(57)【要約】【解決手段】本発明は、特定された癌の治療効果を予測するのに有用なマーカーをスクリーニングする方法を提供するものであって、（ａ）臨床追跡データが注記された複数の組織サンプルを有する組織バンクから組織マイクロアレイを構築すること、（ｂ）潜在的アンプリコンとして知られる腫瘍遺伝子又は癌関連遺伝子に特異的なポリ核酸プローブを標識化すること、（ｃ）蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法で組織マイクロアレイの解析を行なうこと、（ｄ）蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の結果を、臨床追跡データと関連づけすること、を含んでいる。さらに、本発明は、乳癌を治療する方法を提供するものであって、乳癌患者のＨＴＰＡＰの発現量又は増幅を測定し、ＨＴＰＡＰの発現量又ＨＴＰＡＰの増幅が増加した患者に対し、ＨＴＰＡＰのホスファチジン酸ホスファターゼ活性を妨げる少なくとも１種の化合物を治療上有効な量を投与することを含んでいる。さらに、本発明の乳癌治療方法は、ｃＭＹＣ遺伝子の増幅に関して乳癌患者をスクリーニングし、次に、ｃＭＹＣ遺伝子の増幅を有する患者に、ＨＥＲ２シグナル伝達を妨げる化合物を治療上有効な量を投与することを含んでいる。【選択図】図１ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌を治療する方法であって、
乳癌患者のＨＴＰＡＰの発現量又は増幅を測定し、
ＨＴＰＡＰの発現量又ＨＴＰＡＰの増幅が増加した患者に対し、ＨＴＰＡＰのホスファチジン酸ホスファターゼ活性を妨げる少なくとも１種の化合物を治療上有効な量を投与することを含んでいる、方法。
【請求項２】
ＨＴＰＡＰの発現量は、酵素免疫測定法、放射免疫測定法及びフローサイトメトリー法からなる群から選択される方法により測定される請求項１の方法。
【請求項３】
酵素免疫測定法では、患者から得た上清の可溶性ＨＴＰＡＰ蛋白濃度が測定される請求項２の方法。
【請求項４】
ＨＴＰＡＰの発現量は、リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定される請求項１の方法。
【請求項５】
少なくとも１種の化合物は、抗ＨＴＰＡＰ特異的抗体である請求項１の方法。
【請求項６】
抗ＨＴＰＡＰ特異的抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である請求項５の方法。
【請求項７】
ＨＴＰＡＰの増幅は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法によって測定される請求項１の方法。
【請求項８】
乳癌の治療をモニタリングする方法であって、乳癌患者のＨＴＰＡＰの発現量又は増幅を測定することを含んでおり、ＨＴＰＡＰ量の低下を有効な治療の指標とする、方法。
【請求項９】
ＨＴＰＡＰの発現量は、酵素免疫測定法、放射免疫測定法及びフローサイトメトリー法からなる群から選択される方法により測定される請求項８の方法。
【請求項１０】
酵素免疫測定法では、患者から得た上清の可溶性ＨＴＰＡＰ蛋白濃度が測定される請求項９の方法。
【請求項１１】
ＨＴＰＡＰの発現量は、リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応によって測定される請求項８の方法。
【請求項１２】
ＨＴＰＡＰの増幅は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法により測定される請求項８の方法。
【請求項１３】
乳癌を治療する方法であって、
ｃＭＹＣ遺伝子の増幅に関して、乳癌患者をスクリーニングし、
ｃＭＹＣ遺伝子の増幅を有する患者に、ＨＥＲ２シグナル伝達を妨げる化合物を治療上有効な量を投与することを含んでいる、方法。
【請求項１４】
ＨＥＲ２シグナル伝達を妨げる治療量の化合物は、トラスツズマブである請求項１３の方法。
【請求項１５】
ｃＭＹＣ遺伝子の増幅のスクリーニングは、癌細胞のサンプルを用いて、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法により行われる請求項１３の方法。
【請求項１６】
ＨＥＲ２遺伝子の増幅に関して、乳癌患者をスクリーニングすることをさらに含んでいる請求項１３の方法。
【請求項１７】
ＨＥＲ２遺伝子の増幅のスクリーニングは、癌組織のサンプルを用いて、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法により行われる請求項１６の方法。
【請求項１８】
ｃＭＹＣ遺伝子とＨＥＲ２遺伝子の両方について増幅を有する患者を治療するために、ＨＥＲ２シグナル伝達を妨げる化合物を、治療上有効な量が投与される請求項１６の方法。
【請求項１９】
患者の治療は、ＨＥＲ２シグナル伝達を妨げる治療量の化合物の投与と、化学療法を併用することによって行われる請求項１３の方法。
【請求項２０】
ｃＭＹＣ遺伝子の増幅のスクリーニングは、癌組織のサンプルを用いて、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法によって行われる請求項１３の方法。
【請求項２１】
特定された癌の治療効果を予測するのに有用なマーカーをスクリーニングする方法であって、
臨床追跡データの注釈がつけられた複数の組織サンプルを有する組織バンクから組織マイクロアレイを構築し、
潜在的アンプリコンとして知られる腫瘍遺伝子又は癌関連遺伝子に特異的なポリ核酸プローブを標識化し、
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法で組織マイクロアレイの解析を行ない、
蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法の結果を、臨床追跡データと関連づけることを含んでいる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の記載＞
この出願は、２００４年１２月１５日に出願された米国仮出願第６０／６３６,１６９号、２００５年７月１１日に出願された米国仮出願第６０／６９８,１１２号、２００５年９月１４日に出願された米国仮出願第６０／７１７,４８５号の優先権を主張し、これらはすべて、引用を以て本願に組み込まれるものとする。
【背景技術】
【０００２】
＜発明の背景＞
乳癌は、治療に対する臨床所見及び対応に関して一様性のない病気である。この多様性は、乳癌のサブタイプ毎に癌細胞を構成する分子が異なることによる。しかしながら、現在治療標的として利用されているのは、２種類の分子的特性にすぎない。これらは、抗エストロゲン剤の標的であるエストロゲン受容体と、ハーセプチンの標的であるＨＥＲ２である。これらの分子を標的にするための努力により、極めてプロダクティブ(productive)であることが立証されている。しかしながら、これら２種類の標的を有しない腫瘍の治療は、一般的には、増殖細胞を標的とする化学療法で治療されることがしばしばある。重要な正常細胞の一部も増殖するので、正常細胞も化学療法によって同時に損傷を受ける。化学療法は、毒性の強さと関係がある。ＥＲ又はＨＥＲ２に加えて、腫瘍における分子標的の同定(identification)は、新しい抗癌治療において重要である。
【０００３】
ｃＤＮＡアレイを用いた発現プロファイリングと比較ゲノムハイブリダイゼーション(“ＣＧＨ”)の組合せを用いた最近の研究では、乳癌の転写プログラムにおける遺伝子増幅の役割が解明されている。
【０００４】
Pollackらの研究では、４４の局部進行性乳癌と１０の乳癌細胞株について、６６９１のマップされたヒト遺伝子のコピー数変更と発現量が調べられた［Pollack JR, Sorlic T, Perou CM et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(20):12963-12968］。この研究のデータによれば、乳癌の遺伝子発現における全ての変動のうちの少なくとも１２％は、遺伝子のコピー数の変動そのものに直接起因することを示唆している。ゲノム変化(増加と減少)の総数は、高悪性度(Ｐ＝０.００８)、陰性ＥＲ(Ｐ＝０.０４)及びｐ５３突然変異(Ｐ＝０.０００６)との関連性が大きい。１１７の高レベル増幅(９１の異なる遺伝子を示す)のうち６２％(５４の遺伝子を示す)は、ｍＲＮＡレベルが少なくとも中程度の上昇であり、４２％(３６の異なる遺伝子)は、ｍＲＮＡレベルの高度の上昇であることが認められた。Hymanらは、同様な試みにおいて、１３８２４の遺伝子のｃＤＮＡマイクロアレイを用いて、１４の乳癌細胞株におけるコピー数と発現量の相関関係を調べている［Hyman E, Kauraniemi P, Hautaniemi S et al., Cancer Res 2002; 62(21):6240-6245］。彼らの報告では、高度に増幅した遺伝子の４４％は、過剰発現が起こり、過剰発現した遺伝子の１０.５％が増幅されている。
【０００５】
これら２つの結果は、乳癌の遺伝子発現の転写制御における遺伝子増幅の重要な役割を示しており、治療及び診断の発展のための望ましい標的として、増幅した遺伝子を追跡するための理論的解明を提供する。
【０００６】
しかしながら、少数遺伝子の増幅については、アレイＣＧＨによって同定され、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(“ＦＩＳＨ”)によって調べられ、予後に関連する(prognostic)ことが分かっているけれども、これまで、乳癌における増幅遺伝子の総合リストと臨床転帰の相関については全く研究が行われていない。増幅パターンのスクリーニングに対して最大の障壁となるのは、アレイＣＧＨ解析のために高品質ＤＮＡが必要であり、そのコストが高いことである。
【０００７】
一方では、ＦＩＳＨは日常の臨床現場で用いられるホルマリン固定パラフィン包埋切片と共に使用できる安定した方法である。ＨＥＲ２のＦＩＳＨプローブは、ハーセプチン効果の予測試験として、ＦＤＡに承認されている。パラフィン包埋切片におけるＤＮＡの安定性により、ＲＮＡに基づく臨床検定又は免疫組織化学に基づく臨床検定よりも信頼性が高い。しかしながら、潜在的に重要な増幅遺伝子用のＦＩＳＨプローブは、総合的な開発が行われていない。実際のところ、プローブのアレイを供給するメーカーは唯一つであり(Vysis, Downers Grove, IL)、これらのプローブの殆どは、現時点では、予後因子として用いられ、臨床的に有効ではない。また、これらのプローブは、非常に高価で(１ケース当たり約＄３００)、種類が限られており、固形腫瘍(例えば乳癌や大腸癌)において潜在的に重要なアンプリコン(amplicons)のレパトアをスクラッチすることは殆どない。
【０００８】
１１００例の乳癌において潜在的に推定される重要なアンプリコンに対して、Vysis社の市販の５種類のＦＩＳＨプローブ(ＨＥＲ２、ＭＤＭ２、ＭＹＣ、ＣＣＮＤ１、ＥＧＦＲ)の最近の調査として、Al-Kurayaらは、５種類の遺伝子アンプリコンの全てではないが、治療情報が無く不完全と定義された臨床的集団における生存結果と相関を有するものがあることを見出した［Al-Kuraya K, Schraml P, Torhorst J et al, Cancer Res 2004; 64(23):8534-8540］。一方で、彼らは、症例の６０％は、試験した５種類の遺伝子について増幅は全くなかったことを見出した。さらに、遺伝子増幅の量的効果として、生存率の「順序は、増幅無し＞１増幅＞２増幅＞３増幅であることを見出した。このデータは、ゲノムの不安定性レベルの上昇と、増幅発展の高い可能性を有するいわゆる「拡充的(amplificatory)」表現型を支持し、それゆえ、乳癌のアンプリコンの包括的臨床相関関係の必要性を支持する。
【０００９】
近年、乳癌の分子分類学が進歩しているが、それでも、治療標的として現在活用されているのは２種類の分子的特性にすぎない。これらは、抗エストロゲン剤の標的であるエストロゲン受容体(タモキシフェン及びアロマターゼ阻害剤)と、ハーセプチンの標的であるＨＥＲ２である。これらの分子を標的にするための努力により、非常に生産的であることが立証されている。しかしながら、これら２種類の標的を有しない腫瘍の治療は、一般的には、増殖細胞を標的とする化学療法で治療されることがしばしばある。重要な正常細胞の一部も増殖するので、正常細胞も化学療法によって同時に損傷を受ける。それゆえ、化学療法は、毒性の強さと関係がある。ＥＲ又はＨＥＲ２に加えて、腫瘍における分子標的の同定は、新しい抗癌治療において重要である。
【００１０】
乳癌全体の約１５〜２０％は、その細胞表面にＨＥＲ２蛋白が過剰発現している［Paik S, Hazan R, Fisher ER et al., J Clin Oncol 1990; 8(1):103-112］。そのような腫瘍は、ＨＥＲ２蛋白が過剰発現していないものよりも、予後が悪いことが知られている［Paik S, Hazan R, Fisher ER et al., J Clin Oncol 1990; 8(1):103-112］。ＨＥＲ２蛋白の過剰発現は、ＨＥＲ２をエンコードする遺伝子の増幅又はコピー数の増加により、殆ど不変である。
【００１１】
表面にＨＥＲ２蛋白が過剰発現した癌細胞の増殖を停止させる手段として、ＨＥＲ２シグナリングを標的化する複数の薬物が開発されている。これらの薬物のうちの１つは、Genentechによって開発されたトラスツズマブ(ハーセプチン)である。ハーセプチンは、ＨＥＲ２過剰発現の進行型乳癌と診断された患者の延命に有効であることが示されている［Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S et al, N Engl J Med 2001; 344(11):783-792］。ＨＥＲ２蛋白が過剰発現又はＨＥＲ２遺伝子が増幅した早期乳癌の患者においても、ハーセプチンは、再発及び死亡を低減する効果があることが示されている［Romond EH, Pesez EA, Bryant J et. al, N Eng Med 2005; 353(16); 1673-1684］。再発率の低下について、ハーセプチンとアジュバント療法における化学療剤単独使用を比較した場合、ハーセプチンは約５０％である［Romand EH, Pesez EA, Bryant J et. al, N Eng Med 2005; 353(16); 1673-1684］。この高価な治療は、全ての患者に治療効果をもたらすとは限らないし、また、重大な心臓毒性の可能性を有している。それゆえ、ハーセプチン又はその他のＨＥＲ２薬物から大きな効果がもたらされる患者を同定する方法が必要である［Slamon DJ, Leyland-Jones B, Shak S et al, N Engl J Med 2001; 344(11):783-792; Goldman B., J Natl Cancer Inst 2003; 95 (23):1744-1746］。多くの研究所では、ハーセプチンに対する反応の予測因子として、ＨＥＲ２シグナル経路のコンポーネント(例えばＰＴＥＮ)の異常を調べる研究を行なっており、そのような異常があると、腫瘍細胞は、ＨＥＲ２蛋白過剰発現の場合でも、ハーセプチンに抵抗性となると考えられている［Crowder RJ, Lombardi DP, and Ellis MJ., Cancer Cell 2004; 6(2):103-104; Nagata Y, Lan KH, Zhou X et al., Cancer Cell 2004; 6(2):117-127］。そのような研究は、ＨＥＲ２シグナル経路で直接的役割を持つ分子についてのみ行われており、臨床的研究で実証されたものは無く、臨床分野でハーセプチンに対する反応を予測するのに使用されるマーカーはこれまで存在しない。
【００１２】
乳癌で増幅される遺伝子が数多くあることは、ＣＧＨ研究によって示されている。前述したように、乳癌で過剰発現した遺伝子の約１０％は、遺伝子増幅によるものである［Pollack JR, Sorlic T, Perou CM et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(20):12963-12968］。ヒト癌で頻繁に増幅される遺伝子の１つは、染色体８に位置するｃＭＹＣである。正常細胞でも、ｃＭＹＣの発現は、高度に制御された状態で行われ、細胞はＧ１からＳフェーズに移行する。おそらく正常細胞増殖においてその重要な役割があるため、ｃＭＹＣを阻害するための取組みは、医薬産業では主たる焦点が当てられていない。現在、薬剤の臨床試験を行なっている会社はただ１社(Cylene Pharmaceuticals)のみである。研究結果によれば、ｃＭＹＣは、プログラム細胞死又は細胞増殖による細胞運命を決定する分子スイッチとしての重要な役割を有している［Pelengaris S, Khan M, Evan G., Nat Rev Cancer 2002; 2(10):764-776; Pelengaris S, Khan M, Evan GI., Cell 2002; 109(3):321-334］。ｃＭＹＣが過剰発現すると、細胞の増殖は、非制御状態になり、生存シグナルの不存在下では、プログラム細胞死の影響を受け易くなる(図１ａ参照)。ｃＭＹＣは、プログラム細胞死経路の多くのコンポーネントを調節することによって、アポトーシスを誘導するが、主たるエフェクタは、Ｂａｘであると考えられている［Pelengaris S, Khan M, Evan G., Nat Rev Cancer 2002; 2(10):764-776］。
【００１３】
結局のところ、ｃＭＹＣ過剰発現を有する細胞は、局所的に利用可能な生存因子の枯渇により、集団自殺する。同時に、ｃＭＹＣの過剰発現は、ゲノムの不安定性を引き起こすことも知られている。これは、他の腫瘍遺伝子(例えばＨＥＲ２)の増幅を引き起こす可能性がある［Fest T, Mougey V, Dalstein V et al., Oncogene 2002; 21(19):2981-2990］。その他の遺伝子の増幅は、アポトーシス抑制シグナルを生成して、アポトーシス経路を阻害する。例えば、ＨＥＲ２増幅の場合、ＨＥＲ２は、Ｂａｘを阻害する抗アポトーシス蛋白Ｂｃｌ−２を誘発するという報告がある［Milella M, Trisciuoglio D, Bruno T et al., Clin. Cancer Res 2004; 10(22):7747-7756］。
【００１４】
それでもなお、治療の有効性の予後指標をもたらすマーカー／遺伝子を同定することの必要性は、依然として要請されている。前記文献及び付属書類で言及する文献については、引用を以て本願への記載加入とする。
【発明の開示】
【００１５】
＜発明の要旨＞
本発明は、新規な予後予測及び治療標的であるＨＴＰＡＰ遺伝子について記載するもどである。ＨＴＰＡＰ遺伝子は、標準の化学療法(ドキソルビシン、シクロホスファミド及びパクリタキセルを含む)での治療後であっても、増幅すると、乳癌患者に予後不良をもたらす。ＨＴＰＡＰの増幅は、腫瘍サイズ、治療、陽性の腋窩リンパ節の数、年齢及びホルモン受容体の状態、ＨＥＲ２増幅、及びｃＭＹＣ増幅に関して、独立した予後予測因子(prognosticator)である。さらに、ｃＭＹＣは、ハーセプチンに対する反応の予測因子であって、ｃＭＹＣ増幅とＨＥＲ２増幅／過剰発現とを有する患者について、ハーセプチンが化学療法に加えられると、癌再発率は７５％低下する。一方、ｃＭＹＣ増幅を有しない患者の場合、再発率の低下は４５％にすぎない。ＨＥＲ２増幅又は過剰発現を有する乳癌患者の約３０％は、ｃＭＹＣが増幅する。トラスツズマブによるＨＥＲ２シグナル伝達が阻害されると、ｃＭＹＣの役割は、増殖スイッチからアポトーシススイッチ(pro-apoptotic switch)に変化するものと思われる。本発明は、以下の臨床的適用を含むものである：  トラスツズマブと、ＨＥＲ２シグナル経路を標的にする他の薬物を使用して、患者毎の治療法を決定する方法を最適化すること；  トラスツズマブ又はＨＥＲ２標的療法後にも再発危険性の高い患者を同定することにより、血管新生を標的にするベバシツマブ(アバスチン)等の他の薬物又は標的療法の追加を行なう将来の臨床的研究に関する患者選択の方法を最適化すること；  ＰＣＲを用いて、ＨＥＲ２とｃＭＹＣの両遺伝子の増幅状態の検出をシングルチューブアッセイ(single tube assay)で行ない、乳癌患者の反応の予後予測及び予測を行なうこと；  アポトーシス抑制シグナルを他の活性腫瘍遺伝子から阻害し、そのアポトーシス活性の間接的調節を行なうことによって、ｃＭＹＣ標的療法を合理的に開発すること。
【００１６】
＜発明の記述＞
商業的に入手可能なＦＩＳＨプローブの価格が高い理由の１つは、プローブである細菌人工クローン(ＢＡＣ)を直接蛍光標識するのが困難で高コストであるためである。本発明は、パラフィン包埋組織に対して１０年以上前から行われている全ゲノム増幅法及び効率的ＦＩＳＨ法とを組み合わせることにより、既知のアンプリコンを表すＢＡＣクローンを効率的に蛍光標識する方法を提供するものである(図２に概要を示す)。この標識及びＦＩＳＨ法は、商業的に入手可能なプローブと比べて、ログオーダで安価である。パラフィンブロック組織サンプルを３０,０００以上の乳癌及び大腸癌の症例に使用し、臨床追跡情報(clinical follow up information)及び施された治療に対して全て注釈が付けられてあり(annotated)、臨床的相関の研究に対して、他とは異なる特異な情報源が提供される。ＦＩＳＨ法と組織マイクロアレイ(ＴＭＡ)を組み合わせることにより、単一の顕微鏡用切片を用いて１００以上の症例をスクリーニングすることが可能になり、何千もの症例の中で複数のアンプリコンのスクリーニングを実現することができる。当該分野の専門家であれば、当該分野で広く知られたいかなる方法についてもは、ＦＩＳＨ適用のためのプローブを標識するのに用いられることは容易に認識するであろう。さらに、ＦＩＳＨは増幅の決定に用いられるから、その他多くの定量法又は半定量法を、限定するものではないが、抗体を用いたアッセイ(例えばＥＬＩＳＡ(酵素免疫測定法))及びｑｔ ＰＣＲに用いられることができる。
【００１７】
＜パイロットプロジェクト＞
パイロット実証プロジェクトにおいて、National Surgical Adjuvant Breast and Bowel Project (“ＮＳＡＢＰ”)Ｂ−２８のトライアルから９８７以上の症例をスクリーニングし、アリアマイシン(Ariamycin)シクロホスファミドを４サイクル行なったものと、同じ薬剤投与後パクリタキセルを４サイクル行なったものとを比較した。この研究では、組織マイクロアレイを構築し、ＦＩＳＨアッセイは、アレイＣＧＨデータに基づいた１０の異なる内部開発プローブに対して行なった(２セットは、ＨＥＲ２及びＭＬＮ６４と、ＡＰＰＢＰ２及びＰＰＭＩＤであり、互いに極めて近い)。アンプリコン及びそれらの染色体位置は次のとおり示される。
ＳＥＢ４Ｄ  ２０ｑ１３.３２
ＺＮＦ２１７  ２０ｑ１３.２
ＡＰＰＢＰ２  １７ｑ２３.２
ＴＰＤ５２  ８ｑ２１
ＭＬＮ６４  １７ｑ１１−ｑ１２
ＰＰＭ１Ｄ  １７ｑ２３.２
ＨＥＲ２  １７ｑ２１.１
ＣＹＣＬＩＮＤ１  １１ｑ１３
ＭＡＬ２  ８ｑ２３
Ｃ−ＭＹＣ  ８ｑ２４.１２−ｑ２４.１３
【００１８】
個々のプローブのハイブリダイゼーション後、症例は、増幅ありの例(シグナルが細胞核当たり３コピーよりも多い)と、増幅なしの例(２コピー以下)を示している。これらの１０のアンプリコンについて増幅パターンの自然分類(natural class)を調べるために、非監視下の階層的クラスタリングを行なった。パイロット研究の結果は図３に示されている。その結果で注目すべきことは、ＰＰＭＩＤ及びＡＰＰＢＰ２と、ＨＥＲ２及びＭＬＮ６４の増幅状態に密接な相関を有することであり、染色体位置が非常に近接しているためと考えられる。このデータは、請求の範囲に記載したＢＡＣ標識に関する方法が、再現結果を得られる可能性が高いことを証明している。
【００１９】
さらに、１０のアンプリコンのどれにも増幅無しの症例がある。かかる症例の割合は、より多くのアンプリコンがスクリーニングされると減少するので、増幅に対して相対的に抵抗性のサブグループが存在する可能性が高い。
【００２０】
Ｂ−２８の治療において、増幅がある場合と増幅がない場合の予後値(prognostic-value)を調べた。１０のアンプリコンの全てについて、増幅がない患者の無再発生存は、遺伝子のどれかに増幅を有する患者より遙かに優れていたが(図４)、このパイロットで選択された１０のアンプリコン中の遺伝子の性質から推測されるように、このプロトコルの一般的な増幅表現型に基づいてＡＣにタキソールを加えることによってもたらされる利点との相関はなかった。
【００２１】
過剰発現を有する２７の候補アンプリコン(表１)について機能的スクリーニングを行なうと、３のアンプリコン(ＨＥＲ２、ｃＭＹＣ及びＨＴＰＡＰ(ＰＰＡＰＤＣ１Ｂとしても知られている))は、他の予後変数を含む多変量解析で試験したとき、標準的化学療法で治療された節陽性乳癌において、個々に予後と関連性を有することが確認された。これら３つのアンプリコンの確認は、３つのＢＡＣｓ(HER2-Path Vysion HER2 Assay(Vysis)、cMYC-LS1 C-MYC(Vysis)及びHTPAP-RP11-513D5)を用いて行われた。なお、当該分野の専門家であれば、同じ遺伝子に対する複数の他のプローブ源についても本発明に利用できることは容易に認識し得るであろう。当該分野の専門家であれば、同じ遺伝子に対するいかなるプローブ源を標識する複数の他の方法についても、本発明に利用できることは容易に認識し得るであろう。これらの方法には、蛍光プローブ標識法及び色素プローブ標識法が含まれる。
【００２２】
ＮＳＡＢＰのＢ−２８トライアルから構築されたＴＭＡに対してＦＩＳＨ法により、これら２７のアンプリコンがスクリーニングされ、補助的節陽性乳癌患者に対して、ランダムに、アドリアマイシン(ドキソルビシン)及びシクロホスファミド(ＡＣ)を４サイクル施し、その後にタキソールを施した(Ｎ＝１９０１)。これは、約５１,３２７のＦＩＳＨアッセイが行なわれたことを意味する(２７×１９０１)。２７のアンプリコンの選択は、次の基準に基づいて行なった：１）選択されたアンプリコンは全て、Pollackらの研究及びHymanらの研究において、乳癌腫瘍又は細胞株に増幅され、コード化された遺伝子の遺伝子発現が中〜高レベルであることが示されたものである［Pollack JR, Sorlie T, Perou CM et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(20):12963-12968; Hyman E, Kauraniemi P, Hautaniemi S et al., Cancer Res 2002; 62(21):6240-6245］。；２）パブリックのゲノム配列マップを調べて、ＦＩＳＨ法で確認されたＢＡＣクローンで、選択されたアンプリコンと最良の対応関係をもつものが選択された。；３）ＨＥＲ２と非常に近い位置にある幾つかのアンプリコン(例えばＭＬＮ６４)を、アッセイの再現性及び有効性の内部制御として含めた(すなわち、ＨＥＲ２とＭＬＮ６４の増幅が、染色体位置の近似性と密接な相関を有するとの推定に基づく)。
【００２３】
増幅状態は、増幅あり(amplified)と増幅なし(not amplified)のカテゴリーに分類され、インサイチューハイブリダイゼーションによる４シグナル(１つの癌細胞核当たり４ドット)より多いものを遺伝子の増幅と規定した。単変量Ｃｏｘ比例ハザードモデルを用いて、臨床転帰(clinical outcome)と相関すると、ＨＥＲ２、ＭＬＮ６４(ＨＥＲ２と非常に近い位置にあって相関性が高い)、ｃＭＹＣ、ＨＴＰＡＰ、ＴＰＤ５２、ＭＡＬ２及びＺＮＦ２１７は、Ｂ−２８トライアルに組み入れられた患者の臨床転帰と有意の相関関係を有することが示された(表１)。さらに、全ての増幅の存在と増幅の数も、臨床転帰と有意の相関関係を有することも示した。スクリーニングされた２７のアンプリコンの各々に対するカプランマイヤープロットは、図５〜図３１に示されている。増幅ありの症例と、増幅なしの症例とを比較するカプランマイヤープロットは、図３２に示されている。
【００２４】
従来の予後マーカー(腫瘍サイズ、陽性節の数、ホルモン受容体の状態及び年齢)を含む多変量解析を行なった。３つのアンプリコン(ＨＥＲ２、ｃＭＹＣ及びＨＴＰＡＰ)(表２参照)は、有意の儘であった。
【００２５】
＜ＨＴＰＡＰ＞
ＨＥＲ２とｃＭＹＣは両方とも、乳癌において予後に関連することは既に示されている。ＨＥＲ２は、ハーセプチンの治療標的である。しかしながら、化学療法で治療された患者におけるそれらの予後予測的役割は、明確に例証されていない。他方では、ＨＴＰＡＰは、ホスファチジン酸ホスファターゼ相同ドメイン及び５'膜貫通ドメインを含有する蛋白、並びに蛋白質が分泌されたことを示すシグナルペプチドに翻訳する新規な遺伝子である(図３３参照)。ＨＴＰＡＰ用のＦＩＳＨプローブ(クローンRP-11-513D5)の生成に用いられた細菌人工染色体クローンは、その中に３種類の遺伝子(ＨＴＰＡＰ、ＷＨＳＣ１Ｌ１及びＤＤＨＤ２)だけを有している。これらの中で、遺伝子増幅と、乳癌細胞株における発現との相関に関する他の研究では、ＨＴＰＡＰは、この領域が増幅されるときに過剰発現するものであることが示されている［Pollack JR, Sorlie T, Perou CM et al., Proc Natl Acad Sci USA 2002; 99(20):12963-12968; Hyman E, Kauraniemi P, Hautaniemi S et al., Cancer Res 2002; 62(21):6240-6245; Ray ME, Yang ZQ, Albertson D et al., Cancer Res 2004; 64(l):40-47］。乳癌における遺伝子発現のマイクロアレイ解析によるデータの検討において、ＨＴＰＡＰの過剰発現は、９４の他の遺伝子を有する乳癌患者の予後不良と関連があることが報告されている［Jenssen TK, Kuo WP, Stokke T, Hovig E.］。乳癌における遺伝子発現と患者の生存との関係が報告されている［Hum Genet 2002; 111(4-5):411-420］。これらの結果は、ＨＴＰＡＰ遺伝子の増幅が、標準的化学療法による治療後でも、乳癌の独立した予後予測因子であることを示している。
【００２６】
ＨＥＲ２及びｃＭＹＣは両方とも、乳癌において予後に関連することは既に示されている。ＨＥＲ２は、ハーセプチンの治療標的である。一方において、ＨＴＰＡＰは、ホスファチジン酸ホスファターゼ・ホモロジードメイン及び５'膜貫通ドメインを含有する蛋白、並びに蛋白質が分泌されたことを示すシグナルペプチドに翻訳する新規な遺伝子である(図３３参照)。
【００２７】
８ｐ１１−１２増幅を有する限定された数の乳癌におけるＨＴＰＡＰの増幅及び過剰発現については、これまでにも、他の研究者によって報告されているが、それらの報告では、増幅領域から過剰発現する他の遺伝子があり、ＨＴＰＡＰはそれら増幅の主たるドライバー遺伝子(driver gene)として特定されていない。ここでは、３種類の遺伝子(その中でＨＴＰＡＰが唯１つの過剰発現遺伝子である)だけを含む比較的小さなＦＩＳＨプローブを使用し、多数の症例を、前向きの単一の臨床的試験で決定された治療でスクリーニングしており、乳癌におけるその他の予後予測因子から独立した予後因子としてその役割を初めて例証するものである。標準的な化学療法の後であっても、増幅され、予後不良と相関を有するため、ＨＴＰＡＰもまた、乳癌に対する重要な治療標的でもある。
【００２８】
ＨＴＰＡＰが乳癌の理想的な治療及び診断標的になるのは、次の特徴を有するからである：１）ＨＴＰＡＰは増幅され、ＦＩＳＨ又はＰＣＲを使用する安定した臨床診断アッセイを、増幅状態を検出するために使用できること；２）ＨＴＰＡＰは、多くの治療を受けた患者における独立した予後因子であること；３）ＨＴＰＡＰは、酵素活性を有する膜貫通蛋白であること；４）ＨＴＰＡＰは分泌されること。
【００２９】
この遺伝子の増幅と予後不良との相関が密接であることは、これらの活性を阻害することが有益な治療効果をもたらすことを意味する(例えば、増幅されている予後因子と同様な特徴を有するＨＥＲ２遺伝子、予後因子、細胞の表面にある受容体など)。
【００３０】
本発明の幾つかの実施例では、ＨＴＰＡＰ蛋白の細胞外ドメインに対して特異性を有するモノクローナル抗体又は一連のモノクローナル抗体を含んでいる。これらの抗体は、単独で、又は化学療法薬若しくはその他標的に対する抗体と共に用いられることができる。そのような抗体の生成は、当該分野で広く知られたモノクローナル抗体のあらゆる生産方法によって行なうことができる。
【００３１】
本発明の幾つかの実施例において、これらの抗ＨＴＰＡＰ抗体は、血清又は血漿又は体液(例えば患者からの乳頭吸引液)中に分泌されたＨＴＰＡＰ蛋白を検出するのに用いられ、治療中の疾病の診断又はモニタリング中の正常レベルと比較された。検出方法は、限定されるものではないが、放射免疫測定法(radioimmunoassay)、フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ又はその他の比色アッセイ等の当該分野で広く知られたあらゆる方法によって実現されることができる。
【００３２】
ホスファチジン酸ホスファターゼドメインは、一般的には、癌細胞内で重要なシグナル伝達分子として作用する。本発明の実施例では、そのような作用を妨げるか又は調節する小分子の発展を標的にする際に、ＨＴＰＡＰ遺伝子のこれらドメインを使用することを含んでいる。さらにまた、ＨＴＰＡＰに対する抗体の使用は、ＨＴＰＡＰに対する下流シグナル伝達分子を同定するために使用されることができ、その後、小分子治療による標的とされることができる。
【００３３】
その他の実施例には、当該分野で広く知られたｓｉＲＮＡ、アンチセンス・オリゴヌクレオチド、又はリボザイム法を使用し、ＨＴＰＡＰ遺伝子活性を阻害することを含んでいる。
【００３４】
ＡＣ又はＡＣＴで治療された節陽性乳癌に関するこのコホート研究において、限界予後予測力(marginal prognostic power)であると考えられるその他遺伝子(ＴＰＤ５２、ＭＡＬ２、ＺＮＦ２１７、ＮＣＯＡ３、ＺＨＸ１、ＢＭ＿００９、ＢＭＰ７及びＳＴＫ６を含む)は、治療を受けていない患者又は節陽性患者に有意の予後予測力をもたらすことができ、それらはさらに、治療発展のための魅力ある標的をもたらす。本発明の幾つかの実施例において、３種類の増幅した遺伝子ＨＥＲ２、ｃＭＹＣ及びＨＴＰＡＰは、乳癌患者の治療法の決定へと案内するための予後指標を作成するのに用いられることができる。その他の実施例は、治療法の決定を誘導する予後指標を作成するために、前記の３種類の遺伝子に臨床的変数を含めることができる。
【００３５】
＜ｃＭＹＣ予測因子＞
ｃＭＹＣ増幅による悪性形質転換が起こった細胞は、ＨＥＲ２増幅の作用によりアポトーシスの運命を脱出できるように思われるが、これはまた、それら細胞を、生存へのＨＥＲ２信号伝達に依存させることになる(図２ｂ)。それゆえ、トラスツズマブによりＨＥＲ２シグナルが阻害されると、そのような癌細胞ではｃＭＹＣのアポトーシス促進作用をトリガすることができる。これは、ＮＳＡＢＰのＢ−３１トライアルの一部として回収された腫瘍試料のレトロスペクティブ分析で検証された。そこでは、ＨＥＲ過剰発現腫瘍を有すると診断された患者がランダムに選ばれ、化学療法又は、化学療法＋ハーセプチンが施された。この分析の結果では、ＨＥＲ２とｃＭＹＣ遺伝子の両方について増幅を有する腫瘍は、トラスツズマブに感受性である(sensitive)。
【００３６】
乳癌における臨床的に重要な遺伝子増幅を同定するために、乳癌で共通して増幅した２７の異なる遺伝子を、ＦＩＳＨを使用してスクリーニングした。前述の如く、１９００人の患者の臨床転帰と、２７の異なる遺伝子／座(loci)の遺伝子増幅の状態との相関を調べる未公開の研究において、ＨＥＲ２、ｃＭＹＣ及びＨＴＰＡＰは、標準的な複合タキサンを含む補助的化学療法の後であっても予後を悪化させる３つの個々に増幅した遺伝子として同定された。さらに、ＨＥＲ２及びｃＭＹＣの両方について増幅を有する症例は、遺伝子の何れか１つの増幅を有する症例より、予後はさらに悪かった。
【００３７】
ＮＳＡＢＰのＢ−３１トライアルを受けた１３４４人の患者のｃＭＹＣの状態を調べ、ＨＥＲ２遺伝子増幅／過剰発現を有する早期乳癌と診断された患者の治療において、トラスツズマブを化学療法に追加したことによる潜在的利点を調べた。商業的に入手したＤＮＡプローブ(Vysis)を用いてｃＭＹＣ遺伝子のコピー数を数えるのに、ＦＩＳＨ法を用いた。この分析では、１０％より多くの細胞についてｃＭＹＣ遺伝子のコピー数が４よりも多い腫瘍は全て、ｃＭＹＣ遺伝子増幅として分類した。ｃＭＹＣ増幅として分類されたのは１３４４人のうち３４４人であった。ＨＥＲ２シグナルがトラスツズマブによって阻害されるとアポトーシス促進シグナルが活性化するため、ｃＭＹＣ増幅を有する腫瘍は、ＨＥＲ２シグナル伝達の阻害に対して感受性であると考えられ、これは、ｃＭＹＣの増幅が無い患者と比べて、ｃＭＹＣ増幅されたコホートでの再発率の顕著な低下をもたらすと考えられる。
【００３８】
ｃＭＹＣ増幅を有するＢ−３１患者の無再発生存は、図３４に示されている。ｃＭＹＣ遺伝子の増幅が無い患者(Ｎ＝９４５)は、化学療法にトラスツズマブが加えられた場合、再発率が３４％低下した(ｐ＝０.０２)。一方、ｃＭＹＣ増幅を有する患者(Ｎ＝３９９)は、化学療法にトラスツズマブが加えられた場合、再発率が７４％低下した(ｐ＜０.０００１)。２つのコホート間のこの差異が統計的に有意かどうかを決定するための相互作用試験に関するＰ値は０.０１４であり、ｃＭＹＣがトラスツズマブ相互作用によることを証明している。予後が極めて悪い状態で開始したにもかかわらず、ＨＥＲ２とｃＭＹＣの２つの増幅を有する腫瘍を持つ患者は、トラスツズマブと化学療法によって、病気はほぼ治癒したことを示している。
【００３９】
トラスツズマブは、ＨＥＲ２過剰発現腫瘍を全て治癒させる訳ではないが、他の標的療法(例えば血管新生の阻害剤)を追加することは有用な場合がある。しかしながら、そのような方法は、毒性が強く、非常に費用がかかる。ｃＭＹＣが増幅した症例では、トラスツズマブに対して感受性であるゆえに、(トラスツズマブ以外の)追加の治療法を用いるべきではない。それゆえ、本願発明の１つは、他の標的療法をトラスツズマブに追加することを求める患者をスクリーニングすることである。さらにまた、本発明は、癌患者のｃＭＹＣ及びＨＥＲ２の増幅状態を判定する方法を含んでいる。本発明の効果は、ｃＭＹＣのアポトーシス促進作用の活性化による間接的なものであるから、本発明は他のＨＥＲ２標的療法にも適用することができる。換言すれば、本発明は、トラスツズマブと、患者のｃＭＹＣ及びＨＥＲ２状態に基づく他の材料とを用いて、患者の治療法を決定する方法及び患者を治療する方法を含んでいる。
【００４０】
他の実施例において、本発明は、ＨＥＲ２増幅無しのｃＭＹＣ増幅腫瘍におけるｃＭＹＣのアポトーシス促進作用を引き出すことに適用されることができる。ｃＭＹＣ活性を直接阻害するのではなく、ｃＭＹＣのプロアポトーシス促進作用の活性化によって生存シグナルを阻害する間接的な方法により、そのような腫瘍を、プログラムされた細胞死に至らしめることができるであろう。
【００４１】
本発明において、ｃＭＹＣに対する試験は、ＦＩＳＨ法、定量的ポリメラーゼ連鎖反応、免疫組織化学法又は均質化された腫瘍組織における他の免疫学的検出法等のどれかの方法によって行なうことができ、例えば、ＨＥＲ２、ｃＭＹＣ、ＨＴＰＡＰ及び参照遺伝子が入れられた単一チューブの「リアルタイム」定量的ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)アッセイがあり、それら３種類の遺伝子の増幅の存在を同時に検出し、トラスツズマブ又はその他のＨＥＲ２標的治療に対する反応の予測と予後情報を提供するものであって、そのようなアッセイの結果に基づいて患者を治療する方法も含まれる。他の実施例において、本発明は、ＨＥＲ２増幅が無いｃＭＹＣ増幅腫瘍において、ｃＭＹＣのアポトーシス促進作用を引き出すのに適用されることができる。ｃＭＹＣ活性を直接阻害するのではなく、ｃＭＹＣ活性を直接阻害するのではなく、ｃＭＹＣのプロアポトーシス促進作用の活性化によって生存シグナルを阻害する間接的な方法により、そのような腫瘍を、プログラムされた細胞死に至らしめることができるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１ａ】アポトーシススイッチとしてのｃＭＹＣの概略説明図である。
【図１ｂ】増殖スイッチとしてのｃＭＹＣの概略説明図である。
【図１ｃ】ＨＥＲ２からのアポトーシス抑制シグナルの概略説明図である。
【図２】治療標的を同定する方法を説明するフローチャートである。
【図３】クラスタリング研究の結果を示す図である。
【図４】増幅による再発を示す図である。
【図５】ＡＰＰＢＰ２に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図６】ＢＭＰ７に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図７】ｂｍ＿００９に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図８】ＣＡＣＮＢ１に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図９】ｃｈｋに関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図１０】ｃ＿ｍｙｃに関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図１１】ｃｙｃｌｉｎｄ１に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図１２】ｄｅｃｒ１に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図１３】ＦＬＪ １０７８３に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図１４】ＧＲＯ１に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図１５】ＧＲＢ２に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図１６】ＨＢＳ１Ｌに関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図１７】ＨＥＲ２に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図１８】ＭＡＬ２に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図１９】ＨＴＰＡＰに関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図２０】ＭＬＮ６４に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図２１】ＭＲＰＳ７に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図２２】ＰＰＭ１Ｄに関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図２３】ＮＣＯ４３に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図２４】ＲＰＳ６ＫＢ１に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図２５】ＳＥＢ４Ｄに関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図２６】ｓｔｋ６に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図２７】ＳＩＰ２＿２８に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図２８】ＴＰＤ５２に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図２９】ＴＲＡＦ４に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図３０】ＺＮＦ２１７に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図３１】ＺＨＸ１に関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図３２】あらゆるアンプリコンに関するカプランマイヤープロットを示す図である。
【図３３】ＨＴＰＡＰ遺伝子を示す図である。
【図３４ａ】無再発生存期間を示す図である。
【図３４ｂ】無再発生存期間を示す図である。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４ａ】
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【図３４ｂ】
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【国際調査報告】
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