１６】
従って、ｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節する試験化合物能力を同定する方法を提供することは本発明の第一の態様であり、該方法は：
ｉ．ｐ７５ＮＴＲもしくはその細胞死誘導フラグメントをコードするベクターで真核細胞の懸濁液をトランスフェクションし、
ｉｉ．試験する化合物と該細胞を接触させ、そして
ｉｉｉ．該細胞におけるアポトーシス応答を決定し、ここで、該試験化合物の不在下でのアポトーシス応答と比較した該試験化合物の存在下でのアポトーシス応答の改変は、ｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節する試験化合物の能力の指標である
ことを含んでなる。
【００１７】
本発明のこの方法において、真核細胞の懸濁液はＣＨＯ細胞、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ−５Ｙ細胞、感覚後根神経節ニューロン、シュワン細胞、ヒト黒色腫細胞系Ａ８７５、ラットＰＣ１２細胞およびＨｅｋ２９３Ｔ細胞よりなる群から選択され、特にＨｅｋ２９３Ｔ細胞である。細胞懸濁液は、０．４〜３．０ｘ１０４細胞／１００μｌの細胞密度で用いられる。特に、０．５〜２．０ｘ１０４細胞／１００μｌの範囲において、なおさらに特に０．４〜０．８ｘ１０４細胞／１００μｌの範囲において。本発明のさらなる態様において、該細胞は特に６〜１のトランスフェクション試薬対ＤＮＡの比率で、なおさらに特に５〜３のトランスフェクション試薬対ＤＮＡの比率において、最も特に４の比率で、脂質ベースのトランスフェクション試薬の存在下でトランスフェクションされる。１０ｍｌの最終トランスフェクションミックス当たりで表されるトランスフェクション試薬の量は８．０〜１２．０μｌの範囲において、特に６．０〜１０．０μｌの範囲において、さらに特に１０．０μｌであり、そしてＤＮＡの量は２．０〜３．５μｇの範囲において、特に２．０〜３．０、さらに特に２．５μｌである。
【００１８】
典型的に使用される脂質ベースのトランスフェクション試薬は、例えば、リポフェクトアミン、ＥｆｆｅｃｔｅｎｅおよびＤＭＲＩＥ−Ｃのような市販されている試薬である。以下に例示されるように、好ましい態様において、トランスフェクションは、４のトランスフェクション試薬対ＤＮＡの比率でトランスフェクション試薬としてリポフェクトアミンを用いて５０００細胞／１００μｌの密度でＨｅｋ２９３Ｔ細胞の懸濁液で行われる。
【００１９】
本発明の方法における細胞のアポトーシス応答は、当該技術分野で既知である方法を用いて決定される。特にアネキシンＶもしくは核染色を用いる。好ましい態様において、アポトーシス応答はアネキシン−Ｖ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８およびヘキスト３３３４２を用いて決定される。
【００２０】
上記で使用されるようなｐ７５ＮＴＲ受容体は、ラットｐ７５ＮＴＲ受容体（配列番号２）もしくはその哺乳類オーソログに対応する。上記で使用されるようなｐ７５ＮＴＲ細胞死誘導フラグメントは、ｐ７５  Ｃｈｏｐｐｅｒドメイン（配列番号１０）を含んでなり、そして特にｐ７５＿ＩＣＤ（配列番号４）、ｐ７５＿ＣＤ（配列番号６）もしくはｐ７５＿ＴＮＦ（配列番号８）からなる。
【００２１】
本発明のこのおよびさらなる態様は、以下にさらに詳細に説明される。
【００２２】
詳細な記述
本発明を記述する目的のために：ｐ７５ＮＴＲ受容体は、本明細書において用いる場合、Ｒａｄｅｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９８７，３２５，５９３−５９７において特性化され、そしてＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ受託番号Ｐ０７１７４で入手可能である、
低親和性神経成長因子受容体、Ｇｐ８０−ＬＮＧＦＲ、ｐ７５  ＩＣＤおよびｐ７５ＮＴＲとしても知られている、ラットＮＧＦＲ受容体タンパク質を、ならびに配列番号：２に少なくとも７０％同一である、好ましくは８０％同一である、さらにより好ましくは少なくとも９０％同一である、好ましくは少なくとも９５％同一である、より好ましくは少なくとも９７％同一である、そして最も好ましくは少なくとも９９％同一であるその哺乳類オーソログをさし、特に該哺乳類オーソログは、ヒトｐ７５ＮＴＲ受容体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０８１３８−配列番号：１１）、マウスｐ７５ＮＴＲ受容体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｑ９２０Ｗ１−配列番号：１２）もしくはニワトリｐ７５ＮＴＲ受容体（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１８５１９−配列番号：１３）からなる。
【００２３】
全長ｐ７５ＮＴＲ受容体の代わりに、該受容体の「細胞死誘導フラグメント」を本発明のアッセイにおいて用いることができる。該細胞死誘導フラグメントは、例えばＣｏｕｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５，３０５３７−３０５４５）に記述されているトランケーションされたｐ７５ＮＴＲタンパク質ｓｐｔｃ１５２およびｓｐｔｃ３５のような、細胞においてアポトーシスを誘導する能力を保持するｐ７５ＮＴＲ受容体タンパク質の欠失構築物に対応する。さらなる欠失構築物は；ｐ７５ＮＴＲタンパク質の膜貫通領域および全細胞内ドメインに連結されたｐ７５ＮＴＲシグナルペプチドをコードする、特にラットｐ７５ＮＴＲタンパク質のアミノ酸２４７〜４２５に連結されたアミノ酸１〜３２に対応するアミノ酸（配列番号４）をコードする構築物；ｐ７５ＮＴＲタンパク質の膜貫通領域および細胞内膜近傍領域に連結されたｐ７５ＮＴＲシグナルペプチドをコードする、特にラットｐ７５ＮＴＲタンパク質のアミノ酸２４７〜３０８に連結されたアミノ酸１〜３２に対応するアミノ酸（配列番号６）をコードする構築物；シグナルペプチド、膜貫通領域、および「ｃｈｏｐｐｅｒ」ドメインを欠くがＴＮＦ受容体様デスドメインを含む細胞内ドメインの部分からなるタンパク質をコードする、特にラットｐ７５ＮＴＲタンパク質のアミノ酸２４７〜２７３およびアミノ酸３０３〜４２５に連結されたアミノ酸１〜３２に対応するアミノ酸（配列番号８）をコードする構築物からなる。１つの態様において、ｐ７５ＮＴＲ細胞死誘導フラグメントは、Ｃｈｏｐｐｅｒドメイン（配列番号：１０）、ｐ７５＿ＩＣＤ（配列番号：４）、ｐ７５＿ＣＤ（配列番号：６）もしくはｐ７５＿ＮＴＦ（配列番号：８）と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％もしくは９９％の配列同一性を有するポリペプチドから選択される。本発明の好ましい態様において、上記に使用されるようなｐ７５ＮＴＲ細胞死誘導フラグメントは、ｐ７５  Ｃｈｏｐｐｅｒドメイン（配列番号１０）を含んでなり、そして特にｐ７５＿ＩＣＤ（配列番号４）、ｐ７５＿ＣＤ（配列番号６）もしくはｐ７５＿ＮＴＦ（配列番号８）からなる。
【００２４】
２つもしくはそれ以上の配列の同一性および類似性を比較する方法は、当該技術分野において周知である。従って、例えば、ウィスコンシン配列分析パッケージ、バージョン９．１（Ｄｅｖｒｅｕｘ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１２，３８７−３９５，１９８４）において利用可能なプログラム、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを用いて２つのポリヌクレオチド間の同一性％ならびに２つのペプチドもしくはポリペプチド配列間の同一性％および類似性％を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４７，１９５−１９７，１９８１）の「局所的相同性」アルゴリズムを使用し、そして２つの配列間の類似性の最良単一領域を見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが異なる２つのポリヌクレオチドまたは２つのペプチドもしくはポリペプチド配列を比較するためにより適しており、該プログラムは、短い方の配列が長い方の一部に相当すると仮定する。比較して、ＧＡＰは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８，４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに従って、２つの配列を整列させ、「最大類似性」を見出す。ＧＡＰは、ほぼ同じ長さである配列を比較するためにより適しており、そしてアライメントは全長にわたって予想される。好ましくは、各プログラムにおいて使用さ
れるパラメーター「ギャップ加重」および「長さ加重」は、それぞれ、ポリヌクレオチド配列では５０および３、そしてポリペプチド配列では１２および４である。好ましくは、同一性および類似性％は、比較されている２つの配列が最適に整列される場合に決定される。配列間の同一性および／もしくは類似性を決定する他のプログラムもまた、当該技術分野において既知であり、例えばプログラムのＢＬＡＳＴファミリー（Ａｌｔｓｃｈｕｌ
Ｓ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２，１９９７）。
【００２５】
「化合物」、「試験化合物」、「薬剤」もしくは「候補薬剤」という用語は、本明細書において用いる場合、ｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節するそれらの能力について調べたいと思う例えばペプチド、ポリヌクレオチドもしくは小分子を包含する任意のタイプの分子であることができ、そしてここで、該薬剤は、それを受け取る被験体に治療的利点を提供することができる。候補薬剤は、例えば、経口的もしくは非経口的、例えば静脈内、筋肉内、皮下、眼窩内、嚢内、腹腔内、直腸内、槽内またはそれぞれ例えば皮膚パッチもしくは経皮イオン導入を用いる皮膚を通した受動的もしくは促進吸収によるを包含する様々な経路により個体に投与することができる。さらに、化合物は注入、挿管によりもしくは局所的に投与することができ、これらのうち後者は、例えば軟膏の直接使用により受動的あるか、または例えば鼻腔用スプレーもしくは吸入剤を用いて能動的であることができ、この場合、組成物の１つの成分は適切な推進剤である。化合物の投与の経路は、一つには、化合物の化学構造によって決まる。例えば、ペプチドおよびポリヌクレオチドは消化管において分解され得るので、経口的に投与する場合にそれらは特に有用ではない。しかしながら、ペプチドを化学的に修飾する、例えば、それらを分解されにくくする方法は周知であり、そして例えばＤ−アミノ酸の使用、ペプチド模倣物に基づくドメインの使用、もしくはビニル性ペプトイドのようなペプトイドの使用が包含される。
【００２６】
スクリーニング方法において使用する薬剤は、製薬学的に許容しうる担体において用いることができる。例えば、典型的な担体および薬剤の配合物の製造と併せて用いることができる製薬学的組成物を製造する常法を開示し、そして本明細書に引用することにより組み込まれる、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡによる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、最新版を参照。
【００２７】
細胞
上記にすでに概説したように、本発明はｐ７５ＮＴＲもしくはその死誘導フラグメントをコードするベクターで一時的にトランスフェクションされた細胞の懸濁液を提供する。特に、該ベクターでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５７３）は形質転換された胚性ヒト腎臓細胞に由来し、そして接着増殖特性を有することが既知である（Ｇｒａｈａｍ  Ｆ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．１９７７，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２）。ＨＥＫ２９３細胞は、懸濁して維持する場合に細胞生存能力に影響を及ぼす凝集体を形成する標準的傾向を有する（Ｄａｖｉｄ  Ａ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，１９９９  Ｆｏｃｕｓ  ２１（１）：２２−２４）。結果として、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションは接着細胞上で典型的に行われる。マルチウェルスクリーニング形態において、これは細胞がトランスフェクションの少なくとも１日前に各個々のウェルにおいて平板培養されることを意味する。本発明のトランスフェクションプロトコルを用いて、均質なトランスフェクション混合物をＨＥＫ２９３細胞の懸濁液に加え、そしてこのようにして得られる細胞混合物を個々の細胞に平板培養する。上記のものと比較して、これはサイクル時間だけでなく、ピペッティング工程の数も減らし、そしてそのようなものとしてより均質な再現可能なアッセイ形態を提供する。さらに、本発明の特定のトランスフェクション方法を考えると、ほんの少数の細胞、ＤＮＡおよびトランスフェクション試薬が必要とされ、ウェル当たりのコストをさらに減少す
る。
【００２８】
本発明の方法において使用するベクターは、分子生物学の当該技術分野において日常的に構築され、そしてタンパク質発現を可能にするために、必要である可能性がありそして正しい方向性で位置する、プラスミドＤＮＡならびに適切なイニシエーター、プロモーター、エンハンサーおよび他の要素の使用を伴うことができる。一般に、ポリヌクレオチドを維持するか、増やすかもしくは発現させて宿主においてポリペプチドを生産するために適当な任意の系もしくはベクターを用いることができる。適切なヌクレオチド配列、すなわち、上記に定義されるようなｐ７５ＮＴＲタンパク質もしくはその死誘導フラグメントのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列は、例えばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９７に記載のもののような様々な周知のそして日常的な技術のいずれかにより発現系に挿入することができる。
【００２９】
従って、ｐ７５ＮＴＲもしくはその死誘導フラグメントをコードするベクターを提供することは本発明の目的であり、ここで、該ベクターは配列番号：１（ラットｐ７５ＮＴＲ）、配列番号：３（ｐ７５ＮＴＲ＿ＩＣＤ）、配列番号：５（ｐ７５ＮＴＲ＿ＣＤ）もしくは配列番号：７（ｐ７５ＮＴＲ＿ＴＮＦ）と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、９７％もしくは９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチド配列から選択されるポリヌクレオチド配列を含んでなる。
【００３０】
特定の態様において、本発明のＨＥＫ２９３細胞は、それぞれラットｐ７５ＮＴＲ（配列番号：１）もしくはｐ７５ＮＴＲ＿ＩＣＤ（配列番号：３）、ｐ７５ＮＴＲ＿ＣＤ（配列番号：５）およびｐ７５ＮＴＲ＿ＴＮＦ（配列番号：７）からなるその死誘導フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を含んでなる市販されている発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクションされる。
【００３１】
核酸構築物の製造、突然変異誘発、シークエンシング、細胞へのＤＮＡの導入および遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析に関連するさらなる詳細は、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：第２版，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。
【００３２】
アッセイ
本発明はまた、細胞におけるｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節する化合物能力を同定するアッセイも提供する。
【００３３】
本発明のアッセイは、細胞におけるアポトーシス応答を調節する能力について化合物をスクリーニングする当該技術分野において一般に既知である多数の形態において設計することができる。細胞におけるアポトーシスは、形態学的および生化学的基準に基づいて典型的に決定される。形態学的特徴には、例えば、細胞収縮、細胞質凝縮、クロマチン分離、核凝縮、膜ブレッディング（ｂｌｅｄｄｉｎｇ）および膜結合型アポトーシス小体の形成が包含される。これらの形態学的変化を決定する伝統的な方法には、とりわけ、例えばＤＡＰＩ、ＤＲＡＱ−５、ＳＹＢＲ１４、ヨウ化プロピジウム（ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  ｉｏｄｉｎｅ）、ヘキスト染色のような生体染色色素および核染色液を用いる光学および電子顕微鏡検査が包含される。生化学的変化は、オリゴヌクレオソーム長フラグメントへのヌクレオソーム間ＤＮＡ切断を最終的にもたらす、例えばＭＡＰキナーゼ活性化、カルパイン活性化およびカスパーゼ−３活性化のような、細胞死関連経路の活性化と関連する。一般に用いられる生化学的方法には、ＤＮＡラダー形成、アネキシン結合、ミトコンドリア膜電位喪失を評価することならびに例えばｃ−Ｊｕｎ（ＪＮＫ）のリン酸化、ＰＡＲＰ
切断およびシトクロムＣ放出のような細胞死関連経路の１つもしくはそれ以上における酵素活性を測定することが包含される（Ｂｕｄｄ  Ｒ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．１９９７，Ｃｏｒｏｎ  Ａｒｔｅｒｙ  Ｄｉｓ．８（１０）：５９３−５９７；Ｌｏｏ  Ｄ．Ｔ．ａｎｄ
Ｒｉｌｌｅｍａ  Ｊ．Ｒ．，１９９８，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５７：２５１−２６４）。
【００３４】
本発明のアッセイは、ｐ７５ＮＴＲもしくは該ｐ７５ＮＴＲの細胞死誘導フラグメントでの細胞の懸濁液のトランスフェクションが、該細胞においてアポトーシスを誘導するために培養培地におけるｐ７５ＮＴＲリガンドの存在をもはや必要とせず、従って、細胞においてｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節する化合物の能力を決定する方法を簡素化することを都合よく利用する。
【００３５】
従って、本発明は試験化合物をスクリーニングするためのアッセイを提供し、該アッセイは、ａ）ｐ７５ＮＴＲもしくはその死誘導フラグメントで細胞の懸濁液をトランスフェクションすること；ｂ）試験する化合物と該細胞をインキュベーションすること；およびｃ）該細胞のアポトーシス応答を測定することを含んでなる。
【００３６】
本発明の第一の態様において、細胞の懸濁液はＣＨＯ細胞、ヒト神経芽細胞腫ＳＫ−Ｎ−ＢＥ細胞、ヒト神経芽細胞腫ＳＨ−ＳＹ−５Ｙ細胞、感覚後根神経節ニューロン、シュワン細胞、ヒト黒色腫細胞系Ａ８７５、ラットＰＣ１２細胞およびＨｅｋ２９３Ｔ細胞よりなる群から選択される。該細胞は、当該技術分野で既知であるトランスフェクション方法を用いて、特に例えばリポフェクトアミン、ＥｆｆｅｃｔｅｎｅおよびＤＭＲＩＥ−Ｃのような脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いて本発明のベクター（上記参照）でトランスフェクションされる。
【００３７】
本発明の特定の態様において、細胞の懸濁液は、トランスフェクション試薬としてリポフェクトアミンを用いて本発明のベクターでトランスフェクションされたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からなる。
【００３８】
細胞におけるアポトーシス応答を測定する方法は上記に提供され、そして典型的には例えばヘキスト３３３４２、ＤＡＰＩおよびＤＲＡＱ−５のような核染色液と組み合わせた例えば検出可能に標識されたアネキシンＶのような初期アポトーシスマーカーの使用を含んでなる。検出可能に標識されたアネキシン−Ｖには、例えば市販されている蛍光標識されたアネキシン−Ｖ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ３５０、アネキシン−Ｖ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８、アネキシン−Ｖ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５６８、アネキシン−Ｖ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ５９４、アネキシン−Ｖ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６４７、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣおよび酵素標識されたアネキシン−Ｖ−ビオチン、アネキシン−Ｖ−Ｃｙ５およびアネキシン−Ｖ−Ｃｙ５．５のような放射性標識された、蛍光標識されたおよび酵素標識されたアネキシンＶが包含される。
【００３９】
本発明の別の態様において、細胞のアポトーシス応答は、アポトーシス細胞の割合を決定するためのアネキシン結合と細胞の総数を決定するためのヘキスト染色の組み合わせを用いて決定される。特定の態様において、アポトーシス応答はヘキスト３３３４２およびアネキシン−Ｖ−Ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ４８８を用いて決定される。
【００４０】
処置の方法
本発明の方法を用いて同定される化合物の好ましい用途は、例えばアテローム性動脈硬化症、先天性およびリウマチ性心疾患、ならびに血管炎症のような血管病変の処置において、そして神経細胞発達および神経細胞アポトーシスと関連する病変の処置においてである。後者には、脳卒中、パーキンソン病、ハンチントン病、アルツハイマー病、ＡＬＳ、
ＳＣＩ、ＭＳ、ＭＮＤおよびプリオン病、すなわちＴＳＥのようなＣＮＳにおける主要疾患が包含される。
【００４１】
本発明の方法を用いて同定される化合物の別の好ましい用途は、鎮痛効果のような他の治療効果の生成においてである。本発明の方法を用いて同定される化合物は、好ましくは、そのような処置を必要とする患者においてこれらの効果の１つもしくはそれ以上をもたらすために用いられる。
【００４２】
そのような処置を必要とする患者は、標準的な医学的技術により同定することができる。例えば、鎮痛活性の生成は、以下のもの：糖尿病および多発性硬化症で起こるような末梢神経障害；脊髄損傷で見られるもののような中心性疼痛；痛覚過敏；癌性疼痛ならびに異痛を包含する急性および慢性疼痛の臨床症状を患っている患者を処置するために用いることができる。
【００４３】
患者を処置する方法において、ｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスをインビトロで調節する化合物の治療的に有効な量を患者に投与する。特に、ヒトを包含する温血動物への本発明の化合物の有効量の全身もしくは局所投与。典型的に、化合物はアロステリックモジュレーターとしてまたはｐ７５結合部位活性化のアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用することによりｐ７５ＮＴＲ受容体活性を調節する。好ましくは、患者は神経学的疾患もしくは障害を患い、好ましくは、化合物は生理学的活性への効果を有する。そのような生理学的活性は、痙攣、神経保護、神経細胞死、神経細胞発達、心臓活動の中枢制御、覚醒、運動の制御および前庭動眼反射の制御であることができる。
【００４４】
ｐ７５ＮＴＲ誘導性アポトーシスを調節することにより処置することができる疾患もしくは障害には、以下のタイプの１つもしくはそれ以上が包含される：（１）異常なｐ７５ＮＴＲ発現（例えば、種類（突然変異体）もしくは大きさが異なる）を特徴とするもの；（２）ｐ７５ＮＴＲ受容体を活性化する細胞外もしくは細胞内メッセンジャーの異常な量を特徴とするもの；（３）ｐ７５ＮＴＲ受容体活性によりそれ自体が改善されることができる細胞内もしくは細胞外メッセンジャーの異常な効果（例えば、種類もしくは大きさの異なる効果）を特徴とするもの；および（４）ｐ７５ＮＴＲ受容体活性の調節が有益な効果を及ぼす他の疾患もしくは障害、例えば、ｐ７５ＮＴＲ活性により刺激される細胞内もしくは細胞外メッセンジャーの生成が異なるメッセンジャーの異常な量を補う疾患もしくは障害において。
【００４５】
化合物および方法はまた、鎮痛効果、認知増進効果および筋弛緩効果のような他の効果をもたらすために用いることもできる。
【００４６】
「患者」は、ｐ７５ＮＴＲ受容体活性の調節が有益な効果を有する哺乳類をさす。ｐ７５ＮＴＲ受容体活性の調節を伴う処置を必要とする患者は、医療従事者に既知である標準的な技術を用いて同定することができる。好ましくは、患者は以下のもの：（１）異常なｐ７５ＮＴＲ発現（例えば、種類（突然変異体）もしくは大きさの異なる）を特徴とするもの；（２）ｐ７５ＮＴＲ受容体を活性化する細胞外もしくは細胞内メッセンジャーの異常な量を特徴とするもの；（３）ｐ７５ＮＴＲ受容体活性によりそれ自体が改善されることができる細胞内もしくは細胞外メッセンジャーの異常な効果（例えば、種類もしくは大きさの異なる効果）を特徴とするものの１つもしくはそれ以上を特徴とする疾患もしくは障害を患っているヒトである。
【００４７】
「治療的に有効な量」は、患者における疾患もしくは障害の１つもしくはそれ以上の症状をある程度軽減するか；または疾患と関連するかもしくはその原因となる１つもしくはそれ以上の生理学的もしくは生化学的パラメーターを部分的にもしくは完全に正常に戻す
薬剤の量を意味する。
【００４８】
より一般的に、本発明は、代謝型グルタミン酸受容体においてグルタミン酸塩の１つもしくはそれ以上の効果を模倣するかもしくは代謝型グルタミン酸受容体においてグルタミン酸塩の１つもしくはそれ以上の効果を阻止するために十分な代謝型グルタミン酸受容体調節分子の量を代謝型グルタミン酸受容体を有する細胞に与えることにより代謝型グルタミン酸受容体活性を調節する方法を提供する。該方法はインビトロもしくはインビボで実施することができる。
【００４９】
そのような薬剤は、製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤と一緒に薬剤を含んでなる組成物に調合することができる。薬剤はエステルまたは塩、例えば酸付加塩もしくは塩基性金属塩、またはＮもしくはＳオキシドのような生理学的に機能性の誘導体の形態であることができる。組成物は、任意の適当な投与経路および手段用に調合することができる。製薬学的に許容しうる担体もしくは希釈剤には、経口、直腸、鼻腔内、吸入可能、局所（口腔および舌下を包含する）、膣内もしくは非経口（皮下、筋肉内、静脈内、皮内、髄腔内および硬膜外を包含する）投与に適当な製剤において用いられるものが包含される。担体もしくは希釈剤の選択は、もちろん、薬剤およびその治療目的に依存し得る、提示される投与経路によって決まる。製剤は、単位投与形態物において都合よく与えることができ、そして薬学の当該技術分野において周知である方法のいずれかにより製造することができる。そのような方法は、１つもしくはそれ以上の副成分を成す担体と有効成分を会合させる段階を含む。一般に、製剤は、液状担体もしくは細かく分割された固形担体もしくは両方と有効成分を均一にそして密接に会合させ、そして次に必要に応じて生成物を成形することにより製造される。
【００５０】
固形組成物では、通常の無毒の固形担体には、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、グルコース、ショ糖、炭酸マグネシウムなどが包含され、用いることができる。上記に定義されるような活性化合物は、担体として例えばポリアルキレングリコール、アセチル化トリグリセリドなどを用いて座薬として調合することができる。液状の製薬学的に投与可能な組成物は、例えば、上記に定義するような活性化合物および任意の製薬学的添加剤を例えば水、食塩水、水性デキストロース、グリセロール、エタノールなどのような担体に溶解、分散などしてそれにより溶液もしくは懸濁液を生成せしめることにより製造することができる。所望に応じて、投与する製薬学的組成物はまた、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエートなどのような微量の無毒の補助剤を含有することもできる。そのような投与形態物を製造する実際の方法は、当業者に既知であるかもしくは明らかである；例えば、Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９０を参照。
【００５１】
投与する組成物もしくは製剤は、いずれにしても、処置する被験体の症状を軽減するために有効な量の活性化合物（１つもしくは複数）の量を含有する。
【００５２】
０．２５〜９５％の範囲の有効成分を含有し、残りは無毒の担体からなる投与形態物もしくは組成物を製造することができる。
【００５３】
経口投与には、製薬学的に許容しうる無毒の組成物は、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、セルロース、セルロース誘導体、クロスカルメロースナトリウム、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、グルコース、ショ糖
、炭酸マグネシウムなどのような通常用いられる賦形剤のいずれかの導入により形成される。そのような組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、持続放出製剤などの形態をとる。そのような組成物は１％〜９５％、より好ましくは２〜５０％、最も好ましくは５〜８％の有効成分を含有することができる。
【００５４】
非経口投与は、一般に、皮下、筋肉内もしくは静脈内のいずれかでの注入を特徴とする。注入物質は、液状溶液もしくは懸濁液、注入の前の液体における溶解もしくは懸濁に適当な固形形態として、またはエマルジョンとして、通常の形態で製造することができる。適当な賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどである。さらに、所望に応じて、投与する製薬学的組成物はまた、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノールアミンオレエート、トリエタノールアミン酢酸ナトリウムなどのような微量の無毒の補助剤を含有することもできる。
【００５５】
そのような非経口組成物に含有される活性化合物のパーセンテージは、その特定の性質、ならびに化合物の活性および被験体の必要性に非常に依存する。しかしながら、溶液中０．１％〜１０％の有効成分のパーセンテージを用いることができ、そして組成物が上記のパーセンテージに後で希釈される固体である場合にはより高い。好ましくは、組成物は溶液中０．２〜２％の有効成分を含んでなる。
【００５６】
本記述の全体にわたって、「標準的な方法」、「標準的なプロトコル」および「標準的な方法」という用語は、分子生物学技術との関連で用いる場合、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，編集者Ｆ．Ａｕｓｕｂｅｌ
ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．１９９４、もしくはＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  １９８９のような通常の実験室マニュアルに見出されるプロトコルおよび方法と理解されるべきである。
【００５７】
本発明は、以下の実験の詳細を参照することでよりよく理解されるが、当業者は、これらがその後に続く請求項においてさらに十分に記述されるような本発明を例証するだけであることを容易に理解する。さらに、本願の全体にわたって、様々な公開が引用される。これらの公開の開示は、本発明が関係する最先端技術をさらに十分に記述するために本願に引用することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００５８】
実験
材料および方法
【００５９】
ｐ７５（ＮＴＲ）構築物
ＥＭＢＬ受託番号Ｘ０５１３７に従って、野生型ラットｐ７５（ＮＴＲ）ｃＤＮＡ配列（配列番号１）を含有するｐＣＤＮＡ３構築物（ｐ７５＿ＦＬ）は、Ｃａｒｌｏｓ  Ｉｂａｎｅｚによって親切に提供された。以前に記述された、ｐ７５（ＮＴＲ）受容体のトランケーション形態（Ｃｏｕｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）をコードする２つの欠失構築物は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により作製した。両方の欠失構築物：ｐ７５＿Ｉｎｔｒａ−Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｏｍａｉｎ（ｐ７５＿ＩＣＤ）（配列番号３）およびｐ７５  Ｃｈｏｐｐｅｒ  Ｄｏｍａｉｎ（ｐ７５＿ＣＤ）（配列番号５）は、導入された５’ＥｃｏＲＩおよび３’ＡｐａＩ制限部位を用いてｐＣＤＮＡ３ベクターのマルチクローニング部位にＰＣＲ生成物をクローン化することにより作製した。ｐ７５＿ＦＬ構築
物に存在する１１４核酸５’非翻訳領域（ＵＴＲ）および１６３核酸３’ＵＴＲは、欠失構築物において維持された。
【００６０】
ｐ７５＿ＩＣＤ  ＤＮＡ構築物は、ラットｐ７５（ＮＴＲ）タンパク質のアミノ酸２４７〜４２５に連結されたアミノ酸１〜３２をコードする。従って、シグナルペプチド、膜貫通領域および全細胞内ドメインを含む。ｐ７５＿ＣＤ  ＤＮＡ構築物は、アミノ酸２４７〜３０８に連結されたアミノ酸１〜３２をコードする。従って、シグナルペプチド、膜貫通領域および「ｃｈｏｐｐｅｒ」デスドメインと呼ばれる細胞内膜近傍領域を含む。ｐ７５＿ＮＴＦ  ＤＮＡ構築物は、ラットｐ７５（ＮＴＲ）タンパク質のアミノ酸２４７〜２７３およびアミノ酸３０３〜４２５に連結されたアミノ酸１〜３２からなるポリペプチドをコードする。従って、シグナルペプチド、膜貫通領域、およびＣｈｏｐｐｅｒドメインを欠くがＴＮＦ受容体様デスドメインを包含する細胞内ドメインの部分を含む。シグナルペプチドと膜貫通領域との間に、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質（ＨＡ）エピトープタグを挿入した。
【００６１】
アッセイ
全ての細胞培養およびインキュベーション工程は、他に示されない限り、３７℃および５％ＣＯ２で１０％もしくは３％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）のいずれかを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）において行った。
【００６２】
準備：１日目に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６０，０００細胞／ｃｍ２の密度でｐ１７５ｃｍ２培養フラスコにおいて接種し、そして４０〜７０％の飽和密度に達するまで一晩培養したままにした（ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）。
【００６３】
トランスフェクション：２日目に、一晩培養したＨＥＫ２９３Ｔ細胞を９６ウェルプレートに移し（各ウェルは、１００μｌの培地（ＤＭＥＭ＋３％ＦＢＳ）中に５０００細胞を含有する）、そしてこのアッセイ用に開発された方法を用いて、４８時間トランスフェクションした。簡潔に言えば：
再現性を保証するために、十分なトランスフェクションミックスを少なくとも２５０ウェル用に調製した。より多数のウェルが必要とされた場合、容量および量を比例的にスケールアップした。
【００６４】
２５０ウェル用のトランスフェクションミックスは、以下のように調製した：
血清なしにＤＭＥＭを含有するチューブに、６．２５μｇの適切なＤＮＡ構築物を１２５０μｌの最終容量に加え、ボルテックスした。血清なしに１２２５μｌのＤＭＥＭを含有する第二のチューブに、２５μｌのリポフェクトアミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を加え、ボルテックスした。室温（ＲＴ）で５分のインキュベーション期間の後に、２つのチューブの中身を合わせ、穏やかに混合し、そしてＲＴでさらに２０分間インキュベーションした。
【００６５】
その間に２ｍｌの０．００５％トリプシン、０．０４％ＥＤＴＡ溶液を用いてｐ１７５ｃｍ２培養フラスコからＨＥＫ２９３Ｔ細胞を取り除き、続いて８ｍｌの培地（ＤＭＥＭ＋３％ＦＢＳ）でトリプシン中和した。Ｃｏｕｌｔｅｒカウンターを用いて細胞濃度を決定し、そして培地（ＤＭＥＭ＋３％ＦＢＳ）で５５，０００細胞／ｍｌに調整した。２０分のインキュベーション期間の最後に、ＤＮＡ／リポフェクトアミン２０００ミックスを２２．５ｍｌの細胞懸濁液と合わせることにより２５ｍｌのトランスフェクション懸濁液を調製した。穏やかであるが完全な混合の後に、１００μｌのトランスフェクション懸濁液をポリ−Ｌ−リシン被覆９６ウェルプレートの適切なウェルにすぐに移した。最終的に、各プレートは、空のｐＣＤＮＡ３ベクター（模擬トランスフェクション、陰性コントロ
ール）、ｐＣＤＮＡ３＿ＩＣＤ、ｐｃＤＮＡ３＿ＴＮＦおよび／もしくはｐＣＤＮＡ３＿ＣＤ  ＤＮＡ構築物でトランスフェクションされた細胞を保持する、別個のウェルを含有する。
【００６６】
プレートを測定の前に４８時間インキュベーションした。
【００６７】
化合物の添加：
上記のＤＮＡ発現構築物により誘導されるアポトーシスへの多数の小分子の影響を決定するために、トランスフェクションの開始後６時間で、９６ウェルプレートの適切なウェルに加えた。化合物は、培地（ＤＭＥＭ＋３％ＦＢＳ＋１％ＤＭＳＯ）における１０倍ストック溶液として加え、ウェル当たり１１０μｌの培地の最終容量および約０．１％のＤＭＳＯ濃度をもたらした。化合物添加なしのウェルを同じ容量およびＤＭＳＯ濃度に調整した。
【００６８】
検出：
検出の１時間前に、アネキシン−Ｖ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８コンジュゲート（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｐｒｏｂｅｓ）およびヘキスト３３３４２（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
ｐｒｏｂｅｓ）をそれぞれ５０倍の最終希釈および６．７μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに加えた。続いて、プレートをさらに１時間インキュベーションした。
【００６９】
総細胞数（ヘキスト陽性）、アポトーシス＋壊死細胞数および蛍光強度（アネキシンＶ陽性）の定量は、ＭＩＡＳ−１もしくはＭＩＡＳ−２細胞イメージングプラットフォーム（Ｕｎｉｏｎ  Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃａ）上で９６ウェルプレートを分析することにより行われた。
【００７０】
Ｃｏｕｌｓｏｎ  Ｅ．Ｊ．，ＪＢＳ“Ｃｈｏｐｐｅｒ，ａ  ｎｅｗ  ｄｅａｔｈ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｐ７５  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈａｔ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ”，２０００，２７５（９），３０５３７−３０５４５．
【図面の簡単な説明】
【００７１】
【図１】ラットｐ７５ＮＴＲ構築物（配列番号：１）でトランスフェクションされたＨｅｋ２９３細胞のアポトーシス応答への試験化合物の用量反応曲線。誘導される毒性はアネキシンＶ染色により定量され、そしてｐ７５＿ＦＬの相対的毒性を１００％として、ｐ７５ＮＴＲ誘導毒性とコントロール（模擬）との間の相対的差として表される。アッセイは、アネキシンＶ−Ａｌｅｘａ−４８８陽性細胞のパーセンテージとしての定量、ヘキスト３３３４２による対比染色で３８４ウェルプレート形態で行われた。
【図２】ラットｐ７５ＮＴＲｃｈｏｐｐｅｒ構築物（配列番号：５）でトランスフェクションされたＨｅｋ２９３細胞のアポトーシス応答への試験化合物の用量反応曲線。誘導される毒性はアネキシンＶ染色により定量され、そしてｐ７５＿ＣＤの相対的毒性を１００％として、ｐ７５ＮＴＲ誘導毒性とコントロール（模擬）との間の相対的差として表される。アッセイは、平均アネキシンＶ−Ａｌｅｘａ−４８８蛍光強度としての定量、ヘキスト３３３４２による対比染色で９６ウェルプレート形態で行われた。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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