(57)【要約】  本発明は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型の少なくとも１つに由来する少なくとも１つのヘマグルチニンと、ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートとからなるタンパク質複合体であって、該ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートは、ボツリヌス毒素の重鎖またはそのＮ末端フラグメントに連結された選択されたポリペプチドからなる、タンパク質複合体に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型の少なくとも１つに由来する少なくとも１つのヘマグルチニンと、ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートとからなるタンパク質複合体であって、前記ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートは、ボツリヌス毒素の重鎖またはそのＮ末端フラグメントに連結された選択されたポリペプチドからなる、タンパク質複合体。
【請求項２】
前記ヘマグルチニンは、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型の少なくとも１つに由来する、ヘマグルチニンの混合物である、請求項１に記載のタンパク質複合体。
【請求項３】
前記タンパク質複合体は、無毒な非赤血球凝集性タンパク質をさらに含む、請求項１または２のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項４】
前記重鎖は、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型のボツリヌス毒素複合体の１つから単離される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項５】
前記重鎖は、適当な発現系で組換えにより製造される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項６】
前記ポリペプチドは、ホルモン、サイトカイン、成長因子、抗原、抗体、インヒビター、受容体アゴニスト、受容体アンタゴニスト、または凝固因子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項７】
前記選択されたポリペプチドおよび前記重鎖またはそのＮ末端フラグメントは、融合タンパク質として組換えにより製造される、請求項１〜６のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項８】
前記選択されたポリペプチドおよび前記重鎖またはそのＮ末端フラグメントは、化学結合により連結されている、請求項１〜７のいずれか１項に記載のタンパク質複合体。
【請求項９】
前記化学結合はジスルフィド結合である、請求項８に記載のタンパク質複合体。
【請求項１０】
前記化学結合はペプチド結合である、請求項８に記載のタンパク質複合体。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質複合体を製造する方法であって、
ａ）２．０〜６．５の範囲のｐＨ値で、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）からボツリヌス複合体を単離するステップと、
ｂ）ステップａ）の単離されたボツリヌス複合体を、７．０〜１０．０の範囲のｐＨ値に調整するステップと、
ｃ）前記ボツリヌス毒素を、クロマトグラフ法で前記複合タンパク質から除去するステップと、
ｄ）ステップｃ）で得られた複合タンパク質を、ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートと混合するステップ、または
ｅ）ステップｃ）で得られた複合タンパク質を分離して、少なくとも１つの複合タンパク質を、ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートと混合するステップと、
ｆ）ステップｄ）またはｅ）の混合物を、６．５〜２．０の範囲のｐＨ値の緩衝溶液に対して透析するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
薬理学的に活性であり、免疫学的に活性なポリペプチドの輸送媒体としての、または診断目的に使用されるポリペプチドの輸送媒体としての、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のタンパク質複合体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型の少なくとも１つに由来する少なくとも１つのヘマグルチニンと、ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートとからなり、該ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートは、ボツリヌス毒素の重鎖またはそのＮ末端フラグメントに連結した選択されたポリペプチドからなるタンパク質複合体に関する。
【背景技術】
【０００２】
多くの医薬品はきわめて有効であるが、これらの物質は、経口投与することができず、非経口的投与（これは注射によることを意味する）に限られるということによって、それらの治療用途は大幅に損なわれる。特に、タンパク質物質は、経口経路によってそれらの作用部位に到達することができないため、タンパク質物質の経口投与は成功しない。経口投与後、タンパク質は、克服することが困難な２つの障害にあう：消化管内の変性条件は、タンパク質の失活を招き、多くのプロテアーゼはポリペプチドの分解を促進し、また、たとえタンパク質がこうした状態に抵抗性を示しても、高分子物質は、血中に移行して作用部位に到達するために、腸粘膜のバリヤーを乗り越えることができない。タンパク質は、プロテアーゼにより、それぞれ、胃および小腸内で切断され、切断生成物であるアミノ酸およびペプチドは、吸収されるかまたは排泄される。したがって、タンパク質薬物は、経口的に投与されると効果がない。
【０００３】
この不都合を克服し、タンパク物質を、経口的に生物が利用できるようにするために、多大な努力がなされてきた。この際に、幾つかの手法に言及する：プロテアーゼインヒビターの混合物によるタンパク質分解を防ぐ努力がなされてきた。この点について、たとえばアプロチニン、ベスタチン、ピューロマイシン、大豆−トリプシン−インヒビター等の、プロテアーゼインヒビターが、タンパク物質と同時に投与された；そうすることにより、分解は防止されることを意味し、タンパク物質は損傷なく吸収されることを意味する。
【０００４】
製剤により胃／腸内の局所ｐＨ値を調節することも試みられた。化学的修飾によりアミノ酸の安定性を高め、併せて吸収性を高めるために、タンパク物質そのものにさえ取り組んできた。後者は、親油性を高めることにより（たとえば、パルミトイル化による）達成される予定であった。１例として、インスリンと両染性オリゴマーとのカップリングが記載されている（ノベックス・コーポレーション（ＮＯＢＥＸ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）社のヘキシル−インスリンモノコンジュゲート）。さらなる手法は、たとえば、それぞれ、ラウリル硫酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等の、キレート剤および界面活性剤の投与による、粘膜の透過性の増強にある。このコンセプトはまた、濃縮した低分子担体分子（たとえば、４−（４−２−ヒドロキシベンゾイル）−アミノフェニル）−ブタン酸）の同時投与も含む。さらなる手法では、腸壁における特異的輸送機構の使用を試みる。この点については、ビタミンＢ１２吸収のための輸送機構があり、これは、上記医薬品をビタミンＢ１２にカップリングすることにより、タンパク物質に利用されることを意味する。今まで、こうした様々な手法の全てが、経口的に生物が利用可能な、承認された薬物に至っていない。
【０００５】
経口的に生物が利用可能なタンパク質を提供するためのさらなる手法は、ＷＯ０３／１０１４８４に記述されている。その記述によれば、ボツリヌス毒素の重鎖のＣ末端残基が、ポリペプチドに連結される。該Ｃ末端残基は、上皮膜を通り抜ける輸送を仲介すると言われている。ハイブリッドタンパク質を経口投与するために、該ハイブリッドタンパク質を、該ボツリヌス毒素を生来包囲している補助タンパク質と混合することが可能である。
【０００６】
さらに、ＷＯ０２／０５８４４は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）のボツリヌス毒素複合体の少なくとも１つのヘマグルチニンと潜在的に無毒な非赤血球凝集性タンパク質（ＮＴＮＨ）との複合体中に組み込まれている、経口的に生物が利用可能なタンパク質および低分子薬物の提供について記述している。しかし、＜５０ｋＤａの分子量を有するポリペプチドへ組み込みは、利益が上がる商品化に十分になるほど効果的ではないことが分かっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の根底にある問題は、ポリペプチドを、経口的に生物が利用可能にする方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
この問題は、特許請求の範囲に規定されている主題事項によって解決される。
【０００９】
添付の図は、本発明を説明するものである。
【００１０】
用語「タンパク質複合体」は、本明細書で使用されるとき、他の選択されたポリペプチドを、ヒトおよび動物の血液系内に輸送することが可能な媒体を指す。該タンパク質複合体は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型の少なくとも１つに由来するボツリヌス毒素複合体の少なくとも１つのヘマグルチニンと、潜在的に無毒な非赤血球凝集性タンパク質（ＮＴＮＨ）とからなる。該ヘマグルチニンおよびＮＴＮＨは、クロストリジウムに存在するタンパク質を代表し、そのたんぱく質は、自然に、ボツリヌス毒素とボツリヌス毒素複合体を形成する。明確にするために、該タンパク質複合体は、しかしながら、ボツリヌス毒素を含まないことを言及すべきである。
【００１１】
用語「ボツリヌス毒素複合体」は、本明細書で使用されるとき、ボツリヌス毒素、ヘマグルチニンおよび無毒な非赤血球凝集性タンパク質（ＮＴＮＨ）を含む、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）由来のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型の、天然のタンパク質凝集体に関する。
【００１２】
用語「ポリペプチド」または「選択されたポリペプチド」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも２つのアミノ酸からなるペプチドに関する。該ポリペプチドは、線状、環状または分枝状であってもよい。さらに、該ポリペプチドは、複数のアミノ酸鎖からなってもよく、該鎖は、たとえばジスルフィド結合により、互いに連結されていてもよい。さらに、該ポリペプチドは、修飾されたアミノ酸および通常の翻訳後修飾、たとえばグリコシル化等を含んでもよい。該ポリペプチドは、薬理学的または免疫学的に活性なポリペプチドであってもよく、または診断目的に使用されるポリペプチド、たとえば抗体であってもよい。
【００１３】
用語「担体」は、本明細書で使用されるとき、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型のボツリヌス毒素複合体から選択されるボツリヌス毒素の重鎖（Ｈｃ）全体または重鎖のＮ末端フラグメントに関する。
【００１４】
用語「ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲート」、「Ｈｃ−コンジュゲート」または「コンジュゲート」は、本明細書で使用されるとき、選択されたポリペプチドに共有結合されている担体に関する。たとえば、インスリン−Ｈｃ−コンジュゲートは、ボツリヌス毒素の重鎖またはそのＮ末端フラグメントに連結されたインスリンからなる分子に関する。
【００１５】
用語「ネオコンプレックス（ｎｅｏｃｏｍｐｌｅｘ）」は、本明細書で使用されるとき、Ｈｃ−コンジュゲートが組み込まれているタンパク質複合体の複合体に関する。
【００１６】
細菌ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）は、タンパク質を経口経路により生体内に移行させ、その後上記タンパク質はその標的細胞により取り込まれる、能率的な機構を持つようになった。上記タンパク質は、今までに知られている最も毒性の強い物質、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）−毒素（以下、ボツリヌス毒素とも称する）を表す。自然の状況で、ボツリヌス毒素は、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）により発現される、多数のさらなるタンパク質とのボツリヌス毒素複合体中に存在する。該ボツリヌス毒素複合体が経口投与されると、高分子の神経毒ボツリヌス毒素は、腸内で吸収され、続いて標的細胞である、運動終板における運動ニューロンに到達する。その作用部位で、該神経毒は、アセチルコリンの放出を妨害し、したがってそれぞれの筋肉の麻痺を来たす。
【００１７】
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）は、７つの血清型に分けられ、それらの毒素、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ型に基づいて区別される。該毒素は、約１５０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量を有するタンパク質を表す。該ボツリヌス毒素複合体は通常、汚染された食物とともに摂取され、腸で吸収されてその作用部位である運動終板に到達する。
【００１８】
該ボツリヌス毒素は、２つのサブユニットからなる。上記各サブユニットは、異なる機能を果たす：重鎖（分子量１００ｋＤａ）は、神経細胞に極めて特異的に結合し、続いて、軽鎖が、該細胞の細胞質中に転位できるようにする。天然のボツリヌス毒素では、重鎖（Ｈｃ）は、ジスルフィド架橋により軽鎖（Ｌｃ）に連結されている。該軽鎖は、神経細胞の泌小胞と膜との融合に関与するタンパク質（スネア（ＳＮＡＲＥ）タンパク質）を切断する、プロテアーゼの役割を果たす。したがって、該分泌小胞は、アセチルコリンを放出することができず、筋肉の活性化は阻止される。
【００１９】
両鎖はともに、元来、タンパク質分解的切断により合成されたポリペプチドに由来する。幾つかの型のクロストリジウムの場合には、該切断は、クロストリジウム自身のプロテアーゼ（Ａ型、Ｃ型、部分的にＢ型）により既に行われるが、他の型の場合には、該切断は、受容者の腸管内（トリプシン）かまたは組織内のみで行われる。単離形で、軽鎖または毒素全体の混入がない重鎖は、全く無毒であり、そのままで、神経細胞におけるアセチルコリンの放出を阻止することはできない。
【００２０】
クロストリジウムは、酸性環境で安定であるとともに、神経毒の変性およびタンパク質分解を防止し、さらに腸粘膜を介した取り込みを可能にする、ボツリヌス毒素との複合体（ボツリヌス毒素複合体）を形成する多数のさらなるタンパク質を合成する。
【００２１】
以下、複合タンパク質と呼ぶ、さらなるタンパク質は、多数のヘマグルチニンおよび約１２０，０００Ｄａの分子量を有する無毒な非赤血球凝集性タンパク質（ＮＴＮＨ）を表す。該さらなるタンパク質は、タンパク質複合体を形成する。Ａ型のボツリヌス毒素複合体の場合には、以下のヘマグルチニンが記載されている：約１６，９００Ｄａを有するＨａ２、約２１，０００Ｄａを有するＨａ３ａ、約５２，０００Ｄａを有するＨａ３ｂおよび約３５，０００Ｄａを有するＨａ１。
【００２２】
Ｂ〜Ｇ型のボツリヌス毒素複合体は、類似したスキームに従って構築される。１例として、Ｂ型のボツリヌス毒素複合体に言及する。この場合、該ＮＴＮＨに加えて、約７０，０００Ｄａの分子量を有するＨＡ−７０、約１７，０００Ｄａの分子量を有するＨａ−１７、および約３３，０００Ｄａの分子量を有するＨａ−３３が記載されている（Ｂｈａｎｄａｒｉ，Ｍ．ら（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ３５，２０７〜２１４ページ参照）。
【００２３】
さらに、Ｅａｓｔ，Ａ．Ｋ．ら（（１９９４）Ｓｙｓｔｅｍ  Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１７，３０６〜３１２ページ）は、Ｂ型のＨａ−３３の配列を、Ａ型およびＣ型の配列と比較して記述している。Ｃ型およびＤ型に関しては−Ａ型と同様に−Ｈａ３３（＝Ｈａ１）に加えて、記述されており約３３，０００Ｄａの分子量を有するＨａ３ｂ、約５３，０００Ｄａを有するＨａ３ｂおよび約２２〜２４，０００Ｄａを有するＨａ３ａおよび約１７，０００Ｄａを有するＨａ２も記述されている（Ｉｎｏｕｅ，Ｋ．ら、（１９９９）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４５，２５３３〜２５４２ページ参照）。
【００２４】
意外なことに、本発明者は、単独のまたはポリペプチドに連結された、ボツリヌス毒素の重鎖のみ（これは、軽鎖を含まないことを意味する）が、該タンパク質複合体中に定量的に組み込まれることを再構成実験で発見した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
該ポリペプチドは、ボツリヌス毒素の重鎖に化学的に連結させて、少なくとも１つの複合タンパク質からなるタンパク質複合体に組み込んでもよい。該タンパク質を重鎖に連結させる場合、複数の化学的方法を使用することができる。２つの異なるタンパク質の連結を可能にする広範囲の二官能性試薬がある。優先的に、カップリングパートナーのシステインとジスルフィド架橋を確立する試薬が使用される。その後、担体、重鎖への連結が、次のステップで実行される。このようなカップリングに適するのは、たとえばＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジ−３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオネート）またはＤＴＤＰ（４，４′−ジチオジピリジン）等の試薬であり、その場合、タンパク質の間にスペーサーがない、単一のジスルフィド架橋が確立される。上記カップリングは、還元条件でｉｎ  ｖｉｖｏで、たとえば細胞質内でチオレドキシン系により、切断できるという利点を有する。この場合、該カップリングは、該タンパク質複合体への重鎖の組み込みが妨げられず、また該ポリペプチドの生物学的活性が保持されるように、選択される。あるいは、重鎖と該ポリペプチドとのカップリングは、適当な発現系における組換え融合タンパク質として、両ペプチドを合成することにより得ることも可能である。
【００２６】
担体に連結されたポリペプチドは、優先的に、薬理学的にまたは免疫学的に活性なポリペプチドであり、治療効果または予防効果がある可能性がある、本発明によるタンパク質複合体を使用して経口投与される。選択されるポリペプチドは、たとえばホルモン類、サイトカイン類、酵素類、成長因子類、抗原類、抗体類、インヒビター類、レセプターアゴニストまたは受容体アンタゴニスト、または凝固因子であってもよい。この点に関して、該ポリペプチドが組換えで作られたか、または天然源から単離されたかは、決定的に重要ではない。好ましいポリペプチド類は、インスリン、エリスロポエチン、インターフェロン類、インターロイキン類、ＨＩＶプロテアーゼインヒビター類、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球／マクロファージ刺激因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＰＤＧＦ（血小板由来成長因子）、ＦＧＦ（線維芽細胞成長因子）、プラスミノーゲン活性化因子、たとえばＴＰＡ（組織プラスミノーゲン活性化因子）、レニンインヒビター類、ヒト成長因子、ＩＧＦ（インスリン様成長因子）、ワクチン、たとえば破傷風ワクチン、Ｂ型肝炎ワクチン、ジフテリアワクチン等、抗体たとえばハーセプチン（Ｈｅｒ２に対する抗体）、ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）に対する抗体、ＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦに対する抗体、ＩｇＥに対する抗体、ＣＤ１１ａに対する抗体、カルシトニン、ウロキナーゼ、ストレプトキナーゼ、血管新生インヒビター、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘａ因子アンタゴニスト、メタロプロテイナーゼインヒビターである。
【００２７】
診断目的で使用されるポリペプチドは、たとえば抗体またはリガンドであってもよく、該ポリペプチドは、標識されていてもよい。標識として、ヒトまたは動物の体内で検出することが可能なあらゆる標識を考えることが可能である。好ましい標識は、同位元素、たとえばＣ13、または放射性標識である。標識抗体は、腫瘍の検出に使用することができ、標識リガンドは、たとえば病理的受容体の検出に使用することができる。
【００２８】
該ポリペプチドに連結された担体は、タンパク質複合体に組み込まれる。該タンパク質複合体は、少なくとも１つのヘマグルチニンおよび必要に応じて少なくとも１つのＮＴＮＨから構成される。この点に関して、該ヘマグルチニンおよびＮＴＮＨは、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）のＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型の天然のボツリヌス毒素複合体から選択される。しかし、該タンパク質複合体は、その天然の組成物と異なる組成物を含んでもよく、たとえばＮＴＮＨ−タンパク質を含まず、ヘマグルチニンのみで構成されていてもよい。さらに、該タンパク質複合体は、天然のボツリヌス毒素複合体より少ないヘマグルチニン種で構成されていてもよく、選択的に３つの異なるヘマグルチニン種、選択的に２つの異なるヘマグルチニン種、特に好ましくは１つのヘマグルチニン種で構成されており、いずれの場合にも、該タンパク質複合体は、ＮＴＮＨ−タンパク質を含んでもよく、含まなくてもよい。さらに、該タンパク質複合体は、１つまたは複数のヘマグルチニン種および／または異なる血清型のＮＴＮＨ−タンパク質の混合物から構成されてもよい。
【００２９】
好ましいのは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型のボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）由来の天然のタンパク質複合体（ボツリヌス毒素を含まない）に相当するタンパク質複合体、たとえばＢ型のボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）由来のＨａ１、Ｈａ２、Ｈａ３ａ、Ｈａ３ｂおよびＮＴＮＨとのタンパク質複合体である。さらに、該タンパク質複合体は、Ｈａ１、Ｈａ２、Ｈａ３ａおよびＮＴＮＨを、Ｈａ１、Ｈａ２、Ｈａ３ｂおよびＮＴＮＨを、ならびにＨａ１およびＨａ３ａを、Ｈａ３ｂおよびＮＴＮＨを含んでもよく、さらに、Ｈａ２、Ｈａ３ａ、Ｈａ３ｂおよびＮＴＮＨを、Ｈａ１、Ｈａ２およびＮＴＮＨを、Ｈａ１、Ｈａ３ａおよびＮＴＮＨを、Ｈａ１、Ｈａ３ｂおよびＮＴＮＨを、Ｈａ２、Ｈａ３ａおよびＮＴＮＨを、Ｈａ２、Ｈａ３ｂおよびＮＴＮＨを、Ｈａ３ａ、Ｈａ３ｂおよびＮＴＮＨを、または列挙した複合タンパク質のさらなる任意の組み合わせを含んでもよい。さらに、該タンパク質複合体は、ヘマグルチニンの１つおよびＮＴＮＨを含んでもよく、加えて、該タンパク質複合体は、ＮＴＮＨを含まない、ヘマグルチニンの列挙された組み合わせを含んでもよい。Ｂ型の典型的なタンパク質複合体によれば、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型のヘマグルチニンおよび／またはＮＴＮＨのタンパク質複合体がさらに好ましい。
【００３０】
本発明のさらなる態様は、本発明によるタンパク質複合体の製造方法の提供に関し、当該方法は、下記のステップ：ａ）少なくとも１つボツリヌス毒素複合体２．０〜約６．５の範囲のｐＨ値で、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）からＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、ＦまたはＧ型の少なくとも１つのボツリヌス毒素複合体を個別に単離するステップと、ｂ）ｐＨ値を、約７．０〜約１０．０の範囲の値に上げるステップと、ｃ）クロマトグラフ法を使用して、該複合タンパク質からそれぞれのボツリヌス毒素を除去するステップと、ｄ）ステップｃ）で得られた複合タンパク質を、選択されたポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートと混合するステップ、またはｅ）ステップｃ）で得られた複合タンパク質を分離し、少なくとも１つの複合タンパク質を、ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートと混合するステップと、ｆ）ステップｄ）またはｅ）の混合物を、約６．５〜約２．０の範囲、優先的に約４．０〜約６．０の範囲、特に好ましくは６．０の、ｐＨ値の緩衝溶液に対して透析するステップとを含む。
【００３１】
該複合タンパク質は、天然のボツリヌス毒素複合体から単離することが可能である。典型的な単離方法は下記の通りである：第一に、該ボツリヌス毒素複合体を、酸性のｐＨ値で、優先的に約２．０〜約６．５の範囲のｐＨ値で、殊に好ましくは約４．０〜約６．５の範囲、特に好ましくはｐＨ６．０で、クロストリジウムから単離する。ｐＨ値を、約７．０〜約１０．０の範囲の値、優先的に約７．０〜約８．０の範囲のｐＨ値に上げた後、タンパク質化学でよく使用されるクロマトグラフ法で、該ボツリヌス毒素を除去する。該複合体は、ｐＨ値＜６．５で安定しており、それぞれ、中性およびアルカリ性のｐＨ値で分解して、毒素が放出されるため、上記方法は有効である。次いで、毒素を含まない複合タンパク質を、ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートと混合してもよく、そのｐＨ値は、タンパク質化学でよく使用される緩衝液に対する、特に好ましくはリン酸緩衝液、酢酸緩衝液、またはクエン酸緩衝液に対する透析により、約２．０〜約６．５の範囲のｐＨ値に、優先的に約４．０〜約６．０の範囲、特に好ましくはｐＨ６．０に下げてもよい。それによって、ポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートを含むポリペプチドタンパク質複合体が形成され、このような方法で、選択されたポリペプチドの経口生体内利用度を提供する。
【００３２】
タンパク質化学でよく使用される、他のクロマトグラフ法、濃度法および沈殿もまた、該複合タンパク質の単離に使用することができる。
【００３３】
それらのＤＮＡ配列が知られているため、該複合タンパク質もまた、ＤＮＡ組換え技術を用いて、特定の宿主生物で、組換えにより製造することが可能である。このようにして製造される複合タンパク質はさらに、修飾を示す可能性があり、これは、該複合タンパク質の誘導体である可能性があることを意味する。この点に関して、修飾は、欠失、付加、挿入または置換のみならず、アミノ酸の化学的修飾、たとえばメチル化、またはアセチル化ならびに翻訳後修飾、たとえばグリコシル化またはリン酸化リン酸化も意味する。異なる宿主における所望のタンパク質の発現は、当業者に周知であり、本明細書に別途、記載する必要はない。この点に関して、該タンパク質複合体に必要な複合タンパク質は、宿主生物で別々に発現されてもよく、同時に発現されてもよい。好ましいのは、細菌、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）またはクロストリジウム・ディフィシル（ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）における、あるいは、真核細胞、たとえばＣＨＯ細胞での、昆虫細胞での、たとえばバキュロウイルス系を使用した、または酵母細胞における、組換え複合タンパク質の製造である。該複合タンパク質は、上記の方法に従って、単離して選択されたポリペプチド−コンジュゲートと混合することが可能である。さらに、該選択されたポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートは、複合タンパク質と一緒に融合タンパク質として、宿主生物で同時に発現させることが可能である。特に好ましいのは、酵母で、ＹＡＣを使用して、該選択されたポリペプチド−Ｈｃ−コンジュゲートと一緒に、それぞれの複合タンパク質を同時に、または別々に製造することである。
【００３４】
さらに、本発明によるタンパク質複合体は、組換えで製造された複合タンパク質および天然のボツリヌス毒素複合体から単離された複合タンパク質の混合物を含んでいてもよい。
【実施例】
【００３５】
下記の実施例は、本発明を例証するものであって、限定するものと考えてはならない。
【００３６】
＜実施例１：ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素Ａ型の重鎖の単離＞
以下の通りに記載された修飾を示す、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素Ａ型（菌株ＡＴＣＣ  ３５０２）を、公開された方法に従って培養した。（Ｄａｓ  Ｇｕｐｔａ  ＆  Ｓａｔｈｙａｍｏｏｒｔｈｙ、１９８４、Ｔｏｘｉｃｏｎ  ２２、４１５〜４２４ページ参照）。７２時間培養後、３Ｎの硫酸を加えて、該毒素を沈殿させた。沈殿を抽出し、核酸を除去した後、硫酸アンモニウムを用いて該毒素を沈殿させた。可溶化して透析した後、ｐＨ６．０でＤＥＡＥ−セファロースクロマトグラフィー（２．６×１５ｃｍ）を実施した。結合した毒素を、１５０ｍＭのＮａＣｌで溶離し、５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌに対して透析し、セファロースＱカラム（２．６×１０．０ｃｍ）を使用して、さらなるイオン交換クロマトグラフィーに付した。該神経毒を、ＮａＣｌ勾配（０−３００ｍＭのＮａＣｌ）で溶離した。該神経毒含有画分をプールし、１０ｍＭのリン酸ナトリウム（ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ）ｐＨ７．０に対して透析した。透析液をセファロースＳカラム（１．６×１１ｃｍ）に負荷し、ＮａＣｌ勾配（０−３００ｍＭのＮａＣｌ）で溶離した。該クロマトグラフィーで、高純度神経毒が得られた。
【００３７】
以下の通りに記載された修飾を示す、出版された文献にしたがって、該神経毒の重鎖の単離を実施した（Ｋｏｚａｋｉら、１９８１、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．Ｂｉｏｌ．３４、６１〜６８ページ参照）。この点に関して、高純度神経毒Ａ型を、ホウ酸／リン酸緩衝液ｐＨ８．５に対して透析し、ＱＡＥセファデックス充填カラム（１×５ｃｍ）に結合させた。１０ｍＭのＤＴＥをさらに含むホウ酸／リン酸緩衝液で洗浄した後、カラムを、１５０ｍＭのＤＴＥおよび２Ｍの尿素をさらに含むホウ酸／リン酸緩衝液３ｍｌとともに一晩インキュベートした。次に、ホウ酸／リン酸緩衝液＋１０ｍＭのＤＴＥ＋２Ｎ尿素で軽鎖を溶離した後、同緩衝液と混合された重鎖を、２００ｍＭのＮａＣｌで溶離した。残存する不完全に除去された活性な神経毒を除去するために、プール画分をアフィニティーカラム上に４回ポンピングした。該アフィニティーカラムにセファロースを充填し、それにボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）毒素Ａ型の軽鎖に対する抗体を結合させた。上記クロマトグラフィー後、軽鎖または生来の毒素を含む不純物を含まない重鎖が得られた。高濃度でも、活性テスト（マウス横隔膜アッセイ）で、活性は認められなかった。
【００３８】
＜実施例２：ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｂ型の複合タンパク質の調製＞
ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｂ型の複合タンパク質は、一部の工程に変更を加えた、公開された方法（Ｅｖａｎｓら、１９８６；Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈ．１５４、４０９〜４１６ページ参照）に従って、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｂ型（菌株Ｏｋｒａ）の発酵後、単離される：
【００３９】
実施例１の場合と同様に、酸沈殿バイオマスの抽出後、抽出液から核酸を沈殿させ、有毒なボツリヌス毒素複合体を、上清から硫酸アンモニウムで沈殿させた。この沈殿を０．０５Ｍのクエン酸ナトリウム＋１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ５．５）中に再懸濁させ、透析後、高分子の複合体は、カラム（５ｘ１２ｃｍ）に結合されず、カラムを定量的に通過する、ＤＥＡＥ−セファデックスクロマトグラフィーを使用して精製した。５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ７．９）に対して透析後、該複合体溶離液を、セファロースＱカラムを使用したクロマトグラフィーに付し、該複合タンパク質は、カラムに結合されなかったが、該神経毒は、カラムに結合されたまま残り、塩勾配のみで溶離された。同緩衝液（５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣ１、１ｍＭのＥＤＴＡ）で平衡化されているＱ  Ｈｙｐｅｒ  Ｄカラム（２．６×１３ｃｍ）で、該複合タンパク質をさらに精製した。毒素を含まないタンパク質複合体を、塩化ナトリウム勾配（０〜３００ｍＭのＮａＣｌ）で溶離した。
【００４０】
最後の痕跡量の神経毒を、アフィニティークロマトグラフィーで除去した。このために、アフィニティーマトリクスとして、ボツリヌス神経毒Ｂ型に対する抗体（ＩｇＧ画分）に結合したセファロースが入っているカラム上に、該複合体含有溶液を４回ポンピングした。その後、活性テスト（マウス片側横隔膜アッセイ）で、生物学的活性（毒性）はもはや検出できなかった。
【００４１】
＜実施例３：ボツリヌス菌Ｂ型のタンパク質複合体への、ボツリヌス毒素Ａ型の重鎖の組み込み＞
実施例のＢ型由来の高純度複合タンパク質１００μｇ（３４μｌ）を、実施例１のＡ型由来の単離された重鎖２００μｇ（６９０μｌ）と混合した。該混合物を、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ）緩衝溶液ｐＨ６．０に対して、２〜８℃で３日間透析した。その後、４Ｍ硫酸アンモニウム１５０μｌを加えて、４５０μｌを沈殿させた。こうした沈殿条件で、該タンパク質複合体に組み込まれていない重鎖は溶液中に残るが、タンパク質複合体（組み込まれた重鎖を含むまたは含まない）は、定量的に沈殿する。一晩、再インキュベートした後、ペレットを遠心分離し、１２０μｌのリン酸ナトリウム（ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ）、ｍｍＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）中に再懸濁した。バイオセプ（ＢｉｏＳｅｐ）Ｓ−３０００を通す「ゲル濾過」で、タンパク質複合体の形成をテストした。クロマトグラムは、１つのピーク（約５００，０００ダルトンの分子量）のみを示した。ピーク画分は、Ｂ型由来の複合タンパク質およびボツリヌス毒素Ａ型由来の重鎖の両者を含むことが、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動から分かった。
【００４２】
＜実施例４：ボツリヌス毒素Ａ型の重鎖への、インスリンの結合ＳＰＤＰ−インスリンの合成＞
インスリン（ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）、組換え）１２．５ｍｇを、緩衝液（１０ｍＭ炭酸ナトリム  ｐＨ＝６．９）６．３ｍｌに溶解した。このために、α−アミノ基をブロックするためにｃｉｔａｃｏｎａｎｈｙｄｒｉｄｅ（フルカ（Ｆｌｕｋａ））３μｌを正確にとり、混合物を室温でインキュベートし、ｐＨ値を観測した。１ＭのＮａＯＨを加えることにより、ｐＨ値を６．８〜７．０に維持した。続いて、該反応混合物を、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウムｐＨ＝７．３に対して、４℃で一晩透析した。
【００４３】
ＳＰＤＰ（Ｎ−スクシンイミジル３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオネート、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ））６．２ｍｇを、５００μｌのＤＭＦに溶解した。上記溶液２７４μｌを、インスリン誘導体（ｐＨ８．３に調整済）６．３ｍｌに加え、その混合物を、ミキサー上で、室温で１時間半インキュベートした。依然として残存するＳＰＤＰを、５０ｍＭのリン酸ナトリウム、１００ｍＭのＮａＣｌ（ｐＨ＝７．３）に対する透析で除去した。保護基を除去するために、水に対して（室温で２時間）透析を実施し、次いで１０ｍＭのＨＣｌに対して室温で５時間半、透析を実施した。最後に、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１００ｍＭ塩化ナトリウム、４ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ＝７．３）に対して透析を一晩実施した（ＳＰＤＰ溶液の最終体積：７ｍｌ）。
【００４４】
＜インスリン−Ｈｃ−コンジュゲートの製造＞
実施例１に従って単離された、ボツリヌス毒素Ａ型由来の重鎖２５ｍｇをインスリン−ＳＰＤＰ８ｍｇと混合し（最終量：４１．５ｍｇ）、４℃で４日間インキュベートした（回転ミキサー）。未結合のインスリン−ＳＰＤＰを除去するために、５０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡに対して透析を実施したが、透析ホースは、５０ｋＤという排除限界を示した。
【００４５】
生成物をウェスタンブロットで分析した。インスリンに対する抗体を使用して、〜１００ｋＤの分子量を有するタンパク質を同定した。したがって、これは、重鎖およびインスリンのコンジュゲート（＝インスリン−Ｈｃ−コンジュゲート）に相当する。３Ｔ３細胞を使用して、該インスリンの活性をｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出した。
【００４６】
＜実施例５：ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｂ型のタンパク質複合体へのインスリン−Ｈｃ−コンジュゲートの組み込み＞
（実施例４の）インスリン−Ｈｃ−コンジュゲート７．４ｍｇを、５２ｍｌ中のタンパク質複合体（実施例２に従って精製）２１ｍｇと混合し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）に対して、４℃で４日間、透析した。サンプル５００μｌを、バイオセプ（ＢｉｏＳｅｐ）Ｓ−３０００−カラム（フェノメネックス（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ））を使用したゲル濾過で分析した。唯一の高分子ピークを、〜６００ｋＤの分子量に示した。ピーク画分のサンプルを、ウェスタンブロットで分析した。インスリンに対する抗体を使用して、インスリン（インスリン−Ｈｃ−コンジュゲートとして）が、該タンパク質複合体（ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）由来の複合タンパク質からなる）に組み込まれたことが明らかにされた。
【００４７】
＜実施例６：ブドウ糖負荷試験を使用した、ラットでのインスリン−ネオコンプレックスのテスト＞
タンパク質複合体に組み込まれたインスリン−Ｈｃ−コンジュゲート（以下、インスリン−ネオコンプレックスと称する）の、経口投与後の効力を、ラットを用いた動物実験でテストした。
【００４８】
ラット４匹のグループに、インスリン−ネオコンプレックスかまたは非結合インスリン−Ｈｃ−コンジュゲート（複合タンパク質を含まない）のいずれかを投与した。非投与動物は、コントロールの役割をした。インスリン用量は、両群で同じであり、２Ｕ／動物であった。溶液を、経管補給により投与した。さらなるコントロールとして、０．１Ｕ、０．６Ｕおよび２．０Ｕのインスリンを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。インスリン−ネオコンプレックスおよび非結合インスリン−Ｈｃ−コンジュゲート投与の１時間後に、動物にグルコース（２ｇ／ｋｇ経口的）を負荷した。この時、陽性コントロール（０．１Ｕ、０．６Ｕおよび２．０単位のインスリン）の注射も行った。３０分、６０分、１２０分および１８０分後、血液を採取してグルコースレベルを測定した。６０分後に、コントロール動物の場合には、約１４０ｍｇ／ｍｌというグルコース最高濃度に達したが、インスリン−ネオコンプレックス投与動物の場合には、その濃度は僅かに上昇しただけであった（図１参照）。一連のグルコース濃度（曲線下面積、ＡＵＣ）を考えるのであれば、インスリン−ネオコンプレックスの効果は、腹腔内（ｉ．ｐ．）投与されたインスリンに匹敵する（図２）。
【００４９】
インスリン−Ｈｃ−コンジュゲートのみを投与した動物の場合には、該グルコース濃度は、コントロールの場合と同様の挙動を示し、その濃度は６０分まで大幅に上昇した。このことから、インスリン−Ｈｃ−コンジュゲート単独では、インスリンレベルに対する影響はなく、したがって、タンパク質に組み込まれていないインスリン−Ｈｃ−コンジュゲートの投与は、インスリンを、経口的に生物が利用可能にするのに適さないと結論づけることができる。
【００５０】
＜実施例７：インスリン−Ｈｃ−コンジュゲートと、ボツリヌス毒素の重鎖のＣ末端に連結されたインスリンとの融合物の比較＞
ボツリヌス毒素Ａ型の重鎖（Ｍｒ〜５０ｋＤ；以下、Ｈ１−フラグメントとも称する）のＣ末端を、大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）で組換えにより発現させた。このために、Ｈｉｓ−ｔａｇに連結されたボツリヌス毒素Ａ型のＣ末端フラグメントのＤＮＡ配列ａａ  ８７１−１２９６（ＮＩＩＮＴ．．．．．．ＥＲＰＬ）を、ベクターｐＢＮ２９４７７２にクローニングした；大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ  Ｎ１５［ｐＲＥＰ４］（キアゲン（Ｑｕｉａｇｅｎ））を、そのベクターによって形質転換し、発現したフラグメントを、Ｎｉ−ＮＴＡ−セファロースカラムを使用したアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【００５１】
ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｂ型由来の毒素を含まない複合タンパク質１００μｇを、組換えＣ末端フラグメント２００μｇ（３４０μｌ）と混合し、１５０ｍＭのＮａＣｌを含む５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ）（ｐＨ６．０）に対して、２〜８℃で３日間、透析した。その後、反応を、Ｈ2Ｏとともに４５０μｌまで貯蔵し、４Ｍ硫酸アンモニウム１５０μｌを加えて沈殿させた。こうした沈殿条件で、該タンパク質複合体に組み込まれていないＣ末端フラグメントは溶液中に残るが、タンパク質複合体（組み込まれたＣ末端フラグメントを含むまたは含まない）は、定量的に沈殿する。一晩、再インキュベートした後、ペレットを遠心分離し、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ）１５０μｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ（ｐＨ６．０）中に再懸濁した。１００μｌを、バイオセプ（Ｂｉｏｓｅｐ）Ｓ−３０００ゲル濾過カラムで、該複合体と、混入物質として存在する可能性がある未結合のＣ末端フラグメントに分離した。２つのピークが溶離された：第１のピーク（１２．２分）は、該タンパク質複合体を示す。非常に小さいピークは、遊離のＣ末端フラグメント−フラグメントを示す。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して、第１のピークを試験した；該複合タンパク質のみが存在し、したがって、該Ｃ末端フラグメントは、該複合体に組み込まれていなかったが、硫酸アンモニウム沈殿の間、溶液中で未結合のままであった。結論として、ボツリヌス毒素のＣ末端フラグメントを、該複合体に組み込むことはできない。
【００５２】
＜実施例８：インスリン−Ｈ１−コンジュゲートとインスリン−Ｈｃ−コンジュゲートの生物学的活性の比較＞
ボツリヌス毒素Ａ型の重鎖のＣ末端フラグメント（Ｈ１−フラグメント）を、実施例７に記載の通りに製造した。誘導体化後、Ｈ１−フラグメント１３ｍｇを、８ｍｇのインスリン−ＳＰＤＰと混合した。インスリン−ＳＰＤＰの製造は、実施例４と同様に実行した。４℃で２４時間インキュベートした後、未結合のインスリン−ＳＰＤＰを、５０ｍＭトリス（Ｔｒｉｓ）／ＨＣｌ、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡに対する透析で除去した。
【００５３】
該重鎖の該複合体への組み込み（実施例５）の場合には、３．８ｍｇ（Ｈ１−インスリン−コンジュゲート）を、毒素を含まないタンパク質複合体（実施例２に従って精製）２１ｍｇとともに、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ＮａＰｈｏｓｐｈａｔｅ）、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ６．０に対して、４℃で５日間、透析した。動物実験を使用して、この混合物をテストした。
【００５４】
ラット４匹のグループに、インスリン−Ｈｃ−コンジュゲート（実施例５）またはインスリン−Ｈ１−コンジュゲート＋複合タンパク質または生理食塩水のいずれかを投与した。最初の２群の用量は、動物１匹当たりインスリン２Ｕであった。投与の１時間後、グルコースを負荷した（０．５ｇ／ｋｇ  ｉ．ｐ．）。３０分後、生理食塩水を投与された動物の場合には、血糖値の測定値は、１７０±１２ｍｇ／ｄｌを示したが、ＨＣ−コンジュゲートネオコンプレックスを投与された群では、１１５±１４ｍｇ／ｄｌまで上昇しただけであった。グルコース注射の初期値は、８５±１４ｍｇ／ｄであった。結論として、該複合タンパク質を含むＨ１−インスリン−コンジュゲートは、動物実験で少しも影響を示さなかった。
【００５５】
＜実施例９：Ｃ末端短縮重鎖を有するインスリン−コンジュゲートの使用＞
Ｃ末端が３０アミノ酸分短縮された鎖を得るために、ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ａ型（ＡＴＣＣ  ３５０２）の培養から染色体ＤＮＡを作成した。ＰＣＲ増幅、を用いて、軽鎖をコードし、ループ領域にトロンビン切断部位もさらに含む遺伝子フラグメントを、プラスミドｐＱＥ６０（ｐＱＥ−ＢｏＮＴ（Ａ）−Ｌ）にクローニングした。Ｃ末端が３０アミノ酸分短縮された鎖をコードする、ＰＣＲ増幅遺伝子フラグメントを、該染色体ＤＮＡから作成した。上記遺伝子フラグメントを、ＢｏＮＴ（Ａ）−Ｌコード遺伝子フラグメントの３’末端にクローニングし、発現プラスミドｐＱＥ−ＢｏＮＴ（Ａ）−Ｌ（ｐＱＥ−ＢｏＮＴ（Ａ）−Ｌ  Ｈ３０ｍｉｎ）とした。大腸菌発現菌株Ｍ１５［ｐＲＥＰ４］（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を、上記プラスミドで形質転換した。５００μＭのＩＰＴＧで誘導（２５℃、一晩）した後、該細胞を溶解し、Ｎｉ−ＮＴＡ−アガロースカラムを使用したクロマトグラフィーに付した。このような方法で得て、３０アミノ酸分、短縮されている毒素から、重鎖Ｈ３０ｍｉｎを、実施例１に記載の通りに単離した。実施例４と同様に、該重鎖Ｈ３０ｍｉｎを、インスリンとコンジュゲート形成させ、実施例５と同様に、ボツリヌス菌（Ｃ．ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）Ｂ型由来の無毒素複合体に融合させた。
【００５６】
このような方法で合成されたネオコンプレックスを、動物４匹によるブドウ糖負荷試験を使用して、複合体を含まないコントロール（実施例８による）と比較してテストした。インスリン２Ｕに相当する用量で、血糖値は、３０分後に１１０±１８ｍｇ／ｄｌに上昇したが、コントロール動物の場合には、１６８±１４ｍｇ／ｄｌに上昇した（初期値９０±５ｍｇ／ｄｌ）。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、ラットを用いたブドウ糖負荷試験の結果をグラフで示す図である。動物４匹に、２Ｕのインスリン−Ｈｃ−コンジュゲートを、また動物４匹に、複合体（インスリン複合体）に組み入れられた２Ｕのインスリン−Ｈｃ−コンジュゲートを経口的投与（経管補給）した。６０分後、該動物に２ｇ／ｋｇグルコースを負荷した。さらなる３群に、０．１Ｕ、０．６Ｕ、２Ｕのインスリンを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与し、２ｇ／ｋｇグルコースも同時に投与した。約３０分間隔で、グルコースレベルを測定した。
【図２】図２は、インスリン−Ｈｃ−コンジュゲート、複合体（インスリン複合体）に組み込まれたインスリン−Ｈｃ−コンジュゲートおよび腹腔内（ｉ．ｐ．）投与されたインスリンの効果の比較の結果をグラフで示す図である。実験条件は、図１に示すものと全く同じである。グルコース濃度の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。
【図１】
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【図２】
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