(57)【要約】  薬理学的剤を投与することによる中枢神経系、髄膜若しくは筋細胞でのタンパク質合成を選択的に妨害するための方法および組成物が開示される。とりわけ、ＳＯＤ−１タンパク質合成を妨害する方法および組成物が開示される。
2008531710.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
薬理学的剤が核内受容体と相互作用しかつＳＯＤタンパク質をコードする遺伝子の転写を阻害するように、該剤に細胞に投与することを含んでなり、該剤がピリメタミン若しくはその機能的アナログである、細胞中のＳＯＤタンパク質の産生の低下方法。
【請求項２】
細胞が、脳中の細胞、脊髄中の細胞、髄膜組織中の細胞および筋中の細胞よりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
細胞がＡＬＳを伴う被験体の神経細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＳＯＤタンパク質がＳＯＤ−１タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
薬理学的剤がピリメタミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
薬理学的剤が、ベンゼン環中に最低１個の修飾を伴うピリメタミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
薬理学的剤が、ピリミジン環中に最低１個の修飾を伴うピリメタミンである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
遺伝子の転写の阻害がＳＯＤタンパク質の発現レベルをモニターすることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
遺伝子の転写の阻害が、ＳＯＤタンパク質をコードする核酸分子のレベルをモニターすることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
核酸分子がリボ核酸若しくはデオキシ核酸よりなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
予防上若しくは治療上有効な量の薬理学的剤を被験体に投与することを含んでなり、該剤はＳＯＤ−１タンパク質をコードする遺伝子の転写を阻害する、被験体における筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の症状の発生の予防またはその症状若しくは進行の改善方法。
【請求項１２】
薬理学的剤がピリメタミン若しくはその機能的アナログである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
薬理学的剤が、ベンゼン環中に最低１個の修飾を伴うピリメタミンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
薬理学的剤が、ピリミジン環中に最低１個の修飾を伴うピリメタミンである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
被験体の生存の延長をモニターすることによりＡＬＳの改善をモニターすることをさらに含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
ＡＬＳの改善をモニターする段階が、被験体の神経学的スコアをモニターすることを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＡＬＳの改善をモニターする段階が、ＳＯＤ−１タンパク質の発現レベルをモニターすることを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＬＳの改善をモニターする段階が、ＳＯＤ−１をコードする核酸分子のレベルをモニターすることを含んでなる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
核酸分子がリボ核酸若しくはデオキシ核酸よりなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年３月４日出願の米国仮出願第６０／６５８，５０５号（その開示全体は引用することにより本明細書に組み込まれる）に対する優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は最も一般に診断される進行性運動ニューロン疾患である。該疾患は、大脳皮質、脳幹および脊髄の運動ニューロンの変性を特徴とする（非特許文献１；非特許文献２）。該疾患の原因は未知であり、そして、ＡＬＳは、発症の典型となる、非対称の四肢の衰弱および疲労感、上肢の局在化線維束性痙攣ならびに／若しくは脚の痙直を患者が経験し始める場合にのみ診断されうる。ＡＬＳの少なくとも若干の発生に対する遺伝成分が存在する。
【０００３】
ほぼ全例において、散発性ＡＬＳおよび常染色体優性の家族性ＡＬＳ（ＦＡＬＳ）は臨床上同様である（非特許文献３）。若干の、しかし全部ではないＦＡＬＳの家系で、該疾患が染色体２１ｑ上の遺伝子欠損と結び付けられることが示された（非特許文献４）。
【０００４】
とりわけ、染色体２１ｑ上に位置するＳＯＤ−１遺伝子中の突然変異が家族性の形態のＡＬＳと関連しているようである。ＳＯＤ−１上の多様な突然変異の有害な影響は、もっともありそうには、ＳＯＤ−１活性の喪失よりむしろ毒性機能の獲得により媒介される（非特許文献５；非特許文献６）。毒性は不明である一方、該タンパク質それ自身の排除が該毒性を改善することができることを示唆する証拠が存在する。
【０００５】
神経変性疾患の経過を変え得る、若しくはこうした疾患を伴う患者の生存時間を延長し得る治療を開発することの必要性が存在する。とりわけ、ＡＬＳ患者の脳および脊髄で産生されるＳＯＤ−１タンパク質を減少させる必要性が存在する。野性型若しくは変異体ＳＯＤ−１タンパク質の形成を予防することは、疾患の進行を停止しかつＡＬＳ症状の改善を見込むとみられる。
【非特許文献１】Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、１９９１  ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク
【非特許文献２】Ｔａｎｄａｎら（１９８５）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１８：２７１−２８０、４１９−４３１
【非特許文献３】Ｍｕｌｄｅｒら（１９８６）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、３６：５１１−５１７
【非特許文献４】Ｓｉｄｄｉｑｕｅら（１９９１）Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２４：１３８１−１３８４
【非特許文献５】Ａｌ−ＣｈａｌａｂｉとＬｅｉｇｈ、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｔｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．、１３、３９７−４０５
【非特許文献６】Ａｌｉｓｋｙら（２０００）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．、１１、２３１５−２３２９
【発明の開示】
【０００６】
［発明の要約］
薬理学的剤を投与することによる脳、脊髄、髄膜および筋細胞中のタンパク質合成を妨害するための方法および組成物が開示される。とりわけ、ＳＯＤ−１遺伝子発現を減少させる方法および組成物が開示される。
【０００７】
本発明の方法および組成物は、例えば、ＳＯＤ−１  ｍＲＮＡの転写若しくは転写物の安定性を阻害するための剤、例えばピリメタミンを投与することにより、神経変性疾患に関連するタンパク質、例えばＳＯＤ−１の発現を減少若しくは阻害するために使用し得る。ＳＯＤ−１  ｍＲＮＡの減少はその場合ＳＯＤ−１の低下されたタンパク質レベルにつながり、それは細胞中でのその蓄積を減少させかつ疾患を改善する。変異体ＳＯＤ−１の発現および蓄積は、家族性ＡＬＳの根底にある広く受け入れられた病態生理学的機構であり、そして散発性の形態の該疾患でもまたある役割を演じているとみられる。
【０００８】
従って、一局面において、本発明は、核内受容体を調節する薬理学的剤を細胞に投与してその結果該剤が核内受容体と相互作用しかつＳＯＤタンパク質をコードする遺伝子の転写を阻害することを含んでなる、細胞中のＳＯＤタンパク質の産生の低下方法に関する。細胞は、例えばＡＬＳ（例えば家族性ＡＬＳ）を伴う被験体中の神経細胞、若しくは脊髄、髄膜組織中のいずれかの細胞、または筋細胞であり得る。ＳＯＤタンパク質はＳＯＤ−１タンパク質であり得る。細胞の例は、限定されるものでないが、ニューロン、介在ニューロン、神経膠細胞、小膠細胞、筋細胞、免疫応答に関与する細胞などを挙げることができる。
【０００９】
一態様において、薬理学的剤はピリメタミンおよびその機能的アナログである。別の態様において、薬理学的剤は、ベンゼン環中に最低１個の修飾をもつピリメタミンである。なお別の態様において、薬理学的剤はピリミジン環中に最低１個の修飾をもつピリメタミンである。
【００１０】
遺伝子の転写の阻害はＳＯＤタンパク質、例えばＳＯＤ−１タンパク質の発現レベルを測定することによりモニターすることを含んでなる。あるいは、遺伝子の転写の阻害は、例えばリボ核酸若しくはデオキシ核酸レベルをモニターすることによる、ＳＯＤタンパク質をコードする核酸分子のレベルをモニターすることを含んでなる。
【００１１】
別の局面において、本発明は、治療上有効な量の薬理学的剤を被験体に投与することによる、被験体におけるＡＬＳの症状若しくは進行の予防、改善若しくは処置方法に関し、該剤は細胞の核と相互作用しかつＳＯＤ−１タンパク質をコードする遺伝子の転写を阻害する。症状の改善は、被験体の生存の延長を測定すること、例えば被験体の神経学的スコアをモニターすることによりモニターし得る。あるいは、該改善は、ＳＯＤ−１タンパク質の発現レベル若しくはＳＯＤ−１タンパク質をコードする核酸分子のレベルをモニターすることにより決定し得る。
【００１２】
［発明の詳細な記述］
本発明の実務は、別の方法で示されない限り、当該技術分野の熟練内の微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の慣習的方法を使用する。こうした技術は文献に完全に説明されている。（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（最新版）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ編、最新版）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓとＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、最新版）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．ＨａｍｅｓとＳ．Ｈｉｇｇｉｎｓ編、最新版）；ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ、ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ編）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、第２版、Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．ＦｉｅｌｄｓとＤ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ編）を参照されたい）。
【００１３】
本発明がより明瞭に理解されるように以下の用語を定義する。
【００１４】
「神経変性障害」若しくは「神経変性疾患」という用語は本明細書で互換性に使用され、そして、被験体若しくは被験体群における正常な神経学的機能の損傷若しくは非存在、または異常な神経学的機能の存在を指す。例えば、神経学的障害は疾患、傷害および／若しくは加齢の結果であり得る。本明細書で使用されるところの神経変性障害は、神経細胞若しくは神経細胞のある集団の形態および／若しくは機能異常を引き起こす神経変性もまた包含する。形態および機能異常の制限しない例は、神経細胞の物理的劣化および／若しくは死、神経細胞の異常な成長パターン、神経細胞間の物理的結合の異常、神経細胞による物質（１種若しくは複数）例えば神経伝達物質の過小若しくは過剰産生、それが通常産生する物質（１種若しくは複数）を産生することの神経細胞の失敗、物質例えば神経伝達物質の産生、ならびに／または異常なパターン若しくは異常な時間での電気的衝撃の伝播を包含する。神経変性は被験体の脳のいかなる領域でも起こり得、そして、例えば筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、ハンチントン病、パーキンソン病、アルツハイマー病、プリオン関連疾患（ＣＪＤ）、脊髄性筋萎縮症、脊髄性小脳性運動失調および脊髄傷害を包含する多くの障害で見られる。
【００１５】
本明細書で使用されるところの「薬理学的剤」および「核内受容体を調節する薬理学的剤」という用語は互換性に使用することを意図しており、そして、これらの用語は、神経脊髄、髄膜若しくは筋細胞でのタンパク質合成を選択的に妨害する化合物（１種若しくは複数）を指す。とりわけ、ＳＯＤタンパク質、例えばＳＯＤ−１タンパク質のタンパク質合成を妨害する。好ましくは、薬理学的剤はピリメタミンおよびそのアナログである。
【００１６】
「調節する」若しくは「調節すること」若しくは「調節される」という用語は本明細書で互換性に使用され、該調節が被験体若しくは被験体群で治療効果を生じるような、変化ＳＯＤ−１活性若しくは発現、すなわちＳＯＤ−１活性若しくは発現の増大若しくは減少もまた指す。治療効果はＡＬＳの症状若しくは進行の改善をもたらすものである。活性の変化は、例えばウエスタンブロット分析によるＳＯＤ−１タンパク質レベルの定量的若しくは定性的測定により測定し得る。定量的アッセイを使用して、ピリメタミンおよびそのアナログのような薬理学的剤の存在下でのＳＯＤ−１タンパク質レベルの上方制御若しくは下方制御を測定し得る。適する薬理学的剤は、ＳＯＤ−１発現を対照に比較して約５パーセントないし約５０パーセント下方制御するものであり得る。発現の変化は、例えばＲＮＡ若しくはＤＮＡの発現レベルを測定することによるＳＯＤ−１に関連する核酸レベルの定量的若しくは定性的測定によってもまた測定し得る。
【００１７】
被験体若しくは被験体群に対するＳＯＤ−１調節の効果は、該被験体若しくは被験体群の生存を検査することによってもまた検討し得る。例えば、生存の変化、または神経変性疾患例えばＡＬＳの１種若しくはそれ以上の動物モデルでの生存の延長を測定することにより。生存の変化は、ＡＬＳマウスモデルに投与されるピリメタミン若しくは機能的アナログのような薬理学的剤の投与により得る。薬理学的剤の影響は、対照の剤を与えられたか若しくは剤を与えられないＡＬＳマウスの対照群に比較してのＡＬＳマウスの試験群の生存の日数の増大に基づき決定し得る。一態様において、薬理学的剤若しくはその機能的アナログは被験体若しくは被験体の集団（例えば雄性集団若しくは雌性集団）の生存に対する効果パーセントを最低２％ないし約１００％増大させる。好ましくは、被験体若しくは被験体の集団の生存に対する効果パーセントは、最低５％ないし約５０％、最低１０％ないし約２５％である。なおより好ましくは、被験体若しくは被験体の集団の生存に対する効果パーセントは、最低３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％および５０％である。ＳＯＤ−１調節の影響は、例えば筋の動きの改善を評価することにより、または疾患の症状の緩和若しくは改善を検査することにより被験体若しくは被験体群の神経学的スコアを検査することによってもまた決定しうる。好ましい一態様において、被験体若しくは被験体群の神経学的スコアは、標準的統計学的解析手順を使用して決定される際にｐ＜０．０５とｐ＜０．０００１の間の有意性水準を伴い、未処置の対照被験体のものと有意に異なる。
【００１８】
該用語は、該調節が被験体若しくは被験体群で治療効果を生じるような、薬理学的剤との相互作用に際しての核内受容体の変化、すなわち核内受容体の活性、構造、または核内受容体若しくは核内受容体のサブユニットの発現の変化、すなわち核内受容体の活性若しくは発現の増大若しくは減少を指すのにもまた使用しうる。
【００１９】
本明細書で使用されるところの「阻害する」若しくは「阻害すること」という用語は、標的遺伝子若しくは標的タンパク質例えばＳＯＤ−１の発現の測定可能な減少を指す。該用語は標的タンパク質の活性の測定可能な低下もまた指す。好ましくは、発現の減少は最低約１０％である。より好ましくは、発現の減少は約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、８０％、９０％およびなおより好ましくは約１００％である。
【００２０】
本明細書で使用されるところの「ＳＯＤ活性と関連する障害」若しくは「ＳＯＤ活性と関連する疾患」という句は、ＳＯＤタンパク質（例えばＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＳＯＤ−３など）の発現と関連するいかなる疾患状態も指す。とりわけ、本句は、ＳＯＤタンパク質産生と関連する毒性機能の獲得を指す。ＳＯＤタンパク質は野性型ＳＯＤタンパク質若しくは変異体ＳＯＤタンパク質であり得、そして、野性型ＳＯＤ遺伝子若しくは最低１個の突然変異を伴うＳＯＤ遺伝子に由来し得る。
【００２１】
本明細書で使用されるところの「被験体」という用語は、免疫応答が導き出されるいかなる生存生物体も指す。被験体という用語は、限定されるものでないが、ヒト、チンパンジーならびに他の類人猿およびサル種のようなヒト以外の霊長類；畜牛、ヒツジ、ブタ、ヤギおよびウマのような家畜；イヌおよびネコのような家畜哺乳類；マウス、ラットおよびモルモットなどのようなげっ歯類を包含する実験動物を挙げることができる。該用語は特定の齢若しくは性を示さない。従って、成体および新生被験体、ならびに胎児は、雄性であれ雌性であれ包含されることを意図している。
【００２２】
本明細書で使用されるところの「アルキル」基は、直鎖状アルキル基（例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなど）、環状アルキル基（または「シクロアルキル」若しくは「脂肪環」若しくは「炭素環」基）（例えばシクロプロピル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、シクロオクチルなど）、分枝状鎖アルキル基（イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチルなど）を包含する１個若しくはそれ以上の炭素原子を有する飽和炭化水素を包含する。別の方法で明記されない限り、アルキルという用語は、「未置換アルキル」および「置換アルキル」双方を包含し、それらの後者は炭化水素バックボーンの１個若しくはそれ以上の炭素上の１個若しくはそれ以上の水素を置換する置換基を有するアルキル基を指す。
【００２３】
本明細書で使用されるところの「アルコキシ基」という用語は、１個の酸素原子がそれに結合されているアルキル基を意味している。代表的アルコキシ基は１〜１０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子を有する基、例えばメトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシなどを包含する。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、ｉｓｏ−プロポキシ、ブトキシ、ペントキシを包含する。
【００２４】
「芳香族基」若しくは「アリール基」という用語は、１個若しくはそれ以上の環を含有する不飽和および芳香族環状炭化水素ならびに不飽和および芳香族複素環を包含する。アリール基は、多環を形成するように脂環若しくは芳香族でない複素環と縮合若しくは架橋されてもよい（例えばテトラリン）。アリール基は、多環を形成するように脂環若しくは芳香族でない複素環と縮合若しくは架橋もまたし得る（例えばテトラリン）。
【００２５】
「アリールアルキル」基は、アリール基で置換されたアルキル基である（例えばフェニルメチル（すなわちベンジル））。「アルキルアリール」部分はアルキル基で置換されたアリール基である（例えばｐ−メチルフェニル（すなわちｐ−トルイル））。「アルコキシフェニル」基（若しくは「アルキルオキシフェニル」基）はアルコキシ基で置換されたフェニル基である（例えばｐ−メトキシフェニル）。「アリールアルコキシ」基はフェニル基で置換されたアルコキシ基であり（例えばベンジルオキシ）、「アリールオキシアルキル」基はオキシアリール基で置換されたアルキル基であり（例えばフェニルメチルエーテル（すなわちフェノキシメチル））、「アリールオキシフェニル」基はフェノキシ基で置換されたフェニル基であり（例えばビフェニルエーテル（すなわちフェノキシフェニル））、「フェノキシ」基はフェニル基に結合された１個の酸素原子である。
【００２６】
「ヘテロアリール基」という用語は、環中の炭素原子の１個若しくはそれ以上が炭素以外の元素、例えば窒素、イオウ若しくは酸素である不飽和および芳香族環状基を包含する。
【００２７】
「複素環基」という用語は、環中の炭素原子の１個若しくはそれ以上が炭素以外の元素、例えば窒素、イオウ若しくは酸素である炭素環基に類似の閉鎖環構造を包含する。複素環基は飽和でも若しくは不飽和でもよい。加えて、複素環基（ピロリル、ピリジル、イソキノリル、キノリル、プリニルおよびフリルのような）は芳香族の特徴を有することがあり、その場合、それらは「ヘテロアリール」若しくは「ヘテロ芳香族」基と称されうる。
【００２８】
「ヘテロアリールアルキル」基はヘテロアリール基で置換されたアルキル基である（例えば４−メチルピリジン）。
【００２９】
「ヘテロアリールアルコキシ」基はヘテロアリール基で置換されたアルコキシ基である（例えば４−メトキシピリジン）。
【００３０】
Ｉ．神経変性疾患
一局面において、本発明は、薬理学的剤、例えば核内受容体を調節する薬理学的剤を投与することにより細胞中でのＳＯＤタンパク質の発現を変えることに関する。細胞は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のようなＳＯＤタンパク質を巻き込む神経変性疾患に関連する神経細胞であり得る。核内受容体は、リガンド例えばピリメタミンおよびその機能的アナログを高親和性で結合しかつ広範な遺伝子の発現を阻害若しくは活性化するようにゲノムＤＮＡに作用する、リガンド活性化転写因子であり得る。核内受容体（例えばエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体若しくはオーファン核内受容体）は雄性および雌性双方で脊髄およびほぼ全部の細胞で見出され、そして従って神経変性疾患例えばＡＬＳの有用な治療標的を構成する。核内受容体の機能の変化は、例えば、ＡＬＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病および多発性硬化症を包含する多くの神経変性状態の中心にあるとみられ、それらのそれぞれを下述する。
【００３１】
ルー・ゲーリッグ病ともまた呼ばれる筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は大脳皮質、脳幹および脊髄の運動ニューロンを冒す致死的な神経変性疾患である。（Ｈｉｒａｎｏ、（１９９６）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４７（４  Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ６３−６）。ＡＬＳの発症は人生の第四若しくは第五の１０年に起こり（発症年齢の中央値は５７歳である）、そして診断後２ないし５年以内に致死的である（Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９１）Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎ．Ｐｒｏｃ．、６６：５４−８２）。ＡＬＳはおよそ３０，０００人の米国人を冒しており、米国で毎年ほぼ８，０００例の死亡が報告されている。ＡＬＳ患者は累進的に全部の運動機能を喪失する（すなわち自分自身で歩行する、話す若しくは呼吸することが不可能）。
【００３２】
ＡＬＳの基本的な特徴は、それらの制御下の筋を衰弱かつ消耗させて麻痺に至る脊髄運動ニューロンの喪失である。ＡＬＳは家族性（５〜１０％）および散発性双方の形態を有し、そして家族性の形態は７種の別個の遺伝子座に結び付けられている（Ｄｅｎｇら（１９９５）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．、４：１１１３−１６；Ｓｉｄｄｉｑｕｅら（１９９５）Ｃｌｉｎ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、３：３３８−４７；Ｓｉｄｄｉｑｕｅら（１９９７）Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ．Ｓｕｐｐｌ．、４９：２１９−３３；Ｂｅｎ  Ｈａｍｉｄａら（１９９０）Ｂｒａｉｎ、１１３：３４７−６３；Ｙａｎｇら（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２９：１６０−６５；Ｈａｄａｎｏら（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２９：１６６−７３）。家族性の症例の約１５〜２０％がＣｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）をコードする遺伝子中の突然変異による（Ｓｉｄｄｉｑｕｅら（１９９１）Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、３２４：１３８１−８４；Ｒｏｓｅｎら（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ、３６２：５９−６２）。
【００３３】
疾患の病因は不明であるとは言え、１つの理論は、ＡＬＳにおける神経細胞死が過剰な細胞外グルタミン酸による神経細胞の過剰興奮の結果であることである。グルタミン酸はグルタミン作動性ニューロンにより放出される神経伝達物質であり、そして神経膠細胞に取り込まれ、そこでそれは酵素、グルタミン合成酵素によりグルタミンに転化され、グルタミンはその後ニューロンに再進入し、そしてグルタミナーゼにより加水分解されてグルタミン酸を形成し、従って、該神経伝達物質プールを補給する。正常な脊髄および脳幹における細胞外グルタミン酸濃度は、ニューロンを支援するように部分的に機能する神経膠細胞が興奮性アミノ酸輸送体タイプ２（ＥＡＡＴ２）タンパク質を使用してグルタミン酸を即座に吸収するため、細胞外液中で低マイクロモル濃度に保たれる。ＡＬＳを伴う患者での正常なＥＡＡＴ２タンパク質の欠乏は、該疾患の病理学で重要であるとして同定された（例えば、Ｍｅｙｅｒら（１９９８）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、６５：５９４−５９６；Ａｏｋｉら（１９９８）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．４３：６４５−６５３；Ｂｒｉｓｔｏｌら（１９９６）Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ．３９：６７６−６７９を参照されたい）。ＥＡＡＴ２の低下されたレベルについての１つの説明は、ＥＡＡＴ２が異常にスプライスされることである（Ｌｉｎら（１９９８）Ｎｅｕｒｏｎ、２０：５８９−６０２）。異常なスプライシングは、ＥＡＡＴ２タンパク質のＣ末端領域に位置する４５ないし１０７アミノ酸の欠失を伴うスプライスバリアントを生じる（Ｍｅｙｅｒら（１９９８）Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．２４１：６８−７０）。ＥＡＡＴ２の欠如若しくは不完全性により、細胞外グルタミン酸が蓄積して継続的にニューロンを興奮させる。グルタミン酸の蓄積は、ニューロンの継続的興奮が早期の細胞死につながるため、神経細胞に対する毒性効果を有する。
【００３４】
ＡＬＳの病理学については多くが知られているとは言え、散発性の形態の病因論および家族性ＡＬＳにおける変異体ＳＯＤタンパク質の原因特性についてはほとんど知られていない（Ｂｒｕｉｊｎら（１９９６）Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．、２２：３７３−８７；Ｂｒｕｉｊｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：１８５１−５４）。グルタミン酸の毒性、低酸素状態、酸化的ストレス、タンパク質凝集、神経フィラメントおよびミトコンドリア機能不全を包含する多くのモデルが推測されているＣｌｅｖｅｌａｎｄら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：３４２−４３；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、４７（４  Ｓｕｐｐｌ．２）：Ｓ５４−６１、考察Ｓ６１−２（１９９６）；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、（１９９９）Ｎｅｕｒｏｎ、２４：５１５−２０；Ｃｌｅｖｅｌａｎｄら（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．２：８０６−１９；Ｃｏｕｉｌｌａｒｄ−Ｄｅｓｐｒｅｓら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ  Ｓ  Ａ、９５：９６２６−３０；Ｍｉｔｓｕｍｏｔｏ、（１９９７）Ａｎｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．、３１：７７９−８１；Ｓｋｅｎｅら（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２８：１０７−８；Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎら（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８８：３９９）。
【００３５】
現在、ＡＬＳの治療法は存在せず、該疾患を予防若しくはその経過を逆転するのに有効と判明した治療法も存在しない。数種の薬物が最近米国食品医薬品局（ＦＤＡ）により承認された。今日まで、ＡＬＳを処置するための試みは、細胞保護効果を有する長鎖脂肪アルコール（米国特許第５，１３５，９５６号明細書を参照されたい）；若しくはピルビン酸の塩（米国特許第５，３９５，８２２号明細書を参照されたい）で神経変性を処置すること；およびグルタミン合成酵素を使用してグルタミン酸カスケードを阻害すること（米国特許第５，９０６，９７６号明細書を参照されたい）を伴う。例えば、グルタミン酸放出阻害剤ＲｉｌｕｚｏｌｅＴＭは、ＡＬＳの処置のため米国で承認されており、そしてＡＬＳを伴う少なくとも若干の患者の寿命を延長するようである。しかしながら、いくつかの報告が、ＲｉｌｕｚｏｌｅＴＭ療法が生存時間を延長し得る場合であっても、それは患者の筋の強さの改善を提供すると思われないことを示している。従って、ＲｉｌｕｚｏｌｅＴＭの効果は、該療法が患者の生活の質を改変しないために制限される（Ｂｏｒｒａｓ−Ｂｌａｓｃｏら（１９９８）Ｒｅｖ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２７：１０２１−１０２７）。
【００３６】
ＩＩ．ＳＯＤおよびＳＯＤ突然変異
本発明は、薬理学的調節剤およびそれらの機能的アナログを用いてＳＯＤ−１タンパク質（例えば変異体ＳＯＤ−１タンパク質）の発現を低下若しくは除外することにより細胞中の該タンパク質を減少させることに関する。ＳＯＤ−１遺伝子は染色体２１ｑ２２．１に位置を突き止められている。ＳＯＤ−１配列はＰＣＴ公開第ＷＯ  ９４／１９４９３号明細書に開示されているはＳＯＤ−１をコードするオリゴヌクレオチド配列であり、そして、疾患を伴う患者を処置するための医薬品の製造における変異体および野性型いずれの形態のＳＯＤ−１をコードする遺伝子のアンチセンスＤＮＡホモログの使用も一般に特許請求されている。ヒトＳＯＤ−１遺伝子の核酸配列はＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＭ＿０００４５４に見出し得る。ヒトＳＯＤ−１のヌクレオチド配列は配列番号１にもまた提示する。対応するＳＯＤ−１タンパク質配列を配列番号２に提示する。
【００３７】
ＩＩＩ．核内受容体およびリガンド
一局面において、本発明はＳＯＤ、例えばＳＯＤ−１の遺伝子発現若しくはタンパク質産生を変える薬理学的剤を使用することに関する。該薬理学的剤は核内受容体薬理学的剤であり得る。核内受容体は、リガンドを高親和性で結合しかつ広範な遺伝子の発現を阻害若しくは活性化するようにゲノムＤＮＡに作用する、リガンド活性化転写因子であり得る。エストロゲン受容体およびプロゲステロン受容体のような核内受容体は神経変性障害に関与している。
【００３８】
核内受容体スーパーファミリーのメンバーのおよそ７０メンバーが同定されている（ＭｏｒａｓとＧｒｏｎｅｍｅｙｅｒ  １９９８）。それらのいくつかのみがリガンド結合受容体である一方、他者は、特異的リガンドが未だ同定されていないか若しくはなお存在しないかもしれない、いわゆるオーファン受容体のサブファミリーに属する（Ｏ’ＭａｌｌｅｙとＣｏｎｎｅｅｌｙ  １９９２）。これらの核内受容体の多くは、標的遺伝子の調節領域の特定のエレメントと相互作用することにより直接、若しくは多様な成長因子シグナル伝達経路を活性化することにより間接的に遺伝子発現を調節し得る。
【００３９】
核内受容体スーパーファミリーの構造の特徴は同様である。それぞれは４個の主要機能領域、すなわちＮ末端トランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）、中央ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、Ｃ末端リガンド結合ドメイン（ＬＢＤ）、ならびにＤＢＤおよびＬＢＤを結合するヒンジ領域を有する（Ｍａｎｇｅｌｓｄｏｒｆら  １９９５）。２種の自律トランス活性化機能、すなわちＮ末端で発する構成的に活性な活性化機能（ＡＦ−１）およびＬＢＤ中で生じるリガンド依存性活性化機能（ＡＦ−２）が、核内受容体の転写活性の原因である（ＧｒｏｎｅｍｅｙｅｒとＬａｕｄｅｔ  １９９５）。
【００４０】
核内受容体のＤＢＤは、該サブファミリーの他メンバーに対する高程度のアミノ酸配列同一性を表す。結果、該４受容体は、核ＤＮＡ中の同一でない場合は非常に類似のホルモン応答エレメント（ＨＲＥ）を認識する。
【００４１】
該分子のＣ末端に位置するＬＢＤへのリガンド（例えばピリメタミン、プロゲステロン若しくはエストロゲン）の結合から生じるコンホメーション変化は、リガンド応答を活性化する原因である。異なる核内受容体ファミリーのＬＢＤ間の２０％くらい低い低配列同一性にもかかわらず、全部の核内受容体はこの領域で類似の折り畳み（ｆｏｌｄ）を共有する。それらは１２個までのヘリックス、およびいわゆるα−らせんサンドイッチ中に配置された１個の小さな−シートより構成される。ＡＦ−１およびＡＦ−２のトランス活性化機能は核内受容体のそれぞれＴＡＤおよびＬＢＤに位置し、そして、それらの活性は、遺伝子転写のため活性の開始前部位を形成するための共活性化因子分子の動員に依存する（Ｏｎａｔｅら  １９９８、Ｂｅｖａｎら  １９９９）。それらのＬＢＤの欠失を伴う受容体は構成的に活性であり、ＡＦ−１がリガンド非依存性であることを示唆する。強いＡＦ−２は、レチン酸受容体（ＲＡＲ）（Ｄｕｒａｎｄら  １９９４）、レチン酸−Ｘ受容体（ＲＸＲ）（ｖｏｍ  Ｂａｕｒら  １９９８）、ビタミンＤ受容体（Ｊｉｍｅｎeｚら  １９９９）、ＧＲ（Ｓｈｅｌｄｏｎら  １９９９）、ＰＲ（Ｏｎａｔｅら  １９９８）、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲγ）（Ｎｏｌｔｅら  １９９８）、エストロゲン受容体（ＥＲ）（Ｔｏｒａら  １９８９）、および甲状腺ホルモン受容体（ＴＨＲ）（Ｂａｒｅｔｔｉｎｏら  １９９４）のＬＢＤで示されたが、しかしＡＲではされなかった（Ｂｅｒｒｅｖｏｅｔｓら  １９９８、Ｂｅｖａｎら  １９９９）。
【００４２】
核内受容体の転写活性は、リガンド選択性およびＤＮＡ結合能力を包含する核内受容体の多数の機能特性に影響する補助調節因子により影響される。核内受容体補助調節因子は、ヒストンの修飾により直接、若しくはクロマチン修飾複合体の動員により、ならびに基礎転写機械装置の動員において機能することにより間接的にのいずれかで、標的遺伝子のＤＮＡ修飾に参画する（ＨｅｉｎｌｅｉｎとＣｈａｎｇ  ２００２）。より良好に特徴付けられた補助調節因子のいくつかはｐ１６０ファミリーのメンバーすなわちＡＲＡ７０、ＡＲＡ５５、ＡＲＡ５４、ＡＲＡ２６７−α、Ｓｍａｄ−３およびＡＩＢ１（Ｙｅｈら  １９９９ａ）である。ＡＲＡ５５およびＡＲＡ７０双方は１７β−エストラジオール（Ｅ２）によるアンドロゲン受容体の活性化を可能にし、ＡＲＡ７０がＥ２にアンドロゲン活性を賦与するための最も有効な共活性化因子である（Ｍｉｙａｍｏｔｏら  １９９８、Ｙｅｈら  １９９８、Ｆｕｊｉｍｏｔｏら  １９９９）。さらに、ＡＲＡ５５およびＳｍａｄ−３双方は、トランスフォーミング増殖因子−βシグナル伝達経路とアンドロゲン／アンドロゲン受容体の作用の間のクロストークの架橋として機能することが示唆されている（Ｆｕｊｉｍｏｔｏら  １９９９、Ｋａｎｇら  ２００１）。
【００４３】
（ｉ）リガンド依存性の活性化
リガンド、例えばエストロゲン／プロゲステロンおよびピリメタミンは標的細胞に拡散しかつ核内受容体に結合し得る。リガンド結合が、受容体による標的遺伝子の調節に至る一連の事象を開始する。占有された受容体はそのＬＢＤでアロステリックな変化を受け、そして、ｈｓｐ９０、ｈｓｐ７０およびｈｓｐ５６のような熱ショックタンパク質から解離し（Ｒｏｙら  ２００１）、複合体形成、例えば二量体化し、そして、既に存在していない場合は核に移動される。核ＤＮＡ中の応答エレメント、例えばホルモン応答エレメント（ＨＲＥ）への結合に際して、受容体の二量体はｐ１６０ファミリーのような共活性化因子を動員して活性の開始前複合体を形成し、そして基礎転写機械装置と相互作用して標的遺伝子の転写を阻害若しくは誘発する。
【００４４】
（ｉｉ）リガンド非依存性の活性化
核内受容体は細胞表面で発したシグナル伝達経路によってもまた活性化されうる。核内受容体は、他の転写因子と一緒に、可逆的リン酸化により調節される（Ｏｒｔｉら  １９９２）。キナーゼ媒介性シグナル伝達経路が核内受容体の活性に影響し得る（ＢｕｒｎｓｔｅｉｎとＣｉｄｌｏｗｓｋｉ  １９９３）。ある種のコンセンサスリン酸化部位は、ＤＮＡ依存性タンパク質キナーゼ、プロテインキナーゼＡ、プロテインキナーゼＣ、マイトジェン活性化キナーゼおよびカゼインキナーゼＩＩの基質となり得る（Ｂｌｏｋら  １９９６）。
【００４５】
核内受容体の数種の天然に存在するリガンドが既知である。例えば、エストロゲン受容体の天然のリガンドはエストロゲンリガンドであるが、しかし、またリガンドとしてはたらくエストラジオールのような合成化合物が作成されている。プロゲステロン受容体の天然のリガンドはプロゲステロンリガンドであるが、しかし、またリガンドとしてはたらくノルエチンドロンのような合成化合物が作成されている。天然のリガンドに加え、ピリメタミンのような他の剤もまた核内受容体のリガンドとして作用しうる。
【００４６】
リガンドは核内受容体に結合して受容体／リガンド複合体を創製する。本複合体は核ＤＮＡ中に存在する特異的遺伝子プロモーターに結合する。ＤＮＡに一旦結合されれば、該複合体はその遺伝子によりコードされるｍＲＮＡおよびタンパク質の産生を調節する。従って、核内受容体調節剤は、ＳＯＤ−１機能と関連しない疾患に現在使用されているＦＤＡ承認の治療薬、例えば抗マラリア薬、およびそれらの改変されたバリアントであり得る。核内受容体調節剤は、ＳＯＤ−１発現を変える新たに合成された化合物でもまたあり得る。
【００４７】
ＩＶ．ピリメタミンおよびその機能的アナログ
一局面において、本発明は、タンパク質合成を妨害する薬理学的剤としてピリメタミンおよびその機能的アナログを使用することに関する。ピリメタミンは身体および脳の細胞に容易に浸透する抗マラリア薬である。ピリメタミンはマラリア、トキソプラズマ症および数種の他の微生物感染症の処置に使用されている（総説については、Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら（１９９０）ＦＡＳＥＢ  Ｊ  ４：２４４１−２４５２を参照されたい）。ピリメタミンの抗菌効果は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、および葉酸合成経路に関与する酵素のその阻害の結果である。マラリア寄生虫は葉酸を新たに合成する一方、ヒト宿主は予め形成された葉酸を得なければならず、そして葉酸を合成し得ない。外因性の葉酸を利用することの寄生虫の無能は葉酸生合成を良好な薬物標的にする。ＤＨＦＲはジヒドロ葉酸をテトラヒドロ葉酸に還元することにより葉酸の再利用に参画する偏在酵素である。テトラヒドロ葉酸はその後、それが生合成反応（例えばチミジル酸合成酵素）に参画する際にジヒドロ葉酸に再び酸化される。ＤＨＦＲを阻害することはチミジル酸の形成を予防することができ、そしてＤＮＡ合成の停止およびその後の寄生虫死につながることができる。ピリメタミンは抗マラリア薬として使用される最も一般的なＤＨＦＲ阻害剤である。他のＤＨＦＲ阻害剤は、限定されるものでないが、スルファドキシン、トリメトプリム、スルファジアジン、トリメトプリム、およびスルファメトキサゾールを挙げることができる。
【００４８】
一局面において、本発明は、ピリメタミンのような薬理学的調節剤の投与によりＳＤＯ−１発現を減少させることに関する。ピリメタミンは、実施例に示されるところのＨｅＬａ細胞およびマウスＮｅｕｒｏ２Ａ細胞株でＳＯＤ−１発現の強力な阻害剤である。ＳＯＤ−１の減少の作用機序は現在知られていないが、しかし、ＳＯＤ−１をコードするタンパク質およびｍＲＮＡ双方のレベルは用量依存性に低下される。ピリメタミンは、しかしながら、葉酸（ＤＨＦＲの酵素的産物）を使用してその効果を予防若しくは逆転し得なかったため、ジヒドロ葉酸還元酵素阻害を介して作用しない。さらに、無関係の化学構造をもつ強力なＤＨＦＲ阻害剤メトトレキサートは、ＨｅＬａ細胞でＳＯＤ−１タンパク質を減少させなかった。最後に、ピリメタミンは７０μＭ超のＥＣ５０を伴うヒトＤＨＦＲの非常に弱い阻害剤である。（Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒら、（１９９０）上記）。ピリメタミンはセントロメアＤＮＡに作用することが報告されており、また、最もありそうには、転写因子に対する作用により、若しくはより少なくありそうにはゲノムＤＮＡそれ自身への直接作用により、ＳＯＤ−１遺伝子の転写を阻害する。
【００４９】
機構を提供することを必要とされない一方、ＳＯＤ−１発現の阻害のために、ピリメタミンおよびその機能的アナログが今までのところ同定されていない核内受容体を介してヒトＳＯＤ１の発現を低下させるように推定上作用すると考えられる。簡潔には、ピリメタミンは受容体タンパク質に高親和性で結合して、それを活性化しかつそれを別の活性化された受容体と二量体化させる。二量体化された受容体は細胞の核に輸送されるか、若しくは既に核中にあり、そしてｈＳＯＤ１の開始コドンに対し５’のゲノムＤＮＡに結合する。輸送された受容体はＳＯＤ−１遺伝子のプロモーター領域のパリンドロームＤＮＡの伸長に結合し、そこで受容体−リガンド−ＤＮＡ複合体が立体障害を発揮して転写の開始を予防する。従って、ＳＯＤ１をコードするより少ないＲＮＡが作成され、そして結果としてより少ないタンパク質が作成される。産生される変異体ＳＯＤ１タンパク質の量の減少は、その後、その神経毒性効果を予防しかつＡＬＳの疾患進行を改善するとみられる。
【００５０】
一態様において、薬理学的調節剤はピリメタミンである。式Ｉに示されるところのピリメタミンのファルマコフォア。
【００５１】
【化１】
2008531710.tif 000003
【００５２】
別の態様において、薬理学的調節剤はピリメタミンの機能的アナログである。ピリメタミン系統の化合物内の構造活性相関（ＳＡＲ）を、図３に示される代表的な３０種の化合物の一群で確立し得る。系統的ＳＡＲ研究はこれらの化合物が特異的細胞標的により作用することを示しうる。これらの化合物の数種は商業的に入手可能である一方、他者は標準的有機化学の方法を使用して合成されている。化合物の設計はリード分子ピリメタミンに基づくは２個の主構造的特徴に分解しかつ別個に改変しうる。該２種の主構造的特徴は（１）ベンゼン環および（２）ピリミジン環である。多数のアナログ若しくは誘導体が、下述されるとおり設計された。
【００５３】
（１）ベンゼン環の修飾の至適化
式Ｉのベンゼン環は多数の異なる方法で修飾し得る。一態様において、式ＩＩ中のＲを、Ｍｅ、Ｅｔなどよりなる群から選択されるアルキル基で置換することにより。
【００５４】
【化２】
2008531710.tif 000004
【００５５】
別の態様において、ベンゼン環の置換基を置換基の位置および性質に関して至適化することにより。これは式ＩＩＩに示されるとおり多様な位置でのベンゼン環のメチル走査により実施しうる。
【００５６】
【化３】
2008531710.tif 000005
【００５７】
別の態様において、該化合物は、式ＩＶに示されるとおり複素環を包含する別の環で該環を置換することにより製造し得る。
【００５８】
【化４】
2008531710.tif 000006
【００５９】
（２）ピリミジン環の修飾：
ピリミジン環は単独で若しくはベンゼン環に対する修飾とともに修飾し得る。一態様において、ピリミジン環は、式Ｖのアルキル（Ｒ）基を除去若しくはＨ、Ｍｅ、イソプロピル（ｉＰｒ）などよりなる群から選択される他の官能基で置換することにより修飾する。
【００６０】
【化５】
2008531710.tif 000007
【００６１】
別の態様において、パラアミノ基（ベンゼン環に関して）を、式ＶＩに示されるとおり除去し得るか若しくは酸素で置換し得る。
【００６２】
【化６】
2008531710.tif 000008
【００６３】
別の態様において、オルトアミノ基（ベンゼン環に関して）は、式ＶＩＩに示されるとおり除去し得るか若しくは酸素で置換し得る。
【００６４】
【化７】
2008531710.tif 000009
【００６５】
別の態様において、一級アミン基の双方は、式ＶＩＩＩに示されるとおり該分子から除外し得る。
【００６６】
【化８】
2008531710.tif 000010
【００６７】
別の態様において、環内窒素の一方を式ＩＸに示されるとおり該分子から除去し得る。
【００６８】
【化９】
2008531710.tif 000011
【００６９】
別の態様において、一級アミンおよび環内窒素を、式Ｘに示されるとおり同時に除去し得る。
【００７０】
【化１０】
2008531710.tif 000012
【００７１】
別の態様において、ピリミジン環を式ＸＩに示されるとおりピラジン環系で置換する。
【００７２】
【化１１】
2008531710.tif 000013
【００７３】
化合物は全部、式Ｉに示されるリード構造に存在するファルマコフォアの特徴を含有する。これらの修飾は該分子の効力、経口活性および薬物特性を保持若しくは改良するために行う。他の態様において、標準的有機合成化学を使用して全く新たな化合物を合成する。これらの新たな化合物は元のファルマコフォアの特徴を保持する。新たな化合物のアナログもまた合成し得る。一態様において、２環間の回転の自由を除去する構造を式ＸＩＩに示されるとおり合成し得る。
【００７４】
【化１２】
2008531710.tif 000014
【００７５】
別の態様において、オルトアミノ基で２環を結合する構造を、式ＸＩＩＩに示されるとおり合成し得る。
【００７６】
【化１３】
2008531710.tif 000015
【００７７】
別の態様において、ピリミジンをイソキノリンで置換する構造を、式ＸＩＩＩＩに示されるとおり合成し得る。
【００７８】
【化１４】
2008531710.tif 000016
【００７９】
いくつかの態様において、本発明は、式ＸＶ
【００８０】
【化１５】
2008531710.tif 000017
【００８１】
［式中、Ｒ１は、水素、Ｃ１−Ｃ１０直鎖状アルキル、分枝状Ｃ３−Ｃ７アルキル、置換若しくは未置換シクロアルキル基、Ｃ１−Ｃ３アルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノおよびアルコキシよりなる群から選択される１若しくは２置換基で場合によっては置換されているアリール基、置換若しくは未置換アリールオキシフェニル基、置換若しくは未置換アルキルオキシフェニル基、置換若しくは未置換アリールアルキル、置換若しくは未置換アルキルアリール、置換若しくは未置換アリールアルコキシ基、置換若しくは未置換アリールオキシアルキル基、置換若しくは未置換ヘテロアリール基、置換若しくは未置換ヘテロアリールアルキル、置換若しくは未置換ヘテロアリールアルコキシ基、ハロゲン、シアノおよびＮＲ’Ｒ”よりなる群から選択され；式中、ＲおよびＲ”は、水素、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基および置換若しくは未置換アリールアルキル基よりなる群からそれぞれ独立に選択される。
Ｒ２は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、置換若しくは未置換アリール基、アミノ、置換若しくは未置換アリールアルキル基、置換若しくは未置換ヘテロアリール基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、およびＮＲ’Ｒ”よりなる群から選択され；式中、Ｒ’およびＲ”は、水素、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル基よりなる群からそれぞれ独立に選択される。
Ｒ３は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル基、ヒドロキシル−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル基、置換若しくは未置換フェノキシ基、およびＮＲ’Ｒ”よりなる群から選択され；式中、Ｒ’およびＲ”は、水素、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル基よりなる群からそれぞれ独立に選択される。
Ｒ４およびＲ５は、水素、ヒドロキシル、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル、置換若しくは未置換アリールアルコキシ基、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ基、アルコキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、ヒドロキシル−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、またはカルボキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基よりなる群からそれぞれ独立に選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ５は、それらが結合されている窒素原子と一緒になって環を形成し得、前記環は、例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキル、カルボキシル（保護されうる）、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、ハロゲン、置換若しくは未置換ベンゾイルおよび置換若しくは未置換アリールアルキル（例えばベンジルの）基よりなる群から選択される１若しくは２置換基で場合によっては置換され得るピリジル、ピペラジノ、モルホリノ、ピロリジノ、ベンジルアミノおよびピペラジノよりなる群から選択され得る］
の化合物に少なくとも部分的に関する。
【００８２】
いくつかの態様において、本発明は、式ＸＶＩ：
【００８３】
【化１６】
2008531710.tif 000018
【００８４】
［式中
ＸおよびＹは飽和若しくは不飽和環の部分を形成し；ここでＸおよびＹのそれぞれは炭素、窒素、酸素およびイオウよりなる群からそれぞれ独立に選択され；また、ここで炭素および窒素原子は置換若しくは未置換であり得；Ａは置換若しくは未置換いずれかの炭素原子であり；Ｂは炭素、窒素、酸素およびイオウよりなる群から選択され；かつ、式中、ｎは１と３の間の整数であり、かつ、ｍは０と２の間の整数であり；また、ここでｎ＋ｍは７に等しいかそれ未満である。
Ｒ２は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、ヒドロキシル、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換ヘテロアリール基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、ＮＲ’Ｒ”よりなる群から選択され；式中、Ｒ’およびＲ”はそれぞれ独立に、水素、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル基、置換若しくは未置換アリールアルコキシ基、置換若しくは未置換アリールオキシアルキル基、置換若しくは未置換フェノキシ基である。
Ｒ４およびＲ５は、水素、ヒドロキシル、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル、置換若しくは未置換アリールアルコキシ基、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ基、アルコキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、ヒドロキシル−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、またはカルボキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基よりなる群からそれぞれ独立に選択されるか、あるいは、Ｒ４およびＲ５は、それらが結合されている窒素原子と一緒になって環を形成し、前記環は、Ｃ１−Ｃ６アルキル、カルボキシル（保護されうる）、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、ハロゲン、置換若しくは未置換ベンゾイル、置換若しくは未置換アリールアルキル（例えばベンジルの）基よりなる群から選択される１若しくは２置換基で場合によっては置換され得る、ピリジル、ピペラジノ、モルホリノ、ピロリジノおよびピペラジノよりなる群から選択される］
の化合物に少なくとも部分的に関する。
【００８５】
別の態様において、本発明は、式ＸＶＩＩ：
【００８６】
【化１７】
2008531710.tif 000019
【００８７】
［式中：
Ｘ、ＹおよびＺは飽和若しくは不飽和環の部分を形成し；式中、Ｘ、ＹおよびＺのそれぞれは、炭素、窒素、酸素およびイオウよりなる群からそれぞれ独立に選択され；また、式中、Ｒ１は水素、置換若しくは未置換Ｃ１−Ｃ１０アルキル、分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換若しくは未置換シクロアルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換フェノキシ基、置換若しくは未置換アルコキシフェニル基、置換若しくは未置換アリールアルキル、置換若しくは未置換アリールアルコキシ基、置換若しくは未置換ヘテロアリール基、置換若しくは未置換ヘテロアリールアルキル、置換若しくは未置換ヘテロアリールアルコキシ基、ハロゲン、シアノ、置換若しくは未置換アリールオキシアルキル基よりなる群から選択される。
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ７分枝状アルキル、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、アルキルアミノアルキル、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル基、置換若しくは未置換ヘテロアリール基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、およびＮＲ’Ｒ”よりなる群からそれぞれ独立に選択され；式中Ｒ’およびＲ”は、水素、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル基よりなる群からそれぞれ独立に選択される。あるいは、Ｒ２およびＲ３双方、ならびに／若しくはＲ４およびＲ５双方が酸素原子であり得る。
Ｒ６およびＲ７は、ヒドロキシル、アルコキシ、フェノキシ、アリールオキシアルキル、アリールアルコキシ、アミノ、ＮＲ’Ｒ”よりなる群からそれぞれ独立に選択され；Ｒ’およびＲ”は、水素、ヒドロキシル、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル、置換若しくは未置換アリールアルコキシ基、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ基、アルコキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、ヒドロキシル−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、またはカルボキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基よりなる群からそれぞれ独立に選択されるか、あるいは、Ｒ’およびＲ”は、それらが結合されている窒素原子と一緒になって環を形成し得、前記環は、例えば、ピリジル、ピペラジノ、モルホリノ、ピロリジノおよびピペラジノよりなる群から選択され得、かつ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、カルボキシル（保護されうる）、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、ハロゲン、置換若しくは未置換ベンゾイル、置換若しくは未置換アリールアルキル（例えばベンジルの）基よりなる群から選択される１若しくは２置換基で場合によっては置換され得る］
の化合物に少なくとも部分的に関する。
【００８８】
他の態様において、本発明は、式ＸＶＩＩＩ：
【００８９】
【化１８】
2008531710.tif 000020
【００９０】
［式中：
Ｘ、ＹおよびＺは最低１、２若しくは３個の交互の二重結合を有する不飽和環の部分を形成し；ここで、Ｘ、ＹおよびＺのそれぞれは炭素、窒素、酸素およびイオウよりなる群から独立に選択され；その結果、Ｃ（１）−Ｚ間の二重結合はＣ（２）およびＣ（３）が２置換基で場合によっては置換されることを必要とすることがあり；ここで、Ｃ（１）−ＺおよびＣ（２）−Ｙ間の二重結合は、Ｃ（３）が２置換基で場合によっては置換されることを必要とすることがあり、また、ここで、Ｃ（１）−Ｚ、Ｃ（２）−ＹおよびＣ（３）−Ｘ間の二重結合が、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４が水素、置換若しくは未置換Ｃ１−Ｃ１０直鎖アルキル、分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換若しくは未置換シクロアルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換ベンジルの基、置換若しくは未置換アリールオキシフェニル基、置換若しくは未置換アルキルオキシフェニル基、置換若しくは未置換アルコキシフェニル基、置換若しくは未置換アリールアルキル、置換若しくは未置換アリールアルコキシ基置換若しくは未置換ヘテロアリール基、置換若しくは未置換ヘテロアリールアルキル、置換若しくは未置換ヘテロアリールアルコキシ基ハロゲン、シアノ、置換若しくは未置換ベンジルの基よりなる群からそれぞれ独立に選択されることを必要とすることがある。
Ｒ１は、水素、置換若しくは未置換Ｃ１−Ｃ１０直鎖アルキル、分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル、置換若しくは未置換シクロアルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールオキシフェニル基、置換若しくは未置換アルキルオキシフェニル基、置換若しくは未置換アリールアルキル、置換若しくは未置換アリールアルコキシ基、置換若しくは未置換ヘテロアリール基、置換若しくは未置換ヘテロアリールアルキル、置換若しくは未置換ヘテロアリールアルコキシ基、ハロゲン、およびシアノよりなる群から選択される。
あるいは、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、水素、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ７分枝状アルキル、ヒドロキシル、シアノ、アミノ、アルキルアミノアルキル、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル基、置換若しくは未置換ヘテロアリール基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基、およびＮＲ’Ｒ”よりなる群からそれぞれ独立に選択され得；式中、Ｒ’およびＲ”は、水素、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル基よりなる群からそれぞれ独立に選択される］
の化合物に少なくとも部分的に関する。
【００９１】
なお別の態様において、本発明は、式ＸＩＸ：
【００９２】
【化１９】
2008531710.tif 000021
【００９３】
［式中：
Ｘ、Ｙ、ＡおよびＢは、炭素、窒素、酸素およびイオウよりなる群からそれぞれ独立に選択され；かつ、式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ７分枝状アルキル、ヒドロキシル、ハロゲン、シアノ、アルキルアミノアルキル、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル基、置換若しくは未置換ヘテロアリール基、Ｃ３−Ｃ６シクロアルキル基およびＮＲ’Ｒ”よりなる群からそれぞれ独立に選択され；式中、Ｒ’およびＲ”はそれぞれ独立に水素、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル（例えばベンジルの）基である。
Ｒ５は、水素、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ３−Ｃ７分枝状アルキル、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキルおよびＮＲ’Ｒ”よりなる群から選択され；式中、Ｒ’およびＲ”は、それぞれ独立に水素、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル（例えばベンジルの）基である。
Ｒ６およびＲ７は、水素、ヒドロキシル、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル、置換若しくは未置換アリールアルコキシ基、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ基、アルコキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、ヒドロキシル−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、またはカルボキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基よりなる群からそれぞれ独立に選択されるか、あるいは、Ｒ６およびＲ７は、それらが結合されている窒素原子と一緒になって環を形成し、前記環は、例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキルカルボキシル（保護されうる）、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、ハロゲン、置換若しくは未置換ベンゾイル、置換若しくは未置換アリールアルキル（例えばベンジルの）基よりなる群から選択される１若しくは２置換基で場合によっては置換され得る、ピリジル、ピペラジノ、モルホリノ、ピロリジノおよびピペラジノよりなる群から選択される］
の化合物に少なくとも部分的に関する。
【００９４】
なお別の態様において、本発明は、式ＸＸ：
【００９５】
【化２０】
2008531710.tif 000022
【００９６】
［式中：
Ｘ、Ｙ、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは炭素、窒素、酸素およびイオウよりなる群からそれぞれ独立に選択され；かつ、式中、Ａ、Ｂ、ＣおよびＤは飽和若しくは不飽和環の部分を形成する。
Ｒ１、Ｒ２は水素、Ｃ１−Ｃ１０原子を有する置換若しくは未置換アルキル、Ｃ３−Ｃ７原子を有する置換若しくは未置換の分枝状アルキル、置換若しくは未置換アリール、置換若しくは未置換アリールアルキル、置換若しくは未置換アリールアルコキシ、置換若しくは未置換ヘテロアリール、置換若しくは未置換ヘテロアリールアルキル、置換若しくは未置換ヘテロアリールアルコキシ、置換若しくは未置換アリールオキシフェニル、置換若しくは未置換アルコキシフェニルよりなる群から選択される。
Ｒ３およびＲ４は、水素、ヒドロキシル、直鎖若しくは分枝状Ｃ１−Ｃ６アルキル基、置換若しくは未置換アリール基、置換若しくは未置換アリールアルキル、置換若しくは未置換アリールアルコキシ基、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、直鎖若しくは分枝状ハロ−Ｃ１−Ｃ６−アルコキシ基、アルコキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、ヒドロキシル−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基、またはカルボキシ−Ｃ１−Ｃ６−アルキル基よりなる群からそれぞれ独立に選択されるか、あるいは、Ｒ３およびＲ４はそれらが結合されている窒素原子と一緒になって環を形成し、前記環は、例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキル、カルボキシル（保護されうる）、アミノ、シアノ、ヒドロキシル、ハロゲン、置換若しくは未置換ベンゾイル、置換若しくは未置換ベンジルの基よりなる群から選択される１若しくは２置換基で場合によっては置換され得る、ピリジル、ピペラジノ、モルホリノ、ピロリジノおよびピペラジノよりなる群から選択される］
の化合物に少なくとも部分的に関する。
【００９７】
他の態様において、上および図３に示される構造ならびにそれらのアナログを合成し得る。
【００９８】
これらの構造のいくつかは、Ａｖａｉｌａｂｌｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙのような包括的化学物質データベースから商業的に入手可能でありうる。しかしながら構造の多くは新規かつ該データベースで入手不可能である。商業的に入手可能でない化合物の合成は十分に確立された合成の方法論により実施し得る。所望のアナログの全部の合成を記述する多くの合成論文および特許が存在する。（例えば、米国特許第３，９４０，３９３号明細書；Ｓａｒｄａｒｉａｎら、（２００３）Ｏｒｇ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１：９６０−９６４；Ｒｏｓｓら、（１９７６）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ、１９：７２３−７２５を参照されたい）。
【００９９】
Ｖ．薬理学的剤を使用する神経変性障害の調節
ＡＬＳのような神経変性疾患における核内受容体の役割、および核内受容体と関連する経路の調節は、ＡＬＳ若しくは他の神経変性疾患における臨床研究の標的となりうる。実施例の節に示されるデータは、ピリメタミンおよびそのアナログがＳＯＤ−１の発現の減少においてある役割を演じていることを示す。
【０１００】
ＡＬＳのＳＯＤ１  Ｇ９３Ａ（高コピー）マウスモデルは、２３コピーのヒトＧ９３Ａ  ＳＯＤ突然変異を保有しかつ内因性プロモーターにより駆動される適するマウスである。該マウスの生存はコピー依存性である。高コピーＧ９３Ａは約１２８日の生存中央値を有する。変異体ＳＯＤタンパク質の高分子量複合体は、ほぼ第３０日に開始して、脊髄中で見られる。第６０日に反応性星状細胞増加（ＧＦＡＰ反応性）が観察され；活性化された小膠細胞が第９０日から後に観察される。Ｇｕｒｎｅｙらによる研究は、第９０日に、反応性星状細胞増加が統計学的有意性を喪失する一方で、小膠細胞活性化が有意に上昇され、そして疾患の最終段階までずっと上昇されることを継続することを示した（Ｇｕｒｎｅｙら（１９９６）Ａｎｎ．Ｎｅｒｕｏｌ．、３９：１４７−５７３９を参照されたい）。
【０１０１】
このモデルで有効性を示した多くの薬物はヒト臨床試験に前進した。ＡＬＳの処置において唯一承認された薬物、リルゾールでの経験は、マウスＡＬＳモデルが臨床的有効性の良好な予測体であることを示す。クレアチン、セレブレックス、補酵素Ｑ１０およびミノサイクリンのような他の薬物は、このモデルでの研究に基づき臨床評価中である。
【０１０２】
Ｖ．核内受容体を調節する薬理学的剤の送達
本発明の薬理学的剤は、被験体への投与に適する製薬学的組成物に組み込み得る。典型的には、製薬学的組成物は、核内受容体を調節する薬理学的剤、例えばピリメタミン、および製薬学的に許容できる担体を含んでなる。本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる担体」は、生理学的に適合性であるいずれかのおよび全部の溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを包含する。製薬学的に許容できる担体の例は、水、生理的食塩水、リン酸緩衝生理的食塩水、Ｄ−ブドウ糖、グリセロール、エタノールなどの１種若しくはそれ以上、ならびにそれらの組合せを包含する。多くの場合、等張剤、例えば糖、マンニトール、ソルビトールのような多価アルコール、若しくは塩化ナトリウムを組成物中に包含することが好ましいことができる。製薬学的に許容できる担体は、薬理学的剤の貯蔵寿命若しくは有効性を高める湿潤剤若しくは乳化剤、保存剤若しくは緩衝剤のような少量の補助物質をさらに含みうる。
【０１０３】
製薬学的組成物は多様な形態にありうる。これらは、例えば、液体溶液（例えば注入可能（ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ）および注入可能（ｉｎｆｕｓｉｂｌｅ）溶液）、分散剤若しくは懸濁剤、錠剤、丸剤、粉末、リポソームならびに坐剤のような液体、半固形および固体の投薬形態物を包含する。好ましい形態物は意図される投与様式および治療的応用に依存する。好ましい投与様式は非経口（例えば静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい一態様において、薬理学的剤は腹腔内注入により投与される。
【０１０４】
典型的には、組成物は液体溶液若しくは懸濁剤いずれかとしての注入可能物として製造され；注入前の液体ベヒクル中の溶液若しくは懸濁液に適する固体の形態もまた製造し得る。該製剤はまた、乳化もし得るか、あるいは高められた補助効果のためリポソームまたはポリラクチド、ポリグリコリド若しくはコポリマーのような微小粒子中に被包化もし得る（例えばＬａｎｇｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９、１５２７（１９９０）およびＨａｎｅｓ、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ２８、９７−１１９（１９９７）を参照されたい）。本発明の剤は、有効成分の持続若しくはパルス放出を可能にするような様式で処方し得るデポー注射剤若しくは植込物製剤の形態でもまた投与し得る。デポー注射剤若しくは植込物製剤は、例えばピリメタミン化合物若しくは機能的アナログの１種若しくはそれ以上を含み得るか、または異なる剤の組合せ（例えばピリメタミンおよびノルエチンドロン）を含み得る。
【０１０５】
製薬学的組成物は、典型的には製造および貯蔵条件下で無菌かつ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、分散剤、リポソーム、若しくは高薬物濃度に適する他の規則正しい構造として処方し得る。無菌の注入可能な溶液は、必要とされる量の有効成分（すなわち薬理学的剤）を必要とされるとおり上で挙げられた成分の１種若しくは組合せと適切な溶媒中で組み込むこと、次いで濾過滅菌により製造し得る。
【０１０６】
一般に、分散剤は、上で挙げられたものからの基本的分散媒および必要とされる他成分を含有する無菌ベヒクルに有効成分を組み込むことにより製造する。無菌の注入可能な溶液の製造のための無菌の凍結乾燥粉末の場合、好ましい製造方法は、その以前に滅菌濾過した溶液からの有効成分およびいかなる付加的な所望の成分の粉末も生じる真空乾燥および噴霧乾燥である。溶液の適正な流動性は、例えばレシチンのようなコーティングの使用、分散剤の場合には必要とされる粒子径の維持、および界面活性剤の使用により維持し得る。注入可能な組成物の長時間吸収は、吸収を遅らせる剤、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを組成物に包含することによりもたらされ得る。
【０１０７】
核内受容体を調節する薬理学的剤は、当該技術分野で既知の多様な方法により投与し得る。当業者により認識されるであろうとおり、投与経路および／若しくは様式は所望の結果に依存して変動することができる。ある態様において、有効成分は、植込物、経皮貼付剤および微小被包化送達系を包含する徐放製剤のような、迅速放出に対し化合物を保護することができる担体とともに製造しうる。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸のような生物分解性の生物適合性ポリマーを使用し得る。こうした製剤の多くの製造方法が特許されているか、若しくは当業者に公知である。（例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ編、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク、１９７８；Ｋａｂａｎｏｖらへの米国特許第６，３３３，０５１号、およびＫａｂａｎｏｖらへの同第６，３８７，４０６号明細書を参照されたい）。
【０１０８】
ある態様において、核内受容体を調節する薬理学的剤は、例えば不活性希釈剤若しくは吸収可能な可食性担体とともに経口投与しうる。化合物（および所望の場合は他成分）は、硬若しくは軟殻ゼラチンカプセルに封入しても、錠剤に圧縮しても、または被験体の食餌に直接組み込んでもまたよい。経口の治療的投与のため、化合物を賦形剤とともに取り込みかつ摂取可能な錠剤、頬側錠剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用しうる。本発明の化合物を非経口投与以外により投与するために、化合物をその不活性化を予防する物質で被覆すること若しくはそれらと該化合物を共投与することが必要でありうる。
【０１０９】
ある態様において、核内受容体を調節する薬理学的剤は液体の形態で投与し得る。該薬理学的剤は、例えばメタノール、エタノールおよびイソプロパノールのような多様な溶媒に可溶性であるべきである。水および他の水性溶液中での薬理学的剤の溶解性を改良するための多様な方法が当該技術分野で既知である。例えば、Ａｌ−Ｒａｚｚａｋらへの米国特許第６，００８，１９２号明細書は、化合物の投与を改良するための親水相および界面活性剤若しくは界面活性剤の混合物を含んでなる親水性二相系（ｂｉｎａｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）を教示する。
【０１１０】
補助的有効成分もまた組成物に組込み得る。ある態様において、核内受容体を調節する薬理学的剤は、該薬理学的剤の薬物動態を改良するのに有用である１種若しくはそれ以上の付加的な治療薬と共処方かつ／若しくは共投与し得る。本発明の薬理学的剤の薬物動態を改良するための多様な方法が当該技術分野で既知である。（例えば、Ｎｏｒｂｅｃｋらへの米国特許第６，０３７，１５７号明細書を参照されたい）。
【０１１１】
薬理学的剤の薬物動態の他の改良方法は、例えば、Ｍａｓｔｅｒｓへの米国特許第６，３４２，２５０号、Ｋａｂａｎｏｖらへの同第６，３３３，０５１号、Ｓｔｒａｕｂらへの同第６，３９５，３００号、Ｋａｂａｎｏｖらへの同第６，３８７，４０６号、およびＲｅｅｄらへの同第６，２９９，９００号明細書に開示されている。Ｍａｓｔｅｒｓは薬理学的有効成分の除放のための薬物送達装置および方法を開示している。Ｍａｓｔｅｒｓにより開示される薬物送達装置は、１種若しくはそれ以上の生物分解性ポリマー物質、１種若しくはそれ以上の生物適合性溶媒、および薄膜全体に均一に分散された１種若しくはそれ以上の薬理学的有効成分を含んでなる薄膜である。米国特許第６，３３３，０５１号明細書において、Ｋａｂａｎｏｖらは、最低１種の架橋ポリアミンポリマーフラグメント、最低１種の非イオン性の水溶性ポリマーフラグメント、および最低１種の適する生物学的剤（薬理学的剤を包含する）を有するコポリマー網状構造を開示する。この特許の教示によれば、ナノゲル網状構造と称されるこの網状構造は、副作用を減少させかつ治療作用を増大させることにより薬理学的剤の治療効果を改善する。別の特許すなわち米国特許第６，３８７，４０６号明細書で、Ｋａｂａｎｏｖらは、多数の薬理学的剤の経口送達を改良するための別の組成物もまた開示している。
【０１１２】
薬理学的剤の送達および投与の他の改良方法は、膜を横断する、およびとりわけ血液脳関門を横断する薬理学的剤の能力の向上手段を包含する。一態様において、薬理学的剤を、血液脳関門を横断するその能力を向上させるように改変し得、また、代替の一態様において、薬理学的剤は、血液脳関門を横断する該薬理学的剤の能力を向上させる例えば抗真菌化合物のような付加的な剤と共投与し得る。あるいは、脳の特定部位への薬理学的剤の正確な送達は、定位微小注入技術を使用して実施し得る。例えば、処置されている被験体を定位支持枠（ＭＲＩ適合性）内に配置し得、そしてその後、高解像度ＭＲＩを使用して画像化して処置されるべき特定領域の三次元の位置決めを決定し得る。ＭＲＩ画像をその後、適切な定位固定ソフトウェアを有するコンピュータに転送し得、そして多数の画像を使用して薬理学的剤の微小注入のための標的部位および軌道を決定する。該ソフトウェアが、該定位枠について正確に登録されている三次元座標に軌道を翻訳する。頭蓋内送達の場合には、頭蓋を露出させることができ、進入部位の上にバーホールをドリルで開けることができ、そして定位固定装置を使用して針の位置を決めかつ予め決められた深さでの植込を確実にすることができる。薬理学的剤は、疾患若しくは障害と関連する脊髄、脳幹若しくは脳の細胞のような領域に送達し得る。例えば、標的領域は、脳髄質、橋、および中脳、小脳、間脳（例えば視床、視床下部）、終脳（例えば線条体、大脳皮質、または大脳皮質、後頭葉、側頭葉、頭頂葉若しくは前頭葉内）、あるいはそれらの組合せを包含し得る。
【０１１３】
薬理学的剤は、神経変性障害を処置するために単独で若しくは組合せで使用し得る。例えば、薬理学的剤は、例えば相加若しくは相乗効果を生じるために他の既存の核内受容体調節物質とともに使用し得る。同様に、該薬理学的剤は、単独で、若しくは付加的な剤、例えば治療的組成物に有益な属性を与える剤、例えば該組成物の粘度を遂げる剤とともに使用し得る。該組成物は、例えば該組合せが、形成される組成物がその意図される機能を発揮し得るようである場合に、１種以上の付加的な剤、例えば２若しくは３種の付加的な剤もまた包含し得る。いくつかの態様において、本発明は、例えばノルエチンドロンのような最低１種のプロゲステロン関連化合物、若しくはエストラジオールのような最低１種のエストロゲン関連化合物と一緒に、本発明のピリメタミン化合物若しくはその機能的アナログを投与することを包含する。これらの化合物および投与の説明については、２００６年３月１日出願の”Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（プロゲステロン受容体による神経変性疾患の調節）“および”Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  Ｅｓｔｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ（エストロゲン受容体による神経変性疾患の調節）“と題された同時係属出願を参照されたい。
【０１１４】
本発明の化合物は、水性溶液としてのそれらの長期貯蔵および投薬を容易にするために製薬学的に許容できる酸の塩と複合し得る。例えば、塩は製薬学的に許容できる担体（例えば水）の使用を伴い若しくは伴わずに製薬学的に許容できる酸（例えばＨＣｌ）由来であり得る。こうした塩は、例えば塩酸、臭化水素酸、酢酸、クエン酸、フマル酸、マレイン酸、ベンゼンスルホン酸およびアスコルビン酸を包含する無機若しくは有機いずれかの酸由来であり得る。担体および塩の組合せにより得られる製薬学的組成物は、一般に、所望の生物学的効果を導き出すのに必要な投薬量で使用することができる。これは、治療上有効な量、若しくは他の生物学的有効成分と組合せで使用される場合により少量でのその使用を包含する。
【０１１５】
本発明の製薬学的組成物は、本発明の薬理学的剤の「治療上有効な量」若しくは「予防上有効な量」を包含しうる。「治療上有効な量」は、所望の治療結果を達成するのに必要な投薬量でかつ時間の間有効な量を指す。薬理学的剤の治療上有効な量は、個体の疾患状態、齢、性および重量、ならびに個体で所望の応答を導き出す該薬理学的剤の能力のような因子により変動しうる。治療上有効な量は、薬理学的剤のいかなる毒性若しくは有害な効果も治療上有益な効果により超えられるものでもまたある。「予防上有効な量」は、所望の予防結果を達成するのに必要な投薬量でかつ時間の間有効な量を指す。典型的には、予防的用量は疾患の前若しくは早期段階に被験体で使用されるため、予防上有効な量は治療上有効な量より少ないことができる。
【０１１６】
投薬レジメンは至適の所望の応答（例えば治療若しくは予防応答）を提供するように調節しうる。例えば、単一ボーラスを投与することができるか、数回の分割用量を長時間に投与しうるか、または用量は治療状況の要件により示されるとおり比例して減少若しくは増大しうる。投与の容易さおよび投薬量の均一性のため非経口組成物を投薬単位形態物に処方することがとりわけ有利である。本明細書で使用されるところの投薬単位形態物は、処置されるべき哺乳動物被験体に対し単位投薬量として適する物理的に別個の単位を指し；各単位は、必要とされる製薬学的担体とともに所望の治療効果を生じるよう計算された予め決められた量の有効成分を含有する。本発明の投薬単位形態物の仕様は、（ａ）有効成分の独特の特徴および達成されるべき特定の治療若しくは予防効果、ならびに（ｂ）個体での過敏症の処置のための有効成分のような調合の技術分野に固有の制限により支配され、かつ、それらに直接依存する。
【０１１７】
薬理学的剤（例えばピリメタミン）の治療上若しくは予防上有効な量の例示的な制限しない一範囲は、被験体若しくは被験体群に投与される５ｍｇ／日ないし約２００ｍｇ／日、好ましくは約１０ｍｇ／日ないし約１５０ｍｇ／日、より好ましくは約５ｍｇ／日ないし約２０ｍｇ／日、および最も好ましくは約３ｍｇ／日ないし１０ｍｇ／日の間である。好ましくは、治療上有効な量の薬理学的剤（例えばピリメタミン）の投与は、１ナノモル（ｎＭ）ないし１００ミリモル（ｍＭ）濃度の範囲の血流中の薬理学的剤の濃度をもたらす。例えば、約１００ｎＭないし約１０ｍＭ、約１ｎＭないし約１ｍＭ、約１ｎＭないし約１００マイクロモル（μＭ）、約１μＭないし約５００μＭ、約１μＭないし約２００μＭ、若しくは約１０μＭないし約５０μＭの濃度範囲。投薬量の値は緩和されるべき状態の型および重症度とともに変動しうることが注目されるべきである。いずれかの特定の被験体について、特定の投薬レジメンを個々の必要性、および該組成物を投与する若しくはその投与を監督する人の専門的判断に従って長期間調節すべきであること、また、本明細書に示される投薬量範囲は例示のみでありかつ特許請求される組成物の範囲若しくは実務を制限することを意図していないことがさらに理解されるべきである。
【０１１８】
当業者は、上述の態様に基づき、本発明のさらなる特徴および利点を認識するであろう。従って、本発明は、付随する請求の範囲により示されるところを除き、具体的に示されかつ記述されたものにより制限されるべきでない。本明細書で引用される全部の刊行物および参考文献は、明らかに、そっくりそのまま引用することにより本明細書に組み込まれる。
【実施例１】
【０１１９】
材料および方法：
（ｉ）細胞培養
ヒト子宮頚癌由来ＨｅＬａ細胞株（ＡＴＣＣ）はＳＯＤ−１タンパク質およびｍＲＮＡを発現することが見出され、そして、ＳＯＤ−１発現を阻害する化合物を同定するためのモデル系として使用した。簡潔には、グルタミン４ｍＭ、認定ウシ胎児血清１０％、ならびにペニシリン、ストレプトマイシンおよびナイスタチン（全部Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補充した高グルコースを含むダルベッコの最小必須培地中で細胞を維持した。インキュベーション条件は５％のＣＯ２を伴う３７度および９９％相対湿度であった。培養物が９０％コンフルエンスに達した場合にそれらを継代した。薬理学的実験のため、細胞を１５０μｌの培地中３，５００細胞／ウェルの密度で、無菌組織培養処理済み９６ウェルプレートに接種した。
【０１２０】
（ｉｉ）薬物：
全部の化合物は１０ｍＭのストック濃度で１００％ＤＭＳＯに溶解した。薬物はＭｉｃｒｏｓｏｕｒｃｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ若しくはＳｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから得た。
【０１２１】
（ｉｉｉ）実験プロトコル：
接種および接着のための６時間後に、薬物を１０μＭの濃度で培地に添加した。薬物との７２時間のインキュベーション後に、細胞障害性を評価し得たように倒立顕微鏡およびデジタルカメラを使用して、細胞を１００倍で写真撮影した。写真文書化後に培地を除去し、そして細胞をリン酸緩衝生理的食塩水で１回洗浄し、およびその後、プロテアーゼインヒビターカクテルを含有する５０μｌの分子生物学等級水を添加した。１０分のインキュベーション後に、プレートを−８０度に置いて完全な溶解を誘導した。プレートをその後融解し、そして、２５μｌを、７５μｌのリン酸緩衝生理的食塩水を含有した、抗ヒトＳＯＤ−１抗体で被覆したマクスソープ（ｍａｘｓｏｒｐ）ＥＬＩＳＡプレートに各ウェルから移した。二次抗体対（ポリクローナル抗ＳＯＤ−１／ＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギ）をその後ウェルに添加し、そしてインキュベーションを室温で１時間実施した。インキュベーションの終了時にプレートを３回洗浄し（ＫＰＬ  Ｉｎｃ．からの洗浄緩衝液）、そしてＳｕｒｅ  Ｂｌｕｅ  Ｒｅｓｅｒｖｅ  ＨＲＰ基質を添加した。５〜１０分のインキュベーション後に反応（変動する程度まで青色に変わった）を停止試薬（ＫＰＬ）の添加により停止した。プレートをその後穏やかに５秒間振とうし、そして４５０ｎｍでの吸光度をＴｅｃａｎプレートリーダーで読取った。各サンプルからの吸光度を、同一ＥＬＩＳＡプレートでアッセイした精製組換えヒトＳＯＤ−１の標準曲線と比較し、そして、ＳＯＤ−１免疫反応性（ｎｇ／ｍｌ）を標準曲線との比較により推定した。
【０１２２】
（ｉｖ）ブラッドフォードタンパク質アッセイ：
ＳＯＤ−１アッセイで見出された減少分が単に薬物処理の細胞傷害効果の結果であったかどうかを決定するため、全タンパク質を各ウェルについて測定した。ＥＬＩＳＡインキュベーションを進行中に、１０μｌの残存するライセートを各ウェルから取り出しかつ別の空のプレートに入れ、そしてＢｉｏＲａｄブラッドフォード試薬（１００μｌ）をタンパク質に添加した。室温で１５分インキュベーション後に、プレートを穏やかに５秒間振とうし、そして吸光度をＴｅｃａｎ  Ｓｕｎｒｉｓｅプレートリーダーにて５９５ｎｍで読取った。各ウェル中のタンパク質濃度は、同一プレートで実験したタンパク質標準との比較によりかように決定した。
【０１２３】
（ｖ）定量的ＲＴ−ＰＣＲ：
９６ウェルプレート中の３５００細胞／ウェルのＨｅＬａ細胞を上のとおり本発明の化合物で７２時間処理し、そしてその後細胞を溶解し、そしてＧｅｎｔｒａ  ＲＮＡ抽出プロトコルおよび試薬を使用して全ＲＮＡを抽出した。精製したＲＮＡをその後、オリゴＤＴでプライミングするＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＭＭＬＶ転写酵素を使用する逆転写反応で鋳型として使用した。結果として生じるｃＤＮＡでＰＣＲ反応を実施して、ヒトＳＯＤ−１、ヒトＴＡＴＡボックス結合タンパク質およびヒトβ−２ミクログロブリンに対応するｃＤＮＡを増幅した。ＰＣＲ反応は別個のチューブ中で２０、２５および３０サイクル実施し、そしてアンプリコンをその後、臭化エチジウムを含有する２％アガロースゲル上で泳動した。ＵＶ光源による刺激後に、臭化エチジウム染色バンドにより発射される蛍光をデジタルカメラを使用して記録した。デジタル化した画像はＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して解析し、そしてＳＯＤ−１のバンドを、サイクルの直線範囲（これらの条件下で２５サイクル）の間で、対照に関する増大若しくは減少について、ＴＡＴＡボックス結合タンパク質およびβ２ミクログロブリン（これらのハウスキーピング遺伝子は該薬物により影響されなかった）のバンドと比較した。
【０１２４】
（ｖｉ）ＧｅｎｅＣｈｉｐ実験：
全細胞ｍＲＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡミニキット、次いでオリゴテックスｍＲＮＡミニキットを使用する処理を伴い若しくは伴わずにＨｅＬａ細胞から調製した。製造元の推奨に従い、Ｔ７−（ｄＴ）２４プライマーを用いｃＤＮＡ合成のためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２μｇの全ＲＮＡから二本鎖ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡをフェーズロックゲル（ＰＬＧ）フェノール／クロロホルム抽出により浄化し、そしてエタノール沈殿により濃縮した。供給元の推奨に従ってＢｉｏａｒｒａｙ  ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ  ＲＮＡ転写物標識キット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を使用するｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写により、ｃＤＮＡからビオチン標識ｃＲＮＡを合成した。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写産物はＲＮｅａｓｙスピンカラム（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して浄化し、そして断片化緩衝液（４０ｍＭトリス−酢酸、ｐＨ８．１、１００ｍＭ  ＫＯＡｃ、３０ｍＭ  ＭｇＯＡｃ）中で金属誘導加水分解により断片化した。断片化したｃＲＮＡをその後、ハイブリダイゼーション緩衝液（１００ｍＭ  ＭＥＳ、１Ｍ  ＮａＣｌ、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０１％  Ｔｗｅｅｎ−２０）中でＡｆｆｙｍｅｔｉｘ  ＧｅｎｅＣｈｉｐセットにかけた。ＧｅｎｅＣｈｉｐ画像をＡｆｆｙｍｅｔｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ  Ｖ５．０およびＡｆｆｙｍｅｔｉｘ  Ｄａｔａ  Ｍｉｎｉｎｇ  Ｔｏｏｌ  Ｖ３．０で解析した。全プローブ組のシグナル強度を１５０の標的値に対し概算した（ｓｃａｌｅｄ）。Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｃａｌｌ、Ｃｈａｎｇｅ  ＣａｌｌおよびＳｉｇｎａｌ  Ｌｏｇ  Ｒａｔｉｏの結果を、絶対および比較双方の解析のための統計学的アルゴリズムにデフォルトのパラメータを適用することにより得た。
【０１２５】
（ｖｉｉ）ウエスタンブロッティング。
動物にペントバルビタールナトリウムを過剰投与した（２５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）。脊髄を解剖し、そして２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２ｍＭ  ＤＴＴ、０．１ｍｇのロイペプチン、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１ｍＭ  ＥＧＴＡ中でホモジナイズした。ホモジェネートをその後１４，０００×ｇで遠心分離して破片をペレットにした。タンパク質濃度はＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）を使用して測定した。各サンプルからのタンパク質（２５μｇ）を４〜２０％トリス−グリシンゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州サンディエゴ）上で泳動した。転写後、メンブレンをＰＢＳで洗浄し、次いでブロッキング緩衝液（０．２％Ｉ−ｂｌｏｃｋ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州フォスターシティ）、ＰＢＳおよび０．１％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で一夜インキュベートした。メンブレンをその後、４０００倍希釈のポリクローナルウサギ抗ウシＳＯＤ１（Ｓｉｇｍａ）抗体でプロービングした。数回洗浄後、メンブレンをアルカリホスファターゼ結合二次抗体（ブロッキング緩衝液中５０００倍）とインキュベートし、そして増強化学発光試薬ＣＤＰ  Ｓｔａｒ（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｓｔａｒキット；Ｔｒｏｐｉｘ）を使用して免疫反応性シグナルを可視化した。露光後にフィルムを走査し、そしてその後、バンド密度の量についてＮＩＨ  Ｉｍａｇｅにインポートした。
【実施例２】
【０１２６】
抗マラリア薬の効果の試験
本実施例は、ＳＯＤ−１活性に対する抗マラリア薬ピリメタミンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効果を検査する方法を記述する。ヒト子宮頚癌由来ＨｅＬａ細胞株（ＡＴＣＣ）を、グルタミン４ｍＭ、認定ウシ胎児血清１０％、ならびにペニシリン、ストレプトマイシンおよびナイスタチン（全部Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから）を補充した高グルコースを含むダルベッコの最小必須培地中で培養した。インキュベーション条件は５％のＣＯ２を伴う３７℃および９９％相対湿度であった。培養物が９０％コンフルエンスに達した場合にそれらを継代した。薬理学的実験のため、細胞を１５０μｌの培地中３，５００細胞／ウェルの密度で、無菌組織培養処理済み９６ウェルプレートに接種した。
【０１２７】
ピリメタミンとの７２時間インキュベーション後に細胞を写真撮影し、そして実施例１（ｉｉｉ）に記述されるとおり処理した。ライセートの全タンパク質を実施例１（ｉｖ）に記述されるところのブラッドフォードアッセイにより測定した。この試験の結果を図１に示す。これらの結果は、収集７２時間前にＨｅＬａ細胞の培地に添加したピリメタミンがＳＯＤ−１タンパク質のレベルを有意に低下させた一方、全タンパク質レベルは影響されなかったことを示す。この低下は用量に関連しかつ３μＭ未満のＩＣ５０を伴い１０μＭまでに最大であった。図２は、ノルエチンドロンおよびピリメタミン（５μＭ）双方が７２時間処理後にＨｅＬａ細胞でｈＳＯＤ−１  ｍＲＮＡの用量に関連した減少を引き起こしたことを示す。
【０１２８】
α−シヌクレインは、パーキンソン病（ＰＤ）およびレヴィー小体を伴う痴呆のようなレヴィー小体封入体を特徴とする神経変性障害に関与している。レヴィー小体様封入体は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を伴う患者の脊髄ニューロンでもまた観察され、そして、報告は、ＡＬＳ患者における可能なα−シヌクレイン異常を示唆しているα−シヌクレインはタンパク質シャペロン１４−３−−３に対する有意の物理的および機能的相同性を共有する遍在タンパク質であり、そして脳中でとりわけ豊富である（Ｏｓｔｒｅｒｏｖａ  Ｎ．ら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９：５７８２（１９９０））。増大するα−シヌクレイン凝集率がレヴィー小体病における神経変性の機構に寄与するとみられる。トランスジェニック動物での研究もまた、α−シヌクレインの凝集がニューロンに有害であることを示唆している。野性型ヒトα−シヌクレインを発現するトランスジェニックマウスでドーパミン系の機能不全が発生したこと（Ｍａｓｌｉａｈ，Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２８７：１２６５−１２６９（２０００））、およびα−シヌクレインを過剰発現するショウジョウバエが、α−シヌクレイン凝集物の発生と関連するドーパミン系の機能不全およびドーパミン作動性神経死を表したこと（Ｆｅａｎｙ，Ｍ  Ｂ，ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４０４：３９４−８（２０００））が報告された。証拠は、ドーパミンを含むニューロンが、α−シヌクレイン凝集物を発生しかつこれらの凝集物発生の際に変性することを示唆している。
【０１２９】
図４に示されるＧｅｎｅｃｈｉｐ分析の結果は、ピリメタミン（ＡＬＧ−２００１）（３μＭ）およびノルエチンドロン（ＡＬＧ−３００１）（３μＭ）が、４日の処置後にＨｅＬａ細胞中のαシヌクレインのｍＲＮＡを実質的に減少させたことを具体的に説明する。従って、本発明の化合物はレヴィー小体病における神経変性を遅らせ得る。これは、ＡＬＳおよびＰＤの進行の遅延若しくはそれらの影響の改善における本発明の化合物の役割を具体的に説明する。
【実施例３】
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの薬理学的剤の効果の試験
（ａ）ＳＯＤ−９３Ａマウスモデル
実施例２に記述された薬理学的剤、例えばピリメタミンおよびそのアナログの効果を、ＡＬＳのＳＯＤ−９３Ａマウスモデルでｉｎ  ｖｉｖｏで試験し、そしてＳＯＤ−１レベルの低下を測定した。ＲＮＡ発現の阻害は、標準的ＲＴ−ＰＣＲ技術を使用して、化合物のＡＬＳ誘導前および後の技術に認識されたマウスモデルからの単離した血液サンプルによりモニターした。ＳＯＤ−１タンパク質の発現は、Ｓｉｇｍａからの抗ＳＯＤ−１抗体を用いるウエスタンブロット技術を使用して測定した。
【０１３１】
図５および６に示されるとおり、ピリメタミンでの慢性処置（１０ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ×１４日）はマウスリンパ球中のＳＯＤ−１タンパク質およびαシヌクレインを有意に（Ｐ＜０．０５、ｎ＝７）減少させた。該結果はスチューデントのｔ検定解析を使用して統計学的に有意であることが示された。対照はベヒクル（生理的食塩水）であった。
【０１３２】
慢性ピリメタミン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）は、図７に示されるとおり、１４日処理後にＧ９３Ａマウスにおいて脊髄ＳＯＤ−１を有意に減少させた。ピリメタミンは１４日間経口投与した。脊髄を収集し、そして上述されたとおりウエスタンブロット分析により分析した。
【０１３３】
（ｂ）ヒト家族性ＡＬＳ患者
３８歳の家族性ＡＬＳ患者志願者は、ピリメタミンの経口処置（１００ｍｇ／日、３０日間）後にＳＯＤ−１レベルの有意の低下を示した。図８は、処置前（ｐｒｅｄｒｕｇ）と比較した薬物の投与後（ｐｏｓｔ  ｄｒｕｇ）の家族性ＳＯＤ１患者での低下したリンパ球ＳＯＤ１レベルを示す。およそ５〜８ｃｃの血液を患者から収集した。ＳＯＤ−１レベルはＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析により分析した。
【０１３４】
ｉｎ  ｖｉｖｏ効果は、Ｒｅｎａｉｓｓａｎｃｅ  Ｐｕｒｉｔａｎ  Ｂｅｎｎｅｔｔ肺活量計を使用して努力肺活量（ＦＶＣ）を測定することにより被験体の呼吸をモニターすることによってもまた測定し得る。最大吸気力（ｍａｘｉｍｕｍ  ｉｎｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒｃｅ）（ＭＩＦ）もまた、携帯型マノメータを使用して測定し得る。
【実施例４】
【０１３５】
神経学的評価
核内受容体を調節する薬理学的剤の効果は、４点尺度で記録した神経学的スコアによってもまた決定し得る。
０＝後肢での正常反射（動物はその尾で持ち上げる場合にその後肢を広げることができる）
１＝異常反射（動物をその尾で持ち上げる場合の後肢の広げの欠如）
２＝異常反射および麻痺の目に見える証拠
３＝後肢の反射の欠如および完全麻痺
４＝側臥にした場合にそれら自身を３０秒で起こすことの不能、若しくは死亡して見出される。動物は生存の場合この段階で殺す。
【０１３６】
神経学的スコア、体重および生存に関する統計学的解析は、ＡＮＯＶＡ、Ｋａｐｌａｎ  Ｍｅｉｅｒ、ｔ検定、Ｃｏｘの比例ハザード回帰モデル、対数ロジスティックおよびパラメトリック法、ならびに線形混合モデル法を利用することにより実施し得る。全部の統計学的解析は当該技術分野で既知の標準的手順を使用して実施した。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】ピリメタミンによるＳＯＤ−１タンパク質発現の減少を示すグラフである。
【図２】ピリメタミンおよびノルエチンドロンでのＳＯＤ−１  ｍＲＮＡの低下された発現を示す棒グラフである。
【図３】本発明の数種の代表的ピリメタミン機能的アナログを示す図解である。
【図４】ピリメタミンおよびノルエチンドロンでの処理後のＨｅＬａ細胞中のαシヌクレインのｍＲＮＡの低下した発現を示す棒グラフである。
【図５】慢性ピリメタミン処置（ＴＸ）での雄性および雌性ＳＯＤ−９３ＡマウスにおけるＳＯＤ−１タンパク質発現の減少を示す棒グラフである。
【図６】慢性ピリメタミン処置でのマウスリンパ球中でのαシヌクレインの発現の減少を示す棒グラフである。
【図７】ピリメタミンの経口投与後のＳＯＤ−９３Ａマウスにおける脊髄ＳＯＤ−１の減少した発現を示す棒グラフである。
【図８】ピリメタミンの経口投与３０日後の家族性ＳＯＤ−１患者におけるリンパ球ＳＯＤ−１レベルの減少を示す棒グラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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