(57)【要約】  本発明は、単離した前駆細胞から分化した内皮細胞および平滑筋細胞を播種したマトリックスを、予備調整することにより人工心臓弁を調製する方法を対象とする。これらの細胞を播種したマトリックスは、心臓を通る血流を模する流体条件に暴露されて、自然な心臓弁に類似する組織を工作した心臓弁が製造される。
2008532653.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
前駆細胞から分化した内皮細胞群を得；
心臓弁形を有するマトリックスに、細胞がマトリックスに付着して内皮細胞層を形成するように内皮細胞を播種し；
前駆細胞から分化した平滑筋細胞群を得；
平滑筋細胞が内皮細胞層に連結する平滑筋細胞層を形成するように、平滑筋細胞を内皮細胞層上に沈着させ；
播種されたマトリックスを、予備調整する小室中の第取付け要素に取り付け、ここで取付け要素は、流体流系に流動的につながれたチャンネルを有し；そして
生物学的流体が播種されたマトリックスを通って移動する流系で播種されたマトリックスを予備調整し、ここで生物学的流体の流速および脈拍数は、予備調整された心臓弁が引き起こすように制御される、
ことを含んでなる予備調整された心臓弁の製造法。
【請求項２】
生体適合性マトリックスが脱細胞化マトリックス、エレクトロスピンされたマトリックスおよび合成ポリマーマトリックスからなる群から選択される請求項１に記載の方法。
【請求項３】
予備調整する小室が心臓弁リーフレットを取り付けるために適する寸法を有する容器である請求項１に記載の方法。
【請求項４】
マトリックスを予備調整する工程が、生物学的流体を、閉鎖された一方向の流体流系に取り付けられたマトリックスの内側表面を通して運ぶことを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項５】
マトリックスを予備調整する工程が、生物学的流体を、取り付けられたマトリックスの内側表面を通して連続流として運ぶことを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項６】
連続流が約１ダイン／ｃｍ２〜約３０ダイン／ｃｍ２の範囲の壁体剪断応力を誘導するように経時的に増やされる流速を有する請求項５に記載の方法。
【請求項７】
マトリックスを予備調整する工程が、生物学的流体を、取り付けられたマトリックスの内側表面を通してパルス流として運ぶことを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項８】
パルス流が、約１０ダイン／ｃｍ２〜約４５ダイン／ｃｍ２の範囲の壁体剪断応力を誘導するように経時的に増やされる脈拍数を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
パルス流が、約６０〜約２００ｍＨｇの範囲の壁体圧分布を誘導するように経時的に増やされる脈拍数を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
生物学的流体が、播種された管状マトリックスを通ってポンプにより運ばれる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
生物学的流体が、血液と等価な組成および粘度を有する請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
生物学的流体が、培養基、バッファー媒質および生理学的媒質からなる群から選択される請求項１に記載方法。
【請求項１３】
管状マトリックスの外側表面が生理学的流体に暴露されるように、ある容量の生物学的流体を予備調整する小室にさらに加えることを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
マトリックスが、少なくとも１つの天然成分および少なくとも１つの合成ポリマー成分およびナノ粒子に結合した治療薬を含んでなるエレクトロスピンされたマトリックスである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
天然成分がコラーゲンであり、そして合成ポリマー成分がポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（ＰＬＧＡ）である請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらにエラスチンを含んでなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
治療薬がヘパリンであり、そしてナノ粒子が量子ドットである請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
ヘパリンおよび量子ドットがポリマーにカプセル化されている請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ナノ粒子からのヘパリンの放出が、約７００ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲の波長の放射の適用により制御される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
加熱がポリマーの超構造を改変するように、ナノ粒子を加熱することによりナノ粒子からヘパリンが局所的に放出される請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ナノスパンマトリックスがさらに画像強化剤を含んでなる請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
画像強化剤がガドリニウムである請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
内皮細胞がヒトの伏在静脈から単離される請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
内皮細胞が末梢血または骨髄から単離された前駆細胞から誘導される請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前駆細胞から分化した内皮細胞群を播種した心臓弁形を有する生体適合性マトリックス、ここで内皮細胞がマトリックスに付着して内皮細胞層を形成し；
内皮細胞層上に播種した前駆細胞から分化した平滑筋細胞群、ここで平滑筋細胞は内皮細胞層に付着する平滑筋細胞層を形成し；そして
播種された細胞は、心臓を通る正常な血流と等価の流速および脈拍数で播種されたマトリックスを通って通過する生物学的流体に播種された細胞を暴露する予備調整する小室中で予備調整されている、
を含んでなる予備調整され組織を工作した心臓弁。
【請求項２６】
生体適合性マトリックスが脱細胞化マトリックス、エレクトロスピンされたマトリックスおよび合成ポリマーマトリックスからなる群から選択される請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
生体適合性マトリックスが脱細胞化心臓弁である請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年３月１１日に出願された特許文献１、および２００５年６月１日に出願された特許文献２の優先権を主張し、両出願の内容は引用により全部、本明細書に編入する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本発明の技術分野は、組織が工作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）心臓弁に関する。心臓弁代用物は、ドナーの組織の供給が不十分であることから限られている。機械的な心臓弁および生体人工器官（ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｔｉｃ）の弁のように、数種の弁が心臓移植に使用されてきた。生体人工器官の弁は、多くは他の種から得られたものであり、そして異種移植片として知られている。ブタの弁が最も多い異種移植片である。
【０００３】
機械的な心臓弁とは異なり、生体人工器官の弁は自然なトリリーフレット構造を有し、そしてヒトの弁に類似する流れの特性を有するべきである。しかし弁の細胞成分に対する免疫応答を防止するために、異種移植片組織はグルタルアルデヒドのような化学的架橋結合剤で処理される。この取り組みはこれら移植片の急性の拒絶を成功裏に制限するが、重大な制限がある。例えばリーフレットの柔軟性が拘束され（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅｄ）、リーフレットの曲げの堅さ（ｓｔｉｆｆｉｎｅｓｓ）が有意に上がる。またグルタルアルデヒド固定は、リーフレットおよび大動脈導管のカルシウム沈着の発生および程度を上げる。これらの因子は組み合わさって生体人工器官の弁の恒久性を下げ、そして自然な弁よりも失敗し易くする。
【０００４】
代用心臓弁の別の主要な問題は、一般に血液凝固の形成および血栓症の危険性である。血栓症は弁の機械的な流体流特性を変え、そしてその機能性を下げ、ならびに患者に心不全の危険性を上げる。
【０００５】
したがって自然な心臓弁と類似する機能性を有するが、心臓弁に存在する悪影響が無い改善された代用心臓弁の必要性が存在する。
【参考文献】
【０００６】
【特許文献１】米国特許仮出願第６０／６６０，８３２号明細書
【特許文献２】米国特許仮出願第６０／６８６，３１６号明細書
【発明の開示】
【０００７】
発明の要約
本発明は、組織を工作した心臓弁を調製するための方法および組成物を提供する。組織を工作した弁は、生育可能な細胞成分を有し、患者自身の心臓組織と表現型的に適合性がある。代用弁は内皮細胞および平滑筋細胞のような筋肉細胞から生産される。弁表面の内皮細胞の覆いは、血栓症形成の発生を防止する。本発明では、循環している前駆細胞が管の疾患を有する患者の末梢血から単離され得る。これらの単離された前駆細胞は、マトリックスを播種するために使用することができる内皮および筋肉細胞に成長させ、そして分化させることができる。これらの細胞を播種したマトリックスは心臓を通る血流を模する流体条件に暴露され、予備調整されて自然な心臓弁に類似する組織が工作された心臓弁を生じることができる。このように工作された弁はそれらが自然に有する以上の柔軟性を保持し、すなわちその生体内の相対物のようにより効率的に機能するように設計することができる。
【０００８】
これらの心臓弁は、循環している前駆細胞から誘導された内皮細胞および筋肉細胞を播種したエレクトロスピンされたマトリックスまたは脱細胞化マトリックスから作成することができる。これらの播種されたマトリックスは血液成分、流速および脈拍数、ならびに自然な心臓弁の開閉機能を模する生理学的な流体条件下で予備調整されることができる。この方法には、播種されるマトリックスを中に配置することができる予備調整する小室を使用することが関与する。次いで播種されたマトリックスは、生物学的流体が閉鎖ループ系で播種されたマトリックスを通って流れる、変動する流体流パラメーターに供することができる。生物学的流体は血液および血漿のコンシステンシーを有するように設計される。流体流の条件下でマトリックス上の組織層の連続した成長および分化は、自然な生体内の心臓弁として機能する組織を工作した心臓弁の形成を生じることができる。マトリックスは治療薬の制御放出のためにナノ粒子および治療薬とカップリングされることができ、かつ／または生体内で組織およびスカフォールドの改造をモニタリングするための画像強化剤とカップリングされることができる。
【０００９】
したがって１つの観点では、本発明は前駆細胞から分化した内皮細胞群を播種した生体適合性マトリックスを提供することにより、予備調整された心臓弁を生産する方法に関する。播種されたマトリックスは内皮細胞がマトリックスに付着し、そして内皮細胞層を形成するまで培養されることができる。次いで前駆細胞から分化した平滑筋細胞群が内皮細胞層上に沈着し、そして平滑筋細胞が形成され、そして内皮細胞層に付着するまで培養することができる。次いで播種されたマトリックスは、予備調整する小室中の取り付け要素に取り付けられることができる。取り付け要素は流体流系に流動的につながったチャンネルを含んでなる。次いで播種されたマトリックスは、生物学的流体が生理学的条件下で播種されたマトリックスを通って移動する流系に暴露されることにより予備調整する小室中で予備調整されることができる。予備調整された心臓弁は、心臓弁を通る生物学的流体の流速および脈拍数を制御することより製造されることができる。
【００１０】
別の観点では、本発明は前駆細胞から分化した内皮細胞群を播種された心臓弁形を有する生体適合性マトリックスを含んでなる予備調整し、組織を工作された心臓弁に関する。これらの内皮細胞はマトリックスに付着し、そして培養されて内皮細胞層を形成する。また心臓弁は内皮細胞層上に播種され、そして平滑筋細胞が内皮細胞層に付着した平滑筋細胞層を形成するように培養された前駆細胞から分化した平滑筋細胞群も含んでなる。播種された細胞は、心臓を通って流れる正常な血流に等価の流速および脈拍数で、播種されたマトリックスを介して通過することができる生物学的流体に播種された細胞を暴露することができる予備調整する小室中で予備調整され得る。
【００１１】
生体適合性マトリックスは脱細胞化マトリックス、エレクトロスピンされたマトリックスおよび合成ポリマーマトリックスであることができる。好適な態様では、生体適合性マトリックスは脱細胞化心臓弁である。内皮細胞は例えばヒトの伏在静脈から単離されることができ、または末梢血もしくは骨髄から単離された前駆細胞から誘導され得る。予備調整する小室はマトリックスの長さを取り付けるために適する寸法を有する容器である。例えば取り付け要素を加えることができる各末端に穴を有する長方形の箱の形状。取り付け要素は、生物学的流体が、閉じたループの流体流系で予備調整する小室の一端から播種されたマトリックスを介して通り、そして小室のもう一端から出るように、開放形状（ｏｐｅｎ  ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ）で播種されたマトリックスの末端を保持する。
【００１２】
マトリックスを予備調整する工程には、生物学的流体を、閉じた流体流系に取り付けられたマトリックスの内側表面を通して運ぶことを含むことができる。これにより播種されたマトリックスの内側表側が流体流に対して予備調整されるようになることを可能とし、そして播種された細胞が自然な血管中にあるような流体流条件下で発育できるようになる。予備調整する工程には、生物学的流体を、例えば約１ダイン／ｃｍ２〜約３０ダイン／ｃｍ２の範囲の壁体剪断応力（ｗａｌｌ  ｓｈｅａｒ）を誘導するように経時的に増やすことができる流速で、取り付けられたマトリックスの内側表面を通して連続流として運ぶことを含む。またマトリックスを予備調整する工程には、生物学的流体を、約１０ダイン／ｃｍ２〜約４５ダイン／ｃｍ２の範囲の壁体剪断応力を誘導するように経時的に増やされる脈拍数を有するパルス流として、取り付けられたマトリックスの内側表面を通してパルス流として運ぶことを含むことができる。脈拍数は、工作された血管に約６０〜約２００ｍｍＨｇの範囲の壁体圧分布を誘導するように経時的に増やすことができる。
【００１３】
生物学的流体は、機械的ポンプのようなポンプにより、播種されたマトリックスを通って移動することができる。生物学的流体は、播種したマトリックスの管腔を通って容易に移動することができるものである。流体の例には限定するわけではないが、培養基、バッファー媒質および生理学的媒質を含む。生物学的流体の組成および粘度は、血液と等価となるように改変することができる。これは４０％の１００ｋＤａデキストランのような高分子量タンパク質を培養基、バッファー媒質および生理学的媒質に加えることにより達成することができる。
【００１４】
また予備調整する工程には、内皮細胞群と同じか、または異なることができる別の細胞群を外側マトリックスに播種し、そして外側の播種したマトリックスを生理学的流体に暴露することによりマトリックスの外側を予備調整することも含むことができる。これはマトリックスの外側表面が生物学的流体に暴露されるように、ある容量の生物学的流体を予備調整する小室に加えることにより行うことができる。１つの態様では、弁の播種したリーフレットの内側を予備調整するために使用する生物学的流体は、弁の外側を予備調整するために使用する生物学的流体と同じである。別の態様では、管の内側を予備調整するために使用する生物学的流体は、管の外側を予備調整するために使用する生物学的流体とは異なる。例えばマトリックス（管腔側）の内側に内皮細胞を播種し、そして内皮細胞の成長および増殖に最適な生物学的流体で予備調整することができ、一方、マトリックスの外側に平滑筋細胞を播種し、そして平滑筋細胞の成長および増殖に最適な生物学的流体で予備調整することができる。流体流のパラメーターを別個に制御して、播種したマトリックスの内側および外側に最適な予備調整を提供することができると認識されだろう。
【００１５】
別の態様では、マトリックスは少なくとも１つの天然成分および少なくとも１つの合成ポリマー成分およびナノ粒子にカップリングした治療薬を含んでなるエレクトロスピンされたマトリックスであることができる。天然成分がコラーゲンであり、そして合成ポリマー成分がポリ（ラクチド−コ−グリコライド）（ＰＬＧＡ）であることができる。エレクトロスピンされたマトリックスはさらにエラスチンを含んでなることができる。治療薬がヘパリンであり、そしてナノ粒子が量子ドットであることができる。ヘパリンおよび量子ドットがポリマーにカプセル化されることができ、そしてナノ粒子からのヘパリンの放出は、約７００ｎｍ〜約１０００ｎｍの範囲の波長の照射の適用により局所的に制御され得る。ヘパリンは、加熱がポリマーの超構造を改変してヘパリンを放出するように、ナノ粒子を加熱することによりナノ粒子から局所的に放出され得る。別の態様では、ナノスピンされたマトリックスがさらにガドリニウムのような画像強化剤を含んでなることができる。
【００１６】
詳細な説明
本発明をより容易に理解できるように、特定の用語を最初に定義する。
【００１７】
本明細書で使用する用語「付着」または「付着する」とは、基質に直接的または間接的に付着する細胞、ならびに他の細胞に付着する細胞を指す。
【００１８】
本明細書で使用する句「生体適合性基質」とは、個体への移植に適する、その上へ細胞群が沈着できる物質を指す。生体適合性基質はいったん個体に移植されると毒性または傷害効果を引き起こさない。１つの態様では、生体適合性基質は修復または置き換えを必要とする所望の構造に形成することができる表面を持つポリマーである。またこのポリマーは修復または置き換えを必要とする構造の一部として形成することもできる。生体適合性基質はそれに細胞を付着し、そしてその上で成長することを可能とする支持的な枠組を提供する。次いで培養した細胞群を生体適合性基質上で成長させることができ、基質は細胞−細胞相互作用に必要な適切な間隙距離を提供する。
【００１９】
本明細書で使用する用語「個体」は、免疫応答が誘導される生きている生物を含むことを意図する。好適な個体は哺乳動物である。個体の例には限定するわけではないが、ヒト、サル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジを含む。
【００２０】
本明細書で使用する用語「脱細胞化された」または「脱細胞化」とは、細胞および組織の内容物が除去された生体構造（例えば、臓器または臓器の一部）を指し、完全な無細胞のインフラ構造を後に残す。腎臓のような臓器は種々の特殊化された組織からなる。この臓器の特殊化された組織構造または実質は、臓器に関係する特異的機能を提供する。臓器を支持する繊維状ネットワークは基質（ｓｔｒｏｍａ）である。ほとんどの臓器は特殊化された組織を支持する非特殊化連結組織からなる基質のネットワークを有する。脱細胞化のプロセスは特殊化された組織を取り除き、後に複雑な３次元の連結組織ネットワークを残す。連結組織のインフラ構造は、主にコラーゲンからなる。脱細胞化された構造は、その上で種々の細胞群が浸出できる生体適合性基質を提供する。脱細胞化された生体構造は剛性（ｒｉｇｉｄ）または半剛性であることができ、それらの形状を改変する能力を有する。本発明に有用な脱細胞化された臓器の例には、限定するわけではないが心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿道および尿道を含む。
【００２１】
本明細書で使用する句「３次元スカフォールド」とは、天然の生体構造、例えば臓器が脱細胞化された時、形成された残りのインフラ構造を指す。この複雑な３次元のスカフォールドは、細胞がそれに付き、そしてその上で成長できるようにする支持的な枠組を提供する。次いで培養された細胞群は、３次元スカフォールド上で成長でき、これが細胞−細胞相互作用に必要な正確な間隙距離を提供する。これは自然な生体内臓器に似ている再構築臓器を提供する。この３次元スカフォールドは、培養した細胞群、例えば内皮細胞を潅流することができ、これが成長し、そして発育して少なくとも１つのさらに培養した細胞群の成長および発育を支持することができる内皮組織層を提供する。
【００２２】
本明細書で使用する用語「自然な生体構造」とは、個体、例えば限定するわけではないが心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿道および尿道を含む臓器内に見いだされる生物学的配置を指す。また用語「自然な生体構造」とは生体構造の一部（例えば臓器の一部の例は腎臓の腎臓動脈）も含むことを意図している。
【００２３】
本明細書で使用する用語「エレクトロスピニング」または「エレクトロスピンされた」は、電場の存在下で物質が流され、噴霧され、スパッターされ、滴下されまたはそうではなく輸送される任意の方法を指す。エレクトロスピンされる物質は接地した標的に向けて荷電した容器の方向から、または接地した容器から荷電した標的の方向へ沈着することができる。特に用語「エレクトロスピニング」は、繊維が少なくとも１つの天然の生物学的物質、少なくとも１つの合成ポリマー物質またはそれらの組み合わせを含んでなる荷電した溶液から、接地した標的に向けられた開口または口を介して電気的に荷電した溶液を流すことにより形成される工程を意味する。
【００２４】
天然の生物学的物質は、哺乳動物、植物または他の生物のボディに自然に見いだされる任意の物質を含む自然に存在する有機物質であることができる。合成のポリマー性物質は人工的な合成、処理または製造法を通して調製される任意の物質であることができる。好ましくは合成物質は生物学的に適合性のある物質である。また天然または合成物質は、電場の下で荷電することができるものである。
【００２５】
用語「溶液」および「流体」は、エレクトロスピンされたマトリックスを製造する内容で使用され、そして荷電させることができ、そして少なくとも１つの天然物質、少なくとも１つの合成物質またはその組み合わせを含んでなる液体を記載する。好適な態様では、流体は少なくとも１つの種類のコラーゲン、少なくとも１つの種類のエラスチンのようなさらなる天然物質、および少なくとも１つの合成ポリマー、例えばポリ−Ｌ−グリコール酸（ＰＬＧＡ）を含んでなる。
【００２６】
本明細書で使用する用語「コ−ポリマー」とは、コ−ポリマー、ター−ポリマーおよびブロック、グラフまたはポリマー性成分の無作為な組み合わせにより形成される、より高次元の多重ポリマー組成を包含することを意図している。
【００２７】
用語「ナノ粒子」、「ナノ構造」および「量子ドット」は本明細書で互換的に使用して、１または数ナノメートルから数マイクロメートル、より好ましくは約１〜約１０００ナノメートルの次元の寸法を有する物質を記載する。
【００２８】
本明細書で使用する用語「予備調整する小室」とは、マトリックス上の細胞が生理学的条件下で発育するように、細胞を播種したマトリックスを調整できるようする容器を指す。例えば血管を作成するために、マトリックスに内皮細胞を播種することができ、そして内皮細胞が自然な管を通る血液の脈拍数を模するパルス化条件のような自然な流体条件、あるいは圧の変化での流体流条件下で発育することを可能とする。最初に、脈拍数および流速は細胞がこの脈拍数または流速に調整されるまで遅くすることができ、次いで流速および脈拍数は、細胞が新たな脈拍数および流速などに調整されるまで漸次上げることができる。脈拍数および流速を漸次上げることにより、管は調整されて各心拍中に生じるような高い圧にも耐え得るようになる。
【００２９】
同様に、自然な心臓弁を模する心臓弁を作成するために、細胞を播種したマトリックス（例えば脱細胞化心臓弁）は、大動脈弁を通る血流を模する予備調整する小室中で予備調整され得る。予備調整する小室は、自然な心臓の収縮および拡張圧を模するように設計されて、播種された細胞が自然な心臓弁と同じ拍動する応力および歪み条件下で発育できるようにする。
【００３０】
生物学的流体は、連続流として取り付けられたマトリックスの内側表面を通って、例えば約１ダイン／ｃｍ２〜約３０ダイン／ｃｍ２の範囲の壁体剪断応力を誘導するように、経時的に上げることができる流速で運ばれることができる。またマトリックスを予備調整する工程には、パルス流、例えば約１０ダイン／ｃｍ２〜約４５ダイン／ｃｍ２の範囲の壁体剪断応力を誘導するように、経時的に上げられる脈拍数を有するパルス流として、取り付けたマトリックスの内側表面を通って生物学的流体を移動させることを含むこともできる。脈拍数は約６０〜約２００ｍｍＨｇの範囲で工作された血管または心臓弁に壁圧分布を誘導するように、経時的に上げることができる。異なるか、同じ生物学的流体を使用して、マトリックスの外側を予備調整することもできる。
【００３１】
本明細書で使用する用語「生物学的流体」とは、工作した血管を予備調整するために使用することができる液体を指す。生物学的流体は工作した血管が自然な血管と同じ流体流の動力学に暴露されるように、血液を模する組成および粘度を有する。生物学的流体の例には、任意のバッファー、生理学的流体の媒質（例えば１０％ＦＣＳを含む血液の粘度を有するＤＭＥＭ）を含むことができる。流体の粘度は１００ｋＤａのデキストランのような高分子量タンパク質を加えることにより改変することができる。他の分子量のデキストランも使用することができる。使用するデキストランの量は分子量に依存し、そして約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％および６０％の範囲であることができる。組成は塩のような他の血液様成分を加えることにより変動させてもよい。
【００３２】
Ｉ  エレクトロスピンされたマトリックス
本発明はエレクトロスピンされたマトリックスを製造し、そして使用するための方法および組成物に関する。エレクトロスピニングの方法には、一般に液体の表面に電場を作成することが関与する。生じた電力は電荷を運ぶ液体ジェットを作成する。液体ジェットは適切な電位で他の電気的に荷電した物体に引き付けられることができる。液体ジェットが延長し、そして移動すると、硬化し、そして乾燥する。延長した液体ジェットの硬化および乾燥は液体を冷却すること、すなわち液体は通常、室温で固体であり；例えば脱水による溶媒の蒸発（物理的に誘導された硬化）により；あるいは硬化（ｃｕｒｉｎｇ）メカニズム（化学的に誘導された硬化）により生じることができる。製造された繊維は適切に配置された反対に荷電した標的基質上に集められる。
【００３３】
エレクトロスピニング装置には、電着メカニズムおよび標的基質を含む。電着メカニズムにはエレクトロスピンされるための溶液を保持する少なくとも１つの容器を含む。容器は、容器から溶液の流れを可能とするために少なくとも１つの口またはノズルを有する。多くの容器がある場合、複数のノズルを使用することができる。容器と連結して使用する１もしくは複数のポンプ（例えばシリンジポンプ）は、ノズルを通って容器から溶液が流れる流れを制御するために使用することができる。ポンプはエレクトロスピニング中に異なる点で流れを上げるか、または下げるためにプログラムすることができる。
【００３４】
エレクトロスピニングは、口または標的のいずれかにおける荷電の存在により生じるが、一方は接地されている。幾つかの態様では、ノズルまたは口が荷電され、そして標的が接地されている。エレクトロスピニング技術の当業者は、ノズルおよび溶液を接地でき、そして標的を電気的に荷電することができると認識している。
【００３５】
標的は、口からの溶液流が特異的な方向に向けられるように、予め選択したパターンに沿って特異的に荷電させるか、または接地することができる。電場は所望の幾何図形的配列を有するエレクトロスピンされたマトリックスを作成するために、マイクロプロセッサーにより制御することができる。標的およびノズル（１もしくは複数）は、互いに可動性となるように工作することができ、これにより形成されるエレクトロスピンされたマトリックスの幾何図形的配列にわたりさらなる制御を可能とする。全工程は、特異的な予め選択したエレクトロスピンされるマトリックスを得る特異的パラメーターでプログラムされたマイクロプロセッサーにより制御することができる。
【００３６】
２つの物質が合わさって第３の物質を形成する態様では、これらの成分を含有する溶液を互いに混合した後直ぐにそれらをエレクトロスピニング法で口から流すことができる。このように第３物質がエレクトロスピニング法でミクロファイバーとして事実上形成する。
【００３７】
以下は好適な方法の説明であるが、同じ結果を達成するために他のプロトコールにも従うことができる。図１では、口またはノズル１２（例えばＴａｙｌｏｒコーン）を有する容器１０（例えばシリンジまたはマイクロピペット）に、少なくとも１つの天然物質および少なくとも１つの合成物質１４を含む溶液を充填する。容器１０は、金属接地スクリーンのような接地した標的１６の反対側に釣り下げる。細いワイヤ１８を溶液中に配置して、容器中の溶液に高電圧をかける。各溶液に定めた特異的電圧で、容器のノズル中の溶液は接地標的に向けられる。接地した標的（例えば迅速に回転している心棒）に到達すると、物質の１つのジェット流２０が噴霧化ジェット２２を形成する。噴霧ジェットを集め、そして乾燥して３次元の超薄のエレクトロスピンファイバーの内部連結マトリックスを形成する。幾つかの態様では、複数の容器を異なる化合物を保持する各容器に使用することができる。
【００３８】
最小電流がエレクトロスピニング法に関与し、この電流は工程中に溶液の温度をほとんど上げないか、上げないので、この方法はエレクトロスピンされるマトリックスを形成する物質を変性させない。
【００３９】
エレクトロスピニング法はエレクトロスピンされたマトリックスの任意の所定の応用に対する特異的要件に合うように操作することができる。１つの態様では、シリンジを接地した基質に関してｘ、ｙおよびｚ面で移動する枠上に取り付けることができる。別の態様では、シリンジを接地した基質の回り、例えば管状主軸に取り付けることができる。このようにシリンジから流れるマトリックスを形成する物質は、特異的にねらいを定め、またはパターン化することができる。マイクロピペットは手動で動かすことができるが、シリンジが取り付けられる枠も、流れのパターンを予め決定できるようにするマイクロプロセッサーおよびモーターにより制御することができる。そのようなマイクロプロセッサーおよびモーターは当業者には既知であり、例えばマトリックス繊維が特異的方向に配列され、それらは重層され、またはそれらは完全に無作為に、そして方向性をもたないようにプログラムされ得る。
【００４０】
分枝の程度は限定するわけではないが、電圧（例えば約０〜３０，０００ボルトの範囲）、シリンジのチップから基質への距離（例えば１〜１００ｃｍ、０〜４０ｃｍおよび１〜１０ｃｍ）、回転速度、主軸の形状、シリンジのチップと標的との相対的位置（例えば前、上、下、横等）、およびシリンジのチップの直径（約０〜２ｍｍ）を含む多くの因子、およびエレクトロスピンされるマトリックスを形成する化合物の濃度および比率により変動することができる。重要である他のパラメーターには、温度、圧、湿度のような溶媒の蒸発に影響する因子を含む。ポリマーの分子量は、からみ、そして繊維を形成するその能力を改善し、そして１００ｋＤａの分子量を持つポリマーが一般に機能する（ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ）。当業者はこれらの、および他のパラメーターを変動させて、具体的な応用に特に適する特性を持つエレクトロスピン物質を形成することができることを認識している。
【００４１】
接地した標的の幾何図形的配置は、所望のマトリックスを製造するために修飾することができる。接地した幾何図形的配置を変動させることにより、例えば平面状または線状または多点の接地を有する場合、流れる物質の方向を変動させ、そして特定の応用にカスタマイズすることができる。例えば一連の平行線を含んでなる接地標的は、エレクトロスピンされる物質を特異的方向に配向するために使用することができる。接地標的は円筒状の主軸であることができ、これにより管状マトリックスが形成される。接地は、プログラムされる具体的な接地の幾何図形的配置を記録するマイクロプロセッサーにより制御され得る変動可能な表面であることができる。あるいは接地は静止した容器、例えばシリンジまたはマイクロピペットの先端に対してｘ、ｙおよびｚ面で移動する枠上に取り付けることができる。
【００４２】
エレクトロスピニングは、大きな柔軟性を可能とし、そして構造を必要とされるほとんどすべての形状にカスタマイズすることを可能にする。マトリックスの形成では、マトリックスの一部を例えば加熱シーリング、化学シーリング、および機械的圧力の適用、またはそれらの組み合わせにより互いに密閉することができる。エレクトロスピンされる組成物は皮膚パッチ、腹腔用インプラント、皮下インプラント、ステントの内部裏打ち、心血管バルブ、腱、靭帯、筋肉インプラント、神経ガイド等のような形に形成することができる。
【００４３】
またエレクトロスピニング法は、例えば（ｉ）同じ容器中で混合溶液（例えば細胞、増殖因子または両方のような基質と一緒の物質）を使用してエレクトロスピンされる化合物、ならびに「ブレンド」を生成するための１もしくは複数の物質からなる繊維を生成し；そして（ｉｉ）Ｔｅｆｌｏｎのような作用物質を標的上に適用して、標的からエレクトロスピンされた化合物の除去を促進する（すなわち、エレクトロスピンされたマトリックスが標的に接着しないように、マトリックスをより滑り易くする）ことにより修飾してもよい。
【００４４】
エレクトロスピンされる物質の様々な特性は、懸濁し、そしてマトリックス中で成長させる細胞の必要性および仕様に従い調整することができる。例えば孔性は、エレクトロスピンされる物質またはマトリックスを作成する方法に従い変動させることができる。例えば特定のマトリックスのエレクトロスピニングは、繊維のサイズおよび密度により変動させることができる。マトリックス中で成長する細胞が高栄養物流および廃棄物の排除を要する場合、ゆるいマトリックスを作成することができる。一方、作成される組織が稠密な環境を要する場合、稠密なマトリックスが設計される。孔性は塩もしくは他の抽出可能な作用物質を混合することにより操作することができる。塩を除去することは、マトリックスに定めたサイズの穴を残す。
【００４５】
マトリックスをエレクトロスピンするための適切な条件に関する１つの態様は、以下の通りである。４５％のコラーゲンＩ、１５％のエラスチンおよび４０％のＰＬＧＡを合わせることによりマトリックスをエレクトロスピンするために、適切なおよその範囲は：電圧０〜３０，０００ボルト（１０〜１００ｋＶ電位、好ましくは１５〜３０ｋＶ）；ｐＨ７．０〜８．０；温度２０〜４０℃、例えば２５℃の室温；および容器から接地板までの距離を約１ｃｍ〜約１００ｃｍ、好ましくは約１ｃｍ〜１０ｃｍの範囲にすることができる。荷電した繊維を接地板に沈着させることに加え、繊維はステンレス鋼製の主軸のようなどのような基質上にも沈着させることができる。主軸は２０〜１０００ｒｐｍ、好ましくは３００〜７００ｒｐｍで回転することができる。
【００４６】
自然に存在する物質の例には、限定するわけではないがアミノ酸、ペプチド、変性コラーゲンに由来するゼラチンのような変性ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、炭水化物、脂質、核酸、糖タンパク質、リポタンパク質、糖脂質、グリコサミノグリガンおよびプロテオグリカンがある。好適な態様では、物質化合物は細胞外マトリックス物質、限定するわけではないがコラーゲン、フィブリン、ラミニン、エラスチン、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、コンドロイチン４−硫酸、コンドロイチン６−硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン硫酸、ヘパリンおよびケラタン硫酸およびプロテオグリカンである。これらの物質はヒトまたは他の動物または細胞から単離することができる。好適な天然化合物はコラーゲンである。コラーゲンの例には限定するわけではないが、コラーゲンＩ、コラーゲンＩＩ、コラーゲンＩＩＩ、コラーゲンＩＶ、コラーゲンＶ、コラーゲンＶＩ、コラーゲンＶＩＩ、コラーゲンＶＩＩＩ、コラーゲンＩＸおよびコラーゲンＸを含む。別の好適な天然化合物はエラスチンである。エラスチン繊維は数種の組織の弾性の原因となる。エラスチンは例えば皮膚、血管および肺の組織に見いだされ、ここでエラスチンは強度、弾性および柔軟性を与える。
【００４７】
合成ポリマー物質の１つの種類は、生態適合性の合成ポリマーである。そのようなポリマーには限定するわけではないが、ポリ（ウレタン）、ポリ（シロキサン）もしくはシリコーン、ポリ（エチレン）、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）、ポリ（Ｎ−ビニルピロリドン）、ポリ（メチルメタクリレート）、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（ビニル酢酸）、ポリアクリルアミド、ポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）、ポリ（エチレングリコール）、ポリ（メタクリル酸）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ナイロン、ポリアミド、ポリ無水物、ポリ（エチレン−コ−ビニルアルコール）（ＥＶＯＨ）、ポリカプロラクトン、ポリ（ビニル酢酸）、ポリビニルヒドロキシド、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）、およびポリオルトエステル、あるいは生物学的に適合性である開発され得る任意の他の同様な合成ポリマーを含む。好適な合成ポリマーはＰＧＬＡである。
【００４８】
エレクトロスピンされたエラスチン（弾性のために）、エレクトロスピンされたコラーゲン（細胞の浸出を促進し、そして機械的完全性を与えるために）、およびＰＬＧＡ、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＥＯ、ＰＶＡ、または他のブレンドのような他の成分からなるマトリックスでは、マトリックス中の種々の成分の相対的比率を、具体的な応用にあつらえることができる（例えば、工作する組織に依存してより多くのエラスチン、少ないコラーゲン）。
【００４９】
エレクトロスピンされるマトリックスは、生物学的に適合性のある合成ポリマーのエレクトロスピンされる繊維から形成され得る。用語「生物学的に適合性のある」とはコポリマーおよびブレンド、ならびに前記のものを一緒に、もしくは他のポリマーとの他の組み合わせを含む。これらのポリマーの用途は所定の応用および必要な仕様に依存する。これらのポリマーおよびポリマーの種類に関するさらに詳細な検討は、Ｂｒａｎｎｏｎ−Ｐｅｐｐａｓ，Ｌｉｓａ，「制御された薬剤送達におけるポリマー（Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、メディカルプラスチックス  アンド  バイオマテリアルズ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｌａｓｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ）、１９９７年１１月（これは引用により本明細書に編入する）に説明されている。
【００５０】
天然および合成の物質の両方がエレクトロスピンされるマトリックスに使用される場合、天然物質の成分は約５パーセント〜約９５パーセント、好ましくは約２５パーセント〜約７５重量パーセントの範囲であることができる。合成物質の成分は約５パーセント〜約９５パーセント、好ましくは約２５パーセント〜約７５重量パーセントの範囲であることができる。特定の態様では、コラーゲンおよびエラスチンの両方を天然物質の成分として、好ましくはコラーゲンを優勢に、例えば天然物質の成分の４０パーセントより高く含むことができる。コラーゲン、エラスチンおよびＰＬＧＡの比率は、応用に合うようにあつらえることができる：例えばコラーゲンおよびエラスチンの標準レベルは心臓に近いより弾性の管から、心臓からさらに離れた柔軟性が低い（ｌｅｓｓ  ｃｏｍｐｌｉａｎｔ）な管で変動する。大動脈のような血管は遠位の管よりも多いエラスチン含量を有する。コラーゲンＩ、エラスチンおよび他のコラーゲン（血管用のコラーゲンＩＩＩ、または例えば関節用のコラーゲンＩＩ）の割合は、これらコラーゲンの分子量がエレクトロスピニング法で繊維を形成するために十分である限り、どのように所望することもできる。コラーゲンＩの割合は４０％〜８０％、または５０％〜１００％となり得る。エラスチンもまた、５％〜５０％のより高い比率で使用できる。ＰＬＧＡまたは他の合成の生物分解性ポリマーは、５〜８０％の所望する比率で使用することができる。完全に生物学的な基質には、合成ポリマーは完全に省略され、そして生物学的ポリマーのみを使用することができる。
【００５１】
エレクトロスピンされる化合物は、溶液中にエレクトロスピンを可能とする任意の濃度で存在することができる。１つの態様では、エレクトロスピンされ得る化合物は、０から約１０００ｇ／ｍｌの間の濃度で溶液中に存在する。別の態様では、エレクトロスピンされ得る化合物は１０〜１５重量／容量％（１００〜１５０ｍｇ／ｍｌまたは０〜０．１ｇ／Ｌ）の間の全溶液濃度で溶液中に存在する。
【００５２】
化合物は、化合物がエレクトロスピンされる条件下で口、シリンジの先端に化合物の送達を可能にする任意の溶媒に溶解することができる。材料または物質を溶解または懸濁するために有用な溶媒は、化合物に依存する。エレクトロスピン技法はしばしばより特異的な溶媒条件を要する。例えばコラーゲンを水、２，２，２−トリフルオロエタノール、１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（ヘキサフルオロイソプロパノールまたはＨＦＩＰとしても知られている）またはそれらの組み合わせ中で溶液もしくは懸濁液として電着することができる。フィブリンモノマーは、尿素、モノクロロ酢酸、水、２，２，２−トリフルオロエタノール、ＨＦＩＰまたはそれらの組み合わせのような溶媒から電着またはエレクトロスピンされ得る。エラスチンは、水、２，２，２−トリフルオロエタノール、イソプロパノール、ＨＦＩＰまたはイソプロパノールと水のようなそれらを組み合わせた中の溶液もしくは懸濁液として電着され得る。１つの望ましい態様では、エラスチンは２５０ｍｇ／ｍｌのエラスチンを含有する７０％イソプロパノールおよび３０％水の溶液からエレクトロスピンされる。他の低次元アルコール、特にハロゲン化アルコールを使用してもよい。天然のマトリックス物質のエレクトロスピンにおいて使用できる他の溶媒、または他の溶媒との組み合わせることができる溶媒には、アセトアミド、Ｎ−メチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、酢酸、トリフルオロ酢酸、酢酸エチル、アセトニトリル、無水トリフルオロ酢酸、１，１，１−トリフルオロアセトン、マレイン酸、ヘキサフルオロアセトンがある。メタノール、クロロホルムおよびトリフルオロエタノール（ＴＦＥ）および乳化剤のような有機溶媒。
【００５３】
溶媒の選択は、ポリマー−ポリマー相互作用を安定化する２次的な力の考察、およびこれらの強いポリマー−溶媒相互作用を置き換える溶媒の能力に一部基づく。コラーゲンのようなポリペプチド、そして共有架橋結合が不存在の場合、鎖間の主要な２次的な力は：（１）骨格上の固定電荷の誘引から生じ、そして１次構造により規定される（例えばリシンおよびアルギニン残基は生理学的ｐＨで正に荷電しているが、アスパラギン酸またはグルタミン酸残基は、負に荷電している）、クーロン力：（２）永久双極子の相互作用から生じる双極子−双極子；通常、ポリペプチドに見いだされる水素結合は、そのような相互作用の中で最強である；および（３）非極性種が極性の水分子と好ましく相互作用する低い傾向による、ポリペプチドの非極性領域の会合から生じる疎水性相互作用。したがってこれらの相互作用と好ましく競合することができる溶媒または溶媒の組み合わせは、ポリペプチドを溶解または分散させることができる。例えばＨＦＩＰおよびＴＦＥは、大変疎水的な弗化領域に隣接する高度に極性のＯＨ結合を有する。以下の理論に拘束されることは望まないが、アルコール部分はペプチドと水素結合することができ、そしてまた骨格上の電荷も溶媒和化することができ、これにより分子間のクーロン相互作用を減じると考えられる。さらにこれら溶媒の疎水性部分は、ポリペプチド中の疎水性ドメインと相互作用でき、ポリペプチドが疎水性相互作用を介して凝集する傾向に抵抗することを助ける。さらにＨＦＩＰおよびＴＦＥのような溶媒は、水と比べてそれらの低い全体的極性により、アルファヘリックスのような２次構造を安定化する分子間水素結合と十分に競合しないと考えられる。その結果、これら溶媒のアルファヘリックスは、より強い分子間水素結合により安定化されると考えられる。これら溶媒中でのポリペプチドの２次構造の安定化は、特にコラーゲンおよびエラスチンの場合に、エレクトロスピン中にコラーゲン原繊維の正しい形成を保存するために望ましいと考えられる。
【００５４】
１つの態様では、溶媒は溶媒が蒸発する時、エレクトロスピンジェットが繊維を作成する安定化を促進するために、比較的高い蒸気圧を有する。より高い沸点の溶媒が関与する態様では、スピンまたは噴霧溶液、および場合によりエレクトロスピン流自体を暖めることにより、あるいは低減した大気圧でエレクトロスピンすることにより、溶媒の蒸発を促進することが望ましいことが多い。また繊維を生じる安定なジェットの作成は、ポリマー／溶媒混合物の高い表面張力により促進されると考えられる。
【００５５】
従来のエレクトロスピンに類似して、他のエレクトロスピン技法と同じ実験的設定を採用する中空（ｍｉｄａｉｒ）エレクトロスピンを使用することができる。しかし繊維が接地標的に達する前に繊維を沈殿させるために、針から接地標的への距離を上げることができる。例えば距離を１０〜３０ｃｍから３０〜４０ｃｍの距離に上げる。場の強さは維持されるか、または針の先端に適用する電位を上げることにより改変できる。針の先端から接地標的への距離を上げることは、ポリマージェットにより長い「飛行時間」を体験させることを可能とする。加わった飛行時間は、繊維の完全な発生を可能とするジェットから完全な溶媒の蒸発を可能とする。
【００５６】
エレクトロスピンされる繊維の組成を変動させることにより、異なる物理的または化学的性質を有する繊維を得ることができると考えられる。これは各々が仕上げられる生成物の望ましい特性に寄与することができる複数の成分を含有する液体をスピンするか、あるいは多数の液体供給源から種々の組成物の繊維を同時にスピンすること（次いでこれは同時に沈着してマトリックスを形成する）、のいずれかにより達成され得る。生じるマトリックスは種々の成分が混ざりあった繊維の層を含んでなる。この異なる物質の複数の層は、所望する特性を生じる複合マトリックスに運ぶことができ、各々異なる層が異なる特性を提供し、例えば１つの層が弾性に寄与すると同時に、別の層が複合マトリックスの機械的強度に貢献する。これらの方法は血管のような多くの層を有する組織を作成するために使用され得る。
【００５７】
エレクトロスピンされたマトリックスは、細胞の成長、増殖、分化および発育を支持する３次元ネットワークを持つ超構造を有する。繊維間の空間的距離は、成長ならびに細胞−細胞相互作用が起こることを可能とするための栄養を得ることができる細胞に重要な役割を果たす。すなわち本発明の種々の態様では、繊維間の距離が約５０ナノメートル、約１００ナノメートル、約１５０ナノメートル、約２００ナノメートル、約２５０ナノメートル、約３００ナノメートル、約３５０ナノメートル、約６００ナノメートル、約７５０ナノメートル、約８００ナノメートル、約８５０ナノメートル、約９００ナノメートル、約９５０ナノメートル、約１０００ナノメートル（１ミクロン）、１０ミクロン、５０ミクロン、約１００ミクロン、約１５０ミクロン、約２００ミクロン、約２５０ミクロン、約３００ミクロン、約３５０ミクロン、約４００ミクロン、約４５０ミクロンまたは約５００ミクロンであることができる。様々な態様において、繊維間の距離は、５０ナノメートル未満または５００ミクロンより大きく、そして言及した範囲の間ならびに整数の長さでよい。
【００５８】
さらに本発明の様々な態様において、繊維は約５０ナノメートル、約１００ナノメートル、約１５０ナノメートル、約２００ナノメートル、約２５０ナノメートル、約３００ナノメートル、約３５０ナノメートル、約６００ナノメートル、約７５０ナノメートル、約８００ナノメートル、約８５０ナノメートル、約９００ナノメートル、約９５０ナノメートル、約１０００ナノメートル（１ミクロン）、５０ミクロン、約１００ミクロン、約１５０ミクロン、約２００ミクロン、約２５０ミクロン、約３００ミクロン、約３５０ミクロン、約４００ミクロン、約４５０ミクロンまたは約５００ミクロンの直径を有することができ、あるいは直径は５０ナノメートル未満または５００ミクロンより大きく、そして言及した範囲の間ならびに整数の直径でよい。
【００５９】
エレクトロスピンされたマトリックスの孔サイズは、材料の組成およびエレクトロスピンのパラメーターの操作を介して制御することもできる。幾つかの態様では、エレクトロスピンされたマトリックスは、１もしくは複数の種類の細胞に透過性となるように十分に小さい孔サイズを有する。１つの態様では、平均の孔の直径は約５００ナノメートル以下である。別の態様では、平均の孔の直径は約１ミクロン以下である。別の態様では、平均の孔の直径は約２ミクロン以下である。別の態様では、平均の孔の直径は約５ミクロン以下である。別の態様では、平均の孔の直径は約８ミクロン以下である。幾つかの態様では、細胞の浸出を妨害しない孔サイズを有する。別の態様では、マトリックスは約０．１から約１００μｍ２の間の孔サイズを有する。別の態様では、マトリックスは約０．１から約５０μｍ２の間の孔サイズを有する。別の態様では、マトリックスは約１．０μｍから約２５μｍの間の孔サイズを有する。別の態様では、マトリックスは約１．０μｍから約５μｍ２の間の孔サイズを有する。また浸出は、より小さい孔サイズのインプラントを用いて達成することもできる。エレクトロスピンされたマトリックスの孔サイズは、例えば電場強度および主軸運動を介して繊維の沈着速度を制御することにより、溶液濃度を変動させることにより（すなわち繊維のサイズ）、工程のパラメーターの制御を介して容易に操作することができる。また孔性は、塩または他の抽出可能な作用物質のような孔形成材料を混合することにより操作することもでき、その溶解はマトリックスに定めたサイズの穴を残す。また孔サイズはマトリックスに存在する架橋結合の量により制御され得る。
【００６０】
マトリックスの機械的特性は、ポリマーの分子量およびポリマーの型／混合物に依存する。これはまた繊維の方向（好適な方向は、繊維回収工程中に回転する、または移動する表面の速度を変えることにより得ることができる）、繊維の直径およびもつれに依存する。ポリマーの架橋結合は繊維化工程後のその機械的強度にも影響する。
【００６１】
エレクトロスピンされるマトリックスは、架橋結合されてその安定性および強度を上げることができる。架橋結合は一般に室温および中性ｐＨ条件で行うことができるが、条件を変動させて特定の応用および使用する架橋結合の化学を至適化してもよい。ＭＥＳ／ＥｔＯＨ中でＮＨＳを用いるＥＤＣ化学を使用した架橋結合には、４．０〜８．０のｐＨおよび０℃から室温（２５℃）の温度で２時間を使用することができる。ＥＤＣの分解により、より高温はこの化学に好ましくないことが知られている。同様にこの化学を使用する場合、塩基性ｐＨ（例えば８〜１４）もこの理由から好適ではない。他の架橋結合化学も、例えばエレクトロスピンされたマトリックスを２０％デキストラン溶液に浸し（縮みを減らすために）、続いて１％グルタルアルデヒド溶液に浸すことにより使用することができる。さらに別の架橋結合の化学には、Ｎ−保護アミノ酸を含む架橋結合剤にスペーサーとしてポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を使用することが関与する。
【００６２】
ＩＩ．脱細胞化マトリックス
自然な生体構造、例えば血管もしくは臓器は、個体と同じ種のドナー、例えばヒトの受容者にはヒトの死体の血管もしくは臓器から得ることができる。また自然な生体構造は限定するわけではないがサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジを含む様々な種から得ることもできる。また自然な生体構造は再構成される臓器を必要とする個体から得、そして以下に記載する工程を使用して取り出し、そして機能不全血管を取り出し、そして脱細胞化することができる。個体の脱細胞化血管は、個体から単離した培養内皮細胞（例えばヒトの内皮細胞）を使用して人工血管を再構成するための３次元的スカフォールドとして使用することができる。１つの態様では、内皮細胞がヒトの伏在静脈から単離される。別の態様では、内皮細胞は個体の血液または骨髄から単離された前駆細胞から生産され得る。人工的な再構成血管はさらに発育するために個体に戻して移植され得る。
【００６３】
生体構造、例えば血管または血管の一部は血管から全細胞および組織内容物を除去することにより脱細胞化され得る。脱細胞化工程は一連の順次抽出を含んでなる。この抽出工程の重要な特徴は、生体構造の複雑なインフラ構造を混乱もしくは破壊し得る苛酷な抽出工程を回避することである。第１段階には細胞屑の除去および細胞膜の可溶化を含む。これに続いて核の細胞質成分である核成分を可溶化する。
【００６４】
好ましくは生体構造、例えば血管は穏やかな機械的破壊法を使用して血管の周囲にある細胞膜および細胞屑を除去することにより脱細胞化される。穏やかな機械的破壊法は細胞膜を破壊するために十分でなければならない。しかし脱細胞化の工程は生体構造の複雑なインフラ構造の傷害もしくは妨害を回避すべきである。穏やかな機械的破壊法は、血管表面を掻き取り、血管をかきまぜ、または血管を適切な容量の流体、例えば蒸留水中で撹拌することを含む。１つの態様では穏やかな機械的破壊法には、血液を適切な容量の蒸留水中で、細胞膜が破壊され、そして細胞屑が血管から除去されるまで、磁気撹拌（例えば磁気撹拌棒および磁石板を使用する）することを含む。
【００６５】
細胞膜が除去された後、生体構造の核および細胞質成分が除去される。これは細胞および核成分をインフラ構造の破壊無しに可溶化することにより達成することができる。核成分を可溶化するために、非イオン性界面活性剤もしくは表面活性剤を使用することができる。非イオン性界面活性剤もしくは表面活性剤の例には限定するわけではないが、ペンシルバニア州、フィラデルフィアのローム  アンド  ハース（Ｒｏｈｍ  ａｎｄ  Ｈａａｓ）から入手可能なＴｒｉｔｏｎシリーズ、これには多くの売主から市販されているＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｎ−１０１、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−７０５およびＴｒｉｔｏｎ  ＤＦ−１６がある；モノラウレート（Ｔｗｅｅｎ２０）、モノパルミテート（Ｔｗｅｅｎ４０）、モノオレート（Ｔｗｅｅｎ８０）のようなＴｗｅｅｎシリーズ、およびポリオキシエチレン−２３−ラウリル  エーテル（Ｂｒｉｊ３５）、ポリオキシエチレンエーテル  Ｗ−１（Ｐｏｌｙｏｘ）等、コール酸ナトリウム、デオキシコレート、ＣＨＡＰＳ、サポニン、ｎ−デシル−β−Ｄ−グルコプラノシド、ｎ−ヘプチルβ−Ｄグルコピラノシド、ｎ−オクチル−α−Ｄ−グルコプラノシドおよびＮｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０がある。
【００６６】
当業者は前記の分類に属する化合物および売主の記載が商業的に得られ、そして「化学的分類、乳化剤および界面活性剤（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）」、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎの乳化剤および界面活性剤（Ｅｍｕｌｓｉｆｉｅｒｓ  ａｎｄ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ）、１９８６、ノース  アメリカ  アンド  インターナショナル版（Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎｓ）、ＭｃＣｕｔｃｈｅｏｎ部門、ＭＣ出版社，Ｇｌｅｎ  Ｒｏｃｋ，Ｎ．Ｊ．，Ｕ．Ｓ．Ａ．およびＪｕｄｉｔｈ  Ｎｅｕｇｅｂａｕｅｒ，生物学および生化学における界面活性剤の性質および用途の指針（Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ａｎｄ  Ｕｓｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｔｅｒｇｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、カルビオケム、ヘキスト  セラニーズ社（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｈｏｅｃｈｓｔ  Ｃｅｌａｎｅｓｅ  Ｃｏｒｐ）、１９８７に見いだすことができると考えるだろう。１つの好適な態様では、非イオン性表面活性剤はＴｒｉｔｏｎシリーズ、好ましくはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００である。
【００６７】
非イオン性表面活性剤の濃度は、脱細胞化される生体構造の種類に依存して改変され得る。例えば繊細な組織、例えば血管については、界面活性剤の濃度は減少すべきである。好適な非イオン性界面活性剤の濃度範囲は、約０．００１〜約２．０（重量／容量）％となり得る。さらに好ましくは約０．０５〜約１．０（重量／容量）％である。より一層好ましくは約０．１（重量／容量）％〜約０．８（重量／容量）％である。
【００６８】
これらの範囲の好適な濃度は約０．００１〜約０．２（重量／容量）％であり、約０．０５〜約０．１（重量／容量）％が特に好適である。
【００６９】
稠密な細胞質フィラメントネットワーク、細胞間複合体および頂端（ａｐｉｃａｌ）微細胞構造からなることを含んでなる細胞骨格成分は、水酸化アンモニウムのようなアルカリ溶液を使用して可溶化することができる。アンモニウム塩もしくはそれらの誘導体からなる他のアルカリ溶液を使用して、細胞骨格成分を可溶化することもできる。他の適当なアンモニウム溶液の例には、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウムおよび水酸化アンモニウムがある。好適な態様では、水酸化アンモニウムを使用する。
【００７０】
アルカリ溶液、例えば水酸化アンモニウムの濃度は、脱細胞化される生体構造の種類に依存して改変してよい。例えば繊細な組織、例えば血管については、界面活性剤の濃度は減少すべきである。好適な濃度範囲は、約０．００１〜約２．０（重量／容量）％となり得る。さらに好ましくは約０．００５〜約０．１（重量／容量）％である。より一層好ましくは約０．０１（重量／容量）％〜約０．０８（重量／容量）％である。
【００７１】
脱細胞化され、凍結乾燥された構造は、使用に必要となるまで適切な温度で保存することができる。使用前に、脱細胞化構造は適切な等張バッファーもしくは細胞培養基中で平衡化され得る。適切なバッファーには限定するわけではないが、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）、塩水、ＭＯＰＳ、ＨＥＰＥＳ、ハンクスバランス塩溶液等がある。適切な細胞培養基には限定するわけではないが、ＲＰＭＩ１６４０、Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、ダルベッコの培地等がある。
【００７２】
ＩＩＩ．合成マトリックス
また本発明は、利用可能な生体適合性マトリックス上もしくは中に培養した組織細胞を播種することにより人工組織構造を生成することに関する。生体適合性とは、生物学的機能に毒性もしくは傷害性効果をもたない物質を指す。生分解性とは、患者の体内に吸収もしくは分解され得る物質を指す。生分解性物質を形成する代表的な材料には、コラーゲン、ポリ（乳酸）のようなポリ（アルファ  エステル）、ポリ（グリコール酸）、ポリオルトエステルおよびポリ無水物およびそれらのコポリマーのような天然もしくは合成のポリマーを含み、これらは制御された速度で加水分解により分解され、そして再吸収される。これらの物質は、分解性、扱い易さ（ｍａｎａｇｅａｂｉｌｉｔｙ）、サイズおよび形状の最大の制御を提供する。好適な生分解性ポリマー物質には、吸収性の合成縫合材料として開発されたポリグリコール酸およびポリグラクチン（ｐｏｌｙｇｌａｃｔｉｎ）がある。
【００７３】
ポリグルコール酸およびポリグラクチン繊維は、製造者により供給されるように使用することができる。他の生分解性物質には限定するわけではないが、セルロースエーテル、セルロース、セルロースエステル、弗化ポリエチレン、フェノール樹脂（ｐｈｅｎｏｌｉｃ）、ポリ−４−メチルペンテン、ポリアクリロニトリル、ポリアミド、ポリアミドイミド、ポリアクリレート、ポリベンゾオキサゾール、ポリカーボネート、ポリシアノアリールエーテル、ポリエステル、ポリエステルカーボネート、ポリエーテル、ポリエーテルエーテルケトン、ポリエーテルイミド、ポリエーテルケトン、ポリエーテルスルホン、ポリエチレン、ポリフルオロオレフィン、ポリイミド、ポリオレフィン、ポリオキサジアゾール、ポリフェニレンオキシド、ポリフェニレンスルフィド、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリスルフィド、ポリスルホン、ポリテトラフルオロエチレン、ポリチオエーテル、ポリトリアゾール、ポリウレタン、ポリビニル、弗化ポリビニリデン、再生セルロース、シリコン、尿素−ホルムアルデヒド、またはこれら物質のコポリマーもしくは物理的ブレンドを含む。物質に適切な抗菌剤を含浸させ、そして色の添加により着色して可視性を改善し、そして外科手術を援助することができる。
【００７４】
幾つかの態様では、細胞の生体適合性基質への付着が、マトリックスを基底膜成分、寒天、アガロース、ゼラチン、アカシアガム、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、グリコサミノグリカン、それらの混合物、および細胞培養の当業者が既知の生物学的マトリックス分子に類似する特性を有する他の物質のような化合物でコーティングすることにより強化される。マトリックスを確実にする機械的および生化学的パラメーターは、その後の細胞の成長および増殖に十分な支持を提供する。栄養物、増殖因子、分化もしくは脱分化のインデューサー、分泌産物、免疫調節物質、炎症のインヒビター、後退（ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ）因子、リンパのネットワークまたは神経繊維の内伸（ｉｎｇｒｏｗｔｈ）を強化または可能にする生物学的に活性な化合物、および薬剤を含む因子をマトリックスに包含するか、あるいはマトリックスと一緒に提供することができる。同様に付着ペプチドＲＧＤ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ）のようなペプチドを含有するポリマーを、マトリックスを形成する用途に合成することができる。
【００７５】
コーティングとは、溶かしたコポリマー（ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド  ５０：５０  ８０ｍｇ／ｍｌ  塩化メチレン）のような物質でマトリックスを被覆または浸透させて、その機械的特性を改変させることを指す。コーティングは１層で達成されるか、あるいは所望する機械的特性に達するまで多層で行うことができる。これらの成形技術は組み合わせて採用することができ、例えばポリマー性マトリックスは織られ、圧縮成形され、そして一緒に接着される。さらに異なる工程により形成された種々のポリマー性物質を一緒に合わせて複合形を形成してもよい。複合形は重層構造であることができる。例えばポリマー性マトリックスを１もしくは複数のポリマー性マトリックスに付けて、多層ポリマー性マトリックス構造を形成することができる。付着は、液体ポリマーでの接着、ステープリング、縫合またはこれらの方法の組み合わせのような任意の適切な手段により行うことができる。加えて、ポリマー性マトリックスは固体ブロックとして形成され、そしてその最終的形にレーザーもしくは他の標準的な機械技術により成形することができる。レーザー成形とは、レーザーを使用して物質を除去する方法を称する。
【００７６】
ポリマーは、引っ張り強さのような機械的特性をＩｎｓｔｒｏｎ試験機を使用して、ポリマーの分子量をゲル排除クロマトグラフィー（ＧＰＣ）により、ガラス転移温度を示差走査熱量測定法（ＤＳＣ）により、そして結合構造を赤外線（ＩＲ）分光法により特性付けることができ；毒性についてはＡｍｅｓアッセイおよびインビトロ催奇性アッセイが関与する初めのスクリーニング試験により、そして免疫原性、炎症、放出および分解実験については動物を対象とした移植実験により特性付けることができる。インビトロでの細胞の付着および生存性は、走査型電子顕微鏡、組織学および放射性同位体での定量的評価を使用して評価することができる。
【００７７】
基質は、例えば移植後に新規組織の形成を促進するために、移植前（ポリマー性基質に細胞が播種される前または後）に添加物または薬剤で処理することができる。すなわち例えば増殖因子、サイトカイン、細胞外マトリックス成分および他の生物活性物質を基質に加えて、新規組織の移植治癒および形成を促進することができる。そのような添加物は一般に、適切な新規組織が移植された臓器または組織中に形成されることを確実とするために、再構成または強化される組織または臓器に従い選択される（例えば骨の治癒を促進するために使用するそのような添加剤は、例えばＫｉｒｋｅｒ−Ｈｅａｄ，Ｃ．Ａ．Ｖｅｔ．Ｓｕｒｇ．２４（５）：４０８−１９（１９９５）を参照にされたい）。例えば、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ、例えば米国特許第５，６５４，２７３号明細書を参照にされたい。これは引用により本明細書に編入する）は、新規な管組織の形成を促進するために使用することができる。増殖因子および他の添加剤（例えば上皮増殖因子（ＥＧＦ）、ヘパリン−結合上皮様増殖因子（ＨＢＧＦ）、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、サイトカイン、遺伝子、タンパク質等）は、基質上に播種した細胞により生産され得るそのような増殖因子（もしあれば）の量よりも過剰な量で加えることができる。そのような添加剤は好ましくは修復または強化（例えば宿主細胞の移植片への浸潤を生じるか、または加速することにより）される組織または増殖に適切な種類の新規組織の形成を促進するために十分な量で提供される。他の有用な添加剤には抗生物質のような抗菌剤を含む。
【００７８】
生体適合性基質は、溶媒流延、圧縮成形、フィラメント延伸（ｄｒａｗｉｎｇ）、メッシング（ｍｅｓｈｉｎｇ）、浸出（ｌｅａｃｈｉｎｇ）、製織およびコーティングのような方法を使用して形成することができる。溶媒流延では、塩化メチレンのような適切な溶媒中の１もしくは複数のポリマーが分枝パターンリリーフ構造として流延される。溶媒が蒸発した後、薄いフィルムが得られる。圧縮成形では、基質は平方インチあたり最高３０，０００ポンドの圧で適切なパターンに圧縮される。フィラメント延伸には溶融ポリマーからの延伸が関与し、そしてメッシングには繊維をフェルト様の物質に圧縮することによりメッシュを形成することが関与する。浸出では２つの物質を含有する溶液が組織の最終形態に近い形状に広げられる。次いで溶媒を使用して成分の１つを溶解し、孔の形成を生じる（Ｍｉｋｏｓ、米国特許第５，５１４，３７８号明細書を参照にされたい。これは引用により本明細書に編入する）。
【００７９】
核形成では、組織の形の薄いフィルムが照射により損傷された物質の痕跡を作る放射性開裂産物に暴露される。次いでポリカーボネートシートが酸もしくは塩基でエッチングされ、照射により損傷された物質の痕跡が孔になる。最後にレーザーを使用して多くの物質を介して個々の穴を形成し、そして焼いて、均一な孔サイズを有する組織構造を形成する。基質は、栄養物が培養基から沈着した細胞群に到達できるようにする制御された孔構造を有するように仕上げられ得る。インビトロでの細胞の付着および細胞の生育能は、走査型電子顕微鏡、組織学および放射性同位体の定量的評価を使用して評価することができる。
【００８０】
このように基質は任意の数の全体的系、幾何図形的配列または空間的限定を満たす多数の所望する形態に形成され得る。マトリックスは異なるサイズの患者の必要な構造と同じくするために、異なるサイズに形成することができる。
【００８１】
また基質は、物質、例えば溶かしたコポリマー（ポリ−ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド  ５０：５０  ８０ｍｇ／ｍｌ  塩化メチレン）を浸透させて、その機械的特性を変化させることができる。これは１層を、あるいは所望する機械的特性に達するまで多層をコーティングすることにより行うことができる。
【００８２】
また基質は個体中のマトリックスの分解／吸収を制御する種々の因子およびタンパク質で処理するか、またはそれを播種することができる。例えば基質内に播種された細胞がゆっくり成長する場合、細胞が十分な時間再生し、そして成長できるようにするために十分に長い期間にわたりマトリックスの完全性を維持することが有利である。一方、細胞が迅速に再生し、そして成長することができる場合、短い寿命の基質が望ましい。アプロチニン添加剤、アミノカプロン酸、トラネキサム酸または類似の繊維溶解性インヒビターの濃度、あるいはマトリックス中の化学架橋結合の程度を変動させることは、この可変性を正確に制御するために使用できる。また基質には移植で血管の成長を促進するために、血管形成因子のような変動する増殖因子を播種することもできる。
【００８３】
ＶＩ．機能化マトリックス
マトリックス（例えばエレクトロスピンされたマトリックス、天然の脱細胞化マトリックス、または合成マトリックス）は、治療薬もしくは生物製剤（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ）に結合した量子ドット（ＱＤ）のようなナノ粒子の取り込みにより機能化することができる。またマトリックスは官能化されて造影増強剤（例えばガドリニウム）を取り込むことができる。
【００８４】
１つの観点では、本発明は標的部位に制御された様式で治療薬もしくは生物製剤を放出することに関する。これは治療薬／生物製剤がカップリングしている量子ドットを使用してなされる。量子ドットはサイズ依存的な可視および電子特性をもつ半導体ナノ結晶である。特に粒子ドットのバンドギャップエネルギーは、結晶の直径で変動する。ＱＤの平均直径は、約１〜約１００ｎｍの間、約１０〜８０ｎｍの間、そして約２５〜４０ｎｍの間であり得る。カップリングした作用物質は、レーザー源からの近赤外線（ＮＩＲ）照射（これは作用物質とＱＤとの間の結合の破壊を引き起こし、これにより作用物質を放出する）のようなエネルギーの適用により放出させることができる。これにより作用物質の放出をエネルギーの適用で誘起することにより、作用物質が制御されて放出できるようになる。量子ドットは光に安定な生物学的蛍光標識、半導体および熱療法として使用されてきた。高い伝導性、散乱−制限減衰および量子ドットの最小加熱効果は、これらを治療薬／生物製剤のカップリングに適切なものとする。１つの態様では、ＮＩＲ  ＣｄＳｅ量子ドット（エビデント  テクノロジーズ：Ｅｖｉｄｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用することができる。これらのＱＤは７００〜１０００ｎｍの可視吸収範囲を有する。このスペクトル範囲のＮＩＲエネルギーは、組織に最高２３ｃｍの深度で浸透することが示されたが、介入する組織に観察できる傷害は無かった。
【００８５】
治療薬もしくは生物製剤にカップリングしたＱＤで機能化されたマトリックスは、個体の標的で治療薬もしくは生物製剤の制御された放出に使用することができる。治療薬もしくは生物製剤は、近赤外線照射のような所望する波長でエネルギーを適用することにより放出され得る。ＱＤの局所化された加熱により、超構造的変化がカップリングした作用物質の放出を引き起こす。放出の動力学は、使用するＱＤの種類および照射の波長に依存して変動することができる。また放出の動力学は照射の強度および時間を改変することにより変動することができる。例えばカプセル化されたヘパリンにカップリングされたＱＤ（例えばエビデント  テクノロジーズからのＣｄＳｅ  ＱＤ）を、エレクトロスピンマトリックスに包含することができる。７００〜１０００ｎｍの波長の近赤外線照射の適用で、ヘパリンは以下の実施例に記載されるように制御された様式で放出される。
実施例の章における実験は、ヘパリンナノ粒子に結合した量子ドットがＮＩＲ照射により照射された時、経時的にヘパリンのバースト放出を示す。この系により術後に治療薬／生物製剤の放出速度を医療従事者が調節できるようになる。
【００８６】
量子ドットの発光スペクトルはサンプルのサイズの異質性により、わずか２５〜３０ｎｍの狭さのライン幅（ｌｉｎｅｗｉｄｔｈ）、およびテーリング領域の不存在により対称的、ガウスまたはほぼガウスであるライン形（ｌｉｎｅｓｈａｐｅ）を有する。調整性、狭いライン幅およびテーリング領域が無い対称発光スペクトルの組み合わせは、系内の多くのサイズの量子ドットの高い解像を提供し、そしてＱＤで標識した種々の生物学的部分の同時調査を可能とする。
【００８７】
さらに量子ドットの励起波長の範囲は広く、しかもエネルギーはすべての利用できる量子ドットの発光波長よりも高くなり得る。その結果、これにより１つの光源で系内のすべての量子ドットの同時励起が可能となる。ＱＤのサイズを制御する能力により、ＵＶ−可視−ＩＲ領域における任意の波長で蛍光発光を有するＱＤを構築することができるようになる。したがってＱＤの色（発光）は任意の所望するペクトル波長に調整することができる。さらに単分散ＱＤの波長スペクトルは、わずか２５〜３０ｎｍの狭いライン幅を有する。ライン幅は各調製物中のＱＤのサイズ異質性に依存する。１つの態様では、ＱＤは紫外線の波長で発光する。別の態様では、ＱＤは可視波長で発光する。別の態様では、ＱＤは近赤外線および赤外線波長で発光する。ＱＤにより発光する光の色はサイズ−調整性であり、そして励起エネルギーは調整可能である。
【００８８】
多くのＱＤは、周期表のＩＩ−ＶＩ、ＩＩＩ−ＶおよびＩＶ族からの元素から構築されている。それらは量子封じ込め効果をそれらの物理特性において現し、そして本発明の組成物に使用することができる。量子ドットとして使用するために適する例示的物質は、限定するわけではないがＺｎＳ、ＺｎＳｅ、ＺｎＴｅ、ＣｄＳ、ＣｄＳｅ、ＣｄＴｅ、ＧａＮ、ＧａＰ、ＧａＡｓ、ＧａＳｂ、ＩｎＰ、ＩｎＡｓ、ＩｎＳｂ、ＡｌＳ、ＡｌＰ、ＡｌＡｓ、ＡｌＳｂ、ＰｂＳ、ＰｂＳｅ、ＧｅおよびＳｉおよびそれらの３要素および４要素の混合物を含む。量子ドットはさらに、より大きなバンドギャップを有する半導体のオーバーコーティング層を含むことができる。
【００８９】
遺伝物質、増殖因子、サイトカイン、酵素のような任意の適する治療薬もしくは生物製剤をＱＤにカップリングすることができる。治療薬もしくは生物製剤はＱＤとカップリングされた作用物質との間の結合を破壊するエネルギーの適用により放出され得る。作用物質は経時的に周囲環境におけるマトリックスの生物分解の関数として特異的部位に放出され得る。
【００９０】
治療薬もしくは生物製剤の例には限定するわけではないが、タンパク質増殖因子、抗体、核酸分子、炭水化物等がある。本発明に有用な増殖因子には限定するわけではないが、トランスフォーミング増殖因子−アルファ（ＴＧＦ−α）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＦＧＦ酸性アイソフォーム１および２、ＦＧＦ塩基形２およびＦＧＦ４，８，９および１０を含む繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、ＮＧＦ２．５ｓ、ＮＧＦ７．０ｓおよびベータＮＧＦおよびニューロトロフィン、脳由来神経栄養因子を含む神経成長因子（ＮＧＦ）、関節由来因子、骨増殖因子（ＢＧＦ）、塩基性繊維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）ＩおよびＩＩ、肝細胞増殖因子、グリア神経栄養増殖因子（ＧＤＮＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、角質細胞増殖因子（ＫＧＦ）、ＴＧＦアルファ、ベータ、ベータ１、ベータ２、ベータ３を含むトランスフォーミング増殖因子（ＴＧＦ）、骨格増殖因子、骨マトリックス由来増殖因子および骨由来増殖因子およびそれらの混合物を含む。
【００９１】
本発明に有用なサイトカインには限定するわけではないが、カルジオトロピン、ストロマ細胞由来因子、マクロファージ由来ケモカイン（ＭＤＣ）、メラノーマ増殖刺激活性（ＭＧＳＡ）、マクロファージ炎症タンパク質１アルファ（ＭＩＰ−１アルファ）、２、３アルファ、３ベータ、４および５、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７，ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＴＮＦ−アルファおよびＴＮＦ−ベータを含む。
【００９２】
本発明に有用な免疫グロブリンには限定するわけではないが、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびそれらの混合物を含む。幾つかの好適な増殖因子にはＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）、ＮＧＦ（神経成長因子）、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＦＧＦｂ、ＦＧＦａおよびＢＧＦを含む。
【００９３】
治療薬もしくは生物製剤として有用な他の分子には、限定するわけではないが、成長ホルモン、レプチン、白血病阻害因子（ＬＩＦ）、エンドスタチン、トロンボスポンジン、骨形成タンパク質−１、骨誘導因子２および７、オステオネクチン、ソマトメジン様ペプチド、オステオカルシン、インターフェロンアルファ、インターフェロンアルファＡ、インターフェロンベータ、インターフェロンガンマ、インターフェロン１アルファがある。
【００９４】
アミノ酸、ペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質が関与する態様には、任意のサイズおよび複雑さのそのような分子の種類または組み合わせを含むことができる。例には限定するわけではないが、構造タンパク質、酵素およびペプチドホルモンを含む。これらの化合物は種々の機能を提供できる。幾つかの態様では、マトリックスは活性部位の競合を介して酵素活性を抑制する配列を含有するペプチドを含むことができる。他の応用では、免疫応答を促進し、そして免疫を誘発する抗原性の作用物質を、構造物に包含することができる。核酸のような物質には、任意の核酸が存在できる。例には限定するわけではないが、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）がある。ＤＮＡが関与する態様には限定するわけではないが、ｃＤＮＡ配列、任意の起源の天然のＤＮＡ配列、およびセンスおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む。例えばＤＮＡは裸（例えば米国特許第５，５８０，８５９号、同第５，９１０，４８８号明細書）であるか、または錯化もしくはカプセル化（例えば米国特許第５，９０８，７７７号；同第５，７８７，５６７号明細書）されることができる。ＤＮＡは任意の種類のベクター、例えばウイルスもしくはプラスミドベクターに存在できる。幾つかの態様では、使用する核酸は、エレクトロスピンされたマトリックスの内側および／または外側の細胞で遺伝子の発現を促進または抑制するために役立つ。核酸は細胞へのその取り込みを強化するために効果的な任意の形態であることができる。
【００９５】
包含された治療薬もしくは生物製剤と関連してエレクトロスピンされたマトリックスの状態は、治療薬／生物製剤がカプセル化されているかどうかにかかわらず、カップリング化学、マトリックス化合物の選択、使用するＱＤの種類、溶媒（１もしくは複数）、およびこれら溶媒中のマトリックス化合物の溶解性により制御され得る。これらのパラメーターは、治療薬／生物製剤の放出を制御するために操作することができる。治療薬／生物製剤はエレクトロスピンされたマトリックスに封入もしくは引っ掛け、マトリックスに結合され、エレクトロスピンされたマトリックス（例えば繊維、原繊維、粒子）の腔、囲い、含有物またはポケット、または構造に含ませるか、あるいはマトリックス上の特異的部位に外部的に結合され得る。
【００９６】
また治療薬もしくは生物製剤は封入、例えばＱＤを含むポリマーにカプセル化され得る。カプセル化されたＱＤ剤は、少なくとも１つの天然化合物および少なくとも１つの合成化合物を含んでなる溶液と混合され、そしてマトリックスにエレクトロスピンされる。
【００９７】
特に治療薬もしくは生物製剤およびナノ粒子（例えば量子ドット）は、封入またはカプセル化されて「ナノカプセル」を製造することができる。作用物質およびナノ粒子を含有するこれらのナノカプセルは、標準的なカプセル化法で製造され得る。作用物質のマイクロカプセル化には一般に３工程が関与する：（ａ）作用物質を包むマイクロカプセルを生成し（例えば細胞を含有する液体のアルギン酸塩の液滴を形成し、続いて塩化カルシウムの溶液に暴露して固体ゲルを形成することにより）、（ｂ）生じたゲル化球をさらに外側コーティングでコーティングして（例えばポリリシンおよび／またはポリオルニチンを含んでなる外側コーティング）、半透膜を形成し；そして（ｃ）元の芯のゲルを溶かす（例えばクエン酸ナトリウムの溶液を使用する錯化による）。この３工程は典型的には標準食塩水中での洗浄により分けられる。
【００９８】
アルギン酸塩はマンヌロン酸およびグルロン酸残基の線状ポリマーである。一価のカチオンアルギン酸塩、例えばＮａ−アルギン酸は一般に溶解性である。Ｃａ２＋、Ｂａ２＋またはＳｒ２＋のような二価のカチオンはグルロン酸塩と相互作用する傾向があり、架橋結合を提供し、そして安定なアルギン酸塩ゲルを形成する。アルギン酸塩のカプセル化技法は、典型的には二価カチオン溶液の存在下でアルギン酸塩のゲル化を利用する。作用物質−ナノ粒子のアルギン酸塩のカプセル化は一般に、作用物質−ナノ粒子を懸濁して、一価カチオンのアルギン酸塩の溶液中にカプセル化されるようにし、この溶液の液滴を形成し、そして液滴を二価カチオンの溶液と接触させることが関与する。二価カチオンは液滴と二価カチオンの溶液との間の相転移でアルギン酸塩と相互作用し、形成されるべき安定なアルギン酸塩ゲルマトリックスの形成をもたらす。この技法の変法が米国特許第５，７３８，８７６号明細書に報告され、ここで細胞は多価イオンの溶液（例えば二価カチオン）でおおい、次いでゲル化ポリマー（例えばアルギン酸塩）の溶液に懸濁して、ポリマーのコーティングを提供する。
【００９９】
作用物質−ナノ粒子をマイクロカプセル化する別の方法は、アルギン酸塩−ポリアミノ酸技法である。細胞は塩水中でアルギン酸ナトリウムに懸濁され、そして小島を含有する液滴が生成される。細胞を含有するアルギン酸塩の液滴は塩水中で塩化カルシウムに流入する。負に荷電したアルギン酸塩の液滴はカルシウムに結合し、そしてアルギン酸カルシウムゲルを形成する。このマイクロカプセルは塩水で洗浄され、そしてポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）またはポリ−Ｌ−オルニチン（またはそれらの組み合わせ）とインキュベーションされる；正に荷電したポリ−ｌ−リシンおよび／またはポリ−Ｌ−オルニチンはカルシウムイオンと置き換わり、そして（イオン性の）負に荷電したアルギン酸塩に結合し、外側にポリ−電解質膜を生じる。アルギン酸ナトリウムの最終的コーティングは、マイクロカプセルを、ポリ−Ｌ−リシンおよび／またはポリ−Ｌ−オルニチン層にイオン的に結合するアルギン酸ナトリウムの溶液で洗浄することにより加えることができる。Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌへの米国特許第４，３９１，９０９号明細書を参照にされたい（すべての米国特許は引用により全部、本明細書に編入することを意図する）。この技法は、いわゆる「単壁（ｓｉｎｇｌｅ−ｗａｌｌ）」マイクロカプセルと呼ばれて来た。好適なマイクロカプセルは本質的に丸く、小さく、しかも均一なサイズである。（Ｗｏｌｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｐｐｌｉ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ．３：２８１（１９９２））。
【０１００】
次いでアルギン酸塩−ポリリシンマイクロカプセルも、クエン酸ナトリウム中でインキュベーションして、ポリ−ｌ−リシンと反応しなかったいかなるアルギン酸カルシウムも可溶化することができ、すなわち小島細胞を含有するアルギン酸ナトリウムの内部の芯を可溶化し、これにより液状化した細胞含有芯部分を持つマイクロカプセルを生じる。Ｌｉｍ  ａｎｄ  Ｓｕｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１０：９０８（１９８０）を参照にされたい。そのようなマイクロカプセルは本明細書では「錯化（ｃｈｅｌａｔｅｄ）」、「中空（ｈｏｌｌｏｗ）」または「液体」の芯を有すると呼ぶ。「二重壁」マイクロカプセルは、単壁マイクロカプセルに関する手順と同じ手順に従い生成されるが、クエン酸ナトリウムとインキュベーションする前に、マイクロカプセルは再度、ポリ−ｌ−リシンおよびアルギン酸ナトリウムとインキュベーションされる。
【０１０１】
作用物質をカプセル化する多くの別の技法が当該技術分野では知られ、そして本発明で使用することができる。米国特許第５，０８４，３５０号明細書は、より大きなマトリックスに封入されたマイクロカプセルを開示し、ここでマイクロカプセルはいったん大きなマトリックス内にあれば液化される。Ｔｓａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第４，６６３，２８６号明細書は、アルギン酸塩ポリマーを使用したカプセル化を開示し、ここでゲル層はポリリシンのようなポリカチオン性ポリマーで架橋結合され、そして第２層が第２のポリカチオン性ポリマー（ポリオルニチンのような）を使用して形成され：次いで第２層はアルギン酸塩により被覆され得る。Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，７６２，９５９号明細書は、芯にポリマー性物質を含む、定めたアルギン酸塩カルシウム／バリウムの比率の固体（非錯化）アルギン酸塩ゲル芯を有するマイクロカプセルを開示する。Ｈｕｂｂｅｌｌへの米国特許第５，８０１，０３３号および同第５，５７３，９３４号明細書は、最後にポリマー性コーティング（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を有するアルギン酸塩／ポリリシン微小球を記載する；Ｓａｗｈｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １３：８６３（１９９１）は、生体適合性を改善するために、マイクロカプセル表面にポリ−ｌ−リシンおよびポリエチレンオキシドのグラフトコポリマーを包含するアルギン酸塩／ポリリシンマイクロカプセルを記載する；米国特許第５，３８０，５３６号明細書は、ポリエチレン（オキシド）のような水溶性非イオン性ポリマーの最外層を持つマイクロカプセルを記載する。Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，２２７，２９８号明細書は、すでにポリリシンアルギン酸塩で被覆された細胞に対して第２のアルギン酸塩ゲルコーティングを提供する方法を記載する；両アルギン酸塩コーティングがポリリシンで安定化される。Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．への米国特許第５，５７８，３１４号明細書は、精製されたアルギン酸塩の多くのコーティングを使用してマイクロカプセル化する方法を提供する。Ｄｏｒｉａｎへの米国特許第５，６９３，５１４号明細書は、非繊維形成誘導性アルギン酸塩の使用法を報告し、ここでアルギン酸塩コーティングの外面は、カルシウムイオンおよび／またはマグネシウムイオンを含んでなるアルカリ土類金属カチオンと反応させて、アルカリ土類金属アルギン酸塩コーティングを形成する。アルギン酸塩コーティングの外面は、ポリリシンと反応しない。Ｓｏｏｎ−Ｓｈｉｏｎｇへの米国特許第５，８４６，５３０号明細書は、カプセル化前に、個別に重合可能なアルギン酸塩、またはポリリシンのような重合可能なポリカチオンで被覆された細胞を含有するマイクロカプセルを記載する。
【０１０２】
１つの態様では、ヘパリンがナノ粒子にカップリングされ、そしてヘパリンの放出動力学の制御をモニタリングすることができる。当業者は制御放出動力学が、ナノカプセルサイズ、ヘパリンおよび量子ドットの負荷量、およびポリマー組成を含むカプセル化パラメーターに依存すると考える。ナノ粒子の平均直径は、調製工程の混合速度および調製媒質の粘度に依存する。ナノカプセルのサイズは調製物を約３０秒から約１２０秒の範囲にわたり超音波に暴露することにより、超音波の強度を約５ワットから約２０ワットに上げることにより、または有機ポリマー相対水性ヘパリン相の比率を変動させることにより下げることができる。ナノカプセルのサイズは走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）、コールターカウンターおよび光散乱により特性決定することができる。
【０１０３】
１つの態様では、ヘパリンがＥＤＣ／ＮＨＳ化学法を使用することにより量子ドットに結合され得る。種々の濃度のヘパリン（１０〜３０重量％ポリマーの範囲）および量子ドットを使用して最適な負荷効率を決定することができる。
【０１０４】
ポリマーのカプセル化には、ＦＤＡ認可の生分解性ポリマー（ＰＬＡ、ＰＬＧＡ、ＰＣＬ）を、カプセル化およびインビボでナノカプセルの分解の制御に使用することができる。
【０１０５】
実施例は、ヘパリン放出のバーストが広域赤外線（ＩＲ）源を使用して起こることを示す。生理学的バッファー中に懸濁されたＱＤ−ヘパリンナノカプセル（ＮＣ）の測定量を使用して、放出動力学に及ぼす波長、強度および照射時間の変動の影響を測定することができる。１つの態様では、ＱＤ−ヘパリンで使用した照射の波長は、フィルターを通したキセノン源を使用して、７００ｎｍ、８００ｎｍおよび９００ｎｍのような近赤外線波長の範囲であることができる。照射エネルギーの強度は、０（対照）から１ｍＷ／ｃｍ２、１０ｍＷ／ｃｍ２、１００ｍＷ／ｃｍ２、１Ｗ／ｃｍ２および１０Ｗ／ｃｍ２の増分段階で調整することができる。照射時間もそれぞれの効果的な出力強度で、最適な照射時間を決定するために変動させることができる。照射時間は０（対照）から、１０、６０、３００および６００秒の暴露で変動し得る。
【０１０６】
カプセル化されたＱＤ−ヘパリンは、ナノカプセルに超構造的変化を誘導する量子ドットの局所化された加熱により近赤外線（ＮＩＲ）照射で放出される。放出動力学は、ヘパリンの制御された放出を生じるために、ＮＩＲ照射の強度および時間を調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）することにより、標的部位で変動させる。ナノカプセルから放出されるヘパリンの定量的測定は、経時的に測定することができ（２、４、６、１２および２４時間、およびその後３０日まで毎日）、そしてその抗−因子Ｘａ活性についてキットのＲｏｔａｃｈｒｏｍ（ダイアグノスティカ  スタゴ社：Ｓｉａｇｎｏｓｔｉｃａ  Ｓｔａｇｏ  Ｉｎｃ．）を使用して合成発色基質を用いて測定することができる。
【０１０７】
別の観点では、本発明は組織を工作した構造物の組織の改造をモニタリングすることに関する。ゆっくりと起こる改造は、周囲組織の病的応答および管のコンプライアンスの不釣り合いを生じる。急速な改造は工作される構造物に未熟な失敗を生じる恐れがある。磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）は、改造工程をモニタリングするために長い間使用することができる強力で、非侵襲的な技法である。ナノ粒子（例えばＱＤ、画像強化剤）は、脱細胞化マトリックスおよびエレクトロスピンされたマトリックスの両方に容易に結合することができ、そしてまたエレクトロスピンされたマトリックスのナノファイバー内に埋め込まれ得る。ナノ粒子は高ＭＲＩコントラストを提供し、そしてそれらの小さいサイズにより標準的な生物学的プロセスを妨害しない。ガドリニウム（Ｇｄ）のような常磁性金属を含有する有機ランタニド錯体は、電磁場でゆがみを生じることが知られてきた。水中でプロトンがこの歪んだ場と相互作用する時、それらの磁気的特性は有意に変化してＭＲＩにより検出できる。実施例は、強化された造影が、血管マトリックスまたはナノカプセルの表面に結合し、および／または中に取り込まれたＧｄ機能化ナノ粒子を用いたＭＲＩコントラストを使用して観察されたことを示す。コントラスト強化剤の他の例には、限定するわけではないがセリウム、サマリウム、テルビウム、エルビウム、ルテチウム、スカンジウムのような希土類金属、バリウム、ビスマス、セリウム、ジスポロジウム、ユーロピウム、ハフニウム、インジウム、ランタン、ネオジミウム、ニオビウム、プラセオジミウム、ストロンチウム、タンタル、イッテルビウム、イットリウムおよびジルコニウムがある。
【０１０８】
１つの態様では、作用物質はペプチド結合によりマトリックスに連結される。例えばナノ粒子は、ペプチド結合を形成するためにＥＤＣ（１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド）およびスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロシル−スルホ−スクシンイミド）を使用してマトリックスの一部として包含され得る。種々の他の既知の技法を、例えばＨｅｕｍａｎｓｏｎ、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、アカデミック出版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア州、１９９６（引用により本明細書に編入する）に記載されているように使用することができる。例えば外部の機能化には、カルボキシレートとアミノ基との間にペプチド結合を形成するために、ペプチド結合はＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ法を使用してマトリックスとカルボキシル化ガドリニウムナノ粒子との間に形成することができる。治療薬／生物製剤、コントラスト強化剤、例えばガドリニウムまたは両方にカップリングした量子ドットは、各成分を少なくとも１つの天然成分および少なくとも１つの合成化合物を含む溶液に包含させることにより、エレクトロスピンされたマトリックスの内部に加えることもできる。例えばコラーゲンＩ、エラスチンおよびＰＬＧＡを含有する溶液は、実施例に記載するようにエレクトロスピンでコントラスト強化剤ガドリニウムを成功裏に包含した。ガドリニウムのマトリックスへの包含は、磁気共鳴造影法（ＭＲＩ）のような検出法を使用してインビトロおよびインビボで観察することができる。このようにコントラスト剤で機能化されたマトリックスで、マトリックスの分解がモニタリングできるようになる。
【０１０９】
任意の種類の官能化法を使用することができる。幾つかの可能な官能化化学の例には限定するわけではないが、エステル化（例えばアシルハライド、酸無水物、カルボン酸または交換反応を介するエステルを用いて）、エーテル形成（例えばウィルアムソンのエーテル合成を介して）、イソシアネートを用いた反応を介するウレタン形成、例えばクロロスルホン酸を用いるスルホン化、および広い様々な化合物と反応するためにジアゾに転換することができるアミン誘導体を提供するためのｂ−スルファト−エチルスルホニルアニリンの反応を含む。そのような化学は限定するわけではないが、クラウンエーテル（Ｋｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２１，２７７７）、酵素（Ｃｈａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７，２０５）、およびヌクレオチド（Ｏｖｅｒｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．２７，３５８９）を含め、エレクトロスピンされたマトリックスに広い種類の物質を付けるために使用することができる。
【０１１０】
Ｖ．細胞の培養
人工組織は、個体自身の組織に由来する同種異系の細胞群を使用することにより作成することができる。人工組織は異種であることもでき、この場合、細胞群は個体と異なる哺乳動物種に由来する。例えば組織細胞はサル、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギおよびヒツジのような哺乳動物に由来することができる。
【０１１１】
単離された細胞は、好ましくは個体自身の組織から綿棒もしくは生検により得られた細胞である。生検は処置を迅速および簡単にする局所麻酔下で生検針を使用することにより得ることができる。次いで単離された組織の小さい生検コアを拡大し、そして培養して組織細胞を得ることができる。同種の親戚または他のドナーに由来する細胞も、適切な免疫抑制を用いて使用することができる。
【０１１２】
細胞の単離および培養に関する方法は、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ、動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）、基本技術のマニュアル（Ａ  Ｍａｎｕｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）、第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ社、ニューヨーク、１９８７、第９章、１０７〜１２６頁に検討されている。細胞は当業者に知られている技法を使用して単離することができる。例えば組織を小片に切断し、機械的に凝集を解き（ｄｉｓａｇｇｒｅｇａｔｅｄ）、かつ／または隣接する細胞間の結合を弱める消化酵素および／または認められる細胞の破損なしに個々の細胞を懸濁液に組織を分散することを可能にするキレート剤で処理することができる。必要ならば酵素解離は、組織を細かく切り刻み、そして刻んだ組織を単独もしくは組み合わせた任意の数の消化酵素を用いて処理することにより行うことができる。これらの酵素には限定するわけではないが、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼおよび／またはヒアルロニダーゼ、ＤＮａｓｅ、プロナーゼおよびジスパーゼを含む。機械的破壊は限定するわけではないが、幾つかを挙げれは組織の表面を掻き取ること、グラインダー、ブレンダー、篩、ホモジナイザー、細胞の圧縮、または超音波細胞打砕機（ｉｎｓｏｎａｔｏｒ）の使用を含む多くの方法により達成することができる。
【０１１３】
細胞型には限定するわけではないが、ヒト内皮細胞のような内皮細胞、種々の細胞に分化するように誘導できる末梢血骨から単離される前駆細胞、幹細胞、約束された（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ）細胞を含み、および／または分化した細胞を使用してもよい。また作成される組織または臓器の種類に依存して、特異的な型に約束された幹細胞を使用することができる。例えば筋芽細胞を使用して種々の筋肉構造を築くことができる。他の種類の約束された幹細胞を使用して、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿道のような臓器または臓器様組織を作成することができる。他の細胞には限定するわけではないが、内皮細胞、筋肉細胞、平滑筋細胞、繊維芽細胞、骨芽細胞、筋芽細胞、神経細胞、繊維芽細胞、神経膠芽細胞；胚芽細胞、肝細胞、軟骨細胞、角質細胞、心筋細胞、連結組織細胞、上皮細胞、内皮細胞、ホルモン−分泌細胞、免疫系の細胞、ニューロン、心臓、腎臓、肝臓、膵臓、脾臓、膀胱、尿管および尿道に由来する細胞等がある。幾つかの態様では、多くの型の幹細胞がいったん所定の臓器に送達されれば、器官特異的パターンで分化を誘導され得るので、使用する幹細胞の型を予め選択する必要はない。例えば肝臓に送達される幹細胞は、肝臓の生化学的環境内に単に幹細胞を置くだけて肝臓細胞になるように誘導され得る。
【０１１４】
また例には遺伝的に操作された細胞、形質転換された細胞、および不死化された細胞も含む。本発明に有用な遺伝的に操作された細胞の一例は、１もしくは複数の所望する分子を作成し、そして分泌する遺伝的に操作された細胞である。遺伝的に操作された細胞を含んでなるマトリックスが生物体に移植される場合、生産される分子は局所的効果または全身的効果を生じることができ、そして可能な物質として上記のように同定される分子を含むことができる。
【０１１５】
細胞は、炎症を抑制または刺激する物質を生産し；治癒を促進し；免疫拒絶に抵抗し；ホルモン補充を提供し；神経伝達を交替し；ガン細胞を抑制または破壊し；細胞の増殖を促進し；血管の形成を抑制または刺激し；組織を増やし；そして以下の組織を補充またはそれと交替する：ニューロン、皮膚、滑液、腱、関節、靭帯、骨、筋肉、臓器、硬膜、血管、骨髄および細胞外マトリックス。
【０１１６】
細胞外マトリックスの形状は、細胞が所望する様式で特異的な型に成長し、そして再生するためのシグナルを送る手助けをすることができる。特異的な型の細胞の成長を促進するために、他の因子および分化インデューサーをマトリックスに加えてもよい。  
【０１１７】
いったん組織が個々の細胞の懸濁物に縮小（ｒｅｄｕｃｅ）したら、懸濁物は細胞の要素を得ることができる部分集団に分画され得る。これはまた、限定するわけではないが特異的細胞型のクローニングおよび選択、望ましくない細胞の選択的破壊（ネガティブ選択）、混合集団における示差的な細胞の凝集能（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｇｇｌｕｔｉｎａｂｉｌｉｔｙ）に基づく分離、凍結−解凍処理、混合集団における細胞の示差的な接着性、濾過、従来の、およびゾーン遠心、遠心的水簸（逆流遠心）、単位重力分離、向流分配、電気泳動および蛍光−活性化細胞ソーティング（例えば、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，（１９８７）動物細胞の培養（Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ）．基本技術のマニュアル（Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、第２版、Ａ．Ｒ．Ｌｉｓｓ社、ニューヨーク、第１１および１２章、１３７〜１６８頁を参照にされたい）を含む細胞分離に関する標準技法を使用して行うこともできる。例えば唾液細胞は蛍光−活性化細胞ソーティングにより濃縮することができる。磁気ソーティングも使用できる。
【０１１８】
また細胞分画は、例えばドナーがガンもしくは腫瘍のような疾患を有する場合に望ましい。細胞群を分別して正常な非ガン細胞からガンもしくは腫瘍細胞を分けることができる。１もしくは複数の分離技術から単離された正常な非ガン細胞は、次いで組織の再構成に使用することができる。
【０１１９】
単離された細胞はインビトロで培養して、生体適合性の基質に播種できる細胞数に上げることができる。人工組織構造物の移植後の免疫応答を防止するために、個体はシクロスポリンもしくはＦＫ５０６のような免疫抑制剤で処置することができる。
【０１２０】
単離した細胞は核酸配列でトランスフェクションしてもよい。有用な核酸配列は、例えば宿主中での免疫応答を下げるか、または排除する遺伝子配列であり得る。例えばクラスＩおよびＩＩ組織適合性抗原のような細胞表面抗原の発現を抑制することができる。加えてトランスフェクションは、遺伝子送達に使用することもできる。細胞は生体適合性代替物上に播種される前に特異的遺伝子でトランスフェクトすることができる。このように培養した細胞は、特定の障害を改善するために役立つ所望のタンパク質を生産する遺伝子産物を発現するように操作することができる。
【０１２１】
エレクトロスピンされたマトリックス上で成長した組織細胞は、移植に有利な遺伝子産物、例えば抗−炎症因子、例えば抗−ＧＭ−ＣＳＦ、抗−ＴＮＦ、抗−ＩＬ−１および抗−ＩＬ−２を生産するように遺伝的に操作することができる。あるいは組織細胞は炎症を促進する天然の遺伝子産物、例えばＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２の発現を「ノックアウト」するか、あるいは拒絶の危険性を下げるためにＭＨＣの発現を「ノックアウト」するために遺伝的に操作することができる。
【０１２２】
例えばレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、ポリエチレングリコール、または当業者に知られている他の方法により細胞を遺伝的に操作する方法を使用することができる。これらの方法には、細胞中で核酸分子を輸送および発現する発現ベクターを使用することを含む。（Ｇｅｏｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，アカデミック出版、サンディエゴ、カリフォルニア州（１９９０）を参照にされたい）。
【０１２３】
ベクターＤＮＡは通例の形質転換またはトランスフェクション技法を介して原核もしくは真核細胞に導入される。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．モレキュラークローニング：ア  ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリー出版（１９８９）および他の研究用テキストブックに見いだすことができる。
【０１２４】
いったんマトリックス上に播種したら、細胞は増殖し、そしてマトリックス上で発育して組織層を形成する。重要なことは、マトリックスは培養基が組織層に達することを可能にするインフラ−構造を有するので、細胞群は成長し、分割し、そして機能的に活性を維持し続けて、インビボの類似構造に似ている形態を有する組織に発育する。
【０１２５】
強化する特定の組織についてインビボで見いだされる細胞の微環境を、培養で元通り（ｒｅｃｒｅａｔｅ）にすることが重要である。インビボの組織構造に類似するか、もしくは同じインフラ構造を保持するマトリックスを使用することにより、細胞−細胞の相互作用、細胞群の発育および分化に関する最適環境が創造される。
【０１２６】
増殖因子および調節因子は、培養中に増殖および細胞の成熟および分化を強化し、改変し、または調節するために培地に加えることができる。培養中の細胞の成長および活性は
、成長ホルモン、ソマトメジン、コロニー刺激因子、エリスロポエチン、上皮増殖因子、肝性赤血球生成因子（ヘパトポエチン）等のような種々の増殖因子により影響を受け得る。増殖および／または分化を調節する他の因子は、プロスタグランジン、インターロイキンおよび自然に存在するカローンを含む。
【０１２７】
本発明の人工組織構造物は、様々な応用に使用することができる。例えば人工組織構造物は個体に移植されて、既存の組織に置き換わるか、または増すことができる。個体は、障害を改善するための人工組織または臓器の移植後にモニタリングされることができる。
【０１２８】
人工組織は製剤、化学剤、増殖／調節因子の効力および細胞傷害性について、広い様々な化合物をスクリーニングするためにインビトロで使用することができる。培養物はインビトロで維持し、そして試験する化合物に暴露することができる。細胞傷害性化合物の活性は、培養中の細胞を傷害または殺すその能力により測定することができる。これは生きている（ｖｉｔａｌ）染色技術により容易に評価することができる。増殖／調節因子の効果は、マトリックスの細胞含量を分析することにより、例えば総細胞カウントおよび示差的（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）細胞カウントにより評価することができる。これは、型特異的な細胞抗原を定める抗体を使用する免疫細胞化学的技法の使用を含む標準的な細胞学的および／または組織学的技法を使用して達成することができる。人工組織で培養された標準細胞に及ぼす種々の薬剤の効果を評価することができる。
【０１２９】
ＶＩ．予備調整する小室
血管は、予備調整する小室の１つの態様である図１１に示すように、予備調整する小室で作成することができる。小室の寸法は、細胞を播種したマトリックスを保持することができるようなものである。適切なサイズの範囲は、約２００×２００×６００ｍｍ、１００×１００×３００ｍｍ、好ましくは約５０×５０×１５０ｍｍのレンジフォーム（ｒａｎｇｅ  ｆｏｒｍ）である。図１１Ａは、第１および第２の長壁４２および第１および第２の短壁４４を持つ予備調整する小室４０の１つの態様の上面図である。第１および第２の短壁４４はそれぞれ、取り付け要素５２を有する容器５０を保持することができるプラットホーム４８を収容する開口４６を有する。細胞を播種したマトリックス（破線で示す）は、容器の第１および第２の取り付け末端５３に取り付けることができる。容器は、生物学的流体を容器５０の一端を介し、細胞を播種した取り付けた管状マトリックスを介し、そして容器のもう一端に連続する様式でポンプ送液することができる流体流系（示さず）と操作可能に連結される。図１１Ｂは、図１１Ａの予備調整す小室の側面を示し、そして図１１Ｃは図１１Ａの断面を示す。
【０１３０】
生物学的流体は、ギアポンプのような任意のポンプメカニズムを使用してポンプ送液することができる。小室はさらに小室を所望する角度、例えば４５゜、９０゜、１８０゜および３６０゜で回転するために使用できる回転デバイスを含んでなることができる。回転デバイスは手動で操作することができ、または小室を所望する速度および所望する時期に回転するように自動化することができる。別の態様では、小室を複数の小室とし（ｍｕｌｔｉｃｈａｍｂｅｒｅｄ）、そして１より多くの血管を収容することができる。別の態様では、播種したマトリックスの内側および外側の両方が本発明の予備調整する小室を使用して予備調整され得る。そのような態様では、小室を取り付けた播種したマトリックスを覆うことができる予備調整流体の容量で満たす。マトリックスの外側の生物学的流体の流体流は、マトリックスの内側の流体流と同じか、または別のメカニズムにより制御することができる。外側の生物学的流体は、内側の生物学的流体と同じでよい。代わりにまたは外側の生物学的流体は、内側の生物学的流体と異なってもよい。流体流のパラメーターは、内側および外側の生物学的流体と同じであるか、または異なることができる。
【０１３１】
予備調整する小室の壁は、物質が生物学的流体と反応しない限り、プレキシグラス、プラスチック等のような任意の適切な物質から作成することができる。生物学的流体は連続的な一方向流、例えば約１ダイン／ｃｍ２〜約３０ダイン／ｃｍ２の範囲の壁体剪断応力を誘導するために、経時的に増分することができる連続的な流速で、取り付けたマトリックスの内側表面（管腔）を通って運ばれることができる。またマトリックスの予備調整には、生物学的流体をパルス流、例えば約１０ダイン／ｃｍ２〜約４５ダイン／ｃｍ２の範囲の壁体剪断応力を誘導するために、経時的に増分される脈拍数を有するパルス流で、取り付けたマトリックスの内側を通って運ぶことが関与し得る。脈拍数は約６０〜２００ｍｍＨｇの範囲で強化された血管に壁圧分布の誘導するために、経時的に増分することができる。異なる、または同じ生物学的流体を使用して、マトリックスの外側を予備調整することができる。
【０１３２】
工作された血管が自然な血管と同じ流体流の動力学に暴露されるように、生物学的流体は血管を模する組成および粘度を有することができる。生物学的流体の例は、任意のバッファー、生理学的流体の媒質（例えば１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ）を含むことができる。流体の粘度は１００ｋＤａのデキストランのような高分子量タンパク質を加えることにより改変することができる。他の分子量のデキストランを使用することもできる。使用するデキストランの量は分子量に依存し、そして約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％および６０％の範囲であることができると考えられる。組成は塩のような他の血液様成分を加えることにより変動させてもよい。
【０１３３】
予備調整する小室は、心臓弁のような他の組織を予備調整するために使用することができると考えられる。生体内の心臓弁は動的な流れの環境下で機能するが、リーフレットの細胞代謝のほとんどの実験は静的培養中に行われてきた。本方法は、流れが播種した細胞により生産されるコラーゲンおよびエラスチンおよびグリコサミノグリカン生合成のようなタンパク質の調節および発現に効果を及ぼすことができるような動的流動条件下で、播種した細胞の活性を模する。さらに動的流れは弁リーフレット上の細胞の方向性（ｏｒｉｅｎｔａｔｉｏｎ）に影響を及ぼすことができる。
【０１３４】
工作した弁は、個体の末梢血液循環から単離された前駆細胞から分化された内皮細胞および筋肉細胞を播種したマトリックスから作成できる。次いで播種された弁マトリックスは、心臓、例えば大動脈弁の動的流れの環境を模する滅菌された拍動性の流系に暴露されることができる。
【０１３５】
このように本発明の方法および組成物は、心臓における血流の高応力環境下に暴露された時、弁のリーフレット上に細胞の再集合の付着およびそれらの機能性を考慮している。弁のリーフレットは、リーフレット上でどのように良く細胞が成長し、そして機能するかに影響を及ぼすことができる幾つかの機械的力に暴露される。弁が心拡張中に閉じた時、弁は系の圧（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）、リーフレットの大動脈側上（線維板：ｌａｍｉｎａ  ｆｉｂｒｏｓａ）の細胞に直接影響を及ぼす正常応力を支持しなければならない。この応力はコラーゲン繊維に並んだ組織内の細胞にも伝達され得る。一方、リーフレットの心室面は血液が弁を通って排出される時、心収縮中に流体剪断応力を経験する。移植した弁を介する流れの多回刺激は、この剪断応力がピークの収縮で１３０ダイン／ｃｍ２を越える可能性があることを示す。曲げ応力は心周期の過程中にリーフレットの運動から生じ、そして細胞の挙動および機能に影響を及ぼす可能性がある。
【０１３６】
播種された細胞に及ぼす流速、周期の周波数（ｃｙｃｌｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）および圧の効果を調査することができる。これはリーフレットのマトリックス上に播種された細胞の保持に関する条件の至適化、およびどのようにこれらの物理的因子がこれら細胞の活性、付着および機能に影響を及ぼすかの調査を可能とする。この拍動性の流れは、外植細胞の付着、移動および活性の両方を修飾するために使用できるので、最適な細胞密度および自然な弁のリーフレットの典型的な機能を達成することができる。
【０１３７】
剪断応力、圧および周期の周波数の組み合わせにより改変される細胞の出来事は多いが、流れの条件がどのように外植細胞と組織マトリックスの相互作用に影響を及ぼすかを考慮する特に興味深い事柄には、細胞の付着性、増殖速度、移動速度および細胞外マトリックスタンパク質を作成する細胞の能力がある。細胞表面上に見いだされる接着タンパク質の中で、細胞と細胞外マトリックスとの間の最強の力はインテグリンにより媒介される（Ｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５５：５２５−５２８）。これら各タンパク質は、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニンおよびビトロネクチンのような特定のマトリックスタンパク質に対する特異性を有する。インテグリンの合成およびそれらのｍＲＮＡの発現は、１．５ダイン／ｃｍ２の剪断の大変低レベルの剪断応力でも内皮細胞により調節される（Ａｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６７：Ｃ６７９−Ｃ６８７）。流れはインテグリン合成に影響を及ぼすだけでなく、脱着に対する抵抗を増すために細胞表面上のこれらタンパク質の局在の認識の助けにもなる（Ｄａｖｉｅｓ（１９９５）Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ  ７５：５１９−５６０）。心圧の過剰負荷は心室細胞が増殖し、そしてコラーゲンの合成および沈着の上昇を直接引き起こすことが可能である。また他の細胞も圧−応答性であり、そして力に応答して改変されたタンパク質合成を示すことが可能である。
【０１３８】
移植前に生育可能な心臓弁を物理的に予備調整する予備調整小室は、心臓弁の全体的な質を有意に改善し、そして血栓形成性、カルシウム沈着および失敗の傾向を下げる。したがって最適な条件の流れ、脈拍数および圧の適用は、生理学的レベルの細胞活性を表すインプラントを提供し、そして延長した耐久性および性能がある移植片を提供する。
【０１３９】
予備調整する小室は心臓の流動力学を模するように設計される。播種されたマトリックスを小室の取り付け部位に取り付けることができる。拍動性ポノプ、例えばピストンポンプ（ビビトロ（Ｖｉｖｉｔｒｏ）、モデルＳＰＳ３８９１）を使用して、拍動性の流れを駆動することができ、この運動は波形生成機でプログラムすることができるので（ビビトロ  モデルＷＧ５８９１）、流れの波形を容易に変更することができる。ピストンは取り付けた弁を通る生理学的流体を置き換えることができる。ピストンの運動は、心臓の周期を刺激するが、６０〜１２０ｂｐｍの可変周期および２〜７．５Ｌ／分の心出力で、流れを生じるようにプログラムすることができる。
【０１４０】
マトリックス上に播種された内皮細胞および平滑筋細胞は、約１〜約５０ダイン／ｃｍ２の範囲、そして好ましくは約１０〜約２５ダイン／ｃｍ２、そして最も好ましくは約１５ダイン／ｃｍ２の剪断応力に暴露することができる。細胞がリーフレットの表面から剪断されるかどうかは、細胞を表面に固定する結合の数および強度に依存する。ほとんどの細胞接着の研究は、内皮に沿って広がり、炎症部位を見いだし、そして付着することができる白血球および好中球のような免疫系の細胞に集中した。予備調整した細胞に対する機械的、生化学的および形態学的変化は、実施例に記載するように評価される。
【０１４１】
ＶＩＩ．マトリックスの使用
本発明の方法および組成物は、治療薬／生物製剤の局所化された送達、ならびに個体の標的部位にそのような作用物質の制御された放出に使用することができる。
【０１４２】
（ｉ）管構造物
本発明の方法および組成物は、血管を構築するために使用することができる。エレクトロスピンされたマトリックスまたは脱細胞化マトリックスの１つの応用は、媒体および小径の管構造物の形成にある。この態様のための幾つかの好適な物質はコラーゲンおよびエラスチン、特にコラーゲンＩ型およびコラーゲンＩＩＩ型である。血管構造物の例には、限定するわけではないがバイパスもしくはグラフトのための冠状血管、大腿部動脈、膝窩動脈、上腕動脈、脛骨動脈、ぎょう橈骨動脈または対応する静脈を含む。エレクトロスピンされた物質は、内皮細胞および平滑筋細胞と組み合わせた時、特に有用である。先細型および／または分枝型血管を含むより複雑な形状も構築され得る。
【０１４３】
種々の形状の主軸が大きな繊維を回りに巻き取るために、またはエレクトロスピンされたポリマーを指向するために必要である。
【０１４４】
管マトリックスでの幾つかの複雑さは、（１）血栓の形成および（２）インビボで管移植片の完全性を定量的に監視することができない点である。血栓形成の問題は、管移植片のよくある失敗をもたらす最も難しい課題の幾つかである。有力な抗凝固剤であるヘパリンは、血栓の形成を回避するために通常、臨床的に投与されている。しかしヘパリンの全身的使用は特定量の危険性があり、すなわち局所的に投与されるヘパリンが好ましい。本発明の方法および組成物は、量子ドットに基づくナノテクノロジーを利用することにより、薬剤放出の制御の欠損を克服するために使用することができる。具体的には、ＮＩＲエネルギーを使用した量子ドットからの放出を誘起することにより、標的の場所（管移植片）でヘパリンのような抗凝固剤の放出の加速。これにより抗凝固剤、例えばヘパリンの放出動力学を調節できるようにする。
【０１４５】
実施例の章で示す実験は、近赤外線（ＮＩＲ）量子ドットに結合したヘパリンがナノ粒子および管スカフォールドに成功裏に包含されることができ、近赤外線の暴露により開始される経時的なヘパリンの放出制御（またはバースト放出）を可能とすることを示す。
【０１４６】
ガドリニウムのようなＭＲＩコントラスト剤も、成功裏にスカフォールドに取り付けられるか、または包含されて視覚化を強化した。このように管スカフォールドからヘパリンの制御された放出は、近赤外線（ＮＩＲ）量子ドットおよびヘパリンを使用して達成でき、そして（２）管スカフォールド上で機能化されるか、または中に包含されるナノコントラスト剤を使用してヘパリンの放出を評価し、そしてモニタリングすることができる。
【０１４７】
（ｉｉ）組織臓器構造物
本発明の方法および組成物は、工作された組織臓器構造物、または臓器構造物の一部、例えば心臓、心弁、肝臓、腎臓等を構築するために使用できる。生体工学によって組織または臓器を作るためにエレクトロスピンされた物質およびマトリックスを使用する能力は、生体工学によって作成される広範な組織代替的応用を創造する。生体工学によって作られる部品の例には限定するわけではないが、血管、心臓、肝臓、腎臓、骨格筋、心筋および神経ガイドを含む。幾つかの態様では、そのようなマトリックスはインプラントの機能を改善する治療薬と合わせられる。例えば抗生物質、抗炎症剤、局所麻酔薬またはそれらの組み合わせを生物工学で作った臓器のマトリックスに加えて、治癒プロセスを早め、そして不快を減少することができる。
【０１４８】
（ｉｉｉ）物質の送達
本発明の方法および組成物は、１もしくは複数の治療薬を所望する場所に送達するために使用することができる。本組成物は治療薬をインビボの場所に、インビトロの場所に、または他の場所に送達するために使用することができる。本組成物は任意の方法を使用してこれらの場所に投与され得る。あるいは細胞を含有するエレクトロスピンされたマトリックスが体内に移植され、そして移植後の細胞により生産された分子を送達するために使用することができる。
【０１４９】
治療薬の選択およびその薬をエレクトロスピンされた物質と組み合わせる方法は、物質の放出プロファイルに影響する。作用物質がエレクトロスピンされたマトリックスにより固定化される程度まで、放出速度はエレクトロスピンされた物質が分解する速度により一層緊密に関連する。例えば治療薬はマトリックスとエレクトロスピンされ、そしてエレクトロスピンされたフィラメント中に封入され、この場合、放出の動力学はエレクトロスピンされたマトリックスが分解する速度により決定される。別の態様では、治療薬はＱＤとカップリングされ、そしてマトリックスにエレクトロスピンされる。そのような場合、放出の動力学は治療薬とＱＤとの間のカップリング結合を破壊して治療薬を放出する照射エネルギーの適用により制御される。別の態様では、治療薬はポリマーマトリックスにカプセル化され、そしてカプセル化された治療薬をエレクトロスピン工程中に加えることができるので、カプセル化された治療薬がマトリックスに埋包される。これらの状況下で、放出の動力学はエレクトロスピンされたマトリックスが分解する速度、ならびにカプセル化するポリマーの性質および分解特性に依存する。さらに別の態様では、治療薬を量子ドットにカップリングし、そしてカプセル化し、次いでエレクトロスピンしてマトリックスに埋包されるようにすることができる。そのような状況下では、放出の動力学は治療薬とＱＤとの間のカップリング結合を破壊して治療薬を放出する照射エネルギーの適用により制御される。物質の放出速度に影響を及ぼすエレクトロスピンされた物質の孔性も調節することができる。
【０１５０】
例えばオリゴヌクレオチド、プロモーターまたは細胞接着のインヒビター、ホルモンおよび増殖因子を初めとする細胞の機能に影響を及ぼす化学物質がエレクトロスピンされたマトリックスに取り込まれ、そしてエレクトロスピンされたマトリックスからそのような物質の放出は、エレクトロスピンされたマトリックス中の細胞の発現もしくは他の機能を制御する手段を提供することができる。
【０１５１】
幾つかの態様における放出の動力学は、任意の手段を介してエレクトロスピンされた物質を架橋結合することにより操作される。幾つかの態様では、架橋結合はエレクトロスピンされたマトリックスの構造的な剛性を上げ、そしてその後の溶解を遅らせることにより、例えばエレクトロスピンされたマトリックスが分解する速度、またはエレクトロスピンされたマトリックスから化合物が放出される速度を改変する。エレクトロスピンされたマトリックスは架橋結合剤の存在下で形成されることができ、またはエレクトロスピン後に架橋結合剤で処理することができる。物質を架橋結合する任意の技術を、当業者に知られているように使用することができる。架橋結合剤の例には、限定するわけてはないが、アルデヒド、例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミドＥＤＣ（１−エチル−３（３−ジメチル  アミノプロピル））のような縮合剤、光の特定波長への暴露で架橋結合する光感受性物質、オスミウムテトラオキシド、塩酸カルボジイミドおよびＮＨＳ（ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）がある。
【０１５２】
またマトリックスの放出動力学は、エレクトロスピンされるマトリックスの物理的および化学的組成を操作することにより制御される。例えばＰＬＧＡの小さい繊維は、ＰＬＧＡのより大きな直径の繊維よりも加水分解に感受性である。より小さいＰＬＧＡ繊維からなるエレクトロスピンされたマトリックス内に送達される作用物質は、より大きな直径のＰＬＧＡ繊維からなるマトリックス中で調製された場合よりも早く放出される。
【０１５３】
エレクトロスピンされるマトリックスの物理的処理は、放出動力学を操作する別の方法である。幾つかの態様では、圧縮のようなエレクトロスピンされるマトリックスに適用される機械的な力が、マトリックスの結晶構造を改変することによりマトリックスの分解を促進する。マトリックスの構造はこのように放出の動力学に影響を与えるように操作することができる別のパラメーターである。ポリウレタンおよびポリ（エチレン−コ−酢酸ビニル）のような他の弾性物質、シリコンおよびポリジエン（例えばポリイソプレン）、ポリカプロラクトン、ポリグルコール酸および関連するポリマーは、放出速度が機械的歪み（ｓｔｒａｉｎ）により改変できる物質の例である。
【０１５４】
ＶＩＩＩ．保存 
マトリックスは保存され、そして移植直前にそれに細胞を播種することにより使用することができる。多くのエレクトロスピンされたマトリックスは、いったんスピンされると乾燥され、そして乾燥もしくは凍結状態で保存することができる。保存条件は使用したエレクトロスピンされた化合物、および治療薬がマトリックス上または中に包含されているかどうかに依存する。治療薬が包含されている態様では、マトリックスは０℃未満の温度で真空下、または凍結乾燥状態で保存することができる。他の保存条件、例えばマトリックス中および上の物質に依存して室温、暗中、真空もしくは減圧下、不活性な雰囲気下、冷蔵温度、水性もしくは他の液体溶液中、または粉末状態を使用することができる。
【０１５５】
マトリックスは照射および加熱のような当業者に知られている通常の手段を介して滅菌することができる。またマトリックスはバクテリアの成長を阻害するためにチメロサールのような静菌剤と組み合わせることもできる。幾つかの態様では、組成物は化学品、溶液、または保存および輸送に安定性を与える方法で処理することができる。
【０１５６】
本発明の他の態様および使用は、本明細書に開示する本発明の明細および実施を考慮することより当業者には明らかとなるだろう。本明細書に引用するすべての米国特許および参考文献は、どのような理由でも参照により特別に編入する。明細書および実施例は例としてのみ考えるべきであり、本発明の真の範囲および精神は特許請求の範囲により示される。
【実施例】
【０１５７】
実施例１：方法および材料
材料
他に言及しない限り、すべての化学品はシグマ（Ｓｉｇｍａ）（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。ＥＣＬバッファーおよび１２５Ｉ−ナトリウムはパーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）ＮＥＮ（ボストン、マサチューセッツ州）から購入した。コラゲナーゼＩＩ型（１ｍｇ／ｍｌ）はベーリンガーマンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）（マンハイム、ドイツ）から購入した。内皮培地（ＥＢＭ−２）はカムブレックスバイオサイエンス（Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）（ウォーカーズヴィル、メリーランド州）から購入した。ＰＣＲ試薬およびプライマー、Ｍ１９９培地、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）およびペニシリンは、ライフテクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ゲチスバーグ、メリーランド州）から購入した。塩基性繊維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）は、Ｊｕｄｉｔｈ  Ａｂｒａｈａｍ（サイオス  ノバ、カリフォルニア州）からの贈呈であった。抗ヒトＣＤ３１抗体、抗−フォンビルブランド因子（ｖＷＦ）、および抗−平滑筋アクチン抗体は、ダコ（ＤＡＫＯ）（グロストラップ、デンマーク）から購入した。抗−ＣＤ１０５抗体はＢＤファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した。抗Ｆｌｋ−１抗体は、サンタクルズ（サンタクルズ、カリフォルニア州）から購入した。ＦＩＴＣ結合アビジンは、ベクターラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ベーリンガム、カリフォルニア州）から購入した。無胸腺マウスはジャクソンラボズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）（バーハーバー、メイン州）から購入した。
【０１５８】
方法
（ｉ）スカフォールドの調製
エレクトロスピンされたナノファイバースカフォールドは、コラーゲンＩ型、エラスチンおよびポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ、モル．比５０：５０、Ｍｗ  １１０，０００）（ベーリンガー−インゲルハイム（Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）、ドイツ）の溶液を使用して作成した。ウシの皮膚由来のコラーゲンＩ型（エラスチン  プロダクツ  カンパニー（Ｅｌａｓｔｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、オウンズヴィル、ミズーリ州）、項靭帯（ウシ首の靭帯）由来のエラスチン（エラスチン  プロダクツ  カンパニー、オウンズヴィル、ミズーリ州）およびＰＬＧＡを、４５％のコラーゲン、４０％のＰＬＧＡおよび１５％のエラスチンの相対的重量濃度で混合する。溶液を１，１，１，３，３，３−ヘキサフルオロ−２−プロパノール（９９＋％）（シグマケミカルカンパニー、セントルイス、ミズーリ州）に、１５（重量／容量）％（１５０ｍｇ／ｍＬ）の総溶液濃度で溶解する。高分子量ＰＬＧＡ（前に組織スカフォールドをエレクトロスピニングするために使用した）を溶液に加えて、スカフォールドの機械的強度を上げ、そして溶液の粘度およびスピニング特性を上げる。
【０１５９】
物理的に、エレクトロスピン法は高電力供給源、シリンジポンプ、ポリマー溶液またはスピンされるメルト、および接地した回収面を必要とする。エレクトロスピン中、接地した主軸は回転し、同時に台が移動して繊維の主軸面への均一な沈着が確実となる。溶液は高電力供給源（スペルマンの高電力（Ｓｐｅｌｌｍａｎ  Ｈｉｇｈ  Ｖｏｌｔａｇｅ）、ハウパージ、ニューヨーク）を２５ｋＶの電位で溶液先端と接地面との間で使用してエレクトロスピンされた。溶液は１８ゲージの平坦な先端針を介して、シリンジポンプを使用して３．０ｍＬ／時間の流速で５ｍＬのシリンジを用いて送達された。ファイバーは先端から１５ｃｍの距離で接地した主軸上に集まる。主軸は〜５００ｒｐｍで回転する３０３ステンレス鋼の棒である。主軸のサイズは、架橋による移植片の収縮を可能とするために、最初に４．７５ｍｍである。１２０ｍｍ長の均一なスカフォールドが２．４ｍＬの溶液を使用して作成された。この装置は図１に概略的に示す。
【０１６０】
さらにスカフォールドは、２つの架橋結合法を使用して安定性および強度を上げるために架橋結合された。スカフォールドは、スカフォールドの水和が誘導する膨潤および収縮を減らすために、架橋結合前にリン酸緩衝化生理食塩水中の２０％デキストラン溶液に２分間浸された。スカフォールドは、１）１％グルタルアルデヒド溶液、および２）ＭＥＳ／ＥｔＯＨ溶液中のＥＤＣ／ＮＨＳで２時間、室温にて浸漬することにより架橋結合された。これらのデータは、生物学的ポリマーから脱細胞化スカフォールドおよび自然な動脈に類似する機能的構造および構造を持つ管スカフォールドを作成することが可能であることを示す。
【０１６１】
図１は、溶液の表面積／容量比を上げることにより溶媒が蒸発する時、ファイバーが接地した回収面上に沈着するエレクトロスピン装置を表す。静電界は溶液の噴霧を引き起こし、そして十分な粘度および表面張力の溶液が接地した面に付着する繊維状マットを形成する。
【０１６２】
（ｉｉ）細胞の播種
内皮細胞のコンフルエントな単層は、血栓形成に対する最も重要なバリアであり、そして内皮細胞が媒介するＮＯ生産は血管のトーン（ｔｏｎｅ）を維持するために重要である。細胞はマウスの内皮細胞株ＭＳ１細胞を播種した。組織培養ポリスチレンフラスコ中で、５％ＣＯ２の雰囲気下、３７℃にて通常に培養した細胞を、０．１％トリプシン−ＥＤＴＡで処理した後に回収した。スカフォールドは組織培養皿に乗せられた。ＰＢＳで平衡化した後、細胞（１×１０５／ｍＬ）をスカフォールドに播種した。使用した培養基は、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を含有するＤＭＥＭ培地であった。２日間培養した後、細胞の接着を走査型電子顕微鏡を使用して評価した。
【０１６３】
（ｉｉｉ）顕微鏡
血管スカフォールド中のコラーゲンおよびエラスチンの相対的量および分布は、播種した移植片の機械的特性および機能に重要である（図１）。スカフォールドの成分分布を決定するために、組織−および免疫組織化学的分析を行ってコラーゲンおよびエラスチンの分布を同定した。
【０１６４】
（ｉｖ）生体適合性試験（細胞の生育能および増殖）
細胞の長期生育能が、生きている利用可能な（ｐａｔｅｎｔ）血管に播種したスカフォールドを改造するために必要である。標準的な方法を使用して、生育能および増殖を評価した。細胞の生育能を試験するために、構造物を２４ウェルプレートにウェルあたり約１００ｍｇの物質で入れた。４種の型の物質を生体適合性および細胞の生育能について試験し、１つの陰性対照ウェルは物質を含まなかった：（１）ＧＡ−ＮＦＳ（１％グルタルアルデヒド架橋結合化エレクトロスピン化スカフォールド）；（２）ＥＤＣ−ＮＦＳ（ＥＤＣ−架橋結合化エレクトロスピン化スカフォールド）；（３）ｎＢＶ（自然な血管、脱細胞化）；（４）Ｌａｔｅｘ（ラテックスゴム、陽性対照）。
【０１６５】
内皮細胞は、直接的な接触法を介して試験するためにウェル中のスカフォールド上に播種された。細胞の生育能については、細胞層をＰＢＳですすいだ。０．００５（重量／容量）％の中性レッドを培養基に加えた。中性レッド溶液は３７℃で４時間のインキュベーション後に１％酢酸で除去し、そして容量で５０容量％エタノール溶液を色素抽出のために加え、そして色素抽出は５分間振盪した。次いで吸収は分光光度計を使用して５４０ｎｍで測定した。得られた赤色の強度は細胞の生育能に直接比例し、そして物質の毒性に逆比例した。
【０１６６】
細胞の増殖はミトコンドリアの代謝活性アッセイを使用して試験した。細胞層を最初にＰＢＳで洗浄した。ＭＴＴ溶液は、１ｍｇ／ｍＬのグルコースを含有するＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで加えた。ＭＴＴ溶液は３７℃で４時間のインキュベーション後に除去した。ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を使用して不溶性のホルマザン結晶を溶解し、そして５４０ｎｍでの吸収を分光光度計を使用して測定した。青色の強度は細胞群の代謝活性に直接比例し、そして物質もしくは抽出の毒性に対して逆比例した。
【０１６７】
（ｖ）機械的試験
コンプライアンスの不釣り合いが管移植片の失敗の最も多い原因であり、内膜過形成および閉塞を生じる。スカフォールドがコンプライアントすぎると、動脈瘤を形成する恐れがある。
【０１６８】
スカフォールドは水浴に浸し、そして各末端にカニューレを挿入した。１つのカニューレは水のカラムにつなぎ、もう１つは廃液管につないだ。水のカラムは管形スカフォールド内に１２０ｍｍＨｇの圧を形成するほど十分高かった。水は１０ｍｍＨｇの増分で圧を下げるために、スカフォールドを通して廃液した。各増分で、スカフォールドの直径はデジタルカメラを使用して記録した。この工程を圧が０ｍｍＨｇになるまで繰り返した。
【０１６９】
（ｖｉ）軸および周囲セグメント試験
管は軸方向よりも周囲方向で、より高い応力に抵抗しなければならない。自然な管はそれらの機能的構造をそれらの負荷環境に適応させる。エレクトロスピンされたスカフォールドは少なくとも自然な管の機械的強度を現すことが重要である。機械的負荷試験は、一軸負荷試験機を使用して軸および周囲方向でエレクトロスピンされた管について行った（インストロン社（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、イサックアー、ワシントン州）。軸の試験には、管状スカフォールドからの短いセグメントをその切断末端で挟んだ。クロスヘッドスピードは０．５ｍｍ／秒に設定し、そして試験は落下が起こった後、歪みが１０％まで減少した時、止めた。周囲方向での試験では、物質のリングをスカフォールドから切り取り、ストリップに開き、次いでストリップのいずれかの末端を挟んだ。この試験も０．５ｍｍ／秒の速度で行った。
【０１７０】
（ｖｉｉ）バースト圧試験
管スカフォールドに関するバースト圧は、落下が起こるまで管内の圧を上げることをモニタリングすることにより見いだされた。圧カテーテルは管の１端でカニューレの固定を介して挿入した。６０ｃｃの圧シリンジを、血管のもう１端で通例のカニューレを介して挿入した。圧は破壊、落下もしくは漏出が起こるまで上げ、そして圧の変化を記録した。
【０１７１】
（ｖｉｉｉ）マトリックスの機能化
マトリックスを機能化するために、ＥＤＣ（１０ｍｇ）およびスルホ−ＮＨＳ（２ｍｇ）を水溶液中５ｍＬ（０．０５ｍｇ／ｍＬ）のカルボキシル化量子ドットに、室温で１時間、穏やかに撹拌しながら加えた。ＥＤＣ活性化ヘパリン（３０ｍｇ／２０μｌ）を同じＥＤＣおよびＮＨＳ法に従い調製した。量子ドットとヘパリンを結合させるために、５ｍｇのＰＤＡを活性化量子ドットおよびヘパリン溶液に、室温で２時間撹拌しながら加えた。量子ドット−ヘパリン（ＱＤ−ヘパリン）結合体は、等容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ７．４）を加えることによりクエンチし、そして４℃で保存することができる（図２）。
【０１７２】
（ｉｘ）カプセル化
ＱＤ−ヘパリンのマイクロカプセル化は、二重エマージョン（ｅｍｅｒｓｉｏｎ）により行った。簡単に説明すると、３０ｍｇのＱＤ−ヘパリンおよび安定化剤として１０ｍｇのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する４ｍＬの内部水性相を、ジクロロメタン中１００ｍｇのＰＬＧＡおよび１００ｍｇのＰＣＬの８ｍｌ溶液中で乳化した。溶液は室温で５分間、ボルテックス混合することより乳化した。このＷ／Ｏ分散物を２００ｍｌの１（重量／容量）％の水性ＰＶＡ溶液に、室温で４時間撹拌しながら希釈した。マイクロカプセルを脱イオン水で数回洗浄し、次いで一晩、凍結乾燥した。
【０１７３】
（ｘ）量子ドットのＩＲ照射を使用したヘパリン放出
ヘパリンのバースト放出を評価するために、ＱＤ−ヘパリンを含有する０．５５ｍｇのＰＬＧＡマイクロカプセルを、２ｍｌのＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）に懸濁した。溶液は０、１０および３０分間、７５ｍＷ／ｃｍ２のＡＭ１．５ソーラーシュミレーターを使用して照射した。次いで１、３および５日目に、サンプルを４℃に冷却し、４５００ｒｐｍで２０分間遠心し、そして濾過（０．４５μｍの孔サイズ）して、光学的測定用にマイクロカプセルを取り出した。ルミネセンス測定は、アルゴンイオンレーザー（４００ｍＷ／ｃｍ２で５１４．５ｎｍ）を励起源として使用して行い、そしてスペクトルはＣＣＤ分光光度計を使用して４０秒の積分時間で集めた。
【０１７４】
（ｘｉ）マウスモデル
マウス（Ｃ５７ＢＬ６）は、メリーランド州、バーハーバーのジャクソンラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から得られる。マウスを対象としたすべての実験は、全身麻酔下で無菌的に行う（ケタミン；４５〜７５ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン；１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ）。切開部位はベタジンで洗い、そしてアルコールで拭く。痛覚脱失（ブプレノルフィン０．０５〜０．１ｍｇ／ｋｇ、ＳＣ）を移植の手術後に与える。予防的な抗生物質（セファゾリン２５ｍｇ／ｋｇ、ｓｃ）を移植後、術後に与える。準備された血管（２×０．５ｃｍ）は、動物あたり２個のインプラントを最小縦断正中切開を介してマウスの背側皮下空間に移植する。創傷は断続的吸収糸で閉じ、そして動物を分析のために移植後１、２、４、８、１２、１８および２４週に屠殺する。血管サンプルの回収には、マウスに麻酔をかけ、そして血液は心臓穿刺を使用してヘパリンを含有する管を回収し（ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ）、そしてマウスをその後に屠殺する。
【０１７５】
（ｘｉｉ）ヒツジモデル
全部で１２０匹のヒツジを使用する。実験は６つの異なる血管群からなる。各動物はそれ自身を対照として用いる。動物は移植後１、３、６、１２および１８月に屠殺される。動物は０、１、２、３および４週間、そして１カ月以上移植した移植片について毎月モニタリングする。
【０１７６】
ヒツジはケタミン（５ｍｇ／ｋｇ、ＩＭ）で鎮静化し、挿管し、そしてイソフルオラン（Ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）（１〜３％）で麻酔をかけ、そしてベンチレーターに置いて、維持のためにイソフルランを投与する。自然な大腿動脈の二重超音波造影後、鼠蹊部を滅菌様式でプレプし、そして抗生物質を投与する（セファゾリン２５ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）。皮相大腿動脈上に縦断切開を作成し、これを６〜８ｃｍの長さにわたり露出する。動物は手術の４８時間前にアスピリン（８０ｍｇ、ｐ．ｏ．）を受容し、そしてヘパリンが移植直前に投与される（１００Ｕ／Ｋｇ、ｉ．ｖ．）。次いで大腿動脈を挟み、そして近位で分割し、そして自然な動脈と工作された動脈との間に末端から側への吻合を７−０Ｐｒｏｌｅｎｅ糸で作成する。次いで遠位吻合を同様の様式で作成し、そして血流がインプラントを介して回復する。次いで二重超音波は、動脈の寸法および移植後即座の血流を確立するために、滅菌の手術中のプローブカバーを使用して繰り返す。次いで創傷を吸収性糸で閉じ、そして動物はアトロピン（０．０２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｖ．）を使用した麻酔から回復した後、標準的な住まいに戻す。術後の抗生物質は手順に従い３日間投与する（セファゾリン２５ｍｇ／ｋｇ／日）。無痛覚を３日間、６〜１２時間ごとに投与する（ケトプロフェン２ｍｇ／ｋｇ）。アスピリンも抗凝固のため経口的に７日間投与する（毎日８０ｍｇ）。動物は分析用に移植から１、３、６、１２および１８カ月後に屠殺する。各時点で、６匹の動物が分析のためにに安楽死させられる。
【０１７７】
実施例２：エレクトロスピンされたマトリックス  
エレクトロスピンされたマトリックスは、実施例１に概説する方法を使用して形成された。コラーゲンＩ型、エラスチンおよびＰＬＧＡの溶液を使用した。コラーゲンＩ型、エラスチンおよびＰＬＧＡは、重量で４５％のコラーゲン、４０％のＰＬＧＡおよび１５％のエラスチンの相対濃度で混合した。
【０１７８】
生じた繊維状スカフォールドは、１２ｃｍの長さおよび１ｍｍの厚さを有した。２ｃｍの代表サンプルを図３に示す。これはコラーゲンＩ型およびエラスチンが、溶液中３％〜８重量％の濃度を使用してナノメートルからマイクロメートルの直径の繊維にスピニングできることを示す。またこれらの結果は、ＰＬＧＡ（ＭＷ１１０，０００）を混合物、高粘度溶液に加え、スピニング特性の改善が達成できたことも示す。溶液濃度を１５％に上げることにより、コラーゲンおよびエラスチン成分を維持しながら、より強いスカフォールドを構築できた。
【０１７９】
コラーゲンＩ型は脱細胞化スカフォールド上で陽性に染まり、均一な分布を示した。スカフォールド内のエラスチンの分布は、Ｍｏｖａｔ染色により測定した。１５％のエラスチンを含むエレクトロスピンされたスカフォールドは、スカフォールド壁全体にわたり均一なエラスチンマトリックスを示した。これらの知見は、エレクトロスピンされたスカフォールドのマトリックス含量および分布が、必要に応じて種々のマトリックス組成を達成するために操作できることを示す。
【０１８０】
生体適合性アッセイの結果は、陰性対照および脱細胞化血管に類似して行った両エレクトロスピンされたスカフォールドの割合として算出した。これらのデータは、エレクトロスピンされたスカフォールドの生体適合性が脱細胞化スカフォールドの生体適合性に類似することを示唆する。
【０１８１】
コンプライアンスに関する機械的試験の結果は、自然な血管、ならびに脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドについて典型的な圧−直径曲線を示す。直径の変化は自然な血管について約５％であり、そしてエレクトロスピンされたスカフォールドは、ブタおよびヒトの動脈のインビボでの機械的挙動と一致する生理学的圧の範囲内であった（図４）。これらのデータは、作成されたエレクトロスピンされたスカフォールドが自然な管に類似するコンプライアンスを有することを示す。
【０１８２】
エレクトロスピンされたスカフォールドの軸および周囲の機械的試験結果は、より等方性の挙動を現す傾向があった。軸および周囲方向の歪みは、落下が起こる前、ほとんど等しかった。
【０１８３】
バースト圧試験の結果は、エレクトロスピンされた構造物についてのバースト圧が１，４２５ｍｍＨｇ、すなわち収縮期圧のほぼ１２倍であった。これらのデータは、エレクトロスピンされたスカフォールドが十分な初期強度、および循環環境に外科的に配置された場合に、機械的環境に耐えるための弾性を有することを示唆する。
【０１８４】
マウスに由来する拡大した管スカフォールドの組織学的分析は、炎症または組織のカプセル化の証拠が無いことを示した。
【０１８５】
まとめると、これらの結果は管移植片として使用するためのエレクトロスピンされたスカフォールドの組成を制御することが可能であることを示す。これまでに使用されたものより高濃度のコラーゲンＩ型およびエラスチン、そしてＰＬＧＡを混合することにより、移植片の改善されたスピニング特性および強度がもたらされ、これはほぼ１２Ｘの収縮期圧に耐える。またスカフォールドは、自然な動脈に類似するコンプライアンス特性も現した。スカフォールドは７２０ナノメートルの平均繊維直径を有した。ＥＤＣ架橋結合化スカフォールドは、ミトコンドリア代謝活性アッセイにより評価した時、グルタルアルデヒド架橋結合化スカフォールドよりも優れた細胞増殖特性を示す。細胞の生育能アッセイは、架橋化法で顕著な差異を示さなかった。これらの結果は、生物学的ポリマーおよびＰＬＧＡを用いて作成したエレクトロスピンされたスカフォールドの生体適合性に関する幾つかの最初のデータとなる。この実験は、管移植片スカフォールドの製作法としてエレクトロスピニングが有望であることを示す。
【０１８６】
実施例３：エレクトロスピンされたマトリックスの架橋結合
この実施例は、化学的な架橋結合によりエレクトロスピンされたスカフォールドの強度および安定性がどのように上昇するかを示す。スカフォールドは架橋結合する前にリン酸緩衝化生理食塩水中の２０％デキストラン溶液に浸して、水和が誘導する膨潤およびスカフォールドの収縮を下げる。スカフォールドは、ＭＥＳ／ＥｔＯＨ溶液中のＥＤＣ／ＮＨＳに室温で２時間含浸することにより架橋結合された。生じた繊維の走査型電子顕微鏡では、５００ｎｍ以下の繊維直径および無作為な方向性の繊維が示された。スカフォールドの原子間力顕微鏡および接着している内皮細胞を含むナノファイバーの共焦点画像は、スカフォールド構造を示す。これらのデータは、生物学的ポリマーから、脱細胞化スカフォールドおよび自然な動脈に類似する機能的特性および構造をもつ管スカフォールドを作成することが可能であることを示す。
【０１８７】
実施例４：コラーゲンおよびエラスチン含量の分布
管スカフォールド中のコラーゲンおよびエラスチンの相対的量および分布は、播種した移植片の機械的特性および機能に重要である。スカフォールド組成はコラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型、エラスチンに関する組織化学的分析を使用して評価し、そしてヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）も行った。
【０１８８】
脱細胞化マトリックスのコラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型、エラスチンのレベル、およびエレクトロスピンされたマトリックスのコラーゲンＩ型およびエラスチンのレベルは、コンピューター処理された組織形態学的分析を使用して分析した。ＮＩＨ画像／Ｊ画像分析ソフトウェア（国立衛生院、ベセスダ、メリーランド州）を分析に使用した。
【０１８９】
コラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型に特異的な抗体を使用した免疫組織化学的分析は、脱細胞化され、そしてエレクトロスピンされたスカフォールドについて行った。脱細胞化スカフォールドは、管媒体で類似のコラーゲンＩおよびＩＩＩを示したが、これは自然な血管に対応する。この実験では、４５％のコラーゲンＩ型を使用して、スカフォールド作成の制御性を示した。コラーゲンＩ型は脱細胞化スカフォールド上で陽性に染まったが、コラーゲンＩＩＩ型は陰性に染まった。スカフォールド中のエラスチン分布は、Ｍｏｖａｔ染色により測定した。豊富なエラスチン繊維は、脱細胞化スカフォールド壁全体に観察され、漿膜および管腔面で優勢に分布した。１５％のエラスチンを含むエレクトロスピンされたスカフォールドは、スカフォールド壁全体にわたり均一なエラスチンマトリックスを示した。これらの知見は脱細胞化された血管スカフォールドが正常な管に類似するマトリックスを有し、そしてエレクトロスピンされたスカフォールドのマトリックス含量および分布を操作して必要に応じて種々のマトリックス組成を達成できることを示す。
【０１９０】
色の分布のヒストグラムは、陰性対照に対して各染色からの各成分の相対的量を決定するために使用した。すべての値は比較のために面積により標準化された。コラーゲンＩ、エラスチンおよびＰＬＧＡの量は、製造パラメーターによりエレクトロスピンされたマトリックスについて知られていた。コラーゲンの相対量について画像データをカリブレーションすることは、陰性対照を用いて両標準化領域を利用し、そしてエレクトロスピンされたマトリックスの既知の組成に基づきカリブレーションされた。
【０１９１】
結果は脱細胞化スカフォールド中のコラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩおよびエラスチンの組成、ならびにエレクトロスピンされたマトリックス中の成分の割合について示す。
これらの実験は、脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドのコラーゲンおよびエラスチン含量が自然な管の含量に類似することを示す。
【０１９２】
実施例５：スカフォールドのコンプライアンス試験
コンプライアンスの不釣り合いは、管移植片の失敗の最も多い原因であり、内膜の過形成および閉塞を生じる。スカフォールドがコンプライアントすぎると、動脈瘤を形成する恐れがある。この実施例はスカフォールドのコンプライアンスについてどのように試験するかを記載する。脱細胞化およびエレクトロスピンされた管に形状化されたスカフォールドを水浴に浸し、そして各末端にカニューレを挿入した。１つのカニューレは水のカラムにつなぎ、もう１つは廃液管につないだ。水のカラムは管形スカフォールド内に１２０ｍｍＨｇの圧を形成するために十分高かった。水は１０ｍｍＨｇの増分で圧を下げるために、スカフォールドを通して廃液した。各増分で、スカフォールドの直径はデジタルカメラを使用して記録した。この工程を圧が０ｍｍＨｇになるまで繰り返した。結果は自然な管について典型的な圧−直径曲線を、そして脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドについて実験的曲線を示す。直径の変化は、ブタおよびヒトの動脈のインビボでの機械的挙動と一致する生理学的圧の範囲内で、自然な管およびエレクトロスピンされたスカフォールドについて約５％であり、そして脱細胞化されたスカフォールドについて１５％であった。このように脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドの両方が、自然な管に類似するコンプライアンスを有する。
【０１９３】
実施例６：脱細胞化およびエレクトロスピンされた管の周囲および軸負荷
管は軸方向よりも周囲方向で、高い応力に抵抗しなければならない。自然な管はその機能的構造をそれらの負荷環境に適応させる。脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドは、自然な管の機械的挙動を現すことが重要である。このように機械的負荷試験は、一軸負荷試験機（インストロン社（Ｉｎｓｔｒｏｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、イサックアー、ワシントン州）を使用して軸および周囲方向で脱細胞化された管およびエレクトロスピンされた管について行った。軸の試験には、全体が管状のスカフォールドをその切断末端で挟んだ。クロスヘッドスピードは０．５ｍｍ／秒に設定し、そして試験はひずみが落下の発生後１０％まで減少した時、止めた。周囲での試験では、リング状の物質をスカフォールドから切り取り、ストリップに開き、次いでストリップのいずれかの末端を挟んだ。この試験も０．５ｍｍ／秒の速度で行った。エレクトロスピンされたスカフォールドからの軸および周囲方向の機械的試験の結果は、図５Ａおよび５Ｂにそれぞれ示す。
【０１９４】
エレクトロスピンされたスカフォールドは、より等方向性の挙動を現す傾向があった。軸および周囲方向の歪みは、落下が起こる前はほぼ等しかった。一般に、脱細胞化構造物は動脈の既知の機械的挙動から予想される直伸の機械的挙動を現す。特に周囲方向の歪みは、軸方向の歪みより低い。これは移植前および後のスカフォールドについても当てはまる。
【０１９５】
管スカフォールドに関するバースト圧は、落下が起こるまで管内の圧を上昇させることをモニタリングすることにより見いだされた。圧カテーテルは、管の一端のカニューレ用取り付具を介して挿入した。６０ｃｃの圧シリンジを管のもう一つの端で通常のカニューレを介して挿入した。圧は落下または漏出が起こるまで上げ、そして圧の変化を記録した。結果は脱細胞化構造物に関するバースト圧が１，９６０ｍｍＨｇ、すなわち収縮期圧の約１６倍であったことを示す。エレクトロスピンされた構造物のバースト圧は１，４２５ｍｍＨｇ、すなわち収縮期圧のほぼ１２倍であった。我々はエレクトロスピンおよび脱細胞化された両スカフォールドが十分な強度および弾性を有し、自然な管と置き換えることができることを証明した。
【０１９６】
実施例７：ヒツジ前駆細胞ＥＰＣおよびＭＰＣの単離、特性決定および管への播種
前駆細胞ＥＰＣおよび前駆筋肉細胞（ＭＰＣ）は、ヒツジの内頸静脈の６０ｍｌの末梢血から単離した。白血球画分は、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ密度勾配で遠心により得た。幾つかの細胞を培地に再懸濁し、そしてフィブロネクチンを被覆したプレートに播いた。２４時間間隔で、浮遊する細胞を新たなフィブロネクチン被覆プレートに移した。ＥＰＣは、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦの含有するＥＧＭ−２培地で成長させることにより誘導した。残りの細胞は１０μＭの５−アザシチジンの存在下、２４時間培養した。その後、浮遊する細胞を新しいフィブロネクチン被覆プレートに移し、そしてＭＰＣを誘導するために筋性培地（２０％ウシ胎児血清、１０％ウマ血清、１％ニワトリ胚エキスおよび１％抗生物質を含むＤＭＥＭ低グルコース）で培養した。ＥＰＣおよびＭＰＣは分化した形態を受け入れるために、４〜６週間培養した。ＥＰＣの免疫組織化学的分析は、ほとんどの細胞がＶＥカドヘリンおよびＣＤ３１を発現したが、デスミンは発現しなかったことを示した。しかしＭＰＣはビメンチンおよびデスミンの発現を示したが、ＶＥカドヘリンの発現は示さなかった。これらのマーカーの発現はインビトロの培養中に維持された。これらの結果は培養したＥＰＣおよびＭＰＣがそれぞれＥＣおよび筋肉細胞の表現型を有することを示す。
【０１９７】
ＥＰＣをＰＫＨ２６緑色蛍光色素で標識し、そしてＭＰＣをＰＫＨ２７赤色蛍光色素で標識した。標識したＥＰＣおよびＭＰＣは、脱細胞化管の生体適合性を証明するために、それぞれ脱細胞化管セグメントの管腔および外側表面に播種した。７日後、脱細胞化管上の赤色および緑色の標識化細胞の存在を記録した。さらに播種した管に赤色標識ＭＰＣおよび緑色標識ＥＰＣ（５×１０６細胞／ｍｌ）の懸濁液を播種し、そして細胞を７日間成長させた。凍結切片を得るために、管はＯＣＴ培養に包埋した。切片をＤＡＰＩで染色した。細胞核を検出するために、切片は蛍光顕微鏡を使用して視覚化した。データはＥＰＣがスカフォールドの管腔側に維持され、そしてＭＰＣが漿膜上に維持されたことを示す。
【０１９８】
実施例８：細胞の付着
内皮細胞のコンフルエントな単層は、血栓形成に対して最も重要なバリアとなる。内皮細胞が媒介するＮＯ生産は、管のトーンを維持するために重要である。細胞の付着を調査するために、脱細胞化およびエレクトロスピンされた管に内皮細胞を播いた。細胞の付着は、マウスの内皮細胞株（ＭＳ１）を播種したスカフォールドの走査型電子顕微鏡を使用して評価した。ＳＥＭの顕微鏡写真では、脱細胞化およびエレクトロスピンされた管の両方の内側表面上に４８時間でコンフルエントな単層が明らかとなった。これらの結果は、内皮細胞が脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールド上にコンフルエントな単層を形成することを示す。
【０１９９】
実施例９：生体適合性（細胞の生育能および増殖）
細胞の長期生育能は、播種したスカフォールドを生育可能な利用できる管へ改造するために必要である。細胞の生育能を試験するために、脱細胞化およびエレクトロスピンされた構造物を２４ウェルプレートにウェルあたり約１００ｍｇの物質で入れた。４種の型の物質を生体適合性および細胞の生育能について試験し、１つの陰性対照ウェルは物質を含まなかった：（１）ＧＡ−ＮＦＳ（１％グルタルアルデヒド架橋結合エレクトロスピン化スカフォールド）；（２）ＥＤＣ−ＮＦＳ（ＥＤＣ−架橋結合エレクトロスピン化スカフォールド）；（３）ｎＢＶ（自然な血管、脱細胞化）；（４）Ｌａｔｅｘ（ラテックスゴム、陽性対照）。
【０２００】
内皮細胞は、直接的な接触法を介して試験するためにスカフォールド上のウェルに播種された。細胞の生育能については、細胞層をＰＢＳですすいだ。０．００５（重量／容量）％の中性レッドを培養基に加えた。中性レッド溶液は３７℃で４時間のインキュベーション後に１％酢酸で除去し、そして容量で５０％エタノール溶液を色素抽出のために加え、そして色素抽出は５分間振盪した。次いで吸収は分光光度計を使用して５４０ｎｍで測定した。得られた赤色の強度は細胞の生育能に直接比例し、そして物質の毒性に逆比例した。結果は陰性対照の割合として報告し、そして両エレクトロスピンされたスカフォールドは脱細胞化血管と同様に機能した（図６Ａ）。
【０２０１】
細胞の増殖はミトコンドリアの代謝活性アッセイを使用して試験した。細胞層を最初にＰＢＳですすいだ。ＭＴＴ溶液は、１ｍｇ／ｍＬのグルコースを含有するＰＢＳ中１ｍｇ／ｍＬで加えた。ＭＴＴ溶液は３７℃で４時間のインキュベーション後に除去した。ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）を使用して不溶性のホルマザン結晶を溶解し、そして５４０分光光度計での吸収。青色の強度は細胞群の代謝活性に直接比例し、そして物質もしくは抽出の毒性に対して逆比例した。グルタルアルデヒドで処理したマトリックスは増殖アッセイよりも顕著な差異を表し、ＥＤＣ処理スカフォールドは自然な血管に類似する（図６Ｂ）。
【０２０２】
また細胞の生育能および増殖試験も、種々の濃度のガドリニウム（Ｇｄ）がスカフォールドに、細胞の生育に及ぼす効果を測定するために行った（図７）。試験では、細胞の生育能または生存に及ぼすＧｄレベルの効果がほとんどないことが明らかとなった。この結果は両スカフォールドが細胞の成長を促進し、そして管移植片の生体工学に使用できることを示す。
【０２０３】
実施例１０：マトリックスの外部機能化
この実施例は、画像強化剤および量子ドットを用いてどのようにマトリックスを生成するかを記載する。特に外部スカフォールドのＧｄ−ＤＰＴＡおよび量子ドット機能化。スカフォールドは合成ＰＧＡマトリックス、エレクトロスピンされたマトリックスまたは脱細胞化マトリックスのような任意の生体適合性基質であることができる。現在、インビボでの移植片の取り組みを非侵襲的にモニタリングできる臨床的に利用可能な管移植片は無く、抗凝固剤をその構造に包含する移植片もない。機能性を上げるために、特に物質マーカーとして、および抗凝固用にナノ物質をスカフォールド、例えば管スカフォールドに付けるための信頼できる方法が必要である。カルボキシル化Ｇｄおよび量子ドット（ＱＤ）物質は、脱細胞化およびエレクトロスピンされたスカフォールドの両方の表面に、ＥＤＣ／スルホ−ＮＨＳ法を使用してカップリングされた。いかなる未反応物質もクエンチされ、そしてスカフォールドを０．１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファーですすぐことにより除去された。最終洗浄からの液体はＵＶ除去下で無色であった。
【０２０４】
不可視光線の照明下で、機能化スカフォールドは多色蛍光を示す。赤−オレンジ色の発光領域は量子ドットに由来する。淡い白色（これは対照組織よりも強度が強い）は、淡い青色を含む蛍光であり得る物質を含有するＧｄから来る。データはヘパリンをスカフォールドの表面上に包含できることを示す。またスカフォールドはＧｄに結合できる。
【０２０５】
実施例１１：マトリックスの内部機能化
この実施例は画像強化剤および治療薬を用いてエレクトロスピンされたマトリックスの生産を記載する。特に内部エレクトロスピンスカフォールドへのＧｄ−ＤＰＴＡおよびＱＤ添加。エレクトロスピンを使用した管のスカフォールドを作成することは、バルク材料中に画像強化剤を包含する好機を提供する。１５ｍｇ／ｍＬの濃度でＨＦＰ中にガドリニウムジエチレントリアミンペンタ酢酸（Ｇｄ−ＤＰＴＡ）を含有する溶液は成功裏にスピンされ、そして量子ドットはトルエン中２５．５ナノモル／ｍＬの量子ドット溶液から８容量％の濃度で加えられた。Ｇｄ−ＤＰＴＡまたはＱＤの添加により、スカフォールド中で形態学的変化は記録されなかった。これらの結果はスカフォールドへのナノ粒子の取り込みが、生じる構造の形態に最小の効果を有するだけであることを示す。
【０２０６】
実施例１２：量子ドットを含むマトリックス
この実施例はヘパリンのような治療薬を量子ドット（ＱＤ）にどのようにカップリングするかを記載する。ヘパリンは有力な抗凝固剤である。全身的投与を回避するために、管スカフォールドからヘパリンの放出を制御し、そしてヘパリンをスカフォールドに結合させる方法が必要である。この実施例では、ＥＤＣ（１０ｍｇ）およびスルホ−ＮＨＳ（２ｍｇ）を水溶液中５ｍＬ（０．０５ｍｇ／ｍＬ）のカルボキシル化量子ドットに、室温で１時間、穏やかに撹拌しながら加えた。ＥＤＣ活性化ヘパリン（３０ｍｇ）は、上記に記載した同じＥＤＣおよびＮＨＳ法に従い調製した。量子ドットおよびヘパリンを結合するために、５ｍｇのフェニレンジアミン（ＰＤＡ）を活性化量子ドットおよびヘパリン溶液に、室温で２時間、撹拌しながら加えた。量子ドット−ヘパリン（ＱＤ−ヘパリン）結合体は、等容量の１Ｍ  Ｔｒｉｓバッファー溶液（ｐＨ７．４）を加えることによりクエンチし、そして４℃に保存した。
【０２０７】
ＱＤ−ヘパリンのマイクロカプセル化は、二重エマージョンにより行った。簡単に説明すると、ＤＣＭ中１００ｍｇのＰＬＧＡ（ＭＷ；１１０，０００）および１００ｍｇのＰＣＬ（ＭＷ；１１０，０００）の８ｍｌ溶液中で乳化した３０ｍｇのＱＤ−ヘパリン結合体および１０ｍｇのウシ血清アルブミンを含有する４ｍＬの内部水性相。この溶液は室温で５分間、ボルテックス混合することより乳化した。このＷ／Ｏ分散物を２００ｍｌの１（重量／容量）％の水性ＰＶＡ溶液に、室温で４時間撹拌しながら希釈した。マイクロカプセル（ＭＣｓ）を脱イオン水で数回洗浄し、次いで一晩、凍結乾燥した。ＱＤ−ヘパリンナノカプセル（ＮＣ）は、機能化された管のスカフォールドをＰＢＳ中１重量％ＰＬＬに置くことによりスカフォールドに取り込まれた。管のスカフォールドはＰＬＬ−ナノカプセル溶液に３〜４時間含浸され、そして凍結乾燥させた後、ガンマ線照射により滅菌した。
【０２０８】
量子ドットを含有する単離されたマイクロカプセルの蛍光画像は、この実験で使用する量子ドットからの特徴的蛍光が５００ｎｍであることを示す。このデータは、ヘパリンが量子ドットに結合し、そして結合したヘパリンを管のスカフォールドに付けるために生分解性ポリマーにカプセル化することが可能であることを示す。
【０２０９】
実施例１３：ヘパリンの放出動力学：ヘパリンのインビトロ放出および照射によるバースト放出
ヘパリンの送達制御について量子ドットの効果を評価するために、薬剤の放出動力学を照射バースト後に分析した。ヘパリンのバースト放出を評価するために、ＱＤ−ヘパリンを含む０．５５ｍｇのＰＬＧＡマイクロカプセルを、２ｍｌの緩衝化塩溶液に懸濁した。溶液はＡＭ１．５ソーラーシミュレーターを使用して７５ｍＷ／ｃｍ２で０．０、１０および３０分間照射した。次いで１、３および５日に、サンプルを４℃に冷却し、そして４５００ｒｐｍで２０分間遠心した。溶液を濾過して（０．４５ｍの孔サイズ）、光学測定のためにマイクロカプセルを取り出した。
【０２１０】
ルミネセンス測定は、アルゴンイオンレーザー（４００ｍＷ／ｃｍ２で５１４．５ｎｍ）を励起源として使用して行い、そしてスペクトルはＣＣＤ分光光度計を使用して４０秒の積分時間で集めた。照射したサンプルは経時的に上昇したルミネセンスを表し、「バースト効果」を示す。ヘパリンの動力学プロファイルで、照射が機能化されたマイクロカプセルからのバースト放出を誘導したことが確認される。ヘパリンの放出は光学的分析（図８Ａ）および生化学的分析（図８Ｂ）によりモニタリングされた。これらの結果は、ＮＩＲがＱＤ−ヘパリンマイクロカプセルからヘパリンの放出を開始するため使用できることを示す。
【０２１１】
通常、ヘパリンは急性の血栓症を防ぐために、手術直後に移植部位に投与される。その後、ヘパリンは第１週に１日２回、注射により投与される。患者のコンプライアンスを改善するために、ヘパリンは長期間、管スカフォールド中に固定化することができる。しかしスカフォールドへのヘパリンの固定化は、血栓防止には適切ではないヘパリンの遅い放出をもたらす。ヘパリンのバースト放出を加速するために、ヘパリンに結合した量子ドットの近赤外線（ＮＩＲ）照射を使用してこの目的を達成することができる。
【０２１２】
実施例１４：マウスから回収した（ｒｅｔｒｉｅｖｅｄ）管インプラント中に残るヘパリンの測定
インビボモデルにおいてヘパリンの効力を評価するために、ヘパリンはスカフォールドの外植後に評価されなければならない。マウスに移植された機能化された血管（ヘパリン−ＱＤ）中に残るヘパリンは、トルイジンブルー染色により測定され、そしてほとんどのヘパリンが移植から２週間後に管の外へ拡散したことが示される。ヘパリン含量はＲｏｔａｃｈｒｏｍｅキットにより分析され、そしてデータでは大変少量のヘパリンが２週間後に残っていることが確認される。データはヘパリンの活性がスカフォールド中でその通常の１〜２時間の半減期を越えて成功裏に延長されたことを示す（図９）。
【０２１３】
量子ドットの炎症反応は、臨床的応用のために取り組まれるべきである。マウスに由来する外移植された管スカフォールドの組織学的分析から、炎症または組織カプセル化の証拠は無かった。このデータは、結合したヘパリンが最少の炎症応答を有するだけであったことを示す。
【０２１４】
実施例１５：管に固定化されたヘパリンの抗−血栓形成性の評価
ヘパリンは強力な抗凝固剤であるが、この特性が固定化後でも存在することを確認することが重要であった。２つのヘパリン結合法を試験した。３０ミリグラムのヘパリンを、ＰＢＳ中の２０ｍＭ  ＥＤＣおよび１０ｍＭ  スルホ−ＮＨＳ中で室温にて２時間インキュベーションし、そして３ｍｍ直径の脱細胞化スカフォールドを次いでヘパリン−ＥＤＣ溶液に室温で２時間、浸した。架橋結合後、サンプルをＰＢＳ中で数回すすぎ、残存するＥＤＣを完全に除去した。続いて物理的吸着によるヘパリンの固定化は、ポリ（Ｌ−リシン）（ＰＬＬ）を使用して行った：３ｍｍ直径の脱細胞化スカフォールドを室温にて２時間、２ｍｇ／ｍＬのＰＬＬ溶液中でインキュベーションした。ＰＬＬ−吸着スカフォールドを１５ｍｇ／ｍＬのヘパリン溶液に室温にて１時間浸した。各方法の抗−血栓形成性は、トルイジンブルー染色によりヒツジ由来の全血を使用して評価した。即座の凝固が脱細胞化スカフォールドから観察されたが、血液処置後３６時間、ＥＤＣおよびＰＬＬと反応した脱細胞化スカフォールドの両方から有意な凝固の兆候は見られなかった。ヘパリン−ＰＬＬ脱細胞化スカフォールドは、ヘパリンをスカフォールドに最高に負荷したことを示す最も弱い染色が示された。これらの結果は固定化されたヘパリンが血栓の防止に効果的であったことを示した。
【０２１５】
実施例１６：強化されたＭＲＩ造影
この実施例は、ガドリニウムで観察された改善された造影を示す。インビトロの実験は、磁気共鳴造影において改善を測定するために、ガドリニウムを含む細胞スカフォールドについて行った。２０ミリメートルの長さ、１０ミリメートルの内部半径、および１４ミリメートルの外部半径の円筒状の細胞スカフォールドを、種々のＧｄ負荷濃度で作成した。細胞スカフォールドは個別に試験管に配置し、そしてＰＢＳに沈めた。４つの試験管を左から右へ以下の順序で配置した：非機能化細胞スカフォールド（対照１）、機能化スカフォールド（対照２）、１ｘＧｄ濃度の細胞スカフォールド、１００ｘＧｄ濃度（対照３）および１０００ｘＧｄ濃度の細胞スカフォールド。（１００ｘとはＧｄ−ＤＰＴＡの５５ｍｇ／ｋｇの機能化中、溶液中の濃度を表す）軸Ｔ１強調スピンエコー画像は、ＧＥヘルスケア  テクノロジーズ（Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の磁気共鳴造影（ＭＲＩ）１．５Ｔ  ＴｗｉｎＳｐｅｅｄスキャナーで得た。
【０２１６】
フェイズアレイコイルで得たＴ１強調画像および２００ミリ秒の反復時間（ＴＲ）が得られた。さらなる造影パラメーターは以下の通りである：エコー時間（ＴＥ）＝１３ｍｓ、スライス厚＝０．８ｍｍ、２５６ｘ１２８、視野（ＦＯＶ）＝１２ｃｍｘ６ｃｍ、平均の数＝１００、および相の方向は右から左。１０００ｘＧｄ（最も右の試験管）を負荷した細胞スカフォールドは、対照１、２および３と比べて明らからに目で見える。サンプルはＴＲＩＳバッファーおよびＰＢＳで２回洗浄し、そして造影する前に２週間、ＰＢＳ中で保存した。
【０２１７】
以前に記載した実験を、２つの異なるＧｄ負荷スカフォールド調製物について繰り返した：表面および容量負荷。左のスカフォールドは、表面負荷１０００ｘＧｄ調製物を用いて以前に記載した実験と同一の円筒状に成形されたスカフォールドである。右のスカフォールドは、前に記載したようにエレクトロスピンされた繊維全体に埋包されたＧｄを含む平面シートのスカフォールドである。繊維にＧｄがエレクトロスピンされたスカフォールドは、さらに高いコントラストを示した。表面調製物および容量調製物に関するスカフォールドの標準化シグナルの強度は、それぞれ１．５±０．２および２．９８±０．３５であった。Ｇｄ負荷スカフォールドのＭＲＩ造影についてのデータは、Ｇｄがスカフォールドに負荷されたＧｄのレベルに比例してＭＲＩコントラストを上げることを示した。
【０２１８】
実施例１７：齧歯類に関するインビボの予備データ
Ｇｄはインビトロでスカフォールド中に維持され得るが、それがインビボで機能性を維持することを示す必要がある。この実験はスカフォールドのインビボ機能性を調査する。エレクトロスピンされた管のスカフォールドは、造影の２週間前にマウスの皮下に移植された。Ｇｄを管のスカフォールドの１つに加えて、Ｔ１強調画像でそのコントラストを強化した。矢状縫合局所化画像はマウスから得、そして２つのスカフォールドを含有するＴ１強調冠状面画像は、矢状縫合画像を規定した（ｐｒｅｓｃｒｉｂｅｄ  ｏｆｆ）。Ｔ１強調画像の重要な造影パラメーターは、反復時間（ＴＲ）３００ミリ秒、エコー時間（ＴＥ）１４ミリ秒およびスライス厚２ミリメートルである。対照に比べてＧｄスカフォールドの画像コントラストに５０％の改善。齧歯類モデルにおけるこれらの結果は、インビトロで見られる特徴がインビボでも維持されることを示す。
【０２１９】
実施例１８：ヒツジの工作した管に関するエクスビボの予備データ
齧歯類を対象としたインビボの結果は、皮下検体に限られた。大きな動物モデルの血流に暴露されたスカフォールドにおいて、類似の結果を示す必要があった。細胞を播種したスカフォールドを含有するナノ粒子（量子ドットに結合したヘパリンおよびＧｄ−ＤＴＰＡ）を使用する可能性を決定するために、大腿動脈バイパス法をヒツジで行った。末梢血サンプルを集め、循環している前駆細胞を選択し、そして培養で内皮および平滑筋細胞に分化させた。各細胞型を成長させ、別個に拡大し、そしてナノ粒子を含有する脱細胞化された管状スカフォールドに播種した（３０ｍｍ長）。ナノ粒子を含有する細胞を含まないスカフォールドを対照とした。全身麻酔下で、スカフォールドの移植前に高解像１５ＭＨｚプローブ（ＨＤＩ−５０００、ＡＴＬ）でヒツジの大腿動脈を二重超音波検査法（Ｂ−モード超音波およびドップラースペクトル分析）で造影した。大腿動脈は６〜８ｃｍの長さにわたる縦軸切開を介して露出した。アスピリンおよびヘパリンを抗凝固剤として使用し、そして大腿動脈を挟み、そして基部方向に（ｐｒｏｘｉｍａｌｌｙ）分割した。末端から側面への吻合は、自然の、および工作した動脈との間に作成した。遠位吻合を類似様式で作成し、そして血流をインプラントを介して回復し、続いて２つの吻合間に自然な大腿動脈を連結した。ドップラー超音波検査法は滅菌プローブを使用して行い、移植後のスカフォールドの寸法および血流を確立した。創傷を閉じ、そして動物は３５００の前に麻酔から回復さて、標準的部屋に戻した。アスピリンは抗凝固のために７日間、経口的に規則的に投与した。
【０２２０】
二重超音波造影法は、血栓症の存在、管腔を狭くする内膜の過形成および移植片壁狭窄および移植片の動脈瘤衰退を測定するために行った。術前および術後の動脈セグメントの縦および断面画像は、正常動脈のように類似のピーク収縮期、終末拡張期および時間平均速度で利用可能な管腔０を示した。工作されたバイパスの動脈壁厚および管腔直径は、自然な動脈に類似した。工作した動脈バイパスおよび反対側の正常大腿動脈を、ＭＲＩで走査した。Ｔ１強調スピンエコーＭＲ画像は、以下のパラメーターで得た：２５６ｘ１２６マトリックス、１２ｘ６ｍｍＦＯＶ、４００ｍｓＴＲ、１３ｍｓＴＥ、１ｍｍスライス厚、および５０励起（ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ）。サンプルの平均シグナル強度は、バックグラウンドの水の強度により標準化して、レシーバーコイルの非均一性を説明した。標準化された強度はスカフォールドおよび正常管についてそれぞれ２．６２および２．１０であった。
【０２２１】
この実験は幾つかの異なるＴＲで繰り返し、そしてスカフォールドおよび正常管に関してシグナル強度を測定した。予想どおり、ガドリニウム強化スカフォールドのシグナル強度は、正常管よりいつも大きい。これらの結果により、Ｇｄおよびヘパリンを負荷した脱細胞化スカフォールドが、ヒツジモデルで利用可能性を維持し、そしてＭＲＩコントラストを維持することが確認された。
【０２２２】
ガドリニウムは、組織におけるプロトンのスピン−格子緩和時間（Ｔ１）を下げることにより主に画像を強化するＭＲコントラスト剤である。放射性核種とは異なり、これは工作された管に局在する限り効果的である。これらの結果はインビトロでＧｄをドープしたスカフォールドの繰り返し水洗浄を介して、およびインビボで工作された管の造影を介して、機能化されたＧｄナノ粒子がマトリックス中で安定であることを示す。最初の３カ月で、約８０％の移植片が改造される。マトリックス中で局在化されたＧｄは、最初に移植片の画像を強化する。経時的なＭＲシグナルにおける変化は、Ｇｄの濃度が管移植片の改造で減少するので、改造率が定量できるようになる。
【０２２３】
実施例１９：ヒツジにおけるバイパス移植片の組織形態学的特性
最初に内皮細胞および筋肉細胞を播種した回収した工作管への細胞付着を示すために、走査型電子顕微鏡を移植から２週間後に行った。細胞を播種した移植した脱細胞化スカフォールドでは、正常な管に類似する工作した動脈の管腔表面上への均一な細胞の付着が示された。細胞を含まないスカフォールドは、細胞の付着を表すことができなかった。これらの考察は、脱細胞化管のスカフォールドに播種された細胞が生存でき、そして手術後も付着したままであることを示す。
【０２２４】
ヒツジにおける工作された動脈バイパス移植片から回収した組織の組織形態学的特徴を評価するために、組織学的評価を行った。工作した動脈検体を固定し、処理し、そしてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびＭｏｖａｔ染色で染色した。細胞を播種した工作移植片は管壁全体に均一な細胞性（ｃｅｌｌｕｌａｒｉｔｙ）を含んだ。豊富なエラスチン繊維が全動脈壁に観察され、主要な分布は漿膜および管腔表面であった。これらの知見は、内皮細胞および平滑筋細胞に分化する末梢血由来前駆細胞を播種した工作された管が、自然な管に類似する十分な細胞構造を表すことができることを証明する。
【０２２５】
まとめるとこれらの実験は、陽性の治療的利益を有することが知られている細胞（内皮および平滑筋）およびナノ物質（量子ドットを結合したヘパリン）を含む脱細胞化およびエレクトロスピンスカフォールドの両方を、作成し、そして機能化することが可能であることを示す。さらにデータは経時的に工作された管をモニタリングするために、ＭＲＩコントラストを強化する分子（ガドリニウム）の成功裏の包含を示す。機能化および造影の組み合わせは、これらのスカフォールドを理想的な管代替物とする可能性を提供する。マトリックスは生体適合性であり、理想的な物理的および構造的特性を有し、そしてヒツジの頸動脈で４カ月間にわたり機能的であることが示された。
【０２２６】
実施例２０：工作した管移植片を特性決定するために
管が正常に機能するために、管は断続的な容量変化を収容するための適切な構造的特性を有するべきである。病的な状態では、正常な管機能および機械的特性は拘束され得る。生体工学で作成した管の使用を患者に移すために、最初に正常な管が形成され、そしてそれらが十分な表現型および機能的特性を経時的、特に成長しながら保持していることを確認することが必要である。
【０２２７】
（ｉ）機械的試験
外植した管の機械的特性の解明は、宿主動物中でそれらの管が受けた適応できる改造についての情報を提供する。機械的試験は動脈の伸長（軸および周囲）、コンプライアンス、バースト圧、ストレス緩和およびクリープを含む。
【０２２８】
（ｉｉ）表現型および組成の分析
組織学的および免疫組織化学的分析は、回収した管の移植片について行うことができる。縦および断面は、自然な管と移植片との間の転移ゾーンからおよび移植片の残りから取る。検体を固定し、処理し、そしてヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）およびＭａｓｓｏｎのトリクロームで染色した。外膜、中膜、内膜（ｉｎｔｉｍａ）および管腔の断面積は、コンピューターによるデジタル画像分析（ＮＩＨ画像ソフトウェア）を使用して測定する。工作した動脈体の断面分析に加えて、自然な動脈と工作した動脈との間の吻合領域について別個の分析を行う。近位および遠位吻合をホルマリンで固定し、パラフィンに埋包し、次いで各吻合に広がる段階−区分（ｓｔｅｐ−ｓｅｃｔｉｏｎ）の管腔の内径および動脈壁厚化を分析するために断面に切断した。平行して血栓形成の定量をＨ＆Ｅ染色を使用して行う。回収した組織の表現型の特性は経時的に測定する。
【０２２９】
正常組織と比較して生物工学で作成した管の内皮および平滑筋含量の程度を経時的に測定するために、多分子マーカーを上記のように免疫細胞化学的に、そしてウエスタンブロット分析でプローブした。これらのマーカーは抗−デスミンおよび抗−アルファ平滑筋アクチンを含み、これらは平滑筋細胞を特異的に検出する。内皮化は、ＥＣを特異的に染色する抗−フォン−ビルブランド因子抗−ＣＤ−３１および抗−ＶＥＧＦ受容体、ＫＤＲ、抗体により評価する。工作した動脈の細胞の増殖およびアポトーシスは、ＢｒｄＵの取り込みおよびＴＵＮＥＬ染色により測定する。
【０２３０】
コラーゲンおよびエラスチンのような細胞外マトリックス成分の組成および分布は、血管の正常な機能に重要である。コラーゲンネットワークは引っ張り強さの原因であり、エラスチンは管の弾性の回復に重要である。故にコラーゲンおよびエラスチン含量および回収した組織の経時的な分布の評価は、組織学的および定量的生化学アッセイで行う。回収した管が標準濃度のコラーゲンおよびエラスチンを有するかどうかを測定するために、標準対照と比べて回収した組織サンプルの単位湿潤重量あたり全コラーゲンおよびエラスチン含量は、ＳｉｒｃｏｌコラーゲンおよびＦａｓｔｉｎエラスチンアッセイ系を使用して定量的に測定する（アキュレートケミカルズ＆サイエンティフィック（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）社、ウエストベリー、ニューヨーク州）。対照と比較して、工作した管内のコラーゲンの解剖学的分布を測定するために、コラーゲンＩ、ＩＩおよびＩＩＩ型の免疫細胞化学的局在化を、特異的モノクローナル抗体（サザン  バイオテクノロジーアソシエイツ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）社、バーミンガム、アラバマ州）、およびエラスチン特異的染色、Ｍｏｖａｔを用いて行う。
【０２３１】
（ｉｉｉ）生理学的分析
硝酸（ＮＯ）のような血管に作用する薬剤を合成する能力は、工作した管のスカフォールドの機能性を決定する。血管のホメオスタシスにおけるＮＯの重要性に関する証拠が増えてきている。ＮＯは静止している管のトーンに貢献し、血小板の活性化を減じ、そして白血球の内皮への付着を防ぐ。
【０２３２】
簡単に説明すると、モルモットの胸大動脈を取り出し、そして内皮層を穏やかにこすることにより取り出し、そして５ｍｍのセグメントに切断した。各セグメントは等尺性の張力の測定に、２つのタングステンスターラップ間に掛けられる。管のセグメントは、５％ＣＯ２、１５％Ｏ２およびＮ２のバランスの混合物を含む１０ｍｌのクレブスバッファー溶液を含む臓器チャンバーに３７℃で置く。各管（２〜３ｃｍ長）を２１Ｇ針に結び、これをプラスチックＩＶチュービングに付け、そして新しい大動脈セグメントを臓器チャンバーの上に配置した。セグメントは８０ｍＭのＫＣｌクレブスバッファーを用いて段階的様式で収縮されて、４ｇの静止張力を得た。９０分間の静止後、セグメントは安定な収縮である最大ＫＣｌ誘導型収縮の約５０％が達成されるまで、１０−７Ｍの最終濃度までプロスタグランジンＦ２αに応答して収縮する。次いで血管に作用する作用物質およびアンタゴニストは、注入ポンプを使用して管を介して加えてＮＯ生産を誘導する。１０−７〜１０−３Ｍの間の血管に作用する作用物質の用量を試験し、そして用量応答曲線を構築する。
【０２３３】
実施例２１：脱細胞化組織および臓器の調製
以下の方法は、臓器または組織の複雑な３次元的インフラ構造を破壊せずに、臓器または組織の全細胞含量を除去する工程を記載する。
【０２３４】
（ｉ）臓器
肝臓はＣ７ブラックマウスから組織摘出の標準的な技法を使用して外科的に取り出した。肝臓は単離した肝臓を覆う適当容量の蒸留水を含むフラスコに入れた。磁気撹拌プレートおよび磁気スターラーを使用して単離した肝臓を蒸留水中で４℃にて２４〜４８時間、適切な速度で回転した。この工程は細胞屑および単離された肝臓の回りの細胞膜を除去する。
【０２３５】
この最初の除去工程後、蒸留水を０．５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する０．０５％の水酸化アンモニウム溶液と置き換える。肝臓はこの溶液中で４℃にて７２時間、磁気撹拌プレートおよび磁気スターラーを使用して回転させた。このアルカリ溶液は単離した肝臓の核および細胞質成分を可溶化した。界面活性剤ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を使用して、肝臓の核成分を取り出し、同時に水酸化アンモニウム溶液は単離した肝臓の細胞膜および細胞質タンパク質を溶解するために使用した。
【０２３６】
次いで単離した肝臓は磁気撹拌プレートおよび磁気スターラーを使用して４℃にて２４〜４８時間、蒸留水中で洗浄した。この洗浄工程後、単離物からの細胞成分の除去は、肝臓の小片の組織学的分析により確認した。必要ならば単離した腎臓を再度、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する水酸化アンモニウム溶液を用いて処理して単離した肝臓の全細胞含量を除去した。可溶化成分の除去後、単離した肝臓の形状のコラーゲンの３次元枠組が生じた。
【０２３７】
この脱細胞化肝臓を１ｘリン酸バッファー溶液（ＰＢＳ）で、脱細胞化した肝臓を４℃で一晩、磁気撹拌プレートおよび磁気スターラーを使用して回転させることにより平衡化した。平衡化後、脱細胞化肝臓を真空下で一晩、凍結乾燥した。凍結乾燥した肝臓は７２時間、エチレンオキシドガスを使用して滅菌した。滅菌後、脱細胞化肝臓を即座に使用するか、または４℃でもしくは室温で必要となるまで保存した。保存した臓器は組織培養基で一晩、４℃にて平衡化した後、培養した細胞を播種した。
【０２３８】
（ｉｉ）血管
ブタの動脈セグメントは、ブタ（２０〜３０Ｋｇ、パターソン  ファーム（Ｐａｔｅｒｓｏｎ  Ｆａｒｍ）、マサチューセッツ州）から得た。３〜４ｍｍの内膜管腔サイズを持つ血管を、約４ｃｍ長のセグメントに切断した。管を蒸留水中に１時間置いて赤血球の溶解を誘導し、徹底的に洗浄し、そして機械的回転シェーカー（１２０ＲＰＭ）内で塩水中に１％Ｔｒｉｔｏｎ  １００Ｘおよび０．１％水酸化アンモニウムを含有する脱細胞化溶液中で、４℃にて４８時間インキュベーションした。この工程を２回繰り返し、次いで蒸留水で徹底的に洗浄した。脱細胞化された管をＰＢＳ中に２４時間置き、次いで凍結乾燥し（ビルティス（Ｖｉｒｔｉｓ）；ガルディナー、ニューヨーク州）、そして冷ガス中で滅菌した。
【０２３９】
脱細胞化法の結果は、脱細胞化および凍結乾燥された動脈セグメントがそれらの管状の外観を維持し、そして有意に縮んでいないことを示した。脱細胞化された管のヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色は、管壁内にコラーゲン様の繊維の層を表し、脱細胞化法が自然な管壁の非細胞成分を損傷しなかったことを示唆した。
【０２４０】
脱細胞化管壁マトリックスの組成を調査するために、異なる細胞外成分間を識別するＭｏｖａｔ染色を行った。結果は、内部および外部エラスチン層（茶色染色）および中央の幾つかのコラーゲン層（赤色染色）を含め、脱細胞化管がそれらの細胞外マトリックス構造を保存したことを示した。脱細胞化された管の管腔側の走査型顕微鏡（ＳＥＭ）調査は、自然な細胞層の除去を表し、平らな表面を残した。管壁の断面では、管腔側よりも稠密な多くのコラーゲン層が明らかになった。
【０２４１】
また脱細胞化された管の機械的挙動は、脱細胞化管がどのように機械的負荷に応答するかを調査することにより評価された。結果は、純粋なコラーゲン管に関する典型的な圧−直径曲線を示した（図１０Ａ）。直径の変化は両方の管について４〜５％の範囲であり、これはヒトにおける大動脈のインビボでの機械的挙動と一致する。機械的負荷試験は、脱細胞化された管について一軸負荷試験機を使用して軸および周囲方向で行った。脱細胞化された管は、動脈の既知の機械的挙動から予想される直交異方性の機械的挙動を現した。特に周囲方向の歪みは軸方向の歪みよりも低い程度で起こった（図１０Ｂ）。脱細胞化構造物に関するバースト圧は１，９６０ｍｍＨｇ、すなわち収縮期圧の約１６倍であった。一緒に考慮すると、これらの結果はブタ動脈セグメントの脱細胞化が管から細胞成分を確実に除去すると同時に、管壁内の細胞外マトリックスおよびその機械的強度を保存することを示す。
【０２４２】
実施例２２：ヒト伏在内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）の単離
十分な説明に基づく同意を得た後、伏在静脈の捨てたセグメントをＣＡＢＧを受けている患者から得た。管は２０％ＦＣＳを含有するＭ１９９培地に入れた。約１ｃｍのセグメントを両端で挟み、そして無血清Ｍ１９９培地中の１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＩＩ型で満たし、そして５％ＣＯ２湿潤化インキュベーターに３７℃にて２０分間置いた。次いで静脈に５０ｍｌのＭ１９９を流し、そして細胞は３００×ｇで１０分間遠心することにより集めた。続いて細胞は、２０％ＦＢＳを含有する３ｍｌのＥＢＭ−２培地に再懸濁し、そして３ｃｍのゼラチン被覆皿に播種した。コンフルエンス付近に達した後、ＨＳＶＥＣはＵｌｅｘユーロピアスＩレクチン（ＵＥＡ−Ｉ：ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）、ベーリンガム、カリフォルニア州）被覆磁気ビーズ（ダイナル：Ｄｙｎａｌ、ノルウェイ）をＪａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．：２５７−２６２に記載されているように使用して免疫単離により精製した。続いてＨＳＶＥＣはゼラチン被覆１０ｃｍプレートで培養し、そして培地を３日毎に交換した。細胞の回収および免疫単離工程は、数回繰り返して同じ結果を得、そし細胞は１２継代以上培養した。免疫組織化学的分析には、８個のチャンバースライドに播種したＨＳＶＥＣを２％パラホルムアルデヒドで固定し、洗浄し、そして１次抗体とインキュベーションした。ビオチン化２次抗体を使用し、そしてＦＩＴＣ結合アビジンにより検出した。スライドにＤＡＰＩ含有培地を乗せ、そして蛍光顕微鏡下で視覚化した。１０ｃｍ皿内の培養したＨＳＶＥＣは、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎおよびプロテアーゼインヒビターを含有するバッファーに溶解した。免疫沈降およびウエスタンブロットは抗−ＫＤＲ抗体を用いて行った。
【０２４３】
実施例２３：バイオリアクター小室
自然なインビボの血管（すなわち血流および脈拍数の変動に耐えることができる）を模する機械的特性を有する血管を製造するために、バイオリアクター小室を設計し、そして工作する血管を予備調整するために使用した。
【０２４４】
組織を工作した小内径血管（ＴＥＢＶ）の物理的特性の構成（ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ）および強化は、ヒト内皮細胞を被覆した脱細胞化したブタの頸動脈を使用して具体的に説明する。細胞を播種したマトリックスをバイオリアクターに入れ、ここでそれらを生理学的流れおよび圧の条件で１週間インキュベーションした。
【０２４５】
この方法には滅菌した脱細胞化血液をバイオリアクターにルアーフィッティング（ｌｕｅｒ  ｆｉｔｔｉｎｇ）を介して取り付けた（図１２）。ヒト内皮細胞は１．５ｘ１０６細胞／ｍｌの密度で管腔に挿入し、そして密閉して静的播種を可能にした。次いでバイオリアククーは２回転するために３分毎に９０度回転させた。回転後、細胞をさらに３０分間、静的にインキュベーションした後、剪断応力を誘導するために流系にあるバイオリアククー（管）に配置した。定常流を安定して４日間増加して、３〜２０ダイン／ｃｍ２の壁体剪断応力値を誘導した。拍動性流条件をさらに２日間続けて、１０〜２５ダイン／ｃｍ２の壁体剪断応力値および８０〜１８０ｍｍＨｇの圧分布を生成した。低温切片（８μｍ）はヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）を用いて組織学的に分析して、内皮細胞の結合を識別した。
【０２４６】
機能的なコンフルエントなＥＣ層は、移植片血栓症および動脈硬化症の防止に必須な成分である。したがって脱細胞化した血管の管腔に正しい播種を有することは重要である。バイオリアククーを使用して、内皮細胞は内皮の均一なコンフルエント層を提供することが見いだされた。
【０２４７】
脱細胞化された管の機械的特性（バースト圧、ストレスおよび歪み）は、自然なヒトの動脈に大変類似した。ヘマトキシリンおよびエオシン染色（Ｈ＆Ｅ）は、管腔側に播種した内皮細胞がマトリックスに付着し、そして均一な単層を形成することを具体的に説明した。これら結果は、内皮細胞を被覆したＴＥＢＶが小内径の管の多くの形態学的および機能的特徴を有することを明らかにした。ＴＥＢＶは潜在的に管移植片として臨床的に有用となり得る。
【０２４８】
実施例２４：脱細胞化したブタの動脈セグメントにＨＳＶＥＣの播種
実施例２３に記載したバイオリアクターから管の出口の一つを密閉し、そして約０．５ｍｌのＨＳＶＥＣ（５ｘ１０６細胞／ｍｌ）懸濁液をもう一つの出口から挿入し、そして管を１５分毎に回転しなが１時間放置した。その後、ＥＢＭ−２を穏やかに加え、そして培地を２〜３日毎に交換した。細胞はマトリックス上で５〜７日成長させた。１６個のＨＳＶＥＣを播いた脱細胞化されたブタの管を、８匹の無胸腺マウスの皮下空間に移植し、そして７日後に組織学的分析のために回収した。回収したマトリックスをＯ．Ｃ．Ｔ．化合物（サクラ  ファインテック（Ｓａｋｕｒａ  Ｆｉｎｅｔｅｋ）、トランス、カリフォルニア州）に浸し、そして液体窒素中で凍結した。低温切片（５μｍ）をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）で組織学的に、そして抗ＣＤ−３１抗体で免疫染色することにより分析した。対照染色は正常なヤギ血清を使用して行った。１次抗体はアビジン−ビオチン−イムノペルオキシダーゼ法を使用して検出した。対照として、１次抗体を正常ヤギ血清に置き換えた。
【０２４９】
脱細胞化動脈セグメントは完全な管状構造を維持し、それらを短期導管として役に立つようにできたが、機能的にコンフルエントなＥＣ層が移植片血栓症および動脈硬化を防止するために必須な成分である。したがって臨床的に関連するヒト起源のＥＣを調査した。ＥＣは捨てられたヒト伏在静脈セグメント（ＨＳＶＥＣ）から単離し、そしてＵｌｅｘユーロピアスＩレクチン使用して免疫単離により初代培養物から精製した。数名のドナーに由来するＨＳＶＥＣは、培養、長期、で成功裏に拡大し、そしてそれらは典型的なＥＣ単層をコンフルエントに形成した。ＨＳＶＥＣの抗フォンヴィルブラント因子（ｖＷＦ）および抗−ＫＤＲ抗体を用いた免疫組織化学的分析では、典型的な穿刺染色が示された。抗−ＣＤ３１染色は特異的な細胞膜染色である。対照的にＨＳＶＥＣは平滑筋細胞（ＳＭＣ）アクチン染色には陰性であった。内皮−特異的ＶＥＧＦ受容体２（ＫＤＲ）の発現は、免疫沈降および抗−ＫＤＲ抗体でのウエスタンブロットにより確認された。これらＥＣマーカーの発現は、インビトロでの培養中に維持された。これらの結果は培養したＨＳＶＥＣがＥＣ表現型を有し、そして特異的なＥＣ遺伝子および機能的増殖因子受容体を発現することを示す。
【０２５０】
ＨＳＶＥＣを脱細胞化されたブタの管腔に播種し、そして細胞を播種した管をさらに５〜７日間、カルチャー中でインキュベーションした。播種した管のＳＥＭ調査は、細胞の均一層の表面被覆を示した。播種した管のセグメントをさらにｍＲＮＡ単離用に処理した。細胞を播種した脱細胞化された管のＲＴ−ＰＣＲ分析では、培養したＨＳＶＥＣの発現レベルに類似するＶＥＧＦ受容体、Ｆｌｔ−１、ＫＤＲおよびＮＲＰ−１ならびにＧＡＰＤＨの発現が明らかとなった。対照的に、これら遺伝子の発現は、非播種脱細胞化管では検出できず、動脈セグメントの完全な脱細胞化が確認された。これらの結果は、細胞の播種から５〜７日後に、インビトロで脱細胞化された管上のＨＳＶＥＣの存在を確認するものであった。
【０２５１】
細胞を播種した脱細胞化された管のセグメントは、ＨＳＶＥＣが脱細胞化された管上でインビボで維持され得るかどうかを試験するために、無胸腺マウスの皮下空間に移植された。管のインプラントは７日後に取り出し、そして組織学的分析のために処理した。Ｈ＆Ｅ染色は、脱細胞化された管の管腔面上の均一な細胞単層を示した。抗−ヒトＣＤ３１での免疫組織化学的染色では、細胞層がＨＳＶＥＣからなることが確認された。あわせるとこれらの結果は、脱細胞化された管がインビトロおよびインビボでＥＣ用に適合性がある基質であることを示す。
【０２５２】
実施例２５：血管の特性決定
この実施例は播種した血管の特性を決定するために使用した様々な技術を説明する。
【０２５３】
（ｉ）ＲＮＡ単離およびＲＴ−ＰＣＲ
脱細胞化されたブタの管、ＨＳＶＥＣを播種した管（約４ｃｍ）および培養したＨＳＶＥＣをＲＮＡｚｏｌ試薬で４０Ｃにて組織ホモジナイザーを使用して均一化した。ＲＮＡは製造元（テルテスト（ＴｅｌＴｅｓｔ）、フレンズウッド、テキサス州）のプロトコールに従い単離した。相補的ＤＮＡは２ｍｇのＲＮＡからＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ逆転写酵素およびプライマーとしてランダムヘキサマーを使用して合成した。Ｆｌｔ−１、ＫＤＲ、ニューロピリン−１（ＮＲＰ−１）およびグリセルアルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）プライマー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カールスバット、カリフォルニア州）を使用したＲＴ−ＰＣＲ分析は、製造元のプロトコールを使用して行った。Ｆｌｔ−１（４１６ｂｐ）、ＫＤＲ（４７９ｂｐ）、ＮＲＰ−１（４０９ｂｐ）およびＧＡＰＤＨ（６７３ｂｐ）に相当するＰＣＲ産物は、２％アガロースゲルで解析し、エチジウムブロミドで染色し、そしてＵ．Ｖ．光下で視覚化した。
【０２５４】
（ｉｉ）プロスタグランジンＦ１αの合成
プロスタグランジンＦ１αの合成は、調整培養中の６−ケトプロスタグランジンＦ１αを測定することにより決定した。簡単に説明すると、ＨＳＶＥＣを脱細胞化したマトリックス（約１．５ｘ１０５細胞／５０ｍｍ２）に播種した。４８時間後、マトリックスを４８ウェル皿の別個のウェルに移した。平行して、ＨＳＶＥＣの量を上げながら４８ウェル皿に播種した。３日後、５０ｍｌの調整した培地を製造元（ケイマンケミカル；ケイマン諸島）の使用説明に従い酵素イムノアッセイキットを使用してアッセイした。レベルは細胞数あたり３日間の６−ケトプロスタグランジンＦ１ａの生産として算出した。
【０２５５】
（ｉｉｉ）硝酸（ＮＯ）生産
ＮＯ媒介型の管の弛緩は、臓器−チャンバー中で評価した。簡単に説明すると、モルモットの胸大動脈を回収し、内皮層を穏やかに掻き取るにとにより取り出し、そして５ｍｍのセグメントに切断した。各セグメントを等尺性の張力の測定のために、２つのタングステンスターラップの間に掛けた。管のセグメントは、３７℃で５％ＣＯ２、１５％Ｏ２およびＮ２のバランスの混合物を含む１０ｍｌのクレブスバッファー溶液を含む臓器チャンバーに置いた。各ＨＳＶＥＣ播種管（２〜３ｃｍ長）を２１Ｇ針に結び、これをプラスチックＩＶチュービングに付け、そして新しい大動脈セグメントを臓器チャンバーの上に配置した。セグメントは８０ｍＭのＫＣｌクレブスバッファーを用いて段階的様式で収縮させて、４ｇの静止張力を得た。９０分間の静止後、セグメントは最大ＫＣｌ誘導型収縮の約５０％の安定な収縮が達成されるまで、１０−７の最終濃度までプロスタグランジンＦ２αに応答して収縮した。次いで血管作用物質およびアンタゴニストを、注入ポンプを使用してＨＳＶＥＣ播種管を介して加えてＮＯ生産を誘導した。１０−７Ｍ〜１０−３Ｍの間の用量の血管作用物質を試験し、そして用量応答曲線を構築した。
【０２５６】
脱細胞化された管上に播種されたＨＳＶＥＣが機能的であるかどうかを調査するために、細胞のプロスタグランジンおよび硝酸代謝を評価した。６−ケトプロスタグランジンＦ１α、血小板凝固の有力なインヒビターおよび血管平滑筋弛緩物質の合成を調査し、ならびにＰＧＩ２の加水分解を調査した（図１４Ａ）。
【０２５７】
脱細胞化された管に播種したＨＳＶＥＣは、３日間に約８０ｐｇの６−ケトプロスタグランジン（ＰＧ）Ｆ１αを分泌した。このレベルは７５ｍｍ２の組織培養皿でのＨＳＶＥＣのサブ−コンフルエントな単層（１００，０００細胞）により分泌される６−ケトＰＧＦ１ａの量に類似する。ＨＳＶＥＣがＮＯを生産する能力も、臓器−チャンバー法を使用して調査した（図１４Ｂ）。モルモットの大動脈の内皮−剥離セグメントは、プロスタグランジンＦ２アルファで収縮した。このセグメントは、同じ臓器チャンバー中でＨＳＶＥＣを播種した移植片を通して潅流したカルシウムイオノフォアＡ２３１８７にその濃度を上昇させながら暴露した。モルモットの大動脈セグメントは用量依存的様式で弛緩した。Ａ２３１８７に対するこの用量依存的弛緩は、内皮ＮＯ−シンターゼインヒビターＬ−ＮＡＭＥの１ｘ１０−３Ｍの添加により有意に弱まった（７５．０％対１０．７％、ｐ＜０．００１）。Ａ２３１８７がＨＳＶＥＣを播種されていない移植片を通って潅流する時、モルモットの大動脈セグメントは、完全に収縮したままだった。最後に大動脈セグメントをニトロプルシドナトリウム（ＳＮＰ）、内皮独立的ＮＯドナーの濃度の上げながらそれに暴露すると、用量応答的な弛緩が生じ、モルモットの大動脈セグメントにおける正常な平滑筋機能を示す。これらの結果は脱細胞化管に播種されたＨＳＶＥＣが生理学的刺激物に応答してＥＣ特異的な代謝を生じることができることを示す。
【０２５８】
これらの結果は、小さい直径の管移植片が内皮細胞を播種した脱細胞化マトリックスまたはナノスピンされたマトリックスのようなマトリックスを使用して、そして本発明のバイオリアクター小室および方法で作成できることを表す。ヒト起源の内皮細胞で脱細胞化された動脈をコーティングすることによる臨床的使用のための小さい管腔直径の血管。ヒト伏在静脈内皮細胞（ＨＳＶＥＣ）は、捨てられた伏在静脈のセグメントから成功裏に単離され、そして脱細胞化された管上に単層を形成した。これらの結果は、ヒト内皮細胞を播種した脱細胞化管が外科的目的の小さい直径の血管の臨床的代替物として役立つことができることを示唆する。
【０２５９】
脱細胞化されたブタの大動脈セグメントは、シート様のマトリックスを管状する必要無しで管の手術に適切なサイズ範囲であった。脱細胞化された管のマトリックスは、Ｍｏｖａｔ染色に示されるようにエラスチンの層を取り巻くコラーゲンの層からなる。多くのコラーゲン層が、認知され得る漏出無しに１，９００ｍｍＨｇの圧に抵抗する脱細胞化された管の機械的強度に貢献した。脱細胞化プロセスはＳＥＭにより示されるように管壁の孔性を改変しなかった。管の管腔上のエラスチン層の存在は、内皮細胞の付着および成長を強化した。
【０２６０】
小さい管腔の人工器官の移植片上のコンフルエントな内皮細胞単層の存在は、移植後の血栓形成の防止を提供するために必須である。異種移植片に対する免疫応答を回避するために、主に非ヒト内皮細胞の高い免疫原性により、ヒト内皮細胞は伏在静脈から単離され、そして脱細胞化マトリックスに播種するために使用された。伏在静脈に由来する内皮細胞は、酵素的消化により単離され、そしてインビトロで１０〜１４日後に５ｃｍ長の脱細胞化された管（約５ｘ１０６細胞）に播種するために必要な決定的な量の細胞に達した。ＨＳＶＥＣは最高１２継代まで、典型的な内皮細胞の単層を維持し、そしてＣＤ３１、ｖＷＦおよびＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）のような内皮細胞マーカーを発現した。
【０２６１】
本発明のバイオリアクター小室は、脱細胞化された管上に細胞を播種するために使用された。細胞は管の管腔側に付着し、そしてインビボで７日後に保存された連続的単層を形成した。これらの結果は、脱細胞化法がコラーゲンおよびエラスチンからなる生体適合性マトリックスをもたらし、そして自然なマトリックスがＨＳＶＥＣの成長を支持できることを示す。
【０２６２】
さらに播種されたＨＳＶＥＣは、調整培地中で６−ケトＰＧＦ１ａのレベルにより測定されるようなプロスタグランジン（ＰＧ）１２を合成し、そして臓器−小室分析によりＮＯを生産したことが示された。これらの有力な血管拡張薬は、生化学的および機械的刺激に応答して内皮細胞により特異的に分泌されるが、長期の移植片の利用性を維持するために必須である。血管作用物質を合成する能力は、さらにＨＳＶＥＣが脱細胞化された管腔を被覆する機能的層として役立つことを示す。ＮＯは静止している管のトーンに貢献し、血小板活性化を減じ、そして白血球の内皮への付着を防ぐ。ＮＯが管癖に及ぼすこれらの効果は、初期の血栓形成および後期の動脈硬化に対して移植した移植片を保護するために重要である。
【０２６３】
このように本発明の方法は機能的血管、特に小さい内径の血管の生成に有用である。
【０２６４】
実施例２６：組織を工作した心臓弁の作成
この実施例は血管に疾患がある患者から得た循環している前駆細胞から、心臓弁を製造し、そして予備調整するための種々の技術を記載した。
【０２６５】
循環している前駆細胞は、血管に疾患がある患者の血液サンプルから単離し、成長させ、そして拡張した。細胞は既知の細胞特異的マーカーを用いて特性決定した。拡張した細胞は、内皮および平滑筋細胞系統へ誘導し、続いて細胞の特性決定を行った。細胞をコラーゲンを基材とするブタに由来する弁のマトリックス上に播種した。細胞を播種した弁のマトリックスを、正常な循環を模する動的流動条件下に置くことができる。弁の構造物は組織学的、構造的および生化学的に経時的に調査することができる。
【０２６６】
循環している前駆細胞群は、血管に疾患がある患者の末梢血液について成功裏に単離され、成長させ、そして拡張された。前駆細胞は多くの細胞特異的マーカーを使用して確認された。分化した内皮および筋肉細胞は、細胞特異的抗体およびウエスタンブロット分析を使用して免疫組織化学的に特性決定した。弁のマトリックスに播種した細胞は、付着し、増殖し、そして定めた細胞層を形成した。工作した弁の組織は正常な弁の組織に類似する生物機械的特性を有した。凝固の程度は細胞を含まない対照と比較した時、細胞で覆われた弁の表面で最少であった。この実験の結果を図１５〜２５に示す。
【０２６７】
この実験は、前駆細胞が血管に疾患がある患者の末梢血から単離され、そして成長させることができることを示す。循環している前駆細胞から分化した内皮および筋肉細胞は弁表面を覆い、そして凝固を防ぐことができる。弁は機械的に、生化学的に、そして形態学的に分析された。播種したマトリックス上のプレート沈着は、全血をマトリックスにプレーティングした後、走査型電子顕微鏡で同定された。血小板の量（走査型電子顕微鏡における白色ビーズ状の形）をＳＥＭ下で観察した。この技術の使用により、血栓形成の発症を最少とすることにより心臓弁手術の成果を改善することができる。
【図面の簡単な説明】
【０２６８】
【図１】エレクトロスピン装置の該略図である。
【図２】量子ドット上のヘパリンの結合の該略図である。
【図３】エレクトロスピンナノファイバーである。
【図４】管の移植片スカフォールドの圧−直径曲線のグラフである。
【図５】５Ａは、２つの脱細胞化構造物の一軸試験からの軸および周囲応力−歪みデータのグラフである。  ５Ｂは、エレクトロスピンされた管の一軸試験からの軸および周囲応力−歪みデータのグラフである。
【図６】６Ａは、４つのマトリックス上の培養された内皮細胞の細胞生育能のグラフである。  ６Ｂは、４つのマトリックス上の培養された内皮細胞のミトコンドリア代謝活性のグラフである。
【図７】７Ａは、５つのマトリックス上の培養された内皮細胞の細胞生育能のグラフである。  ７Ｂは、５つのマトリックス上の培養された内皮細胞のミトコンドリア代謝活性のグラフである。
【図８】８は、近赤外線照射でヘパリン放出を示すヘパリン含有マイクロカプセルのグラフである。
【図９】回収した管スカフォールドから残るヘパリンの定量を示すグラフである。
【図１０】１０Ａは、脱細胞化および自然な血管の圧−直径曲線を示すグラフである。  １０Ｂは、脱細胞化および自然な血管の軸および周囲応力および歪みを示すグラフである。
【図１１】１１Ａは、本発明の予備調整小室の上該略図である。  １１Ｂは、本発明の予備調整小室の側面該略図である。    １１Ｃは、本発明の予備調整小室の横断該略図である。
【図１２】本発明の予備調整小室の写真である。
【図１３】本発明の予備調整小室内の拍動性流の流速波形を示すグラフである。
【図１４】１４Ａは、ヒト内皮細胞を播種した脱細胞化された血管から６−ケトＰＧＦ１の生産を示す棒グラフである。  １４Ｂは、ヒト内皮細胞を播種した脱細胞化された血管から硝酸の生産を示すグラフである。
【図１５】１５Ａは、正常な僧帽弁（Ａ）、ブタの代用弁（Ｂ）および人工代用弁（Ｃ）の該略図である。
【図１６】１６ＡおよびＢは、内皮細胞を播種した画像マトリックスである。
【図１７】１７ＡおよびＢは、血小板沈着アッセイにおける細胞の画像である。
【図１８】末梢血から細胞の単離を示す該略図である。
【図１９】前駆細胞から分化したヒト内皮および平滑筋様細胞の画像である。
【図２０】前駆細胞から分化したヒト内皮および平滑筋様細胞の位相差画像である。
【図２１】分化した内皮細胞（Ａ）および平滑筋様細胞（Ｂ）のウエスタンブロットの写真である。
【図２２】脱細胞化前（Ａ）、脱細胞化後（Ｂ）および凍結乾燥後（Ｃ）のブタ心臓弁の写真である。
【図２３】ブタ弁脱細胞化マトリックス（Ａ）、および脱細胞化マトリックスのＤＮＡアッセイを示すアガロースゲル（Ｂ）の画像を示す。
【図２４】ブタ脱細胞化マトリックスの画像である。
【図２５】脱細胞化リーフレットの機械的試験の結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図２５】
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【図３】
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【図１２】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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