(57)【要約】  本発明は、荷電高分子および粒子を膜を電場で用いることによる電気濾過で精製する時の選択性および生産性を向上させる方法に関する。前記電場と前記膜を透過する透過液の流量の間の比率を一定に保持する。
2008532753.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
荷電高分子および粒子を膜を電場で用いる電気濾過により精製する時の選択性および生産性を向上させる方法であって、上述した電場と前記膜を透過する透過液の流量の比率を一定に保持することを特徴とする方法。
【請求項２】
電場を５００から５０００Ｖ／ｍにすることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
濃縮液用チャンバと透過液用チャンバの間の透過液の流量を分離膜を透過する液体の流れが確保されるように調整することを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項４】
下記の物質：蛋白質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、多糖、ウイルス、ウイルス構成物質、細胞、細胞構成物質、鏡像異性体、ジアステレオマーの中の１種以上に処理を受けさせる前請求項記載の方法。
【請求項５】
蛋白質がモノクローナルもしくはポリクローナル抗体である前請求項記載の方法。
【請求項６】
膜の孔径が１から１０００ｎｍであることを特徴とする前請求項記載の方法。
【請求項７】
出発溶液の伝導率が２０から０．５ｍＳ／ｃｍであることを特徴とする前請求項記載の方法。
【請求項８】
用いる電解質が弱酸と弱塩基、弱酸と強塩基または強酸と弱塩基の組み合わせである前請求項のいずれか記載の方法。
【請求項９】
電解質の溶液に下記の物質：ホウ酸、燐酸、Ｎ−２−（アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−２−（アセトアミド）イミノジ酢酸、アラニン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、アンモニア、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、２，２−ビス（ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、酢酸、グリシン、グリシルグリシン、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸、ヒスチジン、イミダゾール、乳酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、２−モルホリノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、トリエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸の中の１種以上を含ませることを特徴とする前請求項のいずれか記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、荷電高分子および粒子を膜を電場で用いることによる電気濾過（ｅｌｅｃｔｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）で精製する時の選択性および生産性を向上させる方法に関する。上述した電場と前記膜を透過する透過液の流量の比率を一定に保持する。
【０００２】
膜電気泳動および電気濾過を予備分離技術として用いることは５０年代から調査されてきている。
【０００３】
両方法とも、分離用チャンバは互いに半透膜で分離されている。
【０００４】
膜電気泳動では、溶解しているイオンおよび分散している荷電粒子および凝集物の移行が電場内で起こるが、分離膜を透過する液体の流れは実質的に存在しない。そのような材料を輸送する推進力は電場である。
【０００５】
電気濾過の場合には、電場に加えて流体静力学的圧力差が分離用チャンバ間に作り出され、その結果として、その分離膜を透過する流体の流れが誘発される。従って、材料を輸送する推進力は、電場ばかりでなく分離用チャンバ間の圧力差である。
【０００６】
電気濾過はＢｉｅｒによっていわゆる「強制流動電気泳動」として１９５９年に初めて記述された（特許文献１）。それは酵母菌を濾過する時に起きる膜の遮断を軽減する目的で用いられたばかりでなくまた細胞およびアルブミンを血液から取り除く時にも用いられた。
【０００７】
２つの流れ（供給材料および透過液）を平行に流す膜電気泳動法が特許文献２に記述されている。その分離用チャンバ内の流速は非常に低い（＜０．０１ｃｍ／秒）。その結果として熱の放出および非乱流が相対的に劣り、それによって、望ましくない濃度の偏りがもたらされる。用いられた分離用膜は非選択的である。
【０００８】
電気濾過に関するさらなる出版物は非特許文献１である。これは、電気濾過を用いてＩｇＧをヒト血漿から分離することに関する。しかしながら、ＩｇＧを除去しておいた血漿をヒトに戻す必要があることから、操作を生理学的食塩水濃度で実施する様式が選択された。従って、脱塩を実施する時期は処理前でも処理中でもなくかつ操作は一定電流および一定圧力の様式で実施される。しかしながら、血漿は高い伝導率を示すことから、実現可能であるとしても生産性は低い。
【０００９】
電気濾過法は更に特許文献３でも調査された。特許文献３に記述されている選択性に関する電気濾過分離効率は蛋白質含有モデル溶液を用いた時の効率である。分離可能な生体分子は等電点の差が０．１の生体分子である。開示された例では、その方法を一定の電流で実施している。高度に希釈された供給材料溶液が透過液通路および電極室の中で示す伝導率は非常に低くかつ他の緩衝液が示すそれとほとんど同じであることから、供給材料溶液中の伝導率の変化はほとんど起こらない可能性がある。それらはモデル物質を用いた実験室規模の適用であり、実用には関係しない。それとは対照的に、実際には伝導率の変化が起こる。
【００１０】
いわゆる“高分子量を有する分子の電気透析（Ｅｌｅｃｔｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ  ｏｆ
ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｈａｖｉｎｇ  ａ  ｈｉｇｈ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ）”が特許文献２に説明されている。特許文献２には、透析の分離技術から始まって、
１種以上の分離膜を用いた可能な電池デザインそして希釈液および濃縮液用のいろいろなチャンバが記述されている。その膜は荷電していない膜およびイオン交換膜の両方であってもよい。その方法は膜を透過する透過液流れ無し（古典的な膜電気泳動）にか或は圧力による強制的な流れを伴わせて実施可能である（また以下に電気濾過としても記述する）。それは上述したデザインでか或は平行に位置する多数の通路を用いて実施可能であり、その結果として、その方法の膜領域、従って費用効果が向上するばかりでなく恐らくは多数の分離段階を連続的に実施することが可能になる。特許文献２には、ＢＳＡとヘモブロビンの分離が実施例に記述されている。その手順は一定の電圧および一定の圧力（６７ミリバールの膜透過圧力）で実施され、電圧は比較的高く（１６０Ｖ）かつ膜透過流量は比較的低い（０．１から０．２ｍ／秒）。そのようなパラメーター組み合わせを用いると、工業規模の時に熱の除去に対して問題が起こりかつ分離用膜の所で蛋白質の濃度が偏るであろう。
【００１１】
膜電気泳動およびいわゆるＧｒａｄｉｆｌｏｗ技術（特許文献６）を用いてマウスの腹膜水から抗体、特にモノクローナル抗体を精製することが特許文献５に記述されている。前記膜を通過する溶液のｐＨを前記抗体が帯電していない形態で存在しかつ荷電不純物が電気泳動的に除去されるように調整することが行われた。
【００１２】
抗体の精製、即ち不純物の除去をできるだけ完全に実施しようとする時には、実験を中断して多量の濃縮液を交換するか或は実験を２段階で実験してもよく、それに応じて、その溶液のｐＨ、膜の孔径および電場の方向を適合させることが行われる。そのような方法は２００Ｖの一定電圧で実施される。工業規模では結果として電場の強度が高くなることから、熱の除去に関して問題が生じかつ膜の所の濃度が偏りかつ蛋白質が変性を起こすであろう。
【００１３】
同様な方法が特許文献７に開示されている。この特許文献に示されている実験室のプラントが初めてスケールアップ可能なプラントである（１ｌの受け槽体積）。分離用チャンバ内の流速を５．２ｃｍ／秒にすることで充分に高い放熱を確保することができる。膜が固体／液体界面の所に電気的に荷電二重層を形成しており、イオンは前記膜の外側から水性媒体の中に向かって拡散する。従って、そのような多孔質膜を用いると電場内に電気浸透圧が誘発され、それによって、前記膜を正確に通過する液体の流れがもたらされる。そのような方法では、電気浸透流を補う目的で正確に注文に合わせた電気浸透圧を分離用膜の中の１つの上にかけている。そのように電気浸透流を補うと、結果として、電気泳動方法の生産性、特に選択性が有意に向上し得る。
【００１４】
その上、膜モジュールが特許文献８に記述されており、それを用いて好適には蛋白質の分離を膜電気泳動または電気濾過で実施することができる。それの利点は、密封されていてしっかりと連結されているデザインである点にあり、それによって、分離用通路内の膜透過流速が高くなり、デッドスペースが最小限になりかつ非常に小型であることが確保される。この特許文献８には、また、電気濾過用モジュールの基本的使用も記述されている。操作パラメーター、例えば静水圧および電場強度などを選択しかつ最適にすることは、この特許文献８の主題ではない。
【００１５】
抗体の精製は一般に特許文献９により詳細に説明されている特定の方法を用いて実施される。
【００１６】
精製段階は一定の数で存在し、それらは１つまたは他の組み合わせおよび順で用いられる。
【００１７】
そのような方法の鍵となる段階は、発酵媒体からの生成物の回収および濃縮である。そ
れは一般に限外濾過による濃縮および再緩衝化に続くアフィニティークロマトグラフィー段階から成る。後者は高い選択性を示しはするが、工業規模では数多くの欠点を有する。挙げられる例は下記である：
【００１８】
・  クロマトグラフィー用媒体が高価であること
・  処理（一般に追加的クロマトグラフィー段階）後に必要な毒性リガンド蛋白質Ａが洗い流される危険性があること
・  溶離液が示すｐＨが低く（＜３）、それによって、その媒体にその方法の次の段階を受けさせることができるようにさらなる再緩衝化段階が必要であること。
【００１９】
生成物を回収（捕捉）した後に一般にさらなるクロマトグラフィー段階が少なくとも２回実施される［精製およびポリッシング（ｐｏｌｉｓｈｉｎｇ）］。
【００２０】
このように、抗体精製に関して今日までに記述された方法は下記の如き数多くの欠点を有する：
【００２１】
古典的方法：
発酵に由来する蛋白質を通常に精製する時、少なくとも上述した数の工程段階を用いて実施される。そのように工程が複雑なことから、それに伴って費用が高くなるが、本発明に従う新規な方法を用いると費用を低くすることができる。
【００２２】
一般的電気泳動方法：
膜電気泳動および電気濾過は今日まで産業規模でも生産規模でも実施されていない。加うるに、大部分のケースで生理学的食塩水濃度の液体が示す伝導率よりも実質的に低い伝導率を示すモデル溶液、例えば細胞培養媒体のモデル溶液などが選択されていた。
【００２３】
電気濾過：
過去に実施された電気濾過の実験は一定電流または一定電圧のいずれかで行われた。そのような方法におけるバイオテクノロジー媒体および生成物溶液が示す伝導率は相対的に高いことから、電場内で高い可動性を達成、従って工程の高い生産性を達成するには、電気濾過中の伝導率を低くする必要がある。従って、そのような方法をいやしくも実験室規模以外およびモデル溶液を用いた方法以外の様式で実施することができるようにしようとする場合には下記を注目する必要がある：
【００２４】
生産性に加えて、選択性が電気濾過方法のさらなる目標パラメーターである。分離の選択性は、同様に、分離用膜を透過する材料の圧力推進輸送および供給材料用通路の中で蛋白質が示す移動速度に決定的に依存する。溶解しているイオンが電場の中で示す移動の方向は、圧力によって推進される材料輸送の方向と同じであるか或は反対方向のいずれかであり得る。ここに、所定方法におけるパラメーターである電圧および静水圧を操作することで目標パラメーターである生産性および選択性を最適にすることができる。そのような操作パラメーターを溶解している成分が示す物性（例えば等電点、モル質量、選択したｐＨにおける有効電荷）および媒体の物性（例えば伝導性）の関数として選択する。しかしながら、供給材料用通路内で媒体が示す伝導率が変化すると、操作パラメーターを一定にしながら最適な操作点を維持するのは不可能である。
【００２５】
分離用膜を用いてモノクローナル抗体を供給材料溶液の中に保持させながら二次的成分を除去しようとする時の問題を電気濾過方法の例として説明すべきであろう。モノクローナル抗体が負の電荷を持つように溶液のｐＨを選択する。ここで、モノクローナル抗体が電場内で示す移動速度が少なくとも媒体が膜を透過する透過液速度に相当しかつそれの方向が前記媒体の方向と逆になるように静水圧および電圧を選択する。そのような分離用膜
を用いて中性または正電荷を有する二次的成分を除去する。
【００２６】
細胞培養媒体が示す生理学的伝導率（約１０ｍＳ／ｃｍ）に相当する伝導率を有する溶液を透過液用チャンバで用いると、抗体が示す移動速度と分離用膜を透過する媒体が示す透過速度の最適な比率を実験過程全体に渡って維持することができる。従って、その実験過程全体に渡って選択率が一定して最適になる。しかしながら、伝導率が高くかつ放熱が限られていることから、達成可能であるとしても生産性は相対的に低い。
【００２７】
しかしながら、供給材料用通路内で細胞培養媒体に脱塩を受けさせる目的で伝導率が低い溶液を透過液用チャンバで用いると、実験過程中に前記媒体が供給材料用通路内で示す伝導率と透過液用通路のそれとが合致する。操作を一定電圧で実施すると、供給材料用通路内の電場強度が高くなることから抗体の移動速度が高くなる。しかしながら、静水圧を一定にして高い生産率を実現するのは困難であり得る。他方、実験の開始から高い静水圧を選択すると、高い生産性が達成される。しかしながら、そのような方法の選択性はその方法の開始時に低く、かつ抗体の収率が低下する。
【００２８】
【特許文献１】米国特許第３  ０７９  ３１８号
【特許文献２】米国特許第３  ９８９  ６１３号（Ｇｒｉｔｚｎｅｒ  １９７６）
【特許文献３】Ｐｅｒｒｙ他の米国特許第５  ０８７  ３３８号（１９９２）
【特許文献４】Ｌａｕｓｔｓｅｎの米国特許第５  ４３７  ７７４号（１９９３）
【特許文献５】表題が“Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”のＧｒａｄｉｐｏｒｅ社の特許出願ＷＯ  Ａ  ９９／６２９３７（１９９９）
【特許文献６】ＡＵ  Ａ  ６０１０４０
【特許文献７】ＤＥ  Ａ  １０２  ５３４  ８３（２００４）
【特許文献８】ＤＥ  Ａ  ０  ４０  ０７  ８４８，“Ｖｏｒｒｉｃｈｔｕｎｇ  ｕｎｄ  Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ  ｆｕｅｒ  ｄｉｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｌｅｋｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅ  ｕｎｄ  Ｅｌｅｋｔｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ［膜電気泳動および電気濾過用装置および方法］”
【特許文献９】米国特許第５  ４２９  ７４６号，Ｓｈａｄｌｅ  他“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”（１９９５）
【非特許文献１】Ｔｉｓｏｎの学位論文（１９８６），Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｃａｓｃａｄｅ  ｅｌｅｃｔｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
【発明の開示】
【００２９】
従って、本発明の目的は、荷電高分子を精製する方法を提供することにあり、ここでは、目標パラメーターである生産性および選択性が実験過程全体に渡って選択した最適さになるように前記操作パラメーターを適合させることができる。
【００３０】
電気濾過を用いて高分子が入っている媒体、特に蛋白質が入っている媒体、特に抗体が入っている発酵媒体に濃縮を受けさせそして前記発酵の上澄み液に存在する二次的成分を目標の蛋白質から分離する。
【００３１】
従って、本発明は、荷電高分子および粒子を膜を電場で用いることによる電気濾過で精製する方法に関し、本方法を用いることで、その過程全体における選択性および生産性を向上させる。
【００３２】
これを特に適合させた方法を用いて達成するが、この方法は、透過液流量と電場強度の比率が一定になるように進行させることを特徴とする。
【００３３】
この目的で、好適には、本方法を一定の電流で実施するか、或は実験の過程で特定の電
流プロファイルを指定するか、或は電流を供給材料媒体の伝導率の関数として調節する。
【００３４】
別法として、本方法を供給材料用通路を基にして一定の電場強度で実施してもよいか、或は供給材料用通路に関して特定の電場強度プロファイルを指定するか、或は電場強度または電場チャネル（ｆｉｅｌｄ  ｃｈａｎｎｅｌ）を供給材料媒体の伝導率の関数として調節する。
【００３５】
分離膜を透過する透過液の流量を電場強度と透過液流量の最適な一定の比率が達成されるように調節する。
【００３６】
生理学的食塩水濃度の溶液、即ち伝導率が相対的に高い溶液から生成物を精製する必要がある時には、供給材料用通路内の電場強度と透過液の流量の両方を同時に適合させ、特に高くし、好適には供給材料用通路内の伝導率を脱塩によって低くする過程で高くすることで、両方のパラメーターが常に互いに一定の比率になるようにする。
【００３７】
電場Ｅは一般に
【００３８】
【数１】
2008532753.tif 000003
【００３９】
として記述され、ここで、
Ｕはかけられた電圧であり、そしてｄは電極の間隔である。
【００４０】
供給材料用通路内の電場強度を計算する時に下記の式を用いる：
【００４１】
【数２】
2008532753.tif 000004
【００４２】
ここで、伝導率はＣでありそして電流はＩである。
【００４３】
その結果として供給材料用通路内の電場は下記である：
【００４４】
【数３】
2008532753.tif 000005
【００４５】
供給材料媒体の伝導率をフロー電池で測定する。かける電流を計算して適切に設定してもよい。この調節を自動装置および外部制御可能電力装置を用いて実施する。
【００４６】
透過液流量をこれと供給材料用通路内の電場強度の比率が一定になるように保持する。透過液流量の調節は例えば受け槽にかける圧力でか或は供給材料用通路および透過液用通路内の容積率を適切に調整することで実施可能である。
【００４７】
上述したように供給材料用通路内の電場強度と膜を透過する透過液の流量を合致させることを実験室プラントで実現した。
【００４８】
電気濾過を供給材料用通路内の電場強度と透過液流量の比率が一定になるように実施し
かつ操作パラメーターを最適にすることによって、驚くべきことに、高分子を精製する時の生産性および選択性を向上させることができた。
【００４９】
荷電高分子および粒子を膜を電場で用いることによる電気濾過で精製する本発明に従う方法を、上述した供給材料用通路内の電場と前記膜を透過する透過液の流量の比率が例えば自動化した監視などによって一定に保持されるように実施する。
【００５０】
その電場は５００から５０００Ｖ／ｍ、好適には１０００から２０００Ｖ／ｍであると思われる。その電場強度の調整を発生する電場が荷電分子が供給材料用通路から除去されるように移動して適切な時間内に透過液用通路の中に入ると同時に反対の電荷を有する分子はそのまま、従って供給材料用通路内に保持されるに充分な電場であるように実施すべきである。適切な電場強度を電気濾過の予備実験で決定すべきである。その場合の適切は、荷電高分子、特に生体分子が変性を起こさないように条件を上述した条件にすることばかりでなくまた温度を０から４０℃、特に６から２５℃に保持することを意味する。
【００５１】
透過液流量は５から１００、好適には１０から３０  ｌ／（ｈ＊ｍ2）である。
【００５２】
本方法を用いて下記の高分子、特に生体高分子物質の中の１種以上を処理することができる：蛋白質、ペプチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオチド、オリゴ糖、多糖、ウイルス、ウイルス構成物質、細胞、細胞構成物質、鏡像異性体、ジアステレオマー。
【００５３】
上述した生体高分子物質は蛋白質、特にモノクローナルまたはポリクローナル抗体であってもよい。
【００５４】
使用する膜の孔径は１から１０００ｎｍ、好適には１０から５００ｎｍであり、これを好適には下記の材料の中の１種で構成させる：セルロースエステル、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリエーテル、ポリエーテルスルホン、ポリプロピレン、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、ポリフッ化ビニリデン、またはアルミナ、シリカ、酸化チタン、酸化ジルコニウムおよび上述した酸化物の混合セラミック。
【００５５】
いろいろな荷電高分子または粒子の混合物、好適には発酵の細胞培養上澄み液の混合物である出発溶液が示す伝導率は一般に２０ｍＳ／ｃｍから０．５ｍＳ／ｃｍ、特に１２から１．５ｍＳ／ｃｍである。
【００５６】
本方法の過程中に伝導率が好適には３から０．５ｍＳ／ｃｍにまで低下する。
【００５７】
本方法をまた連続運転方法として実施することも可能である。ここで、連続は、最初に多数の電気泳動モジュールをカスケードまたはクリスマスツリー構造に連結させることを実現し、この始動過程中にこの上により詳細に記述した操作パラメーターを時間の関数として変え、その後、空間、即ちいろいろな膜モジュール内の空間を変える。次に行う連続操作は、電気泳動モジュールの操作を透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に相当する連続取り出しおよび部分流れ供給を伴わせて実施することを意味する。始動過程中の操作パラメーターも同様に時間の関数として定常状態に到達するまで変える。
【００５８】
細胞培養上澄み液を直接用いることも可能ではあるが、好適には、精密濾過膜を用いた予備濾過で細胞残渣を除去しておく。
【００５９】
細胞培養上澄み液に濃縮を限外濾過を用いて受けさせてもよい。
【００６０】
供給材料、透過液および電極洗浄循環で用いる電解質を弱酸と弱塩基、弱酸と強塩基ま
たは強酸と弱塩基の組み合わせで構成させる。
【００６１】
その電解質の溶液に好適には下記の物質：ホウ酸、燐酸、Ｎ−２−（アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−２−（アセトアミド）イミノジ酢酸、アラニン、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール、アンモニア、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、２，２−ビス（ヒドロキシエチル）イミノトリス（ヒドロキシメチル）メタン、２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸、酢酸、グリシン、グリシルグリシン、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）１−ピペラジニル］エタンスルホン酸、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸、ヒスチジン、イミダゾール、乳酸、２−モルホリノエタンスルホン酸、２−モルホリノプロパンスルホン酸、ピペラジン−１，４−ビス（２−エタンスルホン酸）、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］−２−アミノエタンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、トリエタノールアミン、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン、クエン酸の中の１種以上を入れる。
【００６２】
そのような緩衝系のｐＨを３から１１にする。
【００６３】
前記電解質の溶液は、電場による電荷輸送を可能にする特定のイオン負荷を与えかつ前記溶液中のｐＨを決めておいたｐＨに設定しかつ前記ｐＨを一定に保持するための緩衝系を与える水溶液である。
【００６４】
当該高分子が示す安定性を予備実験でそれらをいろいろな電解質溶液にいろいろな濃度、塩含有量および温度で入れて調製しかつ前記高分子、好適には生体分子が示す沈澱または凝集を観察することを通して測定しておくべきである。その観察を目で実施しかつクロマトグラフィー分析方法による蛋白質含有量測定で実施する。
【００６５】
本電気濾過方法の後に必要ならばさらなる膜電気泳動段階（この段階で高分子を更に精製する）をいろいろな工程条件、例えばｐＨを変えることなどで実施してもよい。
【００６６】
本方法を、また、電場をかけないで脱塩および濃縮を行った後に電気濾過を行う段階の組み合わせとして実施することも可能である。両方の段階を同じ膜モジュールを用いて同じプラント内で実施してもよい。
【００６７】
本方法を、また、ある程度の脱塩または再緩衝化を行う目的で膜電気泳動を行った後に荷電高分子を分離する目的で電気濾過を行う組み合わせとして実施することも可能である。
【００６８】
記述した変法は全部バッチ手順、即ち不連続および供給と取り出し手順、即ち連続の両方で実施可能である。
【００６９】
記述した変法は全部生体分子、特に蛋白質、非常に特別には抗体を精製する時の工程を強化する目的で使用可能である。
【００７０】
本発明を以下に本図および実施例を言及することでより詳細に説明または例示するが、しかしながら、それらは本発明を限定するものでない。
【実施例】
【００７１】
以下に記述する実施例で用いるプラント（図１）には各々濃縮液１、透過液２および電極緩衝液３用の熱安定性受け槽が含まれている。溶液をポンプ４、５、６で前方流ライン
２２、２４、２６そして戻りライン２３、２５、２７に通して再循環させそして電気泳動分離モジュール７の中に通して流す。膜を透過する透過液の流量を調整する目的で濃縮液用チャンバの気体空間部の中にライン１２から来る窒素で圧力をかけるが、これを、下流の圧力制御装置８を用いて実施する。その下流の圧力制御装置を同様にレベルプローブ（ｌｅｖｅｌ  ｐｒｏｂｅ）１０で調節する。
【００７２】
この電気濾過プラントには、各場合とも平行に位置する４個の濃縮液用チャンバ１６ａ−ｄおよび透過液用チャンバ１７ａ−ｄを有するモジュール７ａが含まれている（図２を参照）。濃縮液用チャンバ１６および透過液用チャンバ１７に液体分配装置２８、２９を通って来た平行な流れが入り込み、そしてそれらは制限膜１４および分離用膜１５で囲まれている。ここで、濃縮液用チャンバおよび透過液用チャンバの中に網または織り布（示していないが、これらは膜間のスペーサーとして働きかつ邪魔板としても働く）を装備しておいてもよい。電極チャンバ１８、２１に平行な流れが入り込み、そしてそれらは制限膜１４で囲まれている。電極１９、２０を用いて電場を生じさせる。電場を図２に示す如くにか或は反対の方向に生じさせてもよい。その電場を濃縮液供給用ライン２２の中の伝導率９を外部の自動装置の所で測定することで調節し、かつ電力装置１１で設定する。前記膜を透過する透過液の流量を、上流に実際にかけた電場を計算し、同様に濃縮液供給ライン２２内の伝導率９を測定しかつ各時点で到達する実際の電場強度と必要な電場強度の比率を計算しそしてこの比率を外部の自動装置で透過液の透過速度に適用することで適合させる。
【００７３】
実施例：
図１に示したプラントおよび図２に概略を示したモジュール７ａを用いてモノクローナル抗体の分離および濃縮を実施した。発酵後に限外濾過（膜の孔径が２μｍ）を用いて生成物が入っている細胞培養媒体を細胞および細胞部分から分離した。前記抗体はハイブリドーマ細胞が発現するＩｇＧ型であり、それの発酵を０．８Ｌの撹拌型生物反応槽内で実施した。その抗体が示した等電点は６．５で大きさは１５０ｋＤであった。
【００７４】
モジュール７ａは、有効膜面積が膜層当たり４８ｃｍ2になるように我々自身が開発したモジュールであり、これを特許出願ＤＥ  Ａ  ０  ４０  ０７  ８４８，Ｖｏｒｒｉｃｈｔｕｎｇ  ｕｎｄ  Ｖｅｒｆａｈｒｅｎ  ｆｕｅｒ  ｄｉｅ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｌｅｋｔｒｏｐｈｏｒｅｓｅ  ｕｎｄ  Ｅｌｅｋｔｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ［膜電気泳動および電気濾過用の装置および方法］により詳細に記述する。
【００７５】
モジュール７ａには、少なくとも１個の１番目の保持板、電極が入っている１番目の電極チャンバ、少なくとも１個の入り口および出口用各々のチャンバ、電極が入っている２番目の電極チャンバおよび２番目の保持板が含まれており、前記チャンバは互いにある大きさに切断しておいたシート様膜断片で分離されており、そして密に連結したモジュールが生じるように少なくとも前記膜は縁領域が密封用枠で結合しており、そしてその密封用枠には供給材料用通路および液体除去用通路が備わっていて、それらはそこから離れて選択したチャンバにつながっており、そして連結用通路は、少なくとも１個の保持板の中に存在する前記密封用枠の中の個々の通路に相当する。
【００７６】
ＴＲＩＳ／クエン酸緩衝液（３４．４ｍＭのＴＲＩＳおよび７．５ｍＭのクエン酸，ｐＨ８．０，伝導率１．５３ｍＳ／ｃｍ）を用いた。透過液用受け槽２に緩衝液を１０００ｍｌ充填し、そして電極洗浄用溶液の受け槽３にも同様に緩衝液を１０００ｍｌ充填した。濃縮液用受け槽には細胞培養上澄み液（ｐＨ８）を１５００ｍｌ充填した。
【００７７】
実験を６から１０℃の温度で実施した。
【００７８】
分離用モジュールに名目上のカットオフが１０ｋＤａの制限膜１４および名目上のカットオフが３００ｋＤａの分離膜１５を装備する。
【００７９】
実験を負電位を濃縮液側の電極２０にかけて電場強度を最大値である１５００Ｖ／ｍにまで高くしながら実施した。それと同時に、電場の強度と透過液の流量の比率が一定になるように透過液の流量を最大値である３０Ｌ／（ｈ＊ｍ2）にまで高くした。循環している濃縮液および透過液が示した体積流量は各場合とも３２０ｍＬ／分であり、これは膜透過流速が５．２ｃｍ／秒であることに相当し、そして電極内の循環体積流量は５５０ｍＬ／分であった。抗体の濃度を蛋白質Ａカラムを用いたＨＰＬＣで測定した。全蛋白質濃度の分析をＢＣＡ［ビシンチノニックアシッド（ｂｉｃｉｎｃｈｉｎｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）方法を用いかつ還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ゲルを調製することで二次的成分除去の尺度として実施した。
【００８０】
下記の実験を実施した：
電場を高くしかつそれに関係させて膜を透過する透過液の透過速度を高くした電気濾過。
【００８１】
表１に、この実施例の試験パラメーターおよび濃度曲線を含める。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
図３に、還元条件下のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。Ｕ２からＵ１２は実験中のいろいろな時間における上流サンプルである。
【００８４】
二次的成分が除去されると、結果として、２４０分後の濃縮液の濃縮係数が８．６で抗体収率が０．７４の時の質量が基になった除去分率（ｄｅｐｌｅｔｅｄ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）は０．８９である。
【００８５】
従って、実施例２の過程全体に渡る選択率は７．３であり、
ｍ／ｍ０（ＨＳＡ）：濃縮液中のＨＳＡの質量が基になった残存分率      ［−］
ｍ／ｍ０（ＩｇＧ）：濃縮液中のＩｇＧの質量が基になった残存分率      ［−］
【００８６】
【数４】
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【００８７】
である。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】図１に、電場の自動調節が備わっている電気濾過プラントおよび透過液の流量を調節する働きをする圧力制御装置の図を示す。
【図２】図２に、多通路デザインの膜モジュールの図を示す。
【図３】図３に、例えば還元条件下などのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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