(57)【要約】  本発明は、急性肝障害の処置に用いられることができ、そして、例えば、急性肝障害の対する肝臓組織における初期の内因性の保護応答の促進、肝細胞におけるＤＮＡ合成の促進、急性肝障害を有する患者の肝臓組織の肝細胞死の予防、いずれかの病因の急性肝障害に続く残った肝実質の再生の刺激、および部分肝切除に続く肝細胞の再生の刺激を目的として投与される、医薬の製造におけるアンフィレグリンの使用に関する。本発明によれば、いずれかの病因の急性肝障害を有する患者のための肝保護薬として、および／または、生存提供者または死亡提供者からの肝臓移植の受容者のための肝保護薬および肝細胞再生刺激薬として、アンフィレグリンは投与される。2008506754.tif 000004
2008506754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アンフィレグリンが、急性肝障害の処置用医薬の製造に用いられることを特徴とする、アンフィレグリンの使用。
【請求項２】
医薬が、急性肝障害に対する肝臓組織の初期の内因性保護応答の促進に有用であることを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリンの使用。
【請求項３】
医薬が、肝細胞のＤＮＡ合成促進に有用であることを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリンの使用。
【請求項４】
医薬が、急性肝障害を有する患者の肝臓組織の肝細胞死予防に有用であることを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリンの使用。
【請求項５】
医薬が、いずれかの病因の急性肝障害の後の、残った肝臓実質の再生の刺激に有用であることを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリンの使用。
【請求項６】
医薬が、いずれかの病因の急性肝障害を有する患者のための肝臓保護薬として有用であることを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリンの使用。
【請求項７】
医薬が、部分肝切除後の肝臓再生の刺激に有用であることを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリンの使用。
【請求項８】
医薬が、生体、または死体からの肝移植の受容者である患者において、肝臓保護薬として、そして、肝細胞再生の刺激薬として有用であることを特徴とする、請求項１に記載のアンフィレグリンの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の技術分野
本発明は、肝疾患、そして、特に急性肝障害、例えば急性肝不全（ＡＬＦ）の治療のための、医療製薬領域に適用される生物工学の分野に帰属する。
より詳しくは、本発明は、アンフィレグリン（amphiregulin）（ＡＲ）の使用に基づいて、新規な治療をこの種の疾患に提供する。
【背景技術】
【０００２】
本発明以前の技術状況
急性肝障害は、肝細胞死による機能的な肝臓の大部分の喪失が続く急性肝不全（ＡＬＦ）として表されることができる極めて重い障害である。ＡＬＦは、このように疾患ではなくむしろ肝細胞損失の程度と比例した重篤性を有する症候群である。障害は、劇的で、そして、脳障害、脳浮腫、敗血症、呼吸および腎臓障害、腸の出血および心血管虚脱を含む多様な臓器への影響をもたらす合併症を有する［Sanyal, A.J., Stravitz, R.T.The liver.Chapter 16.Pages:445-496.Zakim and Boyer Eds.Saunders.Philadelphia.2003］。
【０００３】
ＡＬＦは特に一般的ではないが、関連する死亡率は４０および９５％の間にある［Sanyal, A.J., Stravitz, R.T. The liver. Chapter 16. Pages:445-496. Zakim and Boyer Eds. Saunders. Philadelphia. 2003、 および Galun, E., Axelrod, J.H.Biochim.Biophys.Acta. 1592: 345-358. 2002(下記 (15) )]
【０００４】
地理的多様性に伴い、ＡＬＦの病因論は、多様である；その正しい定義は、予後を確立して、治療を適用するために重要である。
ＡＬＦが生じることができる薬剤の中で、記載は、肝炎ウィルス、特定の薬および毒素、代謝異常、急性虚血のいくつかの例および肝実質の大量切除について述べられている[Sanyal, A.J. ibid、 Galun, E. ibid]。
【０００５】
ＡＬＦの成功的な解決は、肝細胞損傷を阻害する可能性に、そして、損傷を受けた実質の再生に依存する。現在の臨床診療において、利用可能なほとんどの治療手段は、ＡＬＦの多臓器出現を和らげることを試みる；しかしながら、壊死およびアポトーシスを減らすことができ、または幹細胞再生を促進することができる治療的な戦略はない−肝臓移植が、患者を治療する最終的に唯一の可能な選択肢である、 [Sanyal, A.J. ibid、 Galun, E. ibid]。
【０００６】
細胞保護および再生する機構は、部分的な肝除去（ｐＨ）に対して従属的な肝の組織損失、または中毒性であるか、ウィルスであるか、虚血性であるか、または免疫起源の損傷の後に、肝臓において、活性化されることは公知である。 [(1) Michalopoulos, G.K., DeFrances, M.C. 1997. Liver regeneration. Science 276: 60-66. (2) Fausto, N. 2000. Liver regeneration. J. Hepatol. 32 (suppl 1): 19-31. (3) Taub, R.A. 2003. Hepatic regeneration. In:The Liver. D. Zakim, J.L. Boyer, Saunders, Philadelphia.  U.S.A. 31-48]。
【０００７】
異なる実験的なアプローチは、重度肝臓損傷の後で、肝機能を保って、機能的な肝重量を回復するために貢献する根底にあるメカニズムを決定するのを助けた [(4) Koniaris, L.G., McKillop, I.H., Schwartz, S.I., Zimmers, T.A. 2003. Liver regeneration. J. Am. Coll. Surg. 197: 634-659]。
【０００８】
一連の調整された段階を進展させる過程の関係で、この複雑な反応は、サイトカイン、共同分裂刺激剤および成長因子のネットワークにより媒介される [(2), (3), (5) Kosai, K., Matsumoto, K., Nagata, S., Tsujimoto, Y., Nakamura, T. 1998. Abrogation of Fas-induced fulminant hepatic failure in mice by hepatocyte growth factor. Biochem. Biophys. Res. Commun. 244: 683-690. (6). Ethier, C., Raymond, V-A., Musallam, L., Houle, R., and Bilodeau, M. 2003. Antiapoptotic effect of EGF on mouse hepatocytes associated with downregulation of proapoptotic Bid protein. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 285: G298-G308. (7). Kanda, D., Takagi, H., Toyoda, M., Horiguchi, N., Nakajima, H., Otsuka, T., Mori, M. 2002. Transforming growth factor .alpha. protects against Fas-mediated liver apoptosis in mice. FEBS Lett. 519: 11-15]。動物モデルにおいて、損傷または切除への再生応答にきわめて重要なサイトカインおよび成長因子の多くは、肝臓再生の経過で、人間においても発現すると考えられる。よって、種間での基本的なメカニズムの保存を示唆する。
【０００９】
実験的なレベルでは、特定の成長因子およびサイトカインの動物（ラットおよびマウス）への投与が、細胞死を回避して、肝実質の再生を刺激して、ＡＬＦから保護することが示された。
【００１０】
かかる因子は、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦ―α）および上皮細胞増殖因子（ＥＧＦ）を含む。[Kosai, K., Matsumoto, K. Nagata, S., Tsujimoto, Y., Nalamura, T. Biochem. Biohys. Res. Commun. 244:683-690.1998 下記 (5)、 Kand, D., Takagi, H., Toyoda, M., Horiguchi, N., Nakajima, H., Otsuka, T., Mori, M. FEBS Lett. 519-11-15.2002、 and Ethier, C., Raymond, V.A., Musallam, L., Houle, R., Bilodeau, M. Am. J. Physiol. 285: G298-G308.2003]。
【００１１】
サイトカインの中で、インターロイキン６（ＩＬ―６）およびカルジオトロフィン―１（ＣＴ―１）が言及され得る。[Kovalovich, K., DeAngelis, R.A., Li, W., Durth, E.E, Ciliberto, G., Taub, R. Hepatology 31:149-159.2000 下記(26)、 そして、 Bustos, M., Beraza, N., Lasarte, J.J., Baixeras, E., Alzuguren, P., Bordet, T., Prieto, J. Gastroenterology 125:192-201.2003 下記(43)]。
【００１２】
肝臓再生は、実質切除または損傷に続く肝重量を回復させることを意図する固有の応答である。生存および増殖シグナルは、サイトカインおよび成長因子の調整された方法で作動する複雑なネットワークを介して伝えられ得る。
【００１３】
しかしながら、過去数十年の精力的な研究にもかかわらず、肝臓障害に対する生理的適応反応に関する分子およびメカニズムは十分には解明されていない。
【００１４】
発明者らは、最近、四塩化炭素（ＣＣｌ４）で処理されたラット肝臓並びに、肝細胞損傷患者の肝臓において、ウィルムス腫瘍抑制遺伝子ＷＴ１が誘導されることを観察した［(8) Berasain, C., Herrero, J.I., Garcia-Trevijano, E.R., Avila, M.A., Esteban, J.I., Mato, J.M., and Prieto, J. 2003. Expression of Wilms' tumor suppressor in the cirrhotic liver: relationship to HNF4 levels and hepatocellular function. Hepatology 38: 148-157]。ＷＴ１遺伝子は、成長および分化に関わる様々な遺伝子の発現を制御することができるジンクフィンガー（zinc finger）を有する転写因子をコードする[(9) Scharnhorst, V., Van der Eb, A.J, and Jochemsen, A.G. WT1 proteins: functions in growth and differentiation. 2001]. Gene 273:141-161]。
【００１５】
ＷＴ１によって直接的に惹起される主な生理的ターゲットの一つは、アンフィレグリン（ＡＲ）である[(10) Lee, S.B., Huang, K., Palmer, R., Truong, V.B., Herzlinger, D., Kolquist, K.A., Wong, J., Paulding, C., Yoon, S.K., Gerald, W., Oliner, J.D., and Haber, D.A. 1999. The Wilms' tumor suppressor WT1 encodes a transcriptional activator of amphiregulin. Cell 98: 663-673]。ＡＲは、ＥＧＦファミリーに属するポリペプチド成長因子であり、ＥＧＦ受容体（ＥＧＦ―Ｒ）のリガンドであり、最初は、ホルボール１２―ミリスチン酸塩１３―酢酸塩で処理されたＭＣＦ―７ヒト乳癌細胞の培養上清から単離されたものである[(11) Shoyab, M., McDonald, V.L., Bradley, G., and Todaro, G.J. 1988. Amphiregulin: a bifunctional growth-modulating glycoprotein produced by the phorbol 12-myristate 13-acetate-treated human breast adenocarcinoma cell line MCF-7. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 85: 6528-6532]。ＥＧＦおよびＴＧＦαと同様に、ＡＲは、膜貫通の前駆体として合成され、タンパク質分解的にプロセッシングされ成熟分泌型を生じる[(12) Lee, D.C., Sunnarborg, S.W., Hinkle, C.L., Myers, T.J., Stevenson, M.Y., Russell, W.E, Castner, B.J., Gerhart, M.J., Paxton, R.J., Black, R.A., Chang, A., and Jackson, L.F. 2003. TACE/ADAM17 processing of EGF-R ligands indicates a role as a physiological convertase. Ann. N.Y. Acad. Sci. 995: 22-38]。ＡＲの発現は組織特異的である。ヒトにおいては、卵巣および胎盤で優勢であり、肝臓では検出されない[(13) Plowman, G.D., Green, J.M., McDonald, V.L., Neubauer, M.G., Disteche, C.M., Todaro, G.J., and Shoyab, M. 1990. Amphiregulin gene encodes a novel epidermal growth factor-related protein with tumor-inhibitory activity. Mol. Cell Biol. 10: 1969-1981]。
【００１６】
ＡＲは二面的な機能を有し、多様な正常細胞の分化を刺激し、多くの腫瘍細胞株を阻害する[(10), (13)および(14) Kato, M., Inazu, T., Kawai, Y., Masamura, K., Yoshida, M., Tanaka, N., Miyamoto, K., and Miyamori, I. Amphiregulin is a potent mitogen for the vascular smooth muscle cell line, A75. 2003. Biochem. Biophys. Res. Commun. 301: 1109-1115]。
【００１７】
米国特許５１１５０９６号は、アンフィレグリンの物理化学的な特徴および上皮起源の癌細胞に対するその反増殖的な効果、並びに、損傷の治療、癌の診断および治療におけるその使用を記載する。肝臓でのアンフィレグリン産生のレベルの確かな低下について述べられ、それから、それが明らかに「いくつかの機能的役割をしている」ことが推測される。
【００１８】
米国特許５９８０８８５号は、哺乳類神経組織での前駆細胞の増殖の惹起のための、繊維芽細胞増殖因子と併用されるＡＲに関する使用方法について記載されている。
米国特許６２０４３５９号は、損傷および癌の治療において、ケラチノサイトによって産生されるＡＲの新規な形の使用を記載する。
【００１９】
米国特許出願２００１１０５１３５８号は、他の適用の中で、肝臓疾患の治療のためのＥＥＧＦ（細胞外／上皮細胞増殖因子）由来のポリペプチドの取得および使用を記載する。それは、また、肝臓再生に関する処置の可能性にも言及する。しかしながら、ＡＲは本技術分野において既知の生成物として述べられるのみであり、おそらく本明細書中で記載される発明がそれを上回るものである。
【００２０】
特許出願ＷＯ−０１４５６９７号は、ＡＲ発現を阻害する調節薬剤およびヒト皮膚治療におけるその使用を記載する。
【００２１】
最後に、特許出願ＷＯ−０２１０２３１９号は、ＢＧＳ―８ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、そして、他の適用の中で、肝臓疾患および肝臓に影響を及ぼす増殖状態の治療および予防に有用である後者の断片および相同物を記載する。それはまた、ｂＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＡＲ、ベータセルリン、潜在―(crypto−）およびＴＧＦ―アルファ等のＥＧＦタンパク質ファミリーとの高い相同性のため、ＢＧＳ―８ポリペプチドがそのファミリーに属するタンパク質と少なくともいくつかの生物学的活性を共有することが予想され得ることが示される。
【００２２】
本技術分野の状況は、ＡＬＦ治療の新しい代替の必要を証明する。従って、その投与がＡＬＦにおける肝臓の保護を提供できる、成長因子やサイトカインの提供に基づいた、ＡＬＦのより有効な治療を見出すことが、望まれている。
【発明の開示】
【００２３】
本発明の記載
上記で述べられた技術状況に基づいて、発明者らは、予想外にも、外部から投与されるＡＲが、例えば、急性肝不全（ＡＬＦ）を導く（または、すでに発症した）急性肝障害の保護剤として有効であることを見出した。
【００２４】
したがって、本発明の目的は、急性肝障害の治療用の薬剤の製造のためのアンフィレグリンの使用である。
【００２５】
本発明の別の目的は、急性肝障害に対して肝臓組織の初期の内因性防御反応を補強するために、前記因子が投与されるこの薬剤の使用である。
【００２６】
さらなる本発明の目的は、急性肝障害の肝臓実質細胞のＤＮＡ合成を促進するために投与される薬剤の製造におけるアンフィレグリンの使用である。
【００２７】
本発明の別の目的は、急性肝障害の肝臓実質の細胞死を予防するために投与される薬剤の製造におけるＡＲの使用である。
【００２８】
さらに他の目的は、いかなる病因論の急性肝障害の後に続く、残った肝実質の再生を刺激する薬剤の製造におけるＡＲの使用である。
【００２９】
本発明の他の目的は、部分的な肝切除術の後の肝臓再生の刺激に有用な薬剤の製造におけるＡＲの使用である。
【００３０】
本発明の更に別の目的は、生体で、または、死体から移植される肝臓の受容者である患者において、肝保護薬として、そして、肝細胞再生の刺激剤として有用な薬剤の製造におけるＡＲの使用である。
【００３１】
アンフィレグリンは、従って、かかる治療を必要としている患者への投与を経て、急性肝障害の治療に有用である。よって、アンフィレグリンが、かかる治療を必要としている患者にＡＲの有効量の投与を含む急性肝障害の処置のための方法で用いられることが可能である。
かかる使用の前後関係において、薬は、ＡＲが投与される患者の処置において、下記達成のために使うことができる（例えば）：
* 急性肝障害に対する肝臓組織の初期の内因性防御反応の増強；
および／または
* 急性肝障害の間の肝細胞のＤＮＡ合成の促進；
および／または
* 急性肝障害の間の肝細胞死の予防；
および／または
* 急性肝障害の後、肝実質再生を維持する刺激；
および／または
* 肝障害に対する肝臓組織の初期の内因性防御反応の増強および／または肝細胞ＤＮＡ合成の促進；
および／または
* 急性肝障害患者の肝臓組織の肝細胞死の予防；
そして、または、
* いかなる病因論の急性肝障害の後の残った肝実質の再生の刺激；
および／または
* 部分的な肝切除術後の肝臓再生の刺激；
および／または
* 生体で（de vivo）、または、死体からの肝移植の受容者である患者の肝細胞再生の刺激。
【００３２】
発明者らは、驚くべきことに、ＡＲの投与が肝障害の間、肝細胞生存を誘発し得ることを見出した。したがって、ＡＲが細胞分裂（mitogenic）または増殖因子として機能することが証明されている。発明者らは、ＡＲが、単離された肝細胞に直接的に働くことができ、それらの増殖を促進し、アポトーシスを阻害することを示した。これらの効果は、ＥＧＦ―Ｒおよび細胞外で制御されたキナーゼ１／２（ＥＲＫ１／２）、シグナル−３トランスデューサおよび転写アクチベーター（ＳＴＡＴ−３）、c-jun  Ｎ−ターミナルキナーゼ（ＪＮＫ）およびＡｋｔの活性化を通して媒介されるようである。さらに、ＡＲは、単離肝細胞において２つの生存メディエーター、ＴＧＦαおよびＣＴ−１の発現を惹起する。
【００３３】
同様に、発明者らは、肝障害の２つの臨床的に関連したモデルである、Ｆａｓリガンド受容体を特異的に活性化する抗体ＪＯ２、またはＣＣｌ４による急性肝障害[(4), (15) Galun, E., and Axelrod, J.H. 2002. The role of cytokines in liver failure and regeneration: potential new molecular therapies. Biochim. Biophys. Acta. 1592: 345-358]に罹患したマウスに対するＡＲのインビボ投与が、肝組織を顕著に保護し、アポトーシスを阻害することを示すことができた。したがって、発明者らの発見は、重篤な肝障害または病変の場合に、肝細胞性損傷を減らすための治療的な有用性を反映する、肝臓におけるＡＲの新規な機能を明らかにする。
【００３４】
上記のコメントは、ヒト急性肝障害に関連する肝細胞性損傷のモデルにおける、アンフィレグリンの肝保護特性およびその細胞分裂効果を反映する。
【００３５】
ＡＲは、非経腸経路を経た注入として、そして、−それが皮下、または、筋注で投与されることもできるにもかかわらず、好ましくは静脈内経路により投与されることができる。
【００３６】
非経腸投与用の形態は、ＡＲと緩衝化剤（buffer）、安定化剤、防腐剤、可溶化剤、強壮剤、および／または懸濁化剤を混ぜ合わせることによって、従来どおりに、得ることが可能である。ＡＲ分子で見受けられるジスルフィド結合に対する効果を回避するために、製剤は、これらのジスルフィド結合を調節する（減らす）ことができる構成要素を含むべきではない。組成物は、周知の技術を使用して殺菌されて、注入として投与されるために包装される。
【００３７】
可能性のある緩衝化剤は、有機リン酸に基づく塩を含む。
【００３８】
可溶化剤の例は、ポリオキシエチレン、ポリソルベート８０、ニコチンアミドおよびマクロゴールと共に、凝固させたヒマシ油である。
【００３９】
安定化剤として、ナトリウム亜硫酸塩またはメタナトリウム亜硫酸塩、そして、防腐剤として、ソルビン酸、クレゾール、パラクレゾール、その他を使うことができる。
【００４０】
より好ましい投与形態として、注射可能な組成物は、溶液、エマルジョンまたは無菌の分散でもよい。該注入可能な形態は、注入のための水において、一種以上の賦形剤と共にＡＲ溶解、エマルジョンまたは分散により調製される。
【００４１】
皮下投与用の注射可能な製剤の一部を形成できる賦形剤においては、組織の注入によって、緩衝化能力があるかないか、そして、生理的ｐＨでの活性物質または複数の活性化物質の安定性によって、緩衝化剤につき言及され得る。緩衝化剤においては、クエン酸−クエン酸ナトリウム、酢酸−酢酸ナトリウムおよび炭酸一ナトリウム−炭酸二ナトリウム、その他等の調節溶液について、言及され得る。
【００４２】
他の任意の賦形剤は、発熱物質および／または汚染物質の存在を回避するための滅菌剤である。
【００４３】
皮下の経路を経た投与用の医薬品組成物の他の任意の成分は、例えば水、炭化水素、アルコール類、ポリオール類、エーテル類、植物油、ラノリンおよびメチルケトン、その他等の、一またはそれ以上の液体担体剤である。
【００４４】
静脈内であるか腹膜内注射用の製剤は、１日につき、１回または数回、０．５〜１．８ｍｇ／患者体重ｋｇで、例えば、１日につき０．８５〜１．５５ｍｇ／患者体重ｋｇで、とりわけ１日につき１〜１．５ｍｇ／患者体重ｋｇで投与することができるように設計され得る。
【００４５】
図面の簡単な説明
図１Ａ：対照（n=26）および肝硬変患者（チャイルドピュー(Child-Pugh)  Ａ  肝硬変、n=7、チャイルドピュー  Ｂ＋Ｃ  肝硬変、n=22）由来の肝臓サンプルにおけるリアルタイムポリメラーゼチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定された、ヒトおよび実験的肝硬変におけるＡＲ遺伝子の発現。
【００４６】
図１Ｂ：ＲＴ―ＰＣＲによって測定された対照ラット肝臓およびＣＣｌ４により誘導される肝硬変肝臓におけるＡＲ遺伝子の発現（１群あたりｎ＝６）。
【００４７】
図２Ａ：対照マウスの肝臓およびＪｏ２抗体またはＣＣｌ４による急性肝障害の惹起後の肝臓におけるＡＲの発現。ＡＲの発現は、前述の処置の投与５ｈ後に、ＲＴ―ＰＣＲにより評価された。
【００４８】
図２Ｂ：Ｊｏ２抗体またはＣＣｌ４により惹起された急性肝障害におけるＡＲの発現およびウェスタンブロッティングによる評価。それぞれ、肝臓組織のサンプルは、Ｊｏ２およびＣＣｌ４の処置の１２および２４ｈ後、得られた。
分析は、アフィニティー精製およびビオチン化された抗ＡＲ抗体により行われた.矢印（arrow tip）は異なる形態のＡＲを示し、そして、グループにつき３つの代表的なサンプルが示されている。ローディングコントロールとして、アクチンに特異的な抗体によって、膜をハイブリダイズした。代表的なイメージを示す。
【００４９】
図３Ａ：ＡＲによる処置はＣＣｌ４により惹起された急性肝障害を予防する。ＣＣｌ４で処置されたマウスの血清トランスアミナーゼ・レベルに加えて、肝臓組織学を示す（Ｈ＆Ｅ染色、原物の拡大Ｘ２００）。血清および肝臓組織サンプルは、ＣＣｌ４投与の２４ｈ後に集められた。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。
【００５０】
図３Ｂ：Ｊｏ２で処置されたマウスの肝臓組織学および血清トランスアミナーゼ（Ｈ＆Ｅ染色、原物の拡大Ｘ２００）に対するＡＲ治療の効果。血清および肝臓組織のサンプルは、Ｊｏ２投与の１２ｈ後に得られた。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。アスタリスクは、対Ｊｏ２単独、Ｐ＜０．０１を示す。
【００５１】
図３Ｃ：Ｊｏ２注入の１２ｈ後に測定されたマウス肝臓のカスパーゼ―３活性におけるＡＲ治療の効果。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。アスタリスクは、Ｐ＜０．０１対Ｊｏ２単独、を示す。
【００５２】
図３Ｄ：対照マウスの肝臓―Ｃ―およびＪｏ２注入の１２ｈ後に得られた肝臓抽出物における、活性カスパーゼ―３のｐ１７サブユニットおよびＢｃｌ―ｘＬタンパク質のレベルに対するＡＲ治療の効果。ローディングコントロールとして、アクチンに特異的な抗体によって、膜をハイブリダイズした。代表的なイメージを示す。
【００５３】
図４Ａ：マウス肝細胞初代培養におけるＡＲの抗アポトーシス効果。アポトーシスは、ＡＲの濃度増加の存在下、アクチノマイシンＤおよびＪｏ２で処理することにより惹起された。アポトーシスは、細胞質でのモノ−およびオリゴヌクレオソーム放出の特異的な濃縮を測定することにより評価された（濃縮係数：EF)。値は、対照肝細胞−Ｃ−で得られた値に関して標準化された。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表され、アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対Ｊｏ２、を示す。
【００５４】
図４Ｂ：左パネル：アクチノマイシンＤおよびＪｏ２で処理された培養マウス肝細胞のカスパーゼ―３活性に対するＡＲ（２０ｎＭ）の効果。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表され、アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対アクチノマイシンＤおよびＪｏ２で処理された細胞、を示す。
右パネル：左パネルに記載されている同じサンプルの活性カスパーゼ―３のｐ１７サブユニットおよびＢｃｌ―ｘＬタンパク質のウエスタンブロット分析。
【００５５】
図４Ｃ：培養マウス肝細胞におけるＡＲによる反アポトーシスシグナリング経路の活性化。Ａｋｔ、ＥＲＫ１／２およびＳＴＡＴ３リン酸化状態は、ＡＲ（２０ｎＭ）の添加の後、異なる時間でマウス肝細胞の抽出物のウエスタンブロッティングを介して評価された。
代表的な画像は、デュプリケートで行われた３つの実験の中で示される。
【００５６】
図４Ｄ：ＥＧＦ―Ｒ阻害剤剤ＰＤ１５３０３５（１μＭ）、ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ９８０５９（１０μＭ）またはＰＩ−３Ｋの阻害剤ＬＹ−２９４００２（２０μＭ）の存在下で培養されたマウス肝細胞における、アクチノマイシンＤおよびＪｏ―２により惹起されるアポトーシスに対するＡＲ（２０ｎＭ）の効果。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表され、アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対Ｊｏ２、を示す。
【００５７】
図５Ａ、５Ｂ：部分的な肝切除術（ＰＨ）後の、ラット肝臓（図５Ａ）およびマウス肝臓（図５Ｂ）におけるＡＲ遺伝子発現。
ＡＲコードするｍＲＮＡのレベルは、ＰＨの後異なる時間で、残った肝実質において、リアルタイムＰＣＲにより分析された。値は、３匹の異なる動物の平均±ＳＥＭとして表される。中塗り円（closed circle）は肝切除された動物に対応し、中抜き円（open circle）は虚偽の手術を受けた動物に対応する。
【００５８】
図６Ａ：培養ラット肝細胞におけるＡＲによるＤＮＡ合成の刺激。肝細胞を濃度を増加させたＡＲで処理し、ＤＮＡ合成を［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定することにより評価した。ＡＲにより誘導されるＤＮＡ合成におけるＴＧＦβ（８ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す。値は、クワドルプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。１つのアスタリスクはＰ＜０．０５を示し、２つのアスタリスクはＰ＜０．０１対対照を示す。
【００５９】
図６Ｂ：培養ラット肝細胞におけるＡＲによるＥＧＦ―Ｒのチロシン残基リン酸化の刺激。チロシンをリン酸化されたＥＧＦ―Ｒおよび全体のＥＧＦ―Ｒはウエスタンブロッティングにより検出された。代表的な画像は、デュプリケートで実施された３つの実験の中で示される。
【００６０】
図６Ｃ：培養ラット肝細胞における、ＡＲによる細胞増殖に関するシグナリング経路の活性化。Ａｋｔ、ＥＲＫ１／２およびＪＮＫのリン酸化状態は、ＡＲの添加後、異なる時間で、ラット肝細胞抽出物の特異的抗体を使用するウエスタンブロッティングによって評価された。代表的な画像は、デュプリケートで実施された３つの実験の中で示される。
【００６１】
図６Ｄ：ＥＧＦ―Ｒ阻害剤ＰＤ１５３０３５（１μＭ）、ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ９８０５９（１０μＭ）、ＰＩ−３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２（２０μＭ）、ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（２０μＭ）またはｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０２１９０（２５μＭ）の存在下のラット肝細胞におけるＤＮＡ合成に対するＡＲ（１００ｎＭ）の効果。アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対ＡＲ単独を示す。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。
【００６２】
図７Ａ：異なる期間でＩＬ―１β（２ｎｇ／ｍｌ）で処理された培養ラット肝細胞におけるＡＲ遺伝子発現（クローズド・バー）。ＡＲの遺伝子発現は、リアルタイムＰＣＲで測定された。アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対対照（オープン・バー）を示す。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。
【００６３】
図７Ｂ：異なる期間でＰＧＥ２（１０μＭ）（クローズド・バー）で処理されたラット肝細胞におけるＡＲ遺伝子発現。ＡＲの遺伝子発現は、リアルタイムのＰＣＲで測定された。アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対対照（オープン・バー）を示す。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。
【００６４】
図７Ｃ：培養期間に依存したラット肝細胞におけるＡＲのベースライン遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲによる解析。代表的な実験を示す。
【００６５】
図７Ｄ：ＷＴ１の４つのアイソフォームをコードするｐＣＢ６プラスミドの等モル混合物、または等量の該アイソフォームをコードしない（gutless）ｐＣＢ６ベクターでトランスフェクションした２４ｈ後の培養ラット肝細胞におけるＡＲ遺伝子発現。ＡＲ遺伝子発現は、リアルタイムＰＣＲで測定された。
【００６６】
図８Ａ、８Ｂ：異なる期間でＡＲ処理した培養ラット肝細胞におけるTGFα（図８Ａ）およびＣＴ−１（図８Ｂ）遺伝子発現。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表され、各時点に対応する数−倍増加対対照として表される。アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対対照を示す。
【００６７】
図９：対照マウス−Ｃ−の肝臓、およびＪｏ２抗体で処置されたマウスの肝臓における、ＥＧＦ−Ｒ、ＡＲ、ＴＧＦα、ＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦリガンドの遺伝子発現。これらの遺伝子の発現は、ＲＴ―ＰＣＲで測定された。アスタリスクは、Ｐ＜０．０１対対照を示す。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。
【００６８】
試行
ＡＲ遺伝子発現は、肝硬変のヒト肝臓において検出され、実験的な肝障害において、そして部分的な肝切除術に続いて、急速に誘導される。発明者らによって実施された実験は、科学的基礎および本発明に含まれるＡＲの使用に対するサポートを構成する、得られた結果の精力的な分析と共に、以下に示される。
【００６９】
慢性および急性肝障害において誘導されるＡＲ遺伝子発現
発明者らは、転写制御因子ＷＴ１の発現が、肝硬変のヒト肝臓のほとんどすべての試験されたサンプルにおいて、そしてラットＣＣｌ４惹起肝硬変において誘導されることをすでに示した（８）。ＡＲがＷＴ１の主要な転写ターゲットであるという事実（１０）は、発明者に肝硬変患者の肝臓におけるこの成長因子の発現を検討させた。リアルタイムＰＣＲ分析（ＲＴｉ―ＰＣＲ）は、健常人の肝臓のＡＲ発現のかろうじて検出可能なレベルを示したが、肝硬変患者の約７５％においては、高いレベルのＡＲをコードするｍＲＮＡが観察された（図１Ａ）。
【００７０】
大変興味深いことは、ＡＲ遺伝子発現のレベルが、対照肝臓および肝硬変の個人におけるＷＴ１遺伝子のそれと直接相関した（ｒ＝０．７５２、Ｐ＜０．００１）という事実である。ヒトのデータと一致して、ＡＲ発現は、ＣＣｌ４投与（図１Ｂ）および胆管結紮（図示せず）に続く、ラットで惹起される実験的な肝硬変においても増加した。
【００７１】
ＡＲが侵襲に対する急速な肝臓反応の一部をなし得るか否かを決定するために、ＣＣｌ４（１μｌ／ｇ）の単回腹腔内注射の投与後の、または、Ｊｏ２抗体（４ｍｇ／マウス）の注入の後のマウス肝臓における、ＡＲをコードするｍＲＮＡおよびタンパク質のレベルについて評価した。図２Ａは、ＡＲをコードするｍＲＮＡのレベルが処置開始５ｈ後に著しく誘導されたことを示す。ウエスタンブロットを、それぞれ、抗体Ｊｏ２またはＣＣｌ４の投与１２および２４ｈ後に、得られた肝臓のサンプルで実施した。アフィニティー精製およびビオチン化された抗ＡＲ抗体を用いて、処置されたマウスの肝臓にのみ存在する一組のタンパク質を検出した（図２Ｂ）。約５０、４３、２８および１９ｋＤａの４バンドは、上皮細胞に記載されているＡＲの異なる形態と一致している[(22) Brown, C.L., Meise, K.S., Plowman, G .D., Coffey, R.J., Dempsey, P.J. 1998. Cell surface ectodomain cleavage of human amphiregulin precursor is sensitive to a metalloprotease inhibitor. J. Biol. Chem. 273: 17258-17268]。５０および２８ＫＤａに対応するバンドは、おそらく膜アンカー型のＡＲを表し、一方、４３および１９ＫＤａに対応するバンドは、タンパク質分解によりプロセッシングされた可溶型のＡＲであり得る（２２）。
【００７２】
ＡＲ投与による、マウスにおけるＣＣｌ４またはＦａｓ活性化により惹起される急性肝障害の抑制
ＡＲが肝障害の程度を制限できるかどうか決定するために、発明者らは、ＣＣｌ４または抗体Ｊｏ２処置による二次的な急性肝障害に罹患したマウスにおけるＡＲの投与の効果を検討した。ＣＣｌ４は、細胞、リソソームおよびミトコンドリア膜透過性を変化させるため、肝壊死およびアポトーシスを惹起する[(23) Berger, M.L., Bhatt, H., Combes, B., Estabrook, R. 1986. CCl4-induced toxicity in isolated hepatocytes: the importance of direct solvent injury. Hepatology 6: 36-45. (24) Kovalovich, K., Li, W., DeAngelis, R., Greenbaum, L.E., Ciliberto, G., and Taub, R. 2001. Interleukin-6 protects against Fas-mediated death by establishing a critical level of anti-apoptotic hepatic proteins FLIP, Bcl-2, and Bcl-xL. J. Biol. Chem. 276: 26605-26613. (25) Shi, J., Aisaki, K., Ikawa, Y., Wake, K. 1998. Evidence of hepatocyte apoptosis in rat liver after the administration of carbon tetrachloride. Am. J. Pathol. 153: 515-525. (26) Kovalovich, K., DeAngelis, R.A., Li, W., Furth, E.E., Ciliberto, G., Taub, R. 2000. Increased toxin-induced liver injury and fibrosis in interleukin-6-deficient mice. Hepatology 31: 149-159. (27) Czaja, M.J., Xu, J., Alt, E. 1995. Prevention of carbon tetrachloride-induced rat liver injury by soluble tumor necrosis factor receptor. Gastroenterology 108: 1849-1854]。ＡＳＴおよびＡＬＴの血清レベルは、ＣＣｌ４注入の２４ｈ後に、かなり増加した。しかしながら、この増加は、ＡＲで処置したマウスにおいて、明らかに減少した（図３Ａ）。これと整合して、組織学的損傷の程度は、ＡＲで処置したマウスにおいて減少した（図３Ａ）。
【００７３】
血清ＡＳＴおよびＡＬＴレベルは、Ｊｏ２注入の１２ｈ後に、かなり増加した（図３Ｂ）。ＡＲ処理は、血清トランスアミナーゼの上昇を強く抑制し、そして、組織病理学的分析は、ＡＲの投与がほぼ完全に肝障害を回避することを確認した（図３Ｂ）。アポトーシス細胞死は、Ｆａｓにより媒介される肝障害の主要な決定要素である[(5)-(7), (28) Ogasawara, J., Watanabe-Fukunaga, R., Adachi, M., Matsuzawa, A., Kasugai, T., Kitamura, Y., Itoh, N., Suda, T., Nagata, S.1993. Lethal effect of the anti-Fas antibody in mice. Nature 364: 806-809. (29) Nagata, S. 1997. Apoptosis by death factor. Cell 88: 355-365]。Ｆａｓにより媒介される肝障害に対するＡＲの肝保護効果が抗アポトーシスの活性から生じることを確認するために、発明者らは、マウス肝抽出物におけるカスパーゼ−３のタンパク質分解の活性化およびその活性を測定した。それらは、抗体Ｊｏ２で処置したマウスにおいて検出されるカスパーゼ−３活性の誘導が、ＡＲの投与により強く阻害されることを発見した（図３Ｃ）。特異的に活性カスパーゼ−３のｐ１７サブユニットを認識する抗体を用いて、カスパーゼ−３の破裂がＡＲ処置により回避されることを認めた−よって、Ｆａｓにより惹起されるアポトーシスのルートの特異的なＡＲ−媒介遮断が示唆された（図３Ｄ）。Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質は、Ｆａｓにより媒介されるアポトーシスを含む、様々な刺激により惹起されるアポトーシスを阻害する[(30) Shimizu, S., Eguchi, Y., Kosaka, H., Kamiike, W., Matsuda, H., Tsujimoto, Y. 1995. Prevention of hypoxia-induced cell death by Bcl-2 and Bcl-xL. Nature 374: 811-813. (31) Stoll, S.W., Benedict, M., Mitra, R., Hiniker, A., Elder, J.T., Nunez, G. 1998. EGF receptor signaling inhibits keratinocyte apoptosis: evidence for mediation by Bcl-xL. Oncogene 16: 1493-1499. (32) Lacronique, V., Mignon, A., Fabre, M., Viollet, B., Rouquet, N., Molina, T., Porteu, A., Henrion, A., Bouscary, D., Varlet, P., Joulin, V., Kahn, A. 1996. Bcl-2 protects from lethal hepatic apoptosis induced by an anti-Fas antibody in mice. Nat. Med. 2: 80-86]。Ｂｃｌ−ｘＬタンパク質の発現を、Ｊｏ２抗体注入の６ｈ後に、ウエスタンブロットにより評価した。Ｂｃｌ―ｘＬタンパク質レベルは、抗体Ｊｏ２単独で処置したマウスに対し、ＡＲおよび抗体Ｊｏ２で処置したマウスの肝臓において、より高かった（図３Ｄ）。
【００７４】
初代培養肝細胞におけるＡＲの直接的抗アポトーシス効果
ＡＲのインビトロ抗アポトーシス効果が肝臓実質細胞におけるＡＲの直接作用により媒介され得るかどうか決定するために、発明者らは、初代培養マウス肝細胞を使用した。
Ｊｏ−２抗体に暴露された肝細胞は、アクチノマイシンＤの存在下で効率的にアポトーシスを被ることが報告されている[(5), (6), (33) Ni, R., Tomita, Y., Matsuda, K., Ichiara, A., Ishimura, K., Ogasawara, J., Nagata, S. 1994. Fas-mediated apoptosis in primary cultured mouse hepatocytes. Exp. Cell Res. 215: 332-337]。肝細胞を、アクチノマイシンＤおよびＪｏ２抗体の添加の前に、３ｈの間、異なる濃度のＡＲによって、前処理した。アポトーシスおよび関連した分子イベントの測定を、１８ｈ後に行った。図４Ａから分かるように、肝細胞は、濃度依存的にＡＲによりアポトーシスから保護され、よって、Ｆａｓにより媒介される肝細胞アポトーシスの防止において、ＡＲの直接的な細胞保護効果が示された。ＡＲにより媒介される細胞保護活性は、また、ＴＮＦα＋ガラクトサミン、オカダ酸およびトランスフォーミング成長因子β（ＴＧＦβ）等の他の薬剤により惹起されるアポトーシスにも認められた（データ示さず）。ＡＲの抗アポトーシス効果に基づいて、発明者らは、Ｊｏ２抗体により誘導されるカスパーゼ−３のタンパク質分解および活性化がＡＲによって著しく阻害されることを見出した（図４ｂ）。同様に、発明者らは、抗アポトーシスのタンパク質Ｂｃｌ−ｘＬがＪｏ２処置マウス肝細胞において、ＡＲ処置により誘導されることを見出した（図４Ｂ）。ＡＲの抗アポトーシスのシグナリングメカニズムを同定するために、細胞生存の一般的なメディエーターであるＰＩ−３Ｋ／ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２経路を検討した[(4), (6)]。ＡＲで処理した培養マウス肝細胞は、ＡｋｔおよびＥＲＫ１／２のリン酸化の亢進を示した（図４Ｃ）。Ｆａｓにより惹起される肝障害に対する保護に関係する鍵となるシグナリング分子は、ＳＴＡＴ３である[(34) Shen, Y., Devgan, G., Darnell, J.E., Bromberg, J.F. 2001. Constitutively activated Stat3 protects fibroblasts from serum withdrawal and UV-induced apoptosis and antagonizes the proapoptotic effects of activated Stat1. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 1543-1548. (35) Haga, S., Terui, K., Zhang, H.Q., Enosawa, S., Ogawa, W., Inoue, H., Okuyama, T., Takeda, K., Akira, S., Ogino, T., et al. 2003. Stat3 protects against Fas-induced liver injury by redox-dependent and independent mechanisms. J. Clin. Invest. 112: 989-998]。ＡＲは、ＳＴＡＴ３のリン酸化を刺激すると認められた（図４Ｃ）。
【００７５】
ＡＲによるＥＧＦ−Ｒ活性化は、Ｆａｓにより惹起される細胞死に対する、この成長因子の抗アポトーシス効果を媒介する際に欠かせないようである。マウス肝細胞が、ＡＲの添加前に、ＥＧＦ−Ｒ阻害剤ＰＤ１５３０３５で１ｈの間、前処理されるときに、このことは明らかであり、そして、ＡＲにより提供される保護は失われた（図４Ｄ）。また、アポトーシスを回避するために、ＡＲが、ＥＧＦ−Ｒの下流で作動するＰＩ−３Ｋ／Ａｋｔ経路を活性化させることが必要であることも判明した。これは、ＡＲにより提供される保護に対するＰＩ−３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２の顕著な抑制効果により示された（図４Ｄ）。しかしながら、ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ９８０５９は、ＡＲの抗アポトーシス効果を妨げなかった（図４Ｄ）。
【００７６】
部分的な肝切除術後の肝臓におけるＡＲ発現
本発明の発明者らも、２／３部分の肝切除術の後、マウスおよびラット肝臓にけるＡＲ発現を検討した[(1), (4)]。図５Ａから分かるように、ＡＲｍＲＮＡはＰＨ前にはラット肝臓で検出できないが、手術後３０分でその出現が検出された−６時間後ピーク値に達し、続いて１５および２４時間の間に発現が徐々に低下した。面白いことに、虚偽の手術（ＳＨ）を受けたラットのＡＲ遺伝子の発現は、６〜１５ｈの後で、一過性に誘導された。
マウス肝臓のＡＲ遺伝子の発現は、ＰＨの後、すぐに誘導された（図５Ａ）。ＡＲをコードしているｍＲＮＡのレベルは、ＰＨの０．５ｈ後に増加するのが認められ、２４〜４８ｈでピークに達し、その後減少した（図５Ｂ）。動力学がラットにおいてより非常に速かったが、ＡＲ遺伝子の発現は虚偽の手術を受けたマウスにおいても誘導された。評価された最も短い時点（０．５ｈ）で、虚偽の手術を受けたマウスは、肝切除された動物と類似のＡＲをコードしているｍＲＮＡのレベルを示した。しかしながら、介入の１ｈ後に、ＡＲをコードしているｍＲＮＡのレベルは、切除を受けた動物と比較して虚偽の手術を受けたマウスにおいて、著しく減少し、そして、この状況は残りの研究の全体にわたって持続した（図５Ｂ）。
【００７７】
ＡＲは単離肝細胞のＤＮＡ合成の誘導を媒介した
一度、発明者らがＡＲ遺伝子の発現が肝障害およびＰＨにおいて、急速に誘導され、そして、ＡＲが肝実質に対し保護的役割をすることができることを示したので、彼らは、ＡＲがまた肝細胞に対し分裂促進的に挙動できることの証明を試みた。
【００７８】
図６Ａで分かるように、濃度依存的にＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン取り込みを刺激するので、ＡＲは単離された初代培養肝細胞のための純粋な分裂促進物質として挙動する。ＡＲのＤＮＡ合成への効果は、肝臓再生する反応の生理的終了に関係する成長因子であるＴＧＦβにより無効にされた（１）。
【００７９】
ＡＲはＥＧＦ―Ｒリガンドであり、そして、成熟した動物の肝細胞で多量に発現する受容体である[(36) Salomon, D.S., Brandt, R., Ciardiello, F., Normanno, N. 1995. Epidermal growth factor-related peptides and their receptors in human malignancies. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19: 183-232. (37) Carver, R.S., Stevenson, M.C., Scheving, L.A., and Russell, W.E. 2002 Diverse expression of ErbB receptor proteins during rat liver development and regeneration. Gastroenterology 123: 2017-2027]。  発明者らは、培養ラット肝細胞のＡＲの細胞内シグナリングを調べた。単離ラット肝細胞をＡＲで処置することにより、ＥＧＦ―Ｒの急速なおよび一過性のリン酸化を惹起された（図６Ｂ）。成長因子に対する肝細胞の分裂促進反応の主なシグナル伝達カスケードとして、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）およびホスファチジルイノシトール３―キナーゼ（ＰＩ―３Ｋ）の経路を解析した[(38) Band, C.J., Mounier, C., Posner, B. 1999. Epidermal growth factor and insulin-induced deoxyribonucleic acid synthesis in primary rat hepatocytes is phosphatidylinositol 3-kinase dependent and dissociated from protooncogene induction. Endocrinology 140: 5625-5634. (39) Coutant, A., Rescan, C., Gilot, D., Loyer, P., Guguen-Guillouzo, C., Baffet, G. 2002. PI3K-FRAP/mTOR pathway is critical for hepatocyte proliferation whereas MEK/ERK supports both proliferation and survival. Hepatology 36: 1079-1088]。さらに最近、c-JunN末端キナーゼが、ＰＨ後の肝細胞増殖に顕著に関与することが示された[(40) Schwabe, R.F., Bradham, C.A., Uehara, T., Hatano, E., Bennett, B.L., Schoonhoven, R., Brenner, D.A. 2003. c-Jun-N-Terminal kinase drives cyclin D1 expression and proliferation during liver regeneration. Hepatology 37: 824-832]。マウス肝細胞で観察されたように、単離ラット肝細胞のＡＲでの処置は、ＥＲＫ１／２およびＡｋｔのリン酸化を急速に惹起する（図６Ｃ）。さらに、発明者らは、ＡＲ処置に応答してＪＮＫリン酸化を観察した（図６Ｃ）。
【００８０】
肝細胞増殖におけるＡＲシグナリングを評価するために、発明者らは、これらのシグナリング経路の阻害剤の存在下で、ＡＲで処置したラット肝細胞におけるＤＮＡへの［３Ｈ］チミジン取り込みを測定した。図６Ｄから分かるように、ＥＧＦ―Ｒチロシンキナーゼ活性阻害剤（ＰＤ１５３０３５）は、ＡＲにより刺激されるＤＮＡ合成を完全に防止する。同程度の阻害はＰＩ―３Ｋの阻害剤（ＬＹ２９４００２）でも観察されたが、その一方で、ＭＥＫ１阻害剤、ＰＤ９８０５９およびＪＮＫ阻害剤（ＳＰ６００１２５）は７０％（図６Ｄ）ＡＲの効果を低減した。しかしながら、ｐ３８―ＭＡＰＫ阻害剤（ＳＢ２０２１９０）での処置は、ＡＲにより刺激されるＤＮＡ合成に対してたいした効果を及ぼさなかった（図６Ｄ）。
【００８１】
単離された肝細胞におけるＡＲ遺伝子発現
発明者らは、ＡＲが損傷の異なる状況および肝臓組織の再生の下で、肝臓において、発現されることを示した。ＡＲ誘導に対して責任があるメカニズムを確認するために、ラット肝臓実質細胞が単離され、そして、ＡＲ遺伝子発現は異なる状況の下で調べられた。第１に、肝臓の炎症および再生の過程に関係のある種々の因子、例えばＩＬ―１β、ＩＬ―６、ＴＮＦα、ＨＧＦおよびプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の効果を評価した[(1)-(4), (41) Rudnick, D.A., Perlmutter, D.H., and Muglia, L.J. 2001. Prostaglandins are required for CREB activation and cellular proliferation during liver regeneration. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98: 8885-8890]。評価したサイトカインおよび成長因子の中で、ＩＬ―１βが、ＡＲ遺伝子発現を刺激すると認められる唯一の分子であった（図７Ａ）。結腸癌細胞における初期の観察に基づいて[(42) Shao, J., Lee, S.B., Guo, H., Evers, M., and Sheng, H. 2003. Prostaglandin E2 stimulates the growth of colon cancer cells via induction of amphiregulin. Cancer Res. 63: 5218-5223]、ラット肝細胞のPGE2による処置が、ＡＲ遺伝子発現の素早い誘導を引き起こすことが認められた（図７Ｂ）。ＰＧＥ２媒介ＡＲ遺伝子発現刺激は、ＡＲプロモーターにおけるｃＡＭＰ応答エレメント上で作用する、ｃＡＭＰ／プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）経路により惹起されると仮定されてきた（４２）。このメカニズムに一致して、発明者らは、単離肝細胞において、ｃＡＭＰ誘導物質ホルスコリンが、ＡＲ遺伝子の発現を促進することを見出した（データ示さず）。種々の酸化ストレス惹起剤、例えば過酸化水素およびメナジオンでの肝細胞の処置は、ＡＲ遺伝子の発現に効果を及ぼさない（データを示さず）。
【００８２】
ＡＲ遺伝子の発現が、培養肝細胞で惹起されること、およびこの効果の規模が培養時間と共に増大することが見出された（図７Ｃ）。ＡＲは、ＷＴ１転写制御因子の真実のターゲットである（１０）。発明者らは、ＷＴ１の４つのアイソフォームをコードするプラスミドの等量混合物の肝細胞へのトランスフェクションが、リアルタイムＰＣＲにより決定されるＡＲをコードするｍＲＮＡのレベルを増加させることを見出した。これらのデータは、ＷＴ１が単離肝細胞においてＡＲ遺伝子発現を制御することができることを示しているが、培養肝細胞におけるＡＲの誘導はＷＴ１の誘導より先に起こり（データ示さず）、よって、以前同定された因子、ＩＬ−１βおよびＰＧＥ２が、培養肝細胞におけるＡＲ遺伝子発現の素早い最初の誘導の原因となり得ることが示される。
【００８３】
単離肝細胞における肝保護および再生メディエーターの発現のＡＲによる誘導
ＡＲの肝保護効果の基礎をなしているメカニズムをより深く検討するために、発明者らは、肝臓障害およびＰＨの内因性応答に関する鍵となる分子である[(7),(43) Bustos, M., Beraza, N., Lasarte, J-J., Baixeras, E., Alzuguren, P., Bordet, T., Prieto, J. 2003. Protection against liver damage by cardiotrophin-1: a hepatocyte survival factor up-regulated in the regenerating liver in rats. Gastroenterology 125: 192-201. (44) Webber, E.M., Fitzgerald, M.J., Brown, P.I., Bartlett, M.H., Fausto, N. 1993. Transforming growth factor-α expression during liver regeneration after partial hepatectomy and toxic injury, and potential interactions between transforming growth factor-α and hepatocyte growth factor. Hepatology 18: 1422-1431]、ＴＧＦαおよびカルジオトロフィン―１（ＣＴ―１）の発現におけるこの成長因子の効果を評価した。単離ラット肝細胞におけるＡＲ処置は、ＴＧＦαおよびＣＴ−１をコードするｍＲＮＡのレベルを増加させた（図８ＡおよびＢ）。これらの応答は、肝栄養因子としてのＡＲの関与を強調する。
【００８４】
Ｆａｓにより媒介される急性肝障害におけるＥＧＦ−Ｒリガンドの発現
ＡＲに加えて、ＥＧＦ−Ｒは、ＥＧＦおよびＴＧＦαと共にヘパリン結合ＥＧＦタイプ成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）を含むリガンドのファミリーによって活性化される[(36), (45) Holbro, T., Hynes, N.E. 2004. ErbB receptors: directing key signaling networks throughout life. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 44: 195-217]。肝臓障害に続く素早い肝保護および再生反応に対する、これらＥＧＦ−Ｒリガンドの相対的な寄与のより深い評価のために、発明者らは、ＪＯ２抗体で処置したマウスにおける遺伝子発現プロファイルを検討した。図９に示されるように、以前はＡＲをコードするｍＲＮＡの検出不可能な発現レベルを示した、対照マウスの肝臓において、ＥＧＦ、ＴＧＦαおよびＨＢ−ＥＧＦの発現がリアルタイムＰＣＲを介して検出された。ＪＯ２抗体の投与５時間後、ＥＧＦ、ＴＧＦαおよびＨＢ−ＥＧＦに対応するｍＲＮＡのレベルは減少し、ＡＲ遺伝子発現の好ましい誘導が観察された。これらの知見は、ＡＲが、急性肝障害の初期の間、マウス肝臓で惹起される、唯一の評価されたＥＧＦ−Ｒリガンドであることを、全体的に示す。
【００８５】
上記の概要として、ＡＲ遺伝子発現が、異なる肝臓障害モデルにおいて、素早くおよび一貫して誘導されること、およびＡＲの外部からの投与が、顕著な肝保護を提供することが示される。
【００８６】
上記知見は、ＡＲが複雑な肝再生の過程において、新規の活性のある関係物として認識され得ることを、明確に、且つ決定的なやり方で、全体的に示す。したがって、ＡＲは、急性肝障害により生じる病的状況−特にＡＬＦのような危機的な状況において強調される−の管理のために、非常に大きい治療能力を提供し得る。
【００８７】
発明の実施態様
本発明は、上記図と共に本発明を発展させるのに使用される実験的方法論を示す以下の実施例によって説明される。本分野の専門家は、なされ得る修飾および変化が本発明の範囲内であることを把握し得ると理解される。
【実施例】
【００８８】
実施例
患者
肝臓組織の検体は、２つのグループの被験者から得られた：（ａ）最小限の肝変性を有する対照（ｎ＝２６；１９人の男性；平均年齢５０．８歳、１８―７３歳の範囲）。組織サンプルは、消化管腫瘍手術（１６ケース）の結果として、または、肝機能検査パラメータの小さい変更のため実行された経皮的肝生検（１０ケース）から得られた；そして、（ｂ）肝硬変（ｎ＝２９；２４人の男性、平均年齢５６（範囲３６―７７年））、８つのケースではＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）感染症、１３のケースではアルコール中毒、３つのケースではＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）感染症、３つのケースでは自己免疫肝炎、１つのケースではヘモクロマトーシスおよび他のケースでは原因不明の肝炎に起因する。関連する肝細胞癌（ＨＣＣ）は、肝硬変患者１０人に存在した。この研究は、スペイン、ナバラ大学のＨｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｒｅｖｉｅｗ委員会の承認を得て、ヘルシンキのＤｅｃｌａｒａｔｉｏｎの原理に従った。
【００８９】
動物モデル
実験は、実験動物の使用に関するナバラ大学のガイドラインに従って行われた。他所に記載されているように、肝硬変を雄性ＷｉｓｔａｒラットにおいてＣＣｌ４により惹起させた[(16) Castilla-Cortazar, I., Garcia, M., Muguerza, B., Quiroga, J., Perez, R., Santidrian, S., Prieto, J. 1997. Hepatoprotective effects of insulin-like growth factor I in rats with carbon tetrachloride-induced cirrhosis. Gastroenterology 113:1682-1691]。２／３のＰＨまたは虚偽手術は、ヒギンズおよびアンデルセンの方法に従って、雄性ウィスターラット（１５０ｇ）および雄性Ｃ５７／ＢＬ６マウス（２０ｇ）において行われた[(17) Higgins, G. M., Andersen, R. M. 1931. Experimental pathology of liver: restoration of liver of the white rat following partial surgical removal. Arch. Pathol. 12:186-202. (18) Latasa, M.U., Boukaba, A., Garcia-Trevijano, E.R., Torres, L., Rodriguez, J.L., Caballeria, J., Lu, S.C., Lopez-Rodas, G., Franco, L., Mato, J.M., et al. 2001. Hepatocyte growth factor induces MAT2A expression and histone acetylation in rat hepatocytes. Role in liver regeneration. FASEB J. 10.1096/fj.00-0556fje. (19) Chen, L., Zeng, Y., Yang, H., Lee, T.D., French, S.W., Corrales, F.J., Garcia-Trevijano, E.R., Avila, M.A., Mato, J.M., and Lu, S.C. 2004. Impaired liver regeneration in mice lacking methionine adenosyltransferase 1A. FASEB J. 18: 914-916]。鎮静の後、虚偽手術動物において、肝臓を露出させ、そして腹腔内へ戻した。急性肝障害を、ＣＣｌ４（オリーブオイル中、１μｌ／体重ｇ）（Sigma, St. Louis, MO, USA）またはＪｏ２モノクローナル抗体（生理食塩水溶液中、４μg／マウス）（BD PharMingen, San Diego, CA, USA）の単回腹腔内投与により、雄性C57/BL6マウス（２０ｇ）（条件および時間によりｎ＝３−５）において惹起した[(5),(20) Martinez-Chantar, M.L., Corrales, F.J., Martinez-Cruz, A., Garcia-Trevijano, E.R., Huang, Z.Z., Chen, L.X., Kanel, G., Avila, M.A., Mato, J.M., Lu, S.C. 2002. Spontaneous oxidative stress and liver tumors in mice lacking methionine adenosyltransferase 1A. FASEB J. 10.1096/fj.02-0078fje]。対照には、等量のオリーブオイルまたは生理食塩水を与えた。上記場合において、マウスに、Ｊｏ２抗体の６および０．５ｈ前および３ｈ後、またはＣＣｌ４の０．５ｈ前および１２ｈ後に、ヒト組換ＡＲ（9.5μｇ／マウス）（Sigma）の腹腔内注射を行った。示された時間において、マウスより血液サンプリングをし、血清を、他で記載されているように、アラニンおよびアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴおよびＡＳＴ）のために分析した[(16) and (21)    Lasarte, J.J., Sarobe, P., Boya, P., Casares, N., Arribillaga, L., Lopez-Diaz of Cerio, A., Gorraiz, M., Borras-Cuesta, F., Prieto, J. 2003. A recombinant adenovirus encoding hepatitis C virus core and E1 proteins protects mice against cytokine-induced liver damage. Hepatology 37: 461-470]。マウスを頚椎脱臼により屠殺し、肝臓を液体窒素中で即座に凍結するか、またはホルマリン中で固定し、ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いる染色のために、パラフィン中で包埋された。
【００９０】
ラットおよびマウスの肝細胞の単離、培養および処置
肝細胞を、他所に記載されているように[(18), (20)]、雄性Ｗｉｓｔａｒラット（１５０ｇ）およびＣ５７／ＢＬ６マウス（２０ｇ）から、コラゲナーゼ（Gibco-BRL, Paisley, UK）を伴う潅流により単離した。細胞（５Ｘ１０５細胞／ウェル）をコラーゲンコート（タイプＩコラーゲン、Collaborative Biomedical, Bedford, MA, USA）した６穴プレート上にプレーティングした。培養を１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、非必須アミノ酸、グルタミン２ｍＭおよび抗生物質（全てGibco-BRLより供給された）を補ったＭＥＭ培地中で維持した。２ｈのインキュベーション後、培地を除去し、細胞を再び５％ＦＣＳを補った同じ培地中で培養した。該当するとき、肝細胞は、Ｒｏｃｈｅ（Mannheim, Germany）よりのＩＬ−１βまたはＴＮＦα、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（San Diego, CA, USA）よりのＨＧＦまたはホルスコリン、ＲＤ Systems（Wiesbaden-Nordenstadt, Germany）よりのＩＬ６、またはAlexis QBiogene（Carlsbad, CA, USA）よりのＰＧＥ２で処置した。
【００９１】
アポトーシスを、他所（５）に記載されているように、０．５μｇ／ｍｌのＪｏ２抗体および０．０５μｇ／ｍｌのアクチノマイシンＤを用いた処置により培養マウス肝細胞で惹起した。該当するとき、肝細胞をＪｏ２抗体およびアクチノマイシンＤの添加６時間前にＡＲで処置した。アポトーシスを、可溶性ヒストン−ＤＮＡ複合体をCell Death Detection Assay（Ｒｏｃｈｅ）を用いて測定することにより評価した。細胞死測定のためのＥＬＩＳＡ試験を製造者の指示書に従って実施した。細胞質に放出されたモノ−およびオリゴヌクレオソームの特異的な濃縮（濃縮係数、ＥＦ）を、処置細胞および対照細胞に対応するサンプルの吸光度の間の比として計算した。ＭＥＫ１阻害剤、ＰＤ９８０５９、ＰＩ―３Ｋ阻害剤、ＬＹ―２９４００２およびＥＧＦ―Ｒチロシンキナーゼ活性阻害剤ＰＤ１５３０３５−全てＣａｌｂｉｏｃｈｅｍにより供給された−の存在下、Ｆａｓにより媒介されるアポトーシスに対するＡＲの効果を、また評価した。
【００９２】
ＤＮＡ合成の評価
ＤＮＡの合成に対して、ラット肝細胞をコラーゲンコートされた９６穴プレートに、１０％ＦＣＳを補ったＭＥＭ培地中、３Ｘ１０４細胞／ウェルの密度でプレーティングした。プレーティングの５時間後、培地を交換し、細胞を血清無しで更なる２０時間維持した。ＤＮＡ合成をＡＲ処置の３０時間後に試験した。［３Ｈ］チミジンのパルスを、ＡＲの添加の２２ｈ後に、行った（１μＣｉ／ウェル）（Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA）。細胞を回収し、チミジンの取り込みをシンチレーションカウンターで測定した。ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ９８０５９、ＰＩ―３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２、ｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０２１９０、ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５およびＥＧＦ―Ｒチロシンキナーゼ活性阻害剤ＰＤ１５３０３５−全てはＣａｌｂｉｏｃｈｅｍより供給された−の存在下、ＡＲのＤＮＡ合成に対する効果を評価した。
【００９３】
ラット肝細胞の一過性トランスフェクション
初代培養ラット肝細胞を、Ｔｆｘ−５０（登録商標）reagent（Promega, Madison, WI, USA）を用い、製造者の指示書に従って、単離２４時間後にトランスフェクションした。細胞に、ＷＴ１の４つのアイソフォーム（エクソン５およびＫＴＳの存在または非存在により特徴付けられる）をコードするｐＣＢ６プラスミドの等量混合物、または、Ｊｏｃｈｅｍｓｅｎ博士（Leiden University Medical Center, Leiden, The Netherlands）の御厚意により提供していただいた挿入物の無いｐＣＢ６ベクターの等量をトランスフェクションした。ＷＴ１の４つのアイソフォームの等量混合物のトランスフェクション効率は、アイソフォームを区別する特異的プライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ解析によってモニターされた。
【００９４】
ＲＮＡ単離および遺伝子解析
全ＲＮＡをＴＲＩ試薬（Sigma）を用いて抽出した。２μｇのＲＮＡを、Ｍ−ＭＬＶ酵素をＲＮａｓｅ ＯＵＴ（Gibco-BRL）の存在下で用い（Gibco-BRL）る逆転写の前に、ＤＮａｓｅＩ（Gibco-BRL）で処理した。ＰＣＲ産物を２％アガロースゲル電気泳動にかけ、続いてエチジウムブロマイドで染色し、Molecular Analyst software（Bio-Rad, Hercules, CA, USA）を用いて定量化した。データをβ−アクチン遺伝子発現レベルに関して標準化した。研究はβ−アクチンの増幅と比較され得るｍＲＮＡ増幅を伴うそれらサンプルを含むのみであった。全てのプライマーをゲノムＤＮＡとｃＤＮＡの増幅を区別するように設計し、全ての産物を配列決定して特異的に確認した。使用したプライマーを下記表Ｉに記載する：
【表１】
2008506754.tif 000003
リアルタイムＰＣＲをiCycler（BioRad）およびiQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）を用いて実施した。最終ＰＣＲ産物の特異性をモニターするために、後者を融合曲線および電気泳動により分析した。それぞれの転写産物の量を、参照遺伝子（β−アクチン）の発現に対するｎ−倍相違として表した（２ΔＣｔ、ここで、ΔＣｔは、標的遺伝子および対照遺伝子の間の閾値サイクルの相違を表す）。
【００９５】
カスパーゼ―３活性の測定
マウス肝細胞および肝臓組織溶解物のカスパーゼ―３活性を、Ｃａｓｐａｓｅ―３／ＣＰＰ３２比色アッセイキット（BioVision, Palo Alto, CA, USA）を使用して測定した。培養細胞（５Ｘ１０５／条件）を対応する処置の後、キットで提供される溶解バッファーで直接溶解した。肝組織を溶解バッファー中でダウンスホモジナイザー（Dounce homogenizer）を用いてホモジナイズし、１５０００回転、１０分間遠心分離した。肝臓ホモジネート由来の細胞溶解物および上清を、製造者指示書に従ったカスパーゼ−３活性測定のために使用した（５０μｌ中の２００μｇ）。
【００９６】
ウェスタンブロット
肝臓サンプルおよび単離肝細胞からのホモジネートを他所で記載されている[(19, (20)]ようにウェスタンブロット分析した。使用した抗体は：アフィニティー精製されたマウスＡＲに特異的に標的化されたビオチン化ポリクローナル抗体（ＢＡＦ９８９）（RD Systems）；活性化カスパーゼ−３のｐ１７サブユニットに対する特異的抗体（９６６４Ｓ）、リン酸化Ａｋｔ（Ｓｅｒ４７３）（９２７１Ｓ）およびリン酸化ＳＴＡＴ３（Ｔｙｒ７０５）（９１３１Ｓ）（Cell Signaling, Beverly, MA, USA）；ＥＲＫ１／２（０６−１８２）、リン酸化ＥＧＦ−Ｒ（Ｔｙｒ１１７３）（０５−４８３）およびＳＴＡＴ３（０６−５９６）（Upstate Biotechnology, Charlottesville, VA, USA）。全ての他の抗体は、Santa Cruz Biotechnology （Santa Cruz, CA, USA）から：ＢｃｌｘＬ（ｓｃ８３９２）、Ｂｃｌ２（ｓｃ７３８２）、ＥＧＦ―Ｒ（ｓｃ―０３）、リン酸化ＥＲＫ１／２（Ｔｙｒ２０４）（ｓｃ７３８３）、Ａｋｔ（ｓｃ５２９８）、ＪＮＫ（ｓｃ５７１）およびリン酸化ＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）（ｓｃ６２５４）。
【００９７】
統計解析
正規分布を示すデータは、独立したStudent t-試験および分散分析（ＡＮＯＶＡ）を用いて群間比較した。正規分布を示さないデータは、Kruskal-WallisおよびMann-Whitney試験を用いて比較した。相関関係を、SpearmanまたはPearson相関係数により評価した。Ｐ＜０．０５の値を有意とした。データを平均±ＳＥＭ、またはメジアンおよび四分位範囲として表す。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１Ａ】対照（n=26）および肝硬変患者（チャイルドピュー  Ａ  肝硬変、n=7、チャイルドピュー  Ｂ＋Ｃ  肝硬変、n=22）由来の肝臓サンプルにおけるリアルタイムポリメラーゼチェインリアクション（ＲＴ−ＰＣＲ）により測定された、ヒトおよび実験的肝硬変におけるＡＲ遺伝子の発現。
【図１Ｂ】ＲＴ―ＰＣＲによって測定された対照ラット肝臓およびＣＣｌ４により誘導される肝硬変肝臓におけるＡＲ遺伝子の発現（１群あたりｎ＝６）。
【図２Ａ】対照マウスの肝臓およびＪｏ２抗体またはＣＣｌ４による急性肝障害の惹起後の肝臓におけるＡＲの発現。ＡＲの発現は、前述の処置の投与５ｈ後に、ＲＴ―ＰＣＲにより評価された。
【図２Ｂ】Ｊｏ２抗体またはＣＣｌ４により惹起された急性肝障害におけるＡＲの発現およびウェスタンブロッティングによる評価。それぞれ、肝臓組織のサンプルは、Ｊｏ２およびＣＣｌ４の処置の１２および２４ｈ後、得られた。分析は、アフィニティー精製およびビオチン化された抗ＡＲ抗体により行われた.矢印（arrow tip）は異なる形態のＡＲを示し、そして、グループにつき３つの代表的なサンプルが示されている。ローディングコントロールとして、アクチンに特異的な抗体によって、膜をハイブリダイズした。代表的なイメージを示す。
【図３Ａ】ＡＲによる処置はＣＣｌ４により惹起された急性肝障害を予防する。ＣＣｌ４で処置されたマウスの血清トランスアミナーゼ・レベルに加えて、肝臓組織学を示す（Ｈ＆Ｅ染色、原物の拡大Ｘ２００）。血清および肝臓組織サンプルは、ＣＣｌ４投与の２４ｈ後に集められた。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。
【図３Ｂ】Ｊｏ２で処置されたマウスの肝臓組織学および血清トランスアミナーゼ（Ｈ＆Ｅ染色、原物の拡大Ｘ２００）に対するＡＲ治療の効果。血清および肝臓組織のサンプルは、Ｊｏ２投与の１２ｈ後に得られた。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。アスタリスクは、対Ｊｏ２単独、Ｐ＜０．０１を示す。
【図３Ｃ】Ｊｏ２注入の１２ｈ後に測定されたマウス肝臓のカスパーゼ―３活性におけるＡＲ治療の効果。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。アスタリスクは、Ｐ＜０．０１対Ｊｏ２単独、を示す。
【図３Ｄ】対照マウスの肝臓―Ｃ―およびＪｏ２注入の１２ｈ後に得られた肝臓抽出物における、活性カスパーゼ―３のｐ１７サブユニットおよびＢｃｌ―ｘＬタンパク質のレベルに対するＡＲ治療の効果。ローディングコントロールとして、アクチンに特異的な抗体によって、膜をハイブリダイズした。代表的なイメージを示す。
【図４Ａ】マウス肝細胞初代培養におけるＡＲの抗アポトーシス効果。アポトーシスは、ＡＲの濃度増加の存在下、アクチノマイシンＤおよびＪｏ２で処理することにより惹起された。アポトーシスは、細胞質でのモノ−およびオリゴヌクレオソーム放出の特異的な濃縮を測定することにより評価された（濃縮係数：EF)。値は、対照肝細胞−Ｃ−で得られた値に関して標準化された。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表され、アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対Ｊｏ２、を示す。
【図４Ｂ】左パネル：アクチノマイシンＤおよびＪｏ２で処理された培養マウス肝細胞のカスパーゼ―３活性に対するＡＲ（２０ｎＭ）の効果。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表され、アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対アクチノマイシンＤおよびＪｏ２で処理された細胞、を示す。右パネル：左パネルに記載されている同じサンプルの活性カスパーゼ―３のｐ１７サブユニットおよびＢｃｌ―ｘＬタンパク質のウエスタンブロット分析。
【図４Ｃ】培養マウス肝細胞におけるＡＲによる反アポトーシスシグナリング経路の活性化。Ａｋｔ、ＥＲＫ１／２およびＳＴＡＴ３リン酸化状態は、ＡＲ（２０ｎＭ）の添加の後、異なる時間でマウス肝細胞の抽出物のウエスタンブロッティングを介して評価された。代表的な画像は、デュプリケートで行われた３つの実験の中で示される。
【図４Ｄ】ＥＧＦ―Ｒ阻害剤剤ＰＤ１５３０３５（１μＭ）、ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ９８０５９（１０μＭ）またはＰＩ−３Ｋの阻害剤ＬＹ−２９４００２（２０μＭ）の存在下で培養されたマウス肝細胞における、アクチノマイシンＤおよびＪｏ―２により惹起されるアポトーシスに対するＡＲ（２０ｎＭ）の効果。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表され、アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対Ｊｏ２、を示す。
【図５】部分的な肝切除術（ＰＨ）後の、ラット肝臓（図５Ａ）およびマウス肝臓（図５Ｂ）におけるＡＲ遺伝子発現。ＡＲコードするｍＲＮＡのレベルは、ＰＨの後異なる時間で、残った肝実質において、リアルタイムＰＣＲにより分析された。値は、３匹の異なる動物の平均±ＳＥＭとして表される。中塗り円（closed circle）は肝切除された動物に対応し、中抜き円（open circle）は虚偽の手術を受けた動物に対応する。
【図６Ａ】培養ラット肝細胞におけるＡＲによるＤＮＡ合成の刺激。肝細胞を濃度を増加させたＡＲで処理し、ＤＮＡ合成を［３Ｈ］チミジンの取り込みを測定することにより評価した。ＡＲにより誘導されるＤＮＡ合成におけるＴＧＦβ（８ｎｇ／ｍｌ）の効果を示す。値は、クワドルプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。１つのアスタリスクはＰ＜０．０５を示し、２つのアスタリスクはＰ＜０．０１対対照を示す。
【図６Ｂ】培養ラット肝細胞におけるＡＲによるＥＧＦ―Ｒのチロシン残基リン酸化の刺激。チロシンをリン酸化されたＥＧＦ―Ｒおよび全体のＥＧＦ―Ｒはウエスタンブロッティングにより検出された。代表的な画像は、デュプリケートで実施された３つの実験の中で示される。
【図６Ｃ】培養ラット肝細胞における、ＡＲによる細胞増殖に関するシグナリング経路の活性化。Ａｋｔ、ＥＲＫ１／２およびＪＮＫのリン酸化状態は、ＡＲの添加後、異なる時間で、ラット肝細胞抽出物の特異的抗体を使用するウエスタンブロッティングによって評価された。代表的な画像は、デュプリケートで実施された３つの実験の中で示される。
【図６Ｄ】ＥＧＦ―Ｒ阻害剤ＰＤ１５３０３５（１μＭ）、ＭＥＫ１阻害剤ＰＤ９８０５９（１０μＭ）、ＰＩ−３Ｋ阻害剤ＬＹ２９４００２（２０μＭ）、ＪＮＫ阻害剤ＳＰ６００１２５（２０μＭ）またはｐ３８  ＭＡＰＫ阻害剤ＳＢ２０２１９０（２５μＭ）の存在下のラット肝細胞におけるＤＮＡ合成に対するＡＲ（１００ｎＭ）の効果。アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対ＡＲ単独を示す。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。
【図７】図７Ａ：異なる期間でＩＬ―１β（２ｎｇ／ｍｌ）で処理された培養ラット肝細胞におけるＡＲ遺伝子発現（クローズド・バー）。ＡＲの遺伝子発現は、リアルタイムＰＣＲで測定された。アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対対照（オープン・バー）を示す。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。    図７Ｂ：異なる期間でＰＧＥ２（１０μＭ）（クローズド・バー）で処理されたラット肝細胞におけるＡＲ遺伝子発現。ＡＲの遺伝子発現は、リアルタイムのＰＣＲで測定された。アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対対照（オープン・バー）を示す。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。    図７Ｃ：培養期間に依存したラット肝細胞におけるＡＲのベースライン遺伝子発現のＲＴ−ＰＣＲによる解析。代表的な実験を示す。    図７Ｄ：ＷＴ１の４つのアイソフォームをコードするｐＣＢ６プラスミドの等モル混合物、または等量の該アイソフォームをコードしない（gutless）ｐＣＢ６ベクターでトランスフェクションした２４ｈ後の培養ラット肝細胞におけるＡＲ遺伝子発現。ＡＲ遺伝子発現は、リアルタイムＰＣＲで測定された。
【図８】異なる期間でＡＲ処理した培養ラット肝細胞におけるTGFα（図８Ａ）およびＣＴ−１（図８Ｂ）遺伝子発現。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表され、各時点に対応する数−倍増加対対照として表される。アスタリスクは、Ｐ＜０．０５対対照を示す。
【図９】対照マウス−Ｃ−の肝臓、およびＪｏ２抗体で処置されたマウスの肝臓における、ＥＧＦ−Ｒ、ＡＲ、ＴＧＦα、ＥＧＦおよびＨＢ−ＥＧＦリガンドの遺伝子発現。これらの遺伝子の発現は、ＲＴ―ＰＣＲで測定された。アスタリスクは、Ｐ＜０．０１対対照を示す。値は、トリプリケートで実施された３つの実験の平均±ＳＥＭとして表される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
2008506754.tif 000007
【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
2008506754.tif 000009
【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
2008506754.tif 000012
【図４Ａ】
2008506754.tif 000013
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2008506754.tif 000016
【図５】
2008506754.tif 000017
【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
2008506754.tif 000019
【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図７】
2008506754.tif 000022
【図８】
2008506754.tif 000023
【図９】
2008506754.tif 000024
【配列表】
2008506754000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年3月26日(2007.3.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2008506754.tif 000029
2008506754.tif 000030
2008506754.tif 000031
2008506754.tif 000032
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