(57)【要約】本明細書において病原菌による細胞の感染を減少させる、例えば病原菌感染を治療または予防する方法を開示する。例示的な病原菌は、脂質リフトを利用するものを含む。Rab9AおよびRab11Aのモジュレーターなどの病原菌感染に関与する薬剤を同定する方法もまた開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞におけるRab9AまたはRab11Aの活性を減少する工程を含む、病原体による宿主細胞の感染を減少する方法であって、Rab9AまたはRab11Aの活性を減少することにより、病原体による宿主細胞の感染が減少する方法。
【請求項２】
Rab9Aの活性を減少する工程が、Rab9A活性を増大するRab9Aモジュレーターの活性を減少する工程か、またはRab9A活性を減少するRab9Aモジュレーターの活性を増大する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
Rab11Aの活性を減少する工程が、Rab11A活性を増大するRab11Aモジュレーターの活性を減少する工程か、またはRab11A活性を減少するRab11Aモジュレーターの活性を増大する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
病原体が脂質ラフトをハイジャックする、請求項1記載の方法。
【請求項５】
病原体が脂質ラフトをハイジャックする病原体が、カンピロバクター・ジュジュニ（Campylobacter jujuni）、コレラ菌（Vibrio cholerae）、SV40、レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophila）、アエロモナス・ハイドロフィリア（Aeromonas hydrophilia）、エコーウイルス1、エコーウイルス11、ブルセラ（Brucella）種、クロストリジウム（Clostridium）種、トリ肉腫および白血病ウイルス、大腸菌（Escherichia coli）、化膿性連鎖球菌（Streptcoccus pyogenes）、セムリキ森林ウイルス、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、エコトロピックマウス白血病ウイルス、フレキシナ赤痢菌（Shigella flexneri）、卒倒病菌（Bacillus thuringiensis）、HTLV-1、クラミジア（Chlamydia）種、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、HIV-1、ミコバクテリア種（Mycobacterium）、リステリア菌（Li.steria monocytogenes）、エボラ、マールブルク、麻疹、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス（RSV）、またはEBウイルスである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
脂質ラフトをハイジャックする病原体が、被膜RNAウイルスを含む、請求項4記載の方法。
【請求項７】
被膜RNAウイルスが、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）-1、HIV-2、エボラウイルス、マールブルグウイルス、RSV、または麻疹ウイルスを含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
Rab9AまたはRab11Aの活性を減少する工程が、Rab9AまたはRab11AをコードするmRNAの量を減少することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項９】
Rab9AをコードするmRNAの量を減少させる工程が、mRNAをSEQ ID NO:5〜9、16〜32、または47〜66のいずれかと接触させる工程を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
Rab9A活性を増大するRab9Aモジュレーターが、v-SNAREタンパク質、t-SNAREタンパク質、GDP解離阻害剤、グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）、グアニンヌクレオチド置換因子（GDF）、マンノース-6-リン酸受容体、TIP47、またはRab9Aエフェクターである、請求項2記載の方法。
【請求項１１】
Rab9エフェクターがp40である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
GDFがYip3である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
Rab9A活性を増大するRab9AモジュレーターがPIKfyve、TIP47、またはp40である、請求項2記載の方法。
【請求項１４】
Rab11A活性を増大するRab11Aモジュレーターが、Sec 15、Rip11、FIP1、FIP2、FIP3／エフェリン（eferin）、FIP4、またはRab-カップリングタンパク質（RCP）である、請求項3記載の方法。
【請求項１５】
Rab9AがSEQ ID NO:1または2と関連する標的核酸配列に対して少なくとも90%の配列同一性を含む宿主核酸によってコードされる、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
宿主核酸が、SEQ ID NO:1または2と関連する標的核酸配列を含む、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
Rab9Aの活性を減少させる工程が、Rab9A活性を増強する1つまたは複数のRab9Aモジュレーターの活性を減少させる工程を含む、請求項2記載の方法。
【請求項１８】
Rab11Aの活性を減少させる工程が、Rab11A活性を増強する1つまたは複数のRab11Aモジュレーターの活性を減少させる工程を含む、請求項3記載の方法。
【請求項１９】
Rab9Aの活性を減少させる工程が、Rab9AおよびRab9A活性を増強する1つまたは複数のRab9Aモジュレーターの活性を減少させる工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
Rab11Aの活性を減少させる工程が、Rab11AおよびRab11A活性を増強する1つまたは複数のRab11Aモジュレーターの活性を減少させる工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
Rab9AまたはRab11Aの活性を減少させる工程が、Rab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、またはRab11Aモジュレータータンパク質の発現を減少させることによって、病原体タンパク質とRab9Aタンパク質との相互作用を減少させる工程、病原体タンパク質とRab11Aタンパク質との相互作用を減少させる工程、病原体タンパク質とRab9Aモジュレータータンパク質との相互作用を減少させる工程、または病原体タンパク質およびRab11Aモジュレータータンパク質との相互作用を減少させる工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
病原体タンパク質がウイルスを含み、ウイルスと、Rab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、またはRab11Aモジュレータータンパク質との相互作用を減少させることにより、ウイルスによる宿主細胞の感染を減少する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
Rab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、またはRab11Aモジュレータータンパク質の発現を減少させる工程が、Rab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、またはRab11Aモジュレータータンパク質をコードするmRNAの転写を減少させる工程を含む、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
mRNAの転写を減少させる工程が、Rab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、またはRab11Aモジュレータータンパク質をコードする核酸配列のコード領域にトランスポゾンまたは挿入ベクターを挿入することを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
mRNAの転写を減少させる工程が、アンチセンスRNA、三重らせん分子、リボザイム、ミクロRNA、またはmRNAを認識するsiRNAとmRNAを接触させる工程を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
siRNA配列が、SEQ ID NO:5〜9および16〜32の1つまたは複数を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
アンチセンスRNA配列が、SEQ ID NO:47〜56の1つまたは複数を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２８】
リボザイムRNA配列が、SEQ ID NO:57〜66の1つまたは複数を含む、請求項25記載の方法。
【請求項２９】
宿主細胞が被験者に存在し、mRNAをアンチセンスRNA、三重らせん分子、リボザイム、ミクロRNA、またはmRNAを認識するsiRNAと接触させる工程が被験者に対してアンチセンスRNA、三重らせん分子、リボザイム、ミクロRNA、またはsiRNAを投与する工程を含む、請求項25記載の方法。
【請求項３０】
病原体タンパク質と、Rab9タンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、またはRab11Aモジュレータータンパク質との相互作用を減少させる工程が、宿主細胞をRab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、またはRab11Aモジュレータータンパク質の活性を減少させる薬剤と接触させる工程を含む、請求項21記載の方法。
【請求項３１】
宿主細胞が宿主被験者に存在し、薬剤と宿主細胞を接触させる工程が被験者に薬剤を投与する工程を含む、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
薬剤が、Rab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、またはRab11Aモジュレータータンパク質と特異的に結合する抗タンパク質結合剤であり、抗タンパク質結合剤が、Rab9タンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、またはRab11Aモジュレータータンパク質と病原体との間の相互作用を減少させる、請求項30記載の方法。
【請求項３３】
抗タンパク質結合剤が、抗体または化学物質である、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
宿主細胞が、哺乳類宿主細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項３５】
病原体感染を有する被験者に対して病原体と宿主タンパク質との相互作用を妨害する薬剤の有効な量を投与する工程を含む、宿主被験者における病原体感染を治療する方法であって、宿主タンパク質が、Rab9A、Rab11A、Rab9A活性を増強するRab9Aモジュレーター、またはRab11A活性を増強するRab11Aモジュレーターである方法。
【請求項３６】
薬剤が、Rab9A、Rab11A、Rab9A活性を増強するRab9Aモジュレーター、またはRab11A活性を増強するRab11Aモジュレーターをコードする核酸配列の発現を減少させる、請求項35記載の方法。
【請求項３７】
薬剤が、アンチセンスである、三重らせん分子、リボザイム、ミクロRNA、またはRab9A、Rab11A、Rab9A活性を増強するRab9Aモジュレーター、もしくはRab11A活性を増強するRab11Aモジュレーターをコードする核酸配列を認識するsiRNA分子である、請求項35記載の方法。
【請求項３８】
有効な量が、宿主における予防効果を誘導して、病原体による宿主の感染を減少させる、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
宿主が、以前に病原体によって感染しており、有効な量が、宿主における治療効果を誘導する、請求項35記載の方法。
【請求項４０】
Rab9A標的またはRab11A標的と試験薬剤を接触させる工程；および
試験薬剤がRab9A活性またはRab11A活性を減少させるかどうかを決定する工程、
を含む病原体の病原性を減少させる薬剤を同定する方法であって、
Rab9A活性またはRab11A活性の減少が、薬剤が病原体の病原性を減少させることを示す方法。
【請求項４１】
病原体が、脂質ラフトをハイジャックする病原体である、請求項40記載の方法。
【請求項４２】
脂質ラフトをハイジャックする病原体が、カンピロバクター・ジュジュニ、コレラ菌、SV40、レジオネラ・ニューモフィラ、アエロモナス・ハイドロフィリア、エコーウイルス1、エコーウイルス11、ブルセラ種、クロストリジウム種、トリ肉腫および白血病ウイルス、大腸菌、化膿性連鎖球菌、セムリキ森林ウイルス、ネズミチフス菌、炭疽菌、エコトロピックマウス白血病ウイルス、フレキシナ赤痢菌、卒倒病菌、HTLV-1、クラミジア種、ヘリコバクター・ピロリ、HIV-1、ミコバクテリア種、リステリア菌（Lysteria monocytogenes）、エボラ、マールブルク、麻疹、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス（RSV）、またはEBウイルスである、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
試験薬剤がRab9A活性またはRab11A活性を減少させるかどうかを決定する工程が、試験薬剤がRab9A、Rab11A、Rab9A活性に影響を及ぼすRab9Aモジュレーター、またはRab11A活性に影響を及ぼすRab11Aモジュレーターの細胞における発現を減少させるかどうかを決定する工程を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４４】
試験薬剤がRab9A、Rab11A、Rab9A活性に影響を及ぼすRab9Aモジュレーター、またはRab11A活性に影響を及ぼすRab11Aモジュレーターの発現を減少させるかどうか決定する工程が、試験薬剤が細胞におけるRab9A mRNA、Rab11A mRNA、Rab9A活性に影響を及ぼすRab9AモジュレーターmRNA、またはRab11A活性に影響を及ぼすRab11A mRNAモジュレーターのレベルを減少させるかどうかを決定する工程を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
病原体がウイルス、細菌、または原生動物を含む、請求項40記載の方法。
【請求項４６】
病原体がウイルスを含む、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
ウイルスがウイルスの外被タンパク質を含む、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
ウイルスがRNAウイルスを含み、かつ被膜化されている、請求項46記載の方法。
【請求項４９】
Rab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーター遺伝子の機能的欠失を含む細胞であって、脂質ラフトをハイジャックする病原体による感染に対する感受性が減少した細胞。
【請求項５０】
Rab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーター遺伝子の機能的欠失を含む非ヒト・トランスジェニック哺乳類であって、脂質ラフトをハイジャックする病原体による感染に対する感受性が減少した哺乳類。
【請求項５１】
Rab9AまたはRab11Aを発現する細胞における推定上のRab9AまたはRab11Aモジュレーターの発現を減少する工程；
細胞を、脂質ラフトをハイジャックする病原体と接触させる工程；および、
脂質ラフトをハイジャックする病原体による感染の量を検出する工程、
を含む脂質ラフトをハイジャックする病原体による感染に関与するRab9AまたはRab11Aのモジュレーターを同定する方法であって、
感染の減少が、推定上のRab9AまたはRab11Aモジュレーターがそれぞれ、脂質ラフトをハイジャックする病原体による感染に関与するRab9AまたはRab11Aモジュレーターであることを示す方法。
【請求項５２】
感染の量をRab9AまたはRab11A核酸分子、タンパク質、または活性の量と関連づける工程をさらに含み、感染の減少およびRab9AまたはRab11Aの量の減少の存在が、Rab9AまたはRab11Aの推定上のモジュレーターがそれぞれ、脂質ラフトをハイジャックする病原体による感染に関与するRab9AまたはRab11Aのモジュレーターであることを示す、請求項51記載の方法。
【請求項５３】
Rab9AまたはRab11Aの推定上のモジュレーターの発現を減少させる工程が、Rab9AまたはRab11Aの推定上のモジュレーターをコードするmRNAの量を減少させる工程を含む、請求項51記載の方法。
【請求項５４】
被験者の第一の核酸配列を、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーター配列を含む第二の核酸配列と比較する工程を含む、被験者における病原体感染に対する耐性または感受性を決定する方法であって、第一と第二の核酸配列との間の類似性が高いほど、被験者が病原体感染に対してより感受性であることを示し、かつ第一と第二の核酸配列との間の類似性が小さいほど、被験者が病原体感染に対してより耐性であることを示す方法。
【請求項５５】
第一の核酸配列が、被験者の生体試料から得られる、請求項54記載の方法。
【請求項５６】
第一の核酸配列が、複数の核酸配列を含み、それぞれの核酸配列が、異なる被験者から得られる、請求項54記載の方法。
【請求項５７】
集団内で多型変化を決定することをさらに含む、請求項56記載の方法。
【請求項５８】
SEQ ID NO:5〜9、16〜32、または47〜66に示したいずれかの核酸配列を含む、単離された核酸配列。
【請求項５９】
請求項58記載の単離された核酸配列を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
分野
本開示は、ウイルスなどの病原体の感染もしくは生活環のその他の段階を治療し、または減少させるために、たとえばRab9AまたはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターの活性を減少させることよって、Rab9AまたはRab11Aの活性を減少させる方法に関する。また、本開示は、Rab9AおよびRab11Aのモジュレーターなどの、病原体感染に関与する薬剤を同定する方法にも関する。
【０００２】
関連出願に対する相互参照
本願は、2004年2月24日に出願された米国仮出願第60/547,328号の利益、および2003年11月18日に出願された第PCT/US2003/037143号（これは、2002年11月18日に出願された米国仮出願第60/427,464号および2003年6月25日に出願された第60/482,604号の利益を主張する）の利益を主張し、これらの全てが本明細書に参照として組み入れられる。
【背景技術】
【０００３】
背景
感染症は、世界中の人々および動物の健康に影響を及ぼし、重病および死を生じさせる。公衆衛生の取り組みでは、感染の発病率を減少させるための行動修飾およびその他の公衆衛生活動に焦点をおいてきたが、一方で、これらの疾患のための治療計画では、抗生物質および抗ウイルス剤などの医薬に焦点をおいてきた。しかし、行動修飾について人々を教育することは、困難であり得るし、このアプローチ単独により、感染の発病率を有意に減少させることができるのはまれである。さらに、家畜または野生動物の行動を修飾しても、感染は減少しないと考えられる。動物集団における感染の広がりを止めるには、典型的には、大量に虐殺することを含む。ほとんどのワクチンは、有用ではないか、またはまったく有効ではなく、これらは、特定の状態に対して特異的な傾向がある。
【０００４】
HIV（ヒト免疫不全症ウイルス）の感染の割合は、増大している。HIVおよびこれに付随する後天性免疫不全症候群（AIDS）は、2000年の米国における全ての死の約5%の原因であり、一方で、313,000人以上の人が、その同年にAIDSを伴って生存していることが報告された。Centers for Disease Control and Prevention, HIV/SIDS Surveillance Supplemental Report,8 （1）： 1-22 （2002）。HIV感染の様式は、ほぼ20年間公知であり、また世界中の教育プログラムでは、HIV感染症を減少させることを意図した行動修飾が促されてきたが、これらの感染率は増大してきた。HIV疾患による発病率および死亡率は、一部には積極的抗ウイルス療法（これは、頻繁に中毒性副作用があり、厳密な投与計画である）によって、90年代半ばから減少してきた。しかし、治療によっても患者は疾患が治癒せず、現在まで有効なワクチン療法は見いだされていない。
【０００５】
エボラウイルスによる感染などのその他の疾患では、治療が限定されるだけでなく、ウイルスのライフサイクルが周知ではないために、感染の封じ込めまたは予防が困難である。エボラウイルスのための天然の貯蔵所（これは、天然においウイルスがヒト間に大発生が存在する場所または集団である）は、いまだ同定されなかった。
【０００６】
さらに、種々のウイルス株が、薬物の使用に応答して、迅速に進化して、薬剤耐性株を生じ得る。たとえば、最近、アマンタジンおよびリマンタジンに耐性のインフルエンザウイルスの株が生じた。New YorkのRockefeller University のAIDS Research Center によって行われた80人の新たに感染した人々の最近の研究では、これらの個体の16.3%程度が、いくつかの治療に対する耐性と関連したHIVの株を有し、3.8%が、いくつかの現在利用可能な抗HIV薬に対して耐性があるように見えることを見いだした。したがって、感染症のための代わりの治療および感染症と戦うための新薬を同定する方法についての需要が存在する。
【発明の開示】
【０００７】
概要
ウイルス感染に関与するいくつかの宿主核酸配列を、遺伝子トラップ法を使用して同定した。これらの宿主配列およびこれらのコード産物を同定することにより、治療的介入のためにターゲットすることができる配列を同定することができる。感染に関与し、またはさらに必要とされる核酸およびタンパク質のゲノム科学に基づいた発見により、感染に対する個体または集団の耐性を評価する工程、および感染症のための新規診断標的および薬物標的を見いだす工程、および宿主核酸配列のヌクレオチド配列を変更する工程を含む、感染症の種々の局面を同定し、確証するための新たな方法がもたらされる。
【０００８】
これらの宿主配列の一つは、Ras発癌遺伝子ファミリー・メンバーのRab9Aをコードする（SEQ ID NO:1〜2と関連する標的配列、およびこれによりコードされるタンパク質、並びにRab9A生物活性を保持するこれらの変異体、融合、および断片を含む）。Rab11Aは、トランスゴルジから細胞表面までのタンパク質の輸送に関与する。Rab9A、Rab11A、およびこれらのモジュレーターは、本明細書において、種々の病原体による感染において役割を果たすことが示される。特定の例では、Rab9A、Rab11A、およびこれらのモジュレーターは、脂質ラフトをハイジャックすることができる病原体などの感染粒子の形態形成のために、類似の経路を使用する病原体による感染に関与する。Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターは、感染を媒介することができ、いくつかの例では、病原体による感染のために必要とされる。
【０００９】
Rab9A、Rab11A、およびこれらのモジュレーターが病原感染に関与するという観察に基づいて、本明細書において、Rab9AまたはRab11Aの活性を妨害することによって、たとえばRab9AもしくはRab11A活性を増大する1つまたは複数のこれらのモジュレーターの活性を減少させることよって、またはRab9AもしくはRab11A活性を減少させる1つまたは複数のこれらのモジュレーターの活性を増大することよって、脂質ラフトをハイジャックすることができる病原体などの病原体による宿主細胞の感染を減少し、またはこのような感染を治療するための方法が提供される。病原体による宿主細胞の感染を減少するために、たとえば病原体による宿主細胞の感染を阻害するための方法が、本明細書に開示される。特定の例において、感染の減少は、感染の100%の減少を必要としない。たとえば、少なくとも50%の減少、少なくとも75%、少なくとも90%、または少なくとも98%の減少（たとえば治療薬がない場合の感染の量と比較して）でも、十分であり得る。
【００１０】
特定の例において、本方法は、たとえばRab9AもしくはRab11A活性を増大する1つまたは複数のこれらのモジュレーターの活性を減少させることよって、またはRab9AもしくはRab11A活性を減少させる1つまたは複数のこれらのモジュレーターの活性を増大することよって、宿主細胞におけるRab11A9AまたはRab11Aの生物活性を減少させる（阻害など）工程を含む。このような生物活性の減少または除去により、病原体による宿主細胞の感染が減少（たとえば阻害）する。本方法は、Rab9AもしくはRab11A活性を増大する2つ以上、3以上、または1〜4Rab9AもしくはRab11Aモジュレーターなどの1つまたは複数のRab9AもしくはRab11Aモジュレーターの活性を減少させる工程を含むことができる。同様に、本方法は、Rab9AもしくはRab11A活性を減少させる2つ以上、3以上、または1〜4のRab9AもしくはRab11Aモジュレーターなどの、1つまたは複数のRab9AまたはRab11Aモジュレーターの活性を増大する工程を含むことができる。いくつかの例において、Rab9A、Rab11A、およびRab9AまたはRab11A活性を増大するこれらの1つまたは複数のモジュレーターの活性は、減少される。
【００１１】
核酸またはタンパク質配列の生物活性を減少させる方法は、当技術分野において公知である。一つの例において、本方法は、病原体タンパク質とRab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、またはこれらのモジュレータータンパク質との間の相互作用を減少させる（および、いくつかの例では、除去する）工程を含む。たとえば、Rab9AまたはRab11Aの発現を減少する（および、いくつかの例では、除去する）ことにより（たとえば、Rab9もしくはRab11Aの活性を刺激する、または増強するこれらのモジュレーターの発現を減少させることよる）、病原体タンパク質とRab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、またはこれらのモジュレータータンパク質との間の相互作用が減少される。一つの例において、タンパク質発現は、Rab9A、Rab11A、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターをコードするmRNAの量を減少させることによって、たとえばmRNAを、mRNAを認識するアンチセンスRNA、リボザイム、ミクロRNA、三重らせん分子、またはsiRNAと接触させることによって減少される。使用することができるもう一つの方法は、Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターと特異的に結合する抗体などのRab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、またはこれらのモジュレータータンパク質間の病原体タンパク質に対する結合を減少させる薬剤を投与する工程である。このような方法は、関連する病原体による宿主細胞の感染を減少し、阻害し、またはさらに防止するために使用することができる。
【００１２】
被験者における病原体感染を治療する方法が開示される。特定の例において、本方法は、病原体感染を有する被験者に対して、Rab9AまたはRab11Aの活性を妨害する1つまたは複数の薬剤の治療上有効な量を投与する工程を含む（たとえば、Rab9AもしくはRab11A活性を増大する1つもしくは複数のこれらのモジュレーターの活性を減少させる薬剤、またはRab9AもしくはRab11A活性を減少させるモジュレーターの活性を増大する薬剤を投与することによって）。一つの例において、薬剤は、病原体タンパク質とRab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、またはRab9AもしくはRab11Aの1つもしくは複数のモジュレータータンパク質との相互作用を妨害する。もう一つの例において、本方法は、病原体感染を有する被験者に細胞におけるRab9AもしくはRab11AをコードするmRNAの量を減少させる1つまたは複数の薬剤の治療上有効な量を投与する工程を含む（たとえば、Rab9AもしくはRab11A活性を増大するモジュレーターをコードするmRNAの量を減少させる薬剤、またはRab9AもしくはRab11A活性を減少させるモジュレーターをコードするmRNAの量を増大させる薬剤）。いくつかの例において、このような方法は、被験者における予防効果または治療効果を誘導する。
【００１３】
また、脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による宿主細胞の感染を減少させることができる薬剤を同定するための方法が提供される。特定の例において、本方法では、Rab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、またはこれらのモジュレータータンパク質に対する病原体タンパク質の結合を減少させる化合物を同定する。本方法は、Rab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、またはこれらのモジュレータータンパク質を病原体タンパク質および1つまたは複数の試験化合物と接触させる工程、次いでRab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質に対する病原体タンパク質の結合が試験化合物の存在下において減少するかどうかを決定する工程を含む。結合の減少は、試験化合物が病原体感染を減少させることを示す。
【００１４】
脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による感染に関与するRab9AまたはRab11Aのモジュレーターを同定するための方法が開示される。特定の例において、本方法は、Rab9AまたはRab11Aを発現する細胞における推定上のRab9AまたはRab11Aモジュレーターの発現を減少する工程、病原体（脂質ラフトをハイジャックする病原体など）と細胞を接触させる工程、および次いで病原体による感染の量を検出する工程を含む。感染の減少（および、いくつかの例では、完全な除去）は、Rab9AまたはRab11Aの推定上のモジュレーターが、Rab9AまたはRab11A活性を増大し、かつそれぞれ病原体による感染に関与するRab9AまたはRab11Bのモジュレーターであることを示す。感染の増大（および、いくつかの例では、検出可能な変化がない）は、Rab9AまたはRab11Aの推定上のモジュレーターが、Rab9AまたはRab11A活性を減少させ、かつそれぞれ病原体による感染に関与するRab9AまたはRab11Bのモジュレーターであることを示す。
【００１５】
開示された方法を使用して同定される薬剤は、治療的に、または予防的に使用すること、たとえば感染を減少させ、将来の感染を防止し、または既存の感染を治療するために被験者に投与することができる。
【００１６】
脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による感染に対する感受性が減少した細胞および非ヒト哺乳類が提供される。特定の例において、このような細胞および哺乳類は、Rab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、またはこれらのモジュレーター遺伝子の機能的欠失を含む。
【００１７】
また、本明細書において、被験者のRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーター核酸またはアミノ酸配列を特徴づけることによって、感染に対する耐性または感受性について被験者をスクリーニングする方法が提供される。
【００１８】
Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーター（Rab9AまたはRab11A活性を増大するものなど）の発現を減少させることができる特定の例示的な単離された核酸配列を本明細書に開示してある。一つの例において、このような単離された核酸配列は、SEQ ID NO:5〜9、16〜32、または47〜66のいずれかに示した核酸配列を含む。しかし、このような配列の変異体、断片、および融合も、これらがmRNA発現を減少させる能力が50%以上減少されていない限り、本開示に包含される。このような単離された核酸配列は、ベクターの一部であることができる。また、このような単離された核酸配列およびベクターを含む哺乳類細胞などの細胞も、本開示によって提供される。
【００１９】
前述の、およびその他の本開示の目的、特徴、並びに利点は、以下の詳細な説明（これは、添付の図に続く）により明らかになるであろう。
【００２０】
配列表
本明細書に記述したヌクレオチド配列は、ヌクレオチド塩基に関する標準的な文字略語を使用して示してある。各核酸配列の片側鎖のみ示されているが、相補鎖は、表示鎖に対する任意の言及により包含されるものと理解される。さらに、SEQ ID NO:1〜2に示した核酸配列は、これらのポリペプチド配列が本明細書に明確に提供されていない場合でも、本質的にコード配列の対応するポリペプチド配列（生じるヌクレオチド配列の翻訳）を開示する。
【００２１】
siRNA配列は、センス鎖のsiRNA配列を示し；相補鎖がセンス鎖にハイブリダイズして治療的なsiRNA分子を形成する。これらのsiRNA配列（SEQ ID NO:9、および32以外）は、それぞれの鎖に対して3'オーバーハングとしてのUU（図示せず）および5'アンチセンス鎖上にのみリン酸を有する。
【００２２】
SEQ ID NO:1は、病原体感染と関連する核酸配列であり、ヌクレオチド配列MV3-E5として同定されたクローンである。遠位端。ヒト相同体は、GenBankアクセッション番号AC079383.17、ras発癌遺伝子ファミリー・メンバーRab9Aの（+）鎖である。
【００２３】
SEQ ID NO:2は、病原体感染と関連する核酸配列であり、ヌクレオチド配列MV3-E5として同定されたクローンである。近端部。ヒト相同体は、GenBankアクセッション番号AC079383.17、ras発癌遺伝子ファミリー・メンバーRab9Aの（-）鎖である。
【００２４】
SEQ ID NO:3〜4は、相補性であるとみなされる例示的な配列である。
【００２５】
SEQ ID NO:5〜9は、例示的なRab9A siRNA配列である。
【００２６】
SEQ ID NO:10〜11は、ヒトRab9A cDNAを検出するために使用されるプライマーである。
【００２７】
SEQ ID NO:12は、ヒトRab9A cDNAを検出するために使用されるFam標識されたプローブである。
【００２８】
SEQ ID NO:13〜14は、サルRab9A cDNAを検出するために使用されるプライマーである。
【００２９】
SEQ ID NO:15は、サルRab9A cDNAを検出するために使用されるFam標識されたプローブである。
【００３０】
SEQ ID NO:16〜19は、例示的なRab11A siRNA配列である。
【００３１】
SEQ ID NO:20〜23は、例示的なヒトPIKfyve siRNA配列である。
【００３２】
SEQ ID NO:24〜27は、例示的なヒトp40 siRNA配列である。
【００３３】
SEQ ID NO:28〜32は、例示的なヒトTIP47 siRNA配列である。
【００３４】
SEQ ID NO:33〜36は、サルRab9Aをクローン化するために使用されるプライマーである。
【００３５】
SEQ ID NO:37〜38は、RSVを検出するために使用することができるプライマーである。
【００３６】
SEQ ID NO:39〜40は、マウス・インターフェロン-γを検出するために使用することができるプライマーである。
【００３７】
SEQ ID NO:41〜42は、マウス・インターロイキン-10を検出するために使用することができるプライマーである。
【００３８】
SEQ ID NO:43〜44は、マウス・インターロイキン-12を検出するために使用することができるプライマーである。
【００３９】
SEQ ID NO:45〜46は、マウスβ-アクチンを検出するために使用することができるプライマーである。
【００４０】
SEQ ID NO:47〜48は、例示的なヒトRab9AアンチセンスRNA配列である。
【００４１】
SEQ ID NO:49〜50は、例示的なヒトRab11AアンチセンスRNA配列である。
【００４２】
SEQ ID NO:51〜52は、例示的なヒトPIKfyveアンチセンスRNA配列である。
【００４３】
SEQ ID NO:53〜54は、例示的なヒトp40アンチセンスRNA配列である。
【００４４】
SEQ ID NO:55〜56は、例示的なヒトTIP47アンチセンスRNA配列である。
【００４５】
SEQ ID NO:57〜58は、例示的なヒトRab9AリボザイムRNA配列である。
【００４６】
SEQ ID NO:59〜60は、例示的なヒトRab11AリボザイムRNA配列である。
【００４７】
SEQ ID NO:61〜62は、例示的なヒトPIKfyveリボザイムRNA配列である。
【００４８】
SEQ ID NO:63〜64は、例示的なヒトp40リボザイムRNA配列である。
【００４９】
SEQ ID NO:65〜66は、例示的なヒトTIP47リボザイムRNA配列である。
【００５０】
詳細な説明
略語および用語
用語および方法の以下の説明は、本開示をよりよく説明し、本開示の実践における当業者への手引きために提供される。単数形「一つの」および「その」には、文脈により他に明記されていなければ複数対象が含まれる。たとえば、「これらのモジュレーターを含む」という用語は、単一もしくは複数のRab9AまたはRab11Aモジュレーターを含み、「少なくとも1つのRab9Aまたは少なくとも1つのRab11Aモジュレーターを含む」という句、または「1つもしくは複数のRab9AまたはRab11Aモジュレーターを含む」という句と等価であるとみなされる。「または」という用語は、前後が明らかにそうでなことを示さない限り、言及した二者択一の要素または2つ以上の要素の組み合わせの単一の要素をいう。たとえば、「Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーター」という句は、Rab9A、Rab11A、1つもしくは複数のRab9Aモジュレーター、1つもしくは複数のRab11Aモジュレーター、またはこれらの組み合わせをいう。本明細書に使用される「含む（comprising）」は、「含む（including）」ことを意味する。したがって、「AまたはBを含む」は、さらなる要素を除外することなく「A、B、またはAおよびBを含む」ことを意味する。
【００５１】
他に説明がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示に関係する当業者により共通して理解される用語と同じ意味を有する。本明細書に記載のものに類似のまたは同等の方法および材料を、本開示を実践するうえでまたは試験するうえで使用することができるが、適当な方法および材料を以下に説明する。材料、方法、および例は、単なる例示に過ぎず限定することを企図するものではない。
【００５２】
開示されたGenbankアクセッション番号に提供した全ての配列は、参照として本明細書に組み入れられる。
DNA=デオキシリボ核酸
ds=二本鎖（たとえば、dsDNA）
PCR=ポリメラーゼ連鎖反応法
RNA=リボ核酸
mRNA=メッセンジャーRNA
MOI=感染効率
RSV=呼吸器合胞体ウイルス
siRNA=単鎖干渉または妨害RNA
ss=一本鎖（たとえば、ssDNA）
μg=マイクログラム
μl=マイクロリットル
【００５３】
活性：
Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーター核酸またはタンパク質配列などの分子の天然の生物活性をいう。分子の生物活性を妨害する方法は、当技術分野において公知であり、タンパク質または核酸配列の発現を減少する工程（たとえば、転写または翻訳の減少）、並びに所望の分子とその標的との間の相互作用を減少する工程（病原体、たとえば病原体タンパク質など）を含むが、これらに限定されるわけではない。また、分子の生物活性を増大する方法も当技術分野において公知であり、タンパク質または核酸配列の発現を増大する工程（転写または翻訳を増大する工程などの）、並びに所望の分子とその標的との間の相互作用を増大する工程を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５４】
アンチセンス、センス、および抗遺伝子：
アンチセンス分子は、RNAまたはDNAのプラス鎖に対して、特異的にハイブリダイズ可能か、または特異的に相補的である分子である。センス分子は、DNAのマイナス鎖に対して、特異的にハイブリダイズ可能であるか、または特異的に相補的である分子である。抗遺伝子分子は、特定のdsDNA標的に向けられたアンチセンスまたはセンス分子である。これらの分子は、Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターの発現などの遺伝子発現を妨害するために使用することができる。
【００５５】
cDNA（相補DNA）：
内部の、非コード部分（イントロン）および転写を決定する調節配列がないDNAの断片。また、cDNAは、対応するRNA分子の翻訳調節の役割を担う非翻訳領域（UTR）を含むことができる。cDNAは、細胞から抽出したメッセンジャーRNAからの逆転写によって実験室での合成などの種々の方法を使用して産生することができる。
【００５６】
相補：
1つの核酸分子の塩基がもう一つの核酸分子の塩基と水素結合を形成する場合に生じる相補結合。通常、塩基アデニン（A）は、チミジン（T）およびウラシル（U）に対して相補であり、一方シトシン（C）は、グアニン（G）に対して相補である。たとえば、1つのssDNA分子の配列5'-ATCG-3'は、もう一つのssDNAの3'-TAGC-5'と結合して、dsDNAを形成することができる。
【００５７】
核酸分子は、それぞれの分子の全ての塩基において完全な水素結合がない場合でさえ、互いに対して相補的であることができる。例のみとして（および、限定されるわけではないが）、ssDNA：
2008506356.tif 000002
は、第7番目の位置にミスマッチ塩基対（A-TまたはG-CではなくA-C）がある場合であっても、ssDNA
2008506356.tif 000003
に相補的であるとみなされる。
【００５８】
保存的置換：
アミノ酸残基を同様の生化学的性質を有する別のアミノ酸残基に置換すること。典型的には、保存的置換は、生じるポリペプチドの生物活性に対してほとんど影響をもたない。特定の例において、保存的置換は、ペプチドの生物学的機能に対して実質的に影響を及ぼさないペプチドにおけるアミノ酸置換である。ペプチドは、1つまたは複数のアミノ酸置換、たとえば2、5または10個の保存的置換などの2〜10個の保存的置換、2〜5個の保存的置換、4〜9個の保存的置換を含むことができる。
【００５９】
たとえば、Rab9Aペプチドにおける保存的置換は、Rab9Aが、脂質ラフトをハイジャックすることができる病原体などの病原体、たとえばHIV、マールブルク、麻疹、RSV、またはエボラウイルスによる感染に対して耐性を与える能力に実質的に影響を及ぼさないものである。
【００６０】
ペプチドは、そのペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、たとえば部位特異的変異誘発またはPCRもしくはペプチド合成法などの当技術分野において公知の手順を使用して、1つまたは複数の保存的置換を含むように作製することができる。アラニン・スキャンは、タンパク質のどのアミノ酸残基が、アミノ酸置換を許容することができるかを同定するために使用することができる。一つの例において、タンパク質の生物活性は、アラニン、またはその他の保存的アミノ酸（下記のこれらの一覧表に記載したものなど）が、1つまたは複数の天然のアミノ酸を置換した場合に、25%以上、たとえば20%以上、たとえば10%以上減少しない。
【００６１】
タンパク質の本来のアミノ酸を置換することができ、かつ保存的置換と考えられているアミノ酸の例は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。
2008506356.tif 000004
【００６２】
保存的置換に関するさらなる情報は、Ben-Bassat et al.（J. Bacteriol. 169：751-7, 1987）, O'Reganet al.（Gene 77：237-51, 1989）, Sahin-Toth et al.（Protein Sci. 3：240-7, 1994）, Hochuli et al.（Bio/Technology 6：1321-5, 1988）および遺伝学および分子生物学の標準的な教科書に見いだすことができる。
【００６３】
減少：
たとえば対照と比較して、何かの量または活性を減少させること。「減少」という用語が本明細書に使用される場合に、100%の減少は必要とされていない。したがって、本用語は、少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、またはさらに少なくとも100%の減少をいうことができる。特定の例において、減少の量は、治療的もしくは予防の薬剤を受けていない試料または被験者などの対照と比較される。
【００６４】
エボラウイルス：
最初に認識された場所であるアフリカのコンゴ民主共和国（以前は、ザイール）の川の名をとって名づけられた非常に伝染出血性ウイルス。エボラは、フィロウイルスと呼ばれるRNAウイルスのファミリーの2つのメンバーのうちの1つである。4つのエボラウイルスのサブタイプが同定された。エボラ-ザイール、エボラ-スーダン、およびエボラ-アイボリーコーストは、ヒトでの疾患を引き起こした。エボラ-レストンは、ヒト以外の霊長類での疾患を引き起こしたが、ヒトではない。
【００６５】
エボラウイルス感染によって生じるエボラ出血熱（エボラHF）は、重篤で、たいていヒトおよびヒト以外の霊長類（たとえば、サル、ゴリラ、およびチンパンジー）に致命的な疾患である。エボラ感染の初期の症候は、赤い眼および皮膚発疹を含み得る。症状発現の数日後にエボラHFの症例を診断するためには、抗原-捕獲酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）試験、IgM ELISA、PCR、およびウイルス単離を用いることができる。疾患の経過後半、または回復後に試験した被験者をIgMおよびIgG抗体について試験することができる。また、本疾患は、免疫組織化学試験、ウイルス単離、またはPCRを使用することによって診断することができる。
【００６６】
コードする：
その前後から明らかでなければ、本用語が典型的に使用されるように、ペプチドをコードするDNA配列、並びに阻害性アンチセンス分子に転写されるDNA配列を含む。
【００６７】
被膜RNAウイルス：
ゲノムがRNA（プラスまたはマイナスRNA鎖）を含み、および宿主由来のエンベロープに由来することができるウイルス。ウイルスのエンベロープは、それが由来する膜の脂質およびタンパク質成分を含む。特定の例において、エンベロープは、宿主細胞原形質膜に（HIVの場合と同様に）、宿主核膜に（ヘルペスウイルスの場合と同様に）、または宿主ゴルジ体（ワクシニアの場合と同様に）に由来する。
【００６８】
エンベロープを有するポジティブ鎖RNAウイルスの特定の例は：トガウイルス（この例には、風疹を含む）；アルファウイルス（西ウマ脳炎ウイルス、東ウマ脳炎ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスなど）；フラビウイルス（この例には、デングウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、およびC型肝炎ウイルスを含む）；およびコロナウイルス属（SARSなど）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００６９】
ポジティブ鎖RNAウイルスの具体例は、レトロウイルスである。レトロウイルス・ゲノムは、一本鎖の（+）センスである2つのRNAの分子からなり、5'キャップおよび3'ポリ（A）（mRNAと同等）を有する。レトロウイルスの具体例は：ヒト免疫不全症ウイルス1型（HIV-1）、HIV-2；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコの免疫不全ウイルス（FIV）；ネコ白血病ウイルス（FeLV）；サル免疫不全ウイルス（SIV）；およびトリ肉腫ウイルスを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００７０】
エンベロープを有する例示的ネガティブ鎖RNAウイルスは：オルソミクソウイルス（インフルエンザウイルスなど）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルスなど）、パラミキソウイルス（この例には、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、呼吸器合胞体ウイルスを含む）、およびフィロウイルス（マールブルクおよびエボラなど）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００７１】
発現：
遺伝子配列に関して、遺伝子の転写を、および適切ならば、生じるmRNA転写物のタンパク質への翻訳をいう。したがって、タンパク質コード配列の発現は、コード配列の転写および翻訳によって生じる。
【００７２】
機能的欠失：
突然変異、部分的もしくは完全な欠失、挿入、または遺伝子産物の産生を阻害するか、または機能しない遺伝子産物を与える遺伝子配列を生じさせるその他の変異。たとえば、細胞におけるRab9A遺伝子の機能的欠失により、機能しないRab9Aタンパク質を有する細胞を生じて、脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による感染に対して増大された耐性を有する細胞を生じる。
【００７３】
遺伝子：
プロモーターまたはオペレーターなどの制御配列の制御下でペプチドをコードする核酸配列。遺伝子は、ペプチドをコードするオープンリーディングフレーム、並びにエキソンおよび（任意に）イントロン配列を含む。イントロンは、タンパク質に翻訳されず、一般にエキソンの間に見いだされる所与の遺伝子に存在するDNA配列である。遺伝子のコード配列は、適切な制御配列の制御下に配置した場合に（インビボで、インビトロで、またはインサイチューで）、ペプチドに転写され、変換される部分である。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端の開始コドンおよび3'（カルボキシル）末端の終止コドンによって決定することができる。コード配列が真核細胞に発現される場合、ポリアデニル化シグナルおよび転写終結配列を、コード配列に対して3'に含めることができる。
【００７４】
転写および翻訳制御配列には、宿主細胞における発現などのコード配列の発現をもたらすプロモーター、エンハンサ、およびターミネーターなどのDNA制御配列を含むが、これらに限定されるわけではない。ポリアデニル化シグナルは、例示的真核生物の制御配列である。プロモーターは、RNAポリメラーゼを結合すること、および下流の（3'方向）コード配列の転写を開始することができる制御領域である。さらに、遺伝子は、細胞の表面上に分泌され、または発現されるタンパク質のコード配列の初めのシグナル配列を含むことができる。この配列は、成熟ポリペプチドに対してN末端に、ポリペプチドを転位置するように宿主細胞を指揮するシグナルペプチドをコードすることができる。
【００７５】
宿主細胞：
ウイルスなどの病原体に感染し得る任意の細胞。宿主細胞は、昆虫、甲殻類、哺乳類、鳥類、爬虫類、酵母由来の細胞などの原核生物もしくは真核生物、または大腸菌（Escherichia coli）などの細菌であることができる。例示的な宿主細胞は、哺乳類Bリンパ球細胞を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００７６】
宿主細胞は、生物体（ヒトまたは獣医学的被験者など）の一部、または哺乳動物細胞の培養もしくは細菌培養などの細胞培養の一部であることができる。宿主核酸分子は、宿主タンパク質を発現する宿主細胞に存在する核酸分子である。Rab9A、Rab11A、もしくはこれらのモジュレーター（Rab9AまたはRab11A活性を増大するモジュレーターなど）、ペプチド、または核酸分子と病原体（病原体タンパク質など）との間の相互作用を減少させること、または阻害することは、インビトロの、インビボの、およびインサイチューの環境で生じさせることができる。
【００７７】
ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）：
ヒトにおいて免疫抑制を生じさせ、後天性免疫不全症候群（AIDS）として公知の疾患複合体を引き起こすレトロウイルス。免疫抑制は、CD4細胞表面糖タンパク質を発現するTリンパ球の進行性の枯渇および機能損傷により生じる。CD4 T細胞の枯渇は、HIVがこれらのT細胞に選択的に感染して複製し、最終的に破壊する能力によって生じる（たとえば、Klatzmann et al., Science 225：59, 1984を参照されたい）。CD4自体は、HIVのための細胞受容体の重要な成分、いくつかの例においては必須成分である。
【００７８】
HIVサブタイプは、HIV-1およびHIV-2などの特定の番号によって同定することができる。HIVライフサイクルにおいて、ウイルスは、少なくとも3つの段階：受容体ドッキング、ウイルスの細胞膜融合、および粒子摂取で宿主細胞に入る（D'Souza et al., JAMA 284：215, 2000）。HIVに関するより詳細な情報は、 Coffin et al., Retroviruses （Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1997）に見いだすことができる。
【００７９】
HIVは、感染個体に存在するHIVウイルスの量を測定する定量的PCR法、およびHIV抗体が被験者の血液に存在するかどうかを決定する抗体アッセイ法（ELISAアッセイ法またはウエスタンブロット法など）などの、ルーチンの方法を使用して被験者において診断することができる。
【００８０】
HIV感染症の初期の症候は、通常、以下の1つまたは複数などの任意のウイルス感染について観察されるものである：発熱、頭痛、疲労、およびリンパ節の拡大。AIDSの発症を含むHIV感染症の後期の症候は、以下の1つまたは複数を含むことができる：エネルギーの欠如、体重減少、頻繁発熱および発汗、持続的または頻繁な酵母感染（経口または膣）、持続的皮膚発疹または鱗状皮膚、治療に応答しない女性の骨盤内炎症性疾患、および短期記憶喪失。
【００８１】
ハイブリダイゼーション：
核酸分子のハイブリダイゼーションは、2つの相補核酸分子が互いに水素結合の量を受ける場合に生じる。特定の程度のストリンジェンシーを生じるハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション法および組成物の性質並びにハイブリダイズする核酸配列の長さによって変化すると考えられる。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（Na+濃度などの）が、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定すると考えられる。特定の程度のストリンジェンシーを達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する算出は、Sambrook et al.（1989） Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, NY （chapters 9 and 11）および Tijssen, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes PartI, Chapter 2 （Elsevier, New York, 1993）において論議されている。
【００８２】
以下は、ハイブリダイゼーション条件の例示的なセットであり、限定されるわけではない。
非常に高いストリンジェンシー（90%の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：5×SSCを65℃にて16時間
洗浄2回：2×SSCを室温（RT）にてそれぞれ15分間
洗浄2回：0.5×SSCを65℃にてそれぞれ20分間
高いストリンジェンシー（80%以上の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：5×〜6×SSCを65℃〜70℃にて16〜20時間
洗浄2回：2×SSCを室温にてそれぞれ5〜20分
洗浄2回：1×SSCを55℃〜70℃にてそれぞれ30分間
低いストリンジェンシー（50%以上の同一性を共有する配列を検出する）
ハイブリダイゼーション：6×SSCをRT〜55℃にて16〜20時間
少なくとも2回の洗浄：2×〜3×SSCをRT〜55℃にてそれぞれ20〜30分間。
【００８３】
感染：
ウイルスまたはその他の感染性病原体の宿主細胞への侵入、複製、挿入、溶解、または発病（pathogensis）に関与するその他のイベントもしくはプロセス。したがって、感染を減少することには、ウイルスまたはその他の病原体の細胞もしくは被験者への侵入、複製、挿入、溶解、もしくはその他の発病（pathogensis）、またはこれらの組み合わせを減少させることを含む。感染は、非組換えウイルス、組換えウイルス、プラスミド、細菌、プリオン、真核生物の微生物、細菌、真菌、原生動物、または被験者の細胞などの宿主に感染することができるその他の媒介物などの感染媒介物の導入を含む。
【００８４】
もう一つの例において、感染は、たとえば形質導入、形質転換、またはトランスフェクションを経た、宿主細胞への組換えベクターの導入である。たとえば、組換えベクターは、Rab9A（SEQ ID NO:1〜2と関連する任意の標的配列、またはこれらの変異体、融合、もしくは断片、並びにSEQ ID NO:1〜2それ自体など）、Rab11A、またはRab9AもしくはRab11Aのモジュレーターを認識するアンチセンス分子またはsiRNAを含むことができる。
【００８５】
単離された：
「単離された」生物学的成分（核酸分子またはタンパク質など）は、実質的に、その他の染色体および染色体外DNAおよびRNA、並びにタンパク質などの成分が天然に存在する生物体の細胞のその他の生物学的成分から分離され、これらから分離して産生され、またはこれらから分離して精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質は、標準的な精製法によって精製された核酸分子およびタンパク質、宿主細胞における組換え発現によって調製されたもの、並びに化学的に合成された核酸分子およびタンパク質を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００８６】
マールブルグウイルス（MBGV）：
最初の大発生が1967年に発生したMarburg, Germanyの名をとって名づけられた高度に伝染出血性のウイルス。マールブルクは、フィロビリダエ（Filoviridae）と呼ばれるRNAウイルスのファミリーのフィロウイルスの2つのメンバーのうちの1つである。マールブルク型に属するウイルス間には、ほとんど遺伝的多様性がない。
【００８７】
マールブルク感染の症候は、以下の1つまたは複数を含み得る：発熱（典型的には、7日間持続する）の突然の発症、斑丘疹点状出血の発疹、および大量出血。
【００８８】
マールブルクは、当技術分野において公知の方法を使用して診断することができる。特定の例には、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：Taqman-RT-PCR（たとえば、Weidmann et al., J. Clin. Virol. 30：94-9, 2004を参照されたい）、リアルタイム逆転写-PCR（たとえば、Drosten et al., J. Clin. Microbiol. 40： 2323-30,2002を参照されたい）、並びに被験者から得られた試料中のマールブルク抗体を検出すること。
【００８９】
麻疹ウイルス（MV）：
麻疹は、パラミキソウイルス科と呼ばれるウイルスのファミリーの麻疹ウイルス属である。麻疹は、最も高度な接触感染性の感染症のうちの1つである。ウイルスは、風媒性小滴によって伝達し、人から人に容易に広がる。ウイルスは、上気道を介して体に入る。
【００９０】
麻疹感染の症候は、以下の1つまたは複数を含み得る：発熱、鼻水、咳、および赤、なみだ眼、しばしば光に対する感受性を伴う。
【００９１】
麻疹は、当技術分野において公知の方法を使用して診断することができる。特定の例には、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：咽喉からウイルスを単離するか、または抗体についての血液試験によるなど、被験者から得られた試料における麻疹ウイルスまたは麻疹抗体を検出すること。
【００９２】
ミクロRNA（miR）：
相同的mRNAとの相互作用を介して遺伝子発現の転写後調節を指揮する小さな非コードRNA配列。MiRは、翻訳を阻害することができるか、または標的mRNAを直接切断することができる。したがって、miRsは、遺伝子の発現を減少し、または阻害するために使用することができる。特定の例において、miRsは、約21〜26のヌクレオチドの長さである。
【００９３】
核酸：
一本鎖（ss）もしくは二本鎖（ds）形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド重合体であり、天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で核酸にハイブリダイズする天然のヌクレオチドの類似体を含むことができる。いくつかの例において、核酸は、ヌクレオチド類似体である。
【００９４】
特に明記しない限り、核酸分子に対するいずれの言及にも、核酸の逆相補体を含む。本明細書の文面により、一本鎖であることが必要とされる場合（たとえば、ssRNA分子）を除き、一本鎖のみを示すために書かれた任意の核酸には、対応する二本鎖核酸の両方の鎖を包含する。たとえば、dsDNAのプラス鎖の描写には、そのdsDNAの相補マイナス鎖も包含する。さらに、具体的タンパク質をコードする核酸分子またはこれらの断片に対する言及には、センス鎖およびその逆相補体を包含する。
【００９５】
核酸分子の断片には、Rab9A核酸配列（SEQ ID NO:1〜2と関連する配列など）、Rab11A核酸配列、またはRab11AもしくはRab9Aモジュレーターの核酸配列などの核酸配列由来の少なくとも5つの隣接する塩基を含む。特定の例において、核酸分子の断片は、所望の核酸配列の少なくとも10個の隣接する塩基、少なくとも20個の隣接する塩基、少なくとも25個の隣接する塩基、少なくとも50個の隣接する塩基、少なくとも100個の隣接する塩基、少なくとも250個の隣接する塩基、またはさらに少なくとも500個の隣接する塩基に対応する。本明細書に記述した核酸の断片は、siRNA、リボザイム、三重らせん体、ミクロRNA、およびアンチセンス分子を作製するために使用することができる。
【００９６】
オリゴヌクレオチド
少なくとも9ヌクレオチド、たとえば少なくとも15、少なくとも18、少なくとも24、少なくとも25、少なくとも30、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも200、またはさらに少なくとも500ヌクレオチドの長さの直鎖状ポリヌクレオチド（DNAまたはRNAなど）配列。特定の例において、オリゴヌクレオチドは、6〜50塩基、たとえば10〜25塩基、12〜20塩基などである。
【００９７】
オリゴヌクレオチド類似体は、オリゴヌクレオチドに類似して機能するが、天然に存在しない部分を有する部分をいう。たとえば、オリゴヌクレオチド類似体は、ホスホロチオアート・オリゴデオキシヌクレオチドなどの、糖残基またはインター糖結合が変更されたものなどの天然に存在しない部分を含むことができる。天然に存在するポリヌクレオチドの機能的類似体は、RNAまたはDNAと結合することができ、ペプチド核酸（PNA）分子を含む。
【００９８】
オープンリーディングフレーム（ORF）
内部にいずれの終止コドンも含まないアミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット（コドン）。これらの配列は、通常ペプチドに翻訳可能である。
【００９９】
作動可能に連結された
第一の核酸配列は、第一の核酸配列が第二の核酸配列と機能的な関係に配置される場合に、第二の核酸配列と作動可能に連結されている。たとえば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列に作動可能に連結されている。一般に、作動可能に連結されたDNA配列は、隣接しており、2つのタンパク質コード領域を連結することが必要な場合は、同じ読み枠にある。
【０１００】
p40（またはRab9p40）：
p40という用語は、任意の生物体に由来する任意のp40遺伝子、cDNA、RNA、またはタンパク質を含み、これは、Rab9-GTPに結合することができ、エンドソームからトランスゴルジへの輸送を刺激することができるp40である（たとえば、Diaz et al., J. Cell Biol. 138：283-90, 1997を参照されたい）。p40は、文献においてRab9p40ともいわれる。特定の例において、p40は、またp40-PIKfyveと相互作用し、PIKfyve相互作用およびその後のPIKfyveで触媒されるp40リン酸化により、p40を別々の膜にアンカーして、後期エンドソームからトランスゴルジへの輸送を容易にする。
【０１０１】
天然のp40配列の例には、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：Genbankアクセッション番号：NM_015040、NM_005833.2、およびCR456837.1（cDNA）、並びにNP_005824およびCAG33118（タンパク質）。一つ例において、p40配列は、全長野生型（または天然の）配列、並びに後期エンドソームからトランスゴルジへの輸送を容易にする能力を保持するp40変異体、断片、相同体、または融合配列を含む。一定の例において、p40は、ヒトp40ヌクレオチドまたはタンパク質配列などの天然のp40配列に対して、少なくとも80%の配列同一性、たとえば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有する。
【０１０２】
その他の例において、p40核酸配列は、GenBankアクセッション番号NM_005833.2またはCR456837.1に記載された配列に対して高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができ、p40活性を保持する。
【０１０３】
病原体：疾患を生じる因子
例には、ウイルス、細菌、原生動物、および真菌を含むが、これらに限定されるわけではない。特定の例において、病原体は、脂質ラフトをハイジャックすることができるものである。
【０１０４】
ウイルスの例には、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：パルボウイルス、乳頭腫ウイルス、フィロウイルス、SARS（重症急性呼吸器症候群）ウイルス、ハンタウイルス、インフルエンザウイルス（インフルエンザA型、B型、およびC型ウイルスなど）、A〜G型肝炎ウイルス、カリチウイルス、アストロウイルス、ロタウイルス、コロナウイルス、（たとえば、ヒト呼吸器コロナウイルス）、ピコルナウイルス、（たとえば、ヒトライノウイルスおよびエンテロウイルス）、ヒトヘルペスウイルス（帯状疱疹、エプスタイン-バー、およびヒトサイトメガロウイルスを含むHSV-1〜9など）、ヒトアデノウイルス、天然痘ウイルス、およびハンタウイルス。特定の例において、ウイルスは、HIV（HIV-1およびHIV-2を含む）、エボラウイルス、マールブルグウイルス、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）、および麻疹ウイルスなどの被膜RNAウイルスである。
【０１０５】
細菌の例は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：リステリア（種）、ミコバクテリア種（Mycobacterium）（結核菌など）、リケッチア（Rickettsia）（全ての型）、エーリキア（Ehrlichia）、キラミダ（Chylamida）、カンピロバクタージェジュニ（Campylobacter jujuni）、ノカルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）、レジオネラ（Legionella）種（L. ニューモフィラ（L. pneumophila））、ブルセラ（Brucella）種（ウシ流産菌（B. abortus）など）、大腸菌、サルモネラ（Salmonella）種（ネズミチフス菌（S. typhimurium）など）、赤痢菌（Shigella）種、（フレキシナ赤痢菌（S. flexneri）など）、ペスト菌（Yersinia pestis）、パスツレラ・ヘモリチカ（Pasteurella haemolytica）、パスツレラ・ムルトシダ、アクチノバシラス・プリューロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）、リステリア菌（Listeria monocytogenes）、コードリア・ルミナンチウム（Cowdria ruminantium）、コルシエラ・ブネッチ（Coxiella burnetti）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、コレラ菌、カンピロバクター（Campylobacter）種、髄膜炎菌（Neiserria meningitidis）、淋菌（Neisseria gonorrhea）、シュードモナス（Pseudomonas）種、インフルエンザ桿菌（Haemophilus influenzae）、および破傷風菌（Clostridium tetani）。
【０１０６】
原生動物および真菌の種の実施例は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）、トキソプラズマ原虫（Toxoplasma gondii）、ニューモシステイス・カリニ（Pneumocystis carinii）、クルーズトリパノソーマ（Trypanosoma cruzi）、リーシュマニアドノヴァニ（Leishmania donovani）、タイレリア・アヌラタ（Theileria annulata）、鶏球虫（Eimeria tenella）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Histoplasma capsulatum）、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Cryptococcus neoformans）、ブラストミセスデルマティティディス（Blastomyces dermatitidis）、コクシジオイデス・イミティス（Coccidioides immitis）、パラコクシジオイデス・ブラシリエンシス（Paracoccidioides brasiliensis）、ペニシリウム・マルネフェイ（Penicillium marneffei）、およびカンディダ（Candida）種。
【０１０７】
脂質ラフトをハイジャックする病原体：
その複製サイクルの少なくとも1つの工程を完了するために脂質ラフトを使用することができる病原体。脂質ラフトをハイジャックする病原体の例は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：カンピロバクター・ジュジュニ、コレラ菌、SV40、レジオネラ・ニューモフィラ、アエロモナス・ハイドロフィリア、エコーウイルス1、エコーウイルス11、ブルセラ種、クロストリジウム種、トリ肉腫および白血病ウイルス、HimH, Dr大腸菌、化膿性連鎖球菌（Streptcoccus pyogenes）、セムリキ森林ウイルス、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、エコトロピックマウス白血病ウイルス、フレキシナ赤痢菌（Shigella flexneri）、卒倒病菌（Bacillus thuringiensis）、HTLV-1、クラミジア（Chlamydia）種、ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）、HIV-1、ミコバクテリア種、リステリア菌（Lysteria monocytogenes）、エボラ、マールブルク、麻疹、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス（RSV）、またはEBウイルス。
【０１０８】
医薬品または薬物：
単独で、または別の治療薬もしくは薬学的に許容される担体と組み合わせて被験者に投与された場合に、所望の治療的もしくは予防の効果を誘導することができる化学物質または組成物。特定の例において、医薬品は、ウイルスなどの病原体による、被験者の細胞などの細胞の感染を減少し、またはさらに阻害する。
【０１０９】
PIKfyve（またはPIP5K3）：
PIKfyveという用語は、任意の生物体に由来する任意のPIKfyve遺伝子、cDNA、RNAまたはタンパク質を含み、これは、ホスファチジルイノシトール（PtdIns）5-リン酸塩（P）およびホスファチジルイノシトール3,5-P（2）の合成を触媒することができるPIKfyveである。一定の例において、PIKfyveは、後期エンドソームからトランスゴルジ網輸送因子Rab9エフェクターp40の膜付着に関連し、および促進する（たとえば、Ikonomov et al.J. Biol. Chem. 278：50863-71, 2003を参照されたい）。
【０１１０】
天然のPIKfyve配列の例は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。：Genbankアクセッション番号：NM_015040、AY457063、およびBC032389（cDNA）、並びにNP_055855.1、Q9Y2I7、およびAAR19397（タンパク質）。一つの例において、PIKfyve配列は、全長野生型（または天然の）配列、並びにPtdIns 5-PおよびPtdIns 3,5-P（2）の合成を触媒する能力を保持するPIKfyve変異体、断片、相同体または融合配列を含む。一定の例において、PIKfyveは、天然のPIKfyveタンパク質または核酸配列に対して少なくとも80%の配列同一性、たとえば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有する。
【０１１１】
特定の例において、PIKfyve核酸配列は、GenBankアクセッション番号AY457063またはBC032389に記載された配列に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができ、PIKfyve活性を保持する。
【０１１２】
多型
核酸配列の2つ以上のバージョンが被験者集団に存在する場合に、多型が存在する。たとえば、多型核酸は、最も共通する対立遺伝子が99%以下の頻度を有するものであることができる。異なる対立遺伝子は、核酸配列の相違に従って同定することができ、集団の1%よりも多くに生じる遺伝的変異（これは、多型を定義するための一般に認められた頻度である）は、一定の適用のために有用な多型である。
【０１１３】
対立遺伝子の頻度（特定された型の集団内の全ての対立遺伝子核酸の比率）は、集団内の対立遺伝子の数および型を計数するか、または推定して直接決定することができる。対立遺伝子頻度を決定するための多型および方法は、Hartl, D.L. and Clark, A.G., Principles of Population Genetics, Third Edition （Sinauer Associates, Inc., Sunderland Massachusetts, 1997）に、特に1章および2章に議論してある。
【０１１４】
疾患を予防し、または治療すること：疾患を「予防する」ことは、疾患の完全な発症を阻害すること、たとえば病原体感染の発症を予防することをいう。「治療」は、病原体感染を阻害し、または減少させるなど、疾患の徴候もしくは症候または病原体感染に関連した病状を寛解させる治療的介入をいう。
【０１１５】
タンパク質コード配列またはペプチドをコードする配列：
適切な制御配列の制御下に配置された場合に、インビトロまたはインビボで転写され（DNAの場合）、およびペプチドに変換される（mRNAの場合）核酸配列。コード配列の境界は、5'（アミノ）末端の開始コドンおよび3'（カルボキシ）終点の翻訳終止コドンによって決定される。コード配列は、原核または真核生物のmRNA由来のcDNA、原核または真核生物のDNA由来のゲノムのDNA配列、およびさらに合成DNA配列を含むことができるが、これらに限定されるわけではない。転写終結配列は、通常コード配列に対して3'に位置する。
【０１１６】
精製された：
精製されたという用語は、絶対純度を必要とせず；むしろ、これは、相対的な語である。したがって、たとえば精製されたタンパク質標品は、タンパク質が細胞成分（核酸、脂質、炭水化物、およびその他のタンパク質）（これは、それを伴ってもよい）から実質的に分離されるように、タンパク質が細胞内の環境にあるよりも、タンパク質が濃縮されたものである。もう一つの例において、精製したタンパク質標品は、タンパク質の化学合成後に存在するかもしれないものなどのタンパク質に混入物が実質的にないものである。
【０１１７】
一つの例において、タンパク質は、試料の少なくとも60重量%がタンパク質で構成される場合に、たとえば少なくとも75%、少なくとも95%、または試料の少なくとも99%以上が、Rab9Aペプチドなどのタンパク質で構成される場合に、精製されている。タンパク質を精製するために使用することができる方法の例は、Sambrook et al.（Molecular Cloning： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1989, Ch. 17）に開示された方法を含むが、これに限定されるわけではない。タンパク質純度は、たとえばタンパク質試料のポリアクリルアミドゲル電気泳動、続くポリアクリルアミドゲル染色による単一のポリペプチド・バンドの可視化；高圧液体クロマトグラフィー；シーケンシング；またはその他の従来法によって決定することができる。
【０１１８】
Rab9A：
Rab9Aという用語は、任意の生物体由来の任意のRab9A遺伝子、cDNA、RNA、またはタンパク質を含み、これは、後期エンドソームからトランスゴルジに輸送して、ras様のGTPaseとして機能することができるRab9Aである。いくつかの例において、Rab9Aは、脂質ラフト形成に関与する。
【０１１９】
天然のRab9A核酸配列の例には、SEQ ID NO:1および2と関連する標的配列を含むが、これに限定されるわけではない。Rab9A配列の例には、Genbankアクセッション番号：BC017265.2およびNM_004251.3（cDNA）、並びにP51151およびAAH17265（タンパク質）を含むが、これに限定されるわけではない。言及したGenBankアクセッション番号下で提供される配列は、この参照によってその全体が本明細書に取り込まれる。一つの例において、Rab9A配列は、全長野生型（または天然の）配列、並びに後期エンドソームからトランスゴルジに輸送する能力を保持するRab9A変異体、断片、相同体、または融合配列を含む。一定の例において、Rab9Aは、天然のRab9A配列に対して少なくとも80%の配列同一性、たとえば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有する。特定の例において、Rab9A核酸配列は、GenBankアクセッション番号BC017265.2またはNM_004251.3に記載された配列に対して高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズすることができ、Rab9A活性を保持する。
【０１２０】
Rab9Aモジュレーター：
ヌクレオチドまたはタンパク質配列などのRab9Aと直接または間接的に相互作用する分子。いくつかの例において、Rab9Aモジュレーターは、たとえばRab9A mRNAの転写または翻訳を増大することによってRab9A活性を増大する。その他の例において、Rab9Aモジュレーターは、たとえばRab9A mRNAの転写または翻訳を減少させることによってRab9A活性を減少させる。特定の例において、Rab9Aモジュレーターは、Rab9Aとの相互作用を経て後期エンドソームからトランスゴルジへのタンパク質およびその他の分子の輸送に関与するタンパク質である。
【０１２１】
例示的Rab9Aモジュレーターには、以下を含むが、これに限定されるわけではない：p40（本明細書において、p40と称される）などのRab9エフェクター；PIKfyve；Yip3（たとえば、Sivars et al., Nature 425：856-9, 2003を参照されたい；例示的なYip3核酸およびペプチド配列については、GenBankアクセッション番号NM_006423を参照されたい）などのGDI-置換因子（GDF）（たとえば、Dirac-Svejstrup et al., EMBO J. 16：465-72, 1997を参照されたい）；腫瘍感受性遺伝子101（TSG101；たとえば、Panchal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100：15936-41, 2003を参照されたい；例示的なTSG101核酸およびペプチド配列についてはGenBankアクセッション番号NM_006292を参照されたい）；TIP47（例示的なTIP47核酸およびペプチド配列については、GenBankアクセッション番号NM_005817を参照されたい）；v-SNAREタンパク質（例示的なv-SNARE核酸およびペプチド配列についてはGenBankアクセッション番号XM_371718参照されたい）；マンノース-6-リン酸受容体（例示的なマンノース-6-リン酸受容体核酸およびペプチド配列についてはGenBankアクセッション番号NM_002355参照されたい）；マプモジュリン（mapmodulin）（たとえば、Itin et al., Mol. Biol. Cell. 10：2191-7, 1999を参照されたい；例示的なマプモジュリン核酸およびペプチド配列についてはGenBankアクセッション番号AF025684を参照されたい）；シンタキシン11、t-SNAREタンパク質（例示的なt-SNARE核酸およびペプチド配列についてはGenBankアクセッション番号AF044309参照されたい）；GDP解離阻害剤（例示的なGDP核酸およびペプチド配列についてはGenBankアクセッション番号NM_001493を参照されたい）；およびグアニンヌクレオチド交換因子（GEF）（例示的なGEF核酸およびペプチド配列についてはGenBankアクセッション番号L13858を参照されたい）。具体例において、Rab9Aモジュレーターは、PIKfyve、p40、TIP47、またはこれらの組み合わせを含む。もう一つの具体例において、Rab9Aモジュレーターは、TIP47を除外する。
【０１２２】
Rab11A：
Rab11Aという用語は、任意の生物体由来の任意のRab11A遺伝子、cDNA、RNA、またはタンパク質を含み、トランスゴルジから細胞膜への輸送を媒介することができるRab11Aである。また、Rab11Aは、エンドソームを再利用する際に発現される。
【０１２３】
Rab11A配列の例は：Genbankアクセッション番号：X56740およびL19260（cDNA）、並びにCAA40064およびAAA31491（タンパク質）を含むが、これに限定されるわけではない。一つの例において、Rab11A配列は、全長野生型（または天然の）配列、並びにトランスゴルジから細胞膜への輸送を媒介する能力を保持するRab11A変異体、断片、または融合配列を含む。一定の例において、Rab11Aは、天然のRab11配列に対して少なくとも80%の配列同一性、たとえば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有する。特定の例において、Rab11A核酸配列は、GenBankアクセッション番号X56740またはL19260に記載された配列にして高いストリンジェンシー下でハイブリダイズすることができ、Rab11A活性を保持する。
【０１２４】
Rab11Aモジュレーター：
ヌクレオチドまたはタンパク質配列などのRab11Aと直接または間接的に相互作用する分子。いくつかの例において、Rab9Aモジュレーターは、たとえばRab9A mRNAの転写または翻訳を増大することによってRab9A活性を増大する。その他の例において、Rab9Aモジュレーターは、たとえばRab9A mRNAの転写または翻訳を減少させることによってRab9A活性を減少させる。いくつかの例において、Rab11Aモジュレーターは、Rab11Aとの相互作用を経てトランスゴルジから細胞膜へのタンパク質およびその他の分子の輸送に関与するタンパク質である。
【０１２５】
Rab11Aモジュレーターの例には、Rab11-相互作用タンパク質（FIP）のファミリーのメンバーなどのRab11エフェクターを含むが、これに限定されるわけではない。具体例には、以下を含むが、これに限定されるわけではない：Secl5（たとえば、Zhang et al., J. Biol. Chem. 279：43027-34, 2004を参照されたい；例示的なSec15の核酸およびペプチド配列については、それぞれGenBankアクセッション番号NM_019053およびNP_061926を参照されたい）、Rip11（たとえば、Prekeris et al., Mol. Cell. 6：1437-48, 2000を参照されたい；例示的なRip11核酸およびペプチド配列については、それぞれGenBankアクセッション番号AF334812およびAAK20892を参照されたい）,FIP2（たとえば、Cullis et al., J. Biol. Chem. 277：49158-66,2002 を参照されたい；例示的なFIP2核酸およびペプチド配列については、それぞれGenBankアクセッション番号NM_014904およびNP_055719を参照されたい）、Rab-カップリングタンパク質（RCP）（たとえば、Lindsay et al., J. Biol. Chem. 277：12190-9, 2002を参照されたい；例示的なRCP核酸およびペプチド配列については、GenBankアクセッション番号AF368294を参照されたい）、FIP3／エフェリン（たとえば、Prekeris et al., J. Biol. Chem. 276：38966-70, 2001を参照されたい；例示的なFIP3核酸およびペプチド配列については、それぞれGenBankアクセッション番号NM_014700およびNP_055515を参照されたい）、FIP4（たとえば、Wallace et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 299：770-9, 2002を参照されたい；例示的なFIP4核酸およびペプチド配列については、それぞれGenBankアクセッション番号NM_032932およびNP_116321を参照されたい）、およびFIP 1（たとえば、Hales et al., J. Biol. Chem. 276：39067-75, 2001を参照されたい；例示的なFIP1核酸およびペプチド配列については、GenBankアクセッション番号NM_001002814を参照されたい）。全てのFIPは、Rab11/25-結合ドメイン（RBD）として公知である保存されたC末端モチーフを有する。さらなる構造ドメインの存在に基づいて、FIPは、3群に分類される：C2ドメインを含むクラスI FIP（Rip11、FIP2、およびRCP）、EFハンドのモチーフを含むクラスII FIP（FIP3／エフェリンおよびFIP4）、および公知のタンパク質ドメインに対して相同性のないクラスIII FIP（FIP1）。
【０１２６】
組換え：
組換え核酸またはタンパク質は、天然に存在しない配列を有するか、または2つの別々の分離された配列のセグメントの人為的組み合わせによって作製された配列を有するものである。この人為的組み合わせは、たとえば化学合成によって、または核酸もしくはタンパク質の単離されたセグメントの人為的操作によって、たとえば遺伝子工学技術によって達成することができる。
【０１２７】
RNA干渉（RNAi）：
二重鎖RNA（dsRNA）によって媒介される転写後の遺伝子サイレンシング・メカニズム。siRNA化合物などのdsRNAの細胞への導入により、相同配列をもつRNA分子のターゲットされた分解を誘導する。RNAi化合物は、たとえばRab9A、Rab11、およびこれらのモジュレーターなどの遺伝子をサイレンシングすることによって、転写を調整するために使用することができる。一定の例において、RNAi分子を、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターなどの標的遺伝子に向けられ、病原体感染を減少させるために使用される。
【０１２８】
配列同一性：
核酸またはアミノ酸配列との類似性は、配列間の類似性によって表される。配列同一性は、百分率同一性（または類似性もしくは相同性）によって測定されることが多く；百分率が高くなるほど、2つの配列は類似する。タンパク質もしくは核酸配列の相同体または変異体、およびこれらの対応するcDNAおよびタンパク質配列は、標準的な方法を使用して整列させた場合に、比較的高い程度の配列同一性を有する。
【０１２９】
比較のための配列の整列の方法は、当技術分野において周知である。種々のプログラムおよび整列アルゴリズムを以下に記述してある：Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2：482, 1981； Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48：443, 1970； Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85：2444, 1988； Higgins and Sharp, Gene 73：237-44, 1988； Higgins and Sharp, CABIOS 5：151-3, 1989； Corpet et al., Nucl. Acids Res. 16：10881-90, 1988； Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85：2444, 1988；およびAltschul et al., Nature Genet. 6：119-29, 1994。
【０１３０】
配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxと関連して使用するためのNCBI Basic Local Alignment Search Tool （BLAST（商標））（Altschul et al., J. Mol. Biol. 215：403-10, 1990）は、National Center for Biotechnology Information （NCBI, Bethesda, MD）を含むいくつかの供与源およびインターネット上から入手可能である。
【０１３１】
Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターなどのペプチドの変異体は、典型的には、デフォルト・パラメーターに設定したNCBI Blast 2.0ギャップドblastpを使用してアミノ酸配列で全長整列にわたって少なくとも70%の配列同一性をもつと計数されることによって特徴づけられる。約30アミノ酸を超えるアミノ酸配列の比較のためには、デフォルト・パラメーターに設定したデフォルトBLOSUM62マトリックス・セットを使用して、Blast 2の配列関数が利用される（11のギャップ存在コスト、および残基あたり1のギャップ・コスト）。短いペプチド（約30足らずのアミノ酸）を整列させる場合は、デフォルト・パラメーターに対するPAM30マトリックス・セットを使用して、Blast 2配列関数を使用して整列を行う（オープン・ギャップ9、エクステンション・ギャップ1ペナルティー）。参照配列に対してさらに高い類似性をもつタンパク質では、この方法によって評価した場合に、少なくとも80%などの、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、またはさらに少なくとも99%の配列同一性などの百分率同一性の増大を示す。完全な配列より少ないものを配列同一性について比較する場合に、相同体および変異体では、10〜20アミノ酸の短いウインドウにわたって、典型的には少なくとも80%配列同一性を有し、参照配列に対するこれらの類似性に応じて少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有し得る。このような短いウインドウにわたって配列同一性を決定するための方法は、National Center for Biotechnology Information in Bethesda, Marylandによって維持されているウェブサイトに記述されている。当業者であれば、これらの配列同一性範囲が、ガイダンスだけのために提供されることを認識し；提供された範囲外に入る強く有意な相同体を得ることができることも、十分にあり得る。
【０１３２】
同様の方法を使用して、2つ以上の核酸間の配列同一性を決定することができる。2つの核酸配列を比較するために、BLASTN選択肢を以下のとおりに設定することができる：-iは、比較される第一の核酸配列を含むファイル（C：＼seq1.txtなど）に設定する；-jは、比較される第二の核酸配列を含むファイル（C：＼seq2.txtなど）に設定する；-pは、blastnに設定する；-oは、任意の所望のファイル名に設定する（C：＼output.txtなど）；-qは、-1に設定する；-rは、2に設定する；およびその他の選択肢は、全てこれらの省略時設定のままにする。たとえば、以下のコマンドを2つの配列間の比較を含む出力ファイルを作製するために使用することができる：C：＼B12seq-i c：＼seq1.txt-j c：＼seq2.txt-p blastn-o c：＼output.txt-q-1-r 2。
【０１３３】
一旦整列させると、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が両方の配列に提示される位置の数を計数することにより、マッチの数を決定する。百分率配列同一性は、同定された配列に記載された配列の長さによるか、または明瞭に表現された長さ（たとえば、同定された配列に記載した配列からの100個の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基）によるか、いずれかによってマッチの数を割って、続いて生じる値に100を掛けることによって決定される。たとえば、1166個のマッチを有する核酸配列は、1154個のヌクレオチドを有する試験配列と共に整列させた場合に、試験配列に対して75.0パーセント同一である（たとえば、1166÷1554*100=75.0）。百分率配列同一性の値は、最も近い10の数にまるめる。たとえば、75.11、75.12、75.13、および75.14は、75.1に切り捨て、75.15、75.16、75.17、75.18、および75.19は、75.2に切り上げる。長さの値は、常に整数である。もう一つの例において、以下のとおりに同定された配列から20個の連続したヌクレオチドとともに整列させた20ヌクレオチド領域を含む標的配列は、その同定された配列に対して75パーセントの配列同一性を共有する領域を含む（たとえば、15÷20*100=75）。
2008506356.tif 000005
【０１３４】
本明細書に開示した核酸配列は、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーター核酸配列のヌクレオチド配列に対して少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、または少なくとも99%同一のヌクレオチド配列を有する核酸を含む。特定の例において、核酸配列は、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターヌクレオチド配列に対して実質的に類似する。第一の核酸は、第一の核酸が第二の核酸（またはその相補鎖）と共に至適に整列させた場合に（適切なヌクレオチド欠失またはギャップ挿入で）、少なくとも約90%のヌクレオチド配列同一性、たとえば少なくとも約95%、少なくとも98%または少なくとも99%の同一性がある場合に、第二の核酸に対して「実質的に類似する」。2つの核酸分子が密接に関連することの代わりの指標は、2つの分子がストリンジェントな条件下で互いにハイブリダイズすることである。
【０１３５】
それにもかかわらず、高度な同一性を示さない核酸配列でも、遺伝暗号の縮重のために、類似のアミノ酸配列をコードするかもしれない。この縮重を使用して核酸配列の変化を作製し、全実質的に同じタンパク質をコードする複数の核酸分子を生じさせることができることが理解される。
【０１３６】
短鎖干渉または妨害RNA（siRNA）：
配列特異的転写後遺伝子サイレンシングを誘導することができ、これにより遺伝子発現を減少し、またはさらに阻害する二重鎖RNA。いくつかの例において、siRNA分子は、21〜23ヌクレオチドなど、約19〜23ヌクレオチドの長さである。特定の例において、siRNA分子は、少なくとも21ヌクレオチドの、たとえば少なくとも23ヌクレオチドの長さである。一つの例において、siRNA分子は、両方の鎖上に2ntの3'オーバーハングを有する様式で対になった21ヌクレオチド（nt）センスおよび21ntアンチセンス鎖で構成されるsiRNA二重鎖である。もう一つの例において、siRNAは、N末端およびC末端にて2つのdTオーバーハングを有する19ntの長さである。
【０１３７】
一つの例において、siRNAは、siRNAと標的RNAとの間の配列同一性の領域内で、mRNAなどの相同的RNA分子の特異的分解をトリガーする。たとえば、国際公開公報第02/44321号は、3'にオーバーハング末端をもつ塩基対の場合に、標的mRNAの配列特異的分解ができるsiRNAを開示する。dsRNAプロセシングの方向により、センスまたはアンチセンス標的RNAを産生されたsiRNAエンドヌクレアーゼ複合体によって切断することができるかどうかが決まる。したがって、siRNAは、たとえばRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターなどの遺伝子をサイレンシングすることによって転写を調整するために使用することができる。siRNAの効果は、ショウジョウバエ、線虫、昆虫、カエル、植物、真菌、マウス、およびヒトを含む種々の生物体から細胞において証明されている（たとえば、国際公開公報第02/44321号；Gitlin et al., Nature 418：430-4, 2002；Caplen et al., Proc. Natl Acad. Sci. 98：9742-9747, 2001；およびElbashir et al., Nature 411：494-8, 2001）。
【０１３８】
特異的結合剤
実質的に定義された標的のみと結合する薬剤。たとえば、タンパク質特異的結合剤は、実質的に特定されたタンパク質のみに結合し、核酸分子特異的結合剤は、実質的に特定された核酸配列のみに結合する。
【０１３９】
本明細書に使用される「タンパク質[X]特異的結合剤」という用語は、抗-[X]タンパク質抗体（ポリクローナルまたはモノクローナル抗体およびこれらの機能的断片など）および実質的に[X]タンパク質のみと結合するその他の薬剤（可溶性受容体など）を含む。この状況において、[X]は、任意の特異的または指定されたタンパク質、たとえばRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターをいう。
【０１４０】
抗[X]タンパク質抗体は、HarlowおよびLane（Using Antibodies： A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press： Cold Spring Harbor, 1998）に記述したものなどの標準的方法を使用して産生することができる。例示的な抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、Fab断片、F（ab'）2断片、単鎖の抗体、およびキメラ抗体を含むが、これらに限定されるわけではない。たとえば、ポリクローナル抗体は、所望のペプチド（Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターなど）を注射することによって宿主動物を免疫することによって産生することができる。モノクローナル抗体の産生は、ハイブリドーマ技術（Kohler and Milstein, Nature 256：495-7, 1975）、ヒトB細胞技術（Kosbor et al., Immunology Today 4：72, 1983）、またはEBV-ハイブリドーマ技術（Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1983）などの種々の方法によって達成することができる。さらに、キメラ抗体（たとえば、Morrison et al., J. Bacteriol. 159：870, 1984； Neuberger et al., Nature 312：604-8, 1984；およびTakeda et al., Nature 314：452-4, 1985を参照されたい）、並びに単鎖抗体（たとえば、米国特許第5,476,786号；第5,132,405号；および第4,946,778号を参照されたい）を産生することができる。
【０１４１】
特定の薬剤が実質的に特定されたタンパク質のみと結合することの決定は、ルーチンの手順を使用し、または適応することによって容易に行うことができる。たとえば、抗[X]タンパク質モノクローナル抗体などの所与のタンパク質結合薬剤が実質的に[X]タンパク質に対してのみ結合することを決定するために、ウエスタンブロット法を使用することができる。その他のアッセイ法には、対称または非対称の直接的または間接的な検出形式として、競合的および非競合的な均一および不均一な酵素結合抗体免疫吸着アッセイ法（ELISA）；「サンドイッチ」免疫アッセイ法；免疫拡散法アッセイ法；インサイチュー免疫アッセイ法（たとえば、コロイド金、酵素、または放射性同位元素標識を使用する）；凝集アッセイ法；相補体結合アッセイ法；免役電気泳動アッセイ法；酵素結合免役スポットアッセイ法（ELISPOT）；放射性アレルゲン吸着試験（RAST）；蛍光顕微鏡検査法、およびフローサイトメトリーに使用されるなどの蛍光試験；ウェスタン、グリッド、ドット、または組織ブロット；尿試験紙アッセイ法；ハロゲンアッセイ法；または抗体アレイ（たとえば、O'Meara and Tovey, Clin. Rev. Allergy Immunol., 18：341-95, 2000； Sambrook et al., 2001, Appendix 9； Simonnet and Guilloteau, in： Methods of Immunological Analysis, Masseyeff et al.（Eds.）, VCH, New York, 1993, pp. 270-388を参照されたい）。
【０１４２】
また、特異的結合剤は、直接検出のために標識することができる（Chapter 9, Harlow and Lane, Antibodies： A Laboratory Manual. 1988を参照されたい）。適切な標識は、酵素（アルカリホスファターゼ（AP）または西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）など）、蛍光標識、比色標識、放射性同位元素、キレート薬、色素、コロイド金、リガンド（ビオチンなど）、および化学発光薬剤を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１４３】
また、より短い抗体の断片を特異的結合剤として送達することができる。たとえば、特定されたタンパク質に対して結合するFab、Fvs、および単鎖Fvs（SCFvs）は、特異的結合剤である。これらの抗体断片は、以下を含む：（1）Fab、酵素パパインで抗体全体を消化して、無処置の軽鎖と一方の重鎖の一部とを得ることによって産生される抗体分子の一価の抗体結合性断片を含む断片；（2）Fab'、ペプシンで抗体全体を処置し、続いて還元して、無処置の軽鎖と重鎖の一部とを得ることによって得られる抗体分子の断片；抗体分子あたり2つのFab'断片が得られる；（3）（Fab'）2、酵素ペプシンで抗体全体を処置することにより、その後に還元することなく得られる抗体の断片；（4）F（ab'）2、2つのジスルフィド結合によって共に保持された2つのFab'断片の二量体；（5）Fv、2つの鎖として発現される軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子操作された断片；および（6）単鎖抗体（「SCA」）、遺伝的に融合された単一の鎖状分子としての適切なポリペプチド・リンカーによって連結された、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝的に操作された分子。これらの断片を作製する方法は、ルーチンである。たとえば、Fab発現ライブラリーの構築により、本明細書に記述したタンパク質に対する所望の特異性をもつモノクローナルFab断片の迅速かつ簡単な同定が可能になる。
【０１４４】
被験者：
ヒトおよび獣医学的被験者を含む、生きている多細胞脊椎動物の生物体。獣医学的被験者の特定の例は、家畜化された動物（ネコおよびイヌなど）、家畜（たとえば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、およびヤギ）、実験動物（たとえば、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモット、および非ヒト霊長類）、並びに鳥類、爬虫類、および魚を含む。
【０１４５】
SEQ ID NO:と関連する標的配列
本明細書に使用される場合に、この句は、病原体感染に関与し、したがって病原体感染を減少し、または阻害するための標的として役立ち、かつ特定されたSEQ ID NOであるか、もしくは含むか、SEQ ID NOの発現に関与するか、またはこのような特定されたSEQ ID NOによって発現されるペプチド配列である任意の核酸配列、アミノ酸配列、または核酸およびアミノ酸配列の組み合わせをいう。標的配列は、特定の種から得られる配列のSEQ ID NOに言及していてもよいが、標的配列は、その他の哺乳類などのその他の近縁種由来の配列の相同体を含む。たとえば、「SEQ ID NO Xと関連する標的配列」という句は、特定のSEQ ID NO Xが一部にある完全な遺伝子配列、適切なコード配列、遺伝子と関連するプロモーター配列、または対応するタンパク質配列、並びに天然の配列の活性を保持するこれらの変異体、断片、相同体、および融合をいうことができる。
【０１４６】
たとえば、「SEQ ID NO:1〜2と関連する配列」という句を使用する場合は、この用語は、Rab9Aゲノム配列、Rab9Aの発現を促進する内因性プロモーター配列、Rab9Aコード配列、およびRab9Aタンパク質、並びに天然のRab9A配列の活性を保持するこれらの変異体、断片、および融合を包含する。
【０１４７】
本明細書には、病原体感染に関与する宿主タンパク質をコードする（または、コードする配列内に含まれる）配列を提供してあるが、最終目標は、病原に関与することが同定されたタンパク質の活性を妨害することであることが理解されるはずである。このような妨害は、タンパク質をコードする核酸分子のレベル（たとえば、タンパク質の発現を減少させるか、またはさもなければ崩壊させることによる）か、またはタンパク質自体のレベル（たとえば、タンパク質の活性または病原体とその相互作用を妨害することによる）かのいずれであることもできる。特定の種においてこれらの目標を達成するための具体的技術の開示は、本方法をこれらの特定の技術に限定するものと解釈されるべきではない。
【０１４８】
核酸の標的配列：
治療的に有効なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体に対してハイブリダイゼーションすることにより、感染因子による感染の減少またはさらに阻害を生じる核酸分子の一部。アンチセンスまたはセンス分子は、いずれもdsDNAの一部の発現を妨害することができるので、dsDNAのその部分をターゲットするために使用することができる。アンチセンス分子は、プラス鎖に結合することができ、センス分子は、マイナス鎖に結合することができる。したがって、標的配列は、ssDNA、dsDNA、およびRNAであることができる。
【０１４９】
治療的に活性な分子：
所望の治療効果を有するタンパク質、抗体、または核酸分子などの薬剤。このような薬剤の例は、たとえば臨床応答として測定されるような病原体感染に関与するRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーター（感染の阻害などの、病原体による感染の減少など）の活性を減少させることができるものである。また、治療的に活性な薬剤は、治療的に有効なペプチド、抗体、もしくは核酸分子の効果を模倣する有機またはその他の化学物質を含む。
【０１５０】
治療上有効な量：
単独で、または薬学的に許容される担体または1つもしくは複数のさらなる治療薬と共に、所望の応答を誘導する製剤の量。本明細書に開示される製剤は、治療上有効な量で投与される。
【０１５１】
一つの例において、所望の応答は、被験者の細胞などの病原体による細胞の感染を減少し、または阻害することである。医薬品製剤が治療的に有効であるためには、感染が完全に阻害される必要はない。たとえば、製剤は、所望の量によって、製剤の非存在下での感染の量と比較して、たとえば少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも98%、またはさらに少なくとも100%感染を減少させることができる。この減少または阻害は、病原体感染によって引き起こされる病的状態の進行の停止か、もしくは遅延、または退行の誘導を生じさせることができ、または状態によって生じる徴候もしくは症候を軽減することができるか。
【０１５２】
もう一つの、またはさらなる例において、これは、宿主被験者内で部分的または完全に病原体感染の症候を軽減するために十分な量である。治療は、一時的に感染の進行を遅らせることを含むことができるだけでなく、永久に感染の進行を停止させ、または逆転させることも含むことができる。
【０１５３】
本明細書に記述した治療薬の有効な量は、細胞または被験者の感染率における減少のためにアッセイすること、宿主内のウイルスの負荷の減少、感染した被験者の生理学的状態の改善、またはウイルスに対する曝露に続く感染に対する増大された耐性などの多くの異なる方法で決定することができる。また、有効な量は、本明細書に記述したアッセイ法を含む、種々のインビトロの、インビボの、またはインサイチューのアッセイ法によって決定することができる。
【０１５４】
開示した治療薬は、治療の過程の間に、単一用量で、または数回の服用量で、たとえば毎日投与することができる。しかし、有効な量は、適用される供与源（たとえば、細胞の抽出物から単離された核酸分子、対化学的に合成して精製された核酸）、治療される被験者、治療される状態の重症度およびタイプ、並びに投与の様式に依存的であり得る。
【０１５５】
TIP47（47kDaの尾部相互作用するタンパク質）：
TIP47という用語は、任意の生物体由来の任意のTIP47遺伝子、cDNA、RNA、またはタンパク質を含み、これは、エンドソームからTGNへマンノース-6-リン酸受容体を輸送することができる。TIP47は、陽イオン依存的マンノース-6-リン酸受容体（CD-MPR）および陽イオン非依存的MPR（CI-MPR）のサイトゾルドメインに対して高い特異性で結合する。加えて、TIP47は、Rab9Aに対して直接結合し、これにより、MPR細胞質ドメインに対するTIP47の親和性を増強する。また、文献において、またはマンノース-6-リン酸受容体結合タンパク質1、M6PRBP1ともいわれる。
【０１５６】
TIP47配列の例には、Genbankアクセッション番号：NM_005817およびBC007566（cDNA）並びにNP_005808およびAAH05818（タンパク質）を含むが、これらに限定されるわけではない。一つの例において、TIP47配列は、全長野生型（または天然の）配列、並びにエンドソームからTGNへマンノース-6-リン酸受容体を輸送する能力を保持するTIP47変異体、断片、または融合配列を含む。一定の例において、TIP47は、天然のTIP47配列に対して少なくとも80%の配列同一性、たとえば少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%の配列同一性を有する。
【０１５７】
特定の例において、TIP47核酸配列は、高いストリンジェンシー下で、GenBankアクセッション番号NM_005817またはBC007566に記載された配列に対してハイブリダイズすることができ、TIP47活性を保持する。
【０１５８】
導入する、形質転換する、またはトランスフェクトする：細胞へ核酸分子を導入すること。これらの用語は、ウイルスベクターでのトランスフェクション、プラスミドベクターでの形質転換、および電気穿孔法による裸のDNAの導入、リポフェクション、および粒子銃加速を含むが、これらに限定されるわけではない、核酸分子を細胞に導入することができる全ての技術を包含する。トランスフェクトされ、または形質転換された細胞は、分子生物学技術によって核酸分子が導入された細胞である。特定の例において、核酸分子は、たとえば細胞ゲノムへ核酸分子を組み込むことによって、またはエピソームの複製によって、細胞により安定に複製されるようになる。
【０１５９】
導入遺伝子：
たとえば、ベクターによって供給される外来核酸配列。一つの例において、導入遺伝子は、Rab9A、Rab11A、またはRab9AもしくはRab11Aのモジュレーターをコードするか、またはこれらに特異的にハイブリダイズする核酸を含む。
【０１６０】
変異体、断片、または融合：SEQ ID NO:1または2と関連する標的配列、およびこれらによりコードされるタンパク質（並びに、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、およびRab11Aモジュレータータンパク質および核酸配列）などの開示された核酸配列には、これらの変異体、断片、および融合を含み、これは天然の生物活性（病原体感染に役割を果たすなど）を保持する。タンパク質もしくはこれらの融合物、または断片もしくはこれらの変異体のタンパク質をコードするDNA配列を操作して、真核細胞または真核生物、細菌、昆虫、または植物に発現させることができる。発現を得るために、DNA配列を変更して、その他の制御配列に作動可能に連結することができる。制御配列および治療的なタンパク質を含む最終産物は、ベクターと称する。このベクターを細胞に導入することができる。一旦細胞内部にはいれば、ベクターは、タンパク質を産生することができる。
【０１６１】
当業者であれば、多数の方法で、コードされるタンパク質の生物活性に影響を及ぼすことのなく、DNAを変更することができることを認識するであろう。たとえば、タンパク質をコードするDNA配列に変異を生じさせるために、PCRを使用することができる。このような変異体は、タンパク質を発現させるために使用する宿主細胞のコドン選択に最適化された変異体、または発現を容易にするその他の配列変化であることができる。
【０１６２】
ベクター：
宿主細胞に導入され、これにより形質転換された宿主細胞を産生する核酸分子。ベクターは、複製開始点などの、宿主細胞において核酸配列を複製することができる核酸配列を含むことができ、また、1つまたは複数の選択可能なマーカー遺伝子およびその他の遺伝因子を含むこともできる。挿入ベクターは、それ自体を宿主核酸に挿入することができる。ベクターは、ウイルス、プラスミド、コスミド、および人工染色体ベクターを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１６３】
野生型
天然に存在する核酸またはタンパク質配列の変異されていないバージョン。複対立遺伝子の中で、集団内で最も高頻度である対立遺伝子が、通常野生型である（しかし、必然的ではなく）。「天然の」という用語は、「野生型」と同義語として使用することができる。
【０１６４】
感染を減少する方法
Rab9Aは、遺伝子トラップ法を使用してウイルス感染に関与する宿主核酸配列として同定された。Rab9Aは、マンノース-6-リン酸受容体（MPR）および47kDa（TIP47）の尾部相互作用タンパク質と共に後期エンドソーム微小ドメインに存在するGTPaseである。Rab9Aは、後期エンドソームからTGNにタンパク質およびその他の分子を輸送する。たとえば、Rab9Aは、新たに合成されたリソソーム酵素をゴルジ体からエンドソームに輸送し、次いでゴルジに戻す。Rab11Aは、TGNから細胞表面へのタンパク質の輸送に関与する。
【０１６５】
Rab9Aに加えて、Rab11AおよびRab9Aのモジュレーター（TIP47、PIKfyve、およびp40を含む）がウイルス感染に関与することも本明細書において証明されている。しかし、Rab9A、Rab11A、並びにRab9AおよびRab11Aのモジュレーターの役割は、このようなタンパク質（およびこれらの対応する核酸配列）が、一般に、感染と同様の経路を使用する病原体などの病原体ウイルス、細菌（たとえば、シュードモナス属（Pseudomonas）のメンバー）、原生動物、および真菌など）による感染に関与するため、ウイルス感染に限定されない。
【０１６６】
本開示に基づいて、本方法は、哺乳類細胞などの宿主細胞におけるRab9AまたはRab11Aの生物活性を減少させ、病原体による宿主細胞の感染を減少させるために提供される。感染の減少は、インビトロで、エキソビボで、またはインビボで生じさせることができる。いくつかの例において、Rab9AまたはRab11Aの生物活性は、それぞれRab9AまたはRab11A活性を増大するRab9AまたはRab11Aモジュレーターの活性を減少させることによって減少される。または（または加えて）、Rab9AまたはRab11Aの生物活性は、それぞれRab9AまたはRab11A活性を減少させるRab9AまたはRab11Aモジュレーターの活性を増大させることによって減少される。
【０１６７】
特定の例において、Rab9Aは、SEQ ID NO:1または2と関連する標的核酸配列に対して少なくとも95%の配列同一性などの、少なくとも90%の配列同一性を共有する宿主核酸配列などの、SEQ ID NO:1〜2と関連する標的配列を含む。本方法は、Rab9A、Rab11A、少なくとも1つのRab9Aモジュレーター、2つ以上のRab9Aモジュレーター、3つ以上のRab9Aモジュレーター、1〜5つのRab9Aモジュレーター、少なくとも1つのRab11Aモジュレーター、2つ以上のRab11Aモジュレーター、3つ以上のRab11Aモジュレーター、1〜5つのRab11Aモジュレーター、またはこれらの組み合わせの生物活性を減少すること、いくつかの例においては、抑制することを含むことができる。Rab9A、Rab11A、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターの活性を減少し、または阻害することにより、ウイルスゲノムの転写または翻訳を引き起こすシグナル経路またはウイルスの下位部分の構築を遮断するなどの、病原体のライフサイクルの成分を遮断することができる。
【０１６８】
核酸またはタンパク質配列の生物活性を減少させる方法は、当技術分野において公知である。このような方法の特定の例を例示目的で本明細書に提供してあるが、本開示は、このような方法に限定されるわけではない。特定の例において、Rab9AまたはRab11Aの生物活性を減少させるには（たとえば、Rab9AまたはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターの活性を減少することによる）、100%の減少を必要でない。たとえば、対照（治療薬で治療されない細胞における活性の量など）と比較して、少なくとも20%の減少、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%で十分である。
【０１６９】
病原体
病原体は、ウイルス、細菌、原生動物、および真菌を含むが、これらに限定されるわけではない。一つの例において、病原体は、脂質ラフトをハイジャックするものを含む。脂質ラフトは、スフィンゴ脂質およびコレステロール中に濃縮された、液体の規則正しい微小ドメインであり、生合成輸送、シグナル伝達、およびエンドサイトーシスに関与する。いくつかの病原体は、これらの細胞宿主への侵入、構築、および出芽などの、これらの複製サイクルのいくつかの工程を完了するために、ラフトを利用する（「ハイジャックする」）。脂質ラフトをハイジャックする病原体の例には、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：カンピロバクター・ジュジュニ、コレラ菌、SV40、レジオネラ・ニューモフィラ、アエロモナス・ハイドロフィリア、エコーウイルス1、エコーウイルス11、ブルセラ種、クロストリジウム種、トリ肉腫および白血病ウイルス、大腸菌、化膿性連鎖球菌、セムリキ森林ウイルス、ネズミチフス菌、炭疽菌、エコトロピックマウス白血病ウイルス、フレキシナ赤痢菌、卒倒病菌、HTLV-1、クラミジア（Chlamydia）種、ヘリコバクター・ピロリ、HIV-1、ミコバクテリア種、リステリア菌、エボラ、マールブルク、麻疹、単純ヘルペスウイルス、インフルエンザウイルス、呼吸器系合胞体ウイルス（RSV）、またはEBウイルス。
【０１７０】
一つの例において、脂質ラフトをハイジャックする病原体は、被膜RNAウイルスである。被膜RNAウイルスは、被膜ポジティブ鎖RNAウイルス、被膜ネガティブ鎖RNAウイルス、およびレトロウイルスを含む。エンベロープを有する例示的なポジティブ鎖RNAウイルスは：トガウイルス（この例には、風疹を含む）；アルファウイルス（西ウマ脳炎ウイルス、東ウマ脳炎ウイルス、およびベネズエラウマ脳炎ウイルスなど）；フラビウイルス（この例には、デングウイルス、西ナイルウイルス、日本脳炎ウイルス、およびC型肝炎ウイルスを含む）；およびコロナウイルス属（SARSなど）を含むが、これらに限定されるわけではない。エンベロープを有する例示的なネガティブ鎖RNAウイルスは：オルソミクソウイルス（インフルエンザウイルスなど）、ラブドウイルス（狂犬病ウイルス[など）、パラミキソウイルス（この例には、麻疹ウイルス、おたふくかぜウイルス、呼吸器合胞体ウイルスを含む）、およびフィロウイルス（マールブルクおよびエボラなど）を含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１７１】
レトロウイルスの例には：ヒト免疫不全症ウイルス1型（HIV-1）、HIV-2；ウマ伝染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（FIV）；ネコ白血病ウイルス（FeLV）；サル免疫不全ウイルス（SIV）；およびトリ肉腫ウイルスを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１７２】
特定の例において、病原体は、ヒト免疫不全症ウイルス（HIV）-1、HIV-2、エボラウイルス、マールブルグウイルス、RSV、または麻疹ウイルスである。
【０１７３】
Rab9Aモジュレーター
Rab9Aモジュレーターは、Rab9Aと直接または間接的に相互作用する核酸およびタンパク質配列を含む。いくつかの例において、モジュレーターは、たとえばRab9A mRNAの転写または翻訳を増大することよってRab9A活性を増大させる。その他の例において、モジュレーターは、たとえばRab9A mRNAの転写または翻訳を減少させることによってRab9A活性を減少させる。いくつかのRab9Aモジュレーターは、Rab9Aに直接結合して、Rab9Aの生物活性を増強する。特定の例において、Rab9Aモジュレーターは、転写活性化によって、またはRab9Aに対して結合することによってRab9A発現を調整する。いくつかの例において、Rab9Aモジュレーターは、Rab9Aと相互作用することによって後期エンドソームからTGNへのタンパク質またはその他の分子の輸送に関与するタンパク質である。したがって、Rab9Aモジュレーターは、Rab9Aと結合し、またはRab9Aとの複合体に含まれるタンパク質であることができ、後期エンドソームからTGNへのタンパク質およびその他の分子の輸送に関与する。
【０１７４】
例示的なRab9Aモジュレーターには、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：p40（本明細書においてp40とも称される）などのRab9エフェクター；PIKfyve；GDI-置換因子（GDF）などのYip3；腫瘍感受性遺伝子101（TSG101）；TIP47；v-SNARE；マンノース-6-リン酸受容体；t-SNARE；GDP解離阻害剤、グアニンヌクレオチド交換因子（GEF）、マプモジュリン、またはこれらの組み合わせ。具体例において、Rab9Aモジュレーターは、PIKfyve、p40、またはTIP47である。
【０１７５】
Rab11Aモジュレーター
Rab11Aモジュレーターは、Rab11Aと直接または間接的に相互作用する核酸およびタンパク質配列を含む。いくつかの例において、モジュレーターは、たとえばRab11A mRNAの転写または翻訳を増大することよってRab11A活性を増大させる。その他の例において、モジュレーターは、たとえばRab11A mRNAの転写または翻訳を減少させることによってRab11A活性を減少させる。いくつかのRab11Aモジュレーターは、Rab11Aに直接結合して、Rab11Aの生物活性を増強する。特定の例において、Rab11Aモジュレーターは、転写活性化によって、またはRab11Aに対して結合することによってRab11A発現を調整する。いくつかの例において、Rab11Aモジュレーターは、Rab11Aと相互作用することによってトランスゴルジから細胞膜へのタンパク質またはその他の分子の輸送に関与するタンパク質である。したがって、Rab11Aモジュレーターは、Rab11Aと結合し、またはRab11Aとの複合体に含まれるタンパク質であることができ、トランスゴルジから細胞膜へのタンパク質およびその他の分子の輸送に関与する。
【０１７６】
例示的Rab11Aモジュレーターは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：Sec15、Rip11、FIP1、FIP2、FIP3／エフェリン、FIP4、Rab-カップリングタンパク質（RCP）、またはこれらの組み合わせ。
【０１７７】
活性を減少させるための方法
Rab9AまたはRab11A核酸またはタンパク質配列の生物活性を減少させるために使用することができる一つの特定の方法（たとえば、Rab9AまたはRab11Aの活性を増大するモジュレーターの活性を減少させることによる）では、細胞におけるRab9AもしくはRab11A（または、これらのモジュレーター）、またはこれらの組み合わせをコードするmRNAの転写または翻訳を減少し、または崩壊させる。
【０１７８】
一つの例において、Rab9A、Rab11A、Rab9モジュレーター、またはRAb11Aモジュレーターの少なくとも1つ（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）の転写または翻訳が減少される。たとえば、Rab9Aの転写または翻訳を減少し、または阻害することができる。もう一つの例において、Rab11Aの転写または翻訳が減少される。特定の例において、1つまたは複数のRab9Aモジュレーターの転写または翻訳が減少される。もう一つの例において、1つまたは複数のRab11Aモジュレーターの転写または翻訳が減少される。もう一つの例において、Rab9Aおよび少なくとも1つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab9Aモジュレーターの転写または翻訳が減少される。さらにもう一つの例において、Rab11Aおよび少なくとも1つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab11Aモジュレーターの転写または翻訳が減少される。もう一つの例において、Rab9Aおよび少なくとも1つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab11Aモジュレーターの転写または翻訳が減少される。さらにもう一つの例において、Rab11Aおよび少なくとも1つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab9Aモジュレーターの転写または翻訳が減少される。具体例において、Rab9A、Rab11A、および少なくとも1つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab9Aモジュレーターの転写または翻訳が減少される。もう一つの具体例において、Rab9A、Rab11A、および少なくとも1つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab11Aモジュレーターの転写または翻訳が減少される。さらにもう一つの具体例において、Rab9A、Rab11A、および少なくとも1つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab11Aモジュレーター、および少なくとも1つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab9Aモジュレーターの転写または翻訳が減少される。
【０１７９】
公的に利用できるRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、およびRab11Aモジュレーター核酸配列（このような配列の変異体、融合および断片を含む）に基づいて、このような核酸の転写を妨害し、または変更するために使用することができる方法は、部位特異的変異誘発（トランスポゾンまたは挿入ベクターによって生じる突然変異を含む）、タンパク質のコード領域と結合するDNA結合性タンパク質を提供すること（したがって、転写に関与するRNAポリメラーゼまたは別のタンパク質を遮断し、または妨害する）、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーターの発現を崩壊させること、コード配列（たとえば、機能的にコード配列を欠失させることによって、突然変異によるなどの、挿入、または欠失）、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレータータンパク質、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質のアミノ酸配列または全体の形状を変更すること、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレータータンパク質、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質を分解すること、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されるわけでない。
【０１８０】
種々の不活性および組換えDNA結合性タンパク質、および転写に対するこれらの効果は、Lewin, Genes VIIに論議されている。核酸分子の翻訳の妨害または変更に使用することができる方法は、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーターをコードする核酸によって転写されるメッセンジャーRNAに結合するアンチセンスRNA、リボザイム、またはsiRNAを使用する工程を含むが、これらに限定されるわけでない。このような方法は、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーター核酸分子の発現を減少し、または阻害して病原体感染を減少させるために使用することができる。
【０１８１】
たとえば、mRNAの量は、たとえばアンチセンスRNA、リボザイム、三重らせん分子、miR、またはsiRNAを細胞に投与することによって、mRNAを、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーターと結合する分子、mRNAに特異的であるアンチセンスRNA、リボザイム、三重らせん分子、miR、またはsiRNAなどのメッセンジャーRNAと接触させることによって、細胞において減少することができる。一つの例において、アンチセンスRNA、三重らせん分子、リボザイム、miR、またはsiRNA分子を、分子を細胞に導入することができる条件下で細胞と接触させる。特定の例において、細胞を形質転換するために、1つまたは複数のRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11AモジュレーターmRNA配列を認識するアンチセンスRNA、、リボザイム、三重らせん分子、miR、またはsiRNA配列を転写する発現ベクターが使用される。
【０１８２】
特定のsiRNA、アンチセンス、およびリボザイム分子を本明細書に開示してある。たとえば、細胞におけるRab9A mRNAの量を減少させるために、SEQ ID NO:5〜9、47〜48、および57〜58（または、これらの配列のうちの少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなどのこれらの組み合わせ）のいずれを使用することもできる。同様に、細胞における1つまたは複数のRab9AモジュレーターmRNAの量を減少させるために、SEQ ID NO:20〜32、51〜56、および61〜66（または、これらの配列のうちの少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなどのこれらの組み合わせ）のいずれを使用することもできる。加えて、細胞におけるRab11A mRNAの量を減少させるために、SEQ ID NO:16〜19、49〜50、および59〜60（または、これらの配列のうちの少なくとも2つう、少なくとも3つ、または少なくとも4つなどのこれらの組み合わせ）のいずれを使用することもできる。しかし、本開示は、mRNAを減少させる特定の分子の使用に限定されるわけではない。
【０１８３】
特定の例において、Rab9AまたはRab11Aの生物活性を減少する工程には、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーター核酸またはペプチド配列と病原体タンパク質との間の相互作用を減少する工程を含む。病原体タンパク質とRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質または核酸配列との間の相互作用を減少し、または阻害するための方法は、公知である。病原体およびRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質または核酸分子は、インビトロでの溶液、インビボの発現系、または宿主組織または被験者でのインサイチューでの一部であることができる。病原体タンパク質は、成熟ウイルス外被上の外被タンパク質またはウイルス外被の断片などの、より大きな分子または複合体の一部であることができる。また、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質は、融合タンパク質の一部として発現されたか、または輸送タンパク質、細胞受容器、構造タンパク質、もしくは酵素などのより大きなタンパク質の1つのサブユニットとして含まれる、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターペプチドなどのより大きな分子または複合体の一部であることができる。Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーター核酸分子は、宿主ゲノム、組換えベクター、またはトランスジェニック生物もしくは微生物（染色体外分子またはゲノム挿入の両方を含む）内に含まれる核酸配列などのより大きな分子、複合体、生物体、または微生物の部分であることができる。
【０１８４】
一つの例において、病原体タンパク質は、ウイルス（被膜RNAウイルスなど）であり、ウイルスとRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質との相互作用を減少することにより、ウイルスによる宿主細胞の感染を減少し、または阻害する。特定の例において、このような相互作用を減少することには、宿主核酸（宿主ゲノムなど）にウイルス核酸（ウイルスゲノムなど）の組込みを減少させることを含む。
【０１８５】
一つの例において、1つまたは複数の病原体タンパク質と少なくとも1つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab9A、Rab11A、Rab9モジュレーター、もしくはRAb11Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が、減少され、または阻害される。たとえば、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab9A核酸分子またはペプチドとの間の相互作用を減少し、または阻害することができる。もう一つの例において、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab11A核酸分子またはペプチドとの間の相互作用を減少し、または阻害することができる。特定の例において、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab9Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用を減少し、または阻害することができる。もう一つの例において、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab11Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用を減少し、または阻害することができる。もう一つの例において、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab9A核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が減少され、または阻害され、並びに1つまたは複数の病原体タンパク質と少なくとも一つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab9Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が、減少され、または阻害される。さらにもう一つの例において、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab11A核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が減少され、または阻害され、並びに1つまたは複数の病原体タンパク質と少なくとも一つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab11Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が、減少され、または阻害される。もう一つの例において、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab9A核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が減少され、または阻害され、並びに1つまたは複数の病原体タンパク質と少なくとも一つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab11Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が、減少され、または阻害される。さらにもう一つの例において、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab11A核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が減少され、または阻害され、並びに1つまたは複数の病原体タンパク質と少なくとも一つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab9Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が、減少され、または阻害される。具体例において、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab9A核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が減少され、または阻害され、並びに1つまたは複数の病原体タンパク質と少なくとも一つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab9Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が、減少され、または阻害され、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab11Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が、減少され、または阻害される。もう一つの具体例において、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab9A核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が減少され、または阻害され、並びに1つまたは複数の病原体タンパク質と少なくとも一つの（少なくとも2���、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab11Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が、減少され、または阻害され、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab11Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が、減少され、または阻害される。さらにもう一つの具体例において、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab9A核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が減少され、または阻害され、並びに1つまたは複数の病原体タンパク質と少なくとも一つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab11AおよびRab9Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が減少され、または阻害され、1つまたは複数の病原体タンパク質とRab11Aモジュレーター核酸分子またはペプチドとの間の相互作用が減少され、または阻害される。1つまたは複数の病原体と1つまたは複数のRab9A、Rab11A、Rab9モジュレーター、もしくはRAb11Aモジュレーター核酸分子またはペプチドタンパク質の相互作用を減少し、または阻害することにより、相加的または指数関数的な効果の増大がある。
【０１８６】
このような相互作用を崩壊させ、または減少させるために使用することができる方法は、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターの発現の減少について上記したものを含む。たとえば、例示的な宿主Rab9Aペプチドは、SEQ ID NO:1〜2と関連する標的配列によってコードされる。SEQ ID NO:1〜2と関連する任意の標的配列を含む核酸配列の発現を崩壊させることにより、対応するRab9Aペプチドの産生を減少させ、または防げることができ、Rab9Aペプチドにアクセスすることがなく、病原体（脂質ラフトをハイジャックする病原体など）は、宿主細胞に感染することができない。Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーター核酸分子の発現が完全に崩壊されてない場合でも、病原体感染は、なおも減少させ、またはさらに阻害することができる。たとえば、SEQ ID NO:1〜2と関連する任意の標的配列によってコードされる宿主タンパク質での妨害により、病原体による認識に利用することができる宿主細胞内のRab9Aタンパク質の数が減少し、したがって病原体による感染を阻害する。
【０１８７】
特定の例において、Rab9A、Rab11A、1つもしくは複数のRab9Aモジュレーター、もしくは1つもしくは複数のRab11Aモジュレーター核酸またはペプチド配列と1つまたは複数の病原体タンパク質との間の相互作用は、Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターの発現を崩壊させ、または減少させることによって減少される。Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターの発現が減少されると、病原体タンパク質と相互作用するために利用できる核酸分子またはタンパク質の量が減少されることとなる。たとえば、細胞内のRab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターmRNAの量を減少させるための上述した方法を使用することができる。このような方法により、mRNAコードするRab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターの転写を減少し、またはさらに阻害する。特定の例において、mRNA転写は、Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターコード領域にトランスポゾンまたは挿入ベクターを挿入することによって減少され、または阻害される。
【０１８８】
Rab9A、Rab11A、1つもしくは複数のRab9Aモジュレーター、もしくは1つもしくは複数のRab11Aモジュレーター核酸またはペプチド配列と病原体タンパク質との間の相互作用を減少させるために使用することができる方法のもう一つの例は、Rab9AモジュレーターとRab9Aとの間、Rab11AモジュレーターとRab11Aとの間の相互作用（たとえば、結合相互作用）、またはRab9A、Rab9Aモジュレーター、Rab11A、またはRab11Aモジュレーターと病原体タンパク質との間の相互作用を減少し、阻害し、または崩壊させる薬剤を投与することである。Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質を認識する薬剤は、病原体または病原体タンパク質（ウイルスタンパク質など）などのこれらの一部がRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターへ結合するのを妨げ、これにより病原体による感染を減少し、または阻害する。たとえば、Rab9AまたはRab9Aモジュレータータンパク質と結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、Rab9Aに対するHIV、エボラ、RSV、マールブルク、または麻疹ウイルスの結合を遮断し、したがってその細胞の感染を遮断することができる。同様に、Rab11AまたはRab11Aモジュレータータンパク質と結合するモノクローナルまたはポリクローナル抗体は、Rab11Aに対するHIV、エボラ、RSV、マールブルク、または麻疹ウイルスの結合を遮断し、したがって、その細胞の感染を遮断することができる。
【０１８９】
このような薬剤の例は、抗体、ペプチド、または化学物質などのRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターと特異的に結合する抗タンパク質結合剤を含むが、これらに限定されるわけではない。Rab9Aと特異的に結合する抗体は、当技術分野において公知であり（たとえば、Soldati et al., Mol. Biol. Cell 4 ：425-34,1993およびVoigt Global Distribution LLCからの#552101CBを参照されたい）、TIP47などの（たとえば、Diaz and Pfeffer, Cell 93 ： 433-43,1998を参照されたい）、PIKfyve（たとえば、Sbrissa et al., J. Biol. Chem. 274：21589-97,1999を参照されたい）、およびM6PR（たとえば、Lombardi et al., EMB0 J. 12 ： 677-82,1993を参照されたい）などのRab9Aモジュレーターに結合する抗体も同様である。また、Rab11A抗体は、公的に入手でき（Sigmaからの#R5903、St. Louis, Mo；およびSanta Cruz Biotechnologyから入手可能、Santa Cruz、CA）、FIP1などのRab11Aモジュレーターを認識する抗体（たとえば、Preker et al., Cell 81 ：379-89,1995を参照されたい）、並びにFIP2およびFIP3／エフェリン（Meyers et al., J. Biol. Chem., 277： 49003-10, 2002）も当技術分野において公知である。このような抗タンパク質結合剤は、Rab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9モジュレータータンパク質、またはRab11モジュレータータンパク質と病原体との間の相互作用を減少させることができる。
【０１９０】
Rab9AまたはRab11Aモジュレーターペプチドが、細胞受容器または細胞受容器の部分である例において、ペプチドの発現を減少し、もしくは阻害すること、またはペプチドの3次元の構造を変更することにより、受容体と病原体タンパク質との間の相互作用を減少させ、または阻害することができる。同様に、Rab9AまたはRab11Aモジュレーターリガンドペプチドの発現を減少し、阻害し、または防げること（または、このようなリガンドの構造を変更すること）により、病原体タンパク質とリガンドとの間の相互作用を減少させ、または阻害することができる。
【０１９１】
感染の治療または予防の方法
Rab9AまたはRab11Aの生物活性を減少させるために本明細書に開示した方法（たとえば、それぞれRab9AもしくはRab11A活性を増大させるRab9AまたはRab11Aモジュレーターの活性を減少することによるか、またはそれぞれRab9AもしくはRab11A活性を減少させるRab9AまたはRab11Aモジュレーターの活性を増大することによる）は、脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による感染を治療し、または予防するためにも使用することができる。特定の例において、Rab9A、Rab11A、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターの生物活性を減少させるには、100%の減少を必要としない。たとえば、感染を治療し、または予防するためには、対照（治療薬で治療されていない細胞におけるRab9AまたはRab11A活性の量）と比較して、少なくとも20%、少なくとも40%、少なくとも50%にて、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも99%の減少で十分である。
【０１９２】
たとえば、細胞におけるRab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するモジュレーター遺伝子の機能的欠失により、機能しないRab9A、機能しないRab11A、または機能しないRab9AもしくはRab11A活性を増大するRab9AまたはRab11Aモジュレーターを有する細胞を生じて、被験者の細胞などの細胞の病原体による感染に対する耐性が増大する。このような耐性は、被験者における予防効果を提供するために使用し、これにより病原体による被験者の感染を減少し、またはさらに予防することができる。その他の例において、Rab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、Rab9Aモジュレーター遺伝子、またはRab11Aモジュレーター遺伝子の機能的欠失により、病原体（病原体核酸配列、ペプチド、または無傷の病原体など）の量が減少した、被験者の細胞などの細胞が生じる。このような減少を被験者に治療効果をもたらすために使用し、これにより被験者における1つまたは複数の感染の症候を減少し、またはさらに除去することができる。
【０１９３】
被験者の既存の病原体感染を治療するための、または病原体感染に感受性である被験者に対して予防効果をもたらすための方法を開示する。特定の例において、本方法は、被験者に対してRab9AまたはRab11Aの生物活性を減少させる（たとえば、それぞれRab9AもしくはRab11A活性を増大するRab9AまたはRab11Aモジュレーターの活性を減少することによるか、またはそれぞれRab9AもしくはRab11A活性を減少させるRab9AまたはRab11Aモジュレーターの活性を増大することによる）薬剤の治療上有効な量を投与する工程を含む。任意の投与様式を使用することができる。Rab9A、Rab11A（または、Rab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーター）の生物活性を減少させる薬剤は、治療的に有効な用量にて投与される。しかし、治療的に有効な用量を達成するために複数回の投与を必要としてもよい。Rab9AもしくはRab11A核酸またはタンパク質配列（または、Rab9AもしくはRab11Aのモジュレーター）の生物活性を減少する薬剤は、被験者に単独で、またはその他の薬剤と組み合わせて投与することができる。このような薬剤の治療的な量は、病原体感染の治療のために、被験者に、または病原体に対する被験者の曝露の前に予防処置として投与することができる。薬剤が効果を発揮した後に、感染と関連する1つまたは複数の症候について被験者をモニターすることができる。
【０１９４】
一つの例において、薬剤は、病原体とRab9と、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質または核酸配列の間の相互作用を妨害する。たとえば、病原体とRab9Aと、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質または核酸配列の間の相互作用を減少し、またはさらに阻害することにより、被験者の病原体感染を減少し、阻害し、もしくはさらに予防し、またはさもなければ、感染の進行もしくは臨床症状を減少し、または阻害することができる。加えて、病原体とRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質または核酸配列との相互作用を減少させることにより、発熱などの感染と関連する1つまたは複数の症候を減少させ、または軽減することができる。
【０１９５】
一つの例において、Rab9AまたはRab11Aコード配列の発現を減少し、または崩壊させる（たとえば、Rab9AまたはRab11A活性を増大するモジュレーターの発現を減少することによる）薬剤は、たとえば被験者に投与することによって細胞と接触される。このような薬剤は、予防または治療目的のために使用することができる。たとえば、Rab9A、Rab11A、もしくはこれらのモジュレーターを認識するアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、三重らせん分子、miRs、およびsiRNA分子は、それぞれRab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターの発現を崩壊させるために被験者に投与することができる。特定の例において、Rab9A、Rab11A、もしくはこれらのモジュレーター核酸配列をターゲットするアンチセンスRNA、リボザイム、三重らせん分子、miR、またはsiRNA分子を含む発現ベクターが被験者の骨髄に導入される。脂質ラフトをハイジャックすることができる病原体などの（HIV、RSV、マールブルク、麻疹、またはエボラなどの）病原体に感染した細胞内のベクターの摂取およびアンチセンスRNA、リボザイム、三重らせん分子、miR、またはsiRNAの発現により、これらの細胞内でのRab9A、Rab11A、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターの発現の減少を示し、したがって病原体による感染を減少し、またはさらに阻害する。特定の例において、アンチセンスRNA、リボザイム、三重らせん分子、miR、またはsiRNAの発現は、誘導性プロモーターなどのプロモーターの制御下にある。ベクターまたはその他の核酸分子は、任意の標準的な分子生物学方法によって被験者に導入することができ、薬学的に許容される担体を含む組成物中に含めることができる。
【０１９６】
病原体とRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質または核酸配列との間の相互作用（このような配列間の結合など）を減少させるために使用することができるその他の分子の例は、Rab9A、Rab11Aもしくはこれらのモジュレーターを認識する抗体、ペプチド、またはその他の化合物などの特異的な結合剤を含むが、これらに限定されるわけではない。たとえば、細胞に提供され、または被験者に投与される場合に、Rab9Aと病原体または病原体タンパク質（HIVタンパク質など）との間の相互作用を妨害する薬剤は、病原体（HIVなど）による感染に対して予防または治療効果をもたらす。
【０１９７】
特定の例において、Rab9Aペプチド、Rab11Aペプチド、Rab9Aモジュレーターペプチド、もしくはRab11Aモジュレーターペプチドに似た構造を有するペプチドまたはペプチド類似体が、予防的または治療的使用のために利用される。たとえば、病原体によって認識されるこのようなペプチドまたはペプチド類似体は、薬学的組成物として被験者に投与することができる。これらのポリペプチドは、その被験者にすでに感染した病原体と相互作用するか、または被験者が病原体に曝露の危険にさらされている場合に感染に対する予防的防衛機構を提供する。たとえば、Rab9Aに構造的に類似するペプチドは、HIVによって認識される。このようなポリペプチドがHIV陽性の被験者に投与された場合、被験者にすでに存在するウイルスは、その被験者のT細胞受容体に加えて、これらのペプチドと相互作用し、したがってHIVがT細胞に感染する割合を阻害する。投与されたペプチドは、HIVがT細胞受容体と相互作用するのを遮断する「デコイ」として作用する。
【０１９８】
Rab9AおよびRab11Aモジュレーターの同定
本開示は、脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による感染に関与するRab9AおよびRab11Aモジュレーターを同定する方法を提供する。特定の例において、本方法は、Rab9A（またはRab11A）を発現する細胞における推定上のRab9A（またはRab11A）モジュレーターの発現を減少させる（阻害するなど）工程、またはRab9A（またはRab11A）を発現する細胞における推定上のRab9A（またはRab11A）モジュレーターの生物活性を減少させる工程を含む。細胞を所望の病原体（脂質ラフトをハイジャックする病原体など）と接触させて、病原体による感染の量を決定する。感染の減少（およびいくつかの例においては、除去）は、Rab9A（またはRab11A）の推定上のモジュレーターが、病原体による感染に関与するRab9A（またはRab11A）モジュレーターであることを示す。特定の例において、対照（推定上のRab9A（またはRab11A）モジュレーターの発現が減少されていない細胞の感染など）と比較して、少なくとも40%、少なくとも50%、少なくとも60%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも100%の感染の減少は、推定上のRab9モジュレーターが病原体による感染に関与するRab9モジュレーターであることを示す。一つの例において、病原体は、被膜RNAウイルス、たとえばHIV、エボラ、マールブルク、RSV、または麻疹ウイルスなどのウイルスである。
【０１９９】
本方法は、感染の量を、Rab9A（またはRab11A）の量（細胞におけるRab9A（またはRab11A）核酸分子、たとえばcDNAもしくはmRNA、またはタンパク質の量など）、または細胞におけるRab9A（またはRab11A）生物活性の量と関連づける工程をさらに含むことができ、感染の減少およびRab9A（またはRab11A）またはRab9A活性（またはRab11A活性）の量の減少の存在は、Rab9A（またはRab11A）の推定上のモジュレーターが病原体による感染に関与するRab9A（またはRab11A）のモジュレーターであることを示す。
【０２００】
また、当業者であれば、たとえばRab9A（またはRab11A）阻害と関連する細胞変化を観察することによって、Rab9A（またはRab11A）生物活性に対するRab9A（またはRab11A）モジュレーターを阻害する効果を評価することができる。たとえば、細胞を試験薬剤に曝露することができ、Rab9A（またはRab11A）に対する薬剤の効果を、活性が後期エンドソームからトランスゴルジへの（または、Rab11Aについてはトランスゴルジから細胞膜への）小胞輸送の相違を測定することによって評価することができる。このプロセスを視覚化するための方法は、当技術分野において公知である（たとえば、Barbero et al., J. Cell. Biol. 156：511-8, 2002を参照されたい。本明細書に参照として組み入れられる）。もう一つの例において、Rab9A（またはRab11A）活性を刺激し、または阻害することが公知であるもう一つの分子に対するRab9A（またはRab11A）の結合が測定される。Rab9A（またはRab11A）とその他のタンパク質との間の相互作用は、直接的または間接的であることができる。直接の相互作用の例は、もう一つのタンパク質に対するRab9A（またはRab11A）の結合である。さらにもう一つの例において、試験薬剤の存在下におけるRab9A（またはRab11A）の発現は、たとえば細胞におけるRab9A（またはRab11A）mRNAのレベルを決定し、Rab9A（またはRab11A）発現が試験薬剤によって減少するかどうか判断することによって測定される。
【０２０１】
感染を減少させる薬剤についてのスクリーニング
Rab9A、Rab11A、およびRab9Aモジュレーター（および、同様の結果がRab11Aモジュレーターでも予想される）が病原体感染に関与するという観察に基づいて、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーター核酸分子またはタンパク質に対する病原体（病原体タンパク質など）の結合を減少し、または阻害する薬剤を同定するための方法が開示される。このような薬剤は、本明細書に記述した方法を使用して、病原体感染を減少させるために、並びに病原体感染を治療し、または予防するために使用することができる。
【０２０２】
いくつかの例において、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質または核酸分子の1つまたは複数などのRab9A分子、Rab11A分子、またはこれらのモジュレーター分子を病原体または（病原体タンパク質などの）これらの一部と接触させる。病原体の特定の例は、ウイルス、ウイルス外被、ウイルスタンパク質（ウイルスの外被タンパク質など）、細菌、細菌蛋白、真菌、真菌タンパク質、原生動物、または原生動物タンパク質を含むが、これらに限定されるわけではない。1つまたは複数の試験薬剤を、Rab9A分子、Rab11A分子、またはこれらのモジュレーター分子、および病原体を接触させる前に間に、または後に、1つまたは複数のRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質または核酸分子、および病原体と接触させる。特定の例において、Rab9A分子、Rab11A分子、またはこれらのモジュレーター分子は、細胞にあり、Rab9A分子、Rab11A分子、またはこれらのモジュレーター分子を病原体および試験薬剤と接触させる工程は、細胞を病原体に、および試験薬剤に曝露する工程を含む。その後、Rab9A分子、Rab11A分子、またはこれらのモジュレーター分子に病対する原体の結合が試験薬剤の存在下において減少かどうかが決定され、結合の減少は、試験薬剤がRab9A、Rab11A、またはRab9AまたはRab11Aのモジュレーターに対する病原体の結合を減少させ、したがって病原体による感染を減少し、治療し、またはさらに予防するために使用することができる薬剤であることの指標となる。特定の例において、Rab9A、Rab11A、またはRab9AもしくはRab11A分子のモジュレーター（タンパク質など）、病原体（病原体タンパク質など）、または両方が、検出可能な標識を含み、結合が減少するかどうかを決定する工程には、存在する標識の量を検出する工程を含む。
【０２０３】
結合の減少は、科学文献において報告された結合の量などの標準品に対して、または対照（試験薬剤の非存在下での結合の量など）に対して比較することによって決定することができる。任意の適切な化合物または組成物を試験薬剤として使用することができる。特定の例は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：芳香族、脂肪酸、および炭水化物を含む有機または無機化学薬品；モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、およびその他の特異的な結合剤などのペプチド；および核酸分子。病原体または病原体タンパク質は、HIV、RSV、マールブルク、エボラ、麻疹ウイルス、大腸菌、シュードモナスなどの任意の適切な病原体から得ることができる。
【０２０４】
たとえば、Rab9Aの結合、Rab11A、またはこれらのモジュレーターのHIV（またはHIVエンベロープ糖タンパク質）に対する結合を試験薬剤の存在下において決定することができる。Rab9A、Rab11A、またはRab9もしくはRab11AモジュレーターとHIVとの間の結合活性の減少は、試験薬剤がRab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターに対するHIVの結合を減少させ、薬剤が抗HIV薬剤として使用するための候補であることを示す。
【０２０５】
開示したアプローチで同定される治療薬は、抗ウイルス薬または抗菌活性などのより優れた抗病原体活性をさらに有するその他の薬剤を同定するためのリード化合物として使用することができる。たとえば、同定された化学的実体の化学的類似体、または変異体、ペプチド薬剤の融合物の断片を、開示されたアッセイ法を使用して、これらが病原体感染を減少させる能力について試験することができる。これらの方法を利用して同定された化合物は、インビトロで、エキソビボで、またはインビボでの細胞の感染を減少させるために使用することができる。また、候補薬剤を動物における安全性について試験して、次いで動物またはヒトにおける臨床試験のために使用することができる。
【０２０６】
トランスジェニック細胞および非ヒト哺乳類
機能的に欠失されたRab9A、Rab11A、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターを含む組換えおよびノックアウト動物を含むトランスジェニック動物モデルは、当技術分野において公知の方法を使用して作製することができる。トランスジェニック動物、トランスジェニック動物を製作し、および使用する方法は、公知である（たとえば、国際公開公報第01/43540号；国際公開公報第02/19811号；米国特許第：2001-0044937号および第2002-0066117号；および米国特許第：5,859,308号；第6,281,408号；および第6,376,743号；およびその中の引例を参照されたい）。
【０２０７】
このような動物は、脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による感染に対する感受性が減少している。例示的なトランスジェニック非ヒト哺乳類には、非ヒト霊長類、マウス、ラット、ニワトリ、ウシ、およびブタを含むが、これらに限定されるわけではない。一定の例において、トランスジェニック非ヒト哺乳類は、SEQ ID NO:1または2と関連する任意の標的配列のノックアウトを有し、脂質ラフトを使用する病原体による感染に対する感受性が減少されている。開示したノックアウト動物は、動物からヒトまでの病原体（ウイルスなどの）の伝達を減少させるために有用である。加えて、本明細書に提供した同じ標的を利用する動物病原体を動物において減少させることができる。
【０２０８】
Rab9A、Rab11A、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターをノックアウトまたは機能的に欠失させるために使用した配列の発現は、適切なプロモーター配列を選択することによって調節することができる。たとえば、構成的プロモーターは、機能的に欠失する遺伝子が動物によって発現されないことを保証するために使用することができる。対照的に、トランスジェニック動物が、関心対象の遺伝子を発現するか、または発現しない場合を制御するために、誘導性プロモーターを使用することができる。例示的誘導性プロモーターは、組織特異プロモーターおよび特定の刺激に応答性か、または非応答性のプロモーターを含む（光、酸素、テトラサイクリン誘導性プロモーターなどの化学的濃度など）。
【０２０９】
たとえば、Rab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーター遺伝子を含むトランスジェニックマウス、またはRab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーター遺伝子が崩壊されたマウスを種々の病原体に対する曝露の間に調べることができる。比較データにより、病原体のライフサイクルに対する洞察をもたらすことができる。そのうえ、遺伝子の破壊によって与えられる感染に対する耐性を決定するために、ノックアウトしなければ感染（たとえばSIV）に感受性であるノックアウト動物（霊長類など）を作製することができる。
【０２１０】
機能的に欠失したRab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーター遺伝子を含む細胞は、脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による感染に耐性である。したがって、このような細胞は、HIV、エボラ、マールブルク、麻疹、RSV、または細菌および真菌を含む任意の本明細書に記述したその他の病原体などの被膜RNAウイルスによる感染に対する感受性が減少した細胞を含んでいてもよい。また、本開示の細胞は、機能的に欠失したRab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、Rab9Aモジュレーター遺伝子、またはRab11Aモジュレーター遺伝子をもつ造血幹細胞を含む。
【０２１１】
感染に対する耐性についてのスクリーニング
また、宿主Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーター核酸もしくはアミノ酸配列、またはこれらの組み合わせを特徴づけることによって感染に対する耐性または感受性について宿主被験者をスクリーニングする方法が本明細書に提供される。たとえば、Rab9Aモジュレーター（またはRab9A、Rab11A、もしくはRab11Aモジュレーター）核酸分子を被験者から単離して、シーケンスして、Rab9Aモジュレーター（または、それぞれRab9A、Rab11A、もしくはRab11Aモジュレーター）の野生型（または天然の）配列と比較することができる。被験者のRab9Aモジュレーター（またはRab9A、Rab11A、もしくはRab11Aモジュレーター）核酸配列と野生型Rab9Aモジュレーター（または、それぞれRab9A、Rab11A、もしくはRab11Aモジュレーター）配列との間の類似性が高いほど、その被験者は、感染に対してより感受性であり、一方、被験者のRab9Aモジュレーター（またはRab9A、Rab11A、もしくはRab11Aモジュレーター）核酸と野生型Rab9A（または、それぞれRab9A、Rab11A、もしくはRab11Aモジュレーター）モジュレーター配列との間の類似性が減少すると、その被験者は感染に対してより耐性となり得る。
【０２１２】
集団の遺伝的特徴を評価することにより、ウイルス感染などの病原体感染に対するその集団の感受性または耐性に関する情報を提供することができる。たとえば、特定の都市または地理的エリアの集団などの特定のヒト集団における対立遺伝子の多型解析により、その集団が感染に対してどれくらい感受性かについて示すことができる。野生型配列に対して実質的に類似する対立遺伝子の割合が高いほど、集団が感染に対してより感受性であることを示し、一方、野生型配列とは実質的に異なる多数の多型対立遺伝子は、集団が感染により耐性であることを示す。このような情報は、たとえば感受性の個体群にワクチン接種をすることについての公衆衛生決定を作製する際に使用することができる。
【０２１３】
また、本開示は、病原体による感染に対して感受性が減少されることと関連する、Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターの変異体について細胞をスクリーニングする方法を提供する。Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、Rab11Aモジュレーターの変異体は、遺伝子に機能的欠失または変化、たとえば遺伝子産物の量または活性が変更されるような突然変異、挿入、複製等をもつ遺伝子であることができる。Rab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、Rab9Aモジュレーター遺伝子、またはRab11Aモジュレーター遺伝子の変異体を含むこれらの細胞を病原体と接触させて、Rab9A遺伝子、Rab11A遺伝子、Rab9Aモジュレーター遺伝子、またはRab11Aモジュレーター遺伝子の天然に存在する変異体を有する細胞が、脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による感染に対してこれらの耐性が異なるかどうかを決定することができる。たとえば、ニワトリなどの動物由来の細胞を、Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターの変異体形態についてスクリーニングすることができる。天然に存在する変異体があり、かつこれらのゲノムに遺伝子の変異体形態を有するニワトリが、感染に対して感受性が少ない場合、これらのニワトリを選択的に繁殖させて、感染に耐性な群れを確立することができる。同様に、その他の動物も、Rab9A、Rab11Aまたはこれらのモジュレーターの変異体形態についてスクリーニングすることができる。
【０２１４】
天然に存在する変異体があり、これらのゲノムに遺伝子の変異体形態を有する動物が、感染に対して感受性が少ない場合、これらの動物を選択的に繁殖させて、感染に耐性な群れを確立することができる。これらの動物は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：ネコ、イヌ、家畜（たとえば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、実験動物（たとえば、マウス、ウサギ、ラット、スナネズミ、モルモット等）、およびトリ種（たとえば、ニワトリ、シチメンチョウ、カモ、キジ、ハト、ハト等）。
【０２１５】
実施例1
Rab9A siRNA分子は、HIV複製を減少させる
本実施例は、以下のような発現が、HIV複製および感染を減少させることができるかどうかを決定するために、Rab9A（SEQ ID NO:1〜2と関連する標的配列など）、KOX4（KOX4（LOC131880）およびLOC166140に類似）；KIAA1259；F3（組織因子3；スロンボプラスチン）；AXL（AXL受容体チロシンキナーゼ）；SelB（セレン含有タンパク質翻訳のための伸長因子）；FKBP38（Bcl-2をミトコンドリアにシャトルするシャペロン）を認識するsiRNAを発現するために使用される方法を記述する。
【０２１６】
位置55〜73
2008506356.tif 000006
、274〜292
2008506356.tif 000007
、および368〜386
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にてヒトRab9A mRNAに対して向けられたSMARTプールsiRNAオリゴヌクレオチドは、Dharmacon（Lafayette, CO）からのものであった。これらの配列は、センス鎖のsiRNA配列を示し；反対の鎖は、センス鎖にハイブリダイズして治療的siRNA分子を形成する。これらのsiRNA配列は、それぞれの鎖に3'オーバーハングとしてUUを、および5'にアンチセンス鎖のみにリン酸を有する。しかし、本開示は、これらの位置に限定されるわけではない。たとえば、当業者であれば、Rab9A配列断片
2008506356.tif 000009
を認識するsiRNA配列を使用することができることを認識するであろう。また、KOX4；KIAA 1259；F3；AXL；SelB；およびFKBP38を認識したsiRNA配列も使用した。
【０２１７】
それぞれの遺伝子（Rab9A、KOX4、KIAA1259、F3、AXL SelV、およびFKBP38）について、4つのsiRNA配列を別々にプールした。その適切な相補配列にハイブリダイズしたsiRNAのそれぞれのプールを使用してJC53（HIVを受け入れるように修飾されたHeLa細胞）にトランスフェクトした。細胞は、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ATCC、Mannassas, VA）から得た。GFP siRNA配列は、ネガティブ対照として使用した（Qiagen, Inc.）。
【０２１８】
細胞（20,000〜250,000）を無血清培地中で24時間インキュベートした。カクテルは、リポフェクトアミン2000（4-16μl）およびRNAse阻害剤（1-4μl）と適切な二重鎖siRNA（50〜100pmoles）をOptimem（無血清培地）の溶液に200〜2000μlの総容積で混合することによって作製した。リポフェクトアミンは、siRNAの添加前に5分間室温でインキュベートした。カクテルのアリコート（50〜500μl）を細胞に添加し、37℃にて48時間インキュベートした。次いで、細胞には、HIVを感染させて、3〜7日間インキュベーションを続けた。トランスフェクション後、トランスフェクション効率を確認するために、および感染に対する細胞の耐性を決定するために、いくつかのアッセイを行った。
【０２１９】
HIVに感染したJC53-BL細胞のp24レベルの定量化は、製造業者推奨に従ってCoulter HIV-1 p24 Antigen Neutralization Kitを使用して決定した。簡単には、siRNAでのトランスフェクションの2日後に、JC53-BL細胞をX4-向性HIV LAV（MOI=1）で一晩感染させた。LAV感染の後、HIV p24アッセイ法を、24ウェルプレートにおいてウェルあたり25,000子の細胞を播種することによって行い、HIV-1 p24 Antigen ELISA Test System（Beckman／Coulter／Immunotech, Brea, CA）を使用して、感染の3日後の上清からp24産生についてアッセイした。LAV（MOI=1）での感染1日後の洗浄剤可溶化液中で、Steady-Glo Luciferase assay system （Promega, Madison, WI）およびEL 312eMicroplate Bio-kinetics Reader （Bio-Tek Instruments, Winooski, VT）を使用して、ルシフェラーゼ活性を測定することによって、ルシフェラーゼアッセイ法を4回行った。ルシフェラーゼアッセイ法では、JC53-BL細胞のHIV感染の定量化±siRNAでのトランスフェクションが可能であり、一方、p24アッセイ法では、上清内への感染性ウイルス（および、ウイルス様粒子）を測定する。
【０２２０】
siRNA分子の有無におけるRab9A mRNAの相対量は、以下のとおりに決定した。総mRNAはRNeasyミニおよびQIAshredder Kitsを使用して、示したsiRNAトランスフェクションの2または5日後に、親の、およびsiRNAトランスフェクトしたJC53-BL細胞（ヒトRab9A）またはVero細胞（サルRab9A）から単離した。mRNAは、ランダムヘキサマーを使用して37℃にて60分間cDNAに逆転写した（Applied Biosystems、Foster City,CA）。元々存在するRab9Aメッセージの相対的レベルは、リアルタイムPCRによって決定した。リアルタイム定量的PCRは、3μlのJC53-BLまたはVero cDNAの1：10の希釈を25μLの反応体積で行い、Mx4000 Multiplex Quantitative PCR System（Stratagene）で定量化した。ヒトRab9A cDNAは、200nMの終濃度で
2008506356.tif 000010
を使用して検出した。サルRab9A cDNAは、
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を使用して検出した。構成的に発現された遺伝子ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HGPRT）は、ヒトHGPRT TaqMan assay kit（Applied Biosystems）を使用して検出した。アッセイ条件は、95℃にて10分、続いて95℃にて15秒および52℃30秒を50サイクルであった。未処置の、およびsiRNAトランスフェクトした細胞において検出されるRab9A mRNAは、検出されたHGPRT mRNA発現レベルに対して規準化した。
【０２２１】
図1Aに示したように、試験したsiRNAの中で、Rab9A siRNAは、HIV-1複製を遮断して（p24産生の〜90%の阻害）、緑色蛍光タンパク質（GFP）に対して無関係なsiRNA対照をトランスフェクトした細胞と比較して、最も明白な効果を示した。
【０２２２】
トランスフェクトしなかったJC53-BL細胞およびRab9A siRNAをトランスフェクトしたJC53-BL細胞は、同様のルシフェラーゼ活性を示し（図1B）、これらが同様の割合で感染したことを示す。これは、観察されたRab9A阻害に続くHIV-1ライフサイクルの欠陥が、ウイルス侵入および初期のプロウイルスの遺伝子発現の下流に生じたことを示す。GFPに対する対照siRNAトランスフェクションと比較した場合に、HIV-1複製およびRab9A発現を阻害する際にRab9A siRNAの特異性が見られた（図1Aおよび1C）。
【０２２３】
細胞質の二重鎖RNA>30bpは、インターフェロン反応を誘導し、タンパク質合成およびアポトーシスの非特異的シャットダウンを引き起こすが、本明細書に使用したもののように、より短いsiRNA（21bp）では、一般に誘導しない。Rab9A siRNAでのウイルスの阻害は、同一サイズであるが、GFPまたは異なる細胞メッセージに対して向けられたその他のsiRNAによる強力なHIV-1阻害がないことを考慮すると、インターフェロン反応のためである可能性は低い（図1A）。さらに、同じRab9A 標的に対する小さなヘアピンRNAを安定に発現するJC53-BLおよび293Tの株化細胞は両方とも、培養における1月間に生存度または増殖速度動態に対して何ら識別可能な効果を伴わずに、〜80%のRab9A mRNAノックダウンを有し、〜70%のHIV-1複製の阻害を示した。
【０２２４】
実施例2
Rab9AモジュレーターおよびRab11A siRNA分子は、HIV複製を減少させる
本実施例は、以下のような発現が、HIV複製を減少させることができるかどうかを決定するために、Rab9Aモジュレーター、TIP47、p40、およびPIKfyve、並びにRab11Aを認識するsiRNAを発現するために使用した方法を記述する。Rab9A siRNAは実施例1に記述してある。また、TIP47、p40、PIKfyve、およびRab11A（並びに、対照としてRin2およびIP09）を認識したsiRNA配列を使用した。全てのsiRNAは、Dharmacon（Lafayette, CO）からであった。
【０２２５】
以下のヒトRab11A mRNA（アクセッション番号：NM_004663）に対して向けられたSMARTプールsiRNAオリゴヌクレオチドを使用した。
2008506356.tif 000012
【０２２６】
以下のヒトPIKfyve mRNA（アクセッション番号：NM_015040）に対して向けられたSMARTプールsiRNAオリゴヌクレオチドを使用した。
2008506356.tif 000013
【０２２７】
以下のヒトp40 mRNA（アクセッション番号：NM_005833）に対して向けられたSMARTプールsiRNAオリゴヌクレオチドを使用した。
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【０２２８】
以下のヒトTIP47 mRNA（アクセッション番号：NM_005817）に対して向けられたSMARTプールsiRNAオリゴヌクレオチドを使用した。
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【０２２９】
これらの配列の全てが、センス鎖のsiRNA配列を示し；反対の鎖は、センス鎖にハイブリダイズして治療的siRNA分子を形成する。これらのsiRNA配列は、それぞれの鎖に3'オーバーハングとしてUUを、および5'にアンチセンス鎖のみにリン酸を有する。
【０２３０】
しかし、本開示は、これらのsiRNA配列に限定されるわけではない。たとえば、TIP47は、配列
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でもターゲットすることができる。
【０２３１】
siRNA配列をJC53細胞にトランスフェクトして、実施例1に記述した方法を使用してp24レベルを定量化した。
【０２３２】
図2に示したように、Rab9A、Rab11A、およびRab9AモジュレーターsiRNAは、緑色蛍光タンパク質（GFP）に対して無関係なsiRNA対照をトランスフェクトした細胞と比較して、HIV-1複製を遮断することができ（p24産生の約60〜90%の阻害）。対照的に、Rin2およびIP02 sirRNAは、HIV-1複製に対して効果を有さなかった。
【０２３３】
実施例3
Rab9A siRNA分子は、エボラ、マールブルク、RSV、および麻疹複製を減少させる
本実施例は、Rab9Aが、その他の被膜RNAウイルス、たとえばエボラ、マールブルク、麻疹ウイルス、およびRSVなどのその他のウイルスの複製に利用されることを証明するために使用した方法を記述する。
【０２３４】
エボラウイルスおよびマールブルクウイルス感染およびアッセイ法
Vero細胞（アフリカミドリザル腎臓株化細胞）には、実施例1に記述したように、6ウェルプレートにおいてRab9A siRNAをトランスフェクトした。Vero細胞をトランスフェクトした2日後に、培養を最大封じ込め研究室へ運搬して、エボラウイルス（ザイールspecies,1976 Mayinga株）およびマールブルグウイルス（1967Voege株）の低継代株を感染させた。ウイルス株の希釈は、10%のウシ胎児血清を含むダルベッコ最小必須培地中に作製した。ウェルには、2,500プラーク形成単位（pfu）のエボラウイルスまたは2,500もしくは25,000pfuマールブルグウイルスを含む0.1mlの希釈したウイルス株を播種した。培養を6〜7日間インキュベートして、組織培養液体を低速遠心分離（1,500 rpm,5分）によって透明にした。上澄み液を除去して、分注し、液体窒素中で貯蔵するか、またはドライアイス上でのガンマ照射（>3Mrad）によって不活性化する。
【０２３５】
細胞を1mlのリン酸緩衝食塩水（PBS；0.01 M、pH 7.2）中でこすることによって収集し、ミクロチューブ中に5,000rpmでペレットにして、スポットし、12-ウェルガラススライド上で乾燥させた。スライドをγ照射し（上澄み液に加えて）、次いで、アセトンで10分間固定した。細胞の間接蛍光抗体染色は、一次抗体としてエボラウイルスまたはマールブルグウイルスタンパク質に対して反応性のウサギ・ポリクローナル抗血清を、二次抗体としてFITC抱合したヤギ抗ウサギのIgG（Kirkegaard & Perry Laboratories, Inc.）を使用して行った。細胞は、HQ-41001/FITCフィルタセット（Chroma Technology Corp.）およびペルティエ冷却を備えたQ-Color5 Imagingシステムを使用するイメージキャプチャ（Olympus）を装着したOlympus BX51を使用して、特異的染色について検分した。
【０２３６】
上澄み液におけるウイルス抗原の検出は、エボラウイルスまたはNPのVP40タンパク質およびマールブルグウイルスのVP40タンパク質を検出するために、固体の相抗原捕獲アッセイ法を使用して行った。アッセイは、本質的に以前に記述したとように、感染の6日後に行った（Ksiazek et al., J. Clin. Microbiol. 30： 947,1992）。
【０２３７】
麻疹ウイルスのインビトロアッセイ法
Vero細胞には、実施例1に記載されているようにトランスフェクトして、感染の2日後に麻疹ウイルス（MV）のEdmonston（Edm）株を0.1のMOIにてトランスフェクションした。MV産生を測定するために、培養液上清を毎日除去して-70℃に貯蔵した。各時間に、細胞には、次の6日間、新鮮な培地を補充した。その後、放出されたウイルスの力価をVero単層上でのウイルスのプラーク検定によって決定した。
【０２３８】
シンシチウム形成は、MV感染の2および6日後に検出された。感染細胞は、チャンバースライド上に乗せて、一次抗体mab-KK2およびalexa蛍石抱合ヤギ抗マウス二次抗体（Molecular Probes,Eugene,OR）を使用してMV核タンパク質を染色した（Chemicon International, Temecula, CA）。
【０２３９】
RSVインビトロアッセイ法
インビトロ系において、RSVによる感染を減少させるためにRab9A siRNA分子を使用した。Vero E6細胞（2×105細胞／ウェル）を、siRNA試験の24時間前に、24ウェルプレートにおいて10%のウシ胎児血清（FBS）を含むダルベッコ修飾イーグルスMedium（DMEM）中で培養した。Mirus-Transit-TKOトランスフェクション試薬を全てのトランスフェクションのために使用した。カクテルは、DMEMで適切な二重鎖siRNA（50〜100pmole）を混合することによって作製した。2マイクロリットルのTransit TKOを50μl のDMEM／10% FBSに添加して、室温で10分間インキュベートした。培地中のFBSを除去するために、細胞をDMEMで洗浄して、siRNA混合物を細胞に添加し、3分間揺らした。細胞を37℃、5% CO2にて6時間インキュベートした。トランスフェクションの6時間後に、細胞をインキュベーターから取り出して、DMEMで洗浄することによって、細胞からsiRNA混合物を除去した。
【０２４０】
RSV株A2は、DMEMに100〜200PFU／100μlに希釈して、24ウェルプレートあたり100μlを添加し、37℃、5% CO2にて1時間インキュベートした。感染の1時間後に、細胞をインキュベーターから取り出して、1mlの2% 完全メチルセルロースを細胞上に覆って、37℃、5% CO2にて5日間インキュベートした。感染の5日後に、メチルセルロース上敷きを取り除き、RSVプラークを抗Fタンパク質（クローン131-2A）モノクローナル抗体で免疫染色することによって数えた。
【０２４１】
サルRab9A cDNAのクローニング
cDNAは、上記のとおりにVero細胞から調製して、サルRab9A cDNAは、これらの領域のヒトとマウス遺伝子との間で観察された相同性に基づいて、フォワードプライマー
2008506356.tif 000017
およびリバースプライマー
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を使用して増幅した。サルRab9A cDNAは、Topo TA Cloning Kit（InVitrogen）を使用してクローン化して、クローニングベクターに対してアニーリングするフォワードプライマー
2008506356.tif 000019
およびリバースプライマー
2008506356.tif 000020
を使用して使用してシーケンスした。
【０２４２】
結果
mRNA発現の定量化のために適したプライマーをデザインする際の助けとなるように、サルRab9A遺伝子をクローン化した。配列分析により、サルRab9Aが、ヒトRab9A mRNAに対して全体で98%相同性を示し（図3A）、選んだsiRNA標的部位では100%相同であることが明らかになった。トランスフェクションの2日後に、総mRNAを単離して、実施例1に記載したように逆転写した。Vero細胞をRab9A siRNAで処置することにより、〜90%までRab9A mRNAの発現を効率的に減少したが、一方で、GFP siRNA処置した細胞では、親細胞と同様のmRNAレベルを示した（図3B）。
【０２４３】
ウイルスタンパク質の免疫蛍光染色の劇的な減少は、GFP siRNAで処置した対照細胞と比較して、Rab9A siRNAをトランスフェクトしたEBO感染細胞において（および、MBG-感染細胞では、より少ない程度に）観察された。これらの結果は、培地に放出されるウイルス抗原の〜70〜75%の減少を示す抗原捕獲アッセイ法でも補強された（図3C）。
【０２４４】
また、MV複製は、siRNAで分解するためのRab9Am RNAをターゲットすることによって減少された。GFPおよびRab9A siRNAトランスフェクタントは両方とも、MVのEdm株での感染（MOI=0.1）の2日後の細胞の〜80〜90%において、ウイルスタンパク質核タンパク質およびヘマグルチニンのFACS検出に基づいて容易に感染可能であった。しかし、GFP siRNAトランスフェクタントと比較して、ウイルス粒子構築の下流のイベントおよびRab9A siRNAトランスフェクタントにおけるシンシチウム形成の遅延があった。シンシチウム形成および培養液上清へのウイルス粒子の分泌は、Rab9A siRNAトランスフェクタントでは感染2日後に検出されず、そのRab9AトランスフェクタントにおけるMV産生は、感染の5日後のGFP siRNAトランスフェクタントにおけるよりも、およそ〜90%低かった（図4）。ウイルス産生速度の遅延は、Rab9Aトランスフェクタントでは感染後の6日までに克服されていることから、siRNAを使用するmRNAのノックダウンの一過性の性質を反映し得る（図2C）。
【０２４５】
また、Rab9A siRNAがRSV感染を70〜95%まで減少させたことが観察された。
【０２４６】
まとめると、実施例1〜3に示した結果は、短鎖干渉RNAでの分解のためにRab9A mRNA、Rab11A mRNA、またはこれらのモジュレーターのmRNAをターゲットすることにより、劇的にHIV-1、フィロウイルス（MBGおよびエボラ（EBO））、RSV、および麻疹（MV）の複製を減少させることを示し、Rab9A、Rab11A、これらのモジュレーターを広域スペクトル抗ウイルス剤の開発で標的に使用することができることを示している。
【０２４７】
実施例4
Rab9A siRNAは、脂質ラフト形成を減少させる
上記の実施例に記載されているように、Rab9Aを認識するsiRNA分子は、被膜RNAウイルスなどウイルス感染を減少する。Rab9Aは、後期エンドソームをトランスゴルに輸送する。これらの結果に基づいて、Rab9Aは、脂質ラフト形成において役割を果たすことが示される（図5）。
【０２４８】
脂質ラフトは、スフィンゴ脂質およびコレステロールに濃縮される液体の規律正しい微小ドメインであり、生合成輸送に、シグナル伝達、およびエンドサイトーシスに関与する。ウイルスは、これらの細胞宿主への侵入、構築、および出芽など、これらの複製サイクルのいくつかの工程を完了するために、（「ハイジャック」）ラフトを利用する。特定の理論に拘束されることは望まないが、Rab9Aがウイルスの構築および出芽に関与するものなどの、病原体タンパク質（ウイルスタンパク質など）または脂質ラフト成分の適当な細胞下の局在化を促進することが提唱される。たとえば、Rab7、Rab9A、およびRab11Aは、正常なスフィンゴ脂質およびコレステロール輸送（共に、脂質ラフトを保持する「接着剤」）を調節する。加えて、Rab7またはRab9A過剰発現は、ニーマン-ピック Cスフィンゴ脂質蓄積症におけるスフィンゴ脂質およびコレステロール輸送欠陥を直す。したがって、Rab7、Rab9A、およびRab9A活性を増大するRab9Aモジュレーターの発現を減少させ、または阻害することにより、コレステロールおよびスフィンゴ脂質輸送を、無視することができ、結果として脂質ラフト形成および感染（ウイルスの複製など）に障害が生じる。
【０２４９】
実施例1に示したように、後期エンドソームからトランスゴルジへの輸送を媒介するRab9Aの枯渇は、HIV-1複製を激減させる。これらの結果は、HeLa細胞におけるウイルス放出が後期エンドソームにおけるウイルスの構築によって生じ、続いて予め形成されたGag-Env複合体が原形質膜への途中のトランスゴルジ網へRab9A依存的に輸送され、ここで出芽が完了することを示す。
【０２５０】
EBOおよびMBGウイルスのVP40基質タンパク質は、原形質膜と細胞内ウイルス封入体との間で不定に分配する（Martin-Serrano et al., Nat. Med. 7：1313, 2001； Kolesnikova et al., J. Virol. 78：2382, 2004）。MBG VP40は、後期エンドソームと会合し、VP40を細胞表面へ移動させるために小胞輸送を使用する（Kolesnikova et al., J. Virol. 78：2382, 2004）。HIV-1およびMBGは、後期エンドソームにて構築されると考えられ、またHIV-1およびEBOは、出芽のためにエンドソームのソーティング機構を利用することを考えると（Martin-Serrano et al., Nat. Med. 7：1313, 2001）、上記した結果は、トランスゴルジ網を経て細胞膜に対して輸送するために、HIV-1、EBO、およびMBGによるRab9Aに対する依存性が保存されていることを示す。したがって、Rab9AまたはRab11A活性を、たとえばその発現を減少させることによって（または、Rab9AまたはRab11A活性に必要とされるか、またはこれらを増強するこれらのモジュレーターの発現を減少することによって）減少させ、または阻害することにより、これらを分解するためにリソソームへのウイルスタンパク質の再指示を生じ得る。
【０２５１】
脂質ラフトをハイジャックする病原体の例は、表2にて示したものを含むが、これらに限定されるわけではない。機能的Rab9Aおよび脂質ラフトがない（または、ラフトの数が減少する）場合、ウイルスは、出芽し、または感染することができないかもしれない。したがって、Rab9AまたはRab9Aモジュレーターの活性を減少する薬剤の使用は、その他の病原体による感染、並びに表2に示したものなどの脂質ラフトをハイジャックする炭疽菌などの毒素を減少させるために使用することができる。
【０２５２】
（表２）脂質ラフトをハイジャックする例示的な病原体
2008506356.tif 000021
【０２５３】
実施例5
RSV感染した動物のRab9A siRNAでの治療
本実施例は、病原体感染を有する動物を治療する、または将来の動物を保護から保護（予防）するために使用することができる方法を記述する。例には、特にRSV（呼吸器系合胞体ウイルス）およびRab9A siRNA分子を使用する方法を記述しているが、当業者であれば、同様の方法をヒト被験者などのその他の被験者において、その他の病原体感染をその他の分子（Rab11AもしくはRab9AモジュレーターsiRNA、またはRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーターアンチセンス分子など）で治療するために使用することができることを認識するであろう。
【０２５４】
RSVは、齧歯類モデルを利用することができる被膜RNAウイルスである。RSV感染は、乳児および子供に原因細気管支炎を引き起こし、特に免疫無防備状態の患者においては致命的であり得る。RSVのためのマウスモデルは、BALB／cマウス、並びにシクロホスファミドで前処理したBALB／cマウスを含む（たとえば、Kong et al., Virol J. 2：3, 2005を参照されたい）。また、コトンラット（Sigmodon hispidus）もRSVのための宿主モデルである（Harlan Sprague Dawley, Indianapolis, IN）。
【０２５５】
マウスにおけるRSV感染を阻害する（予防を含む）ために、以下の方法を使用することができる。Rab9A（またはRab9Aモジュレーター）siRNA（1〜5mg/kg）を、鼻腔内投与を経てマウス肺に投与し（6〜16週間目のBALB／cマウスなど；Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME）、その後に（または、siRNA投与と同時に）マウスを50μlの量で105〜107 PFU／マウス（5×105 PFUなど）で鼻腔内に感染させる。マウスのRSV感染を治療するためには、以下の方法を使用することができる。マウスには、最初にRSVで鼻腔内感染させ、その後にRab9 siRNAを鼻腔内から肺に投与する（しかし、全身投与も使用することができる）。必要に応じて、BALB／Cマウスには、RSV感染の5日前に、シクロホスファミドを1kgあたり100mgの単一用量で腹腔内に（i. p.）投与することができる（Sigma, St. Louis, MO）。ヒトRSVのA2株（American Type Culture Collection, Manassas, VA）をHEp-2、Vero E6、A549、または初代上皮細胞系列中で増殖させることができる。または、RSV株B1を使用することもできる。このような治療の前に、動物被験者を麻酔することができる。同様の方法は、コトンラットに感染させるために使用することができる（100μlに2×105 PFUのRSVなど）。
【０２５６】
特定の例において、以下の方法が使用される。予防のために感染の4時間前に、または治療のために感染12、24、48、または72時間後に、雌の6〜8週間目のBALB／cマウス（Harlan Sprague）を2,2,2-トリブロモエタノール（Avertin）の腹腔内注射によって麻酔し、50μlの総容積で5〜100μg siRNAを鼻腔内に投与する。麻酔マウスには、RSV株A2またはB1の106プラーク形成単位を鼻腔内に感染させる。所望の時点（感染1〜7日後など）にて肺を除去する前に、マウスをアベルチンで麻酔して、右尾動脈を切断することによって失血させた。血液を収集し、血清を単離する。肺を除去し、1.0mlのダルベッコリン酸緩衝食塩水（D-PBS、Invitrogen）中に収集し、ウイルス力価の同時解析のために-70℃に貯蔵する。ウイルス力価／グラム肺組織は、標準的な免疫染色プラーク検定によってアッセイする（たとえば、J. Immunol. 164：5913-21, 2000を参照されたい）。
【０２５７】
予防方法の例：
2008506356.tif 000022
【０２５８】
治療方法の例：
2008506356.tif 000023
【０２５９】
その後に、動物を重量、肺状態、血清抗体価、インターフェロン・レベルなどの、RSV感染のウイルス力価および病態について調べる。対照（治療的分子を受けたRSVに感染したマウスまたはその他の被験者）と比較して、ウイルス力価もしくはRSV感染の1つまたは複数の症候の減少は、siRNA分子がRSV感染を予防し、または治療することができることを示す。
【０２６０】
たとえば、RSV感染0、5、10、および17日後の体重減少について、動物をモニターすることができる感染の5日後にマウスを屠殺して、これらの肺を、RSV力価サイトカイン・レベル、および組織病理学の決定のために除去する。
【０２６１】
RSV力価を決定するためには、RSVプラーク検定を使用することができる。たとえば、6ウェルプレートのHEp-2細胞（5×105／ウェル）を37℃にて2時間、ウェルあたり5×105pfu RSVで感染させる。RSVを除去し、ウェルを、0.8%のメチルセルロースを含む1.5mlの増殖培地で覆い、次いで、細胞を37℃にて72時間インキュベートし、その後、上敷きを除去する。インキュベーション後、細胞を冷却した80%のメタノール中で3時固定し、1%のウマ血清のPBS溶液で37℃にて30分間ブロックし、次いで1：400希釈した抗RSVモノクローナル抗体（NCL-RSV 3, Vector Laboratories, Burlingame, CA）と共に37℃にて1時間インキュベートする。Vectastain ABC Kit （Vector Laboratories）およびクロマゲン（chromagen）として使用したジアミノベンジジンのH2O2溶液（Pierce, Rockford, IL）を使用して、二次抗体染色および基質反応を行うことができる。プラークは、顕微鏡観察によって数え上げることができる。
【０２６２】
気道過敏（AHR）を決定するために、以下の方法を使用することができる。AHRは、体全体のプレチスモグラフを使用して、抑制されていないマウスにおいて測定し（Buxco、Troy、NY）、休止の増強（Penh）として表すことができる。マウスを、超音波ネブライザーを使用して、噴霧したPBSに対して5分間噴霧し、その後に噴霧した濃度を増大しながらメタコリン（MCh； Sigma, St, Louis, MO）のPBS溶液（6、12、25、および50mg/ml）に対して曝露する。噴霧後、5分間記録する。Penh値を平均して、PBS曝露後に得られたベースラインPenh値の割合として表すことができる。
【０２６３】
肺の免疫組織化学的解析は、以下のとおりに行うことができる。簡単には、肺をPBSの気管内注射でリンスし、次いで10%の中性緩衝ホルマリンで灌流する。肺を除去して、パラフィンに包埋し、20μmにて切片にして、ヘマトキシリン‐エオジンで染色する。肺切片の炎症細胞の半定量的評価を決定することができる。肺全体のホモジネートを、TissueMizerを使用して調製して、製造業者の指示に従って、ELISAによってサイトカインIL-10、IL-12、およびIFN-γ（R&D Systems, Minneapolis MN）についてアッセイすることができる。結果は、肺のグラムあたりのピコグラム（pg/g）のサイトカイン量として表すことができる。
【０２６４】
肺におけるRSVおよびサイトカインは、RT-PCRを使用して検出することができる。簡単には、総細胞RNAを、TRIZOL試薬を使用して肺組織から単離することができる（Life Technologies、Gaithersburg、MD）。使用することができるフォワードおよびリバースプライマーは、以下の通りである。
2008506356.tif 000024
反応は、25〜35サイクルの間、95℃にて1分間変性させ、56℃にて30秒間アニールして、72℃にて1分間伸長する。PCR単位複製配列産物は、アガロースゲル電気泳動によって分離し、定量化することができる。
【０２６５】
気管支肺胞洗浄（BAL）液における細胞の数え上げは、以下のとおりに行うことができる。簡単には、BALを遠心し、細胞ペレットを200μlのPBSに懸濁して、血球計数器を使用して計数する。次いで、細胞懸濁液を、たとえば室温で5分間1000rpmにてサイトスピン遠心機を使用することによってガラススライド上に遠心する。細胞遠心した（Cytocentrifuged）細胞を風乾させ、修飾されたWright染色で染色して（Leukostat, Fisher Scientific, Atlanta, GA）、これにより単球およびリンパ球の差動的計数が可能になる。
【０２６６】
実施例6
遺伝子発現の破壊のための分子
本実施例は、Rab9A、Rab11A、Rab9A、もしくはRab11A活性を増大するこれらの1つもしくは複数のモジュレーター、またはこれらの組み合わせの発現を減少させ、または崩壊させ、これによりRab9AまたはRab11A（または、これらのいくつかの例のモジュレーター）の生物活性を減少させるために使用することができるsiRNA、アンチセンス、リボザイム、ミクロRNA、および三重らせん分子を記述する。このような薬剤は、病原体による感染の減少、病原体感染の治療、または病原体による将来の感染の予防のために有用である。たとえば、薬剤は、病原体感染を有するか、または病原体感染に感受性の被験者を治療するために使用することができる。このような分子を産生および使用するための技術は、当業者に周知である。たとえば、核酸配列は、自動DNAシンセサイザーを使用することによって合成することができる。これらの分子を使用するための方法は、実施例7に記述してある。
【０２６７】
特定の疾患または状態の治療に有効であるsiRNA、アンチセンス、リボザイム、ミクロRNA、または三重らせん分子の量（治療上有効な量）は、疾患または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。たとえば、このような核酸分子の徐放を達成するための組成物を使用することが有用であり得る。もう一つの例において、所望の治療的分子を含むリポソームは、特異的細胞に対する抗体を経てターゲットされる。
【０２６８】
特定の例において、病原体による感染を治療し、または阻害するために、特に開示したsiRNA分子（SEQ ID NO:5〜9および16-32）、アンチセンスRNA（SEQ ID NO:48〜56）、リボザイムRNA（SEQ ID NO:57〜66）、またはこれらの組み合わせの少なくとも1つが被験者に投与される。一つの例において、投与される（たとえば、単一用量で）開示したsiRNA、アンチセンス、またはリボザイムRNAの量は、1〜5mg/kgまたは3〜7mg／kgなどの1〜10mgの核酸分子／被験者のkgのsiRNA分子である。
【０２６９】
siRNA分子
実施例1〜3に示したように、siRNA分子は、たとえば被膜RNAウイルスによる感染などの病原体が細胞に感染する能力を減少させるために、Rab9AもしくはRab11A活性を増大するRab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターの発現を減少し、または阻害するために使用することができる。Rab9A、Rab11A、p40、TIP47、およびPIKfyveなどのいくつかの異なる遺伝子に対して、例示的siRNA化合物を本明細書に提供してある。しかし、本開示は、これらの特定のsiRNA分子に限定されるわけではない。公的に利用できるRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、およびRab11Aモジュレーター配列に基づいて、当業者であれば、公知の方法を使用してその他のsiRNA分子を作製することができる。たとえば、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、およびRab11Aモジュレーター配列を認識するsiRNA配列は、Sequitur Inc.（Natick, MA）などの市販の実体によってデザインし、調製することができる。
【０２７０】
21merのみをSEQ ID NO:5〜8および16〜31に示してあるが、本開示は、特定の長さのsiRNA化合物に限定されるわけではない。siRNA分子は、少なくとも19ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも21ヌクレオチド、少なくとも22ヌクレオチド、少なくとも23ヌクレオチド、少なくとも24ヌクレオチド、少なくとも25ヌクレオチド、少なくとも26ヌクレオチド、少なくとも27ヌクレオチド、または少なくとも30ヌクレオチドなどの任意の長さであることができる。
【０２７１】
本明細書に記述した方法（たとえば、実施例1、3、5、および7を参照されたい）を使用して、病原体による細胞の感染を減少させ、既存の感染を治療し、将来の感染を予防し、またはこれらの組み合わせのために、siRNA化合物を使用することができる。たとえば、SEQ ID NO:5〜9および16〜31のいずれかに示したsiRNA化合物をその逆相補体とインキュベートし、2つの分子をハイブリダイゼーションさせる。特定の例において、3以上または4以上などの2つ以上のsiRNA化合物が細胞に導入される。たとえば、二重鎖分子を、二重鎖が細胞に入ることができる条件下で、ウイルス感染の減少されることが望まれる被験者の細胞など細胞と接触させる。特定の例において、二重鎖は、細胞にエキソビボで、またはインビトロで投与し、または被験者に直接投与される。もう一つの例において、siRNAは、ベクターの一部であり、ベクターは、細胞にエキソビボで、またはインビトロで投与されるか、または被験者に直接投与される。一つの例において、ベクターは、pSilencer（商標）4.1-CMVベクター（Ambion, Austin, TX）である。
【０２７２】
アンチセンス法
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当技術分野において公知の方法を使用してデザインし、作製することができる。たとえば、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11AモジュレーターmRNA配列を調べる。TTTTTTTTなどの複数の繰り返しを含む配列の領域は、これらが特異性を欠いているので望ましくない。いくつかの異なる領域を選択することができる。これらの中で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、以下の特徴によって選択される：溶液中で最高の高次構造を有するもの；ハイブリダイゼーション特徴のために最適化されたもの；および二次構造を形成する可能性がより少ないもの。二次構造を生じる可能性を有するアンチセンス分子は、あまり望ましくない。
【０２７３】
Rab9A、Rab11A、またはRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターを認識するアンチセンス分子は、少なとも一部のRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、または遺伝子のRab11AモジュレーターRNA転写物に対して相補的な配列を含む。しかし、絶対相補性は必要とされない。アンチセンス配列は、少なくとも一部のRNAに対して相補的であることができ（RNAとハイブリダイズして、安定な二重鎖を形成することができるほど十分に相補性を有する配列を意味する）；二本鎖アンチセンス核酸の場合、したがって、二重鎖DNAの一本鎖を試験してもよく、または三重鎖の形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は、アンチセンス核酸の相補性の程度および長さに依存する。一般に、ハイブリダイズする核酸が長くなるにつれ、RNAとミスマッチする塩基が多くなり、これは、安定な二重鎖（または、場合によっては三重鎖）を含み、さらに安定な二重鎖を形成し得る。当業者であれば、ハイブリダイズした複合体の融点を決定するために、標準的方法を使用することによって、ミスマッチの許容できる程度を確認することができる。
【０２７４】
特定の例において、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターに特異的であるアンチセンス分子は、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーター遺伝子配列の、mRNA配列などの少なくとも断片に対して、少なくとも90%の配列同一性などの少なくとも80%の配列同一性を含む。一つの例において、アンチセンス分子がその相補核酸配列に対して結合する相対的能力は、アンチセンス分子とその相補鎖とのハイブリダイゼーション複合体のTmを決定することによって比較される。Tmが高いほど、ハイブリダイズした鎖の結合の強度が高くなる。
【０２７５】
Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーターを認識するアンチセンス配列を含むプラスミドまたはベクターは、標準的な方法を使用して作製することができる。たとえば、感染に関与するRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質をコードするcDNA断片または変異体は、たとえばPfu DNAポリメラーゼ（Stratagene）を使用してPCRで増幅される。生じる配列は、アンチセンスの向きでpcDNAベクター（InVitrogen、Carlsbad、CA）などのベクターにクローン化する。挿入物のヌクレオチド配列および向きは、シーケンスキット（Amersham Pharmacia Biotech）を使用してシーケンスして確認することができる。このようなベクターは、病原体感染を減少させるために被験者に投与するなど、治療的な量で細胞に投与することができる。
【０２７６】
一般に、「アンチセンス」という用語は、いくらかの配列相補性によりRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11AモジュレーターRNA配列（mRNAなど）の一部にハイブリダイズすることができる核酸分子をいう。本明細書に開示したアンチセンス核酸は、二本鎖ドもしくは一本鎖、RNAもしくはDNA、またはこれらの修飾もしくは誘導体であるオリゴヌクレオチであることができ、細胞に直接投与することができ（たとえば、被験者にアンチセンス分子を投与することによって）、または外部から導入された配列の転写によって細胞内に産生することができる（たとえば、プロモーターの制御下でアンチセンス分子を含むベクターを被験者に投与することによる）。
【０２７７】
アンチセンス核酸は、6〜100ヌクレオチドなど、少なくとも6ヌクレオチド、少なくとも10ヌクレオチド、少なくとも15ヌクレオチド、少なくとも20ヌクレオチド、少なくとも40のヌクレオチド、少なくとも100ヌクレオチド、少なくとも200ヌクレオチドの長さのポリヌクレオチド、たとえば核酸分子である。しかし、アンチセンス分子は、非常に長いこともできる。特定の例において、ヌクレオチドは、1つまたは複数の塩基部分、糖残基、またはリン酸バックボーン（またはこれらの組み合わせ）にて修飾されており、ペプチドまたは細胞膜（Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1989, 86：6553-6； Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84：648-52；国際公開公報第88/09810号）もしくは血液脳関門（国際公開公報第89/10134号）を超えた輸送を容易にする薬剤、ハイブリダイゼーションでトリガーされる切断薬（Krol et al., BioTechniques 1988, 6：958-76）、または挿入剤（Zon、Pharm. Res. 5： 539-49, 1988）などのその他の追加の基を含むことができる。
【０２７８】
修飾された塩基部分の例は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：5-フルオロウラシル、5-ブロモウラシル、5-クロロウラシル、5-ヨードウラシル、ヒポキサンチン、キサンチン、アセチルシトシン、5-（カルボキシヒドロキシルメチル）ウラシル、5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン、5-カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、β-D-ガラクトシルクエオシン、イノシン、N-6-ソペンテニルアデニン、1-メチルグアニン、1-メチルイノシン、2，2-ジメチルグアニン、2-メチルアデニン、2-メチルグアニン、3-メチルシトシン、5-メチルシトシン、N6-アデニン、7-メチルグアニン、5’-メトキシカルボキシメチルウラシル、5-メトキシウラシル、2-メチルチオ-N6-イソペンテニルアデニン、ウラシル-5-オキシ酢酸、5-メチルウラシル、ウラシル-5-オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル-S-オキシ酢酸、5-メチル-2-チオウラシル、3-（3-アミノ-3-N-2-カルボキシプロピル）ウラシル、および2，6-ジアミノプリン。
【０２７９】
修飾された糖部分の例は、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロアミドチオアート、ホスホロアミダート、ホスホロジアミダート、メチルホスホナート、アルキルホスホトリエステル、またはこれらのホルムアセチルもしくは類似体。
【０２８０】
特定の例において、アンチセンス分子は、αアノマーのオリゴヌクレオチドである。αアノマーのオリゴヌクレオチドは、相補RNAと特異的な二本鎖ハイブリッドを形成し、その際に、通常のβ-ユニットに反して、鎖は、互いに並行して走る（Gautier et al., Nucl. Acids Res. 15：6625-41, 1987）。オリゴヌクレオチドは、ペプチド、ハイブリダイゼーションでトリガーされる架橋剤、輸送因子、またはハイブリダイゼーションでトリガーされる切断薬などの別の分子に抱合することができる。オリゴヌクレオチドは、宿主細胞による分子の取り込みを増強するターゲティング部分を含むことができる。ターゲティング部分は、宿主細胞の表面上に存在する分子を認識する抗体またはこれらの断片などの特異的な結合分子であることができる。
【０２８１】
具体例において、Rab9AまたはRab11A核酸分子（または、Rab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーター配列）を認識するアンチセンス分子は、触媒RNAまたはリボザイムを含む（たとえば、国際公開公報第90/11364号；国際公開公報第95/06764；およびSarver et al., Science 247：1222-5, 1990を参照されたい）。mRNA加水分解を媒介することができるテルピリジルCu（II）などの金属錯体とアンチセンスの抱合が、Bashkin et al.（Appl. Biochem Biotechnol. 54：43-56, 1995）に記述されている。一つの例において、アンチセンス・ヌクレオチドは、2’-0-メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., Nucl. Acids Res. 15：6131-48, 1987）またはキメラRNA-DNA類似体（Inoue et al., FEBS Lett. 215：327-30, 1987）である。
【０２８２】
以下の例示的アンチセンス分子を提供してあるが、本開示は、これらの特定の分子に限定されるわけではない。
【０２８３】
例示的なRab9AアンチセンスRNAは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。ヒトRab9Am RNAヌクレオチド位置136〜175を認識する
2008506356.tif 000025
およびヒトRab9AmRNAヌクレオチド位置261〜300を認識する
2008506356.tif 000026
【０２８４】
例示的なRab11AアンチセンスRNAは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。
ヒトRab11A mRNAヌクレオチド位置121〜160を認識する
2008506356.tif 000027
およびヒトRab11A mRNAヌクレオチド位置197〜236を認識する
2008506356.tif 000028
【０２８５】
例示的なPIKfyveアンチセンスRNAは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。
ヒトPIKfyve mRNAヌクレオチド位置879〜918を認識する
2008506356.tif 000029
およびヒトPIKfyve mRNAヌクレオチド位置4983〜5022を認識する
2008506356.tif 000030
【０２８６】
例示的なp40アンチセンスRNAは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。
ヒトp40 mRNAヌクレオチド位置321〜360を認識する
2008506356.tif 000031
およびヒトp40 mRNAヌクレオチド位置434〜473を認識する
2008506356.tif 000032
【０２８７】
例示的なTIP47アンチセンスRNAは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。
ヒトTIP47 mRNAヌクレオチド位置352〜391を認識する
2008506356.tif 000033
およびヒトTIP47mRNAヌクレオチド位置684〜723を認識する
2008506356.tif 000034
【０２８８】
リボザイム
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒することができる酵素的RNA分子である。リボザイム作用のメカニズムは、相補標的RNAに対するリボザイム分子の配列特異的なハイブリダイゼーション、続くヌクレオチド鎖切断による切断を含む。RNA発現を減少し、または阻害するためにリボザイムを使用する方法は、当技術分野において公知である（たとえば、Kashani-Sabet, J. Investig. Dermatol. Symp. Proc., 7：76-78, 2002を参照されたい）。
【０２８９】
リボザイム分子は、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11AモジュレーターmRNAに対して相補的な1つまたは複数の配列を含み、mRNA切断の役割を担う周知の触媒の配列を含む（米国特許第5,093,246号を参照されたい、本明細書に参照として組み入れられる）。
【０２９０】
リボザイム分子をデザインし、作製する方法は、当技術分野において公知である。簡単には、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11AモジュレーターRNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、GUA、GUU、およびGUCを含むリボザイム切断部位についてRNA配列を走査することによって同定される。一旦同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15〜50リボヌクレオチドの間（少なくとも20リボヌクレオチド、少なくとも40リボヌクレオチド、または少なくとも46リボヌクレオチドなど）のRNA配列を、不適当なオリゴヌクレオチド配列にしてしまう可能性のある二次構造などの、予測される構造の特色について評価することができる。また、候補標的の適合性は、リボヌクレアーゼ保護アッセイ法を使用して、これらの相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの到達性を試験することによっても評価される。
【０２９１】
特定の例において、リボザイムは、被験者に直接投与される。もう一つの例において、リボザイムは、発現ベクターにコードされ、リボザイムは、細胞において合成される（国際公開公報第9523225号およびBeigelman et al., Nucl. Acids Res. 1995, 23：4434-42と同様に）。このような細胞またはベクターを被験者に投与することができる。
【０２９２】
具体例において、プロモーター（誘導性プロモーターなど）の後に配置されたRab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターに向けられたリボザイム遺伝子を含むベクターを被験者、たとえば脂質ラフトを利用する病原体（HIV、エボラ、マールブルク、RSV、または麻疹など）による感染に感受性の被験者の細胞にトランスフェクトされる。細胞におけるこのベクターの発現は、細胞におけるRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11AモジュレーターRNA発現を減少させ、または阻害する。一つの例において、ベクターは、pSilencer（商標）4.1-CMVベクター（Ambion）である。
【０２９３】
特定の例において、ベクターは、自己切断する直列型リボザイム（たとえば単一のRNA転写物でコードされる5つのリボザイム）を含む。ひとたび直列型ハンマーヘッド転写物が合成されると、これは、細胞の内因的に発現されたmRNA上のリボザイム標的部位と同一の新たに合成された転写物内でシスにリボザイム切断部位を認識する。次いで、直列型リボザイムは、それ自体を切断して、細胞内の標的mRNAを切断するリボザイムを遊離する。
【０２９４】
以下に例示的なハンマーヘッド・リボザイム分子を提供してあるが、本開示は、これらの特定の分子に限定されるわけではない。
【０２９５】
例示的なRab9AリボザイムRNAは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。
ヒトRab9AmRNAヌクレオチド位置183〜207を認識する
2008506356.tif 000035
およびヒトRab9AmRNAヌクレオチド位置255〜279を認識する
2008506356.tif 000036
【０２９６】
例示的なRab11AリボザイムRNAは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。
ヒトRab11A mRNAヌクレオチド位置74-98を認識する
2008506356.tif 000037
およびヒトRab11A mRNAヌクレオチド位置557〜581を認識する
2008506356.tif 000038
【０２９７】
例示的なPIKfyveリボザイムRNAは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。
ヒトPIKfyve mRNAヌクレオチド位置923〜947を認識する
2008506356.tif 000039
およびヒトPIKfyve mRNAヌクレオチド位置4974〜4998を認識する
2008506356.tif 000040
【０２９８】
例示的なp40リボザイムRNAは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。
ヒトp40 mRNAヌクレオチド位置333〜357を認識する
2008506356.tif 000041
およびヒトp40 mRNAヌクレオチド位置450〜474を認識する
2008506356.tif 000042
【０２９９】
例示的なTIP47リボザイムRNAは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない。
ヒトTIP47 mRNAヌクレオチド位置365〜389を認識する
2008506356.tif 000043
およびヒトTIP47 mRNAヌクレオチド位置703〜727を認識する
2008506356.tif 000044
【０３００】
ミクロRNA
Rab9A mRNA、Rab11A mRNA、Rab9AモジュレーターmRNA、またはRab11AモジュレーターmRNAを認識するミクロRNA（miRs）は、細胞におけるこのようなmRNAの量を減少させるために使用することができる。miRNAは、標的mRNAに相補的なこれらの配列によって転写後のレベルをサイレンスする。特定の例において、miRsは、約18〜26ヌクレオチド、21〜26ヌクレオチドなど、少なくとも18ヌクレオチドなどの長さである。動物miRNAは、、一般に不完全な塩基対形成によってこれらのmRNA標的を認識し、標的の翻訳阻害を引き起こすと考えられる。
【０３０１】
ミクロRNAを作製し、または同定する方法は、当技術分野において公知である（たとえば、Lagos-Quintana et al., Science, 294：853-8, 2001；Lagos-Quintana et al., Curr. Biol. 12：735-9, 2002；および Lagos-Quintana et al., RNA 9：175-9, 2003を参照されたい）。
【０３０２】
三重らせん分子
Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターのための三重らせん形成に使用される核酸分子は、理想的には一本鎖であり、デオキシヌクレオチドで構成される。これらのオリゴヌクレオチドの塩基組成は、フーグスティーン型塩基対規則を経て3重らせん形成を促進するようにデザインされ、一般にプリンまたはピリミジンの大きなひと配列が二重鎖の一方の鎖に存在することが必要である。ヌクレオチド配列は、ピリミジンに基づいていることができ、これにより、生じる三重らせん体の3つの会合した鎖全体に、TATおよびCGC+トリプレットが生じる。ピリミジン・リッチな分子は、二重鎖の一本鎖のプリン・リッチな領域に対し、その鎖に平行した向きの塩基相補性をもたらす。加えて、核酸分子には、たとえばグアニジン残基のひと配列を含むプリン・リッチである選択することができる。これらの分子は、GC対がリッチであるDNA二重らせん体をもつ三重らせん体を形成し、その大部分のプリン残基は、ターゲットされた二重鎖の一本鎖上に位置して、三重鎖における3つの鎖全体にGGC三重鎖を生じる。
【０３０３】
または、3重らせん形成に対してターゲットされるRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、およびRab11Aモジュレーター配列は、「スイッチバック」核酸分子を作製することによって増大される。スイッチバック分子は、これらが、最初に二重鎖の一方の鎖と、次いで他方と塩基対形成し、プリンまたはピリミジン誘導体の大きなひと配列が二重鎖の一方補鎖に存在する必要がなくなるように、交互に5'-3'、3'-5'様式で合成される。
【０３０４】
実施例7
治療および予防の方法
本実施例は、病原体感染を有する被験者を治療し、または将来の感染の発病を予防し、もしくは減少させるために使用することができる方法を提供する。治療方法は、発熱または白血球数の増大などの感染による被験者の1つまたは複数の症候を減少させる方法を含む。しかし、症候の完全な除去は必要とされない。また、治療方法は、被験者におけるウイルスの力価を減少させる工程など、病原体の存在を減少させる工程を含むことができる。予防法は、たとえば病原体による感染に対して感受性である被験者（子供、高齢者、および医療労働者など）の将来の病原体感染の発病率を減少させる工程を含む。
【０３０５】
特定の例において、本方法は、被験者に対してRab9AまたはRab11Aの生物活性を減少させる薬剤の治療上有効な量を投与する工程を含む（たとえば、それぞれRab9AまたはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターの活性を減少することよる）。Rab9A、Rab11A、またはそれぞれRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターの活性が、たとえばこれらのタンパク質または核酸分子レベルを早期にダウンレギュレートすることよって減少した場合に、病原体感染の減少が達成される。したがって、たとえば、Rab9A、Rab11A、またはそれぞれRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターをコードする核酸を認識するアンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、miRs、siRNA、および三重らせん分子（たとえば、上記の実施例に開示したもの）は、それぞれ細胞のRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質の発現を崩壊させるために使用される。開示されたアンチセンス、リボザイム、三重らせん体、miRs、およびsiRNA分子（たとえば、1〜5mg/kgまたは3〜7mg/kgなどの1〜10mgの核酸分子／被験者のkgの濃度にて）被験者に単独で、または薬学的担体、その他の治療薬（抗ウイルス薬化合物など）、もしくはこれらの組み合わせなどのその他の薬剤と組み合わせて投与することができる。一つの例において、被験者は、マウス、非ヒト霊長類、およびヒトなどの哺乳類である。
【０３０６】
一つの例において、siRNA、リボザイム、三重らせん体、miR、またはアンチセンス分子は、ベクターの一部であり、ベクターは、細胞にエキソビボで、もしくはインビトロで投与されるか、または被験者に直接投与される。たとえば、21ヌクレオチドの発現を制御するU6プロモーター、続く8bpのステム-ループ、続く最初の21ヌクレオチドにアニールするさらなる相補的21bpを転写した。21ヌクレオチド配列は、Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターを認識するsiRNAである。転写は、プラスミドにおいて、所望の転写されるヌクレオチドのすぐ下流の最後ける5つのTのひと配列を使用して停止する。もう一つの例において、ベクターは、pSilencer（商標）4.1-CMVベクター（Ambion）である。
【０３０７】
特定の例において、病原体による感染の量が減少されることが望まれる感染に感受性か、または罹患している被験者を、Rab9AまたはRab11A核酸配列（または、それぞれRab9AもしくはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターの核酸配列）を認識するアンチセンス、リボザイム、三重らせん体、miR、またはsiRNA分子（またはこれらの組み合わせ）の治療上有効な量で治療する。同様に、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質を特異的に認識して相互作用し（結合するなど）、これによりタンパク質の病原体と相互作用する能力を減少させる薬剤などのその他の薬剤は、また、感染を減少し、または阻害するために使用される。その他の例示的な薬剤は、下記の実施例に記述した方法を使用して同定されたものである。抗体、ペプチド、核酸分子、有機または無機化合物などのこれらの薬剤は、治療上有効な量で被験者に投与することができる。
薬剤が効果を生じた後（病原体感染のレベルが減少したことが観察されるか、または感染と関連する症候が減少する）たとえば24〜48時間後に、感染と関連する疾患について被験者をモニターすることができる。
【０３０８】
特定の例において、最初に存在する得病原体感染の型を決定するために、被験者がスクリーニングされる。病原体が、脂質ラフトをハイジャックする病原体などの、開示された療法によって減少することができるものである場合、被験者に対する療法が施される。
【０３０９】
また、本明細書に開示した治療は、たとえば病原体による感染を阻害し、または予防するために、予防的に使用することができる。このような投与は、治療が障害の治療または予防のために有用性を有することが示された場合に指示される。予防的使用は、病原体感染と関連する障害に進行することが公知であるか、または疑いがある状態において指示される。
【０３１０】
実施例8
薬学的組成物および投与様式
本明細書に開示した療法を施すための方法は、公知である。特定の例は、リポソームにおけるカプセル化、微小粒子、マイクロカプセル、組換え細胞による発現、受容体依存的エンドサイトーシス（Wu and Wu, J. Biol. Chem. 1987, 262：4429-32）、およびレトロウイルスまたはその他のベクターの一部としての治療的核酸分子の構築を含む。導入の方法は、局所的、皮内、筋肉内、腹腔内、経静脈、皮下、鼻腔、および経口経路を含むが、これらに限定されるわけではない。開示された治療薬は、任意の便利な経路によって投与することができる、たとえば注入または大量瞬時投与によって、上皮または粘膜皮膚の裏打ち（たとえば、口腔粘膜、直腸、膣、および腸粘膜）を介した吸収によって、およびその他の生物活性物質と共に投与することができる。投与は、全身性であることができ、または局部的であることができる。薬学的組成物は、たとえば局所適用によって、治療を必要とする領域に局所的に送達することができる。
【０３１１】
Rab9AまたはRab11Aの発現または活性を減少させる（たとえば、Rab9AまたはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターの活性を減少することによるか、またはRab9AまたはRab11A活性を減少するこれらのモジュレーターの活性を増大することによる）薬剤の治療上有効な量を含む薬学的組成物が開示される。具体例には、アンチセンス、リボザイム、三重らせん体、miR、およびsiRNA分子、並びに抗体などの特異的な結合薬剤を含む。このような薬剤は、単独で、または薬学的に許容される担体と共に投与することができる。さらに、薬学的組成物または治療方法は、その他の抗ウイルス薬または抗細菌薬剤などのその他の治療的処置と組み合わせて（前に、間に、または後になど）投与することができる。
【０３１２】
病原体による感染を減少させるためにアンチセンス、リボザイム、三重らせん体、miR、またはsiRNA分子などの核酸分子が使用される例において、当技術分野において公知の任意の方法を使用することができる。具体例には、細胞内への核酸分子の送達（たとえば、受容体を媒介したメカニズムによる）、細胞内に入るように投与された発現ベクターによるもの（たとえば、レトロウイルスのベクターを使用することによるもの、米国特許第4,980,286号を参照されたい）、細胞に核酸分子を注射することによるもの、微小粒子照射を使用することによるもの（遺伝子銃；Biolistic, Dupontなど）、脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクト薬で核酸分子をコーティングすること、または核に入ることが公知のホメオボックス様のペプチドに連結してこれを投与することによるもの（たとえばJoliot et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1991, 88：1864-8）を含む。本開示は、合成オリゴ、裸のDNA、プラスミドおよびウイルス、ゲノムに組み込まれたか、または組み込まれていないものを含む核酸分子送達の全ての形態を含む。
【０３１３】
本明細書に有用な薬学的に許容される担体は、従来のとおりである。Remington's Pharmaceutical Sciences, by Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition （1975）は、本明細書に開示した治療薬の薬学的送達のために適した組成物および製剤を記述する。一般に、担体の性質は、使用される投与様式に依存する。たとえば、非経口的製剤は、通常、媒体として水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、ゴマ油、グリセロール、エタノール、これらの組み合わせ等の薬学的および生理的に許容される液体を含む注射用液体を含む。担体および組成物は、無菌であることができ、製剤は、投与様式に適している。生物学的に中性の担体に加えて、投与される薬学的組成物は、湿潤剤または乳化剤、防腐剤、およびpH緩衝剤など、たとえば酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレートなどの、わずかな量の無毒の補助的物質を含むことができる。
【０３１４】
本組成物は、液溶体、懸濁液、乳剤、錠剤、丸剤、カプセル、徐放製剤、または粉末であることができる。固体組成物（たとえば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセル形態）については、従来の非毒性固体担体は、たとえば、薬学的等級のマンニトール、乳糖、デンプン、サッカリンナトリウム塩、セルロース、炭酸マグネシウム、またはステアリン酸マグネシウム含むことができる。本組成物は、トリグリセリドなどの従来の結合剤および担体と共に、坐薬として処方することができる。
【０３１５】
病原体による感染の減少または阻害において有効な治療薬の量は、病原体およびその関連する障害または状態の性質に依存し得るし、標準的な臨床的技術によって決定することができる。加えて、最適な用量範囲を同定するためにインビトロの、およびインビボのアッセイ法を使用することができる。たとえば、有効な用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推定することができる。また、製剤に使用される正確な服用量は、投与の経路、および疾患または障害の重症度に依存し、開業医の確定診断およびそれぞれの被験者の環境に従って決定される。
【０３１６】
また、本開示は、薬学的組成物の成分の1つもしくは複数で満たされた薬学的パックまたはキットを含む1つまたは複数の容器を提供する。一つの例において、本キットは、Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターの生物活性を減少させることができる薬剤と、抗ウイルスの組成物または抗細菌組成物などの別の治療薬とを含む。
【０３１７】
実施例9
核酸分子の組換え発現
Rab9AまたはRab11Aの発現を減少させる薬剤（たとえば、Rab9AまたはRab11A活性を増大するこれらのモジュレーターの発現を減少することによるか、またはRab9AまたはRab11A活性を減少するこれらのモジュレーターの発現を増大することよる）標準的な分子生物学的方法を使用して組換えで産生することができる。組換え発現は、病原体感染が減少されることが望まれる細胞における薬剤を発現するために、または治療薬を産生するために（次いで、これを使用前に精製することができる）使用することができる。
【０３１８】
たとえば、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレーター核酸を特異的に認識するアンチセンス、リボザイム、三重らせん分子、miR、またはsiRNAなどの治療的核酸は、発現ベクターに結合することができる。例示的なベクターは、pKC30（Shimatake and Rosenberg, 1981, Nature 292：128）、pKK177-3（Amann and Brosius, 1985, Gene 40：183）、およびpET-3（Studiar and Moffatt, 1986, J. Mol. Biol. 189：113）を含むが、これらに限定されるわけではない。加えて、核酸配列は、バクテリオファージ、コスミド、動物ウイルス、または酵母人工染色体（YAC）（Burke et al., 1987, Science 236：806-12）などのその他の媒体に結合することができる。
【０３１９】
アンチセンスまたはsiRNA分子の発現は、アンチセンスまたはsiRNA配列の上流にプロモーターを配置することによって制御することができる。プロモーターは、構成的または誘導性であることができる。例示的なプロモーターは、以下を含むが、これらに限定されるわけではない：λファージのlac、trp、tac、trc、主要オペレーター、およびプロモーター領域、fdコートタンパク質の制御領域、SV40の初期および後期プロモーター、ポリオーマ、アデノウイルス、レトロウイルス、バキュロウイルス、およびシミアンウィルスに由来するプロモーター、pSV2ベクターのプロモーター（Mulligan and Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78：2072-6）、3-ホスホグリセリン酸キナーゼのためのプロモーター、酵母酸性ホスファターゼのプロモーター、酵母α-接合因子プロモータ、並びにこれらの組み合わせ。
【０３２０】
ヒトまたはその他の哺乳動物細胞などの成熟核への核酸分子の移動、従来技術である。一つの例において、核酸分子（アンチセンス、リボザイム、三重らせん体、miR、またはsiRNA分子など）は、たとえばリン酸カルシウム沈澱法（Graham and vander Eb, 1973, Virology 52：466）、リン酸ストロンチウム法（Brash et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7：2013）、電気穿孔法（Neumann et al., 1982, EMBO J. 1：841）、リポフェクション法（Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci USA 84：7413）、DEAEデキストラン法（McCuthan et al., 1968, J. Natl. Cancer Inst 41：351）、微量注入法（Mueller et al., 1978, Cell 15：579）、プロトプラスト融合法（Schafner, 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77：2163-7）、またはペレット銃（pellet gun）（Klein et al., 1987, Nature 327：70）によって、純粋のDNAとして、被験者の細胞などの細胞に導入される。もう一つの例において、核酸分子は、ウイルスベクター、たとえばレトロウイルス（Bernstein et al., 1985, Gen. Engrg. 7：235）、アデノウイルス（Ahmad et al., J. Virol. 57：267, 1986）、AAV 1、AAV2、AAV3、AAV4）、AAV5、もしくはAAV6などのアデノ随伴ウイルスベクター（Goodman et al. Blood 84：1492, 1994）、レンチウイルスベクター（Naldini et al., Science 272：263, 1996）、仮性型レトロウイルスベクター（Agrawal et al., Exp. Hematol. 24：738, 1996）、ワクシニアベクター（Guo and Bartlett, Expert Opin Biol Ther. 4 （6）：901, 2004）、またはHerpes（Spaete et al., Cell 30：295, 1982）での感染によって細胞（被験者の細胞など）に導入される。
【０３２１】
実施例10
感染を減少する薬剤についてのインビトロスクリーニングアッセイ法
本実施例は、試験薬剤を、これらが病原体による宿主細胞の感染を妨害し、またはさらに阻害する能力についてスクリーニングするために使用することができるインビトロでの方法を記述する。上記の実施例にて開示したように、Rab9A、Rab11A、およびこれらのモジュレーターは、病原体感染に関与し（脂質ラフトを使用する病原体、たとえばHIV、エボラ、マールブルク、RSV、および麻疹による感染など）、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質／病原体タンパク質相互作用は、病原体が細胞に感染する能力の構成要素である。したがって、スクリーニングアッセイ法は、この相互作用を減少し、または妨害する薬剤を同定して解析するために使用することができる。たとえば、以下のアッセイ法は、Rab9A、Rab11A、またはこれらのモジュレーターの病原体タンパク質配列との相互作用を妨害する薬剤を同定するために使用することができる。しかし、本開示は、本明細書に開示した特定の方法に限定されるわけではない。
【０３２２】
開示したアッセイ法を経て同定された薬剤は、たとえば、薬剤の非存在下での感染の量よりも多くによる病原体感染を、少なくとも約10%、少なくとも約20%、少なくとも約50%、またはさらに少なくとも約90%の減少などで減少し、またはさらに阻害する際に有用であることができる。この感染の減少は、発熱などの感染と関連する症候を寛解させるために役立ち得る。同定された薬剤の有効性を試験するためのアッセイ法は、後述してある。
【０３２３】
例示的な試験薬剤は、D-および／またはL-配置アミノ酸でできたペプチド（たとえば、ランダムなペプチドライブラリーの形態のもの；Lam et al., Nature 354：82-4, 1991を参照されたい）、リンペプチド（ランダムな、または部分的に縮重した、特異的リンペプチド・ライブラリーの形態など；たとえば、Songyang et al., Cell 72：767-78, 1993を参照されたい）、抗体、並びに小もしくは大有機または無機分子など、精製されたか、または精製されていない形態の任意のペプチドまたは非ペプチド組成物を含むが、これらに限定されるわけではない。また、試験薬剤は、分子の複合混合物または「カクテル」を含むことができる。
【０３２４】
Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と病原体タンパク質結合パートナーとの間の相互作用を妨害する薬剤を同定するために使用されるアッセイ系の基本原理は、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と1つまたは複数の病原体タンパク質とを含む反応混合物を、タンパク質を相互作用して結合して、したがって複合体を形成させるために十分な条件下で、かつ十分な時間で調製する工程を含む。薬剤を阻害活性について試験するために、試験薬剤の有無において反応を行う。試験薬剤は、最初に反応混合物に含めることができ、またはRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質と病原体タンパク質との添加後の時点で添加することができる。対照では、試験薬剤なしで、または偽薬と共にインキュベートすることができる。例示的な対照は、病原体タンパク質、Rab9Aタンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、またはRab11Aモジュレータータンパク質と結合しないことが公知の薬剤を含む。次いで、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と病原体タンパク質との間の任意の複合体の形成を検出する。対照反応では複合体が形成するが、試験薬剤を含む反応混合物では形成しないことは、薬剤がRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレーターと病原体タンパク質との相互作用を妨害し、したがって、おそらく病原体による感染を減少させるために、たとえば感染を有する被験者を治療し、または将来感染を予防するために使用することができる薬剤であることを示す。
【０３２５】
Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と病原体タンパク質との相互作用を妨害する薬剤のためのアッセイ法は、不均一または均一な形式で行うことができる。不均一アッセイ法は、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質、または病原体タンパク質を固相上にアンカーすること、および反応終了後に固相上にアンカーされた複合体を検出することを含む。いくつかの例において、本方法は、複合体形成または阻害の量を定量化することをさらに含む。複合体の存在を検出するために使用することができる例示的な方法は、タンパク質のうちの1つが標識されている場合に、ELISA、分光光度法、フローサイトメトリー、および顕微鏡観察を含む。均一アッセイ法では、全ての反応が液相で行われる。いずれの方法にもおいても、反応物の添加の順序は、試験される薬剤に関する異なる情報を得るために変更を加えることができる。たとえば、競合などによってタンパク質間の相互作用を妨害する試験薬剤は、試験薬剤の存在下において反応を行うことによって、たとえばRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質および病原体タンパク質の前に、またはと同時に反応混合物に試験薬剤を添加することによって同定することができる。一方で、タンパク質のうちの1つを複合体から置き換えるより高い結合定数をもつ薬剤などの、予め形成された複合体を崩壊させる試験薬剤は、複合体が形成された後に試験薬剤を反応混合物に添加することによって試験することができる。種々の形式を簡単に下記に記述してある。
【０３２６】
一旦同定されれば、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と病原体タンパク質との間の相互作用を阻害し、または減少させることが見いだされた試験薬剤は、薬学的に許容される製剤中の治療的製品（または予防的製品）において処方して、HIV、エボラ、マールブルク、RSV、または麻疹などの病原体と関連する疾患の特異的療法または予防のために使用することができる。
【０３２７】
不均一アッセイ法系
不均一アッセイ系では、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質、または病原体タンパク質（HIV、エボラ、マールブルク、RSV、または麻疹ウイルス標品など）のいずれか一方の結合パートナーを、固体表面（マイクロタイタープレートなど）上にアンカーし、アンカーされていないその結合パートナーを直接または間接的に標識する。例示的な標識は、酵素、フルオロフォア、リガンド、および放射性同位元素を含むが、これらに限定されるわけではない。アンカーされるタンパク質は、非共有結合性または共有結合によって固定することができる。非共有結合性付着は、タンパク質の溶液で固体表面をコーティングし、乾燥することによって簡単に達成することができる。または、固体表面にタンパク質をアンカーするために、タンパク質に特異的な固定された抗体（モノクローナル抗体など）を使用することができる。表面は、前もって調製して、貯蔵することができる。
【０３２８】
アッセイを行うために、固定された種の結合パートナーを試験薬剤の有無においてコーティング表面に添加する。反応完了後に、反応していない成分が除去され（洗浄によるなど）、形成された任意の複合体は、固体表面上に固定されるままである。固体表面上にアンカーされた複合体の検出は、多数の方法で達成することができる。結合パートナーが予め標識されている場合、表面上に固定される標識の検出は、複合体が形成されたことを示す。結合パートナーが予め標識されていない場合、表面上にアンカーされた複合体を検出するために、間接的な標識を表使用することができる；たとえば、結合パートナーに特異的な標識された抗体を使用することによる（次に、抗体を標識された抗Ig抗体で直接標識するか、または間接的に標識することができる）。反応成分の添加の順序に応じて、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を崩壊することができる試験化合物を検出することができる。
【０３２９】
または、たとえば、溶液中で形成された任意の複合体をアンカーするために一方の結合パートナーに対して特異的な固定された抗体と、アンカーされた複合体を検出するための他方の結合パートナーに対して特異的な標識された抗体とを使用することによって；反応を試験薬剤の有無において液相で行い、反応していない成分から反応産物を分離し、複合体を検出することができる。再び、液相に対して反応物を添加する順序に応じて、複合体形成を阻害するか、または予め形成された複合体を崩壊することができる試験化合物を検出することができる。
【０３３０】
均一アッセイ法
代わりの例において、均一アッセイ法を使用することができる。本方法では、予め形成されたRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と病原体タンパク質との複合体のタンパク質の一方が標識されているが、標識によって生じるシグナルが複合体形成によってクエンチされるタンパク質を調製する（たとえば、免疫アッセイ法のためにこのアプローチを利用するRubensteinによる米国特許第4,109,496号を参照されたい）。予め形成された複合体からの結合パートナーのうちの一方と競合して置き換わる試験物質の添加により、バックグラウンド以上のシグナルを生じる。このような方法で、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質-病原体タンパク相互作用を崩壊させる試験薬剤が同定される。
【０３３１】
タンパク質の固定化
特定の例において、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質は、固定化のために組換えDNA技術を使用して調製することができる。たとえば、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質のコード領域を、融合ベクターpGEX-5X-1を使用して、生じる融合タンパク質においてその結合活性が維持されるような様式でグルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）遺伝子に融合することができる。
【０３３２】
不均一アッセイ法では、たとえば、GST-Rab9A、GST-Rab11A、GST-Rab9Aモジュレーター、またはGST-Rab11Aモジュレーター融合タンパク質をグルタチオン-アガロースビーズにアンカーすることができる。次いで、病原体タンパク質標品を、相互作用および結合を生じさせることができる様式で試験薬剤の有無において添加することができる。反応期間の終わりに、結合していない材料を洗い流しすことができ、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質に（または病原体タンパク質に）特異的である標識された抗体（放射性同位元素125Iで標識したものなど）を系に添加して複合型の結合パートナーと結合させることができる。Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と病原体タンパク質との間の相互作用は、グルタチオン-アガロースビーズと関連したままである標識の量を測定することによって検出することができる。試験化合物による相互作用の良好な減少または阻害により、検出可能な標識の減少が生じる。
【０３３３】
または、GST-Rab9A、GST-Rab11A、GST-Rab9Aモジュレーター、またはGST-Rab11Aモジュレーター融合タンパク質、および病原体タンパク質を固体グルタチオン・アガロースビーズの非存在下にて液体中で共に混合することができる。試験薬剤は、結合パートナーを相互作用させる間か、またはさせた後のいずれかに添加することができる。次いで、この混合物をグルタチオン-アガロースビーズに添加することができ、結合していない物質を洗い流す。再び、結合パートナー相互作用の阻害の程度は、標識された抗体を添加する工程、およびビーズと結合した標識（放射能など）を測定する工程によって検出することができる。
【０３３４】
もう一つの例において、全長タンパク質の1つまたは複数のの代わりにRab9Aタンパク質、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、Rab11Aモジュレータータンパク質、または病原体タンパク質の結合ドメインに対応するペプチド断片を使用して、これらと同じ技術を使用することができる。タンパク質の結合部位を同定し、単離するために、当技術分野においてルーチン的に実施される多くの方法を使用することができる。これらの方法は、タンパク質をコードする遺伝子のうちの1つの突然変異誘発および同時免疫沈降アッセイ法における結合の破壊についてのスクリーニングを含むが、これらに限定されるわけではない。宿主遺伝子における補償突然変異（Compensating mutations）を選択することができる。それぞれのタンパク質をコードする遺伝子の配列分析により、相互作用的結合に関与するタンパク質の領域に対応する突然変異が明らかになる。または、1つのタンパク質を上記の方法を使用して、固体表面にアンカーして、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で処置したその標識された結合パートナーと相互作用させ、結合させることができる。洗浄後に、結合ドメインを含む短い標識されたペプチドを固体物質と会合したままにしてもよく、これを単離して、アミノ酸シーケンシングによって同定することができる。また、一旦タンパク質をコードする遺伝子が得られれば、タンパク質のペプチド断片を発現するために短い遺伝子セグメントを操作することができる、次いで、これを結合活性について試験して精製するか、または合成することができる。
【０３３５】
たとえば、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質は、GST-Rab9A、GST-Rab11A、GST-Rab9Aモジュレーター、またはGST-Rab11Aモジュレーター融合タンパク質を作製して上記のとおりに固体物質にアンカーして、これをグルタチオン・アガロースビーズに結合させることができる。病原体タンパク質を35Sなどの放射性同位元素で標識して、トリプシンなどのタンパク質分解酵素で切断することができる。次いで、切断産物をアンカーされたGST-融合タンパク質に添加して、結合させることができる。結合していないペプチドを洗い流した後に、細胞の、または細胞外タンパク質結合ドメインを表す標識された結合物質を溶出して、精製して、アミノ酸配列を解析することができる。こうして同定されたペプチドは、合成的産生することができ、または組換えDNA技術を使用して適切な促通性タンパク質に融合することができる。
【０３３６】
実施例11
感染を減少させる薬剤についての細胞に基づいたスクリーニングアッセイ法
本実施例は、試験薬剤を、これらが脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による宿主細胞の感染を妨害し、またはさらに阻害する能力についてスクリーニングするために使用することができる無処置の細胞を使用する方法を記述する。たとえば、Schreiberおよび共同研究者の酵母ツーハイブリッドアッセイ法または逆位ツーハイブリッドアッセイ法（Proc. Natl. Acad. Sci., USA 94：13396, 1977）を使用して、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と病原体タンパク質との間の会合を崩壊させる薬剤についてスクリーニングすることができる。実施例10と同様に、これらのアプローチによって同定された治療薬は、これらがヒト細胞などの宿主細胞の病原体による感染を減少し、または阻害する能力について試験される。
【０３３７】
一つの例において、酵母ツーハイブリッド系は、抗ウイルス薬を同定するために使用される。この系の一つのバージョンが記述されており（Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88：9578-82, 1991）Clontech（Palo Alto, CA）から市販されている。簡単には、このような系を利用して、2つのハイブリッドタンパク質をコードするプラスミドを構築する：一方は、1つの試験タンパク質「X」に融合された転写活性化タンパク質のDNA-結合ドメインを含み、他方は、別の試験タンパク質「Y」に融合された活性化因子タンパク質の活性化ドメインを含む。したがって、この系において「X」または「Y」のいずれかは、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質であることができ、他方は、試験タンパク質であることができる。その制御領域に活性化因子の結合部位を含むリポーター遺伝子（lacZなど）を含む酵母（S. cerevisiae）の株に、プラスミドを形質転換する。DNA結合ドメイン・ハイブリッドは、これが活性化機能をもたらさないために、および活性化ドメイン・ハイブリッドは、これが活性化因子の結合部位に局在化することができないために、いずれのハイブリッドタンパク質も、単独ではリポーター遺伝子の転写を活性化することができない。2つのタンパク質の相互作用により、機能的な活性化タンパク質を再構成し、リポーター遺伝子の発現を生じ、これをリポーター遺伝子産物についてアッセイすることによって検出する。
【０３３８】
ツーハイブリッド系または関連した方法論は、病原体感染に関与するRab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と相互作用するタンパク質について活性化ドメイン・ライブラリーをスクリーニングするために使用することができる。総ゲノムまたはcDNA配列を、活性化ドメインをコードするDNAに融合させる。DNA結合ドメインに融合されたウイルス感染に関与する宿主タンパク質のハイブリッドをコードするこのライブラリーおよびプラスミドを酵母リポーター株に同時形質転換し、生じる形質転換体を、リポーター遺伝子を発現するものについてスクリーニングする。これらのコロニーを精製し、リポーター遺伝子発現の原因となるプラスミドを単離する。次いで、DNAシーケンシングを使用して、ライブラリープラスミドによってコードされるタンパク質を同定する。
【０３３９】
たとえば、限定するためではないが、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質をコードする宿主遺伝子を、これがGAL4タンパク質のDNA結合ドメインをコードするDNAに翻訳的に融合されるように、ベクターにクローン化することができる。Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と相互作用するタンパク質が検出される株化細胞に由来する株化細胞のcDNAライブラリーを、当技術分野においてルーチン的に実施される方法を使用して作製することができる。この特定の系において、cDNA断片を、これらがGAL4の活性化ドメインに翻訳的に融合されるようにベクターに挿入することができる。このライブラリーを、GAL4活性化配列を含むプロモーターによって駆動されるlacZ遺伝子を含む酵母株に、宿主-GAL4 DNA結合ドメイン融合プラスミドと共に同時形質転換することができる。Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と相互作用する、GAL4活性化ドメインに融合されたタンパク質をコードするcDNAは、活性なGAL4タンパク質を再構成し、これによりlacZ遺伝子の発現を駆動する。lacZを発現するコロニーは、X−galの存在下においてこれらの青い色によって検出することができる。次いで、cDNAをこれらが由来する株から抽出して、当技術分野においてルーチン的に実施される技術を使用して、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と相互作用するタンパク質を産生し、および単離することができる。
【０３４０】
実施例12
迅速なスクリーニングアッセイ法
Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、またはRab11Aモジュレータータンパク質と病原体タンパク質との会合での干渉を検出するために任意のアッセイ法を行う前に、多数の薬剤をこれらがRab9A、Rab11A、Rab11Aモジュレーター、Rab9Aモジュレーター、または病原体タンパク質と結合するかどうかを決定するためのスクリーニングのために、迅速なスクリーニングアッセイ法を使用することができる。たとえば、米国特許第5,230,998号では、HIVタンパク質に対する結合を検出するための迅速なスクリーニングアッセイ法を開示ししており、これは参照として組み入れられる。そのアッセイ法では、Rab9もしくはRab9モジュレータータンパク質、またはHIVタンパク質などの病原体タンパク質を、Rab9タンパク質、Rab11Aタンパク質、Rab9Aモジュレータータンパク質、Rab11Aモジュレータータンパク質、または病原体タンパク質に結合することができる第一の抗体とスクリーニングする薬剤と共にインキュベートする。過剰な結合していない第一の抗体を洗浄し、除去して、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質、または病原体タンパク質に結合した抗体を、第一の抗体に結合する第二の標識された抗体を添加することによって検出する。次いで、結合していない過剰な第二抗体を除去して、標識の量を定量化する。次いで、結合効果の効果を以下の式によって割合で決定する：（試験薬剤の非存在下での標識の量）-（試験薬剤の存在下における標識の量／試験薬剤の非存在下での標識の試験薬剤の量）×100。
【０３４１】
次いで、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、Rab11Aモジュレータータンパク質、もしくは病原体タンパク質に対して高い結合親和性を有することが見いだされた薬剤は、Rab9A、Rab11A、Rab9Aモジュレーター、もしくはRab11Aモジュレータータンパク質／病原体タンパク相互作用の阻害、または病原体感染の阻害を試験するための、より詳細にデザインされたその他のアッセイ法に使用することができる。
【０３４２】
実施例13
Rab9AおよびRab11Aのモジュレーターの同定
本実施例は、脂質ラフトをハイジャックする病原体などの病原体による細胞の感染に関与するRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターを同定するために使用することができる方法を記述する。このように同定されたモジュレーターは、被験者に対する投与など、細胞に対してこのようなモジュレーターを投与することによって、病原体感染を治療し、または防止するために使用することができる。
【０３４３】
一つの例において、推定上のRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターの発現が、Rab9A、Rab11A、または両方を発現する細胞において減少される（阻害されるなど）。または、推定上のRab9AまたはRab11Aモジュレーターの生物活性が、Rab9A、Rab11A、または両方を発現する細胞において減少される（阻害されるなど）。Rab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターの発現または生物活性を減少させる方法は、本出願の全体にわたって記述されている。Rab9A（もしくはRab11A、または両方）を発現するが、少なくとも1つの（少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つなど）Rab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターが機能的に欠失している細胞を所望の病原体と接触させ、病原体による感染の量を決定する。感染の減少（および、いくつかの例では、除去）は、Rab9AまたはRab11Aの推定上のモジュレーターが、それぞれ病原体による感染に関与するRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターであることを示す。感染の量を、推定上のRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターの発現が減少されていない細胞の病原体による感染の量などの対照と比較することができる。一つの例において、病原体は、脂質ラフトをハイジャックすることができる病原体である。
【０３４４】
ウイルスまたはその他の病原体に感染し得る細菌、原生動物、または真菌などの任意の細胞を利用することができる。細胞は、昆虫、甲殻類、哺乳類、鳥類、爬虫類、酵母、または大腸菌（E. coli）などの細菌由来の細胞などの原核生物または真核生物のであることができる。細胞は、生物体の一部または哺乳動物細胞または細菌培養などの細胞培養の一部であることができる。
【０３４５】
推定上のRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターの発現を減少するための方法は、当技術分野において公知であり、機能的に推定上のRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターを欠失させるなどの上記した方法を含む。発現の減少は完全である必要はなく；少なくとも10%、少なくとも50%、少なくとも90%、またはさらに少なくとも99%の減少を得ることができる。一つの例において、Rab9AまたはRab11Aモジュレーターの発現は、Rab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーター遺伝子をノックアウトすることによって阻害される。また、機能的欠失は、突然変異、部分的もしくは完全な欠失、挿入、または遺伝子産物の産生を減少させ、もしくは機能しない産物を与えるRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーター遺伝子配列に対するその他の変異遺伝子によって達成することができる。
【０３４６】
一つの例において、Rab9Aモジュレーターの発現またはRab11Aモジュレーターは、それぞれRab9AモジュレーターまたはRab11AモジュレーターをコードするmRNAの転写または翻訳を崩壊させるか、または減少させることによって減少される。一つの例において、推定上のRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターに特異的であるsiRNA、リボザイム、三重らせん体、またはアンチセンス分子mRNAを細胞と接触させて、細胞内に侵入させ、これにより、細胞における推定上のRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターの発現および推定上のRab9AまたはRab11AモジュレーターmRNAの量をそれぞれ減少させる。
【０３４７】
推定上のRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターの生物活性は、本明細書に記述したものなどの当技術分野において公知の方法を使用して減少させることができる。たとえば、Rab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターの生物活性は、細胞におけるRab9AモジュレーターまたはRab11Aモジュレーターを、Rab9AモジュレーターとRab9Aとの間の相互作用（たとえば、結合相互作用）、Rab11AモジュレーターとRab11Aとの間の相互作用、Rab11Aモジュレーターと病原体タンパク質との間の相互作用、またはRab9Aモジュレーターと病原体タンパク質との間の相互作用を減少させる薬剤と接触させることによって減少させることができる。
【０３４８】
本方法は、感染の量を、Rab9Aの量（細胞におけるRab9A核酸分子、たとえばcDNAまたはmRNAまたはタンパク質の量など）または細胞におけるRab9A生物活性の量と関連づける工程をさらに含むことができ、感染の減少およびRab9AまたはRab9A活性の量の減少の存在は、Rab9Aの推定上のモジュレーターが病原体による感染に関与するRab9Aのモジュレーターであることを示す。同様に、本方法は、感染の量を、Rab11Aの量（細胞におけるRab11A核酸分子、たとえばcDNAまたはmRNAまたはタンパク質の量など）または細胞におけるRab11A生物活性の量と関連づける工程をさらに含むことができ、感染の減少およびRab11AまたはRab11A活性の量の減少の存在は、Rab11Aの推定上のモジュレーターが病原体による感染に関与するRab9Aのモジュレーターであることを示す。
【０３４９】
細胞におけるRab9AまたはRab11Aタンパク質の量を決定するため方法は、当技術分野において公知である。細胞におけるRab9AまたはRab11Aタンパク質の量を定量化するために使用することができる方法の具体例には、ウエスタンブロット法、ELISA法、ELISPOT法、免疫沈降法、免疫蛍光法（フローサイトメトリーまたは顕微鏡観察など）、免疫組織化学法、および免疫細胞化学法を含むが、これらに限定されるわけではない。たとえば、細胞を溶解して、生じる可溶化液を、可溶化液中のRab9Aタンパク質を抗体と結合させるための標識された抗Rab9A抗体と共に、または可溶化液中のRab11Aタンパク質を抗体と結合させるための標識された抗Rab11A抗体と共にインキュベートすることができる。標識は、直接的または二次抗体の使用などを介して間接的であることができる。結合していない抗Rab9Aまたは抗Rab1lA抗体を除去し、残りの標識を検出する。
【０３５０】
同様に、細胞におけるRab9AまたはRab11A核酸分子の量を決定するため方法は、当技術分野において公知である。細胞における核酸分子の量を定量化するために使用することができる方法の特定の例は、インサイチューハイブリダイゼイション法、定量的PCR法、RT-PCR法、ノーザンブロッティング法、ELISPOT法、およびドットブロット法を含むが、これらに限定されるわけではない。たとえば、核酸分子を細胞から単離して、Rab9AまたはRab11A特異的なPCRプライマーと共にインキュベートして、適切なPCR条件下でインキュベートする。もしあれば、生じるRab9AまたはRab11A-単位複製配列を検出して、定量化することができる。
【０３５１】
また、当業者であれば、たとえば後期のエンドソームからトランスゴルジへの小胞輸送の相違を観察することによって、Rab9A生物活性に対するRab9Aモジュレーターを阻害する効果を評価することができる。このプロセスを視覚化するための方法は、当技術分野において公知である（たとえば、Barbero et al., J. Cell. Biol. 156：11-8, 2002を参照されたい。本明細書に参照として組み入れられる）。同様に、当業者であれば、たとえばトランスゴルジから原形質膜への小胞輸送の相違を観察することによって、Rab11Aに対するRab11Aモジュレーター生物活性を阻害する効果も評価することができる。Rab9AまたはRab11Aとその他のタンパク質との間の相互作用は、直接的または間接的であることができる。直接の相互作用の例は、もう一つのタンパク質に対するRab9AまたはRab11Aの結合である。間接的な相互作用の例は、それぞれRab9AまたはRab11Aの活性に影響を及ぼすが、それぞれ直接Rab9AまたはRab11Aと結合しないRab9AまたはRab11Aの上流または下流のいずれかの小胞輸送またはウイルス感染に関与する2つ以上タンパク質の間の相互作用である。
【０３５２】
実施例14
感染の阻害を測定するためのアッセイ法
前述のアッセイ系で同定された任意の試験薬剤を、これらが脂質ラフトを使用する病原体などの病原体による感染を減少し、または阻害する能力について試験することができる。
【０３５３】
細胞に基づいたアッセイ法
例示的な方法を上記の実施例1および3に提供してある。簡潔には、細胞（20,000〜250,000）を所望の病原体（脂質ラフトをハイジャックすることができる病原体など）で感染し、3〜7日間インキュベーションを続ける。試験薬剤は、病原体での感染の間、または後に細胞に適用することができる。病原体および投与される薬剤の量は、熟練した開業医によって決定することができる。いくつかの例において、至適投与量範囲を同定するために、潜在性治療薬のいくつかの異なる服用量を投与することができる。試験薬剤の投与に続き、細胞の感染に対する耐性を決定するために、アッセイを行う。
【０３５４】
たとえば、ウイルス感染を解析する場合、ウイルス抗原の存在を、ウイルスタンパク質に特異的な抗体を使用して抗体を検出することによって決定することができる。一つの例において、ウイルスタンパク質と特異的に結合する抗体を、たとえば発蛍光団など検出可能なマーカーで標識する。もう一つの例において、標識を含む二次抗体使用することによって抗体を検出する。次いで、細胞結合性抗体の存在を、たとえば顕微鏡観察、フローサイトメトリー、またはELISAを使用して検出する。同様の方法を細菌、原生動物、または真菌感染をモニターするために使用することができる（抗体は、それぞれ細菌、原生動物の、または真菌のタンパク質を認識することを除く）。
【０３５５】
また、細胞が病原体の存在下において生存する能力を、病原体感染の程度として使用することができる。たとえばトリパンブルー排除などの細胞生存率測定を行うことができ、細胞生存度の減少は、病原体感染の存在を示し、細胞生存度の増加は、ウイルス感染の減少を示す。
【０３５６】
動物モデル・アッセイ法
上で提供した方法を使用して同定されたものなどの薬剤が病原体による感染を予防し、または減少させる能力を、動物モデルにおいて評価することができる。病原体感染のためのいくつかの動物モデルが当技術分野において公知である。たとえば、マウスHIVモデルは、Sutton et al.（Res. Initiat Treat. Action, 8：22-4, 2003）およびPincus et al.（AIDS Res. Hum. Retroviruses 19：901-8, 2003）に開示されており；エボラ感染のためのモルモット・モデルは、Parren et al.（J. Virol. 76：6408-12, 2002）およびXu et al.（Nat. Med. 4：37-42, 1998）に開示されており；マールブルク感染のためのマウスモデルは、（Ruchko et al., Vopr Virusol. 46：21-4, 2001）に開示されており；並びに麻疹感染のためのマカク・モデルは、Premenko-Lanier et al.（J. Infect. Dis. 189：2064-71, 2004）に開示されている。また、このような動物モデルは、試験薬剤が病原体感染と関連する症候を寛解させる能力に対しても使用することができる。加えて、このような動物モデルは、動物被験者におけるLD50およびED50を決定するために使用することができ、このようなデータは、潜在的薬剤のインビボの有効性を決定するために使用することができる。
【０３５７】
マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ブタ、マイクロ-ピッグ、ヤギ、並びにヒヒ、サル、およびチンパンジーなどの非ヒト霊長類を含むが、これらに限定されるわけではない任意の種の動物は、必要に応じて病原体感染の動物モデルを作製するために使用される。
【０３５８】
上記実施例において同定された試験薬剤の有無において、適切な動物に所望の病原体を接種する。病原体の量および投与される薬剤は、熟練した開業医によって決定することができる。いくつかの例において、至適投与量範囲を同定するために、潜在的治療薬のいくつかの異なる服用量を、異なる試験被験者に投与することができる。治療薬は、病原体感染の前に、間に、または後に投与することができる。治療後に、適切な病原体感染およびそれと関連した症候の発症について、動物を観察する。試験薬剤の存在下における適切な病原体感染、またはそれと関連した症候の発症の減少は、試験薬剤を被験者における病原体感染を減少し、またはさらに阻害するために使用することができる治療薬である証拠を提供する。
【０３５９】
開示した発明の原理を適用してもよい多くの可能な態様からみて、例示態様が、本発明の好ましい例だけであり、、本発明の範囲を限定するモノとして考慮されるべきではないことがされるはずではないことが認識されるはずである。むしろ、本発明の範囲は、特許請求項によって定義される。したがって、本発明者らは、本発明者らの発明として、そのようなもの全てがこれらの請求の範囲の範囲および趣旨内に入ることを主張する。
【図面の簡単な説明】
【０３６０】
【図１】図1Aは、種々のsiRNAの存在下におけるHIVに感染した細胞におけるp24の相対量を示す棒グラフである。この図は、siRNAでのRab9AmRNA分解がHIV複製を減少することを証明する。Rab9A；KOX4（KOX4（LOC 131880）およびLOC 166140に類似）；KIAA 1259；F3（組織因子3；スロンボプラスチン）；AXL（AXL受容体チロシンキナーゼ）；SelB（セレン含有タンパク質翻訳のための伸長因子）；FKBP38。図1Bは、細胞において測定されるルシフェラーゼ活性の相対量を示す棒グラフであり、これは、HIV感染症（n=5）の量に対応する。図1Cは、Rab9A siRNAでのトランスフェクション後の細胞におけるRab9A mRNAの存在量を示す棒グラフである。
【図２】Rab9A、Rab11A、およびRab9AモジュレーターsiRNAの存在下におけるHIVに感染した細胞におけるp24の相対量を示す棒グラフである。この図は、siRNAでのRab9A、Rab11A、またはRab9AモジュレーターmRNA分解がHIV複製を減少することを証明する。
【図３】図3Aは、ヒトRab9A cDNA（Genbankアクセッション番号NM004251）とサルRab9A cDNA（Genbankアクセッション番号AY601640）との間のヌクレオチド配列整列である。非保存ヌクレオチドを示してある。図3Bは、Rab9A siRNAのトランスフェクション後の細胞におけるVero細胞におけるRab9A mRNAの存在量を示す棒グラフである。図3Cは、Rab9A siRNAの有無において、培養上清中に分泌されるエボラおよびマールブルクウイルス抗原（感染6日後）の定量化を示す棒グラフである。
【図４】siRNAをトランスフェクトしたVero細胞の感染後培地中に放出されるMVの力価の減少を示す棒グラフである。データポイントは、3回の独立した実験から決定した平均ウイルスの力価を表す。リポフェクトアミンのみのトランスフェクタントからは、1×105pfu/mL（2日）および1×106pfu/mL（5日）が検出された。
【図５】Rab9A、Rab11A、およびRab9Aモジュレーターの、脂質ラフト形成における関与のモデルを示す模式図である。
【図１】
2008506356.tif 000045
【図２】
2008506356.tif 000046
【図３Ａ】
2008506356.tif 000047
【図３Ｂ】
2008506356.tif 000048
【図３Ｃ】
2008506356.tif 000049
【図４】
2008506356.tif 000050
【図５】
2008506356.tif 000051
【配列表】
2008506356000001.app
【国際調査報告】
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