(57)【要約】本発明は、実質的に平面な上面（３）及び底面（５）を有する多孔性ブロック（１）を含む、複数の試料化合物の生物学的効果を試験するための装置に関する。上面（３）は多数の細胞接着領域（７）及び細胞非接着領域（９）を含み、そして底面（５）は試料化合物をロードするための複数部位（１１）を提供する。これらの部位は、多孔性ブロックの上面上の細胞接着領域の反対側に位置する。ある態様において、本発明は試料化合物をロードするための複数部位を提供する少なくとも１つの可溶性層（１３）をさらに含む。【選択図】図１
2008539755.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の試料化合物の生物学的効果を試験するための装置であって、
実質的に平面な上面及び底面を有する多孔性ブロックを含み、ここで前記上面が多数の細胞接着領域及び細胞非接着領域を含み、前記底面が前記試料化合物をロードするための複数部位を提供し、前記部位が前記多孔性ブロックの前記上面上の前記細胞接着領域の反対側に位置する、上記装置。
【請求項２】
複数の試料化合物の生物学的効果を試験するための装置であって：
（ａ）実質的に平面な上面及び底面を有する多孔性ブロック、ここで前記上面が多数の細胞接着領域及び細胞非接着領域を含み；および
（ｂ）前記試料化合物をロードするための複数部位を提供する少なくとも１つの可溶性層、ここで前記部位が前記多孔性ブロックの前記上面上の前記細胞接着領域の反対側に位置し、前記可溶性層が前記底面に近接する、
を含んでなる、上記装置。
【請求項３】
前記装置が、前記多孔性ブロックを取り囲むフレームをさらに含む、請求項１の装置。
【請求項４】
前記装置が、上に上昇しそして前記上面を取り囲む壁をさらに含み、ここで前記壁と前記上面とにより液体を保持することができる、請求項１の装置。
【請求項５】
前記上面が修飾されて、前記細胞接着領域を形成している、請求項１の装置。
【請求項６】
前記多孔性ブロックが、１００ｋＤａ以下の分子量を有する化合物を透過可能である、請求項１の装置。
【請求項７】
前記多孔性ブロックがポリマーを含む、請求項１の装置。
【請求項８】
前記ポリマーが、ポリアミド（ナイロン）、ポリカーボネート、ＥＶＡｃ、ＰＥＴ及びポリスルフォンからなる群より選択される、請求項７の装置。
【請求項９】
前記多孔性ブロックがゲルを含んでなる、請求項１の装置。
【請求項１０】
前記ゲルが、アガロース、ゼラチン、α−ヒドロ−ω−ヒドロキシポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）ブロックコポリマー、刺激感受性ヒドロゲル及び修飾デンプン／セルロースからなる群より選択される、請求項９の装置。
【請求項１１】
刺激感受性ヒドロゲルが、ポリ（ｎ−イソプロピルアリールアミド）及びポリアクリル酸からなる群より選択される、請求項１０の装置。
【請求項１２】
前記多孔性ブロックが膜を含む、請求項１の装置。
【請求項１３】
前記膜が、ナイロン、セルロース、ＥＶＡｃ、ＰＥＴ及びポリスルフォンからなる群より選択される、請求項１２の装置。
【請求項１４】
前記細胞接着領域が、前記上面から前記底面まで伸張している、請求項６の装置。
【請求項１５】
前記上面が、局所親水化により修飾され前記細胞接着領域を形成する、請求項６の装置。
【請求項１６】
前記上面が修飾され前記細胞非接着領域を形成する、請求項１の装置。
【請求項１７】
前記上面が局所疎水化により修飾され、前記細胞非接着領域を形成する、請求項１６の装置。
【請求項１８】
前記上面が少なくとも１つのペプチドの局所添加により修飾され、前記細胞接着領域を形成する、請求項６の装置。
【請求項１９】
前記少なくとも１つのペプチドが、ＲＧＤ及びポリリジンからなる群より選択される、請求項１８の装置。
【請求項２０】
前記上面が局所糖化により修飾され、前記細胞接着領域を形成する、請求項６の装置。
【請求項２１】
前記上面が局所タンパク質修飾又は吸収により修飾され、前記細胞接着領域を形成する、請求項６の装置。
【請求項２２】
前記局所タンパク質修飾が、フィブロネクチン及びコラーゲンからなる群より選択される少なくとも１つのタンパク質の修飾を含んでなる、請求項２１の装置。
【請求項２３】
前記上面が化学基により修飾され、前記細胞接着領域を形成する、請求項６の装置。
【請求項２４】
前記化学基が、ヒドロキシル基、ケトン基、アルデヒド基、カルボキシル基及びアミン基からなる群より選択される、請求項２３の装置。
【請求項２５】
前記上面が物理修飾により修飾され、前記細胞接着領域を形成する、請求項６の装置。
【請求項２６】
前記物理修飾が、機械的擦過、化学的腐食又はレーザーアブレーションからなる群より選択される方法である、請求項２５の装置。
【請求項２７】
前記細胞接着領域及び前記細胞非接着領域が、フォトリソグラフィー、局所ポリマー化及び相互貫入ネットワークの局所形成からなる群より選択される過程により調製される、請求項１の装置。
【請求項２８】
前記複数の試料が前記複数部位にロードされる、請求項１の装置。
【請求項２９】
前記複数部位が、親水性のドット又はウェルである、請求項１の装置。
【請求項３０】
前記複数部位が、疎水性のドット又はウェルである、請求項１の装置。
【請求項３１】
前記可溶性層が、温度感受性、湿度感受性又はｐＨ感受性であるポリマーを含む、請求項２の装置。
【請求項３２】
前記可溶性層が分解性ポリマーを含む、請求項２の装置。
【請求項３３】
前記可溶性層が前記試料化合物に非透過性である、請求項２の装置。
【請求項３４】
前記可溶性層が、前記可溶性層の分解後に前記試料化合物の拡散を可能にする、請求項２の装置。
【請求項３５】
前記可溶性層が、分解状態と非分解状態間で異なる分散係数を有する、請求項２の装置。
【請求項３６】
前記ポリマーが、アガロース、ゼラチン、キチン、ポリアクリル酸及びポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）からなる群より選択される、請求項３１の装置。
【請求項３７】
前記分解性ポリマーが、α−ヒドロ−ω−ヒドロキシポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）ブロックコポリマーを含む、請求項３２の装置。
【請求項３８】
前記上面が局所疎水化により修飾され、前記細胞接着領域を形成する、請求項６の装置。
【請求項３９】
前記上面が局所親水化により修飾され、細胞非接着領域を形成する、請求項１６の装置。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
技術分野
ハイスループットスクリーニング技術は、１つには、医薬工業において、生物学的活性について化合物の大集団をスクリーニングすることの問題を解決するために発展してきた。マイクロアレイ技術及びさまざまな特殊化したアッセイを使用して、多数の化合物を同時にそして同一の条件下で試験して、それらが有用な生物学的活性を保有するかどうかを決定する。生細胞における生物学的活性を測定するアッセイは、何千もの異なる薬剤候補と細胞をインキュベートすることを必要とする。このインキュベーションは、標準化された９６、３８４及び１５３６ウェル配置を有するマルチウェルタイタープレート中で従来行われる。マルチウェルプレートは、試験化合物を迅速にスクリーニングするために、自動液体分配システム及び標準化アッセイと共に使用される。
【０００２】
発明の概要
本発明は、１つの局面において、実質的に平面な上面及び底面を有する多孔性ブロックを含む、複数の試料化合物の生物学的効果を試験するための装置に関する。上面は多数の細胞接着領域及び細胞非接着領域を含み、そして底面は試料化合物をロードするための複数部位を提供する。これらの部位は、多孔性ブロックの上面上の細胞接着領域の反対側に位置する。
【０００３】
別の態様において、本発明は上記のような装置に関するが、試料化合物をロードするための複数部位を提供する少なくとも１つの可溶性層をさらに含む。これらの部位は、多孔性ブロックの上面上の細胞接着領域の反対側に位置する。
【０００４】
ある態様において、上記装置は多孔性ブロックを取り囲むフレームをさらに含む。他の態様において、上記装置は上に上昇しそして上面を取り囲む壁をさらに含む。壁と上面とによって、液体を保持することができる。
【０００５】
発明の詳細な説明
本発明は、複数の試料化合物の生物学的効果を試験するためのさまざまな種類の装置に関する。これらの装置は、所与の試験化合物が細胞の生物学的活性に影響するかどうかを決定するために使用される。生物学的効果は細胞内又は細胞上の任意の計測可能な変化である。そのような変化は、限定はされないが、細胞外観又は構造における変化、細胞活性における変化、遺伝子発現レベルにおける変化、細胞タンパク質発現レベルにおける変化、細胞タンパク質活性における変化、及び細胞タンパク質安定性における変化を含む。
【０００６】
既存の９６及び３８４ウェルプレートは、目的の細胞株と多数の関連化合物を迅速にそして効率的にスクリーニングすることにその能力が限定される。さらに、１５３６ウェルプレートに移したときの４倍の処理改善は、重大な液体操作の問題により相殺されてしまう。１５３６ウェルフォーマットの動作体積は、典型的には１０マイクロリットル以下である。そのような小さい体積においては、化学的揮発、溶媒蒸発及び気泡により、試料間の統計的変動が大きく助長される。これらの問題は、ウェル間の大きな用量変動をもたらす、個々のウェルの細胞集団に対応する細胞数分布の高度な不一致性により悪化される。これらの物理的限界は、続くアッセイ測定において大きな統計的変動を助長し、精度及び信頼性を損なう。
【０００７】
本発明の装置及び方法は、前記の複数ウェルフォーマットによる高密度複数ウェルスクリーニング法に関連する多くの液体操作の問題を解決し、そして代わりに、薬剤候補沈殿物のための場所並びに細胞及び他のアッセイ試薬のための支持の両方として多孔性マトリックスを使用する。多孔性マトリックスブロックの両側上に設計された表面特性は、アッセイ試薬の試料との相互作用を局在化し、そして可視化範囲を多孔性ブロックの細胞側表面上のあらかじめ決定された領域に限定することに役立つ。
【０００８】
本発明の装置は、図１において図解されるように、実質的に平面な上面（３）及び底面（５）を有する多孔性ブロック（１）を含む。上面は、多数の細胞接着領域（７）及び細胞非接着領域（９）を含んでなり、そして底面が試料化合物をロードするための複数部位（１１）を有する。これらの部位（１１）は、細胞接着領域の反対側に位置する。試料化合物は、化合物を多孔性マトリックスに引きつけそして吸収するように設計された部位（１１）内の、多孔性マトリックスの底面上に置かれる。吸収後、細胞は多孔性ブロックの上面上に伸展する。インキュベーター内でのインキュベーション後、細胞は上面に接着する。試料化合物は、多孔性マトリックスを通じてその上面に拡散し、そして上面に固定された細胞と相互作用する。本発明の方法は、試料が底面（５）上に置かれた後に、アッセイ面（上面）（３）が調製されることを可能にする。
【０００９】
本発明の装置のさまざまな構成要素の記載は以下に従う。
多孔性ブロックは、試験しようとする化合物に透過性である限りは、いかなる材料から作られていてよい。多孔性ブロックは、以下に記載するポリマー、ゲル又は膜を含んでよい。
【００１０】
１つの態様において、多孔性ブロックはポリマー化合物から作られる。適したポリマーは、ポリアミド、ポリ（エチレン−酢酸ビニル）（ＥＶＡｃ）、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ポリエステル、ポリエチレン、ポリビニリデン、ポリメチルメタクリレート、及びポリエチレンテレフタレートである。好ましい態様において、ポリマー層は、光学的観察に役立つために透明または半透明である。ポリマー層は、熱エンボス加工、射出成型、伸展成型、及び当該技術分野で公知の方法のような慣用のポリマー成型技術を使用して加工される。
【００１１】
好ましい態様において、ポリマーは、ポリアミドまたはＥＶＡｃである。特に好ましい態様において、ポリマーはナイロンである。
他の態様において、多孔性ブロックはゲルの形である。そのようなゲルの例は、ゼラチン、アガロース、及びアクリルアミドゲルを含む。アガロース及びポリアクリルアミドゲルは、物理的に又は化学的に架橋されたスポンジ状ゲルである。これらは９９．５％まで水を含有しうるが、これらのゲルの孔のサイズは多くのタンパク質及び核酸のサイズに類似する。ゲルは、マトリックス濃度の適切な選択により広い幅のサイズの分子をふるいをかけるために調整される。ゲルの平均の孔のサイズはゲル中の固体のパーセント、及びポリアクリルアミドについてはさらに架橋の量によっても決定される。好ましい態様において、ゲルは、アガロース、ゼラチン、α−ヒドロ−ω−ヒドロキシポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）ブロックコポリマー、及び刺激感受性ヒドロゲル、及び修飾デンプン／セルロースである。特に好ましい態様において、ゲルはセルロース誘導体から作られる。別の好ましい態様において、ゲルは刺激感受性ヒドロゲルである。別の特に好ましい態様において、刺激感受性ヒドロゲルはポリ（ｎ−イソプロピルアリールアミド）及びポリアクリル酸からなる群より選択される。
【００１２】
さらに別の態様において、多孔性ブロックは膜である。好ましい態様において、膜はナイロン、セルロース、ＥＶＡｃ、ＰＥＴ又はポリスルフォンである。特に好ましい態様において、膜は、試料化合物を拡散または膜に透過することを可能にする特定の孔サイズを有するナイロンである。
【００１３】
多孔性ブロックの上面の細胞接着領域は、細胞が結合又は接着可能な領域である。多孔性ブロックの上面は、元から細胞接着領域を含んでいるか、あるいは多孔性ブロックの上面は、修飾され細胞接着領域を形成可能である。細胞接着領域は、細胞が上面に結合するか又は接着することが可能なように設計される。さまざまな方法が細胞接着領域を調製するために使用可能である。そのような方法の例は、細胞接着領域の親水化を含む。親水化の方法は、合成ポリマーの付着、タンパク質の付着、化学的修飾、光化学的修飾、反応性プラズマを用いた修飾、及び物理的修飾を含む。細胞接着領域の調製のこれらの各方法は以下に詳細に論述される。
【００１４】
ある態様において、上面は局所親水化により修飾され細胞接着領域を形成する。親水化とは、「水を好む」表面、即ち荷電したか又は極性のある分子を含有する領域を修飾するか又は使用することを言う。好ましい態様において、上面は少なくとも１つのペプチドの局所添加により修飾され、細胞接着領域を形成する。
【００１５】
ある態様において、表面は合成ポリマーの使用により親水性になる。特に、表面は、細胞接着を容易にするために、ポリスチレン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリカーボネート及びポリエチレンテレフタレートのようなポリマーの層で局所的にコートされる。この合成ポリマーコートはプラスチック表面上に一様な正味の正電化を作り出し、これはいくつかの細胞種について、特に無血清及び低血清条件において、細胞付着、増殖及び分化を増強し得る。ポリ−Ｄ−リジン表面は、初代神経細胞、グリア細胞、神経芽細胞腫、及びＨＥＫ−２９３を含むトランスフェクトされたさまざまな細胞株の付着及び増殖をしばしば改善する。本発明の好ましい態様において、細胞接着モチーフは、異なった湿潤性により定義される領域内の多孔性マトリックスの上面上に移植される。細胞接着モチーフは、表面上の一様な細胞単層の形成を改善し、そしてさらに試料化合物の接着細胞との生物学的に現実的な相互作用を可能にする。
【００１６】
好ましい態様において、上面は少なくとも１つのペプチド又はタンパク質の局所付加により修飾され、細胞接着領域を形成する。
ＲＧＤ（アルギニン−グリシン−アスパラギン酸；配列番号１）配列は、いくつかの重要な細胞外マトリックスタンパク質中に見出され、そして細胞表面受容体のインテグリンファミリーのメンバーへの接着リガンドとして働く。典型的なＲＧＤ配列は、Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ（ＧＲＧＤＳＰ；配列番号２）である。環状ＲＧＤもまた、細胞接着モチーフとして使用可能である。典型的な配列はＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−（Ｄ−Ｐｈｅ）−Ｖａｌ（配列番号３）である。ＲＧＤ修飾表面は、膜上にそのままで（ｉｎ  ｓｉｔｕ）細胞単層の形成を導く。
【００１７】
インテグリンは、細胞を基底膜の細胞外マトリックスタンパク質又は他の細胞上のリガンドに付着させるヘテロ２量体膜貫通糖タンパクの大きなファミリーである。インテグリンは、それぞれサイズ１２０−１７０ＫＤａ及び９０−１００ＫＤａの大（α）サブユニット及び小（β）サブユニットを含有する。あるインテグリンは、直接の細胞と細胞の認識及び相互作用を仲介する。インテグリンは、インテグリンの接着機能に必要な２価の陽イオンＭｇ２＋及びＣａ２＋の結合部位を含有する。哺乳類のインテグリンは、異なるαサブユニットと結合する共通のβサブユニットを共有するいくつかのサブファミリーを形成する。β２インテグリンは排他的に白血球上で発現し、そして活性化時のβサブユニットのリン酸化を包含する立体構造変化を受ける。しかしながら、このリン酸化は、立体構造的活性化には必要でも十分でもない。活性化状態は、アルファ鎖の膜貫通ドメインのすぐ近傍のＧｌｙ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（ＧＦＦＫＲ；配列番号４）部位により制御される。
【００１８】
ある態様において、表面はフィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、コラーゲンのような糖タンパク質で修飾されるかこれを吸収して、そして細胞接着を容易にする。これらは細胞外マトリックスの構成要素であり、そしてインテグリンと相互作用する。他の態様において、表面は局所糖化により修飾される。
【００１９】
別の好ましい態様において、上面は化学基により修飾され、細胞接着領域を形成する。特に好ましい態様において、化学基は、ヒドロキシル基、ケトン基、アルデヒド基、カルボキシル基及びアミン基からなる群より選択される。特別に好ましい態様において、化学基は、ヒドロキシル基である。あるいは、本発明の好ましい態様は、酸、塩基、又は反応性プラズマ、レーザー、及びＵＶ照射のような他の物理学的手段により切断可能な側鎖を含有する均質なポリマーの選択的暴露により製造される。特定領域内の分子中の疎水性側鎖の選択的切断は、親水的表面の特性をもたらすであろう。例えば、ポリ酢酸ビニル（ＰＶＡｃ）表面のＫＯＨのような強塩基への暴露はヒドロキシル基を生成し、そしてＰＶＡｃ表面を親水性にする。
【００２０】
もう１つの方法において、ＵＶ光は、均質な疎水性ＵＶ透過性ポリマーからなる多孔性マトリックス中の疎水性側鎖を切断するために使用される。側鎖の切断はＵＶ暴露領域を親水性にするが、隠された領域はそのままの側鎖を有する疎水性のままであろう。
【００２１】
細胞接着領域を形成する別の方法は、反応性プラズマ処理を利用する。プラズマは、イオン、電子、原子、及び中性種を含有する部分的にイオン化されたガスである。反応性プラズマは、ポリマー表面に高度に反応性である。例えば、酸素プラズマ処理は、酸素存在下でプラズマを使用し、膜の表面上に過酸化物を形成することに関与する。過酸化物は続いて分解し、酸素含有ラジカル基を形成する。ポリマーのプラズマ処理のために一般的に使用されるガスは、酸素、アルゴン、亜酸化窒素、テトラフルオロメタン、及び空気を含む。ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）のような疎水性ポリマー表面の酸素プラズマ処理は、処理された表面を親水性にする。
【００２２】
別の好ましい態様において、上面は物理的修飾により修飾され細胞接着及び細胞非接着領域を形成する。物理的修飾は、第二ポリマーを有する相互貫入ネットワーク（ＩＰＮ）の調製、及び細胞接着に必要な抵抗を提供する機械的擦過（ｓｃｒａｔｃｈｉｎｇ）を含む。好ましい態様において、物理的修飾はＩＰＮの生成である。本態様において、疎水性モノマーは親水性基質中に浸され、そして続いてフォトリソグラフィーを使用してポリマー化される。モノマーがポリマー化されていないフォトリソグラフィーに暴露されていない領域は、次いで溶媒で洗浄され、パターンのある疎水性領域を残す。
【００２３】
細胞非接着領域は、上面に結合するか接着する細胞の分離を可能にするために設計される。言い換えると、細胞が結合又は接着できない上面上の領域を提供することは、別個の細胞の塊を互いに分離することを可能にする。さまざまな方法が細胞非接着領域を調製するために使用可能であり、このような方法は細胞接着領域を調製するために使用される方法を含む。そのような方法の例は、細胞非接着領域を形成するための上面の疎水化を含む。疎水化の方法は、光化学修飾及びレーザーアブレーション（ｌａｓｅｒ  ａｂｌａｔｉｏｎ）を含む。好ましい態様において、光化学修飾は領域ポリマー化及びＩＰＮの局所形成を含む。細胞非接着領域の各調製法は、以下で詳細に論述される。
【００２４】
フォトリソグラフィー法は、疎水性表面上の親水性領域を選択的に定義するために使用可能であり、あるいは逆の場合も同様である。アセチレン（Ｃ２Ｈ２）、トリフルオロクロロエチレン（Ｃ２Ｆ３Ｃｌ）、又はテトラフルオロエチレン（Ｃ２Ｆ４）のような２量体ガス（ｄｉｍｅｒ  ｇａｓ）が深紫外線源（２５０−２００ナノメートル（ｎｍ）波長）により真空で照射されたときに形成される沈殿ポリマーから表面部分を選択的に保護するために、フォトリソグラフィー技術は鋳型又はマスクを使用する。紫外線光はガス中でポリマー化反応を開始し、そして十分な鎖長に達した後に、ポリマーの分子は処理された表面上に沈殿する。この技術は、親水性基質上の疎水性表面領域を選択的に形成するために使用され、あるいは逆の場合も同様である。例えば、反応２量体ガスとしてテトラフルオロエチレンを使用するフォトリソグラフィーは、セルロース又はポリアクリルニトリルのような親水性表面上に疎水性領域を選択的に定義するために使用される疎水性ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）の沈着をもたらす。
【００２５】
バルクの疎水性及び親水性領域は、すでに記載した同様のフォトリソグラフィー技術を使用することにより多孔性マトリックス中に取り込まれるが、ＵＶ光はポリマー化可能な化合物と漬け込んだ（ｍａｒｉｎａｔｅｄ）透明な多孔性マトリックスに適用される。そのように前処理されたマトリックスのＵＶ光への暴露は、その中に含有されるポリマー化可能な化合物をポリマー化し、暴露された領域をそこに存在する選択されたポリマー化可能な化合物の化学的／物理的性質に依存して疎水性または親水性のいずれかにする。非ポリマー化化合物を使用前に多孔性マトリックスから洗浄してよく、あるいは非ポリマー化化合物を透析して、そして親水性にしてもよい。そのような方法において、第二ポリマーネットワークがＵＶ照射時に形成され、そのネットワークは多孔性マトリックスのあらかじめ存在するネットワークと相互貫入する。この形状を相互貫入ポリマーネットワーク（ＩＰＮ）と言う。
【００２６】
多孔性ブロックの上面の細胞非接着領域（９）は、細胞接着領域に比べて減少した能力で細胞は結合するか接着する領域である。好ましい態様において、細胞は計測可能な程度には細胞非接着領域に結合しない。多孔性ブロックの上面は本来的に細胞非接着領域を含んでよく、または多孔性ブロックの上面は修飾され細胞非接着領域を形成してよい。
【００２７】
ある態様において、上面は局所疎水化により修飾され細胞非接着領域を形成する。
あるいは、本発明の好ましい態様は、レーザーアブレーション技術を使用して調製される。広義のレーザーアブレーションは、表面上の物質を除去するか変換するための高エネルギー光の使用に関与する。ポリマーのレーザーアブレーションはポリマーの化学的溶解をもたらし、そしてしたがって暴露された多孔性マトリックス領域を疎水性から親水性特性に変換するため、あるいはその逆にするために使用される。レーザーアブレーションはまた、多孔性マトリックス表面上に望ましい湿潤特性を有する物質を沈殿させるためにも使用可能である。このことは、変換しようとする材料を含有する標的上に衝突するレーザー照射、エネルギーの吸収、局所表面加熱、及び生じた物質の蒸発に関与する。この物質は、標的多孔性マトリックス基材上に沈殿されるプルーム（ｐｌｕｍｅ）を形成する。
【００２８】
図１に関して、化合物は多孔性ブロック（１）の底面（５）上の複数部位（１１）、窓（ｗｉｎｄｏｗ）、又はウェル上にロードされる。化合物は前記部位（１１）にロードされ、そして多孔性物質の毛細管引力によりブロック中に吸収される（図５を参照されたい）。好ましい態様において、多孔性ブロック（１）の底面（５）上には何千もの小さい部位（１１）、窓（ｗｉｎｄｏｗ）、又はウェルがある。これらの部位は、多孔性ブロック（１）の上面（３）上の細胞接着領域（７）の反対に位置する。
【００２９】
本発明の態様において、多孔性マトリックス層の上面上の親水性領域は、多孔性マトリックス層の底面上に並んだ幾何学的に同一な親水性領域と垂直に配列する。上面上の親水性領域は、アッセイ構成要素を引き付ける表面特性の調製に役立つ。底面上の親水性領域は、マイクロピペット又は自動微小液体操作技術（ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏ−ｆｌｕｉｄ  ｈａｎｄｌｉｎｇ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して多孔性マトリックス層上に置かれた試料化合物及びそのキャリアー溶媒を局在させることに役立つ。アッセイ構成要素を拡散円錐（ｄｉｆｆｕｓｉｏｎ  ｃｏｎｅ）の中心軸に対応する最大の試料量に暴露することを確実にすることにより、上面及び底面領域の配列は、次いで多孔性層を通じて上面に固定されたアッセイ構成要素（例えば、細胞）に拡散する、底面上に位置する試料化合物の相互作用を最適化する。
【００３０】
本発明の別の態様において、多孔性マトリックス層の上面上の円形親水性領域は、多孔性マトリックス層の底面上に並んだ幾何学的に同一な疎水性領域と垂直に配列する。前の態様と同様に、上面上の親水性領域は、アッセイの構成要素を引き付ける表面特性の調製に役立つか、又はこれらのような所定の範囲内に細胞のようなアッセイの構成要素を固定するために機能する。多孔性ブロックの底面上の疎水性領域は、マイクロピペット又は自動微小液体操作技術を使用して、表面上に置かれた溶媒中に運び込まれる試料化合物を局在させることに役立つ。この上面及び底面領域の配列は、試料とアッセイの構成要素の相互作用を最適化する。
【００３１】
いかなる種類の細胞も本発明に使用可能である。細胞は不死化した細胞又は初代細胞であってよい。ある態様において、細胞は目的の遺伝子でトランスフェクトされている。
好ましい態様において、細胞は接着性の細胞である。別の好ましい態様において、細胞は真核細胞である。特に好ましい態様において、細胞は哺乳類の細胞である。特別に好ましい態様において、細胞はヒト細胞である。
【００３２】
本発明で利用される細胞の例は、限定されるわけではないが、ＢＨＫ細胞、Ｃ２Ｃ１２細胞、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｆ９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｊｕｒｋｅｔ細胞、Ｌ８細胞、Ｌ９２９細胞、ＮＩＨ３Ｔ３細胞、ＰＣ−１２細胞、Ｓｆ９細胞が含まれる。
【００３３】
非細胞物質の試料化合物との相互作用を決定するためには、当業者は本発明を修正することも可能であることを認識すべきである。例えば、上面の細胞接着領域上の平板細胞（ｐｌａｔｉｎｇ  ｃｅｌｌ）の代わりに、ペプチド及び他の化学化合物が細胞接着領域に接着し、試料化合物との相互作用を試験することも可能である。
【００３４】
図２に関して、装置は試料化合物をロードするための複数部位を提供する可溶性層（１３）を含んでよい。これらの部位は、多孔性ブロック（１）の上面（３）上の細胞接着領域の反対側に位置する。
【００３５】
可溶性層の目的は、層を通じて薬剤の拡散を制御することである。好ましい態様において、プレート上の細胞の固定化を確実にするために細胞をプレート上に置いた後、約１時間から約２時間で可溶性層は溶解する。
【００３６】
可溶性層は、温度感受性、湿度感受性、ｐＨ感受性又は特定の化学物質（例えば、イオン、グルコース、若しくは尿素）に対して感受性であってよい。ある態様において、可溶性層は、アガロース、ゼラチン、キチン、ポリアクリル酸及びポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）、又はプルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）ＴＭ（α−ヒドロ−ω−ヒドロキシポリ（オキシエチレン）ポリ（オキシプロピレン）ポリ（オキシエチレン）ブロックコポリマー）である。
【００３７】
図３及び４（図３は図４の断面図）に関して、好ましい態様において、装置は多孔性ブロックを取り囲むフレーム（１５）をさらに含む。フレームは、多孔性ブロックをさまざまな操作の間、実質的平面な位置に維持するような構造的支持を提供する。
【００３８】
別の態様において、装置は、多孔性マトリックスブロックの上面全体を取り囲む保持壁（ｒｅｔａｉｎｉｎｇ  ｗａｌｌ）（１７）をさらに含む。細胞性、タンパク質性又は他の生物学的構成要素が上面上の規定の細胞接着領域と相互作用する間、壁はアッセイ試薬懸濁液が表面上に分注され、そして上面との接触を維持することを可能にする。懸濁液を移しそして表面を任意にすすいだ時、細胞性、タンパク質性又は他の生物学的構成要素は維持されそして規定の細胞接着領域内に固定される。多孔性マトリックス層を通じて拡散した試料化合物は、直ちに多孔性ブロックの上部上のこれら細胞性、タンパク質性又は他の生物学的構成要素と相互作用可能である。ある態様において、多孔性ブロックは壁を含む。別の態様において、フレームは壁を含む。
【００３９】
別の態様において、装置の上面及び／又は底面はふた（１９）又はフィルムで覆われる。ふた（１９）又はフィルムは、インキュベートされた細胞又はロードされた化合物が汚染されるのを防ぎ、そして装置を無菌状態に維持する。
【００４０】
「試料化合物」、「試験化合物」、又は「薬剤候補化合物」と関連する本明細書で使用される本発明の化合物は、本発明の装置と関連して記載される。そのようなものとして、これらの化合物は、合成に又は天然源に由来する有機化合物又は無機化合物を含む。
【００４１】
コンビナトリアルケミストリーの出現が、潜在的に有望な薬剤候補を同定するために設計されたハイスループットスクリーニング法の発達を推進した。コンビナトリアルケミストリーは、可能性のある薬剤の手がかりの大集団を体系的にそして効率的に作り出す自動工程に依存する。
【００４２】
例えば、非伝統的医薬において使用されるもののような多数の天然化合物をスクリーニング可能であることが望ましい。さらに、多数の既知の以前から存在する薬剤及び化合物を、現在知られている活性を越える生物学的活性についてスクリーニング可能であることが望ましい。また、センス及びアンチセンスオリゴヌクレオチド、ＲＮＡｉ、ｓｉＲＮＡ、プラスミド、及びオリゴヌクレオチド３リン酸を含む多数の核酸並びに核酸類似体をスクリーニング可能であることが望ましい。
【００４３】
そのようなスクリーニングアッセイは化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングの影響を受けやすいアッセイを含み、このことはこのスクリーニングアッセイを特に低分子薬剤候補を同定するために適したものにする。意図される低分子は合成有機又は無機化合物を含み、これらはペプチド、好ましくは可溶性ペプチド、（ポリ）ペプチド免疫グロブリン融合体、抗体を含み、抗体は限定されることなく、ポリ−及びモノクローナル抗体、抗体断片（例えば、ＦＡｂ断片及びＦ（ａｂ）２断片）、１本鎖抗体、抗イディオタイプ抗体、及びそのような抗体又は断片のキメラ又はヒト化のもの、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む。アッセイは、当該技術分野でよく特性付けられているタンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学スクリーニングアッセイ、免疫アッセイ及び細胞に基づくアッセイを含む様々な形式で実行される。
【００４４】
混合物の構成要素は、必要な活性を提供する任意の順序で追加される。インキュベーションは最適な結合を容易にする任意の温度で実行してよく、典型的には約４℃から４０℃、より一般的には約３０℃から４０℃である。インキュベーション期間は最適な結合のために同様に選択されるが、迅速なハイスループットスクリーニングを容易にするために最小化もされ、そして典型的には約０．１から４８時間、好ましくは１２時間から３６時間、より好ましくは２０から２４時間である。インキュベーション後、候補化合物の効果は都合のよいアッセイを使用して決定される。そのようなアッセイは、限定されるわけではないが、細胞の外観又は構造の変化を測定するアッセイ、細胞活性の変化を測定するアッセイ、遺伝子発現レベルの変化を測定するアッセイ、細胞タンパク質発現レベルの変化を測定するアッセイ、細胞タンパク質活性の変化を測定するアッセイ、及び細胞タンパク質安定性の変化を測定するアッセイを含む。
【００４５】
細胞に結合する適した化合物は、ポリペプチド又はポリヌクレオチド断片、あるいは例えばペプチド模倣体のような低分子を含む。通常は分子量１００ＫＤ以下の、より好ましくは１０ＫＤ以下の低分子化合物は、細胞へより透過しやすく、様々な細胞機構による分解をうけにくく、そしてタンパク質又はポリペプチドが有するような免疫反応を引き起こす可能性がないので、治療剤として好ましい。低分子は、限定されるわけではないが、合成有機又は無機化合物を含む。高分子化合物（１００ＫＤ以上の化合物）もまた利用可能である。多くの製薬企業は、本発明のアッセイを使用することにより都合よくスクリーニングされるそのような分子の大規模なライブラリーを有している。非限定的な例は、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖、オリゴ糖、核酸、生物有機分子、ぺプチド模倣体、薬理作用のある剤及びこれらの代謝物、転写及び翻訳制御配列を含む。
【００４６】
細胞と相互作用する化合物を同定するための技術は、キメラ基質（例えば、エピトープタグされた融合免疫付着因子又は融合免疫付着因子）を利用してよい。任意にラベルされた（例えば、放射線ラベルされた）候補化合物の細胞への結合が測定される。
【００４７】
本発明の態様において、細胞が接着した後に、試料が多孔性ブロックを通じて配達されそして拡散する。試料は細胞と相互作用し、そして生じた生物学的効果は試料化合物の潜在的な医薬的効果を示唆する。本発明の装置は、既知の化合物又は他の対照条件に対して高度に予測可能で再現性のある反応を示し、そして正と負の反応間の明確な閾値を示す。本発明はまた、ＦＤＡ承認薬剤又は他の生物活性分子のコレクションのような少なくとも数百の化合物の多様なコレクションを使用したハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）のためのアッセイの適合性及び再現性を示す。本発明のある態様は、酵素指示剤、試薬読取のために必要な化学物質、及び十分な反応基質（ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、又は酵素基質）を生産するための能力のようなＨＴＳを実行するために必要な試薬の利用可能性を必要とする。当業者は、一次のハイスループットスクリーニングにおいて医薬的活性を示した試料の重要性を評価するための様々な既知の方法を利用可能である。これらの方法は、一次のＨＴＳの試みにおいて同定されうる複数のヒット化合物の評価のために使用可能である。二次スクリーニングはまた、人為的な影響を読み取るために、そしてさらなる試験のために化合物を優先順位付けするために含まれうるカウンタースクリーニング（ｃｏｕｎｔｅｒｓｃｒｅｅｎ）を理解するためにも使用してもよい。
【００４８】
生物学的効果は、細胞数、形状（ｃｏｎｆｉｇｕｌａｔｉｏｎ）、サイズ、接着、形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）、又は顕微鏡観察を通じた細胞死を監視することによって測定される効果を含む。
【００４９】
顕微鏡観察に加えて、生物学的効果はアッセイを使用して測定可能である。アッセイは、細胞代謝活性、細胞接着、細胞増殖、細胞成長、又は細胞死（ネクローシス又はアポトーシス）を誘導する候補化合物の能力を測定する。これらのアッセイは、ＭＴＴ（臭化３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラナトリウム）アッセイ、カスパーゼアッセイ、Ｃｒ５１放出アッセイ、ＡＴＰアッセイ、断片化ＤＮＡアッセイ、及び細胞死を測定する他の既知の方法を含む。
【００５０】
アッセイはまた、遺伝子発現のレポーター、酵素活性のレポーター、又は細胞シグナル分子のような特定の分子マーカーを監視し又は追跡することを含む。
以上に論じたように、多孔性ブロックは多数の細胞接着領域及び細胞非接着領域を含む上面を含む。これらの領域は上面から底面に伸張することが可能であり、又は上面から上面と底面の間のある点まで伸張することが可能である。好ましい態様において、親水性領域は上面と底面の両方の上に配列され、そして多孔性マトリックス層全体を通じて接触している。親水性上部及び下部領域は、前記の態様中のように、アッセイ試薬を固定しそして試料沈着を局在化することに役立つ。多孔性マトリックスを通じたこれら親水性領域の伸張は、親水性領域内に試料化合物を保持することによる拡散を容易にし、これにより上面での試料化合物の量を最大にし、そして多孔性マトリックスを通じた試料化合物の重大な側方拡散から生じる試料の試料との汚染の度合いを最小にする。本態様は、多孔性マトリックス内及びその表面の両方で不連続である。
【実施例】
【００５１】
実施例１−多孔性ブロックの形成
多孔性ブロックは、０．４５ミクロンの標準孔サイズを有する直径１０ｍｍで厚さおよそ１００ミクロンの親水性多孔性ナイロン膜から作られる。次いで、膜は単量体メタクリル酸メチル（ＭＭＡ）中に浸漬される。次いで、ナイロン膜は無菌条件下で２枚のガラスプレートの間にサンドイッチされる。
【００５２】
実施例２−細胞接着領域の形成
細胞接着領域を生産するために、ＭＭＡ浸漬ナイロン膜を３００ミクロンの直径を有するレーザービームに暴露し、５秒間、７０℃まで膜の特定の領域を選択的に加熱する。これら選択的加熱領域のＭＭＡはポリマー化しそして疎水性領域を形成し、一方レーザービームに暴露されていないＭＭＡ浸漬ナイロン膜の範囲はそのままであり、親水性のままである。このように、９６の親水性細胞接着領域を含む多孔性ブロックは生産される。次いで、膜をガラスプレートから取り除き、そしてエタノールで洗浄し過剰なＭＭＡを取り除く。このように、パターンのある疎水性領域を有する親水性ナイロン膜が形成される。
【００５３】
次いで、パターンのある膜を型から取り出し、壁を有するフレーム中に挿入する。フレームは多孔性ブロックに追加の支持を提供し、一方壁は液体の閉じ込めを可能にする。
実施例３−細胞のプレーティング
ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞を、１０％子ウシ血清で補われたＤＭＥＭ培地中で、１−１０×１０４細胞／ｍｌの密度で多孔性ブロック上にプレートし、そして５％ＣＯ２インキュベーター中３７℃で一晩インキュベートする。
【００５４】
翌日、培地を交換した。
実施例４−試料化合物のロード
様々な化合物のライブラリーを、合成又は化学的単離及び精製により得る。これら化合物を無菌ＰＢＳ中に溶解し、そして液体移送機械又はアレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）を使用して細胞接着領域から正反対の多孔性ブロックの底面の９６の異なる部位に適用する。多孔性ブロックを逆さまにして（即ち、上面の上に底面）ロードを容易にする。次いで、多孔性ブロックを少なくとも６時間インキュベーターに戻す。
【００５５】
実施例５−ＭＭＴアッセイ
細胞をＰＢＳで３回洗浄する。次いで、細胞を含有するプレートに５ｍｇ／ｍｌのＭＭＴ溶液を添加し（５：１のＤＭＥＭ培地：ＭＭＴ溶液比）、その後ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で５時間プレートと細胞をインキュベートする。次いで、針とシリンジで培地を取り出す。この時点で、各ウェルにＤＭＳＯを添加する（２：１のＤＭＥＭ培地：ＭＭＴ溶液比）。ピペットで吸ったり出したりしいくつかの結晶を溶解することが必要であるかもしれない。次いで、プレートを３７℃で５分間インキュベートし、そしてプレート読取機に移し、そして５５０ｎｍで吸光度を測定する。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１は、親水性細胞接着領域（７）の反対に位置する、試料化合物をロードするための複数親水性部位（１１）を有する装置の断面図である。
【図２】図２は、可溶性層（１３）を有する装置の断面図である。
【図３】図３は、フレーム（１５）及びフレームから伸張する壁（１７）を有する装置の断面図である。
【図４】図４は、親水性細胞接着領域（７）及び疎水性細胞非接着領域（９）を示すフレーム（１５）を有する装置の上面図である。
【図５】図５は、装置の底面（５）上に位置する単一部位（１１）から、装置の上面（３）上に位置する単一の親水性細胞接着領域（７）へ試料化合物の拡散を示す概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年1月16日(2008.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の試料化合物の生物学的効果を試験するための装置であって、
実質的に平面な上面及び底面を有する多孔性ブロックを含み、ここで前記上面が多数の細胞接着領域及び細胞非接着領域を含み、前記底面が前記試料化合物をロードするための複数部位を提供し、前記部位が前記多孔性ブロックの前記上面上の前記細胞接着領域の反対側に位置する、上記装置。
【請求項２】
複数の試料化合物の生物学的効果を試験するための装置であって：
（ａ）実質的に平面な上面及び底面を有する多孔性ブロック、ここで前記上面が多数の細胞接着領域及び細胞非接着領域を含み；および
（ｂ）前記試料化合物をロードするための複数部位を提供する少なくとも１つの可溶性層、ここで前記部位が前記多孔性ブロックの前記上面上の前記細胞接着領域の反対側に位置し、前記可溶性層が前記底面に近接する、
を含んでなる、上記装置。
【請求項３】
前記装置が、上に上昇しそして前記上面を取り囲む壁をさらに含み、ここで前記壁と前記上面とにより液体を保持することができる、請求項１の装置。
【請求項４】
前記多孔性ブロックが、ポリマー、ゲル、または膜を含む、請求項１の装置。
【国際調査報告】
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