(57)【要約】一種の人体リソチーム(Human Lysozyme )の新用途、特にこの人体リソチームをニキビ治療薬物に応用する新用途に関るもので、その応用によって黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ブロビオン酸桿菌、ダニ及び耐薬性細菌によるニキビを治療する。この薬は噴着剤、滴剤または膏薬等に造られる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
人体リソチームが黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、プロピオン酸桿菌、ダニ及び耐薬性細菌によるニキビを治療することを特徴とする、ニキビ治療薬品における人体リソチームの使用。
【請求項２】
請求項1に記載のニキビ治療薬品における人体リソチームの使用であって、該人体リソチームは遺伝子組換えによるものであって、その結構のアミノ基に（グルタミン酸―アミノブロビオン酸）2或いは（グルタミン酸―アミノブロビオン酸）3が修飾され、このような遺伝子工学或いは化学合成による突然変異型によって人体リソチームの組換えを完成することを特徴とする、ニキビ治療薬品における人体リソチームの使用。
【請求項３】
請求項1に記載のニキビ治療薬品における人体リソチームの使用であって、薬物の中に活性300U〜300万U/mlの人体リソチームを含有することを特徴とする、ニキビ治療薬品における人体リソチームの使用。
【請求項４】
請求項1に記載のニキビ治療薬品における人体リソチームの使用であって、該薬品は噴着剤、滴剤、膏薬或は乳剤であることを特徴とする、ニキビ治療薬品における人体リソチームの使用。
【請求項５】
請求項1乃至4に記載のニキビ治療薬品における人体リソチームの使用であって、該薬品に殺カイゼン虫薬SM-650の成分があることを特徴とする、ニキビ治療薬品における人体リソチームの使用。
【請求項６】
請求項1乃至4に記載のニキビ治療薬品における人体リソチームの使用であって、該薬品は噴着剤、滴剤で、成分は遺伝子組換え人体リソチーム300U〜300万U/ml、燐酸塩緩衝液10〜20Mm(PH6.5〜7.5)80％、5〜25％のプロピレングリコール、万分の五のトウイーン80等から成立つことを特徴とする、ニキビ治療薬品における人体リソチームの使用。
【請求項７】
請求項5に記載のニキビ治療薬品における人体リソチームの使用であって、該薬品は噴着剤、滴剤で、成分は遺伝子組換え人体リソチーム300U〜300万U/ml、燐酸塩緩衝液10〜20Mm(PH6.5〜7.5)80％、20％のプロピレングリコール、6％2−pyrrolidone、5-ヒドロキシ酸ナトリウム及び0.9％の水溶性アゾン、万分の三のトウイーン80、殺カイゼン虫薬SM-650（純度99％以上ph6〜8（商品）1％等から成立つことを特徴とする、ニキビ治療薬品における人体リソチームの使用。
【請求項８】
請求項5に記載のニキビ治療薬品における人体リソチームの使用であって、該薬品は噴着剤、滴剤で、成分は遺伝子組換え人体リソチーム300U〜300万U/ml、燐酸塩緩衝液10〜20Mm(PH6.5〜7.5)80％、20％のプロピレングリコール、CBP樹脂1％、エッセンス0.3%、殺カイゼン虫薬SM-650（純度99％以上ph6〜8（商品）1％等から成立つことを特徴とする、ニキビ治療薬品における人体リソチームの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は人体リソチームの新用途に関り、特に人体リソチームをニキビ治療薬物に応用する新用途に関る。
【背景技術】
【０００２】
抗生素は数多くの医学奇跡を創造したが、おかげで、肺炎、脳膜炎、産床熱、敗血症及び結核病等は殆ど姿が消えたが、しかし、21世紀の今日、耐薬性細菌の変異も驚くべきである。耐ペニシリンである肺炎連鎖球菌に対し、以前、ペニシリン、エリスロマイシン、スルファニルアミド等は効目があったが、今は全然効かない。肺炎クレブシェラ・ニューモニエ菌がzinacef及びfortum等16種類の高級抗生素への耐薬性は51.85％〜100％に達する。Meticillin耐性の黄色ブドウ球菌(MRSA)にとって、バンコマイシン(Vancomycin)を使うほか、どうすることも出来ない。これら細菌耐薬性の強さから見れば、新たな抗生素が開発されるにつれて、その耐薬性を持つ細菌も出てくる。一般的に言えば、新種の抗生素を開発するのは10年間くらいかかるが、その耐薬性細菌の変異過程は2年くらいで完成する。速度として抗生素は細菌に敵わない。それで、一種異なる耐薬性細菌にも効目がある“スーパー抗生素”を開発して、臨床に応用するのが燃眉の急になった。
【発明の開示】
【０００３】
本発明の目的は一種の人体リソチームを開発し、その応用によって黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ブロビオン酸桿菌、ヒゼンダニ及び耐薬性細菌によるニキビを治療することである。
本発明は人体リソチームの応用によって、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、ブロビオン酸桿菌、ヒゼンダニ及び耐薬性細菌によるニキビを治療することに関る。
この人体リソチームは遺伝子工学による人体リソチームの組換えに基づき、そのアミノ基に（グルタミン酸―アミノブロビオン酸）2或いは（グルタミン酸―アミノブロビオン酸）3がつながるようにする。このような遺伝子工学或いは化学合成による突然変異型によって人体リソチームの組換えを完成する。
【０００４】
この薬には人体リソチーム300U〜300万U/ml含有し、薬は噴着剤、滴剤、膏薬または乳剤等に造られる。その薬に殺カイゼン虫薬SM-650を加えても構わない。
この発明の実質をよく理解できるため、以下は遺伝子組換えによる人体リソチームの薬理試験及び結果を用いて製薬分野における新用途について説明する。
【０００５】
この遺伝子組換え人体リソチームの200ml培地を例に挙げ、必要とするものは燐酸6ml,硫酸マグ3g,硫酸カリ4g,苛性カリ1g、硫酸カリ1.5 g、それに蒸留水を加え、200mlにする。高圧滅菌を施してからグリセリン管の種を接種し、回転装置250rpm,温度20〜35℃に36〜48時間培養する。先に種缶の培養、最後に生産缶の培養を行う。そして生成した培養液の純化を行い、遺伝子組換え人体リソチームの濃縮液の蛋白質、活性を測定して保存する。純度95％の遺伝子組換え人体リソチーム濃縮液を水に溶解して、30000U/mlにする。それから燐酸塩緩衝液Mm(Ph7.0),25％のグリセリン、トウイーン（tween）80, 殺カイゼン虫薬SM-650純度99％以上、PH：6〜8(商品)の乾燥粉剤を水に溶かし、1％溶液にしておく。
【０００６】
一、遺伝子組換え人体リソチーム（HLZ）の体外抗菌作用についての評価
薬品及び試薬
１．遺伝子組換え人体リソチーム濃縮液（Human Lysozyme HLZ）の活性単位：30000単位/ml、製造元:大連奇龍生物技術研究所。
２．対照リソチーム（contral lysozyme CLZ）白色粉、活性単位：50000単位/mg,製造元：アメリカSIGMA社、ロット番号：L6876。
３．clarithromycin：力価948μ/mg,中国薬品生物製品測定所標準品
ロット番号：
４．roxithromycin：力価878μ/mg、中国薬品生物製品測定所標準品
ロット番号：
５．注射用アモキシシリン（amoxicillin）製造元：ハルピン製薬工場
ロット番号：010504
６．アガロース（BIOWEST AGAROSE）
７．トリメチロール・アミノメタン（Tris）,製造元：成都化学試験工場、ロット番号：010211
【０００７】
試験細菌
用いた細菌は2002.4〜2003.9までに四川、北京地区で収集した臨床分離細菌で、本試験所ではAPI方法によって改め鑑定してから試験に用いた。
品質制御細菌：黄色ブドウ球菌ATCC25923
大腸菌ATCC25922
緑濃菌ATCC27853
【０００８】
培地：
１．Tris-HCI緩衝液：0.1M Tris 100ml,0.1M HCI 70ml,High water 800ml,PHを測定し、HCI溶液を用いてPHを7.2にする。High Waterを加え1000mlにする。
２．Tris-HCI寒天培地：Tris-HCIの緩衝液にアガロースを加え、116℃加熱し、滅菌後使用。
３．M-H培地：中国薬品生物製品測定所製品、M-H肉湯培地：25g計り1000mlの蒸留水を加え、加熱溶解させ、分け入れ、116℃で20分間高圧滅菌を行う。M-H固体培地：36g計り1000mlの蒸留水を加え、116℃で20分間高圧滅菌を行う。本品はグラム陽性、陰性好気性細菌の薬品過敏試験に用いる。
４．血培地：M-H培地に5−10％の脱繊維兎血を加えて作ったもので、大腸球菌、連鎖球菌の薬品過敏試験に用いる。
【０００９】
試験方法
寒天二倍希釈方法を用い、試験薬物が試験細菌を抑制する最低の濃度（MIC）を測定すること。先に試験薬物を滅菌した蒸留水で溶解、適当に希釈して、それからその1ml薬液に9mlの溶解したTris-HCIアガロース固体培地を加え、均一に混合。二倍に希釈する。薬液を盛る皿を準備して、それぞれの皿の薬物濃度が4,2,1,0.5,0.25、0.125,0.06,0.03・・・・・0.0001mg/mlなるようにする。次に、多点接種計器（DenleyA400,England）を用いて105CFU/mlまで希釈した試験細菌をそれぞれの皿の表面に接種し、37℃の下で8−10時間培養する。それから6ml溶解したM-H培地(50℃)を用いてそれぞれの皿表面を覆い、37℃の下で10時間培養してから取り出し、結果を観察する。これら細菌がない皿の薬物最低濃度をこの細菌を抑制する最低細菌抑制濃度とする(MIC)。
試験結果（1）人体リソチームの臨床分離細菌にとっての体外抗菌活性は表1に示す通りである。（2）、人体リソチームが379個の臨床分離細菌に対する作用MIC50,MIC90は表2に示す通りである。
【００１０】
以上の試験結果から見れば、人体リソチームは体外でも一定の抗菌効果があり、耐薬性細菌にも優れた抗菌効果がある。人体リソチームは一種微小蛋白質で,人体の涙、痰、鼻汁、白細胞及び血清の中にあって、多種のグラム陽性細菌及び少数のグラム陰性細菌を殺虫する効果がある。遺伝子組換え人体リソチーム（Human Lysozyme ）はペプチドグリカン結構のN-アセトグルコース・アミンとN-アセト細胞壁酸のβ−1,4グルコシドチェーンを切断し、ペプチドグリカン結構を破壊して、細菌を殺す。
【００１１】
表1  人体リソチーム、鶏リソチーム、clarithromycin，roxithromycinの体外抗菌活性
2008501733.tif 000002
2008501733.tif 000003
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注：HLZは人体リソチーム、 CLZ は対照リソチーム（鶏リソチーム）、CLA はclarithromycin，ROXは roxithromycin のことである。
【００１２】
二、遺伝子組換え人体リソチーム（HLZ）に殺カイゼン虫薬SM-650を加える効果についての評価
１．遺伝子組換え人体リソチーム（HLZ）濃縮液活性単位：300単位/mlの試験
薬品及び試薬
1, 遺伝子組換え人体リソチーム（HLZ）濃縮液活性単位：300単位/ml,製造元：大連奇龍生物技術研究所。
2、殺カイゼン虫薬SM-650は白色の粉で、純度99％以上、PH：6〜8、
製造元：北京耐特生物化学技術研究所
試験に用いるダニ
試験に用いるダニの標本は第四軍医大学臨床外来診のニキビ患者より提供。
試験方法
体外ダニ殺虫の活性測定：試験過程の写真を撮る、人体リソチーム（HLZ）に殺カイゼン虫薬SM-650を加え、最低の有効濃度を測定する。ダニ標本をガラスに分布し、その上に人体リソチーム（HLZ）300単位/mlと殺カイゼン虫薬SM-6501％／MIの滴を垂らす。それらの効果を比較して、最低有効濃度を決める。
【００１３】
試験の結果は表3に示す通りで、人体リソチーム（HLZ）に殺カイゼン虫薬SM-650を加えるとダニ退治の効果がるのを証明する。
表3
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【００１４】
2、遺伝子組換え人体リソチーム濃縮液活性単位：3000単位/mlの試験
1, 遺伝子組換え人体リソチーム濃縮液（Human Lysozyme HLZ）活性単位：3000単位/ml,製造元：大連奇龍生物技術研究所。
2、殺カイゼン虫薬SM-650は白色の粉で、純度99％以上、PH：6〜8、
製造元：北京耐特生物化学技術研究所。
試験に用いるダニ
試験に用いるダニの標本は第四軍医大学臨床外来診のニキビ患者より提供。
試験方法
体外殺ダニの活性測定：試験過程の写真を撮る、人体リソチーム（HLZ）に殺カイゼン虫薬SM-650を加え、最低の有効濃度を測定する。ダニ標本をガラスに分布し、その上に人体リソチーム（HLZ）3000単位/mlと殺カイゼン虫薬SM-6501％／MIの滴を垂らす。その半数ダニ退治の濃度（MBC）を決める。
【００１５】
試験の結果は表4に示す通りで、人体リソチーム（HLZ）に殺カイゼ)ン虫薬SM-650を加えるとダニ退治の効果がるのを証明する。
表4
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【００１６】
3, 遺伝子組換え人体リソチーム濃縮液活性単位：30000単位/mlの試験
1, 遺伝子組換え人体リソチーム濃縮液（Human Lysozyme HLZ）活性単位：30000単位/ml,製造元：大連奇龍生物技術研究所。
2、殺カイゼン虫薬SM-650は白色の粉で、純度99％以上、PH：6〜8、
製造元：北京耐特生物化学技術研究所。
試験に用いるダニ
試験に用いるダニの標本は第四軍医大学臨床外来診のニキビ患者より提供。
体外ダニ殺虫の活性測定：試験過程の写真を撮る、人体リソチーム（HLZ）に殺カイゼン虫薬SM-650を加え、最低の有効濃度を測定する。ダニ標本をガラスに分布し、その上に人体リソチーム（HLZ）30000単位/mlと殺カイゼン虫薬SM-6501％／MIの滴を垂らす。その全数ダニ退治の濃度を決める。
【００１７】
試験の結果は表5に示す通りで、人体リソチーム（HLZ）に殺カイゼ)ン虫薬SM-650を加えるとダニ退治の効果がるのを証明する。
表5
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【００１８】
試験過程の写真を撮り、人体リソチーム（HLZ）に殺カイゼン虫薬SM-650
を加え、5人分のダニ標本の体外退治を行う。その結果により、人体リソチーム（HLZ）に殺カイゼン虫薬SM-650を加えることはダニ退治に効果があるのが分かる。殺カイゼン虫薬SM-650の最低濃度MICrengeは0.2〜2％で、人体リソチーム(HLZ)の活性単位は300〜30000単位/mlである。大連奇龍生物技術研究所が開発した遺伝子組換え人体リソチーム(Human Lysozyme)は、その他のリソチームと同じ功能があり、ペプチドグリカン結構のN-アセトグルコース・アミンとN-アセト細胞壁酸のβ−1,4グルコシドチェーンを切断し、ペプチドグリカン結構を破壊して、細菌を殺す。故に、殺カイゼン虫薬SM-650は強いダニ退治の効果があることが分かる。
【００１９】
以上から見れば、本発明は以下の如く利点がある。
（1）、本発明遺伝子組換え人体リソチームの新たな治療用途を開発し、新たな応用分野を開拓した。
（2）、本発明遺伝子組換え人体リソチームは安全で毒副作用が無し、薬用の前景は有望である。
（3）、本発明遺伝子組換え人体リソチームの資源が豊富で、製造工芸が簡単で、なお、噴着剤、滴剤、牛乳剤、乳剤、膏薬等に造られる。
【００２０】
具体的な実施方式
以下は実施例に照らして本発明を説明する。
【実施例１】
【００２１】
遺伝子組換え人体リソチームの高圧滅菌を施してからグリセリン管の種を接種し、回転装置250rpm,培養温度20℃、恒温の培地で36時間培養する。先に種缶の培養、最後に生産缶の培養を行う。そして生成した培養液の純化を行う。純化処理した蛋白濃縮液を冷凍、乾燥させ、その蛋白質量、純度及びリソチームの活性を測定してから保存しておく。次は95％純度の遺伝子組換え人体リソチームを用いて300U 〜300万U/ml溶液を作り、そして、燐酸塩緩衝液10〜20Mm(PH6.5〜7.5)80％、5〜25％のプロピレングリコール、万分の五のトウイーン80等を常温の下で均一に混合して（GMPの条件に符合する製薬工場で、プロセスに従って完成すること）、噴着剤または滴剤を作る。
【実施例２】
【００２２】
95％純度の遺伝子組換え人体リソチームを用いて300U 〜300万U/ml溶液を作り、そして、燐酸塩緩衝液10Mm(PH6.0)80％、20％のプロピレングリコール、6％2−pyrrolidone、5-ヒドロキシ酸ナトリウム及び0.9％の水溶性アゾン、万分の三のトウイーン80、殺カイゼン虫薬SM-650（純度99％以上ph6〜8（商品）1％等を常温の下で均一に混合して、噴着剤または滴剤を作る。
【実施例３】
【００２３】
95％純度の遺伝子組換え人体リソチームを用いて300U 〜300万U/ml/g溶液を作り、そして、燐酸塩緩衝液20Mm(PH7.0)85％、20％のプロピレングリコール、CBP樹脂1％、エッセンス0.3%、殺カイゼン虫薬SM-650（純度99％以上ph6〜8（商品）1％等を70℃の下で均一に混合し、遺伝子組換え人体リソチームは常温の元でその他の材料と均一に混合して、膏薬剤または乳剤を作る。
【国際調査報告】
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2008501733.tif 000012