(57)【要約】本発明は、クローニング系、および具体的には、複数の異種核酸配列を連続的にクローニングして対象のキメラコンストラクトを構築するための系を開示する。クローニング系は、個々の挿入核酸配列を、マーカー配列を含まないが、キメラコンストラクトに含めるための他の核酸配列を含むレシピエントコンストラクト中に移すために、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を使用する。1つもしくは複数の挿入核酸配列が移動用のマーカー配列と共に導入された組換えコンストラクトは、組換えコンストラクトを宿主細胞に導入し、および同定可能な特徴を有する宿主細胞を同定することで単離される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、複数の核酸配列を連続的にクローニングするための方法：
(a)複製起点を欠くが、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なセグメントを、マーカー配列を欠くが、複数の核酸配列の少なくとも1つを含むレシピエントコンストラクト中に挿入することで、レシピエントコンストラクト中に移動可能で、かつマーカー配列および核酸配列を含むカセットを含む第1の組換えコンストラクトを形成させる段階；
(b)組換えコンストラクトを宿主細胞に導入する段階；
(c)同定可能な特徴を有する宿主細胞スクリーニングを行うことで、組換えコンストラクトを含む組換え細胞を同定する段階；
(d)組換え細胞に対応する組換えコンストラクトからカセットを得る段階；
(e)カセットを、マーカー配列を欠くが、他の複数の核酸配列の少なくとも1つを含む別のレシピエントコンストラクト中に挿入することで、レシピエントコンストラクト中に任意で移動可能であり、かつカセットおよび他の核酸配列を含む別のカセットを含む別の組換えコンストラクトを形成させる段階；
(f)他の組換えコンストラクトを宿主細胞に導入する段階；ならびに
(g)同定可能な特徴を有する宿主細胞についてスクリーニングを行うことで、他の組換えコンストラクトを含む他の組換え細胞を同定する段階。
【請求項２】
(h)他の組換え細胞に対応する他の組換えコンストラクトから他のカセットを得る段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
対象のキメラコンストラクトを構築するために、段階(e)〜(g)、および任意で(h)を必要に応じて繰り返す段階をさらに含む、請求項2記載の方法。
【請求項４】
段階を1回または複数回繰り返す、請求項3記載の方法。
【請求項５】
同定可能な特徴に加えて、レシピエントコンストラクト中に存在する別のマーカー配列によって付与される異なる同定可能な特徴を示す組換え宿主細胞を同定する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
マーカー配列および他のマーカー配列が、選択可能なマーカーおよびスクリーニング可能なマーカーから選択される、請求項5記載の方法。
【請求項７】
レシピエントコンストラクトが、ベクターおよび宿主細胞のゲノム中に存在する核酸配列から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項８】
レシピエントコンストラクト中に導入されるカセットが、移動可能なセグメントのマーカー配列によって付与される同定可能な特徴とは異なる同定可能な特徴を付与する別のマーカー配列によって提供される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
対象のキメラコンストラクトの構築後にマーカー配列の少なくとも一部分を切り出す段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
マーカー配列の全体または一部が、マーカー配列の内部に位置するか、またはマーカー配列に隣接して位置する標的部位を認識することで切り出しを媒介するリコンビナーゼタンパク質を使用して切り出される、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
個々の核酸配列が、
(1)宿主細胞のゲノム中の標的部位の領域に相同な核酸配列；
(2)転写調節エレメント；
(3)翻訳調節エレメント；
(4)少なくとも1つの制限酵素部位を含む配列；
(5)マーカー配列；
(6)RNA分子をコードする配列；
(7)ポリペプチドをコードする配列；
(8)組換え部位；
(9)複製起点；および
(10)アンチセンス分子、
から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１２】
個々のカセットが、相同組換えを起こすことが可能な、レシピエントコンストラクト中の、または宿主細胞のゲノム中の標的部位での部位特異的な相同組換え用のターゲッティングカセットである、請求項1記載の方法。
【請求項１３】
個々のカセットが核酸増幅によってドナーコンストラクトから増幅され、およびレシピエントコンストラクト中に挿入される、請求項1記載の方法。
【請求項１４】
核酸増幅において、
(1)カセットの末端部分に相補的なヌクレオチド配列、および
(2)増幅されたカセットの一方の末端をレシピエントコンストラクト中に挿入するように機能する部位、
を含む少なくとも1つのプライマーを使用する、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
部位が制限酵素によって切断され得る、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
個々のカセットが、ドナーコンストラクトからレシピエントコンストラクトへ物理的に移動される、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
物理的な移動が、例えば制限エンドヌクレアーゼ、超音波処理、剪断、または組換えを使用する、ドナーコンストラクトからのカセットの切り出しを含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
個々のドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットが、他のドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットを切り出すために使用される切り出し用薬剤とは異なる1つまたは複数の切り出し用薬剤を使用して切り出し可能であって、複製起点を欠くがマーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能セグメントをそれぞれが含む、複数のドナーマーカーコンストラクト
を含む、複数の核酸配列を連続的にクローニングするためのキット。
【請求項１９】
少なくとも2つのドナーマーカーコンストラクトを含む、請求項18記載のキット。
【請求項２０】
少なくとも3つのドナーマーカーコンストラクトを含む、請求項18記載のキット。
【請求項２１】
少なくとも4つのドナーマーカーコンストラクトを含む、請求項18記載のキット。
【請求項２２】
少なくとも5つのドナーマーカーコンストラクトを含む、請求項18記載のキット。
【請求項２３】
少なくとも6つのドナーマーカーコンストラクトを含む、請求項18記載のキット。
【請求項２４】
切り出し用薬剤が、さまざまな認識配列に特異的な制限エンドヌクレアーゼタンパク質およびリコンビナーゼタンパク質から選択される、請求項18記載のキット。
【請求項２５】
個々のドナーマーカーコンストラクトの配列が、ポジティブマーカーを含むか、またはコードする、請求項18記載のキット。
【請求項２６】
ポジティブマーカーが、選択可能なマーカーおよびスクリーニング可能なマーカーから選択される、請求項25記載のキット。
【請求項２７】
マーカー配列が、第1の細胞型と第2の細胞型の両方に同定可能な特徴を付与する、請求項18記載のキット。
【請求項２８】
第1の細胞型が細菌細胞から選択され、かつ第2の細胞型が哺乳動物細胞から選択される、請求項27記載のキット。
【請求項２９】
マーカー配列が、第1の細胞型で機能可能な第1の転写制御配列に、および第2の細胞型で機能する第2の転写制御配列に機能的に連結されている、請求項27記載のキット。
【請求項３０】
マーカー配列が、それが存在するコンストラクトからのマーカー配列の切り出しに媒介するリコンビナーゼタンパク質によって認識されるリコンビナーゼ標的部位に挟まれている、請求項18記載のキット。
【請求項３１】
標的部位がloxP部位およびFRT部位から選択される、請求項30記載のキット。
【請求項３２】
個々のドナーマーカーコンストラクトが、移動可能なカセットの外部に不活性化可能な複製起点を含む、請求項18記載のキット。
【請求項３３】
マーカー配列を欠くが、対象の核酸配列が挿入可能でありかつ移動可能なセグメントが挿入可能な、少なくとも1つのクローニング部位を含む第1のレシピエントコンストラクトをさらに含むキットであって、
ここで前記核酸配列および前記移動可能なセグメントが第1のレシピエントコンストラクト上のそれらの対応するクローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能なカセットが得られる、
請求項18記載のキット。
【請求項３４】
各追加的なレシピエントコンストラクトが、マーカー配列を欠くが別の核酸配列が挿入可能であり、かつ第1のレシピエントコンストラクトの移動可能なカセットが挿入可能である少なくとも1つのクローニング部位を含む、対応する数の他の対象の核酸配列を連続的にクローニングするための少なくとも1つの追加的なレシピエントコンストラクトを含むキットであって、
ここで前記他の核酸配列および前記カセットが追加的なレシピエントコンストラクト上の対応するクローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能なさらなるカセットが得られる、
請求項18記載のキット。
【請求項３５】
個々のレシピエントコンストラクトが、キットの別のコンストラクトとは異なるクローニング部位を含む、請求項34記載のキット。
【請求項３６】
個々のレシピエントコンストラクトが、キットの別のコンストラクトと同じクローニング部位を含む、請求項34記載のキット。
【請求項３７】
個々のレシピエントコンストラクトが、同定可能な特徴を、ドナーマーカーコンストラクトのマーカー配列によって付与される同定可能な特徴とは異なるマーカー配列を含む宿主細胞に付与する別のマーカー配列を含む、請求項34記載のキット。
【請求項３８】
他のマーカー配列が選択可能なマーカー遺伝子を含む、請求項37記載のキット。
【請求項３９】
他のマーカー配列が、スクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む、請求項37記載のキット。
【請求項４０】
ドナーマーカーコンストラクトのマーカー配列がカナマイシン耐性遺伝子を含み、かつ他のマーカー配列がアンピシリン耐性遺伝子を含む、請求項37記載のキット。
【請求項４１】
キットのレシピエントコンストラクトまたは別のコンストラクトが、リコンビナーゼタンパク質が発現可能な核酸配列を含む、請求項34記載のキット。
【請求項４２】
個々のコンストラクトのそれぞれのクローニング部位が、少なくとも1つの制限酵素部位を含む、請求項18または請求項34記載のキット。
【請求項４３】
個々のコンストラクトのそれぞれのクローニング部位が、トポイソメラーゼ基質部位を含むか、またはトポイソメラーゼ基質部位が提供されるように適合される、請求項18または請求項34記載のキット。
【請求項４４】
以下を含む、複数の核酸配列を連続的にクローニングするためのキット：
(1)複製起点を欠くが、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なセグメントを含む、ドナーマーカーコンストラクト；および
(2)核酸配列および移動可能セグメントが第1のレシピエントコンストラクト上のそれらの対応するクローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能なカセットが得られる、マーカー配列を欠くが、前記核酸配列が挿入可能でありかつ前記移動可能なセグメントが挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含む、第1のレシピエントコンストラクト。
【請求項４５】
マーカー配列を欠くが、さらなる核酸配列が挿入可能であり、かつ移動可能なカセットが挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含む少なくとも1つの追加的なレシピエントコンストラクトをさらに含むキットであって、
ここで前記さらなる核酸配列および前記移動可能なカセットが、追加的なレシピエントコンストラクト上のそれらの対応するクローニング部位に挿入されると、レシピエントコンストラクト中に任意で移動可能な別のカセットが得られる、
請求項44記載のキット。
【請求項４６】
少なくとも1つの追加的なレシピエントコンストラクトを含む、請求項45記載のキット。
【請求項４７】
第1に言及されるドナーマーカーコンストラクトと同じマーカー配列を含む移動可能なカセットを含む少なくとも1つの他のドナーマーカーコンストラクトを含むキットであって、
ここで前記第1に言及されるドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットが、第2に言及されるドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットの切り出しに使用される切り出し用薬剤とは異なる1つまたは複数の切り出し用薬剤を使用して切り出し可能である、
請求項44記載のキット。
【請求項４８】
個々のコンストラクトのそれぞれのクローニング部位が、トポイソメラーゼ基質部位を含むか、またはトポイソメラーゼ基質部位が提供されるように適合される、請求項44記載のキット。
【請求項４９】
少なくとも1つの切り出し用薬剤を使用して切り出されると、少なくとも1つの他の切り出し用薬剤を使用した切り出し時とは異なる末端を有するように、移動可能なカセットが複数の異なる切り出し用薬剤を使用して切り出し可能であり、
複製起点を欠くが、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なセグメントを含む少なくとも1つのドナーマーカーコンストラクトを含む、
複数の核酸配列を連続的にクローニングするためのキット。
【請求項５０】
移動可能なカセットが、それぞれの側で、異なるエンドヌクレアーゼによってそれぞれが切断可能な複数の認識部位によって挟まれている、請求項49記載のキット。
【請求項５１】
移動可能なカセットが、それぞれの側で、異なるリコンビナーゼタンパク質によってそれぞれが認識される複数のリコンビナーゼ標的部位によって挟まれている、請求項49記載のキット。
【請求項５２】
個々のドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットが、他のドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットの切り出しに使用される切り出し用薬剤とは異なる1つまたは複数の切り出し用薬剤を使用して切り出し可能であり、ならびに
個々のレシピエントコンストラクトがマーカー配列を欠くが、移動可能なカセットが挿入可能でありかつ任意で対象の核酸配列が挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含み、
ここで前記移動可能なカセットおよび任意で前記対象の核酸配列がレシピエントコンストラクト上のそれらの対応するクローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能なさらなるカセットが得られる、
各ドナーマーカーコンストラクトが、複製起点を欠くが、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なセグメントを含む、複数の核酸配列を連続的にクローニングするためのキットの製造における、複数のドナーマーカーコンストラクトおよび任意で少なくとも1つのレシピエントコンストラクトの使用。
【請求項５３】
複数の核酸配列が、請求項1記載の方法を使用してクローニングされる、請求項52記載の使用。
【請求項５４】
少なくとも1つの切り出し用薬剤を使用して切り出されると少なくとも1つの他の切り出し用薬剤を使用する切り出し時とは異なる末端を有するように、移動可能なカセットが複数の異なる切り出し用薬剤を使用して切り出し可能であり、ならびに
個々のレシピエントコンストラクトが、マーカー配列を欠くが、移動可能なカセットが挿入可能でありかつ任意で対象の核酸配列を挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含み、
ここで前記移動可能なカセットおよび任意で前記対象の核酸配列が、そのレシピエントコンストラクト上のそれらの対応するクローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能な別のカセットが得られる、
それぞれのドナーマーカーコンストラクトが、複製起点を欠くが、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なセグメントを含む、複数の核酸配列を連続的にクローニングするためのキットの作製における、少なくとも1つのドナーマーカーコンストラクトおよび任意で少なくとも1つのレシピエントコンストラクトの使用。
【請求項５５】
個々のドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットが、他のドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットの切り出しに使用される切り出し用薬剤とは異なる1つまたは複数の切り出し用薬剤を使用して切り出し可能であり、ならびに
個々のレシピエントコンストラクトが、マーカー配列を欠くが、移動可能なカセットが挿入可能でありかつ任意で対象の核酸配列が挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含み、
ここで前記移動可能なカセットおよび任意で前記対象の核酸配列がそのレシピエントコンストラクト上のそれらの対応するクローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能なさらなるカセットが得られる、
個々のドナーマーカーコンストラクトが、複製起点を欠くが、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なセグメントを含む、請求項1記載の方法による複数の核酸配列を連続的にクローニングするための、少なくとも1つのドナーマーカーコンストラクトおよび任意で少なくとも1つのレシピエントコンストラクトの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は概してクローニング系に関し、および具体的には、複数の異種核酸配列を連続的にクローニングして対象のキメラコンストラクトを構築するための系に関する。クローニング系は、個々の挿入核酸配列を、マーカー配列を含まないが、キメラコンストラクト中に含めるための他の核酸配列を含むレシピエントコンストラクト中に移すために、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を使用する。1つまたは複数の挿入核酸配列が移動用のマーカー配列と共に導入された組換えコンストラクトは、組換えコンストラクトを宿主細胞に導入し、および同定可能な特徴を有する宿主細胞を同定することで単離される。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
従来、多数の無関係な核酸配列か、または異種の核酸配列を含むキメラコンストラクトが、個々の挿入核酸配列を、キメラコンストラクトに必要な1つまたは複数の他の核酸配列、複製起点、および選択用薬剤(例えば、除草剤、抗生物質、放射線、熱、またはマーカー遺伝子を持たない細胞を損なう他の処理)に対する耐性を元に「選択する」ことを可能とする形質を付与するために使用される選択可能なマーカー遺伝子を含むレシピエントベクター中に挿入することで構築されている。典型的には、レシピエントベクター中への挿入核酸配列の挿入は、挿入核酸配列が含まれるドナーベクターを1つもしくは複数の制限酵素で切断することで、ベクターバックボーン、ならびに平滑末端または付着末端を有し、および挿入核酸配列を含む断片を生じさせる段階を含む。このようなドナーベクターは一般に、それ自体の複製起点、およびレシピエントベクターの選択可能なマーカー遺伝子と同じか、または異なる場合のある選択可能なマーカー遺伝子を含む。レシピエントベクターはまた、1つもしくは複数の制限酵素で切断されて、対象断片の末端と適合するか、または一致する末端を有する直線化されたベクターを生じる。切断されたドナーベクターおよびレシピエントベクターは、次にDNA連結またはトポイソメラーゼ結合反応によって連結され、ならびに挿入核酸配列を含む組換えベクター、他の核酸配列、および選択可能なマーカー遺伝子が、連結過程の産物を宿主細胞(例えば、細菌)中に導入する段階、ならびにレシピエントベクターに対応する選択可能なマーカー遺伝子の存在によって選択用薬剤に耐性を示す細胞を選択する段階によって同定される。
【０００３】
この従来の戦略には、(1)制限酵素によるベクターの非効率的な切断、(2)ドナーベクターのバックボーンへの断片の連結、(3)直線化されたレシピエントベクターの連結による再環状化、および/または(4)所望の組換えベクターを含まない非組換え宿主細胞の有意なバックグラウンド(典型的には99%)に至る、複数のベクターおよび/または複数の挿入配列を含む直線状のコンカテマーの発生を含む、複数の短所がある。したがって、所望の組換えベクターを有する細胞を同定するためには、宿主細胞を対象とした念入りなスクリーニングが必要となる。この効率は、単純なサブクローニング実験には十分な可能性があるが、レシピエントベクター中に連続的にクローニングしてコンストラクトを得ることを必要とする多数の異種核酸配列を必要とするキメラコンストラクトの構築の場合には受入れられない。したがって、上記の従来の戦略は一般に、所望のキメラコンストラクトを作製するためにかなりの労力および時間を必要とする。
【０００４】
非組換え宿主細胞のバックグラウンドを減じる従来からあるアプローチの1つは、通常必要とされる場合より大量のベクターを必要とする、断片および/または直線化されたベクターの連結前における精製である。しかしながら、このアプローチは、さらに長時間を要する段階を必要とし、および精製産物の連結の効率は一般に、精製に使用される微量の薬剤によって減少する。
【０００５】
したがって、複数の無関係な核酸配列を含む組換えベクターの作製効率が改善されたクローニング系が必要である。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
したがって1つの局面では、本発明は、複数の核酸配列を連続的にクローニングする方法を提供する。このような方法は一般に、以下の段階を含む：複製起点を欠くがマーカー配列を含む移動可能なセグメントを、マーカー配列を欠くが複数の核酸配列のうちの少なくとも1つを含むレシピエントコンストラクト中に挿入する段階(段階(a))。マーカー配列は、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与する。複製起点は典型的には、このような方法で得られる組換えコンストラクトの同定に使用される宿主細胞内で機能する。レシピエントコンストラクト中への移動可能なセグメントの挿入によって、レシピエントコンストラクト中に移動可能でかつマーカー配列および核酸配列を含むカセットを含む第1の組換えコンストラクトが形成される。組換えコンストラクトを宿主細胞に導入し(段階(b))、および宿主細胞について同定可能な特徴を有する細胞に関してスクリーニングを行うことで、組換えコンストラクトを含む組換え細胞が同定される(段階(c))。カセットは次に、組換え細胞に対応する組換えコンストラクトから得られ(段階(d))、およびマーカー配列を欠くが複数の核酸配列の他の少なくとも1つを含む別のレシピエントコンストラクト中に挿入することで(段階(e))、別の組換えコンストラクトが形成される。このように形成された他の組換えコンストラクトは、レシピエントコンストラクト中に任意で移動可能な別のカセットを含み、かつカセットおよび他の核酸配列を含む。この他の組換えコンストラクトを次に宿主細胞に導入し(段階(f))、および宿主細胞について同定可能な特徴を有する細胞に関してスクリーニングを行うことで、他の組換えコンストラクトを含む他の組換え細胞が同定される(段階(g))。適切には、この方法はさらに、他の組換え細胞に対応する他の組換えコンストラクトから他のカセットを得る段階(段階(h))を含む。いくつかの態様では、この方法はさらに、対象のキメラコンストラクトを構築することが必要であれば、段階(e)〜(g)および任意で(h)を繰り返す段階を含む。必要に応じて、これらの段階は、少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、さらには少なくとも15回、20回、25回、30回、またはそれ以上の回数、繰り返される。
【０００７】
いくつかの態様では、この方法はさらに、同定可能な特徴に加えて、レシピエントコンストラクト中に存在する別のマーカー配列によって付与される異なる同定可能な特徴を示す組換え宿主細胞を、同定する段階を含む。説明目的の例では、マーカー配列および別のマーカー配列は、選択可能なマーカー、およびスクリーニング可能なマーカーから選択される。
【０００８】
適切にはレシピエントコンストラクトは、ベクター、および宿主細胞のゲノム中に存在する核酸配列から選択される。
【０００９】
いくつかの態様では、個々の組換えコンストラクトの作製のためにレシピエントコンストラクト中に導入される挿入カセットは、移動可能なセグメントのマーカー配列によって付与される同定可能な特徴とは異なる同定可能な特徴を付与する別のマーカー配列によって提供される。これらの態様は特に、組換えコンストラクトが導入される宿主細胞が同定可能な特徴を既に有する場合に有益である。
【００１０】
いくつかの態様では、この方法はさらに、対象のキメラコンストラクトの構築後にマーカー配列の少なくとも一部分を切り出す段階を含む。このタイプの説明目的の例では、マーカー配列は、マーカー配列の内部に位置するか、またはマーカー配列に隣接して位置する標的部位を認識することで切り出しを媒介するリコンビナーゼタンパク質を使用して、その全体または一部分が切り出される。
【００１１】
適切には、個々の核酸配列は以下から選択される：(1)宿主細胞のゲノム中の標的部位の領域と相同な核酸配列；(2)転写調節エレメント；(3)翻訳調節エレメント；(4)少なくとも1つの制限酵素部位を含む配列；(5)マーカー配列；(6)RNA分子をコードする配列；(7)ポリペプチドをコードする配列；(8)組換え部位；(9)複製起点；および(10)アンチセンス分子。
【００１２】
特定の態様では、個々のカセットは、レシピエントコンストラクト中のまたは相同組換えを起こすことが可能な宿主細胞のゲノム中の、標的部位における部位特異的な相同組換え用のターゲッティングカセットである。
【００１３】
いくつかの態様では、個々のカセットは、核酸の増幅(例えば、PCR)によってドナーコンストラクトから増幅されてレシピエントコンストラクト中に挿入される。適切には、核酸の増幅では、(1)カセットの末端部分に相補的なヌクレオチド配列、および(2)増幅されたカセットの一方の末端をレシピエントコンストラクト中への挿入するために機能する部位を含む少なくとも1つのプライマーを使用する。このタイプの説明目的の例では、このような部位は制限酵素によって切断可能である。
【００１４】
他の態様では、個々のカセットは、ドナーコンストラクトからレシピエントコンストラクトへ物理的に移動される。適切には、このような物理的移動は、例えば制限エンドヌクレアーゼ、超音波処理、剪断、または組換えを使用する、ドナーコンストラクトからのカセットの切り出しを含む。
【００１５】
別の局面では、本発明は、核酸配列をクローニングするためのキット、特に複数の核酸配列を連続的にクローニングするためのキットを提供する。このようなキットは、一般に、それぞれが複製起点を欠くがマーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なセグメントをそれぞれが含む複数のドナーマーカーコンストラクトを含み、ここで個々のドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットは、他のドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットの切り出しに使用される切り出し用薬剤とは異なる1つもしくは複数の切り出し用薬剤を使用して切り出し可能である。いくつかの態様ではキットは、少なくとも2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、さらには少なくとも15個、20個、25個、30個、またはそれ以上のドナーマーカーコンストラクトを含む。いくつかの態様では、切り出し用薬剤は、異なる認識配列に特異的な制限エンドヌクレアーゼおよびリコンビナーゼタンパク質から選択される。これらの態様では、さまざまなドナーマーカーコンストラクトが、所望のレシピエントコンストラクトのクローニング部位への挿入に適した移動可能なコンストラクトを作製するための切り出し用薬剤の選択を可能とする。
【００１６】
いくつかの態様では、個々のドナーマーカーコンストラクトのマーカー配列は、ポジティブマーカーを含むかまたはコードする。説明目的のポジティブマーカーは、選択可能なマーカー(例えば、抗生物質耐性遺伝子)、およびスクリーニング可能なマーカー(例えば、EGFPなどの蛍光マーカー遺伝子、またはlacZなどの酵素的マーカー遺伝子)を含む。適切にはマーカー配列は、同定可能な特徴(例えば、ネオマイシン耐性、蛍光)を第1の細胞型と第2の細胞型の両方に付与する。このような場合、第1の細胞型は適切には細菌細胞から選択され、および第2の細胞型は適切には哺乳動物細胞から選択される。特定の非制限的な例では、マーカー配列は、第1の細胞型(例えば、細菌細胞)で機能する第1の転写制御配列(例えば、EM7プロモーター)に、および第2の細胞型(例えば、哺乳動物細胞)で機能する第2の転写制御配列(例えば、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター)に機能的に連結される。
【００１７】
いくつかの態様では、マーカー配列は、マーカー配列が存在するコンストラクトからのマーカー配列の切り出しを媒介するリコンビナーゼタンパク質によって認識されるリコンビナーゼ標的部位に挟まれる。適切には、標的部位はloxP部位およびFRT部位から選択される。
【００１８】
いくつかの態様では、個々のドナーマーカーコンストラクトは、(例えば、複製起点の内部または付近の部位を切断する制限エンドヌクレアーゼなどの切断用薬剤を使用することによって)適切に不活性化可能な複製起点を移動可能なカセットの外部に含む。これらの態様では、ドナーマーカーコンストラクト上の複製起点を不活性化すると、ドナーマーカーコンストラクトを有する宿主細胞の獲得率が低下する。
【００１９】
いくつかの態様では、キットはさらに、マーカー配列を欠くが、核酸配列および移動可能なセグメントが、対象の核酸配列が挿入可能であり、かつ移動可能なセグメントが挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含み、第1のレシピエントコンストラクト上のそれらの対応クローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能なカセットが得られる、第1のレシピエントコンストラクトを含む。いくつかの態様ではキットは、個々の追加的なレシピエントコンストラクトが、マーカー配列を欠くが別の核酸配列が挿入可能であり、かつ第1のレシピエントコンストラクトの移動可能なカセットが挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含み、他の核酸配列およびカセットが追加的なレシピエントコンストラクト上のそれらの対応クローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能な別のカセットが得られる、対応する数の他の対象の核酸配列を連続的にクローニングするための少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、さらには少なくとも15個、20個、25個、30個、またはそれ以上の追加的なレシピエントコンストラクトを含む。
【００２０】
いくつかの態様では、個々のレシピエントコンストラクトは、同キットの別のコンストラクトとは異なるクローニング部位を含み、別の場合は、個々のレシピエントコンストラクトは、同キットの別のコンストラクトと同じクローニング部位を含む。典型的には、個々のレシピエントコンストラクトは複製起点を含む。
【００２１】
いくつかの態様では、個々のレシピエントコンストラクトは、ドナーマーカーコンストラクトのマーカー配列によって付与される同定可能な特徴とは異なるマーカー配列を含む同定可能な特徴を宿主細胞に付与する、別のマーカー配列を含む。このタイプの説明目的の例では、他のマーカー配列は、選択可能なマーカー遺伝子(例えば、アンピシリン耐性遺伝子)、またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子(例えば、EGFPなどの蛍光マーカー遺伝子、もしくはlacZなどの酵素的マーカー遺伝子)を含む。
【００２２】
必要に応じて、レシピエントコンストラクト、または同キットの別のコンストラクトは、リコンビナーゼタンパク質が発現可能な核酸配列を含む場合がある。
【００２３】
いくつかの態様では、個々のコンストラクトの個々のクローニング部位は、少なくとも1つの制限酵素部位を含む。
【００２４】
さらに別の局面では、本発明は、複数の核酸配列を連続的にクローニングするためのキットを提供する。このようなキットは一般に、以下を含む：(1)複製起点を欠くが、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なセグメントを含むドナーマーカーコンストラクト；ならびに(2)核酸配列および移動可能なセグメントが第1のレシピエントコンストラクト上のそれらの対応クローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能なカセットが得られる、マーカー配列を欠くが核酸配列が挿入可能でありかつ移動可能なセグメントが挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含む、第1のレシピエントコンストラクト。いくつかの態様では、キットは、マーカー配列を欠くがさらなる核酸配列を挿入可能でありかつ移動可能なカセットを挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含む、少なくとも1つの追加的なレシピエントコンストラクトをさらに含み、ここで前記さらなる核酸配列および前記移動可能なカセットが追加的なレシピエントコンストラクト上のそれらの対応クローニング部位に挿入されると、レシピエントコンストラクト中に任意で移動可能な別のカセットが得られる。このタイプの説明目的の例では、キットは、少なくとも1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個、さらには少なくとも15個、20個、25個、30個、またはそれ以上の追加的なレシピエントコンストラクトを含む。いくつかの態様では、キットはさらに、第1に言及されたドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットが、第2に言及されたドナーマーカーコンストラクトの移動可能なカセットの切り出しに使用される切り出し用薬剤とは異なる1つまたは複数の切り出し用薬剤を使用して切り出される、第1に言及されたドナーマーカーコンストラクトと同じマーカー配列を含む移動可能なカセットを含む少なくとも1つの他のドナーマーカーコンストラクトを含む。
【００２５】
さらに別の局面では、本発明は、核酸配列をクローニングするための、特に複数の核酸配列を連続的にクローニングするためのキットを提供する。このようなキットは一般に、複製起点を欠くが、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なセグメントを含む少なくとも1つのドナーマーカーコンストラクトを含み、ここで前記移動可能なカセットは、少なくとも1つの切り出し用薬剤を使用して移動可能なカセットが切り出されると、少なくとも1つの他の切り出し用薬剤を使用した切り出し時とは異なる末端を有するように、複数の異なる切り出し用薬剤を使用して切り出し可能である。いくつかの態様では、移動可能なカセットは、それぞれの側が、異なるエンドヌクレアーゼによってそれぞれが切断可能な複数の認識部位(例えば、複数の異なるエンドヌクレアーゼ切断部位)に挟まれる。いくつかの態様では、移動可能なカセットは、それぞれの側が、異なるリコンビナーゼタンパク質によってそれぞれが認識される複数のリコンビナーゼ標的部位によって挟まれる。これらの態様では、個々のドナーマーカーコンストラクトは、対象のレシピエントコンストラクトのクローニング部位に適合する末端を有する移動可能なカセットを提供する切り出し用薬剤の選択を可能とする。いくつかの態様では、キットはさらに、既に広く説明した少なくとも1つのレシピエントコンストラクトを含む。
【００２６】
さらに別の局面では本発明は、少なくとも1つの核酸配列をクローニングするための、および特に複数の核酸配列を連続的にクローニングするためのキットの製造における、既に広く説明した少なくとも1つのドナーマーカーコンストラクト、ならびに任意で、既に広く説明した少なくとも1つのレシピエントコンストラクトの使用に及ぶ。
【００２７】
別の局面では本発明は、既に広く開示した方法で複数の核酸配列を連続的にクローニングするための、既に広く説明した少なくとも1つのドナーマーカーコンストラクト、および任意で、既に広く説明した少なくとも1つのレシピエントコンストラクトの使用を想定している。
【００２８】
発明の詳細な説明
1．定義
文中で特に断らない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する用語と同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似しているか、または同等である任意の方法および材料を、本発明の実施または検討に使用することができるが、好ましい方法および材料は説明される。本発明の目的に鑑み、以下の用語を定義する。
【００２９】
冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は本明細書で、これら冠詞の文法上の目的語の1つまたは複数(すなわち少なくとも1つ)を意味するものとして使用される。例として、「エレメント(an element)」は、1つのエレメントまたは複数のエレメントを意味する。
【００３０】
「アンプリコン」という表現は、増幅対象の標的配列、および/または増幅対象の標的配列の増幅産物を意味する。特定の他の態様では、「アンプリコン」は、増幅に使用されるプローブまたはプライマーの配列を含む場合がある。
【００３１】
「増幅産物」は、核酸増幅法によって生じる核酸産物を意味する。
【００３２】
「細胞」、「宿主細胞」、「形質転換宿主細胞」、「再生可能な宿主細胞」などという表現は、特定の対象細胞だけを意味するのではなく、このような細胞の子孫または潜在的な子孫も意味する表現である。後の世代において特定の修飾が、変異または環境の影響のいずれかのために生じる可能性があるため、このような子孫は実際には親細胞と同一ではない場合があるが、それでも本明細書で用いられる表現の範囲に含まれる。
【００３３】
「キメラコンストラクト」、「キメラ遺伝子」、「キメラ核酸」などという表現は本明細書で、遺伝子もしくは核酸配列、または少なくとも2つの核酸配列を含むセグメント、またはその配列もしくはセグメントが天然の条件では結合しない種に由来するセグメント、または配列もしくはセグメントが、通常は非形質転換宿主の天然のゲノムもしくはヌクレオームには存在しない様式で配置されるかまたは連結されることを意味する表現として使用される。したがって「キメラ遺伝子」は、天然では揃っては存在しない調節配列およびコード配列または非コード配列を含む、天然の遺伝子ではない任意の遺伝子を意味する。この点に関しては、キメラ遺伝子は、さまざまな供給源に由来する調節配列およびコード配列もしくは非コード配列かまたは同じ供給源に由来するが、天然で見出される状態とは異なるように配置された調節配列およびコード配列または非コード配列を含む場合がある。
【００３４】
「コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与する任意の核酸配列を意味する。
【００３５】
本明細書を通して、特に明記しない限りにおいて、「〜を含む(comprise)」、「〜を含む(comprises)」、および「〜を含む(comprising)」という表現は、記載された段階もしくは要素、または一連の段階もしくは要素を含むが、任意の他の段階もしくは要素、または一連の段階もしくは要素を排除しないことを意味すると理解される。
【００３６】
「構成的プロモーター」は、生物体の多くの組織または全ての組織において、機能的に連結された転写可能な配列の発現を誘導するプロモーターを意味する。
【００３７】
「相補的」および「相補性」という表現は、塩基対合則によって関連づけられたポリヌクレオチド(すなわちヌクレオチドの配列)を意味する。例えば配列「A-G-T」は配列「T-C-A」と相補的である。相補性は、核酸の塩基の一部のみが塩基対合則に従って一致する、「部分的」な場合がある。または、核酸間の相補性は「完全」または「全体的(total)」である場合がある。核酸鎖間の相補性の程度は、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意に影響する。
【００３８】
「内因性」という表現は、遺伝子もしくは核酸配列、すなわち通常は宿主生物中に見出されるセグメントを意味する。
【００３９】
「内因性のゲノム核酸配列」という表現は本明細書では、通常は細胞のゲノム中に存在するヌクレオチド配列と定義される。本明細書で説明するように、内因性のゲノム核酸配列は、本発明のターゲッティングコンストラクトの配列との間で部位特異的な相同組換えを起こすことが可能なので、開示されたターゲッティングコンストラクトによる修飾の標的として使用できる。この定義に含まれる配列は、細胞ゲノム中に存在する特定の遺伝子の任意のコード領域または非コード領域である場合がある。このような遺伝子は、本明細書で定義される転写可能な核酸配列を含む。内因性のゲノム核酸配列は、プロモーターエレメント、エンハンサーエレメント、またはリプレッサーエレメントなどの調節エレメントである場合もある。内因性のゲノム標的核酸配列の構成は一般に、ターゲッティングコンストラクト中に存在する特定の配列と類似している。すなわちこれは、部位特異的な相同組換えが起きることを可能とする、ターゲッティングコンストラクト中に存在する配列と実質的に相同な配列を含む。
【００４０】
遺伝子配列に関する「発現」という表現は、遺伝子の転写、および必要に応じて、結果として生じたmRNA転写物のタンパク質への翻訳を意味する。したがって文脈から明らかになるように、コード配列の発現は、コード配列の転写および翻訳によって生じる。逆に非コード配列の発現は、非コード配列の転写によって生じる。
【００４１】
本発明のターゲッティングコンストラクト中における2つまたはそれ以上のヌクレオチド配列間の関係について使われる、「に挟まれた」、「を挟む」などという表現は、これらのヌクレオチド配列の1つが、別のヌクレオチド配列に直に隣接して位置することを必要としない。例えば3つの標準ヌクレオチド配列(A、B、およびC)は、組換え標的部位配列に挟まれる場合があるほか、組換え標的部位配列は、標準配列Bがこれらの部位に直に隣接していない場合であっても、そのような標準配列に隣接する場合がある。したがって、組換え部位「に挟まれた」という表現は、組換え部位「の間にある」という表現と同等であり、および「を挟む」という表現は、組換え部位が標準配列の上流または下流に位置するということと同等である。
【００４２】
本明細書で用いる、「機能」または「機能活性」という表現は、生物学的、酵素学的、または治療的な機能を意味する。
【００４３】
本明細書で用いる「遺伝子」という表現は、宿主ゲノムの任意の、および全ての特定のコード領域、または機能的RNA(例えば、tRNA、rRNA、リボザイムなどの調節性RNA、翻訳後遺伝子サイレンシング-(PTGS)関連RNAなど)のみをコードする領域、および関連する非コード領域、ならびに任意で調節領域を意味する。ある態様では、「遺伝子」という表現は、その範囲内に、特定のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、イントロン、ならびに発現の調節に関与する隣接する5'および3'の非コードヌクレオチド配列を含む。この点に関して遺伝子はさらに、天然の状態で任意の遺伝子、または異種の制御シグナルと結合した状態にある、プロモーター、エンハンサー、終結シグナルおよび/またはポリアデニル化シグナルなどの制御シグナルを含む場合がある。遺伝子配列はcDNAもしくはゲノムDNA、またはこれらの断片の場合がある。遺伝子は、染色体外で維持するために、または宿主への組込ませるために、適切なベクター中に導入可能である。
【００４４】
「宿主」という表現は、組換えコンストラクトが安定にまたは一過的に導入可能な対象が真核生物か原核細胞の別を問わない、任意の生物またはこの細胞を意味する。
【００４５】
「単離された」という表現は、実質的または本質的に、その天然の状態において通常であれば伴う成分を含まない材料を意味する。例えば、本明細書で用いる「単離されたポリヌクレオチド」という表現は、天然の状態では隣接する配列から精製されたポリヌクレオチド、例えば通常であれば隣接する配列から除去されたDNA断片を意味する。
【００４６】
本明細書で用いる、「結合する(join)」または「結合する(joining)」という表現は、1つの核酸と別の核酸の、または核酸の一方の末端と核酸の別の末端の共有結合による結合と非共有結合による結合の両方を意味する。「共有結合的な」結合は、核酸鎖の一方の末端の、核酸鎖の別の末端へのリン酸結合を介した結合、または2本鎖の核酸の一方の末端の、別の2本鎖の末端への、一方の鎖もしくは両方の鎖におけるリン酸結合を介した結合を意味する。「非共有結合的な」結合は、核酸の一方の末端の別の末端への、相互の1本鎖領域のアニーリングを介した結合を意味する；すなわちこの態様では、リン酸結合は生じない。
【００４７】
「連結する(Ligate)」または「連結された(ligated)」という表現は、1つまたは複数の核酸分子の2つの末端の共有結合による連結を意味する。
【００４８】
「ノックイン」という表現は一般に、相同組換えによってゲノム中に挿入された異種もしくは外来の遺伝子、またはこの一部を意味する。ノックイン遺伝子または遺伝子部分は、内因性の野生型の遺伝子または遺伝子部分を置き換える遺伝子または遺伝子部分の変異型の場合がある。このような変異は、正常な遺伝子発現を妨げたり、破壊したり、または改変したりする、異種配列の挿入、欠失、点変異、フレームシフト変異、および任意の他の変異を含む。したがって、本明細書で使用される「ノックイン」動物は、特定の遺伝子またはその一部分が外来の遺伝子もしくはDNA配列と置換された遺伝子改変動物を意味する。「条件的ノックイン」という表現は、相同組換えによってゲノム中に挿入され、および特定の発生段階において、または特定の環境条件下で発現される異種もしくは外来の遺伝子、またはこの一部を意味する。「条件的ノックインベクター」は、ゲノム中に相同組換えによって挿入可能であり、および特定の発生段階において、または特定の環境条件下で発現可能な異種遺伝子もしくは外来遺伝子、またはこの一部を含むベクターである。
【００４９】
「ノックアウト」という表現は、遺伝子の発現産物のレベルもしくは機能活性を低下させる、抑制する、または阻害する、遺伝子の不活性化または機能喪失を意味する。「ノックアウト」動物は、遺伝子が不活性化されているか、または機能を失っている遺伝子改変動物を意味する。「条件的ノックアウト」という表現は、組織特異的または時間特異的なパターンで不活性化されているかまたは機能が失われている遺伝子などの、特定の条件下で不活性化されているかまたは機能を失っている遺伝子を意味する。「条件的ノックアウトベクター」は、特定の条件において不活性化可能か、またはその機能が喪失され得る遺伝子を含むベクターである。
【００５０】
「哺乳動物」という表現は、本明細書で極めて広い意味で用いられ、齧歯類、霊長類、ヒツジ、ウシ、反芻動物、ウサギ、ブタ、ヤギ、ウマ、イヌ、およびネコを含む。好ましい非ヒト哺乳動物は、齧歯類(例えば、ラットおよびマウス)を含む齧歯目、最も好ましくはマウスから選択される。
【００５１】
「マーカー遺伝子」という表現は、マーカー遺伝子を発現する細胞に特定の表現型を付与することで、そのような形質転換細胞を、マーカーをもたない細胞と区別可能とする遺伝子を意味する。選択可能なマーカー遺伝子は、選択用薬剤(例えば、除草剤、抗生物質、放射線、熱、または非形質転換細胞を損なう他の処理)に対する耐性を元に「選択する」ことが可能な形質を付与する。スクリーニング可能なマーカー遺伝子(またはレポーター遺伝子)は、観察または検討によって、すなわち「スクリーニングを行う」ことで同定可能な形質(例えば、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、もしくは非形質転換細胞には存在しない他の活性)を付与する。
【００５２】
「非コード配列」という表現は、遺伝子のポリペプチド産物のコードに寄与しない任意の核酸配列を意味する。
【００５３】
「5'非コード領域」という表現は、本明細書では、遺伝子のポリペプチド産物を含むアミノ酸残基をコードする配列を除く、発現可能遺伝子の上流領域に由来する全てのヌクレオチド配列を含むように、極めて広い意味で用いられ、5'非コード領域は、遺伝子の発現を少なくとも部分的には付与するか、または活性化するか、もしくは促進する。
【００５４】
「ヌクレオーム」は全核酸相補物を意味し、ならびにゲノム、染色体外の核酸分子、およびmRNA、ヘテロ核RNA(hnRNA)、核低分子RNA(snRNA)、核小体低分子RNA(snoRNA)、細胞質低分子RNA(scRNA)、リボソームRNA(rRNA)、転写制御RNA(tcRNA)、転移RNA(tRNA)、eRNA、メッセンジャー-RNA-干渉性相補的RNA(micRNA)、または干渉RNA(iRNA)、葉緑体すなわち色素体のRNA(cpRNA)、およびミトコンドリアRNA(mtRNA)などの全RNA分子を含む。
【００５５】
本明細書で用いる「オリゴヌクレオチド」という表現は、ホスホジエステル結合(またはこれと関連する構造異型もしくは合成類似体)を介して連結された非常に多数のヌクレオチド単位(デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド、またはこれと関連する構造異型もしくは合成類似体)を含むポリマーを意味する。したがって、「オリゴヌクレオチド」という表現は、典型的には、ヌクレオチドおよびヌクレオチド間の結合が天然であるヌクレオチドのポリマーを意味するが、同表現は、その範囲内にペプチド核酸(PNA)、ホスホラミダイト、ホスホロチオネート、メチルホスホン酸、2-O-メチルリボ核酸などを含むがこれらに限定されない、さまざまな類似体も含むと理解されたい。分子の真のサイズは、特定の応用に依存して変動する可能性がある。オリゴヌクレオチドは、典型的には、長さが短く、一般には約10〜30ヌクレオチドであるが、同表現は、「ポリヌクレオチド」または「核酸」という表現が典型的には大きなオリゴヌクレオチドについて用いられる一方で、任意の長さの分子を意味する場合がある。
【００５６】
「オープンリーディングフレーム」および「ORF」という表現は、コード配列の翻訳の開始コドンと終止コドンの間にコードされたアミノ酸配列を意味する。「開始コドン」および「終止コドン」という表現は、タンパク質合成(mRNAの翻訳)の開始および鎖の停止のそれぞれを規定するコード配列中の3個の隣接ヌクレオチド(「コドン」)の単位を意味する。
【００５７】
「機能的に連結された(operably connected)」、「機能的に連結された(operably linked)」、「機能的に連結された状態の」、「機能的に連結されている」などという表現は本明細書で、配列の転写、および任意で翻訳を制御するプロモーターの調節制御下における、転写可能な配列の配置を意味する表現として用いられる。異種プロモーター/転写可能な配列の組み合わせの構築では、遺伝子配列またはプロモーターを、遺伝子配列またはプロモーターとこれを天然の状態で制御する遺伝子との間の距離、すなわち、遺伝子配列またはプロモーターが由来する遺伝子が由来する遺伝子とほぼ同じ距離をおいて、遺伝子転写開始部位から配置することが一般に望ましい。当技術分野で周知なように、この距離に関するある程度の変動は、機能の喪失を生じることなく設けることが可能である。同様に、調節配列エレメントの、その制御下に置かれる異種遺伝子に対する望ましい配置は、天然の状態におけるエレメントの配置、すなわちこれが由来する遺伝子によって決定される。
【００５８】
「複製起点」という表現は、宿主細胞における機能的な複製能力を付与する核酸配列を意味する。「複製起点を欠く移動可能なセグメント」などの語句と関連して、この表現は、移動可能なカセットが導入される宿主細胞では機能しない複製起点を含むが、他の宿主細胞で機能する複製起点は除外されないと解釈されるものとする。
【００５９】
本明細書で用いる「ポリヌクレオチド」または「核酸」という表現は、mRNA、RNA、cRNA、cDNA、またはDNAを意味する。この表現は、典型的には、長さが30ヌクレオチドを上回るオリゴヌクレオチドを意味する。
【００６０】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において、アミノ酸残基のポリマー、ならびにアミノ酸残基の異型および合成類似体を意味するように同義的に用いられる。したがって、これらの表現は、対応する天然のアミノ酸の化学的類似体などの、1つまたは複数のアミノ酸残基が合成の非天然アミノ酸であるアミノ酸ポリマー、および天然のアミノ酸ポリマーに適用される。
【００６１】
「プライマー」は、DNA鎖と対を形成する場合に、プライマー伸長産物の合成を、適切な重合剤の存在下で開始可能なオリゴヌクレオチドを意味する。プライマーは典型的には、増幅の効率が最大となる1本鎖であるが、2本鎖の場合もある。プライマーは、重合剤の存在下で伸長産物の合成を開始するために十分に長くなければならない。プライマーの長さは、用途、使用温度、鋳型反応条件、他の試薬、およびプライマーの供給源を含む多くの因子に依存する。例えば、標的配列の複雑性に依存して、オリゴヌクレオチドプライマーは典型的には15〜35残基またはそれ以上のヌクレオチドを含むが、これより少ないヌクレオチドを含む場合がある。プライマーは、約200ヌクレオチド〜数キロ塩基、またはそれ以上などの大きなポリヌクレオチドの場合がある。プライマーは、ハイブリダイズし、および合成開始部位として作用するように設計される、鋳型上の配列に対して「実質的に相補的な」ものを選択することができる。「実質的に相補的な」という表現は、プライマーが、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズするのに十分に相補的なことを意味する。適切にはプライマーは、ハイブリダイズするように設計される鋳型と不一致を含まないが、これは本質的ではない。例えば非相補的なヌクレオチドはプライマーの5'末端に結合し、プライマー配列の残りの部分は鋳型と相補的である場合がある。あるいは、非相補的なヌクレオチド、または一連の非相補的なヌクレオチドは、プライマーの配列が、鋳型とハイブリダイズすることで、プライマーの伸長産物の合成用の鋳型を形成するように鋳型の配列と十分な相補性を有するという条件で、プライマー中に分散可能である。
【００６２】
「プロモーター」は、少なくとも部分的には転写の開始および転写レベルを制御するDNAの領域を意味する。本明細書で言及される「プロモーター」という表現は極めて広い意味で理解され、ならびにTATAボックス配列およびCCAATボックス配列を含む従来型のゲノム遺伝子の転写調節配列、ならびに発生段階における刺激および/または環境刺激に反応して、または組織特異的もしくは細胞型特異的に遺伝子発現を変化させる追加的な調節エレメント(すなわち活性化配列、エンハンサー、およびサイレンサー)を含む。プロモーターは通常、発現制御対象となる転写可能配列(例えば、コード配列、または機能性RNAをコードする配列)の上流すなわち5'側に位置するが、必ずしもこの位置に位置するわけではない。さらに、プロモーターを含む調節エレメントは通常、遺伝子の転写の開始部位から2 kb以内に位置する。本発明のプロモーターは、細胞内における発現をさらに促進するために、および/または機能的に連結された構造遺伝子の発現のタイミングもしくは誘導能を変化させるために、開始部位からより遠位に位置する追加的な特異的な調節エレメントを含む場合がある。「プロモーター」という表現は、その範囲に、誘導型プロモーター、抑制型プロモーター、および構成的プロモーター、ならびに最小プロモーターも含む。最小プロモーターは典型的には、機能的に連結されている、選択されたDNA配列の転写を開始可能な最小発現制御エレメントを意味する。いくつかの例では、最小プロモーターは、追加的な調節エレメント(例えば、エンハンサーまたは他のシス作用性の調節エレメント)の非存在下では、基礎レベルを超えて転写を開始できない。最小プロモーターは高頻度でTATAボックスまたはTATA様ボックスからなる。数多くの最小プロモーター配列が文献上、知られている。例えば最小プロモーターは、fos、CMV、SV40、およびIL-2ほかに由来するプロモーター領域を含む多様な既知配列から選択され得る。説明目的の例は、最小CMVプロモーターまたは最小IL 2遺伝子プロモーター(始点に対して-72〜+45；Siebenlist, 1986)を含む。
【００６３】
「リコンビナーゼ標的部位」(RTS)は、リコンビナーゼによって介在性配列が切り出される核酸配列を意味する。これは、2つのRTSが切り出しに必要なことと理解される。したがって、Creリコンビナーゼが使用される場合は、個々のRTSはloxP部位を含み；loxP部位が使用される場合は、対応するリコンビナーゼはCreリコンビナーゼである。すなわち、リコンビナーゼはRTSに対応していなければならないか、またはRTSを認識しなければならない。FLPリコンビナーゼが使用される場合は、個々のRTSはFLP組換え標的部位(FRT)を含み；FRT部位が使用される場合は、対応するリコンビナーゼはFLPリコンビナーゼである。
【００６４】
「調節可能なプロモーター」という表現は、構成的ではなく、時間的および/または空間的に調節される様式で遺伝子発現を誘導するプロモーターを意味し、ならびに組織特異的なプロモーターと誘導型プロモーターの両方を含む。これは天然および合成の配列を含み、ならびに合成および天然の配列の組み合わせの場合がある。さまざまなプロモーターが、さまざまな組織または細胞型において、または発生のさまざまな段階で、またはさまざまな環境条件に反応して遺伝子の発現を誘導し得る。宿主細胞に有用な、さまざまなタイプの新しいプロモーターが継続して発見されつつある。多くの場合、調節配列の正確な境界は完全には決定されていないので、さまざまな長さの核酸断片が同一のプロモーター活性を有する場合がある。
【００６５】
「調節配列」または「調節エレメント」は、コード配列の上流に位置するヌクレオチド配列(5'非コード配列)、内部に位置するヌクレオチド配列、または下流に位置するヌクレオチド配列(3'非コード配列)を意味し、および結合したコード配列の転写、RNAのプロセシングもしくは安定性、または翻訳に影響を及ぼす。調節配列は、エンハンサー、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、およびポリアデニル化シグナル配列を含む。これらは、天然および合成の配列、ならびに合成および天然の配列の組み合わせの場合がある配列を含む。
【００６６】
「部位特異的な相同組換え」という表現は、ヌクレオチド組成が実質的に類似する核酸配列間における鎖の交換交差現象を意味する。このような交差現象は、本発明のターゲッティングコンストラクトと内因性のゲノム核酸配列に含まれる配列間で生じ得る。加えて、複数の部位特異的な相同組換え現象が生じることが可能であり、このことから、ターゲッティングコンストラクト内に含まれる核酸配列が内因性のゲノム配列中に存在する特定の配列と置換される置換現象を生じる可能性がある。
【００６７】
「実質的に非相同的な」、または「実質的に相同でない」という表現は、ゲノム配列が、部位特異的な相同組換えの過程が起きることを可能とするためにゲノム配列を標的とするための十分に類似したヌクレオチド配列を含まない、ターゲッティングコンストラクトのセグメントを意味する。この能力を有する非類似配列は、2つの配列間の塩基対組成の不一致のために、標的ゲノム配列と部位特異的な相同組換えを起こせない。
【００６８】
「転写可能な核酸配列」または「転写された核酸配列」という表現には、転写を誘導する非転写調節配列は含まれない。本発明の局面に応じて、転写可能な配列は、その全体または一部分が、植物、真菌、動物、細菌のゲノムもしくはエピソーム、真核生物、核、もしくはプラスミドのDNA、cDNA、ウイルスDNA、または化学的に合成されたDNAを含む、当技術分野で既知の任意の供給源に由来する場合がある。転写可能な配列は、コード領域か、または発現産物の生物学的活性もしくは化学構造、発現速度、または発現制御様式に影響を及ぼす可能性のある非翻訳領域のいずれかにおける1つもしくは複数の修飾を含む場合がある。このような修飾は、1つもしくは複数のヌクレオチドの挿入、欠失、および置換を含むがこれらに限定されない。転写可能な配列は、分断されていないコード配列を含む場合があるほか、適切なスプライス部位により結合された1つまたは複数のイントロンを含む場合がある。転写可能な配列は、融合タンパク質をコードする場合もある。他の態様では、転写可能な配列は非コード領域のみを含む。
【００６９】
「形質転換」という表現は、本発明による、発現系の導入による宿主の遺伝子型の改変を意味する。
【００７０】
「導入遺伝子」という表現は、本明細書では、ヌクレオーム、特に宿主のゲノム中に人工的に導入されたか、または導入予定であり、および宿主の子孫に伝達される遺伝的材料を意味する表現として用いられる。導入遺伝子は、宿主細胞を形質転換するために使用される。つまり宿主細胞において、本明細書で定義された発現系の1つまたは複数の核酸成分の組入れ後に、永久的または一過的な遺伝的変化、特に永久的な遺伝的変化が誘導される。
【００７１】
宿主細胞、宿主部分(host part)、宿主組織、または宿主に関して本明細書で用いる「トランスジェニック」または「形質転換された」という表現は、宿主細胞、宿主部分、宿主組織、または宿主のヌクレオーム、特にゲノム中に導入されたターゲッティングカセットもしくはこの誘導体(本発明の調節性遺伝子は除く)を含む宿主細胞、宿主部分、宿主組織、または宿主を意味する。
【００７２】
「ベクター」は、適切には例えば、内部に核酸配列を挿入またはクローン化可能なプラスミド、バクテリオファージ、または植物ウイルスに由来するDNA分子である核酸分子を意味する。ベクターは典型的には、1つまたは複数の固有の制限酵素部位を含み、および標的となる細胞または組織、またはこの子孫の細胞もしくは組織を含む特定の宿主細胞における自律的複製能力を有する場合があるほか、クローニングされた配列が複製可能となるように特定の宿主のゲノムに組込まれ得る。したがってベクターは、自己複製型のベクター、すなわち例えば閉鎖環状プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体などの、その複製が染色体の複製に依存しない染色体外の存在として存在するベクターの場合がある。ベクターは、自己複製を確実なものとする任意の手段を含む場合がある。またはベクターは、宿主細胞に導入時に、ゲノム中に組込まれ、および組込まれた染色体と共に複製されるベクターの場合がある。ベクター系は、共に宿主細胞のゲノム、またはトランスポゾン中に導入される全DNAを含む、1つのベクターもしくはプラスミド、2つもしくはそれ以上のベクターもしくはプラスミドを含む場合がある。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞に対するベクターの適合性に依存する。ベクターは、適切な形質転換体の同定に使用可能な抗生物質耐性遺伝子などのマーカーを含む場合もある。このような耐性遺伝子の例は当業者に周知である。
【００７３】
2．省略形
本出願では、以下の省略形を使用する。
nt =ヌクレオチド
nts =ヌクレオチド
aa =アミノ酸
kb =キロ塩基またはキロ塩基対
kDa =キロダルトン
d =日
h =時
s =秒
【００７４】
3．複数の核酸配列を連続的にクローニングするための系
本発明は部分的に、対象のキメラコンストラクトを構築するために複数の異種核酸配列を連続的にクローニングするための新たな戦略に基づく。この戦略では、異種核酸配列の少なくとも1つを、マーカー配列を含まないがキメラコンストラクトの構築用の1つまたは複数の他の異種核酸配列を含むレシピエントコンストラクト中に移すために、配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を使用する。一般に、移される核酸配列およびマーカー配列は、カセットが組換えコンストラクトの同定に使用される宿主細胞内でそれ自身では実質的に自律的に複製できないように、複製起点を欠くカセットの形状でレシピエントコンストラクト中に導入される。レシピエントコンストラクトへのカセットの導入によって形成された組換えコンストラクトは、移された核酸配列、他の核酸配列、およびマーカー配列を含み、これらの全てが実質的にそれ自身では自律的に複製不能であり、および1つまたは複数の追加的な異種核酸配列を含むレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能な別のカセットの少なくとも一部分を形成する。他のカセット中におけるマーカー配列の存在により、組換えコンストラクトを同定可能な特徴を示さない宿主細胞内に導入する段階、および同定可能な特徴を示す組換え宿主細胞を同定する段階を一般に含む、組換えコンストラクトを含む組換え宿主細胞の同定が容易となる。必要に応じて、組換え宿主細胞の同定は、レシピエントコンストラクト中に存在するマーカー配列によって付与される別の同定可能な特徴も示す宿主細胞を対象にスクリーニングを行うことで、確認できる。
【００７５】
仮に、対象のキメラコンストラクトを構築するために1つまたは複数の追加的な核酸配列が必要な場合、他のカセットを、追加的な核酸配列を含む別のレシピエントコンストラクト中に導入することで、他のカセットおよび追加的な核酸配列が、それ自身では実質的に自律的に複製できず、および任意で1つまたは複数の別の異種核酸配列を含むレシピエントコンストラクト中に移動可能な別のカセットの少なくとも一部分を形成する別の組換えコンストラクトを形成させる。別のカセット中にマーカー配列が存在することで、第1に言及された組換えコンストラクトを含む組換え細胞の同定に関して論じられた類似の段階を使用する、他の組換えコンストラクトを含む組換え宿主細胞の同定が容易になる。任意で、組換え宿主細胞の同定は、他のレシピエントコンストラクト中に存在する別のマーカー配列によって付与される、異なる同定可能な特徴も示す宿主細胞を対象にスクリーニングを行うことで、確認可能である。
【００７６】
上記の手順は、対象のキメラコンストラクトの構築に必要とされる任意の別の核酸配列に対して、コンストラクトが構築されるまで必要に応じて繰り返される。典型的には手順は、少なくとも1回、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、さらには少なくとも11回、12回、13回、14回、15回、16回、17回、18回、19回、20回、21回、22回、23回、24回、25回、26回、27回、28回、29回、30回、またはそれ以上の回数、繰り返される。
【００７７】
したがって、組換えコンストラクトを含む宿主細胞の選択およびスクリーニング用のレシピエントコンストラクト中に存在するマーカーに依存する従来のクローニング戦略とは異なり、本発明の戦略では、異種核酸配列を1つのレシピエントコンストラクト中に移した後に、少なくとも1つの他のレシピエントコンストラクト中に連続的に移すことによって、追加的な異種核酸配列がマーカー配列によって個々の連続的なレシピエントコンストラクト中に移されるために、移動可能なセグメントまたは挿入カセット中には存在するが、レシピエントコンストラクト中には存在しないマーカー配列を使用する。組換えコンストラクトは、レシピエントコンストラクト中に存在するマーカー配列ではなく、個々の挿入カセット中に存在するマーカー配列によって付与される特徴の同定に基づいて同定されるため、非組換えコンストラクトの出現率はこの戦略を採用することで顕著に減少し、このことによってレシピエントコンストラクトのみを有する宿主細胞の出現率を実質的に減じる。加えて、個々の挿入カセットは複製起点を欠くために、実質的に自律的に複製できない。いくつかの態様では、マーカー配列または個々の挿入カセットが得られるドナーコンストラクトは、移動可能なカセットの外部に不活性化可能な複製起点を含む。複製起点の不活性化は、任意の適切な手段によって(例えば、複製起点の内部または近傍の部位を切断する制限エンドヌクレアーゼなどの切断用薬剤を使用することで)達成され得る。これらの態様では、ドナーコンストラクト上の複製起点の不活性化は、ドナーマーカーコンストラクトを有する宿主細胞が得られる確率を減じる。
【００７８】
いくつかの態様では、挿入カセット中に含まれるマーカー配列、およびレシピエントコンストラクト中に含まれるマーカー配列が、2つの異なる同定可能な特徴を宿主細胞に付与するために使用される。これらの態様では、さらに大きな濃縮が、所望の組換えコンストラクトを含む宿主細胞に関して得られる。というのは、挿入配列のみまたはレシピエントコンストラクトのみを含む任意の宿主細胞は、両方の同定可能な特徴を示さない場合があるからである。このように達成された濃縮は、従来のクローニング戦略で必要とされる通常は実施に1〜2日間を要する場合のある、カセットおよびバックボーンの、連結による結合またはトポイソメラーゼによる結合に先だって挿入カセットおよびレシピエントコンストラクトのバックボーンを精製する必要性を効率的に減じるか、または必要性を回避する。したがって本発明のこれらの態様は、対象のキメラコンストラクトの構築に必要な個々のクローニング段階の数が大きくなればなるほど大きな節約が可能となるように(例えば、構築に4〜6つのクローニング段階を必要とするキメラコンストラクトの場合は最長2〜3週間)、個々のクローニング段階にかかる時間と資源の両方を大きく節約することになる。
【００７９】
個々のレシピエントコンストラクトは、組換えコンストラクトを作製可能な宿主細胞に適合するベクターから選択することができる。あるいは、これらは宿主細胞のゲノムに含まれる核酸配列を明らかにする場合がある。
【００８０】
典型的には、個々のクローニング段階は、マーカー配列、および任意で1つまたは複数の異種核酸配列を含む挿入カセットを、レシピエントコンストラクト上の部位に導入する段階を含む。一般に挿入カセットは、実質的に宿主細胞において自律的に複製不能となるように複製起点を欠く。あるいは仮に挿入カセットが複製起点を含む場合は、組換え法もしくは変異誘発法、または当業者に既知の目的に適した任意の他の手法で実質的に機能しなくなるようにされる。
【００８１】
いくつかの態様では、挿入カセットが挿入されるレシピエントコンストラクト上の部位は、レシピエントコンストラクトに少なくとも1つの連結基質部位を提供するために対応する制限酵素によって切断可能な少なくとも1つの制限酵素部位を含み、連結基質部位は、挿入カセットの一方の末端または両端と実質的に相補的か、または適合性の、典型的には直線化されたレシピエントコンストラクトの平滑末端もしくは付着末端とされる。通常、レシピエントコンストラクトの切断に使用される制限酵素部位は、挿入カセットを受入れるように適合したコンストラクトのバックボーン中には存在しない。これらの態様では、挿入カセットは、コンストラクトへの挿入カセットの連結を可能とするためにレシピエントコンストラクトの末端に相補的か、または一致する末端を有するものも提供される。挿入カセットは、例えば、挿入カセットを含むドナーコンストラクトを、一致する末端を提供する1つまたは複数の制限酵素で切断することで得られる。一般に、ドナーコンストラクトの切断に使用される制限酵素部位は、挿入カセットそのものの中には存在しない。
【００８２】
あるいは挿入カセットは、挿入カセットを鋳型依存性の核酸増幅によって、特異的なプライマーで増幅することで得られる。複数の鋳型依存性の核酸増幅過程を挿入カセットの増幅に利用することができる。例えば、Mullis et al.,(米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号；ならびに欧州特許出願第86302298.4号、第86302299.2号、および第87300203.4号、ならびにMethods in Enzymology, Volume 155, 1987, pp. 335-350を参照)に記載されているポリメラーゼ連鎖反応法(PCR)が最も有名な方法の1つである。PCRでは、標的配列を含む2本鎖DNAの2つの相補鎖に対応するプライマーとして一対の特異的なオリゴヌクレオチドを使用する。プライマーは、標的配列の3'側に位置する、個々の相補的標的鎖の末端にハイブリダイズするものが選択される。それに続く、それぞれの鎖における鋳型依存性のDNA合成は、適切な試薬の存在下で熱安定性DNAポリメラーゼを使用することで触媒可能である。合成に先だって特異的なハイブリッドを形成させるために、かつ合成後に、合成によって形成された2本鎖核酸を変性させるためには熱サイクリング過程が必要である。サイクリング過程を繰り返すことで標的配列が幾何級数的に増幅される。
【００８３】
逆転写段階を利用するPCR法は、RNA依存性DNAポリメラーゼを使用してDNA鋳型を作製するRNA標的に対しても用いられる。このようなPCR法は、プロモーター配列をPCR反応に使用されるプライマーの1つに組入れ、および続いてPCR法による増幅後に2本鎖DNAを1本鎖RNAの転写用の鋳型として使用することでRNAの転写とカップリングされている(例えば、Murakawa et al., DNA 7:287-295 (1988)を参照)。
【００８４】
しかしながら、挿入カセットの増幅に使用可能な複数の非PCRベースの増幅法が存在する。非PCRベースの増幅法の1つのタイプは、DNA標的もしくはRNA標的を増幅するための、マルチサイクルのDNA依存性RNAポリメラーゼ駆動型のRNA転写の増幅、またはRNA誘導型のDNAの合成および転写を含む(例えば、Burg et al., WO 89/01050；Gingeras et al., WO 88/10315；Kacian and Fultz、EPO出願第89313154号；Davey and Malek、EPO出願第88113948.9号；Malek et al., WO91/02818、および米国特許第5,130,238号；Davey et al.、米国特許第5,409,818号；第5,466,586号；第5,554,517号、および第6,063,603号；Eberwine et al.、米国特許第5,514,545号；Lin et al.、米国特許第6,197,554号；ならびにKacian et al.、米国特許第5,888,779号を参照)。
【００８５】
別のタイプの増幅法では、例えば欧州特許出願第320,308号に記載されているリガーゼ連鎖反応(LCR)を使用する。この方法では、2つが同じ核酸鋳型とハイブリダイズすることで、個々の3'末端および5'末端が連結に先だって併置される少なくとも4つの別個のオリゴヌクレオチドが必要とされる。続いて、ハイブリダイズしたオリゴヌクレオチドが連結されて、核酸鋳型の相補鎖が形成される。次に2本鎖核酸が変性され、ならびに第3および第4のオリゴヌクレオチドが、共に結合された第1および第2のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズする。次に第3および第4のオリゴヌクレオチドが、共に連結される。増幅は、ハイブリダイゼーション、連結、および変性のさらなるサイクルによって達成される。
【００８６】
さらに別の増幅法が、例えばPCT出願第87/06270号および米国特許第4,786,600号に記載された、レプリカーゼ酵素による特異的な転写が可能な特異的なRNAプローブを使用するQβレプリカーゼ(Qβ)法である。この方法では、レプリカーゼ開始部位を有するRNAプローブの設計および合成が必要である。
【００８７】
あるいは、例えばEPO出願第0427073A号および第0427074A号に記載された、核酸標的配列とヘアピンを形成するパリンドロームプローブを使用することができる。このプローブは、RNA転写物が作られるヘアピン領域内に位置する機能性のプロモーターを含む。
【００８８】
相補的なDNA配列とハイブリダイズして、等温条件で多くのコピーの標的DNA配列を生じる同じ鎖のDNA配列を置換するためにDNAの1本の鎖を使用する、複数のバージョンの鎖置換増幅法も存在する。
【００８９】
Walker et al., Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 89:392-396 (January 1992), Walker et al., Nucl. Acids Res. 20:1691-1696 (1992)、欧州特許出願第EP 0 497272号、および欧州特許出願第EP 0 500 224号には、制限エンドヌクレアーゼを使用するオリゴヌクレオチド駆動型の増幅法について記載されている。制限エンドヌクレアーゼは、DNA/DNA複合体にニックを入れることで伸長反応を可能とし、引いては増幅を可能とする。
【００９０】
Becker et al.、EPO出願第88306717.5号には、プライマーが核酸配列とハイブリダイズし、ならびに結果として生じる2本鎖が伸長反応および増幅に先だって切断される増幅法について記載されている。
【００９１】
Dattagupta et al.には、エキソヌクレアーゼ活性または制限エンドヌクレアーゼ活性を必要としない等温的な増幅を実施するための、5'エキソヌクレアーゼ活性を欠く核酸ポリメラーゼ、および一組のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する別のバージョンの鎖置換増幅法が記載されている(米国特許第6,214,587号)。
【００９２】
挿入カセットの増幅に使用可能な、さらに別の増幅法がローリングサークル型増幅である。この方法では、対象の核酸分子が直鎖状のベクターに挿入されて、1本の鎖が連続的であり、および他の鎖が不連続である環状ベクターが形成される。環状ベクターの連続的な鎖が次にローリングサークル型複製によって増幅され、この過程で、挿入された核酸分子が増幅される。増幅は迅速であり、かつ効率的である。というのは、ベクター配列を指数関数的に複製する単回の等温的反応が関与するからである(Lizardiによる米国特許第6,287,824号)。
【００９３】
類似のアプローチを使用する関連する増幅法は、分岐伸長増幅(ramification extension amplification; RAM)と呼ばれる(Zhang et al.による米国特許第5,942,391号)。RAM法は、標的核酸を、それぞれ捕捉/増幅用プローブおよび増幅用プローブと呼ばれる、標的核酸中の隣接領域にハイブリダイズする複数の非重複性のオリゴヌクレオチドプローブと、リガンド結合部分でコーティングされた常磁性ビーズの存在下でハイブリダイズさせる段階を含む。捕捉/増幅用プローブの一方の末端に結合するリガンドの結合、ならびに標的核酸中の隣接配列に対するプローブの一部の特異的なハイブリダイゼーションによって、標的核酸、プローブ、および常磁性ビーズを含む複合体が形成される。プローブは次に、共に連結して、ビーズに結合する連続的な連結した増幅配列を形成可能であり、この複合体を変性させることで、標的核酸および非連結状態のプローブを除去することができる。
【００９４】
いくつかの態様では、核酸増幅反応における挿入カセットの増幅に使用される少なくとも1つのプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドは、レシピエントコンストラクトの末端に一致する典型的には平滑末端または付着末端を含む少なくとも1つの連結基質部位を有する、増幅された挿入カセットまたはアンプリコンを提供する、対応する制限酵素によって切断され得る制限酵素部位を含む。典型的には、プライマーの制限酵素部位は、挿入カセット内の標的配列に実質的に相補的なターゲッティング配列の上流(5'側)に位置する。
【００９５】
他の態様では、少なくとも1つのプライマーまたは他のオリゴヌクレオチドは、増幅された挿入カセットが挿入配列の一方の末端にトポイソメラーゼ認識部位を含むように、トポイソメラーゼ認識部位(例えば、トポイソメラーゼIの認識部位)を含む。認識部位とトポイソメラーゼ酵素が反応することで、トポイソメラーゼおよび増幅された挿入カセットを含む共有結合中間体が生じ、かつ共有結合中間体は、トポイソメラーゼによる共有結合中間体との連結の基質であるレシピエントコンストラクトと反応する。他の構成では、レシピエントコンストラクトにトポイソメラーゼ認識配列を加え、および挿入カセットと反応させることができる。さらに他の構成では、レシピエントコンストラクトと挿入カセットの両方にトポイソメラーゼ認識部位を加えることができる。トポイソメラーゼを使用するクローニング法は、Invitrogen Corporation, Carlsbad, Califから販売されている。組換え的なクローニングとトポイソメラーゼによるクローニングの両方を用いる方法は、共に文献に記載されている(例えば、WO 02/46372を参照)。
【００９６】
適合性の連結基質部位または適合性のトポイソメラーゼ基質部位を有する挿入カセットおよびレシピエントコンストラクトは次に、連結またはトポイソメラーゼによる結合を受け、および連結の産物が宿主細胞に導入される。次に宿主細胞を対象に、移動可能なマーカー配列によって付与される同定可能な特徴の存在に関して、および任意でレシピエントコンストラクトのマーカー配列によって付与される同定可能な特徴の存在に関してスクリーニングが行われることで、組換えコンストラクトを含む宿主細胞が同定される。
【００９７】
他の態様では、挿入カセットが挿入される部位は、マーカー配列に隣接する挿入カセットの一部と十分に相同であり、および宿主細胞を介する、挿入カセットと標的部位間の相同組換えを可能とする標的配列を含む標的部位を含む。標的部位中の標的配列と実質的に相同な挿入カセットの隣接部分は、良好なターゲッティングのために正確に考慮しなくてはならない重要なパラメータである。一般に、相同性の1つの領域は、わずか25 bpの場合がある(Ayares et al. 1986, Genetics 83:5199)が、当業者によって理解されるように、有意に、より長い相同性領域が使用されることが推奨される。隣接部分は、標的部位と相同な任意の配列を含む場合があり、および非コード核酸配列またはコード核酸配列を含む場合がある。
【００９８】
望ましくは隣接部分は、細胞の内因性の標的ゲノム配列に対して有意に高い配列同一性または配列相同性を示す。高い相同性によって、部位特異的な相同組換えの交差および鎖交換の過程における効率のよい塩基対合が可能となる。隣接部分と標的部位間における任意の一致塩基対合は、組換え反応に負に作用する。例えば、隣接部分が標的部位に対して100%相同である(すなわち同質遺伝子ある)ことが望ましく、80%相同であることはそれほど望ましくなく、および50%相同であることはさらに望ましくない。非同質系の隣接部分を使用する場合、これらの部分は通常、少なくとも約1,500 nts、2,000 nts、2,500 nts、3,000 nts、またはそれ以上の長さである。一般に、挿入カセットおよびレシピエントコンストラクトの配列は、宿主細胞の内因性のゲノム配列に対して実質的に非相同であり、およびしたがって、これらの配列と部位特異的な組換えを起こさない。
【００９９】
典型的には、上記の組換えに関する態様では、レシピエントコンストラクトを含む宿主細胞に挿入カセットが導入されることで、挿入カセットとレシピエントコンストラクト中の標的部位間の相同組換えが可能となる。適切には、これらの態様におけるレシピエントコンストラクトは、宿主細胞のヌクレオームの一部を形成し、および例えば、宿主細胞または宿主細胞のゲノム中に自己複製型の染色体外ベクターを含む場合がある。相同組換えが起こるために十分な時間を経過した後に、宿主細胞を、移動可能なマーカー配列によって付与される同定可能な特徴の存在に関して、および任意でレシピエントコンストラクトのマーカー配列によって付与される同定可能な特徴の存在に関してスクリーニングを行うことで、組換えコンストラクトを含む宿主細胞が同定される。
【０１００】
挿入カセットのマーカー配列、および任意でレシピエントコンストラクトのマーカー配列は、同定可能な特徴を付与する任意の配列を含む場合がある。同定可能な特徴は単に、例えば制限酵素解析、配列解析、サザンブロッティング、ノーザンブロッティング、およびポリメラーゼ連鎖反応(PCR)などがあるが、これらに限定されない核酸解析法による、マーカー配列そのものの検出能に存在する場合がある。他の態様では、同定可能な特徴は、マーカー配列の発現産物の活性または物理的特性に存在する。これらの態様では、マーカー配列は、発現されることで、マーカー遺伝子を含みかつ発現する細胞の同定および/または選択を促進する表現型を細胞に付与するマーカー(例えば、転写物もしくはタンパク質)をコードするヌクレオチド配列に機能的に連結されるプロモーターを含むマーカー遺伝子とされる。このタイプの説明目的のマーカーは、シグナル産生タンパク質、エピトープ、蛍光マーカーもしくは酵素的マーカー、または細胞機能の阻害剤を含む。例えば選択可能なマーカーは、β-ガラクトシダーゼもしくはβ-ラクタマーゼなどのマーカー酵素、またはルシフェラーゼもしくはGFPなどのレポータータンパク質もしくはシグナル産生タンパク質、リボザイム、RNA干渉(RNAi)分子、Tetリプレッサーなどの条件的転写調節因子、または細胞の状態を伝達するタンパク質などの測定用タンパク質、例えば細胞内膜電位を伝達するタンパク質から選択可能である。場合によってはマーカーは、分泌が、形質転換細胞を同定または選択する手段として検出可能な「分泌可能マーカー」である。例は、抗原結合分子(例えば、抗体)によって同定可能な分泌型抗原、またはその触媒活性によって同定可能な分泌型酵素を含む。分泌型タンパク質は、細胞壁中に挿入または捕捉されているタンパク質(例えば、エクステンシンまたはタバコPR-Sの発現単位中に見出されるようなリーダー配列を含むタンパク質)；例えばELISAによって検出可能な小型の拡散性タンパク質；ならびに細胞外溶液中に検出可能な小型の活性酵素(例えば、α-アミラーゼ、β-ラクタマーゼ、フォスフィノスリシンアセチル基転移酵素)を含むが、これらに限定されない。
【０１０１】
いくつかの態様では、マーカーは、タンパク質および糖タンパク質、または通常は免疫組織学的手法によって宿主細胞内で検出されないこれらの一部分から一般に選択される抗原(例えば、タンパク質を含むエピトープ)である。例えば抗原はCD4(免疫系で通常発現されているタンパク質)の場合があり、ならびに非免疫細胞(例えば、ES細胞または植物細胞)中で発現されて検出される場合がある。
【０１０２】
他の態様では、マーカーは、選択用薬剤に対する耐性または寛容性を付与する選択可能なマーカーである。このタイプの説明目的の例(およびこれらの選択用薬剤)は、カナマイシンキナーゼ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、およびアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(カナマイシン、パロモマイシン、G418など)、ピューロマイシンN-アセチルトランスフェラーゼ、およびピューロマイシン耐性タンパク質(ピューロマイシン)、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ(ハイグロマイシン)、ブレオマイシン耐性タンパク質(ブレオマイシン)、フレオマイシン結合タンパク質(フレオマイシン)、ブラストサイジンデアミナーゼ(ブラストサイジン)、β-ラクタマーゼ(アンピシリン)、テトラサイクリン耐性タンパク質(テトラサイクリン)、グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(キサンチン)、グルタミン合成酵素、およびEP-A 275 957に記載されたストレプトマイセス・ビリドクロモジェネス(Streptomyces viridochromogenes)に由来するアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(フォスフィノスリシン)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ヒポキサンチン)、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素(クロラムフェニコール)、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(グルタチオン)、ヒスチジノールデヒドロゲナーゼ(ヒスチジノール)、5-エノールシキミ酸-3-リン酸シンターゼ(EPSPS)(N-ホスホノメチルグリシン)、バルスター(barstar)(ビアラホス)、クレブシエラ・オザエナエ(Klebsiella ozaenae)に由来するBxnなどのニトリラーゼ(ブロモキシニル)、ジヒドロ葉酸還元酵素(メトトレキセート)、EP-A-154 204に記載されている変異型アセト乳酸シンターゼ(ALS)(イミダゾリノン、スルホニル尿素、または他のALS阻害化合物)、変異型アントラニル酸シンターゼ(5-メチルトリプトファン)、ならびにダラポンデハロゲナーゼ遺伝子(2,2-ジクロロプロピオン酸)、ならびにこれらの生物学的に活性のある断片、異型、および誘導体を含むが、これらに限定されない。特定の態様では、選択可能なマーカーは、選択用薬剤に対する耐性または寛容性を少なくとも2つの異なる宿主細胞に付与する。適切には、これらの宿主細胞は、異なる生物に由来するか、または異なる生物、例えば細菌、酵母、植物、昆虫、鳥類、爬虫類、および哺乳動物とされる。例えば、カナマイシン/ネオマイシン耐性は、細菌細胞と哺乳動物細胞の両方に付与され得る。
【０１０３】
さらに他の態様では、マーカーはスクリーニング可能なマーカーである。望ましいスクリーニング可能なマーカーは、さまざまな色素生産性基質が既知であるβ-グルクロニダーゼ(GUS)酵素；さまざまな色素生産性基質が既知である西洋ワサビペルオキシダーゼ；色素生産性基質が既知であるβ-ガラクトシダーゼ；さまざまな色素生産性基質が既知であるヒト胎盤アルカリホスファターゼおよびアルカリホスファターゼ；カルシウム感受性の生物発光検出に使用可能なイクオリン；さまざまな色素生産性基質が既知である酵素をコードするβ-ラクタマーゼ(例えば、色素生産性のセファロスポリンであるPADAC)；植物組織におけるアントシアニン色素(赤色)の産生を調節するR-座の遺伝子産物(Dellaporta et al., 1988, in Chromosome Structure and Function, pp.263-282)；α-アミラーゼ(Ikuta et al., 1990, Biotech., 8:241)；チロシンを、容易に検出可能な化合物メラニンを生成するように縮合するドーパおよびドーパキノンに酸化するチロシナーゼ(Katz et al., 1983, J. Gen. Microbiol., 129:2703)；または色素生産性カテコールを変換可能なカテコールジオキシゲナーゼをコードするキシロース輸送体(Zukowsky et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:1101)を含むが、これらに限定されない。またはスクリーニング可能なマーカーは、特定の変異体を含む緑色蛍光タンパク質(GFP)、またはBFP、CFP、YFP(Aurora Biosciences)(例えば、Tsien et al.、米国特許第6,124,128号を参照)および強化型GFP(EGFP)などの改変型のGFP、ならびにDsRed(Clontech)、青色、シアン、緑色、黄色、または赤色の蛍光タンパク質、速やかに分解するGFP融合タンパク質(Clontech, Feng et al., 2000, Neuron, 28:41-51)、および一部はGFPとは異なるスペクトル特性を有し、ならびに黄色および赤色の波長で光を放出する、GFPに相同な蛍光タンパク質(Matz et al., 1999, Nat. Biotechnol. 17(10): 969-973)などの蛍光タンパク質から選択することができる。
【０１０４】
特定のクローニング段階を使用する必要のある、いくつかの態様では、移動可能なマーカー配列によって付与される同定可能な特徴を既に示す宿主細胞を(例えば、宿主細胞が特定の選択用薬剤に既に耐性を示す場合に)、補助的なマーカー配列を挿入カセット中に導入して、移動可能なマーカーによって付与される特徴とは異なる同定可能な特徴を宿主細胞に付与することができる。これによって、クローニング段階によって得られる組換えコンストラクトを含む組換え宿主細胞の同定が可能となる可能性がある。
【０１０５】
いくつかの態様では、個々のマーカー配列には、同配列の内部または近傍に位置し、および標的部位間の核酸配列を切り出して、そのようなマーカー配列の場合にマーカー配列の少なくとも一部分の欠失、または機能の喪失を招く、部位特異的なリコンビナーゼタンパク質によって認識される標的部位が提供される。説明目的の部位特異的リコンビナーゼは、Cre、FLP-野生型(wt)、FLP-L、またはFLPeを含むが、これらに限定されない。組換えは、当技術分野で既知の任意の方法、例えばDoetschman et al.(1987, Nature 330:576-578)に記載の方法；Thomas et al.(1986, Cell 44:419-428)に記載の方法；Cre-loxP組換え系(Sternberg and Hamilton, 1981, J. Mol. Biol. 150:467-486；Lakso et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6232-6236)；出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)のFLPリコンビナーゼ系(O'Gorman et al., 1991, Science 251:1351-1355；Lyznik et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(19):3784-3789)；Cre-loxP-テトラサイクリン制御スイッチ(Gossen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51)；ならびにリガンド調節型のリコンビナーゼ系(Kellendonk et al., 1999, J. Mol. Biol. 285:175-82)によって達成され得る。望ましくは、リコンビナーゼは活性が高く、例えばCre-loxP系またはFLPe系であり、および熱安定性が高い(Rodrguez et al., 2000, Nature Genetics 25:139-40)。特定の態様では、マーカー配列の少なくとも一部分(適切であれば、その調節配列を含む)は、Creリコンビナーゼによって特異的に認識されるloxP標的部位か、またはFLPリコンビナーゼによって特異的に認識されるFRT標的部位のいずれかに挟まれている。loxP標的部位の配列の説明目的の例は、
2008539766.tif 000002
である。FRT標的部位の配列の説明目的の例は、
2008539766.tif 000003
である。
【０１０６】
他の複数の組換え系も本発明における使用に適している。これらは例えば、ファージMuのGinリコンビナーゼ(Crisona et al., 1994, J. Mol. Biol. 243 (3) :437-457)、大腸菌のPinリコンビナーゼ(例えば、Kutsukake et al., 1985, Gene 34(2-3):343-350を参照)、シゲラ(Shigella)由来のPinB、PinD、およびPinF(Tominaga et al., 1991, J. Bacteriol 173(13):4079-4087)、pSR1プラスミドのR/RS系(Araki et al., 1992, J. Mol. Biol. 225 (1) :25-37)、ならびにcin、hin、およびβ-リコンビナーゼを含む。本明細書に記載された本発明と関連する他の組換え系は、クリュベロミセス(Kluyveromyces)種、ファージ、および組込型ウイルス(例えば、SSV1にコードされたインテグラーゼ)に由来する組換え系である。
【０１０７】
ある態様では、リコンビナーゼ系は、第2の誘導型または抑制型の転写調節系と連結される。例えば、細胞特異的なCre-loxP介在型の組換え系(Gossen and Bujard, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-51)を、細胞特異的なテトラサイクリン依存性の時間スイッチ(例えばEwald et al., 1996, Science 273:1384-1386；Furth et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 91 :9302-9306；St-Onge et al., 1996, Nucleic Acids Res. 24(19): 3875-7387を参照)に連結することができる。説明目的の例では、哺乳動物細胞における発現が強化された改変型のcre遺伝子が使用される(Gorski and Jones, 1999, Nucleic Acids Res. 27(9): 2059-2061)。
【０１０８】
別の説明目的の例では、Kellendonk et al. (1999, J. Mol. Biol. 285: 175-182)に記載のリガンド調節型のリコンビナーゼ系が使用される。この系では、受容体のリガンド結合ドメイン(LBD)が、リコンビナーゼの特異性を高めるためにCreリコンビナーゼと融合される。このようにして、リコンビナーゼの活性が、宿主細胞における核受容体に対するリガンドの存在によって制御される。LBDは適切には、一部分が核受容体のリガンド結合部分を含む核受容体の一部分または全体の誘導体を含む。核受容体は、宿主細胞に対して内因性である場合があるほか、別の種に由来する場合がある。この核受容体誘導体は、エストロゲン、アンドロゲン、副腎グルココルチコイド、アルドステロン、およびプロゲステロンの受容体を含むステロイド-ホルモン依存性の受容体；ビタミンD、レチノイド、甲状腺ホルモンの受容体を含む核ホルモン受容体；ならびにペルオキシソーム増殖因子活性化受容体を含むオーファン核受容体、およびCOUP-TFI/IIおよびSF-Iなどがあるがこれらに限定されない、脂質受容体からなる群より選択される場合がある。適切には、核受容体のリガンド結合部分は、ステロイドホルモン依存性受容体の一部分または誘導体であり、および望ましくはエストロゲン受容体のLBDの誘導体である。有利なことには、エストロゲン受容体のLBDの誘導体は、内因性のエストロゲンおよびエストロゲン関連ホルモンに対して、正常な結合親和性の基準範囲に関して低い親和性を示すか、または親和性を示さない。このタイプのある態様では、エストロゲン受容体のLBDの誘導体は、タモキシフェンやこの類似体などの非内因性のエストロゲンホルモン類似体に親和性を示す。リガンド結合ドメインは、リコンビナーゼタンパク質のN末端またはC末端に融合させることができる。特定の態様では、エストロゲン受容体の結合ドメインはCreリコンビナーゼタンパク質のC末端に融合される。
【０１０９】
適切には、対象のコンストラクトの構築用の個々の核酸配列は、(1)宿主細胞のゲノム中の標的部位の領域に相同な核酸配列；(2)転写調節エレメント；(3)翻訳調節エレメント；(4)少なくとも1つの制限酵素部位を含む配列；(5)マーカー配列；(6)RNA分子をコードする配列；(7)ポリペプチドをコードする配列；(8)組換え部位；(9)複製起点；および(10)アンチセンス分子から選択される。
【０１１０】
したがって、いくつかの態様では、異種核酸配列は、天然では宿主のゲノム中に見出される内因性のポリヌクレオチドである。他の態様では、異種核酸配列は、組換え型または人工的な核酸である。例えば異種核酸配列は、(1)mRNAに転写され、かつポリペプチドに翻訳される遺伝子、ならびに(2)RNA(例えば、rRNA、tRNA、RNAi、リボザイム、およびアンチセンスRNAなどの機能性のRNA分子)に転写されるだけの遺伝子、から選択され得る。いくつかの態様では、異種核酸配列は、ポリペプチドが宿主、宿主細胞、または宿主部分から抽出されるか、または精製される、市販用のポリペプチドをコードする。このようなポリペプチドは、抗生物質または二次代謝物、ワクチンに使用される免疫原性分子、サイトカイン、およびホルモンの生合成に関与するポリペプチドを含むが、これらに限定されない。他の態様では、異種核酸配列は、宿主に有益な特性を付与する産物をコードするか、または、除草剤に対する耐性もしくは寛容性(例えば、グリフォセート耐性もしくはグルホシネート耐性)、ストレス耐性(例えば、塩耐性)、不稔性、食糧増加の改善、または収量増加(例えば、デンプン分岐酵素、デンプン合成酵素、ADP-グルコースピロホスホリラーゼなどのデンプンの生合成もしくは修飾に影響する産物、デサチュラーゼもしくはヒドロキシラーゼなどの脂肪酸生合成に関与する産物、ならびにインベルターゼ、ショ糖異性化酵素、もしくはショ糖合成酵素などのショ糖代謝を改変する産物)、ならびに疾患に対する耐性もしくは寛容性(例えば、説明目的の例が、細菌、ウイルス、線虫、蠕虫、昆虫、原生動物、もしくはウイルス病原体に対する耐性、癌もしくは腫瘍に対する耐性、自己免疫疾患に対する耐性、腫瘍、自己、細菌、ウイルス、線虫、蠕虫、昆虫、原生動物、もしくはウイルス起源に対する抗原；バチルス・チューリンゲンシス(Bacillus thuringiensis)の結晶トキシンタンパク質などの昆虫耐性を付与する産物；ウイルスのコートタンパク質もしくはキャプシドタンパク質などのウイルス耐性を付与する産物；キチナーゼ、β-1,3-グルカナーゼ、もしくはフィトアレキシンなどの、真菌耐性を付与する産物を含む)を含むが、これらに限定されない他の有益な特徴をコードする。
【０１１１】
他の態様では、異種核酸配列は、説明目的の例ではマーカー配列の発現、および任意で別の異種核酸配列の発現を調節するプロモーターを含む。本発明で想定されるプロモーターは、宿主細胞もしくは生物体に対して天然であってもよく、またはプロモーターが宿主細胞もしくは生物体で機能する別の供給源に由来してもよい、構成的プロモーターおよび調節可能なプロモーターを含む。特定のプロモーターの選択は、機能的に連結された核酸配列の発現に使用される細胞の型に依存する。一部の真核生物由来のプロモーターは広い宿主範囲を有するが、限られた一群の細胞型で機能するものもある。哺乳動物細胞を含む真核細胞で機能するプロモーター配列の説明目的の例は、シミアンウイルス(例えば、SV40)、パピローマウイルス、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、ラウス肉腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、ポリオーマ、サイトメガロウイルスに由来するプロモーター、モロニーマウス白血病ウイルスのLTRなどのモロニー白血病ウイルスの末端反復配列(LTR)、SV40の初期および後期のプロモーター、および単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーター、3-ホスホグリセリン酸キナーゼもしくは他の糖分解酵素遺伝子のプロモーター、酸ホスファターゼ遺伝子のプロモーター、例えばPho5、ならびにヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HPTR)、アデノシンデアミナーゼ、ピルビン酸キナーゼ、およびβ-アクチンの遺伝子のプロモーターを含むが、これらに限定されない。原核生物系もしくは真核生物系で機能するプロモーターの他の説明目的の例は、lac系、trp系、TAC系またはTRC系のプロモーター、T7 RNAポリメラーゼによって発現が誘導されるT7プロモーター、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、酵母α-接合因子のプロモーター、バキュロウイルス系のポリヘドロンプロモーター、ならびに原核細胞もしくは真核細胞、またはこれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが既知である他の配列、ならびに、これらのさまざまな組み合わせを含む。
【０１１２】
ある態様では、結果として得られる対象のコンストラクトは、植物宿主細胞における発現に、または植物ゲノムの遺伝子改変に有用なので、植物細胞で機能するプロモーターを含む。植物細胞において活性を示す数多くのプロモーターが文献に記載されており、この説明目的の例は、(アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)の腫瘍誘導性プラスミドに保持されている)ノパリンシンターゼ(NOS)プロモーター、オクトピンシンターゼ(OCS)プロモーター、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)の19Sプロモーター、およびCaMVの35Sプロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルスの35S-プロモーターなどのコーリモウイルスのプロモーター、リブロース-1,5-ビス-リン酸カルボキシラーゼの小サブユニット(ssRUBISCO)の光誘導型プロモーター、Adhプロモーター、ショ糖合成酵素のプロモーター、R遺伝子複合体のプロモーター、GST-II-27遺伝子のプロモーター、およびクロロフィルa/b結合タンパク質遺伝子のプロモーターを含む。
【０１１３】
葉、種子、根、または茎などの植物の供給源組織で発現させる目的のために、特定の遺伝子の発現を駆動するプロモーターが、これらの特定の組織における比較的強い発現を有することが時に望ましい。この目的のために、プロモーターを組織もしくは細胞に特異的な発現、または強化された発現用の遺伝子に対する、いくつかのプロモーターから選択することができる。このようなプロモーターの例は、エンドウマメの葉緑体グルタミンシンターゼのGS2プロモーター、コムギの葉緑体フルクトース-1,6-ビスホスファターゼ(FBPase)のプロモーター、ジャガイモの核光合成ST-LS1プロモーター、シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)のセリン/スレオニンキナーゼ(PAL)プロモーターおよびグルコアミラーゼ(CHS)プロモーターを含む。光合成的に活性のある組織において活性を示すことも報告されているプロモーターは、カラマツ(Larix laricina)のリブロース-1,5-ビスリン酸カルボキシラーゼ(RbcS)プロモーター、マツのcab遺伝子であるcab6のプロモーター、コムギのCab-1遺伝子のプロモーター、ホウレンソウのCAB-1遺伝子のプロモーター、イネのcab1R遺伝子のプロモーター、トウモロコシのピルビン酸オルトリン酸ジキナーゼ(PPDK)プロモーター、タバコLhcb1*2遺伝子のプロモーター、シロイヌナズナのSUC2ショ糖-H+共輸送体、およびホウレンソウのチラコイド膜タンパク質(psaD、psaF、psaE、PC、FNR、atpC、atpD、cab、rbcS)のプロモーターを含む。シロガラシのLhcB遺伝子およびPsbP遺伝子のプロモーターなどの、クロロフィルa/b-結合タンパク質の他のプロモーターも本発明で利用可能である。
【０１１４】
ジャガイモ植物の塊茎などの植物のシンク器官、トマトの果実、またはトウモロコシ、コムギ、イネ、およびオオムギの種子で発現させる目的では、対象の遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、これらの特定の組織において比較的強い発現を有することが望ましい。クラスIのパタチンプロモーター、ジャガイモ塊茎のADPGPP遺伝子のプロモーター、大サブユニットと小サブユニットの両方、ショ糖合成酵素のプロモーター、22 kdタンパク質複合体およびプロテアーゼインヒビターを含む主要塊茎タンパク質のプロモーター、デンプン顆粒結合型合成酵素遺伝子(GBSS)のプロモーター、ならびに他のクラスIおよびIIのパタチンプロモーターを含む、塊茎特異的に発現するかまたは塊茎で発現が強化される遺伝子のいくつかのプロモーターが知られている。
【０１１５】
他のプロモーターも、選択された遺伝子を種子または果実などの特定の組織で発現させるために使用することができる。このようなプロモーターの例は、ナピン、ファゼオリン、ダイズトリプシンインヒビター、ACP、ステアロイル-ACPデサチュラーゼ、β-コングリシニン(soy 7s)のダイズα'サブユニット、およびオレオシンなどの遺伝子に由来する5'調節領域を含む。他の例には、β-コングリシニンのプロモーターなどがある。トウモロコシの胚乳中に存在する貯蔵タンパク質の一群であるゼインも含まれる。ゼイン遺伝子のゲノムクローンは単離されており、およびこれらのクローンに由来する、15 kD、16 kD、19 kD、22 kD、27 kD、および遺伝子を含む、プロモーターを使用することもできる。例えばトウモロコシで機能することが知られている他のプロモーターは、waxy、Brittle、Shrunken 2、分枝酵素IおよびII、デンプン合成酵素、脱分岐酵素、オレオシン、グルテリン、およびショ糖合成酵素の遺伝子のプロモーターを含む。コムギにおける発現に適切なプロモーターの例は、ADPグルコースピロシンターゼ(ADPGPP)のサブユニット、顆粒結合型および他のデンプン合成酵素、分岐酵素および脱分岐酵素、胚発生時蓄積タンパク質(embryogenesis-abundant protein)、グリアジンおよびグルテニンのプロモーターを含む。イネにおけるこのようなプロモーターの例は、ADPGPPサブユニット、顆粒結合型および他のデンプン合成酵素、分岐酵素、脱分岐酵素、ショ糖合成酵素、およびグルテリンのプロモーターを含む。オオムギに関するこのようなプロモーターの例は、ADPGPPサブユニット、顆粒結合型、および他のデンプン合成酵素、分岐酵素、脱分岐酵素、ショ糖合成酵素、ホルデイン、胚グロブリン、およびアリューロン特異的タンパク質のプロモーターを含む。
【０１１６】
根に特異的なプロモーターを使用することもできる。このようなプロモーターの一例が、酸キチナーゼ遺伝子のプロモーターである。根組織における発現は、同定済みのCaMV35Sプロモーターの根に特異的なサブドメインを使用して達成することもできる。
【０１１７】
ある態様では、異種核酸配列は、説明目的の例では、マーカー配列および/または別の異種対象ヌクレオチド配列(本明細書では個別に、または集合的に「コンストラクト系ポリヌクレオチド」と呼ばれる)に機能的に連結されており、かつ選択された宿主細胞で転写を終結させたり、および/またはポリアデニル化されたヌクレオチド配列の、コンストラクト系ポリヌクレオチドから転写されたRNA配列の3'末端への付加を引き起こすように機能する3'非翻訳配列を含む。したがって3'非翻訳配列は、転写終結シグナルおよび/またはポリアデニル化シグナル、ならびにmRNAのプロセシングまたは遺伝子発現を実現可能な任意の他の調節シグナル(例えば、翻訳終結シグナル)を含む核酸セグメントを含む遺伝子の一部を意味する。ポリアデニル化シグナルは、mRNA前駆体の3'末端へのポリアデニル酸の連続の付加を引き起こすことを特徴とする。ポリアデニル化シグナルは一般に、標準型の5'AATAAA-3'に対する相同性の存在によって認識されるが異型も珍しくはない。3'非翻訳調節配列は望ましくは約50〜1,000 ntsを含み、ならびに宿主細胞において機能する転写および翻訳の終結配列を含む。
【０１１８】
選択されたプロモーターによって生じるレベルを上回るコンストラクト系ポリヌクレオチドの転写は、好都合なことには、エンハンサーを使用して高めることができ、このエンハンサーは、DNAのシス作用性エレメントで、通常は約10〜300 ntsであり、プロモーターに作用して転写を高め、かつ対象のコンストラクトの異種核酸配列を定義しうる。本発明のキメラコンストラクトの構築に有用なエンハンサーは、サイトメガロウイルスの初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスのエンハンサーを含むが、これらに限定されない。植物で使用される転写エンハンサーの例は、例えば、Last et al.(米国特許第5,290,924号)に記載されている、CaMVの35Sプロモーターおよびオクトピンシンターゼ遺伝子に由来するエレメントを含むが、これらに限定されない。植物の形質転換に関して応用する場合、ocsエレメント、特にマルチコピーの同エレメントなどのエンハンサーエレメントの使用が、隣接するプロモーターからの転写のレベルを高めるように作用すると提案されている。転写はされるが翻訳はされないリーダー配列は遺伝子発現に影響を及ぼす場合があるので、ターゲッティング系ポリヌクレオチドの発現を高めるために特定のリーダー配列を使用することもできる。適切なリーダー配列は、ターゲッティング系のポリヌクレオチドの最適な発現を誘導するように選択される配列を含む配列を含む。例えば、そのようなリーダー配列は、例えばJoshi(1987, Nucl. Acid Res., 15:6643)に記載されている、mRNAの安定性を高めたりまたは維持したりすることが可能な、および翻訳の不適当な開始を妨げることが可能な、コンセンサス配列を含む。しかしながら、他のリーダー配列、例えばRTBVのリーダー配列は、mRNAの安定性を低下させるか、および/またはmRNAの翻訳を低下させることが推定される高度の二次構造を有する。したがって、(i)高度の二次構造を有しないリーダー配列、(ii)二次構造がmRNAの安定性を阻害しないか、および/または翻訳を低下させない高度の二次構造を有しないリーダー配列、または(iii)植物で強く発現される遺伝子に由来するリーダー配列、が最も望ましい。例えば、Vasil et al. (1989, Plant Physiol., 91:5175)に記載されているショ糖合成酵素のイントロン、例えばCallis et al.(1987, Genes Develop., II)に記載されているAdhのイントロンI、または例えばGallie et al. (1989, The Plant Cell,1:301)に記載されているTMVのオメガエレメントなどの調節エレメントを必要に応じて含めることもできる。本発明の実施に有用な他のこのような調節エレメントは、当業者に既知である。
【０１１９】
これらのエンハンサーエレメントは当業者に周知であり、およびATG開始コドンおよび隣接する配列を含む場合がある。開始コドンは、配列全体の翻訳を確実なものとするために、外来または内因性のDNA配列と関連するコード配列の読み枠と一致していなければならない。翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然と合成の両方の、さまざまな起源の場合があり得る。翻訳開始領域は、転写開始領域の供給源から、または外来もしくは内因性のDNA配列から提供される場合がある。配列は、転写を駆動するように選択されたプロモーターの供給源に由来する場合もあり、およびmRNAの翻訳を高めるために特異的に修飾される場合もある。
【０１２０】
加えて異種核酸配列は、細胞内の細胞内区画への、または細胞外環境へのコンストラクト系ポリヌクレオチドのタンパク質産物(例えば、別の異種の対象のヌクレオチド配列のマーカー配列産物または発現産物)を標的とするターゲッティング配列から選択可能である。例えば、輸送ペプチドまたはシグナルペプチドの配列をコードする核酸配列を、翻訳時に輸送ペプチドまたはシグナルペプチドがタンパク質をそれぞれ特定の細胞内または細胞外の目的地へ輸送可能なように、および続いて翻訳後に除去可能なように、所望のタンパク質をコードする配列に機能的に連結することができる。シグナルペプチドがタンパク質を細胞外の膜を通過するよう誘導する一方で、輸送ペプチドまたはシグナルペプチドは、細胞内の膜、例えば周辺質、空胞、小胞、色素体、およびミトコンドリア膜を介したタンパク質の輸送を促進することで作用する。例えば輸送ペプチドまたはシグナルペプチドは、所望のタンパク質を、細胞質ではなく色素体(例えば、葉緑体)などの特定の細胞小器官へ誘導可能である。したがって本発明のコンストラクトは、プロモーターとコンストラクト系ポリヌクレオチドの間に機能的に連結された核酸配列をコードする色素体輸送ペプチドをさらに含む場合がある。例えば、Heijne et al.(1989, Eur. J. Biochem., 180:535)、およびKeegstra et al.(1989, Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40:471)を参照することができる。
【０１２１】
本発明のコンストラクトは、限定的な場合があるか、またはプラスミドなどのベクター中に導入可能であり得る。プラスミドベクターは、原核細胞および真核細胞における発現カセットの容易な選択、増幅、および形質転換を提供する追加的な核酸配列を含み、この非制限的な例は、pUC由来のベクター、pSK由来のベクター、pGEM由来のベクター、pSP由来のベクター、またはpBS由来のベクターを含む。追加的な核酸配列は、ベクターの自律的な複製を提供する複製起点、選択可能なマーカー遺伝子、望ましくは抗生物質耐性もしくは除草剤耐性をコードするマーカー遺伝子、多数の部位への核酸配列の挿入を提供する固有のマルチクローニングサイト、またはキメラコンストラクトにコードされた遺伝子、ならびに原核細胞および真核細胞の形質転換を促進する配列を含む。
【０１２２】
自律的な複製のためには、ベクターは、対象の宿主細胞におけるベクターの自律的な複製を可能とする複製起点をさらに含む場合がある。細菌の複製起点の非制限的な例は、大腸菌における複製を可能とするプラスミドpBR322、pUC19、pACYC177、およびpACYC184、ならびにバチルス(Bacillus)における複製を可能とするpUB110、pE194、pTA1060、およびpAMβ1の複製起点を含む。複製起点は、その機能をバチルス細胞において温度感受性とする変異を有する起点の場合がある(例えば、Ehrlich, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75:1433を参照)。
【０１２３】
特定の態様では、対象のコンストラクトはターゲッティングコンストラクトである。例えばターゲッティングコンストラクトは、マーカー配列、通常は選択可能なマーカーの遺伝子が、ターゲッティングカセットと標的部位間の相同組換えを可能とする、細胞ゲノム中の標的部位の領域と十分に相同な、ターゲッティングカセットの2つの隣接部分間に機能的に配置されるように配列され得る。例えば標的部位は、内因性の遺伝子(例えば、エキソン配列もしくはコード配列、または機能性RNAをコードする配列を含むもの)を含む場合があり、およびある態様では、マーカー配列は、内因性遺伝子の少なくとも一部分を破壊または置換することで、内因性遺伝子を不活性に、引いては非機能性とするように、ターゲッティングカセットの隣接部分の近傍に配置される。これらの態様では、隣接部分の1つは、内因性遺伝子の5'非翻訳配列の少なくとも一部分と実質的に相同な場合があり、および他の部分は、内因性遺伝子の3'非翻訳配列の少なくとも一部分に実質的に相同な場合がある。一般に、このような非条件的なノックアウトアプローチは、短い遺伝子を標的とする際に使用される。ターゲッティングコンストラクトと標的部位間における部位特異的な相同組換えは、実質的に、内因性遺伝子の少なくとも一部分とマーカー遺伝子の置換を生じる。このような場合、ターゲッティングコンストラクトは、内因性遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子の、部分的もしくは完全な機能の喪失を有するノックアウト生物を作製するために使用される。
【０１２４】
他の態様では、ターゲッティングカセットはさらに、カセットの隣接部分間に外来または外因性の対象のヌクレオチド配列(例えば、外来遺伝子もしくは調節エレメント、またはこの一部分)を含む。例えば、対象のヌクレオチド配列は、内因性遺伝子の少なくとも一部分を対象のヌクレオチド配列と置換して改変型もしくは修飾型の内因性遺伝子を作るために、または内因性遺伝子を対象のヌクレオチド配列と置換するか、または内因性遺伝子と機能的に連結された新たな調節エレメントを導入するために、ターゲッティングカセットの隣接部分の近傍に配置される。他の例では、対象のヌクレオチド配列は、エキソンすなわちコード配列、イントロン、エキソンの非翻訳領域、またはプロモーターなどの調節エレメント領域などの遺伝子配列を含まないゲノム領域(例えば、遺伝子間配列)を置換するようにターゲッティングカセットの隣接部分の近傍に配置される。このシナリオでは、細胞は、そのような特定の座位を不活性化することなく、座位における部位特異的な相同組換えを起こすものを選択できる。他の例では、対象のヌクレオチド配列は、導入が調節配列、エキソン配列すなわちコード配列を破壊しないように、ゲノムのイントロンすなわち非コード領域の内部に導入するために、ターゲッティングカセットの隣接部分の近傍に配置される。このような例では、隣接部分の1つは、内因性遺伝子のエクソンおよびイントロンの一部分と実質的に相同な場合があり、ならびに他の隣接部分は、イントロンの一部分および下流のエクソンと実質的に相同である。ターゲッティングコンストラクトと細胞の内因性のゲノム標的配列間の部位特異的な相同組換えは、イントロンの内部に対象のヌクレオチド配列を配置させるので、重要なエキソンコード配列を破壊しない。このシナリオの要件は、対象のヌクレオチド配列が、ターゲッティングカセットの内部に存在する調節エレメントの制御下に存在しなければならないことである。さらに他の例では、対象のヌクレオチド配列は、ターゲッティングカセット中の上流のプロモーターを欠き、かつ内因性の細胞調節エレメントの下流のゲノム領域中への挿入のためにターゲッティングカセットの隣接部分の近傍に配置される。これらの例では、隣接部分の1つは、プロモーターおよび5'非翻訳領域の一部分と実質的に相同な場合があり、および他の部分は、イントロンおよび下流のエクソンと実質的に相同な場合がある。このシナリオでは、ターゲッティングコンストラクトは、ターゲッティングコンストラクトによって標的とされる特定の遺伝子に対して内因性の調節エレメントの制御下で、対象のヌクレオチド配列の転写を駆動するように設計される。ターゲッティングコンストラクトと標的部位間における相同組換えは、対象のヌクレオチド配列の転写を後に駆動する標的化遺伝子に特異的な調節エレメントを提供する。対象のヌクレオチド配列は、部位特異的な相同組換えが生じることにより、これらの配列の転写を駆動するのに十分な内因性の細胞調節エレメントが提供されない限りは、多くの場合、転写されない。加えてターゲッティングコンストラクトが、(例えば、有効な遺伝子量を高めるために)同じ場合があるか、または相補的な作用を達成させるために異なる��合のある、複数の対象のヌクレオチド配列または導入遺伝子を発現するように改変可能なことは当業者には容易に明らかになる。個々の導入遺伝子は、(例えば、内部リボソームエントリー部位(IRES)エレメント使用することで)同じプロモーターの制御下にある場合があるほか、異なるプロモーターの制御下にある場合がある。IRESエレメントは、読み枠の効率的な翻訳の開始配列として機能する。特にIRESは、1つの転写物上の2つの異なる遺伝子の翻訳を可能とし、および均一に高レベルで導入遺伝子を発現する細胞の選択を大きく促進する。IRESエレメントは当技術分野で既知であり、その説明目的の例は、ポリオウイルスI型由来のIRESエレメント、脳心筋炎ウイルス(EMV)の5'UTR、「タイラーマウス脳脊髄炎ウイルス」(TMEV)の5'UTR、「口蹄疫ウイルス」(FMDV)の5'UTR、「ウシエンテロウイルス」(BEV)の5'UTR、「コクサッキーB型ウイルス」(CBV)の5'UTR、または「ヒトライノウイルス」(HRV)の5'UTR、または「ヒト免疫グロブリン重鎖結合タンパク質」(BIP)の5'UTR、ショウジョウバエのアンテナペディア(antennapediae)の5'UTR、またはショウジョウバエのウルトラバイソラックス(ultrabithorax)の5'UTR、または上記配列に由来する遺伝子ハイブリッドもしくは断片を含む。これについては例えば、Kim et al., 1992, Molecular and Cellular Biology 12(8): 3636-3643；McBratney et al., 1993, Current Opinion in Cell Biology 5: 961-965；Oh and Sarnow, 1993, Current Opinion in Genetics and Development 3: 295-300；およびRamesh et al., 1996, Nucleic Acids Research 24:2697-2700を参照されたい。上記の場合、ターゲッティングコンストラクトは、生物体のゲノムに少なくとも1コピーの対象のヌクレオチド配列を含むトランスジェニック生物またはノックイン生物の作製に適している。
【０１２５】
対象キメラコンストラクトの作製には、さまざまな宿主細胞が想定され、および原核生物の宿主および真核生物の宿主が含まれる。ある態様では、宿主細胞型は部位特異的な相同組換えを起こすことが可能である。代表的な原核生物宿主は細菌を含むが、これに限定されない。真核生物宿主の説明目的の例は、酵母などの真菌、ならびにアスペルギルス(Aspergillus)、トリコデルマ(Trichoderma)、およびアカパンカビ(Neurospora)の種を含む糸状菌；説明目的の例が魚類(例えば、サケ、マス、テュラピア(tulapia)、マグロ、コイ、ヒラメ、オヒョウ、メカジキ、タラ、およびゼブラフィッシュ)、鳥類(例えば、ニワトリ、アヒル、ウズラ、キジ、およびシチメンチョウ、ならびに他の野鶏または狩猟鳥)、ならびに哺乳動物(例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、水牛、シカ、ヒツジ、ウサギ、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモットなどの齧歯類、ヤギ、ブタ、霊長類、イルカおよびクジラを含む海生哺乳動物、を含む脊椎動物を含む動物宿主、ならびに任意の組織もしくは幹細胞型のヒトまたは他の哺乳動物の細胞株(例えば、COS、NIH 3T3 CHO、BHK、293、またはHeLa細胞)などの細胞株、ならびに多能性および非多能性および胚性幹細胞、ならびに非ヒト接合子）、ならびに説明目的の例が線虫(代表的な属は、鈎虫(Ancylostoma)、鶏回虫属(Ascaridia)、回虫(Ascaris)、ブノストムム(Bunostomum)、線虫(Caenorhabditis)、毛細線虫(Capillaria)、大口腸線虫(Chabertia)、クーペリア(Cooperia)、肺虫(Dictyocaulus)、ハエルノンチョス(Haernonchus)、ヘテラキス(Heterakis)、ネマトディルス(Nematodirus)、エソファゴストーマム(Oesophagostomum)、オステルタジア(Ostertagia)、オキシウリス(Oxyuris)、ウマカイチュウ(Parascaris)、エンチュウ(Strongylus)、トキサスカリス(Toxascaris)、鞭虫(Trichuris)、毛様線虫(Trichostrongylus)、トフリチョネマ(Tflichonema)、回虫(Toxocara)、ウンシナリア(Uncinaria)などの動物に感染する属、ならびにブルサファレンクス(Bursaphalenchus)、クリコネリエラ(Criconerriella)、ジイレンクス(Diiylenchus)、ジチレンクス(Ditylenchus)、シストセンチュウ(Globodera)、ヘリコティレンクス(Helicotylenchus)、ヘテロデラ(Heterodera)、ロンギドルス(Longidorus)、メロドイジン(Melodoigyne)、ナコッブス(Nacobbus)、パラティレンクス(Paratylenchus)、ネグサレセンチュウ(Pratylenchus)、ラドフォルス(Radopholus)、ロテリンクス(Rotelynchus)、チレンクス(Tylenchus)、およびチフィネルラ(Xiphinerna)などがあるが、これらに限定されない植物に感染する属を含む)、および他の線虫、ショウジョウバエ、ならびに他の昆虫(ミツバチ科(Apidae)、ゾウムシ科(Curculionidae)、コガネムシ科(Scarabaeidae)、ミバエ科(Tephritidae)、ハマキガ科(Tortricidae)、特に代表的な目がコウチュウ目(Coleoptera)、ハエ目(Diptera)、チョウ目(Lepidoptera)、およびヨコバイ亜目(Homoptera)を含むものに由来するもの、を含む無脊椎動物を含むが、これらに限定されない。
【０１２６】
ある態様では、宿主は、単子葉植物、双子葉植物、および裸子植物から適切に選択される植物である。植物は鑑賞植物または作物植物の場合がある。鑑賞植物の説明目的の例は、リンゴ属(Malus spp.)、サンザシ属(Crataegus spp.)、バラ属(Rosa spp.)、カバノキ属(Betula spp.)、ナナカマド属(Sorbus spp.)、オリーブ属(Olea spp.)、キョウチクトウ属(Nerium spp.)、ヤナギ属(Salix spp.)、ポプラ属(Populus spp.)を含むがこれらに限定されない。作物植物の説明目的の例は、アベルモスカス・エスクレントゥス(Abelmoschus esculentus)(オクラ)、アカシア属(Acacia spp.)(アカシア)、アガベ・フォウルクロイデス(Agave fourcroydes)(ヘネケン)、アガベ・サイザラナ(Agave sisalana)(サイザル)、ネムノキ属(Albizia spp.)、アリウム・フィスチュロスム(Allium fistulosum)(ネギ(bunching onion))、アリウム・サティバム(Allium sativum)(ニンニク)、アリウム属(Allium spp.)(タマネギ)、アルピニア・ガランガ(Alpinia galanga)(ナンキョウソウ)、ヒモゲイトウ(Amaranthus caudatus)、アマランサス属(Amaranthus spp.)、アンカルジウム属(Anacardium spp.)(カシュー)、アナナス・コモスス(Ananas comosus)(パイナップル)、アネスム・グラベオレンス(Anethum graveolens)(ディル)、アノナ・チェリモラ(Annona cherimola)(チェリモヤ)、アピオス・アメリカーナ(Apios americana)(アメリカホドイモ)、アラキス・ヒポゲア(Arachis hypogaea)(ピーナッツ)、アークチウム属(Arctium spp.)(ゴボウ)、アルテミシア属(Artemisia spp.)(ヨモギ)、アスパラサス・リネアリス(Aspalathus linearis)(レッドブッシュティー)、アセルトニア・ディベルシフォリア(Athertonia diversifolia)、アトリプレックス・ヌムラリア(Atriplex nummularia)(オールドマン・ソルトブッシュ)、アヴェロア・カランボラ(Averrhoa carambola)(スターフルーツ)、アザディラクタ・インディカ(Azadirachta indica)(ニーム)、バックホーシア属(Backhousia spp.)、バンブザ属(Bambusa spp.)(タケ)、ベータ・ブルガリス(Beta vulgaris)(テンサイ)、ボエメリア・ニベア(Boehmeria nivea)(カラムシ)、ボクチョイ(bok choy)、ボロニア・メガスティグマ(Boronia megastigma)(スイートボロニア)、ブラシカ・カリナータ(Brassica carinata)(アビニニアガラシ)、ブラシカ・ユンセア(Brassica juncea)(セイヨウカラシナ)、ブラシカ・ナプス(Brassica napus)(アブラナ)、ブラシカ・オレラセア(Brassica oleracea)(キャベツ、ブロッコリー)、ブラシカ・オレラセア(Brassica oleracea var Albogabra)(gai lum)、ブラシカ・パラキネンシス(Brassica parachinensis)(ツケナ(choi sum))、ブラシカ・ペケンシス(Brassica pekensis)(ワンボクもしくは白菜)、アブラナ属(Brassica spp.)、ブルセラ・オヴォヴァタ(Burcella obovata)、カジャヌス・カジャン(Cajanus cajan)(キマメ)、カメリア・シネンシス(Camellia sinensis)(チャ)、カンナビス・サティバ(Cannabis sativa)(非薬剤用大麻)、トウガラシ属(Capsicum spp.)、カリカ属(Carica spp.)(パパイヤ)、カルサマス・チンクトリウス(Carthamus tinctorius)(ベニバナ)、カルム・カルヴィ(Carum carvi)(キャラウェイ)、カッシニア属(Cassinia spp.)、カスタノスペルマム・アウストラーレ(Castanospermum australe)(ブラックビーン)、カンニンガムモクマオウ(Casuarina cunninghamiana)(ビーフウッド)、セラトニア・シリクア(Ceratonia siliqua)(イナゴマメ)、カマエメルム・ノビレ(Chamaemelum nobile)(カモミル)、カメラウシウム属(Chamelaucium spp.)(ジェラルトン・ワックス)、ケノポジューム・キノア(Chenopodium quinoa)(キノア)、キク(タナセタム)、ジョチュウギク(Tanacetum)、 シネ���リフォリウム(cinerariifolium)(ピレスラム)、キケル・アリエティナム(Cicer arietinum)(ヒヨコマメ)、キコリウム・インティブス(Cichorium intybus)(チコリー)、クレマチス属(Clematis spp.)、クリアンサス・フォルモスス(Clianthus formosus)(スターツ・デザート・ピー)、ココス・ヌシフェラ(Cocos nucifera)(ココナツ)、コフェア属(Coffea spp.)(コーヒー)、コロカシア・エスクレンタ(Colocasia esculenta)(タロイモ)、コリアンドラム・サティヴァム(Coriandrum sativum)(コリアンダー)、クランベ・アビシニカ(Crambe abyssinica)(クランベ)、クロッカス・サティウス(Crocus sativus)(サフラン)、ククルビタ・フォエチディッシマ(Cucurbita foetidissima)(バッファロー・ゴーアド)、ククルビタ属(Cucurbita spp.)(ヘチマ)、キアモプシス・テトラゴノロバ(Cyamopsis tetragonoloba)(グアール)、キンボポゴン属(Cymbopogon spp.)(レモングラス)、シチスス・プロリフェルス(Cytisus proliferus)(タガサステ)、ダウクス・カロタ(Daucus carota)(ニンジン)、ヒメギンネム属(Desmanthus spp.)、ディオスコレア・エスクレンタ(Dioscorea esculenta)(アジア産ヤム)、ディオスコレア属(Dioscorea spp.)(ヤムイモ)、カキノキ属(Diospyros spp.)(カキ)、ドロニクム属(Doronicum sp.)、エキナセア属(Echinacea spp.)、エレオカリス・ドゥルシス(Eleocharis dulcis)(クワイ)、エレウシネ・コラカナ(Eleusine coracana)(シコクビエ)、エマンサス・アルンジナセウス(Emanthus arundinaceus)、エラグロスティス・テフ(Eragrostis tef)(テフ)、エリアンサス・アルンジナセウス(Erianthus arundinaceus)、エリオボトリア・ヤポニカ(Eriobotrya japonica)(ビワ)、ユーカリ属(Eucalyptus spp.)、ユーカリ属(Eucalyptus spp.)（ギルマリー(gil mallee)）、ユークレア属(Euclea spp.)、ユージニア・マラセンシス(Eugenia malaccensis)(jumba)、トウダイグサ属(Euphorbia spp.)、ユーフォリア・ロンガーナ(Euphoria longana)(ロンガン)、エウトレマ・ワサビ(Eutrema wasabi)(ワサビ)、ファゴピルム・エスクレンタム(Fagopyrum esculentum)(ソバ(buckwheat))、フェストゥカ・アルンジナセア(Festuca arundinacea)(ヒロハノウシノケグサ)、フィカス属(Ficus spp.)(イチジク)、フラコウルティア・イネルミス(Flacourtia inermis)、フリンデルシア・グレイリアナ(Flindersia grayliana)(クイーンズランドメープル)、フォエニクルム・オレアリア(Foeniculum olearia)、フォエニクルム・ウルガレ(Foeniculum vulgare)(ウイキョウ)、ガルシニア・マンゴスタナ(Garcinia mangostana)(マンゴスチン)、グリシン・ラティフォリア(Glycine latifolia)、グリシン・マックス(Glycine max)(ダイズ)、グリシン・マックス(野菜ダイズ)、グリシリザ・グラブラ(Glycyrrhiza glabra)(カンゾウ)、ゴシピウム属(Gossypium spp.)(ワタ)、グレビレア属(Grevillea spp.)、グリンデリア属(Grindelia spp.)、キバナタカサブロウ(Guizotia abyssinica)(ニガー)、ハーパゴフィラム属(Harpagophyllum sp.)、ヘリアンサス・アンヌス(Helianthus annuus)(ハイオレイックヒマワリ)、ヘリアンサス・アンヌス(monosun sunflower)、キクイモ(Helianthus tuberosus)(エルサレムアーティチョーク)、ハイビスカス・カンナビヌス(Hibiscus cannabinus)(ケナフ)、ホルデウム・(Hordeum bulbosum)、オオムギ属(Hordeum spp.)(モチオオムギ)、ホルデウム・ウルガレ(Hordeum vulgare)(オオムギ)、野生オオムギ(Hordeum vulgare subsp. spontaneum)、フルムス・ルプルス(Humulus lupulus)(ホップ)、ヒドラスチス・カチデンシス(Hydrastis canadensis)(ゴールデンシール)、ヒメナクネ属(Hymenachne spp.)、ヒソップス・オフィシナリス(Hyssopus officinalis)(ヒソップ)、コマ���ナギ属(Indigofera spp.)、インガ・エドゥリス(Inga edulis)(アイスクリームビーン)、イノカルプス・ツジテール(Inocarpus tugiter)、イポメア・バタタス(Ipomoea batatas)(サツマイモ)、イポメア属(Ipomoea sp.)(カンコン)、ラブラブ・プルプレウス(Lablab purpureus)(white lablab)、ラクツカ属(Lactuca spp.)(レタス)、ラティルス属(Lathyrus spp.)(ベッチ)、ラバンドゥラ属(Lavandula spp.)(ラベンダー)、レンス属(Lens spp.)(レンズマメ)、レスクエレラ属(Lesquerella spp.)(bladderpod)、レウカエナ属(Leucaena spp.)、ユリ属(Lilium spp.)、リムナンテス属(Limnanthes spp.)(メドウフォーム)、リナム・ウシタチシマム(Linum usitatissimum)(アマ)、リナム・ウシタチシマム(リンシード)、リナム・ウシタチシマム(Linola.TM.)、リッチ・チネンシス(Litchi chinensis)(レイチ)、ロータス・コルニクラツス(Lotus corniculatus)(セイヨウミヤコグサ)、ロータス・ペドゥンクラツス(Lotus pedunculatus)、ミヤコグサ属(Lotus sp.)、ルッファ属(Luffa spp.)、ルナリア・アヌア(Lunaria annua)(ゴウダソウ(honesty))、ルピナス・ムタビリス(Lupinus mutabilis)(pearl lupin)、ルピナス属(Lupinus spp.)(ルピナス)、マカデミア属(Macadamia spp.)、マンギフェラ・インディカ(Mangifera indica)(マンゴー)、マニホット・エスクレンタ(Manihot esculenta)(キャッサバ)、メディカゴ属(Medicago spp.)(ルーサン)、メディカゴ属(Medicago spp.)、メラレウカ属(Melaleuca spp.)(ティートリー)、メラレウカ・ウンシナータ(Melaleuca uncinata)(ブルームブッシュ)、メンサ・タスマニア(Mentha tasmannia)、メンサ・スピカータ(Mentha spicata)(ハッカ)、メンサ・X・ピペリータ(Mentha X piperita)(ペパーミント)、モモルディカ・カランティア(Momordica charantia)(ニガウリ)、ムサ属(Musa spp.)(バナナ)、ミルシアリア・カウリフローラ(Myrciaria cauliflora)(ジャボチカバ)、ミロタムヌス・フラベリフォリア(Myrothamnus flabellifolia)、ネフェリウム・ラッパセウム(Nephelium lappaceum)(ランブータン)、ネリネ属(Nerine spp.)、オキムム・バシリクム(Ocimum basilicum)(バジル)、オエナンテ・ジャバニカ(Oenanthe javanica)(セリ)、オエノセラ・ビエニス(Oenothera biennis)(ツキミソウ)、オレア・エウロパエア(Olea europaea)(オリーブ)、オレアリア属(Olearia sp.)、オリガヌム属(Origanum spp.)(マジョラム、オレガノ)、オリザ属(Oryza spp.)(イネ)、オキサリス・チューバロサ(Oxalis tuberosa)(オカ)、オゾタムヌス属(Ozothamnus spp.)(ライスフラワー)、パキルリズス・アヒパ(Pachyrrhizus ahipa)(クズイモ)、パナクス属(Panax spp.)(チョウセンニンジン)、パニカム・ミリアセウム(Panicum miliaceum)(キビ)、パパベル属(Papaver spp.)(ケシ)、パルテニウム・アルジェンタトゥム(Parthenium argentatum)(グアユール)、パシフローラ属(Passiflora sp.)、パウロウニア・トメントーサ(Paulownia tomemtosa)(キリ)、ペラルゴニウム・グラベオレンス(Pelargonium graveolens)(ローズ・ゼラニウム)、ペラルゴニウム属(Pelargonium sp.)、ペニセツム・アメリカヌム(Pennisetum americanum)(バルラッシュもしくはパールミレット)、ペルスーニア属(Persoonia spp.)、ペトロセリヌム・クリスプム(Petroselinum crispum)(パセリ)、ファセリア・タナセチフォリア(Phacelia tanacetifolia)(ヨモギ)、ファラリス・カナデンシス(Phalaris canariensis)(カナリークサヨシ)、ファラリス属(Phalaris sp.)、ファセオルス・コキネウス(Phaseolus coccineus)(ベニバナインゲン)、ファセオルス・ルナツス(Phaseolus lunatus)(リママメ)、インゲンマメ属(Phaseolus spp.)、ファセオルス・ヴルガリス(Phaseolus vulgaris)(culinary bean)���ファセオルス・ヴルガリス(ネイビービーン)、ファセオルス・ヴルガリス(red kidney bean)、エンドウ(Pisum sativum)(サヤエンドウ)、プランタゴ・オバタ(Plantago ovata)(オオバコ)、ポリゴヌム・ミヌス(Polygonum minus)、ポリゴヌム・オドラツム(Polygonum odoratum)、プルヌス・ムメ(Prunus mume)(ウメ)、シジュウム・グアジャバ(Psidium guajava)(グアバ)、ソフォカルプス・テトラゴノロブス(Psophocarpus tetragonolobus)(シカクマメ)、ピルス属(Pyrus spp.)(ナシ)、ラファヌス・サツルス(Raphanus satulus)(ダイコン(long white radish))、ラゴディア属(Rhagodia spp.)(ソルトブッシュ)、リベス・ニグルム(Ribes nigrum)(クロフサスグリ)、リシヌス・コムニス(Ricinus communis)(トウゴマ)、ロスマリヌス・オフィシナリス(Rosmarinus officinalis)(ローズマリー)、ルンジア・クロシイ(Rungia klossii)(ルンジア)、サ
ッカルム・オフィシナラム(Saccharum officinarum)(サトウキビ)、サルビア・オフィシナリス(Salvia officinalis)(セージ)、サルビア・スクラレア(Salvia sclarea)(クラリセージ)、サルビア属(Salvia sp.)、サンダーソニア属(Sandersonia sp.)、サンタラム・アクミナトウム(Santalum acuminatum)(スイート・クァンドン(sweet quandong))、サンタルム属(Santalum spp.)(サンダルウッド)、スクレロカリア・カフラ(Sclerocarya caffra)(マルラ)、クテラリア・ガレリクラタ(Scutellaria galericulata)(スカルキャップ)、セカレ・セレアレ(Secale cereale)(ライムギ)、セサムム・インディクム(Sesamum indicum)(ゴマ)、セタリア・イタリカ(Setaria italica)(アワ)、シモンドシア属(Simmondsia spp.)(ホホバ)、ソラヌム属(Solanum spp.)、ソルガム・アルムム(Sorghum almum)(ソルガム)、スタキス・ベトニカ(Stachys betonica)(カッコウチョロギ)、ステナンテマム・スコルテチェニイ(Stenanthemum scortechenii)、ストリクノス・コッキュロイデス(Strychnos cocculoides)(モンキーオレンジ)、スタイロサンテス属(Stylosanthes spp.)(スタイロ)、フトモモ属(Syzygium spp.)、タスマニア・ランセオラータ(Tasmannia lanceolata)(マウンテンペッパー)、テルミナリア・カルンバチイ(Terminalia karnbachii)、テオブロマ・カカオ(Theobroma cacao)(カカオ)、タイムス・ブルガリス(Thymus vulgaris)(タイム)、トーナ・アウストラリス(Toona australis)(レッドシダー)、トリフォリウム属(Trifoliium spp.)(クローバー)、トリフォリウム・アレクサンドリヌム(Trifolium alexandrinum)(ベルシームクローバー)、トリフォリウム・レスピナツム(Trifolium resupinatum)(persian clover)、コムギ属(Triticum spp.)、トリティカム・タウスキイ(Triticum tauschii)、チロセマ・エスクレンタム(Tylosema esculentum)(morama bean)、バレリアナ属(Valeriana sp.)(カノコソウ)、ベルノニア属(Vernonia spp.)、ベティベール・ジザニオイデス(Vetiver zizanioides)(ベチバーグラス)、ビシア・ベンガレンシス(Vicia benghalensis)(パープルベッチ)、ビシア・ファバ(Vicia faba)(ソラマメ)、ビシア・ナルボネンシス(Vicia narbonensis)(narbon bean)、ビシア・サティバ(Vicia sativa)、ビシア属(Vicia spp.)、ビグナ・アコニチフォリア(Vigna aconitifolia)(モスビーン)、ビグナ・アンギュラリス(Vigna angularis)(アズキ)、ケツルアズキ(Vigna mungo)(ブラックグラム)、ビグナ・ラジアタ(Vigna radiata)(リョクトウ)、ササゲ属(Vigna spp.)、ビグナ・ウンギクラタ(Vigna unguiculata)(ササゲ)、ブドウ属(Vitis spp.)(ブドウ)、ボアンドザイア・サブテラニア(Voandzeia subterranea)(バンバラマメ)、トリチコセカレ(Triticosecale)(ライコムギ)、トウモロコシ(Zea mays)(bicolour sweetcorn)、トウモロコシ(メイズ)、トウモロコシ(スイートコーン)、トウモロコシ(Zea mays subsp. mexicana)(テオシンテ)、ジエリア属(Zieria spp.)、ジンジバー・オフィシナーレ(Zingiber officinale)(ショウガ)、ジザニア属(Zizania spp.)(ワイルドライス)、ジジフス・ジュジュバ(Ziziphus jujuba)(ナツメ)などがあるが、これらに限定されない収穫可能な産物を作る目的で栽培される植物種を含む。本発明を実施する上で望ましい作物は、ニコチアナ・タバカム(Nicotiana tabacum)(タバコ)、ならびに例えば、アナナス・コモサス(Ananas comosus)(パイナップル)、サッカラム属(Saccharum spp)(サトウキビ)、ムサ属(Musa spp.)(バナナ)、リコペルシコン・エスクレンタム(Lycopersicon esculentum)(トマト)、およびソラナム・チュバロサム(Solanum tuberosum)(ジャガイモ)などの園芸作物を含む。
【０１２７】
有利なことには、1つのレシピエントコンストラクトから別のレシピエントコンストラクトへ異種核酸配列を移す際に使用される移動可能なマーカー配列は、少なくとも2つの異なる宿主細胞型に同定可能な特徴を付与する。例えば、ある態様では、さまざまなクローニング段階を、細菌宿主細胞において、および他のクローニング段階を哺乳動物宿主細胞において実施できる。このような場合には、細菌と哺乳動物の宿主細胞型の両方に同定可能な特徴を付与するために単一のマーカー配列を使用することが望ましい。このようなマーカー配列の説明目的の例は、カナマイシン/ネオマイシン耐性遺伝子などがあるが、これらに限定されない選択可能なマーカー遺伝子、ならびに説明目的の例がGFPおよびルシフェラーゼを含むスクリーニング可能なマーカー遺伝子を含む。
【０１２８】
本発明のコンストラクトは、核酸、例えば発現ベクターの、レシピエント細胞への、核酸を介した遺伝子輸送による導入手段として当技術分野で認識されている「形質導入」および「トランスフェクション」を含む任意の適切な手法で宿主に導入される。しかしながら「形質転換」は、外因性DNAもしくはRNAの細胞による取り込みの結果として宿主の遺伝子型が変化する過程を意味し、および例えば、形質転換細胞は本発明の発現系を含む。ターゲッティングコンストラクトを細胞内に導入する多くの方法が存在する。典型的には、使用される方法は、宿主細胞の選択に依存する。ターゲッティングコンストラクトを宿主細胞内に導入する手法は当業者に周知である。核酸分子を細胞内に輸送する方法の4つの一般的な分類を以下に挙げる：(1)リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレングリコール(PEG)による沈殿、およびリポフェクションなどの化学的な方法；(2)マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、加速法、および真空浸透などの物理的な方法；(3)細菌ベクターおよびウイルスベクターによる形質転換などのベクターベースの方法；ならびに(4)受容体介在法。これらの分類および他の分類に含まれる形質転換法は当業者に周知であり、および新しい手法は継続して知られつつある。形質転換の手法の個別の選択は、その宿主種の形質転換効率、ならびに本発明を、選択される特定の方法で実施する者の経験および好みによって決定される。細胞内にターゲッティングコンストラクトを導入するための形質転換系の個別の選択は、許容可能なレベルの核酸輸送が達成されるのであれば、本発明に本質的ではないか、または本発明を制限しないことは当業者には明らかであろう。
【０１２９】
したがって本発明のコンストラクトは、ウイルス感染、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、または小胞の融合を含む任意の数の経路で組織内または宿主細胞内に導入される。ジェット注射を(例えば、Furth et al., Anal Biochem 205:365-368 (1992)に記載された手順で)筋肉内投与に使用することもできる。コンストラクトで微小発射体をコーティングし、および宿主細胞内または組織内に、微粒子銃装置すなわち「遺伝子銃」によって輸送することができる(例えば、Tang et al., Nature 356:152-154 (1992)を参照)。あるいはコンストラクトを、宿主生物に直接取り込ませるか、または宿主生物中に注入することが可能なほか、細胞の内部に(すなわち細胞内に)導入したり、生物体の空隙、間質腔に、循環中に細胞外に導入したり、経口的に導入したりすることができる。経口導入法は、ターゲッティングコンストラクトと生物体の食料の直接的な混合を含む。ある態様では、水力学的な核酸導入プロトコルが用いられる(例えば、Chang et al., 2001, J. Virol. 75:3469-3473；Liu et al., 1999, Gene Ther. 6:1258-1266；Wolff et al., 1990, Science 247:1465-1468；Zhang et al., 1999, Hum. Gene Ther. 10:1735-1737；およびZhang et al., 1999, Gene Ther. 7:1344-1349を参照)。
【０１３０】
本発明のある態様は、本発明のコンストラクトを植物細胞内に導入する段階に関する。植物の改善のための形質転換系の実際の実施に際しての手引きは、例えば、Birch(1997, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Molec. Biol. 48:297-326)に記載されている。したがって、これらの態様では、形質転換、およびこれに続く、安定に形質転換された稔性を有する植物への再生に感受性のあるレシピエント植物細胞が使用される。例えば単子葉植物の形質転換の場合、未成熟の胚、成長点組織、配偶子組織、胚形成性懸濁培養物、または胚形成性カルス組織を、本発明の実施に有用なレシピエント細胞の供給源として使用できる。双子葉植物の形質転換の場合、器官培養物および組織培養物をレシピエント細胞の供給源として使用できる。したがって、双子葉植物の組織、例えば葉、種子、および根は、本発明の実施に有用なレシピエント細胞の供給源となる。培養された感受性のあるレシピエント細胞を固相支持体上で適切に成長させる。栄養は培地の状態で培養物に提供され、および培養の環境条件が制御される。再生可能な植物培養物の成長を支持する培地および環境条件は当技術分野で周知である。
【０１３１】
原理的には、形質転換に適した双子葉植物と単子葉植物のいずれもが、本発明のコンストラクトをレシピエント細胞に導入し、および本発明のコンストラクトを有する新しい植物体を成長させることで修飾され得る。説明目的の形質転換法は、アグロバクテリウムによる輸送、カリフラワーモザイクウイルス(CaMV)による輸送、エレクトロポレーション、微粒子銃、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿法、もしくはポリエチレングリコール沈殿法、花粉を介した輸送法、またはこれらの組み合わせを含む。これらのクラスおよび他のクラスに含まれる形質転換の手法は当業者に周知であり、ならびに形質転換の手法の個別の選択は、選択された宿主種の形質転換効率によって決定される。
【０１３２】
本発明は、本発明のコンストラクトが導入済みの宿主細胞も想定している。加えて、本明細書に記載された発明は、本発明のコンストラクトが導入済みの細胞に由来する遺伝子改変された植物および非ヒト動物を含む遺伝子改変生物を含む。
【０１３３】
本発明は、複数の核酸配列を連続的にクローニングするためのキットも想定している。いくつかの態様ではキットは、複製起点を欠くが、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なカセットを含むドナーマーカーコンストラクトを含む。ドナーマーカーコンストラクトは、ベクター上のいずれかの部位に、適合性の宿主細胞におけるドナーベクターの自律的な複製を可能とする複製起点を含む場合がある。ある有益な態様では、複製起点は例えば、その機能が無効となるかまたは損なわれ、宿主細胞における自律的な組換えが実質的に不能となるように、破壊されるかまたは弱めることによって、不活性化可能である。適切には、この機能の障害または機能の喪失は、制限エンドヌクレアーゼによる切断、または複製起点、もしくはその機能活性に影響を及ぼす同起点に隣接する配列の部位特異的な変異導入によって達成される。移動可能なカセットは、望ましくは、簡便な切り出し、およびこれに続く対象のレシピエントコンストラクト中への挿入のために、1つまたは複数の制限酵素部位に挟まれる。説明目的の例では、キットは、個々の移動可能なカセットを切り出すための制限酵素部位が、別のドナーマーカーベクターの対応する制限酵素部位とは少なくとも1つが異なる制限酵素部位をそれぞれが含む複数のドナーマーカーベクターを含む。このような例では個々のドナーマーカーベクターは、移動可能なカセットが挿入される特定のレシピエントコンストラクトの末端に一致させるために異なる種類の末端を有する移動可能なカセットを提供するように使用される。いくつかの態様では、個々のドナーマーカーベクターは、対象のレシピエントコンストラクト中への移動可能なセグメントのトポイソメラーゼ依存性挿入の基質として、移動可能なセグメントの少なくとも一方の末端にトポイソメラーゼ認識配列を含む。
【０１３４】
いくつかの態様では、キットはさらに、マーカー配列を欠くが、核酸配列が挿入可能でかつ移動可能なカセットが挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含む第1のレシピエントコンストラクトを含み、ここで前記核酸配列および前記移動可能なカセットが、第1のレシピエントコンストラクト上におけるそれらの対応クローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能な別のカセットが得られる。いくつかの例では、個々のクローニング部位は少なくとも1つの制限酵素部位を含み、別の例では、トポイソメラーゼによる結合の基質を含むか、または定める。典型的には、第1のレシピエントコンストラクトは、複製起点、および移動可能なカセットのマーカー配列によって付与される特徴とは異なる同定可能な特徴を付与する別のマーカー配列を含む。このタイプの説明目的の例では、他のマーカー配列は、選択可能なマーカー遺伝子(例えば、アンピシリン耐性遺伝子)、またはスクリーニング可能なマーカー遺伝子(例えば、EGFPなどの蛍光マーカー遺伝子、もしくはlacZなどの酵素的マーカー遺伝子)を含む。
【０１３５】
いくつかの態様ではキットはさらに、マーカー配列を欠くが、別の核酸配列が挿入可能で、かつ他のカセットが挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含む第3のレシピエントコンストラクトを含み、ここで他の核酸配列および他のカセットが、第2のレシピエントコンストラクト上におけるそれらの対応クローニング部位に挿入されると、別のレシピエントコンストラクト中に任意で移動可能な別のカセットが得られる。適切にはキットはさらに、マーカー配列を欠くが、別の核酸配列が挿入可能で、かつ別のカセットが挿入可能な少なくとも1つのクローニング部位を含む少なくとも1つの追加的なレシピエントコンストラクトを含み、ここで別の核酸配列および別のカセットが、追加的なレシピエントコンストラクト上におけるそれらの対応クローニング部位に挿入されると、レシピエントコンストラクト中に任意で移動可能な別のカセットが得られる。このタイプの説明目的の例ではキットは、少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、さらには少なくとも15、20、25、30、またはそれ以上の追加的なレシピエントコンストラクトを含む。
【０１３６】
コンストラクトがリコンビナーゼ認識配列を含むいくつかの態様では、キットはさらに、リコンビナーゼタンパク質が発現可能な核酸配列を含むコンストラクトを含む。
【０１３７】
いくつかの態様では、マーカー配列は、マーカー配列の、それが存在するコンストラクトからの切り出しを媒介するリコンビナーゼタンパク質によって認識されるリコンビナーゼ標的部位に挟まれる。適切には、標的部位はloxP部位およびFRT部位から選択される。
【０１３８】
いくつかの態様ではキットは、複製起点を欠くが、マーカー配列を含む宿主細胞に同定可能な特徴を付与するマーカー配列を含む移動可能なセグメントを含む少なくとも1つのドナーマーカーコンストラクトを含み、ここで移動可能なカセットが複数の異なる切り出し用薬剤を使用して切り出し可能であるか、またはさらには移動可能なカセットが、少なくとも1つの他の切り出し用薬剤を使用して切り出されると、少なくとも1つの他の切り出し用薬剤を使用した切り出し時にとは異なる末端を有する。適切には、移動可能なカセットは個々の側が、複数の異なる認識部位(例えば、少なくとも2つ、3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、9つ、10つ、またはそれ以上の箇所)で挟まれる。このタイプの説明目的の例では個々の認識部位は、異なるエンドヌクレアーゼによって切断可能であり、かつしたがって、例えば、複数の異なるエンドヌクレアーゼ切断部位(例えば、マルチクローニングサイトを構成する切断部位)を含む。代替的または追加的に、移動可能なカセットは、それぞれの側が、それぞれが異なるリコンビナーゼタンパク質によって認識される複数のリコンビナーゼ標的部位で挟まれる。これらの態様では、個々のドナーマーカーコンストラクトは、対象のレシピエントコンストラクトのクローニング部位に適合する末端を有する移動可能なカセットを提供するように切り出し用薬剤の選択を提供する。
【０１３９】
一般にキットはさらに、説明目的の例が実施例14に記載されている、本発明の方法の段階の実施に関する指示書を含む。このようなキットは、本発明の方法における、制限エンドヌクレアーゼおよびその使用、ならびにDNAリガーゼ、エビアルカリホスファターゼ(SAP)、トポイソメラーゼ、およびDNAポリメラーゼなどの他の酵素の使用に適した反応緩衝液を含む場合もある。説明目的の例ではキットはさらに、相同組換えを実施するための、キットの内容物の使用に関するプロトコルを含む場合がある。さらにキットは、コンピテント細菌宿主細胞、例えば大腸菌細胞、または特定の真核細胞もしくは細胞株を含む場合がある。
【０１４０】
本発明が容易に理解され、および実際的な効果を示すことを可能とするために、特定の好ましい態様について以下の非制限的な例を用いて説明する。
【０１４１】
実施例
実施例1
Pelle クローニング系
「Pelle」クローニング系は、既に広く説明したクローニング系の1つの態様である。図1に示すPelleカセットは、細菌のEM7プロモーター(EM7)および哺乳動物のPGKプロモーター(PGK)の下流に位置し、かつNeo転写物の適切な終結およびプロセシングのためのウシ成長ホルモン(BGH)のポリアデニル化シグナル(pA)の上流に位置するネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む(図1)。
【０１４２】
PelleカセットのNeo遺伝子は、細菌のEM7プロモーターの制御下にあり、細菌にカナマイシン耐性を提供する。この例ではPelleカセットは、アンピシリン耐性遺伝子を含むPelleドナープラスミドの一部を形成する。したがってPelleドナープラスミドは、選択下でカナマイシンとアンピシリンの両方に耐性を示す。Pelleカセットを挿入可能なレシピエントのコンストラクトまたはベクターは、カナマイシン耐性を付与しない。レシピエントベクターへのPelleカセットの挿入前に、ドナーベクター中のアンピシリン遺伝子を、ドナーベクターを制限エンドヌクレアーゼAclIで切断することで破壊し、さらに、切断後のドナーベクターをエビアルカリホスファターゼで処理することで、脱リン酸化による自己再連結をさらに防ぐ。
【０１４３】
Pelleカセットを、アンピシリン耐性遺伝子、ならびに対象の核酸コンストラクトの一部を形成するDNA断片を含む直線化されたレシピエントプラスミドのアームに連結する(図2参照)。組換えプラスミドを大腸菌宿主細胞に導入し、カナマイシンの存在下で培養して耐性細胞を選択する。この選択によって、レシピエントベクター、またはPelleドナーベクターのバックボーンのみを含むコロニーが効率的に除去され、レシピエントベクターに挿入されたPelleカセットを含むコロニーのみが残る。最小バックグラウンドコロニーは、ドナーのみの対照連結から観察される(一般に、レシピエントとドナーの連結によって生じるコロニー数の10%未満を含み、および典型的には1%未満を含む)。これらのコロニーは、制限エンドヌクレアーゼの非効率性による、Pelleカセットとドナーベクターバックボーンの自己再連結の結果として生ずる。
【０１４４】
このクローニング系では、従来のクローニング系と比較して時間が節約され、および一般に、挿入DNA断片をゲル抽出によって精製する必要性が回避され(図3参照)、ならびに対象の組換えベクターを有する割合の高い組換えコロニーが提供される(一般に、所望の挿入配列を有する組換えクローンの90%以上、および典型的には最大100%)(図4)。挿入DNA断片を精製することで、組換え効率がさらにより高くなることに注目されたい。
【０１４５】
実施例2
Pelle-Lベクター
図5は、Pelle-Lと命名された、Pelleドナープラスミドの別の態様を示す。この態様ではPelleカセットは、Creを介したPGK-Neoカセットの切り出しを可能とする2つのloxP部位に挟まれている。PacIを使用してPelleカセットを放出させることができる。
【０１４６】
実施例3
Pelle-Fベクター
図6は、Pelle-Fと命名された、Pelleドナープラスミドのさらに別の態様を示す。この態様ではPelleカセットは、FLPeによるPGK-Neoカセットの切り出しを可能とする2つのFRT部位に挟まれている。PacIを使用してPelleカセットを放出させることができる。
【０１４７】
実施例4
Pelle-FLベクター
図7は、Pelle-FLと命名された、Pelleドナープラスミドのさらに別の態様を示す。この態様ではドナープラスミドは、ポリアデニル化シグナル(pA)の下流に1つのloxP部位と、およびPGK-Neoカセットを挟む2つのFRT部位を含む。これは、標的エクソンの5'末端へのloxP部位の挿入による条件的遺伝子アレルの構築を可能とする。PacIまたはAscIを使用してPelleカセットを切り出すことができる。
【０１４８】
実施例5
PalLベクター
図8は、PalLと命名された、Pelleドナープラスミドの別の態様を示す。このベクターは、1つのloxP部位をPGK neoカセットの上流に含み、かつ二重ターゲッティング用の第2のコンストラクトとして使用することができる。PacIを使用してPelleカセットを放出させることができる。
【０１４９】
実施例6
NotINeoベクター
図9は、NotINeoと命名された、Pelleドナープラスミドのさらに別の態様を示す。このベクターは、1つのloxP部位をpAシグナルの下流に含み、および標的エクソンの5'末端へのloxP部位の挿入による条件的遺伝子アレルの構築を可能とする、PGK-Neoカセットを挟む2つのFRT部位を含む。NotIを使用してPelleカセットを放出させることができる。
【０１５０】
実施例7
FEcoRINeoベクター
図10は、FEcoRINeoと命名された、Pelleドナープラスミドのさらに別の態様を示す。このベクターは、二重ターゲッティング用の第2のコンストラクトとして使用可能な1つのFRT部位をpAシグナルの下流に含む。EcoRIを使用してPelleカセットを放出させることができる。
【０１５１】
実施例8
LEcoRINeoベクター
図11は、1つのloxP部位をpAシグナルの下流に含む、LEcoRINeoと命名された、Pelleドナープラスミドの別の態様を示す。このベクターは、二重ターゲッティング用の第2のコンストラクトとして使用することができる。EcoRIを使用してPelleカセットを放出させることができる。
【０１５２】
実施例9
SgfINeoベクター
図12は、SgfINeoと命名された、Pelleドナープラスミドのさらに別の態様を示す。このベクターは、1つのloxP部位をpAシグナルの下流に含み、およびPGK-Neoカセットを挟む2つのFRT部位を含み、ならびに標的エクソンの5'末端へのloxP部位の挿入によって条件的遺伝子アレルの構築を可能とする。SgfIを使用してPelleカセットを放出させることができる。
【０１５３】
実施例10
FAscINeoベクター
図13は、FAscINeoと命名された、Pelleドナープラスミドのさらに別の態様を示す。これは、1つのFRT部位をpAシグナルの下流に含み、および二重ターゲッティング用の第2のコンストラクトとして使用することができる。AscIを使用してPelleカセットを放出させることができる。
【０１５４】
実施例11
FNheINeoベクター
図14は、1つのFRT部位をpAシグナルの下流に含む、FNheINeoと命名された、Pelleドナープラスミドの別の態様を示す。このベクターは、二重ターゲッティング用の第2のコンストラクトとして使用することができる。NheIを使用してPelleカセットを放出させることができる。
【０１５５】
実施例12
FBsrGINeoベクター
図15は、1つのFRT部位をpAシグナルの下流に含む、FBsrGINeoと命名された、Pelleドナープラスミドのさらに別の態様を示す。このベクターは、二重ターゲッティング用の第2のコンストラクトとして使用することができる。BsrGIを使用してPelleカセットを切り出すことができる。
【０１５６】
実施例13
FBstBINeoベクター
図16は、1つのFRT部位をpAシグナルの下流に含む、FBstBINeoと命名された、Pelleドナープラスミドの別の態様を示す。このベクターは、二重ターゲッティング用の第2のコンストラクトとして使用することができる。BstBIを使用してPelleカセットを放出させることができる。
【０１５７】
実施例14
5つの異なる配列からなるターゲッティングコンストラクトのクローニング
本発明による、配列1、配列2、配列3、配列4、および配列5と命名された5つの異なるヌクレオチド配列をクローニングする説明目的のクローニング戦略は、以下の段階を含む。
【０１５８】
段階1
制限酵素部位「A」に挟まれた選択カセットを以下に示す。
2008539766.tif 000004
【０１５９】
制限酵素部位「B」および1つの「A」に挟まれた配列1を以下に示す。
2008539766.tif 000005
【０１６０】
これらの2つの配列を使用して、選択カセットを、制限酵素「A」を使用して配列1中にクローニングすることができる。
【０１６１】
段階2
段階1で得られた配列は、段階2用の新たな選択カセットとなる。制限酵素部位「B」に挟まれた新たな選択カセットを以下に示す。
2008539766.tif 000006
【０１６２】
制限酵素部位「C」および1つの「B」に挟まれた配列2を以下に示す。
2008539766.tif 000007
【０１６３】
これら2つの配列を使用して、新たな選択カセットを、制限酵素「B」を使用して配列2中にクローニングすることができる。
【０１６４】
段階3
段階2で得られた配列は、段階3用の新たな選択カセットとなる。制限酵素部位「C」に挟まれた新たな選択カセットを以下に示す。
2008539766.tif 000008
【０１６５】
制限酵素部位「D」および1つの「C」に挟まれた配列3を以下に示す。
2008539766.tif 000009
【０１６６】
これら2つの配列を使用して、新たな選択カセットを、制限酵素「C」を使用して配列3中にクローニングすることができる。
【０１６７】
段階4
段階3で得られた配列は、段階4用の新たな選択カセットとなる。制限酵素部位「D」に挟まれた新たな選択カセットを以下に示す。
2008539766.tif 000010
【０１６８】
制限酵素部位「E」および1つの「D」に挟まれた配列4を以下に示す。
2008539766.tif 000011
これら2つの配列を使用して、新たな選択カセットを、制限酵素「D」を使用して配列4中にクローニングすることができる。
【０１６９】
段階5
段階4で得られた配列は、段階5用の新たな選択カセットとなる。制限酵素部位「E」に挟まれた新たな選択カセットを以下に示す。
2008539766.tif 000012
【０１７０】
制限酵素部位「F」および1つの「E」に挟まれた配列5を以下に示す。
2008539766.tif 000013
【０１７１】
これら2つの配列を使用して、新たな選択カセットを、制限酵素「E」を使用して配列5中にクローニングすることができる。
【０１７２】
段階5の後に得られた、最終的なターゲッティングコンストラクトを以下に示す。
2008539766.tif 000014
【０１７３】
本明細書で引用された全ての特許、特許出願、および出版物の開示は、参照により、その全体が本明細書に組入れられる。
【０１７４】
本明細書における任意の参考文献の引用は、対象の参考文献が本出願に対する「先行技術」として扱われることが認められたと解釈すべきではない。
【０１７５】
本明細書を通じての目的は、本発明の好ましい態様を、本発明を任意の1つの態様、または特定の一群の特徴に制限することなく記述することにある。したがって当業者であれば、本開示に鑑みて、例示された特定の態様において、さまざまな修正および変更が、本発明の範囲から逸脱することなく実施可能なことを理解するであろう。そのような全ての修正および変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１７６】
【図１】本発明で「Pelle」と命名された挿入カセットを含むドナーマーカーベクターの1つの態様の図表示。
【図２】Pelleカセットを含む組換えベクターを作製するための、Pelleドナープラスミドからレシピエントベクター中へのPelle挿入カセットのクローニングを示す図表示。
【図３】Pelleクローニング系と従来のクローニング系の時間的な比較を示す図表示。
【図４】Pelleクローニング系を使用して組換えコロニーが多くなることを示す写真表示。パネルAは、アンピシリンおよびカナマイシンによる選択後の多数の組換えコロニーを含む第1の寒天プレートを示し、第2の寒天プレートでは、ドナーベクターのみを含む同じ選択基準使用時に、バックグラウンドのコロニーは実質的に認められなかった。パネルBは、第1のプレートに由来する6個のコロニーの制限酵素切断解析を示す。うち2個の組換えベクター(クローン2および5)は、Pelleカセットを一方向に含むものとして得られ、ならびに4個の組換えベクター(クローン1、3、4、および6)は、Pelleカセットを逆方向に含むものとして得られた。
【図５】Pelle-Lと命名されたドナーマーカープラスミドの別の態様の図表示。
【図６】Pelle-Fと命名されたドナーマーカープラスミドの別の態様の図表示。
【図７】Pelle-FLと命名されたドナーマーカープラスミドのさらに別の態様の図表示。
【図８】Pa1Lと命名されたドナーマーカープラスミドのさらに別の態様の図表示。
【図９】NotINeoと命名されたドナーマーカープラスミドの別の態様の図表示。
【図１０】FEcoRINeoと命名されたドナーマーカープラスミドのさらに別の態様の図表示。
【図１１】LEcoRINeoと命名されたドナーマーカープラスミドの別の態様の図表示。
【図１２】SgfINeoと命名されたドナーマーカープラスミドのさらに別の態様の図表示。
【図１３】FAscINeoと命名されたドナーマーカープラスミドの別の態様の図表示。
【図１４】FNheINeoと命名されたドナーマーカープラスミドのさらに別の態様の図表示。
【図１５】FBsrGINeoと命名されたドナーマーカープラスミドの別の態様の図表示。
【図１６】FBstBINeoと命名されたドナーマーカープラスミドのさらに別の態様の図表示。
【図１】
2008539766.tif 000015
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
2008539766.tif 000029
【図１６】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年5月27日(2008.5.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008539766000001.app
【国際調査報告】
2008539766.tif 000031
2008539766.tif 000032