(57)【要約】  多量体タンパク質の結合部位に結合して前記多量体タンパク質に影響を与え、それによりユニットの平衡状態に影響を与えるよう適合された作用物質を含有する組成物であって、該多量体タンパク質は複数の前記ユニットを有する会合体であり、各ユニットは第一の相補面と第二の相補面を有し、多量体タンパク質において、（１）各ユニットの構造が該異なる四次アイソフォームの構造を決定し、（２）該ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）該異なる四次アイソフォームの構造が該多量体タンパク質の機能に影響を与えるという条件で、会合体が異なる四次アイソフォームの少なくとも一つであることを前提として、一つのユニットの第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合し、前記多量体タンパク質がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒ、キナーゼ／ホスホターゼ、哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼまたはペロキシレドキシンである組成物。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多量体タンパク質の結合部位に結合して前記多量体タンパク質に影響を与え、それによりユニットの平衡状態に影響を与えるよう適合された作用物質を含有する組成物であって、前記多量体タンパク質は複数の前記ユニットを含む会合体を有し、各ユニットは第一の相補面と第二の相補面とを有し、前記多量体タンパク質において、（１）各ユニットの構造が異なる四次アイソフォームの構造を決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）前記異なる四次アイソフォームの構造が該多量体タンパク質の機能に影響を与えるという条件で、会合体が前記異なる四次アイソフォームの少なくともいずれか１つであることを前提として、１つのユニットの前記第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合し、前記多量体タンパク質がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒ、キナーゼ／ホスファターゼ、哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼおよびペロキシレドキシンから選択されたメンバーである、組成物。
【請求項２】
前記多量体タンパク質に対する影響に、四次アイソフォームの形成に対する影響が含まれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記多量体タンパク質に対する影響に、前記多量体タンパク質の機能に対する影響が含まれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記多量体タンパク質の機能が活性であり、影響が阻害作用または活性化作用の少なくともどちらか１つである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
作用物質が活性の低い四次アイソフォームまたは活性の高い四次アイソフォームの少なくともどちらか１つに結合する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ユニットのそれぞれが単量体、二量体、三量体、四量体、六量体、および八量体から選択されたユニットである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
多量体タンパク質に影響を与える方法であって、
複数のユニットを有する会合体を含む多量体タンパク質を提供する工程であって、各ユニットが第一の相補面と第二の相補面とを有し、（１）前記ユニットの構造が異なる四次アイソフォームを決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）前記異なる四次アイソフォームの構造が前記多量体タンパク質の機能に影響を与えることを条件で、会合体が異なる四次アイソフォームの少なくとも一つであることを前提として、１つのユニットの前記第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合する、工程と、
請求項１に記載の組成物を提供する工程であって、前記作用物質は会合体上の結合部位に結合させることによって平衡状態に影響を与えるよう適合されている、工程と、
作用物質と会合体とを接触させる工程であって、作用物質が結合部位に対する結合によって平衡に影響を与え、その結果前記多量体タンパク質にも影響を与える工程と、
からなる方法。
【請求項８】
前記多量体タンパク質に対する影響に、四次アイソフォームの形成に対する影響が含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記多量体タンパク質に対する影響に、前記多量体タンパク質の機能に対する影響が含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ユニットが単量体、二量体、三量体、四量体、六量体、および八量体から選択されたユニ
ットである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
作用物質が、前記多量体タンパク質の機能に影響を与えるよう適合されている、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記多量体タンパク質の機能が活性であり、影響が阻害作用または活性化作用の少なくともいずれか１つである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
作用物質が、活性の低い四次アイソフォームまたは活性の高い四次アイソフォームのいずれか１つに結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
作用物質が、活性の高い四次アイソフォームに結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
細胞、組織または有機体における生理学的活性を調節する方法であって、
細胞、組織または有機体を提供する工程であって、前記細胞、組織または有機体は複数のユニットを有する会合体を含む多量体タンパク質を有し、各ユニットが第一の相補面と第二の相補面とを有し、（１）前記ユニットの構造が異なる四次アイソフォームを決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）前記異なる四次アイソフォームが、前記多量体タンパク質の機能に影響を与えるという条件で、会合体が異なる四次アイソフォームの少なくとも一つであることを前提として、１つのユニットの前記第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合する、工程と、
請求項１記載の組成物を、細胞、組織または有機体に提供する工程であって、前記作用物質は、ユニット上の結合部位に結合することによって平衡状態に影響を与え、それによって四次アイソフォームの形成に影響を与え、ひいては生理活性も調節するよう適合されている、工程と、
からなる方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本明細書にモルフィンとして定義されている１つまたは複数の異なる四次会合体の安定化を通じたタンパク質機能のアロステリック制御に関する。所与のタンパク質の各種モルフィンは、広範にわたる生物活性剤の開発の標的としうるさまざまな表面特性を備えている。特に、本発明は、モルフィン系としてのＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒ、キナーゼ／ホスファターゼ、哺乳類ＣｏＡトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼおよびペロキシレドキシンに関する。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質の三次元構造はそのタンパク質の配列によって決定され、各タンパク質に１つの構造が存在するということが一般に受け入れられている［１］。このような規則に対する例外として、用語としてはまだ賛否両論であるが、プリオンなどが挙げられ、生物学的活性を有する球状形から、無制限に成長してアミロイド斑（例えばスクレピー）を生じさせる疾患になりうる凝集体を形成する線維形状に変化させるタンパク質のことを指すために採用されている。球状プリオンタンパク質構造からのアミロイドタンパク質構造の形成は、不可逆的であると考えられている。本発明は、プリオンタンパク質を扱うわけでもなければ、変性などのタンパク質の形状における他の不可逆的変換を取り扱うわけでもない。１つのタンパク質が２つの型で、特に、２つの四次会合体で存在していることが知られているような状況の第二の例は、一部のウイルスカプシドタンパク質の準等価として発生する［２，３］。準等価ウイルスカプシドタンパク質は、ウイルスをカプセル化するジオデシックドームの安定した成分である。これらの安定した構造はさらに大きな会合体の一部として存在し、本明細書記載のモルフィン構造とは基本的に異なっている。
【０００３】
リガンド結合および／または触媒活性に対するアロステリック効果は、リガンド結合部位または活性部位とは異なるタンパク質上の部位に対する、別の分子（アロステリックエフェクター分子）の結合によって生じる前記結合または活性の変化である。多くのタンパク質の挙動はアロステリック制御を受けることで知られている。多くのアロステリックタンパク質が、同型多量体（サブユニットのそれぞれの配列が他の配列と同一であるサブユニットで構成されているオリゴマー）として存在することで知られている。アロステリック制御に関する２つの十分に容認されているモデルのＭｏｎｏｄ  Ｗｙｍａｎ  ＣｈａｎｇｅｕｘモデルとＫｏｓｈｌａｎｄモデルが存在している［４，５］。これらモデルのいずれもが明らかに、アロステリック「オン」状態とアロステリック「オフ」状態が図１に模式的に例示されているように一定のオリゴマー多様性を備えていることを仮定している。本発明は、同種オリゴマータンパク質の「オン」状態と「オフ」状態のオリゴマー多様性が異なるモルフィンモデルであるタンパク質機能のアロステリック制御のための第三のモデルに関する。
【０００４】
テトラピロール生合成は、動物、植物および細菌類、古細菌、菌類および原生生物をはじめとする微生物における基本的経路である。第一の共通の中間体は、５−アミノレブリン酸（ＡＬＡ）である。ＡＬＡからウロポルフィリノーゲンへの酵素反応は、すべての有機体におけるテトラピロール生合成に共通である［６，７］。
【０００５】
５−アミノレブリン酸デヒドロターゼ（ＡＬＡＤ）としても知られている酵素ポルフォビリノーゲン合成酵素（ＰＢＧＳ、ＥＣ  ４．２．１．２４）は、ヘム、クロロフィル、ビタミンＢ１２およびコファクターＦ４３０をはじめとするテトラピロールの生合成にお
ける第一の共通の工程を触媒する、高度に保存された古代のタンパク質である［８，９］。ＰＢＧＳは、２つの５−アミノレブリン酸分子の縮合を触媒して、テトラピロール前駆体ポルフォビリノーゲンを形成する。
【０００６】
ＰＢＧＳは、触媒部位とアロステリック部位における多種多様な二価および一価のカチオンを利用する、ホモ八量体金属酵素であるとかつて考えられていた。第一の１８個の堆積Ｘ線結晶構造が、図２におけるヒトＰＢＧＳに関して例示されている八量体会合を示している［１０］。哺乳動物および酵母の酵素は、通常Ｚｎ（ＩＩ）を必要とし、一部の原核生物酵素はＭｇ（ＩＩ）またはＺｎ（ＩＩ）あるいは最大活性ではその両方を必要とし、植物酵素は、酵素活性にＭｇ（ＩＩ）のみを必要とするようである。少数の有機体は、Ｚｎ（ＩＩ）またはＭｇ（ＩＩ）のいずれも必要としないＰＢＧＳ酵素を備えている。金属イオンの使用における差異は、少なくとも２つの金属結合領域における一次構造内の多種多様な残基によって生じる［１１］。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳの構造は図３Ａ−Ｃに例示されているとおりであり、ＰＢＧＳ構造における共通の金属結合の差異を示すのに役立っている。各Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳ単量体には、２個の金属イオンが含まれているが、そのいずれもが、系統発生学的に保存されてはいない。活性部位には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳ活性に必要不可欠な亜鉛イオンが含まれているが、その３つのシステインリガンドは、多くのＰＢＧＳに存在していない。この第二基材分子の結合および反応でこの亜鉛が機能を果たす［１２］。亜鉛部位の詳細は、図３Ｂに例示されているとおりである。さらに、隣接サブユニットのＮ末端アームと各α、βバレルの界面で結合されていると思われているアロステリックマグネシウムが存在している。構造の詳細は、図３Ｃのとおりである。アロステリックマグネシウムを結合するための配列決定因子は、すべてのＰＢＧＳに存在しているわけではない。ＰＢＧＳは、触媒亜鉛結合部位を保有しているか否かおよび図４に図解されているように、アロステリックマグネシウム結合部位を所有しているか否かに基づいて４群に分類されている。
【０００７】
図４は、活性部位亜鉛を使用しているか否かおよびアロステリックマグネシウムを使用しているか否かを基準として、ＰＢＧＳを４群に分類するための模式図である［１１］。第一のマトリックス（いちばん左）は、２クラスすなわち、（ａ）左側の活性部位亜鉛（陰影付き）および（ｂ）右側の非活性部位亜鉛（陰影なし）に分類されている。第二のマトリックスは、２つのクラスすなわち（ａ）上端のアロステリックマグネシウムなし（白）および（ｂ）底部のアロステリックマグネシウム（四角）に分類されている。２つのマトリックスを統合すると、北西象限（ＱＮＷ）が＋Ｚｎ／−Ｍｇを表し、北東象限（ＱＮＥ）が−Ｚｎ／−Ｍｇを表し、南西象限（ＱＳＷ）が＋Ｚｎ／＋Ｍｇを表し、南東象限（ＱＳＥ）が−Ｚｎ／＋Ｍｇを表す。ＱＮＷ、ＱＮＥ、ＱＳＷ、ＱＳＥという用語は、本明細書全体を通じて図４の象限を表すのに使用されている。
【０００８】
発明者は、公知の配列の下記の分布を四つの象限、ＱＮＷ＝９、ＱＮＥ＝２、ＱＳＷ＝５５およびＱＳＥ＝６３にすでに定量化している［１１］。したがって、現在利用可能な配列の約２分の１が活性部位亜鉛の要求量をコードし、半分はコードしない（すなわちＱＮＷ＋ＱＳＷ〜ＱＮＥ＋ＱＳＥ）。活性部位金属パターン分布とは逆に、ＰＢＧＳ配列の９０％以上にアロステリックマグネシウム結合の決定因子が含まれている（すなわちＱＳＷ＋ＱＳＥ＞＞ＱＮＷ＋ＱＮＥ）。
【０００９】
一部の発生源からのＰＢＧＳの比活性は、図５に図解されているようにタンパク質濃度に依存するということが明らかとなっている。例えば、Ｂ．Ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓおよびえんどう豆のＰＢＧＳに関する比活性のタンパク質濃度依存性が確認されているが、Ｅ．ｃｏｌｉ、イースト菌からのＰＢＧＳまたは哺乳動物源からのＰＢＧＳについては記録がない［１３−１５］。このような現象について本願出願時以前は、活性度が最高度の八量体の、活性の低いまたは不活性な
四量体および／または二量体への単純な解離反応であると解釈されていた（図５）。本願出願時以前の解釈には、ＰＢＧＳの代替モルフィンは含まれていない。
【００１０】
活性部位またはアロステリック部位から金属を除去すなわちエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）または１，１０−フェナントロリンでＰＢＧＳを処置することによって、ＰＢＧＳを阻害することが知られている［１６，１７］。
【００１１】
今日、多くの消費者たちが、おしぼりやオムツなどのヒト用の衛生製品が目的とする役割だけでなく、例えば消費者の健康を損なうことなく細菌類、古細菌および／または真核生物と接触することによって生じる疾患または損傷に対する治療または予防を行える能力を備えることを要求しつつある。このような要求を満たすため、抗菌剤をおしぼりなどの広範にわたる消費者製品に組み込んで、皮膚上に一時的に寄生する細菌類または常駐する細菌類の双方の殺傷を試みた。抗菌剤含有製品は現在ローション、デオドラント石鹸、塗装面クリーナー、おしぼりおよび外科手術用消毒剤などの多くの形態で市販されている。
【００１２】
生物膜は特定の面で問題となる可能性がある。生物膜は、十分な水分が存在する、基本的にはどのような環境表面にでも見出すことができる。これらの発生は、十分な栄養を摂取することができる流水系ですぐに認められる。生物膜は、環境表面に合着した微生物集団またはコミュニティで構成されており、細胞や多糖類の複合体である。これらの微生物は、自身が合成する細胞外多糖類内に通常格納されている。例えば、生物膜は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓおよびＫｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの混合培地から形成され得る。生物膜は、生体内の柔らかい組織面上の水分や液体−大気界面の水分と接触する固形基材上に形成され得る。生物膜産生の代表的場所として、海洋または淡水環境における岩やその他の基材面が挙げられる。さらに生物膜は、一般に植物と動物双方の生態と関連付けられる。豊かな水性培地内に定常的に浴液している歯や腸粘膜などの組織面は、それ自体が産生する細胞外多糖類内に封じ込められた微生物の複合体をすぐに発生させる。自己の細胞内に親ヨード性多糖類またはグリコーゲン様分子を口腔細菌が格納できる能力は、これら格納化合物が、乳酸情報が発生する時間を延長することができるので、虫歯と関連付けられる。つまり、乳酸に長い期間曝露すると歯のエナメル質の脱カルシウム化が生じる。
【００１３】
ヒトは、居住環境補修領域で主として微生物の生物膜を活用してきた。水処理工場、排水処理工場および個人の住宅に関連付けられる汚水処理タンクは、病原体を取り除き、生物膜との相互作用によって水中や排水中の有機物質の量を減少させる。その一方で生物膜は、人口基材が導入されている患者では特に、健康に対する重大な脅威ともなっている。さらに生物膜は、フジツボが成長し、オイルポンプや除湿機などのパイプの表面または外面または内面を腐食させる可能性がある船底に対する脅威である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
前述の開発状況にもかかわらず、幅広い用途を持つ生物活性組成物を提供することが望まれている。さらに、多量体タンパク質のユニットの平衡を阻害できる薬剤、例えば、ポルフォビリノーゲン合成酵素の活性の低い四次会合体の安定化を通じて植物および／または細菌類におけるテトラピロールの生合成を阻害する阻害剤などを提供することも望まれている。さらに、ヒトや動物に適用不能な機序を介して、このような阻害を達成し、生菌活性、抗菌活性または除草活性に対する新規かつきわめて特異的なアプローチを生み出すことが望まれている。多くの必須タンパク質が、本質的に同種オリゴマーおよびアロステリックの性格を備えているので、四次会合体の平衡状態の摂動を通じて、これらの同種オリゴマータンパク質を阻害または活性化する生物活性化合物を提供することが望まれている。
本明細書に引用した参考文献はすべて、その全文を参照により本明細書に組み込む。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
したがって、本発明は、前記多量体タンパク質の結合部位に結合して前記多量体タンパク質に影響を与え、それによりユニットの平衡状態に影響を与えるよう適合された作用物質を含有する組成物であって、多量体タンパク質は複数の前記ユニットを有する会合体であり、各ユニットは第一の相補面と第二の相補面を有し、多量体タンパク質において、（１）各ユニットの構造が前記異なる四次アイソフォームの構造を決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）異なる四次アイソフォームの構造が該多量体タンパク質の機能に影響を与えるという条件で、会合体が各種四次アイソフォームの少なくとも１つであることを前提として、一つのユニットの第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合し、前記多量体タンパク質がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒ、キナーゼ／ホスファターゼ、哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼおよびペロキシレドキシンから選択されたユニットである、組成物を提供する。特定の実施形態では、前記多量体タンパク質に対する影響には、四次アイソフォームの形成に対する影響が含まれている。
【００１６】
特定の実施形態では、前記多量体タンパク質に対する影響には、前記多量体タンパク質の機能に対する影響も含まれる。前記多量体タンパク質機能の非限定的な例として、活性が挙げられ、この場合影響は阻害または活性の少なくともどちらか一方となる。
【００１７】
特定の実施形態では、作用物質は、活性が低い四次アイソフォームまたは活性が高い四次アイソフォームの少なくともいずれか１つに結合する。
ユニットの非限定的な例には、単量体、二量体、三量体、四量体、六量体および八量体が挙げられる。ユニットは、五量体、七量体、九量体、十量体などであってもよい。
【００１８】
特定の実施形態では、前記多量体タンパク質は、８つのポルフォビリノーゲン合成酵素単量体を有するポルフォビリノーゲン合成酵素である。他の実施形態では、多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素の活性型は、８つ未満の単量体を有する。
【００１９】
特定の実施形態では、前記多量体タンパク質は、ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼであり、活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に対する選択的結合を通じて、作用物質がＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼを阻害する。ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼの既存の四量体結晶構造［１８］は、活性型が六量体［１９］であるということを生化学データが予測しているために、不活性型であると予想される。
【００２０】
特定の実施形態では、前記多量体タンパク質はヒスチジン含有ホスフォキャリアタンパク質キナーゼ／ホスファターゼであり、作用物質は、活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に対する選択的結合を介して阻害する。この場合、結晶構造が存在している六量体型は、ホスファターゼ活性を有し、キナーゼ活性は不活性であると予想される［２０］。したがって、六量体を捕捉するとキナーゼ活性の低い型が捕捉される。
【００２１】
特定の実施形態では、前記多量体タンパク質は哺乳動物のＣｏＡトランスフェラーゼであり、作用物質は活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に対する選択的結合を介して、哺乳動物のＣｏＡトランスフェラーゼを阻害する。哺乳動物のＣｏＡトランスフェラーゼは、大きな速度論的障壁によって分離される二量体型および四量体型の双方に存在することが報告されている［２１］。四量体型の活性が等しいものであるか、または基材存在下で活性二量体型に対する即時再平衡化が存在するか否かは定かではない。
【００２２】
特定の実施形態では、前記多量体タンパク質はプリンヌクレオシドホスフォリラーゼであり、作用物質が活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に対する選択的結合を介して、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼを阻害する。現在のデータは、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼのモルフィンが二量体、三量体および２つの異なる六量体であることを示唆しているが［２２、２３］、どちらが不活性型であるかを提唱するデータは揃っていない。特定の実施形態では、前記多量体タンパク質はペロキシレドキシンであり、作用物質が活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に対する選択的結合を介して、ペロキシレドキシンを阻害する。ペロキシレドキシンの四次アイソフォームは、多量体を形成できない二量体、多量体を形成できる二量体および多量体を形成できる二量体の十量体からなると思われる［２４、２５］。不活性モルフィンは十量体を形成できる二量体であると提唱されている。
【００２３】
さらに第一の単量体の数が第二の単量体の数より大きい、第二の単量体の数を有する多量体タンパク質の活性の低い型に結合することによって、第一の単量体の数を有する多量体タンパク質の活性型の形成を阻害するよう適合された阻害薬を有する組成物を提供する。
【００２４】
特定の実施形態では、前記活性の低い型は六量体である。特定の実施形態では、前記活性の低い型は二量体である。特定の実施形態では、多量体タンパク質の活性型は八量体である。
【００２５】
特定の実施形態では、阻害剤が金属イオンと置き換わるので、金属イオン結合部位で結合する。特定の実施形態では、金属イオンは亜鉛および／またはマグネシウムである。
特定の実施形態では、阻害剤は活性部位で結合する。
【００２６】
特定の実施形態では、阻害剤は金属カチオンではない。
特定の実施形態では、組成物は、さらに、医薬として許容される媒質、経口投与可能な担体、抗菌媒質、除草剤効果のある媒質から選択されたメンバーである送達媒質を有している。
【００２７】
有利な点として、組成物は、多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素の活性型の形成を阻害または予防する効果があるので、細菌類、古細菌および／または真核生物の発生または成長を阻害または防止する効果がある。この実施形態の１つの態様では、組成物は、細菌類、古細菌および／または真核生物に接触することによって生じる疾患を治療または予防するのに効果がある。この実施形態の１つの態様では、組成物は、薬剤、練り歯磨き、石鹸、消毒剤、抗生物膜組成物および除草剤の少なくともいずれか１つである。
【００２８】
特定の実施形態では、組成物は、多量体タンパク質の活性型の形成を阻害または防止し、したがって、細菌類、古細菌および／または真核生物の発生または成長を阻害または防止する効果がある。この実施形態の１つの態様では、組成物は、細菌類、古細菌および／または真核生物に接触することによって生じる疾患を治療または予防するのに効果がある。この実施形態の１つの態様では、組成物は、薬剤、練り歯磨き、石鹸および消毒剤の少なくともいずれか１つである。
【００２９】
さらに、多量体タンパク質に影響を与える方法であって、
複数のユニットを有する会合体を含む多量体タンパク質を提供する工程であって、各ユニットが第一の相補面と第二の相補面を有し、（１）前記ユニットの構造が異なる四次アイソフォームの構造を決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）前記異なる四次アイソフォームの構造が前記多量体タンパク質の機能に影響を与えるという条件で、会合体が異なる四次アイソフォームの少なくとも一つであることを前提として、１つ
のユニットの第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合する、工程と、
会合体上の結合部位に結合することによって平衡に影響を与えるよう適合されている作用物質を含有する本発明の組成物を提供する工程と、
作用物質と会合体を接触させる工程であって、作用物質が結合部位に結合することによって平衡に影響を与え、その結果Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒ、キナーゼ／ホスファターゼ、哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼおよびペロキシレドキシンから選択されたメンバーである多量体タンパク質に影響を与える工程と、
からなる方法を提供する。
【００３０】
前記方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質に対する影響には、四次アイソフォームの形成に対する影響も含まれている。前記方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質に対する影響には、前記多量体タンパク質の機能に対する影響も含まれる。
【００３１】
本方法の特定の実施形態では、ユニットには、単量体、二量体、三量体、四量体、六量体および八量体が含まれる。ＰＢＧＳ以外のタンパク質の場合、ユニットは、五量体、七量体、九量体、十量体などであってもよい。
【００３２】
本方法の特定の実施形態では、作用物質は、前記多量体タンパク質の機能に影響を与えるよう適合されている。
本方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質の機能が活性であり、影響は阻害または活性化の少なくともいずれか１つである。
【００３３】
本方法の特定の実施形態では、作用物質は、活性の低い四次アイソフォームまたは活性の高い四次アイソフォームの少なくともいずれか１つに結合する。
本方法の特定の実施形態では、作用物質は、活性の高い四次アイソフォームに結合する。
【００３４】
本方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質は、８つのポルフォビリノーゲン合成酵素単量体を有するホルフォビリノーゲン合成酵素である。
本方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質はＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼであり、作用物質は活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に対する選択的結合を介してＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼを阻害する。
【００３５】
本方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質は、ヒスチジン含有ホスフォキャリアタンパク質キナーゼ／ホスファターゼであり、作用物質は活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に対する選択的結合を介してヒスチジン含有ホスフォキャリアタンパク質キナーゼ／ホスファターゼを阻害する。
【００３６】
本方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質は哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼであり、作用物質は活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に対する選択的結合を介して哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼを阻害する。
【００３７】
本方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質は尿ヌクレオシドホスフォリラーゼであり、作用物質は活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に対する選択的結合を介して尿ヌクレオシドホスフォリラーゼを阻害する。
【００３８】
本方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質はペロキシレドキシンであり、作用物質は活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に対する選択的結合を介してペ
ロキシレドキシンを阻害する。
【００３９】
さらに、細胞、組織または有機体における生理活性を調節する方法であって、
細胞、組織または有機体を提供する工程であって、前記細胞、組織または有機体は複数のユニットを有する会合体を含む多量体タンパク質を有し、各ユニットが第一の相補面と第二の相補面を有し、（１）前記ユニットの構造が前記異なる四次アイソフォームの構造を決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）前記異なる四次アイソフォームの構造が該多量体タンパク質の機能に影響を与えるという条件で、会合体が異なる四次アイソフォームの少なくとも一つであることを前提として、１つのユニットの第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合し、前記多量体タンパク質はＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒ、キナーゼ／ホスファターゼ、哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼおよびペロキシレドキシンから選択されたメンバーである工程と、
ユニット上の結合部位に結合することによって平衡に影響を与え、それによって、四次アイソフォームの形成に影響を与え、ひいては生理活性も調節するよう適合された作用物質を含有する本発明の組成物を、前記細胞、組織または有機体に提供する工程と、
からなる方法を提供する。
【００４０】
さらに、抗菌面を製造するための方法であって、
（１）多量体ホルフォビリノーゲン合成酵素の活性型の形成を阻害または防止し、したがって、細菌類、古細菌および／または真核生物の発生または成長を阻害または予防する効果のある本発明の組成物を提供する工程であって、多量体ホルフォビリノーゲン合成酵素の活性型がアロステリックマグネシウム結合部位を含み、組成物が、薬剤、練り歯磨き、石鹸、消毒剤、抗生物膜組成物および除草剤のうちの少なくともいずれか１つである工程と、
（２）表面形成基材を提供する工程と、
（３）表面形成基材と組成物を結合し、それにより抗菌面を製造する工程と、
からなる方法も提供する。本方法の一つの態様では、抗菌面は生物膜の形成を予防または阻害するよう適合される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４１】
本発明は、テトラピロール生合成の基本的科学に関する発明者の研究によって促進されたものである。酵素ポルフォビリノーゲン合成酵素の不測の挙動により、発明者はこのタンパク質およびおそらくは他のタンパク質もＡｎｆｉｎｓｅｎのパラダイム（１タンパク質、１構造）［１］を否定し、さらには、各四次会合体が単量体ユニットの別の立体構造の当然の帰結であるような複数の生理学的関連性のある四次会合体として存在しうるということを提唱するに至っている。これらの別の四次会合体にはモルフィンという名称が与えられている。同種オリゴマータンパク質の別の四次会合体としてのモルフィンの二次元模式表示は、図６に示されているとおりである。以下に詳細に述べる構造体であるＰＢＧＳのモルフィンおよび１部のＰＢＧＳが、アロステリック制御の対象となるという発明者の知見により、図７に例図されており、すでに提唱されているアロステリスムのモデルすべてとは基本的には異なるタンパク質機能のアロステリック制御のモルフィンモデルを提唱するに至った（図１に示されている）。アロステリック制御のモルフィンモデルでは、オリゴマータンパク質がオン状態からオフ状態へ、あるいはその逆にアロステリック遷移の一環として劇的に再配列しなくてはならない。
【００４２】
本発明は、信号伝達および細胞周期制御に関わる状態など、異なるオリゴマー化状態がどのようにして経路を亢進させたり減衰させたりしうるのかに関して思考する新規な方法を提供する。本発明に従い、アロステリック制御がモルフィン間の平衡状態によって定義
されうる任意のタンパク質の活性がこれらのモルフィンの１つまたは別のモルフィンの固有の表面機構に結合するので、図８に示されているように四次型の平衡を移行させる作用物質（小分子など）によって調節可能である。これら作用物質の結合部位は、特異的モルフィンの形状に特有な表面ポケットであってもよいので、これら部位は一般には、系統発生学的に保存された配列を含むということが予想されておらず、従って種特異性が許容される。ポルフォビリノーゲン合成酵素は、アロステリック制御の対象となる原型モルフィン系として表され、本発明の最も特異的な実施形態は、１つまたは複数の低活性（オフ状態）モルフィンの安定化を介したポルフォビリノーゲン合成酵素の阻害に関する。
【００４３】
本明細書に全体が取り込まれている、ＪａｆｆｅのＰＣＴ公開ＷＯ２００５／００７８１７には、ＰＢＧＳのモルフィン間における平衡状態を調節することによってテトラピロール生合成が調整可能であると記載されている。したがって、ＰＢＧＳ六量体の固有の表面成分と優先的に相互作用し、六量体の型方向にモルフィンの分布を置き換える（植物と一部の細菌類ＰＢＧＳでは不活性型であると考えられている）阻害剤分子を発見することができる。
【００４４】
有利な点として、本発明は、前記多量体タンパク質の結合部位に結合し、それによってユニットの平衡状態に影響を与えることにより多量体タンパク質に影響を与えるように適合された作用物質を含む組成物であって、多量体タンパク質は複数の前記ユニットを有する会合体であり、各ユニットは第一の相補面と第二の相補面を有し、（１）各ユニットの構造が前記異なる四次アイソフォームの構造を決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）異なる四次アイソフォームの構造が該多量体タンパク質の機能に影響を与えるという条件で、会合体が異なる四次アイソフォームの少なくとも１つであるということを前提として、１つのユニットの第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合し、前記多量体タンパク質がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒ、キナーゼ／ホスファターゼ、哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼまたはペロキシレドキシンの少なくともいずれか１つである、組成物を提供する。
【００４５】
本発明の組成物は、宿主有機体における細菌類、古細菌および／または真核生物の発生または成長を阻害または防止するのに使用することができる。例えば、本発明の組成物は、薬剤、練り歯磨き、石鹸、消毒剤、抗生物膜組成物および除草剤の形態で使用することが可能である。特に、薬剤は、抗がん剤、新陳代謝に影響を及ぼす薬剤または低温薬剤、抗生物質、抗ウイルス剤などであってよい。本発明は、所望の効果を達成しそれに影響を与えることができるようにする標的有機体の選択について説明する。
【００４６】
多量体タンパク質のユニットは、例えば、単量体、二量体、三量体、四量体、六量体および八量体であってよい。特定の実施形態では、前記多量体タンパク質に対する影響には四次アイソフォームの形成に対する影響も含まれる。特定の実施形態では、前記多量体タンパク質に対する影響には、前記多量体タンパク質の機能に対する影響も含まれる。前記多量体タンパク質の機能の非限定的例として、活性が挙げられ、ここで「影響を与える」とは阻害または活性化の少なくともいずれか１つである。さらに以下に述べるように、用途次第では、作用物質は、活性の低い四次アイソフォームまたは活性の高い四次アイソフォームの少なくともどちらか１つに結合することができるので、多量体タンパク質を阻害または活性化する。
【００４７】
多量体タンパク質の例として、ポルフォビリノーゲン合成酵素およびクラスＩａリボヌクレオチドリダクターゼ（ＤＮＡ複製に必須のデオキシリボヌクレオチドの均衡を保つ役割を果たす高度に調製された酵素）などのリボヌクレオチドリダクターゼが挙げられる。
【００４８】
下記の５つの系は、潜在的モルフィン系として特定されている。第一の系が、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼで、これは保護生物膜の作成を助長する、ヒト病原体Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａをカプセル化する多糖類であるアルギン酸塩の生合成における主要な調節酵素である。第二の系が、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒ（ホスフォキャリアタンパク質を含むヒスチジン）、炭素異化代謝抑制／活性化の調節に関与する、ほとんどのグラム陽性（および一部のグラム陰性）菌のキナーゼ／ホスファターゼ（ＨＰｒＫ／Ｐ）である。酵素の調節により、細菌類は、炭素源における環境変化に即時適合することができる。第三の系は、哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼで、これはケトン体の代謝にとって必須のミトコンドリア酵素である。第四の系がプリンヌクレオシドホスフォリラーゼ（ＰＮＰ）酵素で、これらは、プリンサルベージ経路で主要な役割を果たす多様なオリゴマー化学量を有するとして報告されている。第五の系が、ペロキシレドキシン族で、細胞シグナリング経路、アポトーシスおよび細胞分化の調節で抗酸化剤としての役割を果たす系統発生的多様なタンパク質族である。
【００４９】
このように、特定の実施形態では、作用物質は、活性が低い四次アイソフォームに結合する阻害剤であり、ここで四次アイソフォームには、８つ未満のポルフォビリノーゲン合成酵素単量体が含まれている。同様に、多量体タンパク質はクラスＩａリボヌクレオチドリダクターゼまたは別のモルフィン系であるが、作用物質は活性の低い四次アイソフォームに固有の結合部位に選択的に結合することによって、クラスＩａリボヌクレオチドリダクターゼを阻害する。
【００５０】
本発明では、多量体タンパク質の一例としてＰＢＧＳの使用法について以下のように解説している。したがって本発明は、第一の単量体の数が第二の単量体数より大きい、第二の単量体の数を有する多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素の活性の低い型に結合することによって、第一の数の単量体を有する多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素の活性型の形成を阻害するよう適合された阻害剤を含む組成物を提供する。
【００５１】
本発明者は、少なくとも２つの代替四次構造、すなわち八量体と六量体でＰＢＧＳが存在しうることをつきとめた。より数の少ないＰＢＧＳ単量体を有する多量体ＰＢＧＳも、本発明の対象として取り込まれる。本願以前には、八量体型のみの存在が知られていた。いずれの型でも、α８β８バレルの中央に活性部位が含まれているＣ末端３００アミノ酸からなるα８β８バレルが単量体に含まれている。サブユニットの可変長Ｎ末端部分は両方のオリゴマー型間、すなわち八量体と六量体における広範囲にわたるサブユニット間相互作用に関与する拡張アーム構造を形成する。２つの四次構造体間における大きな相違は、Ｎ末端アームの立体構造にある。図２は、抱合二量体の四量体としての八量体ＰＢＧＳの会合体を表している。図９は、分離二量体の三量体としての六量体ＰＢＧＳの会合体を表している。
【００５２】
特定の実施形態では、多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素は、八量体ポルフォビリノーゲン合成酵素がアロステリックマグネシウム結合部位を含んでいるという前提条件下に、細菌類、古細菌または真核生物に由来する。本実施形態の１つの態様では、多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素に触媒亜鉛結合部位が含まれている。
モルフィンの一例としてのポルフォビリノーゲン合成酵素
以下に、ＰＢＧＳが本明細書で「モルフィン」（図２，６，９）と呼ばれている代替四次状態で存在する場合があり、モルフィンがアロステリック制御のための構造基礎であり（図７，８，１０）、これら状態の相互変換が一部の種におけるこのＰＢＧＳのアロステリック制御のための構造基礎を形成する（図１１，１４）という知見について述べる。ＰＢＧＳの公知の四次状態は、抱合二量体で構成される八量体である（図２）。また、特に
図４のＱＳＥのＰＢＧＳなど、一部のＰＢＧＳが比活性に対するタンパク質濃度依存性によって示されるような四次型の平衡状態として存在している（図５）ということも公知である。比活性に対するタンパク質濃度依存性は、最大限の活性を有するオリゴマーが、小さな活性の低い型に解離するかまたは再結合しうるということを示唆している。小さい活性の低い型は、抱合二量体の多重体（図５にモデル化）であると以前は考えられていた。四次アイソフォーム間でＱＮＷにおけるＰＢＧＳが速やかに平衡状態に達することがないという事実によって、分離二量体の安定したオリゴマーの観察および特徴付けが可能となった。したがって、ヒトＰＢＧＳのＦ１２Ｌ突然変異によって発明者は六量体の安定型について調べ、それが野生型ヒトＰＢＧＳを基準としたＦ１２Ｌの劇的に異なる機能特性を表す六量体特性である（特異的Ｆ１２Ｌ突然変異はない）という見解を確立するにいたった。Ｆ１２Ｌは、ヒトＰＢＧＳに自然発生する希少な対立遺伝子である［２６、２７］。従来の技術によってＥ．ｃｏｌｉ内に異種構造として発現され、精製されたヒトＰＢＧＳ（野生型とＦ１２Ｌの双方）の研究成果について、以下の実施例１に記載する。野生型とＦ１２Ｌの異なる物理的速度論的特性を、図１２、表１および図１６Ａならびに１６Ｂに図示する。
【００５３】
野生型ヒトＰＢＧＳ、Ｆ１２Ｌ変異型およびＷＴ＋Ｆ１２Ｌ異量体に関するデータは、野生型タンパク質とＦ１２Ｌ変異型との間の速度論的差異が、基本的には以下の実施例２に詳細に述べるように四次構造体における差異によるものであるということを明確にしている。他の選択ヒトＰＢＧＳ突然変異型（Ｒ２４０Ａ、Ｔ２３ＰおよびＴ２３Ｐ／Ｆ１２Ｌ）に関するさらなる研究により、六量体の速度論が、Ｆ１２Ｌの速度論と同様であり、八量体の速度論が野生型タンパク質の速度論と同様であることが確認されている。
【００５４】
代謝回転（触媒活動）時におけるヒトＰＢＧＳモルフィンの相互変換は、以下の実施例２に詳細に述べているように、図１７Ａ−Ｄおよび表３に図解されているような異量体ＷＴ＋Ｆ１２Ｌオリゴマーの物理的および速度論的特性に基づいて仮説が立てられた。延長された代謝回転中にこれらの異種オリゴマーの不均衡が、ヒトＰＢＧＳのモルフィンが実施例３に図示されているように、動的平衡状態で存在しうることを実証している。
【００５５】
八量体対六量体ヒトＰＢＧＳの構造を考慮すると、これら２種の型のＰＢＧＳで最適なｐＨの劇的な差についての仮説を打ち立てることができる。ＰＢＧＳ触媒反応の化学的性質では、少なくとも２つのＳｃｈｉｆｆ塩基の中間体の形成が必要である［２８］。これらＳｃｈｉｆｆ塩基に対するカルビノールアミン前駆体の形成には、関与するアミノ基が帯電しないことまたは局部ｐＨがアミノ基のｐＫａより上でなくてはならない。六量体ＰＢＧＳと八量体ＰＢＧＳとの間における１つの大きな構造上の差異は、活性部位のフタを有するアミノ酸に認められる秩序の度合いである。六量体ＰＢＧＳ  Ｆ１２Ｌの結晶構造は、活性部位フタを形成する残基のほとんどから密度が欠失しており、したがって、六量体構造は、閉じたフタ構造を不安定化させることが示唆される。活性部位をバルク溶剤から単離させるための閉じたフタの非存在下では、ＰＢＧＳ触媒反応は、外部ｐＨがＳｃｈｉｆｆ塩基の形成に関与するアミノ基のｐＫａより高くなるまで先に進むことはできない。したがって、六量体構造は、外部ｐＨがＳｃｈｉｆｆ塩基形成を促進する十分な塩基性を呈したときだけ活性を示すことが提唱されている。高いＫm値は、ＰＢＧＳ八量体の結
晶構造がフタ上の残基とＫm値を決定する基材分子との間の安定化相互作用を示すので、
活性部位フタの不安定化に起因するとも考えられる。本成果により、ＰＢＧＳ機能の調整についての理解に対する新規のアプローチが得られている。以下に述べるように、ＰＢＧＳ六量体の特定から得られた洞察は、ヒト以外の種におけるＰＢＧＳ活性のアロステリック制御を再考する上でかなり重要な意味を持っている。
ＰＢＧＳのアロステリック制御は、八量体−六量体間平衡に起因しうる
ＰＢＧＳ八量体と六量体との比較から、ＰＢＧＳのアロステリック制御の基本概念が明らかとなる。ＰＢＧＳ活性部位のすべての明らかな成分が単量体に含まれているという事
実は別として、ほとんどのＰＢＧＳタンパク質には抱合二量体のアーム−バレル界面に特定されるアロステリックマグネシウムの結合部位が含まれている［１１、２９］。アロステリックマグネシウムの位置は、図１８Ａの後部に示されているように、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ［２９］およびＥ．ｃｏｌｉＰＢＧＳ［３０］両方の結晶構造に認められる。図１８Ａには、黒いボールとしてアロステリックマグネシウムが示されている抱合二量体（明るいリボン、暗い鎖）が示されており、その黒いボールの１つが大きな黒を背景とした白の矢印で図示されている。酵母およびヒトＰＢＧＳの構造は、すでに図示したように［９］、アロステリックマグネシウムに代わりアルギニンのグアニジニウム基が残留していることを示している。これはヒトＰＢＧＳのＡｒｇ２４０である。適切な条件下ですべてのＰＢＧＳが六量体状態で存在しうると想定した場合、アロステリックマグネシウムの位置は、その金属結合部位が八量体に存在し（抱合二量体で構成される）、六量体には存在しない（分離二量体で構成される）ために、六量体から八量体への遷移に関係がある。図１８Ｂは、ＰＢＧＳ八量体における３つのサブユニット間の界面を表している。白い背景に黒の矢印は、バレル−バレル間界面を表しており、これは、八量体ＰＢＧＳ会合体と六量体ＰＢＧＳ会合体の双方にとって共通である。黒い背景に点線で表した矢印は、アーム−バレルの塩基間相互作用を表しており、これもまた八量体ＰＢＧＳ会合体と六量体ＰＢＧＳ会合体の双方にとって共通である。アロステリックマグネシウム結合部位に相同の黒い背景に白い矢印は、八量体（抱合二量体）で存在し、六量体（分離二量体）では存在しないアーム−バレル相互作用を表している。アロステリックマグネシウムが六量体−八量体平衡状態を介在するという概念と、Ｅ．ｃｏｌｉＰＢＧＳ運動論パラメータに対するマグネシウムの影響とは、一致している。この場合、アロステリックマグネシウムを添加するとＫm値が〜２ｍＭから〜２００μＭまで減少するが［３１］
、これはヒトＰＢＧＳの六量体型および八量体型のＫm値間における差異を驚くほど連想
させる（表１）。さらに留意すべき点として、本質的に純粋なＥ．ｃｏｌｉＰＢＧＳが未処理ゲル電気泳動で複数のバンドを示すこと、これらバンドの移動性が八量体、六量体、四量体および二量体の分子サイズと一致していること、マグネシウムの添加が最も大きな（八量体）型に有利に働くこと［３１］（図１９に再現）に関する発明者の以前の観察が挙げられる。さらに注意すべきこととして、ヒトＰＢＧＳ変異型Ｒ２４０Ａは、六量体として〜８０％、八量体として２０％を精製し、八量体のオリゴマーは不安定であり、時間の経過に伴い六量体へと再構成されるという点が挙げられる。
【００５６】
タンパク質濃度依存性比活性の観察は、モルフィンの平衡状態の存在に関する診断ツールの１つである
六量体と八量体との間のＰＢＧＳの相互変換は、一部の種由来のＰＢＧＳタンパク質濃度依存性比活性を担う機序として提唱されている。今日までに、本発明者は、アロステリックマグネシウムを含む４種類の異なるＰＢＧＳを特徴付けしている。酵素は、Ｅ．ｃｏｌｉ（γ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒ）、Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ（α−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒ）、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（γ−ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒ）およびＰｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ（緑色植物）の種から得ている。最後の３つは活性部位触媒亜鉛を使用せず［１１］、タンパク質濃度依存性比活性の特異な特性を共有しているという点で、ヒトＰＢＧＳとは異なっている［１３，１４，３２］（図５参照）。後者の特性は、活性が最も高いオリゴマーが、活性の低いまたは不活性の小さな型に解離しうるということを示している。図５に示されているように、公表されている演算モデルは、最も活性の高い八量体が活性の低いまたは不活性の四量体および／または二量体に解離すると想定している［１３，１４］。
【００５７】
ヒトＰＢＧＳ変異型Ｆ１２Ｌの六量体構造により、本発明者は、図２０Ａおよび２０Ｂに示されているように、植物と特定の細菌類ＰＢＧＳのタンパク質濃度依存性は、むしろ活性の低い六量体型と活性の高い八量体型間における平衡状態に起因すると考えるにいたっている。このような平衡状態の存在は、えんどう豆ＰＢＧＳに関する沈殿平衡状態研究
によって裏付けられている。マグネシウムは抱合二量体と別の分離二量体との間の差にとって必要不可欠であるために、このイオンは、抱合二量体ひいては八量体の形成に有利に働くと考えられている。図２０Ｃは、えんどう豆ＰＢＧＳからのマグネシウムの除去が最も大きな型には不利に働いて、小さな型には有利に働くことを示唆しており、この場合、２つの型の移動性は八量体と六量体の移動性に一致している。モデルでは六量体は生理的ｐＨでは活性が低く、ＡＬＡの生理学的濃度を十分に超えるＫm値によって特徴付けられ
ることから、ＰＢＧＳタンパク質の推定上の保存型である。それとは逆に、八量体は生理学的ｐＨで活性であり、活性テトラピロール生合成時のＡＬＡ濃度の適切な範囲内にあるＫm値を保持する。
【００５８】
まとめると、これらの研究は、クロロフィル生合成の複雑な制御でのＰＢＧＳに対する役割が存在しているという考えを裏付けている［３３−３５］。植物の緑化の記録では、＜１ｍＭから＞１０ｍＭへの葉緑体におけるマグネシウム濃度の劇的増加が示されている［３６］。えんどう豆ＰＢＧＳのアロステリックマグネシウムのＫｄは２．５ｍＭで生理学的に妥当である［１３］。緑化プロセスを伴う一連の生化学的変化の一環としてのＰＢＧＳの即時活性化を、不活性六量体の保存型が可能にするということを想像することができる。植物および藻類ＰＢＧＳの四次構造に関するいくつかのゲルろ過研究の結果、オリゴマーは六量体であると結論付けているが［３７］、これらの研究は、八量体の結晶構造の定量に先行しており、八量体−六量体平衡状態が存在しているという点を考慮してはいない。陰イオン交換クロマトグラフィーによって分離されたＰＢＧＳの相互変換可能四次型の存在を裏付ける文献が、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｒｅｇｕｌａｒｉｓ由来のＰＢＧＳに関する早期段階のレポート［３８］に見受けられるが、この研究者は同様に特異な現象について報告しているのであって、モルフィンの存在の予見を指摘してはいない。
【００５９】
六量体ヒトＰＢＧＳは、タンパク質機能のアロステリック制御に関する新規な構造上のパラダイムを解明し、モルフィンとして存在しうるタンパク質の最初の例となっている。
ヒトＰＢＧＳ変異型Ｆ１２Ｌの特徴付けの結果、この点突然変異は、ＰＢＧＳの構造および機能における劇的な変化を生じさせていることが明らかとなっている。この突然変異は、進化の過程におけるタンパク質の挙動での大きな変化を生じさせる１個のアミノ酸変化の先例としての役割を果たしうる。Ｆ１２Ｌ突然変異は、ＰＢＧＳ八量体を不安定化させ、六量体の形成へと導く。八量体と六量体との間の構造上の遷移は、２種類の二量体構造を含む先例のない平衡状態を通過しなくてはならない。ほとんどのＰＢＧＳに存在するアロステリックマグネシウムは、八量体内に結合部位を有するが、六量体内には有していない。未処理ゲルのデータは、アロステリックマグネシウムの除去が、八量体よりも六量体の形成に有利に働くことを示唆している（図２０Ｃ参照）。八量体−六量体遷移は、タンパク質機能の金属イオン依存アロステリック制御の新規なメカニズムを定義するものである。
【００６０】
本発明は、ＰＢＧＳの不活性モルフィンおよび／またはモルフィンの相互変換によって調節されうる他のタンパク質の安定化を介した、タンパク質機能の阻害について説明している。ＰＢＧＳの六量体型に選択的に結合し、これを安定化させる分子を解明するために、本発明者は、下記のアプローチを用いている。ＱＳＥ（図４および１４を参照）におけるＰＢＧＳのみが、八量体として活性を有することが実証されているため現在標的として検討されているが、それらはタンパク質濃度依存特異性活性現象を呈する。標的分子は、図１３にボール状で示されているような、六量体の「アーム−ピット」に選択的に結合する分子である。本発明者は、標的有機体由来の六量体型のＰＢＧＳに結合する分子に関する分子ライブラリを検索するのに「コンピュータでの」アプローチを採用している。
【００６１】
モルフィンの相互変換によって調節可能な他のタンパク質についても同様のアプローチを用いることができる。活性の低いモルフィンの結晶構造またはそのモデル、さらには、
活性モルフィン上には存在しないこの標的モルフィン上の固有の表面結合ポケットの局在化を備える必要がある。場合によっては、固有結合ポケットを局在化させるために、活性モルフィンと不活性モルフィン双方を代表する結晶構造を所有する必要もあるであろう。それ以外には、固有表面結合ポケットを予測するための活性モルフィンに関する生化学的または生物物理的なデータと関連して、不活性モルフィンの構造を検討することも可能であろう。実施例５および６では、ＧＭＤおよびＨＰｒＰ／Ｋに関して提唱されている固有表面結合ポケットについて解説する。
ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼの阻害
アルギン酸塩は、一部の病原性ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＡｚｏｔｏｂａｃｔｅｒによって覆われた褐藻類の細胞壁内および莢膜物質（生物膜）内に存在する多糖類属である。人類においては、アルギン酸塩は、創傷被覆材として用いられているが、病原体によって蓄積されたアルギン酸塩は、人類に被害を与え、宿主の免疫反応や抗生物質に対する障壁を与える。このようにアルギン酸塩生合成の阻害は、特に偏在する院内病原となってきた抗生物質耐性Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａに対抗する抗生物質の開発のための魅力的な標的となっている。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼ（ＧＭＤ、ＥＣ  １．１．１．１３２）は、アルギン酸塩の生合成における主要な調節酵素である［９２］。本発明者は、ＧＭＤモルフィンベースの公表されている速度論現象の存在について提唱している［１９］。比活性は、酵素の濃度に依存しており、さらに反応成分の添加順序にも依存している。  酵素の添加によって開始される活性試験の結果、顕著なヒステリシス現象を示す一方で、ＮＡＤコファクターの添加によって開始された同じ組成物の試験では、一定の活性が認められ、活性の低い型からより活性の高い型へのＧＭＤモルフィンの再平衡化を基材が開始したことを示唆している。ＧＭＤのサイズと共同性の測定の結果、触媒作用による活性型は、六量体であり、三量体ではおそらく平衡状態になることを示唆している［１９］。ただし、公表されている結晶構造（図２９Ａ）は、２つの緩やかに結合した二量体から構成される四量体を示している［１８］。活性および不活性型の裏付けとして、「共同」型ではＮＡＤのアフィニティが低いがＶmax値は高く、「非共同」型ではＮＡＤに関するアフィニテ
ィは高いが、Ｖmax値が低い［１９，９３］、２種類の型間で「即時相互変換する」とい
うことが報告されている。本発明者は、利用可能な結晶構造が低Ｖmax値のモルフィンを
表していると提唱している。
【００６２】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼの結晶構造四量体（図２９Ａ、ＰＤＢコード１ＭＶ８）は、サブユニットＡとＢまたはＣとＤ間における緊密なほぼプレッツェル様の関係を示すが、ＡＢ二量体とＣＤ二量体との間の相互作用が弱いことを示している。図２９Ｂは、ＡＢ二量体の側面図を表しており、左半分にはリボンを使用してタンパク質が表わされ、酵素結合リガンドを白く塗りつぶした状態で表示している。右半分には同様にタンパク質が塗りつぶしを使用して表示されている。左半分と右半分の比較の結果から、サブユニット間に活性部位リガンドがどのように配置されているかが示されており、さらに実際にはサブユニット間に活性部位リガンドがほぼ埋め込まれている状態が示されている。結晶構造ではＮＡＤおよびＧＤＰ−マンノースの類似体であるリガンドを放出させるために、タンパク質はこれらのサブユニットを実質的に方向変更する必要があるのではないかと考えるであろう。本発明者は、このような二量体または四量体は、ＮＡＤに極めてしっかりと結合する低活性型であり、さらに、構造が未知である活性六量体の形成を抑止するためにこの型を捕捉することが可能であると提唱している。この構造が速やかに解離するという概念の裏づけとして、サブユニットの界面に多数の水分子が存在している。図２９Ｃは、サブユニットＡとＢ双方の４．０Ａ内に存在する水分子（白い球形）を表している。
【００６３】
ＧＭＤのＡＢ二量体の表面は、新薬発見のための標的とすることのできる少なくともひとつの深いポケットを備えている（図２９Ｄ）。この結合ポケットは、両サブユニットか
らの残基で構成され、この部位で結合しているリガンドは、この推定上活性の低い型に向けてモルフィン平衡を引き寄せると予想されている。この例は、活性の高い六量体モルフィンを形成させるためには、緊密に相互に絡み合っている二量体を引き離し、再会合させねばならないという前提に基づいている。この仮説を実証するために、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＭＤの１．６Ａ結晶構造を用い、このポケットを薬剤結合部位として選択し、引用されているコンピュータを使用した方法を用いて、その部位に成分を結合させる。次に、比活性に対するタンパク質濃度依存性に影響を与える方法で、ＧＭＤを阻害する能力の有無についてヒットした分子を試験する。
ホスファターゼ活性オリゴマーとしての細菌ヒスチジン含有ホスフォキャリアタンパク質キナーゼ／ホスファターゼの固定
ほとんどのグラム陽性菌（および一部のグラム陰性菌）の二元機能ＨＰｒキナーゼ／ホスファターゼ（ＨＰｒＫ／Ｐ、ＥＣ  ２．７．１．−／３．１．３）は、炭素異化生成物の抑止または活性化の調節に関与している。この複雑な調節経路により、細菌類は、炭素源における環境変化にすみやかに適合することができるので［２０］、それらの生存が確保される。本発明者は、以下の理由によりモルフィンとしてＨＰｒＫ／Ｐが存在すると提唱している。ＨＰｒＫ／Ｐの複雑な速度論は、さまざまな度合いで共同性が反応条件に依存していることを示している。Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｓ  ｃａｓｅｉ［９４］、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｘｙｌｏｓｉｓ［９５］およびＭｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｎｏｎｉａｅ［９６］に由来するＨＰｒＫ／Ｐの結晶構造はすべて、２個の三量体からなる六量体会合体を示している。このような結晶構造に基づき、ヌクレオチド結合がヌクレオチドの特異な立体構造にかかわりを持つという点、またはタンパク質がヌクレオチドを収容するためにその四次構造を変えなければならない［２０］という点が示唆されている。したがってこの六量体モルフィンは、ホスファターゼ活性を有する型であるとして提唱されている。このモルフィンは、ヌクレオチドに結合できない場合にはキナーゼともなりえない。Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒＫ／Ｐの詳細な分析結果から、単量体、二量体および六量体のｐＨ依存構造平衡が示唆されており［９７］、構造が未知である低オリゴマー状態がキナーゼ活性型であると提唱されている。オリゴマー構造の平衡は、アロステリック活性因子および基材の影響を受け、このことは、オリゴマー化状態がキナーゼとホスファターゼ活性間における切り替えに重要な役割を果たしていることを示唆している［９７］。結晶構造の決定以前のトリプトファン蛍光研究は、酵素が２つの型のほぼ５０／５０の混合物であるオリゴマーの異種集団として存在していると結論付けている。１つの型には、溶剤に曝露した位置に１個のトリプトファン残基が含まれており、もう１つの型では、溶剤から埋め込まれた位置にトリプトファンが含まれていた［９８］。本発明者は、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｉｓ  ｃａｓｅｉ  ＨＰｒＫ／Ｐ（ＰＤＢコード１ＫＫＪ）の結晶構造にＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒＫ／Ｐの固有のトリプトファンをマップし、このトリプトファンが完全に溶剤に曝露されていることを突き止めたが（図３０に例示）、これはトリプトファン蛍光がヨウ化物の添加によって急冷されたオリゴマー（〜５０％）の集団を反映すると解釈される。このトリプトファンは六量体の表面上に存在しているので、六量体の三量体、二量体または単量体への単純な解離では、固有トリプトファンの溶剤曝露特性を変化させることはない。したがって、キナーゼ活性型は、このトリプトファンが埋め込まれている別のモルフィン立体構造に関与すると提唱される。
【００６４】
ＨＰｒＫ／Ｐのキナーゼ活性型に関する結晶構造は利用不能であるため、本発明者はホスファターゼ活性六量体型を捕捉するための論理的根拠を示唆している。ＨＰｒはＳｅｒ−４６でリン酸化するときに、炭素異化生成物制御タンパク質と相互作用することができる。このような相互作用の非存在下では、利用可能炭素源を代謝させるのに必要な遺伝子を細菌類がオンの状態に活性化することができないということを予測できるであろう。したがって、六量体会合体でＨＰｒＫ／Ｐを捕捉するということは、細菌細胞の成長を阻害するかまたは細菌類が胞子形成状態に入るように作用することである、と論じることも可能であろう。図３０に示されているＬ．ｃａｓｅｉ構造は、この六量体のタンパク質の推
定キナーゼ不活性型を捕捉する推定薬剤分子に関する固有の表面結合部位の基礎を形成する３つの表面トリプトファンを表している。このようにしてクラスター化した表面トリプトファン残基は、卓越した結合部位を形成するはずであるが、亀裂は浅い。さらにこのトリプトファンは、病原有機体由来のＨＰｒＫ／Ｐすべてに保存されるわけではない。図３１は、深い表面亀裂であり、ＨＰｒＫ／Ｐタンパク質すべてにとって共通の構造であると予想される（共通の配列ではない場合）ＨＰｒＫ／Ｐの六量体会合体内の別の亀裂を表している。
標的六量体ＰＢＧＳの相同モデルの構築
本発明者は、ヒトＰＢＧＳ臨床変異型Ｆ１２Ｌ、ＰＤＢコード１ＰＶ８の結晶構造に基づいて標的六量体ＰＢＧＳのモデルを構築した［３９］。残念なことに、Ｆ１２Ｌの結晶構造は極めて無秩序であり、相同モデルの構築のための完全な基礎として使用することの妨げとなっている。しかしながら、ヒトＰＢＧＳ八量体構造と六量体構造（ＰＤＢコード１Ｅ５１と１ＰＶ８）を比較すると、ＴＩＭ様のα、βバレルドメインを有する〜３００アミノ酸についてほとんど同一性が認められる。ヒトＰＢＧＳに関しては、八量体と六量体との間の差異は、２４アミノ末端アミノ酸と六量体ではさらに無秩序である各種領域の構造に認められる［３９］。したがって、標的ＰＢＧＳのα、βバレルドメインを構築する相同モデルとしてＰＢＧＳ八量体の高品質の結晶構造を使用することができる。選択された構造は、ＰＤＢコード１ＧＺＧ［４０］であり、これはＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳの高度に秩序だった高分解能結晶構造を表しており、それ自体ＰＢＧＳ六量体を「捕捉」する阻害剤の標的である。六量体型のＰ．Ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳは、Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ  （ｗｗｗ．ｅｘｐａｓｙ．ｃｈ／ｓｐｄｂｖ／ｍａｉｎｐａｇｅ．ｈｔｍｌ）および他のプログラムの各種能力を用いて構築されている。Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳ六量体を構築するために、Ｎ末端アームを１ＧＺＧ二量体の構造ファイルから削除した。生成されたα、βバレルドメイン（残基３２−３３５）を六量体１ＰＶ８の３つの二量体上に順次重ね、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳα、βバレルの六量体会合体を作成した。ヒトとＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳとのＮ末端アーム間における大きな配列の一致性は認められなかったが、Ｎ末端アームの構造内に保存されたαらせんが認められる。したがって、八量体型のヒトＰＢＧＳとＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳの構造アラインメントを用いて、このαらせんセグメントにとって適切な配列アラインメントを判定した。この情報を用いて、六量体におけるＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳのアミノ酸２２−２９を空間配置した。Ｌｏｏｐｙのプログラム［４１］を使用して、Ｎ末端αらせんを各サブユニットのα、βバレルドメインに接続できるように、アミノ酸２９−３２をモデル化した。最後に、ファイル１ＰＶ８内に存在している残りのＮ末端アミノ酸を六量体ヒトＰＢＧＳの対応するアミノ酸に関するφ、ψおよびωの角度情報を用いてＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳ構造体へと組み立てた。ヒトＰＢＧＳ六量体（１ＰＶ８）のＮ末端の一部における無秩序さにより、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳの六量体モデルは、サブユニットＡ、ＣおよびＥの残基１−９、ならびにサブユニットＢ、ＤおよびＦの残基１−１１が欠失している。六量体Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳは、以前に行ったように、十分に確立した公表されている方法を用いて六量体えんどう豆ＰＢＧＳのモデルを構築するための基礎構造である［１６］。
【００６５】
六量体ＰＢＧＳに優先的に結合する分子を追求したところ、下記が発見された。ＰＢＧＳの六量体の分析結果から、想定される「阻害因子」結合部位（アーム−ピットとしても表される）には、３個のサブユニット、Ａ、ＢおよびＥの要素が含まれている。サブユニットＡおよびＢは、すでに定義されている「分離二量体」を有しており、ここでいちばん下のサブユニット（サブユニットＡ、図２１）は、α、βバレルの中心にある活性部位を直接眺めることができるように代表例として示されている。サブユニットＢはサブユニットＡとバレル−バレル界面を共有している。サブユニットＥは、サブユニットＢと相互作用を行うが、ここで一方のサブユニットのＮ末端アームは他のサブユニットのαβバレル
の基部に入れ子されている。図示されている三量体のアーム−ピットは、小分子の計算処理による検索で「結合部位」として使用された。この部位に小分子を結合させるための計算法を使用するプロセスをドッキングと呼んでいる。使用されたドッキングプログラムはＧｌｉｄｅ［４２、４３］であり、頑強な本体としてタンパク質を支持して、結合部位に最適な相補配列（形状、電荷）を捜し求めて小分子が多くの立体構造をサンプリングするのを可能にする。このプロセスをドッキングと呼ぶ。図２１は、以下に述べるドッキングした阻害剤であるロスマリン酸を示している。このドッキングの結果、ロスマリン酸は、３つのサブユニットすべてと、図２１に示されているような直接的相互作用を行う。
【００６６】
共同研究者であるＧｅｏｒｇｅ  Ｍａｒｋｈａｍによって組み立てられた多様な「小分子」分子ライブラリを用いて、ドッキングプロセスにより六量体型でＰＢＧＳを捕捉する分子を発見しようとした。初期ライブラリのスクリーニングでは、代謝産物と天然の産物に焦点を当てた。今日までに、〜１，０００，０００個の分子の分子ライブラリの中から〜３０，０００個がえんどう豆ＰＢＧＳの六量体モデルの「アーム−ピット」に結合する分子として選別されている。ドッキングスコアの高いいくつかの分子を購入し、これらがえんどう豆ＰＢＧＳを阻害するか否かを確認する試験を行った。天然産物であるロスマリン酸で最適な結果が得られた。
【００６７】
本発明の詳細な説明の理解を当業者が理解しやすいように、以下に概念と定義を述べる。
「プロモータ」または「プロモータ領域」という用語は、適切な部位における転写を開始するのに必要なＲＮＡポリメラーゼまたは他の因子のための認識部位を提供することによって、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の産生制御により、コーディング配列の発現を制御するコーディング配列の上流（５‘）に通常認められる核酸配列を表す。本明細書で意図されているように、プロモータまたはプロモータ領域には、各種調節配列に対する結合、ランダム突然変異または制御突然変異、および、エンハンサー配列の添加または複製などにより得られた、プロモータの変異型が含まれている。本明細書に開示されているプロモータ領域およびその生物学的機能同等物は、ｍＲＮＡを産生できるということによって実証されているような、好適な組み換えベクターの一部として宿主に投入されたときにこれらの制御下でコーディング配列の転写を推進する役割を担っている。
【００６８】
「再生」は、植物細胞由来の植物を生育させる工程を表す（例えば植物原形質体または外植片）。
「形質転換」は、染色体に外性核酸を取り込むかまたは自律複製を行うことのできる細胞または原形質体への外性核酸配列（例えばベクター、組み換え核酸分子）を導入する工程を表す。
【００６９】
「形質転換細胞」は、外性核酸分子をその細胞に導入することによってＤＮＡが改質されている細胞である。
「遺伝子」という用語は、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ、または、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質またはＲＮＡ分子および発現の調節に関与するコーディング配列の側面に位置する領域をコードする他のＤＮＡを表す。
【００７０】
「プロモータ領域に異種のＤＮＡセグメント」という語句は、コーディングＤＮＡセグメントが現在接着しているプロモータと同じ遺伝子内に天然には存在していないということを意味する。
【００７１】
「コーディングＤＮＡ」という用語は、本明細書で論じている酵素のどれか１つをコードする、染色体ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ｃＤＮＡまたは合成ＤＮＡを表す。
「ゲノム」という用語は、細菌宿主細胞内の染色体およびプラスミド双方を含む細菌類
に適用される。したがって、細菌類宿主細胞に導入された本発明のコーディングＤＮＡは、染色体に組み込まれる場合もあるしプラスミドに局在化する場合もありうる。「ゲノム」という用語は、核内に見られる染色体ＤＮＡのみならず、細胞の細胞成分内に見られるオルガネラＤＮＡを取り囲む植物細胞にも適用される。したがって、植物細胞に導入された本発明のＤＮＡは染色体に組み込まれる場合もあるし、プラスミドに局在化する場合もある。
【００７２】
「除草剤」という用語は、植物、植物細胞、植物の種子または植物組織を殺傷またはその成長を抑止するのに使用される化学物質を表す。
「阻害剤」という用語は、有機体の成長または生存に必須である生合成酵素、レセプター、信号伝達タンパク質、構造遺伝子生成物または輸送タンパク質などといったタンパク質の酵素活性を不活性化させる化学物質を表す。本発明に関しては、阻害剤は、ポルフォビリノーゲン合成酵素の酵素活性を不活性化させる化学物質である。「除草剤」という用語は、植物、植物細胞、植物の種子または植物組織に適用されるときに阻害剤を定義するのに本明細書で使用されている。
【００７３】
「微生物」または「微小生物」という用語は、藻類、細菌類、古細菌類、菌類および原生生物を表す。
「過剰発現」は、ポリペプチドまたはタンパク質が通常宿主細胞に存在していない、または前記ポリペプチドまたはタンパク質が前記ポリペプチドまたはタンパク質をコードしている外生遺伝子から通常発現するレベルよりさらに高いレベルで前記宿主細胞に存在しているような、宿主細胞に導入されたＤＮＡによってコードされているポリペプチドまたはタンパク質の発現を表す。
【００７４】
「植物」という用語は、任意の発達段階における植物またはその一部を表す。ここには、挿し木、細胞または組織培養物および種子も含まれる。本発明と関連して使用されているように、「植物組織」という用語には、植物全体、植物細胞、植物器官、植物の種子、プロトプラスト、カルス細胞、細胞培養物および構造および／または機能ユニットに組織化された植物細胞の任意の群が含まれるが、これらに限定されない。
【００７５】
「色素体」という用語は、アミロプラスト、クロロプラスト、クロモプラスト、エライオプラスト、エオプラスト、エチオプラスト、ロイコプラストおよびプロプラスチド原形質体を含む植物細胞小器官の類を表す。これらの小器官は自己複製型であり、植物種により約１２０ｋｂ〜約２１７ｋｂの範囲のサイズであり、通常は逆反復領域を含む円形ＤＮＡ分子である、「クロロプラストゲノム」と一般に呼ばれているものを含んでいる。
【００７６】
「許容性／耐性」という用語は、阻害剤または除草剤に曝露したときに通常の生育または機能を継続することのできる能力を表す。
「形質転換」という用語は、異種ＤＮＡを細胞、組織または植物に導入するためのプロセスを表す。形質転換された細胞、組織または植物は、形質転換プロセスの最終生成物であるだけでなく、それらの形質転換子孫も含むと解釈される。
【００７７】
「口腔組成物」は、通常の利用方法では、特定の治療薬の全身投与を目的として意図的に嚥下するのではなく、むしろ口腔活性を目的として歯の表面および／または口腔組織の実質的にすべてに十分接触できるだけの時間の間口腔内に維持される生成物である。口腔組成物は、単一相の口腔組成物であってもよいし、２種類またはそれ以上の口腔組成物の組み合わせであってもよい。
【００７８】
本明細書で使用している「口腔許容担体」という用語は、好適な賦形剤を意味しているが、これは安全かつ効果的な方法で口腔に本組成物を適用するのに使用できる。このよう
な賦形剤には、フッ素イオン源、添加抗結石剤、緩衝液、他の研磨剤、過酸化物源、アルカリ金属重炭酸塩類、増粘剤、保湿剤、水分、表面活性剤、二酸化チタン、香味系、甘味料、キシリトール、着色剤およびそれらの混合物などといった物質が含まれていてもよい。
モルフィンについての概念
「モルフィン」という用語は、本開示では本発明者により、以下に詳細に述べるようなタンパク質の各種四次アイソフォームを説明するために使用されている。所与のタンパク質のモルフィンは、相互に平衡状態にあり、場合によってはモルフィンがアロステリック制御のための基礎を形成しうる。植物および一部の細菌ＰＢＧＳの場合には、モルフィン間における遷移のための刺激となるのが、アロステリック制御因子すなわち作用物質（例えばマグネシウム）である。
【００７９】
近年の生化学の１つの教義では、タンパク質の三次元構造はそのタンパク質のアミノ酸配列の直接的帰結であるとしている。したがって、１つのタンパク質配列が１つの未処理構造を形成するということが教示される。プリオンの発見は、この１つの構造の概論に対する課題を提起しているが、これらが「異常な折りたたみ構造」であると考える場合にはそうではない。本発明は、単量体ユニットにおける立体構造の変化の生理学的に関連する帰結である別のタンパク質四次構造体であるモルフィンの発見である新たな発見に導き出している。モルフィンの場合、別の未処理の状態は相互にエネルギー的に接近しているが各状態は図６に模式的に示されているように異なる有限の四次多様性を表している。
【００８０】
所与のタンパク質のモルフィンは、第二次および第三次構造で部分的に相違しており、これらの相違は四次構造における差異を表している。特定の態様では、モルフィンはプリオンすなわち、改質された四次構造（凝集状態）となる立体構造の変化を受ける可能性のある１つのタンパク質配列と似ている。しかしながら、他の態様では、モルフィンはオリゴマーが有限多様性を備え、四次構造体の変化が可逆的、非病原的であり、通常の生理学的制御プロセスの一部である点でプリオンとは異なっている。
【００８１】
図６では、基本構造ユニットが単量体であり、任意の２つのユニットの会合が太線に隣接した破線の配置によって駆動される。これが会合の規則である。図６は、基本構造ユニット（単量体として表示）の形状と会合の規則によって会合体の多様性が指示されるという概念の二次元図である。図６では、基本ユニットに４つの異なる形状がある。左下側の単量体パックマン様の形状は、太線に隣接した破線に置き換わるように、それ自体ともに動き、この単量体はオリゴマー化し得ない。半楕円単量体形状は、それ自体会合して二量体を形成しうる。二量体が形成されると、破線のすべてが太線すべてに隣接し、オリゴマー化が二量体で停止する。パイ一切れ形の形状が同じようにして一緒に会合することができるが、太線すべてに破線すべてを隣接させるためには３つのユニットが必要である。したがって、パイ一切れ形単量体は、三量体に向けて多量体化するよう方向付けられる。最終的に、同じ論理に従って、四量会合体を形成するために四角い単量体型が方向付けられる。
【００８２】
モルフィンの概念の範囲内で作業した場合、各多量体は、異なるＫmおよびＶmax値など異なる生理学的関連性のある機能特性を呈する。例えば１つの多量体は、高い酵素活性を持つアロステリック「オン状態」であり、もう１つの多量体が低い活性を持つアロステリック「オフ」状態であるかもしれない。または異なるオリゴマーの機能がオリゴマーの分子面における差異の結果であるとも考えられる。例えば、図６に示されている三量体の丸い面は、二量体の楕円形の面または四量体の先のとがった面ではなく異なるレセプターや結合相手と相互作用するであろう。これらの分子面における差異は、複合体の細胞局在化を表すといえよう。図８は、図６におけるモルフィン会合体の一方または他方を安定化させることのできる作用物質の二次元模式図である。
【００８３】
モルフィンの１つの実施例が、野生型（主として）八量体タンパク質を基準として非常に異なる触媒特性を備えていることが判明している、天然に発生するヒトＰＢＧＳ変異型Ｆ１２Ｌの特徴付けから、別の四次会合体の発見が生じた、ポルフォビリノーゲン合成酵素（ＰＢＧＳ）系である。六量体ＰＢＧＳの会合体は、図９に示されているとおりで、ＰＢＧＳ八量体（図２）の会合体とは非常に異なっている。幸いなことに、ＰＢＧＳのＮ末端アームセグメントのアミノ酸配列には、大きな系統発生上の変化が発生する。この配列の変化は、ＰＢＧＳの別の四次アイソフォームが相互変換する速度の大きな系統発生上の変化をもたらす。ヒトＰＢＧＳでは、特に代謝回転の非存在下で、四次アイソフォームの相互変換速度は非常に低速で測定不能であるため、ヒトタンパク質の八量体および六量体型の安定した結晶構造を観察することが可能となる。２つの型のヒトＰＢＧＳの発見は、モルフィンの第一の具体的実施例であり、実施例１に詳細に示されている。実施例１は、Ｆ１２Ｌに関する六量体構造とその固有の特性の発見についての説明である。実施例２は、特異的突然変異ではなく、四次構造がＦ１２Ｌの固有の特性を担っていることを実証する実験についての説明である。実施例３は、ヒトＰＢＧＳの八量体モルフィンおよび六量体モルフィンが動的平衡状態で存在しうるということを実証し、したがって図６および図２４に示されているようなモルフィンの平衡状態が存在しうることを実証する実験についての説明である。
【００８４】
本発明者の一部のＰＢＧＳおよびアロステリックマグネシウム結合部位の場所に対するマグネシウム結合のアロステリック効果に関する本発明者の以前の知見により、一部のＰＢＧＳでは、八量体および六量体ＰＢＧＳ間の四次構造平衡がアロステリズム現象の構造上の基礎を形成していること示唆していた。その結果、基本的にはアロステリズムの旧来のモデルとは異なる、アロステリック規制（図７）のモルフィンモデルの公式化が可能になった。
【００８５】
アロステリズムは、酵素活性が触媒部位ではないタンパク質上の結合部位に対するアロステリック制御因子分子の結合によって影響を受けるという一般概念である。アロステリック制御のほとんどのモデルが、活性状態と不活性状態が同じ多様性のオリゴマーであること、これら２つの型が相互に状態にあることおよびアロステリック制御因子分子の結合がこの平衡状態をシフトさせうること（図１参照）を提唱している。場合によっては、この旧来のモデルは、オンおよびオフ状態のＸ線結晶構造によって十分に支持されうるかまたは実証さえされている。しかしながら、概して、アロステリック制御が結合する場所、オンおよびオフ状態がどのように異なるか、またはなぜ１つの型が他の型より活性が高いのかについての理解を深めるための構造情報（例えば３次元Ｘ線結晶構造）は不十分である。２種類の異なる型の四次ＰＢＧＳの発明者の最近の発見により、これらの型を調査し、マグネシウムによる一部の有機体のＰＢＧＳのアロステリック制御に関する妥当な説明を導き出すことができる。さらに、ＰＢＧＳの別の四次型の観察により、タンパク質機能の調節メカニズムとしてのモルフィンの概念についての総説とタンパク質機能を方向付けできるようなモルフィン型の１つまたはもう１つを捕獲することのできる作用物質の記述を行うことができる。これは、図７に示されているようなアロステリック制御のモルフィンモデルである。図１０は、図７に示されている例えば、四量体および三量体を用いた概念を表しているが、四量体だけに結合しうるアロステリック制御因子を図示するために「スプリンター」を付加している。スプリンターの結合は、四次構造の平衡状態を摂動させ、四量体型方向へと系を導く。図８は、タンパク質の所望の四次状態をトラップし、その状態に向けて平衡状態を引き寄せる作用する作用物質（楔）の概念を図示している。したがってモルフィンの四次構造平衡状態を摂動するこれらの作用物質は、タンパク質を阻害または活性化しうる。本発明の１つの実施形態では、作用物質は、不活性型をトラップし、したがって活性型の形成を阻止する阻害剤である。１つの実施形態では、タンパク質はＰＢＧＳで、不活性型が六量体、活性型が八量体である。阻害剤の非限定的な例として、
ロスマリン酸またはその誘導体が挙げられる。本発明の別の実施形態では、作用物質は、タンパク質の活性型を捕獲する活性剤である。
【００８６】
したがって本発明では、モルフィン（四次構造のアイソフォーム）を用いたアロステリック制御の一般的機序が提唱されている。この機序では、単量体構造が、それらの二級／三級構造の一部の態様では異なっており、これらの差異は、１つのモルフィンあるいはもう１つのモルフィンへの会合を表している。このモルフィンを用いたアロステリック機序が図７に模式的に図示されている。
【００８７】
図１０は、タンパク質の２つの型（モルフィン）間における平衡状態を二次元で表したものである。１つの型（本明細書では四角として表示）のユニット（例えば単量体）には、線分、太線、破線および曲がりくねった線であるような異なる４つの面を含む。自然に会合している相補面は、本明細書では、破線付の太線で表されている。この会合が、ユニット間における係合の規則を定義している。四角のサブユニット会合能が満たされると（要するにすべての太いがすべての破線と結合したときに）、得られる最適な会合体が四量体である。このようにオリゴマー会合体は、単量体の構造と係合の規則によって表される。図１０に示されているように、四角の構造は、作用物質（例えばアロステリック制御因子分子など）の模式的表示である「スプリンター」と会合しうる。四角い単量体と四角い四量体のスプリンターとの会合は、多量体タンパク質の機能に影響を与え、例えば植物および一部の細菌ＰＢＧＳ場合、マグネシウムがタンパク質のこれらの型に対し安定性を与える。
【００８８】
四角いユニットは、一部を共有しているが、その二次および三次構造のすべては共有せず、したがって表面特性の一部だけを共有しているような別の構造との平衡状態にある。別のユニットが「セグメント」として図１０に示されている。この単量体には、太線と破線によって表された面が含まれている。これら面間の係合の規則は四角ユニットに関する係合の規則と同じである。したがって、この係合の規則に従うと、別のユニットが会合して三量体となる。三量体構造とその個々の成分には、アロステリック制御因子分子（スプリンター）の結合部位が含まれていないという点が重要である。スプリンターは四角とそのオリゴマーを安定化させるので、スプリンターの存在は四次構造を四角およびオリゴマーへ平衡を引っ張る。
【００８９】
六量体ＰＢＧＳの観察の結果、四次構造体がタンパク質機能のアロステリック制御の構造上の基礎としての役割をいかに果たすかについての最初の例を与えた。光合成有機体および一部の細菌由来のＰＢＧＳでは、比活性のタンパク質濃度依存性から、完全に活性（おそらくは八量体）型と不活性（おそらくは六量体）型（図５Ａ、２０Ａおよび２０Ｂを参照）間における平衡状態の証拠が得られる。
【００９０】
図１０は、図１１における空間充填図を用いてよりわかりやすく図示されているＰＢＧＳの挙動の模式説明である。ＰＢＧＳの場合、図１０に示されている四角は、抱合二量体であり、図１０に示されているセグメントは分離二量体である。いずれの場合も、構造体は一部の表面特性を共有しているが、すべての表面特性は共有せず、表面間の係合規則は２つの別の構造体間で共有されている最初の近似に対するものである。ＰＢＧＳの場合、オリゴマー構造における差異は、図１２に示されているｐＨ速度プロフィールおよび表１に示されているＫmおよびＶmax値などの各種機能的特徴として解釈される。他のタンパク質の別の四次構造体も異なる機能特性として解釈されると想定することは妥当である。レセプターの二量体化は信号伝達に関連付けられることは周知の事実である。本発明の以前には知られていなかった事柄として、二量体構造内の単量体の構造が、二量体構造内にない場合の単量体の構造と同じではないという点が挙げられる。
【００９１】
【表１】
2008546389.tif 000002
図１１は、Ｍｇが一部の種由来のＰＢＧＳのアロステリック活性剤としてどのように働くかを示し、図１３は、活性の低い六量体型の安定化を介してＰＢＧＳの阻害剤として働く作用物質を示している。分離ニ量体のアーム−ピットに収まるボールとして描かれているこの模式的な作用物質は、本発明の作用物質の図解である。
【００９２】
モルフィンを含むタンパク質の別の非限定的な例としては、Ｃｌａｓｓ  Ｉａのリボヌクレオチド還元酵素がある。Ｃｌａｓｓ  Ｉａのリボヌクレオチド還元酵素のアロステリック制御のために考案された現在のモデルでは、四量体と六量体の間の平衡が説明される［４４］。この場合、モデルは単に模式的なものであり、著者らは推測されるモルフィンのおける差異を定義するタンパク質構造をもたない。しかしながら、リボヌクレオチド還元酵素は新たなＤＮＡ生合成に必須であり、Ｃｌａｓｓ  Ｉａ酵素はすべての真核生物に見られ、新たなＤＮＡ生合成の阻害は癌の化学治療の合理的アプローチである。従って、Ｃｌａｓｓ  Ｉａリボヌクレオチド還元酵素の機能に影響を与える（例えば、阻害）ことは、活性の低いモルフィンに固有な表面にエフェクターを選択的に結合することにより達成可能である。
【００９３】
ＰＢＧＳは、２種類の別の四次型の両方に関する結晶構造が利用可能な第一の例であるが、モルフィンの概念が適用可能であると考えられる他の系も文献に記載されている。準安定状態なので、モルフィンが同じタンパク質の別の結晶構造であると以前は理解されていなかった点は驚くにあたらない。同種オリゴマー酵素におけるモルフィンの存在の手がかりが、酵素比活性に対するタンパク質濃度依存性などといった速度論的現象から、二重双曲型方程式に適合する非Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ挙動から、速度論的ヒステリシスから、反応成分の添加順序に対する活性の依存性から、または複数の四次アイソフォームを示唆する各種タンパク質サイズ決定法から得られる。これらの特性だけがモルフィン平衡状態の診断を与えるわけではない。
【００９４】
本発明の多量体タンパク質は、タンパク質濃度依存比活性または例えばイオン交換クロマトグラフィー、未処理ゲル電気泳動、分析超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー（サイズを基礎として）による各種会合体へ分離する能力などといった少なくとも１つの特性を所有していなくてはならない。平衡状態を実証するためには、例えば、Ｋmおよび
Ｖmax値、ＭＭ方程式に適合する基材濃度の関数としての活性を提示するために速度論研
究を実施することができる。モルフィンは、双曲線にうまく適合しないが、図２８に図解されているようにｐＨ９での野生型ヒトＰＢＧＳに認められるように二重双曲線には適合する。多量体タンパク質の機能の非限定的な例が、酵素活性、および、例えば異なるタンパク質に結合する能力など他の分子と相互作用する能力である。この機能は阻害または増
強（あるいは活性化）することができる。機能の変化のモニタリングは、例えば、当業者が認識する速度論パラメータＫmおよびＶmax値をモニタリングすることによって実施可能である。本発明の特定の実施形態では、タンパク質機能の阻害は、活性の低いモルフィンの安定化を通じて行われる。
【００９５】
特定の実施形態では、作用物質は多量体タンパク質の機能に影響を与えるように適合される。多量体タンパク質の機能の非限定的な例は、影響が阻害または活性化の少なくともどちらか１つである活性である。特定の実施形態では、作用物質は、活性がより低い四次アイソフォームと会合する。特定の実施形態では、作用物質は、活性がより高い四次アイソフォームと結合する。八量体ＰＢＧＳを阻害する作用物質の非限定的な例を以下にさらに述べる。
【００９６】
八量体型のＰＢＧＳは、生理学的に関連性のある濃度範囲内で基材に結合し、生理学的ｐＨで活性を持つ。八量体は、４個の抱合二量体からなるが、この場合１つのサブユニットのアームが隣接サブユニットのバレルを抱合し、それにより強固なバレル−バレル間相互作用が存在する（図２を参照）。
【００９７】
新たに発見された六量体型のＰＢＧＳが、植物および一部の病原性細菌を含むがヒト、動物および菌類を含まない有機体サブセットにおけるテトラピロール生合成の調節の基本的成分であると提唱されている。六量体型は、生理学的条件下では極めて不活性である。特に、六量体は、Ｋm値が八量体のＫm値より少なくとも２桁は大きいので、生理学的に関連性のある濃度範囲内で基材と結合することが不可能である。六量体は、３個の分離二量体で構成されているが、この場合Ｎ末端アームは、強固なバレル−バレル間接触が存在する隣接サブユニットと相互作用しない（図９を参照）。
【００９８】
六量体型と八量体型間の遷移には、タンパク質構造内の大きな変化が伴うが、これは、α８β８バレルを基準としたＮ末端アームの劇的な方向変換である。本発明の特定の実施形態は、六量体から八量体（図１３に示されているように）への構造の変化の阻害による、植物および／または細菌類におけるＰＢＧＳおよびテトラピロール生合成の活性化の阻害に関する。阻害機序は、植物および細菌類には効果的であるが、動物には効果はないので、本発明は静菌剤、抗生物質および除草剤の用途に対する新規なアプローチを提供する。
【００９９】
このように特定の実施形態では、本発明は、マグネシウムによって生理学的に調整されるＰＢＧＳに関する六量体−八量体遷移の阻害剤を含む。阻害剤は、既知または新規な化合物のどちらであってもよい。阻害剤は、六量体−八量体遷移が生理学的に重要であるような生育および発達のその時点での植物および細菌病原体におけるテトラピロール生合成を阻害するときに効果を発する。六量体ＰＢＧＳから八量体ＰＢＧＳへの四次構造遷移の阻害は抗生物質および除草剤の開発のための新規な標的となる。
どのＰＢＧＳタンパク質が標的となるかの決定
一部がアロステリックマグネシウムを有しそれ以外がアロステリックマグネシウムを有していないＰＢＧＳタンパク質には系統発生学的バリエーションが存在する。アロステリックマグネシウムを有するＰＢＧＳは、古細菌、ロードバクター族を例外とするすべての細菌類、すべての光合成真核生物（緑色植物など）からなる［１１］（図４および１４）。ごく最近の別の例外として、マラリア原虫のＰｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍが挙げられるであろう［４５］。Ｅ．ｃｏｌｉＰＢＧＳの発明者の以前に決定した結晶構造および本明細書に開示されている六量体ＰＢＧＳの構造に基づくと、アロステリックマグネシウムの役割が低活性六量体と高活性八量体との間の構造変化を誘発すると考えられる（図１１および２０Ｃを参照）。ＰＢＧＳに作用するＭｇの六量体−八量体間遷移は、タンパク質機能のアロステリック制御に関する新規な構造パラダイムである。
【０１００】
六量体を安定化させる阻害剤は、アロステリックマグネシウムを含むが活性部位亜鉛を含まないＰＢＧＳのサブセットに対して最も効果的である（例えばＱＳＥ内のＰＢＧＳ、図４を参照）。これらは、光合成真核生物や、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａなどといった病原体を含む細菌サブセットである。これらのＰＢＧＳタンパク質は、大きな活性四次型と小さな低活性四次型における相互変換を示唆する、タンパク質濃度依存比活性の特性を誘発する（図５、２０Ａおよび２０Ｂを参照）。少なくとも１つの種の活性型が六量体であるようなＮＥ象限も認められる［１５］。
【０１０１】
このように、八量体ＰＢＧＳにはアロステリックマグネシウム結合部位が含まれているということを前提として、細菌類、古細菌または真核生物に由来する八量体ＰＢＧＳの形成を本発明の阻害剤が阻害するのに効果的である。本発明の組成物によって阻害されうる八量体ＰＢＧＳ源の非限定的リストが図１４に示されているが、これは、細菌類、古細菌および真核生物をはじめとする有機体の分類である。図１５Ａ、１５Ｂならびに１５Ｃは、ジェンバンクから入手したＰＢＧＳ配列の活性部位金属結合残基と２００２年４月時点で利用可能な他のＷｅｂ検索可能ゲノムとのアラインメントを表している。図４の４つの象限のどれか１つへの有機体のアラインメントは、図１５Ａ−Ｃに表されている配列情報に基づいている。活性部位亜鉛結合部位の存在は、活性部位のフタ（ヒトＰＢＧＳの位置２２１）上のアルギニン残基との会合でシステイン豊富なクラスタ（ヒトＰＢＧＳの位置１２２、１２４および１３２）によって指摘されている。システイン豊富な活性部位亜鉛結合クラスタを所有していない種は、代わりにアルパラギン酸豊富な領域を含んでおり、活性部位フタ残基がリシンである。
【０１０２】
本発明の特定の実施形態では、阻害剤が、金属イオンを置き換えそれによって金属イオン結合部位で結合し、好ましくは金属イオンが亜鉛またはマグネシウムである。本発明の特定の実施形態では、阻害剤は活性部位で結合する。阻害剤はどこにでも結合しうるが、結合部位は、１つの四次構造を安定させなければならない。結合部位は１つのモルフィンに存在するが他のモルフィンには存在しないような部位であることが好ましい。
【０１０３】
本発明の阻害剤は下記プロトコルを用いて特定することができる。第一にアロステリックマグネシウムを含むが、活性部位亜鉛を含まないＰＢＧＳの六量体型に関するモデルが与えられる。実施例４には、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓなどの他の六量体ＰＢＧＳタンパク質をさらに日常的に構築するためのテンプレートとしての役割を果たしうるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａＰＢＧＳの六量体のモデルを構築するのに使用されている方法について記載している［１５］。初期モデルは、例えばえんどう豆ＰＢＧＳのどれか１つであってもよい。第二に、小分子データベースがサブユニットのＮ末端部分に隣接した抱合不能化ドメインに適合する分子に関するコンピュータによるでスクリーニングを行った。一部の小分子データベースはオンラインで利用可能であり［４６］、それ以外はＦｏｘ  Ｃｈａｓｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒに組み込まれている。抱合不能化ドメインは、活性八量体を形成するのに必要な二量体の抱合バレルから二量体のアームを阻害剤の結合が阻害する分離二量体の少なくとも１つの領域である。丸が阻害剤を表している図１３を参照。抱合不能化ドメインの想定されうる部位は、サブユニットの本体の抱合アームが結合している継ぎ目（すなわち「アーム−ピット」）の下にある。理論的に好適な分子は、人工遺伝子構築物を用いて利用可能なえんどう豆ＰＢＧＳのタンパク質濃度依存比活性に対するそれぞれの影響を判定することによって試験管内で経験的に試験することができる。タンパク質濃度依存様式でタンパク質の比活性を阻害する分子は、阻害剤としての優れた候補となりうる（図５を参照）。
【０１０４】
本発明の阻害剤は、結晶構造またはモデル構造が標的タンパク質の不活性四次アイソフォームの結晶構造のために準備されることを前提として、同様のコンピュータによるスク
リーニングアプローチを用いて他のモルフィン標的に関して特定することができる。
【０１０５】
以下の方法では、必ずしもＰＢＧＳの抱合不能化ドメイン内に存在しないがどこかで結合する阻害剤を識別することにより、八量体形成を阻害できる。ＰＢＧＳの比活性に関する機能試験を初めに使用して、例えば、ヒトにとって有害ではない物質など、コンピュータによるスクリーニングで特定される利用可能分子から潜在的阻害剤を選択する。潜在的阻害剤を選択した後で、これらをさらにタンパク質濃度に基づいて比活性への影響についてスクリーニングする。阻害剤に関するこの従来のスクリーニング法は、モルフィン特異的様式で結合する阻害剤を選択するための特殊な傾向を備えてはいない。
【０１０６】
したがって、本発明は多量体タンパク質に影響を与える方法であって、
複数のユニットを有する会合体を含む多量体タンパク質を提供する工程であって、各ユニットが第一の相補面と第二の相補面を有し、（１）前記ユニットの構造が前記異なる四次アイソフォームの構造を決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、さらに（３）前記異なる四次アイソフォームの構造が多量体タンパク質の機能に影響を与えるという条件の下に、会合体が異なる四次アイソフォームの少なくともどれか１つであるという前提で、さらに１つのユニットの第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と会合している工程と、
会合体上の結合部位に結合することによって平衡状態に影響を与えるように適合される作用物質を含有する本発明の組成物を提供する工程と、
前記作用物質と前記会合体を接触させる工程であって、前記作用物質は、結合部位に結合しそれにより前記多量体タンパク質に影響を与えることによって平衡状態に影響を与える工程と、
からなる方法を提供する。本方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質に対する影響には、四次アイソフォームの形成に対する影響が含まれる。本方法の特定の実施形態では、前記多量体タンパク質に対する影響には、前記多量体タンパク質の機能に対する影響も含まれる。
【０１０７】
さらに、多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素が活性型を形成するのを阻害する方法であって、多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素に対し本発明の組成物を適用する工程と、活性の低い型と組成物を会合させる工程と、活性の低い型が活性の高い型へ会合するのを阻害しその結果多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素が活性型を形成するのを阻害する工程と、からなる方法を提供する。阻害剤の非限定的な例としてロスマリン酸またはその誘導体が挙げられるが、えんどう豆ＰＢＧＳの阻害剤としてのそれらの特徴付けが実施例５に記載されている。
【０１０８】
本発明の組成物の好ましい用途は、ヒトまたは動物宿主における細菌類、古細菌および／または真核生物の発生または生育を阻害または防止するためのものである。本発明の組成物の他の用途には、歯、パイプ、配管、船または、損傷を与える細菌類が特定される水／大気混合物内に沈められた面をはじめとする一般的な各種面上の生物膜の防止または阻害が含まれる。このように、例えば本発明の組成物は、船の面上のフジツボの生育を防止または阻害するのに効果的である。
【０１０９】
標的有機体しだいでは本発明の組成物を使用すると、特定の種によって生じる損傷を防止または阻害することができる。すべての植物だけでなく多くの原生生物もＱＳＥ（図４を参照）にある。ＱＳＥの細菌の例が表２に掲載されており、これらの有機体は、本発明の組成物を適用するための主要な標的である。表２を手引きとして用いると、本発明の組成物の各種用途、例えば、薬剤、練り歯磨き、石鹸、消毒剤、抗生物膜組成物、植物への利用および除草剤などが期待されうる。
【０１１０】
【表２】
2008546389.tif 000003
2008546389.tif 000004
有利な点として、本発明の組成物が、細菌類、古細菌および／または真核生物によって生じる疾患を治療または予防するのに効果があるという点が挙げられる。この組成物は、多量体ＰＢＧＳ（例えば八量体ＰＢＧＳまたは少数の単量体を有する別の活性型）の形成を防止するのに効果があるので、細菌類、古菌類および／または真核生物の発生または生育を阻害または防止することができる。特定の実施形態では、多量体ＰＢＧＳには、アロステリックマグネシウム結合部位が含まれている。この実施形態の１つの態様では、組成物は、細菌類、古細菌および／または真核生物に接触させることによって生じる疾患を治療または予防するのに効果を示す。本実施形態のさらに別の態様では、組成物は、薬剤、練り歯磨き、石鹸、消毒剤、抗生物膜組成物および除草剤の少なくともどれか１つである。
【０１１１】
特定の実施形態では、組成物には、アロステリックマグネシウム結合部位および触媒亜鉛結合部位は含まれていない。この実施形態の１つの態様では、組成物は、細菌類、古細菌および／または真核生物に接触させることによって生じる疾患を治療または予防するのに効果を示す。この実施形態のさらに別の態様では、組成物は、薬剤、練り歯磨き、石鹸および消毒剤の少なくともどれか１つである。
【０１１２】
抗生物質、除草剤および殺菌剤は多くの場合、細菌類、植物または菌類に特異的であるがヒト／動物には存在していない必須経路の阻害に基づいている。例えば、１）ペニシリンクラスの抗生物質は、細菌細胞の細胞壁の生合成に対応し、動物細胞は細胞壁を持たない、または２）除草剤のグリホサートは芳香族アミノ酸生合成に対応し、ヒトはこの経路を持たず我々は芳香族アミノ酸を食せねばならない。さらに、各種タンパク質／酵素に関する配列および構造における差異に関してさらなる知見を得るにともない、動物、植物、細菌類および菌類に偏在している基本的経路を標的とすることが可能となっている。これは、抗菌剤または除草剤の基礎としてのＰＢＧＳの阻害を介したテトラピロール生合成経路を標的化する場合に該当する。各種有機体のＰＢＧＳ間における金属結合部位における系統発生学的変化は、ヒトＰＢＧＳに向けて阻害することのない阻害剤の開発にとって十分な構造上の差異を提供する。ＰＢＧＳの場合、ＰＢＧＳがモルフィン型間で平衡状態にいたる固有の能力とモルフィン面のアミノ酸配列において有機体間の大きな差異が存在している。１つのモルフィン型の選択的安定化を介して、タンパク質機能がさらに一般的に阻害される場合には、標的がヒトに存在しない経路である場合またはモルフィンの面が非常に異なる活性部位以外の外部における十分な系統発生学的変化を標的が単に備えているケースが想定される。例えば、タンパク質における配列の保存は、酵素活性部位に見られるように、共有機能の領域で最高度に認められる。配列の保存は、共有機能に関与しない領域では高くない。タンパク質の表面は進化の過程での変化に最も大きく感受し、有機体（例えばヒト）とその病原との間ではほとんど保存されないと論じることができる。
【０１１３】
特定の実施形態では、組成物は、作用物質の他に、医薬として許容される媒質を含んでいる。「医薬として許容される媒質」という表示は、例えば、阻害剤を送達できる溶剤や比較的安全かつ効果的方法で標的有機体に組成物内の他の活性作用物質を送達できる溶剤などといった媒質を表す。媒質そのものは薬剤活性を備えている必要はない。
【０１１４】
本明細書に使用している「医薬として許容される媒質」には、いずれかのおよびすべての溶剤、分散媒質、塗膜、抗細菌剤と抗菌剤、アイソトニックおよび吸収遅延剤などが含まれる。医薬活性物質にこのような媒質や作用物質を使用することは当技術分野では周知のことである。いずれかの従来の媒質や作用物質が本発明の阻害剤と不適合であるという場合を除き、治療用組成物におけるその利用が計画されている。補足または追加の活性成分も、本組成物に組み込むことが可能である。
【０１１５】
遊離塩基または医薬として許容される塩類としての活性成分の溶液を、例えば、ヒドロキシプロピルセルロースなどといった界面活性剤と好適に混合した水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中ならびに油中でも分散液を調製することができる。通常の保管および使用条件下で、これらの調製液には、すべての微生物の生育を防止するための保存料が含まれている。
【０１１６】
本発明の組成物には、旧来の医薬製剤も含んでもよい。本発明によるこれらの組成物の投与は、標的組織がその経路を介して利用可能である限りは、一般的な経路を介して行われる。これには、経口、経鼻、口腔、直腸、膣または局所などが含まれる。または投与は、同所、皮内、皮下、筋肉、腹腔内または静脈の注射によって行ってもよい。このような組成物は通常、上述の医薬として許容される組成物として投与される。
【０１１７】
本発明の組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかの注入可能組成物の型で投与すると有利である。注入前の液体中の溶液または懸濁液に好適な固形で調製することもできる。これらの調製は乳化してもよい。このような目的による代表的組成物には、１ミリリットルのリン酸塩緩衝生理食塩水当たり５０ｍｇまたは約１００ｍｇまでのヒト血清アルブミンを含む。他の医薬として許容される担体には、塩類、保存料、緩衝液などを含む水溶液、無毒性賦形剤などが挙げられる。非水性溶剤の例としてプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油およびオレイン酸エチルなどの注入可能な有機エステルが挙げられる。水性担体には、水、アルコール／水性溶液、生理食塩水溶液、塩化ナトリウム、リンガーのＤ形グルコースなどの非経口賦形剤が含まれる。静脈注射賦形剤には、液体および栄養補充液が含まれる。保存料には、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスなどが含まれる。製剤における各種成分のｐＨおよび正確な濃度は公知のパラメータに従って調製される。
【０１１８】
さらなる調剤が経口投与に好適である。経口投与調剤には、例えば、医薬等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、マグネシウムステアレート、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの代表的賦形剤が含まれる。組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性調剤または粉末などの型をとる。投与経路が局所である場合にはこの形態はクリーム、軟膏、油薬またはスプレーなどであってもよい。
【０１１９】
治療薬の有効量は、意図する目標に基づいて決定される。「単位用量」という用語は、被験体で使用するのに好適な物理的に独立した単位を表し、各単位は、その投与すなわち適切な経路および処置計画に関連付けられる所望の反応を生み出すよう計算された治療組成物の規定の数量を含んでいる。治療回数および単位用量の両方に従った投与量は、被験体の状態および所望の保護レベルなど処置する被験体によって異なる。治療組成物の詳細な量は、医師の判断にも委ねられ各個体により異なる。
【０１２０】
本発明のもう１つの用途が除草剤であり、この場合組成物にはさらに、除草剤として効果的な媒質が含まれている。「除草剤として効果的な媒質」という表示は阻害剤や組成物における他の活性作用物質も標的有機体に送達することのできる溶剤などといった媒質を表す。媒質そのものは除草剤活性を有する必要はない。
【０１２１】
穀類に対する抗菌組成物の応用に関する指針が以下のように提供されている。すべての光合成真核生物が図４のＱＳＥ象限に収まるので、これら自体が、本発明で提案されている阻害剤の標的である。しかしながら、図１３に示されているアーム−ピット阻害剤結合部位には、植物と細菌類との間の大きな系統発生学的変化が存在している。したがって、穀類で抗菌スプレーとして作用する作用物質は、植物ＰＢＧＳではなく細菌ＰＢＧＳ内のこの部位に結合することができる作用物質である。
【０１２２】
即時使用できる体勢の整った希釈組成物と、通常水によって使用前に希釈する必要のある濃縮組成物との両方が、本発明の組成物に含まれる。
固形組成物は、顆粒状または散布粉末の形態をとることができるが、この場合活性成分は、カオリン、ベントナイト、珪藻土、ドロマイト、炭酸カルシウム、タルク、粉末マグネシア、フラー土またはジプサムまたはそれらの組み合わせなど、細かく粉砕された固形希釈剤と混合される。これらは、液体中の粉末または粒子の分散を促進する湿潤剤を有する分散可能な粉末または粒子の形態をとることも可能である。粉末型の固形成分は、散剤として適用してもよい。
【０１２３】
液体組成物は、任意で表面活性剤を含む。水中の活性成分の溶液、懸濁液または分散液からなっていてもよいしまた水中の水滴として分散している水非混合性有機溶剤中の活性成分の溶液または分散液を有していてもよい。除草剤組成物は、すぐに使用できる希釈組
成物を生成するタンクでの混合と濃縮物の調剤のいずれにも好適である。
【０１２４】
溶液または分散液は、湿潤剤または分散剤（複数もあり）を任意で含む水または有機溶剤中に活性成分を溶解させ、次に有機溶剤を使用するときに湿潤剤または分散剤（複数もあり）を任意で含む水に取得される混合物を追加して調製してもよい。好適な有機溶剤には、例えばニ塩化エチレン、イソプロピルアルコール、プロピレングリコール、ジアセトンアルコール、トルエン、ケロシン、メチルナフタレン、キシレンまたはトリクロロエチレンあるいはそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１２５】
その他の添加物および補助剤は、本発明の組成物内に存在していてもよい。実施例には、エチレングリコールやプロピレングリコールなどの抗凍結剤、染料、分散剤、理論的薬剤、シリコン基材の薬剤などの抗発泡剤およびエチレングリコールなどの湿潤剤なども含まれる。
【０１２６】
このような基礎での除草剤の開発により、図４における４つの象限の上半分に相当するＰＢＧＳ、例えばヒトＰＢＧＳなどに対して、耐性穀類を遺伝子組み換えにする（すなわち、別の種から人工的に移入された遺伝子物質を含む）ことにより除草剤耐性穀類を開発することが可能となる。
除草剤耐性植物
抱合二量体の多量体型で実質的に存在する多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素の遺伝子組み換えに適合された除草剤耐性植物もさらに提供される。特定の実施形態では、多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素はヒト由来である。特定の実施形態では、多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素には、アロステリックマグネシウム結合部位は含まれていない。以下に、多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素の遺伝子組み換えに適合された除草剤耐性植物を製造するための指針を提供する。
【０１２７】
二重鎖ＤＮＡの型で存在する遺伝子の植物における発現には、ＲＮＡポリメラーゼ酵素によるＤＮＡの１本の鎖からのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の転写、及びそれに続く核内におけるｍＲＮＡの一次転写産物の処理がある。この処理では、ＲＮＡの３’端にポリアデニル酸ヌクレオチドを付加する３’非翻訳領域が関与する。ｍＲＮＡに対するＤＮＡの転写は、通常、プロモータと表示されているＤＮＡの領域によって調節される。プロモータ領域には、ＤＮＡと会合し、ｍＲＮＡの対応する相補鎖を作成するためのテンプレートとしてＤＮＡ鎖のどちらか一つを用いて、ｍＲＮＡの転写を開始するようＲＮＡポリメラーゼに信号を送る塩基配列が含まれている。このｍＲＮＡは細胞タンパク質生合成装置によってそこでコードされるタンパク質の産生のためのテンプレートとして使用される。
【０１２８】
本発明では選択されたプロモータは、所望の組織および発達特異性を備えている。したがって、プロモータ機能は、所望の組織発現能と近似したプロモータ強度を有するプロモータを選択し、さらに所望のＰＢＧＳ活性を生み出す形質転換細胞を選択することによって最適化されねばならない。形質転換細胞のプールからのこのような選択アプローチは、植物ゲノム内の遺伝子挿入部位による同じ異種遺伝子を含む形質転換細胞間の変化（通常「位置効果」と呼ばれている）が生じるので、植物における異種構造遺伝子の発現で日常的に採用されている。植物細胞におけるＤＮＡの  （構成上または組織特異的）  転写を生じさせることで知られているプロモータに加え、対象となる時期に選択的に好ましく発現する遺伝子の植物ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングし、ついで当技術分野で既知の方法によってプロモータ領域を単離することにより本発明で使用するための他のプロモータも特定してもよい。
【０１２９】
本発明の好ましい実施形態では、ＰＢＧＳ導入遺伝子は、光に反応して葉緑体で発現せ
ねばならない。さらに具体的には、ＰＢＧＳ導入遺伝子は、核内のｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡは細胞質における前駆体ポリペプチド（葉緑体トランスポートペプチド（ＣＴＰ）／ＰＢＧＳ）に翻訳される。次に前駆体ポリペプチドは葉緑体に転写（インポート）される。植物細胞で活性を有する複数の葉緑体光誘導可能プロモータについて記載された文献がある。このようなプロモータの例として、リブロースー１，５−ビスフォフェートカルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）の微小サブユニット由来の光誘導性プロモータ、きわめて豊富な植物ポリペプチド、クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質遺伝子プロモータ、および光交換可能プロモータ系で近年利用されてきたフィトクロムプロモータなどが挙げられる。これらのプロモータのうちの一部が、植物で発現するさまざまな種類のＤＮＡ構築物を作り出すのに使用されてきた。例としてＰＣＴ国際公開ＷＯ８４／０２９１３を参照されたい。
【０１３０】
光に反応して植物内でＤＮＡの転写を生じさせることで知られている、またはそれが突き止められている他のプロモータを本発明では使用してもよい。このようなプロモータは、植物及び植物ウイルスなどの多様な源から得られ、拡張ＣａＭＶ３５Ｓプロモータおよびリブロースー１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子の微小サブユニットなど植物遺伝子から単離したプロモータが含まれるが、これらに限定されない。以下に述べるように、選択された特定のプロモータは、生長を維持するのに十分なテトラピロールを産生するのに効果的な量のＰＢＧＳ酵素の産生に到るに十分な発現を生じさせることができることが好ましい。一つの実施形態では、前記プロモータは、植物の非光合成機能にとって必要なテトラピロールを提供するために漏れやすくなっている。
ＰＢＧＳ活性の色素体有向性発現
本発明の好ましい実施形態では、ＰＢＧＳ遺伝子は色素体にＰＢＧＳタンパク質を標的化するため、ＣＴＰに融合される。以後使用されているように、葉緑体と色素体は、アミロプラストを含む各種型の色素体を包含することを目的としている。多くの色素体局在化タンパク質が、前駆体として核遺伝子から発現し、インポート工程で除去される、ＣＴＰによって色素体に標的化される。このような葉緑体タンパク質の例として、リブロースー１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ，ＳＳＵ）の微小サブユニット、５−エノールピルビルシキミ酸−３−リン酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）、フェレドキシン、フェレドキシンオキシドレダクターゼ、光収穫系複合体タンパク質IおよびII、およ
びチオレドキンＦが挙げられる。グリホサート耐性ＥＰＳＰ合成酵素植物遺伝子もまた、植物細胞内の葉緑体にＥＰＳＰ合成酵素ポリペプチドを輸送させることができるＣＴＰを含むポリペプチドをコードする［４８］。非色素体タンパク質は、ＣＴＰとのタンパク質融合の使用によって葉緑体に標的化され、ＣＴＰ配列は色素体にタンパク質を標的化するのに十分であるということがすでに実証されている。当業者は、植物細胞色素体にＰＢＧＳ酵素をインポートするために特定の色素体輸送ペプチドの機能を利用する他の各種キメラ構築物を作成することができるということも認識されよう。ＰＢＧＳ遺伝子は、葉緑体ゲノムに遺伝子を形質転換させることによって色素体に標的化させることも可能である［４９］。概して、ＣＴＰなどの葉緑体摂取信号は、Ｓｅｒ，Ｔｈｒ、および小さな親水性アミノ酸残基に豊富に存在している。
【０１３１】
本発明のＤＮＡ構築物によって産生されるＲＮＡには、５’非翻訳リーダー配列を含んでいてもよい。この配列は、遺伝子を発現させるように選択されたプロモータに由来することができ、ｍＲＮＡの翻訳を増大させるように特異的に修飾可能である。５’非翻訳領域は、ウイルスＲＮＡ、好適な原核細胞遺伝子、または合成遺伝子配列から取得することもできる。本発明は非翻訳領域がプロモータ配列を伴う５’  非翻訳配列に由来する構築物に限定されない。むしろ、非翻訳リーダー配列は、無関係のプロモータまたはコーディング配列に由来していてもよい。
【０１３２】
単子葉植物では、イントロンを遺伝子構築物に取り込み、コーディング配列の発現を促
進、または増進させることが好ましい。好適なイントロンの例として、ＨＳＰ７０イントロンおよび米アクチンイントロンが挙げられるが、これらはいずれも当技術分野では公知である。もう一つの好適なイントロンがトウゴマの実のカタラーゼイントロンである［５０］。
【０１３３】
キメラ植物遺伝子の３’非翻訳領域には、ＲＮＡの３’端にポリアデニレートヌクレオチドを付加させる機能を植物内で果たすポリアデニル化信号が含まれている。好適な３’領域の例として、（１）ノパリン合成酵素（ＮＯＳ）遺伝子といったアグロ細菌類腫瘍誘発性（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化信号を含む３’転写非翻訳領域、および（２）ダイズ保存タンパク質遺伝子やリブロースー１，５−二リン酸カルボキシラーゼ（ｓｓＲＵＢＩＳＣＯ）遺伝子の微小サブユニットのような植物遺伝子が挙げられる。
【０１３４】
本発明の核酸構築物の開発では、構築物の各種成分、または各フラグメントが、例えばＥ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主内で複製可能であるプラスミドなど、便宜性のあるクローニングベクターに通常挿入される。文献に記載されている数多くのベクターが存在しているが、それらの多くが市販されている。各クローニング後に、所望の挿入部を備えたクローニングベクターを単離させ、所望の配列を構成するための制限消化、新しいフラグメント、またはヌクレオチドの挿入、結合、欠失、突然変異、切除などの操作を行ってもよい。構築物が完成したならば、次に、宿主細胞の形質転換の方法に合わせてさらに操作するのに適したベクターに移植してもよい。
【０１３５】
本発明の組み換えＤＮＡ分子は、通常は、形質転換された細胞を容易に特定し、形質転換されない細胞から選択されるように、選択マーカーを含んでいる。このような例として、カナマイシン耐性を付与するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｐｔＩＩ）［５１］遺伝子が挙げられるが、これに限定されない。ｎｐｔＩＩ遺伝子を発現する細胞は、カナマイシンやＧ４１８などの適切な抗生物質を用いて選択することができる。他の一般に使用されている選択マーカーには、ビアラホス耐性を付与する棒状遺伝子、グリホサート耐性を付与する変異ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子［５２］、ブロモキシニル耐性を付与するニトリラーゼ遺伝子［５３］、イミダゾリノンまたはスルフォニル尿素耐性を付与する変異アセト乳酸シンターゼ遺伝子（ＡＬＳ）［５４］、メトトレキサート耐性ＤＨＦＲ遺伝子［５５］が含まれる。
【０１３６】
ＰＢＧＳ導入遺伝子を発現するために作成可能な植物には、アカシア、アルファルファ、アニス、リンゴ、アプリコット、アーティチョーク、ルッコラ、アスパラガス、アボカド、バナナ、大麦、豆類、ビート、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリ、メキャベツ、キャベツ、キャノーラ、カンタロープメロン、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、セロリー、サクランボ、コリアンダー、シトラス（かんきつ類）、クレメンティーン、コーヒー、トウモロコシ、綿花、キュウリ、ベイマツ、ナス、エンダイブ、キクヂシャ、ユーカリ、フェンネル、イチジク、ヒョウタン、ブドウ、グレープフルーツ、ハニーデューメロン、クズイモ、キーウィーフルーツ、レタス、リーキ、レモン、ライム、テーダマツ、マンゴ、メロン、きのこ、ナッツ、オーツ麦、ナタネ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞植物、パパイヤ、パセリ、豆、モモ、ラッカセイ、ナシ、トウガラシ、カキ、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ポプラ、ジャガイモ、カボチャ、マルメロ、ラジアータマツ、赤チコリ、ラディッシュ、ラズベリー、イネ、ライ麦、サトウモロコシ、サザンパイン、ダイズ、ホウレンソウ、ウリ、イチゴ、サトウダイコン、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、モミジバソウ、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、ライ小麦、芝、つる性植物、スイカ、小麦、ヤムイモ、およびズッキーニが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３７】
ＰＢＧＳ遺伝子は、任意の好適な方法によって植物のゲノムに挿入することができる。
好適な植物形質転換ベクターには、アグロバクテリウムチュームファシエンスのＴｉプラスミド由来のベクターだけでなく、例えば、［５６−５８］およびＥＰＯ公開公報１２０，５１６に開示されているベクターが含まれる。アグロ細菌類のＴｉまたはルート誘発性（ＲＩ）プラスミド由来の植物形質転換ベクターのほかに、本発明のＤＮＡ構築物を植物細胞に挿入するのに別の方法を使用することもできる。このような方法には、例えば、リポゾームやエレクトロポレーション、遊離ＤＮＡ取り込みを増大させる化学物質の使用、マイクロプロジェクタイル照射を介した遊離ＤＮＡ送達、およびウイルスや花粉を使用した形質転換などを含む。ＤＮＡは葉緑体ゲノムに挿入されてもよい［４９］。
【０１３８】
マイクロプロジェクタイル照射を用いた単子葉植物におけるＰＢＧＳ遺伝子の導入に好適なプラスミド発現ベクターは、ＣＴＰ、光誘導性プロモータ、ＰＢＧＳ遺伝子、Ｈｓｐ７０イントロン［５９］などの遺伝子の発現を促進させるスプライス部位を提供するイントロン、およびノパリン合成酵素３’配列（ＮＯＳ３’；［６０］）などの３’ポリアデニル化配列からなる。この発現カセットは、植物に注入する大量のＤＮＡの産生に好適な高写レプリコンで組み立ててもよい。
【０１３９】
双子葉植物の形質転換で使用するための特に有用なアグロ細菌類をベースとした植物形質転換ベクターは、プラスミドベクターｐＭＯＮ５３０［６１］である。プラスミドｐＭＯＮ５３０はｐＭＯＮ５２６にｐＭＯＮ３１６［６１］の２．３ｋｂ  ＳｔｕＩ−ＨｉｎｄＩＩＩフラグメントを転移させることによって調製されるｐＭＯＮ５０５の誘導体である。プラスミドｐＭＯＮ５２６は、ＸｍａＩでの消化、クレノウポリメラーゼによる処置、および結合によってＳｍａＩ部位が除去されるｐＭＯＮ５０５の単純な誘導体である。プラスミドｐＭＯＮ５３０は、ｐＭＯＮ５０５のすべての特性とＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯＳ発現カセットを保持し、現段階では、プロモータとポリアデニル化信号との間のＳｍａＩの固有の開裂部位を含んでいる。
【０１４０】
バイナリーベクターｐＭＯＮ５０５は、Ｔｉプラスミド相同領域、ＬＩＨが微小ＲＫ２プラスミド、ｐＴＪＳ７５［６２］の３．８ｋｂ  ＨｉｎｄＩＩＩ〜ＳｍａＩセグメントと置き換えられているｐＭＯＮ２００［６１］の誘導体である。このセグメントには、３親結合手順を用いてアグロ細菌類に接合させるための複製のＲＫ２起点、ｏｒｉＶおよび転移起点ｏｒｉＴを含む［６３］。プラスミドｐＭＯＮ５０５は、所望のＤＮＡフラグメントの挿入のための合成多リンカー、植物細胞にカナマイシン耐性のためのキメラＮＯＳ／ＮＰＴＩＩ／ＮＯＳ遺伝子、Ｅ−ｃｏｌｉおよびＡ−チュームファシエンで選択するためのスペクティノマイシン／ストレプトマイシン耐性決定因子、子孫における形質転換および継承を容易にスコアリングするための完全なノパリン合成酵素遺伝子およびＥ．ｃｏｌｉで大量のベクターを容易に作成するためのｐＢＲ３２２起点を含むｐＭＯＮ２００の重要な特徴を保持する。プラスミドｐＭＯＮ５０５には、ｐＴｉＴ３７ノパリン型Ｔ−ＤＮＡの右末端に由来する単一Ｔ−ＤＮＡのボーダーが含まれている。サザンブロット分析の結果、プラスミドｐＭＯＮ５０５とそれが運ぶ任意のＤＮＡが植物ゲノムに組み込まれること、すなわちプラスミド全体が植物ゲノムに挿入されるＴ−ＤＮＡであることが実証されている。組み込まれたＤＮＡの一端が、右ボーダー配列とノパリン合成酵素遺伝子の間に配置され、他端が、ボーダー配列とｐＢＲ３２２配列との間に配置される。
【０１４１】
もう一つの特に有用なＴｉプラスミドカセットベクターは、ｐＭＯＮ１７２２７である。このベクターについては、ＰＣＴ国際公開ＷＯ９２／０４４４９に記載があり、ジャガイモやトマトを初めとする多くの植物の優れた選択マーカー遺伝子であるグリホサート耐性（ＣＰ４と命名）を付与する酵素をコードする遺伝子を含む。この遺伝子を、アラビドプシスＥＰＳＰ葉緑体輸送ペプチド（ＣＴＰ２）に融合させ、本明細書に記載されているようにＦＭＶプロモータから発現させる。
ＰＢＧＳ遺伝子を含む十分な量の細胞（または原形質体）が取得されたなら、それらの細
胞（または原形質体）を植物全体に再生させる。再生工程のための手法の選択は重要ではなく、マメ科（アルファルファ、ダイズ、クローバー等）、セリ科（ニンジン、セロリー、アメリカボウフウ）、アブラナ科（キャベツ、ラディッシュ、キャノーラ／ナタネ等）、ウリ科（メロンおよびキュウリ）、イネ科（小麦、大麦、イネ、トウモロコシ等）、ナス科（ジャガイモ、タバコ、トマト、トウガラシ）、ヒマワリなどの各種花卉、アーモンド、カシューナッツ、クルミ、ペカンなどの実をつける樹木からの宿主に好適なプロトコルが利用可能である。例えば［６４−６８］参照。
一つの実施形態では、ＰＢＧＳ遺伝子は、ＰＢＧＳ酵素がＭｇ2＋を含んでいないがＺｎ2＋を含んでいる種に由来する。好ましい実施形態ではこの種は酵母またはヒトである。別の好ましい実施形態では、変異ＰＢＧＳ遺伝子を使用して遺伝子組み換え植物を生成させる。さらなる実施形態では、ＰＢＧＳ遺伝子を同種組み換えによって植物ゲノムに導入する。野生型ヒトＰＢＧＳゲノムＤＮＡおよび遺伝子組み換え植物を生成するのに使用されうる全長ｃＤＮＡを以下に示す。
ヒトＰＢＧＳ遺伝子（配列番号１）
cttacgcggtctgtgggagaccggagcgggagacagcggtgacaggagcagcggccgggagcccttagggaggcagacagagcctgcagccaatgccccaggagccctcggttccaaccaactgatgcccctgtgcccactggcccacgccatgcagccccagtccgttctgcacagcggctacttccacccactacttcgggcctggcagacagccaccaccaccctcaatgcctccaacctcatctaccccatctttgtcacggatgttcctgatgacatacagcctatcaccagcctcccaggagtggccaggtatggtgtgaagcggctggaagagatgctgaggcccttggtggaagagggcctacgctgtgtcttgatctttggcgtccccagcagagttcccaaggacgagcggggttccgcagctgactccgaggagtccccagctattgaggcaatccatc tgttgaggaagaccttccccaacctcctggtggcctgtgatgtctgcctgtgtccctacacctcccatggtcactgcgggctcctgagtgaaaacggagcattccgggctgaggagagccgccagcggctggctgaggtggcattggcgtatgccaaggcaggatgtcaggtggtagccccgtcggacatgatggatggacgcgtggaagccatcaaagaggccctgatggcacatggacttggcaacagggtatc ggtgatgagctacagtgccaaatttgcttcctgtttctatggccctttccgggatgcagctaagtcaagcccagcttttggggaccgccgctgctaccagctgccccctggagcacgaggcctggctctccgagctgtggaccgggatgtacgggaaggagctgacatgctcatggtgaagccgggaatgccctacctggacatcgtgcgggaggtaaaggacaagcaccctgacctccctctcgccgtgtaccac gtctctggagagtttgccatgctgtggcatggagcccaggccggggcatttgatctcaaggctgccgtactggaggccatgactgccttccgcagagcaggtgctgacatcatcatcacctactacacaccgcagctgctgcagtggctgaaggaggaatgatggagacagtgccaggcccaagaactagaactttaaaacgttcccggggcctcagacaagtgaaaaccaaagtaaatgctgcttttagaactgt gccctcatgccctcttcctgctcacatgctagcggggcccagcagccctgggtggttttgccagcatgctaactcttgtaactcgcagctgcatcctatgagctctcccaagcttccccgcccctcccctgggtcagccgtgaggcccacctttgccaccctcagctctttcctctggtgtggcttcagcttgaaagcaacctggagtcgggggcacagcctttggggcctggctgggagagggtcttggagcatt aggggaagaagagagcagtgggatcttggggcctgagaagccttggaacgcttctggcagcagagctgggtgtgggaatgaggcctagatcgatatccctgggttagagttgaaatttgccgcaattccactggaaggcatttcccacgaggccagaggttgccaggctgcctgaggtctcctattctactctgaaccataaacccagagaagaattactcattaaccagcataaatactgcctgaggatcaaaac tcagaggcaaagagggagttcctgactgctagaggtgccaccaccacaaacactttttattcaggagatactttttgagaatctctgctctgttcctaggttcagtgctgggtcctgggaatacagcaggacagacctcagcttatctcttcatagaaattatacaaagagaattggggagacagctaagaagaaaacaaagaaataaagcagttacaaattgtgataagtgctttgaaggaaagaaggggtctga gacaacaacagggaaggggcctctcttgaaacagtagttgggaaggaggcagacatgcaccagtgatgtggtgacaggtgctctgaaggaggtcaccaggacctgacctctttgaaggatcagaaaatacttccctgaaggactgacatttgagcctagacctgaagggtgagccatcaagctaagacaattggggaagagcattccagggagagggaggagttgtgcaaaggccctggggctccttctagctgga ggaatgcaaggctagcttgtctggagcactgagaggatggcctgaactgagtggagagagacagaccaggaccaaaccatgcagaggtcaagggccacattcaccttttcagagtgactcaatcaaatttgtagtttgtaaaagtattttaacagctctgcggcaaagtgcaaatgaaaagtcttgatggcatggactggagcggggacagtggggatggagaaaggggaatggattgtggatgtgtttagaaggt agattcgatgtgaaggatgaatctggcttgaccttctgggtggctgatgggccatttactgagatggggcagcctggaagaggaacagaagcagggtcggggtggagggagaatactaaacttagcttgagacattttgcaataaggaagctatatctagagtgcttatgtgactcacctaaggccactcaacaagtttgtggcagaactggattagaactgcacagaaaacagccaagctgggatttgaacccat gtagtccaactccaaggcctctgcccctaaccactgtgccataccacctcccaataatcaacagcaaaattataggtctaacaatgttttatagac
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ヒトＰＢＧＳ  ｃＤＮＡ（配列番号２）
gcagccaaagccccaggagccctaggttccaaccaactgatgcccctgtgcccactggcccacgccatgcagccccagtccgttctgcacagcggctacttccacccactacttcgggcctggcagacagccaccaccaccctcaatgcctccaacctcatctaccccatctttgtcacggatgttcctgatgacatacagcctatcaccagcctcccaggagtggccaggtatggtgtgaagcggctggaagagatgctgaggcccttggtggaagagggcctacgctgtgtcttgatctttggcgtccccagcagagttcccaaggacgagcggggttccgcagctgactccgaggagtccccagctattgaggcaat ccatctgttgaggaagaccttccccaacctcctggtggcctgtgatgtctgcctgtgtccctacacctcccatggtcactgcgggctcctgagtgaaaacggagcattccgggctgaggagagccgccagcggctggctgaggtggcattggcgtatgccaaggcaggatgtcaggtggtagccccgtcggacatgatggatggacgcgtggaagccatcaaagaggccctgatggcacatggacttggcaacagg gtatcggtgatgagctacagtgccaaatttgcttcctgtttctatggccctttccgggatgcagctaagtcaagcccagcttttggggaccgccgctgctaccagctgccccctggagcacgaggcctggctctccgagctgtggaccgggatgtacgggaaggagctgacatgctcatggtgaagccgggaatgccctacctggacatcgtgcgggaggtaaaggacaagcaccctgacctccctctcgccgtgt accacgtctctggagagtttgccatgctgtggcatggagcccaggccggggcatttgatctcaaggctgccgtactggaggccatgactgccttccgcagagcaggtgctgacatcatcatcacctactacacaccgcagctgctgcagtggctgaaggaggaatgatggaggacagtgccaggcccaagaactagaactttcaaacgttcccggggcctcagacaagtgacaaccaaagtaaatgctgcttttag aactgt
ヒトＰＢＧＳアミノ酸配列（配列番号３）
MQPQSVLHSGYFHPLLRAWQTATTTLNASNLIYPIFVTDVPDDIQPITSLPGVARYGVKRLEEMLRPLVEEGLRCVLIFGVPSRVPKDERGSAADSEESPAIEAIHLLRKTFPNLLVACDVCLCPYTSHGHCGLLSENGAFRAEESRQRLAEVALAYAKAGCQVVAPSDMMDGRVEAIKEALMAHGLGNRVSVMSYSAKFASCFYGPFRDAAKSSPAFGDRRCYQLPPGARGLALRAVDRDVREGADMLMVKPGMP YLDIVREVKDKHPDLPLAVYHVSGEFAMLWHGAQAGAFDLKAAVLEAMTAFRRAGADI[Pi]TYYTPQLLQ WLKEE
本発明の組成物は、例えば、シャンプー、入浴剤、ヘアケア製品、（飽和および／または不飽和脂肪酸からなる合成界面活性剤および塩類を基材とした）液体および固形石鹸、ローションとクリーム、脱臭剤、その他例えば皮膚のためのクレンジング液のような水またはアルコール溶液、湿潤清掃布、オイルまたはパウダーなどの人体のケア製品の調製で、抗菌活性成分として好適である。したがって本発明は、Ｈｏｌｚｌらに授与された米国特許第６，６８９，３７２号に記載されているように、本発明の組成物および美容上忍容性のある担体または補助材を任意で含む人体のケア製品の調剤に関する。組成物は抗菌効果を有するすなわち、細菌の活性を阻害または防止するのに効果のある量で使用しなくてはならない。他の成分、例えば金属イオン封鎖剤、着色剤、香油、増粘剤または固化（一貫性調節剤）剤、皮膚軟化剤、ＵＶ吸収剤、皮膚保護剤、酸化防止剤、ジカルボキシル酸および／または脂肪酸のＡｌ、Ｚｎ、ＣａおよびＭｇ塩類などの機械的性質を向上させる添加剤、ならびに任意で保存料などの他の成分も使用することができる。さらに、本発明は、本発明の化合物の抗菌効果のある量での前期抗菌処置が必要な場合に、ヒトの皮膚、粘膜または毛髪の表面に接触する工程を有する、皮膚、粘膜または毛髪の抗菌処理の方法を提供する。
【０１４２】
本発明によるヒトのケア調剤は、油中水または水中油乳液として、アルコール剤形またはアルコール含有剤形として、イオンまたは非イオン両親媒性脂質の小胞体分散液として、ゲル、固形スティックとして、あるいはエアロゾル剤形として処方してもよい。
【０１４３】
油中水または水中油乳化液として、美容的に容認性のある補助剤には、例えば、５〜５０％の油相、５〜２０％の乳化剤および３０〜９０％の水を含む。油相には、例えば一種類またはそれ以上の炭化水素オイル、ワックス、天然オイル、シリコンオイル、脂肪酸エステルまたは脂肪アルコールなど、美容剤形に好適な任意のオイルを含んでいてもよい。
好ましい一価アルコールまたは多価アルコールにはエタノール、イソプロパノール、プロピレングリコール、ヘキシレングリコール、グリセロールおよびソルビトールがある。
【０１４４】
本発明による美容剤形は、Ｈｏｌｚｌらによる米国特許第６，６８９，３７２号に記載されている広範にわたる美容調剤に含んでもよい。特に、例えば下記の調剤を考慮に入れる。スキンケア調剤、例えば錠剤形、または液体石鹸、ソープレス殺菌剤または洗浄用ペーストの形態での皮膚洗浄液やクレンジング液、液体（フォームバス、ミルク、シャワー用製剤）またはバスキューブやバスソルトなどの固形バス調剤液、例えば乳液、マルチ乳液またはスキンオイルなどのスキンケア製剤、例えばデイクリームやパウダークリーム、フェイスパウダー（軟または固形）、頬紅またはクリーム状のメイクアップ、アイシャドウ、マスカラ、アイライナー、アイクリームまたはアイフィックスクリームなどのアイケア製品、リップスティック、リップグロス、リップ輪郭ペンシルなどのリップケア製品、マニキュア、マニキュアリムーバー、爪硬化剤またはキューティクルリムーバーなどの爪ケア製品、インティメイト洗浄ローションまたはインティメイトスプレーなどのインティメイト衛生製品、足浴、足パウダー、足クリームまたは足バルサムなどの足ケア製品、特殊消臭剤および抗発汗剤またはカロアスリムービング製品、サンミルク、ローション、クリームおよびオイル、サンブロックまたはトロピカル、プレタンニング製品などの日焼け止め製品または日焼け手入れ製品、セルフタンニングクリームなどのスキンタンニング製品、例えば皮膚の美白のための製品や皮膚ハイライト製品などの脱色素製品、害虫駆除油、ローション、スプレーまたはスティックなどの害虫駆除剤、脱臭スプレー、ポンプスプレー、デオドラントジェル、スティックまたはロールオンなどの消臭剤、抗発汗スティック、クリームまたはロールオンなどの抗発汗剤、例えばソープレス消毒剤（固形または液体）、ピーリングまたはスクラブ製品またはピーリングマスクなどといった染みのための洗浄およびケア製品、脱毛パウダー、液体脱毛製品、クリームまたはペースト状脱毛製品、ジェル状またはエアロゾル状の脱毛製品などの化学形態（脱毛剤）での脱毛製品、例えばシェービングソープ、シェービングフォームクリーム、非泡立ちシェービングクリーム、フォームおよびジェル、ドライシェービング用のプレシェーブ製品、アフターシェーブまたはアフターシェープローションなどのシェービング製品、香水（オーデコロン、オードトワレ、オードパフューム、パフュームトワレ、香水）、香油またはクリーム香水などのフレグランス製品、例えば練り歯磨き、ゲル状練り歯磨き、歯磨き粉、マウスウォッシュ濃縮液、抗プラーク口内洗浄液、入れ歯クリーナーまたは入れ歯固定剤などの歯科用、入れ歯用、口腔用製品、シャンプーやコンディショナーなどの洗髪製品、プレトリートメント製品、ヘアトニック、スタイリングクリーム、スタイリングジェル、ポマード、ヘアリンス、トリートメントパック、集中ヘアトリートメント、ヘアストラクチャリング製品、パーマネント（ホットパーマ、マイルドパーマ、コールドパーマ）のためのヘアウェイブ製品、ヘアストレートパーマ製品、液体ヘアセット製品、フォーム、へアスプレーなどの整髪製品、過酸化水素液、ライトニングシャンプー、漂白クリーム、漂白粉、漂白ペーストまたはオイル、一時的、半永久的、永久的なヘア着色剤、自己酸化染料を含む製品またはヘンナやカモミールなどの天然の毛髪染料。
【０１４５】
本発明による口腔組成物は、例えば、ジェル、ペースト、クリームまたは水性の調剤（マウスウォッシュ）の形態であってもよい。
本発明による口腔組成物は、例えばナトリウム、カリウム、アンモニアまたはフッ化カルシウムなどの無機フッ化塩類、あるいは例えばＯｌａｆｌｕｏｒという商標名で知られているフッ化アミンなどの有機フッ化塩類など、虫歯の形成に対抗する効果のあるフッ素イオンを放出する化合物を含んでいてもよい。
【０１４６】
本発明の組成物は、繊維材の処理にも好適である。このような材料は、例えばシルク、ウール、ポリアミドまたはポリウレタンなどの未染色および染色またはプリント繊維材ならびに特にすべての種類のセルロース繊維材が含まれる。このような繊維材は、例えば綿
、リネン、ジュートおよび麻などの天然のセルロース繊維の他に、セルロースや再生セルロースも含まれる。好ましい好適な繊維材は、綿で製造されている。本発明の組成物は、例えば液体、粉末洗浄剤や柔軟剤などで、洗浄およびクリーニング剤形としても使用することができる。
【０１４７】
本発明による組成物は、例えばポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリエステル、ポリアミド、ポリカーボネート、ラテックスなどのプラスチックに抗菌特性を付与するのにも好適である。本発明の組成物を使用する分野には、例えば、床のカバーリング、プラスチックコーティング、プラスチックコンテナ、パッケージング材、台所および浴室製品（例えばブラシ、シャワーカーテン、スポンジ、バスマット）、ラテックスフィルター材（エアフィルターおよび水フィルター）、ドレッシング材、シリンジ、カテーテルなどいわゆる医療用具、手袋、マットレスなどの医療分野で使用されるプラスチック製品などがある。
【０１４８】
紙、例えば衛生目的で使用される紙類には、本発明による組成物を用いて抗菌特性を付与してもよい。
例えば生理用ナプキン／オムツ、衛生タオル、パンティライナーなどの不織布および公衆衛生および家庭用の布に本発明に従った抗菌特性を付与することも可能である。
【０１４９】
本発明は固い面を洗浄および殺菌するための家庭用クリーナーおよび汎用のクリーナーにも使用できる。
美容製品や家庭製品を保存するだけでなく、紙処理液、のりやセルロース誘導体の印刷用増粘剤、表面塗膜および塗料などといった技術製品も保存し抗菌特性を付与することができる。
【０１５０】
本発明の組成物は、木材の抗菌処理および皮革の抗菌処理さらには、皮革に抗菌特性を付与するのにも好適である。
本発明による組成物は、細菌による被害から美容製品および家庭用製品を保護するのにも好適である。
【０１５１】
さらに、本発明の組成物は、Ｗｈｉｔｅ，Ｊｒ．らによる米国特許第６，７４０，３１１号に記載の、口腔許容可能担体と結合した歯磨き組成物などの、口腔組成物として使用することができる。このような口腔組成物の非限定的な例として、ヒトや動物に好適な練り歯磨き、歯磨き粉、予防用ペースト、薬用キャンディ、ガムなどが挙げられる。
【０１５２】
さらに本発明の組成物は、抗菌面を調製するのにも使用できる。さらに、抗菌面を形成するための方法であって、
（１）多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素の活性型が、アロステリックマグネシウム結合部位を含んでおり、組成物が薬剤、練り歯磨き、石鹸、消毒剤、抗生物膜組成物および除草剤のどれか１つであることを前提として、組成物が多量体ポルフォビリノーゲン合成酵素の活性型の形成を阻害または防止するので、細菌類、古菌類および／または真核生物の発生または生育を阻害または防止する、本発明の組成物を提供する工程と、
（２）面形成基材を提供する工程と、
（３）面形成基材と組成物を結合し、抗菌面を形成する工程と、
からなる方法が提供される。この方法の１つの態様では、抗菌面が、生物膜の形成を防止または阻害するように適合される。
【０１５３】
本明細書で使用されている「面形成基材」という用語には、ポリマー、生物分解性および非生物分解性のポリマー、シリカ、セラミックスおよび、混合、層化または基材と組成物の会合を行うためのそれらの組み合わせが含まれる。組成物は、基材の上面または底面
のどちらにでも配置することができる。
【０１５４】
さらに本発明は、植物の生育または発生を操作するための方法であって、植物に除草剤耐性があり、抱合二量体の多量体型で実質的に存在している多量体タンパク質の遺伝子組み換えとして適合されている植物に、除草剤の形態での本発明の組成物を適用する工程を含む方法も提供する。
【０１５５】
本発明は、下記実施例を参照してさらに詳細に説明するが、本発明はそれに限定されないということは理解すべきである。
【実施例】
【０１５６】
実施例１
ヒトＰＢＧＳ変異型Ｆ１２Ｌの六量体会合の発見
タンパク質発現
親ヒトＰＢＧＳは十分に特徴づけされたＮ５９／Ｃ１６２Ａである［７０］。Ｎ５９は、ＰＢＧＳタンパク質をコードする二種類の共優勢対立遺伝子のうちのより溶解度の高いほうに一致する。Ｃ１６２Ａは、異常ジスルフィド結合をゆっくりと形成する可能性を排除する良性突然変異である。Ｎ５９／Ｃ１６２Ａの人工遺伝子を以下ではＷｔと呼んでいる。Ｆ１２Ｌ変異型へのＷｔのＣｕｉｋＣｈａｎｇｅ突然変異誘発に使用されるセンス鎖プライマーは、ＧＧＣＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＣＡＣＴＧＣＴＴＣＧＧＧＣＣであった。複数の構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＷｔおよびＦ１２Ｌの共発現のために調製した。遺伝子の順序とプロモータの数の両方を変えたが、これらの変化は結果には影響を与えなかった。１つのプロモータの制御下でＷｔとＦ１２Ｌを含む構築物について記述する。Ｗｔを含むプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ３ａＷｔ）を、ＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩで消化させてＷｔを切断した。ｐＥＴ１７ｂベクターＤＮＡをＢａｍＨＩおよびＮｄｅＩによる消化によって線形化し、ＷｔのＡＴＧ開始コドンがベクターによってコードされるリボゾーム結合部位の６塩基対下流となるようにＷｔと結合させた。得られたプラスミドは、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１ブルーに形質転換された。プラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ１７ｂＷｔ）を調製し、ＳｐｅＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで線形化した。遺伝子Ｆ１２Ｌを含むプラスミドＤＮＡ（ｐＥＴ３ａＦ１２Ｌ）を、ＸｂａＩおよびＢｐｕ１１０２Ｉで消化させて、リボゾーム結合部位とＦ１２Ｌの遺伝子を含むフラグメントを産生した。Ｆ１２Ｌの遺伝子と線形化されたｐＥＴ１７Ｗｔベクターを、Ｆ１２Ｌ遺伝子のリボゾーム結合部位がＷｔの停止コドンの３５塩基対下流に位置し、ターミネーターがＦ１２Ｌ遺伝子の停止コドンの５２塩基対下流に来るように結合させた。プラスミドｐＥＴ１７ｂＷｔＦ１２ＬをＥ．ｃｏｌｉ  ＸＬ１ブルーに形質転換させ、プラスミドＤＮＡを調製し、すでに述べたようにタンパク質発現のためＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬＲ（ＤＥ３）に形質転換させた。
タンパク質精製
タンパク質精製手順の大半（細胞破壊、硫酸アンモニウム分画、フェニル・セファロース上での疎水性クロマトグラフィー、陰イオン交換クロマトグラフィーおよびセファクリル  Ｓ−３００上でのゲル濾過クロマトグラフィー）は、７０ｍｌ  Ｑ−セファロースカラムを、陰イオン交換工程のためＤＥＡＥアガロースカラムに代わって使用したという点を除けば、すでに述べた手順［７０］に従っている。Ｑ−セファロースは、３０ｍＭのカリウムリン酸塩、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  ２メルカプトエタノール、１０μＭ  Ｚｎ（ＩＩ）を用い、図１７Ａに示されているようにＫＣｌ勾配を用いて、室温で流動させた。この勾配は、３ｍＬ  ｍｉｎ-1の流速で実施したＲａｉｎｉｎ  ＨＰＬＣシステムによって制御し、１０ｍｌ分画を収集した。
【０１５７】
ＷｔおよびＦ１２Ｌが異なる機能特性を有しているということを実証するために、ＰＢＧＳ変異型の速度論的特徴づけを用いた
すべての速度論的定量を、０．１ビストリスプロパン、１０ｍＭ  ２メルカプトエタノ
ール、１０μＭ  Ｚｎで実施した。ｐＨ速度プロフィールに関しては、報告されているｐＨは、１０ｍＭ  ＡＬＡ−ＨＣｌの添加後の分析用ｐＨを表している。ＫmおよびＶmaxの定量に関しては、ＡＬＡの濃度が、１０μＭ、３０μＭ、１００μＭ、３００μＭ、１ｍＭ、３ｍＭおよび１０ｍＭであり、それぞれ二重に実施した。ＡＬＡ−ＨＣｌの濃度における変化は、株０．１Ｍ  ＡＬＡ−ＨＣｌを分析用混合液に定量添加する前に、０．１  Ｍ  ＨＣｌに希釈したために、最終ｐＨが変化することがなかった。試験はすべて、エールリッヒ試薬を用いて、一定時間、３７℃で実施して、形成されたポルフォビリノーゲンを定量した。
分析用超遠心分離
タンパク質試料を、３０ｍＭカリウムリン酸塩、ｐＨ７．５、０．１ｍＭ  ＤＴＴおよび１０μＭ  ＺｎＣｌ２で超遠心分離にかける直前に透析した。負荷濃度は、野生型とＦ１２Ｌ変異型酵素それぞれで１０．６μＭと１２．８μＭであった。すべての沈降平衡実験を、Ａｎ６０  Ｔｉ回転子を備えたＢｅｃｋｍａｎのＯｐｔｉｍａ  ＸＬ−Ａ分析用超遠心分離機と、石英窓を使用した、６チャンネル、１２ｍｍパス長のチャコール充填Ｅｐｏｎセンターピースを使用して、４℃で実施した。３種類の回転速度（８，０００、１１，０００および１４，０００ｒｐｍ）でデータを収集したところ、０．００１ｃｍのスキャン刻みを使用して２０回のスキャンの平均を表した。温度補正部分的比体積および溶液密度を、Ｓｅｄｎｔｅｒｐプログラムを用いて計算した［７１］。溶液密度は、１．００１９１ｇｍ／ｍＬで、部分的比体積は野生型および変異型タンパク質のそれぞれで０．７３９４および０．７３９７ｍＬ／ｇｍであった。コネチカット大学（Ｓｔｏｒｒｓ、ＣＴ）の分析用超遠心分離設備からのＨＩＤプログラムを用いてデータを分析した。データのモデル分析は、適合からの残留物が明らかに非ランダムであるので単一の種を無視した。Ｆ１２Ｌの結晶構造を判定した
５０ｍＭビストリスプロパン、１０ｍＭ  βＭＥおよび１０μＭ  ＺｎＣｌ２でＦ１２Ｌを透析した。シッティングドロップ法を用いて結晶を形成し、等量のＦ１２Ｌ（４．０ｍｇ  ｍｌ-1）を沈殿物と混合した（０．４Ｍリン酸水素アンモニウム）。タンパク質サブユニット濃度に等モルのＡＬＡを添加したところ、３−５日内に結晶が形成された。ＯＳＭＩＣ光学計を備え、５０ｋＶおよび１００ｍａで操作したＲＵ−２００回転陰極ジェネレーターと結合させたＭＡＲ３４５画像プレート検出器で１００Ｋで回折データを収集した。各溶液で３分間、１２％、１７％、２３％および３０％のグリセロールを含有する貯蔵溶液でこれらを転移させることによって凍結前に結晶が凍結防止された。活性部位領域における任意のリガンドの高い度合いの無秩序と欠失を示すいくつかのデータセットを収集した。したがって最初の２種類の凍結防止液に添加された２ｍＭ  ＡＬＡの他に最後の二種類の液に添加された０．２ｍＭ  ＺｎＣｌ２でＦ１２Ｌの結晶を浸漬させた、最終データセットは、１フレームあたり３．５分間の曝露時間で０．５°の振動に対応する５２５のフレームで構成されていた。結晶は、六角形、空間グループＰ６３、ユニットセルパラメータａ＝ｂ＝８９．６Å、ｃ＝１５３．２Åに属している。非対称ユニットには２つの分子が存在している。４５−２．２Å分解能範囲では３３．６１５の反射でプログラムパッケージＨＫＬ２０００、Ｒmｅｒｇｅ（Ｉ）＝５．０％で回折データが減少された
。
【０１５８】
初期モデルとしてヒトＰＢＧＳ構造（ｐｄｂコード１Ｅ５１）の分子Ａを使用して、ＡｍｏＲｅプログラムパッケージで分子置換によって構造を解き明かした。プログラムＣＮＳを使用してさらにデータを手直しした。最終モデルには、Ｆ１２Ｌ分子Ａ（残基１１−８２、９７−１２４、１４０−１６９、１７２−２１２、２２２−３３０）およびＢ（残基３−８２、９７−１２２、１４０−１６９、１７２−２１２、２２６−３２８）の１つの二量体、を含んでおり、分子Ａの活性部位に結合している触媒反応の中間生成物の１分子、２４１の水分子および占有率が低いと思われるＺｎの２個の原子が含まれていた。結晶学上のＲ因子は１９．９％で、Ｒ（遊離）は２．２Åの分解能データで２８．６％で、結合長さと結合角度のＲＭＳ偏差はそれぞれ０．１８Åと２．０°である。残基はすべて
、ラマチャンドランプロットでは許容される配座領域に属している。
ヒトＰＢＧＳ変異型Ｆ１２Ｌの特性
ヒトＰＢＧＳ変異型Ｆ１２Ｌは、野生型タンパク質とは非常に異なっている。精製されたＦ１２Ｌの特徴づけにより、触媒活性は、野生型ヒトＰＢＧＳが最も活性が高い条件下ではきわめて低いことが確認されている。しかしながらＦ１２Ｌは高度に変化しているｐＨ速度プロフィールを示し、基本ｐＨ値でかなりの活性を呈している（図１２）。Ｆ１２Ｌおよび野生型ヒトＰＢＧＳのＫmおよびＶmax値を、野生型タンパク質にとって最適であるｐＨ７とＦ１２Ｌに最適なｐＨ９で定量した。結果は表１のとおりである。Ｆ１２Ｌは、基材５アミノレブリン酸（ＡＬＡ）の生理学的濃度を十分越えるきわめて高いＫm値を
もつ通常のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ速度論を示している。しかしながら、ｐＨ９では、Ｆ１２ＬのＶmaxは野生型タンパク質よりも非常に高い。最適ｐＨおよび金属イ
オンの最適構成条件下では、特徴付けしたすべての種に由来する野生型ＰＢＧＳは、ｐＨ７における野生型ヒトＰＢＧＳで認められるように、１００μＭの範囲内で［１４、３１、７０、７２］、Ｋm値を持つと報告されている。野生型ヒトＰＢＧＳのｐＨ９における
速度論的挙動は、標準のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎの速度論を呈することがなかったが、その基礎は当初は、明らかではなかった。おおまかな調査では、野生型タンパク質は、Ｈｉｌｌ係数が０．３５レベルの極度の負の協同性を呈すると考えられていた。実際に、データは、二重双曲型方程式に最適に適合したが、後に、これは２つの形態のＫm
値が極めて異なる四次アイソフォーム（モルフィン、八量体および六量体）の混合体によって触媒反応から導出されたと認識されるようになった。この現象については、後段で詳しく述べる。
【０１５９】
Ｆ１２Ｌ変異型と野生型タンパク質との間の異常ともいえる差異に関するさらなる証拠が、陰イオン交換クロマトグラフィー（図１６Ａ）および未処理ゲル電気泳動（図１６Ｂ）工程における移動性の変化から得られたが、そのいずれもがオリゴマー構造の差異を示唆する。陰イオン交換カラムで分離を行うと、概して、中性フェニルアラニンに関する中性ロイシンの置き換えに起因し得ない、異なる面電荷が示される。電気泳動による同じ電荷／質量比の２つの種を分離すると、異なるサイズまたは異なる形状のいずれかが示される。これらの差異はともに、Ｆ１２Ｌと野生型ヒトＰＢＧＳが異なるオリゴマー状態で存在することを示唆している。
【０１６０】
分析用超遠心分離器を用いて野生型タンパク質と変異タンパク質で沈降平衡分析を行ったところ、野生型タンパク質とＦ１２Ｌの分子量がそれぞれ２４４，０００±８，９００ダルトンと１９７，９００±６，５００ダルトンであることが判明した。前者は、八量体と六量体に予想される分子量の中間に属し、後者は、六量体と四量体に予想される分子量の中間に属する。データについてのモデル分析では、野生型タンパク質は、二量体、六量体および八量体の３相モデルにそれぞれ７．６％、５１％および４２％で最適に適合し、Ｆ１２Ｌは、八量体を含まない四量体および六量体の２相モデルで７０％から３０％の割合で最適に適合している。したがって、本発明者は、ヒトＰＢＧＳ変異型Ｆ１２Ｌの結晶構造の判定に着手した。
ヒトＰＢＧＳおよびＦ１２Ｌ変異型の結晶構造は、新しい四次アイソフォームを決定し、モルフィンの第一の例を明らかにする、単量体の構造における顕著な差異を呈する
菌類、後世動物および細菌類由来のＰＢＧＳ［２９、３０、４０、７３−７９］のすでに決定されている１７個の結晶構造から、中心軸を中心とした９０度の回転により４個の二量体が関連付けられる、共通の同種八量体構造が明らかになっている（図２）。ＰＢＧＳは、ＴＩＭα／βバレルタンパク質のアルドラーゼ上科に属するタンパク質である［８０］。各サブユニットでは、触媒の中心が、バレル内に完全に納まっており、２０＋アミノ酸Ｎ末端アームが広範にわたるサブユニットの相互作用に関与している。触媒の中心の配列は、系統発生的に保存されているが、Ｎ末端アームの配列は保存されていない。八量体に認められるＰＢＧＳ二量体（図２、左側）は、高度に保存されたバレル−バレル間の
接触を伴い、１つのサブユニットのＮ末端アームが、姉妹サブユニットのバレルを抱合している。したがって、これは、抱合二量体と表示されている［９］。アミノ酸１２の側鎖は、抱合相互作用には関与しない。中心軸の周りに９０度回転させた第二の抱合二量体の付加によって得られる四量体の会合（図２、中央）では、１つのサブユニットのアームと隣接二量体からのα／βバレルの塩基との間の相互作用が付加される。アミノ酸１２の側鎖がこのサブユニット相互作用に参加する。中心軸の周りにそれぞれ９０度回転させたさらに２個の二量体を付加すると、八量体が得られる（図２、右側）。二量体と四量体の図を基準として手前に９０度回転させた八量体は、風車のような形をしている。Ｆ１２Ｌの結晶構造を決定する前に、すべてのＰＢＧＳタンパク質が、同じ同種八量体構造を共有していると想定した［９］。しかしながら、緑色植物や一部の細菌類由来のＰＢＧＳに関しては、最大限活性の高い八量体が、小さく活性の低い構造ユニットに解離しうることを示唆する速度論的証拠が存在している［１３、１４］。この速度論的証拠は、えんどう豆ＰＢＧＳに関する図５および２０Ｂに示されている、比活性に対するタンパク質濃度である。
【０１６１】
顕著なこととして、Ｆ１２ＬヒトＰＢＧＳ対立遺伝子（ＰＤＢコード１ＰＶ８）の新たに決定された結晶構造により、α／βバレルを基準としたＮ末端アームの重大な再配列を伴う四次構造が明らかとなった（図９）。この場合、二量体は上述のバレル−バレル間接触を保持するが、Ｎ末端アームは抱合するのではなく分離する（図９、左側）。四量体の会合体は、１つのサブユニットのアームと隣接二量体からのα／βバレルの塩基との間上述の相互作用を保持する。しかし、このアームは突出しているので、この会合は、中心軸の周りに１２０度回転することを決定付けている。したがって、オリゴマー構造では、それぞれ中心軸の周りに１２０度回転させた３個の分離二量体が存在し、六量体を形成できる（図９、右側。風車の形内を参照）。野生型ヒトＰＢＧＳに観察される八量体から、Ｆ１２Ｌで観察される六量体への前例のない構造遷移は、タンパク質の構造と機能に微小な突然変異がどのようにして顕著な影響を与えうるか、を表す明確な一例であり、これら２種類の四次形態がエネルギーの点でいかに近接しているかを示唆している。さらに、これらの構造を観察すると、八量体と六量体との間の平衡状態が、抱合二量体と分離二量体の相互変換を通じて進行せねばならないことも明らかである。このような相互変換工程が、図２４に示されている。
【０１６２】
Ｆ１２Ｌの新しい構造（２．２Åの分解能）には、すでに堆積している野生型ヒトＰＢＧＳ構造（ＰＤＢコード１Ｅ５１、２．８３Åの分解能）を基準とした、活性部位の構造比較を妨害する大きな無秩序な領域が含まれている。アミノ酸１２は、どちらの構造でも活性部位の残基とは直接相互作用しない。さらに、双方の構造で観察されるアミノ酸に関しては、ほとんどが重ね合わせ可能である。したがって、Ｆ１２Ｌの特有の速度論的特性（例えば、図１２、表１）の基礎をさらに実証するため、本発明者は、Ｆ１２Ｌおよび野生型ヒトＰＢＧＳの共発現に着手した。
実施例２
この実施例では、特異的突然変異ではなく四次構造が、Ｆ１２Ｌの特有の特性を担うことを実証するための実験について解説する。
【０１６３】
野生型ヒトＰＢＧＳとＦ２１Ｌの共発現によって、四次構造が速度論的差異の基礎であることが解明された
野生型ヒトＰＢＧＳとＦ１２Ｌ変異型の双方を、同じＲＮＡメッセージから１：１の割合で産生するため、共発現系を調製した。ＷＴ＋Ｆ１２Ｌと呼ばれる共発現タンパク質の精製により、陰イオン交換クロマトグラフィーでＰＢＧＳタンパク質の２つの顕著なピークが得られることが明らかとなった（図１７Ａ）。最初に溶出するピーク（Ｐｏｏｌ  Ｉ）は、未処理ゲル上でＦ１２Ｌと同等に伝わり、第二のピーク（Ｐｏｏｌ  ＩＩ）は野生型ヒトＰＢＧＳと同等に伝わった（図１７Ｂ）。Ｐｏｏｌ  Ｉは、ｐＨ９で拡張した活性
を示し、Ｐｏｏｌ  ＩＩは、ｐＨ７で拡張した活性を示した（図１７Ｃ）。両Ｐｏｏｌとも、トリプシン消化後にマススペクトロスコピーによって個別に分析したところ、それぞれが、かなりの量のＮ末端２０１０．２ダルトンのＰｈｅ含有ペプチドと１９７６．２ダルトンのＬｅｕ含有ペプチドの両方を含んでいることが判明し、両プールとも、異量性種を含んでいることが確認された。異量性プール内の各鎖のパーセンテージをＮ末端配列決定によって定量化したところ、Ｐｏｏｌ  Ｉには４８．５％のＰｈｅと５１．５％のＬｅｕが含まれ、Ｐｏｏｌ  ＩＩには７１．１％のＰｈｅと２８．３％のＬｅｕが含まれていることが実証された。これらの割合は後に、各精製により異なることが、実施例３に示されている不均化反応を通じて明らかとなった。これらの割合によって、異量性種の四次構造がを左右する事柄が明確に解明されることはない。Ｐｏｏｌ  ＩとＩＩをセファクリルＳ３００でゲルろ過によってさらに精製し、異量体の二次汚染を低減させた。Ｓ３００によって精製されたＰｏｏｌ  ＩとＰｏｏｌ  ＩＩのｐＨ速度プロフィールは、Ｆ１２Ｌおよび野生型ヒトＰＢＧＳとそれぞれ非常によく似ている（図１７Ｃ）。クロマトグラフィー、マススペクトロスコピーおよび定量Ｎ末端配列決定の各データに基づいて、Ｐｏｏｌ
Ｉは、異種六量体からなり、Ｐｏｏｌ  ＩＩは、異種八量体からなるという結論が得られた。ｐＨ速度プロフィールは、位置１２ではアミノ酸組成物よりも四次構造によって強く支配されることが明らかとなった。
【０１６４】
Ｓ３００によって精製されたプールの速度論パラメータであるＫmとＶmaxをｐＨ７およびｐＨ９で判定した（表３には、最初は７０％Ｌｅｕと３０％Ｐｈｅでの異種六量体（Ｐｏｏｌ  Ｉ）に関するデータが掲載され、最初は３０％Ｌｅｕと７０％Ｐｈｅでの異種八量体（Ｐｏｏｌ  ＩＩ）に関するデータが掲載されている）。速度論データは、単純なＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ  関係（双曲型適合）に従っていないが、異なるＫmお
よびＶmax値をもつ酵素の２種類の形態による（二重双曲型適合）による触媒作用に起因
すると考えられる［８１］。図１７Ｄは、基材濃度の関数として活性を示している。速度論データは、酵素の六量体形態と八量体形態がそれぞれ、高いＫm値と低いＫm値を呈するモデルに均一に適合する。この二重双曲型適合（実線）は、単一の双曲型適合（破線）に比べはるかに優れている。ｐＨ９で検出されるＰｏｏｌ  Ｉで存在する微量の八量体は例外として、すべての速度論値が十分に判定された（表３を参照）。ｐＨ９における野生型ヒトＰＢＧＳに関するデータも、八量体−六量体モデルに対して優れた適合を示し、この解は、表３と１に掲載されている。試験条件下でヒトＰＢＧＳ異量体の平衡状態を左右する要因は、いまだ解明されていない。
【０１６５】
Ｐｏｏｌ  ＩとＰｏｏｌ  ＩＩは、図１７Ａに示されているように、Ｑ−セファロースカラムから溶出し、さらにセファクリルＳ−３００カラムでのさらなる精製を受ける、ＰＢＧＳ活性の２つのプールである。Ｋm1とＫm2  （どちらもｍＭ）は、それぞれ八量体と六量体のＫm値として解釈される。
【０１６６】
【表３】
2008546389.tif 000005
報告されているＶmax値（単位はμｍｏｌ  ｈ-1  ｍｇ-1）は、試験条件下で四次種の
モル比を表しているが、これは今だ決定されていない。適合したＫm値は、四次種の分布
とは無関係である。
実施例３
この実施例では、ヒトＰＢＧＳの八量体および六量体モルフィンが動的平衡状態で存在していることを明らかにし、したがって図２４に示されているようにモルフィン平衡状態が存在しうることを実証する実験について解説する。
【０１６７】
上記のオリゴマーの速度論的挙動から、代謝回転がオリゴマー構造の相互変換を促進するという仮説に至った。酵素活性部位におけるリガンドの相互作用が、ヒトＰＢＧＳ四次構造アイソフォーム間における構造上の相互変換を促進し、八量体の形成に有利に働くことを、以下の実験で実証する。この知見に基づいて、オリゴマータンパク質の会合と解離が、酵素による触媒作用を伴うタンパク質の動作によって促進されうることを解説する。
【０１６８】
それぞれ八量体および六量体へ会合させるための野生型ヒトＰＢＧＳおよびＦ１２Ｌの優先度に関する熱力学的基礎は、不確かではあるが、本研究では、ＷＴ＋Ｆ１２Ｌの四次構造アイソフォームの相互変換に影響を与える因子を評価するのに、このような差別的優先度を活用する。以下の実験では、基材の付加時に、図２４に示されているように、ヒトＰＢＧＳの異種オリゴマーが相互変換するという仮説を立証する。このような動的構造再配置が実証されたのは、これが初めてである。本研究では、六量体と八量体の各種速度論的特性、クロマトグラフィーによる特性、および電気泳動による特性を活用し、動的光分散を使用して、ＰＢＧＳ四次構造アイソフォームの相互変換を触媒する因子を決定する。
【０１６９】
任意の有機体由来のＰＢＧＳは、二量体より小さな形態で観察されることはない。したがって、異量体ＷＴ＋Ｆ１２Ｌタンパク質は、位置１２ではＰｈｅ＋Ｐｈｅ、Ｐｈｅ＋ＬｅｕおよびＬｅｕ＋Ｌｅｕである３種類の組成物の安定した二量体を構成すると考えられている。一部の異種発現ヒトＰＢＧＳは封入体に区画化されているので、これらの二量体比が、可溶性単離タンパク質では１：２：１と想定することはできない。しかしながら、タンパク質を含む同量体Ｐｈｅ１２は折畳んで、優先的に八量体として会合し、タンパク質を含む同量体Ｌｅｕ１２は折畳んで、排他的に六量体として会合するので、Ｐｈｅ＋Ｐｈｅ二量体は優先的に八量体に会合し、Ｌｅｕ＋Ｌｅｕ二量体は優先的に六量体に会合す
ると提唱することができる。これは、すでに報告され［３９］ており、本明細書で確認した異種オリゴマーの観察されたＰｈｅ：Ｌｅｕ比と定量的に一貫している。この根拠に従えば、異量体オリゴマー（図２４）の動的再平衡化から、八量体におけるＰｈｅ１２、六量体におけるＬｅｕ１２の蓄積に有利に働く不均化反応が生じる。
平衡透析実験
透析緩衝液は、所望のｐＨ値における０．１Ｍ  ＢＴＰ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  βＭＥおよび１０μＭ  ＺｎＣｌ２  であった。報告されているｐＨ値は、（含まれている場合）ＡＬＡの添加後の透析緩衝液ｐＨを表している。空気式攪拌機内で静かに攪拌して（５０−６０ＰＲＭ）、２４時間またはそれ以上の間、３７℃で、３００ｍＬの緩衝液を用いてＡＬＡ存在下または非存在下で、タンパク質溶液（３−７ｍｇ／ｍｌで〜２００μｌ）を透析した。緩衝液の試料を定期的に抽出し、エールリッヒ試薬（上記を参照）を使用して、ポルフォビリノーゲンの濃度を判定した。未処理ゲル電気泳動のため、試料を所望の時点で透析カセットからも採取した。次にゲルをスキャンし、各時点におけるタンパク質バンドの分画強度をＳｉｇｍａＧｅｌＴＭ  Ｇｅｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ
（Ｊａｎｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用して分析した。
未処理ゲル電気泳動
未処理ゲル電気泳動を、ＰｈａｓｔＧｅｌシステム（Ａｍｅｒｓｈａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で行った。未処理ゲル流動バッファ（０．１Ｍ  トリス／ＨＣｌ  ｐＨ８．８、２０％グリセロール、０．００２５％ブロモフェノールブルー）とタンパク質溶液を混合して、最終タンパク質濃度〜１ｍｇ／ｍＬとすることによって、試料を調製した。各試料溶液４μｌを同種１２．５ポリアクリルアミド・ゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、分離ゾーンに１２．５％の総アクリルアミド、緩衝液０．１１２Ｍアセテート、０．１１２Ｍ  トリス、ｐＨ６．５）に負荷した。ＰｈａｓｔＧｅｌ未処理緩衝液ストリップ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、０．８８Ｍ  Ｌ−アラニン、０．２５Ｍ  トリス、ｐＨ８．８、３％のアガロースＩＥＦで製造）でゲルを流した。分離後、クマシー染色によりＰｈａｓｔＧｅｌシステム上にゲルが現像された。
光分散測定
基材誘発性動的相互変換時の分子量の変化を、温度制御式ＤｙｎｏＰｒｏ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  （Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．）を使用して３７℃でモニターした。タンパク質（〜１ｍｇ／ｍＬ）を３７℃で１０分間、分析用緩衝液で予備インキュベートした。ＡＬＡを添加して最終濃度１０ｍＭに達した直後に、混合溶液を、３７℃の予備保温しておいた光分散キュベットに、０．２μｍの膜を通じてろ過した。光分散測定を行ったときを除いて、実験中、キュベットをインキュベーター内で３７℃に保持した。計算した平均分子量は、ＫＣ／Ｒ９０の測定値に基づいている［８２］。計算分子量は、おそらくは低い濃度の二量体の存在により、八量体および六量体の予測値より低い。
異量体オリゴマーの不均化のマススペクトル分析
ＷＴ＋Ｆ１２Ｌ  Ｐｏｏｌ  ＩおよびＰｏｏｌ  ＩＩタンパク質溶液に対して、１０ｍＭ  ＡＬＡの存在下で、２４時間平衡透析を行った。タンパク質の六量体および八量体の形態を、１ｍｌ  のＭｏｎｏ−Ｑカラムを使用して、透析後に分離した。Ｍｏｎｏ−Ｑ緩衝溶液は、３０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１０ｍＭ  βＭＥおよび１０μｌのＺｎＣｌ２である。六量体形態と八量体形態を２７のカラム体積で、０．０２−１．０Ｍ
ＫＣｌ勾配を用いて分離した。六量体型と八量体型を含む画分を貯留し、最終濃度〜１ｍｇ／ｍＬになるまで濃縮した。濃縮したプールを３時間、ｐＨ７．０で、３００ｍＬの２ｍＭ  ＢＴＰ−ＨＣｌ緩衝液で透析して、Ｍｏｎｏ−Ｑ緩衝液からリン酸塩を除去した。試料に対し、１：２０（ｗ／ｗ）のトリプシン：タンパク質比を用いて一晩トリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ、修飾配列決定等級）消化を行った。トリプシンペプチド混合液を、上面にシアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸基材のある金製プレート上で点滴分析した。Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＶ  Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ  マススペクトロメーター（Ｂｒｕ
ｋｅｒ  Ｉｎｃ．）を使用して、マススペクトルデータを収集した。
【０１７０】
（ＷＴ＋Ｆ１２Ｌ）異量体オリゴマーの相互変換と再平衡化を平衡透析によってモニターした。異量体Ｐｏｏｌ  ＩとＰｏｏｌ  ＩＩを用いて、平衡透析を使用し、図２４に示されている反応に準じて、八量体と六量体との間の再平衡化を基材が促進しうることを物理的に実証した。Ｐｏｏｌ  ＩとＰｏｏｌ  ＩＩからなるタンパク質を基材ＡＬＡの存在下および非存在下で、３７℃で別々に透析し、透析時間の関数として、未処理ゲル電気泳動により四次構造をプローブした。透析液で生成物の形成をモニターしたところ、透析手順全体を通じて触媒作用が進んでいることが示唆された（図２５Ａ）。電気泳動の結果（図２５Ｂ）は、透析を基材の非存在下で実施したときには、少なくとも４６時間オリゴマー構造が安定していたことそ示す。しかし、基材の存在が四次構造アイソフォームの動的再平衡化を生じさせ、すべての事例で（ｐＨ７．０およびｐＨ９．０におけるＰｏｏｌ  ＩとＰｏｏｌ  ＩＩ）八量体の蓄積に有利に働く。これらのｐＨ値は、それぞれ八量体と六量体の活性にとって最適なｐＨに一致している［３９］。濃度計を使用して、データを指数関数に適合させて、ｐＨ７およびｐＨ９でＰｏｏｌ  Ｉに関して、ｐＨ９でＰｏｏｌ
ＩＩに関して再平衡化反応の速度と範囲を見積もり、それぞれ０．５４ｈ-1（Ｐｏｏｌ
Ｉ、ｐＨ７）、０．４ｈ-1（Ｐｏｏｌ  Ｉ、ｐＨ９）および１．８ｈ-1（Ｐｏｏｌ  ＩＩ、ｐＨ７）の速度定数に適合させた。Ｐｏｏｌ  Ｉの八量体への変換の速度と範囲の値は、ｐＨ９の場合よりもｐＨ７の場合のほうが大きく、ＰＢＧＳ四次構造アイソフォーム間における平衡状態に対するｐＨ依存性が存在していることを示唆している。これは、速度論的証拠が、ｐＨ９における八量体と六量体双方による触媒作用とｐＨ７における八量体単独の触媒作用を示す、野生型ヒトＰＢＧＳ（八量体）と一致している［３９］。
【０１７１】
四次アイソフォームの基材誘発性相互変換後の、Ｐｏｏｌ  ＩおよびＰｏｏｌ  ＩＩオリゴマーの分析
ＷＴ＋Ｆ１２Ｌの新鮮な調製済み異種オリゴマーを用いて、Ｐｏｏｌ  ＩとＰｏｏｌ  ＩＩタンパク質をクロマトグラフィーにより分離した後に、１０ｍＭ  ＡＬＡの存在下、ｐＨ７で、２４時間透析した。透析後に、再平衡化した異種オリゴマーをＭｏｎｏ−Ｑカラム上でクロマトグラフィーによって六量体と八量体の各成分に再度分離した。分離したタンパク質で、比活性とＰｈｅ１２およびＬｅｕ１２の含有量について特徴づけを行った。六量体と八量体の比活性は、非常に異なっており、六量体はｐＨ９で最適活性を示し、八量体はｐＨ７で最適活性を示した（表４）［３９］。これらのタンパク質の未処理ゲルは、透析前、Ｍｏｎｏ−Ｑクロマトグラフィー後の試料中の八量体と六量体の相対的分布を示している（図２６Ａ）。クロマトグラフィーによる分離後のタンパク質をＰｏｏｌ  Ｉ六量体、Ｐｏｏｌ  Ｉ八量体、Ｐｏｏｌ  ＩＩ六量体、Ｐｏｏｌ  ＩＩ八量体と名づけ、以下に説明する。Ｍｏｎｏ−Ｑカラムで最初に溶出するまでのピークは、六量体であるＦ１２Ｌ突然変異型と同等に流動した。六量体構造を未処理ゲル電気泳動およびｐＨ７とｐＨ９における比活性によって立証した（図２６Ａと表４）。溶出までの第二ピークは、八量体であるＷＴヒトＰＢＧＳと同等に流動した。八量体構造は、未処理ゲル電気泳動と、ｐＨ７およびｐＨ９における比活性によって立証した（図２６Ａと表４）。ヒトＰＢＧＳ六量体および八量体の文書化された特性と一致して［３９］、Ｐｏｏｌ  Ｉ六量体とＰｏｏｌ  ＩＩ六量体は、ｐＨ７では活性が非常に低く、ｐＨ９ではかなりの活性が認められた。Ｐｏｏｌ  Ｉ八量体とＰｏｏｌ  ＩＩ八量体はともに、ｐＨ９よりもｐＨ７でかなり高い活性を示した。
【０１７２】
異種オリゴマーＷＴ＋Ｆ１２Ｌプールが不均化し、八量体にＰｈｅ１２が、六量体にＬｅｕ１２がそれぞれ蓄積するという仮説に対応するため、異量体ＰＢＧＳオリゴマーのＰｈｅ１２とＬｅｕ１２の含有量を、透析前とＭｏｎｏ−Ｑクロマトグラフィー後に定量した。タンパク質をトリプシン消化させ、Ｎ末端ペプチドをレーザー脱離マススペクトロスコピーによって分析した。先行の研究では、この技法が、これら２種類の非常に類似した
ペプチドに関する定量的Ｎ末端配列決定によって取得した結果と同等の定量的結果をもたらすということを立証している［３９］。Ｎ末端トリプシンペプチドの質量は、Ｐｈｅ１２含有ペプチドで２０１０．２ダルトン、Ｌｅｕ１２含有ペプチドで１９７６．２ダルトンである（図２６Ｂ）。Ｐｏｏｌ  ＩとＰｏｏｌ  ＩＩ双方には異量体種が含まれていることが、データによって確認されている。ＡＬＡで透析したときには、３２：６８のＰｈｅ：Ｌｅｕ比で、最初は異種六量体であったＰｏｏｌ  Ｉタンパク質が、それぞれ１３：８６および５１：４９の比のＰｏｏｌ  Ｉ  六量体とＰｏｏｌ  Ｉ  八量体を産生している。このことは、Ｌｅｕ含有種の六量体への動的不均化、Ｐｈｅ含有種の八量体への動的不均化を実証している。Ｐｈｅ：Ｌｅｕ比における劇的変化は、最初６７：３２であったＰｏｏｌ  Ｉタンパク質をＡＬＡで透析したときにも観察される。未処理ゲル上では、Ｐｏｏｌ  ＩＩが大きな八量体バンドと軽微な六量体バンドを示す（図２６Ａ）。ＡＬＡ存在下での２４時間の透析後に、Ｐｏｏｌ  ＩＩ  八量体がＰｈｅで豊富になり（８１：１９のＰｈｅ：Ｌｅｕ比）、少量の残留六量体がＬｅｕｄｅ豊富になった（１４：８６のＰｈｅ：Ｌｅｕ比）。マススペクトルデータが、代謝回転条件下では、異量体ＰＢＧＳアイソフォームの不均化を明白に確証している。マススペクトルデータからは、位置１２にフェニルアラニンを有するヒトＰＢＧＳが抱合二量体から会合する八量体を選好し、位置１２にロイシンを有するタンパク質が分離二量体から会合する六量体を選好することも確認した。図２４に示されている動的構造相互変換が、成分単量体に二量体が解離することによってさらに複雑化するか否かは不明である。このような二量体の再平衡化の結果、Ｐｈｅ＋Ｌｅｕ二量体集団のＰｈｅ＋ＰｈｅおよびＬｅｕ＋Ｌｅｕ二量体への不均化が生じる可能性がある。
【０１７３】
ＷＴ＋Ｆ１２Ｌ異種オリゴマーＰＢＧＳ四次構造アイソフォームの動的相互変換が、ｐＨ７における活性の増大によって実現することが観察されている。ＰＢＧＳに関する先行の速度論的研究が、基材濃度に対する活性の依存性が、単純な双曲型Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｏｎ関係に従ってはいないことを実証している（表１および３）。速度論パラメータが異なる２種類の酵素が同じ反応を触媒するモデルに適用可能な、二重双曲型方程式を用いると、速度論的データが最適に適合する［８１］。基材誘発性構造相互変換（図２５Ａ−２５Ｃおよび２６Ａ−２６Ｃ）並びに発生した比活性における変化（表４）が、異量体ＷＴ＋Ｆ１２Ｌプールが試験条件下で構造の再配列を経たことを示唆している。基材誘発性相互変換は、六量体を基準としてｐＨ７では活性を高める八量体に有利に働くので、経時的生成物形成は、時間の経過に伴って速度の上昇を示すはずである。このような変化は、八量体と六量体との間の活性の差異が最大になるｐＨ７におけるＰｏｏｌ  Ｉ（ＷＴ＋Ｆ１２Ｌの系統発生的に発現した異種六量体）で最も劇的であると提唱されている。予測したとおり、ＷＴ＋Ｆ１２Ｌ  Ｐｏｏｌ  Ｉ  タンパク質の比活性が時間の経過に伴って増大している（図２７Ａ）。速度定数（１．０５ｈ-1）は、指数関数的レート方程式に対するデータの適合に基づいており、平衡透析実験から判定された速度（０．５４ｈ-1）の約２倍もの早さであり、基材と生成物が透析膜を通過するのに必要な時間によって生じる予想される遅れと定性的に一致している。類似した挙動が、速度定数が７．９ｈ-1であるＷＴ＋Ｆ１２Ｌ  Ｐｏｏｌ  ＩＩ  で観察された（図２７Ｂ）。
【０１７４】
六量体と八量体との間の構造上の相互変換はタンパク質の活性に影響を与えるだけでなく、タンパク質の平均分子量も変える。動的光分散法を用いて、基材存在下におけるＰｏｏｌ  ＩとＰｏｏｌ  ＩＩの構造上の再配置中の分子量の変化をモニターした（図２７Ａ−２７Ｂ）。光分散データにより、経時的活性試験からの速度定数（ｐＨ７でＰｏｏｌ  Ｉの場合１．０ｈ-1、Ｐｏｏｌ  ＩＩの場合５．０ｈ-1）と同等の速度定数が得られたため、活性の増大は、基材存在下で六量体が八量体に相互変換したことによるという結論が裏付けられた。
【０１７５】
光分散法を、四次構造アイソフォームの平衡化をモニターするための方法として使用し
た。精製モニタリング［８３］、凝集［８４］、会合［８５］、構造の安定性［８６］および結晶の成長［８７］など、タンパク質の特徴づけのための強力なツールとして光分散法を使用した。同量体タンパク質の四次構造アイソフォームの動的相互変換による分子量の変化をモニターするのに、光分散法方を用いたのは、本研究が初めてであった。この実証作業は、場合によっては、他の分光法ではモニターすることが非常に難しいタンパク質構造の変化に関する速度論の調査に対する可能性を開くものである。
【０１７６】
ＰＢＧＳ四次アイソフォームの動的相互変換および生じる不均化から、四次構造の平衡についてのモルフィンの概念が導入されている。モルフィンの概念は、八量体型と六量体型のＰＢＧＳなど、機能的特性が異なるタンパク質の別の四次構造を解説している。オリゴマーの多様性、構造および機能における差異は、単量体における劇的な立体構造の変化に由来するものである。異量体ヒトＰＢＧＳモルフィン間の相互変換と不均化は、本明細書で実証したように、図２５に示されている反応を立証している。
【０１７７】
【表４】
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実施例４
この実施例では、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳおよびＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＰＢＧＳの六量体モルフィンのモデルを構築する方法について解説する。
【０１７８】
六量体Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  （または、他のいずれかの）ＰＢＧＳのモデルに基づく既存の唯一の結晶構造は、六量体ヒトＰＢＧＳ臨床変異型Ｆ１２Ｌ、ＰＤＢコード１ＰＶ８の結晶構造である［３９］。残念ながら、Ｆ１２Ｌの結晶構造は、相同モデルの構築のための唯一の基礎としてのその使用を制限している、かなりの無秩序を呈している。しかし、ヒトＰＢＧＳ八量体構造と六量体構造（ＰＤＢコード１Ｅ５１および１ＰＶ８）の比較から、ＴＩＭ様αβバレルドメインを有するアミノ酸に関してはほぼ同一性を示している。八量体と六量体との間における差異は、２４Ｎ末端アミノ酸と無秩序領域に存在している［３９］。したがって、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＰＢＧＳのαβバレルドメインを構築する相同モデルに、ＰＢＧＳ八量体の質の高い結晶構造を使用できる。選択された構造は、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳの高度に秩序だった高分解能結晶構造で、５６％の配列がＲ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＰＢＧＳに一致している、ＰＤＢコード１ＧＺＧである［４０］。モデル構築手順は、２工程プロセスである。第一の工程では、六量体型Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳのモデルを構築する。第二の工程では、その六量体を使用して、Ｒ．ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ  ＰＢＧＳ六量体を構築する。
【０１７９】
Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳ六量体の調製には、Ｓｗｉｓｓ−ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ  プログラム［８８］と他の社内プログラムの各種能力を利用した。第一に、Ｎ末端アーム（アミノ酸数＜３２）を１ＧＺＧ二量体に関する構造ファイルから除去した。得られたαβバレルドメインは、六量体１ＰＶ８の３個の二量体上にうまく重なり合い、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳαβバレルの六量体会合を作り出す。ヒトＰＢＧＳとＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳとの間には顕著な配列同一性は認められなかったので、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳ六量体の外側に突出したアームを構築しようと試みたときに、アラインメントのあいまいさが存在する。しかし、ヒト八量体と六量体の
双方に、αらせんセグメントであるアームの領域が存在している。したがって、ヒトＰＢＧＳとＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳの八量体型の構造アラインメントを用いて、このαらせんセグメントにとって適切な配列アラインメントを判定した。この情報を利用して、ヒトＰＢＧＳの六量体におけるこのらせんの位置に従い、六量体中のＰ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳのアミノ酸２２−２９を空間的に位置付けした。Ｌｏｏｐｙプログラム［９０］とＳＣＷＲＬプログラム［９１］の機能を結合した、ＦＣＣＣ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙで開発された、グラフィカルユーザー環境［８９］でループと側鎖の予測を行った。この環境内で、Ｌｏｏｐｙプログラム［９０］を用いて、Ｎ末端αらせんを各サブユニットのαβバレルドメインに接続させるように、アミノ酸２９−３２のバックボーンをモデル化した。六量体ヒトＰＢＧＳの対応するアミノ酸に関するφ、ψおよびω角度情報を使用したＳｗｉｓｓ−ＰＤＢビュワーソフトウェア内で、ほとんどのＮ末端アミノ酸を構造体に構築した。最後に、ＳＣＷＲＬプログラム［９１］を用いて、Ｎ末端アームセグメントの側鎖を位置づけして、えんどう豆やＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ  ＰＢＧＳの八量体型に関して以前に実施した、他のＰＢＧＳの六量体モデルの作成に後に使用できる、六量体Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＢＧＳのモデルを生成した［１３、１６］。六量体Ｒ．ｃａｐｕｌａｔｕｓ  ＰＢＧＳのモデルを、社内で開発した同じ統合グラフィカル環境を用いて構築した。このソフトウェアは、挿入および欠失に対処するため、配列アラインメント、スレッディング、ループモデルの構築、さらにはすでに公表されているモデルに使用されている方法と類似した側鎖最適化を結合している［１３、１６］。
実施例５
ロスマリン酸を用いた実験データ
ロスマリン酸（ベンゼンプロパン酸、α［［（２Ｅ）−３−（３，４−デヒドロキシフェニル）−１−オキソ−２プロペニル］オキシ］−３，４−ジヒドロキシ−，（αＲ）−（９Ｃｌ））を用いた阻害データは、八量体より小さいえんどう豆ＰＢＧＳの四次型にロスマリン酸が優先的に結合する、ｓｌｏｗ−ｔｉｇｈｔ  結合阻害モデルと一致している。図２２Ａの白抜きの記号は、３．５μｇ／ｍｌＰＢＧＳで最大活性の半分を示すえんどう豆ＰＢＧＳの比活性のタンパク質濃度依存性を表している。つまり、３．５μｇ／ｍｌ（試験条件未満）では、四次アイソフォーム（モルフィン）の平衡状態には、約５０％八量体と約５０％の活性の低い小さなアイソフォーム（例えば六量体）が含まれている。阻害剤がこれらの小さい形態に対する優先的結合を介して作用したなら、モルフィン平衡状態にこれらの小さい形態が含まれる条件下では、さらに顕著な阻害作用が期待できよう。要するに、阻害剤は、図２２Ａ（以下を参照）にロスマリン酸に関して示されている、より高いタンパク質濃度へタンパク質濃度依存性をシフトさせることが予想される。図２２Ｂと２２Ｃは、タンパク質濃度依存性におけるこのようなシフトを最適に実証する方法を決定するために実施した実験を示している。図２２Ｂは、阻害剤が、基材の添加前に、タンパク質で作用できるように、３０分間与えられたときには、ロスマリン酸のＩＣ５０は、〜６３μＭであることを示唆するえんどう豆ＰＢＧＳに関する用量反応曲線を表している。予備インキュベーション時間に対する阻害作用の依存性は示されていないが、ここでは予備インキュベーション時間を長くするとロスマリン酸のいずれか１つの濃度による阻害作用が増大し、ロスマリン酸が低速結合阻害剤として作用することを示している。図２２Ｃは、阻害作用が発生すると、タンパク質は３０分間の試験時間内には回復しないことを示す。図２２Ａ，２２Ｂおよび２２Ｃで得られたデータを使用して、下記のようにえんどう豆ＰＢＧＳのタンパク質濃度依存性に対するロスマリン酸の効果を実証するのに必要な適切な条件を選定した。図２２Ａの閉じた円は、３０μＭロスマリン酸で３０分間処置した後の、えんどう豆ＰＢＧＳの比活性のタンパク質濃度依存性を示しているが、１３．５μｇ／ｍｌのＰＢＧＳで、最適活性の半分が得られた。このように、ロスマリン酸によるこのような処置の後に、四次型の平衡状態が、３．５μＭから１３．５μＭにシフトした。このような条件下で、１３．５μｇ／ｍｌのＰＢＧＳを用いて、５０％の八量体で平衡状態を得た。これは、図１３にボールによって模式的に示されているように、ＰＢＧＳ
の小さな活性の低い型をロスマリン酸が安定化させるという解釈と一致している。図２３Ａ−２３Ｂ（以下に詳述する）は、未処理ゲル電気泳動データによるこの結論を裏付けている。
【０１８０】
図２３Ａは、えんどう豆ＰＢＧＳ（変異型Ｃ３２６Ａ）の六量体−八量体平衡状態に対するマグネシウムとＡＬＡの効果を示している［１３］。レーン１−精製されたえんどう豆ＰＢＧＳが八量体／六量体の混合体として流動している。レーン２−六量体えんどう豆ＰＢＧＳは、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０ｍＭ  ＢＴＰによる透析によって（レーン１から）調製可能である。このことは、マグネシウムが八量体を安定化させることを示唆している。レーン３−レーン２から六量体えんどう豆ＰＢＧＳを１０ｍＭのＭｇＣｌ２でインキュベートした。八量体を安定化させる特異的アロステリック活性剤であるとして提唱されているマグネシウムは、実際にこの役割を十分に果たした。レーン４−レーン２からの六量体えんどう豆ＰＢＧＳを１ｍＭのＡＬＡでインキュベートしたが、レーン２と異なる流動特性は示さなかった。これは、六量体型がＡＬＡとあまり結合しないことを示す、ヒトタンパク質に関するデータと一致している。レーン５−１０ｍＭのＭｇＣｌ２および１ｍＭのＡＬＡの双方で六量体をインキュベートした。タンパク質が活性であり、平衡状態が八量体方向へ引き寄せられうる条件下では、六量体の八量体への劇的変換が観察されるであろう。他のすべてのインキュベーションと同様に、この場合、３７℃で５分間インキュベートした。
【０１８１】
図２３Ｂは、ＡＬＡおよびマグネシウムの存在下で、八量体への変換に対して、ロスマリン酸が六量体えんどう豆ＰＢＧＳを安定化させることを示している。図２３Ｂは、レーン１−精製済み、レーン２−透析により六量体生成、レーン３−３７℃で３０分間六量体えんどう豆ＰＢＧＳ（レーン２から）を予備インキュベートした後に、１ｍＭのＡＬＡおよび１ｍＭのＭｇＣｌ２で５分間インキュベート、という条件下でえんどう豆ＰＢＧＳ（Ｃ３２６Ａ）を用いて取得したものである。ここでも、これは、レーン３同様レーン４−７で、ただし１２．５μＭ、１２５μＭ、１．２５ｍＭ，１２．５ｍＭのロスマリン酸で、予備インキュベーション混合液にロスマリン酸を添加した状態で、基材とマグネシウムがどのようにして六量体を八量体に変換させるかを実証している。
【０１８２】
本発明者のモデリングの結果に基づいて、このビフェニル化合物（ロスマリン酸）とえんどう豆ＰＢＧＳの六量体の「アーム−ピット」との相互作用は主として、タンパク質サブユニットＡ、ＢおよびＥとロスマリン酸の極性部分との間の水素結合によるものである。タンパク質には、４．０オングストローム内でのロスマリン酸のさらなる水素結合能力が備わっている。したがって、ロスマリン酸分子に更なる水素結合能力を与えることにより、結合作用が改良されるロスマリン酸の誘導体を作成できる。例えば、どちらかのフェにール部分の位置５でヒドロキシ基を付加し、タンパク質に対する水素結合作用を改良することができる。タンパク質とのさらなる疎水性相互作用は、分子のプロパン酸部分の位置２でフェニール基またはベンジル基を置換すると、実現される。
本発明については、その固有の実施例を参照しながら詳細に説明してきたが、その精神と範囲から逸脱することなく各種変更および修正を行えることは、当業者にとって明らかであろう。
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【図面の簡単な説明】
【０１８３】
【図１】（先行技術）タンパク質機能のアロステリック制御のための旧来のモデルである。アロステリックの平衡状態（オン状態とオフ状態）が図解されている。アロステリック制御因子（グラニットフィッシュの形状）は、正方形の四量体に結合し、その方向に平衡状態を引き寄せることができる。オリゴマーの解離は、平衡プロセスの必須部分ではない。この旧来のモデルは、アロステリックタンパク質の四次会合体の化学量論がオン状態とオフ状態との間で定常的であるという想定に基づいている。この図では、いずれもが四量体である。
【図２】（先行技術）リボンの表示を用いて、八量体ヒトＰＢＧＳ（ＰＤＢコード１ｅ５１）の会合体を示している。左側には、抱合二量体がある。中央には、四量体（抱合二量体と同じ向き）があり、その右側には、八量体の平面図が表わされている。二量体ごとに、１個の単量体が薄い灰色で示され、それ以外の多量体が暗い灰色で示されている。
【図３Ａ】（先行技術）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳの１個の二量体の立体図を表しており、タンパク質サブユニットは、リボンの形状の黒色および薄い灰色として示されている。活性部位亜鉛イオンは、灰色の球形で示されており、アロステリックマグネシウムイオンは、黒い球形として示されている。活性部位リガンドは、図示されていない。
【図３Ｂ】（先行技術）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳの活性部位亜鉛の詳細構造の立体図を表している。システインリガンドには標識が付けられ、システインスルファ原子は白いボール状で示されている。水には標識が付けられている。活性部位リガンド４，７−ＤＯＳＡは、灰色で示されており、酸素原子はボール状で示されている。
【図３Ｃ】（先行技術）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳの結合部位アロステリックマグネシウムの詳細構造の立体図を表している。白いボールは、隣接した残基のマグネシウム原子、酸素原子および窒素原子間における延長した結合ネットワークを形成している水分子を示している。このネットワーク内に取り込まれているアミノ酸は、棒の形状で表されており、炭素は図３Ａの鎖に従って明るい色または暗い色に着色されている。結合ネットワーク内に取り込まれている酸素原子または窒素原子は明暗のある陰影付きで示されている。標識アミノ酸Ｅ２３１は、マグネシウムの第一の配位圏内の唯一のアミノ酸である。Ｒ１１は、図３Ａに示されている抱合二量体の隣接サブユニットのＮ末端アームに由来する。
【図４】活性部位亜鉛（左端の暗い灰色領域）の存在および活性部位Ｚｎの欠失（左四角の白い領域）、アロステリックマグネシウム（Ｍｇ）の存在（中央四角のチェッカー表示領域）、アロステリックＭｇの欠失（中央の四角の白い領域）に関する個別の分離基準に従ったＰＢＧＳの図式による分類を表している。得られたマトリックス（いちばん右）は、北西象限（ＱＮＷ）が＋Ｚｎ／−Ｍｇを表し、北東象限（ＱＮＥ）が−Ｚｎ／−Ｍｇを表し、南西象限（ＱＳＷ）が＋Ｚｎ／＋Ｍｇを表し、南東象限（ＱＳＥ）が−Ｚｎ／＋Ｍｇを表す、四象限で構成されている。
【図５】（先行技術）（参考［１３］から直接抽出）Ｐ．ｓａｔｉｖｕｍ（白い丸の一般的な植物えんどう豆）に由来するＰＢＧＳおよびＢ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ  ＰＢＧＳ（黒丸）のタンパク質濃度依存性に関する統合データを表している。実線は、データに対する単純な双曲型適合を表している。他の線は、八量体が四量体および二量体に解離するデータの好評されている解釈に従った各種オリゴマーのモル濃度を表している。このモデルは、二量体（点線）が不活性で、四量体の非対称ユニットの半分（破線）が活性で、八量体の非対称ユニットのすべて（鎖線）が活性であるという想定の下に作成されている。
【図６】タンパク質オリゴマーの平衡会合体に関するモルフィン概念の二次元模式表示である。タンパク質単量体の各種立体構造が異なるかたちで（標識ａ−ｄ）で表されている。各形状は、破線で示された１つの面と太線で示された１つの面を備えている。オリゴマー会合体に関しては、任意の２個の単量体間における接合規則により、太線を破線に関連付けて示されている。単量体の４つの可能な代替立体構造が示されており、これら立体構造のそれぞれが、異なる四次構造を表している。立体構造（ａ）は、２次元における接合の規則を幾何学図形上満たすことができないので、オリゴマー化することができない。立体構造（ｂ）は、ニ量体を形成し、その後でオリゴマー化が完了することによって接合の規則を完全に満たすことができる。立体構造（ｃ）は、三量体を形成することによって接合の規則を完全に満たすことができる。立体構造（ｄ）は、四量体を形成することによって接合の規則を完全に満たすことができる。このフレームワーク内では、タンパク質の二量体化には、三種間における平衡状態が必要となる。これらは、二量体を形成することのできない単量体立体構造（ａ）、二量体を形成しうる単量体立体構造（ｂ）、および二量体（ｂ）である。
【図７】モルフィンの平衡状態としてアロステリック制御の別の表示を表している。このＭＯＲＰＨＥＥＩＮ  ＭＯＤＥＬ  ＯＦ  ＡＬＬＯＳＴＥＲＩＣ  ＲＥＧＵＬＡＴＩＯＮの決定的特長は、１）単量体の構造がオリゴマーの別の化学量（丸い三量体、正方形の四量体）を表しており、さらに、２）基本ユニットの必須の解離と再会合が存在しているという点が挙げられる。グラニット物質は、楔としての役割を果たし、単量体型の相互変換を阻害することによって正方形の形状へと平衡状態を引き寄せる役割を担うアロステリック制御因子を表している。モルフィン表示では、オリゴマー状態における変化は、単純な会合／解離現象よりも複雑である。モルフィン平衡状態には、（少なくとも部分的に解離した）単量体ユニットの立体構造における劇的変化が必要である。モルフィンの概念は、図１に例示されているものとは基本的に異なるアロステリック制御に関する新規な構造パラダイムを提供している。
【図８】アロステリック制御因子（作用物質）に関与するユニットとオリゴマーとの間の平衡状態の二次元模式表示を表している。アロステリック制御因子は、ユニットまたは多量体タンパク質のいずれかに結合した灰色の形状として表されている。アロステリック制御因子は、オリゴマー状態間における平衡状態を摂動することができる。本図は、図６に図示されている平衡状態をシフトさせる楔を例示している。
【図９】六量体ヒトＰＢＧＳ変異型Ｆ１２Ｌ（ＰＤＢコード１ＰＶ８）の会合体を表している。左側には分離した二量体があり、中央には四量体（分離した二量体と同じ方位）、さらに右側には六量体の平面図がある。二量体ごとに、１つの単量体が明るい灰色で示され、それ以外は暗い灰色で示されている。図９と図２を比較すると、八量体ヒトＰＢＧＳと六量体ヒトＰＢＧＳの会合体の違いが表されている。
【図１０】タンパク質の機能に影響を与えることのできる作用物質が、１つの型であって別の型ではないユニット上に結合部位を備えていることを実証しているタンパク質の２個のアイソフォーム間における平衡状態の二次元模式表示である。いずれの場合も、多量体化に関する規則では、１本の太線が１本の破線に並列する。
【図１１】（左から右へ）六量体、分離二量体、抱合二量体および八量体を表している、ＰＢＧＳモルフィンの平衡状態を図解するための空間充填表示を用いている。図の下側の部分には、アーム−バレル側面の界面を安定化させることによって、抱合二量体を構成するモルフィンをマグネシウムが安定化させる方法を表している。
【図１２】ヒトＰＢＧＳ  ＷＴ（白い四角）とＦ１２Ｌ（白いダイヤモンド型）との間の機能的相違を、それらのｐＨ活性プロフィールの点から示している。
【図１３】本発明の（円によって表された）阻害剤が、二量体ＰＢＧＳまたは六量体ＰＢＧＳの１つまたはそれ以上のドメインに結合して、八量体の形成を阻害し、結合型を安定化させ、平衡状態をシフトさせている、本発明の阻害プロセスの１つの実施形態を模式的に表している。この例では、阻害剤は、抱合二量体／六量体型のアーム−ピット（穴）に結合している円である。
【図１４】ＰＢＧＳの金属結合特性の分布が図４に従ってコード化されている、細菌類、古菌類および真核生物をはじめとするＰＢＧＳの由来源の分類である。各種由来源から得られたＰＢＧＳに対する発明者の経験から、背景が白（チェッカー模様であるものまたはそうでないもの）の有機体は、モルフィン型間で急速に平衡化し、本発明の阻害剤に感受しうることが期待される。
【図１５Ａ】ＧｅｎＢａｎｋおよび２００２年４月現在利用可能な他のウェブ検索可能ゲノムから得られた、真核生物および古細菌のＰＢＧＳ配列の活性部位金属結合残基の配列を表している。
【図１５Ｂ】ＧｅｎＢａｎｋおよび２００２年４月現在利用可能な他のウェブ検索可能ゲノムから取得したＥｕｂａｃｔｅｒｉａのＰＢＧＳ配列の活性部位金属結合残基の配列を表している。
【図１５Ｃ】ＧｅｎＢａｎｋおよび２００２年４月現在利用可能な他のウェブ検索可能ゲノムから取得したＥｕｂａｃｔｅｒｉａのＰＢＧＳ配列の活性部位金属結合残基の配列を表している。
【図１６Ａ】塩勾配（破線）を用いたＭｏｎｏ−Ｑカラムでの野生型ヒト（ＷＴ）ＰＢＧＳおよびＦ１２Ｌのクロマトグラフィー分離を表している。
【図１６Ｂ】１２．５％のポリアクリルアミド未加工ゲル電気泳動上の野生型（ＷＴ）ヒトＰＢＧＳおよびＦ１２Ｌの分別移動性を表している。
【図１７Ａ】Ｑ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（ＫＣｌ勾配（−  −  −）、Ａ２８０（−））における異種発現ＷＴ＋Ｆ１２Ｌ（いずれの遺伝子も同じｍＲＮＡ上）の２つのピークのクロマトグラフィー分離を示している。Ｐｏｏｌ  Ｉには異種六量体が含まれ、Ｐｏｏｌ  ＩＩには異種八量体が含まれている。
【図１７Ｂ】未処理ゲル電気泳動上の野生型（ＷＴ）ヒトＰＢＧＳおよびＦ１２Ｌを基準とした、２つのＷＴ＋Ｆ１２Ｌプールの分別移動性を示している。
【図１７Ｃ】Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ３００上のさらに精製した後の、（図１７に準じた）ＷＴ＋Ｆ１２ＬのＰｏｏｌ  Ｉ（●）とＰｏｏｌ  ＩＩ（■）のｐＨ速度プロフィールを表している。
【図１７Ｄ】ｐＨ７（黒）およびｐＨ９（白）におけるＳ３００精製Ｐｏｏｌ  Ｉ（丸）およびＰｏｏｌ  ＩＩ（三角）のＫmおよびＶmax値を決定するためのＡＬＡ（１０μＭ−１０ｍＭ）の活性対濃度のプロットを表している。実線は、二重双曲型方程式（モルフィン混合による触媒を表す）に対するデータの最適適合を表している。それぞれが適合度の低い破線は、単一双曲型方程式に対しデータを適合させた結果を示している。
【図１８Ａ】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳの抱合二量体の結晶構造のリボン型図表示を表している。矢印は、アロステリックマグネシウムの配置を表している。
【図１８Ｂ】六量体（右側）を基準としたヒトＰＢＧＳ八量体（左側）のサブユニットの界面を表している。第一の二量体は、空間を充填して（灰色と黒）表され、残りのサブユニットは鎖表示で表されている。黒で縁取られた白い矢印は、図１８Ａのアロステリックマグネシウムと比較した配置を表している。この結合部位は八量体に存在し、六量体には存在しない。
【図１９Ａ】精製Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳのＳＤＳゲルを表している。
【図１９Ｂ】Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳ（１２．５％のアクリルアミド）の未処理ゲルを表している。未処置タンパク質は、いちばん左側のレーンに示されている。バンドには、（上から下に）八量体、六量体、四量体および二量体と一貫した移動性が認められる。以下のレーンは、マグネシウムキレーターＥＤＴＡ、マグネシウム、ＡＬＡまたはマグネシウムプラスＡＬＡの添加により、未処理ゲル環境におけるＥ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳモルフィンの平衡状態がシフトされうることを示している。ＥＤＴＡによるマグネシウムの除去は二量体に有意に働く。過剰なマグネシウムまたは基材ＡＬＡあるいはその両方を添加すると、八量体の形成に有意に働く。いちばん右のレーンは、１本のバンドとして類似のヒトＰＢＧＳが表される、ウシＰＢＧＳを表している。ウシＰＢＧＳの八量体には、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＰＢＧＳの八量体とは異なる電荷があるため、ゲル上で異なる移動性を呈する。
【図２０Ａ】抱合二量体型に暗い陰影を用い、分離二量体型に明るい陰影を用いた、えんどう豆ＰＢＧＳモルフィンの平衡状態を表す模式図である。この図はえんどう豆ＰＢＧＳのモデルを採用している。
【図２０Ｂ】えんどう豆ＰＢＧＳのタンパク質濃度依存度を表しており、分離二量体型に低活性が対応し、抱合二量体型に高活性が対応するという解釈に従って、データ点に着色してある（図２０Ａに準じて）。
【図２０Ｃ】八量体えんどう豆ＰＢＧＳと六量体えんどう豆ＰＢＧＳの平衡状態に対するＥＤＴＡの効果を表す未処理ゲルを示している。図２０Ａに準じたＥＤＴＡによるマグネシウムの除去により、抱合二量体型を不安定化させている。
【図２１】えんどう豆ＰＢＧＳの六量体モルフィンのモデルの３個のサブユニットを表している。ロスマリン酸は、推定薬剤（本発明の一例）の結合部位に結合された状態で示されている。
【図２２Ａ】えんどう豆ＰＢＧＳのタンパク質濃度依存性に対するロスマリン酸の効果を表している。
【図２２Ｂ】えんどう豆ＰＢＧＳに作用するロスマリン酸の用量反応曲線を表している。
【図２２Ｃ】ロスマリン酸による処置後の、酵素触媒反応速度が線形であることを示している。
【図２３Ａ】１２．５％のアクリルアミド未処理ゲル電気泳動によって分析した、えんどう豆ＰＢＧＳのモルフィン平衡状態に対する各種処置の分別効果を示している。タンパク質は、野生型タンパク質のすべての特徴を備えた、えんどう豆ＰＢＧＳ変異型Ｃ３２６Ａである。レーン１−精製済み；レーン２−低塩（１０ｍＭ  ＢＴＰ）のＥＤＴＡで透析し六量体を精製、レーン３−六量体から八量体を形成するのに役立つ１０ｍＭマグネシウムで処置した六量体えんどう豆ＰＢＧＳ（レーン２と同じ）、レーン４−六量体から八量体を再生しないＡＬＡ単独で処置した六量体えんどう豆ＰＢＧＳ、レーン５−八量体に向けて平衡状態をシフトさせる際に単独マグネシウムよりも効果を示す１０ｍＭマグネシウムおよび１ｍＭ  ＡＬＡで処置した六量体えんどう豆ＰＢＧＳ。
【図２３Ｂ】六量体から八量体への変換でえんどう豆ＰＢＧＳ  Ｃ３２６Ａの六量体をロスマリン酸が安定化させることを示している。レーン１−精製済み；レーン２−低塩（１０ｍＭ  ＢＴＰ）のＥＤＴＡで透析し六量体を精製、レーン３−六量体から八量体に向けて平衡状態をシフトさせるため、１ｍＭ  ＡＬＡおよび１ｍＭ  ＭｇＣｌ２で３０分間、さらに５分間３７℃で予備インキュベートした六量体えんどう豆ＰＢＧＳ（レーン２と同じ）。レーン４−７は、レーン３と同様であるが、１２．５μＭ、１２５μＭ、１．２５ｍＭおよび１２．５ｍＭのロスマリン酸で予備インキュベーション混合液にロスマリン酸を添加した。ロスマリン酸濃度の増加がマグネシウムおよびＡＬＡによる八量体への六量体の変換を抑止することが示されている。
【図２４】ヒトＰＢＧＳ八量体および六量体の相互変換を表している。ヒトＰＢＧＳ六量体と八量体の相互変換および不均化が、成分二量体へのオリゴマーの解離、二量体型の相互変換およびオリゴマーの再会合を通過させることが提唱されている。図２５−２７に示されている不均化反応によって、この反応が発生することが実証されている。
【図２５Ａ】図２５Ａ−２５Ｃは平衡状態透析中の異量体ＷＴ＋Ｆ１２ＬヒトＰＢＧＳの動的相互変換を表している。図２５ＡはＡＬＡを含有する緩衝液に対するＰｏｏｌ  ＩおよびＩＩ（図１７Ａに準じる）の均衡状態透析中のポルフォビリノーゲン形成を示すグラフである。（◇）Ｐｏｏｌ  ＩＩ、ｐＨ７．０；（△）Ｐｏｏｌ  Ｉ、ｐＨ７．０；（□）Ｐｏｏｌ  ＩＩ、ｐＨ９．０；（○）Ｐｏｏｌ  Ｉ、ｐＨ９．０。
【図２５Ｂ】各時間におけるＡＬＡの存在下および非存在下における３７℃での透析中のＷＴ＋Ｆ１２Ｌ  Ｐｏｏｌ  ＩおよびＰｏｏｌ  ＩＩの未処理電気泳動ゲルの図である。ＡＬＡ非存在下では、八量体と六量体の比率は不変である。ＡＬＡ存在下では、すべてのＰｏｏｌの平衡状態が八量体方向へとシフトする。
【図２５Ｃ】図２５Ｂに示されている未処理ゲルデータの濃度計分析の結果を表すグラフである。（■）Ｐｏｏｌ  ＩＩ、ｐＨ９．０；（▲）Ｐｏｏｌ  Ｉ、ｐＨ７．０；（●）Ｐｏｏｌ  Ｉ、ｐＨ９．０。各線は、単一の速度指数関数に最適に適合している。
【図２６Ａ】図２６ＡおよびＢは、図１７Ａにはじめに示されている、ヒトＷＴ＋Ｆ１２Ｌ  Ｐｏｏｌ  ＩおよびＰｏｏｌ  ＩＩの不均化生成物の分析結果を表している。図２６Ａは、ｐＨ７のＡＬＡに対する２４時間の透析後およびＭｏｎｏ−Ｑカラムでのクロマトグラフィー分離後の、透析前の両Ｐｏｏｌの未処理ゲル電気泳動で取得したゲルの図を表している。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、不均化反応およびＭｏｎｏ−Ｑクロマトグラフィー前後におけるＷＴ＋Ｆ１２Ｌ  Ｐｏｏｌ  ＩおよびＷＴ＋Ｆ１２Ｌ  Ｐｏｏｌ  ＩＩのＮ末端トリプシンペプチドに関するマススペクトルデータを表している。ＷＴおよびＦ１２Ｌは標準として取り込まれている。
【図２７Ａ】経時的比活性の増大（▲）および動的光分散による分子サイズの増大をモニターすることによる、ｐＨ７におけるＷＴ＋Ｆ１２Ｌ異種八量体に対する、ＷＴ＋Ｆ１２Ｌ異種六量体（Ｐｏｏｌ  Ｉ）の基材誘発性動的相互変換（不均化）を表している。Ｐｏｏｌ  Ｉは図１７Ａに示されている。
【図２７Ｂ】図２７Ａと同様であるが、Ｐｏｏｌ  ＩＩで始まっている。Ｐｏｏｌ  ＩＩは、図１７Ａに示されている。
【図２８】ｐＨ９における基材ＡＬＡの濃度に対する野生型ヒトＰＢＧＳ活性の依存性を表している。点線は、単一の双曲型Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ  Ｍｅｎｔｏｎ方程式に適合している。実線は、１つが低Ｋm値であり、もう１つが高Ｋm値である２つのモルフィンによる触媒を示す、二重双曲型方程式に適合している。
【図２９Ａ】四量体である［１８］Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼの結晶非対称ユニットの図である。タンパク質サブユニットはリボンで表され、サブユニットＡおよびＣは黒で、サブユニットＢおよびＤは灰色でそれぞれ表されている。
【図２９Ｂ】空間充填表示すなわち白の酵素結合リガンドを含む、ＡＢ二量体の側面図である。左側の図には、リボンを使用してサブユニットＡおよびＢが表示されており、いっぽう右側の図は空間充填表示が使用されている。右側の図には、活性部位リガンドがどのように埋め込まれているかが示されている。
【図２９Ｃ】二量体界面を溶解する多数の秩序立った水分子を例図した、ＡＢ二量体の同様の側面図である。
【図２９Ｄ】推定薬剤結合部位として予測される、面裂隙を表すＡＢ二量体の側面図の空間充填表示を用いている。この部位は、左側で拡大している。
【図３０】Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ（灰色のリボン）のＨＰｒタンパク質と複合化した、六量体会合体（白のリボン）内のＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＨＰｒＫ／Ｐの結晶構造の二方位を表している。空間充填表示（濃い灰色）を用いて表されているトリプトファンは、Ｌ．ｃａｓｅｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ双方のＨＰｒＫ／Ｐにおける唯一のトリプトファンである。推定薬剤結合部位は、矢印で示されている。
【図３１】ＨＰｒタンパク質を伴わない、六量体会合体におけるＬａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｓｅｉ  ＨＰｒＫ／Ｐの結晶構造の同じ二方位を表している。矢印は別の薬剤結合部位を表している。上の図は、空間充填表示を用いており、いちばん下の図はリボン図を使用している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月25日(2008.4.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
多量体タンパク質の結合部位に結合して前記多量体タンパク質に影響を与え、それによりユニットの平衡状態に影響を与えるよう適合された作用物質を含有する組成物であって、前記多量体タンパク質は複数の前記ユニットを含む会合体を有し、各ユニットは第一の相補面と第二の相補面とを有し、前記多量体タンパク質において、（１）各ユニットの構造が異なる四次アイソフォームの構造を決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）前記異なる四次アイソフォームの構造が該多量体タンパク質の機能に影響を与えるという条件で、会合体が前記異なる四次アイソフォームの少なくともいずれか１つであることを前提として、１つのユニットの前記第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合し、前記多量体タンパク質がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒ、キナーゼ／ホスファターゼ、哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼおよびペロキシレドキシンから選択されたメンバーである、組成物。
【請求項２】
前記多量体タンパク質に対する影響に、四次アイソフォームの形成に対する影響が含まれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記多量体タンパク質に対する影響に、前記多量体タンパク質の機能に対する影響が含まれる、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記多量体タンパク質の機能が活性であり、影響が阻害作用または活性化作用の少なくともどちらか１つである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
作用物質が活性の低い四次アイソフォームまたは活性の高い四次アイソフォームの少なくともどちらか１つに結合する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記ユニットのそれぞれが単量体、二量体、三量体、四量体、六量体、および八量体から選択されたユニットである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
多量体タンパク質に影響を与える方法であって、
複数のユニットを有する会合体を含む多量体タンパク質を提供する工程であって、各ユニットが第一の相補面と第二の相補面とを有し、（１）前記ユニットの構造が異なる四次アイソフォームを決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）前記異なる四次アイソフォームの構造が前記多量体タンパク質の機能に影響を与えることを条件で、会合体が異なる四次アイソフォームの少なくとも一つであることを前提として、１つのユニットの前記第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合する、工程と、
請求項１に記載の組成物を提供する工程であって、前記作用物質は会合体上の結合部位
に結合させることによって平衡状態に影響を与えるよう適合されている、工程と、
作用物質と会合体とを接触させる工程であって、作用物質が結合部位に対する結合によって平衡に影響を与え、その結果前記多量体タンパク質にも影響を与える工程と、
からなる方法。
【請求項８】
前記多量体タンパク質に対する影響に、四次アイソフォームの形成に対する影響が含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記多量体タンパク質に対する影響に、前記多量体タンパク質の機能に対する影響が含まれる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ユニットが単量体、二量体、三量体、四量体、六量体、および八量体から選択されたユニットである、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
作用物質が、前記多量体タンパク質の機能に影響を与えるよう適合されている、請求項７記載の方法。
【請求項１２】
前記多量体タンパク質の機能が活性であり、影響が阻害作用または活性化作用の少なくともいずれか１つである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
作用物質が、活性の低い四次アイソフォームまたは活性の高い四次アイソフォームのいずれか１つに結合する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
作用物質が、活性の高い四次アイソフォームに結合する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
多量体タンパク質の結合部位に結合して前記多量体タンパク質に影響を与え、それによりユニットの平衡状態に影響を与えるよう適合された作用物質を含有する組成物であって、前記多量体タンパク質は複数の前記ユニットを含む会合体を有し、各ユニットは第一の相補面と第二の相補面とを有し、前記多量体タンパク質において、（１）各ユニットの構造が異なる四次アイソフォームの構造を決定し、（２）前記ユニットが平衡状態にあり、かつ（３）前記異なる四次アイソフォームの構造が該多量体タンパク質の機能に影響を与えるという条件で、会合体が前記異なる四次アイソフォームの少なくともいずれか１つであることを前提として、１つのユニットの前記第一の相補面が別のユニットの第二の相補面と結合し、前記多量体タンパク質がＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＧＤＰ−マンノース  デヒドロゲナーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＨＰｒ、キナーゼ／ホスファターゼ、哺乳動物ＣｏＡトランスフェラーゼ、プリンヌクレオシドホスフォリラーゼおよびペロキシレドキシンから選択されたメンバーである、組成物の、細胞、組織または有機体における生理学的活性を調節するための医薬を製造するための使用方法。