(57)【要約】本発明は、生物組織の移植後石灰化を阻害するために組織を処理する方法を提供する。本発明の１つの方法では、組織は、予め処理されたグルタルアルデヒド溶液（すなわち、加熱処理されたかまたはｐＨが調整されたグルタルアルデヒド溶液）中に浸漬されるか、さもなければこの予め処理されたグルタルアルデヒド溶液と接触される。この組織を予め処理されたグルタルアルデヒドと接触させる工程の前に、この工程後に、またはこの工程と並行して、この組織はグルタルアルデヒドで部分的に固定され得る。予め処理されたグルタルアルデヒドとの接触は、組織上に遊離アミン基を生じ、これはその後、架橋された組織をブロッキング剤と接触させることによってブロッキングされる。別の実施形態では、予め処理されていないグルタルアルデヒドまたはｐＨが調整されたグルタルアルデヒド溶液のいずれかと、組織を架橋するのに十分な時間にわたって組織を接触させる。
2008534067.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分的に固定された結合タンパク質組織を含んでいる生物組織の移植後石灰化を緩和するための方法であって、該方法は、
ａ）該部分的に固定された組織を水溶液中で加熱する工程；
ｂ）該加熱された部分的に固定された組織を、該加熱された部分的に固定された組織を構成し得る遊離アミン基をブロッキングするためのブロッキング剤を含んでいる溶液と接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ブロッキング剤が、前記遊離アミン基と反応性である官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記クロッキング剤が、一官能性アルデヒド、ポリエポキシまたは糖である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一官能性アルデヒドが、ホルムアルデヒドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリエポキシが、エチレングリコールジグリシジルエーテルである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶液が、低い酸含量を有するグルタルアルデヒド溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記グルタルアルデヒド溶液が、抗鉱物化緩衝液を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗鉱物化緩衝液が、リン酸イオンが欠乏している緩衝液である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液が、ｐＨ約６を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記水溶液が非等張緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記非等張緩衝液が、低張性緩衝液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記水溶液が、リン酸塩が欠乏している溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）の前に、前記組織を、界面活性剤または塩および糖の高重量オスモル濃度の水溶液と接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組織を生体負荷還元に供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体負荷還元プロセスが、前記組織を、界面活性剤、アルデヒドおよびアルコールを含んでいる生体負荷還元溶液と接触させる工程を包含する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体負荷溶液が、
ホルムアルデヒド：２〜１０重量％；
エタノール：１０〜４５重量％；および
Ｔｗｅｅｎ  ８０：０．１〜１０重量％
を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１７】
生体補綴物を滅菌する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記滅菌が、前記生体補綴物を最終滅菌溶液と接触させる工程、および該最終滅菌溶液を、移植時までの該生体補綴物の滅菌を確実にするのに十分な時間にわたって約２０℃〜約５０℃の間の温度まで加熱する工程を包含する、請求項１８に記載の方法。
【請求項１９】
前記最終滅菌溶液が、ｐＨ約７．４に緩衝化された０．２重量％〜１．０重量％のグルタルアルデヒド水溶液を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２０】
前記最終滅菌溶液が、少なくとも一つの化学滅菌剤と組み合わせて、浸透圧のバランスがとれた塩溶液を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織を第１の生体負荷還元プロセスに供する工程；
任意の所望の非生物学的構成要素を該組織に添加して、生体補綴物を製造する工程；
該組織を第２の生体負荷還元プロセスに供する工程；および
該生体補綴物を滅菌する工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
生体補綴物を、グルタルアルデヒドおよび抗酸化剤を含む保存溶液中に保存する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗酸化剤がアスコルビン酸である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程のうちの一つ以上が非酸化条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記非酸化条件が、
窒素ブランケット；
低化学線安全光；および
機械式カバー
からなる群より選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２６】
生体補綴物の移植後石灰化を緩和するための方法であって、該方法は、
（ａ）グルタルアルデヒド溶液のｐＨを、約５．０〜約７．０の範囲のｐＨに合わせる工程；
（ｂ）結合組織タンパク質を含む一定量の生物組織を、グルタルアルデヒド溶液と接触させる工程；
（ｃ）該グルタルアルデヒド溶液および該組織を、約３０℃〜約７０℃の範囲の温度まで一定期間にわたって加熱し、それにより、該組織上に遊離アミン基を生じる工程であって、ここで該組織は、
（ｉ）工程（ｃ）の実行の前に少なくとも部分的に固定されるか、
（ｉｉ）工程（ｃ）の実行の後に固定されるか、または、
（ｉｉｉ）工程（ｃ）の実行と同時に固定され、そして
該組織は、架橋剤としてグルタルアルデヒドを含む架橋溶液に該組織を浸漬することによって固定される、工程；ならびに
（ｄ）該固定された組織を、遊離アミン基をブロッキングするブロッキング試薬を含んでいる溶液と接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項２７】
前記ｐＨが、約６．０に調整される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２８】
前記温度が、約４０℃〜約６０℃の範囲にある、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記期間が、約１時間と約６ヵ月との間である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記ブロッキング剤が、前記遊離アミン基と反応性である官能基を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記ブロッキング剤が、一官能性アルデヒド、ポリエポキシ、糖またはコラーゲンである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記一官能性アルデヒドがホルムアルデヒドである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３３】
前記ポリエポキシがエチレングリコールジグリシジルエーテルである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記グルタルアルデヒドが、低い酸含量を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３５】
前記架橋溶液が、非等張緩衝液を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３６】
前記非等張緩衝液が、低張性緩衝液である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３７】
工程（ａ）の前に、前記組織を、界面活性剤または塩および糖の高重量オスモル濃度の水溶液と接触させる工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３８】
前記組織を生体負荷還元に供する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体負荷還元プロセスが、前記組織を、界面活性剤、アルデヒドおよびアルコールを含んでいる生体負荷還元溶液と接触させる工程を包含する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４０】
生体補綴物を滅菌する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４１】
前記滅菌が、前記生体補綴物を最終滅菌溶液と接触させる工程、および該最終滅菌溶液を、移植時までの該生体補綴物の滅菌を確実にするのに十分な時間にわたって約２０℃〜約５０℃の間の温度まで加熱する工程を包含する、請求項に記載の方法。
【請求項４２】
前記最終滅菌溶液が、ｐＨ約７．４に緩衝化された０．２重量％〜１．０重量％のグルタルアルデヒド水溶液を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４３】
前記最終滅菌溶液が、少なくとも一つの化学滅菌剤と組み合わせて、浸透圧のバランスがとれた塩溶液を含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記生体補綴物を、グルタルアルデヒドおよび抗酸化剤を含む保存溶液中に保存する工程をさらに包含する、請求項２７に記載の方法。
【請求項４５】
前記抗酸化剤がアスコルビン酸である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４６】
前記工程のうちの一つ以上が非酸化条件下で実施される、請求項２７に記載の方法。
【請求項４７】
前記非酸化条件が、
窒素ブランケット；
低化学線安全光；および
機械式カバー
からなる群より選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４８】
部分的に固定された、結合タンパク質組織を含んでいる生物組織の移植後石灰化を緩和するための方法であって、該方法は、
ａ）水性グルタルアルデヒド溶液中で該部分的に固定された組織を加熱する工程；
ｂ）該部分的に固定された組織を、該部分的に固定された組織を構成する遊離アミン基のブロッキングのためのブロッキング剤を含んでいる溶液と接触させる工程；および
ｂ）該部分的に固定された組織を、該組織上のアルデヒドおよびカルボン酸基を減らす還元剤で処理する工程
を包含する、方法。
【請求項４９】
前記グルタルアルデヒド溶液のｐＨが、約５．０〜約７．０の範囲にある、請求項４９に記載の方法。
【請求項５０】
前記還元剤が、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウムまたは水素である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記グルタルアルデヒド溶液が、低い酸含量を有する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記グルタルアルデヒド溶液が、抗鉱物化緩衝液を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記抗鉱物化緩衝液が、リン酸塩が欠乏している緩衝液である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５４】
前記グルタルアルデヒド溶液が、非等張緩衝液を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記非等張緩衝液が、低張性緩衝液である、請求項５５に記載の方法。
【請求項５６】
工程（ａ）の前に、前記組織を、界面活性剤または塩および糖の高重量オスモル濃度の水溶液と接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項５７】
前記組織を生体負荷還元に供する工程をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
生体補綴物を滅菌する工程をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
前記生体補綴物を、グルタルアルデヒドおよび抗酸化剤を含む保存溶液中に保存する工程をさらに包含する、請求項４９に記載の方法。
【請求項６０】
生体補綴物であって、該生体補綴物は、石灰化緩和処理に供された部分的に固定された組織を含み、該処理は、以下の工程：
ａ）水性グルタルアルデヒド溶液中で該部分的に固定された組織を加熱する工程；および
ｂ）該部分的に固定された組織を、該部分的に固定された組織を構成する遊離アミン基のブロッキングのためのブロッキング剤を含んでいる溶液と接触させる工程
を包含する、生体補綴物。
【請求項６１】
前記生体補綴物が、心臓弁、血管、皮膚、硬膜、心膜、靭帯、腱、小腸粘膜下組織、ならびに心臓弁、血管、皮膚、硬膜、心膜、靭帯、腱および小腸粘膜下組織の組合せからなる組織の群より選択される組織を含む、請求項６１に記載の生体補綴物。
【請求項６２】
工程（ａ）における前記グルタルアルデヒド溶液が、前記生物組織の非存在下で該グルタルアルデヒド溶液を所定の終点に到達するまで加熱することにより調製され、該所定の終点が、該溶液の遊離アルデヒド含量の約２５％以上の減少；約７．４から約６．０への該溶液のｐＨの低下；該溶液のｐＨの約２０％の低下；および黄色または褐色への該溶液の色の変化から選択される少なくとも一つの指標により示される、請求項６１に記載の生体補綴物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、一般に、医療方法／デバイスに関し、より詳細には、生物組織を固定（例えば、なめしまたは架橋）し、滅菌して、固定された組織が移植後に石灰化する傾向を減少させ、そして固定された組織の血栓形成性を減少させるための方法に関係する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
移植可能な生物組織は、いわゆる同種移植片組織を凍結（すなわち、低温保存）することにより保存されたヒト組織から、または、いわゆる生体補綴物（非特許文献１）を化学的に固定する（すなわち、なめす）ことにより保存された動物組織から形成され得る。生体補綴物として使用されるタイプの生物組織としては、心臓弁、血管、皮膚、硬膜、心膜、小腸粘膜下組織（「ＳＩＳ組織」）、靭帯および腱が挙げられる。これらの生物組織は代表的に、組織の支えとなる骨格として作用する結合組織タンパク質（すなわち、コラーゲンおよびエラスチン）を含む。各生物組織の柔軟性または剛性は主に、組織内に存在するコラーゲンおよびエラスチンの相対量によって、ならびに／またはその結合組織骨格の物理構造および構成によって決定される。コラーゲンは、大部分の組織に存在する最も豊富な結合組織タンパク質である。各コラーゲン分子は、コイル状らせん構成の絡み合った３つポリペプチド鎖から構成される。
【０００３】
生物組織の化学固定のために使用される技術は、代表的に、所定のコラーゲン分子内のポリペプチド鎖間（すなわち、分子内架橋）において、または、隣接するコラーゲン分子間（すなわち、分子間架橋）において架橋を形成する一つ以上の化学固定剤（すなわち、なめし剤）への生物組織の曝露を含む。
【０００４】
コラーゲン性の生物組織を架橋させるために利用されている化学固定剤の例としては、以下が挙げられる：ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ジアルデヒドデンプン、ヘキサメチレンジイソシアネートおよび特定のポリエポキシ化合物。利用可能な様々な化学固定剤のうち、グルタルアルデヒドは、１９６８年のＣａｒｐｅｎｔｉｅｒ博士によるその抗免疫学作用および抗分解作用の発見以来、最も広く使われている。非特許文献２を参照のこと。さらに、グルタルアルデヒドは、最も効率的な滅菌剤のうちの１つである。グルタルアルデヒドは、多くの市販の生体補綴物製品（例えば、ブタの生体心臓弁（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−ＥｄｗａｒｄｓＴＭステント処理ブタＢｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）、ウシ心膜心臓弁（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−ＥｄｗａｒｄｓＴＭ  Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）およびステントのないブタ大動脈弁（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＲＩＭＡ  ＰｌｕｓＴＭ  Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）（全て、Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡによって製造販売されている））用の固定剤および滅菌剤（ｓｔｅｒｉｌａｎｔ）として用いられている。
【０００５】
固定は、例えば、組織の酵素分解を防止することによって、機械的安定化を、提供する。グルタルアルデヒドは、コラーゲンのアミノ酸残基（例えば、リジンおよびヒドロキシリジンのε−アミノ基またはアスパラギン酸およびグルタミン酸のカルボキシル基）と反応する架橋剤として広範囲に使用されている。グルタルアルデヒド−アミン反応の化学的性質は、グルタルアルデヒド分子の反応性およびジアルデヒドの自己重合に起因して複雑である。アルデヒドおよび一級アミンの反応生成物のうちで最も重要な構成要素は、窒素がアルデヒド炭素との二重結合を形成して、カルボニル炭素と酸素との間の二重結合を置き換えるシッフ塩基の形成を含む。
【０００６】
多くの生体補綴材料の移植と関連した１つの課題は、これらの材料内の結合組織タンパク質（すなわち、コラーゲンおよびエラスチン）が身体内での移植の後に石灰化されることになり得るということである。この種の石灰化は、生体補綴物の望ましくない硬化または分解をもたらし得る。固定したコラーゲン生体補綴物中で２種類の石灰化（内因性および外因性）が起こることが公知である。内因性石灰化は、組織によるリポタンパク質およびカルシウム結合タンパク質の吸着後に起こる。外因性石灰化は、生体補綴物への細胞（例えば、血小板）の接着後に起こり、生体補綴物上のリン酸カルシウム含有表面斑の発達をもたらす。
【０００７】
固定された組織生体補綴物が石灰化を受ける速度に影響を及ぼす要因は、完全には解明されていない。しかしながら、石灰化の速度に影響を及ぼすと考えられる要因としては、患者の齢、代謝障害（すなわち、高カルシウム血症、糖尿病など）の存在、食事要因、感染の存在、非経口的カルシウム投与、脱水、生体補綴物のその場所での歪み（例えば、機械的ストレス）、外科的移植後の初期期間中の不適切な抗凝血療法および免疫学的宿主組織応答が挙げられる。
【０００８】
さらに、グルタルアルデヒド固定は、組織石灰化に影響を及ぼし得る。さらに、多くの場合、固定された組織は、無菌性を維持するためにグルタルアルデヒドを含んでいる媒体中に保存される。未反応のグルタルアルデヒドまたは保存中に吸着されたグルタルアルデヒドは、移植後に身体中に漏出して、副作用を引き起こし得る。グルタルアルデヒドは細胞毒性であると考えられるからである。さらに、未反応のアルデヒド基は代表的に、固定された組織上に存在し、これは酸化されてカルボン酸部分になり得る。これらの部分は、インビボでカルシウムイオンを誘引し得、そして最初の石灰化に貢献し得る。
【０００９】
生体補綴組織の石灰化を遅延させる努力は、近年数多くなされている。これらの努力から生じる技術は、大きく２つのカテゴリーに分けられ得る：石灰化を阻害する（または石灰化がより起こりにくくするように固定された組織を修飾する）一つ以上の化合物を用いた、グルタルアルデヒドで固定した組織の前処理または後処理を含むもの、ならびにグルタルアルデヒド以外の化合物を用いた組織の固定により石灰化を減少させることを含むもの。
【００１０】
前者のカテゴリーの技術としては、以下のような化合物を用いた処理が挙げられるが、これらに限定されない：ａ）グルタルアルデヒド固定後の、洗剤または界面活性剤；ｂ）グルタルアルデヒドで固定した組織に共有結合されるかまたは注入を介して生体補綴物レシピエントに投与されるかまたは浸透ポンプもしくは制御放出マトリックスを介して部位特異的に送達される、ジホスホネート；ｃ）グルタルアルデヒド固定後に共有結合された、アミノ置換された脂肪族官能性酸；ｄ）グルタルアルデヒド固定後、好ましくは他のマトリックス安定化材料を用いた処理後に硫酸で処理された多糖（特にコンドロイチン硫酸）；ｅ）固定後のキトサン／ヘパリン結合；ｆ）グルタルアルデヒド固定の前または後のいずれかでの、第二鉄塩または第二スズ塩；ｇ）グルタルアルデヒドで固定された組織に組み込まれたポリマー（特に、弾性重合体）；またはｈ）グルタルアルデヒド固定後の、リン酸エステルまたは第四級アンモニウム塩または硫酸化高級脂肪族アルコールの水溶性溶液。
【００１１】
生体補綴組織の石灰化を減らすための後者のカテゴリーの技術（すなわち、グルタルアルデヒド以外の化合物を用いた組織の固定を含んでいる技術）としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：ａ）生体補綴組織を、光酸化触媒を含んでいる高重量オスモル濃度の水溶液に浸漬し、次いでこの組織を光に曝露することによりこの組織を光酸化によって固定することによる処理；ならびにｂ）ポリエポキシ化合物（例えば、ポリグリシジルエーテル（ポリエポキシ）化合物）を用いた処理による固定。
【００１２】
近年、カルシウム緩和の新たな技術は、特許文献１（これは、その全体が本明細書中に参考として援用される）に記載された。この方法は、固定されたか、固定されていないか、または部分的に固定された組織を、その組織との接触の前に予め熱処理されたかまたはｐＨが調整されたグルタルアルデヒド溶液と接触させることを含む。非特許文献３は、アミノ化合物（例えば、ＮＨ２−ＰＥＯ−ＳＯ３またはヘパリンを含んでいるアミノ基）を用いてブロッキングすることによって、未反応のグルタルアルデヒド残基を緩和する方法を開示した。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００３／０１２５８１３号明細書
【非特許文献１】Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  ｉｎ  Ｈｅａｒｔ  Ｖａｌｖｅ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ（１９７２），Ｉｏｎｅｓｃｕ編
【非特許文献２】Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ，Ａ．，Ｊ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，５８：４６７−６９（１９６９）
【非特許文献３】Ｌｅｅら，Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，５８（１）；２７−３５（２００１）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
これらの技術のうちのいくつかは、石灰化の低減において効率的であることが証明されているが、固定された生体補綴組織の移植後石灰化の傾向を少なくするための、既存の技術のさらなる改良または新たな石灰化緩和技術の開発の必要性が当該分野には残っている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の要旨）
本発明は、組織の移植後石灰化を阻害するために生物組織を処理するための方法を提供する。本発明の１つの方法によれば、組織は、予め処理されたグルタルアルデヒド溶液中に浸漬されるか、さもなければこの溶液と接触させられる。本発明の好ましい実施態様において、グルタルアルデヒド溶液は、そのｐＨを約５．０〜約７．０の範囲内のｐＨに、そして好ましくは約６．０に調整することによって予め処理される。この予め処理されたグルタルアルデヒド溶液は、次いで、約３０℃〜約７０℃の範囲の温度で、より好ましくは約４０℃〜約６０℃の間の温度で、そして最も好ましくは約４５℃〜約５５℃の温度で、この組織を処理するために用いられる。好ましい実施形態において、この組織は、約１時間〜約６ヵ月間の期間にわたって、そしてより好ましくは、約１日〜約２ヵ月間の期間にわたって処理される。この組織は、この組織を、予め処理されたグルタルアルデヒドと接触させる工程の前に、またはこの工程の後に、またはこの工程と同時に、少なくとも部分的に固定され、ここで、この組織は、架橋剤としてグルタルアルデヒドを含んでいる溶液にこの組織を浸漬することによって固定される。予め処理されたグルタルアルデヒドとの接触は、組織上に遊離アミン基を生じ、このアミン基は続いて、架橋された組織をブロッキング剤と接触させることによってブロッキングされる。
【００１５】
本発明の方法のさらにもう一つの実施形態において、組織は、この組織を架橋するのに十分な期間にわたって、グルタルアルデヒド溶液またはｐＨが調整されたグルタルアルデヒド溶液のいずれかと接触させられる。架橋された組織は、最初に加熱され、次いで固定された組織上のアルデヒドおよびカルボン酸基を減少させる還元剤で処理される。
【００１６】
本発明の各方法において、予め処理されたグルタルアルデヒド溶液はまた、ブロッキング工程に続いて、最終滅菌溶液としても用いられ得る。さらに、予め処理されるかどうかにかかわらず、グルタルアルデヒド溶液はまた、その効力を強化するために他の化学物質（例えば、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）、アルコール（例えば、エタノール）および／またはアルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド）を含んでもよい。
【００１７】
さらに、本発明によれば、本発明の方法の各種実施形態に従って処理された組織から完全にまたは部分的に形成される生体補綴物デバイスまたは生体補綴物品が提供される。本発明の生体補綴物デバイスまたは生体補綴物品に使用され得るヒトまたは動物起源の生物組織の例としては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：心臓弁、静脈弁、血管、尿管、腱、硬膜、皮膚、心膜、軟骨（例えば、半月板）、靭帯、骨、腸（例えば、腸壁）、小腸粘膜下組織（「ＳＩＳ組織」）および口周囲（ｐｅｒｉｏｓｔｉｕｍ）が含まれる。
【００１８】
さらに、本発明によれば、本発明の方法の各種実施形態の石灰化緩和処理を受けた生体補綴材料を移植することによって、哺乳動物患者の疾患および障害を処置するための方法が提供される。この種の処理方法は、以下を含むが、これらに限定されない：ａ）本発明に従ってグルタルアルデヒドで処理された生体補綴物心臓弁による、罹患した心臓弁の外科的な置き換え、ｂ）本発明に従ってグルタルアルデヒドで処理された生物学的血管移植片を移植するによる、血管の修復またはバイパス形成、ｃ）本発明に従って調製された生体補綴靭帯を移植することによる、裂けているかまたは欠損のある靭帯の外科的な置き換えまたは修復、ならびにｄ）本発明に従って調製された一つ以上の生体高分子組織骨格または生体補綴組織骨格（例えば、天然組織または生体高分子骨格を用いて操作された組織）を移植することによる、ネイティブな組織の修復、再建、再形成、強化、増量、内部成長、再建または再生。
【００１９】
生体補綴組織の移植後石灰化を緩和する方法の各種実施形態は、以前の実践に勝る重要な利点を提供する。これは、遊離アミン基をブロッキングするかまたはアルデヒドおよび酸性の官能基を減少させるという望ましい特徴は、保存および／または滅菌溶液中に存在する固定された組織とグルタルアルデヒドとの間での厄介であるかまたは望ましくない反応の可能性を少なくするからである。
【００２０】
また意図されるのは、保存に関する長期の低い酸安定性を促進する抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）を含むｐＨ緩衝剤処方物の使用である。
【００２１】
本発明のさらなる利点および新規の特徴は、以下の説明において部分的に記載されるものとし、そして部分的は、以下の明細書をしらべれば当業者にとって明らかになるかまたは本発明の実施によって学ばれ得るものとする。本発明の利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される手段、組合せ、組成物および方法によって実現および達成され得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
添付の図面（これは、本明細書中に組み込まれており、本明細書の一部を形成する）は、本発明の好ましい実施形態を例示しており、そして説明と共に、本発明の原則を説明するのに役立つ。
【００２３】
（発明の詳細な説明）
流体を動かしながら（例えば、振盪しながら）５０℃で２ヵ月間、０．６２５％のグルタルアルデヒドリン酸塩溶液中で事後処理された生体補綴組織が、マウス皮下移植モデルおよびウサギ筋内移植モデルにおいて、代表的条件（すなわち、室温にて１〜１４日間）下で０．６２５％のグルタルアルデヒドリン酸塩溶液中で固定されたコントロールの架橋された生体補綴組織よりも少ない石灰化を示したことが以前に報告された。米国特許第５，９３１，９６９号（その全体が具体的に本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。
【００２４】
組織との接触の前にグルタルアルデヒド溶液において加熱工程を実施することが有利であることもまた、以前に報告された。米国公開第２００３／０１２５８１３号（これは、その全体が具体的に本明細書中に参考として援用される）を参照のこと。熱処理されたグルタルアルデヒドは、次いで、より低い温度に冷却され得、そしてこの組織は次いで、減少した厳しさか、より便宜的か、または両方（例えば、より短い時間、より低い温度または両方とも）の条件下において、冷却されたグルタルアルデヒド溶液に添加され得る。組織がない状態でグルタルアルデヒド溶液を加熱処理することによって、組織を危険にさらすことも、組織にいかなる有害な作用を引き起こすこともなく、熱処理プロセス中に、より高い温度、より高い濃度または両方ともが使用され得る。
【００２５】
あるいは、溶液のｐＨを約５．０〜約７．０の範囲、好ましくは約６．０に調整することによって、グルタルアルデヒド溶液が、加熱処理よりはむしろ、緩衝化され得ることもまた、米国公開第２００３／０１２５８１３号において報告された。緩衝化されたグルタルアルデヒド溶液は、熱処理グルタルアルデヒド溶液として、（わずかに少ないとはいえ）類似の有利な効果を有する。
【００２６】
上記の開示以来、出願人らは、固定された組織からカルボン酸残基およびアルデヒド残基（酸化されてカルボン酸になる可能性がある）を取り除くことが有利であるということを見出した。なぜなら、カルボン酸の部分がカルシウムイオンを誘引して、生体補綴組織の石灰化の開始に寄与するということが提唱されたからである。したがって、本発明の１つの方法において、組織は、（約５重量％未満の）グルタルアルデヒド溶液中に浸漬されるか、さもなければこのグルタルアルデヒド溶液と接触させられる。組織をグルタルアルデヒドと接触させる工程の前に、またはこの工程の後に、またはこの工程と同時に、この組織は少なくとも部分的に固定され、ここで、この組織は、架橋剤としてグルタルアルデヒドを含んでいる溶液中にこの組織を浸漬することによって固定される。この様式での溶液との接触は、組織のコラーゲンスーパーへリックスの表面またはその付近に位置する不安定なシッフ塩基結合を加水分解し、従って、シッフ塩基結合を介して組織に結合したアルデヒドおよび酸性基を取り除き、そして組織上にアミン基を生じる。スーパーへリックス内のより深くにあるシッフ塩基結合は立体配置的に保護されており、それゆえ、加水分解されない。遊離アミン基は、次いで、架橋された組織をブロッキング剤と接触させることによって、次の工程でブロッキングされる。
【００２７】
本発明の代替の実施形態では、この組織は、グルタルアルデヒド溶液のｐＨを約５．０〜約７．０の範囲内のｐＨに、そして好ましくは約６．０に調整することにより調製される予め処理されたグルタルアルデヒドを用いて処理される。この組織を、ｐＨを調整したグルタルアルデヒドと接触させる工程の前に、この工程の後に、またはこの工程と同時に、この組織は少なくとも部分的に固定され、ここで、この組織は、架橋剤としてグルタルアルデヒドを含んでいる溶液にこの組織を浸漬することによって固定される。ｐＨを調整したグルタルアルデヒド溶液は次いで、好ましくは約３０℃〜７０℃の範囲の温度で、より好ましくは約４０℃〜６０℃の間の温度で、最も好ましくは約４５℃〜約５５℃の温度で組織を処理するために用いられる。好ましい実施形態において、この組織は、約１時間〜約６ヵ月間の期間にわたって、そしてより好ましくは約１日〜２ヵ月間にわたって処理される。この様式でのｐＨを調整したグルタルアルデヒドとの接触は、コラーゲンスーパーへリックスの表面またはその付近に位置する不安定なシッフ塩基結合を加水分解し、従って、シッフ塩基結合を介して組織に連結したアルデヒドおよび酸性基を除去し、そして組織上に遊離アミン基を生じる。遊離アミン基は、次いで、架橋された組織をブロッキング剤と接触させることによって、その後の工程でブロッキングされる。
【００２８】
本発明の方法のさらに別の実施形態において、この組織は、架橋を促進するのに十分な時間にわたって加熱することなく、未処理のグルタルアルデヒド溶液またはｐＨを調整したグルタルアルデヒド溶液と接触させられる。この架橋された組織は、次いで、固定された組織に結合したアルデヒドおよびカルボン酸基を還元する還元剤を用いて処理される。
【００２９】
（Ａ．予め処理されたグルタルアルデヒドを用いて生体補綴材料の石灰化を緩和するための方法）
図１は、本発明の方法の一つの実施形態を一般的に図示するフロー図である。図１に示すように、このプロセスの第一工程は、組織の非存在下で、予め処理されたグルタルアルデヒド溶液（例えば、熱処理されたグルタルアルデヒドまたはｐＨを調整したグルタルアルデヒド）を調製することである。
【００３０】
（１．組織の非存在下での熱処理されたグルタルアルデヒドの調製）
手短に述べると、熱処理されたグルタルアルデヒド溶液は、溶液を第１の期間にわたって第１の温度まで加熱することによって、組織の非存在下で調製される。グルタルアルデヒド溶液の温度は、次いで、組織と接触させる前に、第２の温度（好ましくは、第１の温度より低い）に調整される。しかしながら、この工程はまた、水溶液または未加熱のグルタルアルデヒドの溶液を用いて実行されてもよい。
【００３１】
出発溶液中のグルタルアルデヒドの濃度が変化してもよいことが認識される。その後、溶液濃度は、所望の場合、組織の添加の前に調整され得る。わずか０．１％のグルタルアルデヒド濃度および２５％以上ものグルタルアルデヒド濃度が熱処理工程中に用いられ得ると考えられる。０．６％〜２．５％という減少させたグルタルアルデヒド濃度は、現在まで、出願人によって成功裏に得られて使用されており、当業者は、より高いかまたはより低い濃度のグルタルアルデヒドが実際にこのプロセスの熱処理工程中に有利であると判明し得ることを認識するであろう。熱処理工程（図１）中の使用のための好適な濃度は、１．０％〜２．０％である。グルタルアルデヒドのこの熱処理は、この溶液の遊離アルデヒド含量が約２５％以上低下し、かつそのレベル（例えば、１．８％の溶液の、約０．６％以下への低下）で安定なままであるまで、この溶液を加熱することにより達成され得る。最初に、グルタルアルデヒドを含んでいる溶液は、リン酸緩衝液、非リン酸緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ緩衝液）または他の適切に緩衝化された溶液を用いてｐＨ７．４に緩衝化され得、そして、そのような場合、遊離アルデヒド含有量の低下を引き起こす、溶液の加熱はまた、溶液のｐＨの低下をも引き起こす。
【００３２】
一実施形態において、１．８重量％のグルタルアルデヒド水溶液は、清浄な不活性な容器（例えば、ステンレス鋼、プラスチックまたはホウ珪酸ガラス製の容器）において調製され、そしてこのような溶液は次いで、リン酸緩衝化生理食塩溶液を加えることによって、約７．４のｐＨに緩衝化される。
【００３３】
グルタルアルデヒドが加熱される第１の温度は、グルタルアルデヒド溶液の遊離アルデヒド含量およびｐＨの所定量の低下を引き起こすに十分に高く、かつ十分に長いように維持される。好ましくは、グルタルアルデヒド溶液を先に熱処理することは、溶液の遊離アルデヒド濃度の約２５％の減少、より好ましくは約５０％の減少を引き起こす。このグルタルアルデヒド溶液は、そのｐＨが最初に約７．２〜７．８の範囲内になるように、好ましくは約７．４になるように緩衝化され得る。加熱が行われたあと、この溶液のｐＨは代表的に約５．０〜約７．０、好ましくは６．０に低下する。グルタルアルデヒド溶液の事前加熱に起因して、この手順において後で組織を処理するために用いるときに、この溶液はその化学的特徴を著しくは変化させない。
【００３４】
グルタルアルデヒドの加熱処理は、任意の適切な手段によって達成され得る。例えば、このグルタルアルデヒドは、約２０℃〜約９０℃の間、好ましくは約６０℃〜約８０℃の間、最も好ましくは６５℃〜７５℃の温度になるように事前加熱され得、そして遊離アルデヒド濃度の少なくとも２５％の低下を引き起こすに十分な期間にわたって、かつ、この溶液のｐＨが約６．０に低下するのに十分な期間にわたって（すなわち、ｐＨ６．０は、約０．３％〜約０．７％の遊離アルデヒド濃度に対応する）、この温度において維持され得る。この時点で、この溶液の色は、無色から金色、または茶色であり得る。６．０への溶液のｐＨの低下およびそれに伴う金色または茶色への色の変化は、事前加熱処理が完了したことを示す。使用される温度に応じて、このグルタルアルデヒドの加熱処理工程は、使用される温度に依存して、１時間から６ヵ月以上のどこであってもよく、そして代表的には、１日〜１４日間の間であり得る。好適な方法は、約６５℃〜７５℃まで、約１日〜２ヵ月間にわたって、または、遊離アルデヒド濃度の少なくとも２５％以上の所望の低下および約６．０のｐＨが観察されるまで、グルタルアルデヒド溶液を加熱することである。約９０℃までのより高い温度が使用され得、そしてこのようなより高い温度を使用することにより、代表的には、遊離アルデヒド濃度の所望の低下およびそれに伴うｐＨの変化を促進する（例えば、７．４に調整された出発ｐＨを有する溶液は、９０℃にて約１日〜３日後には約６．０のｐＨまで低下する）。約２０℃まで下の範囲の、より低い温度もまた、使用され得、そして、このような、より低い温度を使用することにより、代表的には、所望の遊離アルデヒド含量およびｐＨの変化が引き起こされるにはより長くかかる。
【００３５】
グルタルアルデヒドの加熱処理が完了した後、この溶液は濾過され、そして、組織に損傷を引き起こさない第２の温度（例えば、約３０℃〜約７０℃、好ましくは約４０℃〜約６０℃、または最も好ましくは約５０℃）へと冷却される。
【００３６】
必要に応じて、このグルタルアルデヒドが加熱処理された後、この溶液は、約５０℃まで冷却され、そしてそのｐＨは、リン酸緩衝化生理食塩水または何らかの他の適切な緩衝液を添加することによって約７．４に調整される。
【００３７】
（２．ｐＨを調整したグルタルアルデヒドの調製）
本発明の別の実施形態では、このグルタルアルデヒド溶液は、事前に加熱されず、むしろ、このグルタルアルデヒド溶液のｐＨは、約５．０〜約７．０の範囲内のｐＨに、好ましくは約６．０に調整される。
【００３８】
（３．組織の収集および調製）
所望の生物組織は、人間の死体または動物ドナーから収集され、そしてその後の固定および処理のために調製される。この組織は代表的に、その宿主動物からの外科的切断または取り出しによって収集される。その後、それは、代表的には、切り取られるかまたは寸法通りに切断され、滅菌水、塩基性塩溶液、食塩水または他の適切な洗浄溶液を用いて洗浄される。
【００３９】
一実施形態において、この組織は、固定の前に、界面活性剤溶液（例えば、エタノールおよび／またはホルムアルデヒドを用いるかまたは用いない、Ｔｗｅｅｎ  ８０）中で、または、生理学的溶液（例えば、食塩水または平衡塩溶液）中で、約３７℃と６０℃との間、好ましくは約４５℃の温度において、約１時間〜約６ヵ月間、好ましくは約１日〜約１５日間にわたって加熱処理され得、次いで上記の通りに、加熱処理されたグルタルアルデヒド溶液中で加熱処理され得る。
【００４０】
一実施形態において、組織は、組織が単に表面だけでなく全体に固定されることを確実にするために脂質、脂肪酸、コレステロールなどを取り除くために、固定の前に界面活性剤を用いて処理される。しかしながら、あまりにも強い溶液を用いることによってクリーニング作用をやりすぎることによりベース組織に損傷を与えることがないように注意を払わなければならない。それゆえ、０．５重量％〜６重量％の界面活性剤を含んでいる水溶液の形態の界面活性剤を使用することが好ましい。適切な処理時間は、２時間〜６時間であり、好ましくは３時間である（その全体が本明細書中に参考として援用される米国特許第４，５５３，９７４号を参照のこと）。界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、両性界面活性剤またはそれらの混合物であり得る。適切なアニオン性界面活性剤の例は、ドデシル硫酸ナトリウム、ドデシルスルホ酢酸ナトリウムおよびアルカリルポリエーテルスルホネートのナトリウム塩である。適切な非イオン性界面活性剤の例は、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート（Ｔｗｅｅｎ  ８０）、ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート（Ｔｗｅｅｎ  ６０）である。適切な両性界面活性剤の例は、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔとして一般に知られるスルホベタインである。
【００４１】
あるいは、脂質は、組織を高い重量オスモル濃度の水溶液（例えば、塩および糖の溶液）に浸漬することによって除去され、ここで、米国特許第６，３５０，７３２号（これはその全体が本明細書中に参考として援用される）にて説明されるように、この塩はサンプルに浸透し得、そしてこの糖は溶液の高い重量オスモル濃度を維持するように機能する。適切な塩の例としては、塩化ナトリウムおよび塩化カリウムが挙げられるがこれらに限定されず、そして適切な糖の例としては、蔗糖およびフラクトースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４２】
（４．生物組織の固定）
生物組織は、予め処理されたグルタルアルデヒドを用いた処理の前に、その処理中に、またはその処理後に固定され得る。図１において図示される例において、この組織は、予め処理されたグルタルアルデヒドを用いた処理を受ける前に固定される。この例では、リン酸緩衝液のような適切な緩衝液によってｐＨ約７．４に緩衝化された０．６２５重量％のグルタルアルデヒド溶液中に、室温において１〜１４日間にわたって組織を浸漬することにより固定が行われる。
【００４３】
好ましくは、組織固定は、高純度グルタルアルデヒドモノマー（分子量（ＭＷ）１００）、高純度グルタルアルデヒドダイマー（ＭＷ  １８２）、この２種類の混合物、低酸を透析したかまたは商業的なグルタルアルデヒドなどの低い酸形成可能性を有するグルタルアルデヒド溶液を含む溶液中に組織を浸漬することにより行われる。
【００４４】
固定または滅菌を強化するために、界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０）および／またはエタノールおよび／またはホルムアルデヒドのような他の化合物がこのグルタルアルデヒドに添加され得る。
【００４５】
組織が固定液から取り出された後に、この組織は、食塩水溶液、塩基性塩溶液、遊離グルタルアルデヒド溶液または他の何らかの適切な洗浄溶液で徹底的にリンスされる。
【００４６】
（５．固定されていないか、部分的に固定されたか、または固定された組織の加熱処理）
固定されていないか、部分的に固定されたか、または固定された組織は、次いで、上記の通りに調製された予め処理されたグルタルアルデヒド溶液（加熱処理されたかまたはｐＨが調整されたかのいずれか）と接触させられる。この点に関しては、「完全に固定された」組織は、この組織がこのインプラントとしての使用に適している程度まで固定されたことを意味し、その一方で、「部分的に固定された」とは、この組織が完全に固定されるよりも若干短い程度まで固定されたことを意味する。
【００４７】
図１の例による組織処理工程は、予め処理されたグルタルアルデヒド溶液を流体の動きの有無にかかわらず、約３０℃〜約７０℃、好ましくは約４０℃〜約６０℃、または最も好ましくは約５０℃において維持しながら、この溶液中に固定されたか、部分的に固定されたか、または固定されていない組織を浸漬することによって好ましくは達成される。溶液のｐＨが溶液内での組織の配置の前に約６．０のままにされることが好ましい。その後、この溶液の温度は、この組織をこの溶液中に浸漬して、グルタルアルデヒド溶液をこの組織と相互作用させるかまたはそれによりこの組織を改変しながら、約５０℃に維持される。組織の移植後の石灰化のしやすさは、予め処理されたグルタルアルデヒド中での（主として使用される温度に依存して）わずか１時間から６ヵ月以上にもわたってまでの浸漬後に有意に低減されるが、代表的には５０℃にて１日〜１５日間で行われる。その後、この組織は溶液から取り出される。この組織は、この時点で、代表的には色が褐色である。この組織が、予め処理されたグルタルアルデヒド溶液から取り出された後、この組織は、食塩水、塩基性塩溶液または他の何らかの適切な洗浄溶液で徹底的にリンスされる。
【００４８】
（６．遊離アミン基のブロッキング）
組織をグルタルアルデヒドで処理することの一つの最終的な結果は、組織表面上および／または組織表面付近の安定性のより低いシッフ塩基結合の炭素−窒素二重結合の加水分解であり、これにより同時に、シッフ塩基結合を介して組織に連結していたアルデヒドおよび酸性基が除去される。これは望ましい。なぜなら、未反応のアルデヒド基は、酸化されてカルボン酸部分になり得、そしてこれは次いでインビボでカルシウムイオンを誘引し、石灰化の開始に貢献する。しかしながら、グルタルアルデヒドを用いた処理は、組織表面上および／または組織表面付近に遊離アミン残基を有する架橋した組織をもたらす。
【００４９】
シッフ塩基結合の加水分解もまた、滅菌後および保存溶液に存在するグルタルアルデヒドと反応し得る、組織上の一級アミン残基の存在をもたらす（図１）ので本発明者らは、一級アミンと反応して一級アミンをブロックするブロッキング試薬を含む溶液とこの一級アミンとを接触させ、従って、本発明に従って次の工程で使用する溶液中に存在するグルタルアルデヒドと遊離アミンとの間の反応を回避することが有利であるということを見出した。これは、次に、酸へと潜在的に酸化され得る、組織に結合した遊離アルデヒド基の量を減らす。従って、予め処理されたグルタルアルデヒドを用いた処理の後、この組織はリンスされ、次いでブロッキング剤と接触させられる（図１）。本明細書中で使用される場合、「ブロッキング剤」は、アミン基と十分に反応性である官能基または化学部分を有している任意の化合物ある。アミン基と反応性であって本発明での使用に適したブロッキング剤としては、モノアルデヒド（すなわち、単一のアルデヒド官能基を含んでいる分子（例えば、ホルムアルデヒド））、糖、水溶性ポリエポキシ（例えば、エチレングリコールジグリシジルエーテル（Ｄｅｎａｃｏｌとしても公知）、コラーゲン、およびアミン反応性官能基を含んでいる当該分野において公知の他の任意の薬剤（但し、アミン基およびブロッキング剤との間の反応生成物は、遊離アルデヒドもカルボン酸基も含まない）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
例えば、ホルムアルデヒド（これは、単一のアルデヒド官能基を有する）は、組織上の一級アミンと反応して、シッフ塩基結合を形成し得、ここで、一級アミンの窒素は、ホルムアルデヒドのカルボニル炭素と二重結合を形成する。一級アミンとグルタルアルデヒドとの間での反応とは対照的に、一級アミンとホルムアルデヒドとの間の反応から形成されるシッフ塩基結合は、酸化されてカルボン酸になり得る遊離アルデヒド部分を有さず、したがって、ホルムアルデヒドを用いてアミンをブロックすることは、組織が移植後に石灰化する傾向を増加させない。ブロッキング試薬としてホルムアルデヒドを利用することのさらなる利点は、シッフ塩基結合が移植後にゆっくりと加水分解されて、移植された組織の周囲の領域にホルムアルデヒドを放出するということである。ゆっくりと放出されたホルムアルデヒドは、組織移植での過形成（すなわち、組織細胞数の異常な増加）を抑制し、それゆえ、移植された生体補綴組織上での組織の過剰成長を減らすかまたは防止する。
【００５１】
適切なブロッキング剤の別の例は、ポリグリシジルエーテルであり、これは、アミンと容易に反応する。ポリグリシジルエーテルブロッキング剤の例としては、様々なＤｅｎａｃｏｌのいずれかおよびそれらの個々の反応性種（一官能性エポキシド、二官能性エポキシド、三官能性エポキシドおよび多官能性エポキシドを含む）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００５２】
糖もまた、アミンと反応し、それゆえ、本発明によるブロッキング剤としても適切である。適切な糖としては、還元糖が挙げられ、還元糖は、組織上の遊離アミン基とのシッフ塩基結合を形成し得る。還元糖の例としては、グリセロース（ｇｌｙｃｅｒｏｓｅ）、トレオース、エリスロース、リキソース、キシロース、アラビノース、リボース、アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース、タロースまたは他の任意のジオース、トリオース、テトロース、ペントース、ヘキソース、セプトース（ｓｅｐｔｏｓｅ）、オクトース、ナノース（ｎａｎｏｓｅ）またはデコースが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５３】
（Ｂ．未処理の、およびｐＨを調整したグルタルアルデヒドおよびその後の還元を使用して、生体補綴材料の石灰化を緩和するための方法）
本発明の別法は、図２に例示される。
【００５４】
生物組織は、人間の死体または動物ドナーから収集され、そして本明細書において記載されるとおり、その後の固定および処理のために調製される。この組織は、本明細書において記載されているとおり、単に表面にだけでなく組織全体を固定することを確実にするために、脂質、脂肪酸、コレステロールなどを取り除くために、固定の前に界面活性剤または高重量オスモル濃度の水溶液で必要に応じて処理される。
【００５５】
この組織は次いで、予め処理されていないグルタルアルデヒドまたはｐＨを調整したグルタルアルデヒド溶液のいずれかと、組織を架橋するのに十分な期間にわたって接触させられ、ここで、このｐＨは、約５．０〜７．０の範囲内にあり、そして好ましくは約６．０である。
【００５６】
次いで、架橋された組織は、固定された組織に結合したアルデヒド基およびカルボン酸基を還元する還元剤を用いて処理される。これにおいて、架橋された組織は、カルボン酸または潜在的酸形成官能基（例えば、アルデヒド）を還元する還元剤を用いて処理される。架橋された組織上のカルボン酸および／または潜在的酸形成官能基の全てまたは実質的に全てを取り除くことは、従って、石灰化が発生する潜在的核形成部位を除去する。
【００５７】
理論的には、カルボン酸官能基およびアルデヒド官能基を効果的に還元する任意の還元剤（例えば水素化物、チオール、ギ酸など）がこの工程のために用いられ得るが、好ましくは、還元剤は水素化ホウ素であり、より好ましくは水素化ホウ素ナトリウムである。他の還元剤としては、代表的には圧力および１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）下での水素（すなわち、水素を利用する標準還元法において用いられるとおりの水素）を含む。収率を改善するためにＮ−ヒドロキシスクシンイミド（またはあるいは、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（ＮＨＳＳ））とともにＥＤＡＣを使用することが当業者に公知である。ＥＤＡＣは、任意の利用可能なアミンに結合することによって任意の遊離カルボニル基を「還元」（結合）し、従って、それがまた、アミンについてのブロッキング剤としても用いられ得る。
【００５８】
（Ｃ．さらなる石灰化緩和手順）
リン酸イオンのようなイオンの存在が石灰化の発生を増加させる傾向があることが公知である。従って、本発明の方法の生産工程のいずれかまたは全てにおいて使用される緩衝液または溶液は好ましくは、移植後の組織の石灰化を減らすに有効な量まで減少したレベルのリン酸塩、硫酸塩、炭酸塩、カルシウムおよび／またはマグネシウムを有する緩衝液または抗鉱物化（ａｎｔｉｍｉｎｅｒａｌｉｚａｔｉｏｎ）溶液を含む。一つの実施形態では、この緩衝液は、リン酸塩が欠乏している溶液である。リン酸塩が欠乏している溶液は、移植後の上記組織の石灰化を減らすに有効な量まで減少したレベルのリン酸塩を有し、この溶液は、組織にとって非破壊的であるかまたは非不安定性である。従来の組織処理溶液の調製において使用される大部分の化学物質には痕跡量で見つかるので、実質的にリン酸塩を含まない溶液は、痕跡量のリン酸塩だけを含む溶液である。リン酸塩が欠乏している溶液の例としては、ホウ酸塩、重炭酸塩、カコジル酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＰＲＳおよびＰＩＰＥＳが挙げられるがこれらに限定されない。抗鉱物化溶液または緩衝液の他の例としては、塩化ナトリウム溶液、アスコルビン酸溶液およびグルタル酸溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５９】
別の実施形態では、本発明の方法のプロセス工程のいずれかまたは全てにおいて利用される緩衝液としては、非等張緩衝液（すなわち、高張性または低張性の緩衝液）が挙げられ、ここで、この緩衝液の重量オスモル濃度は所望の組織特性（例えば、密度、モジュラス、張力、強度など）を誘導するように調整されている。例えば、高張性緩衝液（すなわち、正常細胞中よりも高い塩濃度を有する緩衝液）は、組織から水を引き出す。その結果、組織構成要素はより近くにともに引きよせられ、そして、それによって、それらがより容易に架橋することができ、それゆえ、密度が上昇する。あるいは、低張性緩衝液（すなわち、正常細胞中よりも低い塩濃度を有する緩衝液）は組織を膨潤させ、架橋剤がより深く浸透するのを許容する。
【００６０】
別の実施形態では、本発明の方法の工程のうちの一つ以上は、窒素ブランケット、低化学線安全光および／または機械式カバーの下で工程を実行することを含むがこれらに限定されない、非酸化条件下で実行される。
【００６１】
（Ｄ．生体補綴物の事後滅菌、アセンブリ／製造および保存）
１．第１の生体負荷還元（ＢＲＥＰ  Ｉ）
組織が固定されて、本発明の方法に従って移植後石灰化を緩和するために処理され、そしてすすがれた後、この組織は、第１の生体負荷還元処理に供される。例えば、この組織は、以下を含む混合物中に浸漬されるか、またはさもなければこの混合物と接触させられる：ｉ）架橋剤、ｉｉ）変性剤、およびｉｉｉ）界面活性剤（すなわち、ＣＤＳ溶液）。１つの好適なＣＤＳ溶液（米国特許第４，８８５，００５号および米国特許第４，６４８，８８１号（これらの各々は、本明細書中に参考として援用される）に記載される）は、ｉ）ホルムアルデヒド、ｉｉ）エタノールおよびｉｉｉ）界面活性剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ  ８０ＴＭ界面活性剤（ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ、Ｂｒａｎｔｆｏｒｄ、Ｏｎｔａｒｉｏから入手可能）の混合物である。このような好適なＣＤＳ溶液は、頭字語「ＦＥＴＳ」とも呼ばれ得、そして以下の通りの好適な処方を有する：ホルムアルデヒド（４．０±０．４重量％）、エタノール（２２．０±２．２重量％）およびＴｗｅｅｎ  ８０（１．２±０．２重量％）。この組織は、２時間〜７日、代表的に約２時間までのＣＤＳ溶液に好ましくは浸漬される。この浸漬期間中に、ＣＤＳ溶液は、４℃〜５０℃の温度で、好ましくは約２０℃〜約３７℃で維持される。
【００６２】
当業者は、後述するように、さまざまな代替の化合物または溶液によってＣＤＳ溶液の各成分が置き換えられ得ることを認識する。
【００６３】
潜在的な代替の変性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルコール／溶媒：（例えば、エタノールまたはイソプロピルアルコール）；酸性化されたエーテル（例えば、硫酸／エーテル混合物、アセトン、小さなアルキルサイズのエーテル（例えば、メチル、エチルなど））；ケトン（例えば、メチルエチルケトン）：商業的な溶媒系（例えば、ＧｅｎｅｓｏｌｖｅＴＭ（Ａｌｌｉｅｄ  Ｓｉｇｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｍｏｒｒｉｓｔｏｗｎ、Ｎ．Ｊ．））；グリコール（例えば、グリセロールエチレングリコール、ポリエチレングリコール、低分子量のカーボワックス）；および高濃度塩溶液（例えば、塩化マグネシウムおよび塩化ナトリウム）。
【００６４】
潜在的な代替の界面活性剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
ａ）アニオン性界面活性剤：例えば、ラウリン酸のエステル（ラウリル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウムとも呼ばれる）を含むがこれに限定されない）；およびアルキルスルホン酸塩（例えば、１−デカンスルホン酸ナトリウム塩）。
【００６５】
ｂ）非イオン性化合物：例えば、ポリオキシエチレンエーテル構造に基づく化合物（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１１４、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−４０５、Ｎ−１０１（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯから市販される）が挙げられる）および関連した構造物；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ界面活性剤およびＴｅｔｒｏｎｉｃ界面活性剤（ＢＡＳＦ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ、Ｎ．Ｊ．から市販される）。
【００６６】
ｃ）アルキル化フェノキシポリエトキシアルコール：例えば、ＮＰ４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、Ｉｇｅｐａｌ、ＣＡ６３０、加水分解された／官能基化された動植物の化合物（Ｔｗｅｅｎ  ８０、Ｔｗｅｅｎ  ２０、オクチル誘導体、オクチルβ−グルコシド、オクチルβ−チオグルコピラノシド、デオキシコレートおよびそれらの誘導体が挙げられる）、両性イオン化合物、３−（［コラミドプロピル］−ジメチルアミノ）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、３−（［コラミドプロピル］−ジメチルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬから入手可能）。
【００６７】
上記の界面活性剤化合物は、個々に用いられてもよく、または混合して（例えば、デオキシコレート／Ｔｒｉｔｏｎまたは市販の混合物（例えば、Ｍｉｃｒｏ−８０／９０）用いられてもよい。
【００６８】
（２．製造／アセンブリ）
第１の生体負荷還元が完了した後、この組織は、等張生理食塩水または０．６２５％のグルタルアルデヒドのような適切なリンス溶液で再びすすがれ得、そしてクリーンルームまたは無菌の環境に輸送され得る。その後、この組織は、（必要に応じて）さらに切り取られ得るかまたは成形され得、そして任意の非生物学的構成要素（例えば、ステント、フレーム、縫合リング、導管、縫合が全体に裂けるのを防止するポリエステルメッシュのセグメントなど）と結合されるかまたはアセンブリされて、所望の生体補綴物デバイスが形成され得る。生物組織および非生物学的構成要素の両方から組み立てられる生体補綴物デバイスの例としては、ステント処理された豚の生体補綴心臓弁（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−ＥｄｗａｒｄｓＴＭ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）、およびウシ心臓周囲心臓弁（例えば、Ｃａｒｐｅｎｔｉｅｒ−ＥｄｗａｒｄｓＴＭ  Ｐｅｒｉｃａｒｄｉａｌ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）、布補強材を組み込んだステントのないブタ大動脈弁（例えば、Ｅｄｗａｒｄｓ  ＰＲＩＭＡ  ＰｌｕｓＴＭ  Ｓｔｅｎｔｌｅｓｓ  Ａｏｒｔｉｃ  Ｂｉｏｐｒｏｓｔｈｅｓｉｓ）、および生物力学心室補助デバイスのための導管弁（例えば、Ｎｏｖａｃｏｒ  Ｎ−１００ＰＣモデル）（全てＥｄｗａｒｄｓ  Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＬＬＣ、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡから入手可能）。
【００６９】
（３．第２の生体負荷還元（ＢＲＥＰ  ＩＩ））
生体補綴物が製造されて組み立てられた後、これは、上記の第１の生体負荷還元の本質的に繰り返しである第２の生体負荷還元に供されるが、この第２の生体負荷還元工程では、この溶液は好ましくは、約２時間〜１０日間（好ましくは９時間）にわたって約３７℃に維持される。
【００７０】
（４．最終滅菌および保存）
第２の生体負荷還元の完了後、この組織（または生体補綴物）は、適切なリンス溶液（例えば、等張生理食塩水または０．６２５％グルタルアルデヒド溶液）でリンスされて、その後、保存および滅菌のための最終的な溶液中に入れられる。好適な最終滅菌溶液は、約０．２重量％〜１．０重量％のグルタルアルデヒドの濃度を有し、最も好ましくは約０．６２５重量％のグルタルアルデヒドの濃度を有する、グルタルアルデヒド溶液である。この溶液は、この溶液の最終的な加熱により強化され得る強い滅菌効果を有する。
【００７１】
最終滅菌工程の一実施形態では、組織（または生体補綴物）は、最終滅菌溶液中に浸漬されるかまたは最終滅菌溶液と接触され、そして移植の時間まで生体補綴物の無菌性を確実にするのに十分な期間にわたって加熱される。加熱期間は、利用される温度に依存して変化し、すなわち、温度が低いほど、期間が長くなる。例えば、１または２時間から１ヵ月までの温度については、それぞれ、約５０℃と約２０℃との間である。好ましくは、期間は３７℃にて１〜６日であるか、または、５０℃にて６時間〜２日間であるが、当業者はこれらの温度または時間の値が、本発明の範囲内で改変され得ることを認識する。
【００７２】
さらなる輸送および操作を回避するために、最終滅菌は、生体補綴物が輸送されて移植時まで保存される密封された保存容器またはパッケージ内で好ましくは行われる。組織（または生体補綴物）は、水酸化ナトリウムを用いてｐＨ７．４に緩衝化された０．６２５％のグルタルアルデヒド水溶液が予備充填された保存容器に無菌的に配置され、その結果、組織（または生体補綴物）は、緩衝化されたグルタルアルデヒド溶液に完全に浸漬される。その後で、この容器は密閉され、そして室温にて少なくとも７日間、または、オーブン中に３７℃にて２４時間、または、５０℃にて６時間配置されて、グルタルアルデヒドの滅菌力が強化される。その後、この容器は室温まで冷やされ、そして病院または他の場所に出荷され、そこでこの容器は生体補綴物の使用時まで保存される。
【００７３】
別の実施形態では、この組織は、以下の工程を含む容器内最終滅菌プロセスにより滅菌される：約７．４のｐＨに緩衝化された、０．２重量％〜１．０重量％のグルタルアルデヒドを含む最終滅菌剤溶液の量を含む容器を提供する工程；この容器内の最終滅菌剤溶液にこの組織を浸漬する工程；この容器を密閉する工程；この容器、その中に含まれる最終滅菌剤溶液および生体補綴物を約６時間〜６日間の期間にわたって約３７℃〜５０℃の温度において加熱する工程；容器、その中に含まれる最終滅菌剤溶液および生体補綴物を室温まで冷やす工程；および哺乳類の患者に生体補綴物を移植することが所望されるまで、この容器を密閉されたままにする工程。
【００７４】
別の実施形態では、最終滅菌は、保存容器中に組織または生体補綴物を配置する前に実施される。
【００７５】
場合によっては、本発明に従って加熱処理されたグルタルアルデヒドは、最終溶液として使用され得、そしてそのような場合、保存の最終工程まで、すなわち、最終滅菌工程と並行して、本発明の方法に従う組織の処理のいくつかまたは全てを達成することを代わりに選択して、予め加熱処理されたグルタルアルデヒド中に組織を浸漬する工程の前の工程を短縮するかまたは完全に除去することが可能であり得る。
【００７６】
好ましい実施形態において、本方法が実施される組織としては、生物学的構成要素を有する補綴デバイスを調製する際に役立つ、実質的に任意の哺乳類の組織が挙げられる。例えば、１つの実施形態において、この組織は、器官に由来する。別の実施形態では、この組織は、神経組織、腺組織（例えば、リンパ組織）、呼吸組織、消化組織、尿路組織、感覚組織（例えば、角膜、レンズなど）および生殖組織から選択される。しかしながら、生物学的材料が生物学的流体である関連した実施形態において、生物学的流体のイオン強度を希釈して抽出溶媒の混和性を許容しない限り、液体の添加は必要ではないようである。
【００７７】
現在好ましい実施形態において、組織は、筋組織、脂肪組織、上皮組織および内皮組織から選択される。特に好ましい実施形態において、組織は、心筋組織および脈管組織から選択される。関連した実施形態において、組織は、心臓弁、静脈弁、血管、尿管、腱、硬膜、皮膚、心膜、腸（例えば腸壁）または口周囲を含むが、これらに限定されない群から選択される。特に好ましい実施形態では、組織は、骨、軟骨（例えば、半月板）、腱、靭帯または他の任意の結合組織に由来する。
【００７８】
この目的のために使用される材料の供給源は両方の組織型に関して変化し得るので、この供給源はまた、種のタイプ（自己由来組織、同種組織、または異種組織）に関しても変化し得る。当業者は、本発明の方法が一つ以上のタイプの組織または材料を含む生体補綴物デバイスについて用いられ得ることを認識している。
【００７９】
生物材料が中実の組織または生成物である好ましい実施形態において、これが抽出プロセスに適するように、これは、水溶液中に最初に懸濁され得る。例えば、脳組織は、１０％のｗ／ｖのスクロース溶液（例えば、０．３２Ｍスクロース）中に懸濁され得る。他の低張溶液または等張溶液としては、５％デキストロース、リン酸緩衝化生理食塩水、三緩衝化食塩水、ＨＥＰＥＳ緩衝化食塩水または上記の緩衝液のいずれかが挙げられる。水溶液中の生物材料はまた、処理剤とこの生物材料との間の接触を最大にするために、均質化されてもよく、粉砕されてもよく、さもなければ破壊されてもよい。
【００８０】
特に好ましい実施形態では、生物材料は、移植片レシピエントへの移植が設計および意図される、生体補綴組織の一部または全体を形成する。
【００８１】
さらに別の好ましい実施形態において、組織の構造完全性が保持される。構造完全性は、組織がその必要な生物学的機能を実行する能力と定義され得る。当業者は、組織がその必要な機能を実行するために必要とされる構造完全性の程度は、異なるタイプの組織によって変化し得ることを認識する。さらに、組織が用いられる特定適用は、異なるレベルの構造完全性を必要とし得る。
【００８２】
上記の説明は、本発明のいくつかの例示的実施形態を説明および例示する目的のためにのみ提供されている。当業者は、本発明の他の実施形態が可能であるが、本明細書では詳述していないことを認識する。それゆえ、これらの実施例は、いかなる形であれ、本発明の範囲を限定することを目的としていない。特に定義されていない限り、本明細書において用いられるすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。好適な方法および材料が現在記載されているが、本明細書において記載されている方法および材料と類似であるかまたは均等な材料および材料は、本発明の実施または試験において用いられ得る。用語「含む」、「含んでいる」、「挙げられる」、「挙げられている」および「挙げられる」は、本明細書および特許請求の範囲において用いられる場合、言及した特徴、整数、構成要素または工程の存在を特定することを意図しているが、それらは、それらのうちの一つ以上の他の特徴、整数、構成要素、工程または群の存在または付加を排除しない。
【００８３】
（実施例）
本明細書において記載されている実施例および実施例が、例示のみを目的としており、そして、それを考慮すれば、様々な改変または変更が当業者に示唆され、そしてまた、本出願の精神および範囲内に含まれており、そして添付の特許請求の範囲の範囲内にあるとみなされることが理解される。本明細書において引用されるすべての刊行物、特許および特許出願は、すべての目的のために、それらの全体が本明細書中に参考として援用される。
【００８４】
上記が本発明の好ましい実施形態の完全な説明であるが、様々な代替物、改変および均等物が用いられ得る。さらに、特定の他の改変が添付の特許請求の範囲内で実施され得ることが明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】図１は、組織上の遊離アミン基のブロッキングによって生体補綴組織の石灰化を緩和するためのフロー図である。
【図２】図２は、組織に結合したアルデヒドおよび酸性基を減少させることによって、生体補綴組織の石灰化を緩和するためのフロー図である。
【図１】
2008534067.tif 000003
【図２】
2008534067.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月22日(2007.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
部分的に固定された結合タンパク質組織を含んでいる生物組織の移植後石灰化を緩和するための方法であって、該方法は、
ａ）該部分的に固定された組織を水溶液中で加熱する工程；
ｂ）該加熱された部分的に固定された組織を、該加熱された部分的に固定された組織を構成し得る遊離アミン基をブロッキングするためのブロッキング剤を含んでいる溶液と接触させる工程
を包含する、方法。
【請求項２】
前記ブロッキング剤が、前記遊離アミン基と反応性である官能基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ブロッキング剤が、一官能性アルデヒド、ポリエポキシまたは糖である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記一官能性アルデヒドが、ホルムアルデヒドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ポリエポキシが、エチレングリコールジグリシジルエーテルである、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記水溶液が、低い酸含量を有するグルタルアルデヒド溶液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記グルタルアルデヒド溶液が、抗鉱物化緩衝液を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記抗鉱物化緩衝液が、リン酸イオンが欠乏している緩衝液である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記水溶液が、ｐＨ約６を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記水溶液が非等張緩衝液を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記非等張緩衝液が、低張性緩衝液である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記水溶液が、リン酸塩が欠乏している溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）の前に、前記組織を、界面活性剤または塩および糖の高重量オスモル濃度の水溶液と接触させる工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記組織を生体負荷還元に供する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記生体負荷還元プロセスが、前記組織を、界面活性剤、アルデヒドおよびアルコールを含んでいる生体負荷還元溶液と接触させる工程を包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体負荷還元溶液が、
ホルムアルデヒド：２〜１０重量％；
エタノール：１０〜４５重量％；および
Ｔｗｅｅｎ  ８０：０．１〜１０重量％
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
生体補綴物を滅菌する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記滅菌が、前記生体補綴物を最終滅菌溶液と接触させる工程、および該最終滅菌溶液を、移植時までの該生体補綴物の滅菌を確実にするのに十分な時間にわたって約２０℃〜約５０℃の間の温度まで加熱する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記最終滅菌溶液が、ｐＨ約７．４に緩衝化された０．２重量％〜１．０重量％のグルタルアルデヒド水溶液を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記最終滅菌溶液が、少なくとも一つの化学滅菌剤と組み合わせて、浸透圧のバランスがとれた塩溶液を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記組織を第１の生体負荷還元プロセスに供する工程；
任意の所望の非生物学的構成要素を該組織に添加して、生体補綴物を製造する工程；
該組織を第２の生体負荷還元プロセスに供する工程；および
該生体補綴物を滅菌する工程
をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
生体補綴物を、グルタルアルデヒドおよび抗酸化剤を含む保存溶液中に保存する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗酸化剤がアスコルビン酸である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程のうちの一つ以上が非酸化条件下で実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記非酸化条件が、
窒素ブランケット；
低化学線安全光；および
機械式カバー
からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【国際調査報告】
2008534067.tif 000005
2008534067.tif 000006
2008534067.tif 000007