(57)【要約】本発明は治療標的としてＭｙＤ８８を使用して抗癌剤を同定するための方法に関する。本発明の方法は、抗癌剤を同定するための方法であって、ａ）ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントを発現する細胞と試験サンプルとを接触させる工程；およびｂ）該細胞中でのＭｙＤ８８発現レベルを測定する工程を包含し、これにより、コントロール細胞と比較した場合に、該試験サンプルがＭｙＤ８８発現の減少を引き起こすならば、該試験サンプルが抗癌剤を含むと同定される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤を同定するための方法であって、以下：
ａ）ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントを発現する細胞と試験サンプルとを接触させる工程；および
ｂ）該細胞中でのＭｙＤ８８発現レベルを測定する工程
を包含し、これにより、コントロール細胞と比較した場合に、該試験サンプルがＭｙＤ８８発現の減少を引き起こすならば、該試験サンプルが抗癌剤を含むと同定される、方法。
【請求項２】
前記接触させる工程が、前記サンプルを前記細胞に導入することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
抗癌剤を同定するための方法であって、以下：
ａ）ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントをコードしている核酸を含んでいるベクターを有する細胞と試験サンプルとを接触させる工程；および
ｂ）該細胞中でのＭｙＤ８８発現レベルを測定する工程
を包含し、これにより、コントロール細胞と比較した場合に、該試験サンプルがＭｙＤ８８発現の減少を引き起こすならば、該試験サンプルが抗癌剤を含むと同定される、方法。
【請求項４】
前記接触させる工程が、前記サンプルを前記細胞に導入することを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
抗癌剤を同定するための方法であって、以下：
ａ）レポーター遺伝子に作動可能に連結された、ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントをコードしている核酸を含んでいるベクターを有する細胞と試験サンプルとを接触させる工程；および
ｂ）該細胞中でのＭｙＤ８８発現レベルを測定する工程
を包含し、これにより、コントロール細胞と比較した場合に、該試験サンプルがＭｙＤ８８発現の減少を引き起こすならば、該試験サンプルが抗癌剤を含むと同定される
する、方法。
【請求項６】
前記接触させる工程が、前記サンプルを前記細胞に導入することを含む、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の援用）
適用なし。
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、治療標的としてＭｙＤ８８を使用して抗癌剤を同定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
（背景）
癌は、世界中の主要な死因のうちの１つである。従って、我々がこの致命的な疾患を処置するための新しい方法を開発することは、極めて重要である。多くの現在の癌治療は、急速に分裂する細胞に影響を及ぼす。これらの治療は全ての急速に分裂する細胞（例えば、癌細胞だけでなく、胃腸管および毛嚢の細胞）に影響を及ぼすので、これらの治療はひどい副作用を有する。従って、このようなひどい副作用がない、新しい処置方法が必要とされる。本出願は、癌の処置における治療標的として、ＭｙＤ８８を同定する。
【０００４】
哺乳動物ＭｙＤ８８は、インターロイキン１（ＩＬ−１）レセプターおよびＴｏｌｌ様レセプター（ＴＬＲ）により媒介されるシグナル伝達経路のアダプタータンパク質である。ＴＬＲおよびＩＬ−１ファミリーのレセプターは、タンパク質ＭｙＤ８８と相互作用する。具体的には、ＭｙＤ８８のカルボキシ末端Ｔｏｌｌ／ＩＬ−１レセプター（ＴＩＲ）ドメインは、ＴＬＲの細胞質内尾部中の同族ドメインと相互作用する。次いで、ＭｙＤ８８は、ＩＲＡＫ（ＩＬ−１レセプター関連キナーゼ）ファミリーのＰｅｌｌｅ関連キナーゼと相互作用する。具体的には、ＭｙＤ８８のアミノ末端死ドメインは、ＩＲＡＫの対応するドメインとの相互作用を媒介する。これらの相互作用の結果はＲｅＩ転写因子ＮＦ−κＢの活性化である。これは、炎症応答遺伝子の活性化をもたらす。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の要旨）
本発明の実施形態は、抗癌剤を同定するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントを発現する細胞と試験サンプルとを接触させる工程；およびｂ）該細胞中でのＭｙＤ８８発現レベルを測定する工程を包含し、これにより、コントロール細胞と比較した場合に、該試験サンプルがＭｙＤ８８発現の減少を引き起こすならば、該試験サンプルが抗癌剤を含むと同定される。この接触させる工程は、サンプルを細胞に導入することを含み得る。
【０００６】
本発明の代替的実施形態は、抗癌剤を同定するための方法を提供し、この方法は、ａ）ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントをコードしている核酸を含んでいるベクターを有する細胞と試験サンプルとを接触させる工程；およびｂ）該細胞中でのＭｙＤ８８発現レベルを測定する工程を包含し、これにより、コントロール細胞と比較した場合に、該試験サンプルがＭｙＤ８８発現の減少を引き起こすならば、該試験サンプルが抗癌剤を含むと同定される。この接触させる工程は、サンプルを細胞に導入することを含み得る。
【０００７】
本発明の別の実施形態は、抗癌剤を同定するための方法を提供し、この方法は、ａ）レポーター遺伝子に作動可能に連結された、ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントをコードしている核酸を含んでいるベクターを有する細胞と試験サンプルとを接触させる工程；およびｂ）該細胞中でのＭｙＤ８８発現レベルを測定する工程を包含し、これにより、コントロール細胞と比較した場合に、該試験サンプルがＭｙＤ８８発現の減少を引き起こすならば、該試験サンプルが抗癌剤を含むと同定される。この接触させる工程は、サンプルを細胞に導入することを含み得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
（発明の詳細な説明）
本明細書において引用される全ての刊行物は、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【０００９】
（定義）
用語「薬剤」は、任意の分子または化合物（例えば、低分子（有機分子）、抗体または抗体フラグメント、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、ポリペプチド、ＤＮＡおよびＲＮＡ）を意味する。
【００１０】
用語「抗体」は免疫グロブリンを意味する（すなわち、Ｆｃフラグメントに連結された２つのＦａｂフラグメントを含む）。用語「抗体」は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、霊長類化された（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）抗体、ヒト化抗体およびヒト抗体を包含する。用語「抗体」は、免疫グロブリンの５つの主要クラス（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ）およびさらには免疫グロブリンサブクラス（アイソタイプ）（すなわち、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡおよびＩｇＡ２）のうちのいずれか一つを含む。
【００１１】
用語「抗体フラグメント」は、任意のフラグメントまたは免疫グロブリンのフラグメントの組合せ（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖフラグメント）を意味する。
【００１２】
用語「生物学的に活性なフラグメント」は、タンパク質全体の完全または部分的な生物学的活性を有するタンパク質のフラグメントを意味する。
【００１３】
用語「癌」は、無秩序な細胞増殖によって代表的に特徴づけられる生理的状態を記載する。癌の例としては、癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病が挙げられるが、これらに限定されない。より特定の例としては、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸の癌、膵臓癌、グリア芽細胞腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、唾液腺癌、腎臓癌、前立腺癌、外陰癌、甲状腺癌、肝癌および様々な形の頭頚部癌が挙げられる。
【００１４】
用語「化学療法化合物」は、癌の処置に役立つ化合物を意味する。
【００１５】
用語「コントロール細胞」は、ＭｙＤ８８を発現するが、試験サンプルと接触しなかった細胞を意味する。
【００１６】
用語「処置」は、疾患または障害の一つ以上の症状の緩和、疾患または障害の後退および疾患または障害の進行の緩徐化または停止を含むがこれらに限定されない、任意の臨床的に望ましいかまたは有益な効果をもたらす、疾患または障害についての、治療的であるか、予防であるか、または抑制性である措置を意味する。
【００１７】
用語「ｓｉＲＮＡ」は、短い干渉するＲＮＡを意味する。
【００１８】
用語「発現する」、「発現す」、「発現」および「発現している」は全て、ポリペプチドを生じる、核酸の転写および翻訳を意味する。細胞において、これは、ポリペプチドが分泌されるか、細胞質に残るか、または少なくとも部分的に細胞膜に存在することを意味する。
【００１９】
用語「リガンド」は、別の分子と特異的に結合し得る任意の分子を意味する。「リガンド」は、例えば、低分子（有機分子）、抗体または抗体フラグメント、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ポリペプチド、ＤＮＡおよびＲＮＡであり得る。
【００２０】
用語「患者」は、ヒトおよび非ヒト動物の両方を意味する。
【００２１】
用語「試験サンプル」は、ＭｙＤ８８の発現レベルを低下させるその能力を試験される薬剤を含むサンプルを意味する。
【００２２】
用語「治療上有効量」は、医学的状態、疾患または障害を特徴づけるパラメータの一つ以上を改善する薬剤の量を意味する。
【００２３】
用語「有効量」および「有効な量」は、特定の効果（例えば、抗癌効果）を引き起こす薬学的組成物（例えば、薬剤）量を意味する。
【００２４】
（ＭｙＤ８８の特徴付け）
ヒトＭｙＤ８８遺伝子の完全なオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベース登録番号ＢＣ０１３５８９において見出され得る。さらに、ヒトＭｙＤ８８のアミノ酸配列は、登録番号ＡＡＨ１３５８９としてＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースで見出され得る。
【００２５】
当業者は、従来技術において、ＭｙＤ８８の核酸およびアミノ酸配列が与えられれば、標準的な分子生物学の技術を使用して、いかなるＭｙＤ８８タンパク質またはそのフラグメントも、そのタンパク質またはフラグメントに対する抗体も、核酸またはそのフラグメントも、核酸プローブ、アンチセンス、ｓｉＲＮＡなども、生成し得る。次いで、これらの分子は、ＭｙＤ８８またはそのフラグメントをコードする核酸を含んでいるベクターを有する細胞を提供するために使用され得る。
【００２６】
本発明は、ＤＭＢＡ／ＴＰＡ二段階ｒａｓ依存性皮膚発癌プロトコルに供した場合に、ほぼどのＭｙＤ８８−／−マウスも腫瘍を発達させないという知見に部分的に基づく。
【００２７】
（ＭｙＤ８８を発現する細胞と試験サンプルとを接触させること）
本発明の方法の工程は、ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントを発現する細胞と試験サンプルとを接触させる工程を含む。接触させる工程は、サンプルと細胞とが互いに接触し得るように、物理的に近接したところに試験サンプルと細胞とを近づけることを含む。接触させる工程によりサンプルが細胞に入り得、その結果、ＭｙＤ８８の発現レベルに対するサンプルの効果が決定され得る。あるいは、サンプルは、細胞に直接導入され得る。例えば、サンプルは、エレクトロポレーション、注入、形質導入またはトランスフェクションによって細胞に導入され得る。
【００２８】
（ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントを発現する細胞）
本発明の方法の工程は、ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントを発現する細胞を含む。細胞は、ＭｙＤ８８を発現するいかなる種類の細胞でもあってもよいが、好ましくは哺乳動物細胞である。細胞は、天然に存在する細胞あってもよく、または細胞株由来の細胞であってもよい。さらに、細胞は、ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントをコードしている核酸を含んでいるベクターを含んで発現し得る。あるいは、細胞は、レポーター遺伝子に作動可能に連結された、ＭｙＤ８８またはその生物学的に活性なフラグメントをコードしている核酸を含んでいるベクターを含んで発現し得る。
【００２９】
（ポリペプチド）
本明細書中で使用される場合、用語「ポリペプチド」または「ペプチド」は、完全タンパク質中の残基の総数までおよび残基の総数を含め、少なくとも８、好ましくは少なくとも１２、より好ましくは少なくとも２０、そして最も好ましくは少なくとも３０以上連続したアミノ酸残基を含め、（例えば、ＭｙＤ８８の）フラグメントまたはセグメントを意味する。ポリペプチドは、タンパク質の完全配列の任意の一部を含み得る。従って、ポリペプチドが、完全なタンパク質のタンパク質分解性切断によって、化学合成によって、または、組換えＤＮＡ技術を適用することによって生成され得る。さらに、用語「ポリペプチド」はまた、タンパク質の付加物、置換物、欠失物および改変体を包含する。ポリペプチドは、単独であろうと、またはより免疫原性になるようにキャリア分子に架橋させようともしくは結合されようと、抗体の産生を惹起するための抗原として有用である。抗体は、例えば、完全なタンパク質のイムノアッセイにおいて、イムノアフィニティー精製などのために用いられ得る。
【００３０】
（核酸および発現ベクター）
本明細書中で使用される場合、用語「単離された核酸」は、細胞において、または、組換えＤＮＡ発現系において、通常見出される他の成分から実質的に分離されている、核酸（例えば、ＲＮＡもしくはＤＮＡ分子または混合ポリマー）を意味する。これらの成分としては、リボソーム、ポリメラーゼ、血清成分および隣接ゲノム配列が挙げられるが、これらに限定されない。従って、この用語は、その天然で存在する環境から取り出された核酸を包含し、そして組換えの、またはクローン化されたＤＮＡ単離株、および化学的に合成されたアナログまたは異種系によって生物学的に合成されたアナログが挙げられる。実質的に純粋な分子は、単離された形態の分子を包含する。
【００３１】
単離された核酸は、一般に、分子の均一な組成物であるが、いくつかの実施形態において、軽微な不均一性を含み得る。このような不均一性は、核酸コード配列の末端の、または、所望の生物学的機能もしくは活性にそれほど重大でない領域で、代表的に見出される。
【００３２】
「組換え核酸」は、その製造方法または構造のいずれかによって定義される。いくつかの組換え核酸は、操作または選択において人間の介入を含む、組換えＤＮＡ技術を用いて作製される。他は、天然では互いに隣接しない２つのフラグメントを融合させることによって作製される。任意の合成オリゴヌクレオチドプロセスを使用して誘導される配列を含んでいる核酸と同様に、操作されたベクターが包含される。
【００３３】
例えば、核酸配列認識部位を導入するまたは除去すると同時に、野生型コドンは同じアミノ酸残基または保存的置換をコードしている冗長なコドンによって置き換えられ得る。同様に、所望の機能をコードしている核酸セグメントは融合されて、天然では一緒に見出されない機能の所望の組合せをコードしている単一の遺伝子実体を生成し得る。制限酵素認識部位がしばしばこのような人工の操作の標的であるにもかかわらず、他の部位特異的標的、例えば、プロモーター、ＤＮＡ複製部位、制御配列、調節配列または他の有用な特徴は、設計により組み込まれ得る。上記の通りの検出または精製のためのエピトープタグをコードしている配列もまた、組み込まれ得る。
【００３４】
核酸「フラグメント」は、少なくとも１７、一般に少なくとも２５、好ましくは少なくとも３５、より好ましくは少なくとも４５、そして最も好ましくは少なくとも５５以上隣接したヌクレオチドを含んでいるヌクレオチド配列として本明細書において定義される。
【００３５】
本発明はさらに、本明細書に記載される配列と同一であるかまたは高度に相同である配列を有する組換えＤＮＡ分子およびフラグメントを包含する。本発明の核酸は、転写、翻訳およびＤＮＡ複製を調節するＤＮＡセグメントに作動可能に連結され得る。
【００３６】
タンパク質（例えば、ＭｙＤ８８）をコードしている核酸またはそのフラグメントは、標準法により調製され得る。例えば、ＤＮＡは、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら［Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：３１８５（１９８１）］のホスホルアミダイト固体支持法、Ｙｏｏら［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．７６４：１７０７８（１９８９）］の方法または他の周知の方法を使用して、化学的に合成され得る。これは、合成オリゴヌクレオチドの対を含んでいる一連のオリゴヌクレオチドカセットを順次連結することによって行われ得る。
【００３７】
もちろん、遺伝暗号の縮重に起因して、多くの異なるヌクレオチド配列は、ＭｙＤ８８をコードし得る。コドンは、原核生物系または真核生物系での最適発現のために選択され得る。このような縮重改変体は、本発明での使用にもちろん含まれる。
【００３８】
さらに、ＭｙＤ８８をコードしている核酸は、ヌクレオチド置換、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド挿入およびヌクレオチドストレッチの逆転によって、容易に改変され得る。このような改変は、野生型タンパク質と共通の免疫原活性または抗原活性を有する抗原をコードする新しいＤＮＡ配列をもたらす。これらの改変配列は、野生型もしくは変異体タンパク質を生成するか、または組換えＤＮＡ系における発現を強化するために使用され得る。
【００３９】
ＤＮＡおよびベクターの両方の末端が適合性の制限部位を含む場合、ベクターにＭｙＤ８８をコードしているＤＮＡの挿入は容易に達成される。これができない場合、制限エンドヌクレアーゼ切断によって生成される一本鎖ＤＮＡ突出を消化することによってＤＮＡおよび／もしくはベクターの末端を改変して平滑末端を生じるか、または適切なＤＮＡポリメラーゼを用いて一本鎖末端をフィルインすることによって同じ結果を達成することが必要であり得る。
【００４０】
あるいは、所望の部位が、例えば、末端へヌクレオチド配列（リンカー）を連結することによって生成され得る。このようなリンカーは、所望の制限部位を規定する特定のオリゴヌクレオチド配列を含み得る。制限部位はまた、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて生成され得る。例えば、Ｓａｉｋｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：４８７（１９８８）を参照のこと。切断されたベクターおよびＤＮＡフラグメントはまた、必要であれば、ホモポリマーテーリングにより改変され得る。
【００４１】
本発明において使用される組換え発現ベクターは、適合性宿主細胞における核酸の発現を制御し得る適切な遺伝子調節エレメントに作動可能に連結された、ＭｙＤ８８またはそのフラグメントをコードしている核酸を含んでいる代表的には自己複製するＤＮＡまたはＲＮＡの構造物である。遺伝子調節エレメントは、原核生物プロモーター系または真核生物プロモーター発現調節系を含み得、そして代表的には、転写プロモーター、転写の開始を制御する必要に応じたオペレーター、メッセンジャーＲＮＡ発現のレベルを上昇させる転写エンハンサー、適切なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を終了する配列を含む。発現ベクターはまた、ベクターが宿主細胞中で独立して複製するのを可能にする複製起点を含み得る。
【００４２】
本発明において使用され得るベクターとしては、微生物プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡフラグメントおよび宿主ゲノムへの核酸の組み込みを促進し得る他のビヒクルが挙げられる。プラスミドは、最も一般的に用いられる形態のベクターであるが、均等な機能を果たしかつ当該分野で公知の、または公知になる他の全ての形態のベクターは、本明細書での使用に適している。例えば、Ｐｏｕｗｅｌｓら，Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８５および補遺，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．，およびＲｏｄｒｉｇｕｅｚら（編），Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡを参照のこと。
【００４３】
ＭｙＤ８８をコードしている核酸の発現は、原核生物細胞または真核生物細胞において従来法により実施され得る。Ｅ．ｃｏｌｉ株が原核生物系で最も頻繁に使用されるが、多くの他の細菌（例えば、ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓおよびＢａｃｉｌｌｕｓのさまざまな株は当該分野で公知であり、同様に使用され得る。
【００４４】
代表的に使用される原核生物の発現調節配列としては、以下を含め、プロモーターが挙げられる：それらは由来したβ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系［Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ，１９８：１０５６（１９７７）］、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系［Ｇｏｅｄｄｅｌら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．８：４０５７  （１９８０）］、λＰＬプロモーター系［Ｓｈｉｍａｔａｋｅら，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：１２８  （１９８１）］およびｔａｃプロモーター［Ｄｅ  Ｂｏｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２９２：１２８  （１９８３）］。このような調節配列を含んでいる多数の発現ベクターは、当該分野で公知であり、市販される。
【００４５】
ＭｙＤ８８またはそのフラグメントをコードしている核酸を発現するための適切な宿主細胞として、原核生物および高等真核生物が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性生物体およびグラム陽性生物体の両方、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉおよびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓが挙げられる。高等真核生物としては、非哺乳動物起源（例えば、昆虫細胞およびトリ）および哺乳動物起源（例えば、ヒト、霊長類および齧歯動物）の両方の動物細胞から樹立された組織培養細胞株が挙げられる。
【００４６】
原核生物の宿主−ベクター系としては、多くの異なる種のための多種多様なベクターガ挙げられる。本明細書中で使用される場合、Ｅ．ｃｏｌｉおよびそのベクターは、他の原核生物において使用される等価なベクターを含むように一般的に用いられる。ＤＮＡを増幅するための代表的なベクターは、ｐＢＲ３２２またはその多数の誘導体である。ＭｙＤ８８を発現するために使用され得るベクターとしては、ｌａｃプロモーターを含んでいるもの（ｐＵＣシリーズ）；ｔｒｐプロモーターを含んでいるもの（ｐＢＲ３２２−ｔｒｐ）；ｌｐｐプロモーターを含んでいるもの（ｐＩＮシリーズ）；λ−ｐＰもしくはｐＲプロモーターを含んでいるもの（ｐＯＴＳ）；またはハイブリドプロモーターを含んでいるもの（例えば、ｐｔａｃ（ｐＤＲ５４０））が挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｒｏｓｉｕｓら（「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  Ｌａｍｂｄａ−，ｔｒｐ−，ｌａｃ−，ａｎｄ  Ｉｐｐ−ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ」，ＲｏｄｒｉｇｕｅｚおよびＤｅｎｈａｒｄｔ（編）Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｕｓｅｓ，１９８８，Ｂｕｔｔｅｒｓｗｏｒｔｈ，Ｂｏｓｔｏｎ，ｐｐ．２０５−２３６．）を参照のこと。
【００４７】
高等真核生物組織培養細胞は、ＭｙＤ８８またはそのフラグメントの組換え産生のための好適な宿主である。昆虫バキュロウイルス発現系を含め、任意の高等真核生物組織培養細胞株が使用され得るが、哺乳動物細胞が好ましい。このような細胞の形質転換またはトランスフェクションおよび増殖は、慣用手順になった。有用な細胞株の例としては、ＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、乳児ラット腎臓（ＢＲＫ）細胞株、昆虫細胞株、トリ細胞株およびサル（ＣＯＳ）細胞株が挙げられる。
【００４８】
このような細胞株についての発現ベクターは通常、複製起点、プロモーター、翻訳開始部位、ＲＮＡスプライス部位（ゲノムＤＮＡが使われる場合）、ポリアデニル化部位および転写終結部位を含む。これらのベクターも通常、選択遺伝子または増幅遺伝子を含む。適切な発現ベクターは、例えば、アデノウイルス、ＳＶ４０、パルボウイルス、ワクシニアウイルスまたはサイトメガロウイルスのような供給源に由来するプロモーターを保有しているプラスミド、ウイルスまたはレトロウイルスであり得る。適切な発現ベクターの代表例としては、ｐＣＲ（登録商標）３．１、ｐＣＤＮＡ１、ｐＣＤ［Ｏｋａｙａｍａら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：１１３６（１９８５）］）、ｐＭＣ１ｎｅｏ  Ｐｏｌｙ−Ａ［Ｔｈｏｍａｓら，Ｃｅｌｌ  ５１：５０３  （１９８７）］、ｐＵＣ１９、ｐＲＥＰ８、ｐＳＶＳＰＯＲＴおよびその誘導体、ならびにバキュロウイルスベクター（例えば、ｐＡＣ  ３７３またはｐＡＣ  ６１０）が挙げられる。
【００４９】
ＭｙＤ８８またはそのフラグメントをコードしている核酸は、レポーター遺伝子に作動可能に連結され得る。用語「使作動可能に連結される」は、ＭｙＤ８８またはそのフラグメントをコードしている核酸とレポーター遺伝子とが、ＭｙＤ８８またはそのフラグメントをコードしている核酸の発現がレポーター遺伝子の発現をももたらすように連結されていることを意味する。その発現が検出され得る限り、当該分野で公知の任意のレポーター遺伝子が本発明の方法で用いられ得る。レポーター遺伝子の例としては、ルシフェラーゼ遺伝子、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子、β−ガラクトシダーゼ遺伝子またはポリヒスチジンタグをコードする遺伝子が挙げられる。
【００５０】
ベクターは、当該分野で公知の任意の手段によって細胞に導入され得る。このような手段の例としては、形質導入、トランスフェクション、エレクトロポレーションおよびリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。
【００５１】
（ＭｙＤ８８の発現レベルの測定）
本発明の方法の別の工程は、ＭｙＤ８８の発現レベルを測定することを含む。当該分野で公知のように、タンパク質の発現レベルを測定する多くの方法がある。例えば、抗体または抗体フラグメントは、タンパク質に結合して、このタンパク質の発現レベルを測定するために使用され得る。また、細胞は、（ウエスタンブロットによって）特定のタンパク質または（ノーザンブロットによって）特定のＲＮＡの発現レベルを決定するために溶解され得る。例えば、一群の細胞は、例えば実験コントロールにおいてコントロール細胞を用いてＭｙＤ８８発現の平均レベルを決定するために犠牲にされ得る。次いで、試験サンプルと接触する細胞のＭｙＤ８８発現のレベルは、抗癌剤を同定するために、実験コントロールにおけるＭｙＤ８８発現のレベルと比較され得る。
【００５２】
（抗体産生）
リガンド結合活性を有してもまたは有さなくてもよい、ＭｙＤ８８の抗原性（すなわち、免疫原）フラグメントが、産生され得る。それらが活性を有するか否かにかかわらず、このようなフラグメントは、完全タンパク質と同様に、標準法によって抗体を調製するための抗原として有用である。より短いフラグメントを連結してもよく、またはキャリアに取り付けてもよい。エピトープは一般に少なくとも５個、好ましくは少なくとも８個のアミノ酸残基を含むことが当該分野で周知である［Ｏｈｎｏら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：２９４５（１９８５）］）ので、抗体産生のために使用されるフラグメントは、通常、少なくともそのサイズである。好ましくは、それらは、より多くの残基を含む。所定のフラグメントが免疫原であるか否かは、慣用実験によって容易に決定され得る。
【００５３】
完全なＭｙＤ８８タンパク質が免疫学的に能力のある宿主において抗体産生を惹起するための抗原として用いられる場合には通常、必要ないが、より小さい抗原性のフラグメントは好ましくは最初に、架橋もしくは連結によって、または、免疫原性キャリア分子（すなわち、それぞれに宿主動物において免疫応答を惹起する特性を有する高分子）に対する結合によって、より免疫原性にされる。小さいポリペプチドフラグメントが時々ハプテン（抗体と特異的に結合できるが、抗体産生を惹起することができない分子、すなわち、これらは免疫原性ではない）として作用するので、キャリア分子に対する連結または結合が必要とされ得る。免疫原性キャリア分子に対するこのようなフラグメントの結合によって、「キャリア効果」として一般に知られるものにより、これらは、より免疫原性になる。
【００５４】
適切なキャリア分子としては、例えば、タンパク質および天然または合成の高分子化合物（例えば、ポリペプチド、多糖、リポポリサッカリドなど）が挙げられる。キーホールリンペットヘモシニアンおよび哺乳動物の血清タンパク（例えば、このようなタンパク質のヒトもしくはウシのγグロブリン、ヒト、ウシもしくはウサギの血清アルブミン、またはこのようなタンパク質のメチル化誘導体もしくは他の誘導体）が挙げられるがこれらに限定されない、タンパク質キャリア分子が特に好ましい。他のタンパク質キャリアは、当業者にとって明らかである。好ましくは、タンパク質キャリアは、フラグメントに対する抗体が惹起される宿主動物に対して外来のものであるが、必ずしもその必要はない。
【００５５】
キャリア分子に対する共有結合は当該分野で周知の方法を使用して達成され得、その正確な選択は、使用されるキャリア分子の性質により指図される。免疫原性キャリア分子がタンパク質である場合、例えば、水溶性カルボジイミド（例えば、ジシクロヘキシルカルボジイミドまたはグルタルアルデヒド）を使用して、本発明のフラグメントを連結し得る。
【００５６】
これらのようなカップリング剤はまた、別々のキャリア分子を用いずにそれ自身にフラグメントを架橋させるために使用され得る。凝集物へのこのような架橋はまた、免疫原性を上昇させ得る。免疫原性はまた、単独で、または結合もしくは凝集と組み合わせて公知のアジュバントを用いて上昇させ得る。
【００５７】
動物の予防接種のための適切なアジュバントとしては、アジュバント６５（落花生油、マンニド（ｍａｎｎｉｄｅ）モノオレエートおよびモノステアリン酸アルミニウムを含む）；フロイントの完全または不完全なアジュバント、ミネラルゲル（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびミョウバン）；界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド、Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシメチル）プロパンジアミン、メトキシヘキサデシルグリセロールおよびプルロニックポリオール）；ポリアニオン（例えばピラン、硫酸デキストラン、ポリＩＣ、ポリアクリル酸およびカルボポール）；ペプチド（例えばムラミルジペプチド、ジメチルグリシンおよびタフトシン）；ならびに油乳濁剤が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドはまた、リポソームまたは他のマイクロキャリアへの取り込み後に投与され得る。
【００５８】
アジュバントおよびイムノアッセイのさまざまな局面に関する情報は、例えば、Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ，第３版，１９８７，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋによるシリーズにおいて開示される。ポリクローナル抗血清を調製するための方法を含む他の有用な参考文献としては、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９６９，Ｈｏｅｂｅｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，ＨａｒｐｅｒおよびＲｏｗ；Ｌａｎｄｓｔｅｉｎｅｒ，Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  Ｓｅｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，１９６２，Ｄｏｖｅｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ならびにＷｉｌｌｉａｍｓら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第１巻，１９６７，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋが挙げられる。
【００５９】
標準法を用いて免疫された動物から産生される血清は、直接用いられてもよく、または標準法（例えば、血漿搬出またはＩｇＧ特異的吸着剤（例えば、固定されたプロテインＡ）を用いた吸着クロマトグラフィ）を使用して血清からＩｇＧ画分が分離されてもよい。あるいは、モノクローナル抗体を調製し得る。
【００６０】
ＭｙＤ８８またはその抗原性フラグメントに対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマが、周知の技術によって作製される。通常、このプロセスは、所望の抗体を産生するＢリンパ球と不死化細胞株との融合を含む。あるいは、例えば、不死の抗体産生細胞株を生成するための非融合技術法（例えば、ウイルスで誘導された形質転換［Ｃａｓａｌｉら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：４７６（１９８６）］）が、使用され得る。不死化細胞株は通常、形質転換された哺乳動物細胞（特に、齧歯類、ウシおよびヒト起源の骨髄腫細胞）である。最も頻繁には、ラットまたはマウス骨髄腫細胞株は、便宜および入手可能性の問題から使用される。
【００６１】
抗原を注射した哺乳動物から抗体産生性リンパ球を得るための技術は周知である。通常、ヒト起源の細胞が使用される場合、末梢血リンパ球（ＰＢＬ）が使用されるか、または、脾臓もしくは非ヒト哺乳動物供給源からのリンパ節細胞が使用される。宿主動物は、精製された抗原の繰り返された投与量により注射され（ヒト細胞は、インビトロで感作され）、そして動物は所望の抗体産生細胞を生成し得、その後、これらは、不死化細胞株との融合のために集められる。融合に関する技術もまた、当該分野で周知であり、一般に、細胞と融合剤（例えば、ポリエチレングリコール）とを混ぜ合わせることを含む。
【００６２】
ハイブリドーマは、標準手順（例えば、ＨＡＴ（ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン）選択により選択される。所望の抗体を分泌しているものは、標準イムノアッセイ（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬｌＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、ＲＩＡ（ラジオイムノアッセイ）等を使用して選択される。抗体は、標準的なタンパク質精製技術［Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）］を使用して、培地から回収される。
【００６３】
多くの参考文献は、上記の技術を適用する際のガイダンスを提供するために利用可能である［Ｋｏｈｌｅｒら，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  （Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）；Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）；Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８４）；Ｈｕｒｒｅｌｌ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９８２）］。モノクローナル抗体はまた、周知のバクテリオファージライブラリー系を使用して産生され得る。例えば、Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５（１９８９）；Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ，３４１：５４４（１９８９）を参照のこと。
【００６４】
ポリクローン性であろうとモノクローナル性であろうと、このように産生された抗体は、例えば、免疫アフィニティークロマトグラフィーによってタンパク質を精製するために、周知の方法によって固体支持体に結合された固定された形態で用いられ得る。
【００６５】
非標識であるかまたは標準法によって標識された、抗原性フラグメントに対する抗体もまた、ＭｙＤ８８のイムノアッセイに対する基準として用いられ得る。使用される特定の標識は、イムノアッセイのタイプに依存する。用いられ得る標識の例としては、放射標識（例えば、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈおよび１４Ｃ）；蛍光標識（例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシルおよびウンベリフェロン）；化学発光体（ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｒ）（例えば、ルシフェリア（ｌｕｃｉｆｅｒｉａ）および２，３−ジヒドロフタラジンジオン）、ならびに酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、リゾチームおよびグルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６６】
抗体は、公知の方法によってこのような標識でタグ化され得る。例えば、カップリング剤（例えば、アルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミド、イミデート、スクシンイミド、ビスジアゾ化されたベンザジンなど）は、抗体を蛍光標識、化学発光標識または酵素標識でタグ化するために使用され得る。関係する一般的方法は、当該分野で周知であり、例えば、Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ，１９８７，Ｃｈａｎ（編），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｏｒｌａｎｄｏ，ＦＬに記載されている。このようなイムノアッセイは、例えば、タンパク質の精製中に得られた画分について実施され得る。
【００６７】
本発明の抗体はまた、発現クローニングシステムにおいてＭｙＤ８８を発現している特定のｃＤＮＡクローンを同定するために用いられ得る。
【００６８】
ＭｙＤ８８に特異的な中和抗体もまた、タンパク質をブロックするためのアンタゴニスト（インヒビター）として用いることもできる。このような中和抗体は、慣用実験によって（例えば、下記のラジオリガンド結合アッセイを用いて）容易に同定され得る。ＭｙＤ８８に対する結合は、完全な抗体分子、または周知の抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆｃ、Ｆ（ａｂ）２およびＦｖフラグメント）を用いて達成され得る。
【００６９】
このようなフラグメントの定義は、例えば、Ｋｌｅｉｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８２）；Ｐａｒｈａｍ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １４，Ｗｅｉｒ編，Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第４版（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８６）で見出され得る。抗体フラグメントの使用および生成は、例えば、以下に記載されている：Ｆａｂフラグメント［Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ａｎｄ  Ｔｈｅｏｒｙ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ａｍｓｔｅｒｄａｍ，１９８５）］、Ｆｖフラグメント［Ｈｏｃｈｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １２：１１３０（１９７３）；Ｓｈａｒｏｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７５：１５９１（１９７６）；Ｅｈｒｌｉｃｈら，米国特許第４，３５５，０２３号］および抗体の半分の分子（Ａｕｄｉｔｏｒｅ−Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ、米国特許第４，４７０，９２５号）。公知の抗体の重鎖可変領域の配列および軽鎖可変領域の配列に基づいて組換えＦｖフラグメントを作製するための方法は、例えば、Ｍｏｏｒｅら（米国特許第４，６４２，３３４号）およびＰｌｕｅｃｋｔｈｕｎ［Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５（１９９１）］によってさらに記載されている。あるいは、これらは、標準法によって、化学的に合成され得る。
【００７０】
抗イディオタイプ抗体（ポリクローナルおよびモノクローナルの両方）もまた、抗原としてのタンパク質に対して惹起される抗体を使用して産生され得る。これらはタンパク質を模倣し得るので、このような抗体は有用であり得る。
【００７１】
（将来の開発）
本発明は、治療標的としてＭｙＤ８８を使用して抗癌剤を同定するための方法に関する。下記の実施例に基づいて、本発明者らは、癌治療のための治療薬としての、ＭｙＤ８８発現インヒビター（例えば、ｓｉＲＮＡ、リボザイムまたはアンチセンス核酸）または機能インヒビター（例えば、低分子または有機化合物）の使用を提案する。一旦適切な薬剤が同定されると、それは、患者への投与のための薬学的組成物に処方され得る。さらに、癌を予防または処置する際の薬剤の有効性は、同じ目的のために効果的である化学療法化合物または処置と組み合わせて薬剤を投与することにより改善され得る。癌のための処置としては、癌を取り除くための手術および癌もしくは腫瘍を減少させるかもしくは殺傷するための放射線処置が挙げられる。あるいは、癌を予防するかまたは処置する際の薬剤の有効性は、他の治療法（例えば、ファルネシルトランスフェラーゼインヒビター）と組み合わせて、薬剤を投与することにより改善され得る。
【実施例】
【００７２】
本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することにより、よりよく理解され得る。以下の実施例は、本発明の例示として提供される。以下の実施例は、本発明をより完全に例示するために示されており、本発明の幅広い範囲を制限するものとして決して解釈されてはならない。特に明記しない限り、それぞれ、固体混合物中の固体、液体中の液体、および液体中の固体に関して以下に示すパーセンテージは、それぞれ、ｗｔ／ｗｔ、ｖｏｌ／ｖｏｌおよびｗｔ／ｖｏｌに基づく。無菌条件は、通常、細胞培養中維持された。
【００７３】
（材料および一般的方法）
例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，１９８２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（第２版），第１〜３巻，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ；Ａｕｓｕｂｅｌら，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｂｒｏｏｋｌｙｎ，ＮＹ；またはＡｕｓｕｂｅｌら（１９８７および補遺），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ／Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｉｎｎｉｓら（編）ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，１９９０，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．に記載されるような標準法を使用した。
【００７４】
（実施例１）
実験のこれらのセットにおいて、本発明者らは、野生型（ｗｔ）マウス、ＭｙＤ８８−／−マウスおよびＩＬ−１Ｒ−／−マウスをＤＭＢＡ／ＴＰＡ二段階ｒａｓ依存性皮膚発癌プロトコルに供した。
【００７５】
野生型Ｃ５６ＢＬ／６マウスを、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｌ’ａｒｂｒｅｓｌｅ、Ｆｒａｎｃｅ）から得た。ＭｙＤ８８−／−マウスを、日本の大阪大学の審良静男博士から得た。ＩＬ−１Ｒ−／−マウスを、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎｅ）から購入した。
【００７６】
二段階化学物質発癌のために、８週齢のマウスの背中を剃り、そして７，１２−ジメチルベンズ［ａ］アントラセン（ＤＭＢＡ、２００μｌアセトン中２５μＧ；Ｓｉｇｍａ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を１回塗布し、続いて１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボール−１３−アセテート（ＴＰＡ、アセトン中１０−４Ｍの溶液２００μｌ；Ｓｉｇｍａ，Ｌｙｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）を２０週間にわたって２週間に一回塗布することによって処置した。マウスを１週間に少なくとも二回目視検査し、そしてマウス１匹当たりの腫瘍を計数した。瀕死の場合、いずれかの個々の腫瘍が直径１ｃｍに達した場合、または実験終了時に、マウスを屠殺した。使われたプロトコルの全てがｒａｓ依存性であったので、これらの実験はｒａｓ媒介性癌に取り組んだ。
【００７７】
これらの実験の結果は、２０週間後に、ほとんど全てのＭｙＤ８８−／−マウスが腫瘍を発達させず、一方、ｗｔマウスの８５％およびＩＬ−１Ｒ−／−マウスの約４０％が腫瘍を発達させたことを示す。具体的には、時間とともに腫瘍を発達させたｗｔマウスのパーセンテージは、以下の通りだった：０〜８週間については０％、９週間で１５％、１０〜１１週間で３５％、１２週間で４０％、１３週間で５０％、１４〜１５週間で７０％、１６週間で８０％、そして１７〜２０週間で８５％。時間とともに腫瘍を発達させたＩＬ−１Ｒ−／−マウスのパーセンテージは以下の通りであった：０〜１０週間については０％、１１週間で１０％、１２〜１３週間で２０％、１４〜１７週間で３０％、そして１８週間で４０％。時間とともに腫瘍を発達させたＭｙＤ８８−／−マウスのパーセンテージは以下の通りであった：０〜１４週間で０％、そして１５〜２０週間で５％。
【００７８】
ほとんど全てのＭｙＤ８８−／−マウスが腫瘍を発達させなかったことは明らかである。さらに、ＭｙＤ８８−／−マウスの抵抗性は、ＩＬ−１シグナリングの欠如に起因しなかった。なぜなら、ＩＬ−１Ｒ−／−マウスは腫瘍の発達に対してｗｔマウスよりも感受性が低かったが、ＤＭＢＡ／ＴＰＡに応答して皮膚腫瘍を発達させたからである。
【００７９】
（実施例２）
上記実施例のデータは、ｒａｓ媒介性腫瘍発生におけるＭｙＤ８８に関する別の非炎症性機能を示唆した。ＭｙＤ８８が細胞自律様式で作用するか否かについて取り組むために、本発明者らは、ｗｔマウスおよびＭｙＤ８８−／−マウスの両方からマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を作製した。
【００８０】
ＭＥＦの単離のために、Ｅ１４日目の胚を、妊娠した野生型マウスまたはＭｙＤ８８−／−マウスから収集し、そしてＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に入れた。１０個の胚を用いて、実験のために充分な量の細胞の収集を可能にした。頭部および肝臓を除去し、そして胴体をＤＭＥＭ中で３時間洗浄した。次いで、胚を無菌のかみそりの刃で細かく切り刻み、５ｍｌトリプシン：ヴェルセン（１：１）中に配置し、そして３７℃で２０分間インキュベートした。細胞を、１０％血清を有する培地中で集め、次いで遠心分離し、５０ｍｌのＤＭＥＭ＋１０％のＦＣＳ中に再懸濁し、そしてＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳを含んでいる５枚の１０ｃｍ組織培養皿上へ播種した。培地を翌日交換し、そして細胞をコンフルエントになるまで増殖させ、次いで１：１０に分割し、そしてコンフルエンシーになるまで再度増殖させた。ＭＥＦを培養培地中で３日間増殖させ、次いでＢｒｄＵで６０分間パルスした。固定、浸透処理およびＦＩＴＣ標識抗ＢｒｄＵ  ｍＡｂでの染色の後に、細胞を、ＦＡＣＳにより分析した。指数関数的に増殖する細胞を、１μｇ／ｍｌ  ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）を含んでいる培養培地中で１時間インキュベートした。標識された細胞を１×ＰＢＳによって二回洗浄し、次いで、７０％エチルアルコールで３０分間固定した。固定された細胞を、１Ｍ  ＨＣｌにより２０分間処理し；１Ｍホウ砂によって３分間中和し、そしてＰＢＳ／２．５％  ＦＣＳによって二回洗浄した。細胞を、細胞周期分析のために、抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびヨウ化プロピジウム（ＰＩ）で染色した。
【００８１】
このデータは、ＢｒｄＵを組み込んだｗｔ  ＭＥＦのパーセンテージが４０％であり、一方、ＭｙＤ８８−／−ＭＥＦのわずか２６％がＢｒｄＵを組み込んだことを示す。
【００８２】
これらのデータは、ＭｙＤ８８−／−ＭＥＦがｗｔ  ＭＥＦよりいくらかゆっくり増殖したことを示す。それゆえ、ＭｙＤ８８の欠如は、ＭＥＦの増殖速度を減少させる。
【００８３】
（実施例３）
本発明者らは、上記の通り、ｗｔマウスおよびＭｙＤ８８−／−マウスの両方からマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を作製した。ｗｔ  ＭＥＦおよびＭｙＤ８８−／−ＭＥＦを両方とも、ＤＭＢＡで１回処理し、次いで１週間に２回、３週間にわたってＴＰＡで処理した。コントロールＭＥＦ（ｗｔおよびＭｙＤ８８−／−）は、未処理であった。次いで、プレートを４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％クリスタルバイオレットで着色し、次いで病巣を観察した。
【００８４】
この結果は、中程度の数の病巣が未処理のｗｔ  ＭＥＦプレートにおいて発達し、一方、多数の病巣が、処理したｗｔ  ＭＥＦプレートにおいて発達したことを示す。対照的に、未処理のＭｙＤ８８−／−ＭＥＦおよび処理したＭｙＤ８８−／−ＭＥＦは、病巣が発達しないことを明らかにした。
【００８５】
これらのデータは、ＭｙＤ８８−／−ＭＥＦがＤＭＢＡ／ＴＰＡによるインビトロでの細胞のトランスフォーメーションに完全に抵抗性であったことを示す。それゆえ、ＭｙＤ８８の欠如は、ＤＭＢＡ／ＴＰＡによるインビトロでの細胞トランスフォーメーションに対するＭＥＦの抵抗性を向上させる。
【００８６】
（実施例４）
本発明者らは、上記の通り、ｗｔマウスおよびＭｙＤ８８−／−マウスの両方からマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を作製した。ｗｔ  ＭＥＦおよびＭｙＤ８８−／−ＭＥＦの両方を、ｒａｓおよびｍｙｃによってトランスフェクションし、次いで、３×１０５細胞／１０ｃｍで培養皿上にプレーティングした。１４日後に、皿を４％パラホルムアルデヒドで固定し、０．１％のクリスタルバイオレットによって着色し、そして病巣を計数した。
【００８７】
この結果は、ｗｔ  ＭＥＦが１４個の病巣／皿を発達させ、一方、ＭｙＤ８８−／−ＭＥＦが０．２５個の病巣／皿を発達させたことを示す。
【００８８】
これらのデータは、ＭｙＤ８８−／−ＭＥＦがｒａｓおよびｍｙｃでのトランスフェクションに完全に抵抗性であったことを示す。それゆえ、ＭｙＤ８８の欠如は、ｒａｓおよびｍｙｃでのトランスフェクションに対するＭＥＦの抵抗性を向上させる。
【国際調査報告】
2008506414.tif 000002
2008506414.tif 000003
2008506414.tif 000004