(57)【要約】【課題】本発明は、トランスジェニックマウスを作製するための、抗HLA−DP抗体によって特異的に認識される機能的な複合体をコードする発現ベクターの使用、該マウス、及びウイルス感染後に誘導される免疫応答、あるいはテスト化合物によって誘導される免疫応答を研究するための実験モデルとしての、上記マウスの使用を提供する。【解決手段】トランスジェニックマウスを作製するための、抗HLA−DP抗体によって特異的に認識される機能的なHLA−DPα103β401複合体をコードする発現ベクターコンストラクトの使用に関し、該コンストラクトは、DPα103及びDPβ401をコードするcDNAに関係するIAβ遺伝子及びIAα遺伝子のマウスプロモーターを含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
トランスジェニックマウスを作製するための、抗HLA−DP抗体によって特異的に認識される機能的なHLA−DPα103β401複合体をコードする発現ベクターコンストラクトの使用に関し、該コンストラクトは、DPα103及びDPβ401をコードするcDNAに関係するIAβ遺伝子及びIAα遺伝子のマウスプロモーターを含むことを特徴とする該発現ベクターコンストラクトの使用。
【請求項２】
HLA−DPα103導入遺伝子又はHLA−DPβ401導入遺伝子を個別に発現するヒト化マウス、あるいは、それら２つの導入遺伝子を同時に発現するヒト化マウスであることを特徴とする請求項１によって作製されたトランスジェニックマウス。
【請求項３】
HLA−DP（α103β401）の遺伝子導入を行い、H−２クラスII（HLA−DP＋／＋IAβ°／°）に対してノックアウトした請求項２に記載のトランスジェニックマウス。
【請求項４】
HLA−DP（α103β401）hCD4+/+の遺伝子導入を行い、H−２クラスII IAβ°／°mCD4°／°に対してノックアウトした、請求項３記載のトランスジェニックマウス。
【請求項５】
種々のワクチン候補の有効性に関する比較前臨床研究のための、請求項３又は４記載のトランスジェニックマウスの使用。
【請求項６】
望まない自己免疫疾患の誘発に関係した危険性の評価のための、請求項３又は４記載のトランスジェニックマウスの使用。
【請求項７】
治療計画の決定するための、請求項３又は４記載のトランスジェニックマウスの使用。
【請求項８】
感染症後又は免疫化後の特異的な免疫応答をモニタリングするために使用される新規な試薬の開発を可能にする新規なエピトープを同定するための、請求項３又は４記載のトランスジェニックマウスの使用。
【請求項９】
請求項３又は４記載のトランスジェニックマウストランスジェニックマウスの免疫化後に、該マウスから単離したCD４＋リンパ球。
【請求項１０】
特異的な細胞系を構築するための、請求項８記載のCD４＋リンパ球の使用。
【請求項１１】
細胞融合によって、特異的なTハイブリドーマを作製するための、請求項８記載のCD４＋リンパ球の使用。
【請求項１２】
請求項９により構築された細胞系。
【請求項１３】
請求項１０により得られたハイブリドーマ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規なHLAクラスIIトランスジェニックマウス、及びワクチン候補の有効性を研究するための動物実験モデルとしての、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在、重篤な病状を発現させるHIV、HCV、CMV、HSV等のウイルスの感染を防御する、有効なワクチンの必要に迫られている。
【０００３】
免疫化した個体の大多数に対してワクチンの防御効果を発揮させるためには、ワクチンによる防御は、感染細胞を迅速に除去するために、ウイルスに特異的なCD4＋Tリンパ球とCD8＋Tリンパ球、さらに、同一のウイルスによる再感染を防ぐため、抗ウイルス中和抗体を産生するBリンパ球を協同させて行うべきである。
【０００４】
これら全ての効果により、非常に有効な全体的防御と記憶が与えられる。
【０００５】
ウイルスに特異的なTリンパ球は、感染細胞のHLAクラスI分子及びクラスII分子によって提示された、ウイルスのタンパク質に由来するペプチドを認識する。
【０００６】
HLAクラスI分子によって提示される多くのペプチドが同定されているが、他方、HLAクラスII分子によって提示されるペプチドは、それに比較すると知られていない。しかしながら、それらのペプチドを同定することは、効果的なワクチンの開発を決定することになる。
【０００７】
ヒト材料を使用して、これらの調節応答に関して研究することは、HLAクラスII分子が多型であって、同一個体において、多くのHLAクラスII分子の発現があることから困難である。
【０００８】
最近では、HLAクラスIIトランスジェニックマウスを利用することができる。このマウスは、マウスIEβb鎖とペアになる、単離されたHLA−DRα鎖、又はヒト由来のα鎖及びβ鎖の組み合わせを発現する。
【０００９】
ハギハラらは、異種反応の研究をもとにして、野生型HLA−DPβ401α01に対する遺伝子導入を行ったトランスジェニックマウスを産生した。しかしながら、観察された反応は、非常に弱いように思われる。実際、その導入遺伝子の機能性に関する詳細な研究報告、また、及びこれらのマウスの正常な免疫応答能への該機能性の関与に関する詳細な研究報告はなされておらず、これにより、これらのマウスは機能的でないことを示唆している。
【００１０】
より最近では、自己免疫疾患を研究するため、IAβ鎖のH−２bハプロタイプが不活性化したH−２クラスII  KOのHLAクラスIIトランスジェニックマウスが作製されている（Taneja and David, 2000, Arthritis Res., 2, 205−7参照）。このマウスの一部を用いることにより、寄生虫CD４エピトープのin  vivoでの検証が可能となった。
【００１１】
本発明者は、この分野の研究により、H−クラスII遺伝子をノックアウトした、新規な動物実験モデルであるヒト化HLA−DPトランスジェニックマウスを開発した。これは、白人人口の約50％の割合で現れる特異的なアレルを使用しており、それにより、今日利用できる動物実験モデルよりも、ヒトに対し、より効果的なワクチンの研究を可能にする。
【００１２】
このマウスは、種々のワクチン候補の有効性に関する比較前臨床研究、及び望まない自己免疫疾患の誘発に関係した危険性の評価、に対して、非常に有効であることがわかった。また、それは、採用すべき最適な治療計画の決定を可能にする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、本発明の目的は、トランスジェニックマウスを作製するための、抗HLA−DP抗体によって特異的に認識される機能的な複合体をコードする発現ベクターの使用にある。
【００１４】
また、本発明の目的は、そうしたマウスの提供、及びウイルス感染後に誘導される免疫応答、あるいはテスト化合物によって誘導される免疫応答を研究するための実験モデルとしての、上記マウスの使用を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
このように、本発明は、トランスジェニックマウスを作製するための、抗HLA−DP抗体によって特異的に認識される機能的なHLA−DPα103β401複合体をコードする発現ベクターコンストラクトの使用に関し、該コンストラクトは、DPα103及びDPβ401をコードするcDNAに関係するIAβ遺伝子及びIAα遺伝子のマウスプロモーターを含むことを特徴とする。
【００１６】
本発明のトランスジェニックマウスは、HLA−DPα103導入遺伝子又はHLA−DPβ401導入遺伝子を個別に発現するヒト化マウス、あるいは、それら２つの導入遺伝子を同時に発現するヒト化マウスであることを特徴とする。
【００１７】
本発明は、特にHLA−DP（α103β401）の遺伝子導入を行い、H−２クラスII（HLA−DP＋／＋IAβ°／°）に対してノックアウトした、トランスジェニックマウスに関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
このマウスは、プラスミドから得た、上記複合体をコードするDNA断片をファウンダーマウスの卵母細胞にマイクロインジェクションし、HLA−DPα103導入遺伝子又はHLA−DP
β401導入遺伝子を個別に発現するファウンダーマウス間の交配、又は、それら２つの導入遺伝子を同時に発現するファウンダーマウスとIAβ°マウスとを交配して作製することが好ましい。
【００１９】
エピトープに対する応答について高い能力を有する、特に好ましいマウスは、hCD4の遺伝子導入を行い、mCD4に対してノックアウトしたマウスである。それは、HLA−DP（α103β401）IAβ°．hCD4+/+mCD°／°マウスである。
【００２０】
HLA−DP（α103β401）IAβ°． hCD4+/+mCD°／°マウスを作製するには、本発明のトランスジェニックマウス（HLA−DP＋／＋IAβ°／°）を、hCD4+/+マウス及びmCD4°／°マウスと連続的に交配させ、HLA−DP（α103β401）IAβ°．hCD4+/+mCD4°／°表現型に該当する新規なマウスを作製する。
【００２１】
本発明のマウス（HLA−DP（α103β401）IAβ°及びHLA−DP（α103β401）IAβ°． hCD4+/+mCD4°／°）は、マウス及びヒトに対して免疫原生であるHLA−DP拘束性エピトープを同定するための、ヒト化マウスの新規な動物実験モデルである。
【００２２】
こうして同定されたエピトープは、ワクチン、特にポリエピトープワクチンの開発のためのサブユニットとして使用することができる。
【００２３】
それは、感染症後又は免疫化後の特異的な免疫応答をモニタリングするために使用される新規な試薬（例えば、ペプチド／HLAクラスIIテトラマー）の開発を可能にする。
【００２４】
上記試薬は、与えられたウイルス及び／又はウイルス感染のモニタリングに関して、個体の保護状態を予測するテストを開発するために使用することができる。
【００２５】
また、本発明の新規な実験モデルは、好ましくは、種々のワクチン候補又は種々の免疫プロトコルによって誘導されるTヘルパー応答の有効性を比較することを可能にする。この点において、該実験モデルは、自己免疫疾患の誘導の危険を評価するモデルとなる。
【００２６】
また、本発明の新規な実験モデルは、マウスのCD４Tリンパ球とCD８ Tリンパ球の細胞協同作用、そして、それに続く、ウイルス抗原に対する免疫化の解析、及び所望により、相乗的に作用する、HTLエピトープとCTLエピトープのペアの決定に利用することができる。
【００２７】
また、本発明は、上記定義されたトランスジェニックマウスの免疫化後に単離したCD４＋リンパ球に関する。
【００２８】
また、本発明は、特異的な細胞系を構築するための、及び、従来技術を用いて細胞融合により、特異的なTハイブリドーマを作製するための、上記リンパ球の使用に関する。この細胞系及びハイブリドーマも、新規産物として本発明の対象である。
【００２９】
この細胞系は、例えば、HLAクラスIIテトラマー品質試験の調整又は実施のために、特異的なモニタリング試薬を調製するのに非常に有益である。
【００３０】
本発明の他の特徴及び利点は、後述する実施例において述べられる。
【実施例】
【００３１】
材料及び方法
１）開始遺伝子及びcDNA
IAβ  b遺伝子：Aβ19コスミドから単離した、完全なゲノム立体配置にある９kb  KPNI−XBAI断片。２つの制限部位の選択はLahrammarマッピングに基づく（JBC、1985、260、14111−14119）。
【００３２】
IAαb遺伝子
pUT626から採取した250bpのSalI−NotI断片が３’に結合した、6.8 kb のLS8.1コスミド（KpnI切り出し後）から採取したKpnI−SalI断片のサブクローニングによって作製。SV40ポリアデニル化部位を提供する。
【００３３】
DPβ401及びDPα103に対するcDNAの調製
ホモ接合体HLAハプロタイプ（A3、C1、B27、DR1、DQ5、DPβ0401、DPα0103）のHOM−２細胞から全RNAを単離した。該細胞は、Epstein  Barrウイルスで形質転換された細胞であり、MHCクラスII分子を発現する。以下のプライマーを用いて、該RNAに対しRT−PCR法を行った。
DPβ401に対しては、IAβ bのサブクローニングのため、BspD1部位を導入する5’プライマー（SEQ  ID  No.1）5’CCT  TTT  ATC  gAT  CCA  TgA  Tgg  TTC  TgC  Agg  3’；
IAβ bのサブクローニングのため、Sall部位を導入する3’プライマー（SEQ  ID  No.2）5’TTA  AAA  gTC  gAC  TTA  CCT  gTT  TAT  gCT  gAT  CCT  C  3’
【００３４】
DPα103に対しては、IAα b のサブクローニングのため、Xho1部位を導入する5’プライマー（SEQ  ID  No.3）5’CCT  TTT  ATC  gAT  CAA  CAT  gCg  CCC  TgA  AgA  C    3’；
IAαb でのサブクローニングのため、Xho1部位を導入する3’プライマー（SEQ  ID  No.4）5’TTA  AAA  CTC  gAg  gTg  TgA  gCA  CgT  ACC  gTT  ggT  ggC  CTg  AgT  gTg  3’
【００３５】
長い形態である長鎖DPαと長鎖DPβ（DPαとDPβの相補的DNAの全体）を調製し、pCR  Topo  2ベクター（Invitrogen）に導入し、その後、RZ1032菌内でクローニングした。
【００３６】
２）部位特異的変異導入法によるIAα b遺伝子及びIAβ b遺伝子の修飾
DPα、DPβのcDNAのクローニングに必要な制限部位を導入するため、種々の読み枠を考慮しつつ、Kunkel法（P.N.A.S  USA、1985  Jan；82（2）：488-92）に基づいて、部位特異的変異導入法を行った。簡略に述べると、標的遺伝子を含むベクターを前もって導入したRZ1032菌（UTPase-、エラーにより組み込まれたUが除去不能）にKO.7バクテリオファージを感染させて一本鎖DNA鋳型を調製する。
ホスホリル化された変異原性オリゴヌクレオチドは、この鋳型上でハイブリダイゼーションする。DNAポリメラーゼは変異鎖を合成する。次いで、スーパーコンピテントXL1（UTPase+）細菌の形質移入を行い、その細菌内において、置換されたU鎖（変異なし）は分解され、該変異鎖は保存される。
【００３７】
長鎖型
長鎖DPβ401：pcR2  TopoのEcoR1断片（シグナル配列及びヒトβ1及びβ2ドメインの配列）を、IAβ b  BspD1＋Sal1＋のHindIII−Xbal断片（3kb）を含むpBlueScript／KS-プラスミドでサブクローニングする。このコンストラクトから得られたBspD1−Xbal断片を、BspD1−XbalにオープンのpBlueScript／KS- IAβ bに挿入した。このようにして、IAβ bの末端部分は再構築され、完全なDPβ401が挿入される。
【００３８】
長鎖DPα103：pcR  Topo2のBspD1−Sall断片（シグナル配列及びヒトα1及びα2ドメインの配列）を、BspD1−Sall にオープンのpBlueScript／KS-IAα bプラスミドでサブクローニングする。
【００３９】
続いて、最終のコンストラクトであるpIADPβ（8.5Kb）を得るために、上記長鎖DPβ401を、ハイグロマイシンカセットを含むベクターに導入した（図１）。
【００４０】
最終のコンストラクトであるpIADPα（8Kb）を得るために、上記長鎖DPα103を、ネオマイシンカセットを含むベクターに導入した（図１）。次いで、これらの各種コンストラクトは、スーパーコンピテントXL1細菌及び安全確実な細菌（コンピテント）内でクローニングし、その後、Sanger法によるシークエンス解析した。
【００４１】
長鎖DPβαコンストラクトの前の強力なRous  sarcomaプロモーターの導入
長鎖pSRDPα（7.9kb）：長鎖DPα−pcR2  TopoのSacI−EcoRV断片の、SmaI(blunt)−SacIにオープンのNT  Hygrodでのサブクローニング  
長鎖pSRDPβ（7.7kb）：長鎖DPβc.8−15  pcR2  TopoのSacI−EcoRV断片の、SacI−EcoRVにオープンのNT  NeodでのSacI−EcoRV(blunt)のサブクローニング  
【００４２】
３）細胞及び形質移入体
HeLa細胞（ヒト子宮頸部細胞）、L  Kuhn細胞（C3H  H−2kマウス繊維芽細胞）及びP815細胞（DBA／2  H−2dマウス由来のマウス肥満細胞腫）を、10％のFCS、ペニシリン−ストレプトマイシン（200IU／ml）、ピルビン酸ナトリウム（1mM）及びL−グルタミン（2mM）を含むRPMI1640完全培地で培養した。指数関数的成長期にある細胞に長鎖型＋／−CIITA（MHC  II遺伝子の転写調節因子）を同時形質移入し、この形質移入24時間後、G418（1mg／ml）で選択し、24時間後にハイグロマイシンB（400μg／ml）で選択した。
【００４３】
得られたクローンは、直接免疫蛍光法及びフローメトリー法（FACScan、Becton  Dickinson）によって評価した。大まかには、500000細胞を、PBS、1％のBSA、2mMのEDTAの中で、HLA−DP（B721）、Iad（MKD6）又はHLA−A3（GAPA3）であるマウス抗体と40分間インキュベートし、次いで洗浄後、1％のBSA、2mMのEDTAを含むPBS中で、FITC標識ヤギ抗マウス二次抗体と40分間インキュベートし、1％のBSA、2mMのEDTAを含むPBS中で洗浄した。
【００４４】
４）ゲノムDNA抽出、サザンブロッティング解析及び導入遺伝子に対する診断PCR
以下の方法に従い、形質移入体又はマウスの尾からゲノムDNAを調製する。
すなわち、プロテイナーゼKによる処理、56℃で16時間のインキュベーション、飽和NaClによる処理、２−イソプロパノールによるDNAの沈降、70％エタノール及び150μlのpH7.5、10mM  Tris  1mM  EDTAのDNAペレットでの洗浄。DP形質移入体から抽出したDNAを、長鎖DPαのサザン解析のために、BamHIで消化し、長鎖DPβのサザン解析のため、EcoRIで消化した。その後、0.6％アガロースゲル電気泳動後、ニトロセルロース膜にブロットし、相当するプローブとハイブリダイズさせる。DPαプローブは、完全なDPα103cDNAに相当し、DPβプローブは、DPβ401cDNAに相当する。これらのプローブには製造者のガイドラインに従って、dCTO32で放射性標識が取り込まれる（Megaprime  DNA  labeling  system、Amersham  Pharmacia）。
【００４５】
DPβ401導入遺伝子とDPα103導入遺伝子の発現は、DP配列に特異的なプライマーを使用したPCRによって検出した。PCRは、マウスゲノムDNA（300ngのDPβ401とDPα103）、PCRバッファー、15pMの各プライマー、12pMのdNTP及び1.25UのTaqポリメラーゼ（GibcoBRL）を含み、DPβ401の場合は最終濃度が2.6mMのMgCl2、DPα103の場合は4.1mMのMgCl2を含む試験管内で行った。最初の解離サイクルは94℃で7分であり、続いて94℃での変性を30秒、55℃でのハイブリダイゼーションを30秒、72℃での伸長を30秒行うサイクルを30回行い、最後の伸長サイクルを72℃で4分間行う。
【００４６】
DPβ401に対しては、センスプライマーは5’（SEQ  ID  No．5）ggATTggAAAgAggCTC  3’であり、アンチセンスプライマーは5’（SEQ  ID  No．6）gCACtgCCCgCTTTCTCC  3’である。DPα103に対しては、センスプライマーは5’（SEQ  ID  No．7）TAATACAAAgTCTgCAgCTggC  3’であり、アンチセンスプライマーは（SEQ  ID  No．8）、5’AgCAATgTTAgCCAgCC  3’である。
【００４７】
HLA−DPα103導入遺伝子又はHLA−DPβ401導入遺伝子をコードする発現ベクターの作製
4種のプラスミド、長鎖pIADPα、長鎖pIADPβ、長鎖pSRDPα及び長鎖pSRDPβの地図を、それぞれ図１Aから１Dに示す。
長鎖pIADPα：プロモーター  IAα／DPα103／Nc IAα
長鎖pIADPβ：プロモーター  IAβ／DPβ401／Nc IAβ
長鎖pSRDPα：プロモーター  SR／DPα103／NcSV40
長鎖pSRDPβ：プロモーター  SR／DPβ401／NcSV40
上記プラスミドは完全に配列が決定、確認されている。
【００４８】
コンストラクトの機能性
コンストラクトの機能性を、マウス繊維芽細胞（L  Kuhn、H−2k）及びマウス肥満細胞腫（P815、H−2d）の形質移入によって評価した。これらの２種の細胞型は、自然にはクラスII組織適合性分子を発現しない。DPβ DPα遺伝子の形質移入は、ヒト転写調節因子CIITAをコードするプラスミドの形質移入と組み合わせた。該因子はHLA−DP、−DQ及び−DR系のHLAクラスII遺伝子（α及びβ）の活性化を決定し、また、不変鎖をコードする遺伝子を活性化する。B721抗体と同一の免疫グロブリンをもつMKD6（抗IAd）及びGAPA3（抗HLA−A3）抗体をコントロールとして使用した。野生型DPαβコンストラクトの表面発現は、L形質移入体（抗IAd  MKD6と非反応）及びP815形質移入体の表面で再度記録できた。後者の場合、MKD6抗原で強い反応性が観察されたがGAPA3では観察されなかった。これはCIITA遺伝子の形質移入に続くIAd遺伝子の転写活性を反映している。
【００４９】
長鎖pSRDPα及び長鎖pSRDPβベクターの機能性をL  Kuhn  ヒト細胞及びHeLa細胞の同時形質移入により評価した。長鎖pIADPα及び長鎖pIADPβベクターの機能性を、pCIITAプラスミド及びヒトCIITA（ヒトCHTA転写調節因子）に加え、P815細胞の同時形質移入により評価した。
【００５０】
得られた結果を図２に示す。図２Aはモノクローナル抗体B721（抗HLA−DP）、MKD6（抗IA）又はGAPA3（抗HLA−A3）、次いで、ヤギ抗マウスIgG−FITCとインキュベートした、P815非形質移入のHLA−DP形質移入体、長鎖DPα／長鎖DPβ／CIITA又はCIITAを同時形質移入した形質移入体に該当する。細胞はフローサイトメトリーで解析する。図2BはL−Kuhn−DP及びHela−DP形質移入体に該当する。
【００５１】
これらの評価によって、上記コンストラクトが機能的であり、特異的な抗HLA−DP抗体によって特異的に認識される機能的なHLA−DPα103β401複合体をコードすることが確認された。
【００５２】
トランスジェニックマウスの作製及び導入遺伝子に対する診断PCR
以下のように、２つの遺伝子導入アプローチを実施した。
Paul  Brousse病院で一連のシングルの遺伝子導入を行った。すなわち、長鎖DPα及び長鎖DPβコンストラクトを、C57BL／6×DBA2マウスの受精卵にそれぞれマイクロインジェクションした。
Cochin病院で、一連のダブルの遺伝子導入を行った。すなわち、C57BL／6×DBA2マウスの受精卵に長鎖DPα／長鎖DPβコンストラクトをマイクロインジェクションした。
【００５３】
上記シングル又はダブルのトランスジェニックファウンダーマウスを検出するため、マウスの尾から抽出したDNAの診断PCR試験を行った。図３ａは、得られた結果と長鎖DPα導入遺伝子の検出を表している。この導入遺伝子に特徴的な445bpのバンドが、長鎖DPαトランスジェニックマウスのDNAに現れている。このバンドはDBA2及びB6コントロールマウスには本来欠損している。図3bは、長鎖DPβ導入遺伝子の検出を表している。得られた815bpのバンドは、該導入遺伝子に特徴的である。11匹のトランスジェニックマウスを作製した。すなわち、5匹の長鎖DPαマウスと5匹の長鎖DPβマウスである。
【００５４】
HLA−DPα103導入遺伝子又はHLA−DPβ401導入遺伝子をそれぞれ発現するファウンダーマウスを互いに交配した。次いで、HLA− DPα103 DPβ401＋IAβ°マウスを作製するため、HLA−DPα103導入遺伝子及びHLA−DPβ401導入遺伝子を同時に発現するファウンダーマウスを、C57BL／6IAβ°マウスと交配した。
【００５５】
種々の導入遺伝子の発現、IAβ遺伝子の発現の欠損をPCR法で解析し、さらに、一部はサザンブロッティング法でも解析する。
【００５６】
導入遺伝子に対する診断PCRのプロトコル：HLA−DPα103
製品：TAQ  DNAポリメラーゼ（Invitrogen）
50mM  MgCl2  II（Invitrogen）
10×PCRバッファー（Invitrogen）
滅菌H2O
各dNTP  4mM
プライマー：
プロモーター  IAα（センスプライマー）（SEQ  ID  No．9）
5’TAA  TAC  AAA  gTC  TgC  AgC  Tgg  C  3’
DP2αアンチセンス（SEQ  ID  No．10）
5’AgC  AAT  gTT  AgC  CAg  CC  3’
（MgCl2）最終濃度＝4.1mM
Tm  55℃
【００５７】
DPαに対しては、該導入遺伝子の特徴である約445bpの断片を以下のように増幅する。B6及びDBA／2のネガティブコントロールは増幅を示さない。
PCRサイクル
94℃で7分間
（94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒）×40サイクル
72℃で4分間
4℃
【００５８】
HLA−DPβ401導入遺伝子の診断PCR
製品：TAQ  DNAポリメラーゼ（Invitrogen）
50mM  MgCl2  （Invitrogen）
10×PCRバッファー（Invitrogen）
滅菌H2O
各dNTP  4mM
プライマー：
プロモーター  IAβ（センスプライマー）（SEQ  ID  No．11）
5’ggA  TTg  gAA  AgA  ggC  TC  3’
DPβアンチセンス（SEQ  ID  No．12）
5’gCA  CTg  CCC  gCT  TCT  CC  3’
（MgCl2）最終濃度＝2.6mM
Tm  55℃
【００５９】
DPβに対しては、該導入遺伝子の特徴である約815bpの断片を以下のように増幅する。B6及びDBA／2のネガティブコントロールは増幅を示さない。
PCRサイクル
94℃で7分間
（94℃で30秒、55℃で30秒、72℃で30秒）×40サイクル
72℃で4分間
4℃
【００６０】
HLA− DPα103 DPβ401＋IAβ°マウスの表現型
HLA−DP＋／αIAβ°トランスジェニックマウスのHLA−DPトランスジェニック複合体の細胞表面での発現のレベルは、フローサイトメトリーで測定した。結果を表４に示す。
【００６１】
マウス（HLA−DP＋Iab°）において、末梢CD4＋Tリンパ球及びCD8＋Tリンパ球の数を測定した。結果を表５に示す。
【００６２】
C57BL／6マウス（図5AのB6）、HLA−DP／H−2クラスII−KOマウス（図5BのDPCHKO）及びH−2クラスI／クラスII−KOマウス（図5CのCI  CHKO）の脾細胞を、PE（マウス抗CD4抗体、Y軸）で標識したCT−CD4モノクローナル抗体及びFITC  53−6、7（抗CD8抗体、X軸）で標識した抗体で染色した。示された数値は、全脾細胞中のCD4＋T細胞（図5A、左上部分）又はCD8＋T細胞（図5C、左下部分）に相当する。
【００６３】
イムノスコープ分析を使用して、CD4＋Tリンパ球の種々のTCR  Vbのレパートリー多様性は、（HLA−DP＋／αIAβ°）マウスとC57BL6マウスの間で類似していることを示した（図６参照）。
【００６４】
機能性の研究
KLH抗体（T依存性）を使用することにより、6／6（HLa−DP＋／IAβ°／°）マウスにおいて、該マウスは、この抗原に対して増殖応答することができるが、6／6（IAβ°／°）マウスには応答が観察されないことが明らかになった。得られた結果を図7A及び7Bに示した。
【００６５】
他の実験では、HBsタンパク質（preS2−S）をコードするpCMV−HBsプラスミドをインジェクションして遺伝子免疫を行った後、（HLA−DP＋／IAβ°／°）マウス間における抗HBs細胞性及び体液性応答を同時に解析するための研究モデルとして、B型肝炎ウイルスのHBsエンベロープ抗原（preS2−S）を使用した。
【００６６】
以下の方法を使用した。
特異的な抗HBs体液性応答（抗preS2抗体及び抗S抗体）をモニタリングするための ELISA法；
HBsタンパク質由来の HLA−DP拘束性エピトープ（HBs  Celis  DP）に特異的なヘルパー細胞応答をモニタリングするための特異的な細胞増殖法
【００６７】
HLA−DP拘束性TエピトープHBs  Celis  DP（FLLRILTIP）は、E．Celis  and  R  W  Karr，J．Virol．1989、Feb；63（2）747−52に記載されている。
【００６８】
同時に、HBsに対して免疫化した3／4（HLA−DP＋／IAβ°／°）マウスにおいて、HBs  Celis  DP Tエピトープに対する強い特異的増殖細胞応答（増殖係数＞3）の存在（図８参照）、及び抗HB抗体及び抗preS2抗体の存在（図９参照）を示した。
【００６９】
pCMV−S2Sプラスミドで免疫化したIAβ°マウス（0／4）は、HBs   Tエピトープ、又は抗preS2抗体若しくは抗S抗体の応答に対し、特異的な細胞性応答を示さない。
【００７０】
これらの結果は、（HLa−DP＋／IAβ°／°）マウスが、種々の抗原に存在するHLA−DP拘束性エピトープの同定に好適な、ヒト化マウスの新規な動物実験モデルであることを示している。
【００７１】
HLA−DP（α103β401）IAβ°／°hCD4+/+m CD4／トランスジェニックマウス
HLA−DP4ペプチド（Celis）で免疫化後の増殖応答の研究に関して、H−2クラスII  KOトランスジェニックHLA−DP4マウス（HLA−DP（α103β401）IAβ°／°）及びHLA−DP4ヒトCD4  CII  KOマウス（HLA−DP（α103β401）IAβ°／°hCD4+/+m CD4°／°）を用いて行った実験結果を次に示す。
【００７２】
Ii −DP（Celis）で免疫化したHLA−DPトランスジェニックマウスの、HLA−DP4ペプチド （Celis）に対するCD4  T増殖応答
【００７３】
【表１】
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【００７４】
H−2クラスII  KOトランスジェニックHLA−DP 4マウスでは、3％のCD4  Tリンパ球が観察されるのに対し、H−2クラスII  KO マウスでは0.8％、HLA−DP4ヒトCD4マウスCD4  KO  CII  KOトランスジェニックマウスでは12％観察される。
【００７５】
トランスジェニックHLA−DP 4マウスのKLHに対するCD4  T増殖応答について、図10A（H−2クラスII  KO  HLA−DP4トランスジェニックマウス）（HLA−DP（α103β401）IAβ°／°）、図10B（HLA−DP4ヒトCD4  CII  KOマウス）（HLA−DP（α103β401）IAβ°／°hCD4+/+m CD4°／°のヒストグラムに図示する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明に係る使用された４種のプラスミドコンストラクトの地図である。
【図２】本発明に係る使用された２種のベクターの機能性を評価する図である。
【図３】HLA−DP導入遺伝子のPCR解析図である。
【図４】本発明に係るトランスジェニックマウスのHLA−DP分子発現のフローサイトメトリー解析図である。
【図５】CD８＋及びCD４＋脾臓T細胞の数を示す図である。
【図６】（HLA−DP＋／IAβ°）マウス及びC57BL6マウスにおける種々のCD４＋Tリンパ球のTCR  Vbのレパートリー多様性を示す図である。
【図７】本発明のトランスジェニックマウスにKLHで免疫化した後の特異的な増殖応答を示す図である。
【図８】本発明のトランスジェニックマウスにHBs抗原で免疫化した後の特異的な増殖応答を示す図である。
【図９】本発明のトランスジェニックマウスにHBs抗原で免疫化した後の特異的な抗体応答を示す図である。
【図１０】マウス（HLA−DP（α103β401）IAβ°及びHLA−DP（α103β401）IAβ°． hCD4+/+mCD4°／°）間における、所定の抗原を使用した免疫化後の特異的TCD４増殖応答の比較研究を示すヒストグラムである。上記２種のマウスの遺伝的背景はC57／BL6マウスに相当する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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