(57)【要約】  本発明は、血管新生を阻害するキメラ組み換えタンパク質をコードするＤＮＡ配列、該キメラタンパク質自体、該キメラタンパク質の薬学的使用、および上記組み換えタンパク質を含む製剤の薬学的組成物に関する。
2008503243.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＥＧＦ受容体であるＦＬＴ−１およびＫＤＲの様々な断片からなる一種のキメラタンパク質であって、以下の（ａ）〜（ｅ）からなる群より選択されることを特徴とするキメラタンパク質。
（ａ）ＫＤＲの第１Ｉｇ様ドメインと、ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメインと、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメインとからなり、KDRd1-FLTd2-KDRd3と称されるキメラタンパク質
（ｂ）ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメインと、ＫＤＲの第３および第４Ｉｇ様ドメインとからなり、FLTd2-KDRd3,4と称されるキメラタンパク質
（ｃ）ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメインと、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメインと、ＦＬＴ−１の第４Ｉｇ様ドメインとからなり、FLTd2-KDRd3-FLTd4と称されるキメラタンパク質
（ｄ）ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメインと、ＫＤＲの第３、第４、および第５Ｉｇ様ドメインとからなり、FLTd2-KDRd3,4,5と称されるキメラタンパク質
（ｅ）ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメインと、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメインと、ＦＬＴ−１の第４および第５Ｉｇ様ドメインとからなり、FLTd2-KDRd3-FLTd4,5と称されるキメラタンパク質
【請求項２】
請求項１に記載のキメラタンパク質とヒト免疫グロブリンのＦｃとからなる一種のキメラタンパク質であって、以下の（ｆ）〜（ｊ）からなる群より選択されるキメラタンパク質。
（ｆ）KDRd1-FLTd2-KDRd3-Fcと称されるＦＰ２’
（ｇ）FLTd2-KDRd3,4-Fcと称されるＦＰ３’
（ｈ）FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fcと称されるＦＰ４’
（ｉ）FLTd2-KDRd3,4,5-Fcと称されるＦＰ５’
（ｊ）FLTd2-KDRd3-FLTd4,5-Fcと称されるＦＰ６’
【請求項３】
上記ヒト免疫グロブリンのＦｃは、ヒト免疫グロブリンのクラスまたはサブクラスに由来する請求項２に記載のキメラタンパク質。
【請求項４】
上記免疫グロブリンのＦｃの断片は、全長のＦｃまたはＦｃ配列の断片である請求項３に記載のキメラタンパク質。
【請求項５】
アミノ酸配列が、配列番号７で表される請求項２に記載のキメラタンパク質ＦＰ３。
【請求項６】
請求項１〜４のキメラタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ。
【請求項７】
請求項５に記載のキメラタンパク質をコードする組み換えＤＮＡであって、ＤＮＡ配列が、配列番号６で表される組み換えＤＮＡ。
【請求項８】
請求項６または７に記載の組み換えＤＮＡの配列を含み、
プラスミド、ウィルス、またはＤＮＡ断片から選択されるベクター。
【請求項９】
請求項８に記載の組み換えベクターを含み、
真核細胞または原核細胞である組み換え宿主。
【請求項１０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用方法であって、
該キメラタンパク質を抗血管新生の薬剤の調製に用いる使用方法。
【請求項１１】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質と、薬学的に許容可能な担体とを含む薬学的組成物。
【請求項１２】
注射溶液である請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
請求項１１に記載の薬学的組成物の使用方法であって、
該薬学的組成物を、腫瘍、糖尿病性網膜症、関節炎、貧血症、および子宮内膜増殖症を含む、血管新生に関連する疾患の治療に用いる使用方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、遺伝子工学技術に関するものであって、より具体的には、血管新生を阻害する組み換えキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡにコードされるキメラタンパク質、該キメラタンパク質の治療への利用、並びに、該キメラタンパク質を含む医療用組成物および製剤に関するものである。
【０００２】
〔発明の背景〕
血管新生は、現存の血管から新しい血管を形成させる過程である。たいていの成人の血管システムは、無活動な状態であり、血管新生は、ある生理的機構および病的機構においてのみ起こる。上記生理的機構および病的機構としては、腫瘍、糖尿病性網膜症、関節炎、貧血器官、子宮内膜増殖症などを挙げることができる。血管新生は、腫瘍の分化過程で、腫瘍細胞が急激に増殖するのに重要な役割を果たす（Hanahan and Folkman: Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis, Cell, 1996, 86:353-364）。動物の癌モデルおよびヒトの臨床試験の研究によって、腫瘍の血管新生を阻害すると、腫瘍の成長および分化が効果的に阻害され、その結果、患者の寿命を延ばせることが、すでに知られている。血管新生は、多くの生物学的因子によって、影響され、かつ制御される。血管新生に影響を与える主な細胞は、血管内皮細胞である。血管内皮細胞は、血管壁の内側を形成する細胞である。様々な増殖因子は、血管内皮細胞の表面上にある適切な受容体に結合することができる。そして、細胞内情報伝達を介する細胞プロセスを制御し、結果として、血管新生に影響を与えることができる。
【０００３】
様々な増殖因子の中で、ＶＥＧＦ（vascular endothelial cell growth factor、血管内皮細胞増殖因子）は、最も重要な血管新生因子である（Ferrara: VEGF and the quest for tumor angiogenesis factor, Nat. Rev. Cancer, 2002, 10: 795-803; Ferrara: Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications, Semin. Oncol., 2002，29 (6 sumppl): 10-14）。ＶＥＧＦは、多くの種類の細胞によって、分泌される。しかし、腫瘍細胞では、しばしば、過剰に発現される。ＶＥＧＦは、適切な受容体に結合することによって機能する。ＶＥＧＦ受容体には、主な２種類の受容体がある。具体的には、ＦＬＴ−１（fms-like tyrosine kinase、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ）、およびＫＤＲである。分子構造の点において、これら２つの受容体は、共に、３つの異なる機能を有する領域からなる。１つ目の領域は、細胞外領域である。該細胞外領域は、７つの免疫グロブリン様（Ｉｇ様）ドメイン（d1〜d7）からなり、ＶＥＧＦに対する特異的な親和性を有する。また、ＶＥＧＦへの結合において重要な領域である。２つ目の領域は、疎水性のアミノ酸残基を含む膜貫通領域である。３つ目の領域は、チロシンキナーゼとしての機能団（functioning group）を含む細胞内ドメインである。該細胞内ドメインは、該受容体がＶＥＧＦによって活性化された後、リン酸化される。そして、細胞内情報伝達を誘発し、内皮細胞の機能的な効果および血管新生を引き起こす。
【０００４】
ＦＬＴ−１およびＫＤＲは、主に、血管内皮細胞に分布している。したがって、ＶＥＧＦが血管内皮細胞に影響を与える活性は、非常に特異的である。ＶＥＧＦは、内皮細胞の分化を促進し、内皮細胞の移動を誘導し、アポトーシスを阻害し、また、血管の形態学的な変化を引き起こす。つまり、ＶＥＧＦは、非常に効果的に血管新生を促進させる因子である。
【０００５】
腫瘍組織におけるＶＥＧＦの発現レベルは、正常組織におけるそれよりも高い。さらに、腫瘍の急激な成長は、しばしば、該腫瘍の内部で低酸素症を引き起こす。低酸素症は、さらに、ＶＥＧＦの発現を誘導する。したがって、ＶＥＧＦは、腫瘍の血管新生を促進させる重要な因子である。動物を用いた多くの研究によって、ＶＥＧＦがその受容体に結合することを阻害することにより、腫瘍の血管新生は効果的に阻害され、その結果、腫瘍の成長が阻害されることが明らかとなった。例えば、糖尿病性網膜症および関節炎などのような他の血管新生が関与する疾患においても、ＶＥＧＦはこれら疾患の進行に密接に関連している（Ferrara: Role of vascular endothelial growth factor in physiologic and pathologic angiogenesis: therapeutic implications. Semin. Oncol. 2002, 29 (6 sumppl): 10-14）。
【０００６】
癌および他の疾患においてＶＥＧＦは重要な役割を果たしているため、ＶＥＧＦを特異的に阻害するタンパク質または化学物質は、治療に利用できる可能性を有している。例えば、ＶＥＧＦに対する中和抗体は、腫瘍の成長を効果的に阻害できることが研究により示されている（Jain: Tumor angiogenesis and accessibility: role of vascular endothelial growth factor, Semin. Oncol., 2002，29 (6 suppl): 3-9）。したがって、有効なＶＥＧＦ阻害剤を新たに開発することは、臨床的な研究において重要である。ＦＬＴ−１およびＫＤＲは、ＶＥＧＦの本来の受容体であるため、可溶性のＦＬＴ−１（ＦＬＴ−１の細胞内ドメイン）および可溶性のＫＤＲ（ＫＤＲの細胞内ドメイン）の血管新生を抑制する機能を調べた研究がある（Yoko Hasumi: Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Cancer. Cancer Research 62, 2002: 2019-2023）。上記可溶性のＦＬＴ−１は、in vitroにおいて、血管内皮細胞の成長を効果的に阻害することができる。しかし、上記可溶性のＦＬＴ−１は、血清半減期が短く、効果的な血清濃度には達しない。同様に、上記可溶性のＫＤＲも、in vitroにおいて、血管内皮細胞の成長を阻害することができた。しかし、モデル動物における抗腫瘍活性は十分ではなかった（Yoko Hasumi: Soluble FLT-1 Expression Suppresses Carcinomatous Ascites in Nude Mice Bearing Ovarian Cancer. Cancer Research 62, 2002: 2019-2023）。上記従来技術の欠点を克服するために、本発明は、ＦＬＴ−１およびＫＤＲの種々の断片を含み、ＶＥＧＦの生物学的活性を効果的に阻止し、血管新生を阻害する新規なキメラタンパク質を提供する。
【０００７】
〔発明の概要〕
本発明の第１の形態として、ＶＥＧＦの生物学的な活性を阻止し、血管新生を阻害する新規な組み換えキメラタンパク質を提供する。
【０００８】
本発明の第２の形態として、上記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を提供する。
【０００９】
本発明の第３の形態として、上記キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベクター、および該ベクターの組み換え宿主を提供する。
【００１０】
本発明の第４の形態として、ＶＥＧＦ活性を阻止し、血管新生を阻害する薬剤を調製するための上記キメラタンパク質の使用、上記キメラタンパク質と適切な医療担体とを含む医療用組成物およびその製剤、並びに、上記医療用組成物を用いた治療を提供する。
【００１１】
本発明の重要な点は、種々のＦＬＴ−１またはＫＤＲの断片をもつ一連のキメラタンパク質を設計し、作製すること、および、その後、ＶＥＧＦ結合アッセイを含む試験法を用いて、ＶＥＧＦに対して高い親和性を有するキメラタンパク質を選択すること、さらに、最終的には、適切なＶＥＧＦ阻害剤を取得することにある。上記キメラタンパク質は、ヒト免疫グロブリンのＦｃを含むことが好ましい。なお、その作製方法は、図１に示す。上記キメラタンパク質は、従来の分子クローニング技術を用いて作製する。実験の詳細な方法論は、Molecular Cloning, the 2nd or the 3rd edition (Joseph Sambrook)のようなラボマニュアルに記載されている。
【００１２】
本発明によれば、組み換えＤＮＡ技術によって作製されたキメラタンパク質は、ＶＥＧＦ受容体であるＦＬＴ−１およびＫＤＲの種々の断片を含む。また、上記キメラタンパク質は、ＫＤＲの第１Ｉｇ様ドメインと、ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメインと、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメインとからなるキメラタンパク質（「KDRd1-FLTd2-KDRd3」と称する）；ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメインと、ＫＤＲの第３および第４Ｉｇ様ドメインとからなるキメラタンパク質（「FLTd2-KDRd3,4」と称する）；ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメインと、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメインと、ＦＬＴ−１の第４Ｉｇ様ドメインとからなるキメラタンパク質（「FLTd2-KDRd3-FLTd4」と称する）；ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメインと、ＫＤＲの第３、第４、および第５Ｉｇ様ドメインとからなるキメラタンパク質（「FLTd2-KDRd3,4,5」と称する）；並びに、ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメインと、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメインと、ＦＬＴ−１の第４および第５Ｉｇ様ドメインとからなるキメラタンパク質（「FLTd2-KDRd3-FLTd4,5」と称する）；からなる群より選択される。
【００１３】
FLTd2のアミノ酸配列は、配列番号１に示されている。FLTd4のアミノ酸配列は、配列番号２に示されている。KDRd1のアミノ酸配列は、配列番号３に示されている。KDRd3のアミノ酸配列は、配列番号４に示されている。KDRd4のアミノ酸配列は、配列番号５に示されている。
【００１４】
本明細書において、ＦＬＴは、ＦＬＴ−１配列を示す。ＫＤＲは、ＫＤＲ配列を示す。また、ｄｉは、ＦＬＴ−１またはＫＤＲにおける第ｉＩｇ様ドメインを示す。
【００１５】
好ましくは、本発明は、ヒト免疫グロブリンのＦｃを含む、一種のキメラタンパク質を提供する。このようなキメラタンパク質は、KDRd1-FLTd2-KDRd3-Fcと称されるＦＰ２’;FLTd2-KDRd3,4-Fcと称されるＦＰ３’;FLTd2-KDRd3-FLTd4-Fcと称されるＦＰ４’;FLTd2-KDRd3,4,5-Fcと称されるＦＰ５’;および、FLTd2-KDRd3-FLTd4,5-Fcと称されるＦＰ６’；からなる群より選択されることが好ましい。
【００１６】
本明細書において、Ｆｃは、ヒト免疫グロブリンのＦＣに由来するヒト免疫グロブリンのＦｃの断片を示す。上記ヒト免疫グロブリンとしては、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびＩｇＡ、またはサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４が挙げられる。上記Ｆｃ領域は、Ｆｃ配列の全長であってもよし、ＣＨ２、ＣＨ３、またはヒンジ領域に由来するＦｃ配列の断片であってもよい。
【００１７】
図１に示すように、従来技術において知られているキメラタンパク質（「ＦＰ１’」と称する）は、ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメイン（FLTd2）と、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメイン（KDRd3）と、ヒト免疫グロブリンのＦｃとからなる。本発明において提供されるキメラタンパク質ＦＰ２’は、ＦＰ１’にＫＤＲの第１Ｉｇ様ドメイン（KDRd1）のアミノ酸配列を付加したものである。ＦＰ’２は、ＶＥＧＦの結合部位が増加し、ＶＥＧＦに対する親和性が向上されている。キメラタンパク質ＦＰ３’およびＦＰ４’は、それぞれ、ＦＰ１’を基本として、ＫＤＲの第４Ｉｇ様ドメイン（KDRd4）またはＦＬＴ−１の第４Ｉｇ様ドメイン（FLTd4）のアミノ酸配列を付加したものである。ＦＰ５’およびＦＰ６’は、それぞれ、ＦＰ１’を基本として、ＫＤＲの第４および第５Ｉｇ様ドメイン（KDRd4,5）、または、ＦＬＴ−１の第４および第５Ｉｇ様ドメイン（KLT-1d4,5）の配列を付加したものである。これらの付加された配列は、キメラタンパク質の２量体化を促進し、ＶＥＧＦの結合に適した３次元構造に折りたたみ、ＶＥＧＦに対する親和性を向上させることができる。
【００１８】
より好ましくは、本発明は、配列番号７に示されるアミノ酸配列を有するキメラタンパク質ＦＰ３を提供する。
【００１９】
本発明において述べられるキメラタンパク質は、従来の組み換えＤＮＡ技術を用いて取得することができる。まず、上述したキメラタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ配列を取得する。このとき、ＦＬＴ−１およびＫＤＲをコードするＤＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋ（NCBI (National Center for Biotechnology Information)）から利用することができる。次に、上述したキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲにより合成した後、ベクターにクローニングする。本発明において、上記ベクターは、通常、プラスミド、ウィルス、または分子生物学におけるＤＮＡ断片が用いられる。上記キメラタンパク質を細胞外に確実に分泌させるために、分泌のためのシグナル配列が、上記キメラペプチドのＤＮＡ配列の末端に挿入される。上記ベクターの配列は、遺伝子の転写を可能にするプロモーター領域、タンパク質の翻訳を開始させるシグナルおよび終止させるシグナル、並びにpoly A配列を含む。上記ベクターは、微生物の増殖に対する抗生物質の耐性遺伝子を含む。さらに、上記ベクターは、安定な形質移入細胞株を選抜するための真核細胞の選抜遺伝子を含む。
【００２０】
ＦＬＴ−１およびＫＤＲにおける全てのＩｇ様ドメインのアミノ酸配列について、完全な境界はないため、これらドメインの配列長にはバラツキがある。したがって、本発明において述べられるキメラタンパク質の配列には、同様に、バラツキがある。これら配列の全てのバリエーションは、本発明の範囲に含まれると理解されるものである。
【００２１】
上述したキメラタンパク質のプラスミドを構築した後、該プラスミドは、上記キメラタンパク質を発現させるための宿主細胞に形質移入するために用いられる。これらキメラタンパク質の発現系は数多く存在する。上記発現系には、哺乳類細胞、微生物、酵母、および昆虫細胞が含まれるが、これらに限定されるものではない。上記のうち、哺乳類細胞および昆虫細胞は、真核細胞である。一方、微生物および酵母の細胞は、原核細胞である。哺乳類細胞で発現したタンパク質は、グリコシル化されている。本発明のキメラタンパク質は、グリコシル化部位を含むため、哺乳類細胞は、該キメラタンパク質を発現させるために最も適した細胞である。大スケールでタンパク質を製造するために適した哺乳類細胞の種類は多く存在する。例えば、２９３細胞、ＣＨＯ細胞、ＳＰ２０細胞、ＮＳ０細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、およびＰｅｒＣ６細胞などが挙げられる。また、他の多くの種類の細胞も、上記キメラタンパク質を発現させ、製造するために用いることができる。これらは、全て、本発明の範囲に含まれる。上述したキメラタンパク質をコードするプラスミドは、上記細胞に形質移入される。形質移入の方法には、エレクトロポレーション法、リポソームを用いたトランスフェクション、およびカルシウム沈殿法などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２２】
また、これらキメラタンパク質を発現させるために、哺乳類細胞以外、例えば、微生物、酵母、および昆虫細胞などの発現系を用いることができる。これらは、すべて、本発明の範囲に含まれると考えるべきである。これらの発現系は、哺乳類細胞と比較して、タンパク質の製造収率がより高い。しかし、これらの発現系では、哺乳類細胞の発現系とは異なり、グリコシル化されていないタンパク質、またはグリコシル化された炭化水素鎖を有するタンパク質が製造される。
【００２３】
上記キメラタンパク質を発現させた後、細胞培養培地におけるキメラタンパク質濃度を、ＥＬＩＳＡまたはその他の試験法によって測定することができる。上記キメラタンパク質は免疫グロブリンのＦｃ領域を含むため、該キメラタンパク質を、ＰｒｏｔｅｉｎＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することができる。
【００２４】
様々なキメラタンパク質を上記組み換え宿主細胞の培地から取得した後、それらキメラタンパク質の試験を行い、ＶＥＧＦに対する親和性を比較する。上記試験は、ＶＥＧＦの結合実験によって行う。さらに、それらキメラタンパク質のＶＥＧＦ阻害活性を試験する。該試験は、ＶＥＧＦによって誘導されるヒト血管内皮細胞の増殖実験によって行う。上記実験結果から、本発明において作製されたキメラタンパク質は、全て、従来技術であるＦＰ１’と比較して、高い親和性でＶＥＧＦに結合できることが明らかとなった（図２）。さらに、本発明にかかるキメラタンパク質は、血管内皮細胞のＶＥＧＦによる活性化を効果的に阻止し、該内皮細胞の成長を阻害した。さらなる実験から、ＦＰ３は、本発明にかかるキメラタンパク質の中で、ＶＥＧＦに対する阻害活性が最も高く、最も効果的にＶＥＧＦを阻止することが明らかとなった。
【００２５】
このように、本発明において作製されるキメラタンパク質は、ＶＥＧＦに対する非常に高い阻害活性を有する。また、上記キメラタンパク質は、全て、血管新生を抑制する生物学的活性を有する。したがって、血管新生またはＶＥＧＦに関連する疾患を治療するために用いることができる。上記疾患には、様々な腫瘍、糖尿病性網膜症、関節炎、貧血症、および子宮内膜増殖症などが含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
in vivoにおいて上記キメラタンパク質が血管新生を抑制する効果をさらに実証するために、いくつかの動物モデル実験を行った。これらの実験の結果から、Ｂ１６Ｆ１０メラノーマＢＡＬＢ／Ｃヌードモデルマウス、およびヒトＰＣ−３前立腺腫瘍異種移植モデルマウスにおいて、本発明のキメラタンパク質は、従来技術のＦＰ１’よりもずっと優れており、腫瘍の成長を効果的に阻害し、動物の寿命を延ばすことが明らかとなった。このように、本発明のキメラタンパク質は、高い抗癌活性を有する。
【００２７】
また、本発明は、上述したキメラタンパク質および適切な医療担体を含む医療用組成物を提供する。該医療用組成物は、従来の調合方法を用いて、あらゆる製剤に調合することができる。中でも、注射剤に調合することが好ましく、凍結乾燥された形態に調合されることがさらに好ましい。
【００２８】
〔具体的な実施形態〕
図１は、本発明の好ましい実施形態にかかる５つのキメラタンパク質および従来技術のＦＰ１の構造を示す。これらは、遺伝子工学技術により、ＦＬＴ−１、ＫＤＲ、および免疫グロブリンのＦｃ領域に由来する様々な断片を用いて作製される。
【００２９】
図２は、本発明の好ましい実施形態にかかる５つのキメラタンパク質のＶＥＧＦへの結合を、従来技術のＦＰ１のＶＥＧＦへの結合と比較した結果を示す。ＯＤ値は、ＶＥＧＦにキメラタンパク質が結合していることを表すシグナルを示す。上記結果から、上記５つのキメラタンパク質は、全て、ＦＰ１よりも非常に高い親和性で、ＶＥＧＦに結合することが明らかとなった。また、上記５つのキメラタンパク質のうち、ＦＰ３は、最も親和性が高いことが明らかとなった。
【００３０】
図３は、本発明のキメラタンパク質は、ＦＰ１と比較して、in vitroでヒト血管内皮細胞の増殖を効果的に阻害することを示す。図４は、キメラタンパク質ＦＰ３は、マウスにおいて、Ｂ１６Ｆ１０メラローマ腫瘍の成長を効果的に阻害することを示す。図５は、キメラタンパク質ＦＰ３は、マウスにおいて、ヒトＰＣ−３前立腺腫瘍の成長を効果的に阻害することを示す。図６は、本発明のキメラタンパク質ＦＰ６のマウスにおける腫瘍の成長抑制活性と、従来技術のＦＰ１のそれとを比較するものである。
【００３１】
以下の例は、本発明で述べるキメラタンパク質の作製、実験方法、および用途を詳細に記載するものである。しかし、これらの例は、本発明の保護範囲を限定するものであると解釈されるべきではない。
【００３２】
＜実施形態１：キメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列のクローニングおよび組み換えベクターの構築＞
免疫グロブリンのＦｃをコードするＤＮＡ配列を除いて、本発明の様々なキメラタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ＦＬＴ−１およびＫＤＲのｃＤＮＡに由来するものである。ＦＬＴ−１およびＫＤＲは、主に、血管内皮細胞で発現されるため、ヒトの臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）から、ＲＮＡ精製キット（QIAGEN）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。その後、ＡＭＶ逆転写酵素（Promega）を用いて、ＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、様々なプライマーを用いて、様々なＦＬＴ−１断片およびＫＤＲ断片をＰＣＲにて増幅させた。最終的に、ＦＬＴ−１、ＫＤＲ、およびヒト免疫グロブリンのＦｃ（IgG1 Fc）の配列をＰＣＲによって、融合し、様々なキメラタンパク質をコードする組み換えＤＮＡ配列を構築した。従来技術のＦＰ１を含む、６つ全てのキメラタンパク質の構造を図１に示す。
【００３３】
〔実施例１：ＦＰ３をコードする配列および組み換えベクターの構築〕
ＥＧＭ−２培地（Clonetics）を用いて、Ｔ−１７５フラスコ内で、ＨＵＶＥＣ細胞（Clonetics）を培養した。１×１０７個の細胞を収集し、ＲＮＡ精製キット（QIAGEN）を用いて、全ＲＮＡを抽出した。その後、ｃＤＮＡキット（Invitrogen）を用いて、ｃＤＮＡを合成した。そのｃＤＮＡ産物は、使用するまで−８０℃で保存した。上記のＨＵＶＥＣ由来のｃＤＮＡから、ＦＬＴ−１およびＫＤＲの様々なドメインをＰＣＲにより増幅させるために、以下の特異的なプライマーを用いた。また、リンパ節ｃＤＮＡ（BD Clontech）から、ヒトIgG1 FcをＰＣＲにより増幅させるために、以下の特異的なプライマーを用いた。
【００３４】
プライマー：
FLT-1 d2 forward:  5’-cctttcgtagagatgtacagtga-3’
FLT-1d2 reverse:   5’-tatgattgtattggtttgtccat-3’
KDR d3-4 forward:  5’-gatgtggttctgagtccgtctca-3’
KDR d3-4 reverse:       5’-cggtgggacatacacaaccaga-3’
ヒトIgG1 Fc forward: 5’-gacaaaactcacacatgcccact-3’
ヒトIgG1 Fc reverse: 5’-tcatttacccggagacagggagag-3’
Ｉｇ様ドメインおよびヒトIgG1 Fcの断片は、以下の条件のＰＣＲにより増幅された。
変性：９５℃で３０秒間
アニーリング：５６℃で４５秒間
伸長：７２℃で２分間
サイクル数：３０サイクル。
【００３５】
その後、ＰＣＲ産物は、ＴＡクローニングキットを用いて、プラスミドｐＣＲ２．１（Invitrogen）にクローニングされた。Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）に形質転換した後、白いコロニーを選び取り、ＬＢ培地で一晩培養した。Qiagenのキットを用いて、ＤＮＡプラスミドを調製し、酵素消化して、ＤＮＡ配列解読を行った。
【００３６】
ＥｃｏＲＩ部位を含むプライマーを用いて、ＦＬＴ−１、ＫＤＲ、およびＩｇＧのＦｃのｃＤＮＡを、ＰＣＲにより縫い合わせ、融合させた。ＥｃｏＲＩで消化した後、ＤＮＡ断片を、Qiagenの精製キットを用いて精製した。そして、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１にクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉ（ＪＭ１０９）に形質転換した後、ポジティブコロニーを選び取り、ＬＢ培地で一晩培養した。Qiagenのプラスミド精製キットを用いて、ＤＮＡプラスミドを抽出し、その後、酵素消化して、ＤＮＡ配列解読を行った。こうして得られたＦＰ３をコードするＤＮＡ配列を配列番号６に示す。上記の通り確認されたプラスミドを用いて、２９３細胞またはＣＨＯ細胞に形質移入し、ＦＰ３を発現する安定な細胞株を取得した。ＦＰ３のアミノ酸配列を、配列番号７に示す。
【００３７】
〔実施例２：ＦＰ１遺伝子および組み換えベクターの構築〕
ＦＰ１は、ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメイン、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメイン、および実施例１と同一のヒトIgG1 Fcを融合させて目的の組み換えＤＮＡを構築したことを除いて、実施例１と同様にして作製した。
【００３８】
〔実施例３：ＦＰ２遺伝子および組み換えベクターの構築〕
ＦＰ２は、ＫＤＲの第１Ｉｇ様ドメイン、ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメイン、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメイン、および実施例１と同一のヒトIgG1 Fcを融合させて目的の組み換えＤＮＡを構築したことを除いて、実施例１と同様にして作製した。
【００３９】
〔実施例４：ＦＰ４遺伝子および組み換えベクターの構築〕
ＦＰ４は、ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメイン、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメイン、ＦＬＴ−１の第４Ｉｇ様ドメイン、および実施例１と同一のヒトIgG1 Fcを融合させて目的の組み換えＤＮＡを構築したことを除いて、実施例１と同様にして作製した。
【００４０】
〔実施例５：ＦＰ５遺伝子および組み換えベクターの構築〕
ＦＰ５は、ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメイン、ＫＤＲの第３、第４、および第５Ｉｇ様ドメイン、並びに実施例１と同一のヒトIgG1 Fcを融合させて目的の組み換えＤＮＡを構築したことを除いて、実施例１と同様にして作製した。
【００４１】
〔実施例６：ＦＰ６遺伝子および組み換えベクターの構築〕
ＦＰ６は、ＦＬＴ−１の第２Ｉｇ様ドメイン、ＫＤＲの第３Ｉｇ様ドメイン、ＦＬＴ−１の第４および第５Ｉｇ様ドメイン、並びに実施例１と同一のヒトIgG1 Fcを融合させて目的の組み換えＤＮＡを構築したことを除いて、実施例１と同様にして作製した。
【００４２】
＜実施形態２：細胞内でのキメラタンパク質の発現＞
〔実施例７：キメラタンパク質ＦＰ３の発現〕
上述した組み換えプラスミドの構築の後、Qiagenのプラスミドキットを用いて高品質のプラスミドＤＮＡを取得した。その後、ＦＵＧＥＮ６トランスフェクションキット（Roche）を用いて、２９３細胞（ＡＴＣＣ）に形質移入した。キメラタンパク質の発現させるために、必要とされるタンパク質の量に応じて異なる２つの方法を用いた。
【００４３】
第１の方法は、一過性の形質移入法である。この方法を用いて、少量のキメラタンパク質を製造した。まず、１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地を用いて、組織培養皿内で２９３細胞を培養した。６０〜８０％の細胞密集率（cell confluence）のとき、プラスミドＤＮＡとＦＵＧＥＮ６試薬との混合物を上記培養液中に添加した。翌日、上記培地を血清無添加のＤＭＥＭに交換した。そして、さらに３日間、上記細胞の培養を続けた。その後、培地を回収した。これらの培地は、発現したキメラタンパク質を含んでおり、該キメラタンパク質の濃度を、ＥＬＩＳＡによって検定した。
【００４４】
第２の方法は、安定な形質移入法である。安定な細胞株を確立し、上記キメラタンパク質を大量に製造した。宿主細胞は、再び２９３細胞（ＡＴＣＣ）とした。組み換えプラスミドを形質移入する工程は、上述した一過性の形質移入法と同一とした。しかし、第２日目に、ネオマイシンを含むＤＭＥＭで細胞を培養し、有限希釈によりクローン化した。約２１日後、ネオマイシン耐性クローンを選び取り、より大きなスケールで培養した。最終的に、撹拌フラスコ内で、キメラタンパク質を発現させた。キメラタンパク質の濃度をＥＬＩＳＡにより検定した。
【００４５】
ＦＰ３は、アフィニティークロマトグラフィーおよびゲルろ過などを含む試験法を用いて、培養された培地から精製された。ＦＰ３の分子量は、１４０ＫＤであった。
【００４６】
〔実施例８：他のキメラタンパク質の発現〕
キメラタンパク質ＦＰ１、ＦＰ２、ＦＰ４、およびＦＰ５を、実施例７の方法に従って、取得した。
【００４７】
＜実施形態３：上記キメラタンパク質のＶＥＧＦに対する結合実験＞
本発明において、キメラタンパク質のＶＥＧＦに対する親和性は、ＶＥＧＦ結合アッセイによって調べた。まず、組み換えＶＥＧＦタンパク質（Chemicom）を、９６穴ＥＬＩＳＡプレートにコートした。その後、該プレートにおいて、タンパク質が非特異的に結合する部分を、５％ミルク溶液を用いてマスクした。次に、様々なキメラタンパク質を、様々な濃度で、各ウェルに添加した。そして、３７℃で２時間インキュベートした。洗浄後、ウサギ抗ヒトＩｇ−ＨＲＰ（Sigma）を各ウェルに添加した。最終的に、発色させるための酵素の基質を上記プレートに添加した。吸光度ＯＤの読取値は、ＥＬＩＳＡプレートリーダーを用いて、記録した。より高いＯＤ値は、該キメラタンパク質のＶＥＧＦに対する結合親和性がより高いことを示した。
【００４８】
図２に示すように、本発明の実施形態において構築し、発現させた５つ全てのキメラタンパク質は、ＶＥＧＦに結合することができた。また、従来技術のＦＰ１よりも高い親和性を有していた。ＶＥＧＦとの結合は、１μｇ／ｍｌという低濃度で検出することができた。好ましくは、ＦＰ３は、最も高い親和性を有しており、最もよいＶＥＧＦ阻害剤であった。その半最大結合濃度（half maximal binding concentration）は、ＦＰ１のそれよりも約５倍低かった。ＦＰ５は、ＦＰ３よりもわずかに親和性が低かった。これらの結果は、ＫＤＲの第４Ｉｇ様ドメインは、該キメラタンパク質のＶＥＧＦに対する阻害活性を実質的に増加させることを示唆している。しかし、第５Ｉｇ様ドメインのようなＫＤＲドメインをさらに付加しても、ＶＥＧＦに対する阻害効果をさらに強化することはできなった。残りの３つのキメラタンパク質は、ＦＰ３およびＦＰ５と比較すると、低い親和性しか示さなかったが、ＦＰ１よりも高い親和性を示した。
【００４９】
＜実施形態４：in vitroにおけるヒト血管内皮細胞の増殖の、上記キメラタンパク質による効果的な阻害＞
本発明のこの好ましい実施形態は、上記キメラタンパク質が、血管内皮細胞のＶＥＧＦによって誘導される増殖を効果的に阻止することを立証することである。実験では、ＨＵＶＥＣ細胞（Clonetics）を、２％ＦＢＳおよび１５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦを含むＥＢＭ培地を入れた９６穴組織培養プレートに移した。キメラタンパク質を含む２９３細胞の上清を、様々な量で上記プレートに添加した。ネガティブコントロールとして、キメラタンパク質を含まない非形質移入２９３細胞の培地を用いた。ＨＵＶＥＣ細胞は全て、３７℃で３日間培養した。その後、細胞密度を、細胞計測により測定した。
【００５０】
ＨＵＶＥＣの増殖実験から、本発明に従って作製された５つのキメラタンパク質は全て、従来技術のＦＰ１よりも効果的に血管内皮細胞の増殖を阻害できることが明らかとなった（図３）。上記実験におけるＨＵＶＥＣ細胞の増殖は、ＶＥＧＦの活性化によって誘導される。したがって、５つのキメラタンパク質は全て、ＶＥＧＦの受容体の活性化を阻害でき、抗血管新生活性を有することを示唆している。上記５つのキメラタンパク質のうち、ＦＰ３は、ＨＵＶＥＣ細胞に対して、最も高い阻害効果を示し、そのＩＣ５０は、約３ｎｇ／ｍｌであった。従来技術のＦＰ１のＩＣ５０は、約１２ｎｇ／ｍｌであった。また、ＦＰ２、ＦＰ４、ＦＰ５およびＦＰ６のＩＣは、全て、約５〜８ｎｇ／ｍｌであった。
【００５１】
＜実施形態５：マウスにおける腫瘍増殖の上記キメラタンパク質による阻害＞
〔実施例９：上記キメラタンパク質を含む注射剤の調製〕
２４ｍｇ／ｍｌのＦＰ３、５ｍＭのＰＢ、１００ｍＭのＮａＣｌ、および２０％ショ糖を用いた注射剤を、従来のありふれた方法を用いて調製した。
【００５２】
〔実施例１０：マウスにおけるＢ１６Ｆ１０メラローマ細胞の増殖の、上記キメラタンパク質による効果的な阻害〕
本発明のキメラタンパク質の用途の１つは、ＶＥＧＦ阻害剤として、抗癌治療に用いることである。ＶＥＧＦに対して、非常に効果的な遮断効果を有するため、ＦＰ３を、モデル動物における抗腫瘍実験を行うために選択した。
【００５３】
上記モデル動物は、急激に増殖する腫瘍細胞の一種であるＢ１６Ｆ１０メラローマ細胞をもつマウスであった。実験では、まず、１×１０５個のＢ１６Ｆ１０細胞（０．０５ｍｌ）をＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスの背中に、皮下注射した。その後、精製キメラタンパク質を、マウス１匹（マウスの平均体重２２ｇ）当たり４００μｇずつ、週に２回、腹腔内注射した。同じ量の精製ヒト免疫グロブリンのＦｃをネガティブコントロールのマウスに注射した。腫瘍の増殖曲線を図４に示した。それは、キメラタンパク質ＦＰ３が上記メラローマ細胞の成長を効果的に阻害することを示した（Ｐ＜０．０１）。
【００５４】
〔実施例１１：マウスにおける異種移植された前立腺癌の増殖の、上記キメラタンパク質による効率的な阻害〕
ヌードマウスにおいて成長するヒト腫瘍細胞の異種移植モデルは、動物モデルの一つである。それは、ヒトの腫瘍と最も類似している。ヌードマウスは免疫拒絶を欠くので、ヌードマウス内で多くのヒト腫瘍細胞を成長させることができる。キメラタンパク質ＦＰ３が、ＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスにおけるヒト前立腺腫瘍ＰＣ−３細胞（ＡＴＣＣ）の増殖を阻害することを調べた。このモデルでは、まず、１×１０５個の細胞（０．０５ｍｌ）をマウスの背中に皮下注射した。その後、精製キメラタンパク質をマウス１匹当たり４００μｇずつ、週に２回、腹腔内注射した。同量の精製ヒト免疫グロブリンのＦｃをネガティブコントロールのマウスに注射した。上記実験の結果を図５に示した。コントロールのマウスでは、腫瘍は、移植後、４５日目で、１０００ｍｍ３よりも大きく成長した。しかし、上記キメラタンパク質を投与したマウスでは、ＦＰ３は上記腫瘍の成長をほぼ完全に阻害した（Ｐ＜０．０１）。このことは、ＦＰ３の治療上の著しい抗腫瘍効果を示すものである。
【００５５】
＜実施形態６：マウスにおける腫瘍の成長阻害に関する、キメラタンパク質ＦＰ３と従来技術のＦＰ１との比較研究＞
ＦＰ３の非常に優れた抗癌活性をさらに実証するために、腫瘍の成長実験において、ＦＰ１およびＦＰ３の効果を比較した。健常なＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスを１０匹選択し、それぞれの背中に、１×１０５個のラット膠芽細胞腫Ｃ６細胞（０．０５ｍｌ）を皮下注射した。その後、２．５ｍｇ／ｋｇの精製ＰＦ１またはＰＦ３を、それぞれ、週に２回、３１日目まで腹腔内注射した。同量の精製ヒト免疫グロブリンのＦｃを、ネガティブコントロールのマウスに注射した。上記実験の結果を図６に示した。ＦＰ１およびＦＰ３は共に、上記腫瘍に対して著しい治療効果を示した。３５日目のＦＰ１およびＦＰ３を投与されたマウスの腫瘍容積は、それぞれ、１１６７．３および５５７．６であった。一方、Ｆｃで処理をしたコントロールマウスの腫瘍容積は、２４日目で、すでに１３１２．３に達した。したがって、ＦＰ３は、従来技術のＦＰ１よりも著しい効果を示した（Ｐ＜０．０５）。
【００５６】
以上をまとめると、本発明に従って作製されたキメラタンパク質は、ＶＥＧＦに対して高い親和性を有していた。また、in vitroでの血管内皮細胞の増殖を阻害することができた。さらに、in vivoにおいて、腫瘍の成長を効果的に阻害した。血管新生は、全ての腫瘍の増殖において重要であるため、本発明のキメラタンパク質は、多くの腫瘍に対する治療用途に用いることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】図１は、本発明の好ましい実施形態にかかる５つのキメラタンパク質および従来技術のＦＰ１の構造を示す図である。
【図２】図２は、本発明の好ましい実施形態にかかる５つのキメラタンパク質のＶＥＧＦへの結合を、従来技術のＦＰ１のＶＥＧＦへの結合と比較した結果を示す図である。
【図３】図３は、本発明のキメラタンパク質が、ＦＰ１と比較して、in vitroにおけるヒト血管内皮細胞の増殖を効果的に阻害することを示す図である。
【図４】図４は、キメラタンパク質ＦＰ３が、マウスにおいて、Ｂ１６Ｆ１０メラローマ腫瘍の成長を効果的に阻害することを示す図である。
【図５】図５は、キメラタンパク質ＦＰ３が、マウスにおいて、ヒトＰＣ−３前立腺腫瘍の成長を効果的に阻害することを示す図である。
【図６】図６は、本発明のキメラタンパク質ＦＰ６のマウスにおける腫瘍の成長抑制活性と、従来技術のＦＰ１のそれとを比較した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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