(57)【要約】  本発明は、有毒物質（例えば内分泌かく乱物質）によって引き起こされた後成的な多世代DNA変異を対象で検出する方法を提供する。本発明を用いて、同定されたDNA変異を有する対象を治療薬の開発により診断及び/又は治療するか、密接に関連する疾患及び/又は機能不全を予防するか又は前記の開始を遅らせることができる。【選択図】  なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
妊娠中の母親対象に少なくとも1つの内分泌かく乱物質を投与することを含む、新生児期の雄の子孫の生殖系列DNAに後成的で世代間伝達性の変異を誘発する方法であって、前記母親対象が雄の子孫対象を出産し、前記子孫対象がその生殖系列DNAに後成的で世代間伝達性の変異を有する、前記方法。
【請求項２】
前記後成的で世代間伝達性の変異が雄の子孫の生殖系列DNAのDNAメチル化である、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
雄の子孫の生殖系列DNAにおける変異が疾患及び/又は機能不全と密接に関連する、請求項1に記載の方法。
【請求項４】
後成的で世代間伝達性の変異をその生殖系列DNAに有する、請求項1に記載の母親対象の雄の子孫対象。
【請求項５】
F1、F2、F3又はF4世代である、請求項4に記載の子孫動物。
【請求項６】
生殖系列DNAにおける前記後成的で世代間伝達性の変異が雄の子孫対象の生殖能低下又は生殖不能をもたらす、請求項1、2、3又は5に記載の雄の子孫動物。
【請求項７】
雄の子孫対象の生殖能低下又は生殖不能が、異常な精巣の発育、異常な精子形成、精子運動性の低下、及び/又は精子前進運動の低下と密接に関連する、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1つの内分泌かく乱物質を投与された母親対象に由来する雄の子孫対象の生殖系列DNAで後成的で世代間伝達性の変異を検出する方法であって、前記方法が前記雄の子孫対象の生殖系列でメチル化DNAを同定することを含む、前記方法。
【請求項９】
前記方法がマイクロアレイアッセイの使用を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法が、DNAメチル化における変異を同定するために、メチル化感受性制限酵素消化分析と前記分析に続くPCRの使用を含む、請求項8に記載の方法。
【請求項１１】
前記疾患又は機能不全が、子癇前症、前立腺疾患、雄の生殖不能、免疫細胞活性化及び癌から成る群から選択される、請求項3に記載の方法。
【請求項１２】
雄の子孫対象でメチル化DNAプロフィルを同定することを含む、雄の子孫対象で疾患及び/又は機能不全を同定するか、又は当該疾患及び/又は機能不全を進行させる前記対象の性向を同定する方法であって、前記疾患及び/又は機能不全が、前記雄の子孫対象の生殖系列DNAと少なくとも1つの内分泌かく乱物質との妊娠中の接触から生じる後成的で世代間伝達性のDNA変異と密接に関連し、前記プロフィルが以前に疾患及び/又は機能不全と密接な関連を示し、それによって、実質的に類似のメチル化DNAプロフィルの存在が疾患及び/又は機能不全の存在を示すか、又は当該疾患及び/又は機能不全を進行させる前記対象の性向を示す、前記方法。
【請求項１３】
（a）対象で疾患及び/又は機能不全と密接に関連する変異メチル化DNAプロフィルの存在を同定する工程；及び（b）対象の生殖系列DNAの前記メチル化の状態を改変し、それによって前記疾患及び/又は機能不全を前記対象で防止するか又は遅延させる工程を含む、世代間で伝達される影響を受けた対象の生殖系列DNAにおける疾患及び/又は機能不全の開始を防止するか又は遅延させる方法であって、後成的で世代間伝達性のDNA変異と密接に関連する前記疾患及び/又は機能不全が、世代間で伝達される影響を受けた、後成的な変異を保有する対象の生殖系列DNAと少なくとも1つのかく乱物質との母親の妊娠中の接触に起因する、前記方法。
【請求項１４】
変異メチル化DNAを有する世代間伝達性遺伝子が、メチル化感受性制限酵素分析と前記分析に続くPCRを用いて同定される、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
第一のテスト物質が、後成的で世代間伝達性の雄の生殖能低下又は生殖不能を誘発するか否を決定する方法であって、前記方法が、精巣の器官培養で索形成を変化させるために適した条件下で、精巣の器官培養を前記第一のテスト物質と接触させる工程、及び異常な索形成を検出する工程によって実施される、前記方法。
【請求項１６】
さらに、第二のテスト物質が後成的で世代間伝達性の雄の生殖能低下又は生殖不能を抑制するか否を判定することを含む、請求項15に記載の方法であって、前記方法が、動物の精巣の器官培養と後成的で世代間伝達性の雄の生殖能低下又は生殖不能を誘発する第一のテスト物質との第一の接触後に、前記器官培養を前記第二のテスト物質と接触させる工程、及び、第二のテスト物質の投与後に前記精巣の器官培養で前記第一の物質の作用が逆転されるか、又は妨げられるか否かを決定する工程を含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
かく乱物質に暴露された雄対象の子孫でメチル化の欠陥を同定する方法であって、前記方法が、前記対象から精巣又は精子DNAサンプルを調製する工程、及び異常なメチル化又は遺伝子発現が前記精巣又は精子DNAサンプルで変異するか否かを観察する工程を含む、前記方法。
【請求項１８】
（a）対象で疾患及び/又は機能不全と密接に関連する変異したメチル化DNAプロフィルの存在を同定する工程；及び（b）前記変異メチル化DNAプロフィル内の遺伝子を同定する工程を含む、世代間で伝達される影響を受けた対象の生殖系列DNAで疾患又は機能不全と密接に関連する遺伝子を同定する方法であって、前記疾患及び/又は機能不全が後成的で世代間伝達性のDNA変異と密接に関連する、前記方法。
【請求項１９】
変異したメチル化DNA配列の存在を同定する工程が、メチル化制限酵素消化、重亜硫酸塩処理DNA使用又は不使用マイクロアッセイ分析、及びDNAの直接重亜硫酸塩シークェンシングから成る群から選択され、さらに前記遺伝子を同定する工程がPCR分析によって実施される、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
（a）対象で疾患及び/又は機能不全と密接に関連する変異メチル化DNAプロフィルの存在を同定する工程；（b）前記変異メチル化DNAプロフィル内の遺伝子を同定する工程；及び（c）前記同定した遺伝子の発現を変化させる物質を同定する工程を含む、世代間で伝達される影響を受けた対象の生殖系列DNAにおける疾患又は機能不全の治療のための治療薬剤を開発する方法であって、前記疾患及び/又は機能不全が後成的で世代間伝達性のDNA変異と密接に関連する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
本明細書に記載の研究は少なくとも部分的にはアメリカ合衆国環境保護庁グラント番号99-NCERQA-D2（#R827405-02-0）の支援によって補助された。合衆国政府はしたがって本発明において一定の権利を有する。
本出願を通して種々の刊行物が括弧内に引用される。本発明が属する分野の状態をより完全に説明するために、それら刊行物の全体が参照により本明細書に含まれる。
本発明は、環境性有毒物質の哺乳動物生殖系列に対する後成的で世代を超えて伝達される作用に関し、より具体的には、生殖系列に対する内分泌かく乱物質の影響の診断及び関連疾患の治療に関する。
【０００２】
背景技術
胎児期又は生後初期の環境性化合物（例えば内分泌かく乱物質）への暴露は、ヒトを含む多様な種で異常な発生及び疾患を促進することが示された[135, 136, 137, 138]。多数の環境性因子、例えば喫煙、カロリー制限[139, 140]、及びプラスチックから農薬に至る合成化合物が、成人で開始する疾患及び異常を促進しえるが、これら因子の作用メカニズムはほとんど解明されていない。
“遺伝的刷り込み”は、いくつかの遺伝子はそれらが由来した親の性別を“記憶”し、この“親の記憶”がそれらの活性を調節することを提唱している。この調節は種々の形態を取ることができるが、通常は一方の対立遺伝子がサイレントであり、その結果一方の親のコピーが活性を示す。いくつかの被刷り込み遺伝子の場合、父親の対立遺伝子だけが活性を示し、他方、別の被刷り込み遺伝子については、母親の対立遺伝子だけが活性を示す。遺伝子のコピーを伝えた親の性別に依存するこの弁別的遺伝子活性は、“遺伝的刷り込み”と称される。遺伝的刷り込みが生じるためには、何らかの種類の分子マークが存在し、父親の対立遺伝子から母親の対立遺伝子を識別しなければならない。この分子マーカーは“後成的”である（“後成的”とは、DNAヌクレオチド配列を直接改変しないが、遺伝子活性の遺伝可能な変化を引き起こすことを意味する）。後成的改変は、一次塩基配列である“テキスト”の“フォント”のように機能し、遺伝メッセージに強力に影響を及ぼす。
【０００３】
多数のヒトの疾患が異常な後成的（すなわちDNAメチル化）プログラミングの結果であり、前記にはアンゲルマン症候群、ベックウィン-ヴィーデマン症候群及びプラーダー-ヴィリ症候群が含まれる[143, 144, 145]。被刷り込み遺伝子のDNAメチル化パターンにおける変化はまた疾患の進行を促進することが示された[146]。in vitro受精（すなわち細胞質内精子注入）から誕生した小児の潜在的な後成的異常が同定された[147]。一卵性双生児の研究は疾患に対する環境の後成的影響を示唆した[148]。したがって、多くの研究及び臨床症状は、後成的遺伝（epigenetics）が疾患の因果関係において決定的因子でありえることを示唆している。
放射線照射、化学物質処理（例えば化学療法）及び環境性有毒物質（例えば内分泌かく乱物質）の世代を超える伝達作用がここ10年間にわたって観察されている。世代間伝達で観察されたものの大半は、単純に妊婦に対する薬剤の影響及びその後のF1世代に属する子孫に対する作用である[1−3]。多数の世代に対する世代間伝達作用はいまだ十分には研究されておらず、生殖系列を介する伝達が要求される。外用薬が世代間伝達作用を誘発する能力は、DNAメチル化又は安定な染色体変異を含む後成的現象を介する可能性がある[4−7]。放射線照射の世代間伝達作用は同定されるべき最初のものであり、いくつかは生殖細胞系列を介して多数の世代に伝達されることが示された[4−6]。これらはしばしば後続の世代における変異発生及び腫瘍形成と密接な関連を示した。化学療法剤による癌の治療もまた、世代間伝達作用を惹起することが示されたが[8−10]、多数の世代に対する影響は未だ十分には解明されていない。最近、F1世代に対する栄養に関する作用が観察されたが[11]、いずれも世代間伝達性は示されなかった。環境性有毒物質（例えば内分泌かく乱物質）もまた、親が暴露された後F1世代に影響を与えることが示されたが[9, 12−14]、多数の世代に対して世代間伝達作用をもつことを示した研究はほとんどない。しかしながら、内分泌かく乱物質のそのような世代間伝達作用の潜在的影響が既に考察されている[15]。
【０００４】
特定の遺伝的特質又は分子的事象（例えば刷り込み）の世代を超えた伝達をもたらす後成的変異が最近同定された[16−19]。これらの観察によって、生殖系列の変異メチル化状態による再プログラミングが原因であるという結論が導かれた。前記が人間の健康に与える影響及び進化における重要性は重大である[16 ,17]。始原生殖細胞（PGC）のメチル化状態の最近の研究によって、PGCが生殖隆起に移動するとき、脱メチル化（すなわちメチル化の抹消）が開始し、さらに初期性腺におけるコロニー形成時に脱メチル化が完成されることが示された[20−22]。前記は主として特定の被刷り込み遺伝子の分析を介して観察された[23]。性腺における性決定期間中に、生殖細胞は、生殖細胞の性特異的決定を必要とする再メチル化を受ける。脱メチル化は性腺内の体細胞を必要としないかもしれないが[21]、生殖細胞系列の再メチル化は性腺内の体細胞との密接な関係に左右されるようである[20, 22]。
多くの報告が、環境性内分泌かく乱物質（エストロゲンに類似する作用を示すか又は抗エストロゲン若しくは抗アンドロゲンとして作用する）は生殖に有害であり、異常（例えば精子数低下、精巣癌の増加[24, 25]及び多くの種での性決定における異常の増加[26]）の原因因子である可能性があることを示唆した。ヒト及び他の動物における生殖系に対する悪影響を与える環境性内分泌かく乱物質の例は、農薬（例えばメトキシクロル）、殺カビ剤（例えばヴィンクロゾリン）、一連のゼノエストロゲン、及びある種のフタレートである。これらの化学物質の大半は環境中のいたるところに存在し、人間及び他の動物の両者が毎日それらに暴露される。これらの化合物及び内分泌かく乱物質の多くが、エストロゲン作用及び抗アンドロゲン作用の両作用活性へと代謝される[27]。これまでの研究では、メトキシクロル及びヴィンクロゾリンは内分泌腺かく乱物質モデルとして用いられ[28]、エストロゲン作用及び抗アンドロゲン作用をもつ代謝物質の両方を有する[27]。
【０００５】
多くの環境性内分泌かく乱物質は弱いエストロゲン様作用を有し、エストロゲンレセプターを介してそれらの作用を引き出す。エストロゲンのための2つの哺乳動物のレセプター（ER-α及びER-β）は生殖路全体及び胎児の性腺発生時に広く分布する[29, 30]。ER-βは胎児精巣及び卵巣により高濃度で存在し、一方、ER-αは主として子宮内に存在する[31, 32]。胎児の精巣発生時に、ER-βは最初セルトリ細胞で発現され、輸精索（seminiferous cord）形成後は筋様細胞で発現される[33]。ラットでは、ER-βはまた前精原細胞に分布していた（これは、生後初期の原生殖細胞培養に対するエストロゲンの増殖性作用を説明しえる[34]）。ER-αの重要性は、この遺伝子の発現を欠くノックアウトマウス[35]及び人間の男性[36]が生殖不能であることが判明したときにいっそう正確に説明された。これらの実験では胎児の精巣の発育には変化はなかった。二重ノックアウトにおける初期胎児精巣の形態学はまだ調査の必要がある[37]。新生児期におけるエストロゲンへの暴露は、出生後の精巣及び発育中の視床下部/下垂体のER-α及びER-β発現に変化を与える[38, 39]。興味深いことには、エストロゲン様化合物、ジエチルスチルベストロールに対する新生児期暴露は、異常な精巣及び雄の生殖管発育を促進する。したがって、エストロゲンレセプターに対するエストロゲン様内分泌かく乱物質としての作用は、正常な胎児の性腺発育を阻害するか、又は生殖不能をもたらす細胞の不適切な分化を刺激する可能性がある。エストロゲンレセプターは精巣の発育に役割を果たすと考えられているが[40−42]、固有の機能はまだ解明されていない。胎生初期のエストロゲンによる雄の処置は、アンドロゲンレセプター（AR）発現パターンを変化させることによってアンドロゲンに対する応答性に変化を与える可能性がある[43, 44]。
【０００６】
抗アンドロゲン作用をもつ内分泌かく乱物質はまた胎児の性腺発育に影響を与えることができる。ARの発現は、発生時の精巣におけるER-βの発現と非常に類似する[32, 45]。しかしながら、ARはステージ依存性であるが、ER-β発現はより構成的発現であるように見える[32]。ARは、輸精索形成直後にセルトリ細胞、筋様細胞及び前精原細胞において検出される[46]。ARはまた発生後期に間質細胞で検出できる。ARは中腎から遊走する細胞に存在し、索形成の始動を可能にすると提唱されている[46]。したがって、内分泌かく乱物質による処置を介するARの不適切な発現又は作用は、形態学的な性分化の過程（索形成）に影響を与える可能性がある。種々の妊娠時期の妊娠ラットに投与された抗アンドロゲン（例えばフルタミド[47]又はシプロテロンアセテート（CPA）[48]）は、雄の子孫の生殖能を障害する。フルタミド及びCPAはともに、ウォルフ管を安定化させるアンドロゲン及び上皮増殖因子（EGF）の能力を阻止する[49]。テストステロンは、発生中の精巣におけるEGFレセプターの発現を増加させることが示された[49]。したがって、ARの混乱はまた精巣における増殖因子の不適切な発現及び作用を引き起こす可能性がある。一般的に用いられる抗アンドロゲン性内分泌かく乱物質はヴィンクロゾリンであり、前記はワイン工業で殺カビ剤として用いられる[50, 51]。ヴィンクロゾリンは環境性抗アンドロゲンとして作用し、さらに性腺の発育及び生殖能に影響を及ぼすことが示された。
【０００７】
メトキシクロルは、DDTの代替として現在米国で用いられている塩素化炭化水素農薬である[52]。メトキシクロルは、肝臓により2つのジメチル化化合物（すなわちモノ-OH-M及びビス-OH-M）に代謝されえる。もっとも活性なエストロゲン様代謝物質は、2,2-ビス-(p-ヒドロキシフェニル)-1,1,1-トリクロロエタン、（HPTE）である[28, 53, 54]。他のメトキシクロル代謝物質は、抗アンドロゲン性活性を有しているようである[27]。HPTEは、弱いエストロゲン様作用を有し[55−57]、エストロゲンレセプターの発現を刺激する[58]。最近、メトキシクロルHPTEのエストロゲン様代謝物質は、ER-α及びER-βに対して弁別的作用を有し、ER-αアゴニスト及びER-βアンタゴニストであることが見出された[59, 60]。他のメトキシクロル代謝物質もまたER-α及びER-βに対して弁別的作用を有する[60]。したがって、メトキシクロル又はHPTEの作用を調べるときには、ERアゴニスト及びアンタゴニスト活性を、抗アンドロゲン性活性と同様に考慮する必要がある。これらの弁別的活性を斟酌することは、内分泌かく乱物質（例えばメトキシクロル）の作用メカニズムの解明に極めて重要である。以前に、メトキシクロルの代謝物質は別個の種に由来するERに対して弁別的に作用することが示された[61]。胎児期又は生後初期におけるメトキシクロルの作用はより後の成人期における生殖機能に影響を及ぼすことができる[62−64]。新生児期のメトキシクロルへの暴露は、妊娠[65, 66]、卵巣及び視床下部機能[67, 68]、生殖行動[69]、前立腺の発育[70]、胸腺の発育[71]、並びに精巣の発育[72]に影響を及ぼすことができる。したがって、内分泌かく乱物質への胚の一過性暴露は、成人の生殖生理学で提示される作用の再プログラミング及び/又は刷り込みをもたらしえる。ある研究は、妊娠母獣に対する作用はその後の妊娠にも同様に影響を及ぼす可能性があることを示した[73]。
【０００８】
ヴィンクロゾリンは、ブテン酸及びエナニリド誘導体（それぞれM1及びM2と称される）に代謝される抗アンドロゲン性化合物である[74]。代謝物質のアンドロゲンレセプターに対する親和性は、親化合物よりも10−15倍高い（すなわちKiは10−100μM）。新生児の抗アンドロゲン性化合物への暴露は性分化及び性腺形成における異常を引き起こす[75, 76]。雄のラットで性成熟期頃の抗アンドロゲンへの暴露は、性成熟期を遅延させ、アンドロゲン依存組織の発育を阻害し、アンドロゲンレセプター機能を変化させる[77−79]。胎児期及び生後初期の暴露は、その後の雄の性分化及び生殖能に影響を及ぼすことができる[80−83]。精巣形成時の胚の暴露時期は、もっとも感受性の高い抗アンドロゲン暴露時期であるように思われる[84]。種々の有毒化合物を用いて得られた証拠から、エストロゲン様物質の代謝物質（例えばp,p'DDE（DDTの代謝物質））は抗アンドロゲンとして作用し、アンドロゲン調節遺伝子の転写を阻害すると決定された[85]。最近の報告は、ヴィンクロゾリンとアンドロゲンとの間のアンタゴニスト的及び相乗作用的相互作用を示唆している[86]。したがって、有毒化合物の影響はより複雑で、生殖及び性腺発育に対するそれらのエストロゲン様及び抗アンドロゲン性作用を解明する必要がある。
【０００９】
成人の精巣は精細管（周囲の間質によって取り囲まれている）で構成される複雑な器官である。精細管は精子形成部位であり、そこでは生殖細胞がセルトリ細胞と密接に相互作用しながら精子に発育する。セルトリ細胞[87]は精細管を形成し、発育中の胚細胞に細胞構築設備を提供する[88]。セルトリ細胞間の密な結合複合構造は血液精巣関門の維持に寄与し[89]、細管内に固有の環境を作り出す[90, 91]。セルトリ分泌生成物の大半[92−97]はホルモンにより調節され、セルトリ細胞の分化の有用なマーカーを提供する。セルトリ細胞の周囲には1層の細管周囲筋様細胞があり、前記は細管の収縮において役割を果たす。細管周囲細胞は精細管を取り巻き、精細管の外壁を形成する。細管周囲細胞は間葉に由来する細胞であり、フィブロネクチン[98]及びいくつかの細胞外マトリックス成分[99]を分泌する。細管周囲細胞及びセルトリ細胞の両細胞は精細管を取り巻く基底膜を形成し、それらの相互作用は生殖細胞の発育に重要である。精細管の周りの間質間隙は別の体細胞型、ライディッヒ細胞を含み、前記はテストステロン産生に必要である。ライディッヒ細胞は、精細管及び下垂体の両者に対するテストステロンの作用を通じて精子形成に主要な影響を及ぼす。ライデッヒ細胞は多数の分泌生成物[100]を有するが、精細管に対して作用するアンドロゲンを産生する前記細胞の能力はこの細胞の最も重要な分泌物生成能力である。ライディッヒ細胞のアンドロゲン産生は、内分泌かく乱物質メトキシクロル及びその代謝物質HPTEの作用によって直接影響を受けることができる[101]。したがって、3種の体細胞、セルトリ細胞、細管周囲細胞及びライディッヒ細胞全ての相互作用が、精巣における正常な精子形成の調節のために重要である[100]。胎児の精巣形成の過程は胚の発育後期に生じ（ラットでは13日胚（E13））、最初は卵黄嚢から続いて後腸から生殖隆起への始原生殖細胞の遊走によって開始する。性腺は生殖細胞遊走後には両能性であり、隣接する中腎とは形態学的に区別することができるが（ラットのE12）、卵巣としても又は精巣としても認定することはできない。2つの事象が13日胚（E13）の初期に発生し前記両能性を変化させる。第一に、セルトリ細胞（分化する精巣内の最初の細胞であると言われている）が始原生殖細胞周囲に凝集する[102, 103]。第二に、隣接する中腎から発育中の性腺へと間葉細胞の遊走が生じ、前記セルトリ細胞-胚細胞凝集物を取り囲む。この遊走細胞集団は前細管周囲細胞ではないかと考えられている[104, 105]。この遊走メカニズムは、細胞遊走を促進する精巣が発する化学走性シグナルのためである[106]。したがって、初期の精巣発生時にセルトリ-細管周囲細胞相互作用は索の形成を促進する。前記索は、新生時期に輸精索に発育し、思春期開始時に精細管に発育する。輸精索はセルトリ細胞-始原生殖細胞凝集物として形成されより組織化されて、遊走中腎間葉細胞（すなわち前細管周囲細胞）によって完全に取り囲まれる。輸精索の形成（ラットのE14）は、前記は雄の性分化の最初の表示であるので精巣形成の決定的な事象である。索形成過程の間、セルトリ細胞は、以下を含む多数の形態学的変化を経る：間葉から上皮細胞マーカーの発現変化（ヴィメンチンからサイトケラチン）[107]、サイトケラチン19からサイトケラチン18への発現変化（サイトケラチン19は卵巣で発現される）［108］、及びミューラー管（雌の子宮、子宮頸、ファロピウス管及び膣上部の前駆体）の発育を阻害するMISの発現[109, 110]。輸精索の外側では、細管周囲細胞層は、E15には間質又はライディッヒ細胞と区別できるようになり[111]、3βHSD産生がE15後に検出される[112]。これは重要である。なぜならば、ライディッヒ細胞によるテストステロン及びアンドロゲンの産生は、正常な雄の管の発育のためにウォルフ管派生物を安定化させることが示されたからである[113]。したがって、索形成期頃の精巣における体細胞型の適切な分化は、精巣の正常な発育のためだけでなく、持続的なウォルフ管の存続のためにもまた必須である。
【００１０】
始原生殖細胞は、索形成前にセルトリ細胞と凝集塊を形成し[102, 103]、続いて精巣の形態形成が開始するときに輸精索内に局在化する。生殖細胞は胚の発育の後期（この時期には生殖細胞は休止状態になる）まで急速な有糸分裂を経る。げっ歯類では出生後、生殖細胞の有糸分裂が再び始まり、思春期及び精細管形成の開始時に精子形成が始まる。発育の間中、生殖細胞は体細胞（例えばセルトリ細胞）と密接に連携する。体細胞分化の変化は、生殖細胞に直接的影響を示すとともに、間接的にも生殖細胞の発育に影響しえよう。
精巣のトランスクリプトーム（すなわち包括的遺伝子発現プロフィル）は、多様な種々の細胞型の分化及び成長のために精巣発育中に変化するであろう。精巣のトランスクリプトームにおけるこれらの変化は、正常な精巣機能及び発育を促進するために要求される決定的な調節遺伝子及び遺伝子ファミリーを反映する。機能的に関連する多様な遺伝子、例えば転写因子、シグナルトランスダクション遺伝子、細胞周期遺伝子、細胞生存遺伝子及び増殖因子が精巣の発育及びトランスクリプトームの部分に中心的に関与するであろう。精巣トランスクリプトーム並びに固有の遺伝子及び遺伝子ファミリーを変化させる内分泌かく乱物質の能力は、部分的には胎児及び成獣の精巣機能及び発育を変化させるために用いられるメカニズムの1つである。胚の精巣発育に影響を与えることが示された遺伝子ファミリーの例には上皮増殖因子（EGF）ファミリー[114−116]、形質転換増殖因子β（TGFβ）ファミリー[117]及びニューロトロピン増殖因子ファミリー[118, 119]が含まれる。
【００１１】
8から15日胚（E8−E15）の妊娠母獣のメトキシクロル又はヴィンクロゾリンへの一過性暴露は、F1世代の成獣で精子形成能の低下、精子形成細胞のアポトーシスの増加及び精子数及び運動性の低下を促進することが以前に示された[120, 121]。妊娠ラットに100又は200mg/kgの内分泌かく乱物質を毎日腹腔内に注射した。これらの用量は以前のin vivo実験と類似し、予想される環境的暴露レベルの範囲内にある[27, 28, 52−72, 74-82, 84, 85, 121−123]。15−20日胚（E15−E20）での同様な一過性暴露は、F1世代の精巣に対して全く影響を与えなかった。
多数のヒトの疾患が異常な後成的（すなわちDNAメチル化）プログラミングの結果である。それら疾患にはアンゲルマン症候群、ベックウィン-ヴィーデマン症候群及びプラーダー-ヴィリ症候群が含まれる[143−145]。被刷り込み遺伝子のDNAメチル化パターンにおける変化はまた、疾患の進行を促進することが示された[146]。in vitro受精（すなわち細胞質内精子注入）による小児の潜在的な後成的異常が同定された[147]。一卵性双生児の研究によって、疾患に対する環境性後成的作用が示唆された[148]。したがって、多数の研究及び臨床症状は、後成的事象が疾患の原因に極めて重要であることを提唱している。
環境性有毒物質（例えば内分泌かく乱物質）は、妊婦の生殖系列に対して後成的作用を有し、雄の生殖に対して世代間で伝達される影響を引き起こしえるという観察は、これら化合物の人間及び他の哺乳動物種の健康に対する危険性の認識に重大な衝撃を与える。この現象を解明することによって、環境性有毒物質の真の危険性に対するより深い理解が可能になり、固有の原因物質の同定が可能になり、適切な予防的及び治療的手段の開発が可能になる。興味をもたれた特定の化合物又は物質とは別個に、この潜在的な作用メカニズムを確定することは極めて重要であり、哺乳動物の胚の発育及び成人の生殖に影響を及ぼす環境因子の作用の理解を提供する。
【００１２】
発明の要旨
本発明は、環境性有毒物質、例えば内分泌かく乱物質（endocrine disruptor）は、暴露された母親動物の雄の子孫における哺乳動物生殖系列に対して後成的（epigenetic）な世代間伝達性（transgenerational）作用を引き起こすという発見を根拠にしている。これらの作用は多様な疾患と密接に関連する。
本発明は、妊娠中の母親対象（female parental subject）を少なくとも1つの内分泌かく乱物質に暴露することによって、新生児期の雄の子孫対象（neonatal progeny subject）における生殖系列DNAに後成的で世代間伝達性変異を誘発する方法を提供する。前記母親対象は、その生殖系列DNAに後成的で世代間伝達性変異を有する雄の子孫を出産する。
前記変異は、DNAのメチル化を介する生殖系列DNAの永久的な再プログラミングを含む。前記変異は子孫対象における疾患又は機能不全と密接に関連する可能性がある。前記疾患又は機能不全は、雌の子孫対象における子癇前症、雄の子孫対象における前立腺疾患、雄の生殖能低下、免疫細胞活性化、未成熟加齢又は癌でありえる。雄の子孫対象は、異常な精巣発育、異常な精子形成、精子運動性低下又は精子全身運動の低下と密接に関連する生殖能低下又は生殖不能を有する可能性がある。
本発明は、雄の子孫対象の生殖系列における異常なメチル化DNAを同定することによって、内分泌かく乱物質に暴露された雄の子孫対象の生殖系列DNAにおける、後成的で世代間伝達性変異を検出する方法を含む。
本発明のさらに別の方法は、親対象が妊娠中に雄の子孫対象の生殖系列DNAと内分泌かく乱物質とが接触することにより生じる疾患若しくは機能不全、又は疾患若しくは機能不全を進行させる性向を診断する方法を含む。前記方法は、雄の子孫対象のメチル化DNAプロフィルを特定し、以前に疾患又は機能不全と密接な関連を示したプロフィルと比較して、それにより子孫対象における実質的に類似するメチル化DNAプロフィルの存在が、疾患若しくは機能不全の存在を示すか、又は疾患若しくは機能不全進行の性向の存在を示すことによって実施される。
【００１３】
本発明のさらに別の方法は、対象の生殖系列の異常なDNAメチル化プロフィルと密接に関連する疾患又は機能不全を防ぐ方法を含む。前記方法は、雄の対象の生殖系列の正常なDNAメチル化プロフィルを特定し、続いて思春期又は成熟期の雄の対象の生殖系列における疾患又は機能不全と密接に関連する変異DNAメチル化部位を検出し、前記変異DNAを改変して正常なメチル化プロフィルを回復させて、疾患又は機能不全を防ぐことによって実施される。さらにまた、雄の対象の生殖系列で疾患又は機能不全と密接に関連する変異メチル化DNA部位を含む遺伝子を診断物質として用いて、前記雄が前記変異メチル化DNAと密接に関連する疾患又は機能不全を発達させる蓋然性を検出することができる。さらにまた、治療物質を設計して前記遺伝子生成物を阻害するか又は前記遺伝子の発現を改変し、関連する疾患又は機能不全を治療することができる。
本発明のまた別の方法は、テスト物質が、後成的で世代間伝達性を有する雄の生殖能低下又は生殖不能を誘発するか否かを決定することを目的とし、前記方法は、精巣器官培養で索形成を阻害するために適した条件下で、テスト物質と接触させた精巣器官培養を用い、さらに索形成が阻害されるか否かを検出する。さらにまた前記方法は、テスト物質が、内分泌かく乱物質によって引き起こされた後成的で世代間伝達性の雄の生殖能低下又は生殖不能を抑制するか否か決定することをさらに含み、前記方法は、雄の生殖能低下又は生殖不能を誘発する第一の内分泌かく乱物質と接触させた精巣器官培養を用い、続いて第一の物質の活性の阻害物質と言われているテスト物質で処理し、前記精巣器官培養で索の形成又はDNAメチル化又は遺伝子の発現がなお変異しているか否かを決定することによって実施される。
本発明の方法は、内分泌かく乱物質に暴露された雄の対象の子孫でメチル化の欠陥を同定することを含み、前記方法は、前記対象からDNA（すなわち精子又は精巣）を調製し、メチル化が異常であるか、又は遺伝子発現（マイクロアレーで発現される遺伝子レベル）が変化しているか否かを観察することによって実施される。
【００１４】
発明の詳細な説明
本発明は、特定の環境性有毒物質（例えば内分泌かく乱物質）は、性決定の決定的時期における胚の一過性暴露後に、始原生殖細胞の再メチル化に直接結びつく、世代を超えて伝達される後成的な作用を引き起こしえるという発見を開示する。前記後成的な作用は、おそらく部分的には被刷り込み遺伝子を巻き込むDNAのメチル化事象を介して生殖系列を再プログラムする。発生におけるこの重大な段階で作用し、さらに永久的に生殖系列を再プログラムして世代間伝達性作用を引き起こす環境性有毒物質の能力は、以前には理解されていなかった。そのような化合物の危険性についての我々の理解に対して前記が与える影響は重大である。生殖の欠陥（例えば雄の生殖能低下）に加えて、他の臨床的な異常及び病的状態、例えば前立腺異常、腫瘍の発達、異常な免疫系活性化、及び未成熟な加齢が誘発されえる。本発明の応用には、これらの病的状態の解明のため、または関連する疾患の治療及び診断のための新規な方法が含まれる。
本出願で使用される全ての学術及び技術用語は、別に指定されないかぎり、当分野で一般的に用いられる意味を有する。本出願で用いられるように、以下の語句は以下で特定される意味を有する。
“世代間伝達性”とは、単純に暴露された妊娠雌F0のF1世代を含むのではなく、F1からF2へ、F3・・・への異常な病的表現型の生殖系列伝達と定義される。
“後成的”とは、改変されたDNA状態（すなわちDNAメチル化）と定義され、前記はヌクレオチド配列の変異を含まない。
“被刷り込み様（imprinted-like）遺伝子”とは、変異又は異常なDNAメチル化部位（すなわち遺伝子内の任意の場所のCpG部位）を有する遺伝子と定義され、前記では、変異メチル化状態は世代を超えて伝達され、生殖系列を介して伝えられる。
【００１５】
本発明の方法
本発明の方法を用いて、哺乳動物のゲノムに対する環境性有毒物質（例えば内分泌かく乱物質）の影響を検出し、さらに診断的、予防的及び治療的処置を開発することができる。
下記の実施例は、新しい被刷り込み遺伝子又はDNA配列の存在を誘発することによって、環境性因子が、対象で生殖系列の後成的なDNAメチル化プログラミングに影響を与ええることの直接的証拠を提供する。DNA配列のメチル化におけるこれらの変化を疾患と密接に関連させるこの能力は、これら特定の遺伝子及びDNA配列のメチル化パターンは、発症前でさえも用いることができる疾患の診断マーカーを提供することができることを示唆する。
例えば、いったん特定の遺伝子又はDNA配列が、内分泌かく乱物質によって影響を受ける（すなわち、変異又は異常メチル化部位を有する）ことが確認されたら、それらをゲノム使用マイクロアレイアプローチ、又はメチル化感受性制限酵素消化法で用いて、リスクアセスメントを決定し、さらに対象の哺乳動物対象のさかのぼる世代の内分泌かく乱物質への暴露を立証することができる。影響を受けた遺伝子で同定されたものについては、前記遺伝子に対応するmRNAの発現レベルもまた、伝統的な発現マイクロアレイ法により判定することができる。マイクロアレイ法を用い、重亜硫酸塩変換感受性[124−126]によりメチル化の相違を判定することができる。
ある実施態様では、個々のDNAにおける診断のための後成的変異DNAメチル化変化の存在は、例えば以下の方法を用いて検出される：1）メチル化制限酵素消化及び特定の遺伝子についてのPCR分析；又は2）一群又は多数の遺伝子のメチル化における変化を判定するための重亜硫酸塩処理DNA使用又は非使用マイクロアレイ分析；又は3）問題のDNA配列の直接重亜硫酸塩シークェンシング。DNA配列メチル化変異の検出は、発症前でさえも特定の病的状態について診断を提供する。前記の情報は、発症後に疾患を治療するための治療薬に加えて、疾患予防のための療法を目的とする予防的治療薬の開発を順次可能にする。例えば、いくつかのDNA配列が有毒物質暴露後にメチル化に相違を有することが見出されたら、DNAサンプルを採取し、続いて後成的変化（すなわちメチル化）について分析し、変化が確認されたら、有毒物質に暴露されており、後に症状を呈し易い感受性を有するとの診断が下される。異なる組織は異なる後成的マーカーを有すると予想され、異なる有毒物質は異なる後成的マーカーを誘発する可能性がある。
【００１６】
マイクロアッセイを用いて、対象における有害な暴露に対するリスクアセスメント及び対象の発症（例えば生殖能低下）の可能性が判定される。重亜硫酸塩はシトシン（C）残基をチミン残基に変換し、シトシンがメチル化されている場合は前記残基を変換することができない。メチル化変化を判定するマイクロアレイは、C及びT変換を有する種々の配列をもつオリゴヌクレオチドのアレイを含み、メチル化における変異を判定する。DNAを単離し、重亜硫酸塩の非存在下又は存在下でインキュベートし、続いてポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で増幅させる。続いてこのサンプルをマイクロアレイに暴露し、対応するマイクロアレイのハイブリダイゼーションによってメチル化状態が決定される。また別には、種々のプライマーセットによる多重PCRを用い、続いてメチル化感受性制限酵素消化を実施して分析することができる。
異常なメチル化状態を同定した後、適切な予防的又は治療的方法を実施する。例えば、対象が生殖能低下又は前立腺疾患を有すると予想されたならば、精巣又は前立腺機能を高めるホルモン治療を用いて低生殖能又は疾患の開始を予防することができる。
本発明の実施態様は、新生時期の雄の子孫の生殖系列DNAにおいて後成的で世代間伝達性の変異を誘発する方法である。前記方法は、妊娠中の母親対象に少なくとも1つの内分泌かく乱物質を投与する工程を含み、ここで前記母親対象は雄の子孫対象を出産し、前記雄の子孫対象は後成的で世代間伝達性の変異をその生殖系列DNAに有する。前記後成的で世代間伝達性の変異は、前記雄の子孫対象の生殖系列DNAにおけるDNAのメチル化である。雄の子孫の生殖系列DNAにおける変異は疾患及び/又は機能不全と密接な関連を有する。前記母親対象の雄の子孫は、それらの生殖系列DNAにおいて後成的で世代間伝達性の変異を有し、それら子孫はF1、F2、F3又はF4世代である。
【００１７】
前記雄の子孫の生殖系列DNAにおける後成的で世代間伝達性の変異は、雄の生殖能低下又は生殖不能をもたらし、これらは異常な精巣の発育、異常な精子形成、精子運動性の低下及び/又は精子の前進運動の低下と密接に関連する。
本発明の別の実施態様では、少なくとも1つの内分泌かく乱物質を投与された母親対象に由来する雄の子孫対象の生殖系列DNAにおける後成的で世代間伝達性変異を検出する方法は、前記雄の子孫対象の生殖系列のメチル化DNAを同定する工程を含む。前記方法は、マイクロアッセイ、PCRを伴うメチル化感受性制限酵素消化分析を用いて、DNAメチル化における変異を同定することができる。
前記方法における疾患又は機能不全は、子癇前症、前立腺疾患、雄の生殖能低下、免疫細胞活性化及び癌から選択されるが、ただしこれらに限定されない。
本発明はまた、雄の子孫対象における疾患及び/又は機能不全を特定する方法、又は疾患及び/又は機能不全を発生させる対象の性向を特定する方法である実施態様を含み、ここで前記疾患及び/又は機能不全は、雄の子孫対象の生殖系列DNAと少なくとも1つの内分泌かく乱物質との妊娠中の接触から生じる後成的で世代間伝達性のDNAの変異と密接に関連する。前記方法は、雄の子孫対象におけるメチル化DNAプロフィルを特定し、ここで前記プロフィルは疾患及び/又は機能不全と以前に密接な関連を示し、それによって、実質的に類似するメチル化DNAプロフィルの存在は前記疾患及び/又は機能不全の存在を示すか、又は前記疾患及び/又は機能不全を発生させる対象の性向を示す。
さらに本発明は、世代間で伝達される影響を受けた対象の生殖系列DNAの疾患及び/又は機能不全の開始を妨げるか又は遅らせる方法であり、ここで前記疾患及び/又は機能不全は、世代間で伝達される影響を受けた、後成的な変異を保有する対象の生殖系列DNAと少なくとも1つの内分泌かく乱物質との母親対象の妊娠中の接触から生じる後成的で世代間伝達性のDNAの変異と密接に関連する。前記方法は、1）対象の疾患及び/又は機能不全と密接な関連を有する変異したメチル化DNAプロフィルの存在を確認する工程、及び2）前記疾患及び/又は機能不全を前記対象で妨げるか又は遅らせることができるように、前記対象の生殖系列DNAのメチル化状態を改変する工程を含む。メチル化DNA変異を有する前記世代間で伝達される遺伝子は、PCRを伴うメチル化感受性制限酵素分析を用いて同定される。
【００１８】
本発明はまた、第一のテスト物質が、後成的で世代間伝達性の雄の生殖能低下又は生殖不能を誘発するか否かを決定する方法を含む。前記方法は、精巣器官培養を第一のテスト物質と、精巣器官培養で索形成を変化させるために適した条件下で接触させ、さらになんらかの異常な索形成を検出することによって実施される。さらにまた、第二のテスト物質が後成的で世代間伝達性の雄の生殖能低下又は生殖不能を抑制するか否かを決定するために、精巣器官培養と後成的で世代間伝達性の雄の生殖能低下又は生殖不能を誘発する第一のテスト物質との第一の接触後に、動物の精巣器官培養を第二のテスト物質と接触させ、前記第二のテスト物質の投与後に前記第一の物質の作用が精巣器官培養で逆転されるか又は妨げられるかを決定することによって、前記第二のテスト物質を判定することができる。
さらに別の実施態様では、かく乱物質に暴露された雄の対象の子孫におけるメチル化の欠陥を同定する方法は、前記対象から精巣又は精子DNAサンプルを調製し、前記精巣又は精子DNAサンプルにおいてメチル化の異常又は遺伝子発現が変異しているか否かを観察することを含む。
別の実施態様では、世代間で伝達される影響を受けた対象の疾患又は機能不全（ここで前記疾患及び/又は機能不全は後成的で世代間伝達性のDNA変異と密接に関連する）と密接に関連する遺伝子を生殖系列DNAで同定する方法は、1）対象で疾患及び/又は機能不全と密接に関連する変異したメチル化DNAプロフィルの存在を確認する工程、及び2）前記変異したメチル化DNAプロフィル内の遺伝子を同定する工程を含む。メチル化が変異したDNA配列の存在を確認する前記工程は、メチル化制限酵素消化、重亜硫酸塩処理DNAの存在下及び非存在下でのマイクロアレイ分析、及びDNAの直接的重亜硫酸塩シークェンシングから成る群から選択され（ただしこれらに限定されない）、さらに前記遺伝子を同定する工程はPCR分析によって実施される。
さらに別の実施態様では、世代間で伝達される影響を受けた対象の疾患又は機能不全（ここで前記疾患及び/又は機能不全は後成的で世代間伝達性のDNA変異と密接に関連する）を生殖系列DNAで治療する治療薬剤を開発する方法は、1）対象で疾患及び/又は機能不全と密接に関連する変異したメチル化DNAプロフィルの存在を確認する工程、2）前記変異したメチル化DNAプロフィル内の遺伝子を同定する工程、及び3）前記同定された遺伝子の発現を変化させる物質を同定する工程を含む。
下記実施例は、精巣の発育に対する内分泌かく乱物質の作用を、成獣の精子形成細胞の生存率及び発育（すなわち精子形成）に対する遅延作用とともに示す。
以下の実施例は、本発明を詳述し、さらに当業者による本発明の実施及び使用を容易にするために提供される。方法論及び結果は、用いられる処置及び方法の目標にしたがって変動しえる。本実施例は本発明の範囲を限定しようとするものではない。
【００１９】
実施例I
本実施例は、発生中の精巣のトランスクリプトームに対する内分泌かく乱モデル物質（メトキシクロル及びヴィンクロゾリン）の世代間伝達作用を明示して、精巣発育に対する前記の影響を決定する。
in vivo方法：ワシントン州立大学動物飼育場（Washington State University Vivarium）で飼育された、妊娠時期設定妊娠コロニーから入手した異種交配スプラーグ-ドーリー及び同系交配フィッシャーラットの妊娠母獣の腹腔内に、以前に記載したように[123]、ヴィンクロゾリン（100mg/kg/日）及びメトキシクロル（200mg/kg/日）を妊娠（F0世代）の8−15日胚（E8−E15、膣塗抹標本で精子陽性日をE0とする）から注射した。賦形剤（ゴマ油又はDMSOを投与した妊娠母獣をコントロールとして供した。これらの分析のために、少なくとも6ライン（注射した個々のF0の雌）をコントロール及び処置群のために調製した。コントロール及び処置群の雄のラットをP60−P180で分析のために採集した。処置F1の雄を処置F1の雌と交配してF2処置世代を調製し、さらに処置F2の雄を処置F2の雌と交配してF3世代を調製し、同じ態様でF3を交配してF4世代を調製した。コントロール群のラットを全世代について同じ態様で交配した。同系または兄弟間交配は調製しなかった。処置F2の雄と野生型の雌と交配することにより（合計6匹の同腹仔）、アウトクロス（outcross）群（VOC）を調製し、処置F2の雌を野生型の雄と交配することにより（合計3匹の同腹仔）戻しアウトクロス群（RVOC）を調製した。DNAメチル化分析のために、P6でフィッシャー系ラットのF1世代からコントロール（n＝4）及び処置（n＝4）雄を採集した（下記参照）。全ての方法がワシントン州立大学動物管理委員会によって承認された。実験におけるレプリケートのために用いられた動物の数（すなわちn値）はヴィンクロゾリン処置については以下のとおりである：F1（コントロール11、処置12）；F2（コントロール19、処置30）；F3（コントロール19、処置26）；F4（コントロール10、処置17）；VOC（18）；及びRVOC（6）。メトキシクロル処置動物数については、F1について（コントロール6、処置9）及びF2について（コントロール16、処置22）であった。
【００２０】
精子の運動性と濃度の分析：動物を殺し、精巣上体尾の精子の運動性を精巣上体尾の精子を用いて決定した。簡単に記せば、精巣上体を結合組織から取り外し、小切片を前記尾部から作成した。0.1%BSAを含む5mLの培養液に前記組織を37℃で10分間置いた。一部分を温スライド上に置き、静かにカバースリップで覆った。直ちに位相差顕微鏡を100倍の拡大で用い前記標本を調べた。運動性を有する全ての精子（急速な直進性、緩慢な直進性及び非直進性を含む）をWHOカテゴリーにしたがって数えた[127]。運動性精子対精子総数（動かない精子を含む）のパーセント比を算出した。精巣上体精子数は、いくつかの改変を含む以前に記載された方法にしたがって同じ精巣上体サンプルを用いて決定した[128]。
組織学：組織をブアン（Bouin）固定液（Amresco, Solon, OH）で固定し、パラフィンで包埋し、続いて切片を標準的方法にしたがってヘマトキシリンとエオシンで染色した。ヴィンクロゾリン処置ではn＝50、コントロールではn＝42であった。
細胞アポトーシスの検出：精巣切片のアポトーシス細胞を検出するために、フルオレセインin situ細胞死検出キット（Roche Applied Science, Indianapolis, IN）を用いた[123]。このシステムは、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素（TUNELアッセイの原理を用いてポリマーテールを形成する）を用いてフルオレセイン-12-dUTPをDNAの3'-OH末端に酵素的に取り込むことによって、アポトーシス細胞に由来する分断化DNAを測定する。蛍光性アポトーシス細胞を共焦点顕微鏡で画像化し、精巣横断面当たりのアポトーシス細胞数を定量した。各世代に対し、ヴィンクロゾリンについては最小でn＝8、コントロールについてはn＝6であった。TUNEL分析に用いた全ての横断切片が正常な精巣の形態学を示した。
DNAメチル化アッセイ：コントロール及び内分泌かく乱物質処置P6精巣又は精巣上体精子から単離したDNAのメチル化状態では、以前に記載された[129, 131]、メチル化感受性制限酵素の組合せ及びPCRアプローチが用いられた。簡単に記せば、単離したゲノムDNAをRsaIとともに、メチル化感受性（HpaII）又は非感受性（MspI）制限酵素とともにインキュベートし、続いてメチル化部位を増幅するように設計した10プライマーセットを用いるPCRを実施した。PCR生成物を電気泳動により分離し、Sybrグリーン染色（Molecular Probes, Eugene, OR）で可視化し、内分泌かく乱物質の作用を特異的バンドの有無によって決定した。問題のPCR生成物を単離しクローニングし、さらに配列を決定しBLAST Genbank解析[51, 52]によって染色体上の位置を決定した。P6精巣分析を異なる親の同腹仔に由来する4匹の動物を用いて繰り返した。
【００２１】
重亜硫酸塩シークェンシング：ゲノムDNAをDNeasyティシュキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いてF1及びF4の精子から単離し、RsaIで消化した。続いてゲノムDNAを重亜硫酸ナトリウムで処理し、その後以前に確立された方法[126, 132, 133]を実施した。簡単に記せば、5μgの消化DNAをNaOHで変性させ、続いて4.0Mのメタ重亜硫酸ナトリウム（pH5.0）で16時間55℃にて処理した。脱塩後、DNAをNaOHで脱スルホン化し、中和して酢酸アンモニウム及びエタノールで沈殿させた。DNAサンプルを30μLのトリス緩衝液（1mM、pH8.0）に再懸濁した。配列特異的プライマーを作成して、問題の領域を増幅した。PCR生成物をpGemT Easyベクター（Promega Corporation）でクローニングし、配列を決定した。CpG部位のメチル化部位の分析のために、各PCR生成物から約35クローンの配列を決定した。変異メチル化状態の確認には、重亜硫酸塩処理後の配列の比較を必要とした。リゾホスホリパーゼPCR重亜硫酸塩分析のためのプライマーは、5'GGT ATA TAT AGA GGA AGG TAG GTA GG3'及び5'TAA AAA CCT CCA AAA AAC AAA CAC T3'であった。
統計解析：アポトーシス細胞数、精子運動性及び精子数のデータはSASプログラムを用いて解析した。値は平均±SEMとして表した。統計解析を実施し、ペアードスチューデントｔ検定を用いて処置の平均及び対応するコントロール間の相違を決定した。1つの実験のデータを平均し、解析のための1レプリケートとして用いた。各データ点に付き6−30の個体を用いてin vivo実験を繰り返した。統計的有意差はP＜0.05で確認した。
【００２２】
実験1
内分泌かく乱物質の潜在的に有害な作用を強調し、最適なタイミングを特定するために、F1世代のみに関する実験が以前に記載された[120, 121]。妊娠母獣におけるメトキシクロル及びヴィンクロゾリン（すなわち抗アンドロゲン性内分泌かく乱物質）の使用に関するこれらの実験は、発生を通して性決定又は全体的な精巣の組織学に対して主要な作用を示さなかった。動物は子宮内E8−E15で暴露され、続いて精子形成の欠陥がF1世代の思春期及び成獣で観察された[120, 121]。処置動物は精子形成細胞のアポトーシスの増加を示した。類似の結果が、両内分泌かく乱物質について生後20日目又は60日目で観察された。この精子形成細胞の生存の低下に加えて、精子の運動性及び形態もまた障害されることが判明した[120, 121]（図1）。興味深いことに、子宮内のE15−E20（すなわち出生頃のE20）で同じ用量の内分泌かく乱物質に暴露された動物は精子形成細胞の欠陥を示さなかった[120, 121]。したがって、発生のE8−E15期における暴露のみが後の成獣期の精子形成に対して影響を与え、精巣の発生のE15を過ぎた場合には影響は観察されなかった。これは、E15後の成長期と比較して、E10−E15期の間の重大なプロセス、例えば生殖細胞の再メチル化、索形成及び性決定と相互に関連する。暴露にE15後のラットを用いた、精巣に対する内分泌かく乱物質の作用に関する以前の実験は、この重要なE10−E15期を逃していたために作用を見落とした可能性は高い。
E15−E20の間のメトキシクロル及びヴィンクロゾリンの一過性暴露は、いずれも生後/成獣期の精子形成に対して作用を示さなかったという観察のために、E8−E15から観察された作用は、人工的産物（例えば離乳期に暴露された母獣からのミルク伝播による出生後の暴露、又は暴露母獣による寝わらの汚染）のためではない。なぜならばE8−E15もE15−E20も同じ潜在的な伝播を有しえるからである。さらにまた、合計体重に対する影響はいずれの内分泌かく乱物質処置からも観察されず、観察された影響は成長速度に対する作用のためではないことを示した。したがって、F1世代で観察された内分泌かく乱物質の作用は、E8−E15期の間の精巣の発育及び生殖細胞成熟に対する局部的な影響のためであり、発生後期における有害作用のためではない。
この実施例で述べた世代間伝達性作用のいずれも内分泌かく乱物質の毒性によるものではなかった。なぜならばその後妊娠母獣も幼獣ラットもその後暴露されておらず、F0の妊娠母獣のみが暴露されただけだからである。したがって、観察された精子形成の欠陥は、性決定時期における一過性の胚の精巣発育に対する内分泌かく乱物質の作用のためであり、暴露の人工産物でも毒性によるものではないようである。
【００２３】
実験2
ヴィンクロゾリンを用い、F1世代の雄動物を別の親の同腹仔のF1世代のメスと交配してF2子孫を得た。引き続いて4世代の交配を継続し、十分な数の動物を得て兄弟内の同種交配による人工産物を回避した。生後60日から180日のF1、F2、F3及びF4世代の成獣雄を採集し、組織学的調査のために精巣を単離した。精巣上体尾の精子を精子数及び運動性測定のために採集した。F1世代の最初の妊娠母獣（F0）のみが一過性の内分泌かく乱物質処置を受けた（E8−E15）。コントロール群の動物は、F0妊娠母獣の賦形剤処置の後で分析のために類似の態様で交配した。細胞アポトーシス分析によって、ヴィンクロゾリン処置動物では2−3倍増加の精子形成細胞アポトーシスがF1、F2、F3及びF4の全世代で示された（図1A）。ヴィンクロゾリン処置動物の全世代（F1−F4）で、精子数はほぼ20％、精子の前進運動性は20%減少した（図1B及び1C）。分析した全ての雄の90%を超える動物が精子形成細胞アポトーシスの増加を示し、全世代のほとんど全ての雄が影響を受けた。
異なる内分泌かく乱物質、メトキシクロルを用いて、同様な実験を実施した。胚の一過性のメトキシクロル暴露（E8−E15）の後で、F1及びF2動物の両世代で類似の表現型が観察された（図4）。したがって、ヴィンクロゾリン及びメトキシクロルの両物質が、精子形成能及び精子生存率で世代間伝達性欠陥を誘発した。
世代を超えて伝達される表現型は雄の生殖系列を介して伝達されるのか否かを決定するためにアウトクロス実験を実施した。ヴィンクロゾリンF2世代の雄（すなわちF0処置母獣の雄の子孫）を野生型の未処置コントロール雌と交配させ、その仔を分析した。ヴィンクロゾリンアウトクロス（VOC）の雄もまた精子形成細胞のアポトーシスが増加し精子数及び運動性は低下した（図1）。処置F0母獣のF2世代の雌の子孫及び野生型雄との戻しヴィンクロゾリンアウトクロス（RVOC）は精子形成細胞に対して影響を示さなかった（図1）。したがって、内分泌かく乱物質によって誘発される世代間伝達性表現型は、雄の生殖系列を介して伝達されるようである。
【００２４】
コントロール及び処置動物由来の精巣の組織学は、調査した生後60日の全ての動物について、ヴィンクロゾリンF1−F4世代においても類似していた。しばしば定期的に、90日齢を超える雄のラットは小精巣及び重度の精子形成低下を伴う生殖能低下を発症した。これは合計50匹のF1、F2、F3及びF4世代動物のうち4匹で生じた。したがって世代間伝達ヴィンクロゾリン動物の8%が完全な生殖能低下を発症した。42匹のコントロールF1−F4世代動物のいずれも生殖能低下を発症しなかった。選択した生殖能低下ヴィンクロゾリンF3世代動物についての精巣の組織像を図2に示すが、正常な精子形成消失及び異常な輸精管の組織像を示している。コントロールF3雄は正常な精子形成をもつ正常な組織像を示した（図2）。90日齢を超える動物の大半が生殖能を有していたが、ほぼ20%が精子形成能の劇的な低下を発し、一方、調査した全世代で8%が完全な生殖能低下を発症した。ヴィンクロゾリンアウトクロス（VOC）の雄でもまた生殖能低下が増加したが、処置雌との戻しアウトクロス（RVOC）は生殖能低下を示さなかった。生殖能を有していた処置雄は、調査したF1−F4世代の任意のコントロール動物と比較したとき、同腹仔の数、新生時期の幼獣の体重又は体重当たりの精巣重量には変化を示さなかった。処置雄子孫のほとんど全てが図1に示した最低限の表現型を示した。
世代間伝達的態様における、内分泌かく乱物質により誘発される精巣の表現型の伝達は、雄の生殖系列の後成的変異を必要とする。生殖系列の伝達に影響を与えることがこれまでに判明している唯一のメカニズムは、被刷り込み遺伝子のメチル化パターンを含む。これまでの実験は全ゲノムに対する内分泌かく乱物質の影響を調べた。内分泌かく乱物質がメチル化における変異を促進することが可能か否かを決定するために、生後6日目（P6）の精巣をヴィンクロゾリン処置F0母獣の雄のF1子孫及びコントロール動物の雄から採集した。フィッシャーラットは低い多型性がメチル化実験をより定常的にし、再現性を与えるので、このラットを使用した。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を用いるメチル化感受性制限酵素消化分析を以前に記載 [129, 130]したように用いて、DNAメチル化パターンにおける変化を判定した（図5）。親の異なる種々の同腹仔に由来する多数の動物（n＝4）をコントロール及び処置動物で分析した。ヴィンクロゾリン誘発メチル化パターン変異はレプリケート動物で類似していた。ほぼ25の別個のPCR生成物が同定され、前記は、内分泌かく乱物質処置由来の明白な変異DNAメチル化パターンを有していた。メチル化パターンにおける代表的な変化は図3Aに示されている。
【００２５】
このメチル化実験を、ヴィンクロゾリン処置に応答して明白な変異メチル化をもつDNAフラグメントのいくつかを単離しクローニングすることによってさらに拡大した。このDNAフラグメントの2つの配列を決定し、染色体6q32及び8q32上のCpG富裕領域にマッピングした（図3B）。クローン7は6q32にマッピングされ、前記はリゾホスホリパーゼ（LPLase）遺伝子（GenBankアクセッション番号NM144750.1）内に存在していた。LPLaseは、重要な生物活性をもつ脂質の合成及び関連するシグナリングに必須の酵素である[134]。クローン17は8q32にマッピングされ、性状未決定タンパク質（“サイトカイン誘発性SH2 STAT様含有タンパク質”（GenBankアクセッション番号AJ243907）と称される）の開始部位の1kb内に存在する。雄の生殖系列を介する変異メチル化パターンの後成的で世代を超えた伝達を究明した。PCRプライマーをクローン17遺伝子（サイトカイン誘発性SH2 STAT様タンパク質）のフランキング領域に対して設計し、メチル化感受性制限酵素消化による変異メチル化の解明に用いた。精巣上体の精子をヴィンクロゾリンF2及びF3世代動物から分析のために単離した。図3Cで示されるように、コントロール動物はPCR生成物を示したが、ヴィンクロゾリンF2及びF3動物は示さなかった。コントロールRsaI消化物は全てのサンプルでPCR生成物を有していた。したがって、ヴィンクロゾリンF2及びF3世代の選択した精子サンプルは、コントロールサンプルと比較してこのクローン17遺伝子に変異したメチル化を有するようであった。メチル化の変化を確認するために、オルタネート重亜硫酸塩DNA配列分析を用いた[131−133]。重亜硫酸塩処理分析によって、特定されたCpGアイランド内でのリゾホスホリパーゼ遺伝子の変異メチル化が確認された（図6）。この重亜硫酸塩変異配列は、分析したヴィンクロゾリン処理精子DNAサンプルのほぼ25%で観察された。これらの結果は、内分泌かく乱物質は、哺乳動物の雄の生殖系列のDNAメチル化パターンにおいて後成的で世代を超えて伝達される変化を誘発することを示している。
【００２６】
これらの結果は、少なくとも2つの異なる内分泌かく乱物質、ヴィンクロゾリン及びメトキシクロルは、性決定の決定的な時期（ラットではE8−E15）（ただしそれより後期（E15−20）ではない）の胚への一過性の暴露後に精子形成能低下を有する成獣雄の精巣表現型及び雄の生殖能低下を促進することを示している。調査した他のいずれの組織においても肉眼的異常は観察されず、血中テストステロンレベルは全ての動物で正常であることが見出された。この表現型は世代間伝達性であり、雄の生殖系列のDNAメチル化変異と密接に関連している。この表現型は、ヴィンクロゾリンの全世代のほとんど全ての雄で観察され、したがって遺伝子突然変異（例えばセグリゲーション）が主要因子ではないようである。生殖系列に対するこの後成的で世代を超えて伝達される作用は、多様な他の疾患を誘発する蓋然性が高い。
雌の動物では、予備的データは雌の卵巣に対しては主要な作用を示していないが、多数の異常妊娠による所産がヴィンクロゾリン世代（F1、F2及びF3）の妊娠中の雌で観察されたが、コントロールでは観察されなかった。この異常な表現型は、死亡、重度の貧血及び血液細胞の欠陥を含む子癇前症と類似性を有し、ヴィンクロゾリン世代の雌の全妊娠のほぼ15%で発生した。他の症状は、例えば前立腺の異常、腫瘍発生、異常な免疫系の活性化及び未成熟な加齢が、内分泌かく乱物質の後成的で世代間伝達性の作用によって誘発されえる。
これらの結果は、環境性因子（例えば内分泌かく乱物質）が、哺乳動物の雄の生殖系列の明白な再プログラミングを介して、後成的で世代間伝達性（すなわち多世代、F2）の表現型（雄の生殖能低下）を誘発することができることを示している。特に、雄の生殖細胞DNAのメチル化に対する内分泌かく乱物質の後成的影響を示すデータは、胚の性決定期間に生殖細胞の再メチル化が要求されるという観察と相関性を示し、観察された世代間伝達作用のための原因メカニズムを提供する。
F1世代に関する以前の実験[120, 121]は、本明細書の実施例で観察された後成的で世代間伝達性の表現型を明示できなかったが、明瞭に毒物学の欠如を示し調査するべき表現型を明確にした。
【００２７】
実施例２
性腺の性決定期における内分泌かく乱物質暴露による雄の生殖系列の世代を超えて伝達される後成的な刷り込み
精子の採集：上記実施例IIで述べたように、ヴィンクロゾリンを用いて妊娠8−15日胚（E8−15）ラットを処理した。簡単に記せば、4ライン（個々のF0処置雌動物）をコントロール用に調製し、さらに4ラインをヴィンクロゾリン実験群用に調製した。F1ヴィンクロゾリン世代の雄をF1ヴィンクロゾリン世代の雌と交配して、F2ヴィンクロゾリン世代を調製し、さらにF2ヴィンクロゾリン世代動物を交配して、F3ヴィンクロゾリン世代動物を調製した。同じ態様で、コントロール群のラットを全ての世代のために交配した。兄弟間交配が生じないようにして同系交配の人工産物を一切回避した。コントロールの雄ラット及びヴィンクロゾリン世代動物を生後60日−80日（P60−P80）で分析のために採集した。動物を安楽死させ、精巣上体尾の精子を更なる実験のために採集した。簡単に記せば、精巣上体を切り出し、以前に記載されたように[121]、1%BSAを含む予め温めたF12培養液に37℃で静置した。DNA単離のために精子を培養液から採集した。フィッシャーラット（CDF）の同系交配系統を最初のメチル化スクリーニングに用い、DNA多型性の欠如をもたらす候補メチル化部位を同定した。異種交配された多型性によって隠蔽される後成的作用を排除し、観察されたメチル化の変化を確認するために、スプラーグ-ドーリー（SD）ラットの異種交配系統を、重亜硫酸塩分析に用いてF1−F3世代間のメチル化の変異を究明し、さらにマイクロアレイ遺伝子発現データのために用いた。
DNAメチル化アッセイ：CDFコントロール及びヴィンクロゾリン世代の精巣上体精子から単離したDNAのメチル化状態を、上記の実施例Iに記載したメチル化感受性制限酵素及びPCR方法の組合せ（MSRE-PCR）を用いて決定した。簡単に記せば、ゲノムDNAを精子サンプルからDNeasyティシュキット（Qiagen, Valencia, CA）を用いて単離した。コントロール及びヴィンクロゾリン世代精子DNAのそれぞれ2マイクログラム別々に、RsaI及びメチル化感受性酵素HpaII又は非感受性酵素MspIのどちらかを用いて消化し、続いて固有のプライマーセット（表1）を用いてPCRを実施した。PCR生成物を電気泳動によりポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色によって可視化した。コントロール及びヴィンクロゾリン世代の精子DNA間での有無が再現性をもって示されたPCR生成物（すなわちバンド）を染色したゲルから切り出し、同じPCRプライマーセットを用いて再度増幅し、続いてクローニングして配列を決定した。そのDNA配列及び染色体上の位置をNCBIラットゲノムデータバンクBLASTシステムを用いて決定した。
【００２８】
【表１−１】
2008539797.tif 000003
【表１−２】
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【００２９】
亜硫酸塩シークェンシング：亜硫酸塩シークェンシングを用いてDNAメチル化パターン及びその変化の性状を調べた。DNeasyティシュキットを用いて、ゲノムDNAをコントロール並びにヴィンクロゾリンF2及びF3世代精巣上体精子から単離した。上記の実施例Iに記載したように、ゲノムDNA（10μg）をRsaIで消化し、続いて重亜硫酸塩で処理した。精製した後、重亜硫酸塩変換DNAをPCRのための鋳型として用いた。各候補物のための重亜硫酸塩プライマーは、MethPrimer（www.urogene.org/methprimer）システム（Li and Dahiya, 2002）を用いて設計した（それらは表2に列挙されている）。配列特異的プライマーを作成して問題のCpG領域を増幅してメチル化パターンの性状を決定した。増幅のためのPCR条件は以下のとおりであった：ネステッドプライマーを用いて30サイクル、その後さらに30サイクル（95℃で30秒、50℃で45秒及び72℃で50秒）、続いて改変1ｘ緩衝液を用いて72℃で5分（10ｘ改変緩衝液：166mMの(NH4)2SO4、670mMトリス（pH8.8）、67mMのMgCl2、100mMのβ-メルカプトエタノール）。PCR生成物をpGEM-Tイージーベクター（Promega）でクローニングし、Big-Dye Terminator（Applied BioSystems）を用いて配列を決定した。各PCR生成物から得たほぼ50個の別個のクローンの配列を決定して、同定したCpG部位のメチル化状態の性状を決定した。最低限3匹の別個のコントロール及びヴィンクロゾリンF2又はF3世代の動物の混合物を用いて分析した。メチル化状態間の統計的相違はフィッシャーの精密検定（Fisher's Exact Test）を用いて決定した。
【００３０】
【表２−１】
2008539797.tif 000005
【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
2008539797.tif 000008
【００３１】
ゲノムDNA及びメチル化感受性制限酵素PCR：ゲノムDNAを別個のコントロール及びヴィンクロゾリンF1−F3世代の精巣上体精子サンプルから単離した。合計1μgのゲノムDNAをメチル化感受性HpaII又はAciI酵素を用いて消化した（37℃、6−12時間）。消化したDNAを沈殿させ、30μLの蒸留水に溶解した。続いて3μL部分を、特異的プライマーを（表1）含む30μLの反応物中でPCRによって分析し、25サイクルに付し、このPCR生成物を1.5%アガロースゲル上で電気泳動により分離した。コントロールとヴィンクロゾリンF1−F3世代精子サンプル間の相違を、高い最適消化性能をもつことが判明した選択遺伝子について決定した。
マイクロアレイ分析：上記の実施例Iに記載したように、コントロール並びにE16のヴィンクロゾリンF1及びF2世代動物の13、14及び16日胚（E16）の精巣からRNAを採集した。RNAをAffymetrix（Affymetrix, Santa Clara, California）ラット230A遺伝子チップとハイブリダイズさせた。ワシントン州立大学（Pullman, WA）の生殖生物学センターのゲノミクスコア（The Genomics Core）が、以前に記載したように分析を実施し、前記は参照により本明細書に含まれる[149, 150]。簡単に記せば、細胞RNAをcDNAに逆転写し、続いてビオチン標識RNAに転写した。続いてビオチン標識RNAをAffymetrixラット230A遺伝子チップとハイブリダイズさせた。各遺伝子セットは16対の24-merオリゴヌクレオチド（遺伝子に特異的な１つのセンス鎖及び比較用陰性コントロールとして使用するための単一点変異をもつ1つのアンチセンス鎖を有する）で構成される。続いて、フィコエリスリン結合アビジンを用いて標識することによってビオチン添加RNAを可視化した。このマイクロアレイをヒューレット-パッカードのジーンアレイスキャナー（Hewlett-Packard Co., Palo Alto, CA）でスキャンした。
【００３２】
バイオインフォーマティクス：大半のデータ分析は、アフィメトリクス・マイクロアレーシュートソフトウェア（Affymetrix Microarray Suit Software, Affymetrix, Santa Clara, California）を用いて実施した。この実験の大半で、提供された比較分析ソフト及び上記の実施例Iに記載した分析パラメーターが用いられた[150]。各コントロール並びにヴィンクロゾリンF1及びF2世代のE16精巣について2回繰り返し実施し、前記実験で4回の比較が可能であった。4回の比較全てで定常的発現を示し、さらに少なくとも50の相対的ハイブリダイゼーション強度を有した遺伝子のみを分析に含めた。基本的な発現の分析は、マイクロアレイシュートソフトウェアによりアフィメトリクスデータベースにアクセスすることによって実施した。経路分析は、経路アシストジーンスプリングソフトウェア（Pathway Assist Gene Spring Software）（Silicon Genetis）によって実施した。
上記実施例Iに記載したように、妊娠ラットを胚の性腺性決定期（E8−E16）に抗アンドロゲン性内分泌かく乱物質ヴィンクロゾリンに一過性に暴露した。続いて、コントロール及びヴィンクロゾリン処理F0母獣からF1、F2及びF3世代子孫を調製した。コントロール（賦形剤処理、n＝4）及びヴィンクロゾリン処理（n＝4）のために使用されるF0母獣は同腹の姉妹であり、その結果、コントロールとヴィンクロゾリン世代の遺伝的背景は類似していた。コントロール及びヴィンクロゾリン世代動物は同じ条件で（すなわち飼育部屋、ラック、飼料）維持したが、別個のケージで維持された。コントロール及びヴィンクロゾリン（F1−F3）世代の雄は成獣（すなわち90−80日齢）のときに安楽死させ、続いて精巣上体精子を採集しDNAを単離した。これらの精子DNAサンプルを用い、コントロールとヴィンクロゾリン世代の雄の生殖系列間の潜在的な後成的変化（すなわちDNAメチル化）を究明した。
【００３３】
F3世代サンプルを用い、コントロールとヴィンクロゾリン世代精子間のDNAメチル化変異を同定した。この分析によって、観察された変化は世代を超えて伝達される後成的なものによるものであり、F1世代に存在しえる毒物学的なものによるものではないことが確認された。このメチル化分析は、コンセンサスCpGメチル化部位に対する別個の10PCRプライマーセットの使用を必要とする感受性制限酵素（MSRE）方法を用いた（MSRE-PCR）。最低限3匹の別個の動物を含む3つの別個の調製物から得た、コントロールとヴィンクロゾリンF3世代動物の精子DNAを分析した。１セットのPCRプライマーについての代表的なゲルが図7A−７Cに示されている。前記では3つのコントロール及びヴィンクロゾリンサンプルが示されている。メチル化感受性制限酵素HpaII（H）消化における違いは、ヴィンクロゾリンサンプルにはPCR生成物（バンド）が存在するが、コントロールサンプルには存在しないことを示している（図7）。3匹のレプリケート動物のうち最低限2匹でPCR生成物（バンド）に違いが出現したならば、それらを更なる分析のために選んだ。この分析によって、コントロールとヴィンクロゾリン精子サンプル間に潜在的なDNAメチル化変異をもつ34の候補物が得られ、1−34と番号を付した（表1）。候補物#19−22について代表的な違いが図7に示されている。他のゲル及び候補物については図8に示されている。興味深いことには、選ばれた全ての候補物がヴィンクロゾリンサンプルに存在したが、コントロールサンプルには存在しなかった。コントロールサンプルには存在するが、ヴィンクロゾリンサンプルには存在しない候補物はなかった。全ての候補物についてのPCR生成物（すなわちバンド）をゲルから切り出し、サブクローニングし、続いて配列を決定した。候補物の性状決定は表1に示されている。2つ以上の候補物番号が一緒に存在する場合は（例えば2、3、24）、別個の候補物に類似の配列が存在することを示している。候補物の配列にもっとも近い遺伝子がGenBankアクセッション番号とともに列挙されている。候補のDNAメチル化部位の物理的地図（すなわち位置）は、DNAのプロモーター、エキソン、イントロン又は遠位非コード領域中の存在として示されている（表1）。配列が問題の遺伝子の転写開始部位の1000bp上流内に存在する場合は、前記配列はプロモーター内にあると考えられた。全ての候補DNAメチル化配列の染色体上の位置は図9A−9Bに示されている。メチル化部位変異候補物は、主要なホットスポット領域をもたない種々の常染色体上に存在し、性染色体上には存在しない。前記ラットのゲノムは完全ではなく、したがっていくつかの候補配列は位置が決定されず、性状が未だ確定されていない染色体領域に存在するようである（図9A−9B）。したがって、MSRE-PCRスクリーニングによって、潜在的な変異メチル化部位を有する25の個々の候補DNA配列（前記はコントロールとヴィンクロゾリンF3世代精子DNAサンプル間で異なっている）が同定された（表1）。下記で考察するように、これら候補物のいくつかは、特定の遺伝子のプロモーター、エキソン又はイントロンに分類され、一方、他のものは、遺伝子に対して遠位側の非コード領域に存在し、もっとも近い遺伝子が挙げられている（表1）。
【００３４】
これらの候補物（表1）がDNAメチル化において固有の変異を有するということを実証するためには、重亜硫酸塩シークェンシング分析が要求された。重亜硫酸塩は、CpGがシトシンの5'位でメチル化されないかぎり、シトシン（C）残基をチミン（T）残基に変換する（メチル化は変換を阻害する）。特別な重亜硫酸塩プライマーを用いて、重亜硫酸塩変換DNAを増幅し、続いて個々のクローンの配列を決定してそれらのメチル化状態についてCpG部位を判定した。各候補物のために用いた重亜硫酸塩プライマーは表2に列挙され、候補物の各々の分析は下記に記載されている。各候補物の分析には最低限3匹の別個のコントロール及びヴィンクロゾリンF2及びF3動物が含まれ、ほぼ50の別個のサブクローニングDNAサンプルが配列決定された。統計的に有意なメチル化の変化を含む個々の候補物の各々についての重亜硫酸塩分析は図10A−10Qに示されている。メチル化部位の染色体上の位置及びもっとも近い遺伝子が、候補部位のDNA配列とともに示され、前記配列の潜在的なメチル化CpG部位には下線が付され、さらに星印（*）はコントロールとヴィンクロゾリン世代サンプル間で異なるメチル化状態を有する特定のCpGを示している。種々のクローンの全重亜硫酸塩配列分析のためのメチル化分析は、メチル化CpG部位については黒丸で、非メチル化部位については白丸で示されている。候補物#1は、8q23にマッピングされ、最近注釈を付された仮説的遺伝子LOC503205（ホスホグリセレートムターゼB鎖と類似する）のエキソン/イントロン領域に内に存在し、もっとも近い公知の遺伝子は神経細胞粘着分子1（NCAM1）である（図11A）。4つの潜在的なCpG部位が存在するが、このDNA配列の高いGC含有量は特定の重亜硫酸塩プライマーの設計を妨げ、その結果重亜硫酸塩メチル化分析が不可能であった（図11A）。候補物#2、3、24は6q12にマッピングされ、非コード遠位領域に存在し、もっとも近い遺伝子はロイシン富裕タンパク質157（Lrpprc）及びタンパク質ホスファターゼ1B（Ppm1b）である（図10A）。重亜硫酸塩メチル化分析は、4つの潜在的なCpGを示し、2つは44%及び20%に高度にメチル化されている（図12及び図13）。候補物#4、19は13q21にマッピングされ、カルシウムチャネル、電圧依存性L型α1Eサブユニット（Cacnale）のイントロン内に存在する（図11B）。重亜硫酸塩メチル化分析によって、検出可能なメチル化の相違を全く示さない6つの潜在的なCpGが示された（図11）。候補物#5、6、9は4q42にマッピングされ、性状未決定遺伝子FLJ22405タンパク質に対してエキソン/イントロン内に存在する（図10B）。重亜硫酸塩メチル化分析によって、9つの潜在的なCpGが明示され、2つは50%及び35%に高度にメチル化されていた（図12及び13）。候補物#7は16q16にマッピングされ、アンキリンリピートタンパク質28（Ankrd28）及びポリペプチドN-アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ（Galnt12）に対し遠位側の非コード領域内に存在し（図11C）、重亜硫酸塩分析後に検出可能な相違を示さなかった。候補物#8は1q42にマッピングされ、リプリン-α1及びデスドメインを介して結合したFas（TNFRSF6）（Fadd）に対して遠位側の非コード領域内に存在する（図10C）。重亜硫酸塩メチル化分析によって5つの潜在的なCpG部位が明示され、1つは65%に高度にメチル化されていた（図12及び13）。候補物#10は特定の染���体上にマッピングされず、性状は不明であり（図9）、したがって重亜硫酸塩によるメチル化分析は可能ではなかった（図11D）。候補物#11は4q24にマッピングされ、60Sリボソームタンパク質L7a及び性状未決定のRIKEN cDNA1200009022に対して遠位側の非コード領域に存在する（図10D）。重亜硫酸塩メチル化分析によって3つの潜在的なCpGが明らかにされ、2つは49%及び21%に高度にメチル化されていた（図12及び図13）。候補物#12は14q11にマッピングされ、インポーチン7と類似する仮説的遺伝子、LOC501910に対してプロモーター内に存在する（図10E）。重亜硫酸塩メチル化分析によって6つの潜在的なCpG部位が明らかにされ、1つは51%に高度にメチル化されていた（図12及び図13）。候補物#13は19q11にマッピングされ、Nfixタンパク質に対してイントロン内に存在する（図10F）。重亜硫酸塩メチル化分析によって17の潜在的なCpGが明らかにされ、4つは50−60%に高度にメチル化されていた（図12及び図13）。候補物#14、15は8q24にマッピングされ、ロイシン富裕反復ニューロン6A（Lrrn6a）に対して遠位側の非コード領域に存在する（図10G）。重亜硫酸塩メチル化分析によって4つの潜在的なCpGが明らかにされ、2つは27%に高度にメチル化されていた（図12及び図13）。候補物#16は17q12にマッピングされ、オプチネウリンのプロモーター/エキソン/イントロン内に存在する（図10H）。重亜硫酸塩メチル化分析によって6つの潜在的なCpG部位が明らかにされ、1つは79%に高度にメチル化されていた（図12及び図13）。候補物#17は13q24にマッピングされ、ニカストリン及びコアトマータンパク質複合体サブユニットアルファに対して二方向性プロモーター内に存在する（図10I）。重亜硫酸塩メチル化分析によって20の潜在的なCpG部位が明らかにされ、2つは55%及び30%に高度にメチル化されていた（図12及び図13）。候補物#20は染色体上にマッピングできず、性状は決定されていない（図9）。したがって重亜硫酸塩メチル化分析は可能ではなかった（図11E）。候補物#21、32は8q23にマッピングされ、ホスホグリセレートムターゼB鎖と類似する、最近注釈を付された仮説的遺伝子LOC503205のエキソン/イントロン領域に存在し（図10F）、重亜硫酸塩分析後にメチル化における相違は検出されなかった。もっとも近い公知の遺伝子は神経細胞粘着分子1（NCAM1）である。この潜在的なメチル化部位は候補物#1とは別個のものであるが、同じ仮説的遺伝子内に存在する。候補物#22は8q32にマッピングされ、tgolgin-1に対しイントロン内に存在する（図10J）。重亜硫酸塩メチル化分析によって5つの潜在的なCpG部位が明らかにされ、1つは67%に高度にメチル化されていた（図12及び図13）。候補物#23は7q22にマッピングされ、リボソームタンパク質、LOC503150及びU1核内小リボヌクレオプロテインサブユニット（snRP1c）と類似する仮説的遺伝子に対して遠位側の非コード領域に存在し（図11G）、重亜硫酸塩シークェンシング後にメチル化における相違は検出されなかった。候補物#25は5q24にマッピングされ、主要な尿タンパク質（Mup4）に対して遠位側の非コード領域内及び主要な尿タンパク質前駆体（MUP）、LOC502951の仮説的遺伝子内に存在し（図11H）、重亜硫酸塩分析を用いて検出されるメチル化には相違は存在しなかった。しかしながら、候補物#25の配列は、染色体5q24の異なる12の位置に存在する反復配列である。他���位置に存在する潜在的なメチル化の変化は、今後究明されねばならない。候補物#26は10q26にマッピングされ、アセチル補酵素Aカルボキシラーゼアルファ（Acaca）に対しプロモーター内に存在する（図10K）。重亜硫酸塩メチル化分析によって5つの潜在的なCpG部位が明らかにされ、2つは50%及び28%に高度にメチル化されていた（図12及び図13）。候補物#27、28は4q24にマッピングされ、ジンクフィンガータンパク質212に対しイントロン内に存在する（図10L）。重亜硫酸塩メチル化分析によって、8つの潜在的なCpG部位が明示され、2つは45%及び48%に高度にメチル化されていた（図12及び13）。候補物#29は11q11にマッピングされ、Runx1に対し遠位にある非コード領域内に存在し、細胞壁タンパク質Awa1p（LOC501772）と類似する（図10M）。重亜硫酸塩メチル化分析によって、6つの潜在的なCpG部位が明示され、1つは48％に高度にメチル化されていた（図12及び13）。候補物#30は染色体上にマッピングできず、性状は決定されていない（図11）。したがって、重亜硫酸塩によるメチル化分析はできなかった（図11）。候補物#31は3q23にマッピングされ、ウィスコット-アルドリッチ症候群タンパク質相互作用タンパク質（Waspip）及び仮説的タンパク質、LOC499811に対し遠位の非コード領域内に存在する（図10N）。重亜硫酸塩メチル化分析によって、4つの潜在的なCpG部位が明示され、1つは42%に高度にメチル化されていた（図12及び13）。候補物#33は6q12にマッピングされ、sine oculisホメオボックスホモローグ3（Six3）に対し遠位にある非コード領域内に存在し、Six2と予想される（図10O）。重亜硫酸塩メチル化分析によって6つの潜在的なCpG部位が明示され、2つは31%及び57%に高度にメチル化されていた（図12及び13）。候補物#34は9q37にマッピングされ、GTP結合タンパク質RAB12及びRasオンコジーンファミリーのメンバーに対しプロモーター内に存在する（図11J）。このDNA配列の高いGC含有量のために、重亜硫酸塩PCRプライマーを設計して全配列を分析することはできなかった。したがって、メチル化分析は部分的領域を除いて不可能であり、この部分的領域はメチル化の変化を示さなかった（図11J）。したがって、ヴィンクロゾリン世代の精子においてメチル化の変異を有する25の候補DNA配列のうち、15が、図12及び図13にまとめたように、特異的な高メチル化を有することが確認された。候補物のうち6つの性状を調べたが、DNAメチル化変異は検出されなかった。分析したこれら配列に対し基部領域内でメチル化が生じるか否かを、重亜硫酸塩分析を用いて確認することができる。2つの候補物#1（NCAM1/ホスホグリセレートムターゼと類似）及び#34（RAB12）は、高いGC含有量のために完全には分析できなかった。コントロールとして、公知の被刷り込み遺伝子H19[151]を分析して、メチル化の変化が誘発されたか否かを決定した。コントロールとヴィンクロゾリンF2/F3精子DNAサンプル間で、H19のメチル化に変化は検出されなかった（図10P）。
【００３５】
最初のMSRE-PCR及び重亜硫酸塩分析で用いたコントロールとヴィンクロゾリン世代の精子DNAは、F2及びF3世代の雄に由来していた。したがって、雄の生殖系列で観察された後成的変化は世代間伝達性であり、精子DNAで永久的にプログラム化されるように思われる。特定の候補DNA配列についてのメチル化感受性制限酵素分析を実施した（図14）。MSRE分析では、コントロールに対してヴィンクロゾリン世代精子DNAのPCR生成物を得るため候補物に対し遺伝子特異的PCRプライマーが必要とされた。F1、F2及びF3コントロール及びヴィンクロゾリン世代動物由来の精子DNAの分析によって、候補物#1、#14、#17/18、#27/28及び#33は全てF1−F3精子について類似のPCRの結果を示すことが示された（図14）。全てのヴィンクロゾリン世代の精子DNAサンプルでPCR生成物が観察されたが、コントロールでは観察されなかった。したがって、確認されたメチル化変化は世代間伝達性であり、雄の生殖系列に刷り込まれているように思われる。図10及び12に示されたメチル化における多様性のために、分析した候補物及びDNA配列の多くが、固有のMSRE分析を実施することができなかった。これら候補物のうちの1つ（#33）は、コンセンサスHpaII消化部位をもたなかったが、再現性をもって確かにDNAを消化し（図14）、また別の候補物（#27/28）は別のメチル化感受性制限酵素AciIを利用した。
これらの結果は、有毒物質への暴露により生じる雄の生殖系列の後成的変化は被刷り込み様の特徴を生じ、世代間伝達性であるらしいことを示している。
【００３６】
ヴィンクロゾリンによって誘発され、その後の世代に存在する雄の生殖系列における後成的変化の帰結が、同定したDNAメチル化部位と密接に関連することが確認された遺伝子の遺伝子発現を調べることによって究明された。16日胚（E16）の精巣をコントロール及びヴィンクロゾリンF1及びF2世代動物から単離し、続いてRNAを単離しマイクロアレイ分析を実施した。胚の精巣で発現されることが判明した遺伝子は図15A−15Cに示されている。他の全てのものはマイクロアレイチップ上に存在しないか又は検出限界未満であり、E16精巣では発現されていないことを示している。E13、E14及びE16の精巣発育における遺伝子発現プロフィルは15Aに提示されている。E16のF1及びF2コントロールがE16のF1及びF2ヴィンクロゾリン世代発現と比較されている。ankyrin 28、Ncstn、Rab12、Lrrn6aを含む多数の遺伝子がヴィンクロゾリンF1及びF2世代のE16精巣で発現を低下させた（図15A−15C）。コントロールと比較して、ヴィンクロゾリンF1及びF2世代のE16精巣で発現が増加した遺伝子はFadd、Pbm1b、Rps12及びWaspipであった（図15A）。したがって、図10及び12に示した遺伝子の高メチル化の作用は、胚における精巣の発育時において遺伝子発現の増加及び減少の両方を引き起こした。F3世代の分析によって、遺伝子発現の変化が世代間伝達性を継続するか否かが決定されるであろう。
【００３７】
候補物#1で同定された変異メチル化部位に最も近い遺伝子の1つ（NCAM1）の発現は、主として脳特異的である。脳のNCAMについての遺伝子発現の分析を実施した。成獣コントロール及びヴィンクロゾリンF3世代雄の脳を単離し、RNAを調製した。4匹のコントロール及び5匹のヴィンクロゾリンF3世代動物を別々に分析した。半定量PCRをNCAM1のために実施し、NCAM1のmRNAレベルがコントロールと比較してヴィンクロゾリン世代動物で有意に低下することが示された（図15B）。構成的に発現される内部遺伝子、リボソームタンパク質L19によって、RNAの完全性及びコントロールと等しいローディングが示された。このNCAM1の発現低下を定量し、10倍を超える発現低下がコントロールとヴィンクロゾリンF3世代の雄の間で観察された（図15C）。したがって、精子DNAにおける候補物#1の高メチル化は、ヴィンクロゾリンF3世代の成獣雄の脳のNCAM1発現の低下と密接に関連していた。観察を総合すれば、雄の生殖系列で確認された後成的変異は、発育中の期間における遺伝子発現と密接に関係するらしいということが示唆される。
確認された後成的変化と密接に関連する特定の遺伝子を潜在的な機能的関係について調べた。公知の機能をもつ遺伝子又は同族体について、経路アシストバイオインフォーマティクスプログラムを用いて、種々の遺伝子間の機能的連関を同定した（図16）。多数の細胞性機能及びプロセス（例えば増殖、成熟、運動性）が種々の遺伝子によって影響を受けるが、重要なクラスタリングは様々遺伝子の間で観察されなかった（図16）。
確認されたメチル化の変化と密接に関連する多数の遺伝子が種々の病的状態と関連性を有する（表3）。興味深いことに、これら遺伝子の全てが特定された疾患及び/又は遺伝子に対して後成的成分を有することが示された（表3）。したがった、後成的変異（DNAメチル化）及び/又は発現は多数の病的状態と密接に関連する。以前の文献とのこれらの相関性に加えて、6−12ヶ月齢のヴィンクロゾリン世代（F1−F4）動物は多様な病的状態又は異常を発達させる（表4）[153]。したがって、使用したヴィンクロゾリン世代動物は多様な疾患を発達させ[153]、雄の生殖系列の後成的プログラミングに変異を有する。観察を総合すれば、生殖系列DNA及び本実施例で同定した密接に関連する遺伝子における後成的変異は、多くの病的状態と密接に関連することが示されている（表3及び4）。
【００３８】
表３：候補遺伝子と密接に関連する関連疾患のまとめ
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【００３９】
表4：ヴィンクロゾリン誘発（F1−F4）世代間伝達性症状
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【００４０】
個々に提示した結果は、性腺の性決定時期における2つの別個の内分泌かく乱物質（すなわち抗アンドロゲン性ヴィンクロゾリン及びエストロゲン様メトキシクロル）に対する暴露は、4世代（F1−F4）にわたって成人開始疾患を促進することを示している。世代間伝達性症状を観察された高い頻度で促進する能力は、DNA配列の突然変異では説明することができない。ホットスポットDNA配列の突然変異は、一般的には0.01%未満の頻度で発生し、各世代で減少していく[14, 184]。世代を超えて伝達される後成的メカニズムは生殖系列の中心的な関与を必要とする。興味深いことには、始原生殖細胞は性腺の性決定時期に脱メチル化および再メチル化を経る[185, 186]。したがって、環境因子（例えば内分泌かく乱物質ヴィンクロゾリン）は、性腺の発育を変化させ、生殖系列のDNAメチル化プログラミングに影響を与えることができよう。これらの実施例は、胚性腺の性決定時期におけるヴィンクロゾリンへの暴露は、観察された世代間伝達性疾患の表現型と密接に関連する雄の生殖系列（すなわち精子）の後成的刷り込みを促進することを示している。
DNAのメチル化は、遺伝子発現[187]、哺乳動物の発生[188]及び疾患（例えば腫瘍形成）[10, 189, 190]の調節で決定的な役割を果たす後成的因子である。特異的なDNAメチル化パターンは、転写活性化複合体に応答するか、及び/又は遺伝子発現に影響を与えるクロマチン構造に影響を与える、遺伝子のプロモーター領域の能力を調節する役割を有しえる[191]。ほとんど全てのゲノムDNAのメチル化が受精後に“リセット”されるが[185]、被刷り込み遺伝子の小サブセットが規定のDNAメチル化パターンを維持し、前記は雄又は雌の生殖系列を介して伝達され、対立遺伝子座の発現の違いをもたらす[192−194]。被刷り込み遺伝子は、片親由来（a parent-of-origin）態様で単一対立遺伝子座的に（monoallelically）発現され、最近バイオインフォーマティクスによるアプローチによって600もの被刷り込み候補遺伝子がマウスゲノムで同定された[146]。これまでの研究で同定された全ての遺伝子について、特異的な単一対立遺伝子座発現パターンが直接決定されたわけではないが、父性対立遺伝子座の中心的関与が多数の世代の精子を調査することによって決定された。同定されたいずれのラット遺伝子もマウスの同族体も、報告された600の候補物のマウスリストには存在しないが［146」、種の違いが問題である可能性がある。これまでの実施例は、環境性因子は生殖系列を再プログラムして、新しい被刷り込み様遺伝子/DNA配列の存在を促進することができるという新規な観察を提示する。これらの新しい被刷り込み様遺伝子/DNA配列は、変異DNAメチル化パターンを獲得し、前記パターンは雄の生殖系列（すなわち父性対立遺伝子座）を介して後続世代（F1−F3）に伝達される。生殖系列の後成的再プログラミングが可能であることをこれらの観察は示唆している。個体及び後続の全子孫の世代を超えて伝達される後成的なバックグラウンドを変異させえる環境性因子の能力は疾患病因論に重大な影響を与える。
【００４１】
コントロール及びヴィンクロゾリンF1−F3世代の雄から精巣上体尾精子を採集し、DNAメチル化における潜在的な相違を明らかにした。これまでの実施例で用いた方法は、PCRを伴うメチル化感受性制限酵素分析（MSRE）を使用し、DNAメチル化における変異を同定する。この分析は、潜在的な変異メチル化を有する25の別個の候補DNA配列を提供した。メチル化結合タンパク質及びマイクロアレイを必要とする別の方法[195]が最近開発され、前記方法は、ここに引用することにより本明細書に含まれる。前記25の候補物の分析によって、15がDNAメチル化パターンに変化を有し、これらのパターンは世代間伝達性（すなわち被刷り込み様）であることが確認された。確認されなかった10遺伝子/DNA配列は、それらの単離に必要とされる方法から、“被刷り込み様”であると考えられる。フランキングDNA配列の更なる分析によって、特異的なメチル化変化を同定することができる。多数の変異DNAメチル化部位が、もっとも近くの遺伝子に対し遠位側の非コード領域に存在する。これらの部位は、遠位の遺伝子に影響を与えるクロマチン構造変化（例えばポジショニング）に中心的に関与しえる。NCAM1発現はこの潜在的調節の例である。
候補メチル化部位と密接に関連するいくつかの遺伝子の発現の分析によって、F1及びF2ヴィンクロゾリン世代の胚精巣において遺伝子発現の変異が示された。脳特異的遺伝子NCAM1の分析によって、ヴィンクロゾリン世代の雄成獣の脳におけるNCAM1発現の劇的な低下が明らかにされた。したがって、雄の生殖系列に対する世代を超えて伝達される後成的な刷り込みの効果は、特定器官における関連する遺伝子の遺伝子発現に対する影響である。環境性化合物ヴィンクロゾリン（すなわち殺カビ剤）は、雄の生殖系列の後成的再プログラミングを誘発し、新しい被刷り込み様遺伝子/DNA配列は、関連器官の関連する遺伝子の発現に影響を及ぼす。
【００４２】
DNAメチル化部位の変異に関連する遺伝子は、細胞粘着分子、イオンチャネル、シグナリング因子（例えばホスファターゼ及びGTP結合タンパク質）、転写因子、翻訳制御因子、及び膜タンパク質（表1）に及ぶ。バイオインフォーマティクス経路分析によって、種々の遺伝子間に重要なクラスター又は直接的関係は示されなかったが、細胞性プロセス（例えば増殖、成熟（すなわち分化）、運動性及びアッセンブリー（すなわち構造性））が、同定された遺伝子によって影響される。同定された全ての被刷り込み様DNA配列は、コントロール世代の精子DNAと比較して高度にメチル化されていた。この高メチル化は、刷り込みメカニズムに中心的に関与する潜在的なメカニズムを示唆している。
これまでの実施例で、雄の生殖系列における被刷り込み様遺伝子/DNA配列の世代間伝達性誘発が確認された。前記関連遺伝子の多数が、以下を含む公知の疾患（表2）と相関関係を有することが示された：アルツハイマー（ニカストリン）[153−158]、ポリモーダル侵害受容器（Lrppc）［159］、不全リンパ球症候群（Ankrd 28）[165, 166]、高血糖症（cacnale）［160−163］、開放隅角緑内障（optineurin）[168, 169]、急性骨髄性白血病（Runx1）［178］、ウィスコット-アルドリッチ症候群（Waspip）［179]及び全前脳症（Six3）[180, 182, 183]。したがって、確認された多数の後成的変化が、ヒトの疾患と後成的連関を有することが以前に示された遺伝子と密接に関連する。例として、神経細胞粘着分子1（NCAM1）は、神経管および脳の発育に必須であり、NCAM1における異常は、アルツハイマーを含む多数の脳疾患及び異常を引き起こす［153−158］。ヴィンクロゾリン世代の雄の成獣でNCAM発現の世代間伝達性の劇的低下が観察されている。さらにまた、ニカストリン（nicastrin）はガンマ-セクレターゼ複合体と相互作用し、正常なセクレターゼ膜機能のために必須である[196]。ニカストリンの阻害はガンマ-セクレターゼ除去活性を変化させ、アルツハイマー病の因子として連関されてきた[197]。疫学的研究は、アルツハイマー病は潜在的な父性伝達を示し、父方の寿命はこの疾患について危険因子であることを示した[198]。これらの観察を総合すれば、環境性因子は、脳疾患及びアルツハイマー病と密接に関連する2つの別個の遺伝子で被刷り込み様の後成的変化を誘発することができることを示唆している（これらの遺伝子は、前記疾患の潜在的因子としてそれらの後成遺伝学（epigenetics）を男性の生殖系列（すなわち父親の対立遺伝子座）を介して伝達する）。
【００４３】
本明細書の実施例で示したように、性決定期に胚をヴィンクロゾリンに暴露することによって、成人疾患の発生が世代を超えて促進される。これらの世代間伝達性疾患には、男性の生殖能異常、腫瘍発生、腎疾患、前立腺疾患及び免疫異常が含まれる[152]。精子DNAの後成的刷り込みを確認するために本実験で用いたヴィンクロゾリン世代動物は、ほぼ85%の頻度で発症する。したがって、確認された被刷り込み様遺伝子/DNA配列はこれら症状と密接に関連する。これら被刷り込み様遺伝子/DNA配列および種々の疾患との相関関係の更なる研究によって、以前には考慮されなかった新規な後成的診断及び治療標的が特定されるであろう。
後成遺伝学は多数の疾患及び異常と密接に関連するが、疾患の原因についてのこれまでの主要な理論的枠組みは、古典的な遺伝学及びDNA配列の突然変異を主要な因子として必要とする。発症率及び環境的影響における明瞭な領域的相違は、発症におけるさらに別の因子の存在を示唆した。これまでの実施例で提示した観察は、環境性化合物（内分泌かく乱物質）は生殖系列の後成的刷り込みにおける再プログラミングを誘発することができることを示している。生殖系列の永久的な後成的変化を促進する環境性因子の能力は、疾患の原因における後成的成分及び疾患に影響を及ぼす環境性因子の能力のための分子メカニズムを提唱する。この“世代間伝達性後成的変異誘導”は、性決定期の胚の発育に影響を与え、新しい被刷り込み様遺伝子/DNA配列の誘発を介して生殖系列を後成的に再プログラムし、続いて遺伝子発現における後成的変化をもたらし、病的状態の世代間伝達を促進する環境性因子（例えば内分泌かく乱物質）の能力を必要とする。この後成的病因論の更なる分析によって、新規な後成的診断及び治療標的が提供され、疾患の治療法が進歩するであろう。病因論に加えて、この世代を超えて伝達される後成的な突然変異はまた基礎的な発生生物学及びより広い生物学分野（例えば進化）にも影響を及ぼす。
【００４４】
参考文献
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【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】下記の実施例Iに記載したように、妊娠母獣F0のヴィンクロゾリン処置後の世代を超えて伝達される表現型を示す。P60−180のコントロール並びにヴィンクロゾリン処理スプラーグドーリーラットのF1、F2、F3及びF4世代、並びにヴィンクロゾリンF2世代の雄と野生型コントロール雌とのアウトクロス（outcross）（VOC）、並びにヴィンクロゾリンF2世代の雌と野生型コントロール雄との戻しアウトクロス（RVOC）における（A）精子形成細胞のアポトーシス、（B）精巣上体の精子数、及び（C）精巣上体の精子の運動性。コントロールとヴィンクロゾリンの世代動物間の統計的有意差は、P＜0.05に対し（*）によって示されている。各棒線の“n”値は、F1−F4、VOC及びRVOCについて10−30の範囲であった。
【図２】下記の実施例Iに記載したように、100日齢コントロール（A）及びヴィンクロゾリン（B）のF3世代動物の精巣の組織学検査の結果を示す（拡大200x）。ヴィンクロゾリンのF3世代動物は、精細管内に精子形成細胞を欠くことによって確認される、代表的な生殖能低下の雄である。
【図３】下記の実施例Iに記載したように、コントロール及びヴィンクロゾリンの精巣のDNAメチル化分析の結果を示す。（A）PCRを用いるメチル化感受性HpaII（H）制限酵素消化分析の代表的なゲル画像であり、コントロール動物（コントロール）及びヴィンクロゾリン処置動物（ヴィンクロゾリン）から得た生後6日目の精巣における影響を受けた代表的なバンド（矢印）を有する。各レーンは別個の動物個体を示す（n＝4）。（B）変異したDNAメチル化パターンを有するクローン7及び17と命名した2つの代表的なDNA配列のための固有の染色体上の選択配列の分布。（C）コントロール及びヴィンクロゾリン処置動物のF2並びにF3世代から得たクローン17（精巣上体精子のサイトカイン誘発性SH2 STAT様タンパク質遺伝子）のメチル化状態のメチル化感受性制限酵素PCR分析。提示されているバンドは、異なる動物の異なる同腹仔から採集された精子DNAの代表的なものであり、調べた8匹のF2動物の4匹、及び5匹のF3動物の2匹で一致している。
【図４】メトキシクロル処置後に世代を超えて伝達される現象を示す。F1及びF2世代におけるP60−120のコントロール及び処置フィッシャーラットの（A）精子形成細胞のアポトーシス、（B）精巣上体の精子数、及び（C）精巣上体の精子の運動性。世代内のコントロールと処置動物間の統計的有意差は、P＜0.05に対し（*）によって示されている。各棒線の動物数は6から12の範囲であった。
【図５】コントロール及び処置P6精巣のDNAメチル化分析を示す。PCRによるメチル化感受性H-HpaII＋RsaI（H）及び非感受性MspI＋RsaI（M）並びにコントロールとしてのRsaI（R）制限酵素消化分析の代表的なゲル画像であり、ヴィンクロゾリンへのin vivo暴露で影響を受けた代表的なバンド（矢印）（200bp）を示す。コントロール（コントロール）及びヴィンクロゾリン処置（処置）から得られた生後6日目（P6）の精巣が示されている。各レーンは、別個の動物のP6精巣の分析を示す（n＝4）。
【図６】変異メチル化パターンを有するリゾホスホリパーゼ（LPL）遺伝子のDNA配列を示す。塩基対32270685から32270889のLPLゲノム配列（GENBANKアクセッション番号NW_047762.1）。コントロールとヴィンクロゾリンの両世代動物の精子に存在するメチル化シトシン残基（太字のCG）には黒丸で印が付けられ、ヴィンクロゾリンF1−F4世代の精子サンプルで変異しているものには白丸で印が付けられている。
【図７】コントロール（C）及びヴィンクロゾリン（V）F3の精巣上体尾の精子のDNAメチル化の分析を示す。PCRによるメチル化感受性HpaII＋RsaI（Hレーン）、非感受性MspI＋RsaI（Mレーン）及び消化物としてのコントロールRsaI（Rレーン）制限酵素消化分析の代表的なゲル画像である。合致するコントロールとヴィンクロゾリンサンプル間で弁別的にメチル化されるように見えるバンドをHバンドについて拡大し、具体的な候補物#19、20、21、22について矢印で示されている。DNA100bpサイズラダーは左のレーン（Ma）に示されている。
【図８】コントロール（Con）及びヴィンクロゾリン（Tre）F3世代の精巣上体尾精子のDNAメチル化分析を示す。下記実施例IIで詳細に記載した、PCRによるメチル化感受性制限分析スクリーニングのゲル画像である。全ての候補物は右端に示されている。
【図９】各染色体（Chr）について各候補物（番号）の染色体上の位置及び物理的マッピングを示す。マッピングされていない未知の配列（UN）が表示されている。
【図１０】重亜硫酸塩シークェンシングによる候補物のメチル化状態を示す。各分析は、対象のDNA配列、アラインメント（矢印）を含む物理的染色体地図、及び重亜硫酸塩シークェンシングの結果を提供する。潜在的なメチル化シトシン残基は下線により印を付され、星印は変異メチル化CpG部位を示す。重亜硫酸塩シークェンシングは、非メチル化を示す白丸及びメチル化を示す黒丸を用い、下線を付したCpG部位を表す一連の丸印として提示されている。一連の丸印の各々は分析された個々のクローン化DNA配列を表している。ヴィンクロゾリン世代の精子DNAの統計的に有意な変異メチル化を有するCpGは星印（*）で示されている。
【図１１】下記の実施例IIに記載したように、重亜硫酸塩シークェンシングによる候補物のメチル化を、アラインメント（矢印）を含む物理的染色体地図、対象のDNA配列、及び提示された重亜硫酸塩シークェンシングの結果とともに示す。
【図１２】確認された各候補物についての重亜硫酸塩シークェンシングによって決定された変異メチル化変化のまとめを示す。パーセントメチル化は、コントロール又はヴィンクロゾリンのF2/F3世代の精子DNAについて丸印の色で示されている。星印（*）は統計的に有意な種々のメチル化の変化を示し、各丸印はDNA配列中の個々のCpG部位を表している。
【図１３】下記の実施例IIに記載したように、確認された各候補物の重亜硫酸塩シークェンシング分析によって決定された変異メチル化変化のまとめを示す。（斜線入りの枠は、提示の各部位について全てのメチル化百分率を有する統計的に異なる（p＜0.05）変化である）。
【図１４】メチル化感受性（HpaII又はAciI）制限酵素PCR分析を用いた、コントロール（C）及びヴィンクロゾリン（V）のF1、F2及びF3世代における精巣上体の精子のDNAメチル化状態を示す。候補物No 1、14、17、27及び33の消化物が提示されている。提示されたバンドは、各世代の種々の動物から得た代表的な精子DNAである。PCRプライマーは表2に提供されている。
【図１５】（A）コントロール及びヴィンクロゾリンF1及びF2世代並びに野生型（Wt）コントロールの13、14及び16日胚（E13、E14、E16）の精巣のマイクロアレイ遺伝子発現分析を示す。相対的なハイブリダイゼーションシグナル（平均±SEM）が提示されている。（B）構成的に発現される遺伝子L19と比較される半定量的PCRを用いた、コントロール及びヴィンクロゾリンF3世代の個々の動物における成獣脳のNCAM1の遺伝子発現を示す。PCR分析は、351bpのNCAM1の生成物および195bpのL19を提示し、各レーンは別個の動物を表している。（C）コントロール及びヴィンクロゾリンデータ（平均±SEM）についてNCAM1の脳における相対的発現の定量。
【図１６】候補物（白抜き）との遺伝子相互作用及び細胞性経路（四角）との相互作用遺伝子（黒塗り）の経路アシスト分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１０−４】
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【図１０−５】
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【図１０−６】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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