(57)【要約】  ＲＩＰを含む組成物は、好都合には、持続放出及び分解からの保護を可能にし、治療効果を改善した組成物に調合される。そのためには、ＲＩＰ組成物は、軟膏等として皮膚又は粘膜に送達されてもよい。代わりに又はそれに加えて、ＲＩＰ組成物は、生分解性であってもよいポリマーナノ粒子担体で投与されてもよい。このような製剤は、経口投与に適している。ナノ粒子は、ＲＩＰ及び少なくとも１つの他の抗菌剤、例えば、抗生物質又は抗菌ペプチドを含む組成物を収納してもよい。ナノ粒子は、さらに、細胞標的化を支援するために、被覆又は抗体若しくはその断片のような部分を含んでもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド（ＲＩＰ）を含むポリマーナノ粒子を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記ＲＩＰが
（ａ）配列ＹＸ2ＰＸ1ＴＮＦの隣接する５個のアミノ酸、式中、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸であり、Ｘ2は、Ｋ又はＳであり；あるいは
（ｂ）２個の置換又は欠失によって配列ＹＸ2ＰＸ1ＴＮＦとは異なった配列を有するアミノ酸、式中、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸であり、Ｘ2は、Ｋ又はＳであるを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＲＩＰが、配列ＹＳＰＸ1ＴＮＦから成らず、式中、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＲＩＰが、１個の置換又は欠失によって配列ＹＸ2ＰＸ1ＴＮＦとは異なった配列を有するアミノ酸を含み、式中、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸であり、Ｘ2は、Ｋ又はＳである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ＲＩＰが、アミノ酸配列ＹＫＰＸ1ＴＮＦを含み、式中、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＲＩＰ配列中のＸ2が、Ｋである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＲＩＰが、アミノ酸配列ＩＫＫＹＸ2ＰＸ1ＴＮＦを含み、式中、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸であり、Ｘ2は、Ｋ又はＳである、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＲＩＰが、配列ＰＣＴＮＦ、ＹＫＰＩＴＮＦ、又はＹＫＰＷＴＮＦを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＲＩＰが、長さにして１０個のアミノ酸である、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ナノ粒子が、抗生物質をさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記抗生物質が、アミノ−グリコシド又はベータ−ラクタムである、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記ナノ粒子が、抗菌ペプチドをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記ナノ粒子が、生分解性ポリマーを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記ナノ粒子が、約１０〜５０００ｎｍの平均径を有する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記ナノ粒子が、約２０００〜５０００ｎｍの平均径を有する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ナノ粒子が、約２００〜５００ｎｍの平均径を有する、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ナノ粒子が、正に帯電している、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ナノ粒子が、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリ（ラクチド−グリコリド）、ポリ（乳酸）、ポリ（グリコール酸）、又はポリ（カプロラクトン）ポリマーを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ナノ粒子が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）とグリコール酸を約５０：５０の割合で含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ナノ粒子が、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）とグリコール酸を約６５：３５〜約７５：２５の割合で含む、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ナノ粒子が、破裂−放出の反応速度論を示す、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ナノ粒子の表面が、ポリ（エチレングリコール）、ポロキサマー、又はポロキサミンを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記ナノ粒子の表面が、標的細胞の表面上の部分に対して特異的な親和性を有する分子を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記ナノ粒子が、ナノスフェアである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記ナノ粒子が、ナノカプセルである、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
ＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド（ＲＩＰ）を含むポリマーナノ粒子を含む医薬組成物を製造する方法。
【請求項２８】
前記ＲＩＰを含む水相と前記ポリマーを含む有機相とを均質化し、エマルジョンを作り出すことを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
溶媒蒸発又は溶媒拡散をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
個体における細菌感染を治療し又はその危険性を低下させる方法であって、前記個体における細菌感染を治療し又はその危険性を低下させるのに有効な量で、ＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド（ＲＩＰ）を含むポリマーナノ粒子を投与することを含む方法。
【請求項３１】
前記ナノ粒子が、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、鼻腔内、局所、又はイオントフォレーゼによる経路によって投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記細菌感染が、細菌性敗血症、細菌誘導による全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、蜂巣炎、角膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、乳腺炎、皮膚感染、肺炎、心内膜炎、髄膜炎、手術後の創感染、装置に関連した感染、歯周炎、又は毒素性ショック症候群に関連する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記細菌感染が、バイオフィルムに関連する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
細菌感染を治療し又はその危険性を低下させるのに有効な量でＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド（ＲＩＰ）を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物が哺乳動物の個体の皮膚又は粘膜表面に送達されると、ＲＮＡＩＩＩが前記細菌感染に対し機能を果たす、医薬組成物。
【請求項３５】
前記組成物が、半固体の組成物、粘性のあるエマルジョン、スプレー、洗液、フォーム、デポジットリー（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）又はデポット（ｄｅｐｏｔ）として調合される、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３６】
前記ＲＩＰが、ポリマーナノ粒子に含有される、請求項３４に記載の医薬組成物。
【請求項３７】
ナノ粒子が生分解性である、請求項３５に記載の医薬組成物。
【請求項３８】
前記組成物が、オイル、皮膚水和剤（ｈｙｄｒａｔｏｒ）、抗生物質、鎮痛剤、又は抗炎症剤をさらに含む、請求項３４に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、参照により本明細書中に全体として援用される２００５年５月１０日に出願された米国特許仮出願第６０／６７９，５１６号の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本出願は、全般的に、ナノ粒子担体システムを有する又は有しない、粘膜表面へのＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチドを送達するための薬理組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド
最近の研究によって、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含む細菌種の病理学においてクオラムセンシングが重要であることが明らかになった。クオラムセンシングとは、細菌集団が隣接細胞からの情報を受け入れ、宿主内で自らが生存できるように適切な応答を誘発する機構である。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０：４３８−４０（１９９８年）；ミラーら（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）セル（Ｃｅｌｌ）１１０：３０３−１４（２００２年）；ヘンツァーら（Ｈｅｎｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）エンボ・ジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）２２：３８０３−１５（２００３年）；コレムら（Ｋｏｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．）エフイーエムエス・マイクロバイオロジー・レター（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．）２２３：１６７−７５（２００３年）を参照されたい。ブドウ球菌属では、クオラムセンシングは、疾患助長に関与する定着、散在、及び複数の毒素の産生など細菌毒性に関わるタンパク質の発現を調節する。これらの毒性因子のいくつかは、宿主の免疫システムの過剰刺激を引き起こすスーパー抗原として作用するエンテロトキシン及び中毒性ショック症候群トキシン−１（ＴＳＳＴ−１）であり、これらはサイトカインの過度の放出を引き起こし、Ｔ細胞の過剰増殖を誘導する。
【０００４】
黄色ブドウ球菌におけるクオラムセンシングでは、エフェクタークオラムセンシング分子であるＲＮＡＩＩＩ活性化ペプチド（ＲＡＰ）が、ブドウ球菌属の中で高度に保存されている２１ｋＤａのタンパク質である「ＲＮＡＩＩＩ活性化タンパク質の標的」（ＴＲＡＰ）をリン酸化する。ＴＲＡＰリン酸化は、細菌付着、及び毒素合成に関与するＲＮＡＩＩＩと呼ばれる制御性ＲＮＡ分子の下流産生を助長する。バラバン（Ｂａｌａｂａｎ）（１９９８年）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７６：２６５８−６７（２００１年）。ＲＡＰの拮抗物質であるＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド（ＲＩＰ）は、ＴＲＡＰのリン酸化を阻害し、それによってインビボにおける毒性因子の下流産生、細菌付着、バイオフィルム形成、及び感染を強力に阻害する。ＲＩＰ作用の機構は、汎用の抗生物質とは異なる：細菌を殺傷する代わりに、ＲＩＰは、細菌の細胞−細胞コミュニケーションを阻害し、細菌を宿主の防御機構に対し脆弱化させる。バラバン（Ｂａｌａｂａｎ）（１９９８年）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ペプタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２１：１３０１−１１（２０００年）；ゴブら（Ｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）ペプタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２２：１６０９−２０（２００１年）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１８７：６２５−３０（２００３年）；シリオニら（Ｃｉｒｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）１０８：７６７−７１（２００３年）；リベリロら（Ｒｉｂｅｉｒｏ  ｅｔ  ａｌ．）ペプタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２４：１８２９−３６（２００３年）；ギアコメッティら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４７：１９７９−８３（２００３年）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）キドニー・インターナショナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．）２３：３４０−４５（２００３年）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４８：２５４４−５０（２００４年）；デル・アクアら（Ｄｅｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．）ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１９０：３１８−２０（２００４年）を参照されたい。
【０００５】
コロイド状薬物担体
リポソーム及びナノ粒子などのコロイド状薬物担体は、それらの生体内分布を変更し、それ故、それらの有効性を増加させ及び／又はそれらの毒性を低下させることによって従来の薬物分子及び新規な薬物分子の治療指数を改善するために使用されている。カプセル化した薬物の分布は、薬物自体の物理化学的性質に依存するよりはむしろ、担体の分布に従う。ワサンら（Ｗａｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．）イムノファルマコロジー・アンド・イムノトキシコロジー（Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ．）１７：１−１５（１９９５年）。
【０００６】
リポソームは、水性コンパートメントを取り囲む１以上の同心の脂質二重層からなる小胞である。薬物用の担体としてリポソームを使用する理論的根拠は、その薬物動態学及び組織分布を変更することによって薬物の有効性を改善することにある。Ａｌｌｅｎ、Ｄｒｕｇｓ  ５４：８−１４（１９９７年）。リポソームは、多用途の送達システムであると考えられる。リポソームのサイズ及びその他の物理化学的特徴、例えば、表面電荷、表面被覆、及び二重層の硬さは、脂質組成を変えることによって容易に操作することができる。このように、リポソームの生体内分布、安定性及び細胞間相互作用は、予測通りに調整することができる。ピント−アルファンドリーら（Ｐｉｎｔｏ−Ａｌｐｈａｎｄｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）インターナショナル・ジャーナル・オブ・アンチマイクロバイアル・エージェンツ（Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ）１３：１５５−６８（２０００年）；アブラら（Ａｂｒａ  ｅｔ  ａｌ．）バイオキミカ・エト・バイオフィジカ・アクタ（Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ）６６６：４９３−５０３（１９８８年）。ＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド用の担体としてのリポソームの使用は、例えば、２００３年２月３日出願の米国特許出願第１０／３５８，４４８号；２００１年４月１９日出願の米国特許出願第０９／８３９，６９５号；及び１９９８年４月２日出願の米国特許出願第０９／０５４，３３１号であって、現在の米国特許第６，２９１，４３１号に記載され、これらは、各々、参照により本明細書中に全体として援用される。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
概要
ＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチドを投与するための組成物は、好都合には、感染部位又は感染の危険性のある部位で、持続した高い局所濃度のＲＩＰを提供する。本発明は、宿主の外部表面、例えば、皮膚又は粘膜表面にＲＩＰ組成物の適用を提供する。適した組成物は、ＲＩＰを含む半固体の組成物、粘性のあるエマルジョン、スプレー、洗液、フォーム、デポジットリー（ｄｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）又は他の移植されたデポット（ｄｅｐｏｔ）を含む。ナノ粒子担体システムは、ＲＩＰ組成物を外的又は内的に送達するための好都合な送達ビヒクルを提供し、他のコロイド状送達システムよりも長い貯蔵期間及びインビボでの安定性を提供する。より大きなインビボでの安定性は、より長い持続送達、最終的には、細菌感染に晒される血液又は組織中でのＲＩＰ組成物のより大きな蓄積を可能にする。ＲＩＰ組成物を含むナノ粒子は、ＲＩＰ組成物の所望の分布に応じて、非経口的又は局所的に投与されてもよいが、このナノ粒子は、好ましくは、経口又は鼻腔内経路を通じて投与される。一実施態様において、ＲＩＰを外的に送達するために使用される組成物は、ＲＩＰを含有するナノ粒子を含む。別の実施態様において、ナノ粒子は、容器、例えばカプセル又は錠剤に入れて、あるいは宿主内に摂取され又は移植される装置の被覆に送達され、ＲＩＰ組成物の持続的な局所送達を提供する。
【０００８】
本発明の第１の側面によれば、ナノ粒子は、ＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド、場合によっては抗生物質又は抗菌ペプチドなどのＲＩＰの抗菌効果を補足又は助長する追加の活性剤を含むＲＩＰ組成物を含む。この組成物は、宿主による組成物の吸収を支援又は遅延する物質などの他の医薬として許容される物質をさらに含んでもよい。
【０００９】
ＲＩＰは、配列ＹＸ2ＰＸ1ＴＮＦの隣接する５個のアミノ酸を含んでもよく、ここで、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸であり、Ｘ2は、Ｋ又はＳであり；あるいは、２個の置換又は欠失によって配列ＹＸ2ＰＸ1ＴＮＦとは異なった配列を有するアミノ酸を含んでもよく、ここで、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸であり、Ｘ2は、Ｋ又はＳである。一実施態様において、ＲＩＰは、配列ＹＳＰＸ1ＴＮＦから成らず、ここで、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸である。代わりに、ＲＩＰは、１個の置換又は欠失によって配列ＹＸ2ＰＸ1ＴＮＦとは異なった配列を有するアミノ酸を含んでもよく、ここで、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸であり、Ｘ2は、Ｋ又はＳである。様々な他の実施態様において、ＲＩＰは、アミノ酸配列ＹＫＰＸ1ＴＮＦ、ここで、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸である；アミノ酸配列ＩＫＫＹＸ2ＰＸ1ＴＮＦ、ここで、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸であり、Ｘ2は、Ｋ又はＳである；あるいは、配列ＰＣＴＮＦ、ＹＫＰＩＴＮＦ又はＹＫＰＷＴＮＦの１つを含む。ＲＩＰは、長さにして１０個のアミノ酸であってもよく、組成物の約０．１重量％〜５０重量％、又は組成物の約２重量％〜２０重量％を含んでもよい。
【００１０】
本発明の第２の側面によれば、細菌感染と関連した疾患を治療する方法は、ナノ粒子担体システムに調合されるＲＩＰを含む組成物を投与することを含む。この方法は、全身性細菌感染、又は体の特定の組織、皮膚若しくは領域に局在化した感染を治療するために使用されてもよい。感染は、細菌種、蜂巣炎、角膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎又は乳腺炎と関連付けられてもよく、あるいは、この方法は、バイオフィルムと関連した細菌感染の治療、又はバイオフィルムと関連した疾患の危険性の低下に使用されてもよい。例えば、本組成物は、移植された装置がバイオフィルムを作り出すであろう危険性を低下させるために個体内に挿入された装置の被覆に使用されてもよい。ナノ粒子担体システムは、それを必要とする個体に送達される方法に適するように調合される。例えば、ＲＩＰ組成物を含むナノ粒子が、注入され又は注入される場合、それらは、薬理学的に許容される液体分散剤を含む液体懸濁液に調合されてもよい。皮膚又は粘液表面に適用される場合、ナノ粒子は、半個体の組成物又は粘性のあるエマルジョン、例えば、軟膏に含有されてもよい。他の適した製剤は、治療されるべき感染の性質及び所望の放出の反応速度論に応じて、スプレー、フォーム、洗液、インプラント、又はデポット等を含む。一実施態様において、ナノ粒子は、投与後１、２、３、７、又は２４時間以内に、ナノ粒子担体からの実質的な放出を意味する「破裂−放出の反応速度論」を示す。
【００１１】
本発明の第３の側面によれば、ＲＩＰ組成物は、皮膚又は粘膜であってもよい個体の外部表面に送達される。特定の適用に応じて、ＲＩＰ組成物は、ＲＩＰを含む半個体の組成物、粘性のあるエマルジョン、スプレー、洗液、フォーム、デポジットリー又は他の移植されたデポット等で送達されてもよく、そうすることで、この製剤は、好都合に、所望の表面にＲＩＰを長期間晒すことになる。
【００１２】
この方法は、さらに、細菌によって引き起こされる感染の危険性にある又は感染の疑いのある個体、例えば、火傷又は外傷等を被っている患者に実施されてもよい。代わりに、組成物は、進行中の感染を治療し、細菌感染の症状の開始を遅らせ、又は感染を発症する危険性を低下させるために投与されてもよい。
【００１３】
一実施態様において、組成物を受け入れる個体は、ＲＮＡＩＩＩ又はＴＲＡＰが病因において関与する細菌によって感染させられ、又は感染の危険性にある。別の実施態様において、感染又はその危険性は、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含む連鎖球菌属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）などのグラム陽性細菌、又はその抗生物質耐性菌株による。他の実施態様において、病原菌は、リステリア・イノキュア（Ｌ．ｉｎｎｏｃｕａ）及びリステリア・モノサイトゲネス（Ｌ．ｍｏｎｏｃｔｏｇｅｎｅｓ）を含むリステリア属（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ）、ラクトコッカス属（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、エンテロコッカス属（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｔｙｌｉｃｕｍ）、枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、炭疽菌（Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、及びセレウス菌（Ｂ．ｃｅｒｅｕｓ）を含むバシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ）若しくはその抗生物質耐性菌株であってもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
詳細な説明
ＲＩＰ組成物がリポソームを用いて調合される場合に達成される利点と同じく、ＲＩＰ組成物は、毒性を減少し、持続放出を達成し、ＲＩＰを分解から保護し、改善された治療効果を達成するように調合されればよい。ナノ粒子担体の使用は、ＲＩＰを含む組成物の経口又は鼻腔内投与に特に有利である。
【００１５】
本発明のＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド
クオラムセンシング阻害剤であるＲＩＰは、細菌の成長に作用しないが、外毒素の産生をもたらす情報伝達を干渉することによって、細菌の病原的な潜在能力を低下させる。ＲＩＰは、ａｇｒ遺伝子座の上流の活性化因子であるＲＩＰの標的分子ＴＲＡＰのリン酸化を阻害することによって毒素産生を阻止する。図１Ａは、ａｇｒ遺伝子座の下流の活性化におけるＴＲＡＰリン酸化の役割を示す。細胞が増殖するにつれて、ＲＡＰは、細胞外環境に蓄積し、ＴＲＡＰリン酸化を助長し、成長の中期指数段階における細菌付着及びａｇｒ活性化の増加をもたらす。ａｇｒ活性化は、ＴＲＡＰリン酸化を減らす自己誘導ペプチド（ＡＩＰ）の産生をもたらすが、溶血素及びエンテロトキシン産生を増加するＲＮＡＩＩＩの発現を可能にする。図１Ｂは、ＴＲＡＰリン酸化の阻害、ＴＲＡＰ酵素の非リン酸化不活性形態への平衡のシフト、及びａｇｒ発現の阻止、それによる細菌の付着、バイオフィルム形成、及び毒素産生におけるＲＩＰ又は抗ＲＡＰ抗体などのＲＩＰ作動薬の役割を示す。図１Ｃは、ＴＲＡＰリン酸化の助長、ＲＩＰ活性の拮抗におけるＲＡＰの効果を示す。
【００１６】
ＲＩＰは、一般式ＹＸ2ＰＸ1ＴＮＦを含み、ここで、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸であり、Ｘ2は、Ｋ又はＳである。具体的なＲＩＰ配列は、米国特許第６，２９１，４３１号、２００３年２月３日出願の米国特許出願第１０／３５８，４４８号、２００１年４月１９日出願の米国特許出願第０９／８３９，６９５号、及びゴブら（Ｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）ペプタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２２：１６０９−２０（２００１年）に開示され、これらの全ては、参照により本明細書中に援用される。ＲＩＰ配列は、アミノ酸配列ＫＫＹＸ2ＰＸ1ＴＮを含むポリペプチドを含み、ここで、Ｘ1は、Ｃ、Ｗ、Ｉ又は修飾したアミノ酸配列であり、Ｘ2は、Ｋ又はＳである。ＲＩＰ配列はまた、ＹＳＰＸ1ＴＮＦ、ここで、Ｘ1は、Ｃ又はＷである、及びＹＫＰＩＴＮを含むポリペプチドを含む。一実施態様において、上記の一般式ＹＸ2ＰＸ1ＴＮＦを含むＲＩＰは、ＲＩＰが活性を示すという条件で、１又は２個のアミノ酸の置換、欠失、及び他の修飾によってさらに修飾される。
【００１７】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」又は「ペプチド」は、ＲＩＰ及び抗菌ペプチドの両方に関して本明細書中で使用されるとき、修飾した配列（例えば、グリコシル化されたもの、ＰＥＧ化されたもの、保存されたアミノ酸置換を含有するもの、保護基を含有するもの、５−オキソプロピルを含むもの、アミド化されたもの、Ｄ−アミノ酸等）を含む。アミノ酸置換は、典型的には、下記の基：グリシン、アラニン；バリン、イソロイシン、ロイシン；アスパラギン酸、グルタミン酸；アスパラギン、グルタミン；セリン、スレオニン；リジン、アルギニン；及びフェニルアラニン、チロシン内である保存的置換を含む。
【００１８】
本発明のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドを精製又は単離することができる。「精製した」とは、自然の状態で見られる化合物に通常付随する成分が実質的に存在しない、例えば、約６０％存在しない、約７５％存在しない、又は約９０％存在しない化合物を意味する。「単離した」化合物は、化合物が天然に発生する環境とは異なった環境にある。本発明のタンパク質、ポリペプチド及びペプチドは、天然に発生しているか、あるいは当該技術分野において周知の方法に従って、組換え的に若しくは化学合成によって生産されてもよい。
【００１９】
外用のためのＲＩＰ組成物
ＲＩＰ組成物は、個体の外部表面への適用のために具体的に調合されればよく、ここで、「外部表面」は、皮膚又は粘膜表面を含む。好ましい投与部位は、火傷、創傷のほか、特に感染する恐れのある皮膚又は粘膜表面の開口部を含む。このような用途に適した組成物としては、軟膏、油薬、香膏、クリーム等などの半固体の組成物が含まれる。粘性のエマルジョンも有用であり得て、ここで、ＲＩＰは、一相のコロイド状懸濁液に溶解される。例えば、ＲＩＰは、部分的に油性エマルジョン中の水相に溶解されてもよい。有用なエマルジョンは、ＲＩＰを高い局所濃度で維持しながら、容易に塗付することができるように十分に高い粘性を有するであろう。スプレー又はフォームは、皮膚又は別の接近しにくい粘膜表面にＲＩＰを送達するための便利な組成物を提供する。例えば、鼻腔内スプレーは、鼻腔内の粘膜表面にＲＩＰを送達するのに有用である。フォームは、例えば、歯科用途において、ＲＩＰを歯肉に送達するのに特に有用である。デポジットリー又は他の移植された装置は、別の接近しにくい粘膜表面、特に結腸のようなものにＲＩＰを持続送達するのに特に有用であり、それは血中に送達された薬物の迅速な吸収を提供する。ＲＩＰ組成物の局所適用に有用な粘膜表面としては、迅速な吸収が望まれる場合、結膜、鼻咽頭、中咽頭、膣、結腸、尿道又は膀胱の粘膜などが好ましい。所望の一般的特徴を有する組成物を製造する方法は、薬力学、薬物吸収、生物学的利用能、投与、分布及び排出の原則通りで、当該技術分野において周知である。例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）「調剤の科学及び実践」（“Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”）、ゲナーロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編集、第２０版、リッピンコット・ウィリアムズ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ）及びウィルキンス（Ｗｉｌｋｉｎｓ）（２０００年）、特に、パート５（「薬剤製造」（“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ”））；グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）及びギルマンズ（Ｇｉｌｍａｎ’ｓ）、「治療学の薬理学的基礎」（“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”）、ハードマンら（Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）編集、第１０版、マクグロー−ヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）（２００１年）、特に、第１章及び第２章を参照されたい。レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）、並びにグッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）及びギルマンズ（Ｇｉｌｍａｎ’ｓ）はともに、参照により本明細書中に全体として援用される。
【００２０】
ＲＩＰ組成物が皮膚を介して送達される場合、オイル又は水和剤（ｈｙｄｒａｔｏｒ）は、皮膚を通じた吸収を助長するために組成物に添加され得る。この組成物は、疼痛及び腫れを軽減するか、そうでなければ治癒を助長するであろう他の成分、例えば、抗生物質、鎮痛剤、抗炎症剤の任意の組合せを含有してもよい。例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）（２０００年）、特にパート７（「薬剤及び医薬」（“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ａｇｅｎｔｓ”））を参照されたい。他の有用な成分、例えば、組成物の粘性又は色を調節する物質は、当該技術分野において周知である。これらの組成物は、より詳細にはここに説明されるナノ粒子の有無を問わず調合されてもよい。
【００２１】
コロイド状ナノ粒子を用いるＲＩＰ組成物の経口及び鼻腔内送達
胃腸（ＧＩ）管内ではペプチドが不安定であり腸粘膜を介したペプチドの浸透性が低いために、一般的に、経口投与後のペプチド及びタンパク質薬剤の生物学的利用能は非常に低い；したがって、ペプチド薬物は、通常、治療効果を得るために注射される。しかしながら、経口及び鼻腔内投与は、薬物送達に関してはより便利であり、しかもより我慢しやすい経路である。
【００２２】
ＲＩＰ組成物の経口送達を助長するために、ＲＩＰ組成物は、生体吸収に利用可能な表面領域を増やすためにナノ粒子担体に導入されてもよく、それによって、ＧＩ分泌液へのＲＩＰの放出を改善する。ナノ粒子はまた、高い生体付着性を持ち、ナノ粒子に調合されたＲＩＰ組成物のＧＩ管中の滞留時間を増やす。薬物担体としてのナノ粒子のこれらの利点は、当然に、他の経路を介した投与用に設計された製剤に同様に当てはまる。経口に送達される場合、ナノ粒子の断片が胃腸管のパイエル板を介してそのまま吸収されることが期待される。
【００２３】
好ましいナノ粒子は、生分解性及び生体適合性ポリマーを含む。有用なナノ粒子は、参照により本明細書中に援用されるボーティエら（Ｖａｕｔｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）アドヴァンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．）５５：５１９−４８（２００３年）に記載される手順によって製造される生分解性ポリ（アルキルシアノアクリレート）ナノ粒子を含む。経口吸収はまた、粘膜付着性のカチオン性ポリマーであるキトサンで被覆したポリ（−ラクチド−グリコリド）ナノ粒子を用いて強化されてもよい。このようなナノ粒子の製造は、例えば、タケウチら（Ｔａｋｅｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．）アドヴァンスド・ドラッグ・デリバリー・レビューズ（Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌ．Ｒｅｖ．）４７：３９−５４（２００１年）に記載され、これもまた参照により本明細書中に援用される。
【００２４】
ナノ粒子は、同様に、気管内（ＩＴ）及び静脈内経路を介して投与されるＲＩＰ組成物の放出制御に適している。ＲＩＰ組成物の鼻腔内送達は、ソマヴァラプら（Ｓｏｍａｖａｒａｐｕ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・ファーマシー・ファーマコロジー（Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．）５４（Ｓｕｐｐ．）：１３１（２００２年）に記載される正に帯電したナノ粒子の使用によって助長されてもよい。さらに、ポイナーら（Ｐｏｙｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・コントロールド・リリース（Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｒｅｌ．）３５：４１−４８（１９９５年）は、動物モデルにおける緑膿菌感染を治療するためのトブラマイシンの送達ビヒクルとしてリポソーム及びポリ（乳酸）（ＰＬＡ）ナノ粒子を比較して、ＩＴ及び静脈内送達の両方についてナノ粒子が有用であることを示した。リポソームカプセル化は、ナノスフェア装填より効果的であった（それぞれ、８５％対３０％）。両担体は、同じ大きさと電荷であったが、リポソームは、わずかにより負に帯電していた。ナノ粒子は、好都合に破裂−放出の反応速度論を示したが、脂質担体の方が放出プロフィールが速いことが観察された。静脈内に投与された場合、リポソームトブラマイシンは、遊離の又はナノ粒子にカプセル化されたトブラマイシンと比較して、肺においてより効果的に保持された。しかしながら、ナノスフェア及びリポソームはともに、ＩＴ投薬後の肺において大きな割合で薬物を維持した。このように、ナノ粒子及びリポソーム担体はともに、ＲＩＰ組成物に関して有用な送達システムとなるであろうし、各々が、特定の適用に利点を提供し得ることが期待される。
【００２５】
ナノ粒子製剤
ナノ粒子は、典型的には、ポリマーマトリックス（「ナノスフェア」）、又は高分子性の薄壁によって囲まれた油性コアを含む貯蔵システム（「ナノカプセル」）のいずれかを含み、ここで、コアは、ＲＩＰ組成物を含む。ナノ粒子の製造に適したポリマーは、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ポリエステル、例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）、ポリ（−カプロラクトン）及びそれらの共重合体を含む。
【００２６】
ナノ粒子は、細胞標的化を支援するために、代わりに又はそれに加えて、被覆、又は抗体若しくはその断片のような部分を含んでもよい。ナノ粒子のサイズ及び形態は、同様に変更して、ＲＩＰ組成物に適した所望の物理化学的特徴、装填、及び放出制御特性を有する製剤を得てもよい。この製剤を適切に修飾することによって、その抗菌作用の迅速な開始に際しＲＩＰの破裂放出をもたらすことができる。
【００２７】
１．生分解性ポリマー
ナノ粒子は、生分解性ポリエステル、例えば、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）のポリマー、及び様々な量のグリコール酸（ＰＬＧＡ）を用いて製造される共重合体を用いて製作されるとよい。ＰＬＡは、ＰＬＧＡと比較してより疎水的であり；したがって、ＰＬＡは、相対的に長期の放出プロフィールを提供する。同様に、共重合プロセスにおけるグリコール酸と乳酸との割合が、得られる共重合体の分解特性をもたらす。一実施態様では、低分子量（１４ｋＤａ）のＰＬＧＡが、高い（５０％）グリコシド含量（ＰＬＧＡ  ５０：５０）を用いて共重合される。これらの粒子は、使用されるＰＬＧＡの低分子量及び高いグリコシド含量に起因して比較的迅速に分解するであろう。９０％のＲＩＰが、３０分以内に放出され、９０％のポリマーが５週間以内に再吸収されるだろうことが期待される。中間又は長期の分解プロフィールを有するナノスフェアを得るために、前述の製剤は、より低いグリコリド含量（ＰＬＧＡ  ６５：３５又は７５：２５）の有無を問わず、より高い分子量の共重合体（例えば、６０〜１００ｋＤａ）を含むとよい。要するに、ＰＬＡ及びＰＬＧＡポリマーの分子量の包括的な範囲、乳酸／グリコール酸の割合、及びＰＬＡ−ＰＬＧＡ混和物は、装填及び放出プロフィールを最適化するために使用されればよい。
【００２８】
ＲＩＰ組成物は、カプセル化、粒子表面上への吸収のいずれか、あるいはその両方によってナノスフェアと関連させてよい。ＲＩＰ組成物中の特定の分子次第であるが、１０％ｗ／ｗ装填レベルが試みられる場合、最大で１００％のペプチド装填効率が期待される。以前のカプセル化試験から、薬物装填が増加すると、粒子サイズの増加が見込まれ；したがって、高い及び低いペプチド装填の製剤を使用する場合は、それぞれ、大きな（約２０００〜５０００ｎｍの平均径）及び小さな（約２００〜５００ｎｍの平均径）の粒子サイズで使用すればよい。より大きなサイズの粒子は、それらの径がミクロンを超えたとしても、本発明の目的のために「ナノ粒子」であると考えられることに注意されたい。
【００２９】
２．二重エマルジョン溶媒蒸発
ナノ粒子は、例えば、乳化及び溶媒蒸発プロセス、即ち、いわゆる二重エマルジョンプロセスを用いて製造されてもよい。他の手順は、既存のナノ粒子の共有結合性の修飾を介して追加のポリマーを添加することを含む。一次エマルジョンを形成するために、安定化乳化剤及びＲＩＰ組成物を含有する内部の水相を氷冷した有機相に添加する。安定化乳化剤は、１０％ｗ／ｖのポリビニルアルコール（ＰＶＡ）であってもよく、有機相は、ジクロロメタン（ＤＣＭ）中に溶解させたポリマーを含んでもよい。ポリマー含量は、必要とされる粒子サイズに従って修飾される。
【００３０】
一実施態様において、一次エマルジョンは、高速ホモジナイザー（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）を用いて高速（１６，０００ＲＰＭ）で３分間、氷上で均質化される。次に、一次エマルジョンは、３％ｗ／ｖのＰＶＡからなる連続相に添加され、氷上で６分間均質化して二次エマルジョンを生産する。二次エマルジョンは、約４００ＲＰＭで一晩ドラフト中で撹拌し、有機溶媒を蒸発させる。この粒子を４℃で１０分間、高速遠心分離（約２０，０００×ｇ、粒子サイズによる）を（３回）繰り返すことによって回収し、再蒸留水（ｄｄＨ2Ｏ）に再懸濁させる。最適な貯蔵及び安定のために、粒子を凍結乾燥させる。
【００３１】
３．二重エマルジョン溶媒分散
あるいは、ＰＬＧＡナノ粒子は、乳化−分散法を用いて製造されてもよい。例えば、２００ｍｇのＰＬＧＡを１０ｍｌの溶媒、例えば、酢酸エチル及びベンジルアルコールに溶解する。有機相は、安定化剤、例えば、ポロキサマー１８８を含有する２０ｍｌの水相に添加される。有機相及び連続相の相互浸透後、この混合物は、高速ホモジナイザー（シルバーソン社、英国）を用いて１２，０００ＲＰＭで７分間乳化される。水相へ完全に分散するために、５００ｍｌの水を穏やかなマグネット使用の撹拌によりＯ／Ｗエマルジョンに添加し、ナノ粒子としてポリマーの沈殿物を得る。薬物装填のナノ粒子の場合には、所定量のペプチドをまず有機溶媒に溶解させる。ナノ粒子を作製するための同様のエマルジョン技術は、ランプレヒトら（Ｌａｍｐｒｅｃｈｔ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・ファーマコロジー・アンド・エクスペリメンタル・セラピューティックス（Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．）２９９：７７５−８１（２００１年）に記載される。関連技術分野の当業者であれば、この手順に対する種々の変更及び修飾の仕方を知っている。
【００３２】
４．ナノ粒子の表面修飾
疎水性ナノ粒子の表面は、食作用を最小限にするために修飾されてもよく、ナノ粒子の持続した全身循環を可能にする。静脈内投与後、疎水性ナノ粒子は、単核性食細胞系（ＭＰＳ）によって全身循環から迅速に一掃され、肝臓又は脾臓においてナノ粒子が迅速に堆積されることになる。肝臓、脾臓又はＭＰＳそれ自体が選択の標的でない場合、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）を用いた修飾を含むナノ粒子表面の種々の修飾は、食作用を最小限にすることができる。ＰＥＧは、優れた生体適合性を示す親水性の非イオン性ポリマーである。ＰＥＧ分子は、他のポリマーと同様に、共有結合、ナノ粒子の製造中での混和、又は表面吸着を含む多数の異なった方法によってナノ粒子に添加することができる。ナノ粒子表面上のＰＥＧの存在は、全身循環における滞留時間の増加に加えて、他の機能も果たす。ＰＥＧは、ナノ粒子へのタンパク質及び酵素の吸着を低下させ、ＰＬＧＡをベースとしたナノ粒子の分解を遅らせることが示されている。その表面上ＰＥＧの密度及び分子量は、タンパク質吸着を最小限にするように調整することができる。ポロキサマー及びポロキサミンはまた、マクロファージによるナノ粒子の捕捉を低下させ、全身循環においてナノ粒子の滞留時間を増加させることが示されている。ＰＬＧＡ粒子はまた、ナノ粒子の半減期を延ばすためにポロキサマー４０７及びポロキサミン９０８で被覆されてもよい。ポリ（エチレングリコール）は、通常、ポリ（乳酸）（ＰＬＡ）などのポリエステルをベースに、（ａ）界面活性剤（例えば、ポロキサマー１８８）の吸着によって、又は（ｂ）ブロック若しくは分岐した共重合体として、表面に導入され得る。さらに、上述したように、細胞標的化はまた、標的細胞の表面上の部分に対して特異的な親和性を有する分子、例えば、抗体のエピトープ結合領域を利用してもよい。
【００３３】
５．物理化学的特徴付け
ナノ粒子のサイズ分布は、それらの生体内分布及び分解の反応速度論に影響を及ぼす。ナノ粒子のサイズ分布、並びに表面及び構造的特徴は、粒子サイズが５０ｎｍ以上である場合、透過型、走査型、又は電界放射電子顕微鏡によって直接的に視覚化してもよい。電子顕微鏡は、取り込んで蛍光標識されたマーカーペプチドを用いて、蛍光顕微鏡又は共焦点顕微鏡によって補完されてもよい。さらに、レーザー回折計（マスターサイザー、マルバーン社、英国）又は光子相関分光計（ＰＣＳ、マルバーン社）は、直径２００ｎｍ以上のナノ粒子のサイズ分布を測定するために使用され、マルチアングルのＰＣＳは、１０ｎｍ〜５０００ｎｍの範囲であるナノ粒子のサイズに対して使用されるであろう。
【００３４】
上述したように、相対的な表面の疎水性はまた、ナノ粒子の薬物動態学に関与する。例えば、ローズ−ベンガル（Ｒｏｓｅ−Ｂｅｎｇａｌ）アッセイの適応は、ナノ粒子の疎水性を測定するために使用されてもよい。ミューラーら（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）バイオケミカル・ソサイエティ・トランスアクションズ（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ’ｙ  Ｔｒａｎｓ．）１９：５０２（１９９１年）を参照されたい。この方法では、疎水的なＲｏｓｅ−Ｂｅｎｇａｌ色素が、その色素とナノ粒子との間の疎水性相互作用の強さを比例して、多量の粒子を結合する。結合していない色素を定量し、結合した色素量の割合として疎水性を表す。このアッセイでは、典型的には、１０ｍｇ／ｍｌ  ローズ−ベンガル（Ｒｏｓｅ−Ｂｅｎｇａｌ）色素の等容積をｄｄＨ2Ｏに溶解し、ナノ粒子の水性懸濁液に添加する。一晩室温で穏やかに撹拌した後、試料を１５，０００×ｇで３０分間、室温で遠心分離する。上清を取り出し、分光光度計を用いて吸光度を５４７ｎｍで読む。
【００３５】
凍結乾燥したナノ粒子製剤は、室温及び周囲光の状態で乾燥させておくことができ、２年を超えても、粒子の分解、物理化学的な変化、又は抗原性の喪失がない。製剤は、好ましくは、凍結乾燥させ、分解を最小限にするために真空下又は窒素下で密封される。
【００３６】
６．ペプチド装填及び放出
ペプチドの装填を測定するために、ＲＩＰを装填したナノ粒子は、塩化メチレンに定量的に溶解すればよく、このペプチドは、リストアクション振とう機上で混合物を１時間振とうすることによって酢酸緩衝液（ｐＨ４、０．１Ｍ）中に抽出されればよい。水性緩衝液相を遠心分離によって分離し、逆相−ＨＰＬＣによって抽出したペプチドを定量する。薬物含有量は、ナノ粒子の％ｗ／ｗとして表してもよい。インビトロでの放出プロフィールを同定するために、ペプチドを装填した粒子の４ｍｇ量（ｎ＝３／時点）を１ｍｌの放出媒体（０．０１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０、ＰＢＳ中０．１％  ＮａＮ3）中で、３７℃で穏やかに撹拌して、様々な時間点：１、２、３、７、及び２４時間（「破裂放出」期間）、７及び１４日、並びに１及び３ヶ月でインキュベートする。回収に際して、粒子は、室温で、粒子サイズに応じて、最大４５分間、１５，０００×ｇで遠心分離されるものとする。ある時間でのペプチドの総放出量は、ＨＰＬＣによって上清中で定量することができる。
【００３７】
７．ペプチドの完全性
ナノ粒子に含有されたペプチドの完全性は、種々の製造方法を用いてナノ粒子を開発する場合に重要である。典型的には、＞９５％のペプチドの完全性が、調合後に維持し得る。ペプチドの安全性の全ての評価において、ＨＰＬＣは、無傷のペプチドの比率を評価するために使用することができる。さらに、このペプチドは、ペプチドとナノ粒子との結合及び解離の保持を示すために放射線標識することができる。簡単には、ペプチドが、ビーズに結合した125Ｉ（ＩＯＤＯ−ＢＥＡＤＳ（登録商標））を含有するリン酸緩衝溶液中でインキュベートされる。チロシン残基（並びに量は少ないがヒスチジン及びトリプトファン）は、ヨウ素に付着し、ビーズからそれを取り除く。過剰の遊離した放射性核種は、脱塩カラムを用いたゲルろ過によって溶液から取り除かれる。
【００３８】
８．ＲＩＰ組成物の臓器局在及び生体内分布
カプセル化されたＲＩＰ組成物の生体内分布を測定するために、放射線標識した製剤をラットに投与してもよい。動物を屠殺し、肝臓、脾臓、肺、腸及び血液を回収し、これら組織の放射活性を監視する。遊離した及びコロイド状のカプセル化したペプチドの両方の薬物動態学は、薬物の投与後、いくつかの間隔で比較されてもよい。ペプチドの濃度は、上述したＨＰＬＣによって測定されるものとする。
【００３９】
ＲＩＰ及びＲＩＰ製剤の活性を測定するためのアッセイシステム
ＲＩＰがクオラムセンシング機構を阻害する機構は、上記で検討したように、ＴＲＡＰのリン酸化の阻害を伴う。表皮ブドウ球菌におけるＴＲＡＰの存在及びＴＲＡＰリン酸化の証拠がある。これによって、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の両方に同様のクオラムセンシング機構が存在し、両種によって引き起こされるバイオフィルム形成及び感染にＲＩＰが干渉する可能性が存在することがわかる。さらに、ＴＲＡＰが、全てのブドウ球菌株及び種の中で保存されているという証拠があり；したがって、ＲＩＰは、いずれかのタイプのブドウ球菌属に対して効果的であるはずである。さらに、枯草菌、炭疽菌、セレウス菌、リステリア・イノキュア、及びリステリア・モノサイトゲネスを含む、感染を引き起こす他の細菌は、ＴＲＡＰに配列類似性を有するタンパク質を有するように見える。さらに、ＲＡＰは、ｒｐｌＢ遺伝子によってコードされたリボソームタンパク質Ｌ２のオルソログである。コレムら（Ｋｏｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．）エフイーエムエス・マイクロバイオロジー・レター（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．）２２３：１６７−７５（２００３年）を参照されたい。それは、ｒｐｌＢ遺伝子によるＲＡＰオルソログのその記述に関して、参照により本明細書中に援用される。Ｌ２は、連鎖球菌属、リステリア属、ラクトコッカス属、エンテロコッカス属、大腸菌、クロストリジウム・アセトブチリクム、及びバシラス属を含む細菌の中で高度に保存される。この所見は、黄色ブドウ球菌におけるＲＡＰの機能を妨げることを目的とする治療がまた、同様にＬ２合成細菌の処置に有効であろうことを示している。
【００４０】
本発明に係る好ましいＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチドは、直接的又は間接的にＲＮＡＩＩＩ阻害活性を示し、それは、多くの日常的なスクリーニングを用いてアッセイすることができる。ＲＩＰは、ブドウ球菌のクオラムセンシングシステムの既知の機能に干渉することによって、ブドウ球菌属の付着及び毒素産生を阻害する。上記で検討したように、ＲＩＰは、ＴＲＡＰリン酸化のＲＡＰ導入と競合し、ＴＲＡＰリン酸化の阻害をもたらす。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７６：２６５８−６７（２００１年）を参照されたい。これは、細胞付着、バイオフィルム形成、及びＲＮＡＩＩＩ合成を減少し、最終的には、毒性表現型を抑制する。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０：４３８−４０（１９９８年）を参照されたい。例えば、ＲＮＡＩＩＩ産生又はＴＲＡＰリン酸化のＲＩＰ阻害は、参照により本明細書中に全体として援用されるバラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ペプタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２１：１３０１−１１（２０００年）に記載される手順を用いてインビトロでアッセイすることができる。合成したＲＩＰ類似体であるＹＳＰＷＴＮＦ（−ＮＨ2）のアミド形態の活性は、黄色ブドウ球菌で感染させたスミス・ディフューズ（Ｓｍｉｔｈ  Ｄｉｆｆｕｓｅ）マウスを用いた蜂巣炎モデル、黄色ブドウ球菌ＬＳ−１に対してマウスを試験する敗血症性関節炎モデル、黄色ブドウ球菌８３２５−４に対してウサギを試験する角膜炎モデル、黄色ブドウ球菌ＭＳに対してウサギを試験する骨髄炎モデル、並びに黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｂｏｕｌｄ３０５、ＡＥ−１及び環境的感染に対して牝ウシを試験する乳腺炎モデルにおいて示すことができる。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ペプタイズ（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２１：１３０１−１１（２０００年）及び表１を参照されたい。（合成したＲＩＰのアミド化していない形態は不活性である。）これらの所見は、ＲＩＰ活性をアッセイするのに利用可能なＲＩＰ活性の範囲及びスクリーニングを示し、さらに、ＲＩＰがブドウ球菌の感染を阻害及び抑制することを示している。
【００４１】
【表１】
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【００４２】
このスクリーニングアッセイは、結合アッセイとすることができ、１以上の分子が、検出可能なシグナルを提供する標識に連結されればよい。精製したＲＩＰは、分子間相互作用をモデリングするために使用することができる３次元の結晶構造を決定するためにさらに使用してもよい。あるいは、スクリーニングアッセイは、ＲＮＡＩＩＩ産生及び／又は毒性因子産生における候補ＲＩＰの効果を測定することができる。例えば、ブドウ球菌属のｒｎａｉｉｉ転写における候補ペプチドの効果が測定され得る。このようなスクリーニングアッセイは、当該技術分野において周知な手順に従って、ＣＡＴ（クロラムフェニコール・アセチルトランスフェラーゼ）、β−ガラクトシダーゼ等のようなレポーター遺伝子システムを含有する組換え宿主細胞を利用することができる。あるいは、このスクリーニングアッセイは、当該技術分野において周知でもあるハイブリダイゼーション技術を用いて、ｒｎａｉｉｉ又は毒性因子転写を検出することができる。
【００４３】
ＲＩＰ製剤のインビトロでのハイスループット分析
ＲＩＰ組成物の以下のスクリーニングアッセイは、特定のＲＩＰ又はＲＩＰ組成物若しくは製剤が生物学的活性の所望のレベルを示すかどうかを決定するために使用されるとよいアッセイのタイプを例示する。このアッセイシステムにおいて、ａｇｒ発現は、ノーザンブロットによって確かめられるＲＮＡＩＩＩレポーター遺伝子アッセイを用いるハイスループットアッセイにおいて試験される。ｒｎａｉｉｉ：：ｂｌａＺ融合構築物を含有する初期指数増殖の黄色ブドウ球菌細胞（約２×１０7コロニー形成単位（ＣＦＵ））は、３７℃で２．５〜５時間振とうしながら、９６ウェルプレートでＲＩＰ製剤の濃度増加を伴って増殖される。このアッセイでは、β−ラクタマーゼが、ＲＮＡＩＩＩに関してレポーター遺伝子として作用する。細菌の生存率は、Ｏ．Ｄ．６５０ｎｍを測定し、さらにＣＦＵを決定するためにプレーティングすることによって試験される。β−ラクタマーゼ活性は、β−ラクタマーゼの基質であるニトロセフィンを添加することによって測定される。β−ラクタマーゼによるニトロセフィンの加水分解は、４９０ｎｍ及び６５０ｎｍでの相対的吸収の変化によって示され、ここで、黄色は、ＲＮＡＩＩＩ合成がないことを指示し、桃色はＲＮＡＩＩＩの合成を指示する。β−ラクタマーゼ・レポーターアッセイの典型的な結果を図２に示す。
【００４４】
ハイスループットアッセイにおいて有効性を示す製剤は、ノーザンブロットによって確かめてもよい。細菌は、候補ＲＩＰ製剤を用いて同様に成長させる。次に、細胞を遠心分離によって回収し、総ＲＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動及びノーザンブロットによって分離する。ＲＮＡＩＩＩは、例えば、ＰＣＲによって産生された放射線標識したＲＮＡＩＩＩ特異的ＤＮＡに対するハイブリダイゼーションによって検出される。対照の製剤は、ランダムペプチドを含有し、典型的には、０〜１０μｇ／１０7の細菌で試験される。
【００４５】
ＲＩＰ製剤のインビボ分析
候補ペプチドはまた、例えば、ヒト以外の動物モデルにおいてブドウ球菌属の毒性因子産生における効果についてスクリーニングすることによってインビボでの活性に関してアッセイすることができる。候補ペプチドは、ブドウ球菌属で感染した動物、又は候補ペプチドと併せて感染投与量のブドウ球菌属を受けた動物に投与される。候補ペプチドは、所望の結果に合わせ任意の方法で投与することができる。例えば、候補ペプチドは、所望の影響が達成されるべき組織に静脈内、筋肉内、皮下、又は直接的に注入することによって投与することができ、あるいは、候補体は、局所、経口等によって送達することができる。このペプチドは、次に、動物に移植されるであろう装置を被覆するために使用することができる。ペプチドの効果は、ブドウ球菌属に関連した病巣の数及びサイズ、感染の微生物学的証拠、健康全般等の評価のような任意の適した方法によって監視することができる。
【００４６】
選択された動物モデルは、候補物質がスクリーニングされるべきブドウ球菌属の特定の病原株又は標的化疾患を含む、当該技術分野において既知の多くの因子を伴って変化するであろう。例えば、毒素産生に関連した感染を抑制するためのＲＩＰ製剤の能力を評価する場合、マウスの敗血症／蜂巣炎モデルが特に有用である。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０：４３８−４０（１９９８年）。このモデルは、例えば、製剤が、ＲＩＰ、並びに、別に炎症反応及び毒素性ショック症候群を誘導するであろう細菌外毒素及び毒性細胞壁成分に結合しかつ中和することができるポリカチオン性抗菌ペプチドを含む場合、特に好ましい。
【００４７】
このマウスの敗血症／蜂巣炎モデルでは、無毛の免疫応答性マウス（ｎ＝１０）は、典型的には、５×１０8ＣＦＵの黄色ブドウ球菌株であるスミス・ディフューズ（Ｓｍｉｔｈ  ｄｉｆｆｕｓｅ）を含有する１００μＬの食塩水及びサイトデックスビーズで皮下注射して検証される。調合したＲＩＰは、静脈内投与又はｉ．ｖ．投与の１０倍で経口強制投与によって投与される。典型的なｉ．ｖ．投与は、＜１０ｍｇのＲＩＰ／ｋｇ宿主体重となる。動物を５日間観察し、病巣を測定する。感染が原因で最初の４８時間以内で敗血症により死亡するものもあるであろうし、種々のサイズの病巣を発症するものもあるであろう。図３は、典型的な病巣及びＲＩＰ製剤による病巣の阻害を示し、下段のマウスはＲＩＰ製剤によって保護されない。
【００４８】
ラット移植片モデルは、バイオフィルム形成と関連した感染を抑制する製剤の能力を評価するのに特に有用である。ギアコメッティら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４７：１９７９−８３（２００３年）；シリオニら（Ｃｉｒｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．）サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）１０８：７６７−７１（２００３年）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）ザ・ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジーズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１８７：６２５−３０（２００３年）。このモデルは、細菌の攻撃とバイオフィルム感染との間の時間間隔を典型的には７２時間以内で実現するため、臨床設定に非常に関連し、ＲＩＰ製剤の最適な投与経路及び投与量の試験を可能にする。バイオフィルムは抗生物質に非常に耐性であることが知られるため、このモデルは、ＲＩＰ活性の検証試験を提供する。
【００４９】
ラット移植片モデルにおける典型的な工程を図４に示す。この試験を用いたところ、移植片が２０μｇ／ｍＬのＲＩＰで２０分間浸された場合、又はＲＩＰが１０ｍｇ  ＲＩＰ／ｋｇ体重で腹腔内経路によって注入された場合、ＲＩＰは４桁まで感染を減少することが示された。ラット移植片モデルを用いたこれらの結果は、ＲＩＰを単独で使用した場合より高い又は低いＲＩＰ濃度を用い、上記のインビトロアッセイを用いて決定した最も有望な製剤とした場合でも繰り返されるであろう。次に、製剤の有効性は、効果的であるとわかっている投与量でＲＩＰを腹腔内投与したときと比較することができる。細菌の攻撃後、０〜６日間のバイオフィルム形成の前及び／又は後で、ＲＩＰ製剤を毎日投与することができる。
【００５０】
典型的な実験では、ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）成熟雄性ラット（ｎ＝１０）を麻酔し、正中線の各側面に１．５ｃｍの切開によって皮下ポケットを作製した。殺菌したコラーゲンで密封した二重のベロアで編んだポリエチレンテレフタレート（ダクロン（Ｄａｃｒｏｎ））移植片（１ｃｍ2）（アルボグラフト（Ａｌｂｏｇｒａｆｔ）（商標）、イタリア）を食塩水、ＲＩＰ活性を持たないランダムペプチド、ＲＩＰ、又はＲＩＰを含むナノ粒子製剤に浸し、ポケット内に移植した。ポケットをスキンクリップで閉じ、２×１０7ＣＦＵ／ｍＬの細菌をツベルクリン注射器を用いて移植片表面に接種し、流体で満たした皮下ポケットを作製する。個別のケージに動物を戻し、毎日試験する。移植片感染後の０〜６日で、動物は、ＲＩＰ又はＲＩＰ製剤の静脈内又は経口投与を受ける。遊離したＲＩＰが、陽性対照として腹腔内経路を介して投与される。移植片は、移植後の７日で外植され、既知の手順、例えば、ギアコメッティら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）（２００３年）に従ってＣＦＵを測定する。外植した移植片を滅菌チューブに入れ、無菌の食塩水中で洗浄し、１０ｍＬのリン酸緩衝生理食塩水を含有するチューブに置き、５分間超音波処理して移植から付着した細菌を取り除く。超音波処理後、移植片を顕微鏡でチェックし、全ての細菌が取り除かれていることを確かめる。（細胞の生存率（ＣＦＵ／ｍＬ）における有意な差は、抗生物質感受性の細菌、抗生物質耐性の細菌のどちらの場合も最大１０分間の超音波処理の効果を試験した際には存在しなかった。）生菌は、血液寒天プレート上の連続希釈した細菌懸濁液（０．１ｍＬ）を培養することによって定量した。全てのプレートを３７℃で４８時間インキュベートし、プレート当りのＣＦＵの数について評価する。この方法の検出限界は、約１０ＣＦＵ／ｍＬである。
【００５１】
治療法
用語「治療」又は「治療すること」は、個々の動物、例えば、哺乳動物、好ましくはヒトにおける任意の治療的介入を意味する。治療は、（ｉ）「予防」、臨床的症状を発症しないようにすること、例えば、有害な状態を発生させ及び／又は発症させることから感染を妨げること；（ｉｉ）「阻害」、臨床的症状の発症を阻むこと、例えば、感染が完全に排除されるように、又は害を及ぼさなくなる程度まで、進行中の感染を停止すること；（ｉｉｉ）「緩和」、臨床的症状の退行を引き起こすこと、例えば、感染によって引き起こされる発熱及び／又は炎症の緩和を引き起こすことを含む。治療は、バイオフィルム形成の予防、阻害、又は緩和を含んでもよい。細菌感染の「危険性がある」個体への投与は、個体が必ずしも細菌感染と診断されていることはないが、個体の環境が感染について正常よりも感染の危険性が高い状態に個体を置くこと、例えば、個体が火傷被害者であることを意味する。細菌感染の「疑いがある」個体への投与は、個体が、感染のいくつかの初期の徴候、例えば、熱上昇を示しているが、診断はまだなされていないか又は確認されていないことを意味する。
【００５２】
用語「有効量」は、治療を行うのに十分な投薬量を意味する。有効な治療に必要な有効成分の量は、投与手段、標的部位、患者の生理的状態、及び投与される他の薬剤を含む多くの異なる因子に依存するであろう；したがって、治療投薬量は、安全性及び有効性を最適化するために漸増されるべきである。典型的には、インビトロで使用される投与量は、有効成分のインビボでの投与に有用な量において、有用な手引きを提供してもよい。特定の障害の治療に有効な投与量の動物試験は、ヒトへの投与量の更なる予測される指標を提供するであろう。医薬製剤の有効成分の濃度は、典型的には、選択される投与の特定の様式に従って、約０．１重量％未満、通常、約２重量％又は少なくとも約２重量％から、２０重量％〜５０重量％程度まで又はそれを超えて変化し、流体の体積、粘度等によって主として選択されるであろう。様々な適切に考慮すべき事項は、例えば、グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）及びギルマンズ（Ｇｉｌｍａｎ’ｓ）、「治療学の薬理学的基礎」（“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”）、ハードマンら（Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．）編集、第１０版、マクグロー−ヒル（ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ）（２００１年）、及びレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：「調剤の科学及び実践」（“Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”）、フィラデルフィア科学大学、第２１版、マック・パブリッシング・コーポレーション（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、イーストン、ＰＡ（２００５年）に記載され、両者は、参照により本明細書中に全体として援用される。投与方法は、その中で検討され、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、鼻腔内、局所、及びイオントフォレーゼによる経路等による投与を含む。
【００５３】
本発明の目的のために、「ＲＩＰ組成物」は、ＲＮＡＩＩＩ阻害ペプチド及び場合により他の薬理学的に活性な物質を含む。適した活性な物質は、抗生物質及び抗菌ペプチドを含む。有用な抗生物質は、限定されないが、アミノ−グリコシド（例えば、ゲンタマイシン）、ベータ−ラクタム（例えば、ペニシリン）、又はセファロスポリンを含む。有用な抗菌ペプチドは、さらに下記に記載される。活性な物質は、ＲＩＰと同じ組成物で、又はＲＩＰ組成物が投与されるのと同間若しくはその前後で別々の製剤で個体に投与されるとよい。例えば、本方法は、ＲＩＰ組成物及び抗生物質の別々の製剤の経口による同時投与を含む。ＲＩＰ及び抗生物質の投与は、約４８時間以内、好ましくは約２〜８時間以内、最も好ましくは実質的に同時に行われてもよい。
【００５４】
本組成物は、細菌性敗血症、細菌誘導の全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、蜂巣炎、角膜炎、骨髄炎、敗血症性関節炎、乳腺炎、皮膚感染、肺炎、心内膜炎、髄膜炎、手術後の創感染、装置に関連した感染、歯周炎及び毒素性ショック症候群を含む細菌感染によって引き起こされる種々の疾患における疾患症状の全般的な病状を和らげるか又はその発症を遅延させるのに有用である。
【００５５】
ＲＩＰを含むナノ粒子組成物
本発明に係るナノ粒子製剤は、上記したように、ＲＩＰ組成物を含む。ＲＩＰ組成物は、細菌感染を治療し又はその危険性を低下させるのに有効な量でＲＩＰペプチドを含み、ＲＩＰの抗菌性活性の助長を手助けする他の有効成分を追加して含んでもよい。例えば、ＲＩＰ組成物は、抗菌ペプチド又は従来の抗生物質を含んでもよい。組成物はまた、望ましい色、味、安定性、緩衝能力、分散又は他の特徴を提供するために組成物に添加してよい不活性な成分を含んでもよい。これらの成分は、酸化鉄、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白色インク等を含む。
【００５６】
ナノ粒子担体それ自体は、追加の物質の有無を問わず投与されるとよい。例えば、ナノ粒子は、経口的又はデポットとして投与される場合、それらは、液体に混入され又はカプセル内に含有されてもよい。ナノ粒子はまた、例えば、投与目的のために、フォーム、軟膏等に含有されてもよい。従来の非毒性な固体担体、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、スターチ、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウム等は、ナノ粒子と同時に使用されてもよい。経口投与の目的のために、医薬として許容される非毒性組成物は、前に列挙した担体などの通常使用される賦形剤のいずれかを、一般的に、ＲＩＰの１０〜９５％、より好ましくは２５％〜７５％で組み込むことによって形成される。
【００５７】
製剤中の治療的に活性な化合物の濃度は、最適な治療応答を提供するために変更させてよい。例えば、いくつかに分割した投薬量は、毎日投与されてもよく、又は治療状況によって指示されるように比例的に減らしてもよい。感染を治療するためのヒトの投薬量レベルは知られ、一般的には、１日当たり約０．１〜５００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約６〜２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約１２〜１００ｍｇ／ｋｇの毎日の投薬量を含む。投与される製剤の量は、当然、患者及び苦痛の重症度、投与法及びスケジュール、並びに処方する医師の判断に依存するであろう。例えば、静脈内に投与した場合、血清濃度は、１０日未満で感染を治療するのに十分なレベルを維持することができるが、本発明によって提供される利点は、ＲＩＰ組成物の相対的に低いレベルで１０日よりも長く治療を伸ばす能力であり、これは、細菌が長期間の治療にわたって本発明の組成物に耐性を発現するであろう可能性の減少のためである。
【００５８】
医薬品等級の有機若しくは無機担体又は希釈剤は、治療的に活性な化合物を含有する組成物を作製するために使用することができる。当該技術分野に既知の希釈剤は、水性媒体、植物及び動物のオイル及び脂肪を含む。安定化剤、湿潤剤及び乳化剤、浸透圧を変えるための塩、又は適切なｐＨ値をもたらすための緩衝剤、及び皮膚浸透増強剤は、補助剤として使用することができる。組成物は、他の医薬賦形剤、担体等を含んでもよい。適した賦形剤は、例えば、水、塩類、デキストロース、グリセロール、エタノール等である。医薬組成物を製造する方法は、当業者に周知である。例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：「調剤の科学及び実践」（“Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”）、フィラデルフィア科学大学、第２１版、マック・パブリッシング・コーポレーション（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．）、イーストン、ＰＡ（２００５年）を参照されたい。
【００５９】
バイオフィルムに関連した感染の治療
表面に付着する細菌は、バイオフィルムを形成するために自ら合成した水和高分子性マトリックスにおいて凝集する。これらの固着性共同体の形成及び抗菌剤に対するそれらの特有の耐性は、多くの持続的及び慢性的な細菌感染の原因となる。コスタートンら（Ｃｏｓｔｅｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８４：１３１８−２２（１９９９年）を参照されたい。バイオフィルムは、不活性な表面又は機能を失った組織上に優先的に発現し、医療用器具及び死骨の腐骨などの機能を失った組織の断片に共通して発生する。バイオフィルムはまた、心内膜炎の場合のように、生存組織に形成することもできる。バイオフィルムは、１以上の箇所にゆっくりと成長し、バイオフィルム感染は、明白な症状を生じさせるのが遅いことが多い。固着性の細菌細胞は、抗原を放出し、抗体産生を刺激するが、抗体は、一般的に、バイオフィルムに対して効果がなく、しかも周辺組織に免疫複合性損傷を引き起こす場合がある。優れた細胞性及び体液性免疫反応を有する個体において、バイオフィルム感染は、宿主の防御機構によって解決されることはめったにない。抗生物質による治療は、典型的には、バイオフィルムから放出された浮遊細胞によって引き起こされる症状を後退させるが、バイオフィルムを死滅さることはない。したがって、バイオフィルム感染は、典型的には、固着性の集団が身体から外科的に取り除かれるまで、何度も繰り返される抗生物質による治療後、頻発の症状を示す。したがって、バイオフィルムが一度形成されると、バイオフィルムを根絶させようとすることよりも、バイオフィルム形成を阻害することが好ましい。
【００６０】
本発明の組成物及び方法は、バイオフィルムに関連した細菌感染の治療、又はバイオフィルムに関連した疾患の危険性の低下に有用である。例えば、ＲＩＰ組成物を含むナノ粒子は、個体に挿入される装置、例えば、外科用装置、カテーテル、人口装具又は他の移植物を被覆し、移植された装置がバイオフィルムを発現するであろう危険性を低下させるために使用するとよい。代わりに、ナノ粒子は、局在化した感染の治療に高い局在化した濃度の組成物を提供するために移植されてもよい。この実施態様では、ナノ粒子は、持続放出可能なデポットとして調合される。下記の表２は、バイオフィルムに関連した院内感染の部分的なリストを提供し、これに対して、本発明のナノ粒子製剤及び関連した方法が有用であると期待される。
【００６１】
【表２】
2008540544.tif 000003
【００６２】
抗菌ペプチド
上記したように、本発明に係るＲＩＰ製剤は、抗菌ペプチドを含んでもよい。遺伝的にコードされた抗菌ペプチドは、多数の微生物に対する宿主防御の第一線を表す大部分の多細胞生物における固有の免疫応答の重要な成分である。抗菌ペプチドは、抗生物質耐性株を含むグラム陰性菌及びグラム陽性菌の両方を殺傷又は中和する広範囲の活性を有する。ハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）、ランセット・インフェクシャス・ディジーズ（Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１：１５６−６４（２００１年）を参照されたい。ワン（Ｗａｎｇ）、ネブラスカ大学医学センター、抗菌ペプチドデータベース（ｈｔｔｐ：／／ａｐｓ．ｕｎｍｃ．ｅｄｕ／ＡＰ／ｍａｉｎ．ｐｈｐ（最終更新日：２００５年３月５日））は、参照により本明細書中に全体として援用され、潜在的に、本発明に有用である抗菌作用を有する約５００個の抗菌ペプチドのデータベースを提供する。通常、１２〜５０個のアミノ酸残基の抗菌ペプチドが作られ、それらはポリカチオン性である。通常、それらのアミノ酸の約５０％が疎水性であり、それらは、一般的に両親媒性であり、それらの一次アミノ酸配列は、疎水性及び極性残基を交互に入れ替えることを含む。抗菌ペプチドは、４つの構造的分類：（ｉ）複数のジスルフィド結合によって安定化されるβ−シート構造（例えば、ヒトデフェシン−１）、（ｉｉ）共有的に安定化したループ構造（例えば、バクテネシン）、（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｔｒｐ）に富んだ伸長したらせん状ペプチド（例えば、インドリシジン）、及び（ｉｖ）両親媒性α−ヘリックス（例えば、マゲイニン及びセクロピン）の１つに適合する。ウォンら（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）バイオケミストリー・アンド・セル・バイオロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）７６：２３５−４６（１９９８年）；スタークら（Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．）アンチマイクロバイアル・エージェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ）４６：３５８５−９０（２００２年を別途参照されたい。）。
【００６３】
ワクチン及び抗体
小さなペプチドであるため、ＲＩＰは、一般的に、非免疫原性である；しかしながら、ナノ粒子製剤、特に持続放出可能なものは、特にアジュバント等と併用して使用される場合、免疫応答の誘発に使用されてもよい。ＲＩＰに対する免疫応答は、好都合には、感染から個体の保護を手助けするＲＡＰの活性に拮抗する。ゴブら（Ｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）（２００１年）を参照されたい。したがって、本発明の一実施態様では、ＲＩＰ製剤は、ＲＩＰに対する免疫応答を誘発するために個体に投与され、ＲＡＰ作用に拮抗することによって感染から個体を保護する抗体を作る。抗体産生Ｂ細胞からモノクローナル抗体を実質的に作る方法は、当該技術分野において周知であり、抗体を分析し、組換え技術を介して抗体を実質的に操作する方法も同様である。抗体に関連するこれらの方法及び他の方法は、２００３年２月３日出願の米国特許出願第１０／３５８，４４８号；２００１年４月１９日出願の米国特許出願第０９／８３９，６９５号；及び１９９８年４月２日出願の米国特許出願第０９／０５４，３３１号であって、現在の米国特許第６，２９１，４３１号に記載され、これらは、各々、参照により本明細書中に全体として援用される。
【００６４】
本明細書中で言及した全ての刊行物及び特許は、これらの刊行物及び特許が引用されるものと関連付けて、具体的な方法及び／又は材料を開示及び記載するために参照により本明細書中に援用される。本明細書中で検討した刊行物及び特許は、本出願の出願日前にそれらが単に開示されたことを示しているだけである。本発明が、先行する発明のために、このような刊行物又は特許を先行する資格を与えられないと認めるように解釈されるべきものは本明細書中にはない。さらに、提供された公開又は発行の日付は、これとは別に確かめられる必要があるかもしれない実際の日付とは異なっていてもよい。
【００６５】
前述の明細書は、例証を目的として提供される実施例とともに、本発明の原理を教示するが、形式上及び詳細な種々の変更は、本発明の真の範囲から逸脱することなくなされ得ることは、この開示の解釈から当業者に承認されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】図１Ａは、ＴＲＡＰ及びａｇｒを介した細菌毒性の制御を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＴＲＡＰのリン酸化の減少による細菌毒性の減少におけるＲＩＰの役割を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ＴＲＡＰのリン酸化を増加するＲＡＰの拮抗作用を示す。
【図２】図２は、本発明のＲＩＰ組成物の活性を測定するための代表的なインビトロでのβ−ラクタマーゼアッセイの典型的な結果を示す。
【図３】図３は、マウスの敗血症／蜂巣炎モデルにおける代表的な結果を示し、ここで、ＲＩＰ組成物の静脈内又は経口投与は、黄色ブドウ球菌感染から上段のマウスを保護したが、下段のマウスは保護されなかった。黄色ブドウ球菌感染によって引き起こされた病巣は、下段のマウスに明らかである。
【図４】図４は、本発明のＲＩＰ組成物を試験するために有用な動物モデルを代表するラット移植片モデルシステムを示す。
【図１Ａ】
2008540544.tif 000004
【図１Ｂ】
2008540544.tif 000005
【図１Ｃ】
2008540544.tif 000006
【図２】
2008540544.tif 000007
【図３】
2008540544.tif 000008
【図４】
2008540544.tif 000009
【国際調査報告】
2008540544.tif 000010