(57)【要約】  本発明は、第１に、微視的要素を分析するための測定空間（ＣＭ）と、第２に、少なくとも２つの異なる分析波長を有し、相互作用光線を形成するために測定空間（ＣＭ）内の微視的要素と相互作用するように設計された、測定空間（ＣＭ）において共役された光線を放出する少なくとも１つの供給源（Ｓ）と、第３に、異なるコードで測定空間（ＣＭ）の上流側の光線をエンコードするためのコード化手段（Ｍ）と、第４に、その波長に応じて蛍光及び／又は散乱相互作用光線を選択的にフィルタリングするための光学フィルタリング手段（ＦＯ）と、第５に、測定空間（ＣＭ）からの相互作用光線の少なくとも一部を電気信号に変換するための検出手段（ＤＥ、ＤＦ）と、第６に、電気信号をデコードして、分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするためのデコード化手段（ＤＲＥ、ＤＲＦ）を含む分析手段（ＭＡ）とを含む、微視的要素を分析するための装置（ＤＡ）に関する。
2008537136.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微視的要素を分析するための測定空間（ＣＭ）と、少なくとも２つの異なる分析波長を有し、相互作用放射線を形成するために前記測定空間（ＣＭ）内の前記微視的要素と相互作用するように設計された放射線を放出することが可能な少なくとも１つの供給源（Ｓ）と、前記測定空間（ＣＭ）から出る前記相互作用放射線の少なくとも一部を電気信号に変換するように設計された検出手段（ＤＥ、ＤＦ）と、前記分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするように、前記電気信号を分析するように設計された分析手段（ＭＡ）と、を含む微視的要素を分析するための装置（ＤＡ）であって、
前記コード化された放射線は、前記測定空間（ＣＭ）内で共役されることと、
ｉ）異なるコード（ωｉ）で前記測定空間（ＣＭ）の上流側の前記放射線をエンコードするように設計されたコード化手段（Ｍ）と、ｉｉ）前記検出手段（ＤＥ、ＤＦ）の上流側の、その波長の関数として前記蛍光及び／又は散乱相互作用放射線を選択的にフィルタリングするように設計された光学フィルタリング手段（ＦＯ、ＬＳ）とを含むことと、
前記分析手段（ＭＡ）は、前記電気信号をデコードして、それらがそれらの元のコードの関数として分析されるように設計されたデコード化手段（ＤＲＥ、ＤＲＦ）を備えること、
を特徴とする装置（ＤＡ）。
【請求項２】
前記供給源（Ｓ）によって放出される前記分析放射線（Ｒｉ）は、分析される前記微視的要素に逐次的に適用されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項３】
前記供給源（Ｓ）によって放出される前記分析放射線（Ｒｉ）は、分析される前記微視的要素に同時に適用されることを特徴とする請求項１に記載の装置。
【請求項４】
前記光学フィルタリング手段（ＦＯ、ＬＳ）は、波長が２つの分析波長の間にそれぞれ挿入され、最長の分析波長を越えて配置される蛍光分析帯域に属する前記蛍光相互作用放射線を選択的にフィルタリングするように設計されることを特徴とする請求項１から３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項５】
前記供給源（Ｓ）は、共役された放射線を前記測定空間（ＣＭ）に放出することが可能な少なくとも２つのレーザーを含むことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項６】
前記レーザーは単色型のものであることを特徴とする請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記供給源（Ｓ）は少なくとも１つの発光ダイオードを含むことを特徴とする請求項１から請求項６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項８】
前記供給源（Ｓ）は多色放射線源を含むことを特徴とする請求項１から請求項４のいずれか１項に記載の装置。
【請求項９】
前記多色放射線源（Ｓ）は、実質的に連続するスペクトルをもつ少なくとも１つの多色レーザーと、白熱ランプと、アーク・ランプとを含む群の中で選択されることを特徴とする請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記供給源（Ｓ）は、連続するモード及び／又はパルス・モードによって前記分析放射線を放出するように設計されることを特徴とする請求項１から請求項９のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１１】
前記供給源（Ｓ）によって放出される各々の分析放射線ビーム（Ｒｉ）の強度（Ｉｉ）は調整可能であることを特徴とする請求項１から請求項１０のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１２】
前記コード化手段（Ｍ）は、前記分析放射線の強度を変調するように設計されることを特徴とする請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１３】
前記コード化手段（Ｍ）の少なくとも一部は、前記分析放射線を形成するように前記供給源（Ｓ）の下流側の放射線に作用するように設計されることを特徴とする請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１４】
前記コード化手段（Ｍ）の少なくとも一部は、前記分析放射線のための分布出力部の上流側の前記供給源（Ｓ）に作用するように設計されることを特徴とする請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１５】
前記コード化手段（Ｍ）の前記一部は、前記供給源（Ｓ）に組み込まれることを特徴とする請求項１４に記載の装置。
【請求項１６】
前記コード化手段（Ｍ）は、前記分析放射線を形成するように前記供給源（Ｓ）によって放出される前記放射線を変調することが可能な音響光学変調器を含むことを特徴とする請求項１から請求項１５のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１７】
前記検出手段（ＤＥ、ＤＦ）は、前記相互作用放射線の検出に合わせて設計された様々な感光センサを含むことを特徴とする請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１８】
前記検出手段（ＤＥ、ＤＦ）は、前記相互作用放射線の検出に合わせて設計され、強制的な通路において前記分析放射線の伝搬の全体的な方向を遮断する軸によって定められる位置に埋め込まれた様々な感光センサを含み、前記軸は、前記全体的な方向に対して０°から３６０°までの範囲の角度をなして配向されることを特徴とする請求項１から請求項１６のいずれか１項に記載の装置。
【請求項１９】
制御ソフトウェア・インタフェースを含むコンピュータ・システム（ＭＣ）を含むことを特徴とする前記請求項のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２０】
微視的要素を分析するための方法であって、
ｉ）測定空間（ＣＭ）内の微視的要素は、相互作用放射線を形成するように、前記測定空間（ＣＭ）内で共役され、少なくとも２つの異なる分析波長及び異なる選ばれたコードによるコード化を有する分析放射線により照射される第１のステップと、
ｉｉ）前記相互作用放射線の少なくとも一部が集光され、次いで、その波長の関数として分離され、フィルタリングされる第２のステップと、
ｉｉｉ）前記フィルタリングされた相互作用放射線が検出され、次いで、電気信号に変換される第３のステップと、
ｉｖ）前記検出された信号が、前記分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするように、それらの元のコードの関数としてデコードされる第４のステップと、
を含むことを特徴とする方法。
【請求項２１】
第１のステップにおいては、前記分析放射線（Ｒｉ）は、分析される前記微視的要素に逐次的に適用されることを特徴とする請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第１のステップにおいては、前記分析放射線（Ｒｉ）は、分析される前記微視的要素に同時に適用されることを特徴とする請求項２０に記載の装置。
【請求項２３】
第２のステップにおいては、波長が２つの分析波長の間にそれぞれ挿入され、最長の分析波長を越えて配置される蛍光分析帯域に属する前記蛍光相互作用放射線は選択的にフィルタリングされることを特徴とする請求項２０から請求項２２のいずれか１項に記載の装置。
【請求項２４】
第４のステップにおいては、分析される微視的要素の１つの種類の屈折率は、散乱プロセスを表す前記相互作用放射線の変換によりもたらされる信号から推論されることを特徴とする請求項２０から請求項２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
全血試料の存在下における第４のステップにおいては、赤血球系の細胞の血球ヘモグロビン濃度は前記屈折率から求められることを特徴とする請求項２０から請求項２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
第４のステップにおいては、前記蛍光色素間のエネルギー伝達を表す結合の度合いは、前記分析放射線と、２つの異なる、空間的に近い蛍光色素との間の相互作用によりもたらされる信号から推論されることを特徴とする請求項２０から請求項２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
生物学的分析、生化学的分析、化学的分析、粒子分析、形態学的分析、特にマルチパラメータ・フローサイトメトリー、液体又はガス流体中の荷電粒子の分析、及び粒径分布を含む群の中で選択される分野における、前記請求項のいずれか１項に記載の分析装置及び方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微視的要素の分析の分野に関し、より特定的には、光を用いた微視的要素のキャラクタリゼーション及び計数専用の装置に関する。
ここで、「微視的要素」とは、微視的な寸法のあらゆる要素、特に生物学的粒子又は細胞（原核生物又は真核生物）を意味することが理解される。
【背景技術】
【０００２】
インビトロ診断学（特に血液計数又はフローサイトメトリー）の分野においては、微視的要素についての質的及び量的情報を取得するために、光と、試料を構成する種々の微視的要素との間の相互作用に基づいて、キャラクタリゼーション及び計数装置を用いることが通常である。
広範に用いられる技術の中でも、透過、回折、反射、及び屈折を含む、散乱技術として知られているもの、並びに、蛍光及び燐光を含む光ルミネセンスとして知られているものに特に言及することができる。これらは、別個で又は組み合わせて、形状、容積、大きさ、色、密度、構造、生化学的性質、又は粒径分布についての情報を特に取得することを可能にする。
【０００３】
それにもかかわらず、フローサイトメトリーの一般的な技術によって取得される、生物学的要素、主に血球のキャラクタリゼーションは、限られた数の変数及び細胞区別の可能性に基づいている。
各々の測定原理は、比較的単純な物理的な方法であるが、これらの測定の同時増倍は、それらを使用不能にするような程度まで後者を干渉する可能性がある相互作用を誘起させる。このように、多数の測定の実施は、これらの相互作用を防止する能力によって制限される。
【０００４】
市場に存在する血液分析装置及びフローサイトメータにおいて、要素は、一般的に、Ｗａｌｌａｃｅ  Ｃｏｕｌｔｅｒ法として知られるインピーダンス測定法か、又は光学的な方法（散乱、光ルミネセンス）のいずれかによって電子的に検出される。
例えば、容積及び屈折率は、単一波長及び２つの異なる観察角度に基づく散乱分析の結果から推論することができる。この検出モードは、例えば、ＴＥＣＨＮＩＣＯＮ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｃｏｒｐ．からの米国特許第４，７３５，５０４号において記載されている。この特許において記載される光学系は、２つの異なる角度範囲にわたり回折される光の測定を用い、要素の光学反応と、容積及び屈折率が較正された要素の光学反応とを比較することにより、要素の容積及び屈折率の値を分離することを可能にする。これらのデータ値の処理は、Ｇｕｓｔａｖ  ＭＩＥによって開発され、特にインターネット・アドレス＜ｈｔｔｐ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｍｉｅ＿ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ＞において記載される、球状粒子による光散乱理論に基づいている。
【０００５】
フローサイトメトリーにおいては、光軸に近い角度範囲にわたる回折（ＦＳＣ（すなわち「前方散乱」）又は軸上回折）の測定は分析された微視的要素の容積の表示を与えることが一般的に認められている。さらに、光軸に対して直角に散乱させられた光（又は「側方散乱」、或いはここでも９０°での散乱）は、要素の内部構造を表すと説明される。これらの特徴は、測定が行われる角度及び波長に密接に関連付けられる。
蛍光は、励起可能な分子がその特性波長の１つにおける光エネルギーによる励起後に基底状態に戻るときに誘起される現象であることが想起される。蛍光発光は、常に、励起の周波数より低い周波数で生じる。蛍光発光は、実質的に等方性である。測定は、一般的に、入射光の励起軸から離れる方向で、光学フィルタを通して行われて、関心のあるスペクトル帯域のみを検出器に伝送する。
【０００６】
蛍光において用いられる分子プローブは、特定の種類の分子について真性親和力を有する生体又は超生体染色とすることができる。オレンジ・チアゾール、Ｏオーラミン、Ｙピロニン、又は他のもののような核酸のための挿入色素に特に言及することもできるし、或いは、一般的には単一若しくはタンデム蛍光色素又は時にはナノ結晶といった染色マーカーが接着された抗体で構成される免疫プローブに言及することもできる。
免疫プローブの実施によるこうしたマーキング・モードは、細胞学的同定のため、特に既述のフローサイトメトリー技術によって普及した。Ｏｒｔｈｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．という会社からの特許第ＥＰ０  ０２２  ６７０号は、その抗原算出基によりフローサイトメトリーを用いた種々の細胞同定を記載する。この特許において記載される技術は、現在、効率的で、安全な、信頼性のある細胞同定技術として認識される免疫表現法の非常に広範な発展への扉を開いた。
【０００７】
それにもかかわらず、マルチパラメータ細胞分析は、抗原同定を用いることなく実行することができる。したがって、Ｊ．ｏｆ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．＆  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ第２４巻、第１号、ｐｐ．３９６−４１１、１９７６年の「Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｕｎｔｉｎｇ  ａｎｄ  Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ  Ｓｔａｉｎｓ  ａｎｄ  Ｆｌｏｗ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔａｔｉｏｎ」という文献において、Ｈｏｗａｒｄ  Ｍ．Ｓｈａｐｉｒｏは、吸収測定、回折測定、及び蛍光測定を行うマルチパラメータ・サイトメータによる血球の一般分類を記載しており、そこでは、要素は核酸及びタンパク質の特定の蛍光色素の混合物と接触状態になる。
同時に、Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｓｔｅｉｎｋａｍｐによる、「Ａ  Ｍｏｄｕｌａｒ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｉｃ  Ｍｕｌｔｉｃｏｌｏｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ」、１９８７年、サイトメトリー８、ｐｐ．３５３−３６５の文献において示される、分析装置内の蛍光測定波長の増倍は、ますます多くのマーカーの使用、したがってますます多くの抗体の使用を可能にしたが、また、装置及びその実施の複雑さも極めて重大に増加させた。
【０００８】
単一波長によって励起される色素の複合使用は、その励起及び／又はその蛍光発光のスペクトルの重なり領域のため、直ちに制限を課す。
スペクトルの重なりについてのこれらの問題を克服するためには、「Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  Ａｒｔｉｆａｃｔｓ，  Ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｃａｖｅａｔｓ」サイトメトリー４５、ｐｐ．１９４−２０５の文献において示されるように、全体的には他の微視的要素のスペクトルの重なりの比例部分によって分析される微視的要素の蛍光信号を減少させることにある「補償」と呼ばれる補正法が、一般的には使用される。
【０００９】
補償によって誘起される１つの問題には、それらが平均値において算出されることと、所与の蛍光色素の族について、それらの値を一度だけ調整することが不可能であるという事実が存在する。実際、特に供給源に依存する同じ族の蛍光色素の物理的特性においては幅広い変動が存在する。したがって、異なる製造業者製の同じ製品が、異なる組の補償をもたらすことがある。このことは、特に、制御されていない供給源は誤った、したがって潜在的に危険な測定を招く可能性があるため、診断学の分野において問題をもたらす。例えば、ＰＥ−ＴＲ伝達効率及び用いられる抗体の性質は、Ｃａｒｌｅｔｏｎ  Ｃ．Ｓｔｅｗａｒｄ及びＳｉｇｒｉｄ  Ｊ．Ｓｔｅｗａｒｄによる「Ｆｏｕｒ  ｃｏｌｏｒ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ」、サイトメトリー、第３８巻、ｐｐ．１６１−１７５、１９９９年の論文において特に説明されるように、最終的なソフトウェア補償を受け入れるには十分に安定したものではない。
幾つかの励起波長の使用は、色素選択の幅を広くすることを可能にし、発光スペクトルをより容易に分離することを可能にする。Ｊ．Ｓｔｅｉｎｋａｍｐによる「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｍｕｌｔｉｌａｓｅｒ／ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ  ｆｏｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ」、Ｊｏｈｎ  Ａ．Ｓｔｅｉｎｋａｍｐ、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｃ．Ｈａｂｂｅｒｓｅｔｔ、及びＲｉｃｈａｒｄ  Ｄ．ＨｉｅｂｅｒｔによるＲｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、第６２（１１）号、ｐｐ．２７５１−２７６４、１９９１年１１月の論文において記載されるように、種々の励起波長は、この場合は、測定タンク内でしばしば空間的に分離されて、幾つかの独立した測定の利点を提供する。この方法に関する問題には、空間的な変位が応答における時間的な位相シフトを誘起させ、しかも、アナログ様式で情報を遅延させるか又はソフトウェア手段によって測定を再調整することによって、下流側で情報の再調整を行う必要がある、という事実が存在する。
【００１０】
励起波長（特にレーザー源）の増倍は、蛍光及び他の光学パラメータの測定と共に、例えば、「Ｎｉｎｅ  Ｃｏｌｏｒ  Ｅｌｅｖｅｎ  Ｐａｒａｍｅｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  Ｕｓｉｎｇ  Ｔｈｒｅｅ  Ｌａｓｅｒ  Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ」、Ｍａｒｔｉｎ  Ｂｉｇｏｓ１９９９年、サイトメトリー３６、ｐｐ．３６−４５という表題の論文において記載されるように、技術的な複雑さ、並びに、実施において著しい困難をもたらす。
結果の解釈におけるエラーのリスクのレベルはパラメータの数と共に増加し、これらの機器の使用は、不適切で誤った、したがって潜在的に危険な結果を得るリスクを覚悟の上で、極めて特殊な技師に限定される。
【発明の開示】
【００１１】
臨界レベルが蛍光色素の数と共に増加する補償の１つの限界は、蛍光測定におけるノイズ及び未処理の測定値を補正するのに用いられるその一次結合の伝搬及び増幅に関する。公知のどの分析装置も完全に満足できるものではないため、したがって、本発明の目的は、この状況を改善することである。特に、本発明は、一般的に従来技術において遭遇した補償問題を克服するように設計されている。
【００１２】
この目的のために、本発明は、
・第１に、微視的要素を分析するための測定空間と、
・第２に、少なくとも２つの異なる分析波長を有し、相互作用放射線を形成するために測定空間内の微視的要素と相互作用するように設計された放射線を放出する少なくとも１つの供給源と、
・第３に、測定空間から出る相互作用放射線の少なくとも一部を電気信号に変換する役割を果たす検出手段と、
・第４に、分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするように電気信号を分析する役割を果たす分析手段と、
を含む、微視的要素を分析するための装置を提供する。
ここで、「相互作用放射線」とは、分析ビームと分析される微視的要素との間の相互作用から生じる放射線のことを指す。この相互作用放射線は、特に、散乱（屈折、反射、回折）及び／又は光ルミネセンス（蛍光、燐光）による放射線とすることができる。
【００１３】
さらに、ここで、「放射線」とは、紫外線から赤外線の間、換言すれば、約１００ｎｍ（０．１μｍ）から約５０００ｎｍ（５μｍ）の間の範囲の波長の光ビームを意味すると理解される。
本発明による装置は、
・コード化された放射線が測定空間内で共役されることと、
・ｉ）異なるコードで測定空間の上流側の放射線をエンコードする役割を果たすコード化手段と、ｉｉ）検出手段の上流側の、その波長の関数として蛍光及び／又は散乱相互作用放射線を選択的にフィルタリングする役割を果たす光学フィルタリング手段とを含むことと、
・その分析手段は、電気信号をデコードして、それらがそれらの元のコードの関数として分析される役割を果たすデコード化手段を含むこと、
を特徴とする。
【００１４】
ここで、「コード化」とは、それ自体が元のコードを含む相互作用放射線を生成する目的で、微視的要素との相互作用の前に、コード（ωｉ）を分析放射線ビーム（Ｒｉ）に適用する動作のことを言う。特に、コード（ωｉ）は、パルス変調を各々の分析放射線ビームに適用するように選択することができる。
これらのパルスは、同期又は非同期とすることができる。同期パルスの場合は、全ての波長は、分析される微視的要素と同時に相互作用する。非同期パルスの場合は、波長は、分析される微視的要素と逐次的に相互作用する。光学フィルタリング手段は、実行される補償を回避するように、所与の族の蛍光色素に合わせて、かつ所与の種類のコード化に合わせて設計される。
【００１５】
本発明による装置は、別個で又は組み合わせてとることができる相補的な特徴を含むことができ、特に、
・その光学フィルタリング手段は、その波長が２つの分析波長の間にそれぞれ挿入され、最長の分析波長を越えて配置される蛍光分析帯域に属する蛍光相互作用放射線を選択的にフィルタリングする役割を果たすことができ、
・そのコード化手段は、周期的に及び／又は正弦的に分析放射線の強度をコード化する役割を果たすことができ、
・そのコード化手段の少なくとも一部は、供給源に組み込むことができる、放射線のための分布出力部の上流側の供給源に作用することができ、
・そのコード化手段の少なくとも一部は、分析放射線を形成するように供給源の下流側の放射線に作用することができ、
・そのコード化手段は、分析放射線を形成するように、例えば音響光学変調器によって、供給源により放出される放射線の強度を変調することができ、
・供給源は、必要に応じて、その分析放射線が測定空間内で共役される、単色型の、及び／又は少なくとも１つの発光ダイオードの、少なくとも２つの結合レーザーを含むことができ、変形態様としては、供給源は、例えば、多色レーザー、白熱ランプ、又はアーク・ランプのような、実質的に連続する多色光源を含むことができ、
・供給源は、連続するモード及び／又はパルス・モードによって分析放射線を放出することができ、
・供給源により放出される各々の分析放射線ビームの強度は、調整可能とすることができ、
・その検出手段は、分析される微視的要素上の分析放射線によって誘起される（散乱及び蛍光プロセスを表す）相互作用放射線の検出専用の様々な感光センサを含むことができ、変形態様としては、検出手段は、散乱プロセスを表す相互作用放射線の検出専用であり、測定空間内の分析放射線の伝搬の全体的な方向を遮断する軸によって定められる位置に埋め込まれた様々な感光センサを含むことができ、この軸は、全体的な方向に対して０°から３６０°までの範囲の角度をなして配向され、
・その分析手段は、散乱プロセスを表す相互作用放射線の変換によりもたらされる信号から分析された微視的要素の１つの種類の反射率を推論することを可能にすることができ、特に、微視的要素が血液試料に属するときは、分析手段は、特に赤血球内ヘモグロビン含有物又は白血球の細胞質内タンパク質含有物を求めることを可能にすることができ、
・その分析手段は、分析放射線と２つの発光剤との間の相互作用によりもたらされる信号から、異なる波長を有する２つの発光剤（又は蛍光色素）間のエネルギー伝達を表す結合の度合いを推論することを可能にすることができる。
【００１６】
本発明はまた、
・測定空間（ＣＭ）内の微視的要素は、相互作用放射線を形成するように、測定空間（ＣＭ）内で共役され、少なくとも２つの異なる分析波長及び異なる選ばれたコードによるコード化を有する分析放射線により照射される第１のステップと、
・相互作用放射線の少なくとも一部が集光され、次いで、その波長の関数として分離され、フィルタリングされる第２のステップと、
・フィルタリングされた相互作用放射線が検出され、次いで、電気信号に変換される第３のステップと、
・検出された信号が、分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするように、それらの元のコードの関数としてデコードされる第４のステップと、
を含む、微視的要素を分析するための方法を提供する。
【００１７】
本発明による方法は、別個で又は組み合わせてとることができる相補的な特徴を含むことができ、特に、
・第１のステップにおいては、分析放射線は、分析される微視的要素に逐次的に又は同時に適用することができ、
・第１のステップにおいては、正弦的な変調は、分析放射線の強度に適用することもでき、
・第２のステップにおいては、その波長が２つの分析波長の間にそれぞれ挿入され、最長の分析波長を越えて配置される蛍光分析帯域に属する蛍光相互作用放射線は、選択的にフィルタリングすることができ、
・第４のステップにおいては、分析された微視的要素の１つの種類の反射率は、散乱プロセスを表す相互作用放射線の変換によりもたらされる信号から推論することができ、特に、微視的要素が血液試料に属するときは、赤血球内ヘモグロビン含有物又は白血球の細胞質内タンパク質含有物を特に求めることができ、
・第４のステップにおいては、異なる波長を有する２つの発光剤（蛍光色素）間のエネルギー伝達を表す結合の度合いは、分析放射線と２つの発光剤との間の相互作用によりもたらされる信号から推論することができる。
【００１８】
限定されない方法ではあるが、本発明は、インビトロ診断学（特にフローサイトメトリー）の分野、並びに、流体における如何なる微視的要素の分析にも特に適している。それは、生物学的分析、生化学的分析、化学的分析、粒子分析、形態学的分析、特にマルチパラメータ・フローサイトメトリー、液体又はガス流体中の荷電粒子の分析、及び粒径分布に特に適用可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び添付の図面を考査することにより明らかとなるであろう。
添付の図面は、本発明を完全なものにするためばかりでなく、必要に応じて、その定義に寄与するためにも用いられることが可能である。
【００２０】
まずは、本発明による光学分析装置ＤＡの２つの例示的な実施形態を説明するために、図１Ａ及び図１Ｂを参照する。
以下において、装置ＤＡは、血液試料中の微視的要素のフローサイトメトリーにおけるキャラクタリゼーション及び計数専用であると考えられる。しかしながら、本発明は、この種の試料又はフローサイトメトリーに限定されるものではない。本発明は、実際は、蛍光及び／又は光散乱によって光学的に分析される微視的要素を含むあらゆる種類の試料、特に流体又は生物学的試料中の粒子に関する。
【００２１】
図１Ａ及び図１Ｂに概略的かつ機能的に示されるように、本発明による分析装置ＤＡは、少なくとも、
・分析される試料の微視的要素が配置される（又は通過する）測定タンク（又は測定領域、或いは、場合によっては測定ウィンドウ）と呼ばれることがある１つの測定空間ＣＭと、
・測定空間（ＣＭ）内で共役される、少なくとも２つの異なる分析波長λｉからλｎを有する放射線Ｒｉを放出する役割を果たす１つの（又は幾つかの）供給源〔図１Ａの場合は、幾つかの波長を出すために単一の供給源Ｓが用いられ、図１Ｂの場合は、各々が１つの波長を送出するために３つの供給源が用いられ、定義上、ここでは、図１Ｂにおける異なる供給源は放射線源の下位部分を形成すると考えられる〕と、
・コード化が例えば図２Ａから図２Ｃまでに示される種類である場合に、少なくとも特定のコードωｉ（ここで、ｉ＝１からｎまで、例えば、ｎ＝２又は３）により波長λｉの各々の光放射線ビームＲｉをコード化する（変調する）役割を果たし、場合によっては制御モジュールＭＣによって制御されるコード化手段Ｍと、
・最長の、分析波長λｎを越えて配置される（最長波長を有する）最後のものを除いて、場合によっては微視的要素と相互作用した後で、測定空間ＣＭから生じる相互作用放射線を選択的にフィルタリングする役割を果たし、各々が２つの分析波長λｉとλｉ＋１との間に挿入される蛍光分析帯域Ｂｉにその波長が属することが好ましい、光学フィルタリング手段ＦＯと、
・場合によっては微視的要素と相互作用した後で、測定空間から生じる蛍光及び／又は散乱相互作用放射線の少なくとも一部を電気信号に変換する役割を果たす感光センサ（又は光センサ）を含む検出手段ＤＦ及び／又はＤＥと、
・分析された微視的要素を表すデータを求めることを可能にするようにそれらのコードωｉの関数としてそれらを分析するための、検出手段ＤＦ及び／又はＤＥによって伝送された電気信号をデコードする役割を果たす少なくともデコード化手段ＤＲＦ及び／又はＤＲＥを含む分析手段ＭＡと、
を含む。
【００２２】
分析装置ＤＡは、蛍光及び／又は散乱分析を実行できることに注目することが重要である。したがって、変形態様に応じて、これは、
・関連するデコード化手段ＤＲＦをもつ蛍光ＤＦ専用の検出手段と関連するが、散乱ＤＥ及び関連するデコード化手段ＤＲＥ専用の検出手段はもたない光学フィルタリング手段ＦＯか、
・関連するデコード化手段ＤＲＦをもつ蛍光ＤＦ専用の検出手段と関連する光学フィルタリング手段ＦＯ、並びに、関連するデコード化手段ＤＲＥをもつ散乱ＤＥ及び専用の検出手段と関連する光学フィルタリング手段ＦＯか、
・散乱ＤＥ及び関連するデコード化手段ＤＲＥ専用であるが、関連するデコード化手段ＤＲＦをもつ蛍光ＤＦ専用の光学フィルタリング手段ＦＯも検出手段ももたない他の検出手段、
のいずれかをもつ。
【００２３】
分析装置ＤＡがフローサイトメトリー又は計数専用である場合には、その測定タンクＣＭ（又は測定空間）は、特許文献第ＦＲ２６５３８８５号に説明されるもののような、「光束結合をもつもの」と呼ばれる種類のものとすることができる。
図１Ａの例においては、供給源Ｓは、
2008537136.tif 000003
であるとすると、それぞれの波長λ１からλｎのｎ個の放射線ビームＲｉの重ね合わせからなる単一光ビームを生成す役割を果たす。図１Ｂの例においては、３つの供給源Ｓの各々が、波長λｉ（λ１、λ２、又はλ３）の１つの放射線ビームＲｉ（Ｒ１、Ｒ２、又はＲ３）からなる単一光ビームを生成する役割を果たす。
【００２４】
Ｉiで示される、各々のビームの強度は、所定の値に調整することができる。このことは、例えば、波長λｉ及び強度Ｉiの分析放射線Ｒｉにより励起されたときに、蛍光色素（又は蛍光化合物）の族の蛍光強度を所定のレベルにすることを可能にする。量子蛍光効率が非常に高い（例えば、オレンジ・チアゾールのような特定の分子プローブの事例である）蛍光色素の族は、さらに、低い強度で励起させることもできる。これとは対照的に、同じ細胞について異なって発現される抗原をマークするために、同一の量子効率をもつ蛍光色素が同時に用いられるときには、それぞれの分析放射線ビームの強度に作用することによって、種々の蛍光色素によって発せられる蛍光レベルをほぼ等しくすることができる。
微視的要素の蛍光レベルを制御するこうした可能性のために、供給源Ｓは、光学「シンセサイザ・イコライザ」とも呼ばれる。
【００２５】
強度Ｉiのｎ個の放射線ビームＲｉの各々は、さらに、後述されるコード化手段によって周期的に及び／又は正弦的にコード化することもできる。例えば図２Ａから図２Ｃに示される種類のこうしたコード化プロセスは、デコード化手段ＤＲＦ及び／又はＤＲＥによって、（特に蛍光及び／又は散乱の機構によって）分析された微視的要素との相互作用の結果生じる放射線の逆多重化を可能にするために、算出的なものである。
供給源Ｓが、例えば、半導体レーザーのようなレーザー、又は発光ダイオードを含むときは、コード化は、注入電流に作用することによって達成することができ、この場合、変調器Ｍは、放射線ビームの各々に適用されるコードの画像電流を送給することが可能な電気発電機である。コード化が正弦型のものであるときは、コード化は、特に、後述される種々の実験的な考慮事項の関数である固定変調周波数ωｉで構成される。
【００２６】
変調器Ｍの出力部においては、測定空間内で場合によっては選択され共役された、選択された波長λｉ及び強度Ｉiのｎ個の放射線ビームＲｉが存在する。正弦コード化の場合は、光度Ｉi（Ｗ／ｍ2における）の式は、付録の式Ａ１によって与えられる。
ｎの放射線Ｒｉのビームは、当業者には公知の任意の技術によって予めマークされ及び／又は染色された微視的要素（ここでは、生物細胞）と相互作用する測定（又は計数）空間内部には示されない光学手段によって合焦される。
【００２７】
図３においては、３つの分析波長λ１からλ３、及び蛍光検出手段ＤＦによって検出される同じ３つの蛍光色素の３つの蛍光スペクトルＳＦ１からＳＦ３に対応する３つの仮想蛍光色素の３つの吸収スペクトルＳＡ１からＳＡ３が示される。基準Ｂ１からＢ３は、光学フィルタリング手段ＦＯが通過させる３つの波長帯域を示す。
異なる種類の蛍光色素の数は、ここでは、説明を容易にするために３つに限定される。しかしながら、本発明は、この数に限定されるものではない。これは、実際は、任意の所与の数の蛍光色素に当て嵌まり得る。
【００２８】
本発明によれば、図３において分かるように、第１の蛍光色素の蛍光スペクトルＳＦ１の最大値に対応する帯域Ｂ１は分析波長λ１とλ２との間に挿入され、第２の蛍光色素の蛍光スペクトルＳＦ２の最大値に対応する帯域Ｂ２は分析波長λ２とλ３との間に挿入され、第３の蛍光色素の蛍光スペクトルＳＦ３の最大値に対応する帯域Ｂ３は分析波長λ３（これらの３つのうちの最長のもの）を超えて配置される。
各々の帯域Ｂｉに対しては、蛍光検出器ＤＦｉが対応することが好ましい。
【００２９】
吸収ＳＡｉ及び蛍光ＳＦｉスペクトルの分析は、この（ｎ＝３）検出器によって送給される（光電）信号と蛍光色素の量との間で行列式を書くことを可能にし、すなわち［ＰＭ0］＝Ｉi［Ｃ］［Ｑ］＋Ｉ2［Ｄ］［Ｑ］＋Ｉ3［Ｅ］［Ｑ］である。
ここで、［ＰＭ0］は、この（ｎ＝３）蛍光検出器ＤＦｉによって送給される光電信号の行列であり、添え字0は、エネルギー伝達がない蛍光信号を示す。ここでの［Ｃ］、［Ｄ］及び［Ｅ］は、蛍光光ビームを算出することを可能にする伝達行列である。ここで、［Ｑ］は、モル数と表現される、（ｎ＝３）蛍光色素の量Ｑ１からＱ３の行列である。
【００３０】
伝達行列［Ｃ］、［Ｄ］及び［Ｅ］の係数ｃij、ｄij及びｅijは、それぞれ付録における式Ａ２、Ａ３及びＡ４によって与えられる。
行列［ＰＭ0］及び関連する係数の分解の考査は、測定信号の一次結合なしで、各々のモル濃度Ｑｉを求めることが可能であることを示す。前述の書き方規約によって、モル濃度Ｑｉは、付録における式Ａ５からＡ７によって与えられる。これらの３つの式Ａ５から式Ａ７においては、項ＰＭｉ（ωｉ）は、コードωｉの特徴を表す。
【００３１】
この特徴は、例えば、分析光パルスの持続時間によって制限された時間にわたる信号のピーク振幅又はｒ．ｍ．ｓ．値とすることもできるし、或いは、蛍光のフェード時間のような信号の一時的な特徴とすることもできる。測定の一次結合を用いることのない、蛍光色素のモル濃度Ｑｉの直接算出は、結果の精度、よって、診断の精度を上げる。
したがって、所与の蛍光色素のモル濃度を求めるために、（種々の信号の一次結合の）補償が用いられる。本発明の堅牢性は、干渉作用、したがって補償を回避することを可能にし、よって、これまでに用いられた通常の方法より信頼性かつ堅牢性がある。
【００３２】
本発明はさらに、「ドナー」蛍光色素と「レシーバ」蛍光色素との間の（蛍光による）エネルギー伝達に対応する２つの蛍光色素（又は蛍光化合物）間の結合程度を求めることを可能にすることができる。２つの蛍光色素間の結合の算出は、例えば、エピトープ又は他のそれらの物理的な関連物の間の距離を測定することを可能にすることができる。
上記で与えられた書き方規約を考慮して、エネルギー伝達の存在下の種々の蛍光信号についての式は、付録における式Ａ８から式Ａ１０によって与えられる。
【００３３】
第１の２つの蛍光色素間のエネルギー伝達の事例は、分析的に後述される。この事例において、付録における式Ａ８からＡ１０によって与えられる種々の光電信号についての式は、付録における式Ａ１１からＡ１３の形態で書き換えることができる。このことは、他の係数κij及びρijを１に等しいとみなして、係数κ12及びρ12だけを考慮すればよいという事実によりもたらされる。
式Ａ２からＡ７についての式を考慮して、次いで、付録における式Ａ１１及び式Ａ１２から、付録における３つの式Ａ１４からＡ１６を抽出することができる。次に、式Ａ１４からＡ１６までからモル濃度Ｑ１からＱ３を除去することによって、第１の２つの蛍光色素間のエネルギー伝達パラメータκ12を求めることができる。このエネルギー伝達パラメータκ12についての式は、付録における式Ａ１７によって与えられる。
【００３４】
次に、第１の２つの蛍光色素間のエネルギー伝達の存在下のモル濃度Ｑ１は、付録における式Ａ１８によって示されるように、再公式化することができる。次に、第１の２つの蛍光色素間のエネルギー伝達の存在下のモル濃度Ｑ２及びＱ３は、付録における式Ａ６及びＡ７によって与えられる。
第１及び第３の蛍光色素間及び／又は第２及び第３の蛍光色素間のエネルギー伝達も考慮される場合は、上記及び付録において与えられた式を展開できることに注目することが重要である。
【００３５】
図４において、供給源Ｓが分析波長の選択と、対応する放射線の強度のコード化の両方のを提供する変調器Ｍに広帯域光（放射線）を供給する、本発明による分析装置ＤＡの上流側部分が示されている。
ここで、広帯域光（又は白色光、或いは多色光）は、微細構造光ファイバＯＦに射出されるパルス・レーザーＬによって得られる。この種の供給源Ｓは、例えば、Ｏｐｔｉｃｓ  Ｅｘｒｅｓｓ、第１２巻、第１９号、２００４年９月の「Ｗｈｉｔｅ−ｌｉｇｈｔ  ｓｕｐｅｒｃｏｎｔｉｎｕｕｍ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌｌｙ  ｄｉｓｐｅｒｓｉｖｅ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｆｉｂｅｒ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔ――ｗａｖｅｌｅｎｇｔｈ  ｐｕｍｐｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ」という表題の論文において出願人によって記載されている。
【００３６】
微細構造光ファイバＯＦのためのポンプとして機能するレーザーＬは、例えば、（例えば、５０ＭＨｚのパルス繰り返し率をもつ）逆バイアス・モード領域で作動するネオジニウムによってドープされた又はイッテルビウムによってドープされた光ファイバ・レーザーと置き換えることができ、この後に微細構造の光ファイバＯＦの非線形相互作用領域における励起と適合性のある光束を放出することが可能な光学増幅器が続く。
この種の供給源Ｓによって放出される多色光は、その空間的コヒーレンスが極めて高い（全ての連続体の光子が同じ空間的モードで発せられる）という事実において白熱ランプによって放出されるものとは異なっている。
【００３７】
もちろん、他の種類の供給源Ｓを想定することができる。このように、供給源は、場合によっては単色型の、少なくとも２つの結合レーザー、及び／又は少なくとも１つの発光ダイオードを含むことができる。これは、例えば、白熱ランプ又はアーク・ランプのような、他の種類の実質的に連続する多色光源を含むこともできる。
微細構造光ファイバＯＦから生じる光のビームは、例えば、反射屈折型（鏡）の光学的な組み合わせにより補正された色収差又はゼロ色収差を用いて、合焦光学系Ｏ１によって調整される。この光ビームは、変調器Ｍ上に合焦され、該変調器は、角色収差が入射のブラッグ角における回折に適合されたピッチの回折格子の空間的重ね合わせによって補正されることが好ましい音響光学セルの形態をとる。
【００３８】
これらの回折格子は、変調された強度Ｉi（ｔ）を与える、付録における式Ａ１内に含まれる変調信号ｍi（ｔ）＝Ｍiｃｏｓ２πωiｔを維持することが可能な電気信号により駆動される圧電型の振動素子により維持される音波の重ね合わせによって生成される。
このような音響光学変調器Ｍは、例えば、Ａ−Ａ  Ｏｐｔｏ−Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃという会社によって市場に出されているものである。
【００３９】
ここで、音響光学変調器Ｍは、（少なくとも）３つの音響周波数（ｆ１、ｆ２、ｆ３）を同時に生成することが可能であり、それ自体が（制御ソフトウェア・インタフェースを含むコンピュータ・システムの一部を形成することができる）制御モジュールＭＣにより制御される制御電子回路ＳＦによって制御される。音響周波数の帯域は、例えば、８０ＭＨｚから１５０ＭＨｚの間の範囲内である。周波数は、ビームの連続光内で、例えば、４８８ｎｍ（青色）、５７０ｎｍ（黄色）、及び９７６ｎｍ（赤外線）に等しい波長のような（説明された例においては）３つの準単色光放射線ビームの選択を可能にするように選ばれる。３つの放射線ビームの等化は、音響信号の強度に作用することによって得られる。音響強度が高くなればなるほど、音響光学変調器Ｍ内の回折効率が高くなる。換言すれば、０回折オーダーから＋１回折オーダーに向かうことができる光の量は、（音響信号の強度に作用することによって）調整することができる。
ここでの準単色光放射線は、幅が１ｎｍから５０ｎｍの間の範囲のスペクトル帯域において発される光を意味することが理解される。
【００４０】
供給源Ｓ及び変調器Ｍのパラメータの全ては（例えば、コンピュータ型の）制御モジュールＭＣによって遠隔的に調整可能であることに注目することが重要である。したがって、ソフトウェア・インタフェースによって、種々の分析波長、並びに分析放射線及び他のもののそれぞれの強度のような、供給源Ｓの全パラメータを操作者が選択することができる。
変調器Ｍの出力において放出される分析放射線Ｒｉは、例えば、測定タンク（又は空間）ＣＭ内で合焦されるように光学系Ｏ２によって調整される。
【００４１】
変調周波数ωｉは、例えば、測定空間ＣＭを通る生物細胞の通過速度、希釈度、測定空間ＣＭの光学ウィンドウの大きさ、分析装置ＤＡの獲得部分（光学フィルタリング手段ＦＯ、検出器ＤＥ及び／又はＤＦ）の帯域幅のような種々のパラメータの関数として選択される。
例えば、分析される生物細胞が、約１ｍ／秒の速度において、約３０μｍの半分の高さにおける幅のガウス・プロファイルを有する放射線の分析ビームを通過する場合には、ほぼガウス形状で、ほぼ３０μｓに等しい持続時間の相互作用放射線（蛍光又は散乱（消光））パルスを発生させる。この場合、周波数スペクトルは、ガウス形状のものであり、半分の高さにおけるその高さは、ほぼ０．３／３０μｓに等しいか、又は約１０ｋＨｚである。電子クロストーク現象を防止するためには、２つの連続した変調周波数ωｉとωｉ＋１との間で１００ｋＨｚの最小分離を選択することが好ましい。例えば、１００ｋＨｚに等しいω１、２００ｋＨｚに等しいω２、及び３００ｋＨｚに等しいω３を選択することができる。
【００４２】
貫流持続時間が３０μｓの代わりに約５μｓである場合には、各々の相互作用放射線パルスは約２００ｋＨｚの周波数帯域を占め、よって、変調周波数は、例えば、ω１＝１ＭＨｚ及びω２＝１．５ＭＨｚのような少なくともこうした特性周波数によって分離されなければならない。
他の種類の変調器Ｍを想定できることに注目することが重要である。特に、変調器Ｍは、少なくともその一部を供給源Ｓに組み込むこともできるし、或いは少なくともその一部が後者の下流側にあるとすることもできる。変調器Ｍはまた、例えば、その電力供給電流を制御するように、少なくともその一部を供給源Ｓの上流側に配置することもできる。
【００４３】
測定タンクＣＭの上流側に位置し、図４を参照して上述された分析装置ＤＡの一部は、図１Ａ又は図１Ｂに示された種類のものの下流側部分に結合することができる。この場合は、散乱の結果生じる相互作用放射線の一部は検出器ＤＥに到達し、ここで該放射線の一部は電気信号に変換されて分析モジュールＭＡにより処理される。
図１Ａにおいては、検出器ＤＥは、一例として、測定空間ＣＭ内の分析放射線の伝搬の全体的な方向に対して約４５°の平均方向に配向される。しかしながら、この平均方向の角度は、望まれる種類の情報に応じて、０°から３６０°までの範囲の任意の所与の値をとることができる。
【００４４】
検出器ＤＥは、これらの光電信号を分析モジュールＭＡのデコーダ（又は復調器）ＤＲＥに伝送して、それらをデコード化する。例えば、この復調器ＤＲＥは、例えばアナログ型の、フィルタリング（デコード化）ステージの形態で構成される。変形態様として、光電信号はデジタル化することができ、フィルタリング（デコード化）動作は、リアルタイムで、又は後処理（記録後）によってデジタル実行することができる。
復調器ＤＲＥの出力においては、３つの散乱信号ＳＥ（λ１＝４８８ｎｍ）、ＳＥ（λ２＝５７０ｎｍ）、及びＳＥ（λ３＝９７６ｎｍ）が存在する。散乱信号ＳＥ（４８８ｎｍ）及びＳＥ（９７６ｎｍ）の値は、屈折率及び赤血球の容積の算出に必要な散乱断面Ｃext（４８８ｎｍ）及びＣext（９７６ｎｍ）を求めることを可能にする。
【００４５】
断面への散乱信号の変換は、例えば、屈折率及び容積が較正されたマイクロビーズを用いる較正手順によって実現される。これらのマイクロビーズは、例えば、ラテックスから作ることもできるし、或いは乳剤から作ることもできる。
蛍光の結果生じる相互作用放射線の一部は、光学フィルタリング手段ＦＯに到達する前に、信号を調整する光学アレイを通過する。次に、相互作用放射線は、その波長がｎ（ここでは、ｎ＝３）の検出帯域Ｂｉに属するもののみが保存されるように波長にフィルタリングされる。
【００４６】
図１Ａにおいて、蛍光検出手段ＤＦは、全てが同じ位置にグループ化される。この場合、光学フィルタリング手段ＦＯは多帯域フィルタを形成する。
図５に示すように、分離手段ＬＳは、蛍光相互作用放射線を少なくとも２つの部分にスペクトル分離するために用いることができる。この目的のために、例えば、場合によっては二色性型の、セパレータ板ＬＳを用いることができる。このように、（少なくとも）２つの蛍光検出及び分析チャネルが定められて、１つのチャネル上では光学フィルタＦＯ１の第１の光学フィルタリング帯域Ｂ１において第１の種類の蛍光の蛍光色素からの蛍光信号を得て、第２のチャネル上では光学フィルタＦＯ２の第２の光学フィルタリング帯域Ｂ２における第２の種類蛍光の蛍光色素からの蛍光信号を得ることを可能にする。
【００４７】
図５内の装置は、例えば、核酸（ＲＮＡ＋ＤＮＡ）の定量化及び膜抗原の検出のために用いることができる。
ここでは、それぞれ４８８ｎｍ及び５６０ｎｍに等しい波長λ１及びλ２を有する、２つの分析放射線ビームＲ１（ω１）及びＲ２（ω２）を用いて、白血球の核酸及び膜抗原をそれぞれマークすることを可能にする、２つの蛍光色素（オレンジ・チアゾール及びＰＥ）の蛍光を検出する。これらの２つの放射線ビームＲ１（ω１）及びＲ２（ω２）は、図４を参照して既述された装置によって得られる。
【００４８】
第１の検出帯域Ｂ１は、λ３（５３０ｎｍ）の中心に位置させられ、例えば、３０ｎｍのスペクトル幅を有し、第２の検出帯域Ｂ２は、λ４（６７０ｎｍ）の中心に位置させられ、例えば、４０ｎｍのスペクトル幅を有する。本発明によれば、λ３は、λ１からλ２の間の範囲内にあり、λ４は、λ２より大きい。
第１の光学フィルタＦＯ１によってフィルタリングされる相互作用放射線は、第１の蛍光検出器ＤＦ１に到達して、信号ＰＭ１（ω１）を送るために、第１の変調周波数ω１によりそれらを復調する役割を果たす分析モジュールＭＡの第１の蛍光デコーダ（又は復調器）ＤＲＦ１に伝送される電気信号に、光検出器によって変換される。
【００４９】
第２の光学フィルタＦＯ２によってフィルタリングされる相互作用放射線は、第２の蛍光検出器ＤＦ２に到達して、信号ＰＭ２（ω１）及び信号ＰＭ２（ω２）を送るために、第１及び第２の変調周波数ω１及びω２によりそれらを復調する役割を果たす分析モジュールＭＡの第２の蛍光デコーダ（又は復調器）ＤＲＦ２に伝送される電気信号に、光検出器によって変換される。
蛍光検出器ＤＲＦ１及びＤＲＦ２は、例えば、バターワース帯域通過型の、変調周波数の中央に位置させられる、アナログ・フィルタリング・ステージで構成される。
【００５０】
前述の励起状態の下では、蛍光色素の量（又はモル濃度）Ｑ１及びＱ２は、その係数ｃ11及びｄ22がＡ２及びＡ３によって定義される、式Ａ５及びＡ６を用いて算出することができる。
モル濃度Ｑ２は、周波数ω２の中央に位置させられる帯域通過型のフィルタを用いて第２の復調器ＤＲＦ２によって、第２の蛍光検出器ＤＦ２により送られる蛍光信号ＰＭ２から抽出することができる。実際に、既述のように、蛍光色素間の光学クロストークのため、ＰＭ２は、２つの周波数成分、すなわち、ｒ．ｍ．ｓ．値又は周波数ω２あたりでフィルタリングされる電気パルスの最大振幅値に対応するＰＭ２（ω２）と、光学クロストークに対応するＰＭ２（ω１）とを含む。したがって、ＰＭ２＝ＰＭ２（ω１）＋ＰＭ２（ω２）である。付録における式Ａ１５及びＡ１６によって定義される、これらの周波数成分ＰＭ２（ω１）及びＰＭ２（ω２）は、周波数ω２の中央に位置させられる単純な帯域通過フィルタによって分離することができる。
【００５１】
モル濃度Ｑ１は、ＰＭ１（ω１）に等しい蛍光信号ＰＭ１から直接抽出することができる。
分離手段ＬＳを含まず、κ12＝１の状況に対応する構成においては、唯一の蛍光検出器ＰＭによって送られる信号は、付録における式Ａ２０の形態で再公式化することができる式Ａ１９によって与えられる。付録における式Ａ２１及びＡ２２によって与えられる、これらの信号ＰＭ（ω１）及びＰＭ（ω２）は、復調によって信号ＰＭから抽出することができる。
【００５２】
式Ａ２１はＱ２を算出することを可能にし、式Ａ２２に入Ｑ２を挿入すると、Ｑ１を求めることが可能になる。
上記で説明された例は、任意の所与の複雑さの光学クロストーク・レベルをもつ任意数の蛍光色素に展開することができる。
【００５３】
第２の例示的な適用例においては、本発明による分析装置ＤＡは、全血試料に含まれる細胞の屈折率を測定することを可能にする。赤血球系の細胞の場合は、この屈折率は、血球ヘモグロビン濃度を表すものとして認識される。
実際、光学的視点からは、赤血球は、厚さが約７ｎｍで、１．４６に近い屈折率の「脂質二重層」の膜からなる。細胞間の含有物は、ヘモグロビン（〜３４ｇ／ｄｌ）、塩（〜０．７ｇ／ｄｌ）、及び少数の有機化合物（〜０．２ｇ／ｄｌ）が存在する、水相中に溶解した幾つかの固体化合物を含む。
【００５４】
屈折率は、式Ａ２３によって与えられる形態で書くことができる。
ヘモグロビンのモル質量が知られている（Ｍ＝６６５００ｇ／モル）ため、濃度（ｍｍｏｌ／ｄｌ）は、質量濃度（ｇ／ｄｌ）と等しくすることができる。赤血球中に溶解したヘモグロビンの平均質量は、１２ｐｇである。これは、３３ｇ／ｄｌ又は５ｍｍｏｌ／ｌの平均濃度をもたらす。
【００５５】
全血については、ヘモグロビン測定は、男性については約４０％から５０％、女性については約３５％から４５％の間に位置するヘマトクリットファクタで補正されなければならない。このヘマトクリットファクタは、０．４２（平均値）に等しいとみなされており、例えば、５ｍｍｏｌ／ｌの血球へモグロビンの平均濃度は、全血において行われた測定については、２．１ｍｍｏｌ／ｌの全ヘモグロビンの平均濃度をもたらす。
上記及び式Ａ２３を考慮して、赤血球の屈折率は、次のように書くことがでる。
９８０ｎｍの分析波長については、ｎ（９８０ｎｍ）＝１．３４＋０．００１９＊Ｈｂ（血球濃度ｇ／ｄｌ）、及び、
４８８ｎｍの分析波長については、ｎ（４８８ｎｍ）＝１．３５＋０．００１６＊Ｈｂ（血球濃度ｇ／ｄｌ）
【００５６】
２５ｇ／ｄｌから５０ｇ／ｄｌに向かう血球ヘモグロビン濃度（ｇ／ｄｌ）については、これらの式の妥当性の範囲がとられる。
９８０ｎｍ及び４８８ｎｍに等しい分析波長における屈折率の虚部は、以下の式によって数値的に求めることができる。
κ（９８０ｎｍ）＝１．４７＊１０-5＊Ｈｂ、及び、
κ（４８８ｎｍ）＝３．７＊１０-5＊Ｈｂ
【００５７】
血球ヘモグロビン濃度は、２つの波長の吸光率の測定値を用いて求めることができる。この目的のために、Ａ．Ｇ．Ｂｏｒｏｖｏｉによって開発された幾何学的手法を用いることができ、これは、球状近似された赤血球の散乱断面Ｃextを算出することを可能にし、この式は、付録における式Ａ２４によって与えられる。
図６に示される種類の等容曲線及び等濃度曲線の図を構成することができ、血球ヘモグロビンの容積及び濃度を分析波長（ここでは、４８８ｎｍ及び９７６ｎｍ）における散乱断面Ｃextの関数として求めることを可能にする。この図においては、測定値Ｃext（４８８ｎｍ）及びＣext（９７６ｎｍ）の各々の対には、所与のヘモグロビン濃度及び容積の単一の球が対応する。
【００５８】
ヘモグロビンの含有物を得ること及びその監視は、特に有用であることが分かる。このことは、特に貧血及び鉄欠乏を監視する場合に当て嵌まる。平均血球ヘモグロビン負荷量は、実際に、成長ホルモン治療（「ｒ−Ｈｕ  ＥＰＯ治療」）によって誘起される高い髄要求の際の監視に特に有用である。細胞治療における網状赤血球及びそれらのヘモグロビン含有物の監視はさらに、Ｃａｒｌｏ  Ｂｒｕｇｎａｒａによる「Ｉｒｏｎ  Ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  Ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ：Ｎｅｗ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４９、２００３年１０月、ｐｐ．１５７３−１５７８の文献において示されるように、有用であることが分かる。
本発明により、現在は、ヘモグロビン含有物の測定（散乱測定による）及び他の測定（蛍光測定による）の同時測定を、それらの間での干渉なしで、かつ処理モードによるエラーのリスクを減少させて実行することが可能である。
【００５９】
この場合、ヘモグロビン含有物は、若い赤血球、すなわち網状赤血球を成熟した要素から分離することを可能にする赤血球内ＲＮＡの蛍光測定によって完全なものにできることが有利である。Ｈａｎｓ  Ｊ．Ｔａｎｋｅによる「Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ＭａｔｕｒｅＥｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅｓ」、Ｆｌｏｗ  Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、ＩＳＢＮ０−１２−４３２９４０−３の論文に特に記載されるように、１つ又はそれ以上の蛍光波長は、
・胎児ヘモグロビン（ＨｂＦ）を含有する赤血球、
・マラリア原虫が侵入した赤血球、
・トランスフェリン（ＣＤ７１）レセプタ、又は、
・グリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）の発現
の同定又は試験のような潜在的に有用な他の特定の同定を可能にする付加的なマーキングのために同時に用いることができる。
本発明の適用例は、有核細胞（白血球及び他のもの）上と、赤血球系又は血小板要素（活性化又は血小板の未成熟のマーキング）上の両方において多数存在する。
【００６０】
さらに、本発明は、血液又は骨髄中に存在する要素の場合に有用であるばかりでなく、それが真核又は原核であろうとも、如何なる生物細胞懸濁液にも適合させることもできる。
上記の説明において、本発明は、主に分析装置の形態で説明された。しかしながら、本発明はまた、説明された分析装置によって、さらにその変形によって実施することができる分析方法の形態で考えることもできる。
【００６１】
本方法の適用は、フローサイトメトリーの他に、インビボ又はインビトロ用途を想定することができる。例えば、本方法は、細胞表面領域（特に、スミア試験及び組織切開）又は細胞懸濁液の走査を行う装置に適合させることができる。
本発明は、単なる一例に過ぎないものであり、上記で説明された光学分析装置及び方法の実施形態に限定されるものではなく、当業者であれば想定することができる全ての変形を特許請求の範囲内に含む。
（付録）
【００６２】
2008537136.tif 000004
ここで、ｉ＝１からｎであり、Ｉjoは、放射線Ｒｉの最大強度であり、Ｍiは、変調深さ（又は振幅）（一般的には、０から１の間の範囲）であり、ωｉは、放射線Ｒｉに適用される変調周波数であり、ｔは、時間である。
【００６３】
＊ｃ11＝α11η11Ｆ11    ｃ12＝０    ｃ13＝０      （Ａ２）
ｃ21＝α11η11Ｆ12    ｃ22＝α21η21Ｆ22    ｃ23＝０
ｃ31＝α11η11Ｆ13    ｃ32＝α21η21Ｆ32    ｃ33＝α31η31Ｆ33
ｄ11＝０    ｄ12＝０    ｄ13＝０      （Ａ３）
ｄ21＝０    ｄ22＝α22η22Ｆ22    ｄ23＝０
ｄ31＝０    ｄ32＝α22η22Ｆ32    ｄ33＝α32η32Ｆ33
ｅ11＝０    ｅ12＝０    ｅ13＝０      （Ａ４）
ｅ21＝０    ｅ22＝０    ｅ23＝０
ｅ31＝０    ｅ32＝０    ｅ33＝α33η33Ｆ33
ここで、αijは、波長λｊにおける化合物ｉのモル吸収係数であり、ηijは、検出帯域Ｂｊにおける化合物ｉの蛍光係数であり、Ｆijは、化合物ｉの蛍光スペクトルの一部のみが検出帯域Ｂｊ内でフィルタリングされるという事実に関連する、０から１の間の範囲の重み係数である。
【００６４】
＊Ｑ1＝ｃ11ＰＭ１（ω1）      （Ａ５）
Ｑ2＝ｄ22ＰＭ２（ω2）      （Ａ６）
Ｑ3＝ｅ33ＰＭ３（ω3）      （Ａ７）
＊ＰＭ１＝κ12＊κ13＊ＰＭ10      （Ａ８）
ＰＭ２＝κ23＊ＰＭ20＋ρ12（１−κ12）κ13ＰＭ10      （Ａ９）
ＰＭ３＝ＰＭ30＋ρ13（１−κ13）κ13ＰＭ10＋ρ23（１−κ23）ＰＭ10      （Ａ１０）
ここで、κijは、蛍光色素ｉから蛍光色素ｊへのエネルギー伝達を表す、０から１までの間の範囲の一定の現象論的結合係数であり、ρijは、蛍光色素ｉから生じる、伝達された光が蛍光色素ｊによって蛍光に変換される量子効率を表す係数である。
【００６５】
＊ＰＭ１＝κ12＊ＰＭ10      （Ａ１１）
ＰＭ２＝ＰＭ20＋ρ12（１−κ12）ＰＭ10    （Ａ１２）
ＰＭ３＝ＰＭ30      （Ａ１３）
＊ＰＭ１（ω１）＝κ12α11η11Ｉ1Ｆ11Ｑ1      （Ａ１４）
ＰＭ２（ω２）＝α22η22Ｉ2Ｆ22Ｑ2      （Ａ１５）
ＰＭ３（ω１）＝α21η21Ｉ1Ｆ22Ｑ2  ＋α11η11Ｉ1Ｆ12Ｑ1＋ρ12（１−κ12）α11η11Ｉ1Ｆ11Ｑ1      （Ａ１６）
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＊Ｑ1＝（１／κ12Ｃ11Ｉ1）ＰＭ１（ω１）      （Ａ１８）
2008537136.tif 000006
＊ＰＭ＝（ａ11＋ａ21）Ｑ1＋ａ22Ｑ2      （Ａ２０）
＊ＰＭ（ω2）＝α22η22Ｉ2Ｆ22Ｑ2      （Ａ２１）
＊ＰＭ（ω1）＝α21η21Ｉ1Ｆ22Ｑ2＋α11η11Ｉ1（Ｆ11＋Ｆ12）Ｑ1    （Ａ２２）
＊ｍ（Ｈｂ，λ）＝ｎ（Ｈｂ，λ）−ｉκ（Ｈｂ，λ）      （Ａ２３）
ここで、ｎ（Ｈｂ，λ）＝ｎo（λ）＋α（λ）＊Ｈｂは、屈折率の実部であり、ｎo（λ）は、純粋な溶剤の屈折率であり、波長の関数であり、α（λ）は、ヘモグロビンの屈折率の特性である増分係数及び波長の関数であり、κ（Ｈｂ，λ）＝β（λ）＊Ｈｂは、屈折率の虚部であり、β（λ）は、モル吸収係数である。
【００６６】
＊Ｃext＝πａ2Ｑext      （Ａ２４）
ここで、
2008537136.tif 000007
ｍ＝ｎ−ｉｋ、すなわち、赤血球の複合屈折率、
ρ＝２ｘ（ｎ−１）、すなわち、位相差を与えるパラメータ、
ｘ＝２πａ／λ、
ａ、すなわち、球の半径、及び
ｔａｎβ＝κ／（ｎ−１）
である。
【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１Ａ】本発明による光学分析装置の第１の例示的な実施形態を概略的かつ機能的に示す。
【図１Ｂ】幾つかの供給源が測定空間（ＣＭ）中で共役されることが意図される放射線を生成することが可能な、本発明による光学分析装置の第２の例示的な実施形態を概略的かつ機能的に示す。
【図２Ａ】光放射線に適用することができる、同時照射をもつ正弦コード化の例を示す。
【図２Ｂ】逐次的な２進法コード化の例を示す。
【図２Ｃ】図２Ｂの２進法コード化が周期的に繰り返される信号の形態を示す。
【図３】３つの分析波長（λ１からλ３）に対応する蛍光色素（ＳＡ１からＳＡ３）の３つの吸収スペクトルと、これらの同じ蛍光色素（ＳＦ１からＳＦ３）の３つの蛍光スペクトルとを示す図である。
【図４】変調器が音響光学型のものである、測定タンクの上流側に位置する分析装置の一部の例示的な実施形態を概略的に示す。
【図５】測定タンクの下流側に位置し、蛍光の検出及び分析専用の分析装置の一部の例示的な実施形態を概略的に示す。
【図６】４８８ｎｍ及び９７６ｎｍに等しい分析波長における散乱断面Ｃextの関数として血球ヘモグロビンの容積及び濃度を求めることを可能にする等容積及び等濃度曲線の図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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