(57)【要約】  本発明は、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁、ペイロード分子およびペイロード捕捉分子を含む、微粒子送達システムを提供する。本発明はさらに、微粒子送達システムを調製する方法および使用する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁およびペイロード捕捉分子を含む、微粒子送達システム。
【請求項２】
ペイロード分子をさらに含み、ペイロード分子およびペイロード捕捉分子が同じ溶媒系に溶ける、請求項１に記載の微粒子送達システム。
【請求項３】
溶媒系が水を含む、請求項２に記載の微粒子送達システム。
【請求項４】
抽出酵母細胞壁がさらに９０重量％未満のβ−グルカンを含む、請求項１に記載の微粒子送達システム。
【請求項５】
抽出酵母細胞壁がさらに５０重量％以上のキチンを含む、請求項１に記載の微粒子送達システム。
【請求項６】
抽出酵母細胞壁がさらに３０重量％以上のマンナンを含む、請求項１に記載の微粒子送達システム。
【請求項７】
抽出酵母細胞壁がさらに１重量％以上のタンパク質を含む、請求項１に記載の微粒子送達システム。
【請求項８】
ペイロード捕捉分子が、アガロース、アルギン酸塩、キサンタン、デキストラン、キトサン、ガラクトマンナンガム、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択される多糖である、請求項１に記載の微粒子送達システム。
【請求項９】
ペイロード捕捉分子がポリアクリルアミドである、請求項１に記載の微粒子送達システム。
【請求項１０】
ペイロード捕捉分子がポリアミドである、請求項１に記載の微粒子送達システム。
【請求項１１】
ペイロード捕捉分子が、陽イオンポリマー、陰イオンポリマー、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の微粒子送達システム。
【請求項１２】
陽イオンポリマーが、キトサン、ポリエチレンイミンおよびポリ−Ｌ−リシンからなる群から選択される、請求項１１に記載のペイロード捕捉分子。
【請求項１３】
陽イオンポリマーと陽イオン界面活性剤との混合物である、請求項１１に記載のペイロード捕捉分子。
【請求項１４】
陽イオンポリマーが、タンパク質、ポリペプチド、短合成ペプチド、らせん状両親媒性ペプチド、陽イオンデンドリマー、グルカルアミド（glucaramide）ポリマー、Ｎ−置換グリシンオリゴマー、ポリ（２−メチルアクリル酸２−［（２−ジメチルアミノ）−エチル］−メチルアミノ）−エチルエステル）、ポリ（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレートおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１１に記載のペイロード捕捉分子。
【請求項１５】
陰イオンポリマーが、アルギン酸塩およびキサンタンからなる群から選択される、請求項１１に記載のペイロード捕捉分子。
【請求項１６】
陽イオン界面活性剤が、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムである請求項１１に記載のペイロード捕捉分子。
【請求項１７】
ペイロード捕捉分子が、陽イオン高分子電解質、陰イオン高分子電解質および両性高分子電解質からなる群から選択される、請求項１に記載の微粒子送達システム。
【請求項１８】
陽イオン高分子電解質が、ビニルピロリドンと第四級メチルメタクリレートとのコポリマー、置換ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリアミンホモポリマー、ポリアミンコポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド、置換デキストラン、修飾グアールガム、置換タンパク質、ポリアミノ酸、スペルミンおよびスペルミジンからなる群から選択される、請求項１７に記載の微粒子送達システム。
【請求項１９】
陰イオン高分子電解質が、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸とのコポリマー、メチルビニルエーテルとマレイン酸とのコポリマー、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、置換ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、デキストラン硫酸、置換サッカライド、ヘパリンおよび製薬上許容できる塩からなる群から選択される、請求項１７に記載の微粒子送達システム。
【請求項２０】
ペイロード分子が、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、小有機活性物質、小無機活性物質およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２に記載の微粒子送達システム。
【請求項２１】
ポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、組換えＤＮＡ構築物およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項２０に記載の微粒子送達システム。
【請求項２２】
組換えＤＮＡ構築物が、タンパク質をコードする翻訳領域に作動的に連結された制御エレメントを含む発現ベクターである、請求項２１に記載の微粒子送達システム。
【請求項２３】
翻訳領域によりコードされるタンパク質が、構造タンパク質、酵素活性を有するタンパク質、膜タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質またはシグナル伝達タンパク質である、請求項２２に記載の微粒子送達システム。
【請求項２４】
翻訳領域によりコードされるタンパク質が抗原性タンパク質である、請求項２２に記載の微粒子送達システム。
【請求項２５】
ポリヌクレオチドが、欠失、欠損したまたは阻害された遺伝子の機能を回復させるヌクレオチド配列を含む、請求項１９に記載の微粒子送達システム。
【請求項２６】
翻訳領域によりコードされるタンパク質が、遺伝障害を有する個体における治療効果をもたらすタンパク質である、請求項２２に記載の微粒子送達システム。
【請求項２７】
遺伝障害が、アールスコグ−スコット症候群、アーセ症候群、軟骨形成不全、先端異骨症、嗜癖、副腎脳白質ジストロフィー、白皮症、無眼瞼大口症候群、アラジル症候群、アルカプトン尿症、α−１−アンチトリプシン欠乏症、アルポート症候群、アルツハイマー病、喘息、自己免疫多腺性症候群、アンドロゲン非感受性症候群、アンジェルマン症候群、運動失調症、毛細血管拡張性運動失調症、アテローム動脈硬化症、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、脱毛症、バッテン病、ベックウィズ−ヴィーデマン症候群、ベスト病、双極性障害、短指症、乳癌、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、シャルコー−マリー−トゥース病、クローン病、唇裂、コケーン症候群、コフィン−ローリー症候群、大腸癌、先天性副腎過形成、コルネリアドランゲ症候群、コステロ症候群、カウデン症候群、頭蓋前頭鼻部形成異常、クリグラー−ナジャー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病、嚢胞性線維症、難聴、鬱病、糖尿病、捻曲性骨異形成症、ディジョージ症候群、ダウン症候群、失読症、デュシェンヌ筋ジストロフィー、デュボヴィッツ症候群、外胚葉異形成症、エリス−ファンクレフェルト症候群、エーレルス−ダンロー症候群、表皮水疱症、てんかん、本態性振戦、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、フリートライヒ運動失調、ゴーシェ病、緑内障、グルコース−ガラクトース吸収不良、グルタル酸尿症、回萎縮、ゴールドベルク−シプリンツェン（Goldberg Shprintzen）症候群（口蓋心顔面症候群）、ゴーリン症候群、ヘーリー−ヘーリー病、片側肥大、ヘモクロマトーシス、血友病、遺伝性運動感覚ニューロパシー（ＨＭＳＮ）、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）、ハンチントン病、高ＩｇＭを伴う免疫不全、若年発症糖尿病、クラインフェルター症候群、カブキ症候群、リー症候群、ＱＴ間隔延長症候群、肺癌、悪性黒色腫、躁うつ病、マルファン症候群、メンケズ症候群、流産、ムコ多糖症候群、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮側索硬化症、筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニューマン−ピック病、ヌーナン症候群、肥満、卵巣癌、ｐ５３腫瘍抑制因子、膵臓癌、パーキンソン病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ペンドレッド症候群、腓骨筋萎縮、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、腎多嚢胞病、プラーダー−ヴィリ症候群、原発性胆汁性肝硬変、前立腺癌、ＲＥＡＲ症候群、レフスム病、色素性網膜炎、網膜芽腫、レット症候群、サンフィリポ症候群、精神分裂病、重症複合免疫不全症、鎌状赤血球貧血、二分脊椎、脊髄性筋萎縮、脊髄小脳萎縮、ＳＲＹ：性決定、成人突然死症候群、タンジアー病、テイ−サックス病、血小板減少橈骨欠損症候群、タウンズ−ブロックス症候群、結節性硬化症、ターナー症候群、アッシャー症候群、フォンヒッペル−リンダウ症候群、ワーデンブルヒ症候群、ウィーバー症候群、ヴェルナー症候群、ウィリアム症候群、ウィルソン病、色素性乾皮症またはツェルヴェーガー症候群である、請求項２５に記載の微粒子送達システム。
【請求項２８】
タンパク質が、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２（ｐ３５サブユニット）、インターロイキン−１３、インターロイキン−１５、オンコステチンＭ、繊毛様神経栄養因子、白血病抑制因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、カルディオトロフィン−１成長ホルモン放出因子、上皮小体ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α−１−アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ組織因子、ヴォンヴィレブランド因子、プロテインＣ、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベジン、トロンビン、α腫瘍壊死因子、β腫瘍壊死因子、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質、血清アルブミン、ミューラー管退行因子、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、ホルモン受容体、成長因子受容体、インテグリン、プロテインＡ、プロテインＤ、リウマトイド因子、神経栄養因子、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５もしくはニューロトロフィン−６、ＮＧＦ−β、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、α線維芽細胞成長因子、βα線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、トランスフォーミング成長因子α、トランスフォーミング成長因子β１、トランスフォーミング成長因子β２、トランスフォーミング成長因子β３、トランスフォーミング成長因子β４、トランスフォーミング成長因子β５、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩ、デス（１−３）インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、骨誘導因子、イムノトキシン、骨形成タンパク質、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ウイルス抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレッシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗体およびそれらの生物学的に活性なフラグメントまたは変異体からなる群から選択される、請求項２０に記載の微粒子送達システム。
【請求項２９】
翻訳領域によりコードされるタンパク質が、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２（ｐ３５サブユニット）、インターロイキン−１３、インターロイキン−１５、オンコステチンＭ、繊毛様神経栄養因子、白血病抑制因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、カルディオトロフィン−１成長ホルモン放出因子、上皮小体ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α−１−アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ組織因子、ヴォンヴィレブランド因子、プロテインＣ、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベジン、トロンビン、α腫瘍壊死因子、β腫瘍壊死因子、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質、血清アルブミン、ミューラー管退行因子、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、ホルモン受容体、成長因子受容体、インテグリン、プロテインＡ、プロテインＤ、リウマトイド因子、神経栄養因子、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５もしくはニューロトロフィン−６、ＮＧＦ−β、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、α線維芽細胞成長因子、βα線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、トランスフォーミング成長因子α、トランスフォーミング成長因子β１、トランスフォーミング成長因子β２、トランスフォーミング成長因子β３、トランスフォーミング成長因子β４、トランスフォーミング成長因子β５、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩ、デス（１−３）インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、骨誘導因子、イムノトキシン、骨形成タンパク質、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ウイルス抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレッシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗体およびそれらの生物学的に活性なフラグメントまたは変異体からなる群から選択される、請求項２２に記載の微粒子送達システム。
【請求項３０】
小有機活性物質が、２本鎖ＤＮＡの小溝に配列特異的に結合している複素環式ポリアミドのオリゴマーである、請求項２０に記載の微粒子送達システム。
【請求項３１】
小有機活性物質が、Ｎ−メチルイミダゾールカルボキサミド、Ｎ−メチルピロールカルボキサミド、βアラニンおよびジメチルアミノプロピルアミドからなる群から選択されるモノマーサブユニットを有するオリゴマーである、請求項２０に記載の微粒子送達システム。
【請求項３２】
小有機活性物質が、避妊薬、胃腸治療薬、非ステロイド避妊薬、副交感神経作用薬、精神療法薬、強力精神安定薬、穏和精神安定薬、鼻うっ血除去薬、催眠鎮静薬、ステロイド、スルホンアミド、ワクチン、ビタミン、栄養素、抗マラリア薬、抗片頭痛薬、抗パーキンソン薬、鎮痙薬、抗コリン薬、鎮咳薬、気管支拡張薬、心血管薬、抗高血圧薬、冠血管拡張薬、有機硝酸エステル、アルカロイド、鎮痛薬、麻薬、抗癌薬、抗けいれん薬、抗嘔吐薬、抗炎症薬、細胞毒性薬または抗生物質である、請求項１９に記載の微粒子送達システム。
【請求項３３】
小有機活性物質が、セファロスポリン、クロラムフェニカル、ゲンタマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、ペニシリン、アンピシリン、ストレプトマイシンＡ、アンチマイシンＡ、クロロパムテニオール、メトロニダゾール、オキシテトラサイクリン、ペニシリンＧ、テトラサイクリンおよびそれらの混合物からなる群から選択される抗生物質である、請求項２０に記載の微粒子送達システム。
【請求項３４】
核酸組成物、タンパク質組成物、小有機分子およびそれらの混合物からなる群から選択されるペイロード分子を含む第１の容器、酵母細胞壁粒子およびペイロード捕捉分子を含む微粒子送達システムを含む第２の容器、ならびに取扱説明書を含む製品。
【請求項３５】
酵母細胞壁粒子、ペイロード捕捉分子ならびにポリヌクレオチド、タンパク質、小有機分子、およびそれらの混合物からなる群から選択される、ペイロード分子を含む製品、ならびに製薬上許容できる賦形剤を含む薬剤組成物。
【請求項３６】
内腔を画定する、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁を供給する段階と、
抽出酵母細胞壁をペイロード分子と接触させ、ペイロード分子が内腔に少なくとも部分的に封じ込められた状態になる段階と、
抽出酵母細胞壁をペイロード捕捉分子と接触させ、ペイロード捕捉分子が抽出酵母細胞壁内のペイロード分子を少なくとも部分的に閉じ込めて微粒子送達システムを形成し、ペイロード分子とペイロード捕捉分子が同じ溶媒系に溶ける段階と、
細胞を微粒子送達システムと接触させる段階と
を含む、ペイロード分子を細胞に送達する方法。
【請求項３７】
細胞により微粒子送達システムを内部へ移行する段階をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
抽出酵母細胞壁が９０重量％未満のβ−グルカンをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
抽出酵母細胞壁が５０重量％以上のキチンをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
抽出酵母細胞壁が３０重量％以上のマンナンをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
抽出酵母細胞壁が１重量％以上のタンパク質をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
ペイロード捕捉分子が、アガロース、アルギン酸塩、キサンタン、デキストラン、キトサン、ガラクトマンナンガム、それらの誘導体またはそれらの混合物からなる群から選択される多糖である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
ペイロード捕捉分子がポリアクリルアミドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
ペイロード捕捉分子がポリアミドである、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
ペイロード捕捉分子が、陽イオンポリマー、陰イオンポリマー、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
陽イオンポリマーが、キトサン、ポリエチレンイミンおよびポリ−Ｌ−リシンからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ペイロード捕捉分子が、陽イオンポリマーと陽イオン界面活性剤との混合物である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
陽イオンポリマーが、タンパク質、ポリペプチド、短合成ペプチド、らせん状両親媒性ペプチド、陽イオンデンドリマー、グルカルアミドポリマー、Ｎ−置換グリシンオリゴマー、ポリ（２−メチルアクリル酸２−［（２−ジメチルアミノ）−エチル］−メチルアミノ）−エチルエステル）、ポリ（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレートおよびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項４９】
陰イオンポリマーが、アルギン酸塩およびキサンタンからなる群から選択される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５０】
陽イオン界面活性剤が臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムである、請求項４５に記載の方法。
【請求項５１】
ペイロード捕捉分子が、陽イオン高分子電解質、陰イオン高分子電解質および両性高分子電解質からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項５２】
陽イオン高分子電解質が、ビニルピロリドンと第四級メチルメタクリレートとのコポリマー、置換ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミン、ポリアミンホモポリマー、ポリアミンコポリマー、ポリジアリルジメチルアンモニウムクロリド、置換デキストラン、修飾グアールガム、置換タンパク質、ポリアミノ酸、スペルミンおよびスペルミジンからなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
陰イオン高分子電解質が、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸とのコポリマー、メチルビニルエーテルとマレイン酸とのコポリマー、アルギン酸、カルボキシメチルセルロース、置換ポリアクリルアミド、ポリアクリル酸、ポリスチレンスルホン酸、デキストラン硫酸、置換サッカライド、ヘパリンおよび製薬上許容できる塩からなる群から選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
ペイロード分子が、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、小有機活性物質、小無機活性物質およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項３６に記載の方法。
【請求項５５】
ポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、組換えＤＮＡ構築物およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
組換えＤＮＡ構築物が、タンパク質をコードする翻訳領域に作動的に連結された制御エレメントを含む発現ベクターである、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
タンパク質を発現させる段階をさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
翻訳領域によりコードされるタンパク質が、構造タンパク質、酵素活性を有するタンパク質、膜タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質またはシグナル伝達タンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
翻訳領域によりコードされるタンパク質が抗原性タンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
ポリヌクレオチドが、欠失、欠損したまたは阻害された遺伝子の機能を回復させるヌクレオチド配列を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
翻訳領域によりコードされるタンパク質が、遺伝障害を有する個体における治療効果をもたらすタンパク質である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
遺伝障害が、アールスコグ−スコット症候群、アーセ症候群、軟骨形成不全、先端異骨症、嗜癖、副腎脳白質ジストロフィー、白皮症、無眼瞼大口症候群、アラジル症候群、アルカプトン尿症、α−１−アンチトリプシン欠乏症、アルポート症候群、アルツハイマー病、喘息、自己免疫多腺性症候群、アンドロゲン非感受性症候群、アンジェルマン症候群、運動失調症、毛細血管拡張性運動失調症、アテローム動脈硬化症、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、脱毛症、バッテン病、ベックウィズ−ヴィーデマン症候群、ベスト病、双極性障害、短指症、乳癌、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、シャルコー−マリー−トゥース病、クローン病、唇裂、コケーン症候群、コフィン−ローリー症候群、大腸癌、先天性副腎過形成、コルネリアドランゲ症候群、コステロ症候群、カウデン症候群、頭蓋前頭鼻部形成異常、クリグラー−ナジャー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病、嚢胞性線維症、難聴、鬱病、糖尿病、捻曲性骨異形成症、ディジョージ症候群、ダウン症候群、失読症、デュシェンヌ筋ジストロフィー、デュボヴィッツ症候群、外胚葉異形成症、エリス−ファンクレフェルト症候群、エーレルス−ダンロー症候群、表皮水疱症、てんかん、本態性振戦、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、フリートライヒ運動失調、ゴーシェ病、緑内障、グルコース−ガラクトース吸収不良、グルタル酸尿症、回萎縮、ゴールドベルク−シプリンツェン症候群（口蓋心顔面症候群）、ゴーリン症候群、ヘーリー−ヘーリー病、片側肥大、ヘモクロマトーシス、血友病、遺伝性運動感覚ニューロパシー（ＨＭＳＮ）、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）、ハンチントン病、高ＩｇＭを伴う免疫不全、若年発症糖尿病、クラインフェルター症候群、カブキ症候群、リー症候群、ＱＴ間隔延長症候群、肺癌、悪性黒色腫、躁うつ病、マルファン症候群、メンケズ症候群、流産、ムコ多糖症候群、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮側索硬化症、筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニューマン−ピック病、ヌーナン症候群、肥満、卵巣癌、ｐ５３腫瘍抑制因子、膵臓癌、パーキンソン病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ペンドレッド症候群、腓骨筋萎縮、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、腎多嚢胞病、プラーダー−ヴィリ症候群、原発性胆汁性肝硬変、前立腺癌、ＲＥＡＲ症候群、レフスム病、色素性網膜炎、網膜芽腫、レット症候群、サンフィリポ症候群、精神分裂病、重症複合免疫不全症、鎌状赤血球貧血、二分脊椎、脊髄性筋萎縮、脊髄小脳萎縮、ＳＲＹ：性決定、成人突然死症候群、タンジアー病、テイ−サックス病、血小板減少橈骨欠損症候群、タウンズ−ブロックス症候群、結節性硬化症、ターナー症候群、アッシャー症候群、フォンヒッペル−リンダウ症候群、ワーデンブルヒ症候群、ウィーバー症候群、ヴェルナー症候群、ウィリアム症候群、ウィルソン病、色素性乾皮症またはツェルヴェーガー症候群である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
タンパク質が、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２（ｐ３５サブユニット）、インターロイキン−１３、インターロイキン−１５、オンコステチンＭ、繊毛様神経栄養因子、白血病抑制因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、カルディオトロフィン−１成長ホルモン放出因子、上皮小体ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α−１−アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ組織因子、ヴォンヴィレブランド因子、プロテインＣ、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベジン、トロンビン、α腫瘍壊死因子、β腫瘍壊死因子、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質、血清アルブミン、ミューラー管退行因子、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロリラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、ホルモン受容体、成長因子受容体、インテグリン、プロテインＡ、プロテインＤ、リウマトイド因子、神経栄養因子、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５もしくはニューロトロフィン−６、ＮＧＦ−β、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、α線維芽細胞成長因子、βα線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、トランスフォーミング成長因子α、トランスフォーミング成長因子β１、トランスフォーミング成長因子β２、トランスフォーミング成長因子β３、トランスフォーミング成長因子β４、トランスフォーミング成長因子β５、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩ、ｄｅｓ（１−３）インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、骨誘導因子、イムノトキシン、骨形成タンパク質、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ウイルス抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレッシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗体およびそれらの生物学的に活性なフラグメントまたは変異体からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項６４】
翻訳領域によりコードされるタンパク質が、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２（ｐ３５サブユニット）、インターロイキン−１３、インターロイキン−１５、オンコステチンＭ、繊毛様神経栄養因子、白血病抑制因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、カルディオトロフィン−１成長ホルモン放出因子、上皮小体ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α−１−アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体形成ホルモン、グルカゴン、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ組織因子、ヴォンヴィレブランド因子、プロテインＣ、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質、ウロキナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子、ボンベジン、トロンビン、α腫瘍壊死因子、β腫瘍壊死因子、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質、血清アルブミン、ミューラー管退行因子、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子、ホルモン受容体、成長因子受容体、インテグリン、プロテインＡ、プロテインＤ、リウマトイド因子、神経栄養因子、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、ニューロトロフィン−４、ニューロトロフィン−５もしくはニューロトロフィン−６、ＮＧＦ−β、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、α線維芽細胞成長因子、βα線維芽細胞成長因子、上皮成長因子、トランスフォーミング成長因子α、トランスフォーミング成長因子β、トランスフォーミング成長因子β２、トランスフォーミング成長因子β３、トランスフォーミング成長因子β４、トランスフォーミング成長因子β５、インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子−ＩＩ、ｄｅｓ（１−３）インスリン様成長因子−Ｉ、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、骨誘導因子、イムノトキシン、骨形成タンパク質、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子、ウイルス抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレッシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗体およびそれらの生物学的に活性なフラグメントまたは変異体からなる群から選択される、請求項５６に記載の方法。
【請求項６５】
小有機活性物質が、２本鎖ＤＮＡの小溝に配列特異的に結合している複素環式ポリアミドのオリゴマーである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６６】
小有機活性物質が、Ｎ−メチルイミダゾールカルボキサミド、Ｎ−メチルピロールカルボキサミド、βアラニンおよびジメチルアミノプロピルアミドからなる群から選択されるモノマーサブユニットを有するオリゴマーである、請求項５４に記載の方法。
【請求項６７】
小有機活性物質が、避妊薬、胃腸治療薬、非ステロイド避妊薬、副交感神経作用薬、精神療法薬、強力精神安定薬、穏和精神安定薬、鼻うっ血除去薬、催眠鎮静薬、ステロイド、スルホンアミド、ワクチン、ビタミン、栄養素、抗マラリア薬、抗片頭痛薬、抗パーキンソン薬、鎮痙薬、抗コリン薬、鎮咳薬、気管支拡張薬、心血管薬、抗高血圧薬、冠血管拡張薬、有機硝酸エステル、アルカロイド、鎮痛薬、麻薬、抗癌薬、抗けいれん薬、抗嘔吐薬、抗炎症薬、細胞毒性薬または抗生物質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６８】
小有機活性物質が、セファロスポリン、クロラムフェニカル、ゲンタマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、ペニシリン、アンピシリン、ストレプトマイシンＡ、アンチマイシンＡ、クロロパムテニオール、メトロニダゾール、オキシテトラサイクリン、ペニシリンＧ、テトラサイクリンおよびそれらの混合物からなる群から選択される抗生物質である、請求項５４に記載の方法。
【請求項６９】
内腔を画定する、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁を供給する段階と、
抽出酵母細胞壁をペイロード分子と接触させ、ペイロード分子が抽出酵母細胞壁と結合した状態になる段階と、
抽出酵母細胞壁をペイロード捕捉分子と接触させ、ペイロード捕捉分子がペイロード分子と抽出酵母細胞壁との結合を安定化して微粒子送達システムを形成し、ペイロード分子とペイロード捕捉分子が同じ溶媒系に溶ける段階と、
食細胞を微粒子薬物送達システムと接触する段階と
を含む、薬剤を食細胞に送達する方法。
【請求項７０】
食細胞により微粒子薬物送達システムを内部へ移行する段階をさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
食細胞により微粒子薬物送達システムを輸送する段階をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
微粒子薬物送達システムから薬剤を放出させる段階をさらに含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
食細胞が、マクロファージ、パイエル板のＭ細胞、単球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞、肺胞食細胞、腹腔マクロファージ、乳汁マクロファージ、小グリア細胞、好酸球、顆粒球、メサンギウム食細胞または滑膜Ａ細胞である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７４】
ペイロード分子が、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、小有機活性物質、小無機活性物質およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７５】
内腔を画定する、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁を供給する段階と、
抽出酵母細胞壁をペイロード分子と接触させ、ペイロード分子が抽出酵母細胞壁と結合した状態になる段階と、
抽出酵母細胞壁をペイロード捕捉分子と接触させ、ペイロード捕捉分子がペイロード分子と抽出酵母細胞壁との結合を安定化して微粒子送達システムを形成する段階と
を含む、微粒子送達システムを調製する方法。
【請求項７６】
微粒子送達システムを洗浄し、乾燥する段階をさらに含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ペイロード分子が、酵母細胞壁により画定される内腔内に少なくとも部分的に存在する、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
ペイロード分子の結合の安定化が、酵母細胞壁により画定される内腔内で少なくとも部分的に起こる、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
ペイロード分子が、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、小有機活性物質、小無機活性物質およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項７５に記載の方法。
【請求項８０】
ポリヌクレオチドが、オリゴヌクレオチド、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、組換えＤＮＡ構築物およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
組換えＤＮＡ構築物が、タンパク質をコードする翻訳領域に作動的に連結された制御エレメントを含む発現ベクターである、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
ペプチドが、ホルモン、神経伝達物質、神経修飾物質、シグナル伝達タンパク質の活性フラグメント、受容体の活性フラグメント、酵素の活性フラグメントおよび核酸結合タンパク質の活性フラグメントからなる群から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８３】
タンパク質が、酵素、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質、核酸結合タンパク質および転写因子から選択される、請求項７９に記載の方法。
【請求項８４】
個体の食細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、ペイロード捕捉分子と、個体の細胞内で制御可能に発現させることができるペプチドをコードする翻訳領域に作動的に連結された制御エレメントを含むポリヌクレオチドであるペイロード分子とを含む微粒子送達システムと接触させる段階を含む、個体を抗原に曝露する方法。
【請求項８５】
ペプチドが、病原体上で示される抗原エピトープと同じまたは実質的に類似している少なくともエピトープを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
ペプチドが、過増殖性疾患関連タンパク質の抗原エピトープと同じまたは実質的に類似している少なくともエピトープを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
ペプチドが、自己免疫疾患関連タンパク質の抗原エピトープと同じまたは実質的に類似している少なくともエピトープを含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８８】
ペプチドがトキソイドである、請求項８４に記載の方法。
【請求項８９】
食細胞が、マクロファージ、パイエル板のＭ細胞、単球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞、肺胞食細胞、腹腔マクロファージ、乳汁マクロファージ、小グリア細胞、好酸球、顆粒球、メサンギウム食細胞または滑膜Ａ細胞である、請求項８４に記載の方法。
【請求項９０】
個体の食細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、ペイロード捕捉分子と、抗原性分子であるペイロード分子とを含む微粒子送達システムと接触させる段階を含む、個体を抗原に曝露する方法。
【請求項９１】
ペイロード分子が、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、小有機活性物質、小無機活性物質およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
ペイロード分子がトキソイドである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
抗原分子が、少なくとも、過増殖性疾患関連タンパク質の抗原エピトープと同じまたは実質的に類似しているエピトープを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
抗原分子が、少なくとも、自己免疫疾患関連タンパク質の抗原エピトープと同じまたは実質的に類似しているエピトープを含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
食細胞が、マクロファージ、パイエル板のＭ細胞、単球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞、肺胞食細胞、腹腔マクロファージ、乳汁マクロファージ、小グリア細胞、好酸球、顆粒球、メサンギウム食細胞または滑膜Ａ細胞である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁、薬剤およびペイロード捕捉分子を含む微粒子送達システムを供給する段階と、
マクロファージ細胞を微粒子薬物送達システムと接触させる段階
を含む、マクロファージ細胞に薬剤を送達する方法。
【請求項９７】
マクロファージにより微粒子薬物送達システムを内部へ移行する段階をさらに含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
マクロファージにより微粒子薬物送達システムを輸送する段階をさらに含む、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
マクロファージ誘引部位に微粒子薬物送達システムを送達する段階をさらに含む、請求項９８に記載の方法。
【請求項１００】
マクロファージ誘引部位が感染、炎症反応、低酸素または過形成の部位である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
マクロファージ誘引部位が腫瘍である、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０２】
微粒子薬物送達システムから薬剤を放出させる段階をさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０３】
細胞外間隙内に薬剤を放出させる段階をさらに含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
薬剤を放出させる段階が組換えタンパク質を発現させ、タンパク質を細胞外間隙内に分泌させる段階を含む、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０５】
個体の細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、ペイロード捕捉分子と、過増殖性疾患関連タンパク質上で示されるエピトープと同じまたは実質的に類似しているエピトープを含むペプチドをコードする翻訳領域に作動的に連結された制御エレメントを含むポリヌクレオチドであるペイロード分子とを含む微粒子送達システムと接触させる段階を含み、コードされたペプチドが前記個体の細胞において発現することができる、過増殖性疾患に対して個体を免疫化する方法。
【請求項１０６】
個体の細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、ペイロード捕捉分子と、ポリヌクレオチドであるペイロード分子とを含む微粒子送達システムと接触させ、それにより、欠失、欠損したまたは阻害された遺伝子の活性を回復させるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを細胞に投与する段階を含む、遺伝病に罹患している個体を治療する方法。
【請求項１０７】
ポリヌクレオチドが、個体における治療効果をもたらし、前記細胞において発現することができるタンパク質をコードする翻訳領域に作動的に連結された制御エレメントを含む、請求項１０６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
薬物送達システムは、時間またはｐＨのような局所的条件に依存する活性薬の制御された放出のための活性薬の生体適合性リザーバーを提供するために設計されている。経皮パッチ、埋込み式浸透圧ポンプおよび埋込み式皮下デポー剤（例えば、NORPLANT（商標））などの巨視的薬物送達システムはある程度の成功をおさめたが、マイクロカプセル、マイクロパーティクルおよびリポソームなどの微視的薬物送達システムに継続的な関心が集められている。
【０００２】
マイクロカプセルおよびマイクロスフェアは、通常、直径が２ｍｍ以下、通常直径が５００μｍ以下の球形粒子からなる粉体である。粒子が１μｍ未満である場合、それらはしばしばナノカプセルまたはナノスフェアと呼ばれる。マイクロスフェアおよびマイクロカプセルを調製し、使用する方法の記述は、例えば、米国特許第５４０７６０９号明細書に見いだすことができる。マイクロカプセルとマイクロスフェアは、活性薬が高分子膜のようなカプセル化構造により囲まれた中心コアに形成されているか、または活性薬が粒子全体に分散されているか、すなわち、内部構造が薬剤と賦形剤、通常、高分子賦形剤との混合物であるかによって互いに区別することができる。マイクロカプセルからの活性薬の放出は、マトリックス材料、通常、高分子賦形剤としてのポリ（ＤＬ−ラクチド）（ＤＬ−ＰＬ）またはポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＤＬ−ＰＬＧ）などの生分解性高分子材料の生分解によりしばしば制御される。
【０００３】
リポソームは、活性薬コアが高分子膜の代わりに脂質膜によって含まれているマイクロカプセルとみなすことができる。リポソームは、脂質層からなる人工脂質小胞であり、抗原をリポソームの水性コンパートメント内にカプセル封入することができ、あるいは表面カップリング法により表面上の抗原と結合させることができる。リポソームは、大規模に、また捕捉された抗原に対して温和な条件下で容易かつ安価に調製することができる。それらは、それら自体に対する免疫反応を誘発せず、非経口的に投与する薬剤用にヒトに使用される。
【０００４】
マイクロカプセル、マイクロスフェアおよびリポソームの高い表面積／体積比は活性薬の放出に有利であるが、それらのサイズが小さいことが製造上の課題である。マイクロカプセルおよびマイクロスフェアを調製する様々な方法が文献、例えば、米国特許第５４０７６０９号に記述されている。これらの方法のいくつかにおいては、乳濁液を用いてマイクロスフェアを、特に、直径が２ｍｍ未満のマイクロスフェアを調製する。そのような方法の例を示すために、ポリマーを適切な有機溶媒（ポリマー溶媒）に溶解し、薬剤をこのポリマー溶液に溶解または分散させ、得られたポリマー／薬剤混合物を水相（処理媒体）中に分散させて処理媒体中に油の小滴が分散した状態の水中油型乳濁液を得、小適から溶媒を除去してマイクロスフェアを形成させる。これらの方法は、油中水型乳濁液および二重乳濁液を用いて実施することもできる。この基本的アプローチに従う乳濁液を用いる方法の使用は、米国特許第３７３７３３７号、第３８９１５７０号、第４３８４９７５号、第４３８９３３０号および第４６５２４４１号のようないくつかの米国特許に記述されている。
【０００５】
あるいは、抽出酵母細胞壁粒子は、直径が約２〜４μｍの容易に入手可能な生分解性の実質的に球形の粒子である。抽出酵母細胞壁粒子の調製は、当技術分野で知られており、例えば、米国特許第４９９２５４０号、第５０８２９３６号、第５０２８７０３号、５０３２４０１号、第５３２２８４１号、第５４０１７２７号、第５５０４０７９号、第５９６８８１１号、第６４４４４４８Ｂ１号、第６４７６００３Ｂ１号、米国特許出願公開第２００３／０２１６３４６Ａ１号、第２００４／００１４７１５Ａ１号およびＰＣＴ出願公開ＷＯ０２／１２３４８Ａ２に記述されている。「全グルカン粒子」と呼ばれている抽出酵母細胞壁粒子の形態は、担体として提案されたが、粒子からの有効成分の単純拡散による放出または全グルカン粒子に化学的に架橋した薬剤の粒子マトリックスの生分解による放出に限定されていた。米国特許第５０３２４０１号および第５６０７６７７号を参照のこと。
【０００６】
抽出酵母細胞壁粒子は、主としてそれらのβ−グルカン含量のためマクロファージおよびリンパ組織の細胞のような食細胞の標的にされる。粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）は、上皮および身体の粘膜の下にある固有層におけるすべてのリンパ細胞を含む。粘膜関連リンパ組織の主な部位は、腸関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）および気管支関連リンパ組織（ＢＡＬＴ）である。
【０００７】
ＧＩ免疫系の他の重要な成分は、Ｍすなわちmicrofold細胞である。Ｍ細胞は、種々のタンパク質およびペプチド抗原をエンドサイトーシスにより取り込むリンパ濾胞上の腸上皮における特異的細胞型である。Ｍ細胞は、これらのタンパク質を消化する代わりに、それらを下にある組織に輸送し、そこで、それらは局所樹状細胞およびマクロファージにより取り込まれる。
【０００８】
Ｍ細胞は、エンドサイトーシスまたは食作用により腸管内腔から分子および粒子を取り込む。次いで、この物質は、小胞の細胞の内部を経て基底細胞膜に輸送され、そこで細胞外間隙に放出される。この過程は、トランスサイトーシスとして知られている。それらの基底面において、Ｍ細胞の細胞膜は、Ｍ細胞から放出された輸送物質を取り込み、抗原提示のためにそれを処理する下にあるリンパ球および抗原提示細胞の周りに広範に折りたたまれている。
【０００９】
パイエル板のＭ細胞による酵母粒子（直径３．４±０．８μｍ）のトランスサイトーシスの所要時間は１時間未満であることが研究により示された（Beier R.およびGebert A.，パイエル板のドームにおける粒子の取り込みの速度論（Kinetics of particle uptake in the domes of Peyer’s patches）、Am J Physiol.１９９８年７月、２７５（１Ｐｔ１）：Ｇ１３０〜７頁）。上皮内マクロファージによる有意な食作用を受けることなく、酵母粒子は２．５〜４時間以内に基底膜まで移動して横切り、速やかに食作用を受けて、パイエル板ドーム外に輸送される。鼻咽頭リンパ組織（扁桃およびアデノイド）に認められるＭ細胞は、呼吸器感染を引き起こすウイルスのサンプリングに含まれることが示された。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｍ細胞モデルの試験で、蛍光標識マイクロスフェア（Fluospheres、０．２μｍ）およびキトサンマイクロパーティクル（０．２μｍ）の取り込みが示された（van der Lubben I.M.ら、ヒト腸Ｍ細胞モデルにおける粘膜ワクチン送達のためのキトサンマイクロ粒子輸送（Transport of chitosan microparticles for mucosal vaccine delivery in a human intestinal M-cell model）、J Drug Target, ２００２年９月、１０（６）：４４９〜５６頁）。レクチンであるハリエニシダ（Ulex europaeus）凝集素１（ＵＥＡ１、α−Ｌ−フコース残基に対して特異的）を用いてポリスチレンマイクロスフェア（０．５μｍ）または重合リポソーム（０．２μｍ）をＭ細胞に対する標的とした（Clark M.A.ら、腸Ｍ細胞に対する重合リポソームワクチン担体のターゲティング（Targeting polymerised liposome vaccine carriers to intestinal M cells）、Vaccine, ２００１年１０月１２日、２０（１〜２）：２０８〜１７頁）。マウスにおけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験で、ポリ−Ｄ，Ｌ−乳酸（ＰＤＬＬＡ）マイクロスフェアまたはゼラチンマイクロスフェア（ＧＭ）をマクロファージおよびＭ細胞により効率よく取り込ませることができることが報告された（Nakase H.ら、粘膜免疫調節細胞を標的とする生分解性マイクロスフェア：炎症性腸疾患の治療に対する新たなアプローチ（Biodegradable microspheres targeting mucosal immune-regulating cells:new approach for treatment of inflammatory bowel disease）、J.Gastroenterol, ２００３年３月、３８補足１５：５９〜６２頁）。
【００１０】
しかし、ポリ（ＤＬ−ラクチド−ｃｏ−グリコリド）マイクロパーティクルおよびリポソームを含む合成微粒子送達賦形剤の取り込みは、非常に変動し、粒子およびＭ細胞の物理的特性によって決定されると報告された（Alpha-Beta Technology.ら、薬剤およびワクチンの送達のためのＭ細胞の利用（Exploiting M cells for drug and vaccine delivery）、Adv Drug Deliv Rev., ２００１年８月２３日、５０（１〜２）：８１〜１０６頁）。同じ試験で、送達は、Ｍ細胞表面に選択的に結合する適切なレシチン、微生物アドヘシンおよび免疫グロブリンを含む試薬で粒子またはリポソームを被覆することにより増大させることができることが報告された。Florence A.T., マイクロおよびナノ微粒子の経口吸収：例外でも異常でもない（The oral absorption of micro-and nanoparticulates:neither exceptional nor unsusual）、Pharm Res., １９９７年３月、１４（３）：２５９〜６６頁も参照のこと。
【００１１】
病原体パターン認識受容体（ＰＲＲｓ）は、微生物表面に存在する共通の構造および分子モチフを認識し、先天性免疫反応の誘導に寄与する。マンノース受容体およびβ−グルカン受容体は、真菌病原体の認識に一部関与する。マクロファージのサブセット上に発現する炭水化物結合受容体であるマンノース受容体（ＭＲ）は、そのようなＰＲＲの１つであるとみなされる。マクロファージは、これらの糖を示す分子に結合し、内部へ移行することができるマンノースおよびマンノース−６−リン酸の受容体を有する。分子は、プレリソソームエンドソーム内へのエンドサイトーシスにより内部へ移行される。このインターナリゼーションは、マンノース−６−リン酸で修飾し、修飾３’末端へのジスルフィド架橋によりオリゴデオキシヌクレオチドンに結合させたウシ血清アルブミンのマクロファージ内への侵入を増大させるために用いられた。Bonfils E.ら、Nucl.Acids Res., １９９２  ２０、４６２１〜４６２９頁を参照のこと。E.Bonfils、C.Mendes、A.C.Roche、M.MonsignyおよびP.Midoux、Bioconj.Chem., ３、２７７〜２８４頁（１９９２）を参照のこと。マクロファージはＣＲ３（Ross G.D.、J.A.Cain、B.L.Myones、S.L.NewmanおよびP.J.Lachmann、１９８７、β−グルカンに対する膜補体受容体タイプ３（ＣＲ３）の選択性（Specificity of membrane complement receptor type three(CR3)for beta-glucans、Complement Inflamm., ４：６１頁）、デクチン−１（Brown G.D.およびS.Gordon、２００１、免疫認識。β−グルカンに対する新規の受容体（Immune recognition. A new receptor for beta-glucans）、Nature ４１３：３６頁）およびラクトシルセラミド（Zimmerman JW、Lindermuth J、Fish PA、Palace GP、Stevenson TT、DeMong DE、β−（１−３）−グルカン免疫調整剤、ＰＧＧ−グルカンおよびヒト白血病のラクトシルセラミド間の新規の炭水化物−スフィンゴ糖脂質相互作用（A novel carbohydrate-glycosphinglipid interaction between a beta-(1-3)-glucan immunomodulator, PGG-glucan and lactosylceramide of human leukocytes）、J Biol Chem、１９９８年８月２１日：２７３（３４）：２２０１４〜２０）を含むβ−グルカン受容体も発現する。β−グルカン受容体ＣＲ３は主として単球、好中球およびＮＫ細胞上に発現するが、デクチン−１は主としてマクロファージの細胞の表面上に発現する。ラクトシルセラミドは、Ｍ細胞に高レベルで認められる。小グリア細胞もβ−グルカン受容体を発現することができる（Muller C.D.ら、小グリア細胞系による機能的β−グルカン受容体発現（Functional beta-glucan receptor expression by a microglial cell line）、Res Immunol、１９９４年５月；１４５（４）：２６７〜７５頁）。
【００１２】
マンノースおよびβ−グルカン受容体への結合の食作用に対する相加効果の証拠が存在する。Giaimisらは、マウスマクロファージ様細胞系ならびにマウス腹膜常在マクロファージによる非オプソニン化熱死滅酵母（サッカロミセス セレビシエ（S. cerevisiae））の食作用がマンノースおよびβ−グルカン受容体によって媒介されることを示唆する所見を報告した。非オプソニン化熱死滅酵母の最大限の食作用を達成するために、マンノースおよびβ−グルカン受容体の共発現が必要である（Giaimis J.ら、マンノースおよびβ−グルカン受容体がマウスマクロファージによる非オプソニン化熱死滅サッカロミセス セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）の食作用に関与している（Both mannose and beta-glucan receptors are involved in phagocytosis of unopsonized, heat-killed Saccharomyces cerevisiae by murine macrophages）、J Leukoc Biol.１９９３年１２月；５４（６）：５６４〜７１頁）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の概要）
好ましい実施形態において、本発明は、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁およびペイロード捕捉分子を含む微粒子送達システムを提供する。微粒子送達システムは、場合によって、しかし、一般的にペイロード分子も含み、ペイロード分子とペイロード捕捉分子が同じ溶媒系に可溶性である。好ましい実施形態において、溶媒系は水を含む。他の好ましい実施形態において、溶媒系は本質的に水からなる。本発明の微粒子送達システムは、細胞へのペイロード分子のｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達に有用である。
【００１４】
特に好ましい実施形態において、抽出酵母細胞壁は、９０重量％未満のβ−グルカンを含む。特定の好ましい実施形態において、抽出酵母細胞壁は、５０重量％以上のキチンを含む。他の好ましい実施形態において、抽出酵母細胞壁は、３０重量％以上のマンナンをさらに含む。特定の実施形態において、抽出酵母細胞壁は、１重量％以上のタンパク質を含む。
【００１５】
好ましい実施形態において、ペイロード分子は、ポリヌクレオチド、ペプチド、タンパク質、小有機活性物質、小無機活性物質およびそれらの混合物からなる群から選択される。特定の好ましい実施形態において、ペイロード分子は、オリゴヌクレオチド、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、組換えＤＮＡ構築物、発現ベクターおよびそれらの混合物からなる群から選択されるポリヌクレオチドである。他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質などのペイドード分子のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達に有用である。ペプチドは、ホルモン、神経伝達物質または神経修飾物質などのシグナル伝達分子であってよく、受容体、酵素または核酸結合タンパク質などのより大きい分子の活性フラグメントであってよい。タンパク質は、酵素、構造タンパク質、シグナル伝達タンパク質または転写因子のような核酸結合タンパク質であってよい。
【００１６】
他の好ましい実施形態において、ペイドード分子は、治療薬または診断薬のような小有機活性物質である。特に好ましい実施形態において、小有機活性物質は、配列特異的ＤＮＡ結合オリゴマー、より好ましくは、両方とも参照により本明細書に組み込まれている米国特許第６５０６９０６号およびDervan P., 小分子によるＤＮＡの分子的認識（Molecular Recognition of DNA by Small Molecules）、Bioorganic & Medicinal Chemistry（２００１年）９：２２１５〜２２３５頁に開示されているような２本鎖ＤＮＡの小溝に結合している複素環式ポリアミドのオリゴマーである。好ましい実施形態において、オリゴマーは、Ｎ−メチルイミダゾールカルボキサミド、Ｎ−メチルピロールカルボキサミド、βアラニンおよびジメチルアミノプロピルアミドからなる群から選択されるモノマーサブユニットを有する。
【００１７】
他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、無機活性物質、例えば、水酸化アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム等の胃腸治療薬を含む。
【００１８】
ペイロード捕捉分子の選択は、微粒子送達システムに特異的な特性を与え得る。一般的に、好ましいペイロード捕捉分子は、生体適合性であり、製薬上許容できるものである。上記のように、ペイロード分子とペイロード捕捉分子が同じ溶媒系に可溶性である。適切なペイロード捕捉分子は、天然および合成ポリマーを含む。特定の実施形態において、アガロースまたはポリアクリルアミドのようなペイロード捕捉分子の物理的特性は、有用な利点を備えている。
【００１９】
適切なポリマーは、多糖を含む。好ましい実施形態において、多糖は、アガロース、アルギン酸塩、キサンタン、デキストラン、キトサン、ガラクトマンナンガム、それらの誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択される。特定の好ましい実施形態において、多糖は、生理的ｐＨで陽イオンまたは陰イオン特性を生ずるように誘導体化した。
【００２０】
他の実施形態において、ペイロード捕捉分子は、陽イオンポリマー、陰イオンポリマー、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤およびそれらの混合物のような生理的ｐＨにおいて荷電した分子である。好ましい陽イオンポリマーは、キトサン、ポリ−Ｌ−リシン、および市販の線状ポリエチレンイミン陽イオンポリマートランスフェクション試薬であるＪｅｔＰＥＩ（Qbiogene,Inc., カリフォルニア州）のような実質的に線状のポリエチレンイミンなどのポリエチレンイミン（ＰＥＩｓ）などである。他の陽イオンポリマートランスフェクション試薬も適しており、好ましくは、独占的な市販の水溶性陽イオンポリマートランスフェクション試薬であるCytoPure（商標）（Qbiogene,Inc., カリフォルニア州）がある。他の好ましい実施形態において、適切な陰イオンポリマーは、誘導体化アルギン酸塩、デキストランおよびキサンタンを含むアルギン酸塩、デキストランおよびキサンタンなどである。さらなる好ましい実施形態において、ペイロード捕捉分子は、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムのような陽イオン界面活性剤である。１つの好ましい実施形態において、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムのような陽イオン界面活性剤とポリエチレンイミンのような陽イオンポリマーとの混合物を用いる。他の好ましい実施形態において、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウムのような陽イオン界面活性剤とキトサンまたはＰＥＩのような陽イオンポリマーとの混合物を用いることができる。
【００２１】
単一の仮説に当てはまらないが、好ましいペイロード捕捉分子は、酵母細胞壁粒子によるペイロードの保持を促進することに加えて、界面活性剤として作用することにより、エンドソームを浸透圧により膨潤させることを促進することにより、あるいは他の効果により、食細胞のエンドソームからのペイロード分子の放出を促進する機能を果たすと考えられている。
【００２２】
他の好ましい実施形態において、本発明は、微粒子送達システムを使用する方法を提供する。特定の好ましい実施形態において、本発明は、内腔を画定する、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁を供給する段階と、抽出酵母細胞壁をペイロード分子と接触させ、ペイロード分子が内腔に少なくとも部分的に封じ込められた状態になる段階と、抽出酵母細胞壁をペイロード捕捉分子と接触させ、ペイロード捕捉分子が抽出酵母細胞壁内のペイロード分子を少なくとも部分的に閉じ込めて微粒子送達システムを形成する段階と、細胞を微粒子送達システムと接触させる段階とを含む、ペイロード分子を細胞に送達する方法を提供する。好ましくは、該方法は、細胞により微粒子送達システムを内部へ移行する段階をさらに含む。
【００２３】
他の好ましい実施形態において、本発明は、内腔を画定する、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁を供給する段階と、抽出酵母細胞壁をペイロード分子と接触させ、ペイロード分子が抽出酵母細胞壁と結合した状態になる段階と、抽出酵母細胞壁をペイロード捕捉分子と接触させ、ペイロード捕捉分子がペイロード分子と抽出酵母細胞壁との結合を安定化して微粒子送達システムを形成する段階とを含む、微粒子送達システムを調製する方法を提供する。好ましい実施形態において、該方法は、微粒子送達システムを洗浄し、乾燥する段階も含む。
【００２４】
他の好ましい実施形態において、本発明は、個体の食細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、ペイロード捕捉分子と、個体の細胞内で制御可能に発現させることができるペプチドをコードする翻訳領域に作動的に連結された制御エレメントを含むポリヌクレオチドであるペイロード分子とを含む微粒子送達システムと接触させる段階を含む、個体を抗原に曝露する方法を提供する。好ましくは、コードされるペプチドは、抗原性ペプチドである。さらなる好ましい実施形態において、本発明は、個体の食細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、ペイロード捕捉分子と、抗原性分子であるペイロード分子とを含む微粒子送達システムと接触させる段階を含む、個体を抗原に曝露する方法を提供する。好ましい抗原性分子は、トキソイドである。
【００２５】
好ましい実施形態において、接触細胞は、マクロファージであるが、パイエル板のＭ細胞、単球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞、肺胞食細胞、腹腔マクロファージ、乳汁マクロファージ、小グリア細胞、好酸球、顆粒球、メサンギウム食細胞、滑膜Ａ細胞および他の食細胞などの、酵母粒子に対して食作用を示すことができる細胞も含んでいてよい。好ましい実施形態において、微粒子送達システムを経口投与し、腸におけるパイエル板のＭ細胞により吸収させる。
【００２６】
好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、タンパク質をコードする翻訳領域に作動的に連結された制御エレメントを含む組換えＤＮＡ構築物、例えば、発現ベクターである。タンパク質は、構造タンパク質、酵素活性を有するタンパク質、膜タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質またはシグナル伝達タンパク質であってよい。特定の好ましい実施形態において、タンパク質は、抗原性タンパク質である。
【００２７】
特定の好ましい実施形態において、方法は、細胞がタンパク質を発現する段階をさらに含む。発現タンパク質は、細胞により細胞内に保持させ、原形質膜のような膜構造に取り込ませ、あるいは細胞により分泌させることができる。
【００２８】
他の実施形態において、複数の種類のポリヌクレオチドが微粒子送達システム内に封じ込められている。好ましい実施形態において、ポリヌクレオチドは、制御下で複数の遺伝子産物を発現する能力を備えている。特定の実施形態において、少なくとも１つの発現可能な遺伝子産物は、膜タンパク質、好ましくは膜受容体、最も好ましくはシグナル伝達分子に対する膜結合受容体である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの発現可能な遺伝子産物は、可溶性タンパク質、好ましくは分泌タンパク質、最も好ましくはシグナル伝達タンパク質またはペプチドである。
【００２９】
他の実施形態において、本発明は、内腔を画定する、β−グルカンを含む実質的に球形の抽出酵母細胞壁を供給する段階と、抽出酵母細胞壁を薬剤と接触させ、薬剤を内腔内に少なくとも部分的に封じ込める段階と、抽出酵母細胞壁を捕捉分子と接触させ、捕捉分子を内腔内に少なくとも部分的に封じ込めて微粒子薬物送達システムを形成させる段階と、マクロファージ細胞を微粒子薬物送達システムと接触させる段階とを含むマクロファージ細胞に薬剤を送達する方法を提供する。好ましくは、該方法は、マクロファージにより微粒子薬物送達システムを内部へ移行する段階も含む。特に好ましい実施形態において、マクロファージが、感染、炎症反応、低酸素または過形成の部位のようなマクロファージ誘引部位に微粒子薬物送達システムを送達する。特定の好ましい実施形態において、マクロファージが腫瘍に微粒子薬物送達システムを送達する。特に好ましい実施形態において、該方法は、微粒子薬物送達システムから薬剤を放出させる段階を含み、より好ましくは薬剤を細胞外間隙に放出させる段階をさらに含む。特定の実施形態において、薬剤を放出させる段階は、組換えタンパク質を発現させ、タンパク質を細胞外間隙に分泌させる段階を含む。
【００３０】
本発明は、病原体に対して個体を免疫化する方法を提供する。該方法は、前記個体の細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁、ペイロード捕捉分子および核酸組成物を含む微粒子送達システムと接触させ、それにより、細胞に、抗原としての前記病原体上で示されるエピトープと同じまたは実質的に類似した少なくともエピトープを含むペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を投与する段階を含み、前記ヌクレオチド配列は、調節配列に機能するように連結されており、核酸分子は、個体の細胞において発現することができる。
【００３１】
他の好ましい実施形態において、本発明は、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁、ペイロード捕捉分子およびトキソイドを含む微粒子送達システムを供給し、食細胞を微粒子送達システムと接触させ、微粒子送達システムの食作用を誘導する段階を含むトキソイドに対する免疫を発生させる方法を提供する。食細胞は、マクロファージ、パイエル板のＭ細胞、単球、好中球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞、クッパー細胞、肺胞食細胞、腹腔マクロファージ、乳汁マクロファージ、小グリア細胞、好酸球、顆粒球、メサンギウム食細胞および滑膜Ａ細胞のうちの１つまたは複数のものであってよい。
【００３２】
本発明は、過増殖性疾患または自己免疫疾患に対して個体を免疫化する方法を提供する。該方法は、前記個体の細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、核酸組成物を含むペイロード捕捉分子とを含む微粒子送達システムと接触させ、それにより、過増殖性疾患関連タンパク質または自己免疫疾患関連タンパク質上にそれぞれ示されるエピトープと同じまたは実質的に類似したエピトープを少なくとも含むペプチドをコードし、調節配列に機能するように連結されたヌクレオチド配列を含み、個体の細胞中で発現させることができる核酸分子を個体の細胞に投与する段階を含む。
【００３３】
本発明はまた、個体の細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、核酸組成物を含むペイロード捕捉分子とを含む微粒子送達システムと接触させ、それにより、欠失、欠損したまたは阻害された遺伝子の活性を回復させるヌクレオチド配列を含む、または個体における治療効果をもたらすタンパク質をコードし、調節配列に機能するように連結されたヌクレオチド配列を含み、個体の細胞中で発現させることができる核酸分子を個体の細胞に投与する段階を含む、自己免疫疾患に罹患している個体を治療する方法を提供する。
【００３４】
さらなる実施形態において、本発明は、個体の細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、ペイロード捕捉分子と、過増殖性疾患関連タンパク質上で示されるエピトープと同じまたは実質的に類似しているエピトープを含むペプチドをコードする翻訳領域に作動的に連結された制御エレメントを含むポリヌクレオチドであるペイロード分子とを含む微粒子送達システムと接触させる段階を含み、コードされたペプチドが個体の細胞において発現することができる、過増殖性疾患に対して個体を免疫化する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、個体の細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、ペイロード捕捉分子と、ポリヌクレオチドであるペイロード分子とを含む微粒子送達システムと接触させ、それにより、欠失、欠損したまたは阻害された遺伝子の活性を回復させるヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを細胞に投与する段階を含む、遺伝病に罹患している個体を治療する方法を提供する。好ましくは、ポリヌクレオチドが、個体における治療効果をもたらし、前記細胞中で発現することができるタンパク質をコードする翻訳領域に機能するように連結されている調節配列を含む。
【００３５】
本発明はまた、個体の細胞を、β−グルカンを含む抽出酵母細胞壁と、核酸組成物を含むペイロード捕捉分子とを含む微粒子送達システムと接触させ、それにより、欠失、欠損したまたは阻害された遺伝子の活性を回復させる、または個体における治療効果をもたらすタンパク質をコードし、調節配列に機能するように連結されている核酸配列を含み、前記細胞中で発現することができる核酸分子を該細胞に投与する段階を含む、自己免疫疾患に罹患している個体を治療する方法に関する。
【発明の効果】
【００３６】
したがって、本発明は、病原体または異常な疾患関連細胞に対して個体を予防的および／または治療的に免疫化する組成物および方法を提供する。遺伝物質は、病原体または標的とする細胞上に認められる免疫原性タンパク質と少なくとも１つのエピトープを共有するペプチドまたはタンパク質をコードする。遺伝物質は、個体の細胞により発現させられ、免疫反応が誘発される免疫原性標的としての役割を果たす。結果として発生する免疫反応は、広範囲であり、体液性免疫反応に加えて、両群の細胞性免疫反応が誘発される。本発明の方法は、予防的および治療的免疫を付与するのに有用である。したがって、免疫化の方法は、病原体チャレンジまたは特定の細胞の発生もしくは増殖から個体を保護する方法、ならびに病原体感染、過増殖性疾患または自己免疫疾患に罹患している個体を治療する方法を含む。したがって、本発明は、標的タンパク質、すなわち、病原体または個体自身の「異常な」細胞に特異的に結合するタンパク質に対する広い免疫反応を誘発させるのに有用である。
【００３７】
本発明はまた、過増殖性細胞に特異的に結合する標的タンパク質に対する免疫反応を誘発させることにより、癌のような過増殖性疾患および障害と闘うのに有用である。本発明はさらに、自己免疫状態に関与する細胞に対する免疫反応を誘発させることにより、自己免疫疾患および障害と闘うのに有用である。
【００３８】
本発明はまた、核酸組成物、タンパク質組成物、小有機分子およびそれらの混合物からなる群から選択されるペイロード分子を含む容器、ならびに酵母細胞壁粒子および捕捉分子を含む容器を含む薬剤キットを提供する。場合によって、そのようなキットに薬剤組成物に関して上述した種類の賦形剤、担体、保存剤および媒体が含まれる。薬剤キットという用語は、本発明の方法に用いる複数の接種物を含むことも意図する。そのようなキットは、異なる接種物および輸送部分を含む独立した容器を含む。本発明による薬剤キットは、治療に用いる一組の接種物ならびに免疫化法および／または治療法を含むことも意図する。
【００３９】
本発明の組成物および方法は、医学および獣医学の分野に有用である。したがって、本発明は、哺乳類、鳥類および魚類の遺伝的免疫化および治療的処置に関する。本発明の方法は、ヒト、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌおよびネコ種の遺伝的免疫化および治療的処置に特に有用である。
【００４０】
微粒子薬物送達システムおよび方法の前記および他の特徴および利点は、同様な参照特性が異なる画像をとおして同じ部分に当てはまる添付図面に例示されているようなシステムおよび方法の好ましい実施形態の以下のより詳細な記述から明らかであろう。
【００４１】
本発明の前記および他の目的、特徴および利点は、同様な参照特性が異なる画像をとおして同じ部分に当てはまる添付図面に例示されているように、本発明の好ましい実施形態の以下のより詳細な記述から明らかであろう。図面は必然的に縮尺に従っておらず、その代わりに本発明の原理を例示することに重点をおいている。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４２】
（発明の詳細な説明）
好ましい実施形態において、本発明は、抽出酵母細胞壁粒子および少なくとも１つのペイロード捕捉分子を含む微粒子送達システムを提供する。好ましくは、酵母細胞壁粒子は、２〜４μｍの酵母細胞壁ゴーストである。
【００４３】
ペイロード捕捉分子
ペイロード捕捉分子は、好ましくは製薬上許容できる賦形剤である。ペイロードおよび捕捉分子は、両方とも溶媒系に溶ける。溶媒系は、酵母細胞粒子の炭水化物マトリックスを通して吸収され、ペイロードおよび捕捉ポリマーの吸収を可能にしなければならない。ペイロードおよび捕捉分子は、好ましくは水溶性である。好ましい実施形態において、捕捉分子は、生分解性である。
【００４４】
所与のペイロードとの捕捉反応の作用機序は、ペイロード捕捉分子の選択を決定づける。静電的相互作用の場合、ペイロードの反対の電荷の荷電ペイドード捕捉分子が必要である。物理的捕捉の場合、ペイロード捕捉分子は、ペイドードの拡散を減少させるマトリックスの形成に適切に関与する。他の実施形態において、ペイロード捕捉分子は、ペイロードの保持に寄与する疎水的結合特性に寄与する。さらなる実施形態において、ペイロード捕捉分子は、ペイロードに選択的に結合し、ペイロードの保持に寄与する親和性相互作用をもたらす。
【００４５】
一般的に、高分子電解質は、適切なペイロード捕捉分子であり得る。いくつかの適切な高分子電解質が米国特許第６１３３２２９号に開示されている。高分子電解質は、陽イオンまたは陰イオン高分子電解質であってよい。両性高分子電解質を用いることもできる。陽イオン高分子電解質は、好ましくは分子鎖に沿って分布する陽性基を有するポリマーである。特定の実施形態において第四級アンモニウム誘導部分を含んでいてよい陽性基は、分子鎖からのペンダント側基に配置されていてよく、あるいは分子鎖に組み込まれていてよい。陽イオン高分子電解質の例としては、ビニルピロリドンと第四級メチルメタクリレートのコポリマー、例えば、ＩＳＰから入手されるGAFQUAT（登録商標）シリーズ（７５５Ｎ、７３４、ＨＳ−１００）、置換ポリアクリルアミド、ポリエチレンイミン、ポリプロピレンイミンおよび置換誘導体、ポリアミンホモポリマー（GOLCHEM（登録商標）ＣＬ１１８）、ポリアミンコポリマー（例えば、エピクロロヒドリンとモノまたはジメチルアミンの縮合体）、ポリジアリルジエチルアンモニウムクロリド（ポリＤＡＤＭＡＣ）、置換デキストラン、修飾糖ガム（ヒドロキシプロピルトリモニウムクロリドで置換）、置換タンパク質（例えば、ダイズタンパク質および加水分解コラーゲン上で置換された第四級基）、ポリアミノ酸（例えば、ポリリシン）、低分子量ポリアミノ化合物（例えば、スペルミンおよびスペルミジン）などがある。天然または人工ポリマーを用いることができる。１５０〜５，０００，０００、好ましくは５０００〜５００，０００、より好ましくは５０００〜１００，０００の分子量を有する陽イオン高分子電解質を用いることができる。０．０１〜１０％、より好ましくは０．１〜２重量／体積％、特に０．０５〜５％の量が好ましい。
【００４６】
陰イオン高分子電解質は、好ましくは分子鎖に沿って分布した陰性基を有するポリマーである。カルボン酸、スルホン酸、硫酸または他の負に荷電したイオン化基を含んでいてよい陰性基は、分子鎖からのペンダント基上に配置されているか、またはポリマー主鎖に直接結合していてよい。天然または人工ポリマーを用いることができる。
【００４７】
陰イオン高分子電解質の例としては、メチルビニルエーテルと無水マレイン酸とのコポリマー、メチルビニルエーテルとマレイン酸とのコポリマー（それぞれGantrez ＡＮシリーズおよびＳシリーズ、International Specialty Products, Wayne, ニュージャージー州）、アルギン酸および塩、カルボキシメチルセルロースおよび塩、置換ポリアクリルアミド（例えば、カルボン酸基で置換）、ポリアクリル酸および塩、ポリスチレンスルホン酸および塩、デキストラン硫酸、置換サッカライド、例えば、スクロースオクトスルフェート、ヘパリンなどがある。１５０〜５，０００，０００、好ましくは５０００〜５００，０００、より好ましくは５０００〜１００，０００の分子量を有する陰イオン高分子電解質を用いることができる。０．０１％〜１０％、特に０．０５〜５％、特に０．１〜２重量／体積％の量が好ましい。
【００４８】
多糖などの生物学的ポリマーは、好ましい捕捉ポリマーである。好ましくは、ポリマーを１００，０００ダルトン未満の平均分子量になるまで処理する。ポリマーを陽イオンまたは陰イオン特性を備えるように誘導体化することが好ましい。適切な多糖としては、キトサン（脱アセチル化キチン）、アルギン酸塩、２−（ジエチルアミノ）エチルエーテルデキストラン（ＤＥＡＥデキストラン）およびデキストラン硫酸などのデキストラン類、キサンタン、イナゴマメガムおよびグアールガムなどがある。
【００４９】
２つの一般的なクラスの陽イオン分子、すなわち、陽イオンポリマーおよび陽イオン脂質は、ポリヌクレオチドのような負に荷電したペイロードの捕捉分子として用いるのに適している。
【００５０】
タンパク質［ヒストン（Fritz J.D.ら、（１９９６年）Hum.Gene Ther. ７、１３９５〜１４０４頁）および高移動度群（ＨＭＧ）タンパク質（Mistry A.R.（１９９７年）Bio Techniques ２２、７１８〜７２９頁）など］およびポリペプチド［ポリリシン（Wu G.Y.およびWu C.H.（１９８７年）J.Biol.Chem. ２６２、４４２９〜４４３２頁、Wagner E.ら、（１９９１年）Bioconjugate Chem.２、２２６〜２３１頁）、短合成ペプチド（Gottschalk S.ら、（１９９６年）Gene Ther. ３、４４８〜４５７頁、Wadhwa M.S.ら、（１９９７年）Bioconjugate Chem. ８、８１〜８８頁）およびらせん状両親媒性ペプチド（Legendre J.Y.ら、（１９９７年）Bioconjugate Chem. ８、５７〜６３頁、Wyman T.B.ら、（１９９７年）Biochemistry ３６、３００８〜３０１７頁）など］から合成ポリマー［ポリエチレンイミン（Boussif O.ら、（１９９６年）Gene Ther. ３、１０７４〜１０８０頁）、陽イオンデンドリマー（Tang M.X.ら、（１９９６年）Bioconjugate Chem. ７、７０３〜７１４頁、Haensler J.ら、（１９９３年）Bioconjugate Chem. ４、３７２〜３７９頁）およびグルカラミドポリマー（Goldman C.K.ら、（１９９７年）Nat.Biotech.１５、４６２〜４６６頁）など］までの種々の陽イオンポリマーがｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションを媒介することが示された。他の適切な陽イオンポリマーとしては、Ｎ置換グリシンオリゴマー（ペプトイド）（Murphy J.E.ら、遺伝子送達用の効率のよい陽イオンペプトイド試薬の発見へのコンビナトリアルアプローチ（A combinatorial approach to the discovery of efficient cationic peptoid reagents for gene delivery）、Proc Natl Acad Sci.USA、１９９８年、９５（４）１５１７〜１５２２頁）、ポリ（２−メチルアクリル酸２−［（２−ジメチルアミノ）−エチル］−メチルアミノ）−エチルエステル）（ｐＤＡＭＡと短縮）およびポリ（２−ジメチルアミノエチル）−メタクリレート（ｐＤＭＡＥＭＡ）（Funhoff A.M.ら、２００４年、Biomacromolecules、５、３２〜３９頁）などがある。
【００５１】
陽イオン脂質も当技術分野でトランスフェクションに適していることが知られている。Felgner P.Llら、リポフェクション：非常に効率の高い脂質媒介ＤＮＡトランスフェクション法（Lipofection:a highly efficient、lipid-mediated DNA-transfection procedure）、Proc Natl Acad Sci USA、１９８７年、８４（２１）：７４１３〜７頁。適切な陽イオン脂質としては、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、［Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２，３−ジ（オレオイルオキシ）−１，４−ブタンジアンモニウムヨーダイド］（Promega Madison、ウィスコンシン州、米国）、ジオクタデシルアミドグリシルスペルミン（Promega Madison、ウィスコンシン州、米国）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレオイルオキシ）］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムプロパンメチルスルフェート（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウムクロリド、１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−ジメチルヒドロキシエチルアンモニウムブロミド（ＤＭＲＩＥ）、
ジミリストレオイルホスホノメチルトリメチルアンモニウム（ＤＭＰＴＡ）（Flochら、１９９７年、造血細胞系およびＣＤ３４＋細胞におけるＤＮＡトランスフェクション用非ウイルスベクターとしての陽イオンホスホノ脂質（Cationic phosphonolipid as non-viral vectors for DNA transfection in hematopoietic cell lines and CD34+ cells）、Blood Cells, Molec & Diseases ２３：６９〜８７を参照）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−（７−ニトロ−２−１，３−ベンゾオキサジアゾール−４−イル）、アンモニウム塩（Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, アラバマ州、米国）、１，２−ジオレオイル−３−トリエチルアンモニウムプロパンクロリド（Avanti Polar Lipids, Inc., Alabaster, アラバマ州、米国）、１，２−ジオレオイル−ｎｓ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（Avanti Polar Lipids、Inc., Alabaster, アラバマ州、米国）および１，３−ジオレオイルオキシ−２−（６−カルボキシスペルミル）プロピルアミド（ＤＯＳＰＥＲ）などがある。
【００５２】
陽イオン捕捉分子として適切なポリアミンは、米国特許第６３７９９６５号および第６３７２４９９号に記述されている。
【００５３】
ペイロード分子
本発明の微粒子送達システムは、オリゴヌクレオチド、アンチセンス構築物、ｓｉＲＮＡ、酵素ＲＮＡおよび発現ベクターを含む組換えＤＮＡ構築物を含むが、これらに限定されないペイロード分子のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達に有用である。
【００５４】
他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、アミノ酸、ペプチドおよびタンパク質のようなペイロード分子のｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ送達に有用である。「タンパク質」とは、鎖長が高レベルの三次および／または四次構造を生ずるのに十分であるアミノ酸の配列を意味する。これは、そのような構造を有さない「ペプチド」または他の小分子量薬物と区別するためである。一般的に、本明細書におけるタンパク質は、少なくとも約１５〜２０ｋＤ、好ましくは少なくとも約２０ｋＤの分子量を有する。
【００５５】
本明細書における定義に含まれるタンパク質は、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモンおよびＧＨ超遺伝子ファミリーの他のメンバーを含む成長ホルモン、成長ホルモン放出因子、副甲状腺ホルモン、甲状腺刺激ホルモン、リポタンパク質、α−１−アンチトリプシン、インスリンＡ鎖、インスリンＢ鎖、プロインスリン、卵胞刺激ホルモン、カルシトニン、黄体化ホルモン、グルカゴン、第ＶＩＩＩＣ因子、第ＩＸ組織因子およびヴォンヴィレブランド因子などの凝固因子、プロテインＣなどの抗凝固因子、心房性ナトリウム利尿因子、肺界面活性物質、ウロキナーゼまたは組織型プラスミノーゲン活性化因子（ｔ−ＰＡ）などのプラスミノーゲン活性化因子、ボンベジン、トロンビン、α腫瘍壊死因子、β腫瘍壊死因子、エンケファリナーゼ、ＲＡＮＴＥＳ（regulated on activation normally T-cell expressed and secreted）、ヒトマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１−α）、ヒト血清アルブミンなどの血清アルブミン、ミューラー管阻害物質、リラキシンＡ鎖、リラキシンＢ鎖、プロレラキシン、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、ＤＮアーゼ、インヒビン、アクチビン、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ホルモンまたは成長因子の受容体、インテグリン、プロテインＡまたはＤ、リウマトイド因子、骨由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３、−４、−５もしくは−６（ＮＴ−３、ＮＴ−４、ＮＴ−５もしくはＮＴ−６）などの神経栄養因子またはＮＧＦ−βなどの神経成長因子、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ａＦＧＦおよびｂＦＧＦなどの線維芽細胞成長因子、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−β４またはＴＧＦ−β５を含むＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）、インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ（ＩＧＦ−ＩおよびＩＧＦ−ＩＩ）、デス（１−３）ＩＧＦ−Ｉ（脳ＩＧＦ−Ｄ）、インスリン様成長因子結合タンパク質、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０などのＣＤタンパク質、骨誘導因子、イムノトキシン、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、Ｔ細胞受容体、表面膜タンパク質、崩壊促進因子（ＤＡＦ）、例えば、ＡＩＤＳエンベロープのようなウイルス抗原、輸送タンパク質、ホーミング受容体、アドレッシン、調節タンパク質、イムノアドヘシン、抗体およびその生物学的に活性なフラグメントまたは変異体などの哺乳類タンパク質を含む。
【００５６】
ＧＨ超遺伝子ファミリーのメンバーは、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、エリトロポイエチン、トロンボポイエチン、インターロイキン−２、インターロイキン−３、インターロイキン−４、インターロイキン−５、インターロイキン−６、インターロイキン−７、インターロイキン−９、インターロイキン−１０、インターロイキン−１１、インターロイキン−１２（ｐ３５サブユニット）、インターロイキン−１３、インターロイキン−１５、オンコスタチンＭ、繊毛様神経栄養因子、白血病抑制因子、αインターフェロン、βインターフェロン、γインターフェロン、ωインターフェロン、τインターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、カルディオトロフィン−１および該ファミリーのメンバーとして確認され、分類された他のタンパク質などである。
【００５７】
タンパク質ペイロード分子は、好ましくは本質的に純粋であり、望ましくは本質的に均一である（すなわち、混入タンパク質等がない）。「本質的に純粋な」タンパク質は、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９０重量％、好ましくは少なくとも約９５重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。「本質的に均一な」タンパク質は、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約９９重量％のタンパク質を含む組成物を意味する。タンパク質は、天然に存在する源由来であるか、または組換え技術により調製したものでよい。タンパク質は、アミノ酸置換または指向タンパク進化法（directed protein evolution）（Kurtzman A.L.ら、繰返し遺伝子組換えによるdirected protein evolution法の進歩：治療タンパク質への適用（Advances in directed protein evolution by recursive genetic recombination:applications to therapeutic proteins）、Curr Opin Biotechnol. ２００１年、１２（４）：３６１〜７０頁）により調製されるタンパク質変異体ならびにＰＥＧ化タンパク質のような誘導体を含む。
【００５８】
特定の実施形態において、タンパク質は抗体である。抗体は、例えば、上記の分子のいずれかに結合することができる。本発明により含まれる抗体の具体例としての分子標的としては、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ１９、ＣＤ２０およびＣＤ３４などのＣＤタンパク質、ＥＧＦ受容体、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３またはＨＥＲ４などのＨＥＲ受容体ファミリーのメンバー、ＬＦＡ−１、Ｍｏｌ、ｐ１５０．９５、ＶＬＡ−４、ＩＣＡＭ−１、ＶＣＡＭおよびそのαもしくはβサブユニットを含むαｖ／β３インテグリン（例えば、抗ＣＤ１１ａ、抗ＣＤ１８もしくは抗ＣＤ１１ｂ抗体）などの細胞接着分子、ＶＥＧＦなどの成長因子、ＩｇＥ、血液型抗原、ｆｌｋ２／ｆｌｔ３受容体、肥満（ＯＢ）受容体、タンパク質Ｃなどがある。
【００５９】
ペプチド、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドに加えて、本発明の微粒子送達システムは、より小さい分子の送達、好ましくは薬剤学的に活性な薬剤、より好ましくは治療用小分子の送達に適している。本発明の微粒子送達システムに適する小分子ペイロードとしては、ジエチルスチルベストロール、１７−β−エストラジオール、エストロン、エチニルエストラジオール、メストラノールなどの避妊薬、ノルエチンドロン、ノルゲストリル、二酢酸エチノジオール、リネストレノール、酢酸メドロキシプロゲステロン、ジメチステロン、酢酸メゲストロール、酢酸クロルマジノン、ノルゲスチメート、ノルエチステロン、エチステロン、メレンゲストロール、ノルエチノドレルなどのプロゲスチン、およびノニルフェノキシポリオキシエチレングリコール、塩化べンゼトニウム、クロルインダノールなどの殺精子化合物などがある。好ましくは、そのようなステロイドペイロードに対して、ペイロードを可溶化するための十分な量の界面活性剤および酵母細胞壁粒子内にペイロードを保持するためのポリマーを含む捕捉分子の混合物を用いる。
【００６０】
本発明の送達システムに組み込むことができる他の活性薬としては、水酸化アルミニウム、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、炭酸ナトリウム等の胃腸治療薬、非ステロイド避妊薬、副交感神経作用薬、精神療法薬、クロロプロマジンＨＣｌ、クロザピン、メソリダジン、メチアピン、レセルピン、チオリダジン等の強力精神安定薬、クロルジアゼポキシド、ジアゼパム、メプロバメート、テマゼパム等の穏和精神安定薬、鼻うっ血除去薬、コデイン、フェノバルニタール、ペントバルビタールナトリウム、セコバルビタールナトリウム等の催眠鎮静薬、テストステロンおよびプロピオン酸テストステロン等の他のステロイド、スルホンアミド、交感神経作用薬、ワクチン、必須アミノ酸、必須脂肪等のビタミンおよび栄養素、４−アミノキノリン、８−アミノキノリン、ピリメタミン等の抗マラリア薬、マジンドール、フェンテルミン等の抗片頭痛薬、Ｌ−ドーパなどの抗パーキンソン薬、アトロピン、臭化メトスコポラミン等の鎮痙薬、胆汁療法、消化薬、酵素等の鎮痙および抗コリン薬、デキストロメトルファン、ノスカピン等の鎮咳薬、気管支拡張薬、抗高血圧薬、インドジャボク（Rauwolfa）アルカロイド、冠血管拡張薬、ニトログリセリン、有機硝酸エステル、四硝酸ペンタエリトリトール等の心血管薬、塩化カリウムなどの電解質置換剤、カフェインを含むまたは含まないエルゴタミン、水素化麦角アルカロイド、メタン硫酸ジヒドロエルゴクリスチン、メタンスルホン酸ジヒドロエルゴコルニン、メタン硫酸ジヒドロエルゴクロイプチンおよびその組合せなどの麦角アルカロイド、硫酸アトロピン、ベラドンナ、臭化水素酸ヒオスシン等のアルカロイド、鎮痛薬、コデイン、ジヒドロコジエノン、メペリジン、モルヒネ等の麻薬、サリチル酸塩、アスピリン、アセトアミノフェン、ｄ−プロポキシフェン等の非麻薬性鎮痛薬などがある。
【００６１】
好ましい実施形態において、本発明のシステムは、セファロスポリン、クロラムフェニカル、ゲンタマイシン、カナマイシンＡ、カナマイシンＢ、ペニシリン、アンピシリン、ストレプトマイシンＡ、アンチマイシンＡ、クロロパムテニオール、メトロニダゾール、オキシテトラサイクリン、ペニシリンＧ、テトラサイクリン等の抗生物質を送達するために用いる。好ましい実施形態において、テトラサイクリンなどの抗生物質のマクロファージへの送達により身体のマクロファージが病原体を不活性化する能力を増大させる。
【００６２】
他の好ましい実施形態において、本発明は、抗癌薬、メフェニトイン、フェノバルビタール、トリメタジオンなどの抗けいれん薬、チエチルペラジンなどの抗嘔吐薬、クロロフィナジン、ジメンヒドリネート、ジフェンヒドラミン、ペルフェナジン、トリペレンバミン等の抗ヒスタミン薬、ホルモン剤、ヒドロコルチゾン、プレドニゾロン、プレドニゾン、非ホルモン剤、アロプリノール、アスピリン、インドメタシン、フェニルブタゾン等の抗炎症薬、プロスタグランジン、チオテパ、クロラムブシル、シクロフォスファミド、メルファラン、ナイトロジェンマスタード、メトトレキサート等の細胞毒性薬を送達するシステムを提供する。
【００６３】
ワクチン
好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、ワクチンの経口送達を行うのに有用である。好ましい実施形態において、該システムは、淋菌（Neisseria gonorrhea）、ヒト型結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ヘルペスウイルス（Herpes virus）（humonis、１および２型）、カンジダアルビカンス（Candida albicans）、カンジダトロピカリス（Candida tropicalis）、膣トリコモナス（Trichomonas vaginalis）、膣ヘモフィフィルス（Haemophilus vaginalis）、群Ｂ連鎖球菌種（Group B Streptococcus sp.）、Microplasma hominis、軟性下疳菌（Hemophilus ducreyi）、鼠径部肉芽腫（Granuloma inguinale）、性病性リンパ異常（Lymphopathia venereum）、梅毒トレポネーマ（Treponema pallidum）、ウシ流産菌（Brucella abortus）、マルタ熱菌（Brucella melitensis）、ブタ流産菌（Brucella suis）、イヌ流産菌（Brucella canis）、Campylobacter fetus、Campylobacter fetus intestinalis、レプトスピラポモナ（Leptospira pomona）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、ブルセラオビス（Brucella ovis）、ウマヘルペスウイルス１、ウマ動脈炎ウイルス、ＩＢＲ−ＩＢＰウイルス、ＢＶＤ−ＭＢウイルス、オウム病クラミジア（Chlamydia psittaci）、トリコモナスフィータス（Trichomonas foetus）、トキソプラスマ（Toxoplasma gondii）、大腸菌（Escherichia coli）、アクチノバシラス エクーリ（Actinobacillus equuli）、ヒツジ流産菌（Salmonella abortus ovis）、ウマ流産菌（Salmonella abortus equi）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、コリネバクテリウム エクイ（Corynebacterium equi）、化膿性コリネバクテリウム（Corynebacterium pygenes）、アクチノバシラス セミニス（Actinobaccilus seminis）、マイコプラスマ ボビゲニタリウム（Mycoplasm bovigenitalium）、アスペルギルスフミガーツス（Aspergillus fumigatus）、Absidia ramosa、トリパノソーマ エキパーダム（Trypanosoma equiperdum）、バベシアカバリ（Babesia caballi）、破傷風菌（Clostridium tetani）、ボツリヌス菌（Clostridium botulinum）などのような微生物の抗原のような抗原を送達するのに有用である。他の実施形態において、該システムは、上の微生物を中和する中和抗体を送達するために用いることができる。
【００６４】
他の実施形態において、該システムは、リボヌクレアーゼ、ノイラミジナーゼ、トリプシン、グリコーゲンホスホリラーゼ、精子乳酸デヒドロゲナーゼ、精子ヒアルロニダーゼ、アデノシントリホスファターゼ、アルカリホスファターゼ、アルカリホスファターゼエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、トリプシンキモトリプシン、アミラーゼ、ムラミダーゼ、アクロソームプロテイナーゼ、ジエステラーゼ、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ、コハク酸デヒドロゲナーゼ、β−グリコホスファターゼ、リパーゼ、ＡＴＰアーゼα−ペプテートγ−グルタミロトランスペプチダーゼ、シテロール−３−β−オール−デヒドロゲナーゼ、ＤＰＮ−ジ−アプロラーゼなどの酵素を送達するために用いることができる。
【００６５】
好ましい実施形態において、該システムは、大痘瘡（痘瘡）、炭疸菌（Bacillus anthracis）（炭疸）、エルシニア ペスティス（Yersinia pestis）（悪疫）、ボツリヌス菌毒素（ボツリヌス中毒）、野兎病菌（Francisella tularensis）（野兎病）、フィロウイルス（エボラ出血熱、マールブルグ出血熱）、アレナウイルス（ラッサ（ラッサ熱）、ジュニン（アルゼンチン出血熱）および関連ウイルス）などのカテゴリＡ病原体、コクシエラ バーネティ（Coxiella burnetti）（Ｑ熱）、ブルセラ（Brucella）種（ブルセラ症）、ブルクホルデリア マレイ（Burkholderia mallei）（鼻疸）、アルファウイルス（ベネズエラ脳脊髄炎、東部および西部ウマ脳脊髄炎）、Ricinus communis（トウゴマの実）のリシン毒素、クロストリジウム パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）のエプシロン毒素、ブドウ球菌（Staphylococcus）外毒素Ｂ、サルモネラ（Salmonella）種、志賀赤痢菌（Shigella dysenteriae）、大腸菌株Ｏ１５７：Ｈ７、コレラ菌（Vibrio cholerae）、クリプトスポリジウム パルブム（Cryptosporidium parvum）などのカテゴリＢ病原体、ならびにニパーウイルス、ハンタウイルス、ダニ媒介出血熱ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、黄熱病および多剤耐性結核などのカテゴリＣ病原体を含むバイオテロ危険生物学的病原体（bioterrorism critical biological agents）の抗原を送達することができる。
【００６６】
好ましい実施形態において、該システムは、トキソイド（不活性化されているが、抗原性毒素）およびトキソイド複合体を含むアナトキシン抗原のような不活性化抗原性毒素を送達するのに用いることができる。好ましい実施形態において、トキソイドは、不活性化微生物毒素である。他の実施形態において、トキソイドは、不活性化植物毒素である。さらなる実施形態において、トキソイドは、不活性化動物毒素である。特定の実施形態において、該システムは、百日咳トキソイド、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheriae）トキソイド、破傷風トキソイド、インフルエンザ菌ｂ型−破傷風トキソイド複合体、ボツリヌス菌Ｄトキソイド、ボツリヌス菌Ｅトキソイド、クロストリジウム ディフィシル（Clostridium difficile）の毒素Ａから生産されたトキソイド、コレラ菌トキソイド、クロストリジウム パーフリンジェンスＣおよびＤ型トキソイド、気腫疸菌（Clostridium chauvoei）トキソイド、ノービ菌（Clostridium nouyi）（Ｂ型）トキソイド、悪性水腫菌（Clostridium seoticum）トキソイド、組換えＨＩＶ  ｔａｔ  ＩＩＩＢトキソイド、ブドウ球菌トキソイド、アクチノバチルス プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）ＡｐｘＩトキソイド、アクチノバチルス プルロニューモニアＡｐｘＩＩトキソイド、アクチノバチルス プルロニューモニアＡｐｘＩＩＩトキソイド、アクチノバチルス プルロニューモニア外膜タンパク質（ＯＭＰ）トキソイド、緑膿菌エラスターゼトキソイド、ヘビ毒トキソイド、リシントキソイド、マンヘミア ヘモリティカ（Mannheimia haemolytica）トキソイド、パスツレラ マルトサイダ（Pasteurella multocida）トキソイド、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）トキソイド、パスツレラ マルトサイダトキソイドおよび気管支敗血症菌（Bordetella bronchiseptica）トキソイドなどのトキソイドを送達するのに用いることができる。
【００６７】
対応する毒素からトキソイドを調製する技術は、例えば、ホルムアルデヒドもしくはアルミニウム塩による化学的処理またはガンマ線照射は、当技術分野で知られている。毒素をトキソイドに変換する組換え法も知られている（Fromen-Romano C.ら、遺伝子工学による非酵素毒素のトキソイドへのトランスフォーメーション（Transformation of a non-enzymatic toxin into a toxoid by genetic engineering）、Protein Engineering、第１０巻１０号、１２１３〜１２２０頁、１９９７年）。好ましい実施形態において、本発明のシステムは、組換えトキソイドを送達するのに用いることができる。他の好ましい実施形態において、本発明のシステムは、組換えトキソイドをコードする発現ベクターを送達するのに用いることができる。
【００６８】
病原体感染に対する防御のための遺伝子ワクチンを生産するためには、防御免疫反応をもたらすことができる免疫原性タンパク質をコードする遺伝物質を核酸組成物に含めなければならない。病原体が、本発明が特に有用である細胞内に感染するか、または細胞外に感染するかにかかわりなく、すべての病原体抗原が防御反応を誘発することは考え難い。ＤＮＡとＲＮＡは両方とも、比較的小さく、比較的容易に調製することができるので、本発明は、複数の病原体抗原を含むワクチンを得ることができるというさらなる利点を提供する。遺伝ワクチンに用いる核酸組成物は、多くの病原体抗原をコードする遺伝物質を含むことができる。例えば、いくつかのウイルス遺伝子を単一構築物に含め、それにより、複数の標的を提供することができる。さらに、個体の種々の細胞に送達することができる複数の接種物を、場合によって、ワクチンに完全な、またはより好ましくは、不完全、例えば、ほぼ完全な一式の遺伝子を集合的に含めるように調製することができる。例えば、完全な一式のウイルス遺伝子を、それぞれが異なる部位に投与するゲノムの異なる半分を含む２つの構築物を用いて投与することができる。したがって、感染性ウイルスが組み立てられるリスクなしに、各抗原に対する免疫反応を誘発することができる。これにより、複数の単一抗原標識の導入が可能になり、防御抗原を特定する必要がなくなる。
【００６９】
本発明によれば、過増殖性疾患に特有の過増殖性細胞に対する広範囲の防御免疫反応をもたらす方法ならびに過増殖性疾患に罹患している個体を治療する方法も提供する。本明細書で用いるように、「過増殖性疾患」という用語は、細胞の過増殖によって特徴づけられる疾患および障害を指す。過増殖性疾患の例は、すべての種類の癌および乾癬を含む。
【００７０】
免疫原性「過増殖性細胞」関連タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸組成物を個体の細胞に導入することにより、個体のワクチン接種細胞中のそれらのタンパク質の産生がもたらされることが発見された。本明細書で用いるように、「過増殖性関連タンパク質」という用語は、過増殖性疾患に関連するタンパク質を指すことを意味する。過増殖性疾患に対する免疫性を与えるために、過増殖性疾患に関連するタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸組成物を個体に投与する。
【００７１】
過増殖性関連タンパク質が有効な免疫原性標的であるためには、それは正常細胞と比較して過増殖性細胞中で独占的またはより高レベルで産生されるタンパク質でなければならない。標的抗原は、そのようなタンパク質、そのフラグメントおよびそのようなタンパク質上に認められる少なくとも１つのエピトープを含むペプチドを含む。場合によって、過増殖性関連タンパク質は、タンパク質をコードする遺伝子の突然変異の産物である。突然変異遺伝子は、正常タンパク質上に認められない異なるエピトープを生じさせるわずかに異なるアミノ酸配列を有すことを除いて、正常タンパク質とほぼ同じであるタンパク質をコードする。そのような標的タンパク質は、ｍｙｂ、ｍｙｃ、ｆｙｎなどの癌遺伝子ならびに転位遺伝子ｂｃｒ／ａｂｌ、ｒａｓ、ｓｒｃ、Ｐ５３、ｎｅｕ、ｔｒｋおよびＥＧＲＦによりコードされるタンパク質であるものを含む。標的抗原としての癌遺伝子産物に加えて、抗癌治療および防御療法用の標的タンパク質は、Ｂ細胞リンパ腫により産生される抗体の可変領域およびいくつかの実施形態において自己免疫疾患の標的抗原としても用いるＴ細胞リンパ腫のＴ細胞受容体の可変領域などである。腫瘍細胞に高レベルで認められ、モノクローナル抗体１７−１Ａにより認識されるタンパク質および葉酸結合タンパク質などのタンパク質のような他の腫瘍関連タンパク質を標的タンパク質として用いることができる。
【００７２】
本発明は１つまたは複数のいくつかの種類の癌に対して個体を免疫化することはできるが、本発明は、特定の癌を発現する素因がある、あるいは癌を経験し、したがって、再発を受けやすい個体を予防的に免疫化するのに有用である。遺伝学およびバイオテクノロジーならびに疫学の発展により、個体における癌の発現の確率の決定およびリスク評価が可能である。遺伝スクリーニングおよび／または家族健康歴を用いて、特定の個体がいくつかの種類の癌のいずれか１つを発現する確率を予測することが可能である。
【００７３】
同様に、既に癌を発現した個体および癌を除去するために治療を受けた個体、あるいは寛解状態にある個体は、特に再発および再発生を受けやすい。治療法の一部として、そのような再発を抑制するために、個体が有すると診断された癌に対してそのような個体を免疫化することができる。したがって、個体がある種類の癌を経験し、再発のリスクがあることが知られているならば、個体の免疫系が癌のさらなる出現を抑制することを準備するために個体を免疫化することができる。
【００７４】
本発明はまた、過増殖性疾患に罹患している個体を治療する方法を提供する。そのような方法において、ペプチド、タンパク質、炭水化物または核酸組成物およびその組合せの導入は、標的タンパク質を産生する過増殖性細胞を根絶するための個体の免疫系を誘導し、促進する免疫療法としての役割を果たす。
【００７５】
本発明は、「自己」誘導抗体を産生する細胞受容体および細胞を含む、自己免疫に関連する標的に対する広範囲の防御免疫反応をもたらすことによる自己免疫疾患および障害に罹患している個体を治療する方法を提供する。
【００７６】
Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患としては、慢性関節リウマチ（ＲＡ）、多発性硬化症（ＭＳ）、シェーグレン症候群、サルコイドーシス、インスリン依存性糖尿病（ＩＤＤＭ）、自己免疫性甲状腺炎、反応性関節炎、強直性脊椎炎、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、乾癬、血管炎、ヴェーグナー肉芽腫炎、クローン病および潰瘍性大腸炎などがある。これらの疾患のそれぞれが、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始させるＴ細胞受容体によって特徴づけられる。Ｔ細胞の可変領域に対するワクチン接種により、それらのＴ細胞を除去するＣＴＬｓを含む免疫反応が誘発されると思われる。
【００７７】
ＲＡにおいて、該疾患に関与するＴ細胞受容体（ＴＣＲｓ）のいくつかの特異的な可変領域が特徴づけられた。これらのＴＣＲｓとしては、Ｖβ−３、Ｖβ−１４、Ｖβ−１７およびＶα−１７などがある。したがって、これらのタンパク質の少なくも１つを送達またはコードするペプチド、タンパク質、炭水化物からなる組成物または核酸組成物およびそれらの組合せを用いたワクチン接種により、ＲＡに関与するＴ細胞を標的とする免疫反応が誘発される。それぞれが参照により本明細書に組み込まれているHowell M.D.ら、１９９１年Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８８：１０９２１〜１０９２５頁、Paliard X.ら、１９９１年Science ２５３：３２５〜３２９頁、Williams W.V.ら、１９９２年J.Clin.Invest. ９０：３２６〜３３３頁を参照のこと。
【００７８】
ＭＳにおいて、該疾患に関与するＴＣＲｓのいくつかの特異的な可変領域が特徴づけられた。これらのＴＣＲｓとしては、Ｖβ−７およびＶα−１０などである。したがって、これらのタンパク質の少なくも１つを送達またはコードするペプチド、タンパク質、炭水化物からなる組成物または核酸組成物およびそれらの組合せを用いたワクチン接種により、ＭＳに関与するＴ細胞を標的とする免疫反応が誘発される。それぞれが参照により本明細書に組み込まれているWucherpfennig K.W.ら、１９９０年Science ２４８：１０１６〜１０19頁、Oksenberg J.R.ら、１９９０年、Nature ３４５：３４４〜３４６頁を参照のこと。
【００７９】
強皮症において、該疾患に関与するＴＣＲｓのいくつかの特異的な可変領域が特徴づけられた。これらのＴＣＲｓとしては、Ｖβ−６、Ｖβ−８、Ｖβ−１４およびＶα−１６、Ｖα−３Ｃ、Ｖα−７、Ｖα−１４、Ｖα−１５、Ｖα−１６、Ｖα−２８およびＶα−１２などがある。これらのタンパク質の少なくも１つを送達またはコードするペプチド、タンパク質、炭水化物からなる組成物または核酸組成物およびそれらの組合せを用いたワクチン接種により、強皮症に関与するＴ細胞を標的とする免疫反応が誘発される。
【００８０】
Ｔ細胞媒介性自己免疫疾患に罹患し、特にＴＣＲの可変領域を特徴づける必要がある患者を治療するために、滑液生検を実施することができる。存在するＴ細胞の試料を採取し、標準的手法を用いてそれらのＴＣＲｓの可変領域を特定することができる。ワクチンは、この情報を用いて調製することができる。
【００８１】
Ｂ細胞媒介性自己免疫疾患としては、狼瘡（ＳＬＥ）、グレーヴス病、重症筋無力症、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性血小板減少症、喘息、クリオグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変および悪性貧血などがある。これらの疾患のそれぞれが、内因性抗原に結合し、自己免疫疾患に関連する炎症カスケードを開始させる抗体によって特徴づけられる。そのような抗体の可変領域に対するワクチン接種により、該抗体を産生するそれらのＢ細胞を除去するＣＴＬｓを含む免疫反応が誘発されると思われる。
【００８２】
Ｂ細胞媒介性自己免疫性疾患に罹患している患者を治療を治療するためには、自己免疫活性の関与する抗体の可変領域を特定しなければならない。生検を実施することができ、また炎症の部位に存在する抗体の試料を採取することができる。それらの抗体の可変領域は、標準的な手法を用いて特定することができる。
【００８３】
ＳＬＥの場合、１つの抗原はＤＮＡであると考えられている。したがって、ＳＬＥに対して免疫化する患者において、患者の血清を抗ＤＮＡ抗体についてスクリーニングすることができ、血清中に認められるそのような抗ＤＮＡ抗体の可変領域をコードする核酸組成物を含むワクチンを調製することができる。
【００８４】
ＴＣＲｓおよび抗体の可変領域の構造の共通の特徴は、よく知られている。特定のＴＣＲまたは抗体をコードするＤＮＡ配列は、参照により本明細書に組み込まれているKabatら、１９８７年、免疫学的に重要なタンパク質の配列（Sequence of Proteins of Immunological Interest）、米国保健福祉省、Bethesda Md.に記載されているようなよく知られている方法により一般的に見いだすことができる。さらに、抗体の機能的可変領域をクローニングする方法は、参照により本明細書に組み込まれているChaudhary V.K.ら、１９９０年、Proc.Natl.Acad.Sci.USA ８７：１０６６頁に見いだすことができる。
【００８５】
遺伝子治療
好ましい実施形態において、本発明は、遺伝的障害または遺伝的構成要素を有する状態を治療するための組成物および方法を提供する。さらなる好ましい実施形態において、本発明は、遺伝的障害または遺伝的構成要素を有する状態を治療するための医薬品の製造に有用な組成物を提供する。
【００８６】
ヒトゲノムプロジェクトは、疾患の遺伝的基礎に関する我々の知識を増加させた。一般的に、http://www.ornl.gov/sci/techresources/Human_Genome/medicine/assist.shtml を参照のこと。
【００８７】
環境および遺伝因子がいずれかの疾患の発現に役割を有する。遺伝的障害は、個体の遺伝物質（ゲノム）の異常により引き起こされる疾患である。次の４種類の遺伝的障害が存在する。すなわち（１）単一遺伝子性、（２）多因子性、（３）染色体性および（４）ミトコンドリア性障害である。
【００８８】
（１）単一遺伝子性（メンデルまたは一遺伝子性とも呼ぶ）−このタイプは、１つの遺伝子のＤＮＡ配列に発生する変化または突然変異によって引き起こされる。大部分の仕事を行う分子であるタンパク質をコードする遺伝子は、大部分の生命機能を果たし、大部分の細胞構造を作りさえする。遺伝子が、そのタンパク質産物がもはやその正常な機能を有さないように突然変異する場合、障害が生じ得る。２００例の出産ごとに約１例の割合で発生する６０００以上の既知の単一遺伝子障害が存在する。一部の例は、嚢胞性線維症、鎌状赤血球貧血、マルファン症候群、ハンチントン病および遺伝性ヘモクロマトーシスである。
【００８９】
（２）多因子性（複合または多遺伝子性とも呼ぶ）−このタイプは、環境因子と複数の遺伝子の突然変異の組合せにより引き起こされる。例えば、乳癌感受性に影響を及ぼす異なる遺伝子が第６、１１、１３、１４、１５、１７および２２染色体上に認められた。そのより複雑な性質のために、単一遺伝子または染色体性障害より解析がはるかに困難である。最も一般的な慢性障害の一部は、多因子性障害である。例としては、心疾患、高血圧、アルツハイマー病、関節炎、糖尿病、癌および肥満である。多因子性遺伝も指紋、身長、眼の色および皮膚の色などの遺伝性素質に関連する。
【００９０】
（３）染色体性−ＤＮＡおよびタンパク質から構成されている独特な構造である染色体は、各細胞の核内にある。染色体は遺伝物質の担体であるので、欠失または余剰のコピーまたは肉眼的切断および再結合（転座）のような染色体構造の異常が疾患をもたらし得る。ある種の重大な染色体異常は、顕微鏡検査により検出することができる。ダウン症候群またはトリソミー２１は、人が第２１染色体の３つのコピーを有するときに起こる一般的な障害である。
【００９１】
（４）ミトコンドリア性−この比較的まれなタイプの遺伝的障害は、ミトコンドリアの非染色体性ＤＮＡの突然変異により引き起こされる。ミトコンドリアは、細胞呼吸に関与し、植物および動物細胞の細胞質に認められる小さく、丸いまたは棒状細胞小器官である。各ミトコンドリアは、５個から１０個のＤＮＡの環状片を含むことがある。
【００９２】
好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、補償遺伝子を含む少なくとも１つのポリヌクレオチドを投与するのに用いる。他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、本発明の微粒子送達システムは、遺伝子産物の発現が遺伝的障害または状態の遺伝的構成要素の治療に有用である場合に、欠失遺伝子の遺伝子産物をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを投与するのに用いる。好ましい実施形態において、所望のペイロード分子を含む本発明の微粒子送達システムは、遺伝的障害または状態の遺伝的構成要素の治療用の医薬品の製造に有用である。そのような医薬品は、経口、直腸、非経口（例えば、静脈内、筋肉内または皮下）、大槽内、膣内、腹腔内、膀胱内、局所的に（例えば、散剤、軟膏剤または滴剤）または口腔剤もしくは鼻内噴霧剤として適切に投与する。医薬品は、好ましくは経口、口腔内および非経口、より好ましくは経口投与する。異なるペイロード、例えば、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチド発現ベクターまたは治療用小分子を添加した粒子を適切な割合で混合し、併用療法のために共に、例えば、カプセルに入れて投与することができる。
【００９３】
遺伝子治療に関する本発明の態様において、核酸組成物は、補償遺伝子または治療タンパク質をコードする遺伝子を含む。補償遺伝子の例としては、ジストロフィンまたは機能フラグメントをコードする遺伝子、嚢胞性線維症に罹患している患者における欠陥遺伝子を補償する遺伝子、ＡＤＡに罹患している患者における欠陥遺伝子を補償する遺伝子および第ＶＩＩＩ因子をコードする遺伝子などがある。治療タンパク質をコードする遺伝子の例としては、エリトロポイエチン、インターフェロン、ＬＤＬ受容体、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−４およびＴＮＦをコードする遺伝子などがある。さらに、毒物に特異的に結合する単鎖抗体成分をコードする核酸組成物を投与することができる。いくつかの好ましい実施形態において、ジストロフィン遺伝子をミニ遺伝子の一部として提供し、筋ジストロフィーに罹患している患者を治療するのに用いる。いくつかの好ましい実施形態において、部分ジストロフィンタンパク質のコーディング配列を含むミニ遺伝子を提供する。ジストロフィン異常は、より軽度のベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）および重度のジュシェーヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）の原因である。ＢＭＤにおいては、ジストロフィンは産生されるが、サイズおよび／または量が異常である。患者は、軽度から中等度の衰弱を有する。ＤＭＤにおいては、ジストロフィンは産生されず、患者は１３歳までに車椅子に拘束され、２０歳までに死亡する。特にＢＭＤに罹患している一部の患者において、本発明により送達されるミニ遺伝子の発現により産生される部分ジストロフィンタンパク質は、筋肉機能の改善をもたらすことができる。
【００９４】
好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、アールスコグ−スコット症候群、アーセ症候群、軟骨形成不全、先端異骨症、嗜癖、副腎脳白質ジストロフィー、白皮症、無眼瞼大口症候群、アラジル症候群、アルカプトン尿症、α−１−アンチトリプシン欠乏症、アルポート症候群、アルツハイマー病、喘息、自己免疫多腺性症候群、アンドロゲン非感受性症候群、アンジェルマン症候群、運動失調症、毛細血管拡張性運動失調症、アテローム動脈硬化症、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）、自閉症、脱毛症、バッテン病、ベックウィズ−ヴィーデマン症候群、ベスト病、双極性障害、短指症、乳癌、バーキットリンパ腫、慢性骨髄性白血病、シャルコー−マリー−トゥース病、クローン病、唇裂、コケーン症候群、コフィン−ローリー症候群、大腸癌、先天性副腎過形成（ＣＡＨ）、コルネリアドランゲ症候群、コステロ症候群、カウデン症候群、頭蓋前頭鼻部形成異常、クリグラー−ナジャー症候群、クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）、嚢胞性線維症、難聴、鬱病、糖尿病、捻曲性骨異形成症、ディジョージ症候群、ダウン症候群、失読症、デュシェンヌ筋ジストロフィー、デュボヴィッツ症候群、外胚葉異形成症、エリス−ファンクレフェルト症候群、エーレルス−ダンロー症候群、表皮水疱症（ＥＢ）、てんかん、本態性振戦、家族性高コレステロール血症、家族性地中海熱、脆弱Ｘ症候群、脆弱Ｘ症候群、フリートライヒ運動失調、ゴーシェ病、緑内障、グルコース−ガラクトース吸収不良、グルタル酸尿症、回萎縮、ゴールドベルクシプリンツェン症候群（口蓋心顔面症候群）、ゴーリン症候群、ヘーリー−ヘーリー病、片側肥大、ヘモクロマトーシス、血友病、遺伝性運動感覚ニューロパシー（ＨＭＳＮ）、遺伝性非ポリポーシス大腸癌（ＨＮＰＣＣ）、ハンチントン病、高ＩｇＭを伴う免疫不全、若年発症糖尿病、クラインフェルター症候群、カブキ症候群、リー病（または症候群）、ＱＴ間隔延長症候群、肺癌、悪性黒色腫、躁うつ病、マルファン症候群、メンケズ症候群、流産、ムコ多糖症候群、多発性内分泌腫、多発性硬化症、筋ジストロフィー、筋萎縮側索硬化症、筋強直性ジストロフィー、神経線維腫症、ニューマン−ピック病、ヌーナン症候群、肥満、卵巣癌、ｐ５３腫瘍抑制因子、膵臓癌、パーキンソン病、発作性夜間ヘモグロビン尿症、ペンドレッド症候群、腓骨筋萎縮、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、腎多嚢胞病、プラーダー−ヴィリ症候群、原発性胆汁性肝硬変、前立腺癌、ＲＥＡＲ症候群、レフスム病、色素性網膜炎、網膜芽腫、レット症候群、サンフィリポ症候群、精神分裂病、重症複合免疫不全症、鎌状赤血球貧血、二分脊椎、脊髄性筋萎縮、脊髄小脳萎縮、ＳＲＹ：性決定、成人突然死症候群、タンジアー病、テイ−サックス病、血小板減少橈骨欠損症候群、タウンズ−ブロックス症候群、結節性硬化症、ターナー症候群、アッシャー症候群、フォンヒッペル−リンダウ症候群、ワーデンブルヒ症候群、ウィーバー症候群、ヴェルナー症候群、ウィリアム症候群、ウィルソン病、色素性乾皮症またはツェルヴェーガー症候群などの遺伝的障害および遺伝的構成要素を有すると考えられている状態の治療のための組成物および方法を提供する。
【００９５】
他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、鎌状赤血球貧血ならびにβ−地中海貧血、α−地中海貧血、マルファン症候群、エーレルス−ダンローＩ型、エーレルス−ダンローＩＩ型、エーレルス−ダンローＩＩＩ型、エーレルス−ダンローＩＶ型常染色体優性、エーレルス−ダンローＩＶ型常染色体劣性、エーレルス−ダンローＩＶ−Ｄ型、エーレルス−ダンローＶ型、エーレルス−ダンローＶＩ型、エーレルス−ダンローＶＩＩ型常染色体優性、エーレルス−ダンローＶＩＩ型常染色体劣性、エーレルス−ダンローＶＩＩＩ、血小板機能不全を伴うエーレルス−ダンロー、ゴム様皮膚、ゴム様皮膚劣性Ｉ型、後角症候群ゴム様皮膚、Ｘ連鎖、骨形成不全Ｉ型、骨形成不全Ｉ−Ｃ型、骨形成不全無症状ＩＩ／ＩＩＩ型、骨形成不全ＩＶ型、骨形成不全新生児致死型および骨形成不全進行性変形を含むタンパク質関連障害のような代謝障害として発現する遺伝的障害および遺伝的構成要素を有すると考えられている状態の治療のための組成物および方法を提供する。
【００９６】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、無フィブリノーゲン血、フィブリノーゲンの完全喪失、第Ｉ因子；フィブリノーゲン異常血、機能不全性フィブリノーゲン、第Ｉ因子；組織因子欠乏症；第Ｖ因子欠乏症、不安定因子欠乏症、第ＶＩＩ因子欠乏症、第ＶＩＩＩ因子欠乏症（血友病Ａ）、第ＩＸ因子欠乏症（血友病Ｂ）、第Ｘ因子欠乏症、第ＸＩ因子欠乏症、ローゼンタール症候群、血漿トロンボプラスチン前駆物質（ＰＴＡ）欠乏症、第ＸＩＩ因子欠乏症、ハーゲマン因子欠乏症、第ＸＩＩＩ因子欠乏症、第ＶおよびＶＩＩＩ因子複合欠乏症、第ＶＩＩＩおよびＩＸ因子複合欠乏症、第ＩＸおよびＸＩ因子複合欠乏症、プロテインＣ欠乏症、プロテインＳ欠乏症、血栓形成傾向、抗トロンビンＩＩＩ欠乏症、巨大血小板症候群、血小板糖タンパク質Ｉｂ欠乏症、ヴォンヴィレブランド病、フレッチャー因子欠乏症およびプレカリクレイン欠乏症などの凝固系の遺伝的障害の治療のための組成物および方法を提供する。
【００９７】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、０型、Ｉ型（フォンギールケ病）、Ｉｂ型、Ｉｃ型、ＩＩ型（ポンペ病）、ＩＩｂ型（ダノン病）、ＩＩＩ型（コーリ病またはフォーブズ病）、ＩＶ型（アンダーセン病）、Ｖ型（マッカードル病）、ＶＩ型（エール病）、ＶＩＩ型（タルイ病）、ＶＩＩＩ型、ＩＸ型およびＸＩ型（ファンコーニ−ビッケル症候群）などのグリコーゲン貯蔵障害の治療のための組成物および方法を提供する。
【００９８】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、遺伝性フルクトース不耐性、アルドラーゼＢ欠乏症、フルクトース尿症、肝フルクトキナーゼ欠乏症、古典的ガラクトース血症、ガラクトースエピメラーゼ欠乏症、ガラクトキナーゼ欠乏症、高血糖症およびグリセロールキナーゼ欠乏症などのフルクトース、ガラクトースおよびグリセロール代謝の欠損の治療のための組成物および方法を提供する。
【００９９】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、アポリポタンパク（ａ）−Ｌｐ（ａ）、Ｉ型高リポタンパク血症、Ｉｂ型高リポタンパク血症、アポリポタンパクＣ−ＩＩ欠乏症、Ｉｃ型高リポタンパク血症、キロミクロン血症、ＩＩ型家族性高コレステロール血症、家族性高βリポタンパク血症、ＩＩＩ型高リポタンパク血症、アポリポタンパクＥ欠乏症、ＩＶ型高リポタンパク血症、Ｖ型高リポタンパク血症、家族性ＬＣＡＴ欠乏症、ウォルマン病、リポタンパクリパーゼ欠乏症、家族性高トリグリセリド血症、Ｖ型高脂血症、ＶＩ型高脂血症、家族性リガンド欠損アポＢ、家族性高αリポタンパク血症、高βリポタンパク血症、アポリポタンパクＢ−１００欠乏症、無βリポタンパク血症、コルンツヴァイク症候群およびタンジアー病、すなわち、家族性高密度リポタンパク欠乏症などのコレステロールおよびリポタンパク質代謝の欠損の治療のための組成物および方法を提供する。
【０１００】
さらなる好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、ＩＨ型ムコ多糖沈着症（フルラー症候群）、ＩＳ型ムコ多糖沈着症（シャイエ症候群）、ＩＨ／Ｓ型ムコ多糖沈着症（フルラー／シャイエ症候群）、ＩＩ型ムコ多糖沈着症（ハンター症候群）、ＩＩＩ型ムコ多糖沈着症（サンフィリポＡ型、サンフィリポＢ型、サンフィリポＣ型、サンフィリポＤ型）、ＩＶ型ムコ多糖沈着症（モルキノＡ型、モルキノＢ型）、ＶＩ型ムコ多糖沈着症（マロトー−ラミー症候群）、ＶＩＩ型ムコ多糖沈着症（スライ症候群）などのムコ多糖および糖脂質障害の治療のための組成物および方法を提供する。
【０１０１】
他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、ＩＩ型全身性ＧＭ１若年形、ＩＩＩ型全身性ＧＭ１成人形を含むＧＭ１ガングリシドーシス、ＧＭ２ガングリシドーシス（サンドホフ−ヤツケウィツ病）、ＧＭ３ガングリシドーシス、テイ−サックス病、テイ−サックスＡＢ変異型、ゴーシェ病、ニーマン−ピック病、Ａ、Ｂ、Ｃ１、Ｃ２およびＤ型、シュナイダー病、ファブリー病、ラクトシルセラミドーシス、ファーバー病、クラッベ病、多種スルファターゼ欠損症、オースチン病、異染性白質萎縮症、スルファチドリポドーシスなどのグリコスフィンゴリピド代謝の障害の治療のための組成物および方法を提供する。
【０１０２】
他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、フルコース蓄積症、ムコリポドーシスＶＩ、シアロリピドーシス、α−マンノシドーシス、β−マンノシドーシス、Ｉ型およびＩＩ型シアリドーシス、ガラクトシアリドーシス、ゴールドバーグ症候群およびアスパルチルグルコサミン尿症などのオリゴ糖蓄積症の治療のための組成物および方法を提供する。
【０１０３】
他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、ムコリピドーシスＩ（シアリドーシス）、ムコリピドーシスＩＩ（Ｉ細胞病）およびムコリピドーシスＩＩＩ（偽性ハーラー病ポリジストロフィー）などのリソソーム酵素輸送の障害の治療のための組成物および方法を提供する。
【０１０４】
他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、フェニルケトン尿症、Ｉ型チロシン血症（チロシン症）、ＩＩ型チロシン血症（リヒナー−ハンハート症候群）、ＩＩＩ型チロシン血症、アルカプトン尿症、ホモシスチン尿症、ヒスチジン尿症、かえで糖尿病（ＭＳＵＤ）、Ｉｂ型ＭＳＵＤ、ＩＩ型ＭＳＵＤ、メチルマロン酸尿症、Ｉ型非ケトン性高血糖症（ＮＫＨＩ）および高リジン血症などのアミノ酸および有機酸代謝の欠損の治療のための組成物および方法を提供する。
【０１０５】
他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、高アンモニア血症、リン酸カルボモイルシンテターゼＩ（ＣＰＳ−Ｉ）欠損症、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症、Ｎ−アセチルグルタミン酸シンターゼ欠損症、アルギニコハク酸尿症、アルギニコハク酸リアーゼ欠損症、高アルギニン血症、アルギナーゼ欠損症、シトルリン血症、アルギニコハク酸シンターゼおよびオルニチンアミノトランスフェラーゼ欠損症などの尿サイクル欠損の治療のための組成物および方法を提供する。他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、Ｉ型シスチン尿症、ＩＩＩ型シスチン尿症、ハートナップ病および高アンモニア血−高オルニチン血−ホモシトルリン尿（ＨＨＨ）症候群などのアミノ酸輸送の欠損の治療のための組成物および方法を提供する。他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、先天性赤血球生成性ポルフィリン症（ＣＥＰ）、赤血球生成性プロトポルフィリン症（ＥＰＰ）、ＡＬＡデヒドラターゼ欠損ポルフィリン症（ＡＤＰ）、急性間欠性ポルフィリン症（ＡＩＰ）、遺伝性コプロポルフィリン症（ＨＣＰ）、ヴァリエゲートポルフィリン症（ＶＰ）、晩発性皮膚ポルフィリン症（ＰＣＴ）、肝赤血球生成性プロトポルフィリン症（ＨＥＰ）、ギルバート症候群、Ｉ型およびＩＩ型クリグラー−ナジャー症候群、デュビン−ジョンソン症候群およびローター症候群などのポルフィリン症およびビリルビン尿症の治療のための組成物および方法を提供する。
【０１０６】
他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、超長鎖アシルＣｏＡデヒドゲナーゼ欠損症（ＶＬＣＡＤ）、長鎖アシルＣｏＡデヒドゲナーゼ欠損症（ＬＣＡＤ）、中鎖アシルＣｏＡデヒドゲナーゼ欠損症（ＭＣＡＤ）、短鎖アシルＣｏＡデヒドゲナーゼ欠損症（ＳＣＡＤ）、カルニチントランスローカーゼ欠損症、カルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩ（ＣＰＴＩ）欠損症およびカルニチンパルミトイルトランスフェラーゼＩＩ（ＣＰＴＩＩ）欠損症などの脂肪酸代謝の誤りの治療のための組成物および方法を提供する。他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、レッシュ−ナイハン症候群、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）欠損に起因する重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）、痛風、アデノシンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＡＰＲＴ）欠損に起因する腎結石症、キサンチンオキシダーゼ欠損に起因するキサンチン尿症、Ｉ型およびＩＩ型オロト酸尿症およびオルニチントランスカルボモイラーゼ欠損症などのヌクレオチド代謝の欠損の治療のための組成物および方法を提供する。
【０１０７】
他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、ウィルソン病、メンケス病、後角症候群およびヘモクロマトーシスなどの金属代謝障害の治療のための組成物および方法を提供する。他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、ツェルヴェーガー症候群、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー、新生児副腎白質ジストロフィー（ＮＡＬＤ）、斑状軟骨形成不全症（ＲＣＤＰ）および乳児レフサム病（ＩＲＤ）などのペルオキシソームの障害の治療のための組成物および方法を提供する。他の好ましい実施形態において、本発明の微粒子送達システムは、毛細血管拡張性運動失調症（ＡＴ）、色素性乾皮症（ＸＰ）、コケーン症候群、ブルーム症候群およびファンコーニ貧血などの欠陥ＤＮＡ修復に伴う障害の治療のための組成物および方法を提供する。
【０１０８】
投与経路
投与経路は、経口、口腔内、舌下、肺、経皮、経粘膜ならびに皮下、腹腔内および筋肉内注射を含むが、これらに限定されない。好ましい投与経路は、経口、口腔内、舌下、肺および経粘膜である。
【０１０９】
本発明の微粒子送達システムは、治療上有効な量で患者に投与する。微粒子送達システムは、単独または製薬上許容できる組成物の一部として投与することができる。さらに、化合物または組成物はすべて、例えばボーラス注射として一度に、一連の錠剤などにより複数回投与、または、例えば、放出制御製剤を用いて一定の時間にわたって実質的に一様に送達することができる。化合物の用量を時間の経過とともに変化させることができることも確認されている。微粒子送達システムは、即放性製剤、放出制御製剤またはそれらの組合せを用いて投与することができる。「放出制御」という用語は、持続放出、遅延放出およびそれらの組合せを含む。
【０１１０】
本発明の薬剤組成物は、１回単位用量として、または複数の１回単位用量として調製、包装またはバルク販売することができる。本明細書で用いるように、「単位用量」は、あらかじめ決定した量の有効成分を含む薬剤組成物の離散的量である。有効成分の量は、一般的に患者に投与されるような有効成分の用量、またはそのような用量の都合のよい分割量、例えば、そのような用量の２分の１もしくは３分の１に等しい。
【０１１１】
本発明の薬剤組成物中の有効成分、製薬上許容できる担体および追加の成分の相対量は、治療を受ける人の特徴、体格および状態によって、またさらに組成物を投与する経路によって異なる。例として、組成物は、０．１％〜１００％（重量／重量）の有効成分を含むことができる。本発明の薬剤組成物の単位用量は、一般的に約１００ｍｇ〜約２ｍｇの有効成分、好ましくは約２００ｍｇ〜約１．０ｍｇの有効成分を含む。
【０１１２】
さらに、本発明の微粒子送達システムは、単独で、異なるペイロードを含む微粒子送達システムと、または他の薬剤学的に活性な化合物と併用投与することができる。他の薬剤学的に活性な化合物は、微粒子送達システムと同じ状態または異なる状態を治療するために選択することができる。
【０１１３】
患者が薬剤学的に活性な化合物の投与を受けることになっているか、受けている場合、化合物は同時またはある順序で逐次的に投与することができる。例えば、錠剤の場合、活性な化合物は、一度にまたはある順序で逐次的に投与することができる１つの錠剤または別個の錠剤に見いだすことができる。さらに、組成物は異なる形態であり得ることを認識すべきである。例えば、１つまたは複数の化合物は錠剤により送達することができるが、他は注射により、またはシロップ剤として経口投与される。
【０１１４】
本発明の他の態様は、本発明の薬剤組成物および教育的資料を含むキットに関する。教育的資料は、本明細書に示すヒトにおける目的の１つにおける本発明の薬剤組成物の有用性を伝達するために用いる刊行物、記録、図表または他のあらゆる表現媒体を含む。教育的資料はまた、例えば、本発明の薬剤組成物の適切な用量を記述することができる。本発明のキットの教育的資料は、例えば、本発明の薬剤組成物を含む容器に添付するか、または該薬剤組成物を含む容器とともに輸送することができる。あるいは、該教育的資料は、教育的資料と薬剤組成物が受容者によりともに用いられるというつもりで、容器と別個に輸送することができる。
【０１１５】
本発明はまた、本発明の薬剤組成物および該組成物をヒトに送達するための送達装置を含むキットを含む。例として、送達装置は、スクイーズ噴霧ビン、計量噴霧ビン、エアゾール噴霧装置、霧化器、乾燥散剤送達装置、自己噴霧式溶媒／散剤投薬装置、注射器、針、タンポンまたは計量容器であってよい。キットはさらに、本明細書で述べたような教育的資料を含んでいてよい。
【０１１６】
例えば、キットは、微粒子送達システムおよび製薬上許容できる担体を含む第１の組成物ならびに第２の薬剤学的に活性な化合物および製薬上許容できる担体を含む組成物をそれぞれ含む２つの別個の薬剤組成物を含んでいてよい。キットはまた、分割ビンまたは分割フォイルパケットなどの異なる組成物用の容器を含む。容器のさらなる例としては、注射器、箱、バッグ等がある。一般的に、キットは、異なる組成物の投与の説明書を含む。キットの形態は、異なる組成物を異なる剤形で投与（例えば、経口および非経口）することが好ましく、異なる投与間隔で投与するとき、あるいは配合物の個々の成分の用量調整が処方医師により望まれているときに特に有利である。
【０１１７】
キットの例は、ブリスターパックである。ブリスターパックは、包装産業でよく知られており、薬剤単位剤形（錠剤、カプセル剤等）の包装に広く用いられている。ブリスターパックは、一般的に好ましくは透明プラスチック材料のフォイルで被覆された比較的硬い材料のシートからなっている。包装工程で、プラスチックフォイルにくぼみが形成される。くぼみは、包装する錠剤またはカプセル剤の大きさと形状を有する。次に、錠剤またはカプセル剤がくぼみに入れられ、比較的硬い材料のシートが、くぼみが形成された方向と反対側にあるプラスチックフォイルの面でプラスチックフォイルに対して封じられる。その結果、錠剤またはカプセル剤はプラスチックフォイルとシートの間のくぼみに封じ込められる。好ましくは、シートの強度は、手でくぼみに圧力を加えてくぼみの位置のシートに開口部を形成させることによって錠剤またはカプセル剤をブリスターパックから取り出すことができるような値である。錠剤またはカプセル剤は、前記開口部から取り出すことができる。
【０１１８】
例えば、当該治療法での錠剤またはカプセル剤を服用すべき日に対応する数を錠剤またはカプセル剤に隣接して示すなど、数の形でキットに記憶補助手段を備えることが望ましい。そのような記憶補助手段の他の例は、例えば、「第１週、月曜日、火曜日、．．．等、第２週、月曜日、火曜日」等のカードに印刷されたカレンダーである。記憶補助手段の他の変形形態は、容易に明らかになるであろう。「１日量」は、所与の日に服用すべき１個の錠剤もしくはカプセル剤または数個の丸剤もしくはカプセル剤であり得る。また、微粒子送達システムの１日量は１個の錠剤もしくはカプセル剤からなっていてよく、一方、第２の化合物の１日量は数個の錠剤もしくはカプセル剤からなっていてよく、また逆の場合も同様である。記憶補助手段は、これを反映し、正しい投与の助けとなるべきである。
【０１１９】
本発明の他の実施形態において、意図する使用の順序で一度に１つずつ１日量を投薬するように設計されたディスペンサーを提供する。好ましくは、投与法の遵守をさらに促進するように、ディスペンサーに記憶補助手段を装着する。そのような記憶補助手段の例は、既に投薬された１日量の数を表示する機械的計数器である。そのような記憶補助手段の他の例は、例えば、最終の１日量を服用した日を読み出し、かつ／または次の量を服用するときにそれを思い出させる液晶表示器または可聴合図シグナルに連結された電池式マイクロチップメモリである。
【０１２０】
場合によって他の薬剤学的に活性な化合物を含む、微粒子送達システム組成物は、経口、直腸、非経口（例えば、静脈内、筋肉内または皮下）、大槽内、膣内、腹腔内、膀胱内、局所的に（例えば、散剤、軟膏剤または滴剤）または口腔剤もしくは鼻内噴霧剤として患者に投与することができる。
【０１２１】
薬剤組成物の非経口投与は、ヒトの組織の物理的侵害および組織における侵害による薬剤組成物の投与によって特徴づけられる投与経路を含む。したがって、非経口投与は、組成物の注射、外科的切開創をとおしての組成物の適用、組織貫通性非外科的創傷をとおしての組成物の適用等による薬剤組成物の投与を含む。特に非経口投与は、皮下、腹腔内、静脈内、動脈内、筋肉内または胸骨内注射ならびに静脈内、動脈内または腎透析注入法を含む。
【０１２２】
非経口注射に適する組成物は、生理学的に許容できる無菌水性もしくは非水性液剤、分散剤、懸濁剤または乳剤などの製薬上許容できる担体と組み合わせた有効成分を含み、あるいは無菌注射用液剤または分散剤に再構成するための無菌散剤を含んでいてよい。適切な水性もしくは非水性担体、希釈剤、溶媒または媒体としては、水、等張食塩水、エタノール、ポリオール（プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、グリセロール等）、それらの適切な混合物、オリーブ油のような植物油を含むトリグリセリドまたはオレイン酸エチルのような注射用有機エステルなどがある。例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散剤の場合には必要な粒径の維持、および／または界面活性剤の使用により、適切な流動性を維持することができる。そのような製剤は、ボーラス投与または持続投与に適する形態で調製、包装または販売することができる。注射剤は、アンプル入り、保存剤を含む反復投与容器入り、または自己注射もしくは医師による注射用１回使用装置入りのような単位剤形で調製、包装または販売することができる。
【０１２３】
非経口投与用製剤としては、懸濁剤、液剤、油性もしくは水性媒体中乳剤、ペースト剤、埋込み式徐放または生分解性製剤などがある。そのような製剤は、さらに懸濁化、安定化または分散剤などの１つまたは複数の追加の成分を含んでいてよい。非経口投与用の製剤の１つの実施形態において、再構成組成物の非経口投与の前に適切な媒体（例えば、病原体を含まない無菌水）で再構成するために有効成分を乾燥した（すなわち、散剤または顆粒剤）形態で提供する。薬剤組成物は、無菌の注射用水性または油性懸濁剤または液剤の形態で調製、包装または販売することができる。この懸濁剤または液剤は、既知の技術に従って調剤することができ、有効成分に加えて、本明細書で述べるような分散剤、加湿剤または懸濁化剤などの追加の成分を含んでいてよい。そのような無菌注射剤は、例えば、水または１，３−ブタンジオールなどの非経口で許容できる無毒性希釈剤または溶媒を用いて調製することができる。他の許容できる希釈剤および溶媒は、リンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液および合成モノまたはジグリセリドのような固定油などである。有用である他の非経口投与可能な製剤としては、リポソーム製剤中に微結晶の形態の、または生分解性ポリマーシステムの成分としての有効成分を含むものなどがある。徐放または埋込み用組成物は、乳剤、イオン交換樹脂、わずかに溶けるポリマーまたはわずかに溶ける塩などの製薬上許容できるポリマーまたは疎水性物質を含んでいてよい。
【０１２４】
これらの組成物は、保存剤、加湿剤、乳化剤および／または分散剤などの佐剤も含んでいてよい。組成物の微生物汚染の予防は、種々の抗菌および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸等の添加により達成することができる。等張剤、例えば、糖、塩化ナトリウム等を含むことも望ましい。注射用薬剤組成物の長期吸収は、吸収を遅延させることができる物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよび／またはゼラチンを用いることによってもたらすことができる。
【０１２５】
剤形は、固体または注射可能な埋込み剤もしくはデポー剤を含み得る。好ましい実施形態において、埋込み剤は、微粒子送達システムの一部および生分解性ポリマーを含む。好ましい実施形態において、適切な生分解性ポリマーは、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、ポリ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、ポリ（ε−カプロラクトン）、ポリ酸無水物、ポリ（β−ヒドロキシ酪酸）、ポリ（オルトエステル）およびポリホスファゼンからなる群から選択することができる。
【０１２６】
経口投与用固体剤形は、カプセル剤、錠剤、散剤および顆粒剤などである。そのような固体剤形において、微粒子送達システムは、クエン酸ナトリウムもしくはリン酸二カルシウムなどの少なくとも１つの通常の不活性賦形剤（もしくは担体）または（ａ）例えば、デンプン、ラクトース、スクロース、マンニトールもしくはケイ酸のような充填剤もしくは増量剤、（ｂ）例えば、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースもしくはアラビアゴムのような結合剤、（ｃ）例えば、グリセロールのような湿潤剤、（ｄ）例えば、カンテン、炭酸カルシウム、ジャガイモもしくはタピオカデンプン、アルギン酸、特定の複合ケイ酸塩もしくは炭酸ナトリウムのような崩壊剤、（ｅ）例えば、パラフィンのような溶液凝固遅延剤、（ｆ）例えば、第四級アンモニウム化合物のような吸収促進剤、（ｇ）例えば、セチルアルコールもしくはモノステアリン酸グリセロールのような加湿剤、（ｈ）例えば、カオリンもしくはベントナイトのような吸着剤、および／または（ｉ）例えば、タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウムもしくはそれらの混合物のような滑沢剤と場合によって混合されている。
【０１２７】
微粒子送達システムを含む錠剤は、例えば、有効成分を場合によって１つまたは複数の追加の成分とともに圧縮または成形して調製することができる。圧縮錠剤は、結合剤、滑沢剤、賦形剤、界面活性剤および分散剤のうちの１つまたは複数のものと場合によって混合されている散剤または顆粒剤のような流動性の形態の有効成分を適切な装置で圧縮して調製することができる。成形錠剤は、有効成分、製薬上許容できる担体および混合物を湿らせるのに少なくとも十分な液体の混合物を適切な装置で成形して調製することができる。錠剤の製造に用いる製薬上許容できる賦形剤は、不活性希釈剤、造粒剤および崩壊剤、結合剤ならびに滑沢剤などである。既知の分散剤は、ジャガイモデンプンおよびデンプングリコール酸ナトリウムなどである。既知の界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウムなどである。既知の希釈剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、微結晶性セルロース、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびリン酸ナトリウムなどである。既知の造粒剤および崩壊剤は、トウモロコシデンプンおよびアルギン酸などである。既知の結合剤は、ゼラチン、アラビアゴム、アルファ化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンおよびヒドロキシプロピルメチルセルロースなどである。既知の滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、シリカおよびタルクなどである。
【０１２８】
錠剤は、非被覆であってよく、あるいはヒトの胃腸管における崩壊の遅延を達成し、それにより、例えば、小腸のパイエル板の領域における微粒子送達システムの持続的放出および吸収をもたらす既知の方法を用いて被覆することができる。例として、モノステアリン酸グリセリルまたはジステアリン酸グリセリルのような物質は、錠剤を被覆するのに用いることができる。さらに例として、錠剤を米国特許第４２５６１０８号、第４１６０４５２号および第４２６５８７４号に記載されている方法を用いて被覆して、浸透圧により放出が制御される錠剤を製造することができる。錠剤はさらに、製薬上上質かつ味のよい製剤を提供するために、甘味料、着香剤、着色剤、保存剤またはこれらのいくつかの組合せを含んでいてよい。
【０１２９】
錠剤、糖衣丸、カプセル剤および顆粒剤などの固形剤形は、腸溶コーティングなどのコーティングまたは外皮および当技術分野でよく知られている他の方法を用いて調製することができる。それらは、不透明化剤も含んでいてよく、また、微粒子送達システムの遅延放出を示すような組成物であってもよい。用いることができる埋込み組成物の例は、ポリマー物質またはワックスである。活性化合物は、適切な場合、１つまたは複数の上記の賦形剤を含むマイクロカプセル化形態であってもよい。
【０１３０】
同様な種類の固形組成物は、ラクトースまたは乳糖のような賦形剤ならびに高分子量ポリエチレングリコール等を用いた軟質または硬質充填ゼラチンカプセル剤における充填剤としても用いることもできる。微粒子送達システムを含む硬質カプセル剤は、ゼラチンのような生理的に分解可能な組成物を用いて調製することができる。そのような硬質カプセル剤は、微粒子送達システムを含み、また例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリンなどの不活性固体希釈剤を含む追加の成分をさらに含んでいてよい。微粒子送達システムを含む軟質カプセル剤は、ゼラチンのような生理的に分解可能な組成物を用いて調製することができる。そのような軟質カプセル剤は、水または落花生油、流動パラフィンもしくはオリーブ油などの油媒体と混合することができる微粒子送達システムを含む。
【０１３１】
経口組成物は、患者の小または大腸において経口投与薬剤を特異的に放出する既知の技術を用いて調製することができる。例えば、結腸を含む胃腸系に送達する製剤としては、ポリマーのみが小腸への入口で溶解し始めるように、ｐＨ６以上でのみ溶ける例えば、ポリ（メタクリル酸、メチルメタクリレート）のようなメタクリレートコポリマーに基づく腸溶システムなどがある。そのようなポリマー製剤崩壊する部位は、腸における移動速度と存在するポリマーの量に依存する。例えば、比較的厚いポリマーコーティングは、近位結腸に送達するために用いる（Hardyら、１９８７年、Aliment.Pharmacol.Therap. １：２７３〜２８０頁）。部位特異的結腸送達をもたらすことができるポリマーも用いることができる。この場合、ポリマーは、ポリマー被覆物の酵素分解とひいては薬剤の放出をもたらすために大腸の細菌叢に依拠している。例えば、アゾポリマー（米国特許第４６６３３０８号）、グリコシド（Friendら、１９８４年、J.Med.Chem. ２７：２６１〜２６８頁）および様々な天然および修飾多糖（ＰＴＣ出願ＰＴＣ／ＧＢ８９／００５８１）は、そのような製剤に用いることができる。
【０１３２】
米国特許第４７７７０４９号に記述されているようなパルス放出技術も胃腸管内の特定の位置に微粒子送達システムを投与するのに用いることができる。そのようなシステムは、あらかじめ定めた時間での送達を可能にし、場合によって、ｉｎ  ｖｉｖｏ放出を可能にするための水の存在以外の外的条件に依拠せずに、安定性と取り込みを促進するために局所微小環境を直接変化させることができる他の添加剤とともに微粒子送達システムを送達するのに用いることができる。
【０１３３】
経口投与用液体剤形としては、製薬上許容できる乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤およびエリキシル剤などがある。液体剤形は、活性化合物に加えて、水もしくは他の溶媒、等張食塩水、例えば、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、油、特に、アーモンド油、ラッカセイ油、ココナツ油、塊根植物油、トウモロコシ油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油、MIGLYOL（商標）、グリセロール、分留植物油、流動パラフィンのような鉱油、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステルまたはこれらの物質の混合物等のような可溶化剤および乳化剤などの当技術分野で一般的に用いられている不活性希釈剤を含んでいてよい。そのような不活性希釈剤のほかに、組成物は、加湿剤、乳化剤および懸濁化剤、粘滑剤、保存剤、緩衝剤、塩、甘味料、着香剤、着色剤および芳香剤などの佐剤も含んでいてよい。懸濁剤は、活性化合物に加えて、例えば、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタールもしくはソルビタンエステル、微結晶性セルロース、水素化可食脂肪、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントゴム、アラビアゴム、カンテンならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなどのセルロース誘導体、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイトまたはこれらの物質の混合物等の懸濁化剤を含んでいてよい。経口投与に適する本発明の薬剤組成物の液体製剤は、液体または使用前に水もしくは他の適切な媒体で再構成することを意図する乾燥製品の形態で調製、包装および販売することができる。
【０１３４】
既知の分散化または加湿剤としては、レシチンなどの天然に存在するホスファチド、アルキレンオキシドと脂肪酸との、長鎖脂肪族アルコールとの、脂肪酸およびヘキシトール由来の部分エステルとの、または脂肪酸およびヘキシトール無水物由来の部分エステルとの縮合生成物（例えば、それぞれステアリン酸ポリオキシエチレン、ヘプタデカエチレンオキシセタノール、ポリエチレンモノオレイン酸ソルビトールおよびポリエチレンモノオレイン酸ソルビタン）などがある。既知の乳化剤は、レシチンおよびアラビアゴムなどである。既知の保存剤は、メチル、エチルまたはｎ−プロピル−パラヒドロキシ安息香酸エステル、アスコルビン酸およびソルビン酸などである。既知の甘味料は、例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロースおよびサッカリンなどである。既知の粘稠化剤は、例えば、蜜ろう、硬質パラフィンおよびセチルアルコールなどである。
【０１３５】
他の実施形態において、薬剤組成物は、機能食品、すなわち、食品の形態もしくは食品に添加した形態（例えば、直接摂取を意図する加工品）または食材（摂取前に食品に混入することを意図する可食成分）として調製することができる。適切な食品の例としては、棒付きキャンディーのようなキャンディー、クラッカー、パン、クッキーおよびスナックケーキのような焼き物、全、裏ごしまたはマッシュ果実および野菜、ならびに加工肉製品などがある。適切な食材の例としては、製粉加工穀物および糖、香辛料および他の調味料、ならびにシロップなどがある。本明細書で述べる微粒子送達システムは、化合物の分解を最小限にするために、長時間にわたり高調理温度に曝露しないことが好ましい。
【０１３６】
直腸または膣投与用組成物は、通常の室温で固体であるが、体温で液体であり、したがって、直腸または膣腔内で融解し、微粒子送達システムを放出するココアバター、ポリエチレングリコールまたは坐剤ワックスなどの適切な非刺激性賦形剤または担体と微粒子送達システムを混合して調製することができる。そのような組成物は、例えば、坐剤、停留浣腸製剤および直腸もしくは結腸潅注用液剤の形態であってよい。坐剤は、さらに抗酸化剤および保存剤を含む様々な追加の成分を含んでいてよい。停留浣腸製剤または直腸もしくは結腸潅注用液剤は、有効成分と製薬上許容できる液体担体とを混合することにより調製することができる。当技術分野で知られているように、浣腸製剤は、ヒトの直腸の解剖学的構造に適応させた送達用具を用いて投与することができ、また該送達用具内に包装することができる。浣腸製剤は、さらに抗酸化剤および保存剤を含む様々な追加の成分を含んでいてよい。
【０１３７】
本発明の薬剤組成物は、口腔を介しての肺投与に適する製剤として調製、包装または販売することができる。そのような組成物は、散剤を分散させるための噴射剤の流れを導くことができる乾燥散剤リザーバーを含む装置を用いて、あるいは密閉容器内の低沸点噴射剤中に懸濁させた微粒子送達システムを含む装置などの自己噴射性溶媒／散剤分配容器を用いて投与するための乾燥散剤の形態であることが都合がよい。乾燥散剤組成物は、糖などの固体微細粉末を含んでいてよく、単位剤形で提供することが都合がよい。低沸点噴射剤は、一般的に大気圧で６５°Ｆ（１８．３℃）以下の沸点を有する液体噴射剤を含む。一般的に噴射剤は組成物の５０〜９９．９％（重量／重量）を構成していてよく、有効成分は組成物の０．１〜２０％（重量／重量）を構成していてよい。噴射剤は、さらに液体非イオン性または固体陰イオン界面活性剤または固体希釈剤（好ましくは微粒子送達システムを構成する粒子と同程度の粒径を有する）のような追加の成分を含んでいてよい。
【０１３８】
肺送達用に製剤化された本発明の薬剤組成物も懸濁剤の液滴の形態の有効成分を提供することができる。そのような製剤は、微粒子送達システムを含む、場合によって無菌の水性または希アルコール性懸濁剤として調製、包装または販売することができ、噴霧または霧化装置を用いて都合よく投与することができる。そのような製剤は、サッカリンナトリウムなどの着香料、揮発油、緩衝剤、界面活性剤またはメチルヒドロキシ安息香酸エステルなどの保存剤を含む１つまたは複数の追加の成分を含んでいてよい。
【０１３９】
本明細書で肺送達に有用であると述べた製剤は、本発明の薬剤組成物の鼻内送達にも有用である。鼻内投与に適する他の製剤は、微粒子送達システムを含む粗散剤である。そのような製剤は、吹入剤を服用する方法、すなわち、外鼻孔近くに保持した散剤の容器からの鼻腔を介しての急速な吸入により投与する。
【０１４０】
本発明の薬剤組成物は、口腔内投与に適する製剤として調製、包装または販売することができる。そのような製剤は、例えば、通常の方法を用いて製造された錠剤またはトローチ剤の形態であってよく、例えば、０．１〜２０％（重量／重量）の微粒子送達システムを含み、残りは経口で溶解性または分解性の組成物ならびに場合によって、本明細書で述べた１つまたは複数の成分を含んでいてよい。あるいは、口腔内投与に適する製剤は、微粒子送達システムを含む散剤あるいはエアゾール化もしくは霧化した液剤または懸濁剤を含んでいてよい。
【０１４１】
抗体
本明細書で用いるように、「抗体」（Ａｂ）または「モノクローナル抗体」（Ｍａｂ）という用語は、タンパク質に特異的に結合することができる完全な分子ならびに抗体フラグメント（例えば、ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメント）を含むことを意味する。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、完全な抗体のＦｃフラグメントを欠き、完全な抗体より循環から速やかに消失し、少ない非特異的組織結合を有する。したがって、Ｆａｂの産物または他の免疫グロブリン発現ライブラリーと同様に、これらのフラグメントは好ましい。さらに、本発明の抗体は、キメラ、単鎖および人化抗体を含む。
【０１４２】
抗体は、当技術分野で知られているかなり多数の技術を用いて調製することができる。適切な技術は、下で簡単に述べる。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであってよい。ポリクローナル抗体は、産生の迅速性ならびに強い免疫蛍光染色および抗原捕捉を保証する複数のエピトープに対する特異性を含む最初の開発に関して重要な利点を有する可能性がある。モノクローナル抗体は、大規模生産に適応できる。好ましい実施形態は、標的抗原のエピトープに対して特異的な少なくとも１つのモノクローナル抗体を含む。ポリクローナル調製物は大規模生産で容易に複製することができないため、他の実施形態では、少なくとも４つのモノクローナル抗体のカクテルを用いる。
【０１４３】
単鎖Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」または「ｓＦｖ」）ポリペプチドは、直接結合またはペプチドをコードするリンカーにより結合しているＶＨおよびＶＬをコードする配列を含む核酸から発現させることができる共有結合ＶＨ：ＶＬヘテロダイマーである（Hustonら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA、８５：５８７９〜５８８３頁（１９８８年））。天然で凝集しているが、化学的には分離している抗体Ｖ領域の軽および重ペプチド鎖を、抗原結合部位の構造に実質的に類似している三次元構造に折りたたまれているｓｃＦｖ分子に変換するための多くの構造がある。例えば、米国特許第６５１２０９７号、第５０９１５１３号および第５１３２４０５号および第４９５６７７８号を参照のこと。
【０１４４】
１つのクラスの実施形態において、組換え設計法を用いて、２つの天然で凝集しているが、化学的には分離している抗体可変領域の軽および重ペプチド鎖を、ネイティブ抗体構造に実質的に類似している三次元構造に折りたたまれているｓＦｖ分子に変換するための適切な化学構造（リンカー）を開発することができる。設計基準は、１つの鎖のＣ末端と他の鎖のＮ末端との間の距離にわたる適切な長さの決定を含む。この場合、リンカーは、コイルまたは二次構造を形成する傾向がない小親水性アミノ酸残基から一般的に形成される。そのような方法は、当技術分野で述べられている。例えば、Hustonらへの米国特許第５０９１５１３号および第５１３２４０５号ならびにLadnerらへの米国特許第４９４６７７８号を参照のこと。
【０１４５】
この点に関して、リンカー設計の最初の一般的な段階は、妥当と思われる結合部位の特定を含む。ＶＨおよびＶＬポリペプチドドメインの各々の適切な結合部位は、ポリペプチドドメインからの残基の最小限の喪失をもたらし、分子の安定性の必要と一致する最小の数の残基を含むリンカーを必要とするものを含む。部位の対は、結合すべき「ギャップ」を定義する。１つのドメインのＣ末端を次のＮ末端に接続するリンカーは、一般的に生理学的溶液中で構造化されていない立体配置をとる親水性アミノ酸を含み、ＶＨおよびＶＬ鎖の適切な折りたたみを妨害するような大きい側基を有する残基を含まないことが好ましい。したがって、本発明による適切なリンカーは、一般的にグリシンおよびセリン残基の交互の組のポリペプチド鎖を含み、溶解度を増大させるために挿入されたグルタミン酸およびリシン残基を含んでいてよい。そのようなリンカー部分をコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で知られている種々のオリゴヌクレオチド合成法を用いて容易に提供することができる。
【０１４６】
あるいは、ヒト化抗体フラグメントは、マウスモノクローナル抗体の抗原結合部位およびヒト抗体由来の可変領域フラグメント（抗原結合部位を欠く）を含んでいてよい。キメラおよびさらに遺伝子工学により改変したモノクローナル抗体の生産の方法は、Riechmannら（Nature ３３２：３２３頁、１９８８年）、Liuら（PNAS ８４：３４３９頁、１９８７年）、Larrickら（Bio Technology ７：９３４頁、１９８９年）ならびにWinterおよびHarris（TIPS １４：１３９頁、１９９３年５月）に記載されている方法を含む。
【０１４７】
ヒト抗体を生産する１つの方法は、トランスジェニックマウスのようなヒト以外の動物を標的抗原で免疫化し、それにより、標的抗原に対して誘導される抗体を前記動物において生成させることを含む。ヒト以外の動物におけるヒト抗体を生成させる方法が開発された。抗体は、部分的にヒトであるか、または好ましくは完全にヒトであってよい。１つまたは複数のヒト免疫グロブリン鎖をコードする遺伝物質が導入されたヒト以外の動物（トランスジェニックマウスのような）を用いることができる。そのようなトランスジェニックマウスは、様々な方法で遺伝的に改変することができる。遺伝子操作により、免疫化により動物によって産生された少なくとも一部（好ましくは実際上すべて）の抗体における内因性免疫グロブリン鎖を置換したヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖が得られる可能性がある。標的抗原によりトランスジェニック動物を免疫化することにより産生された抗体を本明細書に示す。
【０１４８】
１つまたは複数の内因性免疫グロブリン遺伝子が種々の手段により不活性化されているマウスが作られた。ヒト免疫グロブリン遺伝子をマウスに導入して、不活性化マウス遺伝子を置換した。動物において産生された抗体は、動物に導入されたヒト遺伝物質によってコードされるヒト免疫グロブリンポリペプチド鎖を組み込んでいる。産生の技術およびそのようなトランスジェニック動物の使用の例は、参照により本明細書に組み込まれている米国特許第５８１４３１８号、第５５６９８２５号および第５５４５８０６号に記述されている。
【０１４９】
モノクローナル抗体は、通常の方法、例えば、免疫化スケジュールの完了後にトランスジェニック動物から収集された不死化脾臓細胞により産生させることができる。通常の方法により、脾臓細胞を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を生成させることができる。
【０１５０】
ハイブリドーマ細胞系を生成させる方法は、標的抗原の少なくとも７つの近接するアミノ酸残基を含む免疫原でそのようなトランスジェニック動物を免疫化する段階、収集した脾臓細胞を骨髄腫細胞系に融合させ、それにより、ハイブリドーマ細胞を生成させる段階、および標的抗原に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞系を特定する段階を含む。そのようなハイブリドーマ細胞系およびそれから産生されるモノクローナル抗体は、本発明により包含される。ハイブリドーマ細胞系により分泌されるモノクローナル抗体は、通常の技術により精製される。
【０１５１】
他の実施形態において、抗体フラグメントは、一連の競合的抗原の存在下で１組の抗原に対する非免疫ファージディスプレイ抗体レパートリーからの選択により産生させる（Stausbol-Gron B.ら、ファージディスプレイサブトラクションによる細胞型特異抗体−抗原対の新規の特定（De novo identification of cell-type specific antibody-antigen pairs by phage display subtraction）。ヒトケラチン１４に対するヒト単鎖抗体フラグメントの分離（Isolation of a human single chain antibody fragment against human keratin １４）。Eur J Biochem ２００１年５月、２６８（１０）：３０９９〜１０７頁）。このアプローチを用いて、標的抗原に対するファージ抗体を産生させることができる。プロトコールは、一般的にStausbol-Gron B.ら（２００１年）により記載されたものに基づいている。簡単に述べると、非免疫化半合成ファージディスプレイ抗体レパートリーを用いる。該レパートリーは、ｌｏｘライブラリーの重および軽鎖領域を再クローニングすることにより構築される単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ファージミドである（Griffiths A.D.ら（１９９４）大合成レパートリーからの高親和力ヒト抗体の直接的分離（Isolation of high affinity human antibodies directly from large synthetic repertoires, EMBO J. １３、３２４５〜３２６０頁）。大腸菌ＴＧ１（ｓｕｐＥ  ｈｓｄＤ５Δ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｔｈｉＦ’｛ｔｒａＤ３６ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃｑｌａｃＺΔ１５｝）は、アンバーサプレッサー株（ｓｕｐＥ）であり、ファージ粒子の増殖に用いる。大腸菌ＨＢ２１５１（ａｒａΔ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）ｔｈｉＦ’｛ｐｒｏＡＢ＋ｌａｃ）ｑｌａｃＺΔ１５｝）は、ノンサプレッサー株であり、可溶性ｓｃＦｖの発現に用いる。他の実施形態において、記載されているように、ヒト単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ライブラリーを増幅し、救出することができる（Gaoら、化学を感染力に関連づけることにより、化学を選択可
能にする（Making chemistry selectable by linking it to infectivity）、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、９４巻、１１７７７〜１１７８２頁、１９９７年１０月）。ライブラリーをＰＢＳ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に懸濁した標的抗原に対してパンニングし、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ）により陽性ｓｃＦｖファージを選択する。
【０１５２】
他の実施形態において、組換え抗体、好ましくは単鎖Ｆｖ抗体をコードする発現ベクターを供給することにより、抗体を提供する。
【実施例】
【０１５３】
（実施例１）
図１は、外側から内側に、外側原線維層１１０、外側マンノプロテイン層１２０、β−グルカン層１３０、β−グルカン−キチン層１４０、内側マンノプロテイン層１５０、原形質膜１６０および細胞質１７０を示す酵母細胞壁の横断切片の概略図１００である。
【０１５４】
ＷＧＰ粒子の調製
全グルカン粒子（ＷＧＰ、ロットＷ０２８２）は、事前にAlpha-Beta Technologyから入手した。一般的に、全グルカン粒子は、酵母細胞壁からアルカリ不溶性グルカン画分を抽出し、精製することにより酵母細胞から調製する。酵母細胞を酵母細胞壁を破壊することなく水性水酸化物溶液で処理して、細胞のタンパク質および細胞内部分を消化し、有意なタンパク質の混入がなく、β（１−６）およびβ（１−３）結合グルカンの実質的に不変の細胞壁構造を有するグルカン壁成分を残す。酵母細胞（サッカロミセス セレビシエ 株Ｒ４）をフェドバッチ発酵条件下で最少培地中で対数増殖期中期まで増殖させた。２０００ｒｐｍで１０分間のバッチ遠心分離により、細胞（約９０ｇ乾燥細胞重量／Ｌ）を収集した。次いで、細胞を蒸留水で１回洗浄し、１リットルの１Ｍ  ＮａＯＨに再懸濁し、９０℃に加熱した。細胞懸濁液をこの温度で１時間激しく攪拌した。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、細胞壁を含む不溶性物質を回収した。次いで、この物質を１リットルの１Ｍ  ＮａＯＨに再懸濁し、９０℃に再び加熱した。懸濁液をこの温度で１時間激しく攪拌した。次いで、懸濁液を室温に冷却し、抽出をさらに１６時間続けた。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、不溶性残留物を回収した。この物質をＨＣｌでｐＨ４．５とした１リットルの水で７５℃で１時間最終的に抽出した。不溶性残留物を遠心分離により回収し、２００ｍＬの水で３回、２００ｍＬのイソプロパノールで４回、２００ｍＬのアセトンで２回洗浄した。得られたスラリーをガラストレーに入れ、減圧下で５５℃で乾燥して７．７ｇの微細白色粉末を得た。
【０１５５】
全グルカン粒子およびそれらを調製する方法のより詳細は、教示が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第４８１０６４６号、第４９９２５４０号、第５０２８７０３号、第５６０７６７７号および第５７４１４９５号に見いだすことができる。例えば、米国特許第５０２８７０３号は、酵母ＷＧＰ粒子は発酵培養における酵母細胞から生成することができることを開示している。Sorval ＲＣ２−Ｂ遠心分離機で８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して細胞を収集した。次いで、全グルカンの抽出のためにそれらを調製するために細胞を蒸留水で２回洗浄した。最初の段階は、細胞塊を１リットルの４重量／体積％ＮａＯＨに再懸濁し、１００℃に加熱することを必要とした。細胞懸濁液をこの温度で１時間激しく攪拌した。２０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により、細胞壁を含む不溶性物質を回収した。次いで、この物質を２リットルの３重量／体積％ＮａＯＨに再懸濁し、７５℃に加熱した。懸濁液をこの温度で３時間激しく攪拌した。次いで、懸濁液を室温に冷却し、抽出をさらに１６時間続けた。２０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により、不溶性残留物を回収した。この物質をＨＣｌでｐＨ４．５とした２リットルの３重量／体積％ＮａＯＨで７５℃で１時間最終的に抽出した。遠心分離により不溶性残留物を回収し、２００ｍＬの水で３回、２００ｍＬの脱水エタノールで１回、２００ｍＬの脱水エチルエーテルで２回洗浄した。得られたスラリーをペトリプレートにのせ、乾燥した。
【０１５６】
ＹＧＭＰ粒子の調製
サッカロミセス セレビシエ（１００ｇ Fleishmans Bakers酵母）を１リットルの１Ｍ  ＮａＯＨに懸濁し、５５℃に加熱した。細胞懸濁液をこの温度で１時間混合した。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、細胞壁を含む不溶性物質を回収した。次いで、この物質を１リットルの水に懸濁し、ＨＣｌでｐＨ４〜５とし、５５℃で１時間インキュベートした。不溶性残留物を遠心分離により回収し、１０００ｍＬの水で１回、２００ｍＬの脱水イソプロパノールで４回、２００ｍＬのアセトンで２回洗浄した。得られたスラリーをガラストレーに入れ、室温で乾燥して１２．４ｇのわずかに灰色がかった白色の微細な粉末を得た。
【０１５７】
ＹＧＭＰ粒子の調製
サッカロミセス セレビシエ（７５ｇ  ＳＡＦ−マンナン）を１リットルの水に懸濁し、１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ１２〜１２．５に調整し、５５℃に加熱した。細胞懸濁液をこの温度で１時間混合した。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、細胞壁を含む不溶性物質を回収した。次いで、この物質を１リットルの水に懸濁し、ＨＣｌでｐＨ４〜５とし、５５℃で１時間インキュベートした。不溶性残留物を遠心分離により回収し、１０００ｍＬの水で１回、２００ｍＬの脱水イソプロパノールで４回、２００ｍＬのアセトンで２回洗浄した。得られたスラリーをガラストレーに入れ、室温で乾燥して１５．６ｇのわずかに灰色がかった白色の微細な粉末を得た。
【０１５８】
ＹＣＰ粒子の調製
American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、Manassas、ヴァージニア州）から入手した培養物から得られた酵母細胞（ロドトルラ（Rhodotorula）属の種）をＹＰＤで３０℃で定常期まで嫌気的に増殖させた。ＴＣＣから入手可能なロドトルラ属の種の培養は、番号８８６、９１７、９３３６、１８１０１、２０２５４、２０８３７および２８９８３を含んでいる。２０００ｒｐｍで１０分間のバッチ遠心分離により、細胞（１Ｌ）を収集した。細胞を蒸留水で１回洗浄し、ＨＣｌでｐＨ４．５とした水に７５℃で１時間再懸濁した。２０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離により、細胞壁を含む不溶性物質を回収した。次いで、この物質を１リットルの１Ｍ  ＮａＯＨに再懸濁し、９０℃に１時間加熱した。次いで、懸濁液を室温に冷却し、抽出をさらに１６時間続けた。２０００ｒｐｍで１５分間の遠心分離により、不溶性残留物を回収し、１０００ｍＬの水で２回、２００ｍＬのイソプロパノールで４回、２００ｍＬのアセトンで２回洗浄した。得られたスラリーをガラストレーに入れ、室温で乾燥して２．７ｇの微細な淡褐色粉末を得た。
【０１５９】
図２Ａは、酵母細胞壁粒子の構造を示す図である。図２Ｂは、酵母細胞壁粒子のマンナン成分のコンカナバリン−Ａ−ＦＩＴＣ（Ｃｏｎ−Ａ−フルオレセインイソチオシアネート、Sigma Chemical, St.Louis, ミズーリ州）染色を示す蛍光顕微鏡写真である。図２Ｃは、ＹＧＭＰβ−グルカン−マンナン粒子の構造を示す図である。図２Ｄは、ＹＧＭＰβ−グルカン−マンナン粒子の強調Ｃｏｎ−Ａ−ＦＩＴＣ染色を示す蛍光顕微鏡写真である。図２Ｅは、ＹＧＰβ−グルカン−マンナン粒子の構造を示す図である。図２Ｆは、ＹＧＰβ−グルカン粒子のＣｏｎ−Ａ−ＦＩＴＣ染色の非存在を示す蛍光顕微鏡写真である。
【０１６０】
コンカナバリンＡは、マンノースに選択的に結合するレクチンである。種々の酵母細胞壁調製物の表面上のマンナンの量および分布パターンを観測するために、コンカナバリンＡ−ＦＩＴＣ結合を蛍光顕微鏡により評価した。ＰＢＳ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２中パン酵母（Fleishmansパン酵母）、ＹＧＭＰおよびＹＧＰの懸濁液を１×１０８粒子／ｍｌの密度で調製した。Ｃｏｎ−Ａ−ＦＩＴＣ保存溶液は、ＰＢＳ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２中１ｍｇ／ｍｌコンカナバリンＡ−ＦＩＴＣであった。以下の成分からなる標識混合物をマイクロ遠心管中で調製した。
【０１６１】
１００μｌのＰＢＳ＋１ｍＭ  ＭｇＣｌ２＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２
２．５μｌの酵母細胞壁粒子懸濁液
２．５μｌのＣｏｎ−Ａ−ＦＩＴＣ保存溶液
【０１６２】
標識混合物を含むマイクロ遠心管を暗所で室温で１時間インキュベートした。遠心分離（１０，０００ｒｐｍで１０分間）により酵母細胞壁粒子を収集した後、ペレットを１００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。洗浄した酵母細胞壁粒子を１００μｌのＰＢＳに再懸濁し、蛍光顕微鏡で検査するために９６ウェルプレートに移した。実例としての視野の写真を図２Ｂ、２Ｄおよび２Ｆに示す。
【０１６３】
表１に上述のように調製したＷＧＰ粒子、ＹＧＰ粒子、ＹＧＭＰ粒子およびＹＣＰ粒子の化学組成の分析の結果を要約する。ＹＧＰ粒子およびＹＧＭＰ粒子は従来技術のＷＧＰ粒子と比較して低β−グルカンおよび高タンパク質であることに注意すること。ＹＧＭＰ粒子は、他の粒子型と比較して実質的に高いマンナン含量を有する。ＹＧＰ粒子は、他の粒子型と比較して実質的に高いキチン＋キトサン含量を有する。
【表１】
2008503472.tif 000002
【０１６４】
（実施例２  酵母細胞壁粒子の流体力学的体積）
酵母細胞壁粒子の流体力学的体積は、粒子のペイロード容量の尺度として測定した。酵母細胞壁粒子の１ｇずつを風袋控除１５ｍｌ遠心管中で重量を測定して、乾燥粒子の重量を測定した。水（１２．５ｍｌ）を遠心管に加え、遠心管をボルテックスミキサーにかけて酵母細胞壁粒子の懸濁液を混合した。粒子を膨潤させ、水を３０分間吸収させた。粒子懸濁液を２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水を除去し、遠心管を秤量し、吸収された水の重量を計算した。流体力学的体積は、吸収された水の重量と乾燥粒子の重量との比として計算した。表２に従来技術のＷＧＰの２つの調製物ならびに本発明のＹＧＰおよびＹＧＭＰの結果を示す。
【表２】
2008503472.tif 000003
【０１６５】
ＷＧＰ調製物２の流体力学的体積がより低いことは、この調製物中の断片化した粒子の数が多いためと思われる。他の粒子に関しては、「より純粋な」ＹＧＰはＹＧＭＰより高い流体力学的体積を有していた。
【０１６６】
一般的に、酵母細胞壁粒子によるペイロードの定量的吸収を確保するために、ペイロードの体積を流体力学的体積の６６％未満に制限した。この規則により、１ｍｇのＹＧＭ粒子当たり５．５μｌ以下のペイロードが添加され、１ｍｇのＹＧＭＰ粒子当たり４．４μｌ以下のペイロードが添加されるであろう。
【０１６７】
（実施例３  ＹＧＭおよびＹＧＭＰの経口バイオアベイラビリティ）
蛍光標識酵母グルカン粒子（ＹＧＰ−Ｆ）および蛍光標識酵母グルカン−マンナン粒子（ＹＧＭＰ−Ｆ）を取込み試験用に調製した。出発材料は、５ｍｌのＹＧＰ（０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８中５ｍｇ／ｍｌ）、５ｍｌのＹＧＭＰ（０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８中５ｍｇ／ｍｌ）、新たに調製したＤＭＳＯ中２０ｍｇ／ｍｌジクロロトリアジニルアミノフルオレセイン（ＤＴＡＦ）および０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８であった。
【０１６８】
標識反応を２５ｍｇのスケールで行った。２５ｍｇずつの粒子を５ｍｌの０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８に懸濁し、音波処理して粒子の凝集塊を単一粒子に分解した。粒子を遠心分離し、５ｍｌの０．１Ｍホウ酸緩衝液、ｐＨ８に再懸濁した。ＤＴＡＦ（０．５ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ）を再懸濁粒子に加え、３７℃で２日間インキュベートした。インキュベーションの終了時に、５ｍｌの１Ｍトリス緩衝液、ｐＨ８．３を加え、混合物を３０分間インキュベートしてＤＴＡＦを消光させた。インキュベートした粒子を遠心分離し、上清が蛍光を発しなくなるまで、ＰＢＳで洗浄した。洗浄済み粒子を５ｍｇ／ｍｌでＰＢＳに再懸濁した。試料の一部の１：１００希釈物中の粒子の数を数えた。結果：強い蛍光を発する酵母細胞壁粒子が１ｍｌ当たり１．８×１０９ＹＧＰ−Ｆ粒子および１ｍｌ当たり２．１×１０９ＹＧＭＰ−Ｆ粒子の濃度で得られた。
【０１６９】
ペイロードの食作用粒子取込みがマンノース受容体ならびにＣＲ３／デクチン−１βグルカン受容体により標的とされ得るかどうかを検討するために、酵母グルカン粒子の経口バイオアベイラビリティに対する表面炭水化物組成の影響を試験した。いずれかまたは両受容体を標的にする能力は、細胞の標的集団をマクロファージおよび樹状細胞を超えて拡大することができる。
【０１７０】
投与群を下の表３に要約する。出発材料は、ＦＩＴＣ標識酵母グルカン粒子（ＹＧＰ−Ｆ）、ＦＩＴＣ標識酵母グルカン−マンナン粒子（ＹＧＭＰ−Ｆ）、７匹のＣ５７Blackマウスの群および７匹のＣ５７／Ｂ１６マウスであった。０．１ｍｌのＰＢＳ中同等の数の粒子を投与するためにＹＧＰ−Ｆ（１ｍｇ／ｍｌ）およびＹＧＭＰ−Ｆ（３．７ｍｇ／ｍｌ）の用量を準備し、各群の１匹のマウスに５日間毎日強制経口投与した。各群の１匹のマウスに０．１ｍｌの皮下注射により同じ用量を５日間毎日投与した。４日目にケージを交換し、新しい床敷きを与えた。５日目に各群から糞便ペレットを１５ｍｌコニカル管に収集し、後の処理のために凍結した。糞便ペレットは、５ｍｌの水を加え、４℃で２時間保持して処理した。水和糞便ペレットをPolytronホモジナイザーでホモジナイズした。ホモジナイズした糞便ペレットの希釈物を９６ウェルマイクロタイタープレートに入れ、蛍光および透過白色光条件下で蛍光性粒子の存在を顕微鏡により検査した。蛍光性粒子を有する試料の一部をさらに希釈し、１ｍｌ当たりの蛍光性粒子の数を血球計で数えた。
【０１７１】
７日目にマウスを屠殺し、各動物から脾臓を摘出し、氷上のＰＢＳを含む個別の管に入れた。脾臓を鋏で細切し、７０ミクロンスクリーンに押し当てて通過させ、単一細胞懸濁液を生成させた。単一細胞懸濁液の一部を保持し、ＦＡＣＳを用いて蛍光性粒子で標識した細胞の分率を定量するためにＰＢＳ中１％ホルマリンで固定した。マクロファージマーカーに対するフィコエリトリン（ＰＢ）標識抗体、好ましくは、赤脾髄マクロファージ、クッパー細胞、小グリアおよびランゲルハンス細胞を染色するマウス−１（Ｆ４／８０）を用いて細胞懸濁液を染色した。
【０１７２】
細胞懸濁液を、１０％ウシ胎児血清（JRH Scientific）、ペニシリン−ストレプトマイシンおよびグルタミン（Gibco）を含むＤＭＥＭ中で６０ｍｍペトリ皿当たり１０７細胞の密度で平板培養し、５％ＣＯ２雰囲気中３７℃で２４時間インキュベートし、付着させた。インキュベーション後、非付着リンパ球を洗い流した。付着した脾マクロファージ細胞をトリプシン処理し、固定し、蛍光顕微鏡を用いて蛍光性粒子を有する付着細胞の分率を算定した。
【０１７３】
蛍光性粒子の投与の忍容性は良好であった。付着脾マクロファージの分析により、すべての蛍光性粒子投与動物における蛍光性酵母細胞壁粒子の存在が実証された。これらの結果から、ＹＧＰ−ＦおよびＹＧＭＰ−Ｆは経口で生物学的に利用可能であり、マクロファージによって全身に分布させることができることがわかる。糞便の分析により、蛍光性粒子の存在が示され、用いた用量レベルでは経口吸収が不完全であったことがわかる。Ｃ５７／Ｂ１６マウスは、経口投与したＹＧＰ−ＦおよびＹＧＭＰ−Ｆを吸収することができた。糞便中の蛍光性粒子の数を取込み効率の推定値として定量化した。
【表３】
2008503472.tif 000004
【０１７４】
（実施例４：キトサン添加ＹＧＰ粒子の調製）
陽イオン捕捉ポリマーであるキトサンを用いてＹＧＰ粒子を調製した。高分子量（ＨＭＷ）キトサン（約７０，０００ＭＷ、Sigma Chemical, St. Louis, ミズーリ州）または低分子量（ＨＭＷ）キトサン（約１０，０００ＭＷ、Sigma Chemical, St. Louis, ミズーリ州）を用いて１重量／体積％キトサン溶液を調製した。０．１Ｍ酢酸中１重量／体積％ＨＭＷおよびＬＭＷキトサン溶液を、０．１Ｍ酢酸中で調製した。４ｍｌのＨＭＷおよびＬＭＷキトサン溶液を５０ｍｌコニカル遠心管に入れた２ｇのＹＧＰに加え、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。混合物を室温で１時間インキュベートし、液体を吸収させた。ＮａＯＨ（４０ｍｌ、０．１Ｍ）を各遠心管に加え、直ちにボルテックスミキサーにかけて、ＹＧＰの内部でキトサンを沈殿させた。ＹＧＰ：キトサン懸濁液を１８ゲージ針に通して、ＹＧＰ：キトサン粒子の微細懸濁液を生成させた。ＹＧＰ：キトサン粒子を遠心分離（２０００ｒｐｍで１０分間）により収集した後、上清のｐＨが７〜８になるまで脱イオン水でペレットを洗浄した。次いで、ＹＧＰ：キトサン粒子をペレットの２倍量のイソプロパノールで４回洗浄し、次いで、ペレットの２倍量のアセトンで２回洗浄した。ＹＧＰ：キトサン粒子をドラフト内で室温で乾燥した。この手順により１．２ｇのＹＧＰ：ＬＭＷキトサン粒子および１．４ｇのＹＧＰ：ＨＭＷキトサン粒子が得られた。
【０１７５】
（実施例５：CytoPure（商標）添加ＹＧＰ粒子の調製）
独占権下にある市販の水溶性陽イオンポリマートランスフェクション試薬（Qbiogene Inc., カリフォルニア州）である生分解性陽イオン捕捉ポリマーCytoPure（商標）を用いてＹＧＰ粒子を調製した。２０μｌのCytoPure（商標）を０．５ｍｌの脱イオン水で希釈し、５０ｍｌコニカル遠心管に入れた０．５ｇのＹＧＰに加え、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。混合物を４℃で１５分間インキュベートし、液体を吸収させた。２５ｍｌのエタノールを各遠心管に加え、直ちにボルテックスミキサーにかけて、ＹＧＰの内部でCytoPure（商標）を沈殿させた。ＹＧＰ：CytoPure（商標）懸濁液を音波処理して、ＹＧＰ：CytoPure（商標）粒子の微細な懸濁液を生成させた。ＹＧＰ：CytoPure（商標）粒子を遠心分離（２０００ｒｐｍで１０分間）により収集した後、ペレットをペレットの２倍量のイソプロパノールで４回洗浄し、次いで、ペレットの２倍量のアセトンで２回洗浄した。ＹＧＰ：CytoPure（商標）粒子をドラフト内で室温で乾燥した。この手順により０．４５ｇのＹＧＰ：CytoPure（商標）粒子が得られた。
【０１７６】
（実施例６：ポリエチレンイミン添加ＹＧＰ粒子の調製）
陽イオン捕捉ポリマーとしてのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてＹＧＰ粒子を調製した。水中２重量／体積％ＰＥＩ（約５０，０００ＭＷ、Sigma Chemical, St. Louis, ミズーリ州）溶液の０．５ｍｌずつを５０ｍｌコニカル遠心管に入れた０．５ｇのＹＧＰに加え、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。混合物を室温で１時間インキュベートし、液体を吸収させた。２５ｍｌのエタノールを各遠心管に加え、直ちにボルテックスミキサーにかけて、ＹＧＰの内部でＰＥＩを沈殿させた。ＹＧＰ：ＰＥＩ懸濁液を１８ゲージ針に通して、ＹＧＰ：ＰＥＩ粒子の微細懸濁液を生成させた。ＹＧＰ：ＰＥＩ粒子を遠心分離（２０００ｒｐｍで１０分間）により収集した後、ペレットをペレットの２倍量のイソプロパノールで４回洗浄し、次いで、ペレットの２倍量のアセトンで２回洗浄した。ＹＧＰ：ＰＥＩ粒子をドラフト内室温で乾燥した。この手順により０．４８ｇのＹＧＰ：ＰＥＩ粒子が得られた。
【０１７７】
（実施例７：アルギン酸塩添加ＹＧＰ粒子の調製）
陽イオン捕捉ポリマーとしてのアルギン酸塩（Ｆ２００またはＦ２００Ｌ、Multi-Kem Corp., Ridgefield, ニュージャージー州）を用いてＹＧＰ粒子を調製した。水中１重量／体積％アルギン酸塩溶液の２ｍｌずつを５０ｍｌコニカル遠心管に入れた１ｇのＹＧＰに加え、滑らかなペーストが形成されるまで混合した。混合物を室温で１時間インキュベートし、液体を吸収させた。混合物を４０ｍｌの１重量／体積％塩化カルシウム水溶液で希釈した。ＹＧＰ：アルギン酸塩懸濁液を１８ゲージ針に通して、ＹＧＰ：アルギン酸塩粒子の微細懸濁液を生成させた。ＹＧＰ：アルギン酸塩粒子を遠心分離（２０００ｒｐｍで１０分間）により収集した。ＹＧＰ：アルギン酸塩粒子をペレットの２倍量のイソプロパノールで４回洗浄し、次いで、ペレットの２倍量のアセトンで２回洗浄した。ＹＧＰ：アルギン酸塩粒子をドラフト内で室温で乾燥した。この手順により０．９５ｇのＹＧＰ：Ｆ２００アルギン酸塩粒子および０．８６ｇのＹＧＰ：Ｆ２００Ｌアルギン酸塩粒子が得られた。
【０１７８】
（実施例８：ポリ−Ｌ−リシン添加ＹＧＰおよびＹＧＭＰ粒子の調製）
捕捉ポリマーとしてのポリ−Ｌ−リシン（ＰＬＬ）を用いてＹＧＰおよびＹＧＭＰ粒子を調製した。水中１重量／体積％ＰＬＬ（Sigma Chemical, St. Louis, ミズーリ州）溶液の４ｍｌずつを５０ｍｌコニカル遠心管に入れた１ｇのＹＧＰまたはＹＧＭＰに加えた。混合物を５５℃で３０分間インキュベートして、液体を吸収させた。１０ｍｌのエタノールを各遠心管に加え、ホモジナイズ（Polytronホモジナイザー）してＹＧＰ：ＰＬＬまたはＹＧＭＰ：ＰＬＬ粒子の微細懸濁液を生成させた。ＹＧＰ：ＰＬＬまたはＹＧＭＰ：ＰＬＬ粒子を遠心分離（２０００ｒｐｍで１０分間）により収集した。ＹＧＰ：ＰＬＬまたはＹＧＭＰ：ＰＬＬをペレットの２倍量のイソプロパノールで４回洗浄し、次いで、ペレットの２倍量のアセトンで２回洗浄した。ＹＧＰ：ＰＬＬまたはＹＧＭＰ：ＰＬＬ粒子をドラフト内で室温で乾燥した。この手順により１．３ｇのＹＧＰ：ＰＬＬ粒子および１．１ｇのＹＧＭＰ：ＰＬＬ粒子が得られた。顕微鏡による評価で、遊離のＰＬＬ凝集体は存在せず、ＹＧＰ：ＰＬＬまたはＹＧＭＰ：ＰＬＬ粒子のみが示された。
【０１７９】
（実施例９：キサンタン添加ＹＧＰおよびＹＧＭＰ粒子の調製）
陰イオン捕捉ポリマーとしてのキサンタンを用いてＹＧＰおよびＹＧＭＰ粒子を調製した。水中１重量／体積％キサンタン溶液の４ｍｌずつを５５℃に加熱して粘度を低下させ、５０ｍｌコニカル遠心管に入れた１ｇのＹＧＰまたはＹＧＭＰに加えた。混合物を５５℃で３０分間インキュベートした。１０ｍｌのエタノールを各遠心管に加え、ホモジナイズ（Polytronホモジナイザー）してＹＧＰ：キサンタンまたはＹＧＭＰ：キサンタン粒子の微細懸濁液を生成させた。ＹＧＰ：キサンタンまたはＹＧＭＰ：キサンタン粒子を遠心分離（２０００ｒｐｍで１０分間）により収集した。ＹＧＰ：キサンタンまたはＹＧＭＰ：キサンタン粒子をペレットの２倍量のイソプロパノールで４回洗浄し、次いで、ペレットの２倍量のアセトンで２回洗浄した。ＹＧＰ：キサンタンまたはＹＧＭＰ：キサンタン粒子をドラフト内で室温で乾燥した。この手順により１．２ｇのＹＧＰ：キサンタン粒子および１．１ｇのＹＧＭＰ：キサンタン粒子が得られた。顕微鏡による評価で、遊離のＰＬＬ凝集体は存在せず、ＹＧＰ：キサンタンまたはＹＧＭＰ：キサンタン粒子のみが示された。
【０１８０】
（実施例１０：ＹＧＰ：キトサンおよびＹＧＰ：アルギン酸塩が荷電色素に結合する能力の評価）
ＹＧＰ：キトサンおよびＹＧＰ：アルギン酸塩粒子を上の実施例７および９で述べたように調製した。トリパンブルー（Benzamineブルー、ＣＩ２３８５０）、陰イオン色素およびキシレンシアノール（アシドブルー、陽イオン色素）の０．１重量／体積％水溶液を調製した。５０μｌずつの０．１重量／体積％色素水溶液をマイクロ遠心管に入れた１０ｍｇのＹＧＰ、ＹＧＰ：キトサンまたはＹＧＰ：アルギン酸塩に加え、混合物を室温で１時間インキュベートした。上清溶液がもはや呈色しなくなるまで、ペレットを脱イオン水で洗浄した。ペレットの色を評価した。結果を下の表４に示す。
【表４】
2008503472.tif 000005
【０１８１】
ＹＧＰ内部の不溶性捕捉ポリマー間の静電相互作用は、反対の荷電をもつ低分子量モデル色素ペイロードに結合することができた。
【０１８２】
（実施例１１：物理的閉じ込めにより分子を捕捉するためのＹＧＰ：アガロースの使用）
ペイロードをＹＧＰ中に捕捉する手段としての物理的閉じ込めを評価するために、ＹＧＰ：アガロースを調製した。アガロース（Sigma Chemical, St. Louis, ミズーリ州）のＴＥ中２重量／体積％溶液を調製し、５０℃に冷却した。サケ精子ＤＮＡのＴＥ中１ｍｇ／ｍｌ保存溶液をＴＥまたは５０℃の１％アガロースで０．５ｍｇ／ｍｌＤＮＡに希釈した。５００ｍｇずつのＹＧＰを５００μｌのＴＥ中ＤＮＡまたは５００μｌの５０℃アガロース中ＤＮＡと混合し、混合物を５０℃で１時間インキュベートした。次いで、混合物を冷蔵庫で１時間冷却してアガロースを固化した。１時間後に、１０ｍｌのＴＥを加え、冷蔵庫中で一夜インキュベートした。次いで、混合物を遠心分離し、上清中のＤＮＡを２６０ｎｍでの吸収により測定した。加えたＤＮＡの約８０％以上がＹＧＰ：アガロースにより保持されたのに対して、ＹＧＰ：ＴＥ対照により１％未満が保持された。これらの結果から、アガロースは物理的閉じ込めによりＤＮＡをＹＧＰの内側に効果的に捕捉することがわかる。
【０１８３】
（実施例１２：物理的閉じ込めにより分子を捕捉するためのＹＧＰ：ポリアクリルアミドの使用）
ペイロードをＹＧＰ中に捕捉する手段としての物理的閉じ込めを評価するために、ＹＧＰ：ポリアクリルアミドを調製した。サケ精子ＤＮＡのＴＥ中１ｍｇ／ｍｌ保存溶液をＴＥ中または３０％ポリアクリルアミド／ビス（Sigma Chemical, St. Louis, ミズーリ州）で０．５ｍｇ／ｍｌＤＮＡに希釈した。ＴＥＭＥＤ（Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン）を各ＤＮＡ混合物に加え（１μｌのＴＥＭＥＤを５ｍｌのＤＮＡ溶液に）、各溶液の２ｍｌずつを１ｇのＹＧＰに加えた。混合して均一な懸濁液を形成させ、室温で３時間インキュベートした。３時間インキュベートした後、１０ｍｌのＴＥＡを加え、冷蔵庫中で一夜インキュベートした。次いで、混合物を遠心分離し、上清中のＤＮＡを２６０ｎｍでの吸収により測定した。加えたＤＮＡの約９５％以上がＹＧＰ：ポリアクリルアミドにより保持されたのに対して、ＹＧＰ：ＴＥ対照により１％未満が保持された。これらの結果から、ポリアクリルアミドは物理的閉じ込めによりＤＮＡをＹＧＰの内側に捕捉するのに用いるための有効な捕捉ポリマーであることがわかる。
【０１８４】
（実施例１３：小分子テトラサイクリンのＹＧＰ内への添加）
テトラサイクリンのカルシウム塩の相対的不溶性を用いて抗生物質テトラサイクリン（ｔｅｔ）をＹＧＰに添加した。用いた酵母細胞壁粒子は、上述のように調製したＹＧＰ、ＹＧＰ：Ｆ２００アルギン酸塩およびＹＧＰ：Ｆ２００Ｌアルギン酸塩であった。保存溶液は、１Ｍ  ＣａＣｌ２および１００ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンＨＣｌ（Sigma Chemical, St. Louis, ミズーリ州）であった。添加混合物は、下の表５に要約するように準備した。
【表５】
2008503472.tif 000006
【０１８５】
混合物を室温で３０分間インキュベートし、次いで、示したように脱イオン水または１Ｍ  ＣａＣｌ２を加えた。室温で６０分後、混合物を音波処理し、室温で少なくとも３０分間インキュベートした。次いで、混合物を遠心分離し（２０００ｒｐｍで１０分間）た。テトラサイクリンの存在はペレットの黄色および最初の上清の黄色により示された。酵母細胞壁粒子内に添加されたテトラサイクリンの量は、テトラサイクリン吸収スペクトルのピークである３５５ｎｍでの吸収の喪失から計算した。４μｌの１００ｍｇ／ｍｌテトラサイクリンＨＣｌ保存溶液の２００μｌの脱イオン水による希釈物は、脱イオン水ブランクと比較して３５５ｎｍで０．５３８の吸光度を有していた。添加酵母細胞壁粒子からＰＢＳまたは０．１Ｍ  ＨＣｌ中へのテトラサイクリンの放出も分光光度法により測定した。
【０１８６】
結果を上の表５に要約する。一般的に、ＹＧＰ：Ｆ２００アルギン酸塩およびＹＧＰ：Ｆ２００Ｌアルギン酸塩ペレットは洗浄後に黄色であったが、ＹＧＰペレットは黄色でなかったことから、捕捉ポリマーの非存在下ではテトラサイクリンはあるとしてもほとんど塩酸塩またはカルシウム塩として添加されないことがわかる。これに対して、テトラサイクリンはＹＧＰ：Ｆ２００アルギン酸塩およびＹＧＰ：Ｆ２００Ｌアルギン酸塩製剤に有効に添加され、捕捉され、加えたテトラサイクリン添加量の約２５〜３０％がアルギン酸カルシウム塩として吸収された。捕捉されたテトラサイクリンは、ＹＧＰ：Ｆ２００アルギン酸塩およびＹＧＰ：Ｆ２００Ｌアルギン酸塩から０．１Ｍ  ＨＣｌ中に放出された。捕捉されたテトラサイクリンは、ＰＢＳ中ＹＧＰ：Ｆ２００アルギン酸塩およびＹＧＰ：Ｆ２００Ｌアルギン酸塩に３７℃で１時間部分的に保持され、その値は０．１Ｍ  ＨＣｌで抽出可能な量の約２６．５〜５１．６％であった。
【０１８７】
要約すると、テトラサイクリンは、ＹＧＰ−アルギン酸塩−カルシウム組成物にアルギン酸カルシウム塩複合体として容易に捕捉されたが、ＹＧＰのみには有効に添加かつ保持されなかった。ＹＧＰ：Ｆ２００アルギン酸塩およびＹＧＰ：Ｆ２００Ｌアルギン酸塩にアルギン酸カルシウム塩複合体として捕捉されたテトラサイクリンは、ＰＢＳ中に３７℃で徐々に放出され、酸性条件下では実質的に放出される。
【０１８８】
（実施例１４：Ｊ７７４マクロファージのｉｎ  ｖｉｔｒｏ微生物死滅の増大におけるＴｅｔおよびＹＧＰ：Ｔｅｔの有効性）
ＹＧＰ：アルギン酸塩−ｔｅｔを上の実施例１３で述べたように調製した。保存溶液１ｍｌ当たりのＹＧＰおよびＹＧＰ：アルギン酸塩−ｔｅｔの粒子の数は、それぞれ９×１０７／ｍｌおよび６×１０８／ｍｌであった。
【表６】
2008503472.tif 000007
【０１８９】
上の表６に要約したように、１ｍｌのマウスマクロファージＪ７７４（５×１０５／ｍｌ）を種々の濃度のＹＧＰ、ＹＧＰ：アルギン酸塩−ｔｅｔまたはテトラサイクリンと混合した。
【０１９０】
Ｊ７７４細胞は、培地（抗生物質またはグルタミンを含まない１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ）中一夜培養した。培養物を培地単独、培地で希釈したテトラサイクリンまたは培地で希釈した粒子とともに回転させながら３７℃で１時間インキュベートして、粒子の食作用をもたらした。微生物死滅検定は、９６ウェルプレートで行った。培養物を培地で希釈し、一夜インキュベートして、食作用を受けたＹＧＰ：アルギン酸塩−ｔｅｔからｔｅｔを放出させた。表６に示すように細菌チャレンジを加え、培養物をＣＯ２インキュベーター中で３７℃で２時間インキュベートして、Ｊ７７４マウスマクロファージによる黄色ブドウ球菌（S. aureus）食作用および死滅を可能にした。このインキュベーションの後、２００μｌのＬＢブロス（Luria-Bertaniブロス：１．０％トリプトン、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）を各培養物に加えて、マクロファージを溶解した。培養物をインキュベーター中で３７℃でインキュベートして、生存黄色ブドウ球菌の成長を可能にした。成長は、フェノールレッドにより示されるｐＨの変化によりモニターした。ＹＧＰ、ＹＧＰ：アルギン酸塩−ｔｅｔまたはテトラサイクリンの効果を比較した。結果は、表６の右の２つ欄に示す。
【０１９１】
約７．５×１０６ＹＧＰ：アルギン酸塩−ｔｅｔ粒子は、約２．５μｇ／ｍｌテトラサイクリンＨＣｌとほぼ同等のマクロファージに対する効果をもたらした。マクロファージ単独は、いずれかの方式でテトラサイクリンで処理したマクロファージより比較的有効性が低く、空のＹＧＰのみで処理したマクロファージとほぼ同様に有効であった。溶液中遊離のテトラサイクリンと組み合わせたマクロファージは、テトラサイクリン単独より大幅には有効でなかった。ＹＧＰ：アルギン酸塩−ｔｅｔ粒子で処理したマクロファージは、有意な相乗作用を示した。一般的に、結果は、Ｊ７７４マクロファージ細胞内へのテトラサイクリンの食胞送達は黄色ブドウ球菌に対するＪ７７４マクロファージ細胞の死滅能を増大させることを示している。
【０１９２】
（実施例１５：ＹＧＰ内へのタンパク質の添加）
治療用ペプチドもしくはタンパク質、ワクチン抗原または他のペプチドもしくはタンパク質の貯留、輸送および送達に関する本発明の送達システムの有用性をウシ胎児血清の混合タンパク質を用いて評価した。用いた酵母細胞壁粒子は、上述のように調製したＹＧＰ、ＹＧＰ−ＰＥＩおよびＹＧＰ−キトサンであった。保存溶液は、４５ｎｇ／μｌウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Fetal Bovine Serum, JRH Biosciences, Lenexa, カンザス州）、ＴＥ中０．２％ＰＥＩ（Sigma Chemical, St. Louis, ミズーリ州）、０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２（Ｐ緩衝液）および０．０５Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ７．２、１Ｍ  ＮａＣｌ（Ｐ＋塩緩衝液）であった。
【０１９３】
表７に示すように４μｌのＦＣＳをマイクロ遠心管に入れた１ｍｇのＹＧＰ、ＹＧＰ−ＰまたはＹＧＰ−ＣＮに加え、得られた混合物を室温で６０分間インキュベートして、液体を粒子により吸収させた。インキュベーションの後、表７に示すように２００μｌのリン酸緩衝液または２００μｌのＰＥＩを加え、得られた混合物を室温で６０分間インキュベートした。インキュベーションの後、０．５ｍｌのリン酸緩衝液を加え、さらに５分間インキュベートした後、遠心管を音波処理して単一粒子を生じさせた。１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して粒子をペレットとし、上清を除去して新しい管に入れた。０．５ｍｌの０．０５Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．２＋１Ｍ  ＮａＣｌをペレットに加え、さらに５分間インキュベートした後、遠心管を１０，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、高濃度塩溶出上清を除去して新しい管に入れた。上清のタンパク質含量を２８０ｎｍでの吸光度により測定した。
【表７】
2008503472.tif 000008
【０１９４】
タンパク質添加結果を表８に示す。捕捉分子を含まないＹＧＰ粒子は、示したタンパク質の５％を捕捉したにすぎなかった。最初にＦＣＳタンパク質を添加し、次いで、ＰＥＩに曝露したＹＧＰ粒子は、タンパク質添加の４７％を保持した。タンパク質添加に曝露する前にＰＥＩまたはキトサンのような捕捉ポリマーを前添加したＹＧＰ粒子は、タンパク質添加のそれぞれ６８％および６０％を保持した。
【表８】
2008503472.tif 000009
【０１９５】
結果から、血清タンパク質は、捕捉ポリマーを含まないＹＧＰ内に有効に添加かつ捕捉されないことがわかる。ペイロードタンパク質に曝露する前に捕捉ポリマーを前添加したＹＧＰを用いることにより、タンパク質の捕捉の増加がもたらされた。あるいは、タンパク質は、最初にタンパク質を添加し、次いで、可溶性捕捉ポリマーを加えて、タンパク質を粒子内に封鎖することにより、ＹＧＰ内部に捕捉することができる。
【０１９６】
（実施例１６：ＤＮＡをＹＧＰ内に添加する様々な方法の比較）
サケ精子ＤＮＡを、ＹＧＰ、低分子量（ＬＭＷ）キトサンを含むＹＧＰまたは高分子量（ＨＭＷ）キトサンを含むＹＧＰ内に添加するいくつかの方法を評価した。
【０１９７】
ａ．毛細管添加後のエタノール沈殿
サケ精子（Sigma Chemical, St. Louis, ミズーリ州）を１８ゲージ針に４０回通過させてせん断し、５０ｍＭ  ＴＥ（トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．２、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で０．１ｍｇ／ｍｌに希釈した。ＤＮＡ溶液の添加体積を決定し、実施例２のように１００ｍｇずつのＹＧＰ、ＹＧＰ：ＬＭＷキトサンまたはＹＧＰ：ＨＭＷキトサンと遠心管中で２系列で混合し、１時間インキュベートした。各管に１．５ｍｌのエタノールを加えて、インキュベートした混合物をエタノール沈殿させた。２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、不溶性生成物を収集した。１０ｍｌのＴＥを各管に加え、３７℃で１時間インキュベートし、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して不溶性ＹＧＰを沈降させ、上清のＤＮＡ含量を２６０ｎｍでの吸光度により測定した。ＹＧＰ内に残存したＤＮＡの量を計算した。
【０１９８】
ｂ．吸収によるＤＮＡ添加
添加量のＤＮＡ溶液を実施例４ａのように１００ｍｇずつのＹＧＰ、ＹＧＰ：ＬＭＷキトサンまたはＹＧＰ：ＨＭＷキトサンと遠心管中で２系列で混合し、１時間インキュベートした。１０ｍｌのＴＥを各管に加え、３７℃で１時間インキュベートし、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して不溶性ＹＧＰを沈降させた。上清のＤＮＡ含量を２６０ｎｍでの吸光度により測定した。ＹＧＰ内に残存したＤＮＡの量を計算した。
【０１９９】
ｃ．ＣＴＡＢ捕捉によるＤＮＡ添加
添加量のＤＮＡ溶液を実施例４ａのように１００ｍｇずつのＹＧＰ、ＹＧＰ：ＬＭＷキトサンまたはＹＧＰ：ＨＭＷキトサンと遠心管中で２系列で混合し、１時間インキュベートした。１．５ｍｌの臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（臭化セチルトリメチルアンモニウムまたはＣＴＡＢとしても知られている）溶液を各管に加えて、インキュベートした混合物を沈殿させた。１０ｍｌのＴＥを各管に加え、３７℃で１時間インキュベートし、２０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して不溶性ＹＧＰを沈降させた。上清のＤＮＡ含量を２６０ｎｍでの吸光度により測定した。ＹＧＰ内に残存したＤＮＡの量を計算した。
【０２００】
ＹＧＰ内に残存したＤＮＡの量を計算した。
【０２０１】
結果を下の表９に示す。
【表９】
2008503472.tif 000010
【０２０２】
単純ＤＮＡ添加または沈殿によっては、ＤＮＡをＹＧＰ内に添加し、捕捉することはできなかった。これに対して、陽イオン捕捉ポリマーであるキトサンを用いることによって、ＤＮＡをＹＧＰ内に捕捉することができるキトサン−ＤＮＡ複合体が形成された。さらに、陽イオン物質であるＣＴＡＢを用いてＤＮＡをＹＧＰ内に有効に捕捉することができる。
【０２０３】
（実施例１７：ＤＮＡの添加および捕捉）
０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．２中サケ精子ＤＮＡの１ｍｇ／ｍｌ溶液の１ｍｌと１０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９．２中ＤＴＡＦの１ｍｇ／ｍｌ懸濁液の１００μｌを混合して、蛍光性サケ精子ＤＮＡを調製した。３７℃で一夜インキュベートした後、２００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌｐＨ８．３を加え、室温で１５分間インキュベートした。次いで、１００μｌのＮａＣｌおよび３ｍｌのエタノールを加えて、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。−２０℃で一夜保存した後、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してエタノール沈殿物を収集した。エタノール沈殿物を上清が透明になるまで７０％エタノールで洗浄し、１ｍｌのＴＥに再懸濁した。
【０２０４】
ＹＧＰ懸濁液を室温で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、０．４５ｍｌの９５％エタノールを１組（ＹＧＰ、ＹＧＰ−Ｐ、ＹＧＰキトサン）の３本の試験管に加え、０．２ｍｌの２％ＰＥＩを２組の３本の試験管に加え、０．２ｍｌの２％ＣＴＡＢを他の組の３本の試験管に加えた。室温で３０分間インキュベートした後、０．２ｍｌの２％ＣＴＡＢを１組のＰＥＩ管に加え、さらに３０分間インキュベートした。エタノール（１ｍｌ、９５％）を加え、ＹＧＰｓを−２０℃で一夜保存した。ＹＧＰ懸濁液を７０％エタノールで洗浄し、０．５ｍｌのＦＢＳに再懸濁した。結果を蛍光顕微鏡により評価し、表１０に示す。
【表１０】
2008503472.tif 000011
【０２０５】
捕捉ポリマーを用いない単純エタノール沈殿のみを用いた場合、蛍光標識ＤＮＡの有意な捕捉は起こらなかったことから、従来技術はＤＮＡ送達システムとして有効でないことがわかる。陽イオン捕捉ポリマーＰＥＩもしくはキトサン、またはＹＧＰ内の陽イオン界面活性剤ＣＴＡＰにより、蛍光標識ＤＮＡが明らかに捕捉された。ＹＧＰ：ＰＥＩ；ＤＮＡ：ＣＴＡＢ、ＹＧＰ：キトサン：ＤＮＡ：ＣＴＡＢまたはＹＧＰ：ＤＮＡ：ＰＥＩ：ＣＴＡＢのような捕捉ポリマーとＣＴＡＢの組合せを用いた場合、最善のＤＮＡ捕捉が起こった。
【０２０６】
（実施例１８：蛍光標識プラスミドＤＮＡ添加および捕捉）
マウスマクロファージ由来細胞系であるＪ７７４細胞におけるコードされたＥＧＦＰのトランスフェクションおよび発現のためにｐＩＲＥＳプラスミドを含むＹＧＰを調製した。用いた陽イオン捕捉物質は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）のような陽イオンポリマー、独占権下にある市販の水溶性陽イオンポリマートランスフェクション試薬であるCytoPure（商標）（Qbiogene Inc., カリフォルニア州）、キトサンおよび陽イオン界面活性剤臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（ＣＴＡＢ）などであった。好ましいＰＥＩは、市販の線状ポリエチレンイミン陽イオンポリマートランスフェクション試薬であるＪｅｔＰＥＩ（Qbiogene Inc., カリフォルニア州）である。
【０２０７】
ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰ（Clonetech, カリフォルニア州）は、ＭＣＳおよびＥＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）コーディング領域間に脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）の内部リポソームエントリー部位を含む。これにより、問題の遺伝子（ＭＣＳにクローンされる）およびＥＧＦＰが単一２シストロン性ｍＲＮＡから翻訳される。ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、ＥＧＦＰおよび問題の他のタンパク質を発現する一時的にトランスフェクトされた細胞の効果的な選択（フローサイトメトリまたは他の方法により）のために設計されている。高レベルの問題のタンパク質を発現する細胞の選択を最適化するために、ｐＩＲＥＳ−ＥＧＦＰは、部分的不能ＩＲＥＳ配列（１）を用いる。この減弱ＩＲＥＳが、クローン化遺伝子と比較してＥＧＦＰ開始コドンにおける翻訳開始の速度の低下につながる。これにより、ＥＧＦＰの翻訳の最適以下の速度を補償するためにｍＲＮＡおよびひいては標的タンパク質が高レベルで産生される細胞の選択が可能になる。このベクターは、ＥＧＦＰのみを発現させるために、または時間を要する薬物およびクローンの選択を行わずに安定にトランスフェクトされる細胞系を得るために用いることもできる。ＥＧＦＰは、哺乳類細胞においてより高輝度の蛍光およびより高い発現を得るために最適化された野生型ＧＦＰの赤色シフト変異体である。（励起極大＝４８８ｎｍ、放射極大＝５０９ｎｍ）ＥＧＦＰは、Ｐｈｅ−６４からＬｅｕへの、およびＳｅｒ−６５からＴｈｒへのアミノ酸置換を含むＧＦＰｍｕｔ１変異体をコードする。これらの突然変異は、主としてタンパク質保持特性および発色団形成の効率が改善するためにＧＦＰの輝度および溶解度を増加させる。ＥＧＦＰは、好ましいヒトコドンによってほぼ完全に構成される翻訳領域も含む。これは、野生型ＧＦＰと比較して、真核細胞におけるより効率の高い翻訳とひいてはより高い発現レベルにつながる。
【０２０８】
調製した溶液は、水中０．７２μｇ／μｌのｐＩＲＥＳ  ＥＧＦＰプラスミドＤＮＡ、ＴＥ中０．２重量／体積％ＰＥＩ（Sigma）、２μｌ  CytoPure（Qbiogene）＋４８μｌ  ０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２μｌ  JetPEI（Qbiogene）＋４８μｌ  ＴＥ、ＴＥ中０．２％スペルミジン、２％（水性）ＣＴＡＢおよびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であった。
【０２０９】
蛍光性ｐＩＲＥＳプラスミドＤＮＡは、０．１Ｍ炭酸緩衝液ｐＨ９．２中ｐＩＲＥＳ  ＤＮＡの１ｍｇ／ｍｌ溶液の１ｍｌと１０ｍＭ炭酸緩衝液ｐＨ９．２中ＤＴＡＦの１ｍｇ／ｍｌ懸濁液の１００μｌとを混合して調製した。３７℃で一夜インキュベートした後、２００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ  ｐＨ８．３を加え、室温で１５分間インキュベートした。次いで、１００μｌの１Ｍ  ＮａＣｌおよび３ｍｌのエタノールを加えて、ＤＮＡをエタノール沈殿させた。−２０℃で一夜保存した後、１０，０００ｒｐｍで１５分間遠心分離してエタノール沈殿物を収集した。エタノール沈殿物を上清が透明になるまで７０％エタノールで洗浄し、１ｍｌのＴＥに再懸濁した。
【０２１０】
ＹＧＰ懸濁液を室温で３０分間インキュベートした。インキュベートした後、０．４５ｍｌの９５％エタノールを１組（ＹＧＰ、ＹＧＰ−Ｐ、ＹＧＰキトサン）の３本の試験管に加え、０．２ｍｌの２％ＰＥＩを２組の３本の試験管に加え、０．２ｍｌの２％ＣＴＡＢを他の組の３本の試験管に加えた。室温で３０分間インキュベートした後、０．２ｍｌの２％ＣＴＡＢを１組のＰＥＩ管に加え、さらに３０分間インキュベートした。エタノール（１ｍｌ、９５％）を加え、ＹＧＰｓを−２０℃で一夜保存した。ＹＧＰ懸濁液を７０％エタノールで洗浄し、０．５ｍｌのＦＢＳに再懸濁した。
【０２１１】
実施例１４で述べたように、Ｊ７７４マウスマクロファージを６ウェルプレートにウェル当たり２．５×１０５細胞の密度で播種し、一夜インキュベートした。表１１に要約するようにトランスフェクションを行った。粒子を細胞当たり１０個の粒子の比率で培地に加え、プレートを旋回させて粒子を分散させた。細胞を４時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．４％ホルマリンで固定した。
【表１１】
2008503472.tif 000012
【０２１２】
蛍光性ＤＮＡ含有粒子および蛍光性ＤＮＡ含有粒子とともにインキュベートしたＪ７７４細胞を蛍光顕微鏡により評価し、結果を表１２に要約し、図３Ａおよび３Ｂに示す。
【表１２】
2008503472.tif 000013
【０２１３】
図３Ａは、細胞３１０を示す、陽イオン捕捉ポリマーとしてのＰＥＩおよび陽イオン界面活性剤としてのＣＴＡＢを含む蛍光標識ｐＩＲＥＳプラスミドを添加したＹＧＰ粒子に曝露した細胞のカラー光学顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図３Ｂは、図３Ｂに示す同じ細胞３１０により内部へ移行された蛍光ＹＧＰ粒子を表わす高輝度染色を示す細胞の同じ視野のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。
【０２１４】
（実施例１９：ＹＧＰ：ｐＩＲＥＳとともにインキュベートしたＪ７７４マウスマクロファージによるＥＧＦＰ発現）
この実施例では、ｐＩＲＥＳプラスミドＤＮＡを蛍光標識せず、ｐＩＲＥＳによりコードされる緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の機能的発現を、蛍光の発生によって明らかな、添加酵母壁粒子の取込み、ｐＩＲＥＳ  ＤＮＡの細胞内放出およびＧＦＰの発現の実証として用いた。
【０２１５】
ＹＧＰ：ｐＩＲＥＳ製剤は、下の表１２に要約したように調製した。ＤＮＡは、１ｍｇ／ｍｌ保存液を脱イオン水で希釈して調製した。表示量のＤＮＡ溶液をＹＧＰに加え、少なくとも３０分間インキュベートして、液体を吸収させた。示した量のＴＥ中０．２％ＰＥＩまたは酢酸緩衝液中０．２％キトサンを加え、混合物を５分間インキュベートした後、音波処理して単一粒子を生じさせた。さらに少なくとも３０分間インキュベートした後、表示量の２％ＣＴＡＢを加えた。さらに５分間インキュベートした後、管をボルテックスミキサーで混合し、再び少なくとも３０分間インキュベートした。表示量の９５％エタノールを加えた。次いで、各管を混合し、−２０℃で一夜保存した。次いで、ＹＧＰ：ｐＩＲＥＳ調合粒子を遠心分離し、７０％エタノールで２回洗浄し、１０，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して収集し、０．５ｍｌの無菌ＰＢＳに再懸濁し、音波処理して単一粒子を生じさせた。１ｍｌ当たりの粒子数を数え、各製剤を−２０℃で一夜保存した。
【０２１６】
実施例１４で述べたように、Ｊ７７４マウスマクロファージを６ウェルプレートにウェル当たり２．５×１０５細胞の密度で播種し、一夜インキュベートした。上の表１１に要約したようにトランスフェクションを行った。粒子を細胞当たり１０個の粒子の比率で培地に加え、プレートを旋回させて粒子を分散させた。細胞を毎日供給し、２日間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．４％ホルマリンで固定した。
【０２１７】
結果を表１３に要約し、図４Ａ〜Ｃに示す。細胞は、蛍光顕微鏡を用いて検査した。Ｊ７７４細胞の８９％がＹＧＰ−Ｆ粒子を取り込んだ（表１３、ウェル１Ｂ、図４Ａ）。ＥＧＦＰ発現が、ウェル１Ｅ（図４Ｂ）および１Ｆ（図４Ｃ）における空胞中点状蛍光としてＪ７７４細胞の８０％以上で認められた。
【表１３】
2008503472.tif 000014
【０２１８】
図４Ａは、蛍光標識ＹＧＰ粒子に曝露した細胞、例えば、表示細胞４１０のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像であり、図４Ｂは、陽イオン捕捉ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ）および陽イオン界面活性剤臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（臭化セチルトリメチルアンモニウムまたはＣＴＡＢとしても知られている）を含むＹＧＰにより送達されたｐＩＲＥＳ  ＤＮＡからのＧＦＰを発現する、細胞、例えば、表示細胞４２０のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像であり、図４Ｃは、陽イオン捕捉ポリマーキトサンおよび陽イオン界面活性剤ＣＴＡＢを含むＹＧＰ粒子により送達されたｐＩＲＥＳ  ＤＮＡからのＧＦＰを発現する、細胞、例えば、表示細胞４３０のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。
【０２１９】
（実施例２０：ＹＧＰ−陽イオン捕捉ポリマー技術を用いたＪ７７４細胞内への蛍光性ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドおよびｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドの送達）
次の材料を用いた。すなわち、ＹＧＰ：蛍光性サケ精子ＤＮＡ：ＰＥＩ：ＣＴＡＢ粒子、ＹＧＰ：蛍光性オリゴヌクレオチド：ＰＥＩ：ＣＴＡＢ粒子およびＹＧＰ：蛍光性ｓｉＲＮＡ：ＰＥＩ：ＣＴＡＢ。蛍光性オリゴヌクレオチドは、以下の５’末端に付着されたフルオレセイン残基を用いてSigma Genosysにより合成された１８ｍｅｒであった。
【０２２０】
５’フルオレセイン−ＴＴＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＧＣＴＣＴ３’  配列番号１
【０２２１】
蛍光性ｓｉＲＮＡは、以下の５’末端に付着されたフルオレセイン残基（Quiagen, Valencia, カリフォルニア州、カタログ番号１０２２０７９）を用いて合成された２１ｍｅｒの非サイレンシング制御ｓｉＲＮＡであった。
【０２２２】
５’フルオレセイン−ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵｄＴｄＴ３’  配列番号２
【０２２３】
実施例１４で述べたように、Ｊ７７４マウスマクロファージを６ウェルプレートにウェル当たり２．５×１０５細胞の密度で播種し、一夜インキュベートした。表１１に要約したようにトランスフェクションを行った。対照およびポリヌクレオチド添加粒子を培地に加え、プレートを旋回させて粒子を分散させた。細胞を毎日供給し、２４時間インキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、培地を除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．４％ホルマリンで固定した。
【表１４】
2008503472.tif 000015
【０２２４】
結果を図５Ａ〜Ｉに示す。細胞は、蛍光顕微鏡およびＦＡＣＳを用いて検査した。Ｊ７７４細胞の９２％がＹＧＰ−Ｆ粒子を取り込んだ（表１４、ウェル１Ｂ、図５Ａ）。フルオレセインオリゴヌクレオチド（配列番号１）の送達が点状エンドソーム蛍光および散在性細胞質蛍光としてＪ７７４細胞の８０％以上で認められた。蛍光性非サイレンシングｓｉＲＮＡ（配列番号２）の送達が点状エンドソーム蛍光および散在性細胞質蛍光としてＪ７７４細胞の８０％以上で認められた。
【０２２５】
図５Ａは、蛍光標識ＹＧＰ粒子に曝露した細胞、例えば、表示細胞５１０のカラー光学および蛍光複合顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像であり、図５Ｂは、蛍光標識ＹＧＰ粒子を内部へ移行した細胞からのシグナルの分布を表わす主ピーク５２０および蛍光標識ＹＧＰ粒子を含まない細胞からのシグナルの分布を表わす福ピーク５３０を示す蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）試験の結果のグラフ表示であり、図５Ｃは、蛍光標識ＤＮＡ、陽イオン捕捉ポリマーＰＥＩおよび陽イオン界面活性剤ＣＴＡＢを含むＹＧＰ粒子に曝露した細胞、例えば、表示細胞５４０のカラー光学顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像であり、図５Ｄは、同じ表示細胞５４０を示す細胞の同じ視野のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像であり、図５Ｅは、蛍光ＤＮＡペイロードを含むＹＧＰ粒子を内部へ移行した細胞からのシグナルの分布を表わす主ピーク６１０およびＹＧＰ粒子を含まない細胞からのシグナルの分布を表わすショルダー６２０を示すＦＡＣＳ試験の結果のグラフ表示であり、図５Ｆは、蛍光アンチセンスＲＮＡ、ＰＥＩおよびＣＴＡＢを含むＹＧＰ粒子とともにインキュベートした細胞、例えば、表示細胞７１０のカラー光学顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像であり、図５Ｇは、蛍光アンチセンスＲＮＡペイロードを含む、内部へ移行されたＹＧＰを含む同じ表示細胞７１０を示す細胞の同じ視野のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像であり、図５Ｈは、蛍光標識ｓｉＲＮＡ、ＰＥＩおよびＣＴＡＢを含むＹＧＰ粒子とともにインキュベートした細胞、例えば、表示細胞８１０のカラー光学顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像であり、図５Ｉは、蛍光ｓｉＲＮＡペイロードを含む内部へ移行されたＹＧＰ粒子を含む同じ表示細胞８１０を示す細胞の同じ視野のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。
【０２２６】
要約すると、陽イオンポリマーを用いてＹＧＰ内に添加した蛍光性ＤＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡペイロードは、Ｊ７７４細胞内にペイロードを有効に送達する。ペイロードは、２４時間以内にエンドソームコンパートメントから細胞質および核コンパートメント内に放出される。
【０２２７】
特許請求の範囲は、その効果について述べられていない限り、記述された順序または要素に限定されると解釈すべきでない。したがって、以下の特許請求の範囲の範囲および精神に適合する、およびそれと同等のすべての実施形態は、本発明として請求される。
【図面の簡単な説明】
【０２２８】
【図１】図１は、外側から内側に、外側原線維層１１０、外側マンノプロテイン層１２０、β−グルカン層１３０、β−グルカン−キチン層１４０、内側マンノプロテイン層１５０、原形質膜１６０および細胞質１７０を示す酵母細胞壁の横断切片の概略図１００である。
【図２】図２Ａは、酵母細胞壁粒子の構造を示す図である。図２Ｂは、実質的に完全に染色された酵母細胞壁粒子２１０を示すコンカナバリン−Ａ−ＦＩＴＣ（Ｃｏｎ−Ａ−フルオレセインイソチオシアネート、Sigma Chemical, St.Louis, ミズーリ州）による酵母細胞壁粒子のマンナン成分の染色を示すカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図２Ｃは、ＹＧＭＰβ−グルカン−マンナン粒子の構造を示す図である。図２Ｄは、ＹＧＭＰβ−グルカン−マンナン粒子２２０の一様でないＣｏｎ−Ａ−ＦＩＴＣ染色を示すカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図２Ｅは、ＹＧＰβ−グルカン−マンナン粒子の構造を示す図である。図２Ｆは、Ｃｏｎ−Ａ−ＦＩＴＣ染色の非存在を示すカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。
【図３】図３Ａは、細胞３１０を示す、陽イオン捕捉ポリマーとしてのＰＥＩおよび陽イオン界面活性剤としてのＣＴＡＢを含む蛍光標識ｐＩＲＥＳプラスミドを添加したＹＧＰ粒子に曝露した細胞のカラー光学顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図３Ｂは、ここに示す同じ細胞３１０により内部へ移行された蛍光ＹＧＰ粒子を表わす高輝度染色を示す細胞の同じ視野のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。
【図４】図４Ａは、細胞、例えば、表示細胞４１０のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図４Ｂは、ＧＦＰを発現する、ｐＩＲＥＳ  ＤＮＡ、陽イオン捕捉ポリマーポリエチレンイミン（ＰＥＩ）および陽イオン界面活性剤臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム（臭化セチルトリメチルアンモニウムまたはＣＴＡＢとしても知られている）を含むＹＧＰ粒子に曝露した細胞、例えば、表示細胞４２０のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図４Ｃは、ＧＦＰを発現する、ｐＩＲＥＳ  ＤＮＡ、陽イオン捕捉ポリマーキトサンおよび陽イオン界面活性剤ＣＴＡＢを含むＹＧＰ粒子に曝露した細胞、例えば、表示細胞４３０のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。
【図５】図５Ａは、蛍光標識ＹＧＰ粒子に曝露した細胞、例えば、表示細胞５１０のカラー光学および蛍光複合顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図５Ｂは、蛍光標識ＹＧＰ粒子を内部へ移行した細胞からのシグナルの分布を表わす主ピーク５２０および蛍光標識ＹＧＰ粒子を含まない細胞からのシグナルの分布を表わす福ピーク５３０を示す蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）試験の結果を示すグラフ表示である。図５Ｃは、蛍光標識ＤＮＡ、陽イオン捕捉ポリマーＰＥＩおよび陽イオン界面活性剤ＣＴＡＢを含むＹＧＰ粒子に曝露した細胞、例えば、表示細胞５４０のカラー光学顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図５Ｄは、同じ表示細胞５４０を示す細胞の同じ視野のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図５Ｅは、蛍光ＤＮＡペイロードを含むＹＧＰ粒子を内部へ移行した細胞からのシグナルの分布を表わす主ピーク６１０およびＹＧＰ粒子を含まない細胞からのシグナルの分布を表わすショルダー６２０を示すＦＡＣＳ試験の結果を示すグラフ表示である。図５Ｆは、蛍光アンチセンスＲＮＡペイロードを含むＹＧＰ粒子とともにインキュベートした細胞、例えば、表示細胞７１０のカラー光学顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図５Ｇは、同じ表示細胞７１０を示す細胞の同じ視野のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図５Ｈは、蛍光ｓｉＲＮＡ、ＰＥＩおよびＣＴＡＢを含むＹＧＰ粒子とともにインキュベートした細胞、例えば、表示細胞８１０のカラー光学顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。図５Ｉは、蛍光ｓｉＲＮＡペイロードを含む内部へ移行されたＹＧＰ粒子を含む同じ表示細胞８１０を示す細胞の同じ視野のカラー蛍光顕微鏡写真の逆コントラスト（ネガティブ）グレイスケール像である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図５Ｉ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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