(57)【要約】  本発明は、過剰増殖皮膚疾患の治療に使用するための組成物及び方法を提供する。具体的には、本発明は、乾癬、並びに他の関連皮膚障害及び疾患の治療及び維持治療に特に有効であるニコチンアミド及びビタミンＤ代謝物、カルシポトリオールから本質的になる局所投与用医薬組成物を教示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
カルシポトリオール；ニコチンアミド；及びポリエチレングリコールベースの皮膚科的に許容できる賦形剤から本質的になる局所塗布用医薬組成物。
【請求項２】
前記賦形剤が、ＰＥＧ−４０００とＰＥＧ−４００の混合物を含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記組成物が、カルシポトリオール、ニコチンアミド、及びＰＥＧ−４０００とＰＥＧ−４００の混合物から本質的になる、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
以下の配合：
約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでのカルシポトリオール；
約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでのニコチンアミド；
約７０重量％から約８０重量％までのＰＥＧ−４００；
約１５重量％から約２５重量％までのＰＥＧ−４０００；
約１重量％から約５重量％までのステアレス−２０；及び
約０．１重量％から約１重量％までのビタミンＥ
を有する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
カルシポトリオールが、約２０μｇ／ｇから約７０μｇ／ｇまでの濃度で提供される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
カルシポトリオールが、約５０μｇ／ｇの濃度で提供される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項７】
カルシポトリオールが、約３０μｇ／ｇの濃度で提供される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項８】
ニコチンアミドが、約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項９】
ニコチンアミドが、約１ｍｇ／ｇから約２０ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
ニコチンアミドが、約２ｍｇ／ｇから約１０ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
ニコチンアミドが、約２．１ｍｇ／ｇの濃度で提供される、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
以下の組成：
約５０μｇ／ｇのカルシポトリオール；
約２．１ｍｇ／ｇのニコチンアミド；
約７７．７重量％のＰＥＧ−４００；
約２０重量％のＰＥＧ−４０００；
約２重量％のステアレス−２０；及び
約０．３重量％のビタミンＥ
を有する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
以下の配合：
約３０μｇ／ｇのカルシポトリオール；
約２．１ｍｇ／ｇのニコチンアミド；
約７７．７重量％のＰＥＧ−４００；
約２０重量％のＰＥＧ−４０００；
約２重量％のステアレス−２０；及び
約０．３重量％のビタミンＥ
を有する、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
カルシポトリオール；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体を含み、前記カルシポトリオールが皮膚に顕著には浸透しない医薬組成物。
【請求項１５】
５％未満のカルシポトリオールが皮膚に浸透する、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記賦形剤が、ＰＥＧベースの賦形剤である請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記賦形剤が、ＰＥＧ−４００とＰＥＧ−４０００の混合物を含む請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
カルシポトリオール及びＰＥＧベースの賦形剤から本質的になる、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
以下の配合：
約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでのカルシポトリオール；
約７０重量％から約８０重量％までのＰＥＧ−４００；
約１５重量％から約２５重量％までのＰＥＧ−４０００；
約１重量％から約５重量％までのステアレス−２０；及び
約０．１重量％から約１重量％までのビタミンＥ
を有する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
以下の配合：
約５０μｇ／ｇのカルシポトリオール；
約７７重量％のＰＥＧ−４００；
約２０重量％のＰＥＧ−４０００；
約２重量％のステアレス−２０；及び
約０．３重量％のビタミンＥ
を有する、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ニコチンアミドをさらに含む、請求項１９又は２０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ニコチンアミドが、約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される、請求項２１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
過剰増殖皮膚疾患又は障害の治療用の、請求項１から２２までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記過剰増殖皮膚疾患又は障害が、良性過剰増殖疾患又は障害及び悪性過剰増殖疾患又は障害から選択される、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記良性過剰増殖疾患又は障害が、乾癬、日光性角化症、魚鱗癬、グロバー病、尋常性ゆうぜい、角化棘細胞腫、脂漏性角化症、強皮症、及び脂漏症から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記過剰増殖疾患が乾癬である、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記悪性過剰増殖皮膚疾患又は障害が、扁平上皮癌（ＳＣＣ）及び基底細胞癌（ＢＣＣ）から選択される、請求項２４に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
典型的に、請求項１から２２のいずれか一項に記載の医薬組成物の治療有効量をそれを必要とする対象に投与するステップを含む、過剰増殖皮膚疾患又は障害を予防又は治療する方法。
【請求項２９】
カルシポトリオールが約５０μｇ／ｇの濃度で提供され、ニコチンアミドが約２．１ｍｇ／ｇの濃度で提供される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記医薬組成物が、
約５０μｇ／ｇのカルシポトリオール；
約２．１ｍｇ／ｇのニコチンアミド；
及びＰＥＧベースの担体
から本質的になる皮膚科用軟膏である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記医薬組成物が、配合：
約５０μｇ／ｇのカルシポトリオール；
約２．１ｍｇ／ｇのニコチンアミド；
約７７．７重量％のＰＥＧ−４００；
約２０重量％のＰＥＧ−４０００；
約２重量％のステアレス−２０；及び
約０．３重量％のビタミンＥ
を有する皮膚科用軟膏である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記対象が哺乳動物である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
対象がヒト対象である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記過剰増殖疾患が乾癬である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物の医療的に十分な投与量の１日１回又は２回の局所投与を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
過剰増殖疾患の症状を軽減するための開始時期に、約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に局所投与するステップと、
第二の時期に、約１０μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に局所投与するステップと
を含む過剰増殖皮膚疾患又は障害を予防又は治療する方法。
【請求項３７】
過剰増殖疾患の症状を軽減するための開始時期に、約５０μｇ／ｇの濃度のカルシポトリオール；約２．１ｍｇ／ｇの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に局所投与するステップと、
第二の時期に、約１５μｇ／ｇから約３５μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約２．１ｍｇ／ｇの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に局所投与するステップと
を含む過剰増殖皮膚疾患又は障害を治療する方法。
【請求項３８】
前記開始治療時期が、約４週から約２４週である、請求項３６又は３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第二の時期が、約８週から約５２週である、請求項３６又は３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
過剰増殖疾患の局所治療用治療組成物を調製するための、約１０μｇ／ｇ（１グラム当りのマイクログラム）から約１００μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；及び約０．１ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミドから本質的になる組成物の使用。
【請求項４１】
カルシポトリオールが、約２０μｇ／ｇから約７０μｇ／ｇまでの濃度で提供される、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
カルシポトリオールが、約５０μｇ／ｇの濃度で提供される、請求項４０に記載の使用。
【請求項４３】
カルシポトリオールが、約３０μｇ／ｇの濃度で提供される、請求項４０に記載の使用。
【請求項４４】
ニコチンアミドが、約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される、請求項４０に記載の使用。
【請求項４５】
ニコチンアミドが、約１ｍｇ／ｇから約２０ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される、請求項４０に記載の使用。
【請求項４６】
ニコチンアミドが、約２ｍｇ／ｇから約１０ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される、請求項４０に記載の使用。
【請求項４７】
ニコチンアミドが、約２．１ｍｇ／ｇの濃度で提供される、請求項４０に記載の使用。
【請求項４８】
前記治療用組成物が、約５０μｇ／ｇの濃度のカルシポトリオール；及び約２．１ｍｇ／ｇの濃度のニコチンアミドから本質的になる、請求項４０に記載の使用。
【請求項４９】
前記治療用組成物が、水溶液剤、非水溶液剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏、発泡剤、ムース剤、スプレー剤、乳濁液剤、及びミクロ乳濁液剤からなる群から選択される形態で提供される、請求項４０に記載の使用。
【請求項５０】
前記治療用組成物が、クリーム剤、ローション剤、ゲル剤又は軟膏として提供される、請求項４８に記載の使用。
【請求項５１】
前記治療用組成物がポリエチレングリコールベース製剤である、請求項４９に記載の使用。
【請求項５２】
前記治療用組成物が、ＰＥＧ−４０００とＰＥＧ−４００の混合物を含む、請求項５０に記載の使用。
【請求項５３】
前記治療用組成物が、カルシポトリオール、ニコチンアミド及びＰＥＧ−４０００とＰＥＧ−４００の混合物から本質的になる、請求項５１に記載の使用。
【請求項５４】
前記治療用組成物が、以下の組成：
約５０μｇ／ｇのカルシポトリオール；
約２．１ｍｇ／ｇのニコチンアミド；
約７７．７重量％のＰＥＧ−４００；
約２０重量％のＰＥＧ−４０００；
約２重量％のステアレス−２０；及び
約０．３重量％のビタミンＥ
を有する、請求項４０に記載の使用。
【請求項５５】
前記治療用組成物が、以下の組成：
約３０μｇ／ｇのカルシポトリオール；
約２．１ｍｇ／ｇのニコチンアミド；
約７７．７重量％のＰＥＧ−４００；
約２０重量％のＰＥＧ−４０００；
約２重量％のステアレス−２０；及び
約０．３重量％のビタミンＥ
を有する、請求項４０に記載の使用。
【請求項５６】
前記過剰増殖皮膚疾患又は障害が、良性過剰増殖疾患又は障害及び悪性過剰増殖疾患又は障害から選択される、請求項４０に記載の使用。
【請求項５７】
前記良性過剰増殖疾患又は障害が、乾癬、日光性角化症、魚鱗癬、グロバー病、尋常性ゆうぜい、角化棘細胞腫、脂漏性角化症、強皮症及び脂漏症から選択される、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
前記過剰増殖疾患が乾癬である、請求項５７に記載の使用。
【請求項５９】
前記悪性過剰増殖皮膚疾患又は障害が、扁平上皮癌（ＳＣＣ）及び基底細胞癌（ＢＣＣ）から選択される、請求項５６に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、過剰増殖皮膚疾患の治療に有用な組成物に関する。具体的には、本発明は、乾癬並びに他の関連皮膚障害及び疾患の治療に特に有効であるビタミンＤ代謝物、カルシポトリオール及びニコチンアミドから本質的になる局所用組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
過剰増殖皮膚障害及び疾患
過剰増殖皮膚障害とは、ケラチノサイトとして知られた表皮細胞の正常なレベルよりも高い増殖、又、概して異常分化を特徴とする一連の疾患及び障害を称す。
【０００３】
過剰増殖表皮病態は、悪性又は良性であり得る。悪性過剰増殖表皮病態としては：扁平上皮癌（ＳＣＣ）、基底細胞癌（ＢＣＣ）及び他の非黒色腫皮膚癌（ＮＭＳＣ）が挙げられる。良性過剰増殖表皮病態の代表例としては、乾癬、尋常性ゆうぜい、角化棘細胞腫、脂漏性角化症、脂漏症及び魚鱗癬が挙げられる。
【０００４】
乾癬は、世界人口の２％まで罹患している非伝染性皮膚障害である。米国及び欧州では推定一千万人が乾癬に罹患しており、２６０，０００までの新たな症例が毎年診断されている。米国単独では、乾癬に関して１年当り１，５００，０００人を超える診療所来院があり、年間の外来費用は、約２０億ドルであると現在推定されている。
【０００５】
乾癬は、Ｔリンパ球の活性化、増殖、及びケラチノサイトの過剰増殖に至るサイトカイン放出を刺激する未知の因子により引き起こされる。乾癬の原因は未知であるが、罹患ケラチノサイトは、この疾患の典型的な臨床的特徴：体表面の約１０％〜１５％が覆われる銀白色鱗屑で覆われた十分に分画された炎症性皮膚病変を招く。乾癬は主として成人が罹り、それ自体、種々の変化及び重症度で顕われる可能性がある。
【０００６】
乾癬を含む過剰増殖皮膚疾患の治療のための主要な方法は、過剰なケラチニサイト分裂を防ぎ、細胞分化を刺激することである。
【０００７】
現在、乾癬治療の３つの様式がある：
１）軽微で中等度の症例を治療するために、治療用クリーム剤又は軟膏の局所投与；
２）単独で使用されるか、薬物治療又は局所治療と併用する光療法（ＵＶＡ又はＵＶＢ）は、クリニックへの繰返し来院を必要とし、付随する放射線の危険性に患者は曝される；
３）免疫抑制療法に頼る全身治療は、重篤な副作用のため重症な症例に限定される。
【０００８】
ビタミンＤ及び過剰増殖皮膚疾患
ビタキンＤは、ホルモンとして作用する幾つかの活性代謝物を伴うプロホルモンである。皮膚において、プレビタミンＤ３は、７−デヒドロコレステロールから光化学的に合成され、ビタミンＤ結合タンパク質により除去されるビタミンＤ３に徐々に異性化する。肝臓において、ビタミンＤ３は、主要な循環形態である２５（ＯＨ）Ｄ３に変換され、腸肝循環を通過し、腸から再吸収される。腎臓において、それはさらに、より代謝的に活性な形態の１α、２５（ＯＨ）２Ｄ３（１α、２５−ジヒドロキシコレカルシフェロール、カルシトリオール、ビタミンＤホルモン）に水酸化される。
【０００９】
実験的な証拠により、ビタミンＤは、抗増殖剤として機能し、ケラチノサイトの終末分化を刺激することが示されている。乾癬病変において、表皮ケラチノサイトは、過剰増殖及び炎症により誘発される障害性分化を示す。したがって、ビタミンＤ及びある一定の類縁体は、尋常性乾癬を治療する上で有効である（ＤｅＬｕｃａ１９８８年；Ｌｅｈｍａｎｎら、２００４年にレビューされている）。これらの化合物の全身投与は、それらの毒性及びカルシウム代謝に対する副作用によって限定され、したがって局所用製剤が好ましい。
【００１０】
カルシポトリオール（カルシポトリエン）、ビタミンＤ３誘導体は、米国において商品名Ｄｏｖｏｎｅｘ（登録商標）（米国）又はＤａｉｖｏｎｅｘ（登録商標）（欧州）で局所用抗乾癬剤として市販されている。カルシポトリオールは、細胞増殖を調節する上で天然カルシトリオールと同じく効力があるが、カルシウム代謝に対する作用が非常に低い活性である利点を有する。これにもかかわらず、カルシポトリオールは、乾癬病変の治療において部分的にのみ有効である。
【００１１】
当該技術としては、ビタミンＤ類縁体及び誘導体並びにそれらを含む組成物を提供する。
【００１２】
ビタミンＤ類縁体は、米国特許第４，８５１，４０１号（シクロペンタノ−ビタミンＤ類縁体）、米国特許第５，１２０，７２２号（トリヒドロキシカルシフェロール誘導体）、米国特許第５，４４６，０３５号（２０−メチル置換ビタミンＤ）、米国特許第５，４１１，９４９号（２３−オキサ誘導体）、米国特許第５，２３７，１１０号（１９−ノル−ビタミンＤ化合物）、米国特許第４，８５７，５１８号（水酸化２４−ホモ−ビタミンＤ誘導体）に記載されている。さらなるビタミンＤ類縁体は、米国特許第４，８０４，５０２号；米国特許第４，８６６，０４８号；米国特許第５，１４５，８４６号；米国特許第５，３７４，６２９号；米国特許第５，４０３，９４０号；米国特許第５，４４６，０３４号；及び米国特許第５，４４７，９２４号に教示されている。
【００１３】
米国特許第５，０３７，８１６号は、インビトロでの培養腫瘍細胞或いは正常なげっ歯類又はヒト線維芽細胞若しくはケラチノサイトの分化を促進できるビタミンＤ化合物の有効量を局所投与することを含む乾癬を治療する方法に関するものである。
【００１４】
米国特許第６，５５２，００９号は、異常な細胞増殖及び／又は細胞分化を特徴とする障害の治療に有用なビタミンＤ類縁体及びレチノイド誘導体を含む組成物を開示している。一定の好ましい実施形態において、ビタミンＤ類縁体は、カルシトリオール及びカルシポトリオールから選択される。
【００１５】
米国特許第６，７５３，０１３号は、ビタミンＤ類縁体及びコルチコステロイドの併用を含む皮膚使用のための医薬組成物を記載しており、該組成物は、乾癬及び他の炎症性皮膚疾患の治療のために２つの成分療法の不都合さを緩和している。
【００１６】
ニコチンアミド
ビタミンＢ３の誘導体で補酵素ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ）の前駆体であるニコチンアミド（ＮＡ、ニアシンアミド）は、細胞代謝において複数の機能性を示す。ＮＡは、インスリン産生細胞の分化（Ｏｔｏｎｋｏｓｋｉら、１９９３年）及び遺伝毒性剤からの膵臓ベータ細胞の保護を誘導することが示されている。米国特許第６，２４８，７６３号は、皮膚病態、例えば、座瘡及び乾癬を治療するための、活性成分として０．０１％〜１％ニコチン酸メチルを含む特定の局所用組成物に関するものである。
【００１７】
ヒト表皮細胞の分化及び増殖に対するＮＡ及びビタミンＤ代謝物の相乗効果は、本発明者の何人かにより最近報告されている。
【００１８】
本発明者の何人かによる国際特許出願公開ＷＯ  ０１／５１０５１及びＷＯ  ２００４／００６８８７は、ニコチンアミド及び／又は環式アデノシンジホスフェート−リボース（ｃＡＤＰＲ）、並びにそれらの類縁体からなる群から選択される薬剤の治療有効量を対象に投与することを含む、良性及び悪性過剰増殖表皮病態を治療する組成物及び方法に関するものである。この出願はまた、ビタミンＤ３代謝物（１α２５（ＯＨ２）Ｄ３）及びＮＡの組合わせ並びにヒト表皮細胞の分化と増殖に対する相乗効果を開示している。
【００１９】
ビタミンＤ３及びビタミンＤ３類縁体は、抗増殖性及び前分化性を有することが知られており、したがって、過剰増殖皮膚障害、例えば尋常性乾癬の治療に有効である。さらにケラチノサイトの増殖を阻害するビタミンＤ３とニコチンアミドとの相乗効果は、本発明の何人かの発明者によって立証されている。ビタミンＤ３とニコチンアミドとの相乗的阻害効果は、インビトロでのケラチノサイトに示されており、医薬組成物における２つの成分の最適化は全く示されていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
該技術は、過剰増殖皮膚疾患に関連する障害の予防、治療又は弱化のためのビタミンＤ３類縁体及びニコチンアミド類縁体から本質的になる特定の製剤を教示又は示唆していない。
【００２１】
過剰増殖疾患、特に乾癬に関する症状を予防し、治療するのに有用な組成物及び方法に関してさらなる新規な医療的必要性が依然として残されている。
【課題を解決するための手段】
【００２２】
本発明は、過剰増殖疾患の治療のためにビタミンＤ３類縁体及びニコチンアミドから本質的になる組成物、及びそれらの使用方法を提供する。特に、本発明の発明者は、ニコチンアミドと併用した場合、ビタミンＤ代謝物、カルシポトリオールは、特定の濃度範囲で過剰増殖疾患の症状を軽減する上で相乗効果を生じることを予想外に見出している。したがって、本発明は、規定された濃度範囲でカルシポトリオール及びニコチンアミドから本質的になる非常に有効な治療用組成物を提供する。
【００２３】
また、本発明は、カルシポトリオールを含む知られた製剤と対照的に、本組成物のカルシポトリオールは、皮膚に顕著には浸透せず、これによって薬物への全身曝露及び随伴する副作用を除外することを開示する。したがって、本発明の組成物は、予想外にも過剰増殖疾患の即時治療並びに長期維持療法に有用である。
【００２４】
本発明の組成物は、細胞増殖阻害、特に皮膚細胞、さらに特にケラチノサイトの阻害に非常に有効で安全であるように製剤化されており、したがって乾癬及び他の過剰増殖皮膚疾患の治療に有用である。
【００２５】
一態様において、本発明は、過剰増殖皮膚疾患及び障害の治療に有用な：
約１０μｇ／ｇ（１グラム当りのマイクログラム）から約１００μｇ／ｇの濃度のカルシポトリオール；
約０．１ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇの濃度のニコチンアミド；及び
皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体、
から本質的になる局所投与用医薬組成物を提供する。
【００２６】
幾つかの実施形態において、本組成物は、水溶液剤、非水溶液剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏、発泡剤、ムース剤、スプレー剤、乳濁液剤、及びミクロ乳濁液剤からなる群から選択される形態で提供される。
【００２７】
一定の実施形態において、該組成物が、皮膚用軟膏、クリーム剤、ローション剤又はゲル剤の形態で提供される。
【００２８】
幾つかの実施形態において、皮膚科用賦形剤は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含む。幾つかの実施形態において、ＰＥＧは、ＰＥＧ−４００、ＰＥＧ−４０００及びこれら２つの混合物から選択される。該組成物は、ＰＥＧ−４００とＰＥＧ−４０００の混合物を含むことが好ましい。
【００２９】
幾つかの実施形態において、担体はさらに界面活性剤を含む。好適な界面活性剤の一つの非限定例は、ポリオキシエチル化ステアリルアルコール（ステアレス）である。好ましい実施形態において、皮膚科用担体は、ＰＥＧ−４００、ＰＥＧ−４０００及びステアレス２０を含む。幾つかの実施形態において、本発明の組成物は、カルシポトリオール、ニコチンアミド、ＰＥＧ及びステアレス−２０から本質的になる。
【００３０】
特定の実施形態において、皮膚用組成物は、以下の配合：
約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでのカルシポトリオール；
約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでのニコチンアミド；
約７０重量％から約８０重量％までのＰＥＧ−４００；
約１５重量％から約２５重量％までのＰＥＧ−４０００；
約１重量％から約５重量％までのステアレス−２０；及び
約０．１重量％から約１重量％までのビタミンＥ
を有する。
【００３１】
幾つかの実施形態において、カルシポトリオールは、約２０μｇ／ｇから約７０μｇ／ｇまでの濃度で提供される。特定の実施形態において、カルシポトリオールは、約５０μｇ／ｇの濃度で提供される。
【００３２】
他の実施形態において、カルシポトリオールは、約１０μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇまでの濃度で、好ましくは、約１５μｇ／ｇから約３５μｇ／ｇまでの濃度で提供される。幾つかの実施形態において、カルシポトリオールは、約３０μｇ／ｇの濃度で提供される。
【００３３】
幾つかの実施形態において、ニコチンアミドは、約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される。一定の実施形態において、ニコチンアミドは、約１ｍｇ／ｇから約２０ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される。他の実施形態において、ニコチンアミドは、約２ｍｇ／ｇから約１０ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される。特定の実施形態において、ニコチンアミドは、約２．１ｍｇ／ｇの最終濃度で提供される。
【００３４】
したがって、本発明は、過剰増殖皮膚疾患及び障害の治療に有用な：
約５０μｇ／ｇ濃度のカルシポトリオール；
約２．１ｍｇ／ｇ濃度のニコチンアミド；及び
皮膚科的に許容できるＰＥＧベースの賦形剤又は担体、
から本質的になる局所投与用ＰＥＧベースの軟膏を提供する。
【００３５】
幾つかの実施形態において、過剰増殖皮膚疾患は、乾癬、日光性（光線性）角化症、魚鱗癬、グロバー病（一過性棘融解皮膚病）、尋常性ゆうぜい、角化棘細胞腫、脂漏性角化症、強皮症、及び脂漏症から選択される良性過剰増殖疾患である。
【００３６】
他の実施形態において、過剰増殖皮膚疾患としては、悪性過剰増殖皮膚疾患である。悪性過剰増殖表皮病態の代表例は、限定はしないが、扁平上皮癌（ＳＣＣ）基底細胞癌（ＢＣＣ）及び他の非黒色腫皮膚癌（ＮＭＳＣ）が挙げられる。
【００３７】
特定の実施形態において、過剰増殖疾患は乾癬である。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約０．１ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に局所投与するステップを含む過剰増殖皮膚疾患又は障害を予防又は治療する方法を提供する。
【００３９】
該方法は、前記組成物の治療的に十分な投与量の１日約４回までの局所投与を含むことが好ましい。特定の実施形態において、該組成物は、１日一回又は２回投与される。幾つかの実施形態において、該組成物は、約１２時間の間隔で１日２回塗布される。他の実施形態において、該組成物は、１日１回投与される。
【００４０】
幾つかの実施形態において、該治療方法としては、２つの治療期間が挙げられる：開始治療、及び維持治療。最初に開始治療において、約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約０．１ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の開始投与量を開始期間に患者に投与し、その後、約１０μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約０．１ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物のより低い維持投与量を患者に投与する。
【００４１】
維持投与量に関して、カルシポトリオールは、約１０μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇまでの濃度で提供される。さらに他の実施形態において、カルシポトリオールは、約１５μｇ／ｇから約３５μｇ／ｇまでの濃度で提供される。特定の実施形態において、カルシポトリオールは、約３０μｇ／ｇの濃度で提供される。
【００４２】
幾つかの実施形態において、ニコチンアミドは、約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される。一定の実施形態において、ニコチンアミドは、約１ｍｇ／ｇから約２０ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される。他の実施形態において、ニコチンアミドは、約２ｍｇ／ｇから約１０ｍｇ／ｇまでの濃度で、好ましくは、約２．１ｍｇ／ｇの濃度で提供される。
【００４３】
一定の好ましい実施形態によれば、本発明は、過剰増殖皮膚疾患又は障害を予防又は治療する方法を提供し、該方法は、
過剰増殖疾患の症状を軽減するための開始時期に、約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に局所投与するステップと、
第二の時期に、約１０μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に局所投与するステップと
を含む。
【００４４】
一実施形態において、開始時期は、約４週から約２４週まで、好ましくは、約４週から約１６週までである。一定の好ましい実施形態において、開始治療時期は、約６週から約１２週まで、好ましくは、約８週である。第二の時期は、約８週から約５２週まで、好ましくは、約１２週から約２６週までである。
【００４５】
一定の実施形態において、対象は哺乳動物である。特定の実施形態において、対象はヒト対象である。
【００４６】
なお別の態様において、本発明は、カルシポトリオールを含む組成物を提供し、カルシポトリオールは皮膚に顕著には浸透しない。一定の実施形態において、カルシポトリオールの１０％未満、好ましくは、５％未満で皮膚に浸透する。幾つかの実施形態において、カルシポトリオールの３％未満、好ましくは、１％未満が皮膚に浸透する。
【００４７】
幾つかの実施形態において、該組成物は、カルシポトリオール、少なくとも１種のＰＥＧ及び界面活性剤から本質的になる。特定の実施形態において、該組成物は、カルシポトリオール、ＰＥＧ−４００、ＰＥＧ−４０００及びステアレス−２０から本質的になる。
【００４８】
本発明はさらに、過剰増殖疾患の局所治療用治療組成物を調製するために、約１０μｇ／ｇ（１グラム当りのマイクログラム）から約１００μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；及び約０．１ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミドから本質的になる組成物の使用を提供する。
【００４９】
本発明はさらに、前記組成物の投薬に好適な容器にパッケージされた本発明の組成物；及び文書の使用説明書を提供する。
【００５０】
このゆえに、本発明のさらなる態様によれば、
約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；
約０．１ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；
皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体：
及び使用説明書、
から本質的になる組成物を含む製薬用キットが提供される。
【００５１】
一定の好ましい実施形態によれば、本発明は、約５０μｇ／ｇの濃度のカルシポトリオール；約２．１ｍｇ／ｇの濃度のニコチンアミド；皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体：及び使用説明書、から本質的になる局所用組成物を含むキットを提供する。
【００５２】
他の好ましい実施形態によれば、キットは、約１０μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約２．１ｍｇ／ｇの濃度のニコチンアミド；皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体：及び使用説明書から本質的になる局所用組成物をさらに含む。カルシポトリオールの好ましい濃度は約１５μｇ／ｇから約３５μｇ／ｇまで、好ましくは約３０μｇ／ｇである。
【００５３】
これら及び本発明の他の実施形態は、以下の図面、説明及び請求項と結びつけて明らかになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５４】
本発明は、表皮細胞の過剰増殖に関連する皮膚障害の治療に使用できる医薬組成物、キット及び方法に関する。
【００５５】
上記のとおり、ビタミンＤ３及びその類縁体は、乾癬及び他の炎症性皮膚疾患の治療に有用な薬剤として知られている（Ｍｏｒｉｍｏｔｏら、１９８６年）。ニコチンアミド及びその類縁体は、ケラチノサイトの過剰増殖の阻害及び細胞分化の誘導に有効であることが示されている。本発明は、過剰増殖皮膚疾患及び障害の治療に非常に有効であるビタミンＤ誘導体、カルシポトリオール、及びニコチンアミドから本質的になる皮膚用組成物を提供する。
【００５６】
カルシポトリオール及びＮＡを組み合わせた組成物は、個々の活性物質の直接的治療値とは別に患者にさらなる利益の形態で相乗効果を提供する。
【００５７】
乾癬などの皮膚障害の満足すべき治療は、本発明による組成物を用いて、より短い時期に達成できる。さらに、本発明の組成物は、ステロイドを含有しないので、したがってそのクラスの薬物に関連する副作用を除去する。
【００５８】
本発明の組成物は、過剰増殖疾患の治療のために安全で有効な局所用製剤を提供し、市販のカルシポトリオール組成物よりも以下の利点を提供する：
ａ）表皮細胞に対する二重の抗増殖効果及び分化促進効果；
ｂ）良性及び悪性過剰増殖障害に対する組成物の可能性のある治療効果を強化するカルシポトリオール及びニコチンアミドの相乗的治療効果； 
ｃ）抗酸化効果；
ｄ）局所適応に承認された非毒性製剤；
ｅ）当該製剤中のカルシポトリオールは、皮膚に浸透せず、それによって薬物に対する全身曝露及び随伴する副作用が除外される；
ｆ）本発明のカルシポトリオール−ニコチン酸製剤は、無視できる刺激物として分類され、一方、市販の製品は刺激物として標識される；
ｇ）ステロイド及びコルチコステロイド化合物並びに随伴する副作用の回避。
【００５９】
定義
便宜さと明瞭さのために、本明細書、実施例及び請求項に使用される一定の用語を本明細書に記載する。
【００６０】
本明細書に使用される、語句の「有効量」及び「治療有効量」は、過剰増殖疾患の症状を本質的に、抑止し、緩和し、阻害し、軽減し、又は予防するのに十分な薬剤量を記載する。乾癬の症状としては、１つ又は複数の皮膚科炎症；赤色、鱗状皮膚；発疹；かゆみ；プラーク；疱疹が挙げられる。
【００６１】
本発明によれば、カルシポトリオールの最終濃度は、典型的に１０μｇ／ｇと１００μｇ／ｇ組成物との間、好ましくは、約２０μｇ／ｇと７０μｇ／ｇとの間の範囲である。特定の組成物において、カルシポトリオールは、約５０μｇ／ｇの濃度で提供される。
【００６２】
幾つかの実施形態において、最終濃度が約１０μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇまでのカルシポトリオールを含む組成物は、皮膚過剰増殖疾患の維持療法に好適である。幾つかの実施形態において、最終濃度が約１５μｇ／ｇから約３５μｇ／ｇまでのカルシポトリオール、好ましくは、約３０μｇ／ｇのカルシポトリオールが提供される。
【００６３】
用語の「皮膚に顕著には浸透しない」とは、例えば、ブタ耳皮膚細胞アッセイで測定されるように、組成物中の約１０％未満のカルシポトリオールが皮膚細胞に浸透するカルシポトリオールを含む組成物を称す。幾つかの実施形態において、５％未満、好ましくは、３％未満、より好ましくは、１％未満のカルシポトリオールが皮膚に浸透する。ビタミンＤ３の全身の副作用は、当技術分野でよく知られており、カルシポトリオールの皮膚細胞への浸透を防止する組成物は、非常に望ましい。
【００６４】
「維持療法」とは、再発又は回帰を防止するか、過剰増殖疾患に関連する症状の進行を防ぐための治療を称す。ニコチンアミド（ニアシンアミド）は、Ｂ複合体ビタミンＤ３ニアシンの２つの主要な形態のうちの１つである。本発明の何人かの発明者は、特にケラチノサイト細胞増殖阻害剤としてＮＡを同定している。本発明によれば、ＮＡの最終濃度は、典型的に０．１ｍｇ／ｇと２５ｍｇ／ｇ組成物との間、好ましくは、約１ｍｇ／ｇと２０ｍｇ／ｇとの間の範囲である。特定の組成物において、ＮＡは、約２ｍｇ／ｇから約１０ｍｇ／ｇまでの濃度で、より好ましくは、２ｍｇ／ｇから約６．５ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される。好ましい濃度は２．１ｍｇ／ｇである。
【００６５】
本明細書の用語の「治療する」とは、進行を抑止し、本質的に阻害し、遅延若しくは反転し、臨床症状を本質的に改善し、又は過剰増殖疾患に関連する症状の外観を本質的に防止することが挙げられる。用語の「治療する」とはさらに、皮膚の水和化、治癒又は平滑化などを意味する。この症状は増殖、落屑性皮膚、乾燥肌、荒肌、膿疱及び刺激性皮膚を含むがそれらに限定されない。この治療はさらに、これら症状が生じる前のこれら症状の予防、特に落屑性及び刺激性皮膚を含む。
【００６６】
本明細書に用いられる語句の「皮膚科的に許容できる担体」とは、皮膚に顕著な刺激を引き起こさず、塗布される活性剤の生物活性及び性質を抑止しない担体又は希釈剤を称す。
【００６７】
本発明の文脈に有用である皮膚科的に許容できる担体の例としては、限定はしないが、乳濁液剤、クリーム剤、水溶液剤、油剤、軟膏、ペースト、ゲル剤、ローション剤、ミルク、発泡剤、懸濁液及び粉末剤が挙げられる。好ましい担体は、ポリマー類の中でポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のメンバーである。
【００６８】
本発明の皮膚科的に許容できる担体としては、例えば、増粘剤、皮膚軟化剤、乳化剤、保湿剤、界面活性剤、懸濁化剤、フィルム形成剤、発泡成形剤、保存剤、消泡剤、芳香剤、低級モノアルコール性ポリオール、高沸点溶媒、噴射剤、着色剤、色素又はそれらの混合物が挙げられる。好ましい界面活性剤はステアレス−２０である。
【００６９】
したがって、本発明の組成物は、例えば、油剤、ゲル剤、固形スティック剤、ローション剤、クリーム剤、ミルク剤、エーロゾル剤、スプレー剤、発泡剤、ムース剤、軟膏若しくは脂肪軟膏又は粉末剤の形態であり得る。
【００７０】
本発明の組成物は、当技術分野でよく知られた方法、例えば、従来の混合、溶解、顆粒化、ドラッガー作製、湿式粉砕、乳化、カプセル化、混入又は凍結乾燥法により製造できる。
【００７１】
したがって、本発明による使用のための組成物は、活性化合物を製薬的に使用できる製剤への加工を容易にする賦形剤及び助剤を含む１つ又は複数の生理的に許容できる担体を用いて従来の方法で製剤化できる。
【００７２】
製剤化
本発明の組成物は、組成物が皮膚に塗布される場合、それらの分配を容易にするために、カルシポトリオール及びニコチンアミドに対して希釈剤、分散剤又は媒体として作用する皮膚科的又は化粧品的に許容できる担体を含む。水以外又は水に加える媒体としては、液体又は固体皮膚軟化剤、溶媒、保湿剤、増粘剤及び粉末剤が挙げられる。本発明は、水溶液剤又は非水溶液剤、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏、発泡剤、ムース剤、スプレー剤、乳濁液剤、ミクロ乳濁液剤、粘着性パッチ、粉末剤などの形態で局所投与用に製剤化できる。
【００７３】
好ましい一実施形態において、本発明の組成物は、単相組成物、すなわち、軟膏などの単一溶媒系を含む組成物である。製剤の非限定例としては以下のとおりである：
【００７４】
軟膏
軟膏は、活性剤を皮膚に塗布するための有効な方法を提供する。一実施形態において、皮膚科用担体は、ポリエチレングリコールを含む。幾つかの実施形態において、ＰＥＧ類の混合物が好ましい。一定の実施形態において、本発明の皮膚用組成物は、以下の配合：
約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでのカルシポトリオール；
約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでのニコチンアミド；
約７０重量％から約８０重量％までのＰＥＧ−４００；
約１５重量％から約２５重量％までのＰＥＧ−４０００；
約１重量％から約５重量％までのステアレス−２０；及び
約０．１重量％から約１重量％までのビタミンＥ、
を有する。
【００７５】
特定の実施形態において、本発明は、以下の配合：
５０μｇ／ｇのカルシポトリオール；
２．１ｍｇ／ｇのニコチンアミド；
７７．７重量％のＰＥＧ−４００；
２０重量％のＰＥＧ−４０００；
２重量％のステアレス−２０；及び
０．３重量％のビタミンＥ、
を有する皮膚用組成物を提供する。
【００７６】
特定の実施形態において、本発明は、以下の組成：
１０〜５０μｇ／ｇのカルシポトリオール；
２．１ｍｇ／ｇのニコチンアミド；
７７．７重量％のＰＥＧ−４００；
２０重量％のＰＥＧ−４０００；
２重量％のステアレス−２０；及び
０．３重量％のビタミンＥ
を有する皮膚用軟膏を提供する。
【００７７】
他の皮膚用軟膏組成物は、ワセリンをベースにし、以下の組成：
約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでのカルシポトリオール；約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでのニコチンアミド；約３５重量％から約６０重量％までのワセリン；約３５重量％から約５５重量％までの鉱油；約１重量％から約１０重量％までのステアレス−２；及び約０．１重量％から約１重量％までのビタミンＥ、
を有することができる。
【００７８】
一態様において、本発明は、カルシポトリオールを含む組成物を提供し、該カルシポトリオールは、皮膚に顕著には浸透しない。皮膚浸透アッセイは当技術分野で知られているイオンである。一例としては、以下の実施例７に提供される。一定の実施形態において、１０％未満、好ましくは５％未満のカルシポトリオールが皮膚に浸透する。幾つかの実施形態において、３％未満、好ましくは１％未満のカルシポトリオールが皮膚に浸透する。該組成物は、ＰＥＧベースの軟膏を含み：
約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでのカルシポトリオール；
約７０重量％から約８０重量％までのＰＥＧ−４００；
約１５重量％から約２５重量％までのＰＥＧ−４０００；
約１重量％から約５重量％までのステアレス−２０；及び
約０．１重量％から約１重量％までのビタミンＥ、
を含む。
【００７９】
幾つかの好ましい実施形態において、該組成物は以下のとおりである：
約２０μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇまでのカルシポトリオール；約７７．７重量％のＰＥＧ−４００；約２０重量％のＰＥＧ−４０００；約２重量％のステアレス−２０；約０．１重量％から約１重量％までのビタミンＥ。
【００８０】
ローション剤及びクリーム剤
本発明の組成物は、ローション剤又はクリーム剤として提供でき、潤滑剤及び増粘剤のいずれか、又は両方として機能できる少なくとも１種又は複数種の皮膚軟化剤を含むことができる。皮膚軟化剤は、全部で組成物の約０．１重量％から約５０重量％、好ましくは約１重量％から約１０重量％までを含むことができる。ヒト皮膚への塗布に好適なものとして当業者に知られたいずれの皮膚軟化剤も使用できる。これらには、限定はしないが：鉱油、ワセリン、パラフィン、セレシン、オゾケライト、微結晶性ワックス、ポリエチレン、及びペルヒドロスクワレンなどの炭化水素油類及びワックス類；シリコーン油類；植物、動物及び海洋源に由来のものを含むトリグリセリド油脂類；ホホバ油及びシェーバターを含むアセチル化モノグリセリド類などのアセトグリセリドエステル類；エトキシ化グリセリルモノステアレートなどのエトキシ化グリセリド類；脂肪酸類、脂肪族アルコール類及びそれらの誘導体が挙げられる。他の好適な皮膚軟化剤としては、ラノリン及びラノリン誘導体；多価アルコール類及びポリエーテル誘導体；多価アルコールエステル類；ワックスエステル類；植物ワックス類；レシチンなどのリン脂質及び誘導体；限定はしないが、コレステロール及びコレステロール脂肪酸エステル類などのステロール類；脂肪酸アミド類、エトキシ化脂肪酸アミド類、及び固体脂肪酸アルカノールアミド類などのアミド類が挙げられる。
【００８１】
ローション剤はさらに、約１％から約１０％、より好ましくは、２％から５％までの乳化剤を含有することができる。乳化剤は、非イオン性、アニオン性又はカチオン性であり得る。当業者は、皮膚用組成物に好適な乳化剤を選択できる。
【００８２】
このようなローション剤及びクリーム剤の他の従来の成分を含むことができる。このような添加物の１つとしては、組成物の１％から１０％までの濃度の増粘剤がある。好適な増粘剤の例としては、限定はしないが：架橋カルボキシポリメチレンポリマー類、エチルセルロース、ポリエチレングリコール類、トラガカントゴム、カラヤゴム、キサンタンガム、ベントナイト及び他のクレー、ヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。
【００８３】
ローション剤及びクリーム剤は、全ての成分を単に一緒に混合することによって製剤化できる。カルシポトリオールは、混合物中に溶解、懸濁或いは他に均一に分散されることが好ましい。
【００８４】
液剤及び懸濁剤
水性又は非水性であり得る液剤は、活性剤、カルシポトリオール及びＮＡの各々有効な濃度を含有するように製剤化される。
【００８５】
溶媒又は溶媒系の一部として有用で好適な有機物質は以下のとおりである：プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトールエステル類、１，２，６−ヘキサントリオール、エタノール、イソプロパノール、酒石酸ジエチル、ブタンジオール、及びそれらの混液。このような溶媒系はまた、水を含有できる。
【００８６】
本発明の組成物が、乳濁液として製剤化される場合、脂肪相の比率は、組成物の全重量に比して約５重量％から約８０重量％、好ましくは、約５重量％から約５０重量％までの範囲であり得る。乳濁液形態の組成物に組み込まれた油類、乳化剤及び共乳化剤は、化粧品又は皮膚科分野で当業者に知られたものの中から選択される。
【００８７】
ゲル剤及び固形剤
ゲル組成物は、先に記載された液剤又は懸濁剤組成物に好適な増粘剤を単に混合することによって製剤化できる。好適な増粘剤の例は、先のローション剤に関して記載している。
【００８８】
ゲル化組成物は、有効濃度の活性剤；約５％から約７５％までの先に記載された有機溶媒；約０．５％から約２０％までの増粘剤、残りは、水、別の水性担体又は担体の組合わせを含有する。
【００８９】
固形形態の組成物は、皮膚への塗布用に意図されたスティックタイプの組成物として製剤化できる。固形剤はまた、先に記載された皮膚軟化剤の約５０％から約９８％までを含有する。この組成物はさらに、約１％から約２０％の好適な増粘剤、所望又は必要ならば、乳化剤及び水又は緩衝液を含有できる。ローションに関して先に記載された増粘剤を、固形形態の組成物に好適に使用する。
【００９０】
メチルパラベン又はエチルパラベンなどの保存剤、香料、染料などの他の成分は、皮膚への塗布用組成物に所望の安定性、芳香又は着色或いは他の所望の性質を与えることが当技術分野で知られている。
【００９１】
液剤又は懸濁剤として製剤化された組成物は、直接皮膚に塗布できるか、エーロゾル剤として製剤化でき、スプレー剤、発泡剤又はムース剤として皮膚に塗布できる。エーロゾル組成物はさらに、約２０％から８０％、好ましくは、３０％から５０％までの好適な噴射剤を含有する。このような噴射剤の例は、クロル化、フッ素化及びクロロフッ素化された低分子量炭化水素である。亜酸化窒素、二酸化炭素、ブタン、及びプロパンもまた、噴射剤ガスとして用いられる。これらの噴射剤は、当技術分野で知られているとおり、容器の内容物を放出させるのに好適な量と圧の下で用いられる。加圧エーロゾルの場合、投与単位は、計測量を送達させるためにバルブを備えることによって測定できる。
【００９２】
他の実施形態において、本発明の液剤、懸濁剤、ローション剤及びゲル剤として製剤化された組成物は、皮膚塗布用発泡剤又はムース剤として製剤化できる。発泡剤又はムース剤としての製剤化に関連する担体は、例えば、国際特許出願公開ＷＯ  ２００４／０３７２２５及び米国特許第６，７３０，２８８号に教示されている。
【００９３】
用量
本発明の組成物は、１日４回まで活性成分の局所投与用に製剤化される。この製剤化は、毎日の単回投与に治療的に有効であることが好ましい。
【００９４】
添加物
局所用組成物は、さらに第三又は第四の製薬的に許容できる成分を含むことができる。本発明はまた、さらに真菌感染により合併される過剰増殖皮膚疾患の治療に特に有用で、さらに抗真菌剤を含有する本発明による好ましい製剤に関する。抗真菌剤の非限定例としては、ミコナゾール、クロトリマゾール、テルビナフィン、シクロピロックス、ビホナゾール、ニスタチン、ケトコナゾール、エコナゾール、及びアモロールフィンが挙げられる。
【００９５】
添加物の他の例としては、日焼け止めが挙げられる。日焼け止めとしては、紫外線を遮断するために通常使用される物質のものが挙げられる。例示的な化合物としては、ＰＡＢＡ、シンナメート及びサリシレートの誘導体である。例えば、オクチルメトキシシンナメート（ｐａｒｓｏｌ  ＭＣＸ）及び２−ヒドロキシ−４−メトキシベンゾフェノン（オキシベンゾン及びベンゾフェノン−３としても知られている）。該組成物に使用される日焼け止め量は、所望のＵＶ照射保護程度に依って変わり得る。日焼け止めは、活性化合物と適合しなければならないが、一般に該組成物は、約１％から約２０％までの日焼け止めを含むことができる。正確な量は、選択された日焼け止め及び所望の日光保護因子（ＳＰＦ）に依って変わり得る。
【００９６】
本発明の組成物は、さらに抗酸化剤を含むことができる。抗酸化剤／ラジカル捕捉剤の含有は、安定な組成物を提供できる。抗酸化剤／ラジカル捕捉剤は、組成物の全重量の約０．１重量％から約１０重量％の濃度範囲で本発明の組成物に添加することができる。抗酸化剤／ラジカル捕捉剤としては、アスコルビン酸（ビタミンＣ）及びその塩類、及びトコフェロール（ビタミンＥ）が挙げられる。好ましい添加物はビタミンＥである。一定の好ましい濃度範囲は、約０．１％から約１％までである。
【００９７】
他の添加物としては、ヒアルロン酸などのグリコサミノグリカン類が挙げられる。
【００９８】
治療方法
本発明は、約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約０．１ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に局所投与する、ステップを含む過剰増殖皮膚疾患又は障害を予防又は治療する方法をさらに提供する。
【００９９】
該方法は、１日約４回までの組成物の局所投与を含む。好ましい実施形態において、該組成物を、１日１回又は２回投与する。幾つかの実施形態において、該組成物を、約１２時間間隔で１日２回塗布する。他の実施形態において、該組成物を１日１回投与する。
【０１００】
幾つかの実施形態において、治療方法は、２つの治療期間を含む：開始治療と維持治療。
【０１０１】
理論に拘束されることは望まないが、開始治療は、少なくとも幾つかの疾患の徴候及び症状の軽減に役立つが、第二の維持治療は、疾患の再発又は進行を防ぐために役立つ。
【０１０２】
したがって、開始治療において患者に、約１０μｇ／ｇから約１００μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約０．１ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の開始投与量を開始時期に投与し、その後、該患者に、約１０μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約０．１ｍｇ／ｇから約５０ｍｇ／ｇまでの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物のより少ない維持投与量を投与する。
【０１０３】
カルシポトリオールの開始用量は、好ましくは、約２０μｇ／ｇから約７０μｇ／ｇ、より好ましくは、約５０μｇ／ｇであり；ＮＡの開始用量は、約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇ、好ましくは、約１ｍｇ／ｇから約２０ｍｇ／ｇであり、最も好ましくは、約２．１ｍｇ／ｇである。
【０１０４】
維持投与量に関して、カルシポトリオールは、約１０μｇ／ｇから約５０μｇ／ｇまでの濃度で提供される。幾つかの実施形態において、カルシポトリオールは、約１５μｇ／ｇから約３５μｇ／ｇまでの濃度で提供される。特定の実施形態において、カルシポトリオールは、約３０μｇ／ｇの濃度で提供される。ＮＡの維持投与量は、約０．５ｍｇ／ｇから約２５ｍｇ／ｇまでである。一定の実施形態において、ニコチンアミドは、約１ｍｇ／ｇから約２０ｍｇ／ｇまでの濃度で提供される。他の実施形態において、ニコチンアミドは、約２ｍｇ／ｇから約１０ｍｇ／ｇｍの濃度で、好ましくは約２．１ｍｇ／ｇの濃度で提供される。
【０１０５】
一定の好ましい実施形態によれば、本発明は：
過剰増殖疾患の症状を軽減するための開始時期に、約５０μｇ／ｇの濃度のカルシポトリオール；約２．１ｍｇ／ｇの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に局所投与するステップと、
第二の時期に、約１５μｇ／ｇから約３５μｇ／ｇまでの濃度のカルシポトリオール；約２．１ｍｇ／ｇの濃度のニコチンアミド；及び皮膚科的に許容できる賦形剤又は担体から本質的になる組成物の治療有効量を、それを必要とする対象に局所投与するステップと
を含む過剰増殖皮膚疾患又は障害を予防又は治療する方法を提供する。
【０１０６】
一実施形態において、開始治療期間は、約４週から約２４週、好ましくは、約４週から約１６週までである。一定の好ましい実施形態において、開始治療期間は、約６週から約１２週、好ましくは、約８週である。第二の時期は、約８週から約５２週、好ましくは、約１２週から約２６週までである。
【０１０７】
製品のパッケージング及びキット
使用において、例えば、約０．１ｍｌから約１００ｍｌまでの少量の組成物を好適な容器又はアプリケータから皮膚の露出領域に塗布し、次に必要ならば、それを手、指又は好適なデバイスを用いて皮膚上に拡げ、及び／又は擦り付ける。製品は、手又は顔面治療としての使用のために特に製剤化できる。
【０１０８】
製剤化されたら、組成物は、その粘度及び消費者による目的の使用に適するような好適な容器にパッケージできる。例えば、軟膏は、チューブにパッケージでき、ローション又はクリームは、ボトルにパッケージでき、或いは噴射剤駆動エーロゾルデバイス又は容器には、指操作に好適なポンプが取り付けられる。組成物がクリーム剤である場合、それは、チューブ又はふたつきジャーなどの非変形性ボトル又は絞出し容器に簡単に貯蔵できる。したがって、本発明はまた、本明細書に記載された皮膚科的に又は化粧品的に許容できる組成物を含有する密封容器を提供する。容器の形状は、本発明に限定されず、チューブ、ポンプディスペンサー、圧縮ディスペンサー、ボトル、スプレー、サッシェなどであり得る。
【０１０９】
本発明の請求された組成物の多くの薬剤は、生理的に許容できる塩類として提供でき、該薬剤は、陰電荷種又は陽電荷種を形成できる。薬剤が陽電荷部分を形成する塩類の例としては、限定はしないが、塩酸塩、硫酸塩、炭酸塩、乳酸塩、酒石酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩などの四級アンモニウム塩類が挙げられ、四級アンモニウム基の窒素は、適切な酸と反応する本発明の化合物の窒素である。薬剤が、陰電荷種を形成する塩類としては、限定はしないが、分子中のカルボン酸基と、適切な塩基（例えば、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、水酸化カリウム（ＫＯＨ）、水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）など）との反応により形成されたナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩が挙げられる。
【０１１０】
本発明の組成物は、所望ならば、活性成分を含有する１つ又は複数の単位剤形を含有できる規制当局により承認されたキットなど、パック又はディスペンサーデバイスに提供できる。例えば、パックは、ブリスターパックなど、金属又はプラスチックフォイルを含むことができる。パック又はディスペンサーデバイスは、投与用取扱い説明書を添付できる。パック又はディスペンサーはまた、組成物の製造、使用又は販売を規制する政府当局により規定された形態の容器に関連する注意事項を添付でき、それらの注意事項は、組成物又はヒト若しくは獣医学投与の形態について当局による承認事項を反映している。他の実施形態において、該組成物は、一般用医薬品及び販売用に調製される。
【０１１１】
適合性担体中で製剤化された本発明の薬剤を含む組成物を、加齢に関連する皮膚障害の予防及び治療用に適切な容器内でも調製し、配置し、標識できる。
【０１１２】
本発明のさらなる目的、利点、及び新規な特徴は、限定する意図はないが、以下の実施例の試験の際、通常の当業者にとって明らかになるであろう。さらに、本明細書の上記及び以下の請求項の節で請求された本発明の種々の実施形態及び態様の各々は、以下の実施例において実験的に裏付けられる。
【実施例】
【０１１３】
以下の実施例は、当然のことながら単なる例示的で非限定なものとして考慮すべきである。本発明が、多数の修飾、置換及び変型を本発明の範囲から逸脱することなく成すことができることは、本発明に関連する当業者にとって明らかとなろう。
【０１１４】
当該実施例の組成物に基づいて提供されたインビトロ及びインビボデータは以下の通りである：
【０１１５】
（実施例１）
インビトロ実験
ケラチノサイト細胞培養に基づくある一定のインビトロアッセイは、ＮＡ及びＮＡとカルシポトリオールとの組合わせを試験するために実施された。実験的デザインは、本出願の発明者の何人かによるＰＣＴ特許公開ＷＯ  ０１／５１０５１に記載されている。
【０１１６】
インビトロ試験の結果は：
全ての細胞系の増殖（ＨａＣａｔケラチノサイト、ヒトの一次ケラチノサイト、Ａ４３１、ＫＭ１２）は、用量依存様式で薬理学的濃度のＮＡにより顕著に阻止され；
ＮＡとカルシポトリオールとの組合わせは、相乗的抗増殖効果を提供し；
ＮＡは、早期（Ｋ１０）、後期（インボルクリン）及び終末（エンベロープ角化細胞形成）の分化マーカーの発現増加により示される良性及び悪性表皮細胞における分化過程を促進し；
ＮＡは、ＨａＣａｔ細胞及びＡ４３１細胞においてアポトーシス死を誘導せず；及び
ＮＡによるＨａＣａｔケラチノサイトの長期治療により、高レベルの酸化的ストレス（過酸化水素）に対する防護及び高レベルの抗酸化的酵素（グルタチオンペルオキシダーゼ及びカタラーゼ）を立証した、
ことを示している。
【０１１７】
実験とその結果は以下に要約する。
【０１１８】
細胞培養
カルシポトリオール及びニコチンアミドの抗増殖活性を、２つのモデル系で試験した：第一の系は、本明細書で「ＨａＣａｔ細胞」又は「ＨａＣａｔケラチノサイト」と称され、限定はしないが、乾癬表皮などの高増殖表皮用モデル（Ｏｋｅｎｆｅｌｓら、１９９８年）として、表皮分化の外部モジュレーターの効果モデル（Ｐａｒａｍｉｏら、１９９７年）として役立つ、自然発症的不死化ヒトケラチノサイトである。第二の系は、本明細書で「培養ヒト表皮ケラチノサイト」と称され、乾癬の治療において抗増殖剤を検出するモデル（Ｎｉｋｏｌｏｆｆら、１９８８年）として役立つ、急速増殖ヒトケラチノサイトを含む。
【０１１９】
本明細書に記載された薬剤の抗増殖効力を試験するために、これらのモデルを、本発明に従って使用した。継代ヒトケラチノサイトＨａＣａｔ細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）及び１％抗生物質（ペニシリン２０単位／ｍｌ；ストレプトマイシン２０μｇ／ｍｌ及びナイスタチン２．５単位／ｍｌ）で補足されたイーグル最小必須培地（ＭＥＭ−ＥＡＧＬＥ）を用いて、９５％大気／５％ＣＯ２中、３７℃で７５ｃｍ２フラスコでルーチン的に培養する。培地を３〜４日毎に交換する。
【０１２０】
カルシポトリオールにより増殖したＨａＣａｔ細胞の長期培養物は、ルーチン的に使用される培地中、６ヵ月間ＨａＣａｔ細胞を培養することにより得られた。
【０１２１】
他の薬剤により細胞の他の長期培養物は、ＮＡ、ビタミンＤ及びその誘導体並びにビタミンＡの組合わせにより補足された培地中、時間を延長してＨａＣａｔ細胞を培養することにより同様に得られる。
【０１２２】
正常なフェースリフト手術から得られたヒト表皮ケラチノサイト（３〜６継代）が、ケラチノサイトの加速増殖のために低カルシウムを有する無血清ＫＧＭ（登録商標）−２ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ（登録商標）（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、米国）培地中で培養された。
【０１２３】
試薬：
ニコチンアミド（ＮＡ）；カルシトリオール（１α，２５−ジヒドロキシ−ビタミンＤ３）；３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ）；ヨウ化プロピジウム；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）；ショ糖；クエン酸三ナトリウム；ｉｇｅｐａｌＣＡ−６３０（ＮＰ−４０）；トリス−（ヒドロキシメチル）−アミノメタン；トリプシン；トリプシン阻害剤；リボヌクレアーゼＡ；スペルミン−テトラヒドロクロリド；ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）；β−メルカプトエタノール及び過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）は全て、Ｓｉｇｍａ（米国）から入手した。
【０１２４】
イーグル最小必須培地（ＭＥＭ−ＥＡＧＬＥ）；ＤＭＥＭ；抗生物質；ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）；Ｌ−グルタミン；ダルベッコ燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；及びトリプシン０．０５％−ＥＤＴＡ液は、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ（イスラエル）から入手した。
【０１２５】
Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）−２Ｂｕｌｌｅｔ  Ｋｉｔ（登録商標）ＣＣ−３１０７（加速増殖用）は、Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ社（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ、米国）から受領した。
【０１２６】
抗ヒトサイトケラチン１０（ＮＣＬ−ＣＫ１０）及びインボルクリン（ＮＣＬ−ＩＮＶ）マウスモノクローナル抗体は、Ｎｏｖｏｃａｓｔｒａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（英国）から入手し、Ｃｙ（商標）２−結合ヤギ抗マウスＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社（米国）から入手した。
【０１２７】
ＨａＣａｔ細胞は、２５ｃｍ２又は７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）中で増殖させ、２４ウェル及び９６ウェルの組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国）は、細胞と種々の用量のＮＡ（１〜５０ｍＭ／Ｉ）及びカルシポトリオール（１〜１０００ｎＭ）とのインキュベーション用に用いた。
【０１２８】
増殖アッセイ（ＭＴＴ法）
種々の濃度のカルシポトリオール、ニコチンアミド（ＮＡ）又はそれらの組合わせによる処理後、ＨａＣａｔ細胞及び培養ヒト表皮ケラチノサイトの生存度及び／又は増殖は、製造元に従って９６ウェルマイクロタイタープレート中、ＭＴＴアッセイにより測定した。
【０１２９】
アポトーシス及び有糸分裂活性アッセイ
アポトーシス及び壊死の推定は、先に記載された蛍光顕微鏡を用いて解析された（Ｈａｒｅｌら、２００２年）。手短に言うと、ＨａＣａｔ細胞を、ガラススライド上で培養し、種々の濃度のＮＡ（５、１０、２０及び５０ｍＭ）に曝した。７２時間後、細胞を、ＤＮＡ結合染料Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２及びヨウ化プロピジウムで染色した。生存細胞は無処置核及びそれらの青色蛍光により、壊死細胞は無処置核及びそれらの赤色蛍光により、アポトーシスの早期又は後期の細胞は断片核及び青色又は赤色蛍光により確認された。少なくとも一千の細胞が、各処理に対してカウントされた。
【０１３０】
アポトーシス及び細胞周期パラメータの決定は、フローサイトメトリ法により実施された。細胞を、２５ｃｍ２の組織培養フラスコに接種し、４８時間培養してから、それらを５、１０及び２０ｍＭのＮＡに７２時間曝露した。フローサイトメトリ法は、界面活性剤−トリプシン法で調製された核に対して実施し、ヨウ化プロピジウムで染色した（Ｖｉｎｄｅｌｏｖら、１９８３年）。
【０１３１】
ＰＡＲＰ発現の免疫ブロット解析：免疫複合体は、二次抗マウスアルカリホスファターゼ結合抗体ＡＰ１２４Ａ（希釈１：５０００）とのインキュベーションに次いでＢＣＩＰ／ＮＢＴ着色基質と展開させることにより検出した。
【０１３２】
増殖曲線及び有糸分裂活性：１ｍｌ当り２×１０４細胞を、２４ウェルの組織培養プレートに接種し、１０ｍＭのＮＡの有無下でインキュベートした。細胞は、継代後種々の時間（４８時間〜１６８時間）でトリプシン処理により分離し、４分割量でヘマトサイトメーターを用いてカウントした。有糸分裂活性の推定のために、細胞をペトリ皿内のガラスカバースリップ上で培養した。１０ｍＭのＮＡの有無下での７２時間のインキュベーション後、細胞をメタノールで固定し、Ｇｉｅｍｓａ染色剤により染色し、光学顕微鏡により分析した。有糸分裂周期の種々の段階で（プロ期、メタ期、アナ期及びテロ期）有糸分裂細胞数を算出した。少なくとも１０００の細胞が、各実験に対してカウントされた。
【０１３３】
分化アッセイ
角化エンベロープ形成：ＮＡ及び又はカルシポトリオールで処理されたＨａＣａｔ細胞における後期分化過程は、Ｓｕｎ及びＧｒｅｅｎ（１９７６）並びにＰＣＴ公開ＷＯ  ０１／５１０５１に記載された手法に従って角化細胞エンベロープ形成を判定することにより測定された。
【０１３４】
間接的免疫蛍光：
ＨａＣａｔ細胞における早期（ケラチンｋ１０発現）及び後期（インボルクリン発現）分化過程に対するＮＡ及び又はカルシポトリオールの作用は、間接的免疫蛍光により推定された。
【０１３５】
手短に言えば、２×１０４細胞／ｍｌを、０、５、１０及び２０ｍＭのＮＡ又はカルシポトリオールによりペトリ皿内のガラスカバースリップ上で培養した。７２時間のインキュベーション後、ガラスカバースリップ上の細胞をＰＢＳで洗浄し、メタノール：アセトン（１：１）の氷冷混液で固定し、−２０℃で１０分間インキュベートした。固定細胞をＰＢＳ中で洗浄し、遮断用緩衝液（ＰＢＳ中１％ＢＳＡ）と１０分間インキュベートして、一次抗体のカバースリップへの非特異的吸収を最少にした。その後、細胞を、一次モノクローナル抗体（ケラチン１０発現は、１／５０の最終希釈で抗ヒトマウスモノクローナル抗体により検出し；インボルクリン発現は、１／１００の最終希釈で抗ヒトインボルクリンマウスモノクローナル抗体により検出した）と加湿チャンバ中、３７℃で１時間インキュベートした。徹底してＰＢＳ洗浄細胞を、１／５０の最終希釈で蛍光体結合ヤギ抗マウスＩｇＧと共に室温で３０分間インキュベートした。クロスチャネル汚染を避けるために、エピ蛍光オプティクス及び適切なフィルターで装備されたＺｅｉｓｓ顕微鏡（Ａｘｉｏｓｋｏｐ−２）下で該スライドを検視した。ケラチン１０及びインボルクリンの発現レベルは、全細胞数に比して陽性細胞をカウントすることにより推定された。各スライド上で少なくとも５００〜１０００の細胞がスコアされた。
【０１３６】
統計解析
結果は、平均値の平均±標準偏差（平均±ＳＤ）として提供された。統計的な有意性（Ｐ＜０．０５）は、スチューデントのｔ検定により導き出された。
【０１３７】
結果
ＮＡは、用量応答様式でＨａＣａｔ細胞増殖を阻止した。低用量のＮＡ（０．５〜５ｍＭ）と７２時間のインキュベーションでは、ＨａＣａｔ細胞増殖速度を変えなかった。しかしながら、より高濃度のＮＡは、用量依存様式で増殖応答を著しく減少させた。２倍の細胞増殖阻止を生じる約１０ｍＭの薬理学的濃度は、ＨａＣａｔ細胞の有糸分裂活性、増殖曲線及び細胞周期進行に対するＮＡの効果を試験するために選択された。有糸分裂活性の顕微鏡分析により、有糸分裂細胞のパーセンテージは、未処理のものと比較してＮＡ処理細胞の集団において約２．５倍低かったことを示した。同様の増殖抑制結果は、ＨａＣａｔ細胞を１０ｍＭのＮＡと４８〜１６８時間インキュベートした後に得られた。
【０１３８】
ＮＡ処理により誘導された増殖抑制に導くことができる細胞周期における摂動を解明するために、Ｇ０〜Ｇ１期、Ｓ期及びＧ２−Ｍ期の細胞数を、フローサイトメトリ分析により試験した。用量依存様式で７２時間ＮＡとのインキュベーション後、細胞周期のＧ０〜Ｇ１期を介した細胞進行と、Ｓ期及びＧ２−Ｍ−期の細胞数減少との間の逆相関関係が示された。
【０１３９】
ＮＡは、ＨａＣａｔ細胞の壊死ではなくてアポトーシスを誘導する。蛍光顕微鏡を用いて、アポトーシス及び壊死の推定値は、単一のサンプルで成すことができた。無処置ＨａＣａｔ細胞における自発的アポトーシス及び壊死のレベルは、それぞれ０．８±０．２２％及び０．３±０．１％であった。２０ｍＭ及び５０ｍＭのニコチンアミドの濃度により、ＨａＣａｔケラチノサイトにおいて有意なアポトーシス様効果を示す。５０ｍＭのＮＡにおいて、実施細胞の約９１％が後期アポトーシスの徴候（赤色凝縮断片核）を示し、細胞の９％だけが、早期アポトーシス（青色凝縮断片核）の段階にあった。しかしながら、試験濃度のＮＡは、壊死細胞死を誘導しなかった。したがって、ＮＡは、皮膚障害の治療のための良好な候補物である。
【０１４０】
ウェスタンブロット解析に関するデータにより、無処置ＨａＣａｔ細胞及び１０ｍＭ又は２０ｍＭのＮＡで処理された細胞は、基礎レベルの未分解１１６ｋＤａ  ＰＡＲＰ完全タンパク質を発現することを立証している。しかしながら、５０ｍＭのＮＡ用量では、ＰＡＲＰの分解及びＰＡＲＰの８５ｋＤａ開裂断片の出現を誘導した。ケラチノサイトの終結分化は、細胞膜の細胞質側のトランスグルタミナーゼにより触媒されたタンパク質−タンパク質架橋反応を反映する角化エンベロープ細胞形成のレベルにより推定された（Ｓｔｅｉｎｅｒｔ及びＭａｒｅｋｏｖ、１９９７年）。大部分の未処理ＨａＣａｔ細胞は、非成熟基底細胞（５８．６±１０．２４％）からなり、一方、分化された角化エンベロープ細胞は、４．４±２．７８％だけが全細胞数からなった。５ｍＭのＮＡ又は１０ｍＭのＮＡと細胞とのインキュベーションでは、基底及び角化エンベロープ双方の細胞数に対して満足すべき有意な効果が無かった。ＮＡの濃度を１５ｍＭに増加した場合、基底細胞のレベルは、２５．６±５．７６％と大いに減少した。ＮＡのこの濃度において、角化エンベロープ細胞形成は増加した。基底細胞数のさらなる減少及び角化エンベロープ細胞形成の増大のさらなる減少は、２０ｍＭのＮＡに見られた。ＮＡのこの濃度で、基底及び角化エンベロープ双方の細胞数は同じであり、全細胞集団の約１５％に等しかった。
【０１４１】
前述の角化エンベロープ細胞形成の分化促進過程を推定するために、ケラチン１０（Ｋ１０）及びインボルクリンの発現レベルを測定した。２０ｍＭのＮＡ濃度は、ＨａＣａｔケラチノサイトのケラチン１０及びインボルクリンの発現増加を引き起こした。定量的分析により、５ｍＭから１０ｍＭまでの濃度のＮＡは、対照細胞と比較してＫ１０発現に対して効果がなかったことを示している。しかしながら、より高い濃度（２０ｍＭ）のＮＡは、ＨａＣａｔ細胞のＫ１０発現に３倍の刺激を誘導した。Ｋ１０と対照的に、インボルクリン発現は、ＮＡ処理に対して有意により感受性であった。５ｍＭのＮＡで処理されたＨａＣａｔ細胞のインボルクリン発現レベルは、約２倍（１１．２±１．６８％対対照の６．０±１．２２％）増加した。増強されたインボルクリン陽性細胞数は、１０ｍＭ及び２０ｍＭ（それぞれ１１．０±１．１３％及び１５．１±３．９３％）で見られた。これらの結果により、ＮＡ処理は、用量依存様式でＨａＣａｔ細胞の種々の分化マーカーの発現を刺激することを示している。
【０１４２】
結論として、ＮＡの薬理学的用量が安全な療法であり、抗増殖及び分化に対する上記のデータがヒト表皮ＨａＣａｔケラチノサイトに対してこのビタミンの効果を促進するという双方の事実により、種々の過剰増殖皮膚障害の治療に対してＮＡの強力な治療可能性を示唆している。
【０１４３】
（実施例２）
製剤開発戦略
製剤開発戦略は、以下の原理に基づいた：
ａ）組成物が幅広い多様性を有する製剤化；
ｂ）製薬グレードの承認された成分の使用；
ｃ）市販の組成物と比較して、４０℃での加速安定性及びマウス尾モデルで測定された効力を判定すること；
ｄ）マウス尾モデルにより測定された活性に基づいて、活性成分の濃度の最適化。
【０１４４】
軟膏製剤の調製
８種の異なるベース製剤を調製した。製剤１〜４及び８は石油ゲル／鉱油ベースであり；製剤５はＰＥＧベースであり；製剤６はトリグリセリド−水ベースであり；製剤７はトリグリセリド−グリセリンベースであった。このベース製剤（１番から８番まで）に、５０μｇ／ｇのカルシポトリオール及び０．６１ｍｇ／ｇのニコチンアミドを加えた。約３００ｇｒの各製剤を調製した。これらの製剤は、分析方法の開発（抽出）、４０℃での加速安定性及び生物活性評価（効力）のために使用された。
【０１４５】
カルシポトリオールの測定（ＨＰＬＣ法）
この方法は、ＵＶ検出によるＨＰＬＣを用いてカルシポトリオール−ニコチンアミド軟膏製剤中のカルシポトリオール含量を測定するために使用された。
【０１４６】
材料：全ての材料は分析用グレード；全ての溶媒はＨＰＬＣグレード
カルシポトリオール標品（５．０μｇ／ｍｌカルシポトリオール）
メタノール
アセトニトリル
【０１４７】
ＨＰＬＣ条件：
Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（登録商標）ＯＤＳ−２．５μｍ、２５０×４．６ｍｍカラム。
ガードカラム：Ｏｐｔｉ−Ｇｕａｒｄ（登録商標）、Ｃ１８、１ｍｍ
移動相：水中６０％アセトニトリル
移動相の調製：移動相のリットル毎に、６００ｍｌのアセトニトリル及び４００ｍｌの水をよく混合する。希釈剤：水中９０％メタノール。
流速：１ｍｌ／分；サンプル容量：５０μｌ；検出器：ＵＶ２６４ｎｍ；カラム温度：２５℃；オートサンプラー温度：２５℃−制御温度；操作時間：１２分。
【０１４８】
算出：製剤中のカルシポトリオール含量は、サンプルのピーク面積と、全ての作業標品溶液注入の平均ピーク面積との間の比率から算出された。
【０１４９】
ニコチンアミドの測定（ＨＰＬＣ法）
この方法は、ＵＶ検出によるＨＰＬＣを用いてカルシポトリオール−ニコチンアミドクリーム製剤中のニコチンアミド（ナイアシンアミド）含量の測定を目的とする。
【０１５０】
材料：
ニコチンアミド標品（２４μｇ／ｍｌ）
リン酸水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）
水酸化カリウム（ＫＯＨ）
アセトニトリル
水
【０１５１】
ＨＰＬＣ条件：
カラム及びパッキング：Ｇｒｏｍ−Ｓｉｌ  １２０  ＯＤＳ−５ＳＴ、５μｍ、１５０×４ｍｍ、又は等価体。
ガードカラム：Ｏｐｔｉ−Ｇｕａｒｄ（登録商標）、Ｃ１８、１ｍｍ
移動相：溶出液Ａ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）中３％アセトニトリル、溶出液Ｂ：リン酸緩衝液（ｐＨ６．６）中５０％アセトニトリル
流速：０．８ｍｌ／分；注入容量：２０μｌ；検出器：ＵＶ２６１ｎｍ；カラム温度：３０℃；オートサンプラー温度：約２０℃；操作時間：標品溶液に関して９分、サンプル溶液に関して２３分。
【０１５２】
算出：製剤中のニコチンアミド含量は、サンプルのピーク面積と、全ての作業標品溶液注入の平均ピーク面積との間の比率から算出された。
【０１５３】
製剤化カルシポトリオール及びニコチンアミドの抽出法
製剤からカルシポトリオールの抽出
製剤１、２、４、５、６、７は、以下のとおり処理した：
１．約１グラムのサンプルを、２０ｍｌのガラスバイアル中に秤量し、１０ｍｌの希釈剤（メタノール：水９：１容量）を加え、１分間渦巻かせ、５分間放置した。
２．生じた混合物の約１ｍｌを、０．２２ｍｍフィルター付の遠心分離管に移し、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
３．採取されたろ液をＨＰＬＣに注入した。
【０１５４】
製剤３、８は、以下のとおり処理した：
１．約１グラムのサンプルを、２０ｍｌのガラスバイアル中に秤量し、１０ｍｌの希釈剤（メタノール：水９：１容量）を加え、１分間渦巻かせた。
２．周期的に激しく撹拌しながら１０分間の音波処理を実施した。
３．約１分間の渦巻き混合を実施した。
４．生じた混合物の約１ｍｌを、０．２２ｍｍフィルター付の遠心分離管に移し、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
５．採取されたろ液をＨＰＬＣに注入した。
【０１５５】
製剤からニコチンアミドの抽出
製剤２、４、５、６、７は、以下のとおり処理した：
１．約１グラムのサンプルを、２５ｍｌのメスフラスコ中に秤量し、混合により溶解し、水によりこの容量に達した。
２．周期的に激しく撹拌しながら１０分間の音波処理を実施した。
３．生じた混合物の約１ｍｌを、０．２２ｍｍフィルター付の遠心分離管に移し、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。
４．採取されたろ液をＨＰＬＣに注入した。
【０１５６】
製剤１、３、８は、以下のとおり処理した：
１．約１グラムのサンプルを、５０ｍｌのガラスボトル中に秤量し、２５ｍｌの水を加え、３０秒間渦巻き混合し、次いで周期的に激しく撹拌しながら４０℃で３０分間の音波処理をした。
２．次に、生じた混合物を周囲温度に冷却し、０．４５ｍｍフィルターを通してろ過した。
ろ液をＨＰＬＣに注入した。
【０１５７】
結果：製剤１、２及び５は、６０日間４０℃に曝露後、最も安定であることが判明した（カルシポトリオール及びＮＡの８５％超の回収）。製剤５は、曝露１８０日後でも最も安定な状態のままであった。
【０１５８】
（実施例３）
効力評価
効力評価アッセイは、製剤１、２及び５を用いて実施した。効力評価は、以下の修飾によるＢｏｓｍａｎ  Ｂ．ら（１９９２）に公表された手法に従って実施された：
【０１５９】
処置領域のタブを据え付けるよりも舐めることを防ぐために、カラーをマウスに乗せ；オスアルビノマウス（ＩＣＲ）を、同じ体重及び週齢のオスアルビノマウス（ＮＭＲＩ）の代わりに用いた。
【０１６０】
２つの実験を実施し；第一のアッセイを実施して、５０μｇ／ｇのカルシポトリオール及び０．６１ｍｇ／ｇを含む異なるベースの組成物の相対的効力を試験した。製剤１、２及び５が最も安定であることが判り、すなわち、活性成分は、４０℃で６０日後も安定のままである。この実験結果は、図１Ａ（オルト角化症％）及び図１Ｂ（活性成分の活性度％）に提供される。文字「Ｖ」は、媒体単独を称し、Ｖ−１；Ｖ−２及びＶ−５は、それぞれ組成物１、２及び５の媒体を称す。番号１、２及び５は、それぞれ製剤１、２及び５を称す。
【０１６１】
第二のアッセイは、組成物のニコチンアミドの濃度の最適化に関連した。したがって、５０μｇ／ｇのカルシポトリオール及び０．７０ｍｇ／ｇの製剤を出発して３倍増加濃度のニコチンアミドを用いて、それらの効力について６つの異なる組成物をスクリーンした。これらの製剤を、５０μｇ／ｇのカルシポトリオールを含む市販の組成物と比較した。
【０１６２】
実験概要は、本明細書の下表１に提供される。オルト角化症は、下表２に提供される。
【表１】
2008540514.tif 000002
【０１６３】
【表２】
2008540514.tif 000003
【０１６４】
図２Ａは、本発明の種々の組成物によりマウス尾に誘導されたオルト角化症のレベルを示すグラフである。特に、５０μｇ／ｇのカルシポトリオールを含む組成物中のＮＡ濃度の最適化を示した。図２Ｂは、本発明による種々の製剤中の薬物活性レベルを示す。
【０１６５】
５０μｇ／ｇのカルシポトリオール及びＮＡの全て試験された濃度を含む組成物は、５０μｇ／ｇのカルシポトリオールの市販（Ｄａｉｖｏｎｅｘ）組成物よりも良好に実施されたことを、両グラフは示している。最良の結果は、５０μｇ／ｇのカルシポトリオール及び２．１ｍｇ／ｇのＮＡ（ＩＩ）の組成物により得られた。ローマ数字のＩ、ＩＩ、ＩＩ及びＩＶは、５０μｇ／ｇのカルシポトリオール及び０．７ｍｇ／ｇ（Ｉ）；２．１ｍｇ／ｇ（ＩＩ）；６．３ｍｇ／ｇ（ＩＩＩ）又は１８．９ｍｇ／ｇ（ＩＶ）のニコチンアミドの組成物を称す。
【０１６６】
（実施例４）
製剤
薬物製剤を調製する方法
カルシポトリオールを、ポリエチレングリコール（ＰＧ）に溶解した。５重量％のカルシポトリオール溶液を、９５重量％ＰＥＧベースのベース製剤と混合した。ニコチンアミドは、カルシポトリオール溶液に直接又はビタミンＥと一緒に、正確に４５℃でＰＥＧ−４００中、ＰＥＧ−４０００及びステアレス−２０の溶融混合物に加えられ、２．１ｍｇＮＡ／ｇ製剤の最終濃度に達した。
【０１６７】
表３は、本発明のＰＥＧベースのベース製剤を示す。
【表３】
2008540514.tif 000004
【０１６８】
詳細な調製方法
４０℃の水浴中、１ｍｇのカルシポトリオールを１ｍｌのＰＧに加え、全てのカルシポトリオールが溶解し、結晶が観察されなくなるまで軽く撹拌した。この溶液は、２０ｇの製剤に好適である（最終濃度５０μｇ／ｇｒ）。
【０１６９】
ＰＥＧ−４００中のＰＥＧ−４０００及びステアレス−２０を、水浴（約６０℃）中、一緒に溶融し、均一になるまで十分に混合した。混合物を５０℃以下に冷却した。
【０１７０】
ビタミンＥ及びカルシポトリオール／ＰＧを、ＰＧ中の５重量％のＣＰ溶液と９５重量％の混合物の比率でＰＥＧ−４００中のＰＥＧ−４０００及びステアレス−２０混合物に加えた。
【０１７１】
或いは、ニコチンアミドを、ビタミンＥ：４２．０ｍｇ、２０ｇ製剤のためのＮＡ（最終濃度ＮＡが２．１ｍｇ／ｇｒ）に加えるか、カルシポトリオール溶液に溶解することができる。
【０１７２】
この混合物を十分に混合し、チューブに充填する。
【０１７３】
（実施例５）
インビボでのカルシポトリオール及びＮＡの相乗効果
このインビボ試験は、標準的なマウス尾試験（実施例３を参照）を利用してＮＡ及びカルシポトリオールを含む組成物の抗乾癬活性度（効力）を測定することを目的とした。マウス尾皮膚及び／又は異常成熟化（不全角化症）のスケール領域における顆粒層（オルト角化症又は正常な成熟化）の誘導は、抗乾癬活性に関連したパラメータである。
【０１７４】
この試験は、プラセボ（ＰＬ）、カルシポトリオール（ＣＰ）の５０μｇ／ｇｒ及びカルシポトリオールとニコチンアミド（ＣＰＮＡ）の混合物に関して各々１００回の測定値による大型スケールで実施された。９０回の測定値により、ニコチンアミド（ＮＡ）２．１ｍｇ／ｇｒが得られた。
【０１７５】
関与する全てのマウスは、評価前に無作為化し、顕微鏡分析が完全ブラインド法で完了後のみ、処置をデータポイントに再配置した。
【０１７６】
全ての処理に関してＡＮＯＶＡ法を用いて処置を解析した。ＣＰ又はＮＡ単独による処置は、良好な結果を提供したが、ＣＰＮＡによる処置は有意により良好であり、ＣＰ及びＮＡの相乗効果を示した。
【０１７７】
得られた平均値及びそれらの標準偏差は、下表４に示される：
【表４】
2008540514.tif 000005
【０１７８】
１処置当りの単一用量ポイントに関して、個別処置の合計に対する組合わせ処置の結果比率を算出する手段によって相乗効果の推定値Ｓを評価することは可能であり、全ての処置は、以下の式：Ｓ＝（ＣＰＮＡ−ＰＬ）／｛［（ＣＰ−ＰＬ）＋（ＮＡ−ＰＬ）｝のように、各々個別の結果からプラセボ結果を差し引くことにより調整される。
【０１７９】
値Ｓは、標準誤差：０．０２１１の推定値により２．１６であると推定された。したがって、実施された試験の条件に関してＣＰとＮＡとの間に相乗効果が存在することは明瞭である。
【０１８０】
本明細書下表５は、この評価の結果を示す。
【表５】
2008540514.tif 000006
【０１８１】
図３は、上記解析結果を示すグラフである。上記濃度でカルシポトリオール及びニコチンアミドの相乗効果は、明白である（組合わせ、（ＣＰ＋ＮＡ））。
【０１８２】
（実施例６）
ウサギにおける急性皮膚刺激／腐食
この試験は、優良実験室規範のＯＥＣＤ規準（１９９７年に改訂）；優良実験室規範の規準及びコンプライアンスモニタリングについてのＯＥＣＤ環境、健康及び安全性シリーズ−第１号．ＥＮＶ／ＭＣ／ＣＨＥＭ（９８）１７；２００２年４月２４日に採用された、試薬の試験に関するＯＥＣＤガイドライン、４節、第４０４号、「Ａｃｕｔｅ  Ｄｅｒｍａｌ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ／Ｃｏｒｒｏｓｉｏｎ」；及び２００２年９月１日第二版、ＩＳＯ  １０９９３−１０：２００２年（Ｅ）、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｄｅｖｉｃｅｓ−Ｐａｒｔ１０：Ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｌａｙｅｄ−Ｔｙｐｅ  Ｈｙｐｅｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．６．３節Ａｎｉｍａｌ  Ｓｋｉｎ  Ｉｒｒｉｔａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔに従って実施された。
【０１８３】
目的：ウサギへの単回塗布による、皮膚刺激／腐食を生じる試験項目の可能性評価、それにより乾癬用治療剤としてその計画された使用条件下、試験物質への皮膚の曝露から生じ易い可能な健康危険に関する情報を得ること。
【０１８４】
試験材料：以下の濃度でのカルシポトリオール＋ニコチンアミド（ＮＡ）：ＰＥＧベース中、５０マイクログラム／グラムのカルシポトリオール、２．１ミリグラム／グラムのＮＡ。
【０１８５】
試験系：ウサギ／ニュージーランドホワイト（ＮＺＷ）メス、試験開始時に約３〜４月齢、約２ｋｇ。動物を少なくとも５日間馴化させる。獣医師は、到着時に本試験に用いられる動物の健康状態を検査した。健康良好な動物だけを実験室条件に馴化させ、試験に用いた。
【０１８６】
ハウジング：バッテリ内に装備されたステンレススチールケージ内に個々に収容した。ケージの寸法は６０（Ｌ）×５０（Ｗ）×４５（Ｈ）ｃｍプラス棚のサイズは約５０（Ｌ）×２０（Ｗ）ｃｍでケージ床から約２０ｃｍ上に置いた。ウサギをトレー下のプラスチック製格子床に嵌めこんだ。
【０１８７】
食餌と水：動物は、凡そ１００ｇ／ウサギ／日の市販ウサギ用飼料を与え、ステンレススチール製シッパーチューブ付のポリエチレン製ボトルを介して各ケージに供給された飲料水に自由にアクセスさせた。水をろ過し（０．１μフィルター）、塩素化及び酸性にし、年２回汚染物をモニターした。
【０１８８】
環境：試験室内を３０〜７０％の相対湿度（ＲＨ）で１７〜２３℃で温度を維持し、１２時間／１２時間の明暗サイクル及び１５〜３０回／時間の大気交換を維持するために、自動制御環境条件を設定した。温度及びＲＨを毎日モニターした。ライトサイクルを、制御コンピュータによりモニターした。
【０１８９】
識別：動物は、入墨又はマーキング着色耳番号によりブリーダーによって識別された。この番号はまた、各ケージの前部に見えるようにケージカードに記載する。さらにケージカードには、試験番号及び処置群並びに用量レベルに関連する詳細を含んだ。
【０１９０】
終結：動物が重度の疼痛又は苦痛の継続的徴候を示す時期に、或いは組織学的検査が、多義的応答を明瞭にするために必要な場合に、ウサギを、Ｎａ−ペントバルビタールのＩＶ型過量（７５ｍｇ／ｋｇ）により安楽死させた。
【０１９１】
正当化：皮膚刺激／腐食試験に使用のため、ＯＥＣＤ及びＥＰＡガイドラインにより明記された選択種であるように、アルビノウサギが本試験に選択された。
【０１９２】
用量：０．５ｇ／動物
【０１９３】
試験法：
試験の原則：本試験に適用された連続的な方法は、動物の不必要な使用を避けることを目的としたステップ毎の手法を表す。試験は、最初に１匹の動物を用いて実施された。この結果に依って、さらなる動物を用いる確認試験を実施した。試験項目は、試験動物の皮膚に単回投与で適用された。各動物の未処置皮膚の隣接領域は、対照として役立った。刺激／腐食の程度を評価し、特定の間隔でスコア化した。
【０１９４】
動物の前試験調製：凡そ試験２４時間前に、柔毛は、電気クリッパーを用いて動物の胴背部領域をクローズクリッピングすることにより除去した。皮膚を擦りむくことを避けるために注意を払い、健全な無処置皮膚を有する動物だけを用いる。高密度毛の増殖が見られる領域の場合、試験部位としてこれらを使用しない。
【０１９５】
試験項目の塗布：試験項目を、直接皮膚に塗布するか、ガーゼパッチ（凡そ６ｃｍ２）に塗布し、次いで直ちに直接皮膚に貼り付けた。パッチは、非刺激性テープ及び好適な半閉鎖性包帯（ＴＵＢＩＧＲＩＰ平編み）で皮膚と接触させて保持して、曝露４時間を通してガーゼパッチと試験項目とを保持し、動物が試験項目を摂取できないように確保した。各動物の未処置皮膚領域は、対照として供する。試験項目は、以下のとおり連続的に塗布した：
【０１９６】
開始試験：単一のパッチを、１匹の動物に４時間貼り付けた。（皮膚腐食が認められた場合、試験は直ちに終了する）。
【０１９７】
確認試験：必要ではなかった。開始試験で刺激作用が観察された場合、確認試験を、連続様式で又はさらに２匹の動物を同時に曝露することにより実施した。
【０１９８】
曝露時間とパッチの除去
４時間の曝露時間の終末に、存在する応答又は表皮の保全性を変えることなく、残留試験項目を水道水又は適切な溶媒を用いて除去した。試験部位の縁を、引き続く観察セッションを容易にするために、非刺激性且つ非消去性インクでマークした。
【０１９９】
鎮痛：オピオイド鎮痛剤を、研究用の実験室動物の使用のために動物福祉の考慮に鑑みてケースバイケースで使用できる。
【０２００】
観察：
観察期間：所要の観察期間は、観察された作用の大きさ及び反転性を十分に評価するのに十分である必要がある。しかしながら、動物が、重度の疼痛又は苦痛の連続的な徴候を示す時間に実験を終了した。皮膚病変を発生しない動物は、パッチ除去後、７２時間観察される。さらに、貼り付け後１４日までの反転を確立するために観察が必要となり得る。７２時間を超える観察期間の延長の場合、各動物は、反転が見られるまで、又は最大１４日まで観察する。
【０２０１】
皮膚反応の臨床所見及びグレード評価：全ての動物を、紅斑及び浮腫の徴候について検査し、その反応を、パッチ除去後１時間目、２４時間目、４８時間目、及び７２時間目にスコア化した。１匹の動物の開始試験に関して、試験部位はパッチが除去された直後にも検査した。動物が１４日まで観察された場合、さらに病変状態及びそれらの反転性を判定するために、パッチの除去後１日１回検査を実施する。皮膚反応のグレードを、各検査で記録した。
【０２０２】
掲げられたもの以外の任意の皮膚反応（例えば、限定領域の脱毛症、過角化症、肥厚化及び剥れ）は、個別に記録し、重症度の上昇につれて４ポイントグレード化スケール（０＝なし；１＝軽微；２＝中等度；３＝重症）に従ってスコア化した。
【０２０３】
さらに、いずれの全身副作用の検査も、少なくとも１日１回又は処置に対する動物の応答により示された場合は、より頻繁に実施した。
【０２０４】
人道的エンドポイント：瀕死状態が見られる動物及び重度の疼痛並びに重度の苦痛に耐える徴候を示す動物は、人道的に殺処理する必要があった。
【０２０５】
体重：個々の体重測定は、試験項目適用前及び試験終了時になされた。１４日まで観察された動物に関して、さらなる体重測定を、パッチ除去後７日目及び１４日目に実施した。
【０２０６】
病態：観察された反応が保留中の場合、試験責任者の裁量で、疑いのある反応を明瞭にするために組織学的検査を実施できる。
【０２０７】
データ評価：一次刺激指標（ＰＩＩ）：試験項目の可能性のある刺激作用の最終評価は、下記に示されたコンピュータステップに従って一次刺激指標（ＰＩＩ）（ｃ）の判定に基づいた。２４時間、４８時間及び７２時間だけの観察スコアが、ＰＩＩを算出するために使用された。塗布前又は回復をモニタリングするために意図された７２時間後に作製されたいずれの観察もこの判定に使用されなかった。
【０２０８】
各動物に関して、紅斑及び浮腫に関する刺激スコアが算出されて主要刺激指標（ＰＩＩ）を得た。
【表６】
2008540514.tif 000007
【０２０９】
脱毛症（限定領域）、過角化症、肥厚化及び剥れのような反応が、観察期間の終了まで持続する場合、試験項目は刺激性であると考慮され得る。
【０２１０】
定義（ＥＰＡ及びＯＥＣＤガイドラインによる）：
皮膚刺激は、４時間までの試験物質の塗布後の皮膚における不可逆的炎症変化又は任意の損傷の発生である。
【０２１１】
皮膚腐食は、試験物質の塗布後の皮膚における不可逆的組織損傷（すなわち、４時間までの試験物質の塗布後、表皮を介し、及び真皮への肉視できる壊死。腐食反応は、潰瘍、出血、観血的痂皮、皮膚の軟化、及び１４日の観察終了まで脱毛症、及び瘢痕の完全領域による脱色が典型である）の発生である。
【０２１２】
結果：皮膚反応は、試験された３匹の動物の中から２匹が発生した、紅斑だけからなった。紅斑の発症は、パッチ除去後即時又は１時間後であった。１匹の動物における紅斑は、パッチ除去後即時にグレード２（十分に規定された）であったが、その後１（極めて些少）に和らいだ；別の動物における紅斑は、グレード１であった。回復は、前者がパッチ除去後７２時間に、後者は２４時間の観察時点に認められた。
【０２１３】
処置に対する反応において顕著な全身性臨床徴候は、全試験期間を通していずれの動物にも表れなかった。
【０２１４】
体重の異常な変化は認められなかった。
【０２１５】
結論：算出された一次刺激指標（ＰＩＩ）を考慮すると、本発明の組成物刺激レベルは、「無視してよい」皮膚刺激であると考えられる。この結果により、ＣＰ及びＮＡの組合わせは、ＣＰ単独からなる製剤よりも少ない皮膚刺激を有する製剤が提供されることを示している。
【０２１６】
対照的に、Ｄａｉｖｏｎｅｘ（登録商標）クリーム剤（Ｌｅｏ）は、患者の３１．８％のレベルの有害事象を示すデータシートが添付されている。これらの有害事象は、とりわけ損傷性及び周辺損傷性刺激（１３．９％）並びに顔面及び／又は頭皮刺激（１０．６％）を含む。
【０２１７】
（実施例７）
３種の局所用製剤：ＮＡ、ＣＰ及びＣＰ−ＮＡ組合わせのカルシポトリオール及びニコチンアミドの皮膚浸透
当該試験の目的は、３種の局所用製剤：ＮＡ単独の組成物、カルシポトリオール単独の組成物及びＮＡとカルシポトリオールとの組成物からカルシポトリオール及びニコチンアミドの皮膚浸透挙動を測定することであった。
【０２１８】
薬物動態調査
カルシポトリオール：カルシポトリオールは、典型的にローション剤、クリーム剤、ゲル剤、軟膏又は頭皮用液剤として０．００５％の濃度で市販されている。毎週の用量は、一過性の皮膚刺激及び高カルシウム血症を防止するために、クリーム剤又は軟膏について１週当り１００ｇ或いは頭皮用液剤については１週当り６０ｍｌと制限されている。
【０２１９】
ニコチンアミド：ニコチンアミド（ＮＡ）は、ニコチン酸の水溶性アミドであり、Ｂ−複合体ビタミンＢ３の２つの主要形態のうちの１つである。ＮＡの薬物動態は、用量、種、性別、及び投与経路に依存する。局所的な４％ニコチンアミドゲル剤は、尋常性座瘡の治療において１％クリンダマイシンゲルと同等の効力が判明した（Ｓｈａｌｉｔａら、１９９５年）。
【０２２０】
製剤及び方法
３種の製剤が調製された。第一の製剤はノコチンアミド（ＮＡ、２．１ｍｇ／ｇ）を含み、第二の製剤はカルシポトリオール（ＣＰ、５０μｇ／ｇ）を含み、第三の製剤はカルシポトリオール（ＣＰ、５０μｇ／ｇ）とノコチンアミド（ＮＡ、２．１ｍｇ／ｇ）との組合わせ（ＣＰＮＡ）である。
【０２２１】
皮膚浸透測定
Ｆｒａｎｚセルアセンブリ及びブタ耳皮膚を、種々の系及び剤形からインビトロ皮膚を介して薬物の浸透測定のために使用する（Ｄｉｃｋら、１９９２年；Ｓｉｍｏｎら、２０００年；Ｔｏｕｉｔｏｕら、１９９８年；Ｃｈｉｅｎ１９９２年）。実験は、Ｆｒａｎｚ分散セルアセンブリ及びブタ耳の完全厚さ皮膚を用いてインビトロで実施された。分散セルは、不活性材料から作製され、アセンブリは、レシーバ液体混合物及び温度制御を良好にする。
【０２２２】
ブタ耳皮膚を、耳の外部から切除し、基底軟骨から分離した。該皮膚は、使用まで常に１週未満、−２０℃で凍結保存した。実験直前に、該皮膚を室温で１時間解凍し、毛を刈った。該皮膚の完全性をチェックしてから、切断し、ドナーコンパートメントに対して角質層を有する分散セルに乗せた。１００ｍｇの試験製剤量を、ドナーコンパートメント内の１．７７ｃｍ２皮膚に乗せた。レシーバコンパートメントは、系内のシュードシンク条件を維持するために、エタノール：水（３：７）で満たした。レシーバを３７℃に維持し、実験中均質培地を確保するために撹拌した。
【０２２３】
実験は、１２時間非閉塞で操作された。サンプルは、１、２、４、６、９、１１及び１２時間目にレシーバから取り出された。サンプルを、さらに記載されるＨＰＬＣによりニコチンアミド及びカルシポトリオールの濃度に関して分析された。実験は三通り実施した。全部で２４のセルを用い、試験された各製剤（ＮＡ、ＣＰ及びＣＰＮＡ）については８つのセルを用いた。
【０２２４】
局所用製品に関して、有限用量手法を用いた。ドナーは、大気条件に開放したままであり；これは、臨床使用状態を模倣する。
【０２２５】
方法
各製剤は、８枚の皮膚切片上で試験した。全部で２４枚の切片が使用された。
【０２２６】
ＨＰＬＣアッセイ：ニコチンアミド及びカルシポトリオールのＨＰＬＣアッセイは、以下の通り実施した：ニコチンアミドは、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＢＤＳ  Ｃ１８、３μｍ、１５０×２．１ｍｍ（ＣＮ２８１０３−１５２１３０、バッチ番号４７９６）カラムを具備したＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅ  ２７９５ＬＣ及びＱｕａｔｔｒｏ  ｍｉｃｒｏ（商標）ＨＰＬクロマトグラフＬＣ−ＭＳシステム中で分析した。アッセイは、水：アセトニトリル（９：１）中０．１％ＴＦＡを含む移動相により０．２３ｍＬ／分の流速で実施した。
【０２２７】
カルシポトリオールは、５ｃｍフローセルＨＰＬＣシステムでＵＶ検出器を具備したＴＳＰ  ＨＰＬクロマトグラフ上で２６６ｎｍにおいてアッセイした。分離は、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ  ＯＤＳ  ２．５μｍ、１５０×４．６ｍｍカラム（ＣＮ  ３１６０５−０２０、バッチ番号５／１２０／５７４５）を用いて水：アセトニトリル（４：６）を含有する移動相により１．８ｍＬ／分の流速で実施した。
【０２２８】
ニコチンアミド及びカルシポトリオールの水性エタノール液を、検量線及び外部標品として用いた。
【０２２９】
結果
皮膚浸透結果は：
１．Ｑｒ−実験の各時点でレシーバ中の浸透分子の量。
２．Ｑｒ１２−１２時間皮膚に浸透し、レシーバ内に蓄積された浸透分子の量（平均±ＳＤ）。
３．皮膚浸透プロファイル−皮膚対時間で浸透された累積薬物量、として示される。
【０２３０】
製剤ＣＰ及びＣＰＮＡからのカルシポトリオールの浸透
１２時間の浸透実験中、カルシポトリオールは、いずれのセルのレシーバコンパートメントにおいてもＨＰＬＣアッセイにより検出されなかった。エタノール−水溶液中の低量子化レベル（ＱＬ）のカルシポトリオールは、１．３ｎｇ／ｍＬであると判明した。したがって、当該製剤中のカルシポトリオールは、皮膚に浸透しない。
【０２３１】
理論に拘束されるつもりはないが、皮膚内へのカルシポトリオール浸透の欠如は：
ａ）市販のカルシポトリオールを用いてしばしば患者に見られた高カルシウム血症など、全身副作用の排除のため、より高レベルの安全性；及び
ｂ）カルシポトリオールが、その標的細胞、ケラチノサイトと接触して皮膚表面に残っていることから高レベルの有効性など、当該製剤の幾つかの利点を引き出している。
【０２３２】
製剤−ＮＡ及びＣＰＮＡからのニコチンアミドの浸透
製剤ＮＡ及びＣＰＮＡから皮膚に浸透したニコチンアミドの量（Ｑｒ）を、表６に要約する。
【表７】
2008540514.tif 000008
【０２３３】
（実施例８）
臨床試験フェーズＩ／ＩＩａ：中等度乾癬に対する非ステロイド系新規治療
活性物質：「ＣＰＮＡ製剤」：０．３％ビタミンＥ；２％ステアレス２０；７７．７％ＰＥＧ−４００及び２０％ＰＥＧ−４０００のベース中、０．０５％カルシポトリオール及び０．２１％ニコチンアミド。
【０２３４】
方法論：多施設、二重盲検、無作為プラセボ及び活性制御比較試験
【０２３５】
主要目的：本試験の主要目的は、ａ）中等度乾癬患者に、１日２回８週間投与されたＣＰＮＡ製剤の局所塗布の安全性及び有効性を評価すること；及びｂ）ＣＰＮＡ製剤が競合物のＤａｉｖｏｎｅｘ（登録商標）（Ｌｅｏ）に劣らないと決定することであった。
【０２３６】
第二の目的：本試験の第二の目的は：ａ）ＰＧＡ（Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）スコアの追跡；ｂ）ＰＳＡ（Ｐａｔｉｅｎｔ  Ｓｅｌｆ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ）スコアの追跡；ｃ）治療後の持続効果；ｄ）ＣＰＮＡ製剤治療は、ある一定の乾癬治療、特にステロイドベースの組成物に共通するリバウンド作用がないことである。ＰＧＡスコア（Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、２００３年）：スクリーニング来院、選択のための来院（Ｖ１）、及び以下の全ての来院において、乾癬の評価は、ＰＧＡスコアを用いて実施される。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ＰＧＡ）により、調査者は患者の総合的疾患の重症度の単一推定値を有する。表７に示される消去から重症までの７ポイントスケールを使用した。
【表８】
2008540514.tif 000009
【０２３７】
ＰＡＳＩスコア（Ｆｅｌｄｍａｎ及びＫｒｕｅｇｅｒ、２００５年）：スクリーニング来院、選択のための来院（Ｖ１）、及び以下の全ての来院において、乾癬の評価は、Ｐｓｏｒｉａｓｉｓ  Ａｒｅａ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ（ＰＡＳＩ）を用いて実施される。
【０２３８】
症状スコア：紅斑（Ｅ）、硬化（Ｉ）及び剥れ（Ｓ）は、下表８に示されるスケールを用いてスコア化される。
【表９】
2008540514.tif 000010
【０２３９】
面積スコア％：面積スコアは、表９に示される各々体面積に起因する：
【表１０】
2008540514.tif 000011
【０２４０】
ＰＡＳＩスコアは、以下の通り算出された：
ＰＡＳＩスコア＝０．１［（Ｅ＋Ｉ＋Ｓ）×面積スコア］頭部＋０．２［（Ｅ＋Ｉ＋Ｓ）×面積スコア］上肢＋０．３［（Ｅ＋Ｉ＋Ｓ）×面積スコア］胴体＋０．４［（Ｅ＋Ｉ＋Ｓ）×面積スコア］下肢  
【０２４１】
患者自己評価：患者は、２週目の来院（Ｖ２）及び全て以下の来院において、一般的なスコアリング（有効性及び耐容性）により、一般に耐容性治療効果を評価する必要があった。さらに、選択のための来院（Ｖ１）において、患者は、試験の開始時に疾患状態を記載するために同じ有効性スコアを使用した。患者の自己評価は、５つのグレードの定義を有する（（ｉ）有効性（表１０Ａ）及び（ｉｉ）耐容性（表１０Ｂ）：
【表１１】
2008540514.tif 000012
【表１２】
2008540514.tif 000013
【０２４２】
無作為患者数：１２０人の患者を募り、３群に無作為化した：プラセボ、ＣＰ−ＮＡ製剤及びＤａｉｖｏｎｅｘ（１群につき４０人の患者）。
【０２４３】
試験薬物：ＣＰ−ＮＡ製剤、プラセボ及び競合品。全ての処置は、局所塗布により、朝と就寝時に１日２回、８週間塗布した。
【０２４４】
処置期間：必要ならば、最初の処置前に４〜８週のウォッシュアウト期間後、８週。
【０２４５】
追跡期間：４週（最終処置後）。
【０２４６】
選択基準：１８才以上の男性又は女性；軽度の乾癬歴の患者；１４以下のＰＡＳＩスコアを有する患者；妊娠可能性の女性の選択において尿妊娠試験が陰性で有効な避妊薬（経口避妊薬、ＩＵＤ、又は卵間結紮）を用いている患者、本試験に参加同意で文書のインフォームドコンセントにサインをした患者。
【０２４７】
除外規準：試験の参入前１ヵ月以内に軽度乾癬用局所治療薬（コルチイド類、レチノイド類、ビタミンＤ誘導体）で治療を受けた患者；試験の参入前２ヵ月以内に乾癬用の全身治療（生物学的製剤、メトトレキサート、シクロスポリン、レチノイド類）を受けた患者；試験の参入前２ヵ月以内にベータ−ブロッカーを開始したか、それに変更した患者；頭皮乾癬、爪乾癬、屈曲乾癬、掌蹠乾癬、膿疱性乾癬のうちの１つ又は複数の形態を有する患者；妊娠女性又は授乳中の女性又は避妊していない女性、Ｄａｉｖｏｎｅｘに対して過敏症歴を有する患者；参入前３ヵ月以内に臨床試験に参加した患者；責任医師の判定で、試験薬物代謝及び／又は試験実施及び／又は試験パラメータ評価を妨害する主要な医学的／精神的病気又は手術歴を有する患者、情報（言語的又は精神的理由で）を理解できず、試験参加のために彼／彼女のインフォームドコンセントを与えることができない患者；試験参加のために彼／彼女のインフォームドコンセントを与える意志のない患者；保護下にある患者。
【０２４８】
評価基準：治療剤の有効性を評価するための主要基準は、ＰＡＳＩスコア及びＰＧＡスコアである（Ｇｏｔｔｌｉｅｂら、２００３年；Ｆｅｌｄｍａｎ及びＫｒｕｅｇｅｒ、２００５年）。０、２、４、６、８及び１２週目に測定が実施され、試験責任医師により評価される。副次基準は：有効性及び安全性に対する患者の自己評価である。データは、０、２、４、６、８及び１２週目に記録される。
【０２４９】
統計解析：全ての統計解析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）２０００Ｔｅｒｍｉｎａｌの下でＳＡＳ（登録商標）バージョン９．１を用いて実施された。全ての記述的統計は、群及び総合的に提供される。数値的変動は、観察数の平均値、標準偏差、最小値、中間値及び最大値を用いて作表された。カテゴリー変動は、観察数及びパーセントを用いて作表された。
【０２５０】
安全性解析：安全性及び耐容性は、患者により評価され、医師により記録された。全ての「緊急処置」の副作用は記載された。各有害事象の処置によるパーセンテージ、頻度及び帰属が明示される。
【０２５１】
予備的結果
来院１から来院５までの平均的改善（１１５ＩＴＴ対照に基づく）は、プラセボ群に関して１５．４％及び４６％（それぞれ各医療センターにおいて５２．７％及び３８．５％の平均）であることが示された。したがって、当該製剤は、乾癬治療に有効であることを示している。
【０２５２】
本発明は、具体的に記載されているが、当業者は、多数の変形及び修飾を成すことができることを認識するであろう。したがって、本発明は、具体的に記載された実施形態に限定されるものとして解釈してはならず、本発明の範囲、精神及び概念は、冒頭の請求項を参照することにより、より容易に理解されるであろう。
（参考文献）
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【図面の簡単な説明】
【０２５３】
【図１Ａ】図１Ａは、種々の安定な軟膏製剤により誘導されたオルト角化症のレベルを示すグラフであり、該製剤は５０μｇ／ｇのカルシポトリオール及び０．６１ｍｇ／ｇのＮＡを含む。
【図１Ｂ】図１Ｂは、安定な軟膏製剤の薬物活性度を示すグラフであり、該製剤は５０μｇ／ｇのカルシポトリオール及び０．６１ｍｇ／ｇのＮＡを含む。
【図２Ａ】図２Ａは、オルト角化症の増加により判定される軟膏製剤中のＮＡ濃度の最適化を示すグラフである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａから誘導される、５０μｇ／ｇのカルシポトリオール及び種々の濃度のＮＡを有する製剤の薬物活性度を示すグラフである。
【図３】オルト角化症の増加としてＣＰ及びＮＡの相乗効果を示すグラフである。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【国際調査報告】
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