(57)【要約】【解決手段】本発明は、ウシから組織試料を得る工程と、前記組織試料を孵化卵に接種する工程と、前記接種された卵由来の溶液と培地とを混合する工程と、前記卵溶液と混合した前記培地を好ましくは１ヵ月以上約３２℃で培養してスピロプラズマ培養物を確立させる、前記培養する工程とによって、スピロプラズマを単離及び培養する方法を目的とする。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳類からスピロプラズマを単離及び培養する方法であって、
哺乳類から組織試料を得る工程と、
前記組織試料を孵化卵に接種する工程と、
前記接種された卵由来の溶液と培地とを混合する工程と、
前記卵溶液と混合した前記培地を４週間以上、約３２℃で培養してスピロプラズマ培養物を確立させる、前記培養する工程と
を有する方法。
【請求項２】
請求項１記載の方法において、卵溶液と混合した前記培地は、５週間以上培養され、スピロプラズマ培養物を確立させるものである。
【請求項３】
請求項１記載の方法において、卵溶液と混合した前記培地は、６週間以上培養され、スピロプラズマ培養物を確立させるものである。
【請求項４】
請求項１記載の方法において、前記哺乳類は、ウシ、ヒツジ、またはヒトである。
【請求項５】
請求項４記載の方法において、前記哺乳類は、ウシまたはヒトである。
【請求項６】
請求項５記載の方法において、前記哺乳類は、ウシである。
【請求項７】
請求項１記載の方法において、前記哺乳類は、クロイツフェルト−ヤコブ病、スクレイピー、または牛海綿状脳症を有すると診断されているものである。
【請求項８】
請求項１記載の方法において、前記組織試料は、神経組織である。
【請求項９】
請求項１記載の方法において、前記培地は、Ｍ１Ｄ、ＳＰ４、またはＨ−１培地である。
【請求項１０】
ウシ、ヒツジ、ヤギ、シカ、ネコ、ミンク、および反すう動物からなる群から選択される動物からスピロプラズマを単離及び培養する方法であって、
ウシから組織試料を得る工程と、
前記組織試料を孵化卵に接種する工程と、
前記接種された卵由来の溶液と培地とを混合する工程と、
前記卵溶液と混合した前記培地を約３２℃で培養してスピロプラズマ培養物を確立させる、前記培養する工程と
を有する方法。
【請求項１１】
請求項１１記載の方法において、前記卵溶液と混合した前記培地は、１ヶ月以上培養され、スピロプラズマ培養物を確立させるものである。
【請求項１２】
請求項１１記載の方法において、卵溶液と混合した前記培地は、５週間以上培養され、スピロプラズマ培養物を確立させるものである。
【請求項１３】
請求項１１記載の方法において、卵溶液と混合した前記培地は、６週間以上培養され、スピロプラズマ培養物を確立させるものである。
【請求項１４】
請求項１０記載の方法において、前記動物は、ウシである。
【請求項１５】
請求項１４記載の方法において、前記ウシは、牛海綿状脳症を有すると診断されているものである。
【請求項１６】
請求項１１記載の方法において、前記組織試料は、神経組織である。
【請求項１７】
請求項１１記載の方法において、前記培地は、Ｍ１Ｄ、ＳＰ４、またはＨ−１培地である。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳類からスピロプラズマを単離する方法及びそれを培養する方法を目的とする。
【背景技術】
【０００２】
感染性海綿状脳症（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ：ＴＳＥｓ）は、重度且つ致命的な神経学的徴候および症状を伴う脳の海綿状変性によって特徴づけられるヒトおよび動物の一群の疾患である。ＴＳＥｓには、以下の疾患が含まれる。 
・ヒト
ＣＪＤ  クロイツフェルト−ヤコブ病（及び、新しい異型であるＣＪＤ−ｎｖＣＪＤまたはｖＣＪＤ）
ＧＳＳ  ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー症候群
ＦＦＩ  致死性家族性不眠症
クールー
アルパース症候群（仮説）
・他の脊椎動物
ヒツジ、ヤギ、および小型反すう動物におけるスクレイピー
ウシにおける牛海綿状脳症（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＢＳＥ）
シカにおける慢性消耗病（ｃｈｒｏｎｉｃ  ｗａｓｔｉｎｇ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＷＤ）
ミンクにおける伝達性ミンク脳症（Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｍｉｎｋ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＴＭＥ）
ネコにおける猫海綿状脳症（Ｆｅｌｉｎｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ：ＦＳＥ）
ＢＳＥは、ウシの伝達性且つ神経変性の致命的脳疾患である。この疾患は４〜５年の長い潜伏期間を有し、そして発症から数週から数か月以内にウシを死に至らせる疾患である。ＢＳＥは、罹患動物から得られた牛肉を消費することによってヒトに感染するため、きわめて重要度が高い。ＢＳＥには、２００２年の終わりまでに英国経済において、国家経済全体の０．１〜０．２％に相当する３７億ポンド以上の総費用がかかったと推定された（Ｍｉｎｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｆｉｓｈｅｒｉｅｓ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ，"Ｔｈｅ  ＢＳＥ  Ｉｎｑｕｉｒｙ"，Ｖｏｌ．１０，（２０００））。国際獣疫事務局（国際動物流行病事務所）は、牛海綿状脳症診断の国際規格を提供している。国際獣疫事務局のＯＩＥ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｔｅｓｔｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｔｅｒｒｅｓｔｒｉａｌ  Ａｎｉｍａｌｓ，５ｔｈ  ｅｄ．，ｃｈａｐｔｅｒ  ２．３．１３（２００４）を参照。免疫組織化学試験はＢＳＥ診断における判断基準であると考えられており、試料が免疫組織化学に適していないときは、ＯＩＥの「ＳＡＦ」ウエスタンブロットが使用される。カナダ政府は、ＯＩＥに準拠した免疫組織化学およびＳＡＦウエスタンブロットＢＳＥ診断プロトコルに従っている。カナダ食品検査機関、ファクトシート：ＢＳＥ調査のためのカナダプロトコル（Ｃａｎａｄａ'ｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ＢＳＥ  Ｓｕｒｖｅｉｌｌａｎｃｅ）（２００５年８月）。同様に、米国では、ＯＩＥに準拠した免疫組織化学およびＳＡＦウエスタンブロット・プロトコルがＢＳＥの診断に用いられる。動植物検疫所、ファクトシート：ＢＳＥ確認試験（ＢＳＥ  Ｃｏｎｆｉｒｍａｔｏｒｙ  Ｔｅｓｔｓ）（２００５年６月）。
【０００３】
感染性海綿状脳症（ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ  ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ：ＴＳＥｓ）は、誤って折り畳まれたプリオンタンパク質ＰｒＰｒｅｓによって生じることが広く認められている。この仮説の証拠は、主に、疾患への罹病性におけるＰｒＰの重要性およびＴＳＥとＰｒＰｒｅｓとの関連に基づいている（Ｐｒｕｉｓｎｅｒ  ＳＢ．（１９８２）Ｎｏｖｅｌ  ｐｒｏｔｅｉｎａｃｅｏｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｃａｕｓｅ  ｓｃｒａｐｉｅ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１６（４５４２）１３６−１４４）。それにもかかわらず、感染性ＰｒＰｒｅｓタンパク質の仮説だけによっては説明できない多くの観察報告がある。ＰｒＰの量と感染との相関は示されておらず、組換えＰｒＰは感染性ではない。
【０００４】
もう一つの仮説は、スピロプラズマが直接の病原因子である、もしくはスピロプラズマがＰｒＰのもう一つの折りたたみとそのプリオンの摘出とを誘発するというものである（Ｂａｓｔｉｏｎ，Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．Ｖｏ．６４，Ｎｏ．１０，８３３−８３８（２００５））。
【０００５】
スピロプラズマ属は、小さく、運動性で、細胞壁を持たない原核生物である（Ｔｕｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，"ｔｈｅ  Ｇｅｎｕｓ  Ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ，ｉｎ  ＴＨＥ  ＰＲＯＫＡＲＹＯＴＥＳ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ８９（１９８４））。スピロプラズマが細胞壁を欠いている理由は、それらが、長さが変化するらせん形、球状、塊状、および分岐らせん形を含む多型性の形態を有するからである。スピロプラズマの大きさは、直径５０〜２００ｎｍ、体長３〜１２μｍに及ぶ。螺旋は極性があり、平滑粘着末端および先細り（テーパー）末端をもつ。ストレス下では、極度の環境障害に影響されない胞子状の３０〜４０ｎｍの球状形態が優位である。
【０００６】
スピロプラズマの第一宿主は、昆虫および植物であり、有病率については７０パーセントの昆虫が感染していると推定されている（Ｔｕｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４）。今までのところ、スピロプラズマによって引き起こされたと立証された哺乳類の疾患は、齧歯動物における白内障および海綿状神経障害に限られている（Ｃｌａｒｋ，Ｊ．ｏｆ  Ｉｎｆｅｃ．Ｄｉｓ．Ｖｏｌ．１１４，Ｎｏ．５，４７６−４８７（１９６４）；Ｋｅｒｎ  Ｓ，Ｓｃｈｒｏｄｅｒ  Ｊ，Ｒｅｉｓｃｈｌ  Ｕ，Ｌｏｒｅｎｚ  Ｂ．（１９９８）Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ  ｉｎ  ａ  ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｂａｂｙ．９６ｔｈ  ＤＯＧ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｐ９７．）。
【０００７】
スピロプラズマのＴＳＥｓへの関与の証拠として、クロイツフェルト−ヤコブ病（Ｃｒｅｕｔｚｆｅｌｄｔ−Ｊａｋｏｂ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＣＪＤ）の脳生検における透過型電子顕微鏡によるスピロプラズマの形態学的識別、齧歯動物の新生児のスピロプラズマ接種によるインビボ海綿状脳症モデルの開発、スクレイピー抗血清がスピロプラズマのタンパク質と交差反応するという実証、およびＴＳＥ組織におけるスピロプラズマのリボソームＤＮＡの存在が挙げられる。
【０００８】
しかしながら現在まで、スピロプラズマは哺乳類の組織からうまく単離及び培養されていなかった。罹患動物の哺乳類の組織からスピロプラズマを単離及び培養できないということは、原因菌と疾病状態との相関を表す以下のコッホの仮説の調査を妨げた。
【０００９】
１．疾患のあらゆる症例において病原体が存在しなければならない。  
２．病原体は疾患を有する宿主から単離されなければならず、純粋培養によって成長しなければならない。  
３．病原体の純粋培養を健康な感受性宿主に接種したときに、特異的な疾患が再現されなければならない。  
４．病原体は、試験的に感染させた宿主から回収可能でなければならない。
【００１０】
哺乳類におけるスピロプラズマの単離の失敗は、これまで研究者を遠ざけ、ＴＳＥｓの原因菌の候補としてのスピロプラズマの調査を阻害してきた。本発明は、組織試料からスピロプラズマの良好な単離を提供し、続いて単離されたスピロプラズマから発生した培養物の確立を提供する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、以下の工程により、哺乳類からスピロプラズマを単離及び培養する方法を提供する。
哺乳類から組織試料を得る工程、
前記組織試料を孵化卵に接種する工程、
前記接種された卵由来の卵黄と培地とを混合する工程、
前記卵黄と混合した前記培地を約３２℃で４週間以上培養し、スピロプラズマ培養物を確立する、前記培養する工程。
【００１２】
他の実施形態において、本発明は、以下の工程により、ウシからスピロプラズマを単離及び培養する方法を目的とする。
ウシから組織試料を得る工程、
前記組織試料を孵化卵に接種する工程、
前記接種された卵由来の溶液と培地とを混合する工程、
前記卵由来の前記溶液と混合した前記培地を約３２℃で培養し、スピロプラズマ培養物を確立する、前記培養する工程。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明は哺乳類からスピロプラズマを単離し、その単離されたスピロプラズマを培養する方法を目的とする。
【００１４】
本発明はまず、ＴＳＥと診断された動物の組織からスピロプラズマを単離する。ＴＳＥの診断は、任意の適切な手段（例えばＯＩＥによって開発された牛海綿状脳症の診断のための国際基準）を用いて行われ得る。
【００１５】
この組織試料は動物のあらゆる種類の組織から得ても良く、とりわけ神経組織が好ましい。しかしながら、他の組織源（例えば筋肉または血液）を用いることもできる。
【００１６】
前記組織試料を得る被験哺乳類は任意の哺乳類でよいが、特に重要なのはウシまたはヒトの被験者からのスピロプラズマの単離である。
【００１７】
前記動物から得られる前記組織試料を、必要に応じて適切な培地において、任意の従来の手段を用いて均質化する。好ましい培地としては、Ｍ１Ｄ、ＳＰ４、またはＨ−１培地が挙げられる（Ｊｏｎｅｓ  ＡＬ，Ｗｉｔｃｏｍｂ  ＲＦ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＤＬ，Ｃｏａｎ  ＭＥ．（１９７７）Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ４７  ７３８−７４６．）。アンピシリンおよびポリミキシンＢ等の抗生物質、Ｌ−アルギニン等のアミノ酸、およびスフィンゴミエリンを任意選択で前記培地に補充してもよい（Ｈａｃｋｅｔｔ，Ｊ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３７  ５２５−５２７（１９８７））。その後、前記試料を遠心分離し、残屑を除去する。得られた上澄みをフィルタに通して更に精製する。
【００１８】
その後、得られた濾液ストックを順次希釈し、孵化卵に接種するために用いる。接種に用いる孵化卵は通常７〜１０日齢のものである。
【００１９】
その後、前記卵を３２〜３７℃で、好ましくは約３６℃で培養する。培養温度は、胚の生育速度を制御するために変化させてもよい。約６〜１０日間、好ましくは約８日間の時点で、前記卵から溶液を収集し、‐７０℃で保存してストックを準備する。
【００２０】
被接種卵溶液のストック調製を用いて、卵溶液ストックおよび培地の調製希釈液（例えば、１：２および１：１０希釈液）によって懸濁培養を開始する。
【００２１】
この培養物を通常は１ヵ月、好ましくは５または６週間以上、３２℃で培養して、例えば、ｐＨ指示薬であるフェノールレッドを使用した前記培地の酸性化によって観察する。前記培養物は、例えば暗視野顕微鏡法を使用して形態的に、また例えばＰＣＲを使用して遺伝的に、更に観察することができる。
【００２２】
一旦、前記培養物が対数期に到達したら、前記培養物を約２２０ｎｍの細孔径を有するミリポアフィルタによりろ過し、固形培地（例えば、Ｔｕｌｌｙ  ＪＧ，Ｗｈｉｔｃｏｍｂ  ＲＦ，Ｃｌａｒｋ  ＨＦ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＤＬ．（１９７７）Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｓ：ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９５  ８９２−８９４．に開示される固形培地）上に塗布し、そして嫌気的に孵化させる。培養後、単一コロニーを選択し、増殖のための新しい培養液に移した。
【００２３】
一旦、前記スピロプラズマを前記組織試料から単離すれば、そのスピロプラズマを更に特徴づけることができる。例えば、単離したスピロプラズマの形態は、最初に明視野、蛍光、暗視野、および／または電子顕微鏡観察法によって分析することができる。運動性は、顕微鏡観察法および経時的画像法を通じた視覚化によって測定することができる。染色プロトコルは、スピロプラズマの画像化用に開発されており、生物の視覚化を可能にする。大きさおよび形態を分析するために、薄切片の透過電子顕微鏡法またはネガティブ染色は、詳細な視覚化に必要である。
【００２４】
前記単離したスピロプラズマは、ＰＣＲ増幅法および塩基配列決定法を用いて、遺伝的に特徴づけることもできる。例えば、リボソーム遺伝子については、例えばＢＬＡＳＴ検索を用いて、塩基配列を決定し、且つ他の配列と比較し、前記単離したスピロプラズマを系統学的に分類しても良い。
本発明の例示的な実施形態
スピロプラズマの単離：
５００ｍｇの組織試料を、カナダ食品検査機関の基準に従って罹患しているとあらかじめ証明された３匹の罹患動物および３匹の健常な対照動物から単離した（ファクトシート：ＢＳＥ調査のためのカナダプロトコル（２００５年８月））。
【００２５】
使い捨てプラスチック製乳棒を使用し、１．５ｍｌのプラスチック製遠心分離管において、約１００ｍｇの試料を５００μｌのＭ１Ｄ培地（Ｊｏｎｅｓ  １９７７）（５００ユニット／ｍｌアンピシリン、５００ユニット／ｍｌポリミキシンＢ、１．９ｍｇ／ｍｌ  Ｌ−アルギニン、スフィンゴミエリン２５ｍｇ／Ｌを補充したもの）で均質化した。残屑を１０００ｇで１分間遠心分離して洗浄した。得られた上澄みを細孔径４５０ｎｍのフィルタを通して、更に精製した。得られた濾液ストックを孵化鶏卵への接種に用いた。
【００２６】
Ｍ１Ｄ培地の１：１０、１：１００、および１：１０００希釈を準備し、１００μｌを６個の７〜１０日齢孵化卵の卵黄袋（ｙｏｌｋ  ｓａｃｋ）に接種した。その後、前記卵を３６℃で培養し、８日間毎日明かりに照らして生存を確認する。８日目に、前記卵から溶液を収集し、‐７０℃で保存してストックを準備する。卵溶液と培地との１：２および１：１０希釈を準備してＭ１Ｄ懸濁培養を開始する。
【００２７】
その培養物を３２℃で培養し、またｐＨ指示薬であるフェノールレッドを用いた培地の酸性化により観察し、暗視野顕微鏡法およびＰＣＲ法により観察する。
【００２８】
対数期に入った培養物を、２２０ｎｍのミリポアフィルタでろ過して、固形培地（Ｔｕｌｌｙ  ＪＧ，Ｗｈｉｔｃｏｍｂ  ＲＦ，Ｃｌａｒｋ  ＨＦ，Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ  ＤＬ．（１９７７）Ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａｓ：ｃｕｌｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖｅｒｔｅｂｒａｔｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａ  ｎｅｗ  ｓｐｉｒｏｐｌａｓｍａ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９５  ８９２−８９４．）上に塗布し、嫌気的に培養する。培養の後に、単一コロニーを選択し、増殖のための新しい培養液に移す。
【００２９】
単離の確認のための特徴解析
一般的な生物学的特徴の分析。単離したスピロプラズマの形態について、まず、明視野、蛍光、暗視野、および／または電子顕微鏡観察法によって分析することができる。運動性については、顕微鏡観察法および経時的画像法を通じた視覚化によって測定することができる。染色プロトコルは、スピロプラズマの画像化用に開発されており、生物の視覚化を可能にする。大きさおよび形態を分析するために、薄切片の透過電子顕微鏡法またはネガティブ染色は、詳細な視覚化に必要である。
【００３０】
スピロプラズマＤＮＡの存在を確認するために増幅法および塩基配列決定法を用いることができる。ＢＳＥおよび対照動物からの白血球試料を、全血液の密度勾配遠心分離法によって得る。培養物からの試料を遠心分離によって沈殿させ、洗浄する。チオシアン酸グアニジンによってＤＮＡを抽出し、フェノールクロロホルム抽出によって精製する。配列については、Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）によって分析することができ、周知のスピロプラズマ配列との相同性に基づいて系統学的に分類することができる。
【国際調査報告】
2008539734.tif 000002
2008539734.tif 000003