(57)【要約】本発明は、特に酸吸引または敗血症により誘発される重症急性肺損傷、肺水腫、および重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス感染関連肺損傷および障害を処置するための医薬を製造するためのアンギオテンシン変換酵素2(ACE2)の使用に関する。
2008540600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
特に酸吸引または敗血症により誘発される重症急性肺損傷、肺水腫、および重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス感染関連肺損傷および障害を治療するための医薬を製造するためのアンギオテンシン変換酵素2(ACE2)の使用。
【請求項２】
肺損傷または肺疾患を治療するための医薬を製造するためのACE2およびAT1阻害剤の組み合わせの使用。
【請求項３】
該医薬が組換えACE2を含むことを特徴とする請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
該医薬が、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、タソサルタン、エンブサルタン、ホルサルタン、ミルファサルタン、プラトサルタン、リピサルタン、サプリサルタン、ゾラサルタン、またはその混合物、特にテルミサルタン、またはその医薬的に許容される塩からなる群から選ばれるAT1阻害剤を含むことを特徴とする請求項1〜3のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
医薬がACE2に加えてまたはその代わりにACE2をコードする核酸を含むことを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
該医薬がACE阻害剤を含むことを特徴とする請求項1〜5のいずれかに記載の使用。
【請求項７】
ベナゼプリル、カプトプリル、セロナプリル、エナラプリル、ホシノプリル、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、ペリンドプリル、アラセプリル、シラザプリル、デラプリル、スピラプリル、テモカプリル、ゾフェノプリル、またはその混合物、またはその医薬的に許容される塩からなる群から選ばれるACE阻害剤を含むことを特徴とする請求項1〜6のいずれかに記載の使用。
【請求項８】
ブラジキニンレセプター阻害剤、特にデス-Arg9-ブラジキニン阻害剤を含むことを特徴とする請求項1〜7のいずれかに記載の使用。
【請求項９】
該医薬が、Lys-Lys [Hyp3,Cpg5,dTic7,Cpg8]デス-Arg9]-ブラジキニン(B9958)、AcLys-Lys([αMe]Phe5,D-βNal7,Ile8]デス-Arg9-ブラジキニン(R914)、AcLys[DNal7,Ile8][デス-Arg9]-ブラジキニン(R715)、Lys-[Leu8][デス-Arg9]-ブラジキニン、DArg[Hyp3,Thi5,DTic7,Oic8]-ブラジキニン(イカチバント；HOE140)、1-([2,4-ジクロロ-3-{([2,4-ジメチルキノリン-8-イル]オキシ)メチル}フェニル]スルホニル)-N-(3-[{4-(アミノメチル)フェニル}カルボニルアミノ)プロピル)-2(S)-ピロリジンカルボキシアミド(アナチバント；LF160687)、(E)-3-(6-アセトアミド-3-ピリジル)-N-(N-[2,4-ジクロロ-3{(2-メチル-8-キノリニル)オキシ-メチル}フェニル]-N-メチルアミノカルボニル-メチル)アクリルアミド(FR173657)、[[4-[[2-[[(ビス(シクロヘキシルアミノ)メチレン]アミノ]-3-(2-ナフチル)-1-オキソプロピル]アミノ]フェニル]メチル]トリブチルホスホニウムクロリド 1塩酸塩(WIN 64338)、ブラジジト(British Journal of Pharmacology(2000)129、77-86)、(S)-1-[4-(4-ベンズヒドリルチオセミカルバジド)-3-ニトロベンゼンスルホニル]ピロリジン-2-カルボン酸 [2-[(2-ジ-メチルアミノエチル)メチルアミノ]エチル]アミド(ブラジジド；(S)-4)、ブラジキニン B(2)レセプターアンタゴニスト(Curr Med Chem. 2002 May；9(9)：913-28に記載)、またはその混合物、またはその医薬的に許容される塩からなる群から選ばれるブラジキニンレセプター阻害剤を含むことを特徴とする請求項1〜8のいずれかに記載の使用。
【請求項１０】
該医薬を併用医薬として投与することを特徴とする請求項1〜9のいずれかに記載の使用。
【請求項１１】
該医薬を静脈内、腹腔内、粘膜に(特に鼻内)、経口的、または気管内に、またはエアロゾル組成物として投与することを特徴とする請求項1〜10のいずれかに記載の使用。
【請求項１２】
ACE2、およびレニンアンギオテンシン系の阻害剤、および/またはブラジキニンレセプター阻害剤、特にAT1阻害剤、AT2-アゴニスト、ブラジキニンレセプター阻害剤、レニン阻害剤またはACE阻害剤、または該阻害剤の混合物を含む併用医薬。
【請求項１３】
肺損傷または肺障害、好ましくは酸吸引または敗血症により誘発される重症急性肺損傷、肺水腫、およびSARSコロナウイルス感染関連肺損傷および障害、特に肺水腫の予防または治療のためのレニンアンギオテンシン系の阻害剤の使用。
【請求項１４】
レニンアンギオテンシン系の該阻害剤が、ACE阻害剤、ACE2、AT1阻害剤、AT2レセプター、AT2アクチベーター、レニン阻害剤、またはその混合物からなる群から選ばれることを特徴とする請求項13記載の使用。
【請求項１５】
肺損傷または肺障害、好ましくは、酸吸引または敗血症により誘発された重症急性肺損傷、肺水腫、およびSARSコロナウイルス感染関連肺損傷および障害、特に肺水腫の予防または治療のためのブラジキニンレセプター阻害剤の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、肺損傷および肺疾患の治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
2003年の数カ月間に、重症急性呼吸器症候群(SARS)と呼ばれる新たに確認された疾患が、世界を混乱させる旅行、経済、および科学的会議を通して急速に広がった。新たなコロナウイルスが高熱および重症呼吸困難を特徴とする新型肺炎を引き起こすSARSの病原体として同定された。感染後の死亡率は、急性重症肺障害の発現によりほぼ10%に達した。さらに、スペイン風邪のようなインフルエンザおよび新規呼吸器疾患ウイルスの出現は急性肺障害(不全)により感染した個体に高死亡率をもたらした。
【０００３】
SARS感染症の高い死亡率、その甚大な経済的および社会的影響、SARSの新たな発生の恐れ、および生物兵器のようなウイルスの悪用の恐れにより、SARSおよび急性重症肺障害の病因の理解が最も大切である。最近、アンギオテンシン変換酵素2(ACE2)が、細胞系の機能的SARS-コロナウイルスレセプターとして同定された(Li et al.、2003；Wang et al.、2004)。しかしながら、可能性のある第2のレセプターのCD209L(L-SIGN)がin vitro細胞系試験で同定された(Jeffers、et al.、2000)。すなわち、実際にACE2がin vivoのSARS感染に関与する重要な要素であるか否かは不明であった。
【０００４】
最も重症型の急性肺損傷である急性呼吸困難症候群(ARDS)は、高死亡率(30〜60%)の大きな被害をもたらす臨床的症候群である。ARDSの素因的因子は様々であり、敗血症、吸引、およびSARSコロナウイルス感染を含む肺炎が含まれる。今日まで、ARDSの臨床結果を改善するのに有効な薬剤は承認されていない。
【０００５】
ACE2は、カルボキシペプチダーゼとして作用する、AngIから一残基を開裂してAng1-9を生じ、AngIIから一残基を開裂してAng1-7を生じるアンギオテンシン変換酵素である。組換えACE2(rACE2)、ACE2の製造および使用方法は、特にCrackower et al.、2002、WO 00/18899 A2、WO 02/12471 A2、またはWO 2004/000367 A1に記載されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、特に酸吸引または敗血症に関連する急性肺障害、肺水腫、ARDS、およびSARSウイルス感染に関連する肺障害と戦うための有効な予防および治療法を提供することである。さらに、肺損傷および障害に対する新規戦略が必要である。
【０００７】
したがって、本発明は、特に酸吸引または敗血症により誘発される重症急性肺損傷、肺水腫、および重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス感染関連肺損傷および障害を治療するための医薬を製造するためのアンギオテンシン変換酵素2(ACE2)の使用を提供する。
【０００８】
実際に、ACE2がSARSタンパク質と結合することは知られていたが、本発明の過程で、ACE2に対するSARSウイルスタンパク質(Spike(スパイク))の結合がSARS感染の肺に対する有害作用に関与することがわかった。これらの知見はSARSウイルス感染に関連する肺損傷および障害と闘う完全に新しい方針を可能にし、この感染症の治療に対する新たな戦略も開発した。さらに、重症急性肺損傷または肺水腫は、特にACE2に関してこれら観察結果と類似性を示すので(他の肺損傷および肺障害と対照的に)、これら知見も重症急性肺損傷(特に酸吸引または敗血症により誘発されるもの)および肺水腫に効果的に対処する可能性も開く。一般的には、病院の集中治療室での治療が必要な、急性肺障害(特に、集中治療が必要な全ての急性肺障害、例えば上記または他のもの、例えば一般的にはARDS、肺炎性または炭疽性急性肺損傷)のすべての患者は、本発明のACE2投与(単独でまたは下記の特定の阻害剤と組み合わせて)、すなわち、これら急性障害に関連するACE2の損失を外部から置換することによる利益がありうる。
【０００９】
好ましくは、本発明の医薬は組換えACE2(rACE2)を含む。rACE2は大量でも再現性よく製造することができる。製造場所およびロットごとの変動はGMPを適用するとごく僅かである。一方、ACE2突然変異体を、天然アミノ酸配列を有するACE2タンパク質の代わりに本発明のACE2成分として用いてもよい。適切な突然変異体は、特にWO 00/18899 A2、WO 02/12471 A2、またはWO 2004/000367 Alに記載されている。
【００１０】
他方、本発明のために実施した実験研究にしたがって、ACE2、および1またはそれ以上のRAS阻害剤(RAS阻害剤)、またはブラジキニンレセプター阻害剤、好ましくは1またはそれ以上の以下の成分(すべてのこれら物質は医薬的に許容される投与形、例えば塩、エステル、デポー形などを含む)は、肺障害におけるACE2の作用の相乗的改善を可能にする：AT1阻害剤(=AT1レセプターの選択的ブロッカー；しばしば「ANGIIアゴニスト」ともいう(US 2003/0171415))、AT2-アゴニスト(=AT2レセプターの選択的エフェクター)、ACE阻害剤、レニン阻害剤、およびブラジキニンレセプター阻害剤。したがって、例えば、AT1阻害剤+ACE2、AT2-アゴニスト+ACE2、AT1阻害剤+AT2-アゴニスト+ACE2、ACE阻害剤+ACE2、レニン阻害剤+ACE2、およびブラジキニンレセプター阻害剤+ACE2の組み合わせ、およびAT1阻害剤(またはAT2-アゴニスト)+ACE阻害剤+ACE2、AT1阻害剤(またはAT2-アゴニスト)+ブラジキニンレセプター阻害剤+ACE2、ACE阻害剤+ブラジキニンレセプター阻害剤+ACE2、AT1阻害剤+ACE阻害剤+ブラジキニンレセプター阻害剤+ACE2の組み合わせは、種々の肺疾患、特にレニンアンギオテンシン系に関連するものに顕著なさらなる有益性を示す改善された併用医薬の例である。これら併用医薬は、特に重症急性肺損傷(特に、酸吸引または敗血症により誘発されるもの)、肺水腫、および重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス感染関連肺損傷および障害、特に肺水腫の治療または予防に適している。
【００１１】
ACE2をタンパク質(特に組換えタンパク質)として用いる代わりに本発明の医薬は、ACE2に加えてまたはその代わりにACE2をコードする核酸、特にDNA分子を含んでもよい。次に、ACE2を核酸シャトル(ベクター中にACE2のコーディング領域およびACE2発現の制御配列を含む)により送達することができる。次に、併用薬剤の阻害剤成分をACE2遺伝子シャトルとともに送達することができるが、阻害剤成分を独立して投与することが好ましい。
【００１２】
ACE2 DNA分子は、好ましくは組換え形で、プラスミドとして、直接、または組換えウイルスまたは細菌の部分として投与してよい。in vivo投与の例には、筋肉内経路によるかまたは遺伝子銃による「裸の」DNA分子の直接注射がある。組換え有機体の例には、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、Listeria monocytogenesがある(要約はCoulie、P. G.(1997)、Mol. Med. Today 3、261-268に記載されている)。さらに、核酸の合成担体、例えばカチオン脂質、ミクロスフェア、ミクロペレット、またはリポソームは、ACE2をコードする核酸分子のin vivo投与に用いることができる。所望により、適用は、物理的方法、例えばエレクトロポーレーションと組み合わせてよい。
【００１３】
原則的には、あらゆる遺伝子療法を用いてよく、呼吸器疾患に有用な遺伝子療法システムがKlink et al.、J Cyst Fibros. 2004 Aug;3 Suppl 2:203-12に記載されている。
【００１４】
したがって、本発明は、肺損傷または肺疾患を治療するための医薬を製造するためのACE2およびAT1阻害剤の組み合わせの使用も含む。
【００１５】
本発明に従って使用するRAS阻害剤、特にAT1阻害剤、AT2-アゴニスト、レニン阻害剤、ACE阻害剤、またはブラジキニンレセプター阻害剤の正確な性質は重要ではなく、大量の阻害剤物質(これら各阻害剤を遺伝子物質群にする)が存在するが、作用、能力、毒性などの明確な(薬理学的)記録(例えば、「Guide to Receptors and Channels」、特に「Angiotensin」、「Bradykinin」)Brit. J. Pharmacol.141、Suppl.1 (2004) 参照)がむしろ短時間枠内で薬物登録を可能にするために存在する、本発明の該物質の使用が好ましい。したがって、本発明の医薬は、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタン、オルメサルタン、タソサルタン、エンブサルタン、ホルサルタン、ミルファサルタン、プラトサルタン、リピサルタン、サプリサルタン、ゾラサルタン、またはその混合物、またはその医薬的に許容される塩からなる群から選ばれるAT1阻害剤、特にテルミサルタンを含むことが好ましい。特に好ましいAT1阻害剤は、テルミサルタンまたはその医薬的に許容される塩である。
【００１６】
好ましい態様によれば、本発明の医薬は、ACE阻害剤、特に、ベナゼプリル、カプトプリル、セロナプリル、エナラプリル、ホシノプリル、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、キナプリル、ラミプリル、トランドラプリル、ペリンドプリル、アラセプリル、シラザプリル、デラプリル、スピラプリル、テモカプリル、ゾフェノプリル、またはその混合物、またはその医薬的に許容される塩からなる群から選ばれるACE阻害剤を含む。
【００１７】
好ましい態様によれば、本発明の医薬は、レニン阻害剤、特に[アルファ-R [アルファ-R*、ベータ-S*(S*,S*)]-アルファ-ヒドロキシ-ベータ-[[2-[[2-(4-モルホリン-1-カルボキシアミド)-1-オキソ-3-フェニルプロピル]アミノ]-3-メチルチオ-1-オキソ-プロピル]アミノ]シクロヘキサンブタン酸、イソプロピルエステル；アリスキレン(alisk(i)ren)、ザンキレン、2(S),4(S),5(S),7(S)-N-(3-アミノ-2,2-ジメチル-3-オキソプロピル)-2,7-ジ(1-メチルエチル)-4-ヒドロキシ-5-アミノ-8-[4-メトキシ-3-(3-メトキシ-プロポキシ)フェニル]-オクタンアミド、レミキレン、またはその混合物、またはその医薬的に許容される塩からなる群から選ばれるレニン阻害剤を含む。
【００１８】
さらなる好ましい態様によれば、本発明の医薬は、ブラジキニンレセプター阻害剤、好ましくはデス-Arg9-ブラジキニン阻害剤、特にLys-Lys [Hyp3、Cpg5、dTic7、Cpg8]デス-Arg9]-ブラジキニン(B9958)、AcLys-Lys([αMe]Phe5,D-βNal7,Ile8]デス-Arg9-ブラジキニン(R914)、AcLys[D NaI7,Ile8][デス-Arg9]-ブラジキニン(R715)、Lys-[Leu8][デス-Arg9]-ブラジキニン、DArg [Hyp3,Thi5,DTic7,Oic8]-ブラジキニン(イカチバント；HOE140)、1-([2,4-ジクロロ-3-{([2,4-ジメチルキノリン-8-イル]オキシ)メチル}フェニル]スルホニル)-N-(3-[{4-(アミノメチル)フェニル}カルボニルアミノ)プロピル)-2(S)-ピロリジンカルボキシアミド(アナチバント；LF160687)、(E)-3-(6-アセトアミド-3-ピリジル)-N-(N-[2,4-ジクロロ-3{(2-メチル-8-キノリニル)オキシ-メチル}フェニル]-N-メチルアミノカルボニル-メチル)アクリルアミド(FR173657)、[[4-[[2-[[(ビス(シクロヘキシルアミノ)メチレン]アミノ]-3-(2-ナフチル)-1-オキソプロピル]アミノ]フェニル]メチル]トリブチルホスホニウムクロリド 1塩酸塩(WIN 64338)、ブラジジト(bradyzyte)(British Journal of Pharmacology(2000)129、77-86)、(S)-1-[4-(4-ベンズヒドリルチオセミカルバジド)-3-ニトロベンゼンスルホニル]ピロリジン-2-カルボン酸 [2-[(2-ジ-メチルアミノエチル)メチルアミノ]エチル]アミド(ブラジジド；Curr Med Chem. 2002 May；9(9)：913-28の記載の(S)-4)、ブラジキニン B(2)レセプターアンタゴニスト、またはその混合物、またはその医薬的に許容される塩を含む。
【００１９】
本発明によれば、本発明により予想される治療のためにACE2、AT1阻害剤またはACE阻害剤以外のブラジキニンレセプター阻害剤を用いることも可能である。したがって、本発明は、肺損傷または肺疾患、特に酸吸引または敗血症により誘発される重症急性肺損傷、肺水腫、および重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス感染関連肺損傷および障害のためのブラジキニンレセプター阻害剤の使用にも関する。本発明の特に好ましい局面は、肺水腫を治療するための医薬を製造するためのブラジキニンレセプター阻害剤(BK1および/またはBK2)の使用である。ブラジキニンレセプター阻害剤を含むこの肺水腫用医薬は、ACE2または本明細書に記載の他のRAS阻害剤と組み合わせてもよい。
【００２０】
本発明に従った組み合わせの投与は分離した投与により行ってよいが、併用医薬としての組み合わせ投与が好ましい(もしACE2をタンパク質形で投与する場合は)。
【００２１】
本発明の(併用)医薬は、静脈内、腹腔内、粘膜に(特に鼻内)、経口的、または気管内、またはエアロゾル組成物として投与するのが好ましい。異なる成分の相対量は、典型的投与用量内にあるか、または単一医薬の個々の用量以下でありうる(相乗効果による)。
【００２２】
本発明は、ACE2および1またはそれ以上のRAS阻害剤、および/またはブラジキニンレセプター阻害剤、特にブラジキニンレセプター阻害剤、AT1阻害剤、レニン阻害剤、AT2-アゴニスト、およびACE阻害剤を含む併用医薬にも関する。したがって、本発明は、例えば、AT1阻害剤+ACE2、AT2-アゴニスト+ACE2、AT1阻害剤+AT2-アゴニスト+ACE2、ACE阻害剤+ACE2、レニン阻害剤+ACE2、およびブラジキニンレセプター阻害剤+ACE2の組み合わせ、およびAT1阻害剤(またはAT2-アゴニスト)+ACE阻害剤+ACE2、AT1阻害剤(またはAT2-アゴニスト)+ブラジキニンレセプター阻害剤+ACE2、ACE阻害剤+ブラジキニンレセプター阻害剤+ACE2、AT1阻害剤+ACE阻害剤+ブラジキニンレセプター阻害剤+ACE2の組み合わせからなる群から選ばれる併用医薬も含む。これら併用医薬は、適切な医薬的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と混合することが好ましいことがある。上記のACE2および阻害剤またはACE2/阻害剤の組み合わせは、さらに、RAS阻害物質(US 6,387,894)、例えば、レニン阻害剤(例えば、Pharm. Res.、4、364-374(1987)、US 4,814,342、4,855,303、4,895,834、およびUS 6,387,894に記載のもの)、AT2レセプター(AT2)、AT2アクチベーター(例えば、p-アミノ-Phe6アンギオテンシンII(p-NH2Phe6-Ang II)、Nic-Tyr-(エプシロン-CBZ(ベンジルオキシカルボニル)-Arg)Lys-His-Pro-Ile(CGP42112)、US 6,762,167、US 6,747,008、またはUS 6,444,646)に記載のもの)などを含んでもよい。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
RASによる肺水腫形成の制御は本発明が提供する別の驚くべき事実であるから、本発明の別の局面は、肺損傷または肺障害、好ましくは酸吸引または敗血症により誘発される重症急性肺損傷、肺水腫、およびSARSコロナウイルス感染関連肺損傷および障害、特に肺水腫の予防または治療のためのレニンアンギオテンシン系の阻害剤の使用である。肺水腫を引き起こしうる因子は、かなり広範であり(そして一般的にはそれらの全ては本発明により対処することができる)、本発明の肺水腫の好ましい原因は、敗血症、酸吸引、またはSARSに加え、インフルエンザ、炭疽(バイオテロリズム)、細菌、真菌、膵炎、溺水、急性中毒などがある。本発明の薬剤および併用医薬は、肺の病的に亢進した血管透過性を治療するための薬剤を製造するのにも有用である。本発明の特に好ましい局面は、肺水腫を治療するための医薬を製造するためのRAS阻害剤の使用である。RAS阻害剤は、個々に適用するか、好ましくは(相乗効果により)2またはそれ以上の異なるRAS阻害剤、特に異なる標的も有する少なくとも2つのRAS阻害剤の併用医薬として適用してよい。
【００２４】
レニンアンギオテンシン系の好ましい阻害剤は、ACE阻害剤、ACE2、AT1阻害剤、AT2レセプター、AT2アクチベーター、レニン阻害剤、またはその混合物からなる群から選ばれる。
【００２５】
本発明に記載の特定の肺疾患におけるACE2レベルは、これら疾患の状態および進行と相関するので、本発明のさらなる局面は、重症急性肺損傷(特に、酸吸引または敗血症により誘発されるもの)、肺水腫、および重症急性呼吸器症候群(SARS)コロナウイルス感染関連肺損傷および障害の疾患マーカーとしてのACE2および血清または肺アンギオテンシンIIレベルの使用である。したがって、患者(特に血清または肺)から得た試料のACE2レベルおよびアンギオテンシンII(AngII)レベルを用いて、好ましくは以前の試料または標準ACE2またはAngII値(例えば、健康個体からの標準正常レベルまたは値)と比較し、疾患の進行および治療方法の成功を関連づけることができる。ACE2またはAngIIのそのような診断方法は一般に当業者によく知られている。例えば、WO 00/18899 A2、WO 02/12471 A2、またはWO 2004/000367 A1に記載の方法は、本発明に容易に適合させることができる。
【００２６】
本発明をさらに以下の実施例、図面により説明するが、これらに限定されない。
(図  面)
【００２７】
図1．マウス肺におけるACE2の発現。
ａ．ACE2 mRNA発現のin situハイブリダイゼーション分析。野生型マウスからの肺切片は、ジゴキシゲネニン標識した、ACE2エクソン11〜18に及ぶアンチセンスおよびセンスRNAプローブ(ACE配列とホモローガスではない)とハイブリダイズした。b．野生型(WT)およびace2 KOマウスからの肺組織抽出物におけるACE2およびACE発現のWesternブロット分析。ｃ．WTおよびace2 KOマウス(n = 4-6/群)の基礎肺エラスタンス。データは平均±s.e.m.で示す。
【００２８】
図2．ACE2はin vivo SARS感染の重要なレセプターである。
a、b．野生型(WT)およびace2 KOマウスにおけるSARSコロナウイルスの複製(a)およびSARS mRNA(b)の検出。マウスをSARS-CoVのBeijing株(分離株 PUMC01 AY350750、105.23ウイルス；Zou、K et al.、2003)に感染させた。ウイルス複製は、感染第2日の肺組織から検出された(「方法」参照)。ウイルス価(平均log10TCID50/g肺組織)は、個々のマウス(n = 15/群)についてlog10スケールで示す。SARS mRNA発現をSARS Spike(スパイク)のリアルタイムRT-PCRを用いてアッセイした。Spike RNAコピー数は、各試料でマウスβアクチンコピー数により正規化した。データはlog10スケール上で平均値±s.e.m.で示す(n = 15/群)。c.コントロールおよびSARS感染WTおよびace2 KOマウスの肺組織病理学。肺をSARS感染後第8日に得た。SARS感染WTマウスにおける白血球浸潤がみられたが、分析した15匹のace2 KOマウスはいずれも肺病変または肺浸潤のいかなる徴候も示さなかった。重症WT例の画像を示す(H&E、x 200)。
【００２９】
図3．SARS感染によるACE2発現および組換えSARS Spikeタンパク質の下方調節：a．SARS感染後のマウス肺においてACE2タンパク質は低下したが、ACEレベルは正常。肺ホモジネートをコントロールおよびSARS感染野生型またはace2 KOマウスから調製し、Westernブロットにて分析した。b．プルダウンアッセイにおける組換えSpike(スパイク)(S-1190)-Fcタンパク質(S-1190)のヒトACE2(hACE2)およびマウスACE2(mACE2)の結合。コントロールFcタンパク質ではなく、Spike-Fcタンパク質は、それぞれA549ヒト肺胞上皮細胞およびIMCDネズミ腎上皮細胞の全細胞抽出物由来のhACE2およびmACE2を低下(pull down)させた。全溶解物をコントロールとして示す。c．細胞培養中のhACE2およびmACE2に対するSpike-Fcタンパク質の結合。hACE2-またはmACE2-トランスフェクト293細胞をSpike-Fcとインキュベーションし、結合をFACSにより検出した(青線)。Spike-Fc、次いで抗Fc Absとインキュベーションした非トランスフェクト293細胞をコントロールとして示す(黒線)。d．Vero E6細胞における37℃でSpike-Fcタンパク質に結合後のACE2の細胞表面発現の減少(4℃ではみられない)。ACE2表面発現は、抗ACE2モノクローナルAbを用い、Spike-Fcとの3時間インキュベーションで検出された。同様のデータが、表面結合Spike-Fcを直接検出し、ACE2エピトープのマスキングを避ける抗Fc Abを用いて得られた。アイソタイプ対応Abを用いるバックグラウンドコントロールを含む典型的FACSヒストグラムを示す。
【００３０】
図4．SARS Spikeタンパク質は、重症急性肺損傷の重症度を増幅した。
a．Spike-Fcタンパク質またはコントロールFc処置WTマウス(n = 5-7/群)における生理食塩水または酸点滴注入後の肺エラスタンス測定。酸損傷後のSpike-Fc処置およびコントロール-Fc処置WTマウスを比較する全時間経過に対してp<0.05(反復ANOVA検定)。b．肺の組織病理学。Spike-Fc処置WTマウスにおける、白血球浸潤が密集する肺胞壁の増加、肺水腫、肺胞構造の部分的崩壊に注目のこと。典型的画像を示す(H&E、x 200)。c．酸誘発肺損傷の存在または非存在下のコントロールおよびSpike-Fc処置マウスにおける肺水腫のリードアウトとしての肺の湿重量/乾燥重量比。バーは平均値±s.e.m.を示す。アスタリスク：酸チャレンジしたSpike-Fc処置マウスおよびコントロール間でp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。d．酸チャレンジマウスにおけるSpike(S318-510)-Fc処置による重症急性肺障害。スキーム(上パネル)は、Spikeタンパク質(S318-510)のACE2結合ドメインを示す。肺エラスタンス測定(下パネル)は、Spike(S318-510)-Fcは、酸チャレンジWTマウスにおいてSpike(S1190)-Fcに匹敵する重症急性肺障害を誘発したことを示した。n = 5-7/群。酸損傷後のSpike(S318-510)-FcまたはSpike(S1190)-Fc処置、およびコントロール-Fc処置WTマウスを比較する全時間経過についてp<0.05(反復ANOVA検定)。
【００３１】
図5．アンギオテンシンIIレセプター(AT1R)の阻害は、SARS Spike介在重症急性肺損傷を軽減する。a．Spike-Fcタンパク質(S1190)-またはコントロール-Fc-処置ace2 KOマウス(各群につきn = 5-7)における酸点滴注入後の肺エラスタンス測定。酸損傷後のSpike-Fc-処置ace2 KOおよびコントロール-Fc-処置ace2 KOマウス間に有意差はなかった。b．生理食塩水または酸吸引後のSpike-Fcタンパク質-またはコントロール-Fc-処置WTマウスの肺のAngIIペプチドレベル。AngIIレベルをEIAにて3時間で測定した。バーは平均値±s.e.m.を示す。アスタリスク：酸損傷後のSpike-Fc-およびコントロール-Fc-処置WTマウスを比較してp<0.05。c．AT1R阻害剤ロサルタン処置した酸プラスSpike-FcチャレンジWTマウス(n = 4-6/群)における肺エラスタンス測定(「方法」参照)。AT1R阻害剤処置Spike-Fc チャレンジマウスとビークル処置Spike-Fcチャレンジマウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。d．特異的AT1Rブロッカー、ロサルタンの存在下または非存在下における酸およびSpikeチャレンジマウスにおける肺の湿重量/乾燥重量比(n = 4-6マウス/群)。バーは平均値±s.e.m.である。スタリスク：酸損傷後3時間におけるAT1R阻害剤処置ace2 KOとビークル処置ace2 KOマウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。
【００３２】
図6. 組換えSpike-Fcタンパク質およびSpike(S318-510)-FcによるACE2発現低下。a．トランスフェクトCHO細胞の培養上清から単離した精製組換えSpike(S1190)-FcおよびSpike(S318-510)-Fcタンパク質のクマシー染色SDS-PAGEゲル。分子量を示す。b．Vero E6細胞における37℃におけるSpike(S318-510)-Fcタンパク質に対する結合後のACE2の細胞表面発現の減少(4℃ではみられない)。ACE2表面発現が抗ACE2モノクローナルAbを用い、Spike(318-510)-Fcとインキュベーション3時間で検出された。アイソタイプ対応Abによる背景コントロールを含む典型的FACS分析を示す。
【００３３】
図7．ACE2の損失は酸吸引誘発急性肺損傷を悪化させる。a．野生型(WT)およびace2ノックアウト(ace2 KO)マウス(各処置群 n = 10、各生理食塩水コントロール群n = 6)における酸および生理食塩水処置後の肺エラスタンス測定。アスタリスク：酸処置WTおよびace2 KOマウスを比較する全時間経過についてp<0.05(反復測定ANOVA)。b．酸誘発ALIにおけるWTおよびace2 KOマウスの動脈血中の酸素分圧(PaO2)。c．肺損傷後3時間のコントロールおよび酸処置WTおよびace2 KOマウスにおける肺水腫についてのリードアウトとしての肺の湿重量/乾燥重量比。bおよびc中のバーは平均値±s.e.m.を示す。アスタリスク：p<0.05；二重アスタリスクp<0.01(酸処置WTおよびace2 KOマウス(AN-OVAおよび両側t検定)間で)。d．肺の組織病理学。酸処置ace2 KOマウスにおけるヒアリン膜形成の増加、炎症細胞浸潤、および肺水腫に注目のこと。生理食塩水処置WTおよびace2 KO コントロールにおける正常肺形態に注目のこと。典型的画像を示す(H&E、x 200)。e．コントロール肺、および肺損傷後3時間の肺におけるACE2およびACEタンパク質発現。全肺ホモジネートをWesternブロッティングにより分析した。βアクチンはローディングコントロールとして示す。5つの異なる実験の典型的1実験を示す。
【００３４】
図8．ACE2の損失は敗血症誘発ALIを悪化させ、rhuACE2タンパク質は、ace2突然変異体および野生型マウスにおけるALIの重症度を減少させる：a．WTおよびace2 KOマウスにおける敗血症誘発ALI後の肺エラスタンス測定。シャムまたはCLP外科手術後18時間に、動物は別に6時間人工換気を受けた(CLP-処置群各n=10、シャム処置コントロールn = 6)。CLP-処置ace2 KOマウス10匹のうち8匹が4〜4.5時間で死亡したので、ace2 KO群については4時間までのデータのみを示す。肺エラスタンスは4時間においてWTマウスよりace2 KOで有意に高かった。CLP-処置ace2 KOマウスとCLP-処置WTマウスとの比較でp<0.01(ANOVAおよび両側t検定)。b．シャムおよびCLP-処置WTおよびace2 KOマウスにおける湿重量/乾燥重量比を換気4時間で測定した。バーは平均値±s.e.m.を示す。アスタリスク：CLP-処置WTおよびace2 KOマウス間でp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。c．シャムおよびCLP-処置WTおよびace2 KOマウスにおける肺の組織病理学。WTマウスに比べてace2 KOマウスで肺水腫および炎症性浸出物の増加に注目のこと。換気4時間における典型的画像を示す(H&E、x 200)。d、組換えヒトACE2タンパク質(rhuACE2；0.1 mg/kg)、突然変異体rhuACE2(Mut-rhuACE2 ；0.1 mg/kg)、またはビークルのみで処置したace2 KOマウスの酸およびコントロール生理食塩水点滴注入後の肺エラスタンス(「方法」参照)(i.p.、n = 6/群)。アスタリスク：3時間におけるrhuACE2-処置ace2 KOマウスをMut-rhuACE2-処置およびビークル処置ace2 KOマウスと比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。e．酸誘発ALIにおけるrhuACE2-、Mut-rhuACE2-、またはビークル処置ace2 KOマウスの肺の湿重量/乾燥重量比。バーは平均値±s.e.m.を示す。アスタリスク：3時間におけるrhuACE2-処置をMut-rhuACE2-処置またはビークル処置ace2 KOマウスと比較してp<0.05。(AN-OVAおよび両側t検定)。f．rhuACE2タンパク質(0.1 mg/kg)、Mut-rhuACE2タンパク質(0.1 mg/kg)、またはビークルで処置したWTマウスにおける酸点滴注入後の肺エラスタンス測定(n = 6-8/群)。アスタリスク：3時間におけるrhuACE2処置とMut-rhuACE2-処置またはビークル処置WTマウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。
【００３５】
図9．ACE欠乏は急性肺損傷の重症度を減少させる。a．レニン-アンギオテンシン系の略図。b．コントロールおよび酸処置WTおよびace2 KOマウスの肺AngIIレベル。AngIIレベルをEIAにて3時間で測定した。バーは平均値±s.e.m.を示す(n = 3-5/群)。アスタリスク：酸処置WTおよびace2 KOマウス間でp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。c．ace+/+(WT)、ace+/-およびace-/-マウス(n = 4-6マウス/群)における酸点滴注入後の肺エラスタンス測定。アスタリスク：3時間でWTとace+/-およびace-/-マウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。生理食塩水-処置ace-/-およびWTマウスからのデータをコントロールとして示す。d．酸処置ace2 KO、ace+/-ace2 KO、ace-/-ace2 KO、およびWTマウス、および生理食塩水-処置ace-/-ace2 KO、およびWTマウスの肺エラスタンス測定(n = 5マウス/群)。アスタリスク：酸処置後3時間におけるace2 KOをWT、ace+/-ace2 KO、またはace-/-ace2二重突然変異体マウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。損傷なしに、群間で肺エラスタンスに差はなかった。e．肺の組織病理学。ace2 KOマウスにおける重症肺間質水腫および白血球浸潤は、ace突然変異に対するホモ接合性(ace-/-)またはヘテロ接合性(ace+/-)により軽減した。典型的顕微鏡写真を示す(H&E、x200)。
【００３６】
図10．AngIIレセプターAT1aR コントロール ALI重症度および肺血管透過性。a．酸吸引後のagtrla-/-マウス、agtr2-/yマウス、およびWTマウスにおける肺エラスタンス測定(n = 4-6/群)。すべての酸処置agtr2-/yマウスは2時間後に死亡した。二重アスタリスク：酸処置WTおよび酸処置agtr1a-/-マウスを比較する全時間経過についてp<0.01(反復ANOVA検定)、2時間でWTとagtr2-/yマウスを比較してp<0.01(ANOVAおよび両側t検定)。b．AT1R(ロサルタン、15 mg/kg)またはAT2R(PD123.319、15 mg/kg)阻害剤、またはビークルで処置したace2 KOマウスにおける酸または生理食塩水点滴注入後の肺エラスタンス測定(「方法」参照)n = 4-6/群。二重アスタリスク：3時間におけるAT1R阻害剤処置ace2 KOとビークル処置またはAT2R阻害剤処置ace2 KOマウスを比較してp<0.01(ANOVAおよび両側t検定)。c．エバンズブルー(EB)の静脈内注射により測定した肺血管透過性。肺の血管外EBを肺損傷後3時間にWT およびace2 KOマウスにおいて測定した(「方法」参照)。バーは平均値±s.e.m.を示す(n = 5/群)。二重アスタリスク：3時間において酸処置WTおよびace2 KOマウスを比較してp<0.01(ANOVAおよび両側t検定)。d．酸吸引後3時間におけるWTおよびace2 KOマウスのEB注射肺の典型的画像。e．肺損傷後3時間のWTおよびagtr1a KOマウスの肺の血管外EB。バーは平均値±s.e.m.を示す(n = 5/群)。アスタリスク：3時間における酸処置WTおよびagtr1a KOマウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。
【００３７】
図11．ace2突然変異体マウスにおける重症エンドトキシン誘発肺損傷。a．WTおよびace2 KOマウスにおけるエンドトキシン誘発ALI後の肺エラスタンス測定。LPS(0.5μg/g)の気管内点滴注入後1時間に、マウスをザイモサン(3μg/g)でチャレンジした。LPS+ザイモサン処置群各n = 6、生理食塩水コントロール各n = 5、3時間で酸処置WTおよびace2 KOマウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。b．LPS+ザイモサン誘発急性肺損傷におけるWTおよびace2 KOマウスの湿重量/乾燥重量比。バーは平均値±s.e.m.を示す。アスタリスク：LPS+ザイモサン-処置WTおよびace2 KOマウス間でp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。c．WTおよびace2 KOマウスのLPS+ザイモサン処置における肺の組織病理学。WTマウスと比較してace2 KOマウスにおける肺水腫および炎症細胞浸潤の増加に注目のこと。典型的を示す(H&E、x 400)。
【００３８】
図12．組換えACE2製造、および触媒的活性および不活性ACE2による野生型マウスの処置。a．触媒ドメインにおける2つの不活性化突然変異(H374N & H378N)を有する、組換えヒト野生型ACE2(rhuACE2)の細胞外ドメイン(aa1-738)および組換えヒトACE2(Mut-rhuACE2)の突然変異細胞外ドメイン(aa1-738)の触媒活性。特定の蛍光性基質を開裂する精製タンパク質の活性をin vitroで測定した(「方法」参照)。b．トランスフェクトCHO細胞の上清から精製したrhuACE2およびMut-rhuACE2タンパク質のクマシーブルー染色SDS-PAGEゲル。c．酸誘発ALIにおけるrhuACE2-およびMut-rhuACE2-処置WTマウスの肺の湿重量/乾燥重量比。n = 6-8/群。バーは平均値±s.e.m.を示す。アスタリスク：p<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。
【００３９】
図13. ACE2はAngIIレベルを負に制御する。a．コントロールおよび酸処置WTおよびace2 KOマウスにおける血漿AngIIペプチドレベル。AngIIレベルをEIAにより3時間に測定した。バーは平均値±s.e.m.を示す(n = 3-5/群)。b.c．アスタリスク：酸処置WTおよびace2 KOマウス間でp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。酸誘発ALIにおけるWT、ace2 KO、ace-/-、およびace-/-ace2二重突然変異体マウスにおける(b)血漿および(c)肺AngIIペプチドレベル。AngIIレベルはEIAにて3時間に測定した。バーは平均値±s.e.m.を示す(n = 3-5/群)。二重アスタリスク：酸処置ace2 KOと酸処置ace-/-単またはace-/-ace2二重突然変異体マウスを比較してp<0.01(ANOVAおよび両側t検定)。d．ビークルまたはrhuACE2で処置した酸チャレンジ野生型マウスにおける肺AngIIレベル。AngIIレベルをEIAにて3時間に測定した。バーは平均値±s.e.m.を示す(n = 3-5/群)。アスタリスク：p<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。
【００４０】
図14．aceの遺伝子不活性化は肺水腫形成を軽減する。a．WT、ace+/-、およびace-/-マウス、酸誘発ALIおよび生理食塩水-処置ace+/+WTおよびace-/-マウスの肺の湿重量/乾燥重量比を3時間で測定した。バーは平均値±s.e.m.を示す。n = 4-6マウス/群。アスタリスク：酸処置WTと酸処置ace+/-、またはace-/-マウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。b．酸処置ace2 KO、ace+/-ace2 KO、ace-/-ace2 KO、およびWTマウス、および生理食塩水-処置ace-/-ace2 KOおよびWTマウスの肺の湿重量/乾燥重量比を3時間で測定した。バーは平均値±s.e.m.を示す。n = 5マウス/群。アスタリスク：酸処置ace2 KOと酸処置ace+/-ace2 KO、ace-/-ace2 KO、またはWTマウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。
【００４１】
図15. ace欠損はace2 KOバックグラウンドにおけるエンドトキシン誘発急性肺損傷を軽減する。LPS+ザイモサンチャレンジ後のWT、ace2 KO、およびace-/-ace2 KOマウスにおける肺エラスタンス測定。LPSおよびザイモサン点滴注入のタイミングを示す。n = 3-6マウス/群。3時間におけるace2 KOとWTまたはace-/-ace2二重突然変異体マウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。
【００４２】
図16. AT1Rは酸誘発肺水腫を調節する。a．agtr1a-/-、agtr2-/y、およびWTマウスにおける肺の湿重量/乾燥重量比。n = 4-6マウス/群。バーは平均値±s.e.m.を示す。アスタリスク：WTとagtr1a-/-、およびWTとagtr2-/yマウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。損傷なしに、WT、agtr1a-/-、またはagtr2-/yマウス間で肺の湿重量/乾燥重量比に差はなかった。b．特異的AT1Rブロッカー、ロサルタン(15mg/kg)の存在下または非存在下のace2 KO肺の湿重量/乾燥重量比。n = 4-6マウス/群。バーは平均値±s.e.m.を示す。アスタリスク：肺損傷後3時間でAT1R阻害剤処置ace2 KOとビークル処置ace2 KOマウスを比較してp<0.05(ANOVAおよび両側t検定)。
【００４３】
図17．エラスタンスにより測定したALIにおけるブラジキニンレセプター阻害剤の効果。ブラジキニンレセプター阻害剤の添加は、酸吸引誘発急性肺損傷を悪化させる。a．野生型(WT)およびace2ノックアウト(ace2 KO)マウスにおける酸または生理食塩水処置後の肺エラスタンス測定。各酸処置群n = 10。食塩水コントロール群n = 6。アスタリスク：酸処置WTおよびace2 KOマウスを比較する全時間経過についてp<0.05(反復測定ANOVA)。
【実施例】
【００４４】
実施例1：マウス肺におけるACE2発現
ACE2発現は、主として腎臓、肺、およびヒト肺の上皮および内皮細胞にみられた。したがって、マウス肺組織におけるACE2発現を分析した。ヒトと同様に、マウスACE2 mRNAは、in situハイブリダイゼーションを用いて肺の血管内皮および気道上皮細胞に発現する(図1)。Westernブロット分析において、ACE2タンパク質の125 kDaバンドが野生型マウスに特異的に観察されたが、ace2ノックアウト動物では観察されなかった(図1b)。リアルタイムPCRは、ACE発現がACE2発現とace2ノックアウトマウスで同程度であることを示した。ACE2の損失は、基礎肺機能(図1c)または肺構造(図7参照)に影響を与えなかった。同様に、ace単突然変異体、ace/ace2二重ノックアウト、agtr1a-/-、およびagtr2-/-マウスは、正常肺構造および正常ベースライン肺機能を表現する。
実施例2：SARSの病因におけるACE2の重要な役割
【００４５】
ここで、第1の遺伝子的証拠は、ACE2がin vivoの重要なSARSレセプターであることを示す(図2)。興味深いことに、SARS感染およびSARSコロナウイルスのSpikeタンパク質(図6参照)はACE2発現を減少させ(図3)、マウスへのSARS-Spike注射は、in vivoのARDS症状を悪化させる(図4)。重要なことは、Spike介在急性肺障害は、レニン-アンギオテンシン経路の調節により軽減しうる(図5)。これらの結果は、なぜSARS感染が重症のしばしば致死的な肺障害を引き起こすのかを分子的に説明し、SARS、およびおそらく他の呼吸疾患ウイルス(例えば、インフルエンザ、トリインフルエンザ、炭疽、肺炎球菌、...のような)に対する合理的な治療を示唆する。
材料と方法
【００４６】
マウス：ace2突然変異体マウスを記載のごとく作製し、C57B1/6と5回以上戻し交配した。性、年齢、およびバックグラウンド適合マウスのみをコントロールとして用いた。マウスを記載のごとくPCRおよびSouthernブロッティングにより遺伝子型決定し(Crackower et al.、2002)、Institute of Molecular Pathology、Viennaの動物施設で、また、SARS感染についてはInstitute of Laboratory Animal Sciences、Chinese Academy of Meidcal Sciences & Peking Union Medical College、Beijing、P. R. Chinaで、各施設のガイドラインに従って維持した。すべてのSARS実験は中国当局により承認された。
【００４７】
ウイルス：本試験に用いたSARS-CoV(PUMC01分離株、genbank受託番号AY350750)は、PUMC病院のZ. WangおよびY. Liuから分与された。この分離株は、National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Productsにより保証された(No. SH200301298)。該ウイルスを単離(分離)し、8回継代して106.23 50%組織培養感染用量(TCID50)/mlの力価を有するウイルスストックを作製した。感染ウイルスを用いるすべての研究は、バイオセイフティ封じ込めレベル3の施設中、バイオセイフティキャビネット内で行った。SARS-CoV PUMC01分離株を用いるすべての研究は、中華人民共和国の衛生部により検証され、国務院の「Laboratory Biosafety Management of Pathogen」に従って行った。
【００４８】
動物試験：マウス試験は、Ministry of Health Science and Technology部門により承認され、承認された動物バイオ安全レベル3の施設内で行った。雌マウスは4匹/ケージ以下で収容し、雄マウスは1匹/ケージで収容した。マウス(3〜5週齢)をイソフルランで軽く麻酔し、100μlのウイルスを鼻内に接種した。第2日に2匹のマウスを二酸化炭素で安楽死させ、肺を除去し、-70℃で凍結した。凍結組織を解凍し、DMEM培地(Invitrogen)中の10%懸濁液中でホモゲナイズした。ウイルス価を、24および96ウェルプレート中、Vero細胞単層培養を用いて決定した。ウイルス価はTCID50/g肺組織として表現する。Trizol試薬(Invitrogen)を用いてホモゲナイズド肺組織の部分から単離し、-70℃で保存した。
【００４９】
リアルタイムRT-PCR：標準プロトコールを用いた。マウスβアクチンハウスキーピング(housekeeping)遺伝子を試料の正規化に用いた。
【００５０】
SARS-Spikeタンパク質結合実験：SARS spike(スパイク)タンパク質(Urbani株由来アミノ酸1-1190)のコーディング配列、または以前にマップしたもののみを含むSpike配列(Li et al.、2003；Wang et al.、2004)。ACE2結合ドメイン(aa318-510)をコドン最適化し、合成し、PEAKベクターにサブクローンしてヒトIgG1のFc部分を含む融合タンパク質を得た。CHO細胞をSpike-Fc発現ベクターでトランスフェクトし、上清を回収し、Spike-Fcタンパク質をプロテインA Sepharoseカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィにより精製した。in vitro結合アッセイについては、A549ヒト肺胞上皮細胞またはIMCDネズミ腎上皮細胞を、「コンプリート」プロテアーゼ阻害剤カクテル(Roche)および1mM Na3VO4を添加した溶解用緩衝液(50mM Tris-HCl、pH 7.4、20mM EDTA、および1% Triton-X100)中でホモゲナイズした。細胞溶解物を、4℃で2時間静かに撹拌しながらSpike-FcまたはコントロールヒトIgG-Fcタンパク質とインキュベーションした。Spike-FcまたはコントロールヒトIgG-Fcタンパク質をプロテインG Sepharoseによりプルダウンし、タンパク質をSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(PAGE)により分離し、次いでニトロセルロース膜に移した。プルダウンしたヒトおよびマウスACE2を、それぞれ抗ヒトACE2ポリクローナル抗体(R&D系)および抗マウスACE2ポリクローナル抗体(Crackower et al.、2000)により検出した。フローサイトメトリーについては、Vero E6細胞を2mM EDTA/PBSで剥がし、4℃または37℃で3時間、Spike-FcまたはコントロールヒトIgG-Fcタンパク質とインキュベーションした。次に、細胞を、抗ACE2モノクローナル抗体、次いでFITC結合抗マウスIgG Ab(Jackson ImmunoResearch Laboratories、Inc)とインキュベーションした。さらに、FITC結合抗ヒトIgGポリクローナル抗体を、Vero E6細胞と結合したSpike-Fcタンパク質およびコントロールIgG-Fcの検出に用いた。両実験系において、同様の結果が得られた。完全長マウスおよびヒトACE2コーディング領域をPEAKベクターにクローンし、293細胞にトランスフェクトした。Spike-Fc結合を上記のごとく検出した。すべての試料を、FACScan(Becton Dickinson)を用いるフローサイトメトリーにより分析した。
【００５１】
酸誘発急性肺損傷を有するマウスにおける組換えSpike-Fcチャレンジ：酸吸引誘発急性肺損傷のマウスモデルを、Spike-Fc in vivo実験に用いた(Imai et al.、2003)。マウス(2.5〜3カ月齢)にSpike(S1190)-Fc、Spike-(S318-510)-Fc(各5,5 nmol/kg)、またはコントロール-Fcを酸処置前30分、処置後1および2時間の3回i.p.投与した。HCl点滴注入後、動物を示した実験コホートに無作為化した。次に、すべての動物を3時間換気し、Imai et al.に記載のごとく分析した。Spike-Fc-介在急性肺損傷のAT1R阻害については、Spike-FcチャレンジマウスをAT1R阻害剤のロサルタン(15 mg/kg)で処置した。組織学的分析では、5μm厚の切片を切り出し、ヘマトキシリンおよびエオジン(H&E)で染色した。アンギオテンシンIIペプチドレベルの検出では、肺を、Imai et al.に記載のごとく氷上のペプチダーゼ阻害剤含有80%エタノール/0.1% HCl中でホモゲナイズした。
【００５２】
統計分析：全データは平均±s.e.m.で示す。1時点の測定値をANOVAにより分析し、有意性についてはさらに両側t検定により分析した。時間経過は、Bonferroni後-t検定を用いる反復測定(混合モデル)ANOVAにより分析した。すべての統計検定は、GraphPad Prism 4.00(GraphPad Software、San Diego、CA、USA)およびJMP(SAS Institute、Toronto、ONT、Canada)プログラムを用いて計算した。p<0.05を統計的有意を示すとみなした。
(結果および考察)
【００５３】
この問題を遺伝的に検討するため、ace2ノックアウトおよびコントロール野生型マウスをSARS-Coronaウイルスで感染させた。先に報告したように、野生型マウスのSARS感染は、肺のウイルス複製および大量(>107 TCID50/g肺組織)の感染性ウイルスの回収をもたらす(図2a、b)。マウスのSARS感染はその肺における軽度の病理学的変化の発現と関連する(図2c)。ace2 KOマウスにおいて、極少数の感染性SARSウイルスのみが回収され(<102 TCID50/g肺組織)(図2a)、SARS複製は、半定量性リアルタイムRT-PCRを用いて減少した(図2b)。さらに、ace2突然変異体マウスの肺における明らかな病的変化は検出されなかった(図2c)。これらデータは、ACE2が実際に感染性SARSウイルスの効果的複製および回収に必要な重要なSARSレセプターであるという最初の遺伝子的証拠を提供する。
【００５４】
in vivoでの野生型マウスの実験的SARS感染は、肺(図3a)および心臓におけるACE2タンパク質およびmRNA発現の有意な低下ももたらし、ACE2発現の低下が、in vivoにおけるSARS介在重症急性肺病変に役割を果たすことを示した。反対に、ACE発現レベルは、SARS感染マウスで明らかな変化はなかった(図3a)。SARSがACE2を介して肺病変に影響を及ぼすか否かを試験するため、ACE2結合の不可欠なリガンドである組換えSARSコロナウイルス表面-Spikeタンパク質を用いる限定モデル系を樹立した。そのようなモデル系は、in vivoにおけるウイルス複製/感染による二次的効果の可能性を避け、SARS-SpikeがACE2の調節を通して急性肺損傷に悪影響があるか否かを直接試験することができる。
【００５５】
最初に、組換えSARS Spikeタンパク質(図6a)がin vitroプルダウンアッセイを用いてヒトおよびネズミACE2タンパク質と結合するか否かを試験した。組換えSpike-Fcタンパク質は、実際にヒトおよびネズミACE2両方をプルダウンした(図3b)。ヒトおよびマウスACE2に対するSARS Spike-Fcの結合は、ヒトまたはネズミACE2を過剰発現する293細胞に対するSpike-FcのFACSバインディングアッセイにより確認された(図3c)。さらに、Spike-Fcは、Vero E6細胞において内因性ACE2と結合する(図3d)。重要なことは、Spike-FcのVero細胞における内因性ACE2の結合は、ACE2表面発現の下方調節をもたらした(図3d)。Spike-Fcは、293細胞に過剰発現したヒトおよびマウスACE2の表面レベルも減少させ、ネズミACE2トランスフェクト293細胞のシンシチア(syncythia)の形成を引き起こす(コントロールのCD4トランスフェクト293細胞では生じない)。すなわち、他のウイルスレセプター相互作用と同様に、細胞系におけるSARS Spikeタンパク質のACE2に対する結合、またはin vivoでのSARS感染は、ACE2タンパク質発現の低下をもたらす。
【００５６】
ACE2は重要なSARSレセプターであり(図2)、ACE2と結合するSARS-Spikeタンパク質はACE2発現を下方調節するので(図3)、重要なACE2結合タンパク質であるSARS-Spikeタンパク質がin vivoにおける急性肺損傷の重症度に影響を及ぼすか否かについて試験した。興味深いことに、Spike-Fcタンパク質による処置は野生型マウスの肺機能を悪化させたが、コントロール-Fcタンパク質は明らかな影響を示さなかった(図4a)。さらに、酸チャレンジ野生型マウスのSpike-Fc処置は、肺実質の病的変化を増大し(図4b)、湿/乾燥肺重量比で定義した肺水腫を増加させた(図4c)。ヒトFcと融合する先にマップしたACE2結合ドメイン(aa318-510)のみを含むSpike欠失突然変異体も作製した(図4d)。この短いSpike(S318-510)-Fcタンパク質は、FACSアッセイを用い細胞系のACE2にも結合し、ACE2細胞表面発現を下方調節する(図6b)。Spike(S318-51O)-Fcの処置は、野生型マウスにおける酸誘発急性肺損傷を再度悪化させた(図4d)。重要なことは、in vivo Spike-Fcタンパク質投与は、ace2ノックアウトマウスの肺障害の重症度に影響を与えず(図5a)、急性肺損傷に対するSpikeタンパク質の効果はACE2特異的であることを示した。これらの結果は、SARSコロナウイルスSpikeタンパク質がACE2を介して重症急性肺障害の発現に直接影響を及ぼし得ることを示す。
【００５７】
ACE2は、カルボキシペプチダーゼとして機能し、AngIから1残基を開裂してAng1-9を生じ、AngIIから1残基を開裂してAng1-7を生じる。反対に、ACE2同族体のACEは、デカペプチドAngIをオクタペプチドAngIIに開裂する。すなわち、ACE2はACEの機能と逆バランスをとり、AngIIの産生を負に調節する。Spike-Fc注射が実際にレニン-アンギオテンシン系の機能に影響を及ぼすか否かを試験するため、酸/Spike-Fc処置マウスの肺のAngIIレベルを分析した。酸吸引は、野生型マウスの肺のAngIIレベルを増加させた。重要なことは、Spike-Fc処置マウスの肺組織におけるAngIIレベルのさらなる有意な増加が観察された(図5b)。Spike-FcがAngII産生の増加およびRASの機能変化を通して肺疾患病変を増加させるか否かをさらに確認するため、AT1レセプターを特異的阻害剤でブロックした。AT1Rの阻害が実際にSpike-Fc処置マウスにおける急性重症肺損傷を軽減した(図5c)。AT1Rの阻害は、Spike-Fc処置マウスの肺水腫も軽減した(図5d)。総合すると、今回のデータは、アンギオテンシン系の脱制御を介して急性肺障害を増大させうることを示す。さらに、SARS Spikeは、AngIIレセプターの阻害により救済されうる肺障害に介在する。
【００５８】
20世紀初めに2000万人以上が死亡したスペイン風邪ウイルスの死亡率は感染患者の〜0.5%であったが、SARSコロナウイルス感染の死亡率は現代の集中治療によっても10%に達すると推定されている。このSARSの非常に高い死亡率および世界的なSARS発生の甚大な経済的および社会的影響により、該疾患の病因の解明が新たな発生における将来の治療において重要である。さらに、ヒトにおけるトリインフルエンザA(H5N1)の最近の発生も、急性呼吸器障害により70%以下の死亡率をもたらした。SARSコロナウイルスの発見以前は、2つのコロナウイルス(HCoV-229EおよびHCoV-OC43)がヒトに感染することが知られていたが、それらは自己限定的な上部気道感染症(一般の風邪の30%)のみ生じ、重症疾患を生じることは報告されていなかった。ヒトコロナウイルス(HCoV-229E、HCoV-OC43)およびSARS-コロナウイルス間の病原性の劇的な違いを説明しうる分子的決定因子は知られていなかった。
【００５９】
本発明に従ったデータは、SARSと関連する重症肺障害および恐らく死亡率の分子学的説明を提供し、SARSコロナウイルスによる感染は、SARS Spikeタンパク質のACE2への結合を介してACE2の下方調節をもたらす。ACE2は、肺水腫および急性肺障害の重症度に対する重要な負の調節因子であるため、SARS Spikeタンパク質介在性のACE2の下方調節は肺病変の重症度に関与する。このシナリオは、「比較的無害の」コロナウイルスの新規ファミリーメンバーが如何にして致死的ウイルスに変化したかを説明する。
【００６０】
本発明に従ったデータは、SARSの病原性と肺障害におけるRASの役割の分子的関連もたらす。したがって、組換えACE2タンパク質は、SARSの伝搬をブロックするための処置だけでなく、レニンアンギオテンシン系の調節は、SARS患者、および恐らくトリインフルエンザA株のような他のウイルスおよび他の感染性疾患に感染した患者を急性重症肺障害およびARDSの発現から保護するのに利用することもできる。
実施例3：SARS-コロナウイルスレセプターACE2は、重症急性肺障害、肺血管透過性、および肺水腫から保護する。
【００６１】
本実施例の結果は、ACE2が酸吸引または敗血症により誘発される重症急性肺損傷からマウスを保護することを示す。疾患の病因はACE-アンギオテンシンII-アンギオテンシンII タイプ1aレセプター(AT1aR)経路を割り出したが、ACE2およびアンギオテンシンII タイプ2レセプターは急性肺障害を緩和する。機械的に、ACE-AngII-AT1aR軸は、肺水腫の増加と肺機能の損傷を誘導する。これらデータは、急性肺損傷、肺血管透過性、および肺水腫におけるACE2の重要な機能を確認する。さらに、組換えヒトACE2が、重症急性肺損傷、肺血管透過性、および肺水腫からマウスを保護することを示し、SARSおよびインフルエンザ患者を含む、敗血症または肺炎のような種々の疾患を有する、1年に数百万の世界中の人々に影響を及ぼす、しばしば致死的で以前は治療不能であった疾患に対する新規治療方法を示唆する。
【００６２】
方  法：
マウスおよび材料：ace2、ace、agtr1a、およびagtr2突然変異体マウスを先に作製し、記載のごとく遺伝子型別した(Crackower et al.、2002；Sugaya et al.、1995；Hein et al.、1995；Krege et al.、1995)。ace突然変異体マウスは、Jackson Laboratoriesから得た。二重突然変異体マウスを交雑受精により作製した。性別、年齢、およびバックグラウンド適合マウスのみをコントロールとして用いた。基礎肺機能および肺構造は試験したすべてのマウス間で同程度であった。マウスをPCRおよびSouthernブロッティングにより遺伝子型別し、施設のガイドラインに従って維持した。
【００６３】
実験ネズミALIモデル：酸吸引誘発ALIのために、2.5〜3カ月齢のマウスをケタミン(75 mg/kg)およびキシラジン(20 mg/kg)i.p.で麻酔し、気管切開し、コントロール容量調節一定流量換気装置(Voltek Enterprises、Canada)を用いて換気した。容量補充操作(volume  recruitment manoeuvre)(VRM)(25 cmH2O、3秒間)を行って容量歴(volume history)を標準化し、測定値をベースラインとした。HClを気管内点滴注入(pH=1.5；2ml/kg)し、次いでVRM(35 cmH2O、3秒間)後に、動物を3時間換気した(F1O2 1.0)。生理食塩水-処置群をコントロールに用いた。エンドトキシン誘発ALIについては、麻酔し人工換気したマウスに、人工換気開始直後およびその1時間後にそれぞれ0.5μg/gのE. coli O111:B4由来LPS(Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO)および3μg/gのSaccharomyces cerevisiae 由来のザイモサンA(Sigma)を気管内投与した。生理食塩水処置群をコントロールに用いた。敗血症誘発ALIを検討するため、盲腸結紮穿孔(cecal ligation perforation)(CLP)を先に記載のごとく行った(Martin et al.、2003)。簡単には、正中線切開を麻酔したマウスの腹部に行った。盲腸を分離し、盲腸先端から5.0mmを結紮した。次に、盲腸を18ゲージの注射針で2回刺し、排泄物を押し出した(1mm)。盲腸を正常な位置に戻した後、腹部を4-0縫合絹糸で閉じた。シャム(疑似)手術したマウスは、盲腸の結紮および穿刺以外は同じ手順を受けた。全ての動物を18時間の回復期間を通してモニターした。その後、動物は上記のごとく6時間まで人工換気を受けた。全てのALIモデルにおいて、総PEEP(PEEPt)およびプラトー圧(Pplat)をそれぞれ呼気および吸気閉鎖の終了時に測定し、換気期間中30分毎にエラスタンスをPplat−PEEPt)/VΤとして計算した。換気終了時に左肺を肺湿/乾燥質量比を測定するためにサンプリングするか、次の生化学分析用に液体窒素中で急速凍結し、また、右肺を組織学的検査用に10%緩衝ホルマリン中で固定した。
【００６４】
血液酸素化、肺水腫、および肺血管透過性の評価：実験終了時に血液試料を左心室から得、PaO2を測定し(Ciba-Corning Model 248、Bayer、Leverkusen、Germany)、動脈血酸素化を呼吸障害の指標として評価した。肺水腫を評価するため、肺湿/乾燥重量比を計算した。簡単には、切除した肺から血液を排出した後、肺湿重量を測定した。次に肺を定温乾燥器中で24時間65℃に加熱し、次いで計量してベースライン肺乾燥質量レベルを決定した。肺血管透過性をエバンスブルー(Goggel et al.、2004)の肺管外遊出を測定するかまたはデキストラン-FITCを用いて測定した。エバンスブルー(20μg/g)を3時間の換気期間終了時に頸静脈に注射した。エバンスブルー注射後10分に動物を屠殺した。次に肺を氷冷PBSで還流し、次いで肺組織を用いてエバンスブルーの含有量を測定した。
【００６５】
組織学およびin situハイブリダイゼーション：組織学的分析のために、5μm厚の切片を切り出し、ヘマトキシリンとエオジン(H&E)で染色した。in situハイブリダイゼーションのために、肺を4%緩衝ホルマリン中で24時間固定し、5μmの切片とした。ACE2のための鎖特異的センスおよびアンチセンスリボプローブを、ジゴキシゲネニン(DIG)標識UTP(Boehringer Manheim、Laval、PQ、Canada)を組み込むことにより作製した。DIG in situハイブリダイゼーションは本質的に記載のごとく行った(Griffiths et al.、2003)。
【００６６】
ALI中の組換えACE2処置：マウス酸吸引誘発ALIモデル(上記参照)をACE2レスキュー(救済)in vivo実験に用いた。酸点滴注入前30分にマウス(2.5〜3カ月齢)に組換えヒトACE2(rhuACE2)タンパク質(0.1 mg/kg)、触媒的に不活性な突然変異体組換えヒトACE2(Mut-rhuACE2)、またはビークル(0.1% BSA/PBS)をi.p.投与した。次に、すべての動物を3時間換気し、上記のごとく分析した。組換えヒトACE2タンパク質(rhuACE2)を製造するため、ヒトACE2の細胞外ドメイン(aa1-738)のコーディング配列をPEAKベクターにサブクローンしてヒトIgG1のFc部分との融合タンパク質を作製した(rhuACE2)。Mut-rhuACE2については、触媒ドメイン中の2つの不活性化突然変異(H374N & H378N)(Li et al.、2003)を部位指向性突然変異誘発を用いて組換えヒトACE2の細胞外ドメイン(aa1-738)に導入した。CHO細胞をrhuACE2およびMut-rhuACE2発現ベクターでトランスフェクトし、上清を回収し、次いでrhuACE2タンパク質およびMut-rhuACE2タンパク質をプロテインA Sepharoseカラムを用いるアフィニティクロマトグラフィにより精製した。クマシー染色したゲルは、rhuACE2およびMut-rhuACE2の純度が培養液からのウシIgGの同時精製により約90%であったことを示した(図12b)。精製組換えACE2タンパク質の触媒活性を、蛍光性ペプチド基質VI(FPS VI、7Mca-Y-V-A-D-A-P-K(Dnp)-OH、R&D Systems、Minneapolis、MN)を用い、本質的に先に記載のごとく測定した(Huang et al.、2003)。簡単には、反応を、最終反応容量100μlの0.1%BSA、1M NaCl、75 mM Tris、0.5 mM ZnCl2を含む緩衝液(pH 7.5)中37℃で行った。蛍光の変化をFluoroskan II Fluorescence Reader(Global Medical Instrumentation、Inc、MN)を用いてモニターした。Mut-rhuACE2-Fcは触媒活性の95%以上の損失を示した(図12a)。肺機能および肺水腫の形成は組換えACE2タンパク質を用いてace2 KOおよび野生型マウスで改善された。
【００６７】
AT1R/AT2R阻害剤試験：マウス(2.5〜3カ月齢)に、外科処置前30分に、AT1R阻害剤ロサルタン(15 mg/kg)、AT2R阻害剤PD123.319(15 mg/kg)、またはコントロールビークルをi.p.投与した。HCl点滴注入後、動物を4群に無作為化した：(1)ace2 KO、酸,ビークルコントロール；(2)ace2 KO、酸、AT1R阻害剤；(3)ace2 KO、酸、AT2R阻害剤；(4)WT、生理食塩水、ビークルコントロール。次に、動物を3時間換気し、上記のごとく分析した。
【００６８】
アンギオテンシンIIペプチドレベルの検出：肺を、記載のごとく、氷上のペプチダーゼ阻害剤含有80%エタノール/0.1% HCl中でホモゲナイズした(Crackower et al.、2002)。タンパク質ホモゲネートを30,00Ogで20分間遠心し、上清をデカントし、次いで1%(v/v)ヘプタフルオロ酪酸(HFBA、Pierce、Rockford、IL)で酸性化した。上清をSavant真空遠心(Savant、Farming-dale、NY)で5mLに濃縮し、濃縮抽出物を活性化Sep-Paksに適用し、0.1% HFBAで洗浄し、次いで5mlの80%メタノール/0.1% HFBAで溶出した。肺抽出物および血漿中のアンギオテンシンペプチド含有量の分析はEnzyme ImmunoAssay(Spi-Bio)を用いて行った。
【００６９】
Ex vivo還流マウス肺：マウス肺を記載のごとく調製した(Goggel et al.、2004)。簡単には、単離マウス肺を換気し(VΤ 〜8ml/kg、90回/min)、4%アルブミン含有RPMI培地で一定流速1mL/minにて非循環的に還流した。AngIまたはAngIIを肺動脈にボーラス注射(15μg/kg)し、肺動脈圧を測定し、静力学的反応を比較した。1セットの実験において、動物をAngIまたはAng IIの第1回注射前60分に酸点滴注入で前処置した。非処置動物を用いて行った別のセットの実験において、第1チャレンジに次いで連続LPS(10μg/mL)還流の存在下でアンギオテンシンを反復注射した。
【００７０】
心エコー検査および観血的血行動態学：心エコー評価を野生型および突然変異体同腹仔を用いて記載のごとく行った(Crackower et al.、2002)。上記のごとく麻酔したマウスを、8〜12MHz線形変換器を取り付けたSonos 5500(Philips Ultrasound)を用いる経胸壁心エコー検査により試験した。短縮率(FS)を、FS = [(EDD-ESD)/EDD]*100として計算した。動脈血圧測定については、右頸動脈に1.4 Frenchカテーテルを通し、動脈血圧を圧変換器(Harvard Instruments)を用いてモニターした。
【００７１】
統計分析：全てのデータは平均±s.e.m.を示す。1時点での測定値をANOVAにより分析し、有意の場合はさらに両側t検定で分析した。時間経過を、Bonferroni後t検定を用いる反復測定(混合モデル)ANOVAにより分析した。全ての統計的検定は、GraphPad Prism 4.00(GraphPad Soft-ware、San Diego、CA、USA)およびJMP(SAS Institute、Toronto、ONT、Canada)プログラムを用いて計算し、p<0.05を統計的有意を示すとみなした。
結果と考察：
【００７２】
レニン-アンギオテンシン系(RAS)は、血圧の恒常性、および液および塩バランスの維持に重要な役割を果たす。アンギオテンシン変換酵素2(ACE2)は、ACEの同族体であり、RASの負の調節コンポーネントとして機能する。ACE2も、細胞株において重症急性呼吸器症候群(SARS)-コロナウイルスに対するレセプターとして確認されている。SARS-コロナウイルス感染後の死亡率は、ARDSの発現によりほぼ10%に達した。ACE2はヒトおよびマウスの肺に発現するが(上記実施例1参照)、肺におけるACE2の機能は全く解っていなかった。急性肺損傷(ALI)におけるACE2の役割を解明するため、ace2遺伝子欠乏の影響について、敗血症、酸吸引、または肺炎(例えばSARSおよびトリインフルエンザA)を含む複数のヒトの疾患における一般的肺障害の病状を再現する実験モデルを用いて試験した。
【００７３】
低pHを含む胃内容の吸引は、ALI/ARDSの頻繁な原因である。実験的酸吸引は、ヒトALIの多くの特性、すなわち、低酸素血症、肺水腫、および硬い肺を示す。野生型マウスにおける酸吸引は、肺エラスタンスの増加(図7a)、血液酸素化の低下(低酸素血症)(図7b)、および湿/乾燥肺重量比で定義した肺水腫の発現(図7c)を伴う肺機能の急速な機能障害を生じた。組織学的に、酸吸引は、肺胞壁厚、水腫、出血、炎症性細胞浸潤、およびヒアリン膜の形成を生じた(図7d)。興味深いことに、酸処置ace2 KOマウスは、コントロール野生型マウスに比べて有意に高い肺エラスタンスを示したが、生理食塩水-処置ace2 KOおよびWTマウスの間で肺エラスタンスに差はなかった(図7a)。さらに、ace2の損失は、酸素化の悪化(図7b)、広範な肺水腫(図7c)、および顕著な組織学的変化(炎症性細胞浸潤の増加、肺水腫、またはヒアリン膜形成を含む)(図7d)を生じた。重要なことには、ACE2タンパク質発現は酸チャレンジ後の野生型マウスにおいて下方調節される(図7e)。
【００７４】
敗血症は、ALI/ARDSの最も一般的な原因である。今回の結果を拡大解釈するため、敗血症誘発ALIに対するace2遺伝子欠乏の影響を盲腸結紮および穿孔(CLP)モデルを用いて試験した(Martin et al.、2003)。CLPは、急性肺障害を伴う複数菌感染による敗血症および致死的腹膜炎を生じる。CLPモデルにおいて、動物は、最初の損傷またはシャム手術(Martin et al.、2003に記載)後18時間、人工換気を受けた。すべての(n=10)CLP-処置野生型マウスは生存したが、CLP-処置ace2突然変異体マウス10匹のうち2匹のみが実験観察6時間の間に生存した(図8a)。酸吸引と同様に、CLPは、野生型コントロールマウスにおいてエラスタンスの増加(図8a)、肺水腫(図8b)、および白血球蓄積(図8c)で定義される肺障害を生じた。CLP-処置ace2突然変異体マウスも、肺機能の顕著な悪化(図8a)、水腫形成の増加(図8b)、および白血球蓄積(図8c)を示したが、シャム処置ace2 KOおよびシャム処置WTマウス間でこれらパラメータに差はなかった(図8a-c)。さらに、ALIは、リポ多糖(LPS)およびザイモサンの混合投与により誘発され、これは、炎症性細胞浸潤、肺水腫、およびガス交換の悪化を特徴とするヒト敗血症関連ALIにも類似している(mimick)。ace2突然変異体マウスもエンドトキシンチャレンジ後に急性肺損傷の顕著な増強を生じた(図11a-c)。ace2はX染色体にマップされるため、ACE2発現の損失は、雄および雌において同等の重症ALI表現型を生じたことに注目すべきである。3つの異なるALIモデルにおけるこれらのデータは、ace2発現の損失が重症急性肺障害を引き起こすことを示す。
【００７５】
ACE2の損失が、実際に疾患の病因に必須であるか、またはALIを調節する発生的相殺(developmental compensation)を生じるか否かを試験するため、急性レスキュー実験を組換えヒトACE2タンパク質(rhuACE2)を用いて行った(図12a、b)。rhuACE2の酸処置ace2突然変異体マウスへの注射は、実際に肺エラスタンス(図8d)および肺水腫形成(図8e)により評価される急性肺損傷の程度を減少させた。rhuACE2タンパク質を酸処置野生型マウスに注射すると、肺機能(図8f)および水腫形成(図12c)も改善した。生理食塩水処置コントロール野生型またはace2突然変異体マウスにおいて、rhuACE2の注射は、肺機能に影響を与えなかった(図8d-f)。重要なことには、触媒的に不活性なACE2タンパク質(Mut-rhuACE2)(図12a、b)は、ace2 KOマウスの重症肺表現型を救済せず(図8d、e)、野生型マウスのALIの重症度に影響しなかった(図8fおよび図12c)。これらの結果は、ACE2がその触媒活性を介して急性肺損傷から肺を直接保護し得ることを示す。
【００７６】
ACE2はACEの同族体であり、共にRASにおける中心的酵素である。ACEは、デカペプチドAngIをオクタペプチドAngIIに開裂するが、ACE2は、カルボキシペプチダーゼとして機能し、AngIから1残基を開裂してAng1-9を生じ、AngIIから1残基を開裂してAng1-7を生じる。すなわち、ACE2は、AngIIの不活性化を通してRASを調節し、ACEおよびACE2発現間のバランスはAngII保護を決定する(図9a)。野生型マウスの酸吸引は、ACE2タンパク質の顕著な下方調節をもたらしたが、ACEレベルは一定である(図7e)。さらに、触媒的に活性なACE2のみが突然変異体および野生型マウスにおける急性肺損傷表現型を改善した(図8d-f)。急性肺損傷がACEとACE2の間の機能的平衡を変化させるか否かを解明するため、AngIIレベルを、酸処置およびコントロールマウスの肺および血漿において測定した。酸吸引は、野生型マウスの肺(図9b)および血漿(図13a)のAngIIレベルを顕著に増加させた。重要なことには、AngIIレベルのさらなる有意な増加が酸処置ace2 KOマウスの肺(図9b)および血漿(図13a)で観察された。すなわち、急性重症肺損傷は、ACE2発現の減少およびAngIIの産生増加をもたらす。
【００７７】
したがって、ACE2と異なり、ACEはAngII産生の増加を介して疾患の病状を促進する(図9a)。ace2野生型およびace2突然変異体バックグラウンドにおけるaceの遺伝子的不活性化は、実際に肺損傷モデルにおけるAngIIの肺および血漿レベルを顕著に低下させた(図13b、c)。さらに、肺損傷を軽減させたrhuACE2タンパク質による処置(図8d-f)も、酸処置マウスの肺におけるAngIIレベルを低下させた(図13d)。これらデータは、ACEはAngII産生の増加をもたらす酵素であり、ACE2はACEの機能と逆のバランスをとることを確認する。したがって、aceノックアウトマウスにおける肺損傷を評価した。ace2突然変異体とは対照的に、ace-/-マウスは、酸吸引性肺損傷に対して部分的に保護された(図9cおよび図14a)。ace突然変異についてホモ接合性のマウスは、野生型コントロールに比べて酸吸引後の肺機能の改善を示した(図9c)。重要なことには、これらの効果は、遺伝子用量依存性であり、ace-/-マウスと同様の発現系を示したace+/-ヘテロ接合性マウスですでに観察された。さらに、ace2ノックアウトバックグラウンドにおけるaceの不活性化は、ace2単突然変異体に比べて、重症肺障害表現型(図9d)、水腫形成(図14b)、および組織学的変化(図9e)を救済した。また、1つのaceアレルのみの不活性化(ace+/-)は、ace2 KOマウスの重症肺障害を救済し得た(図9d、e)。同様に、LPS/ザイモサン誘発ALIにおいて、ace2 KOマウスの重症肺機能障害は、さらなるace遺伝子欠損により逆転した(図15)。これらのデータは、ACEはALI病状を促進し、ACE2はALI病状を軽減することを示す。
【００７８】
ACEおよびACE2はいずれもさらなる基質を開裂する非特異的プロテアーゼである。すなわち、AngIIレベルの増加はace2欠損と関連したが、AngII経路の上方調節が実際にace2突然変異体マウスに観察されたin vivo表現型の主な原因となることは示さなかった。マウスにおけるAngIIのレセプターは、アンギオテンシンIIレセプタータイプ1a(AT1aR)、タイプ1b(ATIbR)、およびタイプ2(AT2R)である。肺はAT1aRおよびAT2Rを発現するが、AT1bRは発現しない。したがって、AngIIレセプターサブタイプがACE/ACE2調節ALIに関与し、そのレセプターを介したAngII情報伝達がACE2調節肺病状に関与するか否かを検討した(図9a)。これらの問題を検討するため、AT1aRに突然変異を有するマウスを酸吸引でチャレンジした((agtrla-/-)およびAT2R(agtr2-/Y))。野生型マウスに比べて、AT1aR発現の遺伝子的損失は、肺機能の改善(図10a)および水腫形成の減少(図16a)により確定されるALIの顕著な軽減を示した。AT2Rの遺伝子的不活性化は、ace2突然変異体マウスに観察された重症ALIに似た急性肺障害を顕著に悪化させた(図10aおよび図16a)。注目すべきは、agtrla-/-およびagtr2-/Y両マウスにおける酸吸引誘発AngIIレベルは、野生型コントロールのそれと同程度であり、観察された結果がAngII産生の変化に二次的に生じたのではなく、レセプター発現の損失によることを示唆した。次に、特異的AT1RおよびAT2Rブロッカーを用いてace2突然変異体の肺損傷表現型の救済を試みた。AT1Rの阻害は、ace2 KOマウスにおけるALIの重症度を軽減した(図10b)。反対に、AT2Rの薬理学的阻害は、ace2突然変異体の重症急性肺損傷表現型に対する明らかな効果がなかった(図10b)。ace2 KOマウスにおけるAT1Rの阻害は、酸誘発肺水腫も軽減した(図16b)。総合すると本発明に従ったこれらデータは、AT1aRおよびAT2RがALIの重症度の制御に反対の機能を有し、アンギオテンシンIIはそのAT1aRを通して急性肺障害に起因的役割を演じることを示す。
【００７９】
肺水腫は、肺血管収縮による静水圧の増加、および/または微小血管透過性の増加により生じ得た。AngIIが、限定条件下で肺還流圧を分析するためのネズミ単離無血液還流ex vivo肺系を用いて静水圧を増加しうるか否かについて最初に試験した。この系では、肺還流圧は、ベースラインコントロール条件下で野生型およびace2 KOマウス間で同程度であり(コントロール野生型3.0±1.9cmH2O(n=6)、対ace2 KO 1.8±1.6cmH2O(n=9)；平均±s.d.)、これらの値は、酸処置によりまたは連続LPS還流中に変化しなかった。さらに、酸点滴注入動物から得た肺またはLPS還流肺におけるAngIまたはAngII注射により生じた肺還流圧も、野生型およびace2 KOマウス間で同様であった(図17a、b)。さらに、心エコー検査を用いる短縮率(左室収縮機能の指標として)および観血的血液動態測定を用いる平均動脈圧は、実験期間中、ace2 KOおよび野生型マウスで同程度であった。すなわち、ace2 KOマウスにおける重症肺水腫は、全身血液動態変化に二次的に生じるものではないと思われる。
【００８０】
肺血管透過性の増加は、ヒト患者におけるALI/ARDSの顕著な特徴であるので、次に、ace2の損失が血管透過性の増加を生じるか否かを、血管からのアルブミンの漏出のin vivo指標としてエバンズブルー注射を用いて試験した。生理食塩水処置コントロール野生型およびace2 KOマウスは、エバンスブルーの蓄積により示される、同様の非常に低い血管透過性を示した(図10c)。酸吸引は野生型マウスにおける血管透過性を増加した。重要なことには、ace2突然変異体動物において、肺へのエバンスブルーの蓄積は、酸吸引後に顕著に増大した(図10c、d)。これらの結果は、FITC結合デキストラン(40kDa)を用いて確認した。透過性の増加がAngII情報伝達の脱制御により生じる直接の証拠を提供するため、agtr1a KOマウスにおける血管透過性を測定した。酸吸引は、野生型マウスにおける血管透過性の増大をもたらしたが、血管透過性は、agtr1a KOマウスの肺において有意に軽減した(図10e)。すなわち、急性肺損傷において、ACE2発現の損失は、AngII誘発性AT1aR刺激を介した漏出性肺血管をもたらす。
【００８１】
急性呼吸困難症候群(ARDS)は、急性肺損傷(ALI)と呼ばれる広範な病的過程の最も重症型である。ARDSは、血管透過性の増加による肺水腫、炎症性細胞の蓄積、および重症低酸素症を特徴とする。ARDSの誘発因子は多様であり、敗血症、吸引、肺炎(SARSコロナウイルス、またはトリおよびヒトインフルエンザウイルスによる感染を含む)が含まれる。本発明に従ったデータは、急性肺損傷がRASの制御に関与する重要な酵素であるACE2の顕著な下方調節をもたらすことを示す。次に、RASの損傷誘発性脱制御は、アンギオテンシンIIレベルの増加に向かってバランスを変化させる。興味深いことに、機能的な差は、ace突然変異についてヘテロ接合のマウスにおいてすでに観察することができる。しかしながら、他のACE2ペプチド代謝物、例えばブラジキニンは、in vivoで重要な役割を果たすかもしれない。ブラジキニン1(BK1)およびブラジキニン2(BK2)両レセプターの阻害も肺損傷および肺障害を軽減するので(図17)、今回のデータは、ACE2で調節される機能が実際にAngIIにより介在されるという最初の遺伝子的確認ももたらす。
【００８２】
ACE活性に影響を及ぼす挿入/欠失(I/D)ACE多形がARDS感受性および結果と関連することがすでに示されている。今回のデータは、これら臨床所見に対する機構的説明をもたらし、ALIの病因において、AngIIがACEにより脱制御され、AT1aRレセプターを介して重症肺障害を促進することを示す。他方、ACE2およびAT2Rは、反対作用を調節し、肺損傷に対する保護的役割を有する。重要なことは、外因性組換えヒトACE2、およびAT1-RまたはACEの阻害は、ace2 KOおよび野生型マウスにおける急性肺障害を軽減する。これら遺伝子的、薬理学的、およびACE2タンパク質レスキュー実験は、急性肺損傷および肺水腫の病因におけるレニン-アンギオテンシン系の新規で重要な役割を定義し、ACE2およびその代謝物のAngIIおよびブラジキニン(およびブラジキニン開裂誘導体)が急性肺障害、肺血管透過性、および肺水腫の発現および進行に関与する重要な分子であることを示す。
実施例4：急性肺損傷に対するブラジキニンレセプターの影響
【００８３】
この実験では、急性肺損傷(ALI)に対するブラジキニンレセプター(BK1、BK2)阻害剤の影響をネズミ酸吸引誘発ALIモデルを用いて試験した。特に、ブラジキニンレセプター阻害剤がace2ノックアウト(KO)マウスにおける表現型を救済するか否かについて試験した。
方  法：
【００８４】
ネズミ酸吸引誘発肺損傷モデル：酸吸引誘発ALIのために、2.5〜3カ月齢のマウスをケタミン(75 mg/kg)およびキシラジン(20 mg/kg)i.p.で麻酔し、気管切開し、容量調節定流量人工呼吸器(Voltek Enterprises)にて換気した。容量補充マニューバー(manoeuvre)(VRM)(25cmH2O、3sec)を行って容量歴(volume history)を標準化し、測定をベースラインとして行った。HClの気管内点滴注入(pH=1.5；2ml/kg)、次いでVRM(35 cmH2O、3秒)後、動物を3時間換気した(F1O2 1.0)。総PEEP(PEEPt)およびプラトー圧(Pplat)をそれぞれ呼気および吸気閉鎖の終了時に測定し、換気期間中30分間毎にPplat−PEEPt)/VΤを計算した。
【００８５】
ブラジキニンレセプター阻害剤試験：Ace2 KOマウス(2.5〜3カ月齢)に、外科処置前30分に、BK1阻害剤(des Arg HOE、Sigma、1.5mg/kg)、BK2阻害剤(HOE 140、Sigma、1.5mg/kg)、またはコントロールビークルをi.p.投与した。HCl点滴注入後、動物を下記群に無作為化した：(1)ace2 KO、酸、ビークルコントロール；(2)ace2 KO、酸、BK1阻害剤；(3)ace2 KO、酸、BK2阻害剤。次に、動物を3時間換気し、上記のごとく分析した。
結  果：
【００８６】
BK1阻害剤およびBK2阻害剤は共にace2 KOマウスにおける肺エラスタンスにより評価される肺障害を改善した(図17)。
(参考文献)
【００８７】
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【図面の簡単な説明】
【００８８】
【図１】マウス肺におけるACE2の発現。
【図２】ACE2はin vivo SARS感染の重要なレセプターであることを示す。
【図３】SARS感染によるACE2発現および組換えSARS Spikeタンパク質の下方調節。
【図４】SARS Spikeタンパク質は重症急性肺損傷の重症度を増幅したことを示す。
【図５】アンギオテンシンIIレセプター(AT1R)の阻害はSARS Spike介在重症急性肺損傷を軽減することを示す。
【図６】組換えSpike-Fcタンパク質およびSpike(S318-510)-FcによるACE2発現低下。
【図７】ACE2の損失は酸吸引誘発急性肺損傷を悪化させることを示す。
【図８】ACE2の損失は敗血症誘発ALIを悪化させ、rhuACE2タンパク質はace2突然変異体および野生型マウスにおけるALIの重症度を減少させることを示す。
【図９】ACE欠乏は急性肺損傷の重症度を減少させることを示す。
【図１０】AngIIレセプターAT1aR コントロール ALI重症度および肺血管透過性。
【図１１】ace2突然変異体マウスにおける重症エンドトキシン誘発肺損傷。
【図１２】組換えACE2製造、および触媒的活性および不活性ACE2による野生型マウスの処置。
【図１３】ACE2はAngIIレベルを負に制御することを示す。
【図１４】aceの遺伝子不活性化は肺水腫形成を軽減することを示す。
【図１５】ace欠損はace2 KOバックグラウンドにおけるエンドトキシン誘発急性肺損傷を軽減することを示す。
【図１６】AT1Rは酸誘発肺水腫を調節することを示す。
【図１７】エラスタンスにより測定したALIにおけるブラジキニンレセプター阻害剤の効果。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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