(57)【要約】本発明は（ａ）蛋白質を含有した水溶液に燐脂質を分散させ、分散液を製造する段階；（ｂ）前記分散液に剪断力（shearing force）を付加（applying）する段階；（ｃ）段階（ｂ）の結果物に燐脂質を追加的に添加し、段階（ｂ）より高い剪断力を付加する段階；及び（ｄ）追加的な燐脂質と前段階より高い剪断力を利用して、段階（ｃ）を繰返し実施して望む粒子径及び包囲効率を有するナノリポソームを成型する段階を含む蛋白質が包囲されたナノリポソームの製造方法、さらに、蛋白質-包囲ナノリポソームに関する。【選択図】図６
2008534580.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む蛋白質が包囲されたナノリポソームの製造方法：
（ａ）蛋白質を含有する水溶液に燐脂質を分散させ分散液を製造する段階；
（ｂ）前記分散液に剪断力（shearing force）を付加（applying）する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の結果物に燐脂質を追加的に添加し、段階（ｂ）より高い剪断力を付加する段階；及び
（ｄ）追加的な燐脂質と前段階より高い剪断力を利用して、段階（ｃ）を繰返し実施して、望む粒子径及び包囲効率を有するナノリポソームを成型する段階。
【請求項２】
前記蛋白質はホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、信号伝達蛋白質又はその一部分、抗体又はその一部分、短鎖抗体、結合蛋白質又はその結合ドメイン、抗原、付着蛋白質、構造蛋白質、調節蛋白質、毒素蛋白質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子及び植物生体防御誘導蛋白質で構成された群より選ばれることを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項３】
前記蛋白質は人間成長ホルモンであることを特徴とする第２項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項４】
前記燐脂質は大豆レシチン、ジステアロイルホスファチジルコリン、水添大豆レシチン、卵(egg)レシチン、ジオレオイルホスファチジルコリン、水添卵レシチン、ジエルライトイルホスファチジルコリン、ジファルミトイルホスファチジルコリン及びジミリストイルホスファチジルコリンから構成された群より選ばれる一つ又はそれ以上の燐脂質であることを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項５】
前記燐脂質は水添大豆レシチンであることを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項６】
前記剪断力の付加は高圧均質機、音波発生機（sonicator）、微小流動機（microfluidizer）、押出器（extrusion apparatus）又はフレンチプレス（French press）を利用して実施されることを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項７】
前記剪断力の付加は、高圧均質機を利用して実施されることを特徴とする第６項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項８】
前記段階（ｂ）−（ｄ）によりなされる順次的に増加する剪断力の付加は0-1200barの範囲で圧力を増加させながら高圧均質機を利用して実施されることを特徴とする第７項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項９】
前記高圧均質機での圧力の増加は0-800barの範囲でなされることを特徴とする第８項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１０】
前記高圧均質機での圧力の増加は50-200barずつ増加することを特徴とする第８項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１１】
前記高圧均質機での圧力の増加は100barずつ増加することを特徴とする第10項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１２】
前記段階（ａ）−（ｄ）によりなされる順次的に増加する燐脂質の量は0w/v(%)から30w/v(%)まで増加することを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１３】
前記燐脂質の量の順次的増加は1-5w/v(%)ずつ増加することを特徴とする第12項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１４】
前記最終的に成型されたナノリポソームは50-350nmの粒子径を有することを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１５】
前記最終的に成型されたナノリポソームは小型単一層小胞（small unilamellar vesicle）構造を有することを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１６】
前記最終的に成型されたナノリポソームは液状の剤形を有することを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１７】
前記最終的に成型されたナノリポソームに包囲された蛋白質は、包囲される以前の蛋白質の活性を90-100%保有することを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１８】
蛋白質を含む蛋白質-包囲ナノリポソームにおいて前記ナノリポソームの粒子径は50-350nmであり、小型単一層小胞（small unilamellar vesicle）構造を有し、液状の剤形を有し、ナノリポソームに包囲された前記蛋白質は包囲される以前の蛋白質の活性を90-100%保有することを特徴とする蛋白質-包囲ナノリポソーム。
【請求項１９】
前記ナノリポソームは人間成長ホルモンを包囲することを特徴とする第18項記載の蛋白質-包囲ナノリポソーム。
【請求項２０】
前記ナノリポソームは前記第１項乃至第17項のいずれか一つの項の方法により製造されたことを特徴とする第18項記載の蛋白質-包囲ナノリポソーム。
【請求項２１】
前記蛋白質-包囲ナノリポソームを室温で10ヶ月貯蔵した場合、ナノリポソームに包囲された蛋白質は包囲以前の、蛋白質元来の活性の72-80%活性を保有することを特徴とする第18項記載の蛋白質-包囲ナノリポソーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は蛋白質-包囲ナノリポソームの製造方法及び蛋白質-包囲ナノリポソームに関する。
【背景技術】
【０００２】
人間成長ホルモンのような高分子（分子量約22kD）は皮膚角質層を通過できないものとして一般的に知られている。皮膚を通じて効率的に伝達できる分子量は約500Da以下であると一般的に認識されていて、浸透補助剤（penetration enhancers）の補助を受ける場合にも最大で分子量約2kDが超えられないものと報告されている。
【０００３】
皮膚伝達効率測定実験は、主に医薬品を対象に実施されるものの、in vivoでは皮膚に薬物を適用した後、時間経過に伴う薬物の血中濃度を測定し、in vitroではFrantz cellを利用して薬物の時間経過に伴う皮膚透過量を測定するか、又は人工皮膚を利用して同一な方法により測定した。医薬品の場合とは別に化粧品の場合には有効成分が皮膚を透過して血管に達するのが常に好ましいことでもない。特に、人間成長ホルモンのような医薬品として使用される成分である場合にはなおさらである。例えば、人間成長ホルモンを化粧料として利用する場合には、人間成長ホルモンを皮膚の毛嚢までにのみ伝達して皮膚表皮の幹細胞又は、幹細胞を取囲む毛嚢の上皮外毛根鞘（outer root sheath）に存在する人間成長ホルモンの受容体を刺戟して直接、間接的に皮膚再生速度を調節するか、又は毛嚢基質細胞層（hair follicle matrix）に伝達して発毛や育毛作用を促進又は抑制するか、若しくは、メラニンの合成を調節したり、皮脂腺に達するようにして皮脂分泌を調節又は、汗腺に達するようにして汗の分泌を調節、又は毛根鞘（hair root sheath）を取囲む結合組織の繊維芽細胞に間接的に作用して弾力繊維の分泌を調節、又は皮下脂肪細胞に間接的に作用して皮下脂肪分解を調節するのがより好ましい。
【０００４】
一方、蛋白質のような高分子を皮膚に塗布して真皮層に伝達する方法として、ナノリポソームを利用する方法が擧論されているものの、若し、伝達されるとしても角質層の稠密さ、人間成長ホルモンの大きな分子量と親水性を鑑みるに、人間成長ホルモンを包囲したリポソームが皮膚表皮の角質層に直接浸透して伝達されるよりは、先ず、リポソームの助けにより毛嚢に伝達された人間成長ホルモンが、角質層が発達されていないので真皮層との間隔が薄い毛嚢の根鞘を取囲んだ細胞組織と作用して、間接的に真皮層に影響を及ぼすと見る観点がより妥当である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
リポソームを蛋白質伝達の運搬体や、蛋白質を取囲む手段として考慮するに、次の五つの点に特に留意しなければならない：(a)リポソームで取囲もうとする蛋白質に対するリポソーム内の包囲効率（encapsulation efficiency）、(b)蛋白質を含有したリポソームのサイズ範囲、(c)蛋白質を含有したリポソームを生産する方法の産業的適用の容易性、(d)リポソームで取囲み、保管する過程でのリポソームと蛋白質の安定性可否、(e)リポソームによる副作用等がそれである。
【０００６】
第１．薬物のリポソーム内の包囲効率を高める方法を模索する時、考慮すべき点等がある。薬物が疎水性である場合には薬物はリポソームを構成する二重脂質膜の内膜や外膜のいずれか一側の膜に属する脂質の疎水性を帯びた内部（尾の部分）や、二重膜の内膜と外膜間に位置するか、又は内膜と外膜の脂質内部に亙り位置するようになる。この場合、薬物相互間の反発さえなければ、リポソーム内の薬物の包囲効率は、リポソームのサイズとは関係なくリポソームを構成する脂質の総量に比例するようになる。しかしながら、一般的に、受容液中の単位体積当り溶解された単一層小胞（unilamellar vesicle）であるリポソームを構成する脂質の総量は、リポソームのサイズが小さい程増加する。従って、疎水性である薬物の単一層リポソーム内包囲効率は、リポソームのサイズが小さい程、又はリポソームを構成する脂質の量が多い程さらに増加する。ただ、多重層小胞を多量含むリポソームの場合には、単位脂質量を基準にしてリポソームで包囲された溶液の量は、減少して溶液単位嵩当りリポソームを構成する脂質の総量は増加するので、疎水性である薬物の包囲効率を極大化させ得る。一方、薬物が親水性の場合はリポソームの二重脂質膜により、包囲される水溶液内に薬物が存在するようになることから、リポソーム内に包囲される薬物の量は、リポソームで取囲まれた溶液の量に比例する。濃度が一定な親水性薬物を含有する単一層リポソームの包囲効率を考慮するに、便宜上リポソームを構成する脂質の量が制限的な場合と、それとは別にリポソームのサイズが一定していて単位リポソーム内に包囲し得る薬物の量が制限的な場合とに分けて考慮すべきである。脂質の量が限定されている場合は、単位リポソームのサイズが大きい程包囲し得る薬物の量がより多くなり、単位リポソーム内に包囲し得る薬物の量が制限的である場合、つまり、単位リポソームのサイズ範囲が定められている場合には、単位リポソームの数が多い程包囲する薬物の量が多くなる。従って、多くは薬物を含有する単一層リポソームのサイズの範囲が限定的であることから、リポソームの数を増加させる程薬物に対するリポソーム内包囲効率が増加する。一般的に、リポソームのサイズが限定的であれば、単一層リポソームが多重層リポソームよりも溶液がより多く含有できる。
【０００７】
第２．水溶性薬物を含有するリポソームには、一般的に、サイズが均一でサイズの範囲が200nm以下の小型単一層小胞（SUV; small unilamellar vesicle）を選好する。サイズが小さい程目標組織への伝達効率を高めることができ、サイズが均一であれば、一貫性のある薬物の薬動学的（pharmacokinetic）結果を期待することができ、単一層小胞であれば、相対的に多量の薬物が単位リポソームに包囲できる。リポソームの組成決定と性質付与はリポソームに包囲された薬物をどのような方式で目標組織に到達させようとするかにより異なる。例えば、リポソームの二重脂質膜を構成する成分にコレステロールが含まれている時、リポソームの血液内循環時間が長くなる。注射用リポソームの場合、血液に沿って循環するリポソームは細網内皮系により除去されるものの、一般的に、リポソームのサイズが大きい程、又電荷を多く帯びる程、一層迅速に除去される。従って、注射剤として使用されるリポソームはサイズが均一で、サイズの範囲が200nm以下の小型単一層小胞が選好される。
【０００８】
第３．通常実験室水準でrotating evaporatorを利用して燐脂質膜を造り、リポソーム内に入れようとする薬物の水溶液を注ぎ混合してリポソームを生産する方法は、リポソーム内の薬物の包囲効率が高い長所はあるものの、産業的にリポソームを生産するには適切でない。しかも、このような方式で製造されたリポソームは大型多重層小胞（LMV：large multilamellar vesicle）が大部分で、これを小型単一層小胞に転換させるには、液体窒素に複数回凍結と解凍を繰返す過程を経るか、又は超音波で粉砕又は押出器（extruder）を通過させ、望むサイズにリポソームを微細粒子化しなければならない。従って、小型単一層小胞を産業的に多量生産するには高圧均質機を利用して生産するのが効率的である。高圧均質機の短所は、リポソーム内薬物の包囲効率が低い点である。しかしながら、最近リポソーム内薬物の包囲効率を高めながら、小型単一層小胞を大量生産する方法が開発された。ただ、この方法は包囲効率を高める為にはゲル状のリポソームのみでしか作ることができず、その製造過程で高圧均質機が頻繁に詰まり産業的に活用するには不適切な短所がある。
【０００９】
第４．リポソームで取囲み保管する過程でのリポソームと薬物の安定性可否はリポソームをGFC（gel filtration chromatography）を介して分離し、リポソーム内に包囲された薬物の活性をリポソームを破壊した後、その薬物の量を定量するか、又は生物学的活性を測定することにより測定できる。人間成長ホルモンのような蛋白質を一般的に空気中に露出させるか、又は高圧均質機等を通過すると酸化若しくはconformationの変形が起こり、その活性を失う虞が多い。
【００１０】
第５．リポソームの副作用の問題点としては、リポソームを生成する主成分である卵又は大豆の燐脂質成分は長期間化粧品の原料として使用され、皮膚に対する副作用のないことは、既によく知られた事実である。従って、このような燐脂質を利用して望む特性を有する蛋白質-包囲リポソームが製造できるとすれば、皮膚副作用は殆ど発生する可能性がない為、蛋白質を含有するリポソーム製剤は化粧料又は医薬として問題がない。さらに、人間成長ホルモンのような蛋白質は主に、大腸菌や酵母のような微生物から遺伝工学的な方法を利用して生産されるものの、蛋白質を大腸菌を利用して生産する場合は、大腸菌細胞壁の主成分であるLPS（lipopolysaccharide）のようなendotoxinが蛋白質に含まれないように除去する。一般的に、LPSは蛋白質を製剤する過程で除去できる。
【００１１】
一方、人間成長ホルモンのような高分子量の蛋白質を含有するリポソーム或いは蛋白質が皮膚角質層を透過して表皮細胞、表皮の幹細胞又は真皮細胞に達するには常識的には殆ど不可能である。本発明では、初めてリポソームに包囲された人間成長ホルモンがリポソームの助けにより毛嚢に伝達され、毛嚢を取囲む細胞組織に存在する人間成長ホルモンの受容体との相互作用を通じて直接的に毛嚢を構成する細胞組織と作用するか、又は間接的に毛嚢を取囲む細胞組織に影響を及ぼすことにより、従来では全く予想のできなかった人間成長ホルモンの皮膚に対する効能とその機転を提示している。
本明細書で全体に亙り多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容はその全体として、本明細書に参照として挿入され、本発明が属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。
【００１２】
本発明者等は分子量が大きい蛋白質を高い包囲効率で包囲しながらも、所望する粒子のサイズを有し、包囲された蛋白質の活性が殆ど変化がなく、液状のナノリポソームを製造するプロトコルを開発しようと努力した。その結果、ナノリポソームを形成する為の組成物に剪断力を付加するにおいて、低い剪断力から始まり、高い剪断力へと順次的に剪断力を高める方式で剪断力を付加し、燐脂質の量も順次的に増加させ添加する場合には、前記の特性等を表す蛋白質-包囲ナノリポソームが製造できることを確認することにより、本発明を完成するに至った。
【００１３】
従って、本発明の目的は蛋白質が包囲されたナノリポソームの製造方法を提供することにある。
本発明の他の目的は蛋白質-包囲ナノリポソームを提供することにある。
本発明のさらに他の目的及び利点は下記の発明の詳細な説明、請求範囲及び図面により一層明確になる。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明の一態様によれば、本発明は下記の段階を含む蛋白質が包囲されたナノリポソームの製造方法を提供する。(a)蛋白質を含有する水溶液に燐脂質を分散させ分散液を製造する段階；(b)前記分散液に剪断力（shearing force）を付加（applying）する段階；(c)段階(b)の結果物に燐脂質を追加的に添加して、段階(b)より高い剪断力を付加する段階；及び(d)追加的な燐脂質と前段階より高い剪断力を利用して、段階(c)を繰返し実施して望む粒子径及び包囲効率を有するナノリポソームを成型する段階。
【００１５】
本発明者等は分子量が大きい蛋白質を高い包囲効率で包囲しながらも所望する粒子のサイズを有し、包囲された蛋白質の活性が殆ど変化がなく、液状のナノリポソームを製造するプロトコルを開発しようと努力した。その結果、ナノリポソームを形成する為の組成物に剪断力を付加するにおいて、低い剪断力から始まり、高い剪断力へと順次的に剪断力を高める方式で剪断力を付加し、燐脂質の量も順次的に増加させて添加する場合には、前記の特性等を表す蛋白質-包囲ナノリポソームを製造することができた。
【００１６】
本発明によりナノリポソーム内に包囲できる蛋白質は特に制限されず、ホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、信号伝達蛋白質又はその一部分、抗体又はその一部分、短鎖抗体、結合蛋白質又はその結合ドメイン、抗原、付着蛋白質、構造蛋白質、調節蛋白質、毒素蛋白質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子及び植物生体防御誘導蛋白質を含むものの、これに限定されない。好ましくは、本発明に利用される蛋白質はホルモンであり、最も好ましくは、人間成長ホルモン（human growth hormone：hGH）である。
【００１７】
本発明によれば、水溶液に溶解されている状態の蛋白質が利用される。好ましくは、蛋白質は本然の活性が維持できるようにその蛋白質の最適（optimum）pHで緩衝力を有する緩衝溶液に溶解されているものである。例えば、hGHのように約pH7.0で最適pHを有する蛋白質はpH6.5-7.5において緩衝力を有するNaH2PO4, sodium bicarbonate, imidazole(glyoxaline)-HCl又はMOPS緩衝液に溶解されているのが好ましい。本発明がhGH-包囲ナノリポソームを製造する為に利用される場合には、好ましくは、hGHはNaH2PO4(pH6.5-7.5)溶解されているものであり、より好ましくは、EDTA(ethylene diamine tetraacetic acid)を含有するNaH2PO4(pH 6.5-7.5)溶解されているものである。hGH水溶液でNaH2PO4の濃度は5-100mMが好ましく、より好ましくは、10-50mMであり、最も好ましくは、約20mMである。
【００１８】
本発明で利用される蛋白質水溶液は蛋白質の安定化の為に、適切なイオン強度（ionic strength）を与える為に、塩化ナトリウム及びEDTAのような水溶性塩を追加的に含め得る。さらに、蛋白質水溶液は蛋白質の安定化の為、アミノ酸、dipeptide、tripeptide、oligopeptide等のような水溶性peptide類、アルブミン、コラーゲンのような水溶性蛋白質、一糖、二糖、三糖、オリゴ糖のような水溶性糖類と、デキストリン(dextrin)のような水溶性多糖類と、キトサンのような水溶性複合多糖類と、硫酸コンドロイチン（chondroitin sulfate）、ヒアルロン酸（hyaluronic acid）のような水溶性glycosaminoglycanとPEG(polyethylene glycol)、ポリビニルアルコール（polyvinyl alcohol）のような水溶性ポリマー等を追加的に含め得る。
【００１９】
本明細書における用語“人間成長ホルモン（hGH)”とは、人間成長ホルモン活性を表す如何なるポリペプチドも意味し、例えば、mature hGH、Met-hGH、hGH variants、modified-hGH、hGH fragments又はhGH analogueのいずれか一つでもあり得る。好ましくは、mature hGH又はMet-hGHである。mature hGHは人体の血液内に存在する主（major）人間成長ホルモンのアミノ酸配列を有する人間成長ホルモンを指し、Met-hGHはmature hGHのN-末端にメチオニンが添加された人間成長ホルモンを指し、hGH variantsは人体内に存在する主人間成長ホルモン以外の、人間成長ホルモンのアミノ酸配列を有する人間成長ホルモンを指し、modified hGHは人間成長ホルモンの一つ以上のアミノ酸残基にpegylationやglycation等のような添加物の付着により変形された人間成長ホルモンを指し、hGH fragmentsは人間成長ホルモンのアミノ酸配列の一部を遺伝工学的方法、又は生化学的方法により除去した人間成長ホルモンを指し、hGH analogueは人間成長ホルモンのアミノ酸配列を遺伝工学的方法により、類似した性質を有する別のアミノ酸配列に変形させた人間成長ホルモンを指す。
【００２０】
本明細書において、用語“燐脂質”とは、特に別途の言及がない限り、リポソームが形成できる燐脂質を意味し、レシチン（ホスパチジルコリン）、ホスパチジルセリン、ホスパチジルエタノールアミン、ホスパチジルグリセロール、ホスパチジルイノシトール及びスピンコマイエリンを含むものの、これに限定されるものではない。好ましくは、本発明に利用される燐脂質はレシチンであり、最も好ましくは、水添レシチンである。レシチンは卵、大豆及び他の植物からも得られ、最も好ましくは、大豆レシチンである。本発明に利用できる合成、半合成及び天然レシチンは、大豆レシチン、ジステアロイルホスパチジルコリン、水添大豆レシチン、卵(egg)レシチン、ジオルレオイルホスパチジルコリン、水添卵レシチン、ジエライトイルホスパチジルコリン、ジパルミトイルホスパチジルコリン及びジミリストイルホスパチジルコリンを含むものの、これに限定されない。最も好ましくは、本発明に利用される燐脂質は水添大豆レシチンである。
【００２１】
蛋白質を含有した水溶液に燐脂質を分散する過程は、当業界に公知された通常的な方法により実施することができ、例えば、撹拌過程を介して分散させることができる。
リポソームを形成させる為の分散液を製造する段階で利用される蛋白質の濃度は、一般的に、0.1-50mg/ml、好ましくは0.2-30mg/ml、より好ましくは0.3-20mg/ml、最も好ましくは0.8-3mg/mlである。利用される燐脂質の初期濃度は、分散液の総重量対比1-50w/v%、好ましくは2-40w/v%、より好ましくは3-20w/v%、最も好ましくは5-10w/v%である。
引き続き前記分散液に剪断力（shearing force）を付加して、蛋白質-包囲リポソームを形成させる。
剪断力を付加する方法は、当業界に公知されており、好ましくは、高圧均質機（high pressure homogenizer）、音波発生機（sonicator）、微小流動機（microfluidizer）、押出器（extrusion apparatus）又はフレンチプレス（French press）を利用して実施され、最も好ましくは、高圧均質機を利用して実施される。
【００２２】
本発明の最も大きい特徴は、剪断力を付加する過程で高い剪断力を一定して分散液に供給するのではなく、低い剪断力から初めて高い剪断力へと順次的に剪断力を高める方式で剪断力を付加することである。さらに、本発明の特徴によれば、剪断力を増加させるにつれて燐脂質の量も順次的に増加させる。
好ましくは、前記段階(b)-(d)によりなされる順次的に増加する剪断力の付加は、0-1200barの範囲、より好ましくは、0-1000barの範囲、最も好ましくは、0-800barの範囲で圧力を増加させながら高圧均質機を利用して実施される。高圧均質機での圧力の増加は好ましくは、50-200barずつ、より好ましくは約100barずつ増加させる。
【００２３】
本発明の好ましい具現例によれば、前記段階(a)-(d)によりなされる順次的に増加する燐脂質の量は、0w/v(%)から30w/v(%)まで増加する。前記燐脂質の量の順次的増加は、好ましくは1-5w/v(%)ずつ増加させる。
【００２４】
高圧均質機での処理過程は、好ましくは50℃以下、より好ましくは40℃以下、さらにより好ましくは30℃以下、最も好ましくは25-30℃で実施されるようにする。
それぞれの圧力下での高圧均質機処理は、好ましくは数回、より好ましくは2-5回を実施する。高圧均質機の処理は総5-40回、好ましくは10-40回、より好ましくは20-40回、最も好ましくは20-30回実施する。
【００２５】
本発明の具体的な一実施例により、本発明の過程を例示的に説明すれば次の通りである：リポソームを形成させることができ、蛋白質と燐脂質を含む分散液を0 barで高圧均質機に通過させ、このような処理過程を３回繰返す。引き続き高圧均質機-処理された産物に燐脂質を1-5w/v(%)添加し、100barで高圧均質機に３回通過させ、処理された産物に燐脂質を1-5w/v(%)添加し、200barで高圧均質機に３回通過させる。このような高圧均質機処理過程を燐脂質を添加しながら（最大30w/v(%)まで）増加された圧力下で最大800barまで段階的に実施し、最終的に所望する特性を有する蛋白質-包囲ナノリポソームを製造する。
【００２６】
このような段階的な燐脂質の量の増加及び剪断力の増加を介して、ナノリポソームを製造するようになると、早い時間内に熱力学的に安定した形態を取るようになり、燐脂質の溶解度を高め、従って、リポソーム化率が高くなり、従って、蛋白質の包囲効率も増加する効果を有するようになることから、前記の所望する特性を有するナノリポソームが生成される。
【００２７】
本発明の過程により、最終的に収得するようになるナノリポソームは、50-350nmの粒子径、好ましくは50-300nm、より好ましくは100-250nm、最も好ましくは150-200nmの粒子径を有する。ナノリポソームの小さい粒子のサイズは、本発明のナノリポソームが望む目標組織への浸透を容易にする。
【００２８】
本発明により製造されるナノリポソームは、好ましくは小型単一層小胞（small unilamellar vesicle）構造を有する。
【００２９】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のナノリポソームは液状の剤形を有し、これは下記の実施例Ｉで確認できる。
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の方法は50%以上の包囲効率を表す。用語“包囲効率”とは、本発明の過程で最初利用される蛋白質水溶液に含まれている蛋白質の量に対するナノリポソームに包囲された蛋白質の量の比率を意味する。より好ましくは、本発明の方法は70%以上の包囲効率、よりさらに好ましくは80%以上の包囲効率、最も好ましくは90%以上の包囲効率を表す。
【００３０】
このようなナノリポソームの高い包囲効率は、燐脂質の含量を増加させることにより達成できる。しかしながら、燐脂質の含量が高くなると常温では燐脂質を分散させるのが難しくなるばかりでなく、粘度が増加してゲル状態となるので、高圧均質機のような装置を通過する過程で、リポソーム-形成分散液が通る通路を塞ぐので、作業上の連続性と生産効率を阻害する。一方、燐脂質の分散を増進させる為に、熱を加えると燐脂質の分散度を高め得るものの、人間成長ホルモンのような蛋白質は一般的に、60℃以上では変形され、生物学的活性を失うようになる。しかしながら、本発明によれば、燐脂質含量が好ましくは最大20w/v(%)、より好ましくは最大25w/v(%)、最も好ましくは最大30w/v(%)になるようにナノリポソームを製造することができて、高い包囲効率のナノリポソームを製造できる。
【００３１】
人間成長ホルモンのような巨大蛋白質分子を、皮膚を通じて目標組織に局所的に伝達するものの、全身に広がるとか皮膚以外の組織には影響を及ぼさないようにする為には、適切な蛋白質の剤形化が極めて重要である。さらに、人間成長ホルモンのような蛋白質は、一般的に、溶液上で不安定な為変形するか、又は生物学的活性を失うか、若しくは分解され易いので、皮膚局所表面投与用製剤（特に、化粧料）として使用される為に、基本的に要求される条件である溶液上での安定性と長期間保管性を備え難い。
【００３２】
上述した蛋白質の剤形上の問題点を本発明は独特な蛋白質-包囲ナノリポソーム製造方法で解決した。本発明によれば、ナノリポソームに包囲された蛋白質（特にhGH)は包囲される前の物理化学的性質と、生物学的活性を殆どそのまま維持し（参照：実施例VII）、長期間保存性が極めて優れている（参照：実施例V）。
【００３３】
本発明により製造された蛋白質-包囲ナノリポソームにおいて、ナノリポソームに包囲された蛋白質は包囲される前の蛋白質の活性を少なくとも60%、好ましくは少なくとも70%、より好ましくは少なくとも80%、よりさらに好ましくは90-100%、最も好ましくは約100%、保有する。このような活性維持は従来の技術と比較するに、驚異的な効果である。
【００３４】
本発明によれば、人間成長ホルモンのような高価の蛋白質をリポソーム内に包囲するにおいて、産業的生産が容易になるように高圧均質機等を利用してリポソームを生産するものの、生産性が高い連続的製造が可能なように液状を維持しながら製造されるようにし、同時に高い包囲効率で蛋白質がリポソーム内に包囲されるようにする。
【００３５】
本発明の他の態様によれば、本発明は蛋白質を含む蛋白質-包囲ナノリポソームにおいて、前記ナノリポソームの粒子径は50-350nmであり、小型単一層小胞（small unilamellar vesicle：SUV）構造を有し、液状の剤形を有し、ナノリポソームに包囲された前記蛋白質は包囲される前の蛋白質の活性を90-100%保有することを特徴とする蛋白質-包囲ナノリポソームを提供する。
【００３６】
本発明の蛋白質-包囲ナノリポソームは、上述した製造方法に言及された内容を引用して詳細に説明できる。例えば、蛋白質及びリポソーム形成成分としての燐脂質に対する内容は、上述した内容を引用して説明できる。従って、重複された内容は本明細書の過度な複雑性を避ける為にその記載を省略する。
【００３７】
本発明のナノリポソームは50-350nmの粒子径、好ましくは50-300nm、より好ましくは100-250nm、最も好ましくは150-200nmの粒子径を有する。
ナノリポソームの小さい粒子径は、本発明のナノリポソームが望む目標組織への伝達を容易にする。
【００３８】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明のナノリポソームは人間成長ホルモンを包囲する。本発明の好ましい具現例によれば、本発明のナノリポソームは上述した本発明の製造方法により製造されたものである。
【００３９】
本発明の好ましい具現例によれば、本発明の蛋白質-包囲ナノリポソームを室温で10か月貯蔵した場合、ナノリポソームに包囲された蛋白質は包囲以前の蛋白質元来の活性の72-80%活性、最も好ましくは72-78%の活性を保有する。つまり、本発明の蛋白質-包囲ナノリポソームは貯蔵安定性が極めて優れている。
【００４０】
本発明の蛋白質-包囲ナノリポソームは、かなり高い蛋白質の生物学的活性を維持し、粒子のサイズも最も好ましくは150-200nm範囲にあって、SUV構造を有する為、毛嚢への伝達効率が極めて優れているのみならず、皮膚透過率も優れていて皮膚において多様な生理学的活性を表す。
【００４１】
特に、本発明のhGH包囲ナノリポソームは多様な皮膚状態（conditions）の改善に利用できる。好ましくは、本発明のhGH-包囲ナノリポソームは、にきび治療、皺改善、染み除去、皮膚弾力改善、発毛促進、皮膚老化防止、皮膚保湿改善及び皮膚幹細胞増殖及び皮膚表皮幹細胞増殖に有効であり、より好ましくは、にきび治療、皺改善及び発毛促進に有効である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例はひたすら本発明をより具体的に説明する為のものであって、本発明の要旨により本発明の範囲がこれら実施例により制限されないということは、本発明が属する技術分野で通常の知識を有する者において明らかである。
【実施例】
【００４３】
実施例Ｉ：人間成長ホルモン-含有リポソーム（Nanolipo-hGH）製造
Ａ型（クリーム型）：人間成長ホルモン-含有クリーム剤形
Ａ型の製造に利用された燐脂質はlipoid S100(Lipoid GmbH, Germany)又はlipoid S75(Lipoid GmbH, Germany)である。
機器出口（outlet）の温度が30℃を超えないように熱交換器を装置した高圧均質機（max. output 5 L/hr, 最大圧力1200 bar, Model HS-1002, （株）華成機械（South Korea）の熱交換器を氷水中に装置し、蒸留水で機器内部を洗滌して作動準備後、緩衝溶液（20mM NaH2PO4 pH 6.5-7.5, 1mM EDTA）に溶解されている1mg/ml濃度の人間成長ホルモン（LG Life Sciences, Ltd）溶液100mlに燐脂質を5w/v%の比率で添加して十分に水和させ撹拌し、これを常温で均質機を利用して低圧0barで３回以上均質機を通過させた。均質機処理をした溶液に燐脂質を6w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、100barで３回以上均質機を通過させた。その後、100bar条件で均質機を経た溶液に燐脂質を7w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、200barで３回以上均質機を通過させた。その後、200bar条件で均質機を経た溶液に燐脂質を8w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、300barで３回以上均質機を通過させた。前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を9w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、400barで３回以上均質機を通過させた。引続き、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を10w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、500barで３回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を11w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、600barで３回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を12w/v%の比率になるように添加して十分に水和させ撹拌し、800barで３回以上均質機を通過させ、最終的にクリーム型の人間成長ホルモン-含有リポソーム（Nanolipo-hGH）を製造した。
本実施例で製造された人間成長ホルモン-含有リポソームクリーム剤形の電子顕微鏡の写真は図１に示してある。本実施例で製造されたクリーム型リポソームをゴールドコーティングして走査電子顕微鏡（HITACHI S 2500）で観察した結果、屈曲して連結されている基物の形態はゲルと推定され、球型の小さい粒等はナノ大(0.02-0.3μm)のリポソームと判断される。
【００４４】
Ｂ型（リポソーム型）：人間成長ホルモン(hGH)-含有リポソーム剤形
Ｂ型の製造に利用された燐脂質は大豆レシチン（soybean lecithin；（株）新東邦、 South Korea)、Metarin P(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG)、Nutripur S(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG)又はEmultop(Degussa Texturant Systems Deutschland GmbH & Co. KG）である。
機器出口（outlet）の温度が30℃を超えないように熱交換器を装置した高圧均質機（max. output 5L/hr, 最大圧力1200bar, Model HS-1002、（株）華成機械(Korea)）の熱交換器を氷水の中に装置した後、蒸留水で機器内部を洗滌して作動準備後、緩衝溶液（20mM NaH2PO4 pH6.5-7.5, 1mM EDTA）に溶解されている1mg/ml濃度の人間成長ホルモン（LG Life Sciences, Ltd）溶液100mlに、燐脂質を10w/v%の比率で十分に水和させ撹拌し、これを常温で均質機を利用して低圧 0barで３回以上均質機を通過させた。引続き、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を14w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、100barで３回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を18w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、200barで３回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を20w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、300barで３回以上均質機を通過させた。引続き前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を22w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、400barで３回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を24w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、500barで３回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を26w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、600barで３回以上均質機を通過させた。引続き前記均質機過程を経た溶液に燐脂質を28w/v%の比率になるように添加して、十分に水和させ撹拌し、700barで３回以上均質機を通過させた。その後、前記均質機過程を経た溶液を800barで３回以上均質機を通過した後、均質機から溶液を排出し、15,000xgで30分間高速遠心分離して上澄液を分離した。この時、リポソーム内に入らなかった人間成長ホルモンはゲル透過クロマトグラフィー（GE Healthcare, USA）で除去して液状のリポソームを収得した（参照：図２）。
Ｂ剤形で溶液を蒸留水及び緩衝溶液pH6.0-7.5(20mM NaH2PO4, 1mM EDTA, pH6.0-7.5)を使用して製造した結果、リポソームの物性及び安定性に差異点がなく、さらに、結果物を15-30℃で大豆レシチン10w/v%以上で長期間保管（１ヶ月以上）すれば、脂質層と水溶液の相分解が発生（上層は水溶液、下層は脂質層）したものの、10w/v%未満の大豆レシチンでは相分解が起こらず安定性が優れていた。
【００４５】
Ｃ型：ＡとＢ燐脂質を混合したlipo-hGH formulation特性及び安定性
Ｃ型に利用された燐脂質はS(lipoid S100)とB(lipid B)をそれぞれ配合してＢ型均質方法によりlipo-hGHを製造する方法である。ＡとＢ燐脂質配合比率は、それぞれ１型（5%S+10%B）、２型（10%S+10%B）及び３型（5%S+20%B）としてＢ型均質方法でlipo-hGHを製造し、均質機から溶液を排出して高速遠心分離し、上澄液を分離する。常温（15〜30℃）で１型結果物は略、３ヶ月後層分離が起こり、２型結果物は略１ヶ月後層分離が起こる。３型結果物は層分離が起こらない。３型結果物は高濃縮リポソームとして保存が容易なformulation方法である。
【００４６】
実施例II：FPLC分離及びSDS-PAGE分析
前記実施例Ｉの剤形Ｂの人間成長ホルモン-含有リポソーム分析のため、常温でFPLC(Acta explorer, Amersham Bioscience)にSuperdex 200 HR/30コラムを装置し、コラムボリューム２倍の緩衝溶液（20mM NaH2PO4、1mM EDTA及び150mM NaCl）で平衡化させ、人間成長ホルモン-含有リポソームを分離及びその分画を分取後、これをSDS-PAGEで分析した。図３で確認し得るように、約22kDa付近で人間成長ホルモンのバンドが見られる。
【００４７】
実施例III：リポソーム内の人間成長ホルモンの定量
HPLC(Shimazu)にC18 Delta packコラム(Waters, USA)を装着し、溶媒Ａは0.1% TFAアセトニトリル、溶媒Ｂは0.1% TFA H2Oを使用して濃度勾配（B 60-10%：0-25min, B 60%：25.01-30min）方式で流速1ml/minで逆相-HPLCを実施した。蛍光検出器（Excitation：295nm, range：270-300nm, Emission：350nm, range：300-400nm）を利用してoven temp(55℃), run time 30min器機条件において、標準試料（International Standard人間成長ホルモンNIBSC code 98/574）を定量後、試料前処理過程（人間成長ホルモン含有したリポソーム溶液をsonicatorを利用して破砕後50mM Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA, 8M ウレア、2% Tween 20溶液を試料と同じ嵩添加後パイペッティング）し、を蛍光検出器を利用してHPLCで定量した（参照：図４）。
定量結果、実施例Ｉの剤形ＢのNanolipo-hGHは3.69μg/mlの人間成長ホルモンを含有していることが分かった。
【００４８】
実施例IV：燐脂質含量分析
HPLC(Shimazu)にSpherisorb S5 NH2コラム（Waters）を装着し、溶媒として60%アセトニトリル、30%メタノール及び5% H2Oを使用して等溶媒濃度勾配（isocratic gradient）方式で流速1ml/minでHPLCを実施した。紫外線検出器(215nm)を利用してoven temp(35℃)、run time 20min器機条件で燐脂質をメタノール：クロロホルム(90%:10%)である溶液に完全溶解させて定量した。同一な方式で本発明の人間成長ホルモン-含有リポソーム溶液をメタノール：クロロホルム(90%:10%)溶液に完全溶解させてHPLCで定量した（参照：図５）。
定量結果、実施例Ｉの剤形ＢのLipo-hGHは3.26mg/mlの燐脂質を含有していることが分かった。
【００４９】
実施例Ｖ：安定性試験
前記実施例Ｉで製造されたＢ剤形の人間成長ホルモン-含有リポソームの安定性試験を次のように実施した：0.1% methyl parabenを含有した本発明のNanolipo-hGHを褐色の瓶に入れて、それぞれ4℃及び15-30℃に放置して１週置きにhGH含量をHPLCで定量して安定性を調査した。図６で確認できるように、本発明のNanolipo-hGHは貯蔵10ヶ月後、4℃では、初期hGH含量の87.5%に存在し、室温では75%に存在することを確認した。従って、本発明のLipo-hGH安定性が優れていることが分かる。
【００５０】
実施例VI：安全性試験
本発明の人間成長ホルモン-含有リポソーム（実施例ＩのＢ剤形）の安全性を検査する為に、人間角質細胞株であるHaCaT(DKFZ, Germany)と人間胚芽繊維芽細胞であるHEF(gift from Prof. Lee, Jaeyong, Department of Biochemistry, School of Medicine, Hallym University)に対する細胞毒性を調査した。
HaCaTとHEFをそれぞれ1×105細胞/ml及び5×104細胞/mlの濃度で10% FBS/DMEM(FD培地）に懸濁し、これを24wellプレートに1ml添加後、37℃、5% CO2インキュベータで１日間培養した。培養１日後、上層培地を用心深く除去し、適切な量の10%FD培地と濃度別に準備した試料をプレートのウェルに添加し、37℃、5% CO2インキュベータで１日間反応させた。試料として利用されたものは緩衝液（20mM Na-Pi, pH7.0, 1mM EDTA及び0.1% Methyl paraben含有）、リポソーム、人間成長ホルモン及び実施例ＩのＢ剤形のNanolipo-hGHである。反応後、細胞の生存力を3-(4,5-ジメイルチアゾル-2-イル)-2,5-ジフェニールテトラゾリウムブロマイド（MTT：Sigma, USA）を利用して測定した（Shearman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 91(4):1470-4(1994), Shearman et al., J. Neurochem. 65(1):218-27(1995)及びKaneko et al., J. Neurochem.65(6):2585-93(1995)）。MTT反応結果物に対してELISAリーダ（Molecular Devices, USA）を利用して570nmでの吸光度を測定した。各試料による生存度は試料が添加されていないウェルの吸光度を100%にして、相対的な値で表した（図７）。
図７で確認できるように、本発明のHgh-含有ナノリポソームはHaCaTとHEFの細胞生存度に影響を及ぼさないことが分かり、結局生体に極めて安全な剤形であることか分かった。
【００５１】
実施例VII：ナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHのNb2細胞増殖分析
Nb2ノーブルラットリンパ腫細胞株（noble rat lymphoma cell line, NIBSC ECACC #97041101）1×105細胞/ml 50μlがある96-ウェルプレートのウェルにS-hGH（標準人間成長ホルモン）、Standard human growth hormone, NIBSC code 98/574), S-hGH 1000倍希釈された試料前処理溶液（人間成長ホルモンを含有しないリポソーム溶液をsonicatorを利用して破砕後50mM Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA, 8M ウレア、2% Tween 20溶液を試料と同じ嵩添加後パイペッティング）が添加された試料、又は試料前処理過程（人間成長ホルモンを含有したリポソーム溶液をsonicatorを利用して破砕後50mM Tris-Cl pH8.0, 1mM EDTA, 8M ウレア、2% Tween 20溶液を試料と同じ嵩添加後パイペッティング）を経た実施例ＩのＢ剤形Nanolipo-hGH(N-hGH)を1000倍希釈した溶液が添加された試料を添加した。５日間37℃、5% CO2で培養した後、増殖された細胞の量をMTTを利用して測定した。hGHが添加されない対照群の平均吸光度を100%にしたとき、試料が添加された群の相対的な値を計算した。
図８に示した通り、本発明のNanolipo-hGHに包囲された人間成長ホルモンは本来の活性を維持していることが分かった。
【００５２】
実施例VIII：粒子のサイズ分布分析
前記実施例でゲル透過クロマトグラフィーで分離した剤形ＢのNanolipo-hGHをParticle Size Analyzer(Mastersizer 2000/ Malvern Instruments Ltd)を利用して屈折率1.52で粒子のサイズ分布を分析した（参照：図９）。図９で見られる通り、本発明のNanolipo-hGHの粒子のサイズは0.193μmの大きさで最大分布を表しており、剤形ＢのNanolipo-hGHはナノ大で存在することが分かる。
【００５３】
実施例IX：皺改善効能分析
４週令の無毛マウス（韓国化学研究院から購入）と実施例ＩのＢ剤形Nanolipo-hGH(N-hGH)を利用して実験した。動物飼育室の温度は22±2℃、湿度は55-60%に維持させ、明暗循環が12時間単位に調節されるようにし、放射線照射で滅菌した固形飼料（中央実験動物, Seoul, KOREA)と滅菌された給水を自在に摂取できるようにした。２週程の適応期間を有した。このようなヌードマウスの背中に皺を誘導する為に、UVB-20 mJを１週に３回照射する方式で８週間照射した。その後、化粧用ブラシを利用して飼料及び対照群溶液をUVBが照射された背中に８週間塗布した。その後、皺改善効果をDonald方法（Hyun-Seok Kim et. al, Mech. Ageing Dev. (2005. 8.16 In press)）で評価した。実験結果は図10及び図11に示してある。図10において、対照群(n=3)は何等の処理もしていない群であって、UVB-対照群(n=3)はUVB-20mJを処理して皺のみを誘導した群であり、リポソーム(n=3)はUVB-20 mJを処理して皺を誘導し、リポソームを処理した群であり、Nanolipo-hGH(n=3)はUVB-20 mJを処理して皺を誘導し、本発明のNanolipo-hGHを処理した群である。図10及び図11に示された通り、本発明のNanolipo-hGHはUVにより誘導された皺を効果的に除去し、その効果は局所投与後、約２週後から明らかに表れていることが分かる。
【００５４】
実施例X：にきび治療効能分析
本発明の人間成長ホルモン-含有リポソームのにきび治療効能を次のように調査した：
15-40才の女性の内、顔の皮膚ににきびを有する60名を20名ずつ無作為で３グループに分け、前記実施例ＩのhGH-含有リポソーム剤形Ｂ型（剤形１）、リポソームのみが含まれた比較溶液（剤形２）、さらに比較緩衝溶液（剤形３）をそれぞれ３週間朝／夕に１日２回ずつ洗顔後一番先に使用するようにした。その他には平素使用する化粧品に対する特別な制限はしなかった。その後、使用者の意見によりにきびに対する改善程度を下記の評価基準により判定した。試験結果は表に示してある。評価基準：+++(極めて良好な改善効果がある)、++（かなりの改善効果がある）、+（若干の改善効果がある）、±（改善効果はないものの、弱化もしない）、-（弱化した）。
【００５５】
【表１】
2008534580.tif 000003
【００５６】
表１に示した通り、本発明の剤形はにきびに対する改善程度が極めて優れていることが分かり、にきび改善効果はapplication後約２週からはっきりと表れ始めた。しかも、本発明の組成物は皮膚に対する刺戟、例えば、紅斑又は庠み症を殆ど誘発しなかった。
【００５７】
実施例XI：染み除去効能分析
本発明の人間成長ホルモン-含有リポソームの染み除去効能を下記の通り調査した：  40-60才の女性の内、顔の皮膚に染みを有する60名を20名ずつ無作為で３グループに分け、前記実施例ＩのhGH-含有リポソーム剤形Ｂ型（剤形１）、リポソームのみが含まれた比較溶液（剤形２）、さらに比較緩衝溶液（剤形３）をそれぞれ８週間朝／夕に１日２回ずつ洗顔後一番先に使用するようにした。その他は平素使用する化粧品に対する特別な制限はしなかった。その後、使用者の意見により染みに対する改善程度を下記の評価基準により判定した。試験結果は表２に示してある。評価基準：+++（極めて良好な改善効果がある）、++（かなりの改善効果がある）、+（若干の改善効果がある）、±（改善効果はないものの弱化もしない）、-（弱化した）。
【００５８】
【表２】
2008534580.tif 000004
【００５９】
表２に示した通り、本発明の剤形は染みに対する改善程度が、かなり優れていることが分かり、染み改善効果はapplication後約３〜５週からはっきりと表れ始めた。しかも、本発明の組成物は皮膚に対する刺戟、例えば、紅斑又は庠み症を殆ど誘発しなかった。
【００６０】
実施例XII：ナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHのローカリゼイション及び皮膚に及ぼす影響分析
スプラグドリラットの腹の部分を６個の区域（それぞれ半径1cm円）に分けて、下記の試料を処理した：0.1% methyl-paraben緩衝液、0.1%リポソーム、hGH 0.001 U、hGH 0.0001 U、Lipo-hGH 0.001 U及びLipo-hGH 0.0001 U。
24時間毎に50μlずつ２回処理し、総７回処理した。最後の試料処理後24時間が経つと、ラットより組織を採取した。採取した組織を40μm厚に断片化して、１次抗体としてポリクロナル兎、抗-人間成長ホルモン抗体(DAKO,U.S.A.)を処理後、２次抗体としてビオチンが結合されているanti-rabbit antibody(VECTOR. VECTASTAIN ABC kit(RABBIT IgG), U.S.A.)を室温で30分間処理した。以降、VECTASTAIN ABC reagent (VECTOR, U.S.A.)で室温で30分間処理し、DAB基質（Diaminobenzidine, Sigma, USA）で発色反応させた。78%エタノール、85%エタノール、95%エタノール及び100%エタノールで順に脱水させ、ザイレンで５分間処理した。組織をスライドガラスに固定し、Lipo-hGHに含有された人間成長ホルモンの位置を観察した。
図12aで見られる通り、本発明のNanolipo-hGHに包囲された人間成長ホルモン、又はラットが本来有したラット成長ホルモンが毛嚢（hair follicle）のバルジ幹細胞（bulge stem cells）に見られる位置で確認できる。
さらに、図12bで見られる通り、本発明のNanolipo-hGH (0.0001 UのhGH含有）が塗布されたラットの皮膚から真皮層（dermal layer）が広くなり、毛嚢の数が増加したことが分かった。しかも、図12bでhGH水溶液のみを皮膚に塗布した場合にも、毛嚢のバルジ幹細胞位置にhGHが到達していることが分かるものの、このような発見は当業界の技術水準と常識を考慮するに、極めて驚異に値するものである。この結果はリポソームで包囲されたhGHのみならず、hGH水溶液自体を皮膚に塗布する場合にも皮膚状態の改善が達成できる可能性を見せてくれる。
【００６１】
実施例XIII：ナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHがマウスの皮膚に及ぼす影響分析
実施例Ｉで製造した本発明のナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHがICRマウスの皮膚に及ぼす影響をH&E(Hematoxylin & Eosin)染色で分析した。先ず、ICRマウスの背中の毛を除去し、脊椎を中心に分けて対照群と本発明のLipo-hGHを４時間毎に２週間処理した：グループ１（３匹）、非処理グループ２（３匹）、リポソーム／0.1 U本発明のlipo-hGH処理グループ３（３匹）、リポソーム／0.01 U本発明のLipo-hGH処理グループ４（３匹）、リポソーム／0.001 U本発明のLipo-hGH処理。２週処理後、マウスから組織を採取した。採取した組織をパラフィンブロックを造り、４μm厚で断片化してスライドガラスの上に乗せた。引続き前記断片から脱パラフィンした後、ヘマトザイレン溶液で室温で10分間処理し、エオシン溶液で室温で1分間処理した。78%エタノール、85%エタノール、95%エタノール及び100%エタノールで順に脱水させ、ザイレンで５分間処理した。組織を固定化した後、顕微鏡下で染色された組織を観察した。
図13aで見られる通り、本発明のナノリポソーム剤形のLipo-hGHを処理した皮膚の表皮層において、細胞の増殖が大きく増加することが分かり、真皮層では結合組織のリモデリングが発生して、より緻密な結合組織が形成されたことが分かった。図13bは400倍の拡大像にして、真皮層で結合組織のリモデリングが発生したことをより明確に確認できる。
【００６２】
実施例XIV：ナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHが人工皮膚に及ぼす影響分析
Neoderm-EDTM(Tego Science, South Korea)を利用して本発明のナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHが人工皮膚に及ぼす影響を分析した。Neoderm-EDTMはin vitro試験の為の人間皮膚モデルとして、表皮と真皮マトリックスで構成されている。実験群はグループ１は非処理、グループ２は緩衝液のみ処理、グループ３と４はリポソーム処理、グループ５及び６はそれぞれ0.001 unit及び0.01 unitの本発明のLipo-hGH処理群でなされている。パラフィン処理及びH&E染色は前記実施例と同一に実施した。最終的に顕微鏡下で染色された組織を観察した。
図14で見られる通り、本発明のナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHを処理したNeoderm-EDTMの角質細胞層で細胞の細胞の増殖が活発になされた。
【００６３】
実施例XV：ナノリポソーム剤形のNanolipo-hGHを介して毛嚢に伝達されたhGHの確認
８週令の休止期（telogen）時期のC57BL/6(Jung Ang Lab Animal Inc., South Korea)をケタミン（柳韓洋行）＆ラムフン（バイエルコリア株式会社）で麻酔して除毛剤を使用して背中部分の毛を除去した。区域を分けて0.1 U Nanolipo-hGHと0.1 U hGHをそれぞれ150ulずつ19日間１日２回処理した。組織を得る４時間前から30分置きに処理した後組織を得た。組織は10%ホルマリン溶液に固定してパラフィンブロックを造り10umに切断し、１次抗体としてポリクロナル兎抗-人間成長ホルモン抗体(DAKO,U.S.A.)を12時間処理後、Texas-Red蛍光が結合されている抗-兎２次抗体(VECTOR)を室温で１時間30分間処理した。その後、DAPIを含むmounting medium (VECTOR)を落してCover glassを覆い蛍光顕微鏡で観察した。結果は写真で見られるようにNanolipo-hGHで処理した皮膚の毛嚢の外毛根鞘に沿って点々と赤く染色されたhGHを図15で確認することができた。
【００６４】
以上で本発明の特定した部分を詳細に記述したところ、当業界の通常の知識を有する者において、このような具体的な技術は単に好ましい具現例であるのみ、これに本発明の範囲が制限されるものでないことが明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は添付された請求項とその等価物により定義されると言い得る。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】本発明により製造されたhGH-包囲リポソームクリーム剤形の電子顕微鏡写真である。
【図２】本発明により製造されたhGH-包囲リポソーム（Nanolipo-hGH）に対するゲル透過クロマトグラムである。
【図３】本発明により製造されたNanolipo-hGHに包囲されたhGHに対するSDS-PAGE結果である。
【図４】本発明により製造されたNanolipo-hGHに包囲されたhGHに対する逆相HPLCクロマトグラムである。
【図５】本発明により製造されたNanolipo-hGHで燐脂質に対する逆相HPLCクロマトグラムである。
【図６】本発明により製造されたNanolipo-hGHの安定性試験結果を表すグラフである。
【図７】本発明のhGH-包囲リポソームの安定性試験結果を表すグラフである。
【図８】本発明のhGH-包囲リポソームに包囲された人間成長ホルモンの活性を調査した結果を表す。
【図９】本発明のhGH-包囲ナノリポソームに対する粒子のサイズ分布分析結果である。
【図１０】本発明のhGH-包囲リポソームの皺改善効能をUV-誘導された皺を有する無毛マウスを利用して実験した結果である。
【図１１】本発明のhGH-包囲ナノリポソームの皺改善効能を表すグラフである。
【図１２ａ】本発明のhGH-包囲ナノリポソームがスプラグドリラットの毛孔を通じて皮膚に伝達される場合に人間成長ホルモンのローカリゼイションを表す写真である。
【図１２ｂ】本発明のhGH-包囲ナノリポソームがスプラグドリラットの皮膚の真皮層と毛嚢に及ぼす影響を表す写真である。
【図１３ａ】本発明のhGH-包囲ナノリポソームがICRマウス皮膚の表皮及び真皮に及ぼす影響を表す写真である。
【図１３ｂ】本発明のhGH-包囲ナノリポソームがICRマウス真皮層で結合組織のリモデリング誘導を表す写真である。
【図１４】本発明のhGH-包囲ナノリポソームが人間人口皮膚に及ぼす影響を表す写真である。
【図１５】本発明のhGH-包囲ナノリポソームの助けにより毛嚢に伝達されるhGHを免疫組織化学的方法により毛嚢での位置を把握した写真である。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１１】
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【図３】
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【図１０】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月26日(2007.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の段階を含む蛋白質が包囲されたナノリポソームの製造方法：
（ａ）蛋白質を含有する水溶液に燐脂質を分散させ分散液を製造する段階；
（ｂ）前記分散液に剪断力（shearing force）を付加（applying）する段階；
（ｃ）段階（ｂ）の結果物に燐脂質を追加的に添加し、段階（ｂ）より高い剪断力を付加する段階；及び
（ｄ）追加的な燐脂質と前段階より高い剪断力を利用して、段階（ｃ）を繰返し実施して、望む粒子径及び包囲効率を有するナノリポソームを成型する段階。
【請求項２】
前記蛋白質はホルモン、ホルモン類似体、酵素、酵素阻害剤、信号伝達蛋白質又はその一部分、抗体又はその一部分、短鎖抗体、結合蛋白質又はその結合ドメイン、抗原、付着蛋白質、構造蛋白質、調節蛋白質、毒素蛋白質、サイトカイン、転写調節因子、血液凝固因子及び植物生体防御誘導蛋白質で構成された群より選ばれることを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項３】
前記燐脂質は水添大豆レシチンであることを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項４】
前記剪断力の付加は、高圧均質機を利用して実施されることを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項５】
前記高圧均質機での圧力の増加は0-800barの範囲でなされることを特徴とする第４項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項６】
前記高圧均質機での圧力の増加は50-200barずつ増加することを特徴とする第４項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項７】
前記高圧均質機での圧力の増加は100barずつ増加することを特徴とする第６項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項８】
前記段階（ａ）−（ｄ）によりなされる順次的に増加する燐脂質の量は0w/v(%)から30w/v(%)まで増加することを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項９】
前記燐脂質の量の順次的増加は1-5w/v(%)ずつ増加することを特徴とする第８項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１０】
前記最終的に成型されたナノリポソームは50-350nmの粒子径を有することを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１１】
前記最終的に成型されたナノリポソームは小型単一層小胞（small unilamellar vesicle）構造を有することを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１２】
前記最終的に成型されたナノリポソームは液状の剤形を有することを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１３】
前記最終的に成型されたナノリポソームに包囲された蛋白質は、包囲される以前の蛋白質の活性を90-100%保有することを特徴とする第１項記載のナノリポソームの製造方法。
【請求項１４】
蛋白質を含む蛋白質-包囲ナノリポソームにおいて前記ナノリポソームの粒子径は50-350nmであり、小型単一層小胞（small unilamellar vesicle）構造を有し、液状の剤形を有し、ナノリポソームに包囲された前記蛋白質は包囲される以前の蛋白質の活性を90-100%保有することを特徴とする蛋白質-包囲ナノリポソーム。
【請求項１５】
前記ナノリポソームは人間成長ホルモンを包囲することを特徴とする第１４項記載の蛋白質-包囲ナノリポソーム。
【請求項１６】
前記ナノリポソームは前記第１項乃至第１３項のいずれか一つの項の方法により製造されたことを特徴とする第１４項記載の蛋白質-包囲ナノリポソーム。
【請求項１７】
前記蛋白質-包囲ナノリポソームを室温で10ヶ月貯蔵した場合、ナノリポソームに包囲された蛋白質は包囲以前の、蛋白質元来の活性の72-80%活性を保有することを特徴とする第１４項記載の蛋白質-包囲ナノリポソーム。
【国際調査報告】
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