(57)【要約】  CD4＋CD25＋調節性T(Tr)細胞をin vitroで作製／増殖する方法、および細胞性免疫応答（T-および抗体介在性応答を含む）に関連する疾患の治療における前記Tr細胞の使用。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
CD4＋CD25＋調節性T（Tr）細胞を作製する方法であって、ヒトまたは動物から得られるT細胞またはT細胞集団をラパマイシンまたはその誘導体とともにインキュベートすることを含む上記方法。
【請求項２】
T細胞集団中のCD4＋CD25＋Tr細胞集団を増殖または培養する方法であって、ヒトまたは動物から得られるT細胞集団をラパマイシンまたはその誘導体とともにインキュベートすることを含む上記方法。
【請求項３】
T細胞集団中のCD4＋CD25−T細胞を選択的に排除または低減する方法であって、ヒトまたは動物から得られるT細胞集団をラパマイシンまたはその誘導体とともにインキュベートすることを含む上記方法。
【請求項４】
T細胞集団がCD4＋CD25＋Tr細胞およびCD4＋CD25−T細胞を含む、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
得られるCD4＋CD25−T細胞が枯渇または低減した集団を単独でまたは薬物と組合わせて患者に導入する、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
得られるCD4＋CD25＋Tr細胞または細胞集団を単独でまたは薬物と組合わせて患者に導入する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
ヒトまたは動物由来のT細胞を含むサンプルを得ることを含む、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
T細胞を含むサンプルが血液サンプルまたはリンパ器官由来のサンプルである、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
ラパマイシンとともにインキュベートする前にT細胞を精製する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
T細胞を活性化する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
サイトカインの存在下でインキュベートすることをさらに含む、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
サイトカインがIL-2である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
抗原の存在下でインキュベートすることをさらに含む、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
抗原がアレルゲン、アロ抗原、自己抗原、食物抗原、または微生物抗原である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
得られたCD4＋CD25＋Tr細胞をヒトまたは動物患者に導入することをさらに含む、請求項1〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトまたは動物由来のT細胞サンプルを得ること、場合により該サンプルからCD4＋T細胞を単離すること、場合によりT細胞を活性化すること、およびT細胞をラパマイシンまたはその誘導体と共にインキュベートすることを含む細胞療法の方法。
【請求項１７】
その後T細胞を患者に再導入することをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法により作製することができるCD4＋CD25＋Tr細胞またはT細胞集団。
【請求項１９】
細胞性免疫応答をモジュレートするための、請求項１８に記載のCD4＋CD25＋Tr細胞または細胞集団の使用。
【請求項２０】
細胞性免疫応答がT細胞または抗体介在性免疫応答である、請求項１９に記載のCD4＋CD25＋Tr細胞または細胞集団の使用。
【請求項２１】
請求項１８に記載のCD4＋CD25＋Tr細胞または細胞集団、および製薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項２２】
細胞性免疫応答に関連する疾患の治療用医薬品を調製するための、請求項１８に記載のCD4＋CD25＋Tr細胞または細胞集団の使用。
【請求項２３】
細胞性免疫応答がT細胞または抗体介在性免疫応答である、請求項２２に記載のCD4＋CD25＋Tr細胞または細胞集団の使用。
【請求項２４】
同種固形器官拒絶および移植片対宿主病の予防または治療処置における、請求項２２または２３に記載のCD4+CD25+Tr細胞または細胞集団の使用。
【請求項２５】
自己免疫性疾患：自己免疫性（橋本）甲状腺炎、甲状腺機能亢進症（グレーブズ病）、1型糖尿病、インスリン耐性糖尿病、自己免疫性副腎不全（アジソン病）、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性寒冷血色素尿症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少、悪性貧血(pernicious anemia)、赤芽球ろう、自己免疫性凝血異常、重症筋無力症、自己免疫性多発神経炎、多発性硬化症、実験的アレルギー性脳脊髄炎、天疱瘡およびその他の水疱性疾患、リウマチ性心臓炎、グッドパスチャー症候群、心術後症候群、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症；炎症性腸疾患：クローン病、潰瘍性大腸炎；慢性閉塞性肺疾患；慢性炎症性疾患；アレルギー性疾患：喘息、アトピー性皮膚炎；線維性疾患；および遺伝子治療由来の産物に対する免疫応答、の予防または治療処置における、請求項２２または２３に記載のCD4＋CD25＋Tr細胞または細胞集団の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はCD4＋CD25＋調節性T（Tr）細胞または集団をin vitroで作製／増殖する方法、および細胞性免疫応答（T細胞および抗体介在性免疫応答を含む）に関連する疾患を治療するための、かかる細胞または集団の使用に関する。本発明はまた、CD4＋CD25−エフェクターT細胞またはその集団を排除／削減する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞性免疫応答（T細胞および抗体介在性免疫応答を含む）のモジュレーションは治療環境において重要である。
【０００３】
器官および細胞移植は末期の腎不全、心臓または肝臓疾患、自己免疫性1型糖尿病のほとんどの患者に適切な治療であり、そして小腸機能が不足している患者に対する可能性が増大している。移植片の生着は多くの要因に依存するが、そのなかで最も重要なものは強力な免疫抑制薬の投与である。遺伝的に異種の個体間の移植は急速かつ潜在的に有害なアロ反応性免疫応答（alloreactive immune response）を惹起し、もし制御せず放置すれば、移植した器官の完全な破壊または移植片対宿主病（GVHD）に導きうる。免疫抑制薬の投与はこの応答を減弱し、したがって急性移植片拒絶を防止する。しかし、免疫抑制を中止すると拒絶反応が再活性化して急速な移植片破壊をもたらすので、移植片生着の持続は終生または長期の免疫抑制に依存することになる。
【０００４】
現在利用しうる免疫抑制薬は短期間には非常に有効であるが、多くの問題は移植片拒絶を防止するための代替的なより高性能の方法を緊急に開発する必要性を示している。主な障害は、感染性病原体に対する有益な免疫応答と移植片に対する有害な免疫応答との区別ができないことにある。したがって、免疫抑制療法は日和見感染のリスクを増加しうる。いくつかの研究は、非特異的免疫抑制が移植患者における癌の発症率を増加しうることを示している（非特許文献1）。それ故に、移植の全潜在能力は非特異的免疫抑制に代わる方法が見出されるときにのみ発揮される。移植免疫学の主な目的は、移植片に対する免疫応答を防止するが残りの免疫系は損なわれないまま残すプロトコルを開発することである。これを遂行することで、移植寛容をもたらしうる。
【０００５】
自己免疫疾患において、自己抗原に対する望ましくない免疫応答は末梢組織の破壊に導く。自己免疫疾患の治療は現在、炎症のダウンモジュレーションと抗原（Ag）非特異的免疫抑制に基づく。同種移植片拒絶の予防に関して、この方法は退薬した時の高い再発リスクならびに感染および腫瘍を含む過剰免疫抑制の障害を伴うので、長期間にわたって有効でないことが多い。代わりの手法は、宿主防衛機構を損なわずに保つ一方、自己Agに対する病原性応答の「サイレンシング」を目的とする、一過性免疫抑制および／または特異的免疫寛容の誘導に基づく。
【０００６】
免疫系は、自己または非有害抗原に対する免疫寛容（tolerance）を誘導する２つの異なる機構に進化してきた。これらは中枢性および末梢性T細胞免疫寛容と呼ばれる。中枢性免疫寛容は胎児発生中および非常に初期の出生期間に実現され、胸腺発生中の自己応答性T細胞のクローン欠失により成立する。末梢性機構は成熟T細胞の免疫寛容を誘導し、生涯にわたって末梢に生じる。これらの機構には抗原特異的リンパ球の機能不活性化（アネルギーと称する）ならびに抑制及び制御能力をもつ細胞サブセットの活性化が含まれる（非特許文献2で概説される）。
【非特許文献１】Hojo, M., T. Morimoto, et al. Cyclosporine induces cancer progression by a cell-autonomous mechanism. Nature 1999; 397: 530-5344.
【非特許文献２】Battaglia M et al., The puzzling world of murine T regulatory cells. Microbes Infection 2002; 4: 559-566.
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
最近、免疫寛容を達成する方法として調節性T（Tr）細胞の誘導に関心が高まっている。今までに同定されているTr細胞の大多数はCD4＋集団内に存在し、そしてIL-2Rα鎖（CD25）を構成的に発現するCD4＋Tr細胞は、マウスおよびヒトの両方について最もよく特徴付けられているものの1つである。本発明はこのCD4＋CD25＋Tr細胞として同定されたTr細胞サブセットに焦点を当てる。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
ラパマイシンは、哺乳動物のラパマイシン標的（mammalian target of rapamycin；mTOR）と結合することにより、サイトカイン誘導性のT細胞増殖を阻害する免疫抑制化合物である（Sehgal 1998）。ラパマイシンは現在、ヒトにおける急性移植片拒絶を予防するために使われていて、移植のマウスモデルにおいて手術の免疫寛容（operational tolerance）を可能にすることが示されている（Blaha 2003）。しかし、末梢免疫寛容の誘導と維持に重要な役割を果たすTr細胞に対するラパマイシンの直接的効果は今まで実証されてない。本発明者らは、このほど、ラパマイシンが天然のCD4＋CD25＋Tr細胞をin vitroで選択的に増殖または促進することを見出した。したがって、ラパマイシンを用いて、T細胞が介在する疾患のex-vivo細胞療法用のCD4＋CD25＋Tr細胞を作製／増殖することができる。
【０００９】
本発明者らは、CD4＋CD25＋Tr細胞（全CD4＋T細胞の5〜10％）とエフェクターT細胞の両方を含むCD4＋T細胞のラパマイシンによるin vitro処理がCD4＋CD25＋Tr細胞含量を20倍増加することを見出した。
【００１０】
かかる大量のCD4＋CD25＋Tr細胞を選択的に増殖するラパマイシンの能力はin vitro手法に限定されるであろう。
【００１１】
本発明者らはまた、ラパマイシンがかかるエフェクターT細胞とCD4＋CD25＋Tr細胞の両者を含むT細胞集団からCD4＋CD25−エフェクターT細胞をin vitroで選択的に排除することも見出した。
【００１２】
発明の提示
本発明の一態様によれば、CD4＋CD25＋調節性T（Tr）細胞を作製する（培養することを含む）方法であって、ヒトまたは動物から得られるT細胞またはT細胞集団をラパマイシンまたはその誘導体と共にインキュベートすることを含む上記方法が提供される。
【００１３】
本発明の他の態様によれば、T細胞の集団中にCD4＋CD25＋Tr細胞集団を作製または増殖する方法であって、ヒトまたは動物から得られるT細胞集団をラパマイシンまたはその誘導体と共にインキュベートすることを含む上記方法を提供する。
【００１４】
このように、本発明者らは、ラパマイシンまたはその誘導体が、機能性CD4＋CD25＋Tr細胞、特にCD4＋CD25＋FOXP3＋Tr細胞の培養を可能にし、増殖（expansion or proliferation）を促進することを見出した。
【００１５】
「機能性CD4＋CD25＋Tr細胞」により、本発明者らは、当該CD4＋CD25＋Tr細胞がその抑制活性を保持することおよび／またはCD4＋CD25＋Tr細胞がFOXP3などの調節マーカーの発現を維持することを意味する。
【００１６】
本発明の他の態様によれば、T細胞集団中のCD4＋CD25−T細胞の数を選択的に排除するかまたは低減する方法であって、ヒトまたは動物から得られるT細胞集団をラパマイシンまたはその誘導体とともにインキュベートすることを含む上記方法を提供する。
【００１７】
言い換えれば、ラパマイシンはT細胞レセプター（TCR）が介在する増殖をCD4＋CD25−T細胞については選択的にブロックするが、CD4＋CD25＋Tr細胞についてはブロックしない。
【００１８】
いかなる理論にも縛られることを望まないが、ラパマイシンの存在下でCD4＋CD25＋Tr細胞はCD4＋CD25−エフェクターT細胞よりアポトーシスを受けることが少ないと考えられる。あるいはまたはさらに、ラパマイシンがエフェクターT細胞のIL-2に対する感受性をブロックするので、それらは増殖しない。
【００１９】
ワクチンなどの腫瘍細胞に基づく療法および骨髄移植片は、強力な、腫瘍特異的免疫疾患の再発、最も顕著な移植後合併症を誘導しうると考えられる。癌またはその治療によりしばしば機能的に障害のある患者のT細胞と異なり、ドナーT細胞は十分に機能性を有しかつ療法に対して顕著な応答を生じ易いようである。本発明は、T細胞を患者に供与するときに、ラパマイシンとの培養がエフェクターT細胞に関連するリスクを低減するので、有利でありうる。
【００２０】
一実施形態において、本発明によって作製したCD4＋CD25＋Tr細胞を患者に、単独でまたは薬物と組合わせて（再）導入する。
【００２１】
一実施形態において、T細胞はナイーブT細胞である。
【００２２】
好ましくは、T細胞は活性化されている。
【００２３】
一実施形態において、上記方法はサイトカインの存在下でインキュベートすることをさらに含む。好ましくは、上記サイトカインはIL-2である。
【００２４】
一実施形態において、上記方法は抗原の存在下でインキュベートすることをさらに含み、上記抗原にはアレルゲン、アロ抗原、自己抗原、食物抗原、および微生物抗原が含まれる。
【００２５】
本発明の他の態様によれば、本発明の方法により作製したCD4＋CD25＋Tr細胞を提供する。
【００２６】
本発明の他の態様によれば、細胞性免疫応答をモジュレートするための、本発明のCD4＋CD25＋Tr細胞の使用を提供する。
【００２７】
本発明のさらに他の態様によれば、本発明によるCD4＋CD25＋Tr細胞、および製薬上許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明のさらなる態様によれば、細胞性免疫応答に関連する疾患の治療用医薬品を調製するための、本発明によるCD4＋CD25＋Tr細胞の使用を提供する。
【００２９】
1型糖尿病についての従来の実験で、調節性T細胞が免疫抑制を生じなかったことが報告された。しかし、驚くべきことにそれ故に、本発明者らは細胞に基づく治療が本発明の方法を用いると有効でありうることを見出した。従来の実験では、本発明を用いると排除されるエフェクターT細胞の存在によって免疫抑制が生じなかったのかもしれない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本発明の様々な好ましい特徴および実施形態を、非限定的な例を用いてこれから説明する。
【００３１】
一般的に、本明細書に記載した技術は当技術分野で周知であり、特に、Sambrook ら, Molecular Cloning, A Laboratory Manual （1989）およびAusubel ら, Short Protocols in Molecular Biology （1999） 第4版, John Wiley & Sons, Inc （ならびに完全版のCurrent Protocols in Molecular Biology）を参照することができる。
【００３２】
ストレプトマイセス・ハイグロスコピカス（Streptomyces hygroscopicus）が産生するマクロライド抗生物質であるラパマイシンは、同種移植片拒絶を予防するために用いられる新しい有効な薬物である （Kahan 2001）。免疫抑制薬FK506およびシクロスポリンA（CsA）と同様に、ラパマイシンは、細胞内イムノフィリンであるFK506結合タンパク質（FKBP12）との結合によりその効果を及ぼす。しかし、FK506およびCsAと異なり、ラパマイシンはTCR誘導性カルシニューリン活性を阻害しない。むしろ、ラパマイシン-FKBP12複合体はmTOR（哺乳動物のラパマイシン標的）と呼ばれるセリン／トレオニンタンパク質キナーゼ（その活性化がタンパク質合成および細胞サイクル進行に必要である）を阻害する。それ故に、ラパマイシンはサイトカイン／成長因子に応答するシグナル伝達をブロックするが、FK506とCsAはTCR誘導性活性化をブロックすることによりそれらの阻害効果を及ぼす（Abraham 1996で概説される）。ラパマイシンのTrに対する直接的効果は今まで実証されていなかった。
【００３３】
本発明は、ラパマイシンの使用を含む、それを必要とする哺乳動物における細胞介在性疾患を治療または予防するためのex vivoの方法を提供する。本明細書に定義される用語「ラパマイシン」は、基本ラパマイシン核（下記に示す）：
【化１】
2008531009.tif 000002
【００３４】
を含有する免疫抑制化合物のクラスを定義する。本発明のラパマイシンには、ラパマイシン核の誘導体として化学的または生物学的に修飾されているものの、依然として免疫抑制特性を保持する化合物が含まれる。
【００３５】
したがって、用語「ラパマイシン」には、ラパマイシンのエステル、エーテル、オキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミン、ならびにラパマイシン核上の官能基が例えば還元または酸化により改変されているラパマイシンが含まれる。用語「ラパマイシン」にはまた、酸性または塩基性部分を含有することにより、その塩を形成しうるラパマイシンの製薬上許容される塩が含まれる。
【００３６】
上記ラパマイシンのエステルおよびエーテルは、ラパマイシン核の42-および／または31-位のヒドロキシル基、および27-位のヒドロキシル基（27-ケトンの化学還元後）のエステルおよびエーテルであること、そしてラパマイシンのオキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミンは、ラパマイシン核の42-位のケトン（42-ヒドロキシル基の酸化後）および27-位のケトンのオキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミンであることが好ましい。
【００３７】
好ましいラパマイシンの42-および／または31-エステルおよびエーテルは次の特許に開示されていて、これらは全て参照により本明細書に組み入れられる：
アルキルエステル（米国特許第4,316,885号）；アミノアルキルエステル（米国特許第4,650,803号）；フッ素化エステル（米国特許第5,100,883号）；アミドエステル（米国特許第5,118,677号）；カルバミン酸エステル（米国特許第5,118,678号）；シリルエーテル（米国特許第5,120,842号）；アミノエステル（米国特許第5,130,307号）；アセタール（米国特許第5,51,413号）；アミノジエステル（米国特許第5,162,333号）；スルホン酸および硫酸エステル（米国特許第5,177,203号）；エステル（米国特許第5,221,670号）；アルコキシエステル（米国特許第5,233,036号）；O-アリール,-アルキル,-アルケニル、および-アルキニルエーテル（米国特許第5,258,389号）；炭酸エステル（米国特許第5,260,300号）；アリールカルボニルおよびカルバミン酸アルコキシカルボニル（米国特許第5,262,423号）；カルバミン酸エステル（米国特許第5,302,584号）；ヒドロキシエステル（米国特許第5,362,718号）；ヒンダードエステル（米国特許第5,385,908号）；ヘテロ環式エステル（米国特許第5,385,909号）；gem-二置換エステル（米国特許第5,385,910号）；アミノアルカン酸エステル（米国特許第5,389,639号）；ホスホリルカルバミン酸エステル（米国特許第5,391,730号）；カルバミン酸エステル（米国特許第5,411,967号）；カルバミン酸エステル（米国特許第5,434,260号）；アミジノカルバミン酸エステル（米国特許第5,463,048号）；カルバミン酸エステル（米国特許第5,480,988号）；カルバミン酸エステル（米国特許第5,480,989号）；カルバミン酸エステル（米国特許第5,489,680号）；ヒンダードN-オキシドエステル（米国特許第5,491,231号）；ビオチンエステル（米国特許第5,504,091号）；0-アルキルエーテル（米国特許第5,665,772号）；およびラパマイシンのPEGエステル（米国特許第5,780,462号）。これらのエステルおよびエーテルの調製は上記特許に開示されている。
【００３８】
従って、ラパマイシン化合物の例は、式：
【化２】
2008531009.tif 000003
【００３９】
［上記米国特許のいずれか1つに開示された通り、式中、RAおよびRBは水素およびエステルまたはエーテル形成基からそれぞれ選択される］の化合物を含む。
【００４０】
好ましいラパマイシンの27-エステルおよびエーテルは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,256,790号に開示されている。これらのエステルおよびエーテルの調製は、上記特許に開示されている。
【００４１】
好ましいラパマイシンのオキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミンは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,373,014号、第5,378,836号、第5,023,264号および第5,563,145号に開示されている。これらのオキシム、ヒドラゾン、およびヒドロキシルアミンの調製は上記特許に開示されている。42-オキソラパマイシンの調製は、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第5,023,263号に開示されている。
【００４２】
特に好ましいラパマイシンには、ラパマイシン［米国特許第3,929,992号］、3-ヒドロキシ-2-(ヒドロキシメチル)-2-メチルプロピオン酸とのラパマイシン42-エステル［米国特許第5,362,718号］、および42-O-(2-ヒドロキシ)エチルラパマイシン［米国特許第5,665,772号］が含まれる。
【００４３】
適用できる場合、製薬上許容される塩は、ラパマイシンが適当な塩基性部分を含有するとき、有機および無機酸、例えば、酢酸、プロピオン酸、乳酸、クエン酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、マロン酸、マンデル酸、リンゴ酸、フタル酸、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、メタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、カンファースルホン酸、および同様に公知の許容される酸から作ることができる。塩はまた、ラパマイシンが好適な酸性部分を含有するとき、有機および無機塩基、例えばアルカリ金属塩（例えば、ナトリウム、リチウム、またはカリウム）、アルカリ土類金属塩、アンモニウム塩、1〜6個の炭素原子を含有するアルキルアンモニウム塩またはそれぞれのアルキル基に1〜6個の炭素原子を含有するジアルキルアンモニウム塩、およびそれぞれのアルキル基に1〜6個の炭素原子を含有するトリアルキルアンモニウム塩から作ることができる。
【００４４】
調節性T（Tr）細胞
Tr細胞は十分特徴付けられたT細胞サブセットであり、免疫寛容を誘導および維持する上で重要な役割を果たす。CD4＋Tr細胞のなかで、IL-2Rα鎖（CD4＋CD25＋）を発現するT細胞サブセットは今まで最も広範囲に特徴付けられたものの1つである（Fehervari 2004で概説される）。CD4＋CD25＋Tr細胞は胸腺で産生し、正常な末梢T細胞レパートリーの一部である。抑制性CD4＋CD25＋Tr細胞は、CD25、CTLA-4、GITR、および転写因子FOXP3の高い構成的発現に基づいて、活性化されたT細胞と区別することができる。一旦産生すると、胸腺CD4＋CD25＋Tr細胞は末梢組織に移動し、そこでこれらは細胞間接触を必要とする機構を介してCD4＋およびCD8＋T細胞両方による増殖およびサイトカイン産生を強力に抑制する（Fehervari 2004）。骨髄移植モデルにおいて、CD4＋CD25＋Tr細胞は固形臓器移植後の免疫寛容誘導に寄与しかつ移植片対宿主病（GVHD）致死から保護する（Taams 2003）。さらにCD4＋CD25＋Tr細胞は自己免疫、アレルギーおよび感染のいくつかの動物モデルにおいて、重要な免疫調節的役割を果たすことが実証されている（Fehervari 2004）。
【００４５】
本明細書において本発明者らはCD4＋T細胞のラパマイシンへのin vitroでの曝露は、in vitroおよびin vivoで抑制機能を保持する天然のCD4＋CD25＋FOXP3＋Tr細胞の増殖を誘導するという証拠を提供する。
【００４６】
in vitroで初回刺激を受けたT細胞の調製
本発明に使用するT細胞集団は、末梢血液または二次リンパ器官から得ることができる。T細胞はまた、サンプルからα-CD4＋モノクローナル抗体をコートしたマイクロビーズを用いて得ることができる。一実施形態においては、T細胞をα-CD25＋モノクローナル抗体をコートしたマイクロビーズを用いてさらに精製する。T細胞はまた、サンプルからフローサイトメトリー（FACS）を用いて得ることができる。T細胞は、適当な培養培地、例えばX-VIVOで、場合によって、ヒト血清の存在下で培養することができる。サイトカイン、例えばIL2を加えてもよい。T細胞のポリクローン活性化はα-CD3および α-CD28抗体を用いて誘導することができる。あるいはまたはさらに、目的の抗原またはアレルゲンを加えてもよい。T細胞は一般的に抗原提示細胞（APC）と共培養する。しかし、初回刺激したAPCを最初に調製して次いでそれらをT細胞と共にインキュベートすることが好ましいであろう。次いで典型的にはラパマイシンを培養物に加える。アレルゲンまたは抗原をラパマイシンの前に、後に、または実質的に同時に加えてもよい。
【００４７】
一実施形態においては、T細胞をおよそ1〜4週間、好ましくはおよそ3週間の期間にわたりラパマイシンと共にインキュベートする。ラパマイシンをこのインキュベーションの期間にわたって、例えば1週に1回加えてもよい。例えば、ラパマイシンをおよそ100nMの量で加えてもよい。
【００４８】
治療上の用途
本発明を臓器移植、例えば腎臓、心臓、肝臓、膵島（islet）または骨髄移植に関連して、および移植片対宿主病の治療または予防に用いることができる。例えば、骨髄同種移植において、ex vivoで増殖したアロ抗原特異的CD4＋CD25＋Tr細胞は、移植片対宿主病（GVHD）を制御する一方、移植後の免疫系の再構成を可能にすることが実証されている（Taylor 2002、Trenado 2003、Edinger 2003）。CD4＋CD25＋Tr細胞はまた、GVHDをモジュレートすることができる一方、移植片対腫瘍（GVT）または移植片対白血病（GVL）効果を保存することができる。
【００４９】
さらに詳しく説明すると、副組織適合性抗原（mHag）は多型細胞タンパク質由来の免疫原性ペプチドであって、ヒト白血球抗原（HLA）適合、mHag非適合幹細胞移植後に強いT細胞応答を誘導する。広くまたは限定的な組織発現をするmHagは、移植片対宿主（GVH）および移植片対白血病（GVL）応答性に対する標的抗原である。これらの活性の分離はGVH病を伴わない白血病の養子免疫療法にとって極めて重要である。
【００５０】
最近のデータは自己免疫性疾患、例えば糖尿病、多発性硬化症、および慢性関節リウマチの患者はCD4＋CD25＋Tr細胞を欠くかまたはその数が少ない可能性があることを示す。したがって、当該Tr細胞コンパートメントを増加するex vivo細胞療法は非常に有望である。
【００５１】
治療しうる自己免疫疾患に関連する特別な症状としては、自己免疫性（橋本）甲状腺炎、甲状腺機能亢進症（グレーブズ病）、1型糖尿病、インスリン耐性糖尿病、自己免疫性副腎不全（アジソン病）、自己免疫性卵巣炎、自己免疫性睾丸炎、自己免疫性溶血性貧血、発作性寒冷血色素尿症、自己免疫性血小板減少症、自己免疫性好中球減少、悪性貧血（pernicious anemia）、赤芽球ろう、自己免疫性凝血異常、重症筋無力症、自己免疫性多発神経炎、多発性硬化症、実験的アレルギー性脳脊髄炎、天疱瘡およびその他の水疱性疾患、リウマチ性心臓炎、グッドパスチャー症候群、心術後症候群、全身性エリテマトーデス、慢性関節リウマチ、シェーグレン症候群、多発性筋炎、皮膚筋炎、強皮症；炎症性腸疾患：クローン病、潰瘍性大腸炎；慢性閉塞性肺疾患；慢性炎症性疾患；アレルギー性疾患：喘息、アトピー性皮膚炎；線維性疾患；および遺伝子治療由来の産物に対する免疫応答が挙げられる。
【００５２】
本発明はまた、患者に投与する前に、増殖した細胞を、例えばサイトカイン刺激を介して、または目的の遺伝子（例えば治療遺伝子もしくはノックアウト遺伝子）を加えることにより、操作することを企図する。
【００５３】
本発明はCD4＋CD25＋T細胞を増殖する方法を提供するとともに、それらの機能および細胞表面マーカーを容易に研究するために有用なツールを提供する。したがって、本発明はさらに、増殖した細胞のアッセイにおける使用を企図する。
【００５４】
投与
本発明は増殖したTr細胞を細胞療法で使用する方法を提供する。患者からのTr細胞を単離しかつin vitroで増殖して、次いで患者に再投与することができる。他の実施形態においては、Tr細胞をドナーから得ることができる。好ましくは、上記細胞を患者に再注入する。
【００５５】
免疫療法に使用する本発明のTr細胞は、典型的には、患者へ投与するために製薬上許容される担体または希釈剤を用いて製剤化し、医薬組成物を製造する。適当な担体および希釈剤には、等張の生理食塩水溶液、例えばリン酸緩衝化生理食塩水が含まれる。この組成物は、非経口、筋肉内、静脈内、腹腔内、注入、鼻腔内吸入、肺吸入、皮内、関節内、髄腔内、または消化管経由（例えば、パイエル板を介して）用に製剤化することができる。
【００５６】
本発明の細胞及び該細胞を含む医薬品は、典型的には患者に、筋肉内、腹腔内または静脈内注射により、または患者のリンパ節中への直接注射により、好ましくはリンパ節中への直接注射により投与する。
【００５７】
典型的には104/kg〜109/kgの処理細胞、好ましくは105/kg〜107/kgの細胞、より好ましくは約106/kgの細胞を患者に投与する。
【００５８】
記載した投与経路および投与量は、単に手引きであり、医師は任意の特定の患者に対する最適な投与経路および投与量を、例えば、患者の年齢、体重および症状に応じて容易に決定することができる。
【実施例】
【００５９】
実施例1および2の材料と方法
マウス
Balb/c、C57BL/6、およびDO11.10（OVA特異的TCR tg）雌マウスをCharles River Laboratories（Calco、Italy）から購入した。全マウスを特定の病原体未感染条件下に保持した。
【００６０】
フローサイトメトリーおよび細胞ソーティング
細胞を、示したAb（全てBD Biosciences、Mountain View、CAより入手）で染色し、そしてCellQuestソフトウエア（BD Biosciences）を具備したFACScanフローサイトメーターを用いて分析した。高度に精製したCD4＋CD25＋／−T細胞を得るために、αCD4 mAbをコートしたマイクロビーズ（Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany）を用いたポジティブ選択によって、CD4＋T細胞をBalb/cマウスから単離した脾細胞より最初に精製した。その後、CD4＋T細胞をCy-結合αCD4およびPE-結合αCD25 mAb（BD Biosciences）で染色し、そしてCD4＋CD25＋T細胞をFAC-Star（BD Biosciences）上のFACSソーティングにより分類した。
【００６１】
T細胞培養物
CD4＋T細胞を、脾細胞の、αCD4 mAbをコートしたマイクロビーズとのインキュベーションにより得て、MiniMacsカラム（Miltenyi Biotec）に適用した。平均純度は95％であった。
【００６２】
DO11.10tgマウスの脾臓から単離した1X106個のCD4＋T細胞を、4X106個のAPC Balb/c マウス由来のAPC（すなわち3000Radで放射線照射した全脾細胞）および0.6μM OVA323-339ペプチド（OVA）（Primm、Milano、Italy）を用いて刺激した。7日間の刺激をそれぞれ3ラウンド実施した。IL-2（BD Biosciences）を、第2ラウンドの刺激から50U/mlで加えた。あるいは、Balb/cマウスの脾臓から単離した1X106 個のCD4＋T細胞を、コートした10μg/mlのαCD3および1μg/mlの可溶性αCD28 mAb（BD Biosciences）を用いて刺激した。細胞を培地単独または100nMラパマイシン（Sigma、StLouis、MO）の存在下で培養した。7日間の刺激をそれぞれ3ラウンド実施した。IL-2（BD Biosciences）を、第2ラウンドの刺激から50U/mlで加えた。別の実験において、分類した、Balb/cマウスの脾臓から単離したCD4＋CD25＋T細胞を、コートした10μg/mlのαCD3、1μg/mlの可溶性αCD28 mAb（BD Biosciences）および1000 U/mlのIL-2を用いて刺激した。細胞を培地単独または100nMラパマイシン（Sigma, StLouis, MO）の存在下で培養した。それぞれの新しい刺激の開始時に1000 U/mlのIL-2を加えた。
【００６３】
FOXP3定量PCR
全RNAをEurozol（Euroclone、Switzerland）を用いて抽出し、cDNAをHigh Capacity cDNA Archive Kit（Applied Biosystems、New Jersey, USA）を用いて合成した。FOXP3 mRNAのレベルを、TaqMan Universal PCR Master Mix（Applied Biosystems、New Jersey、USA）を具備するDemandリアルタイムPCRキット（Applied Biosystems、New Jersey、USA）のアッセイを用いて定量した。18s rRNAのレベルを、TaqMan PDAR Eukaryotic 18s Endogenus Controls（Applied Biosystems、アッセイID：Mm00475156m1）を用いることにより内部対照として定量した。サンプルを二重に試験し、それぞれのサンプルのセットにおいて、18s発現に対して標準化することによりFOXP3の相対的発現を決定して、値の倍変化（fold-change）を計算した。
【００６４】
抑制実験
ナイーブBalb/cマウスから単離したCD4＋T細胞またはDO11.10tgマウスから単離したKJ1-26＋（αOVA特異的TCR）T細胞を、他（Lyons 1994）にも記載されているようにCFSE（Molecular Probes）で染色し、そして、10μg/ml αCD3 mAb（BD Biosciences）または放射線照射した脾細胞およびOVAをコートした96ウェルプレート（2X105／ウェル）中で培養した。培地またはラパマイシンで3週間培養したT細胞を1：1の比（すなわち105：105）で培養物に加え、そして5日後に細胞を採集してFACSにより分析した。培養した細胞の存在下で分裂したCFSE＋細胞の％を、細胞を加えないで分裂したCFSE＋細胞の％と比較した。
【００６５】
トランスウェル実験において、ナイーブBalb/cマウスから単離したCD4＋T細胞をCFSE（Molecular Probes）で染色し、そして10μg/ml αCD3 mAb（BD Biosciences）でコートした48トランスウェルプレート（5X105／ウェル）の下層で培養した。トランスウェルの上層にT細胞を接種し、3週間、培地または1：1の比のラパマイシンで培養し、αCD3 mAbにより6時間、前活性化した。培養の5日後に、下層コンパートメントからの細胞を採集してFACSにより分析した。
【００６６】
CFSE分析による細胞増殖
in vitroで増殖するCFSE＋細胞の比率を他（Lyons 1994）で記載されている通り計算した。簡単に説明すると、所与のサイクル（分裂：n）における細胞数（事象）を2ｎで除算し、それらが由来する最初の前駆体細胞の％を計算した。分裂1〜6からの最初の前駆体の和は、増殖した前駆体細胞の数を表す。CFSE＋分裂細胞の％を［（増殖した前駆体1〜6の数／全前駆体0〜6の数）X100］により計算した。
【００６７】
膵島（islet）移植片
170mg/kgのストレプトゾトシン（Sigma、St. Louis、MO）を静脈内注射することにより、糖尿病をBalb/cマウスで誘導した。2回続いてグルコース測定値が350mg/dlを超えた後、糖尿病の診断を行った。手で拾ったC57BL/6から単離した膵臓β島を、既に記載のように（Davalli 1996）、レシピエントBalb/c糖尿病マウスの腎臓カプセルにより移植した。
【００６８】
統計分析
全ての統計分析はスチューデントt検定を用いて実施した。カプランマイヤー生存曲線をログランク検定により比較した。
【００６９】
実施例1  ラパマイシンはマウスCD4＋T細胞の活性化誘導細胞死および増殖をブロックしない。
ラパマイシンのT細胞に対する効果を規定するために、DO11.10TCRtgマウス脾臓由来のナイーブCD4＋T細胞を、ラパマイシンの存在または非存在下でAPC＋OVAを用いて活性化し、そして活性化誘導細胞死（AICD）をアネキシンVの結合によりモニターした。ラパマイシンに曝した細胞においては、in vitroで活性化しても対照細胞と比較して、アポトーシスの増加もまたは減少も観察されなかった（図1A）。さらに詳しく説明すると、DO11.10tgCD4＋T細胞をAPC＋OVA（培地）またはAPC＋OVA＋ラパマイシン（ラパマイシン）を用いて培養し、AICDをFACSにより培養の24および72時間後にモニターした。PI＋-アネキシンV＋細胞の％をそれぞれのドットプロットで示す。これらの結果は、αCD3 mAbにより活性化したマウス脾臓単核白血球（Wells 1999）および混合した初代リンパ球培養物中で活性化したヒト末梢血液単核細胞（Koenen 2003）で既に実証されたように、ラパマイシンがCD4＋T細胞のAICDを防止しないことを確認した。
【００７０】
T細胞のラパマイシンへの長期曝露の効果を規定するために、DO11.10TCRtgマウス由来のナイーブCD4＋T細胞を、APC＋OVAを用いて3連続週の間、ラパマイシンの存在または非存在下、in vitroで活性化した。T細胞の倍増殖を各刺激ラウンド後に決定した。図1Bに示すように、培養後1、2、および3週に、APC＋OVA（培地、白色バー）またはAPC＋OVA＋ラパマイシン（ラパマイシン、ドット入りバー）の存在下で、DO11.10 tg CD4＋T細胞の倍増殖を、直接細胞カウントにより評価した。ラパマイシンの存在下で活性化したT細胞は、対照細胞と比較して増殖速度が遅れた。しかし、培養の第3週の末にT細胞数は対照およびラパマイシン培養物において回復した（図1B）。ラパマイシンはFKBP12と結合して、形成した複合体は細胞サイクルの制御と関連する広範囲の生理学的過程に関わるmTORの機能を抑制する。実際、ラパマイシンはG1期にT細胞を停止させることによる、T細胞サイクルの阻害剤であると広く認められている（Dumont 1990, Chung 1992, Morice 1993, Nourse 1994, Kato 1994）。この作用機序に基づいて、ラパマイシンは移植片拒絶の治療用の免疫抑制薬として用いられる。しかし、ラパマイシンを受けた患者は、一般的な免疫抑制により予想されるように、感染に対する高い感受性を表さなかった（Saunders 2001）。さらに、ラパマイシンはCD4＋T細胞サイクルへの移行のブロッキングにいくらかの効果を有するが、大多数の細胞は、細胞サイクルに一旦入ると完全に分裂できることが実証されている（Terada 1993、Terada 1995、Vu 2004）。これらの観察を考えあわせると、本発明者らの結果は、ラパマイシンがCD4＋T細胞増殖をブロックしないことを実証する。
【００７１】
1、2（データは示してない）、または3ラウンドの刺激（図1C）の後に、ラパマイシンの存在下で活性化しかつラパマイシンの非存在下でAPC＋OVAを用いて再刺激したCD4＋T細胞は、その増殖能を保持したが、細胞分裂の全数は僅かに低下した。図1Cについてさらに詳しく説明すると、APC＋OVA（培地）またはAPC＋OVA＋ラパマイシン（ラパマイシン）を用いた3ラウンドの刺激後に、DO11.10tg CD4＋T細胞を、CFSEで染色し、該化合物および外因性IL-2の非存在下でAPC＋OVAを用いて再刺激した。CFSE希釈を活性化後5日目にモニターした。
【００７２】
これらのデータは、ラパマイシンへの曝露はCD4＋T細胞にアネルギーを誘導しないことを示す。これらの結果は、Koenenら（2003）によりin vitroでおよびGhobrialら（1996）によりin vivoで報告された結果と一致することを示したが、ラパマイシンを用いて処理する際にAPC＋Agに応答するTh1細胞クローンがアネルギーになることを示したPowellと協同研究者の知見（Powell 1999）と対照的である。観察された相違についての1つの可能な説明は、上記研究ではAPC＋Agとラパマイシンを用いて一晩刺激したマウスCD4＋T細胞クローンを試験したが、本発明者らの実験モデルでは、Ag特異的方法で3回、ラパマイシンの存在下で活性化したポリクローナルT細胞集団を使用したことでありうる。
【００７３】
ラパマイシンの存在下で3週間繰返しin vitroで活性化したT細胞は対照細胞と同様に増殖したが、ラパマイシンに曝したCD4＋T細胞は、対照細胞より小さくかつより丸い形状を提示した（図1D）。APC＋OVA（培地）またはAPC＋OVA＋ラパマイシン（ラパマイシン）による3ラウンドの刺激後に、DO11.10tg CD4＋T細胞をさらに1週間、さらなる刺激なしにIL-2（50U/ml）の存在下で放置した。7日目の最後に細胞サイズをFACSにより、FSC対SSCパラメーターをプロットすることにより分析した。小細胞（連続線）と大細胞（点線）を円で囲んだ。DO11.10tgマウス由来のナイーブCD4＋T細胞を対照に用いた。
【００７４】
遺伝的モデル生物で行った研究は、細胞分裂と細胞成長は別のプロセスであるが通常は協調していて、細胞は十分な質量、サイズ、および生合成に到達したときにのみ、細胞サイクルに進行することを示唆する（Schmelzle 2000で概説される）。反対に、Fingarとその協同研究者は、細胞成長と細胞サイクル進行は哺乳動物細胞において別のプロセスであること、および適当な細胞サイズへの成長はmTOR依存性シグナルを必要とすることを実証した。この研究において、mTORの阻害こそ、ラパマイシンがラット繊維芽細胞およびヒト骨肉腫細胞株の細胞サイズを低減する機構であることを実証した（Fingar 2002）。これらの知見と一致して、本発明者らのデータは、ラパマイシンがCD4＋T細胞成長をブロックする一方、それらの増殖を許容するという証拠を提供する。
【００７５】
実施例2  ラパマイシンは抑制能をもつCD4＋CD25＋FOXP3＋Tr細胞をin vitroで増殖する。
APC＋OVA（培地）またはAPC＋OVA＋ラパマイシン（ラパマイシン）による3ラウンドの刺激後、DO11.10tgCD4＋ T細胞を1週間さらなる刺激なしにIL-2（50U/ml）の存在下で放置した。7日後、細胞をFACSにより分析した。細胞をCD4＋CD25＋細胞についてゲートした。ここで数字は3つの異なるCD25＋サブセット（すなわちbright、dim、およびlow）の％を表す。DO11.10tgマウス由来のナイーブCD4＋T細胞を対照として用いた。
【００７６】
6実験のそれぞれにおける培地およびラパマイシン培養物中のCD25bright T細胞の含量を示した。星印は統計的有意性を示す（*0.001＜p＜0.05）。
【００７７】
ラパマイシンの存在下で活性化したT細胞は、CD4＋CD25＋T細胞集団のなかのTrサブセットを表すCD4＋CD25brightT細胞に非常に富んでいた（図2AおよびB）（Levings 2002、Belghith 2003）。
【００７８】
1x106個のDO11.10tg CD4＋T細胞（70.000個のCD4＋CD25brightT細胞を含有する）を、APC＋OVA（培地、白色バー）またはAPC＋OVA＋ラパマイシン（ドット入りバー、ラパマイシン）と共に培養した。3ラウンドの刺激後、CD4＋CD25bright T細胞の全数をFACSにより決定した。それによると、3週間の培養およびラパマイシンの存在下でのAg反復刺激後に回収したCD4＋CD25brightT細胞の全数は、対照細胞の全数に対して顕著に高かった（図2C）。
【００７９】
興味深いことに、ラパマイシンに曝したCD4＋T細胞は、APC＋OVAを用いてin vitroで活性化した同系のナイーブCD4＋T細胞の増殖を抑制することができた（図3A、左パネル）。これらのデータが明らかに示すのは、ラパマイシンに曝された細胞は均質な集団でなく、ほぼ60％のCD4＋CD25brightTr細胞を含有する（図2A）が、これらの細胞はin vitroで強い抑制能を提示することである。
【００８０】
ラパマイシンは、樹状細胞のAg摂取能力を低下させることにより、樹状細胞の表現型及び機能に深く影響を与え、それにより寛容原性APCの分化を助けることが実証されている（Hackstein 2002）。したがって、ラパマイシンに曝したT細胞培養物中のTr細胞の存在は、ラパマイシンの、T細胞に対する直接的効果というよりも、寛容原性になってTr細胞集団を誘導するAPCに対する間接的効果によるものでありうる。この仮説を試験するために、本発明者らは「APCを含まない」系におけるT細胞のラパマイシンへの長期曝露の効果を研究した。Balb/cマウス脾臓由来のナイーブCD4＋T細胞を、ラパマイシンの存在または非存在下で3週間、αCD3及びαCD28 mAbによりin vitroで繰り返し活性化した。APC＋OVAを用いて活性化したT細胞について実証したように、APCの非存在下でαCD3およびαCD28 mAbを用いて活性化したT細胞は増殖したが、アネルギー性にならず、対照細胞より小さく（データは示してない）、そして同系ナイーブCD4＋T細胞の増殖をin vitroで抑制した（図3A、右パネル）。さらに詳しく説明すると、DO11.10 tg マウス脾臓から単離したナイーブKJ1-26＋CD4＋tg T細胞をCFSEにより染色し、そしてAPC単独またはAPC＋OVAを用いて活性化した。APC＋OVA（培地-細胞）またはAPC＋OVA＋ラパマイシン（ラパマイシン-細胞）を用いて3週間活性化したDO11.10 CD4＋T細胞を、ナイーブCFSE＋細胞に等数加えた（105：105）（左パネル）。あるいは、Balb/cマウスの脾臓から単離したナイーブCD4＋細胞をCFSEで標識して単独で（無刺激で）またはαCD3 mAbと共に培養した。αCD3＋αCD28 mAb（培地-細胞）またはαCD3＋αCD28 mAb＋ラパマイシン（ラパマイシン-細胞）を用いて3週間活性化したBalb/cCD4＋T細胞をナイーブCFSE＋細胞に等数加えた（105：105）（右パネル）。5日間の培養後、細胞分裂をCFSE希釈のレベルによりモニターした。ヒストグラムはCD4＋CFSE＋T細胞のFACSプロファイルを示す。それぞれの細胞分裂の事象数（n）をそれぞれのピーク頂部に示す。培養T細胞の非存在または存在下で増殖するCD4＋CFSE＋細胞の量を、方法の項で記載したように計算し、それぞれの培養条件における非分裂細胞の％を示した。ナイーブ対照細胞の増殖と比較した抑制％を示す。
【００８１】
これらのデータは、ラパマイシンがCD4＋T細胞に直接作用することによりTr細胞を誘導することを実証する。
【００８２】
ラパマイシンに曝したT細胞の抑制能はまた、レスポンダー及びサプレッサー細胞を別々に保ったトランスウェル系でも試験した。図3A（右パネル）に記載したものと同じ細胞を用いて、トランスウェル系で実験を行い、この系でレスポンダーナイーブCD4＋T細胞をαCD3 mAbを用いてトランスウェルの下層で活性化する一方、培地-またはラパマイシン-細胞をαCD3 mAbを用いて6時間、前活性化した後トランスウェルの上層に加えた（右パネル）。トランスウェル系で得たデータを共培養系で得たデータ（左パネル）と比較した。ラパマイシンに曝したT細胞は共培養系でのみ同系ナイーブCD4＋ T細胞の増殖を抑制することができ（図3A）、これは抑制能力が厳密に細胞間接触に依存することを示す。
【００８３】
ラパマイシンに曝したT細胞培養物中の抑制活性をもつCD4＋CD25＋Tr細胞の存在は、CD25−T細胞からのCD25＋Tr細胞のde-novo誘導、または上記培養の始めに限られた量で既に存在する天然CD4＋CD25＋FOXP3＋Tr細胞サブセット（すなわちナイーブ脾臓で通常認められる約10％のCD4＋CD25brightT細胞）の選択的増殖に起因し得る。この疑問を解明するために、CD25＋Tr細胞を枯渇したCD4＋T細胞を3週間ラパマイシンの存在または非存在下で培養した。CD4＋T細胞（図3A）とは対照的に、ラパマイシンの存在下で活性化したCD4＋CD25−T細胞は、in vitroで細胞増殖を抑制できないT細胞の集団を生じた（図4A）。したがって、FOXP3発現はラパマイシンに曝したCD4＋T細胞においてのみ増強されたが、CD4＋CD25−ラパマイシン処理T細胞においては増強されなかった（図4B）。さらに詳しく説明すると、DO11.10 tg マウス由来の細胞を用いた図3A（左パネル）に記載したものと同じ実験を、3週間、APC＋OVA（培地-細胞）またはAPC＋OVA＋ラパマイシン（ラパマイシン-細胞）と共に培養したCD4＋CD25−T細胞を用いて実施した。培養した細胞をナイーブKJ1-26＋CFSE＋細胞（105：105）に等数加え、増殖をCFSE希釈によりモニターした。培養前に用いた細胞（出発集団）のFACSプロファイルを図4Aの上部に示す。mRNA FOXP3の相対的レベルは、ラパマイシンを用いてまたは用いないでin vitroで繰返し活性化したCD4＋（左パネル）またはCD4＋CD25−（右パネル）T細胞におけるリアルタイム定量RT-PCRにより決定した。FOXP3 mRNAの量は、CD4＋CD25＋T細胞を枯渇した脾細胞の量（任意の値1とした）と相対的に表した。培養（出発）前の細胞中のmRNA FOXP3の相対的レベルも図4Bに示す。
【００８４】
これらのデータは、出発細胞集団由来のCD4＋CD25＋T細胞が枯渇すると、Tr細胞のラパマイシン介在性増殖が可能ではないことを示す。しかしCD4＋CD25−T細胞集団由来のTr細胞のラパマイシン介在性誘導を生じさせるために、CD4＋CD25＋Tr細胞が培養に不可欠であるという可能性を排除することはできない。この点を解明するために、高度に精製し分類したCD4＋CD25＋T細胞（図 5A）をαCD3およびαCD28 mAbを用いて活性化し、そして3週間、ラパマイシンの存在または非存在下で培養した。このように、CD4＋CD25＋T細胞をBalb/cマウス由来の脾臓から単離し、FACSにより分類し、そして分類したCD4＋CD25＋T細胞のFACSプロファイルを図5Aに示す。分類した細胞は93％がCD4＋CD25＋であり、そのうち、46％はCD4＋CD25brightT細胞であった。培養物中の高用量のIL-2（すなわち1000U/ml）は、分類したCD4＋CD25＋T細胞を増殖するために必要であり、そうでなければアネルギー性であった（データは示してない）。
【００８５】
αCD3+αCD28+1000U/ml IL-2（培地、白色バー）またはαCD3+αCD28+1000U/ml IL-2＋ラパマイシン（ラパマイシン、ドットバー）の存在下での培養後、1、2、および3週目のBalb/cCD4＋CD25＋T細胞の倍増殖を直接細胞カウントにより評価した。αCD3+αCD28+1000U/ml IL-2（培地）またはαCD3+αCD28+1000U/ml IL-2＋ラパマイシン（ラパマイシン）による3ラウンドの刺激後に、Balb/cCD4＋CD25＋T細胞を1週間、さらなる刺激なしに低用量のIL-2（50U/ml）の存在下で放置した。7日後に、細胞をFACSにより分析した。細胞をCD4＋CD25＋細胞についてゲートした。数字は3種の異なるCD25＋サブセット（すなわちbright、dim、およびlow）の％を表す。結果を図5BおよびCに示す。ラパマイシンの存在下で活性化したT細胞は、対照細胞と比較して増殖速度が遅れた。しかし、培養の第3週から、ラパマイシンの存在下で活性化したCD4＋CD25＋T細胞は非常に増殖した一方、おそらく高用量のIL-2の存在下でのTCR繰り返し刺激後の消耗により、対照細胞は増殖の低下を示した（図5B）。ラパマイシンの存在下で3週間活性化したCD4＋CD25＋T細胞は、対照細胞と比較してより高い％のCD4＋CD25brightT細胞を含有した（図5C）。
【００８６】
Balb/cマウス由来の細胞について図3A（右パネル）に記載したものと同じ実験を、αCD3+αCD28+1000U/ml IL-2（培地-細胞）またはαCD3+αCD28+1000U/ml IL-2＋ラパマイシン（ラパマイシン-細胞）と共に3週間培養したCD4＋CD25＋T細胞を用いて実施した。培養した細胞を、Balb/cマウスから単離したナイーブCD4＋T細胞に等数加え（105：105）、増殖をCFSE希釈によりモニターした。
【００８７】
mRNA FOXP3の相対的レベルを、in vitroでラパマイシンと共にまたはラパマイシンなしで繰返し活性化したBalb/cCD4＋CD25＋T細胞においてリアルタイム定量RT-PCRにより決定した。FOXP3 mRNAの量をCD4＋CD25＋T細胞が枯渇した脾細胞中の量（任意の値1とした）に対して相対的に表した。培養（出発）前の細胞中のmRNA FOXP3の相対的レベルも示す。
【００８８】
その結果、ラパマイシンに曝したCD4＋CD25＋T細胞だけが同系CD4＋T細胞のin vitroでの増殖を抑制し（図6A）、かつFOXP3発現を保存した（図6B）。驚くべきことに、ラパマイシンの非存在下で増殖したCD4＋CD25＋T細胞はそのin vitroでの抑制機能を失った（図6A）。CD4＋CD25＋T細胞はin vitroで1週間、αCD3およびαCD28 mAb及び高用量のIL-2により、その抑制機能を失うことなく増殖できることが既に示されている（Taylor 2002）が、培地中でのCD4＋CD25＋T細胞の活性化の反復及び高用量のIL-2は、CD4＋CD25＋Tr細胞の増殖よりもむしろ活性化したCD4＋CD25＋エフェクターT細胞の過増殖（overgrowth）をもたらしうる。
【００８９】
糖尿病Balb/cマウスをC57BL/6マウスから精製した膵臓β島を含む腎臓カプセルにより移植した。マウスを処置しない（対照n=4）、または移植日前にBalb/cマウスから単離しかつ3週間ラパマイシンの存在下で活性化した5X106個のCD4＋T細胞を含む移植片を注射した（ラパマイシン-細胞、n=6）。移植片生着を血糖レベルによりモニターした。糖血が250 mg/dlを超える際に移植片は拒絶されたとみなした。カプランマイヤー生存曲線をログランク検定により比較した。結果を図7に示す。
【００９０】
これらのデータ全体は、ラパマイシンが通常はナイーブ脾臓CD4＋T細胞コンパートメント中に存在する天然のCD4＋CD25＋FOXP3＋Tr細胞を選択的に増殖すること、ならびに、高用量のIL-2の存在下で3週間繰返し活性化したCD4＋CD25＋Tr細胞は、ラパマイシンの存在下で培養したときだけ、その表現型およびin vitro抑制機能を保存することを実証する。
【００９１】
実施例3の材料と方法
マウス
NOD雌マウスはCharles River Laboratories（Calco, Italy）から購入した。全マウスは特定の病原体未感染条件下で保持した。
【００９２】
マウスT細胞培養
CD4＋T細胞は、前糖尿病または糖尿病NODマウス由来の脾細胞の、αCD4 mAbをコートしたマイクロビーズとのインキュベーションにより得て、MiniMacsカラム（Miltenyi Biotec）に適用した。平均純度は95％であった。NODマウス脾臓から単離した1X106個のCD4＋T細胞を、コートした10μg/mlのαCD3および1μg/mlの可溶性αCD28 mAb（BD Biosciences）で刺激した。細胞を培地単独または100nMラパマイシン（Sigma、StLouis、MO）の存在下で培養した。7日間の刺激をそれぞれ3ラウンド実施した。第2ラウンドの刺激から、IL-2（BD Biosciences）を100U/ml加えた。
【００９３】
抑制実験
前糖尿病NODマウスから単離したCD4＋T細胞を、他（Lyons 1994）にも記載されているようにCFSE（Molecular Probes）で染色し、10μg/mlのαCD3 mAb（BD Biosciences）でコートした96ウェルプレート（2X105/ウェル）で培養した。3週間、培地またはラパマイシンで培養したT細胞を、1：1の比（すなわち105：105）で培養物に加え、そして5日後にその細胞を採集してFACSにより分析した。培養した細胞の存在下で分裂したCFSE＋細胞の％を、細胞を添加することなく分裂したCFSE＋細胞の％と比較した。
【００９４】
実施例3  ラパマイシンは正常および糖尿病NODマウス由来のCD4＋CD25＋Tr細胞を増殖する。
本実施例において、本発明者らは非肥満性糖尿病（NOD）マウス由来のTr細胞をex vivoで作製することを企てた。自然発生的なNODマウスの自己免疫性糖尿病は主に、自己攻撃性エフェクターT細胞の定量的および定性的変化から生じる。高齢マウスは実際、進行的にTr細胞介在性阻害をより受け難い糖尿病誘発性T細胞を保持する（Youら, Diabetes, 2005）。本発明者らはラパマイシンがNODマウス由来の機能性Tr細胞を増殖できるか、およびこれらの増殖したT細胞が調節機能を有するかを試験した。CD4＋T細胞を前糖尿病の11週齢NODマウスの脾臓から単離し、そして培地またはラパマイシンの存在下で抗CD3および抗CD28 mAbを用いてin vitroで活性化した。3ラウンドの刺激後に、ラパマイシンの存在下で培養したT細胞はCD4＋CD62L＋およびCD45RBlow細胞に非常にに富み、培地培養条件と比較してより高いレベルのCD25を発現した（データは示してない）。興味深いことに、ラパマイシンで増殖したNOD CD4＋ T細胞は調節マーカーを発現する細胞に富むだけでなく、in vitroで抑制性であった（図8）。
【００９５】
図8についてさらに詳しく説明すると、NODマウスから単離しかつラパマイシンの存在下でex vivo増殖したT細胞はin vitroで抑制性である。前糖尿病NODマウスの脾臓から単離したナイーブCD4＋T細胞を、CFSEで染色し、単独で（無刺激で）または抗CD3 mAbと共に培養した。NOD CD4＋ T細胞を3週間、培地またはラパマイシンの存在下で活性化し、そしてナイーブCFSE＋細胞に等数加えた（105：105）。培養の5日後に、細胞分裂をCFSE希釈のレベルによりモニターした。ヒストグラムはナイーブCD4＋CFSE＋T細胞のFACSプロファイルを示す。分裂細胞の％をそれぞれのヒストグラムの上部に示す。培地-細胞の存在下で、ナイーブ対照細胞の増殖と比較した抑制の％を左に示す。2実験のうちの代表的1実験を示す。
【００９６】
ex vivoで増殖したNOD T細胞の、自己免疫性糖尿病のin vivo抑制能を試験するために、ラパマイシン増殖した5 x 106個のT細胞を10週齢の前糖尿病NODマウスに注射し、そして糖尿病発症を30週間にわたってモニターした。40週齢に、全ての対照非注射NODマウスは糖尿病を発症し（n=6）、そして培地増殖したT細胞の養子導入（adoptive transfer）は糖尿病を予防しなかった。興味深いことに、ラパマイシン増殖したT細胞の導入は糖尿病発症をある程度予防した（60％糖尿病発生率n=6）（図9）。これらの予備データは、ラパマイシンが細胞増殖をin vitroで抑制する前糖尿病NODマウス由来のTr細胞をex vivoで増殖できること、およびこれらの細胞は自己免疫をin vivoで予防できることを示唆する。
【００９７】
図9についてさらに詳しく説明すると、ラパマイシン増殖したNOD細胞は糖尿病発症をin vivoで低減する。10週齢の前糖尿病NODマウスを、処置しないか（白丸、対照、n=6）またはNODマウスから単離した5X106個のCD4＋T細胞を注射し、そして3週間、培地（黒ひし形、n=6）またはラパマイシン（黒四角、n=5）で培養した。糖尿病発生率を血糖レベルによって40週齢までモニターした。
【００９８】
1型糖尿病を治療するための細胞療法に基づく手法は、糖尿病被験者から単離した自己T細胞の使用が必要でありそうである。それ故に、既に糖尿病である個体からTr細胞をex vivoで増殖できるかどうかは重大である。このために、本発明者らは、ラパマイシンが明らかに糖尿病であるNODマウス由来のTr細胞をex vivoで増殖できるかどうかを明らかにした。CD4＋T細胞を明らかに糖尿病であるNODマウスの脾臓から単離し、3週間、抗CD3およびCD28 mAbを用いてラパマイシンの存在または非存在下、ex vivoで増殖した。第3週の刺激の終わりに、増殖したT細胞を、同系CD4＋T細胞をin vitroで抑制する能力について試験した。ラパマイシンを用いて増殖したT細胞は効率的に細胞増殖を抑制した（図 10）。これらのデータは、ラパマイシンが糖尿原性T細胞を含む細胞プール由来のTr細胞も効率的にex vivoで増殖できることを示す。
【００９９】
図10についてさらに詳しく説明すると、糖尿病NODマウスから単離しかつラパマイシンの存在下で増殖したT細胞はin vitroで抑制性である。前糖尿病NODマウスの脾臓から単離したナイーブCD4＋T細胞をCFSEで染色し、単独で（無刺激で）または抗CD3 mAbと共に培養した。糖尿病NODから単離しかつ3週間、培地またはラパマイシンの存在下で活性化したCD4＋T細胞を、ナイーブCFSE＋細胞に等数（105：105）加えた。培養の5日後に、細胞分裂をCFSE希釈のレベルによりモニターした。ヒストグラムはCD4＋CFSE＋T細胞のFACSプロファイルを示す。分裂した細胞の％をそれぞれのヒストグラムの上部に示す。培地-細胞の存在下で、ナイーブ対照細胞の増殖と比較した抑制の％を左に示す。
【０１００】
これらの新しいデータ全体は、ラパマイシンが正常および糖尿病のNODマウスの脾臓中に存在する天然のCD4＋CD25＋FOXP3＋ Tr細胞を選択的に増殖することを実証する。
【０１０１】
実施例4〜8の材料と方法
細胞精製
末梢血単核球をLymphoprep（Amersham Biosciences）による密度勾配遠心分離により分離した。CD4＋T細胞をCD4＋T細胞濃縮キット（Miltenyi Biotec、Bergisch Gladbach、Germany）を用いてネガティブ選択により精製した。
【０１０２】
フローサイトメトリー
細胞を、示した表面Ab（全てBD Biosciences、Mountain View、CAより入手）で染色し、そしてCellQuestソフトウエア（BD Biosciences）を具備したFACScanフローサイトメトリーを用いて分析した。h-FOXP3の細胞質内染色は、抗FOXP3 APC染色キット（eBioscience）を用いて製品取扱説明書に従い実施した。
【０１０３】
T細胞培養
健康な被験者またはT1D患者のPBMCから単離したCD4＋T細胞を、可溶性の抗CD28（1μg/ml）mAb（BDBiosciences）および抗CD3（10μg/ml）が結合したプレートを用いて活性化した。細胞を、培地（x-vivo10）のみまたは100nMラパマイシン（Sigma、StLouis、MO）と共に培養した。7日間の刺激をそれぞれ3ラウンド実施した。第２ラウンドの刺激から、IL-2（BD Biosciences）を100 U/ml加えた。
【０１０４】
抑制実験
健康な被験者もしくはT1D患者由来の精製したCD4＋T細胞またはCD4−PBMCをCFSE（Molecular Probes、Eugene、OR）を用いて他（Lyons、1994 No.22）に記載されるように染色し、そして抗CD3（10μg/ml） および可溶性の抗CD28（1μg/ml）mAb（BD Biosciences）でプレコートした96ウェルプレート（2X105／ウェル）で培養した。3週間、培地またはラパマイシンで培養したT細胞を最初にCFSE染色と同じプロトコルに従ってSNARF（分子プローブ）で染色し、次いで1：1比（すなわち105：105）で培養物に加えた。7日後、細胞を採集してFACSにより分析した。培養細胞の存在下で分裂したCFSE＋細胞の％を、細胞を加えないで分裂したCFSE＋細胞の％と比較した。
【０１０５】
in vitroで増殖するT細胞に応答するCFSE＋（FL-1）の割合を、リンパ球および生存細胞（TOPRO−FL-4、Molecular Probes）についてゲートし、SNARF＋（FL-2）細胞を排除することにより計算した。所与のサイクル（分裂：n）におけるゲートした細胞数（事象）を2ｎで除算し、それらの由来する最初の前駆体細胞の％を計算した。分裂1〜6からの最初の前駆体の和は、増殖した前駆体細胞の数を表す。CFSE＋分裂細胞の％を次式：[（増殖した前駆体1〜6の数／全前駆体0〜6の数）X100]（Lyons、1994 No.22）により計算した。
【０１０６】
実施例4  ラパマイシンはCD4＋T細胞のTCR介在性増殖を強力に低減し、T細胞アネルギーを誘導しない。
CD4＋T細胞を、培養（第1週）の開始時、または1（第2週）、または3（第4週）ラウンドの刺激の終わりにCFSEで染色した。100nMラパマイシンの存在または非存在下で、かつ抗CD3＋抗CD28 mAbの存在下でCFSE＋CD4＋T細胞をin vitroで活性化した。CFSE希釈を活性化後、7日目にモニターした。6実験のうちの代表的1実験を図11Aに提示する。
【０１０７】
図11Bに、ラパマイシンの存在または非存在下での培養の始め（出発）および終わり（第4週）に存在するCD4＋T細胞の数を示す。それぞれの線は1つの実験を表す（n＝14）。
【０１０８】
CD4＋T細胞をCFSEで染色し、そして、ラパマイシンの存在または非存在下で抗CD3＋抗CD28 mAbを用いて活性化した。7日後、細胞をヨウ化プロピジウム（PI）で染色し、そしてFACSにより分析した。数字は分裂死細胞（CFSEdiluted-PI＋）、非分裂死細胞（CFSEundiluted-PI＋）、非分裂生細胞（CFSEundiluted-PI−）、および分裂生細胞（CFSEdiluted-PI）の％を表す。図11Cにおいて、5実験のうちの代表的1実験を提示する。
【０１０９】
抗CD3＋抗CD28 mAb（T培地）または抗CD3＋抗CD28 mAb＋ラパマイシン（Tラパマイシン）による3ラウンドの刺激の後、CD4＋T細胞をCFSEで染色し、そして抗CD3＋抗CD28 mAbを用いて該化合物および外因性IL-2の非存在下で再刺激した。CFSE希釈を活性化後7日目にモニタリングした。数字は分裂細胞の％を示す。3実験のうちの代表的な1実験を図11Dに提示する。
【０１１０】
実施例5  ラパマイシンで増殖したCD4＋T細胞は調節マーカーを発現し、同系および同種CD4＋およびCD8＋T細胞の増殖を抑制する。
培養前に新しく単離したCD4＋T細胞によるCD25およびFOXP3の発現をFACSにより試験した。結果を図12Aに示す。
【０１１１】
抗CD3＋抗CD28 mAb（T培地）または抗CD3＋抗CD28 mAb＋ラパマイシン（Tラパマイシン）を用いた3ラウンドの刺激後に、CD4＋T細胞を1週間、さらなる刺激なしにIL-2（10 U/ml）の存在下で放置した。7日後に、細胞をFACSにより分析した。8実験のうち代表的な1実験を図12Bに提示する。
【０１１２】
健康な被験者から単離した精製CD4＋T細胞を、CFSEで染色し、そして抗CD3＋抗CD28 mAbを用いて活性化した（レスポンダーCD4＋T細胞、図12C左パネル）。あるいは、健康な被験者から単離したCD4−細胞をCFSEで染色し、そして抗CD3＋抗CD28 mAbを用いて活性化した。CD8＋T細胞の増殖後、FACS分析時に抗CD8 mAbで染色した（レスポンダーCD8＋T細胞、図12C右パネル）。レスポンダー（自己）として使用した同じ被験者または無関係なドナー（アロ（allo））から単離し、かつ抗CD3＋抗CD28 mAb（T培地）または抗CD3＋抗CD28 mAb＋ラパマイシン（Tラパマイシン）を用いて3週間活性化したCD4＋T細胞を、レスポンダーCFSE＋細胞に等数（105：105）加えた。培養の7日後、細胞分裂をCFSE希釈のレベルによりモニターした。ヒストグラムはCFSE＋T細胞のFACSプロファイルを示す。培養T細胞の非存在または存在下で増殖するCFSE＋細胞の量を計算した。それぞれの培養条件で分裂した細胞の％を示す。レスポンダー細胞の増殖と比較した抑制の％を示す。代表的1実験を図12Cに提示する。
【０１１３】
それぞれ実施した実験における抑制の％を図12Dに示す。それぞれのドットは1実験を表す。線は抑制の平均値を表す。抑制対レスポンダー自己CD4＋T細胞と抑制対アロCD4＋T細胞との間に統計的に有意差はなかった。
【０１１４】
実施例6  ラパマイシンはTCRが介在するCD4＋CD25−T細胞の増殖を選択的にブロックするが、CD4＋CD25＋Tr細胞の増殖をブロックしない。
CD4＋CD25−およびCD4＋CD25brightT細胞をFACS分類した。次いで、分類したCD4＋CD25−T細胞をCSFEで染色し、そして分類したCD4＋CD25＋T細胞を未分類のCD4＋T細胞中に存在するのと同じ量（5％）で加えた（図13、左パネル）。あるいは、分類したCD4＋CD25＋T細胞をCSFEで染色し、そして分類したCD4＋CD25−T細胞を未分類のCD4＋T細胞中に存在するのと同じ量（95％）で加えた（図13、右パネル）。2つの別個のCFSE染色細胞集団を抗CD3＋抗CD28 mAb+IL-2を用いて100nMラパマイシンの存在または非存在下で活性化した。CFSE希釈を活性化後7日目にモニターした。数字はCFSE＋分裂細胞の％を示す。2実験のうちの代表的な1実験を図13に提示する。
【０１１５】
実施例7  正常ドナーとT1D患者のCD4＋T細胞は類似したレベルのFOXP3を発現する。
FOXP3発現を正常ドナー（ND）および1型糖尿病の患者（T1D）から単離した精製CD4＋T細胞でFACSにより試験した。1つの代表的ヒストグラムを図14に示す。試験したそれぞれのT1D患者（n=5）およびNDにおけるCD4＋FOXP3＋細胞の％も示す。それぞれのドットは1ドナーを表す。線はCD4＋FOXP3＋T細胞の平均を表す。ND対T1D被験者におけるFOXP3発現細胞間に統計的有意差はなかった。分析をCD4＋CD25brightT細胞で行ったとき、NDとT1D患者との間にFOXP3発現の差は観察されなかった。
【０１１６】
実施例8  ラパマイシンで増殖したT1D患者由来のCD4＋T細胞はCD4＋およびCD8＋T細胞の増殖を抑制する。
正常ドナーから単離したCD4＋T細胞をCFSEで染色し、抗CD3＋抗CD28 mAbを用いて活性化した（レスポンダーCD4＋T細胞、図15左パネル）。あるいは、T1D患者（中央パネル）または正常ドナー（右パネル）から単離したCD4−細胞をCFSEで染色し、抗CD3＋抗CD28 mAbを用いて活性化した。CD8＋T細胞の増殖後、FACS分析時に抗CD8 mAbで染色した（レスポンダーCD8＋T細胞）。レスポンダー（自己）として使用した同じ被験者からまたは無関係なドナー（アロ）から単離し、かつ抗CD3＋抗CD28 mAb（T培地）または抗CD3＋抗CD28 mAb＋ラパマイシン（Tラパマイシン）を用いて3週間活性化したCD4＋T細胞を、レスポンダーCFSE＋細胞に等数（105：105）加えた。培養7日後、細胞分裂をCFSE希釈のレベルによりモニターした。図15のヒストグラムはCFSE＋T細胞のFACSプロファイルを示す。培養T細胞の非存在または存在下で増殖するCFSE＋細胞の量を上記方法で記載されるように計算し、そしてそれぞれの培養条件で分裂した細胞の％を示す。レスポンダー細胞の増殖と比較した抑制の％を示す。
【０１１７】
実施した各実験における抑制の％を提示する。それぞれのドットは1実験を表す。線は抑制の平均を表す。
【０１１８】
上記明細書に記述された全ての刊行物は参照により本明細書に組み込まれる。記載した本発明の方法 および 系の様々な改変と変法は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態との関係で記載されているが、特許請求の範囲に係る発明はかかる特定の実施形態に不当に限定されるものではない。実際、細胞生物学および／または分子生物学または関係分野の当業者に明らかである、本発明を実施するために記載した様式の様々な改変は、請求の範囲内に含まれることを意図している。
【０１１９】
参考文献
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2008531009.tif 000006
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【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】図１は実施例1の結果を示す。
【図２】図2は実施例2の結果を示す。
【図３】図3は実施例2の結果を示す。
【図４】図4は実施例2の結果を示す。
【図５】図5は実施例2の結果を示す。
【図６】図6は実施例2の結果を示す。
【図７】図7は実施例2の結果を示す。
【図８】図8は実施例3の結果を示す。
【図９】図9は実施例3の結果を示す。
【図１０】図10は実施例3の結果を示す。
【図１１】図11は実施例4の結果を示す。
【図１２−１】図12-1は実施例5の結果を示す。
【図１２−２】図12-2は実施例5の結果を示す。
【図１３】図13は実施例6の結果を示す。
【図１４】図14は実施例7の結果を示す。
【図１５−１】図15-1は実施例8の結果を示す。
【図１５−２】図15-2は実施例8の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【国際調査報告】
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