(57)【要約】  本発明は、無血清培地中で培養した哺乳動物細胞中でタンパク質を製造するための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物血清に由来する成分を含まない細胞培養培地中で成長ホルモンを発現する細胞株の細胞を培養する段階を含み、前記培地が、０．２μＭ〜１．７５μＭの範囲の濃度での亜鉛と、１０ｎＭ〜７５ｎＭの範囲の濃度の銅を含む、成長ホルモンの産出のための方法。
【請求項２】
前記培地がさらに、１〜１０μＭの範囲の濃度で鉄イオンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記培地が０．２μＭにて亜鉛を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記培地が０．５μＭにて亜鉛を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記培地が、硫酸亜鉛として亜鉛を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記培地が２５ｎＭにて銅を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記培地が、硫酸銅として銅を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記培地が５または６μＭにて鉄イオンを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記培地が、クエン酸鉄および／または硝酸鉄として鉄イオンを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記培地がさらに、基礎培地の成分を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基礎培地が、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記成長ホルモンが、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーターの制御下で発現している、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記メタロチオネインプロモーターがマウスＭＴ−１プロモーターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞培養から成長ホルモンを回収する段階をさらに含む、請求項１〜１３のいずれかに１項に記載の方法。
【請求項１５】
さらに成長ホルモンを精製することを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
精製成長ホルモンを、医薬的に許容され得る担体と共に製剤化し、医薬組成物を得ることをさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記成長ホルモンがヒト成長ホルモンである、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
成長ホルモンの産出のための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の培地の使用。
【請求項１９】
成長ホルモンの産出段階の間、培養中で細胞を維持するための、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の培地の使用。
【請求項２０】
前記成長ホルモンが、ヒト成長ホルモンである、請求項１８または１９に記載の使用。
【請求項２１】
前記細胞がマウスＣ１２７細胞である、請求項１８または１９に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、特に、例えばヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）等の組換えタンパク質を産出している細胞を培養するための無血清培養条件下での哺乳動物細胞の培養の分野にある。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、培養中の哺乳動物細胞の成長および維持のための無血清培地に関する。
【０００３】
細胞培養は、今日、ウイルスワクチン、モノクローナル抗体、非抗体免疫調節物、ポリペプチド成長因子、ホルモン、酵素、腫瘍特異的抗原等の多様な生物学的に活性な産物の産出のために広く使用されている。これらの産物は、通常の、または形質転換された、および遺伝子操作された細胞によって産出される。
【０００４】
細胞を培養するために、過去には、培養培地には、生物学的に活性な産物を産出する全ての哺乳動物細胞株の成長および維持のための一般的な栄養分として働く血清が補充された。血清には、ホルモン、成長因子、担体タンパク質、接着および拡散因子、栄養素、微量元素などが含まれる。培養培地は通常、約１０％までの、ウシ(calf)胎児血清（ＦＣＳ）とも呼ばれるウシ(bovine)胎児血清（ＦＢＳ）のような動物血清を含んだ。
【０００５】
広く使用されてはいるが、血清は多くの制限を有する。細胞によって産出される目的の所望される限られた量のタンパク質を干渉する高いレベルの多数のタンパク質を含む。血清に由来するこれらのタンパク質は、目的のタンパク質の精製等の下流の処理の間に産物から分離されなければならず、工程を複雑にし、コストを増加させる。
【０００６】
長期の潜伏またはインキュベーション期間を有するウシの伝染性神経変性疾患であるＢＳＥ（ウシ海綿状脳症）の出現によって、生物学的に活性な産物の産出における動物由来血清の使用に関する規制の懸念事項が持ち上がった。
【０００７】
したがって、生物学的に活性な産物の産出の間、細胞の成長を支持し、且つ細胞を維持する動物血清を含まない代替培地の開発に対する大きな要求が存在する。
【０００８】
一般的に、細胞培養培地には、アミノ酸、ビタミン、塩、脂肪酸および更なる化合物等の異なるカテゴリーの多くの成分が含まれる。
アミノ酸：例えば米国特許第６，０４８，７２８号（Inlow等）は、以下のアミノ酸が細胞培養培地中で使用され得ることを開示する。アラニン、アルギニン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トリプトファン、チロシン、スレオニンおよびバリン。
ビタミン：例えば、米国特許第２００３／００９６４１４号（Clccarone等）または米国特許第５，８１１，２９９号（Renner等）が、以下のビタミンが細胞培養培地中で使用され得ることを開示する。ビオチン、パントテン酸、塩化コリン、葉酸、ミオ−イノシトール、ナイアシンアミド、ピリドキシン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、チアミン、プトレシン。
塩：例えば、米国特許第６，３９９，３８１号（Blum等）は、ＣａＣｌ2、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＮａＣｌ、一塩基リン酸ナトリウム、二塩基リン酸ナトリウム、亜セレン酸ナトリウム、ＣｕＳＯ4、ＺｎＣｌ2を含む培地を開示する。培養培地中で使用され得る無機塩を開示している文書の他の例は、米国特許第２００３／０１５３０４２号（Arnold等）であり、ＣａＣｌ2、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＮａＣｌ、一塩基リン酸ナトリウム、二塩基リン酸ナトリウム、ＣｕＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、ＺｎＣｌ2を含む培地を開示する。
脂肪酸：培地中で使用されることが公知の脂肪酸は、アラキドン酸、リノール酸、オレイン酸、ラウリル酸、ミリスチン酸、ならびにミリスチル−βシクロデキストリンであり、例えば米国特許第５，０４５，４６８号（Darfler）を参照のこと。シクロデキストリンは本質的に脂質ではないが、脂質と複合体を形成する能力があるので、細胞培養培地中で脂質を可溶化するために使用されることに留意すべきである。
特に無血清細胞培養培地の枠において使用される更なる成分は、グルコース、グルタミン、Ｎａ−ピルビン酸、インスリンまたはエタノールアミン等の化合物（例えば欧州特許第２７４４４５号）、またはＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｆ６８等の保護剤である。Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（商標）Ｆ６８（Ｐｏｌｏｘａｍｅｒ  １８８としても知られている）は、エチレンオキシド（ＥＯ）およびプロピレンオキシド（ＰＯ）のブロックコポリマーである。
【０００９】
標準の「基礎培地（ｂａｓｉｃ ｍｅｄｉａ）」も当業者に公知である。これらの培地はすでに上述したいくつかの培地成分を含む。広く適用されるかかる培地の例は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ  Ｆ１２（１：１）、ハム栄養素混合物Ｆ−１０、ロズウェル・パーク・メモリアル・インスティチュート培地（ＲＰＭＩ）、ＭＣＤＢ  １３１またはウイリアム培地Ｅである。これらの市販されている培地は、例えばギブコ（Gibco）、インビトロジェン（Invitrogen）から入手可能である。
【００１０】
亜鉛（Ｚｎ）および銅（Ｃｕ）等の金属は代謝反応に関与する（VaileeおよびFalohuk,1993、またはLindner、1991）。
【００１１】
亜鉛は多数の高分子の構造および機能に対して、および多くの酵素反応に必須であり、タンパク質の適切なフォールディングにおいて触媒的、共触媒的または構造的役割を果たす。Ｚｎ−ＡＴＰは生体アミン合成およびモノアミンオキシダーゼ代謝に必須の２つの補酵素であるピリドキサール−５−リン酸およびフラビンアデノシンジヌクレオチド（ＦＡＤ）の合成のために必要である。
【００１２】
遊離ラジカルによる傷害から生物学的構造を保護することにおける亜鉛の活性は、スーパーオキシドジスムターゼの必須成分として、チオールに対する保護剤として、そして遊離ラジカルを形成するための化学基の鉄との相互作用を防止することにおいて、遊離ラジカルスカベンジャーでもある金属タンパク質の十分なレベルを維持するいくつかの因子によるものであり得る。
【００１３】
更に、Ｚｎの存在は脂質過酸化を防止する。亜鉛は、チューブリン重合化のエフェクターでもあり、インビトロでアクチンフィラメント形成および安定化において働く。亜鉛は、転写タンパク質における一般的なモチーフである、ＤＮＡ結合タンパク質の亜鉛フィンガーモチーフの一成分でもある。
【００１４】
亜鉛イオンは、主にタンパク質および核酸との複合体の形態で存在し、そして中間代謝のすべての観点、遺伝情報の発現の伝達および調節、貯蔵、ペプチドホルモンの合成および作用、およびクロマチンおよび生体膜の構造維持に関与する。
【００１５】
銅もまた多くの細胞酵素の機能のために重要な微量元素である。銅イオンは、酸化Ｃｕ（ＩＩ）または還元Ｃｕ（Ｉ）という異なる酸化還元状態をとり、これによってこの金属が酵素の酸化還元化学における触媒共因子として、細胞の生理機能におけるきわめて重要な役割を果たす。銅イオンは銅オキシダーゼの一群中で機能し、これには、シトクロームｃオキシダーゼ、チロシナーゼ、ドーパミン−β−モノオキシゲナーゼ、アミンオキシダーゼおよびリシルオキシダーゼが含まれる。銅はまた、ミトコンドリア呼吸、セルロプラスミンの一成分としての鉄ホメオスタシス、フリーラジカルスカベンジングおよびエラスチン架橋にも関与する。
【００１６】
亜鉛または銅イオン等の金属イオンを含む無血清培地は、例えば米国特許第６，０４８，７２８号（Inlow等）、米国特許第４，７６７，７０４号（Cleveland等）または国際特許第ＷＯ01/16294号(Life Technologies Inc.）から、当業界において公知である。しかしながら、これらの文書は、標準の産出培地に特定の濃度で加えた場合のこれらのイオンの産出増強効果を示していない。
【００１７】
治療タンパク質またはワクチン等の生物学的に活性な産物の開発および供給のために、多くの量が産出されなければならない。ポリペプチドの産出のために広く使用されている適切な細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００１８】
ＣＨＯ細胞は最初に、雌のチャイニーズハムスターの卵巣の生検から、Ｐｕｃｋ（ｊ.Exp.Med.108,945,1958）によって培養された。これらの元来の細胞から、多数の副株が、多様な特徴をもって調製された。これらのＣＨＯ細胞株の１つ、ＣＨＯ−Ｋ１は、プロリン要求性であり、ジヒドロホレートレダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子に対する二倍体である。この細胞株に由来する他の株は、ＤＨＦＲ欠損ＣＨＯ細胞株（ＣＨＯ  ＤＵＫ  Ｂ１１）であり（PNAS 77,1980,4216−4220）、１つのＤＨＦＲ遺伝子における突然変異と、他の遺伝子のその後の欠損の結果として、ＤＨＦＲ機能の欠損によって特徴づけられる。
【００１９】
ヒトへの投与を意図されたタンパク質を産出するために頻繁に使用される更なる細胞は、ヒト線維肉腫細胞株ＨＴ１０８０またはヒト胎児由来腎臓細胞株２９３等のヒト細胞株である。
【００２０】
マウスＣ１２７細胞株はまた、組換えタンパク質を産出するために非常に適切である（Carter等.,1989，Oka及びRupp，1990）。
【００２１】
注目の１つの治療タンパク質は成長ホルモンである。ソマトロピン（ＩＮＮ）またはソマトトロピンとしても知られているヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、下垂体前葉の成長ホルモン細胞によって産出および分泌されるタンパク質ホルモンである。ヒト成長ホルモンは、タンパク質、炭水化物および脂質の代謝におけるその効果を介して、小児における体成長および大人における代謝において主要な役割を果たす。
【００２２】
ヒト成長ホルモンは、一方ではＣｙｓ−５３とＣｙｓ−１６５の間で分子中に大ループを形成し、他方ではＣｙｓ−１８２およびＣｙｓ−１８９の間でＣ末端近くに小ループを形成する２つのジスルフィド結合を有する１９１アミノ酸の単一ポリペプチド鎖である（Bewly等,1972）。アミノ酸配列を確認したＤＮＡ配列が、Martial等によって報告された(1979)。精製ｈＧＨは、その凍結乾燥形態において白色非結晶質性粉末であり、６．５〜８．５の範囲のｐＨの水性緩衝液に容易に溶ける（濃度＞１０ｍｇ／Ｌ）。
【００２３】
溶液中、ｈＧＨは、ダイマーおよびより高分子量オリゴマーとして小画分にて主にモノマーとして存在する。特定の条件下でｈＧＨを誘導し、多量のダイマー、トリマーおよびより高次のオリゴマーを形成することができる。
【００２４】
いくつかのｈＧＨの誘導体が公知であり、天然の誘導体、変異体および代謝産物、生物合成ｈＧＨの主分解産物、および遺伝的方法によって産出されたｈＧＨの遺伝子操作誘導体が含まれる。ｈＧＨの天然の誘導体の１つの例は、胎盤にて見られる成長ホルモンの変異体であるＧＨ−Ｖである。遺伝子座の他のメンバーは、Chen等（1989）により発表されている。体内において持続性であるように設計された誘導体を含むｈＧＨの任意の誘導体は、ｈＧＨの生物活性を保有する限り、本発明の目的のために使用することができる。
【００２５】
メチオニルｈＧＨは、組換えＤＮＡ技術を介して産出されるｈＧＨの第一の形態であった。本化合物は実際に、そのＮ末端にて１つの更なるメチオニン残基を有するｈＧＨの誘導体である（Goeddel等，1979）。
【００２６】
２０−Ｋ−ｈＧＨと呼ばれるｈＧＨの天然の変異体が、下垂体ならびに血流にて発生することが報告された（Lewis等，1978；Lewi等，1980）。Ｇｌｕ−３２からＧｌｎ−４６の１５アミノ酸残基を欠く本化合物は、メッセンジャーリボ核酸の選択的スプライシングから生じる（DeNot等，1981）。本化合物は、すべてではないが多くのｈＧＨの生物学的特性を共有する。
【００２７】
２０−Ｋ−ｈＧＨは下垂体にて造られ、血中に分泌され、大人の成長ホルモン産出量の約５％、小児の成長ホルモン産出量の約２０％を補う。それは２２ｋＤ成長ホルモンと同様の成長促進活性を有し、２２ｋＤ形態と同等またはより大きな量の脂肪分解活性を有することが報告されてきた。それは２２ｋＤ成長ホルモンと同等の親和力で成長ホルモンレセプターと結合し、２２ｋＤホルモンの１０分の１の乳腺刺激性（プロラクチン様）生物活性を有す。２２ｋＤとは異なり、２０−ｋ−ｈＧＨは弱い抗インスリン活性を有す。
【００２８】
多数のｈＧＨの誘導体は、分子のタンパク質分解改変より発生する。ｈＧＨの代謝に関する主経路はタンパク質分解に関与する。残基１３０〜１５０あたりのｈＧＨの領域は、非常にタンパク質分解を受けやすく、この領域にてニックまたは欠損を有するｈＧＨのいくつかの誘導体が発表された（Thorlaclus-Ussing,1987）。この領域はｈＧＨの大ループ中であり、そこで結合したペプチドの開裂は、Ｃｙｓ−５３とＣｙｓ−１６５でのジスルフィド結合を介して連結した２つの鎖の産出をもたらす。多くのこれらの２−鎖形態は増加した生物活性を有することが報告されている（Singh等，1974）。多くのヒト成長ホルモンの誘導体は酵素の使用を介して人工的に産出される。酵素トリプシンおよびサブチリシン、ならびにその他を使用して、分子の至る所の種々の点にてｈＧＨが修飾された（Lewis等，1977；Graff等，1982）。２−鎖同化促進タンパク質（２−ＣＡＰ）と呼ばれる１つのかかる誘導体が、トリプシンを用いるｈＧＨの制御されたタンパク質分解を介して形成された（Becker等，1989）。２−ＣＡＰは、原型のｈＧＨ分子とは非常に異なる生物学的特性を有することが見出され、ｈＧＨの成長促進活性は大部分が残っており、炭水化物代謝におけるほとんどの効果が無効であった。
【００２９】
タンパク質中のアスパラギンおよびグルタミン残基は、適切な条件下で脱アミド反応を受けやすい。下垂体ｈＧＨは、この型の反応を受けることが示されており、Ａｓｎ−１５２のアスパラギン酸への変換、またより少ない程度で、Ｇｌｎ−１３７のグルタミン酸への変換がもたらされる（Lewis等,1981）。脱アミド化ｈＧＨは、酵素スブチリジンでのタンパク質分解に対して異なった感受性を有することが示されており、脱アミド化がｈＧＨのタンパク質分解開裂に関して生理学的な意義を有することを示唆している。生合成ｈＧＨは特定の貯蔵条件下で分解し、異なるアスパラギン（Ａｓｎ−１４９）で脱アミド化をもたらすことが知られている。これは、脱アミド化の主要な部位であるが、Ａｓｎ−１５２での脱アミド化もまた見られる（Becker等,1988）。Ｇｌｎ−１３７での脱アミド化は、生合成ｈＧＨでは報告されていない。
【００３０】
タンパク質中のメチオニン残基は、主にスルホキシドへ酸化を受けやすい。下垂体由来および生合成ｈＧＨは、共にＭｅｔ−１４およびＭｅｔ−１２５にてスルホキシド化を受ける（Becker等，1988）。またＭｅｔ−１７０での酸化は、下垂体由来では報告されたが、生合成ｈＧＨでは報告されなかった。脱アミド化ｈＧＨおよびＭｅｔ−１４スルホキシドｈＧＨは、共に完全な生物活性を示すことが見出された（Becker等，1988）。
【００３１】
ｈＧＨの切り詰め形態が、酵素の作用を介してまたは遺伝的方法によって産出された。トリプシンの制御作用によって産出された２−ＣＡＰは、ｈＧＨのＮ末端の最初の８つの残基を除去されたものである。ｈＧＨの他の切り詰めバージョンは、適宜宿主中での発現の前に遺伝子を修飾することによって産出された。最初の１３残基が除去されて、ポリペプチド鎖は開裂されない、異なる生物学的特性を有する誘導体が産出された（Gertler等,1986）。
【００３２】
ヒト成長ホルモンは元来、死体の下垂体腺から得られたが、これらの調製物は電気泳動上均質ではなく、抗体は５０％のオーダーの純度の調製物で処理した患者の血清中で現れ、その免疫原性は不活性成分に起因している。組換えＤＮＡ技術によって、多数の異なるシステムにて制限のないｈＧＨを供給する産出が可能になった。培養培地からのｈＧＨの精製は、ほんの少量の混成タンパク質の存在によって促進される。実際にｈＧＨは、逆相ＨＰＬＣカラム上での単一の精製段階によって、研究室規模にて精製可能であることが示されている（Hslung等, 1989）。
【００３３】
組換えヒト成長ホルモン、ｒｈＧＨは、ＳＥＲＯＳＴＩＭ（商標）として、セローノ  インターナショナルＳ．Ａ．（Serono International S.A.）によって生産され、ＡＩＤＳ患者における体重減少および消耗を処置するために、早期のＦＤＡ認可がなされた製品である。ＳＡＩＺＥＮ（商標）は、小児におけるＧＨ欠損、少女におけるターナー症候群、ならびに小児における慢性腎不全を適応とする組換えヒト成長ホルモンである。ジェネンテック社（Genentech,Inc.)（South San Francisco,CA）によって生産された、ＰＲＯＴＲＯＰＩＮ（商標）は、Ｎ末端にて追加的なメチオニン残基を有する天然配列ｈＧＨからの構造においてわずかに異なる。組換えｈＧＨは一般的に、凍結乾燥形態にて、ｈＧＨと、例えばグリシンおよびマンニトール等の追加の賦形剤を含むバイアルとして市販されている。随伴希釈バイアルを提供することによって、患者が投薬前に、所望の濃度まで製品を再構築することを可能にする。組換えｈＧＨは、予め充填されたシリンジ等のような他の周知の様式においても販売可能である。
【００３４】
一般的に、ヒトにおける組換え天然配列ｈＧＨ、組換えＮ−メチオニル−ｈＧＨ、または下垂体由来物質の薬物動態学的または生物学的活性において有意な差は観察されていない（Moore等,1988;Jorgensson等,1988）。
【００３５】
成長ホルモンを使用する多様な医療適用に関して、細胞培養中、特に無血清細胞培養工程にて、十分な量を産出する有効かつ安全な方法に対する必要性が存在する。
【００３６】
無血清培地は当業界において発表されている。例えば、米国特許第６，１６２，６４３号は、ＨＥＣＫ−１０９と呼ばれる、微量の硫酸銅および塩化亜鉛を含む無血清基礎培地を発表している。本培地は特に、ヒト移植のための組織産出の目的で、ケラチノサイト等の正常ヒト細胞の一次および二次培養のために設計される。細胞株中のインビトロでの組換えヒトタンパク質の発現は本米国特許では言及されていない。
【００３７】
米国特許第５，３２４，６５６号は、微量の硫酸銅および塩化亜鉛を含むＭＣＤＢ１２０およびＭＣＤＢ１３１Ｍと呼ばれる無血清基礎培地を開示する。この培地は特に、ヒト筋肉未分化細胞の分化を防止する目的で、これらの細胞のインビトロ培養に関して設計される。組換えヒトタンパク質の産出は、当該文書の枠の中では予想はされない。
【００３８】
英国特許第２ １９６ ３４８号は、ハイブリドーマおよび骨髄腫細胞のインビトロ培養に対する合成培地を発表する。この培地は、銅、亜鉛および鉄イオンを含む。本培地中でのハイブリドーマまたは骨髄腫細胞の培養は、モノクローナル抗体の製造の目的に限られる。
【００３９】
米国特許第６，１０３，５２９号は、動物細胞のインビトロ培養のための無血清細胞培養培地処方を提供する。動物細胞は、ウイルス、モノクローナル抗体、ホルモンまたは成長因子の産出のために使用され得る。しかしながら、成長ホルモンの産出は当該文書では言及されていない。
【００４０】
米国特許第６，０４８，７２８号は、抗体等の天然または組換え産物を産出するために動物細胞の培養のためのＣｏ−、Ｚｎ−およびＦｅ−イオンを含む無血清細胞培養培地を開示する。培養細胞によって産出されるかかる産物には、成長ホルモンまたは成長因子は含まれず、培養中の細胞成長を増強するために無血清培地の成分としてのみ言及されている。
【００４１】
米国特許第５，３１６，９３８号は、ＷＣＭ５と呼ばれる、クエン酸鉄、硫酸亜鉛および硫酸銅を含むチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に対する生化学的に定義された培養培地を開示する。培地は特に、ＣＨＯ細胞中の抗体およびｔＰＡ産出に関して設計されている。
【００４２】
米国特許第５，１２２，４５９号は、特にＣＨＯ細胞の培養に適切な亜鉛および鉄イオンを含む無血清培養培地中で組換えタンパク質を産出するための方法を発表する。成長ホルモンの産出は当該文書では言及されていない。
【００４３】
したがって、本発明の基礎をなす問題は、成長ホルモン、特にヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）の効果的な産出のための無血清細胞培養培地を提供することである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００４４】
発明の概要
本発明は、動物血清に由来する成分を含まず、同時に培養中の哺乳動物細胞の細胞成長および維持に非常に有効であり、特に組換えタンパク質の産出を可能にする、細胞培養培地の開発に基づく。
【課題を解決するための手段】
【００４５】
したがって、第一の観点において、本発明は、微量で亜鉛および／または銅を含む動物血清に由来する成分を含まない細胞培養培地に関する。好ましくは、本発明の培地はさらに、微量で鉄イオンを含む。
【００４６】
第二の観点において、本発明は、本発明の培地中で注目のタンパク質を発現する細胞を培養する段階を含む、タンパク質を産出するための方法に関する。
【００４７】
本発明の第三の観点は、注目のタンパク質を産出するための本発明にかかる培地の使用に関する。
【００４８】
本発明の第四の観点は、注目のポリペプチドを産出する段階の間、培養中の細胞を維持するための本発明にかかる培地の使用に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４９】
発明の詳細な説明
本発明は、動物血清を含まない細胞培養培地の開発に基づく。
本発明による動物血清を含まない細胞培養培地には、
０．２〜１．７５μＭの範囲の濃度にある亜鉛（Ｚｎ）、および／または
１０〜７５ｎＭの範囲の濃度にある銅（Ｃｕ）、および／または
３〜１０μＭの範囲の濃度にある鉄イオン（Ｆｅ）
が含まれる。
【００５０】
後述の実施例で示すように、微量のＺｎおよび／またはＣｕの標準培地への添加は、注目の分泌タンパク質を発現する細胞の生産性の増加をもたらす。
【００５１】
上記に認定した濃度にあるＺｎおよびＣｕを共に添加は、Ｃ１２７細胞内での組換えヒト成長ホルモン（ＧＨ）の、コントロール（標準のＤＭＥＭ中で培養した同一の細胞）と比較して６０％を超える生産性の増加を導いた。ＧＨ発現細胞を、上記で認定した濃度にあるＺｎ、ＣｕおよびＦｅイオンを含む培地中で培養した場合、生産性がコントロールと比較して約７０％まで増加した。
【００５２】
本発明の培地の金属イオンの好適な濃度範囲は以下のとおりである。
約０．２、０．２５、０．３０、０．３５、０．４０、０．４５、０．５、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１、１．０５、１．１、１．１５、１．２、１．２５、１．３、１．３５、１．４、１．４５、１．５、１．５５、１．６、１．６５、１．７、１．７５μＭでの亜鉛。
好適には、亜鉛は約０．５μＭまたは約１．５μＭで含まれる。また亜鉛が硫酸亜鉛として含まれることも好適である。
約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０または７５ｎＭでの銅。
好適には、銅は約２５ｎＭで含まれる。銅が硫酸銅として含まれることも好適である。
鉄イオンは、約１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、４．８、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５または１０μＭで含まれる。
好適には、鉄イオンは、約５または６μＭにて含まれる。鉄イオンは、好適にはクエン酸鉄および／または硝酸鉄として含んでもよく、クエン酸鉄が細胞培養培地中に含まれる鉄イオンのほとんどを占めることがさらに好適である。培地は例えば、約５μＭのクエン酸鉄と約１μＭの硝酸鉄を含み得る。
【００５３】
好適な態様において、培地にはさらに、基礎培地の成分が含まれる。培地が、基礎培地としてダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）を含むことが好適である。標準ＤＭＥＭの組成は後述の実施例で報告される。
【００５４】
本発明の第二の観点は、本発明の培地中の注目のタンパク質を発現する細胞を培養する段階を含む、タンパク質の産出のための方法に関する。
【００５５】
本発明の方法の培養段階は、ペトリ皿、Ｔ−フラスコまたはローラーボトル等の任意の適切な環境にて実施してよいが、例えばバイオリアクター等のより大容量を有す容器にて実施してもよい。
【００５６】
本発明のタンパク質は、使用される特定の細胞型に適する任意のプロモーターを用いて発現され得る。非常に好適な態様では、タンパク質をメタロチオネイン（ＭＴ）プロモーターから発現させる。マウス細胞をタンパク質産出に使用する場合、プロモーターは、好ましくはマウスＭＴ−１プロモーターである。
【００５７】
好適には、当該方法はさらに、当該注目のタンパク質を含む培地を回収する段階を含む。
【００５８】
好適な態様では、当該方法はさらに、当該注目のタンパク質を単離することを含む。
【００５９】
さらに好適な態様では、当該方法はさらに、医薬組成物を得るために、医薬的に許容され得る担体と共に当該単離タンパク質を製剤化することを含む。
【００６０】
第三の観点は、本発明は、注目のポリペプチドを産出するための本発明による培地の使用に関する。
【００６１】
第四の観点は、本発明は、注目のポリペプチドの産出段階の間、培養中の細胞を維持するための、本発明の培地の使用に関する。
【００６２】
本発明の多様な観点の枠において使用すべき細胞は、好適には哺乳動物細胞である。これらは、ヒトまたは動物由来であってもよい。本発明による方法にて培養可能である哺乳動物細胞の例には、例えばマウスＣ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、ヒト骨肉腫細胞、ＭＲＣ−５細胞、ＢＨＫ細胞、ＶＥＲＯ細胞、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ｒＨＥＫ２９３細胞、正常ヒト線維芽細胞、ストローマ細胞、肝臓細胞、またはＰＥＲ．Ｃ６細胞が含まれる。本発明による方法において培養され得るハイブリドーマの例には、例えばＤＡ４，４細胞、１２３Ａ細胞、１２７Ａ細胞、ＧＡＭＭＡ細胞および５７−９−Ｂ細胞が含まれる。
【００６３】
本発明にしたがって、マウスＣ１２７細胞を培養することが好適である。
【００６４】
本発明にしたがって培養された細胞は、懸濁物中で、または足場依存性細胞に関しては固体支持体に接着させて成長し得る。マイクロキャリアおよびＦｉｂｒａ−Ｃａｌ（商標）ディスクは、足場依存性細胞の成長のために哺乳動物細胞培養中で使用され、タンパク質の工業的生産のために確立された技術的プラットフォームの１つである（例えばBohak等.1987；Patti等.1994を参照のこと）。
【００６５】
本発明の方法は好適には、注目のポリペプチドを産出するために供される。したがって、本発明の培地は小規模または大規模いずれかで、注目のポリペプチドまたはタンパク質（産出が所望される任意のポリペペプチドであってよい）のために使用される。
【００６６】
注目のポリペプチドは、例えば天然に分泌されるタンパク質、正常の細胞質タンパク質、正常の膜貫通タンパク質、またはヒトまたはヒト化抗体であってよい。注目のタンパク質が天然の細胞質または天然の膜貫通タンパク質である場合、タンパク質は好適には、溶解性になるように、及び分泌を開始させるために、すなわち、その前に、またはその（溶解性または細胞外）断片の前に、シグナルペプチドを配置することによって）遺伝子操作される。
【００６７】
注目のポリペプチドは、任意起源であってもよい。注目の好適なポリペプチドはヒト由来であり、より好適には注目のタンパク質は治療的なタンパク質である。
【００６８】
好適には、注目のタンパク質は、ホルモン、サイトカイン−結合タンパク質、インターフェロン、可溶性レセプターまたは抗体から選択される。
【００６９】
本発明の方法により産出され得る治療的タンパク質には、例えば絨毛性ゴナドトロピン、卵胞刺激ホルモン、ルトロピン−胎盤性性腺刺激ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、成長ホルモン、特にヒト成長ホルモン、インターフェロン（例えばインターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ）、インターフェロンレセプター（例えばインターフェロンγレセプター）、ＴＮＦレセプターｐ５５およびｐ７５、並びにそれらの可溶性変異体、ＴＡＣＩレセプターおよびそのＦｃ融合タンパク質、インターロイキン（例えばインターロイキン−２、インターロイキン−１１）、インターロイキン結合タンパク質（例えばインターロイキン−１８結合タンパク質）、抗−ＣＤ１１ａ抗体、エリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子、下垂体ペプチドホルモン、閉経期ゴナドトロピン、インスリン様成長因子（例えばソマトメジン−Ｃ）、ケラチノサイト成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン、第ＶＩＩＩ因子、ソマトロピン、骨形態形成タンパク質−２、血小板由来成長因子、ヒルジン、エポイエチン、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼおよびこれらの突然変異タンパク質、断片、可溶性形態、機能的誘導体、融合タンパク質が含まれる。
【００７０】
好適な態様では、ポリペプチドは、絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）、卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、ルトロピン−胎盤性性腺刺激ホルモン（ＬＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）、インターフェロン（例えば、インターフェロンβ−１ａ、インターフェロンβ−１ｂ）、インターフェロンレセプター（例えばインターフェロンγレセプター）、ＴＮＦレセプターｐ５５およびｐ７５、インターロイキン（例えばインターロイキン−２、インターロイキン−１１）、インターロイキン結合タンパク質（例えばインターロイキン−１８結合タンパク質）、抗−ＣＤ１１ａ抗体およびこれらの突然変異タンパク質、断片、可溶性形態、機能的誘導体、融合タンパク質からなる群から選択される。
【００７１】
さらに好適な注目のポリペプチドには、例えばエリスロポエチン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファージコロニー−刺激因子、下垂体ペプチドホルモン、閉経期ゴナドトロピン、インスリン様成長因子（例えばソマトメジン−Ｃ）、ケラチノサイト成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子、トロンボモジュリン、塩基性線維芽細胞成長因子、インスリン、第ＶＩＩＩ因子、ソマトロピン、骨形態形成タンパク質−２、血小板由来成長因子、ヒルジン、エポイエチン、組換えＬＦＡ−３／ＩｇＧ１融合タンパク質、グルコセレブロシダーゼおよびこれらの突然変異タンパク質、断片、可溶性形態、機能的誘導体、融合タンパク質が含まれる。
【００７２】
本発明の方法にて産出される注目のタンパク質は、医薬的に許容され得る担体と共に製剤化されるべきであり、本方法の結果、医薬組成物となる。
【００７３】
「医薬的に許容され得る」の定義は、活性成分の生物活性の効果を干渉せず、投与される宿主に対して毒性ではない任意の担体を含むことを意味する。例えば、非経口投与のために、活性タンパク質（群）を、生理食塩水、デキストロース溶液、血清アルブミンおよびリンガー液等のビヒクル中で、注入用の単位投与形態に製剤化してよい。
【００７４】
その後、本発明により製剤化された医薬組成物は、多様な方法にて個体に投与され得る。投与経路には、皮内、経皮（例えば徐放製剤）、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、頭蓋内、硬膜外、局所、経腸および経鼻経路が含まれる。任意の他の医薬的に有効な投与経路は、例えば内皮または上皮組織を介した吸収、または活性剤をコードしているＤＮＡ分子を患者に（例えばベクターを介して）投与し、当該活性剤がインビボで発現および分泌される遺伝子治療によって使用され得る。さらに、本発明によるタンパク質（類）は、医薬的に許容され得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクル等の生物学的に活性な試薬である他の成分と共に投与され得る。
【００７５】
非経口（例えば静脈内、皮内、筋肉内）投与のために、活性タンパク質（類）は、医薬的に許容され得る非経口ビヒクル（例えば水、生理食塩水、デキストロース溶液）、および等張性（例えばマンニトール）または化学安定性（例えば保存剤および緩衝剤）を維持するための添加物とともに、溶液、懸濁剤、エマルションまたは凍結乾燥粉末として製剤化され得る。製剤は、一般的に使用される技術によって滅菌される。
【００７６】
本発明にしたがって、成長ホルモンを産出するために、本発明の培地を使用することが非常に好適である。
【００７７】
ＧＨは天然物であってよく、すなわち天然に存在するＧＨであってよい。好適には、産出させるＧＨは、ヒト由来である。ＧＨは可溶性の分泌タンパク質であるので、その天然のシグナルペプチドを用いて、またはヘテロシグナルペプチド、すなわち、使用する特定の発現系においてより有効であり得る他の分泌タンパク質に由来するシグナルペプチドを用いて、細胞培養上清に放出される。
【００７８】
語句「成長ホルモン」は、本明細書で「ＧＨ」と同義に使用される。本語句には、野生または天然ＧＨ、組換え的に産出されたＧＨ、ならびに「技術背景」にて詳細に示したＧＨ変異体が含まれる。本明細書において語句「ＧＨ」はさらに、変異タンパク質、機能的誘導体、活性画分、融合タンパク質、環状置換タンパク質およびＧＨの塩が含まれる。ＧＨは好適にはヒトであるが、他の種、特に哺乳動物に由来してもよい。
【００７９】
本明細書において語句「突然変異タンパク質」は、得られる産物の活性を、野生型のＧＨのものと比較して有意に減少させずに、１つ以上の天然のＧＨのアミノ酸残基が、異なるアミノ酸残基によって置換されるか、または欠損するか、或いは１つ以上のアミノ酸残基がＧＨの天然の配列に付加される、ＧＨの類似体を意味する。これらの突然変異タンパク質は、公知の合成によって、および／または部位特異的突然変異技術によって、またはそのために適切である任意の他の公知の技術によって調製される。
【００８０】
本発明による突然変異タンパク質には、ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズする、ストリンジェント条件下でＧＨをコードしている、ＤＮＡまたはＲＮＡ等の核酸によってコードされたタンパク質が含まれる。ＧＨをコードしているＤＮＡは当業界において公知である。語句「ストリンジェント条件」は、通常の当業者が「ストリンジェント」として慣用的に言及する、ハイブダイゼーションおよびその後の洗浄条件を意味する。Ausubel等．，Current Protocols in Molecular Biology、上記、Interscience，N.Y．，§§6.3および6.4（1987、1992）を参照のこと。ストリンジェント条件の例には、制限されずに、研究下でのハイブリッドの算出Ｔｍより１２〜２０℃下回る条件（例えば２×ＳＳＣおよび０．５％ＳＤＳ、５分間、２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ、１５分間；０．１×ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳ  ３７℃にて３０〜６０分間、ついで０．１×ＳＳＣおよび０．５％  ＳＤＳ、６８℃にて３０〜６０分間中）での洗浄が含まれる。通常の当業者は、ストリンジェント条件がまた、ＤＮＡ配列、（１０〜４０塩基のような）オリゴヌクレオチドプローブまたは混合オリゴヌクレオチドプローブの長さに依存することを理解する。混合プローブを使用する場合、ＳＳＣの代わりに、塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ）を使用することが好適である。Ausubel上記を参照のこと。
【００８１】
同一性は、配列を比較することによって決定される、２つ以上のポリペプチド配列、または２つ以上のポリヌクレオチド配列間の関係を反映する。一般的に、同一性は、比較している配列の長さにわたる、それぞれ２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列の、実際のヌクレオチド対ヌクレオチド、またはアミノ酸対アミノ酸対応を意味する。
【００８２】
実際の対応が存在しない配列に関して、「％同一性」を決定してよい。一般的に、比較される２つの配列を並べ、配列間の最大相関を得る。これには、配列の程度を増強するために、１つまたは両方の配列へ「ギャップ」を挿入することを含んでよい。％同一性は、特に同一または非常に近似した長さの配列に対して適切な、比較している各配列それぞれの全長わたって決定されてよく（グローバル配列と呼ぶ）、或いは等しくない長さの配列に対してより適切である、より短く、定義された長さにわたって決定されてよい（ローカル配列と呼ぶ）。
【００８３】
２つ以上の配列の同一性および相同性を比較するための方法は、当業界において周知である。従って例えば、Wisconsin Sequence Analysis Package、バージョン９．１（Devereux Ｊ等.,1984）にて入手可能なプログラム、例えばプログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを使用して、２つのポリヌクレオチド間の％同一性、および２つのポリペプチド配列間の％同一性および％相同性を決定してよい。ＢＥＳＴＦＩＴは、Smith及びWaterman(1981)の「ローカル相同性」アルゴリズムを利用し、２つの配列間の類似性のもっともよい単一領域を見つける。配列間の同一性および／または類似性を決定するための他のプログラムも当業界において公知であり、例えばプログラムのＢＬＡＳＴファミリー（Altschul S F等，1990，Altschul S F等，1997，www.ncbi.nlm.nih.govにてＮＣＢＩのホームページよりアクセス可能）およびＦＡＳＴＡ（Pearson W R,1990）などである。
【００８４】
任意のかかる突然変異タンパク質は好適には、ＧＨと実質的に同様の活性を有するように、ＧＨのアミノ酸配列を十分に再現するアミノ酸の配列を有する。ＧＨの１つの活性は、ＧＨレセプターへの結合能である。突然変異タンパク質が、ＧＨレセプター（ＧＨＲ）に対する実質的結合活性を有する限り、ＧＨに対して実質的に同様の活性を有すると考えることができる。したがって、任意の所定の突然変異タンパク質は、かかる突然変異タンパク質を、例えば、放射免疫アッセイまたはＥＬＩＳＡアッセイ等の、適宜標識化したＧＨＲまたは細胞発現ＧＨＲに結合するかしないか、を決定するために、試料サンドイッチ競合アッセイにかけることを含む、通常の実験によって、ＧＨと同様の活性を実質的に有するかどうかを決定することができる。
【００８５】
好適な態様では、任意のかかる突然変異タンパク質は、ＧＨのアミノ酸またはＤＮＡ配列と、少なくとも４０％の同一性または相同性を有する。これらの配列は、例えばDaNoto等，1981またはMatial等，1979から、当業界において公知である。
【００８６】
より好適には、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または最適には、少なくとも９０％または９５％同一性または相同性を有する。
【００８７】
本発明による突然変異タンパク質に対する好適な変化は、「保存的」置換として知られているものである。ＧＨポリペプチドの保存的アミノ酸置換には、群のメンバー間の置換が、分子の生物学的機能を保存する、十分に同様の生理化学的特性を有する群内での同義アミノ酸が含まれ得る（Grantham，1974）。アミノ酸の挿入および欠損は、特に挿入または欠損が、単に数個のアミノ酸に関与する場合（例えば３０個を下回る、好適には１０個を下回る）、それらの機能を変更しないで、上記定義した配列中でも成され得、そして例えばシステイン残基等の、機能的配座に対して重要であるアミノ酸を除去または置換しないことが明らかである。かかる欠損および／または挿入によって産出されるタンパク質および突然変異タンパク質は、本発明の範囲内にある。
【００８８】
語句「融合タンパク質）」は、他のタンパク質、例えば体液中の残余時間が伸びているものと融合した、ＧＨを含むポリペプチド、またはその突然変異タンパク質または断片を意味する。したがって、ＧＨは他のタンパク質、ポリペプチド等、例えば免疫グロブリンまたはその断片に融合され得る。ＩｇＧのＦｃ部は、免疫グロブリン−融合タンパク質の調製に適する。Ｉｇ融合タンパク質は、例えば欧州特許第３１４  ３１７  Ａ１（ジェネンテック（Genentech））または欧州特許第０  ３２５  ２２４  Ａ２（ザイモジェネティクス社（Zymogenetics Inc.)）にて発表されている。
【００８９】
ＧＨの、または突然変異タンパク質および融合タンパク質の「活性画分」として、本発明は、前記画分がＧＨと実質的に同様の活性を有するという条件で、単独、またはそれに連結した関連物質または残基、例えば糖またはリン酸残基、またはタンパク質分子またはそれ自身による糖残基の凝集物と一緒に、タンパク質分子のポリペプチド鎖の任意の断片または前駆体をカバーする。
【００９０】
本発明のＧＨが医薬組成物として使用されるべきである場合、かかる医薬組成物は、多数の疾患または疾病の処置および／または予防のために使用され得る。かかる疾患または疾病は好適には、不十分な内因性ＧＨ産出に関連する。精製ＧＨは、例えば特に小児でのＧＨ不全、ＡＩＤＳ消耗、リポジストロフィ（またＨＡＲＳ−ＨＩＶ関連異形症／異代謝症候群とも呼ばれる）、または短腸症候群の処置および／または予防のために使用され得る。成長ホルモンの投与が指示される更なる疾病には、肝硬変、成人成長欠損、アテローム性動脈硬化症、クーロン病および潰瘍性大腸炎、変形性関節症、心臓悪液質、うっ血性心不全、慢性腎不全、血液細胞再構成または可動化、男性不妊、造血幹細胞可動化、多発性硬化症、脳卒中、多系統萎縮症またはがんが含まれる。
【００９１】
本発明は本明細書において完全に発表されたため、当業者は、同様のものが、本発明の精神および範囲を逸脱せず、過度の実験をせずに、広い範囲の等価のパラメータ、濃度および条件内で実施可能であることを理解するであろう。
【００９２】
本発明がその特定の態様に関して発表されている一方で、更なる改変が可能であることが理解されるであろう。本願は、一般的に、本発明の原理に従い、本発明の属する技術分野において公知または慣用的な実施の範囲内として、そして添付の特許請求の範囲内にしたがうように本明細書の上記で列記された本質的な特徴に適用し得るように、本開示からのかかる逸脱を含む、本発明の任意の変形例、使用または適用をカバーすることを意図する。
【００９３】
ジャーナル記事または要約、発行されたまたは未発行の米国または外国特許出願、付与された米国または外国特許または任意の他の参考文献を含む、本明細書で引用されたすべての参考文献が、引用された参考文献にて表示されたすべてのデータ、表、図およびテキストを含んで、本明細書に参照して組み込まれている。さらに、本明細書で引用された参考文献内で引用された参考文献のすべての内容も、すべてが参照して組み込まれている。
【００９４】
公知の方法段階、慣用の方法段階、公知の方法または慣用の方法に対する参照は、いずれにしても、本発明の任意の観点、記述または態様を、関連する技術分野にて開示し、教示し、または示唆することを許可するものではない。
【００９５】
特定の態様についての上述の記載は、当業界の技術分野の知識（本明細書で引用された参考文献の内容を含む）を適用することによって、他人が過度な実験をせずに、本発明の一般的な概念から逸脱せず、かかる特定の態様を、容易に種々に適用するために改変および／または適合することができる本発明の一般的特徴を完全に明らかにするであろう。したがって、かかる適合および改変は、本明細書で示された教示および指南に基づいて、開示された態様の等価物の範囲を意味する範囲であることが意図される。本明細書の専門用語および語法が、通常の当業者の知識と組み合わせて、本明細書で示された教義および指南に関して、当業者によって解釈されるように、本明細書の専門用語および語法が、記述の目的のみであって、制限の目的ではないことが理解されるべきである。
【実施例１】
【００９６】
ｈＧＨ発現Ｃ１２７細胞のための新規無血清産出培地の開発
１．イントロダクション
本研究は、微量金属元素の添加による、産出培養培地（ＤＭＥＭ、「ダルベッコ改変イーグル培地」）の開発に関する実験的作業を発表する。本開発の結果として、Ｃ１２７細胞培養中のｒ−ｈＧＨ産出の顕著な増加が得られた。
【００９７】
以下の表１は、本実施例の枠中で示されるであろうＤＭＥＭの組成および開発を要約する。
【表１】
2008518592.tif 000002
【表２】
2008518592.tif 000003
【表３】
2008518592.tif 000004
【表４】
2008518592.tif 000005
【００９８】
２．材料および方法
試薬および溶液
すべての化学試薬を、メルク（Merck）（商標）より得た：硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ4：７Ｈ2Ｏ）、硫酸銅（ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ）、塩化バリウム（ＢａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）、塩化コバルト（ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ）、硫酸カリウムクロム（Ｋ［Ｃｒ（ＳＯ6Ｈ4）2（Ｈ2Ｏ）2］・６Ｈ2Ｏ）、硝酸ニッケル（Ｎｉ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ）、亜セレン酸ナトリウム（Ｎａ2ＳｅＯ3・５Ｈ2Ｏ）、クエン酸鉄（ＦｅＣ6Ｈ5Ｏ7  シグマ（Sigma）（商標）カタログ番号Ｆ３３８８）を鉄供給源として使用した。
【００９９】
増殖培地微量元素混合物（１００，０００×）はＪＲＨ（商標）バイオサイエンセズ（Biosciences）より提供された。
【０１００】
アッセイするべきすべての微量元素溶液を、蒸留水中の濃縮溶液として調製し、０．２μｍフィルターを介したろ過によって滅菌した。
【０１０１】
異なる実験でアッセイした異なるサプリメントの添加（金属溶液など）は、新鮮な培養培地上で直接実施した。
【０１０２】
細胞培養
遺伝的に修飾したＣ１２７マウス細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６１６）を、組換えヒト成長ホルモン（ｒｈＧＨ）の発現のために使用した。ベクターは、ｐＢＲ３２２多重クローニング部位、およびマウス  メタトロチオネイン−１（ＭＴ−１）プロモーターの制御下で、１．６ｋｂのｒｈＧＨミニ遺伝子を含むＢＰＶ６９Ｔに基づく。異なるｒｈＧＨ産出バッチから得た、１つのＷｏｒｋｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋに由来する培養を実験に使用した。
【０１０３】
細胞培養を、３７５ｍＬ±１５ｍＬの培養培地を含む２１２５ｃｍ2ローラーボトル中、または３００ｍＬの培養培地を含む１７００ｃｍ  ｃｍ2ローラーボトル中、３６℃±０．５℃および０．４ｒｐｍにてインキュベートし続けた。
【０１０４】
培養培地
ｒｈＧＨ産出段階のために使用した培養培地は、重炭酸ナトリウム（３．７ｇ／Ｌ）で緩衝させた４．５ｇ／Ｌグルコースを含むＤＭＥＭであった。
【０１０５】
ｒｈＧＨ滴定
培養培地中のｒｈＧＨの測定を、逆相ＨＰＬＣ滴定によって毎日実施した：
材料
Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ  ＲＰ４、１００×４．６ｍｍ  ｉ．ｄ．、３００Å  カタログ番号Ｃ４Ｒ１０３−１０（エイクロム（Eichrom））
Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ＲＰＣ  １ｍＬ、３０ｍｍ×６．４ｍｍ  ｉ．ｄ．、１５μｍ、ａｒｔ  １７−１１８１−０１、アマシャム  バイオサイエンセズ（Amersham Biosciences）
Ｓｙｍｍａｔｒｙ３００、５０ｍｍ×４．６  ｉ．ｄ．、Ｃ４  ５μｍ、Ｐ／Ｎ１８６０００２８７（ウォーターズ（Waters））
試薬
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）(ピアス(Pierc)、カタログ番号２８９０４または同等物)
アセトニトリル（ＡＣＮ）(メルク(Merck)１．０００３０または同等物)
精製水、ＰＷ（例えばＭｉｌｌｉＱ水、、または同等物）
ヘリウム
溶液
移動相Ａ：ＴＦＡ  水中０．０８％（ｖ／ｖ）
ＰＷ水の容積を目盛り付きフラスコ中で測定し、以下の表にしたがってＴＦＡを加える。攪拌し標識する。
【０１０６】
【表５】
2008518592.tif 000006
移動相Ｂ：ＴＦＡ  アセトニトリル中０．０８％（ｖ／ｖ）
ＰＷ水の容積を容積測定フラスコ中で測定し、以下の表にしたがってＴＦＡを加える。攪拌し標識する。
【０１０７】
【表６】
2008518592.tif 000007
クロマトグラフィー条件は以下の通りである。
勾配による溶出：混合相Ａ：相Ｂ  ６０／４０にて開始し、相Ａ／相Ｂ  ２０／８０にて終了する。勾配は５分間で完了する（使用する器具によってわずかに変わる）
注入量  ５０マイクロリットル
検出：２１５ｎｍでのＵＶ吸収
較正曲線：１０、５０、１００、１２０および１５０μｇ／ｍｌでのｒ−ｈＧＨ標準
【０１０８】
試料のｒ−ｈＧＨ濃度を、標準ｒ−ｈＧＨ濃度との比較によって決定する。
【０１０９】
ＧＨ産出
生産性を、ｒｈＧＨのｍｇ／ローラーボトルとして示す。生データは、（ＨＰＬＣによって測定したような）回収中のｒｈＧＨ濃度であり、回収したローラーボトルの総数である。典型的には、回収相の間のローラーボトルには、約１０9細胞が含まれる。
【０１１０】
３．結果
第一の一連の実験にて、断続的に培養培地に加えた高コバルト濃度（２０μＭ  ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ）の効果をアッセイした。添加は、１つのバッチの産出相の初期段階（リンスおよびＰＭ＝産出培地、すなわち回収相の０ポイント）および中間段階（回収６および７）中、２回の培地変更の間に実施した。結果（図示せず）によってプロモーターが活性であり、調節可能であることが示唆された。
【０１１１】
上昇した生産性は、他の金属元素でさらに確認された。それぞれ培地に継続的に加えた１０μＭ濃度のバリウム（ＢａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ）、コバルト（ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ）、クロム（Ｋ［Ｃｒ（ＳＯ6Ｈ4）2（Ｈ2Ｏ）2］・６Ｈ2Ｏ）、およびニッケル（Ｎｉ（ＮＯ3）2・６Ｈ2Ｏ）でアッセイを実施した。本実験の結果を図１および２に示す。
【０１１２】
図１は、実験期間（１４日）にわたり、アッセイする元素を含む培地中で培養したときの、ｈＧＨ発現Ｃ１２７によって分泌されたｈＧＨの量を示している。図２は、各アッセイする元素に関して達した平均産出値を示している。平均産出は、微量元素なしで、コントロール値と比較して得たパーセント、バリウムに関して１．１％間、およびコバルトに関して３２．４％間の範囲で増加する。コバルトで、連続対断続的に誘導してアッセイした場合に、ｒｈＧＨ生産性がコントロール値と比較して、９％〜３２．５％増加したことも確認された。バリウムとクロムは、いずれもＤＭＥＭ中でアッセイした濃度で、生産性増加を示さなかった。
【０１１３】
個々の微量元素の測定
ＤＭＥＭに、以下の表２で報告した濃度で、微量元素Ｚｎ、Ｃｕ、ＳｅおよびＣｏを加えた。これらの濃度は、増殖培地中の金属元素の濃度に相当する。微量元素をＤＭＥＭに加えることによって達成されたｒｈＧＨ生産性の増加を表２に示す。
【０１１４】
表２：ｒｈＧＨ生産性パーセントは、示したμＭ濃度でＤＭＥＭ中の金属イオンをアッセイした場合に増加する
【表７】
2008518592.tif 000008
【０１１５】
亜鉛の場合、１．５μＭのアッセイ濃度によって、「ピーリング−オフ（ｐｅａｌｉｎｇ−ｏｆｆ）」現象、すなわちローラーボトルのプラスチック基質からの細胞単層の脱着が惹起されることに留意すべきである。いくつかの場合、このピーリングが、最後の回収段階（通常回収１２〜１４の間）にて培養の欠損を導く。ピーリング−オフ現象は、Ｃｅｌｌｂｉｎｄ(商標)の名前で、コーニング(Corning)(商標)社から入手可能なローラーボトル等の、適切な細胞培養容器を用いることによって未然に防ぐことができる。
【０１１６】
金属間の相互作用の測定
ｈＧＨ産物の生産性における銅および亜鉛の効果に基づき、要因設計実験を実施して、金属の可能性ある組み合せ効果をアッセイした。
【０１１７】
結果の統計解析を表３に示す。ＣｕおよびＺｎを一緒に用いる生産性における強力な相乗効果（ｐ≦０．０００１）が観察された。
【表８】
2008518592.tif 000009
【０１１８】
ピーリング−オフは、銅の存在の有無にかかわらず、１．５μＭの濃度にて亜鉛で処理したすべての培養中で観察された。
【０１１９】
その後、亜鉛濃度が減少した（Ｚｎ  ０．５μＭ）場合の亜鉛および銅の両方の添加の効果を研究するために、並びに生産性および基質に対する培養の接着を改善し得る増殖培地に対する他の微量元素（マンガン、セレンまたはクエン酸鉄等）の添加の効果を研究するために、要因設計実験を実施した。
【０１２０】
継続的な増殖が、通常の産出開始点から、２０ｍｇ  ｒｈＧＨ／ボトルまで達し、標準ＤＭＥＭを有するコントロール培養の３０ｍｇのｒｈＧＨと比較して７０ｍｇのｒｈＧＨ／ＲＢに近づく最終値となった（図示せず）。コントロールと比較した、ＧＨ生産性における増加に関する平均値（すなわち、１４日目でのｍｇ／ＲＢ中で測定した生産性）を図３に示す。この一連の実験にて、ピーリング−オフ現象が減少した。
【０１２１】
アミノ酸添加
アミノ酸解析を、ｈＧＨ生産性の増加が、任意のアミノ酸の利用能によって制限されるかどうかを決定するために実施した。表４は、培地中に亜鉛および銅を添加した、及び亜鉛および銅を添加しない培養中での、２日後の回収されたアミノ酸の割合を示す。
【０１２２】
表４：標準ＤＭＥＭ培養またはＺｎ  ０．５μＭ、Ｃｕ  ０．０２μＭおよびクエン酸鉄  ４．８μＭを補充したＤＭＥＭで維持した培養から由来する、培養中２日後に回収した、粗培地中のアミノ酸の濃度の割合
【表９】
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【０１２３】
銅、亜鉛およびクエン酸鉄（Ｚｎ  ０．５μＭ、Ｃｕ  ０．０２μＭおよびクエン酸鉄  ４．８μＭ）の混合物を、もっとも高い比率にて消費したこれらのアミノ酸の組み合わせでアッセイした。Ｌ−グルタミン（Ｇｌｎ  ４．８ｍＭ）、Ｌ−セリン（Ｓｅｒ  ０．４９ｍＭ）およびＬ−システイン（Ｃｙｓ  ０．２９ｍＭ）。結果は図４に示す。
【０１２４】
生産性における陽性効果は、個別でも組み合せでも、試験されたどのアミノ酸においても観察されなかった。
【０１２５】
金属をアミノ酸と一緒に加えたときに、生産性におけるわずかな効果：グルタミンのわずかな陽性効果（７８．２％から８１．１％）、システインの陰性効果（７８．２％から６９．９％）だけが観察された。かかる差異は有意であるとはみなされなかった。
【０１２６】
生産性は、ＤＭＥＭ中において金属の混合により処理された培養（約５０ｍｇ  ｒｈＧＨ／ＲＢ／回収、の平均値）と金属を含まないもの（約３０ｍｇ  ｒｈＧＨ／ＲＢ／回収）間で明らかに異なった。これらの結果を見ると、産出培地の起源のアミノ酸組成を修飾する必要性は考慮されなかった。
【０１２７】
銅および亜鉛の滴定の効果
銅の最適濃度を測定するために、実験を実施し、クエン酸鉄濃度（４．８μＭ）および亜鉛濃度（０．５μＭ）定数を維持し、銅濃度を変化させた（図５）。
【０１２８】
図５で示したように、用量反応実験により、ＤＭＥＭ中の銅に対する最適添加濃度は、示した亜鉛およびクエン酸鉄濃度でアッセイした場合に、２５．６ｎＭであることが確認された。
【０１２９】
他の実験では、クエン酸鉄濃度（４．８μＭ）および銅（０．０２５μＭ）濃度を一定に維持し、亜鉛濃度を変化させた（図６）。最大産出レベル（プラトー）は、２００ｎＭ超の亜鉛濃度で観察され、産出は平均コントロール値の約６０％で安定した。
【０１３０】
結果の要約
図７は、鉄イオンと一緒の、または単独での微量濃度にあるＺｎおよびＣｕイオンで得られた結果を要約する。
【０１３１】
以下の値は、ＤＭＥＭ培地に金属微量元素を加えることによる生産性の増加に関して得られたデータに基づいて得られた。
亜鉛  １．５μＭ：１０．３％±５．０％、亜鉛  ０．５μＭ：１６．８％±１．６％
銅  ０．０２μＭ：３２．１％±９．４％
亜鉛  １．５μＭ＋銅  ０．０２μＭ：６６．３％±１６％
亜鉛  ０．５μＭ＋銅  ０．０２μＭ：６１．２％（±１０％）
亜鉛  ０．５μＭ＋銅  ０．０２μＭ＋クエン酸鉄  ４．８μＭ：６９．４％±１９％
【０１３２】
これらのデータを見ると、以下の混合が、ＤＭＥＭ培養への添加物として最適である。
・２５ｎＭにて硫酸銅（ＣｕＳＯ4・５Ｈ2Ｏ）としての銅
・５０ｎＭ〜１５００ｎＭの間の硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ）としての亜鉛、好適には２００〜５００ｎＭの範囲の濃度
・濃度４．８μＭ〜約６μＭのイオンの最終濃度でのクエン酸鉄、硝酸鉄はすでにＤＭＥＭ中に存在する。
【０１３３】
結論
ＤＭＥＭ培地へのサプリメントとして微量の銅、亜鉛および鉄イオンの利用が、標準ＤＭＥＭと比較して５０％を上回るまでｒｈＧＨ生産性を増加させた。
【０１３４】
【表１０】
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【表１１】
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【図面の簡単な説明】
【０１３５】
【図１】１０μＭの異なる成分をＤＭＥＭ培養培地中へ連続して添加する中で、産出段階にて得られたｒｈＧＨ産出プロファイルを示す（ＲＢ＝ローラーボトル、Ｈ１−Ｈ１４＝産出段階１〜１４日）。
【図２】１０μＭの金属（ニッケル、バリウム、コバルト、クロム）をＤＭＥＭ培養培地中へ連続して添加する中で、産出段階にて得られた平均ｒｈＧＨ産出値をｍｇ  ｒｈＧＨ／ローラーボトルとして示す。
【図３】亜鉛（Ｚｎ、０．５μＭ）、銅（Ｃｕ、０．０２μＭ）、セレン（Ｓｅ、０．０５０μＭ）、マンガン（Ｍｎ、０．００１μＭ）およびクエン酸鉄（４．８μＭ）の試験組み合わせに関して、要因デザイン実験にて得られたｒｈＧＨ産出増加の平均値を、コントロールと比較して示す。
【図４】金属微量元素（Ｚｎ  ０．５μＭ、Ｃｕ  ０．０２μＭおよびクエン酸鉄４．８μＭ）およびアミノ酸グルタミン（Ｇｌｎ  ４．８ｍＭ）、セレン（Ｓｅｒ、０．４９ｍＭ）およびシステイン（Ｃｙｓ  ０．２９ｍＭ）の混合物の結果を決定するための、要因デザイン実験の結果を示す。
【図５】ＤＭＥＭ中のｒｈＧＨ生産性における、亜鉛およびクエン酸鉄（Ｚｎ  ０．５μＭ、クエン酸鉄  ４．８μＭ）を組み合せた銅の多様な濃度での効果を示す。
【図６】ＤＭＥＭ中のｒｈＧＨ生産性における、銅およびクエン酸鉄（Ｃｕ  ０．０２μＭ、クエン酸鉄  ４．８μＭ）を組み合せた亜鉛の多様な濃度での効果を示す。
【図７】ｒｈＧＨ−産出Ｃ１２７細胞での異なる実験からの、ＤＭＥＭ補足物として、銅、亜鉛およびクエン酸鉄（Ｚｎ：１．５および０．５μＭ、Ｃｕ：０．０２μＭおよびクエン酸鉄：４．８μＭ）を加えたときに得られたｒｈＧＨ生産性の増加の効果の概要を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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