(57)【要約】本発明は、基礎研究、臨床研究において使用するため、および臨床検出アッセイ法を開発するための核酸検出アッセイ法を開発および最適化する方法およびルーチンを提供する。特に本発明は、多重増幅反応で使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーを設計する方法を提供する。本発明はまた、多重増幅反応を最適化する方法を提供する。本発明はまた、組み合わせ標的およびシグナル生成アッセイの方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ反応（invasive cleavage assay reaction）を含む一段階反応において、存在する場合に標的核酸が検出されるような条件下で試料を検出アッセイ試薬に曝露する段階を含む、試料中の標的核酸を検出する方法。
【請求項２】
試料が未精製体液である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
ポリメラーゼ連鎖反応が20サイクル未満の増幅サイクルを有する、請求項1記載の方法。
【請求項４】
ポリメラーゼ連鎖反応が15サイクル未満の増幅サイクルを有する、請求項1記載の方法。
【請求項５】
ポリメラーゼ連鎖反応が12サイクル未満の増幅サイクルを有する、請求項1記載の方法。
【請求項６】
一段階反応が、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
標的核酸が哺乳動物ゲノムDNAである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
標的核酸が病原体に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項９】
標的核酸が植物に由来する、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
体液が血液を含む、請求項2記載の方法。
【請求項１１】
標的核酸が蛍光によって検出される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
試薬が逆転写酵素、ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ、および緩衝液を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
緩衝液の塩化カリウム濃度が0 mMである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
逆転写酵素、ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ、標的核酸の存在下で侵入型切断構造を生じるように構成されたオリゴヌクレオチド、ならびに一段階反応において該標的核酸の逆転写および検出可能な増幅を可能にする緩衝液を含む、試料中の標的核酸を検出するためのキット。
【請求項１５】
5'ヌクレアーゼがFEN-1エンドヌクレアーゼを含む、請求項14記載のキット。
【請求項１６】
緩衝液の塩化カリウム濃度が0 mMである、請求項14記載のキット。
【請求項１７】
増幅プライマーをさらに含む、請求項14記載のキット。
【請求項１８】
逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドをさらに含む、請求項14記載のキット。
【請求項１９】
標的核酸の存在下で逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチド、ならびに逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断反応を行うための試薬を含む、試料中の標的核酸を検出するためのキット。
【請求項２０】
以下の段階を含む、標的核酸を多重検出する方法：a) マイクロ流体カード中に逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ試薬を提供する段階であって、該試薬が標的核酸を逆転写、増幅、および検出するように構成されている段階；b) 該標的核酸を含むと疑われる試料を遠心力を用いて該試薬に曝露する段階；ならびにc) 該標的核酸の有無を検出する段階。
【請求項２１】
曝露する段階が20サイクル以下のポリメラーゼ連鎖反応を行う段階を含む、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
試薬が逆転写酵素、ポリメラーゼ、および5'ヌクレアーゼを含む、請求項20記載の方法。
【請求項２３】
5'ヌクレアーゼがFEN-1エンドヌクレアーゼを含む、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
逆転写酵素活性およびFEN-1エンドヌクレアーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を含む酵素組成物を含むキット。
【請求項２５】
逆転写酵素を含む、請求項24記載のキット。
【請求項２６】
FEN-1エンドヌクレアーゼを含む、請求項24記載のキット。
【請求項２７】
ポリメラーゼをさらに含む、請求項24記載のキット。
【請求項２８】
逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ反応を含む一段階反応において、標的核酸が定量されるような条件下で試料を検出アッセイ試薬に曝露する段階を含む、試料中の標的核酸配列を定量する方法。
【請求項２９】
定量により、試料中の細胞核酸配列の量に対する標的核酸配列の量が決定する、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
アッセイ試薬が、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドを含む、請求項28記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、特に未精製体液(例えば、血液)中の少量の核酸の迅速かつ高感度な検出を達成するための、標的逆転写反応、増幅反応、およびシグナル増幅反応を組み合わせる方法を提供する。本発明はまた、多重増幅反応を最適化する方法を提供する。本発明はまた、インベーダー(INVADER)アッセイと組み合わせて高度多重化PCRを行う方法を提供する。本発明はさらに、操作も試薬添加も介入する必要なく、(例えば、血液などの未精製体液を用いて)単一の反応容器中で逆転写、PCR、およびインベーダーアッセイを組み合わせて行う方法を提供する。
【０００２】
本出願は、2004年11月3日に提出した米国仮特許出願第60/624,626号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ヒトゲノムの核酸配列決定が完了し、ゲノミクス研究および関連するドラッグデザインの試みのための、迅速で、信頼性があり、費用効果が高く、かつ操作性のよい試験法の需要が著しく高まっている。多くの機関が、遺伝子、遺伝子発現、および表現型(例えば、疾患状態、代謝応答など)間の相関関係を同定するために、入手可能な遺伝子配列情報を積極的に調べている。これらの解析は、個体および集団における遺伝子変異ならびに遺伝子および遺伝子発現の不均一性の影響を特徴づける試みを含む。
【０００４】
逆転写(RT)およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)は、多くの分子生物学および関連適用、特に遺伝子発現解析適用に極めて重要である。これらの適用では、逆転写を用いて初期RNA試料(例えば、mRNA)から鋳型DNAを調製し、次いでPCRを用いて鋳型DNAを増幅して、関心対象の適用のための十分量の増幅産物を生成する。核酸の抽出および増幅における進歩により、遺伝物質を取得し得る生物試料の種類が大幅に拡大した。特に、PCRにより、固定した組織試料、考古学的試料、および総数がひとけた台である多くの種類の細胞から十分量のDNAを取得することが可能となった。同様に、大規模SNP遺伝子型同定プロジェクトでは、標準的な生物試料から得ることが困難な場合がある多量のゲノムDNAを必要とする。この問題に取り組むための1つのアプローチは、PCRに基づく標的増幅に依存する。
【０００５】
PCRにより微量の核酸の解析が可能になる一方で、多くの設定において、かつ多くの種類の問題に関してPCRを実際に適用するには依然として問題がある。反応によって少量の標的核酸が容易に増幅されるため、PCR適用はアッセイからアッセイへの持ち越し汚染に大きく影響されやすい。この脆弱性から、専用設備の設置、または増幅後の操作の数を最小限に抑えるワークフローの設定を必要とする場合も多い。場合によっては、反応容器を開けることなくリアルタイムで反応をモニターすることを可能とする専門の機器が用いられる。
【０００６】
そこで、必要とされるのは、少量の増幅配列からシグナル生成を最大限にすることにより標的増幅の必要性を制限し、検出感度を保持しつつ持ち越し汚染に対する脆弱性を効率的になくす方法である。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
本発明は、基礎研究、臨床研究において使用するため、および臨床検出アッセイ法を開発するための核酸検出アッセイ法を開発および最適化する方法ならびにルーチンを提供する。
【０００８】
いくつかの態様において、本発明は以下の段階を含む方法を提供する；a) 各標的配列が；i) フットプリント領域、ii) フットプリント領域の上流に隣接した5'領域、およびiii) フットプリント領域の下流に隣接した3'領域を含む、少なくともY個の標的配列に関する標的配列情報を提供する段階、ならびにb) 少なくともY個の標的配列それぞれに対するフォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列を含み、各フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、Nはヌクレオチド塩基を表し、xは少なくとも6であり、N[1]はヌクレオチドAまたはCであり、かつ各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'はプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でない)によって表される核酸配列を含むプライマーセットが作製されるように、標的配列情報を処理する段階。
【０００９】
他の態様において、本発明は以下の段階を含む方法を提供する；a) 各標的配列が；i) フットプリント領域、ii) フットプリント領域の上流に隣接した5'領域、およびiii) フットプリント領域の下流に隣接した3'領域を含む、少なくともY個の標的配列に関する標的配列情報を提供する段階、ならびにb) 少なくともY個の標的配列それぞれに対するフォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列を含み、各フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、Nはヌクレオチド塩基を表し、xは少なくとも6であり、N[1]はヌクレオチドGまたはTであり、かつ各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'はプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でない)によって表される核酸配列を含むプライマーセットが作製されるように、標的配列情報を処理する段階。
【００１０】
特定の態様において、方法は以下の段階を含む；a) 各標的配列が；i) フットプリント領域、ii) フットプリント領域の上流に隣接した5'領域、およびiii) フットプリント領域の下流に隣接した3'領域を含む、少なくともY個の標的配列に関する標的配列情報を提供する段階、ならびにb) i) Y個の標的配列それぞれの5'領域の少なくとも一部と同一であるフォワードプライマー配列、およびii) 少なくともY個の標的配列それぞれの3'領域の相補的配列の少なくとも一部と同一であるリバースプライマー配列を含み、各フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、Nはヌクレオチド塩基を表し、xは少なくとも6であり、N[1]はヌクレオチドAまたはCであり、かつ各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'はプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でない)によって表される核酸配列を含むプライマーセットが作製されるように、標的配列情報を処理する段階。
【００１１】
他の態様において、本発明は以下の段階を含む方法を提供する；a) 各標的配列が；i) フットプリント領域、ii) フットプリント領域の上流に隣接した5'領域、およびiii) フットプリント領域の下流に隣接した3'領域を含む、少なくともY個の標的配列についての標的配列情報を提供する段階、ならびにb) i) Y個の標的配列それぞれの5'領域の少なくとも一部と同一であるフォワードプライマー配列、およびii) 少なくともY個の標的配列それぞれの3'領域の相補的配列の少なくとも一部と同一であるリバースプライマー配列を含み、各フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、Nはヌクレオチド塩基を表し、xは少なくとも6であり、N[1]はヌクレオチドGまたはTであり、かつ各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'はプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でない)によって表される核酸配列を含むプライマーセットが作製されるように、標的配列情報を処理する段階。
【００１２】
特定の態様において、本発明は以下の段階を含む方法を提供する；a) 各標的配列が一塩基多型を含む、少なくともY個の標的配列に関する標的配列情報を提供する段階、b) フットプリント領域が各標的配列上に位置しているような一塩基多型を検出するために、各標的配列上のどこに1つまたは複数のアッセイプローブがハイブリダイズするのかを決定する段階、ならびにc) i) Y個の標的配列それぞれのフットプリント領域の5'に隣接した標的配列の少なくとも一部と同一であるフォワードプライマー配列、およびii) 少なくともY個の標的配列それぞれのフットプリント領域の3'に隣接した標的配列の相補的配列の少なくとも一部と同一であるリバースプライマー配列を含み、各フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、Nはヌクレオチド塩基を表し、xは少なくとも6であり、N[1]はヌクレオチドAまたはCであり、かつ各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'はプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でない)によって表される核酸配列を含むプライマーセットが作製されるように、標的配列情報を処理する段階。
【００１３】
いくつかの態様において、本発明は以下の段階を含む方法を提供する；a) 各標的配列が一塩基多型を含む、少なくともY個の標的配列に関する標的配列情報を提供する段階、b) フットプリント領域が各標的配列上に位置しているような一塩基多型を検出するために、各標的配列上のどこに1つまたは複数のアッセイプローブがハイブリダイズするのかを決定する段階、ならびにc) i) Y個の標的配列それぞれのフットプリント領域の5'に隣接した標的配列の少なくとも一部と同一であるフォワードプライマー配列、およびii) 少なくともY個の標的配列それぞれのフットプリント領域の3'に隣接した標的配列の相補的配列の少なくとも一部と同一であるリバースプライマー配列を含み、各フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、Nはヌクレオチド塩基を表し、xは少なくとも6であり、N[1]はヌクレオチドTまたはGであり、かつ各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'はプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でない)によって表される核酸配列を含むプライマーセットが作製されるように、標的配列情報を処理する段階。
【００１４】
ある態様において、プライマーセットは少なくともY個の単位複製配列を増幅する多重PCR反応を行うために構成され、各単位複製配列はフォワードプライマーおよびリバースプライマーの位置により規定される。他の態様において、プライマーセットはデジタル式のまたは印刷された配列情報として作製される。いくつかの態様において、プライマーセットは物理的なプライマーオリゴヌクレオチドとして作製される。
【００１５】
ある態様において、各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[3]-N[2]-N[1]-3'は、プライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[3]-N[2]-N[1]-3'とも相補的でない。他の態様において、処理段階は、各フォワードプライマーのN[1]を5'領域における最も3'側のAまたはCとして最初に選択する段階を含む。ある態様において、処理段階は、各フォワードプライマーのN[1]を5'領域における最も3'側のGまたはTとして最初に選択する段階を含む。いくつかの態様において、処理段階は、各フォワードプライマーのN[1]を5'領域における最も3'側のAまたはCとして最初に選択する段階を含み、かつ処理段階は、各フォワードプライマーのN[2]-N[1]-3'がプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でないという必要条件を欠くフォワードプライマー配列について、N[1]を5'領域における次に最も3'側のAまたはCに変える段階をさらに含む。
【００１６】
他の態様において、処理段階は、各リバースプライマーのN[1]を3'領域の相補体における最も3'側のAまたはCとして最初に選択する段階を含む。いくつかの態様において、処理段階は、各リバースプライマーのN[1]を3'領域の相補体における最も3'側のGまたはTとして最初に選択する段階を含む。さらなる態様において、処理段階は、各リバースプライマーのN[1]を3'領域における最も3'側のAまたはCとして最初に選択する段階を含み、かつ処理段階は、各リバースプライマーのN[2]-N[1]-3'がプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でないという必要条件を欠くリバースプライマー配列について、N[1]を3'領域における次に最も3'側のAまたはCに変える段階をさらに含む。
【００１７】
特定の態様において、フットプリント領域は一塩基多型を含む。いくつかの態様において、フットプリントは変異を含む。いくつかの態様において、各標的配列のフットプリント領域は、一塩基多型を検出するために構成された1つまたは複数のアッセイプローブとハイブリダイズする標的配列の一部を含む。ある態様において、フットプリントはプローブがハイブリダイズするこの領域である。他の態様において、フットプリントは、両末端において付加的ヌクレオチドをさらに含む。
【００１８】
いくつかの態様において、処理段階は、アッセイ成分配列と80パーセント未満の相同性が存在するように、各フォワードプライマーおよびリバースプライマーについてN[5]-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'を選択する段階をさらに含む。好ましい態様において、アッセイ成分はFRETプローブ配列である。ある態様において、標的配列は約300〜500塩基対長または約200〜600塩基対長である。ある態様において、Yは2〜500の間または2〜10,000の間の整数である。
【００１９】
ある態様において、処理段階は、各フォワードプライマーおよびリバースプライマーが摂氏約50度(例えば、摂氏50度、または少なくとも摂氏50度、および摂氏55度以下)という標的配列に関する融解温度を有するように、各フォワードプライマーおよびリバースプライマーについてxを選択する段階を含む。好ましい態様において、(標的配列とハイブリダイズする場合の)プライマーの融解温度は少なくとも摂氏50度であるが、選択された検出アッセイ法の最適反応温度とは少なくとも10度異なる。
【００２０】
いくつかの態様において、フォワードプライマーとリバースプライマーの対の最適濃度は、プライマーセットに対して決定される。他の態様において、処理段階は自動化される。さらなる態様において、処理段階は処理装置で自動化される。
【００２１】
他の態様において、本発明は、本発明の方法によって作製されるプライマーセット、および少なくとも1つの他の成分(例えば、切断剤、ポリメラーゼ、インベーダーオリゴヌクレオチド)を含むキットを提供する。ある態様において、本発明は、本発明の方法によって作製されるプライマーおよびプライマーセットを含む組成物を提供する。
【００２２】
特定の態様において、本発明は以下の段階を含む方法を提供する；a) i) 配列データを受け取るように構成されたユーザーインターフェース、ii) 多重PCRプライマーソフトウェアアプリケーションを内部に記憶しているコンピュータシステムを提供する段階、ならびにb) 少なくともY個の標的配列に関する標的配列情報を含み、各標的配列が；i) フットプリント領域、ii) フットプリント領域の上流に隣接した5'領域、およびiii) フットプリント領域の下流に隣接した3'領域を含む配列データをユーザーインターフェースからコンピュータシステムへ送信する段階、ならびにc) i) Y個の標的配列それぞれのフットプリント領域の5'に隣接した標的配列の少なくとも一部と同一であるフォワードプライマー配列、およびii) 少なくともY個の標的配列それぞれのフットプリント領域の3'に隣接した標的配列の相補的配列の少なくとも一部と同一であるリバースプライマー配列を含み、各フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、Nはヌクレオチド塩基を表し、xは少なくとも6であり、N[1]はヌクレオチドAまたはCであり、かつ各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'はプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でない)によって表される核酸配列を含むプライマーセットを作製するために、多重PCRプライマー対ソフトウェアアプリケーションで標的配列情報を処理する段階。
【００２３】
いくつかの態様において、本発明は以下の段階を含む方法を提供する；a) i) 配列データを受け取るように構成されたユーザーインターフェース、ii) 多重PCRプライマーソフトウェアアプリケーションを内部に記憶しているコンピュータシステムを提供する段階、ならびにb) 少なくともY個の標的配列に関する標的配列情報を含み、各標的配列が；i) フットプリント領域、ii) フットプリント領域の上流に隣接した5'領域、およびiii) フットプリント領域の下流に隣接した3'領域を含む配列データをユーザーインターフェースからコンピュータシステムへ送信する段階、ならびにc) i) Y個の標的配列それぞれのフットプリント領域の5'に隣接した標的配列の少なくとも一部と同一であるフォワードプライマー配列、およびii) 少なくともY個の標的配列それぞれのフットプリント領域の3'に隣接した標的配列の相補的配列の少なくとも一部と同一であるリバースプライマー配列を含み、各フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、Nはヌクレオチド塩基を表し、xは少なくとも6であり、N[1]はヌクレオチドGまたはTであり、かつ各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'はプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でない)によって表される核酸配列を含むプライマーセットを作製するために、多重PCRプライマー対ソフトウェアアプリケーションで標的配列情報を処理する段階。
【００２４】
ある態様において、本発明は以下を含むシステムを提供する；a) 配列データを受け取るように構成され、配列データが少なくともY個の標的配列に関する標的配列情報を含み、各標的配列が；i) フットプリント領域、ii) フットプリント領域の上流に隣接した5'領域、およびiii) フットプリント領域の下流に隣接した3'領域を含むユーザーインターフェースからデータを受け取るように構成されたコンピュータシステム、b) ユーザーインターフェースに機能的にリンクされている多重PCRプライマー対ソフトウェアアプリケーションであって、i) Y個の標的配列それぞれのフットプリント領域の5'に隣接した標的配列の少なくとも一部と同一であるフォワードプライマー配列、およびii) 少なくともY個の標的配列それぞれのフットプリント領域の3'に隣接した標的配列の相補的配列の少なくとも一部と同一であるリバースプライマー配列を含み、各フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、Nはヌクレオチド塩基を表し、xは少なくとも6であり、N[1]はヌクレオチドAまたはCであり、かつ各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'はプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でない)によって表される核酸配列を含むプライマーセットを作製するために、標的配列情報を処理するよう構成されている多重PCRプライマー対ソフトウェアアプリケーション、ならびにc) 多重PCRプライマー対ソフトウェアアプリケーションを内部に記憶しているコンピュータシステムであって、コンピュータメモリおよびコンピュータプロセッサを含むコンピュータシステム。
【００２５】
他の態様において、本発明は以下を含むシステムを提供する；a) 配列データを受け取るように構成され、配列データが少なくともY個の標的配列に関する標的配列情報を含み、各標的配列が；i) フットプリント領域、ii) フットプリント領域の上流に隣接した5'領域、およびiii) フットプリント領域の下流に隣接した3'領域を含むユーザーインターフェースからデータを受け取るように構成されたコンピュータシステム、b) ユーザーインターフェースに機能的にリンクされている多重PCRプライマー対ソフトウェアアプリケーションであって、i) Y個の標的配列それぞれのフットプリント領域の5'に隣接した標的配列の少なくとも一部と同一であるフォワードプライマー配列、およびii) 少なくともY個の標的配列それぞれのフットプリント領域の3'に隣接した標的配列の相補的配列の少なくとも一部と同一であるリバースプライマー配列を含み、各フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列が5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、Nはヌクレオチド塩基を表し、xは少なくとも6であり、N[1]はヌクレオチドGまたはTであり、かつ各フォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'はプライマーセット中のいずれのフォワードプライマーおよびリバースプライマーのN[2]-N[1]-3'とも相補的でない)によって表される核酸配列を含むプライマーセットを作製するために、標的配列情報を処理するよう構成されている多重PCRプライマー対ソフトウェアアプリケーション、ならびにc) 多重PCRプライマー対ソフトウェアアプリケーションを内部に記憶しているコンピュータシステムであって、コンピュータメモリおよびコンピュータプロセッサを含むコンピュータシステム。ある態様において、コンピュータシステムは、プライマーセットをユーザーインターフェースへ戻すように構成されている。
【００２６】
いくつかの態様において、本発明は、単一の反応容器中で逆転写反応ならびに標的増幅反応およびシグナル増幅反応を行う方法を提供する。いくつかの好ましい態様において、標的増幅反応はPCR反応である。いくつかの特定の好ましい態様において、シグナル増幅反応は侵入型切断(インベーダー)アッセイである。他の態様において、組み合わせた標的増幅反応およびシグナル増幅反応のための試薬は、両反応の開始前に添加する。ある態様において、標的増幅反応は20サイクル後に停止する。いくつかの好ましい態様において、標的増幅反応は15サイクル後に停止する、いくつかの特に好ましい態様において、標的増幅反応は11サイクル後に停止する。いくつかの態様においては、いくつかの成分を反応容器に予め分注してから残りのアッセイ成分を添加する。好ましい態様において、予め分注した試薬は反応容器中で乾燥させる。特に好ましい態様において、予め分注した試薬は1つまたは複数のインベーダーアッセイ試薬を含む。いくつかの態様において、反応容器はマイクロ流体カードを含む。好ましい態様において、反応容器は、液体反応物および反応成分の遠心性もしくは求心性の分配または操作のために構成されたマイクロ流体カードを含む。
【００２７】
さらなる他の態様において、本発明は、例えば単一の反応または反応容器中で多色素多重FRETインベーダーアッセイを行うための方法および組成物を提供する。いくつかの好ましい態様において、多重FRETアッセイは合成標的上で行われる。他の好ましい態様において、多重FRETアッセイは核酸断片標的、例えばPCR単位複製配列上で行われる。いくつかの特に好ましい態様において、多重FRETアッセイはゲノムDNA標的上で行われる。さらなる他の好ましい態様において、多重FRETアッセイはRNA標的上で行われる。いくつかの好ましい態様において、多重FRETアッセイは4重反応である。
【００２８】
いくつかの態様において、1つまたは複数のインベーダーアッセイ試薬は、予め分注された形式(すなわち、再測定も再分注もすることなしに手順の一段階において使用できるよう予め測定されている)で提供され得る。いくつかの態様において、選択されたインベーダーアッセイ試薬成分は、共に混合され、予め分注される。他の態様において、好ましい態様において、予め分注されるアッセイ試薬成分は予め分注され、反応容器(これらに限定されないが、反応チューブ、または例えばマイクロタイタープレートにあるようなウェルを含む)中に提供される。特に好ましい態様において、予め分注されたインベーダーアッセイ試薬成分は、反応容器内で乾燥(dry down)される(例えば、乾燥(desiccate)または凍結乾燥される)。
【００２９】
いくつかの態様において、インベーダーアッセイ試薬はキットとして提供される。本明細書で用いる「キット」という用語は、材料を配送するための任意の配送システムを指す。反応アッセイとの関連において、そのような配送システムは、1つの場所から別の場所への反応試薬(例えば、適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など)および/または補助材料(例えば、緩衝液、アッセイを実施するための書面による使用説明書など)の保管、輸送、または配送を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連した反応試薬および/もしくは補助材料を含む、1つまたは複数の封入物(例えば、箱)を含む。本明細書で用いる「分割化キット」という用語は、それぞれが全キット成分の一部を含む2つまたはそれ以上の別個の容器を含む配送システムを指す。容器は、所定の受け手へ一緒にまたは別々に配送され得る。例えば、第1容器はアッセイで使用するための酵素を含み得り、第2容器はオリゴヌクレオチドを含む。「分割化キット」という用語は、米連邦食品医薬品化粧品法(Federal Food, Drug, and Cosmetic Act)の520(e)項の下で規制される分析物特定試薬(Analyte specific reagents；ASR)を含むキットを包含することが意図されるが、これに限定されるわけではない。実際に、それぞれが全キット成分の一部を含む2つまたはそれ以上の別個の容器を含む任意の配送システムは、「分割化キット」という用語に含まれる。対照的に、「一体化キット」とは、単一の容器中に(例えば、所望の成分のそれぞれを収容している単一の箱中に)反応アッセイの成分のすべてを含む配送システムを指す。「キット」という用語は、分割化キットおよび一体化キットの両方を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、本発明は、本発明を実施するのに必要な成分の1つまたは複数を含むインベーダーアッセイ試薬キットを提供する。例えば、本発明は、インベーダーアッセイを実施するために必要な酵素および/または反応成分を保管または配送するためのキットを提供する。キットは、試薬自体、緩衝液、対照試薬(例えば、組織試料、陽性および陰性対照標的オリゴヌクレオチドなど)、固体支持体、標識、文面によるおよび/または絵で表された使用説明書ならびに製品情報、阻害剤、標識および/または検出試薬、パッケージ環境制御(例えば、氷、乾燥剤など)などを含むがこれらに限定されない、アッセイに必要または望ましいあらゆる成分を含み得る。いくつかの態様において、キットは必要とされる成分の一部を提供し、ユーザーが残りの成分を供給することが求められる。いくつかの態様において、キットは、各容器が配送されるべき成分の一部を収容している、2つまたはそれ以上の別個の容器を含む。例えば、第1容器(例えば、箱)は酵素を含み得り(例えば、適切な保存緩衝液および容器中の構造特異的切断酵素)、第2の箱はオリゴヌクレオチド(例えば、インベーダーオリゴヌクレオチド、プローブオリゴヌクレオチド、対照標的オリゴヌクレオチドなど)を含み得る。
【００３１】
いくつかの態様において、本発明は、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ反応を含む一段階反応において、標的核酸が検出されるような条件下で試料を検出アッセイ試薬に曝露する段階を含む、試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。好ましい態様において、一段階反応は単一の反応チューブ中で行われる。いくつかの態様において、一段階反応は、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチド(例えば、侵入型切断反応におけるプローブまたはインベーダーオリゴ)として機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドを含む。
【００３２】
いくつかの態様において、本発明は、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ反応を含む一段階反応において、存在する場合に標的核酸が検出されるような条件下で試料を検出アッセイ試薬に曝露する段階を含む、試料中の標的核酸を検出する方法を提供する。いくつかの態様において、試料は未精製体液である。いくつかの態様において、体液は血液を含む。いくつかの態様において、ポリメラーゼ連鎖反応は20サイクル未満の増幅サイクルを有する。いくつかの態様において、ポリメラーゼ連鎖反応は15サイクル未満の増幅サイクルを有する。いくつかの態様において、ポリメラーゼ連鎖反応は12サイクル未満の増幅サイクルを有する。いくつかの態様において、一段階反応は、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、標的核酸は哺乳動物ゲノムDNAである。いくつかの態様において、標的核酸は病原体に由来する。いくつかの態様において、標的核酸は植物に由来する。いくつかの態様において、標的核酸は蛍光によって検出される。いくつかの態様において、試薬は、逆転写酵素、ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ、および緩衝液を含む。いくつかの態様において、そのような緩衝液の塩化カリウム濃度は0 mMである。
【００３３】
本発明は、逆転写酵素、ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ、標的核酸の存在下で侵入型切断構造を生じるように構成されたオリゴヌクレオチド、ならびに試料中の標的核酸の逆転写および検出可能な増幅を可能にする緩衝液の1つまたは複数を含む、試料中の標的核酸を検出するためのキットを提供する。いくつかの態様において、5'ヌクレアーゼはFEN-1エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、そのような緩衝液の塩化カリウム濃度は0 mMである。いくつかの態様において、キットは増幅プライマーをさらに含む。いくつかの態様において、キットは、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００３４】
本発明はまた、試料、ならびに逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドを含む、試料中の標的核酸を検出するためのキットを提供する。
【００３５】
本発明はまた、以下の段階を含む、標的核酸を多重検出する方法を提供する：a) マイクロ流体カード中に逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ試薬を提供する段階であって、試薬が標的核酸を逆転写、増幅、および検出するように構成されている段階；b) 標的核酸を含むと疑われる試料を遠心力を用いて試薬に曝露する段階；およびc) 標的核酸の有無を検出する段階。いくつかの態様において、曝露する段階は、20サイクル以下のポリメラーゼ連鎖反応を行う段階を含む。いくつかの態様において、試薬は、逆転写酵素、ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、5'ヌクレアーゼはFEN-1エンドヌクレアーゼを含む。
【００３６】
本発明はまた、酵素組成物を含むキットであって、酵素組成物が逆転写酵素活性およびFEN-1エンドヌクレアーゼ活性を有する1つまたは複数の酵素を含むキットを提供する。いくつかの態様において、キットは逆転写酵素を含む。いくつかの態様において、キットはFEN-1エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの態様において、キットはポリメラーゼをさらに含む。
【００３７】
本発明はまた、逆転写反応、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ反応を含む一段階反応において、標的核酸が定量されるような条件下で試料を検出アッセイ試薬に曝露する段階を含む、試料中の標的核酸配列を定量する方法を提供する。いくつかの態様においては、定量により、試料中の細胞核酸配列の量に対する標的核酸配列の量が決定する。いくつかの態様において、アッセイ試薬は、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチドとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドを含む。
【００３８】
定義
本発明の理解を容易にするため、いくつかの用語および語句を以下に定義する。
【００３９】
本明細書で用いる「SNP」、「SNPs」、または「一塩基多型」という用語は、生物体(例えば、ヒト)のゲノムにおける特定の位置での一塩基変化を指す。「SNP」は、遺伝子をコードしないゲノムの部分に位置することができる。または、「SNP」は遺伝子のコード領域に位置してもよい。この場合、「SNP」は、それが関連するRNAまたはタンパク質の構造および機能を変化させる可能性がある。
【００４０】
本明細書で用いる「対立遺伝子」という用語は、所与の配列の変異型(例えば、これに限定されないが、1つまたは複数のSNPを含む遺伝子)を指す。集団においては、多数の遺伝子が複対立遺伝子型で存在する。ある遺伝子の2つの異なる対立遺伝子を有する二倍体生物は、その遺伝子についてヘテロ接合性であると言われるのに対して、ホモ接合体は同じ対立遺伝子を2コピー有する。
【００４１】
本明細書で用いる「連鎖」という用語は、染色体上の2つまたはそれ以上のマーカー(例えば、遺伝子)の近接を指す。
【００４２】
本明細書で用いる「対立遺伝子頻度」という用語は、所与の集団(例えば、特定の性別、人種、または民族集団)における所与の対立遺伝子(例えば、SNPを含む配列)の出現頻度を指す。特定の集団は、他集団よりも高い割合のそのメンバーの範囲内で、所与の対立遺伝子を含む場合がある。例えば、BRCA1と呼ばれる乳癌遺伝子における特定の変異が、一般的なユダヤ人集団の1パーセントに存在することが見出された。比較すると、一般的な米国人集団におけるBRCA1に何らかの変異を有する人の割合は、0.1〜0.6パーセントであると推定されている。一方がBRCA1遺伝子内にあり、もう一方がBRCA2と呼ばれる別の乳癌遺伝子内にある2つのさらなる変異は、アシュケナージ系ユダヤ人集団により大きく普及しており、これらの3つの変異のうちの1つを保有する総合的リスクは2.3パーセントになる。
【００４３】
本明細書で用いる「インシリコ(in silico)解析」という用語は、コンピュータプロセッサおよびコンピュータメモリを用いて行われる解析を指す。例えば、「インシリコSNP解析」とは、コンピュータプロセッサおよびメモリを用いるSNPデータの解析を指す。
【００４４】
本明細書で用いる「遺伝子型」という用語は、(例えば、遺伝子座に有する特定の対立遺伝子の点から見た)生物体の実際の遺伝子構成を指す。遺伝子型の発現は、生物体の身体的外観および特徴‐「表現型」を生じさせる。
【００４５】
本明細書で用いる「遺伝子座」という用語は、染色体上における遺伝子または任意の他の特徴づけられた配列の位置を指す。
【００４６】
本明細書で用いる「疾患」または「疾患状態」という用語は、種のメンバーの正常または平均としてみなされる状態からの逸脱であり、その種の個体の大多数に対して有害でない条件下において、罹患個体に対して有害である逸脱を指す(例えば、下痢、嘔気、発熱、疼痛、および炎症など)。
【００４７】
医学的手順に関連して本明細書で用いる「処置」という用語は、疑われる、予測される、もしくは既存の疾患状態の結果として罹患した個体に対して行われる、または疾患状態のリスクもしくは疑われるリスクの存在する罹患個体に対して行われる段階または行為を指す。処置は、疾患状態もしくは疾患状態の疑いを予測してまたはこれらに応答して提供してもよく、これらに限定されないが、予防、寛解、緩和、または治療段階を含み得る。「治療」という用語は、処置の特定の過程を指す。
【００４８】
「遺伝子」という用語は、ポリペプチド、RNA(例えば、rRNA、tRNAなど)、または前駆体の産生に必要なコード配列を含む核酸(例えば、DNA)配列を指す。ポリペプチド、RNA、または前駆体は、全長コード配列によって、または全長もしくは断片の所望の活性もしくは機能的特性(例えば、リガンド結合、シグナル伝達など)が保持される限りはコード配列の任意の部分によってコードされ得る。この用語はまた、構造遺伝子のコード領域、ならびに遺伝子が全長mRNAの長さに相当するように両末端上の約1 kbの距離に5'および3'末端でコード領域に隣接して位置する配列も包含する。コード領域の5'側に位置し、かつmRNAに存在する配列は、5'非翻訳配列と称される。コード領域の3'側または下流に位置し、かつmRNAに存在する配列は、3'非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、cDNAおよび遺伝子のゲノム型の両方を包含する。遺伝子のゲノム型またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列によって中断されるコード領域を含む。イントロンは、遺伝子がヘテロ核RNA(hnRNA)へ転写される場合に含まれる区域であり；イントロンはエンハンサーなどの調節エレメントを含む場合がある。イントロンは、核転写産物または1次転写産物から除去または「スプライシング」され；したがって、イントロンはメッセンジャーRNA(mRNA)転写産物内には存在しない。mRNAは、翻訳時に、新生ポリペプチドにおけるアミノ酸の配列または順番を特定するように機能する。遺伝子の転写部分における変化(例えば、変異、SNP、挿入、欠失)は、生成されるRNA(例えば、hnRNA、mRNA、rRNA、tRNA)の対応する部分において反映され、通常その部分において検出され得る。
【００４９】
本明細書において「アミノ酸配列」という語句を挙げて天然タンパク質分子のアミノ酸配列を参照する場合、アミノ酸配列、およびポリペプチドまたはタンパク質などの同様の用語は、アミノ酸配列を列挙したタンパク質分子と関連した完全な天然アミノ酸配列に限定することを意図していない。
【００５０】
ゲノム型の遺伝子は、イントロンを含むことに加えて、RNA転写産物に存在する配列の5'および3'末端に位置する配列もまた含み得る。これらの配列は「隣接」配列または領域と称される(これらの隣接配列は、mRNA転写産物に存在する非翻訳配列の5'または3'側に位置する)。5'隣接領域は、遺伝子の転写を制御するまたは転写に影響を及ぼすプロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列を含み得る。3'隣接領域は、転写の終結、転写後切断、およびポリアデニル化を指示する配列を含み得る。
【００５１】
「野生型」という用語は、天然源から単離された場合のその遺伝子または遺伝子産物の特徴を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。野生型遺伝子は集団において最も頻繁に認められるものであり、よってその遺伝子の「正常」型または「野生型」と任意に称される。これに対して、「改変された」、「変異体」、および「変種」という用語は、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合に、配列および/または機能特性の変化(すなわち、変化した特徴)を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。天然の変異体が単離され得ることに留意されたいが；これらは、野生型遺伝子または野生型遺伝子産物と比較した場合に変化した特徴を有するという事実により同定される。
【００５２】
本明細書で用いる「コードする核酸分子」、「コードするDNA分子」、および「コードするDNA」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順番または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順番により、ポリペプチド(タンパク質)鎖に沿ったアミノ酸の順番が決まる。したがって、DNA配列はアミノ酸配列をコードする。
【００５３】
モノヌクレオチドは、1つのモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸がホスホジエステル結合を介してその隣接物の3'酸素と一方向に結合するような様式で反応して、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを形成することから、DNAおよびRNA分子は「5'末端」および「3'末端」を有すると称される。したがって、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの末端は、その5'リン酸がモノヌクレオチドペントース環の3'酸素と結合していない場合に「5'末端」と称され、その3'酸素が次のモノヌクレオチドペントース環の5'リン酸と結合していない場合に「3'末端」と称される。本明細書で用いる核酸配列は、たとえより大きなオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの内部にあっても、5'末端および3'末端を有すると称され得る。直鎖または環状DNA分子のいずれにおいても、不連続のエレメントは「下流」または3'エレメントの「上流」または5'側であると称される。この用語は、転写がDNA鎖に沿って5'側から3'側へという様式で進行するという事実を反映している。連結した遺伝子の転写を指示するプロモーターおよびエンハンサーエレメントは、一般にコード領域の5'側または上流に位置する。しかし、エンハンサーエレメントは、プロモーターエレメントおよびコード領域の3'側に位置する場合でもそれらの効果を発揮し得る。転写終結およびポリアデニル化シグナルは、コード領域の3'側または下流に位置する。
【００５４】
本明細書で用いる「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するオリゴヌクレオチド」および「遺伝子をコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド」という用語は、遺伝子のコード領域を含む核酸配列、すなわち遺伝子産物をコードする核酸配列を意味する。コード領域は、cDNA、ゲノムDNA、またはRNA型で存在し得る。DNA型で存在する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖(すなわち、センス鎖)または二本鎖であってよい。1次RNA転写産物の転写の適切な開始および/または正確なプロセシングを可能にすることが必要な場合には、エンハンサー/プロモーター、スプライス部位、ポリアデニル化シグナルなどの適切な制御エレメントを遺伝子のコード領域に近接して置くことができる。または、本発明の発現ベクターに使用するコード領域は、内因性のエンハンサー/プロモーター、スプライス部位、介在配列、ポリアデニル化シグナルなど、または内因性および外因性制御エレメントの組み合わせを含んでもよい。
【００５５】
本明細書で用いる「相補的」または「相補性」という用語は、塩基対形成規則により関係づけられるポリヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)に関して用いられる。例えば、配列「5'-A-G-T-3'」は配列「3'-T-C-A-5'」に対して相補的である。相補性は、核酸の塩基のいくつかのみが塩基対形成規則に従って一致する「部分的」であってもよい。または、核酸間に「完全な」または「全体的な」相補性が存在してもよい。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強さに顕著な影響を及ぼす。これは、増幅反応のほかに、核酸間の結合に依存する検出法においても特に重要である。
【００５６】
「相同性」という用語は、相補性の程度を指す。部分的相同性または完全な相同性(すなわち、同一性)が存在し得る。部分的に相補的な配列は、完全に相補的な配列が標的核酸にハイブリダイズするのを少なくとも部分的に阻害する配列であり、「実質的に相同的」という機能的用語を用いて参照される。「結合の阻害」という用語は、核酸の結合に関連して用いる場合、標的配列への結合における相同的配列の競合によって起こる結合の阻害を指す。完全に相補的な配列の標的配列へのハイブリダイゼーションの阻害は、低ストリンジェンシー条件下でハイブリダイゼーションアッセイ(サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど)を用いて試験することができる。実質的に相同的な配列またはプローブは、低ストリンジェンシー条件下で、完全に相同的な配列の標的への結合(すなわち、ハイブリダイゼーション)を競合および阻害することになる。低ストリンジェンシー条件が非特異的結合を許容すると言っているわけではなく；低ストリンジェンシー条件は、2つの配列の相互の結合が特異的(すなわち、選択的)相互作用であることを必要とする。非特異的結合が存在しないことは、部分的な相補性の程度さえも欠く(例えば、約30％未満の同一性)第2の標的を用いて試験することができ；非特異的結合が存在しない場合、プローブは第2の非相補的標的にハイブリダイズしないことになる。
【００５７】
当業者は、低ストリンジェンシー条件を構成するために多くの等価な条件を使用できることをよく理解している；プローブの長さおよび性質(DNA、RNA、塩基組成)、ならびに標的の性質(DNA、RNA、塩基組成、溶液中に存在するかまたは固定化されているかなど)、ならびに塩および他の成分の濃度(例えば、ホルムアミド、デキストラン硫酸、ポリエチレングリコールの有無)などの要因を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変更して上記の条件とは異なるが等価である低ストリンジェンシーハイブリダイゼーションの条件を作成することができる。さらに当業者は、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションを促進する条件を理解している(例えば、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄段階の温度を上げる、ハイブリダイゼーション溶液にホルムアミドを使用するなど)。
【００５８】
「実質的に相同的」という用語は、cDNAまたはゲノムクローンなどの二本鎖核酸配列に関して用いる場合、上記の低ストリンジェンシー条件下で二本鎖核酸配列のいずれかまたは両方の鎖とハイブリダイズし得る任意のプローブを指す。
【００５９】
遺伝子は、1次RNA転写産物の差次的スプライシングにより作製される複数のRNA種を産生し得る。同じ遺伝子のスプライス変種であるcDNAは、配列同一性または完全相同性の領域(両方のcDNA上に同じエキソンまたは同じエキソンの一部が存在することを表す)および完全に非同一性の領域(例えば、cDNA 1にエキソン「A」が存在し、cDNA 2がエキソン「B」を代わりに含むこと表す)を含むことになる。2つのcDNAは配列同一性の領域を含むため、これらはどちらも、両方のcDNA上に認められる配列を含む全遺伝子または遺伝子の一部に由来するプローブとハイブリダイズすることになる；したがって、2つのスプライス変種は、そのようなプローブと、および相互に実質的に相同的である。
【００６０】
「実質的に相同的」という用語は、一本鎖核酸配列に関して用いる場合、上記の低ストリンジェンシー条件下で一本鎖核酸配列とハイブリダイズし得る(すなわち、その相補体である)任意のプローブを指す。
【００６１】
本明細書で用いる「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対形成に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強さ(すなわち、核酸間の会合の強さ)は、核酸間の相補性の程度、関与する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのTm、および核酸内のG:C比などの要因により影響を受ける。
【００６２】
本明細書で用いる「Tm」という用語は、「融解温度」に関して用いられる。融解温度とは、二本鎖核酸分子の集団が半分解離して一本鎖になる時の温度である。核酸のTmを計算する式は、当技術分野において周知である。標準的な参考文献により示されるように、Tm値の簡単な概算値は、核酸が1 M NaClの水溶液中に存在する場合、式：Tm = 81.5 + 0.41(％ G + C)により計算され得る(例えば、Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, Nucleic Acid Hybridization [1985]を参照されたい)。他の参考文献は、Tmの計算に構造特性および配列特性を考慮に入れたより精巧な計算を含んでいる。
【００６３】
本明細書で用いる「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションを行う際の温度、イオン強度、および有機溶媒などの他の化合物の存在の条件に関して用いられる。当業者は、記載されたパラメータを個々にまたは協調して変更することにより、「ストリンジェンシー」条件を変更し得ることを理解すると考えられる。「高ストリンジェンシー」条件では、核酸の塩基対形成は、高頻度で相補的塩基配列を有する核酸断片間でのみ起こることになる(例えば、「高ストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションは、約85〜100％の同一性、好ましくは約70〜100％の同一性を有する相同体間で起こり得る)。中程度のストリンジェンシー条件では、核酸の塩基対形成は、中程度の頻度で相補的塩基配列を有する核酸間で起こることになる(例えば、「中程度のストリンジェンシー」条件下でのハイブリダイゼーションは、約50〜70％の同一性を有する相同体間で起こり得る)。したがって、遺伝的に多様な生物に由来する核酸については、相補的配列の頻度が通常は低いために、「弱い」または「低い」ストリンジェンシー条件が必要とされる場合が多い。
【００６４】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いる場合の「高ストリンジェンシー条件」とは、約500ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、42℃での5X SSPE(43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4H2O、および1.85 g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整)、0.5％ SDS、5Xデンハルト試薬、および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる溶液中での結合またはハイブリダイゼーション、その後の42℃での0.1X SSPE、1.0％ SDSを含む溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００６５】
核酸ハイブリダイゼーションに関して用いる場合の「中程度のストリンジェンシー条件」とは、約500ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、42℃での5X SSPE(43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4H2O、および1.85 g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整)、0.5％ SDS、5Xデンハルト試薬、および100μg/ml変性サケ精子DNAからなる溶液中での結合またはハイブリダイゼーション、その後の42℃での1.0X SSPE、1.0％ SDSを含む溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００６６】
「低ストリンジェンシー条件」とは、約500ヌクレオチド長のプローブを使用する場合、42℃での5X SSPE(43.8 g/l NaCl、6.9 g/l NaH2PO4H2O、および1.85 g/l EDTA、NaOHでpHを7.4に調整)、0.1％ SDS、5Xデンハルト試薬[50Xデンハルトは500 ml当たり以下を含む：5 gフィコール(タイプ400、Pharmacia)、5 g BSA(フラクションV；Sigma)]、および100 g/ml変性サケ精子DNAからなる溶液中での結合またはハイブリダイゼーション、その後の42℃での5X SSPE、0.1％ SDSを含む溶液中での洗浄に相当する条件を含む。
【００６７】
以下の用語は、2つまたはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列関係を示すために用いられる：「参照配列」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的同一性」。「参照配列」とは、配列比較のための基本として用いられる所定の配列である；参照配列は、例えば配列リストに与えられた全長cDNA配列の部分として、より大きな配列の一部であってよく、または完全な遺伝子配列を含んでもよい。一般に、参照配列は少なくとも20ヌクレオチド長であり、高い頻度で少なくとも25ヌクレオチド長であり、多くの場合少なくとも50ヌクレオチド長である。2つのポリヌクレオチドはそれぞれ、(1) 2つのポリヌクレオチド間で類似している配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部)を含み得り、かつ(2) 2つのポリヌクレオチド間で異なる配列をさらに含み得るため、2つ(またはそれ以上)のポリヌクレオチド間の配列比較は典型的に、「比較領域(comparison window)」にわたって2つのポリヌクレオチドの配列を比較し、配列類似性の局所的領域を同定および比較することにより行われる。本明細書で用いる「比較領域」とは、ポリヌクレオチド配列が少なくとも20個の連続したヌクレオチドの参照配列と比較され得り、かつ比較領域内にあるポリヌクレオチド配列の一部が、2つの配列の最適アラインメントを得るために(付加または欠失を含まない)参照配列と比較して20％以下の付加または欠失(すなわち、ギャップ)を含み得る場合の、少なくとも20個の連続したヌクレオチド位置の概念的区域を指す。比較領域を整列させるための配列の最適アライメントは、SmithおよびWatermanの局所的相同性アルゴリズム[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2：482 (1981)]により、NeedlemanおよびWunschの相同性アライメントアルゴリズム[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]により、PearsonおよびLipmanの類似度検索法[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)]により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行(Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.のGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA)により、または目視により行うことができ、様々な方法により作成された最も優れたアライメント(すなわち、比較領域にわたって最も高い割合の相同性を生じる)が選択される。「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が比較領域にわたって同一である(すなわち、ヌクレオチドごとに基づいて)ことを意味する。「配列同一性の割合」という用語は、2つの最適に整列された配列を比較領域にわたって比較し、同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、U、またはI)が両方の配列に存在する位置の数を決定して一致位置数を得て、一致位置数を比較領域内の全位置数(すなわち、領域サイズ)で割り、その結果に100を乗じて配列同一性の割合を得ることにより計算する。
【００６８】
ポリヌクレオチドに適用する場合の「実質的同一性」という用語は、参照配列と、参照配列の全部で20％以下の欠失または付加を含み得るポリヌクレオチド配列とを比較領域にわたって比較することにより配列同一性の割合を計算する場合の、少なくとも20ヌクレオチドの位置の比較領域にわたって、多くの場合少なくとも25〜50ヌクレオチドの領域にわたって参照配列と比較して、少なくとも85％の配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95％の配列同一性、通常は少なくとも99％の配列同一性を有する配列を含むポリヌクレオチド配列の特徴を表す。参照配列は、例えば全長配列のスプライス変種として、より大きな配列の一部であってよい。
【００６９】
ポリペプチドに適用する場合の「実質的同一性」という用語は、2つのペプチド配列が、初期設定ギャップウェイトを用いてプログラムGAPまたはBESTFITなどにより最適に整列させた場合に、少なくとも80％の配列同一性、好ましくは少なくとも90％の配列同一性、より好ましくは少なくとも95％以上の配列同一性またはそれ以上(例えば、99％の配列同一性)を共有することを意味する。同一でない残基の位置は、保存的アミノ酸置換により異なることが好ましい。保存的アミノ酸置換とは、類似の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンであり；脂肪族-水酸基側鎖を有するアミノ酸群は、セリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸群は、アスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸群は、リジン、アルギニン、およびヒスチジンであり；硫黄含有側鎖を有するアミノ酸群は、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群は以下の通りである：バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リジン-アルギニン、アラニン-バリン、およびアスパラギン-グルタミン。
【００７０】
「増幅」とは、鋳型特異性を伴う特殊な場合の核酸複製である。これは、非特異的鋳型複製(すなわち、鋳型依存的であるが特定の鋳型に依存しない)と対照的である。鋳型特異性はここでは、複製の忠実度(すなわち、正確なポリヌクレオチド配列の合成)およびヌクレオチド(リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチド)特異性から区別される。鋳型特異性は「標的」特異性という用語で記載される場合が多い。標的配列は、それらが他の核酸から区別されるように求められるという意味において「標的」である。増幅技法は本来、この区別に関して設計された。
【００７１】
鋳型特異性は、酵素の選択により大半の増幅技法において達成される。増幅酵素とは、使用される条件下において、不均一な核酸混合物中の特定の核酸配列のみを処理する酵素である。例えば、Qレプリカーゼの場合、MDV-1 RNAはそのレプリカーゼの特異的鋳型である(D.L. Kacian et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69：3038 [1972])。その他の核酸は、この増幅酵素により複製されない。同様に、T7 RNAポリメラーゼの場合、この増幅酵素はそれ自身のプロモーターに対してストリンジェントな特異性を有する(M. Chamberlin et al.、Nature 228:227 [1970])。T4 DNAリガーゼの場合、この酵素は、連結接合部においてオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド基質と鋳型との間にミスマッチが存在する場合、その2つのオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを連結しない(D.Y. Wu and R. B. Wallace, Genomics 4:560 [1989])。最後に、TaqおよびPfuポリメラーゼは、高温で機能するそれらの能力によって、プライマーが結合しひいてはプライマーにより規定される配列に対して高い特異性を示すことが見出されている；高温は、標的配列とのプライマーのハイブリダイゼーションに有利であり、非標的配列とのハイブリダイゼーションに有利ではない熱力学的条件をもたらす(H.A. Erlich (ed.), PCR Technology, Stockton Press [1989])。
【００７２】
本明細書で用いる「増幅可能な核酸」という用語は、任意の増幅法によって増幅され得る核酸に関して用いられる。「増幅可能な核酸」は通常「試料鋳型」を含むと考えられる。
【００７３】
本明細書で用いる「試料鋳型」という用語は、「標的」(以下に定義)の存在に関して解析される試料に由来する核酸を指す。対照的に、「バックグラウンド鋳型」とは、試料中に存在するまたは存在しない可能性がある、試料鋳型以外の核酸に関して用いられる。バックグラウンド鋳型は、不注意に起因する場合が多い。それは、持ち越し汚染の結果である場合もあれば、または試料から精製除去されるように求められる核酸混入物の存在による場合もある。例えば、検出されるべき核酸以外の生物体由来の核酸は、試験試料にバックグラウンドとして存在する可能性がある。
【００７４】
本明細書で用いる「プライマー」という用語は、精製された制限消化物中に見られるように自然に生じようが合成で作製されようが、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長産物の合成が誘発される条件下に置かれた場合に(すなわち、ヌクレオチドおよびDNAポリメラーゼなどの誘発剤の存在下で、ならびに適切な温度およびpHで)、合成開始点として働き得るオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、増幅の効率を最大限にするために好ましくは一本鎖であるが、または二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、プライマーは最初に鎖を分離するよう処理し、その後伸長産物を調製するために使用する。好ましくは、プライマーはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、誘発剤の存在下で伸長産物の合成をプライミングするのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの供給源、および方法の使用を含む多くの要因に依存することになる。
【００７５】
本明細書で用いる「プローブ」または「ハイブリダイゼーションプローブ」という用語は、精製された制限消化物中に見られるように自然に生じようが、合成で、組換えで、またはPCR増幅により作製されようが、関心対象の別のオリゴヌクレオチドに少なくとも部分的にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチド(すなわち、ヌクレオチドの配列)を指す。プローブは一本鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブは、特定の配列の検出、同定、および単離に有用である。いくつかの好ましい態様において、本発明で使用するプローブは、これらに限定されないが、酵素(例えば、ELISA、および酵素に基づく組織化学的アッセイ法)、蛍光、放射性、および発光系を含む任意の検出系において検出できるように、「レポーター分子」で標識される。本発明は、特定の検出系または標識に限定されることを意図していない。
【００７６】
本明細書で用いる「標的」という用語は、検出または特徴づけされるべき核酸配列または構造を指す。
【００７７】
本明細書で用いる「ポリメラーゼ連鎖反応法」(「PCR法」)という用語は、クローニングまたは精製することなしに、ゲノムDNAの混合物中の標的配列の区域の濃度を増加させる方法について記載した、K.B. Mullisの方法(例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第4,683,195号、同第4,683,202号、および同第4,965,188号を参照されたい)を指す。標的配列を増幅するこの過程は、所望の標的配列を含むDNA混合物に対して大過剰量の2つのオリゴヌクレオチドプライマーを導入する段階、その後のDNAポリメラーゼの存在下でのサーマルサイクリングの正確な連続からなる。2つのプライマーは、二本鎖標的配列のそれぞれの鎖に相補的である。増幅を達成するため、混合物を変性させ、次いでプライマーを標的分子内のそれらの相補的配列へアニーリングさせる。アニーリング後、プライマーは、新しい相補鎖対を形成するようにポリメラーゼによって伸長される。変性、プライマーアニーリング、およびポリメラーゼ伸長の段階を多数回繰り返して(すなわち、変性、アニーリング、および伸長で1つの「サイクル」を構成し；多数の「サイクル」が存在し得る)、所望の標的配列の増幅された区域を高濃度で得ることができる。所望の標的配列の増幅された区域の長さは、互いのプライマーの相対的位置によって決まり、したがってこの長さは制御可能なパラメータである。この過程を繰り返す点から、この方法は「ポリメラーゼ連鎖反応法」(以下「PCR法」)と称される。標的配列の所望の増幅された区域が混合物中で(濃度に関して)優勢な配列となるため、それらは「PCR増幅された」と称される。
【００７８】
PCR法を用いることで、ゲノムDNA中の特定の標的配列の単一コピーを、いくつかの異なる方法(例えば、標識プローブでのハイブリダイゼーション；ビオチン化プライマーの取り込みおよびその後のアビジン-酵素コンジュゲート検出；dCTPまたはdATPなどの32P標識デオキシヌクレオチド三リン酸の増幅区域への取り込み)により検出可能なレベルまで増幅することが可能である。ゲノムDNAに加えて、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド配列をプライマー分子の適切なセットを用いて増幅することもできる。特に、PCR過程自身により生成された増幅区域は、それ自体次のPCR増幅のための有効な鋳型となる。
【００７９】
本明細書で用いる「PCR産物」、「PCR断片」、および「増幅産物」という用語は、変性、アニーリング、および伸長のPCR段階が2サイクルまたはそれ以上のサイクル完了した後に結果として生じる化合物の混合物を指す。これらの用語は、1つまたは複数の標的配列の1つまたは複数の区域の増幅があった場合を包含する。
【００８０】
本明細書で用いる「増幅試薬」という用語は、プライマー、核酸鋳型、および増幅酵素を除いた、増幅のために必要とされる試薬(デオキシリボヌクレオチド三リン酸、緩衝液など)を指す。典型的に、増幅試薬は他の反応成分と共に置かれ、反応容器(試験管、マイクロウェルなど)中に含まれる。
【００８１】
本明細書で用いる「反応容器」という用語は、これらに限定されないが、試験管、ウェル、マイクロウェル(例えば、96ウェル、384ウェル、および1536ウェルアッセイプレートなどのマイクロタイターアッセイプレートのウェル)、キャピラリーチューブ、光ファイバーなどのファイバーの末端、流体チップ、カートリッジ、およびカードなどのマイクロ流体装置(これらに限定されないが、例えば、Woudenberg, et al.の米国特許第6,126,899号、Bedingham, et al.の米国特許第6,627,159号、同第6,720,187号、および同第6,734,401号、Mian, et al.の米国特許第6,319,469号および同第6,709,869号、Wilding, et al.の米国特許第5,587,128号および同第6,660,517号に記載されているものを含む)、または任意の表面(これらに限定されないが、ガラス、プラスチック、もしくはシリコン表面、ビーズ、マイクロチップ、またはゲルもしくはデンドリマーなどの非固形表面)上の試験部位を含む、反応が行われ得る系を指す。
【００８２】
本明細書で用いる「組換えDNA分子」という用語は、分子生物学的技法を用いて結合されたDNAの断片からなるDNA分子を指す。
【００８３】
本明細書で用いる「アンチセンス」という用語は、特定のRNA配列(例えば、mRNA)に相補的なRNA配列に関して用いられる。「アンチセンス鎖」という用語は、「センス」鎖に相補的な核酸鎖に関して用いられる。アンチセンス鎖に関して(-)(すなわち、「マイナス」)という表記が用いられる場合があり、センス(すなわち、「プラス」)鎖に関して(+)という表記が用いられる場合がある。
【００８４】
核酸に関して用いる場合の「単離された」という用語は、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」と同様に、同定され、その天然源において通常会合している少なくとも1つの夾雑核酸から分離された核酸配列を指す。単離された核酸は、天然で認められる形態または状況とは異なる形態または状況で存在する。対照的に、単離されていない核酸とは、天然で存在する状態で認められるDNAおよびRNAのような核酸である。例えば、所与のDNA配列(例えば、遺伝子)は、宿主細胞染色体上で隣接遺伝子の近傍に認められ；特定のタンパク質をコードしている特定のmRNA配列などのRNA配列は、数多くのタンパク質をコードしている多くの他のmRNAとの混合物として細胞内に認められる。しかし、ポリペプチドをコードしている単離された核酸は、一例として、核酸が天然の細胞とは異なる染色体位置にある、またはさもなければ天然で認められるものとは異なる核酸配列が隣接している、そのポリペプチドを通常発現している細胞内にあるような核酸を含む。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、一本鎖または二本鎖の形態で存在し得る。単離された核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドを、タンパク質を発現させるために利用する場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは最小限のセンス鎖またはコード鎖を含むことになるが(すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは一本鎖であってよい)、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方を含んでもよい(すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは二本鎖であってよい)。
【００８５】
本明細書で用いる「部分(一部)」という用語は、(「所与のヌクレオチド配列の一部」のように)ヌクレオチド配列に関する場合、その配列の断片を指す。断片は、4ヌクレオチドから全ヌクレオチド配列マイナス1ヌクレオチドまでの大きさの範囲(例えば、10ヌクレオチド、11、...、20、...)であり得る。
【００８６】
本明細書で用いる「精製された」または「精製する」という用語は、試料からの混入物の除去を指す。本明細書で用いる「精製された」という用語は、その天然環境から取り出された、単離された、または分離された分子(例えば、核酸またはアミノ酸配列)を指す。したがって、「単離された核酸配列」とは精製された核酸配列である。「実質的に精製された」分子は、天然に会合している他の成分を少なくとも60％、好ましくは少なくとも75％、より好ましくは少なくとも90％含まない。
【００８７】
本明細書で用いる「組換えタンパク質」または「組換えポリペプチド」という用語は、組換えDNA分子から発現されるタンパク質分子を指す。
【００８８】
本明細書で用いる「天然タンパク質」という用語は、タンパク質がベクター配列によってコードされるアミノ酸残基を含まないこと示し；すなわち、天然タンパク質は、天然に存在するタンパク質中に見出されるアミノ酸のみを含む。天然タンパク質は組換え手段によって産生させることができ、または天然源から単離することができる。
【００８９】
本明細書で用いる「部分(一部)」という用語は、(「所与のタンパク質の一部」のように)タンパク質に関する場合、そのタンパク質の断片を指す。断片は、4個の連続したアミノ酸残基から全アミノ酸配列マイナス1アミノ酸までの大きさの範囲であり得る。
【００９０】
「サザンブロット」という用語は、大きさに従ってDNAを分画するためのアガロースゲルまたはアクリルアミドゲル上でのDNAの解析、およびその後のゲルからニトロセルロースまたはナイロン膜などの固体支持体へのDNAの転写を指す。次いで、固定化されたDNAを標識プローブでプロービングして、使用したプローブに相補的なDNA種を検出する。DNAは、電気泳動前に制限酵素で切断し得る。電気泳動後、DNAは、固体支持体に転写する前またはその間に、部分的に脱プリン(depurinate)および変性することができる。サザンブロットは、分子生物学者の標準的手段である(J. Sambrook et al., Molecular Cloning：A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY, pp 9.31-9.58 [1989])。
【００９１】
「ウェスタンブロット」という用語は、ニトロセルロースまたは膜などの支持体上に固定化されたタンパク質(またはポリペプチド)の解析を指す。タンパク質は分離のためにアクリルアミドゲルで泳動し、その後ゲルからニトロセルロース膜またはナイロン膜などの固体支持体に転写する。次いで、固定化されたタンパク質を、関心対象の抗原に対する反応性を有する抗体に曝露する。抗体の結合は、標識抗体の使用を含む様々な方法により検出することができる。
【００９２】
「試験化合物」という用語は、任意の所望の活性(例えば、これらに限定されないが、疾患、疾病、病気、もしくは身体機能の障害を治療もしくは予防する、またはさもなくば試料の生理的もしくは細胞状態を変化させる能力)に関してアッセイ(例えば、薬物スクリーニングアッセイ)で試験する任意の化学物質、調合薬、薬物などを指す。試験化合物は、公知の治療化合物および潜在的治療化合物の両方を含む。本発明のスクリーニング法を用いてスクリーニングすることにより、試験化合物が治療的であると判定することができる。「公知の治療化合物」とは、そのような治療または予防において効果的であることが示されている(例えば、動物試験またはヒトへの投与による事前経験による)治療化合物を指す。
【００９３】
本明細書で用いる「試料」という用語は、その最も広い意味において用いられる。ヒト染色体またはヒト染色体に関連した配列を含むと推測される試料は、細胞、細胞から単離された染色体(例えば、中期染色体のスプレッド)、(溶液中のまたはサザンブロット解析用などの固体支持体に結合した)ゲノムDNA、(溶液中のまたはノーザンブロット解析用などの固体支持体に結合した)RNA、(溶液中のまたは固体支持体に結合した)cDNAなどを含み得る。タンパク質を含むと推測される試料は、細胞、組織の一部、1つまたは複数のタンパク質を含む抽出物などを含み得る。試料には、これらに限定されないが、組織切片、血液、血液画分(例えば、血清、血漿、細胞）、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳汁、リンパ液、痰、精液、尿、糞便、羊水、絨毛膜試料(CVS)、頸部拭き取り検体、および頬側拭き取り検体が含まれる。
【００９４】
本明細書で用いる「標識」という用語は、検出可能な(好ましくは定量可能な)効果を提供するために用いることができ、かつ核酸またはタンパク質に結合することができる任意の原子または分子を指す。標識には、これらに限定されないが、色素；32Pなどの放射標識；ビオチンなどの結合部分；ジゴキシゲニンなどのハプテン；発光性、リン光性、または蛍光発生的部分；および単独の、または蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)により発光スペクトルを抑制もしくは転換し得る部分と組み合わせた蛍光色素が含まれる。標識は、蛍光、放射能、比色分析、重量測定、X線回折または吸収、磁気、酵素活性などにより検出可能なシグナルを提供し得る。標識は荷電部分(陽電荷または陰電荷)であってよく、または電荷中性であってもよい。標識は、その標識を含む配列が検出可能である限り、核酸もしくはタンパク質配列を含み得る、またはそれらからなり得る。
【００９５】
本明細書で用いる「シグナル」という用語は、標識もしくはアッセイ反応により引き起こされるまたは提供されるような任意の検出可能な効果を指す。
【００９６】
本明細書で使用する「検出器」という用語は、シグナルまたは効果の存在をユーザーまたはシステムの別の要素(例えば、コンピュータまたはコントローラ)に伝達し得る、システムまたはシステムの要素、例えば機器(例えば、カメラ、蛍光測定装置、電荷結合素子、シンチレーションカウンターなど)または反応媒体(X線フィルムまたはカメラフィルム、pH指示薬など)を指す。検出器は、蛍光もしく化学発光を含めて、紫外光、可視光、もしくは赤外光を検出し得る光度測定システムまたは分光光度測定システム；放射能検出システム；核磁気共鳴分析法、質量分析法、または表面増強ラマン分光法などの分光システム；ゲル電気泳動もしくはキャピラリー電気泳動、またはゲル排除クロマトグラフィーなどのシステム；または、当技術分野において公知の他の検出システム、あるいはこれらの組み合わせであってよい。
【００９７】
本明細書で用いる「流通システム」という用語は、物質を1つの実体から別の実体へまたは1つの場所から別の場所へ運び得るおよび/または配達し得るシステムを指す。例えば、検出パネルを製造業者または販売業者からユーザーへ運ぶ流通システムは、これらに限定されないが、包装部門、郵便仕分け室、および郵便配達システムを含み得る。または、流通システムは、これらに限定されないが、1つまたは複数の配達車および担当する配送員、陳列台、および流通センターを含み得る。本発明のいくつかの態様において、関係者(例えば、検出パネル製造業者)は、流通システムを利用して検出パネルをユーザーに無料で、補助金付きの価格で、または割引料金で運ぶ。
【００９８】
本明細書で用いる「割引料金で」という用語は、割引された直接原価での、受取人(例えばユーザー)への商品またはサービスの運搬を指す。いくつかの態様において、「割引料金で」とは、無料での受取人への商品またはサービスの運搬を指す。
【００９９】
本明細書で用いる「補助金付きの価格で」という用語は、受取人の代金の少なくとも一部が別の団体により見送られるまたは支払われる、商品またはサービスの運搬を指す。いくつかの態様において、「補助金付きの価格で」とは、無料での受取人への商品またはサービスの運搬を指す。
【０１００】
本明細書で用いる「無料で」という用語は、直接金融費用なしでの受取人への商品またはサービスの運搬を指す。例えば、製造業者または販売業者により検出パネルがユーザー(例えば、研究者)に無料で提供される場合、ユーザーはその試験の代金を直接支払うことはない。
【０１０１】
本明細書で用いる「検出」という用語は、試料中の分析物(例えば、DNA、RNA、またはタンパク質)を定量的または定性的に同定することを指す。本明細書で用いる「検出アッセイ」という用語は、試料中の分析物核酸を検出する目的で実施するキット、試験、または手順を指す。検出アッセイは標的分析物の存在下で行われる場合に検出可能なシグナルまたは効果を生成し、検出アッセイには、これらに限定されないが、ハイブリダイゼーション、核酸切断(例えば、エキソヌクレアーゼまたはエンドヌクレアーゼ)、核酸増幅、ヌクレオチド配列決定、プライマー伸長、または核酸連結の過程を組み入れたアッセイが含まれる。
【０１０２】
本明細書で用いる「機能的検出オリゴヌクレオチド」という用語は、機能的検出オリゴヌクレオチドが検出アッセイのオリゴヌクレオチド成分を提供する場合に、検出アッセイが目的とする標的核酸をうまく検出し得る(すなわち、検出可能なシグナルを生成し得る)際の、検出アッセイの成分として用いられるオリゴヌクレオチドを指す。これは非機能的検出オリゴヌクレオチドと対照的であり、非機能的検出オリゴヌクレオチドは検出アッセイのオリゴヌクレオチド成分として提供される場合、特定の標的核酸の検出アッセイにおいて検出可能なシグナルを生成することができない。オリゴヌクレオチドが機能的オリゴヌクレオチドであるかどうかの決定は、検出アッセイを用いて特定の標的核酸の存在下でオリゴヌクレオチドを試験することにより実験的に行うことができる。
【０１０３】
例えば、異なる対象に由来する試料または核酸のような、本明細書で用いる「異なる対象に由来する」という用語は、複数の異なる個体に由来する試料を指す。例えば、第1の人のゲノムDNAを含む血液試料と第2の人のゲノムDNAを含む血液試料は、異なる対象に由来する血液試料およびゲノムDNA試料であるとみなされる。異なる対象に由来する5つの標的核酸を含む試料とは、5名の異なる個体の少なくとも5つの試料を含む試料である。しかし、試料は所与の個体の複数の試料をさらに含んでもよい。
【０１０４】
本明細書で用いる「同時に処理する」という用語は、実験またはアッセイに関して用いる場合、実験を同時にまたは経時的に行い、実験の結果が同時に(すなわち、同じ時間内に)生成される、回収される、または解析されることを指す。例えば、マルチウェルプレートの別のウェルまたはマイクロアレイの異なる部位に位置する複数個の異なる標的配列は、試料に対して検出反応が同時にまたは経時的に行われ、かつアッセイから回収されるデータが同時に解析される場合、検出アッセイにおいて同時に処理される。
【０１０５】
本明細書で用いる「アッセイデータ」および「試験結果データ」という用語は、(例えば、遺伝子、SNP、またはRNAを検出または定量するための)アッセイを実行することにより回収されるデータを指す。試験結果データは任意の形態であってよく、すなわち、生アッセイデータまたは解析されたアッセイデータ(例えば、異なる工程によって以前に解析された)であってよい。さらなる処理または解析がなされていない回収データは、本明細書において「生の」アッセイデータと称され(例えば、チップ上のスポットもしくは反応容器からの蛍光シグナルなどのシグナルの測定値に対応する数値、または例えば質量分析計、HPLC、もしくはキャピラリー分離装置によるような、ピークの高さもしくは面積などのピークの測定値に対応する数値)、さらなる段階または解析により処理された(例えば、計算によって標準化された、比較された、または別の方法で処理された)アッセイデータは、「解析アッセイデータ」または「出力アッセイデータ」と称される。
【０１０６】
本明細書で用いる「データベース」という用語は、例えばコンピュータメモリに記憶されている、検索の利便性のために整理された情報(例えば、データ)の集合体を指す。「ゲノム情報データベース」とは、これらに限定されないが、多型情報(すなわち、遺伝子多型に関する情報)、ゲノム情報(すなわち、ゲノムの情報)、連鎖情報(すなわち、例えば染色体における核酸配列の別の核酸配列に対する物理的位置に関する情報)、および疾患関連情報(すなわち、疾患の存在または疾患に対する感受性を、対象の身体的形質、例えば対象の対立遺伝子と関連づける情報)を含むゲノム情報を含むデータベースである。「データベース情報」とは、データベースに送信される、データベースに記憶される、データベースで処理される、またはデータベースから検索される情報を指す。「配列データベース情報」とは、核酸配列に関するデータベース情報を指す。本明細書で用いる「異なる配列データベース」という用語は、相互に異なる情報を含む2つまたはそれ以上のデータベースを指す。例えば、dbSNPデータベースとGenBankデータベースは、それぞれもう一方には見出されない情報を含むため、異なる配列データベースである。
【０１０７】
本明細書で使用する「プロセッサ」および「中央演算処理装置」または「CPU」という用語は互換的に用いられ、コンピュータメモリ(例えば、ROMまたは他のコンピュータメモリ)からプログラムを読み取り、プログラムに従って一連の工程を実行し得る装置を指す。
【０１０８】
本明細書で用いる「コンピュータメモリ」および「コンピュータメモリ装置」という用語は、コンピュータプロセッサによって読み取り可能な任意の記憶媒体を指す。コンピュータメモリの例には、これらに限定されないが、RAM、ROM、コンピュータチップ、デジタルビデオディスク(DVD)、コンパクトディスク(CD)、ハードディスクドライブ(HDD)、および磁気テープが含まれる。
【０１０９】
本明細書で用いる「コンピュータ可読媒体」という用語は、情報(例えば、データおよび命令)を記憶し、コンピュータプロセッサに提供する任意の装置またはシステムを指す。コンピュータ可読媒体の例には、これらに限定されないが、DVD、CD、ハードディスクドライブ、磁気テープ、およびネットワーク上のストリーミングメディアのサーバーが含まれる。
【０１１０】
本明細書で用いる「ハイパーリンク」という用語は、ある文書から別の文書へ、または文書のある部分(または成分)から別の部分へのナビゲーションリンクを指す。典型的に、ハイパーリンクは強調された語または語句として表示され、マウスを用いてこれをクリックして選択することで、関連する文書または文書の一部にジャンプすることができる。
【０１１１】
本明細書で用いる「ハイパーテキストシステム」という用語は、文書(および、場合により他の種類のデータ要素)がハイパーリンクを介してリンクされ、ユーザーナビゲートが可能な「ウェブ」が形成されたコンピュータベースの情報システムを指す。
【０１１２】
本明細書で用いる「インターネット」という用語は、標準プロトコルを用いたネットワークの任意の集合体を指す。例えば、この用語は、一連の標準プロトコル(TCP/IP、HTTP、およびFTPなど)によって互いにリンクされ、世界的規模の分散ネットワークが形成された、相互接続(公共および/または私的)ネットワークの集合体を含む。この用語は、現在インターネットとして一般に知られているものを指すことを意図しているが、現行の標準プロトコルの変更およびそのプロトコルへの追加または他の媒体(例えば、テレビ、ラジオなど)との融合を含め、将来になされ得る変化形も包含することを意図している。この用語はまた、私的(例えば、法人組織の)イントラネットのような非公開ネットワークを包含することも意図している。
【０１１３】
本明細書で用いる「ワールドワイドウェブ」または「ウェブ」という用語は一般に、(i) インターネットを通じてアクセスできる相互リンクされたユーザー閲覧可能なハイパーテキスト文書(一般に、ウェブ文書またはウェブページと称される)の分散した集合体、および(ii) 標準インターネットプロトコルを用いてそのような文書にユーザーがアクセスできるようにする、クライアントおよびサーバーのソフトウェアコンポーネントの両方を指す。現在、アプリケーションにウェブ文書を見つけ出し、入手させる主要な標準プロトコルはHTTPであり、またウェブページはHTMLを用いてコード化されている。しかし、「ウェブ」および「ワールドワイドウェブ」という用語は、HTMLおよびHTTPの代わりに(または、それらに加えて)用いられる得る将来のマークアップ言語および転送プロトコルを包含することを意図している。
【０１１４】
本明細書で用いる「ウェブサイト」という用語は、ワールドワイドウェブの標準プロトコルを用いて、ネットワーク上で情報コンテンツを提供するコンピュータシステムを指す。典型的に、ウェブサイトは特定のインターネットドメイン名に対応するものであって、特定の団体に関連するコンテンツを含む。本明細書で用いるこの用語は一般に、(i) ネットワーク上で情報コンテンツを提供するハードウェア/ソフトウェアサーバーコンポーネント、および(ii) サーバーコンポーネントと対話してウェブサイトユーザー向けのサービスを実行する、任意の非標準コンポーネントまたは専用コンポーネントを含む「バックエンド」ハードウェア/ソフトウェアコンポーネントの両方を包含することを意図している。
【０１１５】
本明細書で用いる「HTML」という用語は、プレゼンテーションを添付し、かつ属性を文書中の情報コンテンツにリンクする標準のコーディング規約および一組のコードであるハイパーテキストマークアップ言語を指す。HTMLは、SGML、汎用マークアップ言語規約に基づいている。文書作成段階の過程で、HTMLコード(「タグ」と称される)は文書の情報コンテンツ内に埋め込まれる。その後、ウェブ文書(または、HTML文書)がウェブサーバーからブラウザに転送される際に、コードがブラウザによって解読され、これを用いて文書が構文解析および表示される。さらに、どのようにウェブブラウザが文書を表示すべきかを指定する際、HTMLタグを使用して他のウェブ文書へのリンク(一般に「ハイパーリンク」と称される)を作成することができる。
【０１１６】
本明細書で用いる「XML」という用語は、HTMLと同様にSGMLに基づいたアプリケーションプロファイルである拡張マークアップ言語を指す。XMLは以下の点でHTMLと異なる：情報プロバイダーが新たなタグおよび属性名を自由自在に規定することができる；文書構造を任意のレベルの複雑性にネストすることができる；いずれのXML文書も、構造検証を行う必要があるアプリケーションによって使用するための、その文法の任意の記載を含み得る。XML文書は実体と称される記憶装置で構成され、実体は構文解析されるまたはされないデータを含む。構文解析されるデータは文字によって構成され、これらの文字は文字データを構成する場合もあればマークアップを構成する場合もある。マークアップは、文書の記憶レイアウトおよび論理構造の記述を記号化する。XMLは、記憶レイアウトおよび論理構造に対して制約を課す、論理構造に対する制約を規定する、および所定の記憶装置の使用を支持する機構を提供する。XMLプロセッサと称されるソフトウェアモジュールは、XML文書を読むために使用され、そのコンテンツおよび構造へのアクセスを提供する。
【０１１７】
本明細書で用いる「HTTP」という用語は、ブラウザとウェブサーバー間の情報交換(例えば、HTML文書およびそのような文書のクライアント要求)に用いられる標準ワールドワイドウェブ・クライアント-サーバープロトコルであるハイパーテキスト転送プロトコルを指す。HTTPは、クライアントからサーバーへ送信し、様々な種類のサーバーアクションを要求することのできる多くの異なる種類のメッセージを含む。例えば、GETの形式をとる「GET」メッセージにより、サーバーは、指定したURLに置かれた文書またはファイルを返送する。
【０１１８】
本明細書で用いる「URL」という用語は、インターネット上でファイルまたは他の情報源の位置を完全に指定する一意のアドレスであるユニフォームリソースロケーターを指す。URLの一般的な形式は、プロトコル://マシンアドレス:ポート/パス/ファイル名である。ポートの指定は任意であり、ユーザーによって何も入力されない場合には、どのようなサービスがプロトコルとして指定されても、ブラウザは標準ポートをデフォルトに設定する。例えば、HTTPがプロトコルとして指定された場合、ブラウザは80というHTTPデフォルトポートを使用することになる。
【０１１９】
本明細書で用いる「プッシュ技術」という用語は、ネットワークを介してデータをユーザーに送信するために用いられる情報宣伝技術を指す。ウェブページが送信される前にクライアントブラウザがそれを要求するワールドワイドウェブ(「プル」技術)とは対照的に、プッシュ技術は、典型的にユーザーが前もって指定した情報に基づき、自動的にユーザーのコンピュータに情報コンテンツを送信する。
【０１２０】
本明細書で用いる「通信ネットワーク」という用語は、ある場所から別の場所へ情報が送信されることを可能にする任意のネットワークを指す。例えば、あるコンピュータから別のコンピュータへ情報を転送する通信ネットワークには、電送、光伝送、衛星伝送などを用いて情報を転送する任意の公共または私的ネットワークが含まれる。情報を一方から他方へ直接または間接的に転送できるような通信ネットワークの一部である2つまたはそれ以上の装置は、互いに「電子通信している」とみなされる。複数のコンピュータを含むコンピュータネットワークは、特定のタスクを実行する1つまたは複数のサブコンピュータ(「サブノード」)に対して情報を処理する中央コンピュータ(「中央ノード」)を有し得る。ネットワークによっては、互いに「異なる地理的位置に」存在するコンピュータを含み、これはコンピュータが異なる物理的位置に存在する(すなわち、物理的に同一のコンピュータではない、例えば、異なる国、州、市、部屋などに存在する)ことを意味する。
【０１２１】
本明細書で用いる「検出アッセイ成分」という用語は、検出アッセイを行い得る系の成分を指す。検出アッセイ成分には、これらに限定されないが、ハイブリダイゼーションプローブ、緩衝液などが含まれる。
【０１２２】
本明細書で用いる「標的検出のために構成された検出アッセイ法」という用語は、標的核酸を用いて実施した場合に検出可能なシグナルを生成し得るアッセイ成分の集合体を指す。例えば、特定の一塩基多型を検出することが実験的に実証された検出アッセイ法は、標的検出のために構成された検出アッセイ法とみなされる。
【０１２３】
本明細書で用いる「ユニークな検出アッセイ法」という語句は、同じ検出パネル上に位置する他の検出アッセイ法に関して、検出アッセイ成分の異なる集合体を有する検出アッセイ法を指す。ユニークなアッセイ法は必ずしも同じ検出パネル上の他のアッセイ法と異なる標的(例えば、SNP)を検出するとは限らないが、所与の標的を検出するために用いられる成分の集合体において少なくとも1つの相違を有する(例えば、ユニークな検出アッセイ法は、同じ検出パネル上の他のアッセイ法よりも短いまたは長いプローブ配列を使用し得る)。
【０１２４】
本明細書で使用する「候補」という用語は、特定の特徴または性質を有すると考えられるアッセイ法または分析物、例えば核酸を指す。「候補配列」とは特定の配列を含むと考えられる核酸を指し、「候補オリゴヌクレオチド」とは、特定の配列を含むなどの性質を有する、または標的核酸とハイブリダイズするかもしくは検出アッセイにおいて機能する能力を有すると考えられるオリゴヌクレオチドを指す。「候補検出アッセイ法」とは、有効な検出アッセイ法であると考えられる検出アッセイ法である。
【０１２５】
本明細書で使用する「検出パネル」という用語は、標的検出のために構成された少なくとも2つのユニークな候補検出アッセイ法を含む基材または装置を指す。
【０１２６】
本明細書で使用する「有効な検出アッセイ法」という用語は、標的の検出と表現型(例えば、健康状態)との関連性を正確に予測することが示されている検出アッセイ法を指す。有効な検出アッセイ法の例には、これらに限定されないが、標的が検出された場合に、医学的表現型を95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.8％、または99.9％正確に予測する検出アッセイ法が含まれる。有効な検出アッセイ法の他の例には、これらに限定されるわけではないが、分析物特異的試薬(すなわち、FDA規定によって規定される)またはインビトロ診断(すなわち、FDAによって認可される)として質の高いおよび/または市販されている検出アッセイ法が含まれる。
【０１２７】
本明細書で用いる「キット」という用語は、材料を配送するための任意の配送システムを指す。反応アッセイとの関連において、そのような配送システムは、1つの場所から別の場所への反応試薬(例えば、適切な容器中のオリゴヌクレオチド、酵素など)および/または補助材料(例えば、緩衝液、アッセイを実施するための書面による使用説明書など)の保管、輸送、または配送を可能にするシステムを含む。例えば、キットは、関連した反応試薬および/もしくは補助材料を含む、1つまたは複数の封入物(例えば、箱)を含む。本明細書で用いる「分割化キット」という用語は、それぞれが全キット成分の一部を含む2つまたはそれ以上の別個の容器を含む配送システムを指す。容器は、所定の受け手へ一緒にまたは別々に配送され得る。例えば、第1容器はアッセイで使用するための酵素を含み得り、第2容器はオリゴヌクレオチドを含む。「分割化キット」という用語は、米連邦食品医薬品化粧品法の520(e)項の下で規制される分析物特定試薬(ASR)を含むキットを包含することが意図されるが、これに限定されるわけではない。実際に、それぞれが全キット成分の一部を含む2つまたはそれ以上の別個の容器を含む任意の配送システムは、「分割化キット」という用語に含まれる。対照的に、「一体化キット」とは、単一の容器中に(例えば、所望の成分のそれぞれを収容している単一の箱中に)反応アッセイの成分のすべてを含む配送システムを指す。「キット」という用語は、分割化キットおよび一体化キットの両方を含む。
【０１２８】
本明細書で用いる「情報」という用語は、事実またはデータの任意の集合体を指す。これに限定されるわけではないが、インターネットを含むコンピュータシステムを用いて記憶されるまたは処理される情報に関して、本用語は、任意の形式(例えば、アナログ、デジタル、光学式など)で記憶される任意のデータを指す。本明細書で用いる「対象に関連する情報」という用語は、対象(例えば、ヒト、植物、または動物)に関連する事実またはデータを指す。「ゲノム情報」という用語は、これらに限定されないが、核酸配列、遺伝子、対立遺伝子頻度、RNA発現レベル、タンパク質発現、遺伝子型に対応する表現型などを含む、ゲノムに関連した情報を指す。「対立遺伝子頻度情報」とは、これらに限定されないが、対立遺伝子同一性、対立遺伝子の存在と対象(例えば、ヒト対象)の特徴との統計学的相関関係、個体または集団における対立遺伝子の有無、1つまたは複数の特定の特徴を有する個体に存在する対立遺伝子の見込みの割合などを含む、対立遺伝子頻度に関連した事実またはデータを指す。
【０１２９】
本明細書で用いる「アッセイ確証情報」という用語は、試験結果データを処理することで(例えば、コンピュータを利用して処理することで)得られるゲノム情報および/または対立遺伝子頻度情報を指す。アッセイ確証情報は、例えば、特定の候補検出アッセイ法を有効な検出アッセイ法として同定するために使用され得る。
【０１３０】
発明の詳細な説明
生物試料における検出
分子診断の目標は、最小限の労力および段階でできるだけ短時間に分析物の正確で高感度な検出を達成することである。これを達成する1つの方法は試料中の分析物の多重検出であり、これにより単一の反応容器または溶液中で複数の検出事象が可能になる。しかし、多重反応を含む既存の診断法の多くは、反応を行う時間、複雑性、および費用を増大させる試料調製段階を含む多くの段階をなお要する。本発明は、いくつかの態様において、未精製または未処理の生物試料(例えば、血液)で直接行い得るアッセイ法を提供することにより、これらの問題の解決策を提供する。
【０１３１】
天然試料中には診断反応の機能、精度、および一貫性を妨げ得る多くの生物学的要因が存在するため、生物試料(例えば、血液、唾液、尿など)における直接検出は実現しにくい。例えば、多くの核酸検出技術は、特定の塩およびpH条件に鋭敏な、または天然因子によるタンパク質分解もしくは阻害を受けやすい酵素または試薬を使用する。本発明は、任意の所望の試料(例えば、未精製体液)中の核酸標的配列を直接検出するための、単独でまたは逆転写およびPCR法もしくは関連技術と組み合わせてインベーダーアッセイ法を使用するシステムおよび方法を提供する。以下の実施例13および14は、そのような例を提供する。このような方法は、個々の反応として用いることもできれば、多重反応として用いることもできる。いくつかの多重態様を以下に詳述する。
【０１３２】
したがっていくつかの態様において、本発明は、標的核酸が存在する場合にこれが検出されるような条件下で試料を検出アッセイ試薬に曝露する段階を含む、試料中の1つまたは複数の標的核酸を検出するためのシステム、組成物、キット、および方法を提供する。好ましい態様において、本方法は一段階反応で行われる。例えば、試料が試薬に曝露されたならば、検出段階の前にさらなる試薬を添加する必要はない。したがって、本方法は、人または他の介入を加える必要なしに反応容器(例えば、閉じた反応容器)中で行われ得る。好ましい態様において、本方法は、逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応を伴うまたは伴わない侵入型切断反応を含む。他の好ましい態様において、一段階反応は、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および切断構造形成オリゴヌクレオチド(例えば、侵入型切断反応におけるプローブまたはインベーダーオリゴ)として機能するように構成されたオリゴヌクレオチドを含む。侵入型切断反応を用いればシグナルが増幅され、感度が高まり、かつシグナルを定量することができるため、ポリメラーゼ連鎖反応法を用いる場合、限られたサイクル(例えば、20、15、12、10、またはそれ以下)しか用いる必要がない。このような方法を行うまたは支援するためのキットは、本方法に有用な試薬の任意の1つまたは複数を含み得る。例えば、いくつかの態様において、キットは、未精製体液中の標的核酸の検出可能な増幅を可能にする逆転写酵素(例えば、AMV、MMLVなど)、ポリメラーゼ、5'ヌクレアーゼ(例えば、FEN-1エンドヌクレアーゼ)、および緩衝液を含む。
【０１３３】
多重反応
多重PCRは、1988年に導入されて以来(Chamberlain, et al. Nucleic Acids Res., 16:11141 (1988))、単一の反応において複数の遺伝子座を増幅する日常的な手段となっている。このアプローチは、多くの研究および臨床用途において有用である。多重PCR法は、とりわけ診断ウイルス学(Elnifro, et al. Clinical Microbiology Reviews, 13：559 (2000))、親子鑑定(Hidding and Schmitt, Forensic Sci. Int., 113：47 (2000)；Bauer et al., Int. J. Legal Med. 116：39 (2002))、移植前遺伝子診断(Ouhibi, et al., Curr Womens Health Rep. 1：138 (2001))、環境および食品試料における微生物分析(Rudi et al., Int J Food Microbiology, 78：171 (2002))、および獣医学(Zarlenga and Higgins, Vet Parasitol. 101：215 (2001))での使用について記載されている。ごく最近、特に一塩基多型またはSNPに関して遺伝子解析が全ゲノムレベルにまで拡大されたことで、高度多重PCRの能力の必要性が生じている。比較ゲノムワイド関連研究および候補遺伝子研究は、個体当たり100,000〜500,000個のSNPの遺伝子型を同定する能力を必要とする(Kwok, Molecular Medicine Today, 5：538-5435 (1999)；Kwok, Pharmacogenomics, 1：231 (2000)；Risch and Merikangas, Science, 273：1516 (1996))。さらに、コード領域または調節領域に存在するSNPは、重要な方法で遺伝子機能に変化をもたらし(Cargill et al. Nature Genetics, 22：231 (1999)；Halushka et al., Nature Genetics, 22：239(1999))、よってこれらのSNPはオーダーメイド医療の有用な診断ツールとなる(Hagmann, Science, 285：21 (1999)；Cargill et al. Nature Genetics, 22：231 (1999)；Halushka et al., Nature Genetics, 22：239 (1999))。同様に、以前に同定された一連のSNPの医学的関連性を診断パネルの一部として臨床的関連性の可能性に関して確認することは、何千もの個体を何千ものマーカーに関して一度に試験することを意味する。
【０１３４】
その広い魅力および有用性にもかかわらず、いくつかの要因が多重PCR増幅を複雑にしている。これらのうち最も重要であるのは、ある遺伝子座が別の遺伝子座よりも高度に増幅されるPCRまたは増幅の偏りの現象である。2種類の増幅の偏りについて記載されている。1つはPCRドリフトと称され、反応の初期におけるプライマーアニーリングのような段階での確率的変動によるものとされており(Polz and Cavanaugh, Applied and Environmental Microbiology, 64：3724 (1998))、再現性はなく、非常に少量の標的分子を増幅する場合に多く見られ得る(Walsh et al., PCR Methods and Applications, 1：241(1992))。もう1つはPCR選択と称されるもので、プライマーの特徴、単位複製配列の長さ、G-C含量、およびゲノムの他の性質に基づく、いくつかの遺伝子座の優先的増幅に関する(Polz、前記)。
【０１３５】
PCR反応が多重化され得る程度に影響を及ぼす別の要因は、PCR反応がプラトー段階に到達する固有の傾向である。プラトー段階はPCRサイクル後期に見られ、単位複製配列の生成が指数関数的蓄積から擬似的な直線的蓄積に移行し、その後最終的に増加が停止するという観察を反映している。この効果は、DNAポリメラーゼと二本鎖産物自体の非特異的相互作用に起因しているようである。プラトー段階における産物と酵素のモル比は典型的に、いくつかのDNAポリメラーゼに関しては、反応に異なる量の酵素を含めた場合でも一貫しており、産物：酵素は約30:1である。したがって、この効果により、PCR反応で生成され得る二本鎖産物の全量が制限され、そのため、増幅を行う異なる遺伝子座の数は、例えばゲル電気泳動、プライマー伸長などによるその後の解析に所望される各単位複製配列の全量に対してバランスをとる必要がある。
【０１３６】
これらおよび他を考慮すると、50個の遺伝子座を含む多重PCRが報告されてはいるものの(Lindblad-Toh et al., Nature Genet. 4：381 (2000))、多重化は典型的に10個未満の異なる産物に制限される。しかし、単一のゲノムDNA試料から100,000〜450,000個ほどのSNPを解析する必要性を考えると、PCR反応の多重化能力を拡大する手段の明確な必要性が存在する。
【０１３７】
本発明は、例えばインベーダーアッセイを多重PCR増幅と組み合わせることで、PCR反応を実質的に多重化する方法を提供する。インベーダーアッセイは、非常に多数の標的が多重反応で検出されることを可能にする検出段階およびシグナル増幅を提供する。所望の通りに、数百〜数千個から数十万個までの標的が、多重反応で検出され得る。
【０１３８】
インベーダーアッセイによる直接遺伝子型同定は、検出プラットフォームに依存して典型的にSNP当たり5〜100 ngのヒトゲノムDNAを使用する。少数のアッセイの場合には、反応は標的を前もって増幅することなくゲノムDNAを用いて直接行われ得るが、100,000を超えるインベーダーアッセイが開発され、ゲノムワイド関連研究にはさらにより多くのインベーダーアッセイが期待されることで、試料DNAの量が限定要因となり得る。
【０１３９】
インベーダーアッセイは106〜107倍のシグナル増幅を提供するため、インベーダーアッセイ法と組み合わせた多重PCR法は、典型的なPCR法と比較して限られた標的増幅しか使用しない。その結果、低い標的増幅レベルにより混合物中の個々の反応間の干渉が軽減され、産物の蓄積によるPCRの阻害が減少し、よってより大規模な多重化が提供される。さらに、低い増幅レベルにより標的の相互汚染の可能性が減少し、PCR誘発性の変異の数が減少すると考えられる。
【０１４０】
異なる遺伝子座の不均等な増幅は、多重PCRを開発する上で最も大きな課題の1つを示す。2つの遺伝子座間の増幅率の相違は、ゆっくりと増幅する遺伝子座においてインベーダー反応により生成されるシグナルはアッセイの検出限界よりも低く、速く増幅する遺伝子座から生じるシグナルはアッセイの飽和レベルを超えるという状況をもたらし得る。この問題は、いくつかの方法で対処することができる。いくつかの態様では、インベーダー反応を例えばリアルタイムで異なる時点で読み取ることができ、そのため検出のダイナミックレンジが顕著に拡大される。他の態様においては、異なる遺伝子座がより類似した増幅レベルに達することを可能にする条件下で、多重PCRを行うことができる。例えば、プライマー濃度を限定することができ、それにより各遺伝子座がより均一な増幅レベルに到達し得る。さらなる他の態様においては、PCRプライマーの濃度を調整して、異なる遺伝子座の増幅率のバランスを保つことができる。
【０１４１】
本発明は、単一反応中に数百〜数千個の産物を含む高度多重PCR法の設計および特徴を提供する。例えば、100重PCRによって提供される標的の前増幅により、インベーダーに基づくSNP遺伝子型同定に必要なヒトゲノムDNAの量が、アッセイ当たり0.1 ng未満まで低減される。高度多重PCR法の最適化およびプライマー設計のコンピュータプログラムの詳細を、以下に記載する。
【０１４２】
高度多重PCRの方法を提供することに加えて、本発明はさらに、最初の反応設定を超えてその後に操作も試薬添加も行うことなく、単一反応容器中で逆転写反応ならびに標的増幅反応およびシグナル増幅反応を行う方法を提供する。このような組み合わせ反応は、非常に短い反応時間で限られた標的量を定量解析するのに適している。
【０１４３】
以下の考察は、本発明の特定の好ましい例示的態様の説明を提供するものであり、本発明の範囲を制限するものではない。
【０１４４】
I. 多重PCRプライマー設計
インベーダーアッセイ法は、標的を前増幅する必要なしに、わずか10〜100 ng程度のゲノムDNAを用いて一塩基多型(SNP)の検出に使用することができる。しかし、開発された50,000を超えるインベーダーアッセイ法および何十万というSNPを含む全ゲノム関連研究についての可能性については、試料DNAの量が大規模解析の限定要因となる。標的増幅を行わないヒトゲノムDNA(hgDNA)におけるインベーダーアッセイ法の感度のおかげで、インベーダーアッセイ法と組み合わせた多重PCR法は、通常のゲル検出法のために大量の増幅(109〜1012)を必要とする典型的な多重PCR反応と比較して、限られた標的増幅(103〜104)のみを必要とする。インベーダー(商標)検出に用いられる標的増幅が低レベルであることから、一般に標的蓄積に起因する増幅阻害が回避されて、より大規模な多重化が提供される。
【０１４５】
本発明は、多重PCR用のプライマーセットの作製を可能にする(例えば、インベーダーアッセイ法などの検出アッセイ法と組み合わせることができる)方法および選択基準を提供する。好ましい態様において、本発明は、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および侵入型切断アッセイ反応用のインベーダーオリゴとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本発明のソフトウェアアプリケーションは自動化された多重PCRプライマー選択を提供し、よってそれにより設計されたプライマーでの高度多重PCRが可能になる。実施例2に示すように、SNP検出の対応プラットフォームとしてインベーダー医学的関連パネル(Medically Associated Panel；MAP)を用いると、本発明の方法、ソフトウェア、および選択基準により、単一のPCR反応で101個の可能な単位複製配列のうちの94個(約93％)の正確な遺伝子型同定が可能となった。最初のPCR反応では鋳型としてhgDNAを10 ngのみ使用したが、これはインベーダーアッセイ当たり150 pg未満のhgDNAに相当する。
【０１４６】
インベーダーアッセイ法により、等温、単一添加形式を用いる同じ反応において、2つの異なる対立遺伝子の同時検出が可能になる。対立遺伝子の識別はプローブの「構造特異的」切断によって行われ、所与の多型に対応する5'フラップが遊離する。2次反応において、遊離した5'フラップが、適切なFRETカセットを切断することでシグナル生成を媒介する。
【０１４７】
本発明のソフトウェアアプリケーションの1つの態様を用いた、インベーダー医学的関連パネルでの解析に利用できる配列に由来する101個のプライマーセットについてのプライマー対(フォワードプライマーおよびリバースプライマーの両方)の1つの作製は、単一エントリーの試料入力ファイル(例えば、本発明の方法およびソフトウェアにより処理される、SNPを含む単一の標的配列に関する標的配列情報)を含む。標的配列情報は、Third Wave TechnologiesのSNP#、短縮識別名、および括弧で示されたSNP位置を伴う配列を含む。同じエントリーの試料出力ファイル(例えば、本発明のシステムおよび方法およびソフトウェアによって処理された後の標的配列を示す)は、フットプリント領域の配列(SNP部位に隣接している大文字、標的配列中のSNPを検出するために、インベーダーアッセイプローブがこの標的配列にハイブリダイズする領域を示している)、フォワードプライマー配列およびリバースプライマー配列(太字)、ならびにそれらの対応するTmを含む。
【０１４８】
いくつかの態様において、多重PCRが可能なプライマーセットを作製するためのプライマーの選択は、自動化様式で(例えば、ソフトウェアアプリケーションにより)行われる。多重PCR用の自動化プライマー選択は、図8のフローチャートに示すように設計されたソフトウェアプログラムを用いて達成され得る。
【０１４９】
多重PCRは一般的に、選択単位複製配列の偏りのある増幅およびプライマー-ダイマーの形成によって生じる擬似産物の増幅を避けるために、広範囲な最適化を必要とする。これらの問題を避けるため、本発明は、多重PCRおよび検出アッセイ(例えば、インベーダー検出アッセイ)でのその後の使用のために構成されるプライマーセットを作製するための選択基準を提供する方法およびソフトウェアアプリケーションを提供する。
【０１５０】
いくつかの態様において、本発明の方法およびソフトウェアアプリケーションは、ユーザー定義の配列および対応するSNP位置から始まる。特定の態様においては、本方法および/またはソフトウェアアプリケーションにより、各配列について標的配列内のフットプリント領域(インベーダー検出に必要とされる最少の単位複製配列)が決定される。フットプリント領域は、アッセイプローブがハイブリダイズする領域に加え、そこから外側に伸長している任意のユーザー定義の付加的塩基(例えば、アッセイプローブがハイブリダイズする箇所の両側において含まれる5個の付加的塩基)を含む。次に、プライマーがフットプリント領域から外側に設計され、現行の多重化セットにおいて以前に設計されたプライマーとのプライマー-ダイマー形成の可能性も含めて、いくつかの基準に対して評価される。現行の多重化セットにおけるすべての配列に対するプライマーが設計され得るまで、同じ配列セットの複数の相互作用を通してこの過程が続けられ得る。
【０１５１】
プライマーセットが設計されたならば、例えば鋳型として10 ngのhgDNAのみを用いる標準的条件下で、多重PCRを行ってもよい。95℃で10分後、Taq(2.5単位)を50μl反応物に添加し、PCRを50サイクル行い得る。PCR反応物を希釈し、インベーダーMAPプレートに直接添加し得る(3 ul/ウェル)。インベーダーMAPプレート上の各反応物に15 mM MgCl2をさらに3 ul添加し、ミネラルオイル6 ulでカバーし得る。次いで、プレート全体を5分間、95℃まで加熱し、63℃で40分間インキュベートし得る。その後、Cytofluor 4000蛍光プレートリーダーでFAMおよびRED蛍光を測定し、各単位複製配列について「フォールドオーバーゼロ(Fold Over Zero)」(FOZ)値を計算し得る。各SNPから得られた結果は、「パス(pass)」(緑色)、「ミスコール(mis-call)」(ピンク色)、または「ノーコール(no-call)」(白色)として、表において色分けされ得る(以下の実施例2を参照されたい)。
【０１５２】
いくつかの態様において、PCR反応の数は約1〜約10反応である。いくつかの態様において、PCR反応の数は約10〜約50反応である。さらなる態様において、PCR反応の数は約50〜約100反応である。さらなる態様において、PCR反応の数は約100〜約1,000反応である。さらなる他の態様において、PCR反応の数は1,000を超える。
【０１５３】
本発明はまた、多重PCR反応を最適化する方法を提供する(例えば、プライマーセットが作製されたならば、各プライマーまたはプライマー対の濃度が最適化され得る)。例えば、プライマーセットが作製され、多重PCRにおいて等モル濃度で使用された時点で、プライマーは、多重プライマーセットがよりよく機能するように、最適プライマー濃度が決定されるように、別々に評価され得る。
【０１５４】
多重PCR反応は、標準的な1重PCR反応と比較して潜在的に時間効率がよくより費用のかからない、核酸情報を得る手段として、科学、研究、臨床、およびバイオテクノロジー産業において認識されつつある。反応容器(例えば、チューブまたはマルチウェルプレートのウェル)につき単一の増幅反応のみを行うのではなく、単一の反応容器中で多数の増幅反応が行われる。
【０１５５】
標的当たりの費用は、アッセイ設定およびデータ解析で技術者が行う時間を排除すること、ならびに実質的な試薬の節約(特に酵素の費用)により、理論上、低くなる。多重アプローチのもう一つの利点は、はるかに少量の標的試料が必要である点である。何十万という一塩基多型(SNP)を含む全ゲノム関連研究では、標的または試験試料の量が大規模解析を制限するため、例えば100個の結果を得るために100個の試料分割量を使用するのに対して、同じデータセットを得るために1つの試料分割量を使用するという単一反応を行う概念は、魅力的な選択である。
【０１５６】
多重PCR反応を成功させるためのプライマーを設計するには、プライマー間の異常な相互作用の問題に取り組むべきである。たとえ少ない塩基長のみであったとしても、プライマーダイマーが形成されると、両プライマーの標的配列への正しいハイブリダイゼーションが阻害される可能性がある。さらに、ダイマーがプライマーの3'末端においてまたはその近傍で形成される場合、3'末端はプライミング事象に必要であるため、増幅は起こらないか、または非常に低レベルの増幅が起こることになる。明らかに、多重反応当たり多くのプライマーを使用すればするほど、より多くの異常なプライマー相互作用が起こる可能性がある。本救済の方法、システム、およびアプリケーションにより、多数のプライマーセットにおけるプライマーダイマーが妨げられ、高度多重PCRに適したセットが作製される。特に、好ましい態様において、本発明は、逆転写プライマー、ポリメラーゼ連鎖反応プライマー、および侵入型切断アッセイ反応用のインベーダーオリゴとして機能するように構成された多目的オリゴヌクレオチドを提供し、それによって多重反応に使用するプライマー/オリゴヌクレオチドの数が顕著に減少し、バックグラウンド異常(例えば、プライマーダイマー)が制限されることになる。
【０１５７】
多くの部位(例えば、1つの多重PCR反応において100個の部位)に関してプライマー対を設計する場合、プライマー対が設計される順序により、1つの反応についての適合性のあるプライマー対の総数が左右され得る。例えば、プライマーの第1セットが、偶然にもA/Tリッチな標的領域である第1標的領域に対して設計される場合、これらのプライマーはA/Tリッチになると考えられる。選択された第2標的領域も同様に偶然にもA/Tリッチな標的領域である場合、これらの2つのセットに対して設計されるプライマーは、プライマーダイマーのような異常な相互作用のために不適合になる可能性がはるかに高い。しかし、選択された第2標的領域がA/Tリッチでない場合には、第1のA/Tリッチなセットと相互作用しないプライマーセットが設計され得る可能性が非常に高い。入力標的配列の任意の所与のセットに関して、本発明は、プライマーセットが設計される順序をランダム化する(図8を参照されたい)。さらに、いくつかの態様において、本発明は、任意の所与の多重反応に対して適合性のあるプライマーセットの数を最大限にするために、入力標的配列のセットを多くの異なるランダムな順序で並べ替える(図8を参照されたい)。
【０１５８】
本発明は、多重設計において所与の反応標的セットに対する適合性のあるプライマー対の数を最大限にする一方で、3'相互作用を最小限にするプライマー設計の基準を提供する。5'-N[x]-N[x-1]-・・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'と記載されるプライマーに関して、N[1]はAまたはCである(別の態様において、N[1]はGまたはTである)。設計されたフォワードプライマーおよびリバースプライマーそれぞれのN[2]-N[1]は、任意の他のオリゴヌクレオチドのN[2]-N[1]と相補的であるべきではない。特定の態様において、N[3]-N[2]-N[1]は、任意の他のオリゴヌクレオチドのN[3]-N[2]-N[1]と相補的であるべきではない。好ましい態様において、所与のN[1]においてこれらの基準が満たされない場合には、フォワードプライマーについては5'方向の次の塩基またはリバースプライマーについては3'方向の次の塩基がN[1]部位として評価され得る。標的配列のすべてまたは大多数に関してすべての基準が満たされるまで(例えば、標的配列の95％が、これらの基準を満たす、プライマーセット用に作製されたプライマー対を有し得る)、標的ランダム化と共にこの過程が繰り返される。
【０１５９】
多重プライマー設計において克服されるべきもう一つの問題は、実際に必要なヌクレオチド配列、配列の長さ、およびオリゴヌクレオチド融解温度(Tm)の制約間のバランスである。重要なことには、1つの反応における1つの多重プライマーセット中のプライマーは、緩衝液、塩、および温度の同じ反応条件下で機能することになるため、それらは、関心対象の領域がGCリッチであるかATリッチであるかにかかわらず、実質的に類似したTmを有する必要がある。本発明は、最小Tmおよび最大Tmの必要条件、ならびに最小および最大の長さの必要条件を満たすプライマー設計を可能にする。例えば、各プライマーに関する式5'-N[x]-N[x-1]-・・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'において、xは、プライマーが予め定められた融解温度を有するように選択される(例えば、プライマーが摂氏約50度という計算された融解温度を有するまで、プライマーに塩基を含める)。
【０１６０】
PCR反応の産物は、例えばハイブリダイゼーション型の検出アッセイまたはインベーダー反応アッセイのような別の核酸検出手段の標的材料として用いられる場合が多い。2次反応がうまく起こるようにプライマー配置の位置に考慮するべきであり、この場合も同様に、正確な結果およびデータが得られるように、増幅プライマーと2次反応オリゴヌクレオチドとの間の異常な相互作用は、最小限度に抑えられるべきである。多重プライマーセット用に設計されたプライマーが検出アッセイのオリゴヌクレオチド成分と反応しない(例えば、ハイブリダイズしない、または反応を誘発しない)ように、選択基準が用いられ得る。例えば、プライマーが2重インベーダーアッセイのFRETオリゴヌクレオチドと反応するのを妨げるため、特定の相同性基準が用いられる。特に、セット中の各プライマーが5'-N[x]-N[x-1]-・・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'と定義される場合、N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'は、FRETまたはインベーダーオリゴヌクレオチドとの相同性が90％未満であるように選択される。他の態様においては、N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'は各プライマーについて、FRETまたはインベーダーオリゴヌクレオチドとの相同性が80％未満であるように選択される。特定の態様においては、N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'は各プライマーについて、FRETまたはインベーダーオリゴヌクレオチドとの相同性が70％未満であるように選択される。
【０１６１】
プライマーセットを開発するために本発明の基準を使用する一方で、いくつかのプライマー対は規定の基準のすべてを満たさない場合がある(これらはエラーとして拒絶され得る)。例えば、標的100個のセットにおいて、30個は設計されて列挙される基準をすべて満たすが、セット31はそれができない。本発明の方法において、セット31は不合格としてフラグ付けされ得、本方法は、100個の標的のリストを通して、基準を満たさないセットに同様にフラグ付けし続け得る(図8を参照されたい)。100個の標的すべてがプライマー設計の機会を得た時点で、本方法は不合格セットの数を書き留め、新しいランダムな順序で100個の標的を並べ替え、設計過程を繰り返す(図8を参照されたい)。設定可能な回数を実行した後、最も合格した数の多い(不合格セットの数が最も少ない)プライマー対を有するセットが、多重PCR反応について選択される(図8を参照されたい)。
【０１６２】
図8は、本発明の方法およびソフトウェアアプリケーションの特定の態様の基本的な流れについてのフローチャートを示す。好ましい態様において、図8に詳述する過程は、使いやすさの点からソフトウェアアプリケーションに組み入れられる(しかし本方法は、例えば図8を手引きとして使用し、手作業で行うことも可能である)。
【０１６３】
標的配列および/またはプライマー対は、図8に示すシステムに入力される。ボックスの最初のセットは、他の配列がプライマーセットプール(例えば、PDパス(PDPass)、以前に処理され、プライマーダイマーを形成することもFRET配列に対する反応性を有することもなく、共に機能することが示されている配列)およびダイマーテスト(DimerTest)エントリー(例えば、ユーザーが使用することを所望するが、プライマーダイマーまたはfret反応性についてまだ試験されていない対またはプライマー)へとすぐに移される一方で、どのようにして標的配列が、決定されたフットプリントを有する配列のリストに加えられるのかを示す(図8の「B」を参照されたい)。言い換えると、次第に「入力の終わり」へ導くボックスの最初のセットは、後にそれらが正確に処理され得るように配列を分類する。
【０１６４】
図8の「A」から開始して、プライマープールは基本的に、新たな実行を開始するためにクリアされるかまたは「空にされる」。その後、標的配列は「B」に送られて処理され、ダイマーテスト対は「C」に送られて処理される。標的配列は「B」に送られ、そこでユーザーまたはソフトウェアアプリケーションが標的配列についてフットプリント領域(例えば、そこで、標的配列中の変異(例えば、SNP)を検出するためにアッセイプローブがハイブリダイズする)を決定する。設計されるプライマーがこの領域を完全に含むようにこの領域(ハイブリダイゼーション領域を越えたさらなる塩基が付加されるように定めることによって、ユーザーがさらに拡張する場合がある)を設計することが重要である。図8では、ソフトウェアアプリケーションINVADER CREATORを用いて、標的領域とハイブリダイズするであろうインベーダーオリゴヌクレオチドおよび下流プローブを設計する(しかし、任意の種類のシステムのプログラムを用いて、ユーザーがプローブを設計すること、およびそれによって標的配列上にフットプリント領域を決定することに関心を示す任意の種類のプローブを作製することができる)。したがって、コアのフットプリント領域は、その後、標的上のこれらの2つのアッセイプローブの位置により規定される。
【０１６５】
次に、システムはフットプリントの5'端から開始し、第1塩基に到達するまで、または1つめのAもしくはC(またはGもしくはT)に到達するまで、5'方向に移動する。これは、フォワードプライマーの配列を規定する最初の開始点として設定される(すなわち、これは最初のN[1]部位となる)。フォワードプライマーのプライマー配列は、この最初のN[1]部位から、標的領域上に見られる塩基と同じである。例えば、プライマーの初期設定サイズが12塩基として設定される場合、システムはN[1]として選択された塩基から開始し、次いで標的配列中に見出される次の11塩基を加える。この12-merプライマーは、その後(例えば、INVADER CREATORを用いて)融解温度について試験され、その配列が初期設定の最小および最大融解温度(例えば、摂氏約50度、かつ摂氏55度以下)としてユーザーにより指定される融解温度を有するまで、標的配列からさらなる塩基が付加される。例えば、システムは式5'-N[x]-N[x-1]-・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'を使用し、xは最初は12である。その後、システムは前もって設定された融解温度が見出されるまで、xをより大きい数(例えば、より長い配列)へと調節する。特定の態様においては、最大限のプライマーサイズが初期設定パラメータとして用いられ、設計するプライマーの長さの上限となる。いくつかの態様において、最大限のプライマーサイズは約30塩基(例えば、29塩基、30塩基、または31塩基)である。他の態様において、初期設定(例えば、最小および最大のプライマーサイズ、ならびに最小および最大のTm)は、標準的なデータベース操作ツールを用いて修正することができる。
【０１６６】
図8における次のボックスは、これまでに設計されたプライマーがプライマー-ダイマーおよび/またはfret反応性を引き起こすかどうかを決定するために用いられる(例えば、残りの配列既にそのプール中に存在する)。この決定に用いられる基準は、上記で説明されている。プライマーがこの段階に合格する場合には、そのフォワードプライマーはプライマープールへ加えられる。しかしながら、そのフォワードプライマーがこの基準を欠いている場合には、図8に示されるように、開始点(N[1])が5'方向に1ヌクレオチド(または次のAもしくはC、または次のGもしくはTへ)移動する。システムはまず、移動することがプライマーの作製に成功するための十分な余地をその標的配列上に残しているかを確かめるチェックを行う。イエスの場合には、システムは折り返して、この新しいプライマーの融解温度についてチェックする。しかし、配列が設計され得ない場合には、その標的配列はエラーとしてフラグ付けされる(例えば、この標的に対してフォワードプライマーが作製できないことを示す)。
【０１６７】
図8に示すように、この同じ過程が次にリバースプライマーの設計についても繰り返される。リバースプライマーの作製に成功した場合には、その対またはプライマーはプライマープールへと入れられ、システムは「B」に戻るか(処理する標的配列がさらに存在する場合)、またはダイマーテスト対を試験するために「C」へ進む。
【０１６８】
図8の「C」の開始は、プライマー(ダイマーテスト)として入力されたプライマー対がどのようにして本システムにより処理されるかを示している。ダイマーテスト対が存在しない場合には、図8に示されるようにシステムは「D」に進む。しかし、ダイマーテスト対が存在する場合には、これらは上記したように、プライマー-ダイマーおよび/またはFRET反応性について試験される。ダイマーテスト対がこれらの基準を欠く場合には、それらはエラーとしてフラグ付けされる。ダイマーテスト対が基準に合格する場合には、それらはプライマーセットプールに加えられ、その後システムは、評価すべきダイマーテスト対がさらに存在する場合には「C」に戻り、または評価すべきダイマーテスト対がそれ以上存在しない場合には「D」に進む。
【０１６９】
作製されたプライマーのプールは、図8の「D」から開始して評価される。この項における第1段階は、配列の特定のランダム化されたランにより生じたエラー(不合格)の数を調べることである。エラーがない場合、このセットはユーザーへ出力され得る最良のセットである。1個以上のエラーがある場合には、システムはこのランを任意の他の以前のランと比較して、どのランが最も少ないエラーを生じたかを調べる。現行のランがより少ないエラーを有する場合、これは現行の最良セットと表される。この時点でシステムは「A」に戻り、同じ配列の別のランダム化されたセットでランをもう一度開始してもよく、または予め設定されたランの最高数(例えば、5ラン)に、このランで到達してもよい(例えば、これは5番目のランであり、ランの最高数が5として設定されていた)。最高数に到達した場合には、その最良のセットが最良セットとして出力される。この最良のプライマーセットは次いで、多重PCR反応が行われ得るように、オリゴヌクレオチドの物理的セットとして作製するために使用され得る。
【０１７０】
多重PCR反応について克服すべきもう一つの問題は、標準的な多重反応において生じる不均等な単位複製配列の濃度である。増幅の標的とされる異なる遺伝子座は、増幅反応においてそれぞれ異なった挙動を示し、異なる単位複製配列産物はそれぞれ非常に異なった濃度を生じ得る。本発明は、プライマー濃度を最初の検出アッセイの読み取り値(例えば、インベーダーアッセイの読み取り値)に対して調整し、その後、バランスのとれたプライマー濃度を用いて、異なる単位複製配列を実質的に均等な濃度に接近させるために用い得る方法、システム、ソフトウェアアプリケーション、コンピュータシステム、およびコンピュータデータ記憶媒体を提供する。
【０１７１】
種々のプライマー対の濃度は、実験に基づいて決定され得る。いくつかの態様において、最初のランは、すべてのプライマーを等モル濃度にして行われる。次いで、時間の読み取りが行われる。時間の読み取りに基づき、各単位複製配列に関する相対的増幅率が決定される。その後、統一補正方程式に基づき、同じ時点内でより近接したシグナルを得るためには、プライマー濃度がどれくらいであるべきかの推定値が得られる。これらの検出アッセイは、種々のサイズのアレイ(384ウェルプレート)において可能である。
【０１７２】
本発明を検出アッセイおよび検出アッセイのアレイと組み合わせることで、実質的処理効率が提供されることが理解される。本発明を用いて作製されたプライマーまたはプライマー対のバランスのとれた混合物を使用して、1点読み取りを行うことができ、平均的ユーザーが、種々の標的のアレイにわたって高感度および高特異性を必要とする試験を実施する際に、高い効率を得ることができるようになる。
【０１７３】
単一の反応容器中に最適化されたプライマー対濃度を有することで、ユーザーが、単一の反応容器中かつ一段階で多数のまたは多様な増幅標的について増幅を行うことが可能になる。一段階過程の生成物はその後、例えば数百のアッセイの試験結果データを首尾良く得るために使用される。例えば、384ウェルプレート上の各ウェルは、その上で異なる検出アッセイを行うことができる。一段階多重PCR反応の結果は、ゲノムDNAの増幅された384個の異なる標的を有しており、各プレートについて384個の試験結果を提供する。各ウェルが多数のアッセイを有する場合には、よりいっそう高い効率を得ることができる。
【０１７４】
したがって本発明は、各PCR産物の偏りのない増幅を達成するためのパラメータとして、高度多重PCRにおける各プライマーセットの濃度の使用を提供する。いずれのPCRも、プライマーアニーリング段階およびプライマー伸長段階を含む。標準的なPCR条件下では、1 uMオーダーでの高濃度のプライマーにより、プライマーアニーリングの速い反応速度が保証されるが、プライマー伸長段階の最適時間は増幅産物のサイズに依存し、アニーリング段階よりもかなり長くなり得る。プライマー濃度を下げることで、プライマーアニーリング反応速度が律速段階となり得り、PCR増幅率は、プライマー濃度、プライマーの結合反応速度定数、およびアニーリング時間に強く依存することになる。
【０１７５】
プライマーPと標的Tとの結合は、以下のモデルにより説明することができる：
2008518621.tif 000002
モデル中、kaはプライマーアニーリングの結合反応速度定数である。アニーリングはプライマー融解より低い温度で起こり、かつ逆反応は無視できると仮定する。
【０１７６】
プライマー過剰条件下でのこの反応速度についての解式は周知である：
2008518621.tif 000003
式中、[PT]はプライマーと結合した標的分子の濃度であり、T0は最初の標的濃度、cは最初のプライマー濃度、およびtはプライマーアニーリング時間である。プライマーと結合した各標的分子は複製されて完全なサイズのPCR産物を産生すると仮定すると、単一PCRサイクルにおける標的増幅率は以下の通りである。
2008518621.tif 000004
【０１７７】
nサイクル後の全PCR増幅率は、以下の式により与えられる。
2008518621.tif 000005
【０１７８】
式4から導かれるように、プライマーアニーリング反応速度がPCRの律速段階である条件下では、増幅率はプライマー濃度に強く依存することになる。したがって、偏りのある遺伝子座の増幅は、それが個々の結合反応速度定数、プライマー伸長段階、または任意の他の要因によって生じているにせよ、多重PCRにおける各プライマーセットのプライマー濃度を調整することで補正することができる。調整されたプライマー濃度はまた、PCRで前増幅された遺伝子座の解析に用いられるインベーダーアッセイ法の偏りのある性能を補正するために使用することもできる。この基本的原理を用いて、本発明は、増幅効率とプライマー濃度との間の直線的関係を実証し、この式を用いて異なる単位複製配列のプライマー濃度のバランスをとり、その結果、実施例1において10個の異なる単位複製配列が均等に増幅された。この技法は、多重プライマー対の任意の大きさのセットで用いられ得る。
【０１７９】
II. 検出アッセイ設計
以下の項では、本発明と共に用い得る検出アッセイ法について説明する。例えば、多くの異なるアッセイ法を用いて標的核酸配列上のフットプリントを決定し、次いでそれらのアッセイ法を多重PCRの出力において実行する検出アッセイとして使用することができる(または、検出アッセイは多重PCR反応と同時に行ってもよい)。
【０１８０】
1つまたは複数の位置にある標的核酸の配列を決定するために利用できる多種多様な検出技術が存在する。例えば、SNPの有無を検出するために利用できる多くの技術が存在する。これらの技術の多くは、標的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドの使用を必要とする。使用するアッセイ法により、オリゴヌクレオチドはその後切断され、伸長され、連結され、解離され、または別の方法で変化を受け、アッセイにおけるその挙動は標的核酸の配列を特徴づける手段としてモニターされる。これらの技術のいくつかを、以下の第IV項において詳述する。
【０１８１】
本発明は、検出アッセイ法で使用するオリゴヌクレオチドを設計するためのシステムおよび方法を提供する。特に、本発明は、検出アッセイの所望の反応条件(例えば、温度、緩衝液の条件など)下で、標的核酸の適切な領域(例えば、2次構造を含まない標的核酸の領域)にうまくハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを設計するためのシステムおよび方法を提供する。本システムおよび方法により、検出アッセイにおいて同じまたは実質的に同じ反応条件下ですべてが機能する、複数の異なるオリゴヌクレオチド(例えば、標的核酸の異なる部分にハイブリダイズするか、または2つもしくはそれ以上の異なる標的核酸にハイブリダイズするオリゴヌクレオチド)の設計もまた可能になる。これらのシステムおよび方法は、実験反応条件下で機能する対照試料を設計するためにも用いられ得る。
【０１８２】
本発明のシステムおよび方法は特定の検出アッセイ法に限定されないが、以下の記載は、SNPを検出するためにインベーダーアッセイ法(Third Wave Technologies、ウィスコンシン州、マディソン；例えば、米国特許第5,846,717号、同第5,985,557号、同第5,994,069号、および同第6,001,567号、国際公開公報第97/27214号および同第98/42873号、ならびにde Arruda et al., Expert. Rev. Mol. Diagn. 2(5), 487-496 (2002)(すべてその全体が参照により本明細書に組み入れられる)を参照されたい)と組み合わせて用いる場合の本発明について説明する。インベーダーアッセイ法は、本発明のシステムおよび方法と共に用いられる場合に、検出パネル、ASR、および臨床診断で役立つ、使い勝手のよさおよび高感度レベルを提供する。当業者は、この実例の特定の特徴および一般的特徴が、概して他の検出アッセイ法にも適用できることを理解すると考えられる。
【０１８３】
A. インベーダーアッセイ法
インベーダーアッセイ法は、標的核酸の存在に依存した核酸切断構造を形成し、特有の切断産物を放出するように核酸切断構造を切断する手段を提供する。例えば、5'ヌクレアーゼ活性が標的依存的切断構造の切断に用いられ、その結果生じた切断産物は、試料における特定の標的核酸配列の存在を示す。核酸またはオリゴヌクレオチドの2つの鎖がいずれも標的核酸鎖にハイブリダイズして、その結果、以下に記載されるようにそれらが重複した侵入型切断構造を形成する場合に、侵入型切断が起こり得る。切断剤(例えば、5'ヌクレアーゼ)と上流オリゴヌクレオチドの相互作用を通して、切断剤は、特有の断片が生成されるような方式で、内部で下流オリゴヌクレオチドを切断するように作製されてもよい。
【０１８４】
いくつかの態様において、インベーダーアッセイ法は、オリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションおよびプローブの切断の複数のラウンド中に、温度サイクリング(すなわち、標的核酸鎖の定期的な変性のため)も核酸合成(すなわち、標的またはプローブ核酸鎖の重合に基づく置換のため)も用いる必要なしに、標的核酸が再使用またはリサイクルされる検出アッセイ法をさらに提供する。プローブが標的鎖上で連続的に置換される(例えば、プローブ-プローブ置換を通して、もしくはプローブ/標的の会合と解離の平衡を通して、またはこれらの機構を含む組み合わせを通して(Reynaldo et al., J. Mol. Biol. 97：511-520 [2000])条件下で切断反応が行われる場合、複数のプローブが同じ標的にハイブリダイズすることができ、複数の切断および複数の切断産物の生成が可能になる。
【０１８５】
B. インベーターアッセイ法のためのオリゴヌクレオチドの設計
SNPを検出するためのインベーダーアッセイ法で使用するためにオリゴヌクレオチドを設計するいくつかの態様では、関心対象の配列をINVADERCREATORプログラム(Third Wave Technologies、ウィスコンシン州、マディソン)に入力する。上記の通り、INVADERCREATORプログラムをホスティングするコンピュータに直接入力するか、または通信ネットワーク(例えば、LAN、イントラネット、またはインターネットネットワーク)によってリンクされている遠隔コンピュータを介して、解析のために様々な供給源から配列を入力し得る。このプログラムにより、センス鎖およびアンチセンス鎖のプローブが設計される。鎖の選択は一般に、合成の容易さ、2次構造形成が最小限であること、および製造のしやすさに基づく。いくつかの態様においては、ユーザーが設計すべき配列の鎖を選択する。別の態様においては、ソフトウェアが自動的に鎖を選択する。最適なプローブの回転およびシグナル生成のための熱力学的パラメータを取り込むことによって(Allawi and SantaLucia, Biochemistry, 36:10581 [1997])、予め選択されたアッセイ温度(例えば、63℃)で作動するようにオリゴヌクレオチドプローブを設計することができる。これらの基準に基づいて、最終的なプローブセット(例えば、2つの対立遺伝子に対する1次プローブ、およびインベーダーオリゴヌクレオチド)を選択する。
【０１８６】
いくつかの態様において、INVADERCREATORシステムは、BLAST(米国国立衛生研究所国立医学図書館バイオテクノロジー情報センター(National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health)のウェブサイトで利用することができる)へのリンクを含み、かつmfold(Zuker, Science, 244:48 [1989])を組み込んだソフトウェアプログラムであるRNAstructure(Mathews et al., RNA 5:1458 [1999])にリンクすることができる、信頼性の高いサイトアクセスを有するウェブベースのプログラムである。RNAstructureは、INVADERCREATORによって作製されたオリゴヌクレオチドの設計案を、単分子および二分子の複合体形成の可能性について試験する。INVADERCREATORは、オープンデータベースコネクティビティ(ODBC)に対応しており、エクスポート/統合のためにOracleデータベースを使用している。ほとんどのゲノムセンターはUNIXを利用しているため、UNIXシステムで十分に作動するよう、INVADERCREATORシステムにはOracleが組み込まれている。
【０１８７】
いくつかの態様において、INVADERCREATOR解析は別のサーバー(例えば、Sunサーバー)上で提供されるため、大量のバッチジョブの解析を処理することができる。例えば、顧客は、2,000個までのSNP配列を1つの電子メールで提出することができる。サーバーは、配列のバッチをINVADERCREATORソフトウェアに受け渡し、プログラムが開始されると、検出アッセイオリゴヌクレオチドセットを設計する。いくつかの態様において、プローブセットの設計は、配列を受け取ってから24時間以内にユーザーに返送される。
【０１８８】
各インベーダー反応は、1次反応用の少なくとも2つの標的配列特異的な非標識オリゴヌクレオチド：上流インベーダーオリゴヌクレオチドおよび下流プローブオリゴヌクレオチドを含む。インベーダーオリゴヌクレオチドは一般に反応温度において安定して結合するよう設計され、プローブは標的鎖と自由に会合および解離するように設計され、非切断のプローブが、重複するインベーダーオリゴヌクレオチドに隣接してハイブリダイズした場合にのみ切断が起こる。いくつかの態様において、プローブは標的に相補的でない5'フラップまたは「アーム」を含み、このフラップは切断が起きた際にプローブから遊離する。いくつかの態様において、遊離したフラップはインベーダーオリゴヌクレオチドとして2次反応に関与する。
【０１８９】
以下の考察で、INVADERCREATORプログラム用のユーザーインターフェースをどのように構成し得るかの一例を示す。
【０１９０】
ユーザーは、例えばコンピュータのデスクトップディスプレイ(例えば、Windowsのデスクトップ)上のアイコンをクリックするなどして作業画面を開く。ユーザーは、アッセイ法を設計すべき標的配列に関連する情報を入力する。いくつかの態様において、ユーザーは標的配列を入力する。他の態様において、ユーザーは、データベースから配列の検索をもたらすコードまたは番号を入力する。さらなる他の態様においては、ユーザー名、標的配列に付いている識別番号、および/または注文番号など、付加的情報を提供することができる。好ましい態様において、ユーザーは(例えば、チェックボックスまたはドロップダウンメニューにより)標的核酸がDNAであるかRNAであるかを指示する。他の好ましい態様において、ユーザーは核酸が由来する種を指示する。特に好ましい態様において、ユーザーは、設計が1重検出(すなわち、反応当たり1つの標的配列または対立遺伝子)用であるのかまたは多重検出(すなわち、反応当たり複数の標的配列または対立遺伝子)用であるのかを指示する。必要な選択および入力が完了したら、ユーザーは解析処理を開始させる。1つの態様において、ユーザーは、処理を続けるために「設計開始(Go Design It)」ボタンを押す。
【０１９１】
いくつかの態様において、ソフトウェアは処理を行なう前にフィールド入力を認証する。いくつかの態様において、ソフトウェアは、必要なフィールドがいずれも適切な形式の情報を備えているかを確認する。他の態様において、ソフトウェアは、入力配列が選択された要件(例えば、最小または最大の長さ、DNAまたはRNAの含量)に適合しているかを確認する。いずれかのフィールドへの入力が有効でないことが認められた場合には、エラーメッセージまたはダイアログボックスが現れ得る。好ましい態様において、エラーメッセージは、どのフィールドが不完全および/または不適当であるかを表示する。配列の入力が確認されると、ソフトウェアはアッセイ法の設計を開始する。
【０１９２】
いくつかの態様においては、注文入力フィールドに提供された情報によって、どのような種類の設計を行うかが特定される。好ましい態様においては、標的配列および多重チェックボックスによって、どの種類の設計を行うべきかが特定される。設計の選択肢には、SNPアッセイ法、多重SNPアッセイ法(例えば、単一反応において異なった対立遺伝子に対するプローブセットを組み合わせる場合）、複数SNPアッセイ法(例えば、入力した配列が、プローブセットを設計すべき複数の変異部位を有する場合)、および複数プローブアームアッセイ法などがあるが、これらに限定されない。
【０１９３】
いくつかの態様では、INVADERCREATORソフトウェアはウェブ受注(WebOE)処理によって(すなわち、イントラ/インターネットブラウザインターフェースによって)開始され、これらのパラメータは、メニューまたはチェックボックスによって入力されるのではなく、WebOEからアプレット<param>タグを介して転送される。
【０１９４】
複数SNP設計の場合、ユーザーは使用する2つまたはそれ以上の設計を選択する。いくつかの態様では、この選択により新しい画面(例えば、複数SNP設計選択画面)が開く。いくつかの態様において、ソフトウェアは標的配列中の各遺伝子座に対して設計を行い、それぞれをスコアリングし、それらをこの画面においてユーザーに表示する。そこで、ユーザーは使用すべき設計を任意に2つ選択することができる。いくつかの態様において、ユーザーは(例えば、メニューまたはボタンにより)第1および第2の設計を選択し、作業を続けるために「設計開始」ボタンをクリックする。
【０１９５】
予め選択した反応温度で最適に機能するプローブ配列を選択するため、最近接モデルおよび公開されているDNA二本鎖形成パラメータ(Allawi and SantaLucia, Biochemistry, 36:10581 [1997])を用いて、検出すべきSNPの融解温度(Tm)を計算する。標的鎖がRNAである態様では、RNA/DNAヘテロ二本鎖形成に適したパラメータを用いることができる。アッセイの塩濃度は最近接パラメータが得られる溶液条件(1 M NaClおよび二価金属なし)とは異なる場合が多いため、ならびに酵素の有無および濃度が最適反応温度に影響するため、計算されたTmを調整して、反応を行なうべき最適温度を決定しなければならない。これらの因子を補正する1つの方法は、融解温度を計算する際の塩濃度について与えられる値を変化させることである。この調整を「塩補正」という。本明細書で用いる「塩補正」という用語は、核酸二本鎖に影響を及ぼす塩以外のパラメータまたは条件の、そのような二本鎖についてのTm計算に及ぼす効果を反映させるために、塩濃度について与えられる値を変化させることを指す。鎖濃度について与えられる値の変化もまた、これらの計算の結果に影響を及ぼすことになる。0.5 M NaClという値(SantaLucia, Proc Natl Acad Sci U S A, 95:1460 [1998])ならびにプローブ約1 mMおよび標的1 fMという鎖濃度を用いることで、プローブ-標的融解温度の計算に使用するアルゴリズムは、最適なインベーダーアッセイ反応温度の予測に使用できるように適合化された。プローブ30個のセットについて、この方法で計算された最適なアッセイ温度と実験によって決定された最適なアッセイ温度との平均偏差は約1.5℃である。
【０１９６】
所与のSNPに対する下流プローブの長さは、反応を行なうために選択された温度(例えば、63℃)により規定される。標的DNA上の変種ヌクレオチド(目的とする切断部位の5'側のプローブヌクレオチドと対合する標的塩基)の位置から始めて、3'末端に付加していき、所望の反応温度に適合する計算上の最適反応温度(Tm＋酵素の影響を補償する塩補正)に到達するまで、プローブの標的結合領域の長さを一度に1塩基対ずつ増やしていくという反復法を用いる。プローブの非相補的アームは好ましくは、2次反応が同一の反応温度で繰り返すことができるように選択する。mfold(Zuker, Science, 244：48 [1989])またはOligo 5.0(Rychlik and Rhoads, Nucleic Acids Res, 17：8543 [1989])などのプログラムを用いて、反応を妨げ得るダイマー複合体または2次構造が形成される可能性について、全プローブオリゴヌクレオチドをスクリーニングする。インベーダーオリゴヌクレオチドの設計も同じ原理に従う。簡潔に説明すると、標的DNA上のN位から始めて、インベーダーオリゴヌクレオチドの3'末端を、試験試料に含まれると考えられるどちらの対立遺伝子とも相補的でないヌクレオチドを有するように設計する。ミスマッチは切断に悪影響を与えず(Lyamichev et al., Nature Biotechnology, 17：292 [1999])、また、おそらくは2つのプローブ間の同軸的安定化作用を最小限にすることによって、プローブの回転を促進し得る。標的DNAに相補的なさらなる残基を、N-1位から始めて、インベーダーオリゴヌクレオチド-標的ハイブリッドの安定性がプローブ-標的ハイブリッドの安定性(ひいては、予定のアッセイ反応温度)を超えるまで、一般的に15〜20℃超えるまで、5'方向に付加して行く。
【０１９７】
1次反応と2次反応が同じ最適温度で起こるようにプローブ配列のすべてを選択し得り、そのため反応段階を同時に行なうことができることは、本アッセイ設計の1つの局面である。別の態様においては、異なる最適温度で作動するようにプローブを設計し得り、そのため反応段階はそれらの最適温度で同時に起こらない。
【０１９８】
いくつかの態様において、ソフトウェアはユーザーに、以下を含むがそれらに限定されない様々な設計局面を変更する機会を提供する：プローブ、標的、およびインベーダーオリゴヌクレオチドの最適温度および濃度；保護基；プローブアーム；色素、キャッピング基、および他の付加物；プローブおよび標的の個々の塩基(例えば、標的および/もしくはプローブの末端からの塩基の付加もしくは欠失、またはインベーダーおよび/もしくはプローブおよび/もしくは標的オリゴヌクレオチドの内部塩基の変更)。いくつかの態様では、メニューから選択して変更を行う。他の態様では、テキストまたはダイアログボックスに変更を入力する。
好ましい態様においては、この選択によって新しい画面(例えば、デザイナーワークシート(Designer Worksheet)画面)が開く。
【０１９９】
いくつかの態様において、ソフトウェアは、アッセイ設計の質(例えば、効率の見込み値)を表示するための採点システムを提供する。1つの態様において、採点システムは、理想的な設計を表す初期スコアの点数(例えば、100点)を含み、またこのシステムでは、アッセイ効率に悪影響をもたらすことが知られているか、またはそう考えられる設計上の特徴にペナルティー値が割り当てられる。ペナルティー値は、設計が意図されるアッセイ法の種類(例えば、1重、多重)およびアッセイ反応を行う温度などを含むがこれらに限定されない、配列以外のアッセイパラメータによって変動し得る。以下の例は、実験によって特定される情報に基づいた、インベーダーアッセイ法のいくつかの態様と共に使用するための例示的な採点基準を提供する。スコアペナルティーを課し得る設計上の特徴の例には以下のものが含まれるが、これらに限定されるわけではない[ペナルティー値を括弧内に示す。最初の数字は低温アッセイ法(例えば、62〜64℃)に対するものであり、2番目の数字は高温アッセイ法(例えば、65〜66℃)に対するものである]：
1. [100:100] インベーダーオリゴヌクレオチドの3'末端がプローブアームに類似している：
2008518621.tif 000006
2. [70:70] プローブが多型を含む5塩基の直列配列(すなわち、一列になった5個の同じ塩基)を有する；
3. [60:60] プローブが多型に隣接した5塩基の直列配列を有する；
4. [50:50] プローブが多型から1塩基のところに5塩基の直列配列を有する；
5. [40:40] プローブが多型から2塩基のところに5塩基の直列配列を有する；
6. [50:50] プローブの5塩基の直列配列がGである−追加ペナルティー；
7. [100:100] プローブがいずれかに6塩基の直列配列を有する；
8. [90:90] 2塩基または3塩基の配列が少なくとも4回繰り返される；
9. [100:100] 縮重塩基がプローブ中に存在する；
10. [60:90] プローブがハイブリダイズする領域が短い(65〜67℃用の設計では13塩基以下；62〜64℃用の設計では12塩基以下)
11. [40:90] プローブがハイブリダイズする領域が長い(65〜67℃用の設計では29塩基以上；62〜64℃用の設計では28塩基以上)
12. [5:5] プローブがハイブリダイズする領域の長さ−一塩基ごとの追加ペナルティー
13. [80:80] プローブアームの後にくる最初の3塩基を区別しにくいIns/Del設計
14. [100:100] プローブ標的Tmの7.5℃の範囲内にある計算上のインベーダーオリゴヌクレオチドTm(65〜67℃用の設計では＜70.5℃未満のインベーダーオリゴヌクレオチド、62〜64℃用の設計では＜69.5℃未満のインベーダーオリゴヌクレオチド)
15. [20:20] 計算上のプローブTmが2.0℃を上回って異なる
16. [100:100] プローブがその標的Tmよりも2℃低い計算上のTmを有する
17. [10:10] 一方の鎖がもう一方の鎖よりも8塩基長い標的
18. [30:30] インベーダーオリゴヌクレオチドがいずれかに6塩基の直列配列を有する−初期ペナルティー
19. [70:70] インベーダーオリゴヌクレオチドの6塩基の直列配列がGである−追加ペナルティー
20. [15:15] プローブがハイブリダイズする領域が14、15、もしくは24〜28塩基長(65〜67℃)、または13、14、もしくは26、27塩基長(62〜64℃)である
21. [15:15] プローブが、多型を含むGの4塩基の直列配列を有する
【０２００】
特に好ましい態様では、設計における各オリゴヌクレオチドに関する温度がコンピュータで再計算され、変更がなされるたびにスコアがコンピュータで再計算される。いくつかの態様では、「説明」ボタンをクリックすれば、スコアの記載を見ることができる。いくつかの態様では、BLAST検索の選択肢が提供される。好ましい態様では、「BLAST設計」ボタンをクリックするとBLAST検索が行なわれる。いくつかの態様においては、この操作により、BLAST処理を説明するダイアログボックスが表示される。好ましい態様において、BLAST検索の結果は、デザイナーワークシート上に強調された設計として表示される。
【０２０１】
いくつかの態様において、ユーザーは「受諾」ボタンをクリックして設計を受諾する。他の態様においては、ユーザーの介入なしにプログラムが設計を承認する。好ましい態様においては、プログラムが、承認された設計を次の処理段階に(例えば、作製に；ファイルまたはデータベースに)送り込む。いくつかの態様において、プログラムは画面(例えば、出力ページ)を提示し、作成された最終設計を精査できるようにし、また設計に注釈を付けられるようにする。好ましい態様において、ユーザーは(例えば、「戻る」ボタンをクリックすることによって)デザイナーワークシートに戻ることができ、または(例えば、「保存」ボタンをクリックすることによって)設計を保存し、(例えば、設計されたオリゴヌクレオチドを製造用に提示するよう)続けることができる。
【０２０２】
いくつかの態様において、プログラムは、印刷(例えば、テキストのみの表示)またはその他のエクスポート(例えば、出力画面)について最適化された設計画面を作成する選択肢を提示する。好ましい態様において、出力画面は、印刷する、または(例えば、別のアプリケーションにコピーアンドペーストすることによって)別のアプリケーションへエクスポートするのに特に適した設計の記載を提供する。特に好ましい態様において、出力画面は別のウィンドウの中で開く。
【０２０３】
本発明は、INVADERCREATORソフトウェアの使用に限定されない。実際、GCG Wisconsin Package(Genetics computer Group、ウィスコンシン州、マディソン)および Vector NTI(Informax、メリーランド州、ロックビル)を含むがこれらに限定されない様々なソフトウェアプログラムが考案され、市販されている。その他の検出アッセイ法も本発明において使用することができる。
【０２０４】
1. 直接配列決定アッセイ法
本発明のいくつかの態様では、直接配列決定技法を用いて変種配列を検出する。これらのアッセイ法では、まずDNA試料を任意の適切な方法により対象から単離する。いくつかの態様では、関心対象の領域を適切なベクターにクローニングし、宿主細胞(例えば、細菌)中での増殖によって増幅させる。他の態様においては、関心対象の領域中のDNAはPCRを用いて増幅する。
【０２０５】
増幅後、関心対象の領域(例えば、関心対象のSNPまたは変異を含む領域)中のDNAは、これらに限定されないが、放射性マーカーヌクレオチドを用いた手動配列決定または自動配列決定を含む任意の適切な方法により配列決定を行う。配列決定の結果は任意の適切な方法を用いて表示させる。配列を調べ、所与のSNPまたは変異の有無を決定する。
【０２０６】
2. PCRアッセイ法
本発明のいくつかの態様では、PCRに基づくアッセイ法を用いて変種配列を検出する。いくつかの態様において、PCRアッセイ法は、変種または野生型対立遺伝子と(例えば、多型または変異の領域と)のみハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの使用を含む。両プライマーセットを使用して、DNA試料を増幅する。変異プライマーのみでPCR産物が得られた場合、患者は変異対立遺伝子を有する。野生型プライマーのみでPCR産物が得られた場合、患者は野生型対立遺伝子を有する。
【０２０７】
3. 断片長多型アッセイ法
本発明のいくつかの態様では、断片長多型アッセイ法を用いて変種配列を検出する。断片長多型アッセイ法では、酵素(例えば、制限酵素またはCLEAVASE I[Third Wave Technologies、ウィスコンシン州、マディソン]酵素)を用いて、一連の位置でのDNA切断に基づいた固有のDNAバンド形成パターンを作製する。SNPまたは変異を含む試料によるDNA断片は、野生型と異なるバンド形成パターンを有することになる。
【０２０８】
a. RFLPアッセイ法
本発明のいくつかの態様では、制限断片長多型アッセイ法(RFLP法)を用いて変種配列を検出する。PCRにより関心対象の領域を最初に単離する。次いで、PCR産物を、所与の多型について固有の長さの断片を生じることが判明している制限酵素で切断する。制限酵素消化されたPCR産物は一般に、ゲル電気泳動により分離し、臭化エチジウム染色により可視化し得る。断片の長さを、分子量マーカーならびに野生型および変異体対照から作製した断片と比較する。
【０２０９】
b. CFLPアッセイ法
他の態様では、CLEAVASE断片長多型アッセイ法(CFLP法；Third Wave Technologies、ウィスコンシン州、マディソン；例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、米国特許第5,843,654号；同第5,843,669号；同第5,719,208号；および同第5,888,780号を参照されたい)を用いて変種配列を検出する。このアッセイ法は、一本鎖DNAは折りたたまれた場合に、DNA分子の正確な配列に対して非常に個性的なより高い次元の構造をとるという知見に基づく。これらの2次構造は、一本鎖領域が二本鎖DNAヘアピンと並列するようなDNAの部分的二本鎖領域を含む。CLEAVASE I酵素は、これらの一本鎖領域と二本鎖領域との接合部を認識して切断する構造特異的な熱安定性ヌクレアーゼである。
【０２１０】
例えば、PCRにより関心対象の領域を最初に単離する。好ましい態様では、一方または両方の鎖を標識する。次いで、加熱してDNA鎖を分離する。次に、鎖内2次構造が形成されるように反応物を冷却する。その後、PCR産物をCLEAVASE I酵素で処理して、所与のSNPまたは変異に固有の一連の断片を作製する。CLEAVASE酵素で処理したPCR産物を(例えば、変性ゲル電気泳動により)分離および検出し、(例えば、オートラジオグラフィ、蛍光画像処理、または染色により)可視化する。断片の長さを、分子量マーカーならびに野生型および変異体対照から作製した断片と比較する。
【０２１１】
4. ハイブリダイゼーションアッセイ法
本発明の好ましい態様では、ハイブリダイゼーションアッセイ法により変種配列を検出する。ハイブリダイゼーションアッセイ法では、所与のSNPまたは変異の有無は、相補的DNA分子(例えば、オリゴヌクレオチドプローブ)にハイブリダイズする試料由来のDNAの能力に基づいて決定される。ハイブリダイゼーションおよび検出について様々な技術を用いる様々なハイブリダイゼーションアッセイ法が利用可能である。アッセイの選択の説明を以下に提供する。
【０２１２】
a. ハイブリダイゼーションの直接的検出
いくつかの態様において、関心対象の配列(例えば、SNPまたは変異)に対するプローブのハイブリダイゼーションは、結合したプローブを可視化することにより直接検出される(例えば、ノーザンまたはサザンアッセイ法；例えば、Ausabel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY [1991]を参照されたい)。これらのアッセイ法では、ゲノムDNA(サザン)またはRNA(ノーザン)を対象から単離する。次いでこのDNAまたはRNAを、ゲノム内で切断する頻度が低く、かつアッセイするマーカーのいずれの近くでも切断しない一連の制限酵素で切断する。次にDNAまたはRNAを分離し(例えば、アガロースゲル上で)、膜へ転写する。検出するSNPまたは変異に特異的な1つまたは複数の標識(例えば、放射性ヌクレオチドを取り込むことによる)プローブを、低ストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシー、または高ストリンジェンシー条件下で膜に接触させる。結合していないプローブを除去し、結合の存在を標識プローブの可視化により検出する。
【０２１３】
b. 「DNAチップ」アッセイ法を用いるハイブリダイゼーションの検出
本発明のいくつかの態様では、DNAチップハイブリダイゼーションアッセイ法を用いて変種配列を検出する。このアッセイ法では、一連のオリゴヌクレオチドプローブを固体支持体に付着させる。オリゴヌクレオチドプローブは、所与のSNPまたは変異に固有であるように設計される。関心対象のDNA試料をDNA「チップ」と接触させ、ハイブリダイゼーションを検出する。
【０２１４】
いくつかの態様において、DNAチップアッセイ法はGeneChip(Affymetrix、カリフォルニア州、サンタクララ；例えば、米国特許第6,045,996号；同第5,925,525号；および同第5,858,659号を参照されたい；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)アッセイ法である。GeneChip技術は、「チップ」に付着したオリゴヌクレオチドプローブの小型高密度アレイを使用する。プローブアレイは、固相化学合成を半導体産業で用いられるフォトリソグラフィー製造技術と組み合わせた、Affymetrixの光定方向性化学合成工程により作製される。チップ曝露部位を定めるために一連の光リソグラフィーマスクを使用し、続いて特定の化学合成段階を行うことで、その工程により、各プローブをアレイの所定の位置に有するオリゴヌクレオチドの高密度アレイが構築される。複数のプローブアレイが、大きなガラスウエハー上で同時に合成される。その後ウエハーは四角く切断され、個々のプローブアレイは、環境からそれらを保護し、かつハイブリダイゼーション用のチャンバーとして機能する、射出成形されたプラスチックカートリッジ中に包装される。
【０２１５】
解析しようとする核酸を単離し、PCRにより増幅し、蛍光レポーター基で標識する。次いで、流体工学ステーションを用いて標識DNAをアレイと共にインキュベートする。その後アレイをスキャナーに挿入し、そこでハイブリダイゼーションのパターンが検出される。ハイブリダイゼーションデータは、プローブアレイに結合している、標的に既に取り込まれた蛍光レポーター基から放射される光として収集される。標的に完全に一致するプローブは一般的に、ミスマッチを有するプローブよりも強いシグナルを生じる。アレイにおける各プローブの配列および位置が分かっているため、相補性により、プローブアレイに供した標的核酸の同一性を決定することができる。
【０２１６】
他の態様においては、電子的に捕獲されたプローブを含むDNAマイクロチップ(Nanogen、カリフォルニア州、サンディエゴ)を利用する(例えば、米国特許第6,017,696号；同第6,068,818号；および同第6,051,380号を参照されたい；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)。マイクロエレクトロニクスの使用により、Nanogenの技術によって、その半導体マイクロチップ上の指定された試験部位を往復する荷電分子の活発な運動および濃度が可能になる。所与のSNPまたは変異に固有のDNA捕獲プローブは、マイクロチップ上の特定の部位に電子的に配置されるかまたは「アドレス指定される」。DNAは強い負電荷を有するため、正電荷の領域に電子的に移動され得る。
【０２１７】
最初に、マイクロチップ上の試験部位または試験部位の列が、正電荷で電子的に活性化される。次に、DNAプローブを含む溶液がマイクロチップ上へ導入される。負に帯電したプローブは正に帯電した部位へ迅速に移動し、プローブはそこで濃縮されてマイクロチップ上の部位に化学的に結合される。その後マイクロチップは洗浄され、特異的に結合したDNAプローブのアレイが完成するまで、異なるDNAプローブの別の溶液が添加される。
【０２１８】
次いで、DNA捕獲プローブのどれが試験試料中の相補的DNA(例えば、関心対象のPCR増幅された遺伝子)とハイブリダイズするのかを決定することにより、試験試料が標的DNA分子の存在について解析される。電子電荷はまた、マイクロチップ上の1つまたは複数の試験部位へ標的分子を移動および濃縮させるために用いられる。各試験部位における試料DNAの電子的濃縮は、試料DNAと相補的捕獲プローブとの迅速なハイブリダイゼーションを促進する(ハイブリダイゼーションは、数分内で起こり得る)。結合していないまたは非特異的に結合したDNAを各部位から除去するために、部位の極性または電荷が負に逆転され、それによって結合していないまたは非特異的に結合したDNAが捕獲プローブから溶液へ戻される。結合の検出には、レーザーに基づく蛍光スキャナーが用いられる。
【０２１９】
なおさらなる態様においては、表面張力の差による平面(チップ)上の液体の分離に基づくアレイ技術(ProtoGene、カリフォルニア州、パロアルト)が用いられる(例えば、米国特許第6,001,311号；同第5,985,551号；および同第5,474,796号を参照されたい；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)。Protogeneの技術は、液体が、化学コーティングによって付与された表面張力の差により平面上で分離され得るという事実に基づく。一旦このように分離されたならば、オリゴヌクレオチドプローブが、試薬のインクジェット印刷によりチップ上で直接合成される。反応部位が表面張力により規定されているアレイは、1つ1つが4つの標準的DNA塩基のそれぞれに対応する4つの圧電ノズルのセットの下で、X/Y移動ステージ上に取り付けられる。移動ステージはアレイの各列に沿って移動し、適切な試薬がそれぞれの反応部位に送達される。例えば、Aアミダイトは、その合成段階でアミダイトAが結合されるべき部位にのみ送達される。共通の試薬および洗浄液は、表面全体を浸水させ、次いで急速回転によりそれらを除去することで送達される。
【０２２０】
関心対象のSNPまたは変異に固有なDNAプローブを、Protogeneの技術を用いてチップに付着させる。次いで、チップを関心対象のPCR増幅された遺伝子と接触させる。ハイブリダイゼーション後、結合していないDNAを除去し、ハイブリダイゼーションを任意の適切な方法を用いて(例えば、取り込まれた蛍光基の蛍光脱消光により)検出する。
【０２２１】
さらなる他の態様においては、多型の検出に「ビーズアレイ」を使用する(Illumina、カリフォルニア州、サンディエゴ；例えば、国際公開公報第99/67641号および同第00/39587号を参照されたい、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)。Illuminaは、光ファイバー束と、アレイへと自己会合するビーズを組み合わせたビーズアレイ技術を用いる。各光ファイバー束は、束の直径によって数千から数百万の個々のファイバーを含む。ビーズは、所与のSNPまたは変異の検出に特異的なオリゴヌクレオチドでコーティングされている。ビーズのバッチを組み合わせて、アレイに特異的なプールを形成する。アッセイを行うには、ビーズアレイを、調製した対象試料(例えば、DNA)と接触させる。任意の適切な方法を用いてハイブリダイゼーションを検出する。
【０２２２】
c. ハイブリダイゼーションの酵素検出
本発明のいくつかの態様では、特定の構造の酵素切断によってハイブリダイゼーションを検出する(インベーダーアッセイ法、Third Wave Technologies；例えば、米国特許第5,846,717号、同第6,090,543号；同第6,001,567号；同第5,985,557号；および同第5,994,069号を参照されたい；それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)。インベーダーアッセイ法では、重複オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションによって形成された複合体を切断するための構造特異的酵素を使用することにより、特定のDNAおよびRNA配列を検出する。温度を上昇させ、かつプローブの1つを過剰にすることにより、温度サイクリングなしに、存在する各標的配列について複数のプローブの切断が可能になる。次いで、これらの切断されたプローブにより、第2標識プローブの切断が誘導される。2次プローブオリゴヌクレオチドは、第2色素または他の消光部分によって消光される蛍光色素で5'末端が標識され得る。切断された時点で、脱消光された色素標識産物を、標準的な蛍光プレートリーダーまたは一連の反応中に蛍光データを収集するように構成された装置(すなわち、ABI 7700 Sequence Detection System、Applied Biosystems、カリフォルニア州、フォスターシティーなどの「リアルタイム」蛍光検出器)を用いて検出することができる。
【０２２３】
インベーダーアッセイ法は、増幅していないゲノムDNAにおいて特定の変異およびSNPを検出する。ゲノムDNA中のSNPを検出するために使用するインベーダーアッセイ法の態様において、2つのオリゴヌクレオチド(SNP/変異または野生型配列のいずれかに特異的な1次プローブ、およびインベーダーオリゴヌクレオチド)はゲノムDNAと縦一列にハイブリダイゼーションして重複構造を形成する。構造特異的ヌクレアーゼ酵素はこの重複構造を認識し、1次プローブを切断する。2次反応では、切断された1次プローブが蛍光標識2次プローブと組み合わさって、酵素によって切断される別の重複構造が形成される。最初の反応および2次反応は、同一容器中で同時に行うことができる。上記のように、蛍光検出器を使用して、2次プローブの切断を検出する。試験試料のシグナルを、既知の正および負の対照と比較し得る。
【０２２４】
いくつかの態様では、結合したプローブのハイブリダイゼーションは、TaqManアッセイ法を用いて検出する(PE Biosystems、カリフォルニア州、フォスターシティー；例えば、米国特許第5,962,233号および同第5,538,848号を参照されたい、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)。アッセイはPCR反応中に行なわれる。TaqManアッセイ法は、AMPLITAQ DNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼの5'-3'エキソヌクレアーゼ活性を利用する。所与の対立遺伝子または変異に特異的なプローブを、PCR反応中に含める。プローブは5'-レポーター色素(例えば、蛍光色素)および3'-消光色素を有するオリゴヌクレオチドからなる。PCR過程において、プローブがその標的に結合する場合、AMPLITAQポリメラーゼの5'-3'核酸分解活性は、プローブをレポーター色素と消光色素の間で切断する。消光色素からレポーター色素が分離すると、蛍光が増加する。シグナルは各PCRサイクルで蓄積し、蛍光光度計でモニターすることができる。
【０２２５】
なおさらなる態様では、SNP-ITプライマー伸長アッセイ法を用いて多型を検出する(Orchid Biosciences、ニュージャージー州、プリンストン；例えば米国特許第5,952,174号および同第5,919,626号を参照されたい、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる)。このアッセイ法では、特異的に合成したDNAプライマーおよびDNAポリメラーゼを用いて、SNPと疑われる位置でDNA鎖を1塩基だけ選択的に伸長させて、SNPを同定する。関心対象の領域のDNAを増幅し、変性させる。次いで、マイクロ流体と呼ばれる微小化した系を用いて、ポリメラーゼ反応を行う。SNPまたは変異位置にあると疑われるヌクレオチドに標識を添加して、検出を行なう。DNAへの標識の取り込みは、任意の適切な方法で検出することができる(例えば、ヌクレオチドがビオチン標識を含む場合には、蛍光標識したビオチン特異的抗体で検出する)。
【０２２６】
III. 配列の入力およびユーザーインターフェース
解析のために様々な供給源から配列を入力することができる。多くの態様において、配列情報はコンピュータに入力される。コンピュータは、インシリコ解析を実行するコンピュータシステムと同じである必要はない。いくつかの好ましい態様においては、候補標的配列を、通信ネットワーク(例えば、ローカルエリアネットワーク、インターネット、またはイントラネット)にリンクされているコンピュータに入力し得る。そのような態様において、通信ネットワークにアクセスできるユーザーは世界中のどこにいても、自分の場所で候補配列を入力することができる。いくつかの態様においては、インシリコ解析に必要な情報(例えば、候補標的配列の配列)の入力フィールドを含むユーザーインターフェースが、通信ネットワークを介してユーザーに提供される(例えば、ワールドワイドウェブベースのユーザーインターフェース)。ウェブベースのユーザーインターフェースを使用することにはいくつかの利点がある。例えば、入力ウィザードを提供することにより、ユーザーインターフェースは、ユーザーが正確な形式の情報を必要な量入力したことを保証し得る。いくつかの態様において、ユーザーインターフェースは、標的配列に関する配列情報が最低限の長さであり(例えば、20またはそれ以上、50またはそれ以上、100またはそれ以上のヌクレオチド)、かつ単一の形式(例えば、FASTA)であることを必要とする。他の態様において、情報は任意の形式で入力することができ、本発明のシステムおよび方法が入力情報を解析に適切な形式に変更または修正する。例えば、入力する標的配列が短すぎる場合には、本発明のシステムおよび配列はその短い配列について公開データベースを検索し、固有の配列が同定されたならば、入力した標的配列の一方または両方の末端にヌクレオチドを付加して、短い配列を適切に長い配列に変換する。同様に、配列情報が望ましくない形式で入力されるか、または関係のない配列以外の文字を含む場合には、配列を標準的な形式(例えば、FASTA)に修正してから、さらにインシリコ解析を行い得る。ユーザーインターフェースはまた、ユーザーの名前および住所を含むがこれらに限定されない、ユーザーに関する情報を収集し得る。いくつかの態様において、標的配列の入力はユーザー識別コードを伴う。
【０２２７】
いくつかの態様において、配列は、アッセイ設計ソフトウェア(例えば、INVADERCREATORソフトウェア)から直接入力される。
【０２２８】
好ましい態様において、配列にはそれぞれID番号が与えられる。ID番号は、重複解析を避けるために、解析する標的配列と連関している。例えば、インシリコ解析で、入力配列に相当する標的配列が既に解析済みであると判定された場合、ユーザーにはそのことが報告され、インシリコ解析を回避するか、以前に得られた結果を単に受け取るかの選択肢が与えられる。
【０２２９】
ウェブ上での注文システムおよび方法
検出アッセイ法の注文、設計された検出アッセイ法の入手、または本発明のデータベースもしくは他の情報へのアクセスを望むユーザーは、電子通信システム(例えば、インターネット)を利用し得る。いくつかの態様において、本発明の注文および情報システムは、任意のユーザーが情報にアクセスできるように公共ネットワークに接続されている。いくつかの態様においては、私的電子通信ネットワークが提供される。例えば、顧客またはユーザーがリピート顧客(例えば、販売業者または大規模な診断研究室)である場合、顧客のコンピュータシステムと本発明のシステムのコンピュータシステムとの間に、常時専用プライベート接続が提供され得る。本システムは、対人接触を最小限に抑えるように設定し得る。例えば、いくつかの態様においては、在庫管理ソフトウェアを用いて、顧客が所有している検出アッセイ法の数および種類をモニターする。顧客が適切な数および種類の検出アッセイ法を有しているかどうかを判定するために規定の間隔で質問を送り、不足が認められた場合には、さらなるアッセイ法を設計、作製、および/または配送するための説明書を顧客に送る。いくつかの態様において、本システムはまた、売り手の在庫水準をモニターし、好ましい態様においては、本システムを生産能力および生産時期を管理する生産システムと統合する。
【０２３０】
いくつかの態様において、検出アッセイ法の選択および注文を容易にする操作性のよいインターフェースが提供される。利用できる検出アッセイ法および/またはユーザーが調べたいと考え得る多型が何十万にも上るため、操作性のよいインターフェースで、一連の複雑な選択肢を介したナビゲーションが可能になる。例えば、いくつかの態様においては、一連の山積みのデータベースを用いてユーザーを所望の産物に導く。いくつかの態様において、第1レイヤーは生物体の全染色体の表示を提供する。ユーザーは、関心対象の1つまたは複数の染色体を選択する。染色体を選択すると、染色体上のバンド形成領域を示す、染色体のより詳細なマップが提供される。所望のバンドを選択すると、遺伝子位置を示すマップにつながる。詳細な1つまたは複数のさらなるレイヤーは、多型の塩基位置、遺伝子名、ゲノムデータベース識別タグ、注釈、購入可能な既存の開発済みの検出アッセイ法が存在する染色体の領域、既存の開発済みのアッセイ法は存在しないが、設計および作製に利用できる領域などを提供する。領域、多型、または検出アッセイ法を選択するとユーザーは注文インターフェースに導かれ、そこで情報が収集されて検出アッセイ法の設計および/または注文が開始される。いくつかの態様では、検索エンジンが提供され、遺伝子名、配列領域、多型、または他の質問を入力することで、より迅速にユーザーを適切な情報レイヤーに導く。
【０２３１】
いくつかの態様では、注文、設計、および生産システムを、検出アッセイ法の価格を以下の1つまたは複数の要因によって決定する会計システムと統合する：設計が必要であるか否か、検出アッセイ法の成分に基づく物品の費用、特定の顧客に対する特別割引、大量注文に対する割引、再注文に対する割引、産物が知的所有権または第三者への契約上の支払い義務によって保護されている場合の価格上昇、および使用法に基づく価格選択。例えば、検出アッセイ法を研究用途ではなく臨床診断に使用する予定であるか、または検出アッセイ法が臨床診断に認定されている場合、価格は上昇する。いくつかの態様において、臨床用産物に対する価格上昇は自動的に起こる。例えば、いくつかの態様において、本発明のシステムは、産物が臨床診断用途またはASR用途に認定されているかどうかを決定するために、FDA、公共出版物、または他のデータベースにリンクされる。
【０２３２】
実施例
以下の実施例は本発明の特定の好ましい態様および局面を示しさらに説明するために提供するものであり、その範囲を限定するものと解釈されるべきでない。
【０２３３】
以下の実験の開示においては、以下の略語を使用する：N(規定濃度)；M(モル濃度)；mM(ミリモル濃度)；μM(マイクロモル濃度)；mol(モル)；mmol(ミリモル)；μmol(マイクロモル)；nmol(ナノモル)；pmol(ピコモル)；g(グラム)；mg(ミリグラム)；μg(マイクログラム)；ng(ナノグラム)；lまたはL(リットル)；ml(ミリリットル)；μl(マイクロリットル)；cm(センチメートル)；mm(ミリメートル)；μm(マイクロメートル)；nm(ナノメートル)；DS(硫酸デキストラン)；℃(摂氏温度)；およびSigma(Sigma Chemical Co.、ミズーリ州、セントルイス)。
【０２３４】
実施例1
10重の設計(手作業)：インベーダーアッセイ法の試験
以下の実験例は、多重増幅反応用の増幅プライマーの手作業での設計、およびインベーダーアッセイ法による単位複製配列のその後の検出について記載する。
【０２３５】
TWT社内オリゴヌクレオチドオーダーエントリーデータベースにおいて入手可能な、確証済みのSNP含有配列のセットから、10個の標的配列を選択した。各標的は、以前にインベーダーアッセイ法が設計されたことのある一塩基多型(SNP)を含む。インベーダーアッセイオリゴヌクレオチドはINVADER CREATORソフトウェア(Third Wave Technologies, Inc.、ウィスコンシン州、マディソン)で設計し、したがって本実施例におけるフットプリント領域は、インベーダー「フットプリント」、または関心対象の塩基、この場合は一塩基多型の検出に関して最適に位置づけされたインベーダーオリゴヌクレオチドおよびプローブオリゴヌクレオチドによりカバーされる塩基として定義される。10個の標的配列それぞれの約200ヌクレオチドを、SNP塩基が配列の中心あたりに存在するようにして、増幅プライマー設計解析のために解析した。
【０２３６】
最大および最小のプローブの長さの基準(それぞれ、30ヌクレオチドおよび12ヌクレオチドの初期設定)を規定し、50℃〜60℃というプローブ融解温度Tmの範囲も規定した。本実施例では、予め選択した反応温度で最適に機能するプローブ配列を選択するため、最近接モデルおよび公開されているDNA二本鎖形成パラメータ(Allawi and SantaLucia, Biochemistry, 36:10581 [1997]、参照により本明細書に組み入れられる)を用いて、オリゴヌクレオチドの融解温度(Tm)を計算する。アッセイの塩濃度は最近接パラメータが得られる溶液条件(1 M NaClおよび二価金属なし)とは異なる場合が多いため、ならびに酵素の有無および濃度が最適反応温度に影響するため、計算されたTm値を調整して、反応を行なうべき最適温度を決定しなければならない。これらの因子を補正する1つの方法は、融解温度を計算する際の塩濃度について与えられる値を変化させることである。この調整を「塩補正」という。「塩補正」という用語は、核酸二本鎖に影響を及ぼす塩以外のパラメータまたは条件の、そのような二本鎖についてのTm計算に及ぼす効果を反映させるために、塩濃度について与えられる値を変化させることを指す。鎖濃度について与えられる値の変化もまた、これらの計算の結果に影響を及ぼすことになる。280 nM NaClという値(SantaLucia, Proc Natl Acad Sci U S A, 95:1460 [1998]、参照により本明細書に組み入れられる)ならびにプローブ約10 pMおよび標的1 fMという鎖濃度を用いることで、プローブ-標的融解温度の計算に使用するアルゴリズムは、最適なプライマー設計配列の予測に使用できるように適合化された。
【０２３７】
次に、フットプリント領域に隣接する上流および下流の配列を調査し、5'-N[x]-N[x-1]-・・・・・-N[4]-N[3]-N[2]-N[1]-3'(式中、N[1]はAまたはCとする)と記載されるプライマーの設計を開始するために、最初のAまたはCを選択した。以下の規則を用いることにより、プライマー相補性を回避した：所与のオリゴヌクレオチドプライマーのN[2]-N[1]はいかなる他のオリゴヌクレオチドのN[2]-N[1]とも相補的であるべきでなく、かつN[3]-N[2]-N[1]はいかなる他のオリゴヌクレオチドのN[3]-N[2]-N[1]とも相補的であるべきでない。所与のN[1]においてこれらの基準が満たされない場合には、フォワードプライマーについては5'方向の次の塩基またはリバースプライマーについては3'方向の次の塩基をN[1]部位として評価することになる。手作業で解析する場合には、3'末端の相補性を最低限に抑えるためにA/Cリッチな領域を標的にした。
【０２３８】
本実施例においては、多重増幅反応後にインベーダーアッセイを行った。したがって、2次インベーダー反応オリゴヌクレオチドの部位(FRETオリゴヌクレオチド配列)もまた、プライマー設計の基準として組み込んだ；増幅プライマー配列は、FRETオリゴヌクレオチドの特定の領域と80％未満の相同性であるべきである。
【０２３９】
プライマーはすべて標準的なオリゴヌクレオチド化学法により合成し、(標準的な方法で)脱塩してA260での吸光度により定量化し、50μM濃度の保存液となるよう希釈した。
【０２４０】
次いで、以下の条件下において、等モル量のプライマー(0.01 uM/プライマー)を使用する10重PCRを用いて、多重PCRを実施した：反応物50 ul中、100 mM KCl、3 mM MgCl2、10 mM Tris pH 8.0、200 uM dNTP、2.5 U Taq DNAポリメラーゼ、およびヒトゲノムDNA(hgDNA)鋳型10 ng。反応物を(94℃/30秒、50℃/44秒)で30サイクルインキュベートした。インキュベーション後、多重PCR反応物を水で1:10に希釈し、インベーダーアッセイFRET検出プレート、96ウェルゲノム2重(genomic biplex)、CLEAVASE VIII酵素100 ngを用いるインベーダー解析に供し、インベーダーアッセイを以下のような15 ul反応物：PCR反応物の1:10希釈液1 ul、PPI混合物3 ul、22.5 mM MgCl2 5 ul、dH2O 6μlとして構築し、CHILLOUT液体ワックス15 ulでカバーした。95℃で5分間インキュベートして試料をインベーダー2重中で変性させ、その後63℃でインキュベートし、様々な時点においてCytofluor 4000で蛍光を測定した。
【０２４１】
正確に遺伝子型判定コール(call)が作成されるように以下の基準を用いると(FOZ_FAM + FOZ_RED -2 > 0.6)、63℃で10分間インキュベートした後では、10個のインベーダーアッセイコールのうち2個のみが作成され得り、63℃でさらに50分間インキュベートした(60分)後には、10個のコールのうち5個のみが作成され得た。60分の時点で、検出可能なFOZ値間のばらつきは、最も強いシグナル(41646、FAM_FOZ + RED_FOZ - 2 = 54.2、これはリーダーのダイナミックレンジのはるか外側にある)と最も弱いシグナル(67356、FAM_FOZ + RED_FOZ - 2 = 0.2)との間で100倍を超える。(等モル量の各標的が利用可能であると考えられる)ヒトゲノムDNA 100 ngに対して同じインベーダーアッセイ法を直接用いると、すべての読み取り値がリーダーのダイナミックレンジの範囲内で作成され得り、FOZ値のばらつきはアッセイの最強値(53530、FAM_FOZ + RED_FOZ - 2 = 3.1)と最弱値(53530、FAM_FOZ + RED_FOZ - 2 = 0.43)との間で約7倍であった。このことから、同じ多重PCR反応中の異なる単位複製配列間に見られるFOZ値の著しい相違は、増幅の偏りによるものであって、インベーダーアッセイ法に帰する変動性ではないことが示唆される。これらの条件下では、異なるインベーダーアッセイによって生じたFOZ値は互いに直接比較することができ、増幅の効率の指標として確実に使用することができる。
【０２４２】
FOZ値を用いた所与の単位複製配列の増幅率の推定
所与の単位複製配列の増幅率(F)を推定するために、インベーダーアッセイのFOZ値を用いて単位複製配列の存在量を推定することができる。所与の時間における未知濃度を有する所与の単位複製配列のFOZ(FOZm)を、規定の時点(240分)における既知量の標的(例えば、ゲノムDNA 100 ng = 30,000コピーの単一遺伝子)のFOZ(FOZ240)と直接比較し、これを用いて未知の単位複製配列のコピー数を計算することができる。式1において、FOZmは、インベーダーアッセイにおいて所与の時間量(m)インキュベートした未知濃度の標的のRED_FOZとFAM_FOZの合計を表す。FOZ240は、240分の時点で、既知コピー数の標的(例えば、hgDNA 100 ng＝約30,000コピー)を用いて実験的に決定されたRED_FOZ値(インベーダーアッセイ41646を用いる)を表す。
2008518621.tif 000007
【０２４３】
式1aは、プライマー濃度と増幅率Fとの間の直線的関係を決定するために用いられるが、式1a'は10重PCR(等モル量のプライマーおよび最適濃度のプライマーによる)に関する増幅率Fの計算において用いられ、D値はPCR反応物の希釈係数を表す。多重PCR反応物50 ulを1:3希釈した場合、D = 0.3333である。
2008518621.tif 000008
【０２４４】
式1aおよび1a'は10重の多重PCRの記述において用いられるが、107重PCRでのプライマー濃度の最適化においては、この式をさらにより正しく適合化させたものを使用した。この場合、FOZ240 = 標的としてhgDNAを用いるインベーダーMAPプレート全体にわたるFAM_FOZ240 + RED_FOZ240の平均であり(FOZ240 = 3.42)、希釈係数Dは0.125に設定する。
2008518621.tif 000009
【０２４５】
増幅率Fの推定に関してより正確を期すために、FOZ値は、読み取り値を計測する装置のダイナミックレンジの範囲内であるべきであるということに留意すべきである。本研究で使用したCytofluor 4000の場合、ダイナミックレンジは約1.5 〜約12 FOZであった。
【０２４６】
第3項 増幅率とプライマー濃度との直線的関係
プライマー濃度と増幅因子(F)との関係を決定するため、プライマー1117-70-17および1117-70-18をそれぞれ0.01 uM、0.012 uM、0.014 uM、0.020 uMの濃度で使用して、4つの異なる1重PCRを実行した。4つの独立したPCR反応は、鋳型としてhgDNA 10 ngを使用し、以下の条件下で実施した：100 mM KCl、3 mM MgCl2、10 mM Tris pH 8.0、200 uM dNTP。インキュベーションは、(94℃/30秒、50℃/20秒)で30サイクル行った。PCR後、反応物を水で1:10に希釈し、インベーダーアッセイFRET検出プレート、96ウェルゲノム2重、CLEAVASE VIII酵素100 ngを使用して標準的条件下で反応を行った。15 ul反応物はそれぞれ以下のように設定した：1:10希釈したPCR反応物1 ul、PPI混合物SNP#47932 3 ul、22.5 mM MgCl2 5 u l、水6 ul、CHILLOUT液体ワックス15 ul。プレート全体を95℃で5分間、およびその後63℃で60分間インキュベートし、その時点でCytofluor 4000蛍光プレートリーダーにて単一の読み取り値を得た。4つの異なるプライマー濃度(0.01 uM、0.012 uM、0.014 uM、0.020 uM)それぞれについて、FOZm = 60分におけるFOZ_FAMとFOZ_REDの合計、m = 60、およびFOZ240 = 1.7として式1a使用し、増幅率Fを計算した。各反応のプライマー濃度を増幅率の対数Log(F)に対してプロットすると、強い直線的関係が示された。これらのデータポイントを用いて、増幅率とプライマー濃度との直線的関係を表す式を式2に記載する。
2008518621.tif 000010
【０２４７】
式2を用いると、既知濃度のプライマー(X)を使用して予想可能な形で、所与の単位複製配列の増幅率Log(F) = Yを操作することができると考えられる。逆の様式で、多重PCRにおいて等モルプライマー濃度の条件下で認められる増幅の偏りは、増幅率Fに基づいた「見かけの」プライマー濃度(X)として測定できると考えられる。多重PCRでは、異なる単位複製配列間の「見かけの」プライマー濃度の値を用いて、異なる遺伝子座の増幅を均等にするために必要とされる各単位複製配列のプライマー量を推定することができる。
2008518621.tif 000011
【０２４８】
第4項 バランスのとれた多重混合物からの見かけのプライマー濃度の計算
前項で記載したように、プライマー濃度は所与の単位複製配列の増幅率に直接影響し得る。等モル量のプライマーの条件下において、FOZm読み取り値を用いて、式2により各単位複製配列の「見かけの」プライマー濃度を計算することができる。式2中のYを所与の増幅率のlog(F)で置き換えて、Xについて解くことにより、多重反応における所与の単位複製配列の相対的存在量に基づく「見かけの」プライマー濃度が得られる。多重反応における(等モル濃度で提供された)すべてのプライマーの「見かけの」プライマー濃度を計算するために方程式2を用いることにより、プライマーセットを互いに標準化する手段が提供される。「最適化」多重プライマー混合物Rに加えるべき各プライマーの相対量を導くには、最も強い単位複製配列が1の値に設定され、残りの単位複製配列が1以上の値に設定されるように、「見かけの」プライマー濃度のそれぞれで最大の見かけのプライマー濃度(Xmax)を割る必要がある。
2008518621.tif 000012
【０２４９】
R[n]の値を相対的プライマー濃度の任意の値として使用し、R[n]の値に一定のプライマー濃度を掛け算すると、所与の多重反応における各プライマーの作業濃度が提供される。示した実施例では、SNPアッセイ41646に対応する単位複製配列が、1に等しいR[n]値を有する。最も低いプライマー濃度が、1に設定された41646のR[n]または0.01 uMとなるように、すべてのR[n]値に0.01 uM(等モルの多重PCR反応における最初の開始プライマー濃度)を掛け算した。残りのプライマーセットもやはり比例して増加した。「最適化」プライマー混合物を用いた多重PCRの結果を以下に記載する。
【０２５０】
第5項 多重PCRにおける最適化プライマー濃度の使用による、10個のインベーダーアッセイ間のFOZのばらつきの大幅な減少
容量に基づいて様々な量のプライマーを使用する10重PCR法を用いて、多重PCRを実施した(X[max]はSNP41646であり、1x = 0.01 uM/プライマーに設定)。多重PCRは、等モルプライマー混合物を用いた場合に使用した条件と同じ条件下で行った：反応物50 u l中、100 mM KCl、3 mM MgCl、10 mM Tris pH 8.0、200 uM dNTP、2.5 U taq、およびhgDNA鋳型10 ng。反応物を(94℃/30秒、50℃/44秒)で30サイクルインキュベートした。インキュベーション後、多重PCR反応物を水で1:10に希釈し、インベーダー解析に供した。インベーダーアッセイFRET検出プレート、(96ウェルゲノム2重、CLEAVASE VIII酵素100 ng)を用いて、反応物を以下のような15 ul反応物として構築した；PCR反応物の1:10希釈液1 ul、適切なPPI混合物3 ul、22.5 mM MgCl2 5 ul、dH2O 6 ul。各ウェルにCHILL OUT 15 ulをさらに添加し、次いで95℃で5分間インキュベートした。プレートを63℃でインキュベートし、10分の時点でCytofluor 4000にて蛍光を測定した。
【０２５１】
正確に遺伝子型判定コールが作成されるように以下の基準を用いると(FOZ_FAM + FOZ_RED -2 > 0.6)、63℃で10分間インキュベートした後に、10個中10個すべて(100 ％)のインベーダーコールが作成され得る。さらに、FAM + RED - 2の値(増幅率に直接関係する全体的なシグナル生成の指標(式2を参照されたい))のばらつきは、最も低いシグナル(67325、FAM + RED -2 = 0.7)と最も高いシグナル(47892、FAM + RED -2 = 4.3)との間で7倍未満であった。
【０２５２】
実施例2
ソフトウェアアプリケーションを使用した101重PCRの設計
TWTオリゴオーダーエントリーデータベースを用いて、各配列のSNP位置を示すために括弧でSNPが注釈づけられた200ヌクレオチド長未満の144個の配列を得た(例えば、NNNNNNN[N(wt)/N(mt)]NNNNNNNN)。関心対象のSNPに隣接する配列データを拡張するため、BLAST解析を用いて、配列を約1 kB長(SNPの各側に隣接する500ヌクレオチド)にまで拡張した。144個の開始配列のうち、16個はBLASTにより拡張することができず、結果として約1 kB長まで拡張された128個の配列の最終セットが得られた。これらの拡張された配列を、各配列の以下の情報を有するExcel形式でユーザーに提供した：(1) TWT番号、(2) 短縮識別名、および(3) 配列。Excelファイルをカンマ区切り形式に変換し、Primer Designer INVADER CREATOR v1.3.3ソフトウェア(このバージョンのプログラムは、プライマーのFRET反応性についてスクリーニングせず、またユーザーにプライマーの最大長を指定させない)の入力ファイルとして使用した。INVADER CREATOR Primer Designer v1.3.3は、Tmlowを60℃に設定すること以外は、初期設定条件(例えば、最小プライマーサイズ12、最大プライマーサイズ30)を用いて実行した。出力ファイルは128組のプライマーセット(256個のプライマー)を含み、そのうちの4組はプライマー配列が過度に長いために排除され(SNP # 47854、47889、54874、67396)、合成に利用できる124組のプライマーセット(248個のプライマー)が残された。残っているプライマーを標準的な手順により200 nmolのスケールで合成し、脱塩して精製した。合成の失敗もあり、107組のプライマーセットが等モルの107重のプライマー混合物の構築に利用できた(214個のプライマー)。増幅に利用できる107組のプライマーセットのうち、101組のみがインベーダーMAPプレート上に存在し、これらについて増幅率を評価した。
【０２５３】
以下の条件下において、等モル量のプライマー(0.025 uM/プライマー)を使用する101重PCRを用いて、多重PCRを実施した；反応物50 ul中、100 mM KCl、3 mM MgCl2、10 mM Tris pH 8.0、200 uM dNTP、およびヒトゲノムDNA(hgDNA)鋳型10 ng。95℃で10分間変性させた後、Taq 2.5単位を添加し、反応物を(94℃/30秒、50℃/44秒)で50サイクルインキュベートした。インキュベーション後、多重PCR反応物を水で1:24に希釈し、インベーダーMAP検出プラットフォームを用いるインベーダーアッセイ解析に供した。各インベーダーMAPアッセイは、以下のような6 ul反応物として実行した；PCR反応物の1:24希釈液3 ul(総希釈度1:8 D = 0.125に等しい)、15 mM MgCl2 3 ul、これをCHILLOUT 6 ulでカバー。95℃で5分間インキュベートして試料をインベーダーMAPプレート中で変性させ、その後63℃でインキュベートし、160分間にわたり様々な時点においてCytofluor 4000(384ウェルリーダー)で蛍光を測定した。10、20、40、80、160分において計算したFOZ値の解析から、正しいコール(同じDNA試料のゲノムのコールと比較して)が、インベーダーMAPプラットフォームにより検出可能な101個の単位複製配列のうちの94個についてなされ得たことが示される。これは、INVADER CREATER Primer Designerソフトウェアが、高度多重化PCRにおいて機能するプライマーセットを作成できるという証拠を提供する。
【０２５４】
160分間の時間経過を通して得られたFOZ値を使用して、101個の単位複製配列それぞれについて増幅率FおよびR[n]を計算した。R[nmax]は1.6に設定したが、160分の時点で十分なFOZmシグナルを与えることができなかった単位複製配列については、R[n]に12という任意の値を割り当てて、低い端の補正を行った。10分の時点でのFOZm値が読み取られた単位複製配列の高い端の補正に関しては、1というR[n]値を任意に割り当てた。10重の実施例および式1bで概説した基本的原理を使用し、1というR[n]を0.025 uMプライマーに対応させて、101重の最適プライマー濃度を計算した(様々なプライマー濃度に関しては図15を参照されたい)。多重PCRは以下の条件下で行った；反応物50 ul中、100 mM KCl、3 mM MgCl2、10 mM Tris pH 8.0、200 uM dNTP、およびヒトゲノムDNA(hgDNA)鋳型10 ng。95℃で10分間変性させた後、Taq 2.5単位を添加し、反応物を(94℃/30秒、50℃/44秒)で50サイクルインキュベートした。インキュベーション後、多重PCR反応物を水で1:24に希釈し、インベーダーMAP検出プラットフォームを用いるインベーダーアッセイ解析に供した。各インベーダーMAPアッセイは、以下のような6 ul反応物として実行した；PCR反応物の1:24希釈液3 ul(総希釈度1:8 D = 0.125に等しい)、15 mM MgCl2 3 ul、これをCHILLOUT 6 ulでカバー。95℃で5分間インキュベートして試料をインベーダーMAPプレート中で変性させ、その後63℃でインキュベートし、160分間にわたり様々な時点においてCytofluor 4000(384ウェルリーダー)で蛍光を測定した。10、20、および40分においてFOZ値の解析を行い、ゲノムDNAに対して直接作成されたコールと比較した。等モルプライマー濃度を使用する101重PCRにより10分の時点で作成されたコールと、最適プライマー濃度下で実行した101重PCRにより10分の時点で作成されたコールを比較した。等モルのプライマー濃度下では、多重PCRにより10分の時点で正しいコールが50個のみ得られたが、最適プライマー濃度下では、多重PCRにより71個の正しいコールが得られ、結果として21個(42％)の新しいコールが得られた。10分の時点では101個すべてのコールは作成され得なかったが、40分の時点では94個のコールが作成され得り、大多数の単位複製配列の増幅効率が向上したことが示唆される。1ラウンドの最適化のみを必要とする10重の最適化とは異なり、より複雑な多重反応では、すべての遺伝子座の増幅のバランスをとるために複数ラウンドの最適化が必要とされ得る。
【０２５５】
実施例3
PCRの増幅率を決定するためのインベーダーアッセイ法の使用
インベーダーアッセイ法を使用して、PCR反応過程における増幅の進行をモニターすることができる、すなわち、反応における特定の単位複製配列の増幅効率を反映する増幅率Fを決定することができる。特に、インベーダーアッセイ法を使用して、PCR反応の任意の時点で存在する分子数を、定量した参照DNA分子から作成した検量線を参照して決定することができる。増幅率Fは、最初の標的濃度に対する増幅後のPCR産物濃度の比として測定される。本実施例では、測定される増幅率に及ぼす様々なプライマー濃度の影響について実証する。
【０２５６】
反応の進行をインベーダーアッセイ法を用いて評価して、蓄積した産物を測定できるように、PCR反応はサイクル数を5きざみの変数、すなわち5、10、15、20、25、30で行った。標的の量がインベーダーアッセイを飽和させないように、すなわち、測定値がアッセイの直線的範囲で得られ得るように、反応物を段階希釈した。既知量の単位複製配列を含む希釈系列を用いて、インベーターアッセイ検量線を作成した。この検量線を用いて、表示したサイクル数後のPCR反応物中に存在する増幅されたDNA断片の数を推定した。増幅前に存在した分子数に対する所与のPCRサイクル数後の分子数の比を用いて、各PCR反応の増幅率、Fを導く。
【０２５７】
PCR反応
等モル量のプライマー(例えば、0.02μMまたは0.1μMプライマー、最終濃度)を用いてPCR反応を設定した。それぞれのプライマー濃度での反応は、試験する各増幅レベル、すなわち5、10、15、20、25、および30 PCRサイクルに関して三つ組で設定した。6つの標準的PCR反応(それぞれ三つ組 X 2つのプライマー濃度)プラス対照2個 X 6つの試験(PCRサイクル数5、10、15、20、25、または30)に十分なマスターミックスには、過剰量を見越すため、余分な反応に十分な量を加味した。
【０２５８】
PCR反応産物の段階希釈
インベーダーアッセイ反応に標的として添加するPCR産物の量が、PERSEPTIVE BIOSYSTEMS CYTOFLUOR 4000におけるリアルタイムアッセイのダイナミックレンジを超えないようにするため、インベーダーアッセイに添加する前にPCR反応産物を希釈した。各反応物について最初に20倍希釈を行い、その後5倍の段階希釈を行った。
【０２５９】
標準物質を作製するため、様々なサイクル数の試験において使用したのと同じプライマーを用いて生成した増幅産物を、標準的な方法により非変性ポリアクリルアミドゲルから単離し、PICOGREENアッセイ法により定量化した。200 pMの作業保存液を作製し、これらの濃度標準物質の段階希釈物を30 ng/μlのtRNAを含むdH2Oで作製し、0.5、1、2.5、6.25、15.62、39、および100 fMという最終単位複製配列濃度を有する一組を得た。
【０２６０】
インベーダーアッセイ反応
各PCR反応物および標的なしの対照の適切な希釈物を三つ組で作製し、これらを標準的な一つ組インベーダーアッセイ反応で試験した。すべてのインベーダーアッセイ反応用にマスターミックスを作製した。全部で、6つのPCRサイクル条件 X 24の個々の試験アッセイ[(三つ組希釈物についての1つの試験 X 2つのプライマー濃度 X 3つのPCR複製物) = 18 + 標的なしの対照6個]が存在した。さらに、定量した単位複製配列標準物質の希釈物7個、および標準物質系列における標的なしの対照1個が存在した。標準物質系列は2枚のプレートそれぞれにおいて反復して解析し、さらに32のインベーダーアッセイが生じた。インベーダーアッセイの総数は、6 X 24 + 32 = 176である。マスターミックスには、32反応分の過剰量を含めた。インベーダーアッセイマスターミックスは、以下の標準的な成分を含んだ：16ウェル分を加えて192ウェル分のFRET緩衝液/Cleavase XI/Mg/PPI混合物。
PPI混合物には以下のオリゴヌクレオチドを含めた。
アッセイ2用の0.25μMインベーダー
2008518621.tif 000013
アッセイ2用の2.5μM Aプローブ
2008518621.tif 000014
アッセイ2用の2.5μM Gプローブ
2008518621.tif 000015
すべてのウェルにミネラルオイル15μlを重層し、95℃で5分インキュベートし、次いで63℃でインキュベートして、生成されるシグナルのレベルに応じて様々な間隔で、例えば20、40、80、または160分で読み取りを行った。反応プレートは、CytoFluor(登録商標)シリーズ4000蛍光マルチウェルプレートリーダーで読み取りを行った。使用した設定は以下の通りである：F色素検出のための励起/バンド幅 485/20 nmおよび蛍光/バンド幅 530/25 nm、ならびにR色素検出のための励起/バンド幅 560/20 nmおよび蛍光/バンド幅 620/40 nm。100〜200の絶対蛍光単位(AFU)で非標的ブランクが生成されないように、各色素について機器のゲインを設定した。
【０２６１】
結果：
三つ組インベーダーアッセイの結果を、サイクル数(x軸)の関数としての増幅率のlog10(y軸)のプロットにおいて図示する際には、PCR産物の濃度は、検量線に外挿することによってインベーダーアッセイから推定した。反復したアッセイによるデータは平均化せず、図中で複数の重複する点として表した。
【０２６２】
これらの結果から、PCR反応は試験したサイクルの範囲にわたり指数関数的であることが示される。異なるプライマー濃度を使用すると異なった傾きが得られ、高濃度のプライマー(0.1μM)を用いて行ったPCR反応物のインベーダーアッセイ解析により得られた傾きは、低濃度(0.02μM)で得られた傾きよりも急であった。さらに、0.1μMを用いて得られた傾きは、完全な倍加に関して予測される傾き(0.301)に近似する。それぞれのプライマー濃度でのPCR反応による増幅率を傾きから求めた：
0.1μMプライマーでは、傾き = 0.286；増幅率：1.93
0.02μMプライマーでは、傾き = 0.218；増幅率：1.65。
グラフの線は原点にまで及ぶように見えず、おそらくはヒトゲノムDNAの開始濃度の推定における誤差を反映して、0〜5サイクルでX軸を横切るように見える。
【０２６３】
このように、これらのデータから、プライマー濃度がPCR反応過程における増幅の程度に影響することが示される。これらのデータから、インベーダーアッセイ法が、PCR反応中の増幅をモニターするのに有効な手段であることがさらに実証される。
【０２６４】
実施例4
増幅率のプライマー濃度への依存
本実施例では、増幅率、Fとプライマー濃度、cとの相関関係について実証する。本実施例では、2つの対立遺伝子についてFを決定するが、それらに由来する6つのSNPをそれぞれ4つの異なるプライマー濃度において1重PCR反応で増幅させ、したがって6つのプライマー対 X 2つのゲノム試料 X 4つのプライマー濃度 = 48 PCR反応となる。
【０２６５】
実施例3では、単一の増幅領域において2つのプライマー濃度でPCRサイクル数の影響について試験したが、本実施例では、試験PCR反応はすべて20サイクル行い、様々なプライマー濃度の影響を4つの異なる濃度レベル：0.01μM、0.025μM、0.05μM、0.1μMにおいて調べた。さらに本実施例では、異なるゲノム領域の増幅の相違について検討し、(a) 異なるゲノム領域は異なる程度に増幅されるかどうか(すなわち、PCRの偏り)および(b) 異なるゲノム領域の増幅はどのようにプライマー濃度に依存するのかを調べた。
【０２６６】
実施例3と同様に、Fは、精製して定量化した参照単位複製配列調製物の希釈系列を使用し、各遺伝子座について検量線を作成することにより測定した。この場合には、12の異なる参照単位複製配列を作製した：プライマー対によって増幅される6つのゲノム領域内に含まれるSNPを、各対立遺伝子につき1つ。参照単位複製配列濃度はそれぞれインベーダーアッセイ法で試験し、単位複製配列濃度に対する蛍光カウントの検量線を作成した。また、ゲノムDNA試料でPCR反応を行い、産物を希釈し、次いでインベーダーアッセイ法で試験して、検量線と比較することにより分子数の点から増幅程度を決定した。
【０２６７】
a. 定量化した参照単位複製配列を用いた検量線の作成
全血から単離した全部で8つのゲノムDNA試料を標準的な2重インベーダーアッセイ法でスクリーニングし、全部で6つの異なる遺伝子座において野生型または変種対立遺伝子に関してホモ接合性である試料を同定するために、24のSNPにおいて遺伝子型を決定した。
【０２６８】
これらの遺伝子座が同定された時点で、野生型および変種ゲノムDNA試料を、各SNPを含むゲノム領域に隣接するプライマーを用いる個々のPCR反応で解析した。各SNPにおいて、一方の対立遺伝子はFAM色素をレポートし、もう一方はRED色素をレポートした。
【０２６９】
次いで、適切なゲノムDNA調製物を標準的な個々の1重PCR反応で増幅させ、実施例3に記載したように、PCR参照標準物質として使用するための増幅断片を作製した。
【０２７０】
PCRの後、増幅されたDNAを標準的な方法によりゲルから単離し、PICOGREENアッセイ法により前もって定量した。これらの濃度標準物質の段階希釈物を以下のように作製した。
【０２７１】
精製した単位複製配列をそれぞれ希釈して、200 pM濃度で作業保存液を作製した。次に、これらの保存液を以下のように段階希釈した。各単位複製配列の作業保存液を、30 ng/μlのtRNAを含むdH2O中の1.25 pM濃度として調製した。作業保存液は96ウェルマイクロタイタープレートにおいて希釈し、次いで段階希釈して、インベーダーアッセイ法における以下の最終濃度を得た：1、2.5、6.25、15.6、39、100、および250 fM。1枚のプレートは、FAM色素をレポートするプローブオリゴヌクレオチドを使用するインベーダーアッセイ法において検出すべき単位複製配列について調製し、もう1枚のプレートはRED色素をレポートするプローブオリゴヌクレオチドを用いて試験すべき単位複製配列について調製した。単位複製配列の希釈物はすべて二つ組で解析した。
【０２７２】
一定分量100μlをこの配置で96ウェルMJ Researchプレートに移し、95℃で5分変性させてから、インベーダーアッセイに添加した。
【０２７３】
b. 異なるプライマー濃度におけるゲノム試料のPCR増幅
前の実施例に記載した6つのゲノム領域の個々の増幅について、2つの対立遺伝子のそれぞれにおいて4つの異なるプライマー濃度でPCR反応を設定し、全部で48のPCR反応とした。PCRはすべて20サイクル行った。以下のプライマー濃度について試験した：0.01μM、0.025μM、0.05μM、および0.1μM。
プライマー濃度を修正し、さらなる23反応分(16個の反応物は調製したが使用しなかった、7つのさらなる反応分の過剰量を調製した)の過剰量を加えること以外は、標準的な手順に従って、48の反応すべてに対するマスターミックスを調製した。
【０２７４】
c. PCR反応物の希釈
インベーダーアッセイ法により解析する前に、実施例1および2に記載するように、PCR反応の産物を希釈することが必要であった。PCR反応物48個それぞれの段階希釈物を、各SNPに対して1枚の96ウェルプレートを用いて作製した。プレートの左半分はFAMをレポートするプローブオリゴヌクレオチドを用いて試験すべきSNPを含み；右半分はREDをレポートするプローブオリゴヌクレオチドを用いて試験すべきSNPを含んだ。最初の希釈は1:20であり；その後の希釈は1:5であり、1:62,500になるまで行った。
【０２７５】
d. PCR希釈物および参照単位複製配列のインベーダーアッセイ解析
各PCR反応の産物の希釈物すべておよび(各単位複製配列の検量線を作成するための)定量済みの各参照単位複製配列の表示した希釈物において、標準的な2重インベーダーアッセイ法によりインベーダー解析を行った。
【０２７６】
すべてのウェルにミネラルオイル15μlを重層した。試料を95℃で5分加熱して変性させ、次いで64℃でインキュベートした。40分および80分の時点において、CytoFluor(登録商標) 4000蛍光プレートリーダー(Applied Biosystems、カリフォルニア州、フォスターシティー)により蛍光測定値を得た。使用した設定は以下の通りである：F色素検出のための励起/バンド幅 485/20 nmおよび蛍光/バンド幅 530/25 nm、ならびにR色素検出のための励起/バンド幅 560/20 nmおよび蛍光/バンド幅 620/40 nm。100〜200の絶対蛍光単位(AFU)で非標的ブランクが生成されないように、各色素について機器のゲインを設定した。使用した装置/機器で生データを作成し、アッセイの性能を測定する(リアルタイムまたはエンドポイントモード)。
【０２７７】
lnFのcへの依存から、同じ反応条件下において12のPCRでは増幅率が異なることが実証されるが、その相違は同じSNPを表す各標的対内でははるかに小さいことが、これらの結果から示される。増幅率は、低いプライマー濃度ではcに強く依存し、高いプライマー濃度では頭打ちになる傾向がある。この現象は、プライマーアニーリングの反応速度の点から説明することができる。高いプライマー濃度では、アニーリングの反応速度が速いためにプライマーがすべての標的に結合し、最大増幅速度が達成されるが、一方低いプライマー濃度では、プライマーアニーリング反応速度が律速段階となり、Fが低下する。
【０２７８】
この解析から、ln(2 - F1/n)対cの座標においてプライマー濃度の関数として増幅率をプロットすると、傾き- kataを有する直線が得られることが示される。そのln(2 - F1/n)対cの座標においてデータを再度プロットすることで、0.1μMプライマー濃度では予測される増幅率よりも低いために直線性から逸脱する(Fは105またはそれ以上)、低いプライマー濃度についての予測された直線的な依存(低い増幅率)が実証される。kata値は、以下の式を用いて各PCRについて計算することができる。
2008518621.tif 000016
【０２７９】
実施例5
192重PCR反応のインベーダーアッセイ解析
本実施例では、ヒトゲノム中の192の異なる遺伝子座を増幅するよう設計された高度多重PCR反応の産物を検出するための、インベーダーアッセイ法の使用について記載する。
【０２８０】
ゲノムDNAの抽出
全血5 mlからゲノムDNAを単離し、Gentra Systems, Inc.(ミネソタ州、ミネアポリス)製のAutopureを用いて精製した。精製DNAはdH2O中で500μlとした。
【０２８１】
プライマーの設計
192の遺伝子座用のフォワードプライマーおよびリバースプライマーセットは、Prime Designer、バージョン1.3.4を用いて設計した(図8を含めて上記のプライマー設計の項を参照されたい)。PrimerDesignerの入力ファイルとして使用するため、該当するSNP部位に500以下の塩基が隣接しているインベーダー設計に使用した標的配列を、カンマ区切りのテキストファイルに変換した。PrimerDesignerは、オリゴTmを60℃に設定する以外は初期設定パラメータを用いて実行した。
【０２８２】
プライマーの合成
オリゴヌクレオチドプライマーは、Polyplex(GeneMachines、カリフォルニア州、サンカルロス)で標準的な手順により合成した。スケールは0.2μモルであり、NAP-10で脱塩のみ行い(未精製)、乾燥はさせなかった。
【０２８３】
PCR反応
2つのマスターミックスを作製した。マスターミックス1は遺伝子座1〜96を増幅するためのプライマーを含み；マスターミックス2は遺伝子座97〜192を増幅するためのプライマーを含んだ。これらの混合物は標準的な手順に従って作製し、標準的な成分を含んだ。プライマーはすべて最終濃度0.025μMで存在し、KClは100 mM、およびMgCl2は3 mMで存在した。PCRサイクリング条件は、MJ PTC-100サーモサイクラー(MJ Research、マサチューセッツ州、ウォルサム)中で以下の通りであった：95℃で15分；94℃で30秒、次いで55℃で44秒 X 50サイクル。
【０２８４】
サイクリング後、4つのPCR反応物をすべて混合し、一定分量3μlをCYBI-well 2000自動ピペッティングステーション(CyBio AG、ドイツ、イエナ)を用いて384ディープウェルプレートに分注した。この装置は、384ウェルマイクロプレートの各ウェルに個々の試薬を添加する。添加すべき試薬はそれ自体、384ウェルディープハーフプレート中で配置されている。
【０２８５】
インベーダーアッセイ反応
インベーダーアッセイはCYBI-well 2000を用いて設定した。ゲノムDNA標的の一定分量3μlを適切なウェルに添加した。標的なしの対照は、Te(10 mM Tris、pH 8.0、0.1 mM EDTA) 3μlからなった。インベーダーアッセイで使用する試薬は、標準的なPPI混合物、緩衝液、FRETオリゴヌクレオチド、およびCleavase VIII酵素であり、これらはCYBI-well 2000により各ウェルに個々に添加した。
【０２８６】
試薬を添加した後、各ウェルにミネラルオイル6μlを重層した。MJ PTC-200 DNA ENGINEサーモサイクラー(MJ Research)でプレートを95℃で5分加熱し、次いでインキュベーション温度63℃まで冷却した。20分および40分の時点で、Safireマイクロプレートリーダー(Tecan、スイス、チューリッヒ)を用いて以下の設定により蛍光を読み取った、F色素検出のための励起/バンド幅 495/5 nmおよび蛍光/バンド幅 520/5 nm；ならびにR色素検出のための励起/バンド幅 600/5 nm、蛍光/バンド幅 575/5 nm Z位置、5600μs；フラッシュ回数、10；遅延時間、0；積算時間、40μ秒。F色素についてはゲインを90 nmに設定し、R色素については120に設定した。使用した装置/機器で生データを作成し、アッセイの性能を測定する(リアルタイムまたはエンドポイントモード)。
【０２８７】
192個の反応物のうち、20分後には157個および40分後には158個、または全体の82％について遺伝子型コールが作成され得た。これらのアッセイのうち88個については、1重PCRおよびその後のインベーダー解析またはゲノムDNAの解析から直接得られたインベーダー結果のいずれかを用いて以前に得られたデータからの遺伝子型同定結果が比較に利用できた。69個の反応物に関しては、確実な遺伝子型結果は利用できなかった。
【０２８８】
本実施例により、単一の多重PCR反応において150個を超える遺伝子座を増幅することが可能であることが示される。本実施例から、そのような多重PCR反応で産生された各増幅断片の量が、インベーダーアッセイの標的として使用した場合に、識別可能な遺伝子型コールを生成するのに十分であることもさらに示される。また、この多重PCRアッセイで産生された単位複製配列の多くは、インベーダーアッセイにおいてFOZとして測定される高いシグナルを与えたが、いくつかは遺伝子型コールが作成され得ない低いシグナルを与えた。さらに別の単位複製配列は、そのように低いレベルで存在するかまたは全く存在せず、インベーダーアッセイにおいてシグナルを生じることができなかった。
【０２８９】
実施例6
高度多重PCR反応の性能を改善するためのプライマー濃度の最適化
多重PCRにおける個々の反応間での競合は、増幅の偏りを悪化させ、1重PCRと比較して増幅率の全体的な減少を招き得る。増幅率がプライマー濃度に依存することを利用して、PCRの偏りを軽減することができる。増幅率へのプライマー濃度の影響を示す実施例3による結果と合わせて、前の実施例の192重PCRで増幅された異なる遺伝子座から生成されたシグナルのレベルが様々であったことから、プライマー濃度を調節することで、インベーダーアッセイ法で使用するのに十分な標的を産生するPCR反応の割合を改善できることが示唆される。
【０２９０】
例えば、実施例5で解析した1つの特定の試料は、インベーダーアッセイでの40分間のインキュベーション後に、29.54 FAMおよび66.98 REDというFOZ結果をもたらしたが、別の試料は40分後にそれぞれ1.09および1.22というFOZ結果を与え、遺伝子型コールを作成するには十分なシグナルがないという判定がもたらされた。第1試料では下げて第2試料では上げるというように、プライマー濃度を調節することで、2つの試料の増幅率を同じ値により近づけることが可能となるはずである。この種の調節は反復過程であり、互いに十分に近接した増幅率をもたらして、多重PCR反応中の大部分またはすべての遺伝子座がほぼ同等の効率で増幅されるようにするには、2回以上の修正を必要とすることが想定される。
【０２９１】
実施例7
多重例
原理上、PCR増幅は、複数の遺伝子座を同じチューブ内で増幅する多重形式で行うことができる。しかし実際のところ、このアプローチでは、PCRの偏りに起因して個々の増幅産物の収量は大きく異なり得る。本実施例では、増幅の偏りを最小限に抑えるための多重反応条件の最適化について記載する。増幅の偏りは個々の反応間の異なる増幅速度が原因であり、これがサイクル数を重ねる間にPCR産物収量の顕著な相違をもたらす。本実施例では、定量インベーダーアッセイを使用して、反応の全範囲にわたってPCR標的増幅を解析し、PCR収量に影響するパラメータを調べた。この研究から、増幅の偏りの根底にある機構を解明する、標的増幅率のプライマー濃度およびプライマーアニーニング時間への依存を説明するモデルを開発した。偏りを最小限に抑える様々な条件を試験するためのモデルシステムとして6重PCRを使用し、2つのアプローチを同定した。第1のアプローチは、異なる遺伝子座の増幅率のバランスをとるために、プライマー濃度の調節を利用する。第2のアプローチでは、個々の反応すべて対してプライマー濃度を同等に保つが、プライマーアニーリング時間および増幅のサイクル数を最適化して、増幅の偏りを最小限に抑えた。最適化したPCR条件を用いて、インベーダーアッセイ法による遺伝子型同定に使用するための、8つのゲノムDNA試料の192重PCR増幅を行った。
【０２９２】
材料および方法
材料
化学物質および緩衝液は、特記しない限り、Fisher Scienificから入手した。構造特異的5'ヌクレアーゼCleavase(登録商標)1酵素(Third Wave Technologies)は、記載されている通りに精製した(5)。この酵素は透析し、50％グリセロール、20 mM Tris HCl、pH 8、50 mM KCl、0.5％ Tween 20、0.5％ Nonidet P40、100μg/ml BSA中で保存した。特記しない限り、A、G、C、およびTはデオキシリボヌクレオチドを指す。
【０２９３】
ゲノムDNAの調製
白血球10 mlから、AutoPure LS装置(Gentra Systems、ミネソタ州、ミネアポリス)を使用して、8つのゲノムDNA試料G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、およびG8を調製した。精製したDNAは、10 mM Tris HCl pH 8.0、0.1 mM EDTAを含むTe緩衝液で13.3 ng/μlになるように希釈した。
【０２９４】
オリゴヌクレオチドの合成
1重PCR反応および6重PCR反応を伴うインベーダーアッセイで使用するオリゴヌクレオチドは、PerSeptive Biosystems装置および標準的なホスホラミダイト化学法を用いて、A、G、C、T、6-カルボキシフルオレセイン色素(FAM)(Glen Research)、Redmond RED(商標)色素(RED)(Epoch Biosciences、ワシントン州、レドモンド)、およびEclipse(商標) Dark Quencher(Z)(Epoch Biosceinces)を含めて合成した。一次プローブおよびFRETカセットはResource Qカラム(Amersham-Pharmacia Biotech、ニュージャージー州、ニューアーク)を使用してイオン交換HPLCにより精製し、侵入プローブはNAP-10カラム(Amersham 17-0854-02)で脱塩して精製した。192重PCRアッセイで使用する一次プローブはC16 CPGカラム(Biosearch Technologies、カリフォルニア州、ナバト、BG1-SD14-1)を使用してBiosearch Technologiesによって合成され、SuperPure Plus Purificationカラム(Biosearch、SP-2000-96)を用いて精製した。192重アッセイ用の侵入プローブは、trityl-on 5'捕獲精製を用いてBiosearch Technologiesにより合成および精製された。PCRプライマーは、Integrated DNA Technologies、イリノイ州、シカゴにより合成された。オリゴヌクレオチド濃度は、260 nmでの吸収(A260)、ならびにA、C、G、およびTそれぞれに対する15,400、7,400、11,500、および8,700 A260 M-1という励起係数を用いて決定した。
【０２９５】
多重PCR用のプライマーの設計
多重PCR用のプライマーの設計を支援するため、およびプライマー-ダイマー形成の可能性を低減させるために、コンピュータプログラム、PrimerDesignerソフトウェア(Third Wave Technologies、ウィスコンシン州、マディソン；図8および上記のプライマー設計の考察を参照されたい)を開発した。多重形式用のPCRプライマーは、上記のプライマー設計の考察および図8と併せて以下のパラメータを用いて、PrimerDesignerソフトウェアで設計した。増幅すべき遺伝子座のそれぞれに対して、SNPの両側に500ヌクレオチドを含め、遺伝子座当たり全部で1001塩基とした。各遺伝子座について、侵入プローブおよび一次プローブの結合に必要な60〜80ヌクレオチドの配列を決定し、この領域から外側に「歩行」していき、候補のフォワードおよびリバースPCRプライマーを同定した。候補プライマーは以下の基準に基づいて選択した：(1) プライマー-ダイマーの形成を回避するため、プライマーはその3'末端にAまたはCをもたなければならない；(2) プライマーのTmは60℃である(11、12)；(3) プライマーは12〜30ヌクレオチド長であるべきである；(4) 任意のプライマーの2つおよび3つの3'末端塩基は、多重PCR混合物の任意の他のプライマーの2つおよび3つの3'末端塩基と相補的であるべきではない；(5) プライマーは、インベーダー一次プローブの切断される5'アーム配列と80％を超える配列類似性を有するべきではない。ランダムに選択した遺伝子座に対する最初の2つのプライマーの設計からアルゴリズムを開始し、プールにさらなるプライマーを繰り返し添加していくことでアルゴリズムを進めていく。遺伝子座の1つに対してプライマーを設計することができない場合には、ランダムに選択した新たな遺伝子座を用いて最初からアルゴリズムを開始させる。
【０２９６】
インベーダーアッセイの設計
インベーダーアッセイの一次プローブおよび侵入プローブは、他所(Lyamichev, V. and Neri, B. (2003) INVADER assay for SNP genotyping. Methods Mol Biol, 212, 229-40、参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている通りにINVADERCreatorアルゴリズムで設計した。PCR1〜6それぞれに対応するインベーダーアッセイ1〜6用のプローブ配列。192重PCR実験のための192インベーダーアッセイ用の配列も、同じアルゴリズムを用いて設計した。
【０２９７】
インベーダーアッセイを用いたPCRの定量解析
1重形式および6重形式のPCR1〜6を、本文中に明記した濃度のプライマー、0.2 mM dNTP、Amplitaq DNAポリメラーゼ(PE Biosystems、N808-0171) 1μl(5 U/μl)、TaqStart抗体(Clontech、カタログ番号5400-2、カリフォルニア州、パロアルト) 1μl(1.1μg/μl)、およびヒトゲノムDNA 50 ngまたは標的なしの対照用のTe緩衝液3.8μlを含むGeneAmp PCR緩衝液(PE Biosystems、カリフォルニア州、フォスターシティー) 50μl中で行った。蒸発を防ぐため、各ウェルを透明Chill-out(MJ Research、カタログ番号CHO-1411、ネバダ州、ラスベガス) 15μlで覆い、プレートをホイルシール(Beckman Coulter、カタログ番号BK 538619、カリフォルニア州、フラートン)で覆った。サイクル数および各サイクルの時間-温度プロファイルは本文中に明記する。各PCRは、95℃で15分の最初の試料変性段階および99℃で10分の最後のインキュベーション段階を含んだ。反応はそれぞれ96ウェルプレートで三つ組にて実施した。産物濃度をインベーダーアッセイのダイナミックレンジの範囲内にもっていくため、30μg/ml tRNA(Boehringer Mannheim、カタログ番号BK 538619、インディアナ州、インディアナポリス)を含むTe緩衝液により、PCR産物を最初の段階において20倍で段階希釈し、その後5倍希釈した。
【０２９８】
希釈したPCR産物を用いたインベーダー反応は、96ウェルプレートにおいて、0.05μM侵入オリゴヌクレオチド、0.5μM各プライマープローブ、0.33μM各FRETカセット、5.3 ng/μL Cleavase XI酵素、12 mM MOPS(pH 7.5)、15.3 mM MgCl2、2.5％ PEG 8000、0.02％ NP40、0.02％ Tween 20を含む15μl中で、ミネラルオイル(Sigma) 15μlを重層して行った。PCR産物は、反応液15μLのうちの7.5μLを占めた。標的なしの対照については、PCR産物の代わりにTe緩衝液7.5μLを使用した。標的を変性させるために反応物を95℃で5分インキュベートし、次いで20分〜3時間の間63℃でインキュベートした。プレートを室温まで冷却して反応を停止させ、FAM色素には485/20 nm励起フィルターおよび530/25 nm発光フィルターならびにRED色素には560/20 nm励起フィルターおよび620/40発光フィルターを使用して、Cytofluor 4000蛍光プレートリーダー(PE Biosystems)で蛍光シグナルを検出した。各PCR複製物は対応するインベーダーアッセイ法で三つ組にて解析し、したがって各PCR反応について9つのデータポイントを収集した。
【０２９９】
PCR産物の濃度を決定するため、対応するPCR産物の標準濃度を使用して、インベーダーアッセイ1〜6のそれぞれについて検量線を得た。アッセイ1〜6についてのPCR標準物質は、DNA試料G1、G2、G6、またはG8をPCR増幅することで調製した。増幅産物をエタノール沈殿により濃縮し、8％ポリアクリルアミド非変性ゲルで電気泳動することによって精製し、Picogreen dsDNA定量キット(Molecular Probes、オレゴン州、ユージーン、カタログ番号P7589)を用いて定量した。検量線のためのインベーダー反応は、解析するPCR産物と同じマイクロタイタープレートにおいて、PCR標準物質0〜100 fMで二つ組にて行った。
【０３００】
解析したPCR産物の濃度は、蛍光シグナルを基にして、PCR試料の蛍光シグナルの値に近い検量線の3つのデータポイントを用いた直線回帰により決定した。PCR産物濃度およびその分散は、三つ組インベーダーアッセイ測定値からPCR複製物のそれぞれについて推定した。三つ組PCRのPCR産物濃度は、三つ組インベーダーアッセイ解析の分散により重み付けした複製物それぞれの平均値を用いて推定した。PCRに使用したゲノムDNA試料の最初の濃度は、同じ検量線を用いて三つ組インベーダーアッセイにより決定した。増幅率Fは、推定PCR産物濃度に希釈係数を掛け算し、PCRに使用したゲノムDNA濃度で割って決定した。
【０３０１】
192重PCRは、単一の複製物において、DNA試料G1〜G8、各プライマー濃度0.2μM、プライマーアニーリング時間1.5分、プライマー伸張時間2.5分、および最初の95℃での試料変性段階2.5分を用いて、PCR 1〜6について記載した条件下で17サイクル行った。192重PCRの標的なしの対照には、ゲノムDNAの代わりにTe緩衝液を使用した。192重PCR反応物を30μg/ml tRNA(Boehringer Mannheim、109 525)を含むTe緩衝液で30倍希釈し、95℃で5分加熱してからインベーダー反応物に添加した。インベーダー反応は、侵入プローブを0.07μMにし、各一次プローブを0.7μMにすること以外は、アッセイ1〜6について記載した通りに行った。ゲノムPCR試料および標的なしのPCR対照について、FAMおよびRED蛍光シグナルを、15、30、および60分後に、または本文に指定した通りに収集した。192のインベーダーアッセイそれぞれの試料シグナルから標的なしのシグナルを引き算することにより、正味の蛍光シグナルを決定した。遺伝子型同定ソフトウェアにより、以下のアルゴリズムを解析に適用した。(1) 試料シグナルを標的なしの対照のシグナルで割り算して、FAMシグナル(FOZF)およびREDシグナル(FOZR)のフォールドオーバーゼロ値を、各インベーダーアッセイについて決定した。(2) 各インベーダーアッセイについて、比値Hを(FOZF-1)/(FOZR-1)として決定した。(3) 0.25<H<4であり、かつFOZFおよびFOZRの両方が>1.3である場合、試料をヘテロ接合性(HET)と定義し；H>4かつFOZF>1.6である場合、試料をホモ接合性FAMと定義し；またH<0.25かつFOZR>1.6である場合、試料をホモ接合性REDと定義した。(4) その他の場合はすべて、試料を「不明」と判定した。
【０３０２】
PCRに影響を及ぼすパラメータを調べるため、定量インベーダーアッセイ法を用いて反応の全範囲にわたり標的増幅率Fを決定する方法を開発した。F率を増幅産物の濃度と最初のゲノムDNAの濃度の比と定義し、いずれも「材料および方法」に記載したように既知量のPCR産物で得られた検量線を用いてインベーダーアッセイ法で測定した。
【０３０３】
最初に、FをPCRのサイクル数nの関数として解析した。DNA G2を使用して0.1μMのプライマー濃度cで1重PCR 5を行い、5、10、15、20、25、30、および35のnの後にFを決定した(図2)。図2に示したように、PCR 5から、最初の25サイクルに関する傾き0.296±0.0016を有するlgFのnへの直線的依存が明らかになり、標的増幅が7桁の範囲にわたって指数関数的であることが実証された。直線的依存の傾きから決定したPCRサイクル当たりの平均増幅率は1.98±0.007に等しく、標的の量は各サイクル後にほぼ2倍になることが示された。図2の挿入図は、標的として大量のDNA G2を使用すること以外は同じ条件下における、PCR 5のサイクル1、2、3、および5に関するlgFのnへの依存を示す。この依存もまた、lgF対nの傾き0.283を有する一次関数により近似され得る。25サイクル後、PCR 5は2 X 108というFでプラトーに達し、これは0.28 fMの最初のゲノムDNA濃度から決定された標的濃度0.06μMに相当する。プラトーは、PCRで使用した0.1μM濃度のプライマーの枯渇によるか、または自身の産物によるPCRの阻害によって説明できると考えられる。PCR 5と同様にPCR 2の定量解析からも、最初の25サイクルに関する傾き0.295±0.004を有するlgFのnへの直線的依存および3 x 108というFでのプラトーが示される(データは示さず)。これらの結果から、PCR標的増幅解析の定量法としてのインベーダーアッセイ法が確証され、また、PCRが7桁の範囲にわたってまたは少なくとも25サイクル間、指数関数的に進行することが実証される。
【０３０４】
Fを調節してそれによって増幅の偏りを低減させる手段としてcのFへの影響を調べるため(Henegariu, O., et al., Biotechniques, 23, 504-11, 1997)、定量インベーダーアッセイ法を用いて1重PCR 1〜6について検討した。PCRはそれぞれ、0.01、0.025、0.04、0.05、または0.1μMというcを用いて20サイクル実施した。図3Aに、cの関数としてのFの対数をPCR 1、2、4、および5について示す。図3Aから、PCR 1(●)、PCR 2(○)、PCR 4(■)、およびPCR 5(□)に関して、プライマー濃度cのlgFへの影響が示される。PCR増幅は、0.01、0.025、0.04、0.05、または0.1 mMというcで、PCR 1、4、および5についてはゲノムDNA G2 50 ngまたはPCR 2についてはゲノムDNA G6 50 ngを用いて50 mL中で行った。PCRはそれぞれ、各サイクルについて鋳型変性段階95℃で30秒、プライマーアニーリング段階55℃で44秒、およびプライマー伸長段階72℃で60秒を用いて、20サイクル実施した。0.01 mMというcを用いたPCR 1のlgF値は、確実な測定値としては低すぎた。PCRを三つ組で行い、各複製物を対応する定量インベーダーアッセイ法でやはり三つ組で行うことにより、標準誤差を推定した。PCR 3および6はそれぞれPCR 5および2に非常に類似した挙動を示し、よって簡潔を期すために表示していない。同じ反応条件下で行ったPCR間のFには有意差がある。差は低いcにおいて最も顕著であるが；より高いcではlgFはlg(220)または6.0という理論上の最大値に近づき、差は有意でなくなっていく。前の項で示したように、PCRは20サイクルの時点では指数関数的反応とみなすことができ、よってFを用いて単一PCRサイクルでの標的増幅率zをF1/nとして決定することができる。
【０３０５】
先に上記したように、cがFに対して見せる影響は、低いcではプライマーアニーリングがPCRの律速段階であると仮定するモデルによって説明することができる。このモデルでは、プライマーPの標的Tへの結合は、結合反応速度定数kaを有する2次反応によって説明される。
2008518621.tif 000017
【０３０６】
プライマーが標的よりも過剰であり、かつアニーリングがプライマー融解より低い温度で起こり、そのため逆反応は無視できると仮定すると、反応(1)についての解式は以下となり、
2008518621.tif 000018
式中、[PT]はプライミングされた標的の濃度であり、T0は前のPCRサイクル後の標的濃度であり、およびtaはプライマーアニーリング時間である。両方のPCRプライマーが同じkaを有し、かつアニーリング時間taがプライミングされた各標的分子の複製を完了するのに十分長いと仮定すると、zは
2008518621.tif 000019
と決定することができ、nサイクル後のFは
2008518621.tif 000020
により与えられる。式4によれば、ln(2 - F1/n)は、- kataに等しい傾きを有するcの一次関数となるはずである。
【０３０７】
図3Aに示したデータをln(2 - F1/n)対cの座標を用いて変換すると、予測される直線的依存がそれぞれのPCRに対して実証され(図3B)、モデルへの強力な支持が提供される。図3Bにおいて、直線はそれぞれのPCRに関して最小二乗フィットを示す。0.1 mMのcにおけるPCR 2および5のデータポイントは、標準誤差が大きいために使用しなかった。ln(2 - F1/n)対cの傾きを用いて、最も低いkaを有するプライマーによって主に規定されるプライマーアニーリング段階の見かけの反応速度定数kaappを決定することができる。44秒というtaを使用した図3Bから決定されるPCR 1、2、4、および5のkaapp値は、それぞれ0.34 106、0.73 106、0.45 106、および1.2 106 s-1 M-1である。これらの値は、同様の緩衝液条件下において短いオリゴヌクレオチドについて得られた1.5 106 s-1 M-1および2.6 106 s-1 M-1というka値に近い。最も遅いKa(PCR 1)と最も速いKa(PCR 5)との間には少なくとも3倍の差があり、プライマーアニーリング反応速度が増幅の偏りに顕著に寄与し得ることが示唆される。
【０３０８】
PCR増幅の定量解析の結果から、多重PCRにおいて標的増幅のバランスをとるための2つのアプローチが示唆される：(1) lgF対cの依存を利用したそれぞれに対するcの調節、および(2) 式4から得られる、cを固定した状態で標的すべてを最大増幅に近づけるためのcおよびtaの増大。
【０３０９】
PCR 1〜6のそれぞれについて期待F値104を提供する調節されたプライマー濃度cadj(表1)を、図3Aに示したデータから決定した。
【０３１０】
（表１）調節したプライマー濃度の条件下での多重PCR 1、2、3、4、5、および6の増幅率の対数lgF
2008518621.tif 000021
a 多重PCR 1、2、3、4、5、および6は、各サイクルについて変性段階95℃で30秒、プライマーアニーリング段階55℃で44秒、およびプライマー伸長段階72℃で60秒を使用し、ゲノムDNA G2またはG6 50 ngを用いて50μL中で20サイクル行った。
b cadjは、期待lgF値4を提供するために、図2からPCR 1、2、3、4、5、および6のそれぞれについて決定した。
c PCR 1、3、4、5、およびPCR 2、6のlgFadjおよびlgF0.025は、それぞれゲノムDNA G2およびG6を用いて行った定量インベーダーアッセイおよび6重PCRのFAMシグナルを用いて決定した。標準誤差は、それぞれ対応するインベーダーアッセイ法により三つ組にて解析した三つ組PCR反応から決定した。
【０３１１】
標的としてDNA G2またはG6を使用し、図3と同じ条件下において、それぞれのPCRに対して調節した濃度cadjまたは0.025μMという固定したc0.025のいずれかを用いて6重PCR1〜6を行った。表1に示すように、cadj条件下では、6つの標的すべてが平均lgFを4.15±0.17として約104倍に増幅され、最も速いもの(PCR 3)と最も遅いもの(PCR 1)のFの差は2.75倍であった。c0.025条件下では、多重PCRで増幅された全産物量は平均lgF 3.89±0.91を有し、cadjを用いたPCRと同等であったが、最も速いPCRと最も遅いPCR(それぞれ3および1)のFの差が26.3倍であることから示されるように、顕著な増幅の偏りが存在した。PCR 1〜6はまた、6重形式の条件下でcadjまたはc0.025を用いて1重形式でも行ったが、F値は表1に示す対応するF値と非常に類似していることが示された。この結果から、6重形式における個々のPCR間に有意な干渉がないことが示唆される。
【０３１２】
cを調節することによってPCRのバランスをとることは、増幅の偏りを最小限にする強力なアプローチである；しかし、これは各PCRのFのcに対する既知の依存、またはプライマー濃度の反復した最適化を使用するものである。別のアプローチは、固定したc値を使用するが、偏りを最小限にする条件下でPCRを行うというものである。実験データ(図3)および理論解析(式3)の両方から、cta項の値が増大するにつれてzが2に漸近して近づくことが示唆される。したがって、図3に示した条件下で使用した最大濃度である0.1μM、または0.2μMという固定したcを用いて、プライマーアニーリング段階を44秒の代わりに90秒にして多重PCRを行った。6重PCR 1〜6は、標的としてDNA G1、G2、G6、またはG8を使用し、理論上の最大lgF値5.1を提供するように17サイクル行った。インベーダーアッセイ1〜6を用いたFの定量解析は、FAMシグナルおよびREDシグナル(ゲノムDNAの遺伝子型用 表S3を参照されたい)の両方を用いて行い、そのlgF値を表2に示す。
【０３１３】
（表２）固定したプライマー濃度の条件下での多重PCR 1、2、3、4、5、および6の増幅率の対数lgF
2008518621.tif 000022
a 多重PCR 1、2、3、4、5、および6は、各サイクルについて変性段階95℃で30秒、プライマーアニーリング段階55℃で90秒、およびプライマー伸長段階72℃で150秒を使用し、0.1または0.2μMのc、ゲノムDNA G1、G2、G6、またはG8 50 ngを用いて50μL中で17サイクル行った。標準誤差は、それぞれ対応するインベーダーアッセイ法により三つ組にて解析した三つ組PCR反応から決定した。
b インベーダーアッセイのレポート蛍光色素。
【０３１４】
FAMシグナルとREDシグナルを用いて得られた平均lgF値間の差は、0.1μMおよび0.2μM PCR条件のいずれにおいてもそれぞれ0.88および0.77というt検定p値を有して統計的有意性はなく、Fの解析はインベーダーアッセイの種類に依存しないことが示唆される。0.2μMのcでのPCR 1〜6の平均lgF値は、それぞれ4.55±0.10、5.03±0.11、4.96±0.11、4.80±0.10、5.42±0.18、および5.15±0.11であり、期待値5.1に非常に近かった。PCR 5のlgF値5.42がどのような理由で期待値よりも統計的に高かったのかは不明であるが、インベーダーアッセイ5はすべてのゲノムDNA試料で他のアッセイに比べて比較的低い性能を示し、そのためPCR産物濃度とゲノムDNA濃度の比が見かけ上高くなり、lgFの値が過大評価されたのかもしれない。
【０３１５】
0.2μMと0.1μMのcで得られた平均lgF値間の差は、PCR 1、2、4、および6それぞれについて0.32、0.13、0.18、および0.17であった。この差は、対応するt検定p値<0.0001、0.04、0.01、および0.02を有して統計的に有意であった。最も速いPCR(3および5)の0.2μM平均lgF値と0.1μM平均lgF値との差はそれぞれ0.07および0.08であり、t検定p値0.37および0.47を有して、統計的有意性はないと考えられる。この解析から、cta項の増大により遅いPCRの性能が改善され、多重反応における、明らかに増幅のプラトーに達していた速いPCRの性能は影響を受けないことが実証される。
【０３１６】
本実施例の次の取り組みは192重PCRの開発であり、これはインベーダーアッセイ法によるSNP遺伝子型同定用に(Ohnishi, et al., J Hum Genet, 46, 471-7, 2001)によって達成された100という多重率を本質的に倍増するものである。第5、第11、第14、第15、第16、第17、および第19染色体を表す192個のSNPをランダムに選択し、SNPそれぞれに対してインベーダーアッセイ法を設計した。選択過程において、反復領域のSNPに対する識別は行わなかった。そのため、192個のSNPのうちのいくつかは、複数の遺伝子座において増幅される可能性があった。バランスのとれた増幅用に開発するPCR条件は、簡潔さおよび開発時間の短縮から、プライマー濃度を固定して使用した。ゲノムDNA試料G1〜G8を、0.2μMという固定したc、プライマーアニーリング時間1.5分、プライマー伸長時間2.5分での17サイクルという192重PCRにより増幅し、次いで「材料および方法」に記載した通りに192の2重インベーダーアッセイ法で解析した。試料シグナルから標的なしの対照シグナルを引き算することにより、REDおよびFAMの正味のシグナルを得た。正味シグナルから遺伝子型を同定する1つの方法は、「材料および方法」に記載したように各アッセイについて共通の判定基準を使用するというものである。これらの基準では、ホモ接合性試料は一方の対立遺伝子からのシグナルのみを有し、もう一方の対立遺伝子からの交差反応性シグナルをほとんど有さず、ヘテロ接合性試料は両対立遺伝子についてほぼ同等のシグナルを生成することを前提とする。このような厳格な基準のために、その他の点では機能的なインベーダーアッセイ法においてあいまいなコールが生じ得る場合が多い。
【０３１７】
別の方法としては、インベーダーアッセイそれぞれについて8つのDNA試料すべてのFAMおよびRED正味シグナルを散布図としてプロットし、ホモ接合性試料およびヘテロ接合性試料に相当するクラスターを視覚的に同定することによって、遺伝子型を判定する。含まれる試料の数が少なすぎる場合には、散布図解析を行うことはできない；この種類の視覚的解析は実施する人の判定に依存するため、この解析は主観性の要素も含む。本研究において、8つの試料は、192のインベーダーアッセイの大部分の視覚的コールを作成するのに十分であることが分かった。図4に、散布図解析の成功および失敗の例を示す。図4は、8つのゲノムDNA試料についての正味のFAMおよびREDインベーダーアッセイシグナルの散布図を示す。インベーダーアッセイ正味FAMシグナルおよび正味REDシグナルを、196重PCRで増幅したDNA試料G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7、およびG8についてプロットした。A〜C、アッセイ7、9、および25で遺伝子型同定に成功したものであり、すべての試料が特徴のあるクラスターに指定されて、ホモ接合性FAM(○)、ホモ接合性RED(□)、またはヘテロ接合性(×)として同定された。D〜F、遺伝子型同定に失敗したものである。アッセイ6(D)では、座標の原点に最も近い試料をクラスターのいずれにも指定することができない；アッセイ47(E)では、試料は3つの特徴的なクラスターを形成するが、いずれの試料にもFAMシグナルが存在しない；アッセイ54(F)では、高いFAMシグナル交差反応性を有するホモ接合性REDとひずんだRED/FAM比を有するヘテロ接合性とを識別することができない。RFU−相対蛍光単位。
【０３１８】
視覚的解析には慎重な基準を使用し、試料の1つでもクラスターに指定され得ない場合には試料の全セットを排除した。また、両方のチャネルにおいて強いシグナルを有するセットは、インベーダーアッセイ法の交差反応性が高いこと、またはおそらくPCRにより複数の相同的遺伝子座が増幅されることが想定され、正確な遺伝子型を与えると見なさかった。これらの基準を用いた場合、192のアッセイのうちの161または84％についてコールが作成された。「材料および方法」に記載した遺伝子型同定ソフトウェアを使用して作成したコールは、これらのコールの82.5％と一致した。
【０３１９】
失敗に終わった31のインベーダーアッセイについては、失敗がPCR増幅率が低いことによるのか、インベーダーアッセイの性能が低いことによるのか、またはPCRにより高度に相同的な配列が増幅されたことによるのかを決定した。PCR標的配列をBLATにより解析し、個々のPCRのいずれかが2つ以上の遺伝子座を増幅したかどうかを判定した。31アッセイのうち8つは、それぞれPCRによって複数の遺伝子座が増幅される可能性が高く、各遺伝子座がインベーダーアッセイ法により検出され得ることが理由で、明らかに失敗となった。残りの23アッセイは、以下の理由の1つまたは組み合わせのために失敗したと考えられた：PCR増幅の低さ、オリゴヌクレオチド設計および製造の不備、または2003年4月ヒトゲノムアセンブリーに含まれていない未認識の反復配列。ゲノムにおける反復配列のために失敗した8つのアッセイを除けば、インベーダーアッセイ遺伝子型同定を伴う192重PCRの効率は、161/184または87.5％と推定された。
【０３２０】
192重PCRにおける増幅の偏りを推定するため、図5に示すように、8つのDNA試料で行った161の成功したインベーダーアッセイについて、対立遺伝子当たりに標準化したRED正味蛍光シグナルをPCR標的の長さに対してプロットした。図5は、PCR標的の長さの関数としての、161の成功したインベーダーアッセイの対立遺伝子当たりに標準化した正味のRED蛍光シグナルを示す。インベーダー反応は、それぞれ196重PCRで増幅した8つのDNA試料を用いて60分間行った。グラフの線は、PCR標的の長さの関数としての正味シグナルの直線回帰を示す。
【０３２１】
PCR増幅およびインベーダーアッセイ法の性能のばらつきを含む正味シグナルには、顕著なばらつきがある。FAM正味シグナルについても同様の結果が得られた。正味シグナルと標的の長さの間には弱い相関関係があり、700 bpよりも長いPCR標的は、遺伝型同定を成功させる可能性が低いことが示唆される。
【０３２２】
驚くべきことに、正味シグナルのばらつきが高いにもかかわらず、遺伝子型同定はシグナル分布の高いおよび低い末端のいずれにおいても成功していた。インベーダーアッセイ遺伝子型同定で見られる頑強性について調べるため、同様の192個のインベーダー反応の正味シグナルを15、30、および60分後に測定した。インベーダーアッセイにおけるシグナル増幅は時間の2次式で表されるため(1)、30分および60分時点は、それぞれ4倍および16倍高い標的レベルで実施した15分反応と等しいことになり、したがって低い、中程度の、および高いレベルのPCR増幅を模倣することになる。例として、15、30、および60分の時点で得られたインベーダーアッセイ110の散布図を図6に示す。図6は、8つのDNA試料の正味FAMシグナルおよび正味REDシグナルの散布図を示す。インベーダーアッセイ110は196重PCRで増幅したDNA試料を用いて行い、15分(A)、30分(B)、および60分(C)後にシグナルを測定した。散布図解析により、試料をホモ接合性FAM(○)、ホモ接合性RED(□)、またはヘテロ接合性(×)として同定した。RFU−相対蛍光単位。
【０３２３】
この散布図から、クラスター解析によるインベーダー遺伝子型同定は正味シグナルが強いことに影響されず、FAMおよびREDの正味シグナルが飽和に達する60分反応についてさえも読み取り可能であることが実証される。この影響の結果として、インベーダー反応を長く行うことで、遅いPCRではシグナルがさらに生成され、遺伝子型同定が改善され、それと同時に速いPCRの高いシグナルは試料のクラスター形成に影響しないために、より多くのコールが作成され得る。
【０３２４】
実施例8
単一反応容器中でのPCR増幅およびインベーダーアッセイ解析
本実施例では、単一の反応容器中で、少量の標的を増幅するためのPCRおよびその後のインベーダーアッセイ解析を用いる方法について記載する。特に、本実施例では、単一の反応を設定した後に操作も試薬添加も必要とせずにこれら2つの反応を行うことについて記載する。特記しない限り、以下の実施例は、DLEU遺伝子(第13染色体)およびα-アクチン遺伝子(第1染色体)中の配列を検出するために、表示のアッセイ試薬を用いて行った：
10 mM MOPS緩衝液、ph 7.5
7.5 mM MgCl2
dNTP、各25μM
ゲノムDNA 10 ng
PCRプライマー 各200 nM
1次プローブ 0.5μM
インベーダーオリゴ 0.05μM
FRETプローブ 0.05μM
CLEAVASE酵素(VIIIまたはX) 100 ng
Stoffelまた天然Taq DNAポリメラーゼ 1 u
DLEU用PCRプライマー：
フォワードプライマー1716-14-1(SEQ ID NO：1)：
2008518621.tif 000023
リバースプライマー1716-14-2(SEQ ID NO：2)：
2008518621.tif 000024
α-アクチン用PCRプライマー：
フォワードプライマー1716-14-3(SEQ ID NO：3)：
2008518621.tif 000025
リバースプライマー1716-14-4(SEQ ID NO：4)：
2008518621.tif 000026
プローブ、インベーダーオリゴ、FRETカセット(下線を引いた塩基はフラップ配列を示す；太字の塩基はインベーダーアッセイにおける1位を示す)
α-アクチンプローブ1734-57
2008518621.tif 000027
α-アクチンインベーダーオリゴ1734-57
2008518621.tif 000028
DLEUプローブ
2008518621.tif 000029
DLEUインベーダーオリゴ
2008518621.tif 000030
DLEU FAM FRET 23-428
2008518621.tif 000031
α-アクチン RED FRET
2008518621.tif 000032
【０３２５】
A. 組み合わせPCR-インベーダー反応の構成
場合によっては、例えば、インベーダー反応に好ましくない条件下でPCRを行い、その後インベーダー反応が進行するように反応条件を修正するなどして、PCR反応とインベーダー反応を時間的に分けることが望ましい場合がある。異なる反応条件を作成する1つのそのような手段は、Light Cycler TaqBlock抗体(Roche Applied Sciences)のような、反応で使用する酵素に対する抗体の使用による。別のそのような手段は温度による。本実施例では、PCRプライマーはアニーリング温度＞70℃で設計し、インベーダーアッセイで使用するプローブオリゴヌクレオチドは、プローブがPCRサイクルのアニーリング、伸長、または変性段階で標的分子と反応できないように、約63℃のTmで設計した。さらに、Taq DNAポリメラーゼのStoffel断片および天然Taq DNAポリメラーゼは高温(この場合、99℃で10分)への長期曝露により不活化され得るものの、いくつかのCLEAVASE酵素はこのような処理後に活性を維持すると判断した。特に、CLEAVASE VIIIはそのような加熱に対して非常に安定であるようであり、よって以後、実験ではこれを使用した。
【０３２６】
上記の成分を用いてすべての試薬を最終容量10μlで混合し、ミネラルオイルを重層して反応を行った。PCRは11〜20サイクル(95℃で30秒；72℃で30秒〜2分)行った。これらのサイクリング反応後、混合物を99℃で10分加熱して、Taq DNAポリメラーゼを不活化した。次いで、反応混合物を63℃で30分〜3時間インキュベートして、インベーダー反応を進行させた。
【０３２７】
B. インベーダーアッセイシグナル生成の阻害の評価
最初の結果から、インベーダーアッセイのシグナル生成を制限する阻害が存在するらしいことが示された。種々の反応成分のこの阻害への寄与の可能性を評価するため、以下の実験を行った。
【０３２８】
種々の反応成分の影響を試験するため、部分的反応物を構築した。具体的には、最初の反応設定から種々のインベーダー反応成分を取り除き、DNAポリメラーゼを熱により不活化した後にこれを反応物に添加した。以下の表において、「+」は成分が最初の反応設定中に含まれたことを示し；「-」は、インベーダー反応を進行させるために成分がTaq DNAポリメラーゼの熱変性後に添加されたことを示す。
2008518621.tif 000033
【０３２９】
PCR反応中にFRET混合物を含めたカラム2およびカラム5の結果を、PCR反応を停止してからFRETプローブを添加したカラム1、3〜4、および6の結果と比較すると、インベーダーアッセイで生成されるシグナルがPPI-FRET混合物の存在により阻害されることが示唆される。PCR反応過程においてPPI-FRET混合物の各成分を取り除いた次の実験から(以下を参照されたい)、FRETプローブが阻害性であることが確認される。
2008518621.tif 000034
【０３３０】
この表の最も右側の3つのカラムの試験から、反応の始めからFRETプローブのいずれかまたは両方が存在した(「+」)反応では、それらが取り除かれた反応と比較して、インベーダーアッセイシグナル生成が低かったことが示される。
【０３３１】
Taqポリメラーゼの量を増やすさらなる実験から、Stoffel DNAポリメラーゼを2倍増やすことにより、インベーダーアッセイのシグナル生成が増加することが実証された。これらの実験に基づき、PCR反応過程の伸長時間の延長に加えて、Taq DNAポリメラーゼ濃度の最適化が、この阻害の影響を低減すると判断した。
【０３３２】
C. 組み合わせPCRおよびインベーダーアッセイ反応条件の最適化
組み合わせアッセイにおける種々の反応成分の量および種々の段階の時間を最適化するために、実験を行った。MgCl2濃度は1.7 mM〜7.5 mMの範囲にわたって変更した；dTNP濃度は25〜75 mMの範囲にわたって試験した；プライマー濃度は0.2μM〜0.4μMで変更した。天然Taqポリメラーゼを使用して得られた例示的なデータを以下に示すが、このデータから、FAMシグナルの生成がDLEUインベーダーオリゴの存在に依存すること、およびどちらのインベーダー反応も、PCRを17サイクル行い、次に天然Taq DNAポリメラーゼを変性させるために99℃で10分処理し、次に61℃で30分インベーダー反応を行うことでシグナルを生成することが示される。
2008518621.tif 000035
【０３３３】
D. 組み合わせPCR-インベーダーアッセイの用量反応
一連の開始ゲノムDNA標的の濃度の範囲にわたって組み合わせPCR-インベーダーアッセイにおけるシグナル生成をモニターするために、実験を行った。反応物は以下のように設定した。
2008518621.tif 000036
【０３３４】
インベーダー反応を120分行い、60分後または120分後に結果を読み取った。120分での読み取りによる結果を図7に示す。これらの結果から、組み合わせPCR-インベーダー反応は一連のDNA濃度の範囲で直線状であり、1.5 ngほどのわずかなヒトゲノムDNAを検出するほど十分感度が高いことが示される。
【０３３５】
E. 2重インベーダーアッセイ検出と組み合わせた多重PCR
インベーダーアッセイと組み合わせた多重PCR反応について解析するため、さらなる実験を行った。以下に記載するように20重PCR反応を設定した。PCR CF混合物は、以下の表中のプライマーをそれぞれ1μM濃度で含んだ。ゲノムDNA試料は、以下の表の通りCoriellから入手した。
2008518621.tif 000037
【０３３６】
Coriell試料を以下のように番号づけした(例えば、「C」n)
2008518621.tif 000038
【０３３７】
PCRプライマーは以下から選択した。
2008518621.tif 000039
【０３３８】
PCR反応は、72℃で2.5分の伸長および95℃で45秒の変性の14サイクルで上記の通り行った。混合物を99℃で10分加熱し、次いで63℃で1時間冷却した。結果を図9A〜Bに示す。delF508試料はCoriell #3であり；G85E/621 +1 G>TはCoriell 21であり；1717-1G>AはCoriell 28であり；delF508/R117HはCoriell 30であり；delF508/3849 + 10kbはCoriell 5であり；A455E/delF508はCoriell 8であり、R560T/delF508はCoriell 9であった。これらの結果から、組み合わせPCRおよびインベーダーアッセイ法は多重PCR反応と共に実行可能であることが示される。
【０３３９】
実施例9
4重インベーダーアッセイ法：4色素システム
解析処理量を増大させるさらなる手段は、単一の反応または反応容器において実行および解析し得るインベーダー反応の数を増大させることである。本実施例では、単一反応中に4セットのオリゴヌクレオチドを含める4重インベーダーアッセイの実行について記載する。この場合、反応はまた4つの異なる標的配列：2つの異なるSNPの野生型および変種型を含んだ。4つの異なる遺伝子座、3つの異なる遺伝子座および1つの内部対照などを含む、別の構成もまた意図する。
【０３４０】
多重FRET解析用のインベーダーアッセイ法を構成する上で様々に変更できるものは、FRETプローブに含める色素の選択に関する。色素および消光剤の多くの組み合わせが当技術分野において公知である(例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,925,517号、同第5,691,146号、および同第6,103,476号を参照されたい)。いくつかの態様においては、CLEAVASE酵素の切断活性への干渉が最小限である色素-消光剤の組み合わせを選択することが望ましい。インベーダーアッセイ法と共に使用する場合のそのような色素-消光剤の組み合わせは、より最適な回転率を支持し得る。
【０３４１】
色素の選択に影響する別の考慮事項は、それらのスペクトル特性に関する。例えば蛍光プレートリーダーで検出するアッセイに関するいくつかの態様では、各色素からの蛍光シグナルは装置によりスペクトル的に相互に分離可能であることが好ましい。それらがスペクトル的に十分に異ならない場合には、1つの色素による蛍光出力が別の色素のシグナルを妨げるか、または別の色素のシグナルに「流出して」しまい得る。この「クロストーク」は、アッセイ感度の減少または誤差率の増大をもたらし得る。装置によっては複数のチャネルで検出したシグナルの検出を分離する実質的な能力を有し(例えば、光学フィルターの使用、および/または収集したシグナルのソフトウェア操作による)、そのため色素の種々の組み合わせの選択は、多重反応の検出に使用する装置に関連する。
【０３４２】
蛍光プレートリーダースキャンからの所与の色素の蛍光出力は、以下のようにその濃度に比例する：
2008518621.tif 000040
式中、αはプレートリーダーの励起波長および蛍光波長ならびにゲイン設定で変化する定数であり、bはバックグラウンドである。複数の色素が存在する場合には、以下のように各色素が全蛍光に寄与する。
2008518621.tif 000041
または
2008518621.tif 000042
【０３４３】
複数のスキャンを行う場合、各スキャンからの蛍光は以下のように記載することができる：
2008518621.tif 000043
式中、下付き数字は、各スキャンの蛍光読み取り値、色素係数、およびバックグラウンド成分を表す。この一連の1次方程式は、以下のような行列形式で表記することができる
2008518621.tif 000044
または
2008518621.tif 000045
式中、線形行列Fの要素はバックグラウンドを差し引いた蛍光読み取り値であり、Aは二次元係数行列であり、dはその要素がインベーダーアッセイから放出された各遊離色素の量である一次行列である。F行列およびA行列の要素は、それぞれ異なるスキャンについて純粋な色素およびブランクを使用したある種の較正が存在する場合に決定することができる。したがって、dの解は、式(4)の両側にAの逆数を左からかけることにより見い出すことができる。
【０３４４】
以下のように、4重色素セットについてそのような行列を導き出した。色素-T10オリゴヌクレオチド、すなわち5'末端色素を有する10個のdT残基を含むオリゴを用いて、「遊離色素」の蛍光特性を決定した。インベーダーアッセイからの経時的なシグナル生成を模倣するため、このdT10オリゴを様々な比率で、対応する色素および適切な消光剤を含むFRETプローブと混合した。各dT10および各FRETプローブそれぞれの500 nM作業保存液を作製した。試料全量は15μlであり、各試料にミネラルオイル15μlを重層した。試験した比率は、0％ dT10/100％ FRETプローブ；25％ dT10/75％ FRETプローブ；50％ dT10/50％ FRETプローブ；75％ dT10/25％ FRETプローブ；および100％ dT10/0％ FRETプローブであった。試験した色素は、フルオレセイン(FAM)、Cal-GoldおよびCal-Orange(Biosearch Technologies, Inc.、カリフォルニア州、ナバト)、ならびにREDMOND RED(Synthetic Genetics)であった。Tecan Safire XFLUOR 4で各色素に適切な励起波長および蛍光波長において、チューブの読み取りを行った。いずれの場合にも、各色素から観察される蛍光はdT10オリゴの割合の増加と共に直線的に増加し、シグナルは相加的であった。直線回帰の傾きを、以下のように係数行列に挿入した。
2008518621.tif 000046
【０３４５】
上記のようにA-1を得て、ひいてはそれぞれの場合の遊離色素の割合、dを導くために、各値の逆数をとることで対応する行列を作成した。
【０３４６】
インベーダーアッセイは以下の通り行った。CLEAVASE VIII酵素および5 pM(最終)合成標的を用いて、上記のように15μl最終量で標準的な反応物を設定した。本実施例では4つの異なる合成標的を使用した：SNP1およびSNP2の野生型ならびに変異体。使用したFRETプローブは以下の通りであった：
2008518621.tif 000047
【０３４７】
アッセイ物を63℃でインキュベートし、20分後に表示した波長で蛍光を読み取った。これらの組み合わせ反応の結果を図10に示すが、これにより様々な組み合わせの標的分子の検出が示される。
【０３４８】
実施例10
標的検出のためのインベーダーアッセイ試薬を予め添加したマイクロ流体カード
以下の実施例では、DNA試料を調べるためのインベーダーアッセイ試薬を含むマイクロ流体カードの使用について記載した。本実施例では、標的物質はPCRにより別に調製しておいた。3Mマイクロ流体カードは8つの挿入口を有し、挿入口はそれぞれカードの遠心に際して48の個々の反応チャンバーに液体試薬を供給するよう構成されている。反応チャンバーは、(例えば、以下の実施例11に示すような)1つまたは複数の特定の対立遺伝子を検出するための、予め分注し乾燥させたインベーダーアッセイ試薬成分を含む。これらの試薬は、カードの遠心に際して液体試薬と接触した場合に溶解される。
【０３４９】
多重PCR反応混合物は、以下の成分を用いて調製した(示した濃度は、PCR反応における最終濃度である)：2 ng/uLのゲノムDNA、0.2 uMの多重PCRプライマー混合物、1XのPCR緩衝液 + MgCl2、0.2 mMのdNTP、および0.2 U/rxnの天然Taqポリメラーゼ。最終反応量は20 uLとした。これらの混合物を95℃で2.5分加熱し、次いで30秒95℃の段階、1.5分55℃の段階、および2.5分72℃の段階を20サイクル行った。最後に、ポリメラーゼ活性を破壊するために、試料を99℃で10分インキュベートした。
【０３５０】
PCR後、単位複製配列をdH2Oで1:125希釈し、この試料のうち50 uLを、28 mM MgCl2および4 ng/μlのCLEAVASE X酵素を含む溶液50μlと混合した。次いで、この混合物を前の実施例で記載した3M CFマイクロ流体カードの8つの個々の挿入口の1つに添加した。インベーダーアッセイを63℃で20分行い、アッセイからの蛍光をマイクロプレート蛍光光度計で検出した。結果を図11A〜11Gに示す。ゲノム試料DNAの遺伝子型を各パネルの上部に示し、試験したそれぞれの変異をX軸に沿って示す。
【０３５１】
実施例11
3M CFマイクロ流体カードでのインベーダーおよびPCR
以下の実施例では、DNA試料を調べるためのインベーダーアッセイ試薬を含むマイクロ流体カードの使用について記載した。本実施例では、単一反応において標的物質を増幅し検出する。反応は、上記のように3Mマイクロ流体カードで行った。
【０３５２】
マイクロ流体カードの反応チャンバーは、48の異なるインベーダーアッセイを行うための、カード上で乾燥させたインベーダーアッセイ反応成分(すなわち、インベーダーオリゴヌクレオチド、1次プローブ、およびFRETカセット)を含む。そのようなカードを調製するため、2μlの1X PPIFF-MOPS混合物(10 mM MOPS緩衝液に溶解したそれぞれ0.25μMの1次プローブオリゴヌクレオチド、それぞれ0.125μMのFRETオリゴヌクレオチド、0.025μMインベーダーオリゴヌクレオチド)をマイクロ流体カードのウェルに分注する。次いで、HEPAフィルターをかけた空気を通すエアボックス中でカードを乾燥させる。通常、空気の温度または相対湿度を調節する必要はない。構築したマイクロ流体カード内の各反応チャンバーの容量は約1.7 uLであり、よって反応過程におけるこれらの成分の最終濃度は、1X PPIFF-MOPS混合物の濃度の約1.18倍である。
【０３５３】
インベーダーアッセイオリゴヌクレオチドセットで検出する対立遺伝子変種は、以下の通りであった。
2008518621.tif 000048
【０３５４】
インベーダーアッセイに必要なCLEAVASE VIII酵素と共に、インベーダーアッセイの標的を増幅する多重PCRに必要な物質すべて含むマスターミックスを調製し、8プールに分割した。8プールのうち7プールにゲノムDNAの固有の試料を添加し、残りの試料は鋳型を含まない対照として使用した。これらの8つ混合物のそれぞれ100 uLをカードの各挿入口に添加し、遠心によってカードのウェルに添加した。これらの混合物中の成分の最終濃度は以下の通りであった：7.5 mM MgCl2、6.67 ng/uL Cleavase VIII、.033 U/uL 天然Taq-pol、25 uM dNTP混合物、0.2 uM多重PCRプライマー。
【０３５５】
組み合わせたPCRおよびインベーダーアッセイ反応物を以下のようにインキュベートした：95℃で15秒および75℃で2分15秒の15サイクル、次の天然Taq-pol活性を破壊するための99℃で10分の単一段階、次のインベーダーアッセイ反応のための60℃での1時間。
【０３５６】
インベーダーアッセイからの蛍光シグナルを蛍光マイクロプレートリーダーで検出し、その結果を12A〜12Gに示す(標的なしの対照試料は省略してある)。各ゲノム試料DNAの遺伝子型を各パネルの上部に示し、試験したそれぞれの変異をX軸に沿って示す。
【０３５７】
実施例12
未精製全血試料での直接検出
本実施例では、未精製全血試料における標的配列の直接検出の達成について記載する。特に本実施例では、上記の実施例と同様に、単一反応容器中でPCR増幅とインベーダーアッセイ検出を組み合わせてゲノムDNAを検出することについて記載する。しかし本実施例は、単一反応容器、組み合わせPCR-インベーダー解析の方法を未精製全血試料に適用することで、上記の実施例をさらに拡張する。
【０３５８】
全量20 ulのPCR/インベーダーアッセイ反応混合液を以下のように調製する。緩衝液には、Shimadzu製の0.5X AMPDIRECT-A(5X Amp Addition-1を加えない)または約pH 9の10 mM TAPS生理的緩衝液(3-[[トリス(ヒドロキシメチル)メチル]アミノ]プロパンスルホン酸)のいずれか約4 ulを使用する。
【０３５９】
AMPDIRECT-AよりもむしろTAPS pH 9が、全血での直接的PCRおよびインベーダー検出の緩衝液として機能すると分かることは予想外であったことに留意されたい。また、全血におけるAMPDIRECT-A緩衝液およびPCRのさらなる詳細は、例えば米国特許公報第20020102660号および同第20020142402号、ならびにNishimura et al., Clin. Lab., 2002, 48:377-84、およびNishimura et al., Ann. Clin Biochem, 2000, 37:674-80(これらはすべて、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み入れられる)に見い出すことができる。以下のさらなる試薬を使用する：それぞれ6.25 uMのdNTP、それぞれ0.2 uMのPCRプライマー、Taqポリメラーゼ(天然) 0.3単位、CLEAVASE VIII 40 ng、3 mM MgCl2(AMPDIRECT緩衝液を使用する場合には、この緩衝液中のMgCl2に追加する)、検出する各標的に対する0.5 uM 1次プローブ(例えば、標的ゲノムDNA用および内部対照用)、検出する各対立遺伝子に対する0.05 uMインベーダーオリゴヌクレオチド(SNPを検出する場合、複数の1次プローブと共に使用する)、または検出する各標的に対する0.05 uMインベーダーオリゴヌクレオチド(例えば、内部対照標的に対して可変量の標的を定量する場合に使用する)、それぞれ0.25 uMのFRETプローブ(標的および対照反応用)、および全反応量を20 uLにするための蒸留水。
【０３６０】
まず、試験する液体ヒト全血試料を、クエン酸ナトリウム、EDTA二カリウム、またはヘパリンナトリウムなどの抗凝固剤で処理する。この処理したヒト全血約0.4 ul(またはそれ以下)を、反応チューブの底に混合することなく供することで、PCR/インベーダー反応混合液に添加する。必要に応じてミネラルオイルを重層し得る。次いで、試料に対してPCRを全部で28サイクル行う。PCRは、例えばヒト全血に適した以下の温度プロファイルを用いて行い得る：80℃で15分、次いで94℃で4.5分の予熱処理、次の94℃で30秒、アニーリング温度で1分、72℃で1分の28サイクル、および72℃での7分。
【０３６１】
これらのサイクリング反応後、混合物を99℃で10分加熱して、Taq DNAポリメラーゼを不活化する。次いで、反応混合物を63℃で約30分〜約3時間インキュベートして、インベーダーアッセイ反応を進行させる。インベーダーアッセイによる結果を収集する(例えば、上記の実施例を参照されたい)。本実施例の結果から、全血におけるゲノムDNA中の標的配列のPCR増幅が良好であること、および関心対象の標的配列のインベーダーアッセイ検出が良好であることが示される。関心対象の標的核酸のこの全血からの検出における成功は、緩衝液としてAMPDIRECTを使用しようとTAPS Ph 9を使用しようと可能である。
【０３６２】
組み合わせPCRおよびインベーダーアッセイ法による直接DNA検出はまた、WHATMANに由来するような血液スポットカードを用いて行うことも可能である。上記と類似したPCR-インベーダー反応緩衝液は、以下のように調製し得る：10 mM TAPS pH 9緩衝液、3 mM MgCl2、それぞれ0.2 uMのPCRプライマー、それぞれ6.25 uMのdNTP、検出する各標的に対する0.5 uM 1次プローブ(例えば、標的ゲノムDNA用および内部対照用)、検出する各対立遺伝子に対する0.05 uMインベーダーオリゴヌクレオチド(SNPを検出する場合、複数の1次プローブと共に使用する)、または検出する各標的に対する0.05 uMインベーダーオリゴヌクレオチド(例えば、内部対照標的に対して可変量の標的を定量する場合に使用する)、それぞれ0.25 uMのFRETプローブ(標的および対照反応用)、0.06 ulのTaqPol(天然、5 u/ul)、0.2 ulのCLEAVASE VIII 200 ng/ul、および最終容量を20 ulにするための蒸留水。
【０３６３】
血液をスポットしたWHATMAN FTA Geneカードから、血液を含む1つの1ミリメートルパンチを採取し、カード上の血液を含まない位置から同じ直径の1つの対照パンチを採取する。次いで、ペーパーパンチを水1 ml中で、撹拌するために時々振動させながら約10分洗浄する。
【０３６４】
PCRおよびインベーダーアッセイを上記のように行った。この手順の結果から、全血におけるゲノム中の標的配列のPCR増幅が良好であること、および関心対象の標的配列のインベーダーアッセイ検出が良好であることが示される。
【０３６５】
実施例13
単一の反応チューブ中での逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、および侵入型切断アッセイ反応を含む一段階反応
精製段階も添加段階も介入せずに、単一チューブ内の単一反応において逆転写(RT)によるcDNA合成、PCRによる増幅、およびインベーダーアッセイによる検出の段階を行うことによる、関心対象(例えば、関心対象の遺伝子の発現レベルを検出するため、または病原体核酸の存在を判定するため)の核酸(例えば、RNA)の検出を以下に提供する。
【０３６６】
単一のチューブ内でRT、PCR、およびインベーターアッセイを行う最初の試みは、困難であった。一段階反応が機能する条件を決定するため、複数の反応条件を試験した(例えば表3を参照されたい)。
【０３６７】
RNA鋳型の量および他の反応成分を一定にしつつ、緩衝液中のKCl塩、CLEAVASE酵素、およびMgCl2の最終濃度を変更した。一定にした反応成分は以下の通りである：10 mM MOPS緩衝液、25 uM dNTP、0.5 uMプローブオリゴヌクレオチド、0.05 uMインベーダーオリゴヌクレオチド、0.25 uM FRETオリゴヌクレオチド、0.4 uM RT/PCRプライマーオリゴヌクレオチド、0.5単位/rxn AMV RT酵素、および0.5単位/rxn Taq DNAポリメラーゼ酵素。同様に、温度サイクリング反応条件も、48℃で45分；95℃で5分；95℃で45秒、72℃で2分の2段階を反復して20サイクル；99℃で10分、および63℃で90分で一定にした。以下から分かるように(例えば表3を参照されたい)、最良の反応条件は、0 mM KCl、100 ng CLEAVASE酵素、および7.5 mM MgCl2であるようである。さらに、反応条件をすべて一定にし、RT酵素のみを置換することにより、MMLV由来の逆転写酵素がAMV由来の逆転写酵素(より高いバックグラウンドシグナルを生じる)よりやや効率的で感度のよい反応条件を提供することが判明した。
【０３６８】
したがって数々の試みの後に、一段階反応により、反応が効率的に機能するために重要であることが判明したいくつかの反応条件を用いて、検出可能なシグナルが提供された(例えば表3を参照されたい)。特に、緩衝液組成およびRT酵素の同一性が、一段階反応の効率および感度において役割を担うことが判明した(しかし、より低い効率または感度を所望するまたは必要とする場合には、別の条件を用いることも可能である)。
【０３６９】
（表３）一段階反応条件の最適化
2008518621.tif 000049
【０３７０】
単一チューブ中でRT、PCR、およびインベーダーアッセイを行う試みが成功したところで、標的核酸として精製ウイルスRNAを使用してさらなる最適化を行った。標的RNAを以下のアッセイ成分と混合し、最終反応量15 uLでアッセイした：75単位/rxn MMLV逆転写酵素、0.5単位/rxn Taq DNAポリメラーゼ酵素、100 ng/rxn CLEAVASE VIII酵素、7.5 mM MgCl2、10 mM MOPS緩衝液、0.667μMプローブオリゴヌクレオチド、0.067μMインベーダーオリゴヌクレオチド、1μMフォワードプライマー、1μMリバースプライマー、0.333μM FRETプローブ、および25μM dNTP。アッセイは以下の条件下で行った：42℃で1時間；95℃で5分；95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で2分の3段階を反復して28サイクル；99℃で10分、および63℃で1時間。
【０３７１】
標的RNAを加えない一段階反応を対照として含めた(例えば表4、NTCを参照されたい)。標的RNAの検出を示す(例えば表4、FOZ-フォールドオーバーゼロを参照されたい)。このように、精製段階も添加段階も介入することなく単一チューブ中で行われる、逆転写、PCR、およびインベーダーアッセイによる検出を含む本発明の一段階反応により、試料中の標的RNAを検出する効率的かつ高感度な(例えば、1コピーほどのわずかなウイルスRNAにより＞3 FOZシグナルが得られた、表2)方法が提供される。
【０３７２】
（表４）単一チューブ中でのRT/PCR/インベーダー(商標)
2008518621.tif 000050
【０３７３】
実施例14
多目的オリゴヌクレオチド
多目的オリゴヌクレオチドを、逆転写時のcDNA合成用のプライマー、PCR増幅時の3'(「リバース」)プライマー、およびインベーダーアッセイの侵入型切断反応で使用するためのインベーダーオリゴヌクレオチドとして働くよう構成した。実施例13に記載したように、RT、PCR、およびインベーダーアッセイによる検出は、単一チューブ中で行い得る。
【０３７４】
精製ウイルスRNAを標的核酸として使用した。標的RNAを以下のアッセイ成分と混合し、最終反応量15 uLでアッセイした：75単位/rxn MMLV逆転写酵素、0.5単位/rxn Taq DNAポリメラーゼ酵素、100 ng/rxn CLEAVASE VIII酵素、7.5 mM MgCl2、10 mM MOPS緩衝液、0.667μMプローブオリゴヌクレオチド、1μMフォワードプライマー、1μMリバースプライマー/インベーダーオリゴヌクレオチド、0.333μM FRETプローブ、および25μM dNTP。アッセイは以下の条件下で行った：42℃で1時間；95℃で5分；95℃で30秒、60℃で30秒、72℃で2分の3段階を反復して28サイクル；99℃で10分、および63℃で1時間。
【０３７５】
対照として、標的RNAを含まない試料を含めた(例えば表5、NTCを参照されたい)。比較する目的で、同じ標的RNAを、単一チューブ中にRT、PCR、およびインベーダー用の従来の成分を含む反応において試験した。このアッセイは、同量の上記成分のすべてに加えて、1μMの最終濃度で反応中に含めたインベーダー(商標)オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション部位の下流に位置するさらなるオリゴヌクレオチドからなった。この場合、インベーダーオリゴヌクレオチドは、0.067μMの最終濃度で反応中に存在した。同様にこの場合、インベーダーオリゴヌクレオチドはその3'末端において、RTまたはPCR時の伸長を阻害するミスマッチを含んだ。2つのアッセイを平行して行った(例えば表5および6を参照されたい)。このように、単一のオリゴヌクレオチドをRTのリバースプライマーとして、PCRプライマーとして、および切断構造形成オリゴヌクレオチド(例えば、侵入型切断反応におけるプローブまたはインベーダーオリゴ)として使用することにより、各反応について複数のオリゴヌクレオチドを使用する従来法に代わる、より効率的でかつ感度の高い別法が提供される。
【０３７６】
（表５）多目的RT/3'PCR/インベーダーオリゴヌクレオチド
2008518621.tif 000051
【０３７７】
（表６）従来のRT/PCR/インベーダー
2008518621.tif 000052
【０３７８】
上記明細書において言及した刊行物および特許はすべて、本明細書に明確に記載されたがごとく、参照により本明細書に組み入れられる。本発明記載の方法および系の様々な改変および修正は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかであると思われる。本発明を特定の好ましい態様に関して説明したが、主張される本発明がそのような特定の態様に過度に限定されるべきではないことは理解されるべきである。実際に、当業者にとって明らかである、本発明を実施するための記載様式の様々な改変は、添付の特許請求の範囲の範囲内であることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０３７９】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面および態様をさらに実証するために含めるものである。本明細書に示した特定の態様の説明と併せてこれらの図面の1つまたは複数を参照することにより、本発明をさらに理解することができる。
【図１】インベーダーアッセイ法の態様の概略図を示す。1次反応では、標的分子(斜線を施した長方形)が、侵入プローブ(白い長方形)、ならびに標的特異的領域(白い長方形)および5'フラップ(黒い長方形)を含む1次プローブと重複-フラップ構造を形成する。重複-フラップは構造特異的5'ヌクレアーゼにより切断される。矢印で示した重複-フラップの切断部位は、1次プローブの標的特異的領域の5'末端ヌクレオチドの後に位置する。SNPを同定するには、プローブ間の重複を多型部位(X)の反対側に位置づける。Xヌクレオチドが1次プローブと相補的でない場合、特異的切断は起こらない。2次反応では、切断された5'フラップが、色素(D)および消光剤(Q)で標識されたFRETカセット(灰色線)と重複-フラップ構造を形成する。5'ヌクレアーゼによるFRETカセットの切断により、脱消光色素が遊離する。半円状の矢印は、シグナル増幅に必須であるオリゴヌクレオチド回転過程を示す。2重インベーダーアッセイでは、同様のカスケード(表示していない)が別のSNPヌクレオチドの検出に用いられる。
【図２】PCR 5に関する増幅率の対数lgFのPCRサイクル数nへの依存を示すグラフである。
【図３】図3Aは、PCR 1(●)、PCR 2(○)、PCR 4(■)、およびPCR 5(□)に関する、プライマー濃度cのlgFへの影響を示すグラフである。図3Bは、3Aに示したデータを用いた、ln(2-F0.05)とcとの関係を示すグラフである。
【図４】実施例7に記載した反応における8つのゲノムDNA試料についての正味FAMおよび正味REDインベーダーアッセイシグナルの散布図を示す。
【図５】実施例7に記載した反応における、PCR標的の長さの関数としての、161の成功したインベーダーアッセイの対立遺伝子当たりに標準化した正味RED蛍光シグナルを示す。
【図６】実施例7に記載した反応における8つのDNA試料の正味FAMシグナルおよび正味REDシグナルの散布図を示す。
【図７】実施例8の方法による組み合わせ標的およびシグナル増幅反応の結果を表示するグラフを示す。
【図８】多重PCRに有用なプライマーセットを作製するために実施し得る段階を概説するフローチャートを示す。
【図９】図9Aおよび9Bは、実施例8の方法による組み合わせ多重標的およびシグナル増幅反応の結果を表示するグラフを示す。
【図１０】実施例9に記載した4重インベーダーアッセイの結果を表示するグラフを示す。
【図１１】図11A〜11Gは、マイクロ流体カードにおける、多重PCR増幅した標的DNAのインベーダーアッセイ検出の結果を表示するグラフを示す。
【図１２】図12A〜12Gは、マイクロ流体カードにおける、組み合わせ多重PCRおよびインベーダーアッセイシグナル増幅反応の結果を表示するグラフを示す。
【図１】
2008518621.tif 000053
【図２】
2008518621.tif 000054
【図３】
2008518621.tif 000055
【図４】
2008518621.tif 000056
【図５】
2008518621.tif 000057
【図６】
2008518621.tif 000058
【図７】
2008518621.tif 000059
【図８】
2008518621.tif 000060
【図９Ａ】
2008518621.tif 000061
【図９Ｂ】
2008518621.tif 000062
【図１０】
2008518621.tif 000063
【図１１Ａ】
2008518621.tif 000064
【図１１Ｂ】
2008518621.tif 000065
【図１１Ｃ】
2008518621.tif 000066
【図１１Ｄ】
2008518621.tif 000067
【図１１Ｅ】
2008518621.tif 000068
【図１１Ｆ】
2008518621.tif 000069
【図１１Ｇ】
2008518621.tif 000070
【図１２Ａ】
2008518621.tif 000071
【図１２Ｂ】
2008518621.tif 000072
【図１２Ｃ】
2008518621.tif 000073
【図１２Ｄ】
2008518621.tif 000074
【図１２Ｅ】
2008518621.tif 000075
【図１２Ｆ】
2008518621.tif 000076
【図１２Ｇ】
2008518621.tif 000077
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月24日(2007.8.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008518621000001.app