(57)【要約】  微量流体デバイスで使用するのに適した、凍結乾燥ペレット及びこれを製造するための方法を記載する。該凍結乾燥ペレットは、様々な生物学的試薬、又は微小粒子、及び低温保護剤を含む。該凍結乾燥ペレットは、高度の球形度を有し、また0.5〜35μLなる範囲のサイズを持つ。これらのペレットは、試薬溶液の滴を、極低温に冷却されたプレート上に分配し、次いで真空下に置くことによって製造する。
2008539727.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
低温保護剤；PCR試薬混合物；KCl、MgCl2及び(NH4)2SO4からなる群から選択される塩；及び場合により緩衝剤を含有し、0.5〜35μLなる範囲内の体積を持つことを特徴とする凍結乾燥ペレット。
【請求項２】
該PCR試薬混合物が、少なくとも一つの酵素；少なくとも一つのタンパク質；少なくとも一つのプライマー；少なくとも一つのフルオロゲン性プローブ；少なくとも一つのプラスミド；少なくとも一つのポリペプチド；及びdATP、dGTP、dCTP、dTTP、及びdUTPからなる群から選択される、少なくとも一つのヌクレオチド；及び場合により少なくとも1種の非-特異的なコントロール核酸を含む、請求項1記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項３】
緩衝剤を含有し、該緩衝剤がトリスである、請求項1記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項４】
該低温保護剤が、トレハロースである、請求項1記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項５】
更に、増量剤をも含む、請求項1記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項６】
凍結乾燥ペレットの製造方法であって、
分取チップ内に液状組成物を導入する工程と；
該分取チップを、極低温状態に冷却されたプレート上に配置する工程であって、該プレートが、疎水性表面を有し、かつ該チップが、該表面と近接状態にある工程と；
該チップからの、該液状組成物の液滴を、該表面上に分配する工程であって、該液滴が、該チップ及び該表面両者と瞬間的に接触状態にある工程と；
該チップを、該表面との近接状態から開放して、該液滴を該表面との接触状態に維持する工程と；
該液滴が凍結して、凍結液滴を形成するような期間に渡り、該液滴を、該表面との接触状態に維持する工程と；
該凍結液滴を、凍結乾燥ペレットの生成にとって十分な条件下にある、凍結乾燥装置内に配置する工程、
を含むことを特徴とする、上記製造方法。
【請求項７】
該極低温状態に冷却されたプレートが、約-65℃〜-180℃なる範囲内の温度を持つ、請求項6記載の方法。
【請求項８】
該疎水性表面が、本質的に平坦である、請求項6記載の方法。
【請求項９】
該疎水性表面が、ダイヤモンド表面、酸化ケイ素表面、ダイヤモンド-SiO2スライド、及びPTFEからなる群から選択される、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
該方法が、多重法であって、多数の分取チップを含み、結果として多数の凍結乾燥ペレットを同時に製造する、請求項6記載の方法。
【請求項１１】
該凍結乾燥ペレットが、本質的に球状である、請求項6記載の方法。
【請求項１２】
該液状組成物が、一定濃度の微小球を含む、請求項6記載の方法。
【請求項１３】
該濃度が、103〜1013個の微小球/mLなる範囲内にある、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
該濃度が、106〜108個の微小球/mLなる範囲内にある、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
約1〜約1012個なる範囲の微小球を含む、請求項12記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項１６】
該微小球が、ポリカチオン性物質で被覆されている、請求項6記載の方法。
【請求項１７】
該液状組成物が、酵素混合物；及びPCR試薬混合物からなる群から選択される生物学的な試薬の混合物を含む、請求項6記載の方法。
【請求項１８】
該表面に対する近接状態が、0.5〜1.5mmなる範囲の距離での隔置状態である、請求項6記載の方法。
【請求項１９】
該凍結乾燥ペレットが、0.5〜35μLなる範囲の体積を持つ、請求項6記載の方法。
【請求項２０】
該凍結乾燥ペレットが、2〜25μLなる範囲の体積を持つ、請求項6記載の方法。
【請求項２１】
該凍結乾燥ペレットが、1〜10μLなる範囲の体積を持つ、請求項6記載の方法。
【請求項２２】
該凍結乾燥ペレットの生成にとって十分な条件が、約20〜40時間なる範囲の、該凍結乾燥装置内での滞留時間を含む、請求項6記載の方法。
【請求項２３】
該凍結乾燥ペレットが、約0.5〜約5mmなる範囲内の直径を持つ、請求項6記載の方法。
【請求項２４】
0.75〜1なる範囲内の球形度を有することを特徴とする、請求項6記載の方法によって製造した、凍結乾燥ペレット。
【請求項２５】
凍結乾燥ペレットを製造するための装置であって、
疎水性表面を有する、極低温状態に冷却されたプレート；
分取チップを、該疎水性表面上であって、かつこれと近接状態で配置するように形成された分配装置であって、該分取チップが、該疎水性表面上に、液滴を分配して、凍結液滴の生成を生じるように形作られている分配装置、及び
少なくとも該疎水性表面を包囲し、かつ該凍結液滴を凍結乾燥するのに十分な温度並びに圧力条件を、適用するように形作られているチャンバー、
を含むことを特徴とする装置。
【請求項２６】
微量流体用カートリッジであって、
試薬導入口であって、各々1又はそれ以上の試薬を含むように、1又はそれ以上の凍結乾燥ペレットが、配置されている試薬導入口；及び
該試薬導入口と接続されている、少なくとも一つの微量流体チャンネルを有する、微量流体ネットワークであって、該チャンネルが、該導入口から該チャンネルに、流体が流通することを可能とするように形作られている微量流体ネットワーク、
を含み、
該1又はそれ以上の凍結乾燥ペレットが、請求項1記載の組成物を含む、ことを特徴とする、上記カートリッジ。
【請求項２７】
更に、溶解チャンバーを含み、該溶解チャンバー内に、各々1又はそれ以上の溶解試薬を含む、1又はそれ以上の凍結乾燥ペレットが配置されている、請求項26記載のカートリッジ。
【請求項２８】
該ネットワークが、更にバルブ、ゲート、出口、ベント、及びチャンネルからなる群から選択される、少なくとも一つの部品をも含む、請求項26記載のカートリッジ。
【請求項２９】
低温保護剤；及び103〜1013/mLなる範囲内の濃度を持つ、複数の微小球を含み、0.5〜35μLなる範囲の体積を持つことを特徴とする、凍結乾燥ペレット。
【請求項３０】
本質的に球形の形状を持つ、請求項29記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項３１】
該微小球が、ポリカチオン性物質で被覆されている、請求項29記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項３２】
該ポリカチオン性物質が、ポリ-D-リジン、ポリエチレンイミン、ポリ-DL-オルニチン、及びポリ-ヒスチジンからなる群から選択される、請求項31記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項３３】
該ポリカチオン性物質が、ポリ-D-リジンであり、その構成分子が、1,000〜4,000ダルトンなる範囲内の分子量を持つ、請求項32記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項３４】
該ポリ-D-リジンが、約1770ダルトンなる平均分子量を持つ、請求項33記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項３５】
該ポリカチオン性物質が、ポリエチレンイミンであり、その構成分子が、600〜800ダルトンなる範囲内の分子量を有する、請求項32記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項３６】
該ポリカチオン性物質が、ポリ-DL-オルニチンであり、その構成分子が、12,000〜30,000ダルトンなる範囲内の分子量を有する、請求項32記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項３７】
更に、増量剤をも含む、請求項29記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項３８】
該低温保護剤が、トレハロースである、請求項29記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項３９】
更に、酵素混合物をも含む、請求項29記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項４０】
低温保護剤；プライマー；プローブ；内部コントロールプラスミド；特異性コントロール；PCR試薬；随意の塩；随意の増量剤；及びポリメラーゼを含むことを特徴とする、凍結乾燥ペレット。
【請求項４１】
該プライマー、該プローブ及び該特異性コントロールが、第B群のストレプトコッカスに対して特異的なものである、請求項39記載の凍結乾燥ペレット。
【請求項４２】
該プライマー、該プローブ及び該特異性コントロールが、エルシニア・ペスティス；エルウィニア・ヘルビコラ；バチルス・アンスラシス；バチルス・グロビジイ；リステリア・モノサイトゲネス；イー・コリO157；ヘルペス・シンプレックスウイルス1；及びヘルペス・シンプレックスウイルス2からなる群から選択される病原体に対して特異的である、請求項39記載の凍結乾燥ペレット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（優先権の請求）
本特許出願は、2005年11月16日付で出願された、米国仮特許出願第60/737,519号の優先権の利益を請求するものであり、また2005年5月3日付で出願された、国際特許出願第PCT/US2005/015345号の優先権の利益をも請求するものである。これら両者の全体を、参考としてここに組入れる。
本発明は、一般に凍結乾燥ペレットに関連する。本発明は、特に微量流体(microfluidic)デバイスにおいて使用するのに適した、凍結乾燥ペレット、及びその製造方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
しばしば冷凍(凍結)乾燥(freeze-drying)とも呼ばれる、凍結乾燥(lyophilization)は、生物学的な試薬を、取扱いの便利な形状に添加するための効果的な方法であるが、該生物学的な試薬の活性の付随的な喪失をもたらすことはない。凍結乾燥は、非水性成分の濃度が増大するように、凍結された混合物から、通常は真空下で、昇華によって含有水を除去することを含む。凍結乾燥された物質は、典型的には、この工程中に、該物質内で、水蒸気の気泡が膨張する際に生成される、多孔質構造を持つ。凍結乾燥物質は、取扱いに注意を要する可能性があるが、これらは通常、その成分の溶液状態に容易に再生でき、また対応する溶液状態よりも著しく軽量である。凍結乾燥方法及び装置は、例えばLyophilization - Introduction and Basic Principles, T.A. Jennings, (CRC プレス(Press) LLC,ボカラトン(Boca Raton), FL)に記載されている。これを参考文献としてここに組入れる。
【０００３】
凍結乾燥は、微粉末(サブミクロン程度の径)の構成成分と同程度に小さなペレット及び径3〜10mmのより大きなペレットを製造するのに利用されている。しかし、これまでは、0.5〜3mmなる範囲の径(約0.1〜15μL)の凍結乾燥ペレットを製造することは困難であった。このようなペレットは、入手できるとすれば、微量流体系における試薬の実際の放出にとって有用であり、該系において、該試薬の体積は、数マイクロリットル程度であり、またその反応チャンバーは、その寸法において数ミリメータ(mm)程度に過ぎない。
それにも拘らず、凍結乾燥ペレットを製造するための既存の技術を、0.1〜15μLなる範囲の、微量流体デバイスに配備するのに適した形状のペレットを製造するために、適応させることは容易でない。
【発明の開示】
【０００４】
本発明は、凍結乾燥ペレット及び該ペレットの製法に関する。該ペレットは、好ましくは1又はそれ以上の試薬を含む。より一層好ましくは、該試薬は、酵素等の生物学的な試薬である。更に一層好ましくは、該試薬(例えば、プライマー、コントロールプラスミド、ポリメラーゼ酵素)は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)において、あるいはPCRを実施するために付随的な諸工程、例えばサンプル調製において有効利用されているものである。従って、本発明の凍結乾燥ペレットは、また該ペレットが溶解試薬(例えば、酵素)を含んでいる場合には、細胞を溶解するためにも適している。特に、溶解酵素(例えば、特定の微生物に対して特異的な、又は非-特異的な)を含む、本発明の凍結乾燥ペレットは、細胞を溶解して、ポリヌクレオチドを放出させることができる。該凍結乾燥ペレットは、付随的に、あるいは別法では、タンパク質を分解する酵素(例えば、プロテアーゼ)、特定の核酸を分解するヌクレアーゼ(例えば、RNAase又はDNAase)、又は脂質を分解するリパーゼを含むことができる。本発明の凍結乾燥ペレットは、微量流体デバイスにおいて利用するのに特に適している。
【０００５】
幾つかの態様において、該凍結乾燥ペレットは、多数の小粒子、例えば微小球を含んでおり、その各々は、これに結合している複数のリガンドを持つ。このようなリガンドは、他の種、例えばPCR阻害剤と結合する、これらの性質に比して、ポリヌクレオチド等の生体分子と優先的に結合する。このような凍結乾燥ペレットは、該凍結乾燥ペレットが、付随的に溶解剤(例えば、酵素)を含む場合には、細胞を溶解するのに適している。好ましくは、このような試薬は、細胞を溶解して、ポリヌクレオチドを放出させる。該細胞由来のポリヌクレオチドは、より小さな粒子と結合しているリガンドと結合することになる。該凍結乾燥ペレットは、またタンパク質を溶解する酵素(例えば、プロテアーゼ)を含むことができる。
該凍結乾燥ペレットを再生するために、これと細胞を含む溶液とを併合することによって、該細胞を溶解することができる。該ペレットから再生された溶解試薬は、これらの細胞を溶解する。溶解中に、該溶液は、加熱(例えば、加熱ランプ等のランプの輻射を利用)することができる。
【０００６】
本発明は、更に凍結乾燥ペレットの製造方法を含み、該方法は、1又はそれ以上の試薬及び低温保護剤(cryoprotectant)(例えば、糖又はポリ-アルコール)を含む溶液を製造する工程を含む。この溶液を、冷却した疎水性表面、例えばダイヤモンドフィルム、酸化ケイ素フィルム、又はポリテトラフルオロエチレン(PTFE)表面上に、滴下堆積させる。好ましくは、該表面は、ダイヤモンドと酸化ケイ素との複合体である。該ペレットを凍結させ、かつ(典型的には、依然として凍結状態で)減圧条件下に、該溶媒を除去(例えば、昇華による)するのに十分な時間おく。
本発明は、また凍結乾燥ペレットをも包含し、これは低温保護剤；酵素、タンパク質、プライマー、フルオロゲン性(fluorogenic)プローブ、プラスミド、ポリペプチド核酸及びヌクレオチドdATP、dGTP、dCTP、dTTP、及び随意のdUTPからなる群から選択される群の生物学的試薬；緩衝剤、例えばトリス(Tris)；及び塩、例えばKCl、MgCl2及び(NH4)2SO4を含有し、該凍結乾燥ペレットが、0.1〜35μLなる範囲、及び好ましくは0.5〜25μLなる範囲、より好ましくは1〜15μLなる範囲、及びより一層好ましくは2〜10μLなる範囲内の体積を持つことを特徴とする。
【０００７】
本発明は、また凍結乾燥ペレットを包含し、これは低温保護剤；及び103〜1013個/mLなる範囲、及び好ましくは106〜1010個の微小球/mLなる範囲の濃度を持つ複数の微小球を含有し、該凍結乾燥ペレットが、0.5〜35μLなる範囲、及び好ましくは0.5〜25μLなる範囲、より好ましくは1〜15μLなる範囲、及びより一層好ましくは2〜10μLなる範囲内の体積を持つことを特徴とする。
本発明は、また凍結乾燥ペレットの製造方法をも包含し、この方法は、分取チップ内に液状組成物を導入する工程；該分取チップを、極低温状態に冷却されたプレート上に配置する工程、ここで該プレートは、疎水性表面を有し、かつ該チップは、該表面と近接状態にあり；該チップからの、該液状組成物の液滴を、該表面上に分配する工程；該チップを、該表面との近接状態から開放して、該液滴を該表面との接触状態に維持する工程；該液滴が凍結して、凍結液滴を形成するような期間に渡り、該液滴を、該表面との接触状態に維持する工程；及び該凍結液滴を、凍結乾燥ペレットの生成にとって十分な条件下にある、凍結乾燥装置内に配置する工程を含む。
本発明は、更に0.75〜1なる範囲内の球形度を持つ、上記方法によって製造された凍結乾燥ペレットをも包含する。本発明は、またペレット中に、更に約1〜1010個の微小球なる範囲の量で微小球を含有する、このような凍結乾燥ペレットをも包含する。
【０００８】
本発明は、更に凍結乾燥ペレットを製造するための装置をも包含し、該装置は、疎水性表面を持つ、極低温状態に冷却されたプレート；液体の液滴を該疎水性表面上に分取して、該液滴を凍結するように形成された、分取チップ；該分取チップを、該疎水性表面上であって、かつこれと近接状態で配置するように形成された分配装置；及び少なくとも該疎水性表面を包囲し、かつ該液滴を凍結乾燥するのに十分な温度並びに圧力条件を適用するように形作られているチャンバーを含む。
本発明は、更に微量流体用カートリッジをも包含し、該カートリッジは、試薬導入口と、ここには、各々1又はそれ以上の試薬を含んでいる、1又はそれ以上の凍結乾燥ペレットが、配置されており；溶解チャンバーと、ここには、各々1又はそれ以上の溶解試薬を含んでいる、1又はそれ以上の凍結乾燥ペレットが、配置されており；少なくとも一つのバルブ；少なくとも一つのゲート；少なくとも一つの出口；少なくとも一つのベント；及び導入口、チャンバー、及び出口間に流体を通すことを可能とするように形作られている、少なくとも一つのチャンネルを含み；該1又はそれ以上の凍結乾燥ペレットが、ここにおいて更に説明されるような組成物を含んでいることを特徴とする。
本発明の1又はそれ以上の態様の詳細を、添付図面及びここに与える説明において示す。本発明の他の特徴、目的、及び利点は、以下の説明及び添付図、並びに特許請求の範囲から明らかになるであろう。尚、添付図において、類似の参照記号は、類似の要素を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
本発明の凍結乾燥ペレットは、微小球を含有する組成物を放出するのに、特に適している。他の組成物は、正に酵素等の、1種又はそれ以上の生物学的な試薬を含んでいる。更に別の凍結乾燥ペレットは、微小球と、1種又はそれ以上の生物学的な試薬を含んでいる。
本発明の方法は、生物学的な物質と微小球の懸濁液との組合せを、これらあらゆる個々の成分の活性の大幅な喪失無しに、凍結乾燥することを可能とする。
本発明の方法は、マスター混合物としての生物学的な物質(酵素、他のタンパク質、プライマー、フルオロゲン性プローブ、プラスミド等)を含む混合物を、該生物学的な物質が、その活性及び好ましくはその全活性を維持するように、凍結乾燥することを可能とする。
【００１０】
本発明の方法は、また微小粒子の懸濁液、例えばポリスチレンラテックス微小球又は磁性微小球(両者とも、活性化された表面化学作用を含む)を、凍結乾燥することを可能とする。このような微小粒子は、親和性物質の例である。
本発明の凍結乾燥ペレットは、サンプル中における、1種又はそれ以上のポリヌクレオチドの存在を確認するための方法において使用できる。故に、本発明の凍結乾燥ペレットは、典型的には数種の試薬を含む。幾つかの態様において、該凍結乾燥ペレットは、ポリヌクレオチドの存在を確認し、及び/又は該ポリヌクレオチドの濃度を高めるための反応において使用する、1種又はそれ以上の化合物を含む。例えば、凍結乾燥ペレットは、該ポリヌクレオチドをPCRによって増幅するための1種又はそれ以上の酵素を含むことができる。
微小球を本発明と共に使用する場合には、該微小球は、好ましくは1種又はそれ以上のポリカチオン性物質で被覆される。該ポリカチオン性物質は、好ましくはポリ-D-リジン、ポリエチレンイミン(PEI)、ポリ-DL-オルニチン、及びポリ-ヒスチジンからなる群から選択される。
【００１１】
好ましくは、このようなポリカチオン性物質は、1,000〜4,000ダルトンなる範囲内の分子量を持つポリ-D-リジンである。更に一層好ましくは、該ポリカチオン性物質は、約1770ダルトンなる平均分子量を持つポリ-D-リジンである。
該ポリカチオン性物質がPEIである場合、その分子量は600〜800ダルトンなる範囲内にある。分岐したPEIが、等価な分子量を持つ直鎖PEIよりも、凍結乾燥すべき微小球を形成するのに、より効果的であることが分かっている。
該ポリカチオン性物質が、ポリ-DL-オルニチンである場合、その分子量は、12,000〜30,000ダルトンなる範囲内にある。
ポリ-ヒスチジンは、RNA用途に対して特に好ましい。というのは、RNAに対するその適用において、このものは、匹敵するDNA用途に対して適用できるpHよりも、低いpHを、結合、洗浄並びに遊離(放出)のために使用することを可能とするからである。ポリ-ヒスチジンは、約4なるpHにおいてRNAと結合し、4-5なる範囲のpHにて洗浄でき、また8-9なるpHにて放出できる。
【００１２】
典型的には、本発明の凍結乾燥ペレットは、約0.1μL〜約5μLなる範囲(例えば、約4μL、約3μL、約2μL、又は約1μL)なる平均体積を有する。体積νを持つペレットに対して適用されるような、該用語「約」とは、該ペレットが、ν±0.5μLなる体積を持つことを意味するものと理解すべきである。好ましくは、製造するペレットは、2μLなる体積を持つが、0.5μL程度の小さなペレットを使用することも可能である。
典型的には、該凍結乾燥ペレットは、好ましくはその形状において球形であるが、該ペレットは、その径において不均一であってもよく、また約0.5mm〜約5mm(例えば、約4mm、約3mm、約2.5mm、約2mm、又は約1mm)なる範囲の平均径を持つことができる。平均径dを持つペレットに対して適用されるような、該用語「約」とは、該ペレットが、d±0.5mmなる平均径を持つことを意味するものと理解すべきである。
本発明の方法によって製造した該凍結乾燥ペレットは、これらが球形であり、高度に均一性を持つことから、有利である。このことは、真空ピックアップ法によって、該ペレットをより一層効率的に扱うことを可能とする。ペレットの球形度：sは、比率間の比として定義されるパラメータによって測定できる。特に、これは該ペレットの表面積対体積の比を、該ペレットと同一の押しのけ容積(displacement volume)を持つ理想的な球の表面積対体積の比で割った値である。従って、体積Vを持つ完全な球の表面積対体積の比をs0とし、また同様に体積Vを持つ本発明のペレットの表面積対体積の比をspとすると、このペレットの球形度は、式：s = sp/s0によって与えられる。好ましくは、本発明のペレットは、0.7〜1.0なる範囲内(ここで、1.0は、完全な球状のペレットを表す)の球形度を持つ。より一層好ましくは、該球形度は、0.9〜1.0なる範囲内にある。
【００１３】
本発明の方法によって製造したペレットのある集団が、限られた範囲、例えば相互に±0.5mmの範囲内にある平均径を持つことが好ましい。かくして、例えばペレットのある集団は、その全てのペレットの平均径が、3±0.5mmなる範囲内にあるペレットで構成される。
例示的な一態様において、凍結乾燥ペレットのある集団は、約2μLなる平均体積、及び約1.35mmなる平均径を持つ。好ましい2μLのPCRペレットの平均径は、約1.3〜1.7mmなる範囲にある。
低温保護剤は、一般的に該凍結乾燥ペレットの安定性を高めるのに役立つが、該ペレット中の試薬に対する損傷防止のために役立つ(例えば、該ペレットの調製中及び/又は保存中、及び更に該ペレットの再生中の酵素の変性を防止することによる)。更に、低温保護剤は、また該ペレットに物理的な安定性を付与する。幾つかの低温保護剤は、また該試薬の酸化を防止する。好ましくは、該低温保護剤は糖、又はトレハロースである。幾つかの態様において、該低温保護剤は、デキストリン等の増量剤との組合せで使用される。適当な低温保護剤は、またグリコール、例えばエチレングリコール、プロピレングリコール、及びグリセロールをも含む。幾つかの態様において、該低温保護剤は、1種又はそれ以上のポリアルコール(例えば、マニトール、ソルビトール)と混合された、1種又はそれ以上の糖(例えば、1種又はそれ以上の二糖類、例えばトレハロース、メレジトース(melizitose)、ラフィノース)を含む。
【００１４】
該ペレットは、また1種又はそれ以上の、デキストラン等の増量剤を含むこともできる。増量剤は、該凍結乾燥ペレットの合成を維持するのに役立つ。不活性であることから、これらは上記試薬分子を相互に物理的に分離された状態に維持し、結果としてその他の分子との反応性を減じている。
本発明の凍結乾燥ペレットにおいて見出された、成分の好ましい3つの組合せは、以下の通りである：第一の態様における、PCRの実施に適したペレットにおいて、該ペレットは、低温保護剤；及びPCR試薬混合物；場合によりKCl、MgCl2及び(NH4)2SO4等の塩；場合により緩衝剤；及び場合により増量剤を含む。該第一の態様の一変形において、該ペレットは、上記の試薬からなり、また該第一の態様の更に別の変形において、該ペレットは、本質的に上記の試薬からなる。該第一の態様で使用するのに適した、PCR試薬混合物は、当業者には馴染み深いものであり、該混合物は、好ましくは少なくとも一つの酵素；少なくとも一つのタンパク質；少なくとも一つのプライマー；少なくとも一つのフルオロゲン性プローブ；少なくとも一つのプラスミド；少なくとも一つのポリペプチド；非-特異的コントロールとして機能する少なくとも1種の随意の核酸；及び少なくとも一つのヌクレオチド、例えばdATP、dGTP、dCTP、dTTP、又はdUTPを含む。
【００１５】
第二の態様において、該ペレットは、例えばDNAの捕獲用途に適しており、また該ペレットは、103〜1013個/mLなる範囲内の濃度を持つ複数の微小球；低温保護剤；及び場合により増量剤を含み、ここで該微小球は、その外部と結合した、結合剤、例えばリガンドを有する。該第二の態様の一変形において、該ペレットは、上記の試薬からなり、また該第二の態様の更に別の変形において、該ペレットは、本質的に上記の試薬からなる。
第三の態様において、該ペレットは、微量流体分析との関連で、サンプル調製において使用されるような、酵素混合物を含む。このようなペレットは、酵素混合物、及び低温保護剤、随意の塩、随意の緩衝剤、及び随意の増量剤を含む。該第三の態様の一変形において、該ペレットは、上記の試薬からなり、また該第三の態様の更に別の変形において、該ペレットは、本質的に上記の試薬からなる。好ましくは、該酵素の混合物は、2種を越える酵素、例えば3、4、5、7、10、又はそれ以上の異なる酵素で構成される。好ましくは、該酵素の混合物は、RNase A、プロナーゼ、プロテイナーセK、及びムタノリジン(mutanolysin)からなる群から選択される、少なくとも1種の酵素を含有する。
【００１６】
更に別の態様において、該第二及び第三の態様は併合され、該ペレットは、低温保護剤；及びサンプルの調製において使用される酵素混合物；及び核酸捕獲用の複数の微小球を含む。これらペレットに含めることのできる他の生体分子は、外部コントロールとしての特異的又は非-特異的な核酸、例えばDNAプラスミド、コントロールとして選択された他の生物の完全なゲノムDNA、保護されたRNA類、PNA類、LNA類又は他の変性された核酸を含むが、これらに限定されない。付随的な捕獲物質を、複数の微小球内に含め、係留することも可能であり、該物質は、抗体、アプタマー(aptamers)、レクチン、及び対象とする生体分子に対して特異的又は非-特異的なアフィニティーを持つ他のオリゴヌクレオチドをも含むことができる。
【００１７】
サンプル中の、第B群のストレプトコッカス(GBS)等の生物学的な薬剤の存在を確認するための系において使用される、例示的態様において、該凍結乾燥ペレットは、1種又はそれ以上の低温保護剤、1種又はそれ以上の塩、1種又はそれ以上のプライマー(例えば、GBS前進及び逆プライマー(GBSプライマーF及びGBSプライマーRとして知られている)、1種又はそれ以上のプローブ(例えば、GBSプローブ-FAM、ここでFAMは、蛍光色を表す)、1種又はそれ以上の内部コントロールプラスミド、1種又はそれ以上の特異性コントロール(例えば、GBSのPCR用の交叉反応性コントロールとしての、ストレプトコッカスニューモニア(pneumoniae)DNA)、1種又はそれ以上のPCR試薬(例えば、dNTP類及び/又はdUTP類)、1種又はそれ以上の遮断剤又は増量剤(例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、RNase A、又はゼラチン等の非-特異的タンパク質)、及びポリメラーゼ(例えば、グリセロールを含まない、Taqポリメラーゼ)を含む。好ましくは、存在するこれら全ての成分が、何れかの与えられたペレット中に見出されることを理解すべきである。当業者には、サンプル中のGBSの存在を確認するのに適した、このような処方物が、他の成分(例えば、他のプライマー及び/又は特異性コントロール)を使用するに際して、他のポリヌクレオチドの増幅のために使用することができることが理解されよう。その例は、病原体、例えばエルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)(ペスト)；エルウィニア・ヘルビコラ(Erwinia herbicola)(しばしば悪疫刺激剤として使用される植物病原体)；バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、及びバチルス・グロビジイ(Bacillus globigii)(炭疽刺激剤)；リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)；E.コリ(E. coli) O157；ヘルペス・シンプレックスウイルス(Herpes Simplex Virus) 1及び2を含むが、これらに制限されない。
【００１８】
本発明の凍結乾燥ペレットは、好ましくは図1のパネルA〜Fに示されているような、以下の方法によって製造される。典型的には、該凍結乾燥ペレット内に配置すべき試薬は、溶媒(例えば、水)及び低温保護剤と組み合わされて、溶液115を生成する。次いで、分配法によって(例えば、液滴等の不連続なアリコート、例えばピペット110等によって生成)、冷却された疎水性表面120(図1のパネルA-Cを参照のこと)上に、この溶液を配置する。このようにして、例えば該溶液は、分取チップに導入され、またこの分取チップは、該表面上に液体の滴を分配する前には、該表面120の上方に位置する。好ましくは、少なくとも該液体を該分取チップに導入する期間、該分取チップを配置する期間、及び該液体を分配する期間中、該液体を攪拌する。該ピペット110は、垂直方向の運動並びに該疎水性表面に平行な水平面内の運動を制御して、該表面の様々な部分に幾つかの液滴を分配することを可能とする、ロボット式の分配装置によって、好ましくは調節される。該ピペット110の先端は、好ましくは、液体の分配にとって望ましい時点まで、該疎水性表面から離れた状態(例えば、約1-10cm)に維持される。ロボット式に制御される分配装置は、多重系であり得、多数の、例えば4、8、10、20、又は24個の分取チップを有し、これら全てが、溶液を同時に分配でき、またアレイ状に又は直線状に配列されている。
【００１９】
分配中の該液体が、分配ヘッド110(例えば、ロボットヘッド、又はピペッタチップ(pipettor tip))内で凍結しないが、該表面と接触して数秒以内に底部から迅速に凍結(図1のD参照)して、蒸発による著しい損失がなく、しかも該分配された試薬ペレットの物理的な形状における、大幅な変化を生じることがないように、該疎水性表面の温度が調節される。該溶液は、不連続なペレット140として凍結される。このようにして、ほとんど球形のペレット140が生成する。このような制御は、液体窒素等の冷媒の浴から離れた位置(高い位置)において達成される。この分配は、該チップが、該疎水性表面と接触しないように行われる。この制御は、更に該分配された液体試薬と、(凍結によって)接着しないように、かつ該液滴が、図1のパネルC、D及びEに置けるように、該ピペットチップ及び該疎水性表面と、何れかの側で結合しないように行われる。とりわけ、該ピペットチップは、液体の分配を開始する際に、該疎水性ウエル表面から、約0.5〜1.5mmなる範囲、及び好ましくは0.5〜1.0mmなる範囲の距離に配置する(図1のB参照)。従って、分配速度は、緩慢かつ制御されたものである。液滴130が、該ピペットチップから現れ、また該低温の疎水性表面と接触した際に、該液滴はその底部から上方に向かって凍結する(図1のD)。更に、該チップを該表面から移動させる前に、全液体の体積(0.5〜35μL、及び好ましくは2〜25μL)が分配されるまで、液体の分配を続ける(図1のE)。例えば、2μLのペレットに関連して、その分配時間は、その凍結時間よりも僅かに短い(1-2秒)。25μLのペレットに関連して、その分配時間は、その凍結時間である2-5秒に比して、2-3秒である。
【００２０】
疎水性表面120の好ましい例は、ダイヤモンドフィルム、又はポリテトラフルオロエチレン(PTFE)表面、特にテフロン（登録商標）(TeflonTM)-被覆したガラススライド、又はダイヤモンド-SiO2混合物(これらの比は、様々な程度の疎水性を達成すべく調節される)である。該疎水性表面は、好ましくは金属スライド表面に対して、堆積法、例えば化学蒸着法(CVD)によって製造する。他の表面製造法は、炭素/二酸化ケイ素被覆材料のレーザー堆積法である。
図2A及び2Bは、このような疎水性表面の平面図であり、ベース210上に配置された、一群のウエル200(同様に「マイクロチャンバー」とも呼ばれる)内に、相互に分離された状態で、如何にして多数のペレットを供給できるかを示している。図3A及び3Bは、図2A及び2Bに示された表面の側面図を示す。該疎水性表面は、好ましくは本質的に平坦である。このことは、該表面が完全に平滑であって、該ペレットがこれに接着せず、また好ましくは水平に配向されることを意味する。該ウエルの数は、可変であり、好ましくは多重-液滴分配装置の使用を容易にするような数である。その数は、約100、例えば96又は125、あるいは400程度、あるいは更に1,000であり得る。この数は、分配すべきペレットのサイズ並びに凍結乾燥装置の入手可能なサイズに依存する。
【００２１】
ウエル200及びベース210両者は、疎水性表面120を持つ、同一の材料で作られている。好ましくは、該ベース210全体を、極低温液体、例えば液体窒素等を含む液体浴(図示せず)に配置することによって、該ウエルを冷却する。一般に、該表面の温度は、該冷却材の温度近傍まで低下させる。かくして、液体窒素源(その温度は、典型的には約-196℃であり、該表面は、好ましくは約-65℃〜-180℃なる範囲、より好ましくは約-100℃〜-150℃なる範囲にある)近傍に配置される。この方法は、また温度が-50℃〜-150℃なる範囲にある場合にも機能する。場合によっては、該分配前に、液体窒素中に該疎水性表面を浸漬し、かつ該表面と該液体窒素とを平衡化させることによって、該表面を冷却する。
該凍結ペレット140を、凍結乾燥装置に導入し、依然として凍結されたままで、該ペレットから該溶媒を除去する(例えば、昇華によって)のに十分な圧力及び時間条件下で、真空下におき、結果的に凍結乾燥ペレットを生成する(図3A)。蓋220(図1及び2を参照のこと)を、該ベース210に適合するように形成し、かつ環境から該凍結乾燥ペレットを封止することができる(図3B)。該凍結乾燥装置内での、凍結乾燥ペレットを製造するのに十分な滞留時間は、ペレットのサイズ及び組成に依存して変化するが、典型的には約20〜40時間、好ましくは約24〜30時間、及びより一層好ましくは約25〜27時間の範囲にある。
【００２２】
本発明の凍結乾燥ペレットを製造するための例示的な装置は、更に図4及び5に示されている。図4(一定の案分比で示されてはいない)において、分配ヘッド402(例えば、ピペットチップ)は、生物学的な試薬混合物、例えばPCRマスター混合物、又はサンプル調製用の酵素混合物、微細粒子懸濁液(例えば、アフィニティービーズ懸濁液)、又はサンプル調製用の酵素混合物と微細粒子懸濁液との混合物等の流体404を、疎水性表面410(例えば、化学蒸着法によって堆積したダイヤモンド-SiO2スライド又はテフロン（登録商標）-被覆スライド)上に分配させる。該流体は、小さなペレット406(例えば、体積2μL)、又は大きなペレット(例えば、体積25μL)の何れかとして図示されている、ペレットとして分配される。表面410は、例えば幾分かの下向きの勾配を持つ、「マフィントレー」形状のものとして図4に示されている、支持体412上に静止しており、該トレー内には、液体窒素414等の冷却剤がある。このマフィントレー形状の利点の一つは、液体窒素を個々のウエルに、その全容積の3/4まで満たし、結果的に該疎水性スライドを、該液体中に実際に沈めることなしに、その上に支持することを可能とする点にある。そのために、最少量での、LN2の使用を可能とする。LN2含有容器上に、該スライドを支持することのできる、任意の他の格子状の構造も、十分に使用できるものと考えられる。
【００２３】
図5は、もう一つの態様を示すものである(一定の案分比で示されてはいない)。分配ヘッド502(例えば、ロボットにより制御される)は、ペレット用の各ウエルを備えている、凍結乾燥用の高度に疎水性の分配/採集並びに配置プレート504上に、ペレット状の流体を分配する。このプレートは、凍結乾燥装置への直接的な配置に適している。これは、凍結乾燥工程の完了後に、図示されていない整合リッドによって、該凍結乾燥装置内部を気密封止できる。例えば、該リッドは、該凍結乾燥装置内側にピストンを適用することによって、プレート504と接触させることができる。液体窒素で冷却した冷却プレート506は、LN2の入口508及び窒素ガスのベント510を持つ。
本発明の凍結乾燥ペレットの製造における工程数は、図6に示されている。工程602において、効率化のために、凍結乾燥装置内の棚は、予め冷却されており、一方で該試薬が製造される。これは、該凍結乾燥装置に関する通常の調節によって達成される。工程604において、該試薬混合物が、調製される。該試薬混合物は、例えば6X PCR混合物、又は大量の溶解混合物であり得る。工程606において、及び該試薬混合物を分配する前に、該疎水性スライドは、その直ぐ下に該冷却剤タンク、及びペレットを扱うために使用できるピンセット又はその他の器具があるので、清浄化される。これらの器具の清浄化は、適当な溶媒で濯ぐことによって行うことができる。次いで、これらの部品を、液体窒素中で濯ぐことにより冷却する。
【００２４】
工程608において、該試薬混合物を該清浄化し、冷却した疎水性のスライド上に分配し、結果として本明細書に既に述べたようにペレットを生成する。該ペレットをバイアルに投入し(工程610)、該バイアルを緩く覆い、該凍結乾燥装置に配置する。該用語「緩く覆う」とは、該バイアルを、好ましくは「凍結乾燥ストッパー」(20mmのブチルゴム製3本フォークフランジ型バイアル栓)で覆うことを意味する。該ストッパーは、該バイアル中に半分押込まれた場合に、その側部にガス抜きスリットを有していて、凍結乾燥工程を進めることを可能とする。
この凍結乾燥装置は、好ましくは該ペレットに適用すべき一連の条件を予めプログラム化することのできる自動制御装置を持つ。変更できる典型的なパラメータは、温度、温度上昇及び降下速度、及び特定の群の条件を維持する期間を含むが、これらに限定されない。全てのペレット材料にとって、同一条件が最適であるわけではないことを、当業者は理解するであろう。しかし、該凍結乾燥装置の制御サイクルを、最良のペレットが得られるように調節することは、当業者の能力の範囲内である。
【００２５】
当分野において使用されており、また本発明において使用するのに適した、典型的な凍結乾燥装置は、ビルティスアドバンテージXLベンチトップフリーズドライヤー(Virtis Advantage XL Benchtop Freeze Dryer)及びビルティスジェネシス25スーパーXLパイロットスケールフリーズドライヤー(Virtis Genesis 25 Super XL Pilot Scale Freeze Dryer)(両者共にNY州、ガーディナー(Gardiner)のビルティス(Virtis)社製)を含むが、これらに制限されない。
これらの完了後、凍結乾燥プログラムを停止412させ、該チャンバーを、所定の圧、即ち500Torrまで、再度窒素ガスで満たす。該バイアルを、依然として該凍結乾燥装置内に維持したまま封止する。これは、該バイアルが、典型的には、例えば容易に該材料のガス抜きを可能とする、凍結乾燥ストッパーで緩く閉じられており、また該凍結乾燥装置自体が水圧によって調節でき、あるいは圧縮乾燥窒素ガスによって作動されるプレートを含むので、達成することができる。該プレートは、該凍結乾燥装置内に下げ、そのドアを開放する前に、該バイアルを完全に封止することができる。次いで、凍結乾燥チャンバードアの締め具を解除し、該ドアが共生的に開放されるまで、該チャンバー内の圧力を、再度窒素ガスで満たすことによって高める。このようにして、該封止されたバイアルが完成され、例えばクリンプキャップでクリンプ封止し、アルミニウムホイル等の包装体中に包み、後の使用のために保存する。該バイアルを、低温、例えば4℃にて保存して、該ペレットの寿命を延長する。
【００２６】
一般に、該ペレットを製造する該溶液中の化合物の濃度は、再生する際の濃度よりも高い。これは、特に該ペレットが微量流体デバイス内で再生される場合に正しい。典型的には、該溶液の濃度対該再生濃度との比は、少なくとも3(例えば、少なくとも約4.5)である。PCRペレットの幾つかの態様では、この比は、約6である。サンプル調製ペレットにとって、好ましくは、この比は約2〜約20なる範囲にある。
有利には、本発明の凍結乾燥ペレットは、国際特許出願第PCT/US2005/015345(2005年5月3日付けで出願)(この特許出願の内容全体を、参考としてここに組入れる)に記載されているように、微量流体カートリッジ内で有効利用される。例えば、微量流体デバイスにおいて使用するための幾つかの凍結乾燥ペレットは、PCR試薬を含み、またそこには如何なる微細粒子をも含まない。他の凍結乾燥ペレットは、優先的に核酸分子を捕獲できる試薬で被覆された微細粒子を含む。更に別の凍結乾燥ペレットは、1種又はそれ以上の様々な用途用の酵素を含むが、微細粒子を含まない。該微細粒子は、多くの用途との関連で使用されるが、酵素は異なる用途毎に交換されるので、幾つかの状況においては、微細粒子及び酵素両者を含有する凍結乾燥ペレットを使用することが有利である。
【００２７】
例示的な微量流体カートリッジを、図7A及び7Bに示した。図示した微量流体カートリッジ300は、細胞から既に遊離されたポリヌクレオチドを受取るように形作られているが、他の微量流体デバイスも、細胞からポリヌクレオチドを遊離する(例えば、該細胞の溶解により)ように形作ることができる。例えば、図7A及び7Bにおける微量流体カートリッジ300は、サンプル溶解チャンバー302を含み、そこでは細胞が溶解されて、そこにポリヌクレオチドを遊離する。本発明の、溶解試薬を含有する凍結乾燥ペレットは、チャンバー302内に存在して、細胞-含有サンプルを導入した後、熱を掛けた際に、該溶解試薬が放出され、該サンプル中の細胞が溶解されることになる。微量流体デバイス300は、更に基質層L1-L3、微量流体ネットワーク304(その一部のみが図7A及び7Bに示されている)、及び液状試薬タンクR1-R4を含む。液状試薬タンクR1-R4は、液状試薬を維持(例えば、サンプル物質を処理するために)し、また試薬ポートRP1-RP4 (RP3及びRP4は図示されていない)によってネットワーク304に接続されている。
【００２８】
ネットワーク304は、実質的に層L2及びL3の間に画成されているが、部分的には3つ全ての層L1-L3間に伸びている。微量流体ネットワーク304は、チャンネルCn、サンプル導入口SPn、バルブVn、ゲートGn、検出ゾーンDn、処理チャンバーDn、廃棄ゾーンWn、ベントHn、及び他の図示されていない部品、例えば二重バルブV'n、ガスアクチュエータ(例えば、ポンプ)Pn、及び混合ガスMGnを含む、多数の部品を含む。このような部品は、更に別の部分で、例えば国際特許出願第PCT/US2005/015345に記載されている。
微量流体デバイスにおいて、バルブ、ベント及びアクチュエータ等の部品の組合せの作用は、溶液と凍結乾燥ペレットとの接触を引起し、結果的に該ペレットを溶解し、またその中の試薬を該溶液中に遊離する。このような溶解は、典型的には極めて迅速であり、約2分以内に起る。次いで、該溶解した試薬を含有する溶液部分は、更に微量流体ネットワークを動き回り、サンプルとの接触を引起し、あるいは他の試薬溶液との混合が可能である。
【実施例】
【００２９】
本明細書において使用される略号は、当業者には馴染み深いものである。
実施例1：第B群のストレプトコッカス(Streptococcus)(GBS)確認用試薬
第B群のストレプトコッカス(Streptococcus)(GBS)バクテリアと関連するポリヌクレオチドを増幅するための、代表的な試薬を含む、例示的な凍結乾燥ペレットを、ここに説明する。
GBS存在の指標としての、ポリヌクレオチドの増幅において使用する、凍結乾燥ペレットを製造するための例示的な溶液は、低温保護剤(例えば、乾燥粉末状態にある、120mgのトレハロース)、随意の増量剤(例えば、同様に乾燥粉末状態にある、12mgのデキストラン)、緩衝溶液(例えば、50xGBS PCR緩衝液、1Mのトリス-ベースの溶液(pH 8.4)48μL、2.5M KCl、及び200mM MgCl2)、第一プライマー(例えば、1.92μLの500μM GBSプライマーF、インビトロゲン(Invitrogen)社から入手)、第二プライマー(例えば、1.92μLの500μM GBSプライマーR、インビトロゲン社から入手)、プローブ(例えば、1.92μLの250μM GBSプローブ-FAM、IDT/バイオサーチテクノロジーズ(Biosearch Technologies)社から入手)、コントロールプローブ(例えば、1.92μLの250μMカルオレンジ(Cal Orange) 560、バイオサーチテクノロジーズ社から入手)、鋳型プラスミド(例えば、1μL当たり105プラスミドコピーを含む0.6μLの溶液)、特異性コントロール(例えば、1μL当たり10ng(例えば、1μL当たり約5,000,000コピー)のストレプトコッカスニューモニアDNA(ATCCから入手できる)を含む溶液1.2μL)、PCR試薬(例えば、dNTPの100mM溶液4.8μL、エピセンター(Epicenter)から入手及び4.8μLの、dUTPの20mM溶液、エピセンターから入手)、増量剤(例えば、24μLの、BSA(インビトロゲン社)の50mg/mL溶液)、ポリメラーゼ(例えば、60μLの、グリセロールを含まないTaqポリメラーゼの、5U/μL溶液、インビトロゲン/エッペンドルフ(Eppendorf)社から入手)及び溶媒(例えば、水)を併合して、約400μLの溶液とすることによって製造できる。この溶液の約200個のアリコート(夫々約2μL)を凍結し、ここに記載した方法に従って脱溶媒し、200個のペレットを製造する。再生する際に、これら200個のペレットは、全体積約2.4mLのPCR試薬溶液を生成する。
【００３０】
実施例2：凍結乾燥されたPCR試薬ペレット
本実施例では、200個の凍結乾燥されたPCRマスター混合物ペレットの製造につき説明する。図6は、実施例2において使用した一般的な手順のフロー図であり、これを以下の説明部分において更に例証する。
使用した凍結乾燥マスター混合物の全体積は400μLであった。各ペレットは、初めの体積2μLを有し、6Xなる濃度で作成した。従って、反応容積12μLに対して、試薬を含有するように、各ペレットを製造した。全凍結乾燥混合物は、最終的な作用反応容積2.4mLに対して計算された。
試薬を組込み、一方で該凍結乾燥装置の棚を、-55℃にて1時間予備冷却した。使用した凍結乾燥装置は、ビルティスアドバンテージXLベンチトップフリーズドライヤー(Virtis Advantage XL Benchtop Freeze Dryer)であった。該凍結乾燥装置のドアは、該棚上での凍結結露の蓄積を防止するために、閉めておいた。
【００３１】
該6X PCRカクテルを、以下の表1に示す試薬から調製し、一方で4℃の環境内で作業し、また物質を氷上に維持した。トレハロース粉末(120mg)を、注意して、1.7mLの清浄なエッペンドルフ管内に秤取した(低DNA結合性の管を使用した)。凍結させた50X PCR緩衝液を室温にて解凍し、結晶が最早存在しなくなるまで、十分に攪拌し、その後、48mLの緩衝液を該エッペンドルフ管に添加した。引続き、表1の残りの成分を、該管に順次添加した。各成分、特に該ICプラスミド鋳型及び該ストレプトコッカスニューモニアゲノムDNAは、添加する前に十分に攪拌した。全ての試薬の添加後、蒸留した脱イオン水を(ddH2O)を添加して、全体積を400μLとした。この混合物を十分に攪拌し、氷上に維持した。
【００３２】
疎水性スライド(レーザー堆積された炭素/二酸化ケイ素被覆物質の層を持つスライド)、「マフィントレー」(28cm×18cm×38mmの6-ウエルポリテトラフルオロエチレン被覆トレー)及びピンセットを、ddH2O、無水エタノール、イソプロパノール、無水エタノール、によって順次洗浄し、最終的に再度ddH2Oで濯ぐことによって清浄化した。濡れた物質を、必要に応じて、圧縮空気で乾燥させた。
表1において、dUTPは、随意の成分として掲載されている。というのは、これは、適用可能な混在物の持込を防止するためにのみ使用され、また最終製品においては使用されないからである。
該マフィントレーの中央部ウエルの一つは、液体窒素(LN2)で満たされていた。該清浄化された疎水性スライドは、該LN2で満たされたウエルのマウスを横切るように配置された。約100mLのLN2を、該疎水性スライドの上部に流込み、また該スライドを、約2-3分間、該LN2と平衡化させた。
【００３３】
【表１】
2008539727.tif 000003
【００３４】
清浄で新鮮かつ無菌の0.2mL自動ピペッタチップを、自動ピペッタに配置させた。この自動ピペッタを、2μLを放出するように設定並びに自動的較正を行った。該PCR 6X混合物を、気泡を引込むことなしに、該自動ピペッタチップに汲み上げた。該自動ピペッタチップを、該PCR 6X混合物を含むエッペンドルフ管の内側と接触しないように操作した。該分配工程に先立って、清浄な使い捨て可能な実験室用の拭い布で、該チップを拭いて乾燥させた。
【００３５】
引続き、凍結した6X PCR混合物ペレットを、2μL容の該6X PCR混合物を、ピペットで該疎水性スライド上に取ることにより調製した。該自動ピペッタチップを、該スライドと実際に接触させずに、これと近接状態に維持し、該チップが、出来る限り該スライドと直交するように維持した。該2μL容のPCR混合物は、殆ど瞬間的に凍結してペレットとなり、また殆ど完全に球形であった。周期的に該チップを、使い捨て可能な実験室用の拭い布で拭って、チップの外側の乾燥状態を保証した。分取しない場合には、該チップは、LN2から十分に離れた状態に維持して、該チップにおける該PCR混合物の凍結を回避した。不正確な分配又は誤って形成されたペレットは、一対のピンセットで回収され、該マスター混合物に戻され、また再度分配する前に十分に攪拌された。該チップを、再度分配する前に、清浄な使い捨て可能な実験室用の拭い布で拭いて乾燥させた。このようにして、全ての該PCR混合物を凍結ペレットに転化させた。周期的に、該マフィントレーのウエルを、LN2で再度満たして、該ペレットを凍結状態に維持する。しかし、如何なる時点においても、該試薬混合物又は該ペレットの何れかが、形成中にLN2と接触することはなかった。
【００３６】
凍結乾燥バイアルは、40本の20mL硼珪酸ガラス製バイアルを、タイトル「6X PCRペレット」、ロット番号、及び日付で標識した。これらの標識付けした凍結乾燥用バイアルを、該マフィントレーの隣接ウエルに配置し、またこれらのウエルを、LN2で満たした。引続き、5個のペレットを、順次、各LN2で満たした凍結乾燥バイアルに、一対のピンセットを用いて投入した。該ピンセットの先端を、頻繁にLN2中に浸すことによって冷却した。完全に充填されたバイアルを、2-5cmのLN2を含有するスチロフォームボックス内に維持して、サンプルを該凍結乾燥装置内に配置するまで、該ペレットが常にLN2中に沈められているように維持した。
該充填されたバイアルを、栓(20mmのブチルゴム製3本フォークフランジ型バイアル栓)で緩く覆って、該キャップの側面上のくぼみを介して、自由な空気の交換を可能にした。該充填されたバイアルを、該凍結乾燥装置内に配置し、該凍結乾燥装置のドアを即座に閉じた。該凍結乾燥装置は、ガラス製のドアを持つが、これをアルミニウム箔で覆って、外部の光から該PCRペレットを保護した。
【００３７】
【表２】
2008539727.tif 000004
【００３８】
該凍結乾燥装置は、500トールまで排気し、この時点で、表2に示された自動凍結乾燥プログラムを、「主乾燥」の段階1において開始させた。
28時間後(該「二次乾燥」の段階8の終了時点)、この凍結乾燥工程を、手作業で停止させた。このチャンバーを、取り付けられた低圧乾燥N2タンク(そのレギュレータを、予めほぼ0kPaに設定した)のレギュレータのバルブを開放することによって、乾燥N2で500トールなる圧力まで、即座に再充填した。該チャンバーが500トールに達したら、取り付けられた高圧乾燥N2タンク(そのレギュレータを、予めほぼ689kPaに設定した)のバルブを開放した。この凍結乾燥装置は、停止レバーを備えており、これは緩く挿入されたブチルゴムバイアル栓に抗して十分な力で動作して、該栓で該バイアルを封止した。該レバーを、5秒間に渡り「ダウン」位置に維持して、該バイアルにおける栓を封止し、次いで「アップ」位置に戻した。該高圧乾燥N2タンクにおけるバルブを、閉じた。この凍結乾燥装置の「真空解除(vac release)」機能が作動し、また該凍結乾燥装置チャンバーのドアハンドルの閉め具を解除した。該低圧タンクから該チャンバーに、該凍結乾燥チャンバーのドアが開放されるまで、窒素ガスを流動させた。該窒素タンクのバルブを閉じ、該サンプルバイアルを取り出し、また20mmの赤色アルミニウム引裂き封止クリンプを、手作業で該栓の上にクリンプ封止した。これらバイアルを、4℃にて、遮光容器内で保存した。
【００３９】
実施例3：凍結乾燥サンプル調製ペレット
本実施例は、酵素混合物(BLP-EM)を含有する、1,000個の凍結乾燥サンプル調製ペレットの製造に付き説明する。図6は、実施例3において使用した一般的な手順のフロー図であり、これを以下の説明部分において更に例証する。
使用した凍結乾燥マスター混合物の全体積は25mLであった。各ペレットは、初めの体積2μLを有していた。2個のペレットが、各1mLの溶解反応に対して必要とされる。従って、各ペレットは、500μLなる反応容積に対する試薬を含有し、また全凍結乾燥混合物は、1.0mLという最終的な作業反応容積について計算された。
1mLの臨床的なサンプルを処理するためには、4つのサンプル調製ペレット、即ち各2つの酵素ペレット及びアフィニティーペレット(実施例4参照)を使用することが好ましい。従って、アフィニティービーズを含有する、凍結乾燥サンプル調製ペレットに加えて、2つの酵素ペレットが、単一の1mLの溶解ならびにDNA結合反応に対する、全凍結乾燥混合物を構成する。
【００４０】
試薬を組込み、一方で該凍結乾燥装置の棚を、-55℃にて1時間予備冷却した。該凍結乾燥装置のドアは、該棚上での凍結結露の蓄積を防止するために、閉めておいた。
損センナ多量の溶解混合物を、4℃の環境で作業し、かつ物質を氷上に維持しつつ、以下のようにして調製した。トレハロース粉末(7.5g)を、注意深く、50mL容のファルコン(Falcon)チューブ(低DNA結合性チューブを使用)に計り取り、18mLのddH2Oを、該トレハロース粉末に添加し、攪拌により混合した。以下の表3における成分を、指定した量で順次添加した。各成分は、添加する前に、十分に攪拌させた。
【００４１】
【表３】
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【００４２】
全ての試薬を添加した後、ddH2Oを添加して、全体積を25mLとした。多量の溶解混合物を、十分に混合し、また氷上に維持した。
疎水性スライド(レーザー堆積された炭素/二酸化ケイ素被覆物質の層を持つスライド)、マフィントレー(28cm×18cm×38mmの6-ウエルポリテトラフルオロエチレン被覆トレー)及びピンセットを、ddH2O、無水エタノール、イソプロパノール、無水エタノール、によって順次洗浄し、最終的に再度ddH2Oで濯ぐことにより清浄化した。濡れた物質を、必要に応じて、圧縮空気で乾燥させた。
該マフィントレーのウエル全てを、LN2で、そのヘリまで満たした。該清浄化された疎水性スライドは、該LN2で満たされた各ウエルのマウスを横切るように配置された。約100mLのLN2を、該疎水性スライド各々の上部に流し込み、また該スライドを、約2-3分間、該LN2と平衡化させた。
清浄で新鮮かつ無菌の0.5mL自動ピペッタチップを、自動ピペッタに配置させた。この自動ピペッタを、25μLを放出するように設定並びに自動的較正を行った。該多量の溶解混合物を、気泡を引込むことなしに、該自動ピペッタチップに汲み上げた。該自動ピペッタチップを、該多量の溶解混合物源の容器の内側と接触しないように操作した。該分配工程に先立って、清浄な使い捨て可能な実験室用の拭い布で、該チップを拭いて乾燥させた。
【００４３】
引続き、凍結した、多量の溶解混合物のペレットを、25μL容の該多量の溶解混合物を、ピペットで該疎水性スライド上に取ることにより調製した。該自動ピペッタチップを、該スライドと実際に接触させずに、これと近接状態に維持し、該チップが、出来る限り該スライドと直交するように維持した。該25μL容の多量の溶解混合物は、その液滴の底部において、殆ど瞬間的に凍結してペレットとなり、また該液滴全体が凍結するまで、その上部に向かって徐々に凍結した。周期的に該ピペットチップを、使い捨て可能な実験室用の拭い布で拭って、チップの外側の乾燥状態を保証した。分配しない場合には、該チップは、LN2から十分に離れた状態に維持して、該チップにおける該多量の溶解混合物の凍結を回避した。不正確な分配又は誤って形成されたペレットは、一対のピンセットで回収され、該マスター混合物に戻され、また再度分配する前に十分に攪拌された。該チップを、再度分配する前に、清浄な使い捨て可能な実験室用の拭い布で拭いて乾燥させた。このようにして、全ての該多量の溶解混合物を凍結ペレットに転化させた。周期的に、該マフィントレーのウエルを、LN2で再度満たして、該スライドを低温に、また該ペレットを凍結状態に維持する。
【００４４】
凍結乾燥バイアルは、50本の20mL硼珪酸ガラス製バイアルを、タイトル「BLP-EM」、ロット番号、及び日付で標識した。これらの標識付けした凍結乾燥用バイアルを、該マフィントレーの隣接ウエルに配置し、またこれらのウエルを、LN2で満たした。引続き、20個のペレットを、順次、各LN2で満たした凍結乾燥バイアルに、一対のピンセットを用いて投入した。該ピンセットの先端を、頻繁にLN2中に浸すことによって冷却した。完全に充填されたバイアルを、2-5cmのLN2を含有するスチロフォームボックス内に維持して、サンプルを該凍結乾燥装置内に配置するまで、該ペレットが常にLN2中に沈められているように維持した。
該充填されたバイアルを、栓(20mmのブチルゴム製3本フォークフランジ型バイアル栓)で緩く覆って、該キャップの側面上のくぼみを介して、自由な空気の交換を可能にした。該充填されたバイアルを、該凍結乾燥装置内に配置し、該凍結乾燥装置のドアを即座に閉じた。該凍結乾燥装置は、ガラス製のドアを持つが、これをアルミニウム箔で覆って、外部の光から該多量の溶解ペレットを保護した。
この凍結乾燥装置は、500トールまで排気し、この時点で、表4に示された自動凍結乾燥プログラムを、「主乾燥」の段階1において開始させた。
【００４５】
【表４】
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【００４６】
30時間後(表4における「二次乾燥」の段階8の終了時点)、この凍結乾燥工程を、手作業で停止させた。このチャンバーを、取り付けられた低圧乾燥N2タンク(そのレギュレータを、予めほぼ0kPaに設定した)のレギュレータのバルブを開放することによって、乾燥N2で500トールなる圧力まで、即座に再充填した。該チャンバーが500トールに達したら、取り付けられた高圧乾燥N2タンク(そのレギュレータを、予めほぼ689kPaに設定した)のバルブを開放した。この凍結乾燥装置は、停止レバーを備えており、これは緩く挿入されたブチルゴムバイアル栓に抗して十分な力で動作して、該栓で該バイアルを封止した。該レバーを、5秒間に渡り「ダウン」位置に維持して、該バイアルにおける栓を封止し、次いで「アップ」位置に戻した。該高圧乾燥N2タンクにおけるバルブを、閉じた。この凍結乾燥装置の「真空解除(vac release)」機能が作動し、また該凍結乾燥装置チャンバーのドアハンドルの閉め具を解除した。該低圧タンクから該チャンバーに、該凍結乾燥チャンバーのドアが開放されるまで、窒素ガスを流動させた。該窒素タンクのバルブを閉じ、該サンプルバイアルを取り出し、また20mmの赤色アルミニウム引裂き封止クリンプを、手作業で該栓の上にクリンプ封止した。これらバイアルを、4℃にて、遮光容器内で保存した。
【００４７】
実施例4：凍結乾燥された微小粒子を含有するペレット
DNAアフィニティー微小球を含む、凍結乾燥ペレットを、実施例4及び図6において概説したものと実質上同一の手順を利用して製造した。但し、使用した組成は、以下の表5に示す通りであり、また微小粒子懸濁液の製法は、以下の通りである。
【００４８】
【表５】
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【００４９】
7.5gのトレハロース粉末を、注意深く50mLの無菌ファルコン(Falcon)チューブ中に図り取った。アフィニティービーズを、以下のようにして調製した：15.0mLの微小球をピペットで、50mLの無菌ファルコンチューブに取った。該微小球を、3,500rpmにて15布分間スイング式バケットロータ中で、遠心処理してペレットとした。得られた上澄を注意して、また完全に除去かつ棄却した。該微小球を、10.0mLの超純粋な水に再懸濁し、十分に攪拌した。この再懸濁したPSPDL微小球を、該トレハロースと、追加の8.0mLの超純粋な水に添加した。この混合物を、全てのトレハロースが完全に溶解するまで攪拌した。
この混合物の体積を、超純粋な水で25mLにした。(この水は、25mLのピペットに該混合物全てを取込み、次いで液体がその先端に達するまで分取することにより25mLとすることができる。体積における差を、該混合物に添加すべきである)。
該凍結乾燥ペレットの製造は、図6の工程606に進む前に、該混合物を十分に攪拌し、これを氷上に維持することによって行われる。
【００５０】
実施例5：病原体確認用の試薬
PCRペレットを、エルシニア・ペスティス(Yersinia pestis)(ペスト)；エルウィニア・ヘルビコラ(Erwinia herbicola)(しばしば悪疫刺激剤として使用される植物病原体)；バチルス・アンスラシス(Bacillus anthracis)、及びバチルス・グロビジイ(Bacillus globigii)(炭疽刺激剤)の確認のために、実施例1の処方に従って製造した。但し、各病原体に対するプライマーを、該GBSプライマー及びプローブと置換えた。同様に、PCRペレットは、リステリア・モノサイトゲネス(Listeria monocytogenes)；E.コリ(E. coli) O157；ヘルペス・シンプレックスウイルス(Herpes Simplex Virus) 1及び2に対しても、同様な処方に従って製造することができる。
【００５１】
以上、多数の本発明の態様を説明した。しかし、本発明の精神並びに範囲を逸脱することなしに、様々な変更を行うことが可能である。例えば、追加の又は別の試薬を、本発明の凍結乾燥ペレットにおいて使用することができる。従って、他の態様も、上記特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】疎水性表面上に、チップから液滴を分配し、殆ど球形のペレットを製造する方法を例示する図である。
【図２】図2A及び2Bは、凍結乾燥トレー(平面図)、及び特にペレットの凍結乾燥及び保存のための、容器及び蓋を示すものである。
【図３】図3A及び3Bは、凍結乾燥中の凍結乾燥トレーの側面図(図3A)及び蓋及びシールが凍結乾燥後に取り付けられた、封止された容器を示すものである。
【図４】凍結乾燥ペレットを製造するための、例示的な装置を示すものである。
【図５】凍結乾燥ペレットを製造するための、例示的な装置を示すものである。
【図６】凍結乾燥ペレットの製法に関するフロー図である。
【図７】図7A及び7Bは、凍結乾燥ペレットを使用するための、例示的な微量流体カートリッジを示すものである。
【符号の説明】
【００５３】
１１５・・溶液；
１１０・・ピペット；
１２０、４１０・・疎水性表面；
１３０・・液滴；
１４０、４０６・・ペレット；
２００・・ウエル；
２１０・・ベース； 
２２０・・蓋；
３００・・微量流体カートリッジ；
３０２・・サンプル溶解チャンバー；
３０４・・ネットワーク；
４０２・・分配ヘッド；
４０４・・流体； 
４１２・・支持体；
４１４・・液体窒素；
５０２・・分配ヘッド；
５０４・・配置プレート；
５０６・・冷却プレート；
５０８・・入口；
５１０・・ベント；
L1-L3・・基質層；
R1-R4・・液状試薬タンク；
RP1-RP4・・試薬ポート
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【国際調査報告】
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