(57)【要約】  本発明は、テルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)の抽出物を含む、医薬組成物のような組成物および食品、ならびにヒトのような哺乳動物における糖尿病、肥満、心血管疾患、癌および関連症状の予防方法または治療方法、ならびにそのための使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物における、肥満、癌、心血管疾患および糖尿病を含む群から選択される疾患の治療方法であって、前記哺乳動物に、有効で非毒性の量の、表1〜24に定義される抽出物から選択される少なくとも１種のテルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)由来の抽出物を投与することを含む前記方法。
【請求項２】
疾患が肥満であり、かつ抽出物がAV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、およびAV016FrDi(65)04(100)からなる群より選択されるまたはその２以上の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
疾患が癌であり、かつ抽出物がAV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)およびAV016BaSu(65)04(100)からなる群より選択されるまたはその２以上の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
疾患が心血管疾患であり、かつ抽出物がAV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、およびAV016BaSu(65)01(100)からなる群より選択されるまたはその２以上の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
疾患が糖尿病であり、かつ抽出物がAV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、AV016BaSu(105)08(100)、AV016FrDi(65)04(100)、およびAV016FrSu(105)08(100)からなる群より選択されるまたはその２以上の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
疾患が糖尿病、肥満および心血管疾患であり、かつ抽出物がAV016BaDi(65)04(100)およびAV016BaDi(28)04(20)からなる群より選択されるまたはこの２種の組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
治療が予防治療である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
糖尿病、肥満、心血管疾患、および癌からなる群より選択される疾患の治療に使用するための医薬製剤であって、テルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)から単離され、かつ表1〜24に記載された抽出物から選択される少なくとも１種の抽出物を、製薬上許容される担体と混合状態で含んでなる前記医薬製剤。
【請求項９】
AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、AV016BaSu(105)08(100)、AV016FrDi(65)04(100)、およびAV016FrSu(105)08(100)からなる群より選択される少なくとも１種の抽出物またはその２以上の組み合わせを含む、糖尿病の治療用の、請求項８に記載の製剤。
【請求項１０】
AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)、およびAV016BaSu(65)04(100)からなる群より選択される少なくとも１種の抽出物あるいはその２以上の組み合わせを含む、癌の治療用の、請求項８に記載の製剤。
【請求項１１】
AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、およびAV016BaSu(65)01(100)からなる群より選択される少なくとも１種の抽出物あるいはその２以上の組み合わせを含む、心血管疾患の治療用の、請求項８に記載の製剤。
【請求項１２】
AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、およびAV016FrDi(65)04(100)からなる群より選択される少なくとも１種の抽出物あるいはその２以上の組み合わせを含む、肥満治療用の、請求項８に記載の製剤。
【請求項１３】
AV016BaDi(65)04(100)およびAV016BaDi(28)04(20)からなる群より選択される少なくとも１種の抽出物またはこの２つの組み合わせを含む、糖尿病、肥満および心血管疾患の治療用の請求項８に記載の製剤。
【請求項１４】
予防用の、請求項８〜１３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項１５】
少なくとも１種の本発明の抽出物、およびそのための製薬上許容される担体を、一緒にすることを含む、医薬製剤の調製方法。
【請求項１６】
表1〜24に記載のHPLCおよび／またはMS特性を有する抽出物からなる群より選択されるテルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)由来の抽出物。
【請求項１７】
表1〜24に記載のHPLCおよび／またはMS特性を有する抽出物からなる群より選択される少なくとも１種のテルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)由来の抽出物を含む食品。
【請求項１８】
少なくとも１種の抽出物を含む、癌の予防用の、請求項１７に記載の食品。
【請求項１９】
少なくとも１種の抽出物を含む、心血管疾患の予防用の、請求項１７に記載の食品。
【請求項２０】
少なくとも１種の抽出物を含む、糖尿病の予防用の、請求項１７に記載の食品。
【請求項２１】
少なくとも１種の抽出物を含む、肥満の予防用の、請求項１７に記載の食品。
【請求項２２】
AV016BaDi(65)04(100)およびAV016BaDi(28)04(20)から選択される少なくとも１種の抽出物を、単独でまたは１以上のその組み合わせとして含む、糖尿病、肥満および心血管疾患の予防用の、請求項１７に記載の食品。
【請求項２３】
糖尿病、癌、心血管疾患および肥満からなる群より選択される疾患の治療用の医薬の調製における、表1〜24に記載のHPLCおよび／またはMS特性を有する抽出物からなる群より選択される抽出物の使用。
【請求項２４】
糖尿病および／または関連疾患の治療または予防用の医薬の調製のための、AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、AV016BaSu(105)08(100)、AV016FrDi(65)04(100)、およびAV016FrSu(105)08(100)からなる群より選択される抽出物の、請求項２３に記載の使用。
【請求項２５】
肥満の治療または予防用の医薬の調製のための、AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、およびAV016FrDi(65)04(100)からなる群より選択される抽出物の、請求項２３に記載の使用。
【請求項２６】
心血管疾患の治療または予防用の医薬の調製のための、AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、およびAV016BaSu(65)01(100)からなる群より選択される抽出物の、単独でまたは１以上のその組み合わせとしての、請求項２３に記載の使用。
【請求項２７】
癌の治療または予防用の医薬の調製のための、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)、およびAV016BaSu(65)04(100)からなる群より選択される抽出物の、単独でまたは１以上のその組み合わせとしての、請求項２３に記載の使用。
【請求項２８】
糖尿病、肥満、および心血管疾患の治療または予防用の医薬の調製のための、抽出物AV016BaDi(65)04(100)およびAV016BaDi(28)04(20)の、単独でまたは１以上のその組み合わせとしての、請求項２３に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、糖尿病、肥満、心血管疾患、および癌のような疾患、ならびに関連疾患状態を管理するための方法に使用されうるモモタマナ属(Terminalia)植物種由来の抽出物に関する。より詳細には、本発明は、テルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)由来の特定の抽出物、哺乳動物、特にヒトにおける、糖尿病、肥満、心血管疾患および癌のような特定の疾患の治療用の薬剤としてのその使用、それらの取得方法、ならびにそれらのための送達フォーマットに関する。
【背景技術】
【０００２】
真正糖尿病
真正糖尿病は、ありふれた、深刻な疾患であり、高血糖を特徴とする。この疾患は２つの主要なサブクラスに分けることができる。すなわち、I型糖尿病とも呼ばれるインスリン依存性真正糖尿病(IDDM)、およびII型糖尿病とも呼ばれる非インスリン依存性真正糖尿病(NIDDM)(World Health Organization Study Group. Diabetes mellitus. WHO Tech. Rep. Ser. 727:1-113, 1985)である。IDDMは、膵臓β細胞の細胞媒介性自己免疫性破壊により引き起こされるインスリン欠乏に起因し、これは一般的に若年者に発症する(Yoon J W., Insulin-dependent diabetes mellitus. In: Roitt I M and Delves P J. (編) Encyclopedia of Immunology, 第２版 Academic Press Ltd., London, pp. 1390-1398, 1998; Bach J F., Insulin-dependent diabetes mellitus as a beta cell targeted disease of immunoregulation. J. Autoimm. 8:439-463, 1995)。IDDMは、世界中の糖尿病人口の約10〜15％を占める(World Health Organization Study Group. Diabetes mellitus. WHO Tech. Rep. Ser. 727:1-113, 1985)。対照的に、NIDDMは、インスリン抵抗性およびインスリン欠乏の変化しうる組み合わせに起因し、これは一般に成人に発症する(Jun H S, ら, Pathogenesis of non-insulin-dependent (Type II) diabetes mellitus (NIDDM)--Genetic predisposition and metabolic abnormalities. Advanced Drug Delivery Reviews 35:157-177, 1999; DeFronzo R A., The triumvirate: .beta.-cell, muscle, liver: a collusion responsible for NIDDM. Diabetes 37:667-687, 1988)。しかしながら、NIDDMはより若い年齢においても発症することがあり、これは若年者の成人発症型糖尿病に見られるとおりである (Pirart J., Diabetes mellitus and its degenerative complications: a prospective study of 4400 patients observed between 1947 and 1973. Diabetes Care 1:168-188, 1978)。NIDDMは、世界中の糖尿病人口の85％以上を占める。IDDMとNIDDMは両方とも、微少血管および大血管合併症を引き起こすことが可能であり、これは罹病率および死亡率の上昇をもたらす(Fajans S S, ら, Prediabetes, subclinical diabetes, and latent clinical diabetes: interpretation, diagnosis and treatment. In: Leibel D S, Wrenshall G S. (編) On the Nature and Treatment of Diabetes. Excerpta Medica, Amsterdam, pp. 641-656, 1965)。
【０００３】
NIDDMは複雑な疾患であり、それは２以上の遺伝子または環境因子により誘発されると現在考えられている(Ghosh S, ら, Genetic analysis of NIDDM. Diabetes 45:1-14, 1995; Kobberling J. Studies on the genetic heterogeneity of diabetes mellitus. Diabetologia 7:46-49, 1971; Rotter J L, ら, Genetics of diabetes mellitus. In: Rifkin H, Porte D (編) Diabetes Mellitus Theory and Practice. Elsevier, N.Y., pp. 378-413, 1990)。家族集積性および一卵性双子における疾患の高い一致率(60〜100％)から、遺伝的要因がNIDDMの発病機序において重要な役割を果たすことが示唆される(O'Rahilly S, ら, Type 2 (noninsulin dependent) diabetes mellitus. New genetics for old nightmares. Diabetologia 31:407-414, 1988; Barnett A H, ら, Diabetes in identical twins. A study of 200 pairs. Diabetologia 20:87-93, 1981)。さらに肥満、身体活動および食事のような環境的要因もまた、この疾患の発症において大きな役割を果たす(Knowler W C, ら, Gm and type 2 diabetes mellitus: an association in American Indians with genetic admixture. Am. J. Hum. Genet. 43:520-526, 1988; Bennett P H, ら, Epidemiology and natural history of NIDDM: non-obese and obese. In: Alberti KGMM, DeFronzo R A, Keen H, Zimmett P (編) International Textbook of Diabetes Mellitus. Wiley, N.Y., pp. 147-176, 1992; Helmrich S P, ら, Physical activity and reduced occurrence of NIDDM. N. Engl. J. Med 325:147-152, 1991)。NIDDMの発症に対する遺伝的および環境的要因の相対的な寄与は個体間で変動するが、患者は一般に２種の共通する代謝異常、すなわちインスリン抵抗性およびグルコース刺激性インスリン分泌における欠陥を有し、これが疾患状態につながる(Saad M F, ら, A two step model for development of non-insulin-dependent diabetes. Am. J. Med. 90:229-235, 1991; DeFronzo R A, ら, Pathogenesis of NIDDM: A balanced overview. Diabetes Care 15:318-368, 1992; Lillioja S, ら, Insulin resistance and insulin secretory dysfunction as precursors of non-insulin-dependent diabetes mellitus. N. Engl. J. Med. 329:1988-1992, 1993)。
【０００４】
インスリンへの応答における標的組織の非感受性(インスリン抵抗性)は、必要な環境的要因の存在下で、遺伝的な傾向のある被験者においてまず発症するようである (Jun H S, ら, Pathogenesis of non-insulin-dependent (Type II) diabetes mellitus (NIDDM)--Genetic predisposition and metabolic abnormalities. Advanced Drug Delivery Reviews 35:157-177, 1999)。このことを補償するために、すなわち血糖値を下げ正常血糖を維持するために、β細胞からのインスリン分泌が増大し、結果的に高インスリン血症が生じる。経時的に、インスリン抵抗性は悪化し、補償活動は機能しなくなり、最終的にはグルコース寛容障害がもたらされる。インスリン分泌は水平域に達し、β細胞機能は損なわれ、結果的にインスリン欠乏が生じ、最後には高血糖性NIDDMがもたらされる。さらに、高血糖症それ自体が正常な機能の損なわれたインスリン抵抗性およびインスリン分泌をもたらし、疾患を悪化させる。
【０００５】
食事および運動の調節、ならびに／またはインスリンもしくは低血糖薬物を用いた処置が、糖尿病の制御に用いられてきた。こうした薬物を用いた治療はいくつかの事例においては成功するが、死亡指数は増加し続けている。インスリン処置は、NIDDMの治癒よりはむしろ症状の軽減をもたらす。スルホニル尿素やビグアニド(メトホルミン)のような低血糖薬物も血糖値を下げるが、これらもやはり、症状の軽減をもたらすに過ぎない。スルホニル尿素は、脾臓β細胞からのインスリンの放出を刺激することにより血糖値を下げる。こうした薬物はアデノシン三リン酸(ATP)-感受性カリウムチャネルを閉じることおよび細胞膜を脱分極させることによりインスリン放出を直接刺激する(Aguilar-Bryan L, ら, Cloning of the beta cell high-affinity sulfonylurea receptor: a regulator of insulin secretion. Science 268:423-426, 1995; Tan G H, ら, Pharmacologic treatment options for non-insulin-dependent diabetes mellitus. Mayo Clinic Proceedings 71:763-768, 1996; Lubbos H, ら, Oral hypoglycemic agents in type II diabetes mellitus. American Family Physician. 52:2075-2078, 1995)。スルホニル尿素の副作用としては、低血糖症、腎臓疾患および肝臓疾患、胃腸障害、心臓血管性死亡率の増大、皮膚科学的反応、めまい、眠気および頭痛が挙げられる。ビグアニドは、インスリン分泌を刺激することによるのではなく、腸のグルコース吸収および肝臓グルコースを減少させることにより血糖値を下げる。ビグアニドの主な副作用は、乳酸アシドーシスおよび心臓血管死亡率の上昇である。αグルコシダーゼ阻害剤は腸のαグルコシダーゼを阻害し、その結果、糖および複合炭水化物の消化を遅延させる。αグルコシダーゼ阻害剤の副作用としては、胃腸の副作用および低血糖症が挙げられる。チアゾリジンジオンは、インスリン抵抗性を直接改善し、循環インスリンの効果を増強し、直接末梢グルコース取込を刺激しかつ肝臓におけるグルコース産生を阻害する。チアゾリジンジオンは、インスリンの存在下でのみ効果があり、それらは赤血球異常および頭痛を引き起こしうる。
【０００６】
したがって、糖尿病の治療のためのより効果的な薬物が明らかに必要とされている。
【０００７】
肥満
医学界においては、アメリカ合衆国および他のいくつかの国の人口における肥満者が、この数十年で確実に増加している、と一般に認識されている。
【０００８】
肥満は、身体における脂肪の過剰な蓄積を特徴とする症状である。肥満は体重またはボディマス指数(BMI)のいずれかにより測定することができる。慣習的に、体重が、典型的な身長−体重指数表に記載されている体重を20パーセント超えたときに、肥満であるとされる。肥満の別の測定値であるBMIは、身体に存在する脂肪の量であり、運動選手ではない成人における肥満度の信頼できる指標であるとされる。BMIは次の式を用いて計算することができる: BMI ＝ [kg体重]／[メートル身長]2。一般に、正常なBMIは20〜25の範囲であり、対する肥満個体のBMIは30以上である。
【０００９】
このような肥満は、心疾患、高血圧、糖尿病、膝と腰の変形性関節症の発生率の顕著な増大を引き起こしているまたはそれに寄与しており、また関連する医学的症状に起因する死亡率を増大させている。全ての米国の成人の50％が太りすぎであると報告されている。
【００１０】
肥満治療に一般的に用いられる方法はいくつかある。そうしたものとしては、カロリー制限のような食事調整、運動計画、薬物療法、外科手術、および精神療法が挙げられる。しかしながらこれらの治療法の多くは問題を抱えている。
【００１１】
肥満治療のためのヒト成長ホルモン(hGH)の使用は、米国特許第5,597,595号に記載されている。下垂体により分泌される最も豊富なホルモンであるhGHは、哺乳動物の成長に関与する一次ホルモンであり、リポリシス(脂肪代謝)、およびタンパク質合成を増進させる。hGH分泌は肥満な個体において著しく低下している。hGHは、特定の成長ホルモン受容体と相互作用するが、そうした受容体は体中に広く分布している。例えば、脂肪細胞(含脂肪細胞)はhGH受容体を有し、hGHがこうした受容体に結合すると、それは、含脂肪細胞を刺激してトリグリセリドを分解させると同時に、該細胞の循環脂質を取込み蓄積する能力を抑制する。しかしながら、hGHの投与は注意深くモニタリングする必要がある。なぜならばhGH処置を受けている個体は真正糖尿病を発症しうるからである。hGHは細胞によるグルコース取込みの量を減少させ、そのことにより血糖濃度の増大が引き起こされることから、糖尿病が生じうる。この血糖値上昇が膵臓のβ細胞を刺激して追加のインスリンを分泌させるだけでなく、hGHもまたβ細胞を直接刺激してインスリンを産生させる。この２種の刺激効果の組み合わせはインスリン分泌をあまりにも刺激しすぎることから、β細胞が文字通り「燃え尽きる」。このことが生じると、真正糖尿病が発症する可能性がある。Guyton and Hall; TEXTBOOK OF MEDICAL PHYSIOLOGY, 938 (1995)。
【００１２】
体重減少を誘発する最良の方法の一つは、食事療法をすることまたはカロリー制限をすること、すなわち摂取量を出力よりも低くすることによるカロリー不足(deficit)を確立することによる方法である。カロリー摂取量を減らす最も一般的な方法は、低カロリーダイエットによるものである。しかしながら、ダイエットをすることには、いくつかのありがちな落とし穴がある。その１つは、ダイエット者がダイエットを中断し、通常の食事に戻ったときに、過食する動機が増大することである。２つ目として、多くの肥満者は新しいダイエットまたは突飛なダイエットを選択する。この種のダイエットの一例は高脂質／高タンパク質ダイエットである。こうしたダイエットは、高レベルのコレステロールを含み、それがケトン症を促進することから、ケトン体生成ダイエット(ketogenic diet)と呼ばれている。ケトン症は、吐き気、低血圧および嗜眠と関連している(Kaplan ら, supra, 735)。
【００１３】
薬物療法としては、脳内のセロトニンレベルを上昇させ、究極的には食欲を制御することにより機能する薬物を投与することが挙げられる。セロトニン(5-ヒドロキシトリプタミン、5HT)は、睡眠、感情、性欲および食欲のようないくつかの一般的行動に関連する。体重制御薬剤としてよく使用される薬物Redux.RTM. (デクスフェンフルラミン、dexfenfluramine)は、セロトニンレベルを上昇させることにより機能する。詳細には、Redux.RTM.は、セロトニンの再取込みを阻害し、それと同時にセロトニンの放出を刺激することにより機能する。複数の比較臨床試験は、Redux.RTM.が、少なくとも１年に渡り個体がカロリー制限および少ない体重を維持するのを助けることができることを実証した。また、Redux.RTM.は、肥満者において非肥満個体よりも食欲を低下させるようであることにも留意すべきである(Katzung, BASIC & CLINICAL PHARMACOLOGY 276 (1998))。しかしながら、Redux.RTM.には、それに伴ういくつかの有害な副作用、例えば頭痛、不眠症および肺高血圧がある。同上文献。
【００１４】
食物の吸収異常を引き起こすまたは胃の容積を減少させる外科手術方法は、著しく肥満な人々に広く使用されている。胃バイパスは、胃を小さくするために使用される手法である。詳細には、胃の湾曲部の１つをステープリングすることまたは切断することにより、胃を小さくする。胃の容積を減少させる主な目的は、食物の通過を遅くし、そのことにより個体が摂取することのできる食物量を制限することである。結果的には成功するが、多くの有害な副作用が生じる。例えば、嘔吐、電解質不均衡および閉塞が生じうる。代替的な外科手術方法は、脂肪除去手術(lipectomy)すなわち脂肪を除去することである。しかしながら、この技術は主に美容目的で使用され、長い目で見れば体重減少に対して実体的な影響はない(Kaplan ら, 上記参照, 276)。
【００１５】
したがって、上に詳述したあらゆる理由により、肥満または太りすぎの個体における体重減少を促進するための、容易に利用可能でコスト効率のよい改良法が必要とされている。
【００１６】
心血管疾患
心血管疾患(CVD)は主要な死亡の原因であり、全ての世界中の死亡原因の１／３を占める。CVDによる世界中の死亡率および疾患負荷の約85％は、低所得および中所得国が負担する。例えばインドでは、CVD死亡の約53％は年齢が70歳未満の人におけるものであり、中国ではその対応する数値は35％である。毎年発生する推定3200万件の心臓発作および卒中の大部分は、１以上の心臓血管リスク因子(高血圧、糖尿病、喫煙、高レベルの血中脂質、および運動不足)により引き起こされ、こうしたCVD事象のほとんどはこれらのリスク因子に対して有意の行動がとられたならば予防することができる。
【００１７】
膨大な数の人が、その一生のどこかの時点で心臓血管関連障害を体験する運命にある。心血管疾患の結果として毎年約100万人の米国人が死亡し、これに対して毎年癌で死ぬのは556,000人である。こうした事実にもかかわらず、人々は多くの場合、血管疾患を恐れる以上に癌を恐れる。
【００１８】
米国人は、動脈疾患の危険について、現状に甘んずるようになった。その理由の１つは、急性心臓発作で死亡する若年者のパーセンテージがこの50年で急落したことである。こうした低下の説明としては、ライフスタイルの変化、栄養補給食品／予防医薬の使用の増大、および改善された心臓医療が挙げられる。
【００１９】
問題はなぜこんなにも多くの米国人が心臓発作および卒中により死に続けているのかということである。その基本的な答えは、人は長生きするようになったということである。どういうことかと言うと、人間集団の大部分は動脈疾患の発症を遅延させることに成功したのである。ゆえに、50歳で心臓発作により突然死ぬ代わりに、血管の症状は60代や80代にならないと顕れない。この時点では、全身性の動脈硬化により主要な臓器系は損傷しており、複数の変性疾患が、生活の質の低下および寿命の減少をもたらす。
【００２０】
動脈疾患の根本原因の多くは科学文献において同定されている。残念ながら、心臓専門医は、こうした要因の一部にしか対処できていない(例えばコレステロール低下薬物を処方すること、高血圧を制御することなど)。血管関連疾患の流行についての証明された他の原因を度外視しているために、かなりの数の米国人が不要な苦しみを体験しており、時期尚早に死んでいる。
【００２１】
テルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)植物抽出物
テルミナリア・アルジュナは、インド全域に見られる落葉樹であり約60〜90フィートの高さまで成長する。テルミナリア・アルジュナはシクンシ科に属し、その土地の言葉では「アルジュナ」と呼ばれる。テルミナリア・アルジュナはインドでは1500年に渡り強心剤として使用されており、アーユルベーダにおける全３種の要素(humoursin)であるヴァータ(vata)、ピッタ(pitta)、カファ(kapha)の撹乱に対して適用されてきた。テルミナリア・アルジュナの樹皮は、インドの医学体系において種々の目的で広く使用されている。
【００２２】
米国特許第6,162,438号には、哺乳動物における、高血圧、高コレステロール血症および高脂血症を制御するための薬剤用の、テルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)、アーティチョーク(Cynara scolymus)、ジンジャー(Zingibar officinale)、ニンニク(Allium sativum)、セイヨウサンザシ(Crataegus oxycantha)、ウコン(Curcuma longa)、ナハカノコソウ(Boerhaavia diffusa)およびフェヌグリーク(Trigonella foenumgraecum)からなる群より選択される薬草を、少なくとも３種、好ましくは少なくとも６種、混合した可食性の薬草組成物が記載されている。
【００２３】
Sharma VN らは、無作為比較試験を用いて、テルミナリア・アルジュナ樹皮(インド薬局方で一般的な強心性物質)の抗酸化作用およびコレステロール低下作用を評価し、それを既知の抗酸化剤であるビタミンEと比較した。この試験からは、テルミナリア・アルジュナ樹皮粉末が、ビタミンEに匹敵する有意の抗酸化作用を有すると結論付けられた。さらに、それは、有意のコレステロール低下作用をも有する(Antioxidant and hypocholesterolaemic effects of Terminalia arjuna tree-bark powder: a randomised placebo-controlled trial, J Assoc Physicians India 2001 Feb; 49:231-235)。
【００２４】
Chapuis らにより、モーリシャスの薬草テルミナリア・アルジュナ(シクンシ科)の樹皮、幹および葉に存在する癌細胞増殖阻害成分を決定するために、バイオアッセイによりガイドされた分離方法が使用された。癌細胞株に活性な成分は、没食子酸、没食子酸エチル、およびフラボンのルテオリンであることが見出された。この植物中に存在することがそれまで知られていたのは没食子酸のみである。ルテオリンは種々の癌細胞株を阻害するはっきりと立証された記録があり、伝統的な癌治療におけるテルミナリア・アルジュナの使用の基礎をなす論理的根拠の大部分を説明しうる。ルテオリンはまた、病原性細菌の淋菌(Neisseria gonorrhoeae)に対して特異的活性を示すことが見出されている (Antineoplastic agents 338. The cancer cell growth inhibitory constituents of Terminalia arjuna (Combretaceae). J Ethnopharmacol. 1996Aug;53(2):57-63)。
【００２５】
テルミナリア・アルジュナ樹の樹皮は、強心剤としても使用されてきた長い歴史があり、冠動脈疾患、心不全、高コレステロール血症の治療および狭心痛の緩和に処方されてきた( Miller, A. L. Botanical Influences on cardiovascular disease. Alternative Medicine Review. Dec 1998, vol 3. No. 6, pages 421-431)。
【００２６】
テルミナリア・アルジュナの幹の樹皮の水およびメタノールによる抽出物は、0.2 mg/mLにて、HIV-1活動を70％より多く阻害することが見出された ( Kandil F. E. ら A Tannin anti-cancer promoter from Terminalia arjuna. April 1998, Vol 47. No. 8, pages 1567-1568)。
【００２７】
心筋梗塞後狭心症患者におけるテルミナリア・アルジュナ樹皮粉末を用いたアジュバント療法は、狭心症の緩和をもたらし、同時に左心室駆出分画率(LVEF)および左心室重量(LVM)の改善をもたらした(Dwivedi, S. ら Beneficial effects of Terminalia arjuna in coronary Artery Disease. Indian Heart Journal. Spet-Oct 1997, vol. 49. No. 5, pages 507-510.)。
【００２８】
100 mg/kgおよび500 mg/kgの用量のテルミナリア・アルジュナ樹皮のエタノール性抽出物は、高コレステロール血症ウサギにおける総コレステロール値およびLDLコレステロール値を有意に減少させた (Ram ら, Hypocholesterolaemic effects of Terminalia arjuna tree bark. Journal of Ethnopharmacology. Vol 55. No. 3, pages 165-169.)。
【００２９】
従来技術には、糖尿病および肥満の治療または予防または管理における、テルミナリア・アルジュナ抽出物の使用を示唆するデータまたは技術的情報は存在しない。
【００３０】
テルミナリア・アルジュナの幹の水およびエタノールによる抽出物は、HIV-1に対する活性を有することが報告されている。しかしながら、癌の治療における、逐次抽出溶媒系を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮抽出物の使用に関する他の参考文献はない。
【００３１】
テルミナリア・アルジュナ植物はその強心作用について知られている。また、冠動脈疾患、心不全、高コレステロール血症の治療および狭心痛の緩和におけるテルミナリア・アルジュナの使用を示唆する報告も存在する。しかしながら、こうした活性に関する作用機構の明確な評価は存在しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３２】
一方、本発明では、本発明者らはテルミナリア・アルジュナ抽出物で処理された細胞が総脂質量の著しい減少を示すことを立証した。また、前記抽出物は3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵素A (HMG-CoA)レダクターゼ阻害活性を示した。HMG-CoAはコレステロール生合成経路において関係する最初の工程である。コレステロール生合成における速度を律する酵素工程であるHMG-CoAレダクターゼは、総血漿コレステロール、特にLDLコレステロールを低下させるための最も成功した薬物治療となった。
【００３３】
肥満、心血管疾患、特定の癌、および糖尿病ならびに関連疾患の治療に有効な新しい薬の開発が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００３４】
本発明の目的は、以下の記載および実施例から明らかとなるであろう。
【００３５】
本発明は、肥満、心血管疾患、特定の癌、糖尿病および関連疾患などの疾患の治療に潜在的に有用であると示唆される、テルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)のようなモモタマナ属(Terminalia)種の植物由来の植物部分の特定の抽出物に関する。さらに、本発明は、モモタマナ属(Terminalia)種の抽出物、例えばテルミナリア・アルジュナ種由来の抽出物を含む予防用組成物に関する。
【００３６】
抽出物の命名法の簡単な説明
植物抽出物の命名法
2008537539.tif 000002
１．AV- 最初の２文字はAvesthagenを表す。
【００３７】
２．植物名: 使用されたおよび使用する植物に固有の３桁番号を割り当てる。016はテルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)を表す。
【００３８】
３．植物の部分/器官: 使用される各植物部分について２文字のIDを示す。例えば樹皮(Bark)についてはBa、全果実(Fruit)についてはFrなど。
【００３９】
４．溶媒: 抽出に使用した溶媒にも２桁の番号を割り当てる。アセトンには01、ベンゼンには02、クロロホルムには03、エタノールには04、ヘキサンには05、メタノールには06、石油エーテルには07、水には08、酢酸エチルには09が割り当てられる。抽出に使用した溶媒のパーセンテージを括弧内に示す。(20)は20％のその溶媒を表す。例えば20％のエタノールを抽出に使用したならば、それは04(20)と表される。
【００４０】
５．抽出方法: 逐次抽出(successive extraction)をSuと表し、これに対して直接抽出(direct extraction)をDiと表す。抽出の温度を括弧内に記載する。例えばSu(65)は65℃における逐次抽出を表す。
【００４１】
６．抽出物の種類：gは膠質の(gluey)、を表し、ngは非膠質の(non-gluey)、を表す。
【００４２】
表の簡単な説明
表１：抽出物AV016BaDi(65)04(100)のHPLCフィンガープリント。
表２：抽出物AV016BaDi(28)04(20)のHPLCフィンガープリント。 
表３：抽出物AV016BaSu(65)09(100)のHPLCフィンガープリント。 
表４：抽出物AV016BaSu(65)01(100)のHPLCフィンガープリント。 
表５：抽出物AV016BaSu(65)01(100)ngのHPLCフィンガープリント。 
表６：抽出物AV016BaSu(65)01(100)gのHPLCフィンガープリント。 
表７：抽出物AV016BaSu(65)04(100)のHPLCフィンガープリント。 
表８：抽出物AV016BaSu(65)06(100)のHPLCフィンガープリント。 
表９：抽出物AV016BaSu(105)08(100)のHPLCフィンガープリント。 
表１０：抽出物AV016Fr(105)08(100)のHPLCフィンガープリント。 
表１１：抽出物AV016BaDi(28)04(20) (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表１２：抽出物AV016BaDi(28)04(20) (TICスペクトル(Q1 -veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表１３：抽出物AV016BaDi(65)04(100) (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表１４：抽出物AV016BaDi(65)04(100) (TICスペクトル(Q1 -veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表１５：抽出物AV016BaSu(65)09(100) (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表１６：抽出物AV016BaSu(65)01(100) (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表１７：抽出物AV016BaSu(65)01(100) (TICスペクトル(Q1 -veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表１８：抽出物AV016BaSu(65)01(100)ng (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表１９：抽出物AV016BaSu(65)01(100)g (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表２０：抽出物AV016BaSu(65)04(100) (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表２１：抽出物AV016BaSu(65)06(100) (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表２２：抽出物AV016BaSu(105)08(100) (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表２３：抽出物AV016FrDi(65)04(100) (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表２４：抽出物AV016FrSu(105)08(100) (TICスペクトル(Q1 +veモード)のLC/MSフィンガープリント。 
表２５：種々のテルミナリア・アルジュナ植物部分由来の抽出物のα-グルコシダーゼ阻害活性のIC50値。 
表２６：3T3-L1含脂肪細胞におけるグルコース取り込みに対する、インスリンおよびT. arjuna抽出物の影響。 
表２７：テルミナリア・アルジュナ抽出物の抗肥満潜在力。 
表２８：CHO-K1細胞中の脂質レベルに対する、テルミナリア・アルジュナ抽出物の影響。 
表２９：HMG-CoAレダクターゼ活性に対する、テルミナリア・アルジュナ樹皮AV016BaDi(28)04(20)由来の20％エタノール抽出物の影響。 
表３０：HMG-CoAレダクターゼ活性に対する、テルミナリア・アルジュナ樹皮AV016BaDi(65)04(100)由来の直接100％エタノール抽出物の影響。 
表３１：HepG2細胞の細胞生存能力に対する、テルミナリア・アルジュナ抽出物の影響。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
本発明の第１の態様においては、哺乳動物に、有効で非毒性の量の、少なくとも１種の本明細書に定義するテルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)由来の抽出物を投与することを含む、哺乳動物の疾患の治療方法を提供する。好ましくは哺乳動物はヒトである。当業者ならば、哺乳動物における「疾患の治療」が、治療すること、すなわちその疾患の症状を軽減することを意味し、また、進行している(すなわち悪化している)もしくはより侵襲的になりつつあるかかる疾患状態を予防すること、または疾患の進行速度を減速させることという意味において疾患を管理することを意味しうると理解するであろう。
【００４４】
本発明の第２の態様において、糖尿病、肥満、心血管疾患、および癌の群より選択される疾患状態の発生に対する予防用の食品(食材)として調製された、本明細書に定義する有効で非毒性の量のテルミナリア・アルジュナ由来の抽出物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における疾患状態の発生を予防する予防方法を提供する。好ましくは哺乳動物はヒトであり、前記抽出物は、本明細書に詳述する、テルミナリア・アルジュナの植物部分由来の単一種の抽出物またはそれ由来の抽出物の組み合わせを含む。したがって本発明はさらに、テルミナリア・アルジュナ植物の種々の部分(その樹皮や果実など)から単離されうる抽出物、かかる抽出物の調製、かかる抽出物を含む医薬、および医薬の調製におけるこうした抽出物および成分の使用に関する。
【００４５】
本発明の抽出物は、慣用的な有機溶媒抽出法および超臨界流体抽出技術を用いて、テルミナリア・アルジュナのようなモモタマナ属の樹の種から分離することができる。一般に、本明細書に概説するように予防的または治療的に機能しうる本発明の抽出物は、その抽出物に要求される最終目的に応じて、あらゆるテルミナリア・アルジュナ植物組織、例えば樹皮または果実などから抽出されうる。
【００４６】
本発明の第３の態様においては、テルミナリア・アルジュナの植物部分から本発明の抽出物を調製する方法であって、
(i) 選択された植物材料を粉末に微粉砕すること、
(ii) 粉末になった植物材料を溶媒抽出法にかけること、
(iii) 得られた抽出物を凍結乾燥させること、
の各工程を含む方法を提供する。
【００４７】
選択される植物材料は、どのような種類のものであってもよいが、好ましくはテルミナリア・アルジュナ植物の樹皮または果実から選択される。
【００４８】
溶媒抽出方法は、直接抽出型または逐次抽出型の方法、例えば室温またはより高温で極性および／または非極性溶媒を使用し、ソックスレー器具またはフラスコを使用する、植物部分からの抽出などから選択することができる。典型的には、抽出方法は本明細書に概説した方法である。
【００４９】
活性を示す本発明の抽出物の単離において各工程についての溶媒または溶媒混合物の選択には、個別の画分のバイオアッセイ分析(例えば本明細書に記載するおよび／または実施例に示すもの)の結果を指針とすることができることは当業者に明らかであろう。
【００５０】
テルミナリア・アルジュナのようなモモタマナ属種から単離された少なくとも１種の抽出物と、製薬上許容される担体とを混合状態で含む、糖尿病、肥満、心血管疾患、および癌の群から選択される疾患の治療用に適した医薬製剤もまた本発明の範囲に包含される。好ましくは、前記少なくとも１種の抽出物は、対象の疾患および設計に応じて、表1〜24に記載の抽出物から選択される。好ましくは前記少なくとも１種の抽出物は、やはり最終目的に応じて、表25〜30に特定した抽出物の群から選択される。当然ながら、当業者は、かかる組成物が、２種以上の本発明の植物抽出物を、治療効果をもたらすことのできるあらゆる濃度で含みうると理解するであろう。したがって、治療用組成物は、望ましくない汚染化合物を実質的に欠いた、モモタマナ属の植物抽出物を含みうる。植物抽出物は、例えば、望ましくない成分を望ましい成分から実質的に分離して除くために、複数の溶媒抽出工程(例えば実施例および上述の表に記載の方法)を経たものであり得る。
【００５１】
したがって本発明はさらに、哺乳動物(ヒトを含む)における、肥満、癌、心血管疾患、および糖尿病の群から選択される疾患の治療方法であって、表1〜24に記載の抽出物、好ましくは表25〜30に記載の抽出物から選択される臨床上有効量の抽出物を、製薬上有用な形態にて、１日１回もしくは数回または任意の他の適当なスケジュールで、例えば経口からもしくは静脈内から、または乾燥もしくは「湿式」噴霧物としての肺への送達により、使用することを含む前記方法を提供する。
【００５２】
前記疾患の治療に有効であるために必要な抽出化合物の量は、むろん、治療される疾患に応じて変化するであろうし、最終的にはそれは臨床医または獣医の判断によるであろう。考慮されるべき因子としては、治療されている症状、投与経路、製剤の性質、哺乳動物の体重、表面積、年齢および全身的な状態、ならびに投与される具体的な化合物が挙げられる。本発明の抽出物の適当な有効用量は、一般に約0.01〜約120 mg/kg体重、例えば0.1〜約120 mg/kg体重、好ましくは約0.1〜50 mg/kg、例えば0.5〜50 mg/kgである。合計の１日用量は、単回投与、複数回投与、例えば１日当たり２回〜６回の適用として与えられ得る。例えば75 kgの哺乳動物(例えばヒト)の場合、用量範囲は１日当たり約8〜9000 mgであることができ、典型的な用量は１日当たり約50 mgでありうる。別個の複数の用量を適用する場合には、治療は典型的には、15 mgの式(I)で表される化合物を１日当たり最大４回適用することでありうる。
【００５３】
活性抽出物を単独で投与することも可能ではあるが、活性抽出物を医薬製剤として提供することが好ましい。医薬用の本発明の製剤は、本発明の抽出物を、１種以上の製薬上許容される担体と共に、そして場合により他の治療成分と共に含んでなる。担体は、製剤の他の成分と適合可能であり、かつその受容者に実質的に有害ではない、という意味で製薬上許容されるものでなければならない。
【００５４】
したがって、本発明はさらに、表1〜24に記載の抽出物、好ましくは表25〜30に記載の抽出物から選択される少なくとも１種の抽出物を、そのための製薬上許容される担体と共に含んでなる医薬製剤を提供する。好ましい実施形態において、医薬製剤は、治療される疾患の種類に応じて、表25〜30に記載の抽出物から選択される、少なくとも１種の抽出物を含んでなる。当然ながら、当業者ならば、任意の単一種の疾患の治療のために、前述の表に記載の抽出物から２種以上の抽出物を選択するに当たり、その種類の疾患のために、適当に抽出物を選択することができる、と理解するであろう。したがって、例えば、糖尿病の治療のためには、治療を行うのに適当な抽出物が前述の表から選択されるであろう。
【００５５】
当然ながら、当業者は、本発明の活性抽出物を含む任意の医薬製剤が、モモタマナ属(Terminalia)種由来の抽出物から精製された少なくとも１種の活性抽出物を含むことができる、と理解するであろう。したがって医薬製剤は、２以上のモモタマナ属(Terminalia)種由来の２種以上の活性抽出物を含みうる。
【００５６】
本発明の抽出物、およびそのための製薬上許容される担体を一緒にすることを含む、医薬製剤の調製方法もまた提供される。
【００５７】
本発明の製剤には、経口または静脈内投与に適した製剤が含まれる。
【００５８】
少なくとも１種の本発明の抽出物を含む静脈用製剤はまた、適当なリポソーム性もしくはニオソーム性調製物または他の適当な送達ビヒクルの形態で投与することができる。
【００５９】
本発明の製剤に使用するために適当な乳化剤(Emulgent)およびエマルジョン安定剤としては、Tween 60、Span 80、セトステアリルアルコール、ミリスチルアルコール、グリセロールモノステアレートおよびラウリル硫酸ナトリウムが挙げられる。
【００６０】
製剤は適宜、単位剤形として提供することができ、薬学の技術分野で周知のどのような方法により調製してもよい。方法はいずれも、活性抽出物を、１以上の副成分で構成される担体と一緒にする工程を含む。一般に、製剤は、活性抽出物を、液体担体もしくは微粉化固体担体またはその両方と、均一にかつ親密に一緒にすること、およびその後、必要であれば製品を所望の製剤へと成形することにより調製される。
【００６１】
経口投与に適した本発明の製剤は、香味基剤(通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカント)中に活性成分を含むカプセル剤、サシェ剤(sachet)、錠剤、ロゼンジ剤；ゼラチンおよびグリセリン、または、スクロースおよびアカシアのような不活性基剤中に活性成分を含む芳香錠(pastille)；ならびに、適当な液体担体中に活性成分を含む洗口剤のような個々の単位として提供することができる。各製剤は、一般に所定量の活性抽出物を、粉剤または顆粒剤として、またはシロップ、エリキシル、エマルジョンもしくはドラフト(draught)などのような水性または非水性液体中の溶液または懸濁物として含有する。
【００６２】
錠剤は、場合により１以上の副成分を用いて、圧縮によりまたは成形により製造することができる。圧縮錠剤は、粉剤または顆粒剤のような自由流動形態の活性抽出物を、場合により、結合剤、(例えばポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース)、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤(例えばデンプングリコール酸ナトリウム、架橋型ポビドン、架橋型カルボキシメチルセルロースナトリウム)、界面活性剤または分散化剤と混合して、適当な機械で圧縮することにより調製することができる。成型錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせた粉末化抽出物の混合物を、適当な機械で成型することにより製造することができる。錠剤は場合により、コーティングするかまたは刻み目を付けてもよく、また、所望の放出特性を提供するために例えば種々の割合でヒドロキシプロピルメチルセルロースを使用することにより、錠剤中の活性成分の遅延放出または制御放出をもたらすように製剤化することができる。
【００６３】
活性抽出物を、糖(例えばスクロース)の濃縮された水溶液に添加することによりシロップを製造することができ、これに任意の必要な成分も添加することができる。かかる副成分としては、香味剤、糖の結晶化を抑制する物質または任意の他の成分の溶解性を増大させる物質、例えば多価アルコール(例えばグリセロールまたはソルビトール)などが挙げられる。
【００６４】
前述の成分の他に、本発明の製剤は、希釈剤、バッファー、香味剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、保存剤(抗酸化剤も含まれる)などから選択される１以上の副成分をさらに含みうる。
【００６５】
あるいはまた、組成物は、ヒトまたは動物が消費するのに適した、栄養補助食品、食品配合物または飲料配合物である。
【００６６】
本発明は、テルミナリア・アルジュナ植物部分の直接および逐次溶媒抽出物のHPLCプロフィールおよび質量スペクトルを記載しており、それらにより各抽出物はそれ自体の同一性を付与される。逐次抽出法に使用された種々の溶媒は、非極性から極性側の順に、ヘキサン、石油エーテル、酢酸エチル、アセトン、エタノール、メタノールおよび水である。直接抽出法の場合には、アルコール性溶媒のみおよびそれを水と組み合わせたものを、抽出用の溶媒として使用した。
【００６７】
本発明はさらに、テルミナリア・アルジュナ植物の種々の部分から単離される、表1〜24にて明確にしたHPLCおよびMSフィンガープリントを参照することにより定義される新規抽出物、かかる抽出物の調製、前記抽出物を含んでなる医薬、ならびに医薬の調製のためのこうした抽出物および成分の使用、を包含する。
【００６８】
本発明のさらなる態様において、糖尿病および糖尿病関連障害を予防、治療または管理するための医薬製剤は、100％エタノール溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の直接抽出物[AV016BaDi(65)04(100)]および20％ エタノール溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の直接抽出物[AV016BaDi(28)04(20)]、酢酸エチル溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)09(100)]、アセトン溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)01(100)g]、アセトン溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)01(100)ng]、エタノール溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)04(100)]、メタノール溶媒をもちいたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)06(100)]および水溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(105)08(100)]、エタノール溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ果実の直接抽出物[AV016FrDi(65)04(100)]ならびに水溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ果実の逐次抽出物[AV016FrSu(105)08(100)]を、単独でまたはそれらの組み合わせとして含む。かかる医薬製剤は、本明細書に概説したように、製薬上許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含みうる。
【００６９】
本発明のさらなる態様において、肥満および肥満関連障害の予防、治療または管理用の医薬製剤は、100％エタノール溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の直接抽出物[AV016BaDi(65)04(100)]および20％エタノール溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の直接抽出物[AV016BaDi(28)04(20)]、樹皮の酢酸エチル抽出物、膠性のアセトン抽出物、非膠性のアセトン抽出物、エタノール抽出物およびメタノール抽出物のテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物であるAV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)ならびにAV016FrDi(65)04(100)を、単独でまたはそれらの組み合わせとして含む。医薬製剤は、本明細書に概説したように、製薬上許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含みうる。
【００７０】
本発明のさらなる態様において、心血管疾患 (CVD)およびCVD関連障害の予防、治療または管理用の医薬製剤は、100％ エタノール溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の直接抽出物[AV016BaDi(65)04(100)]および20％ エタノール溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の直接抽出物[AV016BaDi(28)04(20)]、酢酸エチルを用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)09(100)]ならびにアセトンを用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)01(100)]を、単独でまたはそれらの組み合わせとして含む。医薬製剤は、本明細書に概説したように、製薬上許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含みうる。
【００７１】
本発明のさらなる態様において、癌および癌に関連する障害の予防、治療または管理用の医薬製剤は、酢酸エチルを用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)09(100)]、アセトンを用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)01(100)]、エタノールを用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)04(100)]、メタノールを用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(65)06(100)] および水を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の逐次抽出物[AV016BaSu(105)08(100)]を、単独でまたはそれらの組み合わせとして含む。医薬製剤は、本明細書に概説したように、製薬上許容される担体、賦形剤、または希釈剤を含みうる。
【００７２】
本発明のさらなる態様において、本明細書の表1〜24に記載の抽出物から選択される、特に表25〜30に記載の抽出物から選択される、少なくとも１種の本発明の抽出物を、典型的には乾燥状態で、例えば凍結乾燥状態で含む食品(comestible)、言い換えれば食材(foodstuff)を提供する。当業者ならば、かかる食品(comestible)は、２種以上の本発明の抽出物を含むことができ、使用することができると理解するであろう。かかる食材(foodstuff)は予防的な様式で使用することができ、また、添加した第１抽出物と類似する機能を有するさらなる抽出物を含むことができ、あるいは異なる予防的機能を有する抽出物をさらに添加することもできる。したがって食材(foodstuff)は、単一の機能的特徴を有する食品(comestible)(例えば糖尿病の発生に対して予防的な効果を有する食品)として提供される抽出物を含むことができ、または食品(comestible)は２種以上の疾患に対する多機能性の予防効果を有しうる。哺乳動物(特にヒト)における２種以上の疾患の予防用または治療用に設計された、似ていない治療または予防特性を有する２種以上の抽出物を含む医薬製剤に対しても同じ様な多機能的役割をもたせることができると考えられている。
【００７３】
少なくとも１種の本発明の抽出物を添加することのできる食材(foodstuff)または食品(comestible)の種類としては、あらゆる加工食品、例えば菓子類、焼いてある食品(ローフブレッドのようなパン、ピタパンのような平たいパン、ナンなどを含む)、ケーキ、ミューズリーバー(muesli bars)のようなスナック食品、圧縮されたドライフルーツバー、ビスケット、ヨーグルトのような乳製品、ミルクおよびミルクに基づく食品、例えばカスタード、クリーム、チーズ、バターおよびクリーム・フレッシュ、マーガリンのような模倣乳製品、オリーブ油に基づくスプレッド(spreads)、およびエルムレア(Elmlea)食品のような低脂肪のクリーム代替品、果実ジュースおよび野菜ジュース、炭酸入りソフトドリンクのような炭酸飲料およびスカッシュのような非炭酸飲料、豆乳、粥およびココナッツミルクなど、パスタ、麺類、野菜、種油および堅果油、ヒマワリ油、菜種油、オリーブ油、クルミ油、ヘーゼルナッツ油、およびゴマ油などの果実油、ならびにアイスクリームや冷凍ヨーグルトなどのような冷凍砂糖菓子が挙げられる。
【００７４】
食品に追加する本発明の抽出物の適当な有効用量は、一般に、約0.01〜約120 mg/kg体重、例えば 0.1〜約120 mg/kg体重の範囲、好ましくは約0.1〜50 mg/kg、例えば0.5〜50 mg/kgの範囲である。合計の一日用量は単回用量、複数回用量、例えば１日当たり２回〜６回の適用として与えられ得る。
【００７５】
本発明のさらなる態様においては、糖尿病、癌、心血管疾患および肥満からなる群より選択される疾患の治療用の医薬の調製のための、表1〜24の抽出物、特に表25〜30の抽出物から選択される抽出物の使用を提供する。
【００７６】
したがって、糖尿病および／または関連疾患の治療または予防用の医薬の調製のための、AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、AV016BaSu(105)08(100)、AV016FrDi(65)04(100)、およびAV016FrSu(105)08(100)からなる群より選択される抽出物の使用を提供する。
【００７７】
さらに、肥満の治療または予防用の医薬の調製のための、AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)、およびAV016FrDi(65)04(100))からなる群より選択される抽出物の使用を提供する。
【００７８】
さらに、心血管疾患の治療または予防用の医薬の調製のための、AV016BaDi(65)04(100)、AV016BaDi(28)04(20)、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)、からなる群より選択される抽出物の、単独でまたはその１以上の組み合わせとしての使用を提供する。
【００７９】
さらに、癌の治療または予防用の医薬の調製のための、AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)、AV016BaSu(65)04(100)、AV016BaSu(65)06(100)およびAV016BaSu(105)08(100)、からなる群より選択される抽出物の、単独でまたはその１以上の組み合わせとしての使用を提供する。
【実施例】
【００８０】
ここで本発明を次の実施例および本明細書に添付の表および図を参照しながら例示する。これらの実施例は、本発明の範囲を、どのような様式においても限定するものとは解釈されないと理解すべきである。
【００８１】
実施例１: テルミナリア・アルジュナ(Terminalia arjuna)の抽出
テルミナリア・アルジュナ植物部分の抽出は、直接抽出法および逐次抽出法の両方を使用し、室温でおよびソックスレー装置および関連液−液技術を用いて、その後凍結乾燥を行うことにより実施した。
【００８２】
I. 逐次抽出：
テルミナリア・アルジュナの樹皮からの逐次抽出はソックスレー抽出器を用いて行った。65℃にて、使用した溶媒は、非極性から開始して極性へとその逐次的な極性に基づき、ヘキサン、石油エーテル、クロロホルム、アセトン、エタノール、メタノールおよび水であった。
【００８３】
詳細な方法を以下に記載する：
１． 粉末化植物材料を100グラム計量し、これを、ソックスレー装置の底に綿を配置して、抽出機(ソックスレー抽出器本体)に入れる。上部を綿で覆う。1000 mLの溶媒を丸底フラスコに加え(ヘキサンを用いて開始する)、それをマントル上に配置し、その中に数個のセラミックチップを添加する。湿らせるだけの100mLの溶媒を材料の上に加える。 
２． 抽出機をフラスコの上に設置し、次にそのフラスコを凝縮器に接続する。 
３． 蛇口から冷水が凝縮器内を継続的に循環するようにする。器具を１つのセットとして組み立てることから、器具はきつくはめ込まれる。 
４． マントルのスイッチを入れ、それを65℃に設定する。フラスコからの溶媒の蒸気が抽出器の注入口を通過し、凝縮される。凝縮された(蒸留された)溶媒は抽出器(本体)中に回収され、このことにより植物材料から化合物を抽出する。 
５． 植物材料が完全に溶媒で満たされたら、フラスコ内で植物材料から溶媒を流し出す。安定した熱と水の循環がある限り、この工程は継続的である。 
６． 抽出を、８時間にわたり、１時間あたり4〜5サイクルにて継続する。 
７． フラスコに回収した抽出物を真空凍結乾燥により濃縮する。 
８． 上記と同じ方法を、次の溶媒についてその溶媒の順番で逐次的に繰り返す。石油エーテル、酢酸エチル、アセトン、エタノール、メタノールおよび水。
【００８４】
II. 直接抽出
a. 100％エタノール溶媒を用いたソックスレーに基づく抽出方法:
１． 布袋中の粉末化植物材料を100グラム計量し、それを抽出機(ソックスレー抽出器本体)内に移す。上部を綿で覆う。 (材料のレベルが、蒸気吸入チューブの１インチ下であるか確認する)。 
２． 1リットルの溶媒(石油エーテルを用いて開始)を丸底フラスコに添加し、フラスコをマントル上に配置し、その中に数個のセラミックチップを添加する。湿らせるだけの100mLの溶媒を材料の上に加える。 
３． 抽出機をフラスコの上に設置し、次にそのフラスコを凝縮器に接続する。 
４． 蛇口から冷水が凝縮器中、継続的に循環するようにする。器具を１つのセットとして組み立てることから、器具はきつくはめ込まれる。 
５． マントルのスイッチを入れ、それを65℃に設定する。フラスコからの溶媒の蒸気が抽出器の注入口を通過し、凝縮される。凝縮された(蒸留された)溶媒は抽出器(本体)中に回収され、このことにより植物材料から化合物を抽出する。 
６．植物材料が完全に溶媒で満たされたら、フラスコ内で植物材料から溶媒を流し出す。安定した熱と水の循環がある限り、この工程は継続的である。 
７． 抽出を、８時間にわたり、１時間あたり4〜5サイクルにて継続する。 
８． フラスコに回収した抽出物を真空凍結乾燥により濃縮する。
【００８５】
b. 室温における、20％エタノール溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の抽出：
１． 既知量(100グラム)の粉末化植物材料を計量して三角フラスコに加え、フラスコの口をアルミホイルで覆って溶媒の蒸発を避ける。 
２． 既知容量(500 mL)の20％エタノール(100 mLエタノール＋400 mL水)溶媒をフラスコに添加し、その後それを環状振とう器に設置し、抽出のために速度を210 rpmおよび室温28℃に設定する。 
３． 植物材料を4時間抽出し、溶媒を流出させる。 
４． 濾液を1000 rpmにて10分、遠心分離する。上清を回収し、それを凍結乾燥に供する。 
５． 2回×2時間に渡り、250 mLの溶媒を用いて再度抽出する。 
６． 濾液を1000 rpmにて10分、遠心分離する。 
７． 真空下で凍結乾燥器を用いて抽出物を濃縮する。
【００８６】
実施例２:テルミナリア・アルジュナ抽出物の代謝的フィンガープリンティング:
テルミナリア・アルジュナ植物部分からのすべての直接抽出物および逐次抽出物の代謝的フィンガープリンティングを、HPLCおよびLC/MS技術により行う。
【００８７】
I. HPLCフィンガープリンティング：
直接/逐次抽出により得られた植物抽出物をHPLC分析に供する。高速液体クロマトグラフィー(HPLC)は、高圧下でC-18カラムに少量のサンプルを注入し、成分がカラムとの相互作用およびカラム内での保持時間に基づき分離される技術である。HPLC分析の主な目的は、植物抽出物中の成分の合計数を調べることである。
【００８８】
適当な重量の抽出物をメタノール中に溶解させることにより、サンプルをHPLC分析のために調製する。こうしたサンプルを濾過し、全回収HPLCバイアル中に回収する。これらのサンプルを、Waters 2695 HPLC装置による分離に供し、その後分析する。
【００８９】
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2008537539.tif 000004
2008537539.tif 000005
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II. 液体クロマトグラフィー質量分析 (LC/MS)フィンガープリンティング:
質量分析法は、分子の質量測定を可能にする計測方法である。質量分析器の５つの基本的な構成要素は、真空システム、サンプル導入デバイス、イオン化源、質量分析器(mass analyzer)およびイオン検出器である。こうした部分を組み合わせることにより、質量分析器は、化合物を、イオン化させ、分離し、そしてその質量対電荷比(m/z)にしたがい分子イオンを測定することにより、化合物の分子量を測定する。
【００９０】
テルミナリア・アルジュナのLC/MSフィンガープリンティングに使用した運転条件を下に示す：
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実施例３：テルミナリア・アルジュナ抽出物の生物−治療的潜在力の決定:
I. 抗糖尿病潜在力:
食事摂取後の急性グルコース増加は、種々のグルコース仲介組織異常、酸化的ストレス、糖化および後生的な糖化最終産物形成と関連しており、これらは実質的にどのヒト臓器系にも広範な構造的および機能的影響を及ぼす。グリコシル化ヘモグロビンを、こうした合併症を予防または遅延させるレベルまで低下させることは、食後のおよび絶食時の血漿グルコースレベルを低減させることによってのみ達成されうる。
【００９１】
小腸におけるα-グルコシダーゼ複合体は、糖の吸収に関わっている。したがって、α-グルコシダーゼの阻害剤は、食事の炭水化物の吸収を制限し、それがさらに食後の高血糖を抑制するであろう。したがって、α-グルコシダーゼ阻害剤は、糖尿病の治療および予防における前途有望な薬物候補である。α-グルコシダーゼ阻害剤(アカルボース(acarbose)、ボグリボース(voglibose)、ミグリトール(miglitol))は、炭水化物の消化と吸収を遅延させるのに有効であり、したがってカロリーを失うこと無しに、食後の血糖値の急上昇を減少させる。
【００９２】
1. α-グルコシダーゼアッセイ
α-グルコシダーゼは、末端の、非還元性1,4-結合α-D-グルコース残基を加水分解し、α-D-グルコースを放出させる。アッセイにおいて酵素活性は、p-ニトロフェニル-α-D-グルコピラノシドの加水分解により生じるp-ニトロフェノールの放出がもたらす400nmにおける吸光度の増大を測定することにより決定する。
【００９３】
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c. 結果と考察:
テルミナリア・アルジュナ樹皮および果実抽出物からの逐次抽出物および直接抽出物を、α-グルコシダーゼ阻害潜在力についてアッセイしたところ、テルミナリア・アルジュナ抽出物がα-グルコシダーゼ阻害において用量依存的低減を示すことが実証された。 IC50 は、酵素活性の50％阻害に必要な抽出物の量と定義される。
【００９４】
IC50値により示される(表25)とおり、すべてのテルミナリア・アルジュナの抽出物は、市販のアカルボース(acarbose)よりも高いα-グルコシダーゼ阻害潜在力を示すことが見出された。
【００９５】
2 グルコース取り込みアッセイ：
脂肪細胞または含脂肪細胞(3T3-L1)によるデオキシ-グルコース取り込みアッセイは、脂肪細胞によるグルコース取り込みを上昇させることを助ける抽出物／生物活性物質を同定することを助ける。分化3T3-L1細胞は、増殖型線維芽細胞から非増殖型含脂肪細胞への変換中に、インスリン刺激グルコース輸送の速度の著しい増大を示す。Green and Kehinde(1975)は、6〜9日のうちに、コンフルーエント3T3-L1細胞が、含脂肪細胞へと分化するようにホルモン的に誘導されうることを始めて実証した。
【００９６】
このことから、アッセイは、血流からのグルコースの素早い除去により糖尿病個体を助け、また同時に、脂肪細胞がよりよいエネルギーの貯蔵物を合成することを助ける、植物抽出物のスクリーニングを助けるであろう。
【００９７】
3T3-L1によるトリチウム化デオキシグルコース取り込みは、抗糖尿病活性を有する活性成分のin-vitroスクリーニングのための、最も受け入れられたアッセイの１つである。
【００９８】
a. 3T3-L1細胞培養:
3T3-L1線維芽細胞を、10％ FCS、NEAA、グルタミン、抗生物質、抗真菌薬などを含有するDME-F12培地で、5％ CO2の大気で37℃にて培養した。線維芽細胞をコンフルーエント状態まで培養した。継代培養は、３日間隔で、トリプシン−EDTA溶液処理を伴って行った。
【００９９】
b. 線維芽細胞の含脂肪細胞への成熟
細胞を48時間に渡り、0.5mmol/l 3-イソブチル-1-メチルキサンチン、4 mg/mLデキサメタゾン、1 mg/mLインスリンおよび10％ FCSを含むDMEM hi グルコース (4.5 gm/リットル)で処理することにより分化を誘導した。続く6〜10日間に渡り、標準的な前述の添加物を有するDMEM培地を用いて細胞を培養した。細胞の少なくとも95％が脂肪滴の蓄積という含脂肪細胞表現型を示すときのみ、その細胞を使用した。こうした細胞を、トリチウム化グルコースを用いたグルコース取り込み実験のために回収した。
【０１００】
c. アッセイ方法
新しい96ウェルプレートの各ウェルに、50,000個の分化した3T3-L1含脂肪細胞を分配する。KRHバッファーを用いて37℃にて10分、インキュベートする。それぞれに、インスリンを10 nM、25 nMおよび50 nM添加する。実験セットに対しては、試験化合物(333.0 μg)の存在下で、インスリン 10 nM有りまたは無しで処理を行った。これに続き、さらに37℃で15分のインキュベーションを行った。KRHバッファーを用いて細胞を１回洗浄する。2-デオキシ[3H]グルコース(最終濃度12.2 kBq/mL)を含む0.1 mM 2-デオキシグルコースを添加することにより、グルコース取り込み反応を開始させる。37℃で１時間インキュベートする。40μMのサイトカラシンBを添加することによりアッセイを終了させる。細胞を氷冷KRHバッファーを用いて３回洗浄する。細胞を20μLの1％ Triton X中で可溶化させる。37℃で10分インキュベートする。マイクロタイタープレート放射能カウンターを用いて放射能をカウンティングする。
【０１０１】
d. 結果と考察:
2.2 kBq/mLのデオキシ-トリチウム化-グルコースを含む0.1mMのデオキシグルコースの取り込みを測定することにより、グルコース取り込み活性を分析した。
【０１０２】
表26に見られるとおり、100 ％ エタノール溶媒を用いたテルミナリア・アルジュナ樹皮の直接抽出物[AV016BaDi(65)04(100)]は、インスリンの不在下で3.0の刺激指数、および10 nM インスリンの存在下で2.0の刺激指数を示した。したがって、このデータはAV016BaDi(65)04(100)が強力なインスリン模倣潜在力を有することを示唆する。
【０１０３】
2. 抗肥満潜在力:
研究からは、中心性肥満の方が一般性肥満よりも脂質／リポタンパク質異常と強く関連していることが実証されている。肥満は、心筋細胞中の脂質蓄積に起因する心臓機能不全を引き起こす可能性があり、またII型糖尿病を誘発する。肥満個体中のこうした有害な脂質／リポタンパク質プロファイルは、心血管疾患 (CVD)の増大したリスクに関与している可能性があることから、重要である。
【０１０４】
アッセイは、植物抽出物の存在下および不在下における、含脂肪細胞分化、ならびにそれ故に、分化のための細胞の刺激後の細胞中の脂質およびトリグリセリド含量の定量に使用される、半定量法である。
【０１０５】
a. アッセイ原理
オイルレッド染色は、含脂肪細胞分化の定量に用いられる半定量法である。油可溶性の染料を用いての染色は、染料が通常の水性アルコール性染料用溶媒よりも類脂質物質中でより可溶性が大きいことに基づく。オイルレッドOは、細胞内脂質滴を染める親油性の赤色染料である。脂質の定量は、有機溶媒を用いた細胞内脂質の抽出後に行うことができる。それ故に、この方法は、細胞を植物抽出物で刺激した後の細胞中の脂質およびトリグリセリド含量を推定するために使用する。
【０１０６】
b. アッセイプロトコル
3T3-L1細胞を、105個／ウェル(分化培地および抽出物(0.33mg)を有する)の密度にて接種し、37℃、5％CO2にて24時間インキュベートする。次いで24時間後に培地を除去し、新鮮な分化培地を添加し、次いで細胞をその培地にさらに24時間維持する。１日目から48時間後に培地を除去し、インスリンのみ培地(DMEM F12 ＋ FBS ＋ インスリン)を添加し、次いで細胞を24時間維持した。24時間のインキュベーション後、培地を吸引し、オイルOレッド染色を行った。
【０１０７】
c. オイルレッドO染色：
各ウェルにおける試薬の合計容量は500μL /ウェルである。培地を除き、細胞をPBSで３回洗浄した。細胞を固定するために、それらを4％ホルマリンと共に１時間インキュベートした。ホルマリンを除去し、再度、PBSを用いて２回洗浄を行う。オイルレッドOでの染色のために、細胞を染料と１時間インキュベートする。１時間後染料を除去し、細胞をPBSで洗浄し、次いでそれを10分乾燥させる。4％NP40を添加する。分光光度計を用いて520nmの吸光度を測定する。
【０１０８】
d. 結果と考察:
3T3-L1細胞を用いた抗肥満アッセイは、テルミナリア・アルジュナ抽出物が、脂質蓄積の阻害を示すことを実証した。表27に見られるとおり、テルミナリア・アルジュナ樹皮直接100％および20％エタノール抽出物である、AV016BaDi(65)04(100)およびAV016BaDi(28)04(20)抽出物は、対照と比較して、76.3および64.3％阻害を示した。
【０１０９】
テルミナリア・アルジュナ樹皮逐次抽出については、酢酸エチル、膠性アセトン、非膠性アセトン、エタノールおよびメタノール抽出物であるAV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)およびAV016BaSu(65)06(100)は、対照と比較して、61.9、58.5、86.8、49.4および57.9％阻害という阻害を示した。テルミナリア・アルジュナ果実直接100％エタノール抽出物AV016FrDi(65)04(100)は、対照と比較して、41.9％阻害という阻害を示した。
【０１１０】
アッセイ＋veコントロールは、対照と比較して104％阻害を示した。
【０１１１】
3. 心血管疾患: 
上昇したコレステロールは、アテローム性動脈硬化症および心血管疾患の通常より高いリスクと関連している。高い血液トリグリセリドレベルは単独ではアテローム性動脈硬化症を引き起こさない。しかしトリグリセリドを豊富に含むリポタンパク質はコレステロールも含み、そのコレステロールが、トリグリセリドの多い人においてアテローム性動脈硬化症を引き起こす。したがって多いトリグリセリドは、CHDに寄与するリポタンパク質疾患の兆候でありうる。
【０１１２】
1. 脂質蓄積のレベルを確認するための細胞に基づくアッセイ：
a. アッセイ原理:
リポタンパク質欠失血清の存在下で細胞を増殖させることは、細胞内の脂質生合成を誘導する。リポタンパク質欠失血清中で増殖させることにより誘導をかけた細胞に対して、その後オイルレッド染色を用いる総脂質推定によりアッセイを行う。オイルレッドOは、細胞中の中性脂肪を染色するために用いられる親油性の赤色染料である。染色の量は、細胞中の脂質量と正比例する。脂質の含量を、処理した抽出物および対照セットについて調べ、染料の量それゆえ脂質の含量は分光光度法的に測定した。
【０１１３】
b. アッセイ方法
CHO-K1細胞を、105 個/ウェルの密度にて、12ウェル−プレートフォーマットに接種した。細胞を、10％ウシ胎仔血清、2mM グルタミン、1.5 gm/L 重炭酸ナトリウムおよび抗真菌薬およびペニシリンおよびストレプトマイシンを有するDMEM-F12培地中で、37℃、5％ CO2環境にて、80％コンフルーエント状態まで増殖させた。２日のインキュベーション後に、培地を、10％リポタンパク質欠失血清、2mM グルタミン、1.5 gm/L重炭酸ナトリウムおよび抗真菌薬およびペニシリンおよびストレプトマイシンを有するDMEM-F12培地で置換して、さらに24時間、37℃、5％ CO2環境にて増殖させた。24時間の最後に、抽出物処理セットに、0.5 mg/mLの濃度のテルミナリア・アルジュナを添加した。これに対して対照セットはビヒクル(DMSO)で処理した。インキュベーションをさらに4時間継続し、その後、細胞を滅菌PBSバッファーで洗浄し、固定し、オイルレッドOで染色した。
【０１１４】
c. オイルレッドO染色：
各ウェルにおける試薬の合計容量は500μL /ウェルである。培地を除き、細胞をPBSで３回洗浄した。細胞を固定するために、それらを4％ホルマリンと共に１時間インキュベートした。ホルマリンを除去し、再度、PBSを用いて２回洗浄を行う。オイルレッドOでの染色のために、細胞を染料と１時間インキュベートする。１時間後染料を除去し、細胞をPBSで洗浄し、次いでそれを10分乾燥させる。4％NP40を添加する。分光光度計を用いて520nmの吸光度を測定する。
【０１１５】
d. 結果と考察:
表28に見られるとおり、テルミナリア・アルジュナ抽出物は、抽出物処理細胞内の総脂質量の著しい減少を示した。テルミナリア・アルジュナ樹皮逐次抽出物AV016BaSu(65)09(100)およびAV016BaSu(65)01(100)は、対照セットと比較して22％および21％阻害を示した。テルミナリア・アルジュナ直接エタノール抽出物AV016BaDi(65)04(100)およびAV016BaDi(28)04(20)は、対照セットと比較して、総脂質レベルにおいて31％および28％阻害を示した。
【０１１６】
2. HMG-CoAレダクターゼアッセイ:
3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル-補酵素A (HMG-CoA)レダクターゼは、コレステロール生合成経路において関係する最初の工程である。コレステロール生合成における速度を律する酵素工程であるHMG-CoAレダクターゼは、総血漿コレステロール、特にLDLコレステロールを低下させるための最も成功した薬物治療となった。
【０１１７】
a. アッセイ原理:
HMG-CoA レダクターゼアッセイは、肝臓ミクロソーム画分由来の固定濃度のHMG-CoA レダクターゼにより触媒される、NADPHのNADPへの酸化に基づく。
【０１１８】
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【０１１９】
NADPHのNADP+ への酸化に伴い340 nmにおける吸光度が減少し、これはサンプル中のHMG-CoA レダクターゼ活性と正比例する。
【０１２０】
b. 結果と考察:
テルミナリア・アルジュナ樹皮直接100％エタノールおよび20％エタノール抽出物AV016BaDi(28)04(20)およびAV016BaDi(65)04(100)の潜在力を、そのHMG-CoA レダクターゼ阻害潜在力について調べた。AV016BaDi(28)04(20)およびAV016BaDi(65)04(100)の両方が、HMG-CoA レダクターゼ活性について対照セットと比較して93％阻害(表29)および63.1％阻害(表30)を示すことが見出された。
【０１２１】
4. 抗癌アッセイ:
テルミナリア・アルジュナ植物抽出物の抗癌潜在力は、植物抽出物を、ヒト肝細胞株HepG2に対する細胞毒性についてin vitroにてスクリーニングすることにより決定した。
【０１２２】
a.実験詳細:
細胞を、１mL当たり2.5×105個の密度にて24ウェルプレートに接種した。細胞を2時間に渡り接着させ、その後抽出物を10μg/mLの濃度にて添加した。ビヒクル、すなわちDMSOを用いるインキュベーションの48時間後、アスコルビン酸および抽出物AV016BaSu(65)09(100)、AV016BaSu(65)01(100)、AV016BaSu(65)04(100)。細胞生存能力は、24時間後に決定した。
【０１２３】
b. アッセイプロトコル
HepG2を１mL当たり2.5×105個の細胞密度にて接種する。アスコルビン酸およびテルミナリア・アルジュナ抽出物を、最終濃度10 μg/mLとなるように添加する。37℃にて48時間に渡り、5％ CO2インキュベーター内でインキュベートする。細胞をトリプシン処理する。１部分のトリパンブルーと4部分のPBSを混合し、トリパンブルーを取り込んだ細胞(非生存細胞)およびそれを排除した細胞(生存細胞)をカウンティングすることにより、生存細胞と非生存細胞をカウンティングする。
【０１２４】
c. 結果と考察:
HepG2細胞を、テルミナリア・アルジュナ逐次酢酸エチルAV016BaSu(65)09(100)、アセトンAV016BaSu(65)01(100)、およびエタノールAV016BaSu(65)04(100)抽出物を用いて処理したところ、未処理のセットまたはDMSOセットの細胞と比較して、薬物処理セットにおいて、総細胞カウンティングおよび生存細胞数の減少があることが見出された(表31)。
【０１２５】
【表１】
2008537539.tif 000018
【０１２６】
【表２】
2008537539.tif 000019
【０１２７】
【表３】
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【０１２８】
【表４】
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【０１２９】
【表５】
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【０１３０】
【表６】
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【０１３１】
【表７】
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【０１３２】
【表８】
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【０１３３】
【表９】
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【０１３４】
【表１０】
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【０１３５】
【表１１】
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【０１３６】
【表１２】
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【０１３７】
【表１３】
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【０１３８】
【表１４】
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【０１３９】
【表１５】
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【０１４０】
【表１６】
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【０１４１】
【表１７】
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【０１４２】
【表１８】
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【０１４３】
【表１９】
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【０１４４】
【表２０】
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【０１４５】
【表２１】
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【０１４６】
【表２２】
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【０１４７】
【表２３】
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【０１４８】
【表２４】
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【０１４９】
【表２５】
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【０１５０】
【表２６】
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【０１５１】
【表２７】
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【０１５２】
【表２８】
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【０１５３】
【表２９】
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【０１５４】
【表３０】
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【０１５５】
【表３１】
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【図面の簡単な説明】
【０１５６】
【図１】図１は、テルミナリア・アルジュナ直接エタノール抽出物であるAV016BaDi(65)04(100)およびAV016BaDi(28)04(20)のα-グルコシダーゼ阻害潜在力を示す。
【図２】図２は、テルミナリア・アルジュナ果実抽出物であるAV016FrDi(65)04(100)、AV016FrSu(65)08(100)のα-グルコシダーゼ阻害潜在力を示す。
【図３】図３は、テルミナリア・アルジュナ逐次抽出物であるAV016BaSu(65)01(100)g、AV016BaSu(65)01(100)ng、AV016BaSu(65)04(100)のα-グルコシダーゼ阻害潜在力を示す。
【図４】図４は、テルミナリア・アルジュナの逐次的なメタノールおよび水による抽出物AV016BaSu(65)06(100)およびAV016BaSu(105)08(100)のα-グルコシダーゼ阻害潜在力を示す。
【図５】図５は、テルミナリア・アルジュナ逐次抽出物AV016BaSu(65)09(100)のα-グルコシダーゼ阻害潜在力を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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