(57)【要約】【課題】【解決手段】  哺乳類被験体において、肥満症を含む各種疾患及び病態を治療するための、少なくとも1種のY2受容体結合ペプチド、例えば、ペプチドYY(PYY)、神経ペプチドY（NPY）、又は膵臓ペプチド（PP）、及び、ペプチドYYの鼻粘膜輸送を強化するための1種又はそれ以上の粘膜輸送強化剤を含む製薬組成物及び方法が記載される。【選択図】図14
2008501634.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬組成物製品において、
a.  治療に有効な血漿濃度を実現するのに十分な濃度のY2受容体結合化合物の水溶液処方と；
b.  前記溶液のエアロゾルの生成が可能なアクチュエータであって、前記エアロゾルのスプレイパターン楕円比が、アクチュエータ先端から0.5 cmから10 cmの距離で高さについて測定した場合、1.00から1.40であるアクチュエータと；
を具えることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２】
請求項1記載のY2受容体結合化合物が、PYY(3-36)を含むことを特徴とするY2受容体結合化合物。
【請求項３】
請求項2記載の水溶液において、前記PYY(3-36)が、少なくとも200 ug/mLの濃度で存在することを特徴とする水溶液。
【請求項４】
請求項1記載の製品において、前記アクチュエータが、1.00から1.30の楕円比を実現することを特徴とする製品。
【請求項５】
請求項1記載の製品において、1回の作動当たり20から200マイクロリットルのエアロゾルを含むことを特徴とする製品。
【請求項６】
請求項3記載の製品において、前記楕円比が、1.15から1.25であることを特徴とする製品。
【請求項７】
製薬組成物製品において、
a.  Y2受容体結合化合物の水溶液と；
b.  前記溶液のエアロゾルを生成するアクチュエータであって、前記エアロゾルのスプレイパターンの大軸及び小軸が、アクチュエータ先端から0.5 cmから10 cmの距離で高さについて測定した場合、10から50 mmの範囲にあるアクチュエータと；
を具えることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項８】
請求項6記載のY2受容体結合化合物が、PYY(3-36)を含むことを特徴とするY2受容体結合化合物。
【請求項９】
請求項7記載の水溶液において、前記PYY(3-36)が、少なくとも200 ug/mLの濃度で存在することを特徴とする水溶液。
【請求項１０】
請求項7記載の製品において、1回の作動当たり20から200マイクロリットルのエアロゾルを含むことを特徴とする製品。
【請求項１１】
製薬組成物製品において、
a.  治療に有効な血漿濃度を実現するのに十分な濃度のY2受容体結合化合物の水溶液処方と；
b.  前記溶液のエアロゾルを生成するアクチュエータであって、その液滴の10%未満が、10ミクロン未満のサイズであるアクチュエータと；
を具えることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１２】
請求項9記載の製品において、前記液滴の5%未満が、10ミクロン未満のサイズであることを特徴とする製品。
【請求項１３】
請求項9記載の製品において、前記液滴の1%未満が、10ミクロン未満のサイズであることを特徴とする製品。
【請求項１４】
請求項11記載の製品において、1回の作動当たり20から200マイクロリットルのエアロゾルを含むことを特徴とする製品。
【請求項１５】
製薬組成物製品において、
a.  治療に有効な血漿濃度を実現するのに十分な濃度のY2受容体結合化合物の水溶液処方と；
b.  前記溶液のエアロゾルを生成するアクチュエータであって、25から700ミクロンの液滴が生成されるアクチュエータと；
を含む製薬組成物製品。
【請求項１６】
請求項15記載の製品において、1回の作動当たり20から200マイクロリットルのエアロゾルを含むことを特徴とする製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
背景技術
肥満症及びその関連障害は、米国を始め世界中に広がっており、きわめて深刻な公衆衛生問題となっている。上体肥満症は、2型糖尿病で知られているもっとも強力な危険因子であり、循環器病についても強力な危険因子である。肥満症は、高血圧、動脈硬化、うっ血性心不全、脳卒中、胆嚢疾患、変形性関節症、睡眠時無呼吸、多嚢胞性卵巣症候群のような生殖機能障害、乳房、前立腺及び結腸のガン、全身麻酔における合併症発生率の増加等の危険因子であることも認められている。肥満症は、寿命を短縮し、前述の合併病態を招く重大な危険を持つばかりでなく、同様に、様々な障害、例えば、感染症、静脈瘤、黒色表皮症、湿疹、運動不耐性、インスリン耐性、高血圧性高コレステロール血症、胆石症、整形外科的傷害、及び血栓塞栓症を招く危険を抱える。肥満症はまた、インスリン耐性症候群、又は「Xシンドローム」と呼ばれる一群の病態の危険因子でもある。
【０００２】
哺乳動物に対して末梢的に投与されるとY2受容体に結合するある種のペプチドは、体重減少を招くことが示されてされている。Y2受容体結合ペプチドは、Y2受容体に結合する神経ペプチドである。神経ペプチドは、ペプチド作用性神経細胞及び内分泌／パラクリン細胞によって合成される大型の前駆タンパクに由来する小型のペプチドである。脳には、一次遺伝子転写物の選択的スプライシング及び差別的前駆物質処理によって、多様な神経ペプチドが存在する。神経ペプチド受容体は、リガンド間の識別を行い、適当なシグナルを作動する役目を持つ。これらのY2受容体結合性ペプチドは、ペプチドYY(PYY)、神経ペプチドY(NPY)、及び膵臓ペプチド(PP)を含む1群のペプチドに属する。
【０００３】
NPYは、36-アミノ酸ペプチドであり、哺乳類脳で特定されたものの内もっとも豊富な神経ペプチドである。NPYは、中枢及び末梢神経系の両方における重要な制御因子であり、広範な生理的パラメータに影響を及ぼす。そのようなパラメータとしては、精神運動活性に対する作用、食物摂取、中枢性内分泌、及び、循環系における血管活動が挙げられる。冠状、脳、及び腎血管に分布する交感神経には高濃度のNPYが見出され、血管収縮に寄与している。NPY結合部位は、脾臓、小腸膜、脳、動脈平滑筋、腎臓、睾丸、及び胎盤を含む様々な組織で同定されている。
【０００４】
近年、神経ペプチドY(NPY)受容体の薬理学は、膵臓のポリペプチドファミリー内における構造活性関係によって定義されている。このファミリーは、主に神経細胞で合成されるNPY、主に腸の内分泌細胞によって合成されるPYY、及び、主に膵臓の内分泌細胞によって合成されるPPを含む。これらの、約36個のアミノ酸から成るペプチドは、ペプチドの中央に「PPフォールド」を含む緊密な螺旋構造を持つ。特質としては、残基1から残基8までのポリプロリン螺旋、残基9から14までのβターン、残基15から30までのαヘリックス、残基30から36までの外方に突出したC末端、及び、生物活性において極めて重要と思われるカルボキシル末端のアミドが挙げられる。これらのペプチドは、Y1、Y2、Y3、Y4、及びY5という名で知られる、少なくとも5種類の受容体サブタイプを定義するのに使用される。NPYによるY1受容体の認識には、このペプチドのNとCの両末端が関与する。Gln34のPro34による置換はかなり良く受容される。NPYによるY2受容体認識は主に、両性αヘリックスに先行される、ペプチドの4個のC末端残基（Arg33 −;Gln34 −;Arg35 -Tyr36 −;NH2）に依存する。Gln34のPro34による置換はあまり受容されない。Y1とY2を区別する重要な薬理学的性質の一つは、Y2受容体は（Y1受容体はそうではない）、NPYペプチドのカルボキシル末端断片NPY-(13-36)と、PYY断片PYY(22-36)に対して高い親和度を持つという事実である。
【０００５】
ペプチドYY(1-36) [PYY(1-36)] [YPIKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY、配列番号1]は、個人に対し末梢的に注入投与すると、減量を招き、従って、肥満症及び関連疾患を治療するための薬剤として使用が可能であることが示されている（非特許文献1）。その後、この作用を実現するために、Y2受容体に対するPYYの結合、及び、Y2受容体に対するY2作用剤の結合が、炭水化物及びタンパクの摂取量、及び食事量の低下を招くことが見出された（非特許文献2）。PYYの別の分子形は、PYY(3-36) IKPEAPGEDASPEELNRYYASLRHYLNLVTRQRY [配列番号2]である（非特許文献3）。この断片は、ヒト及びイヌの小腸抽出物において全PPY様免疫活性の約40%を構成し、絶食状態における全血漿PYY免疫活性の約36%から、食後の50%をやや上回るレベルまでを占める。この断片は、外見上、PYYの、ジペプチジルペプチダーゼ-IV(DPP4)の分断産物のようである。報告によれば、PYY3-36は、N末端欠失（すなわち、C末端断片の）NPY類縁体を好むという薬理学的に特異な性質を持つ、Y2及びY5受容体の選択的リガンドである。さらに、ただ残基22-36しか持たないPYY断片が依然としてY2受容体に結合することも示されている。ところが、このペプチドのカルボキシル末端のどれかが分断されると、ペプチドはY2受容体に結合する能力を失う。従って、PYY作用因子は、完全長PYYの部分配列を持ち、視床下部の弓状核におけるY2受容体に結合することが可能なペプチドである。以後、PYYという用語は、完全長PYY及び、Y2受容体に結合する、PYYの任意の断片を指す。
【０００６】
PYY及びPYY3-36は、静脈輸液又は静脈注射で投与して、ショック時に見られる生命を脅かす低血圧、特にエンドトキシンによって引き起こされる低血圧（特許文献1）を治療したり、環流、非経口的、静脈内、又は皮下投与、及び移植（特許文献2）によって膵臓腫瘍の増殖を抑えたり、かつ、肥満症を治療する（非特許文献1及び特許文献3）ことが可能であることが知られている。さらに、PYYは、家畜及びヒトにおいて、ナトリウム依存性共同輸送栄養素の消化管吸収を強化することによって前記被験体の体重増加を増すのに有効な量として、非経口的、経口的、鼻腔、直腸、及び局所ルートを通じて投与することが可能であることも主張されている（特許文献4）。しかしながら、肥満症と、糖尿病を含むその関連疾患を治療するためには、静注IV投与に限定されており、PYY3-36の別様投与について最適化された効果的処方は無い。これら従来技術教示のいずれも、粘膜（すなわち、鼻、頬、口内粘膜）輸送を強化するために、賦形剤と組み合わせたPYY又はPYY(3-36)を含む処方を提供したことはないし、或いは、非輸液型投与のための、エンドトキシン非含有のY2受容体結合ペプチド処方を教示してもいない。従って、PYY3-36を投与するための処方及び方法の開発が求められている。
【０００７】
エアロゾル処方の実現は、皮膚表面のみならず、粘膜（鼻、頬、口内、膣、及び直腸粘膜）表面における処方の吸収を強化することが可能である。総覧については非特許文献4を参照されたい。
【０００８】
しかしながら、液滴処方と関連する物理的力は、タンパク及びペプチドを破壊又は変性させることがよくある。例えば、ヒトの組み換えデオキシリボヌクレアーゼ(rhDNアーゼ)は、モノマー含量が有意に減少することから示されるように処理中に実質的に変性される。同様に、アルブミンも処理に影響され、元の材料の86%に比べ、モノマーの僅か50-75%しか保持されない。非特許文献5。
【０００９】
ペプチドホルモン、ヒト成長ホルモン(hGH)処方の、空気／水界面に対する暴露時（ボルテックスによる）の物理的安定性が研究されている。このストレスが、可溶性及び不溶性凝集体の形成に及ぼす作用が調べられている。この凝集体は、サイズ排除HPLC及びUV分光光度測定によってその特性が解明され定量されている。リン酸バッファーに溶解したhGH溶液(0.5 mg/mL)をたった1分ボルテックスしただけで、薬剤の67%は不溶性の凝集体として沈殿した。これらの凝集体の性質は非共有的であった。非特許文献6。
【００１０】
【特許文献１】米国特許第4,839,343号
【特許文献２】米国特許第5,574,010号
【特許文献３】米国特許出願第20020141985号
【特許文献４】米国特許第5,912,227号
【非特許文献１】Morley, J. Neuropsychobiology 21:22-30(1989)
【非特許文献２】Leibowitz, S.F. et al. Peptides, 12:1251-1260(1991)
【非特許文献３】Eberlein, Eysselein et al. Peptides 10:797-803(1989)
【非特許文献４】O’Rirdan TG. Formulations and Nebulizer performance. Respir Care 2002 Nov; 47(11):1305-12; discussion 1312-3
【非特許文献５】Bustami RT, Chan HK, Dehghani F, Foster NR. Generation of micro-particles of proteins for aerosol deliver using high pressure modified carbon dioxide. Pharm Res. 2000 Nov; 17(11):1360-6
【非特許文献６】Katakam M, Bell LN, Banga AK. J Pharm Sci. 1995 Jun; 84(6):713-6
【００１１】
発明の開示
本発明は、Y2受容体結合性ペプチド、例えばPYYの、粘膜、特に、鼻腔粘膜輸送に有効な、新規の方法及び組成物を提供することによって、前述の要求を満たし、かつ新たな目的と利点を満足させる。膵臓ペプチド(PP)及びNPYは、肥満症を治療するために、個人に満腹感を誘発し、個人において減量を促進し、糖尿病を予防又は治療する。本発明のある面では、Y2受容体結合性ペプチドは、Y2受容体作用剤処方のある用量が鼻腔内に投与された場合哺乳動物の血漿において、少なくとも5 pmol、好ましくは少なくとも10 pmolのY2受容体結合性ペプチドの濃度を増加させることが可能となるような処方において鼻腔内に投与される。さらに、好ましい処方では、Y2受容体結合性ペプチドは鼻腔内に投与された場合、血漿におけるY2受容体結合性ペプチドの濃度を10 pmol、好ましくは20 pmol上昇させることが可能と考えられる。150 μgが鼻腔内に投与されると、この好ましい処方は、哺乳動物の血漿におけるY2受容体作用剤の濃度を、血漿1リットル当たり少なくとも40 pmol上昇させることが可能であると考えられる。200 μgのY2受容体結合タンパクが鼻腔内に投与されると、本発明の処方は、Y2受容体結合ペプチドの血漿濃度において、1リットル当たり少なくとも80 pmolの上昇を誘発する。好ましい実施態様では、Y2受容体結合ペプチドの上昇濃度は、Y2受容体結合ペプチドの鼻腔内単回投与後少なくとも30分、好ましくは少なくとも60分、哺乳動物血漿において上昇したままである。
【００１２】
好ましくは、Y2受容体結合ペプチドはPP、PYY、又はNPYペプチドであり、哺乳動物はヒトである。もっとも好ましい実施態様では、Y2受容体結合ペプチドは、PPYペプチド、好ましくはPYY(3-36)であり、哺乳動物はヒトである。
【００１３】
本発明はまた、少なくとも50 μgのY2受容体結合ペプチドを含む用量が哺乳動物に投与された場合、哺乳動物の血漿におけるY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも5 pM上昇させることが可能な、Y2受容体結合ペプチド処方に関する。好ましい実施態様では、Y2受容体結合ペプチドの上昇濃度は、Y2受容体結合ペプチドの鼻腔内単回投与後少なくとも30分、好ましくは少なくとも60分、哺乳動物血漿において上昇を持続する。
【００１４】
本発明はまた、少なくとも100 μgのY2受容体結合ペプチドを含む用量が哺乳動物に投与された場合、哺乳動物の血漿におけるY2受容体結合ペプチドの濃度を少なくとも20 pM上昇させることが可能な、Y2受容体結合ペプチド処方に関する。好ましい実施態様では、Y2受容体結合ペプチドの上昇濃度は、Y2受容体結合ペプチドの鼻腔内単回投与後少なくとも30分、好ましくは少なくとも60分、哺乳動物血漿において上昇を持続する。
【００１５】
本発明はまた、Y2受容体結合ペプチド処方であって、哺乳動物に対し鼻腔内に投与された場合、少なくとも150 μgのY2受容体結合ペプチドを含む用量が投与されると、哺乳動物の血漿において、少なくとも30 pMだけY2受容体結合性ペプチドの濃度を増加させることを可能とする処方に関する。好ましい実施態様では、Y2受容体結合ペプチドの上昇濃度は、Y2受容体結合ペプチドの鼻腔内単回投与後少なくとも30分、好ましくは少なくとも60分、哺乳動物血漿において上昇を持続する。好ましくは哺乳動物はヒトである。
【００１６】
本発明はまた、Y2受容体結合ペプチド処方であって、哺乳動物に対し鼻腔内に投与された場合、少なくとも200 μgを含む用量が投与されると、少なくとも60 pMだけY2受容体結合性ペプチドの濃度を増加させることを可能とする処方に関する。好ましい実施態様では、Y2受容体結合ペプチドの上昇濃度は、Y2受容体結合ペプチドの鼻腔内単回投与後少なくとも30分、好ましくは少なくとも60分、哺乳動物血漿において上昇を持続する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００１７】
本発明はまた、処方を安定させるタンパク又はポリペプチドを実質的に含まないY2受容体作用剤の鼻腔内処方にも向けられる。特に、好ましい処方は、アルブミンのようなタンパクや、ゼラチンのようなコラーゲン由来のタンパクを含まない。
【００１８】
本発明の他の面では、Y2受容体結合ペプチドの経粘膜Y2受容体結合処方は、Y2受容体結合ペプチド、水、及び、pH3-6.5を持つ可溶化剤から成る。好ましい実施態様では、可溶化剤はシクロデキストリンである。
【００１９】
本発明の別の実施態様では、Y2受容体結合ペプチドの経粘膜処方は、Y2受容体結合ペプチド、水、及び、好ましくはシクロデキストランである可溶化剤、及び、少なくとも1種のポリオール、好ましくは2種のポリオールから成る。別の実施態様では、処方は、下記の内の一つ又は全てを含んでもよい。すなわち、キレート剤、界面活性剤、及びバッファー剤である。
【００２０】
本発明の別の実施態様では、処方は、Y2受容体結合ペプチド、水、キレート剤、及び可溶化剤から成る。
【００２１】
本発明の別の実施態様では、処方は、Y2受容体結合ペプチド、水、及び、pH3-6.5を持つキレート剤から成る。
【００２２】
本発明の別の実施態様では、Y2受容体結合ペプチドの経粘膜処方は、Y2受容体結合ペプチド、水、キレート剤、及び、少なくとも1種のポリオール、好ましくは2種のポリオールから成る。さらに新たな実施態様は、下記の内の1種以上を含んでもよい。すなわち、界面活性剤、可溶化剤、及びバッファー剤である。
【００２３】
本発明の別の実施態様では、処方は、Y2受容体結合ペプチド、水、及び、ラクトースとソルビトールのような少なくとも2種のポリオールから成る。処方に加えることが可能な、さらに新たな薬剤としては、キレート剤、1種以上のバッファー剤、及び界面活性剤が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【００２４】
本発明の方法及び組成物によるY2受容体結合ペプチド作用剤の鼻腔内輸送の強化によって、哺乳類被験者における各種疾患及び病態を治療するために、これらの薬剤の製薬学的に効果的な使用が可能となる。
【００２５】
本発明は、ポリペプチド又はタンパクである安定剤を実質的に含まない、液性又は脱水Y2受容体結合ペプチド処方を提供することによってこの要求を満足させる。液性PYY処方は、水、PYY、及び、ポリオール、界面活性剤、可溶化剤、及びキレート剤から成る群から選択される添加剤の内の少なくとも一つから成る。処方のpHは好ましくは3から約7.0、好ましくは4.5から6.0、もっとも好ましくは約5.0±0.03である。
【００２６】
本発明のもう一つの実施態様である、本発明の水性Y2受容体結合処方は、水、Y2受容体結合ペプチド、ポリオール、及び界面活性剤から成り、該処方は、約3.0から約6.5のpHを持ち、タンパク又はポリペプチドである安定剤を実質的に含まない。
【００２７】
本発明のもう一つの実施態様は、水、Y2受容体結合ペプチド、ポリオール、及び可溶化剤から成る水性Y2受容体結合ペプチド処方であり、該処方は、約3.0から約6.5のpHを持ち、タンパク又はポリペプチドである安定剤を実質的に含まない。
【００２８】
本発明のもう一つの実施態様は、水、Y2受容体結合ペプチド、可溶化剤、及び界面活性剤から成る水性Y2受容体結合ペプチド処方であり、該処方は、約3.0から約6.5のpHを持ち、タンパク又はポリペプチドである安定剤を実質的に含まない。
【００２９】
本発明のもう一つの実施態様は、水、Y2受容体結合ペプチド、可溶化剤、ポリオール、及び界面活性剤から成る水性Y2受容体結合ペプチド処方であり、該処方は、約3.0から約6.5のpHを持ち、タンパク又はポリペプチドである安定剤を実質的に含まない。
【００３０】
本発明のもう一つの実施態様では、安定な水性処方は脱水され、Y2受容体結合ペプチドと、ポリオール、界面活性剤、可溶化剤、及びキレート剤から成る群から選択される添加剤の内の少なくとも一つとから成る、脱水Y2受容体結合ペプチド処方を生ずる。ここに、前記脱水Y2受容体結合ペプチド処方は、タンパク又はポリペプチド、例えば、アルブミン、コラーゲン、又は、ゼラチンのようなコラーゲン由来タンパクである安定剤を実質的に含まない。脱水は、各種の手段、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、塩誘発沈殿及び、乾燥、真空乾燥、回転蒸発、又は超臨界CO2沈殿によって実現が可能である。
【００３１】
一つの実施態様では、脱水Y2受容体結合ペプチドは、Y2受容体結合ペプチド、ポリオール、及び可溶化剤から成り、該処方は、タンパクである安定化剤を実質的に含まない。
【００３２】
別の実施態様では、脱水Y2受容体結合ペプチド処方は、Y2受容体結合ペプチド、ポリオール、及び界面活性剤から成り、該Y2受容体結合ペプチド処方は、タンパク又はポリペプチドである安定化剤を実質的に含まない。
【００３３】
別の実施態様では、脱水Y2受容体結合ペプチド処方は、Y2受容体結合ペプチド、界面活性剤、及び可溶化剤から成り、該Y2受容体結合ペプチド処方は、タンパク又はポリペプチドである安定化剤を実質的に含まない。
【００３４】
本発明の別の実施態様では、脱水Y2受容体結合ペプチド処方は、Y2受容体結合ペプチド、ポリオール、界面活性剤、及び可溶化剤から成り、該Y2受容体結合ペプチド処方は、タンパク又はポリペプチドである安定化剤を実質的に含まない。
【００３５】
いずれの可溶化剤でも使用が可能であるが、好ましいのは、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストラン、スルホブチルエーテル-β-シクロデキストラン、メチル-β-シクロデキストリン、及びキトサンから成る群から選択される。
【００３６】
一般に、ポリオールは、ラクトース、ソルビトール、トレハロース、スクロース、マンノース、及びマルトース、及びその誘導体及び類縁体から成る群から選択される。
【００３７】
好適な界面活性剤は、L-α-ホスファチジルコリン・ジデカノイル（DDPC）、ポリソルベート20（Tween 20）、ポリソルベート80（Tween 80）、ポリエチレングリコール(PEG)、セチルアルコール、ポリビニルピロリドン(PVP)、ポリビニルアルコール(PVA)、ラノリンアルコール、及びソルビタンモノオレエートから成る群から選択される。
【００３８】
好ましい処方では、Y2受容体結合ペプチド処方はまた、キレート剤、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)又はエチレングリコールテトラ酢酸(EGTA)を含む。さらに、微生物の増殖を抑制するために、クロロブタノール又は塩化ベンジルコニウムのような防腐剤を添加してもよい。
【００３９】
pHは一般に、クエン酸ナトリウム及びクエン酸、及び酢酸ナトリウム及び酢酸のようなバッファーを用いて調整される。別のバッファーとしては、酢酸と酢酸ナトリウム、又はコハク酸と水酸化ナトリウムが挙げられる。
【００４０】
好ましいY2受容体結合ペプチドは、PYY、PP、又はNPYペプチド、好ましくはPYY(3-36)ペプチドである。
【００４１】
本発明はまた、Y2受容体結合ペプチドの濃度が0.1 −15.0 mg/mL、好ましくは1.0 −2 mg/mLで、水溶液のpHが3.0 −6.5、好ましくは5.0 ± 0.3である処方を含む。
【００４２】
本発明はさらに、ポリオールの濃度が約0.1%と10%(w/v)の間にあり、さらに、ポリオールの濃度は、約0.1%から約3%(w/v)の範囲にあるY2受容体結合ペプチド処方を含む。
【００４３】
本発明はまた、界面活性剤の濃度が約0.00001%と約5%(w/v)の間にあり、さらに、可溶化剤の濃度は、約0.0002%と約0.1%(w/v)の間にある処方を含む。
【００４４】
本発明はまた、可溶化剤の濃度が約1%-10%(w/v)であり、さらに、可溶化剤の濃度は、2%から5%(w/v)である処方を含む。
【００４５】
最終溶液は、従来技術に通常に熟達した当業者に既知の方法を用い、かつ、凍結装置メーカーの指示に従って、ろ過・凍結乾燥し、凍結乾燥してもよい。これによって、タンパクである安定剤を実質的に含まない、脱水Y2受容体結合性ペプチド処方が得られる。
【００４６】
本発明の別の実施態様では、Y2受容体結合ペプチド処方は、Y2受容体結合ペプチド、及び製薬学的に受容可能な担体を含み、Y2受容体結合ペプチド処方は、インビトロ組織透過アッセイにおいて、水、塩化ナトリウム、バッファー、及びY2受容体結合ペプチドから成るコントロール処方よりも、実施例2及び7に示す経上皮電気抵抗アッセイによって定量したように、少なくとも1%、好ましくは3%、もっとも好ましくは少なくとも6%高い浸透率を持つ。好ましい実施態様では、Y2受容体結合処方はさらに、界面活性剤、可溶化剤、ポリオール、及びキレート剤から成る群から選択される、少なくとも一つの賦形剤を含む。好ましくは、Y2受容体結合ペプチドは、PYYペプチド、NPYペプチド、又はPPペプチドである。
【００４７】
本発明の別の実施態様では、Y2受容体結合ペプチド処方であって、100 μgの処方が哺乳動物に対し鼻腔内に投与された場合、哺乳動物の血漿において1リットルの血漿当たり、少なくとも5、好ましくは10、20、40、60、80、又はそれ以上のpmolだけY2受容体結合性ペプチドの濃度を上昇させることを可能とする処方が提供される。
【００４８】
例示の実施態様では、本発明の輸送強化法及び組成物は、哺乳類被験体において肥満症及び摂食障害の予防又は治療のために、Y2受容体結合ペプチド作用剤の治療に有効な粘膜輸送を実現する。本発明の一つの面では、治療的有効量のY2受容体結合ペプチド、及び本明細書に記載される1種以上の鼻腔内輸送強化剤を含む製薬処方が提供される。この処方は、哺乳類被験体において肥満症又は摂食障害の発端又は進行を阻止するための本発明の鼻粘膜輸送法において有効である。治療的有効量のY2受容体結合ペプチド作用剤と、1種以上の鼻腔内輸送強化剤の鼻粘膜輸送は、被験体においてY2受容体結合ペプチド作用剤の治療レベルの上昇をもたらし、該哺乳類被験体の食物摂取を抑制し、肥満症又は摂食障害の症状を軽減する。
【００４９】
本発明の輸送強化法及び組成物は、哺乳類被験体において各種疾患及び病態の予防又は治療のために、Y2受容体結合ペプチドの治療的に有効な粘膜輸送を実現する。Y2受容体結合ペプチドは、様々な投与ルートを通じて、例えば、Y2受容体結合ペプチドを、鼻粘膜上皮、気管支又は肺粘膜上皮、口内頬上皮、又は口内及び小腸粘膜面に接触させることによって投与することが可能である。例示の実施態様では、方法及び組成物は、鼻腔輸送（例えば、鼻内粘膜輸送、又は鼻腔内粘膜輸送）のために向けられる、又は処方される。
【００５０】
本発明の一つの面では、治療的有効量のY2受容体結合ペプチド作用剤、及び本明細書に記載される1種以上の鼻腔内輸送強化剤を含む鼻腔内投与に好適な製薬処方が提供される。この処方は、哺乳類被験体において肥満症、糖尿病、ガン、又は、ガンに関連する栄養不良又は消耗の発端又は進行を阻止し、或いは、肥満症について臨床的によく知られる1種以上の症状を緩和する外に、アルツハイマー病、結腸ガン、結腸腺ガン、膵臓ガン、膵臓腺ガン、乳ガンを治療する本発明の鼻粘膜輸送法において有効である。
【００５１】
本発明の別の面では、製薬処方と方法は、ビタミンEコハク酸と組み合わせたY2受容体結合ペプチド作用剤の投与に向けられる。ビタミンEコハク酸と組み合わせたY2受容体結合ペプチド作用剤は、ガン、例えば、結腸腺ガン、膵臓腺ガン、又は乳ガンの症状の緩和、発端の予防、又はその発生頻度又は重度の低減のために投与されてもよい。
【００５２】
本発明の別の面で、驚くべきことに、エンドトキシン非含有のY2受容体結合ペプチド、例えばPYY(3-36)を用いることによって、エンドトキシンが除去されていないペプチドに比べて、粘膜輸送が増加することが見出された。製薬処方におけるエンドトキシン非含有Y2受容体ペプチドの使用は、非輸液ルート、粘膜輸送、鼻粘膜、口腔粘膜、肺粘膜、膣粘膜、直腸粘膜等を含む粘膜輸送を含む非輸液ルートを通じて投与することにより可能となる。
【００５３】
本発明の、前記のY2受容体結合ペプチド粘膜処方及び調製・輸送法は、哺乳類被験体に対するY2受容体結合ペプチドの粘膜輸送の改善を実現する。これらの組成物及び方法は、1種以上のY2受容体結合ペプチドと、1種以上の粘膜輸送強化剤との結合処方、又は共同投与を含んでもよい。これらの処方及び方法を実現するために選択される輸送強化剤の中には、(A)可溶化剤、(B)荷電修飾剤、(C)pH調節剤、(D)分解酵素阻害剤、(E)粘膜分解又は粘液除去剤、（F）繊毛運動阻止剤、(G)膜透過強化剤（すなわち、(i)界面活性剤、(ii)胆汁塩、(iii)リン脂質又は脂肪酸添加物、混合ミセル、リポソーム、又は担体、(iv)アルコール、(v)エナミン、(vi)NO供与化合物、(vii)両性長鎖分子、(viii)低分子疎水性浸透強化剤、(ix)ナトリウム又はサリチル酸誘導体、(x)アセト酢酸のグリセロールエステル、(xi)シクロデキストリン、又はベータ-シクロデキストリン誘導体、(xii)中等長鎖脂肪酸、(xiii)キレート剤、(xiv)アミノ酸又はその塩、(xv)N-アセチルアミノ酸又はその塩、(xvi)選ばれた膜成分に対して分解性の酵素、(xvii)脂肪酸合成阻害剤、(xviii)コレステロール合成阻害剤、(xix)(i)-(xviii)の膜浸透強化剤から選択される任意の組み合わせ、(H)上皮接合生理の修飾剤、例えば、酸化窒素(NO)刺激剤、キトサン、及びキトサン誘導体、(I)血管拡張剤、(J)選択的輸送強化剤、及び(K)安定化輸送媒体、担体、支持体、又は、複合体形成分子であって、Y2受容体結合ペプチド（単数又は複数）と効果的に混合、連結、含有、封入、又は結合して、粘膜輸送を強化する活性剤を安定化する、複合体形成分子種がある。
【００５４】
本発明の種々の実施態様において、Y2受容体結合ペプチドは、上の(A)-(K)に挙げた粘膜輸送強化剤の内の1、2、3、4種以上と組み合わされる。これらの粘膜輸送強化剤は、Y2受容体結合ペプチドに単独で添加、又は、共に混合されるか、或いは、その他のやり方で製薬学的に受容可能な処方又は輸送媒体においてY2受容体結合ペプチドと混合される。Y2受容体結合ペプチドと、1種以上の、本明細書の教示による粘膜輸送強化剤（選択的に、上の(A)-(K)から選択される2種以上の粘膜輸送強化剤による任意の組み合わせを含む）とによる処方は、該処方の、哺乳類被験体の粘膜表面に対する輸送後において、そのY2受容体結合ペプチドのバイオアベイラビリティの増加をもたらす。
【００５５】
従って、本発明は、哺乳動物において、食欲を抑え、減量を促進し、食物摂取を減らし、或いは、肥満症及び／又は糖尿病を治療するための方法であって、Y2受容体結合ペプチドを含む処方を経粘膜的に投与することを含み、そうすることによって、50 μgのY2受容体を該哺乳動物に経粘膜的に投与した場合、哺乳動物の血漿におけるY2受容体結合ペプチドの濃度を、血漿1リットル当たり、少なくとも5 pmol、好ましくは少なくとも10 pmolだけ上昇させることを含む方法である。このような処方の例は前述した。
【００５６】
本発明はさらに、哺乳動物において、食欲を抑え、減量を促進し、食物摂取を下げ、又は肥満を治療するためにY2受容体結合ペプチドを経粘膜的に投与し、そうすることによって、50 μgのY2受容体を該哺乳動物に経粘膜的に投与した場合、哺乳動物の血漿におけるY2受容体結合ペプチドの濃度を、血漿1リットル当たり、少なくとも5 pmolだけ上昇させるための薬剤生産へ向けてのY2受容体結合ペプチドの用法を提供する。100 μgのY2受容体結合ペプチドを哺乳動物に経鼻腔的に投与した場合、Y2受容体結合ペプチドの濃度は、哺乳動物の血漿1リットル当たり、少なくとも20 pmolだけ上昇する。150 μgを鼻腔内に投与した場合、哺乳動物の血漿のY2受容体結合ペプチドの濃度は、少なくとも30 pM上昇する。200 μgを鼻腔内に投与した場合、哺乳動物の血漿のY2受容体結合ペプチドの濃度は、少なくとも60 pM上昇する。好ましい実施態様では、Y2受容体結合ペプチドの上昇濃度は、Y2受容体結合ペプチドの鼻腔内単回投与後少なくとも30分、好ましくは少なくとも60分、哺乳動物血漿において上昇を持続する。好ましくは哺乳動物はヒトである。
【００５７】
本発明の製薬処方におけるペプチドYYの粘膜的に有効な量は、例えば、kg体重当たり約0.001 pmolから約100 pmol、kg体重当たり約0.01 pmolから約10 pmol、kg体重当たり約0.1 pmolから約5 pmolを含む。さらに例示の実施態様では、ペプチドYYの用量は、kg体重当たり約0.5 pmolから約1 pmolを含む。好ましい実施態様では、鼻腔内用量は、50 μgから400μg、好ましくは100 μgから150μg、もっとも好ましくは約100 μgから150μgの範囲を持つ。本発明の製薬処方は、1日に1回以上(例えば、食前)、又は1週に3回、又は、1週に1回、期間は、1週から少なくとも96週間、或いは、患者又は被験体の生涯に渡って投与されてもよい。ある実施態様では、本発明の製薬処方は、1日当たり1回以上、2回、4回、6回、又は、8回投与される。
【００５８】
ペプチドYYの、鼻粘膜面への輸送を強化する鼻腔内輸送強化剤が用いられる。受動的に吸収される薬剤の場合、薬剤輸送にたいする細胞周辺性及び経細胞性通路の相対的寄与は、pKa、分配系数、分子半径と薬剤の荷電、薬剤が輸送される腔環境のpH、及び、吸収表面面積に依存する。本発明の鼻腔内輸送強化剤はpH調節剤である。本発明の製薬処方のpHは、薬剤輸送に対する細胞周辺性及び経細胞性通路によるペプチドYYの吸収に影響を及ぼす因子である。一つの実施態様では、本発明の製薬処方は、約pH3.0から6.5に調節される。さらに別の実施態様では、本発明の製薬処方は、約pH3.0から5.0に調節される。さらに別の実施態様では、本発明の製薬処方は、約pH4.0から5.0に調節される。一般的に、pHは5.0±0.3である。
【００５９】
本発明はまた、水性処方から、Y2受容体結合化合物、PYY(3-36)を見事に噴霧化する驚くべき能力についても記載する。
【００６０】
発明を実施するための最良の形態
前述のように、本発明は、各種疾患及び病態の治療又は予防のために哺乳類被験体に投与されるY2受容体結合ペプチドの粘膜輸送用の改良法及び組成物を提供する。本発明の方法による治療及び予防のための適当な哺乳類被験体の例としては、ヒト及び非ヒト霊長類、家畜種、例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、及びヤギのような家畜種、実験及び家庭内動物種であって、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、及びウサギを含む動物種が挙げられる。
【００６１】
本発明をさらによく理解してもらうために、下記の定義を示す。
【００６２】
Y2受容体結合ペプチド
本発明の粘膜処方に使用されるY2受容体結合ペプチドは、膵臓ポリペプチドファミリーを含む。本明細書で用いられる膵臓ポリペプチドファミリーは、3種の天然の生体活性ペプチドファミリー、PP、NPY、及びPYYを含む。Y2受容体結合ペプチド、及びそれらの用法の例は、米国特許第5,026,685号、米国特許第5,574,010号、米国特許第5,604,203号、米国特許第5,696,093号、米国特許第6,046,167号、Gehlert et al., Proc. Soc Exp Biol Med 218:7-22(1998); Sheikh et al., Am J Physiol, 261:701-15(1991); Fourier et al., Mol Pharmacol 45:93-101(1994); Kirby et al., J Med Chem 38:4579-4586(1995); Rist et al., Eur J Biochem 247:1019-1028(1997); Kirby et al., J Med Chem 36:3802-3808(1993); Grundemar et al., Regulatory Peptides 62:131-136(1996)、米国特許第5,696,093号(PYY作用剤の例)、米国特許第6,046,167号に記載される。本発明によれば、Y2受容体結合ペプチドは、遊離塩基、酸添加塩基、又は、金属塩、例えば、カリウム又はナトリウム塩、或いは、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化と環化（米国特許第6,093,692号、及び米国特許第6,225,445号）、及び、PEG化のような過程によって修飾された、Y2受容体結合ペプチドを含む。
【００６３】
ペプチドYY作用剤
本明細書で用いられる”PYY”は、PYY(1-36)であって、元の配列又は変異形のPYY(1-36)を始め、その誘導体、断片、及び、天然のものであれ、合成であれ、組み換え体であれ、任意の起源に由来するPYYの類縁体を指す。このPYYは、PYY配列の、少なくとも最後の15個のアミノ酸残基、PYY(22-36)（配列番号3）又はその類縁体を含んでいなければならない。使用が可能なその他のPYYペプチドは、PYY(1-36)（配列番号1）、PYY(3-36)(配列番号2)、PYY(4-36)(配列番号4)、PYY(5-36)(配列番号5)、PYY(6-36)(配列番号6)、PYY(7-36)（配列番号7）、PYY(8-36)(配列番号8)、PYY(9-36)（配列番号9）、PYY(10-36)(配列番号10)、PYY(11-36)(配列番号11)、PYY(12-36)(配列番号12)、PYY(13-36)(配列番号13)、PYY(14-36)(配列番号14)、PYY(15-36)(配列番号15)、PYY(16-36)(配列番号16)、PYY(17-36)(配列番号17)、PYY(18-36)(配列番号18)、 PYY(19-36)(配列番号19)、PYY(20-36)(配列番号20)、及びPYY(21-36)（配列番号21）である。通常、これらのペプチドは、脳及びその他の部分のY受容体、特にY2及び／又はY5受容体に結合する。通常、これらのペプチドは、エンドトキシン非含有、又は、発熱物質非含有形として合成されるが、ただしこれは必ずしも必要ではない。
【００６４】
他のPYYペプチドとしては、アミノ酸残基の保存的変化が形成されるPYYペプチド、例えば、PYYペプチドの部位特異的突然変異であって、下記を含むものが挙げられる。すなわち、[Asp15]PYY(15-36)(配列番号90)、[Thr13]PYY(13-36)(配列番号91)、 [Val12]PYY(12-36)(配列番号92)、[Glu11]PYY(11-36)(配列番号93)、[Asp10]PYY(10-36)(配列番号94)、[Val7]PYY(7-36)(配列番号95)、[Asp6]PYY(6-36)(配列番号96)、[Gln4]PYY(4-36)(配列番号97)、[Arg4]PYY(4-36)（配列番号98）、[Asn4]PYY(4-36)(配列番号99)、[Val3]PYY(3-36)(配列番号100)、及び[Leu3]PYY(3-36)(配列番号101)である。その他のPYYペプチドとしては、少なくとも2個のアミノ酸残基保存変化が形成されるペプチドであって、下記を含むものが挙げられる。[Asp10, Asp15]PYY(10-36)（配列番号102）、[Asp6, Thr13]PYY(6-36)（配列番号103）、[Asn4, Asp15]PYY(4-36)（配列番号104）、及び[Leu3, Asp10]PYY(3-36)(配列番号105)である。さらに、PYYの類縁体であって、例えば、米国特許第5,604,203号と5,574,010号、Balasubramaniam et al., Peptide Research 1:32(1988)、日本特許出願第2,225,497号(1990)；Balasubramaniam, et al., Peptides 14:1011, 1993; Grandt, et al., Reg. Peptides 51:151, (1994); PCT国際出願第94/03380号、米国特許第5,604,203及び5,574,010号に開示されるものが挙げられる。これらのペプチドは、脳及びその他の部分のY受容体、特にY2及び／又はY5受容体に結合する。通常、これらのペプチドは、エンドトキシン非含有、又は、発熱物質非含有形として合成されるが、ただしこれは必ずしも必要ではない。
【００６５】
PYY作用剤としては、ラットのPYY（配列番号72）、及び、ヒトに対応するアミノ末端欠失形であるブタPYY（配列番号73）、ヒト及びモルモットPYY（配列番号74）に対応するアミノ末端欠失形であるモルモット、及び、ヒトに対応するアミノ末端欠失形が挙げられる。
【００６６】
本発明によれば、PYYペプチドは、遊離塩基、酸添加塩基、又は、金属塩、例えば、ペプチドのカリウム又はナトリウム塩、及び、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、環化、及び、その他既知の共有的修飾法のような過程によって修飾されたPYYペプチドを含む。通常、これらのペプチドは、脳及びその他の部分のY受容体、特にY2及び／又はY5受容体に結合する。通常、これらのペプチドは、エンドトキシン非含有、又は、発熱物質非含有形として合成されるが、ただしこれは必ずしも必要ではない。
【００６７】
神経ペプチドY作用剤
NPYは、もう一つのY2受容体結合ペプチドである。NPYペプチドは、完全長NPY(1-36)（配列番号22）の外に、アミノ末端で切り詰められたNPY(1-36)の断片も含む。Y2受容体に結合するのに有効であるためには、NPY作用剤は、カルボキシル末端の最後の少なくとも11個のアミノ酸残基、すなわち、NPY(26-36)（配列番号23）を持っていなければならない。Y2受容体に結合するNPY作用剤の他の例としては下記のものがある。すなわち、NPY(3-36)(配列番号24)、NPY(4-36)(配列番号25)、NPY(5-36) (配列番号26)、NPY(6-36)（配列番号27）、NPY(7-36)(配列番号28)、NPY(8-36)(配列番号29)、NPY(9-36)(配列番号30)、NPY(10-36)(配列番号31)、NPY(11-36)(配列番号32)、NPY(12-36)(配列番号33)、NPY(13-36)(配列番号34)、NPY(14-36)(配列番号35)、NPY(15-36)(配列番号36)、NPY(16-36)(配列番号37)、NPY(17-36)(配列番号38)、NPY(18-36)(配列番号39)、NPY(19-36)(配列番号40)、NPY(20-36)(配列番号41)、 NPY(21-36)(配列番号42)、NPY(22-36)（配列番号43）、NPY(23-36)(配列番号44)、NPY(24-36)（配列番号45）、及びNPY(25-36)(配列番号46)である。
【００６８】
その他のNPY作用剤としては、ラットNPY(配列番号75)、及びヒトの形態の場合と同じくNPY(3-36)からNPY(26-36)までのアミノ末端欠失形、ウサギNPY（配列番号76）、及びヒトの形態の場合と同じくNPY(3-36)からNPY(26-36)までのアミノ末端欠失形、イヌNPY（配列番号77）、及びヒトの形態の場合と同じくNPY(3-36)からNPY(26-36)までのアミノ末端欠失形、ブタNPY（配列番号78）、及びヒトの形態の場合と同じくNPY(3-36)からNPY(26-36)までのアミノ末端欠失形、ウシNPY（配列番号79）、及びヒトの形態の場合と同じくNPY(3-36)からNPY(26-36)までのアミノ末端欠失形、ヒツジNPY（配列番号80）、及びヒトの形態の場合と同じくNPY(3-36)からNPY(26-36)までのアミノ末端欠失形、及び、モルモット（配列番号81）、及びヒトの形態の場合と同じくNPY(3-36)からNPY(26-36)までのアミノ末端欠失形が挙げられる。
【００６９】
本発明によれば、NPYペプチドは、遊離塩基、酸添加塩基、又は、金属塩、例えば、ペプチドのカリウム又はナトリウム塩、及び、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、環化、及び、その他既知の共有的修飾法のような過程によって修飾されたNPYペプチドを含む。通常、これらのペプチドは、脳及びその他の部分のY受容体、特にY2及び／又はY5受容体に結合する。通常、これらのペプチドは、エンドトキシン非含有、又は、発熱物質非含有形として合成されるが、ただしこれは必ずしも必要ではない。
【００７０】
膵臓ペプチド
膵臓ペプチド(PP)及びPP作用剤もY2受容体に結合する。PPペプチドは、完全長PP(1-36)（配列番号47）の外に、アミノ末端で切り詰められたいくつかのPPの断片も含む。Y2受容体に結合するためには、PP作用剤は、カルボキシル末端の最後の少なくとも11個のアミノ酸残基、すなわち、PP(26-36)（配列番号48）を持っていなければならない。Y2受容体に結合するPP作用剤の他の例としては下記のものがある。すなわち、PP(3-36)(配列番号49)、PP(4-36)(配列番号50)、PP(5-36) (配列番号51)、PP(6-36)（配列番号52）、PP(7-36)(配列番号53)、PP(8-36)(配列番号54)、PP(9-36)(配列番号55)、PP(10-36)(配列番号56)、PP(11-36)(配列番号57)、PP(12-36)(配列番号58)、PP(13-36)(配列番号59)、PP(14-36)(配列番号60)、PP(15-36)(配列番号61)、PP(16-36)(配列番号62)、PP(17-36)(配列番号63)、PP(18-36)(配列番号64)、PP(19-36)(配列番号65)、PP(20-36)(配列番号66)、 PP(21-36)(配列番号67)、PP(22-36)（配列番号68）、PP(23-36)(配列番号69)、PP(24-36)（配列番号70）、及びPP(25-36)(配列番号71)である。
【００７１】
その他のPP作用剤としては、ヒツジPP（配列番号82）、及びヒトの形態の場合と同じくPP(3-36)からPP(26-36)までのアミノ末端欠失形、ブタPP（配列番号83）、及びヒトの形態の場合と同じくPP(3-36)からPP(26-36)までのアミノ末端欠失形、イヌPP（配列番号84）、及びヒトの形態の場合と同じくPP(3-36)からPP(26-36)までのアミノ末端欠失形、ネコPP（配列番号85）、及びヒトの形態の場合と同じくPP(3-36)からPP(26-36)までのアミノ末端欠失形、ウシPP（配列番号86）、及びヒトの形態の場合と同じくPP(3-36)からPP(26-36)までのアミノ末端欠失形、ラットPP(配列番号87)、及びヒトの形態の場合と同じくPP(3-36)からPP(26-36)までのアミノ末端欠失形、マウスPP(配列番号88)、及びヒトの形態の場合と同じくPP(3-36)からPP(26-36)までのアミノ末端欠失形、及びモルモットPP（配列番号89）が挙げられる。
【００７２】
本発明によれば、PPペプチドはまた、遊離塩基、酸添加塩基、又は、金属塩、例えば、ペプチドのカリウム又はナトリウム塩、及び、アミド化、グリコシル化、アシル化、硫酸化、リン酸化、アセチル化、環化、及び、その他既知の共有的修飾法のような過程によって修飾されるPPペプチドを含む。通常、これらのペプチドは、脳及びその他の部分のY受容体、特にY2及び／又はY5受容体に結合する。通常、これらのペプチドは、エンドトキシン非含有、又は、発熱物質非含有形として合成されるが、ただしこれは必ずしも必要ではない。
【００７３】
粘膜輸送強化剤
「粘膜輸送強化剤」は、水、塩、及び／又は一般的バッファー、及びY2受容体結合ペプチドを含む処方（コントロール処方）に加えた場合、血液、血清、又は脳脊髄液最大濃度（Cmax）によって、或いは、濃度対時間プロットにおいて曲線下面積（AUC）によって測定される、粘膜を横切るY2受容体結合ペプチドの輸送において有意な増加をもたらす処方を生成する化学薬品及びその他の賦形剤である。粘膜としては、鼻粘膜、口内粘膜、小腸粘膜、頬内粘膜、気管支肺粘膜、膣粘膜、及び直腸粘膜面を含み、事実上、外部と交通する、全身の体腔又は管路を被う全ての粘液分泌膜を含む。粘膜輸送強化剤は時に担体と呼ばれることがある。
【００７４】
エンドトキシン非含有処方
「エンドトキシン非含有処方」とは、Y2受容体結合ペプチド、及び、エンドトキシン及び／又は関連発熱物質を実質的に含まない、1種以上の粘膜輸送強化剤とを含む処方を意味する。エンドトキシンとは、微生物の内部に限局しており、その微生物が破壊、又は死亡した場合にのみ放出される毒素を含む。発熱物質としては、細菌及びその他の微生物から得られる、発熱性、熱安定性物質（糖タンパク）が挙げられる。これらの物質は、ヒトに投与されると、熱、低血圧、及びショックを引き起こす。エンドトキシン非含有の処方を製造することは、特別の装置、熟練した職人を必要とし、エンドトキシン非含有ではない処方を製造するよりもはるかに高価となる可能性がある。
【００７５】
げっ歯類において、エンドトキシンの輸液と同時にNPY又はPYYを静注投与すると、エンドトキシン単独の投与に関連する低血圧、さらには死亡さえも阻止することが示されているので（米国特許第4,839,343号）、これらの治療剤においてエンドトキシン非含有処方の製造は、経口（非注入型）投与では必要とされないと思われる。
【００７６】
非輸液投与
「非輸液投与」とは、動脈又は静脈への直接的注入、すなわち、（通常は流体を）何かの中に強制的に押し込む、侵入させる、特に、生体部分に、針、注射器、又はその他の侵襲的方法を用いて導入する方法を含まない任意の輸送法を意味する。非輸液投与としては、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、及び、注入によらない粘膜に対する輸送法が挙げられる。
【００７７】
肥満症の治療と予防
前述のように、本発明は、哺乳類被験体において肥満症を予防及び治療するためにY2受容体結合ペプチドを鼻粘膜輸送するための、有用な改良法及び組成物を提供する。本明細書で用いる場合、肥満症の予防と治療とは、投与時において食事中の食物摂取を低減し、及び／又は体重を減少し、或いは、減量後体重増加が起こる前に低減体重を維持することによって、臨床的肥満の発端の予防、又はその発生又は重度を下げることを意味する。
【００７８】
本発明は、哺乳類被験体における肥満症を予防し治療するために、脳の領域、例えば、視床下部、又はプロオピオメラノコルチン（POMC）及びNPY弓状核神経細胞へ向けて、Y2受容体結合ペプチドの鼻粘膜輸送を実現するために有用な改良法及び組成物を提供する。Y2受容体結合ペプチドはまた、ジヒドロピリジンのようなY1受容体拮抗剤と共に投与してもよい。
【００７９】
輸送法及び輸送組成物
哺乳類被験体に対するY2受容体結合ペプチドの粘膜投与のための改良法及び組成物は、Y2受容体結合ペプチド投与スケジュールを最適化する。本発明は、1種以上の粘膜輸送強化剤と共に処方されるY2受容体結合ペプチドであって、その用量放出は、実質的に正規化され、粘膜投与後、約0.1から2.0時間、0.4から1.5時間、0.7から1.5時間、又は0.8から1.0時間の範囲においてY2受容体結合ペプチド放出の有効輸送期間に渡って維持される。実現されるY2受容体結合ペプチドの持続放出は、本発明の方法及び組成物を利用する外来性のY2受容体結合ペプチドの反復性投与によって促進される。
【００８０】
持続放出組成物及び方法
哺乳類被験体に対するY2受容体結合ペプチドの粘膜投与のための改良組成物及び方法は、Y2受容体結合ペプチド投与スケジュールを最適化する。本発明は、1種以上の粘膜輸送強化剤と任意に選択される持続放出強化剤（単複）を組み合わせた、Y2受容体結合ペプチドを含む処方の、改良型粘膜（例えば、鼻粘膜）輸送を提供する。本発明の粘膜輸送強化剤は、輸送の効果的増加、例えば、最大血漿濃度(Cmax)の増加をもたらし、経粘膜的に投与されたY2受容体結合ペプチドの治療活性を強化する。血漿及びCNSにおけるY2受容体結合ペプチドの治療活性に影響を及ぼすもう一つの要因は、滞在時間(RT)である。鼻腔内輸送強化剤と組み合わせた持続放出強化剤は、Y2受容体結合ペプチドのCmaxを増し、滞在時間(RT)を延ばす。ポリマー性輸送媒体及びその他の薬剤、及び、持続放出強化処方、例えば、ポリエチレングリコール(PEG)を生成する本発明の方法が、本明細書に記載される。本発明は、哺乳類被験体における肥満症、結腸ガン、膵臓ガン、又は乳ガンに関連する症状を治療するための、Y2受容体結合ペプチド輸送の改良法及び用量を提供する。
【００８１】
本発明の粘膜輸送処方及び方法においては、Y2受容体結合ペプチドは、多くの場合、粘膜輸送のために適当な担体又は媒体と混合、又は共同投与される。本明細書で用いる「担体」という用語は、製薬学的に受容可能な固体又は液体の充填剤、希釈剤、又は封入剤を意味する。含水液体担体は、製薬学的に受容可能な添加剤、例えば、酸化剤、アルカリ化剤、抗菌性防腐剤、抗酸化剤、バッファー剤、キレート剤、複合化剤、可溶化剤、保湿剤、溶媒、懸濁剤及び／又は増粘剤、浸透圧剤、湿潤剤、又は、その他の生体適合性物質を含んでもよい。前述のカテゴリーに分けて列挙された成分表をU.S. Pharmacopoeia National Formulary, 1857-1859, (1990)に見出すことができる。製薬学的に受容可能な担体として使用が可能な物質についていくつか例を挙げるとすると、糖類、例えば、ラクトース、グルコース、及びスクロース；でん粉類、例えば、コーンスターチ及びじゃがいもスターチ；セルロース及びその誘導体、例えば、ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、及び酢酸セルロース；粉末状トラガカント；モルト；ゼラチン；タルク；賦形剤、例えば、ココアバター及び坐剤ワックス；油類、例えば、ピーナツ油、綿実油、紅花油、胡麻油、オリーブ油、コーン油、及び大豆油；グリコール類、例えば、プロピレングリコール；ポリオール類、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール；エステル類、例えば、オレイン酸エチル、及びラウリル酸エチル；寒天；バッファー剤、例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム；アルギン酸；発熱物質非含有水；等張生食液；リンゲル液、エチルアルコール、及びリン酸バッファー液、及び、製薬処方に用いられるその他の非毒性適合物質がある。湿潤剤、乳化剤、及び、潤滑剤、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウムの外に、着色剤、剥離剤、コート剤、甘味料、芳香剤及び香料、防腐剤、及び抗酸化剤も、処方者の要求に応じて組成物の中にあってもよい。製薬学的に受容可能な抗酸化剤の例としては、水溶性抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸、システイン塩酸、亜硫酸水素ナトリウム、ピロ亜硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム等；脂溶性抗酸化剤、例えば、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドリキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、アルファ−トコフェロール等；及び、金属キレート剤、例えば、クエン酸、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)、ソルビトール、酒石酸、リン酸等が挙げられる。単一剤形を生成するために担体材料と混合が可能な活性成分の量は、特定の投与法に依存して変動する。
【００８２】
本発明の粘膜輸送組成物及び方法においては、Y2受容体結合ペプチドを、粘膜表面の中に、又は貫いて輸送されることを強化する各種輸送強化剤が用いられる。この点で、粘膜上皮を貫くY2受容体結合ペプチドの輸送は、「細胞経由的に」、又は、「細胞周辺的に」起こりえる。これらの通路が、Y2受容体結合ペプチドの全体的フラックス及びバイオアベイラビリティに寄与する度合いは、粘膜の環境、活性剤の物理化学的性質、及び粘膜上皮の性質に依存する。細胞周辺性輸送には、受動的拡散のみが与るが、細胞経由輸送は、受動的過程か、或いは、促進される、又は能動的過程によって起こる。一般に、新水性で、受動的に輸送される、極性溶質は、細胞周辺ルートを通って拡散するが、一方、より親油性の高い溶質は、細胞経由ルートを用いる。本発明に含まれる、任意に選ばれたY2受容体結合ペプチドについて、様々な、受動的及び能動的に吸収される成分の吸収及びバイオアベイラビリティを、細胞周辺性及び細胞経由性輸送成分に基づいて簡単に評価することが可能である。受動的に吸収される薬剤については、薬剤輸送における細部周辺性通路と細胞経由性通路の相対的寄与は、pKa、分配系数、分子半径と薬剤の荷電、薬剤が輸送される腔環境のpH、及び、吸収表面面積に依存する。細胞周辺経路は、鼻粘膜上皮の接近可能な表面積において比較的小さい部分を表す。一般的に言うと、細胞膜は、細胞周辺空間によって占められる面積よりも1000倍大きな粘膜面積を占めると報告されている。従って、接触面積がより小さいこと、サイズ及び荷電に基づく差別が巨大分子には不利であることなどから、細胞周辺ルートは、概して、薬剤輸送のために、細胞経由輸送よりも不利なルートであることが示唆される。驚くべきことに、本発明の方法及び組成物は、細胞周辺ルートを経由する、粘膜上皮への、また、粘膜上皮を貫く、生体治療剤の輸送を有意に強化する。従って、本発明の方法及び組成物は、細胞周辺ルート及び細胞経由ルートの両方を、交互に、又は、単一方法又は組成物において効果的に標的する。
【００８３】
本明細書で用いる「粘膜輸送強化剤」という用語は、（例えば、輸送部位、又は選択された活性標的部位、例えば、血流又は中枢神経系で測定した）、Y2受容体結合ペプチド、又はその他の生物学的活性成分（単複）の放出又は可溶性（例えば、処方輸送媒体からの）、拡散速度、浸透能力とタイミング、摂取、滞在時間、安定性、実効半減期、ピーク又は持続濃度レベル、クリアランス、及びその他の所望の粘膜輸送特性を強化する薬剤を含む。従って、粘膜輸送の強化は、様々な機構、例えば、Y2受容体結合ペプチドの拡散、輸送、滞在、又は安定の増大、膜流動性の増大、細胞内又は細胞外浸透を調整するカルシウム又はその他のイオンのアベイラビリティ又は活性の変調、粘膜成分（例えば、脂質）の可溶化、粘膜組織における非タンパク及びタンパクスルフヒドリルレベルの変化、粘膜表面を横断する水フラックスの増加、上皮境界生理の変調、粘膜上皮を被う粘液粘度の低下、粘液繊毛のクリアランス速度の低下、及びその他の機構の内から選択される任意の機構によって起こってもよい。
【００８４】
本明細書で用いる「粘膜的に有効な量のY2受容体結合ペプチド」という用語は、様々な輸送又は搬送ルートを含む被験者において、薬剤活性の標的部位に対してY2受容体結合ペプチドを運ぶ効果的な粘膜輸送を含む。例えば、ある活性剤は、粘膜の細胞間の隙間に侵入路を見出し、隣接血管壁に達するかもしれないし、一方で、同じ薬剤が、受動的にか能動的にか、別のルートを通じて、粘膜細胞の中に取り込まれて、細胞の中で活動するか、或いは、細胞外に放出又は移送されるかして、二次的標的部位、例えば、全身循環に達することがある。本発明の方法及び組成物は、1種以上のこのようなルートに沿う活性剤の転移を促進し、或いは、粘膜組織又は近接血管組織に対して直接働きかけて、その活性剤（単複）の吸収又は浸透を増進する可能性がある。この意味における吸収又は浸透の増進は上記機構に限定されない。
【００８５】
本明細書で用いる「血漿におけるY2受容体結合ペプチドのピーク濃度(Cmax)」、「血漿におけるY2受容体結合ペプチドの濃度対時間曲線下面積(AUC)」、「血漿におけるY2受容体結合ペプチドの最大血漿濃度までの時間(tmax)」は、当業者には既知の薬剤速度論パラメータである。Laursen et al., Eur. J. Endocrinology, 135:309-315, 1996.「濃度対時間曲線」は、ある単回用量のY2受容体結合ペプチドを鼻腔内、筋肉内、皮下、又はその他の投与ルートを通じて被験者に投与した後において、該被験者の血漿におけるY2受容体結合ペプチド、対、時間を測定する。”Cmax”とは、被験者にY2受容体結合ペプチドを単回投与した後、該被験者の血漿で見られるY2受容体結合ペプチドの最大濃度である。”tmax”とは、ある単回用量のY2受容体結合ペプチドを被験者に投与した後、該被験者の血漿においてY2受容体結合ペプチドの最大濃度に達するまでの時間である。
【００８６】
「血漿におけるY2受容体結合ペプチドの濃度対時間曲線下面積(AUC)」は、直線的台形規則と残余面積の加算に従って計算される。二つの用量の間における23%の減少又は30%の増加は、90%の確率（II型誤差β=10%）で検出される。「輸送率」又は「吸収率」は、最大濃度(Cmax)に達するまでの時間(tmax)の比較によって推定される。(Cmax)も(tmax)もノンパラメトリック検定法によって分析される。Y2受容体結合ペプチドの筋肉内、皮下、静脈内、及び鼻腔内投与の薬剤速度論的比較は、変動分析(ANOVA)によって行った。ペア比較には、Bonferroni-Holmes逐次過程を用いて有意性を評価した。3種の鼻内用量間の用量反応関係は、回帰分析によって推定した。P<0.05を有意と判定した。結果は、平均値±SEMで表した。
【００８７】
本発明の各種粘膜輸送強化剤では、その吸収増進機構は様々であろうが、この意味での有用な薬剤は、粘膜組織に対して実質的に有害作用を及ぼすことはなく、特定のY2受容体結合ペプチド又は、その他の活性剤又は輸送強化剤の生理化学的特性に従って選択される。この意味で、粘膜組織の浸透又は透過性を増す輸送強化剤は、粘膜の防御的透過性障壁を若干変化させることがよくある。このような輸送強化剤が本発明において有用であるためには、粘膜の透過性に仮に何らかの際立った変化があるとしても、それは、薬剤輸送の所望の持続時間に対して適当な時間枠において可逆的であることが一般に望ましい。さらに、長期の使用によって、粘膜の障壁性に、実質的な、蓄積的な毒性、又は、何らかの恒久的な有害な変化が誘発されてはならない。
【００８８】
本発明のいくつかの面では、本発明のY2受容体結合ペプチドと共同投与、又は混合投与される吸収促進剤は、親水性低分子、例えば、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ジメチルホルムアミド、エタノール、プロピレングリコール、及び2-ピロリドンを含む（ただしこれらに限定されない）親水性低分子の中から選択される。それとは別に、長鎖両性分子、例えば、デアシルメチルスルホキシド、アゾン、ラウリル硫酸ナトリウム、オレイン酸、及び、胆汁塩を、Y2受容体結合ペプチドの粘膜浸透を強化するために用いてもよい。さらに別の面において、Y2受容体結合ペプチドの鼻腔内輸送を強化するために、界面活性剤（例えば、ポリソルベート）が、補佐化合物、処理化合物、又は処方添加物として用いられる。DMSO、ポリエチレングリコール、及びエタノールのような薬剤は、輸送環境に十分高濃度で存在する場合（例えば、事前投与、又は治療処方に含めることによって）、粘膜の水相に進入し、その可溶化性を変え、それによって、Y2受容体結合ペプチドの、媒体から粘膜に向かう分配を強化する。
【００８９】
本発明の共同投与、及び処理法及び混合処方において有用な、さらに別の粘膜輸送強化剤としては、混合ミセル；エナミン；酸化窒素供与体（例えば、S-ニトロソ-N-アセチル-DL-ペニシラミン、NOR1、NOR4があるが、これらは、NO捕集剤、例えば、カルボキシ-PITO、又はドクロフェナックナトリウムと共に共同投与するのが好ましい）；サリチル酸ナトリウム；アセト酢酸のグリセロールエステル（例えば、グリセリル-1,3-ジアセトアセテート、又は1,2-イソプロピリデングリセリン-3-アセトアセテート）；及び、粘膜輸送に対し生理的に適合する、その他の、放出・拡散、又は内上皮又は経上皮浸透促進剤が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。他の吸収促進剤は、Y2受容体結合ペプチドの粘膜輸送、安定性、活性、又は経上皮浸透を強化する、各種担体、塩基、及び賦形剤の内から選択される。そのようなものとして、特に、シクロデキストリン類、及びβ-シクロデキストリン誘導体類（例えば、2-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン、及びヘプタキス(2,6-di-O-メチル-β-シクロデキストリン)が挙げられる。上記化合物は、選択的に、1種以上の前記活性成分と共同投与され、さらに選択的に油脂性基材に基づいて処方されると、本発明の粘膜処方のバイオアベイラビリティを強化する。さらに別の、粘膜輸送に適応した吸収強化剤としては、中等鎖脂肪酸であって、例えば、モノ-、ジ-グリセリド（例えば、カプリン酸ナトリウム−ココナツ油の抽出物、Capmul）、及びトリグリセリド（例えば、アミロデキストリン、Estaram 299、Miglyol 810）を含む中等鎖脂肪酸が挙げられる。
【００９０】
本発明の粘膜性治療及び予防組成物は、Y2受容体結合ペプチドの、粘膜障壁を横断する吸収、拡散、又は浸透を促進する、任意の浸透促進剤を添加されてもよい。この浸透促進剤は、製薬学的に受容可能である限りいずれの促進剤であってもよい。従って、本発明のさらに詳細な面では、サリチル酸ナトリウム、及びサリチル酸誘導体（サリチル酸アセチル、サリチル酸コリン、サリチルアミド等）；アミノ酸及びその塩（例えば、モノアミノカルボン酸、例えば、グリシン、アラニン、フェニルアラニン、プロリン、ヒドロキシプロリン等；ヒドロキシアミノ酸、例えば、セリン；酸性アミノ酸、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸等；及び、塩基性アミノ酸、例えば、リシン等−そのアルカリ金属塩又はアルカリ土類金属塩を含む）；及びN-アセチルアミノ酸（N-アセチルアラニン、N-アセチルフェニルアラニン、N-アセチルセリン、N-アセチルグリシン、N-アセチルリシン、N-アセチルグルタミン酸、N-アセチルプロリン、N-アセチルヒドロキシプロリン等）、及び、それらの塩（アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩）から選択される1種以上の浸透促進剤を組成物が提供される。さらに、本発明の方法及び組成物内に含まれる浸透促進剤として、一般に、乳化剤として使用される物質（例えば、オレイルリン酸ナトリウム、ラウリルリン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ミリスチル硫酸ナトリウム、ポリオキシエチレンアルキルエステル、ポリオキシエチレンアルキルエステル等）、カプロン酸、乳酸、リンゴ酸及びクエン酸、及び、それらのアルカリ金属塩、ピロリドンカルボン酸、アルキルピロリドンカルボン酸エステル、N-アルキルピロリドン、プロリンアシルエステル等も提供される。
【００９１】
本発明の様々の面において、Y2受容体結合ペプチド及び、本発明のその他の治療薬剤を、投与部位と、選択された標的部位の間に存在する粘膜障壁を横断する輸送を可能とする、本発明の改良型鼻粘膜輸送処方及び方法が提供される。ある処方は、選ばれた、標的細胞、組織、又は器官、或いは場合によっては特定の病態に対して特異的に適応される。別の面では、定められた細胞内又は細胞間通路に沿って特異的に移動させられる、Y2受容体結合ペプチドの、効率的で、選択的なエンド、又はトランスサイトーシスを実現するための処方及び方法が提供される。通常、Y2受容体結合ペプチドは、担体、又はその他の輸送媒体に対し効果的な濃度レベルで効率的に負荷され、例えば、鼻粘膜において、及び／又は、遠くの薬剤作用の標的部位（例えば、血流、或いは、定義される組織、器官、又は細胞外区画）に向けて細胞内区画及び膜の貫通時において安定な形で輸送・維持される。Y2受容体結合ペプチドは、輸送媒体に溶解した状態で、或いは、別のやり方で修飾されて（例えば、前投薬の形で）提供されてもよい。後者の場合、Y2受容体結合ペプチドの放出又は作動は、生理的な刺激（例えば、pH変化、リソソーム酵素等）で誘起される。多くの場合、Y2受容体結合ペプチドは、標的部位に達して活性を発揮するまでは、薬理学的不活性である。多くの場合、Y2受容体結合ペプチド及びその他の処方成分は、非毒性で、非免疫誘発性である。この意味で、担体及びその他の処方成分は、一般に、生理的条件下で急速に分解、排出され易いことで選択される。同時に、処方は、効果的保存用の剤形において化学的、物理的に安定である。
【００９２】
ペプチド及びタンパク類縁体及び擬似体
本発明の範囲内で使用される生物学的に活性を持つペプチド及びタンパクの定義の中に含まれるのは、天然又は合成の、治療的活性又は予防的活性の、ペプチド（2種以上の共有的に結合されたアミノ酸から成る）、タンパク、ペプチド又はタンパク断片、ペプチド又はペプチド類縁体、及び、活性ペプチド又はタンパクの化学的に修飾された誘導体又は塩である。本発明の範囲において、多種多様の、Y2受容体結合ペプチドの有用な類縁体及び擬似体の使用が含まれ、生産され、既知の方法に従ってその生物活性を試験することが可能である。多くの場合、本発明の範囲内において使用される、Y2受容体結合ペプチドから成るペプチド又はタンパク、又は、その他の生物学的に活性を持つペプチド又はタンパクは、天然の、又は元の（例えば、野生型、天然の突然変異、又は対立遺伝子変異）ペプチド又はタンパク配列内部の部分的置換、添加、又は欠失によって簡単に得られるムテインである。さらに、元のペプチド又はタンパクの、生物学的に活性を持つ断片も含まれる。このような突然変異誘導体及び断片は、元のペプチド又はタンパクの所望の生物活性を実質的に保持する。炭水化物鎖を持つペプチド又はタンパクの場合、これらの炭水化物の変化によって標識される生物活性を持つ変異種も本発明の中に含まれる。
【００９３】
本明細書で用いる「保存的アミノ酸置換」という用語は、類似の側鎖を持つアミノ酸残基の一般的互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を持つ、一般的に相互交換の可能なアミノ酸群は、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を持つアミノ酸群はセリン及びトレオニンであり、アミド含有側鎖を持つアミノ酸群は、アスパラギン及びグルタミンであり、芳香族側鎖を持つアミノ酸群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンであり、塩基性側鎖を持つアミノ酸群は、リシン、アルギニン、及びヒスチジンであり、及び、硫黄含有性側鎖を持つアミノ酸群はシステインとメチオニンである。保存的置換の例としては、非極性（疎水性）残基の置換、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、又はメチオニンの、別物との置換が挙げられる。同様に、本発明は、極性（親水性）残基の置換、例えば、アルギニンとリシン、グルタミンとアスパラギン、及びトレオニンとセリンの間に見られるような置換を含む。さらに、塩基性残基、例えば、リシン、アルギニン、又はヒスチジンの、別物との置換、或いは、酸性残基、例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸の、別物との置換も含まれる。例示の保存的アミノ酸置換基は、バリン-ロイシン-イソロイシン、フェニルアラニン-チロシン、リシン-アルギニン、アラニン-バリン、及びアスパラギン-グルタミンである。選択された生物活性を定量するために、ペプチド又はタンパク類縁体を、対応する元のペプチド又はタンパクと整列させ、かつ、適当なアッセイ、例えば、接着タンパク又はペプチド結合アッセイを用いることによって、本発明の方法及び組成物の範囲内において使用される、動作的ペプチド及びタンパク類縁体を簡単に特定することができる。動作的ペプチド及びタンパク類縁体は、通常、対応する元のペプチド又はタンパクに対して惹起した抗体と特異的免疫反応を示す。
【００９４】
本発明の固体タンパク処方を安定化する方法は、精製、例えば、凍結タンパクの物理的安定性を増すことである。これは、疎水性相互作用を通じても、タンパクが解けるに従って増加する共有的経路を通じても凝集を抑制する。この意味における安定化処方には、多くの場合、ポリマー系処方、例えば、生分解性ヒドロゲル処方／搬送システムが含まれる。前述のように、タンパクの構造、機能、及び安定性における、水の決定的に重要な役割はよく知られる。通常、タンパクは、大量の水を奪われても、固体状態では比較的安定である。しかしながら、個体の治療タンパク処方は、高い湿度における保存時に、又は、持続放出組成物又は装置から輸送される際に脱水されることがある。タンパクの安定性は、一般に、脱水の増加と共に下がる。水はまた、固体タンパクの凝集において、例えば、タンパクの屈曲性を増し、反応基の接触性を強化することによって、反応基に対して移動相を提供することによって、かつ、ベータ除去及び加水分解のようないくつかの破壊過程において反応基として働くことによって重要な役割を果たす。
【００９５】
約6%から28%の水を含むタンパク標本はもっとも不安定である。このレベル未満では、結合水の移動性及びタンパク内部の運動は低い。このレベルを超えると、水の移動性及びタンパクの運動は、完全な水和のレベルに近づく。いくつかの系において、ある点までは、水和の増加による固相凝集に対する感受性の増加が観察されている。しかしながら、水含量がさらに高くなると、希釈効果のために凝集はより観察されなくなる。
【００９６】
この原理に従うと、粘膜輸送のためにペプチド及びタンパクを固相凝集しないように安定化することは、固体処方における水含量を調節し、処方における水の活性を最適レベルニ維持することである。このレベルは、タンパクの性質によるが、一般に、「単層」水被覆の下に維持されるタンパクは、優れた固体状態安定性を示す。
【００９７】
本発明では、タンパクの安定性を強化するために水含量を効果的に調節する、様々の添加剤、希釈剤、基材、及び輸送媒体が提供される。この意味において抗凝集剤として有効な試薬及び担体材料としては、例えば、様々な機能性を持つポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、デキストラン、ジエチルアミノエチルデキストラン、及びカルボキシメチルセルロースが挙げられる。これらのポリマーは、互いに混合し、又は結合した複数のペプチド及びタンパクの安定性を増し、固相凝集を抑える。ある場合には、タンパクの活性又は物理的安定は、ペプチド又はタンパク薬剤の水溶液に対する各種添加物によって強化することも可能である。例えば、ポリオール（糖類を含む）、アミノ酸、コラーゲンやゼラチンのようなタンパクのような添加物、及び各種塩を使用することが可能である。
【００９８】
ある種の添加物、特に、糖類及びその他のポリオールも、乾燥した、例えば、凍結乾燥タンパクにたいして著明な物理的安定性を賦与する。これらの添加物もまた、凍結乾燥時ばかりでなく、乾燥状態で保存する際にもタンパクを凝集から保護するために、本発明の範囲内で使用される。例えば、スクロースとFicoll 70（スクロース単位を持つポリマー）は、各種条件における固相保存の間、ペプチド又はタンパク凝集に対して著明な保護を示す。これらの添加剤も、ポリマーマトリックスの中に埋没した固体タンパクの安定性を強化する。
【００９９】
さらに別の添加剤、例えば、スクロースも、本発明の、ある持続放出処方において見られるように、高温多湿雰囲気においてタンパクを固相凝集しないように安定化する。タンパク、例えば、ゼラチン及びコラーゲンも、不安定なタンパクの変性及び凝集を抑える安定剤又は充填剤としてこの意味で役立つ。これらの添加剤は、本発明では、ポリマー溶解過程及び組成物の中に含めてもよい。例えば、ポリペプチド微細粒子は、前述の様々の安定化添加物を含む溶液を単純に凍結乾燥することによって、又は噴霧乾燥することによって調製することが可能である。このようにして、凝集していないペプチド及びタンパクの持続放出を長期に渡って入手することが可能である。
【０１００】
凝集し易いペプチド及びタンパクではあるが、可溶化剤を用いて、実質的に純粋な、非凝集形として安定化される、粘膜輸送用処方をもたらす、各種調整的添加成分及び方法を始め、処方の特異的添加物も、本発明において提供される。これらの方法及び処方には、ある範囲の組成物及び添加物の使用が考慮される。これら可溶化剤の例としては、ポリペプチドの疎水性側鎖に選択的に結合するシクロデキストリン(CD)が挙げられる。これらのCDは、凝集を著明に抑制するやり方で、タンパクの疎水性部分に結合することが認められている。この抑制は、参加するCDとタンパクの両方に対して選択的である。タンパク凝集のこのような選択的抑制によって、本発明の鼻腔内輸送法及び組成物では新たな利点が得られる。この意味で使用される新たな薬剤としてCDダイマー、トリマー、及びテトラマーが挙げられる。これらの変動する寸法は、ペプチド及びタンパクの凝集を特異的に阻止するリンカーによって調節される。しかしながら、本発明に含められる可溶化剤及び方法は、タンパク-タンパク相互作用を選択的に阻止するペプチド及びペプチド擬似体の使用も含む。一つの面では、CDマルチマーについて報告されている疎水性側鎖同士の特異的結合は、同様にタンパク凝集を阻止するペプチド及びペプチド擬似体の使用を通じてタンパクにも拡張される。広範な、好適な方法及び抗凝集剤が、本発明の組成物及び過程の中に取り込むために利用が可能である。
【０１０１】
荷電修飾及びpH調節剤及び方法
生物学的活性剤（Y2受容体結合ペプチド、その他の活性ペプチド及びタンパク、及び、巨大分子及び小型分子薬剤を含む）の輸送特性を、疎水性粘膜障壁の横断輸送強化に向けて改善するために、本発明はまた、本明細書に記載される、選ばれた生物学的活性剤又は輸送強化剤の荷電修飾のための技術及び試薬を提供する。この点で、複数の巨大分子の相対的透過度は、一般に、それらの分配系数に関連する。分子のpKaと、粘膜表面のpHに依存する分子のイオン化の程度も、その分子の透過性に影響を及ぼす。本発明のY2受容体結合ペプチド及び類縁体を含む、生物学的活性剤の、粘膜輸送における浸透及び分配は、活性剤又は浸透剤の電荷変化又は電荷拡散によって促進される。この電荷変化又は電荷拡散は、例えば、荷電官能基を変える、活性剤の運ばれる輸送媒体又は溶液のpHを修飾する、或いは、荷電又はpH変調試薬を活性剤と共同投与する等によって促進される。
【０１０２】
上記の一般的教示と一致して、本発明の方法よび組成物における、Y2受容体結合ペプチド及びその他の生物学的に活性を持つペプチド及びタンパクを含む、荷電巨大分子の粘膜輸送は、その活性剤が、実質的にイオン化されない、すなわち、中性の、電気的荷電状態において粘膜表面に輸送されると、実質的に改善される。
【０１０３】
本発明において使用される粘膜処方における、いくつかのY2受容体結合ペプチド及びその他の生物学的に活性を持つペプチド及びタンパクは、該ペプチド又はタンパクの正電荷密度において増加をもたらすように荷電修飾される。これらの修飾はまた、ペプチド及びタンパクの接合体、担体、及び、本明細書に開示される他の輸送形の陽イオン化にも拡張される。陽イオン化は、本発明のタンパク及び巨大分子の生体内分布及び輸送特性を変える好適な手段を提供する。陽イオン化は、活性剤の生物活性を実質的に保存し、かつ、組織損傷や毒性を含めた有害な副作用を制限するやり方で行われる。
【０１０４】
変性酵素抑制剤及び方法
経粘膜調剤に含められてもよいもう一つの賦形剤は、変性酵素阻害剤である。本発明の粘膜輸送処方及び方法において有用な、例示の粘着性ポリマー-酵素阻害剤複合体として、カルボキシメチルセルロース-ペプスタチン（抗ペプシン活性を持つ）；ポリ（アクリル酸）-Bowman-Birk阻害剤（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）-キモスタチン（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）-エラスタチナル（抗エラスターゼ）；カルボキシメチルセルロース-エラスチナル（抗エラスターゼ）；ポリカルボフィル-エラスタチナル（抗エラスターゼ）；キトサン-アンチパイン（抗トリプシン）；ポリ（アクリル酸）-バシトラシン（抗アミノペプチダーゼN）；キトサン-EDTA（抗アミノペプチダーゼN、抗カルボキシペプチダーゼA）；キトサン-EDTA-アンチパイン（抗トリプシン、抗キモトリプシン、抗エラスターゼ）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。下記に詳述するように、本発明のある実施態様は、選択的に、新規キトサン誘導体、又は、キトサンの化学的修飾形を含む。本発明において使用されるこのような新規誘導体の一つは、β-[1->4]-2-グアジノ-2-デオキシ-D-グルコースポリマー（ポリ-GuD）である。
【０１０５】
生物学的活性剤（単複）を保護するために酵素の活性を抑制するものであれば、いずれのものであっても本発明の組成物及び方法において有効に用いられる。生物学的に活性を持つタンパク及びペプチドの保護に有用な酵素阻害剤としては、例えば、大豆トリプシン阻害剤、膵臓トリプリシン阻害剤、キモトリプシン阻害剤、及び、じゃがいも(solanum tuberosum L.)塊茎から単離されたトリプシン及びキモトリプシン阻害剤が挙げられる。阻害剤の結合体又は混合物を使用してもよい。本発明において使用される、それ以外のタンパク分解酵素阻害剤としては、オボムコイド酵素、メシル酸ガバキセート、アルファ1-抗トリプシン、アプロチニン、アマスタチン、ベスタチン、プロマイシン、バシトラシン、ロイペプシン、アルファ2-マクロブロブリン、ペプスタチン、及び卵白又は大豆トリプシン阻害剤が挙げられる。上記及びその他の阻害剤は、単独でも、組み合わせて使用してもよい。阻害剤（単複）は、担体に含めても、又は、生物学的活性剤と組み合わせて、又は、別々に投与される（例えば、前投薬）処方として、担体、例えば、親水性ポリマーに結合させても、鼻粘膜に接触する剤形の表面にコートしても、或いは、表面の表層に含めてもよい。
【０１０６】
本発明の組成物に任意に含まれる阻害剤、例えば、タンパク分解酵素阻害剤の量は、(a)その特定の阻害剤の性質、(b)分子中に存在する官能基の数（ヒドロゲル形成モノマーとの共重合形成にとって必要なエチレン不飽和を導入するために反応する）、及び(c)阻害剤分子の中に存在する、グリコシドのようなレクチン基の数に応じて変動する。問題の量は、投与を意図する、特定の治療剤にも依存する。一般に、酵素阻害剤の有効量は、処方（すなわち、単独のプロテアーゼ阻害剤処方、又は阻害剤と生物活性剤との混合処方）の約0.1 mg/mlから50 mg/ml、多くの場合、約0.2 mg/mlから約25 mg/ml、さらに一般的には0.5 mg/mlから5 mg/mlである。
【０１０７】
トリプシン阻害剤の場合、好適な阻害剤は、例えば、アプロチニン、BBI、大豆トリプシン阻害剤、ニワトリオボムコイド、ニワトリ卵白阻害剤、ヒト膵臓トリプシン阻害剤、メシル酸カモスタット、フラボノイド阻害剤、アンチパイン、ロイペプチン、p-アミノベンズアミド、AEBSF、TLCK（トシリシン、クロロメチケトン）、APMSF, DFP, PMSF, 及び、ポリ（アクリル酸）誘導体の内から選択される。キモトリプシン阻害剤の場合、好適な阻害剤は、例えば、アプロチニン、BBI、大豆トリプシン阻害剤、キモスタチン、ベンジロキシカルボニル-Pro-Phe-CHO、FK-448、ニワトリ卵白阻害剤、糖ベフェニルホウ酸複合体、DFP、PMSF、β-フェニルプロピオン酸、及び、ポリ（アクリル酸）誘導体の内から選択される。エラスターゼ阻害剤の場合、好適な阻害剤は、例えば、エラスタチナル、メトキシスクシニル-Ala-Ala-Pro-Val-クロロメチルケトン(MPCMK)、BBI、大豆トリプシン阻害剤、ニワトリ卵白阻害剤、DFP、及び、PMSFの内から選択される。
【０１０８】
本発明において使用されるさらに別の酵素阻害剤は、その効力及び毒性の程度においてまちまちな、広範な非タンパク阻害剤の内から選択される。下記に詳述するように、毒性作用に遭遇した場合、これらの補助剤を、マトリックス、又はその他の輸送媒体に固定するか、化学的に修飾された類縁体を開発することによって、その毒性作用を簡単に抑制、又は除去することが可能である。本発明として使用される、候補酵素阻害剤から成るこの広範な群の中には、有機リン酸阻害剤、例えば、ジイソプロピルフルオロホスフェート(DFP)、及び、フェニルメチルスルホニルフルオリド(PMSF)がある。これらは、セリンプロテアーゼ（例えば、トリプシン及びキモトリプシン）の強力で、非可逆的阻害剤である。これらの化合物によってさらにアセチルコリンエステラーゼも抑制されることは、輸送が調節されない背景では、該化合物をきわめて毒性の高いものにする。もう一つの候補阻害剤、4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオリド（AEBSF）は、DFP及びPMSFに匹敵する抑制活性を持つが、毒性ははるかに低い。(4-アミノフェニル)-メタンスルホニルフルオリド塩酸(APMSF)は、また別の、トリプシンの強力な阻害剤であるが、非調節的背景では有毒である。これらの阻害剤とは対照的に、4-(4-イソプロピルピペラジノカルボニル)フェニル1,2,3,4-テトラヒドロ-1-ナフトエートメタンスルホン酸(FK-448)は、低毒性物質であるが、キモトリプシンの強力、かつ特異的阻害剤である。この非タンパク阻害剤候補群で、低い毒性危険度しか示さない、さらに別の代表として、メシル酸カモスタット（N,N’-ジメチルカルバモイルメチル-p-(p’-グアニジノ-ベンゾイルオキシ)フェニルアセテートメタンスルホン酸）がある。
【０１０９】
本発明の方法及び組成物において使用されるさらに別のタイプの酵素阻害剤として、特定の治療化合物の酵素的分解を妨げるアミノ酸及びアミノ酸修飾物がある。この意味で用いるためには、アミノ酸及びアミノ酸修飾物は、実質的に無毒であり、低コストで生産される。しかしながら、分子サイズが低く、溶解度が高いために、これらの物質は、粘膜環境において簡単に希釈、吸収される。にも拘わらず、適切な条件下では、アミノ酸は、プロテアーゼ酵素の、可逆的、競合的阻害剤として作用する。ある種のアミノ酸修飾物ははるかに強力な抑制活性を示すことが可能である。この意味における所望のアミノ酸は、「遷移状」アミノ酸と呼ばれる。これらの化合物の強力な抑制活性は、それらの構造が、遷移形態を持つ基質と近似することによるが、これらの化合物は、一般に、基質そのものよりも酵素の活性部位に対しはるかに高い親和性を持つことで選択される。遷移状態阻害剤は、可逆的、競合的阻害剤である。このタイプの阻害剤の例としては、α-アミノボロン酸誘導体、例えば、ボロ-ロイシン、ボロ-バリン、及びボロ-アラニンがある。これらの誘導体におけるホウ素原子は、アミノペプチダーゼによる加水分解時のペプチドの遷移状態と近似すると考えられる四面体のホウ酸イオンを形成することが可能である。これらのアミノ酸誘導体は、アミノペプチダーゼの強力で、可逆的阻害剤であり、ボロ-ロイシンは、酵素阻害において、ベスタチンより100倍以上、プロマイシンより1000倍以上効果的であることが報告されている。強力なプロテアーゼ抑制活性が報告されている、もう一つのアミノ酸修飾物は、アミノペプチダーゼNの酵素活性を抑制するN-アセチルシステインである。この補助剤も、粘液拡散障壁の作用を抑えるために、本発明の方法及び組成物の範囲内で使用が可能な、粘膜分解活性を示す。
【０１１０】
本発明の共同投与法及び混合処方において使用されるさらに別の酵素阻害剤は、ペプチド及びペプチド酵素阻害剤修飾物から選択される。このクラスの阻害剤の重要な代表物は、Bacillus licheniformisから得られた、環状ドデカプチド、バシトラシンである。このタイプのペプチドの外に、ある種のジペプチド及びトリペプチドも、プロテアーゼに対して、弱い、非特異的抑制活性を示す。アミノ酸と似て、これらの抑制活性も化学的修飾によって向上させることが可能である。例えば、リン酸ジペプチド類縁体も、アミノペプチダーゼに対して強力な抑制活性を持つ「遷移状態」阻害剤である。これらは、鼻腔内投与ロイシンエンケファリンを安定化するのに用いられることが報告されている。遷移状態類縁体のもう一つの例は、ペプシンの極めて強力な阻害剤であるペンタペプチドペプスタチン修飾物である。いくつかの合成類縁体について抑制活性を調べることによってペプスタチンの構造を分析した結果、抑制活性を担う分子の主要な構造-機能特性が明らかにされた。もう一つの特異なタイプのペプチド修飾物として、その構造の末端に配されるアルデヒド機能を持つ阻害剤が挙げられる。例えば、キモトリプシンに対する既知の一次及び二次特異性要求を満たす、配列ベンジルオキシカルボニル-Pro-Phe-CHOは、この標的プロテイナーゼの強力な、可逆的阻害剤であることが判明した。末端局在アルデヒド機能を持つさらに別の阻害剤、例えば、アンチパイン、ロイペプチン、キモスタチン、及びエラスタチナルの化学的構造も従来技術で既知であり、外にも同様に、ホスフォラミドン、ベスタチン、プロマイシン、及び、アマスタチンのような、可逆的、ペプチド阻害剤修飾物の構造も既知である。
【０１１１】
比較的高い分子量のために、ポリペプチドプロテアーゼ阻害剤は、小型の化合物よりも、薬剤-担体マトリックスにおける濃縮輸送に対してより柔軟に対応する。本発明の組成物及び方法において用いられる、さらに別のプロテアーゼ阻害剤は、複合化剤の使用を含む。これらの薬剤は、鼻腔内環境（或いは、調製又は治療組成物）から、多くのプロテアーゼの補因子である二価の陽イオンを奪い取ることによって酵素抑制を実現する。例えば、複合化剤EDTA及びDTPAを、共同投与又は混合処方される補助剤として適当な濃度で使用すると、選択されたプロテアーゼを抑制し、それによって、本発明に従って生物学的活性剤の鼻腔内輸送を十分に強化する。このクラスの阻害剤のさらに別の代表はEGTA、1,10-フェナントリン、及びヒドロキシチノリンである。さらに、好んで二価陽イオンをキレート化する傾向を持つために、上記、及びその他の複合化剤は、直接的、吸収促進剤として、本発明において有用である。
【０１１２】
本明細書の別箇所でさらに詳述されるように、本発明の、共同投与、多段階処理及び／又は混合処方方法及び組成物における酵素阻害剤として、各種ポリマー、特に、粘着性ポリマーの使用も考慮される。例えば、ポリ（アクリル酸）誘導体、例えば、ポリ（アクリル酸）及びポリカルボフィルは、トリプシン、キモトリプシンを含む各種プロテアーゼの活性に影響を及ぼすことが可能である。これらのポリマーの抑制作用も、二価の陽イオン、例えば、Ca2+及びZn2+の複合化に基づく。これらのポリマーは、前述のように、さらに新たな酵素阻害剤のための接合体パートナー又は担体として働くことが考えられる。例えば、キトサン-EDTA接合体が開発されているが、これは、亜鉛依存性プロテアーゼの酵素活性に対して強力な抑制作用を示すという点で本発明において有用である。このようにして他の酵素阻害剤を共有的に付着させた後の、ポリマーの粘着性は、実質的に破壊されることは考えられないし、また、本発明における生物学的活性剤の輸送媒体としての一般的有用性も減退するとは考えられない。むしろ逆に、粘着機構によって実現される、輸送媒体と粘膜表面との間の距離の短縮によって、活性剤の、全身循環前の代謝が極小化され、一方、共有的に結合した酵素阻害剤は、薬剤輸送部位に高濃度で存続するので、好ましくない阻害剤の希釈作用ばかりでなく、毒性及びその他の副作用が最小化される。
【０１１３】
本発明の粘膜処方及び方法において有用な粘着ポリマー-酵素阻害剤複合体の例として、カルボキシメチルセルロース-ペプスタチン（抗ペプシン活性を持つ）；ポリ（アクリル酸）-Bowman-Birk阻害剤（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）-キモスタチン（抗キモトリプシン）；ポリ（アクリル酸）-エラスタチナル（抗エラスターゼ）；カルボキシメチルセルロース-エラスチナル（抗エラスターゼ）；ポリカルボフィル-エラスタチナル（抗エラスターゼ）；キトサン-アンチパイン（抗トリプシン）；ポリ（アクリル酸）-バシトラシン（抗アミノペプチダーゼN）；キトサン-EDTA（抗アミノペプチダーゼN、抗カルボキシペプチダーゼA）；キトサン-EDTA-アンチパイン（抗トリプシン、抗キモトリプシン、抗エラスターゼ）が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１１４】
粘液分解及び粘液排除剤及び方法
鼻腔内投与による生体治療剤の効果的輸送を行うには、粘液層の糖タンパクに対する結合による薬剤損失の外に、鼻粘膜の保護的粘液コートを横断する際の、薬剤輸送の減速を考慮しなければならない。正常な粘液は、水、電解質、ムチン、巨大分子、及び、剥離上皮細胞から成る、粘弾性を持つ、ゲル様物質である。これは主に、下層の粘膜組織の細胞保護的、潤滑的コートとして働く、粘液は、鼻腔上皮及びその他の粘膜上皮に散在する分泌細胞によって分泌される。粘液の構造単位はムチンである。この糖タンパクが主に、粘液の粘弾性を担っている。ただし他の巨大分子もこの性質に寄与している。気道粘液では、そのような巨大分子として、局所的に生産される、分泌性IgA、IgM、IgE、ライソザイム、及び気管支トランスフェリンが挙げられる。これらはまた、宿主の防衛機構において重要な役割を果たす。
【０１１５】
本発明の共同投与法は、選択的に、効果的な粘液分解又は粘液排除剤を含む。この薬剤は、鼻腔内粘膜表面の粘液を分解し、薄め、又は、排除し、そうすることによって、鼻腔内投与される生体治療剤の吸収を促進するものである。これらの方法において、粘液分解又は粘液排除剤は、生物学的活性剤の鼻腔内輸送を強化するために、補助化合物として共同投与される。別態様では、有効量の粘液分解又は粘液排除剤が、本発明の多段処理法における処理剤として、或いは、本発明の混合処方における添加剤として取り込まれ、それによって、鼻腔粘液の障壁作用を抑えることによって生体治療化合物の鼻腔内輸送が強化される、改良型処方が得られる。
【０１１６】
本発明の方法及び組成物の中に取り込むために、各種粘液分解又は粘液排除剤の利用が可能である。その作用機構に基づいて、粘液分解又は粘液排除剤は大雑把に、下記の群に分類される。すなわち、ムチン糖タンパクのタンパクの核を分断するプロテアーゼ（例えば、プロナーゼ、パパイン）；ムコタンパクのジスルフィド結合を切り裂くスルフヒドリル化合物；及び、粘液内部の非共有結合を破壊する洗浄剤（例えば、Triton X-100、Tween 20）である。この意味におけるさらに別の化合物としては、胆汁塩及び、界面活性剤、例えば、デオキシコール酸ナトリウム、タウロデオキシコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、及びリソホスファチジルコリンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１１７】
粘液の構造的破断をもたらす胆汁塩の有効性は、デオキシコール酸＞タウロコール酸＞グリココール酸の順である。本発明の方法に従って鼻腔内輸送を強化するために、粘液の粘度又は接着を抑える、他の効果的薬剤として、例えば、短鎖脂肪酸、及び、キレート化によって作用するムコ分解剤、例えば、N-アシルコラーゲンペプチド、胆汁酸、及びサポニン（後者は、一部、粘液層構造の維持に重要な役割を果たすCa2+及び／又はMg2+をキレート化することによって作用する）が挙げられる。
【０１１８】
本発明の方法及び組成物において使用される、さらに別の粘液分解剤としては、N-アセチル-L-システイン(ACS)が挙げられる。これは、気管支・肺粘液の粘度及び接着度の両方を下げる薬剤であって、麻酔ラットにおけるヒトの成長ホルモンの鼻腔内バイオアベイラビリティを僅かに増す（7.5から12.2%）ことが報告されている。上記及びその他の粘液分解又は粘液排除剤は、鼻腔内粘液の極性粘度及び／又は弾性度を下げるために、通常は、約0.2から20 mMの濃度範囲で、生物学的活性剤と共同投与されて、鼻粘膜と接触させられる。
【０１１９】
さらに別の粘液分解又は粘液排除剤は、粘液糖タンパク内のグリコシド結合を分断することが可能な、ある範囲のグリコシダーゼ酵素の中から選択される。α-アミラーゼ及びβ-アミラーゼがこのクラスの酵素の代表であるが、ただしその粘液分解性は限られている。一方、細菌のグリコシダーゼは、これらの微生物が、宿主の粘液層を浸透することを可能にする。
【０１２０】
ペプチド及びタンパク治療剤を含む、本発明におけるもっとも生物学的に活性の高い薬剤と混合使用するには、非電離性洗浄剤も一般に、粘液分解又は粘液排除剤として有用である。これらの薬剤は、通常、治療ポリペプチドの活性を修飾しないし、実質的に損なうこともない。
【０１２１】
繊毛静止剤及び方法
粘液繊毛除去による、ある種の粘膜組織（例えば、鼻粘膜組織）の自浄能力は、保護機能（例えば、塵、アレルゲン、及び細菌を除去するため）として必要であるため、この機能は、粘液薬剤によって実質的に損なうことがあってはならないと一般に考えられていた。気道における粘液繊毛輸送は、感染に対する特に重要な防衛機構である。この機能を実現するために、鼻及び気道の繊毛運動は、粘膜にそって一層の粘液を動かして、吸い込んだ粒子や微生物を排除する。
【０１２２】
本発明の方法及び組成物において、繊毛静止剤は、粘膜的に（例えば、鼻腔内に）投与されたY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、本明細書に開示されるその他の活性剤の滞在時間を延長するために使用される。特に、本発明の方法及び組成物における薬剤の輸送は、1種以上の繊毛静止剤の共同投与又は混合投与によってある面において著明に強化される。これらの繊毛静止剤は、粘膜細胞の繊毛活性を可逆的に抑制するように働き、そによって、粘膜に投与された活性剤（単複）の滞在時間の、一過性、可逆的延長を実現する。本発明のこれらの面で使用されるには、前述の繊毛静止剤は全て、その活性が特異的であれ間接的であれ、粘膜投与部位において、粘液繊毛性排除の、一過性（すなわち、可逆性）低下又は停止を、受け容れがたい悪性の副作用を招くことなくもたらし、Y2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、本明細書に開示されるその他の活性剤の輸送を強化する適当量（濃度、持続時間、及び輸送モードに依存する）として使用される限り、優れた繊毛静止剤として用いられる候補となる。
【０１２３】
さらに詳細な面では、特異的繊毛静止因子は、1種以上のY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、本明細書に開示されるその他の活性剤との混合処方又は共同処方に用いられる。文献において単離され、特性解明された様々な繊毛静止因子も本発明の実施態様で使用してもよい。細菌Pseudomonas aeruginosaから得られた繊毛静止剤としては、フェナジン誘導体、ピオ化合物（2-アルキル-4-ヒドロキシキノリン）、及びラムノリピド（別名ヘモリシン）が挙げられる。ピオ化合物は、50 μg/mlの濃度で、明白な超微細構造損傷を起こすことなく繊毛静止を実現した。フェナジン誘導体も、繊毛運動を抑制したが、若干の膜損傷をもたらした。ただし、濃度は、実質的により大きい400 μg/mlであった。気管の体外移植標本をラムノリピドに短時間暴露したところ、繊毛膜の変化を伴う繊毛静止が得られた。ラムノリピドにさらに長く暴露したところ、アクソネームからダイニンアームが外された。
【０１２４】
界面活性剤と方法
本発明のさらに詳細な面では、Y2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、本明細書に開示されるその他の活性剤の粘膜輸送を強化するために、本発明の粘膜輸送方法又は処方に1種以上の膜浸透強化剤を用いてもよい。この意味における膜浸透強化剤は、(i)界面活性剤、(ii)胆汁塩、(iii)リン脂質添加剤、混合ミセル、リポソーム、又は担体、(iv)アルコール、(v)エナミン、(vi)NO供与体化合物、(vii)長鎖脂肪族分子、(viii)低分子疎水性浸透強化剤、(ix)ナトリウム、又はサリチル酸誘導体、(x)アセト酢酸のグリセロールエステル、(xi)シクロデキストリン、又はベータ-シクロデキストリン誘導体、(xii)中等長鎖脂肪酸、(xiii)キレート剤、(xiv)アミノ酸又はその塩、(xv)N-アセチルアミノ酸又はその塩、(xvi)選ばれた膜成分に対して分解性の酵素、(xvii)脂肪酸合成阻害剤、(xviii)コレステロール合成阻害剤、(xix)(i)-(xix)の膜浸透強化剤から選択される任意の組み合わせ、の内から選択される。
【０１２５】
ある種の界面活性剤は、粘膜吸収強化剤として、本発明の粘膜輸送処方及び方法に簡単に取り込むことが可能である。Y2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、本明細書に開示されるその他の活性剤と、共同投与又は混合投与されるこれらの薬剤は、既知の界面活性剤から成る広範な集合体の中から選択される。界面活性剤は、一般に、三つのクラスに分かれる。すなわち、(1)非電離性ポリオキシエチレンエーテル、(2)胆汁塩、例えば、デオキシコール酸ナトリウム(SCG)及びデオキシコール酸(DOC)、及び、(3)フシジン酸誘導体、例えば、タウロジヒドロフシジン酸ナトリウム（STDHF）である。これら様々なクラスの界面活性剤の作用機構としては、通常、生物学的活性剤の可溶化が挙げられる。しばしば凝集体を形成するタンパク及びペプチドの場合、これらの吸収促進剤の界面活性特性によってタンパクとの相互作用が得られ、それによって、界面活性剤被覆モノマーのような小型ユニットは比較的容易に溶液中に維持される。他の界面活性剤の例としては、L-α-ホスファチジルコリンジデカノイル(DDPC)ポリソルベート80及び20が挙げられる。これらのモノマーは、凝集体よりも輸送がより簡単と思われる。予想される第2の機構は、粘膜環境においてプロテアーゼによるタンパク分解から、ペプチド及びタンパクを保護することである。胆汁塩もいくつかのフシジン酸誘導体も、タンパク吸収に必要な濃度以下の濃度で、鼻粘膜ホモジェネートにおけるタンパクのタンパク分解酵素による分解を抑制することが報告されている。このプロテアーゼ抑制は、生物学的半減期の短いペプチドにとっては特に重要である。
【０１２６】
分解酵素及び脂肪酸及びコレステロール合成の阻害剤
本発明の関連面では、粘膜投与用の、Y2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、その他の活性剤は、分解酵素、代謝刺激剤、或いは、脂肪酸、ステロール、又は、その他の選択された上皮障壁成分の合成阻害剤の内から選択される浸透強化剤と一緒に処方、或いは、共同的に投与される。米国特許第6,190,894号を参照されたい。例えば、粘膜障壁に非可逆的傷害を招くことなく、Y2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、その他の活性剤の粘膜浸透を強化するために、分解酵素、例えば、ホスフォリパーゼ、ヒアルロニダーゼ、ニューラミニダーゼ、及びコンドロイチナーゼを用いてもよい。一つの実施態様では、粘膜の透過性障壁の糖タンパク又は糖タンパク構成分を変えるために、コントロイチナーゼを、本明細書に提供される方法又は成分に採用し、それによってY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、本明細書に開示されるその他の活性剤の粘膜吸収を強化する。
【０１２７】
粘膜障壁構成分合成の阻害剤に関しては、遊離脂肪酸が、重量にして上皮脂質の20-25%を占めることが注目される。遊離脂肪酸の生合成における、二つの速度制限的酵素はアセチルCoAカルボキシラーゼと脂肪酸合成酵素である。一連の工程を経て、脂肪酸はリン脂質に代謝される。従って、本発明の方法及び組成物において使用される、遊離脂肪酸合成及び代謝の阻害剤としては、アセチルCoAカルボキシラーゼの阻害剤、例えば、5-テトラデシクロキシ-2-フランカルボン酸(TOFA)；脂肪酸合成酵素阻害剤；ホスフォリパーゼAの阻害剤、例えば、ゴミシンA、2-(p-アミルシナミル)アミノ-4-クロロベンゾイン酸、ブロモフェナシルブロミド、モノアリド、7,7-ジメチル-5,8-エイコサジエン酸、ニセルゴリン、セファラチン、ニカルジピン、ケルセチン、ジブチリル-サイクリックAMP、R-24571、N-オレオイルエタノールアミン、N-(7-ニトロ-2,1,3-ベンゾキサジアゾール-4-イル)ホスホスチジルセリン、シクロスポリンA、ジブケインを含む局所麻酔剤、プレニラミン、レチノイド、例えば、全トランス及び13-cisレチノイン酸、W-7、トリフルオロペラジン、R-24571（カルミダゾリウム）、1-ヘキサドシル-3-トリフルオロエチルグリセロ-2-ホスフォメントール(MJ33)；カルシウムチャンネル遮断剤、例えば、ニカルジピン、ベラパミル、ジルチアゼム、ニフェジピン、及びニモジピンを含む遮断剤；抗マラリア剤、例えば、キナクリン、メパクリン、クロローキン、及びヒドロキシクローキンを含む抗マラリア剤；プロパノール及びラベタロールを含むベータ遮断剤；カルモジュリン拮抗剤；EGTA；チメルソール；デキサメタゾン及びプレドニソロンを含むグルココルチコステロイド；及び、インドメタシン及びナプロキセンを含む非ステロイド抗炎症剤が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２８】
主にコレステロールから成る遊離ステロールは、重量にして上皮脂質の20-25%を占める。コレステロールの生合成における速度制限性酵素は、3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル(HMG)CoAレダクターゼである。本発明の方法及び組成物において使用されるコレステロール合成阻害剤としては、(HMG)CoAレダクターゼの競合的阻害剤、例えば、シンバスタチン、ロバスタチン、フルインドスタチン（フルバスタチン）、プラバスタチン、メバスタチンを始め、他のHMG CoAレダクターゼ阻害剤、例えば、コレステロールオレエート、コレステロールスルフェート及びホスフェート、及び酸素添加ステロール、例えば、25-OH-及び26-OH-コレステロール；及び、スクアレンエポキシダーゼの阻害剤；DELTA7又はDELTA24レダクターゼの阻害剤、例えば、22,25-ジアザコレステロール、20,25-ジアザコレステロール、AY9944、及びトリパラノールが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０１２９】
活性剤（単複）の上皮浸透の強化を実現するために、脂肪酸合成又はステロール合成の各阻害剤を、Y2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、本明細書に開示されるその他の活性剤と、共同投与又は混合投与してもよい。粘膜輸送用の治療又は補助処方におけるステロール阻害剤の有効濃度範囲は、一般に重量にして合計の約0.0001%から約20%、さらに典型的には約0.01%から約5%である。
【０１３０】
酸化窒素供与剤及び方法
本発明の、他の関連面において、酸化窒素(NO)供与体が、1種以上のY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、本明細書に開示されるその他の活性剤の粘膜輸送を強化するための膜浸透強化剤として選択される。各種NO供与体が従来技術で既知であり、有効濃度では本発明の方法及び処方において有用である。例示のNO供与体としては、ニトログリセリン、ニトロプルシド、NOC5 [3-(2-ヒドロキシ-1-(メチル-エチル)-2-ニトロソヒドラジノ)-1-プロパナミン]、NOC12 [N-エチル-2-(1-エチル-2-(1-エチル-ヒドロキシ-2-ニトロソヒドラジノ)-エタナミン)、SNAP [S-ニトロソ-N-アセチル-DL-ペニシラミン]、NORI、及びNOR4が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。本発明の方法及び組成物においては、有効量の選択されたNO供与体が、1種以上のY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び／又は、本明細書に開示されるその他の活性剤と共に、粘膜上皮の中に、又は経由して共同投与されるか、又は混合処方される。
【０１３１】
上皮接合部構造及び／又は生理を修飾する薬剤
本発明は、粘膜輸送用製薬製剤において、本明細書に開示される粘膜輸送強化剤と組み合わせて処方される、1種以上のY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び／又は、その他の活性剤を含む製薬組成物を提供する。
【０１３２】
透過性促進剤は、被験者における上皮接合部構造及び／又は粘膜上皮表面の生理を修飾することによって、粘膜上皮の細胞周辺輸送を可逆的に強化する。この作用は通常、隣接上皮細胞の上皮膜の接着タンパク間の、ホモ型又はヘテロ型結合に対する、透過性促進剤による抑制を含む。このホモ型又はヘテロ型結合の遮断における標的タンパクは、様々な関連接合部接着分子(JAM)、オクルジン、又はクラウジンの中から選択される。そのようなものの例として、上記タンパクの細胞外ドメインに結合する抗体、抗体断片、1本鎖抗体が挙げられる。
【０１３３】
さらに別の詳しい実施態様では、本発明は、粘膜上皮細胞周辺輸送を強化するための、透過性促進ペプチド、及びペプチド類縁体及び擬似体を提供する。この主題のペプチド及びペプチド類縁体及び擬似体は、本発明の組成物及び方法においては、通常、哺乳類被験体の上皮の接合物構造及び／又は生理を修飾することによって活動する。ある実施態様では、ペプチド及びペプチド類縁体及び擬似体は、接合部接着分子(JAM)、オクルジン、又はクラウジンの中から選択される上皮膜接着タンパクのホモ型及び／ヘテロ型結合を効果的に抑制する。
【０１３４】
これまで詳しく研究されている、そのような薬剤の一つは、Vibrio choleraeから得られ、「閉鎖帯トキシン」(ZOT)と呼ばれる細菌毒素である。この毒素は、小腸粘膜の透過性を増し、感染被験体の下痢を含む症状を引き起こす。Fasano et al., Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A., 8:5242-5246(1991)。ウサギ回腸粘膜で調べると、ZOTは、細胞間の接着結合構造を修飾することによって小腸の透過性を増した。さらに近年、ZOTは、小腸粘膜において接着結合を可逆的に開放することが可能であることが判明した。さらに、ZOTは、鼻粘膜の接着結合も可逆的に開放可能であることが報告されている。
【０１３５】
本発明の方法及び組成物において、ZOTを始め、ZOT活性の作用剤又は拮抗剤として機能する、ZOT類縁体及び擬似体も、鼻粘膜侵入及び経由による細胞周辺吸収を増すことによって生物活性剤の鼻腔内輸送を強化するのに有用である。この意味で、ZOTは通常、接合部タンパクZO1の局在の変化で示される、接合結合の構造的再編成をもたらすことによって作用する。本発明の上記面では、ZOTは、生物学的活性剤と共に、実質的に有害な副作用もなく鼻粘膜透過性を可逆的に増すことによって、その活性剤の吸収を著明に強化するのに有効な量において、共同投与又は混合投与される。
【０１３６】
血管拡張剤及び方法
本発明の、共同投与及び混合処方法及び組成物において有用な効力を示す、もう一つのクラスの吸収促進剤は、血管作動合物、もっと具体的に言うと、血管拡張剤である。この化合物は、本発明においては、粘膜下の血管の構造と生理を変調するように機能し、それによって、粘膜上皮の侵入又は経由による、特定の標的組織又は区画（例えば、全身循環又は中枢神経系）に対する、1種以上のY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、本明細書に開示されるその他の活性剤の輸送の速度を増す。
【０１３７】
本発明において使用される血管拡張剤は通常、細胞質カルシウムの減少、酸化窒素(NO)の増加、又は、ミオシンの軽鎖キナーゼを抑制することによって、粘膜下血管の弛緩をもたらす。血管拡張剤は一般に、9種のクラスに分けられる。すなわち、カルシウム拮抗剤、カリウムチャンネル開放剤、ACE阻害剤、アンギオテンシンII受容体拮抗剤、α-アドレナリン及びイミダゾール受容体拮抗剤、β1-アドレナリン拮抗剤、ホスフォジエステラーゼ阻害剤、エイコサノイド、及びNO供与体である。
【０１３８】
化学的違いがあるにも拘わらず、カルシウム拮抗剤の薬剤速度論的性質は近似する。全身循環への吸収は高く、従って、この薬剤は、肝臓において相当程度の第1関門通過代謝を受け、薬剤速度変化に個体差をもたらす。ジヒドロピリジン型の比較的新しい薬剤（アムロジピン、フェロジピン、イスラジピン、ニルバジピン、ニソルジピン、及びニトレンジピン）を除いては、カルシウム拮抗剤の半減期は短い。従って、上記薬剤の多くについて有効薬剤濃度を維持するためには、本明細書の別の場所に記載するように、複数回投与、又は調節放出処方による輸送が必要となるかも知れない。カリウムチャンネル開放剤ミノキシジルによる治療も、有害な副作用が考えられるので、投与法や投与レベルに制限を受ける。
【０１３９】
ACE阻害剤は、アンギオテンシンIからアンギオテンシンIIへの転換を阻止するので、レニン生産が増加している場合にはもっとも効果的である。ACEは、強力な、内因性血管拡張剤ブラディキニンを不作動するキナーゼIIと同一なので、ACE抑制は、ブラディキニン分解の低下を招く。ACE阻害剤はさらに、動物モデルにおいて、心臓線維症及び心室肥大を阻止・逆転することによって心臓保護及び心臓修復作用を持つという、上記に加えて他の利点を持つ。大抵のACE阻害剤の主要な排除経路は腎臓排泄を通じてである。従って、腎障害は排泄低下と関連するので、中等から重度の腎障害を持つ患者には25から50%の用量低下が奨められる。
【０１４０】
NO供与体に関して言うと、これらの化合物は、粘膜透過性に対してさらに作用を持つために本発明には特に有用である。前述のNO供与体の外に、NO/求核分子と呼ばれるNOと求核分子との複合体、或いはNONOエートは、生理的pHにおいて水溶液に溶解されると自発的に、酵素の仲介なしにNOを放出する。逆に、ニトログリセリンのようなニトロ血管拡張剤は、NO放出のために特定の酵素活性を必要とする。NONOエートは、定義された化学量論の下に、ジエチラミン／NOの＜3分からジエチレントリアミン／NO(DETANO)の約20時間までの範囲の、予測可能な速度でNOを放出する。
【０１４１】
本発明のある方法及び組成物では、選択される血管拡張剤は、共同投与（例えば、全身的又は鼻腔内に、同時に、又は効果的な組み合わせによる時間的関連において）、或いは、被験者の標的組織又は区画（例えば、肝臓、肝臓の門脈、CNS組織又は液、又は血漿）に達するために、活性成分（単複）の粘膜吸収を強化するのに有効な量として、1種以上のY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及びその他の活性剤と共に混合処方される。
【０１４２】
選択的輸送強化剤及び方法
本発明の組成物及び輸送法は、選択的に、1種以上の生物学的活性剤の輸送を促進する選択的輸送強化剤を含む。この輸送強化剤は、本明細書に開示される、1種以上のY2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体との混合処方、又は共同投与に採用されてもよい。これは、粘膜の輸送障壁を横断する、さらに1種以上の生物学的活性剤（単複）の輸送を共同的に強化し、被験者の標的組織又は区画（例えば、粘膜上皮、肝臓、CNS組織又は液、又は血漿）に達するように活性剤（単複）の粘膜輸送を強化するためである。別態様として、輸送強化剤は、追加の生物学的活性剤の輸送強化の実現のある無しを問わず、1種以上のY2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体の粘膜輸送を直接強化するために、混合処方又は共同投与の中に採用されてもよい。
【０１４３】
本発明のこの面において使用される、例示の選択的輸送強化剤としては、グリコシド、糖含有分子、及び、結合剤、例えば、上皮の輸送障壁成分と特異的に相互作用を持つことが知られるレクチン結合剤が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。例えば、受容体仲介性相互作用によって細胞表面の機能基に結合する、各種植物及び細菌レクチンを含む、特定の「生体粘着性」リガンドは、本発明における生物学的活性剤の粘膜、例えば、鼻粘膜輸送を強化するための担体、又は接合輸送仲介剤として採用が可能である。本発明に使用されるある種の生体接着性リガンドは、上皮標的細胞に対する生物シグナルの伝達を仲介し、シグナルは、特別の細胞輸送過程（エンドサイトーシス又はトランスサイトーシス）による選択的取り込みを誘発する。従って、これらの輸送仲介剤は、1種以上のY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及びその他の活性剤の、粘膜上皮への侵入及び／又は経由による選択的取り込みを刺激又は指示する。上記及びその他の選択的輸送強化剤は、本発明における巨大分子生体製薬（特にペプチド、タンパク、オリゴヌクレオチド、及びポリヌクレオチド）の粘膜輸送を著明に強化する。レクチンは、真核細胞の糖タンパク及び糖脂質の表面に見られる特定の糖類に結合する植物タンパクである。レクチンの濃縮液は、「粘液吸収」作用を持ち、かつ、様々の研究によって、粘膜表面を横断する、レクチン及びレクチン接合体（例えば、金のコロイド粒子に接合するコンカナバリンA）の、急速な受容体仲介性エンドサイトーシス（RME）が明らかになった。その後の研究により、レクチンの摂取機構は、インビボにおける小腸薬剤照準行動のために利用が可能であることも報告された。上記研究のあるものでは、ポリスチレンナノ粒子（500 nm）を、トマトレクチンに共有的に結合させたところ、ラットに対する経口投与後、全身摂取の改善が報告されている。
【０１４４】
植物レクチンの外に、微生物接着及び侵入因子が、本発明の粘膜輸送法及び組成物における接着的／選択的輸送担体として使用される、候補剤の豊かな供給源を提供する。細菌の接着過程には二つの成分が必要である。すなわち、細菌の「アドヘジン」（接着又はコロニー化因子）及び宿主の細胞表面における受容体である。粘膜感染を引き起こす細菌は、自らを上皮表面に付着させる前に、粘液層を浸透する必要がある。この付着は、通常、細菌の総又は毛髪構造によって仲介される。もっともこの過程には、他の細胞表面成分も参加する可能性がある。接着性細菌は、シグナル変換機構（毒素の助けを借りる場合もあるし、借りない場合もある）を通じて、標的細胞の内部で一連の生化学的反応を増幅し、起動することによって、粘膜上皮を集団化する。この侵襲的機構と関連して、もともと細菌及びウィルスによって生産される、多彩な生体接着性タンパク（例えば、インバジン、インテルナリン）が知られる。上記によって、宿主及び、特定の標的組織にとっても驚くべき選択性をもって微生物の細胞外付着が可能とされる。この受容体−リガンド相互作用によって伝達されるシグナルは、エンド−及びトランスサイトーシス過程によって、無傷な、生きたままの微生物の、上皮細胞中への、最終的には該細胞を貫く輸送を起動する。この天然現象は、粘膜上皮の侵入又は経由による、及び／又は、薬剤活動の他の表示の標的部位に向けた、生物学的活性剤の輸送強化のために、本明細書の教示に合わせて締め付けることによって（例えば、Y2受容体結合ペプチドのような生物学的活性剤をアドヘジンとを複合体形成することによって）好ましい方向に振り向けることをが可能である。
【０１４５】
特異的なレクチン様やり方で上皮表面に結合する、各種細菌毒素及び植物毒素も、本発明の方法及び組成物にとって有用である。例えば、ジフテリア毒素（DT）は、RMEによって速やかに宿主に侵入する。同様に、E. coliの熱感受性毒素のBサブユニットも、極めて特異的なレクチン様のやり方で小腸上皮細胞のブラシ辺縁に結合する。この毒素の取り込み、及び小腸細胞の基底側面におけるトランスサイトーシスが、インビボでもインビトロでも報告されている。他の研究者は、E. coliにおけるジフテリア毒素の膜貫通ドメインが、マルトース結合融合タンパクであり、高分子量ポリ-L-リシンに化学的結合することを述べている。このようにして得られた複合体を用いると、インビトロにおいてリポーター遺伝子の細胞内取り込みを仲介させることができた。上記の例に加えて、Staphylococcus aureusも1組のタンパク（例えば、ブドウ球菌エンテロトキシンA（SEA）、SEB、毒性ショック症候群毒素1（TSST-1））を生産する。これらは、スーパー抗原としても毒素としても働く、これらのタンパクに関する実験は、Caco-2細胞においてSSB及びTSST-Iのトランスサイトーシスが用量依存的に促進されることを報告している。
【０１４６】
ウィルスの血球凝集素も、本発明の方法及び組成物において生物学的活性剤の粘膜輸送を促進する別のタイプの輸送剤を含む。多くのウィルス感染の最初のステップは、表面タンパク（血球凝集素）の粘膜細胞に対する結合である。この結合タンパクは、ロタウィルス、水痘-帯状疱疹ウィルス、セムリキ森林ウィルス、アデノウィルス、ジャガイモ葉巻病ウィルス、及びレオウィルスを含む大抵のウィルスにおいて特定されている。上記及びその他の例示のウィルス血球凝集素は、本明細書に開示される、1種以上のY2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体との混合処方（例えば、混合又は接合処方）、又は共同プロトコルに採用してもよい。これは、さらに1種以上の生物学的活性剤（単複）の粘膜輸送を共同的に強化するためである。別態様として、ウィルス血球凝集素は、追加の生物学的活性剤の輸送強化の実現のある無しを問わず、1種以上のY2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体の粘膜輸送を直接強化するために、混合処方又は共同投与の中に採用してもよい。
【０１４７】
本発明において使用されるために、各種内因性、選択的輸送仲介因子の利用が可能である。哺乳類細胞は、特定の基質を取り込み、これらを定められた区画に仕分けるのを促進するために1式の機構を発達させている。全部まとめて、この膜変形過程は「エンドサイトーシス」と呼ばれ、ファゴサイトーシス、ピノサイトーシス、受容体仲介エンドサイトーシス（クラスリン仲介RME）、及びポトサイトーシス（非クラスリン仲介RME）を含む。RMEは、極めて特異的な細胞性生物過程である。その名前が示すように、この過程によって、様々なリガンドが細胞表面の受容体に結合し、次に、内部に取り込まれ、細胞内で仕分けられる。多くの細胞において、エンドサイトーシス過程は極めて活発であり、全膜表面が、30分以内に内部に取り込まれ交換される。細胞膜における方向性に基づいて、二つのクラスの受容体が提案されている。I型のアミノ末端は、膜の細胞外側に配されるが、一方、II型受容体は、この同じタンパク尾部を細胞内環境の中に持つ。
【０１４８】
本発明のさらに別の実施態様は、経粘膜的輸送される生物学的活性剤の担体として、或いはRME刺激因子としてトランスフェリンを利用する。トランスフェリンは80 kDaの鉄輸送糖タンパクであるが、これは、RMEによって効率的に細胞に取り込まれる。トランスフェリン受容体は、大抵の増殖細胞の表面、赤芽球や多種類の腫瘍細胞には多数が認められる。トランスフェリン(Tf)及びトランスフェリン複合体のトランスサイトーシスは、Brefeldin A(BFA)、真菌代謝産物の存在下に強化されることが報告されている。別の研究では、BFA処置は、MDCK細胞において、リシンとHRPの両方の、細胞頂上におけるエンドサイトーシスを急速に増大することが報告されている。従って、受容体仲介輸送を刺激するBFA及びその他の薬剤は、Y2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体を含む、生物学的活性剤の受容体仲介輸送を強化するために、混合投与（例えば、接合されて）、及び／又は、共同投与される薬剤として、本発明の方法に採用することが可能である。
【０１４９】
ポリマー輸送媒体及び方法
本発明のある面では、本明細書に開示される、Y2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体、他の生物学的活性剤は、担体又は基材として機能する生体適合性ポリマーを含む、経粘膜（例えば、鼻粘膜）投与処方の中に、個別に、又は、混合物として取り込まれる。このようなポリマー担体としては、いろいろのポリマー形のある中で特に、ポリマーの粉末、マトリックス、又は、微粒子輸送媒体が挙げられる。ポリマーは、植物、動物、又は合成起源のものであってもよい。多くの場合、ポリマーは架橋結合される。さらに、この輸送システムでは、Y2受容体結合ペプチド、類縁体又は擬似体は、ポリマーに共有的に結合され、簡単に洗浄したくらいではポリマーから分離されないようなやり方で機能化されてもよい。他の実施態様では、ポリマーは、生物学的活性剤（単複）及び／又は輸送強化剤（単複）を分解又は不作動する可能性のある、酵素又はその他の薬剤の阻害剤によって化学的に修飾されてもよい。ある処方では、ポリマーは、部分的に、又は完全に水に不溶ではあるが、水で膨潤するポリマー、例えば、ヒドロゲルである。本発明のこの面において有用なポリマーは、望ましくは水と相互作用を持ち、及び／又は、親水性を持ち、十分な量の水を吸収するものであって、多くの場合、水又は水性媒体に、水と平衡に達するほど十分な時間接触するとヒドロゲルを形成する。さらに詳細な実施態様では、ポリマーは、過剰な水に接触すると、水に室温で暴露された場合、平衡時にはその重量の少なくとも2倍の水を吸収するヒロドゲルである。米国特許第6,004,583号を参照されたい。
【０１５０】
多くの生物医学的応用では、生物分解性ポリマーに基づく薬剤輸送システムが好ましい。なぜなら、このようなシステムは、加水分解又は酵素反応によって、無害の分子に分解されるからである。分解速度は、生物分解性ポリマーマトリックスの組成を操作することによって調節される。従って、このタイプのシステムは、生物学的活性剤の長期の放出が必要とされるある状況で用いられる。ポリ（グリコール酸）(PGA)、ポリ（乳酸）(PLA)、及びポリ(D,L-乳酸-コ-グリコール酸)（PLGA）のような生物分解性ポリマーは、予想される薬剤輸送担体として相当の注目を集めた。なぜなら、これらのポリマーの分解産物の毒性は低いことが判明したからである。生体が正常な代謝機能を営んでいる間は、これらのポリマーは分解して二酸化炭素と水になる。これらのポリマーはまた、優れた生体適合性を示す。
【０１５１】
本明細書に開示される、Y2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体、他の生物学的活性剤を始め、任意に用いられる輸送強化剤の生物活性を引き延ばすために、これらの薬剤を、ポリマーマトリックス、例えば、ポリオルトエステル、ポリアンヒドリド、又はポリエステルの中に取り込んでもよい。これによって、例えば、ポリマーマトリックスの分解によって定められるように、活性成分（単複）の持続活性及び放出が得られる。合成ポリマー内へ生体治療分子を封入すると、それらの分子は、保存及び輸送の際に安定化されるけれども、ポリマー依存放出技術の最大の障害は、多くの場合、加熱、超音波処理、又は有機溶媒を用いる処方過程の際に、治療分子の活性損失が生じることである。
【０１５２】
本発明において使用が考えられる吸収促進ポリマーとしては、天然又は合成ポリマー、ゴム、樹脂、及びその他の薬剤の外に、前述のタイプのポリマーの誘導体、及び、化学的又は物理的に改変した修飾バージョンを始め、これらの材料と、他の一つのポリマー、又は複数のポリマーとの混合物が挙げられる。ただし、その改変、修飾、又は混合は、有効な応用に必要な、所望の性質、例えば、水吸収、ヒドロゲル形成、及び／又は、化学的安定性に悪影響を及ぼしてはならない。本発明のさらに詳細な実施態様では、ナイロン、アクリランのようなポリマー、及びその他の正常では疎水性の合成ポリマーは、反応によって、水膨潤性となるように、及び／又は、水性溶媒において安定なゲルを形成するように十分に修飾してもよい。
【０１５３】
本発明の吸収促進ポリマーは、下記のビニルモノマーの各種結合に基づくホモ-及びコポリマーから成る群から選択されるポリマーを含んでもよい。そのビニルモノマーとはすなわち、アクリル及びメタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート又はメタクリレート、ビニルピロリドンを始め、ポリビニルアルコール及び、その、上に挙げたモノマーとのコ-及びターポリマー、ポリビニルアセテート及び、その、上に挙げたモノマーとのコ-及びターポリマー、及び、2-アクリルアミド-2-メチル-プロパンスルホン酸(AMRS（登録商標）)である。極めて有用なのは、上に挙げたモノマーと、コポリマー形成可能な官能モノマー、例えば、アクリル又はメタクリルアミドアクリレート、又はメタクリレートエステル；ステロイド、硫酸、リン酸、又は陽イオンモノマー、例えば、N,N-ジメチルアミノアルキル（メタ）クリルアミド、ジメチルアミノアルキル（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルオキシアルキルトリメチルアンモニウム・クロリド、（メタ）アクリルオキシアルキルジメチルベンジル・アンモニウム・クロリドである。なお、前記メタクリレートエステルでは、エステル基は、直鎖又は分枝鎖のアルキルから得られ、アリール基は、1から4個の炭素原子から成るアルキル置換基を含む最大4個の芳香環を持つ。
【０１５４】
本発明で用いられる、さらに別の吸収促進ポリマーは、デキストラン、デキストリンとして分類されるもの、及び、天然ゴム及び樹脂と分類されるもの、又は、天然ポリマークラス由来のものがある。天然ポリマークラス由来のものとしては、例えば、加工コラーゲン、キチン、キトサン、プララン、ズーグラン、アルギン酸塩、及び、「ケルコロイド」（ポリプロピレングリコール修飾アルギン酸）のような修飾アルギン酸塩、「ケルコゲル」のようなゲランゴム、「ケルトロール」のようなキサナサンゴム、エスタスチン、アルファヒドロキシブチレートとそのコポリマー、ヒアルロン酸とその誘導体、ポリ乳酸及びグリコール酸がある。
【０１５５】
本発明で運用が可能な、極めて有用なポリマーのクラスは、少なくとも1個の作動された、炭素対炭素オレフィン不飽和結合と、少なくとも１個のカルボキシル基を含む、オレフィン不飽和カルボン酸である。すなわち、カルボキシル基に関してアルファ-ベータ位置に、又は、末端メチレン基の一部としてモノマー分子として存在するために、重合化において簡単に機能するオレフィン二重結合を含む酸にすぐに変換される、酸性又は官能基である。このクラスの、オレフィン的に不飽和な酸としては、アクリル酸そのもの、アルファシアノアクリル酸、ベータメチルアクリル酸（クロトン酸）で標識されるアクリル酸；アルファフェニルアクリル酸、ベータアクリルオキシプロピオン酸、ケイ皮酸、p-クロロケイ皮酸、1-カルボキシ-4-フェニルブタジエン-1,3-イタコン酸、シトラコン酸、メサコン酸、グルタコン酸、アコニチン酸、マレイン酸、フマール酸、及び、トリカルボキシエチレンのような物質が挙げられる。本明細書で用いる「カルボン酸」という用語は、ポリカルボン酸、及び該酸の無水物、例えば、無水マレイン酸であって、その無水物基は、同じカルボン酸分子上に配される二つのカルボキシル基から1分子の水を除去することによって形成されることを特徴とする酸の無水物を含む。
【０１５６】
本発明において吸収促進剤として有用な代表的アクリル酸塩としては、メチルアクリル酸、エチルアクリル酸、プロピルアクリル酸、イソプロピルアクリル酸、ブチルアクリル酸、イソブチルアクリル酸、メチルメタクリル酸、メチルエタクリル酸、エチルメタクリル酸、オクチルアクリル酸、ヘプチルアクリル酸、オクチルメタクリル酸、イソプロピルメタクリル酸、2-エチルヘキシルメタクリル酸、ノニルアクリル酸、ヘキシルアクリル酸、n-ヘキシルメタクリル酸等が挙げられる。比較的高級なアルキルアクリル・エステルとしては、デシルアクリル酸、イソデシルアクリル酸、ラウリルアクリル酸、ステアリルアクリル酸、ベヘニルアクリル酸、及びメリシルアクリル酸、及び、そのメタクリル酸バージョンがある。2種、又は3種以上の長鎖アクリルエステルの混合物も、前記のカルボン酸モノマーの内の一つと重合させることが可能である。他のコモノマーとしては、オレフィン類であって、アルファオレフィン、ビニルエーテル、ビニルエステル、及びそれらの混合物が挙げられる。
【０１５７】
アクリルニトリルを含む、他のビニリデンモノマーも、被験者の標的組織又は区画（例えば、肝臓門脈、CNS組織又は液、又は血漿）に対する活性剤（単複）の輸送の強化を含む、1種以上のY2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体、及び他の生物学的活性剤（単複）の輸送と吸収を強化するために、本発明の方法及び組成物における吸収促進剤として使用してよい。有用なアルファ、ベータ-オレフィン的に不飽和なニトリルは、3から10個の炭素原子を持つ、好ましくはモノオレフィン的に不飽和なニトリルであって、例えば、アクリルニトリル、メタクリルニトリル等である。もっとも好ましいのは、アクリロニトリル及びメタクリロニトリルである。モノオレフィン的に不飽和なアミドを含む、3から35個の炭素原子を含むアクリル酸アミドも使用が可能である。代表的なアミドとしては、アクリルアミド、メタクリルアミド、N-t-ブチルアクリルアミド、N-シクロヘキシルアクリルアミド、高級アルキルアミドが挙げられる。高級アルキルアミドでは、窒素上のアルキル基は8から32個の炭素原子を含み、アクリルアミドは、4から10個の炭素原子を有するものを含む、アルファ、ベータ-オレフィン的不飽和カルボン酸のN-アルキロールアミド、例えば、N-メチロールアクリルアミド、N-プロパノールアクリルアミド、N-メチロールメタクリルアミド、N-メチロールマレイミド、N-メチロールマレアミン酸エステル、N-メチロール-p-ベンザミド等を含む。
【０１５８】
さらに別の有用な吸収促進物質は、2から18個の、好ましくは2から8個の炭素原子を含むアルファ-オレフィン；4から10個の炭素原子を含むジエン；ビニルエステル及びアリルエステル、例えば酢酸ビニル；ビニル芳香族化合物、例えば、スチレン、メチルスチレン、及びクロロスチレン；ビニルとアリルのエステル及びケトン、例えば、ビニルメチルエーテル及びメチルビニルケトン；クロロアクリレート；シアノアルキルアクリレート、例えば、アルファ-シナモメチルアクリレート、及びアルファ-、ベータ-、及びガンマ-シアノプロピルアクリレート；アルコキシアクリレート、例えば、メトキシエチルアクリレート；ハロアクリレート、例えば、クロロエチルアクリレート；ハロゲン化ビニル、塩化ビニル、塩化ビニリデン等；ジビニル、ジアクリレート、及びその他のポリ官能モノマー、例えば、ジビニルエーテル、ジエチレングリコール、ジエチレングリコールジアクリレート、エチレングリコールジメタクリレート、メチレン-ビス-アクリルアミド、アリルペンタエリスリトール等；ビス（ベータ-ハロアルキル）アルケニルホスフォネート、例えば、ビス（ベータ-クロロエチル）ビニルホスフォネート等があるが、これらはいずれも当業者には既知である。カルボキシ含有モノマーが希少成分であり、他方のビニリデンモノマーが主要成分であるコポリマーは、本明細書に開示される方法に従って簡単に調製することが可能である。
【０１５９】
本発明においてヒドロゲルが吸収促進剤として用いられる場合、これらは、アクリル酸及びメタクリル酸、アクリルアミド、メタクリルアミド、ヒドロキシエチルアクリレート(HEA)又はメタクリレート（HEMA）から成る群と、水と反応して膨潤性となるビニルピロリドンとの合成コポリマーから構成されてもよい。有用な、特に、ペプチド又はタンパクの輸送にとって有用なポリマーの、具体的な説明例としては、下記のタイプのポリマーがある。すなわち、（メタ）アクリルアミド及び0.1から99 wt.%の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリルアミド及び0.1-75 wt%の（メタ）アクリルオキシエチルトリメチルアンモニウムクロリド；（メタ）アクリルアミド及び0.1-75 wt%の（メタ）アクリルアミド；アクリル酸及び0.1-75 wt%のアルキル（メタ）アクリレート；（メタ）アクリルアミド及び0.1-75 wt%のAMPS.RTM（Lubrizol社の登録商標）；（メタ）アクリルアミド及び0.1-99% wt%のHEMA；（メタ）アクリルアミド及び0.1から75wt%のHEMAと0.1から99%の（メタ）アクリル酸；（メタ）アクリル酸及び0.1-99 wt%のHEMA；50モル%のビニルエーテル及び50モル%の無水マレイン酸；（メタ）アクリルアミド及び0.1から75 wt%の（メタ）アクリルオキシアルキジメチルベンジルアンモニウム・クロリド；（メタ）アクリルアミド及び0.1から99 wt%のビニルピロリドン；（メタ）アクリルアミド及び、50 wt%のビニルピロリドンと0.1-99.9wt%の（メタ）アクリル酸；（メタ９アクリル酸及び、0.1-75wt%のAMPS.RTM及び0.1-75 wt%のアルキル（メタ）アクリルアミドである。上記の例において、アルキルは、C1からC30の、好ましくはC1からC22の直鎖及び分枝鎖並びにC4からC16の環状を意味し、（メタ）が用いられる場合、それは、メチル基を持つモノマーも、持たないモノマーも含まれることを意味する。他の極めて有用なヒドロゲルポリマーとしては、ポリ（ビニルピロリドン）でん粉、カルボキシメチルセルロース、及びポリビニルアルコール等の膨潤可能ではあるが、不溶の変種がある。
【０１６０】
本発明において有用な、さらに別のポリマーヒドロゲル物質としては、（ポリ）ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート；陰イオン性及び陽イオン性ヒドロゲル；ポリ（電解質）複合体；低度のアセテート残基を有するポリ（ビニルアルコール）；架橋結合寒天及び架橋結合カルボキシメチルセルロースから成る膨潤可能な混合物；ほとんど架橋結合していない寒天と混じったメチルセルロースを含む膨潤性組成物；無水マレイン酸と、スチレン、エチレン、プロピレン、又はイソブチレンとのコポリマーであって、微細に粉砕されたコポリマーの分散によって生産される水膨潤性コポリマー；N-ビニルラクタムから成る水膨潤性ポリマー；カルボキシメチルセルロースの膨潤性ナトリウム塩等が挙げられる。
【０１６１】
本発明における生物学的活性剤の粘膜輸送用の親水性ヒドロゲルを形成するのに有用な、その他の、ゲル化可能な、流体吸収・保持性ポリマーとしては、ペクチン；ポリサッカリド、例えば、寒天、アカシア、カラヤ、トラガカント、アルギンとグア、及びそれらの架橋結合変異種；アクリル酸ポリマー、コポリマー、及び塩誘導体、ポリアクリルアミド；水膨潤性インデン無水マレイン酸ポリマー；でん粉グラフトコポリマー；元の重量の約2から400倍の水吸収性を持つ、アクリレート型ポリマー及びコポリマー；ポリグルカンのジエステル；架橋結合ポリ（ビニルアルコール）及びポリ（N-ビニル-2-ピロリドン）の混合物；ポリオキシブチレン-ポリエチレン・ブロックコポリマー・ゲル；カロブ・ガム；ポリエステルゲル；ポリ尿素ゲル；ポリエーテルゲル；ポリアミドゲル；ポリイミドゲル；ポリペプチドゲル；ポリアミノ酸ゲル；ポリセルロースゲル；架橋結合インデン-無水マレイン酸アクリレートポリマー；及びポリサッカリドが挙げられる。
【０１６２】
本発明において用いられる合成ヒドロゲルポリマーは、数種の比率の、数種のモノマーから成る無限の組み合わせによって製造される。ヒドロゲルは架橋結合することが可能で、一般に、流体を吸い込み、吸収して、膨張又は拡張して、拡大平衡状態を取る。典型的には、ヒドロゲルは、鼻粘膜表面に輸送された際に膨張又は拡張し、その重量の、約2-5、5-10、10-50、最大50-100又はそれ以上の倍数の水を吸収する。ある任意のヒドロゲルの膨張性の最適度は、様々な生物学的活性剤について、ポリマー内に捕捉又は封入された活性剤の分子量、サイズ、可溶性、及び分散性、及び、各ポリマーと関連する特異的空間及び協調鎖運動のような要因に応じて決定される。
【０１６３】
本発明において有用な親水性ポリマーは、水溶性であるが、水膨張性である。このような水膨張性ポリマーは通常ヒロドゲル又はゲルと呼ばれる。このようなゲルは、水溶性ポリマーを、適当な架橋剤によって架橋結合するという過程を経ることによって、水溶性ポリマーから好適に製造することが可能である。一方、安定なヒドロゲルは、従来技術で既知の方法に従って、ｐH、温度、及び／又は、イオン濃度の定められた条件の下で形成することが可能である。通常、ポリマーは架橋結合される、すなわち、ポリマーが良好な親水性を所有し、物理的安定性が向上し（同じ、又は類似のタイプの非架橋結合性ポリマーと比べて）、ゲルネットワーク内に、興味の生物学的活性剤と、それと共同投与される添加化合物、例えば、サイトカイン又は酵素阻害剤を保持する能力が向上し、しかし一方では、適当な場所及び時間において活性剤（単複）を放出する能力を保持するように架橋結合される。
【０１６４】
一般に、本発明に使用されるヒドロゲルポリマーは、コポリマーを形成するモノマーの重量に基づいて0.01から25重量パーセントの量として加えられた二重官能性架橋結合剤によって、より好ましくは0.1から20重量パーセント、さらに多くの場合0.1から15重量パーセントの架橋結合剤によって架橋される。架橋結合剤の別の有用な量は、0.1から10重量パーセントである。三重性、四重性、又はさらに高次の官能性架橋結合剤を用いてもよい。このような試薬を用いる場合、当量架橋密度、すなわち、架橋程度、或いは、生物学的活性剤（単複）を効果的に含有するのに十分なネットワーク密度を実現するのに必要とされる量は低くなる。
【０１６５】
架橋結合は、ポリマーが水含有流体の存在下で膨張する能力を所有する限り、共有結合、イオン結合、或いは水素結合であってもよい。このような架橋結合剤及び架橋結合反応は、当業者には既知であり、多くの場合、ポリマーシステムに依存する。従って、架橋結合ネットワークは、不飽和モノマーの、フリーラジカル共重合によって形成されてもよい。ポリマーヒロドゲルはまた、事前形成されたポリマーを、ポリマー上に認められる官能基、例えば、アルコール、酸、グリオキサル、ホルムアルデヒド又はグルタールアルデヒド、ビスアンヒドリド等の基同士を反応させることによって形成してもよい。
【０１６６】
ポリマーはまた、任意のポリエン、例えば、デカジエン又はトリビニルシクロヘキサン；アクリルアミド、例えば、N,N-メチレン-ビス（アクリルアミド）；ポリ官能性アクリレート、例えば、トリメチロールプロパントリアシレート；又は、少なくとも2個の末端CH2<基を含むポリ官能性ビニリデンモノマー、例えば、ジビニルベンゼン、ジビニルナフトレン、アリルアクリレート等によって架橋されてもよい。ある実施態様では、コポリマー調製において使用される架橋結合モノマーは、1分子当たり1個を超えるアルケニルエーテル基を有するポリアルケニルポリエーテルであって、オレフィン二重結合が、末端メチレン基に付着するアルケニル基（例えば、少なくとも2個の炭素原子と少なくとも2個のヒドロキシル基とを含む多価アルコールをエーテル化することによって製造される）を所有するポリアルケニルポリエーテルである。このクラスの化合物は、ハロゲン化アルケニル、例えば、アリルクロリド又はアリルブロミドを、1種以上の多価アルコールのアルカリ度の強い水溶液と反応させることによって製造してもよい。この産物は、ポリエーテルと、様々な数のエーテル基との複合混合物である場合がある。ポリエーテル架橋剤の効率は、分子上における重合可能な基の数と共に増加する。通常、分子当たり平均2個以上のアルケニルエーテル基を含むポリエーテルが使われる。その他の、架橋モノマーとしては、例えば、ジアリルエステル、ジメタリルエーテル、アリル又はメタリルアクリレート及びアクリルアミド、テトラビニルシラン、ポリアルケニルメタン、ジアクリレート、及びジメタクリレート、ジビニル化合物、例えば、ジビニルベンゼン、ポリアリルホスフェート、ジアリルオキシ化合物、及び亜リン酸エステル等が挙げられる。典型的な薬剤は、アリルペンタエリスリトール、アリルスクロース、トリメチロールプロパントリアクリレート、1,6-ヘキサンジオールジアクリレート、トリメチルプロパンジアリルエーテル、ペンタエリスリトールトリアクリレート、テトラメチレンジメタクリレート、エチレンジアクリレート、エチレンジメタクリレート、トリエチレングリコールジメタクリレート等である。アリルペンタエリスチトール、トリメチルプロパンジアリルエーテル、及びアリルスクロースは好適なポリマーである。架橋結合剤が存在する場合には、ポリマー混合物は通常、カルボン酸モノマープラス他のモノマーの合計に対して、約0.01から20重量パーセント、例えば重量にして1%, 5%, 10%以上の架橋性モノマーを含む。
【０１６７】
本発明のさらに詳細な面において、本明細書に開示される、Y2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体、他の生物学的活性剤の粘膜輸送は、徐放性、又は酵素的又は生理的保護担体又は媒体、例えば、活性剤を分解性酵素の活動から遮断するヒドロゲルにおいて活性剤（単複）を保持することによって強化される。ある実施態様では、活性剤は、付加的薬剤、例えば、酵素阻害剤、サイトカイン等が混合又は結合される担体又は媒体に対し、化学的手段によって結合される。活性剤は、別に、十分な物理的捕捉によって、担体又は媒体、例えば、ポリマーマトリックスの内部に固定されてもよい。
【０１６８】
本発明において有用なポリマー、例えば、ヒドロゲルは、本明細書に処方される活性剤の鼻腔内バイオアベイラビリティを強化するためのポリマーの中に化学的に取り込まれるグリコシドのような官能基結合剤を含んでいてもよい。このようなグリコシドの例としては、グルコシド、フルクトシド、ガラクトシド、アラビノシド、マンノシド、及びそれらのアルキル置換誘導体、及び、天然グリコシド、例えば、アルブチン、フロリジン、アミグダリン、ディジトニン、サポニン、及びインジカンがある。典型的なグリコシドをポリマーに結合させるにはいくつかのやり方がある。例えば、グリコシド、又は他の類似の炭水化物のヒドロキシル基の水素を、ヒドロゲルポリマーのアルキル基で置換して、エーテルを形成してもよい。また、グリコシドのヒドロキシル基を反応させて、ポリマーヒドロゲルのカルボキシル基をエステル化してインサイチューでポリメリックエステルを形成してもよい。もう一つのやり方は、マレイン酸のコポリマーにおいてアセトブロモグルコースとコレスト-5-エン-3ベータ-オールとの縮合を用いることである。N-置換ポリアクリルアミドは、下記のオメガ-アミノアルキルグリコシドと、作動ポリマーの反応によって合成することが可能である。すなわち、(1)（炭水化物-スペーサー）(n)-ポリアクリルアミド、「シュードポリサッカリド」；(2)（炭水化物スペーサー）(n)-ホスファチジルエタノールアミン(m)-ポリアクリルアミド、ネオ糖脂質、ホスファチジルエタノールアミンの誘導体；(3)（炭水化物スペーサー）(n)-ビオチン(m)-ポリアクリルアミドである。これらのビオチニル化誘導体は、粘膜表面のレクチンに付着し、生物学的活性剤、例えば、ポリマー封入Y2受容体結合ペプチドの吸収を促進する。
【０１６９】
本発明のさらに詳細な面では、本明細書に開示される1種又はそれ以上のY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び／又は、他の生物学的活性剤は、選択的に二次的活性剤、例えば、プロテアーゼ阻害剤（単複）、サイトカイン（単複）、細胞間接合部の生理の新たな修飾剤（単複）が修飾され、ポリマー担体又はマトリックスに結合される。例えば、これは、ペプチド又はタンパク活性剤及び他の任意に添加される薬剤（単複）を、架橋結合したポリマーネットワークの内部に化学的に結合させることによって実現してもよい。さらにまた、別に、グリコシド含有分子のような相互作用剤によってポリマーを化学的に修飾することも可能である。ある面では、生物学的活性剤（単複）、及び、任意に加えられる二次的活性剤(単複)に官能基付着させてもよい。その際、適当な反応基が特定されるか、又は、活性剤（単複）に化学的に付加される。もっとも多くの場合、エチレン性の、重合可能な基が付加され、次に、この官能基付加活性剤は、標準的な重合法、例えば、溶液重合（通常水中）、乳液、懸濁液、又は分散重合のような重合法によりモノマーと架橋剤によって共重合される。多くの場合、官能基付加剤には、活性剤（単複）上のいくつかの部位が官能基を確実に持つことができるように、十分に高濃度の官能基又は重合可能な基を与えられる。例えば、16個のアミン部位を含むポリペプチドでは、一般に、上記部位の内、少なくとも2、4、5、7、及び最大8個、又はそれ以上に官能基付加することが望ましい。
【０１７０】
官能基付加後、官能基付加活性剤（単複）は、モノマーと、対象のポリマーを形成する試薬を含む架橋剤と混合される。次に、この溶媒において重合が誘発され、結合活性剤（単複）を含むポリマーが形成される。次に、このポリマーを水又は他の適当な溶媒で洗い、さらに別のやり方で精製して、未反応の不純物を除去し、必要なら、物理的手段、例えば、攪拌、メッシュ濾し、超音波処理、或いはその他の適当な手段によって粉砕又は破砕して、所望の粒子サイズにする。次に、溶媒を、通常は水であるが、活性剤（単複）を変性しないように、或いは他のやり方で分解しないようにして除去する。一つの望ましい方法は、凍結乾燥（凍らせて乾燥する）であるが、他の方法も利用可能であり、使用してもよい（例えば、真空乾燥、空気乾燥、スプレイ乾燥等）。
【０１７１】
本発明におけるペプチド、タンパク、及び他の活性剤の中に重合可能な基を導入するには、利用可能なアミノ、ヒドロキシル、チオール、及びその他の反応基を、不飽和基を含む求核成分と反応させることが可能である。例えば、N-ヒドロキシスクシニミジル基を含む不飽和モノマー、活性炭酸塩、例えば、p-ニトロフェニルカーボネート、トリクロロフェニルカーボネート、トレシレート、オキシカルボニルイミダゾール、エポキシド、イソシアネート及びアルデヒド、及び不飽和カルボキシメチルアジド、及び不飽和オルトピリジル-ジスルフィドは、この範疇の試薬に属する。不飽和試薬の説明のための例としては、アリルグリシジルエーテル、アリルクロリド、アリルブロミド、アリルイオジド、アクリオイルクロリド、アリルイソシアネート、アリルスルホニルクロリド、無水マレイン酸、無水マレイン酸とアリルエーテルのコポリマー等がある。
【０１７２】
一般に、アルデヒドを除き、リシン活性誘導体は全て、他のアミノ酸、例えば、ヒスチジンのイミダゾール基、チロシンのヒドロキシル基、及びシスチンのチオール基と、局所環境がこれらの基の求核性を強化するものである場合、反応することが可能である。アルデヒド含有官能基付加試薬は、リシンに対して特異的である。リシン、システイン、チロシンの利用可能な基とのこのタイプの反応は、文献に広く記載されており、当業者には既知である。
【０１７３】
アミノ基を含む生物学的活性剤の場合、この基を、アシロイルクロリド、例えば、アクリロイルクロリドと反応させ、反応試薬に対し重合可能なアクリル基を導入すると好都合である。次に、ポリマーの調製中、例えば、アクリルアミドとアクリル酸のコポリマーの架橋結合時において、前記官能基付加活性剤は、アクリル基を介してポリマーに付着して、それに結合する。
【０１７４】
本発明のさらに別の面では、インビボで生物的活性を持つ、ペプチド、タンパク、ヌクレオシド、及びその他の分子を含む生物学的活性剤は、その構成成分として、親水性成分、例えば、直鎖ポリアルキレングリコールと、親油性成分の両方を含むポリマーに、1種以上の活性剤（単複）を共有的に結合することによって、接合体を形成して安定化される（例えば、米国特許第5,681,811号を参照されたい）。一つの面で、生物学的活性剤は、(i)直鎖ポリアルキレングリコール成分、及び、(ii)親油成分を含むポリマーと共有的に結合され、その際、活性剤、直鎖ポリアルキレングリコール成分、及び親油成分は、活性治療剤が、酵素分解に対するインビボ耐性が強化されるように（すなわち、同じ条件下における、結合するポリマーを欠いた非接合形における安定度と比べた場合の）相互に相対的な立体的位置に配される。別の面では、この接合体安定化処方は、(i)直鎖ポリアルキレングリコール成分、及び、(ii)親油成分を含むポリソルベート複合体と共有的に結合される生物学的活性剤を含む三次元配置を持ち、その際、活性剤、直鎖ポリアルキレングリコール成分、及び親油成分は、(a)親油性分は、三次元配置において外部的に利用が可能であり、かつ、(b)組成物の中の活性剤の酵素分解に対するインビボ耐性が強化されるように相互に相対的な立体的位置に配される。
【０１７５】
さらに一つの関連面では、複数リガンド接合複合体であって、トリグリセリドバックボーン成分と、トリグリセリドバックボーン成分の炭素原子に結合するポリアルキレングリコール・スペーサ基を介して共有的に結合する生物学的活性剤、及び、トリグリセリドバックボーン成分の炭素原子に直接共有的に付着するか、或いは、ポリアルキレングリコール・スペーサ基を介して接合する少なくとも1個の脂肪酸成分とを含む複合体が提供される（米国特許第5,681,811号参照）。この複数リガンド接合治療剤複合体では、トリグリセリド生体活性成分のアルファ及びベータ炭素原子は、直接共有的に接合するか、或いは、ポリアルキレングリコール・スペーサ成分を介して間接的に共有的に接合するかして脂肪酸を付着させる。それと別に、脂肪酸成分は、トリグリセリドバックボーン成分のアルファ及びアルファ´炭素に対して、直接にか、或いは、ポリアルキレングリコール・スペーサ成分を介して共有的に付着してもよい。その際、生体活性治療剤は、トリグリセリドバックボーン成分のガンマ炭素に、直接共有的にか、或いは、ポリアルキレンスペーサ成分を介して間接的に結合される。本発明の範囲内において、トリグリセリドバックボーンを含む複数リガンド接合治療剤複合体については、広範な構造的、組成的、及び立体配置的形態が可能であることが認識される。さらに、このような複数リガンド接合治療剤複合体では、生物学的活性剤（単複）は、トリグリセリド修飾バックボーン成分に対し、アルキル・スペーサ基を介して、或いは、本発明の範囲における他の受容可能なスペーサ基を介して、好適に、共有的に結合されることが注目される。この背景で用いられる場合、スペーサ基の受容性とは、立体的、組成的、末端運用特異的受容可能特性を指す。
【０１７６】
本発明のさらに別の面では、接合安定化複合体であって、ポリソルベート複合体を含み、該複合体はポリソルベート成分を含み、該成分はトリグリセリドバックボーンであって、そのアルファ、アルファ´、及びベータ炭素原子に、(i)脂肪酸基；及び、(ii)生物学的活性剤又は成分を共有的に結合させた、例えば、ポリエチレングリコール基の適当な官能基に結合させたポリエチレングリコール基、を結合させたトリグリセリドバックボーンを含む、このように構成される接合安定化複合体が提供される。この共有結合は、直接的に、例えば、ポリエチレングリコール基の末端のヒドロキシ官能基に対して為されてもよいし、或いは別に、共有結合は、間接的に、例えば、ポリエチレングリコール基のヒドロキシ末端に対し反応的に、末端カルボキシル官能スペーサ基を被せ、それによって、そのキャップされたポリエチレングリコール基が、生物学的活性剤又は成分が共有的に結合することが可能な、末端カルボキシル官能基を持つように為されてもよい。
【０１７７】
本発明のさらに別の面では、安定で、水溶性の、接合安定化複合体であって、生理的に適合的なポリエチレングリコール(PEG)修飾糖脂質成分に共有的に結合した、本明細書に開示される1種以上のY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び／又は、他の生物学的活性剤（単複）を含む、接合安定化複合体が提供される。この複合体では、生物学的活性剤(単複)は、活性剤の遊離アミノ基における弱い共有結合によって、生理的に適合したPEG修飾糖脂質成分に共有的に結合してもよい。この弱い共有結合は、インビボにおいて、生化学的加水分解及び／又はタンパク分解によって分断が可能である。生理的に適合したPEG修飾糖脂質成分は、好適には、ポリソルベートポリマー、例えば、モノパルミテート、ジパルミテート、モノラウレート、ジラウレート、トリラウレート、モノオレエート、ジオレエート、トリオレエート、モノステアレート、ジステアレート、及びトリステアレートから成る群から選択される脂肪酸エステル基を含むポリソルベートポリマーを含む。この複合体では、生理的に適合的なPEG修飾糖脂質成分は、好適には、脂肪酸のポリエチレングリコールエーテル、及び脂肪酸のポリエチレングリコールエステルから成る群から選択されるポリマーを含む。その際、脂肪酸は、例えば、ラウリン酸、パルミチン酸、オレイン酸、及びステアリン酸の中から選択される脂肪酸を含む。
【０１７８】
材料の保存
本発明のある面では、本明細書に記載される混合処方及び／又は共同投与法は、有効量のペプチド及びタンパクを含むが、これらは、荷電ガラスに付着して、容器の中の有効濃度を低減させる可能性がある。ガラス容器に対するポリペプチド又はタンパクの付着を低減するために、最終製品を保存するには、シラン化容器、例えば、シラン化ガラス容器が用いられる。
【０１７９】
本発明のさらに別の面では、哺乳類被験体治療用キットは、哺乳類被験体に対する粘膜輸送用に処方された、1種以上のY2受容体結合ペプチド化合物（単複）から成る安定な製薬組成物を含み、組成物は、受容し難い有害な副作用をもたらすことなく、前記被験体において肥満症、ガン、又はガンと関連する栄養不良又は消耗の内の1種以上の症状（単複）を緩和するのに有効である。キットはさらに、1種以上のY2受容体結合ペプチド化合物を含む製薬試薬瓶を含む。この製薬試薬瓶は、製薬級ポリマー、ガラス、又はその他の好適な材料から構成される。製薬試薬瓶は、例えば、シラン化ガラス瓶である。キットはさらに、組成物を、被験者の鼻粘膜表面に輸送するための開口部を含む。輸送開口は、製薬級ポリマー、ガラス、又はその他の好適な材料から構成される。輸送開口は、例えば、シラン化ガラス瓶である。
【０１８０】
シラン化技術は、シラン化される表面に対する特別の洗浄技術と、低圧におけるシラン化過程とを組み合わせる。シランは気体相としてあり、シラン化される表面に対して高温である。この方法により、単層の特性を持つ、安定、均一、及び機能的シラン層を持つ再現可能な表面が得られる。シラン化表面によって、本発明のポリペプチド又は粘膜輸送強化剤の、ガラスへの付着が阻止される。
【０１８１】
本発明のY2受容体結合ペプチド組成物を保持するためのシラン化製薬瓶を調製する過程は有用である。ガラストレイを、使用前に2回蒸留水（ddH2O）で濯いで洗浄する。次に、このシラントレイを95% EtOHで濯ぎ、アセトントレイをアセトンで濯ぐ。製薬試薬瓶をアセトン中で10分間超音波処理する。アセトン超音波処理後、試薬瓶をddH2O中で少なくとも2回洗浄する。試薬瓶を0.1M NaOH中で10分超音波処理する。試薬瓶をNaOH中で超音波処理している間、シラン液をフード下で調製する。（シラン液：800 mLの95%エタノール；96 Lの氷酢酸；25 mLのグリシドキシプロピルトリメトキシ・シラン）。NaOH超音波処理後、試薬瓶をddH2Oトレイ中で少なくとも2回洗浄する。試薬瓶をシラン液にて3から5分洗浄する。試薬瓶を100% EtOHトレイにて洗浄する。この試薬瓶を、あらかじめ精製したN2ガスにて乾燥し、使用前に少なくとも2時間100℃オーブンにて保存する。
【０１８２】
生体接着性輸送媒体及び方法
本発明のある面では、本明細書に記載される混合処方及び／又は共同投与法は、1種以上の生物学的活性剤（単複）の粘膜輸送を強化するために、補助化合物又は担体として有効量の非毒性生体接着剤を含む。この意味における生体接着剤は、標的粘膜の1種以上の成分又は表面に対し、全体的、又は特異的接着性を示す。生体接着剤は、粘膜上皮への侵入又は貫通に向けて大型分子（例えば、ペプチド及びタンパク）の浸透を確保するために、粘膜中に、又は横断して、生物学的活性剤の所望の濃度勾配を維持する。通常、本発明の方法及び組成物において生体接着剤を用いると、粘膜上皮の侵入又は貫通におけるペプチド及びタンパクの透過性は、2から5倍、多くの場合5から10倍増加する。このように上皮浸透が強化されることで、大型分子の、例えば、鼻粘膜上皮の基底部分、又は、隣接の細胞外区画、或いは、血漿又はCNS組織又は液に対する効果的な経粘膜輸送が多くの場合可能となる。
【０１８３】
この輸送強化によって、生体活性ペプチド、タンパク、及びその他の巨大分子治療分子輸送の有効性が大きく改善される。この結果は、一部は、化合物の親水性に依存する。なぜなら、水に不溶の化合物と比べて、親水性分子ではより高い浸透が実現されるからである。上記の効果に加えて、粘膜表面における薬剤の滞在を強化するために生体接着剤を用いることは、薬剤輸送の引き延ばしのための貯留機構を提供することになる。なぜなら、化合物は、粘膜組織に浸透するだけでなく、表面の物質が消失した場合、粘膜表面へ向けて戻り拡散するからである。
【０１８４】
経口投与のための、様々な好適な生体接着剤が、下記の従来技術において開示されている。米国特許第3,972,995、4,259,314、4,680,323、4,740,365、4,573,996、4,292,299、4,715,369、4,876,092、4,855,142、4,250,163、4,226,848、4,948,580号、米国特許再発行第33,093号。これらは、本発明の新規の方法及び組成物において使用が可能である。本発明の方法及び組成物における、粘膜、例えば、鼻粘膜輸送促進剤としての、各種生体接着ポリマーの有用性は、Y2受容体結合ペプチドの保持及び放出能力の外に、その中に活性剤を取り込んだ後における粘膜表面と相互作用を持つ能力を調べることによって簡単に評価することが可能である。さらに、選択されたポリマーの、粘膜投与部位における組織との生体適合性を調べるには、良く知られた方法が用いられる。標的粘膜が粘液で覆われている場合（すなわち、粘液分解又は粘液排除処置が為されない場合）、ポリマーは、下層の粘膜上皮に対する結合リンクとなることができる。従って、本明細書で用いる「生体接着性」という用語は、本発明において生物学的活性剤の粘膜輸送を強化するのに有用な粘液接着性化合物も含む。しかしながら、粘液ゲル層への接着を介する粘膜組織への接着性接触は、粘液層と下部組織の間の不完全な、又は一過性の付着によって、特に、速やかな粘液排除が行われる鼻粘膜表面では制限される。この点、ムチン糖タンパクは連続的に分泌され、細胞又は腺から放出直後に粘弾性ゲルを形成する。しかしながら、接着性ゲル層の鼻腔対向面は、機械的、酵素的、及び／又は繊毛活動によって絶えず侵食される。このような活動がさらに著明な場合、或いは、さらに長期の接着時間が望ましい場合、本発明の共同投与法及び混合処方はさらに、本明細書において上に開示したような粘液分解及び／又は繊毛静止法又は薬剤を含んでもよい。
【０１８５】
通常、本発明において使用される粘液接着性ポリマーは、複雑な、しかし非特異的な機構によって、濡れた、粘液組織表面に接着する、天然又は合成の巨大分子である。上記粘液接着性ポリマーの外に、本発明はさらに、受容体介在性のものを含む特定の相互作用によって、粘液にではなく、細胞表面に直接接着する生体接着剤を含む方法及び組成物を提供する。この特定のやり方で機能する生体接着剤の一つの例として、レクチンという名の一群の化合物がある。これは、鼻腔上皮細胞膜の一部を形成し、「レクチンリポーター」と見なすことのできる糖分子、例えば、糖タンパク又は糖脂質を特異的に認識し、それに結合する能力を持つ糖タンパクである。
【０１８６】
本発明のある面では、生物学的活性剤の鼻腔内輸送を強化するための生体接着性物質は、親水性、例えば、水溶性又は水膨張性の、濡れた粘液面に接着することが可能なポリマー、又はポリマー混合物を含む。これらの接着剤は、軟膏、ヒドロゲル（上記参照）薄層フィルム、及びその他の塗布用形態を持つように処方されてもよい。多くの場合、これらの接着剤は、生物学的活性剤と混合されて、活性剤の徐放又は局所輸送を実現する。あるものは、活性剤の鼻粘膜経由の浸透、例えば、個人の循環系への浸透を促進するために別の成分と一緒に処方される。
【０１８７】
天然のものであれ、合成のものであれ、各種ポリマーは、生理的条件下において、粘液及び／又は粘膜上皮表面に対し著明な結合性を示す。この相互作用の強度は、機械的剥離又はせん断試験によって簡単に測定が可能である。湿潤な粘膜表面に塗布されると、多くの乾燥物質は、少なくとも僅かばかりは自発的に接着する。この最初の接触後、ある疎水性物質は、吸着、膨潤、又は毛細管力によって水を吸収し始めるが、この水が、下層の基盤、又はポリマー・組織界面から吸収されたものであるならば、この接着は、生物学的活性剤の粘膜吸収を強化するという目標を達するのに十分と考えられる。この「水和による接着」は極めて強力である場合があるが、この機構を採用するのに適応した処方は、投与剤が水和粘滑剤に変形した後も続く膨潤を処理しなければならない。これは、本発明において有用な多くの親水コロイド、特に、あらかじめ水和状態で塗布した場合には一般に非接着性であるいくつかのセルロース誘導体には当てはまる。にも拘わらず、粘膜投与用生体接着性薬剤輸送システムは、このような物質が、ポリマーの乾燥粉末、微小球、又は薄層フィルム輸送形として塗布される場合は、本発明において有効である。
【０１８８】
前記のポリマーの外に、乾燥時に塗布された時ばかりでなく、完全に水和状態でも、過剰な水の存在下でも粘膜表面に接着するポリマーもある。従って、粘液接着剤の選択には、組織への接触が形成され、維持される、生理的ばかりでなく、物理化学的状態に対しても十分な考慮を払うことが必要となる。特に、意図する接着部位に通常存在する水又は水分の量、及び優勢pHは、各種ポリマーの粘液接着性結合強度に大きく影響することが知られている。
【０１８９】
過去20年間に、ポリマー生体接着薬剤輸送システムがいくつか製造され、研究されてきたが、その全てが成功したわけではなかった。しかしながら、このような様々な担体が現在、歯科、整形外科、眼科、及び外科使用を含む臨床用途において用いられている。例えば、アクリル系ヒドロゲルは、生体接着装置のために広範に使用されている。アクリル系ヒドロゲルは、部分的膨張状態における屈曲性と、接触する組織に対する損傷原因となる摩擦が少ない非磨耗性のために生体接着に好適である。さらに、アクリル系ヒドロゲルは、膨張状態において高度の透過性を持つので、未反応モノマー、架橋結合しないポリマー鎖、及び、起動剤が、重合化の後マトリックスから洗い流されるのを可能にする。これは、本発明において使用される生体接着物質の選択にとって重要な特質である。アクリル系ポリマー装置は、極めて高い接着結合強度を示す。ペプチド及びタンパクの調節的粘膜輸送を実現するためには、本発明の方法及び組成物は、任意に、担体、例えば、ポリマー輸送媒体の使用を含む。この媒体は、一部は、生物学的活性剤を、タンパク分解による破壊から遮蔽し、一方同時に、ペプチド又はタンパクの、鼻粘膜に対する侵入又は貫通に向けて浸透強化を実現する。この意味において、生体接着性ポリマーは、経口薬剤輸送の強化において相当の有用性を示している。一例として、9-デスグリシナミド、8-アルギニンバソプレッシン(DGAVP)を、1%(w/v)の粘液接着性ポリ（アクリル酸）誘導体ポリカルボフィルと共にラットの十二指腸内に投与したところ、DGAVPのバイオアベイラビリティは、このポリマー無しのペプチド水溶液と比べて3-5倍増加していた。
【０１９０】
ポリ（アクリル酸）タイプの粘液接着性ポリマーは、いくつかの小腸プロテアーゼの強力な阻害剤である。酵素抑制の機構は、このクラスのポリマーの二価陽イオン、例えば、カルシウム又は亜鉛に対する強力な親和性によって説明される。すなわち、カルシウム、及び亜鉛は、トリプリシン及びキモトリプシンのような金属結合プロテイナーゼの必須の補因子である。ポリ（アクリル酸）によってプロテアーゼからその補因子を取り除くと、酵素活性の喪失を伴う、酵素タンパクの非可逆的構造変化を引き起こすことが報告されている。同時に、ある種の粘液接着ポリマー（例えば、あるセルロース誘導体及びキトサン）は、ある条件下ではタンパク分解酵素を抑制しない。他の酵素阻害剤と違って、本発明において使用が考慮される、比較的小型の分子である（例えば、アプロチニン、ベスタチン）抑制ポリマーでは、それらの分子のサイズから見て、それら抑制ポリマーの経鼻粘膜吸収は極小と考えられ、そのために、有害の副作用の可能性は除去される。従って、粘液接着性ポリマー、特に、ポリ（アクリル酸）型のポリマーは、特に安全性の不安が考えられる際に、ペプチド及びタンパク薬剤の調節輸送を強化するに当たり、吸収促進性接着剤としても、酵素保護剤としても役立つと考えられる。
【０１９１】
酵素分解に対する保護の外に、本発明において使用される、生体接着剤及び、その他のポリマー、又は非ポリマー吸収促進剤は、生物学的活性剤に対する粘膜透過性を直接増す可能性がある。ペプチド及びタンパクのような大型、親水性分子の、鼻粘膜障壁を横断する輸送を促進するためには、粘液接着性ポリマー及びその他の薬剤は、輸送システムの、粘膜到着前滞在時間の延長によって得られる分を超えて浸透作用を強化するように考慮される。薬剤血漿濃度の時間経過から、生体接着性微小球は、鼻粘膜を横切るインスリンの透過性について急性で、一過性の増加をもたらすことが報告されている。本発明において使用されるその他の粘液接着性ポリマー、例えば、キトサンは、水溶液又はゲルとして与えられた場合でも、ある種の粘膜上皮の透過性を強化することが報告されている。上皮の透過性に直接影響を与えることが報告されている、もう一つの粘液接着性ポリマーはヒアルロン酸、及びそのエステル誘導体である。本発明の共同投与、及び／又は混合処方の方法及び組成物において特に有用な生体接着剤はキトサンを始め、その類縁体及び誘導体である。キトサンは非毒性、生体適合性、かつ、生体分解性ポリマーで、毒性が低く、生体適合性が高いという好ましい性質のために、製薬及び医学用とに広く使われている。これは、キチンから、アルカリでN-脱アセチルすることによって調製される天然のポリアミノサッカリドである。本発明の方法及び組成物において使用する場合、キトサンは、本明細書に開示されるY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び／又は、他の生物学的活性剤の、塗布粘膜部位における保持を強化する。この投与方式はまた、患者の協力及び受容体制を改善する。本明細書でさらに示すように、本発明の方法及び組成物は、選択的に、新規キトサン誘導体、又は、キトサンの化学的修飾形を含む。本発明において使用される、この新規の誘導体は、β-[1->4]-2-グアニジノ-2-デオキシ-D-グルコースポリマー（ポリ-GuD）と表される。キトサンは、経口及び経鼻処方用の微小球を調製するために広く用いられるキチンのN-脱アセチル産物である。キトサンポリマーはまた、非経口薬剤輸送用の可溶性担体としても提案されている。本発明の一つの面では、キトサンのアミンをそのグアニジニウム成分に変換するのにo-メチルイソ尿素が用いられる。グアニジニウム化合物は、例えば、pH8.0以上における、キトサンとo-メチルイソ尿素の等規定液同士の反応によって調製される。
【０１９２】
グアニジニウム産物は-[14]-グアニジノ-2-デオキシ-D-グルコース・ポリマーである。これは、この意味でポリ-GuDと略称される（キトサンにおけるアミンのモノマーF.W.=161；ポリ-GuDのグアニジニウムのモノマーF.W.=203）。
【０１９３】
本発明において使用される、一つの例示のポリ-GuD調製法は下記のプロトコルを含む。
【０１９４】
溶液
0.5%酢酸溶液の調製（0.088N）
2.5 mLの氷酢酸を、500 mLの容量フラスコにピペットで取り、純粋で定容量に希釈する。
2N NaOH溶液の調製
約20 gのNaOHペレットを、約150 mLの純粋を含むビーカーに移す。溶解して室温に冷却する。この溶液を250 mLの容量フラスコに移し、純水で定容量に希釈する。
o-メチルイソ尿素スルフェートの調製（0.4N尿素基当量）
約493 mgのO-メチルイソ尿素スルフェートを10 mLの容量フラスコに移し、純水に溶解し、定容量に希釈する。
溶液のpHは4.2である。
塩化バリウム液の調製(0.2M)
約2.086 gの塩化バリウムを50 mLの容量フラスコに移し、純水に溶解し、定容量に希釈する。
キトサン液の調製（0.06Nアミン当量）
約100 mgのキトサンを50 mLのビーカーに移し、10 mLの0.5%酢酸(0.088N)を加える。完全に溶解するまで攪拌する。
溶液のpHは4.5である。
O-メチルイソ尿素クロリド液の調製（0.2N尿素基当量）
5.0 mLのO-メチルイソ尿素スルフェート液（0.4N尿素基当量）及び5 mLの0.2M塩化バリウム液をビーカーにピペットで移す。沈殿が形成される。さらに5分溶液の混合を続ける。溶液を0.45 mフィルターにてろ過し、沈殿を廃棄する。上清液におけるO-メチルイソ尿素クロリドの濃度は、0.1N尿素基当量である。
溶液のpHは4.2である。
【０１９５】
手順
1.5 mLの2N NaOHを、2.5.節に記載した通りに調製した10 mLのキトサン液（0.06Nのアミン当量）に加える。溶液のpHを、2N NaOHにて約8.2から8.4に調節する。溶液をさらに10分攪拌する。上に記載したように調製した、3.0 mLのO-メチルイソ尿素クロリド液（0.2N尿素基当量）を加える。溶液を一晩攪拌する。
溶液のpHを、0.5%酢酸(0.088N)で5.5に調節する。
溶液を蒸留水を用いて最終容量が25 mLとなるまで希釈する。
溶液のポリ-GuD濃度は5 mg/mLで、これは0.025N（グアニジウム基）に相当する。
【０１９６】
本発明において使用され、生体接着剤と分類される追加の化合物は、特定相互作用、通常、生体接着化合物の相補的構造と、粘膜上皮表面のある成分との間の「受容体リガンド相互作用」と分類される相互作用を介することによって作用する。多くの天然の例は、レクチン-糖相互作用によって示されるように、この形の特異的結合による生体接着を示す。レクチンは、ポリサッカライド又は糖接合体に結合する、非免疫起源の(糖)タンパクである。
【０１９７】
製薬吸収促進剤として利用できる可能性についていくつかの植物レクチンがこれまで研究されてきた。一つの植物レクチン、Phaseolus vulgarisの血球凝集素(PHA)は、ラットに食餌を与えた後、10%を超える高い経口的バイオアベイラビリティを示す。トマト（Lycopersicon esculeutum）のレクチン(TL)は、各種の投与法において安全であるようである。
【０１９８】
まとめると、前記生体接着剤は、1種以上のY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び、他の生物学的活性剤の滞在を引き延ばす、或いは、他のやり方で粘膜吸収を増すのに十分な、生体接着剤の有効量と形態を任意に含む、本発明の混合処方及び共同投与法において有用である。生体接着剤は、補助化合物として共同投与されてもよいし、或いは、本発明の混合処方における添加物として投与されてもよい。ある実施態様では、生体接着剤は、「薬剤糊」として活動し、一方、別の実施態様では、生体接着剤の補助輸送又は混合処方は、生物学的活性剤と鼻粘膜との接触を、ある場合には、上皮細胞「受容体」との特異的受容体-リガンド相互作用を通じて強化するのを助け、また別のある場合には、上皮透過性を増すことによって接触の強化を助け、それによって輸送標的部位（例えば、肝臓、血漿、又はCNS組織又は液）における薬剤濃度勾配を著明に増大させる。本発明において使用される、さらに別の生体接着剤は、該生体接着剤と共同的に、又は混合処方において粘膜的に輸送される生体治療剤の安定性を強化するために、酵素（例えば、プロテアーゼ）阻害剤として活動する。
【０１９９】
リポソーム及びミセル輸送媒体
本発明の共同投与法及び混合処方は、選択的に、Y2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体、及び、他の生物学的活性剤の粘膜輸送用改良処方を提供するために、有効な脂質又は脂肪酸系担体、処理剤、又は輸送媒体を含む。例えば、粘膜輸送時における生物学的活性剤の化学・物理的安定を強化し、該活性剤の半減期を引き延ばすために（例えば、タンパク分解、化学的修飾、及び／又は変性に対する感受性を下げることによって）、リポソーム、混合ミセル担体、又は乳液と混合される、それらの中に封入される、又は、それらと共に共同投与される、ペプチド又はタンパクのような1種以上の粘膜輸送用活性剤を含む各種処方及び方法が提供される。
【０２００】
本発明のある面では、生物学的活性剤用の特別輸送システムは、リポソームと呼ばれる小型の脂質小胞を含む。これは、通常、天然の、生分解性、非毒性で、かつ、免疫原性脂質分子によって製造され、ペプチド及びタンパクを含む薬剤分子を、その膜の中に、又は上に効率的に捕捉又は結合させることが可能である。本発明におけるペプチド及びタンパク輸送システムにおけるリポソームの魅力は、封入されたタンパクは、小胞の中の好ましい水性環境の中に留まり、一方、リポソーム膜は、タンパクを、タンパク分解及びその他の不安定要因から保護するという事実によって増大する。既知のリポソーム調製法の必ずしも全てが、その独特の物理的・化学的性質のために、ペプチド及びタンパクの封入を実行できるわけではないが、実質的な作動消失無しに、巨大分子の封入を可能とする方法はいくつかある。
【０２０１】
本発明において使用されるリポソームの調製には様々の方法が利用可能である。米国特許第4,235,871、4,501,728、及び4,837,028号を参照されたい。リポソーム輸送に使用されるためには、生物学的活性剤は通常、脂質小胞であるリポソームの中に封入されるか、或いは、小胞の外側に結合されなければらない。
【０２０２】
リポソーム同様、これも粘膜吸収に対し強化活性を持つ不飽和長鎖脂肪酸も、二重層様構造を持つ閉鎖小胞を形成することが可能である（所謂「ウファソーム」）。これらは、例えば、本発明における粘膜性、例えば、鼻腔内輸送用の生物学的活性を持つペプチド及びタンパクを捕捉するためにオレイン酸を用いて形成することが可能である。
【０２０３】
本発明において用いられるその他の輸送システムは、ポリマーとリポソームを、天然ポリマーフィブリン内部の封入のような両小胞に共通の長所を生かすように、組み合わせて使用する。さらに、この輸送システムからの生体治療化合物の放出は、共有的架橋結合の使用と、フィブリンポリマーに対する抗フィブリン分解剤の添加によって調節が可能である。
【０２０４】
本発明において用いられるさらに簡単な輸送システムは、陽イオン脂質の使用を含む。この陽イオン脂質は、輸送脂質担体と、タンパク及びポリ陰イオン核酸のような生物学的に活性な荷電薬剤との間の静電的相互作用を実現するために効果的に用いられる。これによって、粘膜投与及び／又はその後の全身区画に向けての輸送のために好適な形態に、薬剤を効率的にパッケージすることが可能になる。
【０２０５】
本発明に用いられるさらに別の輸送媒体は、長鎖及び中鎖脂肪酸を始め、界面活性剤混合の脂肪酸ミセルである。エステルの形を取る、天然でもっとも普通に見られる脂質は、粘膜表面の横断輸送に関して重要な意味を持つ。脂肪酸及び、極性基を付着させたそのモノグリセリドは、混合ミセルの形態において、小腸障壁に対して浸透強化剤として活動することが示された。この、遊離脂肪酸（12から20炭素原子の鎖長を持つカルボン酸）及びその極性誘導体の障壁修飾機能の発見は、これらの薬剤を粘膜吸収強化剤として利用する応用に関する広範な研究を刺激した。
【０２０６】
本発明の方法に用いる場合、長鎖脂肪酸、特に融合誘導脂質（オレイン酸、リノレイン酸、リノレイン酸、モノオレイン酸のような脂肪酸及びモノグリセリド）は、本明細書に開示されるY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び／又は、他の生物学的活性剤の粘膜輸送を強化するための有用な担体を提供する。中鎖脂肪酸（C6からC12）及びモノグリセリドも、小腸の薬剤吸収に対する強化活性を持つことが示され、本発明の粘膜輸送処方及び方法における使用に対して適応される。さらに、中鎖及び長鎖脂肪酸のナトリウム塩は、本発明における生物学的活性剤の粘膜輸送に対する、有効な輸送媒体であり、吸収強化剤である。従って、脂肪酸は、ナトリウム塩の可溶形として、或いは、非毒性界面活性剤、例えば、ポリオキシエチル化水素添加ひまし油、タウロコール酸ナトリウム等を添加することによって利用が可能である。本発明において有用な、その他の脂肪酸及び混合ミセル調剤としては、選択的に胆汁塩、例えば、グリココレート及びタウロコレートと混合した、カプリル酸Na（C8）、カプリン酸Na(C10)、ラウリン酸Na(C12)、又は、オレイン酸Na(C18)が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０２０７】
PEG化
本発明において提供されるさらに別の方法及び組成物は、生物学的活性を持つペプチド及びタンパクに、ポリマー材料、例えば、デキストラン、ポリビニルピロリドン、グリコペプチド、ポリエチレングリコール、及びポリアミノ酸を共有的に付着させることによる化学的修飾を含む。得られた、ペプチド及びタンパク接合体は、粘膜投与に対するその生物学的活性及び可溶性を保持する。別の実施態様では、Y2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び／又は、他の生物学的活性剤は、ポリアルキレンオキシド・ポリマー、特にポリエチレングリコール（PEG）に接合される。米国特許第4,179,337号を参照されたい。
【０２０８】
本発明において用いられるアミン反応性PEGポリマーは、分子量2000, 5000, 10000, 12000, 及び20000を持つSC-PEG；U-PEG-10000；NHS-PEG-3400-ビオチン；T-PEG-5000；T-PEG-12000；及びTPC-PEG-5000を含む。生物学的活性ペプチド及びタンパクのPEG化は、カルボキシル部位の修飾（例えば、カルボキシル末端に対するアスパラギン酸又はグルタミン酸の添加）によって実現してもよい。酸性条件においてカルボジイミド作動タンパクのカルボキシル基を選択的に修飾する際にPEG-ヒドラジドが有用であることは既に記載されている。それとは別に、生物学的活性ペプチド及びタンパクの、二官能基PEGによる修飾を用いてもよい。ある過程では、リシン、アスパラギン酸、及びグルタミン酸を含む荷電アミノ酸残基は、タンパク表面において溶媒接触への強い傾向を示す。
【０２０９】
他の活性剤の安定化修飾
PEG化の外に、本発明において使用される、ペプチド及びタンパクのような生物学的活性剤は、既知の、他の保護的又は安定化化合物に接合して活性剤を遮蔽することによって、例えば、活性ペプチド、タンパク、1種以上の担体タンパクと結合した類縁体又は擬似体、例えば、1種以上の免疫グロブリン鎖との融合タンパクを創成することによって、循環半減期を延長するように修飾することが可能である。
【０２１０】
処方と投与
本発明の粘膜輸送処方は、通常、1種以上の製薬学的に受容可能な担体、及び、選択的に加えられる他の治療成分と混合した、Y2受容体結合ペプチド、類縁体、及び擬似体を含む。この担体（単複）は、処方における他の成分と適合し、被験者において受容不能の、有害な作用をもたらすことがないという意味で「製薬学的に受容可能」でなければならない。このような担体は、本明細書においても既に上に記載されており、薬理学に精通した当業者には別の道を通じてよく知られる。好ましくは、処方は、投与される生物学的活性剤が不適合であると知られる酵素又は酸化剤のような物質を含んではならない。処方は、薬学においてよく知られる任意の方法で調製してよい。
【０２１１】
本発明の組成物及び方法においては、本明細書に開示されるY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び／又は、他の生物学的活性剤は、各種粘膜投与モード、例えば、口内、直腸内、膣内、肺内、又は経皮輸送、或いは、眼球、耳、皮膚、又はその他の粘膜表面に対する局所輸送を含む投与モードによって被験体に投与されてよい。選択的に、本明細書に開示されるY2受容体結合ペプチド、類縁体及び擬似体、及び／又は、他の生物学的活性剤は、非粘膜ルート、例えば、筋肉内、皮下、静脈内、心房内、関節内、腹腔内、又は非経口ルートを含むルートを通じて共同的に、或いは補助的に投与されてもよい。別の実施態様では、生物学的活性剤（単複）は、体外において、哺乳類被験体由来の細胞、組織、又は器官に対して、例えば、該生物学的活性成分を適当な液体又は固体の担体中に含む、体外組織又は器官治療処方の成分として直接暴露することによって投与してもよい。
【０２１２】
本発明による組成物は、多くの場合、水溶液の形で、鼻腔又は肺スプレーとして投与されるが、当業者に既知の様々な方法によってスプレイとして投薬されてもよい。鼻腔スプレイとして液体の形で投薬するための好ましいシステムが米国特許第4,511,069号に開示されている。処方は、複数用量容器、例えば、米国特許第4,511,069号に開示される密封投薬システムに入れて提供されてもよい。さらに外のエアロゾル輸送形態としては、例えば、圧縮空気、ジェット、超音波、及び圧電噴霧器が挙げられる。これらは、製薬溶媒、例えば、水、エタノール、又はそれらの混合物中に溶解、又は懸濁した生物学的活性剤を輸送する。
【０２１３】
本発明の鼻腔及び肺スプレイ液は、通常、選択的に、界面活性剤、例えば、非電離性界面活性剤（例えば、ポリスルベート80）、及び1種以上のバッファーと共に処方される、輸送の対象となる薬剤を含む。本発明のある実施態様では、鼻腔スプレイ液はさらに、推進剤を含む。鼻腔スプレイ液のpHは、選択的に、約pH3.0と6.0の間、好ましくは5.0±0.3である。この組成物において用いられる好適なバッファーは、上に記載されており、或いは、従来技術の別の場所において既知である。化学的安定性を強化又は維持するために、例えば、防腐剤、界面活性剤、分散剤、又は気体を含む他の成分を加えてもよい。好適な防腐剤としては、フェノール、メチルパラベン、パラベン、m-クレゾール、チオメルサール、クロロブタノール、ベンジルアルコニマムクロリド等が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。好適な界面活性剤としては、オレイン酸、ソルビタントリオレエート、ポリソルベート、レシチン、フォフソチジルコリン、及び、様々な鎖長のジグリセリド及びリン脂質が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。好適な分散剤としては、エチレンジアミンテトラ酢酸等が挙げられるが、ただしこれに限定されない。好適な気体としては、窒素、ヘリウム、クロロフルオロカーボン(CFC)、ヒドロフルオロカーボン(HFC)、二酸化炭素、空気等が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。
【０２１４】
別の実施態様では、粘膜処方は、鼻腔内投与のために、適当な粒子サイズ、又は、適当な粒子サイズ範囲の乾燥形、通常は凍結乾燥形の中に生物学的活性剤を含む乾燥粉末処方として投与される。鼻腔又は肺通路内で堆積するのに好適な最小粒径は、多くの場合、約0.5 μの、航空力学等価中央値(MMEAD)であり、一般的には約1 μ MMEAD、さらに典型的には約2 μ MMEADである。鼻腔通路内で堆積するのに好適な最大粒径は、多くの場合、約10 μ MMEADであり、一般的には約8 μ MMEAD、さらに典型的には約4 μ MMEADである。このサイズ範囲の、鼻腔内に吸引可能な粉末は、様々な従来技術、例えば、ジェットミル粉砕、スプレイ乾燥、溶液沈殿、上層流体圧縮等によって生産することが可能である。これらの、好適なMMEADの乾燥粉末は、適当な乾燥粉末吸引器(DPI)を通じて患者に投与することが可能である。この吸引器は、患者の呼吸に依存して、肺又は鼻吸引の際に、粉末をエアロゾル量に分散する。それとは別に、乾燥粉末は、外部の電源を用いて粉末をエアロゾル量に分散する、空気介助装置、例えば、ピストンポンプを介して投与してもよい。
【０２１５】
乾燥粉末装置は通常、単一のエアロゾル用量（「パフ」）を生成するために、約1 mgから約20 mgの範囲の粉末量を必要とする。生物学的活性剤の必要又は所望用量がこの量よりも低い場合には、粉末活性剤は通常、その必要な全体粉末量を得るために、製薬的乾燥充填剤と混合される。好ましい乾燥粉末充填剤としては、スクロース、ラクトース、デキストロース、マンニトール、グリシン、トレハロース、ヒト血清アルブミン（HSA）、及びでん粉が挙げられる。別の好適な乾燥粉末充填剤としては、セロビオース、デキストラン、マルトトリオース、ペクチン、クエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウム等が挙げられる。
【０２１６】
本発明における粘膜輸送用組成物を処方するために、生物学的活性成分は、各種の製薬学的に受容可能な添加物を始め、活性剤（単複）分散のための基材又は担体と混合することが可能である。望ましい添加物としては、pH調節剤、例えば、アルギニン、水酸化ナトリウム、グリシン、塩酸、クエン酸等が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。さらに、局所麻酔剤（例えば、ベンジルアルコール）、等張剤（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール、ソルビトール）、吸着阻害剤（例えば、Tween 80）、可溶性強化剤（例えば、シクロデキストリン及びその誘導体）、安定化剤（例えば、血清アルブミン）、及び還元剤（例えば、グルタチオン）を含めることも可能である。粘膜輸送用組成物が液体である場合、0.9%(w/v)の生理的食塩水の浸透圧を単位として参照して測定した場合の浸透圧は、通常、投与部位の鼻粘膜において実質的に不可逆な組織傷害が誘発されない値に調整される。一般に、この溶液の浸透圧は、約1/3から3、より一般的には1/2から2、もっとも多くの場合3/4から1.7に調整される。
【０２１７】
生物学的活性剤は、活性剤及び任意の所望の添加剤を分散する能力を持つ親水性化合物を含む、基材又は媒体中に分散されてもよい。基材は、広範で好適な担体、例えば、ポリカルボン酸又はその塩、無水カルボン酸（例えば、無水マレイン酸）と、他のモノマー（例えば、メチル（メタ）アクリレート、アクリル酸等）とのコポリマー、親水性ビニルポリマー、例えば、ポリビニル酢酸、ポリニビールアルコール、ポリビニルピロリドン、セスロース誘導体、例えば、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース等、及び、天然ポリマー、例えば、キトサン、コラーゲン、アルギン酸ナトリウム、ゼラチン、ヒアルロン酸、及び、その、無毒の金属塩を含む担体中から選択されるが、ただしこれらに限定されない。多くの場合、生分解性ポリマーは、基材又は担体、例えば、ポリ乳酸、ポリ（乳酸-グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシブチル酸、ポリ（ヒドロキシブチル酸-グリコール酸）コポリマー、ポリヒドロキシブチル酸、ポリ（ヒドロキシブチル酸-グリコール酸）コポリマー、及びそれらの混合物を含む基材又は担体として選択される。それとは別に、或いはそれに加えて、合成脂肪酸エステル、例えば、ポリグリセリン脂肪酸エステル、スクロース脂肪酸エステル等も担体として用いることが可能である。親水性ポリマー及びその他の担体は、単独でも、混合しても使用が可能であり、部分的結晶化、イオン結合、架橋結合等によって担体に対し構造的安定の強化を実現することも可能である。担体は、鼻粘膜に対して直接接触させるために、様々な形、例えば、流体又は粘液、ゲル、ペースト、粉末、微小球、及び薄層フィルムを含む形で提供される。このようにして選択された担体を用いることによって、生物学的活性剤の吸収が増進される。
【０２１８】
生物学的活性剤は、様々の方法に従って基材又は担体と混合され、該活性剤の放出は、分散、担体の崩壊、又は、連結される水チャンネル処方によって行われる。ある状況では、活性剤は、適当なポリマー、例えば、イソブチル2-シアノアクリレートのようなポリマーから調製される微小カプセル（微小球）、又はナノカプセル（ナノ小球）中に分散され、かつ、鼻粘膜に適用される生体適合性分散剤において分散される。これによって、長時間に渡って持続性の輸送と生物学的活性が得られる。
【０２１９】
本発明において薬剤の粘膜輸送をさらに強化するために、活性剤を含む処方はまた、低分子量の親水性化合物を、基材又は賦形剤として含んでもよい。この親水性低分子化合物は、水溶性活性剤、例えば、生理的に活性なペプチド又はタンパクが通過する通路媒体を提供し、基材中を分散して体表に達し、そこで活性剤が吸収されるようにする。親水性低分子化合物は、選択的に、粘膜又は投与雰囲気から水分を吸収し、水溶性活性ペプチドを溶解する。親水性低分子化合物の分子量は、一般に10000以下、好ましくは3000以下である。例示の、親水性低分子化合物としては、ポリオール化合物、例えば、オリゴ-、ジ-、及びモノサッカリド、例えば、スクロース、マンニトール、ソルビトール、ラクトース、L-アラビノース、D-エリスロース、D-リボース、D-キシロース、D-マンノース、トレハロース、D-ガラクトース、ラクチュロース、セロビオース、ゲンチビオース、グリセリン、及びポリエチレングリコールが挙げられる。本発明の担体として有用な、親水性低分子化合物の別の例としては、N-メチルピロリドン、及びアルコール類（例えば、オリゴビニルアルコール、エタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール等）が挙げられる。これら親水性低分子化合物は、単独で用いてもよいし、互いに混ぜ合わせても、鼻腔内処方の、別の、活性又は不活性成分と混ぜ合わせてもよい。
【０２２０】
代替的に、本発明の組成物は、製薬学的に受容可能な担体として、必要に応じて、生理条件に近似させる物質、例えば、pH調整剤及びバッファー剤、浸透圧調整剤、湿潤剤等、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、ソルビタンモノラウレート、トリエタノーラミンオレエート等を含んでもよい。固体組成物の場合、通例の無害の製薬学的に受容可能な担体であって、例えば、製薬級のマンニトール、ラクトース、でん粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等を含む担体が使用される。
【０２２１】
生物学的活性剤を投与するための治療処方はまた、溶液、微細乳液、又は、高濃度の活性成分に好適な、他の秩序構造として処方されてもよい。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）、及びそれらの好適な混合物を含む、溶媒又は分散媒体であってもよい。溶液の適切な流動性は、例えば、レクチンのようなコーティングを用いることによって、分散処方の場合は所望の粒子サイズを維持することによって、及び、界面活性剤を用いることによって維持される。多くの場合、組成物の中には、等張剤、例えば、糖類、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、或いは塩化ナトリウムを含めるのが好ましい。生物学的活性剤の持続的吸収は、組成物の中に、吸収を遅らせる薬剤、例えば、モノステアリン酸塩及びゼラチンを含めることによって実現される。
【０２２２】
本発明のある実施態様では、生物学的活性剤は、時間放出処方、例えば、徐放ポリマーを含む組成物に溶解して投与される。活性剤は、急速放出しないように保護する担体、例えば、調節放出媒体、例えば、ポリマー、微小封入輸送システム、又は生体接着性ゲルと共に調製される。本発明の各種組成物における活性剤の長時間輸送は、組成物の中に、吸収を遅らせる薬剤、例えば、一ステアリン酸アルミニウムヒドロゲル及びゼラチンを含めることによって実現される。生物学的活性剤の調節放出処方が望まれる場合、本発明に従って使用するのに好適な調節放出結合剤は、活性剤に対して不活性で、その生物学的活性剤を取り込むことが可能なものであれば、いずれの生体適合的調節放出物質を含むことができる。このような物質は数多くのものが従来技術で既知である。有用な調節放出結合剤は、鼻腔内輸送後の生理的条件下（例えば、鼻粘膜表面において、又は経粘膜輸送後体液の存在下で）でゆっくりと代謝される物質である。適当な結合剤としては、従来技術において、持続放出処方において従来から使用される、生体適合性ポリマー及びコポリマーである。この生体適合性化合物は、周囲組織に対して無毒で不活性であり、有害な副作用、例えば、鼻粘膜刺激、免疫反応、炎症等を引き起こさない。これらの化合物は、代謝産物であって、これもまた生体適合的であり、簡単に体外に排泄される産物に代謝される。
【０２２３】
この意味で使用される例示のポリマー物質としては、加水分解可能なエステル結合を持つ、コポリマー及びホモポリマーポリエステル由来のポリマーマトリックスが挙げられるが、それらに限定されない。これらの内のいくつかは従来技術において生分解性であることが知られており、無毒、又は低い毒性しか持たない分解産物しかもたらさない。例示のポリマーとしては、ポリグリコール酸(PGA)とポリ酢酸(PLA)、ポリ(DL-乳酸-コ-グリコール酸)（DL PLGA）、ポリ（D-乳酸-コ-グリコール酸）（D PLGA）、及びポリ（L-乳酸-コ-グリコール酸）（L PLGA）が挙げられる。他の、有用な生分解性、又は生侵食性ポリマーとしては、例えば、ポリ（イプシロン-カプロラクトン）、ポリ（イプシロン-アプロラクトン-CO-乳酸）、ポリ（ε-アプロラクトン-CO-グリコール酸）、ポリ（ベータ-ヒドロキシブチル酸）、ポリ（アルキル-2-シアノアクリレート）、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート）のようなヒドロゲル、ポリアミド、ポリ（アミノ酸）（すなわち、L-ロイシン、グルタミン酸、L-アスパラギン酸等）、ポリ（エステル尿素）、ポリ（2-ヒドロキシエチルDL-アスパルタミド）、ポリアセタールポリマー、ポリオルトエステル、ポリカーボネート、ポリマレアミド、ポリサッカリド、及び、それらのコポリマーを含むポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。一般に、このような処方を調製するための多くの方法が当業者に知られている。他の、有用な処方としては、調節放出組成物、例えば、米国特許第4,652,441及び4,917,893号に記載の微小カプセル、米国特許第4,677,191及び4,728,721号に記載の、微小カプセル及びその他の処方を製造するのに有用な乳酸-グリコール酸コポリマー、及び、米国特許第4,675,189号に記載の、水溶性ペプチド用の持続放出組成物が挙げられる。
【０２２４】
滅菌溶液は、必要量の活性化物を、上に挙げた、必要な、1種の成分、又は複数の成分の混合物と共に適当な溶媒中に含め、次にろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、作動合物を、基礎分散溶媒と、上に挙げたものから選択される、必要な他の成分とを含む滅菌媒体中に含めることによって調製される。滅菌粉末の場合は、調製法は真空乾燥及び凍結乾燥を含み、これによって、前述の滅菌ろ過液から、活性成分プラス任意の所望の添加成分から成る粉末が得られる。微生物の作用の阻止は、各種抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって実現が可能である。
【０２２５】
本発明による粘膜投与によって、投与と副作用をコントロールし監視する十分な安全策が取られている限り、患者自身による効果的自己投与が可能である。粘膜投与はまた、他の投与形態、例えば、痛みがあったり、患者を感染の危険に暴露したり、また、薬剤のバイオアベイラビリティ問題を生ずる注射について、そのいくつかの欠点を克服する。鼻腔及び肺輸送では、治療液体をスプレイとして調節的エアロゾル投薬するためのシステムがよく知られる。一つの実施態様では、活性成分の測定用量が、米国特許第4,511,069号に記載の特別製の機械的ポンプバルブによって輸送される。
【０２２６】
用量
予防及び治療目的のために、本明細書に開示される生物学的活性剤（単複）は、長時間に渡り、連続輸送を通じて（例えば、連続的経皮、粘膜、又は静脈内輸送）、単回ボーラス輸送として、或いは、反復投与プロトコルに基づいて（例えば、時間、日、週決めの反復投与プロトコル）被験者に投与される。この意味で、Y2受容体結合ペプチドの治療的有効用量とは、長期的予防又は治療投与スケジュールにおける反復投与であって、上に述べた標的疾患又は病態と関連する1種以上の症状、又は検出可能な病態を緩和するほどに臨床的に有意な好成績をもたらす反復投与を含む。この意味における有効用量の決定は、通常、動物モデル実験があって、その後に続くヒトの臨床治験に基づき、被験体において標的疾患の症状又は病態の出現又は重度を有意に低減する、有効用量及び投与プロトコルを定めることによって導かれる。この点において適当なモデルは、例えば、げっ歯類、ラット、ブタ、ネコ類、非ヒト霊長類、及び、その他の、従来技術で認められる動物モデル被験体である。別に、有効用量は、インビトロモデル（例えば、免疫原及び組織病理学的アッセイ）を用いて決定することもできる。このようなモデルを用いる場合、生物学的活性剤（単複）の治療有効量（例えば、所望の反応を引き起こすのに有効な鼻腔内、経皮、静脈内、又は筋肉内投与量）を投与するための適切な濃度及び用量を求めるのに通常必要とされるのは、日常的な計算と調整だけである。
【０２２７】
生物学的活性剤の実際の用量はもちろん、複数の要因、例えば、病気の適応、被験者の特定の状態（例えば、被験者の年齢、大きさ、適合性、症状の程度、感受性因子等）、投与時点及びルート、同時に施される他の薬剤又は治療を始め、該被験者において所望の活性又は生物学的反応を引き起こすための生物学的活性剤（単複）の特定の薬理学等の複数の要因に従って変動する。投与スケジュールは、最適な予防又は治療反応を実現するように調整される。治療的有効量はまた、生物学的活性剤が何らかの有毒又は有害な副作用を持つとしても、その副作用が、臨床的には、治療有効作用によって凌駕される量である。本発明の方法及び処方におけるY2作用剤の治療有効量の非限定的範囲は、0.7 μg/kgから約25 μg/kgである。減量を促進するためには、Y2受容体結合ペプチドの鼻腔内投与は、満腹感を増進するのに十分なほど高く、悪心などの好ましくない副作用を誘発しないほどに低い用量において投与される。PYY3-36の好ましい鼻腔内投与は、患者の体重1kg当たり約1 μg −10 μg/kg、もっとも好ましくは約1.5 μg −3 μg/kgである。標準的投与では、患者には約50 μgから1600 μg/kg、より好ましくは約75 μgから800 μg/kg、もっとも好ましくは約100 μg, 150 μg/kg, 200 μg から約400 μg/kgが与えられる。それとは別に、本発明の方法及び処方における生物学的活性剤の治療有効量の非限定的範囲は、体重1kg当たり約0.001 pmolから約100 pmol、体重1kg当たり約0.01 pmolから約10 pmol、体重1kg当たり約0.1 pmolから約5 pmol、体重1kg当たり約0.5 pmolから約1.0 molである。この範囲の投与は、単回又は複数回投与、例えば、1日の、日毎の、週毎の投与を含む投与によって実現される。1回の投与については、平均的ヒト被験者に対し、少なくとも1グラムの生物学的活性剤（例えば、1種以上のY2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体及び擬似体、及びその他の生物学的活性剤）を、より一般的には、約10 μgから5.0 mg、ある実施態様では、約100 μgから1.0又は2.0 mgを投与するのが望ましい。ある経口投与の場合、十分な血漿レベルを実現するために、体重1 kg当たり0.5 mgもの高用量が必要とされることがある。さらに、各特定の被験者について、特定の投与スケジュールを、時間と共に、その個人の要求に従って、また、透過促進ペプチド（単複）及びその他の生物学的活性剤（単複）の投与を実施し、監督する専門家のその個人に対する判断に従って評価し、調整しなければならないことに注意しなければらない。PYYの鼻腔内用量は、50 μgから1600 μg/kgのPYY、より好ましくは約75 μgから800 μg/kg、もっとも好ましくは約100 μgから200 μg/kgの範囲に渡り、150 μg極めて有効と考えられる用量である。本発明の処方による反復鼻腔内投与において、投与間隔が約0.1から24時間、好ましくは0.5から24.0時間の範囲を持つスケジュールで行われた場合、臨床効果を最大限発揮し、一方、過度の薬剤暴露と副作用の危険を最小に留める、標準化された、持続的なY2受容体結合ペプチドレベルが維持される。この用量は、満腹感を増進するために1日に数回、好ましくは、食事の30分前か、空腹感の生じた時に投与することが可能である。目標は、十分な量のY2受容体結合ペプチドを粘膜輸送することであるが、それは、通常は食後に、すなわち、個人が食事を終えた時に得られるY2受容体結合ペプチドの血漿濃度と同程度に、個人の同じペプチドの血漿濃度をその粘膜輸送によって上昇させることができる量である。
【０２２８】
PYYのようなY2作用剤の用量は、もしも一般大衆剤形として自己投与するのであれば、標的部位において所望の濃度を維持するために主治医又は患者によって変更されてもよい。
【０２２９】
別の実施態様において、本発明は、Y2受容体結合ペプチドの鼻腔内輸送用組成物及び方法を提供する。該組成物及び方法においては、長期の投与期間に渡ってY2受容体結合ペプチドの治療的に有効な高レベル及び低レベルから成る脈動レベルを維持するために、日毎の、又は週毎のスケジュールにおいて、被験者に対するY2受容体結合ペプチドの複数回投与を含む鼻腔内有効投与スケジュールに従って反復投与される。この組成物及び方法によって、8時間から24時間の長期の投与期間においてY2受容体結合ペプチドの治療的に有効な、高と低の脈動レベルを維持するように1日1回から6回の鼻腔処方の形で自己投与される化合物（単複）が得られる。
【０２３０】
キット
本発明はまた、哺乳類被験体において疾患及びその他の病態を予防及び治療するために使用される前述の製薬組成物、活性成分、及び／又は、それらの投与手段を含むキット、パッケージ、及び複数容器から成るユニットを含む。簡単に言うと、これらのキットは、粘膜輸送用製剤として本明細書に開示される、粘膜輸送強化剤と組み合わせて用いられる、1種以上のY2受容体結合ペプチドタンパク、類縁体又は擬似体、及び／又は他の生物学的活性剤を含む容器、又は処方を含む。
【０２３１】
本発明の鼻腔内処方は、任意のスプレイ瓶又はシリンジを用いて投与することが可能である。鼻腔投与用スプレイ瓶の例は、「安全クリップ付き鼻腔スプレイポンプ、Pfeiffer SAP #60548」であり、これは、1回の噴射当たり0.1 mL用量を放出し、36.05 mmのディップ管長を持つ。これは、ニュージャージー州、プリンストンの米国Pfeifferから購入することが可能である。PYYのようなY2受容体結合ペプチドの鼻腔内投与量は、0.1 μg/kgから約1500 μg/kgの範囲にある。鼻腔内スプレイとして投与した場合、スプレイの粒子は、サイズが10 −100 μm、好ましくは20 −100 μmにあることが好ましい。
【０２３２】
減量を促進するには、Y2受容体結合ペプチドPYYの鼻腔内投与は、満腹感を増進するほど十分に高い用量ではあるが、悪心のような望ましくない副作用は絶対に誘発しない程度に低い用量で投与される。PYY(3-36)のようなY2受容体結合ペプチドの好ましい鼻腔内投与量は、約3 μg - 10 μg/kg患者体重、もっとも好ましくは約6 μg/kg患者体重である。標準的投与では、患者には50 μgから800 μg、より好ましくは約100 μgから400 μg、もっとも好ましくは約150 μgから約200 μgが与えられる。PYY(3-36)のようなY2受容体結合ペプチドは、好ましくは、悪心を予防するため、食事の少なくとも10分から1時間前であるが、しかし、食前約12時間から24時間を超えない時間に投与される。患者には、1日に少なくとも1回、好ましくは毎食前に、患者が所望の量の体重を失うまで投与される。次に患者は、その減量を維持するために、少なくとも週に1回、好ましくは毎日維持用量を服用する。
【０２３３】
下記の実施例のデータによって示されるように、本発明のY2受容体結合ペプチド処方を用いてヒトに対して鼻腔内投与した場合、PYY(3-36)は、食欲を下げることが見出された。実施例はまた、PYY(3-36)がY2受容体結合ペプチドである、本発明のY2受容体結合ペプチド処方を用い、鼻腔内投与ルートを通じてPYYペプチドの食後の生理的レベルを実現することが可能であることを始めて示した。
【０２３４】
PYYのエアロゾル鼻腔投与
我々は、Y2受容体結合ペプチドは、鼻腔スプレイ又はエアロゾルを用いて鼻腔内に投与することが可能であることを発見した。これは驚くべきことである。なぜなら、多くのタンパク及びペプチドは、スプレイ又はエアロゾルを生成する際に、推進器による機械的な力によって切断又は変性されることが示されていたからである。この領域では、下記の定義が便利である。
1.  エアロゾル−圧力下に包装され、適当なバルブシステムの作動と同時に放出される治療的に活性な成分を含む産品。
2.  測定エアロゾル−測定用量バルブを含む加圧投与剤形であって、作動の度に一定量のスプレイの放出を可能とする剤形。
3.  粉末エアロゾル−圧力下に包装され、適当なバルブシステムの作動によって放出される、粉末の形で治療的に活性な成分を含む産品。
4.  スプレイエアロゾル−エアロゾル産品であって、この産品を湿潤スプレイとして吐出するのに必要な力を供給する推進剤として圧縮ガスを利用するエアロゾル産品。
5.  スプレイ−空気又は蒸気のジェット流によって微小に分割される液体。鼻腔スプレイ製剤は、非加圧投薬器において溶液又は賦形剤混合物に溶解又は懸濁した治療活性成分を含む。
6.  測定スプレイ−非加圧剤形であって、各作動毎に、ある指定量のスプレイの投薬を可能とするバルブから成る。
7.  懸濁スプレイ−液体媒体に分散した固体粒子であって、粗大液滴又は微細分割固体の形で存在する固体粒子を含む液体製剤。
【０２３５】
薬剤放出装置（”DDD”）としての測定鼻腔スプレイポンプによって発射されるエアロゾルスプレイの流体力学特性分析。スプレイの特性解明は、新規及び既存の鼻腔スプレイポンプに対する、研究及び開発、品質保証、及び安定性試験過程に関する米国食品薬品局（”FDA”）における必要規制条項全体において切り離せない一部となっている。
【０２３６】
スプレイの形態の徹底的特性解明は、鼻腔スプレイポンプの総合性能を示す最善のインディケータとなることが判明した。特に、スプレイが装置を離れる時のスプレイ開度（プルーム形態）の測定値、スプレイ断面の楕円度、均一性及び粒子／液滴の分布（スプレイパターン）、及び、発達するスプレイの時間経過は、鼻腔スプレイポンプの特性を明らかにする点でもっとも代表的な性能定量値となることが判明した。品質保証及び安定性テストに際し、プルーム形態とスプレイパターンの測定値は、鼻腔スプレイポンプの承認データ基準との合致及び一致を証明するための最重要特定因子である。
【０２３７】
定義
プルーム高−アクチュエータ先端から、プルーム角度が、直線流の崩壊のために非直線的となる点までの測定値。ディジタル画像の視覚的検査に基づき、スプレイパターンの最長測定点に一致する幅における測定点を定めるために、本試験では高さ30 mmが定義される。
大軸−COMｗを基本単位（mm）で横切る、適合スプレイパターン内に引くことのできる最大コード
小軸−COMｗを基本単位(mm)で横切る、適合スプレイパターン内に引くことのできる最小コード
楕円比−大軸の小軸に対する比
D10−液滴の直径であって、サンプルの全液体容量の10%が、該液滴よりも小さな直径（μm）の液滴から成る時の液滴の直径
D50−液滴の直径であって、サンプルの全液体容量の50%が、該液滴よりも小さな直径（μm）の液滴から成る時の液滴の直径。全体中央直径とも呼ばれる。
D90−液滴の直径であって、サンプルの全液体容量の90%が、該液滴よりも小さな直径（μm）の液滴から成る時の液滴の直径
スパン−分布幅の測定値。この値が小さければ小さいほど、分布は狭くなる。スパンは、（D90 −D10）/D50から計算される。
%RSD−パーセント相対標準偏差。標準偏差をシリーズの平均で割り、100を掛けたもの。%CVとも呼ばれる。
【０２３８】
図21A及び21Bは、作動前（図21A）と作動後（図21B）の鼻腔スプレイ装置10を示す。鼻腔スプレイ瓶10は、鼻腔用Y2受容体結合ペプチド処方を入れた瓶12と、アクチュエータ14を含む。アクチュエータ14は、作動されると或いは力がかかると、Y2受容体結合ペプチドのスプレイプルーム16を、アクチュエータ14を通じて、スプレイ瓶12から押し出す。スプレイパターンは、プルームの指定の高さ18からスプレイプルーム16の断面写真を撮ることによって求められる。スプレイプルームはまた、スプレイがアクチュエータ14を離れる時の、噴射角度20を持つ。スプレイプルーム16のスプレイパターンを図22に示す。スプレイパターン22は楕円形であり、大軸24と小軸26を持つ。
【０２３９】
下記の実施例は、説明のために提供されるものであって、限定のために与えられるものではない。
【０２４０】
実施例１
本明細書の教示によるペプチドYYの鼻粘膜強化輸送のための例示処方を、下記のように調製し評価した。
【０２４１】
2008501634.tif 000003
【０２４２】
実施例２
鼻粘膜輸送−浸透速度変化及び細胞傷害性
1.  器官タイプモデル
下記の方法は、一般に、本発明の処方及び方法におけるペプチドYYの鼻粘膜輸送パラメータ、速度変化、及び副作用を評価するために有用であるばかりでなく、ペプチドYYとの混合処方又は共同投与用として本明細書に開示される、各種鼻腔内輸送強化剤の効力及び特性を確定するためにも有用である。
【０２４３】
浸透速度変化及び細胞傷害性もまた、粘膜輸送強化剤と共に混合処方又は共同投与されるものとして、本明細書に開示される各種輸送強化剤の効力と特性を確定するために有用である。一つの例示のプロトコルでは、ペプチドYYで表される生物学的活性剤と混合される、上に開示の鼻腔内輸送強化剤について、浸透速度変化と、受容不能の細胞傷害性の欠如が実証される。
【０２４４】
EpiAirway（気道上皮）システムは、気道を被う擬似層構造上皮モデルとしてMatTek社（Ashland、マサチューセッツ州）によって開発された。上皮細胞を、空気液体界面において、多孔性膜基底細胞培養挿入体の上で育成したところ、細胞が、極度に極性形態を持つように分化した。頂上面には繊毛が生え、微小絨毛の超微細構造を備え、上皮は粘液を生産した（ムチンの存在がイムノブロッティングによって確認された）。挿入体は0.875 cmの直径を持ち、0.6 cm2の表面積を呈する。細胞は、工場において出荷の約3週間前に挿入体の上にプレートする。1「キット」は24ユニットから成る。
【０２４５】
A.    到着直後、ユニットを、6ウェルのマイクロプレート上の滅菌支持体の上に置く。各ウェルには、5 mLの同社特製培養液を入れる。このDMEM準拠培養液は、血清無添加であり、上皮増殖因子及びその他の因子を添加したものである。この培養液については常に、鼻腔内輸送に関わると考えられるサイトカイン又は増殖因子の内在レベルについて試験したが、インスリン以外は、これまでに調べた全てのサイトカイン及び因子を含んでいなかった。5 mL容量は、ユニットの底部がその支持体に対し接触を維持するのに丁度いい量であり、上皮の頂上面は、直接空気との接触を維持することが可能である。この工程、及び、ユニットを液体含有ウェルに移送することを要する、その後の全ての工程において、ユニットの底部と培養液の間に空気を捕捉することがないように滅菌ピンセットを用いる。
【０２４６】
B.    プレート中のユニットは、インキュベータにおいて、空気の5%CO2雰囲気下、37℃で24時間維持される。この期間の終了時、培養液を新鮮培養液と交換し、ユニットをインキュベータに戻し、さらに24時間維持する。
【０２４７】
2.  実験プロトコル−浸透速度変化
A.    24個の気道上皮ユニットから成る「キット」は、それぞれ4重ウェルに投与される、5種の異なる手法を評価するために通例的に使用が可能である。各ウェルは、浸透速度変化（4時点）、経皮抵抗、MTT還元で測定するミトコンドリア還元酵素活性、及びLDHの放出で測定した細胞分解の定量のために用いる。さらに別の1組のウェルをコントロールとして用いる。これは、浸透速度変化定量の際には見かけ処理するが、別の点では、経皮抵抗及び生存率の定量のために試験サンプル含有ユニットと同様に取り扱う。コントロールの定量も、通例として4重ユニットで行うが、場合によって我々は、コントロールについては3重ユニットを用い、キットの残りの4ユニットについては、未処理ユニットにおける経皮抵抗と生存率の測定に用いた。或いは、我々は、ユニットを凍結し、解凍して全LDHレベルの定量を行い、これを100%細胞分解の参照値として用いた。
【０２４８】
B.    全ての実験において、調べる鼻粘膜輸送処方は、全頂上面を被うのに十分な100 μLの容量において各ユニットの頂上に投与する。頂上面に投与した濃度における試験処方の適当容量（通常必要とされるのは100 μL以下）は、その後の、ELISA、又は他の指定のアッセイによる活性剤濃度の定量からは除外される。
【０２４９】
C.    ユニットは、実験用スタンド無しで6ウェルプレートに静置される。各ウェルは0.9 mLの培養液を含む。これは、ユニットの多孔性膜底部に接触するには十分であるが、ユニットに対し目立った上向き静水圧を発生しないほどの量である。
【０２５０】
D.    予想される誤差原因を最小にし、濃度勾配の形成をできるだけ避けるために、ユニットは、実験の各時点において、0.9 mL含有ウェルから別のウェルに転送する。この転送は、100 mL容量の試料を頂上面に投与した時点をゼロとし、下記の時点で行う。すなわち、15分、30分、60分、及び120分である。
【０２５１】
E.    各時点の間で、プレートに静置したユニットを37℃インキュベータに保存する。ウェル当たり0.9 mLの培養液を含むプレートはまた、プレートを取り出し、滅菌ピンセットを用いてユニットを一つのウェルから別のウェルへと転送する短い期間に起こる温度変化が最小になるようにインキュベータにおいて維持した。
【０２５２】
F.    各時点の終了時に、各ユニットが転送されるウェルから培養液を取り出し、二つのチューブに分け（一つのチューブには700 μL、別のチューブには200 μL）、浸透試料の濃度の定量について、試料が細胞傷害性を持つ場合には、上皮からの、細胞溶解性酵素、乳酸デヒドロゲナーゼの放出について調べた。これらのサンプルは、アッセイが24時間以内に行われる場合には冷蔵庫に保存し、或いは、サンプルはさらに細かく分液し、アッセイ前に解凍するまで-80℃にて保存する。凍結・解凍の繰り返しサイクルは避けなければならない。
【０２５３】
G.    誤差を最小にするため、チューブ、プレート、及びウェルは全て、実験を始める前にあらかじめラベル表示する。
【０２５４】
H.    120分時点の終了時、ユニットを、最後の0.9 mL含有ウェルから、ウェル当たり0.3 mLの培養液を含む24ウェルプレートに転送する。この容量も、ユニットの底部に接触するには十分であるが、ユニットに対し上向き静水圧を及ぼさないほどの量である。ユニットは、経皮抵抗の測定前にインキュベータに戻す。
【０２５５】
3.  実験プロトコル−経皮抵抗
A.    呼吸気道上皮細胞は、インビボでもインビトロでも接着結合を形成し、溶質が組織を横切って流れるのを制限する。この接合部によって、摘出気道組織には数百オームx cm2の経皮抵抗が付与される。MatTek気道上皮ユニットでは、メーカーの主張するところでは、経皮抵抗（TER）は通常約1000オームx cm2である。我々は、浸透実験の連続工程において見せかけ暴露を行ったコントロール気道上皮ユニットのTERは、比較的低い（700 −800オーム x cm2）ことを見出した。しかしながら、小型分子の浸透は、TERの逆数に比例するのであるから、この値は依然として、浸透に対する大きな障壁となるほど十分に高い。逆に、細胞無しで、多孔性膜を敷いたユニットは、ごく僅かな経膜抵抗(5 -20オーム x cm2)しか示さなかった。
【０２５６】
B.    TERを正確に定量するためには、オームメータの電極を、膜の上と下の相当の面積に配置し、かつ、電極の、膜からの距離を再現可能的に調節できるようにしなければならない。MatTrek社によって推薦され、本明細書に記述される全ての実験において採用されたTER定量法は、World Precision Instruments, Inc., Sarasota、フロリダ州から供給される”EVOM”（登録商標）上皮電圧計と、”ENDOHM”（登録商標）組織抵抗測定チェンバーを用いる。
【０２５７】
C.    チェンバーには、電極を平衡させるため、最初ダルベッコのリン酸バッファー生食液(PBS)をTER定量前少なくとも20分満たす。
【０２５８】
D.    TERの定量は、チェンバーに1.5 mLのPBSを入れ、測定される膜を敷いたユニットには350 μLのPBSを入れて行う。頂上電極は、ユニットの細胞を含まない（しかし、350 μLのPBSは含む）膜の直上位置になるように調整し、次に、再現可能な位置取りを確保するように固定する。細胞非含有ユニットの抵抗は、通常、5 -20オーム x cm2（「背景抵抗」）である。
【０２５９】
E.    チェンバーが調製され、背景抵抗が記録されたならば、浸透定量に使用されたばかりの24ウェルプレートのユニットをインキュベータから取り出し、個別にチェンバーに置きTER定量を行った。
【０２６０】
F.    各ユニットは先ず、膜底部が確実に濡れるようにPBSを含むペトリ皿に入れる。350 μL PBSの分液をユニットに加え、次に、注意深く表示チューブに吸い込み、頂上面を洗い濯ぐ。次に、350 μLの2回目の洗浄液をユニットに加え、同じ採集チューブに吸い込む。
【０２６１】
G.    ユニットに、チェンバー（新鮮な1.5 mLのPBS分液を含む）に移す直前に、そっとろ紙を当ててその外表面の過剰なPBSを除く。350 μLのPBS分液をユニットに加え、次に、頂上電極をチェンバーの上に置き、TERをEVOMメータにて読み取る。
【０２６２】
H.    ユニットのTERをENDOHMチェンバーにて読み取った後、ユニットを取り出し、PBSを吸引・保存し、かつ、ユニットは、頂上面を空気界面に接しさせた状態で、ウェル当たり0.3 mLを含む24ウェルプレートに戻す。
【０２６３】
I.    ユニットは下記の順序で読み取る。全ての見かけ処理コントロール、次に全ての処方処理サンプル、次に各見かけ処理コントロールの第2回TER読み取りである。全てのTER定量が完了した後、24ウェルマイクロプレートのユニットはインキュベータに戻し、MTT還元による生存率の定量に備えた。
【０２６４】
4.  実験プロトコル−MTT還元による生存率
MTTとは、細胞浸透性テトラゾリウム塩であり、ミトコンドリア機能が損なわれていない生存細胞において、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼ活性によって、或いは、呼吸バーストを発生することが可能な細胞において非ミトコンドリア性のNAD(P)Hデヒドロゲナーゼ活性によって、不溶の色付きのホルムアザンに還元される。ホルムアザンの形成は、上皮細胞の生存のよいインディケータとなる。なぜなら、上皮細胞は、著明な呼吸バーストを発生しないからである。我々は、生存率を評価するために、MatTek社が自社のユニットのために調製したMTTキット試薬を用いた。
【０２６５】
A.    MTT試薬は濃縮体として支給されたので、これを、生存率を定量するその日に、MatTek社特製のDMEM準拠希釈液にて希釈する（通常、午前中に浸透速度変化及びTERを定量した日の午後である）。使用前に、不要の試薬を簡単な遠心で取り除く。MTTの最終濃度は1 mg/mLである。
【０２６６】
B.    MTTの最終溶液を、24ウェルマイクロプレートに、ウェル当たり300 μLの容量にて加える。前述したように、この容量は、気道上皮ユニットの膜に接触するには十分であるが、細胞に対し大きな陽性の静水圧を課すほどではない。
【０２６７】
C.    ユニットを、TER定量後置かれていた24ウェルプレートから取り出し、ユニットの外表面から過剰な液体を取り除いた後、MTT試薬を含むプレートに移した。次に、このプレート中のユニットを、インキュベータにおいて、空気の5%CO2雰囲気下、37℃で3時間維持する。
【０２６８】
D.    3時間のインキュベーションの終了時には、生存細胞を含むユニットは、目に見える紫色に変わっている。MTT還元の程度を定量するには、不溶のホルムアザンをユニットの細胞から抽出しなければならない。ホルムアザンの抽出は、ユニットを、ウェル当たり2 mLの抽出液を含む24ウェルマイクロプレートに移し、以前と同様にユニットの外表面から過剰の液体を除去することによって実現される。この容量は、膜と、ユニットの頂上面の両方を完全に被うのに十分な量である。抽出は、光遮断チェンバーにおいて室温で一晩進行させる。従来から、MTT抽出液は高濃度の洗浄剤を含むので細胞を破壊する。
【０２６９】
E.    抽出終了時、各ユニットの流体と、その周囲のウェルの流体とを合わせ、チューブに移し、次に、96ウェルマイクロプレートに分液し（200 μL分液が最適である）、VMaxマルチウェルマイクロプレート分光光度計にて570 nmにおいて吸収を定量する。抽出ユニットから出るゴミによる濁りが吸収に影響しないように、各ウェルについてVMaxにて650 nmにおける吸収も定量し、570 nmにおける吸収から自動的に差し引く。ホルムアザン吸収の定量における「ブランク」は、ユニットが暴露されたことのない抽出液の200 μL分液である。この吸収値は、ゼロ生存率を表すと仮定される。
【０２７０】
F.    1キット24個の気管上皮ユニットの内2ユニットは、浸透速度変化及びTERの定量中未処理のまま放置する。これらのユニットは、100%細胞生存率の陽性コントロールとして用いる。我々が行った全ての実験において、この未処理ユニットの細胞と、浸透速度変化及びTER定量のために見かけ処理されたコントロールユニットにおける細胞の生存率の間に統計的に有意な差は認められなかった。試験処方によって処理された全ユニットの吸収は、MTTとインキュベーションしている時のユニットにおける細胞のパーセント生存率に直線的に比例すると仮定される。このアッセイは、通常、試験物質の頂上表面への導入4時間後直ちに、TER定量時にユニットの頂上表面を洗い濯いだ後に行っていることに注意しなければならない。
【０２７１】
5.  LDH放出による生存率定量
MTT還元によるミトコンドリアレダクターゼ活性の測定は、細胞生存率の感度の高いプローブではあるが、このアッセイは必ず細胞を破壊するので、従って、各実験の終了時にのみ実行される。細胞が壊死性分解を経験すると、細胞質ゾルの内容は、周囲の培養液に溢れ出すので、細胞質ゾル酵素、例えば、乳酸デヒドロゲナーゼ(LDH)がこの培養液において検出される。この培養液におけるLDHアッセイは、2時間の浸透速度変化定量の各時点において取り出された培養液サンプルについて実行が可能である。従って、相当の時間が経つまで進展しない処方の細胞傷害性作用が検出可能となるばかりか、気道上皮に対する暴露の最初の数分で細胞分解を誘発する、処方の作用までもが検出可能となる。
【０２７２】
A.    気道上皮ユニットの細胞分解を評価するために好ましいとされる推薦LDHアッセイは、NADからNADHの発生を伴う乳酸塩からピルビン酸塩への転換に基づく。次に、このNADHを、未精製の「ジアフォラーゼ」製剤による触媒下に、再度酸化し、同時に、テトラゾリウム塩INTを還元する。INTの還元によって形成されるホルムアザンは可溶性であるので、LDH活性の全体アッセイが、乳酸塩、NAD、ジアフォラーゼ、及びINTを含む、均一な水性媒体の中で実行が可能である。
【０２７３】
B.    LDH活性のアッセイは、気道上皮ユニットを取り巻く「上清」培養液で、各時点で収集されたサンプルの50 μL分液について行った。サンプルは、冷蔵庫において24時間未満保存したものか、或いは、収集後数時間内に凍結した後解凍したものである。各気道上皮ユニットは、試験物質の投与後、15分、30分、1時間、及び2時間に収集される上清培養液から成るサンプルを生成する。分液は全て96ウェルマイクロプレートに移される。
【０２７４】
C.    ユニットに暴露されない培養液の50 μL分液が、0%細胞傷害性を表す「ブランク」又は陰性コントロールとされる。我々は、アッセイ試薬混合物と、試験物質に暴露されない培養液との反応後に得られる「内在的」LDHの見かけのレベルが、浸透速度変化実験を行うのに必要な2時間全期間に渡って見せかけ処理された全コントロールユニットによって放出されるLDHの見かけレベルと、実験誤差の範囲内で同じであることを見出した。従って、実験誤差の範囲内で、これらの見せ掛け処理されたユニットは、浸透速度変化測定の全期間に渡って上皮細胞の細胞分解を示すことはない。
【０２７５】
D.    ユニット中の細胞の100%が分解した後に放出されるLDHレベルを反映する上清培養液サンプルを調製するために、全く事前操作を受けないユニットを、浸透速度変化定量プロトコルと同様に0.9 mLの培養液を含む6ウェルマイクロプレートの内の1ウェルに加える。このユニットを含むプレートを-80℃で凍結し、次に、ウェルの内容を解凍した。この凍結-解凍サイクルは、効果的に細胞を分解し、その、LDHを含む細胞質ゾルの内容を上清培養液に放出させる。この凍結・解凍サイクルを経た細胞から得られた培養液の50 μL分液を、100%細胞傷害性を反映する陽性コントロールとして96ウェルプレートに加える。
【０２７６】
E.    上清培養液分液を含む各ウェルに、LDHアッセイ試薬の50 μL分液を加える。次に、プレートを暗黒中で30分インキュベートする。
【０２７７】
F.    反応は、1M酢酸から成る「停止」液を添加することによって終息させ、停止液の添加後1時間以内に、プレートの吸収を490 nmにおいて定量する。
【０２７８】
G.    パーセント細胞分解の計算は、吸収と細胞分解の間に直線関係を仮定することによって行い、培養液単独から得られた吸収率を、0%細胞分解の参照値とし、凍結・解凍ユニットを囲む培養液から得られた吸収率を100%細胞分解の参照値とした。
【０２７９】
6.  ELISA定量
本発明による、粘膜輸送強化剤との共同投与又は混合処方と組み合わせた場合に実現される活性剤の浸透強化を評価するために、試験物質としての生物学的活性剤の濃度を定量するための手順は、概略は上にも、また、既知の方法や、各特定のアッセイに関して用いられるELISAキットに関するメーカーの特異的指示に従って記載されている。生物学的活性剤の浸透速度変化は一般に、生物学的活性剤が上皮細胞の頂上面に接触（これは、頂上細胞面が、粘膜輸送強化剤（単複）に暴露されるのと同時であっても、その後であってもよい）後の複数の時点（例えば、15分、30分、60分、及び120分）で測定することによって定量される。
【０２８０】
哺乳類被験体の、血清、中枢神経系（CNS）の組織又は液、脳脊髄液（CSF）、又はその他の組織又は液におけるペプチドYY、神経ペプチドY、及び膵臓ペプチドの濃度を定量するための手順は、ペプチドYY、神経ペプチドY、及び膵臓ペプチドの免疫学的アッセイによって定められてもよい。本発明による、粘膜輸送強化剤との共同投与又は混合処方と組み合わせた場合に実現される活性剤の浸透強化を評価するために、試験物質としてペプチドYY神経ペプチドY、及び膵臓ペプチドの濃度を定量するための手順は、概略は上にも、また、既知の方法や、ラジオイムノアッセイ(RIA)、酵素イムノアッセイ(EIA)、及び、ペプチドYY神経ペプチドY、及び膵臓ペプチドに向けた免疫組織化学又は免疫蛍光法のための抗体試薬に関するメーカーの特異的指示に従って記載されている。Bachem AG(King of Prussisa、ペンシルバニア州)。
【０２８１】
気道上皮（EpiAirway登録商標）組織膜を、フェノール赤及びヒドロコーチゾン非含有培養液（MatTek Corp., Ashland、マサチューセッツ州）にて培養する。この組織膜を37℃で48時間培養し、組織を平衡させる。各組織膜を0.9 mLの血清無添加培養液を含む6ウェルプレートの各ウェルに置く。100 μLの処方（試験サンプル又はコントロール）を膜の頂上面に投与する。各試験サンプル（生物学的活性剤、ペプチドYYと混合した粘膜輸送強化剤）の3重又は4重サンプル及びコントロール（生物学的活性剤、ペプチドYYのみ）を各アッセイにおいて評価する。各時点で（15、30、60、及び120分）、組織膜を、新鮮な培養液を含む新しいウェルに移す。溜まっている0.9 mLの培養液サンプルを各時点で収集し、ELISA及び乳酸デヒドロドゲナーゼ(LDH)アッセイのために4℃で保存する。
【０２８２】
ELISAキットは通常、2段階サンドイッチELISAである。すなわち、先ず、試験の対象となる活性剤の免疫反応形が、96ウェルマイクロプレートの上に固定される抗体によって「捕捉」され、未結合の物質がウェルから洗い出された後に、検出抗体が、結合免疫反応性薬剤と反応させられる。この検出抗体は通常、酵素（多くの場合西洋ワサビペルオキシダーゼ）と接合し、次に、免疫複合体としてプレートに結合した酵素の量が、その活性を、発色性試薬を用いて定量することによって測定される。浸透速度変化実験の各時点において採取された培養上清サンプルの外に、速度変化実験の開始時にユニットの頂上面に投与した処方（すなわち、対象となる生物学的活性剤を含む処方）の適当に希釈したサンプルについても、1組のメーカー支給の標準と共に定量される。各培養上清サンプルは一般に、ELISAによって二重ウェルについて定量される（浸透速度変化定量では各処方について4重のユニットが用いられ、全部で4回の時点で収集された培養上清サンプルは合計16になることを想起されたい）。
【０２８３】
A.    培養上清サンプル、又は、ユニットの頂上面に投与した物質の希釈サンプルにおける試験活性剤の見かけの濃度が、ELISAの完了後、標準濃度の範囲外に出るのは稀なことではない。実験サンプル中の物質の如何なる濃度でも、標準濃度を超えたところで外挿で決定されたものは無い。むしろ、サンプルは、反復ELISAにおける標準間の内挿によってより正確な決定を可能とする、試験物質の濃度を生成するように適当に再希釈される。
【０２８４】
B.    生物学的に活性な試験薬剤、例えば、ペプチドYYのためのELISAは、その設計及び推薦プロトコルが独特である。多くのキットと異なり、ELISAは2種類のモノクロナール抗体を用いる。一方は捕捉のため、他方は、検出抗体（この抗体は西洋ワサビペルオキシダーゼに接合される）として、生物学的活性試験薬剤、例えば、ペプチドYYに対する、非重複決定因子として働く。アッセイの上限を下回るペプチドYYの濃度が実験サンプルに存在する限り、メーカーの指示通りにアッセイプロトコルを用いることが可能である。その指示によれば、二つの抗体を同時に存在させたままサンプルをELISAプレート上でインキュベートすることが可能である。サンプルのペプチドYYレベルがこの上限よりも際立って高い場合には、免疫反応性ペプチドYYのレベルは、インキュベーション混合物中の抗体量を超えている可能性があり、検出抗体が結合していないあるペプチドYYがプレートに捕捉され、検出抗体を結合させたあるペプチドYYが捕捉されない可能性もある。これは、サンプル中のペプチドYYレベルの重大な過小評価を招く（このようなサンプルにおけるペプチドYYレベルは、アッセイの上限をはるかに下回るように見える）。この可能性を排除するために、アッセイプロトコルは修正された。
【０２８５】
B.1.    希釈サンプルは先ず、不動化捕捉抗体を含むELISAプレート上で、検出抗体を全く含まない状態で1時間インキュベートされる。この1時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄して、未結合物質を除去する。
【０２８６】
B.2.    検出抗体を1時間プレートとインキュベートし、全ての捕捉抗原と免疫複合体を形成させる。検出抗体の濃度は、捕捉抗体によって結合されたペプチドYYの最大レベルと反応するのに十分な量である。次に、このプレートを再び洗浄して未結合検出抗体を全て除去する。
【０２８７】
B.3.    ペルオキシダーゼの基質をプレートに加え、15分インキュベートして発色を起こさせる。
【０２８８】
B.4.    「停止」液をプレートに加えて、VMaxマイクロプレート分光光度計にて450 nm及び490 nmにおいて吸収度を読み取る。490 nmにおける発色産物の吸収は、450 nmにおける吸収度よりもはるかに低いが、各波長における吸収度は依然として産物の濃度に比例する。この2種類の読み取り値から、吸収度は、VMax装置の動作範囲において結合ペプチドYYの量と直線的に比例することが確かめられる（通例として我々は、範囲を0から2.5ODに限定しているが、この装置は、0から3.0ODの範囲に渡って正確であることが報告されている）。サンプルにおけるペプチドYYの量は、ELISAに含まれる様々な標準について得られたOD値の間に内挿することによって得られる。標準について得られた範囲の外側のOD読み取り値を持つサンプルは、再度希釈し、反復ELISAで再試験を行う。
【０２８９】
結果
TERアッセイによる経皮抵抗の測定：アッセイの最終時点後、膜を24ウェル培養プレートの各ウェルに0.3 mLの清浄培養液に浸して静置し、経上皮電気抵抗(TER)を、EVOM上皮電圧抵抗計とEndohmチェンバー(World Precision Instruments, Sarasota, フロリダ州)を用いて測定した。頂上電極は、膜の頂上面に接近するが、接触しないように調節した。一時に一つずつ、組織を、それぞれのウェルから取り出し、底面を、清浄なPBS中に浸して洗浄した。組織ユニットをEndohmチェンバーに入れ、250 μLのPBSをこの挿入体に加え、頂上電極を交換し、抵抗を測定し、記録した。測定後、PBSを傾斜除去し、組織挿入体を培養プレートに戻した。TER値は全て、組織の表面積の関数として報告される。
【０２９０】
最終数値は下記のように計算される、すなわち、
細胞膜のTER＝（膜を含む挿入体の抵抗（R）−ブランク挿入体のR）ｘ膜の面積(0.6 cm2)。
【０２９１】
例示のペプチドYY処方、処方Pは、細胞膜抵抗において最大の低下を示した（表2）。この結果は、例示の処方（例えば、処方P）は、試験濃度において、膜の抵抗を、コントロールの1%未満に下げることを示す。示した数値は、各処方につき3重の結果の平均である。処方AとBは、pH7.4又は5.0のリン酸バッファー生食液(PBS)100 mLに60 μgのペプチドY3-36を含むペプチドYYを再構成することによって調製されるコントロールである。粘膜輸送強化剤を持たないペプチドYYは抵抗を下げなかった。
【０２９２】
この結果は、ペプチドYYの鼻腔内投与強化のための例示の処方（例えば、処方P）は、細胞膜抵抗を下げ、粘膜上皮細胞の透過性を著明に増すことを示す。例示の処方は、血清、又は中枢神経系組織又は流体に対するペプチドYYの鼻腔内輸送を強化する。この結果は、これらの例示の処方は、粘膜上皮に接触すると、ペプチドYYに対する粘膜上皮の透過性の著明な増加をもたらすことを示す。
【０２９３】
2008501634.tif 000004
【０２９４】
ELISAアッセイで測定した浸透速度変化：  ペプチドYY及び鼻腔内輸送強化剤を含む、本発明の製薬処方の、EpiAirway（登録商標）細胞膜（上皮粘膜細胞層）を横切るペプチドYYの浸透に及ぼす影響を前述のように測定する。結果を表3に示す。EpiAirway（登録商標）細胞膜を横切るペプチドYYの浸透は、ELISAアッセイで測定する。
【０２９５】
本発明の例示の鼻腔内処方（例えば、処方P）では、表3で示すように、ペプチドYY浸透の最大増加は処方Pにおいて見られた。複数時点において上皮細胞から周囲の培養液に浸透する生物学的活性剤の濃度を定量するために、この過程ではELISAアッセイを用いる。結果は、処方A又はB（ペプチドYYのコントロール処方、100 mlのリン酸バッファー生食液(PBS)pH7.4又は5.0に60 μgのペプチドYY3-36を溶解したもの、Bachem AG, King of Prussia、ペンシルバニア州）に比べて、処方PにおけるペプチドYYの浸透が増加することを示す。平均して、処方Pの例示の鼻腔処方による120分時の浸透の蓄積的増加は、処方A又はBのコントロールよりも約1195倍大きい。
【０２９６】
2008501634.tif 000005
【０２９７】
MITアッセイ：  MTT-100、MatTekキッチを用いてMTTアッセイを行った。300 mLのMTT液を各ウェルに加えた。組織挿入体を、清浄なPBSで穏やかに濯ぎ、MTT液の中に入れた。サンプルを37℃で3時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞培養挿入体を、各挿入体を完全に被うためにウェル当たり2.0 mLの抽出液に浸した。抽出プレートに、蒸発を減らすために蓋をし密閉した。抽出は、暗黒中RTで一晩行う。抽出期間が完了した後、抽出液を混合し、ピペットで96ウェル・マイクロタイタープレートに移した。各サンプルにつき3重標本を負荷したのを始め、抽出液ブランクも負荷した。次に、サンプルの光学的濁度を、プレートリーダー(Molecular Devices)にて550 nmにおいて測定した。
【０２９８】
コントロール処方（処方A又はB）と比較した場合の、本明細書の教示による、ペプチドYYの鼻粘膜強化輸送のための例示処方（例えば、処方P）に関するMTTアッセイを表4に示す。ペプチドYY及び1種以上の鼻腔内輸送強化剤を含む処方、例えば、処方P（3重標本で行った実験）の結果から、この例示の実施態様では、粘膜上皮組織の生存性に対して最小の毒性作用があることが示される。
【０２９９】
2008501634.tif 000006
【０３００】
LDHアッセイ：  本明細書の教示による、ペプチドYYの鼻粘膜強化輸送のための例示処方（例えば、処方P）に関するLDHアッセイを表4に示す。処方Pの3重標本における結果から、この例示の実施態様では、粘膜上皮組織の生存性に対して最小の毒性作用があることが示される。
【０３０１】
2008501634.tif 000007
【０３０２】
実施例３
トリアムシノロンアセトニド・コルチコステロイドと混合した本発明の処方P（ペプチドYY）は、細胞生存率を改善する
本実施例は、ステロイド組成物、例えば、トリアムシノロンアセトニド、及びさらに、1種以上の鼻腔内輸送強化剤と共に混合した、鼻腔内投与ペプチドYY、例えば、ヒト・ペプチドYYについて、透過性及び粘膜上皮炎症の緩和を定量するために行ったインビトロ実験を紹介する。この実験では、TERアッセイによる上皮細胞の透過性、及び、ペプチドYYとトリアムシノロンアセトニドを含む実施態様投薬によるMTTアッセイにおける細胞生存率によって測定される上皮粘膜の炎症の定量が扱われる。
【０３０３】
処方P（前記表１参照）を、ある処方において、トリアムシノロンアセタニド0.5, 2.0, 5.0、又は50 μgの用量と混合する。季節のアルギー性鼻炎に対する、トリアムシノロンアセタニド(Nasacort（登録商標）、Aventis Pharmaceuticals)の標準用量は、1回スプレイ当たり55 μgである。トリアムシノロンアセトニド・コルチコステロイドと混合した処方Pは、MTTアッセイで測定した場合の細胞生存率を改善し、一方、TER及びELISAアッセイで測定した場合の上皮細胞透過性を維持する。
【０３０４】
本発明の方法及び処方に従って、トリアムシノロンアセトニドの存在下、又は不在下における処方Pの透過度の測定を、気道上皮細胞膜を用い経上皮電気抵抗(TER)アッセイによって行う。処方Pプラス、1回スプレイ当たり0.5, 2.0, 5.0、又は50 μgの濃度のトリアムシノロンアセトニドに対するTERアッセイから、ペプチドYYの透過度は減少せず、処方Pのみの透過度と等しいことが判明した。処方Pプラス、1回スプレイ当たり0から50 μgの濃度のトリアムシノロンアセトニドは、通常、処方A又はB（ペプチドYYコントロール）の透過度よりも少なくとも10倍から100倍大きい。
【０３０５】
本発明の方法及び処方に従って、トリアムシノロンアセトニドの存在下、又は不在下における処方Pの透過度の測定を、気道上皮細胞膜を用いELISAアッセイによって行う。前述のTERアッセイと同様に、処方Pプラス、1回スプレイ当たり0.5, 2.0, 5.0、又は50 μgの濃度のトリアムシノロンアセトニドに対するELISAアッセイから、ペプチドYYの透過度は減少せず、処方Pのみの透過度と等しいことが判明した。処方Pプラス、1回スプレイ当たり0から50 μgの濃度のトリアムシノロンアセトニドは、通常、処方A又はB（ペプチドYYコントロール）の透過度よりも大きい。
【０３０６】
本発明の方法及び処方に従って、トリアムシノロンアセトニドの存在下、又は不在下における処方Pの細胞生存性をMTTアッセイによって測定した。通常、トリアムシノロンアセトニド（1回スプレイ当たり0.5, 2.0, 5.0、又は50 μgの濃度で）の処方Pに対する添加は、トリアムシノロンアセトニド不在下における処方Pに比べて細胞生存率を改善する。
【０３０７】
トリアムシノロンアセトニドの処方Pに対する添加は、細胞生存率を増し、TERアッセイによって測定される上皮透過度を、トリアムシノロンアセトニド不在下における処方Pの透過度とほぼ同じレベルに維持する。
【０３０８】
鼻腔内投与ペプチドYYにおける上皮粘膜炎症の緩和は、通常、高効力化合物又は処方とされるものを始め、ある場合には中等度又は低度の効力を持つ化合物又は処方である1種以上のステロイド又はコルチコステロイド化合物（単複）と混合されたペプチドYYの鼻腔内処方によって実現される。高、中、及び低効力ステロイドの総合効力（当量用量）が示される。通常、高効力ステロイド組成物と混合されるペプチドYYの鼻腔内処方は、ベータメタゾン(0.6から0.75 mg用量)、又はデキサメタゾン（0.75 mg用量）を含むが、ただしこれらに限定されない。別の実施態様では、中効力ステロイド組成物と混合されるペプチドYYの鼻腔内処方は、メチルプレドニソロン(4 mg用量)、トリアムシノロン（4 mg用量）、又はプレドニソロン（5 mg用量）を含むが、ただしこれらに限定されない。さらに別の実施態様では、低効力ステロイド組成物と混合されるペプチドYYの鼻腔内処方は、ヒドロコーチゾン(20 mg用量)、又はコーチゾン（25 mg用量）を含むが、ただしこれらに限定されない。
【０３０９】
実施例４
タンパクである安定化剤無添加PYY処方の調製
PYYの鼻腔内投与に好適で、タンパクである安定化剤を事実上含まないPYY処方を調製した。処方は下記に列挙する通りである。
1.  約3/4の水をビーカーに加え、攪拌プレート上で攪拌棒にて攪拌し、クエン酸を加えて完全に溶解した。
2.  次に、EDTAを加え、完全に溶解するまで攪拌した。
3.  次に、クエン酸を加え、完全に溶解するまで攪拌した。
4.  メチル-β-シクロデキストリンを加え、完全に溶解するまで攪拌した。
5.  次に、DDPCを加え、完全に溶解するまで攪拌した。
6.  次に、ラクトースを加え、完全に溶解するまで攪拌した。
7.  次に、ソルビトールを加え、完全に溶解するまで攪拌した。
8.  次に、クロロブタノールを加え、完全に溶解するまで攪拌した。
9.  PYY3-36を加え、溶解するまで穏やかに攪拌した。
10.  pHが5.0±0.25であることを確認する。希釈HCl又は希釈NaOHを加えてpHを調節する。
11.  水を最終容量となるまで加える。
【０３１０】
2008501634.tif 000008
【０３１１】
実施例５
下記の表7に示すように、PYY3-36の濃度が15 mg/mLであることを除いては、前述と同様にして第2の処方を調製した。
【０３１２】
2008501634.tif 000009
【０３１３】
実施例６
PYYの至適pHの決定
40℃、5日間のpHに対するPYY3-36安定度の定量
A.  PYY(3-36)／pH安定実験サンプルの処方用プロトコル
浸透圧：標的250 mM
クエン酸塩／クエン酸ナトリウム、三塩基バッファー10 mMを使用
浸透圧＝粒子数ｘ浸透圧＝(1 + 4) x 10 mM = 50 mM
従って、100 mM NaCl（2粒子）によって浸透圧を250 mMに上げる。
【０３１４】
B.  下記のように安定性サンプルを調製(3500 μl)
最終濃度
クエン酸バッファー、1400 μL 25 mM（必要とされる最終pHの）10 mM
PYY 700 μl 1.5 mg/mL 300 ug/ml
クロロブタノール 350 μl 2.5%, 0.25%
NaCl、350 μl 1.0M, 100 mM
pHをチェックし、必要なら調整する。
水で3500 μLまで。
手順：
自動サンプル瓶の200 ulシラン化挿入体に120 μlのサンプル
1時点当たり3回プル
サンプルを40℃で5日間インキュベーション
【０３１５】
C.  安定混合物の標的pHと実際の最終pHとの比較
標的pH 実際のpH
3.0       2.99
3.5       3.47
4.0       3.90
4.5       4.42
5.0       4.90
7.0       7.38
【０３１６】
D.  HPLC手順
カラム：          Waters C18 Bondapak 10 μm 4.6 x 300 mm
HPLCシステム：         Waters Alliance 2690
検出器：          Waters 2487 220 nmにおける2重波長
流速：  1 ml/分
注入容量：      30 μL
カラム温度：   30℃
展開相：
バッファーA： 0.1%TFA、1%アセトニトリル水溶液
バッファーB： 0.11%TFAのアセトニトリル溶液
勾配：
時間（分）    %A     %B
0      75     25
17     42     58
19     75     25
28     75     25
【０３１７】
E.  結果及び結論
結果は、本実験で用いられた特定の条件下で得られたものであるが、安定性の至適pHは4.90であることを示す。pHが2.99から4.90に増大すると、安定性も76から87%に上昇する。
比較的高いpH、すなわち7.38では、PYY(3-36)の安定度に大きな低下が見られ、時間0の僅か15%しか残っていない。
【０３１８】
実施例７
鼻腔内処方の開発
ペプチド及びタンパクは、低分子量治療薬と比べると比較的脆弱である。処方開発相の目的は、鼻腔内輸送のために好適な候補処方を特定することである。この目標を達成するために、受容可能な薬剤安定性、鼻粘膜横断輸送、毒性、及び保存効果を持つ処方を特定するために数多くの候補について試験した。
【０３１９】
最初、pHの作用を調べた。図1は、高温(40℃)で見た、3.0から7.4までの各種pHにおけるPYY3-36の安定度を示す。生理的pHでは、高温時には薬剤の実質的な損失が見られた。約pH5.0において最高の安定度が得られた。以後の処方の最適化にはこのpHが選ばれた。
【０３２０】
安定度をさらに最適化するために、各種安定化剤について、薬剤の鼻粘膜貫通を促進する能力について試験した。試験した強化剤は、細胞傷害性は低いが、接着結合を開放できる能力に基づいて選択した。これを行うため、ヒト上皮細胞一次系統モデル（EpiAirway、MatTek, Inc., Ashland、マサチューセッツ州）を用いた。この細胞系統は、鼻の呼吸上皮のものと近似する、接着結合を持つ擬似層状の、柱状上皮細胞層を形成する。薬剤処方は、組織層の頂上側に投与し、薬剤定量は、基材培養液について行った。接着結合の開放度は、経上皮電気抵抗(TEER)の減少によって測定した。細胞生存率及び細胞傷害性は、それぞれ、MTT及びLDHアッセイによって監視した。代表的スクリーニング実験のデータを図2-5に示す。
【０３２１】
図2はTEERのデータを示す。いくつかの場合では、コントロールに比べ、TEERにほとんど、又は全く減少が見られない。これは、接着結合が閉じたままであることを示す。別の場合では、接着結合の開放を示すTEERの実質的な低下が見られた。この結果は、このインビトロ細胞モデルは、様々な処方について、その、接着結合を開放する能力の定量を可能にすることを示す。
【０３２２】
調べた候補処方において、細胞生存率（図3、MTT）は良好であり、細胞傷害性（図4、LDH）は低かった。
【０３２３】
全部で、200を超える様々の処方を試験した。これは、このインビトロスクリーニングモデルの高処理特性を反映する。得られた全てのデータを用いて、各処方成分が、7種の出力変数（薬剤透過度、浸透圧、冷蔵及び加速条件下の安定度、TEER、及び、MTT及びLDHアッセイ）のそれぞれに及ぼす作用を明らかにするために多変数解析を行った。多変数解析は、先ず、各処方成分について、出力パラメータとのある相関レベル（p<0.1）の有無について調べた。このようにして特定されたサブセットについて、直線回帰、又は、段階的論理選択モデルを用いた。結果から、一つの賦形剤は、浸透圧及び毒性と相関し（それぞれr2 = 0.91と0.27）、二つがPYY3-36の浸透と相関し（r2 = 0.44）、三つが安定どに影響を及ぼし(r2 = 0.24)、そして、五つが細胞周辺抵抗に影響を与える(r2 = 0.55)ことが示された。この過程によって求められた最善の処方は、単純なバッファー液と比べた場合、PYY3-36の輸送を少なくとも30-75倍増した。
【０３２４】
これらの分析に基づき、最適化されたPYY3-36処方がその後の開発研究に選ばれた。この最適化処方は、酢酸ナトリウムバッファーpH5.0の中に、2種の安定化剤、2種の浸透強化剤、1種のキレート剤、及び、1種の防腐剤を含んでいた。この処方は、USPの保存有効試験に合格した。薬剤浸透度に及ぼす、各種成分の協調的寄与を図5に示す。同じ浸透圧を持つ単純なバッファー処方と比べると、最適化された処方は、100倍を超える薬剤浸透の増加を示す。
【０３２５】
最後に、最適化処方の臨床前、及び臨床バッチを調製し、最終製品パッケージに収めて5℃及び25℃で安定性について調べた。表8に示す予備データから、5℃、25℃のいずれで最大2ヶ月保存しても90%以上のペプチドが保持されることが明らかとなった。
【０３２６】
2008501634.tif 000010
【０３２７】
要約すると、我々の、処方開発過程によって、4kDペプチドの輸送を可能とする、優れた薬剤安定性、鼻粘膜横断輸送、毒性及び保存効果を持つPYY3-36処方が得られた。
【０３２８】
臨床前実験
現在までに、ラット、ウサギ、及びイヌを用いて一連の6回の臨床前実験を完了した。全ての動物種において、PYY3-36の血漿レベルを、その有効性が証明されている自社開発のラジオイムノアッセイ法によって定量した。
【０３２９】
ラットにおけるバイオアベイラビリティ（血漿で特定された薬剤のモル画分を、鼻からの投与量で除したもの）は、約6%と定量され、ウサギでは約8%であった。これらの値は、真のバイオアベイラビリティを過小評価している可能性がある。なぜなら、サンプリング前にどのペプチドでも分解されるものであり、或いは、プロテイナーゼ阻害剤の存在にも拘わらず、サンプリング後にも分解されるものであり、それらが、バイオアベイラビリティの測定値を下げるからである。
【０３３０】
鼻への毒性は、ラットとウサギにおいて、mg/kgに基づくヒトの予想臨床用量の50倍の用量を最大14日間連続投与して評価した。試験品に関連して顕微鏡的にも、肉眼的にも病理的所見は認められなかった。臨床的所見は無かった。
【０３３１】
静注投与後の全身毒性を、ラット及びウサギモデルで評価した。ヒトの予想用量の、最大で約160倍の静注用量において（ラットでは400 ug/kg、ウサギでは205 ug/kg）、試験品に関連した、顕微鏡的、肉眼的病理的所見は認められなかった。
【０３３２】
循環器毒性は、用量範囲実験設計を用い、麻酔イヌモデルで評価した。最高用量、すなわち、最大24 ug/kgのPYY3-36の60分間静注輸液は、体表面積に基づくヒトの予想用量の33倍に相当する。得られた血漿レベル、30 ng/mLは、イヌ類の基礎血漿レベルの約380倍である。この血漿レベルでも、動脈圧、大腿の血流、又はQTcに対しては作用が認められず、心拍数（平均で123から148bpmへの増加）と呼吸数（54から36への減少）においてごく僅かな変化が認められただけであった。
【０３３３】
これらの臨床前実験では、薬剤速度論データを収集した。ラットにおける一つの実験で得られた、様々な濃度による鼻腔内投与後の血漿レベルを図6、7、及び8に示す。図6から、PYY3-36は、5分以内に血漿に認められ、10-15分（Tmax）以内にピーク血漿濃度に達し、終末の排泄半減期は約15分である。Cmaxも、AUX0-ｔも鼻腔内用量に対して直線的である。
【０３３４】
臨床実験
PYY3-36の鼻腔内処方の安全性、PK、及びバイオアベイラビリティを確立する目的で、用量範囲を定める臨床治験を始めた。今日まで、5回の用量コホートの内、最初の2回で患者を登録した。一人の患者が胸焼けを訴えたが、今日まで外には有害作用は無かった。
【０３３５】
結論
PYY3-36の鼻腔内処方について処方、臨床前研究、及び初期の臨床研究が始まったばかりである。処方に関する探求により、この4kDペプチドについて、細胞毒性を増すことなく、百倍以上の経膜透過度の増加が得られた。臨床前実験によって、PYY3-36の鼻腔、循環器、及び全身毒性には相当の安全性マージンのあることが実証された。現在進行中の用量範囲確定臨床実験に基づいて、慢性投与による減量実験が計画されている。
【０３３６】
実施例８Ａ
臨床プロトコル
健康なヒト被験者における鼻腔内ペプチドYY3-36（PYY3-36）の鼻腔吸収
本実験の目的
本実験の目的は、鼻腔内投与PYY3-36の、鼻から血流中への吸収を評価することである。これは、絶食した、正常で、健康な、男女のボランティアを含む、I相、臨床、単回投与、用量漸増実験である。PYY3-36の安全性、鼻における受容性、及び吸収を評価するために、20 μgから200 μgまでの間で鼻腔内PYY3-36の漸増用量を評価した。各個人における食欲感覚の評価も行った。
【０３３７】
PYY3-36は、それぞれ3人から成る5グループに分割された15名の健康なヒトに投与された。
グループI
第1グループは、20 μgのPYY3-36の0.1 ml溶液から成る鼻腔内スプレイを1回投与された。
グループII
第2グループは、50 μgのPYY3-36の0.1 ml溶液を鼻腔内に投与された。
グループIII
第3グループは、100 μgのPYY3-36の0.1 ml溶液を鼻腔内に投与された。
グループIV
第4グループは、150 μgのPYY3-36の0.1 ml溶液を鼻腔内に投与された。
グループV
第5グループは、200 μgのPYY3-36の0.1 ml溶液を鼻腔内に投与された。
【０３３８】
血液サンプルを採取し、PYYの血漿濃度を、投与後、0（すなわち、投与前）、5、7.5、10、15、20、30、45、60分に定量した。次に被験者に食べさせ、血液サンプルを取り、食後30分にPYYの濃度を定量した。PYY3-36の血漿濃度を、その有効性が証明されている分析法によって定量した。
【０３３９】
各被験者について、独立のモデル実験に従って、PYY3-36の血漿濃度に基づいて、可能な場合は必ず、下記のPKパラメータを計算した。
Cmax    観察された最大濃度
tmax    最大濃度に達するまでの時間
AUC0-t    時間0から、測定可能な最後の時間までの、濃度-時間曲線下面積、直線台形法によって計算した。
【０３４０】
データが正確な推定を可能にする場合、下記のパラメータも計算した。
AUC0-∞    無限大に外挿した場合の濃度-時間曲線下面積で、下式を用いて計算される、すなわち、
AUC0-∞ = AUC0-t + Ct/Ke
式中、Ctは、最後の測定可能な濃度であり、Keは、見かけの終末相速度定数である。
Ke    見かけの終末相速度定数であり、Keは、終末相における、log濃度対時間プロフィールの回帰直線の勾配の大きさである。
t1/2    見かけの終末相半減期（可能な場合は必ず）。ここに、t1/2 = (ln2)/Ke
【０３４１】
PK計算は、市販のソフトウェア、例えば、WinNonlin(Pharsight Corporation、バージョン3.3以上)を用いて行った。結果を下記のグラフに示す。
【０３４２】
考察と結論
背景
各投与群は、指定用量の、合成の、発熱物質非含有、ヒトPYY3-36を含む、本発明の処方によって1回鼻腔内投与された3名の被験者を含む。5通りの投与群を、処方におけるPYY3-36用量の上昇順に配列した。血液サンプルを、指定の間隔で、リチウムヘパリン（凝固を抑制するため）とアプロチニン（PYY3-36を保存するため）を含む血液採取管に吸引した。各血液サンプルから遠心にて血漿を収集し、凍結分液として保存した。各血液サンプルから一つの凍結分液をNastech Analytical Servicesに凍結したまま届くように出荷した。各サンプルは、ラジオイムノアッセイ(RIA)によってPYY濃度を定量するまで凍結保存した。
【０３４３】
観察
グループ1：  このグループの被験者には、20マイクログラムのPYY3-36を投与した。被験者の血漿PYY濃度は、最小「20 pg/ml未満」（ラジオイムノアッセイ定量化の下限を下回る）から最大159 pg/mlまで変動した。観察された濃度の傾向は、薬剤が実験した被験者の血液に著明に吸収される所見とは一致しなかった。
グループ2:   このグループの被験者には、50マイクログラムのPYY3-36を投与した。被験者の血漿PYY濃度は、最小50 pg/mlから最大255 pg/mlまで変動した。観察された濃度の傾向は、薬剤が実験した被験者の血液に著明に吸収される所見と一致した。
グループ3:   このグループの被験者には、100マイクログラムのPYY3-36を投与した。被験者の血漿PYY濃度は、最小87 pg/mlから最大785 pg/mlまで変動した。観察された濃度の傾向は、薬剤が実験した被験者の血液に著明に吸収される所見と一致した。
グループ4:   このグループの被験者には、150マイクログラムのPYY3-36を投与した。被験者の血漿PYY濃度は、最小45 pg/mlから最大2022 pg/mlまで変動した。観察された濃度の傾向は、薬剤が実験した被験者の血液に著明に吸収される所見と一致した。
グループ5:   このグループの被験者には、200マイクログラムのPYY3-36を投与した。被験者の血漿PYY濃度は、最小48 pg/mlから最大1279 pg/mlまで変動した。観察された濃度の傾向は、薬剤が実験した被験者の血液に著明に吸収される所見と一致した。
【０３４４】
これらの結果は、PYY3-36の用量依存性吸収と一致する。
【０３４５】
追加観察とデータ
所見の要約
＊50 ug −200 ugの鼻腔内用量では、PYYの用量依存性血漿摂取が見られる。
＊血漿濃度上昇の持続時間は、55分時に計算された排泄半減期から見て、予想よりも相当長い。
＊Cmax及びAUC0-tは、用量に対し良好な直線性を示す。
＊任意の用量において相当な被験者間のバラツキがある。
＊驚くべきことに、本実験では、食後のPYYの上昇を検出することができなかった。ただし、実際に摂取された食事の量は測定されておらず、食事量が少なすぎることがこの所見を説明する可能性はある。
【０３４６】
＊視覚的なアナログスケールによる空腹設問から、PYY用量の増加とともに空腹が減ることが示唆された。
＊悪心及び眩暈が極度に高いPYY血漿濃度と関連するようである。
ノート
注記
＊PYYの測定単位にpMol/Lが使われる場合もあるし、pg/mLが使われる場合もある。この変換係数は、pmol/L＊4.05＝pg/mLである。
＊ある場合には、150分時点がプロットに示されている。厳密に言うと、これは、食後のデータポイントであり、従ってPK評価を混乱させる恐れがある。しかしながら、下記に詳述するが、食後30分時点は基礎値と変わらないという思いがけない所見が得られた。
【０３４７】
PYY血漿濃度
本明細書に記載されるPYYアッセイは、それ自身のPYY血漿濃度アッセイの有効性について確かめられている。このアッセイを用いて、各時点のサンプルを3重に評価した。180個のデータポイントの内、3個（1.6%）が、生物学的に無意味な「外れもの」であるようである。この予備分析のデータは全て、この3個のデータポイントを取り除いたデータ組を用いている。
【０３４８】
2008501634.tif 000011
【０３４９】
平均PKプロットを調べてみると、用量反応は50 −200 ug用量で現れ、20 μg用量はノイズの中にあることが示される。従って、以後の分析の多くは、50 −200 ug用量のデータのみに基づく。我々はまた、PYYは内在性分子なのであるから、AUC0-tの方がAUC0-無限よりも関連性が高いと考える。
【０３５０】
2008501634.tif 000012
【０３５１】
24分のTmaxは、鼻腔投与品では典型的である。55分の排泄半減期は、予想よりも相当に長い。参考文献は、t1/2は通常5-10分であることを示す。排泄半減期はまた、Tmax以後にも見られる鼻粘膜からの若干の連続的摂取や、ペプチド代謝に作用する処方成分によっても影響される。それとは別に、本明細書に記載されるアッセイは抽出工程を用いているので、アッセイは、遊離PYYとタンパク結合PYYの両方を捕捉するのに対し、抽出を用いないアッセイでは、主に遊離分画のみが定量される。
【０３５２】
基礎値からの平均VAS変化（10、30、及び60分値マイナス基礎値の平均）対用量の分析から、次のことが観察される。すなわち：
【０３５３】
VAS Q1「どのくらい空腹を感じますか？」に対して、被験者は、より高いPYY投与を受ければ受けるほど、空腹感はより少なくなる。VAS Q3「どのくらい食べられると思いますか？」に対しては、被験者は、より高いPYY投与を受ければ受けるほど、食べられると感じる量が少なくなる。しかしながら、VAS Q2「どのくらい満腹ですか？」に対して、被験者は、より高いPYY投与を受ければ受けるほど、満腹感は少ないと感じる。このことは、PYY投与後の感覚は、満腹感、膨満感、又は胃の過度の収縮を含まないことを示す。
【０３５４】
実施例８B
2008501634.tif 000013
【０３５５】
ヒト被験者に対し毎日1回又は2回のスプレイを10日間に渡って投与したところ、2.5ポンドの減量が記録された。投与後10分から12時間の範囲の期間に渡って、被験者は空腹感の減退を記録した。
【０３５６】
実施例９
PYY3-36の頬内処方（予測的）
下記の方法で二層錠剤を調製する。接着層は、70重量部のポリエチレンオキシド(Polyox 301N; Union Cabide)、20重量部のポリアクリル酸(Carbopol 934P; B.F. Goodrich)、及び、10重量部の圧縮可能なキシリトール／カルボキシメチルセルロース充填剤(Xylitab 200; Xyrofin)を秤量することによって調製する。これらの成分を、ジャーの中で3分間捏ねて混ぜ合わせる。次に、混合物を蒸発皿に移し、手早く絶対アルコールで濡れ顆粒状とし、半生パン生地状にする。この塊りを直ちに、速やかに、14メッシュ（1.4 mm開口）のステンレススチール・スクリーンで強制的に濾す。スクリーンには濡れた顆粒が着く。スクリーンを穴明きアルミフォイルで被い、濡れた顆粒を30℃で一晩乾燥させる。乾燥顆粒をスクリーンから外し、次に、20メッシュ（0.85 mm開口）スクリーンを通過させ、顆粒のサイズをさらに小さくする。20メッシュスクリーンを通過しない顆粒は、最終残余量を最小にするために、手早く乳鉢・乳棒で粉砕し、次に20メッシュスクリーンを通過させる。次に、得られた顆粒を混合ジャーに入れ、0.25重量部のステアリン酸と0.06重量部のミント芳香(Universal Flavors)を、顆粒に加え混合する。従って、組成物の最終重量パーセントは、69.78%のポリエチレンオキシド、9.97%の圧縮可能なキシリトール／カルボキシメチルセルロース充填剤、19.94%のポリアクリル酸、0.25%のステアリン酸、及び、0.06%のミント芳香である。この混合物の50 mg量を、0.375インチ直径の金型に入れ、Carver Press Model Cにより0.25メトリックトンの圧力下3秒の滞在時間で前段圧縮することにより接着層を形成する。
【０３５７】
活性層は、49.39重量部のマンニトール、34.33重量部のヒドロキシプロピルセルロース(Klucel LF; Aqualon, Wilmington, デラウェア州)、及び、15.00重量部のタウロコール酸ナトリウム(Aldrich、ミルウォーキー、ウィスコンシン州)を秤量し、ジャーの中で3分間捏ねて混ぜ合わせることによって調製する。次に、混合物を蒸発皿に移し、手早く絶対アルコールで濡れ顆粒状とし、半生パン生地状にする。この塊りを直ちに、速やかに、14メッシュのステンレススチール・スクリーンで強制的に濾す。スクリーンには濡れた顆粒が着く。スクリーンを穴明きアルミフォイルで被い、濡れた顆粒を30℃で乾燥させる。次に、乾燥顆粒をスクリーンを順次、20、40（0.425 mm開口）、及び60（0.25 mm開口）メッシュスクリーンを通過させ、顆粒のサイズをさらに小さくする。スクリーンを通過しない顆粒は、最終残余量を最小にするために、手早く乳鉢・乳棒で粉砕し、次に上記スクリーンを通過させる。ろ過した粒子を秤量し、次に0.91重量部のPYY3-36及び0.06重量部のFD&C黄色#6HTアルミニウムレーキ染料を順次、形態希釈によって乾燥顆粒と混合する。次に、染色された顆粒を混合ジャーに入れ、0.25重量部のステアリン酸と0.06重量物のミント芳香と3分間捏ねることによって混合する。この材料の50 mgサンプルを、部分的に圧縮された接着層の上に置き、両層を、1.0トンの圧力下3秒の滞在時間で圧縮することにより頬内輸送に好適な二層錠剤を得る。
【０３５８】
この過程により、歯槽錠剤であって、活性層が、0.91重量%のPYY3-36、15重量%のNaTC、及び84.09重量%の充填剤、潤滑剤、着色剤、処方支援、又は芳香剤を含む錠剤が得られる。
【０３５９】
実施例１０
実施例1の過程に従って、エンドトキシン非含有PYY(3-36)（配列番号2）対非エンドトキシン非含有PYY(3-36)の、気管支上皮に浸透する能力を比較する実験を行った。エンドトキシン非含有PYY(3-36)は、エンドトキシンを含むPYY(3-36)と比べ、約2倍の量が気管支上皮に浸透することが確定した。
【０３６０】
両処方とも、クロロブタノール2.5 mg/ml、2 mg/mlのDDPC、10 mg/mlのアルブミン、1 mg/mlのEDTA（エデト酸二ナトリウム）、及び45 mg/mlのM-B-CDを含む。一方の処方は、エンドトキシン非含有PYY(3-36)を含み、他方の処方は、70EU以上のエンドトキシンを含んでいた。
【０３６１】
エンドトキシンを含むPYY(3-36)の平均MTTは91.72%であったが、一方、エンドトキシン非含有PYY(3-36)処方の平均MTTは100.16%であった。
【０３６２】
エンドトキシンを含むPYY(3-36)の平均浸透率は5.36%であったが、一方、エンドトキシン非含有PYY(3-36)処方の平均浸透率は10.75%であった。
【０３６３】
いくつかの既知の輸送強化賦形剤は、エンドトキシン非含有Y2受容体結合ペプチド、特に、エンドトキシン非含有PYY3-36と混合されると効果的であり、非輸液処方、特に、経口輸送を改善するのに使用することが可能である。このような賦形剤は、下記の特許出願にふくまれている。なお、これらの特許文書を引用することにより本明細書に含める。
米国特許出願第20030225300, 20030198658, 20030133953, 20030078302, 20030045579, 20030012817, 20030012817, 20030008900, 20020155993, 20020127202, 20020120009, 20020119910, 20020065255, 20020052422, 20020040061, 20020028250, 20020013497, 20020001591, 20010039258, 20010003001号。
【０３６４】
Y2受容体結合ペプチドの経口処方
下記の過程によってY2受容体結合ペプチドの経口処方を調製することが可能である。経口輸送用の好ましい処方は、約0.5 mg/kgのエンドトキシン非含有PYY、及び100から200 mg/kgの1種以上の粘膜輸送強化賦形剤を含む。（予測的）
【０３６５】
実施例１１
N-シクロヘキサノイルフェニルアラニンアルデヒドの調製
フェニルアラニンメチルエステル(1 g, 0.0046モル)をピリジン5 mLに溶解する。シクロヘキサノイルクロリド(0.62 mL)を加え、混合物を2時間攪拌する。反応混合物を塩酸(1N)と砕氷に加える。水性混合物をトルエンで2度抽出する。合わせたトルエン抽出物を真空中で濃縮し、1.1 gの未精製N-シクロヘキサイノイルフェニルアラニンメチルエステルを得る。
【０３６６】
N-シクロヘキサイノイルフェニルアラニンメチルエステル(0.5 g)をエチレングリコールジメチルエーテル(20 mL)に溶解する。この溶液を70℃に冷却し、ジイソブチルアルミニウムヒドリド（2.04 mLの1.5Mトルエン液）を加える。得られた反応混合液を-70℃で2時間攪拌する。反応を2N塩酸の滴下によって停止させる。反応液を冷却酢酸エチルによって抽出する。酢酸エチル液を塩水で洗い、硫酸ナトリウム上で乾燥させる。減圧濃縮により白色固体が得られ、これをシリカゲルクロマトグラフィーによって精製する。1H NMR (300 MHz, DMSO-d6):9.5(s, 1H), 8.2(d, 1H), 7.2(m, 5H), 4.2(m, 1H), 3.2(d, 1H), 2.7(d, 1H), 2.1(m, 1H), 1.6(br.m, 4H), 1.2(br. m, 6H)
R(KBr):3300, 3050, 2900, 2850, 2800, 1700, 1600, 1500 cm-1
質量分析：M+1 m/e 261
【０３６７】
実施例１２
N-アセチルフェニルアラニンアルデヒドの調製
N-アセチルフェニルアラニンメチルエステル(4.2 g, 19ミリモル)をエチレングリコールジメチルエーテルに溶解する。溶液を-70℃に冷却し、ジイソブチルアルミニウムヒドリド（25.3 mLの1.5Mトルエン液、39 mmol）を加える。得られた反応混合液を-70℃で2時間攪拌する。反応を2N塩酸の滴下によって停止させる。混合物を冷却酢酸エチルで4回抽出し、トルエンで4回抽出する。抽出物を合わせ、塩水で洗い、硫酸マグネシウム上で乾燥させる。減圧濃縮により白色固体が得られる。NMRは、文献Biochemistry, 18:921-926(1979)に報告されている。
【０３６８】
実施例１３
3-アセタミド-4-(p-ヒドロキシ)フェニル-2-ブタノン(N-アセチルチロシノンの調製
チロシン（28.9 g, 16 mmol）、無水酢酸(97.9 g, 96 mmol)、及びピリジン(35 g, 16 mmol)の混合物を100℃で1時間加熱する。反応混合液を減圧濃縮したところ黄色油状物が得られる。この油状物を減圧蒸留したところ29.9 gの油状物が得られる。
【０３６９】
1H NMR (DMSO-d6): NMR (d6-DMSO);8.2(d, 1H), 7.3(d, 2H), 7.0(d, 2H), 4.4(m, 1H), 3.1(dd, 1H), 2.7(dd, 1H), 2.3(s, 3H), 1.8(s, 3H)
【０３７０】
実施例１４
3-アセタミド-7-アミノ-2-ブタノン(N-アセチルリシノン)の調製
実施例3の過程に従って、リシンをN-アセチルリシノンに変換する。
【０３７１】
1H NMR (DMSO-d6):8.1(d, 1H), 7.8(br.m. 1H), 4.1(m, 1H), 3.0(m, 2H), 2.0(s, 3H), 1.9(s, 3H)、及び1.3(br.m, 6H)
【０３７２】
実施例１５
3-アセタミド-5-メチル-2-ブタノン(N-アセチルロイシノン)の調製
実施例3の過程に従って、ロイシンをN-アセチルロイシノンに変換する。
1H NMR (DMSO-d6):8.1(d, 1H), 4.2(m, 1H), 2.0(s, 3H), 1.8(s, 3H), 0.8(d, 6H)
【０３７３】
実施例１６
ベンゼンスルホニルクロリドによる4-(4-アミノフェニル)ブチル酸の修飾
4-(4-アミノフェニル)ブチル酸(20 g, 0.11モル)を、110 mLの、2N水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。室温で5分間攪拌した後、ベンゼンスルホニルクロリド(14.2 mL, 0.11モル)を、15分に渡ってこのアミノ酸溶液に滴下する。室温で約3時間攪拌した後、塩酸を加えることによってこの混合物をpH2に酸化する。これによって淡褐色沈殿が得られ、これをろ過によって単離する。沈殿を温水で洗浄し乾燥する。融点は123-25℃である。
【０３７４】
必要ならば、この修飾アミノ酸は、再結晶及び／又はクロマトグラフィーによって精製してもよい。
【０３７５】
実施例１７
ベンゼンスルホニルクロリドによる4-アミノ安息香酸の修飾
実施例6の過程に従って、4-アミノ安息香酸を、4-（フェニルスルホナミド）安息香酸に変換する。
【０３７６】
実施例１８
ベンゼンスルホニルクロリドによる、4-アミノフェニル酢酸、4-アミノ馬尿酸、及び4-アミノメチル安息香酸の修飾
実施例6の過程に従って、4-アミノフェニル酢酸、4-アミノ馬尿酸、及び4-アミノメチル安息香酸を、それぞれ、4-（フェニルスルホナミド）フェニル酢酸、4-(フェニルスルホナミド)馬尿酸、及び4-(フェニルスルホナミドメチル)安息香酸に変換する。
【０３７７】
実施例１９
ベンゼンスルホニルクロリドによるアミノ酸の修飾
化学的修飾の前に、16種のアミノ酸の混合物を調製する。この混合物の組成物を下記の表にまとめる。このアミノ酸混合物の65グラム（[--NH2]基の合計濃度＝0.61モル）を、室温で760 mLの1N水酸化ナトリウム液(0.726当量)に溶解する。20分攪拌後、ベンゼンスルホニルクロリド(78 ml、1当量)を20分間に渡って加える。次に、この反応混合液を加熱することなく2.5時間攪拌する。沈殿がいく分生じたなら、さらにNaOH溶液(2N)を溶液に、pH9.3に達するまで加えてもよい。反応混合液を室温で一晩攪拌する。その後、混合液を、塩酸希釈液(38%, 1:4)で酸化すると、クリーム状有色物質が沈殿する。この得られた沈殿を傾斜分離し、水酸化ナトリウム(2N)に溶解する。次に、この溶液を減圧濃縮すると黄色固体が得られる。これを凍結乾燥器にて乾燥する。
【０３７８】
2008501634.tif 000014
【０３７９】
実施例２０
ベンゼンスルホニルクロリドによる5種のアミノ酸混合物の修飾
複数のアミノ酸（下表参照）の混合物86.1 g(NH2の0.85モル)を、643 mL (1.5当量)の2N水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。室温で30分攪拌した後、ベンゼンスルホニルクロリド(108 mL, 0.86モル)を、15分に渡ってこのアミノ酸溶液に部分に分けて加える。室温で2.5時間攪拌した後、反応混合液のpH(pH5)を、さらに2N水酸化ナトリウムを加えてpH9に調整する。この反応混合液を室温で一晩攪拌する。その後、反応混合液のpHを、希釈塩酸水溶液(4:1, H2O:HCl)を加えてpH2.5に調整すると、修飾アミノ酸の沈殿が得られる。上層を捨て、得られた黄色沈殿物を傾斜分離し、水で洗浄し、2N水酸化ナトリウム(2N)に溶解する。溶液を減圧濃縮すると、黄色固体が得られ、これを一晩凍結乾燥する。
【０３８０】
2008501634.tif 000015
【０３８１】
実施例２１
ベンゼンスルホニルクロリドによる5種のアミノ酸混合物の修飾
複数のアミノ酸（実施例20の表参照）の混合物86 g(NH2の0.85モル)を、637 mL (1.5当量)の2N水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。室温で10分攪拌した後、ベンゾイルクロリド(99 mL, 0.85モル)を、10分に渡ってこのアミノ酸溶液に部分に分けて加える。室温で2.5時間攪拌した後、反応混合液のpH(pH12)を、希釈塩酸(4:1, H2O:HCl)にてpH2.5に調整すると、修飾アミノ酸の沈殿が得られる。1時間底に堆積させて、得られた沈殿物を傾斜分離し、水で洗浄し、水酸化ナトリウム(2N)に溶解する。溶液を減圧濃縮すると、未精製修飾アミノ酸が白色固体として得られる（予想収量、220.5 g）。
【０３８２】
実施例２２
ベンゼンスルホニルクロリドによるL-バリンの修飾
L-バリン(50 g, 0.43 mol)を、376 mL (0.75当量)の2N水酸化ナトリウム水溶液に、室温で10分攪拌して溶解する。次に、ベンゾイルクロリド(68.7 mL, 0.38 mol, 1.25当量)を、20分に渡って室温でこのアミノ酸溶液に加える。室温で2時間攪拌した後、沈殿が現れる。この沈殿を、さらに20 mLの2N水酸化ナトリウムを加えることによって溶解する。さらに30分攪拌した後、希釈塩酸(4:1, H2O:HCl)を、反応混合液のpHが2.6に達するまで加える。修飾アミノ酸の沈殿が形成され、傾斜分離によって回収する。この物質を、2N水酸化ナトリウムに溶解する。未精製修飾アミノ酸の予想収量は、84.6 g, 77%である。
【０３８３】
実施例２３
ヒプリルクロリドによるフェニルアラニンメチルエステルの修飾
L-フェニルアラニンメチルエステル塩酸(15 g, 0.084 mol)を、ジメチルホルムアミド(DMF)(100 mL)に溶解し、これにピリジン(30 mL)を加える。直ちにヒプリルクロリド溶液（100 mLのDMFに16.6 gを溶解、0.084モル）を、二つの部分に分けてこのアミノ酸エステル溶液に加える。この反応混合液を室温で一晩攪拌する。次に、反応混合液を減圧濃縮し1N水酸化ナトリウム水溶液に溶解する。メチルエステルを加水分解して遊離カルボン酸とするために、この溶液を70℃で3時間加熱する。その後、希釈塩酸水溶液(1:3, HCl/H2O)によって溶液をpH2.25まで酸性にする。ゴム状沈殿が形成されるので、これを回収し、1N水酸化ナトリウムに溶解する。溶液を減圧濃縮すると、予想収量18.6 gの未精製修飾アミノ酸産物が得られる。アセトニトリルによる再結晶後、精製修飾フェニルアラニン（予想収量12 g）が白色粉末として回収される。融点223-225℃。
【０３８４】
実施例２４
PYY(3-36)投与液の調製
試験管に、568 mgのアセチルフェニルアラニンアルデヒド、132 mgのカルボメトキシフェニルアラニルロイシン、及び、100 mgのアセチル-Phe-Leu-Leu-Argアルデヒドを、2.9 mlの15%エタノールに加える。この溶液を攪拌し、NaOH(1.0N)を加え、pHを7.2に上げる。水を加え、全体容量を4.0 mLとする。このサンプルは、200 mg/mLの担体濃度を有する。PYY(3-36)(800 μg)を溶液に加える。PYY3-36の全体濃度は200 μg/mLである。
【０３８５】
同様の過程に従って、担体組成物として、668 mgのアセチルフェニルアラニンアルデヒドと132 mgのカルボメトキシフェニルアラニルロイシンとを有する第2溶液、及び、担体としてアセチルフェニルアラニンアルデヒドを有する第3溶液を調製する。各溶液は、エンドトキシン非含有のPYY(3-36)を200 μg/mLの濃度で含む。
【０３８６】
実施例２５
修飾されたアミノ酸／PYY(3-36)組成物の調製
封入型エンドトキシン非含有PYY3-36を含む修飾アミノ酸微小球の調製
実施例9に従って調製された修飾アミノ酸混合物を、40℃で蒸留水(pH7.2)に溶解し100 mg/mlの濃度とする。次に、この溶液を0.2ミクロンフィルターでろ過し、温度を40℃に維持する。PYY3-36(Bachem)を、クエン酸水溶液(1.7N)とゼラチン(5%)に溶解し、150 mg/mlの濃度とする。次に、この溶液を40℃に加熱する。この二つの加熱された溶液を1:1(v/v)で混合する。次に、得られたこの微小球懸濁液をグラスウールでろ過し、1000gで50分遠心する。ペレットを、0.85Nクエン酸で、元の容量の5から7倍未満に再懸濁する。再懸濁ペレットのPYY3-36濃度はHPLCで定量する。PYY3-36を含まない、さらに別の微小球を前述の過程に従って調製する。この「空の微小球」は、必要ならば、封入されたサケPYY3-36微小球製剤を希釈して最終的投与懸濁液を調製するのに用いる。
【０３８７】
(b)可溶性修飾アミノ酸担体／PYY3-36システムの調製
PYY3-36を含む可溶性アミノ酸投与製剤を、修飾アミノ酸物質を、蒸留水(pH8)に適当な濃度となるように溶解することによって調製する。溶液を40℃に加熱し、次に0.2ミクロンフィルターでろ過する。これも蒸留水に溶解したPYY3-36を、経口投与前に、この修飾アミノ酸液に加える。
【０３８８】
PYY3-36の肺輸送（予測的）
後述のように調製される担体化合物は、1種以上の化合物又は塩、ポリアミノ酸、又はペプチドと、肺輸送用エンドトキシン非含有Y2受容体結合ペプチドと単純に混ぜ合わせることによって直接輸送担体として用いることが可能である。
【０３８９】
投与混合物は、投与の直前に、担体の水溶液と活性成分の水溶液とを混合することによって調製される。それとは別に、担体と、生物学的又は化学的に活性を持つ成分とは、製造過程において混合されてもよい。溶液は選択的に、添加剤、例えば、リン酸バファー塩、クエン酸、酢酸、ゼラチン、アカシアゴムのような添加剤を含んでもよい。
【０３９０】
PYYの肺への輸送を向上させるために、エンドトキシン非含有Y2受容体結合ペプチド、特にPYY3-36を用いるには、いくつかの既知の肺輸送法を用いることが可能である。下記の非限定的特許出願を、肺輸送に関して参照することにより本明細書に含める。すなわち、米国特許出願第20030223939, 20030215514, 20030215512, 20030209243, 20030203036, 20030198601, 20030183228, 200301885765, 20030150454, 20030124193, 20030094173号である。
【０３９１】
実施例２６
担体の調製
2-(4-(N-サリチロイル)アミノフェニル)プロピオン酸（担体B）の調製
58.6 g(0.355 mol)の2-(4-アミノフェニル)プロピオン酸と500 mlのメチレンクロリドから成るスラリーを、90.11 ml(77.13 g, 0-710 mol)のトリメチルシリルクロリドで処理し、120分加熱して環流する。この反応混合液を0℃に冷却し、184.44 ml(107.77 g, 1.065 mol)のトリエチルアミンで処理する。5分間攪拌後、この混合液を、70.45 g(0.355 mol)のO-アセチルサリチロイルクロリド及び150 mlのメチレンクロリドの溶液で処理する。反応混合物を25℃に温め、64時間攪拌する。揮発物を減圧除去する。残留物を、2N水酸化ナトリウム水溶液で1時間攪拌し、2Mの硫酸水溶液で酸性にする。固体を、エタノール／水から2回再結晶したところ、漆黒の固体が得られた。ろ過で分離することにより、予想された収量の、53.05 g(52%収率)の2-(4-N-サリチロイル)アミノフェニル）プロピオン酸が得られた。性質。可溶性：200 mg/m: 200 mg + 350 μL 2N NaOH + 650 μL H2O  -pH-7.67。分析：C, 67.36; H, 5.3; N, 4.91
【０３９２】
ナトリウム2-(4-(N-サリチロイル)アミノフェニル)プロピオン酸（担体Bのナトリウム塩）の調製
53.05 g(0.186 mol)の2-(4-(N-サリチロイル)アミノフェニル)プロピオン酸及び300 mlのエタノールから成る溶液を、22 mlの水に溶解した7.59 g(0.190 mol)のNaOHで処理する。この反応混合液を25℃で30分、及び0℃で30分攪拌する。得られた淡黄色固体をろ過によって分離したところ、52.61 gのナトリウム2-(4-(N-サリチロイル)アミノフェニル)プロピオン酸が得られる。性質。可溶性：200 mg/m透明液; pH=6.85。分析：C, 60.45; H, 5.45; N, 3.92; Na, 6.43。融点236-238℃
【０３９３】
担体Cのナトリウム塩の調製
マグネット式攪拌器及び環流凝縮器を備える2Lの丸底フラスコに、ジクロロメタン(250 ml)に溶解した3-(4-アミノフェニル)プロピオン酸(15.0 g, 0.084 mol、1.0当量)を充填する。クロロトリメチルシラン(18.19 g, 0.856 mol、2.0当量)を一度に加え、混合液をアルゴン下に1.5時間加熱して環流する。反応を室温に冷却させ、氷浴に入れる（内部温度<10℃）。環流凝縮器を、トリエチルアミン(25.41 g, 0.251 mol, 3.0当量)を含む添加漏斗と交換する。トリエチルアミンを15分に渡って滴下すると、添加時に黄色固体が形成される。漏斗を、ジクロロメタン(100 mL)に溶解した2,3-ジメトキシベンゾイルクロリド(18.31 g, 0.091 mol, 1.09当量)の溶液を含むさらに別の漏斗と交換する。この溶液を30 nmに渡って滴下する。反応を、さらに30分氷浴で、次に室温で3時間攪拌する。ジクロロメタンを減圧留去すると褐色油状物が得られる。この褐色油状物を氷浴で冷却し、飽和重炭酸ナトリウム(250 ml)の氷冷液を加える。氷浴を取り除き、反応を1時間攪拌すると、透明な褐色液が得られる。この溶液を濃縮HClで酸性にし、ほぼSCで1時間保存する。混合物をジクロロメタン(3回、100 mL)で抽出し、硫酸ナトリウム上で乾燥し、塩を濾し分け、ジクロロメタンを減圧留去する。得られた固体を50%酢酸エチル／水(v/v)から再結晶させると、白色針状の担体C酸が得られる(25.92 g, 90%)。C19H21NO5の分析：C, 66.46; H, 6.16; N, 4.08。融点99-120℃
【０３９４】
12グラムの担体C酸を温めながらエタノール75 mlに溶解する。この溶液に、8.5M水酸化ナトリウム溶液(1.02モル当量、4.5 mLの水に1.426グラム)を加える。この混合液を15分攪拌する。エタノール約4分の3を減圧留去し、得られた油状物にn-ヘプタン100 mLを加えると沈殿が形成される。この固体を50℃で減圧乾燥する。分析：C19H20NO5Na0.067H2O: C, 62.25; H, 5.54; N, 3.82; Na, 6.27。
【０３９５】
N-(4-メチルサリチロイル)-8-アミノカプリル酸（担体D）の調製
(a)オリゴ(4-メチルサリチレート)
無水酢酸(32 mL, 34.5 g, 0.338 mol, 1.03当量)、4-メチルサリチル酸(50 g, 0.329 mmol, 1.00当量)、及びキシレン(100 mL)を、1Lの、4本枝付きフラスコに加える。フラスコには、マグネット攪拌バー、温度計、及び凝縮器が装着される。フラスコを砂浴に置き、白濁混合物の加熱を開始する。反応混合液は、90℃付近で透明に黄色液となる。3時間(135-146℃)かけて揮発性有機物（キシレン類と酢酸）の多くを蒸留し、Dean-Starkトラップに捕捉する。蒸留をさらに1時間（合計110 mLの蒸留）続ける。その間ポットの温度はゆっくりと204℃に上昇し、蒸留物はゆっくりと滴る。残留物を、まだ熱い内に、アルミニウムトレイに注ぐ。冷却すると、脆い黄色ガラスが形成される。この固体を磨砕して微細粉末とする。得られたオリゴ(4-メチルサリチレート)をそれ以上精製することなく使用する。
【０３９６】
(b)N-(4-メチルサリチロイル)-8-アミノカプリル酸の調製
炭酸カリウムの7M溶液(45 mL, 43.2 g, 0.313 mol, 0.95当量)、8-アミノカプリル酸(41.8 g, 262 mol, 798当量)、及び水(20 mL)を、マグネット攪拌棒、凝縮器、及び添加燃料を装着した1 Lの丸底フラスコに加える。白濁混合物を、30分に渡って添加されるオリゴ(4-メチルサリチレート)(44.7 g, 0.329 mmol, 1.09当量)及びジオキサン(250 mL)によって処理する。反応混合液を90℃で3時間（HPLCによってこの時点で反応は終了したと判定された）加熱した。透明な橙色反応混合液を30℃に冷却し、50%硫酸水溶液(64 g)でpH=2まで酸性とした。得られた固体をろ過で分離する。白色固体を、1170 mLの50%エタノール-水から再結晶させる。N-(4-メチルサリチロイル)-8-アミノカプリル酸を白色固体(30.88 g, 52%)として単離する。融点＝113-114o、分析：C6H23NO4: C, 65.51; H, 7.90; N, 4.77。
【０３９７】
次に、PYY(3-36)の水溶液を調製し、1種以上の担体と混合し、PYY(3-36)組成物を生成する。次にこれをスプレイとして肺に投与する。得られた組成物におけるPYY3-36の好適な濃度は約400 μg/mlでなければならない。米国特許出願第20030072740号を参照されたい。
【０３９８】
実施例２７
PYY血漿濃度定量のための全抽出ラジオイムノアッセイ
序論
ヒト血漿におけるヒトペプチドYY(3-36)(hPYY)の濃度を測定するためにラジオイムノアッセイを開発した。サンプルを、抗凝固剤(EDTA)及びプロテアーゼ阻害剤（アプロチニン）と共に収集し、凍結する。アッセイは4日間工程である。サンプル、コントロール、及び標準は、アルコールで抽出し、1日目に乾燥する。サンプルは全て再度回復させ、2日目にhPYYに対するウサギポリクロナール抗体と混合した。ヨード化hPYYを3日目に加える。特定の沈殿物（ヤギ抗ウサギIgG及び正常ウサギ血清）を4日目に加える。結合トレーサーを、遊離トレーサーから遠心によって分離し、結合トレーサーをガンマカウンターにてカウントする。濃度は、標準曲線の内挿によって計算し、アッセイ性能は、品質管理サンプルにてコントロールする。
【０３９９】
材料
2.1  Peninsula PYYキット(Peninsula Laboratories, Cat. No. S-2043-0001)
2.2  試薬アルコール(Fisher Inc., Cat. No. A995-4)（又は等価のもの）
2.3  脱イオンヒト血漿（リチウムヘパリン含有、絶食、プール）Golden West Biologics Inc. (Cat. No., SD1020-H)(分析SOP#A-003)
2.4  氷浴(Fisher, Cat No. 11-676-36)（又は等価のもの）
2.5  ディスポーザブル10 mLピペット(Fisher Cat. No. 13-678-11E)（又は等価のもの）
2.6  Nastech QC(3-36)から購入の標準合成ヒトPYY(Bachem Cat. No. H8585)
2.7  蒸留水(Milli-Q, Millipore, Cat. No. ZMQ56VFT1)（又はそれと等価のもの）
2.8  TritonX-100(Sigma, Cat. No. T-9284)（又はそれと等価のもの）
2.9  アルミニウムフォイル(Fisher, Cat. No. 01-213-3)（又はそれと等価のもの）
2.10  アプロチニン(INC Biochemicals Inc. Cat. No. 190779)（又はそれと等価のもの）
2.11  12x75 mm管(Evergreen Scientific, Cat. No. 214-2023-010)（又はそれと等価のもの）
2.12  12x75 mm管キャップ(Evergreen Scientific, Cat. No. 300-2912-G20)（又はそれと等価のもの）
2.13  1.5 mL微小遠心管(Fisher, Cat. No. 05-402-25)（又はそれと等価のもの）
2.14
【０４００】
3.0  装置
3.1  Wallac WIZARD 1470自動式ガンマカウンター(Perkin Elmer, Model No. 1470-002)（又はそれと等価のもの）
3.2  Isotemp基礎フリーザー、-70℃(Kendro Laboratory Products, Model No. C90-3A31)（又はそれと等価のもの）
3.3  CentriVap濃縮器(Labconco, Cat. No. 7810000)（又はそれと等価のもの）
3.4  VX-2500多数管渦巻き攪拌器(VWR, Cat. No. 58816-115)（又はそれと等価のもの）
3.5  Marathon 21000R遠心器(Fisher, Cat. No. 04-977-21000R)（又はそれと等価のもの）
3.6  搖動バケツローター(Fisher, Cat. No. 04-976-006)（又はそれと等価のもの）
3.7  モーター駆動ピペットエイド(Fisher, Cat. No. 13-681-15E)（又はそれと等価のもの）
3.8  Eppendorfマイクロピペット
3.8.1  2μL-20μL(Fisher, Cat. No. 21-371-6)（又はそれと等価のもの）
3.8.2  20μL-200μL(Fisher, Cat. No. 21-371-6)（又はそれと等価のもの）
3.8.3  100μL-1000μL(Fisher, Cat. No. 21-371-6)（又はそれと等価のもの）
3.9  Eppendorf反復ピペット(Fisher, Cat. No. 21-380-9)（又はそれと等価のもの）
3.10   Eppendorf反復ピペット・コンビチップ
3.10.1  2.5 mL(Fisher, Cat. No. 21-381-331)（又はそれと等価のもの）
3.10.2  25 mL(Fisher, Cat. No. 21-381-115)（又はそれと等価のもの）
3.11  陽性変位ピペット(Fisher, Cat. No. 21-169-10A)（又はそれと等価のもの）
【０４０１】
4.0  過程
1日目
4.1  アッセイのために必要な試薬及びサンプルを解凍する。十分な量が間に合わなければ、１X濃度のRIAバッファー（RIAB）を調製する。
4.2  プールされた脱イオンヒト血漿を用いて標準曲線サンプルを調製する。12.8 μg/mLの開始濃度を用いて下記のように調製する。
4.2.1  チューブOに990 μLのRIABを加える。
4.2.2  チューブAに990 μLのプール血漿を加える。
4.2.3  チューブB-Hに550 μLのプール血漿を加える。
4.2.4  チューブOに10 μLの12.8 μg/mL標準を加える。ボルテックスする。
4.2.5  チューブOからチューブAに10 μL液を加える。ボルテックスする。
4.2.6  チューブAからチューブBに500 μL液を加える。ボルテックスする。
4.2.7  チューブBからビューブCに500 μL液を加える。ボルテックスする。
4.2.8  チューブHまで4.2.7にある通りの希釈を繰り返す（模式図#1を参照）。
4.3  必要ならば、試験するヒトの血漿サンプルを希釈する。サンプルは、プールされたヒトの脱イオン血漿で希釈しなければならない。
4.4  1.2 mLの冷却アルコールを、NSB用、TB用、全標準、QCサンプル用、及び試験の対象となるヒト血漿サンプル用の空のチューブに加える。
4.5  400 μLのプールされたヒト脱イオン血漿を、NSB及びTBチューブに加える。キャップをし、ボルテックスする。
4.6  4.2.5から4.2.8までの各調製標準サンプル400 μLを、それぞれの標準曲線チューブH-Aに加える（模式図#1を参照）。キャップをし、ボルテックスする。
4.7  400 μLのQCサンプルをそれぞれのチューブに加える。キャップをし、ボルテックスする。
4.8  400 μLの各試験サンプルをそれぞれのチューブに加える。キャップをし、ボルテックスする。
4.9  全てのサンプルを氷上で30-60分インキュベートする。
4.10  濃縮器の冷却トラップスイッチをオンする。
4.11  全てのチューブを3000 rpm4℃で15分遠心する。
4.12  各サンプルから1.3 mLの上清を、新しい1組の空のチューブに移す。氷浴に、或いは直ちに回転攪拌しない場合は2-8℃に保存する。
4.13  サンプルを濃縮器に入れる。
4.14  サンプルは40℃で2時間、次に周囲温で合計5時間、又は乾燥するまで回転攪拌する。
4.15  乾燥サンプルを取り出し、蓋をし、2-8℃で一晩保存する。
【０４０２】
2日目
4.16  2-8℃クーラーから乾燥チューブを取り出す。
4.17  各チューブに100 μLの4x RIAバッファー濃縮液を加える。
4.18  各チューブに100 μLの0.6%TX100を加える。(付録#1)。全ての抽出物が完全に再回収されることを確保するために最短30秒ボルテックスする。
4.19  全てのサンプルを氷上で30-60分インキュベートする。
4.20  各チューブに200 μLの蒸留水を加える。ボルテックスする。
4.21  各サンプル抽出物の100 μLをそれぞれのチューブに移す。
注：NSB、TB、TC、標準曲線サンプル、及びQCは通常3重に実験する。従って、各サンプルにつき3本のチューブが必要である。ヒト血漿サンプルは、サンプルの利用可能性に応じて任意に選択される変動回数（最大3重標本）だけ試験してよい。
4.22  Peninsula Laboratoriesのキット挿入指示書に記載されている通りにウサギ抗PYYを調製する。
4.23  各NSBチューブに100 μLのRIABを加える。
4.24  各TCチューブに200 μLのRIABを加える。
4.25  残りの全てのチューブに100 μLのウサギ抗PYYを加える。
4.26  フォイルでカバーし、2-8℃で一晩保存する。
【０４０３】
3日目
4.27  2-8℃クーラーからチューブを取り出す。
4.28  125IペプチドYYトレーサーを調製する(付録#2)。
4.29  全チューブに100 μLの調製トレーサーを加える。キャップし、ボルテックスする。
4.30  2-8℃で一晩保存する。
【０４０４】
4日目
4.31  2-8℃クーラーからチューブを取り出す。
4.32  Peninsula Laboratoriesのキット挿入指示書に記載されている通りにヤギ抗ウサギIgG血清(GARGG)、及び正常ウサギ血清(NRS)を調製する。
4.33  各チューブに100 μLのGARGGを加える（TCチューブを除く）。
4.34  各チューブ（TCチューブを除く）に100 μLのNRSを加える。ボルテックスする。
4.35  室温で90-120分インキュベートする。
4.36  チューブに500 μLのRIABを加え、直ちに遠心する（TCチューブを除く）。ボルテックスする。
注：500 μLのRIABは遠心の直前にチューブに加える。RIABは、遠心の準備の整った数のチューブにのみ加える。さらに別のチューブにも遠心の準備が整ったなら500 μLのRIABを加える。
4.37  チューブ（500 μLのRIABを含む）を4℃、3000 rpmで15分遠心する。TCチューブを遠心してはならない。
4.38  遠心管から上清を吸引する。
4.39  ガンマカウンターによるカウントのために、指定の黒のラックにチューブを置く。第1ラックには、適当なプログラム番号が付着される。それに続くラックは全てプログラム番号を含まない。サンプルは下記の順番で加える。
4.39.1  NSBチューブ
4.39.2  TBチューブ
4.39.3  TCチューブ
4.39.4  標準チューブ（濃度の増加順）
4.39.5  QCサンプル（3種の濃度）
4.39.6  未知のヒトサンプル
4.39.7  QCサンプル（3種の濃度）
4.40  カウントする全てのサンプルが整った後、空の黒ラックに停止ラベルを貼る。
4.41  ガンマカウンター・キーパッドの「スタート」を押してカウントを始める。
4.42  ガンマカウンター・キーパッドのenterを押してCPM結果を表示する。
【０４０５】
5.0  結果の評価
5.1  アッセイの外れものの特定及び拒絶には下記のガイドラインを適用する。ある結果を外れものとして判定し、結果の最終計算に含めないようにするためには、下記の全ての条件が満たされていなければならない。
5.1.1  QCと未知サンプルは：
5.1.1.1  全ての二重標本の%CVは20%よりも大きくなくてはならない。
5.1.1.2  少なくとも3種の評価すべき結果がなければならない。
5.1.1.3  外れものと疑われる結果と、それにもっとも近似する結果との間の差が20%よりも大きくなくてはならない。
5.1.1.4  残余の高い結果と低い結果の差は20%よりも小さくなくてはならない。
5.1.2  標準曲線サンプルは：
5.1.2.1  全ての二重標本の%CVは15%よりも大きくなくてはならない。
5.1.2.2  少なくとも3種の評価すべき結果がなければならない。
5.1.2.3  外れものと疑われる結果と、それにもっとも近似する結果との間の差が15%よりも大きくなくてはならない。
5.1.2.4  残余の高い結果と低い結果の差は15%よりも小さくなくてはならない。
【０４０６】
6.0  アッセイ仕様
6.1  QCサンプルは下記の濃度で調製される。各濃度において二つのQCサンプルをアッセイで試験する。試験した6個のQCサンプルの内4個は下記の範囲（指定濃度の±30%）の中になければならない。データが受容可能であるためには、任意の濃度において試験した二つのQCの内少なくとも一つはアッセイ範囲内になければならない。
6.1.1  QC1(100 pg/mL)       70-130 pg/mL
6.1.2  QC2(200 pg/mL)       140-260 pg/mL
6.1.3  QC3(300 pg/mL)       350-650 pg/mL
6.2  標準曲線パラメータ要件TBD
【０４０７】
2008501634.tif 000016
【０４０８】
付録#1
0.6% TX-100
試薬：0.6% TX-100
材料：Milli-Q蒸留水
TX-100
調製：1)50 mLのMilli-Q蒸留水を測定する。
2)陽性変位ピペットを用いて300 μLのTX-100を加える。
3)よく混合する。
【０４０９】
付録#2
125I-ペプチドPYYトレーサー
試薬：125I-ペプチドPYYトレーサー
材料：1x RIAバッファー
125I-ペプチドPYYトレーサー
調製：1)1 mLの1x RIAバッファーにてトレーサーを再回収する。
2)ガンマカウンターにてトレーサーの量を測定する。10 μLの再回収トレーサーをチューブに移す。チューブを、プログラム#30を付着させたガンマカウンターの黒ラックに置く。
3)ラックを、停止ラックをその後ろにしてガンマカウンターに置く。
4)「スタート」を押してカウントを始め、次に’E’を押してCPM結果を見る。
5)調製すべきトレーサーの量(X μL)と、必要なRIAB(Y mL)を下記のように求める。
X μL = (5 μL)(cpm値)（チューブ数＋10）／（ストック液のcpm）
Y mL = (0.1)(チューブ数+10)
6)X μLの125I-ペプチドPYYとY mLのRIABと混合する。よく混ぜ合わせる。
【０４１０】
実施例２８
タンパクである安定化剤を含まないNPY処方の調製
タンパクである安定化剤を実質的に含まないNPYの鼻腔内投与に好適なPYY処方であって、下に列挙する成分を持つ処方を調製する。
1.  約3/4の水をビーカーに加え、攪拌台上攪拌棒で攪拌し、クエン酸ナトリウムを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
2.  次にEDTAを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
3.  次にクエン酸を加え、完全に溶解するまで攪拌する。
4.  メチル-β-シクロデキストリンを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
5.  次にDDPCを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
6.  次にラクトースを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
7.  次にソルビトールを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
8.  次にクロロブタノールを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
9.  次にNPY(3-36)を加え、溶解するまで穏やかに攪拌する。
10.  pHをチェックし、5.0 ± 0.25であることを確かめる。HCl希釈液又はNaOH希釈液を加えてpHを調節する。
11.  水を最終容量まで加える。
【０４１１】
2008501634.tif 000017
【０４１２】
実施例２９
下記の表13に示すようにNPY(3-36)の濃度を15 mg/mLとしたことを除いては、前述のようにして第2処方を調製する。
【０４１３】
2008501634.tif 000018
【０４１４】
実施例３０
タンパクである安定化剤を含まない膵臓ペプチド(PP)処方の調製
タンパクである安定化剤を実質的に含まないPPの鼻腔内投与に好適なPYY処方であって、下に列挙する成分を持つ処方を調製する。
1.  約3/4の水をビーカーに加え、攪拌台上攪拌棒で攪拌し、クエン酸ナトリウムを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
2.  次にEDTAを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
3.  次にクエン酸を加え、完全に溶解するまで攪拌する。
4.  メチル-β-シクロデキストリンを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
5.  次にDDPCを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
6.  次にラクトースを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
7.  次にソルビトールを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
8.  次にクロロブタノールを加え、完全に溶解するまで攪拌する。
9.  次にPP(3-36)を加え、溶解するまで穏やかに攪拌する。
10.  pHをチェックし、5.0 ± 0.25であることを確かめる。HCl希釈液又はNaOH希釈液を加えてpHを調節する。
11.  水を最終容量まで加える。
【０４１５】
2008501634.tif 000019
【０４１６】
実施例３１
下記の表15に示すようにPP(3-36)の濃度を15 mg/mLとしたことを除いては、前述のようにして第2処方を調製する。
【０４１７】
2008501634.tif 000020
【０４１８】
実施例３２
本実施例は、治療に有効な血漿濃度を実現するのに十分な濃度のY2受容体結合化合物の水溶液処方、及び、前記溶液のエアロゾルを生成するアクチュエータであって、前記エアロゾルのスプレイパターン楕円比が、アクチュエータ先端から0.5 cmから10 cmの距離における高さについて測定した場合に、1.00から1.40の範囲にあるアクチュエータとを含む、製薬組成物製品を記載する。
【０４１９】
驚くべきことに、本明細書のPYY(3-36)処方はエアロゾル化することが可能で、しかも依然として治療的に有効である（実施例8aで示したように）。エアロゾルの容量は、約5マイクロリットルから1.0 mlであってよいが、好ましくは20から200マイクロリットルである。
【０４２０】
この試験法は、Spray View NSPシステムを用いて、Y2受容体結合化合物の鼻腔溶液処方のプルーム形態を明らかにするための試験過程を記載する。プルーム形態は、米国特許第6,665,421号、及び、2003年1月23日に発行の米国特許出願第20030018416号に記載される方法に従って、内臓Spray View NSx 作動ステーション付きSpray View High Speed Optical Spray Characterization System (Image Therm Engineering, Inc., Sudbury、マサチューセッツ州)を用いて解析する。
【０４２１】
表14の処方又はプラシーボを用い、共に、鼻腔スプレイポンプを有する1 mLと3 mL瓶に収容した処方について、そのスプレイの解析及び液滴サイズの定量を行った。いずれの瓶も、1回の噴射当たり0.1 mL用量を発射し、36.05 mmの液浸チューブ長を持つ、安全クリップ、Pfeiffer SAP #60548を持つ。
【０４２２】
液滴サイズデータは下記の表に示す。
【０４２３】
2008501634.tif 000021
【０４２４】
2008501634.tif 000022
【０４２５】
前述の発明は、理解の明瞭のために実施例に基づいて詳細に記述されたわけであるが、ある種の変更及び修正が、限定ではなく、例示のために提示された本開示によって理解され、付属の特許請求項の範囲から逸脱することなく面倒な実験を行うことなしに実行可能であることは専門家には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０４２６】
【図１】図1は、高温(40℃)で見た、3.0から7.4までの各種pHにおけるPYY3-36の安定度を示す。
【図２】図2は、透過強化剤のTEERに関するデータを示す。
【図３】図3は、候補PYY処方の細胞生存率を示す。
【図４】図4は、候補処方の細胞傷害作用を示す。図2-4において、EN1 = PBS pH5.0EN2 = L-アルギニン(10% w/v)EN3 = ポリ-L-アルギニン(0.5% w/v)EN4 = ガンマ-シクロデキストリン(1% w/v)EN5 = アルファ-シクロデキストリン(5% w/v)EN6 = メチル-ベータ-シクロデキストリン(3% w/v)EN7 = n-カプリン酸ナトリウム(0.075% w/v)EN8 = キトサン(0.5% w/v)EN9 = L-アルファ-ホスファチジルコリンジデカニル(3.5% w/v)EN10 = S-ニトロソ-N-アセチル-ペニシラミン(0.02% w/v)EN11 = パルモトイル-DL-カルニチン(0.5% w/v)EN12 = プルロニック-127(0.3% w/v)EN13 = ナトリウムニトロプルシド(0.3% w/v)EN14 = グリココール酸ナトリウム(1% w/v)
【図５】図5は、薬剤浸透に対する各種成分の協調的寄与を示す。図5において、EN1はDDPC、EN2はメチル-β-シクロデキストリン、及びEX1はEDTAである。
【図６】図6は、ラットの血漿におけるPYY3-36を示す。四角は、4.1 μg/kgの用量、三角は41 μg/kgの用量、及び、円は205 μg/kgの用量を表す。
【図７】図7は、Cmax −Cbas pg/mL対用量 μg/kgで見た場合の、ラットにおけるPYY3-36の鼻腔内投与後における用量直線性を示す。
【図８】図8は、AUC対用量 μg/kgで見た場合の、ラットにおけるPYY3-36の鼻腔内投与後における用量直線性を示す。
【図９】図9は、それぞれ20 μgのPYY(3-36)を鼻腔内投与された、3名のヒトボランティアにおけるPYYの平均血漿濃度対分で表した時間を示す。
【図１０】図10は、それぞれ50 μgのPYY(3-36)を鼻腔内投与された、3名のヒトボランティアにおけるPYYの平均血漿濃度対分で表した時間を示す。
【図１１】図11は、それぞれ100 μgのPYY(3-36)を鼻腔内投与された、3名のヒトボランティアにおけるPYYの平均血漿濃度対分で表した時間を示す。
【図１２】図12は、それぞれ150 μgのPYY(3-36)を鼻腔内投与された、3名のヒトボランティアにおけるPYYの平均血漿濃度対分で表した時間を示す。
【図１３】図13は、それぞれ200 μgのPYY(3-36)を鼻腔内投与された、3名のヒトボランティアにおけるPYYの平均血漿濃度対分で表した時間を示す。
【図１４】図14は、PYY(3-36)の鼻腔内投与を受けた健康なヒトのボランティアから成る5グループにおける、pmol/Lで表したPYY血漿濃度対時間を示す。用量は、200 μg、150 μg、100 μg、50 μg、及び20 μgのPYY-36である。
【図１５】図15は、ヒトボランティアに投与した場合の、PYY(3-36)の用量に対する、pg/mLで表したPYYのCmaxの用量直線性を示す。
【図１６】図16は、ヒトボランティアに投与した場合の、PYY(3-36)の用量に対する、pg/mLで表したPYYの平均AUCの用量直線性を示す。
【図１７】図17は、ヒトボランティアに投与した場合の、視覚的アナログスケール(VAS)対PYY(3-36)の用量を示す。質問は、「あなたはどのくらい空腹ですか？」であった。得点が少ないほど、100点スケールにおいて個人の空腹感は少なくなる。
【図１８】図18は、ヒトボランティアに投与した場合の、視覚的アナログスケール(VAS)対PYY(3-36)の用量を示す。質問は「あとどれくらい食べられますか？」であった。得点が少ないほど、100点スケールにおいて個人の空腹感は少なくなる。
【図１９】図19は、ヒトボランティアに投与した場合の、視覚的アナログスケール(VAS)対PYY(3-36)の用量を示す。質問は、「あなたはどのくらい満腹ですか？」であった。得点が少ないほど、100点スケールにおいて個人の満腹感は少なくなる。
【図２０】図20は、エンドトキシンを含むPYY(3-36)対エンドトキシンを含まないPYY(3-36)のパーセント浸透を示す。
【図２１Ａ】図21Aは、作動していない鼻腔スプレイポンプ／アクチュエータを示す。
【図２１Ｂ】図21Bは、作動し、スプレイプルームを吐出する、鼻腔スプレイポンプ／アクチュエータを示す。
【図２２】図22は、本発明のPYY鼻腔スプレイのスプレイパターンの例を示す。
【図１】
2008501634.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2008501634.tif 000039
【図１８】
2008501634.tif 000040
【図１９】
2008501634.tif 000041
【図２０】
2008501634.tif 000042
【図２１Ａ】
2008501634.tif 000043
【図２１Ｂ】
2008501634.tif 000044
【図２２】
2008501634.tif 000045
【配列表】
2008501634000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月8日(2006.12.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬組成物製品において：
ａ．無タンパク質安定化剤と、治療に有効な血漿濃度を実現するのに十分なＰＹＹ化合物の濃度のＰＹＹ化合物とを具える水溶液処方と；
ｂ．前記溶液のエアロゾルの生成が可能なアクチュエータにおいて、前記エアロゾルのスプレイパターン楕円比が、前記アクチュエータ先端から０．５ｃｍから１０ｃｍの高さで測定した場合、１．００から１．４０であるアクチュエータと；
を具えることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２】
請求項１に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物が、ＰＹＹの変異体、誘導体、類似物又はフラグメントであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３】
請求項１に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物が、配列番号：１−２１、７２−７４、及び９０−１０５から成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項４】
請求項１に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物が、ＰＹＹ（３−３６）であることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項５】
請求項１に記載の製薬組成物製品において、前記エアロゾル中のＰＹＹ化合物の量は、１回の作動当たり少なくとも５０μｇであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項６】
請求項１に記載の製薬組成物製品において、前記エアロゾル中のＰＹＹ化合物の量が、１回の作動当たり少なくとも２００μｇであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項７】
請求項１に記載の製薬組成物製品において、前記アクチュエータが、１．００から１．３０の楕円比を実現することを特徴とする医薬化合物。
【請求項８】
請求項１に記載の製薬組成物製品において、前記アクチュエータが、１．１５から１．２５の楕円比を実現することを特徴とする医薬化合物。
【請求項９】
製薬組成物製品において：
ａ．無タンパク質安定化剤と、治療に有効な血漿濃度を実現するのに十分なＰＹＹ化合物の濃度のＰＹＹ化合物とを具える水溶液処方と；
ｂ．前記溶液のエアロゾルの生成が可能なアクチュエータにおいて、前記エアロゾルのスプレイパターン長軸及び短軸が、アクチュエータ先端から０．５ｃｍから１０ｃｍの距離で高さについて測定した場合、１０から５０ｍｍであるアクチュエータと；
を具えることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１０】
請求項９に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物は、ＰＹＹの変異体、誘導体、類似物、又はフラグメントであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１１】
請求項９に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物は、配列番号：１−２１、７２−７４、及び９０−１０５から成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１２】
請求項９に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物は、ＰＹＹ（３−３６）であることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１３】
請求項７に記載の製薬組成物製品において、前記エアロゾルのＰＹＹ化合物の量は、１回の作動当たり少なくとも５０μｇであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１４】
請求項７に記載の製薬組成物製品において、前記エアロゾルのＰＹＹ化合物の量は、１回の作動当たり少なくとも２００μｇであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１５】
製薬組成物製品において：
ａ．無タンパク質安定化剤と、治療に有効な血漿濃度を実現するのに十分なＰＹＹ化合物の濃度のＰＹＹ化合物とを具える水溶液処方と；
ｂ．前記溶液のエアロゾルの生成が可能なアクチュエータにおいて、１０％未満の液滴が、１０ミクロン未満のサイズであるアクチュエータと；
を具えることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１６】
請求項１５に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物が、ＰＹＹの変異体、誘導体、類似物、又はフラグメントであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１７】
請求項１５に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物が、配列番号：１−２１、７２−７４、及び９０−１０５から成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１８】
請求項１５に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物が、ＰＹＹ（３−３６）であることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項１９】
請求項１５に記載の製薬組成物製品において、前記エアロゾルのＰＹＹ化合物の量が、１回の作動当たり少なくとも５０μｇであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２０】
請求項１５に記載の製薬組成物製品において、前記エアロゾルのＰＹＹ化合物の量が、１回の作動当たり少なくとも２００μｇであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２１】
請求項１５に記載の製薬組成物製品において、５％未満の液滴が、１０ミクロン以下のサイズであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２２】
請求項１５に記載の製薬組成物製品において、１％未満の液滴が、１０ミクロン以下のサイズであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２３】
製薬組成物製品において：
ａ．無タンパク質安定化剤と、治療に有効な血漿濃度を実現するのに十分なＰＹＹ化合物の濃度のＰＹＹ化合物とを具える水溶液処方と；
ｂ．前記溶液のエアロゾルを生成するために選択されたアクチュエータであって、２５から７００ミクロンの液滴を生成するアクチュエータと；
を具えることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２４】
請求項２３に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物が、ＰＹＹの変異体、誘導体、類似物、又はフラグメントであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２５】
請求項２３に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物が、配列番号：１−２１、７２−７４、及び９０−１０５から成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２６】
請求項２３に記載の製薬組成物製品において、前記ＰＹＹ化合物が、ＰＹＹ（３−３６）であることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２７】
請求項２３に記載の製薬組成物製品において、前記エアロゾルのＰＹＹ化合物の量が、１回の作動当たり少なくとも５０μｇであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２８】
請求項２３に記載の製薬組成物製品において、前記エアロゾルのＰＹＹ化合物の量が、１回の作動当たり少なくとも２００μｇであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項２９】
請求項１に記載の製薬組成物製品において、無タンパク質安定化剤が、ポリオール、界面活性剤、可溶化剤及びキレート剤から成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３０】
請求項２９に記載の製薬組成物製品において、界面活性剤が、ホスファチジルコリンジデカノイルであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３１】
請求項２９に記載の製薬組成物製品において、前記可溶化剤が、シクロデキストリンであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３２】
請求項２９に記載の製薬組成物製品において、前記無タンパク質安定化剤が、シクロデキストリン、キトサン、ＤＤＰＣ、Ｔｗｅｅｎ８０、エデト酸二ナトリウム、クエン酸、ラクトース、及びソルビトールから成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３３】
請求項９に記載の製薬組成物製品において、前記無タンパク質安定化剤が、ポリオール、界面活性剤、可溶化剤、及びキレート剤から成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３４】
請求項３３に記載の製薬組成物製品において、前記界面活性剤が、ホスファチジルコリンジデカノイルであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３５】
請求項３３に記載の製薬組成物製品において、前記可溶化剤が、シクロデキストリンであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３６】
請求項３３に記載の製薬組成物製品において、前記無タンパク質安定化剤が、シクロデキストリン、キトサン、ＤＤＰＣ、Ｔｗｅｅｎ８０、エデト酸二ナトリウム、クエン酸、ラクトース、及びソルビトールから成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３７】
請求項１５に記載の製薬組成物製品において、前記無タンパク質安定化剤が、ポリオール、界面活性剤、可溶化剤、及びキレート剤から成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３８】
請求項３７に記載の製薬組成物製品において、前記界面活性剤が、ホスファチジルコリンジデカノイルであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項３９】
請求項３７に記載の製薬組成物製品において、前記可溶化剤が、シクロデキストリンであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項４０】
請求項３７に記載の製薬組成物製品において、前記無タンパク質安定化剤が、シクロデキストリン、キトサン、ＤＤＰＣ、Ｔｗｅｅｎ８０、エデト酸二ナトリウム、クエン酸、ラクトース、及びソルビトールから成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項４１】
請求項２３に記載の製薬組成物製品において、前記無タンパク質安定化剤が、ポリオール、界面活性剤、可溶化剤、及びキレート剤から成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項４２】
請求項４１に記載の製薬組成物製品において、前記界面活性剤が、ホスファチジルコリンジデカノイルであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項４３】
請求項４１に記載の製薬組成物製品において、前記可溶化剤が、シクロデキストリンであることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項４４】
請求項４１に記載の製薬組成物製品において、前記無タンパク質安定化剤が、シクロデキストリン、キトサン、ＤＤＰＣ、Ｔｗｅｅｎ８０、エデト酸二ナトリウム、クエン酸、ラクトース、及びソルビトールから成る群より選択されることを特徴とする製薬組成物製品。
【請求項４５】
製薬組成物製品において：
ａ．無タンパク質安定化剤と、治療に有効な血漿濃度を実現するのに十分なＰＹＹ化合物の濃度のＰＹＹ化合物とを具える水溶液処方と；
ｂ．前記溶液のエアロゾルの生成が可能なアクチュエータにおいて、前記エアロゾルのスプレイパターン楕円比が、前記アクチュエータ先端から０．５ｃｍから１０ｃｍの高さで測定した場合、１．００から１．４０であるアクチュエータと；
を具えることを特徴とする製薬組成物製品。
【国際調査報告】
2008501634.tif 000069
2008501634.tif 000070
2008501634.tif 000071