(57)【要約】本発明は、サンプル流体中の分析物の濃度を検出するためのアッセイを行うためのアッセイデバイスを作製する方法を提供する。このアッセイデバイスは、代表的に、一組の部位特異的な固定化された較正スポットアレイを有する実質的に平板の表面を有し、このスポットアレイはこのアレイ上にプリントされた所定の量の分析物を含む。さらに、一組の部位特異的な固定化された試験スポットアレイは、分析物タンパク質に結合するために捕捉抗体を備え、このアッセイデバイス上にプリントされる。この方法は、最初に平板な表面を改変して疎水性結合部位、親水性結合部位および共有結合部位を提供する工程を、包含する。次いでこの方法は、実質的に平板な表面上の部位特異的な固定化された一連の較正スポットアレイおよび一連の部位特的な固定化された試験スポットアレイをプリントする工程を必要とする。
2008506955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル流体中の分析物の濃度を検出するアッセイを行うためのアッセイデバイスを作製する方法であって、該アッセイデバイスは表面を有し、該表面は、該表面上にプリントされた所定の量の分析物を含む部位特異的な固定化較正ドット、および該分析物を結合するための捕捉抗体を含む試験ドットを有し、該方法は、以下：
・該表面を改変して疎水性結合部位、親水性結合部位、および共有結合部位を提供する、工程；
・該試験スポットおよび該較正ドットを該表面上にプリントする工程；
・該試験サンプル流体を該アッセイデバイスに適用する工程；
・該アッセイの感度を試験する工程；ならびに
・該疎水性結合部位  対  該親水性結合部位  対  該共有部位の比を調節して、該アッセイの感度を最適化する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記表面が実質的に平面である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
請求項２に記載の方法であって、前記表面が前記サンプルを受容するための充填部分、および該充填部分がら該サンプルを受容するための読み取り部分を備え、前記較正ドットおよび前記試験ドットが該読み取り部分にプリントされている、方法。
【請求項４】
前記試験スポットおよび前記較正スポットが一定の相対湿度の条件下でプリントされる、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記試験ドットおよび前記較正ドットの厚みが、およそ吸収体の単分子層の厚みである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記一定の相対湿度は１５％〜９０％の範囲にある、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記疎水性結合部位の電荷  対  前記親水性結合部位の電荷  対  前記共有結合部位の電荷の比が、マーカー抗体の最適な接着および機能を維持しながら、最適な結合で、分析物の最適結合比の吸着を確実にする相対範囲にある、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗体−分析物結合を阻害する抗体構造の構造的空間的再整列を引き起こすことなく、捕捉抗体の最適な吸着を確実にするための、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記部位特異的な固定化スポットが分子スペーサーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記部位特異的な固定化ドットが均一に分散した分析物を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
前記部位特異的な固定化ドットは、ステアリン酸の障害が最小化された、均一に分散した分析物を示す、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記部位特異的な固定化ドットが、結合体分析物凝集物および複合体−結合体分析物凝集物の最適な結合を得るために最適化された界面調節性の緩衝剤を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記表面が、アミノ官能基、チオール官能基およびヒドロキシル官能基を介した、ＤＮＡの結合のための基材、タンパク質の結合のための基材、糖タンパク質の結合のための基材、リポポリサッカライドの結合のための基材、ペプチドの結合のための基材、薬物の結合のための基材、レクチンの結合のための基材、ならびに他の分子の結合のための基材を備え、該基がエポキシシランで活性化される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記表面が、アミノ官能基、チオール官能基およびヒドロキシル官能基を介した、ＤＮＡ、タンパク質、糖タンパク質、リポポリサッカライド、ペプチド、薬物、レクチン、ならびに他の分子の結合のためのエポキシシラン活性化ガラスを備える、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記アッセイデバイスが複数の固定化勾配試験ドットアレイおよび較正ドットアレイを備える、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
請求項１５に記載の方法であって、
第一サンプルおよび第二サンプルをアッセイデバイスに導入する工程、および
前記部位特異的固定化ドットアレイと該第二サンプルとを接触させる工程であって、該第二サンプルが特定の基質を含む、工程、
をさらに包含する、方法。
【請求項１７】
前記アッセイデバイスが、該デバイスにおける試験流体の適切かつ制御された流動を確実にするように最適な流体接触角度に対して構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記アッセイデバイスは、分析物の構造の構造的かつ空間的再配置が抗体−分析物の結合を阻害することを引き起こさないように、分析物の最適な吸着を確実にするように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記アッセイデバイスは複数のサンプル区画を備え、該サンプル区画はインテグラル構造を備え、該区画の各々が、該区画にプリントされた複数の固定化勾配試験ドットアレイおよび較正ドットアレイを備える、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、試験サンプル中の分析物の存在を検出しその量を測定するために、その試験サンプル中の抗体の存在を検出するため、および内部標準／較正曲線をアルゴリズムにより作製するための、アッセイデバイスおよびそのための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
免疫診断アッセイのための分析方法は、アッセイが完了する場合に不完全なアッセイ技術から生じる誤差を測定するための技術を包含する。例えば、アッセイ感度の測定は、古典的な統計学的な分析による感度を特徴とし、低濃度サンプルを反復して測定し、サンプルの結果が０とは統計学的に異なっていないことを確認することに基づく。課せられる標準誤差が実際の測定数の数の平方根に反比例する場合、この方法は、本来のアッセイ感度を実際には測定しない。
【０００３】
当該分野で公知であるように、アッセイ感度は検出下限または最小の濃度の変化であり、ここで０標準が数回測定され、そして感度限界はＭ（平均）からの２〜３のＤ（標準偏差）に等しくする濃度になる。しかしながら、精度は、単一かつ均一な容量のマトリクスの複数のアリコートにおける分析物の個々の測定の最も近いものとして当該分野で公知であり、この精度は大規模によって不正確になり得る。導かれる外部較正曲線について同時に適合させることは、真なる値の用量応答曲線を作成しない。この結果は、実際のアッセイ感度において考慮すべき誤差を導き得る。
【０００４】
分析物の真なる濃度に関する方法によって得られる、平均試験結果の最も近いものとして当該分野で公知である正確さを測定するため、正確さは、測定される平均値がその真なる値にどのくらい近いのかを定義するために使用される。測定の差異は、正確さの偏りまたは程度として公知である。偏りは、アッセイの範囲にわたって変動し得る。この真なる値を測定するための方法が開発される必要があることは、当該分野で公知である。
【０００５】
アッセイの再現性または正確さは（分析物のアッセイにおいて、この手順が単一の均一な容量のマトリクスのうちの複数のアリコートに反復して適用される場合の個々の分析物の測定の正確さ、または見積もられる誤差として定義される）は、変動率係数（％ＣＶ）として当該分野で公知である。自動化アッセイ分析機器において、サンプルの濃度、温度、加熱作用および端作用、粒子の不完全な懸濁および固相沈着物により影響され得る。正確さの作用はまた、画分の分離およびエラーの集計から生じる。光学系において、エラーは、濁度、蛍光物質の存在、ランプおよび検出器の劣化、ならびに経時的な試薬の劣化に起因の作用する。これらの要因は、一般的に、シグナル対ノイズ比の有意な低下を導く。機器操作上のエラーは、貧弱なピペッティングおよび装置の乏しい準備期間から生じ得る。
【０００６】
従って、任意の分析方法の正確さについての評価は、規定コントロール溶液または標準コントロール溶液を使用して基底の較正標準を作成することによる、既知かつ適切な濃度において得られる変動性の測定を必要とする。このような標準物質の正確な決定は、所定の間隔での系列希釈における既知濃度の測定に基づき、次いでこの間隔に内挿される。市販の参照溶液または参照標準、および社内で調製した参照溶液または参照標準が利用可能であるが、しばしば標準、外部またはプールされたマトリクスを用いて較正され、これらは実際の患者試験サンプルからかなり変動し得る。これらのエラーを克服するための部分的な解決は、アッセイの正確なプロフィールまたは較正を得るため、広範な濃度に対する正確さをプロットすることである。
【０００７】
交差反応性、アッセイ特異性、偏向が生じる障害、抗原、抗体、抗原結合部位の変更、低用量（競合アッセイ）および高用量（サンドイッチアッセイ）、フック効果、ヘテロフィル抗体の障害、内在性障害性自己抗体、補体、リューマチ因子、固相抗体結合における障害、内在性シグナル生成物質、酵素インヒビター、触媒および補因子もまた、アッセイにおいて同時に見られる作用を表すことを示されており、自動化免疫アッセイ装置およびサンプラーにおけるサンプルの交差反応性、マトリクス効果およびキャリーオーバーが挙げられる。
【０００８】
診断適用に関して、品質管理サンプルは、患者における現実的な医療濃度を反映しなくてもよいし、現在の分析物のスペクトルを反映しなくてもよいし、そして患者サンプルの内容をもはや反映しないサンプルマトリックスとは干渉しなくてもよい。品質管理サンプルは、矛盾した濃度間隔において効力を測定してもよく、これは医療的決定の重要点を反映しなくてもよい。
【０００９】
出願人らは、サンプル中の分析物の存在の迅速な検出を提供するマイクロアレイを開発した。これらは、「Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  Ｒａｐｉｄ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍａｃｒｏ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏ  Ｍａｔｒｉｃｅｓ」という表題の米国特許出願第１０／８５６，７８５号（２００４年５月２８日出願）（これは本明細書により参考として援用される）に記載される。これらのアッセイは、サンプル中の分析物濃度の迅速な定量的かつ定性的な測定を可能にする。分析物は、検出可能なマーカーと結合体化された一次抗体により標識化される。代表的なアッセイデバイスは、充填部分と読み取り部分との間にチャンバを規定し、サンプルの液体部分は充填部分から読み取り部分へと毛管作用によって移動する。試験ドットの部位特異的な固定化されたアレイは、読み取り部分にプリントされる。この試験スポットは、そのアッセイデバイスの表面に結合され、分析物に結合し分析物を標識化するよう適合された二次抗体を含む。このアッセイデバイスはまた、較正ドットの部位特異的な固定化されたアレイを有し、このアレイは、検出可能なマーカーにより標識化された過剰量の一次抗体との反応に対して、所定の量の結合した分析物を含む。一旦、結合体化された分析物が試験ドットに結合されると、この試験ドットにおける分析物の測定は、試験ドット標識強度と較正ドットの標識強度との比較、および適切な較正曲線から分析物濃度を読み取ることにより、決定され得る。
【００１０】
免疫アッセイは、一般的に、抗体の吸着部位に対する抗原の数によって生じるシグナルの直接的な検出および測定に絶対的に依存する。非競合アッセイは、標識された二次抗体を使用することによってこれらの吸着部位を同定し、一方で競合アッセイは占有されていない吸着部位を測定する。免疫アッセイは抗体濃度、容量および親和性定数の関数であるので、これらの値が一定に保たれる場合にのみ、比較的正確な測定を得ることが可能である。サンプル中の実際の分析物の量は、依然として測定される必要がある。分析物濃度は、内部標準としての予め較正された濃度の部位特異的な固定化アレイに対する比較によって測定される。
【００１１】
予め較正された外部参照標準濃度を使用して較正曲線を作成する場合、これらの線は、試験サンプル中に存在すると考えられる分析物濃度へと、内挿された検出シグナルを転換する場合のエラーの一貫した供給源を提供する。分析物の測定に対する抗体のさらなるエラーは、抗原または抗体のいずれかが吸着される固体支持体または基材の使用により導入され得る。基材上の結合電荷を増強することは外部参照のエラーをさらに増すが、周囲の分析物のアッセイは均等に歪められる。
【００１２】
固体支持体表面への吸着は疎水性結合力の追加により増加するが、表面の改変を増強することは、タンパク質分析物の構造変化および抗体の構造変化に複合体形成を大きく変更させ得る。複合体形成の変更を導く構造変化は、標識  対  濃度比を決定するための検出器によって測定されるシグナル量に対して、直接的な作用（例えば、フォトン計数エラー）を有する。
【００１３】
従って、特定の条件下で作製された分析物に関する流体を試験する場合、部位特異的な固定されたアレイの診断値を最適化するための方法についての必要性が存在する。１ｍｌあたりフェムトモル〜ナノモルの分析物濃度の動的検出範囲を有する免疫アッセイの感度を向上させるため、固体支持体に対する、安全な、反復性のある、定量化可能な、再現性のある、調節性の、かつ信頼性のある、異常を有さない取り付けを有するデバイスについての必要性が存在する。調節された基材表面の改変は、ＦＤＡ（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のような管理機関により要求される、信頼性ある動的内部較正を強化する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、試験部位特異的な固定化アレイについての方法に関し、このアレイは、分析物に結合するための捕捉抗体、および較正部位特異的な固定化アレイを有し、アッセイデバイスの共通表面上にプリントされた既知濃度の分析物を含む。本アッセイデバイスは、好ましくは、必要な分子種およびそれらの凝集物を表面に対して、調節されかつ部位特異的な定量可能な結合を可能にするように改変された表面である。デバイスのアッセイ基材表面上の疎水性結合部位、親水性結合部位、および共有結合部位  対  結合部位の比率は、アッセイ特異的基盤上でアッセイの感度を最適化するために調節される。表面エネルギーの調節を多重化は、アッセイの対、すなわち抗原／抗体基盤に対して行われる。
【００１５】
免疫診断デバイスは、固体支持体を有し、この固体支持体の表面は、親水性力と疎水性力との相殺の調節およびこれによる最適化を可能にするように改変されている。この改変は、分析物のタンパク質および抗体の最適な吸着を可能にする。直径５マイクロメートル〜５００マイクロメートル（好ましくは直径５０マイクロメートル〜１２５マイクロメートル）の診断ドットを有する部位特異的な固定化アレイのプリントは、また、相対湿度の関数である。驚くべきことに、部位特異的な固定化アレイの既知濃度の分析物のプリントによる試験の内部較正は、抗体−検出可能なマーカーの余剰複合体の使用による、比例的な測定の決定を可能にする。本方法は、より正確な診断試験結果を得るために、最適な構成を確立するためのパラメータのこの組み合わせに関する。
【００１６】
本発明の１局面に従い、サンプル流体中の分析物濃度を検出するアッセイを行うためのアッセイデバイスを作製する方法が提供され、このアッセイデバイスは表面を有し、この表面は、その表面上にプリントされた所定の量の分析物を含む部位特異的な固定化較正ドット、および該分析物を結合するための捕捉抗体を含む試験ドットを有し、この方法は、以下の工程：
・その表面を改変して疎水性結合部位、親水性結合部位、および共有結合部位を提供する、工程；
・その試験スポットおよび該較正ドットを該表面上にプリントする工程；
・その試験サンプル流体を該アッセイデバイスに適用する工程；
・そのアッセイの感度を試験する工程；ならびに
・疎水性結合部位  対  親水性結合部位  対  共有結合部位の比を調節して、アッセイ感度を最適化する工程、
を包含する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明の方法は、好ましくは、較正ドットの部位特異的固定化アレイおよびアッセイデバイスにプリントされた試験ドットの部位特異的固定化アレイを有するアッセイデバイスに関連して実施される。好ましいアッセイデバイスは、図１に示される。このアッセイデバイスは、実質的に、平面１６を有する。実質的に、平面１６は、そこにプリントされた少なくとも１つおよび好ましくは少なくとも３つの試験捕捉２０および読み取り領域にプリントされた較正部位特異的固定化アレイ２２を有する。より好ましくは、分析物の存在を検出するための試験スポットの複数の部位特異的固定化アレイは、読み取り領域１６にプリントされる。部位特異的固定化アレイ試験スポット２０は、好ましくは、タンパク質分析物に特異的に結合される結合された抗体を含む。この結合された抗体は、好ましくは、隣接する抗原複合体からステアリン酸の障害がない試験抗原に結合するために利用可能な各々の結合された抗体を作製するように離れている。好ましくは、非反応タンパク質は、部位特異的固定化アレイ試験ドットの各々において結合された抗体を分離する。
【００１８】
読み取り領域１６は、そこにプリントされた較正ドット２２の部位特異的固定化アレイを有する。この較正ドットは、検出可能マーカーに結合される容器からの未反応試薬と反応するための所定量の上記分析物を含む。較正スポットの部位特異的固定化アレイは、標識の強度を、存在する抗原の量と相関させることを可能にする。次いで、試験スポットの部位特異的固定化アレイにおける標識の強度は、試験サンプル容積に存在する抗原の量を誘導するために使用される。
【００１９】
アッセイ固定化基材は、シリコン、ガラスおよびポリマー材料を含む、表面改変を可能にする材料から選択され得るが、好ましい実施形態において、プラスティック支持基材（例えば、ポリスチレンおよびポリプロピレン）から作製される。ポリマー表面は、容易に改変されて、抗原および抗体を吸着し得る。タンパク質吸着は、アッセイデバイスの表面への最適な付着のための疎水性結合部位を必要とするが、抗体は、共有結合を含む、親水性電荷リンケージに十分に結合する。試験スポットのこれらの部位特異的固定化アレイは、単位面積の効果的な電荷密度の増加を生じる表面改変の作用として読み取り領域表面に比例して吸着する。ファンデルワールス相互作用に関連する力、親水性および疎水性の力の平衡の増加または変化、ならびに共有結合密度の調節は、読み取り領域面および部位特異的固定化の試験スポットアレイの疎水性特性に対する親水性の選択的な増強を可能にする。
【００２０】
接触角の改変として生じるスポット流体容積の増大した拡散はまた、相対湿度および温度の作用である。相対湿度を増加するにつれて、スポットの乾燥時間が増加し、このことは、試験流体の同様の分配された容積について表面上により大きなスポット形成を可能にする。網目（ｎｅｔ）作用は、非常に薄いスポットを生じ、それによって、捕捉抗体によって最適な分析物捕捉のためのより感受性の分子層を形成する理想的な単一分子層吸着物に近づく。驚くべきとこに、部位特異的固定化試験スポットアレイの全体にわたって分析物の均一な分散が、三次元における試験ドット形態を最適化する。
【００２１】
捕捉および測定されるべき分析物は、分析物特異的マーカー抗体に結合される標識によって同定される。蛍光色素は、正確な標識を提供するための検出可能なマーカーとして当該分野において公知である。驚くべきことに、分析物−抗体−色素複合体は、標準内部分析物較正として用いられる部位特異的固定化アレイ由来のベースラインと等しい場合、分析物濃度の測定を提供する。対照的に、外部較正の使用は、免疫アッセイにおいて一般に見出される受容される誤差の主要な供給源である。
【００２２】
抗分析物抗体に結合された過剰な色素は、それぞれの分析物に結合されず、通常、余分であるとみなされ、当該分野に公知のように洗い流される。驚くべきことに、本発明の方法は、抗分析物抗体を使用して、部位特異的固定化較正アレイから直接的にデバイス較正ライン中に複数の内部を作製する。
【００２３】
分析物を捕捉するための公知の捕捉抗体の部位特異的固定化アッセイ試験ドットとともに、一連の部位特異的固定化アレイ較正ドットは、図１に示されるように、部位特異的固定化アレイの試験ドットに隣接して直接的にプリントされる。この第２のセットの部位特異的固定化較正ドット２２は、１つのドットにつき分析物の既知の濃度の減少している濃度から構成される。従って、現在、デバイス上で実施される場合、このアッセイは、過剰な結合された標識抗体バックグランド濃度が、較正抗原の既知の濃度を含む所定の部位特異的固定化アレイスポットに結合することによって効果的に減少されるので、単一工程のアッセイに減少され、過剰な抗分析物抗体を除去するための中間の洗浄工程を必ずしも必要としない。
【００２４】
驚くべきことに、本発明のプロセスは、調節され、共有結合性で、高い結合能力のアミノ末端オリゴヌクレオチドライブラリー、ｃＤＮＡライブラリー、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、リポポリサッカライド、および低分子（例えば、ビオチニル−３，６−ジオキサオクタンジアミン（Ｐｉｅｒｃｅ、ＥＺ−Ｌｉｎｋ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＰＥＯ−Ａｍｉｎｅ））を有する固定化アレイのためのエポキシシラン基材を提供する。有機溶媒は、プロセスに使用されない。換気フード、特別な廃棄措置のいずれも必要とされない。プリントバッファー３×ＳＳＣ〜６×ＳＳＣ（ｐＨ７）、０．１５Ｍのリン酸ナトリウムバッファー８．５、０．１Ｍのリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．２）および０．１Ｍの重炭酸ナトリウム（ｐＨ８．６）を用いる場合、最適な結果が得られる。スポットサイズは、少量の界面活性剤（０．０１％〜０．０５％のＳＤＳ）を添加することによって調整され得る。
【００２５】
分析物−抗体−色素複合体および過剰な抗−分析物−抗体−色素複合体を含む試験流体は、アッセイデバイスにプリントされる２つの型の部位特異的固定化アレイの試験スポットを流れ、過剰な複合体は、色素濃度が読み取り装置で読み取られる場合、既知の分析物スポットと結合して、較正についての参照濃度を作製する。分析物−抗体−色素複合体は、捕捉抗体部位特異的固定化アレイの試験スポットと結合し、試験溶液中の分析物の濃度についての読み取りを提供する。図８に示されるように、内部動的較正（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）（ＩＤＣＴＭ）についての本発明の方法は、比較内部較正標準曲線を比較試験曲線で積分する。試験流体分析物の実際の濃度は、試験特異的内部較正標準物が同時に提供されるため、正確に決定される。
【００２６】
デバイスと組み合わせて使用される方法は、高密度結合事象（すなわち、アッセイデバイスの単位面積あたりの結合の数）の結果として検出シグナルの損失を生じずに十分に結合しているアッセイ成分についてアッセイデバイス上で誘導される電荷の正確な増強の実験に基づいた決定を提供する。
【００２７】
本発明のアッセイデバイスにおいて最大感受性を達成するために、アッセイデバイスは、較正ドットにおいて既知の濃度の抗原を有する。増加する抗原濃度は、過剰な抗原−抗体に加えて蛍光標識較正複合体との結合の結果としてアッセイの間に読み取られる。必要なタンパク質およびまたは核酸または誘導体であろうとなかろうと、抗原は、アッセイプロセスの期間、可溶性になって洗い流されることを防止するために、アッセイデバイスの固定している基材表面にしっかりと付着されることを必要とする。分析物部位特異的固定化アレイの試験スポットの付着は、疎水性、親水性および共有結合の平衡によって最適化され、プリントされた試験スポットの全体にわたって分析物の均一な分散についての分子スペーサーを含む分析物の懸濁バッファーによって調節される。均一な分散物は、試験スポットあたりの均一な照明レベルを確実にし、ステアリン酸の障害を最小化する。
【００２８】
驚くべきことに、タンパク質吸着に対する最大の表面改変の程度は、図９に示されるように、抗体の吸着に対して逆に作用し得る。最適密度の表面電荷は、抗体が存在するものの抗原が結合する事象が見出されない程度まで、電荷を改変された表面に抗体を結合し得る。直接的な結果として、遊離の抗原−標識複合体は捕捉され得ない。
【００２９】
本発明に従って改変された基材ではない裸の表面に抗体を直接結合することは、その分析物に対する親和性を低減する立体配置的な抗体の変化を生じ得る。分析物はまた、エネルギー付与された表面上に受動的に吸着される。結合した分析物の比率は、５％〜９５％の範囲であり得、従って表面改変およびコーティングプロセスの注意深い最適化が重要である。例えば、タンパク質をプラスチックに結合させることが起こり、水分子が疎水性領域よりも互いに対してずっとより強力な親和性を有するからである。溶液からの疎水性部位の除外は、タンパク質の一部が基材に対して吸着させることを生じる。
【００３０】
アッセイデバイスの固体支持体表面は、抗体結合および試験流体の流動特性のための親水性の強化  対  タンパク質吸着のための、親水性結合および共有結合の維持  のバランスを有するように改変される。分子スペーサーを含む調整緩衝剤中に懸濁された較正ドット分析物および試験ドット分析物をその改変された表面上にプリントすることは、一定の湿度制御の下で実施され、これらのスポットが、分子層厚さの部位特異的な固定化された試験スポットのアレイを形成することに導く、最小の厚さへと傾くことを確実にする。本発明から生じる調節表面の重要な特質としては、アレイの正確さの維持、感度および再現性が挙げられる。
【００３１】
図６に示されるように、アレイの内部較正方法は、正確な診断に対する高い信頼限界を支持するため、複数回の反復からなる。改変された表面に対するドットの接着に適用されたパラメータの有効なバランスは、試験サンプル流体の免疫診断を実施することによって確認される。特定のアッセイについての最適な条件が確認されると、大量生産が、必要とされる間隔で組込まれた品質管理試験で開始する。
【００３２】
一貫性を生じるため、基材表面に対してエポキシシランコーティングを調節して、この基材は界面活性剤溶液中で清浄にされ、数時間洗浄され、次いでブリーチへと移送される。エポキシシランコーティングは、３−グリシジルオキシプロピルトリメトキシシランを添加した新鮮な２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物（ＭＥＳ）溶液に適用される。過剰な水は基材から除去され、そしてこの基材はエポキシシラン／ＭＥＳ溶液に移送される。この基材は、好ましくは３回だが代替的に１回または２回交換したＤＩ中で洗浄され、乾燥される。エポキシシランコーティング直後は、この基材表面は親水性である。焼き入れは、その表面上に反応性エポキシ基を分解することなくその表面を脱水するが、その表面の親水性を低下させる。この基材は最良には室温で保存される。
【００３３】
本発明のこの共有結合性エポキシシランプロセスは、共有結合反応がエネルギーの最小化に熱動力学的に好ましく、そしてエポキシシラン表面が焼き付けの時間および温度を使用して調節され、非常に親水性〜中程度に疎水性に表面エネルギー（接触角度）を制御し得るような、表面のエネルギー調節を生じる最適な方法であることが証明されている。
【００３４】
コーティングの表面張力が基材の表面エネルギーよりも大きい場合、このコーティングは広がらずに薄膜（ｆｉｌｍ）を形成しない。基材表面の表面エネルギーが増やされる場合、コーティングは広がって薄膜を形成するが、乾燥する場合、接着性が乏しくなる。基材の表面エネルギーのさらなる増加は、より容易な湿潤フィルム形成およｂよりより乾燥フィルム接着を生じる。
【実施例】
【００３５】
（実施例１．スポット形態および結合能におけるプリンティング緩衝液の効果）
エポキシ表面に関して（図３）、０．１５０Ｍのリン酸緩衝液が再び最良の結果を生じた。１０％  グリセロールは、最も低いシグナルを生じた。この表面に対して、５０％  ＤＭＳＯもブランクスポットにおいて誤ったシグナルを示した。全体のシグナル強度および結合能は、非常に明らかに、すべてのＢＰＡ濃度、およびすべての緩衝液において、対応するヒドロゲル−エポキシ表面に対するシグナル強度および結合能よりも低い。
【００３６】
図２は、エポキシ基板上の１０個の異なるプリント緩衝液のドット形態を示す。ＢＰＡの８つの希釈物（５×）を、左側の最大１０００μｇ／ｍｌから右側の０．０まで三連でプリントした。基板をブロッキング緩衝液で２時間ブロックした。結合したＢＰＡを、同じブロッキング緩衝液中の４μｇ／ｍｌ  ストレプトアビジン−Ｃｙ３で１時間処理することによってレポートした。リン酸塩  ｐＨ８．５  １０％  ＤＭＳＯ／水  ブランク  ５０％  ＤＭＳＯ／水  １０％  グリセロール／水  ブランク  ＭＥＳ  ｐＨ４．７  ホウ酸塩  ｐＨ９．３  炭酸塩  ｐＨ９．６  ６×ＳＳＣ  ｐＨ７．２  ３×ＳＳＣ  ＰＨ７．２  水。
【００３７】
（実施例２．共有結合マイクロアレイ基板に対するプリンティング最適化および品質管理）
多くの方法が、一般に、ピンプリントマイクロアレイの品質管理に認められている。オリゴアレイまたはｃＤＮＡアレイのプリントライブラリーにおいて、スポット形態および消失したスポットは、ＳＹＢＲ  ５５５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐ３２９３０）のようなＤＮＡインターカレーション色素を用いて、およびＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ色素標識したランダム９マー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ／Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｐ３２９３４、およびＰ３２９３７）とのハイブリダイゼーションによって可視化され得る。標準的な緑色レーザー波長でも赤色レーザー波長でも励起されない蛍光標識を含む追跡ＤＮＡが、ライブラリーのオリゴ毎またはｃＤＮＡ毎に添加され得る。このことは理想的であり、ハイブリダイゼーションシグナルと同時に各スポットでのＤＮＡの定量、第三のレーザーおよび標識トレーサーに対する干渉フィルタによる共焦点顕微鏡での読み取りを提供する。
【００３８】
ライブラリーを基板のバッチ上にプリンティングする努力および費用の前に、そのバッチ自体を結合能、スポット形態、およびバッチ間の均一性について検査することが望ましい。
【００３９】
オリゴヌクレオチド、ｃＤＮＡ、タンパク質または低分子の溶液をマイクロアレイ基板にプリントするにしろ、溶液の最適濃度が存在する。各表面は最大の結合能を有する。これを超えてプリントすることは貴重な材料を無駄にし、より大きいバックグラウンドレベルおよび増加したキャリーオーバーまたはライブラリーの交差汚染を生じ得る。最適量未満をプリントすると、より低いシグナルおよび潜在的に低いシグナル対ノイズ比を生じる。
【００４０】
ＢＳＡ．ローダミンＢ結合体（ＢＳＡ．ＲＢ）．ローダミンＢイソチオシアネート（ＲＢＩＴＣ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ＃２８３９８４）は、Ｃｙ３に対して使用される緑色レーザー波長を吸収し、標準的な走査型共焦点顕微鏡のＣｙ３チャネルおよびＣｙ５チャネルの両方でより広いスペクトルを放射するフルオロフォアである。６ｍｇのＲＢＩＴＣを、６００μＬの乳酸エチルに溶解させた。ウシ胎仔血清アルブミン（ＢＳＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ＃Ａ７５１７）の３つの１ｍｌアリコート（２０ｍｇ／ｍｌ）を、炭酸塩／重炭酸塩緩衝液（ｐＨ９．６）中で調製した。各アリコートを、１００μＬ、２００μＬまたは３００μＬのＲＢＩＴＣ溶液と混合し、一晩反応させた。各アリコートに１０ｍｇのリジンを添加し、２時間反応させたままにすることによって、この反応をクエンチした。ミニカラムをＳｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ５０で充填し、３×ＳＳＣで洗浄した。各アリコートをＧ５０カラムでゲル濾過し、３×ＳＳＣ、意図したマイクロアレイプリント緩衝液中で溶出した。第一の着色ピーク（ＢＳＡ．ＲＢ結合体）を回収し、その後のピークを廃棄した。ＲＢＩＴＣの増加率から得られる結合率を、純粋なＢＳＡ、純粋なＲＢＩＴＣおよび結合体の比較吸収スペクトルから、２：１、５．５：１および１２．８：１色素分子／ＢＳＡ１分子であると見積もった。
【００４１】
５．５：１結合体を、以下に基づいてプリンティングについて選択した。ＢＳＡは、２００マーのｃＤＮＡ鎖とほぼ同じ分子量を有し、２００マーの標的にハイブリダイズした７０マーのオリゴプローブとほぼ同じ表面積を占める。加えて、標識転写物とハイブリダイズすることについての推奨されるヌクレオチド／色素比は、約４０：１、または２００マーあたり５つのフルオロフォアである。それゆえ、ＢＳＡ．ＲＢ結合体分子は、プローブオリゴの１分子あたりの結合表面積、およびマイクロアレイで予測される標的の蛍光標識を模倣する。Ｑｉａｇｅｎ／Ｏｐｅｒｏｎライブラリーの７０マーオリゴは、エポキシ、アルデヒドおよびＮＨＳエステルのような活性表面との共有結合反応のためにアミノ末端終結される。ＲＢＩＴＣと反応していないＢＳＡの表面のリジン残基アミノ基は、同じ化学による表面との反応に利用可能である。
【００４２】
Ｑｉａｇｅｎ／Ｏｐｅｒｏｎ  ７０マーオリゴライブラリーについて推奨されるプリンティング濃度は、１５マイクロモル（１５ｐＭ／μＬ）である。３×ＳＳＣ中のＢＳＡ．ＲＢ結合体の２×連続希釈を、ブランク（３×ＳＳＣ緩衝液単独のみ）が結合体希釈物間で交互になるように３８４ウェル中に調製した。これは、アレイプリンターピンの洗浄を試験するため、およびウェル間のキャリーオーバーまたは交差汚染の重大度を決定するために設計した。したがって、開始濃度を推奨されるよりもわずかに高い、１８ｐＭ／μＬに調節した。
【００４３】
本発明のエポキシシラン共有結合コーティングスライドおよび製造業者によって提供されるＥｒｉｅ  ＳｕｐｅｒＣｈｉｐ  Ｅｐｏｘｙのサンプルを、３８４ウェル連続希釈プレートからＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳｐｏｔＡｒｒａｙによるＰｏｉｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓタングステンスプリットピンを用いてプリントした。洗浄溶液は、ＲＯ水中の１０％  エタノールであり、ＳｐｏｔＡｒｒａｙを２秒間のジェット洗浄、その後のウェル間の２秒間の真空乾燥の３サイクルに設定した。ドットは、図３に示されるように、１列あたり１２スポット（各ＢＳＡ．ＲＢ希釈物の６個の複製物、その後同じ線上に対応する６個の複製物）を３４０ミクロン離して間隔を空けた。
【００４４】
図３は、１％エタノールアミン  ＋  １％ＢＳＡ（ｐＨ８．５）ブロッキング緩衝液で２４時間洗浄する前（上部）および洗浄した後（下部）の、連続希釈したＢＳＡ．ローダミンＢ結合体でプリントした市販のエポキシシラン共有結合マイクロアレイ基板（左）および３つの自家製バッチを示す。各々のセットの上部画像および下部画像を、同じレーザーおよびゲイン設定で走査したが、すべてのセットについて同じではない。
【００４５】
ＢＳＡ．ＲＢ希釈アレイを、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  ＳｃａｎＡｒｒａｙ  Ｅｘｐｒｅｓｓ共焦点レーザー顕微鏡上で走査した。代表的な設定は、レーザー６０％、光電子増倍管５５％であるが、すべてのスライドについて正確に同じではなかった。これらの予備洗浄（ｐｒｅ−ｗａｓｈ）したｔｉｆファイルを次の分析のために保存した。これらのスライドをブロッキング緩衝液（１％エタノールアミン  ＋  １％ＢＳＡ（ＨＣｌでｐＨ８．５に調節した））中で２４時間洗浄し、次いで、同じ設定で再度走査して、洗浄後の画像ファイルを得た。洗浄前画像および洗浄後画像を、ＳｃａｎＡｌｙｚｅ（ＥｉｓｅｎＬａｂｓ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ）で解析した。円が蛍光スポットを正確に囲むように、グリッドおよび円を各アレイについて最適に調節した。
【００４６】
（タンパク質保持およびキャリーオーバーの分析）
バッチに依存して、スポットは、図３に見られるように直径１６０ミクロン〜２５０ミクロンの範囲であった。ピンの洗浄は、６スポットのＢＳＡ．ＲＢ結合体の各希釈物の右に６つの薄いスポットがはっきりと見え得るので、完全ではなかった。これは、ライブラリーの交差汚染を生じ得、ライブラリーが廃棄されなければならなくなる前に実施し得るプリンティング数を制限する。その有効年数を延長するため、および費用を減少させるために、ライブラリーのアリコートを作製することの重要性が強調される。
【００４７】
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃおよび４Ｄは、ドットのプロットした蛍光強度  対  ＢＳＡ．ＲＢ結合体のプリント（予備洗浄）濃度（各チャートの上側の紫色の曲線）、および対応する隣接するブランク（各チャートの下側の紫色の曲線）を示す。これらの図はまた、洗浄後結合体の保持曲線（上側の濃色）およびブランク（下側の淡色）を示す。Ｑｉａｇｅｎ／Ｏｐｅｒｏｎの７０マーライブラリー（１５ｐＭ／μＬ）のプリンティングについてＱｉａｇｅｎ／Ｏｐｅｒｏｎによって推奨される濃度で、キャリーオーバーが非常に高い。分析によって、この濃度でのプリントが約５ｐＭ／μＬ（１／３の濃度）でプリントするよりも保持されたタンパク質がより少ないことが示される。それゆえ、ライブラリー物質は無駄になる。さらに、洗浄を通した後でさえもより多くのタンパク質がピン上でウェルからウェルへと運ばれるので、より高い濃度においてキャリーオーバー／交差汚染がより大きい。
【００４８】
【表２】
2008506955.tif 000003
表２：図２のチャートからの数値解析の概要。これから最適プリント濃度範囲が、２．５ｐＭ／μＬと１０ｐＭ／μＬとの間であることがわかり得る。この範囲にわたって、最大保持タンパク質（シグナル）は維持されるが、キャリーオーバーは減少する。
【００４９】
図５は、ＳｃａｎＡｌｙｚｅで解析したときの、ＥＲＩＥおよび本発明のエポキシシランの３つのバッチについての、洗浄後のスポットしたＢＳＡ．ＲＢ結合体希釈物の平均蛍光強度（Ｗ）を、介在するブランクの洗浄後平均蛍光強度（ＷＣ）で割った比のプロットを示す。平均は、図１の画像に示されるような洗浄前および洗浄後の６個の複製物についてのものである。（キー：Ｐ−プリントしたＢＳＡ．ＲＢ希釈物、ＰＣ−プリントしたブランクキャリーオーバー、Ｗ−洗浄後ＢＳＡ．ＲＢ希釈物、ＷＣ−洗浄後ブランクキャリーオーバー）。
【００５０】
フルオロフォアで標識したタンパク質または７０マーのオリゴの直接的なプリンティングは、ピンでプリントしたマイクロアレイに結合する最小エネルギー吸着基板の結合能または保持割合をチェックする迅速な方法である。異なるバッチのスライドは、高価なライブラリーのプリンティングを受ける前に、結合およびスポットの形態について比較され得る。加えて、この方法は、ピンの洗浄の質を評価すること、そして、ライブラリーについての最適なプリンティング濃度を設定することの両方に有用な方法である。最小の濃度およびキャリオーバーについて、最適なプリンティング濃度、または最大のシグナルを決定することは、ライブラリーを保護し、そして、相互汚染を最小にすることによって、その寿命を延長する。これらの研究に基づいて、本発明者らの、６００ｐＭ  Ｏｐｅｒｏｎ／Ｑｉａｇｅｎ  ヒト７０マーライブラリーを、各々１５０ｐＭの４つのアリコートに分けた。このうち、３つを、全２２Ｋ（バージョン２．１．２）ライブラリーのために保存し、そして、１つを、プロテアーゼ遺伝子、乳癌関連遺伝子、リングフィンガータンパク質遺伝子、ｃｌｏｃｋ遺伝子（サーカディアンリズム関連）、およびＨＯＸ遺伝子について、２００〜８００オリゴの収束サブセット（focused subset）をピックアップするために使用した。これらのサブセットを、さらに、７５ｐＭの二連に分けた。
【００５１】
本発明のエポキシシランの３つのバッチと、市販のエポキシシランスライド（Ｅｒｉｅ  ＳｕｐｅｒＣｈｉｐ  Ｅｐｏｘｙ）を、この方法の例として提示する。結合能は容認可能であり得るが、スポットの形態は、有意に容認できないものであり得る（例えば、バッチ４０４０６）。
【００５２】
最大のシグナルおよびタンパク質の保持は、この実験における全てのスライドについて、２．５〜１０μＭ／μＬの範囲のプリンティング濃度に入る。このおよその最適範囲はまた、９マー〜７０マーのオリゴヌクレオチドを用いた他の実験においても見られた（データ示さず）。実際に、より高い濃度でのプリンティングは、おそらくはステアリン酸の妨害によって、シグナルおよび保持が減少する。本発明のエポキシ基板は、最適な信号対バックグラウンド比を提供し、これは、最適なプリンティング範囲において市販の基板を２倍まで上回る改善であり、図３の画像にはっきりと見られる。
【００５３】
（実施例３．複数の部位に特異的な、固定化した較正および試験のアレイ）
複数のスポットのアレイを、固定化した固体支持表面基板上に吸着させた。
【００５４】
図６に示されるように、アッセイデバイスのある実施形態は、同じ分析物濃度の較正ドット２２の１０個のプリントされたカラムを示す。右側にある、試験ドット２０の最後の２個のカラムは、決定されるべき濃度の試験サンプルを吸着させた捕捉抗体ドットである。各列は、内部動的較正（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ）（ＩＤＢ）を用いた、単回のアッセイを表す。試験の列を、１０回繰り返す。全試験マトリクスは、ＩＤＢについて、１０ドット×１０ドットであり、そして、試験サンプルについて、２×１０ドットである。測定された蛍光強度は、分析物の相対濃度を決定する。
【００５５】
（実施例４．内部動的較正）
図７に示されるように、曲線Ａは、試験サンプルを内部の作成した濃度曲線を用いて測定した場合の、用量応答における代表的なばらつきを表す。曲線Ｂは、低用量の外部較正による測定値の読み、および高用量の外部較正による参照の読みによって決定した場合に、誤って内挿された、誘導された外部較正線（ｅｘｔｅｒｎａｌ  ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｌｉｎｅ）である。次いで、低い点と高い点との間のそれぞれの値を、線（すなわち、曲線Ｂ）を描くことによって統合する。内部動的較正は、いくつかのプロットに基づいた線のプロットを生成し、図８のような試験サンプルの実際に較正した応答を表す曲線をもたらす。
【００５６】
（実施例５．高密度な表面電荷の効果を、電荷を平衡化した最適な表面修飾と比較するために試験されるデバイス）
最適化したデバイスの固体支持体の用量応答（「最適」曲線の上側）を、高度に荷電した固体支持体の修飾された表面の用量応答（「荷電」曲線の下側）と比較すること。動的スポットＣＫ−ＭＢ分析物のタンパク質濃度は、図８に示されるように、２６ｐｇ／ｍｌ〜２６，２００ｐｇ／ｍｌの範囲であった。この高度に荷電した表面領域は、２６２０ｐｇ／ｍｌ未満の濃度において、分析物の結合を効率的に妨げた。
【００５７】
（実施例６：試験デバイスの製造に適用される方法）
図９は、比較のプリントアレイマトリクスを示し、そして、分析物および抗体吸着物の両方について、固体支持体の適切な表面修飾を確認するために修飾された、代表的なデバイスの表面を例示する。この方法は、相対的なドットの大きさを、分配されるドット容量の増分と比較する。
【００５８】
（実施例７．湿度によるドットの大きさ）
表面が修飾された固体支持体を、湿度１８％および湿度４７％において、２４℃における親水性フローの効果を試験した。ドットを、比較的な直径の増加について測定した。表面積は、同じ容量のスポット流体について、より高い湿度において５１％だけ増加し、スポットの厚みを約５０％減少させた。
【００５９】
（実施例８．ドット内に等間隔に分配された分析物を含む、アレイドットの部位特異的な固定化）
図１０Ａは、濃縮した分析物の中央部分の凝集を形成するためにｐＨ９．０において重炭酸緩衝液を用いる効果を示す。この凝集は、放射ピークおよび誤りを含むデータ結果を引き起こす。図１０Ｂは、塩酸グアニジンを追加することの効果を示す。塩酸グアニジンは、分析物の凝集を分散させる。図１０Ｃは、ｐＨ５．０における、ホウ酸および塩酸グアニジンの使用を示す。スポット周囲における分析物の輪の形成（中心部分には、最小濃度が残される）が示される。驚くべきことに、本発明の分子スペーサー成分が、最良のスポットの形態およびシグナルを形成する（図１０Ｄ）。分析物は、ホウ酸（５０ｍＭ  Ｈ３ＢＯ３、ｐＨ５．０）を用いてスポット全体にわたり均一に分配されるが、塩化マグネシウム（５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を加えると、分析物が、スポット全体にわたって、積極的に間隔をあける。
【００６０】
本発明の調節されたエポキシシラン基板は、分析物にも基質にも不適合性の緩衝液と組み合せて用いた場合、図１０に示されるような、分析物および分析物の凝集の不完全な最終パターンを含むアレイスポットを固定化する。アレイスポットにおける分析物の分子の凝集および分散は、分析物濃度の比較的な測定を行なう場合に、重要となる。臨床診断において容認可能なＣＶ％（分散係数％）は、図１０Ｄに示されるように、アレイスポットが均一な分析物の分散を含む場合にのみ得られる。ほぼ全ての表面における最良のドットの形態およびシグナルは、５０ｍＭ  Ｈ３ＢＯ３で最も頻繁に得られたが、多くの場合、５０ｍＭのＭｇＣｌ２を加えた。
【００６１】
（実施例９．本発明のエポキシシラン基板上への核酸の固定化）
アレイは、本発明のエポキシシラン基板上に部位特異的に局在化させた、Ｏｐｅｒｏｎマウスゲノムライブラリーからの７２のオリゴヌクレオチドの指向セットである。この基板を、２ｍｇ／ｍｌの２−アミノエタノール＋１％  ＢＳＡで２４時間ブロッキングし、次いで、脱イオン水で洗浄し、脱水した。
【００６２】
Ｐｒｏｍｅｇａ製のＳＶ総ＲＮＡ抽出システムを用いて、図１１に示されるような、９日目の全マウス胚から抽出したＲＮＡ、および図１２に示されるような、成体マウス脾臓組織から抽出したＲＮＡを、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒを用いて量をチェックした。このＲＮＡを、ＮｕＧｅｎ製のＯｖａｔｉｏｎ法により増幅して、約５０００倍に増幅したアミノアリル−ｃＤＮＡを得た。これを、Ｃｙ５−ＮＨＳと結合体化して、フルオロフォア標識したｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡの収率を、定量化し、そして、標識の組み込み割合を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  １０００光ファイバー分光光度計を用いて確認した。Ｃｙ５−ｃＤＮＡ（８０μｌ中に０．５μｇの総ｃＤＮＡ）を、５×ＳＳＣ＋０．１％  ＳＤＳ中で、部位特異的に固定化したアレイ上で、２０時間ハイブリダイズした。このアレイを、３×ＳＳＣ中で２回、１×ＳＳＣ中で２回、そして、０．１×ＳＳＣで１回、連続的に洗浄し、次いで、脱水した。これらの部位特異的に固定化したスポットアレイを、６５％未満のレーザおよび６０％未満のゲインの比較的低い設定にてＰＥ  ＳｃａｎＡｒｒａｙ共焦点走査型顕微鏡を用いて、読み取った。これらの低い設定において良好な結果が得られることから、ｃＤＮＡが十分に標識されており、そして、本発明のエポキシシラン基板が、ハイブリダイズさせるための標識について最適なプローブオリゴヌクレオチドを保持していることが示唆される。
【００６３】
（実施例１０．本発明の方法を、以下の本発明のＡＰＴデバイスに適用した；最小のエネルギー吸収による、分析物および抗体の測定を最適化するための、マイクロウェルデバイス）
抗病原体抗体の力価の血清診断に適したプロテオミクスマイクロアレイ（ＡＰＴ  Ｄｅｖｉｃｅ）を、以下のように調製した。ヒトＩｇＧおよびＩｇＭの段階希釈を、較正標準としてプリントし、細菌およびウイルスの抗原を、以下の表に示すように、三連でプリントした。
IgM  900μg/ml  H.pylori   T.gondii       IgG  900μg/ml
IgM  300μg/ml                            IgG  300μg/ml
IgM  100μg/ml  Herpes  1  Rubella        IgG  100μg/ml
IgM  33.3μg/ml                           IgG  33.3μg/ml
IgM  11.1μg/ml Herpes  2  Rubeola        IgG  11.1μg/ml
IgM  3.7μg/ml                            IgG  3.7μg/ml
IgM  1.2μg/ml  CMV        C.trachomatis  IgG  1.2μg/ml
IgM  0.4μg/ml                            IgG  0.4μg/ml
IgM  0.14μg/ml EBV        C.jejuni       IgG  0.14μg/ml
IgM  0μg/ml                              IgG  0μg/ml
（表１０．プリントした較正標準、ならびに、細菌およびウイルスの抗原）
【００６４】
表面を、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ｐＨ８）中１％のＢＳＡ（ｐＨ８、ブロッキング緩衝液）で、１８時間ブロッキングした。ヘリコバクターピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）に感染していることが分かっており、参照方法によりその抗体の力価について試験した、患者に由来する血清サンプルを、このブロッキング緩衝液中で、容量で１０分の１に希釈した。これらの希釈したサンプル（１ウェルあたり２００μＬの各サンプル）を、次いで、マイクロアレイ上で１５分間インキュベートした。サンプルをデカントし、そして、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）でウェルを満たし、２０秒間振盪させ、そして、デカントするというサイクルを２回行なうことによって、ウェルを洗浄した。２０秒間の３回目の洗浄は、ブロッキング緩衝液で行なった。ウェルを、次いで、ブロッキング緩衝液中のヤギ抗ヒトＩｇＧ．Ｃｙ３結合体３μｇ／ｍｌと、ヤギ抗ヒトＩｇＭ．Ｄｙ６４７結合体との組み合わせ（２００μＬ）で満たし、そして、１５分間インキュベートした。これらの結合体をデカントし、そして、リン酸緩衝化生理食塩水（ｐＨ７．４）でウェルを満たし、２０秒間振盪させ、そして、デカントするというサイクルを２回行なうことによって、ウェルを洗浄した。ウェルのプラスチック製の側面をくさび（ｗｅｄｇｅ）を用いて取り除き、平坦なスライドガラスの底部を残し、これを、脱イオン水中で２０秒間洗浄し、そして、遠心分離機において５００ＲＰＭにて１分間スピンダウンすることによって乾燥させた。
【００６５】
Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ製のＳｃａｎＡｒｒａｙレーザ走査型共焦点顕微鏡を、以下の設定にて用いて、アレイを画像化した：Ｃｙ３（緑色）チャネル（ＩｇＧ）レーザ  ７０％  光電子増倍管  ７０％、Ｃｙ５（赤色）チャネル（ＩｇＭ）レーザ  ７５％  光電子増倍管  ７５％。この実験のアレイ画像の代表例を、図１３に示す。こうして、約３５分で行なった、多重プロテオミクス診断アッセイが提供され、これは、１０のヒト病原体に対する患者の血清中のＩｇＧおよびＩｇＭの定量的な力価を与える。
【００６６】
当業者は、先に具体的に記載された本発明の実施形態に対する多くの等価物を認識し、そして、慣用的に過ぎない実験を用いて、これらを確認することができる。このような等価物は、添付の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】図１は、固定アレイ試験を実施するための本発明のアッセイデバイスの斜視図である。
【図２】図２は、本発明のアッセイデバイスの上面の写真であり、エポキシ基材上の１０個の異なるプリントバッファーのスポット形態を示す。
【図３】図３は、本発明のアッセイデバイスの上面の写真であり、スポットされたＢＳＡ．ＲＢ結合体希釈の平均蛍光強度を示す。
【図４Ａ】図４Ａは、Ｅｒｉｅ  Ｓｕｐｅｒｃｈｉｐ  ＥｐｏｘｙでスポットされたＢＳＡ．ＲＢ結合体希釈の平均蛍光強度のプロットである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、Ｅｐｏｘｙ  Ｂａｔｃｈ  ４０３０９を含むＥｒｉｅ  Ｓｕｐｅｒｃｈｉｐ  ＥｐｏｘｙでスポットされたＢＳＡ．ＲＢ結合体希釈の平均蛍光強度のプロットである。
【図４Ｃ】図４Ｃは、Ｅｐｏｘｙ  Ｂａｔｃｈ  ４０４０６を含むＥｒｉｅ  Ｓｕｐｅｒｃｈｉｐ  ＥｐｏｘｙでスポットされたＢＳＡ．ＲＢ結合体希釈の平均蛍光強度のプロットである。
【図４Ｄ】図４Ｄは、Ｅｐｏｘｙ  Ｂａｔｃｈ  ４０３０９を含むＥｒｉｅ  Ｓｕｐｅｒｃｈｉｐ  ＥｐｏｘｙでスポットされたＢＳＡ．ＲＢ結合体希釈の平均蛍光強度のプロットである。
【図５】図５は、ＥＲＩＥおよび本発明の３つのバッチのエポキシランについての介在する洗浄後のブランク（ＷＣ）の平均蛍光強度に対する洗浄後のスポットされたＢＳＡ．ＲＢ結合体希釈（Ｗ）の平均蛍光強度の比のプロットである。
【図６】図６は、本発明のアッセイデバイスの代替の実施形態の上面の写真である。
【図７】図７は、内部動的較正曲線を理解するための用量／応答曲線を描いている、グラフである。
【図８】図８は、改変された固体支持体表面への結合の際の電荷密度の関係を示している、グラフである。
【図９】図９は、デバイスの支持体表面の適切な表面の改変を示す、アッセイデバイスの写真である。
【図１０】図１０は、ドット内の分析物の凝集して、まだらで、環状で、かつ均一に間隔のあいた分布を含む、アレイドットの部位特異的固定化を示す、写真である。
【図１１】図１１は、マウス胚の部位特異的固定化されたハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを示す、写真である。
【図１２】図１２は、マウスの脾臓部位特異的固定化されたハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドを示す、写真である。
【図１３】図１３は、１０個の病原体マイクロアレイに加えてＩｇＧおよびＩｇＭ較正標準物に対する患者のＩｇＧおよびＩｇＭ血清応答を示す、写真である。
【図１】
2008506955.tif 000004
【図２】
2008506955.tif 000005
【図３】
2008506955.tif 000006
【図４Ａ】
2008506955.tif 000007
【図４Ｂ】
2008506955.tif 000008
【図４Ｃ】
2008506955.tif 000009
【図４Ｄ】
2008506955.tif 000010
【図５】
2008506955.tif 000011
【図６】
2008506955.tif 000012
【図７】
2008506955.tif 000013
【図８】
2008506955.tif 000014
【図９】
2008506955.tif 000015
【図１０】
2008506955.tif 000016
【図１１】
2008506955.tif 000017
【図１２】
2008506955.tif 000018
【図１３】
2008506955.tif 000019