(57)【要約】本発明は下記式の、MyD88の特定のタンパク質部分を模倣し、そのホモ二量体化を防ぎ、そのTIR ドメインとの相互作用を干渉する、ペプチド性およびペプチド模倣化合物に関する：(X-) AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7［式中、可変性の基は明細書中に定義の通り］。本発明はまた、該化合物の調製方法、それを含む医薬組成物およびその、特に炎症性および自己免疫疾患の治療のための医薬としての使用も提供する。
2008524167.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式 (I)のペプチド性および/またはペプチド模倣化合物： 
(X-) AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7
(I)
［式中:
X- は、 医薬上許容される酸のアニオン、または非存在;
基 AA1 - AA7のそれぞれは、同一であっても異なっていてもよく、以下の意味を有するアミノ酸またはアミノ酸模倣体:
AA1 = L-アルギニン (Arg)、D-アルギニン (arg)、L-ヒスチジン (His)、D-ヒスチジン (his)の残基、またはアルギニノ模倣体基、ここでアルギニノ模倣体とはアルギニンを置換し、官能基の塩基性度を、アルギニンの塩基性度から塩基性度０に調節する、式 (II)、(III)および (IV)の化学構造である：
【化１】
2008524167.tif 000057
(II)
【化２】
2008524167.tif 000058
(III)
【化３】
2008524167.tif 000059
(IV)
または非存在;
AA2 = L-アスパラギン酸 (Asp)、D-アスパラギン酸 (asp)、L-アスパラギン (Asn)、D-アスパラギン (asn)、グリシン (gly または Gly)、または非存在;
AA3 = L-バリン (Val)、D-バリン (val)、アザバリン (Aza-Val)、アザグリシン (Azagly)、アザロイシン (AzaLeu) ;
AA4 = L-ロイシン (Leu)、D-ロイシン (leu)、L-バリン (Val)、D-バリン (val)、L-システイン (Cys)、D-システイン (cys)、アザロイシン (Aza-Leu)、アザバリン (Aza-Val); アザグリシン (Azagly);
AA2 - AA3 - AA4は共にスペーサーによって置換されていてもよく、ここでスペーサーとは、回転自由度が制限された数であって様々に置換および官能化された芳香族リンカー環を含み、１つのカルボン酸基のみと１つの一級アミン基のみが、アミド結合に関与している、式 (V)の疎水性化学構造である:
【化４】
2008524167.tif 000060
(V)
AA5 = L-プロリン (Pro)、D-プロリン (pro)、シス-4,5-(メタノ)-L-プロリン (cMe-Pro)、シス-4,5-(メタノ)-D-プロリン (cMe-pro)、トランス-4,5-(メタノ)-L-プロリン (tMe-Pro)、トランス-4,5-(メタノ)-D-プロリン (tMe-pro);
AA6 = グリシン (gly またはGly)、サルコシン (Sar)、アザグリシン (Azagly);
AA5 - AA6 は共にβ-ターン模倣体によって置換されていてもよく、ここでβ-ターン模倣体とはPro-Gly β-ターンの中央部分を模倣することにより、分子がタンパク質 MyD88との結合の形成に有用な立体構造を取ることを可能にする、式 (VI)および(VII) の化学構造である：
【化５】
2008524167.tif 000061
(VI)
【化６】
2008524167.tif 000062
(VII)
AA7 =グリシン (glyまたはGly)、アザグリシン (Azagly)、L-スレオニン (Thr)、D-スレオニン (thr)、L-システイン (Cys)、D-システイン (cys)の残基、または非存在;
AA4 = AA7 = Cysまたは cysである場合、２つのシステインの間にジスルフィド結合が存在する;
AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6および AA7 の一部または全部がアミノ酸である場合、それらはLまたはDのいずれでもよく、配列は逆転していてもしていなくてもよい;
AA1-AA7 残基の間の結合は常にアミド型である; 
末端アミン基は遊離であってもよく、分子の輸送に有用な医薬上許容されるラジカル、例えば、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、プロピオニル、シクロヘキシル、ミリストイルによってアシル化されていてもよい; 末端カルボキシルはカルボン酸または一級アミドのいずれの形態であってもよい：
ただし以下を条件とする:
少なくとも１つの AA1-AA7 は上記の天然アミノ酸ではない、または
すべてのAA1-AA7 が上記の天然アミノ酸である場合、該AA1-AA7 配列は逆転している］、その個々のエナンチオマー、ジアステレオアイソマー、その混合物およびその医薬上許容される塩。
【請求項２】
該アルギニノ-模倣体が、アルギニンを置換し、官能基の塩基性度をアルギニンの塩基性度から塩基性度０に調節する化学構造である請求項 1の化合物。
【請求項３】
該スペーサーが、回転自由度が制限された数であり、様々に置換および官能化された芳香族リンカー環を含み、１つのみのカルボン酸基と１つのみの一級アミン基がアミド結合に関与している疎水性化学構造である、請求項 1の化合物。
【請求項４】
該β-ターン模倣体が、分子がタンパク質 MyD88との結合の形成に有用な立体構造を取ることを可能にする化学構造である、請求項 1の化合物。
【請求項５】
AA1においてアルギニノ模倣体が以下からなる群から選択される請求項 1または2の化合物：
【化７】
2008524167.tif 000063
［式中、Aは直鎖または分枝鎖 C1-C4 アルキル 基; AlはF、Cl、BrおよびIから選択されるハロゲン 原子］。
【請求項６】
AA2- AA3- AA4 がスペーサー (SPX)n で置換されており、n = 0-3であり、以下からなる群から選択される請求項1〜 3のいずれかの化合物：
【化８−１】
2008524167.tif 000064
【化８−２】
2008524167.tif 000065
［式中、Aは直鎖または分枝鎖 C1-C4 アルキル 基; AlはF、Cl、BrおよびIから選択されるハロゲン 原子］。
【請求項７】
該β-ターンが以下からなる群から選択される請求項1〜4のいずれかの化合物。
【化９】
2008524167.tif 000066
【請求項８】
式 
Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH2 
を有する請求項 1の化合物。
【請求項９】
以下からなる群から選択される請求項 1の化合物。
【化１０−１】
2008524167.tif 000067
【化１０−２】
2008524167.tif 000068
【請求項１０】
AA5 - AA6がβ-ターン模倣体で置換されている請求項 1の化合物。
【請求項１１】
式
【化１１】
2008524167.tif 000069
を有する請求項 10の化合物。
【請求項１２】
AA2 - AA3 - AA4がスペーサーで置換されており、 AA5 - AA6がβ-ターン模倣体で置換されている請求項 1の化合物。
【請求項１３】
以下からなる群から選択される請求項 12の化合物。
【化１２】
2008524167.tif 000070
【化１３】
2008524167.tif 000071
【化１４】
2008524167.tif 000072
【請求項１４】
AA1がアルギニノ模倣体であり、AA5 - AA6がβターン模倣体で置換されている請求項 1の化合物。
【請求項１５】
式
【化１５】
2008524167.tif 000073
を有する請求項 14の化合物。
【請求項１６】
AA1がアルギニノ- 模倣体であり、AA2-AA3-AA4 がスペーサーで置換されている請求項1の化合物。
【請求項１７】
以下からなる群から選択される請求項 16の化合物。
【化１６】
2008524167.tif 000074
【請求項１８】
AA1がアルギニノ模倣体であり、AA2-AA3-AA4がスペーサーで置換されており、AA5-AA6がβターン模倣体で置換されており AA7がアミノ酸である、請求項 1の化合物。
【請求項１９】
式
【化１７】
2008524167.tif 000075
を有する請求項 18の化合物。
【請求項２０】
AA2-AA3-AA4がスペーサーで置換されている請求項 1の化合物。
【請求項２１】
式
【化１８】
2008524167.tif 000076
を有する請求項 20の化合物。
【請求項２２】
１以上のアミノ酸が１以上のアザ-アミノ酸で置換されている請求項 1の化合物。
【請求項２３】
以下からなる群から選択される請求項 16の化合物:
H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH2 
Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2 
Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH2 
Ac-thr-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2 
Ac-Arg-Asp-Val-AzaVal-Pro-Gly-NH2 
Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH2。
【請求項２４】
そのTIR ドメインとの相互作用に干渉することによってタンパク質のホモ二量体化を防ぐ、MyD88の特定のタンパク質部分の模倣体としての請求項1-23のいずれかの化合物の使用。
【請求項２５】
医薬としての請求項1-23のいずれかの化合物。
【請求項２６】
TLR/IL-R1 受容体系のシグナル伝達系の調節不全に起因する疾患の治療に有用な医薬の調製のための請求項1-23のいずれかの化合物の使用。
【請求項２７】
該疾患が、炎症性および自己免疫疾患、心血管およびアテローム生成疾患、敗血症およびショック、移植片拒絶、癌およびウイルス感染症からなる群から選択される、請求項 26の使用。
【請求項２８】
該炎症性および自己免疫疾患が、関節炎、痛風性関節炎、慢性炎症性腸疾患 (IBD)、乾癬、1型糖尿病、多発性硬化症、喘息および全身性エリテマトーデスからなる群から選択される、請求項 27の使用。 
【請求項２９】
該心血管およびアテローム生成疾患が、心筋梗塞、ウイルス性心筋炎、アテローム性動脈硬化症、静脈移植アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、ステントによる再狭窄および血管形成術による再狭窄からなる群から選択される、請求項 27の使用。 
【請求項３０】
請求項1-23 の少なくとも１つの 化合物を少なくとも１つの医薬上許容される媒体および/または賦形剤と混合して含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、MyD88の特定のタンパク質部分を模倣し、そのホモ二量体化を防ぎ、そのTIRドメインとの相互作用に干渉するペプチド性およびペプチド模倣化合物に関する。
【０００２】
本発明は、該化合物の調製方法、それを含む医薬組成物およびその特に炎症性および自己免疫疾患の治療のための医薬としての使用を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
炎症反応は通常防御的性質を有する反応であり、物理化学的傷害および感染性攻撃に起因する損傷を区別し、その結果それを根絶するために生物によって活性化される。しかし場合によっては、刺激の持続による急性炎症性現象が、炎症性活性化過剰状態に発展することもあり、それは慢性となる傾向があり、その結果、正常の周囲組織の自己破壊がしばしば起こる。この工程は、接着分子の誘導の上昇、病原性傷害の部位における炎症性細胞要素の遊出およびその結果としての一連の炎症性メディエーターの放出に起因する (Shanley、T.P.、et al.; Mol. Med. Today、40-45、1995)。
【０００４】
様々なメディエーターの転写配列および可能性のある産生は、転写因子またはTFとして知られている特定のタンパク質因子の制御下にある(Mueller、C. W.; Curr. Opin. Struct. Biol.、11:26-32、2001)。これら因子は、いったん活性化されると、DNAに存在する特定のコンセンサス領域に結合し、炎症性物質の遺伝子発現の誘導または上方制御(overregulation)のための分子スイッチとして作用する。
【０００５】
様々な炎症性条件に関与しているという理由でもっともよく研究されている転写因子は、疑いなく因子NF-κBであり、これは、炎症誘発性サイトカイン (TNF、IL-1、IL-2、IL-6、IL-11、IL-17、GM-CSF)、ケモカイン (IL-8、RANTES、MIP-1α、MCP-2)、接着分子(ICAM-1、VCAM-1、E-セレクチン)および炎症性メディエーターを産生する酵素(iNOSおよびCOX2) をコードする様々な遺伝子のエンハンサーについてのコンセンサス配列を認識する(Ghosh、S.、et al.; Annu. Rev. Immunol.、16: 225-260、1998)。
【０００６】
様々な種類の損傷を与える刺激に応答して、NF-κB 活性化は免疫応答に関与するほとんどすべての細胞、即ち、好中球、マクロファージ、リンパ球および内皮、上皮および間葉系細胞において観察される。NF-κBの、即時の一過性の活性化はそれゆえ、病原性損傷の正常な生理応答の機能において最重要の特性を構成する。にもかかわらず、過剰の、持続性の活性化という形態で現れるこの細密な機構の調節不全は、慢性炎症性疾患に密接に関与していることが判明した(Barnes、P. J. and Karin、M.; New Engl. J. Med.、336: 1066-1071、1997)。
【０００７】
慢性炎症性疾患の誘発においてNF-κBにより発揮される重要な役割により、この因子は標的化治療的介入に好適な治療標的となっている。
【０００８】
「抗-NF-κB」 治療の安全性が考慮される場合において、非特異的副作用と、NF-κBの固有の抑制に直接起因しうる作用の間の区別がなされなければならない。後者は、正常な細胞の生理応答と関連する多数のシグナルが収束する臨界点を構成するため、長期の全般性(generalised)かつ全身性のNF-κBの阻害が望ましくない有害作用をもたらしうると予測することはもっともである。かかるアンタゴニストの治療への応用のために、有効な治療を可能とする一方で同時に望ましくない作用を可能な限り最小にする物質を同定する必要があるという証拠があると考えられる。
【０００９】
潜在的 NF-κB アンタゴニストの設計において非常に重要なパラメーターはそれゆえ作用の選択性にある。
【００１０】
さらに、近位の炎症性シグナル伝達系に干渉することによってNF-κBを阻害することが出来る薬剤は、より遠位の生化学的事象に作用する他の薬剤よりもより安定であろうと予測される。
【００１１】
IL-1の結合をもたらし、転写因子、例えばNF-κBおよびAP-1の活性化を導く分子現象は、複数のタンパク質因子の順次の活性化を基礎とする増幅カスケードを介して起こる。
【００１２】
具体的には、IL-1の結合は受容体ヘテロ複合体 IL-1R/1L-1RacPの形成を誘導し、それは次いでアダプタータンパク質 MyD88を動員する。IL-1RおよびIL-1RAcPの細胞質内ドメインは、それぞれのTIR ドメインの間に起こる同種親和性型の相互作用を介してMyD88と相互作用するということは強調に値する。MyD88のカルボキシ末端部分(TIR ドメイン)は MyD88の受容体ヘテロ複合体とのドッキングの原因であるが、アミノ末端部分 (デスドメイン)のキナーゼ IRAKのデスドメインとの(この場合も、同種親和性型の相互作用を介する)相互作用により、後者のヘテロ複合体への動員が可能となり、それはそのリン酸化が起こる部位である。リン酸化が起こった後、IRAKは複合体から脱離し、アダプタータンパク質 TRAF6と相互作用した後、プロテアソーム(proteosome)において分解すると考えられている。 TRAF6は次いで、キナーゼ TAK1の活性化を導き、それは自己リン酸化し、次いでキナーゼMAP2KおよびNIK (NF-κB Inducing Kinase)を活性化する。最終的な結果は、MAP2KおよびNIKが、重要な炎症性メディエーターをコードする遺伝子の転写に関与する転写因子 AP1およびNF-κBの活性化をそれぞれもたらすこととなる。
【００１３】
最近行われた研究により、IL-1R/TLR スーパーファミリーに関する共通の伝達機構の存在に関する仮説が支持された。効果的にいえば、IL-1により活性化されるシグナル伝達機構が、IL-18およびLPSのシグナル伝達においても作用しているということが示された(O'Neill、LAJ and Dinarello、CA; Immunology Today、21(5):206-209、2000)。
【００１４】
具体的には、アダプタータンパク質 MyD88がIL-1、IL-18およびLPSによりトリガーされる伝達現象において重要な役割を果たしているということが示された。実際、MyD88 KOマウスは、完全に生存可能なことが判明しているが、LPSによる刺激に応答する正常な能力を欠いているということが報告されている (Kawai、T.、et al.; Immunity、11: 115-122、1999)。
【００１５】
これらの結果はさまざまな実験設定において確認されており、MyD88の機能的に活性の二量体の形成を防ぐMyD88のF56N 点突然変異はNF-κB 転写因子の活性化を誘導しないことが示されている(Burns K et al.、J Biol Chem 273(20): 12203-12209、1998)。
【００１６】
さらなる研究(Adachi、O.、et al.; Immunity、9: 143-150、1998) により、MyD88 KOマウスはIL-1またはIL-18による刺激に応答しないということがさらに確立された。実際、これらKOマウスの胸腺細胞および脾臓細胞は、IL-1により刺激された場合に正常な増殖応答を活性化しないことが観察されている。さらに、IFN-γの産生およびNK 細胞活性は、野生型マウスの場合と異なり、IL-18による刺激の結果上昇しない。
【００１７】
上述の知見に基づくと、MyD88が、様々な異なる炎症性刺激、例えば、 IL-1、IL-18、IL-1R ファミリーのアゴニストおよびTLR ファミリーのアゴニスト、例えば、LPS、によりトリガーされるNF-κBの活性化に重要な役割を果たしていることは明らかである(Takeuchi、O. and Akira、S.; Curr. Top. Microbiol. Immunol.、270:155-67、2002)。
【００１８】
炎症性サイトカインのシグナル伝達に拮抗するのに現在用いられているアプローチの目的は、特異的モノクローナル抗体、受容体アンタゴニストまたは可溶性受容体を使用することにより、それらのそれぞれの活性を特異的に中和することであった。明白な目的は、サイトカインの関連する膜受容体への結合を外側から選択的に防ぐことであった。
【００１９】
しかし、もっとも最近の文献は、細胞質アダプタータンパク質に媒介される細胞内シグナル伝達の阻害に基づく実験アプローチの採用は有効な革新的戦略であり得るということを示唆している (L.A.J. O'Neill and C.A. Dinarello; Immunol. Today、21:206-209、2000; M. Muzio、et al.; J. Leukoc. Biol.、67:450-456、2000; J. M. Schuster and P.S. Nelson; J. Leukoc. Biol.、67:767.773、2000)。
【００２０】
それゆえ、異なるリガンドを認識するが同じ伝達経路を共有する細胞膜の外側表面に存在する受容体からのシグナルにトリガーされるNF-κBの活性化に関与するアダプタータンパク質 、例えば、 MyD88の阻害は、原理的には個々のリガンド活性の阻害よりも有効であることが判明している。
【００２１】
受容体 IL-1R/TLRおよびMyD88のTIR ドメインの一次配列のアラインメントにおいて、保存されている一つの領域は第二ベータ鎖と第二アルファヘリックスとの間のループ (BB ループ)にあり、そのコンセンサス配列はRDXφ1φ2GXであり、ここでXはいずれのアミノ酸でもよく、φ1φ2は２つの疎水性アミノ酸であり; 具体的には、φ2 はプロリンであるが、ただし、IL-1RIではそれはバリンである。TLR4における突然変異R677->E、P681->HおよびG682->Vは、シグナル伝達を破壊することが知られている;さらに、受容体 TLR2およびP681->Hに突然変異したTLR2の細胞質内 TIR ドメインの結晶学的座標を比較すると、ループまたはそれに隣接する領域に影響を与える構造変化はない(Nature、2000、Vol. 408,111)。この領域はそれゆえアダプタータンパク質/ 受容体相互作用インターフェイスとして関与している可能性がある。それゆえこの領域もMyD88のホモ二量体形成に重要であると考えられる。
【００２２】
これに関して、Rebek et al.. (Bartfai、T.、et al.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA、100:7971、2003)により行われた研究も知られており、それは細胞内 TIR ドメインのレベルでMyD88/IL1-RI 相互作用に干渉することができるペプチド模倣化合物の潜在的適応性を示したものである; 様々なtoll 受容体およびMyD88のホモログにおいて (F/Y)-(V/L/I)-(P/G)をそのコンセンサス配列として有するBB ループの中央部分の模倣体は、 IL-1βに刺激されたEL4 細胞株におけるタンパク質 キナーゼ p38のリン酸化をインビトロで阻害することができるだけでなく、マウス 組換えIL-1βを注射されたマウスにおける熱性応答をインビボで有意に減弱することができる。この化合物は、しかし、MyD88/TLR4 相互作用の阻害には有効ではない。 
【００２３】
当業者であれば単一のMyD88/受容体相互作用を阻害するのではなく、アダプタータンパク質のホモ二量体化を阻害し、より多数の炎症誘発性シグナルの阻害をもたらし得、したがって治療的により有効である化合物を歓迎するであろう。
【００２４】
さらに、Yale University、CT、USA (WO 02/090520 A2)による最近の特許発明ではTLR4連結(ligation)に応答したMyD88-非依存性シグナル伝達に拮抗するためのTIRAP ポリペプチドの使用を請求項として記載している。
【００２５】
TIRAP は、Medzhitov (Horng、T.、Barton、G.M.、and Medzhitov、R.; Nat. Immunol. 2:835-841、2001)およびO'Neill (Fitzgerald、K.A.、Palsson-McDermott、E.M. et al.; Nature 413:78-83、2001)によって独立に同定されたToll/IL-1 受容体 (TIR) ドメインを含む新規タンパク質である。TIRAP はMyD88-非依存性 NF-kB 活性化に関与しているという最初の期待にもかかわらず、続く研究により、TIRAPはMyD88-非依存性経路に関与しているのではなく、むしろTLR2およびTLR4によって惹起されるMyD88-依存性シグナル伝達経路におけるアダプターとして作用していることが判明した (Yamamoto、M.、Sato、S.、Hemmi、H.; Nature 420:324-329、2002)。実際、同じ研究者らはTrifと称されるさらなるアダプターが、NF-kB のMyD88-非依存性活性化に実際に関与していることを見いだした(Yamamoto、M.、Sato、S.、Hemmi、H. et al.; Science 301、640-643)。現在入手可能な証拠は、すべてのTLRは、唯一TLR3を除き、MyD88を利用していることを示唆する(Takeda、K. and  Akira、S.; Int Immunol. 17:1-14、2005)。Dunne et al.はTIRAPおよびMyD88とTLR2およびTLR4との相互作用についての綿密な研究を行い、TIRAPおよびMyD88は実際にTLR2およびTLR4の異なる領域に結合していることを示した (Dunne、A.、Ejdeback、M.、Ludidi、P.L. et al.; J Biol Chem 278:41443-41451、2003)。
【００２６】
再び、当業者であればTLR2およびTLR4のシグナル伝達にのみ関与する単一の MyD88/受容体相互作用またはアダプター (TIRAP)を阻害するのではない化合物を歓迎するであろう。むしろ、既知のすべての TLR (TLR3は除く)からのシグナル伝達に関与する単一のボトルネックアダプター (MyD88) の阻害がより多数の炎症誘発性シグナルに拮抗すると考えられ、したがってより治療的に有効となるであろう。
【００２７】
文献において現在入手可能な情報に基づくと、TLR/IL-1R 受容体系のシグナル伝達の調節不全に由来する多数の疾患としてはこれらに限定されないが、以下が含まれると考えられている:
【００２８】
- 炎症性および自己免疫疾患、例えば、関節炎、痛風性関節炎、慢性炎症性腸疾患 (IBD)、乾癬、1型糖尿病、多発性硬化症、喘息、および全身性エリテマトーデス (例えば、Sabroe、I.、et al.; J. Immunol.; 171:1630-5、2003; Liu-Bryan R et al. Arithritis Rheum. 52:2936-46、2005; Joosten、LA、et al.; J Immunol.、171:6145-53、2003; Sabroe、I.、et al.; Clin. Exp. Allergy、32:984-9、2002; Lehnardt、S.; Proc. Natl. Acad. Sci. USA、100:8514-9、2003; Choe、JY、et al.; J. Exp. Med.、197:537-42、2003; Sabroe、I.; Thorax、59:81、2004; Bellou、A.; Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol.、3:487-94、2003; O'Neill、LA; Curr. Opin. Pharmacol.、3:396-403、2003; Schon、M.、et al.; Clin. Exp. Immunol.、123:505-10、2001; Leadbetter、EA et al.; Nature、416:603-7、2002; Rifkin、IR et al.; Immunol Rev. 204:27-42、2005を参照)。
【００２９】
- 心血管およびアテローム生成疾患、例えば、心筋梗塞、ウイルス性心筋炎、アテローム性動脈硬化症、静脈移植(vein graft)アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、ステントによる再狭窄および血管形成術による再狭窄 (例えば、de Kleijn、D.、and Pasterkamp G.; Cardiovasc Res.、60:58-67、2003; Oyama、J.-I.、et al.; Circulation、109: 784- 789、2004; Satoh、M.、et al.; Lab. Invest.、84:173-81、2004; Thomas、JA、et al.; Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol.、285:H597-606、2003); Fairweather、D.、et al.; J. Immunol.、170:4731-7、2003; Kiechl、S.、et al.; Ann. Med.、35:164-71、2003; Edfeldt、K.、et al.; Circulation、105:1158-1161、2002; Arditi et al.、US20030148986を参照)。
【００３０】
- 敗血症およびショック (例えば、Read、RC.、and Wyllie、DH.; Curr. Opin. Crit. Care; 7:371-5、2001; Carrillo-Esper、R.; Cir. Cir.、71:252-8、2003; Knuefermann、P.; Chest、121: 13291336、2002; Knuefermann、P.、et al.; Circulation,106: 2608-2615、2002を参照)。
【００３１】
- 移植片拒絶 (例えば、Goldstein、DR.、et al.; J. Clin. Invest.、111:1571-1578、2003; Belperio、J.A.; Am. J. Respir. Crit. Care Med.、168: 623624、2003を参照)。
【００３２】
- 癌 (例えば、Huang、B、et al.; Cancer Res. 65: 5009-14、 2005を参照)。
【００３３】
- ウイルス感染症( 例えば、Bafica、A. et al.; J Immunol. 172:7229-34、2004; Equils、O.、et al.; J Immunol 170:5159-5164、2003; Scheller、C. et al.; J Biol Chem 279:21897-21902、2004; Sundstrom、J.B. et al.;  J Immunol 172:4391-4401、2004を参照)。
【００３４】
Cedars-Sinai Medical Centerが出願人である米国特許出願20030148986には、タンパク質 MyD88の発現または生理活性を阻害する様々な方法が記載されている。これらはまた、タンパク質のシグナル伝達を防ぐペプチド模倣体剤の使用を含む。この阻害はTLR-4 受容体に結合し、それによってMyD88との結合を防ぐ小さいペプチド(10-20 アミノ酸)により達成される。MyD88を小さいオーバーラップするセグメント (およそ 10-20 アミノ酸)に分けて、それらのいずれがTLR-4 受容体への結合によるMyD88 細胞シグナルの伝達を防ぐのかを試験することができる。分けた後、セグメントを複製し、セグメントが 、TLR-4 受容体に結合し、MyD88の結合および細胞シグナル伝達を防ぐ、MyD88の少なくとも一部分を含むのかを試験し、判定する。ペプチドの具体例はこの文献に記載されていない。
【００３５】
本発明者らはMyD88のホモ二量体化の阻害に関する予備的研究をBB ループのコンセンサス配列を含む一連の天然ペプチド(N末端におけるアセチルアミドおよびカルボキシル末端における一級アミドとして合成した)に対する免疫共沈アッセイを用いて行った。表1 は活性であると判明したペプチドおよび非処理タンパク質のパーセンテージとしてMyD88 ホモ二量体においてみられる残余の相互作用を示す。タンパク質 myc-MyD88をHEK293 細胞において一時的に発現させ抗-myc 抗体による免疫沈降により細胞抽出物から単離する。免疫沈降したタンパク質を精製タンパク質 GST-MyD88TIR とともに60分間4℃で合成ペプチドの存在下または非存在下でインキュベートする(終濃度 200 μM)。好適な洗浄の後、免疫沈降に用いた樹脂に吸着したタンパク質をSDSで可溶化し、ウエスタンブロットでmyc-MyD88およびGST-MyD88TIRの存在について分析する。NF-kB 活性化のパーセンテージ阻害もこれら２つのペプチドについて示す。 
【００３６】
表1
【表１】
2008524167.tif 000003
【００３７】
さらに、配列 RQIKIWFQNRRMKWKK (ペネトレイチン(penetratin)) であるショウジョウバエのアンテナペディア (Ap) タンパク質の断片と結合したペプチド ST2348 (Ap-MyD88=ST2345) (Gari、J.、and Kawamura、K.; TRENDS in Biotechnology、19:21-28、2001)は、IL-1αで刺激されたHeLa 細胞におけるNF-κB 活性化を阻害することができることが判明した。一方、対応するスクランブルしたペプチド (ST2403 Ap-PTDLVRG-NH2)は不活性である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３８】
本発明の目的は、そのTIR ドメインとの相互作用に干渉することによって、タンパク質のホモ二量体形成を防ぐ、MyD88の特定のタンパク質部分の模倣体を同定することである。このアプローチにより、それがアダプタータンパク質としての役割を果たすIL-1R/TLR 受容体のそれぞれにMyD88を動員することを回避できるようになる。
【００３９】
本発明により提供される分子は慢性炎症性疾患の治療用医薬として有用であり、IL-1R/TLR 受容体に媒介されるNF-kB 活性化を調節することが出来る。
【００４０】
MyD88のTIR ドメインのコンセンサスペプチドの模倣体を構築する戦略を以下に記載する:
MyD88のTIR ドメインのコンセンサスペプチドのH-Arg-Asp-Val-Leu-Pro-Gly-Thr-OH 構造を以下からなる３つの異なる部分に細分する:
a)アミノ酸Arg-Aspからなる荷電部分、
b)アミノ酸Val-Leuからなる疎水性部分、
c)アミノ酸Leu-Pro-Gly-Thrからなるβターン部分。
【００４１】
これら部分のそれぞれについて特定のタイプの模倣体を選択してコンセンサスペプチド配列においていずれかまたはすべてを(alternatively or simultaneously)置換し、３つの群の間の機能的リンカー基としてアミド結合を維持する:
a) Arg 基をより多く考慮し、それをアルギニノ模倣体基で置換し、ここで、アルギニノ模倣体とは、アルギニンが置換された場合、官能基の塩基性度をアルギニンの塩基性度から塩基性度０に調節する化学構造である。
b)アルギニンとプロリンとの間の距離を考慮し、それをスペーサーで満たし、ここで、スペーサーとは、 回転自由度が制限された数であり、様々に置換され、官能化された芳香族リンカー環を含む疎水性化学構造であって、１つのみのカルボン酸基と１つのみの一級アミン基がアミド結合に関与している化学構造である。
c) Pro-Gly β-ターンの中央部分を考慮し、それをβ-ターン模倣体で置換し、ここでβ-ターン模倣体とは、Pro-Gly β-ターンの中央部分を模倣することによって、分子が、タンパク質 MyD88との結合の形成に有用な立体構造を取ることを可能にする化学構造である。
【課題を解決するための手段】
【００４２】
発明の概要
このたび、以下に記載するペプチド性および/またはペプチド模倣化合物がMyD88の特定のタンパク質部分を模倣し、そのホモ二量体化を防ぎ、そのTIR ドメインとの相互作用に干渉することができるということが見いだされた。
【００４３】
本発明の対象は式 (I)を有するペプチド性および/またはペプチド模倣化合物、その個々のエナンチオマー、ジアステレオマー、混合物およびその医薬上許容される塩である：
(X-) AA1-AA2-AA3-AA4-AA5-AA6-AA7
(I)
［式中:
X- は、医薬上許容される酸のアニオン、または非存在;
基 AA1 - AA7のそれぞれは、同一であっても異なっていてもよく、以下の意味を有するアミノ酸またはアミノ酸模倣体:
AA1 = L-アルギニン (Arg)、D-アルギニン (arg)、L-ヒスチジン (His)、D-ヒスチジン (his) 残基、またはアルギニノ模倣体基または非存在、ここで、アルギニノ模倣体とは、アルギニンを置換し、官能基の塩基性度を、アルギニンの塩基性度から塩基性度０に調節し、式(II)、(III)および(IV)を有する化学構造である：
【化１】
2008524167.tif 000004
(II)
【化２】
2008524167.tif 000005
(III)
【化３】
2008524167.tif 000006
(IV)
;
AA2 = L-アスパラギン酸 (Asp)、D-アスパラギン酸 (asp)、L-アスパラギン (Asn)、D-アスパラギン (asn)、グリシン (glyまたはGly)、または非存在;
AA3 = L-バリン (Val)、D-バリン (val)、アザバリン (AzaVal)、アザグリシン (Azagly)、アザロイシン (AzaLeu) ;
AA4 = L-ロイシン、D-ロイシン、L-バリン (Val)、D-バリン (val)、L-システイン (Cys)、D-システイン (cys)、アザロイシン (AzaLeu)、アザバリン (AzaVal)、アザグリシン (Azagly);
AA2 - AA3 - AA4はともにスペーサーによって置換されていてもよく、ここでスペーサーとは、様々に置換および官能化された芳香族リンカー環を含み、回転自由度が制限された数の疎水性化学構造であって、１つのみのカルボン酸基および１つのみの一級アミン基がアミド結合に関与している、式 (V)を有する化学構造である:
【化４】
2008524167.tif 000007
(V)
AA5 = L-プロリン (Pro)、D-プロリン (pro)、シス-4,5-(メタノ)-L-プロリン (cMe-Pro)、シス-4,5-(メタノ)-D-プロリン (cMe-pro)、トランス-4,5-(メタノ)-L-プロリン (tMe-Pro)、トランス-4,5-(メタノ)-D-プロリン (tMe-pro);
AA6 = グリシン (glyまたはGly)、サルコシン (Sar)、アザグリシン (Azagly);
AA5 - AA6 はともにβ-ターン模倣体によって置換されていてもよく、ここで、β-ターン模倣体とは、 Pro-Gly β-ターンの中央部分を模倣することによって、分子がタンパク質 MyD88との結合の形成に有用な立体構造を取ることを可能にする、式(VI)および(VII)を有する化学構造である：
【化５】
2008524167.tif 000008
(VI)
【化６】
2008524167.tif 000009
(VII)
AA7 =グリシン (gly または Gly)、アザグリシン (Azagly)、L-スレオニン (Thr)、D-スレオニン (thr)、L-システイン (Cys)、D-システイン (cys) 残基、または非存在;
AA4 = AA7 = Cysまたはcysの場合、２つのシステインの間にジスルフィド結合が存在する;
AA1、AA2、AA3、AA4、AA5、AA6およびAA7のいくつかまたはすべてがアミノ酸である場合、それらはLであってもDであってもよく、配列は逆転(reversed)していてもしていなくてもよい;
AA1-AA7 残基間の結合は常にアミド型である; 
末端アミン基は遊離であってもよく、分子の輸送に有用な医薬上許容されるラジカル、例えば、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、プロピオニル、シクロヘキシル、ミリストイルでアシル化されていてもよい; 末端カルボキシルはカルボン酸の形態であっても一級アミドの形態であってもよい;
ただし以下を条件とする:
AA1-AA7の少なくとも１つは上記の中の天然アミノ酸ではなく、または、
AA1-AA7のすべてが上記の中の天然アミノ酸である場合、 該AA1-AA7 配列は逆転している(reversed)］。
【００４４】
式 (I)の化合物は、医薬、特に、TLR/IL-R1受容体系のシグナル伝達の調節不全に起因する疾患、特に、炎症性および自己免疫疾患; 心血管およびアテローム生成疾患; 敗血症およびショック;および移植片拒絶の治療用医薬の調製に有用である。
【００４５】
それゆえ、本発明の対象は、式 (I)の化合物、それを含む医薬組成物およびその医薬としての使用である。
【００４６】
発明の詳細な説明
末端アミン基は遊離であってもよいし、分子の輸送に有用な医薬上許容されるラジカル、例えば、アセチル、ホルミル、ベンゾイル、プロピオニル、シクロヘキシル、ミリストイルでアシル化されていもよい; 末端カルボキシルはカルボン酸の形態であっても一級アミドの形態であってもよい。
【００４７】
医薬上許容される酸のアニオンの例は、 Cl-、Br-、I- CH3COO-、およびCF3COO-である。その他の医薬上許容されるアニオンは当業者により当該分野における使用の通常の基準に従って選択でき、例えば、基準としては、非毒性、または実質的に非毒性、またはあるとしても許容できる毒性、または製剤上の利点、例えば、溶解度または結晶形態が挙げられる。医薬上許容される塩とは、毒性または望ましくない作用を引き起こさないあらゆる塩またはそのような作用が臨床的観点から許容できる形態で現れるものをいう。さらにその一般知識により、当業者であれば容易に、例えば、European Pharmacopoeia またはUnited States Pharmacopeiaを参照することが出来る。
【００４８】
上記のアルギニノ模倣体基の一般定義を前提として、好ましい例は以下である：
【化７】
2008524167.tif 000010
［式中、Aは直鎖または分枝鎖 C1-C4 アルキル 基; ALはF、Cl、BrおよびIから選択されるハロゲン基］。
【００４９】
上記のスペーサー基の一般定義を前提として、この基の好ましい例は式 (SPX)nを有し、ここでn = 0-3 であり、以下の表に定義するものである：
【化８】
2008524167.tif 000011
【化９】
2008524167.tif 000012
［式中、Aは直鎖または分枝鎖 C1-C4 アルキル 基; ALはF、Cl、BrおよびIから選択されるハロゲン原子］。
【００５０】
上記のβ-ターン模倣体の一般定義を前提として、この基の好ましい例は以下である：
【化１０】
2008524167.tif 000013
【００５１】
化合物を実験部分に記載の以下の３つの生物学的一次スクリーニングアッセイに供した: a) ダブルハイブリッドアッセイ、b) NF-κB 阻害アッセイおよびc) RGA アッセイ。３つの生物学的アッセイのいずれかにおいて活性を示した化合物を活性化合物と見なした。
【００５２】
式 (I)で表される化合物は以下のクラスに分けることが出来る:
【００５３】
1.式 IVまたは式 IVIまでスキーム 9にしたがって調製されるペプチド性化合物。
好ましい化合物は:
ST2565：Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH2 
である。
【００５４】
2.式 IIIまたは式 IIIIまでスキーム 9にしたがって調製されるペプチド模倣化合物。
好ましい化合物は: 
【化１１】
2008524167.tif 000014
ST2793: PAM8-SP20-Beta3-NH2
【化１２】
2008524167.tif 000015
ST2806 : AM8-SP38-Beta6
【化１３】
2008524167.tif 000016
ST2825 : PAM4-SP19-Beta8-NH2
【化１４】
2008524167.tif 000017
ST2826: PAM6-SP20-Beta8-NH2
【化１５】
2008524167.tif 000018
ST2828 : SP32-Beta3-NH2
【化１６】
2008524167.tif 000019
ST2941: PAM3-SP33-Beta8-NH2
【化１７】
2008524167.tif 000020
ST3324 : PAM11-SP19-Beta8-NH2
【化１８】
2008524167.tif 000021
ST3374 : PAM10-SP6-Beta8-NH2
【化１９】
2008524167.tif 000022
ST3375 :  PAM3-SP30-Beta8-NH2
である。
【００５５】
3.式III、IIII、IIV およびIVまでスキーム 9 にしたがって調製され、以下のサブクラスに分けられる部分的ペプチド性化合物:
【００５６】
- AA5 - AA6 がβ-ターン模倣体で置換されており、スキーム 9 にしたがって式IIV およびIVまで調製される部分的ペプチド性化合物。
好ましい化合物は:
【化２０】
2008524167.tif 000023
ST2799 : Ac-arg-asp-val-leu-Beta1-NH2
である。
【００５７】
- AA2 - AA3 - AA4 がスペーサーで置換されており、 AA5 - AA6 がβ-ターン模倣体で置換されており、スキーム 9 にしたがって 式 IIIおよびIIIIまで調製される部分的ペプチド性化合物。
好ましい化合物は:
【化２１】
2008524167.tif 000024
ST2804 : Ac-Arg-SP02-Beta2-Gly-NH2 
【化２２】
2008524167.tif 000025
ST2801: Ac-Arg-SP12-Beta2-Thr-NH2 
【化２３】
2008524167.tif 000026
ST2805: NH2-arg -SP02-Beta5
である。
【００５８】
- AA1がアルギニノ-模倣体であり、 AA5 - AA6 がβ-ターン模倣体で置換されており、スキーム 9 にしたがって式 IIVおよび IVまで調製される部分的ペプチド性化合物。
好ましい化合物は:
【化２４】
2008524167.tif 000027
ST2794 :PAM9-Asp-Val-Val-Beta2-NH2
である。
【００５９】
- AA1がアルギニノ-模倣体であり、 AA2-AA3-AA4 がスペーサーで置換されており、スキーム 9 にしたがって式IIIIおよび IIVまで調製される部分的ペプチド性化合物。
好ましい化合物は:
【化２５】
2008524167.tif 000028
ST2807 : PAM9-(SP31)3-Pro-Gly-NH2 
【化２６】
2008524167.tif 000029
ST2796: AM9-SP02-Pro-Gly-NH2
【化２７】
2008524167.tif 000030
ST2797 : PAM8-SP15-Pro-Gly-NH2
【化２８】
2008524167.tif 000031
ST2798 : PAM9-SP38-Pro-Gly-NH2
【化２９】
2008524167.tif 000032
ST2863 : AM9-SP17-Pro-Gly-NH2
である。
【００６０】
- AA1がアルギニノ-模倣体であり、AA2-AA3-AA4 がスペーサーで置換されており、AA5-AA6がβターン模倣体で置換されており、AA7がアミノ酸であって、スキーム 9にしたがって式 IIIIまで調製される部分的ペプチド性化合物。
好ましい化合物は:
【化３０】
2008524167.tif 000033
ST2792 : PAM9-SP02-Beta2-Thr-NH2
である。
【００６１】
- AA2-AA3-AA4がスペーサーで置換されており、スキーム 9 にしたがって式 IIIIまで調製される部分的ペプチド性化合物。
好ましい化合物は:
【化３１】
2008524167.tif 000034
ST2864 : Ac-Gly-Pro-SP30-Arg-NH2
である。
【００６２】
-１以上のアミノ酸が１以上のアザ-アミノ酸により置換されており、スキーム 9 にしたがって式 IVおよびIVIまで調製される部分的ペプチド性化合物。
好ましい化合物は:
ST2926：H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH2
ST3032：Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2
ST2927：Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH2
ST2930：Ac-thr-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2
ST2920：Ac-Arg-Asp-Val-AzaVal-Pro-Gly-NH2
ST2928：Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH2
である。
【００６３】
本発明による化合物は当業者が精通している常套の合成方法により調製することが出来る。一般的ペプチド合成技術が本発明の目的に非常に適している。参考となる文献としては、例えば: Norbert Sewald、Hans-Dieter Jakubke、Peptides: Cemistry and Biology、Wiley VCH (2002); Miklos Bodanszky、Principles of Peptide Synthesis (Sec. Ed.)、Springer-Verlag (1993); John Jones、Amino Acid and Peptide Synthesis (Oxford Cemistry Primers)、Oxford Science Publications (2000)が挙げられる。
【００６４】
一般的合成スキームを以下に示すスキーム 9 に記載し、一般的説明のためにこれを参照するとよい。
【００６５】
本発明による化合物が非ペプチド性部分を含む場合、その合成はそのペプチド性分子が次いでその上に完了される構成要素の構築を必要とする。
【００６６】
以下に記載するスキームにおいて、構成要素は多数の好ましい態様を例示するものであり、その完全な関係で本発明の態様についての当業者へのガイドであることが理解される。実際、具体的に例示されていないものについては、当業者であれば、一般知識によって例えば、市販されているものから出発化合物を見いだすことにより、または実施例に記載のものと類似の方法により調製することによって、それを補充することができる。
【００６７】
構成要素の合成
β-ターン模倣体と称されるペプチド模倣化合物の部分は、以下の実施例に記載の合成方法にしたがって合成した構成要素を用いて合成した:
【００６８】
β-ターン模倣体Beta2を含むペプチド模倣化合物の合成に有用な構成要素 ST2364 (11)は、スキーム 1にしたがって、R.L. Johnson およびその同僚 (Genin、M.J.; et al.; J. Org. Chem.; 1993、58、2334-2337) により記載されたR.D Long and K.D. Moeller (Long、R.D.; et al.; J. Am. Chem. Soc.; 1997、119、12394-1239)によって改変された方法を用いて中間体 8まで合成し、次いで以下の実施例 1に記載の方法を用いて合成した。
【００６９】
スキーム 1
ST2364の合成
【化３２】
2008524167.tif 000035
【００７０】
実施例 1
{(5R)-1-[(9H-フルオレン-9-イル-メトキシ)-カルボニル]-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.4]ノン-7-イル}-酢酸 ST2364 (11)の調製
【００７１】
中間体 [(5R)-1-(terz-ブトキシカルボニル)-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.4]ノン-7-イル]-酢酸 (9)の調製
8.5 g (0.027 mol)の(5R)-7-(2-メトキシ-2-オキソ-エチル)-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.4]ノナン-1-カルボン酸 terz-ブチル エステル (8) を140 mlの H2O および140 mlの ジMeOHに可溶化した。溶液に 7.48 g (0.054 mol)の K2CO3を添加し、混合物を室温で一晩放置して撹拌した。それを次いでHCl 2 NによりpH 5に酸性化し、減圧下で蒸発させた。得られた残渣をH2Oに溶解し、pH を2-3に下げ、抽出をCH2Cl2により行った。有機相をNa2SO4で脱水し、減圧下で乾燥させ、6.5 gのガラス状固体を得た (収率: 81%)。
【００７２】
TLC: CHCl3 8/ MeOH 2/ AcOH 0.1;RF: 0.54
1HNMR (300 MHz、CDCl3):σ1.30-1.60 (2s,9H)、1.80-2.20 (m,4H)、2.20-2.40 (m,2H)、2.40-2.60 (m,2H)、3.30-3.70 (m,4H)、3.85 (d,1H)、3.20-4.20 (sa,1H)、4.50 (d,1H)
【００７３】
中間体 (5R)-7-(カルボキシメチル)-6-オキソ-7-アザ-1-アゾニアスピロ[4.4]ノナノ-トリフルオロアセテート (10)の調製
6 g (0-02 mol)の [(5R)-1-(terz-ブトキシカルボニル)-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ-[4.4]ノン-7-イル]-酢酸 (9) を100 mlの CH2Cl2 および 100 mlの トリフルオロ酢酸に可溶化した。溶液を撹拌下で室温で 1時間保持し、その後それを減圧下で乾燥させ、H2O を残渣に添加し、再び減圧下で蒸発させ、微量のトリフルオロ酢酸を除いた。得られた油を油ポンプで乾燥させ、6.2 gの油状生成物を得た(収率: 100%)。
【００７４】
TLC: CHCl3 60/MeOH 40/H2O 15/iPrOH 10/AcOH 15; RF: 0.33
1HNMR (300 MHz、DMSOd6): δ2.10(m,4H)、2.30 (m,2H)、3.35 (m,2H)、3.50 (m,2H)、4.05 (2d,2H)、9.25 (sa,1H)、9.35 (sa,1H)
【００７５】
{(5R)-1-[(9H-フルオレン-9-イル-メトキシ)-カルボニル]-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.4]ノン-7-イル}-酢酸 ST2364 (11)の調製
6.2 g (0.02 mol)の(5R)-7-(カルボキシメチル)-6-オキソ-7-アザ-1-アゾニア-スピロ[4.4]ノナノ-トリフルオロアセテート (10)および4 g (0.047 mol)の NaHCO3 を200 mlの H2Oに可溶化した。300 mlのアセトンに溶解した7.0 g (0.021 mol)の Fmoc-N-OSu を溶液に添加し、溶液を室温で撹拌して20時間放置した。 H2O を反応混合物に添加し、これを次いでEt2Oで３回洗浄した。水相をHCl 2NでpH 2-3にし、抽出をCHCl3で行った。有機相を無水 Na2SO4で脱水し、減圧下で蒸発させた。得られた粘り気のある固体をCHCl3で結晶化させ、6.1 gの白色固体を得た(収率: 73%)。
【００７６】
TLC: CHCl3 8/ MeOH 2/ AcOH 0.1; RF: 0.55
【００７７】
MP: 144 -146℃.
[α]D:-12.6; MeOH中濃度0.5% 
HPLC: カラム: μBondapack C18 3.9x150 mm;
移動相: KH2PO450mM./CH3CN 75/25;
流速: 1,0 ml/分、室温;
R.T.: 10.9 分
1HNMR (300 MHz、DMSOd6): δ 1.50 (m,1H)、1.60-2.00 (m,4H)、2.40 (q,1H)、2.60、3.02 (2m,1H)、3.30 (m,2H)、3.40 (m,2H)、3.70、4.10 (2d,2H)、4.15、4.20 (2m,1H)、4.35、4.75 (2dd,1H)、7.25-7.45 (m,4H)、7.55-7.70 (m,2H)、7.83 (d,2H) 12.70 (sa,1H)
【００７８】
β-ターン模倣体Beta1を含むペプチド模倣化合物の合成に有用な構成要素 ST2201をスキーム 1にしたがってST 2364 (実施例 1)の合成に用いたのと同じ方法により、L-プロリンではなくD-プロリンを出発物質として開始して合成した。ST2201の分析データを以下の実施例 2に記載する。
【００７９】
【化３３】
2008524167.tif 000036
ST2201
【００８０】
実施例 2
{(5S)-1-[(9H-フルオレン-9-イル-メトキシ)-カルボニル]-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.4]ノン-7-イル}-酢酸 ST2201の調製
TLC: CHCl3 8/ MeOH 2; RF: 0.33
MP: 138-141℃
[α]D: +15.1; MeOH中濃度0.5% 
HPLC: カラム: μBondapack C18 3.9x150 mm;
移動相: KH2PO4 50mM/CH3CN 65/35;
流速: 1.0 ml/分、室温;
R.T.: 8.2 分
1HNMR (300 MHz,DMSOd6): δ 1.50 (m,1H)、1.60-2.00 (m,4H)、2.40 (q,1H)、2.60、3.02 (2m,1H)、3.30 (m,2H)、3.40 (m,2H)、3.70、4.10 (2d,2H)、4.15、4.20 (2m,1H)、4.35、4.75 (2dd,1H)、7.25-7.45 (m,4H)、7.55-7.70 (m,2H)、7.83 (d,2H) 12.70 (sa,1H)
【００８１】
β-ターン模倣体Beta3を含むペプチド模倣化合物の合成に有用な構成要素 ST2451 (22)を、スキーム 2にしたがって、R.L. Johnson およびその同僚 (Genin、M.J.; et al.; J. Med. Chem.; 1999、42、628-637) により記載された方法を用いて中間体 16まで合成し、次いで以下の実施例 3に記載する方法を用いて合成した。
【００８２】
スキーム 2
ST2451の合成
【化３４】
2008524167.tif 000037
【００８３】
実施例 3
{(5S)-1-[(9H-フルオレン-9-イル-メチルオキシ)-カルボニル] -6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.5]デス-7-イル}-酢酸 ST2451 (22)の調製
中間体 2-ブト-3-エン-1-イル-1-(terz-ブトキシ-カルボニル)-L-プロリルグリシン メチルエステル (17)の調製
8.0 g (0.0297 mol)の 2-ブト-3-エン-1-イル-1-(terz-ブトキシカルボニル)-L-プロリン (16)、3.7 g (0,0297 mol)の グリシン メチルエステル 塩酸塩 および4.0 g (0.0297 mol)の ヒドロキシベンゾトリアゾールを100 mlの 無水 CHCl3に可溶化した。溶液に4.1 ml (0.0297 mol)の TEA、次いで100 mlの 無水 CHCl3に溶解した6.1 g (0.0297 mol)の DCCを添加した。反応混合物をN2 雰囲気中で室温で一晩放置して撹拌した。形成したジシクロヘキシルウレア (DCU)をろ過し、ろ液を減圧下で乾燥させた。こうして得られた残渣をEt2Oとともに撹拌し、DCUをろ過して除去し、液相をNaHCO3 1M、塩 H2O、および10% クエン酸、次いで再び塩 H2Oで洗浄した。有機相を無水 Na2SO4で脱水し、減圧下で乾燥させ、13 gの黄色油を得、これを、n-ヘキサン/AcOEt 2:1で溶出するシリカゲルクロマトグラフィー カラムを用いて精製した。精製により9.4 gの白色固体を得た(収率: 93%)。
【００８４】
TLC: ヘキサン 2/AcOEt 1; RF: 0.27
1H-NMR (200 MHz、CDCl3): δ1.54、 1.60 (2s,9H)、1.75 (m,3H)、2.10 (m,4H)、2.75 (m,1H)、3.35 (m,1H)、3.58 (m,1H)、3.75 (s,3H),4.05 (m,2H)、5.00 (m,2H)、5.82 (m,1H)、6.50、8.32 (2sa,1H)
【００８５】
中間体 (5S)-7-(2-メトキシ(methossy)-2-オキソエチル)-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.5]デカノ-1-カルボン酸 terz-ブチル エステル (19)の調製
9.15 g (0.027 mol)の 2-ブト-3-エン-1-イル-1-(terz-ブトキシカルボニル)-L-プロリルグリシン メチルエステル (17) を300 mlのジMeOH/H2O 2:1に可溶化した。0.33 g (0.0013 mol)の OsO4 を溶液に添加し、これを次いでN2の通気後、10 分間放置して撹拌し、その上に 17.1 g (0.08 mol)の NaIO4 を一部ずつ添加した。白色沈殿が暗色溶液から形成し、室温で24 時間放置して撹拌した。H2O を溶液が得られるまで反応混合物に添加し、それを数回AcOEtで抽出した。プールした有機相をH2Oで洗浄し、無水 Na2SO4で脱水し、減圧下で乾燥させ、9.2 gの(5R)-8-ヒドロキシ-7-(2-メトキシ-2-オキソエチル)-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.5]-デカノ-1-カルボン酸 terz-ブチル エステル (18)のジアステレオアイソマーの混合物を暗色油として得、これをさらに精製せずに反応させた。
【００８６】
TLC: AcOEt; RF: 0.39 および 0.52 (ジアステレオアイソマー)
【００８７】
9.0 g (0.026 mol)の(5R)-8-ヒドロキシ-7-(2-メトキシ-2-オキソエチル)-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.5]デカノ-1-カルボン酸 terz-ブチル エステル (18) を180 mlの 無水 THFに可溶化した。18 mlのトリフルオロ酢酸を溶液に添加し、溶液を氷浴で冷却し、4.68 g (0.074 mol)の NaBH3CN を添加した。反応混合物を窒素雰囲気下で20時間室温で放置して撹拌し、次いでK2CO3でアルカリ性にした。 溶液をろ過により残渣から分離し、ろ液を減圧下で乾燥させた。得られた無定型塊をH2Oに溶解し、CH2Cl2で数回抽出した。有機相を無水 Na2SO4で脱水し、減圧下で乾燥させた。9 gの暗色油を得、これをAcOEt/n-ヘキサン 3:1で溶出するシリカカラムクロマトグラフィーで精製した。4.5 g の明色油を得た(収率: 53%)。
【００８８】
TLC: AcOEt; RF: 0.5
1H-NMR (300 MHz、CDCl3): δ1.40、1.60 (2s,9H)、1.60-2.15 (m,6H)、2.15-3.80 (m,2H)、3.30 (m,1H)、3.30-3.80 (m,4H)、3.75、3.76 (2s,3H)、4.70、4.78 (2d,1H)
【００８９】
中間体 [(5S)-1-(terz-ブトキシカルボニル)-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.5]デス-7-イル]-酢酸 (20)の調製
4 g (0.012 mol)の(5S)-7-(2-メトキシ-2-オキソエチル)-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.5]デカノ-1-カルボン酸 terz-ブチル エステル (19)を60 mlの MeOHおよび60 mlの H2Oに溶解した; 3.32 g (0.024 mol)の K2CO3を次いで添加した。反応混合物を撹拌下で室温で20時間保持し、次いでHCl 2N によりpH 5にし、減圧下で乾燥させた。得られた残渣をH2Oに可溶化し、pH 2-3にし、CH2Cl2で数回抽出した。有機相を無水 Na2SO4で脱水し、減圧下で乾燥させ、3.2 g の白色固体を得た(収率: 86%)。
【００９０】
TLC: CHCl3 8/MeOH 2/CH3COOH 0,1; RF: 0.59
1H-NMR (300 MHz、CDCl3): δ1.43 (s,9H)、1.60-2.15 (m,6H)、2.15-2.50 (m,2H)、3.25 (m,1H)、3.30-3.80 (m,4H),4.43、4.98 (2d,1H)
【００９１】
中間体 (5R)-7-(カルボキシメチル)-6-オキソ-7-アザ-1-アゾニアスピロ[4.5]デカノ-トリフルオロアセテート (21)の調製
3.1 g (0.01 mol)の [(5S)-1-(terz-ブトキシカルボニル)-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ-[4.5]デス-7-イル]-酢酸 (20) を60 mlの CH2Cl2 および60 mlの トリフルオロ酢酸に可溶化した;反応溶液を室温で1時間撹拌して放置した。それを次いで30℃で減圧下で乾燥させ、残渣をH2Oにとり、再び減圧下で乾燥させ、油ポンプで徹底的に乾燥させた。3.1 gの明色油を得た(収率: 95%)。
【００９２】
TLC: CHCl3 60/MeOH 40/H2O 15/isoPrOH/10/AcOH 15; RF: 0.4
1H-NMR (200 MHz、D2O): δ 1.85-2.30 (m,8H)、3.20-3.60 (m,4H)、4.05 (d,2H)
【００９３】
{(5S)-1-[(9H-フルオレン-9-イル-メトキシ)-カルボニル]-6-オキソ-1,7-ジアザスピロ[4.5]デス-7-イル}-酢酸 ST2451 (22)の調製
3.2 g (0.01 mol)の(5R)-7-(カルボキシメチル)-6-オキソ-7-アザ-1-アゾニアスピロ-[4.5]デカノ-トリフルオロアセテート (21)を100 mlの H2Oに溶解した; 1.7 g (0.02 mol)の NaHCO3 を溶液に添加し、次いで150 mlのアセトン に溶解した3.7 g (0.011 mol)の Fmoc-N-OSuを添加した。反応混合物を室温で撹拌して24 時間放置し、アセトンを減圧下で蒸発させ、次いでH2Oで希釈し、Et2Oで洗浄した。水相をHCl 2N でpH 2-3にし、CHCl3で抽出した。有機相を無水 Na2SO4で脱水し、減圧下で乾燥させた。得られた生成物をCH2Cl2 およびEt2Oで結晶化させ、1.4 gの白色固体を得た(収率: 32%)。
【００９４】
TLC: CHCl3 8/MeOH 2/CH3COOH 0,1; RF: 0.62
MP: 122℃
[α]D: -26.4 (MeOH 中0.5%)
E.A.:理論値: C 69.10; H 6.03; N 6.44;
実測値: C 67.81; H 5.90; N 6.31
HPLC: カラム: Symmetry C18 (5μ) 3.9x150 mm;
移動相: KH2PO4 50mM pH 3/CH3CN 65/35;
流速: 1.0 ml/分、室温;
R.T.: 5.2 分
1H-NMR (300 MHz、CDCl3): δ 1.20、1.38、1.62 (3m,1H)、1.78-2.20 (m,5H)、2.22-2.50 (m,2H)、2.80、3.45 (2m,1H)、3.25 (m,1H)、3.60 (dd,1H)、3.65 (m,1H)、3.80、3.85 (2d,1H)、4.15、5.2 (2m,1H)、4.2-4.35 (m,1H) 4.40(m,1H)、4.60 (m,1H)、7.20-7.45 (m,8H)、7.58 (m,2H)、7.75 (d,2H)
【００９５】
β-ターン模倣体Beta4を含むペプチド模倣化合物の合成に有用な構成要素 ST2535 (34)は、スキーム 3にしたがって、R.L. Johnson およびその同僚 (Genin、M.J.; et al.; J. Med. Chem.; 1999、42、628-637) により記載された方法を用いて中間体 31まで、次いで以下の実施例 4に記載の方法を用いて合成した。
【００９６】
スキーム 3
ST2535の合成
【化３５】
2008524167.tif 000038
【００９７】
実施例 4
(2R,3'S,7a'R)-1-[(9H-フルオレン-9-イル-メトキシ)-カルボニル]-5'-オキソテトラヒドロスピロ-[ピロリジン-2,6'-ピロール-[2,1-b][1,3]チアゾール]-3'-カルボン酸 ST2535 (34)の調製
中間体 (2R,3'S,7a'R)-1-(terz-ブトキシ-カルボニル)-5'-オキソテトラヒドロスピロ-[ピロリジン-2,6'-ピロール[2,1-b][1,3]チアゾール]-3'-カルボン酸 (32)の調製
5 g (0.014 mol)の(2R,3'S,7a'R)-5'-オキソテトラヒドロ-1H-スピロ-[ピロリジン-2,6'-ピロール[2,1-b][1,3]チアゾール]-1,3'-ジカルボン酸 1-terz-ブチル 3'-メチルエステル (31)を65 mlの H2O および65 mlの MeOHに溶解した。3.87 g (0.028 mol)の K2CO3 を溶液に添加した。懸濁液を室温で20時間撹拌して放置し、混合物のpHをHCl 2Nで5 に下げ、混合物を減圧下で乾燥させた。 残渣をH2Oにとり、pH 2-3にし、CHCl3で抽出した。有機相をH2Oで洗浄し、Na2SO4で乾燥させ、減圧下で乾燥させた。得られたガラス状残渣をEt2Oで結晶化させ、 3 gの白色固体を得た(収率: 64%)。
【００９８】
TLC: CHCl3 8/MeOH 2/CH3COOH 0,1; RF: 0.56
1H-NMR (200 MHz、CDCl3): δ1.45 (s,9H) 1.75-2.45 (m,5H)、2.85 (dd,1H) 3.50 (m,4H) 4.98 (m,1H)、5.20、5.30 (d and dd,1H)、5.00-6.00 (sa,1H)
【００９９】
中間体 (2R,3'S,7a'R)-3'-カルボキシ-5'-オキソテトラヒドロスピロ[ピロリジン-2,6'-ピロール[2,1-b][1,3]チアゾール] トリフルオロ-アセテート (33)の調製
3.0 g (0.0087 mol)の(2R,3'S,7a'R)-1-(terz-ブトキシカルボニル)-5'-オキソテトラヒドロスピロ[ピロリジン-2,6'-ピロール[2,1-b]-[1,3]チアゾール]-3'-カルボン酸 (32) を60 mlの CH2Cl2および60 mlの トリフルオロ酢酸に可溶化した。全体を室温で2 時間撹拌して放置し、30℃で蒸発させた; 得られた油を油ポンプでピッチが得られるまで乾燥させ、それをCHCl3で結晶化させ、2.4 gの白色固体を得た(収率: 80%)。
【０１００】
TLC: CHCl3 60/MeOH 40/H2O 15/isoPrOH 10/AcOH 15; RF: 0.57 
1H-NMR (200 MHz、D2O): δ1.95-2.40 (m,4H)、2.45 (dd,1H)、2.90 (dd,1H)、3.25-3.35 (m,3H) 3.45 (dd,1H),4.93 (dd,1H)、5.22(t,1H)
【０１０１】
(2R,3'S,7a'R)-1-[(9H-フルオレニル-9-イル-メトキシ)-カルボニル]-5'-オキソテトラヒドロスピロ[ピロリジン-2,6'-ピロール[2,1-b][1,3]チアゾール-]-3'-カルボン酸 ST2535 (34)の調製
2.3 g (0.0064 mol)の(2R,3'S,7a'R)-3'-カルボキシ-5'-オキソテトラヒドロ-スピロ-[ピロリジン-2,6'-ピロール[2,1-b][1,3]チアゾール] トリフルオロアセテート (33) を100 mlの H2Oに可溶化した; 1.1 g (0.013 mol)の NaHCO3 を溶液に添加し、次いで 150 mlの アセトンに溶解した4.4 g (0.013 mol)の Fmoc-N-OSuを添加した。全体を室温で20時間撹拌して放置し、アセトンを減圧下で蒸発させた。さらに水を添加し、水溶液をEt2Oで洗浄し、pH 2-3にし、CHCl3で抽出した。有機相を分離し、無水 Na2SO4で脱水し、減圧下で乾燥させた。こうして得られたガラス状固体を酢酸エチルで結晶化させ、2.3 gのろ過性の白色固体を得た(収率: 80%)。
【０１０２】
TLC: CHCl3 8/MeOH 2/CH3COOH 0,1; RF: 0.67
MP: 110℃ 分解
E.A.:理論値: +8.4%H2O = C59.21; H5.71; N5.52 S6.32;
実測値: = C57.11; H4.87; N5.21: S5.43 
[α]20D: +121.9
1H-NMR (300 MHz、CDCl3): δ1.60-2.20 (m,4H)、2.30 (m,1H)、2.80 (m,1H)、3.30、3.35-3.60 (3m,4H)、4.05、4.20 (2m,1H)、4.40 (m,2H)、4.60、4.98(2m,1H)、5.05、5.15 (2m,1H)、6.00-7.20 (sa,1H)、7.20-7.45 (m,8H)、7.58 (m,2H)、7.75 (d,2H)
HPLC: カラム: Symmetry C18 (5 μ) 3.9x150 mm;
移動相: KH2PO4 50mM/CH3CN 65/35;
流速: 1.0 ml/分、室温;
R.T.: 12.1 分
【０１０３】
β-ターン模倣体Beta6を含むペプチド模倣化合物の合成に有用な構成要素 ST2304 (40)を、スキーム 4にしたがって、M.R. Pena and J.K. Stille (J. Am. Chem. Soc.; 1989、111、5417-5424) により記載された方法を用いて中間体 37まで、 次いで以下の実施例 5に記載の方法を用いて合成した。
【０１０４】
スキーム 4
ST2304の合成
【化３６】
2008524167.tif 000039
【０１０５】
実施例 5
((2R,11aS)-2-{[terz-ブチル(ジフェニル)シリル]-オキシ}-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ピロール[2,1-c][1,4]ベンゾ-ジアゼピン-10(5H)-イル)-酢酸 ST 2304 (40)の調製
中間体 (2R,11aS)-2-{[terz-ブチル(ジフェニル)-シリル]オキシ}-2,3-ジヒドロ-1H-ピロール[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン-5,11(10-H,11aH)-ジオン (38)の調製
2.3 g (0.01 mol)の(2R,11aS)-2-ヒドロキシ-2,3-ジヒドロ-1H-ピロール[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン-5,11(10H,11aH)-ジオン (37) を30 mlの DMFに可溶化した; 3.4 g (0.05 mol)の イミダゾールを添加し、5.6 ml (0.022 mol)の terz-ブチル-ジフェニルシリルクロリド をこの溶液に撹拌下で滴下した。溶液を室温で3.5時間撹拌して放置し、次いで 100 mlの H2O を添加し、抽出を100 mlの CH2Cl2により行い、有機相をH2Oで洗浄した。有機相を無水 Na2SO4で脱水し、機械的ポンプも用いて減圧下で乾燥させ、濃密な油を得、これを熱いn-ヘキサン/AcOEtに可溶化し、数回再沈殿させた。 機械的ポンプで乾燥させた後、3.9 gの無定型固体を得た(収率: 83%)。
【０１０６】
TLC: n-ヘキサン 1/ AcOEt1;RF: 0.5
E.A.:理論値: C: 71.45; H: 6.42; N: 5.95; 
実測値: C: 70.47; H: 6.67; N: 5.53
1H-NMR: (200MHz、CDCl3):δ1.03 (s,9H)、2.20 (m,1H)、2.78 (m,1H)、3.55、3.60 (2d,1H)、3.85、3.90 (2d,1H)、4.25 (m,1H)、4.55 (m,1H)、7.00 (d,1H)、7.25-7.55 (m,8H)、7.60-7.80 (m,4H)、8.02 (d,1H)、8.65 (s,1H)
【０１０７】
中間体 、[(2R,11aS)-2-{[terz-ブチル-(ジフェニル)シリル]オキシ}-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ピロール-[2,1-c]-[1,4]ベンゾジアゼピン-10(5H)-イル)-酢酸 terz-ブチル エステル (39)の調製
330 mg (0.008 mol)の 60% NaHを数回 THFで洗浄した後、6 mlの 無水 THFに懸濁した。懸濁液を-40℃に冷却し、18 mlの THFに可溶化した 3.45 g (0.0073 mol)の(2R,11aS)-2-{[terz-ブチル(ジフェニル)-シリル]オキシ}-2,3-ジヒドロ-1H-ピロール[2,1-c][1,4]ベンゾ-ジアゼピン-5,11(10H、11aH)-ジオン (38) を滴下し、溶液を撹拌下に維持した。45 分後、1.2 ml (0.008 mol)の terz-ブチル-ブロモアセテートを滴下し、混合物を撹拌下で2 時間放置して反応させ、温度を室温に昇温させた。懸濁液を 50 mlの H2Oに注ぎ、30 mlの CH2Cl2で２回抽出し、プールした有機相を数回H2Oおよび塩で洗浄し、無水 Na2SO4で脱水した。溶液を減圧下で乾燥させて油を得、石油エーテルで洗浄した後、機械的ポンプで乾燥させ、3.6 g の無定型固体を得た(収率: 84%)。
【０１０８】
TLC: n-ヘキサン 7/ AcOEt:3; R.F. 0.5
E.A.:理論値: C: 69.83; H: 6.89; N: 4.79;
実測値: C: 68.87; H: 7.37; N: 4.01
1H-NMR: (200 MHz、CDCl3): δ1.03 (s,9H)、1.45 (s,9H)、2.15 (m,1H)、2.80 (m,1H)、3.55、3.60 (2d,1H)、3.75、3.82 (2d,1H)、4.30 (m,1H)、4.05-4.60 (dd,2H)、4.62 (m,1H)、7.20 (d,1H)、7.30-7.60 (m,8H)、7.60-7.80 (m,4H)、8.00 (d,1H)
【０１０９】
((2R,11aS)-2-{[terz-ブチル(ジフェニル)シリル]オキシ}-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ピロール[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン-10(5H)-イル)-酢酸 ST2304 (40) の調製
3.6 g (0.0061 mol)の [(2R,11aS)-2-{[terz-ブチル-(ジフェニル)シリル]オキシ}-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ピロール[2,1-c]-[1,4]ベンゾ-ジアゼピン-10(5H)-イル)-酢酸 terz-ブチル エステル (39)を30 mlの CH2Cl2に懸濁し、25 mlの トリフルオロ酢酸を撹拌下で15℃で滴下した。温度を室温まで昇温させ、次いで溶液を45 分間放置して撹拌した。反応溶液を減圧下で機械的ポンプで乾燥させた; 残渣をエチルエーテルに可溶化し、それから冷却によりそれが沈殿し、2.6 g の白色固体が形成した(収率: 81%)。
【０１１０】
TLC: CHCl3 8/ MeOH 2/ CH3COOH 0.1; RF: 0.51
M.P.: 191-193℃.
E.A.:理論値: +0.6% H2O (TG): C: 67.74; H: 6.13; N: 5.26; 
実測値: C: 67.12; H: 6.09; N: 5.28
[α]20D +246.2; 濃度1% CHCl3
1H-NMR (300 MHz、CDCl3): δ1.03 (s,9H)、2.05 (m,1H)、2.75 (m,1H)、3.50、3.55 (2d,1H)、3.75、3.78 (2d,1H)、4.25 (m,1H)、4.20-4.57 (dd,2H)、4.60 (m,1H)、7.10 (d,1H)、7.20-7.50 (m,8H)、7.60 (m,4H)、7.90 (d,1H)
HPLC: カラム: Inertsil ODS 3(5μ) 4.6x250 mm;
移動相: CH3CN/KH2PO4 50mM 70/30; pH 3 (H2PO4 85%);
流速: 1.0 ml/分、t = 30℃;
R.T.: 10.79 分
【０１１１】
β-ターン模倣体Beta5を含むペプチド模倣化合物の合成に有用な構成要素 ST2393 (45)を、スキーム 5にしたがって、M.R. Pena and J.K. Stille (J. Am. Chem. Soc.; 1989、111、5417-5424) により記載された方法を用いて、イサトイック無水物(isatoic anhydride) (41) および L-プロリン (42) を出発物質として用いて合成した。合成を以下の実施例 6に記載する。
【０１１２】
スキーム 5
ST2393の合成
【化３７】
2008524167.tif 000040
【０１１３】
実施例 6
[(11aS)-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ピロール[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン-10(5H)-イル]-酢酸 ST 2393 (45) の調製
中間体 (11aS)-2,3-ジヒドロ-1H-ピロール[2,1-c]-[1,4]ベンゾジアゼピン-5,11(10H,11aH)-ジオン (43) の調製
2.67 g (0.0164 mol)の イサトイック無水物 (41) を20 mlの 無水 DMSOにN2 雰囲気下で可溶化し、1.72 g のL-プロリン (0.0149 mol) (42) を撹拌下で添加した。溶液を撹拌下で2.5 時間120℃に加熱し、冷却し、130 mlの 冷H2Oに撹拌下で注いた。水溶液により形成した沈殿をろ過し、再び冷水で洗浄し、減圧下で3 時間オーブンで乾燥し、2.6 g を得た(収率: 80%)。
【０１１４】
TLC: AcOEt; RF: 0.5
[α]20D: +528 (0.5% CH3OH)
1H-NMR (200 MHz、CDCl3): δ 2.05 (m,3H)、2.80 (m,1H)、3.65 (m,1H) 3.82 (m,1H) 4.12 (d,1H)、7.00 (d,1H)、7.30 (t,1H)、7.52 (t,1H)、8.03 (d,1H)、8.25 (sa,1H)
【０１１５】
中間体 [(11aS)-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ピロール[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン-10(5H)-イル]-酢酸 terz-ブチル エステル (44) の調製
518 mg (0.0127 mol)の 60% NaHを数回THFで洗浄した後、5 mlの 無水 THFに懸濁した。懸濁液を-40℃に冷却し、25 mlの 無水 THFに可溶化した2.5 g (0.0115 mol)の(11aS)-2,3-ジヒドロ-1H-ピロール-[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン-5,11-(10H,11aH)-ジオン (43) を滴下し、溶液を撹拌下で維持した。45 分後、1.87 ml (0.0127 mol)の terz-ブチル-ブロモアセテートを滴下し、混合物を撹拌下で2 時間放置して反応させ、温度を室温に昇温させた。懸濁液を150 mlの H2Oに注ぎ、抽出を100 mlの CH2Cl2で２回行い、プールした有機相を数回 H2Oおよび塩で洗浄し、無水 Na2SO4で脱水した。溶液を減圧下で乾燥させ、油を得、これを石油エーテルで洗浄した後、機械的ポンプで乾燥させ、3.7 gの無定型固体を得た(収率: 97%)。
【０１１６】
TLC: n-ヘキサン 1/ AcOEt 1; RF: 0.4
1H-NMR: (200 MHz、CDCl3):δ1.50 (s,9H)、2.05 (m,3H)、2.68 (m,1H)、3.60 (m,1H)、3.83 (m,1H)、4.15 (m,1H)、4.15 (d,1H)、4.59 (d,1H)、7.18-7.40 (m,2H)、7.55 (dt,1H)、7.97 (dd,1H)
【０１１７】
[(11aS)-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ピロール-[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン-10(5H)-イル]-酢酸 ST2393 (45) の調製
3.5 g (0.01 mol)の [(11aS)-5,11-ジオキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-1H-ピロール[2,1-c][1,4]ベンゾジアゼピン-10(5H)-イル]-酢酸 terz-ブチル エステル (44) を30 mlの CH2Cl2に可溶化し、25 mlの トリフルオロ酢酸を10℃で撹拌下で滴下した。温度を室温まで昇温させ、溶液を1.5 時間撹拌した。反応溶液を減圧下で機械的ポンプで乾燥させた; 残渣をエチルエーテルで処理し、それからそれは固化し、減圧下で2 時間オーブン乾燥した後、2.65 gの白色固体を得た(収率: 96%)。
【０１１８】
TLC: CHCl3 60/ MeOH 40/ H2O 15/IprOH 10/CH3COOH 15; RF: 0.8
M.P.: 267-269℃
E.A.:理論値: +1.9% H2O (TG): C: 60.14; H: 5.26; N: 10.02; 
実測値: C: 60.31; H: 5.36; N: 9.70
[α]20D: +408 (0.7% CHCl3)
1H-NMR (300 MHz、MeOD): δ 2.07 (m,3H)、2.61 (m,1H) 3.55 (m,1H)、3.77(m,1H)、4.25 (m、1H)、4.48 (d,1H)、4.60 (d,1H)、7.38 (m,2H)、7.60 (m,1H)、7.83 (m,1H)
HPLC: カラム: Symmetry C18 (3.5 μ);
移動相: KH2PO4 50mM/CH3CN;
グラジエント: 100% 〜30% KH2PO4 50Mm;
流速: 1.0 mL/分、室温;
R.T.: 10.85 分
【０１１９】
β-ターン模倣体Beta7を含むペプチド模倣化合物の合成に有用な構成要素 ST2590 (52)を、以下のスキーム 6にしたがって、市販化合物 (46)および(47) から出発して合成した。ST2590の合成を以下の実施例 7に記載する:
【０１２０】
スキーム 6
ST2590 の合成
【化３８】
2008524167.tif 000041
【０１２１】
実施例 7
[(11aS)-5,5-ジオシド(diossido)-11-オキソ-2,3,11,-11a-テトラヒドロ-ピロール[1,2-b][1,2,5]ベンゾチアジアゼピン-10(1H)-イル]-酢酸 ST2590 (52) の調製:
中間体 1-[(2-ニトロフェニル)スルホニル]-L-プロリン メチルエステル (48) の調製
5.0 g (30 mmol)の L-プロリン メチルエステル (47)を30 mlの CH2Cl2 に懸濁し、8.5 ml (60 mmol)のトリエチルアミンを撹拌下で添加した。30 mlのジCH2Cl2中の6.75 g (30 mmol)の 2-ニトロ-ベンゼンスルホニルクロリド (46)をN2下で5℃で滴下し、混合物をN2 雰囲気で1.5 時間撹拌下で放置して反応させた。反応溶液を２回冷水で洗浄し、有機相を分離し、無水 Na2SO4で脱水し、減圧下で乾燥させ、油性粗生成物を得、溶出液としてn-ヘキサン/酢酸エチル 6:4を用いるシリカでのクロマトグラフィーの後、3.5 g の生成物を得た(収率: 37%)。
【０１２２】
TLC: n-ヘキサン 1/ AcOEt:1; R.F. 0.56
1H-NMR (200 MHz、CDCl3)δ1.90-2.20 (m,3H)、2.20-2.45 (m,1H)、3.45-3.85 (m,1H)、3.70 (s,3H)、4.65 (dd,1H)、7.70 (m,3H)、8.17 (m,1H)
【０１２３】
中間体 1-[(2-アミノフェニル)-スルホニル]-L-プロリン メチルエステル (49) の調製
3.95 g (12.5 mmol)の 1-[(2-ニトロフェニル)-スルホニル]-L-プロリン メチルエステル (48) を55 mlの メタノールに可溶化し、過剰のラネーニッケルをメタノール中で活性化した後に50% 水性分散液として添加し、溶液を2.5 時間放置して撹拌した。さらに活性化したラネーニッケルを添加し、溶液を放置してさらに45 分撹拌し、セライトでろ過し、酢酸エチルとメタノールの混合物で洗浄し、ラネーニッケル残渣は乾燥させなかった。メタノールろ過溶液を無水 Na2SO4で脱水し、減圧下で乾燥させ、3.1 gの十分に純粋な生成物を得た(収率: 87 %)。
【０１２４】
TLC: n-ヘキサン 1/ AcOEt 1; R.F. 0.45
1H-NMR (200 MHz、CDCl3)δ1.80-2.35 (m,4H)、3.40 (t,2H)、4.55 (dd,1H)、5.05-5.40 (sa,1H)、6.74 (t,2H)、7.30 (t,1H)、7.72 (d,1H)
【０１２５】
中間体 (11aS)-1,2,3,11a-テトラヒドロピロール-[1,2-b][1,2,5]ベンゾチアジアゼピン-11(10H)-オン 5,5-ジオキシド (50) の調製
3.1 g (10.9 mmol)の 1-[(2-アミノフェニル)-スルホニル]-L-プロリン メチルエステル (49) を250 mlの トルエンと50 mgの p-トルエンスルホン酸 (0.268 mmol)とともに可溶化し還流温度で3日間加熱し、ディーン・スタークにより水を除いた。溶液を次いでNaHCO3 の飽和溶液と水で中性pHで２回洗浄し、無水 Na2SO4で脱水し、ろ過し、減圧下で乾燥させた。褐色粗固体をヘキサンおよび酢酸エチルで加熱して結晶化させ、1.1 gの生成物を得た。母液を減圧下で乾燥させ、n-ヘキサン/AcOEt 55:45を溶出液として用いてフラッシュクロマトグラフィーで処理し、さらに550 mgを得た。 全部で 1.65 gの生成物をこうして得た(収率: 60%)。
【０１２６】
TLC: n-ヘキサン1/ AcOEt 1; R.F. 0.25
1H-NMR (200 MHz、CDCl3):δ1.75-2.15 (m,2H)、2.15-2.38 (m,1H)、2.38-2.63 (m,1H)、3.05 (q,1H)、3.55 (q,1H)、4.65 (t,1H)、7.00-7.40 (m,2H)、7.55 (t,1H)、7.95 (d,1H)、8.80 (sa,1H)
【０１２７】
中間体 [(11aS)-5,5-ジオキシド-11-オキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロピロール[1,2-b][1,2,5]ベンゾチアジアゼピン-10(1H)-イル] 酢酸 terz-ブチル エステル (51) の調製
窒素流下で-40℃にした15 mlの 無水 THF中の200 mgの NaH (0.0087 mol)の懸濁液に、25 mlの 無水 THF中の2.0 gの (11aS)-1,2,3,11a-テトラヒドロピロール[1,2-b][1,2,5]-ベンゾチアジアゼピン-11(10H)-オン 5,5-ジオキシド (50) (0.0079 mol)の溶液を添加した。-40℃で45 分後、1,17 mlの terz-ブチル-ブロモアセテート (0.0087 mol) を添加し、温度を20℃ (室温)に昇温させ、溶液を2 時間放置して撹拌した。溶液を冷水で希釈し、CH2Cl2で２回抽出し、有機抽出物をプールし、これを水および塩で洗浄した。有機溶液を無水 Na2SO4で脱水し、ろ過し、減圧下で乾燥させた。生成物を次いでヘキサンおよび酢酸エチルで加熱下で結晶化させ、1.76 gの生成物を得た(収率: 61 %)。
【０１２８】
TLC: n-ヘキサン / AcOEt 1:1; R.F. 0.55
1H-NMR (200 MHz、CDCl3): δ 2.52 e 2.58 (2s,9H)、2.80-2.22 (m,3H)、2.45 (m,1H)、3.45 (m,2H)、3.88 (t,1H)、4.05 (d,1H)、4.70 (d,1H)、7.45 (t,2H)、7.68 (t,1H)、8.03 (d,1H)
【０１２９】
[(11aS)-5,5-ジオキシド-11-オキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロ-ピロール[1,2-b][1,2,5]ベンゾチアジアゼピン-10(1H)-イル])-酢酸 ST2590 (52) の調製
0℃にした20 mlの CH2Cl2中の1.75 g (0.00478 mol)の [(11aS)-5,5-ジオキシド-11-オキソ-2,3,11,11a-テトラヒドロピロール[1,2-b][1,2,5]ベンゾチアジアゼピン-10(1H)-イル]酢酸 terz-ブチル エステル (51) の溶液に13 mlの TFAを滴下し、溶液を室温で2 時間放置して撹拌した。
【０１３０】
TLC制御 (シリカ、CHCl3 9/MeOH 1)の後、溶媒を蒸発させ、残渣をCH2Cl2にとり、有機相をNa2CO3の飽和溶液で処理し、分離した。
【０１３１】
これを次いでエチルエーテルで洗浄し、濃 HCl 溶液で処理した。生成物を溶液から沈殿させ、これをCH2Cl2で抽出し、Na2SO4で脱水し、ロータベーター(rotavapor)で乾燥させ、1.1 gの98% 純度の最終生成物を得た(収率: 74%)。
【０１３２】
M.P.: 149-152℃
[α]D20: +210.1;濃度 0.47% Me-OH
HPLC: カラム: Symmetry C18(3.5 μ)4.6x150 mm;
移動相: KH2PO4 50mM pH3/CH3CN 80/20;
流速:1.0 ml/分、室温;
R.T.: 10.51 分
1H-NMR (300 MHz、CDCl3): δ 1.8-2.2 (3H、m、CH2CH2); 2.4-2.6 (1H、m、CH2CH2);3.4-3.6 (2H、m、CH2N); 3.8-3.9 (1H、m、CHN); 4.25および4.75 (2H、2d,CH2COOH); 5.6-6.6 (1H、bs、COOH); 7.45 (2H、t、Ar); 7.7 (1H、t、Ar); 8.0 (1H、d、Ar)
E.A. (C14H14N2O4):理論値: C: 50.31; H: 4.54; N: 9.02; S: 10.33; 
実測値: C: 50.03 H: 4.45; N: 8.78; S: 10.13
【０１３３】
β-ターン模倣体Beta8を含むペプチド模倣化合物の合成に有用な構成要素 ST2610 (64)を、以下のスキーム 7にしたがって、Ehab M. Khalil およびその同僚、J. Med. Chem.; 1999、42、628-637により記載された方法を用いて中間体 61まで、次いで以下の実施例 8に記載の方法を用いて合成した。
【０１３４】
スキーム 7
ST2610の合成
【化３９】
2008524167.tif 000042
【０１３５】
実施例 8
(2R,4'R,8a'R)-1-[(9H-フルオレン-9-イル-メトキシ)カルボニル]-6'-オキソテトラヒドロ-2'H-スピロ[ピロリジン-2,7'-ピロール-[2,1-b][1,3]チアジン]-4'-カルボン酸 ST2610 (64) の調製
中間体 (2R,4'R,8a'R)-1-(terz-ブトキシ-カルボニル)-6'-オキソテトラヒドロ-2'H-スピロ[ピロリジン-2,7'-ピロール[2,1-b]-[1,3]-チアジン]-4'-カルボン酸 (62) の調製
2.55 g (0.0069 mol)の(2R,4'R,8a'R)-6'-オキソテトラヒドロ-1H,2'H-スピロ[-ピロリジン-2,7'-ピロール[2,1-b][1,3]チアジン]-1,4'-ジカルボン酸 1-terz-ブチル 4'-メチルエステル (61) を45 mlの MeOHおよび45 mlの H2Oに溶解した; 溶液に1.9 g (0.0138 mol)の K2CO3を添加した。溶液を撹拌下で室温で20時間保持し、次いでpH を5に下げることにより処理し、減圧下で乾燥させた。得られた残渣H2Oをにとり、pH 2-3にし、CHCl3で抽出した。有機相を無水 Na2SO4で脱水し、次いで蒸発させて乾燥させた。ピッチ状の塊をエチルエーテルで結晶化させ、2.4 gのろ過性の白色固体を得た(収率: 97%)。
【０１３６】
TLC: CHCl3 8/MeOH 2/CH3COOH 0.1; RF: 0.65;
1H-NMR (300 MHz、CDCl3)δ 1.40、1.45 (2d,9H)、2.70-2.05 (m,4H)、2.00 -2.30 (m,1H)、2.25-2.55 (m,1H)、2.55-2.80 (m,1H)、2.75-3.15 (m,1H)、3.50 (m,2H)、3.70 (t,2H)、4.98 (dd,1H)、5.10 (d,1H)
【０１３７】
中間体 (2R,4'R,8a'R)-4'-カルボキシ-6'-オキソテトラヒドロ-2'H-スピロ[ピロリジン-2,7'-ピロール[2,1-b][1,3]チアジン] トリフルオロアセテート (63) の調製
2.1 g (0.0058 mol)の(2R,4'R,8a'R)-1-(terz-ブトキシカルボニル)-6'-オキソテトラヒドロ-2'H-スピロ[ピロリジン-2,7'-ピロール[2,1-b][1,3]チアジン]-4'-カルボン酸 (62)を45 mlの トリフルオロ酢酸に溶解した。混合物を撹拌下で室温で3 時間保持し、30℃で減圧下で蒸発させて乾燥させ、得られた残渣を少量の CHCl3に可溶化し、エチルエーテルで沈殿させ、形成した固体を迅速にろ過した。この操作を２回行い、1.55 gの非常に吸湿性の白色固体を得た(収率; 74%)。
【０１３８】
TLC: (CHCl3 60/MeOH 40/H2O 15/IsoPrOH 10/AcOH 15); RF: 0.68
1H-NMR (300 MHz、D2O): δ1.75-2.00 (m,1H)、2.00-2.38 (m,5H)、2.45 (dd,1H)、2.70 (dt,1H)、2.77-3.05 (m,2H)、3.25-3.55 (m,2H)、3.96 (d,1H)、5.18 (d,1H)
【０１３９】
(2R,4'R,8a'R)-1-[(9H-フルオレン-9-イル-メトキシ)カルボニル]-6'-オキソテトラヒドロ-2'H-スピロ[ピロリジン-2,7'-ピロール[2,1-b][1,3]チア-ジン]-4'-カルボン酸 ST2610 (64) の調製
1.48 g (0.004 mol)の(2R,4'R,8a'R)-4'-カルボキシ-6'-オキソテトラヒドロ-2'H-スピロ[ピロリジン-2,7'-ピロール[2,1-b]-[1,3]チアジン] トリフルオロアセテート (63) を50 mlの H2Oに可溶化した。0.67 g (0.008 mol)の NaHCO3 を溶液に添加し、次いで75 mlの アセトンに溶解した 1.42 g (0.0042 mol)の Fmoc-N-OSuを添加した。反応溶液を室温で撹拌して20時間放置し、次いでアセトンを減圧下で除去し、H2O を添加し、溶液をEt2Oで洗浄した。水溶液をHCl 2N でpH 3にし、抽出をCHCl3により行った。有機相を無水 Na2SO4で乾燥させ、蒸発を行い、1.9 gのガラス状白色固体を得た(収率: 98%)。
【０１４０】
M.P.: 108-115℃
[α]D20: +70.1
E.A.: (C26H26N2O5S).理論値: 7.47% H2O: C: 60.38; H: 5.90; N 5.41; S: 6.20;
実測値: C : 56.77; H: 4.85; N: 5.06; S: 5.26
1H-NMR (300 MHz、CDCl3): δ 1.85 (m,1H)、1.94 (dd,1H)、2.05 (m,1H)、2.15 (m,1H)、2.42 (m,1H)、2.67 (d,1H)、2.82 (m,2H)、3.00 (m,1H)、3.58 (dd,2H)、4.20 (t,1H)
HPLC: カラム: Symmetry C18 (5 μ) 3.9x150 mm;
移動相: KH2PO4 50mM/CH3CN 65/35;
流速: 1.0 ml/分、室温;
R.T.: 12.19 分
【０１４１】
β-ターン模倣体Beta9を含むペプチド模倣化合物の合成に有用な構成要素 ST2775 (78)を、スキーム 8にしたがって、Ehab M. Khalil およびその同僚、J. Med. Chem.; 1999、42、628-637により記載された方法を用いて合成された中間体 75まで、次いで以下の実施例 9 に記載の方法を用いて合成した。
【０１４２】
スキーム 8
ST2775の合成
【化４０】
2008524167.tif 000043
【０１４３】
実施例 9
(2R,3'S,8a'R)-1-[(9H-フルオレン-9-イル-メトキシ)カルボニル]-5'-オキソテトラヒドロ-7'H-スピロ[ピロリジン-2,6'-[1,3]-チアゾール[3,2-a]ピリジン]-3'-カルボン酸 ST2775 (78) の調製
中間体 (2R,3'S,8a'R)-1-(terz-ブトキシ-カルボニル)-5'-オキソテトラヒドロ-7'H-スピロ[ピロリジン-2,6'-[1,3]チアゾール[3,2-a]-ピリジン]-3'-カルボン酸 (76) の調製
1.5 g (0.004 mol)の(2R,3'S,8a'S)-5'-オキソテトラヒドロ-1H,7'H-スピロ[ピロリジン-2,6'-[1,3]チアゾール[3,2-a]ピリジン]-1,3'-ジカルボン酸 1-terz ブチル 3'-メチルエステル (75)を80 mlの MeOHおよび50 mlの H2Oに溶解した。溶液に1.1 g (0.008 mol)の K2CO3 を添加し、反応混合物を室温で撹拌して20時間放置した。
【０１４４】
反応溶液をpHをHCl 2N で5に下げることによって処理し、次いで減圧下で乾燥させた。得られた残渣をH2Oにとり、pH 2-3にし、抽出をCHCl3で行った。有機相を無水 Na2SO4で脱水し、次いで 蒸発させて乾燥させ、1.4 gのガラス状白色固体を得た(収率: 100%)。
【０１４５】
TLC: CHCl3 8/MeOH 2/CH3COOH 0.1; RF: 0.7
1H-NMR (300 MHz、CDCl3) δ 1.45、1.50 (2s,9H)、1.60-2.18 (m,6H)、2.20-2.50 (m,2H)、3.20-3.80 (m,4H)、4.95 (dd,1H)、4.38 (dd,1H)、7.35 (sa,1H)
【０１４６】
中間体 (2R,3'S,8a'R)-3'-カルボキシ-5'-オキソ-テトラヒドロ-7'H-スピロ[ピロリジン-2,6'-[1,3]チアゾール[3,2-a]ピリジン] トリフルオロアセテート (77) の調製
1.4 g (0.004 mol)の(2R,3'S,8a'R)-1-(terz-ブトキシカルボニル)-5'-オキソテトラヒドロ-7'H-スピロ[ピロリジン-2,6'-[1,3]チアゾール-[3,2-a]ピリジン]-3'-カルボン酸 (76)を25 mlの CH2Cl2 および25 mlの トリフルオロ酢酸に溶解した。混合物を室温で撹拌した; 2 時間後、30℃で蒸発を行った。得られた残渣を少量の CHCl3に可溶化し、Et2Oで沈殿させ、形成した沈殿を迅速にろ過した。この操作を２回繰り返した。1.07 gの非常に吸湿性の白色固体を得た(収率: 70%)。
【０１４７】
TLC: CHCl3 60/MeOH 40/H2O 15/IPrOH 10/AcOH 15; RF: 0.5
1H-NMR (300 MHz、D2O)δ 1.70-2.50 (m,8H)、3.15 (dd、1H)、3.22-3.60 (m,3H)、4.60-5.00 (m,2H)
【０１４８】
(2R,3'S,8a'R)-1-[(9H-フルオレン-9-イル-メトキシ)カルボニル]-5'-オキソテトラヒドロ-7'H-スピロ[ピロリジン-2,6'-[1,3]チアゾール[3,2-a]ピリジン]-3'-カルボン酸 ST2775 (78) の調製
1.00 g (00027 mol)の(2R,3'S,8a'R)-3'-カルボキシ-5'-オキソテトラヒドロ-7'H-スピロ[ピロリジン-2,6'-[1,3]チアゾール[3,2-a]ピリジン] トリフルオロアセテート (77) を50 mlの 水に溶解した。0.45 g (0.0054 mol)の NaHCO3および5分後、75 mlの アセトンに溶解した0.94 g. (0.0028 mol)の Fmoc-N-OSu を得られた溶液に添加した。さらなるアセトンを形成した懸濁液に溶液が得られるまで添加し、これを室温で撹拌して放置した。24 時間後、アセトンを蒸発させ、水を戻し、 洗浄をEt2Oにより行った。混合物を次いでHCl 2 N でpH 3にし、水相をCHCl3で抽出した。有機相を無水 Na2SO4で脱水し、減圧下で乾燥させ、1.2 gのガラス状白色固体を得た(収率: 90%)。
【０１４９】
M.P.: 95-100℃
E.A.: (C26H26N2O5S) 
理論値 3.76% H2Oとともに: C: 62.80; H: 5.69; N: 5.63; S: 6.44.
実測値:                  C: 57.27; H: 4.89; N: 4.97; S: 5.25
[α]20D： +108.6; 濃度MeOH 中0.5%
TLC: CHCl3 8/MeOH 2; RF: 0.64
1H-NMR (CDCl3 300 MHz): δ 1.60-2.20 (m,5H)、2.25-2.45 (m,2H)、2.80、3.05 (2dd,1H)、3.30 3.50 (m,2H)、3.50-3.70 (m,2H)、4.07、4.17-4.35 (s,m,2H)、4.37-4.50 (m,1H)、4.73、4.92 (t,dd,1H)、5.35、5.65 (2dd,1H)、5.00-6.40 (sa、1H)、7.22-7.45 (m,4H)、7.50-7.65 (m,2H)、7.65-7.80 (m,2H)
HPLC： カラム: Symmetry C18 (5 μ) 3.9x150 mm;
移動相: KH2PO4 50mM/CH3CN 60/40;
流速：1.0 ml/分、室温;
R.T.: 7.38 分;
【０１５０】
最終化合物の合成
スキーム 9
【化４１】
2008524167.tif 000044
【０１５１】
R1 = AA1 または AA6 または AA7 または AA5-AA6 (ベータ)
R2 = AA2 または AA2-AA3-AA4 (SP)(R1 = AA1の場合）
R2 = AA4 または AA2-AA3-AA4 (SP) （R1 = AA5-AA6 (ベータ) の場合）
R2 = AA5 （R1 = AA6の場合）
R2 = AA6 （R1 = AA7の場合）
R3 = AA3 （R2 = AA2の場合）
R3 = AA5 （R2 = AA6の場合）
R3 = AA4 または AA2-AA3-AA4 (SP) （R2 = AA5の場合）
R3 = AA3 （R2 = AA4の場合）
R3 = AA1 または AA5-AA6 (ベータ) （R2 = AA2-AA3-AA4 (SP) の場合）
R4 = AA4 または  AA2 (R3 = AA3の場合）
R4 = AA4 （R3 = AA5の場合）
R4 = AA3 （R3 = AA4の場合）
R4 = AA1 （R3 = AA2-AA3-AA4 (SP) の場合）
R5 = AA5 または AA3 （R4 = AA4の場合）
R5 = AA2 （R4 = AA3の場合）
R5 = AA1 （R4 = AA2の場合）
R6 = AA6 （R5 = AA5の場合）
R6 = AA2 （R5 = AA3の場合）
R6 = AA1 （R5 = AA2の場合）
R7 = AA7 （R6 = AA6の場合）
R7 = AA1 （R6 = AA2の場合）
【０１５２】
A.典型的脱保護方法.
B.第一アミノ酸またはβ-ターン模倣体 (AA5-AA6) と アミン基のカップリングの典型的手順
C.次のアミノ酸またはスペーサー (AA2-AA3-AA4)またはβ-ターン模倣体 (AA5-AA6) と カルボキシルのカップリングの典型的手順
D.アルギニノ模倣体基とカルボキシルのカップリングの典型的手順
E.典型的アセチル化方法
F.典型的切断方法
G.アザグリシンの形成の典型的手順
H.アザバリンまたはアザ-ロイシンの形成の典型的手順
I.グアニジン基の形成を伴うアルギニノ模倣体のカップリングの典型的手順
J. 末端アミン基の典型的グアニジニル化方法
【０１５３】
すべての分子は修飾 Rink リンカー (0.74 mmol/g)を備えるアミノメチル NovaGelTM からなるポリマー支持体上に合成し、ペプチド模倣体配列はFmoc 化学に基づくプロトコールによって合成した。反応は通常DMF中で、アシル化反応における活性化種としてHOBt-TBTU 、プロトンスカベンジャーとしてDIPEAを用いて行った。カルボキシル官能基のより激しい活性化が必要である場合、例えば、芳香族アミンのアシル化においては、反応 は70℃で行うか、または、Fmoc-保護アシル化種のカルボキシル官能基を対応する塩化アシル [1]に塩化チオニル (SOCl2)を用いて変換することによって行った。この場合、反応はテトラヒドロフラン中で70℃でプロトンスカベンジャーとしてDIPEAまたはコリジンを用いて行った。
【０１５４】
合成に用いた保護天然アミノ酸、溶媒および試薬はChem-Impexから購入した;置換アミノ安息香酸(スペーサー)はSigma-Aldrichから購入し、文献に記載されているようにフルオレニルメチルオキシカルボニル クロリド (Fmoc-Cl)で保護した。
【０１５５】
合成中間体および反応生成物のLC/MS およびMS-inf. 分析はThermofinnigan LCQ-Duo Mass Spectrometry System でHPLC-RP ランのために0.1% TFA でpH を緩衝したH2O-アセトニトリル グラジエント系 (溶媒 B) を用いて行った。
【０１５６】
【表２】
2008524167.tif 000045
【０１５７】
【表３】
2008524167.tif 000046
【０１５８】
HPLCランは、 Luna (Phenomenex) C18 カラム; 50 x 2 mm; 3 μm、流速 0.5 mL/分 (グラジエント 1) またはJupiter (Phenomenex) C18 カラム; 250 x 4.6 mm; 5 μm、流速 1.0 mL/分 (グラジエント 2)であり、 すべてはTFA/H2O/Tis/ (95:2.5:2.5) (300 μL) からなる切断混合物で乾燥樹脂 (5-10 mg)のサンプルを3 時間処理することによって得た材料で行った。
【０１５９】
半分取 HPLC 精製は Jupiter-Proteo (Phenomenex) C カラム; 250 x 21.2 mm; 10 μm; 90 オングストロームで、H2O-MeCN-TFA (97:3:0.1) グラジエント系 [溶媒 A]およびMeCN:H2O:TFA (80:20:0,1) [溶媒 B] を用いて行った。
【０１６０】
【表４】
2008524167.tif 000047
【０１６１】
略記
AAA：アミノ酸 (総称)
Ac2O：無水酢酸
DMF：ジメチルホルムアミド
DIPEA：ジイソプロピルエチルアミン
DIPEAabs：純粋な ジイソプロピルエチルアミン
Fmoc：9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
HOBt：1-ヒドロキシ-1-H-ベンゾトリアゾール
MeCN：アセトニトリル
分：分間
TBTU：2-(1H-ベンゾトリアゾール-1-イル)-1,1,3,3-テトラメチル-ウロニウム テトラフルオロボラート
THF：テトラヒドロフラン
TFA ：トリフルオロ酢酸
Tis：トリイソプロピルシラン
【０１６２】
典型的反応手順(スキーム 9参照)
典型的手順 A - Rink アミドMBHA 樹脂のリンカーのアミン官能基または樹脂に固着したペプチド-模倣体配列からのFmoc除去
キャップおよび多孔性フリット(porous frit)、そして底に排液栓を備えたポリプロピレン反応器において、樹脂の膨潤を塩化メチレン (15 mL/g 樹脂)およびジメチルホルムアミド (15 mL/g樹脂)を用いて行った。樹脂を次いでジメチルホルムアミド (15 mL/g樹脂)中のピペリジン25% 溶液で処理し、 Fmoc 保護基をリンカーのアミン官能基または樹脂に固着したペプチド模倣体配列から除去し、伸長させた(growing)。混合物を20 分間撹拌した。示された時間の後、脱保護混合物を排出し、樹脂をジメチルホルムアミド (15 mL/g樹脂、5 回繰り返し、各5分間) で洗浄した。 
【０１６３】
典型的手順 B -第一アミノ酸またはβターン模倣体のRink アミドMBHAへのローディング
キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓を備えたポリプロピレン反応器中で、セクション A に記載したようにして得た樹脂リンカーの遊離アミン官能基を、アシル化種 (樹脂に対して5 当量) で処理し、典型的手順 Cに記載のペプチド結合の形成のための標準的方法を用いて第一アミノ酸またはβ-ターン模倣体をローディングした。反応傾向を非反応アミンについてKaiser試験によってモニターした。陽性 Kaiser試験となると、樹脂を反応混合物から排出し、ジメチルホルムアミドで洗浄した (15 mL/g樹脂、5 回繰り返し、各洗浄につき5分間)。 
【０１６４】
典型的手順 C -ペプチジル-アミノアシル-樹脂またはβ-ターン模倣体-樹脂上へのアミノ酸または疎水性 スペーサーのローディング
キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓 を備えたポリプロピレン反応器中で、典型的手順 B に記載のように樹脂に固着したFmoc-脱保護ペプチド模倣体配列をアシル化種 (樹脂に対して5 当量)で処理し、ジメチルホルムアミド中0.5 M のHOBtおよびTBTU(樹脂に対して5 当量)およびジメチルホルムアミド中の1.0  M DIPEA (樹脂に対して10 当量)の溶液に溶解した。混合物を撹拌し、可能であれば、カップリング傾向をKaiser試験によりモニターした。120 分間以内に、樹脂を反応混合物から排出し、ジメチルホルムアミドで洗浄した(15 mL/g樹脂、5回繰り返し、各5分間)。
【０１６５】
典型的手順 D -アミノ酸またはアルギニノ模倣体の疎水性スペーサーの芳香族アミン官能基へのカップリング
ネジ口を備えたガラス反応器中の樹脂に固着したペプチド模倣体配列に、親 Fmoc-アミノ酸またはアルギニノ模倣体の塩化アシル (樹脂に対して5 当量、調製については典型的手順参照) およびテトラヒドロフランに溶解したプロトンスカベンジャー DIPEA (またはコリジン) (500 μL) を添加した。混合物を2 時間70℃で撹拌した。陽性試験結果が得られると、樹脂を反応混合物から排出し、ジメチルホルムアミド (15 mL/g樹脂、5 回繰り返し、各5分間) で洗浄した。
【０１６６】
アルギニノ模倣体塩化アシルの調製
典型的手順: 
ガラス反応器中で塩化チオニル (5 mL) をエチルエーテル中のアルギニノ模倣体酸またはFmoc 保護アルギニノ模倣体酸(20 mL 中16 mmol)の懸濁液にマグネティックスターラーで撹拌しながら添加した。得られた懸濁液を還流状態 (75-80℃)まで2 時間加熱した。 この期間中に、混合物は透明になった。変換が完了したら (メタノール溶解生成物のIPC: TLC 、シリカゲル 60 F 254 Merck プレート、溶出液 N-ヘキサン-AcOEt 70:30)、反応混合物 を周囲温度まで冷却し、溶液を蒸発させた。油性残渣を、N-ヘキサン (4 x 50 mL)と共蒸発させ、 高減圧下で乾燥させ、最終的に目的生成物を得た。
【０１６７】
典型的手順 E - 樹脂に固着したペプチド模倣体のN-末端 アミン官能基のアセチル化
ペプチド模倣体の合成およびFmoc 保護基の除去が典型的手順 Aに記載のようにして完了したら、キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓 を備えたポリプロピレン反応器中で、樹脂に固着した配列をAc2O/DIPEA/DMFの混合物[15:45:40] (10 mL/g樹脂、２回繰り返し、各30 分間) で処理し、ペプチド模倣体配列のN-末端 アミノ酸のα-アミン官能基をアセチル化した。アセチル化傾向をKaiser試験によりモニターした。陽性試験結果が得られると、樹脂を反応混合物から排出し、ジメチルホルムアミド (15 mL/g樹脂、5 回繰り返し、各5分間) 、ジクロロメタン (15 mL/g樹脂、3 回繰り返し、各5分間)、エチルエーテル (15 mL/g樹脂)で洗浄し、窒素ガス流を通すことにより乾燥させた。
【０１６８】
典型的手順 F -ペプチド模倣体配列のRink アミドMBHA 樹脂からの脱離
キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓を備えたポリプロピレン反応器中で、樹脂を、エチルエーテルおよび窒素流で洗浄した後、TFA-Tis-H2Oの混合物[95:2,5:2.5] (10 mL/g樹脂) で処理し、ペプチド模倣体を脱離させた。混合物を2 時間撹拌した。示された時間の後、混合物を樹脂からろ過し、エチルエーテル (15 mL) をろ液に添加した。得られた溶液を12 時間-20℃で冷却した。沈殿を溶液から分離し、混合物を遠心分離して固体を回収した。後者の非存在下では、溶液を減圧下で蒸発させ、残渣を回収した。
【０１６９】
典型的手順 G -樹脂上でのアザグリシンの形成
この手順のために用いたプロトコールは、J. Org. Chem.; 1999、64,7388-7394の記事にてKessler に記載されたものであり、Fmoc- 保護Rink アミドMBHAをその典型的手順 Aに記載のような処理の後に使用し、記事に記載の樹脂は用いなかった:
【０１７０】
キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓を備えたポリプロピレン反応器中で、典型的手順 B に記載のように調製したFmoc 脱保護Rink アミドMBHA 樹脂または樹脂に固着したFmoc-脱保護ペプチド模倣体配列を無水 CH2Cl2 (3x1 mL)で洗浄し、無水 CH2Cl2 (1 mL)中の5-(9H-フルオレン-9-イルメトキシ)-1,3,4-オキサジアゾール-2(3H)-オン (樹脂に対して5 当量) の溶液を添加した。反応混合物を室温で90 分撹拌し、樹脂を反応混合物から排出し、無水 CH2Cl2 (3x1 mL)およびジメチルホルムアミド (3x1 mL) で洗浄した。
【０１７１】
典型的手順 H -樹脂上でのアザバリンおよびアザロイシンの形成
この手順のために用いたプロトコールは樹脂上でのアザ-アラニンの形成についてのJ. Org. Chem.; 1999、64,7388-7394 の記事にてKessler により記載されたものであり、典型的手順 Aの記載に従ってそれを処理した後、2-(クロロカルボニル)-1-Fmoc-2-イソプロピル-ヒドラジンまたは2-(クロロカルボニル)-1-Fmoc-2-イソブチル-ヒドラジンを2-(クロロカルボニル)-1-Fmoc-2-メチル-ヒドラジンの代わりに用い、Fmoc-保護Rink アミドMBHA 樹脂を記事に記載の樹脂の代わりに用いた:
【０１７２】
キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓を備えたポリプロピレン反応器中で、典型的手順 B に記載のように調製した Fmoc 脱保護Rink アミドMBHA 樹脂または樹脂に固着したFmoc-脱保護ペプチド模倣体配列を無水 ジメチルホルムアミド (3x1 mL) で洗浄し、1 mlの 無水 ジメチルホルムアミド中の2-(クロロカルボニル)-1-Fmoc-2-イソプロピル-ヒドラジンまたは2-(クロロカルボニル)-1-Fmoc-2-イソブチル-ヒドラジン (樹脂に対して5 当量)および47 μLのDIPEAの溶液を添加した。 反応混合物を室温で15時間撹拌し、樹脂を反応混合物から排出し、無水 ジメチルホルムアミド (3x1 mL) で洗浄した。
【０１７３】
典型的手順 I-アルギニノ模倣体 AM8の調製
Rink アミドMBHA 樹脂上でのFmoc-イソチオシアナートによるグアニジル基の合成
キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓を備えたポリプロピレン反応器中で、ジメチルホルムアミド (4.0 mL/g) に溶解したFmoc-イソチオシアナート (樹脂に対して10 当量)を典型的手順 A に記載のように処理したRink アミドMBHA 樹脂に添加した。混合物を12 時間撹拌した。この時間の後、樹脂を排出し、ジメチルホルムアミド (5 mL x 5) で洗浄し、ジメチルホルムアミド (10 mL)中のCH3I (樹脂に対して10 当量) およびDIPEA (樹脂に対して30 当量) の溶液で処理した。混合物を2 時間室温で撹拌し、次いで排液し、ジメチルホルムアミド (5 mL x 5)で洗浄した。この物質にジメチルホルムアミド (10 mL)中の1,4-ジアミノブタンの溶液(樹脂に対して10 当量)を添加した。混合物を12 時間室温で撹拌した。この時間の後、樹脂を排出し、ジメチルホルムアミド (5 x 5 mL) で洗浄した。
【０１７４】
典型的手順 J - Rink アミドMBHA 樹脂に固着したペプチド模倣体配列の末端アミン官能基のグアニジニル化
キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓を備えたポリプロピレン反応器中で、Fmoc-非含有ペプチド模倣体配列が固着した樹脂をN-末端 アミン官能基の、ジクロロメタン (15 mL/g)中の1,3-ジ-Boc-2-(トリフルオロメチルスルホニル)グアニジン (3.0 当量) の溶液によるグアニジニル化により処理した。混合物を24 時間撹拌した。陽性試験結果が得られると、樹脂を排出し、反応混合物をジクロロメタン (15 mL/g樹脂、5 回繰り返し、各5分間)およびエチルエーテル (15 mL/g樹脂)で洗浄し、窒素ガス流により乾燥させた。
【０１７５】
実施例 10
ST2565 [Ac-thr-gly-pro-leu-val-asp-arg-NH2、MW = 797.4]の調製
キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓を備えたポリプロピレン反応器中で、Fmoc-(D)Arg(pbf)-OH (250 μmol) を典型的手順 Aに記載のように処理したRink アミドMBHA (66 mg、~ 50 μmol) に添加し、第一アミノ酸を上記のようにローディングした。混合物を45 分間撹拌した。示された時間の後、樹脂をジメチルホルムアミド (2 mL x 5) で洗浄し、Fmoc除去のための処理をした (典型的手順 A)。 記載した合成サイクル を繰り返して第一のアミノ酸の後に以下のアミノ酸をローディングした。伸長しているペプチド模倣体に、以下を順に添加した：Fmoc-(D)Asp(Ot-Bu)-OH (250 μmol)、Fmoc-(D)Val-OH (250 μmol)、Fmoc-(D)Leu-OH (250 μmol)、Fmoc-(D)Pro-OH (250 μmol)、Fmoc-Gly-OH (250 μmol)、およびFmoc-(D)Thr(OtBu)-OH (250 μmol)。カップリングはKaiser試験によりモニターした。配列が完了し、上記のようにFmocを除去して、ペプチド模倣体をAc2O/DIPEA/DMF [15:45:40] の溶液(2 mL x 2 x 30 分)で処理し、最後のアミノ酸のα-アミン官能基のアセチル化を上記のように行った。アセチル化傾向をKaiser試験によりモニターした。陽性試験結果が得られると、樹脂をジメチルホルムアミド (2 mL x 5)、ジクロロメタン (2 mL x 3)、およびエチルエーテル (2 mL) で洗浄し、窒素ガス流で乾燥させた。
【０１７６】
乾燥樹脂をTFA-Tis-H2O [95: 2.5: 2.5] の混合物を用いてペプチド切断(1 mL、2 時間)により上記のように処理した。示された時間の後、混合物をろ過し、エチルエーテル (15 mL)をろ液に添加した。この操作の結果、沈殿が溶液から分離した。懸濁液を-20℃で12 時間維持し、次いで遠心分離した。得られた固体をH2O/アセトニトリル/TFAの溶液[50:50:0.1] (5 mL) に溶解し、凍結乾燥し、目的ペプチドを得た [13.5 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 5.70 分間; Ms: (m +1) = 所与の範囲内]。
【０１７７】
実施例 11
ST2792 [PAM9-SP02-Beta2-Thr-NH2、MW = 552.1] の調製
キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓を備えたポリプロピレン反応器中で、Fmoc-Thr(OtBu)-OH (250 μmol) を典型的手順 Aに記載のように処理したRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~ 50 μmol)に添加し、典型的手順BおよびC に記載のように第一アミノ酸をローディングした。混合物を45 分間撹拌した。この時間の後、樹脂を反応混合物から排出し、ジメチルホルムアミド (2 mL x 5) で洗浄し、典型的手順 A でFmoc除去処理した。 
【０１７８】
記載した合成サイクルを繰り返し、Fmoc-[Beta2]-OH (250 μmol)およびFmoc-SP02-OH (250 μmol)をローディングした。Fmocの除去の後、PAM9-Cl (250 μmol) を典型的手順 Dに記載のように得られたペプチド-模倣体配列に添加し、DIPEAをPAM9-ClとSP02のアミン官能基とのカップリング 反応におけるスカベンジャーとして用いた。混合物を2 時間70℃で撹拌した。陽性試験結果が得られると、樹脂を反応混合物から排出し、ジメチルホルムアミド (2 mL x 5)、ジクロロメタン (2 mL x 3)、およびエチルエーテル (2 mL x 3) で洗浄し、窒素ガス流により乾燥させた。最後に、乾燥樹脂を、典型的手順 Fに記載のようにペプチド模倣体の切断処理した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RPにより精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た[9.1 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 5.55 分間; Ms: (m + 1) 所与の範囲内］。
【０１７９】
実施例 12 
ST2864 [Ac-Gly-Pro-SP30-Arg-NH2、MW =  502,6] の調製
示したペプチド模倣体配列をRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol)上で実施例 11 に記載のように合成した。 樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た[19.0 mg; LC (グラジエント 2): 保持時間 = 17.31 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。 
【０１８０】
実施例 13
ST2794 [PAM9-Asp-Val-Val-Beta2-NH2、MW = 615.2] の調製
示したペプチド模倣体配列 を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RPにより精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [19.0 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 6.20 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１８１】
実施例 14
ST2796 [AM9-SP02-Pro-Gly-NH2、MW = 433.2] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。配列が完了し、Fmocを除去したら、樹脂上のペプチド模倣体を、典型的手順 Jに記載のようにβ-アラニンの末端アミン官能基のグアニジニル化により処理した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [10.0 mg; LC (グラジエント 2): 保持時間 = 19.12 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１８２】
実施例 15
ST2863 [AM9-SP17-Pro-Gly-NH2、MW = 460.5] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 13に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [12.5 mg; LC (グラジエント 2): 保持時間 = 18.12 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。 
【０１８３】
実施例 16
ST2797 [PAM8-SP15-Pro-Gly-NH2、MW = 492.1] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [8.3 mg; LC (グラジエント 2): 保持時間 = 29.03 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１８４】
実施例 17
ST2807 [PAM9-(SP31)3-Pro-Gly-NH2、MW = 675.5] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で典型的手順 Cを３回繰り返して合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [4.4 mg; LC (グラジエント 2): 保持時間 = 22.54 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１８５】
実施例 18
ST2798 [PAM9-SP38-Pro-Gly-NH2、MW = 445.3] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [11.8 mg、LC (グラジエント 2): 保持時間 = 18.83 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１８６】
実施例 19
ST2799 [Ac-arg-asp-val-leu-Beta1-NH2、MW = 722.3] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 10に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [11.9 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 6.30 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１８７】
実施例 20
ST2801 [Ac-Arg-SP12-Beta2-Thr-NH2、MW = 629.3] の調製
示したペプチド模倣体配列を典型的 手順 A、B、C および D に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol)上で合成した(この場合、コリジンをFmoc-Arg(pbf)-Cl とスペーサー 12 アミン官能基とのカップリング 反応および典型的手順Eおよび Fにおけるスカベンジャーとして用いた)。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [2.9 mg; LC (グラジエント 2): 保持時間 = 18.16 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１８８】
実施例 21
ST2804 [Ac-Arg-SP02-Beta 2-Gly-NH2、MW = 601.0] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 21に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [2.7 mg; LC (グラジエント 2): 保持時間 = 18.22 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１８９】
実施例 22
ST2806 [AM8-SP38-Beta6-NH2、MW = 571.3] の調製
キャップおよび多孔性フリット、ならびに底に排液栓を備えたポリプロピレン反応器中で、Rink アミドMBHA 樹脂 (135 mg、~100 μmol)を典型的手順 Iに記載のように処理した。ペプチド模倣体配列の合成を樹脂上で構成されたG8 (80 mg樹脂 ~50 μmol)上で、典型的手順B、C およびFに記載のように完了させた。樹脂からの切断により得られた物質を、HPLC-RPにより精製し、凍結乾燥し、最終的に目的生成物を得た [0.9 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 6.78 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１９０】
実施例 23
ST2805 [NH2-arg-SP02-Beta5、MW = 578.3] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [0.3 mg、LC (グラジエント 2): 保持時間 = 20.70 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１９１】
実施例 24
ST2825 [PAM4-SP19-Beta8-NH2、MW = 591.0] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [9.3 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 =12.28 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１９２】
実施例 25
ST2828 [H-SP32-Beta3-NH2、MW = 384.1] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [33.3 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 7.62 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１９３】
実施例 26
ST3324 [PAM11-SP19-Beta8-NH2、MW = 572.7] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。 樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [9.4 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 =17.30 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１９４】
実施例 27
ST3374 [PAM10-SP6-Beta8-NH2、MW = 514.99] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [1.6 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 10,15 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１９５】
実施例 28
ST3375 [PAM3-SP30-Beta8-NH2、MW = 557.07] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [0.6 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 11,23 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１９６】
実施例 29
ST2793 [PAM8-SP20-Beta3-NH2、MW = 569.2] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [3.5 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 10.02 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１９７】
実施例 30 
ST2941 [PAM3-SP33-Beta8-NH2、MW =  533,0] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [1.3 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 10.08 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１９８】
実施例 31
ST2826 [PAM6-SP20-Beta8-NH2、MW = 565.2]の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成した。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [5.5 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 8.87 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０１９９】
実施例 32
ST2926 [H-Arg-Gly-AzaVal-Val-Pro-Gly-NH2、MW = 583,7] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成し、ただし、アザバリンの形成は典型的手順 Hの記載にしたがって行った。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [4.9 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 4.98 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０２００】
実施例 33
ST3032 [Ac-Azagly-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2、MW = 755.8] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成し、ただし、 アザグリシンの形成は典型的手順 Gの記載にしたがって行った。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [10.0 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 8.25 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０２０１】
実施例 34
ST2927 [Ac-Arg-Asp-Azagly-Val-Pro-Gly-NH2、MW = 641.7] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成し、ただし、 アザグリシンの形成は典型的手順 G の記載にしたがって行った。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [18.2 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 5.17 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０２０２】
実施例 35
ST2930 [Ac-thr-Azagly-pro-leu-val-asp-arg-NH2、MW = 798.9] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成し、ただし、 アザグリシンの形成は典型的手順 G の記載にしたがって行った。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [19.1 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 6.20 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０２０３】
実施例 36
ST2920 [Ac-Arg-Asp-Val-AzaVal-Pro-Gly-NH2、MW = 681.8] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成し、ただし、 アザバリンの形成は典型的手順 Hの記載にしたがって行った。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [11.7 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 5.88 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０２０４】
実施例 37
ST2928[Ac-Arg-Asp-AzaLeu-Val-Pro-Gly-NH2、MW = 697.8] の調製
示したペプチド模倣体配列を実施例 11に記載のようにRink アミドMBHA 樹脂 (66 mg、~50 μmol) 上で合成し、ただし、 アザロイシンの形成は典型的手順 H の記載にしたがって行った。樹脂からの切断生成物を、HPLC-RP により精製し、凍結乾燥し、最終的に目的分子を得た [12.00 mg; LC (グラジエント 1): 保持時間 = 5.18 分間; Ms: (m +1) 所与の範囲内]。
【０２０５】
本発明による化合物は、 医薬および生物学的アッセイにおける使用のための手段として有用である。
【０２０６】
それらの活性はタンパク質 MyD88のホモ二量体化の阻害であり、したがって多数の炎症誘発性シグナルを阻害することができ、より有効な治療薬を構成することができるものである。
【０２０７】
一般用途において、本発明は、TLR/IL-R1 受容体系のシグナル伝達系の調節不全に由来する疾患の治療に有用な医薬の調製のための式 (I)の化合物の使用を提供する。
【０２０８】
当業者であれば、上記の分子生物学的機構に基づいて、治療しうる疾患を決定することが出来る。
【０２０９】
本発明により治療しうる疾患は以下からなる群から選択される：炎症性および自己免疫疾患; 心血管およびアテローム生成疾患; 敗血症およびショック;および移植片拒絶。
【０２１０】
炎症性および自己免疫疾患の例は、関節炎、慢性炎症性腸疾患 (IBD)、乾癬、1型糖尿病、多発性硬化症、喘息、および全身性エリテマトーデスである。
【０２１１】
心血管およびアテローム生成疾患の例は、心筋梗塞、ウイルス性心筋炎、アテローム性動脈硬化症、静脈移植アテローム性動脈硬化症、血栓症、再狭窄、ステントによる再狭窄および血管形成術による再狭窄である。
【０２１２】
非炎症性疾患の例は癌およびAIDSである。
【０２１３】
本発明による医薬は通常の臨床試験にしたがって判断される有効量の 式 (I)の化合物を含むものであろう。かかりつけ医は、治療すべき疾患のタイプ、患者の症状および併用療法にしたがって薬量学を決定するであろう。
【０２１４】
生物学的アッセイ
本発明の対象である化合物を生物学的試験に供し、MyD88のホモ二量体化を部分的または完全に阻害する能力を同定し、したがってNF-kBの活性化を調節する能力を同定した。この目的のために、３タイプのアッセイを用いた: a) 酵母におけるダブルハイブリッドアッセイ、これを以下に簡単に説明する、b) 以下にも報告するNF-kB 阻害アッセイ、およびc) 以下にも報告するルシフェラーゼ活性のレポーター遺伝子アッセイ。活性であるとみなされる化合物は３つの生物学的アッセイのいずれかにおいて活性であると判明したものである。
【０２１５】
a) ダブルハイブリッドアッセイ
酵母(Saccharomyces cerevisiae)におけるダブルハイブリッドシステムはインビトロで転写因子 GAL4を再構成する能力に基づき、転写因子 GAL4は２つの機能的ドメイン、即ち、活性化ドメイン (AD)と結合ドメイン (BD)とに分けることが出来る (Field、S.; Song、O.; Nature、1989、340:245-247; Chien、C.T.; et al.; Proc. Nat. Acad. Sci. USA; 1991、88:9578-9582)。もし分子生物学技術によって、これら２つのドメインが２つの相互作用可能なタンパク質と融合すれば、その結果、GAL4の機能的再構成が起こり、それによって、多数のレポーター遺伝子の転写がその固有の上流活性化配列 (UAS)の制御下で活性化するであろう。レポーター遺伝子のGAL4のUASの制御下での転写により選択培地での成長に重要な酵素の合成が可能となる。アッセイはその底にシリコンマトリックスが存在し、その中に蛍光物質が組み込まれており、その発光が酸素レベルに感受性の384-ウェルプレートを用いて行われる(Wodnicka、M.; et al.; J. Biomol. Scre-en; 1995、5:141-152)。 ダブルハイブリッドシステムにおいて相互作用がそれぞれGAL4のBDおよびAD ドメインに融合した２つのタンパク質の間で起こると、酵母は選択培地中で生育することが可能になり、酸素を消費し、時間の経過と比例して上昇する蛍光が放射され、好適な蛍光リーダーによって検出されるようになる (Fusion、Perkin Elmer)。酵母が相互作用を阻害することができる分子の存在下に置かれると、レポーター遺伝子の転写は低下し、したがって最少培地で生育する能力が阻害され、蛍光シグナルが低下する。
【０２１６】
ドメインADおよびBDと融合したMyD88 の発現に用いられるベクター(pGBKT7 および pGADT7) 、および酵母株 AH109 (共形質転換に用いるMATa、trp1-901 leu2-3 112 ura3-52 his3-200 gal4Δ gal80Δ)および最少培地 SGd/-Leu/-Trp および SGd/-Ade/-His/-Leu/-TrpはClontechから得た。アッセイに用いた384-ウェルプレートはBD Biosciences (Oxygen BioSensor Plates)から得、蛍光測定用装置は Perkin Elmer Fusionデバイスであった。２つの遺伝子融合体によって共形質転換された株 AH109(AD-MyD88およびBD-MyD88) を2 mlの SGd/-Leu/-Trp に前播種し、一晩30℃で200 rpmで撹拌下で インキュベートした。前播種物を次いで384-ウェル プレートの各ウェルについてアッセイされる分子の存在下で100 mlの SGd/-Ade/-His/-Leu/-Trpで希釈(1/20) した(終濃度 100 mM)。 プレートをFusionで30℃でインキュベートし、個々のウェルから放射した蛍光をフルオロフォアの励起波長485 nmを用いて測定し全部で25 回90 分間毎にプレートの底からの630 nmの発光を読んだ。蛍光強度は任意単位であり、それゆえ標準化が必要であった: ある時点nでのウェルの蛍光強度を同じウェルについての初期蛍光強度で割らなければならない。
【０２１７】
蛍光上昇曲線の分析
ダブルハイブリッドアッセイにより作成した蛍光上昇曲線をこのタイプの調査のための特別に作られたシステムにより分析した(ソフトウェアはChrysallis s.a.s. Software-houseが作成し、非制限使用ライセンスでTecnogen S.C.p.A.に許諾された)。 
【０２１８】
曲線分析システムはデータ獲得装置により作成されたファイルと直接にインターフェイスすることができ、データの前処理は必要なく、即時の定性型分析が可能である。
【０２１９】
例えば、図 1/4は、ほとんどのクラス2 化合物を含む１つのプレートから得た曲線を表す。蛍光の上昇についての曲線はNRFとして (時間 0に関する標準化相対蛍光)時間の関数として表される。
【０２２０】
ソフトウェアは個々の曲線の特徴を説明することが出来る定量的パラメーターを提供し、これは図に示すように、非常に異なる側面を表す。具体的には、７種類の記述子を用いた: 勾配 (プラトーの勾配)、レベル (プラトーの高さ)、範囲(プラトー範囲)、ΔT (成長時間)、t1/2(プラトー高さの50%までに成長する時間)、因子 (「hump」 因子)、およびTau (シグモイド τ)。これらの定量的パラメーターにより、実験曲線のセットの多次元表示を得ることが可能である。これから出発して、そして主成分の抽出技術を用いて、データの二次元表示が構築され、例えば、曲線の間の差異が可能な限り鮮明に強調される。分析したプレートから得られた曲線の間に同定された可変性を「説明する」要因の平面(異なる記号によって表示)は、様々なパラメーターまたはその組合せ(図 2/4)に起因する。
【０２２１】
第一の２つの要因軸によって説明される可変性は、77.6% + 13.7% = 91.3%であり第一の要因平面上の二次元グラフは曲線の空間的ばらつきの良好な程度の近似を表示するのに十分な値を超える。第一の要因軸は高いプラトーレベルを有する曲線を分離する傾向があり、それは本発明者らは低いプラトーレベルを有するものより軸の右側に見いだし、低いプラトーレベルのものは、軸の左側にある。後者はまた、右の曲線より高いΔT、Tau、t1/2、範囲および勾配を有するという特徴を示す。これら記述子の値は２つの軸の交差からのものよりも高い。
【０２２２】
このタイプの表示により類似の挙動を示す曲線の「群」の同定が可能となり(同じ記号で示す曲線は類似の特徴を有する曲線に対応する)、どの曲線が酸素の消費に影響を与えしたがって酵母の増殖に影響を与える化合物によって作成されたかの明らかな同定が可能となる。
【０２２３】
それゆえこの表示を提供したこのプレートから選択すると (図 3/4)、図 2/4において記号 xによって示される曲線の群は、以下の統計において報告されるこのプレートに存在する化合物によって作成される曲線の平均値と比較して、低いプラトーレベルを示し、高い成長時間 (ΔT) およびtau値を示す:
ΔT = 36.001 ± 0.0 (14.615 ± 10.252)
レベル = 2.884 ± 0.667 (4.763 ± 1.131)
勾配 = 0.263 ± 0.077 (0.125 ± 0.096)
範囲 = 0.801 ± 0.279 (0.364 ± 0.294)
Tau  = 30.005 ± 0.0 (8.805 ± 12.146)
t 1/2  = 33.006 ± 0.012 (25.142 ± 4.738)
因子 = 0.006 ± 0.002 (0.402 ± 0.258)
【０２２４】
括弧内の値は分析したプレートにおけるパラメーターについて得られた平均値である。
【０２２５】
さらに、図 2/4において記号 ●で示される曲線群はこのプレートから選択され、それらは平均より高い因子および平均より低いΔT 値を表すにもかかわらず、以下の統計において報告するようにプレートに存在する化合物によって作成された曲線の平均より大きいt 1/2、範囲および勾配を示す(図 4/4):
ΔT = 22.687 ± 1.577 (14.615 ± 10.252)
レベル = 4.044 ± 0.377 (4.763 ± 1.131)
勾配 = 0.261 ± 0.071 (0.125 ± 0.096)
範囲 = 0.746 ± 0.201 (0.364 ± 0.294)
Tau = 30.005 ± 0.003 (8.805 ± 12.146)
t 1/2 = 33.004 ± 0.0 (25.142 ± 4.738)
因子 = 0.619 ± 0.056 (0.402 ± 0.258)
【０２２６】
上記分析システムを本発明による化合物の選択に用いたすべてのプレートに同様に適用し、以下の結果を得た:
クラス 1
【化４２】
2008524167.tif 000048
クラス2
【化４３−１】
2008524167.tif 000049
【化４３−２】
2008524167.tif 000050
クラス 3
【化４４】
2008524167.tif 000051
【０２２７】
b) NF-kB 阻害アッセイ
NF-kBの活性化は、MyD88のホモ二量体化およびその多数の受容体複合体の細胞質内部分への結合の下流で起こる現象である。本発明の対象である化合物がIL1αによりトリガーされるシグナルの増幅カスケードの下流でNF-kBの活性化を阻害する能力をそれゆえ評価した。
【０２２８】
すべての分子は前もってMTT 細胞生死判別試験によりアッセイし、 NF-kB 阻害アッセイに用いる化合物の用量が毒性用量よりも低いことを確認した。 
【０２２９】
HeLa* 細胞を2 mM グルタミン + 1% 非必須アミノ酸+ 7.5% FBS (胎児ウシ血清) + 10 ml/lのペニシリン-ストレプトマイシン溶液(10,000 ユニット/ml ペニシリンおよび10 mg/ml ストレプトマイシン)を補充したEMEM (EBSS) 培地 で培養した。(すべての細胞培地および様々な成分はSigma-Aldrichから購入した。*HeLa 細胞株 ヒト ネグロイド 頸部上皮癌 ヒト、 SIGMA ALDRICH ECACC Ref No: 93021013。IL1α* = SIGMA I2778 インターロイキン-1-アルファIL1a ヒト、大腸菌で組換え発現)。
【０２３０】
細胞は細胞継代数14〜35回の後に用いた。
【０２３１】
細胞は完全培地中300,000 細胞/ウェルの密度で6-ウェルプレートに播種し、一晩37℃、5% CO2でインキュベートした。
【０２３２】
およそ18 時間後、完全培地を除去し、細胞をPBS 1xで２回洗浄し、1 mlの FBS-非含有培地を各ウェルに添加した。
【０２３３】
被験分子を次いで培地に100 μM濃度で添加した。細胞を次いで37℃、5% CO2で6 時間インキュベートした。
【０２３４】
アッセイしたすべての分子をDMSOに溶解した。
【０２３５】
等量の DMSO を陰性対照、即ち分子で処理していない細胞に添加した。
【０２３６】
分子による処理の最後に、細胞を5 ng/mlの IL1α* で30 分間刺激し、37℃、5% CO2でインキュベートした。
【０２３７】
等量の PBS/BSA 0.4% (IL1αの溶解に用いた溶液) を陰性対照、即ち非刺激細胞に添加した。
【０２３８】
IL1αによる刺激後、細胞を２回PBS 1xで洗浄し、細胞スクレイパーにより収集した。
【０２３９】
細胞を次いで4℃、10分 、800 rpmで遠心分離した。
【０２４０】
上清を除去した。ペレットを溶解バッファー**に再懸濁し、10分間4℃でインキュベートし、最高速度で4℃で遠心分離した。ペレットを除去し、上清を-80℃で凍結した。
【０２４１】
全タンパク質含量を次いでBradford アッセイにより標準として既知濃度のBSAを用いて測定し、以下に記載のELISA アッセイに用いた。
【０２４２】
NF-kBの活性化/阻害をTrans AM# (Active Motif) キットを用いて評価した。
【０２４３】
IlのTrans AMキットにより、常套のELISA アッセイの最後に得られる比色定量 反応を介してIL1αに誘導されるNF-kBの活性化の検出が可能である。
【０２４４】
キットはNF-kBのコンセンサス部位(5'-GGGACTTT-CC-3')を含むオリゴヌクレオチドを誘導体化した96-ウェルプレートを提供する。このオリゴヌクレオチドはIL1αによる刺激後に遊離するNF-kBの活性形態にのみ特異的に結合する。NF-kBの検出のための一次抗体は転写因子が活性であり、その標的DBNA 配列に結合している場合にのみ利用可能なp65 エピトープを認識する。二次抗体はセイヨウワサビペルオキシダーゼに結合されており、これは色素原基質を添加すると、比色定量反応を可能にし、これは分光光度的に波長450 nmで評価できる。 
【０２４５】
サンプルは二連でアッセイし、10 μgの各抽出物を各ウェルにロードした。
【０２４６】
アッセイの最後に、% 阻害を分光光度的読みにおいて得た値を以下のように処理することによって算出した:
IL*-C*/IL-C = NF-kB の% 活性化
IL* =刺激し、被験分子で処理した細胞のA450
C* =刺激せず、被験分子で処理した細胞のA450
IL =IL1αで刺激し分子で処理していない細胞のA450
C =刺激せず処理していない細胞のA450
【０２４７】
NFkB 活性化が大きいほど、アッセイされた分子の活性は低くなる。
【０２４８】
細胞溶解およびELISA アッセイの実施に用いたすべての試薬は使用したキットから供給された。 
【０２４９】
NF-kB 阻害アッセイにおいて陽性とみなされた化合物は％ 阻害＞15%のものであった。 
【０２５０】
クラス 1
【化４５】
2008524167.tif 000052
【０２５１】
クラス2
【化４６】
2008524167.tif 000053
【０２５２】
クラス 3
【化４７】
2008524167.tif 000054
【０２５３】
c) IL-1で刺激したヒト 腸管 CaCo2 上皮 細胞におけるルシフェラーゼ 活性のレポーター遺伝子アッセイ
それはCaCo2 ヒト 腸管上皮細胞の、そのルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現がIL -1 応答性 ヒト IL-8 プロモーター遺伝子領域の制御下にあるレポーター遺伝子 プラスミドとの一過性共トランスフェクションに基づく。共トランスフェクションにおける第二のプラスミドは対照 ウミシイタケ ルシフェラーゼ レポーター遺伝子をコードするベクターであり、その構成的発現が被験化合物の非特異的細胞毒性の評価に用いられる。アッセイの読み取りはホタルおよびウミシイタケ ルシフェラーゼについての以下の相対応答比 (Relative Response Ratio :RRR)について規定した:
RRR=〔（実験サンプル）−（陰性対照）〕／〔（陽性対照）−（陰性対照）〕x 100
ここで実験サンプルは、未知サンプルについて規定された実験レポーター発光の１秒ごとのカウント (cps)値である。陽性対照は参照阻害剤化合物の非存在下でIL-1による最大誘導を同定するサンプルについて規定されたレポーター発光のcps値である。陰性対照はIL-1による誘導の非存在を同定するサンプルについて規定されたレポーター発光のcps値である。非誘導性ウミシイタケ ルシフェラーゼについて、RRR は以下のように規定される:
RRR=（実験サンプル）／（陽性対照）x 100
【０２５４】
RGAは上記実験の読み取りであり、それは以下のように行った:
6x106 接着 CaCo2 細胞を10 cm プレートに播種した。18-24 時間後、培地を、9 mlの D-MEM + グルタミン 580 mg/L（FBSおよび抗生物質非含有）を用いて交換した。各プレートについて、26 μgのIL-1 応答性 レポーターベクター DNA (pGL2-NA-INT)および4μgの対照 レポーターベクター DNAを500 μL Optimem (Invitrogen) に溶解した。Lipofectamine 2000 試薬 (Invitrogen) 30 μLを次いで 500 μL Optimemに添加した; この後の反応混合物を5 分間室温でインキュベートした。DNA混合物を次いでLipofectamine 2000混合物に滴下した。その結果得られた DNA/Lipofectamine 混合物を20 分間室温でインキュベートし、それをプレートをゆっくりと回転させながら培養プレートに滴下した。培養プレートを次いで約6 時間37℃、5% CO2でインキュベートした。細胞をトリプシン処理し、96 ウェルプレートに100μL 培地 中(D-MEM （FBS 1%+ グルタミン 580 mg/L含有）)5x104 細胞/ウェルとなるよう、実験計画に応じてに移した。その後、細胞を16-18 時間37℃で5% CO2でインキュベートし、以下のように処理した:
各ウェルから培地を取り出す
60μLの新鮮培地を対照細胞ウェルに添加する
40μLの新鮮培地をIL-1 処理ウェルに添加する
40μLの新鮮培地および 20μLの物質100 μM濃度および0.4% DMSOを阻害剤物質ウェルに添加する
20μLの0.4% DMSOを追加した新鮮培地をIL-1 処理ウェルおよび対照細胞ウェルに添加する
37℃、5% CO2で4 時間インキュベートする
2 時間後、20μLのIL-1 (500 pg/mL)でさらに２時間37℃5% CO2で刺激する
適当な量のルシフェラーゼ標準タンパク質をさらなるアッセイウェルに含める
各ウェルに 80 μLの ホタルルシフェラーゼ基質 (Dual-Glo Luciferase Assay System Reagant)を添加する
室温で10分間インキュベートする
ホタルルシフェラーゼ出力をVeritasルミノメーター(Turner BioSystems)で読み取る
即時に各ウェルに 80 μLのウミシイタケ ルシフェラーゼ基質を添加する(Dual-Glo Luciferase Assay System Reagant)
室温で10分間インキュベートする
ウミシイタケ ルシフェラーゼ出力をVeritasルミノメーター(Turner BioSystems)で読み取る
【０２５５】
RGA アッセイにおいて陽性とみなされる化合物は％阻害 ＞ 20%のものであった。 
【０２５６】
クラス2
【化４８】
2008524167.tif 000055
【０２５７】
クラス 3
【化４９】
2008524167.tif 000056
【０２５８】
本発明によると、医薬組成物は少なくとも１つの活性成分を、例えば、有意な治療効果を生じる量にて含む。本発明に含まれる組成物は完全に常套的なものであり医薬産業での慣行の方法により得られ、例えば、Remington's Pharmaceutical Science Handbook、Mack Pub. N.Y Latest editionにより得られる。適用した投与経路にしたがって、組成物は固体または液体形態であり、経口、非経口または静脈内投与に好適なものであろう。本発明による組成物は、活性成分とともに、少なくとも１つの医薬上許容される媒体または賦形剤を含む。製剤補助剤は特に有用であり得、例えば可溶化剤、分散剤、懸濁化剤または乳化剤が挙げられる。
【０２５９】
本発明による化合物のペプチド性の性質により、当業者であれば胃内保護または徐放形態において経口投与のための医薬組成物に化合物を製剤する方法を決定することが出来る。
【図面の簡単な説明】
【０２６０】
原文に記載無し
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008524167.tif 000086
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