(57)【要約】  本発明は、toll-like receptor 4アンタゴニストの投与を包含する、口腔粘膜炎及び胃腸粘膜炎の重篤性を緩和させる方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の口腔粘膜炎又は胃腸粘膜炎の重篤性を低減させる方法であって、toll-like receptor 4の活性化を阻害する化合物を含む組成物を前記患者に投与するステップを包含する、方法。
【請求項２】
前記化合物が、リピッドＡアナログである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記リピッドＡアナログが、以下の式：
【化１】
2008540510.tif 000022
であるか、又は製薬的に許容し得る塩若しくはそのリン酸エステルである、請求項２に記載の方法。
式中、R1は、以下の群：
【化２】
2008540510.tif 000023
【化３】
2008540510.tif 000024
から選択され、ここでJ、K及びQの各々は、個々独立して、直鎖若しくは分岐鎖のC1-C15アルキルであり；Lは、O、NH、又はCH2であり；Mは、O又はNHであり；Gは、NH、O、S、SO、又はSO2であり、
R2は、直鎖若しくは分岐鎖のC5-C15アルキルであり、
R3は、直鎖若しくは分岐鎖のC5-C18アルキル、
【化４】
2008540510.tif 000025
【化５】
2008540510.tif 000026
から成る群から選択され、ここでEは、NH、O、S、SO、又はSO2であり；A、B
及びDの各々は、個々独立して、直鎖若しくは分岐鎖のC1-C15アルキルであり、
R4は、直鎖若しくは分岐鎖のC4-C20アルキル及び
【化６】
2008540510.tif 000027
から成る群から選択され、ここでU及びVの各々は、個々独立して、直裁若しくは分岐鎖のC2-C15アルキルであり、Wは水素又は直鎖若しくは分岐鎖のC1-C5アルキルであり、
RAは、R5又はR5-O-CH2-であり、R5は、水素、J'、-J'-OH、-J'-O-K'、-J'-O-K'-OH、及び-J'-O-PO(OH)2から成る群から選択され、ここでJ'及びK'の各々は、個々独立して、直鎖若しくは分岐鎖のC1-C5アルキルであり、
R6は、ヒドロキシ、ハロゲン、C1-C5アルコキシ及びC1-C5アシルオキシから成る群から選択され、
A1及びA2は、個々独立して、OH、
【化７】
2008540510.tif 000028
から成る群から選択され、ここでZは直鎖若しくは分岐鎖のC1-C10アルキルである。
【請求項４】
前記リピッドＡアナログが、以下の式：
【化８】
2008540510.tif 000029
から成るか、又は製薬的に許容し得る塩若しくはそのリン酸エステルである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記リピッドＡアナログが、以下の式：
【化９】
2008540510.tif 000030
から成るか、又は製薬的に許容し得る塩若しくはそのリン酸エステルである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記粘膜炎が、口腔粘膜炎である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記粘膜炎が、胃腸管のものである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記患者が粘膜炎を患っている、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記患者が粘膜炎を患ってはいないものの、発症するリスクを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記組成物の投与によって、前記患者において、粘膜炎の発症が阻害される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物の投与によって、前記患者において、粘膜炎の発症が予防される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１２】
前記患者が、癌患者である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記患者が、頭部若しくは頸部の放射線療法、又は幹細胞若しくは骨髄の移植を既に受けているか、まもなく受けるか、又は現在受けている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記投与ステップが、前記患者に粘膜炎を発症するリスクを課す治療の前に、それと同時に、その後に、又はそれらの組み合わせにて実施される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１５】
前記投与ステップが、前記患者に粘膜炎を発症するリスクを課す治療の前に行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記投与ステップが、前記患者に粘膜炎を発症するリスクを課す治療と同時に行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記投与ステップが、前記患者に粘膜炎を発症するリスクを課す治療の後に行われる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記投与ステップが、前記患者に粘膜炎を発症するリスクを課す治療と同時に行われ、さらに、前記患者に粘膜炎を発症するリスクをかす前記治療の後０〜３日の間に少なくとも１回、前記組成物を投与するステップを包含する、請求項１４に記載の方法。
【請求項１９】
前記患者に粘膜炎を発症するリスクを課す前記治療が、放射線療法を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２０】
前記患者に粘膜炎を発症するリスクを課す前記治療が、化学療法を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物が、前記患者に局所的に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物が、前記患者に静脈注入によって投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記患者に抗菌療法を施すステップをさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗菌療法が、抗生物質療法である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
患者の口腔粘膜炎又は胃腸粘膜炎の重篤性を低減させる薬剤の調製における、toll-like receptor 4の活性化を阻害する化合物の使用。
【請求項２６】
前記化合物が、以下の式のリピッドＡアナログであるか、又は製薬的に許容し得る塩若しくはそのリン酸エステルである、請求項２５に記載の使用。
【化１０】
2008540510.tif 000031
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、口腔粘膜炎及び胃腸粘膜炎の症状をやわらげる方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
粘膜炎は、胃腸管、口腔及び咽頭などの粘膜の腫れ、炎症、及び不快感によって特徴付けられる疾患であり、それは、口や喉の痛み、下痢、腹部の痙攣や痛み、及び直腸潰瘍に帰着する。当該疾患は、癌患者の約半数に起こり、放射線療法及び／又は化学療法をはじめとする癌治療に共通する副作用である。これら癌治療のアプローチの目的は、急速に分裂する癌細胞を死滅させることであるが、残念なことに、胃腸などの領域に存在する細胞をはじめとする、他の急速に分裂する細胞もまた治療によって死滅し、粘膜炎につながる。粘膜炎の症状は、癌治療開始後５日から１０日で起こり、回復には治療停止後２週から４週かかる。粘膜炎の発生やその痛みは、癌治療の種類や期間などのファクターに依存する。例えば、粘膜炎は、頭部や頸部の放射線治療を受けたほぼ全ての患者に起こる。幹細胞や骨髄の移植の準備において、骨髄抑制のための高投薬量の化学療法及び／又は放射線療法を受けた患者の多くが患う。
【０００３】
粘膜炎は、様々な点において、癌患者の生活の質に悪影響を及ぼす。例えば、粘膜炎による口や喉の痛みは、著しい苦痛をもたらし、食べたり、飲んだり、経口投薬することさえも困難にさせる。粘膜炎はまた、多数の微生物が住む口腔粘膜や胃腸部の保護膜を破壊し、重大な感染リスクを伴う。また、粘膜炎の不快感を阻止する試みは、癌治療の中断、治療投薬量の変更、又は異なる治療態様への変更につながり得る。重大な粘膜炎はまた、非経口的な栄養摂取や入院を必要とする場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
従って、癌患者の看護を改善するためには、粘膜炎を予防及び治療する効果的な方法を開発することが重要である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、口腔粘膜炎又は胃腸粘膜炎の痛みを軽減させる方法を提供する。当該方法は、リピッドＡアナログのような、以下の式の範囲内にあるToll-like receptor 4（TLR4）の活性化を阻止する１つ又は複数の化合物を含有する組成物、又はそれらの製薬的に許容し得る塩若しくはリン酸エステルを患者に投与するステップを包含する。
【０００６】
【化１１】
2008540510.tif 000002
【０００７】
式中、R1は、以下：
【化１２】
2008540510.tif 000003
【化１３】
2008540510.tif 000004
から成る群から選択され、ここで、J、K及びQの各々は、個々独立して、直鎖若しくは分岐鎖のC1〜C15アルキルであり；Lは、O、NH、又はCH2であり；Mは、O又はNHであり；GはNH、O、S、SO、又はSO2であり、
R2は、直鎖若しくは分岐鎖のC5〜C15アルキルであり、
R3は、直鎖若しくは分岐鎖のC5〜C18アルキル、
【化１４】
2008540510.tif 000005
【化１５】
2008540510.tif 000006
から成る群から選択され、ここで、Eは、NH、O、S、SO、又はSO2であり；A、B及びDの各々は、個々独立して、直鎖若しくは分岐鎖のC1〜C15アルキルであり、
R4は、直鎖若しくは分岐鎖のC4〜C20アルキル、
【化１６】
2008540510.tif 000007
から成る群から選択され、ここで、U及びVの各々は、個々独立して、直鎖若しくは分岐鎖のC2〜C15アルキルであり、Wは、水素又は直鎖若しくは分岐鎖のC1〜C5アルキルであり、
RAは、R5又はR5-O-CH2-であり、R5は、水素、J'、-J'-OH、-J'-O-K'、-J'-O-K'-OH、及び-J'-O-PO(OH)2から成る群から選択され、ここで、J'及びK'の各々は、個々独立して、直鎖若しくは分岐鎖のC1〜C5アルキルであり、
R6は、ヒドロキシ、ハロゲン、C1〜C5アルコキシ及びC1〜C5アシルオキシから成る群から選択され、
A1及びA2は、個々独立して、
【化１７】
2008540510.tif 000008
【化１８】
2008540510.tif 000009
から成る群から選択され、ここで、Zは、直鎖若しくは分岐鎖のC1〜C10アルキルである。本発明の一態様には、上記の式のリン酸エステルが包含され、そこでは、A1又はA2の少なくとも１つのヒドロキシ基が置換されてリン酸エステルを形成している。
【０００８】
本発明の組成物に含有され得るリピッドＡアナログの例は、以下の式を有する化合物、又はその製薬的に許容し得る塩若しくはリン酸エステルである。
【０００９】
【化１９】
2008540510.tif 000010
【００１０】
より詳細な例では、当該化合物は、以下の式から成るか、又はその製薬的に許容し得る塩若しくはリン酸エステルである。
【００１１】
【化２０】
2008540510.tif 000011
【００１２】
本発明によって治療し得る患者には、口腔粘膜炎又は胃腸粘膜炎を患っているものが含まれる。さらに、口腔粘膜炎や胃腸粘膜炎を患ってはいないものの、発症するリスクを有する患者も、本発明によって治療することができる。後者のグループの患者に関しては、当該治療によって、粘膜炎の発症を阻害又は予防することができる。
【００１３】
患者に口腔粘膜炎や胃腸粘膜炎を発症するリスクを課す治療の例は、放射線療法や化学療法であり、それについては、本書の他の箇所又は背景技術の欄において説明する。従って、本発明によって治療し得る患者には、癌患者のみならず、例えば、頭部若しくは頸部の放射線療法、又は幹細胞若しくは骨髄の移植を既に受けた患者、まもなく受ける患者、又は現在受けている患者も含まれる。
【００１４】
本発明の方法によれば、本発明で用いられる組成物は、口腔粘膜炎や胃腸粘膜炎のリスクを患者に課す治療の前に、それと同時に、又はその後に、患者に投与することができ、あるいはこれらの方法を組み合わせて用いることができる。一例では、組成物は、治療と同時に、その１〜４時間以内に、又はそれと同じ日に投与することができ、そしてその後１〜３（例えば、１〜２）日間投与することができる（例えば、日に１〜２回）。他の治療処方の例を以下に提示する。
【００１５】
当該組成物は、局所的（例えば、ジェル、リンス、ドロップ、クリーム、軟膏、又は絆創膏によって）、静脈注入、経口的（例えば、錠剤、カプセル、ドロップ、クリーム、軟膏、又は絆創膏によって）、直腸（例えば、座剤、軟膏、又は浣腸によって）、又は膣（例えば、クリーム、軟膏、ジェル、又は外用剤によって）によるものをはじめとする、当分野で既知の任意の許容し得る方法によって患者に投与することができる。また、後に詳細に述べるように、本発明による治療は、抗菌剤や緩和剤による治療をはじめとする他の粘膜炎の治療法と組み合わせて実施することができる。
【００１６】
上記の方法に加えて、本発明はまた、口腔粘膜炎や胃腸粘膜炎の痛みを軽減させるための薬剤の処方における本書記載の組成物及び化合物の使用も包含する。そのような薬剤は、既に粘膜炎を患っており当該疾患の症状を（部分的に又は完全に）やわらげる努力がなされている患者を治療したり、当該疾患が悪化するのを防止したり、及び／又は当該疾患の悪化のレベルを軽減させるために用いることができる。当該薬剤はまた、粘膜炎をまだ患ってはいないものの発症するリスクを有する患者に用いることができる。本書の他の箇所で述べるように、そのような患者には、放射線療法及び／又は化学療法を受ける予定である癌患者、現在受けている癌患者、又は既に受けた癌患者が含まれる。これらの患者に関しては、当該薬剤の投与は、粘膜炎の痛みをやわらげたり、その発症を阻害したり、粘膜炎が起こるのを予防するために実施することができる。また、当該薬剤に含有される化合物は、本書の他の箇所に記載の任意のものとし得、本書の他の箇所に提示される式の範囲内にある化合物とし得る。そのような化合物の具体例は以下の通りであり、その製薬的に許容し得る塩若しくはリン酸エステルも可能である。
【００１７】
【化２１】
2008540510.tif 000012
【００１８】
また、本発明は、上述のように、粘膜炎の痛みをやわらげるために投与すべく調合された、本書記載の化合物を含有する組成物を包含する。後に詳細に述べるように、これらの組成物は、局所投与のためのジェル、リンス、錠剤、カプセル、チューイングガム、ドロップ、クリーム、軟膏、浣腸、座剤若しくは絆創膏の形態にて、化合物を含有し得る。
【００１９】
本発明は、幾つかの利点をもたらす。例えば、放射線療法や化学療法などの治療による不快な副作用である粘膜炎の痛みをやわらげる方法をもたらす点において、本発明の方法は、患者がそのような治療に伴う難題と直面する際に患者の生活状態に寄与し得る。また、本発明の方法は、粘膜炎によって一般的に引き起こされる感染の発生を軽減させることができる。さらに、患者に改善された安楽さをもたらす点において、本発明の方法は、治療処方計画への患者の同意を高めることができ、回復速度の改善にも寄与し得る。
【００２０】
本発明の他の特徴並びに利点は、以下の詳細な説明、図面及び特許請求の範囲から明らかとなろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
本発明は、口腔粘膜炎や胃腸粘膜炎の痛みをやわらげる方法を提供する。当該方法は、既に粘膜炎を患っている患者を治療するのに用いることができる。さらに、当該方法は、粘膜炎を患ってはいないものの発症する恐れのある患者（例えば、放射線療法及び／又は化学療法を受ける予定の、現在受けている、又は既に受けた、癌若しくは他の患者）にも実施することができる。まだ粘膜炎を患っていない後者のグループの患者に関しては、本発明による治療によって、癌治療に伴う粘膜炎の痛みを軽減させたり、粘膜炎の発症を抑えたり、又は粘膜炎を予防したりすることができる。
【００２２】
本発明は、toll-like receptor 4（TLR4）の活性化を防止することによって、粘膜炎の症状を軽減させるのに優れた治療効果がもたらされるという発見に基づいている。TLR4は、成長し死滅する細菌の細胞壁から放出され炎症反応の惹起に関与するエンドトキシン、即ち、リポ多糖（LPS）、のレセプターである。本発明によれば、TLR4レセプターの活性化は、TLR4アンタゴニストの投与によって阻止され、それによって、粘膜炎の症状の緩和に有益な効果がもたらされる。エンドトキシンを阻止するのに加えて、本発明による治療は、粘膜炎における熱ショック蛋白（HSP）の作用を阻害し得る。詳細には、そのような蛋白はストレス誘導性蛋白であり、それは、放射線療法や化学療法をはじめとするストレス下において誘導され得る。HSP 60、70、又は90は、TLR4の内在性リガンドであり、従って、放射線療法による粘膜炎において一定の役割を果たす。
【００２３】
本発明の方法で用いられるTLR4アンタゴニストは、例えば、発明の開示の欄にて記載した式の範囲内にあるリピッドＡアナログのような、LPSのリピッドＡ領域のアナログであり得る。本発明の組成物に含有させ得るリピッドＡアナログの例は、以下の式を有する化合物、又はその製薬的に許容し得る塩若しくはリン酸エステルである。
【００２４】
【化２２】
2008540510.tif 000013
【００２５】
より詳細な例では、当該化合物は、以下の構造、
【化２３】
2008540510.tif 000014
又はその製薬的に許容し得る塩又はリン酸エステルである。この化合物は、eritoranとして知られており（化合物E5564、化合物1287、及びSGEAとしても知られる）、米国特許第５，９３５，９３８号に記載されている。
【００２６】
本発明において用いることのできる化合物の他の例としては、以下の式並びにその製薬的に許容し得る塩若しくはリン酸エステルが挙げられる。
【００２７】
【化２４】
2008540510.tif 000015
【化２５】
2008540510.tif 000016
【化２６】
2008540510.tif 000017
【００２８】
本発明において用いることのできる他のTLR4アンタゴニストとしては、例えば、化合物B531（米国特許第５，５３０，１１３号）や、以下の特許に記載の他の化合物が挙げられる：米国特許第５，９３５，９３８号；米国特許第５，６１２，４７６号；米国特許第５，７５６，７１８号；米国特許第５，８４３，９１８号；米国特許第５，７５０，６６４号；米国特許第６，２３５，７２４号；米国特許第６，１８４，３６６号；米国特許第５，６８１，８２４号。これらの化合物を製造する方法についても、これらの文書には記載がある。そのような薬剤をを製造する他の方法は、例えば、ＷＯ  ０２／９４０１９号に記載がある。
【００２９】
本発明の方法によれば、TLR4アンタゴニストは、口腔粘膜炎や胃腸粘膜炎を引き起こすか又はそのような粘膜炎を発症するリスクを患者に課す療法による治療の前、間、及び／又は後に、患者に投与される。上述のように、そのような治療には、放射線療法及び化学療法が含まれ、それらは、胃腸、呼吸器及び泌尿生殖器の表面に存在する癌細胞や上皮細胞のような、急速に分裂する細胞の成長を阻止するよう作用する。粘膜炎を引き起こす治療の具体例としては、乳癌、腸癌、胃癌、泌尿生殖器（例えば、膀胱、前立腺、又は睾丸）の癌、婦人科（例えば、子宮頸部、子宮内膜、卵巣、又は子宮）の癌、頭部及び頸部／食道癌、白血病、肺（小細胞又は非小細胞）癌、リンパ腫（Hodgkin及び非Hodgkin）、黒種、多発性黒種、膵癌、及び肉腫などの疾患の治療あるいは補助治療において用いられる放射線療法（例えば、頭部及び／又は頸部、全身、照準を合わせた、及び／又は超断片化放射線療法）や化学療法が挙げられる。
【００３０】
当分野で既知のように、これらの癌は、例えば、rituximab、cetuximab、又はbevacizumabなどの薬剤を単独で、又は化学療法あるいは放射線療法と組み合わせて用いることによって、免疫療法をはじめとする方法を用いて治療することができる。他の例では、粘膜炎を惹起する化学療法としては、カルボプラチン、シスプラチン、及びオキサプラチンのような白金誘導体；パクリタキセル、ドセタキセル、ビノレルビン、ビンクリスチン、及びビンブラスチンのような有糸分裂阻害剤；エトポシド、イリノテカン、及びトポテカンのようなトポイソメラーゼ阻害剤；ゲムシタビン、カペシタビン、フルダラビン、メトトレキセート、５−フルオロウラシル、クラドリビン、ペントスタチン、及びシタラビンのような代謝拮抗物質；ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、メクロレタミン及びミトキサントロンのようなＤＮＡ合成阻害剤；シクロホスファミド、イホスファミド、及びメルファランカルムスチンのようなアルキル化剤；エストラムスチンのようなホルモン癌剤；ダカルバジンのような他の若しくは未知のメカニズムを有する薬剤を利用するものが挙げられる。これらの使用、並びに癌の治療法は、当業者には周知である。
【００３１】
上述のようなTLR4アンタゴニストは、例えば、局所法及び静脈注入をはじめとする標準的な方法を用いて投与することができる。特定の患者に用いられる具体的な方法や投薬量は、例えば、癌治療の種類、不快感の場所、並びに患者の全般的な健康状態に依存する。これらのようなファクターに基づいて、開業医は適切な方法を選択することができる。
【００３２】
本発明による治療は、癌治療の前（例えば、癌治療の前、１〜２日あるいは１週間まで）、癌治療と同時（例えば、癌治療と同時に、１〜４時間以内に、あるいは同日に）、又は癌治療停止後まもなく（例えば、停止後１〜４日以内、及び／又は症状が現れる前若しくは現れたとき）に開始することができる。そして治療は、例えば、粘膜炎の症状が実質的になくなるまで、又はそのような症状を発症するリスクがなくなるまで、継続することができる。従って、癌治療の前あるいはそれとほぼ同時に開始した治療は、例えば、１〜３日（例えば、１〜２日）の間継続することができる。他の例では、当業者が適切であると判断する際には、治療は、癌治療の停止後１〜４あるいは２〜３週の間継続される。具体的な例では、本発明による治療は、癌治療の前にのみ；癌治療の前と癌治療と同時に；癌治療の前、同時、及び後に；癌治療と同時にのみ；癌治療と同時、及びその後に；癌治療の後にのみ；あるいは、癌治療の前と後にのみ、実施される。また、本発明による治療は、粘膜炎の症状の状態に応じて、変更、中止、再開することができる。治療は、当業者が適切であると判断する間隔にて実施することができる。例えば、投与は、１、２、３又は４回／日にて実施することができる。
【００３３】
口腔内の粘膜炎を患っている患者又は発症するリスクを有する患者の場合には、本書記載のTLR4アンタゴニストは、患部あるいはリスクのある領域に適用し得るジェル、ペースト、スプレー、クリーム、軟膏、又は絆創膏の形態にて口腔内に投与することができる。当該患者は、薬剤を含有する口用リンス剤、チューイングガム、又はドロップを用いて治療することもできる。直腸あるいは膣領域を患っている患者に対しては、当該薬剤は、ジェル、クリーム、軟膏、懸濁物、又は座剤の形態の調合物を用いて投与することができる。また、投与は、浣腸を用いることもできる。他の例では、鼻腔内を患っている患者の場合には、本書記載のような局所投与によるか、又は薬剤の吸引（例えば、米国特許第６，６８３，０６３号を参照）によって投与することができる。他の方法では、薬剤は、注射（例えば、局所注射）、又は注入（静脈又は筋肉内）によって投与することができる。
【００３４】
上述（及び他の）の投与法において用いられる薬剤の調合は、当分野で既知であり、また、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences (18th edition), ed. A. Gennaro, 1990, Mack Publishing Company, Easton, PAに記載されている（例えば、M.J. Rathbone, ed., Oral Mucosal Drug Delivery, Drugs and the Pharmaceutical Sciences Series, Marcel Dekker, Inc., N.Y., U.S.A., 1996；M.J. Rathbone et al., eds., Modified-Release Drug Delivery Technology, Drugs and the Pharmaceutical Sciences Series, Marcel Dekker, Inc., N.Y., U.S.A., 2003；Ghosh et al., eds., Drug Delivery to the Oral Cavity, Drugs and the Pharmaceutical Sciences Series, Marcel Dekker, Inc., N.Y., U.S.A., 2005；及びMathiowitz et al., eds., Bioadhesive Drug Delivery Systems, Drugs and the Pharmaceutical Sciences Series, Marcel Dekker, Inc., N.Y., U.S.A., 1999も参照されたい）。
【００３５】
全ての患者、特に、局所投与では容易に到達できない内部領域を患っている（又は、リスクを有する）患者は、静脈注入のような全身的なアプローチによって治療することができる。この投与法は、化学療法剤又は他の薬剤の投与のためのカテーテルを既に有する患者の場合に特に有用である。投与される薬剤がeritoran（上記参照）であり且つ薬剤の指示量が被験者の仮定平均体重７０ｋｇを基準とする場合の当該アプローチの例は、以下の通りである。第１の例では、薬剤は、連続的な静脈注入によって、低い投薬量にて投与することができる。具体例を挙げると、薬剤は、治療過程にわたって、１０〜５００（例えば、５０〜４００あるいは１００〜２００）μｇ／時間の速度にて投与することができる。患者が長期の看護を必要とする他の例では、薬剤は、例えば、０．１〜２０（例えば、１〜８、２〜７、３〜６あるいは４〜５）ｍｇ／時間の投薬量にて２〜６（例えば、約４）時間の間、断続的に（例えば、１２〜２４時間毎）投与することができる。このアプローチのバリエーションでは、初期、即ち、装填投薬の後に装填投薬未満（例えば、半分）の量の継続投薬を行うか、又は第１の例において説明した連続的な注入を行う。当該治療の期間は、例えば、疾患の重篤性及び改善の観察などのファクターに基づいて、当業者が決定し得る。注入法を用いた、eritoranなどのTLR4アンタゴニストの投与に関する詳細は、ＵＳ−２００３−０１０５０３３−Ａ１（急速静注又は断続注入）及びＷＯ  ００／４１７０３号（連続的な注入）に提示されており、参照することで各々の内容を本書に取り入れることとする。
【００３６】
静脈注入によって化合物eritoranを投与する場合、当該薬剤と適合性のある装置及び設備（例えば、中心若しくは末梢静脈カテーテルなどのカテーテル、チューブ、ドリップチャンバ、フラッシュバックバルブ、Ｙ形注入部、ストップコック、及び注入バッグ）を用いるのが好ましい。詳細には、クロルヘキシジンをベースとする抗菌コーティングを備えたカテーテルは、調合時に形成された薬剤ミセルの寸法を不均一とし、それによって血液中濃度が不適切となることが確認されている。従って、例えば、１つ又は複数の他の抗生物質（リファンピンやミノサイクリンなど）を含有する抗菌コーティングのような、クロルヘキシジン以外をベースとする抗菌コーティングを有する装置及び設備を用いるのが好ましい。
【００３７】
本発明はまた、１つ又は複数のTLR4アンタゴニスト（例えば、化合物eritoranなどの上述のリピッドＡアナログ）と、本書記載の方法における薬剤の使用説明書とを含んで成るキットを包含する。当該キットはまた、任意に、投与において用いられる装置あるいは設備（例えば、クロルヘキシジンコーティングを有さないカテーテル）、及び／又は５％デキストロース（例えば、グルコース）溶液のような、薬剤を投与するための溶液も含むことができる。
【００３８】
本発明の方法は、単独で用いても、あるいは粘膜炎の重篤性を緩和させる他の方法と組み合わせて用いてもよい。例えば、本発明の方法は、抗菌若しくは殺菌療法（例えば、ナイスタチン、アンフォテリシン、アシクロビル、バラシクロビル、クロチマゾール、及びフルコナゾールなどの殺菌剤の投与を伴う療法）と組み合わせて実施することができる。そのような治療の具体例として、放射線療法を受ける頭部及び頸部癌の患者は、咽頭部にグラム陰性菌が存在する。抗菌剤を用いて口腔内を選択的に浄化することは、放射線療法に伴う口腔粘膜炎を緩和させる利点があるが、そのような治療の効果には限界がある。抗菌療法では、細菌を殺すことはできるもののエンドトキシンを減らすことはできず、実際にはエンドトキシンを増加させる場合もある。エンドトキシンは感染症の有力な媒介物であるため、粘膜炎を悪化させる可能性があり、患者の口腔粘膜炎を治療するには、抗エンドトキシン化合物（例えば、eritoranなどのリピッドＡアナログ）及び抗菌剤を用いた併合療法がより効果的な方法である。
【００３９】
本発明の方法はまた、リドカイン、アルチカイン、及び／又はモルヒネ、並びに他の鎮痛剤や抗炎症剤を含有する局所リンス剤、ジェル若しくは軟膏の使用を伴う一時的緩和療法と組み合わせて用いることもできる。本発明の方法に従ってTLR4アンタゴニストと共に用いることのできる他の薬剤及び方法の具体例としては：palifermin（組み替え型ケラチン合成細胞成長因子；rHuKGF；Kepivance(商標）；Amgen）及びAES-14（摂取改善されたL-グルタミン懸濁物）（Peterson, J. Support Oncol. 4(2 Suppl. 1)9-13, 2006）；口腔冷凍療法、低レベルレーザ療法、クロルヘキシジン、アミホスチン、血液成長因子、ペントキシフィリン、及びグルタミン（Saadeh, Pharmacotherapy 25(4):540-554, 2005）；アミホスチン、抗菌ペースト若しくはトローチ、加水分解酵素、氷片、ベンジダミン、リン酸カルシウム、ハチミツ、口腔ケアプロトコル、ポビドン、及び硫酸亜鉛（Worthington et al., Cochrane Database Syst. Rev. 2: CD000978, 2006）；フルルビプロフェン（例えば、歯補強剤として投与；Stokman et al., Support Care Cancer 13(1):42-48, 2005）；ジフェンヒドラミン、水酸化マグネシウム／水酸化アルミニウム、ナイスタチン、及びコルチコステロイド（Chan et al., J. Oncol. Pharm. Pract. 11(4):139-143, 2005）；経口腔粘膜クエン酸フェンタニル（例えば、ドロップ形態にて投与；Shaiova et al., Support Care Cancer 12(4):268-273, 2004）；clonazepam（例えば、錠剤の形態；Gremeau-Richard et al., Pain 108(102):51-57, 2004）；カプサイシン（例えば、ドロップの形態；Okuno et al., J. Cancer Integr. Med. 2(3):179-183, 2004）；ケタミン（例えば、口腔リンス剤の形態；Slatkin et al., Pain Med. 4(3):298-303, 2003）；及び顆粒細胞マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）／顆粒細胞コロニー刺激因子（G-CSF）、レーザ光療法、及びグルタミン栄養剤（Duncan et al., Aliment, Pharmacol. Ther. 18(9):853-874, 2003）が挙げられる。
【００４０】
本発明は、一部には、以下の実験結果に基づいている。
【００４１】
例Ｉ
１．イントロダクション
１．１  原理
２系統のC3Hマウス（C3H/HeJ及びC3H/HeOuJ）は、LPSレセプターTLR4（C3H/HeOuJ系統に存在）が存在するか存在しないかの点で互いに相違する。C3H/HeJマウスは、全身放射による致死効果に対しより敏感であるが、鼻への局所的な急速放射の後には、C3H/HeOuJマウスほどは口腔粘膜炎を発症しない。この相違に関するメカニズム原理は、解明されていない。
【００４２】
１．２  鼻への急速放射モデル
実験化合物の放射線防護特性を判定するために、マウスの鼻への急速放射モデルを利用した。当該モデルにおける口腔粘膜炎の経過を精査したところ、放射後１０〜１２日に粘膜炎のピークを迎えた。当該急速モデルにはほとんど全身毒性はなく、放射線による動物死はほとんどおこらなかった。本実験では、口腔粘膜炎を惹起させるために３０Ｇｙの線量を用いた。
【００４３】
２．実験目的及び概要
２．１  実験目的
後述する実験の目的は、２系統のマウスに関し、口腔粘膜炎の重篤性及び期間への局所的な急速放射の影響を評価することであった。野生型C3H/HeOuJマウスを、エンドトキシン耐性系統のC3H/HeJと比較した。３０Ｇｙの急速放射線量をマウスの鼻に誘導して粘膜炎を引き起こした。放射後幾つかの時点において、各系統の４匹のマウスのグループを殺した。殺した際、舌を除去し、３つの断片へと切断した。各舌の前１／３を、後続の組織分析のためにホルマリン中に置いた。各舌の中央１／３を、サイトカイン発現濃度の分析のためにmRNAをもたらすべく抽出処理した。各舌の後部は、後の分析のために液体窒素中で瞬間冷凍した。殺した際に、各動物から血液を採取し、後続のサイトカイン分析のために血清を準備した。この実験では、炎症誘発性サイトカインTNF-α及びIL-6に着目した。
【００４４】
２．２  実験概要
合計６４匹のマウスを用いた。０日目に、５６匹のマウス（２８匹がC3H/HeOuJ、２８匹がC3H/HeJ）に、線量３０Ｇｙの放射線を当てた。また、８匹のマウス（４匹がC3H/HeOuJ、４匹がC3H/HeJ）を、放射線を当てない対照用動物として用いた。動物を殺し、表１記載のスケジュールに従って血液及び組織を採取した。
【００４５】
【表１】
2008540510.tif 000018
【００４６】
３．  実験計画
６４匹のマウス（３２匹がC3H/HeOuJ、３２匹がC3H/HeJ）を用いた。マウスは、表２記載のように、放射線処理される各２８匹のグループ（グループ１及び２）と、放射線処理されない対照用の各４匹のグループ（グループ３及び４）とに任意抽出した。
【００４７】
【表２】
2008540510.tif 000019
【００４８】
実験期間（０日目から１４日目）は毎日、各動物の体重を測定した。グループ１及び２の動物は、０日目に、線量３０Ｇｙの放射線を鼻に受けた。鉛シールドによって、動物の体の他の部分を保護した。放射後、２時間、６時間、２４時間（１日）、３日、６日、１０日及び１４日に、グループ１及び２から４匹の動物を殺し、後述のように血液及び組織を採取した。グループ３及び４の動物は、１日目に殺して舌を切断し、血液を採取した。各動物からの舌を３つの断片に切断し（前部、中央部、後部）、各舌をホルマリン中に置いた。ホルマリン漬け舌のヘマトキシリン及びエオシン（H&E）染色部を組織分析することによって、粘膜炎をアッセイした。粘膜炎の評価は、実証スケール（validated scale）に従って盲検法（blinded manner）により行った。標準的なELISAアッセイを用いて、サイトカインTNF-α及びIL-6について血清試料をアッセイした。
【００４９】
４．  素材及び方法
４．１  動物
生後５〜６週の、体重２２．３ｇのC3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウス（Jackson Laboratories）を用いた。動物は、耳パンチを用いて個々に番号を付し、１ケージ当たり約５匹の小グループを配した。動物は、試験開始前に、場に順応させた。この少なくとも２日の間は、欠陥のある状態を呈する動物を除外するために、規則的に動物を観察した。
【００５０】
４．２  ハウジング
実験は、温度７０°Ｆ＋／−５°Ｆ及び相対湿度５０％のろ過処理された空気が提供される動物ルームにて行った。動物ルームは、１時間当たり最低１２〜１５回の換気を維持するように設定した。当該ルームは、衰退期を設けず、オン１２時間オフ１２時間から成る明／暗周期をもたらす自動タイマーが設けられていた。Bed-O-Cobs（登録商標）下地を用い、１週間に最低１度は取り替えた。ケージ、表面、ボトル等は、市販の洗浄剤で洗浄し、空気乾燥させた。使用する前に、これらの品は、ラップし、オートクレーブにかけた。フードに導入される表面や素材を市販の消毒剤を用いて消毒した。床は規則的に掃き、市販の洗浄剤を用いて週に最低２度はモップで掃除した。壁及びケージ台は、希釈した漂白剤溶液を用いて月に最低１回はスポンジで掃除した。実験、投与量、動物番号、及び治療グループを識別するのに必要な情報の付されたケージカード若しくはラベルを、全てのケージに配した。実験中、温度及び相対湿度を記録し、当該記録を維持した。
【００５１】
４．３  食事
動物には、Labdiet（登録商標）5001食材を与え、任意に水を与えた。
【００５２】
４．４  動物の任意抽出及び割り当て
放射前に、マウスを、４つの治療グループへと無作為に分けた。個体番号に対応する耳パッチを用いて、各動物を識別した。ケージカード、即ち、実験番号、治療グループ番号及び動物番号のマークされたラベルを用いて、各ケージを識別した。
【００５３】
４．５  放射
実験開始２週以内は、装置の校正を検証した。グループ１及び２の全ての動物に、０日目に放射線を１回（３０Ｇｙ／１回）当てた。放射線は、０．３５ｍｍＣｕフィルタ装置を備えた、焦点距離５０ｃｍ、電位１６０キロボルト（１５ｍａ）の線源を用いて生成した。照射は、121.5 ｃＧｙ／分の速度にて行った。放射前に、麻酔を用いて動物を麻痺させ、鼻だけが露出するように鉛シールド下に配した。
【００５４】
４．６  組織、血液の採取及び分析
４．６．１  動物の殺処理及び組織採取
グループ３及び４の動物は、放射処理しない対照用の動物であった。これらの動物から得た測定値によって、本実験における放射処理された全サンプルについての対照ベースラインを得た。グループ３及び４の４匹の動物は、１日目に殺した。
【００５５】
グループ１及び２の動物は、実験の幾つかの時点で殺した。各時点において、グループ当たり４匹を殺した。その時点は、放射後、２時間、６時間、２４時間、３日、６日、１０日、及び１４日であった。
【００５６】
殺す際、舌を除去し、３つの断片へと切断した。各舌の前１／３は、後続の組織分析のためにホルマリン中に置いた。各舌の中央１／３は、サイトカイン発現濃度分析のためにmRNAをもたらすべく抽出した。各舌の後１／３は、後の分析のために、液体窒素中で瞬間冷凍し保存した。
【００５７】
殺す際、およそ１ｍＬの血液を各動物から採取し、後続のサイトカイン分析のために血清を準備した。当該実験では、炎症誘導性サイトカインTNF-α及びIL-6に着目した。
【００５８】
４．６．２  サイトカインELISA
酵素結合免疫吸着法（ELISA）は、R and D systemsから販売されているキットを用いて、サイトカインTNF-α及びIL-6について行った。これらのキットは、製造者の説明書に従って用いた。全ての測定は、−８０℃にて保存した血清サンプルについて、２度行った。IL-6及びTNF-αの両方を試験するには十分でない量の血清しか採取されなかった場合には、サンプルを１：２若しくは１：４に希釈し、両アッセイについて２度行った。全てのアッセイは、１ウェル当たりサンプル５０μＬを用いた。
【００５９】
４．６．３  組織構造
組織サンプルは、１０％ホルムアルデヒド／生理食塩水中に置き、標準的な技術を用いてパラフィン組織について処理した。スライドをヘマトキシリン及びエオシン（H&E）で染色し、病理専門家が検査した。
【００６０】
４．７  結果の評価
一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて、治療グループ間の統計学的な差異を評価した。治療グループ間の差異として、体重を評価した。
【００６１】
５．結果及び考察
５．１  生存
１０日目、合計６匹が死んだ。これらは、C3H/HeOuJ及びC3H/HeJグループに等しく分散（各グループ、３匹が死んだ）しており、この結果、１４日目には各グループ１匹のみを殺した。１４日目の時点に関するデータをもたらす追加の動物をもたらすために、追加の動物を放射処理した。
【００６２】
５．２  体重（図１及び２）
各グループの体重変化の平均パーセントを図１に示す。この体重変化データから、両グループとも放射後およそ５％体重が減少し、次いで６日目までは体重が増加したことが分かる。６日目から１３日目までは、C3H/HeJマウスは、開始体重比較で、増加なし〜５％増加の間を維持した。C3H/HeOuJマウスは、７〜９日目の間におよそ１０％体重が減少し、１３日目まで体重は増加しなかった。この２つのグループの相違を評価するために、各個体に関する曲線下部面積（AUC）を計算し、一元配置分散分析を用いて差異を評価した。平均AUCデータを図２に示す。一元配置分散分析から、当該グループ間には統計学的な差異（P=0.008）のあることが分かった。
【００６３】
５．３  血清サイトカイン濃度
血清のサイトカインIL-6及びTNF-α濃度をELISAによって評価した。
【００６４】
５．３．１  血清IL-6濃度
放射線処理されないC3H/HeOuJマウスでは、血清の平均サイトカインIL-6濃度は1.0 pg/mLであった。この濃度は、放射６時間後には88.8 pg/mLまで増加し、放射３日目には12.0 pg/mLに低下し、６日目には122.7 pg/mLのピーク濃度にまで増加した。１０日目及び１４日目には、６日目でみられたピーク濃度から徐々に減少していた。放射処理されないC3H/HeJマウスに関しては、血清の平均IL-6濃度は13.8 pg/mLであった。血清のIL-6濃度が69.4 pg/mLまで増加した１０日目の時点を除いて、他の全ての読み値は25〜42 pg/mLであった。これらのデータは、図３に示す。
【００６５】
５．３．２  血清のTNF-α濃度
放射処理されないC3H/HeOuJマウスの血清のTNF-α平均濃度は、48.0 pg/mLであった。これらのマウスに関しては、２時間後（168.7 pg/mL）と１０日目（410.2 pg/mL）に、血清TNF-α濃度のピークが２つあった。これら２つのピークの間の時点においては、血清TNF-α濃度は、放射処理されないC3H/HeOuJマウスの場合の濃度に近かった（31.6 pg/mL〜87.2 pg/mL）。１０日目及び１４日目には、放射処理されない対照よりも濃度は低かった（それぞれ5.7 pg/mL及び6.6 pg/mL）。C3H/HeJマウスに関しては、放射処理されない対照用マウスは、109.3 pg/mLという血清TNF-α濃度を有した。放射後の読み値は概してこれよりも低く、放射後６時間にて14.2 pg/mLから１０日目にて133.8 pg/mLの範囲であった。これらのデータは、図４に示す。
【００６６】
５．４  舌組織
各舌の部分を、通常のヘマトキシリン及びエオシン（H&E）組織に関して処理した。次いで、これらのスライドを病理専門家が検査し、０〜３のスケールにて上皮組織及び結合組織の病理状態を、また、上皮組織の有糸分裂、潰瘍パーセント、骨格筋の損傷、高倍率領域（high powered fields)１０箇所当たりの炎症細胞数（特異的細胞タイプ分析（differential cell type analysis）を含む）、及び小血管、中血管及び大血管の数を評価した。
【００６７】
５．４．１  組織評価
各サンプルの上皮組織及び結合組織領域は各々、別個に評価した。上皮組織に関する評価は図５に示している。放射処理されていないC3H/HeOuJマウスに関する上皮組織の平均スコアは０であり、平均スコアが０．２５であった１日目、平均スコアが２であった６日目及び１０日目を除く全ての放射後時点においてもそうであった。C3H/HeJマウスに関しては、スコアが０．７５であった６日目を除き、全ての時点において、上皮組織の平均スコアは０であった。結合組織に関する平均スコアのデータは図６に示している。放射処理を受けていないC3H/HeOuJマウスの結合組織の平均組織スコアは２であった。このスコアは、放射後２時間において０に低下し、放射後１日目には１へと増加し、３日目には０に低下し、１０日目及び１４日目には１．５へと増加した。C3H/HeJマウスに関しては、放射処理を受けていないマウスの上皮組織の平均組織スコアは１．２５であり、放射後２時間において０．２５に低下し、１０日目には１．２５へと徐々に増加した。結合組織に関しては、C3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスの両方について、放射後のどの時点よりも、放射処理を受けていない対照用マウスの方が、組織スコアは高かった。この理由は、現在のところ、不明である。
【００６８】
５．４．２  炎症
各時点における、各系統のマウスについて、高倍率領域１０箇所当たりの炎症細胞の平均数を計算し、その結果を図７に示している。放射処理されていない動物の結合組織においてみられた細胞数は、両系統のマウスに関し、予測されたよりも多く、C3H/HeJマウスに関しては、照射後のどの時点においてもそれより少なかった。C3H/HeOuJマウスに関しても、照射処理されていない対照よりも約２倍も細胞数の多い（２時間及び６時間の時点よりも約１０倍多い）１０日目と、放射処理されていない対照よりも数が約５０％多い１４日目を除けば、ほとんどの時点において、炎症細胞の数は、放射処理されていない対照において確認されたものよりも少なかった。結合組織の病理学スコアに関しては、放射処理されていない動物においてみられた予期せぬ高い数値の理由は不明である。全ての場合において、浸潤物の大半はリンパ細胞から構成されており、リンパ細胞以外のほぼ全てがモノサイト及びマクロファージである。有意数のpolymorphonucleocyte（PMN又は好中球）は、１０日目の時点から、３匹（１匹のOuJ及び2匹のHeJ）においてしか見られなかった。
【００６９】
５．４．３  上皮細胞の有糸分裂
上皮細胞層でみられた有糸分裂像の数を数えた。各時点における各系統に関して高倍率領域１０箇所当たりの有糸分裂の平均数を図８に示している。C3H/HeOuJマウスの舌の上皮細胞層における有糸分裂像の数は概して低く、放射処理されていないマウスでは平均０．４であり、平均２．７５が確認された６日目を除いて、全ての時点においてこれよりも低かった。C3H/HeJマウスに関しては、放射処理していないマウスで見られた有糸分裂数は平均０．１であり、C3H/HeOuJマウスの場合よりも低かった。しかしながら、放射後１０日目までに０．４にまで上昇した。
【００７０】
５．４．４  血管
高倍率領域１０箇所当たりの血管数を各サンプルに関し数え、各時点における各系統のマウスに関して平均数を算出した。これらのデータは、図９に示している。高倍率領域１０箇所当たりの血管数は、放射処理していないC3H/HeOuJマウスでは２６．６であり、放射処理していないC3H/HeJマウスでは２７．２であった。C3H/HeOuJマウスに関しては、血管数は、放射後２時間で４．５へと明らかに低下し、１日目に２０．６へと上昇し、３日目に８．５へと下がり、６日目及び１０日目に上昇し、１４日目には３３．７のピーク値に達した。これは、放射処理していない対照に関して２７％の、２時間の時点に関して６４８％の増加を示している。１日目に殺した、放射処理していない対照動物が、１日目の時点と同等のレベルを有することが興味深い。C3H/HeJマウスに関しては、血管数は、放射処理していない対照とほぼ近く、放射後２時間において最小値１８．３になり、放射後６日目には最大値３３．１となった。血管の質的変化を評価するために、高倍率領域１０箇所当たりの大血管の数を評価し、得られた数を、同高倍率領域１０箇所において見られた血管総数のパーセンテージとして表した。この分析結果は図１０に示している。そこでは、C3H/HeOuJマウス中の大血管の数は、放射処理していない対照マウスの平均９．２％から１日目（放射後２４時間）の２６．５％のピークまで増加し、実験の残りの期間では低下したことが分かる。C3H/HeJマウスは、放射処理していないマウスに関しては１３．２％とわずかに高い対照レベルを有し、放射後６日目には１８．７％のピークに増加し、そして放射後１０日目及び１４日目には対照以下のレベルへと低下した。
【００７１】
６．結論
１．この実験期間中、C3H/HeOuJマウスはC3H/HeJマウスよりも体重の低下が大きく、一元配置分散分析試験を用いて評価した際、確認された差異は統計学的に有意であった（P=0.008）。
【００７２】
２．血清サイトカイン濃度の分析では、放射処理していないC3H/HeJ対照マウスは、対応するC3H/HeOuJよりも高い濃度を有するが、C3H/HeOuJマウスはC3H/HeJよりも放射後の血清サイトカインの増大は大きいことが分かった（放射後６日目にIL-6及びTNF-α両者のピーク濃度が確認された）。
【００７３】
３．病理学的に、C3H/HeJマウスに関しては、非常に僅かな変化がみられた。C3H/HeOuJマウスは、放射後６日目及び１０日目に上皮組織の著しい破壊がみられた。結合組織に関する病理学的スコアは、放射処理していない対照C3H/HeOuJマウスは高く、放射後２時間から６日にかけて低下し、放射後１０日目及び１４日目に対照レベル付近に戻った。
【００７４】
４．C3H/HeJマウスに関しては炎症細胞存在数はほとんど変化しなかったが、C3H/HeOuJマウスでは放射後１０日目のピークへと増加し、これは、これらの動物の組織サイトカイン濃度のピークと一致した。浸潤物は、主にリンパ球であった。
【００７５】
５．上皮細胞層において確認された有糸分裂数については、C3H/HeOuJマウスでは６日目に有糸分裂活性が著しく高まったのに対し、C3H/HeJマウスでは僅かに増加し、１０日目にピークを迎えた。
【００７６】
６．血管の数及び寸法の分析については、C3H/HeOuJマウスは放射直後（放射後２時間及び６時間）に血管数が低下し、その後の時点（放射後１０日目及び１４日目）では総じて増加したのに対し、C3H/HeJマウスではほとんど変化はなかった。C3H/HeOuJマウスでは、放射後２４時間に大血管パーセンテージの増加が認められた。
【００７７】
例ＩＩ
１．イントロダクション
１．１  原理
例Ｉで述べたように、２系統のC3Hマウス（C3H/HeJ及びC3H/HeOuJ）は、LPSレセプターTLR4（C3H/HeOuJ系統に存在）が存在するか存在しないかの点で互いに相違する。上述の実験では、C3H/HeOuJ系統は鼻への放射線照射により口腔粘膜炎に感染しやすいのに対し、C3H/HeJ系統は放射線誘導性粘膜炎に比較的耐性のあることが照明された。これらの動物についての炎症誘発性サイトカインの評価では、C3H/HeOuJマウスにおけるLPSレセプターTLR4を介した当該サイトカインの惹起が口腔粘膜炎の発症に或る役割を果たす可能性のあることが示された。以下に述べる実験の目的は、口腔粘膜炎のネズミ科モデルにおいてTLR4の刺激を阻害する化合物（eritoran）を評価することである。
【００７８】
１．２  鼻への急速放射モデル
実験化合物の放射線防護特性を判定するために、マウスの鼻への急速放射モデルを利用した。当該モデルにおける口腔粘膜炎の経過を精査したところ、放射後１０〜１２日に粘膜炎のピークを迎えた。当該急速モデルにはほとんど全身毒性はなく、放射線による動物死はほとんどおこらなかった。本実験では、口腔粘膜炎を惹起させるために３０Ｇｙの線量を用いた。
【００７９】
２．実験目的及び概要
２．１  実験目的
後述する実験の目的は、放射線により惹起された口腔粘膜炎の重篤性及び期間への、皮下投与されたeritoranの効果を検証することであった。３０Ｇｙの急速放射線量をマウスの鼻に誘導して粘膜炎を引き起こした。放射後幾つかの時点において、各系統の４匹のマウスのグループを殺した。殺した際、舌を除去し、３つの断片へと切断した。各舌の前１／３を、後続の組織分析のためにホルマリン中に置いた。各舌の中央１／３を、サイトカイン発現濃度の分析のためにmRNAをもたらすべく抽出処理した。各舌の後部は、後の分析のために液体窒素中で瞬間冷凍し保存した。殺した際に、各動物から血液を採取し、後続のサイトカイン分析のために血清を準備した。
【００８０】
２．２  実験概要
合計５４匹のマウスを用いた。４８匹のC3H/HeOuJマウスを１グループ当たり１６匹から成る３グループ（グループ１−３）へと分けた。残りの６匹は、表２記載のように、別個の対照グループ（グループ４）とした。
【００８１】
３．  実験計画
体重約２２ｇの、生後６〜７週の５４匹の雄のC3H/HeOuJマウスを用いた。それぞれ１６匹から成る３つの治療グループと、放射線を受けない６匹から成る対照グループとした。全ての動物は、３日目に、左頸静脈に挿入された頸部カニューレを有していた。０日目に、グループ１及び４の動物に、カニューレを介してプラシーボを日に２度注入した。グループ２の動物には、０日目に、放射前に２時間以下、1mg/kgにて規則的にeritoranの２ＩＶ注入物を投与し、１０日目まで続けた。グループ３の動物には、０日目に、放射前に２時間以下、10mg/kgにて規則的にeritoranの２ＩＶ注入物を投与し、１０日目まで続けた。グループ１、２及び３の動物には、０日目に、鼻に線量３０Ｇｙの放射線を当てた。グループ４の６匹は、放射処理しない対照用動物として用いた（表２参照）。グループ１、２及び３の各々から８匹を殺し、表２記載のスケジュールに従って血液及び組織を採取した。
【００８２】
【表３】
2008540510.tif 000020
【００８３】
４．  素材及び方法
４．１  動物
生後５〜６週の、体重２１．３ｇのC3H/HeOuJマウス（Jackson Laboratories）を用いた。動物は、耳パンチを用いて個々に番号を付し、個々に住まわせた。動物は、試験開始前に、場に順応させた。この少なくとも２日の間は、欠陥のある状態を呈する動物を除外するために、規則的に動物を観察した。
【００８４】
４．２  ハウジング
実験は、例Ｉのセクション４．２において先述した動物ルームにおいて行った。
【００８５】
４．３  食事
動物には、無菌照射されたネズミ用Labdiet（登録商標）5061食材を与え、任意に水を与えた。
【００８６】
４．４  動物の任意抽出及び割り当て
放射前に、マウスを、３つの治療グループへと無作為に分けた。個体番号に対応する耳パッチを用いて、各動物を識別した。ケージカード、即ち、実験番号、治療グループ番号及び動物番号のマークされたラベルを用いて、各ケージを識別した。
【００８７】
４．５  放射
実験開始２週以内は、装置の校正を検証した。グループ１及び２の全ての動物に、０日目に放射線を１回（３０Ｇｙ／１回）当てた。放射線は、０．３５ｍｍＣｕフィルタ装置を備えた、焦点距離５０ｃｍ、電位１６０キロボルト（１５ｍａ）の線源を用いて生成した。照射は、121.5 ｃＧｙ／分の速度にて行った。放射前に、麻酔を用いて動物を麻痺させ、鼻だけが露出するように鉛シールド下に配した。
【００８８】
４．６  組織の採取及び分析
４．６．１  組織構造
組織サンプルは、１０％ホルムアルデヒド／生理食塩水中に置き、標準的な技術を用いてパラフィン病理組織について処理した。スライドをヘマトキシリン及びエオシン（H&E）で染色した。
【００８９】
４．７  結果の評価
一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて、治療グループ間の統計学的な差異を評価した。治療グループ間の差異として、体重を評価した。
【００９０】
５．結果及び考察
５．１  体重（図１１及び１２）
実験各日における各グループの体重増加の平均パーセントを図１１に示す。放射線を受けていない対照グループは実験中に平均８．１％増加したのに対し、プラシーボグループでは平均０．８％低下した。eritoranを受容したグループに関しては、10mg/kg受容したグループが正味０．２％低下したのに比べて、1mg/kg受容したグループでは平均４．０％体重が増加した。放射線を受容した３グループについてのこの分析結果は、図１２に示している。これら３グループ間には有意な差はなかった（P=0.261）。放射線を受けていない対照と比較すると、放射線を受けていないグループと、プラシーボ（P<0.001）及び10mg/kgのeritoran（P<0.001）を受容した放射線処理したグループとの間には有意の差があった。
【００９１】
５．３  舌組織
各舌を、通常のヘマトキシリン及びエオシン病理組織に関して処理した。幾つかの技術的理由のため、合計４４サンプルを評価した。これら４４サンプルのうち、６個は放射線を受けていない対照グループであり、１２個はプラシーボグループ（６日目及び１０日目についてそれぞれ６つ）であり、１４個はeritoran 1 mg/kgで処理したグループ（６日目及び１０日目についてそれぞれ７つ）、１２個はeritoran 10 mg/kgで処理したグループ（６日目について７個、１０日目について５個）であった。
【００９２】
データセット全体について最もよく見られた結果は正常であった。これは、１４サンプルにおいていえ、そのうちの４つは放射処理を受けていない対照グループであった。1mg/kgのeritoranで処理されたグループの１４サンプルのうちの６つ（６日目の７つのサンプルのうち２つ、１０日目の７つのサンプルのうち４つ）、並びに10mg/kgのeritoranで処理されたグループの１２サンプルのうちの３つ（６日目の７つのサンプルのうち１つ、１０日目の５つのサンプルのうち２つ）についても正常といえる。プラシーボで処理されたグループの１２サンプルのうち１つのみが正常であった（６日目のサンプル）。
【００９３】
過角化症もまた、サンプルのうち１４個において見られた。そのうち、放射線処理を受けていない対照グループにおいてみられなかった。過角化症は、10mg/kgのeritoranで処理したグループから得たサンプルにおいて最もよく見られ、１２サンプルのうち７つ（６日目の７サンプルのうち３つ、１０日目の５サンプルのうち４つ）がそうであった。過角化症は、1mg/kgのeritoranで処理したグループから得た１４サンプルのうち５つ（６日目の７サンプルのうち１つ、１０日目の７サンプルうち４つ）においても見られた。プラシーボグループにおいては２サンプル（各時点において１つ）しか過角化症を呈さなかった。上皮過角化症は５サンプルにおいてのみみられたが、これらのサンプルのうち４つは10mg/kgのeritoranで処理されたグループのもの（各時点において２つ）であり、５番目のものはプラシーボグループのもの（６日目）であった。これらの結果から、プラシーボ対照に比べて、eritoranで処理された両グループは実質的な改善を示したことが分かり、高投薬量にて処理したグループ（10mg/kg）は過形成及び過角化症の傾向を示した。
【００９４】
結合組織の損傷や破壊は、合計１１サンプルにおいて見られた。そのうちの８つはプラシーボで処理されたグループのもの（６日目の６サンプルのうち３つ、１０日目の６サンプルのうち５つ）であり、２つは1mg/kgのeritoranで処理したグループのもの（６日目の両者）であり、１つは10mg/kgのeritoranで処理したグループのもの（６日目）のものであった。上皮の損失や損傷は７サンプルにおいて認められ、上皮の萎縮はさらに５サンプルにおいても認められた。上皮損傷を被ったこれら１２サンプルのうち、５つはプラシーボ処理されたグループのもの（６日目の２つ、１０日目の３つ）であり、５つは1mg/kgのeritoranで処理されたグループのもの（６日目の全て）であり、２つは10mg/kgのeritoranで処理されたグループのもの（６日目の両者）であった。細胞の増大は１０サンプルにおいて見られ、その２つはプラシーボグループ（６日目及び１０日目についてそれぞれ１つ）であり、５つは1mg/kgのeritoranで処理したグループ（６日目の１つ、１０日目の４つ）であり、３つは10mg/kgのeritoranで処理したグループ（６日目の１つ、１０日目の２つ）であった。２種類の浸潤物が確認された。球形細胞又はリンパ球浸潤物は８サンプルにおいて認められ、グループ及び時点について等しく分布しており、放射処理していない６つの対照のうち１つにおいてみられた。マスト細胞浸潤物は９サンプルにおいて認められ、そのうち７つはプラシーボ処理したグループ（６日目の５つ、１０日目の２つ）であり、他の２サンプルは10mg/kgのeritoranで処理したグループのもの（６日目の時点）であった。血管拡張や血管増大に関する他の観察事項は、治療グループ間に等しく存在し、治療グループ間の有意な差異を示すものではなかった。以上、放射線誘発性の結合組織損傷やマスト細胞浸潤物が少ないことから分かるように、eritoran治療は改善された舌組織に帰着することが示された。
【００９５】
５．３．１  舌の背面及び前面の上皮表面の厚さ
各サンプルを、舌の背面及び前面の上皮細胞層の最小数及び最大数について評価した。これらの数から、各時点における各グループについて、平均最小厚さ及び平均最大厚さを算出した。舌の背面について、放射処理しなかった対照の細胞の層数は６細胞層であった。プラシーボ対照治療グループに関しては、細胞の平均層数は、６日目に２．７であり、１０日目に２．０であった。eritoran処理したグループに関しては、細胞の平均最小層数は、1mg/kgグループについて２．８（６日目）及び３．８（１０日目）であり、10mg/kgグループについて３．８（６日目）及び３．３（１０日目）であった。これらのデータは図１３に示している。放射処理していない対照の背面の上皮細胞の平均最大層数は、８であった。プラシーボ処理した対照グループに関しては、細胞の平均層数は、６日目に４．８であり、１０日目に３．５であった。eritoran処理したグループに関しては、細胞の平均最大層数は、1mg/kgグループについて５．３（６日目）及び６．４（１０日目）であり、10mg/kgグループについて６．２（６日目）及び６．１（１０日目）であった。これらのデータは図１４に示している。前面に関しては、放射処理していない対照の細胞の平均最大層数は、４細胞層であった。プラシーボ処理した対照治療グループに関しては、細胞の平均最大層数は、６日目に１．７であり、１０日目に０．９であった。eritoran処理したグループに関しては、細胞の平均最大層数は、1mg/kgのグループについて２．０（６日目）及び２．８（１０日目）であり、10mg/kgのグループについて３．０（６日目及び１０日目）であった。これらのデータは図１５に示している。放射処理していない対照の前面の上皮細胞の平均最大層数は６であった。プラシーボ処理した対照治療グループに関しては、細胞の平均層数は、６日目に４．２であり、１０日目に２．４であった。eritoran処理したグループに関しては、細胞の平均最小層数は、1mg/kgのグループについて３．７（６日目）及び４．６（１０日目）であり、10mg/kgのグループについて５．８（６日目）及び５．９（１０日目）であった。これらのデータは図１６に示している。これらの結果から、eritoranは、上皮細胞層を保護することが示され、10mg/kgのグループは、特に前面に関して1mg/kgのグループよりも僅かに高い保護能を示した。
【００９６】
６．結論
１．この実験では著しい死亡率がみられたが、この過度の死亡率は１つの治療グループに関連するものではなかった。
【００９７】
２．放射処理された３つのグループ間において、体重増加における有意な統計学的差異はみられなかった。
【００９８】
３．正常とされたサンプルの数から分かるように、eritoranで処理した両グループは、プラシーボ処理された対照グループと比較して、舌の病理組織において改善を示し、上皮過角化症及び過形成を増やし、結合組織の損傷やマスト細胞浸潤物を低下させた。
【００９９】
４．eritoranで処理された両グループは舌組織における改善を示したが、1mg/kgのグループと10mg/kgのグループとの間には組織形態において識別し得る差異が存在した（どの投薬量がより大きな改善を示すかは明らかではないが）。
【０１００】
例ＩＩＩ
１．イントロダクション
１．１  原理
上述のように、２系統のC3Hマウス（C3H/HeJ及びC3H/HeOuJ）は、LPSレセプターTLR4（C3H/HeOuJ系統に存在）が存在するか存在しないかの点で互いに相違し、そして、C3H/HeOuJ系統は鼻への放射線照射により口腔粘膜炎に感染しやすいのに対し、C3H/HeJ系統は放射線誘導性粘膜炎に比較的耐性がある。さらに上述のように、これらの動物についての炎症誘発性サイトカインの評価では、C3H/HeOuJマウスにおけるLPSレセプターTLR4を介した当該サイトカインの惹起が口腔粘膜炎の発症に或る役割を果たす可能性のあることが示された。例ＩＩに記載の実験では、口腔粘膜炎のモデルにおいてeritoranの有効性が実証された。以下に述べる実験では、eritoranの最適な投薬スケジュールを決定する。
【０１０１】
１．２  鼻への急速放射モデル
実験化合物の放射線防護特性を判定するために、マウスの鼻への急速放射モデルを利用した。当該モデルにおける口腔粘膜炎の経過を精査したところ、放射後１０〜１２日に粘膜炎のピークを迎えた。当該急速モデルにはほとんど全身毒性はなく、放射線による動物死はほとんどおこらなかった。本実験では、口腔粘膜炎を惹起させるために３０Ｇｙの線量を用いた。
【０１０２】
２．実験目的及び概要
２．１  実験目的
この実験の目的は、放射線により惹起された口腔粘膜炎の重篤性及び期間への、静脈投与されたeritoranのスケジュールの影響を検証することである。３０Ｇｙの急速放射線量をマウスの鼻に誘導して粘膜炎を引き起こした。放射後１０日目に、各治療グループから４匹のマウスのグループを殺した。殺した際、各動物から血液を採取し、後続のサイトカイン分析のために血清を準備した。これらのサンプルは、血清腫瘍壊死因子（TNF-α）、インターロイキン-6（IL-6）、及び血清アミロイドＡ（SAA）濃度の測定のために用いた。
【０１０３】
２．２  実験概要
６０匹のC3H/HeOuJマウスをJackson Laboratoriesから入手した。これらの動物は、頸部カニューレを既に取り付けらた状態で出荷されたものであった。それらの動物を、表４記載のように、グループ当たり１０匹から成る６つのグループへと無作為に分けた。
【０１０４】
３．  実験計画
体重約２２ｇの、生後６〜７週の６０匹の雄のC3H/HeOuJマウスを用いた。それぞれ１０匹から成る５つの治療グループと、放射線を受けない１０匹から成る対照グループとした。０日目に、グループ１−６の動物に、放射前に２時間以下、プラシーボ又は10mg/kgのeritoranの何れかを投与した。投与は、放射処理日（０日目）から９日目まで、日に２度続けた。グループ１及び２の動物には、投与期間中ずっとプラシーボを与えた。グループ３の動物には、投与期間の全体にわたって、10mg/kgにてeritoranを与えた。グループ４の動物には、０日目から３日目まで日に２度10mg/kgにてeritoranを与え、次いで投与期間の終わりまで日に２度プラシーボを与えた。グループ５の動物には、０日目から２日目まで日に２度プラシーボを与え、次いで３日目から６日目まで日に２度10mg/kgにてeritoranを与え、次いで投与期間の終わりまで日に２度プラシーボを与えた。グループ６の動物には０日目から５日目まで日に２度プラシーボを与え、次いで投与期間の終わりまで日に２度10mg/kgにてeritoranを与えた。薬剤及びプラシーボの投与の全ては、頸部カニューレを介して静脈注入であった。
【０１０５】
【表４】
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【０１０６】
実験期間（０日目から１０日目）の毎日、各動物の重量を精度０．１ｇにて量った。放射後１０日目に、全ての動物を殺し、病理組織分析のために舌を採取した。殺した際に血液を採取し、血清を−８０℃にて貯蔵した。
【０１０７】
４．  素材及び方法
４．１  動物
生後５〜６週の、体重２３．２ｇのC3H/HeOuJマウス（Jackson Laboratories）を用いた。動物は、出荷前にJackson Laboratoriesによって頸部カニューレを取り付けられ、そして耳パンチを用いて個々に番号を付し、個々に住まわせた。動物は、試験開始前に、場に順応させた。この少なくとも２日の間は、欠陥のある状態を呈する動物を除外するために、規則的に動物を観察した。
【０１０８】
４．２  ハウジング
実験は、例Ｉのセクション４．２において先述した動物ルームにおいて行った。
【０１０９】
４．３  食事
動物には、無菌照射されたネズミ用Labdiet（登録商標）5061食材を与え、任意に水を与えた。
【０１１０】
４．４  動物の任意抽出及び割り当て
放射前に、マウスを、３つの治療グループへと無作為に分けた。個体番号に対応する耳パッチを用いて、各動物を識別した。ケージカード、即ち、実験番号、治療グループ番号及び動物番号のマークされたラベルを用いて、各ケージを識別した。
【０１１１】
４．５  放射
実験開始２週以内は、装置の校正を検証した。グループ１及び２の全ての動物に、０日目に放射線を１回（３０Ｇｙ／１回）当てた。放射線は、０．３５ｍｍＣｕフィルタ装置を備えた、焦点距離５０ｃｍ、電位１６０キロボルト（１５ｍａ）の線源を用いて生成した。照射は、121.5 ｃＧｙ／分の速度にて行った。放射前に、麻酔を用いて動物を麻痺させ、鼻だけが露出するように鉛シールド下に配した。
【０１１２】
４．６  組織の採取及び分析
４．６．１  組織構造
組織サンプルは、１０％ホルムアルデヒド／生理食塩水中に置き、標準的な技術を用いてパラフィン病理組織について処理した。スライドはヘマトキシリン及びエオシン（H&E）で染色した。
【０１１３】
４．６．２  サイトカインELISA
酵素結合免疫吸着法（ELISA）は、R and D systemsから販売されているキットを用いて、サイトカインTNF-α及びIL-6について行った。血清アミロイドＡの判定は、Biosource InternationalからのELISAキットを用いて行った。これらのキットは、製造者の説明書に従って用いた。全ての測定は、−８０℃にて保存した血清サンプルについて、２度行った。サンプルは３つのアッセイの全てにおいて２度試験し、IL-6、SAA及びTNF-αアッセイを行うには十分でない量の血清しか採取されなかった場合には、サンプルを１：４に希釈した。全てのアッセイは、１ウェル当たりサンプル５０μＬを用いた。
【０１１４】
４．７  結果の評価
一元配置分散分析（one-way ANOVA）を用いて、治療グループ間の統計学的な差異を評価した。治療グループ間の差異として、体重を評価した。
【０１１５】
５．結果及び考察
５．１  生存
この実験では、合計１０８匹のカニューレを挿入された動物を用いた。当該C3H/HeOuJマウスの利用は限られているため、これらの動物は、６週間かけて３グループに処理した。これらのマウスのうち５７匹は、１０日目まで生きていた。１０日目まで生きなかった５１匹のマウスのうち、２１匹は０日目に死亡するか又は安楽死させた。このうち、１１匹は麻酔や放射線によるものであり、１０匹はカニューレの問題によるものであった（初期注入後、凝血塊、カニューレ不通、又はカニューレ脱落により死亡）。実験期間中に死亡するか又は安楽死させた残り３０匹のうち、２匹は１日目に、５匹は２日目に、４匹は３日目に、７匹は４日目に、３匹ずつ５日目及び６日目に、１匹ずつ７日目及び８日目に、２匹ずつ９日目及び１０日目に死んだ。死亡率はグループ間でほぼ等しかった。放射処理しない対照グループ並びに賦形剤対照グループの各々について、９匹の死亡が確認された。０〜１０日目又は０〜３日目に10mg/kgのeritoranで処理したグループの各々について、７匹の死亡が確認された。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループでは９匹の死亡が確認され、また、６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループでは１０匹の死亡が確認された。
【０１１６】
５．２  体重（図１７、１８、１９及び２０）
実験各日における各グループの体重増加の平均パーセントを図１７に示す。放射線を受けていない対照グループは実験中に平均３．２％増加したのに対し、プラシーボグループでは平均１２．１％低下した。10mg/kg にてeritoranを受容したグループに関しては、０−１０日目に処理したグループが平均７．８％の体重低下を示したのに比べて、０−３日目に処理したグループでは正味２．２％低下し、３−６日目に処理したグループでは正味７．３％低下し、６−９日目に処理したグループでは正味８．９％低下した。確認された体重変化の差異が有意であるか否かを判定するために、平均の曲線下面積（AUC）データについて一元配置分散分析を実施した。当該分析の結果を図１８に示す。放射線を受けた３つのグループは放射線を受けていない対照とは著しく異なり、プラシーボグループ（P<0.001）、０日目から１０日目までeritoranで処理したグループ（P=0.014）、及び６日目から９日目までeritoranで処理したグループ（P=0.025）であった。０日目から３日目まで又は３日目から６日目までeritoranで処理したグループは、放射処理しない対照とさほど差異はなかった。しかしながら、０日目から３日目までeritoranで処理したグループは、プラシーボ対照よりも体重低下は著しく少なかった（P=0.030）。実験中に死亡した全ての動物からのデータを除去して、体重データを再分析した。この分析結果は図１９及び２０に示している。この実験では０日目から９日目までeritoranで処理したグループが放射処理していない対照とさほど差異がなかったことを除いて、一元分散分析の結果とほどんど差異はなかった。
【０１１７】
５．３  舌組織
各舌を、通常のヘマトキシリン及びエオシン病理組織に関して処理し、盲検法によってスライドを検査した。合計５７サンプルを評価した。このうち、９個は放射処理しない対照グループのものであり、９個はプラシーボグループのものであり、１１個は０日目から９日目まで10mg/kgにてeritoranで処理したグループのものであり、１１個は０日目から３日目まで10mg/kgにてeritoranで処理したグループのものであり、９個は３日目から６日目まで10mg/kgにてeritoranで処理したグループのものであり、そして９個は６日目から９日目まで10mg/kgにてeritoranで処理したグループのものであった。各サンプルからの３つの部分を以下のパラメータについて評価した：上皮スコア、結合組織スコア、炎症スコア、高倍率領域（hpf）１０箇所当たりの有糸分裂、潰瘍パーセント、hpf１０箇所当たりの炎症細胞の数（好中球、リンパ球、及びモノサイト／マクロファージのパーセント）、hpf１０箇所当たりの小血管、中血管及び大血管の数、並びにhpf１０箇所当たりのマスト細胞の数。
【０１１８】
５．３．１  上皮スコア
セクション４．７．１で概説したように、上皮組織を、０〜３の４点についてスコア付けした。これらのスコアは図２１に示している。放射処理しない動物は全て、スコア０であった。プラシーボ対照グループの平均スコアは、０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループと同様に、１．１であった。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．４５であった。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．８９であった。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．７５であった。
【０１１９】
５．３．２  結合組織スコア
セクション４．７．１で概説したように、結合組織を、０〜３の４点についてスコア付けした。これらのスコアは図２２に示している。放射処理しない動物は全て、スコア０であった。プラシーボ対照グループの平均スコアは０．４であり、０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．６であった。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．４であった。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．６であった。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．８であった。
【０１２０】
５．３．３  炎症スコア
セクション４．７．１で概説したように、炎症を、０〜３の４点についてスコア付けした。これらのスコアは図２３に示している。放射処理しない動物は全て、スコア０であった。プラシーボ対照グループの平均スコアは０．４であり、０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．５であった。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．４であった。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．６であった。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均スコアは０．８であった。
【０１２１】
５．３．４  有糸分裂の数
有糸分裂の数を、高倍率領域（hpf）１０箇所当たりについて数えた。これらのデータは図２４に示している。放射処理しない動物では、hpf１０箇所当たりの有糸分裂数は平均１．２であった。プラシーボ対照グループでは、hpf１０箇所当たりの有糸分裂数は平均３．９であった。０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループでは、hpf１０箇所当たりの有糸分裂数は平均２．３であった。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループでは、hpf１０箇所当たりの有糸分裂数は平均１．５であった。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループでは、hpf１０箇所当たりの有糸分裂数は平均１．６であった。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループでは、hpf１０箇所当たりの有糸分裂数は平均１．５であった。
【０１２２】
５．３．５  潰瘍パーセント
各グループについて、潰瘍パーセントを評価した。これらのデータは図２５に示している。放射処理していない動物に潰瘍はなかった。プラシーボ対照グループは、平均１３．３％の潰瘍を有した。０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、平均１３．２％の潰瘍を有した。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、平均２．７％の潰瘍を有した。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、平均１６．７％の潰瘍を有した。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、平均１０．０％の潰瘍を有した。
【０１２３】
５．３．６  炎症細胞浸潤物
hpf１０箇所当たりの炎症細胞の合計数を数えることによって各サンプルに存在する炎症細胞浸潤物を評価し、そして浸潤物中の好中球、リンパ球、又はモノサイト／マクロファージといった細胞の割合を評価することによって細胞タイプについて評価した。炎症細胞数のデータは図２６に、好中球パーセントは図２７に、リンパ球パーセントは図２８に、そしてモノサイト／マクロファージパーセントは図２９に示している。放射処理しない動物は、１０hpf当たり平均９．３の細胞を有し、平均組成はリンパ球９８．９％及びモノサイト／マクロファージ１．１％であり、好中球は見られなかった。プラシーボ対照グループは、１０hpf当たり平均４４．９の細胞を有し、平均組成は好中球１０．６％、リンパ球８６．７％及びモノサイト／マクロファージ２．８％であった。０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり平均４３．６の細胞を有し、平均組成は好中球１３．６％、リンパ球８２．７％及びモノサイト／マクロファージ４．５％であった。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり平均３３．３の細胞を有し、平均組成は好中球６．４％、リンパ球９３．２％及びモノサイト／マクロファージ０．５％であった。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり平均３１．５の細胞を有し、平均組成は好中球７．２％、リンパ球９１．１％及びモノサイト／マクロファージ１．１５％であった。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり平均５２．１の細胞を有し、平均組成は好中球８％、リンパ球９１．０％及びモノサイト／マクロファージ１．０％であった。
【０１２４】
５．３．７  血管
１０hpf当たりの血管の合計数を数えることによって各サンプル中に存在する血管の数を評価し、当該サンプル中の小血管、中血管及び大血管の数を数えることによって血管サイズを評価した。これらのデータは図３０〜３２に示している。放射処理していない動物は１０hpf当たり平均５．６の血管を有し、その平均組成は小血管６３．３％、中血管２０．７％及び大血管１６．０％であった。プラシーボ対照グループは１０hpf当たり平均８．８の血管を有し、その平均組成は小血管６３．９％、中血管２２．３％及び大血管１３．９％であった。０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり平均９．４の血管を有し、平均組成は小血管７４．６％、中血管１６．１％及び大血管９．３％であった。０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり平均９．４の血管を有し、平均組成は小血管７４．６％、中血管１６．１％及び大血管９．３％であった。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり平均８．２の血管を有し、平均組成は小血管７２．５％、中血管１４．９％及び大血管１２．６％であった。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり平均７．０の血管を有し、平均組成は小血管６７．９％、中血管２０．５％及び大血管１１．６％であった。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり平均７．５の血管を有し、平均組成は小血管７２．１％、中血管１７．３％及び大血管１０．６％であった。
【０１２５】
５．３．８  マスト細胞
１０hpf当たりの細胞数を数えることによって各サンプル中に存在するマスト細胞の数を決定した。これらのデータは図３３に示している。放射処理していない動物は１０hpf当たり２３．７のマスト細胞を有した。プラシーボ対照グループは１０hpf当たり２６のマスト細胞を有した。０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり１８．４のマスト細胞を有した。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり２４．４のマスト細胞を有した。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり２４．２のマスト細胞を有した。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループは、１０hpf当たり２４．５のマスト細胞を有した。
【０１２６】
５．４  血清サイトカイン濃度
TNF-α、IL-6及びSAAの血清濃度は、市販のELISAキットを用いて測定した。
【０１２７】
５．４．１  血清TNF-α濃度
放射処理しない動物の血清TNF-α濃度は43.0pg/mLであった。プラシーボ対照グループの平均血清TNF-α濃度は63.8pg/mLであった。０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均TNF-α濃度は62.0pg/mLであった。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均TNF-α濃度は20.3pg/mLであった。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均TNF-α濃度は40.2pg/mLであった。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均TNF-α濃度は119.1pg/mLであった。これらのデータは図３４に示している。
【０１２８】
５．４．２  血清IL-6濃度
放射処理しない動物の血清IL-6濃度は48.7pg/mLであった。プラシーボ対照グループの平均血清IL-6濃度は154.2pg/mLであった。０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均IL-6濃度は85.6pg/mLであった。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均IL-6濃度は19.7pg/mLであった。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均IL-6濃度は50.4pg/mLであった。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均IL-6濃度は119.3pg/mLであった。これらのデータは図３５に示している。
【０１２９】
５．４．３  血清SAA濃度
放射処理しない動物の血清SAA濃度は597μg/mLであった。プラシーボ対照グループの平均血清SAA濃度は427μg/mLであった。０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均SAA濃度は344μg/mLであった。０日目から３日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均SAA濃度は279μg/mLであった。３日目から６日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均SAA濃度は475μg/mLであった。６日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループの平均SAA濃度は652μg/mLであった。これらのデータは図３６に示している。
【０１３０】
６．結論
１．本実験からの死亡率や体重減少データにおいて、eritoranによる毒性の証拠はなかった。先の実験と同様に、死亡率は高かったが、グループ間に均一に分布していた。
【０１３１】
２．０〜３日目にeritoranで処理したマウスは、プラシーボ処理した対照グループと比較して、体重低下において著しい改善を示した。
【０１３２】
３．プラシーボ処理した対照マウスにおいて確認された口腔粘膜炎のレベルは、予測したよりも低く、口腔粘膜炎のレベルへのeritoranの影響を検査するのは困難であった。
【０１３３】
４．プラシーボ対照グループでみられた比較的低いレベルの粘膜炎に恐らく起因するであろうが、０日目から９日目まで10mg/kgのeritoranで処理したグループに関しては、当該治療プロトコルの有効性が確認された先の実験とは対照的に、ほどんど効果はみられなかった。
【０１３４】
５．放射線を受けたグループの中では、０〜３日目にeritoranで処理したグループが最も低い上皮スコア、結合組織スコア、及び潰瘍パーセントを呈し、他のグループよりもダメージを被らないことが示された。このグループはまた、最も低い炎症スコアを呈し、炎症細胞及び有糸分裂の数においても２番目に低かった。
【０１３５】
６．放射線を受けたグループの中では、０〜３日目にeritoranで処理したグループが最も低いTNF-α、IL-6及びSAAの血清濃度を呈し、炎症反応を軽減させる点でこの処方計画が有効であることが示された。
【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】鼻放射線処理後のC3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスの体重変化パーセントを示すグラフ。動物は毎日重量測定し、０日目からの体重変化パーセントを算出し、各々の日についてグループ平均及び当該平均の標準誤差（SEM）を計算した。
【図２】鼻放射線処理したC3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスが呈した体重変化パーセントについて計算された曲線下面積（AUC）を示すグラフ。この計算は、台形法則変換式を用いて行った。グループ平均を計算し、各グループについて、SEMを表す誤差バーを用いて表した。一元配置分散分析試験によって、グループ間に統計学的に有意な差異のあることが示された（P=0.008）。
【図３】鼻放射処理したC3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスの、表記時点においてELISA分析により測定された平均血清IL-6濃度を示すグラフ
【図４】鼻放射処理したC3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスの、表記時点においてELISA分析により測定された平均血清TNF-α濃度を示すグラフ
【図５】鼻放射処理したC3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスの上皮病理組織スコアのグラフ。上皮細胞層の損傷に関して各サンプルを０〜３のスケールにてスコア付けした。
【図６】鼻放射処理したC3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスの結合組織病理組織スコアのグラフ。結合組織の損傷に関して各サンプルを０〜３のスケールにてスコア付けした。
【図７】鼻放射処理したC3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスの、表記時点において測定した炎症細胞の平均数を示すグラフ
【図８】鼻放射処理したC3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスの、表記時点において測定した上皮細胞における平均有糸分裂数を示すグラフ
【図９】鼻放射処理したC3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスの、表記時点において測定した、高倍率領域１０箇所当たりの平均血管数を示すグラフ
【図１０】C3H/HeOuJ及びC3H/HeJマウスの、表記時点において測定した、全血管におけるパーセンテージとしての高倍率領域１０箇所当たりの大血管の平均数を示すグラフ。値は、当該領域で確認された血管の合計数におけるパーセンテージとして表示。
【図１１】鼻放射線処理の後、表記の量のeritoranで処理したC3H/HeOuJマウスの体重変化パーセントを示すグラフ。当該動物は毎日体重測定し、０日目からの体重変化パーセントを計算し、各々の日についてグループ平均並びに当該平均の標準誤差（SEM）を算出した。
【図１２】図１１記載の鼻放射線処理されたC3H/HeOuJマウスが呈した体重変化パーセントについて計算した曲線下面積（AUC）を示すグラフ。この計算は、台形法則変換式を用いて行った。グループ平均を計算し、各グループについて、SEMを表す誤差バーを用いて表した。一元配置分散分析試験によって、グループ間に統計学的に有意な差異はないことが示された（P=0.261）。
【図１３】表記の時点における、表記の量のeritoranで処理した鼻放射線処理されたC3H/HeOuJマウスの舌の背面の上皮細胞層の最小数を示すグラフ
【図１４】表記の時点における、表記の量のeritoranで処理した鼻放射線処理されたC3H/HeOuJマウスの舌の背面の上皮細胞層の最大数を示すグラフ
【図１５】表記の時点における、表記の量のeritoranで処理した鼻放射線処理されたC3H/HeOuJマウスの舌の前面の上皮細胞層の最小数を示すグラフ
【図１６】表記の時点における、表記の量のeritoranで処理した鼻放射線処理されたC3H/HeOuJマウスの舌の前面の上皮細胞層の最大数を示すグラフ
【図１７】表記の処方計画に従ってeritoran（E5564）で処理した動物並びに放射線処理していない対照及びプラシーボ処理した対照の体重変化パーセントを示すグラフ。当該動物は毎日体重測定し、０日目からの体重変化パーセントを計算し、各々の日についてグループ平均並びに当該平均の標準誤差（SEM）を算出した。
【図１８】実験中に各動物が呈した体重変化パーセントについて計算した曲線下面積（AUC）を示すグラフ。この計算は、台形法則変換式を用いて行った。グループ平均を計算し、各グループについて、SEMを表す誤差バーを用いて表した。単一アスタリスクは放射線を受けたグループと放射処理していない対照との間に統計学的に有意な差異のあることを表し、２つのアスタリスクは０〜３日目にeritoranで処理したグループとプラシーボ対照（未放射）との間に統計学的に有意な差異のあることを表す（P=0.030）。
【図１９】図記載の処方計画に従って処理した動物の体重変化パーセントを示すグラフ。実験の終わりまで生存した動物についてのみデータを示している。当該動物は毎日体重測定し、０日目からの体重変化パーセントを計算し、各々の日についてグループ平均並びに当該平均の標準誤差（SEM）を算出した。
【図２０】グラフ記載の処方計画に従って処理した各動物が呈した体重変化パーセントについて計算した曲線下面積（AUC）を示すグラフ。この計算は、台形法則変換式を用いて行った。グループ平均を計算し、各グループについて、SEMを表す誤差バーを用いて表した。単一アスタリスクは放射線を受けたグループと放射処理していない対照との間に統計学的に有意な差異のあることを表し、２つのアスタリスクは０〜３日目にeritoranで処理したグループとプラシーボ対照（未放射）との間に統計学的に有意な差異のあることを表す（P=0.041）。
【図２１】表記の各グループに関する、平均上皮スコア及び平均標準誤差を示すグラフ
【図２２】表記の各グループに関する、平均結合組織スコア及び平均標準誤差を示すグラフ
【図２３】表記の各グループに関する、平均炎症スコア及び平均標準誤差を示すグラフ
【図２４】表記の各グループに関する、10hpf当たりの平均有糸分裂数及び当該平均の標準誤差を示すグラフ
【図２５】表記の各グループに関する、平均潰瘍パーセント及び当該平均の標準誤差を示すグラフ
【図２６】表記の各グループに関する、10hpf当たりの平均炎症細胞数及び当該平均の標準誤差を示すグラフ
【図２７】各サンプルについて浸潤している炎症細胞（好中球）のパーセンテージ及び表記の各グループに関する平均及び標準偏差を示すグラフ
【図２８】各サンプルについて浸潤している炎症細胞（リンパ球）のパーセンテージ及び表記の各グループに関する平均及び標準偏差を示すグラフ
【図２９】各サンプルについて浸潤している炎症細胞（モノサイト又はマクロファージ）のパーセンテージ及び表記の各グループに関する平均及び標準偏差を示すグラフ
【図３０】表記の各グループに関する、10hpf当たりの小血管数、平均、及び当該平均の標準誤差を示すグラフ
【図３１】表記の各グループに関する、10hpf当たりの中血管数、平均、及び当該平均の標準誤差を示すグラフ
【図３２】表記の各グループに関する、10hpf当たりの大血管数、平均、及び当該平均の標準誤差を示すグラフ
【図３３】表記の各グループに関する、10hpf当たりのマスト細胞数、平均、及び当該平均の標準誤差を示すグラフ
【図３４】表記の各グループに関する、ELISAアッセイを用いて測定した血清TNF-α濃度、平均及び当該平均の標準誤差を示すグラフ
【図３５】表記の各グループに関する、ELISAアッセイを用いて測定した血清IL-6濃度、平均及び当該平均の標準誤差を示すグラフ
【図３６】表記の各グループに関する、ELISAアッセイを用いて測定した血清SAA濃度、平均及び当該平均の標準誤差を示すグラフ
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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