(57)【要約】  本発明は、（脊髄性筋萎縮症などの）下位運動ニューロン疾患に関する症状の治療、予防、および／または緩和のための方法を提供する。この方法は、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与を含む。組成物およびキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体に有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を投与することを含む、個体における下位運動ニューロン疾患の治療方法。
【請求項２】
下位運動ニューロン疾患が脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
下位運動ニューロン疾患が、呼吸困難を伴う脊髄性筋萎縮症１型（ＳＭＡＲＤ１）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アゴニストｔｒｋＣ抗体を投与した後に個体の筋力が改善される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体がヒトｔｒｋＣを結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体が、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体のＦａｂ断片によって評価したとき約１ｎＭ未満の親和性でヒトｔｒｋＣを結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体がヒトｔｒｋＣおよびげっ歯類ｔｒｋＣを結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体が、ｔｒｋＣのドメイン４にあるエピトープを結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体がヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体がヒト化抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体が、配列番号１からの３個のＣＤＲを含む重鎖可変部と、配列番号２からの３個のＣＤＲを含む軽鎖可変部とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体が、配列番号１に示す重鎖可変部アミノ酸配列と、配列番号２に示す軽鎖可変部アミノ酸配列とを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体が抗体Ａ５である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体と薬学的に許容できる担体とを含む、個体において下位運動ニューロン疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項１６】
ａ）アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体および薬学的に許容できる担体を含む医薬組成物と、
ｂ）有効量の前記医薬組成物を個体に投与するための説明書とを含む、下位運動ニューロン疾患を治療するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される２００５年４月２６日出願の米国仮特許出願第６０／６７５３９３号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、下位運動ニューロン疾患の治療および／または予防におけるアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
運動ニューロン疾患は、運動ニューロンが変性し、死に至る障害である。上位運動ニューロンおよび下位運動ニューロンを含む運動ニューロンは、随意筋に影響を及ぼし、随意筋を刺激して収縮させる。上位運動ニューロンは、大脳皮質に始まり、脳幹および脊髄を経由して線維を送り、下位運動ニューロンの制御に関与する。下位運動ニューロンは、脳幹および脊髄に位置し、線維を筋肉に送る。下位運動ニューロン疾患は、下位運動ニューロンの変性を含む疾患である。下位運動ニューロンが変性すると、通常は活性化する筋線維が連絡切断され、収縮せず、筋力低下および反射の減弱が引き起こされる。どちらの型のニューロンの損失も、脱力、すなわち筋萎縮（消耗）をもたらし、無痛性の脱力は、運動ニューロン疾患の臨床的な特徴である。
【０００４】
ＳＭＡＲＤ１は、第２の一般的な常染色体劣性遺伝疾患である脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）の臨床的な変形形態であり、小児期における最も一般的な遺伝的死因である。ＳＭＡおよびＳＭＡＲＤ１は、進行性の筋肉運動麻痺を随伴する下位運動ニューロンの変性を特徴とする。ＳＭＡ症例の大多数が、生存運動神経細胞遺伝子（ＳＭＮ）の突然変異によるものである（１）のに対し、ＳＭＡＲＤ１は、異なる遺伝子、すなわち免疫グロブリンμ−結合タンパク質２遺伝子（ＩＧＨＭＢＰ２）の突然変異によって引き起こされる（２〜５）。ＳＭＡＲＤ１患者は、横隔膜の関与により呼吸器機能の早期の機能障害を患う（４）。一部の予備的な臨床試験で肯定的な結果が出ているにもかかわらず（７）、現在、一般にＳＭＡＲＤ１またはＳＭＡの有効な療法は存在しない（６）。
【０００５】
ｎｍｄマウスは、ＤＮＡ／ＲＮＡヘリカーゼ／ＡＴＰａｓｅタンパク質ファミリーの一員であるマウスＩｇｈｍｂｐ２遺伝子の自然突然変異を有する（８〜１０）。この遺伝的欠陥は、イントロン４における単一の突然変異（Ａ→Ｇ）からなるため、転写物の８０％が異常にスプライスされ、２０％が全長である（９）。マウスではＩＧＨＭＢＰ２の機能発現が完全に消滅しないので、ｎｍｄマウスは、より軽度の形のヒトＳＭＡＲＤ１に類似した疾患表現型を示す（９）。筋力低下は、出生から２週間後に発現し始め、四肢の重度の神経性筋萎縮に進行する（８〜１１）。
【０００６】
神経栄養因子は、運動神経疾患の有望な治療薬であると考えられている。この期待は、培養中の動物胚の運動ニューロンにおけるそれら分子の生存促進特性、すなわち軸索切断後の神経に対するそのプラスの生物学的効果、および神経変性疾患動物モデルにおける病理学的症状の軽減（１２〜１５）に基づいている。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ研究のほとんどで得られる有望な結果を踏まえて、外来のニューロトロフィンが、アルツハイマー病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、末梢ニューロパチー、パーキン病、およびハンチントン病患者のための臨床試験で使用されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
神経栄養因子を適用する際の１つの実際的な難点は、これらのタンパク質がすべて、比較的短い半減期を有する一方で、神経変性疾患は慢性的であり、長期の治療が必要であることである。ニューロトロフィン受容体を標的とする治療用のアゴニスト抗体は、特異性が高く半減期が長いために、神経変性疾患のための新規な手法となり得る。
【０００８】
特許出願および特許公開を含む、本明細書で引用するすべての参考文献は、その全体が参照により援用される。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、個体における（下位運動ニューロン変性を含む）下位運動ニューロン疾患の治療方法を提供する。下位運動ニューロン疾患の例は、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）および呼吸困難を伴う脊髄性筋萎縮症１型（ＳＭＡＲＤ１）である。この方法は、個体への有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与を含む。
【００１０】
一態様では、本発明は、個体における下位運動ニューロン疾患の治療方法であって、その個体への有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与を含む方法を提供する。別の態様では、本発明は、個体において下位運動ニューロン疾患に関連する症状の出現を遅らせる方法であって、その個体への有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与を含む方法を提供する。別の態様では、本発明は、個体において下位運動ニューロン疾患の症状を緩和させる方法であって、その個体への有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与を含む方法を提供する。
【００１１】
一部の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与後に個体の筋肉強度が向上する。一部の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与後に個体の筋肉強度の低下を遅らせる。
【００１２】
一部の実施形態では、個体は、ヒトなどの哺乳動物である。
【００１３】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、当業界で知られている。一部の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、モノクローナル抗体である。一部の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、ヒトｔｒｋＣを結合する。一部の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、ヒトｔｒｋＣを特異的に結合する。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、ヒトおよびげっ歯類ｔｒｋＣを結合するものでよい。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、（抗体６．４．１（ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９８３６１）などの）ヒト抗体でもよいし、または（ヒト化モノクローナル抗体２２５６を含む）ヒト化抗体でもよい。別の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、ＰＣＴ  ＷＯ２００４／０５８１９０および本明細書に記載のヒト化抗体Ａ５である。さらに他の実施形態では、抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体は、表１に示す重鎖可変部アミノ酸配列（配列番号１）と表２に示す軽鎖可変部アミノ酸配列（配列番号２）とを含む。他の実施形態では、抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体は、抗体Ａ５の１個または複数のＣＤＲ（Ａ５からの１、２、３、４、５個、または一部の実施形態では６個すべてのＣＤＲなど）を含む。ＣＤＲの同定は、多分に当分野の技能の範囲内である。一部の実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔＣＤＲを含む。他の実施形態では、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａＣＤＲである。さらに他の実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａの両方のＣＤＲを含む。一部の実施形態では、抗体は、受託番号がＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−５６８２であるベクター中のポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、受託番号がＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−５６８３であるベクター中のポリヌクレオチドによってコードされる重鎖を含む。一部の実施形態では、抗体は、（ａ）受託番号がＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−５６８２であるベクター中のポリヌクレオチドによってコードされる軽鎖と、（ｂ）受託番号がＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−５６８３であるベクター中のポリヌクレオチドによってコードされる重鎖とを含む。一部の実施形態では、抗体は、（ａ）受託番号がＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−５６８２であるベクター中のポリヌクレオチドによってコードされる１個または複数のＣＤＲ、および／または（ｂ）受託番号がＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＰＴＡ−５６８３であるベクター中のポリヌクレオチドによってコードされる重鎖を含む。
【００１４】
抗体は、次のもの、すなわち６．１．２、６．４．１、２３４５、２３４９、２．５．１、２３４４、２２４８、２２５０、２２５３、および２２５６のいずれか１種または複数から選択される抗体と本質的に同じｔｒｋＣエピトープを結合するものでも、またはそうした抗体と結合をめぐって競合するものでもよい。ＰＣＴ公開番号ＷＯ０１／９８３６１を参照されたい。抗体は、免疫学的に不活性である、例えば補体によって媒介される溶解のきっかけとならず、または抗体依存性の細胞によって媒介される細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常部などの、改変された定常部を含むものでもよい。他の実施形態では、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）第２９巻：２６１３〜２６２４ページ、ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１、および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載の通りに定常部を改変する。
【００１５】
抗体は、次のもの、すなわち、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ断片、ダイアボディ、抗体断片から生成される単鎖抗体分子および多特異性抗体、ならびに単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子のうちの１種または複数から選択される抗体断片などの抗体断片でもよい。抗体はキメラでもよく、二重特異性でもよい。
【００１６】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与は、次の手段、すなわち、静脈内、皮下、吸入、動脈内、筋肉内、心臓内、脳室内、くも膜下腔内、脊髄内、および腹腔内のうちの１種または複数を含めて、当業界で知られている適切な任意の方法でよい。投与は、全身（例えば静脈内）および／または局所でよい。投与は、短時間および／または長期間でよい。投与は、下位運動ニューロン疾患の発症前に行うことができる。
【００１７】
別の態様では、本発明は、本発明の方法のいずれかで使用するための、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を含む組成物およびキットを提供する。これらのキットは、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を本明細書に記載の方法のいずれかで使用するための説明書をさらに含むこともある。本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかで使用するための、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体と薬学的に許容できる担体とを含む医薬組成物も提供する。
【００１８】
本発明はまた、医薬としての使用および／または医薬の製造のための使用のいずれの状況にせよ、本明細書に記載の任意の使用について述べた組成物およびキットのいずれかを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、個体における下位運動ニューロン疾患の治療方法であって、その個体への有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与を含む方法を提供する。下位運動ニューロン疾患の例には、ＳＭＡ、およびＳＭＡの臨床的な変形形態であるＳＭＡＲＤ１が含まれる。
【００２０】
一般技術
本発明の実践では、別段の指定がない限り、当分野の技能の範囲内にある（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術が使用される。このような技術は、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編、１９８４年）；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ編、１９９８年）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編、１９８７年）；「Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（Ｊ．Ｐ．ＭａｔｈｅｒおよびＰ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９９８年）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；「Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ」（Ａ．Ｄｏｙｌｅ、Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ、およびＤ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ編、１９９３〜８年）、Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；「Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｄ．Ｍ．ＷｅｉｒおよびＣ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編）；「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ」（Ｊ．Ｍ．ＭｉｌｌｅｒおよびＭ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編、１９８７年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）；「ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ」（Ｍｕｌｌｉｓら編、１９９４年）；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編、１９９１年）；「Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、１９９９年）；「Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ」（Ｃ．Ａ．ＪａｎｅｗａｙおよびＰ．Ｔｒａｖｅｒｓ、１９９７年）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ、１９９７）；「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｄ．Ｃａｔｔｙ編、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８〜１９８９年）；「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ａｐｐｒｏａｃｈ」（Ｐ．ＳｈｅｐｈｅｒｄおよびＣ．Ｄｅａｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、２０００年）；「Ｕｓｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ」（Ｅ．ＨａｒｌｏｗおよびＤ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９９年）；「Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」（Ｍ．ＺａｎｅｔｔｉおよびＪ．Ｄ．Ｃａｐｒａ編、Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕ��ｌｉｓｈｅｒｓ、１９９５年）；および「Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ」（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａら編、Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９３年）などの文献で十分に説明されている。
【００２１】
定義
（複数形でも区別なく使用される）「抗体」とは、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に、免疫グロブリン分子の可変部に位置する少なくとも１個の抗原認識部位を介して特異的に結合することのできる免疫グロブリン分子である。本明細書では、この用語は、無処置のポリクローナルまたはモノクローナル抗体だけでなく、（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどの）これらの断片、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、ダイアボディ、線形抗体、単鎖抗体、多特異性抗体（例えば二重特異性抗体）、および必要な特異性の抗原認識部位を含む他の任意の改変された形状の免疫グロブリン分子も含む。抗体には、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどのどんなクラスの抗体も含まれ、抗体は、任意の特定のクラスのものである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンを異なるクラスに割り振ることができる。免疫グロブリンの５つの主要なクラスは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、およびＩｇＭであり、これらのいくつかは、さらにサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２に分けられる場合もある。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、γ、δ、ε、およびμと呼ばれる。軽鎖にも、κおよびλと呼ばれる２つのクラスがある。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元立体配置はよく知られている。
【００２２】
「モノクローナル抗体」とは、抗原の選択的な結合に関与するアミノ酸（自然に存在するものおよび自然に存在しないもの）からなる同種の抗体集団を指す。モノクローナル抗体の集団は、単一の抗原部位に向けられ、高度に特異的である。用語「モノクローナル抗体」は、無処置のモノクローナル抗体および全長モノクローナル抗体だけでなく、（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなどの）これらの断片、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要な特異性および抗原結合能の抗原認識部位を含む他の任意の改変された形状の免疫グロブリン分子も含む。抗体の供給源または（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物などによる）その製法については、限定されないものとする。
【００２３】
「ヒト化」抗体とは、実質的にヒトでない種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有し、分子の残りの免疫グロブリン構造がヒト免疫グロブリンの構造および／または配列に基づく分子を指す。抗原結合部位は、定常ドメインに融合した完全な可変ドメインを含んでもよいし、または可変ドメイン中の適切なフレームワーク領域に接ぎ合わされた相補性決定領域（ＣＤＲ）のみを含んでもよい。抗原結合部位は、野生型でも、または１つまたは複数のアミノ酸置換によって改変されたもの、例えばヒト免疫グロブリンにより近似するように改変されたものでもよい。ヒト化抗体の一部の形態は、すべてのＣＤＲ配列を保存している（例えば、マウス抗体からの６個のＣＤＲすべてを含むヒト化マウス抗体）。他の形態のヒト化抗体は、もとの抗体に関して変更されている１個または複数のＣＤＲ（１、２、３、４、５、６個）を有する。
【００２４】
本明細書では、「ヒト抗体」とは、ヒトによって産生される抗体に相当するアミノ酸配列を有する抗体を意味し、かつ／または当業界で知られ、または本明細書で開示するヒト抗体の製造技術のいずれかを使用して製造されている。このヒト抗体の定義には、少なくとも１本のヒト重鎖ポリペプチドまたは少なくとも１本のヒト軽鎖ポリペプチドを含む抗体が含まれる。そのような１つの例は、ネズミ軽鎖ポリペプチドとヒト重鎖ポリペプチドとを含む抗体である。ヒト抗体は、当業界で知られている様々な技術を使用して生成することができる。一実施形態では、ヒト抗体は、ヒト抗体を発現させるファージライブラリーから選択される（Ｖａｕｇｈａｎら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１４巻：３０９〜３１４ページ；Ｓｈｅｅｔｓら、１９９８年、ＰＮＡＳ（米）、第９５巻：６１５７〜６１６２ページ；ＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍおよびＷｉｎｔｅｒ、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７〜３８１ページ；Ｍａｒｋｓら、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２２２巻：５８１ページ）。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座を、内在性の免疫グロブリン遺伝子が部分的または完全に不活化されているトランスジェニック動物、例えばマウスに導入して作ることもできる。この手法は、米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号、同第５５６９８２５号、同第５６２５１２６号、同第５６３３４２５号、および同第５６６１０１６号に記載されている。別法として、ヒト抗体は、標的抗原に向けられる抗体を産生するヒトＢリンパ球を不死化して調製することができる（そのようなＢリンパ球は、個体から回収してもよいし、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏで免疫感作したものでもよい）。例えば、Ｃｏｌｅら、「Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ、７７ページ（１９８５年）；Ｂｏｅｒｎｅｒら、１９９１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１４７巻（１）：８６〜９５ページ；および米国特許第５７５０３７３号を参照されたい。
【００２５】
「キメラ抗体」とは、重鎖および軽鎖のアミノ酸配列それぞれの一部分が、ある特定の種に由来し、またはある特定のクラスに属する抗体中の対応する配列と相同であり、鎖の残りの区域が別の抗体中の対応する配列と相同である抗体を指す。通常、これらのキメラ抗体では、軽鎖および重鎖の両方の可変部が、哺乳動物のある種に由来する抗体の可変部を模倣し、定常部分は、別のものに由来する抗体中の配列と相同である。そのようなキメラ形態の１つの明白な利点は、例えば、非ヒト宿主生物から容易に入手可能なハイブリドーマまたはＢ細胞を使用して、現在知られている供給源から、例えばヒト細胞調製物由来の定常部と組み合わせて、可変部を好都合に得ることができる点である。可変部は、調製が容易であるという利点を有し、特異性はその供給源によって影響を受けないが、ヒトである定常部は、抗体が注射されたときに、ヒトでない供給源からの定常部よりもヒト対象からの免疫応答を誘発しにくい。しかし、この定義は、この特定の例に限定されない。
【００２６】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書では区別なく使用する）エピトープとは、当業界でよく理解されている用語であり、そのような特異的または優先的な結合を測定する方法も当業界でよく知られている。分子は、ある特定の細胞または物質と、別の細胞または物質より頻繁に、より迅速に、より長期間、かつ／またはより強い親和性で反応または結合するならば、「特異的結合」または「優先的な結合」を示すと言われる。抗体は、他の物質に結合するよりも強い親和性、すなわち結合力で、より容易に、かつ／またはより長い期間で結合するならば、標的に「特異的に結合する」または「優先的に結合する」。例えば、ｔｒｋＣエピトープに特異的または優先的に結合する抗体とは、他のｔｒｋＣエピトープまたは非ｔｒｋＣエピトープに結合するのより強い親和性、すなわち結合力で、より容易に、かつ／またはより長い期間、このｔｒｋＣエピトープを結合する抗体である。例えば、第１の標的に特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）が、第２の標的に特異的または優先的に結合してもしなくてもよいことも、この定義を読むことで理解される。「特異的結合」または「優先的な結合」は、それ自体として、必ずしも独占的な結合を（含むことがあるとしても）必要としない。必ずしもそうでないが、一般に、結合への言及は優先的な結合を意味する。
【００２７】
「機能Ｆｃ領域」は、未変性配列Ｆｃ領域の少なくとも１種のエフェクター機能を有する。好例となる「エフェクター機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）、食作用、細胞表面受容体（例えばＢ細胞受容体、ＢＣＲ）の下方調節などが含まれる。そのようなエフェクター機能には、一般に、Ｆｃ領域が結合ドメイン（例えば、抗体可変ドメイン）と合体することが必要であり、エフェクター機能は、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当業界で知られている様々なアッセイを使用して評価することができる。
【００２８】
「未変性配列Ｆｃ領域」は、自然界で見られるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を含む。「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１個のアミノ酸の変更によって未変性配列Ｆｃ領域と異なるが、未変性配列Ｆｃ領域の少なくとも１種のエフェクター機能を保持するアミノ酸配列を含む。変異体Ｆｃ領域は、未変性配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドＦｃ領域と比べて少なくとも１つのアミノ酸置換を有することが好ましく、例えば、未変性配列Ｆｃ領域または親ポリペプチドＦｃ領域中に約１〜約１０個のアミノ酸置換、好ましくは約１〜約５個のアミノ酸置換を有する。変異体Ｆｃ領域は、本明細書では、未変性配列Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドＦｃ領域と、少なくとも約８０％の配列同一性、最も好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有することが好ましい。
【００２９】
本明細書では、「抗体依存性細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が、標的細胞上の結合した抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞性の反応を指す。対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、米国特許第５５００３６２号または同第５８２１３３７号に記載のものなどのｉｎ  ｖｉｔｒｏＡＤＣＣアッセイを使用して評価することができる。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー細胞が含まれる。別法としてまたは追加として、対象とする分子のＡＤＣＣ活性は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、例えばＣｌｙｎｅｓら、１９９８年、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）、第９５巻：６５２〜６５６で開示されているものなどの動物モデルで評価することもできる。
【００３０】
「アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体」（区別なく「抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体」とも呼ぶ）とは、ｔｒｋＣ受容体を結合し、および／またはｔｒｋＣシグナル伝達機能によって媒介される下流の経路を活性化することのできる抗体を指す。例えば、アゴニスト抗体は、ｔｒｋＣ受容体の細胞外ドメインに結合し、それによって受容体の二量体化を引き起こし、細胞内の触媒キナーゼドメインの活性化をもたらすことができる。したがって、アゴニスト抗体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで受容体を発現する細胞の増殖および／または分化を刺激し得る。一部の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、ｔｒｋＣに結合し、ｔｒｋＣ生物活性を活性化する。一部の実施形態では、本発明の方法で有用なアゴニスト抗体は、ｔｒｋＣのドメインＶおよび／またはドメインＩＶを認識する。Ｕｒｆｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７３巻：５８２９〜５８４０ページ（１９９８年）を参照されたい。
【００３１】
抗体の「可変部」とは、単独または複合語で、抗体軽鎖の可変部または抗体重鎖の可変部を指す。重鎖および軽鎖の可変部はそれぞれ、超可変領域としても知られている３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。それぞれの鎖のＣＤＲは、ＦＲによってきわめて接近してまとまり、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合性部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定する技術は、少なくとも２種存在する。すなわち（１）異種間の配列可変性に基づく手法（すなわち、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（第５版、１９９１年、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、米メリーランド州ベセズダ））、および（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７年）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．第２７３巻：９２７〜９４８ページ））。本明細書では、ＣＤＲとは、どちらかの手法または両方の手法の組合せによって規定されるＣＤＲを指す場合もある。
【００３２】
抗体の「定常部」とは、単独または複合語で抗体軽鎖の定常部または抗体重鎖の定常部を指す。
【００３３】
本明細書では、「Ｆｃ受容体」および「ＦｃＲ」とは、抗体のＦｃ領域に結合する受容体について述べるものである。好ましいＦｃＲは、未変性配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲは、ＩｇＧ抗体（γ受容体）を結合するものであり、これには、そのアレル変異体および選択的にスプライスされた形態を含めてＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、およびＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体が含まれる。ＦｃγＲＩＩ受容体には、主にその細胞質ドメインが異なる同様のアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化する受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「抑制する受容体」）が含まれる。ＦｃＲは、ＲａｖｅｔｃｈおよびＫｉｎｅｔ、１９９１年、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第９巻：４５７〜９２ページ；Ｃａｐｅｌら、１９９４年、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、第４巻：２５〜３４ページ；およびｄｅ  Ｈａａｓら、１９９５年、Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．、第１２６巻：３３０〜４１ページで総説されている。「ＦｃＲ」には、母親のＩｇＧの胎仔への移動を司る新生児受容体、すなわちＦｃＲｎも含まれる（Ｇｕｙｅｒら、１９７６年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１１７巻：５８７ページ；およびＫｉｍら、１９９４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第２４巻：２４９ページ）。
【００３４】
「補体依存性細胞傷害性」および「ＣＤＣ」とは、補体の存在下で標的を溶解させることを指す。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第１の構成成分が、同族抗原と複合体を形成した分子（例えば抗体）に結合することで開始される。補体活性化を評価するために、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、第２０２巻：１６３ページ（１９９６年）に記載されているようにＣＤＣアッセイを実施することができる。
【００３５】
本明細書では、「親和性成熟」抗体とは、その１個または複数のＣＤＲ中に、抗体の抗原に対する親和性を、変更をもたない親抗体と比べて向上させる１つまたは複数の変更を有する抗体を意味する。一部の実施形態では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対してナノモルまたはさらにはピコモルの親和性を有する。親和性成熟抗体は、当業界で知られている手順によって生成される（Ｍａｒｋｓら、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、第１０巻：７７９〜７８３ページ；Ｂａｒｂａｓら、１９９４年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、ＵＳＡ第９１巻：３８０９〜３８１３ページ；Ｓｃｈｉｅｒら、１９９５年、Ｇｅｎｅ、第１６９巻：１４７〜１５５ページ；Ｙｅｌｔｏｎら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１５５巻：１９９４〜２００４ページ；Ｊａｃｋｓｏｎら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、第１５４巻（７）：３３１０〜９ページ；Ｈａｗｋｉｎｓら、１９９２年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、第２２６巻：８８９〜８９６ページ）。
【００３６】
本明細書では、「ｔｒｋＣ」とは、チロシンキナーゼスーパーファミリーの一員であるｔｒｋＣ受容体ポリペプチドを指す。ｔｒｋＣは、その限りでないが、ヒト、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、霊長類、ならびに（マウスおよびラットを含む）げっ歯類を含めて、任意の哺乳類種の未変性ｔｒｋＣ受容体を含む。全長未変性ｔｒｋＣの細胞外ドメインは、様々な他のタンパク質で同定されている相同またはさもなければ同様の構造に即して規定されている。そのドメインは、成熟ｔｒｋＣ受容体のＮ末端から始めて、１）アミノ酸１からアミノ酸４８まで伸びる第１のシステインリッチドメイン、２）アミノ酸４９からアミノ酸１２０まで伸びるロイシンリッチドメイン、３）アミノ酸１２１からアミノ酸１７７まで伸びる第２のシステインリッチドメイン、４）約アミノ酸１９６からアミノ酸２５７まで伸びる第１の免疫グロブリン様ドメイン、および５）約アミノ酸２８８からアミノ酸３５１まで伸びる第２の免疫グロブリン様ドメインと呼ばれている。例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ０１９８３６１号を参照されたい。ヒトｔｒｋＣ受容体のドメイン構造は、結晶構造に即して次のようにも呼ばれている。すなわち、アミノ酸１〜アミノ酸４７のドメイン１、アミノ酸４８〜アミノ酸１３０のドメイン２、アミノ酸１３１〜アミノ酸１７７のドメイン３、アミノ酸１７８〜アミノ酸１６５のドメイン４、およびアミノ酸１６６〜アミノ酸３８１のドメイン５。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ０１９８３６１；Ｕｒｆｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７３巻：５８２９〜５８４０ページ（１９９８年）を参照されたい。ｔｒｋＣの変異体も含まれ、その例には、その限りでないが、キナーゼドメインを含まない変異体（Ｓｈｅｌｔｏｎら．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第１５巻（１）：４７７〜４９１ページ（１９９５年））および改変されたキナーゼドメインを含む変異体（Ｓｈｅｌｔｏｎら．、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．第１５巻（１）：４７７〜４９１ページ（１９９５年））が含まれる。
【００３７】
「生物活性」とは、本発明のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体と共に使用するとき、一般にｔｒｋＣ受容体チロシンキナーゼを結合し、および／またはｔｒｋＣシグナル伝達機能によって媒介される下流の経路を活性化する能力を有することを指す。本明細書では、「生物活性」は、ｔｒｋＣの未変性リガンドであるＮＴ−３のｔｒｋＣ発現細胞に対する作用によって誘発されるものと同じような、１種または複数のエフェクター機能を含む。ｔｒｋＣの「生物活性」は、下流のシグナル伝達経路、またはＮＴ−３の作用によって誘発されるものと異なるエフェクター機能も含み得る。限定するものではないが、生物活性には、次のもの、すなわち、ｔｒｋＣを結合し活性化する能力；ｔｒｋＣ受容体の二量体化を促進する能力；（損傷を受けた細胞を含む）細胞、特に、末梢（交感神経系、感覚、および腸管）ニューロンおよび中枢（脳および脊髄）ニューロンを含むｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでのニューロン、ならびにニューロンでない細胞、例えば末梢血白血球の発生、生存、機能、維持、および／または再生を促進する能力のいずれか１種または複数が含まれる。特に好ましい生物活性は、下位運動ニューロン疾患の１つまたは複数の症状を（予防を含めて）治療し、および／または下位運動ニューロンの機能を修復および／もしくは改善する能力である。
【００３８】
本明細書では、「治療」とは、有益なまたは所望の臨床的な成果を得るための手法である。本発明の目的では、有益なまたは所望の臨床的な成果には、その限りでないが、次のもの、すなわち、下位運動ニューロン疾患に関連する１種または複数の症状の軽減（例えば、下位運動ニューロンの変性、進行性の筋力低下または運動麻痺、呼吸不全、および低下する反射）；下位運動ニューロン疾患の進行を遅らせまたは緩慢にすること；下位運動ニューロンの変性を安定化する（すなわち、悪化させない）こと；下位運動ニューロンの変性および／または筋肉の脱力の回復；車いす使用の必要を遅らせること；人工呼吸の必要を遅らせること；ならびに最終的に全体としての生存時間を延長することのうちの１種または複数が含まれる。
【００３９】
下位運動ニューロン疾患または下位運動ニューロン疾患の１種または複数の症状を「軽減する」とは、本発明によるアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体による治療を受ける個体または個体集団において、疾患の望ましくない臨床病態の程度および／または時間経過を減らすことを意味する。
【００４０】
下位運動ニューロン疾患の「症状の重症度を軽減する」または下位運動ニューロン疾患の「症状を緩和させる」とは、下位運動ニューロン疾患の１つまたは複数の症状を和らげ、かつ／またはアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を投与しないものと比べて改善させることを意味する。「重症度を低減する」には、症状の期間の短縮または縮小も含まれる。
【００４１】
本明細書では、下位運動ニューロン疾患の出現を「遅らせる」とは、この疾患の出現を先送りし、妨げ、緩慢にし、遅延させ、安定化し、かつ／または延期することを意味する。この遅れは、治療対象となる疾患および／または個体の経歴に応じて様々な長さの時間となり得る。当業者には明らかなように、十分または有意な遅れは、個体が下位運動ニューロンの変性ならびに筋力低下または運動麻痺にかからないという点で、事実上予防を含む。下位運動ニューロン疾患の出現を「遅らせる」方法は、その方法を使用しないのと比べて、所与の時間枠で下位運動ニューロンの変性が出現する確率を低下させ、かつ／または所与の時間枠で下位運動ニューロンの変性の程度を低減する方法である。そのような比較は、通常は、統計学的に有意な数の対象を使用する臨床的な調査に基づく。
【００４２】
下位運動ニューロン疾患の「出現」とは、個体内での下位運動ニューロン疾患に関連する症状（例えば、下位運動ニューロン機能の低下ならびに筋力低下および運動麻痺）の発現および／または進行を意味する。出現は、本明細書に記載の標準の臨床的な技術を使用して検出可能となり得る。しかし、出現は、最初に検出不可能な場合もある疾患の進行をも指す。本発明の目的では、進行とは、この場合では、標準の神経学的検査または患者の問診によって決定され、あるいはより専門の量的試験によって決定される場合もある、疾患状態の生物学的な経過を指す。これらのより専門の量的試験には、その限りでないが、微小神経電図検査による冒されたニューロンの伝導速度の測定、専門の平衡性試験、反射試験、専門の固有受容および／または運動感覚の試験、力の試験（例えば、その限りでないが量的な筋力測定、筋電図検査、ＭＲＩを含む、筋力の臨床検査）、その限りでないが血圧コントロール試験、様々な生理的および薬理学的な刺激に対する心拍応答試験を含む自律神経機能の試験を含めることができる。例として、ＳＭＡでは、試験には、その限りでないが量的な筋力測定、筋電図検査、および／またはＭＲＩを含む筋力の臨床検査などの、運動技能および／または運動力の試験を含めることができる。「出現」には、発生、再発、および発症が含まれる。本明細書では、下位運動ニューロン疾患の「発症」または「発生」には、最初の発症および／または再発が含まれる。
【００４３】
本明細書では、「リスクのある」個体とは、下位運動ニューロン疾患が出現するリスクのある個体である。「リスクのある」個体は、検出可能な疾患にかかっていてもいなくてもよく、本明細書に記載の治療方法の前に検出可能な疾患を呈していてもいなくてもよい。「リスクのある」とは、個体が、生存運動神経細胞遺伝子（ＳＭＮ）または免疫グロブリンμ結合タンパク質２遺伝子（ＩＧＨＭＢＰ２）の突然変異などの疾患の出現と相互に関係がある測定可能なパラメータである、１種または複数のいわゆるリスクファクターを有することを意味する。これらのリスクファクターの１つまたは複数を有する個体は、これらのリスクファクターなしの個体よりも下位運動ニューロン疾患にかかる確率が高い。
【００４４】
「有効量」とは、疾患の発症を遅らせる臨床的な成果を含む、有益なまたは所望の臨床的な成果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１回または複数の投与で投与することができる。本発明の目的では、本明細書に記載のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の有効量は、下位運動ニューロン疾患を緩和させ、安定化し、逆戻りさせ、その進行を緩慢にしかつ／または遅らせ、あるいは予防するのに十分な量である。臨床的な状況の中で理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と共に実現されることもあれば、そうでないこともある。したがって、「有効量」は、１種または複数の治療薬を投与するという状況で考えることができ、１種または複数の他の薬剤と共に望ましい成果が実現される場合がありまたは実現されるならば、単剤が有効量で与えられたと考えることができる。
【００４５】
本明細書では、「共に」投与は、同時の投与および／または異なる時点での投与を含む。共に投与は、合剤（ｃｏ−ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ）としての投与または別個の組成物としての投与も含む。本明細書では、共投与は、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体および別の下位運動ニューロン疾患治療薬またはこれらの組合せが個体に投与され、それが同時および／または別々に起こり得る任意の状況を含む意味である。本明細書でさらに論述するように、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体と他の治療薬を異なる投薬回数または投薬間隔で投与できることは理解される。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体と他の治療薬を、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与できることも理解される。
【００４６】
「個体」は、哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物には、その限りでないが、飼養動物、競技動物、愛玩動物、霊長類、ウマ、乳牛、ネコ、イヌ、および（マウスやラットなどの）げっ歯類も含まれる。
【００４７】
本明細書では、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の形は、別段の指摘がない限り、複数形の言及を含む。例えば、「ａｎ」ａｎｔｉｂｏｄｙは１種または複数の抗体を含み、「ａ  ｓｙｍｐｔｏｍ」は１種または複数の症状を意味する。
【００４８】
本明細書では、「ベクター」とは、宿主細胞中で１種または複数の対象とする遺伝子または配列を放出する、好ましくは発現させることのできる構築物を意味する。ベクターの例には、その限りでないが、ウイルスベクター、裸ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン縮合剤と結合したＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、リポソーム中にカプセル封入されたＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、ならびに産生細胞などのある種の真核細胞が含まれる。
【００４９】
本明細書では、「発現制御配列」とは、核酸の転写を指示する核酸配列を意味する。発現制御配列は、構成的もしくは誘導型プロモーターなどのプロモーター、またはエンハンサーでよい。発現制御配列は、転写される核酸配列に作動可能に連結される。
【００５０】
本明細書では、「核酸」または「ポリヌクレオチド」とは、一本鎖または二本鎖の形のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指し、別段の制限がない限り、自然に存在するヌクレオチドと同様にして核酸とハイブリッド形成する天然ヌクレオチドの既知の類似体を含む。
【００５１】
本明細書では、「薬学的に許容できる担体」には、活性成分と組み合わせたとき、活性成分が生物活性を保持するのを可能にし、対象の免疫系と反応性でない任意の材料が含まれる。例には、その限りでないが、リン酸緩衝溶液、水、水中油型乳濁液などの乳濁液、および様々な種類の湿潤剤などの標準の医薬担体のいずれかが含まれる。エアロゾルまたは非経口投与用の好ましい希釈剤は、リン酸緩衝溶液または通常の（０．９％）生理食塩水である。
【００５２】
そのような担体を含む組成物は、よく知られている従来の方法によって製剤される（例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」、第１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、米ペンシルヴェニア州イーストン、１９９０年；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００年を参照されたい）。
【００５３】
本発明の方法
本明細書に記載のすべての方法に関して、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体への言及は、これらの抗体の１種または複数を含む組成物も含む。これらの組成物は、緩衝剤を含めて薬学的に許容できる賦形剤などの、当業界でよく知られている適切な賦形剤をさらに含んでもよい。
【００５４】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を使用して下位運動ニューロン疾患を治療する方法
本発明は、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を使用して、下位運動ニューロン疾患を治療し、予防し、その症状の出現を遅らせ、かつ／または軽減する方法を含む。この方法は、その必要のある個体にこれらの抗体を有効量投与するものである（様々な適応症および態様は本明細書に記載する）。有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、他の治療薬と共に投与しても、またはそれなしで投与してもよい。個体は、下位運動ニューロン疾患と診断されているものでもよいし、下位運動ニューロン疾患の出現にかかるリスクのあるものでもよい。一部の実施形態では、個体はヒトである。しかし、記載する方法は、獣医学の状況（例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどのヒトでない哺乳動物）にも適用できる。
【００５５】
ＳＭＡやＳＭＡＲＤ１などの下位運動ニューロン疾患を評価する方法およびその治療は、当業界で知られており、本明細書に記載される。
【００５６】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体
本発明の方法は、ｔｒｋＣを活性化する方法でｔｒｋＣと相互作用する抗ｔｒｋＣ抗体を使用するものである。抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体は、以下の特性のいずれか１つまたは複数を示す。すなわち、（ａ）ｔｒｋＣ受容体に結合する、（ｂ）ｔｒｋＣ受容体の１つまたは複数のエピトープに結合する、（ｃ）ｔｒｋＣ受容体に結合し、ｔｒｋＣ生物活性、またはｔｒｋＣシグナル伝達機能によって媒介される１つまたは複数の下流経路を活性化する、（ｄ）ｔｒｋＣ受容体二量体化を促進し、（ｅ）ｔｒｋＣ受容体の活性化を増大させ、（ｆ）好ましい薬物動態および生体利用度特性を示し、（ｇ）細胞の発生、生存、機能、維持、および／または再生を促進する、（ｈ）ｔｒｋＣ受容体に結合し、下位運動ニューロン疾患の１つまたは複数の症状を治療し、予防し、逆戻りさせ、または緩和させる。
【００５７】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、当業界で知られている。ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９８３６１；Ｕｒｆｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８年）第２７３巻：５８２９〜５８４０ページを参照されたい。一部の実施形態では、抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体は、抗体「Ａ５」と呼ばれるヒト化マウス抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体であり、Ａ３３０Ｐ３３１→Ｓ３３０Ｓ３３１の突然変異（アミノ酸の番号付けは野生型ＩｇＧ２ａ配列に即したＫａｂａｔの番号付けに基づく；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）第２９巻：２６１３〜２６２４ページを参照されたい）を含むヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常部；ヒト軽鎖κ定常部；ならびに表１および２に示す重鎖および軽鎖可変部を含む。
【００５８】
表１：Ａ５重鎖可変部。ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲは下線を付したイタリック体として示し、ＫａｂａｔＣＤＲは太字として示す。
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＲＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＥＩＹＰＳＮＡＲＴＮＹＮＥＫＦＫＳＲＶＴＭＴＲＤＴＳＴＳＴＶＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＫＹＹＹＧＮＴＲＲＳＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳ（配列番号１）
【００５９】
表２：Ａ５軽鎖可変部。ＫａｂａｔＣＤＲは下線を付したイタリック体として示し、ＣｈｏｔｈｉａＣＤＲは太字として示す。
【００６０】
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＥＳＩＤＮＹＧＩＳＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡＡＳＮＲＧＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＦＴＩＳＳＬＱＰＥＤＩＡＴＹＹＣＱＱＳＫＴＶＰＲＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲＴ（配列番号２）
【００６１】
Ａ５の重鎖可変部または軽鎖可変部をコードする以下のポリヌクレオチドは、アメリカ培養細胞系統保存機関、１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ、Ｍａｎａｓｓａｓ、Ｖｉｒｇｉｎｉａ、ＵＳＡ（ＡＴＣＣ）に寄託した。
【００６２】
【表１】
2008539266.tif 000002
【００６３】
ベクターＥｂ．ｐｕｒ．２２５６．Ａ５は、Ａ５軽鎖可変部をコードするポリヌクレオチドであり、ベクターＤｂ．２２５６．Ａ５は、Ａ５重鎖可変部をコードするポリヌクレオチドである。
【００６４】
他の実施形態では、抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体は、抗体Ａ５の１個または複数のＣＤＲ（Ａ５からの１、２、３、４、５個、または一部の実施形態では６個すべてのＣＤＲなど）を含む。ＣＤＲ領域の決定は、多分に当分野の技能の範囲内である。ＣＤＲを決定するいくつかの技術は次の通りである。（１）異種間の配列可変性に基づく手法（すなわち、Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（第５版、１９９１年、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、米メリーランド州ベセズダ））、（２）抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法（Ａｌ−ｌａｚｉｋａｎｉら（１９９７年）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．第２７３巻：９２７〜９４８ページ））。ＣＤＲの同定は、多分に当分野の技能の範囲内である。一部の実施形態では、ＣＤＲはＫａｂａｔＣＤＲを含む。他の実施形態では、ＣＤＲはＣｈｏｔｈｉａＣＤＲである。さらに他の実施形態では、ＣＤＲは、ＫａｂａｔおよびＣｈｏｔｈｉａ両方のＣＤＲを含む。
【００６５】
抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、Ｆｃなど）、キメラ抗体、単鎖（ＳｃＦｖ）、これらの突然変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに必要な特異性の抗原認識部位を含む他の改変された形状の免疫グロブリン分子を含み得る。抗体は、（ヒト化抗体を含めて）ネズミ、ラット、ヒト、または他の任意の起源のものでよい。したがって、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、（抗体６．４．１（ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９８３６１）などの）ヒト抗体でもよいし、または（ヒト化モノクローナル抗体Ａ５を含む）ヒト化抗体でもよい。
【００６６】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、ヒトｔｒｋＣを結合するものでよい。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、ヒトおよびげっ歯類のｔｒｋＣを結合するものでもよい。一部の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、ヒトおよびラットのｔｒｋＣを結合するものでよい。一部の実施形態では、抗ｔｒｋＣ抗体は、ヒトおよびマウスのｔｒｋＣを結合するものでよい。一実施形態では、抗体は、ヒトｔｒｋＣ細胞外ドメイン上の１つまたは複数のエピトープを認識する抗体である。別の実施形態では、抗体は、ヒトｔｒｋＣ細胞外ドメイン上の１つまたは複数のエピトープを認識するマウスまたはラット抗体である。一部の実施形態では、抗体はヒトｔｒｋＣを結合し、別の哺乳類種（一部の実施形態では脊椎動物種）からのｔｒｋＣはほとんど結合しない。一部の実施形態では、抗体は、ヒトｔｒｋＣならびに別の哺乳類種（一部の実施形態では脊椎動物種）からの１つまたは複数のｔｒｋＣを結合する。別の実施形態では、抗体は、霊長類、イヌ、ネコ、ウマ、およびウシのもののうちの１種または複数から選択されるｔｒｋＣ上の１つまたは複数のエピトープを認識する。一部の実施形態では、抗体は、ｔｒｋＣを結合し、（同類のニューロトロフィン受容体であるｔｒｋＡおよび／またはｔｒｋＢなどの）他のニューロトロフィン受容体とほとんど交差反応（結合）しない。一部の実施形態では、抗体はｔｒｋＣを結合し、さらにｔｒｋＡおよび／またはｔｒｋＢを結合する。
【００６７】
ｔｒｋＣアゴニスト抗体によって認識されるエピトープは、連続的なものでも、連続的でないものでもよい。一部の実施形態では、抗体は、６．１．２、６．４．１、２３４５、２３４９、２．５．１、２３４４、２２４８、２２５０、２２５３、および２２５６のいずれか１種または複数から選択される抗体と本質的に同じｔｒｋＣエピトープを結合する。ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９８３６１を参照されたい。抗体が向かう先となり得るエピトープの例には、その限りでないが、ｔｒｋＣのドメインＶおよび／またはドメインＩＶが含まれる。別の実施形態では、エピトープには、ヒトｔｒｋＣの残基Ｌ２８４、Ｅ２８７、およびＮ３３５のうちの１種または複数が含まれる。Ｕｒｆｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８年）第２７３巻：５８２９〜５８４０ページ）を参照されたい。さらに他の実施形態では、抗体は、免疫学的に不活性な定常部、例えば、補体によって媒介される溶解のきっかけとならず、または抗体依存性細胞によって媒介される細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激しない定常部などの、改変された定常部を含む。他の実施形態では、定常部は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）第２９巻：２６１３〜２６２４ページ；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載の通りに改変する。一部の実施形態では、定常部は、Ａ３３０Ｐ３３１→Ｓ３３０Ｓ３３１の突然変異（野生型ＩｇＧ２ａ配列に即したアミノ酸の番号付け；Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）第２９巻：２６１３〜２６２４ページを参照されたい）を含むヒト重鎖ＩｇＧ２ａ定常部を含む。
【００６８】
抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体のｔｒｋＣに対する結合親和性は、約５００ｎＭ、４００ｎＭ、３００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭのいずれかから、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、または約４０ｐＭのいずれかまでである場合がある。一部の実施形態では、結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、約５０ｐＭ、または約５０ｐＭ未満のいずれかである。一部の実施形態では、結合親和性は、約１００ｎＭ、約５０ｎＭ、約１０ｎＭ、約１ｎＭ、約５００ｐＭ、約１００ｐＭ、または約５０ｐＭ未満のいずれかである。さらに他の実施形態では、結合親和性は、約２ｐＭ、約５ｐＭ、約１０ｐＭ、約１５ｐＭ、約２０ｐＭ、約４０ｐＭ、または約４０ｐＭ超である。当業界でよく知られているように、結合親和性は、ＫＤまたは解離定数として表すことができ、結合親和性の増大は、ＫＤの低下に一致する。ＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して評価したマウス抗ｔｒｋＣアゴニストモノクローナル抗体２２５６のヒトｔｒｋＣに対する結合親和性は、約４０ｎＭであり、ＢＩＡｃｏｒｅ分析を使用して評価した（本明細書に記載の）ヒト化抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体Ａ５のヒトｔｒｋＣに対する結合親和性は、約０．２８ｎＭである。
【００６９】
抗体のｔｒｋＣに対する結合親和性を測定する１つの方法は、抗体の単機能Ｆａｂ断片の結合親和性を測定することによるものである。単機能Ｆａｂ断片を得るために、抗体（例えばＩｇＧ）をパパインで切断し、または組換えによって発現させることができる。抗体の抗ｔｒｋＣ  Ｆａｂ断片の親和性は、表面プラズモン共鳴（ＢｌＡｃｏｒｅ３０００（商標）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）システム、ＢＩＡｃｏｒｅ，ＩＮＣ、米ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｗａｙ）によって測定することができる。ＣＭ５チップは、供給元の説明書に従って、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイニド塩酸塩（ＥＤＣ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）で活性化することができる。ヒトｔｒｋＣ−Ｆｃ融合タンパク質（「ｈｔｒｋＣ」）（またはラットｔｒｋＣなどの他の任意のｔｒｋＣ）を１０ｍＭの酢酸ナトリウムｐＨ５．０に希釈し、０．０００５ｍｇ／ｍＬの濃度で活性化したチップ上に通液（ｉｎｊｅｃｔ）することができる。個々のチップチャネルでの変動する流動時間を使用して、詳細な動力学研究のための２００〜４００応答単位（ＲＵ）とスクリーニングアッセイのための５００〜１０００ＲＵの２通りの範囲の抗原密度を実現することができる。チップは、エタノールアミンでブロックすることができる。再生研究では、Ｐｉｅｒｃｅ溶離緩衝液（製品番号２１００４、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、米イリノイ州ロックフォード）と４Ｍ  ＮａＣｌ（２：１）の混合物が、２００回を超える通液の間チップ上のｈｔｒｋＣの活性を保ちながら、結合したＦａｂを効果的に除去することが示されている。ＨＢＳ−ＥＰ緩衝液（０．０１ＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．１５のＮａＣｌ、３ｍＭのＥＤＴＡ、０．００５％のＳｕｒｆａｃｔａｎｔＰ２０）をＢＩＡｃｏｒｅアッセイ用の実施緩衝液として使用する。精製したＦａｂサンプルの段階希釈物（推定されるＫＤの０．１〜１０倍）を１００μＬ／分で１分間かけて通液し、最長で２時間の解離時間を与える。Ｆａｂタンパク質の濃度は、（アミノ酸分析によって測定した）既知の濃度のＦａｂを標準として使用するＥＬＩＳＡおよび／またはＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動によって測定する。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎプログラムを使用してデータを１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに当てはめることによって（Ｋａｒｌｓｓｏｎ，Ｒ．、Ｒｏｏｓ，Ｈ．、Ｆａｇｅｒｓｔａｍ，Ｌ．、Ｐｅｔｅｒｓｓｏｎ，Ｂ．（１９９４年）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第６巻：９９〜１１０ページ）、動力学的な結合速度（ｋｏｎ）と解離速度（ｋｏｆｆ）を同時に得る。平衡解離定数（ＫＤ）値をｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。
【００７０】
別の態様では、ヒトｔｒｋＣ受容体を活性化することのできる（例えば、ヒト、ヒト化、マウス、キメラの）抗体は、ｔｒｋＣの１つまたは複数の細胞外ドメインを発現する免疫原を使用して生成することもできる。免疫原の一例は、ｔｒｋＣを高度に発現する細胞であり、本明細書に記載の通りに得ることができる。使用することのできる免疫原の別の例は、ｔｒｋＣ受容体の細胞外ドメインまたは細胞外ドメインの部分を含む（ｔｒｋＣイムノアドヘシンなどの）可溶性タンパク質である。
【００７１】
宿主動物を免疫化する経路およびスケジュールは一般に、本明細書でさらに記載する、抗体の刺激および生成のための確立した技術および従来の技術に合わせることにある。ヒトおよびマウス抗体を生成するための一般技術は、当業界で知られており、本明細書に記載されている。
【００７２】
ヒトを含む任意の哺乳類対象またはその抗体産生細胞は、ヒトを含む哺乳類のハイブリドーマ細胞系を生成する基盤として役立つように操作することができると予想される。通常は、宿主動物に、本明細書に記載のものを含むある量の免疫原を腹腔内接種する。
【００７３】
ハイブリドーマは、Ｋｏｈｌｅｒ，Ｂ．およびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｃ．（１９７５年）、Ｎａｔｕｒｅ第２５６巻：４９５〜４９７ページの一般の体細胞ハイブリッド形成技術を使用して、またはＢｕｃｋ，Ｄ．Ｗ．ら（１９８２年）、Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、第１８巻：３７７〜３８１ページによって変更されている通りに、リンパ球および不死化した骨髄腫細胞から調製することができる。その限りでないが、Ｘ６３−Ａｇ８．６５３、およびＳａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ、米カリフォルニア州サンディエゴからのものを含めて、入手可能な骨髄腫系統をハイブリッド形成で使用することができる。一般に、この技術は、ポリエチレングリコールなどの融合源（ｆｕｓｏｇｅｎ）を使用して、または当業界でよく知られている電気的な手段によって骨髄腫細胞とリンパ球を融合させるものである。融合させた後、細胞を融合培地から分離し、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的な増殖培地で増殖させて、ハイブリッド形成していない親細胞を排除する。モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマの培養には、血清を補充し、または補充しない本明細書に記載の培地のいずれかを使用することができる。細胞融合技術の別の選択肢として、ＥＢＶによって不死化したＢ細胞を使用して、本発明の抗ｔｒｋＣモノクローナル抗体を生成することができる。ハイブリドーマを拡張させ、所望ならばサブクローニングし、従来のイムノアッセイ手順（例えば、放射性免疫測定法、酵素免疫測定法、または蛍光免疫測定法）によって抗免疫原活性があるかどうか上清を検定する。
【００７４】
抗体供給源として使用することのできるハイブリドーマとは、ｔｒｋＣまたはその部分に特異的なモノクローナル抗体を産生するすべての派生物、すなわち親ハイブリドーマの子孫細胞を含む。
【００７５】
そのような抗体を産生するハイブリドーマは、知られている手順を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで増殖させることができる。モノクローナル抗体は、所望ならば、硫安塩析、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、限外ろ過などの従来の免疫グロブリン精製手順によって培地または体液から単離してもよい。所望でない活性が存在するならば、例えば、固相に結合している免疫原でできた吸着剤上での調製を実施し、所望の抗体を免疫原から溶離または解放することによって除去できる。ヒトもしくは他の種のｔｒｋＣ受容体またはヒトもしくは他の種のｔｒｋＣ受容体の断片、あるいは免疫化する種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシのサイログロブリン、または大豆トリプシンインヒビターに、二官能性または誘導体化の薬剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介して結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を介して）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用して結合させたターゲットアミノ酸配列を含むヒトまたは他の種のｔｒｋＣ受容体または断片で宿主動物を免疫化すると、抗体の集団（例えばモノクローナル抗体）を得ることができる。免疫原の別の例は、ｔｒｋＣを高度に発現する細胞であり、これは、組換えの手段によって、あるいは高レベルのｔｒｋＣを発現する天然供給源から細胞を単離または濃縮して得ることができる。これらの細胞は、ヒトまたは他の動物に由来するものでよく、直接に単離された免疫原として使用してもよいし、または免疫原性が増大し、または（ｔｒｋＣ断片の）ｔｒｋＣの発現が増加しもしくは濃縮されるように処理してもよい。その処理には、その限りでないが、細胞またはその断片を、例えばホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、エタノール、アセトン、および／または様々な酸などの、その安定性または免疫原性を増大させるように設計された薬剤で処理することが含まれる。さらに、このような処理の前または後に、所望の免疫原、この場合ではｔｒｋＣまたはその断片を濃縮するため、細胞の処理を行ってもよい。これらの処理ステップには、当業界でよく知られている膜分画法が含まれる。
【００７６】
所望ならば、目的の抗ｔｒｋＣ抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）の配列を決定してもよく、次いでポリヌクレオチド配列をベクターにクローン化して発現または増殖させてもよい。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクターの中で維持することができ、次いで将来の使用に向けて宿主細胞を拡張させ、凍結することができる。別法として、抗体を「ヒト化」し、または抗体の親和性もしくは他の特性を向上させるために、ポリヌクレオチド配列を遺伝子操作に使用してもよい。例えば、抗体をヒトの臨床試験および治療で使用するならば、定常部をヒト定常部により似るように操作して、免疫応答を回避する場合もある。抗体配列を遺伝子操作して、ｔｒｋＣ受容体に対するより強い親和性およびｔｒｋＣ受容体の活性化におけるより高い有効性を得ることが望ましい場合もある。抗ｔｒｋＣ抗体のポリヌクレオチドに１つまたは複数の変更が加えられても、ｔｒｋＣ細胞外ドメインまたはｔｒｋＣエピトープへのその結合能力が維持され得ることは、当業者には明白であろう。
【００７７】
モノクローナル抗体をヒト化するには、大まかな４ステップを踏む。すなわち、（１）出発抗体の軽鎖および重鎖可変ドメインのヌクレオチドおよび推定されるアミノ酸配列を決定するステップ、（２）ヒト化抗体を設計する、すなわち、ヒト化処理の際にどちらの抗体フレームワーク領域を使用するかを決定するステップ、（３）実際のヒト化方法／技術のステップ、および（４）ヒト化抗体の形質移入および発現のステップ。例えば、米国特許第４８１６５６７号、同第５８０７７１５号、同第５８６６６９２号、同第６３３１４１５号、同第５５３０１０１号、同第５６９３７６１号、同第５６９３７６２号、同第５５８５０８９号、同第６１８０３７０号、および同第６５４８６４０号を参照されたい。例えば、抗体をヒトの臨床試験および治療で使用するならば、定常部をヒト定常部により似るように操作して、免疫応答を回避する場合もある。例えば、米国特許第５９９７８６７号および同第５８６６６９２号を参照されたい。
【００７８】
組換えヒト化抗体では、Ｆｃγ部分を変更して、Ｆｃγ受容体および補体免疫系との相互作用を回避することができる。この種類の変更は、ケンブリッジ大学Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ＰａｔｈｏｌｏｇｙのＭｉｋｅ  Ｃｌａｒｋ博士によって設計されたものであり、その抗体を調製する技術は、１９９９年１１月１８日公開のＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２に記載されている。
【００７９】
ヒト定常ドメインと融合させたげっ歯類可変部または改変されたげっ歯類可変部ならびにそれに伴う相補性決定領域（ＣＤＲ）を有するキメラ抗体を含めて、非ヒト免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を含むいくつかの「ヒト化」抗体分子が記載されている。例えば、Ｗｉｎｔｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ第３４９巻：２９３〜２９９ページ（１９９１年）、Ｌｏｂｕｇｌｉｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８６巻：４２２０〜４２２４ページ（１９８９年）、Ｓｈａｗら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１３８巻：４５３４〜４５３８ページ（１９８７年）、およびＢｒｏｗｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第４７巻：３５７７〜３５８３ページ（１９８７年）を参照されたい。他の参考文献は、適切なヒト抗体定常ドメインと融合させる前にヒト支持フレームワーク領域（ＦＲ）に接ぎ合わせたげっ歯類ＣＤＲについて述べている。例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、Ｎａｔｕｒｅ第３３２巻：３２３〜３２７ページ（１９８８年）、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２３９巻：１５３４〜１５３６ページ（１９８８年）、およびＪｏｎｅｓら、Ｎａｔｕｒｅ第３２１巻：５２２〜５２５ページ（１９８６年）を参照されたい。別の参考文献は、組換えによって張り合わせたげっ歯類フレームワーク領域を支持体とするげっ歯類ＣＤＲについて述べている。例えば、欧州特許公開第５１９５９６号を参照されたい。これらの「ヒト化」分子は、ヒトレシピエントの治療にこれらの部分を適用する期間および有効性を制限する、げっ歯類抗ヒト抗体分子に対する不必要な免疫応答を最小限に抑えるように設計される。抗体定常部は、免疫学的に不活性になるように、例えば、補体によって媒介される溶解のきっかけとならず、抗体依存性の細胞によって媒介される細胞傷害性（ＡＤＣＣ）を刺激しないように操作することができる。他の実施形態では、定常部は、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９９年）第２９巻：２６１３〜２６２４ページ；ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／または英国特許出願第９８０９９５１．８号に記載の通りに改変する。例えば、ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；英国特許出願第９８０９９５１．８号を参照されたい。利用することのできる、抗体をヒト化する他の方法は、Ｄａｕｇｈｅｒｔｙら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１９巻：２４７１〜２４７６ページ（１９９１年）および米国特許第６１８０３７７号、同第６０５４２９７号、同第５９９７８６７号、同第５８６６６９２号、同第６２１０６７１号、同第６３５０８６１号、およびＰＣＴ公開ＷＯ０１／２７１６０号で開示されている。
【００８０】
さらに別の選択肢では、特異的なヒト免疫グロブリンタンパク質を発現させるように操作された市販のマウスを使用して、完全なヒト抗体を得ることもできる。より望ましい（例えば、完全なヒト抗体）またはより強固な免疫応答を生み出すように設計されたトランスジェニック動物を、ヒト化抗体またはヒト抗体の産生に使用してもよい。そのような技術の例は、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（米カリフォルニア州フリーモント）のＸｅｎｏｍｏｕｓｅ（商標）ならびにＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（登録商標）およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．（米ニュージャージー州プリンストン）のＴＣ  Ｍｏｕｓｅ（商標）である。
【００８１】
別法では、抗体を組換えによって生成し、当業界で知られている任意の方法を使用して発現させることができる。別の選択肢では、抗体をファージディスプレイ技術によって組換えで生成することができる。例えば、米国特許第５５６５３３２号、同第５５８０７１７号、同第５７３３７４３号、および同第６２６５１５０号、およびＷｉｎｔｅｒら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１２巻：４３３〜４５５ページ（１９９４年）を参照されたい。別法として、ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、Ｎａｔｕｒｅ第３４８巻：５５２〜５５３ページ（１９９０年））を使用すると、未免疫ドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーからｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体断片を生成することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３やｆｄなどの糸状のバクテリオファージの主要または非主要外殻タンパク質遺伝子にインフレームでクローン化し、ファージ粒子表面上に機能性の抗体断片として提示する。糸状の粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能の特性に基づく選択は、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択ともなる。したがって、ファージは、Ｂ細胞の特性の一部を模倣する。ファージディスプレイは、様々な形式で実施することができ、総説については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ第３巻、５６４〜５７１ページ（１９９３年）を参照されたい。いくつかのＶ遺伝子区域供給源をファージディスプレイに使用することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ第３５２巻：６２４〜６２８ページ（１９９１年）は、免疫感作されたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模のランダムなコンビナトリアルライブラリーから、多様な並び方の抗オキサゾロン抗体を単離した。本質的にマークら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２２２巻：５８１〜５９７ページ（１９９１年）またはＧｒｉｆｆｉｔｈら、ＥＭＢＯ  Ｊ．第１２巻：７２５〜７３４ページ（１９９３年）に記載の技術に従って、未免疫のヒトドナーからの一レパートリーのＶ遺伝子を構築することができ、多様なアレイの抗原に対する抗体（自己抗原を含む）を単離することができる。自然の免疫応答では、抗体遺伝子は、高い比率で突然変異を蓄積する（体細胞突然変異）。導入される変化の一部は、より高い親和性を付与することになり、高親和性の表面免疫グロブリンを示すＢ細胞は、その後の抗原による攻撃の際に優先的に複製され、分化する。この自然の過程は、「鎖シャフリング」として知られている技術を使用して模倣することができる。Ｍａｒｋｓら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌ．第１０巻：７７９〜７８３ページ（１９９２年）。この方法では、重鎖および軽鎖可変部遺伝子を、未免疫のドナーから得られたＶドメイン遺伝子の（レパートリー）の自然に存在する変異体のレパートリーと順次交換することによって、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改良することができる。この技術は、ｐＭ〜ｎＭの範囲で親和性を有する抗体および抗体断片の��成を可能にする。（「すべてのライブラリーの母なるもの」としても知られている）非常に大きなファージ抗体レパートリーを作製する戦略は、Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第２１巻：２２６５〜２２６６ページ（１９９３年）に記載されている。遺伝子シャフリングを使用して、げっ歯類抗体から、その出発げっ歯類抗体に対して同様の親和性および特異性を有するヒト抗体を得ることもできる。「エピトープインプリンティング」とも呼ばれるこの方法によれば、ファージディスプレイ技術によって得られたげっ歯類抗体の重鎖または軽鎖Ｖドメイン遺伝子が、ヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーと交換され、げっ歯類−ヒトキメラが作り出される。抗原上での選択により、機能性の抗原結合部位を回復させることのできるヒト可変部が単離される、すなわち、エピトープがパートナーの選択を支配（刷り込み）する。この過程を繰り返して残りのげっ歯類Ｖドメインを交換すると、ヒト抗体が得られる（１９９３年４月１日公開のＰＣＴ公開ＷＯ９３／０６２１３を参照されたい）。ＣＤＲ移植によるげっ歯類抗体の伝統的なヒト化とは異なって、この技術は、げっ歯類由来のフレームワークまたはＣＤＲ残基をもたない完全にヒトの抗体を提供する。上記論述はヒト化抗体に関係するものであるが、論述した一般原理が、例えばイヌ、ネコ、霊長類、ウマ、およびウシで使用するための抗体のカスタマイズに適用できることは言うまでもない。
【００８２】
抗体は、二重特異性抗体、すなわち、少なくとも２種の異なる抗原に対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である場合もあり、本明細書で開示する抗体を使用して調製することができる。二重特異性抗体の生成方法は、当業界で知られている（例えば、Ｓｕｒｅｓｈら、１９８６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ第１２１巻：２１０ページを参照されたい）。伝統的に、二重特異性抗体の組換え生成は、２種の重鎖が異なる特異性を有する２種の免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の同時発現に基づくものであった（ＭｉｌｌｓｔｅｉｎおよびＣｕｅｌｌｏ、１９８３年、Ｎａｔｕｒｅ第３０５巻、５３７〜５３９ページ）。
【００８３】
二重特異性抗体を生成する１つの手法によれば、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン（抗体−抗原合体部位）を、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。ヒンジ、ＣＨ２、およびＣＨ３領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインと融合させることが好ましい。第１の重鎖定常部（ＣＨ１）が、融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含むことが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物、および所望ならば免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡを、別個の発現ベクターに挿入し、適切な宿主生物に同時形質移入する。これは、その構築で使用される３種のポリペプチド鎖の不均等な割合が最適な収率をもたらすとき、実施形態の３種のポリペプチド断片の相互の割合の調整において高い柔軟性をもたらす。しかし、同等の割合の少なくとも２種のポリペプチド鎖の発現が高い収率をもたらすとき、またはその割合が特定の意味をもたないものであるとき、１つの発現ベクター中に２種または３種すべてのポリペプチド鎖のコード配列を挿入することは可能である。
【００８４】
１つの手法では、二重特異性抗体は、一方の腕の第１の結合特異性を有するハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方の腕のハイブリッド免疫グロブリン重鎖−軽鎖対（第２の結合特異性をもたらす）から構成される。二重特異性の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないこの非対称の構造は、望ましくない免疫グロブリン鎖の組合せからの所望の二重特異性化合物の分離を容易にする。この手法は、１９９４年３月３日公開のＰＣＴ公開ＷＯ９４／０４６９０に記載されている。
【００８５】
共有結合によって結合した２種の抗体を含むヘテロコンジュゲート抗体も、本発明の範囲内である。そのような抗体は、免疫系細胞を望ましくない細胞に向けること（米国特許第４６７６９８０号）、およびＨＩＶ感染の治療（ＰＣＴ公開ＷＯ９１／００３６０およびＷＯ９２／２００３７３、ならびにＥＰ０３０８９）に使用されている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の好都合な架橋結合法を使用して作製することができる。適切な架橋剤および技術は、当業界でよく知られており、米国特許第４６７６９８０号に記載されている。
【００８６】
抗体は、最初に宿主動物から作られた抗体を単離し、遺伝子配列を得、その遺伝子配列を使用して宿主細胞（例えばＣＨＯ細胞）中で組換えによって抗体を発現させることで、組換えで作製することができる。使用することのできる別の方法は、植物（例えばタバコ）、トランスジェニック乳汁、または他の生物において抗体配列を発現させることである。植物または乳汁において抗体を組換え発現させる方法は開示されている。例えば、Ｐｅｅｔｅｒｓら（２００１年）、Ｖａｃｃｉｎｅ第１９巻：２７５６ページ；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．およびＤ．Ｈｕｓｚａｒ（１９９５年）、Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ第１３巻：６５ページ；およびＰｏｌｌｏｃｋら（１９９９年）、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ第２３１巻：１４７ページを参照されたい。例えばヒト化、単鎖などの抗体派生物を生成する方法は、当業界で知られている。
【００８７】
キメラまたはハイブリッド抗体も、架橋剤を使用するものを含む既知の合成タンパク質化学の方法を使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで調製することができる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用して、またはチオエーテル結合を形成して、免疫毒素を構築することができる。この目的に適する試薬の例には、イミノチオラートおよびメチル−４−メルカプトブチルイミダートが含まれる。
【００８８】
単鎖Ｆｖ断片も、Ｉｌｉａｄｅｓら、１９９７年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、第４０９巻：４３７〜４４１ページに記載されているように生成することができる。様々なリンカーを使用するそのような単鎖断片の結合は、Ｋｏｒｔｔら、１９９７年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、第１０巻：４２３〜４３３ページに記載されている。組換え産生および抗体の操作のための様々な技術は、当業界でよく知られている。
【００８９】
抗体は、１９９９年１１月１８日公開のＰＣＴ公開ＷＯ９９／５８５７２号に記載の通りに改変することができる。これらの抗体は、標的分子に向けられる結合ドメインに加え、ヒト免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの全部または一部と実質的に相同であるアミノ酸配列を有するエフェクタードメインを含む。これらの抗体は、著しい補体依存性の溶解または細胞性の標的の破壊を誘発することなく、標的分子を結合することができる。エフェクタードメインは、ＦｃＲｎおよび／またはＦｃγＲＩＩｂを特異的に結合し得ることが好ましい。これらは通常、２種以上のヒト免疫グロブリン重鎖ＣＨ２ドメインから得られるキメラドメインに基づくものである。このようにして改変された抗体は、長期にわたる抗体療法で使用して、従来の抗体療法に対する炎症性および他の副作用を回避するのに好ましい。
【００９０】
宿主動物の免疫化によってまたは組換えによって生成される抗体は、次の特性のいずれか１つまたは複数を示すべきである。すなわち、（ａ）ｔｒｋＣ受容体に結合する、（ｂ）ｔｒｋＣ受容体の１つまたは複数のエピトープに結合する、（ｃ）ｔｒｋＣ受容体に結合し、ｔｒｋＣの生物活性、またはｔｒｋＣシグナル伝達機能に媒介される１つまたは複数の下流の経路を活性化する、（ｄ）ｔｒｋＣ受容体の二量体化を促進する、（ｅ）ｔｒｋＣ受容体の活性化を増大させる、（ｆ）好ましい薬物動態および生体利用度特性を示す、（ｇ）細胞の発生、生存、機能、維持、および／または再生を促進する、（ｈ）ｔｒｋＣ受容体に結合し、下位運動ニューロン疾患の１つまたは複数の症状を治療し、予防し、逆戻りさせ、または緩和させる。
【００９１】
イムノアッセイ、およびｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ（ＦＡＣＳ）などのフローサイトメトリー選別技術を使用すると、ｔｒｋＣに特異的な抗体を単離することもできる。
【００９２】
抗体は、多くの異なる担体に結合させることができる。担体は、活性のあるものおよび／または不活性なものでよい。よく知られた担体の例には、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、ガラス、天然および改変型のセルロース、ポリアクリルアミド、アガロース、ならびに磁鉄鉱が含まれる。担体の性質は、本発明の目的では可溶性または不溶性のどちらでもよい。当業者ならば、抗体の結合に適する他の担体について知っており、または常法通りの実験を使用してそれを突き止めることができるであろう。
【００９３】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体をコードするＤＮＡは、当業界で知られているように配列決定することができる。ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９８３６１を参照されたい。一般に、モノクローナル抗体は、従来の手順を使用して（例えば、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することのできるオリゴヌクレオチドプローブを使用して）容易に単離および配列決定がなされる。ハイブリドーマ細胞は、そのようなｃＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。単離されたなら、ＤＮＡは、（ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２で開示されている発現ベクターなどの）発現ベクター中に入れ、次いでそれを、別に免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、骨髄腫細胞などの宿主細胞に形質移入して、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を実現することができる。例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ８７／０４４６２を参照されたい。ＤＮＡは、例えば、相同のネズミ配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を用いて（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．第８１巻：６８５１ページ（１９８４年））、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部もしくは一部に免疫グロブリンコード配列を共有結合によって連結して、改変することもできる。そのようにして、本明細書では、抗ｔｒｋＣモノクローナル抗体の結合特異性を有する「キメラ」または「ハイブリッド」抗体が調製される。（その抗原結合断片などの）アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体をコードするＤＮＡは、ここに記載するような、所望の細胞におけるアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の送達および発現に使用することもできる。ＤＮＡ送達技術については、本明細書でさらに記載する。
【００９４】
抗ｔｒｋＣ抗体は、当業界でよく知られている方法を使用して特徴付けることができる。例えば、１つの方法は、それが結合するエピトープを同定することであり、例えば、ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、「Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、第１１章、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米ニューヨーク州コールドスプリング港、１９９９年に記載されているように、抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子断片発現アッセイ、および合成ペプチドに基づくアッセイがこれに含まれる。追加の例では、エピトープマッピングを使用して、抗ｔｒｋＣ抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープマッピングは、様々な供給元、例えば、Ｐｅｐｓｃａｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｅｄｅｌｈｅｒｔｗｅｇ  １５、８２１９  ＰＨ  Ｌｅｌｙｓｔａｄ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）からの市販品を利用することができる。エピトープは、線形のエピトープ、すなわち、一続きのアミノ酸中に含まれるものである場合もあり、または必ずしも一続きの中に含まれなくてもよい、アミノ酸の三次元の相互作用によって形成される高次構造的なエピトープである場合もある。様々な長さ（例えば少なくとも４〜６アミノ酸長）のペプチドを単離し、または（例えば組換えによって）合成し、抗ｔｒｋＣ抗体との結合アッセイに使用することができる。別の例では、ｔｒｋＣ細胞外配列由来のオーバーラップペプチドを使用し、抗ｔｒｋＣ抗体による結合を判定する系統的なスクリーニングにおいて抗ｔｒｋＣ抗体が結合するエピトープを決定することができる。遺伝子断片発現アッセイによれば、ｔｒｋＣをコードするオープンリーディングフレームを、無作為に、または特異的な遺伝子構築物によって分断し、発現されるｔｒｋＣ断片と試験される抗体との反応性を測定する。遺伝子断片は、例えば、ＰＣＲによって生成し、次いで、放射性アミノ酸の存在下、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでタンパク質へと転写、翻訳することができる。次いで、放射標識されたｔｒｋＣ断片への抗体の結合を、免疫沈殿法およびゲル電気泳動によって測定する。ある種のエピトープは、ファージ粒子表面上に示されるランダムなペプチド配列の大規模なライブラリー（ファージライブラリー）を使用して同定することもできる。
【００９５】
抗ｔｒｋＣ抗体の特徴付けに使用することのできるさらに別の方法は、同じ抗原、すなわちｔｒｋＣ細胞外ドメインに結合することがわかっている他の抗体との競合アッセイを使用して、抗ｔｒｋＣ抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを判定することである。競合アッセイは、当業者によく知られている。競合アッセイにおいて有用な抗体の例には、抗体６．１．２、６．４．１、２３４５、２３４９、２．５．１、２３４４、２２４８、２２５０、２２５３、および２２５６が含まれる。ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９８３６１を参照されたい。
【００９６】
ドメインスワップ突然変異体を使用して、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／９８３６１に記載の通りにエピトープマッピングを実施してもよい。一般に、この手法は、ｔｒｋＡまたはｔｒｋＢとほとんど交差反応しない抗ｔｒｋＣ抗体に有用である。ｔｒｋＣのドメインスワップ突然変異体は、ｔｒｋＣの細胞外ドメインをｔｒｋＢまたはｔｒｋＡの対応するドメインと交換して作製することができる。ＥＬＩＳＡまたは当業界で知られている他の方法を使用して、各アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の様々なドメインスワップ突然変異体への結合を評価し、その野生型（未変性）ｔｒｋＣへの結合と比較することができる。別の手法では、アラニン走査を実施することができる。抗原、すなわちｔｒｋＣ受容体の個々の残基を、意図的に別のアミノ酸（通常はアラニン）に突然変異させ、ＥＬＩＳＡまたは当業界で知られている他の方法を使用して、その改変ｔｒｋＣの抗体への結合能を試験することによって、その変化の影響を評価する。
【００９７】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の同定
アゴニスト抗体は、以下の方法の１つまたは複数を含む業界で認められている方法を使用して同定することができる。例えば、米国特許第５７６６８６３号および同第５８９１６５０号に記載されているキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイを使用することができる。このＥＬＩＳＡ型アッセイは、受容体タンパク質チロシンキナーゼ（ｒＰＴＫ、例えばｔｒｋ受容体）のキナーゼドメインの自己リン酸化を測定することによるキナーゼ活性化の定性的または定量的な測定、ならびに選択されたｒＰＴＫの有望なアゴニストまたはアンタゴニストの同定および特徴付けに適する。アッセイの第１期は、キナーゼ受容体、この場合では真核細胞の細胞膜に存在するｔｒｋＣ受容体のキナーゼドメインのリン酸化を含む。受容体は、内因性の受容体または受容体をコードする核酸でもよいし、受容体構築物を細胞に入れて形質転換してもよい。通常、第１の固相（例えば、第１のアッセイプレートのウェル）を、そのような細胞（普通は哺乳動物細胞系）の実質的に均一な集団でコートして、細胞が固相に付着するようにする。細胞はしばしば接着性であり、そのために自然に第１の固相に付着する。「受容体構築物」を使用する場合、通常これは、キナーゼ受容体とｆｌａｇポリペプチドの融合物を含む。ｆｌａｇポリペプチドは、アッセイのＥＬＩＳＡの部分で捕捉剤、しばしば捕捉抗体によって認識される。次いで、候補アゴニストなどの分析物を、付着細胞を有するウェルに加えて、チロシンキナーゼ受容体（例えばｔｒｋＣ受容体）が、分析物にさらされる（または分析物と接触する）ようにする。このアッセイは、目的のチロシンキナーゼ受容体（例えばｔｒｋＣ）のアゴニストリガンドの同定を可能にするものである。分析物にさらした後、（その中に可溶化洗浄剤を含む）溶解緩衝液を使用して付着細胞を可溶化し、穏やかに攪拌し、それによって細胞可溶化物を放出させ、それを細胞可溶化物の濃縮または清澄の必要なしに直接にアッセイのＥＬＩＳＡ部分にかけることができる。
【００９８】
このように細胞可溶化物を調製し、次いでアッセイのＥＬＩＳＡステージにかける準備をする。ＥＬＩＳＡ段階の第１ステップとして、第２の固相（通常ＥＬＩＳＡマイクロタイタープレートのウェル）を、チロシンキナーゼ受容体、または受容体構築物の場合ではｆｌａｇポリペプチドに特異的に結合する捕捉剤（しばしば捕捉抗体）でコートする。第２の固相のコーティングは、捕捉剤が第２の固相に付着するように実施する。捕捉剤は、一般にモノクローナル抗体であるが、本明細書で実施例に記載するように、ポリクローナル抗体または他の薬剤を使用してもよい。次いで得られる細胞可溶化物を付着性の捕捉剤にさらし、またはそれと接触させて、受容体または受容体構築物が第２の固相に付着する（またはそれに捕捉される）ようにする。次いで、捕捉された受容体または受容体構築物を残して非結合の細胞可溶化物を除去するように洗浄ステップを実施する。次いで、付着しまたは捕捉された受容体または受容体構築物を、チロシンキナーゼ受容体中のリン酸化されたチロシン残基を同定する抗ホスホチロシン抗体にさらし、または接触させる。好ましい実施形態では、抗ホスホチロシン抗体を、非放射性呈色試薬の色調変化を触媒する酵素に（直接または間接的に）結合させる。したがって、受容体のリン酸化は、その後の試薬の色調変化によって測定することができる。酵素は、抗ホスホチロシン抗体に直接に結合することもでき、または結合性の分子（例えばビオチン）を抗ホスホチロシン抗体に結合し、その後酵素をその結合性の分子を介して抗ホスホチロシン抗体に結合することもできる。最後に、捕捉された受容体または受容体構築物への抗ホスホチロシン抗体の結合を、例えば呈色試薬の色調変化によって測定する。
【００９９】
最初の同定の後、候補抗体のアゴニスト活性は、標的指向化された生物活性を試験することが知られているバイオアッセイによってさらに確認し、さらに正確にすることができる。例えば、抗ｔｒｋＣモノクローナル抗体がｔｒｋＣのアゴニストになる能力を、全長ヒトｔｒｋＣを形質移入したＰＣ１２細胞を使用するＰＣ１２神経突起伸長アッセイで試験することができる（Ｕｒｆｅｒら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．第３６巻：４７７５〜４７８１ページ（１９９７年）；Ｔｓｏｕｌｆａｓら、Ｎｅｕｒｏｎ第１０巻：９７５〜９９０ページ（１９９３年））。このアッセイは、適切なリガンドによる刺激に応答したラット好チトクロム腫（ｐｈｅｏｃｙｔｏｃｈｒｏｍａ）細胞（ＰＣ１２）による神経突起伸長の過程を測定するものである。これらの細胞は、内因性のｔｒｋＡを発現し、したがってＮＧＦに応答する。しかし、これらの細胞は、内因性のｔｒｋＣを発現せず、したがって、ｔｒｋＣアゴニストに対する応答を誘発するためにｔｒｋＣ発現構築物を形質移入する。形質移入された細胞を抗ｔｒｋＣ抗体と共にインキュベートした後、神経突起の伸長を測定、例えば、細胞の直径の２倍を超える神経突起を有する細胞をカウントする。形質移入されたＰＣ１２細胞において神経突起の伸長を刺激する抗ｔｒｋＣ抗体は、ｔｒｋＣアゴニスト活性を実証するものである。
【０１００】
ｔｒｋＣの活性化は、胚発生の特定の段階にある様々な特定のニューロンを使用して判定することもできる。適切に選択したニューロンの生存は、ｔｒｋＣの活性化に応じて決まる場合があり、これらのニューロンのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの生存に従ってｔｒｋＣの活性化を測定することが可能である。候補抗体がｔｒｋＣを活性化するならば、適切なニューロンの初代培養物に候補抗体を加えると、これらのニューロンが少なくとも数日間生存するようになる。これによって、候補抗体がｔｒｋＣを活性化する能力の判定が可能になる。この種類のアッセイの一例では、Ｅ１１マウス胎仔の三叉神経節を解剖し、分離し、得られるニューロンを低い密度で組織培養皿に播く。次いで、候補抗体を培地およびプレートに加え、２４〜４８時間インキュベートする。その後、ニューロンの生存を様々な方法のいずれかによって評価する。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を加えたサンプルは通常、対照抗体を加えたサンプルよりも増大した生存率を示し、これによってアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の存在を判定することができる。例えば、Ｂｕｃｈｍａｎら（１９９３年）、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ第１１８巻（３）：９８９〜１００１ページを参照されたい。
【０１０１】
アゴニスト抗体は、自然にまたはｔｒｋＣをコードするＤＮＡを形質移入した後にｔｒｋＣを発現する様々な細胞型において下流のシグナル伝達を活性化するその能力によって同定することができる。そのｔｒｋＣは、ヒトまたは（げっ歯類や霊長類などの）他の哺乳類のｔｒｋＣでよい。下流のシグナルカスケードは、タンパク質のタンパク質発現またはタンパク質リン酸化のレベルなどの、ｔｒｋＣ発現細胞の様々な生化学的または生理学的パラメータへの変化、あるいは（本明細書に記載するようなニューロンの生存および／または神経突起の伸長を含む）細胞の代謝的状態または増殖状態への変化によって検出することができる。関連する生化学的または生理学的パラメータの検出方法は、当業界で知られている。
【０１０２】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の様々な製剤を投与に使用することができる。一部の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を希釈せずに投与する場合もある。一部の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、薬学的に許容できる賦形剤を含む組成物にして投与する。薬学的に許容できる賦形剤は、当業界で知られており、薬理学的に有効な物質の投与を容易にする比較的不活性な物質である。例えば、賦形剤は、形または稠性を与えることができ、または希釈剤として働く。適切な賦形剤には、その限りでないが、安定剤、湿潤剤および乳化剤、様々なモル浸透圧濃度にするための塩、カプセル化剤、緩衝剤、ならびに皮膚浸透性改善剤が含まれる。非経口および非経口でない薬物送達のための賦形剤ならびに製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ、「Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ（２０００年）に記載されている。
【０１０３】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、注射（例えば、腹腔内、静脈内、皮下、筋肉内など）による投与向けに製剤することができる。したがって、抗体は、生理食塩水、リンガー液、デキストロース溶液などの薬学的に許容できる媒体と組み合わせることができる。特定の投与計画、すなわち、投与量、タイミング、および繰返しは、特定の個体およびその個体の治療歴に応じて決まることになる。一般に、約１ｕｇ／ｋｇ体重未満、少なくとも約１ｕｇ／ｋｇ体重；少なくとも約２ｕｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｕｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｕｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２０ｕｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５０ｕｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１００ｕｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２００ｕｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５００ｕｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１０ｍｇ／ｋｇ体重、少なくとも約３０ｍｇ／ｋｇ体重、またはこれより多い量（約５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約５００ｍｇ／ｋｇなど）の投与量が投与される。
【０１０４】
半減期などの経験に基づく考慮事項は、一般に投与量決定の一因となる。ヒト化抗体や完全ヒト抗体などのヒト免疫系と適合性のある抗体を使用すると、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されないようにすることができる。投与の頻度は、治療の過程で決定し調整することができ、一般に、必ずしもそうでないが、患者におけるアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の有効濃度の維持、ならびに下位運動ニューロン疾患の１つまたは複数の症状の抑制および／または回復および／または遅延に基づくものである。別法として、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の持続型の連続放出製剤が適切な場合もある。持続放出を実現するための様々な製剤および装置が当業界で知られている。本発明の方法に従うアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与は、例えば、投与の目的が治療であろうと予防であろうとレシピエントの生理的な状態、および熟練した従業者に知られている他の要素に応じて、継続的である場合もあれば断続的である場合もある。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与は、予め選択された期間にわたる本質的に継続的なものでもよいし、あるいは例えば、下位運動ニューロン疾患の症状の出現の前、最中、もしくは後のいずれか；下位運動ニューロン疾患の症状の出現の前および最中；前および後；最中および後；および／または前、最中、および後の、間隙を挟んだ一連の投与にしてもよい。
【０１０５】
一般に、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与では、初期の候補投与量は、約２ｍｇ／ｋｇでよい。本発明の目的では、典型的な１日投与量は、上述の要素に応じて約３０μｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上の範囲となるであろう。数日またはそれ以上にわたって繰り返される投与では、状態に応じて、疾患症状の所望の抑制が起こるまで、または下位運動ニューロン疾患を治療もしくは予防するのに十分な治療レベルが実現されるまで治療を継続する。好例となる投与計画は、約２ｍｇ／ｋｇの初回量の後、毎週約１ｍｇ／ｋｇの維持量または隔週で約１ｍｇ／ｋｇの維持量のｔｒｋＣアゴニスト抗体の投与を含む。
【０１０６】
一実施形態では、抗体の投与量は、ｔｒｋＣ受容体を活性化して下位運動ニューロン疾患を治療するアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の１回または複数の投与を受けたことのある個体において経験に基づいて決定する場合もある。個体に、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の投与量を徐々に増やして与える。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の有効性を評価するには、本明細書に記載するような下位運動ニューロン疾患状態の指標に従うことができる。
【０１０７】
他の製剤は、その限りでないがリポソームなどの担体を含めて、当業界で知られている適切な送達形態を含む。例えば、Ｍａｈａｔｏら（１９９７年）、Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．第１４巻：８５３〜８５９ページを参照されたい。リポソーム製剤には、その限りでないが、シトフェクチン（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）、多層ベシクル、および単層ベシクルが含まれる。
【０１０８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ投与に使用する製剤は、無菌でなければならない。これは、例えば無菌濾過膜でのろ過によって容易に実現される。治療用のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体組成物は、一般に、無菌の出入口を有する容器、例えば、静脈内溶液バッグ、または皮下投与針によって突き刺すことのできる栓を有するバイアルに入れられる。
【０１０９】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、筋肉内、腹腔内、皮下、経口、くも膜下腔内、または局所的な経路によって、例えば大量瞬時投与としてまたは一定期間にわたる継続的な注入による静脈内投与などの既知の方法に従って個体に投与する。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、吸入によって投与することもできる。ジェットネブライザーおよび超音波ネブライザーを含む市販の液体製剤用ネブライザーは、投与に有用である。液体製剤をそのまま噴霧することもでき、凍結乾燥された粉末を再形成した後に噴霧することもできる。別法として、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、フルオロカーボン製剤および計量投与吸入器を使用してエアロゾル化してもよいし、または凍結乾燥および粉砕した粉末として吸入してもよい。
【０１１０】
一部の実施形態では、複数種の抗体が存在する場合もある。その抗体は、同じもので場合もあれば、互いに異なる場合もある。一部の実施形態では、少なくとも１種、少なくとも２種、少なくとも３種、少なくとも４種、少なくとも５種の異なるｔｒｋＣアゴニスト抗体が存在する。これらの抗体は、互いに不利に影響を及ぼさない相補的な活性を有することが好ましい。
【０１１１】
（その抗原結合断片などの）アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体をコードするポリヌクレオチドは、所望の細胞におけるアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の送達および発現に使用することもできる。発現ベクターを使用してアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の発現を管理できることは言うまでもない。発現ベクターは、腹腔内、静脈内、筋肉内、皮下、くも膜下腔内、脳室内、経口的、経腸的、非経口的、鼻腔内、経皮的に、または吸入によって投与することができる。例えば、発現ベクターの投与には、注射、経口投与、粒子銃、またはカテーテルによる投与を含む局部または全身の投与、ならびに局所投与が含まれる。当業者は、外来タンパク質の発現をｉｎ  ｖｉｖｏで実現するための発現ベクターの投与に精通している。例えば、米国特許第６４３６９０８号、同第６４１３９４２号、および同第６３７６４７１号を参照されたい。
【０１１２】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体をコードするポリヌクレオチドを含む治療用組成物の標的指向化された送達を使用することもできる。受容体を媒介とするＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９３年）第１１巻：２０２ページ；Ｃｈｉｏｕら、「Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｏｆ  Ｄｉｒｅｃｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ」（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ編）（１９９４年）；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８８年）第２６３巻：６２１ページ；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９４年）第２６９巻：５４２ページ；Ｚｅｎｋｅら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）（１９９０年）第８７巻：３６５５ページ；Ｗｕら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９１年）第２６６巻：３３８ページに記載されている。遺伝子治療プロトコルでは、ポリヌクレオチドを含む治療用組成物を、局所投与ではＤＮＡ約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲で投与する。遺伝子治療プロトコルの際に、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇの濃度範囲のＤＮＡを使用することもできる。本発明の治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達媒体を使用して送達することができる。遺伝子送達媒体は、ウイルス由来のものでも、ウイルス由来でないものでもよい（一般に、Ｊｏｌｌｙ、Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）第１巻：５１ページ；Ｋｉｍｕｒａ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９４年）第５巻：８４５ページ；Ｃｏｎｎｅｌｌｙ、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（１９９５年）第１巻：１８５ページ；およびＫａｐｌｉｔｔ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９４年）第６巻：１４８ページ）を参照されたい。そのようなコード配列の発現は、内因性の哺乳類プロモーターまたは異種プロモーターを使用して誘発することができる。コード配列の発現は、構成性または調節性のどちらでもよい。
【０１１３】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞での発現のためのウイルス系ベクターは、当業界でよく知られている。好例となるウイルス系媒体には、その限りでないが、組換えレトロウイルス（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／１１２３０、ＷＯ９３／１０２１８、ＷＯ９１／０２８０５、米国特許第５２１９７４０号、同第４７７７１２７号、英国特許第２２００６５１号、およびＥＰ０３４５２４２を参照されたい）、アルファウイルス系ベクター（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林熱ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３、ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０、ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９、ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、ならびにアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例えば、ＰＣＴ公開ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、およびＷＯ９５／００６５５を参照されたい）が含まれる。Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２年）第３巻：１４７ページに記載の、死滅させたアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与を使用することもできる。
【０１１４】
その限りでないが、死滅させたアデノウイルスのみに連結されまたは連結されていないポリカチオン縮合ＤＮＡ（例えば、Ｃｕｒｉｅｌ、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．（１９９２年）第３巻：１４７ページを参照されたい）、リガンドに連結されたＤＮＡ（例えば、Ｗｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８９年）第２６４巻：１６９８５ページを参照されたい）、真核細胞送達媒体細胞（例えば、米国特許第５８１４４８２号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０７９９４、ＷＯ９６／１７０７２、ＷＯ９５／３０７６３、およびＷＯ９７／４２３３８を参照されたい）、ならびに核電荷中和（ｎｕｃｌｅｉｃ  ｃｈａｒｇｅ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）または細胞膜との融合を含めて、非ウイルスの送達媒体および方法を使用することもできる。裸ＤＮＡを用いてもよい。好例となる裸ＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５５８０８５９号に記載されている。遺伝子送達媒体として働き得るリポソームは、米国特許第５４２２１２０号、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／１３７９６、ＷＯ９４／２３６９７、ＷＯ９１／１４４４５、およびＥＰ０５２４９６８に記載されている。追加の手法は、Ｐｈｉｌｉｐ、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．（１９９４年）第１４巻：２４１１ページ、およびＷｏｆｆｅｎｄｉｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９９４年）第９１巻：１５８１ページに記載されている。
【０１１５】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、下位運動ニューロン疾患を治療するための（１種または複数のニューロトロフィンなどの）１種または複数の他の薬剤と共に、すなわち、１種または複数の薬剤と組み合わせて、一斉に、または順次投与することができる。例えば、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、ＮＴ−４と共に投与することができる。共に投与とは、本明細書では、同時投与および／または異なる時点での投与を含む。共に投与は、合剤（すなわち、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体と他の薬剤とが同じ組成物中に存在するもの（組み合わされたもの））としての投与、および／または別個の組成物としての投与も含む。本明細書では、「共投与」は、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体と他の薬剤が有効量で個体に投与される任意の状況を含む意味である。本明細書でさらに論述するように、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体と他の薬剤を、異なる投薬頻度および／または投薬間隔で投与できることは理解される。例えば、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、毎週投与することができ、その間他の薬剤（例えばＮＴ−４）をより頻繁に投与することができる。アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体と他の薬剤は、同じ投与経路または異なる投与経路を使用して投与することができ、その異なる投与計画を投与の過程で変化させてよいことは理解される。投与は、下位運動ニューロン疾患の発症前でよい。
【０１１６】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体をニューロトロフィンと共に投与するものでは、ニューロトロフィン（例えば、ＣＮＴＦ、ＮＴ−４）をコードするポリヌクレオチドを、本明細書に記載の発現ベクターを利用する所望の細胞（例えば骨格筋細胞）でのニューロトロフィンの送達および発現に使用してもよい。
【０１１７】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体による治療の有効性を評価する方法
治療有効性の評価は、いくつかの異なるレベルで実施することができる。評価は、臨床徴候（例えば、体力試験、電気生理学的な応答、または分子的な変化）をモニターして行うことができる。これらには、標準の神経学的な検査または患者への問診によって決定されるパラメータを含めることができ、あるいは例えば本明細書に記載のより専門の定量的試験によって測定できるものでよい。これらのより専門の定量的試験には、微小神経電図検査などの手段による冒されたニューロンの伝導速度測定、筋電図検査（ＥＭＧ）、握力などの随意筋力測定、音節の反復、１５フィート（４．５７メートル）歩くのにかかる時間によって測定される歩行速度、努力性肺活量（ＦＶＣ）の測定を含む呼吸器の機能試験、呼吸器の能力障害の進行に関連する選択された事象の発生率、聴力、平衡性の試験、固有受容または運動感覚の専門試験、体力試験、筋電図検査；その限りでないが、血圧コントロール試験、様々な生理的および薬理学的な刺激に対する心拍応答試験を含む自律神経機能の試験を含めることができるが、この限りでない。これらの試験には、運動技能または体力の試験を含めることもできる。
【０１１８】
下位運動ニューロン疾患の治療で使用するための組成物
本発明は、本明細書に記載の方法のいずれかで使用するための組成物も提供する。本発明の方法で使用する組成物は、有効量のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を含む。そのような組成物の例ならびに製剤方法は、より前の項および以下でも記載する。本発明は、医薬としての使用および／または医薬の製造のための使用のいずれの状況にせよ、本明細書に記載の任意の使用について述べた組成物のいずれかも提供する。
【０１１９】
本発明で使用する組成物は、凍結乾燥製剤または水溶液の形で、薬学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤をさらに含む場合もある（「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ」、第２０版（２０００年）、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ、Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ編）。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、その投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、リン酸塩、クエン酸塩、他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメソニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール；ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンやプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；ｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖、二糖、ならびにグルコース、マンノース、もしくはデキストランを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、ソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの、塩を生成する対イオン；金属複合体（例えばＺｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む場合もある。薬学的に許容できる賦形剤については本明細書でさらに述べる。
【０１２０】
一態様では、本発明は、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を含む組成物を提供する。他の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体はヒトｔｒｋＣを認識する。さらに他の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体は、（本明細書に記載の抗体Ａ５などの）ヒト化されたものである。他の実施形態では、抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体は、抗体Ａ５の１個または複数のＣＤＲ（Ａ５からの１、２、３、４、５個、または一部の実施形態では６個すべてのＣＤＲなど）を含む。さらに他の実施形態では、抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体は、表１に示す重鎖可変部のアミノ酸配列（配列番号１）と表２に示す軽鎖可変部アミノ酸配列（配列番号２）とを含む。さらに他の実施形態では、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体はヒト抗体である。
【０１２１】
組成物が、複数種のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体（例えば、異なるｔｒｋＣエピトープを認識するアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の混合物）を含む場合もあることは理解される。他の好例となる組成物は、同じエピトープを認識する複数種のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体、または異なるｔｒｋＣエピトープに結合する異なる種のアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を含む。
【０１２２】
アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体およびその組成物は、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体の有効性を強化および／または補完するのに役立つ他の薬剤と共に使用することもできる。例えば、そのような追加の化合物には、下位運動ニューロン疾患の治療に有用であることがわかっている化合物、（ＣＮＴＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＢＤＮＦ、およびＧＤＮＦを含む）１種または複数のニューロトロフィン、およびアゴニスト抗ｔｒｋＢアゴニストを含めることができる。このような分子は、意図した目的に有効な量で組み合わされて存在することが適切である。ｔｒｋＣアゴニスト抗体およびその組成物は、抗体の有効性を強化および／または補完するのに役立つ他の薬剤と共に使用することもできる。
【０１２３】
キット
本発明は、この方法で使用するためのキットも提供する。本発明のキットは、抗ｔｒｋＣアゴニスト抗体を含む１個または複数の容器を含み、一部の実施形態では、（下位運動ニューロン疾患の治療方法などの）本明細書に記載の本発明の方法のいずれかに従って使用するための説明書をさらに含む。一部の実施形態では、これらの説明書は、個体が下位運動ニューロン疾患を有しているかどうか、かつ／または下位運動ニューロン疾患にかかるリスクがあるかどうかの確認に基づき治療に適する個体を選択することについての記述を含み、この疾患の治療および／または予防のためのｔｒｋＣアゴニスト抗体の投与についてさらに述べる場合もある。本発明はまた、医薬としての使用および／または医薬の製造のための使用のいずれの状況にせよ、本明細書に記載の任意の使用について述べたキットのいずれかを提供する。
【０１２４】
したがって、一実施形態では、本発明は、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を含むキットを提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に記載の方法で使用するための、アゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体を含むキットを提供する。本発明のキットは、適切な包装が施されている。適切な包装には、その限りでないが、バイアル、瓶、広口瓶、フレキシブルな包装（例えば、密閉されたＭｙｌａｒ製またはプラスチック製バッグ）などが含まれる。一部の実施形態では、キットは、容器と、容器に貼られまたは添えられるラベルまたは添付文書とを含む。ラベルまたは添付文書は、組成物が下位運動ニューロン疾患を治療し、予防し、または緩和させるのに有用であることを表示する。説明書は、本明細書に記載の方法のいずれかの実施に向けて用意することができる。容器は、下位運動ニューロン疾患の治療に有効な組成物を保持し、無菌の出入口を有する場合もある（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下投与針によって突き刺すことのできる栓を有するバイアルでよい）。組成物中の少なくとも１種の活性薬剤は、ｔｒｋＣアゴニスト抗体である。容器は、第２の薬学的に活性のある薬剤をさらに含む場合もある。キットは、緩衝剤や説明的な情報などの追加の構成成分を場合により提供することもある。
【０１２５】
以下の実施例は、本発明を限定するのでなく例示するためのものである。
【実施例】
【０１２６】
ＳＭＡＲＤ１動物モデルに対するアゴニスト抗ｔｒｋＣ抗体およびＮＴ−４の効果
呼吸困難を伴う脊髄性筋萎縮症１型（ＳＭＡＲＤ１）は、小児の致命的な常染色体劣性遺伝疾患である。この疾患は、下位運動ニューロンの変性、進行性の筋肉麻痺、および呼吸不全を特徴とし、これらに対して有効な治療は存在しない。ｎｍｄ（神経筋変性）マウスの表現型は、ヒトＳＭＡＲＤ１に酷似している。ｎｍｄマウスにおける変異型のマウス遺伝子、すなわちＩｇｈｍｂｐ２の同定は、ＳＭＡＲＤ１に罹患したヒトにおける相同遺伝子の突然変異の発見をもたらした。発明者らは、ｉｎ  ｖｉｖｏの電気生理学的な技術を用いてｎｍｄマウスモデルを研究し、Ｍａｂ２２５６、すなわちチロシンキナーゼ受容体Ｃ（ｔｒｋＣ）に対してアゴニスト効果を有するモノクローナル抗体の、ｎｍｄマウスにおける疾患の進行に対する有効性を評価した。Ｍａｂ２２５６による治療は、ｎｍｄマウスにおいて、著しいが一過性の筋力向上をもたらすだけでなく、高頻度の神経刺激の際の神経筋の衰弱を正常化した。これらの結果は、ＳＭＡＲＤ１などの下位運動ニューロン疾患においてニューロトロフィン受容体に対するモノクローナルアゴニスト抗体を使用することの可能性を示唆するものである。
【０１２７】
この研究では、ＳＭＡＲＤ１のｎｍｄマウスモデルの後肢筋および横隔膜筋のｉｎ  ｖｉｖｏの電気生理学的な特徴付けを実施し、このマウスモデルにおいてｔｒｋＣ受容体に対するアゴニストのモノクローナル抗体（Ｍａｂ２２５６）の潜在的な有効性を評価した。Ｍａｂ２２５６治療が筋力の初期の衰えを予防し、電気刺激を繰返し与えた際の衰弱レベルが正常に回復したことからなる筋肉機能の電気生理学的な改善をもたらしたことが示される。しかし、そのような初期の改善は、筋線維の保存または生存の利益には至らず、この治療戦略をさらに最適化することが強調された。
【０１２８】
結果
ｔｒｋＣ抗体Ｍａｂ２２５６のアゴニスト特性および薬物動態特性
ヒトｔｒｋＣ細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を作製し、アゴニスト活性があるかどうか、細胞に基づく受容体チロシンリン酸化アッセイ（１６）を使用してスクリーニングした。ネズミＩｇＧ１アイソタイプの１つのモノクローナル抗体であるＭａｂ２２５６は、ｔｒｋＡまたはｔｒｋＢとの交差反応性なしにｔｒｋＣ受容体の特異的なバインダーとなることがわかった（データは示さず）。ｔｒｋＣを発現する安定なＣＨＯ細胞中で、Ｍａｂ２２５６は、最大半有効濃度（ＥＣ５０）０．８７ｎＭでｔｒｋＣのチロシンリン酸化を誘発し、一方ＮＴ３は、ＥＣ５０  １．０９ｎＭでｔｒｋＣのチロシンリン酸化を誘発する（図１Ａ）。そのｔｒｋＣ受容体活性化能と一致して、Ｍａｂ２２５６は、ラット胚三叉神経ニューロン培養物の生存もＥＣ５０  ２．５８ｎＭで用量依存的に援助し、一方ＮＴ３のＥＣ５０は０．７３ｐＭである（図１Ｂ）。
【０１２９】
次に、Ｍａｂ２２５６の薬物動態特性を検討した。発明者らは、マウスの腹腔内に投与したとき、Ｍａｂ２２５６の血清からの排出相半減期（ｔ１／２）が約１９９時間であることを見出した。これは、抗体に期待される長く循環する半減期であり、発表されている、内因性ｔｒｋＣアゴニストＮＴ３の約１．２８分の血漿半減期と比較すると有利である（１７）。
【０１３０】
ｎｍｄマウスの運動能力および生存に対するＭａｂ２２５６の効果
変異マウスは、出生時には野生型と識別不能に見受けられたが、出生の２週間後には摂食および成長が不十分になった。したがって、ホモ変異体は、そのより少ない体重によって野生型およびヘテロ接合体の同腹仔と容易に識別可能であった（図２Ａ）。さらに、変異マウスは、筋肉質量が進行性に損失し、前肢および後肢の握力が顕著に低下した（８〜１１）。変異マウスは、重力に対してその身体を支えられず、ケージカバーを掴むことができず、肩および骨盤帯の筋肉質量を徐々に失った。
【０１３１】
本発明者らは、Ｍａｂ２２５６による処置（５ｍｇ／体重ｋｇ、週２回、出生後２０日目、すなわちＰ２０に開始）が、ｎｍｄマウスで起こる筋肉機能の進行性の損失を予防し得るかどうかを検討した。Ｍａｂ２２５６（ｎ＝１０）またはＰＢＳ（ｎ＝５）を６〜８．５週間注射したマウスにおいて、ＥＬＩＳＡ分析によって血清中のモノクローナル抗体の存在を確認した。血清中のＭａｂ２２５６抗体の平均濃度は、１０．６±３．４μｇ／ｍＬであった（Ｍａｂ２２５６注射したマウスｎ＝１０）。野生型およびｎｍｄのＭａｂ２２５６処置マウスに副作用は認められなかった。処置したマウスと未処置のマウスとの体重に有意差はなく（図２Ａ、Ｂ）、Ｐ６０では、Ｍａｂ２２５６処置した突然変異体の体重は１４．５±０．２ｇ（ｎ＝１６）であり、未処置または媒体対照の体重は１４．２±０．８３ｇ（ｎ＝８）であった。
【０１３２】
未処置およびＭａｂ２２５６処置した４〜１０週齢のマウスにおいて、標準の神経学的検査を実施した。前肢握力を調べるために、マウスをその前肢によって床から１０ｃｍ上に金属ワイヤーに吊るした。マウスが吊るされたままであった期間を記録した。未処置のｎｍｄマウス（ＰＢＳ注射したものｎ＝５、注射しなかったものｎ＝９）は、試験全体を通してその前肢のほとんど完全な握力の損失を示した（図２Ｃ、塗りつぶされた四角形）。Ｍａｂ２２５６処置したｎｍｄマウスは、著しく数週間握力を保持した（図２Ｃ、三角形）。ＰＢＳ注射したｎｍｄマウスが自身をワイヤー上に保つことができた平均期間は、４週齢で０．８±０．６秒であり（ｎ＝５）、Ｍａｂ２２５６処置したｎｍｄマウスでは同じ年齢で５．１±１．６秒（９匹のマウス、６匹の同腹仔）（ｐ＜０．０３）、１週間後には４．９±１．４秒（ｐ＜０．０３４）であった。ヘテロ接合体の能力（図２Ｃ、灰色四角形、ｎ＝８）は、野生型の同胞と同一であった（図２Ｃ、白色の四角）。
【０１３３】
ｎｍｄマウスが自身を一定のスピードの回転棒上に保つ能力によって、運動協調性も測定した（試験時間：１０秒）。未処置のｎｍｄマウスは、野生型および異型接合性の同腹仔と比べて平衡性が非常に不十分であった（図２Ｄ、Ｅ）（ｐ＜０．００１）が、Ｍａｂ２２５６処置したｎｍｄマウスは、処置してから１週間後に有意により良好な運動協調性を示した（図２Ｄ、Ｆ）（ｐ＜０．０１８）。これらの結果は、Ｍａｂ２２５６処置がｎｍｄマウスにおいて疾患の進行を緩和させたことを示唆するものであった。
【０１３４】
Ｍａｂ２２５６が生存に影響するかどうかに解答するために、未処置およびＭａｂ２２５６処置したｎｍｄマウスの寿命を離乳から成人期まで記録した。著しい寿命の延長は認められず（マンホイットニーの順位和検定）、Ｍａｂ２２５６処置した変異マウスの中央値の寿命は６９日間（ｎ＝１５）であり、未処置ｎｍｄマウスでは６２日間（ｎ＝３０）（図２Ｇ）であった。
【０１３５】
ｎｍｄマウスにおける電気的神経筋活性
Ｐ７０に内側腓腹筋（ＭＧ）でｉｎ  ｖｉｖｏＥＭＧ測定を実施した。まず最大上振幅の単一の電流パルスによって坐骨神経を刺激し、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）を記録した。ｎｍｄマウスにおけるＣＭＡＰの平均振幅は、対照値の＜５０％に縮小した（図３Ａ；それぞれ２２．９±５．６ｍＶ、ｎ＝９、および４８．８±４．８ｍＶ、ｎ＝１４；ｐ＜０．００２）。Ｍａｂ２２５６の投与は、Ｐ７０のｎｍｄ（２４±３．１ｍＶ、ｎ＝７）または野生型マウス（６１±９．２ｍＶ、ｎ＝８）においてＣＭＡＰの平均振幅に著しい効果を与えず（図３Ａ）、Ｍａｂ２２５６による治療プロトコルでは運動線維の損失を止められないことが示唆された。ｔｒｋＢアゴニストがｔｒｋＣアゴニストより良好となり得るかどうかを問うため、一群の変異マウスをｔｒｋＢアゴニストＮＴ−４／５（５ｍｇ／体重ｋｇ、週２回、Ｐ２０に開始）でも処置した。この場合では、ＣＭＡＰの平均振幅は、ＮＴ−４／５処置によっていずれも変化しなかった（Ｐ７０で２６．７±７．１ｍＶ、ｎ＝３）。
【０１３６】
Ｍａｂ２２５６およびＮＴ−４／５は、高周波によって誘発される神経筋衰弱を正常レベルに回復させる
ｎｍｄマウスにおける神経筋の電気的特性ならびにＭａｂ２２５６およびＮＴ−４／５の効果をさらに調査するために、対パルス、および周波数の異なる短い一続きの刺激を使用し、筋電計の応答を調査した。ＭＧでは、ｎｍｄマウスにおける対パルス最大上刺激（１０秒間隔）に対するＣＭＡＰ応答の振幅（Ａ１およびＡ２）は、野生型のものと大いに異なっていた。野生型マウスでは、第２のＣＭＡＰ（Ａ２）の振幅は、第１の応答（Ａ１）よりかすかに大きいまたは同等であった（図３Ｂ）。変異マウスでは、第２の応答の振幅は、第１の応答よりも２１．４±０．０３％小さかった（ｎ＝７）（図３Ｃ）（ｐ＜０．００５）。したがって、ＣＭＡＰ曲線下の面積はその振幅によって変化し、活性化した線維数が実際に変化したものであり、見せかけの低下ではなかったことが示された（データは示さず）。
【０１３７】
２５０ｍｓの一続きの１００Ｈｚ刺激では、未処置の野生型ＭＧにおけるＣＭＡＰの振幅は、一貫したパターンを示した。すなわち、ＣＭＡＰ振幅は、最初の３〜４回の刺激の間に徐々に増大し、次いで縮小の疑似定常状態値に達するまでの刺激期間にわたって段々に低下した（図３Ｄ、上部のトレース；図３Ｅ、空の四角形）。このパターンは、その刺激の第１と第２のＣＭＡＰの間で振幅が最大に落ち込んだ後、記録期間にわたってさらに縮小することを特徴とする、未処置のｎｍｄマウスで見られるものと非常に異なっていた（図３Ｄ、２番目のトレース；図３Ｅ、塗りつぶされた四角形）。未処置の突然変異体では、縮小が急速であり、ＣＭＡＰの標準化された振幅は、刺激の終わりには野生型よりも大いに小さくなり（それぞれ５５±６．９％、ｎ＝６、および８２．５±７．４％、ｎ＝６）（ｐ＜０．０２）、伝達が活動電位発生の閾値を下回っている線維数の増加が示唆された。刺激しない間隔（２〜４分）を挟んだ後同じ刺激パターンを繰り返すと、刺激のそれぞれの実施に対してほとんど同一の応答パターンが得られた。
【０１３８】
神経筋機能に対するＭａｂ２２５６の有効性を評価するために、モノクローナル抗体で処置した動物の記録を行い、結果を未処置マウスと比較した。繰返しの神経刺激（１００Ｈｚ）では、疑似定常状態での標準化されたＣＭＡＰ振幅は、Ｍａｂ２２５６処置ｎｍｄマウス（７４±４．１％、ｎ＝６）（図３Ｄ、３番目のトレース）において、ＰＢＳ注射した突然変異体（５５±６．９％、ｎ＝６）（図３Ｅ、上部のグラフ）よりも有意に大きい（ｐ＜０．０５）。しかし、刺激の終わりの応答の低下量は、Ｍａｂ２２５６処置マウスと未処置の野生型マウスで有意には異なっておらず（それぞれ７８±９％、ｎ＝８、および８２．５±７．４％、ｎ＝６）（図３Ｅ、上部のグラフ）（ｐ＜０．７３）、モノクローナル抗体による処置が正常な神経筋機能を変化させなかったことが示唆された。
【０１３９】
ＮＴ−４／５処置したｎｍｄマウスでも、最後の定常状態ＣＭＡＰの標準化された振幅が、１００ＨｚでＰＢＳ注射した突然変異体より有意に大きかった（７９±２．５％、ｎ＝３）（図３Ｄ、下方のトレース；図３Ｅ、下方のグラフの塗りつぶされた円）（ｐ＜０．０２）。野生型、Ｍａｂ２２５６処置、および未処置突然変異体における異なる周波数（１０、２０、５０、および１００Ｈｚ）での縮小量を図３Ｆに示す。これらの結果は、Ｍａｂ２２５６およびＮＴ−４／５の両方が、高周波によって誘発される神経筋の衰弱をほぼ完全に正常レベルに回復し得たことを示唆している。
【０１４０】
ｎｍｄマウスにおける紡錘からの求心性線維の機能状態
筋紡錘からの求心性線維の機能状態を評価するために、未処置およびＭａｂ２２５６処置ｎｍｄマウスにおいて、Ｈ波が容易に検出可能である背側の足筋からの記録をとった。Ｈ波は、運動線維の活性化によって、単シナプスの固有受容性感覚求心回路（挿入図４Ａ）を通して誘発され、神経運動線維の直接の刺激によって誘発されるＭ波の後に続く（図４Ａ）。Ｍ／Ｈ波の比は、野生型（６．１±１．３、ｎ＝６）、未処置ｎｍｄ（６．１±０．９、ｎ＝５）、およびＭａｂ２２５６処置したｎｍｄマウス（７．６±２．６、ｎ＝４）で異なっておらず、背側の足筋の伸展反射を司る筋紡錘線維が突然変異体で優先的に失われないこと、およびこの処置がこの回路に影響を及ぼさなかったことが示唆された。
【０１４１】
背側の足筋では、ｎｍｄマウスおよび対照マウスにおける異なる刺激周波数でのＥＭＧ応答の低下量も調査した。１０〜５０Ｈｚの周波数で野生型マウスとｎｍｄマウスとにＣＭＡＰの平均疑似定常状態低下の有意差はなかった（図４Ｂ）。１００Ｈｚ（図４Ｃ）でのみ、低下量がｎｍｄマウス（４０±１．６％、ｎ＝６）において野生型（３２±２．８５％、ｎ＝６）よりわずかに大きく（Ｐ＜０．０３６）、この動物モデルでは背側の足筋がＭＧほど影響を受けないことが示唆された。
【０１４２】
ＭＵＮＥ分析
ｎｍｄマウスのＭＧで記録されたＣＭＡＰ振幅の縮小は、機能運動単位数の減少を示唆するものである。運動単位数推定（ＭＵＮＥ）を使用して、ｎｍｄマウスのＭＧにおける運動ニューロン損失の程度を評価した。機能運動単位数を変異マウス（Ｐ２１５〜Ｐ２３０）の老齢期に測定し、対照同腹仔と比較した。その年齢では、突然変異体においては後肢の筋萎縮症が非常に重篤であったが、ヘテロ接合体では筋肉消耗または体力減退の徴候が認められなかった。連続的な漸増刺激は、対照では運動単位電位の規則的な増加を生じるが（図５Ａ）、ｎｍｄマウスでは異常に大きい運動単位電位を誘発した（図５Ｂ）。強度が段々と増す１０回の「成功した」刺激（すなわち、応答の振幅を増大させた刺激）の後の最終電位サイズは、突然変異体では大きな歩幅の増大（すなわち、巨大な運動単位）が存在するために、対照同胞マウスよりも突然変異体においてはるかに大きかった。２匹の対照（ヘテロ接合体）および２匹の突然変異体同腹仔の電位サイズの定量化を、図５Ｃ〜Ｆのグラフに示す。平均の単一運動単位活動電位（ＳＭＵＡＰ）振幅は、ｎｍｄマウスでは１．２１±０．６２ｍＶ（ｎ＝３）であり、対照マウスでは０．１７８±０．０６ｍＶ（ｎ＝３）であった。したがって、ＭＵＮＥは、ｎｍｄマウス（平均値は３７．５±１１．４、ｎ＝３）において異型接合性の同腹仔（１０５．５±１２．４、ｎ＝３、Ｐ＜０．００１５）と比べて５０％超の減少があった。さらに、対照マウスに十分な弱い強度の刺激は、突然変異体では少しの応答も誘発せず、突然変異体の残りの運動単位の大部分で線維活性化の閾値が増大したことが示唆された（データは示さず）。巨大な運動単位の存在は、おそらくは神経筋伝達の重度の損失を少なくとも部分的に代償する、軸索の出芽および除神経された筋線維の神経再支配の徴候である。しかし、突然変異体の力が主として巨大な運動単位に依存するならば、これらの単位の損失が後に筋肉機能の突然の不全をもたらす場合もある。
【０１４３】
ｎｍｄマウスにおける横隔膜の機能
呼吸不全は、早くも生まれてから最初の年にヒトＳＭＡＲＤ１に特徴的なものである（４）。ｎｍｄマウスにおける呼吸機能およびモノクローナル抗体の潜在的な有効性を評価するために、麻酔条件下でのマウス横隔膜の電気生理学的な特性を検討する。１０週齢を超える１２匹のマウス、すなわち、対照（野生型およびヘテロ接合体、ｎ＝６）、未処置ｎｍｄマウス（ｎ＝３）、およびＭａｂ２２５６処置したｎｍｄマウス（ｎ＝３）がこの研究に含まれた。横隔膜の電気活性は、交互に起こる、自発性の活動電位のバースト（吸息バースト）と呼息と同時に起こる無変化の期間を特徴とする。対照および未処置ｎｍｄマウスの横隔膜からの典型となる記録を、図６Ａ、Ｂの下方のトレースに示す。一般に、対照およびｎｍｄマウスで吸息後の電気活性は、認められなかった。本発明者らは、持続時間および吸息バーストの活性（ＴＩ）が少ししか変動しなかったことを発見した。対照マウスの呼吸回数（１４０．２±１５．７ｂｐｍ、ｎ＝６）は、未処置のｎｍｄ（１４１．７±６．２ｂｐｍ、ｎ＝３）およびＭａｂ２２５６処置したｎｍｄマウス（１３２．９±２２．６、ｎ＝３）と同様であった。しかし、平均吸息持続時間（ＴＩ）は、未処置のｎｍｄマウス（１３１．６±４．１ｍｓ）において対照同腹仔（１８４．１±１１．７ｍｓ）と比べて著しく短縮し（２８％）（Ｐ＜０．００５）、老年期のｎｍｄマウスが軽度の異常な吸息運動の消失を有することが示唆された。Ｍａｂ２２５６処置したｎｍｄマウスでは、ＴＩは１４６．３±８．２ｍｓであり、未処置のｎｍｄマウスよりわずかに長かった。この差は、おそらくはサンプルサイズが小さいために統計学的有意性には到達しなかった（Ｐ＜０．０８）（図６Ｃ）。非常に高週齢の突然変異体（３８週齢）の横隔神経横断面（図６Ｄ）の組織学的検査では、ｎｍｄ（軸索３３７±１８本、ｎ＝２）と対照同腹仔（軸索３６４±１１本、ｎ＝２）の有髄軸索数に有意差は示されなかった（図６Ｅ）。このことは、ｎｍｄマウスにおける呼吸機能不全の根底にあるものが、横隔神経の解剖学的な損失というよりも機能の欠陥であることを示唆している。
【０１４４】
考察
本発明者らは、ｎｍｄマウスの筋電図記録の特性を調査し、疾患の臨床的および電気生理学的な進行に対するｔｒｋＣ受容体のアゴニストモノクローナル抗体（Ｍａｂ２２５６）の有効性を試験した。Ｍａｂ２２５６処置が筋力低下を数週間遅らせ、筋肉機能の電気生理学的な改善をもたらしたことを示す。
【０１４５】
ｎｍｄマウスにおける神経筋機能障害
ｎｍｄ神経筋機能に若干の著しい変化が認められた。主な欠陥には、運動神経線維の重度の損失、およびｎｍｄマウスが繰返しの神経刺激で正常な神経筋伝達を維持できないことが含まれる。通常、繰返しの神経刺激では、ＣＭＡＰは、いくつかのパルスの後、安定した低下レベルに到達するまで振幅が徐々に縮小し、最大低下度は刺激回数に正比例する。本発明者らは、ｎｍｄと野生型のＭＧでこの生理的応答を比較し、ｎｍｄマウスが、その臨床的な欠点と一致した、同腹仔対照よりもはるかに重度のＣＭＡＰ振幅の縮小を示したことを発見したが、このことは、他の運動ニューロン機能障害マウスモデルでも共通の知見である（１８）。ｎｍｄマウスにおけるこの現象が、シナプス前終末での欠陥によるものか、シナプス後の効力の低下によるものか、または筋肉線維のより疲労性の表現型への移行によるものかを確認することが将来的に問題となるはずである。
【０１４６】
ＣＭＡＰ平均振幅は、Ｐ７０のｎｍｄマウスＭＧにおいて５０％を超えて縮小した。これは、この突然変異体で以前に記載されている５週間での腰椎運動ニューロンの４１％までの低下に一致している（１１）。疾患のその後の段階（Ｐ１５０〜２３０）では、ＭＧ筋に残存する運動単位数は、対照値の３５％に減少したが、１２〜１４週間の腰髄に２８％の運動ニューロンが残存するという以前の推定と離れてはいない（１１）。巨大な運動単位電位は、活性化の閾値が高いので、補充が不十分な場合もある。運動単位の重度の損失と共に、繰返しの刺激で有効な伝達を維持できないことは、これらの動物の筋力の減弱を説明するものである。
【０１４７】
神経栄養因子の治療的な可能性
神経栄養因子は、脊髄運動ニューロンの生存を支え、運動ニューロン疾患の動物モデルにおいて病理学的な症状の軽減にプラスの影響を及ぼすことが示されている（１４、１９、２０）。これらの結果に基づき、組換え型の神経栄養因子は、十年以上の間運動ニューロン疾患有望な治療薬であると考えられてきた。しかし、臨床試験では、不適当な投与量、副作用などの問題に遭遇している（２１、２２）。ニューロトロフィン受容体のアゴニストモノクローナル抗体は、外来の投与された神経栄養因子に優るいくつかの理論上の利点、例えば、副作用を低減し得る、所与の栄養受容体に対するその特異性、ならびに薬物投与および治療濃度の維持を容易にするその長い循環半減期を有する。それにもかかわらず、これらの分子は、動物モデルで調査し確認する必要がある。例えば、一部のモデルでは、神経栄養因子による運動ニューロンの救出が、一過性の性質のものであることが判明した（２３、２４）。本発明者らのｎｍｄマウスでの実験では、Ｍａｂ２２５６は、疾患の進行を遅らせるが阻止しなかった。
【０１４８】
繊毛様神経栄養因子（ＣＮＴＦ）およびＮＴ３は、マウス突然変異体ｐｍｎ（進行性運動神経細胞障害）の寿命を延長し得ることが示されている（１４、２５、２６）。ｎｍｄマウスの平均寿命は、５４日であることが記載されている（１０）。本発明者らの動物施設でも、未処置ｎｍｄマウスの生存中央値は同様であった（６４日）。出生後第３週〜第１１週にｎｍｄマウスをＭａｂ２２５６で処置しても、生存確率は有意に増大しなかった（中央値：６９日）。この結果は、ｎｍｄマウスでの全長ＩＧＨＭＢＰ２のニューロン発現もその生存状態を改善し得なかったという事実に従うものである（１０）。
【０１４９】
Ｍａｂ２２５６の一過性の効果について考えられる説明は、ニューロトロフィンを用いる他の研究で示されているように、一部の動物が到達する、血漿中で比較的高レベルとなった薬物が、ｔｒｋＣ受容体の下方制御を引き起こしたのではないかということである（２７、２８）。これが事実であるならば、治療的な投与量および投薬回数は、この効果を回避するために調整すべきである。
【０１５０】
また、Ｍａｂ２２５６は、ニューロン生存バイオアッセイにおいてＮＴ−３ほど強力でなく（ＥＣ５０が約３０００倍の差）、有効でもなかった（最大効果が約３倍の差）。したがって、ｎｍｄマウスモデルにおいてより長くより高い有効性を実現するために、Ｍａｂ２２５６抗体のより高い親和性／活性のものが必要であると思われる。
【０１５１】
その上、下位運動ニューロンは、ｔｒｋＢおよびｔｒｋＣの両方の受容体を発現する。これらおよびことによると他のニューロトロフィン受容体の活性化は、ｎｍｄマウスにおける臨床的に有益な成果に必要であるかもしれない。将来的には、この疾患モデルにおいてｔｒｋＢおよびｔｒｋＣの両方のアゴニストの同時の適用がより大きな治療利益を提供するかどうかを試験することが重要となる。実際に、本発明者らは、Ｍａｂ２２５６および内因性のｔｒｋＢアゴニストであるＮＴ−４／５が、繰返しの刺激プロトコルにおいてなど、ｎｍｄマウス神経筋接合部の電気生理学的特性の側面を回復させ得ることを見出した。ＮＴ−３と他の神経栄養因子の組合せが適切な場合もあり、例えば、ＣＮＴＦ遺伝子およびＮＴ−３遺伝子をコードするアデノウイルスベクターのｐｍｎマウス骨格筋細胞への同時注射は、どちらかのベクター単独でよりも軸索の生存時間を大きく増大させる（２６、２９）。
【０１５２】
ｎｍｄマウスにおいてＭａｂ２２５６でｉｎ  ｖｉｖｏで見られるプラスの影響の原因である正確な細胞ターゲットはまだ不明であるが、運動ニューロン、筋細胞、グリア細胞、または上記の組合せである可能性がある。運動ニューロンは、ＮＴ−３受容体であるｔｒｋＣを発現し、ＮＴ−３に応答し、生存時間が段々と増す（１５、３０〜３２）。最近の証拠は、ＮＴ−３が、運動ニューロンの生存に対するその効果のほかに、神経筋伝達の有効性に影響を及ぼす場合もあることを示唆している（３３〜３６）。外来のＢＮＤＦまたはＮＴ−３は（神経成長因子ＮＧＦではないが）、培養物中で神経筋シナプスを発生させる、自発性およびインパルス誘発型のシナプス活性、すなわち、ｔｒｋＣ受容体を媒介とし、因子が存在する限り存続するように思われる効果を増強する（３７）。その上、単離したニューロンをＮＴ−３で２日間処理すると、新たに形成された神経−筋肉シナプスでの素量的なＡＣｈパケットの平均サイズが増大するのに対し、ＮＴ−３に対する抗体、またはチロシンキナーゼ受容体の特異的な阻害剤であるＫ２５２ａで処理すると、存在するシナプスでの素量サイズが縮小するが、これは、ＮＴ−３が素量的なパケットの発生および維持を司ることを示唆している（３４）。ＮＴ−３によるシナプス伝達の増強も成体海馬スライスで報告されている（３８）。筋肉によって合成されるＮＴ−３およびＮＴ−４／５は、シナプス前の運動ニューロンに対して逆方向に働き、それによって、例えばＡＣｈおよびニューレグリンの合成を増大させることで、途切れないニューロンの機能分化に影響を及ぼす場合がある（３９）。これらのシナプス前の効果のほかに、筋肉によって分泌されるニューロトロフィン（ＢＤＮＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、およびＧＮＤＦ（１５、４０〜４３）は、筋線維それ自体に対して自己分泌の方法で働く場合がある。ＮＴ−３の外からの投与は、クラーレ処理した筋肉において、その処理によって予め変更されたＮＭＪ構造を回復させることが示されている（４４）。筋細胞からのＮＴ−３の放出は、ＮＭＪでのシナプスの活性によって次々に調節されるようである（３６）。
【０１５３】
アデノウイルスを媒介とする、ＮＴ−３の遺伝子導入は、ｐｍｎマウスにおいて運動線維の終端の出芽を促進するが、このことは、ＮＴ−３が遠位の軸索構造の維持および再生にも関与することを示唆している（２６、２９）。さらに、神経栄養因子は、運動神経から脊髄への軸索輸送にも影響を及ぼし得る。チューブリンの重合が変更されたために運動の軸索が変性しているｐｍｎマウス（４５）において、腓腹筋に注射された、または切断された坐骨神経に直接に適用された蛍光トレーサーの逆方向性の輸送は、ＣＮＴＦ、ＢＤＮＦ、またはＮＴ−３によって改善することができるが、ＧＤＮＦまたはＮＧＦによって改善することはできない（４６）。
【０１５４】
Ｍａｂ２２５６は分子サイズが大きいため、無処置の脳血液関門を通過できないと思われる。しかし、ＮＴ−３および他のニューロトロフィン（ＮＴ−４／５、ＢＤＮＦ）は、運動ニューロンの軸索に沿って逆行してその細胞体に輸送することができる（３１、４２、４７、４８）。一度ｔｒｋＣに結合したこのモノクローナル抗体が、逆行して輸送され、運動ニューロンの細胞体に直接の効果を与え得るかどうかを知ることは大きな関心の的となるはずである。正確な部位およびｔｒｋＣ抗体によって発揮される作用様式は、疑いなくさらなる研究が待たれる。
【０１５５】
横隔膜電気活性
ＳＭＡＲＤ１患者では、横隔膜の麻痺が生後最初の１３カ月の間に現れるが（２）、ｎｍｄマウスでは、比較的遅くに呼吸異常が現れる（１０）。疾患の最終段階（Ｐ１５０〜２３０）の際の横隔膜の機能状態を評価するために、変異マウスの横隔膜の自発性の電気活性をｉｎ  ｖｉｖｏで記録した。麻酔下のマウスでは、対照と突然変異体同腹仔との平均呼吸回数に差は見られなかったが、本発明者らは、吸息持続時間（ＴＩ）の２６％の短縮と、それに付随する、横隔膜強度のある種の低下を生み出す場合もある各吸息バーストの際の活動電位数の減少を見出した。電気的な活性のない帯域と探査電極の位置決め誤りを識別するのが困難であったので、その記録から、横隔膜内に機能していない領域があるかどうかを見分けることはできない（方法を参照されたい）。最近では、ｎｍｄマウス横隔膜中の大量の筋障害性変化の存在が記載されている（１１）。さらに、これらのマウスは、二次的に呼吸困難の一因となり得るうっ血性心不全および筋ジストロフィー様の表現型も患う（１０）。しかし、有髄の軸索数は、非常に高週齢のｎｍｄマウス（３８週齢）では減少しなかったが、これは１４週齢ｎｍｄマウスで見られたものに従うものであり（１１）、ある量の全長機能性のＩＧＨＭＢＰ２タンパク質の発現に一致するものである（９）。
【０１５６】
要するに、本発明者らは、ｎｍｄマウスへのＭａｂ２２５６処置が、著しいが一過性の筋力の改善、ならびに高頻度の神経刺激の際の神経筋の機能低下量の正常化を生じたことを発見した。この効果の作用機序を解明する別の研究、ならびに神経筋接合部での神経伝達の際のシナプス前およびシナプス後の事象のより完全な特徴付けは、我々がｎｍｄマウスにおける神経筋の欠陥、運動ニューロン中のＩＧＨＭＢＰ２の生理的役割を理解し、このひどい疾患の合理的な治療手法を探索する助けとなるはずである。
【０１５７】
材料および方法
マウスの繁殖および遺伝子型
Ｂ６．ＢＬＫＳ−ｎｍｄ２ＪマウスをＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから入手した。ｎｍｄ２Ｊについてヘテロ接合体のマウスを交雑し、野生型、ヘテロ接合体、および突然変異体マウスを実験に使用した。マウスを繁殖させ、突然変異体については食物および水をケージの床の高さで利用可能にしたことを除き、標準の条件で維持した。
【０１５８】
マウスの遺伝子型を記載されている通りに同定した（９）。簡潔に述べると、（その突然変異についてホモ接合性である）ｎｍｄマウスの表現型の原因である点突然変異は、野生型マウスには存在しない新しいＤｄｅＩ制限部位を生じる。罹患していない子孫の中の保因動物（ｃａｒｒｉｅｒ）を特定するＰＣＲアッセイは、突然変異が存在する６９４ｂｐのＰＣＲ産物を増幅する、順方向プライマー：５’−ＧＣＴＧＧＡＡＡＣＧＡＴＣＡＣＡＴＡＣＣＧ−３’および逆方向プライマー：５’−ＡＧＣＴＣＣＴＧＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧ−３’の２種のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて実施した。
【０１５９】
マウスの処置
両方の性別のコード化された同腹仔マウスのランダムな群に、モノクローナル抗体Ｍａｂ２２５６（５ｍｇ／体重ｋｇ、週２回、２０〜２１日齢から；Ｒｉｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、米カリフォルニア州パロアルト）、ヒト組換え型ＮＴ−４／５（５ｍｇ／体重ｋｇ、週２回、２１日齢から；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ、米カリフォルニア州サンフランシスコ）、またはＰＢＳのいずれかを腹腔内注射した。すべての動物処置は、制度上の指針および認可に従って実施した。
【０１６０】
受容体チロシンリン酸化アッセイ
Ｍａｂ２２５６のアゴニスト活性は、細胞に基づくｔｒｋＣ受容体チロシンリン酸化アッセイで、以前に記載されている通りに評価した（１６）。Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ、米サンディエゴ）を使用する非線形カーブフィッティングによって、最大半有効濃度を推定した。
【０１６１】
胚三叉神経ニューロン生存アッセイ
Ｅ１２  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットから、三叉神経ニューロンの分離した培養物を樹立した。解体した神経節をトリプシン処理し、摩砕によって分断した（４９）。ニューロンを、９６ウェル組織培養プレート中のポリオルニチン／ラミニン基層上の限定された無血清培地に低密度で播いた。プレーティング時に、様々な濃度のＮＴ３およびＭａｂ２２５６抗体を、それぞれ３通りおよび４通りにして培養物に加えた。異なるそれぞれの条件下でのニューロンの生存を定量化するために、プレーティングから４８時間後に生存していたニューロン数をカウントした。Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＧｒａｐｈＰａｄ、サンディエゴ）を使用する非線形カーブフィッティングによって、最大半量有効濃度を推定した。
【０１６２】
薬物動態研究
メスの成体ＣＤ−１マウス（ｎ＝３）にＭａｂ２２５６を２ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。次いで、注射してから２４、４８、１３６、および１８４時間後に動物の採血を行った。各時点でのＭａｂ２２５６の血清濃度を以下で述べる通りに測定した。
【０１６３】
モノクローナル抗体濃度の測定
マウスモノクローナル抗体Ｍａｂ２２５６の血清レベルは、標準のサンドイッチＥＬＩＳＡによって測定した。９６ウェルＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ）に、ＨＥＫ２９３細胞への一過性の形質移入によって発現させた組換え型ヒトｔｒｋＣ細胞外ドメイン−ＩｇＧ  Ｆｃ融合タンパク質（Ｒｉｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ）をプロテインＡカラムで精製したもの０．２ｍｇ／ｍＬを一晩かけて４℃で予め吸収させた。次いで、ｔｒｋＣコートされたプレートを、０．５％のウシ血清アルブミンおよび０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で２５℃で１時間かけてブロックした。プレートを、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで３回洗浄した。Ｍａｂ２２５６の標準の希釈系列、ならびに適切に希釈した血清サンプルをプレートに入れて２５℃で１時間インキュベートした後、３回洗浄した。西洋わさびペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）を１：５０００で適用し、２５℃で１時間インキュベートして、結合したマウスモノクローナル抗体を検出した。最後に、ＨＲＰとＴＭＢ基質（ＫＰＬ、デンマーク）の比色反応によってシグナルを検出した。
【０１６４】
神経学的試験
突然変異体および同腹仔対照マウスに標準の神経学的検査を行い、神経筋の欠陥の発生および拡大を定量化した（ＳＨＩＲＰＡプロトコル；ｗｗｗ．ｍｇｕ．ｈａｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ｍｕｔａｂａｓｅ／ｓｈｉｒｐａ＿ｓｕｍｍａｒｙ．ｈｔｍｌ）（５０）。平衡能測定では、マウスを尾から吊り下げて四角い薄い棒切れの上に降ろし、逆立ちさせた。次いで、棒切れを１０秒間１秒毎に手で回転させ、マウスが棒切れに留まる能力を秒数で測定した。
【０１６５】
前肢握力については、マウスを水平な針金の上に保持し、降ろして前肢で針金を握らせるようにした。マウスが前肢によってつながっている能力を１０秒間にわたり記録した。
【０１６６】
筋電図検査（ＥＭＧ）
以前に記載されている通り（１８）に、麻酔下（１００ｍｇ／Ｋｇケタミン＋１０ｍｇ／Ｋｇキシラジン）のＰ７０の野生型およびｎｍｄマウスからの筋肉内複合活動電位（ＣＭＡＰ）を記録した。簡潔に述べると、記録針電極を、第５指骨の基部に不関電極を添えて背側の足筋中に置き、または腓腹筋の内側部分（ＭＧ）中に置いた。アース電極を尾の付け根に置いた。刺激針電極を坐骨の切込みおよび腓骨上部に置いた。過最大電流パルスの刺激プロトコル（持続時間０．０５ｍｓ、振幅５ｍＡ）を単一パルスまたは１０、２０、５０、および１００Ｈｚの短い持続時間のパルス列として適用した。刺激パルスは、孤立したパルス刺激装置（Ａ−ＭＳｙｓｔｅｍｓ、２１００モデル）によって作成した。記録された出力を示差的に増幅し（Ｂｒｏｗｎｌｅｅ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ、２１０Ａモデル）、２００００サンプル／秒でデジタル方式で取得し（ＡＤＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、ＰｏｗｅｒＬａｂ／４ＳＰ）、後の分析に向けてコンピュータに保存した。
【０１６７】
ＭＧからの運動単位数推定（ＭＵＮＥ）は、全運動単位の和である最大ＣＭＡＰを単一の運動単位電位の平均サイズで割ることによって算出した。単一の運動単位電位のサンプリングは、精密に制御された電流を、１０回の応答が漸進的に補充されるまで閾値下のレベルから非常に小さな歩幅で適用するものである漸増法（５１、５２）によって行った。各電流振幅を３回適用し、安定であるとみなされたので、それらが同一であったなら受け入れた。個々の運動単位振幅は、各応答の振幅を以前の応答の振幅から差し引いて得た。個々の値の平均が単一の運動単位活動電位（ＳＭＵＡＰ）サイズの推定となった。
【０１６８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ横隔膜記録は、針電極を、中線からわずかにそれた剣状突起の後ろでどちらかの部位に挿入して実施した。不関電極を胸の上、アース電極を尾の付け根に置いた。横隔膜は、呼吸と同時に起こるリズミカルなバーストの発生によって容易に確認された。ピーク振幅および記録の積分による面積によって吸息を定量化した。吸息持続時間（ＴＩ）も分析した。６連続の呼吸サイクルから平均値を算出した。
【０１６９】
研究は、コード化されたマウスを用い、どのマウスを試験しているかについて筋電図記録者は盲検化されるように実施した。
【０１７０】
すべてのデータは平均±ＳＥＭとして報告する。統計学的有意性は、スチューデントのｔ検定を使用して評価した。統計学的有意性判定のための判定基準レベルは、すべての実験についてＰ＜０．０５に設定した。
【０１７１】
組織像
マウスを過量のケタミン／キシラジンで屠殺し、右側横隔神経を、その横隔膜筋への入口近くで採取した。神経を、４％のパラホルムアルデヒドおよび２．５％のグルタルアルデヒドのＰＢＳ中固定液で固定し、次いで２％の四酸化オスミウムで固定した後、ｓｐｕｒｒ樹脂中に包埋した（プラスチック包埋）。厚さ２μｍの切片をトルイジンブルーで染色し、光学顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ３５、Ｚｅｉｓｓ）で調べた。各神経について有髄の軸索をカウントした。
【０１７２】
前述の発明は、理解を明確にする目的で図解および例として若干詳細に記載してきたが、ある種の変更および修正を実行してもよいことは当業者には明白となろう。したがって、その記述および例は、添付の請求項によって叙述される本発明の範囲を限定するものと解釈すべきでない。
【０１７３】
参考文献
１．Ｌｅｆｅｂｖｒｅ，Ｓ．、Ｂｕｒｇｌｅｎ，Ｌ．、Ｒｅｂｏｕｌｌｅｔ，Ｓ．、Ｃｌｅｒｍｏｎｔ，Ｏ．、Ｂｕｒｌｅｔ，Ｐ．、Ｖｉｏｌｌｅｔ，Ｌ．、Ｂｅｎｉｃｈｏｕ，Ｂ．、Ｃｒｕａｕｄ，Ｃ．、Ｍｉｌｌａｓｓｅａｕ，Ｐ．、Ｚｅｖｉａｎｉ，Ｍ．ら（１９９５年）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｇｅｎｅ」、Ｃｅｌｌ、第８０巻、１５５〜６５ページ
２．Ｇｒｏｈｍａｎｎ，Ｋ．、Ｗｉｅｎｋｅｒ，Ｔ．Ｆ．、Ｓａａｒ，Ｋ．、Ｒｕｄｎｉｋ−Ｓｃｈｏｎｅｂｏｒｎ，Ｓ．、Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ−Ｄｉｄｉｎｇｅｒ，Ｇ．、Ｒｏｓｓｉ，Ｒ．、Ｎｏｖｅｌｌｉ，Ｇ．、Ｎｕｒｎｂｅｒｇ，Ｇ．、Ｐｆｅｕｆｅｒ，Ａ．、Ｗｉｒｔｈ，Ｂ．ら（１９９９年）、「Ｄｉａｐｈｒａｇｍａｔｉｃ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｉｓ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｏｕｓ，ａｎｄ  ｏｎｅ  ｆｏｒｍ  Ｉｓ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｏ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １１ｑ１３−ｑ２１」、Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ、第６５巻、１４５９〜６２ページ
３．Ｇｒｏｈｍａｎｎ，Ｋ．、Ｓｃｈｕｅｌｋｅ，Ｍ．、Ｄｉｅｒｓ，Ａ．、Ｈｏｆｆｍａｎｎ，Ｋ．、Ｌｕｃｋｅ，Ｂ．、Ａｄａｍｓ，Ｃ．、Ｂｅｒｔｉｎｉ，Ｅ．、Ｌｅｏｎｈａｒｄｔ−Ｈｏｒｔｉ，Ｈ．、Ｍｕｎｔｏｎｉ，Ｆ．、Ｏｕｖｒｉｅｒ，Ｒ．ら（２００１年）、「Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  ｍｕ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ２  ｃａｕｓｅ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｔｙｐｅ  １」、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ、第２９巻、７５〜７ページ
４．Ｇｒｏｈｍａｎｎ，Ｋ．、Ｖａｒｏｎ，Ｒ．、Ｓｔｏｌｚ，Ｐ．、Ｓｃｈｕｅｌｋｅ，Ｍ．、Ｊａｎｅｔｚｋｉ，Ｃ．、Ｂｅｒｔｉｎｉ，Ｅ．、Ｂｕｓｈｂｙ，Ｋ．、Ｍｕｎｔｏｎｉ，Ｆ．、Ｏｕｖｒｉｅｒ，Ｒ．、Ｖａｎ  Ｍａｌｄｅｒｇｅｍ，Ｌ．ら（２００３年）、「Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｔｙｐｅ  １（ＳＭＡＲＤ１）」、Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、第５４巻、７１９〜２４ページ
５．Ｐｉｔｔ，Ｍ．、Ｈｏｕｌｄｅｎ，Ｈ．、Ｊａｃｏｂｓ，Ｊ．、Ｍｏｋ，Ｑ．、Ｈａｒｄｉｎｇ，Ｂ．、Ｒｅｉｌｌｙ，Ｍ．、およびＳｕｒｔｅｅｓ，Ｒ．（２００３年）、「Ｓｅｖｅｒｅ  ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｐｈｒａｇｍａｔｉｃ  ｗｅａｋｎｅｓｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ＳＭＡＲＤ１」、Ｂｒａｉｎ、第１２６巻、２６８２〜９２ページ
６．Ｗｉｒｔｈ，Ｂ．（２０００年）、「Ａｎ  ｕｐｄａｔｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｇｅｎｅ（ＳＭＮ１）ｉｎ  ａｕｔｏｓｏｍａｌ  ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ（ＳＭＡ）」、Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ、第１５巻、２２８〜３７ページ
７．Ｍｅｒｃｕｒｉ，Ｅ．、Ｂｅｒｔｉｎｉ，Ｅ．、Ｍｅｓｓｉｎａ，Ｓ．、Ｐｅｌｌｉｃｃｉｏｎｉ，Ｍ．、Ｄ’Ａｍｉｃｏ，Ａ．、Ｃｏｌｉｔｔｏ，Ｆ．、Ｍｉｒａｂｅｌｌａ，Ｍ．、Ｔｉｚｉａｎｏ，Ｆ．Ｄ．、Ｖｉｔａｌｉ，Ｔ．、Ａｎｇｅｌｏｚｚｉ，Ｃ．ら（２００４年）、「Ｐｉｌｏｔ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｐｈｅｎｙｌｂｕｔｙｒａｔｅ  ｉｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ」、Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓｏｒｄ、第１４巻、１３０〜５ページ
８．Ｃｏｏｋ，Ｓ．Ａ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｒ．、Ｂｒｏｎｓｏｎ，Ｒ．Ｔ．、およびＤａｖｉｓｓｏｎ，Ｍ．Ｔ．（１９９５年）、「Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ｎｍｄ）：ａ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｍｏｕｓｅ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １９  ｔｈａｔ  ｃａｕｓｅｓ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ、第６巻、１８７〜９１ページ
９．Ｃｏｘ，Ｇ．Ａ．、Ｍａｈａｆｆｅｙ，Ｃ．Ｌ．、およびＦｒａｎｋｅｌ，Ｗ．Ｎ．（１９９８年）、「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｓｅｃｏｎｄ  ｓｉｔｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ａｌｌｅｌｅ」、Ｎｅｕｒｏｎ、第２１巻、１３２７〜３７ページ
１０．Ｍａｄｄａｔｕ，Ｔ．Ｐ．、Ｇａｒｖｅｙ，Ｓ．Ｍ．、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ｄ．Ｇ．、Ｈａｍｐｔｏｎ，Ｔ．Ｇ．、およびＣｏｘ，Ｇ．Ａ．（２００４年）、「Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｒｅｓｃｕｅ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｃ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｎｍｄ  ｍｏｕｓｅ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｉｇｈｍｂｐ２  ｉｎ  ｄｉｌａｔｅｄ  ｃａｒｄｉｏｍｙｏｐａｔｈｙ」、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ、第１３巻、１１０５〜１５ページ
１１．Ｇｒｏｈｍａｎｎ，Ｋ．、Ｒｏｓｓｏｌｌ，Ｗ．、Ｋｏｂｓａｒ，Ｉ．、Ｈｏｌｔｍａｎｎ，Ｂ．、Ｊａｂｌｏｎｋａ，Ｓ．、Ｗｅｓｓｉｇ，Ｃ．、Ｓｔｏｌｔｅｎｂｕｒｇ−Ｄｉｄｉｎｇｅｒ，Ｇ．、Ｆｉｓｃｈｅｒ，Ｕ．、Ｈｕｂｎｅｒ，Ｃ．、Ｍａｒｔｉｎｉ，Ｒ．ら（２００４年）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｇｈｍｂｐ２  ｉｎ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｉｎ  ａ  ｍｏｕｓｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ａｔｒｏｐｈｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｄｉｓｔｒｅｓｓ  ｔｙｐｅ１（ＳＭＡＲＤ１）」、Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ
１２．Ａｒａｋａｗａ，Ｙ．、Ｓｅｎｄｔｎｅｒ，Ｍ．、およびＴｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．（１９９０年）、「Ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ（ＣＮＴＦ）ｏｎ  ｃｈｉｃｋ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｃｕｌｔｕｒｅ：ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｔｈ  ｏｔｈｅｒ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第１０巻、３５０７〜１５ページ
１３．Ｓｅｎｄｔｎｅｒ，Ｍ．、Ｋｒｅｕｔｚｂｅｒｇ，Ｇ．Ｗ．、およびＴｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．（１９９０年）、「Ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｔｈｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ａｘｏｔｏｍｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、第３４５巻、４４０〜１ページ
１４．Ｓｅｎｄｔｎｅｒ，Ｍ．、Ｓｃｈｍａｌｂｒｕｃｈ，Ｈ．、Ｓｔｏｃｋｌｉ，Ｋ．Ａ．、Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｐ．、Ｋｒｅｕｔｚｂｅｒｇ，Ｇ．Ｗ．、およびＴｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．（１９９２年）、「Ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｙ」、Ｎａｔｕｒｅ、第３５８巻、５０２〜４ページ
１５．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．、Ｃａｍｕ，Ｗ．、Ｍｅｔｔｌｉｎｇ，Ｃ．、Ｇｏｕｉｎ，Ａ．、Ｐｏｕｌｓｅｎ，Ｋ．、Ｋａｒｉｈａｌｏｏ，Ｍ．、Ｒｕｌｌａｍａｓ，Ｊ．、Ｅｖａｎｓ，Ｔ．、ＭｃＭａｈｏｎ，Ｓ．Ｂ．、Ａｒｍａｎｉｎｉ，Ｍ．Ｐ．ら（１９９３年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ａｒｅ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｌｉｍｂ  ｂｕｄ」、Ｎａｔｕｒｅ、第３６３巻、２６６〜７０ページ
１６．Ｓａｄｉｃｋ，Ｍ．Ｄ．、Ｇａｌｌｏｗａｙ，Ａ．、Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｄ．、Ｈａｌｅ，Ｖ．、Ｗｅｃｋ，Ｓ．、Ａｎｉｃｅｔｔｉ，Ｖ．、およびＷｏｎｇ，Ｗ．Ｌ．（１９９７年）、「Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ／ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｇＤ−ｆｌａｇ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ（ｇＤ．ＫＩＲＡ）ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ」、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、第２３４巻、３５４〜６１ページ
１７．Ｐｏｄｕｓｌｏ，Ｊ．Ｆ．およびＣｕｒｒａｎ，Ｇ．Ｌ．（１９９６年）、「Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ  ａｔ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ−ｎｅｒｖｅ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ：ＮＧＦ，ＣＮＴＦ，ＮＴ−３，ＢＤＮＦ」、Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ  Ｍｏｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、第３６巻、２８０〜６ページ
１８．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ−Ｃｈａｃｏｎ，Ｒ．、Ｗｏｌｆｅｌ，Ｍ．、Ｎｉｓｈｉｍｕｎｅ，Ｈ．、Ｔａｂａｒｅｓ，Ｌ．、Ｓｃｈｍｉｔｚ，Ｆ．、Ｃａｓｔｅｌｌａｎｏ−Ｍｕｎｏｚ，Ｍ．、Ｒｏｓｅｎｍｕｎｄ，Ｃ．、Ｍｏｎｔｅｓｉｎｏｓ，Ｍ．Ｌ．、Ｓａｎｅｓ，Ｊ．Ｒ．、Ｓｃｈｎｅｇｇｅｎｂｕｒｇｅｒ，Ｒ．ら（２００４年）、「Ｔｈｅ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｖｅｓｉｃｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＣＳＰ  ａｌｐｈａ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｐｒｅｓｙｎａｐｔｉｃ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ」、Ｎｅｕｒｏｎ、第４２巻、２３７〜５１ページ
１９．Ｓａｇｏｔ，Ｙ．、Ｖｅｊｓａｄａ，Ｒ．、およびＫａｔｏ，Ａ．Ｃ．（１９９７年）、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ：ａｎｉｍａｌ  ｍｏｄｅｌｓ，ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｂｃｌ−２  ｏｎｃｏｐｒｏｔｅｉｎ」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ、第１８巻、３３０〜７ページ
２０．Ｍｉｔｓｕｍｏｔｏ，Ｈ．、Ｉｋｅｄａ，Ｋ．、Ｋｌｉｎｋｏｓｚ，Ｂ．、Ｃｅｄａｒｂａｕｍ，Ｊ．Ｍ．、Ｗｏｎｇ，Ｖ．、およびＬｉｎｄｓａｙ，Ｒ．Ｍ．（１９９４年）、「Ａｒｒｅｓｔ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  ｗｏｂｂｌｅｒ  ｍｉｃｅ  ｃｏｔｒｅａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ＣＮＴＦ  ａｎｄ  ＢＤＮＦ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６５巻、１１０７〜１０ページ
２１．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｒ．Ｇ．、Ｐｅｔａｊａｎ，Ｊ．Ｈ．、Ｂｒｙａｎ，Ｗ．Ｗ．、Ａｒｍｏｎ，Ｃ．、Ｂａｒｏｈｎ，Ｒ．Ｊ．、Ｇｏｏｄｐａｓｔｕｒｅ，Ｊ．Ｃ．、Ｈｏａｇｌａｎｄ，Ｒ．Ｊ．、Ｐａｒｒｙ，Ｇ．Ｊ．、Ｒｏｓｓ，Ｍ．Ａ．、およびＳｔｒｏｍａｔｔ，Ｓ．Ｃ．（１９９６年）、「Ａ  ｐｌａｃｅｂｏ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ（ｒｈＣＮＴＦ）ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、ｒｈＣＮＴＦ  ＡＬＳ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ．Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ、第３９巻、２５６〜６０ページ
２２．Ｔｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．およびＳｅｎｄｔｎｅｒ，Ｍ．（２００２年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ：ｆｒｏｍ  ｅｎｔｈｕｓｉａｓｔｉｃ  ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｏｂｅｒｉｎｇ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅｓ  ｔｏ  ｒａｔｉｏｎａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」、Ｎａｔ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第５巻増刊、１０４６〜５０ページ
２３．Ｄｉｅｎｅｒ，Ｐ．Ｓ．およびＢｒｅｇｍａｎ，Ｂ．Ｓ．（１９９４年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｔｈｅ  ｄｅａｔｈ  ｏｆ  ＣＮＳ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ａｆｔｅｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｌｅｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｅｗｂｏｒｎ  ｒａｔｓ」、Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ、第５巻、１９１３〜７ページ
２４．Ｖｅｊｓａｄａ，Ｒ．、Ｓａｇｏｔ，Ｙ．、およびＫａｔｏ，Ａ．Ｃ．（１９９５年）、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｒｅｓｃｕｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｎ  ａｘｏｔｏｍｉｚｅｄ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第７巻、１０８〜１５ページ
２５．Ｓａｇｏｔ，Ｙ．、Ｔａｎ，Ｓ．Ａ．、Ｂａｅｔｇｅ，Ｅ．、Ｓｃｈｍａｌｂｒｕｃｈ，Ｈ．、Ｋａｔｏ，Ａ．Ｃ．、およびＡｅｂｉｓｃｈｅｒ，Ｐ．（１９９５年）、「Ｐｏｌｙｍｅｒ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｔｏ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｃｉｌｉａｒｙ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｃａｎ  ｓｌｏｗ  ｄｏｗｎ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ」、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第７巻、１３１３〜２２ページ
２６．Ｈａａｓｅ，Ｇ．、Ｋｅｎｎｅｌ，Ｐ．、Ｐｅｔｔｍａｎｎ，Ｂ．、Ｖｉｇｎｅ，Ｅ．、Ａｋｌｉ，Ｓ．、Ｒｅｖａｈ，Ｆ．、Ｓｃｈｍａｌｂｒｕｃｈ，Ｈ．、およびＫａｈｎ，Ａ．（１９９７年）、「Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｕｓｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、第３巻、４２９〜３６ページ
２７．Ｂｉｂｅｌ，Ｍ．およびＢａｒｄｅ，Ｙ．Ａ．（２０００年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ：ｋｅｙ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ  ａｎｄ  ｃｅｌｌ  ｓｈａｐｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ」、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ、第１４巻、２９１９〜３７ページ
２８．Ｋｎｕｓｅｌ，Ｂ．、Ｇａｏ，Ｈ．、Ｏｋａｚａｋｉ，Ｔ．、Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｔ．、Ｍｏｒｉ，Ｎ．、Ｈｅｆｔｉ，Ｆ．、およびＫａｐｌａｎ，Ｄ．Ｒ．（１９９７年）、「Ｌｉｇａｎｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄｏｗｎ−ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｒｋ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ、ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｎｄ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｃｏｒｔｉｃａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ」、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、第７８巻、８５１〜６２ページ
２９．Ｓｅｎｄｔｎｅｒ，Ｍ．（１９９７年）、「Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、第３巻、３８０〜１ページ
３０．Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｒ．Ｗ．（１９９６年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｆｏｒ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ：ａｎ  ｅｍｂａｒｒａｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｉｃｈｅｓ」、Ｎｅｕｒｏｎ、第１７巻、１９５〜７ページ
３１．Ｙａｎ，Ｑ．、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．Ｌ．、Ｍａｔｈｅｓｏｎ，Ｃ．、Ｓｕｎ，Ｊ．、Ｚｈａｎｇ，Ｌ．、Ｍｕ，Ｘ．、Ｒｅｘ，Ｋ．Ｌ．、およびＳｎｉｄｅｒ，Ｗ．Ｄ．（１９９３年）、「Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ｏｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ、第２４巻、１５５５〜７７ページ
３２．Ｄｕｂｅｒｌｅｙ，Ｒ．Ｍ．、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｉ．Ｐ．、Ａｎａｎｄ，Ｐ．、Ｌｅｉｇｈ，Ｐ．Ｎ．、およびＣａｉｒｎｓ，Ｎ．Ｊ．（１９９７年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−３−ｌｉｋｅ  ｉｍｍｕｎｏｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  Ｔｒｋ  Ｃ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｅｓ  ｉｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ、第１４８巻、３３〜４０ページ
３３．Ｗａｎｇ，Ｔ．、Ｘｉｅ，Ｋ．、およびＬｕ，Ｂ．（１９９５年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｓｙｎａｐｓｅｓ」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第１５巻、４７９６〜８０５ページ
３４．Ｌｉｏｕ，Ｊ．Ｃ．およびＦｕ，Ｗ．Ｍ．（１９９７年）、「Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｑｕａｎｔａｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｂｙ  ｐｏｓｔｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＮＴ−３」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第１７巻、２４５９〜６８ページ
３５．Ｓｅｎｄｔｎｅｒ，Ｍ．（１９９８年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｉｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｐｌａｔｅ」、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ、第９巻、１〜７ページ
３６．Ｐｏｏ，Ｍ．Ｍ．（２００１年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ａｓ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ」、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第２巻、２４〜３２ページ
３７．Ｌｏｈｏｆ，Ａ．Ｍ．、Ｉｐ，Ｎ．Ｙ．、およびＰｏｏ，Ｍ．Ｍ．（１９９３年）、「Ｐｏｔｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ＮＴ−３  ａｎｄ  ＢＤＮＦ」、Ｎａｔｕｒｅ、第３６３巻、３５０〜３ページ
３８．Ｋａｎｇ，Ｈ．およびＳｃｈｕｍａｎ，Ｅ．Ｍ．（１９９５年）、「Ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｄｕｌｔ  ｈｉｐｐｏｃａｍｐｕｓ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６７巻、１６５８〜６２ページ
３９．Ｌｏｅｂ，Ｊ．Ａ．およびＦｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｇ．Ｄ．（１９９７年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｖｅｎｔｒａｌ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｎｅｕｒｏｎｓ」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第１７巻、１４１６〜２４ページ
４０．Ｇｒｉｅｓｂｅｃｋ，Ｏ．、Ｐａｒｓａｄａｎｉａｎ，Ａ．Ｓ．、Ｓｅｎｄｔｎｅｒ，Ｍ．、およびＴｈｏｅｎｅｎ，Ｈ．（１９９５年）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ：ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ａｎｄ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ、第４２巻、２１〜３３ページ
４１．Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ，Ｃ．Ｅ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．Ｓ．、Ｐｏｌｌｏｃｋ，Ｒ．Ａ．、Ｄａｖｉｅｓ，Ａ．Ｍ．、Ｌｅｍｅｕｌｌｅ，Ｃ．、Ａｒｍａｎｉｎｉ，Ｍ．、Ｓｉｍｍｏｎｓ，Ｌ．、Ｍｏｆｆｅｔ，Ｂ．、Ｖａｎｄｌｅｎ，Ｒ．Ａ．、Ｓｉｍｐｓｏｎ，Ｌ．Ｃ．ら（１９９４年）、「ＧＤＮＦ：ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎｓ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ」、Ｓｃｉｅｎｃｅ、第２６６巻、１０６２〜４ページ
４２．Ｋｏｌｉａｔｓｏｓ，Ｖ．Ｅ．、Ｃｌａｔｔｅｒｂｕｃｋ，Ｒ．Ｅ．、Ｗｉｎｓｌｏｗ，Ｊ．Ｗ．、Ｃａｙｏｕｅｔｔｅ，Ｍ．Ｈ．、およびＰｒｉｃｅ，Ｄ．Ｌ．（１９９３年）、「Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ａ  ｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ」、Ｎｅｕｒｏｎ、第１０巻、３５９〜６７ページ
４３．Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ，Ｈ．、Ｆｒｉｓｅｎ，Ｊ．、Ｂａｒｂａｎｙ，Ｇ．、Ｔｉｍｍｕｓｋ，Ｔ．、Ｚａｃｈｒｉｓｓｏｎ，Ｏ．、Ｖｅｒｇｅ，Ｖ．Ｍ．、およびＰｅｒｓｓｏｎ，Ｈ．（１９９３年）、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍＲＮＡｓ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ａｆｔｅｒ  ａｘｏｔｏｍｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｃｉａｔｉｃ  ｎｅｒｖｅ」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、第１２３巻、４５５〜６５ページ
４４．Ｌｏｅｂ，Ｊ．Ａ．、Ｈｍａｄｃｈａ，Ａ．、Ｆｉｓｃｈｂａｃｈ，Ｇ．Ｄ．、Ｌａｎｄ，Ｓ．Ｊ．、およびＺａｋａｒｉａｎ，Ｖ．Ｌ．（２００２年）、「Ｎｅｕｒｅｇｕｌｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｔ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｓｙｎａｐｓｅｓ  ｉｓ  ｍｏｄｕｌａｔｅｄ  ｂｙ  ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第２２巻、２２０６〜１４ページ
４５．Ｂｏｍｍｅｌ，Ｈ．、Ｘｉｅ，Ｇ．、Ｒｏｓｓｏｌｌ，Ｗ．、Ｗｉｅｓｅ，Ｓ．、Ｊａｂｌｏｎｋａ，Ｓ．、Ｂｏｅｈｍ，Ｔ．、およびＳｅｎｄｔｎｅｒ，Ｍ．（２００２年）、「Ｍｉｓｓｅｎｓｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｂｕｌｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  Ｅ（Ｔｂｃｅ）ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｕｓｅ  ｍｕｔａｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｏｐａｔｈｙ，ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、第１５９巻、５６３〜９ページ
４６．Ｓａｇｏｔ，Ｙ．、Ｒｏｓｓｅ，Ｔ．、Ｖｅｊｓａｄａ，Ｒ．、Ｐｅｒｒｅｌｅｔ，Ｄ．、およびＫａｔｏ，Ａ．Ｃ．（１９９８年）、「Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒｓ  ｏｎ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ  ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｏｔｏｎｅｕｒｏｎ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第１８巻、１１３２〜４１ページ
４７．ＤｉＳｔｅｆａｎｏ，Ｐ．Ｓ．、Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｂ．、Ｒａｄｚｉｅｊｅｗｓｋｉ，Ｃ．、Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｃ．、Ｂｏｌａｎｄ，Ｐ．、Ｓｃｈｉｃｋ，Ｃ．Ｍ．、Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．Ｍ．、およびＷｉｅｇａｎｄ，Ｓ．Ｊ．（１９９２年）、「Ｔｈｅ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎｓ  ＢＤＮＦ，ＮＴ−３，ａｎｄ  ＮＧＦ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｏｆ  ｒｅｔｒｏｇｒａｄｅ  ａｘｏｎａｌ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｎｄ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｕｒｏｎｓ」、Ｎｅｕｒｏｎ、第８巻、９８３〜９３ページ
４８．Ｙａｎ，Ｑ．、Ｅｌｌｉｏｔｔ，Ｊ．、およびＳｎｉｄｅｒ，Ｗ．Ｄ．（１９９２年）、「Ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｓｃｕｅｓ  ｓｐｉｎａｌ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎｓ  ｆｒｏｍ  ａｘｏｔｏｍｙ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ」、Ｎａｔｕｒｅ、第３６０巻、７５３〜５ページ
４９．Ｄａｖｉｅｓ，Ａ．Ｍ．、Ｈｏｒｔｏｎ，Ａ．、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｌ．Ｅ．、Ｓｃｈｍｅｌｚｅｒ，Ｃ．、Ｖａｎｄｌｅｎ，Ｒ．、およびＲｏｓｅｎｔｈａｌ，Ａ．（１９９３年）、「Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｎ−４／５  ｉｓ  ａ  ｍａｍｍａｌｉａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｆａｃｔｏｒ  ｆｏｒ  ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｅｎｓｏｒｙ  ｎｅｕｒｏｎｓ」、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、第１３巻、４９６１〜７ページ
５０．Ｒｏｇｅｒｓ，Ｓ．Ｄ．、Ｄｅｍａｓｔｅｒ，Ｅ．、Ｃａｔｔｏｎ，Ｍ．、Ｇｈｉｌａｒｄｉ，Ｊ．Ｒ．、Ｌｅｖｉｎ，Ｌ．Ａ．、Ｍａｇｇｉｏ，Ｊ．Ｅ．、およびＭａｎｔｙｈ，Ｐ．Ｗ．（１９９７年）、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉｎ−Ｂ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｂｙ  ｇｌｉａ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ａｆｔｅｒ  ＣＮＳ  ｉｎｊｕｒｙ  ｉｎ  ｒａｔｓ，ｒａｂｂｉｔｓ，ａｎｄ  ｈｕｍａｎｓ」、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ、第１４５巻、１８０〜９５ページ
５１．ＭｃＣｏｍａｓ，Ａ．Ｊ．（１９９１年）、「Ｍｏｔｏｒ  ｕｎｉｔ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ：ｍｅｔｈｏｄｓ，ｒｅｓｕｌｔｓ，ａｎｄ  ｐｒｅｓｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ」、Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ、第１４巻、５８５〜９７ページ
５２．Ｓｈｅｆｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．およびＧｏｏｃｈ，Ｃ．Ｌ．（２００２年）、「Ｍｏｔｏｒ  ｕｎｉｔ  ｎｕｍｂｅｒ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ」、Ａｄｖ  Ｎｅｕｒｏｌ、第８８巻、３３〜５２ページ
５３．Ｒｕｉｚ，Ｒ．、Ｌｉｎ，Ｊ．、Ｆｏｒｇｉｅ，Ａ．、Ｆｏｌｅｔｔｉ，Ｄ．、Ｓｈｅｌｔｏｎ，Ｄ．、Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ａ．、およびＴａｂａｒｅｓ，Ｌ．（２００５年）、「Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ｔｒｋＣ  ａｇｏｎｉｓｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｄｅｌａｙｓ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（ｎｍｄ）ｍｉｃｅ」、Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、第１４巻、１８２５〜１８３７ページ
【０１７４】
略語
ＢＤＮＦ：脳由来神経栄養因子
ｂｐｍ：１分あたりの呼吸数
ＣＭＡＰ：複合筋活動電位
ＣＮＴＦ：繊毛様神経栄養因子
ＧＤＮＦ：グリア細胞由来神経栄養因子
ＭＧ：内側腓腹筋
ＩＧＨＭＢＰ２：免疫グロブリンμ結合タンパク質２遺伝子
ｎｍｄ：神経筋変性
ＭＵＮＥ：運動単位数推定
ＮＧＦ：神経成長因子
ＮＭＪ：神経筋接合部
ＮＴ−３：ニューロトロフィン３
ＮＴ−４／５：ニューロトロフィン４／５
ＳＭＡ：脊髄性筋萎縮症
ＳＭＡＲＤ１：脊髄性筋萎縮症１型
ＳＭＮ：生存運動神経細胞遺伝子
ＳＭＵＡＰ：単一運動単位活動電位
ＴＩ：吸息時間
ｔｒｋＡ：チロシンキナーゼ受容体Ａ
ｔｒｋＢ：チロシンキナーゼ受容体Ｂ
ｔｒｋＣ：チロシンキナーゼ受容体Ｃ
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】モノクローナル抗体Ｍａｂ２２５６がｔｒｋＣ受容体を活性化し、培養物中の三叉神経ニューロンの生存を支え得ることを示すグラフである。（Ａ）漸増濃度のＮＴ３（左パネル）、すなわち内因性のｔｒｋＣリガンド、またはモノクローナル抗体Ｍａｂ２２５６（右パネル）、すなわちｔｒｋＣ抗体によって、増大し飽和状態になるレベルのｔｒｋＣ受容体のリン酸化（ＯＤ４５０で示す、ｙ軸）が誘発された。（Ｂ）培養物で４８時間生存するラット胚三叉神経ニューロン数は、培地中の様々な濃度のＮＴ３（左パネル）またはＭａｂ２２５６（右パネル）の存在によって支えられて増加し、飽和状態になった。
【図２】ｎｍｄマウスの疾患徴候および寿命を示すグラフおよび図である。（Ａ）Ｐ２０〜Ｐ７０の野生型（＋／＋）（ｎ＝８）、ｎｍｄ（−／−）（ｎ＝８）、およびヘテロ接合体（＋／−）（ｎ＝８）マウスの平均体重。（Ｂ）モノクローナル抗体Ｍａｂ２２５６を腹腔内注射した３〜１１週の野生型（＋／＋Ａｂ）（ｎ＝１０）およびｎｍｄマウス（−／−Ａｂ）（ｎ＝１６）の平均体重。（Ｃ〜Ｄ）ＰＢＳを注射した野生型（＋／＋、空の記号）（ｎ＝１４）、ヘテロ接合体（＋／−、灰色の記号）（ｎ＝８）、およびｎｍｄ（−／−、塗りつぶされた四角形）（ｎ＝５）、ならびにＭａｂ２２５６を注射したｎｍｄマウス（−／−Ａｂ、三角形）（ｎ＝９）の前肢握り時間（Ｃ）および棒上での平衡能（Ｄ）。（Ｅ〜Ｆ）棒上での野生型およびＭａｂ２２５６処理した突然変異体。突然変異体は、その尾を使って棒を掴むことができなかったが、それにもかかわらず、自身を回転している棒上に数秒間維持することができた。Ｍａｂ２２５６で処置していないｎｍｄマウスは、自身を１秒より長く棒上に維持することができなかった（表示なし）。（Ｇ）未処置（ｎｍｄ）（ｎ＝３０）およびＭａｂ２２５６処置したｎｍｄ（ｎｍｄ  Ａｂ）（ｎ＝１５）マウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存率分析。マンホイットニーの順位和検定で２つの群について有意差は得られなかった。
【図３】野生型およびｎｍｄマウスの内側腓腹筋（ＭＧ）におけるＣＭＡＰ振幅のＥＭＧ測定から、ｎｍｄマウスにおける神経伝達の効力の低下が明らかになることを示すグラフである。（Ａ）未処置の野生型（＋／＋）（ｎ＝１４）、ＰＢＳを注射したまたは注射していないｎｍｄ（−／−）（ｎ＝９）、Ｍａｂ２２５６で処置した野生型（＋／＋Ａｂ）（ｎ＝８）、Ｍａｂ２２５６で処置したｎｍｄ（−／−Ａｂ）（ｎ＝７）、およびＮＴ−４／５で処置したｎｍｄマウス（−／−ＮＴ４／５）（ｎ＝３）における、過最大の刺激に応答してのＣＭＡＰの絶対振幅（平均±ＳＥＭ）。（Ｂ〜Ｃ）野生型（Ｂ）およびｎｍｄマウス（Ｃ）における対パルスプロトコルに対する典型となるＣＭＡＰ応答。刺激間の間隔：１０ｍｓ。経時的なＣＭＡＰのピークからピークまでの振幅（Ａ１およびＡ２）を矢印で表示する。（Ｄ）野生型（上方のトレース）ならびに３種のｎｍｄマウス：未処置（２番目のトレース）、Ｍａｂ２２５６処置（３番目のトレース）、およびＮＴ−４／５処置（４番目のトレース）における、１００Ｈｚでの一続きの刺激の間の典型となる記録。（Ｅ）未処置の野生型マウス（＋／＋）（ｎ＝６）、Ｍａｂ２２５６処置した野生型（＋／＋Ａｂ）（ｎ＝８）、ＰＢＳ注射したｎｍｄ（−／−）（ｎ＝６）、Ｍａｂ２２５６処置したｎｍｄ（−／−Ａｂ）マウス（上方のグラフ、ｎ＝６）、およびＮＴ−４／５処置したマウス（−／−ＮＴ４／５）（下方のグラフ、ｎ＝３）における、１００Ｈｚで２５０ｍｓの一続きの刺激の間の（最初の応答を標準として比較した）ＣＭＡＰ振幅の縮小。（Ｆ）１０〜１００Ｈｚの刺激周波数についての疑似定常状態レベルでのＣＭＡＰ振幅の縮小パーセント。すべてのデータは、Ｐ６９〜７１で行ったＥＭＧ記録からのものである。
【図４】背側の足筋におけるＣＭＡＰ振幅のＥＭＧ測定を示すグラフである。（Ａ）野生型マウスにおいて単一のパルス刺激によって誘発したＭ波およびＨ波。（Ｂ）野生型（＋／＋）（ｎ＝６）およびｎｍｄマウス（−／−）（ｎ＝６）における１０〜１００Ｈｚの刺激周波数についての疑似定常状態レベルでのＣＭＡＰ振幅の縮小パーセント。（Ｃ）野生型マウス（ｎ＝６）およびＰＢＳ注射したｎｍｄ（ｎ＝６）における、１００Ｈｚでの２５０ｍｓの一続きの刺激の間の（最初の応答を標準として比較した）ＣＭＡＰ振幅の縮小の時間経過。すべてのデータは、Ｐ６９〜７１のマウスからのものである。
【図５】Ｐ２１５〜２３０のマウスでのＭＧからの運動単位数推定（ＭＵＮＥ）を示すグラフである。（Ａ〜Ｂ）野生型（Ａ）およびｎｍｄ（Ｂ）マウスの運動単位トレース。（Ｃ〜Ｆ）対照（ＣおよびＥ）ならびにｎｍｄ同胞突然変異体（ＤおよびＦ）マウスにおける、段々と大きさの増す刺激に応答した単一運動単位活動電位（ＳＭＵＡＰ）の振幅。Ｘ軸の各数字は、応答の振幅の増大を誘発した刺激を表す。対照動物はヘテロ接合体であった。
【図６】ｉｎ  ｖｉｖｏで記録した横隔膜の自発性の電気活性を示すグラフである。（ＡおよびＢ）対照（Ａ）およびｎｍｄマウス（Ｂ）の典型となる記録。下方のトレースは未加工の記録であり、上方のトレースは下方のトレースの積分である。円が心臓からの電気活性を表示する。（Ｃ）ＰＢＳ注射した突然変異体（黒色のバー）、およびＭａｂ２２５６処置した突然変異体マウスにおける吸息バーストの平均持続時間（ＴＩ）をｍｓで示すヒストグラム。（Ｄ）対照およびｎｍｄ横隔神経の組織断面。（Ｅ）対照とｎｍｄ同腹仔との有意差を示していない４匹の３８週齢マウスにおける有髄軸索数の定量化。バー：７μｍ。
【図１】
2008539266.tif 000003
【図２】
2008539266.tif 000004
【図３】
2008539266.tif 000005
【図４】
2008539266.tif 000006
【図５】
2008539266.tif 000007
【図６】
2008539266.tif 000008
【配列表】
2008539266000001.app
【国際調査報告】
2008539266.tif 000009
2008539266.tif 000010
2008539266.tif 000011
2008539266.tif 000012