(57)【要約】本明細書では、医療用インプラントを処理する方法および同一物を使用する方法が提供される。【選択図】図１a
2008532640.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医療用インプラントの組織結合能力を強化するために前記医療用インプラントを処理する方法であって、
することを誘発するために前記医療用インプラントを高エネルギー放射線で照射して、前記医療用インプラントにナノ構造トポグラフィを含む表面が形成される工程を含む、方法。
【請求項２】
前記高エネルギー放射線は紫外線である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記医療用インプラントは金属製インプラントである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記医療用インプラントは、金、白金、タンタル、ニオブ、ニッケル、鉄、クロム、コバルト、ジルコニウム、マグネシウム、マグネシウム、アルミニウム、パラジウム、それらから形成された例えばステンレススチールなどの合金、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記医療用インプラントは、歯科用インプラント、顎骨インプラント、骨用の補修および安定化スクリューおよびピンおよびプレート、脊椎インプラント、大腿骨インプラント、頸骨インプラント、膝関節インプラント、手関節インプラント、人工股関節などの関節インプラント、耳および鼻インプラントなどの顎顔面インプラント、傷害および疾患により生じた症状のための四肢プロテーゼ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記高エネルギー放射線で前記医療用インプラントを照射する工程の前に、前記医療用インプラントの表面の少なくとも一部分を物理的処理または化学的処理によって処理する工程をさらに含む、請求項１のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記物理的処理は機械加工、サンドブラスト、または金属もしくは非金属蒸着であり、
前記化学的処理は酸エッチング、サンドブラスト、酸化、またはアルカリ処理である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ナノ構造トポグラフィは、ナノスフェア、ナノコーン、ナノピラミッド、またはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記ナノ構造トポグラフィは、約１ｎｍ〜約１，０００ｎｍの範囲のサイズであるナノスフェアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記ナノ構造トポグラフィは、約１ｎｍ〜約２００ｎｍの範囲のサイズであるナノスフェアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記ナノ構造トポグラフィは、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍの範囲のサイズであるナノスフェアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ナノ構造トポグラフィは、約１０ｎｍ〜約７０ｎｍの範囲のサイズであるナノスフェアを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記医療用インプラントは金属製インプラントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記医療用インプラントはチタン製インプラントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記医療用インプラントはジルコニウム製インプラントまたはクロム−コバルト合金製インプラントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記医療用インプラントは非金属製インプラントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記医療用インプラントはポリマー製インプラントである、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記医療用インプラントは骨セメント材料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記骨セメント材料は、ポリアクリレート、ポリエステル、バイオガラス、セラミック、カルシウムをベースとする材料、リン酸カルシウムをベースとする材料、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される材料を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記骨セメント材料は、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）またはメチルメタクリレート（ＭＭＡ）を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記医療用インプラントは、歯科用インプラント、顎骨インプラント、修理用および安定化スクリュー、骨用のピンおよびプレート、脊椎インプラント、大腿骨インプラント、頸骨インプラント、膝関節インプラント、手関節インプラント、関節インプラント、人工股関節、顎顔面インプラント、耳および鼻インプラント、傷害および疾患により生じた症状のための四肢プロテーゼ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される金属製インプラントである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記医療用インプラントは、歯科用インプラント、顎骨インプラント、修理用および安定化スクリュー、骨用のピンおよびプレート、脊椎インプラント、大腿骨インプラント、頸骨インプラント、膝関節インプラント、手関節インプラント、関節インプラント、人工股関節、顎顔面インプラント、耳および鼻インプラント、傷害および疾患の結果として生じた状態のための四肢プロテーゼ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される非金属製インプラントである、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記医療用インプラントは、歯科用インプラント、顎骨インプラント、骨用の補修および安定化スクリューおよびピンおよびプレート、脊椎インプラント、大腿骨インプラント、頸骨インプラント、膝関節インプラント、手関節インプラント、関節インプラント、人工股関節、顎顔面インプラント、耳および鼻インプラント、傷害および疾患により生じた症状のための四肢プロテーゼ、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
前記医療用インプラントは、チタン製インプラント、ジルコニウム製インプラントまたはクロム−コバルト合金製インプラントである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに記載の方法で処理された医療用インプラント。
【請求項２６】
機械加工された表面、酸エッチングされた表面、蒸着表面、サンドブラスト処理された表面、酸化表面、またはそれらの組み合わせを含む表面を含む、請求項２５に記載の医療用インプラント。
【請求項２７】
哺乳動物における医学的症状を治療する、予防する、または緩和する方法であって、前記哺乳動物に請求項２５に記載のインプラントを植え込む工程を含む、方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物はヒトである、請求項２７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、生物医学的使用のための金属製インプラントに関する。詳細には、本発明は、組織−インプラントおよび骨セメント−インプラントの結合(integration)に対する強化された能力を備える医療用インプラントに関する。
【背景技術】
【０００２】
骨格異常または大腿骨頸骨折および脊椎癒合などの創傷に対する修復術は、一般的手技である。例えば、米国においては人工股関節植込み術および脊椎固定術について各々５００，０００例および２５０，０００例を超える手技が実施されている。一方では、米国内の成人集団の約３０％を占める米国内の約７，４００万人は後４分の１区分に修復する必要がある少なくとも１本の欠損歯を有する。
【０００３】
チタンなどの一部の金属材料は、生体適合性材料が実証されている。例えば、チタン製インプラントの使用は、欠損歯を補充するため、そして罹患した骨、骨折した骨もしくは移植された骨を固定するための標準療法となってきた。チタン製インプラントなどの歯科用インプラントを用いる欠損歯の修復治療は、それによって咀嚼機能(Carlsson GE,Lindquist LW,Int.J.Prosthodont 7(5):448-53(1994);Geertman ME,et al.,Community Dent Oral Epidemiol 24(1):79-84(1996);Pera P,et al.,J Oral Rehabil 25(6):462-7(1998);van Kampen FM,et al.,J Dent Res 83(9):708-11(2004))、発話(Heydecke G,et al.,J Dent Res 83(3):236-40(2004))ならびに日常的行動およびクオリティ・オブ・ライフ(Melas F,et al.,Int J Oral Maxillofac Implants 16(5):700-12(2001))が改善されるものであるが、従来型の可撤式歯科治療と比較して、相当に大きな口腔衛生上の影響を及ぼす。癌もしくは傷害の結果として生じた顔面の欠陥を治療する際には、プロテーゼを保持するために骨内インプラントの使用が極めて重要である(Roumanas ED,et al.,Int J Prosthodont 15(4):325-32(2002))。しかし、これらの分野におけるインプラント療法の適用は、宿主骨の解剖学的構造および質(van Steenberghe D,et al.,Clin Oral Implants Res 13(6):617-22(2002))、糖尿病を含む全身性状態(Nevins ML,Int J Oral Maxillofac Implants 13(5):620-9(1998);Takeshita F,et al.,J Periodontol 69(3):314-20(1998)および骨粗鬆症(Ozawa S,et al.,Bone 30(1):137-43(2002))、ならびに老化(Takeshita F,et al.,J Biomed Mater Res 34(1):1-8(1997))を含む様々なリスク因子のために今も限定されている。より重要なことに、チタン製インプラントが周囲骨と結合するために必要とされる長い治癒期間（約４〜１０カ月間）により、この有益な治療の適用が制限される。例えば、米国内では、歯科用インプラント療法は潜在的患者の２％にしか浸透していない。
【０００４】
整形外科の分野では、例えば大腿骨頸骨折もしくは脊椎癒合の修復は、一般的な問題である。例えば、脊椎固定術のために米国内で毎年実施される２５０，０００例を超える手技中、約３０％以上の患者では確実な骨癒合が達成されていない。これらの領域での骨折は、その性質および場所のために、より良好な治癒のための骨固定化（例、鋳造副子固定術）ができない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
このため、金属製インプラントによるより迅速かつ強力な骨の固定が必要とされている。さらにより強力な骨セメント−金属製インプラントの界面強度に対する必要もある。以下に記載する実施形態は、上記に同定した問題および必要に対応するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本明細書に提供されるのは、医療用インプラントの組織結合能力および／または強化された骨セメント−金属製インプラントの界面強度を強化するための医療用インプラントを処理する方法である。本方法は、医療用インプラントがナノ構造トポグラフィを有する表面を生成することを誘発するために医療用インプラントへ高エネルギー放射線を適用する工程を含む。本医療用インプラントは金属材料および／または非金属材料を含むことができ、任意でセメント組成物を含むことができる。ナノ構造トポグラフィは、ナノスフェア(nanosphere、ナノ粒子)、ナノコーン(nanocone)、ナノピラミッド(nanopyramid)などのナノ構築物、他のナノ構築物、またはそれらの組み合わせを含むことができる。一部の実施形態では、ナノ構築物は、約１ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍ、または約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの範囲内にあるサイズを有する。
【０００７】
本医療用インプラントは、金属製インプラントまたは非金属製インプラントであってよい。一部の実施形態では、本医療用インプラントは、チタン製インプラント、例えば欠損歯を補充するための（歯科用インプラント）、または罹患した、骨折した、もしくは移植された骨を固定するためのチタン製インプラントなどの金属製インプラントである。その他の代表的な金属製インプラントには、チタン合金製インプラント、クロム−コバルト合金製インプラント、白金および白金合金製インプラント、ニッケルおよびニッケル合金製インプラント、ステンレススチール製インプラント、ジルコニウム、クロム−コバルト合金製、金もしくは金合金製インプラント、およびアルミニウムもしくはアルミニウム合金製インプラントが含まれるが、それらに限定されない。
【０００８】
本明細書に記載した医療用インプラントもしくは器具は、本医療用インプラントへ高エネルギー放射線を適用する工程を含むプロセスによって作製できる。本明細書に提供する医療用インプラントは、欠損歯などの医学的状態の症状を治療する、予防する、緩和する、もしくは減少させるために、大腿骨頸骨折、脛骨骨折、手関節骨折、脊椎骨折／障害もしくは脊椎円板置換術、骨折もしくは膝関節炎などの関節の変性性変化、癌、傷害、全身性代謝、感染および老化などの身体状態もしくは障害によって惹起される骨および他の組織欠損もしくは退縮、障害および疾患の結果として生じる手足の切断、ならびにそれらの組み合わせなどの整形外科的固定または骨関連性医学的状態に対する必要のために使用できる。
【０００９】
本明細書で提供されるインプラントは、より良好な組織結合もしくは組織付着のために表面積もしくは表面粗さを増加させるために様々な確立された表面処理を受けさせることができる。代表的な表面処理には、物理的処理および化学的処理が含まれるがそれらに限定されない。物理的処理には、例えば、機械加工プロセス、サンドブラストプロセス、金属蒸着、非金属蒸着（例、アパタイト蒸着）、またはそれらの組み合わせが含まれる。化学的処理には、例えば、酸、塩基（例、アルカリ処理）、酸化、およびそれらの組み合わせなどの化学物質を用いるエッチングが含まれる。例えば、金属製インプラントは、機械加工プロセスまたは酸エッチングプロセスによって様々な表面トポグラフィを形成できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本明細書で提供されるのは、医療用インプラントの組織結合能力および／または強化された骨セメント−金属製インプラントの界面強度を強化するための医療用インプラントを処理する方法である。本方法は、医療用インプラントがナノ構造トポグラフィを有する表面を生成することを誘発するために医療用インプラントへ高エネルギー放射線を適用する工程を含む。本医療用インプラントは金属材料および／または非金属材料を含むことができ、任意でセメント組成物を含むことができる。ナノ構造トポグラフィは、ナノスフェア、ナノコーン、ナノピラミッドなどのナノ構築物、他のナノ構築物またはそれらの組み合わせを含むことができる。一部の実施形態では、ナノ構築物は、約１ｎｍ〜約５００ｎｍ、約１ｎｍ〜約２００ｎｍ、約１ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約１０ｎｍ〜約７０ｎｍ、約２０ｎｍ〜約５０ｎｍまたは約２０ｎｍ〜約４０ｎｍの範囲内にあるサイズを有する。
【００１１】
本明細書で使用するように、用語「組織結合能力」は、医療用インプラントが生体の組織内に結合される能力を指す。インプラントの組織結合能力は、一般に数種の要素によって測定できるが、それらのうちの１つは、インプラント表面の親水性／親油性（疎水性）、または好血性を反映するインプラント表面の湿潤性である。親水性および親油性は、相対語であり、例えば、水の接触角(Oshida Y,et al.,J Mater Science 3:306-312(1992)）、および水の拡散面積（岐阜高専のオンラインテキスト、http://www.gifu-nct.ac.jp/elec/tokoro/fft/contact-angle.html)によって測定できる。本発明のためには、親水性／親油性は、コントロールインプラント表面の１つに比較した本明細書に記載したインプラント表面の水の接触角もしくは拡散面積によって測定できる。本明細書に記載したプロセスを用いて処理されていないインプラント表面と比較して、本明細書に記載したプロセスを用いて処理された医療用インプラントは、実質的に低い水の接触角または実質的に大きな水の拡散面積を有する。
【００１２】
本医療用インプラントは、金属製インプラントまたは非金属製インプラントであってよい。一部の実施形態では、医療用インプラントは、チタン製インプラント、例えば欠損歯を補充するための（歯科用インプラント）、または罹患した、骨折した、もしくは移植された骨を固定するためのチタン製インプラントなどの金属製インプラントである。その他の代表的な金属製インプラントには、チタン合金製インプラント、クロム−コバルト合金製インプラント、白金および白金合金製インプラント、ニッケルおよびニッケル合金製インプラント、ステンレススチール製インプラント、ジルコニウム、クロム−コバルト合金、金もしくは金合金製インプラント、ならびにアルミニウムもしくはアルミニウム合金製インプラントが含まれるが、それらに限定されない。
【００１３】
本明細書に記載した医療用インプラントもしくは器具は、本医療用インプラントへ高エネルギー放射線を適用する工程を含むプロセスによって作製できる。本明細書に提供する医療用インプラントは、欠損歯などの医学的状態の症状を治療する、予防する、緩和する、もしくは減少させるために、大腿骨頸骨折、脛骨骨折、手関節骨折、脊椎骨折／障害もしくは脊椎円板置換術、骨折もしくは膝関節炎などの関節の変性性変化、癌、傷害、全身性代謝、感染および老化などの身体状態もしくは障害によって惹起される骨および他の組織欠損もしくは退縮、障害および疾患の結果として生じる手足の切断、ならびにそれらの組み合わせなどの整形外科的固定または骨関連性医学的状態に対する必要のために使用できる。
【００１４】
本明細書で提供されるインプラントは、より良好な組織結合もしくは組織付着のために表面積もしくは表面粗さを増加させるために様々な確立された表面処理を受けさせることができる。代表的な表面処理には、物理的処理および化学的処理が含まれるがそれらに限定されない。物理的処理には、例えば、機械加工プロセス、サンドブラストプロセス、金属蒸着、非金属蒸着（例、アパタイト蒸着）、またはそれらの組み合わせが含まれる。化学的処理には、例えば、酸、塩基（例、アルカリ処理）、酸化、およびそれらの組み合わせなどの化学物質を用いるエッチングが含まれる。例えば、金属製インプラントは、機械加工プロセスまたは酸エッチングプロセスによって様々な表面トポグラフィを形成できる。
【００１５】
本明細書で使用する用語「光線処理」は、用語「光線活性化」、「光線照射（ｌｉｇｈｔ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）」、「光線照射（ｌｉｇｈｔ  ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）」、「ＵＶ活性化」、「ＵＶ光照射（ｒａｄｉａｔｉｏｎ）」、または「ＵＶ光照射（ｉｒｒａｄｉａｔｉｏｎ）」と互換的に使用できる。
【００１６】
医療用インプラント
強化された組織結合能力を備える本明細書に記載した医療用インプラントには、医学において現在利用できる、または骨折において導入できる任意のインプラントが含まれる。本インプラントは、金属製インプラントまたは非金属製インプラントであってよい。非金属製インプラントには、例えばセラミック製インプラント、リン酸カルシウム製もしくはポリマー製インプラントが含まれる。有用なポリマー製インプラントは、任意の生体適合性インプラント、例えば生分解性ポリマー製インプラントであってよい。代表的なセラミック製インプラントには、例えば、バイオガラスおよび二酸化ケイ素製インプラントが含まれる。リン酸カルシウム製インプラントには、例えば、ハイドロキシアパタイト、リン酸三カルシウム（ＴＣＰ）が含まれる。典型的なポリマー製インプラントには、例えば、乳酸・グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリメタクリレートおよびポリアクリレートなどのポリアクリレート、ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）製インプラントが含まれる。一部の実施形態では、本明細書に記載した医療用インプラントは、詳細には上記の物質のいずれかを除外できる。
【００１７】
一部の実施形態では、本インプラントは、金属製インプラントおよび骨セメント材料を含む。骨セメント材料は、当分野において知られている任意の骨セメント材料であってよい。一部の代表的な骨セメント材料には、ポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）／メチルメタクリレート（ＭＭＡ）などのポリアクリレートもしくはポリメタクリレートをベースとする材料、ＰＬＡもしくはＰＬＧＡなどのポリエステルをベースとする材料、バイオガラス、セラミック、リン酸カルシウムをベースとする材料、カルシウムをベースとする材料、ならびにそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書に記載した医療用インプラントは、詳細には上記の物質のいずれかを除外できる。
【００１８】
本明細書に記載した医療用インプラントには、チタン製インプラントおよび非チタン製インプラントが含まれる。チタン製インプラントには、チタンもしくはチタンを含む合金から製造された歯牙もしくは骨代替物が含まれる。チタン製骨代替物には、例えば、膝関節および股関節プロテーゼ、大腿骨頸代替物、脊椎代替物および修復部品、頸骨代替物および修復部品、顎骨修復部品、固定および強化用、移植骨の固定用、および他の四肢プロテーゼが含まれる。非チタン金属製インプラントには、金、白金、タンタル、ニオビウム、ニッケル、鉄、クロム、コバルト、マグネシウム、マグネシウム、アルミニウム、パラジウム、ジルコニウム、クロム−コバルト合金、例えばステンレススチールなどのそれらから形成された合金、またはそれらの組み合わせから作製された歯牙もしくは骨インプラントが含まれる。一部の実施形態では、金属製インプラントは、詳細には上記の物質のいずれかを除外できる。
【００１９】
本明細書に記載した医療用インプラントは、多孔性または非多孔性インプラントであってよい。多孔性インプラントはより良好な組織結合を付与できるが、非多孔性インプラントはより良好な機械的強度を付与できる。
【００２０】
高エネルギー放射線
本明細書に提供する強化された組織結合能力を備える医療用インプラントは、ある期間にわたり高エネルギー放射線を用いて医療用インプラントを処理する工程によって形成できる。照射期間の長さは、インプラントのタイプに依存する。金属製インプラント（例、チタン製インプラント）のためには、照射期間は、一般には約１分間〜約１カ月間、例えば、約１分間〜約１時間、約１時間〜約５時間、約５時間〜約２４時間、約１日間〜約５日間、約５日間〜約１０日間、または約１０日間〜約１カ月間の範囲に及ぶ。非金属製インプラント、例えば生体適合性、生体内耐久性のポリマー製インプラントのためには、照射期間は、一般には約１分間〜約１カ月間、例えば、約１分間〜約１時間、約１時間〜約５時間、約５時間〜約２４時間、約１日間〜約５日間、約５日間〜約１０日間、または約１０日間〜約１カ月間の範囲に及ぶ。
【００２１】
用語「高エネルギー放射線」には、光波もしくは磁気波による放射線が含まれる。一部の実施形態では、用語「高エネルギー」は、約４００ｎｍ以下の、例えば、約３５０ｎｍ、約３００ｎｍ、約２５０ｎｍ、約２００ｎｍ、約１５０ｎｍ、約１００ｎｍ、約５０ｎｍ、または約１０ｎｍの波長を有する放射線を指す。
【００２２】
一部の実施形態では、放射線は、約５ｎｍ以下の、約１ｎｍ、約０．５ｎｍ、約０．１ｎｍ、約０．０５、約０．０１、約０．００５または約０．００１ｎｍの波長を有していてよい。約４００ｎｍ〜１０ｎｍの波長を有する放射線は、一般には紫外線と呼ばれており、約１０ｎｍ〜０．１ｎｍの波長を有する放射線は一般にｘ線と呼ばれており、そして約０．１ｎｍ〜約０．００１ｎｍの波長を有する放射線は一般にγ線と呼ばれている。
【００２３】
本医療用インプラントは、滅菌を行って、または行わずに照射することができる。当業者であれば、本医療用インプラントは、高エネルギー照射（例、ＵＶ照射）の工程中に滅菌できる。
【００２４】
本発明のまた別の態様では、医療用インプラントを照射するための設備または器具が提供される。１つの実施形態では、設備もしくは器具には、医療用インプラントを配置するためのチャンバ、高エネルギー放射線源、および放射線のスイッチをオンオフするためのスイッチが含まれる。設備もしくは器具は、さらにタイマーを含むことができる。一部の実施形態では、設備もしくは器具は、インプラントの十分な照射のために医療用インプラントもしくは高エネルギー放射線源が回転もしくは旋回することを引き起こす機構をさらに含むことができる。または、医療用インプラントを配置するためのチャンバは、放射線を様々な角度、例えば３６０°の角度から医療用インプラントに方向付けることができるような反射面を有することができる。一部の実施形態では、設備もしくは器具は、強化された骨結合能力の保持機構、例えば光線の多重照射、放射線透過性インプラントパッケージング、パッキングおよび輸送を含むことができる。
【００２５】
医療使用
本明細書に提供する医療用インプラントは、哺乳動物被験者に医療用インプラントを植え込む工程によって医学的状態の症状を治療する、予防する、改善する、補正する、または減少させるために使用できる。哺乳動物被験者は、ヒト、またはイヌ、ネコ、ウマ、ウシ、雄ウシ、またはサルなどの家畜動物であってよい。
【００２６】
本明細書に提供するインプラントを用いて治療もしくは予防できる代表的な医学的状態には、大腿骨頸骨折、欠損歯などの欠損歯もしくは骨関連性医学的状態、大腿骨頸骨折、頸部骨折、手関節骨折、脊椎骨折／障害もしくは脊椎円板置換術などの整形学的固定もしくは骨関連性医学的状態に対する必要、膝関節炎などの関節の骨折もしくは変性性変化、例えば癌、障害、全身性代謝、感染もしくは老化などの障害もしくは身体状態によって誘発された骨およびその他の組織欠損もしくは退縮、ならびにそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されない。
【００２７】
本発明の実施形態を以下に記載した実施例によって具体的に説明する。すべてのパラメータおよびデータは、本発明の実施形態の範囲を過度に限定すると解釈されてはならない。
【実施例１】
【００２８】
光線誘発性の超両親媒性チタン製インプラントによる骨生成
方法
チタンサンプル、表面分析および紫外線（ＵＶ）照射
２つの表面タイプの市販の純チタンを円筒形インプラント（径１ｍｍおよび長さ２ｍｍ）およびディスク（径２０ｍｍおよび厚さ１．５ｍｍ）について調製した。一方は、レーズ（ｌａｔｈｅ）によって回転させた機械加工された表面を有した。他方は、Ｈ２ＳＯ４およびＨＣｌを用いて二重酸エッチングされた（Ｏｓｓｅｏｔｉｔｅ（登録商標）；Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ社、フロリダ州ウェストパームビーチ）。チタン製ディスクは、γ線によって滅菌した。表面形態は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＪＳＭ−５９００ＬＶ、Ｊｏｅｌ社、日本国東京）および原子間力顕微鏡（ＳＰＭ−９５００Ｊ３、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社、日本国東京）によって試験した。平均粗さ（Ｒａ）、二乗平均平方根粗さ（Ｒｒｍｓ）および山−谷粗さ（Ｒｐ−ｖ）を計算した。チタン製ディスクおよびインプラントは、換気をしながら４８時間にわたり０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢのレベルでＵＶ照射した。
【００２９】
チタン表面の湿潤性
蒸留水（親水性試験）およびグリセロール（親油性試験）の接触角および拡散面積。さらに、ラット大動脈から抽出した血液を使用した。１０μＬの蒸留水およびグリセロールをチタン表面上に静かに沈着させ、直ちにデジタル写真を撮影した。拡散面積は、デジタルアナライザ（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ、  Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、メリーランド州シルバースプリング）を用いて平面図における液滴の面積として計測した。接触角θは、方程式：θ＝２ｔａｎ−１（２ｈ／ｄ）（式中、ｈおよびｄは側面図における液滴の高さおよび径である）によって入手した。
【００３０】
細胞培養
８週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットの大腿骨から単離した骨髄細胞は、１５％ウシ胎児血清、５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸、１０−８Ｍのデキサメタゾン、ならびに１０，０００単位／ｍＬのペニシリンＧ溶液、１０，０００ｍｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンおよび２５ｍｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを含有する抗生物質−抗真菌薬溶液を補給したα修正イーグル培地中に入れた。細胞は、９５％の空気、５％のＣＯ２からなる３７℃の加湿雰囲気下でインキュベートした。８０％のコンフルエンシーで、０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−４Ｎａを用いて細胞を剥離させ、１０ｍＭのＮａ−β−グリセロリン酸を含む上述した培地中で５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で機械加工されたチタンもしくは酸エッチングされたチタン製ディスクのどちらかに播種した。培養培地は３日間毎に入れ替えた。ＵＶ照射チタンが線維芽細胞の挙動に及ぼす作用を試験するために、ＮＩＨ３Ｔ３細胞を培養した。
【００３１】
増殖アッセイ
細胞は、ＰＢＳを用いて静かに２回すすぎ洗いし、３７℃で１５分間にわたり３００μＬの０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ中の０．１％コラゲナーゼを用いて処理した。血球計数器を使用して剥離した細胞の数を計数した。選択した基質は、残留している細胞がないことを確証するために走査型電子顕微鏡下で試験した。
【００３２】
遺伝子発現分析
定常状態遺伝子発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて分析した。培養中の全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）および精製カラム（ＲＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出した。ＤＮＡｓｅ  Ｉ処理後に、０．５μｇの全ＲＮＡの逆転写はオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州カールズバッド）の存在下でＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて実施した。ＰＣＲ反応は、α−ＩのＩ型コラーゲン、オステオポンチン、およびオステオカルシンｍＲＮＡを検出するためにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＸ  Ｔａｑ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社、ウィスコンシン州マディソン）を用いて実施した。プライマー配列およびＰＣＲ条件は、補遺２に記載されている。結果として生じた生成物は、臭化エチジウム染色を用いて１．５％アガロースゲル上で視認した。バンドの強度はＵＶ下で定量した（Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅ  ＩＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）。これらの数値は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを参照して標準化した。
【００３３】
鉱化アッセイ
鉱化培養は蒸留水を用いて３回すすぎ洗いし、一晩乾燥させ、写真撮影した。デジタル画像は、デジタルイメージングソフトウエア（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ５．０、Ａｄｏｂｅ社、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて背景色を減じるために処理した。処理した画像は、（白色面積／全ウエル面積）×１００（％）であると規定された鉱化した塊の面積についてデジタル画像分析システム（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ、メリーランド州）によって分析した。
【００３４】
動物の手術
５匹の８週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットに１〜２％のイソフルラン吸入を用いて麻酔をかけた。それらの脚を剃毛して１０％ポビドン−イオジン溶液を用いてスクラブ洗浄した後、大腿骨の遠位側面は皮膚切開および筋肉切開によって露出させた。インプラント配置のために遠位大腿骨の平面を選択した。植込み部位は、０．８ｍｍのラウンドバー、その後にリーマー＃ＩＳＯ  ０９０および１００を用いてドリル穿孔する工程によって大腿骨の遠位端から１１ｍｍに準備した。冷却および清浄化のために無菌等張生理食塩液を用いて十分も洗浄した。１つの未処理円筒形インプラントおよび１つのＵＶ照射インプラントを右および左大腿骨に各々配置した。インプラントの安定性は、受動的な機械的適合を用いて確証した。次に外科部位は、層状で閉鎖した。筋肉および皮膚は、吸収性縫合糸を用いて個別に縫合した。カリフォルニア州立大学ロサンゼルス校（ＵＣＬＡ）学長を長とする動物研究委員会は本試験のプロトコルを承認し、全実験は米合衆国農務省動物研究ガイドラインにしたがって実施した。
【００３５】
インプラントの生体力学的押込み試験
骨−インプラント結合の生体力学的強度を評価するための本方法は、他の場所で記載されている（Ｏｇａｗａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  ７９（１１）：１８５７−６３（２０００））。手短には、円筒形インプラントを含有する大腿骨を採取し、直ちにインプラントレベルを上面にして自家重合樹脂中に包埋した。２０００Ｎのロードセルおよびプッシュロッド（径＝０．８ｍｍ）を備える試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ５５４４電気機械試験システム、Ｉｎｓｔｒｏｎ社、メリーランド州カントン）を使用して１ｍｍ／分のクロスヘッド速度で下向きに垂直にインプラントへ負荷をかけた。押込み試験値は、負荷変位曲線のピークを測定することによって決定した。
【００３６】
ＵＶ誘発性親水性について試験されたその他の金属表面
様々な表面タイプおよび他の金属上のＵＶ誘発性親水性を取り扱うために、市販の純チタンの３種の相違する表面特性、ならびにチタンおよびクロム−コバルト合金の機械加工された表面を調製した。機械加工および酸エッチングされた表面以外の３種の相違するチタン表面は、電子ビームエバポレータを用いて蒸着されたチタン表面、酸化アルミニウム粒子を用いてサンドブラスト処理された表面および６００℃で加熱することにより酸化された表面であった。
【００３７】
統計的分析
ｔ検定を使用して、未処理コントロールとＵＶ照射実験群との差を試験した；＜０．０５を統計的有意と見なした。
【００３８】
結果
チタンの２種の相違する表面トポグラフィ：機械加工された表面および酸エッチングされた表面を調製した。ＳＥＭ試験は、機械加工された表面上で等方性および同心性の逆隆起部を示したが（図１ａ）、他方では酸エッチングされた表面は一様な粗面を示した。ＡＦＭ画像は、機械加工された表面の平滑な波状表面ならびに酸エッチングされた表面のミクロンおよびサブミクロンレベルの粗さを示した（図１ｂ）。両方の表面タイプは、エネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）分析（図１ｃ）によって示されたように、汚染を含んでいない市販の純チタンから構成された。平均粗さ（Ｒａ）、二乗平均平方根粗さ（Ｒｒｍｓ）および山−谷粗さ（Ｒｐ−ｖ）は、機械加工された表面については各々２４．４±５．１ｎｍ、３０±８．２ｎｍ、および１９４．０±４２ｎｍであり、酸エッチングされた表面については２５７．６±４３．２ｎｍ、３０１．６±５０．５ｎｍ、および１９８８．７±５５４．９ｎｍであった。図１ａ〜１ｃでは、ＵＶ照射を０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢのレベルで４８時間にわたり実施した。
【００３９】
チタン表面の湿潤性（親水性、親油性および好血性）における変化およびそれらの保持について試験した。１０μＬの水滴の拡散面積が、ＵＶ照射後に機械加工された表面（１３倍）および酸エッチングされた表面（３０倍）の両方について劇的に増加することは明白であった（図２ａ）。図２ａに示したように、親水性の時間依存性保持もまた提示されている。親水性は、１０μＬの蒸留水の拡散面積（液滴の上面図）および接触角（液滴の側面図）によって評価した。両方の表面トポグラフィ上へのＵＶ照射後に接触角が０．０±０．０°であったことに留意されたい。機械加工された表面および酸エッチングされた表面について６９．９°および８８．４°であった照射前の水の接触角は、ＵＶ照射後に各々０．０±０．０°へ急落した。ＵＶ誘発性親水性は、時間が経過するにつれて弱まり、機械加工された表面より酸エッチングされた表面についての方が有効性であり、より長く保持された。拡散面積によって表示された親水性は、２週間の照射後には、機械加工された表面および酸エッチングされた表面について各々２倍および４倍を超えていた。酸エッチングされた表面の水の拡散によって測定された親水性は、４週間後でさえ、コントロールの２倍高かった。両方の表面タイプについてグリセロールの１０μＬの液滴（図２ｂ）を用いた親油性および５０μＬの血液の液滴（図２ｃ）を用いた好血性の劇的な利得もまた見いだされ、チタン表面のＵＶにより生成された高両親媒性（親水性かつ親油性両方）の確立が確証された。図２ａ〜２ｃでは、記号「＊」は、データがＵＶ照射および未処理コントロール間で統計的有意であることを意味している（ｐ＜０．０００１）。
【００４０】
その細胞親和性（細胞走化性および細胞拡散）、細胞増殖能力、骨関連性タンパク質の遺伝子発現、インビトロ鉱化能力、チタン製インプラントおよび骨生成の生体力学的安定性の確立による骨形成能力についてのＵＶ誘発性両親媒性チタンを試験した。両親媒性チタンの化学走化性能力を評価するために、ラット骨髄に由来する骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）は、細胞のほとんどがチタン表面の側方に面するように（図３ａ）チタン製ディスクを垂直に据え付けたポリスチレン皿内に播種した。図３ａでは、骨髄由来骨芽細胞は垂直に据え付けたチタン表面の方向を向いていた（左上パネル）。ＵＶ照射を行った（右上）、もしくは行っていない（中上）チタン表面に付着した細胞を３時間のインキュベーション後に計数した。コントロール表面よりＵＶ照射された表面への方がより多くの細胞が付着した。
【００４１】
細胞増殖を評価するために、ＢＭＳＣはポリスチレン皿内に水平に配置された機械加工および酸エッチングされたチタン製ディスク上に接種した。ＵＶ照射は、３および７日後に両方の表面上で２倍へ細胞増殖を促進した（図３ｂ）。図３ｂでは、細胞密度は、チタン製ディスクがポリスチレン培養皿内に水平に配置された培養中の細胞数として規定した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている。記号「＊」は、データが、ＵＶ照射および未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１）。
【００４２】
遺伝子発現は、ＢＭＳＣを用いて骨芽細胞培養の数種の時点にＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）によって試験した。コラーゲンＩ、オステオポンチンおよびオステオカルシンの遺伝子発現は、骨芽細胞分化の各々早期、中期および後期での代表的遺伝子マーカーとして試験した（図４ａおよび４ｂ）。７、１４および２８日後の全時点に、遺伝子は両方の表面タイプについてＵＶ照射チタン上でアップレギュレートされたが、これはＵＶにより生成された両親媒性チタン上の骨芽細胞内へのＢＭＳＣの促進された分化を示していた。図４ａは、臭化エチジウム染色を用いて視認された逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）の画像を示している。サンプルは、機械加工されたチタン（上）および酸エッチングされたチタン（下）上の骨芽細胞培養から入手した。図４ｂは、機械加工されたチタン（上）および酸エッチングされたチタン（下）培養について遺伝子の定量された発現レベルおよび時間経過を示している。バンドの強度は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現のレベルによって標準化した。
【００４３】
骨芽細胞鉱化能力にＵＶ照射が及ぼす作用を、ＢＭＳＣ／骨芽細胞培養中の鉱化中の塊の形成によって評価した（図５）。ＵＶ照射後の鉱化中の塊の増加した面積は、機械加工および酸エッチングされたチタン表面上の両方で見いだされた。ＵＶ作用は、１００％〜１５０％の増加を示している酸エッチングされた表面についてより顕著であった。図５では、上方パネルはＵＶ照射を行った、または行わなかった機械加工されたチタン表面および酸エッチングされたチタン表面上の乾燥させた鉱化培養の代表的な画像を示しているが、下方パネルは定量的な鉱化した塊の面積を示している。培養面積に比較した鉱化した塊の面積のパーセンテージは、デジタル画像分析装置を用いて測定した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている。記号「＊」は、データが、ＵＶ照射および未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１）。
【００４４】
ＵＶ照射を行った、または行わなかったチタン製インプラントのインビボ固定は、生体力学的インプラント押込み試験を用いて試験した（図６）。図６によって示した試験では、ＵＶ照射を行った、または行わなかったチタン製インプラントをラット大腿骨内に配置し、インプラントの生体力学的安定性は、押込み負荷に対する破壊強度を測定することによって植込みの２および４週間後に評価した（上方パネル）。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝５）として表示されている。記号「＊」は、データがＵＶ照射および未処理コントロール間で統計的有意であることを示しているが（ｐ＜０．０５）、他方記号「＊＊」はデータがＵＶ照射および未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１）。ラット大腿骨内に配置されたインプラントは垂直に押し込まれ、破壊時の力（負荷変位曲線上の最大力）は押込み試験値として測定された。植込み２週間後の押込み試験値は、ＵＶ照射による機械加工された表面および酸エッチングされた表面について各々１．８倍および３．１倍に急上昇した。４週間後には、ＵＶ照射インプラントの押込み試験値は、機械加工された表面および酸エッチングされた表面について、未処理インプラントに比較して各々５０％および６０％の優位性を保持した。
【００４５】
チタン製インプラントの本体周囲での骨の生成および保持のためには、インプラントの頸部領域周囲での上皮および歯肉組織などの軟組織の成長および保持が、歯科用インプラントの適正な機能および審美性のために重要である。ＵＶ誘発性両親媒性チタンの軟組織成長能力について、線維芽細胞の増殖率を測定することによって試験した。ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞はＵＶ照射を行って、または行わずに機械加工されたチタン製ディスク上に播種し、３日後に細胞密度を評価した。ＵＶ活性化チタン上の増殖率は、未処理コントロール上の増殖率に比較して１００％増加した（図７）。図７では、ＵＶ照射を行った、または行わなかった機械加工されたチタン表面に付着したＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞が３時間のインキュベーション後に計数された。細胞密度は、培養中の細胞数と規定された。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている。記号「＊」は、データが、ＵＶ照射および未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１）。
【００４６】
様々な表面タイプおよび他の金属上のＵＶ誘発性親水性を取り扱うために、市販の純チタンの３種の相違する表面特性、ならびにチタンおよびクロム−コバルト合金の機械加工された表面を調製して試験した。ＵＶ照射は、蒸着されたチタン表面、サンドブラスト処理されたチタン表面、酸化されたチタン表面、機械加工されたチタン合金表面および機械加工されたクロム−コバルト表面上に高度に親水性の表面を誘発した（図８）。図８では、親水性は、１０μＬの蒸留水の液滴の拡散面積および接触角によって評価された。試験した全部のチタン表面タイプおよびチタン合金表面へのＵＶ照射後に接触角は０．０±０．０°であったことに留意されたい。クロム−コバルト合金もまたＵＶ照射による改善された親水性を示した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている。記号「＊」は、データが、ＵＶ照射および未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１）。
【００４７】
考察
上述の結果は、チタンの紫外線（ＵＶ）により誘発された両親媒性表面を示しており、照射は骨−チタン製インプラント結合の加速かつ強化された確立を生じさせる。一般に、インプラント処理の成功した転帰は、オッセオインテグレーション（骨結合）または骨−チタン結合と呼ばれるチタン製インプラントの周囲の骨の生成および保持に貢献する。上述したオッセオインテグレーションの現象は、以下の点で独創的である。（１）新規骨形成はインプラントが配置された場合にのみ開始する（例えば、ＬｅＧｅｒｏｓ  ＲＺ，Ｃｒａｉｇ  ＲＧ，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ  ８  Ｓｕｐｐｌ  ２（Ｓ５８３−９６（１９９３）；Ｏｇａｗａ  Ｔ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｉ，Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｒａｌ  Ｍａｘｉｌｌｏｆａｃ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  １８（２）：２００−１０（２００３）を参照されたい）；（２）骨形成は置換部位の治癒が完了した後でさえ長期間にわたって持続する（Ｇｒｉｚｏｎ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｅｎｔ  ３０（５−６）：１９５−２０３（２００２）；Ｔａｋｅｓｈｉｔａ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ３７（２）：２３５−４２（１９９７）；（３）いったん確立すると、骨質量は代謝回転されることなく保持される（Ｏｇａｗａ  Ｔ，Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  Ｉ，２００３）。
【実施例２】
【００４８】
光線誘発性超両親媒性チタンは選択的な細胞親和性および組織親和性を通して骨−インプラント結合を促進および強化する。
方法
チタンサンプル、表面分析および紫外線（ＵＶ）照射。市販の純チタンの２種の表面タイプを円筒形インプラント（径１ｍｍおよび長さ２ｍｍ）およびディスク（径２０ｍｍおよび厚さ１．５ｍｍ）について調製した。一方は、レーズによって回転させた、機械加工された表面を有した。他方は、Ｈ２ＳＯ４およびＨＣｌを用いて二重酸エッチングされた（Ｏｓｓｅｏｔｉｔｅ（登録商標）；Ｉｍｐｌａｎｔ  Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ社、フロリダ州ウェストパームビーチ）。チタン製ディスクは、γ線によって滅菌した。表面形態は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＪＳＭ−５９００ＬＶ、Ｊｏｅｌ社、日本国東京）および原子間力顕微鏡（ＳＰＭ−９５００Ｊ３、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社、日本国東京）によって試験した。平均粗さ（Ｒａ）、二乗平均平方根粗さ（Ｒｒｍｓ）および山−谷粗さ（Ｒｐ−ｖ）を計算した。チタン製ディスクおよびインプラントは、換気をしながら４８時間にわたり０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢで照射した。
【００４９】
チタン表面の湿潤性。蒸留水（親水性試験）およびグリセロール（親油性試験）の接触角および拡散面積。さらに、ラット大動脈から抽出した血液を使用した。１０μＬの蒸留水およびグリセロールをチタン表面上に静かに沈着させ、直ちにデジタル写真を撮影した。拡散面積は、デジタルアナライザ（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、メリーランド州シルバースプリング）を用いて平面図における液滴の面積として計測した。接触角θは、方程式：θ＝２ｔａｎ−１（２ｈ／ｄ）（式中、ｈおよびｄは側面図における液滴の高さおよび径である）によって入手した（Ｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３，３０６−３１２（１９９２））。
【００５０】
骨芽細胞培養。８週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットの大腿骨から単離した骨髄細胞は、１５％ウシ胎児血清、５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸、１０−８Ｍのデキサメタゾン、ならびに１０，０００単位／ｍＬのペニシリンＧ溶液、１０，０００ｍｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンおよび２５ｍｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを含有する抗生物質−抗真菌薬溶液を補給したα修正イーグル培地中に入れた。細胞は、９５％空気、５％のＣＯ２からなる３７℃の加湿雰囲気下でインキュベートした。８０％のコンフルエンシーで、０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−４Ｎａを用いて細胞を剥離させ、１０ｍＭのＮａ−β−グリセロリン酸を含む上述した培地中で５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度で機械加工されたチタンもしくは酸エッチングされたチタン製ディスクのどちらかに播種した。培養培地は３日間毎に入れ替えた。
【００５１】
線維芽細胞培養。ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞は、１０％ウシ胎児血清および１００Ｕ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよび０．２５μｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを補給したダルベッコの修正イーグル培地（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、ニューヨーク州グランドアイランド）中で培養した。８週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットの下顎側切歯の周囲の歯肉組織から採取した歯肉線維芽細胞は以前に確立されたプロトコールを用いて採取し、ＮＩＨ３Ｔ３細胞と同一方法を用いて培養した。
【００５２】
増殖および化学走化性アッセイ。細胞増殖を試験するために、骨芽細胞はポリスチレン製培養皿上に水平に配置したチタン製ディスク上でインキュベートした。細胞は、ＰＢＳを用いて静かに２回すすぎ洗いし、３７℃で１５分間にわたり３００μＬの０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ中の０．１％コラゲナーゼを用いて処理した。血球計数器を使用して剥離した細胞の数を計数した。チタン培養のＳＥＭ画像もまた確証するために試験した。チタン表面への骨芽細胞の化学走化性を評価するために、細胞は垂直に配置したチタン製ディスクとともに３時間にわたりインキュベートした。付着した細胞は上述したように計数して画像撮影した。
【００５３】
遺伝子発現分析。定常状態遺伝子発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて分析した。ポリメラーゼ連鎖反応のためのプライマーおよび条件は、以下の表に列挙した。
【表１】
2008532640.tif 000003
【００５４】
培養中の全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）および精製カラム（ＲＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出した。ＤＮＡｓｅ  Ｉ処理後、０．５μｇの全ＲＮＡの逆転写は、ＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いてオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州カールズバッド）の存在下で実施した。ＰＣＲ反応は、α−ＩのＩ型コラーゲン、オステオポンチン、およびオステオカルシンｍＲＮＡを検出するためにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＸ  Ｔａｑ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社、ウィスコンシン州マディソン）を用いて実施した。プライマー配列およびＰＣＲ条件は補遺の方法の項に記載されている。結果として生じた生成物は、臭化エチジウム染色を用いて１．５％アガロースゲル上で視認した。バンドの強度はＵＶ光下で定量した（Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅ  ＩＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）。これらの数値は、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを参照して標準化した。
【００５５】
鉱化アッセイ。鉱化培養は蒸留水を用いて３回すすぎ洗いし、一晩乾燥させ、写真を撮影した。デジタル画像は、デジタルイメージングソフトウエア（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ  ５．０、Ａｄｏｂｅ社、カリフォルニア州サンホゼ）を用いて背景色を減じるために処理した。処理した画像は、（白色面積／全ウエル面積）×１００（％）であると規定された鉱化した塊の面積についてデジタル画像分析システム（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、メリーランド州）によって分析した。
【００５６】
動物の手術。５匹の８週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに１〜２％イソフルラン吸入を用いて麻酔をかけた。それらの脚を剃毛して１０％ポビドン−イオジン溶液を用いてスクラブ洗浄した後、大腿骨の遠位側面は皮膚切開および筋肉切開によって露出させた。インプラント配置のために遠位大腿骨の平面を選択した。植込み部位は、０．８ｍｍのラウンドバー、その後にリーマー＃ＩＳＯ  ０９０および１００を用いてドリル穿孔する工程によって大腿骨の遠位端から９ｍｍに準備した。冷却および清浄化のために無菌等張生理食塩液を用いて十分も洗浄した。１つの未処理円筒形インプラントおよび１つのＵＶ照射インプラントを右および左大腿骨に各々配置した。インプラントの安定性は、受動的な機械的適合を用いて確証した。次に外科部位は、層状で閉鎖した。筋肉および皮膚は、吸収性縫合糸を用いて個別に縫合した。カリフォルニア州立大学ロサンゼルス校（ＵＣＬＡ）学長を長とする動物研究委員会は本試験のプロトコルを承認し、全実験は米合衆国農務省動物研究ガイドラインにしたがって実施した。
【００５７】
インプラントの生体力学的押込み試験。骨−インプラント結合の生体力学的強度を評価するための本方法は、Ｏｇａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  ７９，１８５７−６３（２０００）に記載されている。手短には、円筒形インプラントを含有する大腿骨を採取し、直ちにインプラントレベルを上面にして自家重合樹脂中に包埋した。２０００Ｎのロードセルおよびプッシュロッド（径＝０．８ｍｍ）を備える試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ５５４４電気機械試験システム、Ｉｎｓｔｒｏｎ社、メリーランド州カントン）を使用して１ｍｍ／分のクロスヘッド速度で下向きに垂直にインプラントへ負荷をかけた。押込み試験値は、負荷変位曲線のピークを測定することによって決定した。
【００５８】
組織学的標本。オリジナルの酸エッチングされたインプラントおよびＵＶ照射して酸エッチングされたインプラント群について各々、５匹のラットを術後２および４週間の時点に致死させた。大腿骨を採取し、４℃で２週間にわたり１０％緩衝ホルマリン液中で固定した。試料はアルコールすすぎ液の濃度を上昇させながら脱水させ、脱灰させずに光重合型エポキシ樹脂（Ｔｅｃｈｎｏｖｉｔ  ７２００  ＶＬＣ、Ｈｅｒｅａｕｓ  Ｋｕｌｚｅｒ社、独国ヴェールハイム）中に包埋した。包埋した試料はインプラントの尖端から０．５ｍｍの部位で円筒形インプラントの長手軸に垂直に鋸で挽いた。試料は、研削システム（Ｅｘａｋｔ  Ａｐｐａｒａｔｅｂａｕ、独国ノーダーシュテット）を用いて厚さ３０μｍへ研削した。試料は、Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクロム染料により染色し、光線顕微鏡を用いて観察した。
【００５９】
組織形態測定学。コンピュータを使用する組織形態測定学的測定のためにコンピュータディスプレイ上の倍率４０倍のレンズおよび２倍ズームを使用した（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ−ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、メリーランド州シルバースプリング）。組織構造の詳細を同定するために、２００倍までの顕微鏡倍率を使用した。インプラント関連性骨およびインプラント非関連性骨を識別するインプラント組織形態測定学が確立された（Ｏｇａｗａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｒｏｓｔｈｏｄｏｎｔ  １１，２４１−７（２００２））。本方法に基づいて、インプラントを取り囲んでいる組織を次のように２つのゾーンに分割した。近位ゾーン、インプラント表面の５０μｍ以内の周辺ゾーン；遠位ゾーン、インプラント表面の５０μｍ〜２００μｍの周辺ゾーン。次に、以下の変量について分析した。
骨−インプラントの接触率（％）＝
（骨−インプラント接触長さの合計）／（内腔の全周）×１００、
（式中、インプラント−骨接触は、骨組織が軟組織の介入を伴わずにインプラント表面の２０μｍ以内に位置する界面であると規定した）；
近位領域内の骨容積（％）＝
（近位ゾーン内の骨面積）／（近位ゾーンの面積）×１００；および
遠位領域内の骨容積（％）＝
（遠位ゾーン内の骨面積）／（遠位ゾーンの面積）×１００。
【００６０】
統計的分析。ｔ検定を使用して、未処理コントロール群とＵＶ照射実験群との差を試験した；＜０．０５を統計的有意と見なした。
【００６１】
結果
光線処理は様々なチタンのトポグラフィ上に両親媒性表面を作り出す。高両親媒性（親水性かつ親油性の両方）チタン表面の光生成は、１９９７年に初めて導入された（Ｗａｎｇ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８８，４３１−４３２（１９９７））。相違する表面トポグラフィを有するチタンの湿潤性（親水性、親油性および好血性）におけるＵＶ光誘発性変化およびそれらの保持について試験した。チタンの２種の相違する表面トポグラフィ：機械加工された表面および酸エッチングされた表面を調製した。４８時間にわたる０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢのレベルでの光線処理後に、湿潤性を拡散面積および液滴が形成した接触角によって評価した。１０μＬの水滴の拡散面積は機械加工された表面（１３倍）および酸エッチングされた表面（３０倍）両方の光線処理後に劇的に増加した（図９ａ）。図９ａは、光線処理前の疎水性表面および処理後の高親水性の表面を示している。図９ａに示したように、光線誘発性親水性の保持および減少は、両方の表面タイプについて証明されている。親水性は、１０μＬの蒸留水の液滴の拡散面積（チタンディスクの上面図）および接触角（チタンディスクの側面図）によって評価した。両方の表面トポグラフィ上への光線処理後に、接触角は０．０±０．０°（超親水性）であることに留意されたい。機械加工された表面および酸エッチングされた表面について６９．９°および８８．４°であった処理前の水の接触角は、処理後に各々０．０±０．０°へ急落し、これは超親水性表面の発生を指示している。光線誘発性親水性は、時間が経過するにつれて弱まり、機械加工された表面より酸エッチングされた表面についての方が有効性であり、長く保持された。拡散面積によって表示された親水性は、４８時間の処理後には、機械加工された表面および酸エッチングされた表面について各々２倍および１３倍を超えて保持された。光線処理された酸エッチングされた表面の水の拡散によって測定された親水性は、４週間後でさえ、未処理コントロールの２倍高かった。
【００６２】
両方の表面タイプについてグリセロールの１０μＬの液滴（図９ｂ）を用いて親油性および５０μＬの血液の液滴（図９ｃ）を用いて好血性の劇的な利得もまた見いだされ、相違する表面トポグラフィを有するチタンの光線生成による超両親媒性（親水性かつ親油性）表面の確立が確証された。図９ｂは、グリセロールの１０μＬの液滴によって評価した、処理後に高度に親油性表面に変化した光線処理前の親油性表面を示している。図９ｃは、ラット大動脈から抽出された血液の５０μＬの液滴によって評価された、光線処理チタン表面の好血性表面を示している（「＊」は、データが光線処理チタンディスクと未処理チタンディスクとの間で統計的有意であることをデータが示していることを示している（ｐ＜０．０００１））。
【００６３】
本明細書に記載したＵＶ光照射は、チタン表面の表面トポグラフィを変化させる。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）試験は、光線処理前の機械加工された表面上の等方性および同心性の逆隆起部を示したが（図１０ａ）、他方では酸エッチングされた表面は一様な粗面であった。高倍率ＳＥＭは、光線処理後の両方のチタン表面上でのナノスフェアの発生を明らかにした。ナノスフェアのサイズ範囲は径１０〜７０ｎｍに及んだ。二次元ＡＦＭ画像もまた、機械加工および酸エッチングされたチタンの光線処理表面上のコントラストのナノメートルスケールの変化を明らかにした。図１０ａは、４８時間にわたる０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢのレベルでの光線処理の前後での機械加工および酸エッチングされた表面の走査型電子顕微鏡写真を示している。環状コントラストの範囲は径５０〜６００ｎｍに及んだ（図１０ｂ）。両方の表面タイプは、エネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）分析（図１０ｃ）によって示されたように汚染を含んでいない市販の純Ｔｉから構成された。図１０ｂは、４８時間にわたる０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢのレベルでの光線処理の前後での機械加工および酸エッチングされた表面の原子間力顕微鏡写真（ＡＦＭ）を示している。図１０ｃは、４８時間にわたる０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢのレベルでの光線処理の前後での機械加工および酸エッチングされた表面のエネルギー分散型分光学的元素スペクトルを示している。
【００６４】
光線処理Ｔｉは骨芽細胞を誘引し、それらの増殖を促進する。光線処理チタン表面上の骨芽細胞の初期挙動を試験し、光線誘発性両親媒性が骨芽細胞親和性環境を作り出すという仮説について調査した。骨芽細胞親和性は骨芽細胞の化学走化性および増殖能力によって試験した。光線処理チタンへの化学走化性を評価するために、ラット骨髄幹細胞に由来する骨芽細胞（ＢＭＳＣ）は、その中にチタンディスクを垂直に配置したポリスチレン製皿内で３時間インキュベートした（図１１ａ）。図１１ａおよび１１ｂは、細胞誘引性（図１１ａ）および細胞増殖（図１１ｂ）がインビトロ培養中での機械加工および酸エッチングされたチタン表面両方のＵＶ光処理により増加することを示している。
【００６５】
各未処理表面に比較して２倍の細胞が光線処理機械加工および酸エッチングされた表面に付着した。チタン表面のＳＥＭ画像は、光線により強化された化学走化性を確証した。細胞増殖を評価するために、骨芽細胞は、ポリスチレン皿内に水平に配置された機械加工および酸エッチングされたチタン製ディスク上に接種した。光線処理は、両方の表面タイプ上での増殖を２倍にした（図１１ｂ）。
【００６６】
図１１ａに示した試験では、骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）由来骨芽細胞を垂直に据え付けたチタン製プレートとともにインキュベートした（左上パネル）。ＵＶ前処理を行った、もしくは行っていないチタン製プレートに付着した細胞を３時間のインキュベーション後に計数した（右パネル）。結果を確証するために、ＳＥＭ画像を撮影した（左パネル）。図１１ｂに示した試験では、３つの相違する時点に細胞密度によって増殖を評価した。光線処理を行った、または行わないチタン製ディスクはポリスチレン製培養皿内へ水平に配置した。細胞をトリプシン化し、血球計数器を用いて計数した（右パネル）。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている（「＊」は、データが、光線処理および未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１））。定量的試験結果を支持するＳＥＭ画像もまた提示されている。
【００６７】
光線処理は骨芽細胞の成熟および鉱化を促進する。増殖活性が優勢である場合は、分化／成熟活性は骨芽細胞中の個別細胞レベルで抑制されるはずである（例えば、Ｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．＆  Ｌｉａｎ，Ｊ．Ｂ．，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １４，４２４−４２（１９９３）；Ｓｉｄｄｈａｎｔｉ，Ｓ．Ｒ．＆  Ｑｕａｒｌｅｓ，Ｌ．Ｄ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５５，３１０−２０（１９９４）；Ａｌｂｏｒｚｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １６，９４−１０６（１９９６）を参照）；それでも光線活性化チタン上で引き起こされた増加した細胞数はより多くの細胞間相互作用を促進して、細胞集団レベルでの骨芽細胞分化の促進を導く可能性がある。この理論を試験するために骨芽細胞分化マーカーの遺伝子発現をチタン上の骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）由来骨芽細胞培養中でＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応）によって試験した（図１１ｃ）。図１１ｃは、チタン上の光線処理後の骨関連性遺伝子の発現を示している。ＢＭＳＣ由来骨芽細胞は光線処理を行った、または行っていないチタン上で培養し、定常状態遺伝子発現を逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて評価した。代表的な電気泳動法画像は上に示されている。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現のレベルに比較した遺伝子の定量された発現レベルおよび時間経過は下に示されている。
【００６８】
分化マーカー遺伝子の初期発現（７日後まで）は、機械加工および酸エッチングされたチタンの両方の光線処理および未処理表面間で同一のままであった。培養の中期および後期（１４日後〜２８日後）では、これらのマーカー遺伝子のアップレギュレートされた発現（３０％を超える差）が両方の表面タイプの光線処理チタン上で見いだされ、これは骨芽細胞の促進された分化および成熟を示している。骨芽細胞鉱化能力に光線処理が及ぼす作用を、ＢＭＳＣ／骨芽細胞培養中の鉱化中の塊の形成によって評価した（図１１ｄ）。光線処理後の鉱化中の塊の増加した面積は機械加工および酸エッチングされたチタン表面上の両方で見いだされた。その作用は、１００％〜１５０％の増加を示している酸エッチングされた表面についてより顕著であった。図１１ｄは、チタン上の光線処理後の骨芽細胞培養の鉱化能力を示している。左パネルは、処理を行った、または行わなかった機械加工されたチタン表面および酸エッチングされたチタン表面上の鉱化培養の代表的な画像を示しているが、右パネルは定量的な鉱化した塊の面積を示している。培養面積に比較した鉱化した塊の面積のパーセンテージは、デジタル画像分析装置を用いて測定した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている（「＊」は、データが、ＵＶ照射および未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１））。
【００６９】
光線処理Ｔｉ上の線維芽細胞増殖の選択的抑制。新規に形成された骨とチタンとの間への結合組織の介入は、多かれ少なかれ、チタンへの骨の直接接触を遂行する際の極めて重要な不利な現象である。しかし、骨−チタン結合のプロセスに関連する線維芽細胞応答は、これまでほとんど試験されていない。光線処理による線維芽細胞増殖を制御する能力は、光線処理チタンが線維芽細胞増殖に影響を及ぼすかどうかという問題によって決定できる。驚くべきことに、光線処理された機械加工された表面および光線処理された酸エッチングされた表面は反対の作用を誘導した。ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞およびラット歯肉一次線維芽細胞の両方の増殖は、光線処理された機械加工された表面上では未処理の機械加工された表面に比較して促進されたが、光線処理された酸エッチングされた表面上では未処理の酸エッチングされた表面に比較して抑制された（図１１ｅおよび１１ｆ）。このため機械加工されたチタン表面および酸エッチングされたチタン表面はどちらも骨芽細胞親和性かつ線維芽細胞親和性である。図１１ｅおよび１１ｆは、ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞（図１１ｅ）および一次歯肉線維芽細胞（図１１ｆ）の増殖が機械加工された表面および酸エッチングされた表面上で光線処理によって様々に影響を受けたことを示している。
【００７０】
図１１ｅおよび１１ｆに示した試験では、線維芽細胞増殖は２種の相違する細胞タイプ：ＮＩＨ３Ｔ３線維芽細胞およびラット歯肉線維芽細胞を用いて評価した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている（「＊」は、データが、光線処理および未処理チタン間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１））。
【００７１】
光線処理はチタン製インプラント安定化を加速して強化する。インプラント安定性のインビボ確立は、荷重負担固定物としてのインプラントの臨床的有意性を反映する最も適切な変量である。光線処理を行った、または行わなかったチタン製インプラントのインビボ安定性は、ラットモデルにおいて確立された生体力学的インプラント押込み試験を用いて試験した（Ｏｇａｗａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  ７９，１８５７−６３（２０００））（図１２ａ）。図１２ａに示された試験では、ＵＶ光による前処理を行った、または行っていないチタン製インプラントをラット大腿骨内に配置し、インプラントを含む大腿骨試料を採取し、メチルメタクリレートブロック内に包埋した。ｍｉｃｒｏＣＴを使用して、インプラントがインプラントの側方および底部側から皮質骨支持を受けていないことを確証した。次に押込み負荷に対する破壊強度を測定することによって、インプラントの生体力学的安定性を植込み２および４週間後に評価した。
【００７２】
インプラントを膝関節尖端から９ｍｍの場所でラット大腿骨内に配置し、インプラントの位置が成長板もしくは側方および底部皮質骨支持体に含まれていないことを確証した。垂直に押し込まれているインプラントは、機械的に予測された負荷変位曲線を生じさせ、破壊時の力（負荷変位曲線上の最大力）は押込み試験値として測定された。植込み２週間後の押込み試験値は、光線処理による機械加工された表面および酸エッチングされた表面について各々１．８倍および３．１倍に急上昇した（図１２ｂ）。４週間後には、光線処理インプラントの押込み試験値は、機械加工された表面および酸エッチングされた表面について、未処理インプラントに比較して各々５０％および６０％の優位性を保持した。図１２ｂは、光線処理を行った、もしくは行っていない機械加工および酸エッチングされたインプラントの押込み試験値を示している。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝５）として表示されている（光線処理および未処理インプラント間で統計的有意、「＊＊」はｐ＜０．０００１を示しており；「＊」はｐ＜０．００１を示している）。
【００７３】
光線処理により最適化された骨−チタン結合。光線処理チタン製インプラントの増加した生体力学的固定は、インプラントの周囲の増加した骨容積、増加した骨−インプラントの接触、またはその両方の組み合わせに帰することができる。同様に、光線処理された酸エッチングされた表面の証明された線維芽細胞嫌性（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｏｏｈｏｂｉｃｉｔｙ）は疎軟（結合）組織性をもたらすかどうかもまた重要なことがある。これらを取り扱うために、インプラント周囲の骨および軟組織形成についての組織学的および組織形態測定学的分析を実施した。機械加工された表面に比した酸エッチングされた表面の生体力学的固定における有益性ならびに新規に見いだされた線維芽細胞嫌性を前提にして、光線処理のそのような潜在的作用を調査するために酸エッチングされた表面を選択した。光線処理を行った、または行っていない円筒形の酸エッチングされたインプラントをラット大腿骨内に配置し、Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクロム染色組織学検査のためにインプラントの長手軸に垂直な非脱灰横断面を加工作製した。
【００７４】
図１３ａ〜１３ｐは、本試験の結果の一部を示している。Ｇｏｌｄｎｅｒのトリクロム染色を用いた酸エッチングされたインプラントの代表的な組織学的切片はパネルａ〜ｄについては４０倍（図１３ａ〜１３ｄ）、パネルｅ〜ｈについては４０倍（図１３ｅ〜１３ｈ）、およびパネルｉ〜ｌについては１００倍（図１３ｉ〜１３ｌ）のオリジナル倍率で示した。２週間後には、光線処理インプラントには軟組織が骨とインプラントとの間に介入するのを予防する強力な骨走性と関連しており（図１３ｆにおける矢印）、４週間後でのインプラント表面上への直接的な骨沈着を引き起こす（図１３ｊにおける矢印）ことに留意されたい。これとは対照的に、未処理コントロールの周囲の骨は余り伸長せず、骨およびインプラント表面内に移動した軟組織を含んでおり、これは直接的な骨−インプラントの接触の確立を妨害していた（図１３ｉにおける矢印）。インプラント界面骨の形態形成におけるそのような相違は、４週間後切片において明確に所見される（図１３ｇおよび１３ｈ）。軟組織介入（矢印）を伴わない広範囲の骨生成は光線処理インプラント（ｌ）の周囲で示されているが（図１３ｌ）、未処理インプラント周囲の骨は軟組織（ｋ）によってインプラント表面から大きく離されたままである（図１３ｋ）。骨−インプラントの接触（ｍ）の標準偏差（エラーバー）を伴う平均組織形態測定学的数値は図１３ｍに示されているが、図１３ｎは近位ゾーン（ｎ）における骨容積、図１３ｏは遠位ゾーン（ｏ）における骨容積、および図１３ｐは軟組織−インプラントの接触（ｐ）を示している。光線処理および未処理インプラント間での統計的有意は、記号「＊」または「＊＊」によって示されている（＊ｐ＜０．００１；＊＊ｐ＜０．０００１）。
【００７５】
２週間後、繊維状の未成熟の外観を伴う骨組織もしくは骨様組織が、コントロールの酸エッチングされたインプラントおよび光線処理された酸エッチングされたインプラントの両方についてインプラント表面から相当に離れた領域で形成された（図１３ａおよび１３ｂ）。インプラント表面への隣接領域上の焦点は、光線処理と光線処理インプラント周囲の骨が未処理コントロール周囲よりもはるかに広範囲にインプラント表面上へ移動した未処理インプラント間の骨成長における明白な相違を明らかにした（図１３ａおよび１３ｂ）。広汎に拡散した新規骨断片の結果として生じた骨組織の連続性は、光線処理インプラントに沿って所見される。高倍率画像は、光線処理された表面に沿って伸長する強化された骨成長を明白に例示し（図１３ｅおよび１３ｆ）、軟組織介入に関するまた別の顕著な相違を明らかにした。未処理コントロールインプラント周囲の一部の骨組織は、骨とインプラントとの間に挿入された軟組織と結び付いており（図１３ｉ）、これは光線処理インプラントの周囲ではほとんど観察されておらず、新規骨組織がインプラント表面に直接的に接触することを可能にする（図１３ｊ）。
【００７６】
４週間後には、骨組織の骨梁構造は劇的に減少し、層状構造を備える骨組織は広範囲にインプラントを被包化した（図１３ｃおよび１３ｄ）。骨性リモデリングのそのような前進は、光線処理された表面の周囲でより顕著であった。コントロールインプラントは骨とインプラントの表面間に介入している線維性結合組織を依然として示していたが（図１３ｃ、１３ｇおよび１３ｋ）、光線処理を行ったインプラントは結合組織介入を伴わずにチタン表面上に直接的に沈着した骨でほぼ完全に取り囲まれた（図１３ｄ、１３ｈおよび１３ｉ）。
【００７７】
骨組織形態測定学的分析は、光線処理インプラントについての骨−インプラントの接触率が一貫してコントロールインプラントについてより大きいことを証明した（２週間後にはおよそ３．０倍、４週間後には２．０倍）（図１３ｍ）。取り囲んでいる骨生成およびリモデリングから骨−インプラントの結合を示差的に評価するために、骨容積を２つの相違する領域内で測定した；インプラント表面に対して近位および遠位領域。これらの領域は、インプラント周囲の骨生成力学を記載している以前の試験に基づいて分割した（Ｏｇａｗａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｐｒｏｓｔｈｏｄｏｎｔ  １１，２４１−７（２００２））。近位領域はインプラント表面の５０μｍ以内の周辺領域として規定し、遠位領域は５０μｍ〜２００μｍの周辺領域として規定した。近位領域内の骨容積は、コントロールインプラントについてより光線処理インプラントについて２および４週間後に一貫して大きかった（図１３ｎ）。対照的に、遠位領域内の骨容積における光線誘発性変化は見いだされなかった（図１３ｏ）。光線処理により軟組織−インプラントの接触率において有意な減少が生じた（図１３ｐ）。酸エッチングされた表面についての光線処理は、特に４週間後では、骨とインプラント表面との間から軟組織をほぼ完全に閉め出したが、未処理表面の領域における３０％超が２および４週間後のどちらにおいても軟組織と接触していた。
【実施例３】
【００７８】
新しく調製されたサンドブラスト処理されたチタン上で作製された光線誘発性骨芽細胞親和性表面
緒言
新規チタン製インプラントの開発における挑戦課題の１つは、骨芽細胞の増殖率と分化率の逆相関を克服する方法である（Ｓｔｅｉｎ，Ｇ．Ｓ．＆  Ｌｉａｎ，Ｊ．Ｂ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １４，４２４−４２（１９９３）；Ｓｉｄｄｈａｎｔｉ，Ｓ．Ｒ．＆  Ｑｕａｒｌｅｓ，Ｌ．Ｄ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５５，３１０−２０（１９９４）；Ａｌｂｏｒｚｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｒａｎｉｏｆａｃ  Ｇｅｎｅｔ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １６，９４−１０６（１９９６））。例えば、減少した骨芽細胞の増殖を付随する増加した分化率は、歯科用インプラントのための一般的なインプラント表面である様々な粗面において実証されている（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  Ａ  ７２Ａ，２９６−３０５（２００５）．；Ｂａｃｈｌｅ，Ｍ．＆  Ｋｏｈａｌ，Ｒ．Ｊ．，Ｃｌｉｎ  Ｏｒａｌ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  Ｒｅｓ  １５，６８３−９２（２００４））。実施例１および２は、チタンの光線誘発性超両親媒性（親水性および親油性）表面が骨芽細胞の性質を克服することを確定している。骨芽細胞増殖は、分化率を保持または増加させながら、未処理表面に比較して光線処理された機械加工および酸エッチングされた表面上では２倍を超えて増加させた。次に、この現象は、両親媒性の生成が、チタンが経時的に大気、水および洗浄液から炭素および炭化水素などの有機不純物を吸収するという点で、チタン表面上の光線励起ヒドロキシル基（ヒドロキシルラジカル）による表面汚染物質の除去に帰せられるかどうかという問題を提起した。もしそうであれば、この問題は新鮮な、裸のチタン表面上で獲得された親水性を新しく調製された表面は最小量の表面不純物およびヒドロキシル基を含有していなければならないという点で光線処理によってより高度に強化させられないかという問題になる。２つの前提条件のいずれかが否定されることが見いだされる場合は、増加した骨芽細胞増殖をもたらす光線誘発性超親水性の基礎にある、終了したヒドロキシル駆動表面浄化以外の他の機序がある可能性がある。
【００７９】
材料および方法
チタンサンプル、表面分析および紫外線（ＵＶ）光線処理。機械加工された表面を備える市販の純チタン（グレード２）から作製したディスク（径２０ｍｍおよび厚さ１．５ｍｍ）は、３ｋｇ／ｍの圧力を用いて１ｃｍの距離で５０μｍの酸化アルミニウム粒子を用いてサンドブラストした。一部のサンドブラスト処理されたディスクを、大気下で４８時間にわたり０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢの紫外線（ＵＶ）を用いて処理した。
【００８０】
チタン表面の親水性および親油性。身体を接触させずに１、５もしくは１０μＬの蒸留水および５μＬのグリセロールをチタン表面上に静かに置き、直ちにデジタル写真を撮影した。拡散面積は、デジタルアナライザ（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、メリーランド州シルバースプリング）を用いて平面図における液滴の面積として計測した。接触角θは、方程式：θ＝２ｔａｎ−１（２ｈ／ｄ）（式中、ｈおよびｄは側面図における液滴の高さおよび径である）によって入手した（Ｏｓｈｉｄａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３，３０６−３１２（１９９２））。
【００８１】
骨芽細胞培養。８週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ系ラットの大腿骨から単離した骨髄細胞は、１５％ウシ胎児血清、５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸、１０−８Ｍデキサメタゾン、１０ｍＭのＮａ−β−グリセロリン酸、ならびに１０，０００単位／ｍＬのペニシリンＧ溶液、１０，０００ｍｇ／ｍＬの硫酸ストレプトマイシンおよび２５ｍｇ／ｍＬのアムホテリシンＢを含有する抗生物質−抗真菌薬溶液を補給したα修正イーグル培地中に入れた。細胞は、９５％の空気、５％のＣＯ２からなる３７℃の加湿雰囲気下でインキュベートした。８０％のコンフルエンシーで、細胞は０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−４Ｎａを用いて剥離させ、５×１０４ｃｅｌｌｓ／ｃｍ２の密度でチタン製ディスク上に播種した。培養培地は３日間毎に入れ替えた。
【００８２】
増殖アッセイ。細胞増殖を試験するために、細胞はＰＢＳを用いて静かに２回すすぎ洗いし、３７℃で１５分間にわたり３００μＬの０．２５％トリプシン−１ｍＭ  ＥＤＴＡ−４Ｎａ中の０．１％コラゲナーゼを用いて処理した。血球計数器を使用して剥離した細胞の数を計数した。
【００８３】
遺伝子発現分析。骨芽細胞分化の程度を試験するために、遺伝子発現は、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて分析した。培養中の全ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、カリフォルニア州カールズバッド）および精製カラム（ＲＮｅａｓｙ、Ｑｉａｇｅｎ社、カリフォルニア州バレンシア）を用いて抽出した。ＤＮＡｓｅ  Ｉ処理後、０．５μｇの全ＲＮＡの逆転写はＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社、カリフォルニア州カールズバッド）を用いてオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州カールズバッド）の存在下で実施した。ＰＣＲ反応は、α−ＩのＩ型コラーゲンおよびオステオカルシンｍＲＮＡを検出するためにＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（ＥＸ  Ｔａｑ、Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ社、ウィスコンシン州マディソン）を用いて実施した。結果として生じた生成物は、臭化エチジウム染色を用いて１．５％アガロースゲル上で視認した。バンドの強度はＵＶ光下で定量した（Ｅａｇｌｅ  Ｅｙｅ  ＩＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）。これらの数値は、ＧＡＰＤＨを参照して標準化した。
【００８４】
統計的分析。ｔ検定を使用して、未処理コントロールと光線処理実験群との差を試験した；＜０．０５を統計的有意と見なした。
【００８５】
結果
光線処理により強化された両親媒性。機械加工された表面上のサンドブラスト処理は、湿潤性挙動を疎水性から親水性へ変化させた（図１４ａ）。１０μＬの水滴の拡散面積は、機械加工された表面のサンドブラスト処理後に１３倍へ増加した。６９．９°であったサンドブラスト前の水の接触角はサンドブラスト処理後に２．０°へ急落したが、これは超親水性表面の生成を示している。図１４ａは、疎水性の機械加工された表面およびサンドブラスト処理後の親水性表面を示している。親水性は、１０μＬの蒸留水の液滴の拡散面積（チタンディスクの上面図）および接触角（チタンディスクの側面図）によって評価した。
【００８６】
サンドブラスト誘発性の超親水性は、光線処理によって強化された（図１４ｂ）。１μＬの水滴の拡散面積は、未処理の新鮮サンドブラスト処理された表面に比較して光線処理されたサンドブラスト処理された表面上では３倍であった。図１４ｂは、光線処理を行った、または行っていない新鮮に調製されたサンドブラスト処理されたチタン表面の親水性を示している。１μＬの蒸留水の水滴の拡散面積は、光線処理された表面上より大きかった。５μＬの水を用いて測定した接触角が光線処理後に０．０±０．０°（超親水性）であることに留意されたい。
【００８７】
５μＬの水滴を用いて測定された接触角は、光線処理を行った場合は０°であった。同様に、超親油性は、光線処理によってさらに強化され（図１４ｃ）、５μＬのグリセロールの拡散面積は４倍に増加した。光線処理された表面上のグリセロールの接触角は０°であったが、未処理表面上の接触角は４．３°であった。図１４ｃは、光線処理前の親油性が５μＬのグリセロールの液滴によって評価した場合に光線処理後に強化することを示している（「＊」は、データが、２つの群間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１））。
【００８８】
光線処理されたサンドブラスト処理された表面は、骨芽細胞増殖を促進する。骨髄に由来する骨芽細胞は、未処理のサンドブラスト処理された表面上より光線処理されたサンドブラスト処理された表面上の方が増殖した（図１５ａ）。７日後の細胞数は、光線処理によって６０％増加した。図１５ａでは、増殖を２つの相違する時点に細胞密度によって評価した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている（「＊」は、データが、光線処理表面および未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１））。図１５ｂは、光線処理後の骨関連性遺伝子の発現を示している。ＢＭＳＣ由来骨芽細胞は光線処理を行った、または行っていない新鮮に調製したサンドブラスト処理された表面上で培養し、遺伝子発現は逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて評価した。代表的な電気泳動法画像は上に示されている。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現のレベルに比較した遺伝子の定量された発現レベルおよび時間経過は下に示されている。
【００８９】
光線処理は骨芽細胞成熟能力を保持する。初期骨芽細胞分化のマーカーであるコラーゲンＩの遺伝子発現は、サンドブラスト処理された表面の光線処理後に同一のままであった。後期マーカーであるオステオカルシンもまた光線処理表面と未処理表面間で同様に発現したので、これは光線処理が増殖能力を増加させながら骨芽細胞成熟能力を保持することを指示している。
【００９０】
考察
本実施例に記載した試験は、新しく調製してサンドブラスト処理されたチタン上で光線により強化された親水性表面を作製する可能性および骨芽細胞親和性、すなわち保持もしくは増加した分化能力と一緒に骨芽細胞増殖活性を増加させる能力の生成を証明している。これらの結果は、新しく調製されてサンドブラスト処理された表面上の光線処理が現行の親水性をさらに強化して骨芽細胞親和性を上昇させることを証明している。このため、チタン表面の水化およびヒドロキシル化は、親水性および骨芽細胞親和性チタン表面を作製するために必要なプロセスではない。
【実施例４】
【００９１】
骨セメント親和性チタン表面の形成
緒言
主として半重合したポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）の固体部分とメチルメタクリレート（ＭＭＡ）の液体部分を有するアクリル樹脂をベースとする骨セメントは、整形外科用インプラントの安定化および保持のために最も頻回に使用される材料である。骨セメントの機械的特性を修飾するために、様々な修飾技術が試みられてきた。そのＰＭＭＡマトリックス内にＰＭＭＡ繊維を含有するセメントは破損耐性を増加させると思われる（Ｇｉｌｂｅｒｔ  ＪＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９９５；１６：１０４３−５５；Ｗｒｉｇｈｔ  ＤＤ，ｅｔ  ａ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７；３６：４４１−５３）。樹脂をベースとするセメントにバイオガラスもしくはバイオセラミックの添加は、ＰＭＭＡセメントの機械的強度を増加させるために役立つ（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９；４６：４４７−５７；Ｓｈｉｎｚａｔｏ  Ｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｍａｔｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００；５１：２５８−７２）。しかしこれらの修飾は材料の化学的特性ならびに機械的特性を変化させ、それらの生物学的適合性の追加の特性解析を必要とする。さらに、これらのアプローチは骨セメントの内因性の機械的特性を強化させる可能性があるが、それらはセメント−金属界面を強化することには有効ではないと考えられる；セメント−金属製インプラント界面の剥離は不具合の主要な開始部位であると見なされてきた（Ｊａｓｔｙ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ｂｒ  １９９１；７３：５５１−８；Ｖｅｒｄｏｎｓｃｈｏｔ  Ｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｍｅｃｈ  １９９７；３０：７９５−８０２）。
【００９２】
セメント−金属界面強度にとっての１つの改善策は、インプラント周囲の骨セメントによるプレコートである。このプロセスはインプラントの表面上の工業用骨セメントによる無孔性の一様な被覆を可能にし、臨床的成功が得られることが証明されている（Ｃｌｏｈｉｓｙ  ＪＣ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ  １９９９；８１：２４７−５５；Ｏｉｓｈｉ  ＣＳ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇ  Ａｍ  １９９４；７６：１１３０−６）。しかし、本方法は、骨セメントおよび骨−チタン結合によるインプラント固定の複合使用は許容しない。
【００９３】
両親媒性（親水性かつ親油性の両方）チタン表面の光生成は１９９７年に最初に導入された（Ｗａｎｇ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９７；３８８：４３１−４３２）。この表面の特性は紫外線（ＵＶ）処理によって生成した、親水性相および親油性相の微細構造組成物に帰せられる。可能性のある説明は、第一に、両親媒性の生成がチタン表面上の光線励起ヒドロキシル基（ヒドロキシルラジカル）による表面汚染物質の除去に帰せられたというものである。チタンは、大気、水、および洗浄液から炭素および炭化水素などの有機不純物を経時的に吸収する。第二に、光線処理は架橋部位で表面酸素空孔を作り出し、解離性水吸着のために好都合である関連性のＴｉ４＋部位からＴｉ３＋部位への変換を生じさせる。
【００９４】
要約
本明細書に記載したのは、骨セメント材料を変更せずに骨セメント−チタン界面強度を強化するための方法である。骨セメント親和性についてチタンの湿潤性（親水性、親油性および好血性）における光線誘発性変化を試験した。ＵＶ処理チタンは、より高度の骨セメント湿潤性およびより強力な骨セメント−チタン界面強度を示した。光線処理の作用は、機械加工された相当に平滑な表面および酸エッチングされた相当に粗い表面の様々なチタン表面トポグラフィについて実証された。
【００９５】
方法
チタンサンプル、表面分析および紫外線（ＵＶ）光線処理。市販の純チタンの２種の表面タイプを円筒形インプラント（径１ｍｍおよび長さ２ｍｍ）およびディスク（径２０ｍｍおよび厚さ１．５ｍｍ）について調製した。１つはレーズによって回転させた機械加工された表面を有しており、もう１つはＨ２ＳＯ４およびＨＣｌを用いて酸エッチングした。チタン製ディスクは、γ線によって滅菌した。チタン製ディスクおよびインプラントを０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢを用いて換気をしながら４８時間にわたり処理した。光線処理を行った、または行っていないチタンサンプルの表面を走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＪＳＭ−５９００ＬＶ、Ｊｏｅｌ社、日本国東京）エネルギー分散型Ｘ線分光計（ＥＤＸ）（ＪＳＭ−５９００ＬＶ、Ｊｏｅｌ社、日本国東京）および原子間力顕微鏡（ＳＰＭ−９５００Ｊ３、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社、日本国東京）によって試験した。
【００９６】
チタン表面の親水性および骨セメント親和性。蒸留水（親水性試験）および骨セメント（骨セメント親和性試験）の接触角および拡散面積を評価した。１０μＬの蒸留水をチタン表面上に静かに配置し、直ちにデジタル写真を撮影した。拡散面積は、デジタルアナライザ（Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ、Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ社、メリーランド州シルバースプリング）を用いて平面図における液滴の面積として計測した。接触角θは、方程式：θ＝２ｔａｎ−１（２ｈ／ｄ）（式中、ｈおよびｄは側面図における液滴の高さおよび径である）によって入手した（Ｏｓｈｉｄａ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍａｔｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２；３：３０６−３１２）。骨セメントは、１８．８８ｇの液体と２０ｇの粉末を１０秒間混合することによって調製したが、これは製造業者の取扱説明書の２倍の液体比であった（Ｅｎｄｕｒａｎｃｅ  ＭＶ、ＤｅＰｕｙ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃｓ社、インディアナ州ワルソー）。１０μＬの混合セメントをチタン表面上に静かに配置した。
【００９７】
インプラントの機械的押出し試験。本方法は、最初に骨−インプラント結合の生体力学的強度を評価するために開発かつ確立されたが、詳細については他の場所で記載されている（Ｏｇａｗａ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ  ２０００；７９：１８５７−６３）。本明細書では、本方法を使用してインプラント−骨セメント界面強度を評価した。光線処理を行った、または行っていない円筒形インプラント（径１ｍｍおよび長さ２ｍｍ）は、熱硬化型硬質メチルメタクリレート樹脂から作製されたアクリルブロック内に配置した（図１６ａ）。アクリルブロックは、径２ｍｍおよび長さ２ｍｍの事前に作製された穴を有した（図１６ｂ）。骨セメントは製造業者によって指示されたように粉末と液体を混合することによって調製し（１８．８８ｇの液体と４０ｇの粉末を１０秒間混合する）、調製した骨セメントをペーストしたインプラントは、インプラントレベルを上面にして、樹脂ブロックの上面と同一平面となるように穴の中に配置した。骨セメントは３７℃で２４時間にわたり重合させた。図１６ａは、硬質アクリルブロック内に配置した円筒形インプラントを示している。図１６ｂは、インプラント、事前に作製された穴およびアクリルブロック内にインプラントを保持するために使用された骨セメントを示している図である。図１６ｃは、押されているインプラントを示している。２０００Ｎのロードセルおよびプッシュロッド（径＝０．８ｍｍ）を備える試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ５５４４電気機械試験システム、Ｉｎｓｔｒｏｎ社、メリーランド州カントン）を使用して１ｍｍ／分のクロスヘッド速度で下向きに垂直にインプラントへ負荷をかけた（図１６ｃ）。押出し試験値は、負荷変位曲線のピークを測定することによって決定した（図１６ｄ）。図１６ｄは、押出し試験中の負荷変位曲線を示している。曲線の最高負荷であった破壊強度をインプラントの押出し試験値として測定した。
【００９８】
統計的分析。二方向ＡＮＯＶＡを使用してインプラントの押出し試験値にチタンの表面粗さおよび光線処理が及ぼす作用を評価した。Ｔ検定を使用して、未処理コントロールと処理実験群との差を試験した；＜０．０５を統計的有意と見なした。
【００９９】
結果
光線処理により誘発された超親水性チタン。１０μＬの水滴の拡散面積は機械加工された表面（１３倍）および酸エッチングされた表面（３０倍）の両方についてＵＶ処理後に劇的に増加した（図１７）。機械加工された表面および酸エッチングされた表面について６９．９°および８８．４°であった処理前の水の接触角は、ＵＶ照射後に各々０．０±０．０°へ急落し、これは超親水性表面の発生を指示している。図１７に示した試験では、親水性は、１０μＬの蒸留水の液滴の拡散面積（チタンディスクの上面図）および接触角（チタンディスクの側面図）によって評価した。両方の表面トポグラフィ上のＵＶ照射後に接触角は０．０±０．０°（超親水性）であることに留意されたい。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている（「＊」は、データが、ＵＶ処理チタンおよび未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１））。
【０１００】
光線処理後のチタンの表面特性。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）試験は、光線処理前の機械加工された表面上の等方性および同心性の逆隆起部を示したが（図１８ａ）、他方では酸エッチングされた表面は一様な粗面であった。高倍率ＳＥＭは、光線処理後の両方のチタン表面上でのナノスフェアの発生を明らかにした。ナノスフェアのサイズ範囲は径１０〜７０ｎｍに及んだ。二次元ＡＦＭ画像もまた、機械加工および酸エッチングされたチタンの光線処理表面上のコントラストのナノメートルスケールの変化を明らかにした（図１８ｂ）。環状コントラストの範囲は径５０〜６００ｎｍに及んだ。両方の表面タイプは、エネルギー分散型Ｘ線（ＥＤＸ）分析（図１８ｃ）によって示されたように汚染を含んでいない市販の純Ｔｉから構成された。図１８ａは、走査型電子顕微鏡写真を示している。図１８ｂは、原子間力顕微鏡写真（ＡＦＭ）を示している。図１８ｃは、光線処理前後の機械加工および酸エッチングされた表面のエネルギー分散型分光法による元素スペクトルを示している。図１８ａの上方パネルではバー＝５μｍ、中央パネルでは５００ｎｍ、および下方パネルでは２００ｎｍ。
【０１０１】
光線処理により増加したチタン上の骨セメント湿潤性。光線処理された機械加工されたチタンおよび酸エッチングされたチタン上では未処理チタンに比較して、拡散した骨セメントの面積は各々３０％および２０％増加した（図１９）。骨セメントの接触角は光線処理後に減少し、これは光線処理による骨セメントの強化された湿潤性を確証している。図１９に示した試験では、骨セメント親和性は、１０μＬの骨セメントの液滴の拡散面積（チタンディスクの上面図）および接触角（チタンディスクの側面図）によって評価した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている（「＊」は、データが、ＵＶ処理チタンおよび未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．００１））。
【０１０２】
チタンの光線処理により増加した骨セメント−チタン界面の結合強度。押出し試験値によって測定した骨セメント−チタン界面強度は、チタン製インプラントの光線処理によって機械加工された（ｐ＜０．０５、ｔ検定）および酸エッチングされた（ｐ＜０．０１、ｔ検定）表面の両方について増加した（図２０）。図２０では、データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝６）として示されている（光線処理インプラントおよび未処理コントロール間で統計的有意、「＊」はｐ＜０．０５を示しており；「＊＊」はｐ＜０．０１を示している）。この増加は、機械加工された表面については４０％および酸エッチングされた表面については２５％であった。押出し試験値は、機械加工された表面より酸エッチングされた表面についての方が高かった（ｐ＜０．０００１、二方向ＡＮＯＶＡ）。
【０１０３】
光線処理により増加したチタン合金上の骨セメント湿潤性。拡散した骨セメントの面積は、純チタン上で見られたように、光線処理によって機械加工されたチタンおよび酸エッチングされたチタン合金のどちらにおいても増加した（図２１）。骨セメントの接触角は、未処理合金に比較して光線処理チタン合金上では減少した。図２１に示した試験では、骨セメント親和性は、１０μＬの骨セメントの液滴の拡散面積（チタンディスクの上面図）および接触角（チタンディスクの側面図）によって評価した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている（「＊」は、データが、ＵＶ処理チタンおよび未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．００１））。
【実施例５】
【０１０４】
光線処理によるチタン製インプラントのナノスケールおよびミクロスケールの構造的変化
方法
チタンサンプル、表面分析および紫外線（ＵＶ）照射。市販の純チタンの２種の表面タイプを円筒形インプラント（径１ｍｍおよび長さ２ｍｍ）およびディスク（径２０ｍｍおよび厚さ１．５ｍｍ）について調製した。一方は、レーズによって回転させた、機械加工された表面を有した。他方は、Ｈ２ＳＯ４およびＨＣｌを用いて二重酸エッチングされた。表面形態は、走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）（ＪＳＭ−５９００ＬＶ、Ｊｏｅｌ社、日本国東京）および原子間力顕微鏡（ＳＰＭ−９５００Ｊ３、Ｓｈｉｍａｄｚｕ社、日本国東京）によって試験した。平均粗さ（Ｒａ）、二乗平均平方根粗さ（Ｒｒｍｓ）および山−谷粗さ（Ｒｐ−ｖ）を計算した。チタン製ディスクおよび円筒形インプラントを０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢで換気をしながら４８時間もしくは１週間にわたり処理した。
【０１０５】
動物の手術。１０匹の８週齢の雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに１〜２％のイソフルラン吸入を用いて麻酔をかけた。それらの脚を剃毛して１０％ポビドン−イオジン溶液を用いてスクラブ洗浄した後、大腿骨の遠位側面は皮膚切開および筋肉切開によって慎重に露出させた。インプラント配置のために遠位大腿骨の平面を選択した。植込み部位は、０．８ｍｍのラウンドバー、その後にリーマー＃ＩＳＯ  ０９０および１００を用いてドリル穿孔する工程によって大腿骨の遠位端から９ｍｍに準備した。冷却および清浄化のために無菌等張生理食塩液を用いて十分も洗浄した。１つの未処理円筒形インプラントおよび１つのＵＶ処理インプラントを右および左大腿骨に各々配置した。インプラントの安定性は、受動的な機械的適合を用いて確証した。次に外科部位は、層状で閉鎖した。筋肉および皮膚は、吸収性縫合糸を用いて個別に縫合した。カリフォルニア州立大学ロサンゼルス校（ＵＣＬＡ）学長を長とする動物研究委員会は本試験のプロトコルを承認し、全実験は米合衆国農務省動物研究ガイドラインにしたがって実施した。
【０１０６】
インプラントの生体力学的押込み試験。骨−インプラント結合の生体力学的強度を評価するための本方法は、他の場所で記載されている（例えば、Ｏｇａｗａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，７９：１８５７−６３（２０００）を参照）。円筒形インプラントを含有する大腿骨を採取し、直ちにインプラントレベルを上面にして自家重合樹脂中に包埋した。２０００Ｎのロードセルおよびプッシュロッド（径＝０．８ｍｍ）を備える試験機（Ｉｎｓｔｒｏｎ  ５５４４電気機械試験システム、Ｉｎｓｔｒｏｎ社、メリーランド州カントン）を使用して１ｍｍ／分のクロスヘッド速度で下向きに垂直でインプラントへ負荷をかけた。押込み試験値は、負荷変位曲線のピークを測定することによって決定した。
【０１０７】
結果
光線処理によるチタンのナノスケールの構造的変化。走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）試験は、光線処理前の機械加工された表面上の等方性および同心性の逆隆起部を示した（図２２ａ）。図２２ａは、４８時間にわたる光線処理前後の機械加工されたチタン表面の走査型電子顕微鏡写真を示している。４８時間にわたるＵＶ処理後、機械加工された表面でナノスフェア構造が発生した。ナノスフェアのサイズ範囲は径１０〜７０ｎｍに及んだ。酸エッチングされた表面は、光線処理前には一様な粗面にされた（図２２ｂ）。４８時間にわたる光線処理は、全酸エッチングされた表面上でナノスフェアを誘導した。図２２ｂは、４８時間にわたる光線処理前後の酸エッチングされたチタン表面の走査型電子顕微鏡写真を示している。
【０１０８】
光線処理によるチタンのミクロンスケールの構造的変化。ＳＥＭによる観察は、機械加工されたチタン表面が３週間にわたる光線処理後により粗面を示すことを明らかにした（図２２ｃ）。一部の領域は残留しているナノスフェアを示している。図２２ｃは、３週間にわたる光線活性化前後の機械加工されたチタン表面の走査型電子顕微鏡写真を示している。
【０１０９】
これとは対照的に、はっきりした山と谷を有する酸エッチングされたチタンの粗面は、１週間もしくは３週間にわたる光線処理後に丸くなった山および大きな山間距離を備えるようにトポグラフィ特性を変化させた（図２２ｄ）。図２２ｄは、１週間および３週間にわたる光線処理前後の酸エッチングされたチタン表面の走査型電子顕微鏡写真を示している。光線処理前の山間で認識できるナノスケール構造はより長期間の光線処理後に少なくなると思われた。新しく生成された丸くなった凸状は屋根様構造に見え、結果として構造の下方にアンダーカットスペースの作製を生じさせる。
【０１１０】
平均粗さ（Ｒａ）、最高山−谷粗さ（Ｒｐ−ｖ）および凹凸間隔（Ｓｍ）は、機械加工された表面については各々０．０２４±０．００５μｍ、０．１４９±０．０６４μｍ、および０．６５９±０．２６１μｍ、光線処理された機械加工された表面については各々０．０２２±０．００８μｍ、０．２３７±０．０７０μｍ、および０．９３４±０．１７４μｍ、酸エッチングされた表面については各々０．２３１±０．０５１μｍ、１．１９０±０．３８０μｍ、および１．１６３±０．２５２μｍ、ならびに光線処理された酸エッチングされた表面については各々０．０９７±０．０１６μｍ、０．８４６±０．０８２μｍ、および２．０１４±０．３９９μｍであった。光線処理された機械加工された表面は、未処理コントロールより大きな山−谷長さ（Ｒｐ−ｖ）および凹凸間隔（Ｓｍ）を示したが、光線処理された酸エッチングされた表面は未処理コントロールより低い平均粗さ（Ｒａ）および最高山−谷長さ（Ｒｐ−ｖ）、しかし高度の凹凸間隔（Ｓｍ）を示した（ｐ＜０．０５、ｔ検定）。これらの定量された結果は、上記に記載した形態学的観察と一致しており、光線処理がオリジナルの表面トポグラフィに様々に依存して表面トポグラフィを変化させることを示している。
【０１１１】
光線処理はチタン製インプラント安定化を加速して強化する。インプラント安定性のインビボ確立は、荷重負担器具としてのインプラントの臨床的能力を反映する最も適切な変量である。光線処理を行った、または行わなかったチタン製インプラントのインビボ安定性は、ラットモデルにおいて確立された生体力学的インプラント押込み試験を用いて試験した（例えば、Ｏｇａｗａ，Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，７９：１８５７−６３（２０００）を参照）。植込み２週間後の押込み試験値は、未処理コントロールの酸エッチングされたチタン製インプラントに比較して４８時間および１週間にわたり光線処理された酸エッチングされたチタン製インプラントの両方についておよそ３倍に急増した。図２３に示した試験では、光線活性化を行った、または行っていない酸エッチングされたチタン製インプラントをラット大腿骨内に配置し、インプラントを含む大腿骨試料を採取し、メチルメタクリレートブロック内に包埋した。次に押込み負荷に対する破壊強度を測定することによって、インプラントの生体力学的安定性を植込み２週間後に評価した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝５）として表示されている（記号「＊＊」は、データが、光線処理群および未処理コントロール群間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１））。
【実施例６】
【０１１２】
ジルコニウム製インプラント上の光線活性化
ジルコニウム表面のＵＶにより改善される親水性および骨伝導性。ジルコニウムオキシドの湿潤性（親水性）において考えられる光線誘発性変化を以下のとおりに試験した。４８時間にわたる０．１ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＡおよび０．０３ｍＷ／ｃｍ２ＵＶＢのレベルでの光線処理後に、湿潤性を液滴が形成した接触角によって評価した。１０μＬの水滴の接触角は光線処理後におよそ５°のレベルへ劇的に減少し（図２４ａ）、これは光線処理による疎水性表面からの超親水性表面の作製を示していた。ＵＶ光処理後に、ジルコニウム上の表面形態は変化する。ＳＥＭ試験によって、光線処理されたジルコニウム表面が、よりナノスケールの球状、コーン状もしくはピラミッド形のナノ構造からなる、未処理表面より粗くなることが明らかになった。ナノ構造のサイズは、約１０ｎｍ〜１，０００ｎｍの範囲に及んだ。
【０１１３】
図２４ａに示した試験では、親水性は、１０μＬの蒸留水の液滴の接触角（ジルコニウムディスクの側面図）によって評価した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている（「＊」は、データが、ＵＶ処理ジルコニウムおよび未処理ジルコニウム間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１））。
【０１１４】
光線処理されたジルコニウム表面上の骨芽細胞の増殖能力を調査した。細胞増殖を評価するために、ラット骨髄由来骨芽細胞は、光線処理を行った、または行っていないジルコニウム製ディスク上に接種した。ＵＶによる前処理は、１００％まで細胞増殖を有意に増加させた（図２４ｂ）。図２４ｂは、紫外線（ＵＶ）処理によって作製された細胞親和性ジルコニウム表面を示している。増殖は、ラット骨髄幹細胞由来骨芽細胞の細胞密度によって評価した。ＵＶ処理を行った、または行わない機械加工されたジルコニウムジオキシドディスクはポリスチレン製培養皿内へ水平に配置した。培養の相違する時点での細胞をトリプシン化し、血球計数器を用いて計数した。データは、平均値±ＳＤ（ｎ＝３）として表示されている（「＊」は、データが、光線処理および未処理コントロール間で統計的有意であることを示している（ｐ＜０．０００１））。
【０１１５】
骨芽細胞分化マーカーの遺伝子発現をジルコニウム上の骨髄由来骨芽細胞培養中でＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応）によって試験した（図２４ｃ）。オステオポンチン発現は光線処理および未処理表面間で３〜１４日後までにわずかに増加した、または保持されたが、これはジルコニウム上の光線処理が分化能力を危うくすることなく骨芽細胞増殖を増加させることを指示している。図２４ｃは、ジルコニウム表面上の紫外線処理後のオステオポンチン遺伝子の発現を示している。骨芽細胞は光線処理を行った、もしくは行っていないジルコニウムオキシド上で培養し、遺伝子発現を逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いて評価した。ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ発現のレベルに比較したオステオポンチン遺伝子の定量された発現レベルが提示されている。
【０１１６】
本発明の特定実施形態を示して記載してきたが、当業者には、その広範囲の態様において本発明から逸脱せずに変化および修飾を加えられることが明白である。このため、添付の特許請求項は、それらの範囲内に、本発明の真の精神および範囲内に含まれるようなすべてのそのような変化および修飾を含むものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１ａ】実施例１の試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素を示した図であり（機械加工された表面および酸エッチングされた表面）、図１ａは、走査型電子顕微鏡写真を示している（バー＝２０μｍ）。
【図１ｂ】実施例１の試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素を示した図であり（機械加工された表面および酸エッチングされた表面）、図１ｂは、原子間力顕微鏡写真を示している。
【図１ｃ】実施例１の試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素を示した図であり（機械加工された表面および酸エッチングされた表面）、図１ｃは、エネルギー分散型分光学的元素分析を示した図である。
【図２ａ】２つの相違する表面トポグラフィを有するチタン表面上の湿潤性の劇的な紫外線（ＵＶ）誘発性変化を示しており、図２ａは、ＵＶ照射前の疎水性の表面およびＵＶ照射された表面上の高親水性の表面を示している。
【図２ｂ】２つの相違する表面トポグラフィを有するチタン表面上の湿潤性の劇的な紫外線（ＵＶ）誘発性変化を示しており、図２ｂは、グリセロールの１０μＬの液滴によって評価した、ＵＶ照射後に高親油性表面に変化したＵＶ照射前の疎油性表面を示している。
【図２ｃ】２つの相違する表面トポグラフィを有するチタン表面上の湿潤性の劇的な紫外線（ＵＶ）誘発性変化を示しており、図２ｃは、ラット大動脈から抽出した血液の５０μＬの液滴によって評価した、ＵＶ照射されたチタン表面の高好血性の表面を示している。
【図３ａ】チタンへの紫外線照射によって増加したチタンの細胞走化性および細胞増殖活性を各々示した図である。
【図３ｂ】チタンへの紫外線照射によって増加したチタンの細胞走化性および細胞増殖活性を各々示した図である。
【図４ａ】チタンへの紫外線照射後の変化した骨関連遺伝子の発現を示した図である。
【図４ｂ】チタンへの紫外線照射後の変化した骨関連遺伝子の発現を示した図である。
【図５】チタンへの紫外線（ＵＶ）照射により増加した骨芽細胞培養のミネラル化能力を示した図である。
【図６】機械加工および酸エッチングされた表面を用いてチタン製インプラントについての生体力学的押込み試験によって評価された紫外線（ＵＶ）強化骨−チタン結合を示した図である。
【図７】チタンへの紫外線照射により増加した線維芽細胞の細胞増殖活性を示した図である。
【図８】様々な表面特性を有するチタン表面上および他の金属表面上の湿潤性の劇的な紫外線誘発性増加を示した図である。
【図９ａ】２つの相違する表面トポグラフィ：機械加工および酸エッチングされた表面を有するチタン表面の湿潤性の光線誘発性変化を示した図である。
【図９ｂ】２つの相違する表面トポグラフィ：機械加工および酸エッチングされた表面を有するチタン表面の湿潤性の光線誘発性変化を示した図である。
【図９ｃ】２つの相違する表面トポグラフィ：機械加工および酸エッチングされた表面を有するチタン表面の湿潤性の光線誘発性変化を示した図である。
【図１０ａ】紫外線（ＵＶ）処理前後の、本試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素組成を示した図である。
【図１０ｂ】紫外線（ＵＶ）処理前後の、本試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素組成を示した図である。
【図１０ｃ】紫外線（ＵＶ）処理前後の、本試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素組成を示した図である。
【図１１ａ】光線処理により作製されたチタン表面の細胞親和性を示した図である。
【図１１ｂ】光線処理により作製されたチタン表面の細胞親和性を示した図である。
【図１１ｃ】光線処理により作製されたチタン表面の細胞親和性を示した図である。
【図１１ｄ】光線処理により作製されたチタン表面の細胞親和性を示した図である。
【図１１ｅ】光線処理により作製されたチタン表面の細胞親和性を示した図である。
【図１１ｆ】光線処理により作製されたチタン表面の細胞親和性を示した図である。
【図１２ａ】生体力学的押込み試験によって評価された光線により強化された骨−チタン結合を示した図である。
【図１２ｂ】生体力学的押込み試験によって評価された光線により強化された骨−チタン結合を示した図である。
【図１３ａ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｂ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｃ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｄ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｅ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｆ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｇ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｈ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｉ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｊ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｋ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｌ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｍ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｎ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｏ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１３ｐ】インプラント周囲骨生成に光線処理された酸エッチングされたチタンの作用を示した図である。
【図１４ａ】サンドブラスト処理されたチタン表面の湿潤性の光線誘発性変化を示した図である。
【図１４ｂ】サンドブラスト処理されたチタン表面の湿潤性の光線誘発性変化を示した図である。
【図１４ｃ】サンドブラスト処理されたチタン表面の湿潤性の光線誘発性変化を示した図である。
【図１５ａ】光線処理によって作製された骨芽細胞親和性のサンドブラスト処理された表面を示した図である。
【図１５ｂ】光線処理によって作製された骨芽細胞親和性のサンドブラスト処理された表面を示した図である。
【図１６ａ】押出し試験のためのチタンサンプルの調製を示した図である。
【図１６ｂ】押出し試験のためのチタンサンプルの調製を示した図である。
【図１６ｃ】押出し試験のためのチタンサンプルの調製を示した図である。
【図１６ｄ】押出し試験のためのチタンサンプルの調製を示した図である。
【図１７】２つの相違する表面トポグラフィ：機械加工および酸エッチングされた表面を有するチタン表面の湿潤性の紫外線（ＵＶ）誘発性変化を示した図である。
【図１８ａ】紫外線（ＵＶ）処理前後の、本試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素組成を示した図である。
【図１８ｂ】紫外線（ＵＶ）処理前後の、本試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素組成を示した図である。
【図１８ｃ】紫外線（ＵＶ）処理前後の、本試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素組成を示した図である。
【図１９】チタンの骨セメント湿潤性の紫外線（ＵＶ）誘発性変化を示した図である。
【図２０】光線処理を行った、もしくは行っていない機械加工および酸エッチングされたインプラントの押出し試験値。
【図２１】チタン合金上の骨セメント湿潤性の紫外線（ＵＶ）誘発性変化を示した図である。
【図２２ａ】紫外線（ＵＶ）処理前後の、本試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素組成を示した図である。
【図２２ｂ】紫外線（ＵＶ）処理前後の、本試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素組成を示した図である。
【図２２ｃ】紫外線（ＵＶ）処理前後の、本試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素組成を示した図である。
【図２２ｄ】紫外線（ＵＶ）処理前後の、本試験において使用されたチタン表面の表面形態および元素組成を示した図である。
【図２３】生体力学的押込み試験によって評価された、光線により強化された骨−チタン結合を示した図である。
【図２４】機械加工された酸化ジルコニウム表面の水湿潤性の紫外線（ＵＶ）誘発性の改善を示した図である。
【図１ｃ】
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【図４ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図１０ｃ】
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【図１１ｅ】
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【図１１ｆ】
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【図１２ｂ】
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【図１３ｍ】
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【図１３ｎ】
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【図１３ｏ】
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【図１３ｐ】
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【図１５ａ】
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【図１６ｂ】
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【図１６ｄ】
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【図１８ｃ】
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【図２０】
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【図２３】
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【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図２ｃ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４ａ】
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【図５】
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【図６】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図９ｃ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１ａ】
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【図１１ｂ】
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【図１１ｃ−１】
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【図１１ｃ−２】
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【図１１ｄ】
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【図１２ａ】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１３ｃ】
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【図１３ｄ】
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【図１３ｅ】
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【図１３ｆ】
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【図１３ｇ】
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【図１３ｈ】
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【図１３ｉ】
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【図１３ｊ】
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【図１３ｋ】
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【図１３ｌ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１４ｃ】
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【図１５ｂ】
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【図１６ａ】
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【図１６ｃ】
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【図１７】
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【図１８ａ】
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【図１８ｂ】
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【図１９】
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【図２１】
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【図２２ａ】
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【図２２ｂ】
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【図２２ｃ】
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【図２２ｄ】
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【国際調査報告】
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