(57)【要約】  本発明は、還元型コエンザイムQ(CoQH2)で食事を補う望ましさを評価するためのキットおよび方法に関する。この方法は、ヒトのゲノムにおけるNQO1遺伝子のNQO1*2多型の出現を評価することを含む。多型のコピーの出現は、ヒトがCoQH2で食事を補うことから恩恵を受け得ることを示し、NQO1*2多型の2コピーの出現(すなわちホモ接合型)は、CoQH2で食事を補うことが特に望ましいことであり得ることを示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトのゲノムにおけるNQO1*2多型の出現を評価することを含み、前記多型のコピーの出現は、ヒトの食事を還元型コエンザイムQ(CoQH2)で補うことが、ゲノムに前記多型を含まないヒトよりも望ましいことを示す、CoQH2でヒトの食事を補う望ましさを評価する方法。
【請求項２】
ヒトの食事を補うのに適する投与量のCoQH2をさらに含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ヒトのゲノムが前記多型を含まない場合、適切な投与量は実質的にCoQH2を含まない、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
ヒトのゲノムが前記多型を1コピー含む場合は、適切な投与量は1日あたり少なくとも約50ミリグラムのCoQH2である、請求項2に記載の方法。
【請求項５】
ヒトのゲノムが前記多型を2コピー含む場合は、適切な投与量は1日あたり少なくとも約500ミリグラムのCoQH2である、請求項2に記載の方法。
【請求項６】
NQO1遺伝子のNQO1*1型よりも高いストリンジェンシーでNQO1*2多型とアニールする第1のオリゴヌクレオチドと、ヒトのゲノムに由来する核酸を接触させ、第1のオリゴヌクレオチドと核酸とのアニーリングを評価することにより、NQO1*2多型の出現を評価し、第1のオリゴヌクレオチドと核酸とのアニーリングは、ヒトのゲノムがNQO1*2多型を含むことを示す、請求項1に記載の方法。
【請求項７】
前記第1のオリゴヌクレオチドが支持体に付着している、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
前記第1のオリゴヌクレオチドが分子ビーコンオリゴヌクレオチドである、請求項6に記載の方法。
【請求項９】
NQO1*2多型よりも高いストリンジェンシーでNQO1遺伝子のNQO1*1型とアニールする第2のオリゴヌクレオチドと核酸を接触させ、第2のオリゴヌクレオチドと核酸とのアニーリングを評価することにより、NQO1*2多型の出現をさらに評価し、第2のオリゴヌクレオチドと核酸とのアニーリングは、ヒトのゲノムにおけるNQO1遺伝子の少なくとも1個の対立遺伝子がNQO1*2多型を含まないことを示す、請求項6に記載の方法。
【請求項１０】
前記第2のオリゴヌクレオチドが支持体に付着している、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
前記第1および第2のオリゴヌクレオチドが同じ支持体に付着している、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
前記第2のオリゴヌクレオチドが、分子ビーコンオリゴヌクレオチドである、請求項9に記載の方法。
【請求項１３】
前記第1および第2のオリゴヌクレオチドが、スペクトル的に異なる分子ビーコンオリゴヌクレオチドである、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
ヒトのゲノムにおけるNQO1*2多型の出現を評価すること、およびゲノムに前記多型が生じる場合はCoQH2を組成物中に含めることを含む、ヒトに投与するためのコエンザイムQ(CoQ)含有抗酸化組成物を配合する方法。
【請求項１５】
ヒトが前記多型についてホモ接合である場合、実質的に全てのCoQがCoQH2の形態であるように組成物を配合することをさらに含む、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
ヒトのゲノムにおけるNQO1*2多型の出現を評価することを含み、前記多型のコピーの出現は、ヒトがCoQH2を含む栄養補助食品を使用するべきであることを示す、ヒトがCoQH2を含む栄養補助食品を使用すべき妥当性を評価する方法。
【請求項１７】
ヒトのゲノムにおけるNQO1*2多型の出現を評価することを含み、ヒトが前記多型についてホモ接合であることは、ヒトがCoQH2を含む栄養補助食品を使用するべきであることを示す、ヒトがCoQH2を含む栄養補助食品を使用すべき妥当性を評価する方法。
【請求項１８】
ヒトのゲノムにおけるヌルNQO1多型の出現を評価することを含み、前記ヌル多型のコピーの出現は、ヒトの食事をCoQH2で補うことが、ゲノムに前記ヌル多型を含まないヒトよりも望ましいことを示す、還元型コエンザイムQ(CoQH2)でヒトの食事を補う望ましさを評価する方法。
【請求項１９】
前記ヌル多型がNQO1*2である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記ヌル多型がNQO1*3である、請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概ね、遺伝子試験の分野、および栄養補助食品としての抗酸化組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子酸素の特性は、ヒトの代謝を含む代謝過程におけるその利用を促進する。酸素は代謝のための基質として適切であるが、酸素は、また、ヒトの細胞に損傷を与え、または死滅させ得る毒性の形態で存在する。いくつかの毒性の形態の酸素は、生物学的システムにおいて自発的に形成し、その他はヒトの組織において代謝過程の作動により形成される。抗酸化組成物は、通常、ヒトの組織に存在し、組織に対する酸化的損傷の多くを防止する。コエンザイムQ(CoQ;ユビキノンと呼ばれることもある)は、ミトコンドリアにおける電子伝達鎖の構成成分であり、ヒト組織において抗酸化剤として作用することも認められている。
【０００３】
CoQは、酸化型および還元型(CoQH2、ユビキノール、またはCoQのヒドロキノン型と呼ばれる)で存在し得る。酸化型のCoQは、1対の電子を獲得するとCoQH2に変換される。CoQH2の形態では、CoQは、効果的な膜可溶性の抗酸化剤である。CoQH2は、電子対を、毒性の形態の酸素または不適切に酸化された細胞成分などの別の基質に伝達することにより酸化型CoQに変換されて戻されることができる。この電子伝達が、CoQの抗酸化作用の基本である。しかし、酸化型のCoQは、還元型のCoQH2に再変換されるまで、かつ、されなければ、実質的なさらなる抗酸化作用を示さない。
【０００４】
抗酸化のCoQH2を再生するためのCoQへの電子の伝達は、メナジオン還元酵素、およびNAD(P)H:キノンアクセプターレダクターゼの名称でも知られている、DT-ジアホラーゼと呼ばれるミトコンドリアの酵素によって触媒される電子２個の伝達を含む、数々の経路により起こり得る(Beyerら、1994年、Molec. Aspects Med.、15巻(Supp.)、s117〜s129頁;Beyerら、1996年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93巻、2528〜2532頁)。この酵素は、NQO1遺伝子によりコードされ、その発現は抗酸化作用が必要である組織において上方制御されていると認められている(Rossら、2000年、Chemico-Biological Interactions、129巻、77〜97頁;Rainaら、1999年、Redox Rep.、4巻(1〜2)、23〜27頁; SantaCruzら、2004年、Neurobiol. Aging、25巻(1)、63〜69頁)。Rossらは、ホモ接合多型の形質移入細胞におけるNQO1タンパク質の発現および活性が実質的に破壊されたNQO1における一多型を開示した。NQO1*2多型と呼ばれるこの多型の出現を、いくつかのタイプの腫瘍を発生する危険性の増大、およびベンゼン誘発性の血液毒性の増大と別の研究者が関連付けている。しかし、ヒトに好適な抗酸化剤を選択するのにNQO1*2多型を用いることに対する役割を認めていなかったと考えられている。
【０００５】
全てではないにしても殆どのヒト遺伝子は、少なくとも少数の方法において異なる様々な形で生じる。ヒト遺伝子における異質性は、徐々にゲノムに生じた、部分的には、少数の、非致死性の突然変異から生じたと考えられている。場合によっては、遺伝子のオルタナティブ形態(alternative form)間の違いは、遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列における違いとして顕在化する。いくつかのアミノ酸配列の違いにより、タンパク質の反応性または基質特異性が変わることがある。遺伝子のオルタナティブ形態(alternative form)間の違いは、(仮にあったとしても)遺伝子が発現される度合いにも影響を及ぼし得る。しかし、ヒト遺伝子に生じる多くの異質性は、あらゆる特定の表現型と相関していないと思われる。知られている異質性には、例えば、一塩基多型(すなわち、単一のヌクレオチド残基に違いがある遺伝子のオルタナティブ形態(alternative form))が含まれる。他の知られている多型の形には、遺伝子のより大型の(例えば、2〜1000残基)部分の配列が多くの配列の違いを示すもの、および遺伝子の部分の存在または非存在により異なるものが含まれる。
【０００６】
多くの障害および生理学的状態が、障害または生理学的状態を示すヒトのゲノムにおける、個々の遺伝子の1つまたは複数のオルタナティブ形態(alternative form)の出現に相関している。例えば、Kimuraら(2000年、Am. J. Ophthalmol.、130巻、769〜773頁)は、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ遺伝子のSNPの出現と、ある形態の黄斑変性症との間の関係を発表している。
【０００７】
個体の障害と個体の遺伝子の多型との間の関係は知られている。しかし、障害は、通常、比較的多数の遺伝子のいずれかにおける多型の結果として起こり得るものであり、その結果、ヒトのゲノムに生じるあらゆる単一の遺伝子の多型の形を評価しても、通常、ヒトが障害を発症する全体の可能性を予測するものではない。
【０００８】
好適な抗酸化組成物を時宜を得て摂取することにより、予防し、阻害し、遅延し、または重症度を低減することができる多くの障害を含めた障害は、徐々に発症する。このような組成物は、たびたび摂取されるというものではない。なぜならば、組成物を得ること、および、それを定期的に投与することが、高価であり、または不便であるからである。個体の遺伝子の組成により、個体がある障害に罹患しやすいこと、または他者よりもある種の抗酸化組成物の恩恵を受けにくくなっていることを、個体が認識しないことで、抗酸化組成物の、効果的な予防的および治療的使用が、妨げられてもいる。
【０００９】
CoQは、栄養補助食品の形態で市販されている。殆どのCoQサプリメントは、酸化型(ユビキノン)のCoQを提供している。還元型のCoQを含むサプリメントは記載されており(例えば、国際特許公開第WO01/52822号、米国特許第6,056,971号、米国特許第6,300,377号、および米国特許第6,441,050号)、市販されている。CoQH2含有サプリメントは、CoQに比べてCoQH2の利用率および取り込みが強化されていることが認められている。しかし、このようなサプリメントの恩恵を受け得る特定の個体群については、認めていなかったと考えられている。
【特許文献１】国際特許公開第WO01/52822号
【特許文献２】米国特許第6,056,971号
【特許文献３】米国特許第6,300,377号
【特許文献４】米国特許第6,441,050号
【特許文献５】米国特許第6,013,431号
【特許文献６】米国特許第6,004,744号
【非特許文献１】Beyerら、1994年、Molec. Aspects Med.、15巻(Supp.)、s117〜s129頁Beyerら、1996年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93巻、2528〜2532頁
【非特許文献２】Beyerら、1996年、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、93巻、2528〜2532頁
【非特許文献３】Rossら、2000年、Chemico-Biological Interactions、129巻、77〜97頁
【非特許文献４】Rainaら、1999年、Redox Rep.、4巻(1〜2)、23〜27頁
【非特許文献５】SantaCruzら、2004年、Neurobiol. Aging、25巻(1)、63〜69頁
【非特許文献６】Kimuraら、2000年、Am. J. Ophthalmol.、130巻、769〜773頁
【非特許文献７】Kostrikisら、1998年、Science、279巻、1228〜1229頁
【非特許文献８】Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、N.Y.、1989年、6.3.1〜6.3.6
【非特許文献９】EIyら、2000年、J. Orthomolec. Med.、15巻(2)、63〜68頁
【非特許文献１０】Jaiswalら、1988年、J. Biol. Chem.、263巻(27)、13572〜13578頁、Ross、2004年
【非特許文献１１】Ross、2004年、Atlas Genet. Cytogenet. Oncol. Haematol.、ID # NQ01ID375
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
ヒトに対する抗酸化剤の必要性を、そのヒトの遺伝子の組成に基づいて評価する方法が、依然として必要とされている。本発明は、この必要性を満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、ヒトの食事をCoQH2で補う望ましさを評価する方法を含む。この方法は、NQO1*2多型のヒトのゲノムにおける出現を評価することを含む。この多型のコピーの出現は、ヒトの食事をCoQH2で補うことがゲノムに多型を含まないヒトよりも望ましいことを示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
本発明は、還元型コエンザイムQ(CoQH2)で食事を補う、ヒトの必要性の指標として、NQO1*2多型を用いることができるという発見に関する。あるヒトが、ゲノムにNQO1*2多型を0、1、または2コピー有するか否かを評価することにより、そのヒトがCoQH2で食事を補うことを必要とするか否かを決定することができ、そのように補うことが必要だとみなされた場合は、相対的な程度の望ましい補充を決定することができる。
【００１３】
本質的に、本発明は、CoQH2で食事を補う個体の必要性を評価する方法に関する。この方法は、個体のゲノムにおけるNQO1*2多型の出現を分析することを含む。NQO1*2の多型が個体のゲノムに生じない場合は、その個体はCoQH2で補うことを必要とせず、個体の食事を任意のCoQで補うことは、CoQH2よりも入手がより容易で安価であり得る酸化型のCoQを用いて実現することができる。個体のゲノムにNQO1*2多型が1コピー出現すれば、個体がCoQH2の投与から恩恵を受け得ることを示しており、酸化ストレスの増大(例えば、激しい運動)の状態が予測される場合に、CoQH2の投与が個体に特に勧められ得る。個体が、NQO1*2多型についてホモ接合である場合は、CoQH2で食事を補うことは、個体における抗酸化効果を達成するのに有効である可能性があり、(酸化型)CoQで食事を補うことはその個体に有効性がずっと低い可能性があることを示している。
【００１４】
（定義）
本明細書で用いられる、以下の語はそれぞれ、このセクションにおけるそれと関連する意味を有する。
【００１５】
多型の「特徴的な残基」は、ヌクレオチド残基であり、その同一性は、多型に対応するオルタナティブ形態(alternative form)の間で変化することが知られている。
【００１６】
「分子ビーコンオリゴヌクレオチド」は、記載されているように、その5'末端に蛍光標識(例えば、ローダミン、FAM、TET、VIC、JOE、またはHEX)が付着しており、その3'末端に蛍光クエンチャー(例えば、TAMRAまたはDABCYL)が付着している(またはその逆)一本鎖オリゴヌクレオチドである(Kostrikisら、1998年、Science、279巻、1228〜1229頁)。
【００１７】
2つの分子ビーコンオリゴヌクレオチドは、分光光度法、または分光蛍光分析法を用いてディファレンシャルに検出することができる場合に、「スペクトル的に異なる」。スペクトル的に異なるオリゴヌクレオチドを区別するのに用いることができる特徴の例には、吸収または励起の波長、発光の波長、および蛍光の寿命が含まれる。
【００１８】
「教材」は、本明細書に記載するキットの使い方を伝達するのに用いることができる、出版物、記録、図、またはあらゆる他の表現の媒体、キットを用いて検出可能である様々な多型の重要性に重みを加えるための数値、あるいはその両方である。本発明のキットの教材は、例えば、本発明のキットを含む容器に添付されており、またはキットを含む容器と一緒に出荷される。あるいは、教材は、教材およびキットを受容者が共同して用いる意図で容器と別々に出荷してもよい。
【００１９】
2つのポリヌクレオチドがアニールする「ストリンジェンシー」は、溶液の状態がアニーリングにより好ましくなくなった時に、ポリヌクレオチドが溶液中でアニールする相対的な可能性を意味する。ストリンジェントな条件の例は当技術分野では知られており、入手可能な参考文献に見ることができる(例えば、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons、N.Y.、1989年、6.3.1〜6.3.6)。水性および非水系のアニーリング方法がこの参考文献に記載されており、いずれも用いることができる。一般的には、塩濃度、温度、および界面活性剤濃度のうちの1つまたは複数が増大するに従って、ポリヌクレオチドの第1の対が、より高い確率でアニールしている(すなわちアニールしたままでいる)場合に、第1の対は、第2の対よりもより高いストリンジェンシーでアニールしている。
【００２０】
「伸長不可能な」ヌクレオチド残基は、ポリメラーゼによって(すなわち、ポリメラーゼによって触媒され、その相補物に関してポリヌクレオチドを伸長することにより)ポリヌクレオチドに付加することができるヌクレオチド残基であり、かつ、ポリヌクレオチドへの付加の際に、ポリメラーゼによってポリヌクレオチドがさらに伸長されないようにするヌクレオチド残基である。
【００２１】
「コエンザイムQ(CoQ)」は、当技術分野では電子伝達鎖の構成成分として、および抗酸化化合物として知られている、脂質可溶性のベンゾキノンのクラスである。CoQは、芳香族のキノンの「頭部」および多数が連結したイソプレン単位の「尾部」の形態で存在する。CoQ10は、CoQの主に天然に存在する形態であり、10個の連結したイソプレン単位からなる尾部を有する。本明細書で用いられるCoQは、CoQ10だけではなく、食事の補充では当技術分野で知られているCoQ化合物全てを含む。
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、NQO1*2多型を、還元型コエンザイムQ(CoQH2)で食事を補うことに対する個体の必要性の指標に用いることができるという発見に関する。
【００２３】
本発明は、ヒトの食事をCoQH2で補う望ましさを評価する方法を含む。この方法は、ヒトのゲノムにおけるNQO1*2多型の出現を評価することを含む。多型のコピーの出現は、ヒトの食事をCoQH2で補うことについて、ゲノムに多型を含まないヒトよりも望ましいことを示す。2コピーの多型の出現は、CoQH2でヒトの食事を補うことについて、NQO1*2多型が1コピーまたは0コピーのゲノムのヒトの食事を補うよりも、より重要であることを示す。実際、NQO1*2多型についてホモ接合である個体はミトコンドリアのDT-ジアホラーゼ活性を殆どまたは示さないので、CoQH2で食事を補うと、酸化ストレス関連の障害の発症を阻害し、遅らせ、または予防し、あるいは発症するあらゆるそのような障害の重症度を低減することができる。アルツハイマー病、黄斑変性症、および糖尿病などの例を含む、多くの酸化ストレス関連の障害が知られている。
【００２４】
ヒトの身体は、約2グラムのCoQを含むと考えられており、毎日の代謝回転は1日あたり約0.5グラムであると考えられている(EIyら、2000年、J. Orthomolec. Med.、15巻(2)、63〜68頁)。CoQは、生理学的合成により、または食事から得ることができる。CoQの生合成は、ヒトが年をとると共に低減し、典型的な西洋の食事のCoQの平均含有量は比較的低いので(すなわち、1日あたり約5ミリグラム)、食事による補充が得策であることが多い。CoQサプリメントは、1投与量あたり50、100、および200ミリグラムを含む単位投与量形態で通常入手できる。400ミリグラム、800ミリグラム、またはそれを超える量の投薬が知られている。通常の技能を持った医師であれば、個体の年齢、体重、ライフスタイル、疾患の状態、および本明細書に開示する情報を考慮に入れて、個体に好適なCoQの1日投与量を決定することができる。
【００２５】
CoQで食事を補うことは、広く発表されている。殆どのCoQ含有栄養補助食品は、CoQを、還元型であるCoQH2よりも安定であり、入手が一般により安価である、その酸化型で含んでいる。CoQH2は、酸化型のCoQよりも大きい生物学的利用率を示すと報告されている(国際特許公開第WO01/52822号)。しかし、酸化型CoQを還元するヒトの能力に基づいたヒト間での違いについての記載は存在していない。
【００２６】
本明細書に記載するように、ゲノム中にNQO1*2多型が2コピー生じるヒトは、ゲノムがその多型のコピーを含まないヒトよりも、CoQH2を含む栄養補助食品から、より大きな抗酸化の恩恵を得る。ゲノム中にNQO1*2多型が2コピー生じるヒトは、ゲノムがその多型を1コピー含むヒトよりも、CoQH2を含む栄養補助食品から、より大きな抗酸化の恩恵を得る。NQO1*2ホモ接合型とNQO1*1ホモ接合型との間の違いは、NQO1*2ホモ接合型とNQO1*2/NQO1*1ヘテロ接合型との間の違いよりも大きい可能性があるが、NQO1*2ホモ接合型は、また、CoQH2を含む栄養補助食品からヘテロ接合型よりも大きな抗酸化の恩恵を得るはずである。
【００２７】
例示によると、知られている酸化ストレス関連の障害の傾向のない21歳のヒトでは、個体が(正常の)NQO1*1型のNQO1遺伝子にホモ接合型である場合、個体が摂取するあらゆるCoQサプリメントは、CoQH2を含む必要がないと推薦するのが適切であり得る。しかし、同じ個体がNQO1*2/NQO1*1ヘテロ接合型であることが見出された場合は、個体がサプリメントとして摂取するいくらかまたは全てのCoQ(例えば、1日あたり50ミリグラム)はCoQH2の形態であることが推薦され得る。この個体が、本明細書に記載する方法を用いて、NQO1*2ホモ接合型であることを見出した場合は、個体がサプリメントとして摂取する実質的に全てのCoQ(例えば、1日あたり500ミリグラム)は、還元型であることが推薦され得る。
【００２８】
NQO1*2多型の出現は、実質的にあらゆる知られた多型の検出方法によって評価することができる。このような方法には、例示によるものでは、配列に基づく方法、ハイブリダイゼーションに基づく方法、およびプライマー伸長方法(少なくとも一塩基伸長方法およびPCR増幅方法)が含まれる。方法が、ゲノムにおけるNQO1*2多型の出現をそのような出現の欠如から区別することができるのであれば、多型を検出するのに用いる正確な方法は重要ではない。一実施形態では、個体のゲノムに由来する核酸を、NQO1遺伝子のNQO1*1型よりも高いストリンジェンシーでNQO1*2多型とアニールするオリゴヌクレオチドと最初に接触させる。第1のオリゴヌクレオチドと核酸とのアニーリングをその後評価し、第1のオリゴヌクレオチドと核酸とのアニーリングは、個体のゲノムがNQO1*2多型を含むことを示す。
【００２９】
個体のゲノムがNQO1遺伝子の正常のコピー(すなわち、NQO1*1型の遺伝子)を含むか否かを決定するために、個体のゲノムを評価することもできる。イソ型のNQO1遺伝子に関して個体の対立遺伝子を含有するか否かを決定するために、この評価を用いることができる。NQO1*3多型の出現も、評価することができる。しかし、NQO1*3多型は非常に希であるので、事実上無視することができる。もちろん、複数のNQO1多型を検出するために、個体のゲノムに対して複数の試験(すなわち、複数のプローブまたはプライマーを用いた別々の試験または単一の試験のいずれかとして)を行うことができる。このような試験を用いて、個体のゲノムにおいて、1つまたは複数のヌルNQO1多型の(すなわち、NQO1*2およびNQO1*3のいずれかまたは両方)出現、ならびに、個体が疾患に関連する多型にホモ接合型であるかまたはヘテロ接合型であるかを決定することができる。この試験は、全ての知られている多型の形を説明することができ、知られている多型において、またはその部位の付近で以前に特徴付けられていない多型が生じている場合に示すことができるので、結果の「チェック」もできる。
【００３０】
一実施形態では、1対のオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、多型の領域を含むNQO1遺伝子の部分を増幅する。増幅された部分を、1つの多型がその部分で生じた場合にのみ増幅された部分とストリンジェントな条件下でアニールするが、その部分で別の多型が生じた場合は増幅した部分とアニールしない配列を有するオリゴヌクレオチドと接触させることによって、多型の領域に生じる1つまたは複数の多型の検出を実現することができる。様々な、許容できるストリンジェントな条件が当技術分野では知られており、当業者であれば任意の特定の増幅された部分/オリゴヌクレオチド対に対して適切であるとして変更することができる。ストリンジェントな条件の一例は、約45℃で6×塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム(SSC)におけるハイブリダイゼーション、その後50℃で0.2×SSC、0.1%(w/v)SDSにおける1回または複数回の洗浄である。
【００３１】
代替の一実施形態では、対象のゲノム、対象のゲノムの分画、または対象のゲノムから産生した増幅生成物(例えば、NQO1遺伝子の増幅された部分)の1コピーを含むサンプルにおける多型(NQO1*1、NQO1*2、NQO1*3、またはこれらのいくつかの組合せ)を検出するために、1つまたは複数の分子ビーコンオリゴヌクレオチドが用いられる。
【００３２】
分子ビーコンプローブは、記載されているように、その5'末端に蛍光標識(例えば、ローダミン、FAM、TET、VIC、JOE、またはHEX)が付着しており、その3'末端に蛍光クエンチャー(例えば、TAMRAまたはDABCYL)が付着している(または、その逆)一本鎖オリゴヌクレオチドである(Kostrikisら、1998年、Science、279巻、1228〜1229頁)。各分子ビーコンプローブの配列は、それによってプローブがセルフアニーリングしてヘアピン構造を形成することができる2つの相補的なヘアピン領域を含むように選択される。ヘアピン構造を形成する際に、5'および3'末端は、近づいて会合する。プローブは、標的の配列に相補的であるように選択される標的部分も含む(例えば、本明細書に開示する遺伝子の単一の多型)。標的部分および少なくとも1つのヘアピン領域は、相互に近接して位置し、標的部分はヘアピン領域に重複し、またはそれと隣接し、それらの間にせいぜい約5ヌクレオチド残基しかないことを意味している。
【００３３】
分子ビーコンプローブのヘアピン領域が相互にアニールする場合は、プローブは蛍光性ではない、というのは、ヘアピン構造が形成し、プローブの一端に付着している蛍光クエンチャーがプローブの他端に付着している標識の蛍光を消光するからである。プローブの標的部位が、標的配列を有する核酸の領域とアニールする場合は、ヘアピン構造の形成が阻害され、蛍光クエンチャーが蛍光標識と会合せず、プローブは蛍光性である。単一の反応混合液で多数の分子ビーコンプローブを用いることができ、分子ビーコンプローブがスペクトル的に異なる場合は、プローブと関連した蛍光を区別することができる。
【００３４】
したがって、この実施形態では、1つまたは複数の分子ビーコンプローブを使用し、各々は、NQO1遺伝子の1多型の標的領域(例えば、20から40ヌクレオチド残基、より好ましくは20から30残基)に相補的である標的部分を有する。標的領域は、多型がそこに生じるヌクレオチド残基を含み、好ましくはそれをほぼ中心に取り囲んでいる。より好ましくは、一方は遺伝子の多型(例えば、NQO1*1型)の標的領域に完全に相補的な標的領域を有し、他方は遺伝子の別の1多型(例えば、NQO1*2多型)の標的領域に完全に相補的である標的領域を有するような2つのプローブが用いられる。
【００３５】
NQO1遺伝子における多型を評価し得る方法についてのさらに別の一実施形態では、多型形態NQO1の特徴的な残基に隣接している領域に相補的であるオリゴヌクレオチドプライマー(例えば、NQO1*2型では残基609、NQO1*3型では残基465)を、ポリメラーゼ酵素を用いて伸長し、特徴的な残基に相補的である位置におけるプライマーに付加されたヌクレオチド残基の同一性を決定する。限られた数の(またはたった1個の)ヌクレオチド残基がプライマー中に確実に組み入れられるために、伸長不可能なヌクレオチド残基の存在下でプライマーを伸長することができる。このタイプの方法は当技術分野では知られており(例えば、Orchid Biocomputer, IncのSNP-IT(登録商標)技術)、例えば、米国特許第6,013,431号、および第6,004,744号に記載されている。
【００３６】
多型の形態の遺伝子を検出するために、多くの試験および試験様式が市販されている。NQO1多型を検出し、区別し、または検出および区別するのに用いる試験の様式は重要ではない。1つまたは複数の多型を検出するための試薬が支持体に固定されているものを含む迅速試験は、遺伝子サンプルの回収および結果の報告の間の比較的迅速な回転が望まれる場合には、好ましいことがある。
【００３７】
本明細書に記載するNQO1遺伝子の多型の形は以下の通りである。正常の形態の遺伝子は、多型形態NQO1*1と呼ばれ、Jaiswalら、1988年、J. Biol. Chem.、263巻(27)、13572〜13578頁、Ross、2004年、Atlas Genet. Cytogenet. Oncol. Haematol.、ID # NQ01ID375、および文献における他所に記載されている遺伝子の形態である。NQO1*2多型は、ヌクレオチド残基609がC(NQO1*1における)からT(NQO1*2における)に変化し、アミノ酸残基187のプロリン(NQO1*1における)からセリン(NQO1*2における)への変化をもたらしている点でNQO1*1と異なる。NQO1*3多型は、ヌクレオチド残基465がC(NQO1*1における)からT(NQO1*3における)に変化し、アミノ酸残基139のアルギニン(NQO1*1における)からトリプトファン(NQO1*3における)への変化をもたらしている点でNQO1*1と異なる。NQO1*3多型は、非常に希であると思われ、約20000個体に1より少なく生じる。
【００３８】
本明細書に記載するNQO1多型検出試験から得られた情報を用いて、個体のゲノムに基づいて、CoQ含有抗酸化組成物をヒト個体に投与するために配合することができる。ヒトのゲノムが、1つのNQO1*2多型(またはNQO1*3多型)を含む場合、個体は酸化型CoQを還元する能力が損傷されていることが予測できる。これは、個体がCoQH2の投与から恩恵を受けることを示す。個体のゲノムにおける2つのヌルNQO1多型の出現は、個体が酸化型CoQを還元する能力に重度の損傷を示すことを示す。このような個体では、個体に配合されたサプリメントにおける殆どまたは全てのCoQはCoQH2の形態で存在することが推薦され得る。さらに、個体は、個体の身体にすでに存在するCoQを還元するのが困難であるので、特に、個体が(NQO1多型以外の理由で)酸化ストレス関連の障害に対する感受性を増大させている場合に、個体がこのような障害に罹患している場合に、または個体が近い将来酸化ストレスに関連する活動(例えば、激しい運動)に従事すると予想される場合に、補う目的に望ましい量の過量のCoQH2の量を投与することが有利であり得る。
【実施例】
【００３９】
本発明を、次に、以下の実施例を参考に記載する。これらの実施例は、例示の目的で提供するにすぎず、本発明はこれらの実施例に限定されるものではないが、本明細書に提供する教示の結果として明らかである変形形態を全て包含する。
【００４０】
(実施例１：NQO1遺伝子型およびCoQ酸化還元比の相関)
ヒト患者のNQO1遺伝子の対立遺伝子の含有量と、患者の血液にその還元型(CoQH2)で存在するCoQの分画との間に相関が見出された。
【００４１】
盲検法の試験において、ヒト対象のNQO1遺伝子型を評価した。2週間、患者は、CoQサプリメントまたはあらゆる他の抗酸化剤含有栄養補助食品を摂取しなかった。その2週間の後、各対象から血液サンプルを採取し、各血液サンプル中のCoQおよびCoQH2の量を決定した。
【００４２】
ゲノムが正常(NQO1*1)の形態のNQO1遺伝子を2コピー含む対象は、16.9±2.2というCoQ酸化還元比(還元型CoQの濃度を酸化型CoQの濃度で割ったもの)を示した。ゲノムがNQO1*1を1コピーとNQO1*2を1コピー含む対象のCoQ酸化還元比は11.9±1.1であった。これらの結果は、NQO1遺伝子型は、ヒト対象におけるCoQの酸化還元比と相関があり得ることを示している。
【００４３】
Human Genome Epidemiology Network databaseによると、NQO1*2多型は、白人の約40％にヘテロ接合型(すなわち、NQO1*1/NQO1*2ヘテロ接合型)の形態で生じ、白人の約5％にホモ接合型(すなわち、NQO1*2/NQO1*2ホモ接合型)の形態で生じる。これらの観察は、本明細書に記載した方法は、ヒトの集団に広く適用可能であることを示唆している。心臓、神経、および他の組織におけるCoQおよびDT-ジアホラーゼの抗酸化作用の重要性を鑑みると、本明細書に記載した方法は、CoQH2を含む栄養補助食品の摂取から恩恵を受けるヒト対象、特に、心臓、神経および他の組織の酸化ストレス関連の障害に罹患し、またはそれを発症する危険性のある対象を同定するのに有用であることが予想できる。このような障害の例には、アルツハイマー病、黄斑変性症、メタボリックシンドローム、および糖尿病が含まれる。
【００４４】
本明細書に引用した全ての特許、特許出願、および刊行物の開示は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【００４５】
本発明を、特定の実施形態を参考にして開示したが、本発明の他の実施形態および変更形態は、当業者であれば本発明の真の精神および範囲から逸脱することなしに考案することができることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、このような実施形態および同等の変更形態全てを包含する。
【国際調査報告】
2008534013.tif 000002
2008534013.tif 000003