(57)【要約】  ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造内に制約されるアルファヘリックスのキメラペプチドを共有結合的に安定化する方法が開示される。本明細書内で開示されている方法により作られるコイルドコイル構造は、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の融合性立体配座内に含まれる内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部、特にＨＩＶ  ｇｐ４１細胞外領域の内部コイルドコイル領域を模倣する。開示されているＨＩＶ由来のキメラペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮヘリックスの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合された非ＨＩＶ可溶性三量体型のコイルドコイルを含み、前記ペプチドの間のジスルフィド結合または化学選択的結合の形成を通じてホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造内で共有結合的に安定化される。本明細書で開示されている方法により作られる共有結合的に安定化されたＨＩＶ由来のホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造は、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合中間物質のよく似た模倣薬を表し、ＨＩＶ感染の強力阻害剤である。これらのＨＩＶ由来のキメラペプチドでは、ウイルス宿主細胞膜融合プロセスを阻害することによりＨＩＶ感染に対する治療処置を行うことができる。
2008501028.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、
（ｂ）前記ペプチド間の共有結合の形成により三量体コイルドコイル構造において（ａ）から３つのキメラペプチドを安定化させることとを含み、前記共有結合は、化学選択的反応から結果として生じるジスルフィド結合および共有結合からなる群から選択される、前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法。
【請求項２】
（ａ）
（ｉ）エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、
（ｉｉ）前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、
（ｂ）三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、
（ｃ）（ｂ）において形成された前記三量体コイルドコイル構造を酸化させて、前記コイルドコイルの並列するキメラペプチド上のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して前記コイルドコイルを共有結合的に安定化することとを含む、前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法。
【請求項３】
（ａ）における前記可溶性キメラペプチドが、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含む、請求項２に記載の三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法。
【請求項４】
（ａ）エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、
（ｂ）三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、
（ｃ）前記キメラペプチド間の共有結合である化学結合の形成により（ｂ）において前記三量体コイルドコイル構造を安定化させることとを含み、前記化学結合は、化学選択的反応により形成される、前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法。
【請求項５】
（ａ）における前記可溶性キメラペプチドが、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含む請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記化学結合が、チオエーテル結合である請求項５に記載の方法。
【請求項７】
複数の前記可溶性キメラペプチドが、前記結果として得られる三量体コイルドコイル構造が、
（ａ）さらに前記ペプチドのαヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基を含む１つのキメラペプチドと、
（ｂ）それぞれ求電子性部分を組み込むように誘導体化された２つのキメラペプチドとからなる濃度で、インキュベートされ、
（ａ）における前記キメラペプチド中のそれぞれのシステイン残基の求核スルフヒドリル基は、（ｂ）における前記誘導体化されたキメラペプチドの求電子性部分とチオエーテル結合を形成する請求項６に記載の方法。
【請求項８】
（ｂ）における前記２つのキメラペプチドは、ハロゲン化アルキル部分とマイケル受容体とからなる群から選択される求電子性部分を組み込むこように誘導体化される請求項７に記載の方法。
【請求項９】
（ａ）コイルドコイルの可溶性三量体型を含む骨格部分と、
（ｂ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含むＮペプチド部分、またはこの修飾型と、
（ｃ）少なくとも２つのシステイン残基を含むシステイン部分とを含み、
（ａ）における前記骨格部分は、（ｂ）における前記Ｎペプチド部分にヘリックスフェーズで融合されて、αヘリックス領域を形成し、（ｃ）における前記前記システイン部分は、前記αヘリックス領域の外に配置される可溶性キメラペプチド。
【請求項１０】
（ｂ）における前記Ｎペプチド部分が、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１に由来する請求項９に記載のキメラペプチド。
【請求項１１】
前記Ｎペプチド部分が、前記ペプチドの前記骨格部分のＣＯＯＨ末端に融合される請求項１０に記載のキメラペプチド。
【請求項１２】
前記Ｎペプチド部分が、Ｎヘリックスコイルドコイル疎水性ポケットを形成する、アミノ酸残基を含むＨＩＶ−１  ｇｐ４１  Ｎペプチドの十分な部分を含む請求項１１に記載のキメラペプチド。
【請求項１３】
前記Ｎペプチド部分が、Ｎ１７（ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４））を含む請求項１２に記載のキメラペプチド。
【請求項１４】
前記Ｎペプチド部分が、ｇｐ４１のアミノ酸５７７あたりからアミノ酸５８１あたりまでのところに配置されている潜在的免疫優勢エピトープを排除するように変異された修飾ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  Ｎペプチドである請求項１２に記載のキメラペプチド。
【請求項１５】
前記修飾Ｎペプチド部分が、Ｎ１７Ａｌａ４  （ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０））を含む請求項１４に記載のキメラペプチド。
【請求項１６】
前記ペプチドの前記骨格部分が、Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺコイルドコイルモチーフ（ＹＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９））の全部または一部、またはこれの修飾型を含む請求項１１に記載のキメラペプチド。
【請求項１７】
前記ペプチドの前記骨格部分が、ＩＺコイルドコイルモチーフ（ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１））を含む請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項１８】
前記ペプチドの前記骨格部分が、ＥＺコイルドコイルモチーフ（ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２））を含む請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項１９】
前記ペプチドの前記骨格部分が、ＳＺコイルドコイルモチーフ（ＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７））を含む請求項１６に記載のキメラペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドの前記システイン部分が、前記ペプチドの前記αヘリックス領域のＮＨ２末端に配置されている少なくとも２つの連続するシステイン残基を含む請求項１１に記載のキメラペプチド。
【請求項２１】
前記システイン残基が、スペーサー領域により前記αヘリックス領域から分離される請求項２０に記載のキメラペプチド。
【請求項２２】
前記ペプチドの前記システイン部分が、前記ペプチドの前記αヘリックス領域のＣＯＯＨ末端に配置されている少なくとも２つの連続するシステイン残基を含む請求項１１に記載のキメラペプチド。
【請求項２３】
前記システイン部分が、前記ペプチドの前記αヘリックス領域のＮＨ２末端に配置されている３つの連続するシステイン残基を含む請求項１１に記載のキメラペプチド。
【請求項２４】
前記システイン残基が、スペーサー領域により前記αヘリックス領域から分離される請求項２３に記載のキメラペプチド。
【請求項２５】
前記ＮＨ２末端に配置されている前記システイン残基が、保護されたチオール基を有する請求項２４に記載のキメラペプチド。
【請求項２６】
（ａ）ＣＣＩＺＮ１７と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と、
（ｂ）ＣＣＥＺＮ１７と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と、
（ｃ）ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と、
（ｄ）ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９と、
（ｅ）ＣＣＩＺＮ２３と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３と、
（ｆ）ＣＣＥＺＮ２３と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５と、
（ｇ）ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２と、
（ｈ）ＳＣＣＩＺＮ１７と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１と、
（ｉ）ＣＣＳＺＮ１７と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８と、
（ｊ）ＣＣＳ１７Ｎ１７と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００と、
（ｋ）ＣＣＥ１０Ｎ１７と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９と、
（ｌ）ＣＣＥ１７Ｎ１７と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６と、
（ｍ）ＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７と指定されたＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０とからなる群から選択されたアミノ酸配列を含むキメラペプチド。
【請求項２７】
（ａ）ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、
（ｂ）前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含み、前記キメラペプチドは、個々のペプチドの前記システイン残基間のジスルフィド結合を介してコイルドコイルとして共有結合的に安定化される３つのキメラペプチドを含むＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化された三量体コイルドコイル。
【請求項２８】
（ａ）
（ｉ）ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、
（ｉｉ）前記ペプチドの前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含む１つのキメラペプチドと、
（ｂ）それぞれチオエーテル結合を形成することができる求電子性部分とともに誘導体化された、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む２つのキメラペプチドとを含み、
（ａ）における前記キメラペプチド中のそれぞれのシステイン残基の求核スルフヒドリル基は、（ｂ）におけるそれぞれの誘導体化されたキメラペプチドの前記求電子性部分とチオエーテル結合を形成するＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル。
【請求項２９】
（ａ）（ＣＣＩＺＮ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］３）と、
（ｂ）（ＣＣＥＺＮ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］３）と、
（ｃ）（ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］３）と、
（ｄ）（ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９］３）と、
（ｅ）（ＣＣＩＺＮ２３）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３］３）と、
（ｆ）（ＣＣＥＺＮ２３）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５］３）と、
（ｇ）（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２］３）と、
（ｈ）（ＳＣＣＩＺＮ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１］３）と、
（ｉ）Ｃ（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３と、
（ｊ）Ｃ（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３と、
（ｋ）Ｃ（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３と、
（ｌ）Ｃ（ｔｈｉｏＥＺＮ１７）３と、
（ｍ）Ｃ（ｔｈｉｏＥ１７Ｎ１７）３と、
（ｎ）Ｃ（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）３とからなる群から選択されたＨＩＶ−１  Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化した三量体化コイルドコイル。
【請求項３０】
前記ペプチドが、免疫原性担体分子に共有結合される請求項９に記載のキメラペプチドの抗原性抱合体。
【請求項３１】
前記担体分子が、ＯＭＰＣである請求項３０に記載の抗原性抱合体。
【請求項３２】
前記三量体コイルドコイルが、免疫原性担体分子に共有結合される請求項２７に記載の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルの抗原性抱合体。
【請求項３３】
前記担体分子が、ＯＭＰＣである請求項３２に記載の抗原性抱合体。
【請求項３４】
前記三量体コイルドコイルが、免疫原性担体分子に共有結合される請求項２８に記載の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルの抗原性抱合体。
【請求項３５】
前記担体分子が、ＯＭＰＣである請求項３４に記載の抗原性抱合体。
【請求項３６】
前記免疫応答を高めることができる生物学的に有効なアジュバント、タンパク質、または他の薬剤と混合され、前記組成物が、哺乳類のＨＩＶ特異的中和抗体を顕在化させることができる免疫原として使用される請求項３３に記載の有効な量の抗原性抱合体を含む薬剤組成物。
【請求項３７】
前記免疫応答を高めることができる生物学的に有効なアジュバント、タンパク質、または他の薬剤と混合され、前記組成物が、哺乳類のＨＩＶ特異的中和抗体を顕在化させることができる免疫原として使用される請求項３５に記載の有効な量の抗原性抱合体を含む薬剤組成物。
【請求項３８】
ｇｐ４１融合中間物質上のエピトープに結合し、それにより細胞のＨＩＶ感染を阻害することによりｇｐ４１が前記細胞へのＨＩＶの融合を媒介する構造的立体配座をとることに干渉する請求項２７に記載の有効な量の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに前記細胞を接触させることを含む前記細胞へのＨＩＶ融合を阻害する方法。
【請求項３９】
ｇｐ４１融合中間物質上のエピトープに結合し、それにより細胞のＨＩＶ感染を阻害することによりｇｐ４１が前記細胞へのＨＩＶの融合を媒介する構造的立体配座をとることに干渉する請求項２８に記載の有効な量の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに前記細胞を接触させることを含む前記細胞へのＨＩＶ融合を阻害する方法。
【請求項４０】
（ａ）試験化合物、請求項２７に記載の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル、および前記ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイル内の立体配座エピトープを認識する抗体を組み合わせることと、
（ｂ）前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルおよび前記抗体の親和性に対し前記試験化合物が有する効果を測定することと、
（ｃ）前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに対する前記抗体の親和性と前記試験化合物がない場合の前記コイルドコイルに対する前記抗体の親和性に対し前記試験化合物が有する効果を比較することとを含み、
前記試験化合物が、前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに対する前記抗体の親和性を減少させる場合に、前記試験化合物が、ＨＩＶ融合阻害剤として識別されるＨＩＶ融合阻害剤を識別する方法。
【請求項４１】
（ａ）試験化合物、請求項２８に記載の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル、および前記ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイル内の立体配座エピトープを認識する抗体を組み合わせることと、
（ｂ）前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルおよび前記抗体の親和性に対し前記試験化合物が有する効果を測定することと、
（ｃ）前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに対する前記抗体の親和性と前記試験化合物がない場合の前記コイルドコイルに対する前記抗体の親和性に対し前記試験化合物が有する効果を比較することとを含み、
前記試験化合物が、前記共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに対する前記抗体の親和性を減少させる場合に、前記試験化合物が、ＨＩＶ融合阻害剤として識別されるＨＩＶ融合阻害剤を識別する方法。
【請求項４２】
（ａ）コイルドコイルの可溶性三量体型を含む骨格部分と、
（ｂ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含むＮペプチド部分、またはこの修飾型とを含み、
前記キメラペプチドは、チオエーテル結合を形成することができる求電子性部分を組み込むように誘導体化されている可溶性キメラペプチド。
【請求項４３】
前記ペプチドが、ハロゲン化アルキル部分とマイケル受容体とからなる群から選択される求電子性部分を組み込むこように誘導体化される請求項４２に記載のキメラペプチド。
【請求項４４】
前記ハロゲン化アルキル部分は、ブロモアセチル部分である請求項４３に記載のキメラペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に組み込まれている、２００４年６月１日に出願した米国仮出願第６０／５７６，０６２号、２００４年１２月１６日に出願した米国仮出願第６０／６３６，７２４号、および２００５年４月５日に出願した米国仮出願第６０／６６８，３６５号の利益を主張するものである。
【０００２】
本発明は、ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造内に制約されるアルファヘリックスのキメラペプチドを共有結合的に安定化する方法に関するものであり、前記コイルドコイル構造は、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の融合型立体配座内に含まれる内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する。一実施形態では、本発明は、ＨＩＶ  ｇｐ４１細胞外領域の内部コイルドコイル領域の全部または一部を模倣するホモ三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮヘリックスの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合された非ＨＩＶ可溶性三量体型のコイルドコイルを含むキメラペプチドは、前記ペプチドのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかに付加されたシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成を通じて前記コイルドコイル構造内で共有結合的に安定化される。ＨＩＶ  ｇｐ４１細胞外領域の内部コイルドコイル領域を模倣する三量体コイルドコイル構造が化学選択的連結反応の結果として生じる共有結合により安定化される方法も開示される。本明細書で開示されている方法により作られる共有結合的に安定化されたＨＩＶ由来コイルドコイル構造は、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合中間物質のよく似た模倣薬を表し、ＨＩＶ感染の強力阻害剤である。
【背景技術】
【０００３】
ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）は、後天的ヒト免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）および関連疾患の病原因子である。ＨＩＶ遺伝子は、少なくとも９つのタンパク質をコードし、次の３つのクラス、主要構造タンパク質（Ｇａｇ、Ｐｏｌ、およびＥｎｖ）、調節タンパク質（ＴａｔおよびＲｅｖ）、およびアクセサリータンパク質（Ｖｐｕ、Ｖｐｒ、Ｖｉｆ、およびＮｅｆ）に分けられる。
【０００４】
ｅｎｖ遺伝子は、１６０キロダルトン（ｋＤａ）の前駆体（ｇｐ１６０）として翻訳され、次いで、細胞プロテアーゼにより切断され、外部１２０−ｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ１２０）および膜貫通４１ーｋＤａエンベロープ糖タンパク質（ｇｐ４１）を生成するウイルスエンベロープ糖タンパク質をコードする。ｇｐ１２０およびｇｐ４１は、不安定な非共有結合性会合を通じて連結したままとなる。宿主細胞内へのＨＩＶの侵入は、ｇｐ１２０がエンベロープ複合体から、ヘルパーＴリンパ球、マクロファージ、および他の標的細胞の表面上に存在するＣＤ４受容体との相互作用を通じて単体分離することにより開始する。この相互作用は、ｇｐ１２０内に微妙な立体構造変化を引き起こし、第２の宿主細胞受容体、つまりＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４ケモカイン受容体のいずれかとその後相互作用するＶ３ループの構造要素を露出する。ｇｐ１２０が完全にアンマスクされると、ｇｐ４１は、劇的な立体構造変化を受け、最終的に、ウイルスおよび細胞膜の融合が生じ、ウイルス内容物が宿主細胞の細胞質内に挿入される。
【０００５】
ｇｐ４１媒介融合は、糖タンパク質の細胞外領域内に配置された３つの必須成分を伴う複合プロセスであり、これら３つの成分は、ＮＨ２末端融合ペプチド、ＮＨ２末端７回繰り返し（「Ｎヘリックス」）、およびＣＯＯＨ末端７回繰り返し（「Ｃヘリックス」）である。２つの７回繰り返し領域（ＮＨ２：ＨＲ１、ＣＯＯＨ：ＨＲ２）は、糖タンパク質に周期的疎水性を付与し、互いに相互作用して「ヘアピン三量体」と呼ばれるｇｐ４１の融合性（つまり、融合活性の）立体配座、つまり多くのエンベロープを持ったウイルスの融合機序に関わる共通の構造モチーフを形成するアルファヘリックス構造の予兆となるものである。ヘアピン三量体構造は、６つのαヘリックスの束、つまり、中心の３ストランドのコイルドコイル（３つのｇｐ４１細胞外領域からのＮヘリックス領域により形成される）に対して逆平行にパックされた３つのαヘリックス（３つのｇｐ４１細胞外領域からのＣヘリックス領域により形成される）の束である。融合プロセスは、ＮＨ２末端融合ペプチドを標的細胞膜の近く／この中に配置し、Ｎヘリックスコイルドコイルを露出する、ｇｐ４１の「プレヘアピン」立体配座の形成を介して進行する。ヘアピン三量体構造は、３つのＣヘリックスが折り返され、中心のＮヘリックスコイルドコイルと会合したときに形成され、ウイルスと宿主細胞膜との密接な接触を膜融合の前触れとして行わせる。
【０００６】
逆転写酵素またはウイルスプロテアーゼのいずれかを標的とする抗レトロウイルス薬の併用療法を包含する有効な治療計画がＨＩＶ感染者に利用可能である。この療法は、これまでウイルス量の一時的制御に使用すると有効であったが、しかし、大半の患者では時間がたつうちに薬剤耐性が生じること、複合投薬計画を持続的に順守する必要があること、毒性効果を発生する可能性のあることという点から、ＨＩＶ感染と戦うために新しい治療アプローチを策定する重要性が強調される。これらの要求に応えるため、「融合阻害剤」と呼ばれるウイルス侵入を標的とする新しいクラスの抗レトロウイルス薬の研究が進行中である。ＨＩＶと標的細胞膜との融合を阻害し、ウイルスが免疫細胞内に入り込む前にウイルスを遮断する融合阻害剤が設計されている。ＦＤＡは、近年、この新しいクラスの抗レトロウイルス薬のうち第１のものとして、他の抗ＨＩＶ薬と併用するフゼオン（商標）（エンフビルチド、Ｔ−２０とも呼ばれる）を認可した。Ｔ−２０は、多数の合成ペプチド、それぞれＨＩＶ−１ウイルス感染を阻害することが証明されているｇｐ４１のＣまたはＮヘリックス領域のいずれかに由来する「Ｃペプチド」または「Ｎペプチド」のうちの１つである。Ｔ−２０を含む、Ｃペプチドは、優性阻害の形でｇｐ４１のＮヘリックスに結合し、融合性ヘアピン三量体構造の形成を防止し、ＨＩＶ−１感染を阻害する。Ｎペプチドは、さらに、ｇｐ４１の露出されているＣヘリックス領域を標的とするか、またはそれとは別に、ヘテロ三量体コイルドコイルを形成し、ｇｐ４１のコイルドコイル形成に干渉することによりＨＩＶ−１の侵入を阻害する。ウイルス／宿主細胞膜融合を防止する抗ＨＩＶ薬は、さらに、プレヘアピンまたはヘアピン三量体複合体に結合する中和抗体も含む。そのようなものとして、中心のＮヘリックスコイルドコイルにより形成された、ｇｐ４１細胞外領域の７回繰り返し１（ＨＲ１）領域内の疎水性ポケットは、広く交差反応性のある中和抗体をＨＩＶに対し顕在化させる誘引標的と考えられる。
【０００７】
ＨＩＶ−１  Ｎペプチドは、Ｃヘリックス領域が存在しない場合にＮペプチドが凝集するという事実によるものとも考えられるが、Ｃペプチドよりもかなり効力が弱いウイルス侵入阻害剤である。非凝集三量体Ｎペプチドコイルドコイルの形成を容易にするために、Ｅｃｋｅｒｔら（１９９９年、Ｃｅｌｌ  ９９：１０３〜１１５頁）は、骨格として作用する可溶性三量体コイルドコイルに融合されるＮヘリックス領域の一部を含むキメラＮペプチドを構成した。このペプチドは、ＩＱＮ１７（ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７３５１、国際出願ＷＯ００／０６５９９でも開示されている）と呼ばれ、可溶性の安定した三量体コイルドコイルを形成した。ＥｃｋｅｒｔおよびＫｉｍ（２００１年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１１８７〜１１１９２頁）は、他のコイルドコイル骨格、例えばＩＺＮ１７（ＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０１／２９６３７、国際出願ＷＯ０２／２４７３５でも開示されている）に融合されたＩＱＮ１７および他の似た方法で構成されたキメラＮペプチドの阻害活性を試験し、前記ペプチドをＨＩＶ−１侵入の強力阻害剤として同定した。これらの結果は、Ｎペプチドの阻害活性は、この安定性と相関しうることを示唆している。ＨＩＶ融合の似た模倣薬を生成することを目標としてＮペプチドをさらに安定化させるために、本発明では、ペプチド配列の末端にシステイン残基を付加することにより三量体立体配座中の共有結合的に安定化している可溶性のキメラＮペプチドを開示する。中性ｐＨで酸化した後、ジスルフィド架橋が、隣接するＮペプチド分子上の人工的なシステイン残基の間に形成される。前記個別ペプチドのαヘリックス領域の外に配置されている人工的に作り出されたシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成を介してホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル立体配座中のＨＩＶ  ｇｐ４１のキメラＮペプチドを安定化する方法は、ウイルス標的細胞膜融合の調製において内部コイルドコイルモチーフを形成することが知られている他のエンベロープウイルス膜融合タンパク質に適用することができる。
【０００８】
Ｌｏｕｉｓ，Ｊ．Ｍ．ら（２００１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６：２９４８５〜２９４８９頁）は、分子間ジスルフィド架橋により安定化されたｇｐ４１の最小６ヘリックス束のＮＨ２末端上にグラフト化されたＮヘリックス領域を含むキメラｇｐ４１分子を開示している。Ｎヘリックス領域内に配置されているｇｐ４１細胞外領域の残基５７６〜４７８をシステイン−システイン−グリシン（Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ）に変異させることにより６ヘリックス束内に組み込まれたシステイン残基の間にジスルフィド結合が生成される。
【０００９】
Ｌｏｕｉｓ，Ｊ．Ｍ．ら（２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２０２７８〜２０２８５頁）およびＰＣＴ国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０２／４０６８４（国際出願ＷＯ  ０３／０５２１２２）では、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１細胞外領域の内部Ｎヘリックスコイルドコイルを含む２つの可溶性共有結合三量体ポリペプチドを開示している。ＨＩＶ配列は、ｇｐ４１の残基５７６〜５７８のＮヘリックスをＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙに変異させた結果として人工的に作られたサブユニット間ジスルフィド結合を介して安定化される。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣するホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を形成することができる可溶性キメラペプチドを共有結合的に安定化する方法に関するものであり、前記内部三量体コイルドコイルは、ウイルス宿主細胞膜融合に必要な前記膜融合タンパク質の融合性（つまり、融合活性）立体配座のコア領域を表す。ここで開示されているように、前記可溶性キメラペプチドの安定化は、例えば、ジスルフィド結合または結果として化学選択的連結反応から生じる任意の共有結合を含む個々のペプチド間に生じる共有結合の形成を介して発生しうる。したがって、本発明は、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、この方法は、（ａ）前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、（ｂ）前記ペプチド間の共有結合の形成により三量体コイルドコイル構造において（ａ）から３つのキメラペプチドを安定化させることとを含むが、ただし、前記共有結合は、ジスルフィド結合と化学選択的連結反応から結果として生じる結合とからなる群から選択される。本明細書で開示されている方法により生成される前記三量体コイルドコイル構造は、ホモ三量体またはヘテロ三量体構造のいずれかを表すことができる。
【００１１】
本発明は、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、この方法は、コイルドコイル構造内に含まれる並列するαヘリックスペプチド上のシステイン残基間の共有結合であるジスルフィド結合の形成を含むが、ただし、前記システイン残基は、αヘリックス領域の外にある前記ペプチド内に組み込まれる。したがって、本発明は、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣するホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、この方法は、（ａ）（ｉ）前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、（ｉｉ）前記α領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、（ｂ）ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、（ｃ）（ｂ）において形成された前記ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を酸化させて、前記コイルドコイルの並列するキメラペプチド上のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して前記コイルドコイルを共有結合的に安定化することとを含む。本発明の一実施形態では、（ａ）における可溶性キメラペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含む。
【００１２】
本発明は、さらに、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、この方法は、コイルドコイル構造内に含まれる並列するαヘリックスペプチド間の共有結合である化学結合の形成を含むが、ただし、前記共有結合である化学結合は、化学選択的連結反応から結果として生じる。したがって、本発明は、さらに、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣するホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、この方法は、（ａ）前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、（ｂ）三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、（ｃ）前記キメラペプチド間の共有結合である化学結合の形成により（ｂ）において三量体コイルドコイル構造を安定化させることとを含むが、ただし、前記化学結合は、化学選択的反応から形成される。本発明の一実施形態では、化学選択的反応により形成される前記共有結合である化学結合は、チオエーテル結合である。本発明の他の実施形態では、（ｂ）における複数の可溶性キメラペプチドは、結果として得られる三量体コイルドコイル構造が、（ａ）さらに前記ペプチドのαヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基を含む１つのキメラペプチドと、（ｂ）それぞれ求電子性部分を組み込むように誘導体化された２つのキメラペプチドとからなる濃度でインキュベートされるが、ただし、（ａ）におけるキメラペプチド中のそれぞれのシステイン残基の求核スルフヒドリル基は、（ｂ）における誘導体化されたキメラペプチドの求電子性部分とチオエーテル結合を形成する。本発明の他の実施形態では、（ｂ）におけるキメラペプチドは、ハロゲン化アルキル部分とマイケル受容体とからなる群から選択される求電子性部分を組み込むように誘導体化される。上の（ａ）と（ｂ）の両方におけるの可溶性キメラペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含むことができる。
【００１３】
本発明は、さらに、ＨＩＶ  ｇｐ４１細胞外領域の内部三量体コイルドコイル領域の全部または一部を模倣するホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものでもあり、この方法は、（ａ）（ｉ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、（ｉｉ）前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、（ｂ）ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、（ｃ）（ｂ）において形成された前記コイルドコイル構造を酸化させて、前記コイルドコイルの並列するキメラペプチド上のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して前記コイルドコイルを共有結合的に安定化することとを含む。一実施形態では、本発明の方法により共有結合的に安定化されたキメラペプチドのＮペプチド部分は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の細胞外領域に由来する。
【００１４】
本発明は、さらに、限定はしないが、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１の細胞外領域を含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１細胞外領域の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、この方法は、（ａ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、（ｂ）ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、（ｃ）前記キメラペプチド間の共有結合である化学結合の形成により（ｂ）において三量体コイルドコイル構造を安定化させることとを含むが、ただし、前記化学結合は、化学選択的反応から形成される。本発明の一実施形態では、化学結合は、チオエーテル結合である。他の実施形態では、複数の可溶性キメラペプチドは、結果として得られる三量体コイルドコイル構造が、（ａ）さらに前記ペプチドのαヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基を含む１つのキメラペプチドと、（ｂ）それぞれ求電子性部分を組み込むように誘導体化された２つのキメラペプチドとからなる濃度でインキュベートされるが、ただし、（ａ）におけるキメラペプチド中のそれぞれのシステイン残基の求核スルフヒドリル基は、（ｂ）における誘導体化されたキメラペプチドの求電子性部分とチオエーテル結合を形成する。本発明の他の実施形態では、（ｂ）におけるキメラペプチドは、ハロゲン化アルキル部分とマイケル受容体とからなる群から選択される求電子性部分を組み込むように誘導体化される。
【００１５】
本発明は、さらに、開示されている方法により作られる、限定はしないがＨＩＶ−１  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルを含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化されたコイルドコイルに関する。したがって、本発明は、さらに、３つの同一の（つまり、ホモ三量体構造を生成することについて）、または実質的に類似の（ヘテロ三量体構造を生成することについて）キメラペプチドを含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化されたコイルドコイルに関するものでもあり、それぞれのキメラペプチドは、（ａ）ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  Ｎペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、（ｂ）前記ペプチドのαヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含み、前記３つの、同一または実質的に類似のキメラペプチドは、個々のペプチドの前記システイン残基間のジスルフィド結合を介してコイルドコイルとして共有結合的に安定化される。本発明は、さらに、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルに関するものであり、このＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルは、（ａ）（ｉ）ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、（ｉｉ）前記ペプチドのαヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含む１つのキメラペプチドと、（ｂ）それぞれチオエーテル結合を形成することができる求電子性部分とともに誘導体化された、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む２つのキメラペプチドとを含むが、ただし、（ａ）におけるキメラペプチド中のそれぞれのシステイン残基の求核スルフヒドリル基は、（ｂ）における誘導体化されたキメラペプチドの求電子性部分とチオエーテル結合を形成する。本発明の一実施形態では、チオエーテル結合は、（ａ）で説明されているような単一のキメラペプチドと（ｂ）における２つのキメラペプチドとの間に形成され、（ｂ）におけるそれぞれのキメラペプチドは、ハロゲン化アルキル部分（限定はしないが、ブロモアセチルまたはヨードアセチル部分を含む）およびマイケル受容体（限定はしないが、マレイミド部分を含む）からなる群から選択された求電子性部分とともに誘導体化される。
【００１６】
本発明は、さらに、ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル立体配座内で共有結合的に安定化されることができる可溶性キメラペプチドにも関係するが、ただし、前記コイルドコイル構造は、限定はしないが、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１融合中間物質を含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合中間物質の安定した忠実な模倣薬を表す。本発明の一実施形態では、前記可溶性キメラペプチドは、前記ペプチド間の共有結合であるジスルフィド結合の形成を介して三量体コイルドコイル立体配座内で共有結合的に安定化することができる。本発明のこの実施形態の前記可溶性キメラペプチドは、同じ一般設計を取り入れており、それぞれ、成分として、（１）三量体コイルドコイル立体配座を獲得することができるαヘリックス骨格タンパク質（キメラペプチドの「骨格部分」）と、（２）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮＨ２末端７回繰り返し領域（「Ｎヘリックス」）の全部または一部（キメラペプチドの「Ｎペプチド部分」）と、（３）キメラペプチド配列のＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に配置された少なくとも２つのシステイン残基（キメラペプチドの「システイン部分」）とを有する。これらのキメラペプチドは、ここでは、「ＣＣキメラＮペプチド」と指定される。本発明のＣＣキメラＮペプチドのシステイン部分は、柔軟性を増すためにリンカー／スペーサー領域によりキメラペプチド配列から適宜分離される。本発明の前記ペプチドは、平行な向きに物理的に関連付けられた３つのキメラペプチド鎖を含む可溶性三量体コイルドコイル構造を形成することができ、この場合、前記三量体構造は、並列されたペプチド鎖上の人工的に作られたシステインアミノ酸残基の間のジスルフィド結合の形成を介して共有結合的に安定化される。ジスルフィド結合では、キメラペプチド単量体は、非常に低い濃度であっても、解離しないことが確実である。したがって、本発明の可溶性キメラペプチドは、（ａ）コイルドコイルの可溶性三量体型を含む骨格部分と、（ｂ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含むＮペプチド部分、またはこの修飾型と、（ｃ）少なくとも２つのシステイン（Ｃｙｓ）残基を含むシステイン部分とを含み、（ａ）における前記骨格部分は、（ｂ）における前記Ｎペプチド部分にヘリックスフェーズで融合されて、αヘリックス領域を形成し、（ｃ）における前記システイン部分は、前記αヘリックス領域の外に配置され、前記キメラペプチドは、前記ペプチドのＣｙｓ残基の間のジスルフィド結合の形成を介して同一または実質的に類似のペプチドとの共有結合的に安定化されたホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を形成することができる。
【００１７】
本発明は、さらに、前記ペプチド間の共有結合である化学結合の形成を介して三量体コイルドコイル立体配座内で共有結合的に安定化することができる可溶性キメラペプチドに関するものであり、前記化学結合は、化学選択的連結反応により形成される。本発明のこの実施形態の前記可溶性キメラペプチドは、ジスルフィド結合により安定化されるのと類似の一般設計を取り入れており、それぞれ、成分として、（１）三量体コイルドコイル立体配座を獲得することができるαヘリックス骨格タンパク質（キメラペプチドの「骨格部分」）と、（２）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮＨ２末端７回繰り返し領域（「Ｎヘリックス」）の全部または一部（キメラペプチドの「Ｎペプチド部分」）とを有する。しかし、本発明のこの実施形態におけるキメラペプチドは、さらに、上述のように、前記ペプチドとＣＣキメラＮペプチドの間の共有結合ある化学結合を生じる化学選択的連結反応に関与する能力を付与されるように修飾される。前記ペプチドは、ここでは、「誘導体化キメラＮペプチド」と指定される。例えば、本発明の一実施形態では、チオエーテル結合形成により共有結合的に安定化された三量体コイルドコイルは、ペプチド成分として、（ｉ）「骨格部分」、「Ｎペプチド部分」、およびキメラペプチド配列のＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかに配置された少なくとも２つのシステイン残基を有する「システイン部分」を含む、上述のような、１つの可溶性ＣＣキメラＮペプチドと、（ｉｉ）（ｉ）におけるＣＣキメラＮペプチドと同じまたは実質的に類似している骨格およびＮペプチド部分を含む２つの可溶性誘導体化キメラＮペプチドとを含み、それぞれのペプチドは、チオエーテル結合を形成することができる求電子性部分（限定はしないが、ハロゲン化アルキル部分およびマイケル受容体を含む）を組み込むように誘導体化されている。したがって、本発明の一実施形態は、可溶性キメラペプチドに関するものであり、この可溶性キメラペプチドは、（ａ）コイルドコイルの可溶性三量体型を含む骨格部分と、（ｂ）ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含むＮペプチド部分、またはこの修飾型とを含み、前記キメラペプチドは、チオエーテル結合を形成することができる求電子性部分を組み込むように誘導体化されている。
【００１８】
本発明は、さらに、アミノ酸配列を含むキメラペプチドに関するものであり、このアミノ酸配列は、
（ａ）ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、「ＣＣＩＺＮ１７」）、
（ｂ）ＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、「ＣＣＥＺＮ１７」）、
（ｃ）ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、「ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４」）、
（ｄ）ＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、「ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４」）、
（ｅ）ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、「ＣＣＩＺＮ２３」）、
（ｆ）ＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＥＫＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５、「ＣＣＥＺＮ２３」）、
（ｇ）ＧＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２、「ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３」）、
（ｈ）ＳＧＧＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、「ＳＣＣＩＺＮ１７」）、
（ｉ）ＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８、「ＣＣＳＺＮ１７」）、
（ｊ）ＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００、「ＣＣＳ１７Ｎ１７」）、
（ｋ）ＣＣＧＧＩＥＥＫＩＥＥＩＥＥＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９、「ＣＣＥ１０Ｎ１７」）、
（ｌ）ＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６、「ＣＣＥ１７Ｎ１７」）、
（ｍ）ＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＥＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０、「ＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７」）
からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む。
【００１９】
本発明は、さらに、キメラペプチドに関するものでもあるが、ただし、
（ａ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２（「ＣＣＩＺＮ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｂ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７（「ＣＣＥＺＮ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｃ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（「ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｄ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（「ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｅ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３（「ＣＣＩＺＮ２３」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｆ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５（「ＣＣＥＺＮ２３」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｇ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２（「ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｈ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１（「ＳＣＣＩＺＮ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｉ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９８（「ＣＣＳＺＮ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｊ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００（「ＣＣＳ１７Ｎ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｋ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９（「ＣＣＥ１０Ｎ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｌ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３（「ＣＣＣＩＺＮ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｍ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５（「ＣＣＣＳ１７Ｎ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｎ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６（「ＧＧＧＳ１７Ｎ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｏ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１１（「ＣＣＣＥ１０Ｎ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｐ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０（「ＧＧＧＥ１０Ｎ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｑ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１（「ＧＧＧＥＺＮ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｒ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２（「ＣＣＣＥＺＮ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｓ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５（「ＧＧＧＥ１７Ｎ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｔ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６（「ＣＣＣＥ１７Ｎ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｕ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３（「ＧＧＧＥ１７ＧｌｕＮ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなり、
（ｖ）前記キメラペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４（「ＣＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７」）で規定されているようなアミノ酸配列からなる。
【００２０】
本発明は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化したコイルドコイルに関するものであり、このＨＩＶ−１  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルは、（ａ）（ＣＣＩＺＮ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］３）、（ｂ）（ＣＣＥＺＮ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］３）、（ｃ）（ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］３）、（ｄ）（ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９］３）、（ｅ）（ＣＣＩＺＮ２３）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３］３）、（ｆ）（ＣＣＥＺＮ２３）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５］３）、（ｇ）（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２］３）、（ｈ）（ＳＣＣＩＺＮ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１］３）、（ｉ）Ｃ（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３、（ｊ）Ｃ（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３、（ｋ）Ｃ（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３、（ｌ）Ｃ（ｔｈｉｏＥＺＮ１７）３、（ｍ）Ｃ（ｔｈｉｏＥ１７Ｎ１７）３、および（ｎ）Ｃ（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）３からなる群から選択される。本明細書で例示されている共有結合的に安定化したコイルドコイルは、主に、ＮＨ２末端アセチル基およびＣＯＯＨ末端アミド基を持つが、ただし、いかなる形でも、全体として本発明への限定ではない。
【００２１】
本発明は、さらに、免疫原性担体（例えば、ＯＭＰＣ）に共有結合されている本発明の可溶性キメラペプチドを含む本明細書で説明されているＨＩＶ由来キメラペプチドの抗原結合体に関するものである。本発明は、さらに、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する本明細書で説明されている共有結合的に安定化したホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造の抗原結合体に関するものであり、前記コイルドコイル構造は、免疫原性担体に共有結合されている。免疫応答を高めることができる生物学的に有効なアジュバント、タンパク質、または他の薬剤と適宜混合された、前記抗原結合体を含む、薬剤組成物は、哺乳類のＨＩＶ特異的中和抗体を顕在化させることができる免疫原として使用することができる。本発明は、さらに、前記被検体中のＨＩＶに対する免疫応答を顕在化させることによりＨＩＶ陽性被検体を治療する療法に関するものでもある。この方法は、本明細書で説明されている共有結合的に安定化したホモ三量体コイルドコイル、またはこの抗原結合体、および適宜１つまたは複数の担体、１つまたは複数の賦形剤、および／または１つまたは複数の化学的誘導体を含む有効な量の薬剤組成物を被験者に投与することを含む。
【００２２】
本発明は、限定はしないがヒト細胞を含む細胞へのＨＩＶの融合を阻害する方法、および／または本明細書で説明されている有効な量のキメラペプチド組成物にＨＩＶを接触させて、キメラペプチドがｇｐ４１の融合性６ヘリックス立体配座の形成を有効に阻害するようにする、ＨＩＶによる前記細胞の感染を防止する方法に関する。キメラペプチド組成物は、ｇｐ４１融合中間物質中のエピトープに結合することにより前記細胞へのＨＩＶの融合を媒介しうる構造立体配座をｇｐ４１が取る能力に干渉し、それにより前記細胞のＨＩＶ感染を阻害する。一実施形態では、前記細胞は、個体中に存在するヒト細胞である。一実施形態では、キメラペプチド組成物は、３つの同一のキメラペプチドを含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する共有結合的に安定化された有効な量のホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルを含み、それぞれのキメラペプチドは、（ａ）ＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドの全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、（ｂ）前記キメラペプチドのαヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含み、前記３つの、同一または実質的に類似のキメラペプチドは、個々のペプチドの前記システイン残基間のジスルフィド結合を介してコイルドコイルとして共有結合的に安定化される。本発明の他の実施形態では、前記キメラペプチド組成物は、上述のように、化学選択的連結反応から結果として生じる化学共有結合の形成を介して共有結合的に安定化されたＨＩＶ  ｇｐ４１  Ｎペプチドコイルドコイルの全部または一部を模倣する有効な量の三量体コイルドコイルを含む。本発明は、さらに、本明細書で開示されているキメラペプチドを使用して、限定はしないが小分子阻害剤を含む、ＨＩＶ融合阻害剤を識別する方法に関する。
【００２３】
本明細書で使用されているように、「ＨＩＶ」は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、またはＨＩＶ−１および／またはＨＩＶ−２のいずれかを表すことを意図されている。
【００２４】
本明細書で使用されているように、「中和」は、当業で使用されているように、つまり、体外細胞／ウイルスベースアッセイにおいてウイルス感染を抗体が防止できることを指すのに使用される。中和活性は、その特定の抗体に対するＩＣ５０値として定量的に測定することができる。「中和抗体」または「ＨＩＶ中和抗体」は、当業では少なくとも１つのＨＩＶ分離株を中和する受け入れられた感染アッセイとして示されている。
【００２５】
本明細書で使用されているように、「エピトープ」という用語は、抗体に特異結合することができるタンパク質決定基に関する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的活性を有する表面基からなり、通常は、特異的三次元構造特性とともに、比電荷特性も有することがよく知られている。立体配座エピトープと非立体配座エピトープは、前者の結合は変性溶媒の存在下では失われ、後者はそうでないという点で区別される。
【００２６】
本明細書で使用されているように、「マイケル受容体」という用語は、求核種（例えば、Ｏ−、Ｃ−、またはＳ−）と反応することができる分極した、求電子炭素炭素二重結合を含む化学的部分を指す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２７】
本発明は、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣するホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル立体配座内の可溶性キメラペプチドを共有結合的に安定化する方法に関するものであり、前記内部三量体コイルドコイルモチーフは、ウイルス宿主細胞膜融合に必要な前記ウイルス膜融合タンパク質の融合性（つまり、融合活性）立体配座のコア領域を表す。本発明の方法により共有結合的に安定化されたキメラペプチドは、エンベロープウイルス膜融合タンパク質のＮＨ２末端７回繰り返し領域の全部または一部（「Ｎペプチド」部分）にヘリックスフェーズ内で融合された三量体コイルドコイル（「骨格」部分）を形成することができるαヘリックス骨格タンパク質を含むアルファ（「α」）ヘリックス領域を含む。エンベロープウイルスは、コア三量体コイルドコイルモチーフを含む膜融合タンパク質の融合活性立体配座を介してウイルス宿主細胞膜融合を行うことが知られている。上述のように、３つの同一または実質的に類似のキメラペプチドは、ウイルス膜融合タンパク質の前記コア三量体コイルドコイルモチーフを模倣するそれぞれホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を形成することができるが、しかし、低濃度では、個々のキメラペプチド鎖は、解離する。そこで、本発明の一実施形態は、個々のキメラペプチドのαヘリックス領域のＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に少なくとも２つのシステイン残基を付加することを含む前記ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関する。本発明のこの実施形態では、次いで、３つの同一の、または実質的に類似しているシステイン含有キメラペプチドは、密接に関連したキメラペプチド鎖上に並列するシステイン残基の間に酸化条件に従って形成された分子間ジスルフィド結合を介してホモ三量体またはヘテロ三量体分子において共有結合的に安定化される。共有結合的に安定化した、ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルは、事前形成された三量体コイルドコイルを酸化環境に暴露することにより、または酸化条件の下でコイルドコイル立体配座内への個々のペプチド鎖の会合を促進することにより形成される。付加されたシステイン残基は、キメラペプチドのαヘリックス領域の外に配置され、これにより高い立体配座自由度が保証され、リンカーまたはスペーサー領域によりコアキメラペプチド配列から適宜分離される。
【００２８】
本発明の他の実施形態では、ウイルス膜融合タンパク質のコア三量体コイルドコアモチーフを模倣する三量体コイルドコア構造（例えば、ホモ三量体またはヘテロ三量体）を共有結合的に安定化する方法は、化学選択的連結反応から結果として生じる共有結合である化学結合を介して、上述のように、「骨格」領域および「Ｎペプチド」領域を含むアルファ「α」ヘリックスキメラペプチドを安定化することを含む。前記化学選択的連結反応は、限定はしないが、ＨＩＶ  ｇｐ４１を含むエンベロープウイルス膜融合タンパク質の融合性立体配座の内部部分の模倣薬を形成する、前記ペプチド間のチオエーテル結合を安定化することをもたらす。例えば、本発明の一実施形態では、上述のように、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルの全部または一部にヘリックスフェーズにおいて融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型を含むαヘリックス領域をそれぞれが持つ３つのキメラペプチドは、前記ペプチド間のチオエーテル結合形成を介して安定化され、その結果、ペプチド組成物として、（ｉ）さらに前記ペプチドのαヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基を含む１つのキメラペプチドと、（ｉｉ）それぞれ求電子性部分を組み込むように誘導体化された２つのキメラペプチドとを持つ三量体コイルドコイルが形成されるが、ただし、（ａ）におけるキメラペプチド中のそれぞれのシステイン残基の求核スルフヒドリル基は、（ｂ）における誘導体化されたキメラペプチドの求電子性部分（例えば、ハロゲン化アルキル部分、マイケル受容体）とチオエーテル結合を形成する。
【００２９】
ウイルスおよび宿主細胞膜のＨＩＶ  ｇｐ４１媒介融合時に、αヘリックス領域の前兆となる、ｇｐ４１細胞外領域（Ｎヘリックス：ＨＲＩおよびＣヘリックス：ＨＲ２領域）内の２つの７回繰り返し領域は、互いに相互作用して、ヘアピン三量体と呼ばれるｇｐ４１糖タンパク質の融合性立体配座を形成する。ヘアピン三量体構造は、６つのαヘリックスの束、つまり、中心の３ストランドのコイルドコイル（３つのｇｐ４１細胞外領域からのＮヘリックス領域により形成される）に対して逆平行にパックされた３つのαヘリックス（３つのｇｐ４１細胞外領域からのＣヘリックス領域により形成される）の束である。ヘアピン三量体構造の形成に先立って、ＮＨ２末端融合ペプチドを標的細胞膜の近く／この中に配置する「プレヘアピン」立体配座が生成され、２つのＮヘリックスにより形成されるコイルドコイル構造を露出する。ヘアピン三量体構造は、プレヘアピン構造の３つのＣヘリックスが折り返され、Ｎヘリックスコイルドコイルと会合したときに形成され、ウイルスと宿主細胞膜との密接な接触を融合の前触れとして行わせる。
【００３０】
ヘアピン状構造は、多くのエンベロープウイルス膜融合タンパク質に共通する特徴である（Ｓｉｎｇｈら、１９９９年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９０：１０３１〜１０４１頁）。例えば、インフルエンザウイルス（血球凝集素ＨＡ２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ  ｇｐ４１）およびエボラウイルス（エボラＧＰ２）の膜融合タンパク質の高度な構造研究により、ＮＨ２末端融合ペプチド領域に隣接するように配置されたコア平行ホモ三量体コイルドコイルを含むヘアピン状構造が明らかにされている。融合性ヘアピン状構造は、３つの延長ヘリックスが、この内部コイルドコイルを支持する、前記コア（または内部）ホモ三量体構造の外側部分上でパッキングする場合に形成される。上述のこれらのエンベロープを持ったウイルスに加えて、レトロウイルス、パラミクソウイルス、およびフィロウイルス族の他の多くの一員が、類似の構造モチーフを含むことが予測されている（Ｓｉｎｇｈら、１９９９年、上記参照、Ｊｏｓｈｉら、１９９８年、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２４８：２０〜３４頁）。本発明の可溶性キメラペプチドを共有結合的に安定化する方法は、ＨＩＶ  ｇｐ４１特異的キメラペプチドを使用し、「発明を実施するための最良の形態」および「実施例」の両方において本明細書に例示されているが、ただし、この例示は、本発明の範囲をＨＩＶ特異的キメラペプチドの安定化および／または例えばウイルス感染を阻害するための前記共有結合的に安定化したペプチドの使用にのみ制限することを意図していない。本明細書で説明されている基本的戦略において、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣するホモ三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法を、多くのエンベロープウイルス系に適用し、ウイルス標的細胞膜融合を阻害する構造を生成することができることは、当業者に知られている。
【００３１】
本発明の一実施形態は、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣する三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、この実施形態は、コイルドコイル構造内に含まれる並列するαヘリックスペプチド上のシステイン残基間の共有結合であるジスルフィド結合の形成を介して前記三量体コイルドコイルを安定化することを含むが、ただし、前記システイン残基は、前記ペプチドのαヘリックス領域の外にある前記ペプチド内に組み込まれる。したがって、本発明は、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣するホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、この方法は、（ａ）（ｉ）前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域と、（ｉｉ）前記αヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基とを含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、（ｂ）ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、（ｃ）（ｂ）において形成された前記ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を酸化させて、前記コイルドコイルの並列するキメラペプチド上のシステイン残基間のジスルフィド結合の形成を介して前記コイルドコイルを共有結合的に安定化することとを含む。本発明の一実施形態では、ジスルフィド結合形成を介してエンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣するホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルを共有結合的に安定化する方法は、限定はしないがＨＩＶ−１  ｇｐ４１を含む、ＨＩＶ  ｇｐ４１に適用される。この実施形態では、前記結果として生じるホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造は、個々のキメラペプチド鎖内の人工的に作られたシステイン残基の間のジスルフィド結合の形成を介して共有結合的に安定化された、ＨＩＶ  ｇｐ４１、またはこの修飾型の、Ｎペプチドの全部または一部をそれぞれが含む３つのキメラペプチドを含む。本明細書で説明されている共有結合的に安定化したキメラペプチドは、ウイルス侵入を対象とする抗レトロウイルス薬の新しいクラスの一員である。
【００３２】
本発明は、さらに、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣するホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、この方法は、コイルドコイル内に含まれる並列するαヘリックスペプチド間の共有結合である化学結合の形成を介して前記三量体コイルドコイル構造を安定化することを含むが、ただし、前記共有結合である化学結合は、化学選択的連結反応から結果として生じる。したがって、本発明は、さらに、エンベロープウイルス膜融合タンパク質の内部三量体コイルドコイルモチーフの全部または一部を模倣するホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を共有結合的に安定化する方法に関するものであり、この方法は、（ａ）前記エンベロープウイルス膜融合タンパク質の、ＮＨ２末端７回繰り返し領域の全部または一部にヘリックスフェーズ内で融合されたコイルドコイルの可溶性三量体型、またはこの修飾型を含むαヘリックス領域を含む可溶性キメラペプチドを人工的に作ることと、（ｂ）三量体コイルドコイル構造が形成される濃度で複数の前記可溶性キメラペプチドをインキュベートすることと、（ｃ）前記キメラペプチド間の共有結合である化学結合の形成により（ｂ）において三量体コイルドコイル構造を安定化させることとを含むが、ただし、前記化学結合は、化学選択的反応から形成される。本明細書で説明されているようにキメラペプチドを安定化するために使用できる化学選択的連結反応は、限定はしないが、結果として得られる三量体コイルドコイル内に含まれるキメラペプチド内に組み込まれる化学種の間の反応を含むが、ただし、これらの化学種は、（ｉ）ヒドラゾンを形成するアルデヒド／ケトンおよびヒドラジド、（ｉｉ）オキシムを形成するケトンおよびアミノキシ基、（ｉｉｉ）チオセミカルバゾンを形成するケトンおよびチオセミカルバジド、（ｉｖ）チアゾリジンを形成するアルデヒドおよびβアミノチオール、（ｖ）チオエステルを形成するチオカルボン酸塩およびαハロカルボニル、（ｖｉ）アミドを形成するチオエステルおよびＮ末端ペプチドシステイン、（ｖｉｉ）チオエーテルを形成するハロゲン化アルキルおよびチオール、および（ｖｉｉｉ）チオエーテルを形成するマレイミドおよびチオールである。本発明の一部として説明されている一方法では、本明細書で説明されているキメラペプチド間の共有結合的に安定化する化学結合は、チオエーテル結合を生じる化学選択的反応により形成される。本発明の一実施形態では、上の（ｂ）における可溶性キメラペプチドは、結果として得られる三量体コイルドコイル構造が、ペプチド鎖として、（ａ）さらに前記ペプチドのαヘリックス領域の外に配置された少なくとも２つのシステイン残基を含む１つのキメラペプチド（つまり、ＣＣキメラＮペプチド）と、（ｂ）それぞれ求電子性部分を組み込むように誘導体化された２つのキメラペプチド（つまり、誘導体化キメラＮペプチド）とからなる濃度でインキュベートされるが、ただし、（ａ）におけるキメラペプチド中のそれぞれのシステイン残基の求核スルフヒドリル基は、（ｂ）における誘導体化されたキメラペプチドの求電子性部分と��オエーテル結合を形成する。これは、ペプチド（ａ）：ペプチド（ｂ）を約１：２の濃縮比として前記キメラペプチドをインキュベートすることにより得られる。本発明の他の実施形態では、（ｂ）におけるキメラペプチドは、ハロゲン化アルキル部分（限定はしないが、ブロモアセチル部分またはヨードアセチル部分を含む）とマイケル受容体（例えば、マレイミド部分）とからなる群から選択される求電子性部分を組み込むように誘導体化される。上の（ａ）と（ｂ）の両方におけるの可溶性キメラペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮペプチドの全部または一部を含むことができる。
【００３３】
本発明は、共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル構造内に折り込まれ、ヒト細胞を含む、哺乳類細胞のＨＩＶ感染を阻害する、可溶性キメラペプチドに関するものである。本明細書で「ＣＣキメラＮペプチド」と呼ばれる可溶性キメラペプチドは、成分として、（１）三量体コイルドコイル立体配座を獲得することができるαヘリックス骨格タンパク質（「骨格部分」）と、（２）限定はしないが、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮヘリックス領域の全部または一部を含む、ＨＩＶ糖タンパク質ｇｐ４１のＮＨ２末端７回繰り返し領域（「Ｎヘリックス」）の全部または一部（「Ｎペプチド部分」）と、（３）柔軟性を高めるためにリンカー／スペーサー領域によりコアキメラペプチド配列から適宜分離された、キメラペプチド配列のＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に配置された少なくとも２つのシステイン残基（「システイン部分」）とを含む。前記ペプチドは、３つの同一の（つまり、ホモ三量体コイルドコイルを形成する）、または実質的に類似の（つまり、ヘテロ三量体コイルドコイルを形成する）キメラペプチド鎖が平行な向きで物理的に会合する可溶性三量体コイルドコイル構造を形成することができる。本発明の一実施形態では、このホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造は、人工的に作られたシステインアミノ酸残基の間に生じる少なくとも３つのジスルフィド結合の形成を通じて共有結合的に安定化される。本発明のキメラペプチドの間のジスルフィド結合による結びつきにより、ＣＣキメラＮペプチド単量体（つまり、ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造の単一ヘリックスサブユニット）は、非常に低い濃度であっても解離しないことは確かである。本発明の他の実施形態では、単一のＣＣキメラＮペプチド単量体は、化学選択的連結反応の結果形成される共有結合を介して安定化されたホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造内に含まれる。例えば、一実施形態では、後述のように、単一のＣＣキメラＮペプチドは、組み込まれた求電子性部分をそれぞれが持つ２つの誘導体化キメラＮペプチドとの複合体中で共有結合的に安定化され、ＣＣキメラＮペプチド内に組み込まれた少なくとも２つのシステイン残基はそれぞれ、それぞれの誘導体化キメラＮペプチドの求電子性部分と安定したチオエーテル結合を形成する。
【００３４】
したがって、本発明の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル構造は、１つまたは複数のＣＣキメラＮペプチドからなる三量体コイルドコイル構造を包含することが意図され、それにより、前記コイルドコイル構造は、限定はしないが、チオエーテル結合を含む、化学選択的連結反応から結果として生じるジスルフィド結合または共有結合である化学結合のいずれかを介して安定化される。そのため、「共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチド」は、少なくとも１つのＣＣキメラＮペプチドを持つ三量体コイルドコイル構造を包含するものとして定義される。本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチドまたはＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドの共有結合的な安定化では、ＨＩＶ  ｇｐ４１の中心の三量体Ｎヘリックスコイルドコイルの安定した露出部分が得られる。前記共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチドは、ヒトに対し抗ＨＩＶ治療分子として使用することができ、前記治療分子の作用機序は、ＨＩＶの膜融合プロセスを阻害することである。これらの共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチドは、ｇｐ４１の中心のＮヘリックスコイルドコイルの安定した、忠実な模倣薬となるため、これらは、さらに免疫原としても使用することができ、ＨＩＶ融合中間物質を標的とする中和反応を顕在化させる。そして、最後に、前記ペプチドは、ＨＩＶの融合中間物質に結合し、阻害する阻害剤（例えば、小分子、ｓｃＦｖｓ）の同定のためのスクリーニングプロトコルにおいて使用することができる。
【００３５】
三量体コイルドコイル立体配座を獲得することができるαヘリックス骨格タンパク質に融合されたｇｐ４１のＮＨ２末端７回繰り返し領域（Ｎヘリックス）の全部または一部を含むキメラペプチドとして定義される「キメラＮペプチド」は、当業で知られている。本発明の一実施形態では、上記のＥｃｋｅｒｔおよびＫｉｍ（２００１年）で開示されているキメラＮペプチド「ＩＺＮ１７」は、配列Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）をキメラＮペプチドのＮＨ２末端に付加し、本明細書で「ＣＣＩＺＮ１７」と指定されているＣＣキメラＮペプチドを形成し、ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）というアミノ酸配列を持たせることにより修飾される。付加されたシステイン残基は、ＣＣＩＺＮ１７ペプチドが共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルを形成する能力を付与する（ジスルフィド結合安定化されたＣＣＩＺＮ１７由来コイルドコイルについては図１および２Ａを参照し、チオエーテル結合安定化されたＣＣＩＺＮ１７由来コイルドコイルについては図１４を参照のこと）。付加されたグリシン残基は、キメラペプチドのαヘリックス部分からシステインを分離するスペーサー領域を表し、前記システインに対し、ジスルフィドまたは化学選択的（例えば、チオエーテル）結合形成に関与する立体配座に関するより高い自由度を与える。本発明の他の実施形態では、本明細書で説明されているようなキメラＮペプチド（例えば、ＩＺＮ１７）は、化学選択的反応に関与することができる求電子性部分を組み込むように誘導体化される（「誘導体化キメラＮペプチド」）。求電子性部分は、柔軟なリンカー領域（例えば、２つまたはそれ以上の連続するグリシン残基）によりキメラＮペプチドのαヘリックス部分から分離することができ、これにより、キメラペプチドのコイルドコイル形成と共有結合形成のとの間の干渉を最小限に抑えることに寄与し、結果として得られるコイルドコイルを安定化することができる。
【００３６】
元のＩＺＮ１７キメラＮペプチド（ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１））は、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮヘリックス領域の一部分の非凝集性三量体コイルドコイルを形成する能力を持つように設計された。ＩＺＮ１７は、長さがアミノ酸４１個分である連続するコイルドコイルを作成する、ｇｐ４１のＮヘリックス（「Ｎ１７」領域）の一部のＮＨ２末端にヘリックスフェーズにおいて融合された、三量体コイルドコイル、「ＩＺ」領域（上の下線付き）を形成することができる可溶性αヘリックス領域からなるキメラペプチドである。ＩＺ領域は、溶液中でヘリックスであり、三量体である、Ｓｕｚｕｋｉら（１９９８年、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：１０５１〜１０５５頁）により説明されている設計に基づく修飾イソロイシンジッパーである。Ｎ１７領域は、ｇｐ４１細胞外領域のタンパク質切断により同定されたｇｐ４１のＮヘリックス領域に由来する３６アミノ酸ペプチド（「Ｎ３６」）の切り詰められた部分である。ＩＺＮ１７は、円偏光二色性分光法（「ＣＤ」）によりヘリックスであると決定され、また個別の三量体を形成することができると決定された（上記のＥｃｋｅｒｔおよびＫｉｍ（２００１年）を参照）。さらに、ＩＺＮ１７は、酵母転写活性化剤ＧＣＮ４に由来する代替えの三量体コイルドコイルモチーフに融合されたＮ１７ペプチド領域（「ＩＱ」領域）からなる、同様に構成されたキメラペプチドＩＱＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）と比べて一桁効果が高いことが判明した。本発明で説明されているように、個々のＣＣＩＺＮ１７ペプチドは、さらに、平行な向きに配列された三量体ヘリックス構造としても会合し、人工的に作られたシステイン残基の並列を引き起こす。ＣＣキメラＮペプチドのヘリックス領域の外に配置されている、前記システイン残基は、自由に中性ｐＨで自然酸化して、３つのＣＣキメラＮペプチド鎖の間にジスルフィド架橋を形成する。それとは別に、単一ＣキメラＮペプチド上に付加されたシステイン残基は、２つの並列された誘導体化キメラＮペプチド内に組み込まれた求電子性部分との共有チオエーテル結合の形成に自由に加わることができる。３つのＣＣＩＺＮ１７ペプチド間の共有結合であるジスルフィド結合のつながりの存在により、結果として生じる共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル（ＣＣＩＺＮ１７）３（図２Ａを参照）は、元のＩＺＮ１７三量体コイルドコイルよりも安定するが、これは、特に、三量体の存在がもはや単量体鎖の濃度に依存しなくなっているからである。ＶＳＶ−Ｇ−ＨＩＶ（水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質により偽型化されたＨＩＶ）を陰性対照として使用して単一サイクル感染アッセイでＨＩＶの一次分離および実験室分離の両方を阻害する（ＣＣＩＺＮ１７）３とＩＺＮ１７の能力を比較した場合、（ＣＣＩＺＮ１７）３は、ＩＺＮ１７よりも少なくとも一桁高い効果を示す（実施例３を参照）。（ＣＣＩＺＮ１７）３は、現在までに知られている他の融合阻害剤よりも高い効力を有するさまざまなＨＩＶ株に対しピコモルまたは低ナノモルの範囲で抗ウイルス活性を示す。さらに、三量体コイルドコイルａｃ−Ｃ（���ｃｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３（実施例１１を参照）を生成する、単一ＣＣキメラＮペプチド由来ペプチド（ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）ＣＣＩＺＮ１７）と２つの誘導体化ＩＺＮ１７ペプチド（ブロモアセチル由来ＩＺＮ１７）との間のチオエーテル結合の形成は、ＨＩＶに対して（ＣＣＩＺＮ１７）３に匹敵する抗ウイルス活性を示し、ｍＡｂＤ５と類似の結合活性を示す（図１３を参照）。
【００３７】
本発明の一実施形態は、三量体コイルドコイルを形成することができる可溶性αヘリックス領域にヘリックスフェーズにおいて融合された、ＨＩＶ  ｇｐ４１細胞外領域のＮヘリックス７回繰り返し領域の全部または一部として本明細書で定義されている「Ｎペプチド」を含むキメラペプチド配列に関するものであり（本明細書ではキメラペプチドの「骨格領域」または「骨格部分」と呼ばれる）、キメラペプチド配列は、適宜さらに、ＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかに配置され、またキメラペプチドのコアヘリックス領域の外に配置された、少なくとも２つのシステイン残基を含む。本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドの骨格領域または骨格部分は、非ＨＩＶアミノ酸残基を含む。本発明の一実施形態では、骨格領域は、Ｎペプチド領域のＮＨ２末端に融合される。他の実施形態では、骨格領域は、Ｎペプチド領域のＣＯＯＨ末端に融合される。さらに他の実施形態では、骨格領域は、前記領域の部分がＮペプチド領域のＮＨ２およびＣＯＯＨの両方の末端に配置されるように分割することができる。コイルドコイルは、超ヘリックスねじれにより互いの周りを包まれている２つまたはそれ以上のαヘリックスからなるタンパク質構造モチーフである。アミノ酸残基の単純なパターンにより、「ａ」から「ｇ」までの英字により指定されたアミノ酸の特徴的７回繰り返しからなる、コイルドコイルの折り畳みが決まる。７回繰り返しの１番目の位置と４番目の位置、つまり、「ａ」と「ｄ」の位置はそれぞれ、コイルドコイルの相互作用するストランドの内側を形成し、一般に疎水性であると判別されている。本発明の共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチド内に含まれる骨格領域は、主に、三量体コイルドコイル構造を形成し、３つのｇｐ４１細胞外領域のＮヘリックスにより形成されるプレヘアピンおよびヘアピン三量体構造内に存在する内部三量体コイルドコイルを模倣する。コイルドコイルモチーフは、さまざまなソースから分離することができる。本発明の共有結合的に安定化したＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドを含む骨格領域は、特に、Ｓｕｚｕｋｉら（１９９８年、上記、これ以降「Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ」と呼ぶ）で開示されているイソロイシンジッパーモチーフおよびＥｃｋｅｒｔら（１９９８年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８４：８５９〜８６５頁およびＰＣＴ／ＵＳ０１／２９６３７、上記）で開示されているＧＣＮ４−ｐＩＱＩコイルドコイルモチーフ、およびこの切り詰められた、および／または修飾されたバージョンを含む。Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺコイルドコイルモチーフは、アミノ酸配列として、ＹＧＧＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）を持つ。Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺモチーフ（［ＩＥＫＫＩＥＡ（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：３３）］ｎ）を含む７回繰り返しの「ａ」位置に、下線が引かれている。ＧＣＮ４−ｐＩＱＩＺコイルドコイルモチーフは、アミノ酸配列として、ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＬＳＫＱＹＨＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＧＥＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）を持つ。このヘリックスモチーフの「ａ」位置にも下線が引かれている。
【００３８】
本明細書で説明されている方法により生成された共有結合的に安定化したコイルドコイル構造は、ホモ三量体コイルドコイル構造（つまり、３つの同一のキメラペプチドからなる）またはヘテロ三量体コイルドコイル構造（つまり、実質的には類似しているが、同一ではない３つのキメラペプチドからなる）の両方を包含することが考えられる。一実施形態では、本発明のヘテロ三量体コイルドコイル構造の不均質性は、コイルドコイル構造を含む個々のキメラペプチドの安定化領域にあるアミノ酸の違いから生じうる。これは、本明細書では、個々のキメラペプチドの間のチオエーテル結合を介して共有結合的に安定化されたｇｐ４１のＨＩＶ  Ｎペプチドコイルドコイル領域を模倣する三量体コイルドコイル構造の形成により実証される。本明細書で詳しく、また実施例１１においては特に詳しく説明されているように、チオエーテル結合の形成を介して安定化された例示されているヘテロ三量体コイルドコイル構造は、１つのＣキメラＮペプチドおよび２つの誘導体化Ｎペプチドからなる。これら２つの種のそれぞれのコアキメラＮペプチド領域のアミノ酸配列は同一とすることができるが、安定化する機序は、結果として得られるコイルドコイルに不均質性を付与しうる。例えば、ＣキメラＮペプチドは、少なくとも２つのシステイン残基の安定化ユニットおよびコアキメラＮペプチド領域のαヘリックス領域の外に配置されたスペーサーおよびリンカー領域を含むが、それぞれの誘導体化キメラＮペプチドは、組み込まれた求電子性部分とコアキメラＮペプチド領域との間にアミノ酸リンカー領域を持つ（つまり、付加システイン残基はない）。それとは別に、本発明のヘテロ三量体コイルドコイル構造の不均質性は、コイルドコイル内に含まれる個々のペプチドのコアキメラＮペプチド内にあるアミノ酸の違いから生じうる。例えば、本発明の範囲を決して制限することなく、本発明のヘテロ三量体コイルドコイル構造は、ペプチドの三量体化能力に重要な、それぞれの個別のペプチドの７回繰り返しの「ａ」および「ｄ」アミノ酸位置は同一であるが、疎水性領域の外部のアミノ酸位置（つまり、位置「ｆ」）は、三量体コイルドコイルの個別のペプチドの間では異なる３つのキメラペプチドで構成することができる。重要なのは、コイルドコイルの機能は、野生型構造のと類似しているため、このようなヘテロ三量体構造が、ＨＩＶ  ｇｐ４１融合中間物質の忠実な模倣薬としてそのまま識別できたということである（例えば、忠実な立体配座エピトープの抗ウイルス活性および／または生成）。
【００３９】
本明細書で説明されているように、本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドの一部を含む安定化骨格領域は、Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）またはＧＣＮ４−ｐＩＱＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０）コイルドコイルモチーフの全部または一部、またはこの修飾型とすることができる。そのようなものとして、Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺまたはＧＣＮ４−ｐＩＱＩ安定化骨格領域は、１つまたは複数のアミノ酸残基の付加、置換、修飾、および／または削除により変更することができる。「Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ類似の」および「ＧＣＮ４−ｐＩＱＩ類似の」骨格領域は、それぞれ「Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ」または「ＧＣＮ４−ｐＩＱＩ」コイルドコイルの一部、または前記それぞれのコイルドコイルの全部または一部の修飾バージョンを含むコイルドコイルモチーフとして本明細書で定義される。Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ類似およびＧＣＮ４−ｐＩＱＩ類似の骨格領域は、可溶性三量体（ヘリックス）コイルドコイルを形成するようにそれぞれＳｕｚｕｋｉ−ＩＺおよびＧＣＮ４−ｐＩＱＩ三量体コイルドコイル領域の十分な部分（つまり、十分な長さ）、またはこの修飾バージョンから成り立っていなければならない。骨格タンパク質のアミノ酸配列の変化に対する許容範囲は、変化したアミノ酸が構造上および／または機能上の役割を果たすかどうかによって決まる。そのため、本明細書で使用される変異した、または修飾された骨格タンパク質は、三量体コイルドコイルを形成する能力を保持していなければならない。さらに、変異／修飾された骨格領域とともに生成された本発明の少なくとも１つのＣＣキメラＮペプチドからなる共有結合的に安定化されたホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルは、少なくとも低ナノモル濃度範囲における効力によりＨＩＶ感染を阻害する能力、またはＮヘリックスコイルドコイル内に配置された立体配座エピトープを認識するｇｐ４１特異抗体を結合する能力（後述）を保持していなければならない。骨格タンパク質の修飾は、いくつかの利点をもたらしうる。例えば、本発明のキメラペプチドの外面は、生体利用効率を高め（例えば、ペプチドの溶解度を高め）、毒性を下げ、免疫クリアランスを回避するように変えることができる。本明細書で説明されている共有結合的に安定化したキメラペプチドが、複数回投与を必要とする抗ＨＩＶワクチン免疫原または抗ＨＩＶ治療分子のいずれかとして使用されると、個体の骨格領域に抗体ができて、身体からのペプチドクリアランスを高める可能性がある。代替え骨格を包含する本発明のキメラペプチドの複数のバージョンが利用可能であれば、前から存在する抗体を避けることによりこの問題をうまく回避することができるであろう。また、骨格タンパク質は、例えば、グリコシル化部位を外部表面上に導入することによりキメラペプチドの骨格領域の免疫原性を低くしようとして修飾されることもある。さらに、骨格領域は、前記キメラペプチドを免疫原性担体またはアフィニティ樹脂に結合しやすくするために修飾されることもある。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態では、共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル構造を形成する能力を有する、本明細書で説明されている、ＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１細胞外領域のＮヘリックス領域の全部または一部にヘリックスフェーズにおいて融合された、Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ骨格領域の全部または一部、またはこの修飾バージョンを含むが、ただし、非ＨＩＶ骨格は、ＨＩＶ配列のＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端のいずれかに融合される。Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ領域は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９として開示されている。上述のように、この骨格領域（つまり、コイルドコイルモチーフ）は、短くするか、修飾するか、またはその両方を行うことができるが、ただし、切り詰められた、および／または修飾されたＳｕｚｕｋｉ−ＩＺ骨格領域を含む、その結果得られたＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドは、Ｎペプチドコイルドコイル構造を適宜もたらす能力を保持する（つまり、Ｎヘリックス三量体コイルドコイルの安定した忠実な模倣薬を生成する能力を保持する）ことが重要である。前記ＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドがこの構造立体配座を保持するできることは、前記キメラペプチドからなるその結果得られる共有結合的に安定化したホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルが、ＨＩＶ感染を阻害し、および／またはＮペプチド領域内で立体配座エピトープを認識する抗体に結合できるかどうかを試験することにより決定することができる。例えば、本発明の一実施形態では、ＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は、キメラＮペプチドＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に融合された安定化ユニットＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を含む。ＩＺＮ１７は、「ＩＺ」として指定されている修飾されたＳｕｚｕｋｉ−ＩＺ骨格領域のＣＯＯＨ末端に融合されたｇｐ４１のＮヘリックス領域から１７個の連続するアミノ酸（後述のＮ３６ペプチドのＣＯＯＨ末端１７残基を表す）を含む。ＩＺ骨格モチーフは、「ｅ」および「ｇ」位置で著しく改変されたＳｕｚｕｋｉ−ＩＺコイルドコイルモチーフの一部を表し、「ａ」位置におけるイソロイシンからグルラミン（Ｉ→Ｑ）への置換を持つ（上記のＰＣＴ／ＬＴＳ０１／２９６３７を参照）。「ＩＺ」骨格領域のアミノ酸配列は、ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１、「ａ」位置に下線が引かれている）であり、ＮＨ２末端は、アセチル化されており、ＣＯＯＨ末端は、アミド化されている。ＥｃｋｅｒｔおよびＫｉｍ、２００１年（上記）で開示されているキメラＮペプチド、ＩＺＮ１７は、このＩＺ骨格とアミノ酸配列ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を持つＮ１７ペプチドとの融合である。ＩＺＮ１７の骨格領域は、イタリック体であり、このキメラＮペプチドにより生成されるαヘリックス「ａ」位置には下線が引かれている。長いＨＩＶ配列セグメントを持つ代替えキメラＮペプチドとともに、この共有結合的に安定化したバージョン（ＣＣＩＺＮペプチドまたは誘導体化ＩＺＮペプチド）も生成するときに適切なヘリックス構造を維持するた��に、この「ＩＺ」骨格を、アミノ酸１個分から数個分ほど延長し、「ＩＺ類似の」骨格領域を生成する必要がある場合がある。例えば、ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６は、本明細書で説明されている方法を介して安定化することができるＥｃｋｅｒｔおよびＫｉｍ、２００１年（上記）にも開示されているキメラＮペプチドである。ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６は、それぞれ、ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）およびＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）である。ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６の骨格領域は、イタリック体であり、ペプチドの「ａ」位置には下線が引かれている。ＩＺＮ１７およびＣＣＩＺＮ１７を作るために使用されるＩＺ骨格と比較すると、ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６のＩＺ類似の骨格領域は、アミノ酸１個分（ＩＺＮ２３）または２個分（ＩＺＮ３６）だけ延長されている。これは、「ａ」から「ｇ」までの間隔を適切な間隔に維持するために必要であり、これにより、αヘリックス立体配座の生成が容易になる。骨格領域をこのようにして延長するために選択されたアミノ酸では、隣接するヘリックス間の静電気相互作用が可能でなければならない（上記のＳｕｚｕｋｉら（１９９８年）を参照）。本明細書で説明されているような方法により安定化されるべきＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドを生成する場合、骨格領域は、結果として得られるペプチドのヘリックス立体配座を維持するために、ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６に見られるように、改変が最小である必要があることは、当業者には明白なことである。
【００４１】
ＩＺ骨格領域の短縮バージョンも、本発明のＣＣＩＺＮペプチドまたは誘導体化キメラＩＺＮペプチドに組み込むために生成することができる。短縮されたＩＺ類似の領域の具体的例は、ＩＺ骨格の１７個のアミノ酸、ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４０、「ＩＺ１７」として指定され、「ａ」位置には下線が引かれている）を表す。例えば、Ｎ１７にヘリックスフェーズにおいて融合されるＩＺ１７を含むキメラＮペプチドを生成することができるが、これは、アミノ酸配列ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１、「ＩＺ１７Ｎ１７」として指定され、骨格領域には下線が引かれている）を持つ。安定化ユニットＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）をペプチドのＮＨ２末端に付加し、ＣＣＩＺ１７Ｎ１７（ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２））を生成することで、ＩＺ１７Ｎ１７を含むＣＣキメラＮペプチドを生成することができる。それとは別に、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）配列の鏡像であるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）を人工的に作り、キメラＮペプチドのＣＯＯＨ末端に置き、ＣＣキメラＮペプチドＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＧＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４３、「ＩＺ１７Ｎ１７ＣＣ」と指定される）を生成することができる。すでに説明されているように、長いＨＩＶ配列セグメントを持つ代替えキメラペプチドを生成するときに適切なヘリックス構造を維持するために、この「ＩＺ１７」骨格を、アミノ酸１個分から数個分ほど延長し、「ＩＺ１７類似の」骨格領域を生成する必要がある場合がある。例えば、ＩＺ１７Ｎ２３およびＩＺ１７Ｎ３６は、本明細書で説明されている方法を介して安定化することができるキメラＮペプチドである。ＩＺ１７Ｎ２３およびＩＺ１７Ｎ３６は、それぞれ、ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＥＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）およびＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＥＩＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）である。ＩＺ１７Ｎ２３およびＩＺ１７Ｎ３６の骨格領域は、イタリック体であり、ペプチドの「ａ」位置には下線が引かれている。ＩＺ１７Ｎ１７を作るために使用されるＩＺ１７骨格と比較すると、ＩＺ１７Ｎ２３およびＩＺ１７Ｎ３６のＩＺ１７類似の骨格領域は、アミノ酸１個分（ＩＺ１７Ｎ２３）または２個分（ＩＺ１７Ｎ３６）だけ延長されている。これは、「ａ」から「ｇ」までの間隔を適切な間隔に維持するために必要であり、これにより、αヘリックス立体配座の生成が容易になる。したがって、本明細書で説明されているように安定化されるべきキメラペプチドを生成する場合、骨格領域は、結果として得られるペプチドのヘリックス立体配座を維持するために、ＩＺＮ２３およびＩＺＮ３６に見られるように、改変が最小である必要があることは、当業者には明白なことである。
【００４２】
他の実施形態では、人工的に作られたシステイン残基の間のジスルフィドまたは化学選択的結合のいずれかの形成を通じてホモ三量体またはヘテロ三量体立体配座中に共有結合的に安定化されることができる本発明のＣＣキメラＮペプチドまたは誘導体化キメラＮペプチドは、「ＥＺ」骨格として指定された、修飾Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ類似の領域を含み、これは、アミノ酸配列として、ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２、「ａ」位置には下線が引かれている）を持つ。ＥＺ骨格は、ＣＣＥＺＮペプチド（つまり、ｇｐ４１のＮヘリックス領域の全部または一部に融合されたＥＺ骨格を含むＣＣキメラＮペプチド）を免疫原性担体である、髄膜炎菌外膜プロテオソーム複合体（「ＯＭＰＣ」）粒子に結合する作用を容易にするように設計された。ＯＭＰＣは、免疫原性の劣る抗原（例えば、多糖類）および免疫応答性の弱いワクチン（例えば、２歳未満の幼児に使用するワクチン）の場合であっても、非常に有効な免疫原性担体となることが証明されている。しかし、ペプチドを担体に共有結合的に付加する（つまり、担体ペプチド抱合体を調製する）と、ＯＭＰＣペプチド抱合体の場合のように、抱合体の不可逆的沈殿を生じる。これを防ぐために、ＯＭＰＣ  １モルに組み込むことができるペプチドの最大モル数（通常、ペプチド「負荷」と呼ばれる）を慎重に制御しなければならない。多くのペプチド配列について、最適化した後であっても、ＯＭＰＣ上への適切なペプチド負荷を得ることは可能でない。任意の配列のペプチドをＯＰＭＣに直接的に抱合することを可能にし、ペプチド負荷がある閾値よりも高くなることを保証する戦略が近年策定されたが、これは、ペプチドエピトープに対する満足のゆく免疫応答を得るために欠かせない（２００３年１２月１８日に出願されたＢｉａｎｃｈｉらの米国仮特許出願第６０／５３０，８６７号「Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｍａｋｅ  ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｈｉｇｈ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ」を参照）。この方法は、ペプチド配列のｐＩ（等電点）を操作し、その値を、最適な形で、約３．５〜５．０の間に来るように調節することを伴う。ｐＩをこの範囲内に収まるようにするために、ペプチドは活性免疫原性領域の外で修飾され、それにより、ペプチドの免疫学的性質が確実に保持されるようにできる。例えば、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、ＯＭＰＣへの抱合について〜３．５〜５．０の最適な範囲内にない非常に高いｐＩを持つ（表１を参照）。
【００４３】
【表１】
2008501028.tif 000003
【００４４】
高いｐＩ値は、ＩＺ上に存在する多数の塩基性アミノ酸残基により決定されるため、新しい骨格が設計され、「ＥＺ」骨格として指定されており、これはより強い酸性を有する。ＩＺＮ１７ペプチドの「ＩＺ」骨格を生成するために使用されたＳｕｚｕｋｉ−ＩＺ骨格は、Ｓｕｚｕｋｉら、１９９８年、上記（図７を参照）で設計されたように、（ＩＥＫＫＩＥＡ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎ０：３３）の７回繰り返し配列を持つ。ＥＺ骨格を生成するために、この７回繰り返し配列を（ＩＥＫＫＩＥＥ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）７回繰り返しに修飾したが、その際に、Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ７回繰り返しの位置「ｃ」のアラニン残基をグルタミン酸に変異させた（図７を参照）。その結果得られたキメラＮペプチド、ＥＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）は、５．２のｐＩを持つ。円偏光二色性分光法によるＥＺＮ１７の分析結果から、このペプチドは、典型的なコイルドコイルサインを持つ完全ヘリックス立体配座をまだとることができることがわかる（実施例６を参照）。しかし、単一細胞のＨＩＶ感染を阻害する能力について試験すると、ＥＺＮ１７の抗ウイルス活性は、ＩＺＮ１７に比べて効力が数桁低い。この観察結果にもかかわらず、ＥＺＮ１７は、それでも、アフィニティが比較可能なＩＺＮ１７を持つ、ｇｐ４１（後述）のＮヘリックスコイルドコイル領域の疎水性ポケット内に配置された立体配座エピトープを認識する新たに同定された中和抗体である、Ｄ５−ＩｇＧに結合する（図６を参照）。これらの観察結果は、酸性のＥＺ骨格は、おそらくはＨＩＶ融合の仕組みによる骨格または可能な立体障害のせいで、結果として生じるペプチドのＨＩＶ感染阻害能力に干渉することを示しているが、結果として得られるペプチドは、Ｄ５により認識された立体配座エピトープを適切に与えるので、そのまま正確に折り畳まれ、ｇｐ４１融合中間物質の忠実な模倣薬を形成する。このことは、ＣＣＥＺＮ由来ペプチド、およびこれの共有結合的に安定化したホモ三量体またはヘテロ三量体型（例えば、（ＣＣＥＺＮ１７）３、実施例６を参照）が、ｇｐ４１の融合中間物質を標的とするＨＩＶ特異抗体を顕在化する推定免疫原として正当であることを示している。
【００４５】
ＥＺ骨格領域を持つ長いＣＣＥＺＮペプチドまたは誘導体化キメラＮペプチドは、さらに、特にＨＩＶ  Ｎペプチド領域を延長することにより生成することもできる。例えば、本明細書で説明されているように、前記ペプチドの末端に安定化ユニットを付加できるｇｐ４１のＮヘリックス領域の２３個の連続するアミノ酸を含むキメラＮペプチドＥＺＮ２３、ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＥＫＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）を生成することができる。ＥＺＮ２３の骨格領域は、イタリック体であり、αヘリックスの「ａ」位置には下線が引かれている。ＩＺＮおよびＩＺ１７Ｎペプチドに見られるように、本明細書で説明されているＥＺＮまたはＣＣＥＺＮキメラペプチドのＮペプチド領域を延長する場合、ＥＺ骨格領域をアミノ酸残基１つまたはそれ以上の分だけ延長し、結果として得られるαヘリックスの「ａ」から「ｇ」までの適切な間隔を維持する必要がある。例えば、キメラＮペプチド「ＥＺＮ３６」は、アミノ酸配列ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＥＫＩＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）からなる。ＥＺＮ３６の骨格領域は、イタリック体であり、ペプチドの「ａ」位置には下線が引かれている。ＥＺＮ１７およびＥＺＮ２３を作るために使用されるＥＺ骨格と比較すると、ＥＺＮ３６のＥＺ類似の骨格領域は、アミノ酸１個分だけ延長されている。上述のように、ＥＺ骨格領域を延長するために使用されるアミノ酸は、隣接するヘリックス間の静電気相互作用を可能にするために指定される（上記のＳｕｚｕｋｉら（１９９８年）を参照）。
【００４６】
ＥＺ骨格領域の短縮バージョンも、本発明のキメラペプチドに組み込むために生成することができる。短縮されたＥＺ類似の領域の具体的例は、ＥＺ骨格の１７個のアミノ酸、ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４、「Ｅ１７」と指定される）を表す。例えば、Ｎ１７にヘリックスフェーズにおいて融合されるＥ１７を含むキメラＮペプチドを生成することができ、これは、アミノ酸配列ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１５、「Ｅ１７Ｎ１７」として指定され、骨格領域には下線が引かれている）を持つ。安定化ユニットＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）をペプチドのＮＨ２末端に付加し、「ＣＣＥ１７Ｎ１７」（ＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１６）を生成することで、Ｅ１７Ｎ１７を含むＣＣキメラＮペプチドを生成することができる。それとは別に、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）配列の鏡像であるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）を人工的に作り、キメラＮペプチドのＣＯＯＨ末端に置き、ＣＣキメラＮペプチドＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＧＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１７、「Ｅ１７Ｎ１７ＣＣ」と指定される）を生成することができる。Ｅ１７骨格は、これが成分となっているキメラペプチドのｐＩをさらに減らすためにさらに変異させることができる。例えば、Ｅ１７骨格の１つまたは複数のリシン残基をグルタミン酸残基（例えば、ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＥＫＩＥＥＩＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９、「Ｅ１７Ｇｌｕ」と指定）ただし、下線付きのアミノ酸はＬｙｓからＧｌｕに変異されている）に変異させることができる。この骨格は、ジスルフィド結合またはチオエーテル結合の形成を介して三量体構造内の共有結合的な安定化のためＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドのいずれかを生成するのに使用することができる（例えば、図４を参照）。すでに説明されているように、長いＨＩＶ配列セグメントを持つ代替えキメラペプチドを生成するときに適切なヘリックス構造を維持するために、「Ｅ１７」および「Ｅ１７Ｇｌｕ」骨格をアミノ酸１個分から数個分ほど延長し、それぞれ「Ｅ１７類似」または「Ｅ１７Ｇｌｕ類似」の骨格を生成する必要がある場合がある。
【００４７】
本発明のＣＣＩＱＮペプチドは、ＩＱＮペプチドに融合された安定化ユニット（例えば、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８））を含む。それとは別に、本発明の誘導体化ＩＱＮペプチドは、化学選択的反応に関与しうる、限定はしないが、求電子性部分を含む、化学種を組み込むように誘導体化されたＩＱＮペプチドを表す。ＩＱＮペプチドは、ＧＣＮ４−ｐＩＱＩコイルドコイルモチーフ（つまり、骨格領域）の全部または一部、またはこの修飾バージョンにヘリックスフェーズにおいて融合されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１細胞外領域のＮヘリックス領域の全部または一部を含む。ＧＣＮ４−ｐＩＱＩコイルドコイルモチーフは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０として開示されている。上述のように、骨格領域を短縮し、および／または修飾して、Ｎヘリックス三量体コイルドコイルの安定した忠実な模倣薬を形成することがそのままできるＣＣＩＱＮペプチドまたは誘導体化ＩＱＮペプチドを生成することができる。前記ＩＱＮ類似ペプチドが前記構造的立体配座を保持できることは、前記キメラペプチドからなる共有結合的に安定化したホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルが、ＨＩＶ感染を阻害し、および／またはＮペプチド領域内で立体配座エピトープを認識する抗体に結合できるかどうかを試験することにより決定することができる（後述）。例えば、本発明の一実施形態では、ＣＣＩＱＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６）は、ＩＱＮ１７に融合された安定化ユニットＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を含む。ＩＱＮ１７は、「ＩＱ」として指定されているＧＣＮ４−ｐＩＱＩ類似のコイルドコイルモチーフに融合されたｇｐ４１のＮヘリックス領域から１７個のアミノ酸を含み、前記ＩＱ骨格は、アミノ酸配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５、「ａ」位置に下線が引かれている）を持つ。ＩＱ骨格は、ＣＯＯＨ末端の５個のアミノ酸により短縮されることに加えて、溶解度を高めるために３つの置換により修飾されたＧＣＮ４−ｐＩＱＩコイルドコイルモチーフからの連続するアミノ酸残基を含む。ＣＣＩＱＮ１７は、修飾されたＧＣＮ４−ｐＩＱＩコイルドコイルモチーフの２９個のアミノ酸残基、ｇｐ４１のＮ３６ペプチドのＣＯＯＨ末端部分の１７個の残基（後述）、およびキメラＮペプチドのＮＨ２末端に配置されたＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を含む。ＣＣＩＱＮ１７ではＨＩＶアミノ酸配列と非ＨＩＶアミノ酸配列との間に残基１つ分の重なりがあり、前記ＣＣキメラＮペプチドの全長はアミノ酸４９個分になる。ＣＣＩＱＮ１７のコアキメラ配列である、ＩＱＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）は、ヒト細胞のＨＩＶ感染を阻害することが証明されている（上記のＥｃｋｅｒｔおよびＫｉｍ（２００１年）および上記のＰＣＴ／ＵＳ０１／２９６３７を参照）。ＣＣＩＱＮペプチドについては、長いＨＩＶ  Ｎペプチド配列を持つものを生成することができる。例えば、ＩＱＮ２３およびＩＱＮ３６は、本明細書で説明されている方法を介して安定化することができるＥｃｋｅｒｔおよびＫｉｍ、２００１年（上記）に開示されているキメラＮペプチ���である。ＩＱＮ２３は、アミノ酸配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）を持つ。骨格領域は、イタリック体であり、αヘリックスの「ａ」位置には下線が引かれている。上述のＩＺＮ由来、ＩＺ１７Ｎ由来、およびＥＺＮ由来のキメラペプチド、およびこれらの共有結合的に安定化した型からわかるように、長いＨＩＶ  Ｎペプチド配列を持つ代替えキメラペプチドを生成するときに適切なヘリックス構造を維持するために、ＩＱＮ１７／ＩＱＮ２３を生成するために使用されるような「ＩＱ」骨格配列は、アミノ酸１個分から数個分ほど延長する必要がある。例えば、ＥｃｋｅｒｔおよびＫｉｍ、２００１年（上記）で開示されているような、ＩＱＮ３６は、アミノ酸配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬＩＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５）を持つ。骨格領域は、イタリック体であり、αヘリックスの「ａ」位置には下線が引かれている。ＩＱＮ１７およびＩＱＮ２３を作るために使用されるＩＱ骨格と比較すると、ＩＱＮ３６のＩＱ類似の骨格領域は、アミノ酸１個分だけ延長されている。すでに説明されているように、これは、「ａ」から「ｇ」までの間隔を適切な間隔に維持することであり、これにより、αヘリックス立体配座の生成が容易になる。
【００４８】
ＩＱ骨格領域の短縮バージョンも、本発明のＣＣＩＱＮペプチドまたは誘導体化ＩＱＮペプチドに組み込むために生成することができる。短縮されたＩＱ類似の領域の具体的実施例は、ＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＡＩＫＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６）からなるＩＱの１５個のアミノ酸残基、ＫＩＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７）からなるＱ→Ｉ変異を有するＩＱの１５個のアミノ酸残基、ＫＩＥＥＩＥＳＫＱＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３８）からなるＩＱの２１個のアミノ酸残基、およびＫＩＥＥＩＥＳＫＩＫＫＩＥＮＥＩＡＲＩＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３９）からなるＱ→Ｉ変異を有するＩＱの２１個のアミノ酸残基である。
【００４９】
上述のように、本発明のＣＣキメラＮペプチドまたは誘導体化キメラＮペプチドの骨格領域のアミノ酸配列は、修飾し、および／または短縮することができるが、ただし、そうする際に、その結果生じるキメラペプチドは、ｇｐ４１の内部Ｎヘリックスコイルドコイルの安定した忠実な模倣薬を表す三量体コイルドコイルを形成する能力を保持していなければならない。修飾されたおよび／または切り詰められた骨格領域からなるＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドが前記内部コイルドコイルの安定した忠実な模倣薬を形成することができるかどうかを決定するために、さまざまな実験方法を使用することができる。例えば、共有結合的に安定化したホモ三量体またはヘテロ三量体ＣＣキメラＮペプチド（ジスルフィド結合安定化およびチオエーテル結合安定化ホモ三量体コイルドコイルを含む）がＨＩＶ粒子の感染を阻害する能力を測定するように設計されたアッセイを実行することができる。実施例３でさらに説明されているこのような一アッセイでは、ヒトＣＤ４およびＣＣＲ５受容体を安定的に発現し、ＨＩＶ−２  ＬＴＲのｔａｔ反応断片により駆動されるβガラクトシダーゼ受容体遺伝子を保有するヒーラ細胞は、さまざまな濃度の共有結合的に安定化したホモ三量体ＣＣキメラＮペプチドの存在下でさまざまな株のＨＩＶ−１の感染を受ける。一定期間、前記細胞をインキュベートした後、細胞を溶解し、βガラクトシダーゼ活性を定量する。３つのＣＣキメラＮペプチドまたは修飾された／短縮された骨格領域を含むＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドの組合せのいずれかからなる共有結合的に安定化したホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルがｇｐ４１融合中間物質と干渉することによりＨＩＶ感染を阻害する能力を保持している場合、低βガラクトシダーゼ活性が記録される。試験されたキメラペプチドの効力を比較することができる。明らかに、本明細書で説明されているように、本発明の一実施形態は、低ナノモル濃度範囲において抗ウイルス力を有する共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチドを生成し、それにより当業ですでに知られているものよりも強力な阻害剤を表すことを重視している。しかし、本発明の他の実施形態は、ホモ三量体コイルドコイル内で共有結合的に安定化された場合に、弱い抗ウイルス活性を示すが、それでもｇｐ４１融合中間物質の安定した模倣薬を表すことができる、本明細書で説明されているような、共有結合的に安定化したキメラペプチドに関するものである。例えば、共有結合的に安定化したホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルのＮペプチド部分は、内部Ｎヘリックスコイルドコイルの忠実な模倣薬を表すことができるが、安定化骨格タンパク質は、最終的に、共有結合的に安定化したコイルドコイルとｇｐ４１融合の仕組みとの関連に干渉しうる（例えば、立体障害または荷電効果による）。このシナリオは、ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルが、ＨＩＶ感染を阻害する弱い能力を示すが、ｇｐ４１のＮヘリックス領域内の立体配座エピトープを認識する抗体に強く結合する場合に明らかにできる（例えば、Ｄ５抗体、実施例４を参照）。
【００５０】
しかし、骨格領域が変異され／切り詰められ、結果として生じるＣＣキメラＮペプチド含有ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルがもはやｇｐ４１融合中間物質の忠実な模倣薬であることを示さなくなる時点があることを認識することは重要である。これは、「ＣＣＩ１０Ｎ１７」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）と指定されたＣＣキメラＮペプチドにより実証される。ＣＣＩ１０Ｎ１７は、Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）のＮＨ２末端にヘリックスフェーズにおいて融合された、さらにキメラペプチドＣＣＧＧＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０、「ａ」位置に下線が引かれている）のＮＨ２末端のところで安定化ユニットＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）を含む、「Ｉ１０」（ＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４５））と指定されている、短縮されたＩＺ骨格領域を含む。Ｉ１０骨格は、ＩＺ骨格の１０個のアミノ酸からなる。ＣＣＩ１０Ｎ１７は、非ＨＩＶ残基の数を減らす目的で設計されており、したがって、キメラペプチドのＨＩＶ部分への免疫原性応答に集中することを試みる（詳細については、実施例５を参照）。しかし、その結果生じる共有結合的に安定化した三量体ＣＣキメラＮペプチド（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３（図２Ｃを参照）は、長い骨格を有する共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチドと比較した場合に抗ウイルス活性アッセイにおいて効力が低いことが示された。さらに、共有結合的に安定化した（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３三量体は、内部ＮヘリックスコイルドコイルＤ５  ＩｇＧの疎水性ポケット内に配置された立体配座エピトープを結合することが知られている中和抗体に弱結合することを示している（後述）。これは、骨格領域が短すぎてキメラペプチドのＮペプチド領域を忠実に示す、および／または安定化することができない箇所があることを示している。当業者であれば、結果として生じるＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドが、その三量体の共有結合的に安定化した立体配座において、例えば、高い効力でＨＩＶ感染を阻害する能力またはｇｐ４１のＮヘリックス領域内に配置された立体配座エピトープを認識する抗体を結合する能力のいずれかを試験したときにＮペプチド領域を忠実に示すかどうかを容易に決定できる。しかし、本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチドを安定化する代替え方法は、ペプチドの対向する末端にシステイン残基を付加することであることに留意されたい。そのため、最初に、前記ペプチドの一方の末端に置かれるシステイン残基間のジスルフィド結合を介して安定化されたＣＣキメラＮペプチドとともに形成された三量体コイルドコイルが高い効力でＨＩＶ感染を阻害する能力またはＮヘリックス領域内に配置された立体配座エピトープを認識する抗体を結合する能力を示さない場合、当業者であれば、ＣＣキメラＮペプチドの対向する末端に配置された安定化システイン残基を有する類似の共有結合的に安定化された三量体コイルドコイルを生成できる。安定化システイン残基が例えばペプチドのＣＯＯＨ末端に配置されているＣＣキメラＮペプチドを使用するチオエーテル結合の形成を介して本発明の三量体コイルドコイルを安定化��る場合、２つの誘導体化キメラＮペプチド内に組み込まれた求電子性部分が前記ペプチドの同じ末端（この場合、ＣＯＯＨ末端）に配置されていることが重要である。次いで、安定化機序（つまり、スルフィドまたはチオエーテル結合の形成による本明細書で示されているような共有結合機序）の配置が共有結合的に安定化したキメラペプチドの機能性に影響を及ぼすかどうかを判別することができる。安定化機序を対向する末端に移動すると、単位が付加された末端がペプチドの対向端に比べて安定性が低い場合に他の安定化の影響要因を持ちうる。多くの場合、本明細書で説明されているキメラＮペプチドのＮペプチド部分は、ペプチドの骨格部分に比べて安定性が低い、そこで、安定化ユニットをペプチドの骨格末端からＮペプチド末端に移動すると、結果として生じる三量体コイルドコイルの安定性が高まる。例えば、キメラペプチドのＣＯＯＨ末端に安定化システイン残基を配置することにより上述のキメラＮペプチド（つまり、Ｉ１０Ｎ１７）をさらに安定化することが可能である、これは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の鏡像であるＧｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）をＩ１０Ｎ１７キメラＮペプチド配列に付加し、アミノ酸配列ＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＧＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３、「Ｉ１０Ｎ１７ＣＣ」と指定される）を持つＣＣキメラＮペプチドを生成することにより行われる。
【００５１】
本発明の他の実施形態では、本明細書で説明されているＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドの骨格領域は、前記領域の部分がＮペプチド領域のＮＨ２およびＣＯＯＨの両方の末端に配置されるように分割することができる。このような状況では、骨格部分は、キメラペプチドのＮペプチド部分とヘリックスフェーズにおいてそのまま融合され、これにより、結果として生じるペプチドのαヘリックス立体配座が維持される。分割された骨格領域は、上述の、Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺまたはＧＣＮ４−ｐＩＱＩのいずれかの骨格、またはこれの修飾バージョンから誘導できる。
【００５２】
本発明のＣＣキメラＮペプチドは、ＨＩＶ  ｇｐ４１のＮヘリックス７回繰り返し領域の十分な部分にヘリックスフェーズにおいて融合された可溶性三量体コイルドコイル骨格タンパク質（「Ｎペプチド」部分）およびキメラペプチドのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に付加された少なくとも２つのシステイン残基を含む。前記ＣＣキメラＮペプチドは、三量体コイルドコイル立体配座をとることができ、この位置で、システイン残基は、酸化後にペプチド間に共有結合であるジスルフィド結合を形成することにより前記立体配座をさらに安定化することに寄与する。それとは別に、単一のＣＣキメラＮペプチドは、前記ペプチド間のチオエーテル結合の形成を通じて求電子性部分を組み込むようにそれぞれ誘導体化された２つのキメラＮペプチドを持つ三量体コイルドコイル立体配座をもたらすことができ、ＣＣキメラＮペプチドのシステイン部分内の２つのシステイン残基の求核スルフヒドリルは、誘導体化キメラＮペプチドの求電子性部分とチオエーテル結合を形成する。本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、ｇｐ４１のＣヘリックス領域により形成されたαヘリックスにペプチドを結合させられるだけのｇｐ４１のＮヘリックス領域の十分な部分を含まなければならず、したがって、前記共有結合的に安定化したペプチドは、上述のプレヘアピンおよびヘアピン三量体構造の内部Ｎヘリックスコイルドコイル領域の安定した、忠実な模倣薬を表す。それに加えて、本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、共有結合的に安定化されたペプチドが低からナノモル以下までの効力でヒト細胞のＨＩＶ感染を阻害し、および／またはｇｐ４１のＮヘリックスコイルドコイル領域内に配置された立体配座エピトープを認識する抗体に結合することができるだけのＮヘリックス領域の十分な部分を含まなければならない。キメラペプチドのＮペプチド部分は、骨格領域のＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかにヘリックスフェーズにおいて融合されることができる。
【００５３】
ＨＩＶ−１  ｇｐ４１細胞外領域は、約１６９個のアミノ酸基を表し、ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０エンベロープタンパク質中の位置に応じて、残基５１２〜６８１と番号が振られている。この細胞外領域内において、２つの４〜３  ７回繰り返し領域が細胞外領域のＮＨ２およびＣＯＯＨ末端部分に隣接して配置され、それぞれＮおよびＣヘリックス領域として指定された、αヘリックスを形成することが予測される。ＮヘリックスおよびＣヘリックス領域（それぞれ、ＨＲ１およびＨＲ２とも呼ばれる）は、ほぼ、ｇｐ１６０のアミノ酸位置５４１〜５９２および６２３〜６６３に配置されている（例えば、Ｃａｆｆｒｅｙら、１９９８年、ＥＭＢＯ  Ｊ．１７：４５７２〜４５８４頁を参照）。ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のαヘリックス立体配座の結晶化の後、Ｃｈａｎら（１９９７年、Ｃｅｌｌ  ８９：２６３〜２７３頁、さらに米国特許第６，５０６，５５４号も参照）は、ｇｐ４１細胞外領域のコア融合活性構造であると彼らが考えるもの、つまりそれぞれ、ＮヘリックスおよびＣヘリックス領域内に配置された、Ｎ３６およびＣ３４ペプチドと呼ばれる、２つの相互作用するペプチドの三量体を同定した。Ｃｈａｎらは、配列がＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（Ｎ３６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）およびＷＭＥＷＤＲＥＩＮＮＹＴＳＬＩＨＳＬＩＥＥＳＱＮＱＱＥＫＮＥＱＥＬＬ（Ｃ３４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）である前記Ｎ３６およびＣ３４ペプチドからなる最小のエンベロープサブドメインを示した。Ｎ３６／Ｃ３４複合体の結晶構造は、３つのＮ３６ヘリックスが内部的平行コイルドコイルを形成し、３つのＣ３４ヘリックスが傾いた逆平行の形で、高度に保存された疎水性の溝内にパッキングされ、Ｎ３６三量体（つまり、ヘアピン三量体）の表面上に付着する６ヘリックス束である。Ｎ３６は、アミノ酸残基５４６からアミノ酸残基５８１までを含み、これも、ＨＩＶ−１  ｇｐ１６０における位置に応じて番号が振られている。Ｘ線結晶構造解析を使用することで、ヘアピン三量体構造が深いキャビティ（疎水性ポケットとも呼ばれる）により中断されていることが判明した。このような１つのキャビティは、Ｎ３６αヘリックスのそれぞれの溝の底部（つまり、ＣＯＯＨ末端の片割れ）に配置され、並列するＣ３４ヘリックスからのつまみ状の突起により埋められ、ボールソケット配列をなしている。Ｃヘリックスからの３つの残基（トリプトファン６２８、トリプトファン６３１、およびイソロイシン６３５）が、このキャビティに挿入され、広い範囲にわたって疎水性接触をなしている。変異解析から、このキャビティを含む２つのＮ３６残基（ロイシン５６８およびトリプトファン５７１）は、膜融合活性にとって重要であることが示されている（Ｃａｏら、１９９３年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：２７４７〜２７５５頁）。このキャビティは、高親和性でこのキャビティに結合して通常のＮおよびＣヘリックス対合を防ぐ化合物（例えば、小分子、抗体）が効果的なＨＩＶ阻害剤となることを無理なく予想できる場合に、新しい抗ウイルス化合物を開発するうえで魅力的目標となることが証明されている。さらに、このキャビティ内の残基は、多様なＨＩＶ��離株間への保存性が高いため、この部位を標的とする薬物は、多様なＨＩＶ−１分離株、場合によってはＨＩＶ−２分離株に対しても広範な活性を有する可能性が高い。
【００５４】
上記のＣｈａｎらはＨＩＶ−１  ｇｐ４１の最小の安定したエンベロープサブドメインがＮ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６）およびＣ３４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４７）であると同定したが、他のグループは、Ｃｈａｎらにより開示されているものよりもわずかに大きい安定した６ヘリックス束を形成するＨＩＶ−１  ｇｐ４１のヘリックス領域を結晶化した。例えば、Ｗｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎら（１９９７年、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：４２６〜４３０頁）は、Ｎ３６ペプチドをＮ３６ペプチド配列ＡＲＱＬＬＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５３）のＮＨ２末端のところでアミノ酸残基５個分だけ、ＣＯＯＨ末端のところでアミノ酸残基７個分だけ延長している。したがって、本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドのＮペプチド領域は、必ずしも、上で開示されているＮ３６領域の全部または一部に制限されるわけではない。その代わりに、本発明の前記ペプチドのＮペプチド領域は、糖タンパク質のＣヘリックス領域により形成されるαヘリックスに結合するのに十分な量のｇｐ４１のＮヘリックス領域（ほぼｇｐ１６０のアミノ酸残基５４１〜５９２の間で本明細書で識別されている）を含む。典型的には、Ｎヘリックス領域から前記領域の全部の残基までの７つまたはそれ以上のアミノ酸残基は、本発明のＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドのＨＩＶ  ｇｐ４１成分を含むことができる。
【００５５】
一実施形態では、ＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、中心のＮヘリックスコイルドコイルの疎水性ポケットまたはキャビティを形成するアミノ酸残基を含むｇｐ４１  Ｎヘリックスの一部を含む。疎水性ポケットは、長さ約１６Å、幅約７Å、深さ約５〜６Åである。キャビティの頂部は、左Ｎ３６ヘリックスのロイシン５６６（Ｌ５６６）および右Ｎ３６ヘリックスのロイシン５６５（Ｌ５６５）により一列になっている。キャビティの左側は、アミノ酸残基（上から下へ）バリン５７０（Ｖ５７０）、リシン５７４（Ｋ５７４、脂肪族部分）およびグルタミン５７７（Ｑ５７７）を含む、左Ｎ３６ヘリックスからの側鎖により形成される。キャビティの右壁は、右Ｎ３６ヘリックスのアミノ酸残基ロイシン５６８（Ｌ５６８）、トリプトファン５７１（Ｗ５７１）、およびグリシン５７２（Ｇ５７２）により形成される。キャビティの床は、トレオニン５６９（Ｔ５６９）、イソロイシン５７３（Ｉ５７３）、およびロイシン５７６（Ｌ５７６）からなる。そのため、疎水性ポケットを形成するｇｐ４１細胞外領域の部分は、Ｎヘリックスαヘリックス領域のＣＯＯＨ末端の半分のところにある。本発明の一実施形態では、本明細書で説明されているような共有結合的に安定化されたキメラＮペプチドは、ｇｐ１６０配列（ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４））の残基５６５〜５８１に対応する、ＨＩＶ−１のＮ３６  Ｎペプチド（「Ｎ１７」）のＣＯＯＨ末端半分のところに配置された少なくとも１７個のアミノ酸を含む。ＩＺまたはＩＱ骨格領域に融合されたＮ１７ペプチドは、不連続の三量体を形成し、ウイルス感染の強力阻害剤である（上記のＥｃｋｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．およびＰ．Ｓ．Ｋｉｍ、２００１年を参照）。特に、本発明は、少なくとも２つのシステイン残基をｇｐ４１  ＮヘリックスのＮ１７ペプチドを含むキメラＮペプチドＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）、ＥＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）、ＩＺ１７Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４１）、およびＩＱＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）のＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に付加することに関する。
【００５６】
本発明のＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチド上のＣヘリックス結合部位の長いセグメントを露出する戦略は、キメラペプチドのＮペプチド領域を延長することを伴う。本発明の他の実施形態では、本明細書で説明されているように共有結合的に安定化されているＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、ＨＩＶ−１のＮ３６  ＮペプチドのＣＯＯＨ末端に配置された少なくとも約２３個のアミノ酸を含む（例えば、ｇｐ１６０配列「Ｎ２３」：ＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）の残基５５９〜５８１）。Ｎ２３は、ｇｐ４１のＮヘリックス領域により形成されたαヘリックス領域のもう１回転分を表し、ＩＺ類似またはＩＱ類似の骨格領域のいずれかに融合されたときに、結果として生じるキメラＮペプチドは、ＨＩＶ感染を阻害できる不連続な三量体を形成する（上記のＥｃｋｅｒｔおよびＫｉｍ、２００１年を参照）。特に、本発明は、少なくとも２つのシステイン残基をｇｐ４１  ＮヘリックスのＮ２３ペプチドを含むキメラＮペプチドＩＺＮ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＥＺＮ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、ＩＺ１７Ｎ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５７）、およびＩＱＮ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２４）のＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に付加することに関する。Ｎ３６の短縮バージョンを含む本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、例えば、大きなペプチドの場合と比べて生産が用意でありコストも安いため、治療上都合がよい。また、短縮バージョンは、それでも、腎臓内の急速濾過を防ぐ十分な大きさであることも無理なく予想できる。本発明のさらに他の実施形態では、ＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、ＨＩＶ−１のＮヘリックスの少なくとも約３６個のアミノ酸、例えば、本明細書で説明されているように安定化骨格に融合された、ＨＩＶ−１のＮ３６  Ｎペプチド全体、および配列（例えば、ＩＺＮ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、ＥＺＮ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、ＩＺ１７Ｎ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５８）、およびＩＱＮ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５））のＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかに付加された少なくとも２つのシステイン残基を含む。
【００５７】
さらに、上述の実施例のそれぞれにおいて、Ｎペプチド領域は、アミノ酸１個から１２個分ほど延長し、上述のＷｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎらにより同定されたＮヘリックスαヘリックス領域を模倣することができる。そのため、例えば、本明細書で説明されているように共有結合的に安定化されたキメラペプチドは、上記のＣｈａｎらにより説明されているＨＩＶ−１のＮ３６  Ｎペプチドの全部またはＣＯＯＨ末端部分、それに加えて、前記ＮペプチドのＣＯＯＨ末端に配置されたさらに７個までのアミノ酸を含み、Ｎペプチド領域を上記のＷｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎらにより同定されたＮヘリックス領域内にさらに延長することができる。したがって、本発明の一実施形態では、ＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドのＮペプチド部分は、さらに、Ｎ３６ペプチド領域の全部またはＣＯＯＨ末端部分のＣＯＯＨ末端に配置された、７つの追加のアミノ酸、特にＡＶＥＲＹＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９）の全部または一部のいずれかを含むことができる。さらにこれら７つのアミノ酸の全部または一部を含む本発明のＣＣキメラＮペプチドおよび誘導体化キメラＮペプチドは、Ｎ１７ペプチドで同定された推定される免疫原性エッジ効果を克服するのに役立つ（実施例８を参照）。実施例８でさらに説明されているように、Ｎ１７の一番端のＣＯＯＨ末端は、マウスの前記Ｎペプチドへの非中和応答を発生する免疫優勢エピトープを含む、Ｎ１７ペプチドの端の場所のせいで露出された免疫優勢エピトープは、Ｎ１７のＣＯＯＨ末端にアミノ酸残基を付加することにより部分的にマスクすることができる。そのため、一実施形態では、本発明のＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドは、「Ｎ１７＋７」（ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５０））、「Ｎ２３＋７」（ＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５１））、または「Ｎ３６＋７」（ＳＧＩＶＱＱＱＮＮＬＬＲＡＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＶＥＲＹＬＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５２））と指定されたＮペプチド領域を含む。Ｎペプチド領域は、上述のようにＳｕｚｕｋｉ−ＩＺ類似またはＧＣＮ４−ｐＩＱＩ類似の骨格領域のいずれかに融合することができる。特に、本発明は、安定化ユニット（例えば、少なくとも２つの安定化システイン残基または求電子性部分）をｇｐ４１  ＮヘリックスのＮ１７＋７ペプチドを含むキメラＮペプチドＩＺＮ１７＋７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５４）、ＥＺＮ１７＋７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５５）、ＩＺ１７Ｎ１７＋７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５９）、Ｉ１０Ｎ１７＋７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９２）、およびＩＱＮ１７＋７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５６）のＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかに付加することに関する。さらに、本明細書で説明されているように共有結合的に安定化されたキメラペプチドは、Ｎ３６ペプチド配列の全部またはＮＨ２末端部分、それに加えて、前記ＮペプチドのＮＨ２末端に配置されたさらに５個までのアミノ酸を含み、Ｎペプチド領域を上記のＷｅｉｓｓｅｎｈｏｒｎらのＮヘリックス領域のＮＨ２領域内にさらに延長することができる。したがって、本発明のＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドのＮペプチド部分は、さらに、Ｎ３６ペプチド領域のＮＨ２末端に配置された５個のアミノ酸、特にＡＳＱＬＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８４）の全部または一部のいずれかを含むことができる。
【００５８】
本発明の他の実施形態では、本明細書で説明されているＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、中心のＮヘリックスコイルドコイルの疎水性ポケットキャビティを形成するアミノ酸残基を含まないｇｐ４１  Ｎヘリックス領域の一部を含む。Ｎヘリックスコイルドコイル領域の疎水性ポケット領域を含まないＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドは、ｇｐ４１融合中間物質構造を標的とすることによりウイルス粒子宿主細胞膜融合を阻害するために使用することができる。
【００５９】
本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドのＨＩＶ部分は、さらに、元のＨＩＶ  Ｎヘリックス７回繰り返し領域の修飾バージョンとすることもできるが、ただし、結果として生じるキメラペプチドは、本明細書で説明されているように哺乳類の細胞のＨＩＶ感染の阻害剤であり、および／または融合中間物質の立体配座エピトープを標的とする中和抗体を生成することができることを条件とする。上述のように、ＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドの安定化骨格部分にさまざまな修飾を加えることができるが、ただし、これらの変更は、結果として生じるαヘリックスの三量化能力およびＮヘリックス領域の適切な表示を変えないことを条件とする。変更は、ＨＩＶ  ｇｐ４１配列（つまり、Ｎペプチド配列）を含むＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドの部分に加えることもできるが、ただし、骨格領域およびＨＩＶ  Ｎペプチド領域の両方の三量化能力および表面構造が維持されることを条件とする。例えば、非中和免疫優勢領域（つまり、免疫系により最も容易に認識され、したがって誘発された抗体の特異性に最も影響を及ぼす抗原決定基のサブユニット）は、本発明のＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドを生成するために使用されるＮペプチド配列内に存在しうる。実際、ビオチニル化ＩＱＮ１７およびＩＱＮ１７に対し生じた３つの非ＨＩＶ中和マウスモノクローナル抗体を伴う相互作用アッセイを使用したＩＺＮ１７およびその後の分析結果のアラニンスキャニングにより、Ｎヘリックス領域内の免疫優勢領域が同定された。（実施例８）。非中和抗体を生成する前記免疫優勢領域は、ＩＱＮ１７内に含まれるＮ１７の一番端のＣＯＯＨ末端部分内に配置されている。関係するペプチドであるＩＺＮ１７のアラニンスキャニングは、アミノ酸残基アルギニン５７９（Ｒ５７９）が非中和モノクローナル抗体の結合について重要であるように見え、残基グルタミン（Ｑ５７７）およびロイシン５８１（Ｌ５８１）も、結合に関与することを示しているが、試験されたモノクローナルに応じて寄与度は変化することを示している。マウスモノクローナル結合に関与するＮ１７の残基は、ＩＱＮ１７のＮヘリックス領域内のマウスの免疫優勢エピトープを表す可能性のある分子の底部に環を形成する（図８を参照）。興味深いことに、三量体Ｎヘリックスコイルドコイルの疎水性ポケットの裏側を覆うアミノ酸残基は、この推定される免疫優勢エピトープのＮＨ２末端にさらに配置される。疎水性ポケットは、新たに同定された、ＨＩＶ中和抗体、Ｄ５  ＩｇＧに結合する領域を含むものとして同定されており、したがって、疎水性ポケットは、推定される中和立体配座エピトープを含むと考えられる（Ｄ５  ＩｇＧを説明している２００４年６月１日出願された同時係属米国仮出願第６０／５７６０１２号）。そこで、本発明のＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドを生成するために使用されるＮペプチド領域は、疎水性ポケット内の推定される中和エピトープへの免疫応答を重視し、前記同定された非中和免疫優勢領域の抗原応答を最小限に抑える試みにおいて、修飾または短縮することができる。例えば、本発明の一実施形態では、Ｎ３６の一番端のＣＯＯＨ末端部分は、残基ロイシン５８１（Ｌ５８１）、アルギニン５７９（Ｒ５７９）、グルタミン５７７（Ｑ５７７）、および／またはグルタミン５７５（Ｑ５７５）のうちの１つまたは複数で変異される。それぞれの残基は、アラニン（Ａ）アミノ酸に変異されることが好ましいが、それは、アラニンがαヘリックス形成に関与しうるが、ペプチドのコイルドコイル構造を崩壊させないからである。さらに、アラニンは、小さな側鎖を持ち、抗体に対する可能な最小の結合表面を示す。グリシンまたはプロリン残基は、側鎖を持たず、これらの変異に対するよい選択と考えられるが、前記アミノ酸は、αヘリックスを崩壊させることが知られている。本発明の一実施形態では、本明細書で説明されているように、骨格コイルドコイル領域に融合されたＮ１７配列は、引用されている残基４つすべて（Ｌ５８１Ａ、Ｒ５７９Ａ、Ｑ５７７Ａ、およびＱ５７５Ａ）で変異され、配列ＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）を持つ「Ｎ１７Ａｌａ４」として指定されたＮ１７類似Ｎペプチド領域を形成する。変異されたアミノ酸には下線が引かれている。Ｎ１７Ａｌａ４は、本発明のＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチド、例えば、ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）、ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）、ＣＣＩＺ１７Ｎ１７Ａｌａ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６１）、およびＣＣＩＱＮ１７Ａｌａ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７）を生成するために本明細書で説明されている骨格のどれかに融合することができる。ＩＺＮ１７Ａｌａ４ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は、実施例１で説明されているように生成され、親ＩＺＮ１７ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に類似の抗ウイルス活性を有していたかどうかを調べるために単一サイクル感染アッセイで試験された。ＩＺＮ１７Ａｌａ４は、わずか２５ｎＭのＩＣ５０でＨＩＶ−１株ＨＸＢ２を阻害し（図１２Ａを参照）、親ペプチドＩＺＮ１７に関して抗ウイルス活性が約１２５倍減少しているが（ＩＣ５０＝０．２ｎＭ）、ＩＺＮ１７Ａｌａ４は、それでもｇｐ４１細胞外領域の疎水性ポケット内の立体配座エピトープを認識する抗体Ｄ５と相互作用することができる（図１２Ｂを参照）。したがって、Ｃ末端に４つのアミノ酸置換があるにもかかわらず、ＩＺＮ１７Ａｌａ４ペプチドは、それでも、損なわれていない疎水性ポケットをもたらし、結果として抗ウイルス活性を生じさせる陰性ｇｐ４１プレヘアピン構造と相互作用する能力を保持する立体配座をとることができる。さらに、非中和免疫優勢領域を切り詰めるか、または完全に取り除いて、この領域への抗原反応をなくすことができる。例えば、ＣＣＩＺＮ１３（ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）は、１３個のアミノ酸のみ（下線）からなる、切り詰められたＮ１７領域Ｎ１３を含む。このようにしてＮ１７領域を短縮すると、非中和抗体の結合に寄与していることがわかっている４つのアミノ酸のうちの２つが取り除かれる。
【００６０】
本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドのＮペプチド部分は、全体としてペプチドをさらに安定化するように修飾することもできる。例えば、Ｎペプチド領域を修飾することで、より安定しているイソロイシン残基を配列内に組み込むことができる。したがって、例えば、本発明の一実施形態では、Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を、「ａ」および「ｄ」パッキング位置で変異させ、ＬＩＱＬＩＶＷＧＩＫＱＩＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：８５、「Ｎ１７Ｉｌｅ」と指定され、変異残基には下線が引かれている）のように前記イソロイシン残基を組み込むことができる。前記修飾Ｎ１７ペプチドは、本明細書で説明されている多数の異なるＳｕｚｕｋｉ−ＩＺ類似またはＧＣＮ４−ｐＩＱＩ類似の骨格領域にヘリックスフェーズにおいて融合することができる。特に、それぞれジスルフィドまたはチオエーテル結合を介して共有結合的に安定化されたＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドは、短縮されたＩＺ骨格（例えば、Ｉ１０またはＩＺ１７）に融合された、Ｎ１７Ｉｌｅなどの前記領域を安定させるために修飾されたＮペプチド領域を含むことができる。この組合せは、さらに、短縮された骨格を安定化させ、ｇｐ４１融合中間物質の忠実な模倣薬を適切に形成させることができる。したがって、本発明の一実施形態では、他の安定化されたＮペプチド領域、例えば、Ｎ１７Ｉｌｅは、Ｉ１０骨格（例えば、ＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＩＱＬＩＶＷＧＩＫＱＩＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６、「Ｉ１０Ｎ１７Ｉｌｅ」と指定される））またはＩＺ１７骨格（例えば、ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＬＩＱＬＩＶＷＧＩＫＱＩＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８９、「ＩＺ１７Ｎ１７Ｉｌｅ」と指定される））にヘリックスフェーズにおいて融合される。これらのキメラＮペプチドは、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）三量化ユニットをペプチドのＮＨ２末端または、ペプチドのＣＯＯＨ末端に融合された、前記ユニットの鏡像Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８２）に付加することにより媒介されるジスルフィドまたはチオエーテル結合を介して共有結合的に安定化することができるが、例えば、それぞれＣＣＧＧＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＩＱＬＩＶＷＧＩＫＱＩＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８７、「ＣＣＩ１０Ｎ１７Ｉｌｅ」と指定される）、ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＬＩＱＬＩＶＷＧＩＫＱＩＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９０、「ＣＣＩＺ１７Ｎ１７Ｉｌｅ」と指定される）、ＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＩＱＬＩＶＷＧＩＫＱＩＱＡＲＩＬＧＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８８、「Ｉ１０Ｎ１７ＩｌｅＣＣ」と指定される）、ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＬＩＱＬＩＶＷＧＩＫＱＩＱＡＲＩＬＧＧＣＣ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９１、「ＩＺ１７Ｎ１７ＩｌｅＣＣ」と指定される）である。
【００６１】
本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドのＮペプチド部分は、骨格領域のＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端のいずれかに融合することができることに留意されたい。例えば、ＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と指定されている上述のＣＣキメラＮペプチドの１つを変更して、ペプチドの骨格およびＮペプチド部分を逆転させ、これにより、ＣＣキメラＮペプチドＣＣＧＧＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬＡＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９３、「ＣＣＮ１７ＩＺ」と指定される）を生成する。本明細書で説明されているＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドすべてにこの一般的スキームを適用することができる。
【００６２】
本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドを生成するために使用されるＨＩＶ  ｇｐ４１のＮヘリックス部分は、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、他のＨＩＶ株、または他のレンチウイルス種（例えば、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、猫免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、またはビスナウイルス）からの株から分離することができる。他の種の類似のＨＩＶ株および／または免疫不全ウイルスにおける対応するＮペプチド配列は、容易に識別することができ、当業で知られている。例えば、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ３６  Ｎペプチドに揃えた他のレンチウイルスＮＨ２末端αヘリックス領域のアミノ酸配列を表２に示した。さらに、αヘリックスコイルドコイル領域は、他のエンベロープウイルスの膜融合タンパク質内で同定された（上記のＳｉｎｇｈら、１９９９年を参照）。
【００６３】
【表２】
2008501028.tif 000004
【００６４】
本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドのコアキメラペプチド構造は、上で説明されている。しかし、当業ですでに開示されている類似のペプチドと比較したときの本発明のキメラペプチドの重要な相違点は、少なくとも２つのシステイン残基をＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかに付加すること、および／または求電子性部分をコアキメラペプチドのいずれかの末端に組み込み、前記ペプチドの間のそれぞれのジスルフィドおよび／またはチオエーテル結合を安定化させることに関与させることである。前記システイン残基および求電子性部分は、リンカーまたはスペーサー領域によりキメラペプチドのαヘリックス領域から適宜分離される。個々のタンパク質間（つまり、分子間）または単一ポリペプチド鎖内（つまり、分子内）の共有結合架橋は、システイン残基の酸化により形成することができる。ジスルフィド結合は、システイン残基内のチオール（−ＳＨ）基の酸化により形成される。分子内ジスルフィド結合は、タンパク質の三次構造を安定化させるが、分子間に生じる結合は、１つまたは複数のポリペプチドを伴うタンパク質構造を安定化させることに関与する。個々のペプチド／タンパク質の間の共有結合架橋は、さらに、一意的な相互反応基を共有結合される前記ペプチド／タンパク質−結合されるそれぞれのセグメント内のもの−に組み込むことにより課される化学選択的反応（例えば、チオエーテル結合の形成）により形成することもできる（Ｌｅｍｉｅｕｘ  Ｇ．Ａ．およびＢｅｒｔｏｚｚｉ  Ｃ．Ｒ．、１９９８年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５０６〜５１３頁、およびＢｏｒｇｉａ，Ｊ．Ａ．およびＦｉｅｌｄｓ  Ｇ．Ｂ．、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２４３〜２５１頁を参照）。本発明の一目標は、三量体立体配座内に畳まれてまとめられる上述の３つのキメラペプチドからなる共有結合的に安定化した構造を作成することである。前記構造は、３つのＣＣキメラＮペプチドの三量化および共有結合的安定化により実現することができ、前記三量体構造は、前記個々のペプチドのシステイン部分中のシステイン残基間のジスルフィド結合を介して安定化される。キメラペプチドのコアαヘリックス領域に付加されるシステイン残基は、酸化後、ジスルフィド結合を形成し、３つの同一のＣＣキメラＮペプチドにより形成された三量体構造を共有結合的に安定化する。それとは別に、前記構造は、２つの誘導体化キメラＮペプチドがそれぞれ求電子性部分を持つ単一のＣＣキメラＮペプチドの三量化および共有結合的安定化により実現することができ、チオエーテル結合は、ＣＣキメラＮペプチドの人工的に作られたシステイン残基中に存在するそれぞれのチオール反応性官能基とそれぞれの誘導体化キメラＮペプチドの求電子性部分（例えば、ハロゲン化アルキルまたはマイケル受容体）との間に形成される。そのため、本発明のキメラペプチドの間のジスルフィドまたは化学選択的共有結合による結びつきにより、ペプチド単量体（つまり、ホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造の単一のキメラペプチドサブユニット）は、非常に低い濃度であっても解離しないことが保証される。
【００６５】
本発明の一実施形態では、上述のコアキメラＮペプチドは、少なくとも２つのシステインアミノ酸残基を含むように延長され、本明細書で説明されているように、ＣＣキメラＮペプチドを生成する。ＣＣキメラＮペプチドの追加のシステインアミノ酸残基を人工的に作り、キメラペプチドのコアαヘリックス領域の外に配置する。さらに、上述のキメラＮペプチドは、前記ペプチドが化学選択的連結反応に関与することを可能にする部分（例えば、チオエーテル結合を形成できる求電子性部分）を組み込むように誘導体化することができる。前記化学部分は、さらに、キメラＮペプチドの末端に、またキメラペプチドのαヘリックス領域の外に配置される。比較として、ｇｐ４１細胞外領域の内部三量体コイルドコイルを生成するためにＬｏｕｉｓら（２００３年、上記）により使用されている代替え戦略では、Ｎヘリックス領域内の実際の残基をシステイン残基に変異させた。前記変異させたアミノ酸残基の１つは、コイルドコイルの相互作用しているストランドの内側を形成する７回繰り返しの２つの位置のうちの１つとして知られ、さらにＨＩＶ−１クレード間で保存性の高い、αヘリックス領域の「ｄ」位置に配置された（Ｄｏｎｇら、２００１年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．７５：２１５〜２２０頁）。本発明のＣＣキメラＮペプチド内の追加のシステイン残基の余剰ヘリックス配置（つまり、キメラペプチド構造のコアαヘリックス領域の外）は、前記ペプチドのコイルドコイル立体配座と安定化ジスルフィド結合との間の干渉を最小に抑える。
【００６６】
本発明の１つまたは複数のＣＣキメラＮペプチドを含む共有結合的に安定化した三量体構造は、プレヘアピン中間物質とヘアピン三量体立体配座の両方に存在するＮヘリックスの内部三量体の固有形態を模倣する作用をする。１つまたは複数のＣＣキメラＮペプチドを含む複数のホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイルを包含する高次分子構造の安定化とは反対に、不連続の三量体の安定化を確実に行えるようにするために、個々のＣＣキメラＮペプチド鎖毎にちょうど２つのシステイン残基を本明細書で説明されているキメラＮペプチドに付加し、３つのＣＣキメラＮペプチドからなる三量体構造のそれぞれの鎖の間の単一のジスルフィド結合の形成（例えば、図１および２Ａを参照）、または単一のＣＣキメラＮペプチド鎖と２つの誘導体化キメラＮペプチドのそれぞれとの間の単一チオエーテル結合の形成（例えば、図１４を参照）を有利に進めることができる。最初に、３つのＣＣキメラＮペプチドが、平行の向きで物理的に会合したときに、個々のポリペプチド単量体のαヘリックス構造、つまりシステイン残基は、よい近似である。酸化条件の下で、これらの並列されたシステイン残基は、自然発生的に、３つの鎖の間にジスルフィド架橋を形成する。不連続な三量体は、内部Ｎヘリックスコイルドコイルの最も正確な模倣薬であるため、前記不連続な三量体の共有結合的安定化は、特に前記三量体がＮヘリックス領域内の立体配座エピトープへの中和抗体の生成のため予防接種計画の一部として使用される場合に、有利である。したがって、本発明の一実施形態では、ちょうど２つのシステイン残基が本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチド内に存在し、これにより、チオール含有システイン残基とのジスルフィドまたは化学選択的（例えば、チオエーテル）結合の形成を介して前記ペプチドの三量体立体配座の安定化が行いやすくなる。それとは別に、ＣＣキメラＮペプチドの複数の三量体を包含する高次分子構造が望ましい場合、２つよりも多いシステイン残基をコアキメラペプチド配列に加えて、個々の三量体構造間のジスルフィドまたは化学選択的結合の生成を有利に進めることができる。このような状況において、溶液中で２つよりも多い末端システイン残基を有する高濃度の不連続な三量体は、ホモ三量体構造間のジスルフィド結合または化学選択的結合（例えば、チオエーテル結合）の生成を促進することができる。
【００６７】
本明細書で説明されているシステイン残基を、コアキメラＮペプチドのＮＨ２末端またはＣＯＯＨ末端に付加して、ＣＣキメラＮペプチドを生成することができる。本発明の一実施形態では、２つのシステイン残基は、ＣＣキメラＮペプチドのＮＨ２末端で最初の２つのアミノ酸残基を占有するように人工的に作られ、そこでは、骨格コイルドコイル領域は、キメラペプチドのＮＨ２末端半分内に配置される。この配列を使用すると、２つの人工的に作られたシステイン残基は、キメラペプチドのＮペプチド部分のαヘリックス構造および／または例えばＣヘリックスと相互作用する前記ＨＩＶ領域の機能性に干渉する可能性が最も低くなる。それとは別に、本発明の他の実施形態では、２つのシステインアミノ酸残基は、ＣＣキメラＮペプチドのＣＯＯＨ末端で最後の２つのアミノ酸残基を占有するように人工的に作られ、そこでは、骨格コイルドコイル領域は、キメラペプチドのＮＨ２末端半分内に配置される。これは、例えば、骨格領域に隣接して配置されているＣｙｓ−Ｃｙｓ配列が存在するためキメラペプチドの非ＨＩＶ骨格部分を介してＣＣキメラＮペプチドを免疫原性担体または親和性樹脂に抱合することが困難な場合に必要になる。他の実施形態では、２つのシステイン残基は、ＣＣキメラＮペプチドのＮＨ２末端で最初の２つのアミノ酸残基を占有するように人工的に作られ、そこでは、Ｎペプチド領域は、キメラペプチドのＮＨ２末端半分内に配置される。本発明の他の実施形態では、２つのシステイン残基は、ＣＣキメラＮペプチドのＣＯＯＨ末端で最後の２つのアミノ酸残基を占有するように人工的に作られ、そこでは、Ｎペプチド領域は、キメラペプチドのＮＨ２末端半分内に配置される。Ｎペプチドおよび骨格領域の向きを切り替えることで、結果として生じるＣＣキメラＮペプチドがウイルス宿主細胞膜融合を阻害する能力に影響を及ぼすことができる。
【００６８】
本発明の一実施形態では、本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチドのシステイン残基または本明細書で説明されている誘導体化キメラＮペプチドの求電子性部分は、リンカーまたはスペーサー領域によりキメラペプチドのαヘリックス部分から分離される。例えば、このようなスペーサー／リンカー領域がない場合、キメラペプチドのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に配置されたシステイン残基は、ペプチドのヘリックス二次構造内に入れることができる。本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチドのシステイン残基にさらに高い立体配座の自由度を与えるために、前記ペプチドのαヘリックス二次構造に関与しないリンカー／スペーサー領域によりキメラＮペプチドの残り部分からシステインを分離することができる。すると、スペーサー領域は、その正確な位置でＣＣキメラＮペプチドのヘリックス構造を切断し、個々のペプチド鎖上の一致するシステイン残基に、互いに相互作用して分子間安定化ジスルフィド架橋を形成するより大きな自由度を与える働きをする。それとは別に、本発明の誘導体化キメラＮペプチドの求電子性部分は、共有結合形成とコイルドコイル形成との間の干渉を最小にするために、前記ペプチドのαヘリックス二次構造から分離される。スペーサー／リンカー領域は、αヘリックス二次構造を切断する能力を有することが知られている短いアミノ酸配列を含むことができる。本発明の一実施形態では、本発明のＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドは、それぞれ、キメラペプチドのαヘリックス領域（つまり、Ｎペプチド領域にヘリックスフェーズにおいて融合された骨格領域）と付加されたシステイン残基または組み込まれた求電子性部分との間に配置された少なくとも１つのアミノ酸残基のスペーサー領域を有する。単一アミノ酸残基がスペーサー／リンカー領域として使用される場合、前記単一アミノ酸がペプチドのαヘリックス構造、例えば、グリシンまたはプロリン残基を崩壊することができる高い可能性を有するのが最もよい。単一のＤアミノ酸、つまりアミノ酸の右旋性異性体も、本明細書で説明されているキメラペプチドのαヘリックス立体配座を切断するために使用することができるが、このような場合、前記Ｄアミノ酸は、化学合成でしか組み込むことができない。アミノ酸のヘリックス傾向性を測定することにより得られる、ヘリックス傾向性尺度が当業で知られている（例えば、ＰａｃｅおよびＳｃｈｏｌｔｚ、１９９８年、Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７５：４２２〜４２７頁、Ｌｕｑｕｅら、１９９６年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：１３６８１〜１３６８８頁を参照）。本発明の他の実施形態では、本明細書で説明されているＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドは、限定はしないが、２つの連続するグリシン残基または２つの連続するＤアミノ酸を含む、キメラペプチドのαヘリックス領域からそれぞれ組み込まれているシステインまたは求電子性部分を分離するちょうど２つの連続する残基を含む。本発明の他の実施形態では、本明細書で説明されているＣＣおよびは誘導体化キメラＮペプチドは、限定はしないが、３つの連続するグリシン残基または３つの連続するＤアミノ酸を含む、キメラＮペプチドのαヘリックス領域からそれぞれシステインまたは求���子性部分を分離する２つよりも多い連続する残基を含む。これらのアミノ酸は両方とも、αヘリックス構造を崩壊させる可能性が高いため、前記ＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、さらに、スペーサー／リンカー領域内のアミノ酸の組合せ（例えば、１つのグリシンと１つのプロリン残基）を含むことができる。一般に、本発明のＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドがアミノ酸配列を含む場合、前記配列は、可変長としてよいが、キメラペプチド内で非ＨＩＶ配列を最小にするためには、αヘリックス構造を切断するのに必要な最小数の残基がスペーサーとして使用されるのが好ましい。それとは別に、スペーサー／リンカー領域は、化学または合成リンカー、例えば、アミノペンタン酸、アミノヘキサン酸、またはＣ−アルファ側鎖を持たないアミノ酸を含むことができる。一般に、化学リンカーは、コイルドコイルへの摂動なしで適切なジスルフィド架橋の形成を可能にする十分な立体配座の自由度を実現できる場合に使用することができる。
【００６９】
本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチド中に存在するシステイン残基は、一般的に連続するアミノ酸残基である。したがって、本発明の一実施形態では、本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチドは、キメラペプチドのコアαヘリックス領域の外にある、ペプチドのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかに配置され、適宜、スペーサー／リンカーによりコアαヘリックス領域から分離された、少なくとも２つの連続するシステイン残基を含む。本発明の他の実施形態では、本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチドは、キメラペプチドのコアαヘリックス領域の外にある、ペプチドのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかにあり、適宜、スペーサー／リンカーによりコアαヘリックス領域から分離された、ちょうど２つの連続するシステイン残基を含む。本明細書で説明されているシステイン残基は、必ずしも、連続する残基である必要はなく、そのため、前記システイン残基の間に最小数のアミノ酸残基を含めることが可能である。しかし、システイン残基は、同じポリペプチド鎖上のシステイン残基間の分子内ジスルフィド結合を生成できる十分に広い間隔で並べられておらず、三量体コイルドコイル立体配座内の個々のＣＣキメラＮペプチド間の分子間ジスルフィド結合を形成することはできないままであることが重要である。
【００７０】
本発明のＣＣキメラＮペプチドおよび誘導体化キメラＮペプチドは、さらに、キメラペプチドのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端のいずれかに付着されたマーカー領域を含むことができる。例えば、前記ペプチドの構造または機能に干渉することなく、適切に特徴付けられたタンパク質標識を付加して、例えば、免疫アッセイによるペプチド精製または検出を補助することができる。例えば、蛍光基、エピトープ配列（例えば、抗血球凝集素抗体、Ｍｙｃエピトープ、またはＦＬＡＧエピトープにより認識される配列）、またはビオチン分子を本明細書で説明されているキメラペプチドのＮＨ２またはＣＯＯＨ末端に付加することができる（例えば、Ａｌａｒｃｏｎら、２００１年、Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ｒｅｓ．１０：１８３〜１９２頁、Ｃｈａｖａｎｄら、２００１年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．７９：１０７〜１１２頁、Ｒａｓｋａら、２００３年、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ．Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．１４：１０７６〜１０８５頁を参照）。本発明の一実施形態は、キメラペプチドのいずれかの末端に付着されたビオチン分子を持つ、本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチドのビオチニル化形態を含む。本発明の一実施形態では、ビオチンマーカーは、本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチドのＮＨ２末端に付着され、そこでは、安定化骨格領域は、キメラペプチドのＮＨ２末端半分内に配置され、システイン残基は、キメラペプチドのＮＨ２末端に配置される。マーカーが前記システイン残基に近い位置に出現した結果として分子間ジスルフィド結合の形成に関する立体障害を回避するために、マーカー（例えば、ビオチン）およびシステイン残基がキメラペプチドの同じ末端に配置された場合、短いアミノ酸スペーサー領域をマーカーとシステイン残基との間に付加することができる。本発明の一実施形態では、前記スペーサー領域は、１つのグリシン残基を含む。ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）は、ＮＨ２末端を通じてＣＣキメラＮペプチド（ＣＣＩＺＮ２３）に付着され、前記マーカーをキメラペプチド配列から分離する単一グリシン残基を有する、ビオチン分子を含む本明細書で説明されているビオチン抱合ＣＣキメラＮペプチドの一実施例を表している。システイン残基をマーカーから分離するスペーサー領域は、さらに、プロリン残基またはＤアミノ酸も含むことができる。それとは別に、マーカー（例えば、ビオチン）および人工的に作られたシステイン残基は、本発明のＣＣキメラＮペプチドの異なる末端に配置することができる。
【００７１】
ペプチドなどの小分子は、免疫原性が悪く、そこで、前記分子に対する良好な免疫応答を顕在化するために、より大きな高分子（担体）への抱合体を調製する必要がある場合が多い。したがって、本発明は、さらに、免疫原性担体に抱合される本明細書で説明されているＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドに関するものである。本発明のＣＣキメラＮペプチドおよび／または誘導体化キメラＮペプチドは、個々のペプチドとして抱合することができるため、そこで、これらのペプチドをいくつかの状態に曝し、３つの個々に抱合されたペプチドからなるホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を形成する。それとは別に、本発明の１つまたは複数のＣＣキメラＮペプチドからなる共有結合的に安定化したホモ三量体またはヘテロ三量体コイルドコイル構造を、免疫原性担体に抱合させることもできる。担体分子、通常、異種タンパク質は、ペプチドのＨＩＶ部分への免疫応答を呼び起こし、および／または高める手助けをすることができる。ＣＣまたは誘導体化キメラＮペプチドおよびこの担体の反応相手は、非特異架橋剤、モノジェネリックスペーサー、またはバイジェネリックスペーサーにより連結することができる。当業では、本発明のキメラペプチドが抱合されうる多数の免疫原性担体分子が知られている（例えば、Ｓｈｏｄｅｌら、１９９６年、Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４４：９１〜９６頁、ＬａｎｇおよびＫｏｒｈｏｎｅｎ、１９９７年、Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｉｎｓｔ．Ｍｉｔｔ．９８：４００〜４０９頁、Ｂｒｅｎｎａｎら、２００１年、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：１５〜２６頁、ＰｕｍｐｅｎｓおよびＧｒｅｎｓ、２２０１、Ｉｎｔｅｒｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４４：９８〜１１４頁、およびＳｉｍｐｓｏｎら、１９９９年、Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．５６：４７〜６１頁を参照）。前記潜在的免疫原性分子は、限定はしないが、髄膜炎菌ＯＭＰＣ粒子、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、オボアルブミン（ＯＶＡ）、サイログロブリン（ＴＧ）、ＨＢＶコア抗原、ＨＢＶ表面抗原、テタヌスまたはジフテリアタンパク質毒素またはロタウイルスＶＰ６などの免疫原性タンパク質、およびｐ２４からなるＨＩＶカプシド粒子を含む。前記結果として得られる免疫学的抱合体は、ＨＩＶの防除ワクチンの成分として使用することができ、その結果、ＨＩＶに対する活性免疫のためにＨＩＶ特異性のある広く中和を行う抗体が生成される。ワクチンは、ＭＰＬ−Ａなどの当業で知られているアジュバントとともに製剤し、明ばんまたはリン酸アルミニウム上に吸着させることができる。抗原性抱合体は、さらに、限定はしないが、合成された、非天然のパンＨＬＡ  ＤＲ結合エピトープ（ＰＡＤＲＥ）を含む、より強力なヘルパーＴ細胞応答をもたらすＴ細胞ヘルパーエピトープも含めることができる（例えば、Ａｌｅｘａｎｄｅｒら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：１６２５〜１６３３頁およびｄｅｌ  Ｇｕｅｒｃｉｏら、１９９７年、Ｖａｃｃｉｎｅ  １５：４４１〜４４８頁）。本明細書で説明されているキメラペプチドの免疫原性合体は、成分（キメラペプチドまたはホモ三量体／ヘテロ三量体コイルドコイルおよび���体）を分離し、合成し、精製し、次いで、２つの成分を抱合することにより調製することができる。抱合体混合物のその後精製は、必要に応じて行うことができる。キメラペプチドの抗原性抱合体および好適な免疫原性担体は、成分（つまり、キメラペプチドおよび担体）の間に少なくとも１つの共有結合を有し、典型的には、それぞれの担体分子に共有結合された複数のキメラペプチド分子を有する。成分が別々に調製される場合、これらは、非特異架橋剤、モノジェネリックスペーサー、またはバイジェネリックスペーサーにより後で連結することができる。非特異架橋の方法は、当業でよく知られており、限定はしないが、グルタルアルデヒドとの反応、コハク酸化担体の混合を行う場合または行わない場合のＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドとの反応、グリコシル化された置換基の過過ヨウ素酸塩酸化の後の、水素化ホウ素ナトリウムまたは水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下でのタンパク質担体の遊離アミノ基へのカップリング、芳香族アミノ基のジアゾ化の後の、タンパク質のチロシン側鎖残基上のカップリング、イソシアン酸塩との反応、または混合された無水物の反応を含む。全般的には、Ｂｒｉａｎｄら、１９８５年、Ｊ．Ｉｍｍ．Ｍｅｔｈ．７８：５９〜６９頁を参照のこと。
【００７２】
本発明の一実施形態では、キメラペプチド免疫抱合体は、モノジェネリックスペーサーとともに形成することができる。前記スペーサーは、二機能性であり、抱合が行われる前に反応対の反応相手（例えば、キメラペプチドまたは担体）の一方のみの機能化を必要とする。モノジェネリックスペーサーを使用する抱合手順とともに、モノジェネリックスペーサーの実施例については、例えば、Ｓｃｈｎｅｅｒｓｏｎら、１９８０年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１５２：３６１〜３７６頁、およびＦｕｊｉｉら、１９８５年、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓ．２６：１２１〜１２９頁を参照のこと。本発明の一実施形態では、ＣＣキメラＮペプチドと免疫原性担体の抱合体は、バイジェネリックスペーサーとともに形成することができる。バイジェネリックスペーサーは、抱合される反応対のそれぞれの反応相手（例えば、キメラペプチドおよび担体）が二機能性スペーサーで機能化された後に形成される。抱合は、それぞれの機能化された反応相手がもう一方の相手と反応させられたときに生じ、安定した共有結合を形成する（例えば、Ｍａｒｂｕｒｇら、１９８６年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０８：５２８２〜５２８７頁、および１９８７年９月２２日に出願されたＭａｒｂｕｒｇらの米国特許第４，６９５，６２４号を参照）。抱合反応はきちんと特徴付けられており、制御しやすいため、バイジェネリックスペーサーは、ヒトワクチンの抱合体を調製する場合に好ましい。
【００７３】
本明細書で説明されているキメラペプチドを、例えば、樹脂または担体に抱合すること、または標識もしくは部分、例えば、ペグ化鎖とともに前記ペプチドを誘導体化することを容易にするために、本発明のＣＣキメラＮペプチドを、鎖毎にさらに１つのシステイン残基を含むように修飾することができる。本発明のこの実施形態では、それぞれのペプチド鎖は、奇数個のシステイン、例えば、３つの末端システイン残基（例えば、ＣＣＣＩＺＮ１７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）を含む。奇数番号の末端システイン残基は、適宜、柔軟な化学リンカー、例えば、Ｔｔｄｓ（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカミンコハク酸、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２）２−ＣＯ−、実施例９および１１を参照）を使って残りの連続するシステインから適宜分離することができる。奇数個のシステインにより、本発明のＣＣおよび／または誘導体化キメラＮペプチドを含む共有結合的に安定化した三量体を形成した後、マレイミジルなどのチオール反応基とさらに反応させるために共有結合的に安定化した三量体毎に少なくとも１つの反応性チオール基が利用可能であることが保証される。リンカーは、三量化領域のジスルフィド架橋と抱合／誘導体化に適したシステイン残基との間に柔軟性、可溶性をもたらし、間隔をあける。追加のシステイン残基は、ジスルフィドまたは化学選択的結合形成（例えば、チオエーテル結合形成）のいずれかに前記システイン残基が関与することを防ぐために保護チオール基を備えることができる。保護基（限定はしないが、フルオレニルメトキシ（「Ｆｍ」）またはアセトアミドメチル（「Ａｃｍ」）基）を含む）を、共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルの形成の後取り除き、前記新たに露出したチオール基が、抱合反応に利用できるようにすることができる。
【００７４】
本発明の好ましい態様は、図４に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２、指定「ＣＣＩＺＮ１７」として開示されている。ＣＣＩＺＮ１７は、アミノ酸配列ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を持つ。ＣＣＩＺＮ１７は、ＣＣキメラＮペプチドを表し、コアキメラペプチド配列「ＩＺＮ１７」は、Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）のＮＨ２末端に融合されたＩＺ骨格領域（下線が引かれている）からなる。ＣＣＩＺＮ１７は、さらに、コアキメラペプチドのＮＨ２末端に融合された安定化Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）配列を含む。２つの連続するシステイン残基は、システイン残基がペプチドの酸化後に形成される密接に関連するＣＣキメラＮペプチド上に並列するジスルフィド結合の連結に関与する。２つの連続するグリシン残基は、スペーサー領域を表し、システイン残基をコアキメラペプチド配列のαヘリックス領域から分離する。グリシンスペーサー領域は、システイン残基がコアペプチド配列のヘリックス二次構造内に巻き込まれないようにし、前記システインがジスルフィド結合に自由に関与できるようにする。酸化生成物（ＣＣＩＺＮ１７）３（図２Ａを参照）は、分子量が１５５２０Ｄａであり、エレクトロスプレー質量分析法で決定されたとおりである（実施例１）。本発明の他の実施形態では、ＣＣＩＺＮ１７は、キメラペプチドのＮＨ２末端を通してビオチンマーカーに結合され、前記マーカーは、追加のグリシン残基「ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７」（ビオチン−ＧＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８））によりＮＨ２末端に配置された連続するシステイン残基から分離される。ＩＺＮ１７および他の融合阻害剤（５−Ｈｅｌｉｘ、Ｔ−２０、ｍＡｂ２Ｆ５およびＩｇＧＤ５、実施例３を参照）と平行して（ＣＣＩＺＮ１７）３を試験し、一次および実験用分離株を使用して単一サイクル感染アッセイでＨＩＶを阻害する能力と比較した場合、共有結合的に安定化された三量体は、ＨＸＢ２およびＢａＬ分離株に対し少なくとも一桁高い効力を示す。（ＣＣＩＺＮ１７）３は、さらに、８９．６など、一次分離株に対し低いナノモル効力を示すが、ただし、８９．６では、ＩＺＮ１７への完全耐性を有する。共有結合的に安定化された（ＣＣＩＺＮＩ７）３三量体は、さらに、Ｎヘリックスコイルドコイルの疎水性ポケット内に配置された立体配座エピトープを認識する新たに同定されたＨＩＶ中和抗体である、Ｄ５  ＩｇＧに結合する（後述、実施例３を参照）。これにより、必ず、ＣＣキメラＮペプチドのＮ１７部分は、適宜、ＨＩＶ配列を示し、さらにこのことは、前記ペプチドがｇｐ４１細胞外領域のこの部分の忠実な模倣薬であることを示す。
【００７５】
本発明の他の好ましい態様は、図４に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３、指定「ＣＣＩＺＮ２３」として開示されている。ＣＣＩＺＮ２３は、アミノ酸配列ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲｌＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）を持つ。ＣＣＩＺＮ２３は、ＣＣキメラＮペプチドを表し、このコアキメラペプチド配列は、Ｎ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４８）のＮＨ２末端に融合されたＩＺ類似骨格領域（下線が引かれている。ＩＺ骨格のＣＯＯＨ末端のところに追加のグルタミン酸（Ｅ）を加えた「ＩＺ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１））からなる。ＣＣＩＺＮ２３は、さらに、コアキメラペプチド配列のＮＨ２末端に融合された安定化Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）配列を含む。２つの連続するシステイン残基は、システイン残基が密接に関連するＣＣキメラＮペプチド上に並列する、ペプチドの酸化後に形成される、ジスルフィド結合の連結に関与する。２つの連続するグリシン残基は、スペーサー領域を表し、システイン残基をコアキメラペプチド配列のαヘリックス領域から分離する。グリシンスペーサー領域は、システイン残基がジスルフィド結合に自由に関与できるが、ペプチドの残り部分のヘリックス二次構造内に巻き込まれないようにするのに役立つ。本発明の他の実施形態では、ＣＣＩＺＮ２３は、ペプチドのＮＨ２末端を通してビオチン分子に結合され、前記ビオチン分子は、「ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３」（ビオチン−ＧＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＥＩＥＡＱＱＨＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２））と指定された追加のグリシン残基によりＮＨ２末端に配置された連続するシステイン残基から分離される。中性ｐＨでインキュベートした後、ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３は自然に酸化されて共有結合三量体（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３（図２Ｂを参照）を形成するが、ただし、分子量は１８７５１Ｄａであり、エレクトロスプレー質量分析法で決定されたとおりである（実施例１）。単一サイクル感染アッセイにおけるＨＩＶを阻害する能力を比較するためにＩＺＮ２３および（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３を平行して試験した場合、共有結合的に安定化した三量体は、一桁効力が大きい（実施例３を参照）。
【００７６】
本発明の他の好ましい態様は、図４に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７、指定「ＣＣＥＺＮ１７」として開示されている。ＣＣＥＺＮ１７は、アミノ酸配列ＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を持つ。ＣＣＥＺＮ１７は、ＣＣキメラＮペプチドを表し、「ＥＺＮ１７」として指定されているコアキメラペプチド配列は、Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）のＮＨ２末端に融合された、上述の、ＥＺ骨格領域（下線が引かれている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）からなる。ＣＣＥＺＮ１７は、さらに、コアキメラペプチドのＮＨ２末端に融合された安定化Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）配列を含む。２つの連続するシステイン残基は、酸化後システイン残基が密接に関連するＣＣキメラＮペプチド上に並列するジスルフィド結合の連結に関与しうる。２つの連続するグリシン残基は、スペーサー領域を表し、システイン残基をコアキメラペプチド配列のαヘリックス領域から分離する。グリシンスペーサー領域は、システイン残基がペプチドの残り部分のヘリックス二次構造内に巻き込まれないようにし、ジスルフィド結合に自由に関与できるようにするのに役立つ。本発明の他の実施形態では、ＣＣＥＺＮ１７は、キメラペプチドのＮＨ２末端を通してビオチン分子に結合され、前記ビオチン分子は、追加のグリシン残基「ビオチン−ＣＣＥＺＮ１７」（ビオチン−ＧＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６９））によりＮＨ２末端に配置された連続するシステイン残基から分離される。ＣＣＥＺＮ１７は、ＣＣＩＺＮ１７よりも酸性の強い等電点を有し、抱合目的に対してより好ましいため、ＯＭＰＣに抱合するようにより都合のよい抗原として設計された（実施例６を参照）。コアキメラペプチドＥＺＮ１７は、弱い抗ウイルス活性を示すが、Ｄ５  ＩｇＧと強く結合し（実施例６を参照）、キメラペプチドがＮペプチドの疎水性ポケット領域を忠実に示すことがわかっている。そこで、ＣＣＥＺＮ１７は、共有結合的に安定化した三量体を形成することができ、ＨＩＶへの中和抗体の生成のための免疫原として使用できるＥＺＮ１７の誘導体を表す。
【００７７】
本発明の他の好ましい態様は、図４に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、指定「ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４」として開示されている。ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４は、アミノ酸配列ＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を持つ。ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４は、Ｎ１７由来の配列のＮＨ２末端に融合されたＩＺ骨格領域（下線が引かれている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）を含むＣＣキメラＮペプチドを表し、前記Ｎ１７由来の配列は、４つのアミノ酸残基（二重下線が引かれている）のところでアラニン残基「Ｎ１７Ａｌａ４」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）に変異された「Ｎ１７」ペプチド（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）を表している。Ｎ１７Ａｌａ４は、マウスにおいて非中和抗体を生成することが知られているＮ１７ペプチド中の免疫優勢領域をなくすように設計されており、そのため、前記免疫優勢領域に隣接して配置されている疎水性ポケット内に存在することが知られている中和立体配座エピトープへのＮ１７由来のペプチドに抗原反応を集中させる手助けをする。ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４は、さらに、コアキメラペプチドのＮＨ２末端に融合された安定化Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）配列を含む。２つの連続するシステイン残基は、酸化後システイン残基が密接に関連するＣＣキメラＮペプチド上に並列するジスルフィド結合の形成に関与しうる。２つの連続するグリシン残基は、スペーサー領域を表し、システイン残基をコアキメラペプチド配列のαヘリックス領域から分離する。グリシンスペーサー領域は、システイン残基がペプチドの残り部分のヘリックス二次構造内に巻き込まれないようにし、ジスルフィド結合に自由に関与できるようにするのに役立つ。本発明の他の実施形態では、ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４は、キメラペプチドのＮＨ２末端を通してビオチン分子マーカーに結合され、前記マーカーは、追加のグリシン残基「ビオチン−ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４」（ビオチン−ＧＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７０））によりＮＨ２末端に配置された連続するシステイン残基から分離される。
【００７８】
本発明の他の好ましい態様は、図４に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９、指定「ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４」として開示されている。ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４は、アミノ酸配列ＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）を持つ。ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４は、ＣＣキメラＮペプチドを表し、コアキメラペプチド配列は、Ｎ１７由来の配列のＮＨ２末端に融合されたＥＺ骨格領域（一重下線が引かれている、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）からなり、前記Ｎ１７由来の配列は、上で説明されている、４つのアミノ酸残基（二重下線が引かれている）のところでアラニン残基「Ｎ１７Ａｌａ４」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６０）に変異された「Ｎ１７」ペプチドを表している。ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４は、さらに、コアキメラペプチドのＮＨ２末端に融合された安定化Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）配列を含む。２つの連続するシステイン残基は、酸化後システイン残基が密接に関連するＣＣキメラＮペプチド上に並列するジスルフィド結合の形成に関与しうる。２つの連続するグリシン残基は、スペーサー領域を表し、システイン残基をコアキメラペプチド配列のαヘリックス領域から分離する。グリシンスペーサー領域は、システイン残基がペプチドの残り部分のヘリックス二次構造内に巻き込まれないようにし、ジスルフィド結合に自由に関与できるようにするのに役立つ。本発明の他の実施形態では、ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４は、キメラペプチドのＮＨ２末端を通してビオチン分子に結合され、前記マーカーは、追加のグリシン残基「ビオチン−ＣＣＥＺＮ１７Ａｌａ４」（ビオチン−ＧＣＣＧＧＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＡＬＡＡＡＩＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７１））によりＮＨ２末端に配置された連続する安定化システイン残基から分離される。
【００７９】
本発明の好ましい態様は、図４に、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１、指定「ＳＣＣＩＺＮ１７」として開示されている。ＳＣＣＩＺＮ１７は、アミノ酸配列ＳＧＧＣＣＧＧＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＱＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を持つ。ＳＣＣＩＺＮ１７は、ＣＣキメラＮペプチドを表し、コアキメラペプチド配列「ＩＺＮ１７」は、Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４４）のＮＨ２末端に融合されたＩＺ骨格領域（下線が引かれている。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）からなる。ＳＣＣＩＺＮ１７は、さらに、コアキメラペプチドのＮＨ２末端に融合されたＣｙｓ−Ｃｙｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）配列を含む。２つの連続するシステイン残基は、システイン残基がペプチドの酸化後に形成される密接に関連するＣＣキメラＮペプチド上に並列するジスルフィド結合の連結に関与する。２つの連続するグリシン残基は、スペーサー領域を表し、システイン残基をコアキメラペプチド配列のαヘリックス領域から分離する。グリシンスペーサー領域は、システイン残基がコアペプチド配列のヘリックス二次構造内に巻き込まれないようにし、前記システインがジスルフィド結合に自由に関与できるようにする。ＳＣＣＩＺＮ１７は、さらに、連続するシステイン／グリシン残基のＮＨ２末端に融合されたＳｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列を含む。Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ配列は、ＣＣキメラＮペプチドを親和性樹脂に抱合しやすくするために付加された（詳細については実施例２を参照）。酸化生成物（ＳＣＣＩＺＮ１７）３（図３Ａを参照）は、分子量が１５９９５Ｄａであり、エレクトロスプレー質量分析法で決定されたとおりである（実施例２）。
【００８０】
本明細書で説明されているＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、さまざまな異なる目的に使用することができる。共有結合的に安定化したキメラペプチドは、ヒトのＨＩＶ感染を防止するための抗ＨＩＶ治療および／または予防薬剤または薬物として有用である。このような抗ＨＩＶ薬剤の作用機序は、ウイルスの融合プロセスを阻害することである。実際、本明細書で説明されている共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルの一部は、ナノモル以下の濃度で活性のある、ＨＩＶ−１感染（つまり、ウイルス膜融合）の強力阻害剤である。そのため、ＨＩＶが宿主細胞内に侵入した後にウイルスタンパク質を標的とする標準的な抗ＨＩＶ療法とは異なり、ＨＩＶ感染の強力阻害剤であることが示されている本明細書で説明されている共有結合的に安定化したキメラペプチドは、感染を防止するか、または感染が生じる程度を下げるために予防薬として使用することができる。したがって、本発明の一実施形態では、低からナノモル以下の濃度（例えば、ＣＣＩＺＮ１７およびＣＣＩＺＮ２３）でウイルス活性を阻害する能力を有する本明細書で説明されているＣＣキメラＮペプチドは、個体におけるＨＩＶ感染を低減するために使用される。この実施形態では、前記共有結合的に安定化したキメラペプチドは、個体の細胞のＨＩＶ感染を（完全にまたは一部）低減するのに十分な量だけ個体に投与される。ＨＩＶ感染を低減するのに十分な前記キメラペプチドの用量（「有効量」）は、細胞内へのＨＩＶ侵入を完全にまたは一部阻害するような方法（例えば、注射、局所投与、経静脈投与）で投与される。患者投与に適した薬剤として許容される組成物は、許容される温度範囲内で保管中最大の安定性も促進しつつ生物活性を保持する有効な量のペプチドを製剤中に含む。このペプチドベース薬剤組成物は、適宜、薬剤として許容される担体を含むことができる。これらのペプチドは、ＨＩＶ複製を阻害するさまざまな抗レトロウイルス薬と併用することが可能である。ＣＣキメラＮペプチドベース組成物と併用できる抗レトロウイルス薬のクラスは、限定はしないが、ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、およびプロテアーゼ阻害剤（ＰＩ）を含む。
【００８１】
本発明の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルは、ｇｐ４１の内部Ｎヘリックスコイルドコイルの安定した、忠実な模倣薬を表すため、これらは、さらに免疫原としても使用することができ、ＨＩＶ融合中間物質を標的とする中和抗体反応を生じさせる。したがって、本発明は、本明細書に説明されているような共有結合的に安定化したキメラペプチドを免疫原として使用し、ＨＩＶ特異抗体を発現し、ＨＩＶ感染を防止または低減する方法に関するものである。ＣＣキメラＮペプチド関連免疫原は、単独でまたは併用法および／またはプライム／ブースト投薬計画で投与される場合、これまで未感染である個体に対し予防上のメリットがあり、および／または感染個体内のウイルス量レベルを下げ、それによりＨＩＶ感染の無症候フェーズを長くすることにより治療効果をもたらす。本明細書で説明されている共有結合的に安定化したキメラペプチド、またはこれの免疫原性抱合体がキメラペプチドのＨＩＶ成分に対するＨＩＶ中和免疫応答を顕在化することができる場合、前記ペプチド／抱合体は、免疫調節のある、抗ウイルスの、または抗菌の追加の化合物がある場合もない場合も、免疫学的に有効な量だけ哺乳類に投与することができる。前記ペプチド／抱合体は、抱合体のＨＩＶペプチジル部分に対する哺乳類免疫応答を誘発すること、哺乳類のＨＩＶ中和抗体を誘発すること、ヒトに投与してＡＩＤＳを含むＨＩＶ感染または疾病に罹患するのを防止するための本明細書に説明されている前記共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチドを含む免疫原および／または免疫原性組成物を作ること、またはＡＩＤＳを含むＨＩＶ感染または疾病の患者に投与することに関して有用である。抱合された共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチドの１０μｇから５００μｇの範囲の用量、好ましくは抱合体の５０μｇから３００μｇの範囲の用量が、抗ＨＩＶまたはＨＩＶ中和免疫応答を誘発するために哺乳類に投与される。初期投与してから約２から４週間後、追加抗原投与量を投与し、次いで再び、血清抗体価が減少したら投与することができる。抱合体は、免疫学的有効性に必要な全量を構成するのに十分な量だけ、１０μｇ／ｍｌから１ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で、また好ましくは５０から５００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で筋肉内に与えるべきである。重要なのは、本明細書で説明されている共有結合的に安定化したホモ三量体ｇｐ４１模倣薬の骨格領域に対する抗体の生成を最小限に抑えやすくするために、プライム注射に使用される共有結合的に安定化した三量体構造がブースト注射に使用される共有結合的に安定化した三量体構造と異なる骨格領域を持つように（例えば、（ＣＣＩＺＮ１７）３を持つプライマーおよび（ＣＣＥＺＮ１７）３を持つブースト）プライム／ブースト投薬計画を設計することができる。アジュバントは、本発明の免疫原性組成物の調製時に付加してもしなくてもよい。例えば、明ばんは、特に揺変性、粘性を有し同種の水酸化アルミニウムゲルの形態の、ヒトワクチンの典型的な、また好ましいアジュバントである。本発明の一実施形態は、患者に、賦形剤としての明ばんアジュバントを、抗原として共有結合的に安定化したキメラペプチド、またはこの免疫抱合体を、予防接種することである。
【００８２】
最後に、本発明の共有結合的に安定化したキメラペプチドは、ｇｐ４１の融合性構造の内部Ｎヘリックスコイルドコイルの忠実な模倣薬となるため、前記キメラペプチドは、ＨＩＶ融合中間物質に結合する阻害剤（例えば、小分子、ｓｃＦｖｓ）の同定用の試薬として有用である。したがって、本発明は、さらに、ＨＩＶ抗ウイルス化合物をスクリーニングし、選択する方法に関するものである。例えば、本発明の内部Ｎヘリックスコイルドコイル（例えば、Ｄ５  ＩｇＧ）および共有結合的に安定化したキメラペプチド内の立体配座エピトープを認識する中和抗体を伴う抗体／ペプチド／試験化合物相互作用アッセイを考案することができる。このような相互作用アッセイは、中和抗体の結合相手のエピトープ（例えば、Ｄ５  ＩｇＧの場合、ＨＲ１の疎水性ポケット）と会合し、抗体を置き換える小分子をハイスループットスクリーニングで識別することを目的として使用されうる。このような小分子は、次いで、ｇｐ４１細胞外領域のＮおよびＣヘリックスの分子内相互作用をうまく防止できる場合にＨＩＶ融合阻害剤を表すことができる。試験すべき化合物は、ペプチド、タンパク質、非タンパク性有機または無機分子、ＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）またはＲＮＡ（ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡなど）とすることができる。
【００８３】
限定はしないが、ＥＬＩＳＡアッセイ、ＲＩＡアッセイ、ウエスタンブロット分析、分離または洗浄工程を必要としない検出可能な生体相互作用に依存する同質アッセイ（例えば、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）社のＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）を参照）、および／またはＳＰＲベース技術（例えば、ＢＩＡＣｏｒｅを参照）を含む、新しいＨＩＶ抗ウイルス化合物のスクリーニングにおける必須試薬として、本発明の共有結合的に安定化されたキメラペプチドを組み込み、これらに依存する、当業で知られているさまざまな抗体／ペプチドベースアッセイを使用することができる。この目的のために、本発明は、立体配座エピトープ（例えば、Ｄ５  ＩｇＧ）を認識する中和抗体が本明細書で説明されている共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチドに結合することに対し試験化合物が競合する能力を測定する、知られている採用された方法に関係なのない、そのようなアッセイに関するものである。スクリーニングについては、アッセイの一成分（成分１）は、限定はしないが、共有結合的に安定化したＣＣＩＺＮ１７、ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４、およびＣＣＥＺＮ１７三量体を含む、共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチドからなる。これらのＣＣキメラＮペプチドは、さらに、検出が可能になるように部分の共有結合的付加により修飾されることができ、そのような部分は、限定はしないがビオチンを含む他の一次アッセイ成分（成分２）は、限定はしないが、ｇｐ４１の疎水性ポケット内に配置されたエピトープを含む、立体配座エピトープに特異結合する中和抗体からなる。検出を容易にするために、抗体成分は、さらに、フルオレセイン、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ社のＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７−ＮＨＳ）、またはユウロピウムキレート（例えば、Ｗａｌｌａｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社のＥｕ−ＬＡＮＣＥ−ＮＨＳ）などの部分の共有結合的付加により修飾することもできる。
【００８４】
試験が存在する場合、または存在しない場合の抗体／共有結合的に安定化したキメラペプチド相互作用を検出するように設計されたスクリーニングアッセイは、いくつもの形態をとり、本明細書では、制限することなく、わかりやすくするため、そのうちごく少数の実施例をここで取り上げた。一方法は、ビオチン標識された成分１（ペプチド）がコーティング済みマイクロタイタープレートウェル内に固定され、競合物質が存在する、または存在しない場合にストレプトアビジン結合成分２（抗体）と反応させられ、結合されている抗体残留物（洗浄後）が、酵素標識された抗ヒトＩｇＧまたは酵素標識されたタンパク質Ａを使用して検出される、従来の酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）である。後述の第２のフォーマットでは、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）アッセイ技術（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を使用し、この場合、供与体ビーズは、ストレプトアビジンでコーティングされ、受容体ビーズは、タンパク質Ａでコーティングされる。このフォーマットでは、ビオチニル化成分１（ペプチド）は、競合物質が存在する場合または存在しない場合に成分２（抗体）と混合され、反応させられる。結合した後、成分１および成分２の複合体は、供与体および受容体のビーズを付加し、結合を待ち、融合検出器（Ｗａｌｌａｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で放射光をメーカー取扱説明書に従って測定することにより検出される。第３のフォーマット、さらに同種結合フォーマットは、同種時間分解蛍光（ＨＴＲＦ）技術に依存しうる。このフォーマットでは、ビオチニル化成分１（ペプチド）は、競合物質が存在する場合または存在しない場合に、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７と共有結合的に誘導体化された成分２（抗体）と混合される。結合した後、成分１および成分２の複合体は、ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓのユウロピウムキレートにより誘導体化される）を付加し、マイクロプレート蛍光光度計で蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）をメーカー取扱説明書に従って測定することにより検出される。それとは別に、ＨＴＲＦアッセイは、ユウロピウムキレートにより誘導体化された成分２およびＸＬ−６６５により誘導体化されたストレプトアビジンを使用して実行することも可能である。
【００８５】
本発明の共有結合的に安定化したキメラペプチドを組み込むことができるようにする他の利用可能なスクリーニング戦略では、ＢＩＡＣｏｒｅ  ３０００計測器などによる、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）ベースの生体分子相互作用分析を使用する。このような計装には、従来の免疫学的アッセイに勝るいくつかの利点がある。第１に、ＳＰＲ技術を使用すると、標識された試薬を使用する必要がなくなる。代わりに、アッセイ試薬は、ＢＩＡＣｏｒｅ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から入手できる、センサチップ（例えば、ストレプトアビジン（ＳＡ）またはカルボキシメチルデキストラン（ＣＭ５））上に固定化される。第２に、抗体／抗原／試験化合物複合体の形成は、リアルタイムで追随することができ、これにより、反応速度および親和性測定（Ｋｄ）に関する情報を取り出すことができる。この技術は、さらに、共有結合的に安定化したキメラペプチド上のエピトープ類似抗体結合部位と相互作用する試験化合物を選択するための小さな有機分子などの試験化合物の分析にも従う。ｇｐ４１融合中間物質の安定した、忠実な模倣薬を表す共有結合的に安定化した、ビオチニル化キメラペプチド（限定はしないが、ＣＣＩＺＮ１７、ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４、および／またはＣＣＥＺＮ１７三量体を含む）は、ＨＩＶ  ｇｐ４１細胞外領域のＮヘリックスを標的とする阻害剤のＢＩＡＣｏｒｅベースのスクリーンで使用することができる。前記ペプチドは、ＳＡチップ上で、１〜４分間、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）中の１ｎＭのペプチド溶液に１０×Ｔｗｅｅｎを加えたものを流すことにより固定化することができる。結合ペプチドが検体完全抗体の１００ＲＵを結合するのに十分な１０個の共鳴ユニット（ＲＵ）に達するまで手動注入が使用される。それとは別に、ＢＩＡＣｏｒｅアッセイは、上述のような中和抗体の固定化または好ましくはＣＭ５チップに基づくことができる。このようセンサチップは、まず、メーカーの取扱説明書に従ってＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド酸素酸塩）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）により表面活性化される。抗体の固定化は、標的固定化を１５００〜１８００ＲＵに設定し、組み込み固定化ウィザード制御テンプレートを使用して、ｐＨ４．８の酢酸塩緩衝液中１〜５μｇ／ｍｌ（ＢＩＡＣｏｒｅ供給緩衝液を混合する）で実行することができる。流量は、通常、会合解離フェーズでは２０μｌ／分であり、１５ｍＭ  ＨＣｌの１回洗浄による表面再生時には５０μｌ／分である。速度ウィザードは、親和性測定実験を設計するために使用することができ、複製および対照は拡散制限速度を検出することを求めるプロンプトが表示されたときに実行される。ペプチド濃度は、２倍または４倍希釈系列として、Ｋｄ値よりも上および下の濃度のデータを与えるように選択される。会合時間は、典型的には３分、解離時間は、５〜１０分であるが、会合解離測定は、ＨＢＳ＋１０×Ｔｗｅｅｎにおいて２５℃で実行され、非特異結合事象を取り除かなければならない。データの分析は、ＢＩＡＣｏｒｅ曲線当てはめソフトウェアにより実行され、ＲＵに著しい変化のある滑らかな領域からデータが選択される。��業者には、ＢＩＡＣｏｒｅ技術ではＨＩＶ融合阻害剤に対するスクリーンとの関連で、複数のアッセイフォーマットを使用できることは明白である。内部Ｎヘリックスコイルドコイル内の立体配座エピトープを認識するＣＣキメラＮペプチド、ＨＩＶ融合模倣薬、または中和抗体のいずれかの一方または他方が適切なセンサチップに固定化される直接結合アッセイを使用することができる。固定化されたペプチドを含むチップでは、試験化合物の前記共有結合的に安定化したキメラペプチドへの直接結合を測定するアッセイまたは試験化合物と注目しているエピトープを特異結合する中和抗体との間の結合競合を測定する表面競合アッセイが考えられる。それとは別に、限定はしないが、Ｄ５  ＩｇＧを含むプレヘアピンｇｐ４１複合体の内部Ｎヘリックスコイルドコイル内の注目するエピトープを特異結合する中和抗体をセンサチップ上に固定化し、試験化合物および共有結合的に安定化したキメラペプチドコイルドコイルとともに表面競合アッセイで使用することができる。
【００８６】
さまざまな抗体／ペプチド相互作用アッセイを使用することで、本発明の共有結合的に安定化したキメラペプチドを使用し抗ウイルス化合物を検出することができる。このアッセイは、単純な「ｙｅｓ／ｎｏ」アッセイであり、抗体／抗原複合体を形成する能力の変化があるかどうかを調べることができる。このアッセイは、方法、特にＥＬＩＳＡベースアッセイ、同種アッセイ、またはＳＰＲベースアッセイなどいくつでも使用して、容易に定量できる。この目的のために、本発明は、一部は、限定はしないが、前記コイルドコイル構造の疎水性ポケットを含む、ｇｐ４１の内部Ｎヘリックスコイルドコイル内のエピトープに結合する抗ウイルス化合物を識別する方法に関するものであり、前記エピトープを同様に認識する中和抗体を置き換えて、ｇｐ４１細胞外領域のＮおよびＣヘリックスの分子内相互作用を防ぐ。このような方法は、（ａ）（ｉ）本発明の共有結合的に安定化した三量体コイルドコイルおよび（ｉｉ）限定はしないが、前記コイルドコイルの疎水性ポケットを認識する中和抗体を含む、ｇｐ４１細胞外領域の内部Ｎヘリックスコイルドコイル内の立体配座エピトープを認識する、限定はしないが、中和抗体を含む、抗体とともに試験化合物をインキュベートすることと、（ｂ）試験化合物が成分（ｉｉ）について成分（ｉ）の親和性に及ぼす効果を測定することと、（ｃ）試験化合物が成分（ｉｉ）について成分（ｉ）の親和性に及ぼす効果を試験化合物が存在しない場合の成分（ｉｉ）についての成分（ｉ）の親和性に対して比較することとを含む。試験化合物が存在する場合の成分（ｉ）および成分（ｉｉ）の親和性の減少は、試験化合物が、ｇｐ４１のＮヘリックスコイルドコイル内の立体配座エピトープについて相互作用し定量的（つまり、測定可能な）親和性を有する化合物であることを示す。このような試験化合物は、潜在的抗ウイルス性リード化合物（例えば、ＨＩＶ融合阻害剤）と考えられる。
【００８７】
本発明のＣＣおよび誘導体化キメラＮペプチドは、さまざまな方法により生産することができる。例えば、化学合成することができる。長いペプチドは、自動ペプチドシンセサイザを使用して固相担体上で合成することができ、これについては、Ｋｅｎｔら、１９８５年、「Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ」、Ａｌｉｔａｌｏら、（Ｅｄｓ．），Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ、２９〜５７頁で説明されている。手動固相合成は、例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，１９６３年，Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８５：２１４９頁で説明されているように、またはこれの知られている改良法により実行することができる。固相ペプチド合成は、さらに、Ｆｍｏｃ法により実行することもでき、これは、Ｆｍｏｃ保護基を取り除くために非常に希薄な塩基を使用する。液相合成法は、通常、選択された小さなペプチドの場合しか使用できない。密接に関連するペプチドのカクテルを調製することについては、例えば、Ｈｏｕｇｈｔｏｎ、１９８５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１２４２〜１２４６頁を参照のこと。本発明のキメラペプチドは、連続ペプチドとして、または形成された後接合または結合される成分として生産することができる。
【００８８】
それとは別に、本発明のキメラペプチドは、知られている方法および発現系を使用し、キメラペプチド全体をコード化する単一ＤＮＡとすることができる、キメラペプチドコード化ＤＮＡを発現することにより、生産することができる。キメラペプチド遺伝子は、適当なプロモーターおよび他の適切な転写調節要素を含む発現ベクター（例えば、ｐｃＤＮＡ３．ｎｅｏ、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＲ２．１、ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２、またはｐＬＩＴＭＵＳ２８）内に分子クローニングすることによる組み換え技術で発現させ、原核生物または真核生物の宿主細胞内に移動して、キメラペプチドを生成することができる。発現ベクターは、ここでは、クローン化ＤＮＡの転写および適切な祝す内のｍＲＮＡの翻訳に必要なＤＮＡ配列として定義される。このようなベクターは、組み換えＤＮＡを細菌、酵母、藍藻、植物細胞、昆虫細胞、および哺乳類細胞などのさまざまな組み換え宿主細胞内に発現するために使用することができる。適切に構成された発現ベクターは、宿主細胞内の自己複製の複製起点、選択可能なマーカー、限られた数の有用な制限酵素部位、および活性プロモーター遺伝子を含むべきである。発現ベクターは、限定はしないが、クローニングベクター、修飾クローニングベクター、特別に設計されたプラスミドまたはウイルスを含むことができる。市販の哺乳類発現ベクターは、組み換えキメラペプチド発現に適している。また、さまざまな市販の細菌、真菌細胞、および昆虫細胞発現ベクターを使用して、それぞれの細胞型内に組み換えミモトープを発現させることができる。プロモーター遺伝子は、ＤＮＡに結合し、ＲＮＡ合成を開始するようＲＮＡポリメラーゼに指令するＤＮＡ配列として定義される。強いプロモーター遺伝子は、ｍＲＮＡを高頻度で開始させるプロモーター遺伝子である。このような操作技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されており、当業者にはよく知られており、利用可能である。キメラペプチドの適切な遺伝子コード化を含む発現ベクターを、限定はしないが、形質転換、トランスフェクション、原形質融合、およびエレクトロポレーションを含む、多数の技術のうちのどれか１つを介して宿主細胞内に導入することができる。発現ベクター含有細胞を個々に分析して、注目するキメラペプチドを生産するかどうかを調べる。キメラペプチド発現細胞の同定は、限定はしないが、抗ＨＩＶペプチド抗体との免疫学的反応性を含む、複数の手段により実行できる。組み換えキメラペプチドは、アデニル化、カルボキシル化、グリコシル化、水酸化、メチル化、リン酸化、またはミリストイル化などの、同じ有機合成ペプチドと共有されない追加の望ましい構造上の修飾を有する。これらの付加特徴は、組み換え発現系の適切な選択により、選択するか、場合によってはそうすることが好ましい。
【００８９】
宿主細胞内のキメラペプチド遺伝子の発現の後に、キメラペプチドを回収できる。複数のタンパク質精製手順が利用可能であり、塩分画、イオン交換クロマトグラフィ、サイズ排除クロマトグラフィ、水酸燐灰石吸着クロマトグラフィ、および疎水性相互作用クロマトグラフィのさまざまな組合せ、または個別の適用による、細胞溶解物および抽出物から、または調製済み培地からの精製を含む使用に適している。さらに、キメラペプチドは、キメラペプチドに特異的なモノクローナルまたはポリクローナル抗体で作られた免疫親和性カラムを使用して他の細胞タンパク質から分離することができる。本明細書で使用されているように、「精製」および「分離」は、入れ換えて使用され、注目する核酸、タンパク質、またはそれぞれの断片が、生体内環境から実質的に取り除かれており、限定はしないが、ヌクレオチド配列決定法、制限消化、部位特異的変異誘発、および核酸断片の発現ベクター内へのサブクローニング、さらに純粋な量のタンパク質またはタンパク質断片を取得することなどで、当業者により操作可能であるという主張を表す。
【００９０】
本明細書で述べられているすべての刊行物は、本発明に関連して使用されうる方法および材料を説明し開示することを目的として含まれている。本明細書の内容は、本発明が従来の発明によりそのような開示に先行する権利を与えられてないことを許可するものとして解釈すべきではない。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態は付属の図面を参照しつつ説明されているが、当業者であれば、本発明はこれらの正確な実施形態に限定されず、付属の請求項で定められている本発明の範囲または精神から逸脱することなくさまざまな変更および修正を実施できることを理解すべきである。
【００９２】
以下の実施例は、限定することなく、本発明を例示するために掲載されている。
【実施例１】
【００９３】
ペプチド合成および共有結合的安定化
ＩＺＮ１７およびＣＣＩＺＮ１７−ペプチドＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は、Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上のＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学作用を使用して固相により合成された。使用した樹脂は、１％架橋したＦｍｏｃ−Ｌｉｎｋｅｒ  ＡＭ−Ｃｈａｍｐｉｏｎ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、修飾されたＲｉｎｋリンカーｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α−［９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸により誘導体化されたＰＥＧ−ＰＳベース樹脂であった（Ｒｉｎｋ，Ｈ．、１９８７年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８：３７８７〜３７８９頁、Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．ら、１９８９年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３０：４６４５〜４６６７頁）。樹脂遊離アミノ酸基上で４倍過剰量の活性化アミノ酸を使用して、６０〜１２０分間、すべてのアシル化反応を実行した。アミノ酸は、等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）により活性化された。側鎖保護基は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）に対するｔｅｒｔ−ブチル、システイン（Ｃｙｓ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）に対するトリチル、リシン（Ｌｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）に対するｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アルギニン（Ａｒｇ）に対する２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルであった。アセチル化反応は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。合成が終わったら、乾燥ペプチド樹脂を８８％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％のフェノール、および２％のトリイソプロピルシラン、および５％の水（Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．およびＧ．Ｂａｒａｎｙ、１９９２年、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：５３９９〜５４０３頁）により、室温で１．５時間かけて処理した。樹脂を濾過し、溶液を冷たいメチル−ｔ−ブチルエーテルに加え、ペプチドを沈殿させた。遠心分離機にかけた後、ペプチドペレットを新鮮な冷たいメチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄し、不要な有機物を取り除いた。このプロセスを２回繰り返した。最終のペレットを乾燥させ、Ｈ２Ｏ、２０％アセトニトリル中に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
【００９４】
ペプチド原料ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、また溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際に溶離液Ｂの勾配は４０％〜６０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。
【００９５】
ペプチド原料ＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）は、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡを使用して、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂を充填した７００×２６ｍｍカラム上で精製された。典型的実験では、ペプチド原料３００ｍｇを溶離液１２ｍＬ中に溶解し、流量１ｍＬ／分でカラムに直接充填した。溶出留分の分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を備えるＢｅｃｋｍａｎ  ＨＰＬＣ上で実行したが、その際に溶離液Ｂ（上記）の勾配は４０％〜６０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。純度に基づいて、留分をプールし、さらに、逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、また溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、５１７５Ｄａであるが、見つかったＭＷは、５１７５Ｄａである。
【００９６】
ＣＣＩＺＮ１７の（ＣＣＩＺＮ１７）３への酸化−精製されたペプチド前駆体（１２ｍｇ）、ＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を濃度１ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。この条件の下で、ＣＣＩＺＮ１７を空気によりゆっくり酸化し、共有結合三量体（ＣＣＩＺＮ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］３）にした。図２Ａを参照。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。これらのクロマトグラフィ条件の下で、ＣＣＩＺＮ１７は、ｔＲ＝１３．２５’で溶出する。酸化反応は、３時間、円滑に進行し、質量減少が３つのジスルフィド架橋（［ＣＣＩＺＮ１７）３、図２Ａを参照）の形成と一致する３つのＣＣＩＺＮ１７ペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応する質量を持つｔＲ＝１５’で溶離する１つの主要生成物を形成する。酸化反応の全収量は、８０％を超える。溶液（１２ｍＬ）に、ＴＦＡ  ２４μＬを加え、ＴＳＫｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムに溶液を直接充填したが、その際に、溶離液としてＨ２Ｏ／アセトニトリル７０／３０、０．１％  ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用した。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、ＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で４０％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。共有結合三量体に対応するプールされた留分は、さらに、正モード（ＥＳ＋）ナノスプレー１μｌ注入で、ＥＳＩ−ＱｑＴｏＦ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）の質量分析法により分析された。予想ＭＷは、１５５２０．２Ｄａであるが、見つかったＭＷは、１５５２０．１Ｄａである。
【００９７】
ビオチン−ＩＺＮ１７の合成−ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）は、ＩＺＮ１７およびＣＣＩＺＮ１７の合成について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。ビオチンとの反応は、一晩、等モル量のＤＩＰＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）により活性化された４倍過剰量のビオチンと反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料、ビオチン−ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）を準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５５％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際に溶離液Ｂの勾配は４５％〜６０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、５２８１．５２Ｄａであるが、見つかったＭＷは、５２８１．０Ｄａである。
【００９８】
ビオチン−ＩＺＮ２３およびビオチン−ＣＣＩＺＮ２３の合成−ビオチン−ＩＺＮ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびビオチン−ＣＣＩＺＮ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）の合成について概要を述べたのと同じプロトコルに従って合成されたが（上記参照）、ただし、異なるのは、最後の２０個のアミノ酸は、等モル量のＨＡＴＵ（Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ−［４，５−ｂ］ピリジニルメチレン）］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド）および２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）により活性化された点である。側鎖保護基は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）に対するｔｅｒｔ−ブチル、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、システイン（Ｃｙｓ）、およびグルタミン（Ｇｌｎ）に対するトリチル、リシン（Ｌｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）に対するｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アルギニン（Ａｒｇ）に対する２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルであった。
【００９９】
ビオチンとの反応は、一晩、等モル量のＤＩＰＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＡｔ（７−アザ−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）により活性化された４倍過剰量のビオチンと反応させることによりペプチドアセンブリプロセスの終わりに実行された。ペプチド原料ビオチン−ＩＺＮ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）（１６ｍＬのＨ２Ｏ／アセトニトリル、７０／３０、０．１％  ＴＦＡに２７０ｍｇ溶解）は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍｌ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣ（３０％収量）により得られたプールされた留分（純度８０％）は、さらに、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（２５０×２１．２ｍｍ、１０μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を２５ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、準分取逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２０分間であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォームＥＳ＋上で質量分析法により特徴付けられた。見つかったＭＷは、５９８９．０Ｄａであるが、計算で求められた平均ＭＷは、５９８９．２２Ｄａである。
【０１００】
原料ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）ペプチドは、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣ（２５％収量）により得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（２５０×２１．２ｍｍ、１０μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を２５ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、準分取逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォームＥＳ＋上で質量分析法により特徴付けられた。見つかったＭＷは、６２５２．０Ｄａであるが、計算で求められた平均ＭＷは、６２５２．５Ｄａである。
【０１０１】
ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３の（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３への酸化−精製されたペプチド前駆体（７ｍｇ）、ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を濃度１ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。この条件の下で、ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３を一晩空気によりゆっくり酸化し、共有結合三量体（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２］３）にした。図２Ｂを参照。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によりモニターしたが、溶液Ｂの勾配は（上記）、３０％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。これらのクロマトグラフィ条件の下で、ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３は、ｔＲ＝１３．７４’で溶出する。酸化反応収量は、約７０％であり、質量減少が３つのジスルフィド架橋（予想ＭＷは１８７５１．６４Ｄａ、見つかったＭＷは１８７５１．０Ｄａ）の形成と一致する３つのビオチン−ＣＣＩＺＮ２３ペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応する質量を持つｔＲ＝１１’で溶離する１つの主要生成物を形成した。溶液（７ｍＬ）に、ＴＦＡ  １４μＬを加え、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（２５０×２１．６ｍｍ）に溶液を直接充填したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液、流量２５ｍＬ／分を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、３０％〜３０％（５分間）−５０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）であった。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を使用するＨＰＬＣにより分析されたが、その際にＢの勾配は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で３０％〜６０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。共有結合三量体に対応するプールされている留分を回収し、凍結乾燥させて、全収量を精製（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３２ｍｇとした（図２Ｂを参照）。
【０１０２】
ビオチン−ＩＺＮ３６の合成−ビオチン−ＩＺＮ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）は、ＩＺＮ１７およびＣＣＩＺＮ１７の合成について概要を述べたのと同じプロトコルに従って合成されたが（上記参照）、ただし、異なるのは、アミノ酸が、等モル量のＨＡＴＵ（Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ−［４，５−ｂ］ピリジニルメチレン）］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド）および２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）により活性化された点である。側鎖保護基は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、セリン（Ｓｅｒ）、およびトレオニン（Ｔｈｒ）に対するｔｅｒｔ−ブチル、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、システイン（Ｃｙｓ）、およびグルタミン（Ｇｌｎ）に対するトリチル、リシン（Ｌｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）に対するｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アルギニン（Ａｒｇ）に対する２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルであった。
【０１０３】
ビオチンとの反応は、一晩、等モル量のＤＩＰＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）により活性化された４倍過剰量のビオチンと反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料ビオチン−ＩＺＮ３６を準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際に溶離液Ｂの勾配は４０％〜６０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  ＡＰＩ−１００上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、７６５３．１８Ｄａであるが、見つかったＭＷは、７６５３．４Ｄａである。
【０１０４】
ＩＺＮ１７Ａｌａ４の合成−ＩＺＮ１７Ａｌａ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料ＩＺＮ１７Ａｌａ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）を、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際に溶離液Ｂの勾配は４５％〜６５％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、４６１３．７Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４６１３．０Ｄａである。
【０１０５】
ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４の合成−ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。原料ペプチド、ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣ（２５％収量）により得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、流量を８０ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜５５％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、５０％〜６０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォームＥＳ＋上で質量分析法により特徴付けられた。見つかったＭＷは、４９３４．０Ｄａであるが、計算で求められた平均ＭＷは、４９３３．０Ｄａである。
【０１０６】
ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４の（ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４）３への酸化−精製されたペプチド前駆体（２６ｍｇ）、ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）を濃度５ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。この条件の下で、ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４を空気によりゆっくり酸化し、共有結合三量体（ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５］３）にした。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜７０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。これらのクロマトグラフィ条件の下で、ＣＣＩＺＮ１７は、ｔＲ＝１２．５２’で溶出する。酸化反応は、３時間、円滑に進行し、質量減少が３つのジスルフィド架橋（［ＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４）３）の形成と一致する３つのＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４ペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応する質量を持つｔＲ＝１７’で溶離する１つの主要生成物を形成する。酸化反応の全収量は、８０％を超える。溶液に、ＴＦＡ  ４５μＬを加え、ＴＳＫｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムに溶液を直接充填したが、その際に、溶離液としてＨ２Ｏ／アセトニトリル７０／３０、０．１％  ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用した。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で５０％〜７０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。予想ＭＷは、１４７９６．２．２Ｄａであるが、見つかったＭＷは、１４７９７．１Ｄａである。
【実施例２】
【０１０７】
（ＳＣＣＩＺＮ１７）３による親和性精製樹脂の調製
ＳＣＣＩＺＮ１７の合成−ＳＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）は、ＩＺＮ１７およびＣＣＩＺＮ１７の合成について概要が述べられているのと同じプロトコルに従って合成されたが（実施例１を参照）、ただし、Ｎ−末端セリン（Ｓｅｒ）はＮＨ２末端遊離アミンに残された。ペプチド原料（２５０ｍｇを１５ｍＬ  Ｈ２Ｏ／アセトニトリル、７０／３０、０．１％  ＴＦＡに溶解した）は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍｌ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。溶出留分の分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を備えるＢｅｃｋｍａｎ  ＨＰＬＣ上で実行したが、その際に溶離液Ｂ（上記）の勾配は３５％〜５０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。純度に基づいて、留分をプールし、さらに、逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜４５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた（見つかったＭＷ：５２２８．０Ｄａ）。
【０１０８】
ＳＣＣＩＺＮ１７の（ＳＣＣＩＺＮ１７）３への酸化−精製されたペプチド前駆体（１１ｍｇ）、ＳＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）を濃度１ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によりモニターしたが、溶液Ｂの勾配は（上記）、３５％〜５５％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析における保持時間がｔＲ＝１５．３５’であるＳＣＣＩＺＮ１７は、一晩かけて空気によりゆっくり酸化されたが、その際に、結合されて１つにされ、質量減少が３つのジスルフィド架橋（［ＳＣＣＩＺＮ１７）３、図３Ａを参照）の形成と一致する３つのＳＣＣＩＺＮ１７ペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応する質量を持つ１つの主要生成物（ｔＲ＝１４．５’で溶離する）を形成した。酸化反応収量は約７０％であった。溶液（１１ｍＬ）に、ＴＦＡ  ２４μＬを加え、ＴＳＫｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムに溶液を直接充填したが、その際に、溶離液としてＨ２Ｏ／アセトニトリル７０／３０、０．１％  ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用した。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、ＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で３５％〜５５％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。共有結合三量体に対応するプール留分は、プールされ、凍結乾燥され、さらに、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上で質量分析法により分析された。予想ＭＷは、１５９９４．５Ｄａであり、見つかったＭＷは、１５９９５．０Ｄａである。
【０１０９】
結果−アフィニティカラムをワクチン検証プロセスの一部として使用することができる。例えば、可能なワクチン抗原を使用して、前記推定抗原への抗体の存在について抗血清が試験される実験動物（例えば、マウス）に免疫を与えることができる。アフィニティカラムは、前記抗体が存在するかどうかを試験するために使用することができるが、推定抗原はカラムの樹脂に抱合され、これにより、カラム内を流れる抗血清から抗原に対する親和性を有する抗体を捕捉し、抽出する。ＨＩＶ免疫原としての本発明のＣＣキメラＮペプチドの使用をさらに検証するために類似の実験を計画することができる。この目的のために、新しいペプチドを設計し、「ＳＣＣＩＺＮ１７」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）と指定したが、これは、共有結合三量体（ＳＣＣＩＺＮ１７）３（図３Ａ）を生産するために３つのジスルフィド結合を選択的に形成することができた。このペプチドは、親和性樹脂への抱合に適した部分を含む。特に、ＳＳＣＣＩＺＮ１７の設計では、過ヨウ素酸塩により容易に、選択的にアルデヒド機能に酸化でき、ヒドラジド部分との抱合反応において選択的に使用できるペプチド鎖のＮＨ２末端でセリン（Ｓｅｒ）残基を使用する。この戦略は、何年も前から知られており（ＦｉｅｌｄｓおよびＤｉｘｏｎ、１９６８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１０８：８８３〜８８７頁）、ヒドラゾン、チアゾリジン、またはオキシム（−ＯＮ＝ＣＨ−ＣＯ−）結合の形成を通じてバイオコンジュゲートの合成に利用されてきた（ＧｅｏｇｈｅｇａｎおよびＳｔｒｏｈ、１９９２年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．３：１３８〜１４６頁、Ｒｏｓｅら、１９９６年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．７：５５２〜５５６頁）。上記の戦略は、複数のシステイン残基を示すペプチドとともに使用するために活用されてきた（Ｋｉｎｚｅｌら、２００３年、Ｊ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉ．９：３７５〜３８５頁）。ＳＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）の設計において、ＮＨ２末端、アミン遊離セリン（Ｓｅｒ）残基＋２つのグリシン（Ｇｌｙ）残基はスペーサーとして作用するが、これらをＣＣＩＺＮ１７のＮＨ２末端に付加した。結果として得られるＳＣＣＩＺＮ１７ペプチドは、最初に、ＣＣＩＺＮ１７について説明されているように酸化され、精製されて（ＳＣＣＩＺＮ１７）３が得られる（図３Ａを参照）。次いで、共有結合的に安定化した三量体（ＳＣＣＩＺＮ１７）３は、過ヨウ素酸ナトリウムにより酸化され、（Ｏ＝ＣＨ−ＣＯ−ＧＧＣＣＩＺＮ１７）３が得られたが、これはセファロースヒドラジド樹脂に抱合される（Ｏ＝ＣＨ−ＣＯ−ＧＧＣＣＩＺＮ１７への酸化）。
【０１１０】
共有結合的に安定化した（ＳＣＣＩＺＮ１７）３コイルドコイルを使用してアフィニティカラムを準備した。共有結合的に安定化したコイルドコイルは、２６ｍｇ／ｍＬの濃度の５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）０．１１５ｍＬ中に溶解された。溶解されたコイルドコイル（０．０９０ｍＬ）は、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）に溶解されているメタ過ヨウ素酸ナトリウム０．０１０ｍＬ（１８．８４ｍｇ／ｍＬ；Ｐｉｅｒｃｅ  ＃２０５０４）と混合された。混合物を暗所で、室温として、６分間インキュベートし、そのときに、反応混合物９５μｌをＷａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ３００  Ｃ１８逆相カラム上に注入し、０．１％  ＴＦＡ中５％〜８０％アセトニトリルの勾配を使用して精製した。溶媒を取り除いて、酸化されたペプチドを、１．５ｍｇ／ｍＬの濃度の０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）中に再溶解した。Ｐｉｅｒｃｅ  Ｕｌｔｒａｌｉｎｋヒドラジド樹脂（０．５ｍＬ、Ｐｉｅｒｃｅ  ＃５３１４９）を使い捨てカラム内に置き、０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３）１０ｍＬで洗浄した。過剰な緩衝液を樹脂から取り除き、ペプチド１．１ｍＬとＨｅｐｅｓ緩衝液２ｍＬを樹脂に加えて、軽く、ｅｎｄ  ｏｖｅｒ  ｅｎｄ式で、一晩、室温により混合した。翌朝、樹脂から上清を取り除いて、逆相ＨＰＬＣによりペプチド含有量について分析した。結合効率は、９８％と決定された。０．０２％のアジ化ナトリウムを含有するリン酸緩衝生理食塩水で洗浄し、２〜８℃で保管した。
【実施例３】
【０１１１】
共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチドの抗ウイルス活性
単一サイクルＨＩＶ感染アッセイ−ＨＩＶ株ＨＸＢ２、ＢａＬ、８９．６、ＭＮ−１、およびＮＬ４−３をＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から購入した。ＳＨＩＶ−８９．６Ｐ（Ｒｅｉｍａｎｎら、１９９６年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：６９２２〜６９２８頁）を、Ｎ．Ｌｅｔｖｉｎ（Ｂｅｔｈ  Ｉｓｒａｅｌ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、マサチューセッツ州ボストン）から入手し、アッセイで使用する前に末梢血リンパ球で３回継代した。ＶＳＶ−Ｇタンパク質で偽型化されたＨＩＶは、２９３Ｔ細胞にプロウイルスＤＮＡ構造Ｒ８Δｅｎｖ（Ｔｒｏｎｏら、１９８９年、Ｃｅｌｌ  ５９：１１３〜１２０頁、Ｇａｌｌａｙら、１９９５年、Ｃｅｌｌ  ８３：５６９〜５７６頁）およびｐＣＭＶ−ＶＳＶ−Ｇ（Ｗｕら、１９９９年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２１２６〜２１３５頁、Ｊ．Ｋａｐｐｅｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍの贈与）をトランスフェクトすることにより生成された。Ｐ４−２／Ｒ５細胞（Ｃｈａｒｎｅａｕら、１９９２年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６６：２８１４〜２８２０、Ｄｅｎｇら、１９９６年、Ｎａｔｕｒｅ  ３８１：６６１〜６６６頁、Ｎ．Ｌａｎｄａｕ，Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの贈与）は、ヒトＣＤ４およびＣＣＲ５を安定して発現し、ＨＩＶ−２  ＬＴＲのｔａｔ−応答性断片により駆動されるβ−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子を保有するヒーラ細胞である。Ｐ４−２／Ｒ５細胞は、３７℃、フェノールレッドなしのダルベッコ変法イーグル培地中５％  ＣＯ２、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で維持された。感染アッセイでは、細胞を２．５×１０３細胞／ウェルで９６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）内に種まきし、ペプチドの存在下、〜０．０１の感染多重度でＨＩＶ−１のさまざまな株に次の日に感染させた。３７℃／５％  ＣＯ２でさらに４８時間インキュベートした後、細胞を溶解し、メーカー取扱説明書に従ってＧａｌＳｃｒｅｅｎ化学発光基材（Ｔｒｏｐｉｘ、マサチューセッツ州ベッドフォード）を使用してβガラクトシダーゼ活性を定量した。
【０１１２】
Ｄ５  ＩｇＧの説明−Ｄ５  ＩｇＧ  ＨＩＶ中和抗体は、同時係属出願で詳しく説明されている。簡単にいうと、ＨＩＶ−１  ｇｐ４１細胞外領域を標的とする抗体を識別するために、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＣＡＴ）のファージ提示法を２つの特異選択ペプチド、５ヘリックス（Ｒｏｏｔ，Ｍ．Ｊ．ら、２００１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：８８４〜８８８頁）およびＩＺＮ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、Ｅｃｋｅｒｔ，Ｄ．Ｍ．およびＰ．Ｓ．Ｋｉｍ、２００１年、上記）とともに使用したが、両方ともｇｐ４１ヘアピン三量体立体配座内の隣接するＮヘリックスコイルドコイル領域により形成される溝構造を示す。５ヘリックスは、それぞれ、小さなペプチド性リンカーにより合併された、ＮヘリックスおよびＣヘリックス領域に由来する一連の３つの交互に並ぶＮ３６  Ｎペプチドおよび２つのＣ３４  Ｃペプチドからなる。この人工ペプチドは、１つのＣペプチドがないため、５ヘリックス束内に畳み込まれ、それにより、３つの潜在的溝の１つを露出する。ＩＺＮ３６（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）は、ロイシンジッパー（「ＩＺ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）プラスと骨格のＣＯＯＨ末端のところの追加のＧｌｕ−Ｉｌｅ配列からなるＩＺ骨格モチーフ）およびＮ３６  Ｎペプチドを形成するアミノ酸のセグメントかえらなるキメラペプチドである。５ヘリックスおよびＩＺＮ３６は両方とも、ＨＩＶ感染の強力阻害剤を表す。ビオチニル化された５ヘリックスおよびＩＺＮ３６ペプチドを使用して、ヒトＩｇＧの重鎖および軽鎖（ｓｃＦｖｓ）の選択された領域をコード化するバクテリオファージのライブラリをスクリーニングした。中和能力について両方のペプチドを結合したｓｃＦｖｓを試験し、ｓｃＦｖｓ関連抗ウイルス活性を単一サイクルＨＩＶ感染アッセイにおいて確認した。Ｄ５−ｓｃＦｖｓは、ＨＩＶ侵入の本物の阻害剤として出現した。ｓｃＦＶから完全長ＩｇＧ内への可変重（ＶＨ）および可変軽（ＶＬ）領域の転移は、抗ウイルス活性を保存した。
【０１１３】
Ｄ５抗体の結合部位は、Ｎヘリックス領域のＣＯＯＨ末端半分により形成される疎水性ポケット領域に局在した。特に、アミノ酸ロイシン−５６８（Ｌ５６８）、トリプトファン−５７１（Ｗ５７１）、およびリシン−５７４（Ｋ５７４）は、抗体結合にとって重要であるように見え、またバリン−５７０（Ｖ５７０）もそれほどでないにせよ関与しているように見える（図８を参照）。Ｎヘリックス領域の疎水性ポケットと相互作用することにより、Ｄ５  ＩｇＧは、ＮおよびＣペプチドの生体外相互作用を防止する機能性を有する。したがって、Ｄ５抗体は、ｇｐ４１融合中間物質を標的とすることにより抗ウイルス活性を示す抗体の第１の実施例である。
【０１１４】
結果−ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）および（ＣＣＩＺＮ１７）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を平行して試験し、一次および実験用分離株およびＶＳＶ−Ｇ−ＨＩＶ（水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質で偽型化されたＨＩＶ）を陰性対照として使用して、単一サイクル感染アッセイにおいてＨＩＶを阻害する個々の能力を比較した。同じアッセイにおいて、５ヘリックス（Ｒｏｏｔら、２００１年、上記、２９１：８８４〜８８８頁）、Ｔ−２０（Ｆｕｚｅｏｎ（商標）、Ｋｉｌｂｙら、１９９９年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．４：１３０２〜１３０７頁）、ｍＡｂ２Ｆ５（Ｍｕｓｔｅｒら、１９９３年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６７：６６４２〜６６４７頁）、およびＩｇＧＤ５（上記）のような他の融合阻害剤を比較のため試験した（表３）。特に、Ｔ−２０は、ヒトにおいて最近認可された融合阻害剤である。
【０１１５】
【表３】
2008501028.tif 000005
【０１１６】
表３に報告されているデータから、共有結合的に安定化した（ＣＣＩＺＮ１７）３三量体がＨＸＢ２およびＢａＬ株を持つＩＺＮ１７と比べて少なくとも一桁高い効力を示すことがわかる。この共有結合的に安定化した三量体は、さらに、ＩＺＮ１７への完全耐性である８９．６などの一次ＨＩＶ分離株に対し低いナノモル効力も示す。全体として、（ＣＣＩＺＮ１７）３は、表３に示されているように、ピコモルまたは低ナノモルの範囲でさまざまなＨＩＶ株に対し抗ウイルス活性を示し、他の融合阻害剤よりも高い効力を有する。したがって、（ＣＣＩＺＮ１７）３は、これまでに説明された最も強いＨＩＶ融合阻害剤である。
【０１１７】
単一サイクル感染アッセイにおいてＨＩＶを阻害する能力を比較するためにビオチン−ＩＺＮ２３および（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３も平行して試験した（ＨＩＶ  ＨＸＢ２株）。ビオチン−ＩＺＮ２３は、２．１７３のＩＣ５０（ｎＭ）を示したが、（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３は、０．３１６のＩＣ５０（ｎＭ）を示した。したがって、共有結合的に安定化した三量体構造は、単量体構造に関して高い阻害能力を示す。
【実施例４】
【０１１８】
ＣＣキメラＮペプチドのＤ５  ＩｇＧへの結合
ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）結合アッセイ−同種ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）検出キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｃａｔ．＃６７６０６１２）を使用した。ビオチニル化ペプチドは、ストレプトアビジンに抱合された供与体ビーズにカップリングされ、ＩｇＧＤ５は、受容体ビーズにカップリングされたタンパク質Ａにより捕捉される。コーティングされたビーズ複合体を混ぜ合わせ、暗所の９６ウェルプレート内で一晩室温でインキュベートした。次いで、プレートを、供与体ビーズを６８０ｎｍで励起するＦｕｓｉｏｎ  α−ＦＰ  ＨＴ計測器上で分析した。一重項酸素は、供与体ビーズにより放出される。受容体ビーズは、ペプチド／抗体相互作用により近接している場合、一重項酸素は、５２０〜６２０ｎｍの光を放射する受容体ビーズにより捕捉される。計測器は、これらの放射を記録する。
【０１１９】
結果−ＨＩＶに対し本発明のＣＣキメラＮペプチドの抗ウイルス活性を定量することに加えて（実施例３を参照）、前記ペプチドを分析し、ｇｐ４１細胞外領域Ｄ５  ＩｇＧの内部Ｎヘリックスコイルドコイル内に配置された疎水性ポケットを結合する中和抗体とビオチニル化された５ヘリックス（図１３）またはビオチニル化されたＩＺＮ１７（図６）との相互作用に競合する能力を調べた。この試験では、共有結合的に安定化したホモ三量体またはヘテロ三量体ＣＣキメラＮペプチドが、ｇｐ４１の内部Ｎヘリックスコイルドコイルの構造を保存することができるかどうかを決定する。共有結合的に安定化したＣＣＩＺＮ１７コイルドコイルは、親ＩＺＮ１７ペプチドに比べてＨＩＶーＨＸＢ２に対する効力が約１０倍以上高いが（実施例３を参照）、（ＣＣＩＺＮ１７）３は、さらに、Ｄ５  ＩｇＧの５ヘリックスへの結合を、親ペプチドよりも効果的に防止し、０．８６ｎＭのＩＣ５０値が得られ、ＩＺＮ１７に比べて約４倍高い効力を持つ（図１３）。ＥＺＮ１７もＣＣＥＺＮ１７も、著しい抗ウイルス活性を持つように見えないが（図１２Ａおよび１３を参照）、それでも両方のペプチドは、ビオ−５−ヘリックス／Ｄ５  ＩｇＧ（図１３）およびビオ−ＩＺＮ１７／Ｄ５  ＩｇＧ（図６）の相互作用アッセイ（実施例６も参照）においてＤ５  ＩｇＧと相互作用し、疎水性ポケットがこれらのペプチド内で保存される可能性が高いことを示唆している。抗ウイルス活性の欠如は、融合を受けているウイルスのエンベロープ上のｇｐ４１の固有のプレヘアピン構造にペプチドが接近することを妨げうるＥＺ骨格が帯びる大域的なマイナス電荷に起因すると考えられる。短縮された「Ｉ１０」骨格（ＣＣＩ１０Ｎ１７およびＩ１０Ｎ１７ＣＣ）（実施例５を参照）とともに設計された両方のペプチドは、親ＩＺＮ１７およびＣＣＩＺＮ１７ペプチド（図１３）と比較したときに抗ウイルス効力が弱いが、ＩＺＮ１７およびＣＣＩＺＮ１７（図１３を参照）に匹敵するかまたは優れた効力でＤ５  ＩｇＧの結合を妨げるように見える。これは、これらのペプチドの疎水性ポケットが完全に保存されることを示している。ＣＯＯＨ末端共有結合架橋（Ｉ１０Ｎ１７ＣＣ）は、架橋（ＣＣＩ１０Ｎ１７）のＮＨ２末端位置と比べたときに、抗ウイルス効力およびＤ５結合を低くするように見える。免疫優勢であるが非ＨＩＶ中和のエピトープ（実施例８を参照）を含む４つのＣＯＯＨ末端残基がアラニン残基で置換されたペプチドＩＺＮ１７Ａｌａ４およびＣＣＩＺＮ１７Ａｌａ４（実施例１を参照）は、抗ウイルス活性を保持するように見えるが（図１２Ａおよび１３を参照）、これらのペプチドは、明らかにＩＺＮ１７により効力が低い。両方のペプチドは、Ｄ５  ＩｇＧを結合するが、正確なＩＣ５０は、決定できなかった（図１３）。
【実施例５】
【０１２０】
ＩＺ骨格のトリミングの分岐
ＣＣＩ１０Ｎ１７の合成−ＣＣＩ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）は、ＩＺＮ１７およびＣＣＩＺＮ１７の合成について概要が述べられているのと同じプロトコルに従って合成された（実施例１を参照）。原料ＣＣＩ１０Ｎ１７ペプチドを準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用する逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際に溶離液Ｂの勾配は４０％〜６０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた（見つかったＭＷ：３５３６．０Ｄａ）。
【０１２１】
ＣＣＩ１０Ｎ１７の（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３への酸化−精製されたペプチド前駆体（１０ｍｇ）、ＣＣＩ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を濃度１ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、５０％〜８０％Ｂ（２０分）、流量１ｍＬ／分であった。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析における保持時間が６．７’であるＣＣＩ１０Ｎ１７を、５時間かけて空気によりゆっくり酸化させたところ、２つの主要な生成物が形成され、（１）ｔＲ＝１５．６（収量４０％）で溶出する一方の生成物は、推定共有結合三量体（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）を表し、その質量は、連結された３つのＣＣＩ１０Ｎ１７ペプチド鎖（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３の１つの分子の質量に対応し（図２Ｃ参照）、質量減少は３つのジスルフィド架橋の形成と一致し（予想ＭＷは１０６０３．２３Ｄａであり、見つかったＭＷは１０６０３．０Ｄａである）、（２）ｔＲ＝１８．３９（収量４０％）で溶出する他方の生成物は、連結された４つのＣＣＩ１０Ｎ１７ペプチド鎖の１分子の質量である質量を持つ分子に対応し、質量の減少は４つのジスルフィド架橋の形成と一致する（１４１３７．０Ｄａ）。５時間後、ＴＦＡ  ２０μＬを溶液（１０ｍＬ）に加え、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（２５０×２１．６ｍｍ）に溶液を直接充填したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液、流量１ｍＬ／分を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、５０％〜５８％Ｂ（３０分）であった。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）を使用するＨＰＬＣにより分析されたが、その際にＢの勾配は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で５０％〜８０％  Ｂ（３０分）、流量１ｍＬ／分であった。共有結合三量体に対応するプールされた留分（予想ＭＷは１０６０３．２３Ｄａであり、見つかったＭＷは１０６０３．０Ｄａである）が回収され、凍結乾燥された。
【０１２２】
ＩＺＮ１７Ｇ５７２Ｄの合成−ＩＺＮ１７Ｇ５７２Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤＮＯ：１）を合成するために使用したのと同じプロトコルに従って合成された（実施例１を参照）。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料ＩＺＮ１７Ｇ５７２Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）を、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５５％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際にＢの勾配は４０％〜６０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられ、理論的平均ＭＷは４９１３．０Ｄａであり、見つかったＭＷ：４９１１．０Ｄａである。
【０１２３】
Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）結合アッセイ−実施例４を参照。
【０１２４】
単細胞感染アッセイ−実施例３を参照。
【０１２５】
結果−本発明のＣＣキメラＮペプチドを設計したときに、可溶化三量化骨格（例えば、「ＩＺ」コイルドコイル）および共有結合三量化ユニット（例えば、ＣＣＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の両方の役割を考察する必要がある。この点に関して、免疫付与またはスクリーニングを目的として抗ウイルス薬または抗原のいずれかを開発するために本発明のＣＣキメラＮペプチドに関する重要な、また最適な要件を識別するうえで考慮すべき構成が多数ある。
【０１２６】
まず、後述の「ＩＺ」可溶化三量化領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１）は、ＣＣキメラＮペプチドを生成するために使用された。すでに説明されているように、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の場合、ＩＺ骨格は、２４個のアミノ酸残基からなる。共有結合三量化ユニット（ＣＣＧＧ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）をＩＺのＮＨ２末端に付加すると、ＩＺＮペプチドの安定化に大きく影響する（実施例３を参照）。本発明のＣＣＩＺＮペプチドのＩＺ骨格を縮小することができるが、ｇｐ４１融合中間物質の忠実な安定した模倣薬を生成することができるようにしながら、縮小した場合の最小の長さを定義しやすいように、「ＣＣＩ１０Ｎ１７」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）として指定されている短縮されたＩＺ骨格を含むＣＣペプチドＮペプチドを設計した。ｇｐ４１融合中間物質の忠実な安定した模倣薬を生成する能力を維持する結果として得られるＣＣキメラＮペプチドの実験ベンチマークは、（１）最適で広範な抗ウイルス活性を維持すること、および／または（２）例えば（ＣＣＩＺＮ１７）３により達成される限りｇｐ４１（例えば、ＩｇＧＤ５）のＮヘリックスコイルドコイル領域内に配置された立体配座エピトープに結合すること（実施例４を参照）である。骨格のトリミングは、多くの目的に関して有益である。第１に、小さな分子量の阻害剤または免疫原性前駆体の製造コストを安くでき、および／または製造過程の複雑さを軽減できる。第２に、小さな骨格だと、ＨＩＶ融合の仕組みに対する骨格の可能な干渉を低減することによりＣＣキメラＮペプチドのＮペプチド部分によい阻害プロファイルを付与することができる。第３に、ＣＣキメラＮペプチドに対する免疫応答を発生することに関する観点から、骨格が小さければ、非ＨＩＶ残基の内容が縮小され、それにより、免疫応答をペプチドのＨＩＶ  Ｎペプチド部分に向けて集中させやすくなるという点である。
【０１２７】
ＣＣＩ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）内のＩＺ類似の骨格は、「ＩＺ」骨格の１０個のＣＯＯＨ末端残基だけを含み、共有結合三量化ユニット（ＣＣＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８））をペプチドのＮＨ２末端に付加する。非共有結合的に安定化したＣＣＩ１０Ｎ１７コイルドコイル（つまり、非酸化条件の下で形成されるコイルドコイル）を中性ｐＨで溶解させ、円偏光二色性分光法（ＣＤ）によりこの二次構造内容を決定した。このＣＣＩ１０Ｎ１７コイルドコイルは、ヘリックスになっているのは１５μＭ濃度で６１％でしかないことがわかったが、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）コイルドコイルは、同じ条件の下で全部ヘリックスである。これは、骨格長が、非共有結合的に安定化したキメラＮペプチドコイルドコイル分子の形成にとって重要であることを示唆している。
【０１２８】
共有結合三量化ユニット（ＣＣＧＧ；  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８）の役割を理解するために、ＣＣＩ１０Ｎ１７ペプチドを溶解させて、ＣＣＩＺＮ１７についてすでに示されているのと同じ条件の下で空気酸化させ、共有結合的に安定化したコイルドコイル分子（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３を生成した。ＣＣＩＺＮ１７との類似の反応に見られるように不連続なコイルドコイル分子を形成するのとは反対に（＞８０％収量）、ＣＣＩ１０Ｎ１７の場合、２つの主要生成物、三量体（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３および四量体が生成され、それぞれ相当する収量は約４０％であった。三量体（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３をＣＤおよび変性研究により分析し、二次構造内容と安定性の両方を分析した。この分子のヘリックス含量はわずか８５％であり、融解曲線は低協同性プロファイルおよび約６０℃の低融点を示した。データは全体として、共有結合三量体化ユニットがヘリックス構造の安定化に果たす役割はごくわずかであり（６１％から８５％）、長い骨格こそが三量体を安定化する重要な接触部をもたらす不可欠な要素であることを示唆している。
【０１２９】
（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３三量体は、さらに、ＨＩＶを阻害し、Ｄ５  ＩｇＧに結合する能力について試験された。前の観察結果と一致する形で、（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３三量体は、（ＣＣＩＺＮ１７）３と比べてＨＩＶ阻害剤効力がかなり低い。（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３のＩＣ５０は、それぞれ（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３、２４ｎＭ対０．１３２ｎＭの場合と比べて約１５０倍小さい（図１３）。さらに、（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３のＩＣ５０は、非共有結合的に安定化したＩＺＮ１７ペプチドの場合と比べて約１０倍小さい（１．６８ｎＭ）。（ＣＣＩ１０ＮＩ７）３は、さらに、ビオチニル化５ヘリックス／Ｄ５  ＩｇＧおよびビオチニル化ＩＺＮ１７／Ｄ５  ＩｇＧの両方の相互作用アッセイにおいてＤ５  ＩｇＧ抗体への結合について試験された。前の観察結果と一致する形で、（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３は、Ｄ５  ＩｇＧのビオチンＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）への結合について競合するが、ＩＺＮ１７に比べて効果がいくぶん低い（図６を参照。ＣＣＩ１０Ｎ１７のＩＣ５０は、利用可能な実験データを使用したのでは求められなかった）。この実験では、「ＩＺＮ１７Ｇ５７２Ｄ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）と指定されているキメラペプチドは、陰性対照として使用されたが、それは、Ｎ１７  ＨＩＶ領域（ＨＩＶ−１  ＨＸＢ−２）内のＧ５７２Ｄ変異がＤ５  ＩｇＧへの結合を壊すことが知られているからである。共有結合的に安定化したＣＣＩ１０Ｎ１７コイルドコイルは、さらに、Ｄ５  ＩｇＧのビオチン５ヘリックスへの結合についても競合する（図１３を参照）。
【実施例６】
【０１３０】
抱合を目的として設計されたより有益な骨格タンパク質
ＥＺＮ１７の合成−ＥＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料ＥＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）を、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜６５％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際に溶離液Ｂの勾配は３０％〜７０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、５０１５．０６Ｄａであるが、見つかったＭＷは、５０１３．０Ｄａである。
【０１３１】
ＣＣＥＺＮ１７の合成−ＣＣＥＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）と同じプロトコルに従って合成された（実施例１を参照）。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料ＣＣＥＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜６０％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際に溶離液Ｂの勾配は４５％〜６５％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられ、理論的平均ＭＷは５３３５．０Ｄａであり、見つかったＭＷ：５３３３．０Ｄａである。
【０１３２】
ＣＣＥＺＮ１７の（ＣＣＥＺＮ１７）３への酸化−精製されたペプチド前駆体（１４ｍｇ）、ＣＣＥＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を濃度０．５ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。前駆体ペプチドの可溶化に有利なようにＮａＯＨを加えてｐＨを１０に高めた。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析によりモニターしたが、溶液Ｂの勾配は（上記）、３０％〜７０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析における保持時間がｔＲ＝１６．４’であるＣＣＥＺＮ１７は、一晩かけて空気によりゆっくり酸化されたが、その際に、結合され、質量減少が３つのジスルフィド架橋（［ＣＣＥＺＮ１７］３、図３Ｂを参照）の形成と一致する３つのＣＣＥＺＮ１７ペプチド鎖の１つの分子の質量に対応する質量を持つ１つの主要生成物（ｔＲ＝１０’で溶離する）を形成した。溶液（２８ｍＬ）に、ＴＦＡ  ９０μＬを加え、ＴＳＫｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムに溶液を直接充填したが、その際に、溶離液としてＨ２Ｏ／アセトニトリル７０／３０、０．１％  ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用した。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、ＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で３０％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。共有結合三量体に対応する留分は、プールされ、凍結乾燥され、さらに、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上で質量分析法により分析された。予想ＭＷは、１６０００．３Ｄａであり、見つかったＭＷは、１５９９８．０Ｄａである。
【０１３３】
単細胞感染アッセイ−実施例３を参照。
【０１３４】
Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）結合アッセイ−実施例４を参照。
【０１３５】
結果−「ＥＺ」骨格（ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）は、ＣＣＥＺＮペプチド（つまり、ｇｐ４１のＮヘリックス領域の全部または一部に融合されたＥＺ骨格を含むＣＣキメラＮペプチド）を免疫原性担体である、髄膜炎菌ＯＭＰＣ粒子に抱合する作用を容易にするように設計された。ペプチドを担体に共有結合的に付加すると、ＯＭＰＣペプチド抱合体の場合のように、抱合体の不可逆的沈殿を生じる。これを防ぐために、ＯＭＰＣ  １モルに組み込むことができるペプチドの最大モル数（つまり、ペプチド「負荷」）を慎重に制御しなければならない。多くのペプチド配列について、最適化した後であっても、ＯＭＰＣ上への適切なペプチド負荷を得ることは可能でない。任意の配列のペプチドをＯＭＰＣに直接的に抱合することを可能にする戦略が近年策定された（２００３年１２月１８日に出願されたＢｉａｎｃｈｉらの米国仮特許出願第６０／５３０，８６７号「Ａ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｔｏ  Ｍａｋｅ  ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ−Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｈｉｇｈ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ」を参照）。この方法は、ペプチド負荷が、ペプチドエピトープに対する満足のゆく免疫応答を得るために欠かせない因子である特定の閾値よりも高くなることを保証する。この方法は、ペプチド配列のｐＩ（「等電点」）を操作し、その値を、最適な形で、約３．５〜５．０の間に来るように調節することを伴う。ｐＩをこの範囲内に収まるようにするために、ペプチドは活性免疫原性領域の外で修飾され、それにより、ペプチドの免疫学的性質が確実に保持されるようにできる。例えば、ＩＺＮ１７（ＩＫＫＥＩＥＡＩＫＫＥＯＥＡＩＫＫＫＩＥＡＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１、骨格部分に下線が引かれている）は、ＯＭＰＣへの抱合について〜３．５〜５．０の最適な範囲内にない非常に高い、１０．７というｐＩを持つ。ＩＺＮ１７の高いｐＩ値は、たいてい「ＩＺ」骨格上に存在する多数の塩基性アミノ酸残基により決定されるため、新しい骨格、「ＥＺ」骨格が設計されたが、これはより強い酸性を有する。
【０１３６】
Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ骨格、つまり「ＩＺ」骨格の由来元である骨格モチーフは、（ＩＥＫＫＩＥＡ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３）の７回繰り返し配列を持つ。ＥＺ骨格を生成するために、この７回繰り返し配列を（ＩＥＫＫＩＥＥ）ｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４）７回繰り返しに修飾したが、その際に、７回繰り返しの位置「ｃ」のアラニン残基をグルタミン酸に変異させた（図７を参照）。この修飾された骨格領域を含むキメラＮペプチドは、「ＥＺＮ１７」であり、これは、アミノ酸配列（ＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＫＩＥＥＩＥＫＬＬＱＬＴＶＷＧＩＫＱＬＱＡＲＩＬ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６、骨格位置に下線が引かれている）を持つ。このキメラペプチドのｐＩは５．２である。円偏光二色性分光法によるＥＺＮ１７の分析結果から、このペプチドは、典型的なコイルドコイルサインを持つ完全ヘリックス立体配座をまだとることができることがわかる。しかし、単一細胞のＨＩＶ感染を阻害する能力について試験すると、ＥＺＮ１７の抗ウイルス活性は、ＩＺＮ１７に比べて効力が数桁低い（図１２Ａを参照）。この観察結果にもかかわらず、ＥＺＮ１７は、ビオ−ＩＺＮ１７／Ｄ５  ＩｇＧ相互作用アッセイにおいてＩｇＤ５にいぜんとして結合し、親和性はＩＺＮ１７に匹敵する（図６を参照）。これらの観察結果は、酸性のＥＺ骨格は、おそらくはＨＩＶ融合の仕組みによる骨格または可能な立体障害のせいで、結果として生じるペプチドのＨＩＶ感染阻害能力に干渉することを示しているが、結果として得られるペプチドは、Ｄ５により認識された立体配座エピトープを適切に与えるので、そのまま正確に折り畳まれ、ｇｐ４１融合中間物質の忠実な模倣薬を形成する。
【実施例７】
【０１３７】
共有結合的に安定化したＣＣキメラＮペプチドは、低濃度でｇｐ４１細胞外領域の安定した模倣薬である
材料と方法−ＢＩＡＣｏｒｅ３０００計測器を、ＢＩＡＣｏｒｅ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）が供給しているチップＳＡ（固定化されたストレプトアビジン表面）またはＣ５（表面上の活性化可能カルボキシル基）と併せて、測定に使用した。ビオチニル化ペプチドは、ＳＡチップ上で、１〜４分間、ＨＢＳ（ＨＥＰＥＳ緩衝食塩水）中の１ｎＭのペプチド溶液に１０×Ｔｗｅｅｎを加えたものを流すことにより固定化された。結合ペプチドが検体完全抗体の１００ＲＵを結合するのに十分な１０個の共鳴ユニット（ＲＵ）に達するまで手動注入が使用された。Ｃ５チップについては、ＥＤＣ（Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド酸素酸塩）およびＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）による表面活性化の後、標的固定化を１５００〜１８００ＲＵに設定し、組み込み固定化ウィザード制御テンプレートを使用して、ｐＨ４．８の酢酸塩緩衝液中１〜５μｇ／ｍｌ（ＢＩＡＣｏｒｅ供給緩衝液を混合する）で抗体の固定化を実行した。これは、検体ペプチドの最大１００ＲＵまでに結合する十分な活性を持つＤ５−ＩｇＧを固定化することがわかった。流量は、会合解離フェーズでは２０μｌ／分であり、１５ｍＭ  ＨＣｌの１回洗浄による表面再生時には５０μｌ／分であったが、これは、すべての結合ペプチドを解放するのに十分であると決定された。速度ウィザードは、親和性測定実験を設計するために使用され、複製および対照は拡散制限速度を検出することを求めるプロンプトが表示されたときに実行された。検体濃度は、２倍または４倍希釈系列として、Ｋｄ値よりも上および下の濃度のデータを与えるように選択された。会合時間は、典型的には３分、解離時間は、５〜１０分であるが、会合解離測定は、ＨＢＳ＋１０×Ｔｗｅｅｎにおいて２５℃で実行され、非特異結合事象を取り除くよう決定された。データの分析は、ＢＩＡＣｏｒｅ曲線当てはめソフトウェアにより実行され、ＲＵに著しい変化のある滑らかな領域からデータが選択された。第１に、解離速度が推定された。ほとんどの最も希薄な検体試料から得られたデータは、容易に当てはめられ、よく似ていた。しかし、０．２５ｎＭ未満の試料では、基線変動はデータを劣化させ始め、オフレート推定値を信頼できないものとした。最良適合オフレートを使用しすることで、会合曲線をそれぞれＢＩＡＣｏｒｅソフトウェアにおいて当てはめて、オンレートを求めた。使用されたすべての濃度から、容易に当てはめられるオンレートデータが得られた。
【０１３８】
結果−本明細書で説明されているキメラペプチドの共有結合的安定化の影響の追加証明は、新たに同定された、ＨＩＶ中和抗体Ｄ５  ＩｇＧによる結合実験から得られる（実施例３で説明されている）。Ｄ５  ＩｇＧは、ＭｅｒｃｋとＣＡＴとの共同により最近発見された。Ｄ５  ＩｇＧは、ｇｐ４１融合中間物質を標的とすることにより抗ウイルス活性を示す抗体の第１の実施例である。Ｄ５は、元々、ハイブリッド選択プロトコルを使用してＣＡＴ  ｓｃＦｖｓライブラリのスクリーニングにより選択された。ＣＡＴ  ｓｃＦｖｓライブラリは、最初に、ビオチニル化５ヘリックス（固相上）で選択された。２回目の選択は、ビオチニル化ＩＺＮ３６をセレクタとして使用したが、比較的高い濃度のペプチドが必要だった（２５０ｎＭ）。さらに、ビオチニル化ＩＺＮ３６は、前記ペプチドが固定化されたときに不適当なセレクタであったと決定した後、溶液中にある必要がある（固相とは反対に）。第２回の高濃度のビオチニル化ＩＺＮ３６の要件は、ペプチドの中和抗原領域が立体配位座エピトープを表し、これの存在および安定性は、ＩＺＮ３６鎖の三量化平衡状態に依存する。選択が正常に実行される低濃度では、ＩＺＮ３６ペプチドは平衡単量体：三量体状態にあり、したがって、立体配座中和エピトープを完全には示すことができない。したがって、高濃度のＩＺＮ３６は、平衡状態を完全に三量体状態に追いやるために必要である。本発明で説明されている共有結合的に安定化したキメラペプチドを使用することによりこの濃度依存を克服することが可能である。これは、実際には、表面プラスモン共鳴（ＳＰＲ）、つまり、ＢＩＡＣｏｒｅ結合実験を使用して確認された。ＢＩＡＣｏｒｅアッセイは、ＢＩＡＣｏｒｅチップに連結された種の安定性を必要とし、したがって、安定性およびオリゴマー化状態が濃度に依存する連結された種は、不利である。
【０１３９】
この仮説を確かめるために、ＩＺＮ３６のビオチニル化類縁体（ビオチン−ＩＺＮ３６）および共有結合的に安定化したＣＣＩＺＮ２３三量体（［ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３］３、図２Ｂを参照）を最初に、ストレプトアビジン（「ＳＡ」）コーティングチップ上にコーティングし、可溶性Ｄ５−ｓｃＦｖへの結合について分析した（図５Ａ）。次いで、同じ結合相互作用（ビオチン−ＩＺＮ３６／Ｄ５−ｓｃＦｖおよび（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３／Ｄ５−ｓｃＦｖ）に対する解離定数を同じ実験で分析したが、このときは、Ｄ５  ＩｇＧをＣＭ５チップ上に固定化し、ペプチド、ビオチン−ＩＺＮ３６および（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３を溶液中に保持した（図５Ｂ）（表４の結果を参照）。
【０１４０】
【表４】
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【０１４１】
表４に示されているように、ビオチン−ＩＺＮ３６／Ｄ５相互作用について測定された親和性は、使用されるＢＩＡＣｏｒｅ構成により異なる。しかし、この観察結果は、（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３／Ｄ５相互作用については見られなかった。特に、ビオチン−ＩＺＮ３６／Ｄ５に対するＫｄは、Ｄ５がチップに貼り付けられている場合に０．１７ｎＭであるが、ＩＺＮ３６が固定化された場合には１μＭを超えている。それと反対に、共有結合的に安定化した（ＣＣＩＺＮ２３）３／Ｄ５相互作用に対するＫｄは、チップに貼り付けられるか、または溶液中の場合に約０．２ｎＭである。これらのデータから、共有結合的に安定化された三量体ＣＣＩＺＮ２３構造は、低濃度で保存されるｇｐ４１融合中間物質の安定した忠実な模倣薬であることが実証され、ＨＩＶ特異免疫応答を顕在化する抗原として、またＨＩＶ  ｇｐ４１細胞外領域のＮヘリックスを標的とする阻害剤のスクリーニング用の最適なセレクタとして使用することが妥当であると判断される。
【実施例８】
【０１４２】
ＨＩＶ中和または非中和ＭＡｂｓに結合するＮ１７エピトープの同定
アラニンスキャンされたＩＺＮ１７ペプチドの合成−４０ウェル反応ブロックを使用するペプチドマルチシンセサイザＡＰＥＸ  ３９６（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍｔｅｃｈ）上でＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学反応を使用して固相によりペプチド（表５を参照）を合成した。それぞれのペプチドは、１％架橋したＦｍｏｃ−Ｌｉｎｋｅｒ  ＡＭ−Ｃｈａｍｐｉｏｎ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）０．３ｇ、修飾されたＲｉｎｋリンカーｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α−［９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸により誘導体化されたＰＥＧ−ＰＳベース樹脂を使用して合成された（Ｒｉｎｋ、１９８７年、上記、Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚら、１９８９年、上記）。すべてのアミノ酸は、ＤＭＦ中の０．５Ｍ  ＨＯＢｔ（ヒドロキシベンゾトリアゾール）の溶液中に０．５Ｍ濃度で溶解された。樹脂遊離アミノ基上で６倍過剰量の活性化アミノ酸を使用して、６０分間、アシル化反応を実行した。最初の１４個のアミノ酸は、等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）により活性化された。最後の２７個のアミノ酸は、等モル量のＨＡＴＵ（Ｎ−［（ジメチルアミノ）−１Ｈ−１，２，３−トリアゾロ−［４，５−ｂ］ピリジニルメチレン）］−Ｎ−メチルメタンアミニウムヘキサフルオロホスフェートＮ−オキシド）および２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）により活性化された。側鎖保護基は、ＧｌｕおよびＴｈｒに対するｔｅｒｔ−ブチル、ＣｙｓおよびＧｌｎに対するトリチル、Ｌｙｓ、Ｔｒｐに対するｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、およびＡｒｇに対する２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルであった。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。合成が終わったら、乾燥ペプチド樹脂を、８８％のＴＦＡ、５％のフェノール、２％のトリイソプロピルシラン、および５％の水の切断混合液２０ｍＬ（ＳｏｌｅおよびＢａｒａｎｙ、１９９２年、上記）により、室温で１．５時間かけて個別に処理した。それぞれの樹脂を濾過し、溶液を冷たいメチル−ｔ−ブチルエーテルに加え、ペプチドを沈殿させた。遠心分離機にかけた後、ペプチドペレットを新鮮な冷たいメチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄し、不要な有機物を取り除いた。このプロセスを２回繰り返した。最終のペレットを乾燥させ、Ｈ２Ｏ、２０％アセトニトリル中に再懸濁させ、凍結乾燥させた。
【０１４３】
ペプチド原料「ＩＺＮ１７Ａ１」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２）を逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用されたＢの勾配は、４０％〜６０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際にＢの勾配は４０％〜６０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、４８１２．９Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４８１３．０Ｄａである。
【０１４４】
ペプチド原料「ＩＺＮ１７Ａ３」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７３）は、ＩＺＮ１７Ａ１に使用されたのと同じ条件を使用して精製された。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、４７９７．９Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４７９８．０Ｄａである。
【０１４５】
ペプチド原料「ＩＺＮ１７Ａ４」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）は、ＩＺＮ１７Ａ１に使用されたのと同じ条件を使用して精製された。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、４８１２．９Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４８１３．０Ｄａである。
【０１４６】
ペプチド原料「ＩＺＮ１７Ａ６」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）は、ＩＺＮ１７Ａ１に使用されたのと同じ条件を使用して精製された。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、４８２６．９Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４８２７．０Ｄａである。
【０１４７】
ペプチド原料「ＩＺＮ１７Ａ７」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）を逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用されたＢの勾配は、３５％〜５５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際にＢの勾配は３５％〜６５％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、４７３９．９Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４７３９．０Ｄａである。
【０１４８】
ペプチド原料「ＩＺＮ１７Ａ１０」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）を逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用されたＢの勾配は、４５％〜６５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際にＢの勾配は４５％〜７０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、４７９７．９Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４７９８．０Ｄａである。
【０１４９】
ペプチド原料「ＩＺＮ１７Ａ１１」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７８）を逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用されたＢの勾配は、３５％〜５５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際にＢの勾配は４０％〜６０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、４７９７．９Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４７９６．０Ｄａである。
【０１５０】
ペプチド原料「ＩＺＮ１７Ａ１３」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７９）を逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用されたＢの勾配は、４５％〜７０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際にＢの勾配は４５％〜７０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、４７９７．９Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４７９７．０Ｄａである。
【０１５１】
ペプチド原料「ＩＺＮ１７Ａ１５」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８０）を逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用されたＢの勾配は、４０％〜５５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際にＢの勾配は３５％〜６５％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、４７６９．９Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４７６９．０Ｄａである。
【０１５２】
ペプチド原料「ＩＺＮ１７Ａ１７」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８１）を逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用されたＢの勾配は、３５％〜５５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）上で実行したが、その際にＢの勾配は４５％〜６０％  Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均分子量（ＭＷ）は、４８１２．９Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４８１２．０Ｄａである。
【０１５３】
「ＩＺＮ１７Ｇ５７２Ｄ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）に対する合成プロトコルは、実施例５に示されている。
【０１５４】
【表５】
2008501028.tif 000007
【０１５５】
ＣＣＩＮ１３の合成−ＣＣＩＺＮ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。原料ペプチド、ＣＣＩＺＮ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣにより得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、流量を８０ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、３０％〜４５％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォームＥＳ＋上で質量分析法により特徴付けられた。見つかったＭＷは、４７２１．０Ｄａであるが、計算で求められた平均ＭＷは、４７２１．７．０Ｄａであった。
【０１５６】
ＣＣＩＺＮ１３の（ＣＣＩＺＮ１３）３への酸化−精製されたペプチド前駆体（２０ｍｇ）、ＣＣＩＺＮ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）を濃度５ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。この条件の下で、ＣＣＩＺＮ１３を空気によりゆっくり酸化し、共有結合三量体（ＣＣＩＺＮ１３）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５］３）にした。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５５％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。これらのクロマトグラフィ条件の下で、ＣＣＩＺＮ１３は、ｔＲ＝１２．５７’で溶出する。酸化反応は、円滑に進行し、質量減少が３つのジスルフィド架橋（ＣＣＩＺＮ１３）３の形成と一致する３つのＣＣＩＺＮ１３ペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応する質量を持つｔＲ＝１５’で溶離する１つの主要生成物を形成する。酸化反応の全収量は、８０％を超える。溶液に、ＴＦＡ  ４５μＬを加え、ＴＳＫｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムに溶液を直接充填したが、その際に、溶離液としてＨ２Ｏ／アセトニトリル７０／３０、０．１％  ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用した。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で３５％〜５５％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。予想ＭＷは、１４１５８．０Ｄａであるが、見つかったＭＷは、１４１５９．２９Ｄａであった。
【０１５７】
Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）アッセイ−実施例４を参照。
【０１５８】
マウスモノクローナル抗体−さまざまなアジュバントで調製されたＩＱＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）ペプチドをマウスに腹腔内注射して免疫を与えることにより抗ＩＱＮ１７モノクローナル抗体Ａ、Ｂ、およびＣを作製した。免疫を与えられた動物からの脾細胞を取り出して、マウス骨髄腫細胞系に融合させ、抗体分泌ハイブリドーマを生成した。ＩＱＮ１７特異ＥＬＩＳＡにより決定されたように、ＩＱＮ１７と反応するハイブリドーマ生成抗体をマウスに注射して、タンパク質Ａカラムを使用して３つのｍＡｂが精製された腹水を生成した。
【０１５９】
Ｎ１７中和エピトープの概要−新たに同定された、ＨＩＶ中和抗体、Ｄ５−ＩｇＧの付着に必要な疎水性ポケットの特異アミノ酸を同定するために、ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）フォーマットで一連の変異ＩＺＮ１７ペプチドを試験し、Ｄ５−ＩｇＧとビオチニル化ＩＱＮ１７との結合について競合する能力を調べた。アミノ酸置換体は、特に溶媒暴露残基を標的としてＩＺＮ１７内に人工的に作られた。第１に、位置５７２のグリシンがアスパラギン酸で置き換えられたＩＺＮ１７変異体を試験した（「ＩＺＮ１７Ｇ５７２Ｄ」、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）。この変異により、大きな側鎖がＩＺＮ１７の疎水性ポケット内に導入され、このキャビティを埋める。このＧ５７２Ｄ変異体は、ＩＱＮ１７に結合するＤ５と競合することが完全にできず、疎水性ポケット内に大きな側鎖が導入されるとＤ５−ＩｇＧの結合が妨げられることを示している（図９Ａ）。この結果は、さらに、Ｄ５の結合部位が疎水性ポケット内にあることも示している。３つの追加のＩＺＮ１７変異体は、結合するＤ５と競合する能力がない。ＩＺＮ１７における位置Ｋ５７４（ＩＺＮ１７Ａ１０、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７７）、Ｌ５６８（ＩＺＮ１７Ａ４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７４）、およびＷ５７１（ＩＺＮ１７Ａ７、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７６）のアラニン置換（表５および６を参照）は、Ｄ５の結合を完全に壊し、これら３つのアミノ酸は、Ｄ５エピトープを形成する可能性があることを示している（図９Ｂ）。１つの追加の変異体（Ｖ５７０Ａ、ＩＺＮ１７Ａ６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７５）は、野生型ＩＺＮ１７ペプチドと比べてＤ５結合の競合性が実際に低いように見えるが、これは、Ｖ５７０がＤ５−ＩｇＧに対する小さな接触点を形成することを示唆していると思われる。Ｄ５結合に対する３つの重要なアミノ酸は、図８において、３つの隣接するＮ１７セグメントで形成されるキャビティ内に置かれた、正方形の残基により識別されている。まとめについては、図１１を参照されたい。
【０１６０】
上記のアラニンスキャンされたＩＺＮ１７変異体（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７２〜８１）は、ＩＺＮ１７Ｇ５７２Ｄ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２２）に加えて、円偏光二色性分光法と熱変性研究の両方により特徴付けられ、安定したコイルドコイル構造の形成能力についてＩＺＮ１７と比較された。すべての変異体は、完全にヘリックスであり、変性曲線内に１００℃を超える融点を持つ、高い安定性を示している。２Ｍの塩化グアニジニウム（２Ｍ、ＧｄｎＨＣｌ）などの低濃度の変性剤の存在下で熱変性が実行された場合、変異体の融点は、表６に示されているように、ＩＺＮ１７について得られている融点に十分匹敵する。そのため、説明されているように生成された変異体によるＤ５−ＩｇＧ結合の減少は、結合への関与の欠如としか解釈できない。
【０１６１】
【表６】
2008501028.tif 000008
【０１６２】
Ｎ１７非中和エピトープの概要−Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）の技術（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を利用して、３つのＩＱＮ１７特異的マウスｍＡｂ（Ａ、Ｂ、Ｃ）のタンパク質Ａ精製調製物を使用し、ビオチニル化ＩＱＮ１７と３つのマウスｍＡｂのそれぞれのとの間の最適な相互作用条件を見つけた。これらのペプチド／抗体相互作用アッセイを使用することで、溶媒暴露残基がアラニン残基に変異された変異ＩＺＮ１７ペプチドの図を滴定して、抗体の結合に重要な、ペプチドのＮ１７セグメント中のアミノ酸を同定した。ＩＱＮ１７へのｍＡｂ結合に競合できなかった変異ペプチドにより、３つのＩＱＮ１７特異的ｍＡｂの個々のエピトープを含む重要アミノ酸が明らかになった（図１１を参照）。マウスｍＡｂ  Ａは、アミノ酸Ｋ５７４、Ｒ５７９、およびＬ５８１に決定的に依存しているように見える。アミノ酸Ｑ５７５およびＱ５７７も、抗体の接触点を表すように見えるが、結合には本質的でない。そのため、ｍＡｂ  Ａのエピトープは、アミノ酸Ｋ５７４、Ｒ５７９、Ｌ５８１、Ｑ５７５、およびＱ５７７からなる。マウスｍＡｂ  Ｂの場合、アミノ酸Ｒ５７９は、抗体とＩＺＮ１７との相互作用にとって不可欠であるように見える。Ｑ５７５およびＬ５８１も、抗体により接触されるように見えるが、これら２つのアミノ酸は、結合には本質的でない。ｍＡｂ  Ｂのエピトープは、３つのアミノ酸（Ｑ５７７、Ｒ５７９、Ｌ５８１）しか伴わないので、最小であるように見える。最後に、マウスｍＡｂ  Ｃの場合、３つのアミノ酸Ｑ５７７、Ｒ５７９、およびＬ５８１は、この抗体とＩＺＮ１７との相互作用にとって不可欠であるように見える。追加の接触は、Ｑ５７５で行われるように見えるが、この相互作用は、ｍＡｂ  ＣがＩＺＮ１７に結合するうえで重要でない。結論として、ＩＱＮ１７に対し生じたこれら２つのマウスｍＡｂのエピトープは、微妙に異なるが、３つすべてのエピトープは、３つのアミノ酸Ｑ５７７、Ｒ５７９、およびＬ５８１の中心にあるように見える一方で、Ｒ５７９は、３つすべての抗体の結合に本質的である（図１１を参照）。これらの残基は、図８において楕円形で示されている。
【０１６３】
ＨＩＶ  Ｎヘリックスの疎水性ポケット領域に免疫応答を集中させるために、Ｎ１７ペプチドのカルボキシ末端に存在する免疫優勢な非中和エピトープがＣＣキメラＮペプチドＣＣＩＺＮ１３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９５）内で取り除かれた。ＣＣＩＺＮ１３単量体は、酸化されて共有結合三量体（ＣＣＩＺＮ１３）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．９５）になり、抗ウイルス活性について特徴付けられ、ＨＩＶ  ＨＸＢ２に対し８５．３ｎＭのＩＣ５０を示した（図１３）。効力が低いのは、ＩＺＮ１７のアラニンスキャニング変異体（Ａ１５の変異体Ｑ５７７Ａ、実施例８を参照）により示される抗ウイルス活性と呼応している。（ＣＣＩＺＮ１３）３は、Ｄ５  ＩｇＧを結合する能力が（ＣＣＩＺＮ１７）３に比べて２分の１に減少していることも示している（図１３）。
【実施例９】
【０１６４】
Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮペプチドの設計
Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７の合成−Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７（Ｃ−Ｔｄｓ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。Ｔｔｄｓ（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカミンコハク酸、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２）２−ＣＯ−）との反応は、等モル量のＤＩＰＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）で活性化された３倍過剰量のＴｔｄｓと、３時間反応させることにより実行された。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。原料ペプチド、Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７（Ｃ−Ｔｄｓ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣ（２５％収量）により得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、流量を８０ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜６５％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォームＥＳ＋上で質量分析法により特徴付けられた。見つかったＭＷは、５７３９．０Ｄａであるが、計算で求められた平均ＭＷは、５７４０．０Ｄａである。
【０１６５】
Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７の酸化およびマレイミド酪酸による誘導体化−精製されたペプチド前駆体、Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７（Ｃ−Ｔｄｓ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７）を濃度１ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。この条件の下で、Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７を空気によりゆっくり酸化し、共有結合三量体（Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７）３（［Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］３）にした。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、３０％〜７０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。酸化反応は、一晩で円滑に進行し、質量減少が４つのジスルフィド架橋の形成と一致し、それでも合計９つのシステイン残基のうちの１つに１つの遊離チオールが付着している、３つのＣ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７ペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応する質量を持つ生成物を形成する（［Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７］３）。見つかったＭＷは、１７３９５．０  Ｄａである。
【０１６６】
一定量の溶液を３モル過剰量のマレイミド酪酸（ＭＷ  １８３Ｄａ）でインキュベートした（１ｍｇ／ｍＬの水溶液５０μＬをペプチド溶液０．５ｍＬに加えた）。３０分インキュベートした後、ＨＰＬＣ／ＭＳ分析を行ったところ、単一マレイミドブチリル基が三量体種（見つかったＭＷは１７３９であり、計算で求められた平均ＭＷは１７３９５である）上に導入されたことが明らかになり、マレイミド基と反応できる単一遊離Ｃｙｓ残基が存在することが確認された。
【０１６７】
結果−樹脂または担体への抱合、または標識もしくは部分（例えば、ペグ化鎖）による誘導体化などの特定の特徴をＣＣキメラＮペプチドに付与するために有用である遊離チオール基を持つＣＣＥＺＮ１７由来のペプチドが設計された。このペプチドの設計は、異なる長さのＨＩＶ  Ｎペプチド部分を含むＣＣキメラＮペプチドを含む、本明細書で説明されている他のＣＣキメラＮペプチドにも応用することができ、その際に、コアＣＣキメラＮペプチドは、鎖毎にもう１つシステイン残基を含むように修飾される。そのため、それぞれのペプチド鎖は、奇数個のシステイン残基（つまり、この実施例では３個）を含む。奇数のシステインは、柔軟な長いリンカーを使って他の連続するシステイン残基から分離される。本発明の実施例では、リンカーＴｔｄｓ（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカミンコハク酸、−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２）２−ＣＯ−）が選択された。奇数個のシステイン残基だと、共有結合的に安定化した三量体分子の酸化の後、三量体毎に少なくとも１つの反応性チオール基が、チオール反応基（例えば、マレイミジル）との反応に利用できることが保証される。Ｔｄｓなどのリンカーは、三量化領域と抱合／誘導体化に適した遊離チオール含有システイン残基との間に柔軟性、可溶性をもたらし、間隔を設ける。
【０１６８】
この戦略は、試験化合物、マレイミド酪酸との反応を利用して検証された。Ｃ−Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７単量体（ＭＷ  ５７３９Ｄａ）を１ｍｇ／ｍｌでインキュベートし、空気酸化を行わせ、共有結合的に安定化した三量体分子を形成した。反応の後、ＬＣ−ＭＳにより分析した。２４時間インキュベートした後、主要な酸化生成物は４つのジスルフィド架橋（ＭＷ  １７２０９Ｄａ）を持つ三量体種に対応し、三量体構造内の９個のシステイン残基のうち８個がジスルフィド架橋に関与していることが示された。１つのちチオール残基の活性度を、３モル過剰量のマレイミド酪酸によるインキュベートで試験して調べた。３０分間反応させた後、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を行った結果、三量体種（ＭＷ  １７３９５）上に単一マレイミジル酪酸の生成物に対応する化合物が形成されたことがわかった。
【実施例１０】
【０１６９】
骨格領域の改変
Ｎ１７ＩＺの合成−Ｎ１７ＩＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料Ｎ１７ＩＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）を、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、３０％〜５０％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、４６６７．０Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４６６８．７７Ｄａであった。
【０１７０】
ＣＣＩＺＮ１１ＩＺ−の合成−ＣＣＩＺＮ１１ＩＺ−（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。ＧＰＣ（上記参照）により得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、流量を８０ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２５分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォームＥＳ＋上で質量分析法により特徴付けられた。見つかったＭＷは、５４０６．０Ｄａであるが、計算で求められた平均ＭＷは、５４０５．３Ｄａであった。
【０１７１】
ＣＣＩＺＮ１１ＩＺの（ＣＣＩＺＮ１１ＩＺ）３への酸化−精製されたペプチド前駆体（３５ｍｇ）、ＣＣＩＺＮ１１ＩＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）を濃度５ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。この条件の下で、ＣＣＩＺＮ１１ＩＺを空気によりゆっくり酸化し、共有結合三量体（ＣＣＩＺＮ１１ＩＺ）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６］３）にした。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。これらのクロマトグラフィ条件の下で、ＣＣＩＺＮ１１ＩＺは、ｔＲ＝１２．０７’で溶出する。酸化反応は、円滑に進行し、質量減少が３つのジスルフィド架橋（ＣＣＩＺＮ１１ＩＺ）３の形成と一致する３つのＣＣＩＺＮ１１ＩＺペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応する質量を持つｔＲ＝１２．８’で溶離する１つの主要生成物を形成する。酸化反応の全収量は、７０％を超える。溶液に、ＴＦＡ  １００μＬを加え、ＴＳＫｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂を詰めた７００×２６ｍｍカラムに溶液を直接充填したが、その際に、溶離液としてＨ２Ｏ／アセトニトリル４０／６０、０．１％  ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用した。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で４０％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。予想ＭＷは、１６２１０．８５Ｄａであるが、見つかったＭＷは、１６２１５Ｄａであった。
【０１７２】
ＳＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）の合成は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。アセチル化の後、ペプチド原料ＳＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）を、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜５５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、４８４１Ｄａであるが、見つかったＭＷは、４８４１Ｄａであった。
【０１７３】
ＣＣＳ１７Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）の合成は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。原料ペプチド、ＣＣＳ１７Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣにより得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、流量を８０ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜５５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜６０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォームＥＳ＋上で質量分析法により特徴付けられた。見つかったＭＷは、４３５０．０Ｄａであるが、計算で求められた平均ＭＷは、４３５０．０Ｄａであった。
【０１７４】
ＣＣＳ１７Ｎ７の（ＣＣＳ１７Ｎ７）３への酸化−精製されたペプチド前駆体（１７ｍｇ）、ＣＣＳ１７Ｎ７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）を濃度２ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。この条件の下で、ＣＣＳ１７Ｎ１７を空気によりゆっくり酸化し、共有結合三量体（ＣＣＳ１７Ｎ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００］３）にした。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜７０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。これらのクロマトグラフィ条件の下で、ＣＣＳ１７Ｎ１７は、ｔＲ＝１０．７２’で溶出する。酸化反応は、円滑に進行し、質量減少が３つのジスルフィド架橋（ＣＣＳ１７Ｎ１７）３の形成と一致する３つのＣＣＳ１７Ｎ１７ペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応する質量を持つｔＲ＝７．６’で溶離する１つの主要生成物を形成する。酸化反応の全収量は、７０％を超える。溶液に、ＴＦＡ  １００μＬを加え、この溶液を、準分取Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ−４カラム（２１．２×２５０ｍｍ、１５μｍ）（流量８０ｍＬ／分）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で４５％〜６５％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。予想ＭＷは、１３０４２Ｄａであるが、見つかったＭＷは、１３０４３Ｄａである。
【０１７５】
ＣＣＳ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）の合成は、ＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）およびＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）について説明したのと同じプロトコルに従って合成された。アセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。原料ペプチド、ＣＣＳ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣにより得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、流量を８０ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜５５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜６０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォームＥＳ＋上で質量分析法により特徴付けられた。見つかったＭＷは、３５３８．０Ｄａであるが、計算で求められた平均ＭＷは、３５３７．０Ｄａであった。
【０１７６】
ＣＣＳ１０Ｎ１７の（ＣＣＳ１０Ｎ１７）３への酸化−精製されたペプチド前駆体（２０ｍｇ）、ＣＣＳ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２）を濃度５ｍｇ／ｍＬの０．１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．３（ＵＳＢ  Ｃｏｒｐ．）に溶解した。この条件の下で、ＣＣＳ１０Ｎ１７を空気によりゆっくり酸化し、共有結合三量体（ＣＣＳ１０Ｎ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０２］３）にした。酸化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ−４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、５０％〜８０％Ｂ（２３分）、流量１ｍＬ／分であった。酸化反応を一晩かけて進行させたところ、二量体、三量体、および四量体の化学種に対応する複数の生成物が形成された。三量体生成物の形成の全収量は約３０％である。溶液に、ＴＦＡ  １００μＬを加え、この溶液を、準分取Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ−４カラム（２１．２×２５０ｍｍ、１５μｍ）（流量２５ｍＬ／分）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜７０％、２５分間であった。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で４５％〜６５％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。予想ＭＷは、１０６０６Ｄａであるが、見つかったＭＷは、１０６０７Ｄａであった。
【０１７７】
Ａｌｐｈａｓｃｒｅｅｎ（商標）結合アッセイ−実施例４を参照。
【０１７８】
単細胞感染アッセイ−実施例３を参照。
【０１７９】
結果−Ｎ１７配列と併せて、抗ウイルス力に対するＩＺコイルドコイルの役割をさらに調査した。Ｎペプチドの骨格およびＨＩＶ領域の位置を逆にして、ＩＺＮ１７類似体を調製し、Ｎ１７ＩＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９４）を形成したが、ただし、ＩＺ領域は、Ｎ１７配列のカルボキシ末端側に位置する。余分なアラニン残基をＮ１７とＩＺ配列の間に入れて、フレーム内の交互の７回繰り返し（「ａ」から「ｇ」まで）を維持した。融合後ヘアピン三量体（つまり、６ヘリックス束の構造を調べると、ＩＺＮ１７は、ｇｐ４１のＣヘリックスのＮ末端部分を捕捉できなければならないが、ＣヘリックスのＣ末端部分の部分的ねじれは、ＩＺ骨格のコイルドコイルグロッグに衝突するのを回避するために必要であることが示唆される。ＩＺ骨格領域をＮペプチドのカルボキシ末端に配置すると、阻害時のＣ残基による潜在的立体障害を最小にすることができる。対照的に、非常に高い構造的安定性を維持するにもかかわらず、Ｎ１７ＩＺは、抗ウイルスアッセイにおいてＩＺＮ１７に比べて２桁以上活性が弱く、抗ウイルス力はＨＩＶ  ＨＸＢ２に対して８００ｎＭである（図１３を参照）。これは、ＩＺ骨格領域のＣ末端位置が、Ｃヘリックス以外の融合中間物質のある領域とぶつかりうることを示唆している。Ｎ１７ＩＺはそれでもＤ５  ＩｇＧを結合できるが、結合しても効力は弱い（図１３を参照）。
【０１８０】
ＣＣＩＺＮ１１ＩＺ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９６）は、ＣＣキメラＮペプチドのＨＩＶ部分をわずか１１個の残基にまで縮小することによりＨＩＶ  Ｎヘリックスの疎水性ポケットに免疫応答を集中させることを目標として設計された。さらに短縮されたコイルドコイルを安定化させるために、もう８個のＩＺ残基をカルボキシ末端に付加した。これは、底部（先端）からの認識により、コイルドコイルの１つのエッジのみでＨＩＶ部分を標的とする免疫応答を回避することもできる。ＣＣＩＺＮ１１ＩＺの共有結合的に安定化した形態（ＣＣＩＺＮ１１ＩＺ）３は、抗ウイルスアッセイにおいて高い活性を示し、ＨＩＶ  ＨＸＢ２に対し０．３ｎＭの効力を持つ（図１３）。ホモ三量体も、Ｄ５  ＩｇＧを結合する（図１３）。
【０１８１】
Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ骨格（Ｓｕｚｕｋｉら、１９９８年、上記、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９）の未修飾部分を骨格として持つ新しいペプチドＳＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９７）が調製され、ここでは「ＳＺ」と呼ぶ（ＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１２）。比較すると、本明細書で説明されているＩＺ骨格は、縮重を回避するために変異を加えたＳｕｚｋｉ骨格に基づく（上で説明されている）。ＳＺＮ１７は、前記変異が三量体コイルドコイルの不安定にする可能性があるか試験するために調製された。ＳＺＮ１７の安定性を、ＩＺＮ１７の安定性と比較したが、そのために、２Ｍの塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）の存在下で、熱変性分析を実行した。ＩＺＮ１７に対する２ＭのＧｄｎＨＣｌ中の熱変性の中間点は、６１．５℃である。ＳＺＮ１７は、ＩＺＮ１７よりも安定していることが証明されており、これは、２ＭのＧｄｎＨＣｌにおける熱変性の中間点が９０℃よりも高いことを示している。ＳＺＮ１７は、さらに、比較的強い抗ウイルス活性を示し、ＩＣ５０は、説明されている単細胞感染アッセイにおけるＨＩＶ  ＨＸＢ２に対し１．５であった（図１３）。ＳＺ骨格の安定性が明らかに高いので、短いＳＺ骨格領域を持つキメラＮペプチド（例えば、１０〜１７個のアミノ酸からなる）を生成することができるが、ただし、前記ペプチドはＨＩＶの安定した表現（例えば、Ｓ１７Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）、Ｓ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１））を保持する。
【０１８２】
Ｓｕｚｕｋｉ（「ＳＺ」）骨格に基づく短いＣＣキメラＮペプチドＣＣＳ１７Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１００）が調製された。すでに説明されているのと同じ条件を使用して共有結合三量体型（ＣＣＳ１７Ｎ１７）３を生成した。円偏光二色性分光法により三量体コイルドコイルを分析して、二次構造内容の推定を行い、熱変性研究によりこれの安定性を評価した。（ＣＣＳ１７Ｎ１７）３は、非常に安定しており、２Ｍの塩酸グアニジンの存在下であっても、融点は９０℃を超える。「ＳＺ」は、さらにＳ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０１）で最小にされた。この最小の骨格ペプチドは、ＣＤによる熱変性実験からわかるように非常に安定しており、２Ｍの塩化グアニジンの存在下で約６０℃の溶融温度を示した。対照として、ＩＺ骨格に基づく類似の構造（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３は、溶融温度がｐＨ７．３の単純緩衝液中で６０℃の場合にかなり低い安定性を示した。
【０１８３】
免疫応答をＯＭＰＣなどの免疫原担体に抱合されることもできるペプチド模倣薬のＨＩＶ部分に集中させやすくする必要最低限度の安定したペプチド構造を定義するために、「Ｓ１０」骨格配列（ＩＥＫＫＩＥＡＩＥＫ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）を３つの残基中で変異させ、全体的なｐＩが３〜５の範囲であるＮ１７由来のペプチドを実現した。ｐＩがこの範囲内にあるペプチドは、ＯＭＰＣ抱合により適していることが示されている（上記参照）。Ｓ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）骨格の７回繰り返しの位置「ｃ」および「ｆ」にある２つのアミノ酸残基をグルタミン酸残基に変異させたが、ヘリックス間界面（Ｇｌｕ−Ｌｙｓ結合）の位置関係から「ｅ」および「ｇ」位置はそのままにした。これにより、ｐＩが４．２であるペプチド構成Ｅ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）が生成されたが、この値はＯＭＰＣへの抱合の適切な候補値である。
【実施例１１】
【０１８４】
チオエーテル結合によるペプチド模倣薬の共有結合的安定化
Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７（表７のペプチド２）の合成−ＧＧＧＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０４）は、ＩＺＮ１７についてすでに説明されているのと同じプロトコルに従って合成された（実施例１を参照）。ブロモアセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水ブロモ酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。原料ペプチド、Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７（表７のペプチド２）は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣにより得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、５１０６Ｄａであり、見つかったＭＷは、５１０６Ｄａであった。
【０１８５】
ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（表７のペプチド１）の合成−ＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）は、ＩＺＮ１７についてすでに説明されているのと同じプロトコルに従って最初に合成された。Ｔｔｄｓ（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカミンコハク酸（−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２）２−ＣＯ−）との反応は、等モル量のＤＩＰＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）で活性化された３倍過剰量のＴｔｄｓと、３時間反応させることにより実行された。Ｎ末端残基Ｃ（Ｆｍ）をＢｏｃ−Ｃｙｓ（Ｆｍ）−ＯＨとしてアシル化した。原料ペプチド、Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣにより得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、５７１８Ｄａであり、見つかったＭＷは、５７１８Ｄａであった。
【０１８６】
ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３の合成−チオエーテル結合の形成による共有結合三量化−精製されたペプチド前駆体（４５ｍｇ）、Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７（表７のペプチド２）を濃度０．８３ｍｇ／ｍＬの６Ｍ塩化グアニジン、０．２５Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に、他のペプチド前駆体ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（表７のペプチド１）（１９ｍｇ、０．３５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。２つのペプチド前駆体の実際のモル比は、２．６：１（Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７：ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７）であった。三量化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。これらのクロマトグラフィ条件の下でＢｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７は、ｔＲ＝１３．１７’で溶出し、ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７は、ｔＲ＝１４．１５’で溶出した。チオエーテル形成反応は滑らかに進行した。２時間後に、２つの生成物が形成された。主ピークは、ｔＲ＝１７．３９’で溶出し、その質量がアセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７ペプチド鎖へのチオエーテル結合を介して連結された１つのＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７ペプチド鎖を含む１つの分子に対応する、二量体種（１つのチオエーテル結合が形成される）に対応する。第２の生成物はｔＲ＝１７．８’で溶出し、２つのアセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７ペプチド鎖への２つのチオエーテル結合を介して連結された１つのＣ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７ペプチド鎖を含む１つの分子に対応していた。この二量体種を一晩かけて反応させて三量体生成物ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３を形成した。三量化反応の全収量は、９０％を超えた。溶液に、ＴＦＡ  １００μＬを加え、この溶液を、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、０〜４０％（５分間）−６０％（３０分間）、流量８０ｍＬ／分であった。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で４０％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。予想ＭＷは、１５７６６Ｄａであるが、見つかったＭＷは、１５７６７Ｄａであった。
【０１８７】
ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３のＮＨ２末端システインを脱保護してＮＨ２−Ｃ（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３を形成する−精製されたコイルドコイル前駆体ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３を濃度５ｍｇ／ｍｌの１０％ピペリジンＤＭＦ溶液でインキュベートした。溶液は、ＴＦＡの添加により急冷され、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、１５５８９Ｄａであり、見つかったＭＷは、１５５８９Ｄａであった。
【０１８８】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（表７のペプチド３）の合成−ＣＣＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０３）は、ＩＺＮ１７についてすでに説明されているのと同じプロトコルに従って合成された。Ｔｔｄｓ（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカミンコハク酸（−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２）２−ＣＯ−）との反応は、等モル量のＤＩＰＣ（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド）およびＨＯＢｔ（１−ヒドロキシベンゾトリアゾール）で活性化された３倍過剰量のＴｔｄｓと、３時間反応させることにより実行された。Ｎ末端残基Ｃ（Ａｃｍ）をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨとしてアシル化した。Ｆｍｏｃ−基の脱保護の後、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドをアセチル化した。原料ペプチド、ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（表７のペプチド３）は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣにより得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、３５％〜５０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、５２５３Ｄａであり、見つかったＭＷは、５２５４Ｄａであった。
【０１８９】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３の合成−チオエーテル結合の形成による共有結合三量化−精製されたペプチド前駆体（３６．５ｍｇ）、Ｂｒ−アセチル−ＩＺＮ１７（表７のペプチド２）を濃度１．２６ｍｇ／ｍＬの６Ｍ塩化グアニジン、０．２５Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解した。この溶液に、他のペプチド前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（表７のペプチド３）（１５ｍｇ、０．７１ｍｇ／ｍＬ）を加えた。２つのペプチド前駆体のモル比は、２．６：１（Ｂｒ−アセチル−ＩＺＮ１７：ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７）であった。三量化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。チオエーテル形成反応は滑らかに進行した。１時間後に、２つの生成物が形成され、主ピークは、ｔＲ＝１５．９’で溶出し、その質量が２つのＢｒ−アセチル−ＩＺＮ１７ペプチド鎖への２つのチオエーテル結合を介して連結された１つのａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７ペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応している三量体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮｌ７）３（２つのチオエーテル結合が形成されている）に対応していた。第２の生成物はｔＲ＝１４．５’で溶出し、１つのＢｒ−アセチル−ＩＺＮ１７ペプチド鎖への１つのチオエーテル結合を介して連結された１つのａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７ペプチド鎖を含む１つの分子に対応していた。この二量体種を一晩かけて反応させて三量体生成物ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３を形成した。三量化反応の全収量は、９０％を超えた。溶液に、ＴＦＡ  １００μＬを加え、この溶液を、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により直接精製した。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で４５％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。予想ＭＷは、１５７００Ｄａであったが、見つかったＭＷは、１５７０２Ｄａであった。
【０１９０】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３のＮＨ２末端システインを脱保護してａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３を形成する−精製されたコイルドコイル前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３を、ＴＦＡ、アニソール２％、および５０当量のＡｇＯＴｆ（トリフルオロメタンスルホン酸銀）により濃度２０ｍｇ／ｍｌ、４℃で３時間かけて溶解した。氷で冷やした乾燥エーテルを反応混合物に加えて、遠心分離機により沈殿物を分離した。沈殿物を氷で冷やした乾燥エーテルにより２回洗浄した。ペプチドは、Ｈ２Ｏ／アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ中に再溶解され、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、１５５８９Ｄａであり、見つかったＭＷは、１５５８９Ｄａであった。
【０１９１】
Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＳ１７Ｎ１７（表７のペプチド５）の合成−ＧＧＧＳ１７Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０６）は、ＩＺＮ１７についてすでに説明されているのと同じプロトコルに従って合成された（実施例１を参照）。ブロモアセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水ブロモ酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料Ｂｒ−アセチル−Ｓ１７Ｎ１７は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により直接精製された。ＧＰＣにより得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜５５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、４２７９Ｄａであり、見つかったＭＷは、４２７９Ｄａであった。
【０１９２】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＳ１７Ｎ１７（表７のペプチド４）の合成−ＣＣＣＳ１７Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０５）は、ＩＺＮ１７についてすでに説明されているのと同じプロトコルに従って合成された。Ｎ末端残基Ｃ（Ａｃｍ）をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨとしてアシル化した。Ｆｍｏｃ−基の脱保護の後、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドをアセチル化した。原料ペプチド、ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＳ１７Ｎ１７は、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製された。ＧＰＣにより得られたプールされた留分（純度７０％）は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜５５％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、４０％〜６０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、４８２６Ｄａであり、見つかったＭＷは、４８２６Ｄａであった。
【０１９３】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３の合成−チオエーテル結合の形成による共有結合三量化−精製されたペプチド前駆体（６４ｍｇ）、Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＳ１７Ｎ１７（表７のペプチド５）を濃度１０ｍｇ／ｍＬの６Ｍ塩化グアニジン、０．２５Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ６．６ｍＬ中に溶解した。この溶液に、他のペプチド前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＳ１７Ｎ１７（表７のペプチド４）（３３ｍｇ、５ｍｇ／ｍＬ）を加えた。２つのペプチド前駆体のモル比は、２．２：１（Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＳ１７Ｎ１７：ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＳ１７Ｎ１７）であった。三量化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。チオエーテル形成反応は滑らかに進行した。１時間後に、２つの生成物が形成され、主ピークは、ｔＲ＝１６．９７’で溶出し、その質量が２つのＢｒ−アセチル−ＧＧＧＳ１７Ｎ１７ペプチド鎖への２つのチオエーテル結合を介して連結された１つのａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＳ１７Ｎ１７を含む１つの分子の質量に対応している三量体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＳ１７Ｎｌ７）３（２つのチオエーテル結合が形成されている）に対応している。第２の生成物はｔＲ＝２１．６’で溶出し、１つのＢｒ−アセチル−ＧＧＧＳ１７Ｎ１７ペプチド鎖への１つのチオエーテル結合を介して連結された１つのａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＳ１７Ｎ１７を含む１つの分子に対応している。この二量体種を一晩かけて反応させ、三量体生成物ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３を形成する。三量化反応の全収量は、９０％を超える。溶液に、ＴＦＡ  １００μＬを加え、この溶液を、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により直接精製した。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で４５％〜６０％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。予想ＭＷは、１３２２２Ｄａであるが、見つかったＭＷは、１３２２１Ｄａであった。
【０１９４】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３のＮＨ２末端システインを脱保護してａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３を形成する−精製されたペプチド前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３（１５ｍｇ）を、氷酢酸、アニソール２％、および５０当量のＡｇＯＴｆ（トリフルオロメタンスルホン酸銀）により濃度２０ｍｇ／ｍＬ、４℃で、１０分間、溶解した。Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（５０／５０）６００μｌを反応混合物に加え、この溶液を、溶離液として３０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量２ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）に直接充填した。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で４５％〜６５％Ｂ（２０分）−８０％（３分）、流量１ｍＬ／分であった。理論的平均ＭＷは、１３１５０Ｄａであり、見つかったＭＷは、１３１５０Ｄａであった。
【０１９５】
ａｃ−Ｃ−（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３のＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｇｅｌへの共有結合固定化−ＳｕｌｆｏＬｉｎｋ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｇｅｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｃａｔ．Ｎｏ．：４４８９５）２ｍＬを、１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨは８．２に調整）８ｍＬで洗浄した。チオエーテル結合を介したａｃ−Ｃ−（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３、共有結合三量体１２ｍｇを、ペプチド濃度７．２ｍｇ／ｍＬで１００ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨは８．２に調整）１．６６８ｍＬに溶解した。ペプチド溶液を、樹脂上に充填し、カラムを１５分間軽く混合し、一晩、室温でインキュベートした。未結合ペプチドを含む溶液をカラムから排出して、緩衝液７ｍＬで洗浄した。排出されたペプチド溶液およびカラム洗浄溶液を回収してまとめ、カップリング後にペプチド含量を定量した。カップリング効率の定量をカップリング工程の前後にペプチド溶液のＨＰＬＣ／吸収度分析により評価したが、その際に、カラム洗浄希釈液を考慮した。ペプチド量の５０％低減が観察され、これは、ペプチド６ｍｇがカラムに共有結合されたことを示している。カラムをさらに緩衝液２ｍｌで洗浄したが、この溶出液中、ペプチドの痕跡はＨＰＬＣで検出されなかった。ゲル上の未反応結合部位は、緩衝液中、０．０５Ｍのシステイン溶液２ｍＬを使用し、３０分間、室温で、インキュベートすることにより遮断された。次いで、カラムを２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）１５ｍＬで洗浄し、４℃で保管した。
【０１９６】
Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１０Ｎ１７（表７のペプチド６）の合成−ＧＧＧＥ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１０）は、ＩＺＮ１７についてすでに説明されているのと同じプロトコルに従って合成された。ブロモアセチル化反応は、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水ブロモ酢酸と反応させることによりペプチドアセンブリの終わりに実行された。ペプチド原料Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１０Ｎ１７を準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜６０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、５５％〜７０％、１５分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、３５２７Ｄａであり、見つかったＭＷは、３５２７Ｄａであった。
【０１９７】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１０Ｎ１７（表７のペプチド７）の合成−ＣＣＣＥ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０９）は、ＩＺＮ１７についてすでに説明されているのと同じプロトコルに従って合成された。Ｎ末端残基Ｃ（Ａｃｍ）をＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨとしてアシル化した。Ｆｍｏｃ−基の脱保護の後、ＤＭＦ中で１０倍過剰量の無水酢酸と反応させることによりペプチドをアセチル化した。ペプチド原料ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１０Ｎ１７を準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、４５％〜６０％、２０分間、流量８０ｍＬ／分であった。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。使用された溶離液Ｂの勾配は、５０％〜７０％、２０分間−８０％、３分間であった。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられた。理論的平均ＭＷは、４０７３Ｄａであり、見つかったＭＷは、４０７３Ｄａであった。
【０１９８】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３の合成−チオエーテル結合の形成による共有結合三量化−精製されたペプチド前駆体、Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１０Ｎ１７（表７のペプチド６）（５７ｍｇ）を、６Ｍ塩化グアニジン、０．２５Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ  ６．０ｍＬ中に溶解した。この溶液に、他のペプチド前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１０Ｎ１７（表７のペプチド７）（３０ｍｇ）を加えた。２つのペプチド前駆体のモル比は、２．２：１（Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１０Ｎ１７：ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１０Ｎ１７）であった。三量化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターした。使用された溶離液Ｂの勾配は、５０％〜８０％Ｂ（２３分）、流量１ｍＬ／分であった。チオエーテル形成反応は滑らかに進行した。２時間後、質量が２つのＢｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１０Ｎ１７ペプチド鎖への２つのチオエーテル結合を介して連結された１つのａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１０Ｎ１７を含む１つの分子の質量に対応している、ｔＲ＝１９．８’で溶出する、三量体、ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−（ｔｈｉｏＥ１０Ｎｌ７）３（２つのチオエーテル結合が形成されている）に対応している主生成物の定量的形成を観察した。三量化反応の全収量は、９０％を超える。溶液に、ＴＦＡ  １００μＬを加えた。これらの条件において、遠心分離機により分離された三量体生成物の沈殿が観察された。上清を取り除いた後、沈殿物を０．１％  ＴＦＡを含有する水溶液で２回洗浄した。ペプチドペレットを、水とアセトニトリル５０／５０に溶かし、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍにより分析した。予想ＭＷは、１３２２２Ｄａであるが、見つかったＭＷは、１３２２１Ｄａ凍結乾燥であった。
【０１９９】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３を脱保護してａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３を形成する−精製されたペプチド前駆体、ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３（２０ｍｇ）を、氷酢酸、アニソール２％、および５０当量のＡｇＯＴｆ（トリフルオロメタンスルホン酸銀）により濃度２０ｍｇ／ｍＬ、４℃で、１０分間、溶解した。Ｈ２Ｏ／アセトニトリル（４０／６０）６００μｌを反応混合物に加え、この溶液を、溶離液として６０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）に直接充填した。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析したが、その際に、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用した。使用された溶離液Ｂの勾配は、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で６０％〜８０％Ｂ（２３分）、流量１ｍＬ／分であった。理論的平均ＭＷは、１０８９４Ｄａであり、見つかったＭＷは、１０８９４Ｄａであった。
【０２００】
ａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３のＯＭＰＣへの抱合−グラム陰性菌からＯＭＰＣを精製するさまざまな方法が考案されている（Ｆｒａｓｃｈら、１９９７年、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４０：８７頁、Ｆｒａｓｃｈら、１９７８年、Ｊ  Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１４７：６２９頁、米国特許第４，７０７，５４３号、Ｈｅｌｔｉｎｇら、１９８１年、Ａｃｔａ  Ｐａｔｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｓｃａｎｄ．Ｓｅｃｔ．Ｃ．８９：６９頁、および米国特許第４，２７１，１４７号）。髄膜炎菌Ｂ（Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｂ）改善外膜タンパク質複合体（ｉＯＭＰＣ）は、Ｆｕ、米国特許第５，４９４，８０８号により説明されているような当業でよく知られている技術を使用して得ることができる。
【０２０１】
髄膜炎菌改善外膜タンパク質複合体（ｉＯＭＰＣ）溶液（７．１３ｍｇ／ｍｌ）１．０ｍＬに対し、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３（０．１１４ｍＬ）を加えて、最終濃度５０ｍＭ（ｐＨ８．５）にした。これに、ヘテロ二機能性架橋剤スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）の２０μＭ溶液０．３０８ｍＬを２倍過剰量（ＯＭＰＣのリシン残基、０．４２μｍｏｌリシン／ｍｇ  ＯＭＰＣタンパク質に関して）で一滴ずつ加えた。０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ０．０３４ｍＬをさらに加えてｐＨを再調節した。４℃で１時間、暗所において溶液をエージング処理した後、１ＭのＮａＨ２ＰＯ４溶液（１４．８μｌ）を加えてｐＨを中性に下げた。この溶液を、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｓｅｒ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）を使用し、２０Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、２ｍＭ  ＥＤＴＡエチレンジアミン四酢酸）２Ｌの緩衝液を６回交換して（２時間毎に）４℃で透析した。透析後、合計１．５７ｍＬの活性化ＯＭＰＣ（ａＯＭＰＣ）が回収された。
【０２０２】
Ｃｙｓ含有ペプチドａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３の１．９ｍｇ／ｍｌ原液を、脱気した０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．３）溶液中で調製した。沈殿を引き起こすことなく、ａＯＭＰＣに安全に組み込めるペプチドリガンドの最大量を定義するために、最初に抱合反応が小規模な試験で行われ、そこでａＯＭＰＣは、多量のペプチドリガンドでインキュベートされた。ＯＭＰＣに組み込めるマレイミド基の最大数は、全ＯＭＰＣ上のリシン残基、つまり０．４２μｍｏｌのリシン／ｍｇ  ＯＭＰＣにより制限される。ＯＭＰＣに対し４０×１０６Ｄａの平均ＭＷを考えた場合、これは、１６，０００リシンモル／ＯＭＰＣモルに対応する。これらのうち、一部のみがｓＳＭＣＣ（最大３５％まで）により活性化することができ、これは、約５０００モルの達成可能最大ペプチド負荷に対応する。したがって、ａＯＭＰＣは、ＯＭＰＣモル毎に、モル過剰量５００、１０００、２０００、３０００、４０００のペプチドリガンドでインキュベートされた。１時間後、試料をａＯＭＰＣ試料と比較して、沈殿または濁度増大の有無を調べた。４．２５という都合のよいｐＩを持つ、ａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３の場合、使用されるリガンドの最高のモル過剰量、４０００モル／ＯＭＰＣモルまで沈殿も濁度増大も確認されなかった。
【０２０３】
これらの観察結果に基づいて大規模反応を実行し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．３）中ａＯＭＰＣ  １ｍＬ（４．６５ｍｇ）にペプチド原液２．６４ｍＬを、軽くかき混ぜながら一滴ずつ加えたが、これは、ペプチドモル／ＯＭＰＣモルの４０００モル過剰量に対応する。マレイミド活性化ＯＭＰＣ溶液の試料は、最終抱合体のペプチド負荷の定量のためブランクとして保持された。暗所において、４℃で、１７時間の間、抱合反応混合物に対しエージング処理をした。ＯＭＰＣ上の残留マレイミド基を、暗所において、４℃で、１時間の間、μメルカプトエタノールで急冷して、最終濃度１５ｍＭ（添加全体積３．８μＬ）にした。溶液に対し、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｓｅｒにより、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）１Ｌを使用し、４℃で、４×、４時間／交換の透析を行い、未抱合ペプチドおよびβ−メルカプトエタノールを取り除いた。濃度を、ロウリーアッセイ（Ｌｏｗｒｙら、１９５１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５頁）により定量したところ、ＯＭＰＣ−（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３に対し０．９８ｍｇ／ｍＬであることが明らかになった。抱合体およびａＯＭＰＣ試料を、真空にした密封ガラス管内で、７０時間の間、１１０℃で、共沸ＨＣｌにより加水分解した。アミノ酸分析によりアミノ酸組成物が定量された。ＯＭＰＣタンパク質へのペプチドの抱合負荷は、抱合体アミノ酸組成物とＯＭＰＣ担体およびペプチドリガンドの両方とを比較し、さらにデータの重回帰最小二乗分析により定量された（Ｓｈｕｌｅｒら、１９９２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５６：１３７〜１４９頁）。抱合体ＯＭＰＣ−（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３については、ペプチド対ＯＭＰＣモルのモル比、２２６４が得られた。
【０２０４】
Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１７ＧｌｕＮ１７の合成。（表７のペプチド８）−Ｐｉｏｎｅｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でペプチドを固相により合成した。使用した樹脂は、１％架橋したＦｍｏｃ−Ｌｉｎｋｅｒ  ＡＭ−Ｃｈａｍｐｉｏｎ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、修飾されたＲｉｎｋリンカーｐ−［（Ｒ，Ｓ）−α−［９Ｈ−フルオレン−９−イル−メトキシホルムアミド］−２，４−ジメトキシベンジル］−フェノキシ酢酸により誘導体化されたＰＥＧ−ＰＳベース樹脂である（Ｒｉｎｋ，Ｈ．、１９８７年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．２８：３７８７〜３７８９頁、Ｂｅｒｎａｔｏｗｉｃｚ，Ｍ．Ｓ．ら、１９８９年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３０：４６４５〜４６６７頁）。樹脂遊離アミノ酸基上で４倍過剰量の活性化アミノ酸を使用して、９０分間、すべてのアシル化反応を実行した。アミノ酸は、等モル量のＨＢＴＵ（２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート）および２倍モル過剰量のＤＩＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン）により活性化された。標準のＦｍｏｃ／ｔ−Ｂｕ化学反応が使用される。側鎖保護基は、グルタミン酸（Ｇｌｕ）およびトレオニン（Ｔｈｒ）に対するｔｅｒｔ−ブチル、システイン（Ｃｙｓ）およびグルタミン（Ｇｌｎ）に対するトリチル、リシン（Ｌｙｓ）およびトリプトファン（Ｔｒｐ）に対するｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル、アルギニン（Ａｒｇ）に対する２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニルである。アミノ酸アセンブリの終わりに、Ｎ末端基のブロモアセチル化が、ＤＭＦ中１０倍過剰量の無水ブロモ酢酸との反応により行われる。Ｂｒ−アセチル−Ｅ１７ＧｌｕＮ１７の合成が終わったら、乾燥ペプチド樹脂を８８％のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、５％のフェノール、および２％のトリイソプロピルシラン、および５％の水（Ｓｏｌｅ，Ｎ．Ａ．およびＧ．Ｂａｒａｎｙ、１９９２年、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５７：５３９９〜５４０３頁）により、室温で１．５時間かけて処理する。樹脂を濾過し、溶液を冷たいメチル−ｔ−ブチルエーテルに加え、ペプチドを沈殿させる。遠心分離機にかけた後、ペプチドペレットを新鮮な冷たいメチル−ｔ−ブチルエーテルで洗浄し、不要な有機物を取り除く。このプロセスを２回繰り返す。最終のペレットを乾燥させ、Ｈ２Ｏ、２０％アセトニトリル中に再懸濁させ、凍結乾燥させる。
【０２０５】
ペプチド原料Ｂｒ−アセチルＧＧＧＥ１７ＧｌｕＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）は、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により、溶離液として６０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡを使用して、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂を充填した７００×２６ｍｍカラム上で精製される。典型的実験では、ペプチド原料９００ｍｇを溶離液２５ｍＬ中に溶解し、流量１ｍＬ／分でカラムに直接充填する。溶出留分の分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＢｅｃｋｍａｎ  ＨＰＬＣ上で実行する。純度に基づいて、留分をプールし、さらに、逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、また溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用する。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられる。
【０２０６】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７（表７のペプチド９）の合成−ペプチドは、Ｂｒ−アセチルＧＧＧＥ１７Ｇ１ｕＮ１７について説明されているように固相上で組み立てられる。Ｔｔｄｓ（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカミンコハク酸（−ＮＨ−（ＣＨ２）３−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）３−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ２）２−ＣＯ−）との反応は、等モル量のＨＢＴＵおよび２倍モル過剰量のＤＩＥＡで活性化された４倍過剰量のＴｔｄｓと、２時間反応させることにより実行された。Ｎ末端残基Ｃ（Ａｃｍ）は、上のＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＯＨと同じ条件でアシル化され、次いで、Ｆｍｏｃ脱保護の後、ペプチドは、ＤＭＦ中の１０倍過剰量の無水酢酸との反応によりアセチル化される。前の実施例について説明したように樹脂から切断した後、原料ペプチド、アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７（表７のペプチド９）は、溶離液として６０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製される。ＧＰＣにより得られたプールされた留分は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製される。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられる。
【０２０７】
アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）３の合成−チオエーテル結合の形成による共有結合三量化−精製されたペプチド前駆体、Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１７ＧｌｕＮ１７（表７のペプチド８）を濃度５ｍｇ／ｍＬの６Ｍ塩化グアニジン、０．２５Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解する。この溶液に、他のペプチド前駆体アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７（表７のペプチド９）を加える。２つのペプチド前駆体の実際のモル比は、２．２：１（Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１７ＧｌｕＮ１７：アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７）である。三量化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターされる。２時間後、質量が２つのアセチル−ＧＧＧＥ１７ＧｌｕＮ１７ペプチド鎖への２つのチオエーテル結合を介して連結された１つのアセチル−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７ペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応する１つの生成物が形成される。溶液に、ＴＦＡ  ２０μＬを加え、この溶液を、溶離液として６０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により直接精製する。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析されるが、その際に、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用する。
【０２０８】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）３のアセチル化システインを脱保護してａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）３を形成する−精製されたコイルドコイル前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）３を、ＴＦＡ、アニソール２％、および５０当量のＡｇＯＴｆ（トリフルオロメタンスルホン酸銀）により濃度２０ｍｇ／ｍｌ、４℃で３時間かけて溶解する。氷で冷やした乾燥エーテルを反応混合物に加えて、遠心分離機により沈殿物を分離する。沈殿物を氷で冷やした乾燥エーテルにより２回洗浄する。ペプチドは、Ｈ２Ｏ／アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ中に再溶解され、溶離液として６０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製される。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられる。
【０２０９】
Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥＮ１７（表７のペプチド１０）の合成−このペプチドは、Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１７ＧｌｕＮ１７（表７のペプチド８）についてすでに説明されているようにＰｉｏｎｅｅｒ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上で固相により合成される。ペプチド原料Ｂｒ−アセチルＧＧＧＥＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）は、ゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により、溶離液として６０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡを使用して、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂を充填した７００×２６ｍｍカラム上で精製される。典型的実験では、ペプチド原料９００ｍｇを溶離液２５ｍＬ中に溶解し、流量１ｍＬ／分でカラムに直接充填する。溶出留分の分析ＨＰＬＣを、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＢｅｃｋｍａｎ  ＨＰＬＣ上で実行する。純度に基づいて、留分をプールし、さらに、逆相ＨＰＬＣにより精製したが、その際に準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）を使用し、また溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用する。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム分光計上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられる。
【０２１０】
Ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７（表７のペプチド１１）の合成−ペプチドは、Ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７（表７のペプチド９）について説明されているように固相上で組み立てられる。前の実施例について説明したように樹脂から切断した後、原料ペプチド、アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７（表７のペプチド１１）は、溶離液として６０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製される。ＧＰＣにより得られたプールされた留分は、さらに、準分取水ＲＣＭ  Ｄｅｌｔａ−Ｐａｋ（商標）Ｃ−４カートリッジ（４０×２００ｍｍ、１５μｍ）上で、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、逆相ＨＰＬＣにより＞９５％の純度に精製される。ペプチド原料、溶出留分、および精製済みプールの分析は、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ、３００Ａ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上で、流量を１ｍＬ／分とし、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、分析ＨＰＬＣにより実行された。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられる。
【０２１１】
アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥＺＮ１７）３の合成−チオエーテル結合の形成による共有結合三量化−精製されたペプチド前駆体、Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥＺＮ１７（表７のペプチド１０）を濃度５ｍｇ／ｍＬの６Ｍ塩化グアニジン、０．２５Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ８．５）、２ｍＭ  ＥＤＴＡ中に溶解する。この溶液に、他のペプチド前駆体アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７（表７のペプチド１１）を加える。２つのペプチド前駆体の実際のモル比は、２．２：１（Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥＺＮ１７：アセチル−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７）である。三量化反応は、Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  ＰｌａｔｆｏｒｍをＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともに使用し、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用して、ＬＣ−ＭＳ分析によりモニターされる。２時間後、質量が２つのアセチル−ＧＧＧＥＺＮ１７ペプチド鎖への２つのチオエーテル結合を介して連結された１つのアセチル−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７ペプチド鎖を含む１つの分子の質量に対応する１つの生成物が形成される。溶液に、ＴＦＡ  ２０μＬを加え、この溶液を、溶離液として６０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により直接精製する。溶出留分は、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ、Ｊｕｐｉｔｅｒ  Ｃ４カラム（１５０×４．６ｍｍ、５μｍ）とともにＨＰＬＣにより分析されるが、その際に、正モード（ＥＳ＋）のＬＣ−ＭＳ  Ｗａｔｅｒｓ−Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ上で、溶離液として（Ａ）０．１％  ＴＦＡ水溶液および（Ｂ）０．１％  ＴＦＡアセトニトリル溶液を使用する。
【０２１２】
ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥＺＮ１７）３のアセチル化システインを脱保護してａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＥＺＮ１７）３を形成する−精製されたコイルドコイル前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥＺＮ１７）３を、ＴＦＡ、アニソール２％、および５０当量のＡｇＯＴｆ（トリフルオロメタンスルホン酸銀）により濃度２０ｍｇ／ｍｌ、４℃で３時間かけて溶解する。氷で冷やした乾燥エーテルを反応混合物に加えて、遠心分離機により沈殿物を分離する。沈殿物を氷で冷やした乾燥エーテルにより２回洗浄する。ペプチドは、Ｈ２Ｏ／アセトニトリル、０．１％  ＴＦＡ中に再溶解され、溶離液として６０％アセトニトリル水溶液、０．１％ＴＦＡ、流量１ｍＬ／分を使用し、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＨＷ−５０Ｓ樹脂（７００×２６ｍｍカラム）上でゲル浸透クロマトグラフィ（ＧＰＣ）により精製される。精製されたペプチドは、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  ＬＣＺプラットフォーム上でエレクトロスプレー質量分析法により特徴付けられる。
【０２１３】
ａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）３およびａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＥＺＮ１７）３のＯＭＰＣへの抱合−グラム陰性菌からＯＭＰＣを精製するさまざまな方法が考案されている（Ｆｒａｓｃｈら、１９９７年、上記、Ｆｒａｓｃｈら、１９７８年、上記、米国特許第４，７０７，５４３号、Ｈｅｌｔｉｎｇら、１９８１年、上記、および米国特許第４，２７１，１４７号）。髄膜炎菌Ｂ改善外膜タンパク質複合体（ｉＯＭＰＣ）は、Ｆｕ、米国特許第５，４９４，８０８号により説明されているような当業でよく知られている技術を使用して得ることができる。
【０２１４】
髄膜炎菌改善外膜タンパク質複合体（ｉＯＭＰＣ）溶液（７．１３ｍｇ／ｍＬ）１．３６ｍＬに対し、０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３（０．１５１ｍＬ）を加えて、最終濃度５０ｍＭ（ｐＨ８．５）にする。これに、ヘテロ二機能性架橋剤スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）の２０μＭ溶液０．４０７ｍＬを２倍過剰量（ＯＭＰＣのリシン残基、０．４２μｍｏｌリシン／ｍｇ  ＯＭＰＣタンパク質に関して）で一滴ずつ加える。０．５Ｍ  ＮａＨＣＯ３  ０．０４５ｍＬをさらに加えてｐＨを再調節する。４℃で１時間、暗所において溶液をエージング処理した後、１ＭのＮａＨ２ＰＯ４溶液（１６μｌ）を加えてｐＨを中性に下げる。この溶液を、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｓｅｒ（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カリフォルニア州）を使用し、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−エタンスルホン酸）、２ｍＭ  ＥＤＴＡエチレンジアミン四酢酸）２Ｌの緩衝液を６回交換して（２時間毎に）４℃で透析する。透析後、合計１．９ｍＬの活性化ＯＭＰＣ（ａＯＭＰＣ）を回収する。
【０２１５】
２つのＣｙｓ含有ペプチドａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）３の０．５ｍｇ／ｍｌ原液を、脱気した０．１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．３）溶液中で調製する。沈殿を引き起こすことなく、ａＯＭＰＣに安全に組み込めるペプチドリガンドの最大量を定義するために、最初に抱合反応が小規模な試験で行われ、そこでａＯＭＰＣは、多量のペプチドリガンドでインキュベートされる。ＯＭＰＣに組み込めるマレイミド基の最大数は、全ＯＭＰＣ上のリシン残基、つまり０．４２μモルのリシン／ｍｇ  ＯＭＰＣにより制限される。ＯＭＰＣに対し４０×１０６Ｄａの平均ＭＷを考えた場合、これは、１６，０００リシンモル／ＯＭＰＣモルに対応する。これらのうち、一部のみがｓＳＭＣＣ（最大３５％まで）により活性化することができ、これは、約５０００モルの達成可能最大ペプチド負荷に対応する。この場合、ａＯＭＰＣは、ＯＭＰＣモル毎に、モル過剰量１０００、２０００、３０００のペプチドリガンドでインキュベートされる。１時間後、試料をａＯＭＰＣ試料と比較して、沈殿または濁度増大の有無を調べる軽くかき混ぜながらペプチド原液を一滴ずつ加えることにより、大規模な抱合反応を最高のモル過剰量のペプチド／ＯＭＰＣモルで実行する。
【０２１６】
マレイミド活性化ＯＭＰＣ溶液の試料は、最終抱合体のペプチド負荷の定量のためブランクとして保持される。暗所において、４℃で、１７時間の間、抱合反応混合物に対しエージング処理をする。次いで、ＯＭＰＣ上の残留マレイミド基を、暗所において、４℃で、１時間の間、βメルカプトエタノールで急冷して、最終濃度１５ｍＭにする。溶液に対し、３００Ｋ  ＭＷＣＯ  ＤｉｓｐｏＤｉａｌｙｓｅｒにより、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３）１Ｌを使用し、４℃で、４×、４時間／交換の透析を行い、未抱合ペプチドおよびβ−メルカプトエタノールを取り除く。濃度は、ロウリーアッセイにより定量される（Ｌｏｗｒｙら、１９５１年、上記）。抱合体およびａＯＭＰＣ試料を、真空にした密封ガラス管内で、７０時間の間、１１０℃で、共沸ＨＣｌにより加水分解する。アミノ酸分析によりアミノ酸組成物を定量する。ＯＭＰＣタンパク質へのペプチドの抱合負荷は、抱合体アミノ酸組成物とＯＭＰＣ担体およびペプチドリガンドの両方とを比較し、さらにデータの重回帰最小二乗分析により定量される（Ｓｈｕｌｅｒら、１９９２年、上記）。
【０２１７】
結果−複雑な生体分子の合成に関して複数の化学選択的連結反応が提案されている。一般的に、連結反応の化学選択性は、一意的な相互反応基−結合すべきそれぞれのペプチドセグメント内の基を組み込むことにより課される（Ｌｅｍｉｅｕｘ  Ｇ．Ａ．およびＢｅｒｔｏｚｚｉ  Ｃ．Ｒ．、１９９８年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：５０６〜５１３頁、およびＢｏｒｇｉａ，Ｊ．Ａ．およびＦｉｅｌｄｓ  Ｇ．Ｂ．、２０００年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：２４３〜２５１頁）。これらの化学選択的アプローチの１つは、チオエーテル結合の形成を伴う。チオエーテル結合の形成は、求核スルフヒドリルが一方のペプチド／生体分子上に、求電子ブロモアセチルユニットが結合されるべき他方のペプチド／生体分子上にある固有のシステイン残基を含めることにより実行することができる（Ｍｕｉｒ，Ｔ．Ｗ．ら、１９９４年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：７７０１〜７７０８頁、Ｚｅｎｇ，Ｗ．ら、２００１年、Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：３８４３〜３８５２頁、およびＳｃｈｅｌｔｅ，Ｐ．ら、２０００年、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．１１：１１８頁を参照）。
【０２１８】
本明細書では、本発明の三量体コイルドコイル模倣薬の共有結合的安定化の戦略について説明されている。この戦略は、未保護システイン残基の対を含む１つのＣＣキメラＮペプチド鎖とそれぞれさらに求電子性ブロモアセチル部分を含む２つの誘導体化キメラＮペプチドとの間の２つのチオエーテル結合の化学選択的形成に基づく。この実施例では、システイン含有ペプチドは、三量化が完了した後に脱保護できる追加の適当に保護されたシステイン残基を持つ。
【０２１９】
この戦略は、ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３の生成により例示されている。以下の最初の２つのペプチド前駆体が合成された。
【０２２０】
１）ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（表７のペプチド１）：柔軟なスペーサー（−ＧＧ−、他の柔軟なスペーサーが適している）を通じて骨格領域から分離されている２つのシステイン残基および抱合用の保護チオール基を持つ第３のシステイン残基を有するペプチド（フルオレニルメトキシ（Ｆｍ）保護基が使用されているが、他の保護基が適している）、および
２）ブロモアセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７（表７のペプチド２）：柔軟なリンカーを通じて骨格領域から分離されたブロモアセチル部分を有するペプチド（−ＧＧＧ−、他の柔軟なスペーサーが適しているが、ただし、２つの誘導体化キメラＮペプチド鎖と１つのＣＣキメラＮペプチドとの間の２つのチオエーテル結合の形成と親和性があることを条件とする）。
【０２２１】
【表７】
2008501028.tif 000009
【０２２２】
２つのペプチド前駆体ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（表７のペプチド１）およびＢｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７（表７のペプチド２）は、２５ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣＩ緩衝液（ｐＨ８〜８．５）、ＧｕＨＣＩ  ６Ｍ、ＥＤＴＡ  ２ｍＭの脱気した溶液に、それぞれ、１：２．６の濃度比で、溶解された。化学選択的連結反応は、２つのチオエーテル結合の形成とともに進行したが、ただし、Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７ペプチドのそれぞれの臭化物誘導体はＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７ペプチドの２つのシステイン残基のうちの１つと反応する。この化学選択的連結反応は、共有結合的に安定化した三量体ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３を形成する。ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３は、ＨＩＶ−１  ＨＸＢ２（実施例３で説明されているような単細胞感染アッセイ）に対する抗ウイルス活性について試験され、１．１ｎＭのＩＣ５０を持つことがわかったが、これは、共有結合的に安定化したホモ三量体コイルドコイル（ＣＣＩＺＮ１７）３に相当する。
【０２２３】
抱合反応に適した前駆体を用意するために、ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３三量体のＮＨ２末端システイン残基のＦｍ−保護基を取り除く必要がある。脱保護反応は、５ｍｇ／ｍｌの１０％ピペリジンＤＭＦ溶液中でこの三量体をインキュベートすることにより実行された。これらの条件の下で、比較的低い収量の最終生成物ＮＨ２−Ｃ（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３が精製された。したがって、Ａｃｍ（アセトアミドメチル基）をＮＨ２末端システイン残基の保護基として持つ新しい三量体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３が設計された。まず最初に新しいペプチド前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７（表７のペプチド３）が生成され、２つのＢｒ−アセチル−ＧＧＧＩＺＮ１７分子との化学選択的反応が、ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３について説明されているのと同じプロトコルに従って実行され、ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３が生成された。安定化されたコイルドコイルａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３は、ヘテロ三量体のａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７内のＡｃｍ−基の脱保護により合成され、抗ウイルス活性アッセイにおいてＨＩＶ−ＨＸＢ２に対し０．２４ｎＭのＩＣ５０を示した。
【０２２４】
チオエーテル結合により安定化されたＳ１７Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９９）配列に基づく共有結合三量体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３も生成された。チオエーテル結合により安定化された三量体構造を形成できるように、２つのペプチド前駆体Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＳ１７Ｎ１７（表７のペプチド５）およびａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＳ１７Ｎ１７（表７のペプチド４）が合成された。共有結合三量体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３は、ＨＩＶ−１  ＨＸＢ２（実施例３で説明されているような単細胞感染アッセイ）に対する抗ウイルス活性について試験され、０．２７ｎＭのＩＣ５０を持つことがわかったが、これは、共有結合的に安定化した三量体コイルドコイル（ＣＣＳ１７Ｎ１７）３および（ＣＣＩＺＮ１７）３に相当する。
【０２２５】
ＮＨ２末端システイン残基からのアセトアミドメチル基の脱保護により、三量体構造ａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３が生成されたが、これは、担体タンパク質または樹脂に抱合し、抗原特異抗体の精製に適した親和性樹脂を生成する遊離チオール基を持つ。三量体ペプチド模倣薬ａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３は、ＳｕｌｐｈｏＬｉｎｋ−（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３樹脂の調製でうまく使用された。
【０２２６】
チオエーテル結合により安定化されたＥ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）配列に基づく共有結合三量体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３も生成された。チオエーテル結合により安定化された三量体構造を形成できるように、２つのペプチド前駆体Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１０Ｎ１７（表７のペプチド６）およびａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１０Ｎ１７（表７のペプチド７）が合成された。Ｅ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０７）骨格は、Ｓ１０（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１３）骨格の３つのアミノ酸残基を変異させることにより生成された。この結果得られたｐＩが４．２であるＥ１０Ｎ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０８）ペプチドは、ＯＭＰＣ抱合の適切な候補値である。三量体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３は、（ＣＣＳ１０Ｎ１７）３に関して熱変性に対する安定性をさらに増していることを示しており、２Ｍ塩化グアニジンの存在下で、９０℃よりも高い融点を示している。三量体ペプチド前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３を、トリフルオロメタンスルホン酸銀の酢酸溶液で処理して、ＮＨ２末端システイン残基からアセトアミドメチル保護基を取り除いた。遊離チオールの反応性は、マレイミジルビオチン生成物（Ｐｉｅｒｃｅ）との反応により評価され、さらにこれにより、ＥＬＩＳＡによる抗血清スクリーニングに使用されるビオチニル化された（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３ペプチドを調製することができた。次いで、三量体ａｃ−Ｃ（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３を、すでにＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）で活性化されている、マレイミド化されたＯＭＰＣ担体でインキュベートした。さまざまなモル過剰量のペプチドモル／ＯＭＰＣモルを試験したが（例えば、１０００、２０００、３０００、および４０００）、最高の比であっても、沈殿は観察されなかった。したがって、大規模な抱合反応は、４０００モル比に設定された。達成された抱合モル比は、ロウリーアッセイおよびアミノ酸分析により決定されたが、これは、ペプチド／ＯＭＰＣモルの２２６０モルという優れた値を示した。
【０２２７】
２つの三量体ペプチド（ＣＣＳ１０Ｎ１７）３およびａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３を、ＨＩＶ−１  ＨＸＢ２（実施例３で説明されているような単細胞感染アッセイ）に対する抗ウイルス活性について試験したところ、図１３に示されているように、ペプチド（ＣＣＳ１７Ｎ１７）３および（ＣＣＩＺＮ１７）３のような長い骨格を持つ三量体に関して効力がかなり低いことがわかった。
【０２２８】
チオエーテル結合安定化された三量体構造も、ＥＺ−またはＥＺ−類似骨格キメラペプチドを使用して生成することができる（上の実施例６を参照）。例えば、チオエーテル結合により安定化された三量体ペプチド前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥＺＮ１７）３を形成できるように、２つのペプチド前駆体Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥＺＮ１７（表７のペプチド１０）およびａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥＺＮ１７（表７のペプチド１１）を合成することができる。この三量体コイルドコイルの骨格領域は、ＥＺ骨格領域（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２）からなる。同様に、チオエーテル結合により安定化され、短縮されたＥＺ骨格Ｅ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）を持つ三量体ペプチド前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１７Ｎ１７）３を形成できるように、２つのペプチド前駆体Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１７Ｎ１７（表７のペプチド１２）およびａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１７Ｎ１７（表７のペプチド１３）を合成することができる。さらに、チオエーテル結合により安定化され、短縮され変異された（つまり、単一Ｌｙｓ−Ｇｌｕ変異）Ｅ１７類似骨格Ｅ１７Ｇｌｕ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１９）を持つ三量体ペプチド前駆体ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）３を形成できるように、２つのペプチド前駆体Ｂｒ−アセチル−ＧＧＧＥ１７ＧｌｕＮ１７（表７のペプチド８）およびａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＥ１７ＧｌｕＮ１７（表７のペプチド９）を合成することができる。これらのコイルドコイルのＥＺおよびＥＺ類似骨格により、三量体構造とＯＭＰＣとの抱合がしやすくなるが、それは、例えば、ＥＺおよびＥ１７Ｇｌｕ骨格領域とともに表８に示されているように、前記骨格タンパク質があればコイルドコイルの全体的なｐＩを小さくできるからである。これらの三量体前駆体をそれぞれ、トリフルオロメタンスルホン酸銀の酢酸溶液で処理し、ＮＨ２末端システイン残基からアセトアミドメチル保護基を取り除き、チオール基が導入されたペプチド、例えばＣ（ｔｈｉｏＥＺＮ１７）３およびＣ（ｔｈｉｏＥ１７ＧｌｕＮ１７）３、ペプチド５およびペプチド３を形成することができるが、それぞれＮＨ２末端でアセチル化される。これらのチオール基が導入されたペプチドは、マレイミド活性化ＯＭＰＣ担体とのペプチド抱合を調製するために使用することができる。
【０２２９】
【表８】
2008501028.tif 000010
【実施例１２】
【０２３０】
（ＣＣＩＺＮ１７）３を使った免疫付与によるＤ５競合抗体の生成
（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫付与ウサギからの血清はＤ５競合抗体を含有する−６匹のウサギに、ＱＳ２１アジュバントまたは明ばんとＱＳ２１アジュバントの組合せと混合された（ＣＣＩＺＮ１７）３の筋肉注射で免疫を付与した。免疫付与してから約８週間後、これらの動物からの血清試料を試験し、Ｄ５  ＩｇＧ競合抗体の有無について調べた。このような抗体は、血清原料およびタンパク質Ａ精製抗体留分（データは示されていない）内に検出された。いずれの血清原料も精製抗体も、抗ウイルス活性を生じなかった。
【０２３１】
ｇｐ４１細胞外領域の７回繰り返し１（ＨＲ１）領域内に配置された疎水性ポケットと相互作用できる抗体を増やすために、疎水性ポケットを含む異なるペプチドである、５ヘリックス（Ｒｏｏｔ，Ｍ．Ｊ．ら、２００１年、上記）を使用して免疫親和性精製を実行した。複数８週後ブリードからのプールされているウサギ血清にタンパク質Ａクロマトグラフィを実行し、約８００ｍｇの精製ＩｇＧを得た。この物質を５ヘリックスカラム上に浸透させた。カラムをＰＢＳで洗浄し、酸性緩衝液を使用して結合抗体を溶離した。５ヘリックス／Ｄ５−ＦＩＴＣ相互作用アッセイを使用して、洗浄液、貫流、および溶離液を含む、すべてのカラム留分を試験し、Ｄ５競合抗体の有無を調べた。洗浄液は、著しい量のＤ５競合抗体を含まなかったが、複数の貫流および溶離液留分は、検出可能なＤ５競合抗体を含んでいた（図１５Ａを参照）。実際、溶離液留分５および６の中のＤ５競合抗体の濃度は、ＨＩＶ−ＨＸＢ２分離株に対しＤ５  ＩｇＧのＩＣ５０の１０倍に対応していた。
【０２３２】
５ヘリックス上で精製された（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫付与および免疫親和性により顕在化された抗体は、ＨＩＶ−１に対し特異阻害活性を持つ−留分５および６は、１０倍の濃度とし、ＨＩＶ単一サイクル感染アッセイにおいて抗ウイルス活性について試験された（実施例３を参照）。溶離液５および６は両方とも、ＨＩＶ−ＨＸＢ２感染に対する濃度依存の阻害効果を示した（図１５Ｂ、左図を参照）。４〜５μＭのＩＣ５０を精製したこれらの留分（溶離液５−４．１μＭ、溶離液６−５．０μＭ）は、このウイルスアッセイにおけるＤ５  ＩｇＧに比べて約３〜４倍効果が低かった（Ｄ５  ＩｇＧ−１．３５μＭ、図１５Ｂ、左図）。いずれの留分も、ラブドウイルスＶＳＶに由来する異種ウイルスエンベロープで偽型化されたＨＩＶ粒子について試験されたときには阻害活性を生じた（図１５Ｂ、右図）。
【０２３３】
（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫付与により顕在化されたポリクローナルウサギ抗体は、７回繰り返し１領域において形成された疎水性ポケットを結合する−ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎベース（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）アッセイ（実施例４を参照）は、（ＣＣＩＺＮ１７）３顕在化ウサギポリクローナル抗体がＨＲ１疎水性ポケットと相互作用したことを正式に示すように考案された。溶離液５および６に対応する５ヘリックス免疫親和性精製ウサギ抗体は、プールされ、ストレプトアビジンでコーティングされた供与体ビーズおよびタンパク質Ａでコーティングされた受容体ビーズの存在下でビオチニル化５ヘリックスに対し滴定された。これらの後者のビーズは、抗体を特異的に捕捉する。ピーク信号は、１〜１０ｎＭ  ５ヘリックスが２５０μｇ／ｍｌの抗体と組み合わせたときに発生した（図１６Ａ）。これらの結果から、５ヘリックスと相互作用できる抗体の存在が示される。これらの抗体を顕在化するために使用される免疫原（ＣＣＩＺＮ１７）３は５ヘリックスと共通の疎水性ポケットしか持たないので、これらの結果から、これらの留分中の抗体のサブセットが、ＨＲ１疎水性ポケットを相互作用することが示唆される。
【０２３４】
この仮説を直接検証するために、ＨＲ１溝全体を結合するペプチドＣ３４（Ｃｈａｎら、１９９７年、上記）、および疎水性ポケットと特異的に相互作用するＤ１０−ｐ５−２Ｋ（Ｅｃｋｅｒｔら、１９９９年、上記）を、５ヘリックスとのこれらのウサギポリクローナル抗体の結合に干渉する能力について評価した。ウサギ抗体を加える前に、５ヘリックスで高濃度のＣ３４ペプチドをインキュベートすると、５ヘリックスへの抗体の付着の深い阻害が観察された（図１６Ｂ）。効力は小さいが、ペプチドＤ１０−ｐ５−２Ｋ（図１６ＢのＬ−４７２）も、５ヘリックスへの抗体の結合を濃度に応じて抑制することがわかった。陰性対照ペプチド（Ｃ８）では、この相互作用アッセイにおいて、試験された最高濃度で穏やかな効果しかなかった。さらに、（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫付与により顕在化されたウサギポリクローナル抗体のサブセットは、ＨＩＶ中和ｍＡｂ  Ｄ５のエピトープを含むＨＲ１疎水性ポケットと特異的に相互作用することをこれらの結果は示している。
【０２３５】
タンパク質Ａを使用して精製される（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫付与により顕在化される抗体−タンパク質Ａクロマトグラフィを使用して、（ＣＣＩＺＮ１７）３で免役されたウサギの血清からの免疫グロブリン−Ｇ（ＩｇＧ）を精製した。ＩｇＧ調製が、抗ウイルス活性を有するかどうかを評価するために、ＨＩＶ−１単一サイクル感染アッセイで滴定した（実施例３を参照）。ＩｇＧ調製がＨＩＶ−１株ＨＸＢ２に対して滴定されたときにこのアッセイにおいて明確な濃度依存の抗ウイルス活性が観察された（図１７Ａを参照）。このＩｇＧ調製の抗ウイルス活性（ＩＣ５０＝９５１１μｇ／ｍｌ）は、ヒトモノクローナル抗体Ｄ５（ＩＣ５０＝１４４．１μｇ／ｍｌ）で観察されたのと比べて効力が著しく低かった。これらのウサギＩｇＧは、さらに、ＣＣＲ５利用ＨＩＶ−１株ＢａＬによる感染を阻害することもできたが、活性はＨＩＶ−ＨＸＢ２に対して観察された活性と比べた場合、効力が低いように見えた（図１７Ｂ参照）。これらの結果から、（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫付与は、生体外でＨＩＶ−１感染を阻害するポリクローナル抗体を顕在化することがわかる。
【０２３６】
最後に、ウサギＩｇＧ関連の抗ウイルス活性がＨＩＶ−１エンベロープに関して特異的かどうかを調べるために、水疱性口内炎ウイルスに由来する異種ウイルスエンベロープ（ＶＳＶ−Ｇ）を運ぶ同系ＨＩＶ−１クローンについてＩｇＧ調製を試験した（図１７Ｃ）。このウイルス偽型に対しては阻害活性は観察されず、（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫付与ウサギに由来するこれらのＩｇＧに関連する抗ウイルス活性は、ＨＩＶ−１に対し特異的であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０２３７】
【図１】共有結合的に安定化したホモ三量体コイルドコイル（ＣＣＩＺＮ１７）３を生成する酸化反応を示す概略図である。コイルドコイルを安定化するジスルフィド結合が３つあり、それぞれのペプチド鎖の間に１つの結合がある。
【図２Ａ】ＣＣキメラＮペプチド三量体コイルドコイル（ＣＣＩＺＮ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２］３）を安定化するジスルフィド結合の化学構造表現を示す図である。三量体コイルドコイルは、ＮＨ２末端システイン残基のチオール（−ＳＨ）基の間に配置された３つのジスルフィド結合を有する。システイン残基のカルボキシ末端に配置されているアミノ酸は、１文字命名法を使用し、太字になっている。
【図２Ｂ】ＣＣキメラＮペプチド三量体コイルドコイル（ビオチン−ＣＣＩＺＮ２３）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２］３）を安定化するジスルフィド結合の化学構造表現を示す図である。三量体コイルドコイルは、ＮＨ２末端システイン残基のチオール（−ＳＨ）基の間に配置された３つのジスルフィド結合を有する。システイン残基のカルボキシ末端に配置されているアミノ酸は、１文字命名法を使用し、太字になっている。
【図２Ｃ】ＣＣキメラＮペプチド三量体コイルドコイル（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０］３）を安定化するジスルフィド結合の化学構造表現を示す図である。三量体コイルドコイルは、ＮＨ２末端システイン残基のチオール（−ＳＨ）基の間に配置された３つのジスルフィド結合を有する。システイン残基のカルボキシ末端に配置されているアミノ酸は、１文字命名法を使用し、太字になっている。
【図３Ａ】ＣＣキメラＮペプチド三量体コイルドコイル（ＣＣＩＺＮ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１］３）を安定化するジスルフィド結合の化学構造表現を示す図である。三量体コイルドコイルは、ＮＨ２末端システイン残基のチオール（−ＳＨ）基の間に配置された３つのジスルフィド結合を有する。システイン残基のＣＯＯＨおよびＮＨ２末端の両方に配置されているアミノ酸は、１文字命名法を使用し、太字になっている。
【図３Ｂ】ＣＣキメラＮペプチド三量体コイルドコイル（ＣＣＥＺＮ１７）３（［ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７］３）を安定化するジスルフィド結合の化学構造表現を示す図である。三量体コイルドコイルは、ＮＨ２末端システイン残基のチオール（−ＳＨ）基の間に配置された３つのジスルフィド結合を有する。システイン残基のカルボキシ末端に配置されているアミノ酸は、１文字命名法を使用し、太字になっている。
【図４Ａ】本明細書で説明されているキメラペプチドのペプチド配列と配列番号（「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：」）を要約した表である。
【図４Ｂ】本明細書で説明されているキメラペプチドのペプチド配列と配列番号（「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：」）を要約した表である。
【図４Ｃ】本明細書で説明されているキメラペプチドのペプチド配列と配列番号（「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：」）を要約した表である。
【図４Ｄ】本明細書で説明されているキメラペプチドのペプチド配列と配列番号（「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：」）を要約した表である。
【図５Ａ】実施例７で説明されているように実施されるＢＩＡＣｏｒｅ実験の構成を示す概略図である。本明細書で説明されているビオチニル化キメラペプチドは、ストレプトアビジン（「ＳＡ」）−コーティングチップに貼り付けられ、可溶性ＨＩＶ中和抗体、Ｄ５−ｓｃＦｖへの結合に関して分析される。
【図５Ｂ】実施例７で説明されているように実施されるＢＩＡＣｏｒｅ実験の構成を示す概略図である。Ｄ５−ＩｇＧは、カルボキシメチルデキストラン（「ＣＭ５」）−コーティングチップに貼り付けられ、溶液中のビオチニル化キメラペプチドへの結合に関して分析される。
【図６】ペプチドＥＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）および（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）３がＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）ベースアッセイフォーマットにおいてビオチニル化ＩＺＮ１７へのＤ５  ＩｇＧの結合を阻害することができることを示す図である。野生型ＩＺＮ１７ペプチドは、陽性対照として含まれており、このアッセイにおいて、Ｄ５結合を阻害することがすでに示された。ＩＺＮ１７Ｇ５７２Ｄペプチドは、Ｄ５  ＩｇＧに結合できないことから陰性対照として含められた。ペプチド（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３は、明らかにビオチニル化ＩＺＮ１７へのＤ５抗体の結合を阻害するが、ＩＣ５０は試験された濃度の範囲を使用することで求めることはできなかったことに留意されたい。
【図７】Ｓｕｚｕｋｉ−ＩＺ（左）およびＥＺ（右）７回繰り返しをらせん状ホイールで表した図である。３つのＳｕｚｕｋｉ−ＩＺヘリックスおよび３つのＥＺヘリックスは、らせん状射影として表されている。図は、複合体の上から見たものである。ヘリックスは、「ａ」および「ｄ」位置における「ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ」型パッキング相互作用を通じて相互作用する。ＥＺ  ７回繰り返しでは、それぞれのヘリックス内の位置「ｃ」のＡｌａ残基は、Ｇｌｕ残基に変異する。
【図８】ＩＱＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）に対し生成されるＨＩＶ中和抗体、Ｄ５−ＩｇＧ（正方形）、または非ＨＩＶ中和マウスモノクローナル抗体（楕円形）と結合するエピトープを含む前記ペプチド領域の特異アミノ酸残基を描くコイルドコイル構成におけるＮ１７を示すらせん状ホール表現の図である。
【図９Ａ】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）研究でＩＺＮ１７内の変異が前記変異したキメラペプチドへのＤ５−ＩｇＧ結合にどのような影響を及ぼすかを示す図である。ＩＺＮ１７は、ｇｐ４１の疎水性ポケット領域（ＩＺＮ１７  Ｌ５６５Ｍ、ＩＺＮ１７  Ｑ５６７Ｒ、ＩＺＮ１７  Ｇ５７２Ｄ）内に配置されたアミノ酸位置で変異した。変異ペプチドは、ビオチニル化ＩＱＮ１７へのＤ５−ＩｇＧの結合を阻害することができるかどうかについて試験された。この実験から、Ｄ５−ＩｇＧ結合に必要な疎水性ポケット内に重要なアミノ酸があることがわかる。
【図９Ｂ】ＡｌｐｈａＳｃｒｅｅｎ（商標）研究でＩＺＮ１７内の変異が前記変異したキメラペプチドへのＤ５−ＩｇＧ結合にどのような影響を及ぼすかを示す図である。ＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ１７セグメントの個別の溶媒暴露アミノ酸が置換アラニン残基で置換されたＩＺＮ１７ベースのアラニン走査実験が示されている。変異ペプチドは、ビオチニル化ＩＱＮ１７へのＤ５−ＩｇＧの結合を阻害することができるかどうかについて試験された。この実験から、Ｄ５−ＩｇＧ結合に必要な疎水性ポケット内に重要なアミノ酸があることがわかる。
【図１０Ａ】溶媒暴露されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ１７セグメントの個別のアミノ酸がアラニン残基で置換された一連の変異ＩＺＮ１７ペプチドを示す図である。変異ペプチドは、ビオチニル化ＩＱＮ１７への、ＩＱＮ１７に対し生じた非ＨＩＶ中和モノクローナル抗体（Ａ）の結合を阻害することができるかどうかについて試験された。
【図１０Ｂ】溶媒暴露されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ１７セグメントの個別のアミノ酸がアラニン残基で置換された一連の変異ＩＺＮ１７ペプチドを示す図である。変異ペプチドは、ビオチニル化ＩＱＮ１７への、ＩＱＮ１７に対し生じた非ＨＩＶ中和モノクローナル抗体（Ｂ）の結合を阻害することができるかどうかについて試験された。
【図１０Ｃ】溶媒暴露されたＨＩＶ−１  ｇｐ４１のＮ１７セグメントの個別のアミノ酸がアラニン残基で置換された一連の変異ＩＺＮ１７ペプチドを示す図である。変異ペプチドは、ビオチニル化ＩＱＮ１７への、ＩＱＮ１７に対し生じた非ＨＩＶ中和モノクローナル抗体（Ｃ）の結合を阻害することができるかどうかについて試験された。
【図１１】ＩＱＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３）に対し生じたＨＩＶ中和ヒトモノクローナル抗体Ｄ５および３つの非ＨＩＶ中和マウスモノクローナル抗体（Ａ、Ｂ、Ｃ）の結合に関与するｇｐ４１細胞外領域のＮ１７セグメントの個別のアミノ酸を識別する、図９および１０に示されている結果の要約を示す図である。「ＹＥＳ」は、抗体の結合に関してＩＺＮ１７中のアミノ酸が重要であることを示している。「ＷＥＡＫ」は、アミノ酸が抗体結合に寄与するが、本質的ではないことを示し、「ＮＯ」は、アミノ酸が抗体結合に関して可欠であることを示す。
【図１２Ａ】ＨＩＶ−１  ＨＸＢ２に対する抗ウイルスアッセイにおけるキメラＮペプチドＩＺＮ１７Ａｌａ４（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）の活性を示す図である。ＩＺＮ１７Ａｌａ４は、わずか２５ｎＭのＩＣ５０、つまり親キメラＮペプチドＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の抗ウイルス活性に比べて約１２５分の１の低さでＨＩＶ−１  ＨＸＢ２を阻害するが、ＩＺＮ１７Ａｌａ４は、ｇｐ４１細胞外領域の疎水性ポケットを認識する中和抗体と相互作用する。
【図１２Ｂ】ＡｌｐｈａＳｅｒｅｅｎ（商標）ベースアッセイフォーマットにおけるビオチニル化ＩＺＮ１７へのＤ５  ＩｇＧの結合を阻害することができることを示す図である。ＩＺＮ１７Ａｌａ４は、わずか２５ｎＭのＩＣ５０、つまり親キメラＮペプチドＩＺＮ１７（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）の抗ウイルス活性に比べて約１２５分の１の低さでＨＩＶ−１  ＨＸＢ２を阻害するが、ＩＺＮ１７Ａｌａ４は、ｇｐ４１細胞外領域の疎水性ポケットを認識する中和抗体と相互作用する。
【図１３】さまざまなキメラＮペプチド（ＩＺＮ１７、ＥＺＮ１７、ＩＺＮ１７Ａｌａ４、Ｎ１７ＩＺ、およびＳＺＮ１７）、共有結合であるジスルフィド結合により安定化された共有結合的に安定化している三量体ＣＣキメラＮペプチドコイルドコイル（（ＣＣＩＺＮ１７）３、（ＣＣＥＺＮ１７）３、（ＣＣＩ１０Ｎ１７）３、（Ｉ１０Ｎ１７ＣＣ）３、（ＣＣＩＺＮ１７Ａ１ａ４）３、（ＣＣＩＺＮ１３）３、（ＣＣＳ１７Ｎ１７）３、（ＣＣＳ１０Ｎ１７）３、および（ＣＣＩＺＮ１１ＩＺ）３）、およびチオエーテル結合により安定化された、共有結合的に安定化している三量体コイルドコイル（ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３、ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３、ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＥ１０Ｎ１７）３、ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＳ１７Ｎ１７）３）の活性をまとめ、比較した図である。これらのペプチドの活性は、ＨＩＶ−１  ＨＸＢ２株およびビオチニル化５ヘリックス／Ｄ５  ＩｇＧに対する抗ウイルスアッセイの両方、またはビオチニル化５ヘリックス／ＤＳ−ＦＩＴＣ  ＩｇＧ相互作用アッセイで測定される。「ｎ．ｄ．」という記号は、前記実験値がまだ決定されていないことを意味する。
【図１４Ａ】チオエーテル結合により共有結合的に安定化された本発明の２つの三量体コイルドコイル構造の化学構造表現を示す図である（実施例１１を参照）。１つのＣＣキメラＮペプチド、ＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）Ｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７、および２つの誘導体化キメラＮペプチド、ＢｒアセチルＧＧＧＩＺＮ１７の間に形成されるＮＨ２−Ｃ（Ｆｍ）（ｔｈｉｏｌＺＮ１７）３の化学構造表現。（Ａ）および（Ｂ）における両方のコイルドコイル構造は同じペプチド配列組成を有するが、構造は、それぞれの構造のＣＣキメラＮペプチドのＮＨ２末端システイン残基のチオールを遮蔽する保護基により相違している、つまり（Ａ）におけるフルオロエニルメトキシ（「Ｆｍ」）基と（Ｂ）におけるアセトアミドメチル（「Ａｃｍ」）基の違いである。さらに、（Ａ）のコイルドコイルは、ＮＨ２末端に遊離アミノ基を持つが、（Ｂ）のコイルドコイルは、ＮＨ２末端アセチル基を持つ。
【図１４Ｂ】チオエーテル結合により共有結合的に安定化された本発明の２つの三量体コイルドコイル構造の化学構造表現を示す図である（実施例１１を参照）。１つのＣＣキメラＮペプチド、ａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）Ｔｔｄｓ−ＣＣＩＺＮ１７、および２つの誘導体化キメラＮペプチド、ＢｒアセチルＧＧＧＩＺＮ１７の間に形成されるａｃ−Ｃ（Ａｃｍ）（ｔｈｉｏＩＺＮ１７）３の化学構造表現。三量体コイルドコイルは、ＣＣキメラＮペプチドの２つのシステイン残基のそれぞれの上のチオール（−ＳＨ）基（化学構造により図１４で表されている）とそれぞれの誘導体化キメラＮペプチドの求電子性の臭化物部分との間に配置された２つのチオエーテル結合により安定化される。結合されたシステイン残基のＣＯＯＨ末端に配置されているアミノ酸は、１文字命名法が使用されている。（Ａ）および（Ｂ）における両方のコイルドコイル構造は同じペプチド配列組成を有するが、構造は、それぞれの構造のＣＣキメラＮペプチドのＮＨ２末端システイン残基のチオールを遮蔽する保護基により相違している、つまり（Ａ）におけるフルオロエニルメトキシ（「Ｆｍ」）基と（Ｂ）におけるアセトアミドメチル（「Ａｃｍ」）基の違いである。さらに、（Ａ）のコイルドコイルは、ＮＨ２末端に遊離アミノ基を持つが、（Ｂ）のコイルドコイルは、ＮＨ２末端アセチル基を持つ。
【図１５Ａ】（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫を与えられたウサギはＤ５  ＩｇＧ競合抗体を含むことを示す図である。（ＣＣＩＺＮ１７）３の免疫を持たせたウサギからのプール血清を浸透させた５ヘリックスアフィニティカラムから取り出された留分を、Ｄ５競合抗体が存在するかどうかについて５ヘリックス／Ｄ５ーＦＩＴＣ相互作用アッセイで試験した。複数の貫流および溶離液留分は、検出可能なＤ５競合抗体を含む。
【図１５Ｂ】（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫を与えられたウサギからの血清はＤ５  ＩｇＧ競合抗体を含むことを示す図である。溶離液留分５および６から回収された抗体が、阻害活性を有し、濃度依存の阻害効果（左図）を示すことが実証される。いずれの留分も、ラブドウイルスＶＳＶ偽型ＨＩＶ粒子（右図）について試験されたときには阻害活性を生じなかった（右図）。
【図１６Ａ】（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫により誘発されたポリクローナルウサギ抗体が、ＨＩＶ  ｇｐ４１の７回繰り返し１（ＨＲ１）領域に形成された疎水性ポケットを結合することを示す図である。プールされた留分５および６（図１５Ａ参照）は、ストレプトアビジンコーティングされた供与体ビーズおよびタンパク質Ａ受容体ビーズの存在下でビオチニル化５ヘリックスに対し滴定された。１〜１０ｎＭの５ヘリックスを抗体２５０μｇ／ｍｌと組み合わせたときに見られるピーク信号は、５ヘリックスと相互作用することができる抗体の存在を示している。
【図１６Ｂ】（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫により誘発されたポリクローナルウサギ抗体が、ＨＩＶ  ｇｐ４１の７回繰り返し１（ＨＲ１）領域に形成された疎水性ポケットを結合することを示す図である。精製された抗体とＨＲ１疎水性ポケットとの相互作用を防ぐことができるかどうかについて、２つのペプチドＣ３４およびＤ１０−ｐ５−２Ｋについて試験した。Ｃ３４は、ＨＲ１溝全体を結合する。Ｄ１０−ｐ５−２Ｋは、疎水性ポケットと特異的に相互作用する。Ｃ８ペプチドは、陰性対照として使用された。ウサギ抗体の加える前に、５ヘリックスでＣ３４およびＤ１０−ｐ５−２Ｋの濃度を高めるインキュベートを行うと、５ヘリックスへの抗体の付着が阻害されることが示される。
【図１７Ａ】（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫により生成され、その後タンパク質Ａクロマトグラフィにより精製されたウサギ抗体がＨＩＶ−１株、ＨＸＢ２に対するＨＩＶ−１の単一サイクル感染アッセイにおいて抗ウイルス活性を示すことを表す図である。透析ウサギＩｇＧ（円）は、ヒトモノクローナル抗体Ｄ５（開正方形）で実証されている抗ウイルス活性よりも効力が劣る。
【図１７Ｂ】（ＣＣＩＺＮ１７）３免疫により生成され、その後タンパク質Ａクロマトグラフィにより精製されたウサギ抗体がＨＩＶ−１株、ＢａＬに対するＨＩＶ−１の単一サイクル感染アッセイにおいて抗ウイルス活性を示すことを表す図である。透析ウサギＩｇＧ（円）は、ヒトモノクローナル抗体Ｄ５（開正方形）で実証されている抗ウイルス活性よりも効力が劣る。
【図１７Ｃ】透析ウサギＩｇＧ（円）は、ヒトモノクローナル抗体Ｄ５（開正方形）で実証されている抗ウイルス活性よりも効力が劣る。ＶＳＶ−Ｇ偽型ＨＩＶ−１ウイルスに対する阻害活性が観察されなかったことを示す図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2008501028.tif 000018
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
2008501028.tif 000028
【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
2008501028.tif 000031
【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2008501028.tif 000082