(57)【要約】  本発明は、腎不全を予防又は治療するための方法に関する。詳細には本発明は、腎不全を予防又は治療するための方法であって、ＩＬ−６ファミリーのメンバーの可溶性受容体と結合したＩＬ−６ファミリーのメンバー、又はそれをコードする単離ポリヌクレオチドを含む複合体、ｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる複合体を対象に投与し、それによって急性又は慢性腎不全を予防又は治療することを含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における腎不全を予防又は治療するための方法であって、活性物質としてｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチド、及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって腎不全を予防又は治療する方法。
【請求項２】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ＩＬ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＴＣ）、及びこれらの生物活性類似体、断片、又は塩からなる群から選択されるＩＬ−６ファミリーのメンバーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ＩＬ−６ファミリーのメンバーの可溶性受容体と結合したＩＬ−６ファミリーのメンバーを含む複合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記複合体が、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）複合体、ＩＬ−１１／可溶性ＩＬ−１１受容体（ｓＩＬ−１１Ｒ）複合体、ＬＩＦ／可溶性ＬＩＦ受容体（ｓＬＩＦＲ）複合体、ＯＳＭ／可溶性ＯＳＭ受容体（ｓＯＳＭＲ）複合体、ＣＮＴＦ／可溶性ＣＮＴＦ受容体（ｓＣＮＴＦＲ）複合体、ＣＴ−１／可溶性ＣＴ−１受容体（ｓＣＴ−１Ｒ）複合体、ＣＴＣ／可溶性ＣＴＣ受容体（ｓＣＴＣＲ）複合体、及びこれらの生物活性類似体、断片、又は塩からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体がＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ｇｐ１３０に対するモノクローナル抗体、ｇｐ１３０に対するポリクローナル抗体、及びｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる小さな合成分子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記腎不全が、急性腎不全、慢性腎不全、及び末期腎不全からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記急性腎不全が、抗生物質、抗真菌剤、放射性造影剤、造影剤、化学療法剤、金属、有機溶媒、及び四塩化炭素からなる群から選択される薬剤物質、診断用物質、又は毒性物質の使用又はそれへの曝露から生じる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記急性腎不全が、ミオグロビン尿症横紋筋融解症、ヘモグロビン尿症、アテローム塞栓症、腎動脈閉塞、血管炎、溶血性尿毒症症候群、血栓溶解血小板減少性紫斑病、ヴェグナー肉芽腫症、全身性エリテマトーデス、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、グッドパスチャー症候群、急性糸球体腎炎、急性過敏性間質性腎炎、高カルシウム血症、尿路閉塞、急性尿酸腎症、腎盂腎炎、乳頭壊死、肝腎障害症候群、高血圧、細菌性敗血症、全身性炎症ショック、真菌血症、急性ウイルス性疾患、重度の体液量減少、火傷、虚血再灌流、産後合併症、及び外科的処置からなる群から選択される疾患、障害、又は状態から生じる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記医薬組成物を投与する経路が、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口投与経路からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
対象における腎不全を予防又は治療するための方法であって、活性物質としてｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって腎不全を予防又は治療する方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ＩＬ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＴＣ）、及びこれらの生物活性類似体、断片、又は塩からなる群から選択されるＩＬ−６ファミリーのメンバーである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ＩＬ−６ファミリーのメンバーの可溶性受容体と結合したＩＬ−６ファミリーのメンバーを含む複合体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記複合体がＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）複合体、ＩＬ−１１／可溶性ＩＬ−１１受容体（ｓＩＬ−１１Ｒ）複合体、ＬＩＦ／可溶性ＬＩＦ受容体（ｓＬＩＦＲ）複合体、ＯＳＭ／可溶性ＯＳＭ受容体（ｓＯＳＭＲ）複合体、ＣＮＴＦ／可溶性ＣＮＴＦ受容体（ｓＣＮＴＦＲ）複合体、ＣＴ−１／可溶性ＣＴ−１受容体（ｓＣＴ−１Ｒ）複合体、ＣＴＣ／可溶性ＣＴＣ受容体（ｓＣＴＣＲ）複合体、及びこれらの生物活性類似体又は断片からなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体がＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ｇｐ１３０に対するモノクローナル抗体、及びｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができるｇｐ１３０に対するポリクローナル抗体からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記腎不全が急性腎不全、慢性腎不全、及び末期腎不全からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記急性腎不全が、抗生物質、抗真菌剤、放射性造影剤、造影剤、化学療法剤、金属、有機溶媒、及び四塩化炭素からなる群から選択される薬剤物質、診断用物質、又は毒性物質の使用又はそれへの曝露から生じる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記急性腎不全が、ミオグロビン尿症横紋筋融解症、ヘモグロビン尿症、アテローム塞栓症、腎動脈閉塞、血管炎、溶血性尿毒症症候群、血栓溶解血小板減少性紫斑病、ヴェグナー肉芽腫症、全身性エリテマトーデス、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、グッドパスチャー症候群、急性糸球体腎炎、急性過敏性間質性腎炎、高カルシウム血症、尿路閉塞、急性尿酸腎症、腎盂腎炎、乳頭壊死、肝腎障害症候群、高血圧、細菌性敗血症、全身性炎症ショック、真菌血症、急性ウイルス性疾患、重度の体液量減少、火傷、外科的処置、虚血再灌流、及び産後合併症からなる群から選択される疾患、障害、又は状態から生じる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記医薬組成物を投与する経路が局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口投与経路からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項２１】
前記投与の経路が静脈内投与による経路である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
対象における腎不全を予防又は治療するための方法であって、活性物質としてｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって腎不全を予防又は治療する方法。
【請求項２３】
前記発現ベクターが、裸ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、プラスミド及びウイルスベクターからなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ＩＬ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＴＣ）、及びこれらの生物活性類似体又は断片からなる群から選択されるＩＬ−６ファミリーのメンバーである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ＩＬ−６ファミリーのメンバーの可溶性受容体と結合したＩＬ−６ファミリーのメンバーを含む複合体である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記複合体が、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）複合体、ＩＬ−１１／可溶性ＩＬ−１１受容体（ｓＩＬ−１１Ｒ）複合体、ＬＩＦ／可溶性ＬＩＦ受容体（ｓＬＩＦＲ）複合体、ＯＳＭ／可溶性ＯＳＭ受容体（ｓＯＳＭＲ）複合体、ＣＮＴＦ／可溶性ＣＮＴＦ受容体（ｓＣＮＴＦＲ）複合体、ＣＴ−１／可溶性ＣＴ−１受容体（ｓＣＴ−１Ｒ）複合体、ＣＴＣ／可溶性ＣＴＣ受容体（ｓＣＴＣＲ）複合体、及びこれらの生物活性類似体又は断片からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体がＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１つのポリペプチドが、ｇｐ１３０に対するモノクローナル抗体、及びｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができるｇｐ１３０に対するポリクローナル抗体からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２９】
前記腎不全が、急性腎不全、慢性腎不全、及び末期腎不全からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３０】
前記急性腎不全が、抗生物質、抗真菌剤、放射性造影剤、造影剤、化学療法剤、金属、有機溶媒、及び四塩化炭素からなる群から選択される薬剤物質、診断用物質、又は毒性物質の使用又はそれへの曝露から生じる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記急性腎不全が、腎動脈閉塞、血管炎、溶血性尿毒症症候群、血栓溶解血小板減少性紫斑病、ヴェグナー肉芽腫症、全身性エリテマトーデス、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、グッドパスチャー症候群、急性糸球体腎炎、急性過敏性間質性腎炎、高カルシウム血症、尿路閉塞、急性尿酸腎症、腎盂腎炎、乳頭壊死、肝腎障害症候群、高血圧、細菌性敗血症、全身性炎症ショック、真菌血症、急性ウイルス性疾患、重度の体液量減少、火傷、外科的処置、虚血再灌流、及び産後合併症からなる群から選択される疾患、障害、又は状態から生じる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記医薬組成物を投与する経路が、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口投与経路からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項３３】
前記投与が静脈内投与による投与である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
対象における腎不全を予防又は治療するための方法であって、活性物質としてｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができるポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞、及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって腎不全を予防又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腎不全を予防又は治療するための方法に関する。詳細には本発明は、腎不全を予防又は治療するための方法であって、ＩＬ−６ファミリーのメンバーの可溶性受容体と結合したＩＬ−６ファミリーのメンバー、又はそれをコードする単離ポリヌクレオチドを含む複合体を対象に投与することを含む方法に関する。この複合体はｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができ、それによって急性又は慢性腎不全を予防又は治療する。
【背景技術】
【０００２】
急性腎不全（ＡＲＦ）は、依然として入院患者の罹病及び死亡の主な原因であり、病院への入院の５〜７％及び集中治療室への入院の３０％までの経過を悪化させる。ＡＲＦ症例の約４０％は急性尿細管壊死（ＡＴＮ）として定義される。ＡＴＮはさらに、非腎臓起源の疾患に罹患している患者における重度の腎機能障害（いわゆる腎前性及び腎後性腎不全）の最終的な一般経路である。
【０００３】
インターロイキン−６（ＩＬ−６）は、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＩＬ−１１、及びオンコスタチンＭ（ＯＳＭ）を含むサイトカインのファミリーのメンバーであり、広範に（ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ）発現するシグナル伝達タンパク質、ｇｐ１３０の少なくとも１つのサブユニットを含む受容体複合体を介して作用する。
【０００４】
標的細胞においてＩＬ−６は、ｇｐ１３０を誘発し、ヤヌスキナーゼ（Ｊａｋ）／シグナル伝達及び転写の活性化因子（ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ）（ＳＴＡＴ）シグナル経路の活性化、特にＳＴＡＴ−３の活性化をもたらす、インターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）と称される特定の同種（ｃｏｇｎａｔｅ）受容体と結合することによって作用する。広範に発現するｇｐ１３０と異なり、ＩＬ−６Ｒの細胞内分布は肝細胞、及び単核細胞、好中球、及び幾つかのＴ細胞及びＢ細胞を含む幾つかの白血球亜群を含めた数種の細胞型に限られている。しかしながらＩＬ−６Ｒは、可溶形でも存在し（ｓＩＬ−６Ｒ）、これはＩＬ−６と共にｇｐ１３０との直接の相互作用によって細胞を刺激する複合体を生成する。重要なことに、ＩＬ−６トランス−シグナリングと呼ばれるプロセスでは、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体は細胞型に対してアゴニストとして作用するが、それらはＩＬ−６単独には本来応答しないはずであるｇｐ１３０を発現する。
【０００５】
柔軟なペプチド鎖によってｓＩＬ−６Ｒと結合したヒトＩＬ−６からなる、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６と呼ばれる組換え融合タンパク質は、スーパーアゴニスト設計サイトカインであることが示された（Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１４２〜１４５、１９９７）。Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６は、ｇｐ１３０発現細胞に対して非結合ＩＬ−６とｓＩＬ−６Ｒの組合せより活性があり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方でスーパーアゴニスト効果を示すことが分かった（Ｐｅｔｅｒｓ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６１：３５７５〜３５８１、１９９８）。
【０００６】
Ｇａｌｕｎ  ｅｔ  ａｌの米国特許第５，９１９，７６３号は、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体、好ましくはＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の肝臓に対する傷害を治療するための方法を開示している。
【０００７】
Ｇａｌｕｎ  ｅｔ  ａｌの国際出願公開番号ＷＯ９９／６２５３４は、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体、好ましくはＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の肝臓に対する傷害を治療するための方法を開示している。ＷＯ９９／６２５３４はさらに、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６キメラ遺伝子を有するベクターを対象に投与することを含む、対象の肝臓に対する傷害を治療するための遺伝子療法の方法を開示している。
【０００８】
Ａｘｅｌｒｏｄ  ｅｔ  ａｌの国際出願公開番号ＷＯ０３／０２９２８１は、ＩＬ−６ファミリーの組合せ要素及び肝臓再生因子を含む治療用組成物を開示しており、ＩＬ−６ファミリーの組合せ要素はＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体であることが好ましい。ＷＯ０３／０２９２８１はさらに、ＩＬ−６ファミリーの組合せ要素及び肝臓再生因子を含む治療用組成物であって、プラスミドによってコードされるＩＬ−６ファミリーの組合せ要素及び肝臓再生因子の少なくとも１つを投与する、治療用組成物を対象に投与することを含む、対象における病状を治療するための方法を開示している。列挙された病状の中で、腎不全を含めた腎臓疾患を示す。
【０００９】
白血病抑制因子（ＬＩＦ）及びＬＩＦ受容体のｍＲＮＡ発現は、急性腎不全後の回復期中に著しく増大したことが示された（Ｙｏｓｈｉｎｏ、Ｊ．ｅｔ  ａｌ．、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．１４：３０９０〜３１０１、２００３）。ＬＩＦのｍＲＮＡ及びタンパク質の増大した発現は、近位尿細管のＳ３部分において最も顕著であった。ＬＩＦが実験的急性腎不全の後の尿細管再生に関与することが示唆された（Ｙｏｓｈｉｎｏ、Ｊ．、ｅｔ  ａｌ．同書）。しかしながら、ＡＲＦ後にＬＩＦ単独又はＬＩＦ可溶性ＬＩＦ受容体複合体によって腎臓再生を誘導するための、具体的な可能性又は指針は与えられていない。
【００１０】
国際出願公開番号ＷＯ２００５／１１３５９１は、可溶性ＩＬ−１１受容体（ｓＩＬ−１１Ｒ）及びＩＬ−１１からなる融合ポリペプチド、並びに増殖疾患、細胞障害、放射線障害、ＩＬ−１１依存性炎症傷害、ＩＬ−１１依存性変性傷害、及びＩＬ−１１依存性又は介在性軟組織障害を治療するためのその使用を開示している。
【００１１】
ＩＬ−６はグリセロール誘導型ＡＲＦを有するラットにおいて尿細管再生を刺激することが示された（Ｈｏｍｓｉ、Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎｅｐｈｒｏｎ９２：１９２〜１９９、２００２）。これらのラットに投与されたＩＬ−６は、皮質及び髄質中で尿細管細胞増殖の相当な増大を引き起こしたが、これらのラットにおける腎機能の回復を促進させることはできなかった（Ｈｏｍｓｉ、Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．同書）。
【００１２】
腎機能を維持するか或いは回復させそれによって腎不全によって引き起こされる死亡を減らす、腎不全を治療又は予防するための改善された方法を有することは、非常に有利であるはずである。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、活性物質としてｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における腎不全を治療又は予防するための新たな方法を提供する。本発明はさらに、活性物質としてｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、腎不全を治療又は予防するための方法を提供する。本発明はさらに、活性物質として、ｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含有する医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、腎不全を治療又は予防するための方法を提供する。
【００１４】
本明細書でＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６又はＨＩＬ−６と表すＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）複合体、又はＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、急性腎不全（ＡＲＦ）をもたらす急性尿細管壊死（ＡＴＮ）の発症を予防することができることを、ここで初めて開示する。Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６を用いた試験動物の前処置は、ＡＲＦの発症から試験動物を保護し、したがって治療する動物の寿命を延ばす。
【００１５】
さらに、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６は腎臓尿細管を壊死から保護することができることを開示する。腎臓尿細管を壊死又は不全から保護することは、ｇｐ１３０介在シグナルカスケードと関係がある。予想外に、ｇｐ１３０介在シグナルカスケードの活性化及びＡＲＦの予防は、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６などのサイトカイン／可溶性サイトカイン受容体複合体ポリペプチドを投与することによってだけでなく、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６などのサイトカイン／可溶性サイトカイン受容体複合体をコードする単離ポリヌクレオチドを含むプラスミドを投与することによっても実施することができる。驚くことに、プラスミドの全身投与は、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６などのサイトカイン／可溶性サイトカイン受容体複合体の保護又は予防効果を達成する点で非常に有効である。したがって本発明の方法は、尿細管壊死及びＡＲＦを予防するのに、腎不全に対して保護するのに、及び腎機能の全体的な維持に非常に有用である。
【００１６】
一態様によれば本発明は、対象における腎不全を予防又は治療するための方法であって、活性物質としてｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチド、及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与し、それによって腎不全を治療又は予防することを含む方法を提供する。
【００１７】
幾つかの実施形態によれば、医薬組成物内の少なくとも１つのポリペプチドは、ＩＬ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＴＣ）、及びこれらの生物活性類似体、変異体及び塩からなる群から選択されるＩＬ−６ファミリーのメンバーである。
【００１８】
他の実施形態によれば、少なくとも１つのポリペプチドは、ＩＬ−６ファミリーのメンバーの可溶性受容体と結合したＩＬ−６ファミリーのメンバーを含む複合体である。幾つかの実施形態によれば、対象に投与する医薬組成物は、外来性肝臓再生因子を含まない前記複合体を活性物質として含む。他の実施形態によれば、対象に投与する医薬組成物は、外来性増殖因子を含まない前記複合体を活性物質として含む。他の実施形態によれば、対象に投与する医薬組成物は、外来性免疫グロブリン又はその断片を含まない前記複合体を活性物質として含む。
【００１９】
他の実施形態によれば、複合体は、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）複合体、ＩＬ−１１／可溶性ＩＬ−１１受容体（ｓＩＬ−１１Ｒ）複合体、ＬＩＦ／可溶性ＬＩＦ受容体（ｓＬＩＦＲ）複合体、ＯＳＭ／可溶性ＯＳＭ受容体（ｓＯＳＭＲ）複合体、ＣＮＴＦ／可溶性ＣＮＴＦ受容体（ｓＣＮＴＦＲ）複合体、ＣＴ−１／可溶性ＣＴ−１受容体（ｓＣＴ−１Ｒ）複合体、ＣＴＣ／可溶性ＣＴＣ受容体（ｓＣＴＣＲ）複合体、及びこれらの生物活性類似体、変異体及び塩からなる群から選択される。一実施形態によれば、複合体はＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体、好ましくはＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６である。他の実施形態によれば、複合体はＩＬ−１１／ｓＩＬ−１１Ｒである。他の実施形態によれば、複合体はＬＩＦ／ｓＬＩＦＲである。さらに他の実施形態によれば、複合体はＯＳＭ／ｓＯＳＭＲである。さらに他の実施形態によれば、複合体はＣＮＴＦ／ｓＣＮＴＦＲである。他の実施形態によれば、複合体はＣＴ−１／ｓＣＴ−１Ｒである。他の実施形態によれば、複合体はＣＴＣ／ｓＣＴＣＲである。
【００２０】
他の実施形態によれば、ｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチドは、ｇｐ１３０に対するモノクローナル抗体、ｇｐ１３０に対するポリクローナル抗体、及びｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる小さな合成分子からなる群から選択される。
【００２１】
他の態様によれば本発明は、対象における腎不全を予防又は治療するための方法であって、活性物質として本発明の原理によりｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、及び薬剤として許容される担体を含有する医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって腎不全を予防又は治療する方法を提供する。
【００２２】
さらに他の態様によれば本発明は、対象における腎不全を予防又は治療するための方法であって、活性物質として本発明の原理によりｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって腎不全を予防又は治療する方法を提供する。
【００２３】
幾つかの実施形態によれば、発現ベクターは裸ＤＮＡ分子又はＲＮＡ分子、プラスミド及びウイルスベクターからなる群から選択される。
【００２４】
さらに他の態様によれば本発明は、対象における腎不全を予防又は治療するための方法であって、活性物質として本発明の原理によりｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞、及び薬剤として許容される担体を含有する医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって腎不全を予防又は治療する方法を提供する。
【００２５】
他の実施形態によれば、本発明の医薬組成物のいずれかを用いて治療する腎不全は、急性腎不全、慢性腎不全、及び末期腎不全からなる群から選択される。本発明の例示的な実施形態によれば、本発明の医薬組成物のいずれかを用いて治療する腎不全は、急性腎不全である。
【００２６】
治療する急性腎不全は、抗生物質、抗真菌剤、放射性造影剤、造影剤、化学療法剤、金属、有機溶媒、及び四塩化炭素からなる群から選択される薬剤物質、診断用物質、又は毒性物質に対する対象の使用又は曝露から生じる可能性がある。
【００２７】
他の実施形態によれば、本発明の医薬組成物のいずれかを用いて治療する急性腎不全は、ミオグロビン尿症横紋筋融解症、ヘモグロビン尿症、アテローム塞栓症、腎動脈閉塞、血管炎、溶血性尿毒症症候群、血栓溶解血小板減少性紫斑病、ヴェグナー肉芽腫症、全身性エリテマトーデス、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、グッドパスチャー症候群、急性糸球体腎炎、急性過敏性間質性腎炎、高カルシウム血症、尿路閉塞、急性尿酸腎症、腎盂腎炎、乳頭壊死、肝腎障害症候群、高血圧、細菌性敗血症、全身性炎症ショック、真菌血症、急性ウイルス性疾患、重度の体液量減少、火傷、外科的処置、虚血再灌流、及び産後合併症からなる群から選択される疾患、障害、又は状態に関して生じる可能性がある。
【００２８】
さらに他の実施形態によれば、慢性腎不全には慢性糖尿病性腎障害、糖尿病性糸球体症、糖尿病性腎肥大、高血圧性腎硬化、高血圧性糸球体硬化、腎形成異常、糸球体肥大、尿細管肥大、糸球体硬化及び尿細管間質硬化があるが、これらだけには限られない。
【００２９】
幾つかの実施形態によれば、本発明の医薬組成物のいずれかを投与する経路は局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、及び経口投与経路からなる群から選択される。例示的な実施形態によれば、本発明の医薬組成物の投与は静脈内投与による投与である。
【００３０】
本発明のこれら及び他の実施形態は、以下の図面、記載、実施例及び特許請求の範囲に関連してさらに理解されるはずである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
急性腎不全は、腎機能の急な停止又は実質的な低下として定義し、９０〜９５％もの多くの症例において、外傷、外科手術又は他の急性の医学的状態に付随する可能性がある。急性腎不全は、前腎性の原因（例えば、低い心搏出量、血液量減少、変化した血管耐性）、或いは腎臓とは直接関係がなく、迅速に治療した場合、ネフロンの顕著な消失又は腎臓に対する他の傷害を伴わない後腎性の原因（例えば、尿管、膀胱又は尿道の閉塞又は狭窄）によることがある。或いは急性腎不全は、腎臓に対するより直接的な損傷又は傷害と関係があり、ネフロン又は他の腎臓構造に対する永続的な傷害を伴う可能性がある内因性の腎性の原因によることがある。急性腎不全の内因性の原因には、感染疾患（例えば、様々な細菌、ウイルス又は寄生虫感染）、炎症疾患（例えば、糸球体腎炎、全身性エリテマトーデス）、虚血（例えば、腎動脈閉塞症）、毒性症候群（例えば、重金属中毒、抗菌治療又は化学療法の副作用）、及び直接的外傷があるが、これらだけには限られない。
【００３２】
慢性腎不全は、ネフロンの相当且つ連続的な消失による糸球体濾過率（ＧＦＲ）の進行的、永続的且つ相当な低下として定義することができる。慢性腎不全は典型的には、慢性的な腎機能不全（即ち、少なくとも５０〜６０％の腎機能の永続的な低下）が、腎臓組織に対する何らかの損傷を生じネフロン単位の相当な消失を引き起こした時点から始まる。初期の損傷は急性腎不全の発病に附随することも附随しないこともある。ネフロンは累進的に消失しＧＦＲは累進的に低下するので、初期の損傷の性質とは無関係に、慢性腎不全は徴候及び症状の「最終共通経路」を示す。
【００３３】
慢性腎不全の初期段階は、典型的には、ＧＦＲが正常の約３分の１（例えば、平均的なヒト成人に関して３０〜４０ｍｌ／分）まで低下すると始まる。相当なネフロンの消失の結果として、少ないネフロンでの全体のＧＦＲを保つための見かけ上の「試み」において、１ネフロンの平均ＧＦＲ（ＳＮＧＦＲ）は、構造レベルと機能レベルの両方で残存ネフロンを適合させることによって増大する。バイオプシーサンプルの顕微鏡による検査によって容易に検出することができる、この適合の１つの構造的兆候は、腎臓の糸球体と尿細管の両方の「代償性肥大」、糸球体及び尿細管の文字通りの肥大によりそれぞれ残存ネフロンによって生成され得る濾液の体積を、文字通り増大させるプロセスである。同時に、通常排出される溶質の低下した吸収又は増大した分泌などの、残存ネフロンの機能的変化があり、これらは身体中の他の場所のホルモン又はパラクリンの変化（例えば、血清中のカルシウム及びリン酸レベルの変化に応じた副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）のレベルの増大）に対する応答であると思われる。
【００３４】
初期段階の慢性腎不全におけるこれらの適合は、ＧＦＲ又は腎機能の他のパラメータを完全に回復させることはできず、実際に、残存ネフロンが消失する危険を増大する。例えば、ＳＮＧＦＲの増大は、高血圧及び過灌流による糸球体に対する機械的ストレスと関係がある。メサンギウム、上皮及び内皮細胞における増殖効果、並びにコラーゲン及び他のマトリクスタンパク質の沈着の増大も観察される。糸球体と尿細管の両方の硬化は肥大ネフロンの他の一般的な症状であり、糸球体における凝固の危険が増大する。特に、残存ネフロンのこれらの適合は、ＳＮＧＦＲをその通常レベルよりかなり超えて押し上げることによって、水、溶質、又は酸充填の急な変化に応答する残りのネフロンの能力を実際に低下させるため、さらなるネフロン消失の可能性を実際に増大する。
【００３５】
慢性腎不全が進行し、ＧＦＲが正常の１０％未満（例えば、５〜１０ｍｌ／分）まで低下し続けると、対象は末期腎不全（ＥＳＲＤ）に突入する。この段階中、有用な生成物を保持し体液と電解質のバランスを保ちながら、残りのネフロンが血液から老廃物を適切に除去できないことは、多くの器官系、特に心臓血管系が衰え始める可能性がある急速な衰弱をもたらす。例えば、血中尿素窒素（ＢＵＮ）及びクレアチニンレベルが上昇する可能性があり、６０〜１００ｍｇ／ｄｌのＢＵＮレベル及び８〜１２ｍｇ／ｄｌの血清中クレアチニンレベルで、腎臓が窒素代謝の最終産物をもはや除去することができない尿毒症性症候群を、典型的に発症する。この時点で、対象が腎代償療法（即ち、慢性血液透析、連続的な腹膜透析、又は腎臓移植）を受けない限り、腎不全が急速に進行して死に至る。
【００３６】
したがって本発明は、対象における腎不全を予防又は治療するための方法であって、活性物質としてｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができる少なくとも１つのポリペプチドを含有する医薬組成物を対象に投与することを含み、それによって腎不全を治療又は予防する方法を提供する。本発明は、活性物質が本発明の少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、前記少なくとも１つのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又は本発明の発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞である医薬組成物を含む。
【００３７】
本発明によれば、ｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができるポリペプチドには、ｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができるＩＬ−６ファミリーのメンバー、例えばＩＬ−１１、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、カルジオトロフィン−１（ＣＴ−１）、カルジオトロフィン様サイトカイン（ＣＴＣ）、及びこれらの生物活性類似体、断片、又は塩などがあるが、これらだけには限られない。本明細書においてＩＬ−６が、腎不全を予防するのに有用ではないことが示されていることは理解されるべきである（後述の実施例を参照）。
【００３８】
本発明の原理によれば、ｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができるポリペプチドは、ＩＬ−６ファミリーのメンバーの可溶性受容体と結合したＩＬ−６ファミリーのメンバーを含む複合体も含む。ＩＬ−６ファミリーのメンバー及び対応する可溶性サイトカイン受容体の複合体が、ｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができることは当技術分野で知られているので、本発明は、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６受容体（ｓＩＬ−６Ｒ）、ＩＬ−１１／ｓＩＬ−１１Ｒ、ＬＩＦ／ｓＬＩＦＲ、ＯＳＭ／ｓＯＳＭＲ、ＣＮＴＦ／ｓＣＮＴＦＲ、ＣＴ−１／ｓＣＴ−１Ｒ、ＣＬＣ／ｓＣＬＣＲ、及びｇｐ１３０介在シグナル経路を活性化することができるこれらの生物活性類似体、断片、又は塩を含む複合体を企図するがこれらには限られない。
【００３９】
用語「ｇｐ１３０介在シグナル経路」は、例えばＪａｋ／Ｓｔａｔシグナル経路、特にＳＴＡＴ−３、Ｒａｓ−ＭＡＰＫシグナル経路などの細胞内経路の活性化をもたらすｇｐ１３０を含む受容体複合体の形成を指す。如何なる理論にも縛られずに、ｇｐ１３０を含む受容体複合体の形成は、ｇｐ１３０がＩＬ−６ファミリーの任意のメンバーの受容体との受容体複合体中で二量体又はヘテロ二量体として存在しようとしまいと、当技術分野で知られている細胞内経路の活性化をもたらすｇｐ１３０の立体配座の変化を伴う可能性がある。
【００４０】
用語「生物活性」は、ｇｐ１３０シグナル経路を活性化して細胞内経路の活性化をもたらす本発明の任意のポリペプチドの能力を指す。したがって、用語「生物活性」と「ｇｐ１３０シグナル経路の活性化」は、本明細書を通じて交換可能である。
【００４１】
本発明の原理を、ＩＬ−６／可溶性ＩＬ−６Ｒポリペプチド複合体によって本明細書で以下に例示する。しかしながら、本発明の医薬組成物は、その対応する可溶性受容体と結合したＩＬ−６ファミリーのメンバーを含む任意のポリペプチド複合体であって、その複合体がｇｐ１３０シグナル経路を活性化させ、それによって腎不全を治療又は予防することができる複合体を含むことを明らかに意図する。
【００４２】
用語「ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体」は、ＩＬ−６タンパク質と可溶性ＩＬ−６受容体（ＳＩＬ−６Ｒ）タンパク質の両方を特徴とする二分子タンパク質複合体、及び以前に記載されたのと実質的に同様の（完全に述べるが如く参照として本明細書に組込まれる、国際特許出願公開番号ＷＯ９７／３２８９１；ＷＯ９９／６２５３４；ＷＯ０３／０２９８１；Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１４２〜１４７、１９９７；及びＰｅｔｅｒｓ、Ｍ．、Ｊ．Ｉｍｎｕｎｏｌ．１６１：３５７５〜３５８１、１９９８を参照）柔軟なリンカーと結合した、ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒ、好ましくはＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒの生物活性部分を含む単分子タンパク質、並びにこれらの任意の生物活性類似体又は断片を指す。ＩＬ−６に関するアクセッション番号はＭ１４５８４（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列データベース）であり、且つ可溶性ＩＬ−６受容体に関してはＭ５７２３０、Ｍ２０５６６、及びＸ１２８３０である。
【００４３】
二分子タンパク質複合体は、ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒ又は任意の他のＩＬ−６ファミリーのメンバー、及びその対応する可溶性受容体を任意のオーダーで、並びにその生物活性類似体又は断片を含む。用語「生物活性類似体」は、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦ、ＣＴ−１、ＣＬＣ、ｓＣＬＣＲだけには限られないがこれらを含めたＩＬ−６ファミリーのメンバーと相同な（ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ）任意のポリペプチド、及びｓＩＬ−６Ｒ、ｓＩＬ−１１Ｒ、ｓＬＩＦＲ、ｓＯＳＭＲ、ｓＣＮＴＦＲ、ｓＣＴ−１Ｒだけには限られないがこれらを含めたＩＬ−６ファミリーのメンバーの可溶性受容体と相同的な任意のポリペプチドを指し、相同的なポリペプチドは元のポリペプチドの生物活性を保ちながら任意のアミノ酸置換、欠失、又は付加を含む。例えば、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体の生物活性類似体は、ｇｐ１３０として知られるＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体の膜受容体又はｇｐ１３０の下流シグナルの少なくとも１つの要素を直接活性化する能力を保っているはずである。本発明は本明細書で開示するポリペプチドの断片を含む、ただしそれらの断片はポリペプチドの元の生物活性を保っているものとする。
【００４４】
用語「Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６」は、国際特許出願公開番号ＷＯ９７／３２８９１中に記載されたのと実質的に同様の、その参照文献中で「Ｈ−ＩＬ−６」と呼ばれる柔軟なリンカーと結合したＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒの生物活性部分を含む単分子タンパク質を指す。
【００４５】
用語「リンカー」は、ＩＬ−６ファミリーの任意のメンバーとその対応する可溶性受容体を結合させるのに適した、任意の種類のリンカーを指す。このようなリンカーの例には二官能性、化学架橋剤、ＩＬ−６ファミリーのメンバーの第一アミノ酸と対応する可溶性受容体の第二アミノ酸を結合させるジスルフィド架橋、及びペプチド又はポリペプチドがあるが、これらだけには限られない。
【００４６】
単分子タンパク質は融合ポリペプチドであってよい。例えば、ＩＬ−６及びｓＩＬ−６Ｒの生物活性部分を特徴とするポリペプチドは互いに融合させることができ、リンカーは２つのポリペプチドによって生成されるジスルフィド架橋であってよい。リンカーは、２つの他のポリペプチドを互いに結合させるポリペプチドであることが好ましい。これらの融合ポリペプチドは、例えばヒトＩＬ−６Ｒの細胞外サブユニットとヒトＩＬ−６−ポリペプチドであり、ｓＩＬ−６ＲとＩＬ−６が種々のポリペプチド−リンカーによって互いに結合している、ヒトｓＩＬ−６Ｒポリペプチドを含むことができる。ＩＬ−６に関するアクセッション番号はＭ１４５８４（ＧｅｎＢａｎｋタンパク質配列データベース）であり、可溶性ＩＬ−６受容体に関してはＭ５７２３０、Ｍ２０５６６、及びＸ１２８３０である。
【００４７】
本発明の好ましい一実施形態によれば、単分子タンパク質はｓＩＬ−６Ｒポリペプチドのアミノ酸１１４〜３２３及びヒトＩＬ−６−ポリペプチドのアミノ酸２９〜２１２を含む。ｓＩＬ−６Ｒ−ポリペプチドのアミノ酸１１３〜３２３及びＩＬ−６−ポリペプチドのアミノ酸２９〜２１２からなる生物活性類似体も、本発明中に含まれる。他の単分子複合体、二分子複合体、類似体、断片、及びその組合せが本発明中に含まれる、ただしこれらの複合体、類似体、断片、及びその組合せはｇｐ１３０又はｇｐ１３０の下流シグナルの任意の要素を活性化する能力を保っているものとする。
【００４８】
本発明は、腎不全を予防又は治療するための、ｇｐ１３０に対するモノクローナル又はポリクローナル抗体の使用を含む。例えば、樹状細胞に対してｇｐ１３０を活性化させるために使用されるモノクローナル抗体、Ｂ−Ｓ１２、ｇｐ１３０のアゴニスト（Ｗａｎｇ、Ｙ．Ｄ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：５９９〜６０３、２００２を参照）は、腎不全を予防又は治療するために使用することができる。当技術分野で知られているｇｐ１３０に対する他のポリクローナル又はモノクローナル抗体は、本発明を実施するのに有用であり得る。
【００４９】
「ペプチド」は、ペプチドが５０を超えないアミノ酸を含むことを意味する。「ポリペプチド」は、ポリペプチドが５０を超えるアミノ酸残基を一般的に含むことを意味する。
【００５０】
「アミノ酸置換」は、機能的に同等なアミノ酸残基が配列内の残基と置換され、サイレント変異をもたらすことを意味する。例えば、ポリペプチド配列内の１つ又は複数のアミノ酸残基は、機能的同等物として作用する類似の極性の他のアミノ酸によって置換し、サイレント変異をもたらすことができる。配列内のアミノ酸の置換は、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。例えば、無極性（疎水性）アミノ酸にはアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンがある。極性中性アミノ酸にはグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンがある。正に帯電した（塩基性）アミノ酸にはアルギニン、リシン及びヒスチジンがある。負に帯電した（酸性）アミノ酸にはアスパラギン酸及びグルタミン酸がある。このような置換は保存的置換として知られている。さらに、ポリペプチド内の１つのアミノ酸が異なる極性又は疎水性のアミノ酸に置換される、非保存的置換も本発明内に含まれる、ただしそのポリペプチドは元の生物活性を保っているものとする。本発明はさらに、Ｄ−異性体形状で１つ又は複数のアミノ酸を有するポリペプチド、及び１つ又は複数の非天然アミノ酸を有するポリペプチドを含む。
【００５１】
本発明は、少なくとも１つのアミノ酸が修飾されているポリペプチド類似体を含む。アミノ酸残基の修飾にはグリコシル化、酸化、永続的リン酸化、還元、ミリスチル化、硫化、アシル化、アセチル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、環化、ジスルフィド結合形成、ヒドロキシル化、ヨウ化、メチル化、保護／ブロッキング基による誘導体化、又は当技術分野で知られている任意の他の誘導体化法があるが、これらだけには限られない。元のポリペプチドの生物活性を損ねずに維持又は改善する、このような修飾は、ペプチド骨格、アミノ酸側鎖、又はアミノ又はカルボキシル末端に含まれる類似体の配列に沿って任意の場所で生じ得る。
【００５２】
ＩＬ−６ファミリーのポリペプチドメンバー、これら及びその対応する可溶性受容体を含む複合体、これらの類似体及び断片、例えばＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体などは、天然供給源からの単離、合成生成又は組換え生成を含めた当技術分野で知られている様々な方法によって生成することができる。
【００５３】
本発明のポリペプチドは、これに限られないが、血液及び尿を含む天然供給源から単離することができる。ポリペプチドは、合成生成によって生成することができる。ポリペプチドの合成産物は当技術分野でよく知られており、様々な会社から市販されている。ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体などの本発明のポリペプチドは、（例えば、Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ、１９８４、「ペプチド合成の原理（Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）」、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ中に要約されたのと同様の）標準的直接的なペプチド合成法、固相合成（例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、１９６３、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９〜２１５４を参照）などを使用することによって合成することができる。
【００５４】
本発明の範囲内に含まれるのは、そのアミノ又はカルボキシ末端で、或いはその側鎖の１つで、ペプチド結合を介してその対応する可溶性受容体、その断片又は類似体のアミノ酸配列と結合した、ＩＬ−６ファミリーのメンバー、その断片又は類似体を含むキメラ又は融合タンパク質である。タンパク質合成によって、例えばペプチド合成装置を使用することによって、又は当技術分野で知られている方法により、適切なコードフレームで、所望のアミノ酸配列をコードする適切な核酸配列を互いに連結させ、当技術分野で一般に知られている方法により融合タンパク質を発現させることによって、このような融合タンパク質を作製することができる。
【００５５】
組換え体生成は、所望のポリペプチド、例えばＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体、又はその類似体又は断片をコードする単離ポリヌクレオチド、このポリヌクレオチドの発現のためのプロモーターと動作可能に連結した単離ポリヌクレオチドを使用することにより実施することができる。場合によっては、プロモーターの制御物質を加える。ポリペプチド又はその類似体又は断片をコードするポリヌクレオチド、プロモーター、及び場合によっては制御物質を含む構築体を、プラスミド、ウイルス又はファージベクターなどのベクター中に置くことができる。ベクターを使用して、宿主細胞、例えば細菌、酵母菌、昆虫、又は哺乳動物細胞をトランスフェクト又は形質転換することができる。
【００５６】
用語「ポリヌクレオチド」は、任意の供給源から得ることができ、一本鎖又は二本鎖であってよく、且つＤＮＡ又はＲＮＡポリマー中に取り込まれ得る、合成、非天然、又は改変ヌクレオチドを任意に含むことができる、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）又はリボ核酸（ＲＮＡ）のポリマーを意味する。
【００５７】
「単離ポリヌクレオチド」は、本来存在する状態で隣接する配列から分離されたポリヌクレオチドセグメント又は断片、例えば通常はそれと隣接する配列、例えばそれが本来存在するゲノム中においてそれと隣接する配列から除去されたＤＮＡ断片を指す。この用語はさらに、他の成分（核酸、例えばＲＮＡ又はＤＮＡ、又はタンパク質を本来伴い、本来細胞中でそれらを伴う）から実質的に精製されたポリヌクレオチドに適用する。したがってこの用語は、例えばベクター中、自律的に複製するプラスミド又はウイルス中、原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡ中に取り込まれる組換えＤＮＡ、又は他の配列と独立した別個の分子として（例えば、ＰＣＲ又は制限酵素による消化によって生成されたｃＤＮＡ又はゲノム又はｃＤＮＡ断片として）存在する組換えＤＮＡを含む。
【００５８】
用語「コードしている」は、遺伝子、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡなどの、単離ポリヌクレオチド中のヌクレオチドの特異な配列の固有の性質を指し、ヌクレオチド（即ち、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）の規定された配列又はアミノ酸の規定された配列のいずれかと、それらによって生じる生物学的性質とを有し、生物学的プロセスにおける他のポリマー及びマクロ分子の合成用の鋳型として寄与する。したがって、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞又は他の生物系中でタンパク質を生成する場合、その遺伝子はそのタンパク質をコードしている。そのヌクレオチド配列がｍＲＮＡ配列と同一であり通常配列表中に与えられるコード鎖と、遺伝子又はｃＤＮＡの転写用の鋳型として使用される非コード鎖の両方が、タンパク質又はその遺伝子又はｃＤＮＡの他の産物をコードしていると言うことができる。
【００５９】
当業者は、いわゆる「ウォブルの法則」によって与えられるように、遺伝コードの縮重を鑑みてコドンの第三の位置における古典的塩基対形成の例外を許容して、２つ以上の核酸は任意の所与のタンパク質をコードすることができることを理解しているはずである。さらに、より多い又は少ないヌクレオチドを含むポリヌクレオチドが、同一又は同等のタンパク質をもたらすことができる。したがって、本発明は本発明のポリペプチド、例えばＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ、好ましくはＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６をコードする全てのポリヌクレオチドを含むと企図される。
【００６０】
本発明のポリヌクレオチドは、そのポリヌクレオチドを含む宿主細胞が増殖する培地からそのポリペプチドが単離される場合輸送タンパク質として発現させることができ、或いはリーダー又は他のペプチドの欠失によって細胞内タンパク質として発現させてもよく、この場合ポリペプチドは宿主細胞から単離される。次いでこのようにして単離したポリペプチドを、当技術分野で知られているタンパク質精製法によって精製する。
【００６１】
本発明のポリペプチドは、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを細胞に移すことによって、目的とする組織に与えることができる。細胞はポリペプチドを生成及び分泌し、その結果腎臓尿細管内の細胞に適切に与えられてＡＲＦを予防又は治療する。
【００６２】
発現ベクターはプロモーターを含む。本発明の文脈では、プロモーターは細胞内でポリヌクレオチドの発現を誘導することができなければならない。これらだけには限られないが、レトロウイルスＩＴＲ、ＬＴＲ、即時型初期ウイルスプロモーター（ＩＥｐ；ヘルペスウイルスＩｅｐなど、例えば、ＩＣＰ４−ＩＥｐ及びＩＣＰＯ−ＩＥｐ及びサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥｐ）、後期ウイルスプロモーター、潜伏活性型プロモーター（ＬＡＰ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、及びマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）プロモーターを含む多くのウイルスプロモーターが、このような発現カセット中で使用するのに適している。他の適切なプロモーターは、エンハンサー配列を含む真核生物プロモーター（例えば、ウサギβ−グロブリン制御要素）、構成的活性型プロモーター（例えば、β−アクチンプロモーター、ヒトα１−アンチトリプシンプロモーターなど）、シグナル及び／又は組織特異的プロモーター（例えば、誘導的及び／又は抑制的プロモーター、ＴＮＦ又はＲＵ４８６に応答性があるプロモーターなど、メタロチオニンプロモーターなど）、及び腫瘍特異的プロモーターである。
【００６３】
発現ベクター内では、本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドとプロモーターが、プロモーターがポリヌクレオチドの発現を誘導することができるように動作可能に連結している。この動作可能な連結が維持される限り、発現ベクターは２つ以上の遺伝子、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって隔てられる多重遺伝子などを含むことができる。さらに、発現ベクターはスプライシング部位、ポリアデニル化配列、転写制御要素（例えば、エンハンサー、サイレンサーなど）、又は他の配列などの他の要素を場合によっては含むことができる。
【００６４】
発現ベクターは、それらが中に含まれる本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを発現することができるような方法で、細胞中に導入しなければならない。任意の適切なベクターをそのように使用することができ、その多くは当技術分野で知られている。このようなベクターの例には裸ＤＮＡ又はＲＮＡベクター（オリゴヌクレオチド又はプラスミドなど）、アデノ関連ウイルスベクター（Ｂｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．、１９９５、Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７７２：９５〜１０４）、アデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター（Ｆｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９９６、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９：２６５〜２８７）、パッケージアンプリコン（Ｆｅｄｅｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１６３６〜１６４０）、パピローマウイルスベクター、ピコルナウイルスベクター、ポリオーマウイルスベクター、レトロウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、及び当技術分野で知られている他のベクターなどのウイルスベクターがある。目的とする発現ベクターに加え、ベクターは他の遺伝的要素、例えば選択可能なマーカー（例えば、β−ｇａｌ又は毒素に対する耐性を与えるマーカー）をコードする遺伝子、薬理活性タンパク質、転写因子、又は他の生物活性物質なども含むことができる。
【００６５】
単離ポリヌクレオチドを含むベクターを操作するための方法は当技術分野でよく知られており（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、１９８９、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓを参照）、直接的クローニング、リコンビナーゼを使用する部位特異的組換え、相同的組換え、及び組換えベクターを構築する他の適切な方法を含む。このようにして、発現ベクターは、それを任意の所望の細胞中で複製させ、任意の所望の細胞中で発現させることができるように、且つ任意の所望の細胞のゲノムに組込んだ状態にすることがさらに可能であるように構築することができる。
【００６６】
本発明のポリペプチド、例えばＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体、好ましくはＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、細胞中にＤＮＡを移すのに適した任意の手段によって細胞中に導入する。このような方法の多くは当技術分野でよく知られている（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上記；Ｗａｔｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、１９９２、「組換えＤＮＡ（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ）」Ｃｈａｐｔｅｒ１２、２ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓも参照）。真核生物細胞に関しては、例えばエレクトロポレーション、流体力学系トランスフェクションなどのトランスフェクション、感染、ＤＮＡコーティング微粒子銃又はプロトプラスト融合（例えば、Ｌｉｕ、Ｆ．ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１２５８〜１２６６を参照）を使用することによってベクターを導入することができる。
【００６７】
必要な場合には、誘導性プロモーターの制御下でポリヌクレオチドをその中に移入した細胞を、一過性形質転換体として使用することができる。このような細胞自体を、その治療利点のために哺乳動物に移入させることができる。典型的にはこのような細胞を、哺乳動物中で発現されそこから分泌される本発明のポリペプチドが腎臓尿細管細胞と接触して腎不全を予防又は治療するような哺乳動物中の部位に移入する。或いは、特にベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで加えた細胞の場合、細胞に最初に数ラウンドのクローン選択を施して（ベクター中に選択可能なマーカー配列を使用することによって通常容易になる）、安定した形質転換体を選択することができる。このような安定した形質転換体は、その治療利点のために次いで哺乳動物に移入させる。
【００６８】
本発明のポリペプチドは、本発明によるポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含むベクターを他の細胞群にトランスフェクトすることによって、上皮尿細管細胞に与えることもでき、ポリペプチドは前記他の細胞中で発現されそこから分泌される。次いで、このようにトランスフェクトした他の細胞群を、このように分泌されたポリペプチドが腎臓尿細管細胞と接触する哺乳動物中の部位に移動させて腎障害を予防又は治療する。他の細胞からのポリペプチドの発現及び分泌は、したがって腎臓尿細管細胞に対して利点がある。ポリペプチドをコードするＤＮＡが細胞中に安定して組込まれることは必要ではない。ポリペプチドは、細胞中で非組込み又は組込みＤＮＡから発現及び分泌され得る。
【００６９】
細胞内では、細胞がポリペプチドを発現及び分泌するように、ポリヌクレオチドが発現される。ポリヌクレオチドの発現の成功は、標準的な分子生物学の技法（例えば、ノーザンハイブリダイゼーション、ウエスタンブロッティング、免疫沈降、酵素イムノアッセイなど）を使用して評価することができる。トランスフェクト細胞からのポリヌクレオチドの発現及びポリペプチドの分泌を検出するための試薬は、技術分野で知られている（本明細書の以下の実施例も参照）。
【００７０】
組換え技法によって生成される本発明のポリペプチドは、対象に投与するときポリペプチドが実質的に純粋であるように精製することができる。用語「実質的に純粋である」は、それを本来付随する成分から分離された化合物、例えばタンパク質又はポリペプチドを指す。典型的には、サンプル中の全物質の（体積によって、湿潤又は乾燥重量によって、或いはモルパーセント又はモル分率によって）少なくとも１０％、より好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも９０％、及び最も好ましくは少なくとも９９％が当該の化合物であるとき、化合物は実質的に純粋である。純度は任意の適切な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動又はＨＰＬＣ分析によって測定することができる。ポリペプチドはまた、それが本来付随する成分を本質的に含まないとき、或いはその本来の状態で附随する天然の汚染物質から分離されるとき実質的に純粋である。
【００７１】
医薬組成物及び投与経路
本発明は、活性物質としてｇｐ１３０シグナル経路を活性化することができるポリペプチドを含む医薬組成物の使用を提供する。本発明はさらに、活性物質として本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又はこの発現ベクターでトランスフェクトした細胞と、薬剤として許容される担体とを含む医薬組成物の使用を提供する。本発明の医薬組成物は、腎不全を予防又は治療するのに有用である。
【００７２】
本発明は、ポリペプチドの薬剤として許容される塩を含む。薬剤として許容される塩には、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、粘液酸、硝酸、シュウ酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸などから誘導される塩などの遊離アミノ基によって形成される塩、及びアルミニウム、アンモニア、カルシウム、銅、第二鉄、第一鉄、リチウム、マグネシウム、マンガン塩、マンガン（ＩＩ）、カリウム、ナトリウム、亜鉛、第一級、第二級、及び第三級アミン、天然に存在する置換アミンを含めた置換アミン、環状アミン、及び塩基性イオン交換樹脂、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコースアミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどから誘導される塩などの遊離カルボキシル基によって形成される塩がある。
【００７３】
用語「薬剤として許容される」は、連邦又は州政府の統制機関によって承認されていること、或いは米国薬局方又は動物、及びより詳細にはヒトに使用するための他の一般に認められている薬局方中に列挙されていることを意味する。用語「担体」は、活性物質と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、又は賦形薬を指す。このような医薬担体は、ピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油など、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの石油、動物、野菜又は合成起源の液体を含めた水及び油などの滅菌液であってよい。医薬組成物を静脈内投与するとき、水は好ましい担体である。生理食塩水溶液並びに水性デキストロース及びグリセロール溶液を、特に注射溶液用の液状担体として使用することもできる。適切な医薬賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、プロピレングリコール、水、エタノールなどがある。望むならば組成物は、少量の湿潤剤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝剤、酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などを含むこともできる。ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤、アスコルビン酸又は重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤、エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤、及び塩化ナトリウム又はデキストロースなどの緊張性を調節するための物質も想定される。
【００７４】
組成物は溶液、懸濁液、乳化液、錠剤、ピル、カプセル、粉末、座薬、持続放出性配合物などの形をとることができる。経口配合物は、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「レミングトンの薬剤科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」中に記載されている。このような組成物は、好ましくは実質的に精製された形で治療有効量の本発明の活性物質、及び適切な量の担体を含み、対象に適切に投与するための形をもたらすはずである。
【００７５】
腎障害又は不全を予防又は治療する際に有効であるはずである、本発明のポリペプチド、又はポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、又は前記ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又はポリペプチドを発現する細胞の量は、腎障害の性質に依存するはずであり、標準的な臨床技法によって測定することができる。例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを場合によっては使用して、最適用量範囲の同定を手助けすることができる。代替的或いは追加的に、腎不全の動物モデルを用いたｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを実施して、最適用量範囲を決定することができる（本明細書の以下の実施例を参照）。配合物中に使用する正確な用量は、投与の経路、及び腎障害の重度にも依存するはずであり、当業者の判断及び各患者の状況に従い決定されるはずである。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又は動物モデル試験バイオアッセイ又はシステムから誘導した用量応答曲線から、有効用量を推定することができる。
【００７６】
本発明のポリペプチドの供給源（即ち、本明細書で前に記載した、ｇｐ１３０シグナル経路を活性化することができるポリペプチド、又はポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、又は前記ポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、又はポリペプチドを発現する細胞）を含む組成物は全身循環中に導入することができ、それによってポリペプチドの供給源が腎臓組織中に分配されるはずである。或いは、ポリペプチドの供給源を含む組成物を、腎臓組織に局所施用することができる（例えば、組織内への注射或いはボーラスとして）。
【００７７】
本発明のポリペプチドの供給源を含む医薬組成物の導入法には、局所、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、及び経口経路があるが、これらだけには限られない。化合物は任意の好都合な経路によって、例えば注入又はボーラス注射によって、上皮内層（例えば、口腔粘膜、直腸及び腸粘膜など）を介した吸収によって投与することができ、他の治療活性物質と共に投与することができる。投与は局所であってよいが、投与は全身性であってよい。
【００７８】
本発明の医薬組成物は、治療の必要がある腎臓組織に局所的に投与することが望ましいことがあり、これは、非制限的に、例えば外科手術中の局所注入（例えば外科手術後の創傷被覆材を用いた局所施用）によって、注射によって、カテーテルによって、或いは多孔質、非多孔質、又はゼラチン状材料であるインプラントによって実施することができる。幾つかの実施形態によれば、投与は例えば腎障害の部位への注射器を介した直接注射による投与、又は静脈内注入による投与であってよい。
【００７９】
幾つかの実施形態によれば、本発明のポリペプチドの供給源を皮膚に施用することができる。担体は非制限的に例えば軟膏、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム、エアロゾル、座薬、パッド又はゲルスティックの形態であってよい。
【００８０】
直接的内部施用のため、医薬組成物は錠剤又はカプセルの形態であってよく、類似の性質の以下の成分又は化合物のいずれかを含むことができる：微結晶セルロース、トラガカントガム又はゼラチンなどの結合剤；デンプン又はラクトースなどの賦形剤；アルギン酸、プリモゲル、又はコーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；又はコロイド二酸化ケイ素などの流動促進剤。単位剤形がカプセルであるとき、それは前に列挙した成分以外に、脂肪油などの液状担体を含むことができる。さらに、単位剤形は用量単位の物理的な形を変える様々な他の物質、例えば糖、セラック、又は他の腸溶性物質のコーティングを含むことができる。
【００８１】
本発明のポリペプチドは、制御放出系中で送達することができる。一実施形態では、注入ポンプを使用してポリペプチドを投与することができる。或いは、本発明のポリペプチドは、腎臓組織で制御時間ポリペプチドを放出する生分解性、生体適合性ポリマーインプラントと組合せて投与することができる。好ましいポリマー物質の例には、ポリ無水物、ポリオルトエステル、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリエチレン酢酸ビニル、これらのコポリマー及び混合物がある（「制御放出の医学用途（Ｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｒｅｌｅａｓｅ）」、Ｌａｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．）、１９７４、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、Ｆｌａを参照）。
【００８２】
組成物の使用
本発明は、対象における腎不全を予防又は治療するための方法を提供する。これらの方法は、活性物質として治療有効量の本発明のポリペプチドの供給源及び薬剤として許容される担体を含む医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む。本発明によるポリペプチドの供給源は、ｇｐ１３０シグナル経路を活性化することができるポリペプチド、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチド、本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び本発明のポリペプチドをコードする単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクターでトランスフェクトした宿主細胞を指す。
【００８３】
本明細書で使用する用語「治療すること」、「治療する」又は「治療」は、予防（例えば、予防的）、軽減及び治癒的治療を含む。したがって、本発明の方法は、腎不全の状態であるか或いはその危険がある対象において、腎機能を改善するのに有用である。一実施形態によれば、対象は哺乳動物である。他の実施形態によれば、哺乳動物はヒトである。
【００８４】
「治療有効量」とは、過度の生理的悪影響又は副作用なしで、腎障害又は腎不全を治療又は予防するのに有効な量を意味する。本発明の幾つかの実施形態によれば、治療する腎不全は急性腎不全（ＡＲＦ）である。他の実施形態によれば、治療する腎不全は慢性腎不全である。
【００８５】
急性腎不全（ＡＲＦ）は、重度且つしばしば急激に生命を脅かす状態である。ＡＲＦの発病の原因であることが知られている多くのメカニズムが存在する。これらは腎動脈の閉塞、糸球体疾患（１つは糸球体腎炎）、感染（敗血症）、播種性血管内凝固（通常腎臓の皮質壊死を伴う）、腫瘍による尿流の閉塞又は他の閉塞、急性尿細管腎炎（虚血性又は毒性）、及びその他を含む。
【００８６】
本発明によれば、急性腎不全には、アミノグリコシドだけには限られないがこれを含めた抗生物質、アンホテリシンＢだけには限られないがこれを含めた抗真菌剤、塩化第二水銀だけには限られないがこれを含めた金属、有機溶媒、四塩化炭素、放射性造影剤、造影剤、及びシスプラチンなどの化学療法剤からなる群から選択される薬剤物質、診断用物質、又は毒性物質の使用又はそれへの曝露から生じる急性腎不全があるが、これらだけには限られない。
【００８７】
本発明によれば、急性腎不全はミオグロビン尿症横紋筋融解症、ヘモグロビン尿症、アテローム塞栓症、腎動脈閉塞、血管炎、溶血性尿毒症症候群、血栓溶解血小板減少性紫斑病、ヴェグナー肉芽腫症、全身性エリテマトーデス、ヘノッホ−シェーンライン紫斑病、グッドパスチャー症候群、急性糸球体腎炎、急性過敏性間質性腎炎、高カルシウム血症、尿路閉塞、急性尿酸腎症、腎盂腎炎、乳頭壊死、肝腎障害症候群、高血圧、細菌性敗血症、産後虚血、全身性炎症ショック、真菌血症、急性ウイルス性疾患、重度の体液量減少、輸血反応、産後合併症、火傷、虚血再灌流、及び外科的処置からなる群から選択される疾患、障害、又は状態から生じる急性腎不全をさらに含むが、これらだけには限られない。
【００８８】
本発明の方法は、腎臓移植中に腎障害又は腎不全を予防するのに、特に有用であることは理解されよう。したがって、生存中又は産後、腎臓の外科手術による除去の前又はそれと同時であろうと、本発明のポリペプチドの供給源をドナーに投与することができる。代替的或いは追加的に、腎臓移植の前、それと同時或いはその後に、本発明のポリペプチドの供給源をレシピエントに投与することができる。
【００８９】
慢性腎不全には慢性糖尿病性ネフロパシー、糖尿病性糸球体症、糖尿病性腎肥大、高血圧性腎硬化、高血圧性糸球体硬化、腎形成異常、糸球体肥大、尿細管肥大、糸球体硬化及び尿細管間質硬化があるが、これらだけには限られない。
【００９０】
したがって、本発明の方法は、急性又は腎不全用の治癒又は予防治療を提供する。
【００９１】
本発明のポリペプチドの供給源は単独、或いは例えばエリスロポイエチン（ＥＰＯ）などの他の化合物と共に、或いは他の治療法で投与することができる。
【実施例】
【００９２】
試薬
全ての化学物質は、他に述べない限りＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（ＵＳＡ）から購入した。組換えヒトＩＬ−６は、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ、Ｎ．Ｊ．、ＵＳＡ）からのものであった。Ｓｎ（ＩＶ）Ｍｅｓｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸジクロリド（ＳｎＭＰ）は、Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．（Ｌｏｇａｎ  ＵＴ、ＵＳＡ）から購入した。
【００９３】
組換えＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６タンパク質
Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６（ＨＩＬ−６）は、欧州特許ＥＰ−Ｂ１  ０８８８３８４によって定義される、柔軟なペプチドリンカーによって可溶性ＩＬ−６Ｒ（ｓＩＬ−６Ｒ）と共有結合したヒトＩＬ−６からなるタンパク質複合体である。組換えＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６タンパク質は、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６遺伝子カセットを有する遺伝子工学処理したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の培養物上清から単離した（参照によりその全体を本明細書に組込む、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１４２〜１４５、１９９７を参照）。Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６は、以前に記載されたのと同様に精製した（Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、同書）。Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６（ＨＩＬ−６）は−８０℃で保存した。新たな等分試料は各実験用に使用した。
【００９４】
動物
オスＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウス（体重１８〜２３グラム）は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｌｔｄ．、エルサレムから購入し、定期的な微生物スクリーニングによって評価したＳＰＦ条件下において、１２時間の明暗サイクル中に〜２３℃の温度で動物用機器中に保った。マウスには市販のげっ歯類用の餌及び水を任意に与え、使用前に少なくとも４日間順化させた。実験手順は、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅが承認した動物治療プロトコル（ライセンス番号ＯＰＲＲ−Ａ０１−５０１１）に従い行った。
【００９５】
ＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦ
急性腎不全（ＡＲＦ）は、以前に記載されたのと同様に（Ｎａｖａ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７９：Ｆ９１０〜９１８、２０００）、水に溶かしたＨｇＣｌ２の腹腔内（ｉ．ｐ）注射によって誘導した（６〜８ｍｇ／ｋｇ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ＵＳＡ）。ＨｇＣｌ２投与の４時間前にＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６（８μｇ）、ＩＬ−６（２０μｇ）、又は正常生理食塩水（担体）の１５０μｌ体積中の静脈内注射によってマウスを治療した。示した実験では、ＨｇＣｌ２投与後５時間でＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６（４μｇ）の追加投与によってマウスを治療した。第二用量のＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６の投与は、後の実験において防御効果には不要であったことが示された。
【００９６】
グリセロール誘導型ＡＲＦ及びヘムオキシゲナーゼ活性の阻害
ＢＡＬＢ／ｃマウスはＩｓｏｆｌｕｒａｎｅ（登録商標）で麻酔処理し、８ｍ１／体重１ｋｇの合計用量で５０％グリセロール水溶液を注射し、半分の用量は各後足の前腿筋に注射した。Ｔｉｎ  Ｍｅｓｏｐｒｏｔｏｐｏｒｐｈｙｒｉｎ  ＩＸジクロリド（ＳｎＭＰ）、ヘムオキシゲナーゼの特異的阻害剤は、０．１ＮのＨＣｌを用いてｐＨ８．０に調節した０．１ＮのＮａＯＨを含む最終体積の３分の１に溶かし、正常生理食塩水を用いて３ｍｇ／ｍｌにして、グリセロール投与の１．５時間前、及びグリセロール投与後５時間及び２０時間で、２０μｍｏｌ／体重１ｋｇの用量で投与した。同じ実験のＳｎＭＰを投与しなかった平行群中のマウスには、同じ時間地点で等体積の正常生理食塩水を与えた（ｉ．ｐ．）。
【００９７】
プラスミドＤＮＡ構築体
ヒトＩＬ−６及びＨｙｐｅｒ−ＩＬ−６をそれぞれコードする発現プラスミドＤＮＡ、ｐｈＡＡＴ−ＩＬ６及びｐｈＡＡＴ−ＨＩＬ６を、ヒトＩＬ−６及びＨＩＬ−６ｃＤＮＡをそれぞれコードするＨｉｎｄＩＩＩ（充填型）−ＮｏｔＩ制限断片をｐＣＩ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）のＳｍａＩ−ＮｏｔＩ部位に連結させることによって構築した。ＣＭＶプロモーターはＢｇｌＩＩ及びＨｉｎｄＩＩＩを用いた消化によって除去し、ＨｉｎｄＩＩＩ部位に充填し、（Ｄｒ．Ｋａｔｈｅｒｉｎｅ  Ｐｏｎｄｅｒ、ワシントン大学、セントルイス、ＭＯ、ＵＳＡによって好意的に与えられた）ヒトα１−アンチトリプシンプロモーターを含むＢｇｌＩＩ−ＮｏｔＩ（充填型）ＤＮＡ断片と交換した。高圧尾部静脈注射によるｉｎ  ｖｉｖｏ投与用に、Ｑｉａｇｅｎ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ−ＦｒｅｅプラスミドＭａｘｉキット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）
を使用してプラスミドＤＮＡを精製した。
【００９８】
Ｉｎ  ｖｉｖｏＤＮＡトランスフェクション
示した実験では、ｐｈＡＡＴ−ＩＬ６（１０μｇ）、ｐｈＡＡＴ−ＨＩＬ６（２．５μｇ）、又は対照プラスミド、ｐＧＥＭ−７（２０μｇ）のいずれかによる流体力学系ｉｎ  ｖｉｖｏプラスミドＤＮＡトランスフェクション（参照によりその全体を本明細書に組込む、Ｌｉｕ、Ｆ．、ｅｔ  ａｌ．、１９９９、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．６：１２５８〜１２６６）によって動物を治療した。注射用の全てのプラスミドＤＮＡ溶液はエンドトキシンの試験をした正常生理食塩水中で調製し、対照プラスミドＤＮＡ（ｐＧＥＭ−７）を用いて１．８ｍｌの最終体積中で２０μｇＤＮＡに統一した。プラスミドｐｈＡＡＴ−ＩＬ−６及びｐｈＡＡＴ−ＨＩＬ６の流体力学系ｉｎ  ｖｉｖｏトランスフェクション２日後の血清中ＩＬ−６及びＨＩＬ−６レベルは、ヒトＩＬ−６のＥＬＩＳＡにより測定して、それぞれ約５０ｎｇ／ｍｌ及び５ｎｇ／ｍｌであった。
【００９９】
血中尿素窒素の測定
ＡＲＦの誘導後示した時間期間で尾部静脈出血によって血液サンプルを得た。血中尿素窒素レベル（ＢＵＮ）を、Ｒｅｆｌｏｔｒｏｎ（登録商標）システム及び尿素試験片（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用してヘパリン処理血清において測定した。
【０１００】
組織分析
ＨｇＣｌ２投与後２４〜４８時間で外科手術によって腎臓を除去した。腎臓組織サンプルは４％緩衝ホルムアルデヒド、次に８０％エタノール中に固定し、パラフィン切片中に包埋した。２〜４ミクロンの厚さの組織切片はヘマトキシリン−エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０１０１】
ウエスタンブロット分析
ｐＳＴＡＴ３、ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬの分析用のタンパク質抽出物を、１ｍｌの全細胞溶解バッファー（１％のＮＰ−４０、１０ｍＭのトリスｐＨ７．８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、４０ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＰＭＳＦ、４ｍＭのオルトバナジウム酸、ペプスタチンＡ１ｕｇ／ｍｌ、ロイペプチン２ｕｇ／ｍｌ）中での均質化によって組織サンプル（〜１００ｍｇ）から調製した。ＩＬ−６Ｒの分析用のタンパク質抽出物は、製造者の教示書に従いｍ−ＰＥＲバッファー（Ｐｉｅｒｃｅ）中での均質化によって調製した。タンパク質サンプル（５０μｇ）はポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ウエスタンブロット分析に施した。ネズミＩＬ−６Ｒの分析用に、ウエスタンブロット試料をヤギ抗マウスＩＬ−６Ｒ抗体（Ｒ＆Ｄカタログ番号ＡＦ１８３０）、次にウサギ抗ヤギ抗体（Ｚｙｍｅｄ）及び抗ウサギＨＲＰポリマー（ＤＡＫＯ）でプローブ処理し、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓウエスタンブロッティング検出システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して発色させた。ｐＳＴＡＴ３及びＳＴＡＴ３の分析用に、ウエスタンブロット試料を、モノクローナル抗リン酸化ＳＴＡＴ３（ｓｃ−８０５９）及びモノクローナル抗ＳＴＡＴ３（ｓｃ−８０１９）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）でそれぞれプローブ処理した。ＦＬＩＰ、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−ｘＬの分析用に、ウエスタンブロット試料を、マウスモノクローナル抗ヒトＦＬＩＰ（ｓｃ−５２７６）、マウスモノクローナル抗ヒトＢｃｌ−２（ｓｃ−７３８２）及びマウスモノクローナル抗ヒトＢｃｌ−ｘＬ（ｓｃ−８３９２）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）でそれぞれプローブ処理した。充填対照として、ブロット試料を０．１ＭのグリシンｐＨ２．８で切断し、モノクローナル抗−β−アクチン抗体、クローンＡＣ−７４（Ｓｉｇｍａ）で再度プローブ処理し、抗マウスＨＲＰ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎキット（ＤＡＫＯ）を用いて発色させた。
【０１０２】
ＲＮＡ抽出及びＲＴ−ＰＣＲ分析
Ｐｏｌｙｔｒｏｎ高速ホモジェナイザーを使用し次にＤＮＡ−ｆｒｅｅ  ＤＮＡｓｅ（Ａｂｉｏｎ）を用いた処理によって、製造者の教示書に従いトリゾール試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中での均質化によって、約１００ｍｇの急速凍結組織からＲＮＡサンプルを調製した。合計細胞ＲＮＡサンプル（０．５μｇ）は、Ｒｅｖｅｒｓｅ−ｉＴ（商標）１ステップＲＴ−ＰＣＲキット（Ａｂｇｅｎｅ）を使用してＲＴ−ＰＣＲに施した。使用したプライマー配列は以下の通りであった：
【化１】
2008546681.tif 000002
【０１０３】
統計分析
統計上有意であると考えられるＰ≦０．０５で生存分布の一様性を比較するためのカプラン−マイヤー生存曲線手順及びログランク（Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ）検定を使用して、死亡率データを比較した。全ての他の比較値は、統計上有意であると考えられるＰ≦０．０５でスチューデントのｔ−検定に施した。
【０１０４】
（実施例１：ＨｇＣｌ２誘導型障害後の血清中ＩＬ−６タンパク質及び局部的ＳＴＡＴ３シグナル増大）
塩化第二水銀（ＨｇＣｌ２）などの水銀含有化合物の投与は、ネフロトキシン誘導型急性腎不全（ＡＲＦ）の研究用の、充分に確立されており広く使用されているモデルである。マウスへの毒性用量のＨｇＣｌ２の投与は、血清中ＩＬ−６タンパク質レベルの急速且つ相当な上昇をもたらし、これは投与の１時間以内に観察された（図１Ａ）。ＩＬ−６レベルの大きな変動はＨｇＣｌ２投与後１０時間で明らかであり、これはマウスにおけるＨｇＣｌ２の様々な毒性と関係がある可能性が最も高く、数匹のマウスは急速に回復し、一方他のマウスは重度の病的状態を示した。ＩＬ−６のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析（図１Ｂ）によって、ＨｇＣｌ２投与後のＩＬ−６遺伝子発現は腎臓中で強く誘導されたことを示し、血清中ＩＬ−６レベルの上昇は部分的には腎臓中でのＩＬ−６発現の局所誘導によるものであることを示した。ＩＬ−６のｍＲＮＡは肝臓中でも誘導され、脾臓中で適度に誘導される。ＩＬ−６レベルの上昇と同時に、腎臓中のｐＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）レベルの有意な増大及びＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの上方制御、ＨｇＣｌ２誘導型障害後のｇｐ１３０シグナルの誘導を示唆する（図１Ｃ及び１Ｄ）。
【０１０５】
（実施例２：腎臓中にＩＬ−６Ｒが存在しないことによって、ＩＬ−６介在型の保護応答がなくなる）
急性肝不全などの臓器不全のモデルでは、ＩＬ−６は多面的効果を有し、投与の時間に応じて炎症プロセスと組織保護の両方と関係があることが示されてきている。
【０１０６】
ＩＬ−６を用いた予備治療が、ＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦからマウスを保護することができる可能性を調べた。ＨｇＣｌ２の投与前に４時間ＩＬ−６で治療したマウスは、対照マウスのそれらと類似した血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベル及び死亡率を示した（図２Ａ及び２Ｂ）。ＩＬ−６発現プラスミド（ｐｈＡＡＴ−ＩＬ６）の流体力学系ｉｎ  ｖｉｖｏＤＮＡトランスフェクションによるＩＬ−６に対する長期の曝露も、ＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦのレベルに影響を与えず、ＩＬ−６誘導型の影響の欠如は不充分な生物学的利用能によるものではなかったことが示された。したがって、ＩＬ−６を用いた予備治療は、ＨｇＣｌ２誘導型腎障害を軽減することも悪化させることもなかった。
【０１０７】
ＩＬ−６に対する応答性は、標的細胞におけるＩＬ−６Ｒの発現又はｓＩＬ−６Ｒ介在トランスシグナルのいずれかに依存する。ＩＬ−６を用いたマウスの予備治療はＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦの結果に影響を与えなかったので、腎臓柔組織中のＩＬ−６Ｒの発現を調べた。正常及びＨｇＣｌ２治療マウス由来の組織抽出物のウエスタンブロット及びＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ＩＬ−６Ｒタンパク質及びｍＲＮＡは実際、陽性対照として使用した肝臓と比較して、正常マウスの腎臓中では非常に低いレベルで発現されることを示した（図２Ｃ及び２Ｄ）。ＨｇＣｌ２を用いた治療後６時間、わずかではあるが明らかなＩＬ−６ＲのｍＲＮＡの増大が明白であったが、しかしながら、ＩＬ−６Ｒタンパク質のレベルの変化はこの時間では明らかではなかった（図２Ｃ及び２Ｄ）。したがって、腎臓中にＩＬ−６Ｒが存在しないことによって、ＨｇＣｌ２誘導型障害に対するＩＬ−６介在型の保護応答がなくなる。
【０１０８】
（実施例３：ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ融合タンパク質を用いた治療は、マウスを急性腎不全から保護する）
腎臓中にＩＬ−６Ｒが存在しなかったので、ＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ複合体によってｇｐ１３０シグナルを刺激することがＳＴＡＴ３を活性化し、且つ結果としてＨｇＣｌ２誘導型ＡＴＮから腎臓を保護する可能性を調べた。マウスにＩＬ−６／ｓＩＬ−６Ｒ融合タンパク質、Ｈｙｐｅｒ−ＩＬ−６（ＨＩＬ−６）（Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｍ．、ｅｔ  ａｌ．、同書）を注射して、ＨｇＣｌ２投与前に腎臓中のｇｐ１３０を直接刺激した。ＨＩＬ−６はｇｐ１３０発現細胞において完全に活性状態であり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方でｇｐ１３０スーパーアゴニストとして作用する。ＨＩＬ−６がマウス腎臓中でｇｐ１３０シグナルを刺激することができるかどうかを測定するために、ＳＴＡＴ３活性化を誘導するＨＩＬ−６の能力を分析した。マウスへのＨＩＬ−６の注射は、腎臓中でＳＴＡＴ３リン酸化の強い刺激をもたらした（図３Ａ）。ＳＴＡＴ３のαイソ型とβイソ型の両方が腎臓中で発現され、両者はＨＩＬ−６への曝露後に等しくリン酸化されるようである（図３Ａ）。対照的に、ＩＬ−６は腎臓中のＳＴＡＴ３のリン酸化に対してほとんど影響がなく、ＩＬ−６Ｒの不十分な発現と釣りあっている（図３Ａ）。これらの結果は、腎臓中のｇｐ１３０シグナル伝達経路を刺激する際のＨＩＬ−６の有効性を実証する。
【０１０９】
ＡＲＦの進行に対するＨＩＬ−６の影響を評価するために、ＨｇＣｌ２投与前に４時間ＨＩＬ−６タンパク質でマウスを治療し、腎障害の進行を調べた。対照群とは対照的に、ＨＩＬ−６で治療したマウスはＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦに対して劇的に耐性があり、血中尿素レベルの非常にわずかな増大を示した（図３Ｂ）。顕著なことに、対照治療マウスが相当な死亡率を示した一方で、ＨＩＬ−６で治療したマウスはいずれも生存した（ログランク検定、Ｐ＜０．００７）（図３Ｃ）。ＡＴＮの誘導後２４時間で得た対照マウス由来の腎臓サンプルの組織検査によって、近位尿細管の壊死、タンパク質物質の管腔内蓄積、好中球の移動を示す膨張した尿細管及び尿細管周辺毛細血管の密集を示した（図３Ｄ）。対照的に、ＨＩＬ−６で治療したマウスは、ごくわずかな尿細管膨張及び時折アポトーシス上皮細胞を示した（図３Ｅ）。
【０１１０】
（実施例４：ＨＩＬ−６は腎臓中で抗酸化因子を誘導する）
ＨｇＣｌ２誘導型ＡＴＮのメカニズムは、近位尿細管の上皮細胞のアポトーシス及び壊死をもたらす酸化ストレスの増大と関係がある。それによってｇｐ１３０シグナルが腎臓を保護するメカニズムを解明するために、抗アポトーシス及び酸化ストレス関連因子の発現に対するＨＩＬ−６治療の影響を調べた。腎臓ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析によって、ｇｐ１３０のｍＲＮＡは腎臓中で構成的に発現され、ＨＩＬ−６、ＩＬ−６を用いた治療、腎障害の誘導によって影響を受けなかったことが明らかになった（図４Ａ）。ＨＩＬ−６又はＩＬ−６を用いた治療後４時間で得た腎臓のＲＮＡサンプルの分析によって、ＳＯＣＳ３のｍＲＮＡはＩＬ−６によってではなくＨＩＬ−６によって強く誘導されたことが明らかになり（図４Ａ）、腎臓中のｇｐ１３０タンパク質の存在とＩＬ−６Ｒの相対的不在の両方を再度確認した。ＳＯＣＳ３のｍＲＮＡ発現はＨｇＣｌ２投与直後に強く上方制御されたが、ＨｇＣｌ２投与前のＨＩＬ−６治療によってさらに増大することはなかったことを再度観察した（図４Ａ）。対照的に、いずれの試験治療後でも抗アポトーシス因子Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ｘＬ、又はＦＬＩＰのｍＲＮＡ又はタンパク質レベルの実質的な変化は確認されなかった（図４Ａ及び４Ｂ）。したがって、ＨＩＬ−６治療の保護効果は、腎臓中でのこれらの抗アポトーシス因子の即時型上方制御によって介在されないようである。
【０１１１】
水銀の腎毒性は主に、過酸化水素などの活性酸素種（ＲＯＳ）を腎臓が生成することに原因がある。酸化障害に応答して、哺乳動物細胞はヘムオキシゲナーゼ（ＨＯ−１）及び多機能性核タンパク質、アプリニックエンドヌクレアーゼ／酸化還元エフェクター因子（Ｒｅｆ１）を含めた幾つかの酸化還元応答性遺伝子を上方制御することが知られている。これらの発見と一致して、ＨｇＣｌ２投与後のＨＯ−１のｍＲＮＡの強い誘導を観察した（図４Ａ）。ＨＯ−１の発現はＨＩＬ−６治療によってさらに強く上方制御され、ＨｇＣｌ２治療前にＨＩＬ−６を投与したマウスではさらに強く上方制御された（図４Ａ）。我々の予想に反して、腎臓中のＲｅｆ−１のｍＲＮＡレベルは、ＨｇＣｌ２投与後に著しく低下した（図４Ａ）。しかしながら、ＨＩＬ−６を用いた治療はＲｅｆ−１のｍＲＮＡ発現を実質的に増大させ、ＨｇＣｌ２投与前のＨＩＬ−６を用いた治療はＲｅｆ−１のｍＲＮＡを正常レベルに保った（図４Ａ）。これらの結果は、Ｒｅｆ−１はＨｇＣｌ２誘導型ＡＴＮに対するＨＩＬ−６誘導型保護における重要因子であり得ることを示唆する。
【０１１２】
ＨＯ−１の誘導がＨＩＬ−６投与後に観察した保護に貢献したかどうかを測定するために、ＨＯ−１活性の特異的競合阻害剤、スズメソプロトポルフィリン（ＳｎＭＰ）の存在下でのＨＩＬ−６の影響を試験した。しかしながら、ＳｎＭＰの投与がＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦに対するＨＩＬ−６生成型耐性を予防することはなかった（２４時間でのＢＵＮ＝１０３±４３、４７±１０及び４４±１０ｍｇ／ｄｌ（ｎ＝８）、それぞれ生理食塩水治療、ＨＩＬ−６治療及びＨＩＬ−６＋ＳｎＭＰ治療マウス中、ＨＩＬ−６及び生理食塩水に関してＰ＜０．００３、及びＨＩＬ−６及びＨＩＬ−６＋ＳｎＭＰに関してＰ＝０．５４）。
【０１１３】
次にＨＩＬ−６治療が、ＨＯ−１活性が障害耐性に必要であるグリセロール誘導型突然性横紋筋融解症を予防する確率を調べた。グリセロール誘導型ＡＲＦは、毒性近位尿細管細胞の損傷、低酸素症の尿細管の損傷、炎症応答、及び尿細管閉塞による血管収縮と関係がある複雑な病態生理プロセスによって引き起こされる。グリセロール誘導型ＡＲＦ前のＨＩＬ−６タンパク質の一回注射は、相反する統計的有意性の適度な保護効果のみをもたらし（表１）、グリセロール誘導型障害に対する耐性を生み出すために、ＨＩＬ−６の多量又は長期の用量レジメンが必要とされる可能性があることを示唆した。
【表１】
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【０１１４】
ＨＩＬ−６投与を延長するために、グリセロール注射の２日前にＨＩＬ−６発現プラスミド、ｐｈＡＡＴ−ＨＩＬ６でマウスをトランスフェクトした。図５中に示すように、ｐｈＡＡＴ−ＨＩＬ６でトランスフェクトしたマウスはグリセロール誘導型ＡＲＦに劇的に耐性があったが、ＳｎＭＰによるＨＯ−１活性の阻害はＨＩＬ−６の保護効果を有意に阻害し、障害後４８時間でプラスミドＤＮＡ対照群のそれと同等なＡＲＦレベルをもたらした（図５）。対照プラスミドトランスフェクトマウスのＳｎＭＰ治療は腎障害をさらに強烈に悪化させたが、ＳｎＭＰ自体は腎毒性ではなかった。これは、腎臓中でのＨＯ−１発現の誘導は、ＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦではなく、グリセロール誘導型ＡＲＦに対するＨＩＬ−６生成型耐性には必要であることを示す。如何なる作用機構にも縛られることを望まずに、これらの結果は、ＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦに対するＨＩＬ−６誘導型保護は、酸化ストレスを改善するメカニズムによって主に介在されることを示すことができる。
【０１１５】
結論
ＩＬ−６を用いたマウスの予備治療は、ＨｇＣｌ２によって引き起こされるＡＲＦの発症、又は関連死を予防しなかった。本発明の発見は、ＩＬ−６予備治療がグリセロール誘導型ＡＲＦの発症を予防できなかったことを報告している、Ｈｏｍｓｉ  ｅｔ．ａｌの発見（Ｈｏｍｓｉ、Ｅ．、ｅｔ  ａｌ．２００２、「ネフロン（Ｎｅｐｈｒｏｎ）」９２：１９２〜１９９）と類似している。この観察結果の説明として、本発明の試験は、正常な腎臓中でのＩＬ−６Ｒ発現の顕著な不足を実証し、尿細管上皮細胞に対するＩＬ−６の直接の生理的影響を排除する。それにもかかわらず、ＳＴＡＴ３活性化及びＳＯＣＳ３のｍＲＮＡの上方制御の有意な増大を観察し、腎障害後の有意なｇｐ１３０シグナルの存在、及びｇｐ１３０シグナル経路の活性化は腎障害に対する固有の生理的応答であることが示唆された。実際、ＩＬ−６、ＩＬ−１１及び白血病抑制因子（ＬＩＦ）を含めた様々なｇｐ１３０活性化サイトカインのｍＲＮＡ及びタンパク質の強い誘導も、虚血再灌流誘導型腎障害後に観察されている（Ｌｅｍａｙ、Ｓ．、ｅｔ  ａｌ．、２０００、「移植（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ）」６９：９５９〜９６３）。特に、ＬＩＦとＬＩＦＲの両方の発現を、ＬＩＦ又はＬＩＦＲが通常発現されない外側髄質の近位尿細管細胞中で観察した。
【０１１６】
本発明の試験は、腎臓中でのｇｐ１３０シグナルの活性化はＡＲＥを改善する、最初の直接的証拠を与える。２つの独立した異なるＡＲＦのモデルにおいて観察した同様の発見は、様々な形の腎障害に対する広範囲の保護応答の誘導は、腎臓柔組織中のｇｐ１３０シグナルの主要機能であることを示唆する。
【０１１７】
酸化ストレスはＨｇＣｌ２誘導型腎障害のメカニズムにおける主な要因であり、ＨＯ−１を含めた酸化還元感受性遺伝子の強い上方制御をもたらす。ＨＩＬ−６の投与はＨＯ−１遺伝子の発現も強く誘導し、ＨＯ−１遺伝子はＨＩＬ−６及びＨｇＣｌ２の逐次投与によってさらに一層上方制御された。ＨＯ−１の誘導はグリセロール誘導型腎障害に対する保護応答における重要な要因であるが、ＨＯ−１の誘導自体がＨｇＣｌ２誘導型障害に対する保護を与えることはできない。これらの観察結果と一致して、本発明の試験は、ＨＯ−１活性の阻害はＨｇＣｌ２誘導型腎障害ではなく、グリセロール誘導型障害に対するＨＩＬ−６の保護効果を有意に阻害したことを示す。したがって、ｇｐ１３０シグナルは、多数の因子の誘導によって腎障害の様々な原因に対する全体的な保護応答を生み出すことが示唆される。Ｒｅｆ−１は、１つのこのような因子であるようである。
【０１１８】
Ｒｅｆ−１は、塩基除去修復経路におけるエンドヌクレアーゼとして、及びＮＦ−ｋＢを含めた多くの酸化還元感受性転写因子のＤＮＡ結合活性を助長する還元剤の両方として、相互排他的に作用する核タンパク質である。Ｒｅｆ−１は細胞内ＲＯＳ生成をもたらす刺激、及び過酸化水素を含めた酸化剤そのものに応じて上方制御され、Ｒｅｆ−１の発現はＳＴＡＴ３によって制御される。Ｒｅｆ−１の誘導は、ＨｇＣｌ２に曝すとｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏで腎臓上皮細胞によって多量に生じる過酸化水素に対する、細胞の適応耐性の増大と関係がある。全体として本発明の結果は、腎障害に対するｇｐ１３０介在保護は、酸化ストレスを改善するメカニズムによって主に介在されることを示す。ＨＩＬ−６又はＨｇＣｌ２のいずれかの投与後の初期における抗アポトーシス因子の関与は観察されなかったが、これら又は他の抗アポトーシス因子がＡＲＦの進行中の後期に役割を果たす可能性は、現在排除することはできない。
【０１１９】
この試験は、ＨＩＬ−６による治療戦略は障害から腎臓を保護し、ストレス中の腎機能の全体的維持をもたらすのに有用である可能性があるという結論を直接支持する。
【０１２０】
本発明は本明細書で前に詳細に示し記載してきたことに限られないことは、当業者によって理解されるはずである。そうではなく本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１２１】
【図１Ａ】ＨｇＣｌ２治療後のＩＬ−６の発現を示す図である。ＨｇＣｌ２で治療したマウスから得た血清サンプル中の、ＩＬ−６レベルを示す図である。結果は平均±ＳＥＭとして表す。
【図１Ｂ】ＨｇＣｌ２治療後のＩＬ−６の発現を示す図である。ＨｇＣｌ２を用いた治療後６時間でマウスから採取した肝臓、腎臓及び脾臓組織サンプル中のＩＬ−６のｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【図１Ｃ】ＨｇＣｌ２治療後のＩＬ−６の発現を示す図である。ＨｇＣｌ２誘導型傷害前後の腎臓中のリン酸化ＳＴＡＴ３（ｐ−ＳＴＡＴ；Ｔｙｒ７０５）及びＳＴＡＴ３のウエスタンブロット分析を示す図である。
【図１Ｄ】ＨｇＣｌ２治療後のＩＬ−６の発現を示す図である。ＨｇＣｌ２誘導型傷害後のＳＯＣＳ３のｍＲＮＡ誘導のＲＴ−ＰＣＲ分析を示す図である。
【図２Ａ】ネズミ腎臓中のＩＬ−６Ｒ発現の不在を示す図である。外来性ヒトＩＬ−６タンパク質を用いた予備治療（２０μｇ、静脈内）は、マウスにおいて測定したＢＵＮレベルによって示されるように、ＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦからマウスを保護することができないことを示す図である。対照マウスには、ＨｇＣｌ２の投与前に４時間生理食塩水のみを注射した。結果は生存マウスの平均±ＳＥＭとして表す。
【図２Ｂ】ネズミ腎臓中のＩＬ−６Ｒ発現の不在を示す図である。図２Ａのマウスの生存率のカプラン−マイヤーのプロットを示す図である。
【図２Ｃ】ネズミ腎臓中のＩＬ−６Ｒ発現の不在を示す図である。正常なネズミ肝臓及び腎臓由来のＩＬ−６Ｒのウエスタンブロット分析の図である。ブロット試料を除去し、対照としてβ−アクチンタンパク質用に再度プローブ処理した。
【図２Ｄ】ネズミ腎臓中のＩＬ−６Ｒ発現の不在を示す図である。ＨｇＣｌ２投与後６時間の正常な肝臓、正常な腎臓、及び腎臓組織由来のＲＮＡ抽出物のＲＴ−ＰＣＲによるＩＬ−６のｍＲＮＡの分析の図である。β−アクチンｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析を比較用に示す。
【図３Ａ】マウスにおけるＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦからのＨＩＬ−６治療の保護効果を示す図である。ＰＢＳ、ＩＬ−６（２０μｇ）、又はＨＩＬ−６（４μｇ）で治療した後の腎臓中のｐ−ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）及びＳＴＡＴ３のウエスタンブロット分析の図である。
【図３Ｂ】マウスにおけるＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦからのＨＩＬ−６処理の保護効果を示す図である。ＨｇＣｌ２の投与の４時間前にＨＩＬ−６又は通常の生理食塩水で治療したマウス中の腎機能の図である。結果は平均±ＳＥＭとして表す。＊Ｐ＜０．００２及び＊＊Ｐ＜０．００５。
【図３Ｃ】マウスにおけるＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦからのＨＩＬ−６処理の保護効果を示す図である。図３Ｂのマウスの生存率のカプラン−マイヤーのプロットを示す図である。
【図３Ｄ】マウスにおけるＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦからのＨＩＬ−６処理の保護効果を示す図である。ＨｇＣｌ２の投与の４時間前に通常の生理食塩水又はＨＩＬ−６（８μｇ、静脈内）を用いて予備治療したマウスにおける、ＨｇＣｌ２投与後２４時間の組織変化の図である。パラフィン包埋腎臓切片のＨ＆Ｅ染色。生理食塩水で予備治療したマウスは、尿細管上皮細胞の大量壊死（黒矢印）、尿細管内腔の膨張及びタンパク質物質の蓄積（星印）、並びに尿細管周辺毛細血管中の好中球の蓄積（矢じり）を示す。ＨＩＬ−６で予備治療したマウスは、わずかな尿細管傷害及び時折アポトーシス尿細管上皮細胞（矢じり）を示す。元の倍率、×２００及び×４００（高倍率領域、挿入図）。
【図３Ｅ】マウスにおけるＨｇＣｌ２誘導型ＡＲＦからのＨＩＬ−６処理の保護効果を示す図である。
【図４Ａ】正常及びＨｇＣｌ２治療マウスにおける、抗アポトーシス及び酸化ストレス応答遺伝子の発現に対するＨＩＬ−６及びＩＬ−６の影響を示す図である。腎臓ｍＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲ分析の図である。
【図４Ｂ】正常及びＨｇＣｌ２治療マウスにおける、抗アポトーシス及び酸化ストレス応答遺伝子の発現に対するＨＩＬ−６及びＩＬ−６の影響を示す図である。抗アポトーシス因子のウエスタンブロット分析の図である。ＨＩＬ−６を用いた４時間の予備治療有り又は無しのマウスにおいて、ＩＬ−６（２０μｇ、静脈内）又はＨＩＬ−６（８μｇ、静脈内）を用いた治療後４時間、或いはＨｇＣｌ２（６ｍｇ／ｋｇ）の投与後６時間でマウスから腎臓を回収した。
【図５】ＨＯ−１活性の阻害剤によって阻害される、マウスにおけるグリセロール誘導型ＡＲＦからＨＩＬ−６の保護効果を示す図である。５０％グリセロール（複数回）で治療したマウスにおけるＢＵＮレベルによって測定した腎機能は、ＡＲＦの誘導４８時間前にＨＩＬ−６発現プラスミド（ｐｈＡＡＴ−ＨＩＬ６）による流体力学系ｉｎ  ｖｉｖｏＤＮＡトランスフェクションによって治療したマウス（中実線）、対照プラスミドＤＮＡ（ｐＧＥＭ−７）トランスフェクトマウス（斜交線）、正常生理食塩水処理マウス（中空線）、ＨＯ−１阻害剤、ＳｎＭＰで処理した対照プラスミドトランスフェクトマウス（水平方向線）、及びＳｎＭＰで治療したｐｈＡＡＴ−ＨＩＬ６トランスフェクトマウス（まだら線）において評価した。結果は平均±ＳＤとして表す。＊Ｐ＜０．００１とｐＧＥＭ−７、＊＊Ｐ＜０．０１とｐＧＥＭ−７、＊＊＊Ｐ＜０．００１とｐｈＡＡＴ−ＨＩＬ−６、＃Ｐ＝ｎｓと生理食塩水。
【図１Ａ】
2008546681.tif 000004
【図１Ｂ】
2008546681.tif 000005
【図１Ｃ】
2008546681.tif 000006
【図１Ｄ】
2008546681.tif 000007
【図２Ａ】
2008546681.tif 000008
【図２Ｂ】
2008546681.tif 000009
【図２Ｃ】
2008546681.tif 000010
【図２Ｄ】
2008546681.tif 000011
【図３Ａ】
2008546681.tif 000012
【図３Ｂ】
2008546681.tif 000013
【図３Ｃ】
2008546681.tif 000014
【図３Ｄ】
2008546681.tif 000015
【図３Ｅ】
2008546681.tif 000016
【図４Ａ】
2008546681.tif 000017
【図４Ｂ】
2008546681.tif 000018
【図５】
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【配列表】
2008546681000001.app
【国際調査報告】
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