(57)【要約】  個体が肝臓線維化の早い進行速度を示す素因を有するかどうかを明らかにする方法およびキットが提供される。肝臓線維化の早い進行を防止するのに有用な薬剤および医薬組成物、並びに肝臓線維化を加速または誘導させる薬物分子を同定する方法も提供される。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにする方法であって、前記個体のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座、または、前記ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合形態またはヘテロ接合形態での存在または非存在を明らかにし、それにより、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにすることを含む方法。
【請求項２】
前記個体はＣ型肝炎ウイルスに感染している請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座における前記少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１に示されるＣＹＰ２Ｄ６＊４ＳＮＰのアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は短縮型のＣＹＰ２Ｄ６ポリペプチドをコードする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遺伝子型の前記存在により、前記個体における肝臓線維化の早い進行を発症させる増大した素因リスクが示される請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記遺伝子型の前記存在により、肝硬変を発症させる増大した素因リスクが示される請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座と連鎖不平衡にある前記隣接遺伝子座は、配列番号１０に示されるゲノム配列に含まれる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記遺伝子型の存在または非存在を明らかにすることは、ＤＮＡ配列決定、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ分析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析、変性／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）、パイロシーケンシング分析、アシクロプライム分析、リバースドットブロット、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブおよびロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＴａｑＭａｎ、分子ビーコン、インターカレーション色素、ＦＲＥＴプライマー、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ、遺伝子ビット分析（ＧＢＡ）、多重ミニシーケンシング、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ、ＭａｓｓＡｒｒａｙ、ＧＯＯＤアッセイ、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｍｉｎｉｓｅｑ、アレイ型プライマー伸張（ＡＰＥＸ）、マイクロアレイプライマー伸張、Ｔａｇアレイ、コード化ミクロスフェア、テンプレート誘導取り込み（ＴＤＩ）、蛍光分極化、比色法オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、配列コード化ＯＬＡ、マイクロアレイ連結、リガーゼ連鎖反応、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ、ローリングサークル増幅、ならびに、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイからなる群から選択されるＳＮＰ検出法を使用して行われる。
【請求項９】
個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにするためのキットであって、前記個体のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座、または、前記ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合形態またはヘテロ接合形態での存在または非存在を明らかにするための少なくとも１つの試薬を含むキット。
【請求項１０】
前記個体はＣ型肝炎ウイルスに感染している請求項９に記載のキット。
【請求項１１】
ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座における前記少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１に示されるＣＹＰ２Ｄ６＊４ＳＮＰのアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子である請求項９に記載のキット。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は短縮型のＣＹＰ２Ｄ６ポリペプチドをコードする請求項９に記載のキット。
【請求項１３】
前記遺伝子型の前記存在により、前記個体における肝臓線維化の早い進行を発症させる増大した素因リスクが示される請求項１０に記載のキット。
【請求項１４】
前記遺伝子型の前記存在により、肝硬変を発症させる増大した素因リスクが示される請求項１０に記載のキット。
【請求項１５】
前記ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座と連鎖不平衡にある前記隣接遺伝子座は、配列番号１０に示されるゲノム配列に含まれる請求項９に記載のキット。
【請求項１６】
少なくとも１つの試薬を包装する包装材と、前記包装材内または前記包装材上における通知とをさらに含み、前記通知により、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにすることにおける使用についてキットが特定される請求項９に記載のキット。
【請求項１７】
前記少なくとも１つの試薬は、配列番号１に示されるＣＹＰ２Ｄ６＊４ＳＮＰの少なくとも１つの対立遺伝子と特異的にハイブリダイズすることができる少なくとも１つのオリゴヌクレオチドである請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
前記少なくとも１つの試薬は、ＤＮＡ配列決定、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ分析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析、変性／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）、パイロシーケンシング分析、アシクロプライム分析、リバースドットブロット、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブおよびロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＴａｑＭａｎ、分子ビーコン、インターカレーション色素、ＦＲＥＴプライマー、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ、遺伝子ビット分析（ＧＢＡ）、多重ミニシーケンシング、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ、ＭａｓｓＡｒｒａｙ、ＧＯＯＤアッセイ、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｍｉｎｉｓｅｑ、アレイ型プライマー伸張（ＡＰＥＸ）、マイクロアレイプライマー伸張、Ｔａｇアレイ、コード化ミクロスフェア、テンプレート誘導取り込み（ＴＤＩ）、蛍光分極化、比色法オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、配列コード化ＯＬＡ、マイクロアレイ連結、リガーゼ連鎖反応、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ、ローリングサークル増幅、ならびに、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイからなる群から選択される方法において利用可能なように設計されている請求項１６に記載のキット。
【請求項１９】
前記少なくとも１つの試薬は、配列番号４に示されるＣＹＰ２Ｄ６タンパク質の少なくとも１つの多型体と示差的に結合することができる抗体である請求項１６に記載のキット。
【請求項２０】
必要性のある個体において肝臓線維化の早い進行を防止する方法であって、前記個体の肝臓におけるＣＹＰ２Ｄ６の発現レベルおよび／または活性をアップレギュレーションすることができ、それにより、前記個体における肝臓線維化の早い進行を防止することができる薬剤を前記個体に投与することを含む方法。
【請求項２１】
前記個体はＣ型肝炎ウイルスに感染している請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記個体は、肝炎ウイルス感染、肝毒性、肝臓ガン、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、自己免疫疾患、代謝性肝臓疾患、および、肝臓の二次的関与による疾患からなる群から選択される疾患に罹患している請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記肝炎ウイルス感染は、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＤ型肝炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記肝毒性はアルコール誘導の肝毒性および／または薬物誘導の肝毒性である請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記自己免疫疾患は、自己免疫肝炎（ＡＩＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）からなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記代謝性肝臓疾患は、ヘモクロマトーシス、ウイルソン病およびアルファ１アンチトリプシンからなる群から選択される請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
肝臓の二次的関与による前記疾患はセリアック病および／またはアミロイドーシスである請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記アップレギュレーションは、
（ａ）ＣＹＰ２Ｄ６の少なくとも機能的な部分をコードする外因性ポリヌクレオチドを個体の肝臓細胞において発現させること；
（ｂ）個体の肝臓細胞における内因性ＣＹＰ２Ｄ６の発現を増大させること；
（ｃ）個体の肝臓細胞における内因性のＣＹＰ２Ｄ６活性を増大させること；および
（ｄ）ＣＹＰ２Ｄ６発現細胞を個体の肝臓に投与すること
からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって行われる請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記ＣＹＰ２Ｄ６は、初期設定済みパラメーターを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号４によって示されるポリペプチドに対して少なくとも７５％同一であるポリペプチドである請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＣＹＰ２Ｄ６は配列番号４によって示される請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリヌクレオチドは配列番号５によって示される請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
薬物分子が個体において肝臓線維化の早い進行の発達を誘導または促進することができるかどうかを明らかにする方法であって、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素変化体によるこの薬物分子の代謝率を比較することを含み、前記ＣＹＰ２Ｄ６ではなく、前記ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素変化体による前記薬物分子の不良な代謝により、前記薬物分子はこの個体における肝臓線維化の早い進行の発達を誘導または促進することができることが示される方法。
【請求項３３】
前記個体はＣ型肝炎ウイルスに感染している請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記個体は、肝炎ウイルス感染、肝毒性、肝臓ガン、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、自己免疫疾患、代謝性肝臓疾患、および、肝臓の二次的関与による疾患からなる群から選択される疾患に罹患している請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記肝炎ウイルス感染は、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＤ型肝炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記肝毒性はアルコール誘導の肝毒性および／または薬物誘導の肝毒性である請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記自己免疫疾患は、自己免疫肝炎（ＡＩＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）からなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記代謝性肝臓疾患は、ヘモクロマトーシス、ウイルソン病およびアルファ１アンチトリプシンからなる群から選択される請求項３４に記載の方法。
【請求項３９】
肝臓の二次的関与による前記疾患はセリアック病および／またはアミロイドーシスである請求項３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＣＹＰ２Ｄ６の前記不良な代謝酵素変化体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊３およびＣＹＰ２Ｄ６＊５からなる群から選択される請求項３２に記載の方法。
【請求項４１】
前記ＣＹＰ２Ｄ６は配列番号４によって示される請求項３２に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣＹＰ２Ｄ６は、ＣＹＰ２Ｄ６の少なくとも機能的な形態をコードするポリヌクレオチドから発現される請求項３２に記載の方法。
【請求項４３】
前記ポリヌクレオチドは配列番号５によって示される請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記ＣＹＰ２Ｄ６の前記不良な代謝酵素変化体は、短縮型のＣＹＰ２Ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから発現される請求項３２に記載の方法。
【請求項４５】
個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにする方法であって、前記個体のＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｅ１およびＡＰＯ  Ｅからなる群から選択される遺伝子座、または、前記遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合形態またはヘテロ接合形態での存在または非存在を明らかにし、それにより、前記個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにすることを含む方法。
【請求項４６】
個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにするためのキットであって、前記個体のＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｅ１およびＡＰＯ  Ｅからなる群から選択される遺伝子座、または、前記遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における、少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合形態またはヘテロ接合形態での存在または非存在を明らかにするための少なくとも１つの試薬を含むキット。
【請求項４７】
前記ＣＹＰ３Ａ５遺伝子座における前記少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１８のヌクレオチド座標１７４におけるアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子である請求項４５または４６に記載の方法またはキット。
【請求項４８】
前記ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子座における前記少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１７のヌクレオチド座標１７７２におけるチミジンヌクレオチド含有対立遺伝子である請求項４５または４６に記載の方法またはキット。
【請求項４９】
前記ＡＰＯ  Ｅ遺伝子座における前記少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１９のヌクレオチド座標５５におけるシトシンヌクレオチド含有対立遺伝子である請求項４５または４６に記載の方法またはキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ型肝炎患者における線維化進行速度を予測するための方法およびキットに関連し、より具体的には、抗ウイルス治療についてのＨＣＶ患者の適合性を明らかにすることにおけるかかる方法およびキットの使用に関連する。さらに、本発明は、肝臓線維化および／または肝硬変の早い進行を防止する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
慢性Ｃ型肝炎は、世界中で約１億７千万人が罹患する一般的な疾患である（Ｌａｕｅｒ  ＧＭおよびＷａｌｋｅｒ  ＢＤ、Ｃ型肝炎ウイルス感染、Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．２００１、３４５：４１〜５２）。ほとんどのＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染者は良性型の感染を示す一方で、感染者の１５％〜２０％が、究極的には末期肝硬変に進行する肝臓線維化を発症する（Ｓｅｅｆｆ  ＬＢ他、２０００、Ａｎｎ．Ｉｎｔｅｒｎ．Ｍｅｄ．１３２：１０５〜１１）。線維化進行速度はＨＣＶ感染者間で異なり、現時点では所与の個体において予測することができない。
【０００３】
２２３５名のＨＣＶ感染者の研究では、感染日から肝硬変の出現までの平均推定継続期間が３０年であるが、患者の約３３％は２０年未満で肝硬変に進行していたことが明らかにされた（Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ他、１９９７；慢性Ｃ型肝炎患者における肝臓線維化進行の自然史：ＯＢＳＶＩＲＣ群、ＭＥＴＡＶＩＲ群、ＣＬＩＮＩＶＩＲ群およびＤＯＳＶＩＲＣ群、Ｌａｎｃｅｔ、３４９：８２５〜３２）。線維化進行速度におけるこれらのばらつきは、Ｃ型肝炎ウイルスそのものではなく、いくつかの宿主要因（すなわち、感染者に関連した要因）が線維化進行の一因であることを示唆している。
【０００４】
例えば、高齢、男性、アルコール摂取および免疫抑制治療が、肝臓線維化に関してあまり好ましくない結果に関連することが見出されていた［Ｐｏｙｎａｒｄ、１９９７（上掲）］。線維化速度に影響を及ぼし得る他の宿主要因（例えば、喫煙およびボディーマス指数など）が依然として研究中である（Ｆｅｌｄｍａｎ  Ｍ他、２００２、Ｓｌｅｉｓｅｎｇｅｒ＆Ｆｏｒｄｔｒａｎ’ｓ  “Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ａｎｄ  Ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ”（第７版）、ＳＡＵＮＤＥＲＳ  Ａｎ  Ｉｍｐｒｉｎｔ  ｏｆ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）。
【０００５】
加えて、肝臓疾患の自然史および肝臓線維化の進行を明らかにすることにおいて様々な遺伝的要因についての重要な役割を関係づける相当量の証拠が蓄積している。これらには、免疫調節タンパク質、前炎症性サイトカインおよび線維形成促進因子をコードする遺伝子における遺伝子多型が挙げられる（Ｂａｔａｌｌｅｒ  Ｒ他、２００３、肝臓線維化の遺伝子多型および進行：批評的評価、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３７：４９３〜５０３）。例えば、ａｐｏＥ−ε４対立遺伝子が、ＨＣＶにより引き起こされる肝臓損傷に対抗する保護的結果と関連することが見出されていた（Ｗｏｚｎｉａｋ  ＭＡ他、２００２、Ｔｒｅｎｔ  ＨＣＶ研究群：アポリポタンパク質Ｅ−ε４はＣ型肝炎ウイルスにより引き起こされる重篤な肝臓疾患を保護する、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３６：４５６〜６３）。他方で、ヘモクロマトーシス遺伝子（ＨＦＥ）のＣ２８２Ｙ多型が肝硬変に関連することが見出されていた（Ｓｍｉｔｈ  ＢＣ他、１９９８、遺伝性ヘモクロマトーシスについてのヘテロ接合性は慢性Ｃ型肝炎においてより多くの線維化に関連する、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２７：１６９５〜９）。しかしながら、３１６名のＣ型肝炎患者を含んだ別の研究では、著しい差が代償性肝臓疾患および末期肝臓疾患の患者の間でのＨＦＥ変異の存在率において認められなかった（Ｔｕｎｇ  ＢＹ他、２００３、Ｃ型肝炎、鉄状態および疾患重篤性：ＨＦＥ変異との関係性、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２４：３１８〜２６）。
【０００６】
他の研究では、酵素のチトクロームＰ４５０複合体（ＣＹＰ４５０）のいくつかの多型形態が様々な肝臓疾患に関連することが見出されている。最も特筆すべき例は、ＣＹＰ２Ｅ１の遺伝子多型とアルコール性肝臓疾患の進行との間での関連である（Ｌｅｅ  ＨＣ他、２００１、韓国男性集団におけるエタノール代謝酵素の多型とアルコール性肝硬変に対する感受性との関連、Ｊ．Ｋｏｒｅａｎ  Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．１６：７４５〜５０）。
【０００７】
ＣＹＰ２Ｄ６（チトクロームＰ４５０酵素のファミリーに属する）は、５０を超える臨床的に重要な薬物の代謝に関与している（Ｈａｓｌｅｒ  ＪＡ、１９９９、チトクロームＰ４５０の薬理遺伝学、Ｍｏｌ．Ａｓｐｅｃｔｓ  Ｍｅｄ．２０：１２〜２４、２５〜１３７）。ＣＹＰ２Ｄ６には、いくつかの多型形態が含まれ、それらのうちのＣＹＰ２Ｄ６＊３、ＣＹＰ２Ｄ６＊４およびＣＹＰ２Ｄ６＊５が不良な薬物代謝酵素をもたらす。そのような多型対立遺伝子の存在率により、一部の個体における不良な薬物代謝を説明することができる。例えば、全白人の５％〜１０％が薬物代謝不良である。この集団において、ＣＹＰ２Ｄ６＊４の存在率は２３％もの高さである［Ｈａｓｌｅｒ、１９９９（上掲）］。他方で、それ以外の２つの一般的な代謝不良酵素対立遺伝子（ＣＹＰ２Ｄ６＊３およびＣＹＰ２Ｄ６＊５）の存在率ははるかに低い（２％〜５％）。
【０００８】
ＣＹＰ２Ｄ６多型の遺伝子研究では、ＣＹＰ２Ｄ６の活性な形態と様々な発ガンプロセス（例えば、肺または咽頭のガンなど）との関連が明らかにされた（Ａｇｕｎｄｅｚ  ＪＡ他、２００１、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の機能的に活性な複製は咽頭ガン患者および肺ガン患者の間ではより優勢である、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、６１：５９〜６３）。同様に、ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素の遺伝子型（すなわち、ＣＹＰ２Ｄ６＊４およびＣＹＰ２Ｄ６＊３）が、健康なコントロールおよびＨＣＶ非症状保因者では肝炎／肝硬変患者および肝細胞ガン（ＨＣＣ）患者の場合よりも高頻度であることが見出されていた［Ｓｉｌｖｅｓｔｒｉ  Ｌ他、２００３、ＣＹＰ酵素多型ならびにＨＣＶ関連の慢性肝臓疾患および肝臓ガンに対する感受性、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１０４：３１０〜７；Ａｇｕｎｄｅｚ  ＪＡ他、１９９５、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子および肝臓ガンの危険性、Ｌａｎｃｅｔ、３４５（８９５３）：８３０〜１］。
【０００９】
しかしながら、上記の研究はすべてが肝硬変患者を非肝硬変患者と比較しており、ＨＣＶ感染者における治療の評価に対して著しい影響を有する線維化進行速度に対する考慮を行っていない。
【００１０】
慢性Ｃ型肝炎感染の診断はアラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベルの異常によって示唆されることが多く、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）、続く、ＨＣＶ  ＲＮＡの確認測定によって確立される。Ｃ型肝炎ウイルスに感染している個体は、肝臓生検の組織病理学的評価を使用して疾患の進行についてモニターされる。ＮＩＨ  ＣＯＮＣＥＮＳＵＳ  ＦＲＯＭ  ＪＵＮＥ  ２００２によれば、軽度の線維化を有し、門脈Ｆ１を示す患者は、正常な酵素の存在下でさえ、ＰＥＧ−インターフェロンおよびリバビリンを使用する抗ウイルス治療のための候補者である（Ｓｈｉｆｆｍａｎ  ＭＬ他、２００４；以前の治療に失敗している慢性Ｃ型肝炎患者におけるペグインターフェロンα−２ａおよびリバビリン、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、１２６：１０１５〜２３）。これらの患者の中でも、ＨＣＶ遺伝子型のタイプ１およびタイプ４の保因者はそのような抗ウイルス治療に対してあまり効率的に応答しないことが予想される（ＮＩＨ  Ｃｏｎｓｅｎｓ  Ｓｔａｔｅ  Ｓｃｉ  Ｓｔａｔｅｍｅｎｔｓ、２００２、１９：１〜４６）。しかしながら、ウイルスレベルおよび遺伝子型の決定ならびに肝臓酵素の測定は非侵襲的手法を伴う一方で、疾患段階の決定は、全身麻酔および感染などから生じる他の合併症を伴い得る度重なる肝臓生検に基づいている。
【発明の開示】
【００１１】
従って、上記制限を有しない、ＨＣＶ感染者における線維化進行速度を予測する方法が必要であることが広く認識されており、また、そのような方法を有することは非常に好都合である。
【００１２】
本発明の１つの態様によれば、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにする方法が提供され、この場合、この方法は、この個体のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座、または、このＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合形態またはヘテロ接合形態での存在または非存在を明らかにし、それにより、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにすることを含む。
【００１３】
本発明の別の態様によれば、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにするためのキットが提供され、この場合、このキットは、この個体のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座、または、このＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合形態またはヘテロ接合形態での存在または非存在を明らかにするための少なくとも１つの試薬を含む。
【００１４】
本発明のさらに別の態様によれば、その必要性のある個体において肝臓線維化の早い進行を防止する方法が提供され、この場合、この方法は、この個体の肝臓におけるＣＹＰ２Ｄ６の発現レベルおよび／または活性をアップレギュレーションすることができ、それにより、この個体における肝臓線維化の早い進行を防止することができる薬剤をこの個体に投与することを含む。
【００１５】
本発明のなおさらに別の態様によれば、薬物分子が個体において肝臓線維化の早い進行の発達を誘導または促進することができるかどうかを明らかにする方法が提供され、この場合、この方法は、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素変化体によるこの薬物分子の代謝率を比較することを含み、ＣＹＰ２Ｄ６ではなく、ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素変化体によるこの薬物分子の不良な代謝により、その薬物分子はこの個体における肝臓線維化の早い進行の発達を誘導または促進することができることが示される。
【００１６】
本発明のさらなる態様によれば、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにする方法が提供され、この場合、この方法は、この個体のＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｅ１およびＡＰＯ  Ｅからなる群から選択される遺伝子座、または、この遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合形態またはヘテロ接合形態での存在または非存在を明らかにし、それにより、この個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにすることを含む。
【００１７】
本発明のさらにさらなる態様によれば、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにするためのキットが提供され、この場合、このキットは、この個体のＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｅ１およびＡＰＯ  Ｅからなる群から選択される遺伝子座、または、この遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における、少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合形態またはヘテロ接合形態での存在または非存在を明らかにするための少なくとも１つの試薬を含む。
【００１８】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、前述の個体はＣ型肝炎ウイルスに感染している。
【００１９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６＊４ＳＮＰのアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子である。
【００２０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述の少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は短縮型のＣＹＰ２Ｄ６ポリペプチドをコードする。
【００２１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述の遺伝子型の存在により、前述の個体における肝臓線維化の早い進行を発症させる増大した素因リスクが示される。
【００２２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述の遺伝子型の存在により、肝硬変を発症させる増大した素因リスクが示される。
【００２３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座は、配列番号１０に示されるゲノム配列に含まれる。
【００２４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述の遺伝子型の存在または非存在を明らかにすることは、ＤＮＡ配列決定、制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ分析）、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）分析、変性／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）、一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析、ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）、パイロシーケンシング分析、アシクロプライム分析、リバースドットブロット、ＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブおよびロックド核酸（ＬＮＡ）プローブ、ＴａｑＭａｎ、分子ビーコン、インターカレーション色素、ＦＲＥＴプライマー、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ、遺伝子ビット分析（ＧＢＡ）、多重ミニシーケンシング、ＳＮａＰｓｈｏｔ、ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ、ＭａｓｓＡｒｒａｙ、ＧＯＯＤアッセイ、Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｍｉｎｉｓｅｑ、アレイ型プライマー伸張（ＡＰＥＸ）、マイクロアレイプライマー伸張、Ｔａｇアレイ、コード化ミクロスフェア、テンプレート誘導取り込み（ＴＤＩ）、蛍光分極化、比色法オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ）、配列コード化ＯＬＡ、マイクロアレイ連結、リガーゼ連鎖反応、Ｐａｄｌｏｃｋプローブ、ローリングサークル増幅、ならびに、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイからなる群から選択されるＳＮＰ検出法を使用して行われる。
【００２５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、キットはさらに、少なくとも１つの試薬を包装する包装材と、この包装材内またはこの包装材上における通知とを含み、この場合、この通知により、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにすることにおける使用についてキットが特定される。
【００２６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述の少なくとも１つの試薬は、配列番号４によって示されるＣＹＰ２Ｄ６タンパク質の少なくとも１つの多型体と示差的に結合することができる抗体である。
【００２７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述の個体は、肝炎ウイルス感染、肝毒性、肝臓ガン、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、自己免疫疾患、代謝性肝臓疾患、および、肝臓の二次的関与による疾患からなる群から選択される疾患に罹患している。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述の肝炎ウイルス感染は、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよびＤ型肝炎ウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述の肝毒性はアルコール誘導の肝毒性および／または薬物誘導の肝毒性である。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述の自己免疫疾患は、自己免疫肝炎（ＡＩＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）からなる群から選択される。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述の代謝性肝臓疾患は、ヘモクロマトーシス、ウイルソン病およびアルファ１アンチトリプシンからなる群から選択される。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、肝臓の二次的関与による前述の疾患はセリアック病および／またはアミロイドーシスである。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、アップレギュレーションは、
（ａ）ＣＹＰ２Ｄ６の少なくとも機能的な部分をコードする外因性ポリヌクレオチドを個体の肝臓細胞において発現させること；
（ｂ）個体の肝臓細胞における内因性ＣＹＰ２Ｄ６の発現を増大させること；
（ｃ）個体の肝臓細胞における内因性のＣＹＰ２Ｄ６活性を増大させること；および
（ｄ）ＣＹＰ２Ｄ６発現細胞を個体の肝臓に投与すること
からなる群から選択される少なくとも１つの方法によって行われる。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、ＣＹＰ２Ｄ６は、初期設定済みパラメーターを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号４によって示されるポリペプチドに対して少なくとも７５％同一であるポリペプチドである。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、ＣＹＰ２Ｄ６は配列番号４によって示される。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述のポリヌクレオチドは配列番号５によって示される。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、ＣＹＰ２Ｄ６の前述の不良な代謝酵素変化体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊３およびＣＹＰ２Ｄ６＊５からなる群から選択される。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、ＣＹＰ２Ｄ６は、ＣＹＰ２Ｄ６の少なくとも機能的な形態をコードするポリヌクレオチドから発現される。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述のＣＹＰ２Ｄ６の前述の不良な代謝酵素変化体は、短縮型のＣＹＰ２Ｄ６ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドから発現される。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述のＣＹＰ３Ａ５遺伝子座における前述の少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１８のヌクレオチド座標１７４におけるアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子である。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述のＣＹＰ２Ｅ１遺伝子座における前述の少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１７のヌクレオチド座標１７７２におけるチミジンヌクレオチド含有対立遺伝子である。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらにさらなる特徴によれば、前述のＡＰＯ  Ｅ遺伝子座における前述の少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１９のヌクレオチド座標５５におけるシトシンヌクレオチド含有対立遺伝子である。
【００４３】
本発明は、肝臓線維化の早い進行に対する素因を明らかにする方法を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００４４】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００４５】
図面の説明
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
【００４６】
図１は、感染継続期間および感染時年齢を関数とする肝硬変への進行速度を例示する、Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ．他、２００１、Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３４：７３０〜７３９から採用されたグラフである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４７】
本発明は、抗ウイルス治療に対するＣ型肝炎感染者の適合性を明らかにするために使用することができる、肝臓線維化の早い進行に対する素因を明らかにする方法に関する。加えて、本発明は、肝臓線維化の早い進行を防止することにおいて有用な方法および医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明による肝臓線維化の素因を明らかにしその早い進行を防止する方法の原理および作用が、図面および付随する説明を参照してより十分に理解することができる。
【００４９】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施することができ、または、様々な方法で実施される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００５０】
慢性Ｃ型肝炎は、世界中で約１億７千万人が罹患する一般的な疾患である［ＬａｕｅｒおよびＷａｌｋｅｒ、２００１（上掲）］。ＨＣＶ感染者の中で、１５％〜２０％が、多くの場合には末期肝硬変に進行する肝臓線維化を発症する［Ｓｅｅｆｆ、２０００（上掲）］。現在、ＨＣＶ感染者のどのくらいが肝臓線維化を発症するかを予測する手段は何一つない。加えて、感染した時から肝硬変の出現までの継続期間は個体間で異なり、予測することができない［Ｐｏｙｎａｒｄ、１９９７（上掲）］。その上、いくつかの宿主要因（例えば、高齢、男性、アルコール摂取および免疫抑制治療など）が肝臓線維化および肝硬変に関連することが見出されていた［Ｐｏｙｎａｒｄ、１９９７（上掲）］。線維化速度に影響を及ぼし得る他の宿主要因（例えば、喫煙およびボディーマス指数など）が依然として研究中である［Ｆｅｌｄｍａｎ、２００２（上掲）］。
【００５１】
肝臓線維化の一因となる遺伝的要因を特定しようとする以前の試みでは、ヘモクロマトーシス遺伝子（ＨＦＥ）［Ｓｍｉｔｈ、１９９８（上掲）］、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ遺伝子（Ｇｈｏｂａｄｌｏｏ  ＳＭ他、２００４、Ｊ．Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ．Ｓｕｒｇ．８：４２３〜７）、ＩＬ１ＲＡサイトカイン遺伝子（Ｂａｈｒ  ＭＪ他、２００３、Ｌｉｖｅｒ  Ｉｎｔ．２３：４２０〜５）およびミエロペルオキシダーゼ（ＭＰＯ）遺伝子（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ  ＷＦ他、２００２、Ｇｅｎｅｓ  Ｉｍｍｕｎ．３：３４５〜９）における遺伝子多型が肝硬変に関連することが明らかにされていた。他の研究では、肝硬変におけるＣ２８２Ｙ多型の役割に関して矛盾する結果が明らかにされていた［Ｓｍｉｔｈ、１９９８（上掲）；Ｔｕｎｇ、２００３（上掲）］。しかしながら、これらの研究はすべてが肝硬変患者と非肝硬変患者との間での遺伝子多型の存在率を比較しており、ＨＣＶ感染者における治療の評価に対する著しい影響を有する線維化進行速度に対する考慮を行っていなかった。
【００５２】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、肝臓線維化および肝硬変に早く進行するＨＣＶ感染者（すなわち、「早い線維形成者」）、または、遅く進行するＨＣＶ感染者（すなわち、「遅い線維形成者」）の間での遺伝子多型の存在率を比較し、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座における遺伝子型を肝硬変の早い進行と関連づけている。
【００５３】
下記の実施例の節の実施例１において示されるように、本研究は結論として、ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素形態をコードするＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子が、早い肝臓線維形成者の間では遅い肝臓線維形成者の場合よりも一般的であることを示している。その上、ＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子のヘテロ接合個体および／またはホモ接合個体の頻度が、早い肝臓線維形成者の間では遅い肝臓線維形成者の場合よりも大きく、このことは、ＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子が、早い肝臓線維化に対する素因を明らかにすることにおいて使用されることを示唆している。
【００５４】
従って、本発明の１つの態様によれば、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにする方法が提供される。
【００５５】
本明細書中で使用される用語「個体」には、老若男女が含まれる。好ましくは、この用語は、肝臓線維化を発症する危険性がある個体、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスまたは他の肝毒性ウイルス（例えば、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎）に感染している個体、毎日２単位を超えるアルコールの摂取または肝毒性薬物に起因する肝毒性に苦しんでいる個体、肝臓ガン、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、自己免疫疾患（例えば、自己免疫肝炎（ＡＩＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）など）、代謝性肝臓疾患（例えば、ヘモクロマトーシス、ウイルソン病およびアルファ１アンチトリプシンなど）、および／または、肝臓の二次的関与による疾患（例えば、セリアック病またはアミロイドーシスなど）を有する個体を包含する。好ましくは、本発明の個体は、Ｃ型肝炎ウイルスに感染しているヒトである。
【００５６】
本明細書中で使用される用語「素因を有する」は、肝臓線維化の早い進行に関連して使用されるとき、素因を有しない個体よりも、肝臓線維化の早い進行を発症する可能性が大きい個体を示す。
【００５７】
肝臓線維化は、肝臓組織内の線維性組織（すなわち、死細胞の瘢痕組織）の存在によって特徴づけられる。肝臓線維化は、例えば、Ｃ型肝炎ウイルスによる感染に起因する肝臓の慢性的炎症の結果であることが多い。慢性的炎症は、肝臓構造の変化、血液循環の低下および肝臓細胞の壊死（すなわち、死）をもたらす。肝臓線維化の存在を評価する様々な方法が当該分野では知られている。例えば、下記の実施例の節の実施例１において示されるように、肝臓線維化の存在を、肝臓生検の組織病理学所見を使用して検出することができる。従って、肝臓生検の悪性度および段階を、下記の分類からなるＢａｔｔｓおよびＬｕｄｗｉｇのシステム（Ｂ＆Ｌ）に従って評価することができる：１−門脈の線維化；２−門脈周囲の線維化；３−中隔の線維化；４−肝硬変。加えて、肝臓線維化を、臨床的所見（例えば、門脈高圧症の徴候など）、ならびに、研究室所見および適切な放射線学所見を使用して検出することができる。
【００５８】
本明細書中で使用される表現「肝臓線維化の早い進行」は、Ｐｏｙｎａｒｄの線維化進行モデル（Ｐｏｙｎａｒｄ他、２００１、慢性Ｃ型肝炎患者における肝臓線維化進行の速度および危険性因子、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３４：７３０〜９）に基づいて感染時の個体の年齢に従って予想されるよりも短い期間での肝臓線維化の発症を示す。例えば、２０歳未満の若年個体における肝臓線維化の通常の進行速度は４０年である。他方で、４０歳以上で感染する個体は感染時から１０年〜２０年の後に肝臓線維化を発症する。従って、早く進行する肝臓線維化は、本明細書中では、Ｐｏｙｎａｒｄの線維化進行モデルに従って予想されるよりも少なくとも５年短い（より好ましくは、予想されるよりも少なくとも１０年短い、最も好ましくは、予想されるよりも少なくとも２０年短い）期間で発生する線維化として定義される。
【００５９】
この方法は、個体のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座、または、このＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合形態またはヘテロ接合形態での存在または非存在を明らかにし、それにより、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにすることによって行われる。
【００６０】
本明細書中で使用される用語「ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座」は、チトクロームＰ４５０／ファミリー２／サブファミリー２／ポリペプチド６（ＣＹＰ２Ｄ６）をコードし、第２２染色体の長腕（２２ｑ１３．１）において２つのチトクロームＰ４５０偽遺伝子の間に位置する遺伝子を包含するヒトゲノム内の特定のＤＮＡ配列領域を示す。ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質は、デブリソキン（アドレナリン作動性遮断薬）、スパルテインおよびプロパフェノン（ともに抗不整脈剤）、ならびに、アミトリプチリン（抗うつ薬）をはじめとする５０を超える臨床的に重要な薬物の代謝に関与するモノオキシゲナーゼ酵素である［Ｈａｓｌｅｒ、１９９９（上掲）］。ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における遺伝子多型は様々な形態のＣＹＰ２Ｄ６タンパク質をもたらし、そのうちのＣＹＰ２Ｄ６＊３、ＣＹＰ２Ｄ６＊４およびＣＹＰ２Ｄ６＊５（Ｈｅｒｓｂｅｒｇｅｒ  Ｍ他、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４６：１０７２〜７）は不良な薬物代謝酵素を表す（Ｎｅｌｓｏｎ  ＤＲ、チトクロームＰ４５０命名法、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９８、１０７：１５〜２４）。用語「ホモ接合」または用語「ヘテロ接合」は、ある種の多型の２つの同一対立遺伝子または２つの異なる対立遺伝子をそれぞれ示す。
【００６１】
用語「多型」は、より希な形態（または最も希な形態）が頻発的な変異だけによって維持され得ない頻度で、特定の核酸または核酸配列（例えば、遺伝子）の２つ以上の遺伝子的に決定された変化体形態（対立遺伝子）が存在することを示す。多型の非限定的な一例が、配列番号１によって示され、ＣＹＰ２Ｄ６＊４多型をコードする、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子（配列番号６、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ３３３８８）の３４６５位でのＧ／Ａ置換である。
【００６２】
下記の実施例の節の表３に示されるように、本発明者らは、不良な代謝酵素の多型体をコードする、配列番号１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６＊４ＳＮＰのアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子が、早い線維形成者（すなわち、肝臓線維化の早い進行を示す個体）の間では遅い線維形成者（すなわち、肝臓線維化の進行が遅い個体）よりも一般的であることを発見している（ｐ値＝０．０１６６）。その上、下記の実施例の節の表３および表４に示されるように、不良な代謝酵素の対立遺伝子（すなわち、ＣＹＰ２Ｄ６＊４ＳＮＰのアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子）に対してヘテロ接合個体および／またはホモ接合個体は、早い線維形成者群では遅い線維形成者群よりも著しく一般的であった（ｐ値＝０．０２２、ＯＲ＝１１．７、９５％のＣＩ  １．４〜９５．２７）。
【００６３】
加えて、さらには、下記の実施例の節の表７および表８に示され、また、実施例２に記載されるように、さらなる３２名の慢性ｈＣＶ患者がＣＹＰ２Ｄ６＊４ＳＮＰの存在または非存在について調べられた際、ＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子の頻度の全体的な差が、早い線維形成者群では約３３％であり、遅い線維形成者群では約１３％にすぎなかった。加えて、ＣＹＰ２Ｄ６＊４保因者の全体的な頻度が、早い線維形成者群の間では約５１％であり、遅い線維形成者群の間では約２２％にすぎなかった。
【００６４】
ＣＹＰ２Ｄ６＊４多型は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の第３イントロンと第４エキソンとの接合部におけるＡＧスプライスアクセプター部位のグアニンヌクレオチドがアデノシンヌクレオチドにより置換され（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ３３３８８における３４６５でのＧ−＞Ａ）、これにより、短縮型のＣＹＰ２Ｄ６タンパク質をもたらすスプライス変異をコードする。
【００６５】
従って、本発明の好ましい実施形態によれば、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、（少なくとも１つの内部アミノ酸領域または末端アミノ酸領域の欠失を有する）ＣＹＰ２Ｄ６ポリペプチドの短縮型形態（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６＊４多型体、ＣＹＰ２Ｄ６＊３多型体および／またはＣＹＰ２Ｄ６＊５多型体など）をコードする。好ましくは、本発明のそのような早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６＊４ＳＮＰのアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子である。
【００６６】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の方法はまた、隣接遺伝子座に存在し、かつ、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座における早い進行の肝臓線維化関連ＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを特定することによって行うことができる。
【００６７】
表現「隣接遺伝子座」は、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座の極近傍に存在し、かつ、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座におけるＳＮＰと連鎖不平衡にある他のＳＮＰを含むＤＮＡ配列（遺伝子または遺伝子間配列のいずれか）を記載するために本明細書中では使用される。
【００６８】
表現「連鎖不平衡」（ＬＤ）は、２つの隣接する多型遺伝子型の間での統計学的相関を記載するために使用される。典型的には、ＬＤは、配偶子間でのＨａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ平衡（統計学的独立性）を仮定したときの２つの遺伝子座における任意の配偶子の対立遺伝子の間での相関を示す。ＬＤは、Ｌｅｗｏｎｔｉｎの関連パラメーター（Ｄ’）またはＰｅａｒｓｏｎ相関係数（ｒ）のいずれかを用いて定量化される［Ｄｅｖｌｉｎ  Ｂ、Ｒｉｓｃｈ  Ｎ（１９９５）、詳細なマッピングのための連鎖不平衡量の比較、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、２９：３１１〜３２２］。ＬＤ値が１である２つの遺伝子座は完全ＬＤであると言われる。もう一方の極端な場合において、ＬＤが０である２つの遺伝子座は連鎖平衡にあると称される。連鎖不平衡は、ハプロタイプの頻度を推定するための期待値最大化アルゴリズム（ＥＭ）の適用に従って計算される［Ｓｌａｔｋｉｎ  Ｍ、Ｅｘｃｏｆｆｉｅｒ  Ｌ（１９９６）、期待値最大化アルゴリズムを使用する遺伝子型データにおける連鎖不平衡についての試験、Ｈｅｒｅｄｉｔｙ、７６：３７７〜８３］。好ましくは、隣接遺伝子型／遺伝子座についての本発明によるＬＤ値は０．１超（好ましくは０．２超、より好ましくは０．５超、より好ましくは０．６超、さらに一層より好ましくは０．７超、好ましくは０．８超、より好ましくは０．９超、理想的には約１．０）〜１．０で選択される。
【００６９】
隣接遺伝子座に存在するが、ＣＹＰ２Ｄ６＊４多型との連鎖不平衡状態が未だ不明であるＳＮＰが本発明とともに使用され得ることが理解される。そのようなＳＮＰが、配列番号１０に示されるゲノム配列において見出され得る。
【００７０】
その上、他のチトクロームＰ４５０タンパク質の不良な代謝酵素変化体、例えば、ＣＹＰ２Ｃ１９［例えば、ＣＹＰ２Ｃ１９＊２、ＣＹＰ２Ｃ１９＊３、ＣＹＰ２Ｃ１９＊４、ＣＹＰ２Ｃ１９＊７、ＣＹＰ２Ｃ１９＊８（Ｉｂｅａｎｕ  ＧＣ他、１９９９、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９０、６３５〜４０）］、ＣＹＰ２Ａ６［例えば、ＣＹＰ２Ａ６＊４、Ｔ１４１２Ｃ（Ｉｌｅ４７１Ｔｈｒ、Ａｒｉｙｏｓｈｉ，Ｎ．他、２００１、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８１：８１０〜４）、ＣガンマＰ２Ａ６ｖ１、ＣガンマＰ２Ａ６ｖ２、または、ＣガンマＰ２Ａ６遺伝子の欠失対立遺伝子（Ｎａｋａｊｉｍａ  Ｍ他、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．６７：５７〜６９）］、ＣＹＰ２Ｃ９（例えば、ＣＹＰ２Ｃ９＊１、ＣＹＰ２Ｃ９＊３）、ＣＹＰ３Ａ４およびＣＹＰ２Ｅ１（例えば、ＣＹＰ２Ｅ１＊５Ｂ、Ａｂｄｅｌ−Ｒａｈｍａｎ，ＳＺ．他、２０００、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１０：２３９〜４９）などもまた本発明とともに使用することができる。
【００７１】
肝臓線維化の早い進行に対する素因は、遺伝子型の相対的危険性（ＧＲＲ）値を作製および使用することによって定量化することができる。ＧＲＲは、肝臓線維化の早い進行を発症する特定の遺伝子型を有する個体の増大した可能性である。従って、保護的な遺伝子型Ｇ０に対する危険性遺伝子型ＧのＧＲＲは、肝臓線維化の早い進行を発症する遺伝子型Ｇを保有する個体の危険性と、肝臓線維化の早い進行を発症する遺伝子型Ｇ０を保有する個体の危険性との比率である。本明細書中で使用されるＧＲＲは、症例者および対照者におけるＧ対Ｇ０の適切なオッズ比（ＯＲ）に換算して表される。その上、ハプロタイプのＧＲＲのコンピューター計算は、ホモ接合体個体のＧＲＲがヘテロ接合体個体のＧＲＲの平方である乗法モデルに基づいている。さらなる詳細については、ＲｉｓｃｈおよびＭｅｒｉｋａｎｇａｓ、１９９６［複雑なヒト疾患の遺伝子研究の将来、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２７３：１５１６〜１５１７］を参照のこと。
【００７２】
計算すると、ＧＲＲは、肝臓線維化の早い進行を発症する特定のＣＹＰ２Ｄ６遺伝子型を有する個体における増大した素因リスクを反映し得る。
【００７３】
肝臓線維化の早い進行はまた、肝実質が悪化し、小葉に脂肪が浸潤し、高密度の小葉周囲での結合組織が形成される変性疾患である肝硬変をもたらし得る。生存する細胞は再生し、血液供給が低下した生細胞の「島」を形成する。肝硬変プロセスが継続するにつれ、肝臓を通過する血液の流れが低下し、門脈高圧症、低下した肝機能、および、究極的には死をもたらす。
【００７４】
ＣＹＰ２Ｄ６＊４多型体と、肝臓線維化の発症に対する増大した素因との関連により、肝臓線維化の早い進行および／または肝硬変に対する素因を有する個体を特定するために使用することができ、従って、そのような個体における適正な治療療法の選択を可能にし得るツールが提供される。
【００７５】
そのような個体の特定は、ＤＮＡサンプルを個体から得ること、および、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型（すなわち、配列番号６によって示されるようなＣＹＰ２Ｄ６遺伝子の３４６５位でのＧ／Ａ遺伝子型またはＡ／Ａ遺伝子型）の存在または非存在についてサンプルを調べることによって行われる。ＤＮＡサンプルは、末梢血細胞（シリンジを使用して得られる）、皮膚細胞（皮膚生検物から得られる）、口内上皮細胞（口内洗浄液から得られる）など（これらに限定されない）をはじめとする個体の任意の細胞供給源から得ることができる。好ましくは、ＤＮＡサンプルは末梢血サンプルから得られる。ＤＮＡを血液サンプルから抽出する様々な方法が当該分野では広く知られている。
【００７６】
遺伝子型に関連して本明細書中で使用される用語「非存在」は特定の遺伝子型決定試験の負の結果を記載する。例えば、遺伝子型決定試験が、配列番号１に示されるようなＣＹＰ２Ｄ６＊４ＳＮＰのグアニンヌクレオチド含有対立遺伝子を特定するために好適であり、かつ、検査が行われる個体がＣＹＰ２Ｄ６＊４ＳＮＰのアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子についてホモ接合体であるならば、試験の結果は「遺伝子型の非存在」である。
【００７７】
肝臓線維化の早い進行に関連する遺伝子型は、配列の異常を特定するために好適な様々な方法を使用して特定することができる。１つの選択肢は、ＰＣＲ反応生成物の全遺伝子配列を決定することである。あるいは、核酸の所与のセグメントをいくつかの他のレベルで特徴づけることができる。最も低い分解能では、分子のサイズを、同じゲルでの既知の標準物の泳動に対して比較することにより電気泳動によって決定することができる。分子のより詳細な像が、整理されたマップの構築を可能にするための電気泳動前の制限酵素の組合せによる切断によって達成され得る。フラグメント内の特定の遺伝子の存在を、標識されたプローブのハイブリダイゼーションによって検出することができ、あるいは、精密なヌクレオチド配列を部分的な化学的分解または鎖停止ヌクレオチドアナログの存在下でのプライマー伸張によって決定することができる。
【００７８】
下記は、上記で記載されたＳＮＰの１つまたは複数を特定するために使用することができるＳＮＰ検出方法の非限定的な列挙である。
【００７９】
制限フラグメント長多型（ＲＦＬＰ）：この方法では、ＲＦＬＰの生成または破壊をもたらす、制限酵素のための認識部位を変化させるシングルヌクレオチド（ＳＮＰヌクレオチド）での変化が使用される。
【００８０】
例えば、ＲＦＬＰを、個体のゲノムＤＮＡにおけるＣＹＰ２Ｄ６＊４変化体を検出するために使用することができる。簡単に記載すると、ゲノムＤＮＡを、ＣＹＰ２Ｄ６＊４フォワードＰＣＲプライマー（配列番号２）およびＣＹＰ２Ｄ６＊４リバースＰＣＲプライマー（配列番号３）を使用して増幅し、得られたＰＣＲ産物を、制限酵素（例えば、配列番号６の３４６５位に（Ａ対立遺伝子ではなく）Ｇ対立遺伝子を含有するＰＣＲ産物を示差的に消化することができるＭｖａＩなど）を使用する消化に供する。
【００８１】
ＤＮＡヘテロ二重鎖におけるシングルヌクレオチドのミスマッチはまた、いくつかの化学試薬によって認識および切断され、これにより、「ミスマッチ化学的切断」（ＭＣＣ）と一般には呼ばれる、一塩基置換を検出する代わりの方法が提供される（Ｇｏｇｏｓ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：６８０７〜６８１７、１９９０）。しかしながら、この方法では、四酸化オスミウムおよびピペリジン（臨床研究室での使用には適さない２つの非常に有害な薬品）の使用が要求される。
【００８２】
対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）：この方法では、プライマー伸張または連結の事象がマッチまたはミスマッチの指標として使用され得るように、対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）が、多型ヌクレオチドの近くでハイブリダイゼーションするように設計される。放射能標識された対立遺伝子特異的なオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）とのハイブリダイゼーションはまた、特定のＳＮＰの検出にも適用されている（Ｃｏｎｎｅｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８０：２７８〜２８２、１９８３）。この方法は、シングルヌクレオチドによって異なる短いＤＮＡフラグメントの融解温度が異なることに基づいている。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件および洗浄条件により、変異型対立遺伝子および野生型対立遺伝子を識別することができる。
【００８３】
ＣＹＰ２Ｄ６＊４多型の存在を特定するために本発明とともに使用することができる好適なＡＳＯプローブには、ＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子に示差的にハイブリダイゼーションすることができる５’−ＡＧＧＧＧＣＧＴＣＴＴＧＧＧＧプローブ（配列番号９）、および、野生型対立遺伝子（すなわち、ＣＹＰ２Ｄ６）に示差的にハイブリダイゼーションすることができる５’−ＡＧＧＧＧＣＧＴＣＣＴＧＧＧＧプローブ（配列番号８）が含まれる。
【００８４】
変性／温度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ／ＴＧＧＥ）：２つの他の方法は、小さな配列変化に対する応答における電気泳動移動度の変化を検出することに依る。これらの方法の１つが「変性勾配ゲル電気泳動」（ＤＧＧＥ）と呼ばれており、これは、わずかに異なる配列が、勾配ゲルで電気泳動により分離されたとき、局所的融解の異なるパターンを示すという観察結果に基づいている。このように、シングルヌクレオチドが異なるヘテロ二重鎖に対するホモ二重鎖の融解特性の違いにより、それらの電気泳動移動度が対応して変化するために標的配列におけるＳＮＰの存在を検出することができるので、変化体を区別することができる。分析されるフラグメント（通常の場合にはＰＣＲ産物）は、鎖の完全な解離を伴うことなく目的とする配列の完全な変性を可能にするために長い領域のＧ−Ｃ塩基対（３０〜８０）によって一方の端部で「固定」される。ＤＮＡフラグメントへのＧＣ「クランプ」の結合は、ＤＧＧＥによって認識され得る変異の割合を増大させる（Ａｂｒａｍｓ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、７：４６３〜４７５、１９９０）。ＧＣクランプを１つのプライマーに結合することは、増幅された配列が低い解離温度を有すること確保するために重要である（Ｓｈｅｆｆｉｅｌｄ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８６：２３２〜２３６、１９８９；ＬｅｒｍａｎおよびＳｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５５：４８２〜５０１、１９８７）。この技術の様々な改変が、温度勾配を使用して開発されており（Ｗａｒｔｅｌｌ他、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：２６９９〜２７０１、１９９０）、この方法はまたＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖にも適用することができる（Ｓｍｉｔｈ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、３：２１７〜２２３、１９８８）。
【００８５】
ＤＧＧＥの有用性に対する制限には、変性条件を、試験されるＤＮＡの各タイプについて最適化しなければならないことが要求されることが含まれる。さらには、この方法では、ゲルを調製し、かつ、必要となる高い温度を電気泳動期間中に維持するための特別な設備が要求される。それぞれの配列が試験されるための１つのオリゴヌクレオチドでの固定用テールの合成に関連する費用もまた大きな検討事項である。加えて、長い泳動時間がＤＧＧＥのために要求される。ＤＧＧＥの長い泳動時間は、定常変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）と呼ばれるＤＧＧＥの改変法では短縮された（Ｂｏｒｒｅｎｓｅｎ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８８：８４０５、１９９１）。ＣＤＧＥでは、ＳＮＰの検出のための高い効率を達成するために、ゲルが種々の変性条件のもとで行われることが要求される。
【００８６】
温度勾配ゲル電気泳動（ＴＧＧＥ）と呼ばれる、ＤＧＧＥに類似する技術では、化学的な変性勾配ではなく、温度勾配が使用される（Ｓｃｈｏｌｚ他、Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．２：２１５５、１９９３）。ＴＧＧＥでは、電場に対して直交的に配向する温度勾配を生じさせることができる特別な設備を使用することが要求される。ＴＧＧＥでは、変異をＤＮＡの比較的小さいフラグメントにおいて検出することができ、従って、大きい遺伝子セグメントの走査では、ゲルを泳動する前に、多数のＰＣＲ産物の使用が要求される。
【００８７】
一本鎖ＤＮＡ高次構造多型（ＳＳＣＰ）：「一本鎖ＤＮＡ高次構造多型」（ＳＳＣＰ）と呼ばれる別の一般的な方法が、Ｈａｙａｓｈｉ、Ｓｅｋｙａおよび共同研究者によって開発され（Ｈａｙａｓｈｉ（ＰＣＲ  Ｍｅｔｈ．Ａｐｐｌ．１：３４〜３８、１９９１）によって総説される）、これは、核酸の一本鎖が非変性条件では特徴的な立体配座を取ることができ、このような立体配座が電気泳動度に影響を及ぼすという観察結果に基づいている。相補的な鎖は、一方の鎖が反対側の鎖から分離し得る十分に異なる構造を取る。フラグメント内の配列の変化は立体配座をも変化させ、その結果として、移動度を変化させ、かつ、このことを配列変化についてのアッセイとして使用することを可能にする（Ｏｒｉｔａ他、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ、５：８７４〜８７９、１９８９）。
【００８８】
ＳＳＣＰプロセスでは、両方の鎖において標識されるＤＮＡセグメント（例えば、ＰＣＲ産物）を変性させること、その後、分子内相互作用が泳動期間中に形成され、かつ、破壊され得ないように非変性ポリアクリルアミドゲルでのゆっくりとした電気泳動分離を行うことが伴う。この技術はゲルの組成および温度における変動に対して極めて敏感である。この方法の一連の制限は、明らかに類似する条件のもとでも、異なる研究室で得られたデータを比較する際に直面する相対的な困難である。
【００８９】
ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）：ジデオキシフィンガープリンティング（ｄｄＦ）は、変異の存在について遺伝子を走査するために開発された別の技術である（ＬｉｕおよびＳｏｍｍｅｒ、ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉ．４：９７、１９９４）。ｄｄＦ技術は、Ｓａｎｇｅｒジデオキシ配列決定の構成要素をＳＳＣＰと組み合わせたものである。ジデオキシ配列決定反応が、１つのジデオキシターミネーターを使用して行われ、その後、反応生成物が、ＳＳＣＰ分析でのように停止セグメントの移動度の変化を検出するために非変性ポリアクリルアミドゲルで電気泳動される。ｄｄＦは、増大した感度の点でＳＳＣＰを上回る改善である一方で、ｄｄＦでは、高価なジデオキシヌクレオチドの使用が要求され、また、この技術は依然として、ＳＳＣＰのために好適なサイズのフラグメント（すなわち、変異の最適な検出のためには２００塩基〜３００塩基のフラグメント）の分析に限定されている。
【００９０】
上記の制限に加えて、これらの方法はすべてが、分析することができる核酸フラグメントのサイズに関して制限される。直接的な配列決定法については、６００塩基対を超える配列では、フラグメント全体を覆うために、クローン化が必要であり、その結果としての遅延、および、欠失サブクローニングまたはプライマーウォーキングのいずれかの負担が伴う。ＳＳＣＰおよびＤＧＧＥでは、さらに一層厳しいサイズ制限がある。配列変化に対する低下した感度のために、これらの方法は、より大きなフラグメントには適していないと考えられる。ＳＳＣＰは、報告によれば、２００塩基対のフラグメントにおいて９０％の一塩基置換を検出することができるが、その検出は４００塩基対のフラグメントについては５０％未満に低下する。同様に、ＤＧＧＥの感度は、フラグメントの長さが５００塩基対に達するにつれて低下する。ｄｄＦ技術は、直接的な配列決定およびＳＳＣＰの組合せとして、スクリーニングすることができるＤＮＡの比較的小さいサイズによってもまた制限される。
【００９１】
Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（商標）分析（Ｐｙｒｏｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，Ｉｎｃ．Ｗｅｓｔｂｏｒｏｕｇｈ、ＭＡ、米国）：この技術は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰスルフリラーゼ、ルシフェラーゼおよびアピラーゼの各酵素ならびにアデノシン５’ホスホスルファート（ＡＰＳ）およびルシフェリン基質の存在下での一本鎖のＰＣＲ増幅されたＤＮＡテンプレートに対する配列決定用プライマーのハイブリダイゼーションに基づいている。第２工程において、４つのうちの最初のデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）が反応に加えられ、そのデオキシヌクレオチド三リン酸がテンプレート鎖において塩基に対して相補的であるならば、ＤＮＡポリメラーゼがＤＮＡ鎖内へのそのデオキシヌクレオチド三リン酸の取り込みを触媒する。それぞれの取り込み事象には、取り込まれたヌクレオチドの量に対して等モル量でのピロリン酸（ＰＰｉ）の放出が付随する。最後の工程において、ＡＴＰスルフリラーゼがアデノシン５’ホスホスルファートの存在下でＰＰｉをＡＴＰに定量的に変換する。このＡＴＰは、ＡＴＰの量に比例する量で可視光を生じさせるオキシルシフェリンへのルシフェリンのルシフェラーゼ媒介の変換を行わせる。ルシフェラーゼにより触媒される反応で生じた光が電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラによって検出され、ｐｙｒｏｇｒａｍ（商標）におけるピークとして見られる。それぞれの光シグナルが、取り込まれたヌクレオチドの数に比例している。
【００９２】
Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ（商標）分析（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｂｏｓｔｏｎ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、米国）：この技術は蛍光分極化（ＦＰ）検出に基づいている。目的するＳＮＰを含有する配列のＰＣＲ増幅後、過剰なプライマーおよびｄＮＴＰ類がエビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）およびエキソヌクレアーゼＩとのインキュベーションにより除かれる。これらの酵素が熱により不活化されると、Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅ−ＦＰプロセスでは、熱安定ポリメラーゼが、２つの蛍光ターミネーターの一方を、ＳＮＰ部位のすぐ上流側で停止するプライマーに付加するために使用される。添加されたターミネーターはその増大したＦＰによって特定され、元のＤＮＡサンプルに存在する対立遺伝子を表す。Ａｃｙｃｌｏｐｒｉｍｅプロセスでは、ＡｃｙｃｌｏＰｏｌ（商標）（Ａｒｃｈｅｏｎ科から得られる新規な変異型熱安定ポリメラーゼ）、ならびに、目的とするＳＮＰについての可能性のある対立遺伝子を表す、Ｒ１１０およびＴＡＭＲＡにより標識された１対のＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）が使用される。ＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ（商標）非ヌクレオチドアナログは様々なＤＮＡポリメラーゼとともに生物学的に活性である。２’，３’−ジデオキシヌクレオチド−５’−三リン酸と同様に、非環状アナログは鎖ターミネーターとして機能する。このアナログはＤＮＡ鎖の３’末端に塩基特異的な様式でＤＮＡポリメラーゼによって取り込まれ、そして、３’−ヒドロキシルが存在しないので、鎖のさらなる伸張において機能することができない。ＡｃｙｃｌｏＰｏｌは、様々なＴａｑ変異体が誘導体化２’，３’−ジデオキシヌクレオチドターミネーターに対して有するよりも、誘導体化されたＡｃｙｃｌｏＴｅｒｍｉｎａｔｏｒに対する大きな親和性および特異性を有することが見出されている。
【００９３】
リバースドットブロット：この技術では、標識された配列特異的なオリゴヌクレオチドプローブと、非標識の核酸サンプルとが使用される。活性化された第一級アミンコンジュゲート化オリゴヌクレオチドがカルボキシル化ナイロンメンブランに共有結合的に結合させられる。ハイブリダイゼーションおよび洗浄の後、標識されたプローブまたはプローブの標識されたフラグメントを、オリゴマー制限（すなわち、制限酵素による二重鎖ハイブリッドの消化）を使用して放出させることができる。円形のスポットまたは線が、ストレプトアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼのインキュベーションの使用、それに続く、テトラメチルベンジジンおよび過酸化水素を使用する発色によって、または、アビジン−アルカリホスファターゼコンジュゲートと、酵素活性化に敏感な発光性基質（例えば、ＣＳＰＤなど）とのインキュベーションの後での化学発光、それに続く、Ｘ線フィルムへの感光によって、ハイブリダイゼーションの後で比色的に可視化される。
【００９４】
ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）分析（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ、米国）。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）装置は、サーモサイクラーおよびオンライン検出用の蛍光計成分からなる。増幅によって形成されたＰＣＲ産物が、２つの配列特異的なオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブにカップリングされた蛍光団によってオンラインで検出される。オリゴヌクレオチドの一方がその３’末端にフルオレセイン標識を有し（ドナーオリゴヌクレオチド）、もう一方のオリゴヌクレオチドがその５’末端においてＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）−Ｒｅｄ６４０により標識される（アクセプターオリゴヌクレオチド）。両方の標識されたＤＮＡプローブがそれらのテンプレートにハイブリダイゼーションしたとき、エネルギーが、特定の波長を有する外部光源を使用するドナー蛍光団の励起の後でドナー蛍光団からアクセプター蛍光団に移動する。アクセプター蛍光団によって放射される光を規定された波長で検出することができる。この光シグナルの強度はＰＣＲ産物の量に比例している。
【００９５】
例えば、下記の実施例の節の実施例１において示されるように、ＣＹＰ２Ｄ６＊４フォワードＰＣＲプライマーおよびＣＹＰ２Ｄ６＊４リバースＰＣＲプライマー（それぞれ、配列番号２および配列番号３）が、ＣＹＰ２Ｄ６＊４多型の存在を検出するためにアンカープローブおよび変異プローブ（それぞれ、配列番号７および配列番号８）を使用してＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）によってさらに分析することができる３４７ｂｐのＰＣＲ産物を増幅するために使用された。
【００９６】
ＳＮＰ検出の分野における進歩により、下記のようなさらなる正確で、容易で、かつ、費用のかからない大規模なＳＮＰ遺伝子型決定技術が提供されていることが理解される：例えば、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ、Ｈｏｗｅｌｌ，Ｗ．Ｍ．他、１９９９、動的対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション（ＤＡＳＨ）、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：８７〜８）、マイクロプレートアレイ対角ゲル電気泳動［ＭＡＤＧＥ、Ｄａｙ，Ｉ．Ｎ．他、１９９５、マイクロプレートアレイ対角ゲル電気泳動（ＭＡＤＧＥ）のために配置されたウエルを伴う水平ポリアクリルアミドゲルを使用するハイスループット遺伝子型決定、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１９：８３０〜５］、ＴａｑＭａｎシステム（Ｈｏｌｌａｎｄ，Ｐ．Ｍ．他、１９９１、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼの５’−＞３’エキソヌクレアーゼ活性を利用することによる特異的なポリメラーゼ連鎖反応生成物の検出、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８８：７２７６〜８０）、ならびに、様々なＤＮＡ「チップ」技術、例えば、米国特許第６３０００６３号（Ｌｉｐｓｈｕｔｚ他、２００１）（これは参照として全てが本明細書中に組み込まれる）に開示されるＧｅｎｅＣｈｉｐマイクロアレイ（例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＳＮＰチップ）、Ｇｏｅｌｅｔ，Ｐ．他（ＰＣＴ出願番号９２／１５７１２）によって記載されるＧｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（ＧＢＡ（商標））、ペプチド核酸プローブ（ＰＮＡ、Ｒｅｎ  Ｂ他、２００４、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３２：ｅ４２）およびロックド核酸プローブ（ＬＮＡ、Ｌａｔｏｒｒａ  Ｄ他、２００３、Ｈｕｍ．Ｍｕｔａｔ．２２：７９〜８５）、分子ビーコン（Ａｂｒａｖａｙａ  Ｋ他、２００３、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ、４１：４６８〜７４）、インターカレーション色素［Ｇｅｒｍｅｒ，Ｓ．およびＨｉｇｕｃｈｉ，Ｒ．オリゴヌクレオチドプローブを用いないシングルチューブでの遺伝子型決定、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．９：７２〜７８（１９９９）］、ＦＲＥＴプライマー（Ｓｏｌｉｎａｓ  Ａ他、２００１、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：Ｅ９６）、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（Ｂｅａｕｄｅｔ  Ｌ他、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２００１、１１（４）：６００〜８）、ＳＮＰｓｔｒｅａｍ（Ｂｅｌｌ  ＰＡ他、２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｓｕｐｐｉ．７０〜２、７４、７６〜７）、多重ミニ配列決定（Ｃｕｒｃｉｏ  Ｍ他、２００２、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ、２３：１４６７〜７２）、ＳｎａＰｓｈｏｔ（Ｔｕｒｎｅｒ  Ｄ他、２００２、Ｈｕｍ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、６３：５０８〜１３）、ＭａｓｓＥＸＴＥＮＤ（Ｃａｓｈｍａｎ  ＪＲ他、２００１、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ、２９：１６２９〜３７）、ＧＯＯＤアッセイ（Ｓａｕｅｒ  ＳおよびＧｕｔ  ＩＧ、２００３、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１７：１２６５〜７２）、マイクロアレイミニ配列決定（Ｌｉｌｊｅｄａｈｌ  Ｕ他、２００３、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１３：７〜１７）、アレイ型プライマー伸張（ＡＰＥＸ）（Ｔｏｎｉｓｓｏｎ  Ｎ他、２０００、Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．３８：１６５〜７０）、マイクロアレイプライマー伸張（Ｏ’Ｍｅａｒａ  Ｄ他、２００２、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０：ｅ７５）、Ｔａｇアレイ（Ｆａｎ  ＪＢ他、２０００、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１０：８５３〜６０）、テンプレート誘導取り込み（ＴＤＩ）（Ａｋｕｌａ  Ｎ他、２００２、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３２：１０７２〜８）、蛍光分極化（Ｈｓｕ  ＴＭ他、２００１、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３１：５６０、５６２、５６４〜８）、比色法オリゴヌクレオチド連結アッセイ（ＯＬＡ、Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ  ＤＡ他、１９９０、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８７：８９２３〜７）、配列コード化ＯＬＡ（Ｇａｓｐａｒｉｎｉ  Ｐ他、１９９９、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｒｅｅｎ．６：６７〜９）、マイクロアレイ連結、リガーゼ連鎖反応，Ｐａｄｌｏｃｋプローブ、ローリングサークル増幅、Ｉｎｖａｄｅｒアッセイ（総説、Ｓｈｉ  ＭＭ、２００１、ハイスループットな変異検出技術および遺伝子型決定技術による大規模な薬理遺伝学研究が可能になる、Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．４７：１６４〜７２）、コード化マイクロスフェア（Ｒａｏ  ＫＶ他、２００３、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：ｅ６６）およびＭａｓｓＡｒｒａｙ（Ｌｅｕｓｈｎｅｒ  Ｊ、Ｃｈｉｕ  ＮＨ、２０００、Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ．５：３４１〜８０）など。
【００９７】
タンパク質のコード配列に存在し、タンパク質配列の変化を生じさせる遺伝子多型が、ＣＹＰ２Ｄ６のタンパク質遺伝子産物またはその一部分を分析することによって直接に検出できることが理解される。そのような遺伝子多型の非限定的な例には、ミスセンス変異（すなわち、アミノ酸の置換）、ナンセンス変異（すなわち、アミノ酸の代わりに停止コドンの挿入）、欠失（すなわち、少なくとも１つのアミノ酸の欠失）、重複化および／または挿入（すなわち、さらなるアミノ酸の挿入）、ならびに、コード配列（すなわち、エキソン）または非コード配列（すなわち、イントロン）の排除または含有をそれぞれもたらし得るスプライス変異が含まれる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子（配列番号６）における３４６５でのＧ−＞Ａのスプライス変異は、コード配列の排除の結果としての短縮型のタンパク質をもたらす。ＣＹＰ２Ｄ６のタンパク質遺伝子産物またはその一部分の直接的な分析を、免疫学的検出方法を使用して達成することができる。
【００９８】
免疫学的検出方法：本発明の関連で使用される免疫学的検出方法が、例えば、“Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”［Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ編、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）］に詳しく説明されており、当業者は、本発明の一部として本明細書中下記に要約される様々な技術を実行することができる。免疫学的検出方法はすべて、ＣＹＰ２Ｄ６対立遺伝子の少なくとも１つに対して特異的な抗体を必要とする。本発明の一部としての使用に好適な免疫学的検出方法には、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫組織化学分析および蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）が含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）：１つの形式において、この方法では、所望の基質（この場合にはＣＹＰ２Ｄ６）を、特異的な抗体と、沈殿可能なキャリア（例えば、アガロースビーズなど）に固定化されている放射能標識された抗体結合タンパク質（例えば、Ｉ１２５で標識されたプロテインＡ）とを用いて沈殿させることが伴う。沈殿ペレットにおけるカウント数が基質の量に比例している。
【０１００】
ＲＩＡに代わる形式では、標識された基質および非標識の抗体結合タンパク質が用いられる。未知量の基質を含有するサンプルが様々な量で加えられる。標識された基質からの沈殿カウントの減少が、添加されたサンプルにおける基質の量に比例している。
【０１０１】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）：この方法では、表面（例えば、マイクロタイタープレートのウエルなど）への、タンパク質基質を含有するサンプル（例えば、固定処理細胞またはタンパク質性溶液）の固定が伴う。酵素にカップリングされた基質特異的な抗体が添加され、基質に結合させられる。その後、抗体の存在が、抗体にカップリングされた酵素を用いる比色反応によって検出および定量される。この方法において一般的に用いられる酵素には、西洋ワサビペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが含まれる。十分に校正され、かつ、応答の直線範囲内にある場合、サンプルに存在する基質の量は、生じた色の量に比例している。基質標準物が、定量精度を改善するために一般に用いられる。
【０１０２】
ウエスタンブロット：この方法では、基質をアクリルアミドゲルによって他のタンパク質から分離し、その後、基質をメンブラン（例えば、ナイロンまたはＰＶＤＦ）に転写することが伴う。その後、基質の存在が基質に特異的な抗体によって検出され、次いで、抗体が抗体結合試薬によって検出される。抗体結合試薬は、例えば、プロテインＡまたは他の抗体であり得る。抗体結合試薬は、本明細書中上記で記載されたように放射能標識または酵素連結することができる。検出を、オートラジオグラフィー、比色反応または化学発光によって行うことができる。この方法では、基質量の定量と、電気泳動期間中のアクリルアミドゲルにおける移動距離を示すメンブラン上での相対的な位置によるその正体の決定との両方が可能である。
【０１０３】
免疫組織化学分析：この方法では、基質特異的な抗体による、固定処理された細胞におけるｉｎ  ｓｉｔｕでの基質の検出が伴う。基質特異的な抗体は酵素連結することができるか、または蛍光団に連結することができる。検出が顕微鏡および主観的評価によって行われる。酵素連結された抗体が用いられる場合、比色反応が必要となる場合がある。
【０１０４】
蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）：この方法では、基質特異的な抗体による細胞におけるｉｎ  ｓｉｔｕでの基質の検出が伴う。基質特異的な抗体は蛍光団に連結される。検出が、細胞が光ビームを通過するときにそれぞれの細胞から放射される光の波長を読み取る細胞分取装置によって行われる。この方法では、２つ以上の抗体を同時に用いることができる。
【０１０５】
個体のＣＹＰ２Ｄ６表現型を決定することが、直接的（例えば、タンパク質多型体を検出することによって）または遺伝子的（例えば、ＳＮＰ遺伝子型の存在または非存在を検出することによって）のいずれかであっても、血液、血漿、血液細胞、唾液、または、口腔洗浄によって得られる細胞、および、身体分泌物（例えば、尿および涙など）（これらに限定されない）をはじめとする、被検査個体に由来するか、あるいは、生検物などに由来する任意の好適な生物学的サンプルを使用して行われ得ることが当業者によって理解される。あるいは、核酸検査を乾燥サンプル（例えば、毛髪または皮膚）で行うことができる。サンプルは、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含有することができる。ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡおよびＲＮＡを調製する様々な方法が当該分野では広く知られている。
【０１０６】
本発明の方法において使用される抗体は、ＣＹＰ２Ｄ６＊４の多型によってコードされるＣＹＰ２Ｄ６タンパク質の少なくとも１つの形態と示差的に相互作用可能であるように選択され、かつ、野生型タンパク質（すなわち、ＣＹＰ２Ｄ６）および不良な代謝酵素多型体（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６＊３、ＣＹＰ２Ｄ６＊４、ＣＹＰ２Ｄ６＊５）を示差な抗体相互作用によって区別することができる。本発明のこの実施形態の関連での有用な抗体は、当業者に広く知られている抗体調製の様々な方法を使用して調製することができ、例えば、ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質の様々なドメインに由来する合成ペプチドを抗体産生動物へのワクチン接種のために使用し、その後、抗体産生動物から抗体を単離することにより調製することができる。ＣＹＰ２Ｄ６変化体のそれぞれに対して特異的なモノクローナル抗体もまた、例えば、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第Ｉ巻〜第ＩＩＩ巻、Ｃｏｌｉｇａｎ  Ｊ．Ｅ．編（１９９４）；Ｓｔｉｔｅｓ他（編）、“Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、ＣＴ（１９９４）；ＭｉｓｈｅｌｌおよびＳｈｉｉｇｉ（編）、“Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８０））に記載されるように調製することができる。
【０１０７】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、無傷の分子、ならびに、マクロファージに結合することができるその機能的フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖなど）が含まれる。これらの機能的な抗体フラグメントは下記のように定義される：Ｆａｂ、これは、抗体分子の一価の抗原結合性フラグメントを含有し、無傷の軽鎖と、１つの重鎖の一部とを生じさせるために完全な抗体を酵素パパインで消化することによって作製することができるフラグメントである；Ｆａｂ’、これは、無傷の軽鎖と、重鎖の一部とを生じさせるために完全な抗体をペプシンで処理し、その後、還元することによって得ることができる抗体分子のフラグメントであり、２つのＦａｂ’フラグメントが１個の抗体分子について得られる；Ｆ（ａｂ’）２、これは、完全な抗体を酵素ペプシンで処理し、続く還元を行わないことによって得ることができる抗体のフラグメントであり、Ｆ（ａｂ’）２は、２つのジスルフィド結合によって一緒になっている２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である；Ｆｖ、これは、２つの鎖として発現された軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を含有する遺伝子操作されたフラグメントとして定義される；および、単鎖抗体（「ＳＣＡ」）、これは、軽鎖の可変領域および重鎖の可変領域を、遺伝子融合された単鎖分子として好適なポリペプチドリンカーによって連結されて含有する遺伝子操作された分子である。
【０１０８】
これらのフラグメントを作製する様々な方法が当該分野では知られている。例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８８）を参照のこと（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１０９】
本発明による抗体フラグメントは、抗体のタンパク質分解的加水分解によって、あるいは、フラグメントをコードするＤＮＡの大腸菌細胞または哺乳動物細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞培養物または他のタンパク質発現系）における発現によって調製することができる。
【０１１０】
抗体フラグメントは、従来の方法による完全な抗体のペプシン消化またはパパイン消化によって得ることができる。例えば、抗体フラグメントを、Ｆ（ａｂ’）２として示される５Ｓフラグメントを提供するためにペプシンによる抗体の酵素切断によって作製することができる。このフラグメントは、チオール還元剤と、場合により、ジスルフィド連結の切断から生じるスルフヒドリル基に対する保護基とを使用してさらに切断して、３．５ＳのＦａｂ’一価フラグメントを生じさせることができる。あるいは、ペプシンを使用する酵素切断は、２つの一価Ｆａｂ’フラグメントと、１つのＦｃフラグメントとを直接に生じさせる。これらの方法は、例えば、Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ、米国特許第４０３６９４５号および同第４３３１６４７号、ならびに、それらに含まれる参考文献によって記載される（これらの特許はその全てが参照として本明細書に組み込まれる）。Ｐｏｒｔｅｒ，Ｒ．Ｒ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．７３：１１９〜１２６、１９５９もまた参照のこと。抗体を切断する他の方法、例えば、一価の軽鎖フラグメントを形成させるための重鎖の分離、フラグメントのさらなる切断、あるいは、他の酵素的技術、化学的技術または遺伝子的技術などもまた、フラグメントが、無傷の抗体によって認識される抗原に結合する限り、使用することができる。
【０１１１】
ＦｖフラグメントはＶＨ鎖およびＶＬ鎖の会合を含む。この会合は、Ｉｎｂａｒ他、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、６９：２６５９〜６２、１９７２に記載されるように、非共有結合的である場合がある。あるいは、可変鎖を分子間ジスルフィド結合によって連結することができるか、または、グルタルアルデヒドなどの化学試薬によって架橋することができる。好ましくは、Ｆｖフラグメントは、ペプチドリンカーによってつながれたＶＨ鎖およびＶＬ鎖を含む。これらの単鎖の抗原結合性タンパク質（ｓＦｖ）は、オリゴヌクレオチドによってつながれた、ＶＨドメインおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することによって調製される。構造遺伝子は発現ベクターに挿入され、続いて、大腸菌などの宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞により、２つのＶドメインを架橋するリンカーペプチドを含む１つのポリペプチド鎖が合成される。ｓＦｖを作製するための様々な方法が、例えば、ＷｈｉｔｌｏｗおよびＦｉｌｐｕｌａ、Ｍｅｔｈｏｄｓ、２：９７〜１０５、１９９１；Ｂｉｒｄ他、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２：４２３〜４２６、１９８８；Ｐａｃｋ他、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１１：１２７１〜７７、１９９３；Ｌａｄｎｅｒ他、米国特許第４９４６７７８号（これは参照として全てが本明細書中に組み込まれる）によって記載される。
【０１１２】
抗体フラグメントの別の形態が、１つだけの相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（「最小認識ユニット」）は、目的とする抗体のＣＤＲをコードする遺伝子を構築することによって得ることができる。そのような遺伝子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を使用して、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することによって調製される。例えば、ＬａｒｒｉｃｋおよびＦｒｙ、Ｍｅｔｈｏｄｓ，２：１０６〜１０、１９９１を参照のこと。
【０１１３】
本発明による、また、本明細書中上記に記載される、肝臓線維化の早い進行に対する素因を明らかにするための方法によって利用される試薬はキットの一部を形成し得ることが理解される。
【０１１４】
そのようなキットは、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座、または、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合形態またはヘテロ接合形態での存在または非存在を明らかにするための少なくとも１つ試薬を含む。
【０１１５】
好ましい実施形態によれば、キットはさらに、包装材と、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにすることにおける使用についてキットを特定するこの包装材内またはこの包装材上における通知とを含む。
【０１１６】
キットはまた、使用のための適切な説明書、および、診断における使用についてのＦＤＡ承認を示す標識を含む。
【０１１７】
肝臓線維化の早い進行を発症する個体の素因を明らかにする、本発明による方法およびキットは、抗ウイルス治療または他の治療に対する、ＨＣＶ、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、非アルコール性脂肪肝炎（ＮＡＳＨ）に感染した個体の適合性を明らかにするために使用することができる。ＰＥＧ−インターフェロンおよびリバビリンの組合せを使用するそのような治療はすべてのＨＣＶ感染者には提供されていないので、これは特に重要である。結果として、一部の場合には、そのような抗ウイルス治療が、肝臓線維化をその生涯において発症する可能性がない個体に対して用いられ、そして、より重要なことに、他の場合には、抗ウイルス治療が、肝臓線維化の早い進行を発症する危険性があるが、誤診されている個体から（予算上の制限のために）控えられる。
【０１１８】
下記は、本発明の方法が、抗ウイルス治療に対する適合性を明らかにすることを助けるために使用され得る臨床的状況の列挙である。
【０１１９】
正常なＡＬＴ／ＡＳＴレベルを有し、組織学で線維化を有しないＨＣＶ感染患者。この患者群はＨＣＶ患者の２５％からなり（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、１９９８、２７：１２１３）、その約８０％は線維化に向かって著しく進行しない（Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ、２００４、１２６：１４０９）ので、進行があるならば、進行の程度を評価するために５年間隔で肝臓生検により経過を見ることができる。肝臓線維化の早い進行を発症するそのような個体の素因リスクを知ることは、例えば、肝臓生検を行わなければならない間隔を決定することを助けることができる。
【０１２０】
ＨＣＶ遺伝子型タイプ１を有するＨＣＶ感染者の５０％は、混合治療に対する完全な非応答者である。すなわち、その混合治療により、ＨＣＶのＲＮＡレベルを、４週間、１２週間または２４週間の治療の後で、対数値で２ほど低下させることができない（Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．１９９９、３０：１９２〜１９８；Ｈａｐａｔｏｌｏｇｙ、２００３、３８：２４８Ａ；Ｈａｐａｔｏｌｏｇｙ、２００３、３８：２０８Ａ）。加えて、ＨＣＶ遺伝子型タイプ１を有するＨＣＶ感染者の５０％は２４週間の混合治療の後で部分的応答者である。すなわち、そのようなＨＣＶ感染者の５０％は、対数値で２を超える低下したレベルのＨＣＶ  ＲＮＡを有するが、２４週間目においてＨＣＶウイルスを排除していない（Ｈａｐａｔｏｌｏｇｙ、２００３、３８：６４５〜６５２）。そのような患者は、持続したウイルス応答を４８週間目において達成する可能性が低下している。近年の研究では、１８ヶ月の治療は１２ヶ月の治療よりも高い成功をもたらしそうであることが示されている。しかしながら、そのような長期間の治療は費用有効性のために広く受け入れられていない（慢性Ｃ型肝炎における１８ヶ月の治療による再発率の低下：３００名の患者におけるベネルクス無作為化治験、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．２００４、４０（４）：６８９〜６９５）。従って、線維化が遅い非応答者または部分的応答者は、開発されるより良好な治療を待つことができるが、部分的応答者または完全非応答者である早い線維形成者は、より長い継続期間（すなわち、１８ヶ月）にわたって、現在利用可能な抗ウイルス治療を受けなければならない。
【０１２１】
ＨＣＶ遺伝子型タイプ１を有し、かつ、ＡＳＴ／ＡＬＴが上昇しているが、正常な腹部超音波検査を有する、肝臓生検を拒否するＨＣＶ感染者。この場合、そのような患者が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するならば、患者は、生検が行われない場合でさえ、治療されなければならない。
【０１２２】
非代償性肝硬変のＨＣＶ感染者（イスラエルにおけるＨＣＶ感染者の１０％未満）は通常、抗ウイルス治療ではなく、肝臓移植について検討される。しかしながら、多くの場合において、移植された肝臓もまた、肝臓線維化および肝硬変にさらされる。そのような場合、肝臓線維化の早い進行を発症する増大した素因リスクを明らかにすることを、肝臓移植の成功または失敗を予想するために使用することができる。
【０１２３】
７０歳を超えるＨＣＶ患者（全ＨＣＶ感染者の約５％）は、特に、命を脅かす医学的状態を１回以上有するならば、通常、ＰＥＧインターフェロンが与えられず、通常型インターフェロンが与えられている。しかしながら、そのような個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するならば、そのような個体は治療について同様に検討されなければならない。
【０１２４】
著しい肥満（３０Ｋｇ／ｍ２を超えるＢＭＩ）のＨＣＶ感染者は、治療に対する応答率が低下している。そのような患者は、ＰＥＧインターフェロン治療が検討される前に、厳しい減量プログラムを受けなければならない（Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、２００３、３８：６３９）。この場合、そのような患者が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するならば、患者は、命を脅かすこの状況に関してカウンセリングを受け、相当量の体重を減らすための動機づけがなされなければならない。
【０１２５】
著しい量のアルコール（すなわち、１日あたり２単位を超えるアルコール）を毎日飲み続けている、上昇した血清ＡＬＴ／ＡＳＴレベルを示すＨＣＶ感染者は、抗ウイルス治療が施される前に、飲酒を止めるように勧告される。この患者群はイスラエルのＨＣＶ感染者の５％未満を構成する。肝臓線維化の早い進行を発症する素因リスク、ならびに、アルコール摂取中断後６ヶ月で検出されたときの血清中のＡＬＴ／ＡＳＴレベルが、抗ウイルス治療の組合せを施す前に考慮に入れられる場合がある。
【０１２６】
一部のＨＣＶ感染者は鉄の過負荷（すなわち、上昇した身体鉄貯蔵マーカーに関連する肝臓生検での過度な鉄）を示す。そのような患者には、放血治療が、ヘモグロビンレベルの著しい低下が生じるまで毎月提供される。血清ＡＬＴ／ＡＳＴレベルが正常化しているならば、このような患者は、通常、ＨＣＶの第１群患者として管理される。酵素レベルが依然として上昇したままであるならば、このような患者は、通常、抗ウイルス治療の組合せについて検討される。これらの場合において、肝臓線維化の早い進行を発症する素因リスクの知識は治療の選択に影響を及ぼし得る。
【０１２７】
血小板減少症が現れる（すなわち、血小板数が５００００個未満である）ＨＣＶ感染者には、抗ウイルス治療の組合せが提供されていない。しかしながら、そのような患者が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するならば、そのような患者は、費用効果的な観点から日常的には与えられないＧ−ＣＳＦなどの因子により、また、同様に、リバビリンのみにより治療することができる。
【０１２８】
抗うつ治療の使用を必要とする、うつ病の病歴を有するＨＣＶ感染者には、自殺未遂の有無にかかわらず、通常、抗ウイルス治療が提供されていない。そのような場合、患者が肝臓線維化の早い進行を発症する素因を有しないならば（すなわち、患者が遅い線維形成者であるならば）、患者は、治療を施すことなく定期的に追跡調査することが望ましい。
【０１２９】
加えて、肝臓線維化の早い進行を発症する個体の素因状態はまた、遺伝子カウンセリングにおいて使用することができ、それにより、その個体に、肝臓線維化および／または肝硬変の発症を防止および／または遅延するかもしれない推奨される指針が提供される。例えば、肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するＨＣＶ感染者は、いかなるアルコール消費を避け、脂肪摂取を減らし、かつ、身体活動を増大させなければならない。
【０１３０】
ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素形態（ＣＹＰ２Ｄ６＊４）が、肝臓線維化および／または肝硬変の早い進行を発症する増大した素因リスクに関連するので、そのアップレギュレーションが、肝臓線維化の早い進行を防止するために利用できることが理解される。
【０１３１】
従って、本発明の別の態様によれば、その必要性のある個体において肝臓線維化の早い進行を防止する方法が提供される。
【０１３２】
本明細書中で使用される用語「防止する」は、肝臓線維化の進行を回避すること、および／または、肝臓線維化の発症を遅らせることを示す。
【０１３３】
本明細書中で使用される表現「その必要性のある個体」は、肝臓線維化の早い進行を発症する可能性がある、本明細書中上記で記載されたような任意の個体を示す。表現「その必要性のある個体」はまた、肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するとして本発明の教示に従って特定される個体を包含することが理解される。
【０１３４】
この方法は、個体の肝臓におけるＣＹＰ２Ｄ６の発現レベルおよび／または活性をアップレギュレーションすることができる薬剤を個体に投与し、それにより、個体における肝臓線維化の早い進行を防止することによって行われる。
【０１３５】
本明細書中で使用される用語「アップレギュレーションする」は、ＣＹＰ２Ｄ６の発現および／または活性を増大させることを示す。
【０１３６】
ＣＹＰ２Ｄ６のアップレギュレーションは、ゲノムレベル（すなわち、プロモーター、エンハンサー、調節エレメントを介する転写の活性化）で、転写物レベル（すなわち、正しいスプライシング、ポリアデニル化、翻訳の活性化）で、または、タンパク質レベル（すなわち、翻訳後修飾、基質との相互作用など）で行うことができる。
【０１３７】
下記は、ＣＹＰ２Ｄ６の発現レベルおよび／または活性をアップレギュレーションすることができる薬剤の列挙である。
【０１３８】
ＣＹＰ２Ｄ６の発現レベルをアップレギュレーションすることができる薬剤は、ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質の機能的部分を少なくとも発現するように設計および構築された外因性のポリヌクレオチド配列である場合がある。従って、そのような外因性のポリヌクレオチド配列は、様々な薬物（例えば、デブリソキン、スパルテイン、プロパフェノンおよびアミトリプチリンなど）を代謝することができるＣＹＰ２Ｄ６分子をコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列であり得る。
【０１３９】
本明細書中で使用される表現「機能的部分」は、酵素の機能的性質（例えば、基質と結合すること、または、基質を分解することなど）を示す、ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質の一部分（すなわち、ポリペプチド）を示す。本発明の好ましい実施形態によれば、ＣＹＰ２Ｄ６の機能的部分は、配列番号４に示されるような（チトクロームＰ４５０の）アミノ酸５８〜４９３（の領域）を含むポリペプチド配列である。好ましくは、ＣＹＰ２Ｄ６の機能的部分は、配列番号４に示されるようなアミノ酸５８〜４９７（より好ましくは、アミノ酸１〜４９７）を含むポリペプチド配列である。
【０１４０】
ＣＹＰ２Ｄ６がヒトおよびウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ）の供給源からクローン化されている。従って、ＣＹＰ２Ｄ６についてのコード配列情報が、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／を介して利用可能なＧｅｎＢａｎｋデータベースを含むいくつかのデータベースから入手可能である。
【０１４１】
外因性ＣＹＰ２Ｄ６を哺乳動物細胞において発現させるために、ＣＹＰ２Ｄ６をコードするポリヌクレオチド配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００１０６、配列番号５）が、好ましくは、哺乳動物細胞発現のために好適な核酸構築物に連結される。そのような核酸構築物には、ポリヌクレオチド配列の転写を構成的または誘導可能な様式で細胞において行わせるためのプロモーター配列が含まれる。
【０１４２】
本発明の核酸構築物ではまた、所望する活性（すなわち、薬物代謝）を示すＣＹＰ２Ｄ６ホモログが利用できることが理解される。そのようなホモログは、例えば、ギャップの重みが５０であり、長さの重みが３であり、平均マッチは１０であり、平均ミスマッチが−９である、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズムを利用するＷｉｓｃｏｎｓｉｎ配列分析パッケージのＢｅｓｔＦｉｔソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号５に対する同一性が、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または１００％であり得る。
【０１４３】
本発明との使用のために好適な構成的プロモーターは、ほとんどの環境的条件およびほとんどのタイプの細胞のもとで活性であるプロモーター配列である（例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）など）。本発明との使用のために好適な誘導可能なプロモーターには、例えば、テトラサイクリン誘導可能なプロモーター（Ｚａｂａｌａ  Ｍ他、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００４、６４（８）：２７９９〜８０４）が含まれる。ＣＹＰ２Ｄ６をコードするポリヌクレオチドの発現を行わせる応答性プロモーターと、新規なリガンド結合部位を含有するリガンド誘導可能なキメラな転写因子とを含む二重システムもまた、ＣＹＰ２Ｄ６タンパク質を肝臓細胞において発現させるために使用できることが理解される（さらなる詳細については、Ｚｅｒｂｙ  Ｄ他、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００３、１４：７４９〜６１を参照のこと）。
【０１４４】
本発明の核酸構築物（これはまた、本明細書中では「発現ベクター」として示される）には、このベクターを、原核生物、真核生物、または、好ましいことではあるが、（例えば、シャトルベクターでのように）両者における複製および組み込みのために好適にするさらなる配列が含まれる。加えて、典型的なクローニングベクターはまた、転写開始配列および翻訳開始配列、転写ターミネーターおよび翻訳ターミネーター、ならびにポリアデニル化シグナルを含有する場合がある。
【０１４５】
真核生物プロモーターは、典型的には、２つのタイプの認識配列（ＴＡＴＡボックスおよび上流側プロモーターエレメント）を含有する。ＴＡＴＡボックスは転写開始部位の２５塩基対〜３０塩基対上流側に位置し、ＲＮＡ合成を開始することをＲＮＡポリメラーゼに命令することに関与すると考えられる。もう一方の上流側プロモーターエレメントは、転写が開始される速度を決定する。
【０１４６】
エンハンサーエレメントは、連結された同族プロモーターまたは異種プロモーターから転写を１０００倍まで刺激することができる。エンハンサーは、転写開始部位の下流または上流に置かれたときに活性である。ウイルスに由来する多くのエンハンサーエレメントは広い宿主範囲を有し、様々な組織において活性である。例えば、ＳＶ４０の初期遺伝子エンハンサーは多くの細胞タイプに対して好適である。本発明のために好適である他のエンハンサー／プロモーター組合せには、ポリオーマウイルス、ヒトまたはマウスのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、様々なレトロウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス、マウス肉腫ウイルスまたはラウス肉腫ウイルスおよびＨＩＶなど）から得られる長末端反復に由来するエンハンサー／プロモーター組合せが含まれる。Ｅｎｈａｎｃｅｒｓ  ａｎｄ  Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．１９８３）を参照のこと（これは参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０１４７】
発現ベクターの構築において、プロモーターは、好ましくは、プロモーターがその天然の環境において転写開始部位から配置されるのとほぼ同じ距離で異種の転写開始部位から配置される。しかしながら、当該分野では知られているように、この距離におけるある程度の変化が、プロモーター機能の喪失を伴うことなく受け入れられ得る。
【０１４８】
ポリアデニル化配列もまた、ＣＹＰ２Ｄ６のｍＲＮＡの翻訳効率を増大させるために発現ベクターに加えることができる。２つの異なった配列エレメントが正確かつ効率的なポリアデニル化のために要求される（ポリアデニル化部位の下流側に位置するＧＵリッチ配列またはＵリッチ配列、および、１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチド上流側に位置する６ヌクレオチドの高度に保存された配列（ＡＡＵＡＡＡ））。本発明のために好適である終結シグナルおよびポリアデニル化シグナルには、ＳＶ４０に由来するそのようなシグナルが含まれる。
【０１４９】
既に記載されたエレメントに加えて、本発明の発現ベクターは典型的には、クローン化された核酸の発現レベルを増大させるために、または、組換えＤＮＡを有する細胞の同定を容易にするために意図される他の特殊化したエレメントを含有する場合がある。例えば、数多くの動物ウイルスは、許容性細胞タイプにおけるウイルスゲノムの染色体外での複製を促進させるＤＮＡ配列を含有する。これらのウイルスレプリコンを有するプラスミドは、適切な因子が、プラスミドで運ばれる遺伝子、または、宿主細胞のゲノムとともに運ばれる遺伝子のいずれかによって提供される限り、エピソーム的に複製する。
【０１５０】
ベクターは真核生物レプリコンを含んでもよく、または、真核生物レプリコンを含まなくてもよい。真核生物レプリコンが存在するならば、ベクターは、適切な選択マーカーを使用して真核生物において増幅可能である。ベクターが真核生物レプリコンを含まないならば、エピソーム増幅は不可能である。その代わり、組換えＤＮＡは、操作された細胞のゲノムに一体化し、操作された細胞において、プロモーターが所望の核酸の発現を行わせる。
【０１５１】
本発明の発現ベクターはさらに、例えば、１個のｍＲＮＡからの数個のタンパク質の翻訳を可能にするさらなるポリヌクレオチド配列（例えば、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）など）、および、プロモーターキメラなポリペプチドのゲノム組み込みのための配列を含むことができる。
【０１５２】
哺乳動物発現ベクターの例には、ｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１（これらはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能である）、ｐＣＩ（これはＰｒｏｍｅｇａから入手可能である）、ｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ（これらはＳｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能である）、ｐＴＲＥＳ（これはＣｌｏｎｔｅｃｈから入手可能である）、ならびに、それらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５３】
真核生物ウイルス（例えば、レトロウイルスなど）に由来する調節エレメントを含有する発現ベクターもまた使用することができる。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７およびｐＭＴ２が含まれる。ウシ乳頭腫ウイルスに由来するベクターには、ｐＢＶ−１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタイン・バールウイルスに由来するベクターには、ｐＨＥＢＯおよびｐ２Ｏ５が含まれる。他の例示的なベクターには、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、および、ＳＶ−４０初期プロモーター、ＳＶ−４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腫瘍ウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または、真核生物細胞における発現のために効果的であることが示されている他のプロモーターの命令のもとでのタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが含まれる。
【０１５４】
上記で記載されたように、ウイルスは、多くの場合には宿主の防御機構から逃れるように進化してきた非常に特殊化された感染性媒介因子である。典型的には、ウイルスは特定の細胞タイプにおいて感染し、増殖する。ウイルスベクターの標的化特異性では、その天然の特異性が、所定の細胞タイプを特異的に標的化し、それにより、組換え遺伝子を感染細胞に導入するために利用される。従って、本発明によって使用されるベクターのタイプは、形質転換された細胞タイプに依存する。形質転換された細胞タイプに従って好適なベクターを選択することができることは十分に当業者の能力の範囲内であり、そのため、選択の検討の一般的な記述は本明細書中には提供されない。例えば、肝臓細胞を、Ｚｅｒｂｙ  Ｄ他、Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ、２００３、１４（８）：７４９〜６１に記載されるようなヒト低毒性（ｇｕｔｌｅｓｓ）アデノウイルスベクターシステムを使用して標的化することができる。
【０１５５】
組換えウイルスベクターは、様々な利点（例えば、横方向感染および標的化特異性など）を提供するので、ＣＹＰ２Ｄ６のインビボ発現のために有用である。横方向感染は、例えば、レトロウイルスの生活環において固有のものであり、出芽し、周りの細胞に感染する多くの子孫ビリオンを１個の感染細胞が産生するプロセスである。その結果は、最初のウイルス粒子によってそのほとんどが最初に感染していなかった広い面積が素早く感染することである。このことは、感染性因子が娘子孫を介してのみ広がるだけである垂直型の感染とは対照的である。横方向に広がることができないウイルスベクターもまた作製することができる。この特徴は、所望する目的が、指定された遺伝子を局在化した多数の標的化された細胞のみに導入することであるならば、有用であり得る。
【０１５６】
様々な方法を、本発明の発現ベクターを幹細胞に導入するために使用することができる。そのような方法が、一般には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ他、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８９、１９９２）Ａｕｓｕｂｅｌ他、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ、Ｍｄ．（１９８９）；Ｃｈａｎｇ他、Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｇａ他、Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ  Ｍｉｃｈ．（１９９５）；Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ、Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．（１９８８）；Ｇｉｌｂｏａ他［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４（６）：５０４〜５１２、１９８６］に記載され、そのような方法には、例えば、組換えウイルスベクターを用いた安定的トランスフェクションまたは一過性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーションおよび感染が含まれる。加えて、陽性−陰性の選択法については米国特許第５４６４７６４号および同第５４８７９９２号を参照のこと。
【０１５７】
ウイルス感染による核酸の導入は、より大きなトランスフェクション効率をウイルスの感染的性質のために得ることができるので、リポフェクションおよびエレクトロポレーションなどの他の方法を上回る利点をいくつか提供する。
【０１５８】
例えば、ＴＧＦ−β１遺伝子のアンチセンス配列をヒトＣＭＶプロモーターの制御下に含有する組換えＥ１欠失アデノウイルスベクターは、胆管結紮ラットにおいて肝臓線維化を防止することが示された（Ａｒｉａｓ，Ｍ．他、２００３、ＢＭＣ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．３：２９）。
【０１５９】
ＣＹＰ２Ｄ６のアップレギュレーションはまた、ＣＹＰ２Ｄ６発現細胞を個体の肝臓に投与することによって行われ得ることが理解される。
【０１６０】
ＣＹＰ２Ｄ６発現細胞は、その個体に由来し、本明細書中上記で記載されたようにＣＹＰ２Ｄ６を発現するために設計されたポリヌクレオチドを含有する発現ベクターによりエクスビボでトランスフェクションされる任意の好適な細胞（例えば、肝細胞および骨髄細胞など）が可能である。
【０１６１】
本発明のＣＹＰ２Ｄ６発現細胞の投与は、任意の好適な経路（例えば、静脈内、門脈内、腹腔内、肝臓内、胃腸管内、脾臓内、任意の他の器官の被膜下など）を使用して行うことができる。現時点で好ましい実施形態によれば、本発明のＣＹＰ２Ｄ６発現細胞は、静脈内投与、肝臓内投与、胃腸管内投与および／または腹腔内投与を使用して個体に導入される。
【０１６２】
本発明のＣＹＰ２Ｄ６発現細胞は、自家供給源（例えば、自己の骨髄細胞または肝細胞など）または同種供給源（例えば、非自家供給源に由来する骨髄細胞または肝細胞など）のいずれかに由来し得る。非自家細胞は、身体に投与されたとき、免疫反応を誘導する可能性があるので、いくつかの方法が、非自家細胞の拒絶の可能性を低下させるために開発されている。これらには、受容者の免疫系を抑制すること、あるいは、非自家の細胞または組織を移植前に免疫隔離性の半透過性膜でカプセル化することのいずれかが含まれる。
【０１６３】
カプセル化技術は一般に、マイクロカプセル化（これは小さい球状ビヒクルを伴う）およびマクロカプセル化（これはより大きい平らなシート膜および中空線維膜を伴う）に分類される（Ｕｌｕｄａｇ，Ｈ．他、哺乳動物細胞カプセル化技術、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２０００、４２：２９〜６４）。
【０１６４】
マイクロカプセルを調製する様々な方法が当該分野では知られており、これらには、例えば、Ｌｕ  ＭＺ他（アルギン酸塩およびα−フェノキシシンナミリデン−アセチル化ポリ（アリルアミン）を用いた細胞カプセル化、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０００、７０：４７９〜８３）；Ｃｈａｎｇ  ＴＭおよびＰｒａｋａｓｈ  Ｓ（酵素、細胞および遺伝子操作微生物のマイクロカプセル化法、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００１、１７：２４９〜６０）；Ｌｕ  ＭＺ他（光感受性ポリ（アリルアミン  α−シアノシンナミリデンアセタート）を使用する新規な細胞カプセル化方法、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ、２０００、１７：２４５〜５１）によって開示される方法が含まれる。
【０１６５】
例えば、マイクロカプセルが、修飾コラーゲンを、メタクリル酸２−ヒドロキシエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のターポリマー外皮と複合体化し、これにより、２μｍ〜５μｍのカプセル厚さを生じさせることによって調製される。そのようなマイクロカプセルはさらに、負荷電の滑らかな表面を与えるために、また、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、さらなる２μｍ〜５μｍのターポリマー外皮でカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．他、細胞カプセル化のための多層マイクロカプセル、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００２、２３：８４９〜５６）。
【０１６６】
他のマイクロカプセルがアルギン酸塩（海洋多糖）（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ．糖尿病治療におけるカプセル化小島、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．２００３、５：６６５〜８）またはその誘導体に基づく。例えば、マイクロカプセルを、ポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよび硫酸セルロースナトリウムと、ポリカチオンのポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）塩酸塩との、塩化カルシウムの存在下での多電解質複合体化によって調製することができる。
【０１６７】
より小さいカプセルが使用されるとき、細胞マイクロカプセル化が改善されることが理解される。例えば、カプセルサイズが１ｍｍから４００μｍに低下したとき、カプセル化細胞の品質管理、機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が改善された（Ｃａｎａｐｌｅ  Ｌ．他、サイズ制御による細胞カプセル化の改善、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ．２００２、１３：７８３〜９６）。さらに、７ｎｍもの小さい十分に制御された細孔サイズ、用途に合わせて調製された表面化学性、および、的確な微細構造を有するナノ多孔性のバイオカプセルは、細胞のための微小環境を免疫隔離することに成功したことが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ．小さいことは美しい：医療デバイスにおけるマイクロ粒子技術およびナノ粒子技術、Ｍｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９、１０：６〜９；Ｄｅｓａｉ，Ｔ．Ａ．膵臓細胞カプセル化のための微細製造技術、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００２、２：６３３〜４６）。
【０１６８】
肝臓におけるＣＹＰ２Ｄ６発現をアップレギュレーションすることができる薬剤は、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする内因性のＤＮＡまたはｍＲＮＡの肝臓における転写および／または翻訳を増大させることができる任意の化合物である場合がある。
【０１６９】
肝臓におけるＣＹＰ２Ｄ６活性をアップレギュレーションすることができる薬剤は、ＣＹＰ２Ｄ６の（本明細書中上記で記載されたような）機能的部分を少なくとも含む外因性のポリペプチドである場合がある。本発明の好ましい実施形態によれば、そのようなポリペプチドは、初期設定済みパラメーターを使用するＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウエアを使用して決定されたとき、配列番号４によって示されるポリペプチドに対する同一性が、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも８８％、少なくとも９０％、より好ましくは、少なくとも９５％、最も好ましくは、少なくとも９９％である。
【０１７０】
現時点で好ましい実施形態によれば、ＣＹＰ２Ｄ６ポリペプチドは配列番号４によって示される。
【０１７１】
ＣＹＰ２Ｄ６の発現レベルおよび／または活性をアップレギュレーションすることができる薬剤はまた、慢性的ＨＣＶ、肝毒性ウイルス感染（例えば、Ｂ型肝炎、Ｄ型肝炎）、肝臓ガン、肝毒性のアルコールまたは薬物、非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、自己免疫疾患（例えば、自己免疫肝炎（ＡＩＨ）、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）および原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）など）、代謝性肝臓疾患（例えば、ヘモクロマートシス、ウイルソン病およびアルファ１アンチトリプシンなど）、ならびに、肝臓の二次的関与による疾患（例えば、セリアック病またはアミロイドーシスなど）などの疾患に罹患している個体において肝硬変を防止することにおいて使用できることが理解される。
【０１７２】
本明細書中上記で記載されたアップレギュレーション薬剤、または、ＣＹＰ２Ｄ６をコードする発現ベクターはそれぞれが、個々に、または、生理学的に許容され得るキャリアもまた含む医薬組成物の一部として個体に投与され得る。医薬組成物の目的は、生物に対する有効成分の投与を容易にすることである。
【０１７３】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される有効成分の１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、生理学的に好適なキャリアおよび賦形剤）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、生物に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１７４】
本明細書中において、用語「有効成分（活性成分）」は、生物学的効果を説明することができるアップレギュレーション薬剤またはＣＹＰ２Ｄ６をコードする発現ベクターを示す。
【０１７５】
以降、表現「生理学的に許容され得るキャリア」および表現「医薬的に許容され得るキャリア」は交換可能に使用することができ、生物に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された調合物の生物学的活性および生物学的性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。佐剤がこれらの表現に含まれる。
【０１７６】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、有効成分の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１７７】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【０１７８】
好適な投与経路には、例えば、経口送達、直腸送達、経粘膜送達（特に経鼻送達）、腸管送達または非経口送達（これには、筋肉内注射、皮下注射および髄内注射、ならびに、クモ膜下注射、直接的な脳室内注射、静脈内注射、腹腔内注射、鼻内注射または眼内注射が含まれる）が含まれ得る。
【０１７９】
あるいは、例えば患者の組織領域中への医薬組成物の直接注射によって医薬組成物を系統的な方法によりむしろ局所的な方法で投与してもよい。
【０１８０】
本発明の医薬組成物は、この分野で十分に知られている様々なプロセスによって、例えば、混合、溶解、造粒、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、包括化または凍結乾燥の従来のプロセスによって製造することができる。
【０１８１】
本発明に従って使用するための医薬組成物は有効成分を医薬として使用可能な製剤にする加工を容易にする賦形剤及び補助剤を含む一つ以上の医薬的に許容され得るキャリアを使用して従来のように配合されてもよい。適切な配合は選択された投与経路に依存する。
【０１８２】
注射の場合、医薬組成物の活性成分は、水溶液において、好ましくは生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的な生理的食塩水緩衝液など）において配合することができる。
【０１８３】
経口投与の場合、医薬組成物は、活性な化合物を、この分野で十分に知られている薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせることによって容易に配合することができる。そのようなキャリアにより、医薬組成物は、患者によって経口摂取される錠剤、ピル、糖衣錠、カプセル、液剤、ゲル、シロップ、スラリー剤、懸濁物などとして配合することが可能になる。経口使用される薬学的調製物は、錠剤または糖衣錠コアを得るために、固体の賦形剤を使用し、得られた混合物を場合により粉砕し、そして所望する場合には好適な補助剤を添加した後、顆粒の混合物を加工して作製することができる。好適な賦形剤は、具体的には、ラクトース、スクロース、マンニトールまたはソルビトールを含む糖などの充填剤；セルロース調製物、例えば、トウモロコシデンプン、コムギデンプン、コメデンプン、ジャガイモデンプン、ゼラチン、トラガカントゴム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ナトリウムカルボメチルセルロースなど；および／またはポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）などの生理学的に受容可能なポリマーである。所望する場合には、架橋型ポリビニルピロリドン、寒天、またはアルギン酸もしくはその塩（アルギン酸ナトリウムなど）などの崩壊剤を加えることができる。
【０１８４】
糖衣錠コアには、好適なコーティングが施される。この目的のために、高濃度の糖溶液を使用することができ、この場合、糖溶液は、場合により、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポールゲル、ポリエチレングリコール、二酸化チタン、ラッカー溶液および好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料が、活性な化合物の量を明らかにするために、または活性な化合物の量の種々の組合せを特徴づけるために、錠剤または糖衣錠コーティングに添加され得る。
【０１８５】
経口使用され得る医薬組成物には、ゼラチンから作製されたプッシュ・フィット型カプセル、ならびにゼラチンおよび可塑剤（グリセロールまたはソルビトールなど）から作製された軟密閉カプセルが含まれる。プッシュ・フィット型カプセルは、充填剤（ラクトースなど）、結合剤（デンプンなど）、滑剤（タルクまたはステアリン酸マグネシウムなど）および場合により安定化剤と混合された有効成分を含有し得る。軟カプセルでは、活性な化合物を好適な液体（脂肪油、流動パラフィンまたは液状のポリエチレングリコールなど）に溶解または懸濁させることができる。さらに、安定化剤を加えることができる。経口投与される配合物はすべて、選ばれた投与経路に好適な投薬形態でなければならない。
【０１８６】
口内投与の場合、組成物は、従来の様式で配合された錠剤またはトローチの形態を取ることができる。
【０１８７】
鼻腔吸入による投与の場合、本発明に従って使用される有効成分は、好適な噴射剤（例えば、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタンまたは二酸化炭素）の使用により加圧パックまたはネブライザーからのエアロゾルスプレー提示物の形態で都合よく送達される。加圧されたエアロゾルの場合、投薬量単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することによって決定され得る。吸入器または吹き入れ器で使用される、例えば、ゼラチン製のカプセルおよびカートリッジで、化合物と好適な粉末基剤（ラクトースまたはデンプンなど）との粉末混合物を含有するカプセルおよびカートリッジを配合することができる。
【０１８８】
本明細書で記述される医薬組成物は非経口投与、例えばボーラス注射または連続点滴のために配合されることができる。注射のための配合は、単位用量形態（例えばアンプルまたは多用量コンテナ）で提供されることができ、これらには所望により保存剤が添加されている。組成物は懸濁物、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルションであることができ、懸濁剤、安定化剤および／または分散剤の如き配合剤を含むことができる。
【０１８９】
非経口投与される医薬組成物には、水溶性形態における活性な調製物の水溶液が含まれる。さらに、活性な化合物の懸濁物を、適切なオイル状のまたは水ベースの注射用懸濁物として調製することができる。好適な親油性の溶媒またはビヒクルには、脂肪油（ゴマ油など）、または合成脂肪酸エステル（オレイン酸エチルなど）、トリグリセリドまたはリポソームが含まれる。水性の注射用懸濁物は、懸濁物の粘度を増大させる物質、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、ソルビトールまたはデキストランなどを含有し得る。場合により、懸濁物はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするために化合物の溶解性を増大させる好適な安定化剤または薬剤を含有し得る。
【０１９０】
あるいは、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌されたパイロジェン非含有水）を用いて構成される粉末形態にする。
【０１９１】
本発明の医薬組成物はまた、例えば、カカオ脂または他のグリセリドなどの従来の座薬基剤を使用して、座薬または停留浣腸剤などの直腸用組成物に配合することができる。
【０１９２】
本発明に関連した使用のために好適な医薬組成物には、有効成分が、意図された目的を達成するために効果的な量で含有される組成物が含まれる。より具体的には、治療効果がある量は、処置されている対象の障害（例えば肝臓線維化および／または肝硬変の早い進行）の症状を防止、軽減または改善するために、あるいは、処置されている対象の生存を延ばすために効果的な有効成分（アップレギュレーション薬剤またはＣＹＰ２Ｄ６をコードする発現ベクター）の量を意味する。
【０１９３】
治療効果がある量の決定は、特にここに提供される詳細な開示の観点から十分に当業者の範囲内である。
【０１９４】
本発明の方法に使用される調製物に対して、治療的に有効な量又は用量は最初にインビトロ分析および細胞培養分析から分析されることができる。例えば、用量は動物モデルで配合され所望の濃度または力価が達成されることができる。かかる情報は人間に有用な用量をより正確に決定するために使用されることができる。
【０１９５】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療効力は、インビトロ、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって明らかにすることができる。これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイならびに動物研究から得られたデータは、ヒトへの使用のための投薬量範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられる投薬形態物および利用される投与経路に依存して変化し得る。正確な配合、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”（第１章、１頁）を参照のこと）。
【０１９６】
投薬量および間隔は、肝臓線維化および／または肝硬変の早い進行を防止するのに十分な活性成分の血漿レベル（最小有効濃度、ＭＥＣ）を与えるために各個体について調整されることができる。ＭＥＣは各々の調剤について異なるであろうが、インビトロデータから推定されることができる。ＭＥＣを達成するのに必要な投薬量は個体の特性および投与経路に依存するであろう。検出アッセイは血漿濃度を決定するために使用されることができる。
【０１９７】
処置される状態の重篤度および応答性に依存して、投薬は単回投与または多回投与が可能であり、処置の経過が、数日から数週間まで、あるいは、治癒が達成されるまで、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１９８】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、処置されている対象、苦痛の重篤度、投与様式、主治医の判断などに依存する。
【０１９９】
本発明の医薬組成物は、所望される場合には、活性成分を含有する一つ以上の単位投薬形態物を含有し得る、ＦＤＡ承認キットなどのパックまたはディスペンサーデバイスで提供され得る。パックは、例えば、金属箔またはプラスチック箔を含むことができ、例えば、ブリスターパックなどである。パックまたはディスペンサーデバイスには、投与のための説明書が添付され得る。パックまたはディスペンサーにはまた、医薬品の製造、使用または販売を規制する政府当局により定められた形式で容器に付けられた通知が伴い得る。この場合、そのような通知は、組成物の形態またはヒトもしくは動物への投与の当局による承認を反映する。そのような通知は、例えば、処方薬物についての米国食品医薬品局により承認されたラベル書きであり得るか、または承認された製品添付文書であり得る。適合し得る医薬用キャリアに配合された本発明の調製物を含む組成物はまた、あたかもさらに詳しく上述されているように、適応状態の処置のために調製し、適切な容器に入れ、表示することができる。
【０２００】
個体の細胞におけるＣＹＰ２Ｄ６のアップレギュレーションを評価する様々な方法が当該分野では知られており、これらには、免疫学的検出方法（本明細書中上記で記載されたような方法）、細胞化学的方法（例えば、ｉｎ  ｓｉｔｕ活性アッセイおよびインビトロ活性アッセイ）および分子的方法（例えば、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ＲＴ−ＰＣＲ分析、ＲＮＡｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション染色、ｉｎ  ｓｉｔｕＲＴ−ＰＣＲ染色など）が含まれる（Ｎｕｏｖｏ  ＧＪ他、Ａｍ  Ｊ  Ｓｕｒｇ  Ｐａｔｈｏｌ、１９９３、１７：６８３〜９０；Ｋｏｍｍｉｎｏｔｈ  Ｐ他、Ｐａｔｈｏｌ  Ｒｅｓ  Ｐｒａｃｔ、１９９４、１９０：１０１７〜２５）。
【０２０１】
従って、本発明の教示は、慢性Ｃ型肝炎に罹患している個体において肝臓線維化および／または肝硬変の早い進行を防止するために使用することができる。例えば、ＣＹＰ２Ｄ６のｍＲＮＡ（配列番号５）をコードするポリヌクレオチド配列と、肝細胞における発現を可能にするための好適なプロモーター配列とを含む発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）が、静脈内投与または肝臓内投与によって個体に導入される。肝臓におけるそのようなベクターの発現は、肝臓におけるＣＹＰ２Ｄ６の発現レベルおよび／または活性をアップレギュレーションすること、従って、肝臓線維化および／または肝硬変の早い進行を防止することが予想される。そのような発現ベクターの投薬量は、細胞培養実験および動物モデルを使用して修正しなければならない。治療の成功は、好ましくは、実質的にはどこか他のところ（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ＣＡ他、２００４、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４４：２７６〜８３）に記載されるように、個体をＣＹＰ２Ｄ６基質（例えば、デブリソキン）に供し、その代謝産物の血漿中レベルを治療前および治療後に測定することによって評価される。
【０２０２】
そのような治療がＨＣＶ感染直後（すなわち、肝臓線維化の何らかの徴候が現れる前）に用いられるならば、治療は個体における肝臓線維症の進行を防止し得ることが理解される。加えて、発現ベクターは、（形質導入された細胞系統に依存して）限られた寿命を示す体細胞に標的化されるので、そのような治療は、肝臓線維化、あるいは、肝臓線維化および／または肝硬変の早い進行を防止するために定期的に繰り返されることが予想される。
【０２０３】
前述で述べられるように、ＣＹＰ２Ｄ６は、５０を超える臨床的に重要な薬物の代謝に関与している。従って、ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素形態（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６＊４）の存在下では、これらの薬物分子の一部（すなわち、ＣＹＰ２Ｄ６の標的、例えば、メトプロロール、プロパノロール、エンカイニド、コデイン、クロザピン、デクストロメトルファン、ハロペリドール、アミトリプチリン、イミプラミンおよびスパルテインなど）が個体の体内に蓄積することが予想され、肝臓線維化の促進の一因となり得る。
【０２０４】
どの薬物分子が肝臓線維化を促進し得るかを特定するためには、どの薬物の代謝率が、野生型形態と比較して、ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素形態（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６＊４）の存在下で低下するかを特定する必要がある。
【０２０５】
従って、本発明ではまた、薬物分子が、個体における肝臓線維化の早い進行の発症を誘導または促進することができるかを明らかにする方法が包含される。
【０２０６】
この方法は、ＣＹＰ２Ｄ６およびＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素変化体による薬物分子の代謝率を比較することによって行われ、この場合、ＣＹＰ２Ｄ６ではなく、ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素変化体による薬物分子の不良な代謝により、その薬物が個体における肝臓線維化の早い進行の発症を誘導または促進することができることが示される。
【０２０７】
本明細書中で使用される表現「ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素変化体」は、特定の基質の不良な代謝活性を示す任意のＣＹＰ２Ｄ６変化体、または、そのようなＣＹＰ２Ｄ６変化体の機能的部分を少なくとも発現するポリヌクレオチドを示す。そのような変化体の非限定的な例には、ＣＹＰ２Ｄ６＊３、ＣＹＰ２Ｄ６＊４およびＣＹＰ２Ｄ６＊６がある。好ましくは、本発明によって使用される、ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素変化体はＣＹＰ２Ｄ６＊４であるか、または、それを発現するポリヌクレオチドである。
【０２０８】
薬物代謝率は、薬物の代謝産物の蓄積を、例えば、細胞株（例えば、ヒトリンパ芽球様細胞株など）に由来するインビトロ発現システムのミクロソーム調製物を使用してインビトロで測定することによって検出することができる。これらのシステムにおいて、野生型ＣＹＰ２Ｄ６またはその不良な代謝酵素変化体（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６＊４）を候補の薬物分子および適切なインキュベーション緩衝液とともに加えることができ、薬物代謝率を検出することができる（例えば、Ｇｏｔｏ  Ａ他、２００４、抗アレルギー薬オキサトミドの代謝に関与するヒトｐ４５０イソ型の同定および酵素活性に対するその阻害的作用、Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２７：６８４〜９０を参照のこと）。
【０２０９】
加えて、薬物代謝率は、例えば、実質的には、Ｗｏｊｃｉｋｏｗｓｋｉ  Ｊ他、２００４（ヒトチトクロームＰ−４５０イソ酵素によるピペラジン型フェノチアジン系神経遮断薬ペラジンの代謝、Ｅｕｒ．Ｎｅｕｒｏｐｓｙｃｈｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１４：１９９〜２０８）に記載されるように、ヒト肝臓ミクロソームを使用して、エクスビボで測定することができる。
【０２１０】
ヒト肝臓ミクロソームを調製する様々な方法が当該分野では知られており、これらには、例えば、Ｎｅｌｓｏｎ他、２００１（Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ、２９：３１９〜２５）に記載される方法が含まれる。簡単に記載すると、肝臓生検から得られた肝臓組織の一片（約１０ｇ）を、はさみで細かく切り、さらに、２５ｍｌの氷冷した均質化緩衝液（０．１２５Ｍ  塩化カリウムおよび１．０ｍＭ  ＥＤＴＡを含有する０．１Ｍ  リン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．４）においてＴｅｆｌｏｎ−ガラスホモジナイザー（８７０ｒｐｍ）の１０ストローク（それぞれ１５秒）を使用してホモジネートする。ホモジネートをサンプル重量の４体積（約４０ｍｌ）に希釈し、Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＡ−６００ローター（Ｓｏｒｖａｌｌ、Ｎｅｗｔｏｎｍ、ＣＴ）を使用してＳｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂにおいて１２０００ｒｐｍで２０分間遠心分離する。上清を取り出し、ミトコンドリアのペレットを２５ｍｌの同じ緩衝液に再懸濁し、再び遠心分離する。上清を一緒にし、Ｓｏｒｖａｌｌ  Ｔ−１２７０ローターを使用してＳｏｒｖａｌｌ  Ｕｌｔｒａ  Ｐｒｏ８０において１３８０００ｒｐｍで６０分間遠心分離する。上部の脂質層を除き、細胞質ゾル上清を集める。ミクロソームペレットを、３回の均質化ストローク、その後、１３８０００ｒｐｍでの６０分間遠心分離を使用して、０．１２５Ｍ  ＫＣｌ／０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）に再懸濁する。得られたペレットは肝臓ミクロソームを含有する。薬物代謝を測定する前に、ミクロソームペレットを好適なインキュベーション緩衝液（例えば、５ｍＭ  塩化マグネシウムである０．１５Ｍ  Ｔｒｉｓ緩衝液、ｐＨ７．４）に再懸濁する。
【０２１１】
例えば、デブリソキン（ＣＹＰ２Ｄ６の標的薬物分子）の代謝率は、下記のプロトコルを使用して測定することができる：０．１５ｍｇ〜０．３０ｍｇのミクロソームタンパク質を、６０分間、０．２５ｍｌの最終体積で、１ｍＭ  ［グアニジン−１４Ｃ］デブリソキン（０．５μＣｉ／チューブ）、１．０ｍＭ  ＮＡＤＰ、７．５ｍＭ  ＤＬ−イソクエン酸、２Ｕ／ｍｌのイソクエン酸デヒドロゲナーゼ、５ｍＭ  ＭｇＳＯ４および０．１Ｍ  リン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）とインキュベーションする。薬物代謝反応を、０．０２ｍｌの７０％（ｖ／ｖ）過塩素酸を使用して停止させ、上清を、ＨＰＬＣ分析を使用して分析する。クロマトグラフィーを、Ｓｕｐｅｌｃｏｓｉｌ−５  ＬＣ−ＡＢＺの２０ｍｍｘ４ｍｍのカラムによって保護されたＳｕｐｅｌｃｏｓｉｌ−５  ＬＣ−ＡＢＺの１５０ｍｍｘ４．６ｍｍのカラムを用い、かつ、１２％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルおよび８８％（ｖ／ｖ）の２０ｍＭ  過塩素酸ナトリウム（ｐＨ２．５）からなる移動相を２ｍｌ／分の流速で用いて行う。ＨＰＬＣ溶出液の定量を、液体シンチレーション計数を使用して行う（Ａｎｔｈｏｎｙ  Ｂ．Ｒ．他、２０００、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ、２８：１２０２〜１２０９）。
【０２１２】
ＣＹＰ２Ｄ６の２つの変化体による薬物の代謝率を比較するために、使用された肝臓ミクロソームは２名の異なる個体に由来しなければならなず、この場合、そのうちの一方がＣＹＰ２Ｄ６の野生型についてホモ接合であり、他方がＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素形態（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６＊４）についてホモ接合であることが理解される。
【０２１３】
従って、標的薬物分子の代謝率を、野生型ＣＹＰ２Ｄ６と不良な代謝酵素変化体（例えば、ＣＹＰ２Ｄ６＊４）との間で（本明細書中上記で記載された方法のいずれかを使用して）比較することができる。ＣＹＰ２Ｄ６の野生型形態を使用した場合ではなく、ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素形態を使用したときに低下した代謝率を示す薬物分子が、肝臓線維化の早い進行を誘導および／または促進することができるとして特定される。これらの薬物がそのようなものとして認識されると、そのような薬物は、肝臓線維化を発症する危険性があるどの個体にも処方すべきではない。
【０２１４】
さらに本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、さらなる遺伝子座におけるＳＮＰもまた肝臓線維化の早い進行に関連することを発見している。表９、表１０および表１１においてさらに示され、また、下記の実施例の節の実施例２において記載されるように、配列番号１８のヌクレオチド座標１７４におけるアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子（ＣＹＰ３Ａ５＊１対立遺伝子）、配列番号１７のヌクレオチド座標１７７２におけるチミジンヌクレオチド含有対立遺伝子（ＣＹＰ２Ｅ１のＴ−ＲｓａＩ対立遺伝子）、および／または、配列番号１９のヌクレオチド座標５５におけるシトシンヌクレオチド含有対立遺伝子（ＡＰＯ  Ｅ４対立遺伝子）が、慢性ｈＣＶ患者の遅い線維形成者群よりも、早い線維形成者群では非常に高頻度である。
【０２１５】
従って、本発明のさらなる態様によれば、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにする方法が提供される。この方法は、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｅ１およびＡＰＯ  Ｅからなる群から選択される個体の遺伝子座、または、この遺伝子座と連鎖不平衡にある隣接遺伝子座における、少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型のホモ接合型形態またはヘテロ接合型形態での存在または非存在を明らかにし、それにより、個体が肝臓線維化の早い進行に対する素因を有するかどうかを明らかにすることによって行われる。
【０２１６】
本明細書中で使用される表現「ＣＹＰ３Ａ５遺伝子座」は、チトクロームＰ４５０タイプ３Ａ５（ファミリー３、サブファミリーＡ）をコードする遺伝子を包含し、第７染色体（７ｑ２１．１）に存在するヒトゲノム内の特定のＤＮＡ配列領域を示す。ＣＹＰ３Ａ５のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ３５５８００（配列番号１８）だけでなく、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＧ＿０００００４のヌクレオチド座標２５３０８０〜２８４８８９によって示される核酸配列に含まれる。ＣＹＰ３Ａ５のｍＲＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００７７７．２によって示され、ＣＹＰ３Ａ５ポリペプチドのアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００７６８によって示される。
【０２１７】
好ましくは、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、ＣＹＰ３Ａ５＊１変化体、すなわち、配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ３５５８００）に示されるようなヌクレオチド座標１７４におけるアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子である。
【０２１８】
表現「隣接遺伝子座」は、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子座に関連して本発明のこの態様に従って使用されるとき、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子座の極近傍にあり、かつ、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子座のＣＹＰ３Ａ５＊１／＊３のＳＮＰと連鎖不平衡にある他のＳＮＰを含むＤＮＡ配列（遺伝子または遺伝子間配列のいずれか）を記載することを示す。隣接遺伝子座に存在するが、ＣＹＰ３Ａ５＊１多型とのその連鎖不平衡状態が未だ不明であるＳＮＰもまた本発明とともに使用され得ることが理解される。そのようなＳＮＰが、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＧ＿０００００４に示されるゲノム配列において、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＧ＿０００００４のヌクレオチド座標２５３０８０〜２８４８８９の間に、かつ／または、配列番号１８によって示される核酸配列において見出され得る。
【０２１９】
本明細書中で使用される表現「ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子座」は、チトクロームＰ４５０（ファミリー２、サブファミリーＥ、ポリペプチド１）をコードする遺伝子を包含し、第１０染色体（１０ｑ２４．３−ｑｔｅｒ）に存在するヒトゲノム内の特定のＤＮＡ配列領域を示す。ＣＹＰ２Ｅ１のゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｊ０２８４３（配列番号１８）だけでなく、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００００１０のヌクレオチド座標１３５２２９７４６〜１３５２４１５０１によって示される核酸配列に含まれる。ＣＹＰ２Ｅ１のｍＲＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿０００７７３によって示され、ＣＹＰ２Ｅ１ポリペプチドのアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００７６４によって示される。
【０２２０】
好ましくは、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１７に示されるようなヌクレオチド座標１７７２におけるチミジンヌクレオチド含有対立遺伝子である。
【０２２１】
表現「隣接遺伝子座」は、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子座に関連して本発明のこの態様に従って使用されるとき、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子座の極近傍にあり、かつ、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子座の（配列番号１７に示されるようなヌクレオチド１７７２における）ＣＹＰ２Ｅ１のＴ／ＣのＳＮＰと連鎖不平衡にある他のＳＮＰを含むＤＮＡ配列（遺伝子または遺伝子間配列のいずれか）を記載することを示す。隣接遺伝子座に存在するが、（配列番号１７に示されるようなヌクレオチド１７７２における）ＣＹＰ２Ｅ１／Ｔ対立遺伝子とのその連鎖不平衡状態が未だ不明であるＳＮＰもまた本発明とともに使用され得ることが理解される。そのようなＳＮＰが、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＧ＿００００１０に示されるゲノム配列において、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＧ＿００００１０のヌクレオチド座標１３５２２９７４６〜１３５２４１５０１の間に、かつ／または、配列番号１７によって示される核酸配列において見出され得る。
【０２２２】
本明細書中で使用される表現「ＡＰＯ  Ｅ遺伝子座」は、リポタンパク質Ｅをコードする遺伝子を包含し、第１９染色体（１９ｑ１３．２）に存在するヒトゲノム内の特定のＤＮＡ配列領域を示す。ＡＰＯ  Ｅのゲノム配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００００１９のヌクレオチド座標５０１００９０２〜５０１０４４８９によって示される核酸配列に含まれる。ＡＰＯ  ＥのｍＲＮＡ配列がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＭ＿００００４１によって示され、ＡＰＯ  Ｅポリペプチドのアミノ酸配列がＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００００３２によって示される。
【０２２３】
好ましくは、ＡＰＯ  Ｅ遺伝子座における少なくとも１つの早い進行の肝臓線維化関連遺伝子型は、配列番号１９に示されるようなヌクレオチド座標５５におけるシトシンヌクレオチド含有対立遺伝子である。
【０２２４】
表現「隣接遺伝子座」は、ＡＰＯ  Ｅ遺伝子座に関連して本発明のこの態様に従って使用されるとき、ＡＰＯ  Ｅ遺伝子座の極近傍にあり、かつ、ＡＰＯ  Ｅ遺伝子座のＡＰＯ  ＥのＥ４／Ｅ３のＳＭＰ（配列番号１９に示されるようなヌクレオチド５５におけるＣ／ＴのＳＮＰ）と連鎖不平衡にある他のＳＮＰを含むＤＮＡ配列（遺伝子または遺伝子間配列のいずれか）を記載することを示す。隣接遺伝子座に存在するが、ＡＰＯ  Ｅ４対立遺伝子（配列番号１９のヌクレオチド５５におけるＣ対立遺伝子）とのその連鎖不平衡状態が未だ不明であるＳＮＰもまた本発明とともに使用され得ることが理解される。そのようなＳＮＰが、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＧ＿００００１９に示されるゲノム配列において、好ましくは、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＧ＿００００１９のヌクレオチド座標５０１００９０２〜５０１０４４８９の間に見出され得る。
【０２２５】
上記の遺伝子型、例えば、ＣＹＰ３Ａ５＊１対立遺伝子（配列番号１８のヌクレオチド座標１７４においてＡ）、ＣＹＰ２Ｅ１のＴ対立遺伝子（配列番号１７のヌクレオチド１７７２においてＴ）、ＡＰＯ  Ｅ４対立遺伝子（配列番号１９のヌクレオチド座標５５においてＣ）、および／または、そのようなＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰの遺伝子型を、本明細書中上記で記載されたＳＮＰ検出方法のいずれかによって検出することができ、従って、肝臓線維化の早い進行に対する個体の素因を明らかにするために使用することができる。
【０２２６】
本明細書中で使用される用語「約」は±１０％を示す。
【０２２７】
本発明の追加の目的、利点及び新規な特徴は、下記実施例を考察すれば、当業技術者には明らかになるであろう。なおこれら実施例は本発明を限定するものではない。さらに、先に詳述されかつ本願の特許請求の範囲の項に特許請求されている本発明の各種実施態様と側面は各々、下記実施例の実験によって支持されている。
【実施例】
【０２２８】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なおこれら実施例によって本発明は限定されない。
【０２２９】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学及び組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号及び５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；「Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ−Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂｏｓｉｃ  Ｔｅｃｈｉｑｕｅ」Ｆｒｅｓｈｎｅｙ著、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎ．Ｙ．（１９９４）、第３版；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号及び５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．及びＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒ���」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年及び「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｌ．ＨａｉｎｅｓおよびＭａｒｇａｒｅｔ  Ａ．Ｐｅｒｉｃａｋ−Ｖａｎｃｅ編、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ（１９９８）；Ｇｅｎｅｎｔｉｃ  Ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｔｒａｉｔｓ  Ｄ．Ｃ．ＲａｏおよびＭｉｃｈａｅｌ  Ａ．Ｐｒｏｖｉｎｃｅ編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｄ．Ｓ．ＦａｌｃｏｎｅｒおよびＴｒｕｄｙ  Ｆ．Ｃ．Ｍａｃｋａｙ，  Ａｄｄｉｓｏｎ  Ｗｅｓｌｅｙ  Ｌｏｎｇｍａｎ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（１９９６）；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０２３０】
（実施例１）
ＣＹＰ２Ｄ６＊４（不良な代謝酵素）はＨＣＶ患者における肝臓線維化の早い進行に関連する
【０２３１】
末期肝臓疾患はＣ型肝炎ウイルス保有者の１５％〜２０％に影響を及ぼす。進んだ線維化進行速度および末期肝硬変に至る機構は未だ明らかにされてない。ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素対立遺伝子（ＣＹＰ２Ｄ６＊４）により、線維化進行速度が予測できるかどうかを調べるために、本発明者らは、下記のようにＣＹＰ２Ｄ６＊４の対立遺伝子頻度を「遅い」線維形成者と「早い」線維形成者との間で比較している。
【０２３２】
材料および方法
研究症例者。慢性のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）患者を、２００３年８月〜２００４年１月の間、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ（Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｓｏｕｒａｓｋｙ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ、イスラエル）の肝臓部門の外来診療室から募集した。参加基準は、白人起源であること、および、ＰＣＲを使用してＨＣＶ  ＲＮＡについて検査陽性であることであった。患者を人口学的詳細（性別、出生日、年齢）および臨床的データ（ウイルス暴露年齢、感染様式、アルコール消費、ウイルスの遺伝子型、以前の治療、および肝臓移植を含む）について面接した。臨床記録、研究室研究、画像化研究および肝臓の組織病理学を再検討した。除外基準は、ＨＣＶに加えての肝臓疾患（例えば、自己免疫肝炎、アルコール性肝臓疾患、Ｂ型肝炎またはＨＩＶについての陽性の血清学）の存在であった。１日あたり３０ｇｒを超えるアルコールを消費する患者も除外された。１９名の健康な白人新生児の血液サンプルをコントロールとして使用した。研究は、施設倫理委員会、および、保健大臣付属の国家遺伝学委員会によって承認された。
【０２３３】
肝硬変の決定。肝硬変の存在は肝臓生検の組織病理学評価および非生検患者での臨床診断に基づいていた。
【０２３４】
肝臓生検の組織病理学。３６名の患者から得られた肝臓生検物が同じ組織病理学者によって調べられた。悪性度および段階がＢａｔｔｓおよびＬｕｄｗｉｇのシステム（Ｂ＆Ｌ）に従って評価され、１−門脈線維化；２−門脈周囲の線維化；３−中隔の線維化；４−肝硬変として分類された。
【０２３５】
非生検患者における肝硬変の臨床診断。肝硬変の臨床診断は、門脈高圧症の徴候、ならびに、研究室所見および適切な放射線学的所見に基づいていた。
【０２３６】
「早い」線維形成者および「遅い」線維形成者の定義。「早い」線維形成者対「遅い」線維形成者をＰｏｙｎａｒｄの線維化進行モデルに従って定義した（Ｐｏｙｎａｒｄ，Ｔ．他、２００１、慢性Ｃ型肝炎患者における肝臓線維化進行の速度および危険性因子、Ｊ．Ｈｅｐａｔｏｌ．３４：７３０〜９）。それぞれの場合において、感染期間の継続期間を最初の肝臓生検までの暴露日から推定した。モデル曲線によって予測されるように疾患が進行した患者を「遅い」線維形成者として分類した。対照的に、疾患が予測よりも早く進行した患者を「早い」線維形成者として分類した。肝臓生検が行われなかった場合には、感染の継続期間を、暴露日と、臨床診断が行われた日との間の期間として決定した。生検が行われず、かつ、門脈高圧症の証拠がなく、しかし、患者が、モデルに従って肝硬変に達するように十分に長い間、感染している場合、その患者は含められ、「遅い」線維形成者として分類された。暴露日が不明である４５歳未満の肝硬変患者は、たとえ、出生時に感染したとしても、４５歳以前に、モデルに従って線維化に達することは予想されなかったので、「早い」線維形成者と見なした。
【０２３７】
ＣＹＰ２Ｄ６のアッセイ。ゲノムＤＮＡを塩析法（Ｍｉｌｌｅｒ  Ｓ．Ａ．他、１９８８、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１６：１２１５）によって末梢血から抽出した。チトクロームＰ４５０の２Ｄ６＊４変異（配列番号６（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ３３３８８）に示されるような３４６５位でのＧ−＞Ａの置換）の存在を、実質的にはどこか他のところ（Ｂｊｅｒｋｅ，Ｊ．他、２００１、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒを使用する蛍光ハイブリダイゼーションプローブを用いたチトクロームＰ４５０の２Ｄ６＊４変異の遺伝子型決定、“Ｒａｐｉｄ  Ｃｙｃｌｅ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ”、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ；Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｏｇ）に記載されるように、ＣＹＰ２Ｄ６＊４フォワードＰＣＲプライマー（配列番号２）およびＣＹＰ２Ｄ６＊４リバースＰＣＲプライマー（配列番号３）ならびにＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）のアンカープローブ（配列番号７）および変異プローブ（配列番号８）を使用して検出した（本明細書中下記の表１を参照のこと）。
【表１】
2008506369.tif 000002
【０２３８】
統計学的分析。ＳＰＳＳ（バージョン１１）統計学アプリケーションをデータ管理および統計学的分析のために用いた。「早い」線維形成者群および「遅い」線維形成者群のカテゴリーデータについての速度および割合を、χ２検定を使用して比較し、連続データについての平均値および標準誤差を、ｔ検定を使用して比較し、オッズ比を、９５パーセントの信頼区間によりロジスティック回帰モデルを使用して推定した。逆ロジスティック回帰を用いて、年齢、性別、暴露時年齢、疾患継続期間、および、ＣＹＰ２Ｄ６＊４の保因者状況と、早い線維化の可能性との関係性を調べた。
【０２３９】
実験結果
線維化の進行はＨＣＶ感染の年齢および継続期間に依存する。線維化進行に対する感染年齢の影響を明らかにするために、線維化進行（これは、組織病理学を使用して決定される）の確率を、２３１３名のＨＣＶ患者のデータを使用して感染年齢に対してプロットした。図１に示されるように、ＨＣＶに２０歳未満の年齢で感染した患者は感染後４０年以内に肝硬変を発症しなかった。他方で、２０歳代または３０歳代でＨＣＶに感染した患者は感染後３５年以内に肝硬変に進行した（線維化の速度がこの群では感染後３０年以降で急激に増大した）。加えて、４０歳代でＨＣＶに感染した患者は感染後２０年以内で肝硬変を発症した。後者の群では、線維化の速度が感染後１０年以降で非常に急になった。最後に、５０歳を超える年齢でＨＣＶに感染した患者は最も有害な経過を有し、感染後１５年以内で肝硬変を示した。従って、これらの結果は、線維化の進行が年齢および感染からの継続期間に依存することを明らかにしている。
【０２４０】
ＨＣＶ患者を「早い」線維形成者および「遅い」線維形成者として分類した。５０名のＨＣＶ白人患者が研究に含まれた。患者の人口学的データのまとめを本明細書中下記の表２に示す。５０名の患者のうち、３３名の患者が「早い」線維形成者として分類され、１７名が「遅い」線維形成者として分類された。「早い」線維形成者における７名の患者は肝臓生検を受けなかったが、臨床診断に基づいて肝硬変を有するとして診断された。「遅い群」における６名の患者は肝臓生検を受けなかった。そのうちの１名が臨床的および画像化の証拠に基づいて肝硬変の診断を有した。残る５名の患者は肝硬変の証拠がなかった（臨床的、画像的または研究室的に）。それらの患者は、モデルに従って評価のときまでに肝硬変に達することが予想されたので、「遅い」線維形成者として分類された。４５歳未満である６名の肝硬変患者は、暴露事象、従って、暴露継続期間を思い出すことができなかったので、「早い」線維形成者として分類された。まとめると、「早い」線維形成者群における患者はより若く、かつ、感染継続期間がより短かった。しかしながら、暴露年齢はこれら２つの群の間で著しく異なっていなかった。
【表２】
2008506369.tif 000003
【０２４１】
チトクロームＰ４５０−２Ｄ６のＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子は肝硬変の進行に関連する。Ｐ４５０−２Ｄ６＊４変異が肝硬変の早い進行に関連するかどうかを明らかにするために、ＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子の存在を、「早い」線維形成者および「遅い」線維形成者から得られたＤＮＡ、ならびに、健康な新生児コントロールから得られたＤＮＡにおいて明らかにした。本明細書中下記の表３に示されるように、コントロール群におけるＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子の存在率は１０．５％であり、「遅い」群におけるその存在率（１４．７％）との有意な統計学的差はなかった。対照的に、「早い」群におけるＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子の存在率は著しくより大きく、３７．８％であった（Ｐ値＝０．０１６６）。
【表３】
2008506369.tif 000004
【０２４２】
加えて、ロジスティック回帰分析では、ＣＹＰ２Ｄ６＊４保因者（すなわち、ヘテロ接合個体またはホモ接合個体）の頻度が、「早い」線維形成者群（５７．６％）では「遅い」線維形成者群（２３．６％）よりも著しく高いことが明らかにされた（Ｐ値＝０．０２２、本明細書中上記の表３）。加えて、ＣＹＰ２Ｄ６＊４保因者状況のオッズ比が１１．７であった（Ｃ．Ｉ．９５％、信頼区間１．４〜９５．２７、本明細書中下記の表４）。
【０２４３】
対照的に、感染継続期間は早い線維化に対して逆の関係を有した（本明細書中下記の表４）。他方で、より若い暴露年齢、性別および年齢は、促進された線維化速度との著しい関連性はなかった（示さず）。
【表４】
2008506369.tif 000005
【０２４４】
従って、これらの結果は、ＣＹＰ２Ｄ６＊４変異を有するＨＣＶ患者は、肝硬変に早く進行する危険性が増大していることを明らかにしている。
【０２４５】
このように、本発明者らは、ＣＹＰ２Ｄ６遺伝子における遺伝子型がＨＣＶ患者における線維化進行速度を有意に予測するものであることを初めて発見している。
【０２４６】
分析および考察。ＨＣＶ感染の治療における著しい進歩がこの１０年間に生じており、治療可能な患者の集団が拡大している。軽度の疾患（無症状、生検での最小限の線維化、若年での感染）を有する患者は遅進性の経過をたどると従来的には見なされていた。その後は、治療の重篤な副作用に照らして、生活の質が重要であり、また、費用有効性が発生し、治療に対するこのような患者の適格性が依然として議論されている（Ｈｅａｔｈｃｏｔｅ  Ｊ、慢性Ｃ型肝炎患者のための抗ウイルス治療、Ｓｅｍｉｎ．Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓ．２０００、２０：１８５〜９９）。患者の一部が、肝硬変への迅速な進行を伴う有害経過を有すること［Ｐｏｙｎａｒｄ、２００１（上掲）］を知ることにより、このような患者を特定し、かつ、感染の経過の早期に治療を開始することは非常に重要である。
【０２４７】
本発明の結果は、ＣＹＰ２Ｄ６＊４（不良な代謝酵素の遺伝子型）が、促進された線維化速度と著しく関連するという証拠を提供している。この対立遺伝子の存在率は、「早い線維形成者」の方が「遅い線維形成者」の場合よりも著しく大きかった。しかしながら、遅い群およびコントロールにおけるこの対立遺伝子の存在率には著しい差がなかった。その上、ロジスティック回帰分析では、ＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子の保因者状況は、肝硬変への迅速な進行について、より大きな危険性を有することが明らかにされた。
【０２４８】
感染継続期間および線維化段階に関する「早い」群および「遅い」群の間での著しい差（本明細書中上記の表２）により、「早い」および「遅い」と分類することの方法論が有効であることが確認された。これに関して、肝硬変への進行についての感染のメジアン推定継続期間が３０年であることが以前に明らかにされていた［Ｐｏｙｎａｒｄ、１９９７（上掲）］。本研究では、「遅い」群における感染のメジアン期間が、「早い」群における１８．７年の感染と比較して、３６．４年であった。
【０２４９】
Ｃ型肝炎での線維形成プロセスにおけるＣＹＰ２Ｄ６の正確な役割をいつかは明らかにしなければならない。近年、アラキドン酸およびエイコサノイドの代謝におけるＣＹＰ４５０スーパーファミリーおよびＣＹＰ２ファミリーの役割がますます認識されている。これらの物質の様々な代謝経路における複合体の各酵素の正確な関わりが依然として集中的に研究されている（Ｎｅｂｅｒｔ，Ｄ．Ｗ．他、２００２、チトクロームＰ４５０の臨床的重要性、Ｌａｎｃｅｔ、３６０（９３４０）：１１５５〜６２）。アラキドン酸が肝臓の星細胞系におけるコラーゲン遺伝子の転写活性化を介してＩ型コラーゲンの合成をアップレギュレーションしたことが以前に明らかにされていた（Ｎｉｅｔｏ  Ｎ他、２０００、エタノールおよびアラキドン酸は、チトクロームＰ４５０  ２Ｅ１を過剰発現するラット肝臓星細胞におけるアルファ２（Ｉ）コラーゲンの発現を増大させる：Ｈ２Ｏ２およびシクロオキシゲナーゼ−２の役割、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５：２０１３６〜４５）。従って、ＣＹＰ２Ｄ６活性の喪失はアラキドン酸分解を低下させ、従って、肝臓の星細胞からのＩ型コラーゲンの産生を増大させているかもしれない。
【０２５０】
（実施例２）
早い線維化に対する素因におけるＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｅ１およびＡＰＯ  ＥでのＳＮＰの関与
【０２５１】
肝臓線維化および肝硬変の早い進行についてのさらなる危険性因子を特定するために、慢性のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染を有するユダヤ人起源のさらに３２名の白人患者を研究のために集めた。これら３２名の患者は、本明細書中上記の実施例１の材料および方法のところで記載された研究プロトコルに従って、「早い線維形成者」（１４名の患者）または「遅い線維形成者」（１８名の患者）として分類された。合計で、現在、８２名の慢性ＨＣＶ患者がこの研究に含まれる。
【０２５２】
材料および方法
研究対象者および血液サンプル。３２名の慢性ｈＣＶ患者を人口学的データおよび臨床データに関して面接し、患者の医学記録を、本明細書中上記の実施例１における材料および方法のところで記載されたように再検討した。血液サンプルを各患者から集め、ＤＮＡを、本明細書中上記の実施例１における材料および方法のところで記載されたように末梢血リンパ球から抽出した。
【０２５３】
非アルコール性脂肪肝疾患（ＮＡＦＬＤ）患者。今日までに、ユダヤ人起源の１５名の白人ＮＡＦＬＤ患者が登録された。患者を（ｈＣＶ患者と同様に）面接し、すべての医学記録を再検討し、記録した。血液サンプルを集め、ＤＮＡを抽出した。
【０２５４】
慢性ｈＣＶ患者におけるＣＹＰ２Ｄ６遺伝子、ＣＹＰ３Ａ５遺伝子、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子およびＡＰＯ  Ｅ遺伝子でのＳＮＰの存在についての分子的分析。本明細書中下記の表５は、多型ヌクレオチドを含む関連したＰＣＲ産物を増幅するために使用されたＰＣＲプライマーを示す。
【０２５５】
チトクロームＰ４５０の２Ｄ６＊４変異（配列番号６（Ｇｅｎｂａｎｋアクセション番号Ｍ３３３８８）に示されるような３４６５位でのＧ−＞Ａの置換）。これを、本明細書中上記の実施例１に記載されるように検出した。ＣＹＰ２Ｄ６についてのへテロ接合体は＊４（Ａ対立遺伝子）／ＷＴ（Ｇ対立遺伝子）であり、ホモ接合体は＊４（Ａ対立遺伝子）／＊４（Ａ対立遺伝子）である。
【０２５６】
配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｊ０２８４３）に示されるようなヌクレオチド１５３２でのＣＹＰ２Ｅ１プロモーターにおけるＣＹＰ２Ｅ１のＳＮＰ（Ｇ−＞Ｃ）。これを、本明細書中下記の表５に列挙されるフォワードＰＣＲプライマー（配列番号１１）およびリバースＰＣＲプライマー（配列番号１２）を用いてゲノムＤＮＡを増幅することによって検出した。ＰＣＲ増幅後、Ｇ−＞Ｃの多型（ＧＴＧＣＡＧ−＞ＣＴＧＣＡＧ；下線部のヌクレオチドが多型である）を、ＣＴＧＣＡＧ配列（下線部のＣが多型ヌクレオチドである）を認識するＰｓｔＩ制限酵素でＰＣＲ産物（４１３ｂｐ）を消化することによって検出した。従って、ＳＮＰが存在しない場合（野生型、配列番号１７の１５３２位においてＧの共通する対立遺伝子）では、ＰｓｔＩ消化は４１３ｂｐの１個のフラグメントをもたらす。他方で、ＳＮＰが存在する場合（希な対立遺伝子、配列番号１７の１５３２位においてＣ）では、ＰｓｔＩ消化は１１８ｂｐおよび２９５ｂｐの２つのフラグメントをもたらす。
【０２５７】
配列番号１７（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｊ０２８４）に示されるようなヌクレオチド１７７２でのＣＹＰ２Ｅ１プロモーターにおけるＣＹＰ２Ｅ１のＳＮＰ（Ｃ−＞Ｔ）。これを、本明細書中下記の表５に列挙されるフォワードＰＣＲプライマー（配列番号１１）およびリバースＰＣＲプライマー（配列番号１２）を用いてゲノムＤＮＡを増幅することによって検出した。ＰＣＲ増幅後、制限部位をＲｓａＩに変化させる、Ｃ−＞Ｔの多型（ＧＴＡＣ−＞ＧＴＡＴ；下線部のＣおよびＴが多型ヌクレオチドである）を、ＲｓａＩ制限酵素でＰＣＲ産物（４１３ｂｐ）を消化することによって検出する。従って、ＳＮＰが存在しない場合（野生型、配列番号１７の１７７２位においてＣの共通する対立遺伝子）では、ＲｓａＩ消化は６１ｂｐおよび３５２ｂｐの２つのフラグメントをもたらす。他方で、ＳＮＰが存在する場合（配列番号１７の１７７２位においてＴの希な対立遺伝子）では、ＲｓａＩ消化は４１３ｂｐの１個のフラグメントをもたらす。
【０２５８】
配列番号１８（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＦ３５５８００）の１７４位でのＣＹＰ３Ａ５＊３（第３イントロン）のＳＮＰ（Ａ−＞Ｇ）。これを、本明細書中下記の表５に列挙されるフォワードＰＣＲプライマー（配列番号１３）およびリバースＰＣＲプライマー（配列番号１４）を使用して検出した。ＰＣＲ増幅後、Ａ−＞Ｇの多型を、ＣＴＮＡＧ配列（Ｎ＝任意のヌクレオチド）を認識するＤｄｅＩ制限酵素でＰＣＲ産物（２００ｂｐ）を消化することによって検出した。従って、ＳＮＰが存在しない場合（配列番号１８の１７４位にヌクレオチドＡを有するＣＹＰ３Ａ５＊１対立遺伝子）では、ＤｄｅＩ消化は１２９ｂｐおよび７１ｂｐの２つのフラグメントをもたらす。他方で、ＳＮＰが存在する場合（ＣＹＰ３Ａ５＊３対立遺伝子、配列番号１８の１７４位においてＧヌクレオチド）では、ＤｄｅＩ消化は、２２ｂｐ、７１ｂｐおよび１０７ｂｐの３つのフラグメントをもたらす。ＣＹＰ３Ａ５＊３と呼ばれる変化体Ｇ、および、ＣＹＰ３Ａ５＊１と呼ばれる変化体Ａ。ＣＹＰ３Ａ５についてのヘテロ接合体は＊３／＊１（配列番号１８の１７４位においてＧ／Ａ）であり、ホモ接合体は＊３／＊３（配列番号１８の１７４位においてＧ／Ｇ）であり、非存在（＊１対立遺伝子のホモ接合体）は配列番号１８の１７４位においてＡ／Ａを示す。さらなる情報については、Ｓｈｕｉｃｈｉ  Ｆｕｋｕｅｎ他、２００２、ＰＣＲ−ＲＦＬＰによる新規な検出アッセイおよび日本人集団におけるＣＹＰ３Ａ５のＳＮＰ（ＣＹＰ３Ａ５＊３およびＣＹＰ３Ａ５＊６）の頻度、Ｐｈａｒｍａｃｏｇｅｎｅｔｉｃｓ、１２：３３１〜３３４を参照のこと（これは全体が参考として本明細書中に組み込まれる）。
【０２５９】
配列番号１９の５５位（これは、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００００１９：５０１００９０２〜５０１０４４８９におけるヌクレオチド２８８０に対応する）でのＡＰＯ  Ｅ４変化体のＳＮＰ（Ｔ−＞Ｃ）。これを、本明細書中下記の表５に列挙されるフォワードＰＣＲプライマー（配列番号１５）およびリバースＰＣＲプライマー（配列番号１６）を使用して検出した。ＰＣＲ増幅後、Ｔ−＞Ｃの多型を、ＧＣＧＣ配列を認識するＨｉｎ６Ｉ制限酵素でＰＣＲ産物（２２７ｂｐ、配列番号１９）を消化することによって検出した。従って、ＳＮＰが存在しない場合（野生型、配列番号１９の５５位においてＴの共通する対立遺伝子）では、Ｈｉｎ６Ｉ消化は下記のフラグメントをもたらす：２１ｂｐ、１６ｂｐ、９１ｂｐ、１８ｂｐおよび８１ｂｐ。他方で、ＡＰＯ  Ｅ４変化体が存在する場合（配列番号１９の５５位においてＣの希な対立遺伝子）では、Ｈｉｎ６Ｉ消化は下記のフラグメントをもたらす：２１ｂｐ、１６ｂｐ、１９ｂｐ、７２ｐ、１８ｂｐおよび８１ｂｐ（従って、９１ｂｐのフラグメントが１９ｂｐおよび７２ｐの２つのフラグメントに切断される）。このＳＮＰは、ＡＰＯ  Ｅタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００００３２）の１３０位においてアミノ酸残基Ｃｙｓ（コドン、ＴＧＣ）をＡｒｇ（コドン、ＣＧＣ）に変化させる。
【０２６０】
配列番号１９の１９３位（これは、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＣ＿００００１９：５０１００９０２〜５０１０４４８９におけるヌクレオチド３０１８に対応する）でのＡＰＯ  Ｅ２変化体のＳＮＰ（Ｃ−＞Ｔ）。これを、本明細書中下記の表５に列挙されるフォワードＰＣＲプライマー（配列番号１５）およびリバースＰＣＲプライマー（配列番号１６）を使用して検出した。ＰＣＲ増幅後、Ｃ−＞Ｔの多型を、ＧＣＧＣ配列を認識するＨｉｎ６Ｉ制限酵素でＰＣＲ産物（２２７ｂｐ、配列番号１９）を消化することによって検出した。従って、ＳＮＰが存在しない場合（野生型、配列番号１９の１９３位においてＣの共通する対立遺伝子）では、Ｈｉｎ６Ｉ消化は下記のフラグメントをもたらす：２１ｂｐ、１６ｂｐ、９１ｂｐ、１８ｂｐ、４８ｂｐおよび３３ｂｐ。他方で、ＡＰＯ  Ｅ２変化体が存在する場合（配列番号１９の１９３位においてＴの希な対立遺伝子）では、Ｈｉｎ６Ｉ消化は下記のフラグメントをもたらす：２１ｂｐ、１６ｂｐ、９１ｂｐ、１８ｂｐおよび８１ｂｐ（従って、Ｈｉｎ６Ｉ制限部位の消失により、４８ｂｐおよび３３ｂｐのフラグメントの代わりに、８１ｂｐのフラグメントが生じた）。このＳＮＰは、ＡＰＯ  Ｅタンパク質（ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００００３２）の１７６位においてアミノ酸残基Ａｒｇ（コドン、ＣＧＣ）をＣｙｓ（コドン、ＴＧＣ）に変化させる。
【表５】
2008506369.tif 000006
【０２６１】
実験結果
さらなる３２名のｈＣＶ患者の人口学的特徴。本明細書中下記の表６は、本研究のために集められたさらに３０名のｈＣＶ患者の人口学的データのまとめである。表に示されるように、男性が早い線維化に関連していた。加えて、遅い線維形成者群における平均感染継続期間は２３．７±１０．３６であったが、早い線維形成者群における感染継続期間は１５．４３±４．６であった。
【表６】
2008506369.tif 000007
【０２６２】
さらに３２名のｈＣＶ患者の遺伝子型決定により、早い線維形成者の間ではＣＹＰ２Ｄ６＊４変化体に対するヘテロ接合体の頻度が高いことが明らかにされた。ＣＹＰ２Ｄ６の不良な代謝酵素変化体が、本明細書中下記の表７に示されるように、さらに３２名の患者の間ではまた、早い線維化に関連することが見出された。
【表７】
2008506369.tif 000008
【表８】
2008506369.tif 000009
【０２６３】
本明細書中上記の表８に示されるように、本発明のｈＣＶ症例者の全体的な遺伝子型データを早い線維形成者または遅い線維形成者に従って分類したとき、著しい差が、対立遺伝子頻度と、ＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子のホモ接合体、ヘテロ接合体または全体的な保因者との両方の間で得られた。例えば、早い線維形成者の間でのＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子の存在率は約３３％であったが、遅い線維形成者および健康なコントロールの間でのその対立遺伝子の存在率は約１３％であった。加えて、ＣＹＰ２Ｄ６＊４対立遺伝子の全体的な保因者状況は、遅い線維形成者または健康なコントロールと比較したとき、早い線維形成者の間では２倍を超えていた。
【０２６４】
これらの結果は、本明細書中上記の実施例１で示された以前の知見についてのさらなる支持を提供しており、また、ＣＹＰ２Ｄ６＊４変異を保有するｈＣＶ患者は、肝臓線維化および肝硬変に早く進行する危険性が増大していることを明らかにしている。
【０２６５】
早い線維形成者および遅い線維形成者の間でのＣＹＰ３Ａ５遺伝子座、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子座およびＡＰＯ  Ｅ遺伝子座におけるＳＮＰの遺伝子型状況。ＣＹＰ３Ａ５遺伝子座、ＣＹＰ２Ｅ１遺伝子座およびＡＰＯ  Ｅ遺伝子座におけるさらなるＳＮＰの遺伝子型状況を、本明細書中上記の材料および方法のところで記載されたように本研究のさらに３２名のｈＣＶ患者について明らかにした。それらの遺伝子型状況を本明細書中下記の表９〜表１１にまとめる。
【表９】
2008506369.tif 000010
【０２６６】
本明細書中上記の表９に示されるように、ＣＹＰ３Ａ５＊１対立遺伝子が早い線維形成者の間（１４．３％）では遅い線維形成者の間（５．６％）よりも一般的であるように、ＣＹＰ３Ａ５＊３対立遺伝子の頻度におけるわずかな差が早い線維形成者と遅い線維形成者との間で観測された。
【表１０】
2008506369.tif 000011
【０２６７】
本明細書中上記の表１０に示されるように、著しい差が、早い線維形成者および遅い線維形成者の間で、ＣＹＰ２Ｅ１のＧ−＞Ｃ（ＰｓｔＩ；配列番号１７に示されるようなヌクレオチド１５３２）ＳＮＰの頻度において観測されなかった。他方で、ＣＹＰ２Ｅ１のＣ−＞Ｔ（ＲｓａＩ；配列番号１７に示されるようなヌクレオチド１７７２）の頻度における差が早い線維形成者および遅い線維形成者の間で存在した。従って、遅い線維形成者では、すべての患者が野生型対立遺伝子（配列番号１７のヌクレオチド１７７２においてＣ）に対してホモ接合体であったが、Ｔ対立遺伝子（配列番号１７のヌクレオチド１７７２において）に対するヘテロ接合体の頻度は早い線維形成者の間では約７％であった。
【表１１】
2008506369.tif 000012
【０２６８】
本明細書中上記の表１１に示されるように、ＡＰＯ  Ｅ２対立遺伝子の存在率における著しい差が早い線維形成者（約７％）と遅い線維形成者（約８％）との間に存在しなかったが、ＡＰＯ  Ｅ４対立遺伝子の存在率における差が早い線維形成者（約７％）と遅い線維形成者（約３％）との間に存在していた。加えて、ほぼ３倍の差が、ＡＰＯ  Ｅ４対立遺伝子の保因者（ヘテロ接合個体）の頻度において観測された。早い線維形成者では、ヘテロ接合体の頻度が１４．３％であったが、遅い線維形成者では、ヘテロ接合体の頻度が５．５％であった。
【０２６９】
まとめると、これらの結果は、ＣＹＰ２Ｄ６＊４、すなわち、チトクロームＰ４５０の２Ｄ６＊４変異（配列番号６に示されるような３４６５位でのＧ−＞Ａの置換）が、肝臓線維化の早い進行と大きく関連することを明らかにしており、また、そのような多型が、肝臓線維化の早い進行に対する素因を明らかにすることにおいて使用されることを示唆している。
【０２７０】
加えて、それ以外の候補遺伝子（例えば、ＣＹＰ３Ａ５、ＣＹＰ２Ｅ１およびＡＰＯ  Ｅ）の遺伝子型データは、これらの遺伝子および遺伝子座におけるＳＮＰが、肝臓線維化の早い進行に対する個体の素因を明らかにすることにおいて使用されることを示唆している。従って、配列番号１８に示されるようなヌクレオチド座標１７４におけるアデノシンヌクレオチド含有対立遺伝子（ＣＹＰ３Ａ５＊１対立遺伝子）、配列番号１７に示されるようなヌクレオチド座標１７７２におけるチミジンヌクレオチド含有対立遺伝子（ＣＹＰ２Ｅ１のＴ−ＲｓａＩ対立遺伝子）、および／または、配列番号１９に示されるようなヌクレオチド座標５５におけるシトシンヌクレオチド含有対立遺伝子（ＡＰＯ  Ｅ４対立遺伝子）を、肝臓線維化の早い進行に対する素因を明らかにするために使用することができる。
【０２７１】
明確にするため別個の実施形態で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施形態に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施形態で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２７２】
本発明はその特定の実施形態によって説明してきたが、多くの別法、変更及び変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更及び変形すべてを包含するものである。本願で挙げた刊行物、特許および特許願はすべて、個々の刊行物、特許および特許願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用又は確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
2008506369.tif 000013
2008506369.tif 000014
【図面の簡単な説明】
【０２７３】
【図１】感染継続期間および感染時年齢を関数とする肝硬変への進行速度を例示する、Ｐｏｙｎａｒｄ  Ｔ．他、２００１、Ｊ．ｏｆ  Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ、３４：７３０〜７３９から採用されたグラフである。
【配列表フリーテキスト】
【０２７４】
配列番号２，３，７〜９及び１１〜１６は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
配列番号１９はＳＮＰ評価のためのＰＣＲ産物の配列である。
【図１】
2008506369.tif 000015
【配列表】
2008506369000001.xml