(57)【要約】  本発明は、少なくとも１つの精製ＰｏｒＡタンパク質抗原及び少なくとも１つの精製ＦｅｔＡタンパク質抗原を含む組成物に関する。特に上記ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡ抗原は、ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡの可変領域を含む抗原可変性抗原である。ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡエピトープの特定の組合せは、例えば表３に示されている。本発明は、上記組成物を投与することを包含する免疫化方法に、及び当該組成物の製造方法にも関する。好ましくは当該組成物は、精製タンパク質組成物である。好ましくは当該組成物は、ワクチン組成物である。
2008501674.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの精製ＰｏｒＡタンパク質抗原及び少なくとも１つの精製ＦｅｔＡタンパク質抗原を含む組成物。
【請求項２】
前記ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡ抗原がＰｏｒＡ／ＦｅｔＡの可変領域を含む抗原可変性抗原である、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が少なくとも１つのＰｏｒＡ  ＶＲ１エピトープ及び少なくとも１つのＰｏｒＡ  ＶＲ２エピトープを含み、前記エピトープが表３に示された一覧から選択される、請求項１又は２記載の組成物。
【請求項４】
表３に示された一覧から選択される少なくとも１つのＦｅｔＡエピトープを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
ＰｏｒＡエピトープＰ１．５−２、Ｐ１．１０、Ｐ１．７及びＰ１．１３−１並びにＦｅｔＡエピトープＦ５−１及びＦ１−５を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
ＰｏｒＡエピトープＰ１−２０及びＰ１．９並びにＦｅｔＡエピトープＦ３−１をさらに含む、請求項５記載の組成物。
【請求項７】
ＰｏｒＡエピトープＰ１．５−１、Ｐ１．２−２、Ｐ１．５−２、Ｐ１．１６、Ｐ１．５、Ｐ１．１０、Ｐ１．７、Ｐ１．７−２及びＰ１．４並びにＦｅｔＡエピトープＦ１−５、Ｆ５−１及びＦ３−９を含む、請求項５記載の組成物。
【請求項８】
ＰｏｒＡエピトープＰ１．１３−１、Ｐ１−２０及びＰ１．９並びにＦｅｔＡエピトープＦ３−１及びＦ５−５をさらに含む、請求項７記載の組成物。
【請求項９】
ＰｏｒＡエピトープＰ１．１９及びＰ１．１５をさらに含む、請求項８記載の組成物。
【請求項１０】
ＰｏｒＡエピトープＰ１．２、Ｐ１．１９及びＰ１．１５並びにＦｅｔＡエピトープＦ１−７をさらに含む、請求項７記載の組成物。
【請求項１１】
ＰｏｒＡエピトープＰ１．５及びＰ１．２並びにＦｅｔＡエピトープＦ３−６及びＦ５−１を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
ＰｏｒＡエピトープＰ１．７、Ｐ１．１６、Ｐ１．１９及びＰ１．１５並びにＦｅｔＡエピトープＦ３−１を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
ＰｏｒＡエピトープＰ１．７−２及びＰ１．４並びにＦｅｔＡエピトープＦ１−５及びＦ１−７を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
トランスフェリン結合タンパク質、ＰｏｒＢ、Ｏｐａ、ＮｓｐＡから成る群から選択される1つ又は複数の構成成分をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記さらなる構成成分がトランスフェリン結合タンパク質、ＰｏｒＢ及びＯｐａから成る群から選択される、請求項１４記載の組成物。
【請求項１６】
前記さらなる構成成分がＯｐａである、請求項１５記載の組成物。
【請求項１７】
髄膜炎菌感染に対する被検体の免疫化方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物の有効量を前記被検体に投与することを包含する方法。
【請求項１８】
被検体における髄膜炎菌に対する免疫応答の誘導方法であって、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のワクチン組成物の有効量を前記被検体に投与することを包含する方法。
【請求項１９】
生物体に対するワクチン組成物の生産方法であって、
（ｉ）前記生物体に表面タンパク質の配列を提供するステップと、
（ｉｉ）抗原可変性であるタンパク質を前記表面タンパク質から選択するステップと、
（ｉｉｉ）前記生物体の臨床的出現における前記抗原可変性タンパク質の各々の発生率を確定するステップと、
（ｉｖ）前記抗原可変性表面タンパク質から抗原の亜群を選択するステップであって、それにより、最小数の個々の抗原を含みながら前記生物体の異なる単離物（単数又は複数）の最適提示を提供するステップと、
（ｖ）前記ステップ（ｉｖ）で選択される抗原をワクチン組成物中に提供するステップとを包含する方法。
【請求項２０】
同等の免疫応答を誘導する場合に前記組成物中に含入するための個々の抗原がさらに選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記抗原が前記生物体の多数の疾患関連菌株間の変異を代表するものであるようにさらに選択される、請求項１９又は請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
表３に示されるようなＰｏｒＡ及びＦｅｔＡエピトープの組合せを含む組成物。
【請求項２３】
請求項５〜１３のいずれか一項に記載のＰｏｒＡ及びＦｅｔＡエピトープの組合せを含む精製タンパク質組成物。
【請求項２４】
ワクチン組成物である、請求項１〜１６又は請求項２２又は２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が外膜小胞ワクチンである、請求項２４記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はワクチン組成物に関し、そしてそれらの設計に関する。特に本発明は、髄膜炎菌に対する防御のための、例えば髄膜炎菌血清型Ｂに対する防御のためのワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト鼻咽頭の一般的な共生生物である髄膜炎菌は、世界的に細菌性髄膜炎及び敗血症の主因である。無莢膜髄膜炎菌は本質的に無毒性であり、髄膜炎菌血清型を限定する１３個の化学的及び免疫学的に異なる髄膜炎莢膜多糖類のうちの５つのみが、感染病としばしば関連する。タンパク質−多糖複合体ワクチンは血清型Ａ、Ｃ、Ｙ及びＷ１３５により引き起こされる髄膜炎菌性疾患に対する防御の可能性を提供するが、しかしこのアプローチは血清型Ｂ髄膜炎菌に関しては成功していない。さらに包括的防止は、多糖ベースのワクチン単独では可能であるとは思われない。問題は、血清型Ｂ多糖構造の免疫原性が不十分である、という事実から生じる。さらなる問題は、ヒト細胞上のシアリル化糖ペプチドとのその類似性のために生じる。
【０００３】
従来技術のワクチンはしばしば、当該特定生物体の細胞表面から噴出される小胞を表わすいわゆる「泡状突起」の精製を利用した。しかしながらこのような粗生成物は、多数の問題を保有する。例えばこれらの泡状突起の組成に広範な変異が存在する。どのタンパク質がこれらの泡状突起に含まれ又はそれから排除されるかを制御する確かな方法は存在しない。これらの泡状突起は、当該生物体の多糖コーティングエレメントを含むこともある。互いに関連する泡状突起の種々の構成成分の割合は、確実に確定され得るわけではない。これらの泡状突起の組成は、容易に確定又は制御され得ない。
【０００４】
莢膜下抗原、特に外膜タンパク質（ＯＭＰ）を基礎にしたワクチンワクチンを開発するために、多数の試みがなされてきた。髄膜炎菌ＯＭＰは非常に多様であり、そしてＯＭＰ含有外膜小胞（ＯＭＶ）ワクチンはそれらが作製された特定の流行病菌株に対して有効であったが、しかし異種菌株に対する潜在的な交差防御性免疫応答のレベルは期待はずれであった。
【０００５】
従来技術の一ワクチンは、いわゆるＯＭＶ（外膜小胞）ワクチンである。これは９つまでの異なるＰｏｒＡタンパク質を含んでいた。この９つのタンパク質から成るワクチンは細菌の３つの異なる菌株から産生されるＯＭＶから作製され、各々は、その天然ＰｏｒＡに加えて、３つの菌株の各々に工学処理された２つのさらなるＰｏｒＡを保有する。これは、いわゆる「慣用的」ワクチンである。このようなものとして、それは一般的に小胞ワクチンと関連するような従来技術の他の部分に存在するのと同様の問題を被る。これらの問題としては、存在する抗原のレベルを制御するに際しての難しさ、これが小胞ベースのワクチンであるという事実に伴う難しさ、並びに用いられる製剤の粗製性が挙げられる。
【０００６】
外膜タンパク質（ＯＭＰ）を含有するＯＭＶワクチンは、ノルウェー及びキューバにおいて単一菌株により引き起こされる流行病の抑制に用いられてきた。異なる菌株間の多数のＯＭＰの高い抗原多様性のため、この型のワクチンに対する免疫応答は通常は、それらの製造に用いられる菌株又はそれらの近縁物に限定される。その結果として、このアプローチは、多様な菌株に起因すると考えられる風土病性血清型Ｂ疾患の有効抑制を提供する。
【０００７】
Feavers他（１９９６）（Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology Volume 3 pp 444-450）は、髄膜炎菌ＰｏｒＡ外膜タンパク質の抗原多様性を考察している。多岐にわたる血清学的及び核酸類別研究が記載されている。抗原可変性により提示される医学的問題が、ワクチン設計に関連して考察されている。ＰｏｒＡタンパク質ワクチンが記述されているが、しかしそれらは、変異性抗原に対して向けられるタンパク質構成成分ワクチンの設計に関連した問題を例証するという状況で記述されている。実際、これらのワクチンの非予測可能性が考察され、そして保存抗原の同定に向けられる努力が概説されている。
【０００８】
Thompson他（２００３）（Microbiology Volume 149 pp. 1849-1858）は、髄膜炎菌ＦｅｔＡタンパク質の抗原多様性に関して広範に報告している。ＦｅｔＡは、非常に高多様性であることが示されている。検査された１０７個の個々の髄膜炎菌単離物から、６０個の異なるＦｅｔＡ対立遺伝子が同定された。これら６０個の対立遺伝子は、５６個の異なるＦｅｔＡタンパク質配列をコードした。このＦｅｔＡの多様性がワクチン構成成分としてその有効性を弱める、ということを、Thompson他は説明している。実際、或る種の外膜小胞（ＯＭＶ）ワクチンに存在すると考えられるが、これらのワクチンは菌株の特異性の問題を被る。実際、ＯＭＶワクチンを用いて防御の適用範囲を拡大するために、特定領域で優勢な各侵襲性遺伝子型由来のＯＭＶがワクチン処方物中に含まれる必要がある。Thompson他で到達される結論は、ＦｅｔＡがワクチン処方物中で非常に効力がないと思われるほど多様性であり、そして保存抗原がおそらくはワクチン開発が前進する最良の方法を提供する、というものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明は、従来技術に伴う問題（単数又は複数）を克服しようとするものである。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、抗原可変性抗原がワクチン化に際して利用されて、標的生物体の一連の異なる菌株に対して広範な防御を提供する、という意外な知見に基づいている。以前、抗原可変性抗原は、それらの変異性、並びに上に概説された種々のその他の難しさのため、ワクチン組成物のための非常に不十分な候補であると考えられた。変異性抗原は、従来、菌株特異的予防接種に適していると考えられているにすぎない。しかしながら本明細書中で詳細に説明されるように、これらの種々の変異性抗原の系統発生の深い分析は、上記抗原のある種の組合せが有効ワクチン組成物を提供することと組合せて利用され得る、ということを意外にも明示した。
【００１１】
特に、髄膜炎菌ワクチンの分野では、ＰｏｒＡ及びＦｅｔＡ抗原の組合せは、各抗原により個別に引き出される非常によく似た免疫応答のため、特に有益であることが見出されている。これらの応答は、性質が似ているだけでなく、強度も類似している。これらの有益な特性は、本明細書中に記載されるようなワクチン組成物から免疫優勢作用を容易に除去されるようにする。
【００１２】
さらに、そして最も重要であるが、本発明は、研究されてきた非常に広範囲の抗原多様性髄膜炎菌単離物全体のＰｏｒＡ及びＦｅｔＡ抗原の提示へのより深い洞察に基づいている。ＰｏｒＡからの並びに組合わされたＦｅｔＡからの相対的に少数の変異性抗原は、非常に広範囲のそれらの疾患関連単離物に対する防御を提供し得る、ということが意外にも示されている。
【００１３】
したがって第一の態様において、本発明は、少なくとも１つの精製ＰｏｒＡタンパク質抗原及び少なくとも１つの精製ＦｅｔＡタンパク質抗原を含む組成物に関する。これらのタンパク質の抗原可変性領域は、組成物中に、好ましくはワクチン組成物中に用いられて、広範な防御適用範囲を提供する、ということが、意外にも本明細書中で示されている。好ましくはＰｏｒＡ／ＦｅｔＡ抗原は、ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡの可変領域を含む抗原可変性抗原である。
【００１４】
ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡの可変領域は特性化され、エピトープはそれらの領域内で記述されてきた。以下でさらに詳細に考察されるように、エピトープの変異性にもかかわらず、有効なワクチン組成物を提供するためにそれらの変異性エピトープの組合せが利用され得る。エピトープは表３に列挙されている。好ましくは組成物は、少なくとも１つのＰｏｒＡ  ＶＲ１エピトープ及び少なくとも１つのＰｏｒＡ  ＶＲ２エピトープを含み、この場合、上記エピトープは表３に示された一覧から選択される。好ましくは組成物は、表３に示された一覧から選択される少なくとも１つのＦｅｔＡエピトープを含む。
【００１５】
エピトープのある種の限定組合せは、有益には、疾患を引き起こす単離物の特定群に対する防御を提供する。しばしばこれらの組合せ／グループ分けは、オペレーターにより確定される。いくつかの特に有益な組合せは、以下に示される。
【００１６】
一態様では、本発明は、ＰｏｒＡエピトープＰ１．５−２、Ｐ１．１０、Ｐ１．７及びＰ１．１３−１並びにＦｅｔＡエピトープＦ５−１及びＦ１−５を含む上記のような組成物に関する。これは、コア防御を提供する。好ましくは組成物は、ＰｏｒＡエピトープＰ１−２０及びＰ１．９、並びにＦｅｔＡエピトープＦ３−１をさらに含む。これは、アフリカ／アジア単離物に対する防御において特に有用である。
【００１７】
一態様では、本発明は、ＰｏｒＡエピトープＰ１．５−１、Ｐ１．２−２、Ｐ１．５−２、Ｐ１．１６、Ｐ１．５、Ｐ１．１０、Ｐ１．７、Ｐ１．７−２及びＰ１．４並びにＦｅｔＡエピトープＦ１−５、Ｆ５−１及びＦ３−９を含む組成物に関する。これは、広範囲のコア防御を提供する。好ましくは組成物は、ＰｏｒＡエピトープＰ１．１３−１、Ｐ１−２０及びＰ１−９、並びにＦｅｔＡエピトープＦ３−１及びＦ５−５をさらに含む。
【００１８】
これは、全世界の単離物の８８％より大きい適用範囲を有する「標準」ワクチンを提供することが有益である。好ましくは組成物は、ＰｏｒＡエピトープＰ１．１９及びＰ１．１５をさらに含む。これは、全世界の単離物の９０％より大きい適用範囲を有する「増強」ワクチンを提供することが有益である。
【００１９】
別の態様では、本発明は、ＰｏｒＡエピトープＰ１．２、Ｐ１．１９及びＰ１．１５並びにＦｅｔＡエピトープＦ１−７をさらに含む上記のような広範なコア組成物に関する。これは、欧州／米国単離物に対する防御に向けられる組成物、好ましくはワクチン組成物を提供することが有益である。
【００２０】
別の態様では、本発明は、ＰｏｒＡエピトープＰ１．５及びＰ１．２並びにＦｅｔＡエピトープＦ３−６及びＦ５−１を含む上記のような組成物に関する。これは、ＳＴ−１１複合体単離物に向けられる防御を提供することが有益である。
【００２１】
別の態様では、本発明は、ＰｏｒＡエピトープＰ１．７、Ｐ１．１６、Ｐ１．１９及びＰ１．１５並びにＦｅｔＡエピトープＦ３−１を含む上記のような組成物に関する。これは、ＳＴ−３２複合体単離物に向けられる防御を提供することが有益である。
【００２２】
別の態様では、本発明は、ＰｏｒＡエピトープＰ１．７−２及びＰ１．４並びにＦｅｔＡエピトープＦ１−５お呼びＦ１−７を含む上記のような組成物に関する。これは、ＳＴ−４１／４４複合体単離物に向けられる防御を提供することが有益である。
【００２３】
さらなる構成成分は、生成される免疫応答を補足するために組成物（単数又は複数）中に有益に含まれるように用いられ得る。好ましくは上記組成物は、トランスフェリン結合タンパク質、ＰｏｒＢ、Ｏｐａ、ＮｓｐＡから成る群から選択される1つ又は複数の構成成分をさらに含む。好ましくは上記のさらなる構成成分は、トランスフェリン結合タンパク質、ＰｏｒＢ及びＯｐａから成る群から選択される。好ましくは上記のさらなる構成成分はＯｐａである。
【００２４】
好ましくは組成物は、精製タンパク質組成物である。
【００２５】
好ましくは組成物は、ワクチン組成物である。
【００２６】
別の態様では、本発明は、髄膜炎菌感染に対する被検体の免疫化方法であって、有効量の上記のような組成物、好ましくはワクチン組成物を上記被検体に投与することを包含する方法に関する。
【００２７】
別の態様では、本発明は、被検体における髄膜炎菌に対する免疫応答の誘導方法であって、有効量の上記のような組成物、好ましくはワクチン組成物を上記被検体に投与することを包含する方法に関する。
【００２８】
別の態様では、本発明は、生物体に対するワクチン組成物の産生方法であって、以下の：
（ｉ）前記生物体に表面タンパク質の配列を提供するステップと、
（ｉｉ）抗原可変性であるタンパク質を上記表面タンパク質から選択するステップと、
（ｉｉｉ）上記生物体の臨床的出現における上記抗原可変性タンパク質の各々の発生率を確定するステップと、
（ｉｖ）上記抗原可変性表面タンパク質から抗原の亜群を選択するステップであって、それにより、最小数の個々の抗原を含みながら生物体の異なる単離物（単数又は複数）の最適提示を提供する、選択するステップと、
（ｖ）ステップ（ｉｖ）で選択される抗原をワクチン組成物中に提供するステップと
を包含する方法に関する。
【００２９】
組成物は、免疫優勢作用を回避するよう平衡されることが有益であり得る。したがって好ましくは組成物中に含入するための個々の抗原が、同等の免疫応答を誘導する場合に、さらに選択される。組成物は、できるだけ多数の疾患関連菌株を網羅するように製造されることが有益であり得る。したがって好ましくは上記抗原は、上記生物体の多数の疾患関連菌株間の変異を代表するものであるようにさらに選択される。
【００３０】
一実施形態では、組成物中に含まれる抗原の数は、限定されるか又は予め決定され得る。この実施形態では、上記方法のステップ（ｉｖ）は単に、上記抗原可変性表面タンパク質から抗原の亜群を選択して、それにより、予定数の個々の抗原を含みながら生物体の異なる単離物（単数又は複数）の最大提示を提供するようになっている。
【００３１】
別の実施形態では、組成物の適用範囲は、例えば単離物の地理的広がりに、又は単離物の特定のクローン若しくはコレクションに予め決定される。この実施形態では、上記方法のステップ（ｉｖ）は単に、上記抗原可変性表面タンパク質から抗原の亜群を選択して、それにより、単一抗原を選択することにより所望の適用範囲を提供し、適用範囲内で考え得る最大増大を提供し、そしてさらなる抗原の付加が生物体の単離物（単数又は複数）の適用範囲をさらに増大しなくなるまでこれを選択抗原の亜群に付加するようになっている。
【００３２】
いくつかの実施形態では、いわゆる「多重ヒット」アプローチが用いられ得る。「単一ヒット」アプローチは、網羅される各単離物上に存在する少なくとも１つの抗原が組成物中に含まれる場合である。多重ヒットアプローチは、網羅される各単離物上に存在する多数の抗原が組成物中に含まれる場合であり、例えば単離物当たり少なくとも２つの抗原が含まれる「二重ヒット」アプローチである。概して、多重ヒットアプローチが好ましい。
【００３３】
別の態様では、本発明は、表３に示されるようなＰｏｒＡ及びＦｅｔＡエピトープの組合せを含む組成物に関する。好ましくは上記組成物は、上記のようなＰｏｒＡ及びＦｅｔＡエピトープの組合せを含む。好ましくは上記組成物は、ワクチン組成物である。好ましくは上記組成物は、外膜小胞ワクチンである。
【００３４】
好ましくは本発明の組成物は、細胞構成成分、例えば多糖莢膜物質及び／又は小胞を本質的に含有しない。これは、組成物が、存在するように意図されないがしかし細胞残屑により保有され得る付加的抗原を含有しない、という利点を提供する。さらに、これは本発明の組成物は好ましくはそれらの組成物中に予測可能性が低い可能性がある細胞分画を含有せず、したがって、本明細書中に説明したような精製タンパク質組成物のみを用いることで有利に回避される一貫性及びバッチ変異の問題を生じるので、それは規制認可プロセスを促す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
髄膜炎菌多様性
抗原多様性のほかに、髄膜炎菌集団は遺伝的高多様性であり、代謝機能の保存に関する選択の安定化を受けるハウスキーピング遺伝子の検査により、多数の遺伝子型が同定されている。これらの遺伝子型は、多遺伝子座酵素電気泳動（ＭＬＥＥ）により電気泳動型（ＥＴ）として、並びにさらに近年では多遺伝子座配列類別（ＭＬＳＴ）により配列型（ＳＴ）として同定されている。ＭＬＥＥ及びＭＬＳＴを利用する集団試験は、「クローン複合体」と呼ばれる関連遺伝子型の等価群を同定しており、これらは現在、優勢又は中心ＳＴの後に、例えばＳＴ−１複合体と名づけられ、４つ又はそれ以上のＭＬＳＴ遺伝子座でこのＳＴを有する同一対立遺伝子を共有するすべての単離物を含む。無症候的保有髄膜炎菌の集団に対応する単離物コレクションは最大遺伝子多様性を示し、疾患関連髄膜炎菌のコレクション中に存在する多様性は低い。後者は、高侵襲性系統として既知である限定数のクローン複合体に属する髄膜炎菌が優勢を占める。
【００３６】
ＯＭＰ多様性
髄膜炎菌ＯＭＰはペプチド配列中で高多様性であり、そしてそれらの遺伝子は免疫攻撃に曝露されるタンパク質のそれらの部分をコードする領域で強いポジティブ選択を受ける、ということは十分に確立されている。例えばｐｏｒＢ遺伝子において記録されたポジティブ選択の強度は、ＨＩＶ−１のエンベロープタンパク質に関して報告されたものを超える。これらの観察は、免疫優勢成分として髄膜炎菌ＯＭＰを含むワクチンの導入後の効力不足の可能性及びエスケープ変異体の急速拡散を表わす。しかしながら髄膜炎菌集団中に存在する抗原多様性の程度における構造に関する多少の証拠が存在し、そして理解され、利用される場合、これらの制限はワクチン設計及び実行を簡単にし得る。
【００３７】
特定の血清型（ＰｏｒＢ変異体）及び血清亜型（ＰｏｒＡ変異体）とクローン複合体との関連がいくつかの研究で確認されており、ＰｏｒＡ  ＶＲ１及びＶＲ２で観察される変異体は非重複性組合せに構造化される。これらの関連はともに、クローン複合体間で遺伝子を再類別し、そして新規の抗原変異体をコードするモザイク遺伝子を生じる多様化選択及び高比率の組換えに鑑みて、保持されると思われる。さらに、ＳＴ−５複合体におけるＯＭＰ  ＴｂｐＢの抗原変異体の研究は、抗原変異体は流行病拡散中に出現するが、しかしそれらは親遺伝子型より適応性が低く、その後の伝染中に失われる、ということを示した。
【００３８】
ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡ
ＰｏｒＡ及びＦｅｔＡは、髄膜炎菌の外膜タンパク質である。それらの配列組成物は、当業者に既知である。これらのタンパク質の可変領域はマッピングされており、文献中に記載されている。便宜のため、ＦｅｔＡ及びＰｏｒＡの両方に関して配列情報が利用可能である中心的供給源である「neisseria. org」が参照される。各可変領域は、少なくとも１つのエピトープを含む。「可変領域」及び「エピトープ」という用語は、文脈から明らかなように、時として、本明細書中で互換的に用いられる。これは、以下で詳細に説明される。
【００３９】
両タンパク質の可変領域配列（即ちエピトープ配列）は、当該技術分野で既知の容認スキームに従って分類され、そして異なる配列変異体に関する一般的数的呼称がこの文献を通して用いられる（例えばRussell et al 2004 Emerging Infectious Diseases vol. 10 p674参照）。
【００４０】
好ましくは「抗原可変性抗原」という用語は、関与する特定タンパク質の可変領域（単数又は複数）（「ＶＲ」）により含まれる抗原を指す。
【００４１】
ＦｅｔＡは、単一可変領域（エピトープ配列）を有する。この可変領域のすべての既知の変異体の配列は、当該技術分野で既知である。便宜のため、http://neisseria.org/nm/typing/feta/vr shtmlでＦｅｔＡ  ＶＲ配列の一覧が参照される。
【００４２】
ＰｏｒＡは、２つの可変領域（エピトープ配列）、ＶＲ１及びＶＲ２を有する。これら２つの可変領域のすべての既知の変異体の配列は、当該技術分野で既知である。便宜のため、http://neisseria.org/nm/typing/pora/vrl.shtmlでＰｏｒＡ  ＶＲ１配列の一覧、並びにhttp://neisseria.org/nm/typing/pora/vr2.shtmlでＰｏｒＡ  ＶＲ２配列の一覧が参照される。本明細書中に記載されたＰｏｒＡ抗原は、好ましくはＰｏｒＡタンパク質当たり１つのＶＲ１及び１つのＶＲ２を含む。多数のＶＲ１／ＶＲ２配列組合せが現実に既知であり、現実に既知でないそれらの組合せは、必要に応じて関連ＶＲ１及びＶＲ２配列を一緒にＰｏｒＡ状況に置くための初歩的組換え分子生物学技法を用いて、当業者により容易に構築され得る。ＰｏｒＡエピトープ組成物がＶＲ１、ＶＲ２として示される場合、好ましくはこれら２つのエピトープは単一ＰｏｒＡタンパク質上に提供される。しかしながら１つより多いＰｏｒＡタンパク質が特定組成物により含まれる場合には、その特定組成物に関するエピトープの一覧は、任意の１つのＰｏｒＡ分子における特定対合よりも重要である。例えばＰ１．５−１，２−２及びＰ１．５−２，１６が特定される場合、これはＰｏｒＡ分子の組合せ、例えば（Ｐ１．５−１，２−２及びＰ１．５−２，１６）、並びに（Ｐ１．５−１，１６及びＰ１．５−２，２−２）のような組合せ、あるいは列挙されたエピトープの各々を含むスーパーセット(supersets)を含む。好ましくはＰｏｒＡエピトープ組合せは、書き込まれたように提供され、即ち、Ｐ１．５−１，２−２、Ｐ１．５−２，１６が特定される場合には、好ましくはＰｏｒＡは（Ｐ１．５−１，２−２及びＰ１．５−２，１６）として提供される。
【００４３】
好ましくは組成物は、特定化ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡエピトープを含むだけである。
【００４４】
ＰｏｒＡ及びＦｅｔＡは防御性であり、感染及び防御のヒト及び動物モデルにおいて殺菌応答を生じる。従来技術では、ＰｏｒＡはワクチン試験において又は開発において含まれる菌株特異的ワクチンの主要構成要素であった。ＦｅｔＡは従来技術菌株特異的ワクチンに含まれ、そして防御性であるが、しかしそれはｉｎ  ｖｉｔｒｏで良好に発現されないので、相対的にあまり利用されない。ＰｏｒＡ  ＶＲ、特にＶＲ２、並びにＦｅｔＡ  ＶＲは、それらが、容易に限定される相対的に長い表面曝露ペプチド（ＶＲ２は８〜２４アミノ酸長の範囲であり、ＦｅｔＡ  ＶＲは２０〜４２アミノ酸長の範囲である）であるという点で類似する。
【００４５】
抗原組合せ
好ましくは抗原は、類似の全体的免疫応答を提供するために選択される。
【００４６】
例えば類似の免疫原特性を提供する抗原は、組合せに特に適している。十分に限定された可変領域を有するタンパク質は、本発明に用いるのに特に適している。抗原の特に良好な組合せは、個々の抗原が非常に類似した免疫応答を生じる場合に見出される。特に有益なのは類似の強度の免疫応答を有する抗原であるが、これは、この抗原が免疫優勢作用を除去するのを助けるためである。類似の性質の免疫応答を含む抗原も、組合せのための良好な候補である。例えば抗原の各々が既知の殺菌活性を伴って免疫応答を引き出す場合には、これも有益である。この殺菌活性が異なる抗原に関して類似レベルで見出される場合には、それらは組合せにより良好に適合される。要するに、２つの異なる抗原により生成される免疫応答（質及び／又は量に関して）間のマッチが厳密であるほど、それらは組合せのためにより良好な候補である。
【００４７】
ＰｏｒＡ可変領域はそれらの免疫原特性において、考慮された他の外膜タンパク質よりもＦｅｔＡ免疫原領域により類似しているため、ＦｅｔＡ−ＰｏｒＡ組合せは特に有益である。
【００４８】
同様の判定基準は、本発明のワクチン組成物の特に有益な第三の又はさらなる構成成分の選択に適用され得る。これは、本明細書中でさらに詳細に説明される。
【００４９】
ＰｏｒＡ−ＦｅｔＡ組合せのさらなる利点としては、最小数の個々のタンパク質抗原の含入を用いて達成することができる例外的に広範な適用範囲が挙げられる。
【００５０】
組成物
組成物、好ましくはワクチン組成物中のＰｏｒＡ及びＦｅｔＡ変異体の組合せは、これら２つの抗原の免疫原性変異体を発現する細菌集団の強力な構造化を考えると、特に有効であり得る、ということが本明細書中に開示される。７８個の単離物の調査（実施例参照）は、５つのＦｅｔＡ変異体（Ｆ１−５、Ｆ３−１、Ｆ５−１、Ｆ３−９、Ｆ５−５）と組合わされる６つという少ないＰｏｒＡ変異体（Ｐ１．５−１，２−２、Ｐ１．５−２，１６、Ｐ１．５，１０、Ｐ１．７，１３−１、Ｐ１．７−２，４、Ｐ１２０，９）は、７８個の単離物すべてに対する同種防御を提供する、ということを示した。本発明によるＰｏｒＡ及びＦｅｔＡ抗原変異体の組合せは、高侵襲性系統の７８個の代表物が由来するＭＬＳＴを開発するために用いられる１０７個の多様な髄膜炎菌単離物のうちの９５（８９％）に対して防御する。
【００５１】
抗原の形態
抗原は、任意の適切な形態で、例えば精製タンパク質、又は抗原をコードする核酸で用いられ得る。抗原は、好ましくは精製タンパク質抗原の形態で用いられる。この状況における「精製(purified)」という用語は、多糖莢膜物質及び／又は小胞のような細胞構成成分を本質的に含有しないことを意味する。好ましくは抗原は、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより判断した場合、本質的に同種のタンパク質調製物の形態で用いられる。
【００５２】
明らかに、組成物、好ましくはワクチン組成物を産生する別の抗原の精製調製物と混合される一抗原の精製調製物は、それが少なくとも２つの抗原種を含むため、混合物それ自体が均質でない少なくとも２つのポリペプチド種の混合物を生じる。したがって精製Ｘ及び精製Ｙを含む組成物は、上で説明された意味で「精製」されていると理解され、即ち、それは、多糖莢膜物質及び／又は小胞のような細胞構成成分を本質的に含有しない。異なる個々の要素Ｘ及び要素Ｙの全体的組成物中の単なる存在は、それらの要素が記載されたように組合されているということのみに基づいて、もはや「精製」されない、ということを意味しない。
【００５３】
好ましくは抗原は、組換え手段により産生される。好ましくは抗原は、非髄膜炎細胞中での組換え手段による産生といったように、髄膜炎菌の非存在下で産生される。好ましくは抗原は、大腸菌中での発現により産生される。
【００５４】
個々の精製抗原の産生は、当業者の能力内である。これらは、当該技術分野で既知の任意の適切な手段により、例えばIdanpaan-Heikkila, I, Wahlstrom, E., Muttilainen, S, Numinen, M., Kayhty, H., Sarvas, M., and Makela, P.H. (1996) Immunization with meningococcal class 1 outer membrane protein produced in Bacillus subtilis and reconstituted in the presence of Zwitter or Triton X-100（Vaccine 14: 886-891）；Jansen, C., Kuipers,B., van der, B.J., de Cock,H., van der,L.P., and Tommassen,J. (2000) Immunogenicity of in vitro folded outer membrane protein PorA of Neisseria meningitidis（FEMS Immunol. Med. Microbiol. 27: 227-233）；Jansen, C., Wiese, A., Reubsaet, L., Dekket, N., de Cock, H., Seydel, U., and Tommassen, J. (2000) Biochemical and biophysical characterization of in vitro folded outer membrane porin PorA of neisseria meningitides [In Process Citation] Biochim Biophys Acta 1464: 284-298；Qi, H.L., Tai, J.Y., and Blake, M.S.(1994) Expression of Large Amounts of Neisserial Porin Proteins in Escherichia coli and Refolding of the Proteins into Native Trimers Infection and Immunity 62: 2432-2439に記載されたようなｉｎ  ｖｉｔｒｏでの組換え発現、精製及びリフォールディング（必要な場合）により、産生され得る。
【００５５】
抗原は連結され、即ち例えば連続ポリペプチド鎖として発現による多抗原の産生により物理的に結合される。一実施形態では、これは、両タンパク質からのＰｏｒＡ及びＦｅｔＡ発現エピトープの遺伝子工学処理ハイブリッドを用いて成し遂げられ得る。例えば、ＰｏｒＡ−ＦｅｔＡ融合タンパク質が産生されて、ＰｏｒＡ  ＶＲ１及びＶＲ２だけでなくＦｅｔＡ  ＶＲを含むように、ＰｏｒＡの半可変性細胞表面ループ５は、ＦｅｔＡからのＶＲで置き換えられ得る。この型の連結又は融合タンパク質に関するエピトープの選択は、求められる所望の防御により本明細書中で記載される詳細に従う。このアプローチは、同一レベルの交差防御を提供するのに必要とされるタンパク質の物理的な数を有益に低減する。
【００５６】
どんな場合でも、エピトープの連結は、製造方法の簡潔便利性／最適化のために、あるいはその他の理由、例えば誘導免疫応答の平衡のために、実行され得る。好ましくは同等の強度応答を誘導する抗原のみが単一ポリペプチド上に連結される。好ましくは連結は、特定のタンパク質内に生じる抗原についてのみ行われる。好ましくは連結は回避される。好ましくは個々の精製抗原が調製され、そして本発明に従って組成物を産生するために必要とされるまで別々に保存される。
【００５７】
特定のワクチン組成物中の個々の抗原の正確な量は、典型的には本発明を取り扱う人により確定される。好ましくは等モル量の個々の抗原が用いられる。さらに好ましくは用いられる量は、特定抗原種に対して誘導される免疫応答の強度に関して平衡される。したがって抗原が参照抗原の強度の半分だけ応答を引き出す場合には、その抗原のモル量の２倍が用いられるべきである。同様に、抗原が参照抗原の強度の２倍で応答を引き出す場合には、そのモル量の約半分が用いられるべきである。好ましくは最適相対比率及び投与量レベルは、臨床医／臨床試験により確定される。
【００５８】
この平衡化は、ワクチン組成物の個々の抗原構成成分間の不均衡により生じる免疫優勢作用を回避するのを有益に手助けする。このプロセスは、所定のワクチン組成物中の抗原の各々に対する一定応答の、好ましくは所定のワクチン組成物中の抗原の各々に対する一定防御の終点に向けての滴定の簡単な方法と考えられる。滴定は、好ましくは血清殺菌抗体検定又はＥＬＩＳＡにより実施される。
【００５９】
最適化
明らかに、最良のワクチンは最も広範な適用範囲を有するワクチンであるのがよい。しかしながら最も広範な適用範囲を得るためには、ワクチン組成物中への最大数の抗原の含入を要する。したがって好ましくは平衡は、組成物中に含入される抗原の数を最小にすることと、上記組成物によりもたらされ得る防御の適用範囲を最大にすることの間で達せられる。これらは、本発明の抗原の選択を支配するはずの因子である。
【００６０】
さらに詳細には、選択されるべき第一抗原は、当該生物体の最大数の個々の単離物中に生じた単一抗原である。この単一抗原は、それらの単離物全体で最大の適用範囲を提供する。第二抗原として選択するものを考慮する場合、第一抗原の含入によりまだ示されていない単離物に注意を払うべきである。このようにして、今までのところ示されていない単離物全体で最大適用範囲を提供するために、第二抗原が選択されるべきである。この時点で、２つの抗原が選択されている。これらは、２つだけの抗原の選択のために考え得る最良の適用範囲を提供するために選択された。しかしながらまだ示されていない単離物の一群が依然として存在し得る。したがって第三抗原の選択は、まだ示されていない単離物を取り扱うべきである。抗原を選び出し、選定するこの反復方法は、該当単離物の数に関してできるだけ高いレベルの適用範囲を達成し続けるべきである。好ましくは当該方法は、既知の単離物の各々が網羅されるまで、継続されるべきである。
【００６１】
すべての単離物が網羅され、さらなる抗原の含入のために組成物中に余地が依然として存在する場合、上記方法は、最大数の単離物に対するさらなる免疫学的応答を提供するさらなる抗原を選択し続けられ得ることが有益である。このようにして、個々の単離物に対して二元的応答が生成され得る。これは、時として、「二重ヒットアプローチ」と呼ばれる。明らかに、各単離物に対して生成される応答が多いほど、宿主被検体における防御応答を提供する機会はより十分である。したがって各単離物に対してより多数の抗原及びより多数のヒットが好ましい。
【００６２】
しかしながら組成物の調製に際して経費を考慮することを含めた実際の難しさは、その特定のワクチン組成物中に含まれる抗原の数に関する制限を促す。この制限は、用途によって変わる。さらに使用する抗原が少ないほど、ほとんど常に、産生はより容易になり、最終的にはワクチン組成物がより安価になる。さらに、組成物中のワクチン数を低減することの技術的利点、例えば免疫優勢作用の排除、応答平衡の容易性、及び／又は投与の簡易化が存在し得る。特定組成物中に含まれる抗原の数に関する実際の制限は、本発明にとって重要ではない。重要原則は、抗原を選択する場合、それらが上記方法に従って選択されるということ、言い換えれば、防御の適用範囲を最大にすることが最優先権事項であるということである。このようにして、特定ワクチン組成物中に含まれる抗原の数に関する実際の数的制限がなんであれ、その限定数の抗原を含有するワクチン組成物は、本発明に従って抗原が選択される場合、考え得る最大の適用範囲を常に提供する。
【００６３】
したがって、一態様では、特定組成物中に含まれるべき抗原の数は、個々の抗原の選択がなされる前に確定される。次に各々の個々の抗原が上記のように選択されて、組成物、好ましくはワクチン組成物への個々の抗原の各々の付加により得られる適用範囲を最大にする。
【００６４】
別の態様では、特定組成物の適用範囲は、組成物中に含まれるべき抗原の数が確定される前に確定される。次に各々の個々の抗原が上記のように選択され、所望の適用範囲が得られるまで、抗原を一度に１つずつ付加する。
【００６５】
当然の帰結として、多数の組成物は、所望の適用範囲と組成物中に含まれる抗原の数に関する好ましい制限との間の妥協を伴い得る。本発明は、本明細書中に示された指針に従うことによりこのような因子を平衡させることが有益である。
【００６６】
概して、組成物が含む抗原が少ないほど、それはより簡単に且つより安価に製造され、投与され、モニタリングされる。したがって、いくつかの態様では、少数の抗原が有益である。
【００６７】
本発明の態様において、組成物が適用範囲により設計される場合には、明らかに、その適用範囲を得るためにはより多数の抗原が望ましく、そして所望の適用範囲を得させるために、より少数の抗原に対する一般的選択が比較検討される。
【００６８】
ワクチン組成物は２０個の抗原を含み得るし、それより多い場合さえある。好ましくはワクチン組成物は、１８個又はそれより少ない抗原を、好ましくは１６個又はそれより少ない抗原を、好ましくは１４個又はそれより少ない抗原を、好ましくは１２個又はそれより少ない抗原を、好ましくは１１個又はそれより少ない抗原を、好ましくは１０個又はそれより少ない抗原を、好ましくは９個又はそれより少ない抗原を、好ましくは８個又はそれより少ない抗原を、好ましくは７個又はそれより少ない抗原を、好ましくは６個又はそれより少ない抗原を、好ましくは５個又はそれより少ない抗原を、好ましくは４個又はそれより少ない抗原を、好ましくは３個又はそれより少ない抗原を含み、好ましくはワクチン組成物は、２個の抗原を含む。
【００６９】
抗原可変性抗原の定義（抗原保存性抗原と比較して）は当該技術分野で既知であり、例えば可変性抗原は、原型抗原の配列と1つ又は複数のアミノ酸が異なるものである。この配列差の結果、変異体及び原型間で１００％未満の交差反応性である抗体応答を引き出すことになる。可変性抗原は、同義的なヌクレオチド置換を上回る非同義的な置換の優勢により特性化される。
【００７０】
さらなる構成成分
本発明の組成物及び／又はワクチン処方物は、少なくとも１つの精製ＰｏｒＡ抗原及び少なくとも１つの精製ＦｅｔＡ抗原を含む。これらのワクチン組成物は、ワクチンを改良するために、例えばそれらの効力を改良するためにさらなる構成成分（単数又は複数）を補足される、ということが有益であり得る。
【００７１】
この第三の又はさらなる構成成分は、トランスフェリン結合タンパク質、ＰｏｒＢ、混濁に関連する付着因子（Ｏｐａｓ）、ＮｓｐＡ、髄膜炎細胞表面構成成分、例えば外膜タンパク質（単数又は複数）あるいは免疫応答を引き出し得るか又は増大し得るその他の存在物(entity)から成る群から選択されることが有益であり得る。好ましくは第三又はさらなる構成成分は、外膜タンパク質である。好ましくは第三又はさらなる構成成分は、トランスフェリン結合タンパク質、ＰｏｒＢ、Ｏｐａｓから成る一覧から選択される。
【００７２】
ワクチン処方物
本発明は、治療的有効量の本発明のＰｏｒＡ／ＦｅｔＡエピトープ並びに薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤（その組合せを含めて）を含む薬学的組成物／ワクチン組成物を提供する。
【００７３】
薬学的組成物は、ヒト及び獣医学におけるヒト又は動物用途のためのものとすることができ、典型的にはいずれか１つ又は複数の薬学的に許容可能な希釈剤、担体又は賦形剤を含む。治療的使用のための許容可能な担体又は希釈剤は製薬業分野で既知であり、例えばRemington’s Pharmaceutical Sciences、 Mack Publishing Co.（A.R. Gennaro edit 1985）に記載されている。薬学的担体、賦形剤又は希釈剤の選択は、意図される投与経路並びに標準薬学業務に関して選択され得る。薬学的組成物は、担体、賦形剤又は希釈剤として（又はそのほかに）、任意の適切な結合剤（単数又は複数）、滑剤（単数又は複数）、沈殿防止剤（単数又は複数）、コーティング剤（単数又は複数）、可溶化剤（単数又は複数）を含み得る。
【００７４】
防腐剤、安定剤、染料、そして風味剤さえも、薬学的組成物中に提供され得る。防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。酸化防止剤及び沈殿防止剤も用いられ得る。
【００７５】
異なる送達系に応じて、異なる組成／処方要求が存在し得る。例として、本発明の薬学的組成物は、ミニポンプを用いて、又は粘膜経路で、例えば鼻スプレー又は吸入用のエアロゾル又は経口摂取溶液として投与されるよう処方され得るし、あるいは非経口的には、組成物は、例えば静脈内、筋肉内又は皮下経路による送達のために、注射用形態により処方される。あるいは処方物は、多数の経路により投与されるように意図される。
【００７６】
作用物質は、胃腸粘膜を通して粘膜投与されるべきである場合、消化管を通過中は依然として安定であり得るべきであり、例えば作用物質は、タンパク質分解に対して抵抗性があり、酸性ｐＨで安定で、そして胆汁の洗浄作用に対して抵抗性があるべきである。
【００７７】
適切である場合、薬学的組成物は、吸入により、座薬又はペッサリーの形態で、局所的にはローション、溶液、クリーム、軟膏又はダスティングパウダーの形態で、皮膚パッチの使用により、経口的にはデンプン又はラクトースのような賦形剤を含有する錠剤の形態で、あるいはカプセル又は小卵剤中に単独で又は賦形剤との混合物中で、あるいは風味剤又は着色剤を含有するエリキシル、溶液又は懸濁液の形態で投与され得るし、あるいはそれらは非経口的に、例えば静脈内に、筋肉内に又は皮下に注射され得る。非経口投与に関しては、組成物は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又は単糖を含有し得る滅菌水溶液の形態で最良に用いられ得る。頬又は舌下投与に関しては、組成物は、慣用的方法で処方され得る錠剤又はロゼンジの形態で投与され得る。
【００７８】
ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡは、治療されている被検体においてｉｎ  ｓｉｔｕで調製され得る。この点で、上記タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、上記タンパク質が上記ヌクレオチド配列から発現されるよう、非ウイルス技法（例えばリポソームの使用により）及び／又はウイルス技法の使用により、送達され得る。
【００７９】
投与
「投与される」という用語は、ウイルス又は非ウイルス技法による送達を包含する。ウイルス送達メカニズムとしては、アデノウイルスベクター、アデノ関連性ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター及びバキュロウイルスベクターが挙げられるが、これらに限定されない。非ウイルス送達メカニズムとしては、脂質媒介性トランスフェクション、リポソーム、免疫リポソーム、リポフェクチン、陽イオン性顔面両親媒性物質（ＣＦＡ）及びそれらの組合せが挙げられる。
【００８０】
本発明の構成成分は単独で投与され得るが、しかし一般に組成物として投与され、例えば構成成分が存在する場合、意図される投与経路及び標準薬学業務に関して選択される適切な薬学的賦形剤、希釈剤又は担体との混合物中に存在する。
【００８１】
例えば構成成分は、即時放出適用、遅延放出適用、変形放出適用、持続性放出適用、パルス化放出適用又は制御放出適用のために、風味剤又は着色剤を含有し得る錠剤、カプセル、小卵剤、エリキシル、溶液又は懸濁液の形態で投与され得る。
【００８２】
投与が錠剤によるものである場合には、錠剤は賦形剤、例えば微晶質セルロース、ラクトース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム及びグリシン、崩壊剤、例えばデンプン（好ましくはトウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン又はタピオカデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウム及びある種の複合ケイ酸塩、並びに造粒結合剤、例えばポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、スクロース、ゼラチン及びアラビアゴムを含有し得る。さらに滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル及びタルクが含まれ得る。
【００８３】
同様の型の固体組成物も、ゼラチンカプセル中の充填剤として用いられ得る。この点で好ましい賦形剤としては、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖又は高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。水性懸濁液及び／又はエリキシルに関しては、作用物質は種々の甘味剤又は風味剤、着色物質又は染料と、乳化剤及び／又は沈殿防止剤と、そして希釈剤、例えば水、エタノール、プロピレングリコール及びグリセリン、並びにそれらの組合せと併合され得る。
【００８４】
投与（送達）経路としては、１つ又は複数の以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：経口（例えば錠剤、カプセルとして、又は経口摂取溶液として）、局所、粘膜（例えば鼻スプレー又は吸入用エアロゾル）、鼻、非経口（例えば注射用形態による）、胃腸、脊髄内、腹腔内、筋肉内、静脈内、子宮内、眼内、皮内、頭蓋内、気管内、膣内、脳室内、脳内、皮下、眼（例えば硝子体内又は眼房内）、経皮、直腸、頬、膣、硬膜外、舌下。
【００８５】
好ましい態様では、組成物は、注射により送達される。
【００８６】
組成物の構成成分のすべてが同一経路により投与される必要があるというわけではない、と理解されるべきである。同様に、組成物が１つより多い活性構成成分を含む場合には、それらの構成成分は異なる経路により投与され得る。
【００８７】
本発明の構成成分が非経口的に投与される場合には、このような投与の例としては、１つ又は複数の以下のものが挙げられる：静脈内、動脈内、腹腔内、くも膜下腔内、脳室内、尿道内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内又は皮下的に構成成分を投与するか、及び／又は注入技法を用いて投与。
【００８８】
非経口投与に関しては、構成成分は、他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに十分な塩又はグルコースを含有し得る滅菌水溶液の形態で最良に用いられ得る。水溶液は、必要な場合、適切に（好ましくは３〜９のｐＨに）緩衝されるべきである。滅菌条件下での適切な非経口処方物の調製は、当業者に既知の標準薬学的技法により容易に成し遂げられる。
【００８９】
示されたように、本発明の構成成分（単数又は複数）は、鼻内に、又は吸入により投与され得るし、そして適切な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、ヒドロフルオロアルカン、例えば１，１，１，２−テトラフルオロエタン（ＨＦＡ１３４Ａ（商標））又は１，１，１，２，３，３，３−ヘプタフルオロプロパン（ＨＦＡ２２７ＥＡ（商標））、二酸化炭素又はその他の適切なガスの使用を伴って、提示される乾燥粉末吸入器又はエアロゾルスプレーの形態で、加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーから便利に送達され得る。加圧エアロゾルの場合、投薬量単位は、計測量を送達するための弁を提供することにより確定され得る。加圧容器、ポンプ、スプレー又はネブライザーには、例えば溶媒としてエタノール及び噴射剤の混合物を用いて、活性化合物の溶液又は懸濁液が入っていて、これはさらに、滑剤、例えばトリオレイン酸ソルビタンが入っていてもよい。吸入器又は散布器に用いるためのカプセル及びカートリッジ（例えばゼラチン製）は、作用物質の粉末混合物及び適切な粉末基剤、例えばラクトース又はデンプンを含有するよう処方され得る。
【００９０】
本発明の構成成分（単数又は複数）はまた、例えば皮膚パッチの使用により、皮膚投与又は経皮投与され得る。
【００９１】
これらのレジメンは、逐次的に、同時に又は一緒に物質を投与することを包含する、と理解される。
【００９２】
用量レベル
典型的には、個々の被検体に最も適している実投薬量を医者は確定する。任意の特定患者のための特定用量レベル及び投薬頻度は変わり得るし、種々の因子、例えば用いられる特定化合物の活性、その化合物の代謝安定性及び作用の長さ、治療を受けている個体の年齢、体重、全身健康状態、性別、食餌、投与方式及び時間、排出速度に応じて決まる。
【００９３】
必要に応じて、作用物質は、０．００００１ｕｇ／体重１Ｋｇ〜５ｍｇ／体重１Ｋｇ、好ましくは０．０００１ｕｇ／Ｋｇ〜５ｍｇ／Ｋｇ、好ましくは０．００１ｕｇ／Ｋｇ〜１ｍｇ／Ｋｇ、好ましくは０．０１ｕｇ／Ｋｇ〜５００ｕｇ／Ｋｇ、好ましくは０．０２ｕｇ／Ｋｇ〜３００ｕｇ／体重１Ｋｇの用量で投与され得る。好ましくは組成物は、約２５ｕｇまでの各ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡ構成成分を含む。
【００９４】
好ましい実施形態では、約３ｕｇの用量が体重約３〜４Ｋｇの小児に投与される。
【００９５】
好ましくは本発明の組成物は、多糖カプセル物質及び／又は小胞のような細胞構成成分を本質的に含有しない。
【００９６】
好ましくは本発明のワクチン組成物は、タンパク質ワクチン組成物である。
【００９７】
好ましくは本発明のワクチン組成物は、アジュバントを含む。当該技術分野で既知の任意の適切なアジュバントが、本発明に用いられ得る。当業者は、必要とされる免疫応答によって、アジュバント及び／又はその量又は割合を変える。好ましくはこのアジュバントはアルミニウムヒドロゲルである。
【００９８】
特定の例示的組成物が、特に表３を参照しながら、本明細書中に記述される。
【００９９】
ここで、以下の図を参照しながら、実施例により本発明を説明する：
【実施例１】
【０１００】
調査及びワクチン組成物
本実施例は、ワクチン組成物及びそれらの製造方法を示す。
【０１０１】
本発明の髄膜炎菌ワクチン中に含まれるべき変異体の選択を情報提供するために、二十世紀後半のほとんどの髄膜炎菌性疾患大発生に関連した７つの高侵襲性系統を示す７８個の髄膜炎菌のコレクションで、３つの主要ＯＭＰ、ＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ及びＦｅｔＡの変異の調査を着手した。生物体に関する表面タンパク質配列を提示した。これらの抗原をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の分析は、３つのタンパク質すべての免疫原性領域をコードすると前に記載された遺伝子のその部分に作用する確実な選択に関する強力な証拠を明示した。連結抗原遺伝子配列の系統発生学的分析は、クローン複合体と適合するクラスターを生じたが、しかしこの適合は個々の遺伝子座を分析した場合、あまり明らかでなかった。さらに、数十年の世界的拡散中の抗原変異体の特定の組合せの持続性並びに他の点では非関連の単離物中の同一抗原組合せの存在の両方に関する証拠が存在した。この抗原構造化は、７つの高侵襲性系統すべてに対する交差防御を潜在的に提供するワクチンに関して必要とされる構成成分の数を大いに縮小した。例えば５つのＦｅｔＡ変異体と組合わされたＰｏｒＡを６つだけ含有する本発明のワクチンは、本試験に含まれる７８個の単離物のすべてに対する防御を提供する（下記参照）。
【０１０２】
材料及び方法
髄膜炎菌の増殖及びＤＮＡ調製：  二十世紀後半に報告された主要髄膜炎菌疾患大発生を示す総数７８個の髄膜炎菌単離物を、この分析のために選択した（表１）。これらの単離物は、多遺伝子座配列類別（ＭＬＳＴ）により以前に特性化されており、例としては以下のものが挙げられる：３７個の血清型Ａ髄膜炎菌（１４個のＳＴ−１複合体、１１個のＳＴ−４複合体、１２個のＳＴ−５複合体）；ＳＴ−１１複合体からの１０個の単離物（８つの血清型Ｃ及び２つの血清型Ｂ）；ＳＴ−８複合体からの８つの単離物（５つの血清型Ｂ及び３つの血清型Ｃ）；１０個のＳＴ−３２複合体生物（９つの血清型Ｂ、１つの血清型Ｃ）；ＳＴ−４１／４４からの１３個の単離物（すべて血清型Ｂ）。５％ＣＯ２の大気中で８〜１６時間、加熱血液寒天プレート上で単離物を繁殖させた。メーカーのプロトコールに従って「Isoquick核酸抽出キット」（Orca Research Inc.）を用いてゲノムＤＮＡを調製するために、約１０７〜１０９コロニー形成単位を用いた。
【０１０３】
ヌクレオチド配列決定及び遺伝子命名：  髄膜炎菌ｐｏｒＡ、ｐｏｒＢ及びｆｅｔＡ遺伝子のＰＣＲ増幅及びヌクレオチド配列決定は、前に記載されたのと同様であった（Suker, 1994 Mol. Micro. Vol 12 p253; Urwin, 1998 Epid. and Inf. Vol 121 p95; Thompson, 2003 Microbiology Vol 149 p1849）。順方向鎖及び逆方向鎖に関するヌクレオチド配列データを、ＳＴＡＤＥＮソフトウエアパッケージを用いて集めて、「ＧＣＧ」フォーマットに再フォーマットし、ＧＣＧソフトウエアパッケージバージョン１０．１（Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin）内のＳＥＱＬＡＢプログラムを用いて最大位置相同を保持するよう整列させた。分子進化遺伝学分析（ＭＥＧＡ）ソフトウエアパッケージバージョン２．０を用いて、整列配列の各組に関して対比較を実施して、異なる対立遺伝子を同定した；次に、前に定義された命名系（Thompson, 2003、同書）に基づいて、対立遺伝子数を独特のＰｏｒＡ、ＰｏｒＢ及びＦｅｔＡ遺伝子配列の各々に割り当てた。
【０１０４】
可変領域（ＶＲ）同定：  ＰｏｒＡ及びＦｅｔＡのＶＲの同定は直接的であった：限定ＰｏｒＡ可変エピトープ、ＶＲ１及びＶＲ２をコードするヌクレオチド配列を翻訳し、http://neisseria.org/nm/typing/pora/に存在するＰｏｒＡ  ＶＲ配列データベースを照会することにより同定した。ＦｅｔＡ  ＶＲに関して決定されたアミノ酸配列変異体も、http://neisseria.org/nm/typing/feta/でのデータベース照会により同定した。
【０１０５】
ＰｏｒＢタンパク質はしばしば不連続エピトープを有し、この場合、８つのＰｏｒＢ表面曝露可変ループのうちのいくつかがエピトープ形成に関与するので、ＰｏｒＢ  ＶＲ同定はより複雑であった。ループＩＩ及びＩＩＩだけがＰｏｒＢ中で本質的に不変性であるので、ＰｏｒＢエピトープ多様性を確定する場合、ループＩ、ＩＶ−ＶＩＩＩにおけるアミノ酸配列変異を同定する必要があった。したがって公表済みのスキーム（Sacchi, 1998 Clinical and Diagnostic Lab. Imm. Vol 5 p.348）を参照しながら、各表面ループに対応する整列アミノ配列の対比較により、ＰｏｒＢ中の変異を確定した。Poolman他（Frasch, 1985 Reviews of Infectious Diseases Vol. 7 p.504）のスキームを少し変更したスキームを用いて、フォーマット血清型：血清型：亜型：ＦｅｔＡ型、したがってＡ：４，２１：Ｐ１．５−２，１０：Ｆ５−１とともに報告した。このようにして抗原可変性タンパク質を選択した。
【０１０６】
データ操作及び分析：  ＰＡＵＰ＊パッケージで利用可能な最尤（ＭＬ）法を用いて、系統発生樹を構築した。ヌクレオチド置換のＧＴＲモデルを用いて、ヌクレオチド置換マトリックス、不変部位の割合、並びに部位間の変異率のガンマ分布の形状パラメーター（＋）に関する値を、系統発生樹再構築中に概算した（４つの部類に関して）。（ｉ）ＭＬＳＴに用いられる７つのハウスキーピング遺伝子断片（３，２８４ｂｐの総配列長を示す）、並びに（ｉｉ）３つの抗原遺伝子配列（４，２０９塩基対の全体長を示す）に関する連結ＤＮＡ配列を用いて、ＭＬ系統発生を構築した。
【０１０７】
結果
臨床的発生における抗原可変性タンパク質の各々の出現率を、以下のように確定した。
【０１０８】
ＯＭＰ遺伝子及びタンパク質の多様性：  分析のために整列された場合のヌクレオチド配列の長さは以下のようであった：ｆｅｔＡ、２０３１ｂｐ；ｐｏｒＡ、１１５５ｂｐ；及びｐｏｒＢ、１０２３ｂｐ。３３個のＰｏｒＡ配列をコードする３３個のｐｏｒＡ対立遺伝子、３１個のＦｅｔＡ配列をコードする３３個のｆｅｔＡ遺伝子、並びに２８個のＰｏｒＢ配列をコードする３１個のｐｏｒＢ対立遺伝子を伴う３つの遺伝子座で類似レベルの配列多様性を観察した（表２）。２つの異なる対立遺伝子クラスがｐｏｒＢ遺伝子座、ｐｏｒＢ２及びｐｏｒＢ３に存在し、ｐｏｒＢ対立遺伝子間の差の大多数は３つのクラス間の差によるものであり、別々に分析した場合、ｐｏｒＢ２及びｐｏｒＢ３対立遺伝子、並びにそれらのコード化タンパク質内には、低多様性が認められた。動物及びヒトにおける免疫応答に関与するタンパク質の領域で、ペプチド配列変異を確認した。ＦｅｔＡ  ＶＲでは、１６個の独特のペプチド配列を同定した。１２個のＰｏｒＡ  ＶＲ１及び１８個のＰｏｒＡ  ＶＲ２ペプチド配列（２６の独特のＶＲ１、ＶＲ２組合せ）、並びにＰｏｒＢタンパク質のループＩ、ＩＶ−ＶＩＩＩに対応するペプチド配列の２０の独特の組合せが認められた（表１、表２）。
【０１０９】
抗原遺伝子及びハウスキーピング遺伝子から得られる系統発生知見の比較：  連結ハウスキーピング遺伝子を用いて構築されたＭＬ系統樹は単離物をそれらのクローン複合体にクラスター化した（図１Ａ）が、但し、ＳＴ−８複合体単離物Ｂ６１１６／７７は、他のＳＴ−８単離物間に存在するものから分岐した。単離物の類似のクラスターは３つの抗原遺伝子の連結配列から構築されたＭＬ樹で観察されたが、しかし２つの系統樹のより深い分枝パターンは異なった（図１Ｂ）。大部分が血清型ＡであるＳＴ−１、ＳＴ−４及びＳＴ−５複合体に属する単離物は、ハウスキーピング遺伝子系統樹では分岐群を形成したが、しかし抗原遺伝子系統樹においては形成しなかった。逆に、ＳＴ−８及びＳＴ−１１複合体に属する単離物は、ｐｏｒＢ２対立遺伝子クラスに属するｐｏｒＢ対立遺伝子を保有するこれらの単離物の結果として、抗原遺伝子系統樹において分岐群を形成したが、一方、残りの単離物はｐｏｒＢ３クラスのｐｏｒＢ対立遺伝子を保有した。抗原遺伝子系統樹におけるＳＴ−４複合体及びＳＴ−４１／４４複合体の単離物を含む分岐群は、密接に関連したｆｅｔＡ及びｐｏｒＡ遺伝子を共有する単離物の帰結であった。ＳＴ−１単離物を伴う２つのＳＴ３２複合体単離物（２０４／９２及びＢＺ８３）のクラスター化は、ＳＴ−１複合体生物に関するｆｅｔＡ、ｐｏｒＡ及びｐｏｒＢ対立遺伝子の同一性又は類似性を反映した。米国で１９３７年に単離されたコレクション（Ａ４／Ｍ１０２７、ＳＴ−４）中の最も古い単離物は、それが、ＳＴ−１複合体生物間で優勢な対立遺伝子であるｐｏｒＡ−１６対立遺伝子をｐｏｒＡ遺伝子座に有したため（表１）、ＳＴ−４複合体髄膜炎菌により形成される配列の、そうでなければ密接に関連するクラスター外であった。ｆｅｔＡ配列多様性のため、３つのＳＴ−１複合体髄膜炎菌は、他のＳＴ−１単離物とクラスター化しなかった（ほとんどのＳＴ−１複合体単離物に置いて観察されるｆｅｔＡ−３ではなくむしろ、単離物２０及び２５４は、ｆｅｔＡ−８対立遺伝子を有し、単離物１２９はｆｅｔＡ−５７対立遺伝子を有する）。２つのＳＴ−４１／４４複合体単離物（ＮＧ  Ｅ３０及びＮＧ  Ｈ３６）は、分岐ｆｅｔＡ及びｐｏｒＡ対立遺伝子の結果として、この複合体に属する残りの単離物とクラスター化しなかった。
【０１１０】
クローン複合体間のＦｅｔＡ及びＰｏｒＡ抗原変異体の分布：  ＦｅｔＡ及びＰｏｒＡタンパク質配列中で確認された変異のパターンに類似性が認められた。ほとんどの変異は、ＶＲ１及びＶＲ２に対応して、ＰｏｒＡ中の表面曝露ループ１及び４に制限され、そしてＦｅｔＡ  ＶＲに対応して、ＦｅｔＡ中の一表面曝露ループ中に主に見出された。さらにＦｅｔＡ及びＰｏｒＡタンパク質の両方の主要免疫原性領域の変異体はクローン複合体間で不均一に分布し、個々のクローン複合体に関連した３つの抗原領域の特定の組合せを伴った（表１）。ＳＴ−１複合体単離物間の最も一般的な組合せは、Ｐ１．５−２，１０；Ｆ５−１（６／１０単離物）であったが、一方、ＳＴ−４複合体単離物は主として（６／１０）Ｐ１．７，１３−１：Ｆ１−５であり、ＳＴ−５複合体単離物は主に（９／１２）Ｐ１．２０，９：Ｆ３−１であった。ＳＴ−４１／４４単離物の大多数（９／１３）は、Ｐ１．７−２，４：Ｆ１−５であった。ここで分析したＳＴ−８複合体単離物は、優勢ＶＲ配列を伴わない多数の変異体を含有したが、しかしＰ１．５  ＶＲ１配列並びにその変異体Ｐ１．５−１及びＰ１．５−２、ＶＲ２  Ｐ１．２及びそのＰ１．２−２変異体、並びにＦｅｔＡ  ＶＲ  Ｆ３−９の優勢が認められた。いくつかの場合、例えば単離物２５５（ＳＴ−４複合体）、Ｓ４３５５（ＳＴ−５複合体）及び４００（ＳＴ−４１／４４複合体）では、最も一般的な組合せからの逸脱は、単一可変領域に存在し、他の場合には、複数の差異が存在した。例えばＳＴ−１１複合体単離物の間では、異なるペプチド配列との２つの組合せが存在した、すなわち、４つの単離物がＰ１．５，２：Ｆ１−１で、３つがＰ１．５，２−１：Ｆ５−５であった。Ｐ１．７，１６：Ｆ３−３組合せの変異体は、ＳＴ−３２複合体生物の場合より優勢であった。２つの場合、非関連ＳＴを有する単離物は、同一ＰｏｒＡ及びＦｅｔＡ型を示した、すなわち、ＳＴ−４１／４４複合体単離物ＮＧ  Ｅ３０は、ＳＴ−８複合体単離物ＢＺ１６３と同一であり、ともにＰ１．２１，１６：Ｆ１−７であったが、しかしこれらの単離物は同一ｐｏｒＡ及びｆｅｔＡ対立遺伝子を共有しなかった。ＳＴ−３２単離物のうちの１つは、ＳＴ−１複合体生物により示される大多数の抗原型Ｐ１．５−２，１０：Ｆ５−１と同一であったが、しかしこれもまた対立遺伝子配列は同一でなかった。
【０１１１】
クローン複合体間のＰｏｒＢ抗原変異体の分布：  アミノ酸変異は、ループＩＩ及びＩＩＩ以外のＰｏｒＢのすべての表面曝露ループで同一であった。ＰｏｒＢ配列の保存は、すべてのクローン複合体で観察された；モザイク遺伝子構造の広範な証拠は、この多様性のほとんどが既知の配列の再分類により生じるようである、ということを示した。ＳＴ−１複合体生物の大多数（１１／１４）は、すべての表面ループで同一であり、そして表現型的に血清型４，２１と同定されたＰｏｒＢ３タンパク質を保有した。単離物３９３及び３２２／８５のＰｏｒＢ３タンパク質は可変性ループＩにおいてのみ血清型４，２１配列と異なったが、一方、単離物７９１２６は可変性ループＩ、ＶＩ−ＶＩＩＩにおいて分岐する血清型４ＰｏｒＢ３タンパク質を発現した。ＳＴ−４複合体髄膜炎菌はすべて血清型４，２１ＰｏｒＢタンパク質を保有したが、しかし表面ループＶＩＩＩにおける小変異が一単離物（２０５９００１）で同定された。ＳＴ−４複合体生物間で同定される血清型４，２１ＰｏｒＢ３タンパク質は、可変性ループＩＶにおける２つのアミノ酸変化によりＳＴ−１複合体及びＳＴ−５複合体髄膜炎菌で同定されたものと区別された。１０個のＳＴ−５複合体単離物のうちの７つは、ＳＴ−１複合体間で観察されるものと同一である血清型４，２１ＰｏｒＢ３タンパク質を有したが、一方、残り３つの単離物（９２００１、１１−００４及び８００４９）は、ＰｏｒＢ３中に１又は２つの変異体ループ配列を有した。ほとんどのＳＴ−８複合体単離物（５／８）は同一血清型２ｂ  ＰｏｒＢ２アミノ酸配列を有し、アミノ酸変化は、残り３つの単離物９４／１５５、ＢＺ１０及びＡＫ２２のループＩＶ又はループＶＩＩＩで観察された（ＢＺ１０は、この変異にもかかわらず、依然として血清型２ｂモノクローナル抗体と反応した）。ＰｏｒＢ３タンパク質は、ＳＴ−１１複合体髄膜炎菌間で良好に保存された、すなわち、１０個の単離物のうちの９つは同一ＰｏｒＢ２可変性ループを保有し、血清型２ａに対応したが、単離物９０／１８３１１は、ループＶ−ＶＩＩ中に変異体アミノ酸配列を有し、血清型類別可能でなかった。検査された１０個のＳＴ−３２複合体単離物のうちの７つは、血清型１５に対応する同一ＰｏｒＢ３タンパク質を有したが、一方、血清型４ｍＡｂとの反応性と関連した分岐配列は単離物２０４／９２及びＢＺ８３で同定された。残りの単離物（ＢＺ１６９）は、血清型１参照菌株と同一のＰｏｒＢ３アミノ酸配列を保有した。ＳＴ−４１／４４複合体生物の中で、４つの単離物は、血清型４に対応する同一ＰｏｒＢ３アミノ酸配列を共有した。３つの単離物（８８／０３４１５、ＮＧ  Ｅ３０、ＡＫ５０）は変異体ＰｏｒＢ配列を有したが、しかしそれらは血清型４モノクローナル抗体により認識されるループＶＩアミノ酸配列を保有したので、依然として血清型４と定義された。３つの単離物（ＮＧ  Ｈ１５、ＮＧ  Ｈ３６、Ｎ３１９０５）は血清型８に対応する変異体ＰｏｒＢ３配列を有したが、一方、残り３つのＳＴ−４１／４４複合体生物は、血清学的方法により類別可能でない可変性ループ配列の新規の組合せから成る変異体ＰｏｒＢ３タンパク質を保有した。
【０１１２】
抗原遺伝子変異体及び組合せの時間的及び地理的分布：  多数の抗原遺伝子対立遺伝子は、広範囲の時間的及び地理学的分布を示した。ｐｏｒＡ−１６対立遺伝子は、５５年の期間に亘って五大陸からの１５の国で単離された１６個の髄膜炎菌で同定され、ｐｏｒＢ３−２６は、５３年の期間に亘って、インド、米国及びいくつかのアフリカの国々を含めた９カ国から得られた１０個の単離物で同定された。このコレクション中の最も広範囲に分布されたｆｅｔＡ対立遺伝子は、２７年に亘って、９カ国、主にアフリカ（しかし中国及びインドを含む）から生じる１１個の単離物中に存在したｆｅｔＡ−５であった。これらのタンパク質の免疫原性可変領域をコードする多数の配列は、長命及び世界的分布も示し、ＦｅｔＡ  ＶＲ変異体Ｆ１−５は、検査した最古の（Ａ４／Ｍ１０２７、１９３７年に米国で単離された）及び最新の（Ｎ４５／９６、１９９６年にノルウェーで単離された）単離物を含めた単離物コレクションの２６個の成員中に存在した。
【０１１３】
考察
本発明の分析は、初めて、主要高侵襲性髄膜炎菌系統における３つの異なるＯＭＰコード遺伝子座に存在する対立遺伝子多様性を評価した。結果は、これらのタンパク質の広範な多様性を確証し（２８〜３３個のペプチド配列が各タンパク質に関して観察された）、そしてこれらの変異体の組合せの構造化に関する証拠を提供した。
【０１１４】
組換えによって、髄膜炎菌集団におけるより深い系統発生学的シグナルのほとんどが消えてしまったが、しかし共通の祖先を共有する髄膜炎菌を含むと思われる関連遺伝子型の群が、多数の手段により同定され得る。ＭＬＳＴにより、これらの関連遺伝子型はクローン複合体と解明されるが、これは、ヌクレオチド配列比較それ自体というよりむしろ、対立遺伝子差により限定されて、頻繁な組換えを説明する。ハウスキーピング遺伝子配列及び抗原遺伝子配列の両方に関するＭＬ樹は、ここで分析される７つの高侵襲性系統の代表物に関するクローン複合体と大いに適合する分岐群を生じた。クローン複合体名称(designation)を有するハウスキーピング遺伝子を基礎にした系統発生学の適合性は顕著でなかったが、しかし系統発生学的分析で例証される抗原遺伝子配列の分布は予測されなかった。
【０１１５】
厳密には、髄膜炎菌は高頻度の組換えを経るので、クローン法は、抗原変異体とクローン複合体との組合せの適合性を説明できない。クローン性の予測は、クローン複合体に関係なく、データ組全体の同一抗原遺伝子配列の存在によりさらに乱される。最新の共通祖先を共有する特定遺伝子型により非クローン集団が一時的に支配される「流行病性クローン」概念は、観察を説明するために引き合いに出され得る。しかしながらこれは、世界的拡散の数十年に亘る抗原組合せの長命も、あるいはそうでなければ遺伝的に無関係な単離物における同一抗原変異体組合せの存在の２つの例も説明しなかった。
【０１１６】
「流行病性クローン」集団構造はまた、観察される抗原組合せの非重複性に関する説明を提供しない。大多数の場合、特定高侵襲性系統を代表するクローン複合体は、主要抗原変異体を他のクローン複合体と共有しない優勢抗原遺伝子組合せを有する。組合せ間で同一抗原変異体を共有するいくつかの例が存在し、例えばＳＴ−４複合体はＰ１．７変異体をＳＴ−３２複合体と共有し、そしてＦ１−５変異体をＳＴ−４１／４４複合体と共有するが、しかしながら後者クローン複合体のいずれもが、最新ＳＴ−４単離物のすべてが生じたアフリカにおいて近年報告されておらず、したがって、これらの重複抗原変異体複合体は同一伝播系において同時的に存在しないという可能性がある。それに反して、系統は関連する可能性があるが、しかし近年アフリカにおいて疾患を引き起こした血清型Ａ関連クローン複合体のすべて（ＳＴ−１、ＳＴ−４及びＳＴ−５）が、異なる非重複抗原遺伝子組合せを有する。
【０１１７】
宿主免疫性に基づいた菌株構造化のモデルは、抗原変異体の観察された組合せに適応し得る理論的枠組みを提供する。これらのモデルは、所定の伝播系内で、免疫学的変異体を共有する病原体菌株にとって不利である、と仮定する。この点で、多数のクローン複合体は多抗原で変更される抗原変異体組合せを含有する、ということが注目に値した。ＳＴ−１１複合体内の２つの全世界的循環菌株Ｐ１．５，２：Ｆ１−１及びＰ１．５，２−１：Ｆ５−５に関する証拠が存在し、これらの変異体のうちの１つは２つの異なる莢膜に関連し、Ｂ：２ａ：Ｐ１．５，２：Ｆ１−１である２つの単離物及び２つのＣ：２ａ：Ｐ１．５，２：Ｆ１−１を伴った。少なくとも２つのＳＴ−３２複合体変異体が１９７０年代中頃から広範に広がり、これらはＯＭＰ抗原変異体の非重複組合せも示した。「ノルウェー」菌株は典型的にはＢ：１５：Ｐ１．７，１６；Ｆ３−３であったが、一方、「スペイン」菌株はＢ：４：Ｐ１．１９，１５；Ｆ５−１であった。オランダ及び英国において同定されたさらなる変異体は、多数のＳＴ−１複合体単離物とＯＭＰのレベルで同一である（４：Ｐ１．５−２，１０：Ｆ５−１）、ということに関して注目に値した。チリで同定された最後の変異体は、ノルウェー菌株と多少の類似性を保有しながら、Ｂ：１５：Ｐ１．７，３；Ｆ３−１である多数のＯＭＰで異なった。ＳＴ−３２複合体内のこれらの菌株の多数の例が、血清学的及び分子技術により従来記載されてきた。非重複構造に対する例外の多くは、ＰｏｒＢ及びＰｏｒＡ  ＶＲ１を包含し、これらの抗原がＰｏｒＡ  ＶＲ２より相対的に低免疫原性であり得るという多少の証拠が存在する。要するに、髄膜炎菌株又は伝播変異体は、少なくとも一部は、ＯＭＰ変異体組合せ、特にＦｅｔＡ  ＶＲ及びＰｏｒＡ  ＶＲ２のものにより限定され得る可能性がある。したがって亜群の抗原が、臨床的発生で見出される抗原可変性タンパク質から選択された。この選択は、説明されたように、エピトープレベルに拡大される。
【０１１８】
髄膜炎菌抗原変異体が構造化されるメカニズムが何であれ、本発明は、新規のワクチン設計において観察される構造化を利用する。
【０１１９】
この調査の結果は、主要髄膜炎菌高侵襲性系統を支配する抗原変異体組合せの限定レパートリーと一致する。観察された組合せの非重複性は、集団免疫性により課される菌株構造と一致した。これが事実である場合、集団中のいくつかの低頻度変異体は単一宿主内で短期間選択的利点を有するが、しかしこのような変異体は流行病拡散中は低適合性であるようである、といういくつかの証拠が存在する。この枠組みはさらに、新規の変異体は、免疫優勢抗原変異体をコードする多遺伝子座で異なる場合、出現し、経時的に拡散し得るということを、そして異なる遺伝子型が同一抗原型を保有し得るということを予測するが、これらの現象はともにこのデータ組に存在する。さらに細菌は、突然変異又は組換えにより、２つの離れて位置する遺伝子で同時には、変化しにくいと思われるので、少なくとも２つの異なる可変性抗原を標的にするワクチンは、単一抗原の多変異体を有するワクチンを上回る効力改善を示す。
【０１２０】
この分析に用いられる単離物は、過去６０年間に亘って報告された主要高侵襲性系統を表わす。したがって本発明は、血清型とは関係なく、すべての高侵襲性系統に対して有効で相対的に単純な髄膜炎菌ＯＭＰベースのワクチンを提供する。
【０１２１】
実際、５つのＦｅｔＡ変異体（Ｆ１−５、Ｆ３−１、Ｆ５−１、Ｆ３−９、Ｆ５−５）と組合わされる６つという少ないＰｏｒＡ変異体（Ｐ１．５−１，２−２、Ｐ１．５−２，１６、Ｐ１．５，１０、Ｐ１．７，１３−１、Ｐ１．７−２，４、Ｐ１２０，９）が７８個の単離物すべてに対する同種防御を提供する、ということを調査は示した。本発明の変異体によるＰｏｒＡ及びＦｅｔＡ抗原のこの組合せは、高侵襲性系統の７８個の代表物が得られるＭＬＳＴを開発するために用いられる１０７個の多様な髄膜炎菌単離物のうちの９５（８９％）に対して防御する。したがって本発明は、１１個の異なる抗原を含むワクチン組成物を提供するが、この場合、上記の１１個の抗原は、６つのＰｏｒＡ抗原及び５つのＦｅｔＡ抗原を含む。さらに詳細に言えば、本発明は、５つのＦｅｔＡ変異体（Ｆ１−５、Ｆ３−１、Ｆ５−１、Ｆ３−９、Ｆ５−５）と組合わされた６つのＰｏｒＡ変異体（Ｐ１．５−１，２−２、Ｐ１．５−２，１６、Ｐ１．５，１０、Ｐ１．７，１３−１、Ｐ１．７−２，４、Ｐ１２０，９）を含むワクチン組成物を提供する。
【０１２２】
【表１−１】
2008501674.tif 000003
【表１−２】
2008501674.tif 000004
【表１−３】
2008501674.tif 000005
【表１−４】
2008501674.tif 000006
【表１−５】
2008501674.tif 000007
【０１２３】
【表２】
2008501674.tif 000008
【実施例２】
【０１２４】
ワクチン組成物
髄膜炎菌ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡワクチンの組成物
実施例１に示した分析及び方法は、本発明による特定ワクチン組成物の設計を可能にする。
【０１２５】
表３は、本発明による精製ＰｏｒＡ及びＦｅｔＡタンパク質の異なる組合せを含む７つのタンパク質ベースの抗髄膜炎菌ワクチン組成物を示す。
【０１２６】
これらの「処方箋」は、一般に利用可能な流行病学的情報と一致することが有益である。
【０１２７】
各ワクチンに必要とされるタンパク質の数は、含まれる特定エピトープと一緒に、そして多数の異なるシナリオに関して得られる適用範囲と一緒に示される。
【０１２８】
ワクチン適用範囲は多数の単離物コレクションに関して、ワクチンエピトープと相同の少なくとも１つのエピトープを有する単離物のパーセンテージとして算定されてきた。１０７個の単離物のコレクションが、二十世紀後半の世界的疾患を代表するものとして、１９９６年に集められた。１９７５年〜１９９５年の英国の単離物コレクションに属する髄膜炎菌は、この期間中に英国で得られた疾患関連単離物を代表するものである。
【０１２９】
アフリカ／アジアワクチンは、これらの地域における疾患原因髄膜炎菌の相対的に限定された多様性を仮定すると、特に高い適用範囲を有する。
【０１３０】
比較のために、１９９９年に集団規模で導入された従来技術の髄膜炎菌血清型Ｃ接合体（ＭＣＣ）ワクチンにより得られるこれらの単離物コレクションの各々の適用範囲が、比較として示される。このワクチンは、一般に日常的な使用では、本発明の３つのクローン複合体指示(directed)ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡワクチン組成物（ＳＴ−１１、ＳＴ−３２及びＳＴ−４１／４４）の各々の有効性の約３分の１〜２分の１であるに過ぎない、ということは注目に値する。さらにそれは、１０７個の疾患原因単離物の世界的コレクションの適用範囲パーセンテージに基づいて、本発明の標準／増強化及び地理的指示ワクチン組成物の有効性の６分の１〜９分の１であるに過ぎない（表３の最初の４つの横列を参照）。したがって本発明の組成物は、非常に有効であり、そしてＭＣＣワクチンのような従来技術の組成物よりかなり良好である。
【０１３１】
表３に示される組成物の要約を以下に示す：
標準
Ｐ１．５−１、Ｐ１．２−２、Ｆ１−５、Ｐ１．５−２、Ｐ１．１６、Ｆ３−１、Ｐ１．５、Ｐ１．１０、Ｆ５−１、Ｐ１．７、Ｐ１．１３−１、Ｆ３−９、Ｐ１．７−２、Ｐ１．４、Ｆ５−５、Ｐ１−２０、Ｐ１．９
増強化
Ｐ１．５−１、Ｐ１．２−２、Ｆ１−５、Ｐ１．５−２、Ｐ１．１６、Ｆ３−１、Ｐ１．５、Ｐ１．１０、Ｆ５−１、Ｐ１．７、Ｐ１．１３−１、Ｆ３−９、Ｐ１．７−２、Ｐ１．４、Ｆ５−５、Ｐ１−２０、Ｐ１．９、Ｐ１．１９、Ｐ１．１５
欧州／米国
Ｐ１．５−１、Ｐ１．２−２、Ｆ１−５、Ｐ１．５−２、Ｐ１．１６、Ｆ３−６、Ｐ１．５、Ｐ１．１０、Ｆ５−１、Ｐ１．７、Ｐ１．４、Ｆ４−１、Ｐ１．７−２、Ｐ１．２、Ｆ３−９、Ｐ１．１９、Ｐ１．１５、Ｆ１−７
アフリカ／アジア
Ｐ１．５−２、Ｐ１．１０、Ｆ５−１、Ｐ１．７、Ｐ１．１３−１、Ｆ１−５、Ｐ１−２０、Ｐ１．９、Ｆ３−１
ＳＴ−１１複合体
Ｐ１．５、Ｐ１．２、Ｆ３−６、Ｆ５−１
ＳＴ−３２複合体
Ｐ１．７、Ｐ１．１６、Ｆ３−１、Ｐ１．１９、Ｐ１．１５
ＳＴ−４１／４４複合体
Ｐ１．７−２、Ｐ１．４、Ｆ１−５、Ｆ１−７
【０１３２】
【表３】
2008501674.tif 000009
【実施例３】
【０１３３】
ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡエピトープのクローニング及び発現
発現ベクターｐＥＴ３０  ＥｋＬＩＣベクター（Novagen）を、結紮非依存性クローニング（ＬＩＣ）とともに用いるが、これは有益には、制限消化又は結紮を要しない。本実施例は、複数のタンパク質の同時発現の可能性を例証する。
【０１３４】
本実施例で選択される発現系は、Ｔ７  ｌａｃプロモーターから誘導可能なＩＰＴＧであるという特徴を有する。本系は、カラム精製のためのＨｉｓ−タグを組み入れる（大多数のクローンがＮ末端Ｈｉｓ−タグを有し、Ｃ末端Ｈｉｓ−タグを有するものもある）。本系は、必要な場合又は望ましい場合には、Ｎ末端Ｈｉｓタグを切り離すためのエンテロキナーゼ部位を組み入れる。本系は有益には、精製を容易にするための封入体を産生する−  ＰｏｒＡ及びＦｅｔＡ遺伝子はシグナル配列を伴わずにクローン化されて、封入体中でのそれらの発現を可能にする。
【０１３５】
本実施例では、ｐＥＴ  ３０  ＥｋＬＩＣベクターは、ＬＩＣクローニングに適合性である特定末端を用いてＦｅｔＡ及びＰｏｒＡ遺伝子をＰＣＲ増幅することを包含するクローニング法とともに用いられる。これらは次に、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ及びｄＡＴＰで処理されて、５’オーバーハングを作製する。処理挿入物は次に、予備線状化ベクターとアニーリングされる。アニーリング化構築物は次に、クローニング宿主へ形質転換して、環状プラスミドを形成する。これらのプラスミドは次に、発現宿主への形質転換によりスクリーニングされる。必要な場合は、他の方法、例えばシーケンシング、ウエスタンブロット（ＰｏｒＡ  ＭＡｂ、Ｈｉｓ−タグＭＡｂ）を用いて、クローンを立証する。
【０１３６】
クローン化されたＰｏｒＡ型を表Ａに示す。＊は増強化組合せからの菌株３０７２であり、他の菌株はすべて、標準組合せを形成する。
クローン化されたＦｅｔＡ型を表Ｂに示す。これらの型はすべて、標準ワクチン組合せのためのものである。
【実施例４】
【０１３７】
ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡタンパク質抗原の産生
本実施例では、ＩＰＴＧ誘導を用いて、実施例３からのクローン化ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡタンパク質抗原の発現を誘発する。３０μｇ／ｍｌのカナマイシンを補足したルリア寒天／ブロス上で、ＰｏｒＡ／ＦｅｔＡクローンで形質転換されるＢＬ２１（ＤＥ３）を増殖させる。１％グルコースを含入することにより、基礎発現を抑制する。
【０１３８】
プロトコール：産生
発端培養(Starter culture)  −  ５０ｍｌのＬＢに、一般的に、１つのコロニーＢＬ２１（ＤＥ３）クローンを接種して、振盪インキュベーター中で３７℃で一晩増殖させる。ＯＤ６００を測定し、５００ｍｌＬＢに接種して、ＯＤ６００＝０．０５とする。振盪インキュベーター中で３７℃で、２５０ｒｐｍでインキュベートし、ＯＤ６００＝０．５〜０．６とする。ＩＰＴＧを付加して誘導し、最終濃度を１ｍＭとする。振盪インキュベーターに２〜３時間戻す。培養を遠心管に移す。氷上で５分間インキュベートする。遠心分離により細胞を収穫し、−７０℃で凍結する。
【０１３９】
プロトコール：封入体精製
ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）タンパク質抽出試薬中に細胞ペレットを再懸濁する。リソナーゼ（リゾチーム及びヌクレアーゼ）を付加する。粘性でなくなるまで、振盪プラットホーム上でインキュベートする。４℃で２０分間、１２．５ｋｒｐｍで遠心分離する(spin)。同容積のＢｕｇＢｕｓｔｅｒ（商標）試薬中に同一のペレットを再懸濁する。ｒリゾチーム溶液を付加する。室温で５分間、回転させ(vortex)、インキュベートする。６容積の１：１０希釈BugBuster（商標）試薬を付加する。４℃で１５分間、６．５ｋｒｐｍで遠心分離して、封入体を回収する。
【０１４０】
プロトコール：封入体からのさらなるタンパク質精製
０．５容積の１：１０希釈BugBuster（商標）試薬で封入体を洗浄する。反復洗浄し、４℃で１５分間、１２．５ｋｒｐｍで遠心分離して、上清を除去する。ペレットを変性させて、ＴＥ８．０Ｍ尿素中２０ｍｇ湿重量／ｍｌとする。１２．５ｋｒｐｍで１０分間、遠心分離する。上清を４．０Ｍの尿素、０．５ＭのＮａＣｌ、１％Ｚ３−１４に混ぜ合わせる。２０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ７．９、２５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％Ｚ３−１４に対して透析することによりリフォールディングする。１０Ｋで１０分間遠心分離する。可溶化タンパク質を含有する上清を保存する。
【０１４１】
封入体精製後、タグ（本実施例では６Ｈｉｓ−タグ）ベースの精製を用いて進行するのが好ましく、本実施例では、ニッケルカラム精製が用いられる。
【０１４２】
ニッケルカラム精製
Ｈｉｓ結合樹脂（Novagen）を用いる。樹脂を完全に再懸濁する。スラリー（２×カラム容積）をカラムに移す。重力流下で樹脂を詰め込ませる。
【０１４３】
以下を適用することにより、カラムに装填し、平衡させる：
３容積の滅菌脱イオン水
５容積の１×装填緩衝液（硫酸ニッケル）
３容積の１×結合緩衝液＋０．０５％Ｚ３−１４。
【０１４４】
プロトコール：カラムクロマトグラフィー
０．４５ｕｍフィルターを通してタンパク質試料を濾過する。タンパク質抽出物をカラムに結合する。１０×容積の結合緩衝液＋０．０５％Ｚ３−１４で洗浄する（２０ｍＭのイミダゾール）。６×容積の洗浄緩衝液＋０．０５％Ｚ３−１４で洗浄する（６０ｍＭのイミダゾール）。６×容積の溶離緩衝液＋０．０５％Ｚ３−１４で溶離する（１Ｍのイミダゾール）。最終緩衝液：１０ｍＭのトリスＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００に対して透析する。
【０１４５】
本実施例では、ＰｏｒＡ  Ｐ１．７−２，４が発現される。図２を参照すると、レーン１は分子量マーカーであり、数値はｋＤａである；レーン２〜６は非誘導（１〜５時間）である；レーン７〜１１は１ｍＭ  ＩＰＴＧ処理（１〜５時間）である。
【０１４６】
図３を参照すると、ＰｏｒＡ  Ｐ１．７−２，４分別(fractionation)が示されている。レーン０は、分子量マーカーであり、数値はｋＤａである；レーン１は、全細胞（ｔ＝０）である；レーン２は、上清ＩＢ抽出物である；レーン３は、ＩＢ抽出からの洗浄物２である；レーン４は、ＩＢ抽出物からの洗浄物３である；レーン５は、変性後の不溶性分画である；レーン６は、変性後の可溶性分画である；レーン７は、Ｈｉｓカラム溶離分画１である；レーン８は、Ｈｉｓカラム溶離分画２である。
【０１４７】
本実施例によれば、封入体（ＩＢ）抽出及びＨｉｓ結合（ニッケルカラム）精製後、５００ｍｌ培養から約６ｍｇの精製タンパク質を産生する。
【０１４８】
【表４】
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【０１４９】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】（Ａ）７つの連結ハウスキーピング遺伝子配列（３，２８４塩基対）並びに（Ｂ）３つの連結抗原遺伝子配列（４，２０９塩基対）を用いた７８個の高侵襲性髄膜炎菌の系統発生学的分析を示す。各単離物は、多座配列類別（ＭＬＳＴ）により定義されるように、クローン複合体によって色分けされる。
【図２】クーマシー染色ＰＡＧＥタンパク質試料を示す。
【図３】種々の異なる処理／条件からのＰＡＧＥタンパク質試料を示す（詳細に関しては実施例参照）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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