(57)【要約】  本発明は、細菌酵素による５−メトキシフラボノイド類脱メチル化、インビトロでの植物エストロゲン類の生産およびメチル化５−メトキシプレニルフラボノイド類源と組み合わせた医薬組成物におけるこれらの酵素の使用。
2008532558.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ホモ酢酸生成菌の細菌株またはその抽出物の第１組成物を供給すること、
ｂ）５−アルコキシ−フラボノイド類および／または６’−アルコキシカルコン類を含む第２組成物を、細菌株またはその抽出物を含む前記第１組成物と接触させ、前記細菌株または抽出物により前記５−アルコキシ−フラボノイド類および／または６’−メトキシカルコン類を脱アルキル化させることを含む、
１以上の植物エストロゲンをインビトロで生産する方法。
【請求項２】
前記５−アルコキシ−フラボノイド類および／または６’−アルコキシカルコン類が、５−メトキシ−フラボノイド類および／または６’−メトキシカルコン類である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記植物エストロゲンが８−ＰＮである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
５−メトキシプレニルフラボノイドと繰り返しインキュベーションすることにより、前記細菌株の脱アルキル化活性を富化させることをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１組成物が前記細菌株の細菌細胞の培養物である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記細菌株が、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）またはペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）である、請求項６記載の方法。
【請求項７】
前記５−アルコキシ−フラボノイドがＩＸである、請求項１から６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記５−アルコキシ−フラボノイドおよび／または６’−アルコキシカルコンが、植物起源である、請求項１から７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記植物がホップである、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
５−メトキシ−フラボノイドまたは６’−メトキシカルコンのインビトロでの脱メチル化のための細菌細胞株の使用。
【請求項１１】
ユーバクテリウム・リモスム（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｉｍｏｓｕｍ）からの５−メトキシ−フラボノイドメチル転移酵素。
【請求項１２】
５−アルコキシフラボノイド脱アルキル化活性を有するホモ酢酸生成菌、その抽出物、半精製成分、または精製成分を含む第１医薬組成物および／または補助食品と、５−アルコキシ−フラボノイド類源もしくは６’−アルコキシカルコン類源を含む第２医薬組成物および／または補助食品とを含む、同時投与または連続的投与のための、１以上の医薬組成物および／または１以上の補助食品の組み合わせ。
【請求項１３】
前記５−アルコキシ−フラボノイド類源がホップ抽出物である、請求項１２記載の組み合わせ。
【請求項１４】
前記６’−アルコキシ−カルコンが、キサントフモールであり、および／または前記５
’−アルコキシ−フラボノイドが、イソキサントフモールである請求項１２または１３記載の組み合わせ。
【請求項１５】
前記ホモ酢酸生成菌がユーバクテリウム・リモスムである、請求項１２から１４のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項１６】
前記ホモ酢酸生成菌、その抽出物、半精製成分または精製成分が、結腸特異的送達のための製剤で提供される、請求項１３から１５のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項１７】
ホモ酢酸生成菌株の５−アルコキシ−アルキル転移酵素活性を富化する方法であって、５−アルコキシ−フラボノイド類を含む培地上で前記細菌株を拡大させる工程と、最大の５−アルコキシ−アルキル転移酵素活性を有するコロニーを選択する工程とを含む、方法。
【請求項１８】
前記工程が少なくとも２回繰り返される、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
細菌由来の５−アルコキシ−アルキル転移酵素活性を含む組成物。
【請求項２０】
ホモ酢酸生成菌の抽出物である、請求項１９記載の組成物。
【請求項２１】
前記細菌が、ユーバクテリウム属またはペプトストレプトコッカス属である、請求項２０記載の組成物。
【請求項２２】
ＩＸ（２５ｍｇ／Ｌ）の８−ＰＮへの１００％転換が可能である、請求項１９から２１のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、植物エストロゲン類およびその調製、ならびに医薬化合物およびそのような植物エストロゲン類を含む補助食品に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ホップ（Ｈｕｍｕｌｕｓ ｌｕｐｕｌｕｓ Ｌ．）は、ビールに苦味および風味を提供するビール醸造における本質的な原料として何世紀もの間使用されてきた。ここ数年、この植物は、プレニルフラボノイド類、すなわちフェノール環の１つに結合した非極性のプレニル側鎖を含むフラボノイドの下位分類の源として注目度が増してきている。プレニルフラボノイド類は、雌性植物のホップ毬花における小包葉の基部で見られ、ルプリン腺に存在する。これらのプレニルフラボノイド類の中で、２つのカルコン類（キサントフモール（Ｘ）およびデスメチルキサントフモール（ＤＭＸ））および３つのフラバノン類（イソキサントフモール（ＩＸ）、８−プレニルナリンゲニン（８−ＰＮ）および６−プレニルナリンゲニン（６−ＰＮ））（図２）は、それらの潜在的な健康促進特性から、今や多くの注目を受けている。Ｘは、がんの強い化学予防剤として同定されいる一方、８−ＰＮは、これまでに同定された最も強力な植物エストロゲンの１つであり、周知の大豆の植物エストロゲン類よりもかなり高い活性を有することが証明されている。８−ＰＮは、インビボでエストロゲン活性を示し、ラットにおける骨量減少を防ぎ、血管新生および転移を阻害し、抗アンドロゲン活性を示すことが証明された。
【０００３】
Ｘは、最大１％（ｗ／ｗ）の濃度で雌性ホップ毬花中に主要なプレニルカルコンとして存在するが、一方、ＤＭＸは低濃度で存在する（デ・ケウケレール（Ｄｅ  Ｋｅｕｋｅｌｅｉｒｅ）ら（２００３）Ｊ．ｏｆ  Ａｇｒｉｃ．ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．，５１，４４３６−４４４１）。Ｘ／ＤＭＸの割合は、ホップの変種間で異なる。異性体化により、ＸはＩＸに形質転換され、そしてＤＭＸは８−ＰＮおよび６−ＰＮに転換される。
【０００４】
ホップのエストロゲン効果は、何十年もの間、認識されている。ホップ風呂は、婦人科疾患の治療に使用されており、そして女性のホップ摘み労働者の月経障害は報告によれば一般的であった。１９９９年、ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）ら［Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８４，２２４９−２２５２］は、ホップ中に新しい植物エストロゲン、すなわち、８−プレニルナリンゲニンを同定した。それは１７β−エストラジオール（＜１％）よりはるかに弱いが、これまでに同定された最も強力な植物エストロゲンの１つであり、大豆由来化合物のゲニステインやダイゼインなどの他の植物エストロゲン類よりもかなり高い活性を有する。
【０００５】
植物エストロゲンを食事で摂取すること、および／または植物エストロゲンへの環境暴露は、内分泌撹乱のような健康危機を課すのではないかと疑問が投げかけられている。ホップのプレニルフラボノイド類の場合、ビールが主な食餌源である。アメリカ合衆国での平均ビール消費量は、２００１年における人口一人当たり、約２２５ｍｌ／日と計算された（ＵＳＤＡ、２００３年）。この量は、米国主要ブランドのラガービール／ピルスナービール（ビール１Ｌ当たり５００から１０００μｇのプレニルフラボノイド類）として消費されたと仮定すると、プレニルフラボノイド類の毎日の摂取量は約０．１４ｍｇになるであろう。しかしながら、濃いビールは最大４ｍｇ／Ｌのプレニルフラボノイド類を含むので、ビール中（したがって平均の摂取）に検出される濃度は、醸造プロセスに大いに依存する。Ｘはホップ（乾燥重量の０．１％から１％）中に存在する主要なプレニルフラボ
ノイドであるが、そのうちのほとんどは沸騰させながらの加熱処理による異性化によってＩＸに形質転換される。したがって、ＩＸはビール中に見られる主なプレニルフラボノイドであり、５００μｇ／Ｌ（ラガービール／ピルスナービール）から最大４ｍｇ／Ｌ（濃いビール）の濃度で存在する。同様に、ＤＭＸは、８−ＰＮに転換され、最大１００μｇ／Ｌの８−ＰＮ／Ｌのビール中での最終濃度となる。しかし、８−ＰＮの高い活性にもかかわらず、ビール中の全エストロゲン活性は、有害なインビボでの活性（〜１００ｍｇ／Ｌ）に必要とされる濃度よりもなお５００から１０００倍低い（ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）ら（２００２）再生産（Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ），１２３，２３５−２４２）。さらに、多くのビールが全ホップの代わりにホップ抽出物を使用して現在では作られており、低濃度の８−ＰＮを与えるか、または８−ＰＮが全く含まれていない。したがって、現在の知識によれば、適度にビールを消費した場合は、健康に対する不利益な効果は植物エストロゲンに帰することはできないというのが一般に認められている。
【０００６】
他方では、多くのデータが現在、意識的な植物エストロゲン摂取を可能な健康上の利益と関連させている（マギー，ローランド（Ｍａｇｅｅ  ＆  Ｒｏｗｌａｎｄ）（２００４）Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．  ９１，５１３−５３１）。ビールに加えて、ホップ系の栄養補助食品が市販されており、豊胸および顔面紅潮の減少としての効果を謳っている。植物エストロゲン類の全面的な健康の効果は、多種多様の、恐らくは付加活性または阻害活性を有する多くの個々の植物化学物質の組み合わせの作用から潜在的に生じる。今まで、特にビール中の８−ＰＮの濃度は、健康に対する肯定的あるいは否定的な効果には低すぎると考えられるので、イソフラボン類およびリグナン類のみが、ヒトの食餌中の適切な植物エストロゲンと考えられる。
【０００７】
いくつかの特許公報では、食餌のフラボノイド類の健康上の有益な効果について記載している。例えば、骨密度が低下するのを防止するためのＩＸの使用（ＷＯ０４０８９３５９）、エストロゲン特性を有する医薬品でのホップ抽出物の使用（ＷＯ０２０８５３９３）、および抗炎症性または抗老化性の特性を主張する食品中でのＩＸまたはＸの使用（特許ＷＯ０３０９０５５５）である。さらに、皮膚治療用化粧品中の８−ＰＮの使用も示唆されてきた（ＣＡ２４２６４６７）。
【０００８】
インビトロで主張された効果をインビボで発揮するためには、食餌中のフラボノイド類は腸から吸収され、変化しないでその標的に到達する必要がある。一般に、モノマーのフラボノイド類は、未修飾のまま胃を通って小腸の中へ移動し、そこで腸間膜循環における腸からの吸収が起き得る。インビトロの研究では、吸収によりＸ（イルメイザー（Ｙｉｌｍａｚｅｒ）ら（２００１ａ）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４９１，２５２−２５６）および８−ＰＮ（ニコリック（Ｎｉｋｏｌｉｃ）ら（２００４）薬物代謝と動態（Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ）３２，２７２−２７９）の広範囲な肝臓生体内変化を指摘した。しかしながら、小腸での食餌中のポリフェノールの吸収の程度は、むしろ制限され（１０から２０％）、それによって多くの割合のフラボノイド類が大腸に達することを示唆している。８−ＰＮの非プレニル化類似体であるナリンゲニンは、腸の中で、環の開裂および脱ヒドロキシル化（レヒナー（Ｒｅｃｈｎｅｒ）ら（２００４）Ｆｒｅｅ  Ｒａｄｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．３６，２１２−２２５）を含む、微生物による強い生体内変換を示し、続いて吸収および尿中排泄を行う。プレニルフラボノイド類の腸内での生体内変換については殆ど知られていない。ノーカンダー（Ｎｏｏｋａｎｄｅｈ）ら（２００４）植物化学（Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）  ６５，５６１−５７０では、ラットへＸを１０００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与し、糞便から２２の代謝物質を単離した。しかしながら、回収されたフラボノイド類の大多数（８９％）は未変化のＸであった。残りの画分は、いくらかのＩＸを含む少量の異なる代謝物質から成るものであった。アビュラ（Ａｖｕｌａ）ら（２００４）［Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｓｃｉ．４２：３７８−３８２］は、ラットで同様の実験を行ない、多くの未同定の代謝物の次に
主として未変化のＸを検出した。
【０００９】
ＩＸがプロエストロゲンとして作用する可能性は、コルドハム（Ｃｏｌｄｈａｍ）ら（２００２）Ｆｏｏｄ  Ａｄｄｉｔ．Ｃｏｎｔａｍ．１９：１１３８−１１４７によって考察された。この仮定は脱メチル化を含む肝臓の広範囲の生体内変化容量に基づく。しかしながら、ＩＸを肝臓ミクロソームに暴露してもエストロゲン活性の増加につながらず、このことから８−ＰＮが全く生産されなかったと結論づけた。対照的に、ニコリック（Ｎｉｃｏｌｉｃ）らは、肝臓ミクロソームはＩＸを脱メチル化することができるが、Ｘは脱メチル化されないことを報告している（ニコリック（Ｎｉｋｏｌｉｃ）ら（２００５）Ｊ．ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．４０，２８９−２９９）。しかしながら、脱メチル化のほかに、ミクロソームは、また、プレニル側鎖を修飾し、最終的に様々な微量の分解生成物をもたらすことが実証された。シェーファー（Ｓｃｈａｅｆｅｒ）ら（２００３）（Ｊ．Ｓｔｅｒｏｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．８４，３５９−３６０）では、二人の被験者にＩＸを経口摂取させた後、尿中の低レベルの８−ＰＮを同定し、これは肝臓による脱メチル化によるものとした。
【００１０】
肝臓のほかに、結腸も、人体の重要な形質転換部位である。ヒトの結腸は非常に大きな触媒能および加水分解能を有する微生物〜１０１２個／ｃｍ３（約４００の異なった種）を含んでいる。植物エストロゲン類の代謝における、この微生物群集の重要性は、一般に明確に確立されてきている。ワン（Ｗａｎｇ）ら（２０００）Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．４８，１６０６−１６１０は、リグナン類の形質転換の原因となる２つの細菌を同定し、そしてデクロース（Ｄｅｃｒｏｏｓ）ら（２００５）Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１８３，４５−５５は、最近、大豆の植物エストロゲンのダイゼインをエクオールに形質転換することができる微生物集団を単離した。さらに、いくつかの腸内細菌は、植物エストロゲン配糖体の加水分解に必要であるβ−グルコシダーゼを有するので、植物エストロゲンの生物学的利用能を増すことが示された（ローランド（Ｒｏｗｌａｎｄ）ら（２００３）Ｂｒ．Ｊ．Ｎｕｔｒ．８９，Ｓ４５−Ｓ５８）。したがって、腸内細菌は、植物エストロゲンの生物学的利用能にとって重要な要素であると考えられる（ターナー（Ｔｕｒｎｅｒ）ら（２００３）Ｎｕｔｒ．Ｒｅｖ．６１，２０４−２１３）。
【００１１】
雌性ホップの毬花にある精油およびα−酸のみが、重要な醸造成分として経済的に関心を有するもので、具体的にこれらの化合物のみを抽出するのを目的とするホップの種々の抽出法が開発されてきた。一方では、ＣＯ２は、ホップ抽出物の製造のために現在最も受け入れられた溶媒である（パーマー，ティン（Ｐａｌｍｅｒ  ＆  Ｔｉｎｇ）（１９９５）Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．５２，３４５−３５２）。従来の有機溶媒（エタノール、ヘキサン、メタノール、または塩化メチレン）を使用する手順との比較において、ＣＯ２−抽出法は全ホップまたはホップペレットのための良好な代替法としてビールの生産に使用することができる、より選択的な抽出物を提供する。ＣＯ２−抽出物は、イソ−α−酸や還元誘導体などの多くのさらに誘導体化された、または精製された生成物の基礎を形成する。無用のプレニルフラボノイド類を除去することによる、ＣＯ２−抽出物のさらなる精製のための別の手順が、米国特許第３７９４７４４号に開示されている。
【００１２】
他方、具体的に、プレニルフラボノイド類（主としてＸ）を回収し、精製するために様々な方法が開発されている。これらの抽出方法の例として、米国特許第４１２１０４０号およびドイツ特許第１９９３９３５０号に開示されている。これらの工程を使用して、キサントフモールは容易に回収することができるので、化学的にＸを合成する方法の開発には殆ど関心が示されなかった。しかしながら、８−ＰＮはホップ毬花に低濃度で存在するために、天然抽出物から回収するのはより困難である。したがって、市販のナリンゲニンのプレニル化により８−ＰＮを生産するための合成戦略が開発されてきた。最初に、８−ＰＮは、ナリンゲニンの非選択的な低収率の直接Ｃ−プレニル化により、またはフロロア
セトフェノンから出発することにより生産される。効率的な小規模の化学合成は、ユウロピウム（ＩＩＩ）触媒を使ったクライゼン転位によって達成された（ゲスター（Ｇｅｓｔｅｒ）（２００１）４面体（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ）５７，１０１５−１０１８）。最近、この方法に基づいた工業的規模の生産が、ヨーロッパ特許第１５２４２６９号に記載された。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
ホップおよびホップ抽出物の広範囲な工業的使用にもかかわらず、天然源由来の８−ＰＮなどの生物活性なプレニル化植物エストロゲン類の効率的な製造方法はない。
【００１４】
発明の要約
本発明の目的は、天然源から得ることができる５−アルコキシフラボノイド類由来の８−ＰＮなどの生物活性なプレニル化植物エストロゲン類の生産のための効率的な方法、ならびにそのような生物活性なプレニル化植物エストロゲン類を使用する医薬化合物および補助食品を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
最初の態様では、本発明は、５−アルコキシ−フラボノイド転移酵素（５−ＡＯ−ＦＴ）活性および／または６’−アルコキシ−カルコン転移酵素（６’−ＡＯ−ＣＴ）活性を有する組成物を提供する。さらに詳しくは、本発明は、５−メトキシ−フラボノイド−メチル転移酵素（５−ＭＯ−ＦＭＴ）活性および／または６’−メトキシ−カルコン−メチル転移酵素（６’−ＭＯ−ＣＭＴ）活性を有する組成物を提供する。本発明のさらなる実施形態は、プレニル化５−アルコキシ−フラボノイド類および／またはプレニル化６’−アルコキシ−カルコン類を脱アルキル化することができる組成物に関する。本発明の特定の実施形態は、６’−アルコキシカルコンキサントフモール（Ｘ）および／または５−アルコキシ−フラボノイドイソキサントフモール（ＩＸ）を脱アルキル化することができる組成物を提供する。本発明の組成物はこのように生物活性な植物エストロゲン類、より詳しくはプレニル化植物エストロゲン類、さらに詳しくは８−ＰＮを生産することができる。
【００１６】
ある特定の実施形態によれば、５−アルコキシ−フラボノイドおよび／または６’−アルコキシ−カルコン脱アルキル化活性を有する組成物は、非動物起源、より詳しくは原核生物起源の物質を含むまたはそれから由来する組成物である。さらに詳しくは、本発明の組成物は、細菌の細胞、あるいはその抽出物、上清液、または他の精製もしくは半精製物質を含む。本発明の特定実施形態は、ユーバクテリウム属またはペプトストレプトコッカス属、より具体的には、ユーバクテリウム・リモスムまたはペプトストレプトコッカス・プロダクタス（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）などのホモ酢酸生成菌、あるいはそれ由来の抽出物、上清液、または他の精製もしくは半精製物質を含む組成物に関する。
【００１７】
本発明の別の特定の実施形態は、細菌株および／または細胞、その抽出物、上清液、または他の精製もしくは半精製物質を含む組成物を含み、５−アルコキシ−フラボノイド転移酵素（５−ＡＯ−ＦＴ）活性および／または６’−アルコキシ−カルコン転移酵素（６’−ＡＯ−ＣＴ）活性の生産が、より詳しくは５−メトキシプレニルフラボノイドなどの５−アルコキシフラボノイドと繰り返しインキュベーションすることにより富化されている。
【００１８】
本発明のさらに別の特定の実施形態は、ホモ酢酸生成菌株、より詳しくはユーバクテリウム属、最も具体的にはユーバクテリウム・リモスム由来の５−メトキシ−（プレニル）
フラボノイドメチル転移酵素および／または６’−メトキシ−（プレニル）カルコン−メチル転移酵素を含む組成物を含む。
【００１９】
本発明の組成物の特定の実施形態は、ベルギー微生物保存機関（ＢＣＣＭ）のＢＣＣＭ／ＬＭＧコレクションに寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２３５４６として寄託されているユーバクテリウム・リモスムの菌株に由来する、５−アルコキシ−フラボノイド転移酵素（５−ＡＯ−ＦＴ）および／または６’−アルコキシ−カルコン転移酵素（６’−ＡＯ−ＣＴ）の富化された活性を含む組成物に関する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、５−アルコキシ−フラボノイド類の５位での脱アルキル化を含む植物エストロゲンの生産方法または６’−アルコキシカルコン類の対応する６’位での脱アルキル化するための方法を提供し、該方法を、非動物性の真核生物または原核生物の物質を使用してインビトロで実施することを特徴としている。特定の実施形態では、その方法は８−ＰＮの生産に使用される。
【００２１】
特定の実施形態によれば、本発明の方法における脱アルキル化は、脱メチル化であり、非動物性の真核生物または原核生物の物質を使用して実施される。さらに詳しくは、非動物性の物質は、細菌株または細菌株の物質、最も具体的にはホモ酢酸生成菌、あるいは部分的に精製または単離された酵素などの精製または半精製画分または成分である。特定の実施形態は、ユーバクテリウム・リモスムなどのユーバクテリウム属またはペプトストレプトコッカス属からの物質を用いる脱アルキル化に関する。さらに、本発明方法の別の特定の実施形態は、プレニル化５−アルコキシ−フラボノイド類および／またはプレニル化６’−アルコキシ−カルコン類を脱メチル化する方法を含む。
【００２２】
さらなる特定の実施形態によれば、植物起源、より詳しくはホップ起源の５−アルコキシ−フラボノイド類および／または６’−アルコキシ−カルコン類を脱アルキル化する方法が提供される。特定の実施形態によれば、６’−アルコキシカルコン、すなわちキサントフモールおよび／または５−アルコキシ−フラボノイド、すなわちイソキサントフモール脱アルキル化の方法が提供される。
【００２３】
本発明のさらなる態様は、５−アルコキシ−フラボノイド類および／または６’−アルコキシ−カルコン類のインビトロでの脱アルキル化、さらに具体的には５−メトキシ−フラボノイド類および／または６’−メトキシ−カルコン類脱メチル化のための細菌細胞株の使用である。より具体的には、細菌細胞はユーバクテリウム・リモスムなどのホモ酢酸生成菌株由来の細胞である。さらなる特定実施形態は、細菌細胞の使用であって、該菌体中では５−アルコキシ−フラボノイド転移酵素（５−ＡＯ−ＦＴ）活性および／または６’−アルコキシ−カルコン転移酵素（６’−ＡＯ−ＣＴ）活性の生産が、例えば、５−メトキシ−プレニルフラボノイドなどの５−アルコキシフラボノイドと繰り返しインキュベーションすることにより増えている。
【００２４】
本発明のなおさらなる態様は、植物エストロゲンをインビトロで生産する方法を提供し、該方法は、ａ）細菌の細菌株、より詳しくはホモ酢酸生成菌またはその抽出物を供給する工程、ｂ）５−アルコキシ−フラボノイド類、より詳しくは５−メトキシ−フラボノイド類および／または６’−アルコキシ−カルコン類、より具体的には、６’−メトキシ−カルコン類を含む組成物を、細菌株またはその抽出物と接触させ、５−アルコキシ−フラボノイド類、および／または６’−アルコキシ−カルコン類を、該細菌株またはその抽出物で脱アルキル化させる工程を含む。場合によっては、この方法は、生成した脱アルキル化フラボノイドを同定したり、および／または精製したりすることをさらに含む。
【００２５】
これらの方法の特定の実施形態は、細菌株の抽出物を供給することを含む方法であって
、該方法は細菌の抽出物を富化し、場合によっては細菌の抽出物を精製して富化もしくは精製された５−アルコキシ−フラボノイド転移酵素（５−ＡＯ−ＦＴ）活性および／または富化もしくは精製された６’−アルコキシ−カルコン転移酵素（６’−ＡＯ−ＣＴ）活性を含むようにする工程をさらに含む。
【００２６】
場合によっては、本発明の方法は、５−メトキシプレニルフラボノイドなどの５−アルコキシフラボノイドと繰り返しインキュベーションすることにより、５−ＡＯ−ＦＴ活性および／または６’−ＡＯ−ＣＴ活性の細菌株の生産を富化させる工程を含む。
【００２７】
本発明のなお別の態様は、ユーバクテリウム・リモスムから５−メトキシ−プレニルフラボノイドメチル転移酵素および／または６’−メトキシ−プレニルカルコンメチル転移酵素を提供する。
【００２８】
本発明のなお別の態様は、本発明の方法により得られる生物活性な植物エストロゲン類を含む医薬組成物および補助食品を提供する。
【００２９】
本発明のなお別の態様は、同時または連続投与のための２成分を含む医薬組成物または補助食品を提供し、ここで第１成分が５−アルコキシ−フラボノイド転移酵素（５−ＡＯ−ＦＴ）活性および／または６’−アルコキシ−カルコン転移酵素（６’−ＡＯ−ＣＴ）活性を有するホモ酢酸生成菌またはその抽出物もしくは成分を含み、第２成分が５−アルコキシフラボノイド類および／または６’−アルコキシカルコン類もしくはホップ抽出物などのそれらの源ｓを含む。特定の実施形態によれば、フラボノイドは、６’−アルコキシカルコンキサントフモールまたは５−アルコキシ−フラボノイドイソキサントフモールである。さらに特定の実施形態は、ホモ酢酸生成菌がユーバクテリウム・リモスムである、本発明に係る医薬組成物および補助食品に関する。場合によっては、本発明の医薬組成物中の細菌は、結腸特異的送達の製剤で提供される。
【００３０】
本発明は、ＩＸがヒトまたは動物、特に脊椎動物または哺乳動物の腸内細菌などの非動物性微生物によって脱メチル化されて８−ＰＮとすることができ、こうしてＩＸはプロエストロゲンとして作用することができることを開示している。本発明は、さらにＩＸの８−ＰＮへの転換、例えば、８−ＰＮのインビトロでの生産をそのような微生物の培養を使用して実行することのできる微生物を同定している。さらに、本発明は、定量的にＩＸから８−ＰＮを生産することのできる他の菌株を選択する方法を提供する。
【００３１】
本発明は、インビボでの細菌叢によるメチル化フラボノイド植物エストロゲン前駆体の転換は非常にバラツキがあり、それは個体の細菌叢の組成に依存する（個体間で、または異なる時期の同一個体内で）ことをさらに証明している。このことは植物エストロゲンへの個体の暴露が重要な結果を有しているようである。確かに、ホップ抽出物、ビール、および食品または補助食品の中では、エストロゲン作用が弱いＩＸは、８−ＰＮよりはるかに高い濃度で存在する。
【００３２】
活性化された植物エストロゲン類（インビトロまたはインビボで）の生産方法を提示することにより、本発明は現在の食餌中のホップ抽出物に対してさらに興味ある代替品あるいは補完物を提供する。メチル化フラボノイド植物エストロゲン前駆体（例えばＩＸ）のそれらの活性な脱メチル化された化合物への転換の予測不能な収率は、インビトロでの予備転換またはインビボ／インシチュ（ｉｎ  ｓｉｔｕ）での脱アルキル化によって制御することができる。これにより、腸内菌叢中の個体差にもかかわらず、各個体で活性成分への暴露を制御することが可能であり、また具体的にこれらの違いを考慮に入れることが可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
発明の詳細な説明
定義
本出願では、以下の省略記号が使用される：
Ｘ：キサントフモール
ＤＭＸ：デスメチルキサントフモール
ＩＸ：イソキサントフモール
８−ＰＮ：８−プレニルナリンゲニン
６−ＰＮ：６−プレニルナリンゲニン
５−ＡＯ−ＦＴ：５−アルコキシフラボノイドアルキル転移酵素
５−ＭＯ−ＦＭＴ：５−メトキシ−フラボノイドメチル転移酵素
６’−ＡＯ−ＣＴ：６’−アルコキシカルコンアルキル転移酵素
６’−ＭＯ−ＣＭＴ：６’−メトキシ−カルコンメチル転移酵素
用語「フラボノイド類」は、２位、３位または４位の位置に別の芳香族環Ｂを有するクロマン環を有するＣ１５骨格に基づく有機分子の基を意味する（図１Ａ）。図１Ａは、フラボノイド上の置換基のための従来のナンバリングを示し、それは本発明でもまた使用される。フラボノイド類のサブグループは、カルコン類、フラバノン類、フラボン類、フラバノール類およびイソフラボノイド類である。カルコン類（図１Ｂ）は、フラバノン類（図１Ｃ）の異性体である。図１Ｂおよび図２は、カルコン類の従来のナンバリングを示す。フラバノン類は、２位、３位の二重結合を欠く点でフラボン類（図１Ｅ）とは異なる。フラボン類（図１Ｅ）は、フラボノール類（図１Ｅ）の３−ＯＨ基がないフラボノイド類である。イソフラボノイド類（図１Ｆ）は、フェニル環Ｂが３位に位置するフラボノイド類である。これらのサブグループは全て４位にケト官能基を有する。
【００３４】
本発明で使用される用語「プレニルフラボノイド」は、フェノール環の１つに結合した非極性のプレニル側鎖を含むフラボノイドに関する。プレニル側鎖はたいてい８位にあるが、６位にもあるいは６位および８位の両方に［カルコン類では、プレニル側鎖は３’位および／または５’位］にも存在することができる。ホップでは、プレニルフラボノイド類は、主にルプリン腺で発見され、雌性植物のホップ毬花の小包葉の基部にある。プレニルフラボノイド類の他の天然源は、例えば、デンドロビウム・ランセオラタム（Ｄｅｎｄｒｏｌｏｂｉｕｍ  ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ）、ソフォラ・フラベセンス（Ｓｏｐｈｏｒａ  ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ）、ソフォラ・トメントーサ（Ｓｏｐｈｏｒａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）、アルトカルプス・コムヌス（Ａｒｔｏｃａｒｐｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｕｓ）およびマーシャリア・グランジフローラ（Ｍａｒｓｈａｌｌｉａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）である。プレニルフラボノイド類の例としては、カルコン類（キサントフモール（Ｘ）およびデスメチルキサントフモール（ＤＭＸ）、デヒドロシクロキサントフモールなど）およびフラバノン類（イソキサントフモール（ＩＸ）、８−プレニルナリンゲニン（８−ＰＮ）および６−プレニルナリンゲニン（６−ＰＮ））が挙げられる。
【００３５】
本発明で使用される用語「ゲラニルフラボノイド」は、フェノール環の１つに結合した非極性のゲラニル側鎖を含むフラボノイドに関する。例としては、テトラヒドロキシ−ゲラニルカルコン、６−ゲラニルナリンゲニン、３’−ゲラニルカルコンナリンゲニンおよび８−ゲラニルナリンゲニンが挙げられる。これらのゲラニル化された化合物の全ては、ホップ毬花から単離されて、８−ゲラニルナリンゲニンはエストロゲン活性があるとされた（ミリガン（Ｍｉｌｌｉｇａｎ）ら（２０００）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  Ｍｅｔａｂ．８５，４９１２−４９１５）。
【００３６】
本明細書で使用される用語「酵素的脱アルキル化または脱メチル化」は、酵素を使用して化合物から、アルキル基またはメチル基をそれぞれ除去することを意味する。
【００３７】
本明細書で使用される用語「５−アルコキシ脱アルキル化」または「５−メトキシ脱メチル化」は、フラボノイドの５位に位置するアルコキシ基からアルキル基を、あるいはメトキシ（−ＯＣＨ３）基からメチル基をそれぞれ除去することを意味する（環のナンバリングに関しては、図１Ａを参照）。この意味では、「５−メトキシ」および「５−Ｏ−メチル−」は、同じ意味を有する。
【００３８】
用語「５−アルコキシ（プレニル）フラボノイド転移酵素（５−ＡＯ−（Ｐ）ＦＴ）」は、５−アルコキシ（プレニル）フラボノイド類の５−アルコキシ脱アルキル化を確実にすることのできる酵素を意味する。
【００３９】
フラボノイド類の特定のグループは、環のナンバリングが異なるカルコン類である。したがって、カルコン類に関していえば、本発明はカルコン化合物からアルキル基を除去する方法、最も具体的には６’−アルコキシ脱メチル化に関する。すなわち、カルコンの６’位に位置するメトキシ（−ＯＣＨ３）などのアルコキシ基からのメチル基の除去に関する（環のナンバリングに関しては、図１Ｂを参照）。本明細書中で、「６’−メトキシ」および「６’−Ｏ−メチル」は同じ意味である。また、６’−アルコキシ脱アルキル化およびより具体的には６’−メトキシ脱メチル化は、「６’−アルコキシ−（プレニル）カルコン転移酵素（６’−ＡＯ−（Ｐ）ＣＴ）」および「６’−メトキシ−（プレニル）カルコンメチル転移酵素（６’ＭＯ（Ｐ）ＣＭＴ）」とそれぞれ呼ばれる。
【００４０】
本明細書で使用される「微生物」は、細菌およびカビの両方を含む。それは、動物の腸もしくは動物（ヒトを含む）の他の部分の微生物群集、または任意の環境のサンプルからの個々の微生物、微生物集団もしくは微生物群集に関する。
【００４１】
本発明の明細書中で使用される用語「インビトロでの方法」は、多細胞生物の外部で実施される方法に関係し、生細胞の非存在下で実施される方法（例えば、溶解細胞、タンパク質抽出物あるいは組み換えタンパク質の使用）および生細胞、より具体的には単離された細胞の培養物を使用して実施されるプロセスの両方を含む。したがって、インビトロでの方法を参照する場合、それは完全なホップ毬花中あるいは生きている動物の腸内などの自然界で生じるようなプロセスを除外するように意図される。
【００４２】
「インシチュでの脱アルキル化」を参照する場合、身体の１以上の特定の器官におけるインビボでの脱メチル化活性を意図する。
【００４３】
本明細書で「細菌」を参照する場合、好気性細菌または嫌気性細菌の両方を意図する。
細菌に関する「酢酸生成菌」は、ＣＯ２をアセチル−ＣｏＡ経路を経由してアセテートまたは酸化型アセテートに還元する嫌気性細菌である。代表的な酢酸生成菌は、例えば、アセトアネロビウム・ノテラエ（Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｎｏｔｅｒａｅ）、アセトバクテリウム・ウッディ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）、アセトバクテリウム・ビエリンガエ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｉｅｒｉｎｇａｅ）、アセトゲナム・キブイ（Ａｃｅｔｏｇｅｎｕｍ  ｋｉｖｕｉ）、アセチトマクラム・ルミニス（Ａｃｅｔｉｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｒｕｍｉｎｉｓ）、クロストリジウム・アセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・サーモアセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、クロストリジウム・フォルミコアセチカム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｆｏｒｍｉｃｏａｃｅｔｉｃｕｍ）、デスルホトマカラム・オリエンティス（Ｄｅｓｕｌｆｏｔｏｍａｃｕｌｕｍ  ｏｒｉｅｎｔｉｓ）、スポロムサ・パウシボランス（Ｓｐｏｒｏｍｕｓａ  ｐａｕｃｉｖｏｒａｎｓ）、ペプトストレプトコッカス属およびユーバクテリウム属である。
【００４４】
明細書および特許請求の範囲における第１、第２、第３などの用語は、同様の要素を区
別するために使用され、必ずしも順番または年代順に説明するために使用されるのではない。そのように使用される用語は、適切な状況下で交換可能であり、本明細書に記載された本発明の実施形態は、ここに記載された、または例示された順序とは別の順序で操作できることを理解すべきである。
【００４５】
本発明によれば、酵素的脱アルキル化、およびより具体的には、フラボノイド類の５−アルコキシ脱アルキル化は、一般に、５−アルコキシ転移酵素と呼ばれる酵素によって、より詳しくは５−メトキシフラボノイド転移酵素（５−ＭＯ−ＦＭＴ）および／または６’−メトキシカルコンメチル転移酵素（６’−ＭＯ−ＣＭＴ）によって、ならびに５−アルコキシ−フラボノイドアルキル転移酵素または６’−アルコキシカルコンアルキル転移酵素の酵素を生産する完全な生細胞または不活化細胞（または細胞物質）によって、そのような溶解細胞によって、そのような細胞（例えば細胞膜または細胞質）の溶解の画分によって、上記５−アルコキシ−フラボノイドアルキル転移酵素および／または６’−アルコキシカルコンアルキル転移酵素を含む富化されたまたは精製されたタンパク質画分によって、あるいは遺伝子組み換えで発現された５−アルコキシ−フラボノイドアルキル転移酵素および／または６’−アルコキシカルコンアルキル転移酵素によっても達成される。組換え型の脱アルキル化酵素が細胞によって分泌される場合、馴化培地を使用することができる。組換え型の酵素が細胞質性である場合は、分泌シグナルを組み替えＤＮＡに付加させて増殖培地から採取可能なタンパク質を得ることができる。
【００４６】
本発明はアルコキシ−デアルキラーゼ、より詳しくはアルコキシフラボノイドからアルキル基を除去することができる酵素を提供する。該アルキル基は直鎖状または分岐状のアルキルであり得る。より詳細には、アルキル基は、Ｃ１−Ｃ６アルキルである。１つの特定実施形態では、アルキル基はメチルである。
【００４７】
本発明によれば、５−アルコキシ−アルキル転移酵素、より詳しくは原核生物あるいは真核生物の非動物性起源である５−アルコキシ−フラボノイド−アルキル転移酵素が提供され、これは植物細胞あるいは微生物を起源とする５−アルコキシ−アルキル転移酵素を含む。
【００４８】
本発明の第１の態様は、５−アルコキシ−フラボノイド類脱アルキル化、より具体的には５−メトキシフラボノイド類脱メチル化および／または６’−メトキシカルコン類脱メチル化が可能な細胞、抽出物、および富化された半精製または精製されたタンパク質（ならびにこれらの１つ以上を含む組成物にも関する）に関する。本発明の特定の実施形態によれば、５−ＡＯ−ＦＭＴ（および／または６’−ＡＯ−ＣＭＴ）活性を含む細胞、抽出物、およびタンパク質は、細菌起源である。より詳細には、該細菌はホモ酢酸生成菌である。本発明のさらなる実施形態は、ユーバクテリウム種およびペプトストレプトコッカス種から選択されたホモ酢酸生成菌に関する。ホモ酢酸生成菌は、糖類、炭素１個の化合物（例えば蟻酸塩、メタノール、ＣＯおよびＣＯ２＋Ｈ２）、ならびに炭素源としてのアルコキシル化芳香族化合物を使用して嫌気性条件下で培養することができる。増加または富化されたプレニルフラボノイド脱アルキル化活性または脱メチル化活性を有する細菌株は、本明細書の実施例で記載したように、関連する基質上での繰り返しの培養により選択することができる。本明細書で云う活性の富化は、最初の株よりも約１．５倍から約１０倍の高活性である活性に関し、より詳細には最初の菌株よりも約３倍の高活性に関する。場合によっては、本発明の富化方法は、基質（例えば２５ｍｇ／ＬのＩＸを使用して）の９０％から１００％の転換にまで達する酵素活性を確実にする。したがって、本発明はまた、細菌株の５−アルコキシ−フラボノイド転移酵素（５−ＡＯ−ＦＴ）活性および／または６’−アルコキシ−カルコン転移酵素（６’−ＡＯ−ＣＴ）活性を富化させる方法にも関し、該方法は、細菌株を５−メトキシプレニルフラボノイド（または６’−メトキシカルコン）などの５−アルコキシフラボノイドを含む培地で培養する工程を含み、さらに詳
細には、ＩＸ（またはＸ）を含む培地中で細菌を増殖させ、続いてコロニーを生産する最強のものを選択する工程を含む。最も具体的には、細菌株は基質を含む培地中で繰り返し、例えば２回から１０回、さらに具体的には３回または４回、培養し、続いて最高の５−アルコキシ−フラボノイド転移酵素（５−ＡＯ−ＦＴ）活性および／または６’−アルコキシ−カルコン転移酵素（６’−ＡＯ−ＣＴ）活性を有するコロニーを選択する。この活性は、例えば、反応の最終生成物の生産に基づいて測定することができる。特定の実施形態によれば、この富化方法は、ホモ酢酸生成菌株、より具体的にはユーバクテリウムまたはペプトストレプトコッカスの菌株、最も具体的にはユーバクテリウム・リモスムまたはペプトストレプトコッカス・プロダクタスの菌株で実施される。富化された特定の細菌株の例は、ベルギーの微生物保存機関（ＢＣＣＭ）のＢＣＣＭ／ＬＭＧコレクション、微生物学研究室、ゲント大学（ＵＧｅｎｔ）、住所Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａｎｃｋｓｔｒａａｔ
３５，Ｂ−９０００  ゲント市、ベルギーにＷｉｌｌｙ  Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅにより寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２３５４６として２００６年３月１５日に寄託された。
【００４９】
したがって、本発明は、富化された半精製または精製された５−アルコキシフラボノイド転移酵素、より具体的には５−メトキシ−プレニルフラボノイドメチル転移酵素を製造する方法を提供し、該方法は、細菌株を得る工程を含み、より詳しくは、増加／富化した５ＡＯ−ＦＴ活性、さらに詳しくは、増加した５ＭＯ−ＦＭＴ活性を有するユーバクテリウム・リモスムなどのホモ酢酸生成菌を得る工程を含み、硫酸アンモニウムによる沈澱、イオン交換クロマトグラフィおよびゲル濾過クロマトグラフィを含む古典的精製法を使用して該酵素を富化し、半精製または精製する工程を含む。
【００５０】
本発明の細菌株は、アルキル転移酵素またはメチル転移酵素が高濃度で存在し、および／または高活性の自然界に生じる突然変異体が存在する源を提供する。どちらの場合も、「富化された」細菌株として参照される。
【００５１】
さらに別の本発明の実施形態によれば、５−アルコキシ脱アルキル化活性、さらに詳しくは５−メトキシフラボノイド−脱メチル化活性（および／または６’−メトキシカルコン−脱メチル化活性）を有する細胞は、５−アルコキシ−アルキル転移酵素、さらに詳しくは、５−ＭＯ−ＦＭＴ（および／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ）をコードするＤＮＡ配列を微生物または細胞に導入することにより得られる遺伝子導入細胞である。増加した５−ＭＯ−ＦＭＴ（および／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ）活性を有する遺伝子組み換え植物細胞は、増加した５−ＭＯ−ＦＭＴ（および／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ）活性を有する植物に成長することもでき、それは天然または人工的に誘発されたアルコキシフラボノイド（例えばメチルフラボノイド）の高レベルと組み合わせることにより、植物エストロゲン類の「インプランタ（ｉｎ  ｐｌａｎｔａ）」生産をもたらす。したがって、本発明は増加した植物エストロゲン含量を有するホップ植物などの遺伝子組み換え植物を提供するが、これに限定されない。
【００５２】
別の実施形態によれば、５−アルコキシ脱アルキル化活性、さらに詳しくは５−メトキシ脱メチル化活性を含む細胞、抽出物およびタンパク質は、フムラス・ルプラス（Ｈｕｍｕｌｕｓ  ｌｕｐｕｌｕｓ）の植物細胞、またはマーシャリア・グランジフローラ（Ｍａｒｓｈａｌｌｉａ  ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）やソフォラ・トメントーサ（Ｓｏｐｈｏｒａ  ｔｏｍｅｎｔｏｓａ）など、８−ＰＮが合成される、他の植物の植物細胞である。より大規模な転換のために、ＸまたはＩＸから８−ＰＮへの天然の転換が増強された植物は、５−ＭＯ−ＦＭＴ（および／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ）の、あるいは５−ＭＯ−ＦＭＴ（および／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ）を過剰発現する天然の突然変異体を見つけるためにスクリーニングすることができる。
【００５３】
細胞または組成物は、５−ＡＯ−ＦＴ（および／または６’−ＡＯ−ＣＴ）活性につい
て、またはより具体的には５−ＭＯ−ＦＭＴ（６’−ＭＯ−ＣＭＴ）活性についてアッセイにより分析することができ、該アッセイでは５−Ｏ−メチル化フラボノイド（６’−Ｏ−メチル化カルコン）の試験基質のその脱メチル化体への転換が調べられる。この試験基質は、好ましくは、プレニル化された５−メトキシフラボノイドである。特定の実施形態によると、化合物ＩＸは基質として使用され、８−ＰＮへの転換は質量分析、ＨＰＬＣ、または他の分析方法で分析された。５−メトキシ脱メチル化活性を含む細胞、抽出物あるいは組成物の酵素特異性は、他の位置にメトキシ基を有するフラボノイド基質を用いて分析することができる。例えば、分析のための適切な基質は、４’位、５位、６位、７位および８位にメトキシ基を有するタンゲレチンである。この分析は、細菌起源の５−ＡＯ−ＦＴ（および／または６’−ＡＯ−ＣＴ）脱アルキル化活性または５−ＭＯ−ＦＭＴ（および／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ）脱メチル化活性と、哺乳類ミクロソーム、または植物細胞由来の脱メチル化活性とを区別することを可能にする。５−メトキシ脱メチル化活性を保持する細菌または植物細胞の抽出物は、標準的なタンパク質抽出方法によって得られる。５−ＭＯ−ＦＭＴ（および／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ）活性を有する精製されたタンパク質は、精製画分の活性スクリーニングと連結したタンパク質精製方法により得られる。
【００５４】
本発明の第２の態様は、５−アルコキシフラボノイド転移酵素（５−ＡＯ−ＦＴ）および／または６’−アルコキシカルコン転移酵素（６’ＡＯ−ＣＴ）、あるいはより具体的には５−メトキシフラボノイドメチル転移酵素（５−ＭＯ−ＦＭＴ）および／または６’−メトキシカルコンメチル転移酵素（６’−ＭＯ−ＣＭＴ）を生産する細菌の使用に関し、あるいはプレニル化またはゲラニル化された５−メトキシフラボノイド類などを含む天然または合成の５−メトキシフラボノイド類脱アルキル化または脱メチル化に対するこうした活性を含むそれらの抽出物または精製されたタンパク質に関する。
【００５５】
本発明の特定の実施形態では、ＩＸなどの５−メチル化フラボノイド類を８−ＰＮに変換することができる細胞、より具体的には微生物が、８−ＰＮおよび関連する化合物の費用効果の高いインビトロでの生産のために使用される。異なった実施形態は以下のように考えられる：例えば、細菌の脱メチル化株をホップ抽出物あるいは（部分的に）精製されたホップ由来化合物と培養する；例えば、細菌の脱メチル化株、細胞抽出物または最終的な馴化培地をホップ抽出物上に、または（部分的に）精製したホップ由来化合物上に噴霧する；または、後者を例えば脱メチル化細菌または細胞抽出物または最終的に馴化した培地を含む培地中に浸し、一定持間の後に該細菌株をできたら不活性化する。したがって、本発明は、植物エストロゲン類の大規模な、費用効果の高いインビトロ生産方法を提供する。
【００５６】
本発明によれば、５−ＡＯ−ＦＴ（および／または６’−ＭＯ−ＣＴ）活性を含む細菌、抽出物および／またはタンパク質は、活性なエストロゲン類、より具体的には５−アルコキシフラボノイド類から植物エストロゲン類を製造するために使用することができる。本発明の特定の実施形態は、植物のフラボノイド類、より具体的にはホップから得られるフラボノイド類脱メチル化における５ＭＯ−ＦＭＴおよび／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ活性の使用に関する。本発明のさらに特定の実施形態は、実質的に同じ生物活性を有する、ＩＸの８−ＰＮへの転換、またはＩＸの誘導体の８−ＰＮの誘導体への脱メチル化に関する。本発明の特定の実施形態によれば、８−ＰＮなどの脱メチル化されたプレニルフラボノイド類のある種の誘導体は、容易に利用可能なメチル化された前駆体の構造を最初に修飾し、続いて本発明に従って脱メチル化することにより生成させることができ、それにより脱メチル化プレニルフラボノイド誘導体が得られる。可能な修飾は、側鎖の付加または結合の飽和化あるいは不飽和化などである。
【００５７】
さらに、本発明の細胞または抽出物を含む５−ＡＯ−ＦＴ活性および／または６’−Ａ
Ｏ−ＣＴ活性、より具体的には５−ＭＯ−ＦＭＴ活性および／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ活性は、他の５−アルコキシフラボノイド類脱アルキル化のために使用することができる。最も具体的には、ＩＸ（またはＸ）の他に、他の５−メトキシフラボノイド類（または６’−メトキシカルコン類）は、また本発明に係る基質として考えられる。そのような基質としては、４位、６位、７位、８位、２’位、３’位、４’位、５’位および６’位（フラボノイドのナンバリング）に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ６アルコキシおよびＣ１−Ｃ６アシル、ハロゲン、長鎖長の炭素鎖、芳香族基、１以上の糖残基または糖アルコール類、エーテル類、エステル類、燐酸エステル類、硫酸エステル類、アミン類、その他などから成る群からそれぞれ独立して選択される置換基を有する、５−メトキシフラボノイド類または６’−メトキシカルコン類である。
【００５８】
本発明の特定の実施形態によれば、５−アルコキシフラボノイド、より具体的には５−メトキシフラボノイドは、７位の水酸基および／または２位および３位の間の２重結合および／または４’位の水酸基によって特徴づけられる。最も詳しくは、本発明は、６位および／または８位にプレニル基またはゲラニル基を含む５−メトキシフラボノイド脱メチル化における５−ＭＯ−ＦＭＴ活性の使用に関する。場合によっては、このプレニル基またはゲラニル基はさらに、二重結合の修飾、イソプレノイドへの形質転換および置換などの修飾により修飾することができるが、これらに限定されない。ある実施形態では、これらの５−メトキシフラボノイド類は、６’−メトキシカルコン類または５−メトキシフラバノン類であり、それらのプレニル化またはゲラニル化したものも含む。特定の実施形態では、それらは、キサントフモール（Ｘ）（２’，４，４’−トリヒドロキシ−３’−プレニル−６’−メトキシカルコン）（カルコン類のナンバリングは、図１Ｂおよび図２に示される）およびイソキサントフモール（ＩＸ）（５−Ｏ−メチル−８−プレニルナリンゲニン）、またはそれらの誘導体から選択され、それらは実質的に同様の生物活性を有する（またはそれによって、これらの化合物の脱メチル化は、実質的に同様の生物活性を有する化合物を生成する）。
【００５９】
本発明の別の実施形態は、さらに５−メトキシ基を有する以下の分子：４’−アセチル−７−プレニルオキシナリンゲニン、（±）−（Ｅ）−８−（４”−ヒドロキシイソペンテニル）ナリンゲニン（８−ＰＮ−ＯＨ）、（±）−（Ｅ）−８−（４”−オキソイソペンテニル）ナリンゲニン（８−ＰＮ＝Ｏ）および６，８−ジプレニルナリンゲニンから成る群から選択される化合物の脱アルキル化における、５−アルコキシフラボノイド転移酵素（５ＡＯ−ＦＴ）活性および／または６’−アルコキシカルコン転移酵素（６’ＡＯ−ＣＴ）活性を含む細菌またはそれらの抽出物の使用に関する。
【００６０】
本発明は、非動物の原核生物または真核生物の物質を使用して、インビトロで脱メチル化プレニルフラボノイド類を生産する改良方法を提供する。これは、８−ＰＮのような商品価値があるこれらの脱メチル化プレニルフラボノイド類にとって特別に関心がある。上記したように、８−ＰＮは、インビボでエストロゲン活性を示し、骨量減少を防止し、血管新生および転移を阻害する。従って、本発明の方法によって生産される化合物は、骨粗鬆症や癌のような疾患を治療もしくは予防するために使用することができる。本発明の方法で得られる、エストロゲンの特性を有する脱メチル化プレニルフラボノイド類あるいはゲラニルフラボノイド類は、ビールを含む飲料のようなヒトまたは動物の消費のための食品や補助食品に、ならびにヒトや動物の皮膚に使用される化粧品においても含ませることができる。したがって、本発明は、さらにそのような食品や補助食品の生産および医薬品の生産のための改善された方法を提供する。
【００６１】
本発明の別の態様は、５−ＭＯ−ＦＭＴ活性または６’−ＭＯ−ＣＭＴ活性を有する細胞、細胞抽出液または精製された酵素を投与することによる、ヒトまたは動物の身体の腸内または任意の他の部分内でのメチル化フラボノイド類のインシチュでの活性化に関する
。特定の実施形態によれば、５−ＭＯ−ＦＭＴ活性および／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ活性の投与は、メチル化フラボノイド類、またはそれらの起源のものと、別々にあるいは１つの組成物で同時的または連続的な投与と組み合わされる。酵素活性を含む組成物と基質を含む組成物との両方は、医薬組成物または補助食品として供給され得る。メチル化フラボノイド類源は、植物（例えば、ホップ）部分または抽出物または精製されたメチル化フラボノイド化合物を含むが、これらに限定されない。脱メチル化プレニルフラボノイド類、より具体的には８−ＰＮのインシチュでの生産は、エストロゲンを使用しておよび抗アンドロゲン療法として治療することができる骨量減少、病理学的血管新生および転移（これらに限定されないが）などの疾病および状態を治療および／または予防する代替方法を提供する。
【００６２】
場合によっては、アルキル化フラボノイド類を大腸への特異的な標的とする異なった投与戦略を考えることができる。これは、例えば、組成物を大腸での放出につながる組成物のカプセル化により、またはグルクロンニド、硫酸エステル、酢酸エステル、プロピオン酸エステル、グルコシド、アセチル−グルコシド、マロニル−グルコシド、およびそれらの混合物から成る群から選択される複合体を得るための複合によって達成することができる。
【００６３】
別の態様では、本発明は５−ＭＯ−ＦＭＴ活性および／または６’−ＭＯ−ＣＭＴ活性を有する細胞、抽出物または精製タンパク質を含むか、あるいはそれらから成る医薬組成物および／または補助食品に関する。本発明のこの態様の特定の実施形態によれば、細胞は微生物の細胞であり、より詳しくはホモ酢酸生成菌のユーバクテリウムおよびペプトストレプトコッカスなどのホモ酢酸生成菌の細菌細胞である。場合によっては、医薬組成物または補助食品は、脱メチル化化合物として強いエストロゲン活性を示す、メチル化プレニルフラボノイド源またはゲラニルフラボノイド源をさらに含む。そのような供給源は植物の抽出物（特にホップ）、またはその富化された画分である。それはまた、合成メチル化プレニルフラボノイドである。微生物およびメチル化フラボノイドの両方は、同時か連続する投与のために個別の製薬担体の中で／と共に提供することができるか、あるいは均質にまたは不均整に分配されて同じ製薬担体の中で組み合わせることができる。したがって、本発明は、医薬組成物の組み合わせ、医薬組成物と補助食品との組み合わせ、および補助食品の組み合わせを提供する。さらに、本発明は、本発明の医薬組成物をそれを必要とする患者に同時にまたは連続的に投与する段階を含む治療方法を提供する。同様に、本発明は、医薬品を製造するための、５−アルコキシ−アルキル転移酵素活性を含む組成物および／または本明細書に記載した５−アルコキシフラボノイド類を含む組成物の使用を提供する。通常、本発明の組成物は、エストロゲン補充剤として、および／またはエストロゲン代償療法としてそれを必要とする患者に投与される。
【００６４】
メチル化されたＩＸまたはＸ（８−ＰＮに脱メチル化される）の投与量は、１０から２００００μｇ／日／７５ｋｇ、５０から１００００μｇ／日／７５ｋｇまたは５０から７０００μｇ／日／７５ｋｇの範囲であり、例えば、約５、１０または２０ｍｇ／日／７５ｋｇである。それほど強力でないフラボノイド類のメチル化体は、この脱メチル化体のエストロゲン活性を８−ＰＮと比較した後に、したがって高用量で投与することができる。
【００６５】
本発明の１態様は、本発明に係る５−アルコキシ−アルキル転移酵素活性を有する細菌または細菌抽出物および製薬担体を含む医薬組成物を提供する。最適の効果を達成するために、製薬担体は、好ましくは微生物を大腸で放出する。医薬品の結腸を標的とする投与法はよく知られており、例えばコラシア，ジャイン（Ｃｈｏｕｒａｓｉａ  ＆  Ｊａｉｎ）（２００４）Ｄｒｕｇ．  Ｄｅｌｉｖ．１１（２），１２９−１４８の総説がある。薬剤の結腸での放出を標的とする現在利用可能な様々な戦略は、プロドラッグの形成、ｐＨ感受性ポリマーのコーティング、結腸特異的生分解性ポリマーの使用、時限放出システム
、浸透圧システム、および圧力制御薬剤送達システムを含む。標的薬剤の結腸への放出を達成するための様々なアプローチの中で、腸内細菌による特に生分解性ポリマーの使用は、大いに有望である。ポリサッカリダーゼは、薬剤の結腸を標的とする際に利用される、十分な量で入手可能な細菌酵素である。このアプローチに基づいて、様々な多糖類は、結腸特異的薬剤放出について調べられた。これらの多糖類はペクチン、グアーガム、アミロース、イヌリン、デキストラン、キトサン、およびコンドロイチン硫酸を含む。この天然ポリマーの１群は、多くの誘導体化可能な基、広範囲な分子量、変動する化学組成、ならびに大部分は低毒性およびなお高い安定性を有するポリマーから成るので、薬剤送達に対して魅力的である。これらの材料の中で最も好ましい特性は、医薬品賦形剤として承認されていることである。
【００６６】
本発明の脱アルキル化細菌による内部からの分解を避けるために、細菌は最初に非細菌分解性の製薬担体中に置かれ、次に結腸での細菌叢により分解されることができるポリマーでコーティングされる。この後、細菌は、レオポルド（Ｌｅｏｐｏｌｄ）（１９９９）Ｍｅｄ  Ｋｌｉｎ．  ９４  Ｓｕｐｐｌ  １，６−１１で総説されているように、例えば、ｐＨおよび時間で制御された薬剤放出機序によって、あるいは強い蠕動性の波により結腸の管腔圧力の増加を利用することによって放出されることができる。
【００６７】
また、腸内微生物の酵素活性に依存しない結腸特異的送達システムは、公知である。例えば、ヨーロッパ特許ＥＰ０６７３６４５は、結腸への薬剤を標的とする送達システムについて記載しており、該システムは、３つの部分を含む：（１）胃液が送達システムに浸透するのを防止し、それにより胃の中でどんな薬剤の放出をも防ぐための腸溶性コーティング；（２）腸管の上部を通って輸送される間に暴露され、徐々に浸食される浸食性ポリマー層；および（３）浸食可能なポリマー層が浸食された後、容易に崩壊して、薬剤を標的部位、すなわち結腸に薬剤を放出する、有効成分（複数を含む）を含む従来の錠剤またはビーズレットであるコア。
【００６８】
ヨーロッパ特許出願ＥＰ０４５３００１は、腸内で、特に結腸内で、および回腸の末端部分で薬理学的に作用する活性成分の制御標的放出の特性を有する医薬組成物を記載している。有効成分は、多粒子多投与形態に調製され、少なくとも２つの膜で被覆され、そのうちの１つはｐＨ依存性の溶解度を有し、そして他方は、不溶性であるが腸液に対しては浸透性である。被覆された有効成分は、胃の中および最初の腸部分に残存し、すなわちｐＨが５．５未満である間は、それは放出されない。それがより高いｐＨ（小腸または結腸）の環境に達したときに初めて、ｐＨ依存性の膜が溶出し有効成分の放出を始める。この瞬間から、２番目の膜（ｐＨに依存はしないが、腸液に浸透性である）は小腸−結腸管内での薬剤の溶出を遅らせ、制御する作用をする。
【００６９】
ヨーロッパ特許ＥＰ０７７８７７８は、１以上のユーバクテリウムなどの共生微生物および大腸に微生物を輸送する担体を有する組成物を記載している。この担体は、改変された、または改変されていない難消化性澱粉であり、特に高アミロース澱粉であり、これは、大腸の中の微生物のための成長培地あるいは維持培地の役割をする。米国公開特許第２００４１７５３８９号は、共生細菌が胃を通過する間、その生命を保持する一方、腸で放出させる、特に結腸内で放出させる製剤を記載しており、該製剤は水との反応性が低く、したがって長い保存期間を有する。該製剤は、実質的に水を含まない共生細菌と１価のアルギン酸塩との混合物を含み、該混合物は実質的に水のない環境で形成され、維持される。このアルギン酸塩は、アルギン酸ナトリウムおよびアルギン酸カリウムを含むが、アルギン酸マグネシウムあるいはアルギン酸カルシウムのような二価の塩類は含まない。一般に、そのような製剤に対して腸溶性コーティング（例えばゼラチンあるいはセルロースのカプセル化）が提供される。
【００７０】
特定の実施形態、特定の構成および配置、ならびに物質は、以下の実施例の段落で議論されるが、これらは例示的であるのみであり、様々な変更または改変が、形式上または詳細に本発明の範囲と精神から逸脱することなく行われ得ることを理解すべきである。
【００７１】
実施例
実施例１：ヒトの糞便培養物によるイソキサントフモール（ＩＸ）の脱メチル化
糞便サンプルは、２０歳から３５歳の間の１２人の健康なヒト被験者から得て、ＡからＬと名付けた。被験者の誰もが胃腸疾患の病歴を持っておらず、また、被験者はサンプル収集前３カ月以内には抗生物質を服用していなかった。２０％（ｗ／ｖ）の新鮮な糞便サンプルの糞便スラリーは、還元剤として１ｇ／Ｌのチオグリコール酸ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩水（０．１Ｍ、ｐＨ  ７）を用いて糞便を均質化して調製された。微粒子状の物質は遠心分離（１分間、５００×ｇ）によって除いた。上清液は、これ以降「培養物」と呼ぶ。
【００７２】
糞便サンプルＡ、Ｂ、Ｃ、およびＤ（また、培養物Ａ−Ｄとして参照される）から得られた、ホップのプレニルフラボノイドＩＸを分解または形質転換する能力は、糞便培養物（１０％（ｖ／ｖ））を２５ｍｇ／Ｌのイソキサントフモールと共に脳心臓浸出物（ブレインハートインフュージョン）培地（０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩を含む）で嫌気性条件下、８日間、インキュベーションして試験された。０日目と８日目の培養物の抽出物は、Ｒｏｕｔｌｅｄｇｅ  ＆  Ｓｕｍｐｔｅｒ（１９９６）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｃｈｅｍ．１５，２４１−２４８に基づくＤｅ  Ｂｏｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｎｖ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  １０９，６９１−６９７に記載の酵母によるエストロゲンスクリーニングを用いて、ＩＸの生物活性を有する形質転換生成物に関して分析した。要するに、サッカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、ヒトのエストロゲン受容体（ＥＲａ）遺伝子を用いて、応答要素およびｌａｃＺレポーター遺伝子（酵素β−ガラクトシダーゼをコードする）を含む発現プラスミドと共に形質転換された。β−ガラクトシダーゼ活性は、色原体物質クロロフェノールレッド−β−Ｄ−ガラクトピラノシドからクロロフェノールレッドへの転換によって５４０ｎｍで定量される。バイオアッセイ応答は、５４０ｎｍにおける吸収を６３０ｎｍにおける光学密度で割る［（Ａ５４０ｎｍ／Ａ６３０ｎｍ）ｎｅｔ］ことにより表示される。サンプルのエストロゲン活性は、エストロゲン受容体バイオアッセイにおいて１００％の応答を引き出す１０ｎＭエストラジオール（Ｅ２）に対する％当量として表示した。バイオアッセイは、９６穴プレートで実施され、該プレート中では１０μＬの試験化合物が試験され、２４０μＬの遺伝子組み換え酵母（６１０ｎｍにおける０．２５の光学密度）とインキュベーションされた。試験化合物の連続希釈法がジメチルスルホキシド中で行われ、それは活性（横軸）に対する用量（縦軸）の用量反応曲線の生成を可能にした。データは、Ｍａｒｑｕａｒｄｔ−Ｌｅｖｅｎｂｅｒｇアルゴリズムを使用する４パラメータロジステックモデル（Ｓｉｇｍａｐｌｏｔ  ４．０，ＳＰＳＳ  Ｉｎｃ．，Ｃｈｉｃａｇｏ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ，ＵＳＡ）（Ｄｅ  Ｂｏｅｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｅｎｖ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  １０９，６９１−６９７）で適合化された。
【００７３】
結果は図３に示される。培養物のどれもが０日目はエストロゲン応答を示さなかった。８日後に、エストロゲン特性の強い増加は、培養物Ｃ（図３）に見られたが、培養物Ａ、ＢあるいはＤ（データは示されていない）では、見られなかった。これらの結果は、糞便培養物Ｃの、ＩＸを増加したエストロゲン特性を備えた化合物へ変換する能力を示している。この形質転換をさらに試験するために、培養物Ａ−Ｄ（１０％（ｖ／ｖ））は、２５ｍｇ／Ｌの濃度のＸまたはＩＸのいずれかと共にブレインハートインフュージョン培地（０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩を含む）中、嫌気性条件下８日間インキュベーションして、転換生成物がＨＰＬＣにより検出された（表１）。ＩＸは、酵母によるエストロゲン
スクリーニング試験の結果により、培養物Ａ、ＢおよびＤでの形質転換に抵抗することが分かった。しかしながら、培養物Ｃ中では、約４０％の８−ＰＮが回収され、そのことは培養物Ｃのエストロゲン特性の増加を説明するものである。全てのサンプル中で、Ｘは僅かにＩＸに転換されたが、これはＸをオートクレーブした培養物とインキュベーションしたときにも検出されるので、これは非酵素的異性化であった。培養物Ｃでは、再び、ヒト大腸菌によるＩＸの転換に由来する小量の８−ＰＮが検出された。
【００７４】
【表１】
2008532558.tif 000003
【００７５】
この結果は、腸内細菌が成分の５位に存在するメトキシ基の酵素的Ｏ−脱メチル化のプロセスにより、ＸとＩＸを８−ＰＮに形質転換する能力を示す。しかし、全ての培養物がこの反応を実行することができたわけではなかった。したがって、残りの培養物Ｅ−Ｌ（１０％（ｖ／ｖ））は、２５ｍｇ／ＬのＩＸと共にブレインハートインフュージョン培地（０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩を含む）中、嫌気性条件下３日間インキュベーションした（図４）。ＩＸの微生物によるＯ−脱メチル化は、サンプルＥ、Ｊ、およびＫのみに検出された。
【００７６】
この実施例は、メチル化プレニルフラボノイド類が、摂取後は代謝的に不活性ではなく、生物学的に（より大きい）活性な脱メチル化誘導体に活性化されることができることを示している。しかしながら、この形質転換能力は、試験されたサンプルの３分の１のみにＩＸの活性化が起きているので、腸内微生物群集の組成と活性に強く依存している。
【００７７】
さらにこれらの相互個人差を調べるために、合計５１の糞便サンプルは、２５ｍｇ／ＬのＩＸを含むブレインハートインフュージョン培地（０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩を含む）中、嫌気性条件下３日間インキュベーションした（図５）。その結果は、インキュベーションされたＩＸの濃度に対する８−ＰＮ生産の％として表示されており、サンプルは８−ＰＮ生産能力を増加させる順番に並べた。データは２ステップクラスター分析によって分析され、３つのグループが有意に異なる手段（Ｐ＜０．０１、Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定）で検索された（ａ、ｂおよびｃと示した）。
【００７８】
これらのデータは、メチル化プレニルフラボノイド類の活性化は、腸内微生物群集に依存し、各個人を高い（グループｃ、１６％）、中位の（グループｂ、２２％）および遅い（グループａ、６３％）の８−ＰＮ生産者に分けられることを示している。一般に、活性成分への最終暴露は、前駆体濃度と腸内微生物群集の形質転換能力との組み合わせにむし
ろ依存するであろう。
【００７９】
実施例２：８−プレニルナリンゲニン型のエストロゲン特性を有する化合物を生産するための微生物の使用
この実施例は、ＩＸを８−ＰＮに転換する２つのよく特性化された腸内嫌気性細菌の能力について説明する。
【００８０】
ユーバクテリウム・リモスムＡＴＣＣ８４８６およびペプトストレプトコッカス・プロダクタスＡＴＣＣ２７３４０は、ドイツ微生物系統保存施設（ＤＳＭＺ、ブラウンシュワイク（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ）、ドイツ）から入手した。ユーバクテリウム・リモスムは、２５ｍｇ／ＬのＩＸおよび８−ＰＮを含むブレインハートインフュージョン培地（０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩を含む）中、嫌気性条件下１３日間インキュベーションした（表２）。この菌株は、ＩＸを８−ＰＮに転換することができた。この株は、基質として与えられたすべての８−ＰＮが、１３日間のインキュベーション後、回収することができたので、８−ＰＮをさらには分解しなかった、この特徴は、８−ＰＮが広範囲にさらに代謝される肝臓ミクロソーム中で観察されるような代謝経路とは明らかに異なる［ニコリック（Ｎｉｋｏｌｉｃ）ら（２００５）Ｊ．ｏｆ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．４０，  ２８９−２９９；ニコリック（Ｎｉｋｏｌｉｃ）ら（２００４）Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  Ｄｉｓｐｏｓｉｔｉｏｎ  ３２，２７２−２７９］。
【００８１】
【表２】
2008532558.tif 000004
【００８２】
ユーバクテリウム・リモスムのＩＸを８−ＰＮに転換する能力により、８−ＰＮを定量的に生産することのできる細菌株を得るための選択操作が行われた。この選択操作は、２５ｍｇ／ＬのＩＸと共にユーバクテリウム・リモスム［単一のコロニーから成る培養物］の６つの並列したインキュベーションおよび８日間のインキュベーションから成るものであった。次に、最大量の８−ＰＮを生産した培養物が選択され、次のラウンドの６つの並列インキュベーション（表３）の接種源として使用された。第１選択ラウンドでは、最低の生産率がわずか２％だけであった一方、３回の選択工程の後では８２％までの増加が明らかであり、また、最も効率的な培養では、投薬されたＩＸをすべて８−ＰＮに形質転換した。各ラウンドにおける６つのインキュベーションすべての平均生産率は２２．５％から９０．５％まで増加し、また、標準偏差は選択操作の後では２０％から７％まで減少した。このことは、わずか３回のラウンドの後に、殆ど全てのＩＸ（高い平均値）を転換し、および安定でもある（低い標準偏差値）菌株が選択されたことを意味する。
【００８３】
【表３】
2008532558.tif 000005
【００８４】
ペプトストレプトコッカス・プロダクタスのＩＸから８−ＰＮへの酵素的転換を行う能力を試験するために、２５ｍｇ／ＬのＩＸを含むブレインハートインフュージョン培地（０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩を含む）中、嫌気性条件下１３日間、３通りインキュベーションした。サンプルは２日毎に分析し、そして、ＩＸと８−ＰＮの濃度が測定された（図６）。インキュベーションに依存して、ペプトストレプトコッカス・プロダクタスは、インキュベーションされたＩＸから８−ＰＮへ、１０％から５０％形質転換した。このことは、この菌株はまた８−ＰＮの生産に適していることを示す。ペプトストレプトコッカス・プロダクタスの菌株は、ユーバクテリウム・リモスムに対して記載された理論的根拠に従い、富化された脱メチル化活性に関してさらに選択することができる。
【００８５】
富化されたユーバクテリウム・リモスムの細菌株の特定例は、ベルギーの微生物保存機関（ＢＣＣＭ）のＢＣＣＭ／ＬＭＧコレクションに寄託番号ＬＭＧ  Ｐ−２３５４６として３月１５日にＷｉｌｌｙ  Ｖｅｒｓｔｒａｅｔｅによって寄託されている。
【００８６】
実施例３：発酵設定におけるメチル化プレニルフラボノイド類を転換をするための微生物の使用
流加発酵実験は、上記で得た選択されたユーバクテリウム・リモスムの菌株を使用し設計され、発酵設定においてメチル化プレニルフラボノイド類を転換した。発酵は、１．５Ｌのブレインハートインフュージョン培地（０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩を含む）を充填したＢｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ（登録商標）Ｍ発酵槽（２Ｌ容器）中で行った。次いで、発酵槽は、１２１℃で３０分間、高圧蒸気滅菌して殺菌した。接種する前に、発酵槽は窒素ガスを１時間、システムに流すことにより嫌気性とした。この後、発酵槽は、２日間培養のユーバクテリウム・リモスム培養物で接種され、２５ｍｇ／ＬのＩＸを発酵液体に加えた。発酵はｐＨを制御することなく２週間、３７℃で行なった。１日目から日に３回、２５ｍｇ／ＬのＩＸを含む２００ｍｌの嫌気性ブレインハートインフュージョン培地（０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩を含む）を、１０ｍｌ／ｍｉｎで、反応容器に加え、同時に２００ｍｌ／ｍｉｎの発酵内容物がシステムから除かれた。１０ｍｌのサンプルが化学分析のために流出液から抜き取られた。これは、０日目、１日目、２日目およびそれ以降は２日ごとに行われた。データは、％転換（８−ＰＮ／（ＩＸ＋８−ＰＮ））としてのものであった。ＩＸの８−ＰＮへの転換については、０％（０日目）、４３％（１日目）および１００％（２日目およびそれ以降の日）を得た。
【００８７】
この実施例は、選択された菌株が発酵に基づく戦略で、ＩＸを高いエストロゲン活性の８−ＰＮに転換することができることを示し、他の適用のための成分として使用するのに興味のある化合物を精製する目的で、あるいはメチル化フラボノイド類を含むホップ抽出物または他の植物抽出物中の前駆体を活性化する目的で、エストロゲン特性を有する製品の前駆体からの生産などの応用に繋がる。
【００８８】
実施例４：菌株補充はＩＸの８−ＰＮへの生体外での転換を開始する。
実施例２の選択実験から得られた最も効率的なユーバクテリウム・リモスムの菌株は、実施例１の元々は非転換の培養物Ｂに補充され、糞便懸濁液の複雑な環境中で８−ＰＮの生産を開始するためのこの菌株の能力を検討した。菌株は、０％から１００％（ｖ／ｖ）までの範囲の割合で培養物に添加された。この混合物は、２５ｍｇ／ＬのＩＸの１０％（ｖ／ｖ）を含むブレインハートインフュージョン培地（０．５ｇ／Ｌのシステイン塩酸塩を含む）中、嫌気性条件下７日間インキュベーションした。８−ＰＮの濃度は２日毎に追跡した（図７）。その結果は、ユーバクテリウム・リモスムの補充が増大するにつれて、８−ＰＮの生産は増加したことを示している。等量のユーバクテリウム・リモスムと糞便サンプル（図７中、１００％）は、ＩＸの８−ＰＮへの完全な転換を与えたが、１％の補充でも、投薬されたＩＸの半分は、わずか１日後には既に８−ＰＮに転換されていた。注目すべきことに、８−ＰＮの最大濃度は、すべてのインキュベーションについて１日目で到達した。このことは、利用可能なＩＸがすべて直ちに形質転換されたことを示す。１日目および７日目の８−ＰＮの濃度は有意に違わないので、８−ＰＮのそれ以上の転換は、検出されなかった（有意差検定（Ｓｔｕｄｅｎｔ  Ｔ−ｔｅｓｔ）、ｐ＞０．０５））。
【００８９】
この実施例は、選択された菌株が糞便培養物の複雑な環境でＩＸを高度にエストロゲン様の８−ＰＮに変換し、メチル化プレニルフラボノイド類を含むホップ抽出物あるいは他の植物抽出物などの他の様々な媒体において、インシチュで前駆体からエストロゲン特性を有する生成物に転換するなどの可能な適用をもたらすことができることを証明している。
【００９０】
実施例５：腸管のインビトロ動的シミュレーションモデルにおけるメチル化プレニルフラボノイド類の転換
以下の段階では、ＩＸなどの前駆体をエストロゲン特性を有する８−ＰＮなどの生成物に転換するインシチュでの転換を実証するために、腸管のインビトロ動的シミュレーションモデルが使用された（ヒト腸内微生物生態系の模擬実験装置（ＳＨＩＭＥ））、（モエリー（Ｍｏｌｌｙ）ら（１９９３）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３９，２５４−２５８）。ＳＨＩＭＥは、ヒト胃腸管の異なる部分を表す一連の５つの反応装置から成る。最初の２つの反応装置（胃「反応装置１」および小腸「反応装置２」）は、食物の摂取および消化の異なるステップを模擬実験するための、胃および十二指腸コンパートメントに一定量のＳＨＩＭＥ供給材料（３回／日）および膵液と胆汁を加えて、指定された間隔の後にそれぞれの反応装置を空にする蠕動ポンプを備えた投入−引き抜き原理（ｆｉｌｌ−ａｎｄ−ｄｒａｗ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ）に関する。最後の３つのコンパートメント（それぞれ、上行結腸「反応装置３」、横行結腸「反応装置４」および下行結腸「反応装置５」）は、一定の容量およびｐＨ制御を備えた連続的に撹拌される反応装置である。異なる反応容器の保持時間およびｐＨは、胃腸管の異なる部分でのインビボの条件に似るように選択された。小腸中の食物の輸送は、６０ｍｌ人工膵液および胆汁、パンクレアチンならびにＮａＨＣＯ３の添加によって反応装置２の中で模擬実験された。システムの温度は自動温度調節装置によって３７℃に維持され、システムは、毎日１５分間、Ｎ２を流すことにより嫌気性に維持した。接種源は、デ・ボエバー（Ｄｅ  Ｂｏｅｖｅｒ）ら（２０００）Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ  １３０，２５９９−２６０６に記述されるように糞便物質から調製された。反応装置３、４および５は、栄養培地で満たされ、ｐＨはそれぞれのｐＨに調整された。最後に、５０ｍｌの接種原は、最後の３つの反応装置に添加された。
【００９１】
この実験については、上記したシステムの２つは、２つの完全に別個の反応装置として組み合わされ、該別個の反応装置は２つの同じポンプ（２つのポンプヘッドを備えたポンプであって、両方のシステムへ正確に同じ量の液体を投薬することを可能にする）によって運転され、同一のｐＨおよび温度調節を有するとともに、同じ流動食を受け取る。このように、別々に導入することができる２つのシステムでの腸内微生物群集を除いて、パラ
メーターはすべて完全に制御され、同一である。この場合、メチル化プレニルフラボノイド類を活性化することのできる微生物群集（ＰＦ＋）および活性化することのできない微生物群集（ＰＦ−）が導入された。正常なＳＨＩＭＥ食餌物質が投薬された２週間の安定化期間の後、２５ｍｇ／ＬのＩＸが４週間（１５日目から４４日目の間）、ＳＨＩＭＥ食餌物質に投薬された。最後の２週間は、実施例２の選択されたユーバクテリウム・リモスムの菌株が、第１結腸コンパートメントにも投与され、共生細菌としての該菌株の適用を模擬実験した（３０日目から４４日目の間）。
【００９２】
図７および８は、ＰＦ＋微生物群集およびＰＦ−微生物群集に対する上行結腸部位、横行結腸部位および下行結腸部位におけるＩＸおよび８−ＰＮの濃度を示す。ＰＦ＋コンパートメントでは、ＩＸのみを投与したとき（１５日目から３０日目）、メチル化プレニルフラボノイド類の活性化は、遠位結腸部分で示された一方、ＰＦ−コンパートメントでは何の転換も起きなかった。細菌株の補充（３０日目から）をした後、活性化能力はＰＦ＋コンパートメントおよびまたＰＦ−コンパートメントでも増加し、そしてエストロゲン活性の８−ＰＮが遠位結腸部分で検出された。
【００９３】
この実施例は、実施例２の選択された菌株はヒトの腸の模擬実験の条件下では、メチル化プレニルフラボノイド類を活性化することができることを示している。
【００９４】
実施例６：実施例２の選択された菌株のインビボでの５−アルコキシプレニルフラボノイドの脱メチル化能の証明
純粋培養・無菌性のヒトフローラ定着（ＨＦＡ）ラットを用いる実験は、実施例２の選択された菌株のインビボでのメチル化プレニルフラボノイド類の活性化能を試験するために行われた。全部で１２匹の純粋培養されたラットが、研究に使用された。ラットが５週目になった時、プレニルフラボノイド脱メチル化活性を有する、新たに排泄された均質な糞便培養物を経口強制給餌することにより定着させた。これらのＨＦＡラットはＰＦ＋ラットと呼ばれた。
【００９５】
それと同時に、３匹のＨＦＡラットは、プレニルフラボノイド脱メチル化活性を有しない、新たに排泄された均質な糞便培養物を経口強制給餌することにより定着させた。これらのＨＦＡラットはＰＦ−ラットと呼ばれた。残りのラットは、無菌状態の下で維持された。ラットはすべて実験の開始に先立って個別の、密閉された集合的なケージの中で飼われた。
【００９６】
ラット腸内の微生物培養物の３週間の安定化の後に、最初の実験を開始した。ラットを個々の代謝ケージに移動させた後に、２ｍｇのＩＸ／ｋｇ体重を、毎日、各ラットに５日間投与し、２４時間プールした尿を毎日集めた。３日後に、ＩＸおよび８−ＰＮの尿中への排泄量が計測された。転換率［８−ＰＮ／（ＩＸ＋８−ＰＮ）］は、表４に示される。この後、ラットは、第２部の実験の前まで集合ケージに２週間戻された。
【００９７】
ここに、６匹の純粋培養ラットは、実施例２の選択されたユーバクテリウム・リモスムの菌株のｌｏｇ９の細菌懸濁液を毎日、７日間経口強制給餌することにより定着させた。２日目には、ラットは２４時間プールの尿採取のために個々の代謝ケージに移された。２日目から７日目までの間、２ｍｇのＩＸ／ｋｇ体重をラットに経口強制給餌した。７日目には、尿中へのＩＸおよび８−ＰＮの排泄が計測された。転換率［８−ＰＮ／（ＩＸ＋８−ＰＮ）］は表４に示される。
【００９８】
【表４】
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【００９９】
この実施例は、純粋培養ラットが８−ＰＮを生産しなかったように、メチル化プレニルフラボノイド類の活性化は、微生物単独の現象であることを示す。さらに、腸内での形質転換能の相違は、ＰＦ−ラットと比較してＰＦ＋ラットがより高い８−ＰＮ比率を有していたように、異なる８−ＰＮの排泄をもたらす。最後に、この実施例は、選択されたユーバクテリウム・リモスムの菌株は、純粋培養ラットがこの細菌の定着後に８−ＰＮの生産を開始したので、インビボでメチル化プレニルフラボノイド類を活性化することができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
図面は、本発明を説明するように意図されるものであるが、本発明を本明細書中に示された実施形態への如何なる限定をも意味するものではないと考えるべきである。
【図１】フラボノイド類の一般的な構造。
【図２】ホップのプレニルフラボノイド類の構造およびそれらの転換。
【図３】ＩＸとインキュベーションした糞便培養物（Ｃ）のエストロゲン応答（平均＋標準偏差）（ゼロおよび８日間のインキュベーション）（ｎ＝３）。
【図４】３日後のヒト糞便培養物（Ｅ〜Ｌ）によるＩＸ（２５ｍｇ／Ｌ）の８−ＰＮへの形質転換（平均＋標準偏差）（ｎ＝３）。
【図５】５１人の異なるヒト個体からの腸内細菌によるイソキサントフモール（ＩＸ）の８−プレニルナリンゲニン（８−ＰＮ）への転換。ヒト個体は８−ＰＮ生産の増加順に配列した。結果はＩＸの８−ＰＮへの転換の平均％（±標準偏差）（ｎ＝３）として表される。
【図６】ペプトストレプトコッカス・プロダクタスによるＩＸ（２５ｍｇ／Ｌ）の８−ＰＮへの転換（３つの培養物：Ｉｎｃ  １、Ｉｎｃ  ２およびＩｎｃ  ３）。ＩＸ（塗りつぶし記号）の消失および８−ＰＮ（白抜き記号）の生成を、１３日の期間追跡した。
【図７】ユーバクテリウム・リモスム培養物を糞便培養物Ｂに補充後のＩＸの８−ＰＮへの転換（０％（糞便サンプルのみ）から１００％（純粋培養ユーバクテリウム・リモスム培養物）までの％）（ｎ＝３）。
【図８】ＴＷＩＮ  ＳＨＩＭＥのＰＦ＋コンパートメントにおけるメチル化メチルフラボノイド類を活性化する条件下でのヒト腸内細菌エコシステムの模擬実験装置でのＩＸから８−ＰＮへの転換。
【図９】メチル化メチルフラボノイド類を活性化しない条件下でのヒト腸内細菌エコシステムの模擬実験装置におけるＩＸから８−ＰＮへの転換。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月26日(2007.11.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）５−アルコキシフラボノイド脱アルキル化活性および／または６’−アルコキシカルコン−脱アルキル化活性を有する細菌の細菌株またはその抽出物の第１組成物を供給すること、
ｂ）５−アルコキシ−フラボノイド類および／または６’−アルコキシカルコン類を含む第２組成物を、細菌株またはその抽出物を含む前記第１組成物と接触させ、前記細菌株または抽出物により前記５−アルコキシ−フラボノイド類および／または６’−メトキシカルコン類を脱アルキル化させることを含む、
１以上の植物エストロゲンをインビトロで生産する方法。
【請求項２】
前記５−アルコキシ−フラボノイド類および／または６’−アルコキシカルコン類が、５−メトキシフラボノイド類および／または６’−メトキシカルコン類である、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記植物エストロゲンが、８−プレニルナリンゲニンである、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
５−メトキシプレニルフラボノイドと繰り返しインキュベーションすることにより、前記細菌株の脱アルキル化活性を富化することをさらに含む、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１組成物が、ユーバクテリウム属（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．）株またはペプトストレプトコッカス属（Ｐｅｐｔｏｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）株の細菌細胞の培養物である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記５−アルコキシ−フラボノイドがイソキサントフモールである、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
５−メトキシ−フラボノイドまたは６’−メトキシカルコンをインビトロでの脱メチル
化ための、５−アルコキシフラボノイド脱アルキル化活性および／または６’−アルコキシカルコン脱アルキル化活性を有する細菌細胞株の使用。
【請求項８】
５−アルコキシフラボノイド脱アルキル化活性および／または６’−アルコキシカルコン脱アルキル化活性を有する細菌、その抽出物、半精製成分または精製成分を含む第１医薬組成物および／または補助食品と、５−アルコキシ−フラボノイド類源および／または６’−アルコキシカルコン類源を含む第２医薬組成物および／または補助食品とを含む、同時投与または連続的投与のための、１以上の医薬組成物および／または１以上の補助食品の組み合わせ。
【請求項９】
前記５−アルコキシ−フラボノイド類源がホップ抽出物である、請求項８記載の組み合わせ。
【請求項１０】
前記６’−アルコキシ−カルコンが、キサントフモールであり、および／または前記５’−アルコキシ−フラボノイドが、イソキサントフモールである請求項８または９記載の組み合わせ。
【請求項１１】
前記ホモ酢酸生成菌がユーバクテリウム・リモスムである、請求項８から１０のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項１２】
前記ホモ酢酸生成菌、その抽出物、半精製成分または精製成分が、結腸特異的送達のための製剤で提供される、請求項８から１１のいずれか１項に記載の組み合わせ。
【請求項１３】
細菌株の５−アルコキシ−アルキル転移酵素活性を富化する方法であって、５−アルコキシフラボノイド類を含む培地上で前記細菌株を拡大させる工程と、最大の５−アルコキシ−アルキル転移酵素活性を有するコロニーを選択する工程とを含む、方法。
【請求項１４】
前記工程が少なくとも２回繰り返される、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
５−アルコキシフラボノイド５−アルコキシ−アルキル転移酵素活性が富化された細菌株の細胞、抽出物、上清液または半精製もしくは精製物質を含む組成物。
【請求項１６】
ホモ酢酸生成菌ユーバクテリウム属またはペプトストレプトコッカス属の抽出物である、請求項１５記載の組成物。
【国際調査報告】
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