(57)【要約】  プールされたＤＮＡを使って所望の配列を持つ１つ以上のＤＮＡ片を合成するための、階層分割段階と階層アセンブリ段階とを含む方法およびシステム。分割段階では、所望の核酸配列を持つ１つ以上のＤＮＡ片の配列を、再帰的に、部分的にオーバーラップする派生ＤＮＡ片に分割し、最終分割ステップ後を除いて、それら派生ＤＮＡ片を複数のプールに割り当てる。この際、オーバーラップした隣接する派生ＤＮＡ片を、異なるプールに割り当てる。アセンブリ段階では、得られたＤＮＡ片プールに対応するオリゴヌクレオチドプールを取得し、所望の配列を持つ１つ以上のＤＮＡ片を、階層分割とは逆の順序で、オーバーラップ伸長によってアセンブルする。この方法の実施形態は階層アセンブリの利点とプールされたオリゴヌクレオチドの利点とを合わせ持つ。【選択図】  なし
2008534016.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を階層的に合成する方法であって、
（ｉ）核酸配列を複数のＤＮＡ配列に階層的に分割することであって、隣接するＤＮＡ配列がオーバーラップ部分を含むこと；
（ｉｉ）任意に、隣接するＤＮＡ配列のオーバーラップ部分間の正しいハイブリダイゼーションを強化し、かつ間違ったハイブリダイゼーションを弱くするために、ＤＮＡ配列の少なくとも一部を最適化すること；
（ｉｉｉ）分割の最終階層レベルを除く分割の各階層レベルで、ＤＮＡ配列を、複数のＤＮＡ配列プールに割り当てることであって、オーバーラップ部分を持つ隣接するＤＮＡ配列を、異なるプールに割り当てること；ならびに
（ｉｖ）各プール中の各ＤＮＡ配列について、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を再帰的に繰り返すこと
を含む方法による、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列の階層分割を含む方法。
【請求項２】
所望の核酸配列を持つ前記ＤＮＡ片が、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片を含むプールのメンバーであり、かつ
階層分割を、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片の核酸配列に対して同時に行う、
請求項１の方法。
【請求項３】
分割の少なくとも一つの階層レベルにおいて、ＤＮＡ配列の全てが、ほぼ同じサイズである、請求項１の方法。
【請求項４】
分割の少なくとも一つの階層レベル内で最適化することを含み、その最適化が、少なくとも一つのプール中のあらゆるＤＮＡ配列間で起こり得る正しいハイブリダイゼーションおよび間違ったハイブリダイゼーションの全てを包括的に最適化することを含む、請求項１の方法。
【請求項５】
分割の少なくとも一つの階層レベル内で最適化することを含み、その最適化が、正しいハイブリダイゼーションの最も低い融解温度と間違ったハイブリダイゼーションの最も高い融解温度との間の温度ギャップを計算することを含む、請求項１の方法。
【請求項６】
温度ギャップが少なくとも約１℃である、請求項５の方法。
【請求項７】
分割の少なくとも一つの階層レベル内で最適化することを含み、最適化が、サイレントコドン置換を入れ換えることを含む、請求項１の方法。
【請求項８】
サイレントコドン置換が、ある生物のコドン使用頻度の選択に従った置換である、請求項７の方法。
【請求項９】
コドン使用頻度の選択がコドン対の選択である、請求項８の方法。
【請求項１０】
生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である、請求項８の方法。
【請求項１１】
分割の少なくとも一つの階層レベル内で最適化することを含み、最適化が、調節領域コンセンサス配列中の縮重を利用することを含む、請求項１の方法。
【請求項１２】
分割の少なくとも一つの階層レベル内で最適化することを含み、最適化が、隣接する得られたＤＮＡ片間の境界点を調節することを含む、請求項１の方法。
【請求項１３】
分割の少なくとも一つの階層レベルにおける最適化が、直接塩基割り当てを含む、請求項１の方法。
【請求項１４】
プールの少なくとも一つが、次に高い分割の階層レベルからの複数の次に大きなＤＮＡ配列の分割によってもたらされるＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む、請求項１の方法。
【請求項１５】
プールが最大プールである、請求項１の方法。
【請求項１６】
自動化される、請求項１の方法。
【請求項１７】
所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を階層的に合成する方法であって、
（ｖ）所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列に対して行われる請求項１の方法に従って作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応するＤＮＡ片プールを取得すること；
（ｖｉ）各プール中のＤＮＡ片を、次に高い分割の階層レベルにおける次に大きなＤＮＡ片に対応するＤＮＡコンストラクトへと自己集合させること；
（ｖｉｉ）そのＤＮＡコンストラクトから、次に大きなＤＮＡ片を作製すること；
（ｖｉｉｉ）次に高い分割の階層レベルに対応する次に大きなＤＮＡ片のプールを作出すること；ならびに
（ｉｘ）所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を合成するために、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）における階層分割とは逆の順序で、ステップ（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）を再帰的に繰り返すこと
を含む方法による、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の階層アセンブリを含む方法。
【請求項１８】
ステップ（ｖ）におけるＤＮＡ片が合成オリゴヌクレオチドである、請求項１７の方法。
【請求項１９】
アセンブリの少なくとも一つの階層レベルにおいて、次に大きなＤＮＡ片がほぼ同じサイズである、請求項１７の方法。
【請求項２０】
アセンブリの少なくとも一つの階層レベルにおいて、次に大きなＤＮＡ片の作製が、ポリメラーゼオーバーラップ伸長またはライゲーションを含む、請求項１７の方法。
【請求項２１】
アセンブリの少なくとも一つの階層レベルにおいて、
次に大きなＤＮＡの作製がポリメラーゼオーバーラップ伸長を含み、かつ
そのポリメラーゼオーバーラップ伸長が高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ反応を含む、
請求項２０の方法。
【請求項２２】
アセンブリの少なくとも一つの階層レベルにおいて、ステップ（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の少なくとも一つの後に、次に大きなＤＮＡ片を精製することまたは増幅することの少なくとも一つをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項２３】
精製が電気泳動またはクロマトグラフィーの少なくとも一つを含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
精製が酵素による処理を含む、請求項２２の方法。
【請求項２５】
酵素がＭｕｔＳ、Ｔ７エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせである、請求項２４の方法。
【請求項２６】
増幅がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項２２の方法。
【請求項２７】
ステップ（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）の少なくとも一つを自動化する、請求項１７の方法。
【請求項２８】
自動化されたステップの少なくとも一つをマイクロ流体的に行う、請求項２７の方法。
【請求項２９】
所望の核酸配列を持つ前記ＤＮＡ片が、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片を含むプールのメンバーであり、かつ
ステップ（ｖ）におけるＤＮＡ片プールが、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片の核酸配列に対して行われる請求項１の方法に従って作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応する、
請求項１７の方法。
【請求項３０】
最終階層アセンブリの生成物が、所望の配列を持つＤＮＡ片のプールを含む、請求項２９の方法。
【請求項３１】
最後の階層アセンブリステップ後に、所望の配列を持つ少なくとも一つのＤＮＡ片を単離することをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項３２】
単離がポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項３０の方法。
【請求項３３】
最後の階層アセンブリステップ後に、所望の配列を持つＤＮＡ片を選択することをさらに含む、請求項１７の方法。
【請求項３４】
前記選択が、所望の配列を持つＤＮＡ片をフレームシフトベクター中にクローニングすることを含む、請求項３３の方法。
【請求項３５】
フレームシフトベクターが配列番号１または配列番号２を含む、請求項３４の方法。
【請求項３６】
最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応するオリゴヌクレオチドプールを作製することをさらに含む、請求項１の方法。
【請求項３７】
オリゴヌクレオチドプールの少なくとも一つが、固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを含む、請求項３６の方法。
【請求項３８】
固体支持体がビーズ、アレイ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項３７の方法。
【請求項３９】
所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を階層的に合成するためのシステムであって、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列に対して行われる請求項１の方法によって作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応する複数のオリゴヌクレオチドプールを含むシステム。
【請求項４０】
少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプールがチューブ内またはウェル内に配置されている、請求項３９のシステム。
【請求項４１】
少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプールが固体支持体に結合されている、請求項３９のシステム。
【請求項４２】
固体支持体がビーズ、アレイ、またはそれらの組み合わせを含む、請求項４１のシステム。
【請求項４３】
所望の核酸配列を持つＤＮＡ片が、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片を含むプールのメンバーであり、かつ
複数のオリゴヌクレオチドプールが、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片の核酸配列に対して行われる請求項１の方法によって作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応する、
請求項３９のシステム。
【請求項４４】
所望の核酸配列を持つ少なくとも一つのＤＮＡ片を単離するのに適したポリメラーゼ連鎖反応プライマーをさらに含む、請求項３９のシステム。
【請求項４５】
フレームシフトベクターをさらに含む、請求項３９のシステム。
【請求項４６】
複数のオリゴヌクレオチドプールから所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を合成するための指示をさらに含む、請求項３９のシステム。
【請求項４７】
所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を階層的に合成するためのシステムであって、遂行された場合に請求項１の方法を実行する機械可読指示を含む機械可読媒体を含むシステム。
【請求項４８】
機械可読媒体に作動的に連結されたデータ処理ユニットをさらに含み、そのデータ処理ユニットは機械可読指示を遂行するように作動することができる、請求項４７のシステム。
【請求項４９】
所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列に対して行われる請求項１の方法に従って作製された最終階層分割の複数のＤＮＡ配列プールに対応する複数のＤＮＡ配列プール。
【請求項５０】
所望の核酸配列を持つＤＮＡ片が、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片を含むプールのメンバーであり、かつ
複数のＤＮＡ配列プールが、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片の核酸配列に対して行われる請求項１の方法によって作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応する、
請求項４９の複数のＤＮＡ配列プール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年３月３１日に出願された米国出願第６０／６６７，１０８号の利益を主張し、その開示は参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、概してＤＮＡ分子の合成に関し、より具体的には、合成遺伝子または他のＤＮＡ配列の合成に関する。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質は、広範囲にわたる貴重な医学的、薬学的、工業的、または生物学的用途を持つ生体分子の重要な一クラスである。遺伝子は、タンパク質中の各アミノ酸に対して３つのヌクレオチド（１コドンまたは１セットのコドン）を使用する遺伝コードに従ってタンパク質を作製するのに必要な情報をコードする。発現ベクターは、タンパク質への翻訳に関して遺伝子がｍＲＮＡに転写されるのを可能にするＤＮＡ配列を含有する。
【０００４】
多くの場合、関心対象のタンパク質をコードする合成ＤＮＡを取得することが望ましい。化学カップリングによって正確に合成することができるＤＮＡは、通例、約５０〜８０ヌクレオチド以下の短い断片でしかない。それよりかなり長い断片の化学合成は、合成プロセスにおける累積エラー確率ゆえに、問題が多い。遺伝子は、通例、５０〜８０ヌクレオチドよりも明らかに長く、通常、数百ヌクレオチドまたは数千ヌクレオチドは長い。したがって、直接合成は、大きな遺伝子の作製にとっては好都合な方法ではない。
【０００５】
イントロンを含まない遺伝子は、しばしば、ＰＣＲによってゲノムＤＮＡから直接合成することができる。この方法は、細菌、下等真核生物、および多くのウイルスの遺伝子に適している。しかし、高等生物の遺伝子はほぼ全てがイントロンを含んでいる。関連する代替手段は、完全長ｃＤＮＡクローンから遺伝子をＰＣＲすることである。完全長クローンの単離および特徴づけは、多くの場合、時間のかかる退屈な作業であり、完全長ｃＤＮＡクローンを入手することができるのは、関心対象である多くの高等生物の遺伝子のうち、極めてわずかな部分に過ぎない。
【０００６】
いくつかの戦略では、オリゴヌクレオチドと呼ばれる、多数の短い、部分的にオーバーラップするＤＮＡセグメントから合成遺伝子がアセンブルされる。隣接するオーバーラップオリゴヌクレオチドは、所望の遺伝子の反対（ｏｐｐｏｓｉｔｅ：ワトソン（Ｗａｔｓｏｎ）およびクリック（Ｃｒｉｃｋ））鎖に由来する配列を含み、相補的なオーバーラップ端を持つ。これらのセグメントをアニールさせた後、例えばライゲーションおよび／またはポリメラーゼ伸長反応を、単独で使用するか、組み合わせて使用することによって、より長い二本鎖ＤＮＡにアセンブルする。
【０００７】
現在のプロセスは、「アセンブリＰＣＲ（ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ）」「オーバーラップ伸長によるスプライシング（ｓｐｌｉｃｉｎｇ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）」「ポリメラーゼ連鎖アセンブリ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）」「再帰的ＰＣＲ（ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ＰＣＲ）」などと、さまざまに呼ばれている。例えば、Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒら「Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｅｐ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｎｔｉｒｅ  ｐｌａｓｍｉｄ  ｆｒｏｍ  ｌａｒｇｅ  ｎｕｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ」Ｇｅｎｅ，１９９５，１６４，４９−５３およびＤ．Ｅ．Ｃａｓｉｍｉｒｏら「ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ＮＭＲ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ」Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，１９９７，５，１４０７−１４１２を参照されたい。このアプローチによる遺伝子合成のためのオリゴヌクレオチドを自動設計する方法が、最近、Ｄ．Ｍ．ＨｏｏｖｅｒおよびＪ．Ｌｕｂｋｏｗｓｋｉ「ＤＮＡ  Ｗｏｒｋｓ：  ａｎ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｆｏｒ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００２，３０：１０  ｅ４３に記述されている。
【０００８】
これらの方法では、ＤＮＡフラグメント、セグメント、および／またはオリゴヌクレオチドが、相補的なオーバーラップ端の間違ったアニーリング、例えばミスプライミングおよび／またはクロスハイブリダイゼーションなどにより、しばしば間違ってアセンブルされる。そのような間違ったアセンブリは、結果として、多数の間違った生成物と混合した正しい生成物を含有する、さまざまな長さを持つ生成物の混合物をもたらす。例えば電気泳動ゲル上で可視化した場合、結果として生じる混合物は、例えばＨｏｏｖｅｒおよびＬｕｂｏｗｓｋｉ（２００２）の図２、Ｓｍｉｔｈら（２００３）の図３、またはＲｉｃｈｍｏｎｄら（２００４）の図６に見られるように、スメア状のバンドまたは分散したバンドを与える。
【０００９】
ＤＮＡセグメントが間違ってアセンブルされる確率は、セグメントの数の二乗に比例して増加する。なぜなら、全てのセグメントが潜在的に他の全てのセグメントとミスプライムまたはクロスハイブリダイズすることができるからである。この問題に対処するために、例えば、合成遺伝子は、しばしば、階層的にアセンブルされる（階層アセンブリ）。第１ステップでは、連続するオーバーラップ合成オリゴヌクレオチドの小グループを、中間ＤＮＡフラグメントへとアセンブルする。次のステップでは、連続するオーバーラップ中間ＤＮＡフラグメントの小グループを、より大きい中間ＤＮＡフラグメントへとアセンブルする。完全な遺伝子が作製されるまで、このプロセスが続けられる。利点は、アセンブリエラーが減少し、正しい生成物の収率が増加することである。欠点は、必要なアセンブリステップが増えるので、プロセスがより多くの費用を必要とし、より多くの時間を消費することである。
【００１０】
最近、２件の報告により、ＤＮＡチップから得られるオリゴヌクレオチドのプールからのＤＮＡアセンブリが実証されている（Ｒｉｃｈｍｏｎｄら，２００４、Ｔｉａｎら，２００４）。どちらの報告でも、複数のオリゴヌクレオチドがＤＮＡチップ上でパラレルに合成され、それらを基板から離した。どちらの報告でも、コンスタントプライマーを使った単一のＰＣＲ反応で、オリゴをひとまとめにして増幅することができるように、コンスタントＰＣＲリーダーおよびコンストタントＰＣＲトレーラーを持つオリゴが製作された。リーダーおよびトレーラーは増幅後に制限酵素を使ってオリゴから除去された。次に、どちらのアプローチでも、プライマーを差し引いた、消化されたオリゴをアセンブリＰＣＲに使って、より長いＤＮＡフラグメントが作出された。
【００１１】
Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，Ｋ．Ｅ．ら「Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｃｈｉｐ−ｅｌｕｔｅｄ  ＤＮＡ（ＡＡＣＥＤ）：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ」Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，３２（１７）：５０１１−５０１８には、アセンブリＰＣＲ反応からの６０塩基対ＤＮＡコンストラクトの合成が、オリゴヌクレオチドが生物学的に活性であるという概念の証拠として報告されている。これは、ＤＮＡチップから放出（溶出）されたオリゴヌクレオチドの、生物学的用途（例えばアセンブリＰＣＲ）への使用を実証した初めての報告だった。彼らの合成ＤＮＡコンストラクトは非常に短かったので、ミスプライミングによる間違ったアセンブリおよび合成点欠陥（ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｉｎｔ  ｄｅｆｅｃｔｓ）の除去という難題は、無視することができた。
【００１２】
Ｔｉａｎ，Ｊ．ら「Ａｃｃｕｒａｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｆｒｏｍ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ」Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３２：１０５０−１０５４には、ＤＮＡチップからの、マルチプレックス生物学的遺伝子合成を初めて実証するものとして、大腸菌３０Ｓリボソームサブユニットのタンパク質をコードする全２１遺伝子の合成が報告されている。ミスプライミングによる間違ったアセンブリの問題は、専用コンピュータ支援設計ソフトウェア（ＣＡＤ−ＰＡＭ、「投稿準備中」として言及されている）によって対処された。合成点欠陥は、構造オリゴヌクレオチドをビーズ固定化選択オリゴヌクレオチドの２つのプール（同様にＤＮＡチップから合成され放出されたもの）に逐次的にハイブリダイズさせる２ステップハイブリダイゼーションフィルタによって除去された。各選択プールは、各構造オリゴヌクレオチドの半分にハイブリダイズするように設計され、合わせるとＤＮＡ構造全体にまたがるようになっていた。ハイブリダイゼーション熱力学は正しいオリゴヌクレオチドに有利だった。
【００１３】
Ｚｈｏｕ，Ｘ．ら「Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ＰｉｃｏＡｒｒａｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｓｓｅｍｂｌｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００４，３２（１８）：５４０９−５４１７，２００４には、マイクロ流体チャンバが記述されている。このチャンバは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドのマルチプレックス合成に使用され、そしてそのオリゴヌクレオチドは、後に小さな遺伝子の合成に使用された。
【００１４】
他の関連研究には以下に挙げるものがある：Ｅｎｇｅｌｓ，Ｊ．Ｗ．「Ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｎ  ｍｉｃｒｏｃｈｉｐｓ」Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２００５，４４（４４）：７１６６−７１６９；Ｇａｏ，Ｘ．，ら「Ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｃａｌｌｙ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ（ＴＢＩＯ）ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００３，３１（２２）：ｅ１４２；Ｊａｙａｒａｊ，Ｓ．ら「ＧｅＭＳ：ａｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ  ｆｏｒ  ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｇｅｎｅｓ」Ｎｕｃｌ.  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００５，３３（９）：３０１１−３０１６；Ｋｏｄｕｍａｌら「Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，Ｎｏｖ  ２００４，１０１（４４）：１５５７３−１５５７８；Ｒｏｕｉｌｌａｒｄ，Ｊ．−Ｍ．ら「Ｇｅｎｅ２Ｏｌｉｇｏ：ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００４，３２：Ｗ１７６−１８０；Ｒｙｄｚａｎｉｃｚ，Ｒ．ら「Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＰＣＲ  ｏｌｉｇｏ  ｍａｋｅｒ」Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００５，３３：Ｗ５２１−５２５；Ｓａｂｏｕｌａｒｄ  Ｄ，Ｄｕｇａｓ  Ｖ，Ｊａｂｅｒ  Ｍ，ら「Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｃｈｉｐｓ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓｅｐ  ２００５，  ３９（３）：３６３−３６８；Ｓｍｉｔｈ，Ｈ．Ｏ．ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＳＡ，Ｄｅｃ  ２００３，１００（２６）：１５４４０−１５４４５；Ｘｉｏｎｇ，Ａ．−Ｓ．ら「Ａ  ｓｉｍｐｌｅ，ｒａｐｉｄ，ｈｉｇｈ−ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｏｓｔ−ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ  ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ＤＮＡ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｌｏｎｇ  ｇｅｎｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」Ｎｕｃｌ.  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００４，３２（１２）：ｅ９８；およびＹｏｕｎｇ，Ｌ．，Ｄｏｎｇ，Ｑ．「Ｔｗｏ−ｓｔｅｐ  ｔｏｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｍｅｔｈｏｄ」Ｎｕｃｌ.  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００４，３２（７）：ｅ５９。
【００１５】
学術研究者、産業界、および政府からの需要が増大しつつあることに支えられて、遺伝子合成のスピード、コスト、正確さ、およびスケーラビリティの改善が、強く求められている。
【発明の開示】
【００１６】
プールされたＤＮＡを用いて所望の配列を持つ１つ以上のＤＮＡ片を合成するための、階層分割段階と階層アセンブリ段階とを含む、方法およびシステム。分割段階では、所望の核酸配列を持つ１つ以上のＤＮＡ片の配列が、再帰的に、部分的にオーバーラップする派生ＤＮＡ片に分割され、最終分割ステップ後を除いて、それら派生ＤＮＡ片が複数のプールに割り当てられる。この際、オーバーラップした隣接する派生ＤＮＡ片は、異なるプールに割り当てられる。アセンブリ段階では、得られたＤＮＡ片プールに対応するオリゴヌクレオチドプールを取得し、所望の配列を持つ１つ以上のＤＮＡ片が、階層分割とは逆の順序で、オーバーラップ伸長によってアセンブルされる。方法の実施形態は階層アセンブリの利点およびプールされたオリゴヌクレオチドの利点を合わせ持つ。
【００１７】
一部の実施形態は、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を階層的に合成する方法であって、（ｉ）核酸配列を複数のＤＮＡ配列に階層的に分割することであって、隣接するＤＮＡ配列はオーバーラップ部分を含むこと；（ｉｉ）任意に、隣接するＤＮＡ配列のオーバーラップ部分間の正しいハイブリダイゼーションを強化し、かつ間違ったハイブリダイゼーションを弱くするために、ＤＮＡ配列の少なくとも一部を最適化すること；（ｉｉｉ）分割の最終階層レベルを除く分割の各階層レベルで、ＤＮＡ配列を、複数のＤＮＡ配列プールに割り当てることであって、オーバーラップ部分を持つ隣接するＤＮＡ配列を、異なるプールに割り当てること；ならびに（ｉｖ）各プール中の各ＤＮＡ配列について、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）を再帰的に繰り返すことを含む方法による、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列の階層分割を含む方法を提供する。
【００１８】
一部の実施形態では、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片が、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片を含むプールのメンバーであり、階層分割を、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片の核酸配列に対して同時に行う。一部の実施形態では、分割の少なくとも一つの階層レベルにおいて、ＤＮＡ配列の全てが、ほぼ同じサイズである。
【００１９】
一部の実施形態では、本方法が、分割の少なくとも一つの階層レベル内で最適化することを含み、その最適化が、少なくとも一つのプール中のあらゆるＤＮＡ配列間で起こり得る正しいハイブリダイゼーションおよび間違ったハイブリダイゼーションの全てを包括的に最適化することを含む。一部の実施形態では、本方法が、分割の少なくとも一つの階層レベル内で最適化することを含み、その最適化が、正しいハイブリダイゼーションの最も低い融解温度と間違ったハイブリダイゼーションの最も高い融解温度との間の温度ギャップを計算することを含む。一部の実施形態では、その温度ギャップが少なくとも約１℃である。一部の実施形態では、本方法が、分割の少なくとも一つの階層レベル内で最適化することを含み、最適化が、サイレントコドン置換を入れ換えること（ｐｅｒｍｕｔｉｎｇ  ａ  ｓｉｌｅｎｔ  ｃｏｄｏｎ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）を含む。一部の実施形態では、サイレントコドン置換が、ある生物のコドン使用頻度の選択に従った置換である。一部の実施形態では、コドン使用頻度の選択がコドン対の選択である。一部の実施形態では、生物が大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、本方法が、分割の少なくとも一つの階層レベル内で最適化することを含み、最適化が、調節領域コンセンサス配列中の縮重を利用することを含む。一部の実施形態では、本方法が、分割の少なくとも一つの階層レベル内で最適化することを含み、最適化が、隣接する派生ＤＮＡ片間の境界点を調節することを含む。一部の実施形態では、分割の少なくとも一つの階層レベルにおける最適化が、直接塩基割り当て（ｄｉｒｅｃｔ  ｂａｓｅ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ）を含む。
【００２０】
一部の実施形態では、プールの少なくとも一つが、次に高い分割の階層レベルからの複数の次に大きなＤＮＡ配列の分割によってもたらされるＤＮＡ配列の少なくとも一部を含む。一部の実施形態では、プールが最大プールである。
【００２１】
一部の実施系形態では、本方法を自動化する。
【００２２】
別の実施形態は、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を階層的に合成する方法であって、（ｖ）所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列を階層的に分割するための本明細書に開示の方法に従って作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応するＤＮＡ片プールを取得すること；（ｖｉ）各プール中のＤＮＡ片を、次に高い分割の階層レベルにおける次に大きなＤＮＡ片に対応するＤＮＡコンストラクトへと自己集合させること；（ｖｉｉ）そのＤＮＡコンストラクトから、次に大きなＤＮＡ片を作製すること；（ｖｉｉｉ）次に高い分割の階層レベルに対応する次に大きなＤＮＡ片のプールを作出すること；ならびに（ｉｘ）所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を合成するために、ステップ（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、および（ｉｖ）における階層分割とは逆の順序で、ステップ（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、および（ｖｉｉｉ）を再帰的に繰り返すことを含む方法による、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の階層アセンブリを含む方法が提供する。
【００２３】
一部の実施形態では、ステップ（ｖ）におけるＤＮＡ片が、合成オリゴヌクレオチドである。
【００２４】
一部の実施形態では、アセンブリの少なくとも一つの階層レベルにおいて、次に大きなＤＮＡ片が、ほぼ同じサイズである。
【００２５】
一部の実施形態では、アセンブリの少なくとも一つの階層レベルにおいて、次に大きなＤＮＡ片の作製が、ポリメラーゼオーバーラップ伸長またはライゲーションを含む。一部の実施形態では、アセンブリの少なくとも一つの階層レベルにおいて、次に大きなＤＮＡの作製がポリメラーゼオーバーラップ伸長を含み、そのポリメラーゼオーバーラップ伸長が高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ反応を含む。
【００２６】
一部の実施形態はさらに、アセンブリの少なくとも一つの階層レベルにおいて、ステップ（ｖｉｉ）または（ｖｉｉｉ）の少なくとも一つの後に、次に大きなＤＮＡ片を精製することまたは増幅することの少なくとも一つを含む。一部の実施形態では、精製が電気泳動またはクロマトグラフィーの少なくとも一つを含む。一部の実施形態では、精製が酵素による処理を含む。一部の実施形態では、酵素がＭｕｔＳ、Ｔ７エンドヌクレアーゼ、またはそれらの組み合わせである。一部の実施形態では、増幅がポリメラーゼ連鎖反応を含む。
【００２７】
一部の実施形態では、ステップ（ｖｉ）、（ｖｉｉ）、または（ｖｉｉｉ）の少なくとも一つを自動化する。一部の実施形態では、自動化されたステップの少なくとも一つを、マイクロ流体的に行う。
【００２８】
一部の実施形態では、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片が、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片を含むプールのメンバーであり、ステップ（ｖ）におけるＤＮＡ片プールが、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片の核酸配列に対して行われる請求項１の方法に従って作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応する。一部の実施形態では、最終階層アセンブリの生成物が、所望の配列を持つＤＮＡ片のプールを含む。
【００２９】
一部の実施形態は、最後の階層アセンブリステップ後に、所望の配列を持つ少なくとも一つのＤＮＡ片を単離することをさらに含む。一部の実施形態では、単離がポリメラーゼ連鎖反応を含む。一部の実施形態は、最後の階層アセンブリステップ後に、所望の配列を持つＤＮＡ片を選択することをさらに含む。一部の実施形態では、選択が、所望の配列を持つＤＮＡ片を、フレームシフトベクター中にクローニングすることを含む。一部の実施形態では、フレームシフトベクターが配列番号１または配列番号２を含む。
【００３０】
一部の実施形態は、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列を階層的に分割するための本明細書に開示の方法に従って作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応するオリゴヌクレオチドプールを作製することをさらに含む。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドプールの少なくとも一つが、固体支持体に結合されたオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、固体支持体がビーズ、アレイ、またはそれらの組み合わせを含む。
【００３１】
一部の実施形態は、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を階層的に合成するためのシステムであって、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列に対して行われる、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列を階層的に分割するための本明細書に開示の方法に従って作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応する複数のオリゴヌクレオチドプールを含むシステムを提供する。
【００３２】
一部の実施形態では、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプールが、チューブ内またはウェル内に配置されている。一部の実施形態では、少なくとも一つのオリゴヌクレオチドプールが固体支持体に結合されている。一部の実施形態では、固体支持体がビーズ、アレイ、またはそれらの組み合わせを含む。一部の実施形態では、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片が、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片を含むプールのメンバーであり、複数のオリゴヌクレオチドプールは、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片の核酸配列に対して行われる、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列を階層的に分割するための本明細書に開示の方法に従って作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応する。一部の実施形態は、所望の核酸配列を持つ少なくとも一つのＤＮＡ片を単離するのに適したポリメラーゼ連鎖反応プライマーをさらに含む。一部の実施形態は、フレームシフトベクターをさらに含む。一部の実施形態は、複数のオリゴヌクレオチドプールから所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を合成するための指示をさらに含む。
【００３３】
一部の実施形態は、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片を階層的に合成するためのシステムであって、遂行された場合に所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列を階層的に分割するための本明細書に開示の方法を実行する機械可読指示を含む機械可読媒体を含むシステムを提供する。一部の実施形態は、機械可読媒体に作動的に連結されたデータ処理ユニットをさらに含み、そのデータ処理ユニットは機械可読指示を遂行するように作動することができる。
【００３４】
一部の実施形態は、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列に対して行う、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片の核酸配列を階層的に分割するための本明細書に開示の方法に従って作製された最終階層分割の複数のＤＮＡ配列プールに対応する複数のＤＮＡ配列プールを提供する。一部の実施形態では、ＤＮＡ配列のプールが固定媒体に備えられている。一部の実施形態では、所望の核酸配列を持つＤＮＡ片が、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片を含むプールのメンバーであり、複数のＤＮＡ配列プールが、所望の核酸配列を持つ複数のＤＮＡ片の核酸配列に対して行われる請求項１の方法によって作製された最終階層分割のＤＮＡ配列プールに対応する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本明細書で使用するとき、「ＤＮＡ」という用語は、一本鎖ＤＮＡおよび二本鎖ＤＮＡをどちらも包含する。「ＤＮＡ片（ｐｉｅｃｅ  ｏｆ  ＤＮＡ）」という用語は、文脈に従って、物理的なＤＮＡ片とＤＮＡ配列との両方を指す。「隣接する」という用語は、ＤＮＡ片、ＤＮＡフラグメント、およびオリゴヌクレオチドの文脈において、少なくとも部分的にオーバーラップするＤＮＡ片を指す。「遺伝子」という用語は、その通常の意味で使用されると共に、任意の機能および／または配列を持つ大きなＤＮＡ片、１つ以上のオープンリーディングフレームを含むＤＮＡ片、１つ以上のオープンリーディングフレームと１つ以上の調節配列とを含むＤＮＡ片、および／または実質上完全なゲノムを指す。本明細書で使用するとき、「中間フラグメント」という用語は、本明細書に開示する方法による合成遺伝子の合成の途中で合成されるＤＮＡ片を指す。「所望の核酸配列」には、特定のヌクレオチド配列と、その文脈では等価であるヌクレオチド配列との両方が包含される。例えば、ポリペプチド発現の文脈では、所望の核酸配列に、特定のポリペプチドをコードする特別な配列と、その特定ポリペプチドをコードする多くの核酸配列の一つとが含まれる。本明細書において言及する全ての参考文献の開示は、参照により本明細書に組み入れられる。
【００３６】
オーバーラップした中間フラグメントを異なるプールに割り当てることにより、プールされたＤＮＡオリゴヌクレオチドを用いる、１つ以上のＤＮＡ配列を合成するための階層的方法およびシステム、ならびにその方法によって合成されるＤＮＡ配列を開示する。一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドプールが、複数の合成遺伝子を合成するために設計されたオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、複数の合成遺伝子が、プールされたオリゴヌクレオチドから同時に合成される。別の実施形態では、単一の合成遺伝子が、プールされたオリゴヌクレオチドから選択的に合成される。
【００３７】
本明細書に開示する一部の実施形態には、プールされたオリゴヌクレチドから遺伝子を合成する既知の方法と比較して１つ以上の利点が含まれる。例えば、本明細書に開示する方法では、初期アセンブリステップで作製される各中間フラグメントの単純なＰＣＲ増幅が可能である。なぜなら、これらの中間フラグメントはそれぞれが比較的短く、また、オーバーラップ配列を含む隣接する中間フラグメントが別々に合成される（さもないと、これらのオーバーラップ配列はＰＣＲ増幅を妨害することになるだろう）からである。短い断片のＰＣＲは、一般に簡単で、信頼性も高い。初期ステップ後の後続アセンブリステップでは、一般に、各反応に参加する物が少なくなると共に、オーバーラップが長くなり、成されるべき連結は少なくなる。したがって、本方法の一部の実施形態は、他の方法よりも単純で、簡単で、そして／または優れたマルチプレックス遺伝子アセンブリをもたらす。本明細書に開示する方法の一部の実施形態は、各階層レベルで、同じ長さまたはほぼ同じ長さの中間フラグメントを作製する。したがって、本方法の一部の実施形態は、他の方法よりも単純で、簡単で、そして／または優れた中間フラグメントの精製をもたらす。
【００３８】
例えば（１）「デザイナー（ｄｅｓｉｇｎｅｒ）」タンパク質をデノボに作出すること；（２）自動発現・結晶化設備に連結すること；（３）構造プロテオミクスのために新規なタンパク質フォールドを発現させると予想されるＤＮＡ配列を構築すること；（４）タンパク質をコードしない他のＤＮＡ配列を、例えばＲＮＡ構造テンプレートまたはＤＮＡナノテクノロジー構成成分などとして構築すること；（５）タンパク質を、異なる種から、それ自身のコドン使用頻度に従った望ましい発現ベクターで、発現させること；および（６）小さな合成ゲノムを、その望ましいタンパク質配列および調節タンパク質結合部位を指定することによって、作出することなどといった、本明細書に開示する方法を応用することができる無数の用途は、当業者には直ちに把握されるだろう。
【００３９】
図１は、ＤＮＡ配列を合成するための方法１００の実施形態を図解するフローチャートである。方法１００は一般に二つの相、すなわちステップ１０２、１０４、および１０６を含む分割段階と、ステップ１１０、１１２、１１６、１１８、１２０を含むアセンブリ段階とを含む。方法１００の以下の説明では、図２Ａ〜２Ｆを参照する。これらは、３レベル階層法を用いる合成遺伝子の分割およびそのアセンブリを模式的に図解する。
【００４０】
ステップ１０２では、所望のＤＮＡ配列または所望のＤＮＡ配列群を、部分的にオーバーラップする複数のＤＮＡ片またはオリゴヌクレオチドに、階層的に分割する。ステップ１０４では、最終分割ステップを除く分割の各階層レベルで、得られたＤＮＡ片をＤＮＡ片のプールに割り当てる。この際、オーバーラップした隣接するＤＮＡ片は、異なるプールに割り当てられる。ステップ１０６では、ステップ１０２および１０４を、各プールについて階層的に繰り返す。ステップ１１０では、最終階層分割ステップで特定される最小のＤＮＡ片に対応する合成ＤＮＡのプールを取得する。ステップ１１２では、各プール中のＤＮＡ片を、次に高い分割の階層レベルにおける次に大きなＤＮＡ片に対応するＤＮＡコンストラクトへと、自己集合させる。ステップ１１４では、次に大きなＤＮＡ片を、ＤＮＡコンストラクトから、ポリメラーゼオーバーラップ伸長および／またはライゲーションによって作製する。任意のステップ１１６では、次に大きなＤＮＡ片の１つ以上に含まれるエラーを、例えば精製および／または増幅などによって減少させる。ステップ１１８では、次に高い分割の階層レベルに対応する次に大きなＤＮＡ片のプールを作製する。ステップ１２０では、合成遺伝子（群）を合成するために、アセンブリステップ１１２〜１１８を分割ステップ１０２〜１０６とは逆の順序で繰り返す。ステップ１３０では、合成遺伝子（群）を単離する。ステップ１３２では、所望の配列を持つ合成遺伝子を選択する。ステップ１０２、１１０、１１２、１１８の実施形態は、米国特許出願公開第２００４／０２３５０３５号Ａ１および同第２００５／０１０６５９０号Ａ１に、さらに詳しく説明されている。ステップ１３０および１３２の実施形態は、米国特許出願公開第２００５／０１０６５９０号Ａ１に、さらに詳しく説明されている。
【００４１】
任意のステップ１０２では、遺伝子または遺伝子群を、階層アセンブリによるそれら自身の正しい自己集合をコードするように設計、最適化されたＤＮＡ片、例えば中間フラグメントおよび／またはオリゴヌクレオチドなどに分割する。一部の好ましい実施形態では、ステップ１０２における分割および最適化が、米国特許出願公開第２００４／０２３５０３５号Ａ１および同第２００５／０１０６５９０号Ａ１に開示されているように行われる。複数の合成遺伝子が同時に合成される実施形態では、ステップ１０２における分割および最適化プロセスが、それら合成遺伝子の全てを含む。最適化では、隣接するオーバーラップＤＮＡ片間の正しいハイブリダイゼーションが強化され、間違ったハイブリダイゼーションが弱められる。正しいハイブリダイゼーションとは、隣接するＤＮＡ片のオーバーラップ部分間に起こる、計画のまたは所望のハイブリダイゼーションである。間違ったハイブリダイゼーションとは、他の全てのハイブリダイゼーションであり、例えば、１つのＤＮＡ片内で起こるハイブリダイゼーション（例えばヘアピン構造）、隣接するＤＮＡ片の非オーバーラップ部分への望ましくないハイブリダイゼーション、および非隣接ＤＮＡ片間で起こる任意のハイブリダイゼーションなどが挙げられる。一部の好ましい実施形態では、最適化が包括的である。すなわち、全てのＤＮＡ片間で起こり得る全てのハイブリダイゼーションを評価する。一部の実施形態では、包括的最適化が各プール中の全てのＤＮＡ片間で行われる。プールについては後でさらに詳しく論じる。
【００４２】
簡単に述べると、自己集合の最適化は、ＤＮＡ片プールにおける正しいハイブリダイゼーションおよび間違ったハイブリダイゼーションの全てについて、ハイブリダイゼーション性向に関係する１つ以上のパラメータまたは尺度、例えば融解温度、自由エネルギー、エンタルピー、エントロピー、またはそのようなパラメータもしくは尺度の他の算術的または代数的組み合わせを計算することによって行われる。一部の好ましい実施形態では、パラメータが融解温度である。実際には、融解温度自体が、上述のようなパラメータまたは尺度の上述のような算術的または代数的組み合わせの一つである。次に、正しいハイブリダイゼーションと間違ったハイブリダゼーションとの間の融解温度ギャップを決定する。好ましくは、正しいハイブリダイゼーションの最も低い融解温度が、間違ったハイブリゼーションの最も高い融解温度よりも高い。次に、この融解温度ギャップを最適化するか、増加させる。一部の実施形態では、例えばポリペプチドをコードする部分に関して、サイレントコドン置換を入れ換えることによって、ＤＮＡ片を最適化する。一部の実施形態では、そのサイレントコドン置換が、ある生物、例えば大腸菌、または当技術分野で知られる他の適切な生物に関するコドン使用頻度の選択に従った置換である。一部の実施形態では、そのコドン使用頻度の選択は、例えば米国特許第５，０８２，７６７号に開示されているコドン対の選択である。一部の実施形態では、例えば調節領域に関して、調節領域コンセンサス配列中の縮重を利用することによって、ＤＮＡ片が最適化される。一部の実施形態では、隣接するＤＮＡ片間の境界点を調節することによって、ＤＮＡ片が最適化される。一部の実施形態では、例えば遺伝子間領域に関して、直接塩基割り当てによって、ＤＮＡ片が最適化される。
【００４３】
そのような融解温度ギャップのサイズが、後述するアセンブリステップで用いられるアニーリング条件に影響を及ぼすことは、当業者には明確に理解されるだろう。アニーリング条件のストリンジェンシーは、任意の所望するレベルの理想度でアニーリングを得るように調節することができるので、温度ギャップに理論的な最小値はない。しかし一般的には、温度ギャップが狭いほど、必要な忠実度レベルを得るために、よりストリンジェントなアニーリング条件が、アセンブリステップにおいて要求されるだろう。実際には、最低融点の正しいマッチと最高融点の間違ったマッチとの間の差は少なくとも約１℃、より好ましくは少なくとも約４℃、さらに好ましくは少なくとも約８℃、さらに好ましくは少なくとも約１６℃である。一般に、温度ギャップが広いほど、自己集合はより強固になり、その結果、より低いストリンジェンシーを持つアニーリング条件を使用することが可能になる。
【００４４】
図２Ａは、第１階層分割ステップを模式的に図解している。所望の遺伝子２０００を、複数のオーバーラップした中間フラグメント２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、および２６００に分割する。図２Ａ〜２Ｆは、各ステップで６つのフラグメントを使用する代表的な分割ステップおよび再アセンブリステップを図解している。別の実施形態では、一部のステップまたは全てのステップが、６個より多いまたは少ないフラグメントを使用し、そしてまた一部の好ましい実施形態では６個より多くのフラグメントを使用することは、当業者には理解されるだろう。フラグメントの数が奇数または偶数であることも、当業者には理解されるだろう。米国特許出願公開第２００４／０２３５０３５号Ａ１および同第２００５／０１０６５９０号Ａ１で詳しく論じられているように、偶数個のフラグメントとＰＣＲ型のアセンブリとを使用する一部の好ましい実施形態では、ＰＣＲプライマーを使用しない。上述のように、一部の好ましい実施形態では、遺伝子２０００が、あるプール中の複数の遺伝子の一つであり、それら複数遺伝子の全てが、本明細書で説明するように、同時の分割および設計、ならびにアセンブリを受ける。
【００４５】
ステップ１０４では、各階層レベルでのオリゴヌクレオチドまたは中間ＤＮＡフラグメントをマージして複数のプールにする。一部の好ましい実施形態では、プールが最大プールである。本明細書で使用するとき、「最大プール（ｍａｘｉｍａｌ  ｐｏｏｌ）」という用語は、ステップ１０２における分割によって生じる非オーバーラップＤＮＡ片だけを含むＤＮＡフラグメントのプールを指す広義な用語であり、これは、ステップ１０２で考えることのできる他のどの分割によって生じるプールの数よりも少ないかまたはその数に等しいプール数への、ステップ１０２における分割によって生じる。生物学的に合理的なＤＮＡ配列の場合、ステップ１０２で述べるような線状ＤＮＡ片の分割によって生じるフラグメントが、二つの最大プールに割り当て可能であることは、当業者には理解されるだろう。環状ＤＮＡ片の分割によって生じるフラグメントは、多くとも３つの最大プールに割り当て可能であるが、フラグメントが２つの最大プールに割り当て可能である、ステップ１０２による分割が存在することは、当業者には理解されるだろう。
【００４６】
ステップ１０４で作出される各最大プールでは、そのプール中のオリゴヌクレオチドまたは中間フラグメントによって作製される次に大きなＤＮＡ片が、オーバーラップしない。例えば、合成遺伝子の２レベル合成では、遺伝子が中間フラグメントに分割され、次にそれらがオリゴヌクレオチドに分割される。一部の実施形態では、中間フラグメントが、非オーバーラップ中間フラグメントの２つのプールに分割される。ここでは便宜上、それらのフラグメントを、アセンブルされた合成遺伝子におけるそれらの順番を指して、「奇数番」フラグメントまたは「奇数」フラグメントおよび「偶数番」フラグメントまたは「偶数」フラグメントと呼ぶことにする。一部の実施形態では、１つ以上のプールが、非隣接ＤＮＡ片に由来する奇数フラグメントと偶数フラグメント（例えば、より大きい１つのＤＮＡ片に由来する奇数フラグメントと、別の非オーバーラップＤＮＡ片に由来する偶数フラグメント）とを両方とも含むことは、当業者には理解されるだろう。別の実施形態では、どのプールも、非隣接ＤＮＡ片に由来する奇数フラグメントと偶数フラグメントとを両方とも含むことはない。ステップ１０２で設計された隣接中間フラグメントだけが互いにオーバーラップするので、偶数番フラグメントプールおよび奇数番フラグメントプールは、それぞれ、内部的には、非オーバーラップ中間フラグメントから構成される。ステップ１０４では、最終階層分割ステップ後に、奇数中間フラグメントを作製するオリゴヌクレオチドから第１プールが作出され、偶数中間フラグメントを作製するオリゴヌクレオチドから第２プールが作出される。オリゴヌクレオチドから中間フラグメントを作製した後、次に高い階層レベルで次に大きな中間フラグメントを作製するか最終ステップで所望の合成遺伝子（群）を作製するＤＮＡ片のプールを形成するために、得られたプール偶数中間フラグメントを、得られたプール奇数中間フラグメントと組み合わせる。
【００４７】
オリゴヌクレオチドを例に挙げると、オリゴヌクレオチドの配列は高い熱力学的確率で中間フラグメントを作製するように最適化されるので、隣接するオーバーラップ中間フラグメントを形成するオリゴヌクレオチドを分離することにより、望ましくない生成物をもたらし得るオーバーラップフラグメントを含むオリゴヌクレオチド間の望ましくない相互作用が排除される。ステップ１０４が、プールが最大でない実施形態、すなわち、ある階層レベルで２つより多いＤＮＡ片プールを使用する実施形態も包含することは、当業者には理解されるだろう。
【００４８】
図２Ａに戻ると、フラグメント２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、および２６００は、２つの最大プール、すなわち奇数番フラグメント２１００、２３００、および２５００を含む奇数フラグメントプール２０００ａと、偶数番フラグメント２２００、２４００、および２６００を含む偶数フラグメントプール２０００ｂとに分割される。
【００４９】
ステップ１０６では、各プール中の得られたＤＮＡ片、すなわちオリゴヌクレオチドが、例えば化学合成などによって容易に取得することができるようになるまで、ステップ１０２およびステップ１０４を各プールについて繰り返す。
【００５０】
図２Ｂは、中間フラグメント２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、および２６００のそれぞれが複数のオーバーラップ断片に分割される、中間階層分割ステップ１０２を図解している。フラグメント２１１０、２１２０、２１３０、２１４０、２１５０、および２１６０へのフラグメント２１００の分割のみを図解している。
【００５１】
反復ステップ１０４では、反復ステップ１０２で作出されたオーバーラップフラグメントが、最大プールにマージされる。図２Ｂに図解するように、フラグメント２１１０、２１２０、２１３０、２１４０、２１５０、および２１６０が、奇数番フラグメント２１１０、２１３０、および２１５０を含む奇数フラグメントプール２０００ａａと、偶数番フラグメント２１２０、２１４０、および２１６０を含む偶数フラグメントプールとに割り当てられる。奇数フラグメントプール２０００ａａが、奇数フラグメントプール２０００ａのフラグメントの全て（すなわちフラグメント２１００、２３００、および２５００）の分割で作出される奇数フラグメントの全てを含むことは、当業者にはよく理解されるだろう。同様に、偶数フラグメントプール２０００ａｂは、奇数フラグメントプール２０００ａの全てのフラグメントの分割で作出される偶数フラグメントの全てを含む。図２Ｂでは詳しく図解していないが、図２Ａで得た偶数フラグメントプール２０００ｂでもステップ１０２および１０４を繰り返すことにより、奇数フラグメントプール２０００ｂａおよび偶数フラグメントプール２０００ｂｂが生じて、合計４つのプールを得る。一部の実施形態では、分割ステップ１０２およびマージステップ１０４を含む各階層レベルｎが、２ｎ個の最大プールをもたらすことは、当業者には理解されるだろう。別の実施形態では、１つ以上のプールから得られる分割されたフラグメントを、さらに新しいプールにマージせず、その結果、２ｎ個より多いまたは少ないプールが生じる。
【００５２】
上述のように、「奇数」および「偶数」という用語は、非オーバーラップ中間フラグメントを示すために、便宜上用いているに過ぎない。したがって、一部の実施形態では、奇数フラグメントプールが、中間フラグメント２１００の分割で作出された奇数フラグメント２１１０、２１３０、および２１５０と、フラグメント２１００と同じプール内の別の非オーバーラップ中間フラグメント（例えばフラグメント２５００）の分割で作出された偶数フラグメントとを含む。
【００５３】
図２Ｃは、奇数プール２０００ａａから得られるフラグメント２１１０についてオリゴヌクレオチド２１１１、２１１２、２１１３、２１１４、２１１５、および２１１６への最終階層分割ステップ１０２を図解している。上述のように、最終分割では、ステップ１０４を繰り返さないので、得られたオリゴヌクレオチドプール２０００ａａ’は、プール２０００ａａからのフラグメント２１１０、２１３０、および２１５０の分割で作出されたオリゴヌクレオチドの全てを、プール２０００ａａからの他の全てのフラグメントの分割で作出されるオリゴヌクレオチドと共に含む。同様に、プール２０００ａｂ’、２０００ｂａ’、および２０００ｂｂ’は、それぞれプール２０００ａｂ、２０００ｂａ、および２０００ｂｂに対する分割ステップ１０２の適用によって作出される。
【００５４】
一部の好ましい実施形態では、分割段階のステップ、すなわちステップ１０２、１０４、および／または１０６の１つ以上が、例えばデータ処理ユニット、コンピュータ、マイクロプロセッサ、専用装置、および／または当技術分野で知られる他の適切な機械を使うことなどによって自動化されることは、当業者には理解されるだろう。一部の好ましい実施形態では、これらのステップの全てが自動化される。一部の好ましい実施形態では、遂行された場合に自動化されたステップを実行する機械可読指示を、当技術分野で知られる任意の機械可読媒体、例えば磁気媒体、光媒体、光磁気媒体、相変化媒体、固体媒体、それらの組み合わせなどに記憶させる。適切な媒体の具体例として、磁気ディスク、磁気テープ、光ディスク、フラッシュメモリなどが挙げられる。一部の実施形態では、機械可読媒体がユーザーから遠隔に、例えばユーザーが１つ以上のネットワークを使ってアクセスする１つ以上のサーバー上などにある。
【００５５】
ステップ１１０では、合成オリゴヌクレオチドのプールを取得する。一部の好ましい実施形態では、それらオリゴヌクレオチドの全てが合成物である。別の実施形態では、少なくとも一つのオリゴヌクレチドが合成物ではなく、例えば１つ以上の制限酵素を使って、例えば自然源から得られる。合成オリゴヌクレオチドは、例えば固相支持体にて個別に合成されたオリゴヌクレオチド、ＤＮＡチップから切り離されたオリゴヌクレオチドなどといった、任意の適切な供給源から得られる。一部の実施形態では、プールされたオリゴヌクレオチドが、任意に、例えばフィルターかけ（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）および／または電気泳動などにより、ステップ１１６において後述のように精製される。
【００５６】
プールされたオリゴヌクレオチドは、当技術分野で知られる任意の供給源から得られる。一部の実施形態では、プールされたオリゴヌクレオチドが組み合わせにより合成される。一部の実施形態では、プールされたオリゴヌクレオチドが、例えば米国特許第５，８０８，０２２号に報告されているように、ビーズ上で合成される。別の実施形態では、プールされたオリゴヌクレオチドが、例えば米国特許出願公開第２００４／００６８６３３号Ａ１；Ｔｉａｎら，Ｎａｔｕｒｅ，２００４，４３２，１０５０−１０５４；およびＲｉｃｈｉｍｏｎｄら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００４，３２（１７），５０１１−５０１８に開示されているように、アレイまたはマイクロアレイ上で合成される。プールされた合成オリゴヌクレオチドの一部の実施形態の合成は極めて効率が良いので、これらのオリゴヌクレオチドプールは比較的安価である。
【００５７】
図２Ｃを参照して説明すると、ステップ１０６で作出されたプール２０００ａａ’、２０００ａｂ’、２０００ｂａ’、および２０００ｂｂ’に対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドのプールを取得し、任意にフィルターにかける。
【００５８】
ステップ１１２では、各プール内のオリゴヌクレオチドをＤＮＡコンストラクトへと自己集合させる。上述のように、ステップ１０４では、次に高い階層レベルにある各親プールからのＤＮＡ片を、次に低いレベルにある２つの新しいプールに割り当てる。すなわち、一方のプールはその親プールの偶数番中間フラグメントを含み、他方のプールはその親プールの奇数番中間フラグメントを含む。上述のように、ステップ１０４で設計される偶数番フラグメントプールおよび奇数番フラグメントプールは、それぞれ、内部的には、非オーバーラップ中間フラグメントから構成される。したがって、１つ以上の完全長遺伝子を作製する最終アセンブリステップまでは、増幅の各中間ラウンドが中間フラグメントの境界を越えて伸長することはないだろう。この性質は、各階層ステップにおけるアセンブリの複雑さを減少させ、その結果として、間違ったアセンブリ（ミスプライミングまたはクロスハイブリダイゼーション）の可能性を減少させる。一部の実施形態では、あるプール内の全ての中間フラグメントが、同じまたはほぼ同じ長さを持ち、それが、後述のように、より効率の良い精製を可能にする。
【００５９】
図２Ｄは、ＤＮＡコンストラクト２１１０’へのオリゴヌクレオチド２１１１、２１１２、２１１３、２１１４、２１１５の自己集合を図解している。上述のように、オリゴヌクレオチドのプール２０００ａａ’は、プール２０００ａａ内のフラグメントについて図２Ｃに図解したステップ１０２で作出されるオリゴヌクレオチドの全てを含む。したがって、プール２０００ａａ内の他のＤＮＡフラグメント、すなわちフラグメント２１３０および２１５０ならびにフラグメント２３００および２５００の奇数フラグメントに対応するＤＮＡコンストラクトも、このステップで形成される。プール２０００ａｂ’、２０００ｂａ’、および２０００ｂｂ’でも、対応するＤＮＡコンストラクトが形成される。
【００６０】
ステップ１１４では、次に大きなＤＮＡ片が、ステップ１１２で形成させたＤＮＡコンストラクトから、当技術分野で知られる任意の方法を使って、例えば米国特許出願公開第２００４／０２３５０３５号Ａ１および同第２００５／０１０６５９０号Ａ１に開示されているように作製される。簡単に述べると、一部の実施形態では、次に大きなＤＮＡ片が、適当なプライマーを用いるオーバーラップ伸長を使って作製される。一部の好ましい実施形態では、ステップ１１４が高忠実度ＤＮＡポリメラーゼ反応を含む。二本鎖オーバーラップ間にギャップを持たない一部の実施形態では、次に大きなＤＮＡ片が、ライゲーションによって作製される。一部の実施形態では、自己集合したコンストラクトが発現ベクター中にクローニングされ、次に大きなＤＮＡ片が細胞機構によって作製される。一部の好ましい実施形態はオーバーラップ伸長を使用し、これを本明細書ではＰＣＲ型アセンブリまたは単にＰＣＲともいう。
【００６１】
一部の実施形態では、生成物である次に大きなＤＮＡ片の１つ以上が、このステップにおいても増幅される。複数の合成遺伝子を合成するために設計されたオリゴヌクレオチドを含むプールから単一の合成遺伝子を選択的に合成する実施形態では、ステップ１１４において所望の合成遺伝子の合成に特異的なプライマーを使用する。
【００６２】
図２Ｄは、プール２０００ａａ’におけるステップ１１２で形成されるＤＮＡコンストラクトのアセンブリによって、フラグメント２１１０、２１３０、および２１５０を含むプール２０００ａａが得られることを図解している。図解するように、オリゴヌクレオチド２１１１、２１１２、２１１３、２１１４、２１１５、および２１１６を含むコンストラクト２１１０’のオーバーラップ伸長により、フラグメント２１１０が形成される。したがって、得られたプール２０００ａａは、フラグメント２１１０、２１３０、および２１５０、ならびにフラグメント２３００および２５００の奇数フラグメントを含む。プール２０００ａｂ’、２０００ｂａ’、および２０００ｂｂ’におけるコンストラクトのオーバーラップアセンブリは、それぞれプール２０００ａｂ、２０００ｂａ、および２０００ｂｂを与える。
【００６３】
任意のステップ１１６では、当技術分野で知られる任意の適切な方法を使って、例えば精製および／または増幅などによって、次に大きなＤＮＡ片の１つ以上に含まれるエラーを減少させ、および／またはＤＮＡ片の量を増加させる。精製および／または増幅は、当技術分野で知られる任意の適切な手段によって行われる。適切な精製方法の例として、酵素法、電気泳動法、および／またはクロマトグラフィー法が挙げられる。クロマトグラフィー精製を本明細書では「フィルターにかける（ｆｉｌｔｅｒｉｎｇ）」ともいう。適切な増幅方法の例としてＰＣＲが挙げられる。一部の好ましい実施形態では、ステップ１１４においてプールから形成されるＤＮＡ片の全て、例えば得られた反応混合物を、精製および／または増幅条件に付す。
【００６４】
酵素的精製の一部の実施形態では、ミスマッチＤＮＡを切断するＴ７エンドヌクレアーゼを使用する。酵素的精製の一部の実施形態では、ＭｕｔＳ（例えば磁気ビーズに固定化されたもの）を使って、ミスマッチおよび他のエラーを修復する。酵素的精製の一部の実施形態では、例えば米国特許出願公開第２００３／０１３４２８９号Ａ１に開示されているように、固定化ＤＮＡグリコシラーゼを使用する。一部の実施形態では、次に大きなＤＮＡ片を、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）、モレキュラーシーブクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ｆａｓｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｉｑｕｉｄ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：ＦＰＬＣ）、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）、キャピラリー電気泳動、アガロース電気泳動、それらの組み合わせなどを使って、クロマトグラフィー的および／または電気泳動的に精製する。一部の好ましい実施形態では、精製がＰＡＧＥを含む。
【００６５】
一部の好ましい実施形態では、各プールにおける次に大きなＤＮＡ片が、同じまたはほぼ同じサイズを持つように設計される。したがって、正しいおよびほぼ正しい次に大きなＤＮＡ片の全てが、ゲルまたはカラム上をシングルバンドとして流れる。一部の実施形態では、このバンドからＤＮＡが抽出され、ステップ１１８で使用するプールを形成する。任意に、ステップ１１４で作製されたＤＮＡを、例えばＰＣＲを使って増幅する。増幅は、酵素的精製、例えばＴ７および／またはＭｕｔＳによる処理の前および／または後など、ステップ１１６の任意の段階で、任意の時点に行うことができる。一部の実施形態では、増幅がクロマトグラフィーおよび／または電気泳動精製の前および／または後に行われる。
【００６６】
一部の実施形態では、プール内で作製されたＤＮＡ片を、複数の精製方法を含む方法を使って、例えば酵素的方法の後に電気泳動法を行うことなどによって精製する。他の実施形態では他のフィルターかけおよび／または精製方法が使用されることは、当業者には明確に理解されるだろう。
【００６７】
図３は、ポリメラーゼオーバーラップ伸長（ＰＣＲ）によるステップ１１４での次に大きなＤＮＡ片の作製と、酵素技法、クロマトグラフィー技法、および／または電気泳動技法によるステップ１１６での精製とのさまざまな組み合わせを含むステップ１１６の実施形態を図解している。図解した実施形態では、オーバーラップ伸長１１４が、精製ステップ１１６の前、後、および／または間に行われる。精製の実施形態として、酵素的方法およびクロマトグラフィー的／電気泳動的方法の組み合わせが挙げられる。他の組み合わせも可能であることは、当業者には理解されるだろう。一部の実施形態では、図３に図解するオーバーラップ伸長の代わりに、ステップ１１４を実行するための他の方法、例えばライゲーションが使用されることも、当業者には理解されるだろう。
【００６８】
精製および／または増幅は、図２Ｄ〜２Ｆには図解していないものの、一部の態様では、少なくとも１回は、例えば１つ以上の階層アセンブリステップの後に用いられる。
【００６９】
ステップ１１８では、後続の階層合成レベルのためのＤＮＡプールが、ステップ１１４および／または１１６で作製されたＤＮＡのプールを組み合わせることによって作出される。一部の実施形態では、精製および／または増幅ステップ１１６を、ステップ１１８でＤＮＡプールを作出した後に行う。
【００７０】
図２Ｅは、プール２０００ａａおよび２０００ａｂからのプール２０００ａ’の作出を図解している。同様にプール２０００ｂ’はプール２０００ｂａおよび２０００ｂｂから作出される。プール２０００ａ’は、フラグメント２１１０、２１２０、２１３０、２１４０、２１５０、および２１６０、ならびにステップ１０６における中間フラグメント２３００および２５００の分割に対応するＤＮＡフラグメントを含む。プール２０００ｂ’は、ステップ１０６における中間フラグメント２２００、２４００、および２６００の分割に対応するＤＮＡフラグメントを含む。
【００７１】
ステップ１２０では、ステップ１１４、１１６、および１１８を、各階層レベルについて繰り返すことにより、合成遺伝子または合成遺伝子群をアセンブルする。
【００７２】
図２Ｅは、反復ステップ１１２および１１４におけるプール２０００ａ’の自己集合およびオーバーラップ伸長によって、中間フラグメント２１００、２３００、および２５００を含むプール２０００ａが得られることを図解している。中間フラグメント２１００によって、プール２０００ａ内の全ての中間フラグメントのアセンブリを例示している。プール２０００ｂはプール２０００ｂ’から同様にアセンブルされる。
【００７３】
図２Ｆは、反復ステップ１１８におけるプール２０００ａおよび２０００ｂからのプール２０００’の作出、ならびに反復ステップ１１２および１１４における自己集合およびオーバーラップ伸長によって、合成遺伝子２０００が得られることを図解している。図解した実施形態では、最終オーバーラップ伸長ステップ１１４が遺伝子特異的であり、これにより、複数の遺伝子を作製するために設計されたプールから単一の遺伝子を合成することが可能になる。一部の実施形態では、遺伝子特異的なオーバーラップ伸長が、所望の遺伝子だけにアニールするように設計されている１つ以上のＰＣＲプライマーを使用することにより、その遺伝子を選択的に増幅することを含む。
【００７４】
ステップ１３０では、当技術分野で知られる任意の手段により、例えば電気泳動（例：ＰＡＧＥ）および／または適当なプライマーを使ったＰＣＲなどによって、ステップ１２０の最終繰返しの生成物から、１つ以上の合成遺伝子が単離および／または精製される。一部の実施形態では、ステップ１３０が任意である。ステップ１３０の好ましい実施形態が、米国特許出願公開第２００５／０１０６５９０号Ａ１に、いくつか開示されている。
【００７５】
ステップ１３２では、当技術分野で知られる任意の適切な方法によって、正しい配列を持つ１つ以上の合成遺伝子が選択される。一部の好ましい実施形態では、例えば米国特許出願公開第２００５／０１０６５９０号Ａ１に開示されているように、フレームシフトベクターおよび配列決定が、選択に用いられる。
【００７６】
簡単に述べると、少なくとも（ｉ）完全長遺伝子をフレームシフトベクター中のＤＮＡ挿入部位に挿入するステップ；（ｉｉ）得られたベクターで、事前に選択した生物を形質転換するステップ；（ｉｉｉ）所定の表現型を示す生物を選択するステップ；および（ｉｖ）選択した生物から完全長遺伝子を単離するステップを含む方法によって、完全長遺伝子を選択する。フレームシフトベクターは、インジケータ遺伝子およびＤＮＡ挿入部位を含むオープンリーディングフレームを含んでいる。インジケータ遺伝子は、その発現がその生物の表現型を変化させる機能的ポリペプチドをコードする機能的部分を含む。インジケータ遺伝子の機能的部分は、機能的ポリペプチドが発現されないように、上流の開始コドンに対してフレームシフトされている。一部の実施形態では、フレームシフトベクターが開始コドンを含む。一部の実施形態では、開始コドンが合成遺伝子中に設計される。ＤＮＡ挿入部位はインジケータ遺伝子の機能的部分の上流である。
【００７７】
フレームシフトを修正する追加塩基と共にＤＮＡ挿入部位に挿入された場合、正しい完全長遺伝子は、インジケータ遺伝子の機能的部分に、機能的ポリペプチドを発現させる。１塩基または２塩基の挿入または欠失を含有するか、あるいはその合計が３のちょうど倍数（ａｎ  ｅｖｅｎ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ）でない（すなわち０と合同（ｍｏｄ３）ではない）任意の数の塩基挿入および塩基欠失を含有する間違った完全長遺伝子は、インジケータ遺伝子に、機能的ポリペプチドを発現させることができないだろう。＋２フレームシフトが−１フレームシフトと等価であり、−２フレームシフトが＋１フレームシフトと等価であることは、当業者には理解されるだろう。
【００７８】
一部の実施形態では、フレームシフトベクターがプラスミドであり、事前に選択される生物が大腸菌である。一部の好ましい実施形態では、プラスミドがβ−ガラクトシダーゼのα−相補フラグメントの遺伝子を含み、事前に選択される生物がｌａｃＺΔＭ１５遺伝子型を持つ大腸菌株である。一部の実施形態では、形質転換された大腸菌を、イソプロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）および５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトシド（Ｘ−Ｇａｌ）を含むインジケータ寒天上で生育させる。この場合、所定の表現型は青色コロニーである。一部の好ましい実施形態では、プラスミドが配列番号１を持ち（これは、ｌａｃＺΔＭ１５系で役立つフレームシフトベクターである）、事前に選択される生物が大腸菌ＪＭ１０９である。別の実施形態では、表現型の変化が制限温度における成長である。一部の実施形態では、プラスミドがバリル−ｔＲＮＡシンセターゼｔｓであり、事前に選択される生物が大腸菌ＡＢ４１４１である。一部の好ましい実施形態では、プラスミドが配列番号２を持ち、これは、バリル−ｔＲＮＡシンセターゼｔｓ系で役立つフレームシフトベクターである。一部の実施形態では、フレームシフトが−１フレームシフトである。別の実施形態では、フレームシフトが＋１フレームシフトである。一部の実施形態では、ＤＮＡ挿入部位が制限部位を含む。
【００７９】
正しい配列を持つ合成遺伝子を選択するための他の適切な方法も有用であることは、当業者には理解されるだろう。一部の実施形態では、ステップ１３２が任意である。
【００８０】
一部の実施形態では、方法１００におけるステップのいずれかまたは全てが、１つ以上の自動システムを使って履行される。一部の実施形態では、例えばロボット、自動液体処理システム、それらの組み合わせなどといった自動システムを使って、ステップ１１２、１１４、１１６、および／または１１８のいずれかまたは全てが行われる。通例、そのようなシステムはコンピュータおよび／またはマイクロプロセッサの制御を受ける。図４Ａ〜４Ｃは、当技術分野で知られる任意のタイプのマイクロ流体モジュールを用いる、次に大きなＤＮＡ片の精製および増幅（例えば方法１００のステップ１１６）を模式的に図解している。図４Ａは、ステップ１１４で合成されたＤＮＡフラグメントプールの、Ｔ７エンドヌクレアーゼを使った精製を、模式的に図解している。図４Ｂは、ＰＣＲによるＤＮＡフラグメントプールの増幅を、模式的に図解している。図６Ｃは、ＤＮＡフラグメントプールのクロマトグラフィー精製または電気泳動精製を図解している。例えばプールされたオリゴヌクレオチドの合成、ＤＮＡコンストラクトの伸長による次に大きなＤＮＡ片の作製、次の階層合成レベルのためのＤＮＡのプールの作出、所望の合成遺伝子のＰＣＲ単離、フレームシフトベクターへのクローニングなどといった本明細書に開示する方法の他のステップも自動化が可能であることは、当業者には理解されるだろう。
【００８１】
合成遺伝子合成キットも提供する。このキットは複数のオリゴヌクレオチドプールを含み、それら各オリゴヌクレオチドプールの組成は、方法１００のステップ１０２、１０４、および１０６における上述のような分割、最適化、およびマージによって決定される。一部の好ましい実施形態では、階層分割が２レベル分割であり、遺伝子合成キットは３つの構成成分、すなわち奇数オリゴヌクレオチドプール、偶数オリゴヌクレオチドプール、および第１完全長遺伝子を増幅するためのＰＣＲプライマーを含む。オリゴヌクレオチドプールの一部の実施形態は、オリゴヌクレオチドおよび／または中間フラグメントのオーバーラップ伸長反応のための当技術分野で知られる適切なプライマーをさらに含む。合成遺伝子合成キットの別の実施形態は、より高レベルの階層分割（例えば３〜約５）を使用し、したがって、上述のように、さらなるオリゴヌクレオチドプールを含むということは、当業者には理解されるだろう。
【００８２】
上述のように、一部の実施形態では、方法１００のステップ１０２、１０４、および１０６が複数遺伝子の混合物に同時に適用されることにより、ステップ１１２、１１４、１１６、１１８、および１２０の適用による複数遺伝子の混合物へのそれぞれ正しい自己集合をコードするオリゴヌクレオチドプールが得られる。したがって、遺伝子合成キットの一部の実施形態は、最終オーバーラップ伸長反応生成物混合物から第２遺伝子および／または追加遺伝子を増幅するのに有用な１つ以上の追加プライマーセットを含む。一部の好ましい実施形態では、各オリゴヌクレオチドプールおよび／またはプライマーセットが、当技術分野で知られる任意のタイプの適切なチューブまたは容器、例えば微量遠心チューブまたはマイクロタイタープレートのウェルなど（例えばＥｐｐｅｎｄｏｒｆ（ドイツ・ハンブルク）から市販されているもの）に入れて、便利に供給される。一部の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドプールおよび／またはプライマーセットの１つ以上が、固体状態で供給される。
【００８３】
本明細書に開示する方法を使用しない遺伝子合成キットは、通例、各中間ＤＮＡフラグメントをアセンブルするのに必要なオリゴヌクレオチドを含む１本のチューブと、各中間ＤＮＡフラグメント用のＰＣＲプライマーのチューブとを使用する。３チューブ合成遺伝子合成キットの実施形態は、コスト削減および／または作業効率を含む１つ以上の利点を示す。
【００８４】
本明細書に開示する２レベル遺伝子合成キットから合成遺伝子を合成するための方法の実施形態５００を、図５に模式的に図解する。図解した実施形態では、Ｎ個の合成遺伝子の配列を、ステップ１０２、１０４、および１０６において上述のように分割、最適化、およびマージすることにより、奇数中間フラグメントを合成するためのオリゴヌクレオチドプール５０４ａおよび偶数中間フラグメントを合成するためのプール５０４ｂを得る。対応するプールを取得して、適当なＰＣＲプライマー５１２ａおよび５１２ｂと混合する。奇数および偶数中間フラグメントをＰＣＲ５１２によって合成する。得られた中間フラグメントを混合して、次に高次のＤＮＡプール５１６を形成させる。得られたプールをステップ５１４で精製する。図解した実施形態では、中間フラグメントの全てがほぼ同じ長さを持つ。その結果、混合物の電気泳動（例えばＰＡＧＥ）は、プールされた中間フラグメントについて、シングルバンドを与える。合成を完了すると、Ｎ個の合成遺伝子の混合物５１８が得られる。Ｎ個の遺伝子のそれぞれは、適当なプライマー５２３ａ〜５２３Ｎを用いるプロセス５２２ａ〜５２２ＮにおいてＰＣＲを使って混合物５１８から単離することができる。
【００８５】
本方法の別の実施形態６００を図６に図解する。奇数中間フラグメントおよび偶数中間フラグメントは、それぞれのオリゴヌクレオチドプール６０４ａおよび６０４ｂから、ＰＣＲ６１２によって合成される。奇数中間フラグメントと偶数中間フラグメントとを混合すると、中間フラグメントのプール６１６が得られ、これが図解した実施形態では２ステップで精製される。ステップ６１４ａでは、中間フラグメントがＴ７、ＰＡＧＥ、および／またはＨＰＬＣの組み合わせを使って精製される。ステップ６１４ｂでは、中間フラグメントの全てがＰＣＲによって増幅される。得られた増幅プールから、Ｎ個の合成遺伝子の混合物６１８が作製される。合成遺伝子１〜Ｎは、適当なプライマーを使って、ステップ６２２ａ〜６２２ＮにおけるＰＣＲによって、混合物６１８から単離される。
【実施例】
【００８６】
大腸菌で発現させるための酵母Ｔｙ３  ＩＮ遺伝子
再帰的分解およびオーバーラップ伸長アセンブリ
酵母Ｔｙ３インテグラーゼ（Ｔｙ３  ＩＮ）遺伝子はサッカロミセスセレビシェ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来の１６４０ｂｐ遺伝子である。第１階層分割ではこの遺伝子を分割、最適化およびマージすることによって１５個の１９９ｂｐ中間フラグメントを得て、次に、第２階層分割では、それらを９０個のオリゴヌクレオチドに分割した。上述のように、９０個のオリゴヌクレオチドおよび１５個の中間ＤＮＡフラグメントのそれぞれは、隣接するオーバーラップＤＮＡ片だけにハイブリダイズするように、そしてまたは他の全てのオリゴヌクレオチドおよび／または中間ＤＮＡフラグメントに対する間違ったハイブリダイゼーションを全て包括的に回避するように設計した。隣接する中間フラグメント間のオーバーラップは７７ｂｐからだった。隣接するオリゴヌクレオチド間のオーバーラップは２５ｂｐ〜２６ｂｐだった。正しいハイブリダイゼーションの最低融点と間違ったハイブリダイゼーションの最高融点との間の融点ギャップは１９．８℃だった。
【００８７】
最適化されたＴｙ３  ＩＮ遺伝子の配列は配列番号３を持つ。中間フラグメントの遺伝子リーダーおよび遺伝子トレーラー（逆相補鎖）は、それぞれ配列番号４および配列番号５を持つ。１５個の中間フラグメントのそれぞれを「フラグメントｘ」（ここでｘは０〜１４である）とする。これらはそれぞれ配列番号６〜配列番号２０を持つ。９０個のオリゴヌクレオチドのそれぞれを「オリゴ−ｘ−ｙ」（ここでｘは上に定義したとおりであり、ｙは０〜５である）とする。これらはそれぞれ配列番号２１〜配列番号１１０を持つ。ｙが奇数である配列は、それぞれ逆相補鎖である。奇数オリゴヌクレオチドプールは、ｘが奇数である４２個のオリゴヌクレオチドを含んだ。偶数オリゴヌクレオチドプールは、ｘが偶数である４８個のオリゴヌクレオチドを含んだ。
【００８８】
奇数プールおよび偶数プールを、供給業者（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）、アイオワ州コーラルビル）から購入したオリゴヌクレオチドを使って調製した。奇数プール（ｘ奇数）における４２オリゴヌクレオチドのそれぞれの最終濃度を２μＭとした。ただし、各フラグメントについて最初のオリゴおよび最後のオリゴ（オリゴ−ｘ−０およびオリゴ−ｘ−５）は例外であり、これらは１０μＭとした。偶数プール（ｘ偶数）に含まれる４８オリゴヌクレオチドのそれぞれの最終濃度を２μＭとした。ただし、各フラグメントについて最初のオリゴおよび最後のオリゴ（オリゴ−ｘ−０およびオリゴ−ｘ−５）は例外であり、これらは１０μＭとした。それぞれ２．８μＬまたは３．２μＬの奇数または偶数オリゴヌクレオチドプール；１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ類；５μＬの１０×ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＩＩポリメラーゼバッファー；ならびに１μＬ（２．５単位／μＬ）のＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＩＩポリメラーゼを使って、最終体積が５０μＬになるように蒸留Ｈ２Ｏで希釈し、２つのパラレルＰＣＲ反応混合物を調製した。ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＩＩは、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（カリフォルニア州ラホーヤ）から市販されている高忠実度融合ＤＮＡポリメラーゼである。ＰＣＲ反応は、ＭＪ  Ｒｅｓａｅｒｃｈ  ＰＴＣ２２５サーマルサイクラーで、以下の計算制御プロトコールを使って行った：９５℃で１０分間の変性ステップ；次に、９５℃で２０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で１分を２５サイクル；そして７２℃で５分の最終ステップ。正しくアセンブルされたフラグメントはそれぞれ長さが１９９ｂｐ長なので、１．２％アガロースゲルでの電気泳動は、図７Ａに図解するような１本の主要バンドを与える。
【００８９】
各中間フラグメントのアセンブリが計画どおりに進行したことを確認するために、各フラグメントについてそれぞれ適当な最初および最後のオリゴヌクレオチド（オリゴ−ｘ−０およびオリゴ−ｘ−５）をプライマーとして使用することにより、生成した反応混合物に対して、１５個のパラレルＰＣＲ反応を行った。各反応混合物には、適宜、奇数プールまたは偶数プールのＰＣＲ産物１μＬ；それぞれの１０μＭ溶液から１μＬのＰＣＲプライマー；１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ類、５μＬの１０×ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＩＩポリメラーゼバッファー；および１μＬ（２．５単位／μＬ）のＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ポリメラーゼを使用し、最終体積が５０μＬになるように蒸留Ｈ２Ｏで希釈した。ＰＣＲ反応は、ＭＪ  Ｒｅｓａｅｒｃｈ  ＰＴＣ２２５サーマルサイクラーで、以下の計算制御プロトコールを使って行った：９５℃で１０分間の変性ステップ；次に、９５℃で２０秒、６０℃で３０秒、および７２℃で３０秒を２５サイクル；そして７２℃で５分の最終ステップ。アガロースゲル電気泳動分析により、図７Ｂに図解するように、１５個の１９９ｂｐ中間フラグメントの正しいアセンブリが確認された。
【００９０】
次に、合わせた奇数番号フラグメント０．７ｐｍｏｌおよび合わせた偶数番号フラグメント０．８ｐｍｏｌを、１μＬの遺伝子プライマー、リーダーおよびトレーラーミックス（それぞれ最終１０μＭの遺伝子リーダーと遺伝子トレーラーとの混合物）、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ類、５μＬの１０×ＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＩＩポリメラーゼ緩衝液；および１μＬ（２．５単位／μＬ）のＰｆｕＵｌｔｒａ（商標）ＩＩポリメラーゼと共に一つに混合し、最終体積が５０μＬになるように蒸留Ｈ２Ｏで希釈した。ＰＣＲ反応は、ＭＪ  Ｒｅｓａｅｒｃｈ  ＰＴＣ２２５サーマルサイクラーで、以下の計算制御プロトコールを使って行った：９５℃で１０分間の変性ステップ；次に、９５℃で２０秒、６８℃で３０秒、および７２℃で２分を２５サイクル；そして７２℃で５分の最終ステップ。得られた生成物を１．２％アガロース電気泳動で分析したところ、図７Ｃに図解するように、正しいサイズ（１６４０ｂｐ）のシングルバンドを示した。
【００９１】
上に例示し説明した実施形態は、いくつかの好ましい実施形態の例として記載したものである。当業者は、この開示の要旨および範囲から逸脱することなく、本明細書に提示した実施形態にさまざまな改変、変更、置換を加えることができ、この開示の範囲は本願の請求項によってのみ限定される。
【００９２】
上述した方法および／またはシステムの改変、例えば構成成分および／またはステップの付加および／または削除、および／またはそれらの順序の改変などが可能であることは、当業者には理解されるだろう。上の詳細な説明では、さまざまな実施形態に当てはまる新規な特徴を示し、説明し、指摘したが、本明細書に例示した方法および／またはシステムの形態および詳細に、当業者が、この開示の要旨から逸脱することなく、さまざまな省略、置換、および改変を加え得ることは、理解されるだろう。理解されるであろうが、本明細書に説明した特徴および利益の全てを提供するわけではない実施形態もあり、一部の特徴は別途、他の実施形態によって使用または実施されることがある。
【図面の簡単な説明】
【００９３】
【図１】図１は、プールされたＤＮＡを用いて１つ以上の合成遺伝子を合成するための方法を図解するフローチャートである。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｆは、合成遺伝子の３レベル階層分割およびアセンブリの実施形態を模式的に図解している。
【図２Ｂ】図２Ａ〜２Ｆは、合成遺伝子の３レベル階層分割およびアセンブリの実施形態を模式的に図解している。
【図２Ｃ】図２Ａ〜２Ｆは、合成遺伝子の３レベル階層分割およびアセンブリの実施形態を模式的に図解している。
【図２Ｄ】図２Ａ〜２Ｆは、合成遺伝子の３レベル階層分割およびアセンブリの実施形態を模式的に図解している。
【図２Ｅ】図２Ａ〜２Ｆは、合成遺伝子の３レベル階層分割およびアセンブリの実施形態を模式的に図解している。
【図２Ｆ】図２Ａ〜２Ｆは、合成遺伝子の３レベル階層分割およびアセンブリの実施形態を模式的に図解している。
【図３】図３は、次に大きなＤＮＡ片を精製および／または増幅するための異なる方法の実施形態を模式的に図解している。
【００９４】
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、次に大きなＤＮＡ片を精製および／または増幅するためのマイクロ流体的履行の実施形態を模式的に図解している。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、次に大きなＤＮＡ片を精製および／または増幅するためのマイクロ流体的履行の実施形態を模式的に図解している。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、次に大きなＤＮＡ片を精製および／または増幅するためのマイクロ流体的履行の実施形態を模式的に図解している。
【図５】図５は、プールされたＤＮＡから合成遺伝子を合成するための方法の実施形態を模式的に図解している。
【図６】図６は、プールされたＤＮＡから合成遺伝子を合成するための方法の実施形態を模式的に図解している。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｃは、実施例に記載する酵母Ｔｙ３  ＩＮの合成の中間体および最終生成物のアガロースゲル電気泳動分析である。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｃは、実施例に記載する酵母Ｔｙ３  ＩＮの合成の中間体および最終生成物のアガロースゲル電気泳動分析である。
【図７Ｃ】図７Ａ〜７Ｃは、実施例に記載する酵母Ｔｙ３  ＩＮの合成の中間体および最終生成物のアガロースゲル電気泳動分析である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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