(57)【要約】本発明は、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌を含む様々な癌を処置するために抗デスモコリン2（DSC2）抗体の細胞障害性が使用できるという発見に基づく。具体的には、本発明は、エフェクター機能を有するDSC2に対する抗体を提供する。さらに、本発明は、抗体のエフェクター機能を介してDSC2発現細胞を障害するための活性成分として抗DSC2抗体を含む方法および薬学的組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
エフェクター機能を示す、デスモコリン2（DSC2）に対する抗体。
【請求項２】
モノクローナル抗体である、請求項1記載の抗体。
【請求項３】
IgG1である、請求項1記載の抗体。
【請求項４】
エフェクター機能が、抗体依存性細胞障害性もしくは補体依存性細胞障害性のいずれかまたは両方である、請求項1記載の抗体。
【請求項５】
相補性決定領域（CDR）が、
群1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31) ;
群2: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、VH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34)、VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37) ;
群3: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、VH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46) ; ならびに
群4: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、VH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3としてAAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)
からなる群より選択され、CDR1、CDR2、およびCDR3が、フレームワークアミノ酸配列によって分離される、請求項1記載の抗体。
【請求項６】
請求項1記載の抗体または該抗体をコードするポリヌクレオチドを活性成分として含む、DSC2発現細胞を障害するための薬学的組成物。
【請求項７】
DSC2発現細胞が、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の細胞からなる群より選択される、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項８】
抗体がモノクローナル抗体である、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項９】
抗体がIgG1である、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
抗体のエフェクター機能が、抗体依存性細胞障害性もしくは補体依存性細胞障害性のいずれかまたは両方である、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
抗体のCDRが、
群1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31);
群2: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、VH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34); VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37);
群3: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、VH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46); ならびに
群4: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、VH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3としてAAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)
からなる群より選択され、CDR1、CDR2、およびCDR3が、フレームワークアミノ酸配列によって分離される、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
ポリヌクレオチドがベクターに含まれる、請求項6記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
以下の段階を含む、DSC2発現細胞を障害するための方法：
a)DSC2発現細胞を請求項1記載の抗体と接触させる段階；および
b)DSC2発現細胞に結合した抗体のエフェクター機能によって該細胞を障害する段階。
【請求項１４】
DSC2、その免疫学的活性断片、またはDSC2もしくはその免疫学的活性断片を発現するポリヌクレオチドを有効成分として含む、対象におけるDSC2発現細胞に対するエフェクター機能を有する抗体を誘導するための免疫原性組成物。
【請求項１５】
DSC2、その免疫学的活性断片、またはDSC2もしくはその免疫学的活性断片を発現する細胞もしくはポリヌクレオチドを対象に投与する段階を含む、対象におけるDSC2発現細胞に対するエフェクター機能を有する抗体の産生を誘導するための方法。
【請求項１６】
以下の群より選択されるアミノ酸配列の少なくとも一つを含むポリペプチド：
FSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、
YISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、
VHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、
KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、
YTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、
LQYDNLW (SEQ ID NO: 31)、
DYSMH (SEQ ID NO: 32)、
WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、
WLLFDY (SEQ ID NO: 34)、
KSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、
FASTRES (SEQ ID NO: 36)、
QQHYSTPL (SEQ ID NO: 37)、
GNYWS (SEQ ID NO: 39)、
EINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、
VPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、
GNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46)、
GYFWS (SEQ ID NO: 49)、
EINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、
GQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、
SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、
SNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、および
AAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
【請求項１７】
抗体である、請求項16記載のポリペプチド。
【請求項１８】
以下の群
群1-1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28);
群1-2: VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31);
群2-1: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、およびVH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34);
群2-2: VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37);
群3-1: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、およびVH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41);
群3-2: VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46);
群4-1: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、およびVH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51); ならびに
群4-2: VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3として AAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)
におけるVH鎖およびVL鎖のいずれかの相補性決定領域（CDR）として上記アミノ酸配列を含むポリペプチドであって、CDR1、CDR2、およびCDR3が、フレームワークアミノ酸配列によって分離される、請求項17記載のポリペプチド。
【請求項１９】
抗体が、SEQ ID NO: 20または22のマウスVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 21または23のマウスVLアミノ酸配列を含む、請求項17記載のポリペプチド。
【請求項２０】
抗体が、SEQ ID NO: 16または18のヒトVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 17または19のヒトVLアミノ酸配列を含む、請求項17記載のポリペプチド。
【請求項２１】
抗体がヒトIgG1のFc領域を更に含む、請求項17記載のポリペプチド。
【請求項２２】
請求項16記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項22記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２４】
請求項22記載のポリヌクレオチドまたは該ポリヌクレオチドを含むベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２５】
ポリペプチドを発現する細胞を培養する段階、および、細胞培養物からポリペプチドを収集する段階を含む、請求項16記載のポリペプチドを産生する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
DSC2は、肺癌、大腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌の細胞を含む様々な癌細胞において特異的に発現することが見出されている。本発明は、エフェクター機能を有するデスモコリン2（DSC2）に対する抗体に関し、かつ、抗DSC2抗体のエフェクター機能を介してDSC2発現細胞を障害するための方法および組成物における抗体の使用に関する。なお本出願は、2005年5月12日に提出された米国特許仮出願第60/680,609号の恩典を主張し、その内容はその全体が参照として本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
肺癌は、最も一般的な致死的ヒト腫瘍の一つである。非小細胞肺癌（NSCLC）は最も一般的な病型であり、肺腫瘍の80％近くを占める(American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2001, Am. Chem. Soc. Atlanta, 2001（非特許文献１))。大半のNSCLCは進行期前には診断されないため、近年の多様式治療法の進歩にも関わらず、全体的な10年生存率は10％程度の低さのままである(Fry et al., Cancer 86:1867-76, 1999（非特許文献２))。現在、白金を用いた化学療法はNSCLCの基礎的療法であると考えられている。しかしながら薬剤による治療効果は、進行したNSCLC患者の生存をある程度延ばすことができる程度に留まっている(Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group, Bmj 311:899-909, 1995（非特許文献３))。チロシンキナーゼ阻害剤の使用を含む多数の標的療法が研究されている。しかしながらこれまでに、望ましい結果が達成された患者の数は限られており、一部の患者においては、治療効果には重篤な副作用を伴った(Kris et al., Proc Am Soc Clin Oncol 21: 292a (A1166), 2002（非特許文献４))。
【０００３】
結腸直腸癌は先進国での癌による死亡の主な原因である。詳細には、米国では毎年130,000例を上回る結腸直腸癌の新たな症例が報告されている。結腸直腸癌は癌全体のうち約15％に相当する。これらのうち、約5％は先天的な遺伝的欠陥に直接関係する。治療法が最近進歩しているにもかかわらず、進行期の癌患者の予後は依然として悪い。腫瘍抑制遺伝子および/または癌遺伝子の変化が発癌に関与することが分子的な研究によって明らかになってきたが、その厳密な機序は依然として不明である。
【０００４】
膵臓癌は、全ての悪性癌の中で死亡率が最も高いものの一つであり、患者の5年生存率は4％である。毎年28,000人が膵臓癌と診断されており、その患者のほとんど全員がこの疾患のために死亡している(Greenlee RT et al., Cancer statistics, 2001. CA Cancer J Clin 51:15-36, 2001（非特許文献５))。この悪性疾患の予後が不良であることは、初期診断が難しいこと、および現行の治療法に対する応答が不良であることに起因する(Greenlee RT et al., Cancer statistics, 2001. CA Cancer J Clin 51: 15-36, 2001（非特許文献５); Klinkenbijl JH et al., Ann Surg 230: 776-82, and discussion 782-4, 1999（非特許文献６))。特に、現在、疾患の初期のおそらく治癒可能な段階で、信頼できるスクリーニングを行うことができる腫瘍マーカーは同定されていない。
【０００５】
前立腺癌（PRC）は、男性の最も一般的な悪性疾患のうちの一つであり、重大な世界的健康問題となっている。これは、米国における癌死の2番目に高い原因である(Greenlee RT et al., Cancer statistics, 2001 CA Cancer J Clin 51:15-36, 2001（非特許文献５))。PRCの罹患率は、洋食の普及および高齢者人口の増加により先進国において着実に増加しつつある。日本においても、西洋風生活様式の採用のため、この疾患で死亡する患者はますます多くなってきている(Kuroishi T, Epidemiology of prostate cancer. Klinika 25:43-8, 1995（非特許文献７))。現在、PRCの診断は、血清前立腺特異抗原（PSA）の量の増加に基づいている。早期診断は、根治的な手術の機会を提供する。通常、器官限局性のPRCを有する患者は治療を受け、それらの約70％は前立腺全摘出術により根治可能である(Roberts WW et al., Urology 57: 1033-7, 2001（非特許文献８); Roberts SG et al., Mayo Clin Proc 76: 576-81, 2001（非特許文献９))。PRCのアンドロゲン依存性初期増殖のために、疾患が進行または再発した患者の大部分は、アンドロゲン除去療法により処置される。これらの患者の大部分が、初期にはアンドロゲン除去療法に応答するが、疾患は、最終的にはアンドロゲン非依存性PRCへと進行し、この時点では腫瘍はもはやアンドロゲン除去療法に対して応答性でない。
【０００６】
PRCの治療における最も重大な臨床問題のうちの一つは、このアンドロゲン非依存性PRCが他のいかなる既知の療法に対しても非応答性であるということである。したがって、アンドロゲン非依存性増殖機構の解明およびPRCに対するアンドロゲン除去療法以外の新たな療法の確立が、PRCの管理のための緊急の課題である。
【０００７】
乳癌は遺伝的に不均一な疾患であり、女性で最も一般的な悪性疾患である。全世界で毎年、推定約800,000件の新たな症例が報告されている(Parkin DM, et al., CA Cancer J Clin 49:33-64, 1999（非特許文献１０))。本疾患の処置のための同時併用的な選択肢のうち第一のものは乳房切除術である。原発性腫瘍の外科的除去を行っても、診断時点では検出不可能な微小転移のため、局所または遠隔部位での再発が起こる可能性がある(Saphner T, et al., J Clin Oncol 14:2738-46, 1996（非特許文献１１))。これら残存細胞または前癌細胞を死滅させるため、手術後の合併療法として、通常は細胞障害性剤が投与される。
【０００８】
従来の化学療法剤による処置は経験に拠ることが多く、主として組織学的腫瘍パラメータに基づいており、具体的な機序の理解が欠如している。このため、標的指向性薬剤が乳癌に対する基礎的な治療となりつつある。タモキシフェンおよびアロマターゼ阻害剤はこの種の代表例2つであり、転移性乳癌を有する患者にアジュバントまたは化学予防薬として用いた場合、良好に反応することが証明されている(Fisher B et al. J Natl Cancer Inst 90: 1371-88, 1998（非特許文献１２); Cuzick J, Lancet 360:817-24, 2002（非特許文献１３))。しかしながら、エストロゲン受容体を発現している患者しかこれらの薬剤に対する感受性がないことが欠点である。さらに、これらの副作用に関して、長期のタモキシフェン処置は、アロマターゼを処方された患者に、子宮内膜癌、ならびに、閉経後女性における骨折の悪影響を引き起こす可能性がある(Coleman RE Oncology 18(5 Suppl 3):16-20, 2004（非特許文献１４))。副作用および薬剤耐性の出現のために、特徴づけられた作用機序に基づき、選択的で有用な薬剤の新たな分子標的を探索することが明らかに必要である。
【０００９】
胃癌は、世界中、特に極東における癌による主な死因の一つであり、全世界で年間約700,000例の新規症例が診断されている。処置に関しては、化学療法が十分でないために手術が主流である。初期段階の胃癌は、外科的切除によって治癒することができるが、進行胃癌の予後は依然として非常に不良である。
【００１０】
肝細胞癌（HCC）は世界中で最も一般的な癌の一つであり、その発生率は日本や米国で徐々に増大しつつある(Akriviadis EA et al., Br J Surg 85(10):1319-31, 1998（非特許文献１５))。診断における最近の医学の進歩は著しいものの、未だに多くのHCC患者が進行期で診断されており、このような患者が疾患から完全に治癒することは依然として困難である。さらに、肝硬変または慢性肝炎の患者でHCCのリスクが高いため、このような患者は、原腫瘍が完全に除去された後であっても複数の肝腫瘍または新規腫瘍を発症し得る。したがって、高度に有効な化学療法薬および予防戦略の開発は急務である。
【００１１】
発癌機序を解明するための研究により、抗腫瘍剤のための多くの候補標的分子が見出されてきた。例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）は、動物モデルにおいてRas依存性腫瘍の治療に有効である(Sun J, et al., Oncogene.;16:1467-73, 1998（非特許文献１６))。この薬剤は、転写後のファルネシル化に依存するRasに関連する増殖シグナル経路を阻害するために開発された。原癌遺伝子HER2/neuを拮抗するための、抗HER2モノクローナル抗体であるトラスツズマブと抗癌剤を併用投与するヒトでの臨床試験は、臨床反応の改善および乳癌患者の全生存率の改善に成功している。
【００１２】
チロシンキナーゼ阻害剤STI-571はbcr-ab1融合タンパク質を選択的に不活性化する阻害剤である。この薬剤は、bcr-ab1チロシンキナーゼの恒常的な活性化が白血球の形質転換において重要な役割を果たす慢性骨髄性白血病を治療するために開発された。このような薬剤は、特定の遺伝子産物の発癌活性を阻害するように設計されている(O'Dwyer ME & Druker BJ. Curr Opin Oncol.;12:594-7, 2000（非特許文献１７)）。現在、癌細胞において発現が促進される遺伝子産物は、通常、新規抗癌剤を開発するための潜在的標的となる。
【００１３】
別の癌治療戦略は、癌細胞に結合する抗体の使用である。以下は抗体による癌治療の代表的な機序である。
【００１４】
(I) ミサイル治療：
本アプローチにおいて、癌細胞に特異的に結合する抗体に薬剤を結合させ、次に薬剤を癌細胞に特異的に作用させる。本方法によって、薬剤は癌細胞に集中的に作用し、したがって、強い副作用を有する薬剤であっても、少ない副作用で使用することができる。薬剤に加えて、薬剤の前駆体、該前駆体を活性型に代謝する酵素などを抗体に結合させるアプローチも報告されている。
【００１５】
(II) 機能性分子を標的とする抗体の使用：
本アプローチは、例えば増殖因子受容体または増殖因子に結合する抗体を用いて、増殖因子と癌細胞との結合を阻害する。癌細胞の一部は、増殖因子の活性に応じて増殖する。例えば、上皮細胞増殖因子(EGF)または血管内皮増殖因子(VEGF)依存性の癌が知られている。このような癌においては、増殖因子と癌細胞の結合を阻害することで治療効果が期待できる。
【００１６】
(III) 抗体の細胞障害性：
癌細胞のある種の抗原に結合する抗体は、癌細胞に対して細胞障害性を発揮する可能性がある。これらの種類の抗体は、それ自身が直接抗腫瘍効果を有する。癌細胞に対して細胞障害性を示す抗体は、腫瘍に対して高い効果が期待される抗体薬剤として注目されている。
【００１７】
本発明の目的および特徴は、添付の図面および実施例と併せて本発明の以下の開示を読むことによってより完全に明らかになるであろう。しかし、以下の開示は好ましい態様であり、本発明または本発明の他の代替的な態様を制限するものではないことが理解されるべきである。
【００１８】
【非特許文献１】American Cancer Society, Cancer Facts and Figures 2001, Am. Chem. Soc. Atlanta, 2001
【非特許文献２】Fry et al., Cancer 86:1867-76, 1999
【非特許文献３】Non-small Cell Lung Cancer Collaborative Group, Bmj 311:899-909, 1995
【非特許文献４】Kris et al., Proc Am Soc Clin Oncol 21: 292a (A1166), 2002
【非特許文献５】Greenlee RT et al., Cancer statistics, 2001. CA Cancer J Clin 51:15-36, 2001
【非特許文献６】Klinkenbijl JH et al., Ann Surg 230: 776-82, and discussion 782-4, 1999
【非特許文献７】Kuroishi T, Epidemiology of prostate cancer. Klinika 25:43-8, 1995
【非特許文献８】Roberts WW et al., Urology 57: 1033-7, 2001
【非特許文献９】Roberts SG et al., Mayo Clin Proc 76: 576-81, 2001
【非特許文献１０】Parkin DM, et al., CA Cancer J Clin 49:33-64, 1999
【非特許文献１１】Saphner T, et al., J Clin Oncol 14:2738-46, 1996
【非特許文献１２】Fisher B et al. J Natl Cancer Inst 90: 1371-88, 1998
【非特許文献１３】Cuzick J, Lancet 360:817-24, 2002
【非特許文献１４】Coleman RE Oncology 18(5 Suppl 3):16-20, 2004
【非特許文献１５】Akriviadis EA et al., Br J Surg 85(10):1319-31, 1998
【非特許文献１６】Sun J, et al., Oncogene.;16:1467-73, 1998
【非特許文献１７】O'Dwyer ME & Druker BJ. Curr Opin Oncol.;12:594-7, 2000
【発明の開示】
【００１９】
発明の開示
定義
本明細書で用いる「1つの」、「ある」および「その」という用語は、特に明示する場合を除き、「少なくとも1つの」を意味する。
【００２０】
物質（例えば、ポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド等）に関して使用される「単離された」および「精製された」という用語は、その物質が、天然供給源に含まれているかもしれない少なくとも一つの物質を実質的に含まないことを示す。従って、単離された、または精製された抗体とは、そのタンパク質（抗体）が由来する細胞または組織供給源からの炭化水素、脂質、もしくはその他の混入タンパク質のような細胞材料を実質的に含まないか、または、化学合成された場合には、化学前駆物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない抗体を指す。「細胞材料を実質的に含まない」という用語には、ポリペプチドが、それが単離されたかまたは組換えにより作製された細胞の細胞成分から分離されているような、ポリペプチドの調製物が含まれる。従って、細胞材料を実質的に含まないポリペプチドには、（乾重量で）約30％、20％、10％、または5％未満の異種タンパク質（本明細書中、「混入タンパク質」とも呼ばれる）を有するポリペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチドが組み換えにより作製される場合、これは、好ましくは、培養培地を実質的に含まず、かつ、タンパク質調製物の容量の約20％、10％、または5％未満の培養培地を含むポリペプチドの調製物が含まれる。ポリペプチドが化学合成によって作製される場合、これは、好ましくは、化学前駆物質またはその他の化学物質を実質的に含まず、かつ、タンパク質調製物の容量の（乾重量で）約30％、20％、10％、5％未満のタンパク質の合成に関与した化学前駆物質またはその他の化学物質を含むポリペプチドの調製物が含まれる。特定のタンパク質調製物が、単離または精製されたポリペプチドを含有していることは、例えば、タンパク質調製物のドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびゲルのクーマシーブリリアントブルー染色等の後の、単一のバンドの出現によって示され得る。好ましい態様において、本発明の抗体は、単離されているか、または精製されている。
【００２１】
cDNA分子のような「単離された」または「精製された」核酸分子は、他の細胞材料を、もしくは、組み換え技術によって作製された場合には培養培地を実質的に含まない可能性があり、または、化学合成された場合には、化学前駆物質もしくはその他の化学物質を実質的に含まない可能性がある。好ましい態様において、本発明の抗体をコードする核酸分子は、単離されているか、または精製されている。
【００２２】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、抗体を含むアミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書において交換可能に使用される。それらの用語は、天然のアミノ酸ポリマーのみならず、一つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然のアミノ酸の人工的な化学的模倣体のような修飾された残基または天然には存在しない残基であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００２３】
「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および合成のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体およびアミノ酸模倣体を指す。天然のアミノ酸とは、遺伝暗号によってコードされるものおよび細胞内で翻訳後に修飾されたもの（例えば、ヒドロキシプロリン、γ-カルボキシグルタミン酸、およびO-ホスホセリン）である。「アミノ酸類似体」という語句は、天然のアミノ酸と同じ基本化学構造（水素に結合したα炭素、カルボキシ基、アミノ基、およびR基）を有するが、R基または骨格が修飾された化合物（例えば、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニン、スルホキシド、メチオニンメチルスルホニウム）を指す。「アミノ酸模倣体」という語句は、異なる構造を有するが、一般的なアミノ酸と類似した機能を有する化学化合物を指す。
【００２４】
アミノ酸は、本明細書において、IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commissionによって推奨された、一般的に公知の三文字記号または一文字記号によって言及されうる。
【００２５】
「遺伝子」、「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、特記されない限り交換可能に使用され、かつ、アミノ酸と同様に、一般的に認められている一文字コードによって言及される。
【００２６】
「抗原」という用語は、対応する抗体との結合能力を有しており、かつ抗原-抗体反応をインビボで誘導するタンパク質を指す。他方、「免疫原」という用語は、抗原のうち、抗体の産生をインビボで誘導する能力をさらに有しているタンパク質の群を指す。
【００２７】
「抗体」および「免疫グロブリン」は、同一の構造的特徴を有する糖タンパク質である。抗体は、特定の抗原に対する結合特異性を示しているが、免疫グロブリンには、抗体および、抗原特異性が定義されていないその他の抗体様分子の両方が含まれる。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで産生され、骨髄腫によって高レベルで産生される。
【００２８】
本明細書において、「抗体」という用語は、免疫グロブリンの任意のクラスまたはサブクラスに属する分子を指す。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依って、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てられ得る。免疫グロブリンには、五つの主要なクラス（IgA、IgD、IgE、IgG、およびIgM）が存在し、これらのうちのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）（例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1、およびIgA2）へとさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元配置は、周知である。
【００２９】
本明細書において、「抗体」という用語には、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の両方が含まれる。この用語には、元の抗体の特異的な抗原結合能力を保持している修飾抗体、例えば、他の分子に結合した抗体、キメラ抗体（ヒト化抗体等）、一つまたは複数のアミノ酸が置換、欠失、付加、または挿入されている抗体等も含まれる。さらに、この用語は、抗原との特異的結合能力を保持している限り、抗体の断片も包含することを意図している。そのような断片には、例えば、Fv、Fab、F(ab')2、およびscFv等が含まれるが、本発明はそれらに制限されず、元の抗体の特異的結合能力を依然として保有している、はるかに小さな抗体部分を含む。
【００３０】
本明細書において使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均質の抗体の集団から入手される抗体を指す。即ち、集団を構成する個々の抗体は、微量存在するかもしれない起こりうる天然変異を除いて、同一である。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対するものである。さらに、異なる決定要素（エピトープ）に対する異なる抗体を典型的には含んでいる従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対する。その特異性に加え、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンが混入していないハイブリドーマ培養物によって合成され得るという点で有利である。従って、「モノクローナル」という修飾語は、実質的に均質な抗体集団から入手されるような抗体の特徴を示し、かつ、任意の特定の方法による抗体の作製を必要とすると解釈されてはならない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、KohlerおよびMilstein(Nature 256:495-7, 1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、または組み換えDNA法（Cabilly et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:3273-7, 1984）によって作製されてもよい。
【００３１】
本明細書において、モノクローナル抗体には、所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および/または軽鎖の一部が、特定の種に由来するかまたは特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同であり、鎖の残部が、別の種に由来するかまたは別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一または相同である「キメラの」抗体または免疫グロブリン、ならびにそのような抗体の断片も特に含まれる（Cabilly et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:3273-7, 1984；Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851-5, 1984）。最も典型的には、キメラの抗体または免疫グロブリンは、ヒトおよびマウスの抗体断片、一般に、ヒト定常領域およびマウス可変領域を含む。
【００３２】
「エフェクター機能」とは、抗体の細胞障害性を指す。細胞障害性は、通常、抗体のFc領域に関連しているが、本発明はそれに制限されず、「エフェクター機能を有する抗体」には、その抗体の抗原が発現されている細胞に対する障害を引き起こす全ての種類の抗体が包含される。
【００３３】
特に、抗体依存性細胞媒介性細胞障害性（ADCC；抗体依存性細胞性細胞障害性とも呼ばれる）、補体依存性細胞障害性（CDC）、および中和活性が、抗体エフェクター機能として公知であり、以下に詳述される。抗体のこれらの生物学的活性は、独立して細胞を障害することができるが、実際には、生存細胞において複合的に機能する。従って、本発明の抗体は、これらのエフェクター機能のうちの一つ、二つ、または全てを有し得る。本明細書において、好ましいエフェクター機能は、ADCC、CDCのいずれかまたは両方である。
【００３４】
(1）抗体依存性細胞媒介性細胞障害性（ADCC）
抗体依存性細胞媒介性細胞障害性（ADCC）とは、エフェクター細胞および抗体、特に、IgGクラス抗体の作用を介して標的細胞において引き起こされる細胞障害性反応を指す。従って、この効果を引き起こすために必要とされる抗体の量は極めて少なく、この細胞障害性機能は、腫瘍、自己免疫疾患等のように、弱い抗体産生反応しか引き起こされない場合に重要であると考えられる。ADCCは、抗体を使用した癌治療における重要な機序であることが公知である（Clynes RA, et al., Nature Med 6: 443-6, 2000）。例えば、ADCCは、抗CD20キメラ抗体を使用した癌の処置のための重要なエフェクター機序であることが報告されている（Cartron G, et al., Blood 99: 754-8, 2002）。従って、癌治療のために本発明を適用する場合、ADCCのエフェクター機能は、特に重要になる。
【００３５】
この反応に関与している細胞はエフェクター細胞と呼ばれ、抗原が結合した抗体と結合することにより細胞障害性を獲得する。そのような細胞の例には、リンパ球（T細胞、NK細胞等）、マクロファージ、多形核白血球（好中球（neutophils））、K細胞等が含まれる。これらの細胞は、抗原を介して細胞表面に結合した抗体のFc領域と結合するFc受容体と呼ばれる受容体を保持している。Fc受容体は、各々、免疫グロブリンの特定のクラスおよび/またはサブクラスのFc領域を特異的に認識し、それと結合することが公知である。例えば、免疫グロブリンクラスIgGのFc領域に特異的なFc受容体を含む細胞は、T細胞、NK細胞、好中球、およびマクロファージを含み、IgGクラス抗体のFc領域によって活性化されて、これらの抗体が結合した細胞に対する細胞障害性を発揮する。
【００３６】
ADCCは、関与するエフェクター細胞に基づき、IgG依存性マクロファージ媒介性細胞障害性（ADMC）およびIgG依存性NK細胞媒介性細胞障害性（狭義のADCC）へと分類され得る。本明細書において、ADCCという用語は広義に使用され、マクロファージがエフェクター細胞として機能するADMCを包含する。
【００３７】
抗体ADCCは、抗体を使用する癌治療において特に重要な、生体において引き起こされる抗腫瘍効果の重要な機序であることが公知である（Clynes RA, et al., Nature Med 6: 443-6, 2000）。例えば、抗CD20抗体キメラ抗体の治療効果とADCCとの間の密接な関係が報告されている（Cartron G, et al., Blood 99: 754-8, 2002）。従って、本発明において、ADCCは、抗体エフェクター機能の中でも特に重要である。
【００３８】
現在、ADCCの機序は、およそ以下のように説明されている：まず、抗体が標的細胞に結合し、次いで、抗体のFc領域を認識するエフェクター細胞が、抗体に結合する。細胞表面に結合した抗体を介して標的細胞に架橋されたエフェクター細胞は、ある種の致死シグナルを標的細胞に伝達することにより、標的細胞アポトーシスを誘導すると考えられている。
【００３９】
(2）補体依存性細胞障害性（CDC）
抗体-抗原複合体の抗体のFc領域は、補体系を活性化することが公知である。この系に関与している補体は、酵素反応、または他の活性化された補体との結合を通して連続的に活性化され、ヒスタミン放出の誘導、好中球およびマクロファージのための走化性因子としての作用、オプソニン作用等のような生物学的活性を示す分子を形成する。これらの活性化された分子のうち、C5b-9膜侵襲複合体（MAC）は、エフェクター細胞と無関係のウイルス粒子および細胞膜を障害する。MACは、細胞膜に対する強い結合親和性を発揮し、細胞膜に結合した分子は、孔を空け、細胞への水の流入および流出を容易にする。その結果、細胞膜が不安定になるか、または浸透圧の変化を通して細胞が破壊される。活性化された補体または補体の複合体によって引き起こされた生物学的活性は、補体系を活性化した抗原-抗体複合体の近傍の領域にのみ及ぶ。特に、抗体可変領域が結合している細胞を溶解する機能が、CDCとして定義される。
【００４０】
さらに、補体系を活性化する経路は、その経路を誘導する抗体の免疫グロブリンクラスに依って異なることが明らかにされている。例えば、ヒト抗体のうち、IgMおよびIgGは、古典的経路を活性化する。他方、IgA、IgD、およびIgEは、この経路を活性化しない。
【００４１】
(3）中和活性
いくつかの抗体は、病原体の感染性および/または毒素の活性を奪う機能を有することが公知である。そのような病原体および毒素の中和は、抗体の抗原性可変領域と、病原体または毒素に含まれる抗原との結合を通して達成され得る。時に、ウイルスから感染性を奪うために、中和は、抗体媒介のみならず補体媒介も必要とすることが公知である。従って、治療等において補体媒介を必要とする中和活性を有する抗体を使用する場合には、補体系の活性化にとって不可欠なFc領域が、抗原性可変領域に加えて必要である。
【００４２】
他に定義されない限り、本明細書において使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有する。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が適用されるであろう。
【００４３】
発明の詳細な説明
抗体のエフェクター機能を使用して癌細胞を破壊するために必要とされる条件は、例えば、以下の通りである：
（a）標的癌細胞の膜表面における多数の抗原性分子の発現；
（b）標的癌性組織内の均一な抗原の分布；および
（c）抗体に結合した抗原の細胞表面における長時間の滞留。
【００４４】
より具体的には、例えば、抗体によって認識される抗原は、標的癌細胞の細胞膜の表面上に発現されることが必要である。さらに、癌性組織を形成している細胞のうちの抗原陽性細胞の比率が、可能な限り高いことが好ましい。例えば、理想的な状況とは、目的組織における全ての標的癌細胞が、その抗原に関して陽性であることであり得る。目的組織の癌細胞集団の一部にのみ存在する抗原が標的として使用される場合には、その抗原に対する抗体に関して臨床的な治療効果は予想され得ない。通常、標的として使用される抗原の細胞表面における発現が高いほど、強いエフェクター機能が予想される。
【００４５】
さらに、細胞表面上の抗原に結合した抗体が、細胞に取り込まれないことも重要である。一部の受容体は、リガンドと結合した後に細胞に取り込まれ（エンドサイトーシス）、その現象は内部移行と呼ばれる。同様に、内部移行は、細胞表面抗原に結合した抗体に関しても起こり得る。内部移行が起こると、抗体によって引き起こされるエフェクター機能の大部分を担うFc領域も細胞に取り込まれ、このことは、結果として、エフェクター細胞のFc領域または抗原発現細胞の外部にある補体との結合を阻害し、最終的には抗体エフェクター機能を阻害する。従って、エフェクター機能を有する抗体を選択する場合には、抗体内部移行を引き起こすことが少ない抗原を選ぶことが重要である。
【００４６】
さらに、抗体を使用することにより癌を処置するためには、副作用を回避するため、正常な器官においては発現量が低い抗原を選択することも重要である。
【００４７】
従って、本発明者らは、肺癌患者から収集された肺癌細胞および正常細胞のcDNAマイクロアレイを用いた遺伝子発現分析を通して、癌細胞における発現が特異的に増強されたが正常細胞においては低い発現量を示す、多数の遺伝子を同定した。これらの遺伝子のうち、主要器官において低い発現量を示すものを、肺癌治療のための候補標的遺伝子として選択した。
【００４８】
候補標的遺伝子には、デスモコリン2（DSC2）遺伝子が含まれた。DSC2遺伝子によってコードされるアミノ酸配列は、N末端にシグナルペプチドを含むと予想され、従ってこれは、細胞膜の表面上に発現されたタンパク質であると予想された。強制発現系を通して、細胞膜上でのc-myc-Hisタグ付加DSC2の局在化された発現が、免疫蛍光顕微鏡検を介して確認され、DSC2は膜貫通型タンパク質であると考えられた。従って、本発明者らは、DSC2が、肺癌のための有用な臨床マーカーおよび治療標的として役立つと予想した。
【００４９】
特に、これらの候補標的遺伝子によってコードされたタンパク質に対する抗体を、強力な細胞障害性を誘導しかつ最終的に肺癌細胞を障害するためのエフェクター機能の能力に関して調査した。その結果、抗DSC2抗体は、DSC2発現細胞に対するエフェクター機能を有することが確認され得た。さらに、これらの抗体は、DSC2が過剰発現されている結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌の細胞系のようなその他の癌細胞系に対しても類似の効果を引き起こすことが確認された。これらの発見により、本発明者らは、DSC2に対する抗体が、ほとんど副作用の危険なく、癌治療に使用され得ることを企図した。
【００５０】
I-1. ポリペプチド
本発明の一局面によると、以下のアミノ酸配列のうちのいずれかを有するポリペプチドが提供される：
FSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、
YISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、
VHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、
KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、
YTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、
LQYDNLW (SEQ ID NO: 31)、
DYSMH (SEQ ID NO: 32)、
WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、
WLLFDY (SEQ ID NO: 34)、
KSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、
FASTRES (SEQ ID NO: 36)、
QQHYSTPL (SEQ ID NO: 37)、
GNYWS (SEQ ID NO: 39)、
EINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、
VPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、
GNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46)、
GYFWS (SEQ ID NO: 49)、
EINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50), GQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、
SNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、および
AAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
【００５１】
前記のアミノ酸配列は、各々、DSC2を発現している細胞を障害するのに有効であることが確認されたキメラ抗体またはヒト抗体の構築のために使用されたマウス抗体の相補性決定領域（CDR）に関して決定された配列である。単独のCDR領域は、弱いが、その抗原を認識し、特異的に結合し得ることが公知である。さらに、三つのCDRのうちCDR3の役割が、抗体と抗原との結合において特に高いことが、一般に公知である。従って、一部の場合には、前記の本発明のポリペプチドは、DSC2の発現が関与している疾患の診断または処置において単独で使用され得る。
【００５２】
CDRグラフト技術は、当技術分野において公知である（"Immunoglobulin genes", Academic Press (London), pp260-74, 1989；Michael A et al., Proc Natl Acad Sci USA 91: 969-73, 1994）。この技術によると、ある抗体のCDRが、別の抗体のCDRと交換される。そのような交換を通して、前者の抗体の結合特異性が、後者の抗体のものへと変化する。そのようなキメラ抗体のうち、フレームワークアミノ酸がヒト抗体に由来するものは、ヒト化抗体と呼ばれ、ヒトの癌治療において使用された場合、引き起こされる副作用がより少ないと予想される。従って、上記のCDRアミノ酸配列のうちのいずれかからなる本発明のポリペプチドは、そのようなキメラ抗体を調製するためにも使用され得る。
【００５３】
本発明のポリペプチドがキメラ抗体を調製するために使用される場合には、以下のように組み合わせて使用することが好ましい：
群1-1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28);
群1-2: VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31);
群2-1: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、およびVH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34);
群2-2: VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37);
群3-1: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、およびVH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41);
群3-2: VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46);
群4-1: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、およびVH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51); ならびに
群4-2: VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3としてAAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
【００５４】
CDR1、CDR2、およびCDR3がフレームワークアミノ酸配列によって分離されている、上記の組み合わせのアミノ酸配列を含むポリペプチドも、本発明のポリペプチドに包含される。さらに、本発明のポリペプチドは、VH領域およびVL領域の両方を含んでいてもよい。即ち、本発明のポリペプチドは、元の抗体の特異的結合能力を保持するために適切なアミノ酸配列（例えば、フレームワークアミノ酸配列等）によって分離された、上記の群1-1および1-2、群2-1および2-2、群3-1および3-2、または群4-1および4-2の対の全てのアミノ酸配列を含み得る。
【００５５】
別の局面によると、本発明は、以下の群より選択されるアミノ酸配列のうちのいずれかを有するポリペプチドを提供する：
MDSRLNLVFLVLILKGVQCDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARVHYYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 20)、
MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKL (SEQ ID NO: 21)、
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARWLLFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 22)、
MESQTQVLMFLLLWVSGACADIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKL (SEQ ID NO: 23)、
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGNYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGNTKYNPSLKSRVAISADTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 16)、
HVILTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVPG (SEQ ID NO: 17)、
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYFWSWIRQAPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTMTIDTSRKQFSLKLSSVTAADAAVYYCARGQGYYSSLDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 18)、および
SYELTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 19)。
【００５６】
前記のアミノ酸配列は、各々、DSC2を発現する細胞を障害するのに有効であることが確認されたマウスまたはヒトの抗体の軽鎖または重鎖いずれかの可変領域に関して決定された配列である。
【００５７】
様々なキメラ抗体が、当技術分野において公知である。例えば、抗体のFc領域は、任意の可変領域と連結され得る。IgA、IgE、またはIgGクラスの抗体のFc領域は、ADCCを生じるために不可欠である。同様に、IgMまたはIgGクラスの抗体のFc領域は、CDCを生じるために必要である。従って、ヒトに対する癌治療において利用するための抗体は、好ましくは、ADCCおよび/またはCDCを生じさせるためにヒト抗体のFc領域を有する。従って、上記のVHおよびVLのアミノ酸配列のうちのいずれかからなるポリペプチドは、DSC2を発現している細胞を障害するのに有効であることが本発明者らによって確認された可変領域にヒト抗体のFc領域が連結されているようなキメラ抗体を調製するために使用され得る。IgG1クラス抗体は、ADCCおよびCDCの両方を誘発するため、IgG1クラス抗体のFc領域は本発明のために好ましい。ヒトIgG1抗体のFc領域がはるかに好ましい。
【００５８】
一般に、タンパク質の中の一つまたは複数のアミノ酸の修飾は、タンパク質の機能に影響を及ぼさないことが公知である。当業者は、単一のアミノ酸または少ない割合のアミノ酸を改変するアミノ酸配列に対する個々の付加、欠失、挿入、または置換は、タンパク質の改変が、類似した機能を有するタンパク質をもたらす「保存的修飾」であることを認識するであろう。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換の表は、当技術分野において周知である。例えば、以下の八つの群は、各々、相互に保存的置換であるアミノ酸を含有している：
1）アラニン（A）、グリシン（G）；
2）アスパラギン酸（d）、グルタミン酸（E）；
3）アスパラギン（N）、グルタミン（Q）；
4）アルギニン（R）、リジン（K）；
5）イソロイシン（I）、ロイシン（L）、メチオニン（M）、バリン（V）；
6）フェニルアラニン（F）、チロシン（Y）、トリプトファン（W）；
7）セリン（S）、トレオニン（T）；および
8）システイン（C）、メチオニン（M）（例えば、Creighton, Proteins, 1984参照）。
【００５９】
そのような保存的に修飾されたポリペプチドは、本発明のポリペプチドに含まれる。しかしながら、本方法に適用可能なタンパク質はそれらに制限されず、DSC2との特異的結合能力を保持している限り、非保存的な修飾を含んでいてもよい。
【００６０】
前記の修飾に加え、本発明のポリペプチドは、特異的結合能力を保持している限り、他の物質にさらに連結されていてもよい。使用可能なそのような他の物質には、以下のものが含まれる：ペプチド、脂質、糖および糖鎖、アセチル基、天然および合成のポリマー等。これらの種類の修飾は、付加的な機能を付与するか、またはポリペプチドを安定化するために実施され得る。
【００６１】
本発明のポリペプチドは、従来の精製法を介して天然のポリペプチドとして自然界から入手され得るが、より小さな分子の場合には、選択されたアミノ酸配列に基づく化学合成を通して入手することが好ましい。例えば、合成のために採用され得る従来のペプチド合成法には、以下のものが含まれる：
(i) Peptide Synthesis, Interscience, New York, 1966;
(ii) The Proteins, Vol. 2, Academic Press, New York, 1976;
(iii) ペプチド合成、丸善、1975;
(iv) ペプチド合成の基礎と実験、丸善、1985;
(v) 続医薬品の開発、第14巻 (ペプチド合成), 広川書店, 1991;
(vi) 国際公開公報第99/67288号; および
(vii) Barany G. & Merrifield R.B., Peptides Vol. 2, “Solid Phase Peptide Synthesis”, Academic Press, New York, 1980, 100-118。
【００６２】
または、ポリペプチドは、ポリペプチドを作製するための任意の公知の遺伝子操作法を採用して入手されてもよい（例えば、Morrison J, J. Bacteriology 132: 349-51, 1977；Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology (eds. Wu et al.) 101: 347-62, 1983）。例えば、まず、（例えば、プロモーターを含む調節配列の下流に）発現可能な形態で目的のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む適当なベクターが調製され、適当な宿主細胞に形質転換され、次いで、宿主細胞がタンパク質を産生するよう培養される。タンパク質は、インビトロ翻訳系を採用してインビトロで作製されてもよい。
【００６３】
I-2. 抗体
本発明の一局面として、本発明のポリペプチドは、抗体であり得る。本発明の抗体は、免疫グロブリンの任意のクラスまたはサブクラスに属し得る。IgG1クラス抗体は、ADCCおよびCDCの両方を誘発し、このクラスの抗体の非特異的結合は、免疫グロブリンのクラスおよびサブクラスの中でも最も低いと考えられているため、IgG1クラス抗体が、本発明のために特に好ましい。
【００６４】
さらに、抗体が動物の治療のために使用される場合には、同一種に由来する抗体、または少なくとも同一種の抗体のFc領域もしくは定常領域を有する抗体を選択することが好ましい。即ち、ヒトを処置するために使用される場合には、ヒト抗体またはヒト化抗体を使用することが好ましい。
【００６５】
さらに、本発明には、抗原との特異的結合能力を保持している限り、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、元の抗体の特異的抗原結合能力を保持しているキメラ抗体（ヒト化抗体、scFv等）のような修飾された抗体、ならびに抗体断片（例えば、Fv、Fab、F(ab')2等）が含まれる。しかしながら、本発明は、上記の抗体のうちのいずれにも制限されない。
【００６６】
一態様として、本発明の抗体は、以下の配列をCDRとして含む：
群1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31);
群2: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、VH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34); VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37);
群3: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、VH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46); または
群4: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、VH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3としてAAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
【００６７】
好ましくは、それらの中のCDR1、CDR2、およびCDR3配列は、適切なフレームワークアミノ酸配列によって分離されている。より好ましくは、本発明の抗体は、以下の群より選択されるVHおよびVLの配列を有する：
MDSRLNLVFLVLILKGVQCDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARVHYYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 20) および
MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKL (SEQ ID NO: 21);
MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARWLLFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 22) および
MESQTQVLMFLLLWVSGACADIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKL (SEQ ID NO: 23);
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGNYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGNTKYNPSLKSRVAISADTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 16) および
HVILTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVPG (SEQ ID NO: 17); または
QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYFWSWIRQAPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTMTIDTSRKQFSLKLSSVTAADAAVYYCARGQGYYSSLDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 18) および
SYELTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO: 19)。
【００６８】
そのような好ましい抗体の例は、例えば、48-5、s10-4、ch48-5、chs10-4、332、および545（全て、本実施例において調製された）であり得る；しかし、本発明はこれらに制限されない。
【００６９】
本発明の抗体は、エフェクター機能を生じることが特に好ましい。従って、本発明は、少なくとも一つのエフェクター機能を示すDSC2に対する抗体にさらに関する。適当な本発明の抗体は、ADCC、CDC、または両方のようなエフェクター機能を示す。IgA、IgE、またはIgGのFc領域を含む抗体は、ADCCの発現を生じるために不可欠である。同様に、IgMまたはIgGの抗体Fc領域は、CDCの発現のために好ましい。しかしながら、所望のエフェクター機能を駆動する限り、本発明の抗体は制限されない。
【００７０】
Fc部分の変異体、類似体、または誘導体が、例えば、残基または配列の様々な置換を作製することによって構築され得、かつ本発明の抗体のために使用され得る。変異型（または類似体）ポリペプチドには、一つまたは複数のアミノ酸残基がFcアミノ酸配列に追加されている挿入変異体が含まれる。挿入は、タンパク質の一方もしくは両方の末端に位置していてもよいし、またはFcアミノ酸配列の内部領域に位置していてもよい。一方または両方の末端に付加的な残基を含む挿入変異体には、例えば、融合タンパク質、および、アミノ酸タグまたは標識を含むタンパク質が含まれ得る。例えば、特に、大腸菌のような細菌細胞において分子を組み換えにより発現させる場合、Fc分子は、任意で、N末端Metを含有し得る。
【００７１】
Fc欠失変異体においては、Fcの中の一つまたは複数のアミノ酸残基が除去されている。欠失は、Fcポリペプチドの一方もしくは両方の末端における、または、Fcアミノ酸配列内の、一つまたは複数の残基の除去を含み得る。従って、欠失変異体には、Fcポリペプチド配列のあらゆる種類の断片が含まれる。
【００７２】
Fc置換変異体においては、Fcポリペプチドの一つまたは複数のアミノ酸残基が除去され、別の残基と交換されている。一局面において、置換は、保存的な性質のものであるが、本発明には、非保存的置換も包含される。
【００７３】
好ましくは、エフェクター機能を有する本発明の抗体において使用される親ポリペプチドFc領域は、ヒトFc領域、例えば、ヒトIgG1（アロタイプAおよび非A）またはヒトIgG3のもののような天然ヒトFc領域である。一つの態様において、改良されたADCCを有する変異体は、天然配列IgG1またはIgG3 Fc領域および変異体の抗原結合領域を含む抗体よりも実質的に効果的にADCCを媒介する。好ましくは、変異体は、Fc領域の298位、333位、および334位の残基のうちの二つまたは三つの置換を含む、またはそれらから本質的になる。免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、Kabatら（Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md., 1991）（参照により本明細書に明確に組み入れられる）にあるようなEUインデックスのものである。最も好ましくは、298位、333位、および334位の残基が、（例えば、アラニン残基に）置換される。さらに、改良されたADCC活性を有するFc領域変異体を作製するためには、一般に、ADCCの媒介にとって重要なFcRであると考えられるFcγRIIIに対する改良された結合親和性を有するFc領域変異体が遺伝子操作により作製されるであろう。例えば、そのような変異体を作製するために、256位、290位、298位、312位、326位、330位、333位、334位、360位、378位、または430位のアミノ酸のうちのいずれか一つ以上において、親Fc領域へアミノ酸修飾（例えば、挿入、欠失、または置換）が導入され得る。FcγRIIIに対する改良された結合親和性を有する変異体は、さらに、FcγRIIに対する低下した結合親和性、特に、FcγRIIB受容体を阻害するための低下した親和性を有し得る。
【００７４】
いずれにせよ、（例えば、1〜50アミノ酸からの、好ましくは1〜25アミノ酸からの、より好ましくは1〜10アミノ酸からの）任意の変異型アミノ酸の挿入、欠失、および/または置換が企図され、これらは本発明の範囲内である。保存的アミノ酸置換が、一般に、好ましいであろう。さらに、抗体を含む本発明のポリペプチドに関して既に説明されたように、改変は、ペプチド模倣体またはD-アミノ酸のような改変されたアミノ酸の形態であってもよい。
【００７５】
DSC2またはその断片は、本発明の抗体を入手するための免疫原として使用され得る。DSC2は、従来の精製技術を通して任意の種から、好ましくはヒト、マウス、またはラットのような哺乳動物から、より好ましくはヒトから、得られ得る。さらに、ヒトDSC2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は公知である（DSC2 2b型（GenBankアクセッション番号NM_004949；SEQ ID NO: 1）およびDSC2 2a型（GenBankアクセッション番号NM_024422；SEQ ID NO: 2）のcDNAヌクレオチド配列；対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO: 3（GenBankアクセッション番号NP_004940）および4（GenBankアクセッション番号NP_077740）に記載される）。従って、本発明のDSC2抗体を調製するための免疫原を入手するためには、これらの配列情報に基づき、DSC2またはその抗原性断片を化学合成するか、または遺伝学的に作製することができる。例えば、当業者は、目的のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを日常的に単離または構築し、適当な宿主細胞を形質転換するための適当な発現ベクターにその遺伝子を挿入し、タンパク質の発現のための適当な条件の下で宿主細胞を培養することにより、細胞または培養上清から標的アミノ酸配列を含むタンパク質を入手することができる。さらに、DSC2タンパク質またはその断片を発現している細胞自体が、免疫原として使用され得る。
【００７６】
DSC2の断片を免疫原として使用する場合には、細胞外ドメインであると予測された領域を含むアミノ酸配列を選択することが特に好ましい。DSC2のN末端の1〜32位の領域は、シグナル配列に相当すると予測されている（Greenwood MD et al., Genomics 44: 330-5, 1997）。従って、この領域を免疫原として使用することは回避するのが好ましい。さらに、DSC2の細胞外ドメインを、本発明の抗体を入手するための免疫原として採用することが好ましい。
【００７７】
抗原を用いて動物を免役化する方法は当技術分野で公知であり、腹腔内および皮下の抗原注射を含む。具体的には、抗原を、適量のリン酸緩衝食塩水（PBS）、生理食塩水などで希釈および懸濁することができる。所望ならば、抗原懸濁物を、フロイント完全アジュバントなどの適量の標準的なアジュバントと混合し、乳化後に哺乳動物に投与することができる。続いて、適量のフロイント不完全アジュバントと混合した抗原を、4〜21日毎に複数用量で投与することが好ましい。適切な担体を免疫化に使用することもできる。上記で概説したように免疫化を行った後に、標準的な方法によって、免疫化動物の血清中の抗体量を調べることができる。
【００７８】
DSC2タンパク質に対するポリクローナル抗体は、所望の抗体量の増加が確認され得た、免疫化された哺乳動物から調製され得る。これは、これらの動物から血液または血清を収集することにより達成され得る。本発明のポリクローナル抗体は、収集された血清自体であってもよいし、または血清から精製されていてもよい。例えば、DSC2タンパク質またはその抗原性断片を備えたアフィニティカラムを使用したクロマトグラフィが、そのような精製のために使用され得る。さらに、プロテインAまたはプロテインGカラムを使用したさらなる精製によって、IgGおよびIgMが調製されてもよい。
【００７９】
モノクローナル抗体を調製するために、まず、免疫原で免疫化した哺乳動物から抗体産生細胞を収集し、これが血清中の所望の抗体量の増加を示すことを確認する。細胞は、好ましくは脾臓から収集される。収集された抗体産生細胞を、好ましい親細胞、例えば、哺乳動物のミエローマ細胞、およびより好ましくは、薬剤によって融合細胞を選択するための特性を獲得したミエローマ細胞と融合させる。融合は、任意の公知の方法によって、例えばMilsteinらの方法によって達成することができる(Galfre G and Milstein C, Methods Enzymol 73: 3-46, 1981)。
【００８０】
次に、細胞融合によって産生されるハイブリドーマを、HAT培地（ヒポキサンチン、アミノプテリン、およびチミジンを含む培地）などの標準的な選択培地で培養することにより、選択することができる。HAT培地における細胞培養は通常、数日から数週間、所望のハイブリドーマを除く他のすべての細胞（融合していない細胞）を死滅させるのに十分な期間、継続される。次に、標準的な限界希釈を行い、所望の抗体を産生するハイブリドーマ細胞のスクリーニングおよびクローニングを行う。
【００８１】
その後、得られたハイブリドーマをマウスの腹腔に移植して、目的のモノクローナル抗体を含む腹水を抽出する。例えば、アフィニティクロマトグラフィー、濾過、限外濾過、塩析、透析、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動、等電点電気泳動などを含むがこれらに限定されないカラムクロマトグラフィーの選択された組み合わせを含む、従来のタンパク質分離法および/または精製法によって、抗体を腹水から精製することができる(Antibodies： A Laboratory Manual, Harlow and David, Lane (edit.), Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。
【００８２】
プロテインAカラムおよびプロテインGカラムをアフィニティカラムとして使用することができる。使用される例示的なプロテインAカラムには、Hyper D、POROS、およびSepharose F.F.（Pharmacia）が含まれる。
【００８３】
例示的なクロマトグラフィー（アフィニティクロマトグラフィーを除く）には、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、ゲル濾過、逆相クロマトグラフィー、および吸着クロマトグラフィーが含まれる(“Strategies for Protein Purification and Characterization：A Laboratory Course Manual” Daniel R Marshak et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1996)。HPLCやFPLCなどの液相クロマトグラフィーの手順に従って、クロマトグラフィーを実施することができる。
【００８４】
本発明の抗体の産生用の免疫原を用いて任意の哺乳動物を免役化することができる。しかしながら、ハイブリドーマを産生することによりモノクローナル抗体を調製する場合には、ハイブリドーマ産生用の細胞融合において用いる親細胞との適合性を考慮することが好ましい。
【００８５】
一般に、そのような免疫化には、げっ歯類、ウサギ目、または霊長類を使用する。げっ歯類には、例えばマウス、ラット、およびハムスターが含まれる。ウサギ目には、例えばウサギが含まれる。霊長類には、例えばカニクイザル(Macaca fascicularis)、アカゲザル(Macaca mulatta)、マントヒヒ、およびチンパンジーなどの狭鼻猿類（旧世界）サルが含まれる。
【００８６】
さらに、ヒト抗体遺伝子のレパートリーを含むトランスジェニック動物の使用も、当技術分野において公知である（Ishida I, et al., Cloning and Stem Cells 4: 91-102, 2002）。その他の動物と同様に、ヒトモノクローナル抗体を入手するためには、トランスジェニック動物を免疫化し、次いで、抗体産生細胞を動物から収集し、骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得て、これらのハイブリドーマから抗タンパク質ヒト抗体を調製し得る（国際公報第92-03918号、第94-02602号、第94-25585号、第96-33735号、および第96-34096号参照）。
【００８７】
または、癌遺伝子により不死化されたリンパ球が、モノクローナル抗体産生のために使用され得る。例えば、EBウイルス等により感染されたヒトリンパ球が、免疫原によりインビトロで免疫化され得る。次いで、免疫化されたリンパ球を、無限に分裂し得るヒト由来骨髄腫細胞（U266等）と融合させ、このようにして、所望のヒト抗体を産生するハイブリドーマを入手する（日本国特許出願公開公報（JP-A）昭 63-17688）。
【００８８】
一旦、前記の方法のうちのいずれかを介してモノクローナル抗体が入手されたら、それは、遺伝子操作法を使用しても調製され得る（例えば、Borrebaeck CAK and Larrick JW, Therapeutic Monoclonal Antibodies, MacMillan Publishers, UK, 1990参照）。例えば、組換え抗体は、抗体を産生するハイブリドーマまたは免疫化されたリンパ球のような抗原産生細胞から目的の抗体をコードするDNAをクローニングし；次いで、クローニングされたDNAを適切なベクターに挿入し；ベクターを適当な宿主細胞に形質転換することにより調製され得る。そのような組換え抗体も、本発明に包含される。
【００８９】
修飾された抗体も、本発明に含まれる。そのような修飾された抗体は、例えば、化学的修飾によって入手され得る。例えば、抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）のような分子との連結により修飾され得る。抗体のためのそのような化学的修飾の方法は、当業者に周知であり、任意の公知の方法が、本発明において採用され得る。抗体は、他のタンパク質によっても修飾され得る。例えば、別のタンパク質分子と連結した抗体が、遺伝子操作を通して作製され得る。即ち、抗体と他のタンパク質との融合タンパク質が、抗体遺伝子と他のタンパク質をコードする遺伝子とが連結されている遺伝子を含む発現ベクターから発現され得る。本発明の好ましい例として、抗体のエフェクター機能を増強するために、それはサイトカインまたはケモカインに連結され得る。抗体エフェクター機能は、IL-2、GM-CSF等との連結を介して増強されることが報告された（Human Antibody 10: 43-9, 2000）。IL-2、IL-12、GM-CSF、TNF、および好酸球走化性物質（RANTES）等が、抗体のエフェクター機能を増強するために本発明において使用され得る。
【００９０】
さらに、修飾された抗体には、例えば、非ヒト抗体に由来する可変領域がヒト抗体の定常領域と接合しているヒト化抗体、または非ヒト抗体由来のCDRがヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR）と融合しているヒト化抗体（CDRグラフト抗体）に代表される、キメラ抗体が含まれる。そのようなキメラ抗体は、ヒト化抗体の作製のための分子生物学の標準的な技術を介して入手され得る（例えば、Jones et al., Nature 321:522-5, 1986；Riechmann et al., Nature 332:323-7, 1988；およびPresta, Curr Opin Struct Biol 2:593-6, 1992参照）。
【００９１】
例えば、まず、関心対象の抗体の可変領域またはCDRをコードする遺伝子が、抗体産生細胞のRNAからポリメラーゼ連鎖反応（PCR）等によって調製される（例えば、Larrick et al., "Methods: a Companion to Methods in Enzymology", Vol. 2: 106, 1991；Courtenay-Luck, "Genetic Manipulation of Monoclonal Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Production, Engineering and Clinical Application；Ritter et al. (eds.), page 166, Cambridge University Press, 1995, and Ward et al., "Genetic Manipulation and Expression of Antibodies" in Monoclonal Antibodies: Principles and Applications；Birch et al. (eds.), page 137, Wiley-Liss, Inc., 1995参照）。調製された可変領域をコードする遺伝子を、定常領域またはフレームワーク領域をコードする遺伝子と連結する。定常領域またはフレームワーク領域をコードする遺伝子は、CDRをコードする遺伝子と同様に決定され得、または既存の抗体の配列情報に基づき、それらを調製することも可能である。キメラ産物およびCDRグラフト産物をコードするDNA配列は、オリゴヌクレオチド合成技術を使用して、完全にまたは部分的に合成され得る。例えば、Jonesら（Nature 321:522-5, 1986）によって記載されたようなオリゴヌクレオチド用の合成が使用され得る。さらに、一部の場合には、部位特異的突然変異誘発およびポリメラーゼ連鎖反応の技術が、適宜、使用され得る。Verhoeyenら（Science 239: 1534-6, 1988）またはRiechmannら（Nature 332: 323-7, 1988）によって記載された既存の可変領域のオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発のための技術が、可変領域の配列を修飾して、例えば、キメラ抗体の結合能力を増強するために利用され得る。さらに、必要であれば、例えば、Queenら（Proc Natl Acad Sci USA 86: 10029-33, 1989；WO 90/07861）によって記載されたような、T4 DNAポリメラーゼを使用した、ギャップを有するオリゴヌクレオチドの酵素的フィルイン（filling in）が使用され得る。
【００９２】
さらに、本発明の抗体には、得られた抗体がDSC2との結合能力を保持している限り、一つまたは複数のアミノ酸が他のアミノ酸に交換されているもの、あるいは、一つまたは複数のアミノ酸が欠失もしくは付加（挿入を含む）されているものが包含される。部位特異的突然変異誘発のような、他のポリペプチドのために使用されている従来の方法が、この種の修飾された抗体を入手するために利用され得る。
【００９３】
同様に、得られた断片がDSC2との結合能力を保持している限り、任意の上記の本発明の抗体の断片も、本発明に包含される。そのような断片は、パパインまたはペプシンのような適切な酵素により抗体を処理することにより入手され得るFv、Fab、およびF(ab')2に代表される。また一方、抗体の可変領域のはるかに小さな断片も、本発明に含まれる。断片は、化学合成、または、その断片をコードし発現する遺伝子を構築することによる従来の遺伝子操作法を通して入手されてもよい。
【００９４】
単鎖Fv（scFv）も、本発明の抗体に含まれる。sFvは、抗体のVHおよびVLドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖内に存在する。好ましくは、Fvポリペプチドは、scFvが抗原結合のための所望の構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカーを、VHドメインとVLドメインとの間にさらに含む。抗体V領域由来の天然には凝集しているが化学的に分離されたポリペプチド軽鎖および重鎖を、抗原結合部位の構造に実質的に類似した三次元構造に折り畳まれるであろうscFv分子へと変換するために、化学構造を識別するための多数の方法が記載されており（米国特許第5,091,513号、第5,132,405号、および第4,946,778号；Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315, 1994）、それらは全て本発明において利用され得る。
【００９５】
任意の適当な宿主細胞/ベクター系が、修飾された抗体をコードするDNA配列の発現のために使用され得る。特にFAbおよび(Fab')2断片、ならびに特に、Fv断片および単鎖抗体断片、例えば、scFvのような抗体断片の発現のために、細菌、例えば、大腸菌、およびその他の微生物の系が使用され得る。特に、完全抗体分子を含む、より大きなCDRグラフト抗体産物の作製のために、真核宿主細胞発現系、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系が使用され得る。適当な哺乳動物宿主細胞には、CHO細胞および骨髄腫またはハイブリドーマ細胞系が含まれる。
【００９６】
吸光度の測定、酵素結合免疫吸着アッセイ法（ELISA）、酵素免疫アッセイ法（EIA）、放射免疫アッセイ法（RIA）、および/または免疫蛍光法を用いて、本発明の抗体の抗原結合活性を測定することができる。ELISAでは、抗体をプレート上に固定し、それに対する抗原（例えば全長DSC2タンパク質またはその断片）をプレートに添加し、次いで、抗体を産生する細胞の培養上清または精製抗体などの所望の抗体を含む試料を添加する。次に、一次抗体を認識しかつアルカリホスファターゼなどの酵素でタグ付加された二次抗体を添加し、プレートをインキュベーションする。洗浄後に、p-ニトロフェニルリン酸などの酵素基質をプレートに添加し、吸光度を測定して、目的試料の抗原結合能力を評価する。評価はBIAcore(Pharmacia)を用いて行われうる。
【００９７】
さらに、例えばより強力なエフェクター機能を含むモノクローナル抗体を選択するために、抗体のエフェクター機能を試験してもよい。例えば、関心対象の分子のADCC活性を評価するために、米国特許第5,500,362号または同第5,821,337号に記載されたものなどのインビトロADCCアッセイ法を実施してもよい。または、インビボで、たとえばClynesらに開示されたものなどの動物モデルにおいて、関心対象の分子のADCC活性を評価してもよい(Proc Natl Acad Sci USA 95:652-56, 1998)。さらに、本実施例において概説された方法にしたがって、抗体のエフェクター機能を評価することもできる。例えば、そのエフェクター機能を評価すべき抗体の存在下で、DSC2を発現する標的細胞をエフェクター細胞と共にインキュベーションする。標的細胞の破壊が検出されれば、その抗体はADCCを誘導するエフェクター機能を有すると確認できる。抗体またはエフェクター細胞のいずれかの非存在下で、観察される標的細胞の破壊のレベルを、対照として比較することができる。本実施例においてDSC2を発現することが確認された様々な細胞系を含むDSC2発現細胞を、標的細胞として使用することができる。これらの細胞系は、セルバンクから入手することができる。
【００９８】
さらに、関心対象の分子のCDC活性を評価するため、例えばGazzano-Santoroらに記載されたCDCアッセイ法(J Immunol Methods 202: 163-71, 1997)を実行してもよい。
【００９９】
本発明の抗体は、DSC2の精製および検出のために使用するだけでなく、本タンパク質のアゴニストおよびアンタゴニストの候補として働くこともできる。これらの抗体はまた、DSC2の発現を伴う疾患に対する抗体療法にも適用できる。ヒトを処置するために使用する場合、免疫原性が低いためにヒト抗体またはヒト化抗体が好ましい。
【０１００】
II. ポリヌクレオチド
さらに、本発明は、抗体を含む、上記の本発明のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明のポリペプチドをコードする限り、mRNA、RNA、cDNA、ゲノムDNA、化学合成されたポリヌクレオチドなどを含む如何なる形態の本発明のポリヌクレオチドを用いてもよい。得られる物質が目的の本発明のポリペプチドまたはその同等物をコードする限り、本発明のポリヌクレオチドには、所与のヌクレオチド配列およびその縮重配列を含むものが含まれる。
【０１０１】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドには、以下の群より選択されるアミノ酸配列からなる、またはそれを含むポリペプチドをコードする配列が含まれる：
FSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、
YISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、
VHYYYFDY (SEQ ID NO: 28)、
KASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、
YTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、
LQYDNLW (SEQ ID NO: 31)、
DYSMH (SEQ ID NO: 32)、
WINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、
WLLFDY (SEQ ID NO: 34)、
KSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、
FASTRES (SEQ ID NO: 36)、
QQHYSTPL (SEQ ID NO: 37)、
GNYWS (SEQ ID NO: 39)、
EINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、
VPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41)、
TGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、
GNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、
QSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46)、
GYFWS (SEQ ID NO: 49)、
EINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、
GQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51)、
SGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、
SNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、および
AAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
【０１０２】
本発明のポリヌクレオチドは、抗体をコードし得る。本発明の、そのような抗体コーディングポリヌクレオチドは、以下のような配列を有する相補性決定領域（CDR）を含む抗体をコードし得る：
群1-1: VH CDR1としてFSSFGMH (SEQ ID NO: 26)、VH CDR2としてYISSGSSTIYYADTVK (SEQ ID NO: 27)、およびVH CDR3としてVHYYYFDY (SEQ ID NO: 28);
群1-2: VL CDR1としてKASQDINKYIA (SEQ ID NO: 29)、VL CDR2としてYTSTLQP (SEQ ID NO: 30)、およびVL CDR3としてLQYDNLW (SEQ ID NO: 31);
群2-1: VH CDR1としてDYSMH (SEQ ID NO: 32)、VH CDR2としてWINTETGEPTYADDFKG (SEQ ID NO: 33)、およびVH CDR3としてWLLFDY (SEQ ID NO: 34);
群2-2: VL CDR1としてKSSQSLLNSSNQKNYLA (SEQ ID NO: 35)、VL CDR2としてFASTRES (SEQ ID NO: 36)、およびVL CDR3としてQQHYSTPL (SEQ ID NO: 37);
群3-1: VH CDR1としてGNYWS (SEQ ID NO: 39)、VH CDR2としてEINHSGNTKYNPSLKS (SEQ ID NO: 40)、およびVH CDR3としてVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDV (SEQ ID NO: 41);
群3-2: VL CDR1としてTGSSSNIGAGYDVH (SEQ ID NO: 44)、VL CDR2としてGNSNRPS (SEQ ID NO: 45)、およびVL CDR3としてQSYDSSLSGWV (SEQ ID NO: 46);
群4-1: VH CDR1としてGYFWS (SEQ ID NO: 49)、VH CDR2としてEINHSGSTSYNPSLKS (SEQ ID NO: 50)、およびVH CDR3としてGQGYYSSLDP (SEQ ID NO: 51); ならびに
群4-2: VL CDR1としてSGSSSNIGSNTVN (SEQ ID NO: 53)、VL CDR2としてSNNQRPS (SEQ ID NO: 54)、およびVL CDR3としてAAWDDSLNGVV (SEQ ID NO: 55)。
【０１０３】
好ましくは、得られた断片がDSC2との結合親和性を示すように、上記のCDR1、CDR2、およびCDR3配列は、適切なフレームワークアミノ酸配列によって分離されている。
【０１０４】
さらに、本発明のポリヌクレオチドは、SEQ ID NO: 20もしくは22のマウスVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 21もしくは23のマウスVLアミノ酸配列を含む抗体、またはSEQ ID NO: 16もしくは18のヒトVHアミノ酸配列およびSEQ ID NO: 17もしくは19のヒトVLアミノ酸配列を含む抗体をコードし得る。
【０１０５】
さらに、抗体をコードする本発明のポリヌクレオチドは、抗体のFc領域をコードする領域を含み得る。ポリヌクレオチドによりコードされる好ましいFc領域には、ヒトIgG1のものが含まれるが、本発明はそれらに制限されない。
【０１０６】
本発明のポリヌクレオチドは、遺伝子操作法および化学合成を含む当業者に公知の方法によって調製され得る。例えば、本発明の目的のタンパク質（例えば、抗体）を発現する細胞からcDNAライブラリを調製して、目的のタンパク質の公知の部分配列（例えば、目的のタンパク質が抗体である場合には、定常領域またはフレームワーク領域をコードする配列）をプローブとして使用してハイブリダイゼーションを実施することにより、調製され得る。cDNAライブラリ構築は、例えば、Sambrookら（Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989）に記載された方法によって達成され得、または市販のcDNAライブラリを使用してもよい。そのようなライブラリは、目的のタンパク質を発現している細胞からRNAを抽出し、目的のタンパク質の公知の配列に基づきオリゴDNAを合成し、オリゴDNAをプライマーとして使用してPCRを実施し、目的のタンパク質をコードするcDNAを増幅することによっても、調製され得る。
【０１０７】
さらに、得られたcDNAのヌクレオチド配列を決定することによって、cDNAにコードされる翻訳領域を日常的に決定することができ、かつ目的タンパク質のアミノ酸配列も容易に推定することができる。さらに、目的タンパク質のゲノムDNAを単離するためのcDNAライブラリをスクリーニングするのと同じプローブを用いて、本発明のタンパク質に関してゲノムDNAライブラリをスクリーニングすることもできる。
【０１０８】
より詳細には、まず、目的のタンパク質が発現している細胞、組織、または器官からmRNAを調製する。既知の方法を用いてmRNAを単離することができる；例えば、全RNAはグアニジン超遠心(Chirgwin et al., Biochemistry 18: 5294-9, 1979)またはAGPC法(Chomczynski and Sacchi, Anal Biochem 162:156-9, 1987)によって調製できる。さらに、mRNAを、mRNA精製キット（Pharmacia）などを用いて全RNAから精製することができ、または、QuickPrep mRNA精製キット（Pharmacia）により直接精製することができる。
【０１０９】
得られたmRNAを用い、逆転写酵素によってcDNAを合成する。cDNAは、AMV逆転写酵素ファーストストランドcDNA合成キット（生化学工業）などの市販のキットを用いて精製されうる。または、プライマー、5'-Ampli FINDER RACEキット（Clontech）、およびPCRを用いる5'-RACE法(Frohman et al., Proc Natl Acad Sci USA 85: 8998-9002, 1988; Belyavsky et al., Nucleic Acids Res 17: 2919-32, 1989)に従って、cDNAの合成および増幅を行うこともできる。
【０１１０】
所望のDNA断片をPCR産物から調製し、ベクターDNAにライゲーションする。組換えベクターを用いて大腸菌などを形質転換し、選択されたコロニーから、所望の組換えベクターを調製する。所望のDNAのヌクレオチド配列は、ジデオキシヌクレオチド鎖停止法を含む従来の方法で確認することができる。
【０１１１】
本発明のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を、発現のために用いる宿主におけるコドン使用頻度を考慮に入れることにより、より効率的に発現されるように設計することもできる(Grantham et al., Nucleic Acids Res 9:43-74, 1981)。本発明のポリヌクレオチドの配列を、市販のキットまたは従来の方法によって改変することもできる。例えば、制限酵素による消化、合成オリゴヌクレオチドもしくは適切なポリヌクレオチド断片の挿入、リンカーの付加、ならびに/または開始コドン（ATG）および/もしくは終止コドン（TAA、TGA、またはTAG）の挿入によって配列を改変することができる。
【０１１２】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの調製に使用することができる。さらに、DSC2発現細胞が関わる様々な疾患に対する診断および遺伝子治療に使用することもできる。
【０１１３】
III. ベクターおよび宿主細胞
本発明はまた、本発明の上記のポリヌクレオチドが内部に挿入されたベクターも提供する。本発明のベクターは、本発明のポリヌクレオチド、特にDNAを宿主細胞中で維持するため、本発明のポリペプチドを発現させるため、または遺伝子治療用に本発明のポリヌクレオチドを投与するために有用である。
【０１１４】
大腸菌を宿主細胞として使用し、大腸菌（例えばJM109、DH5α、HB101、XL1Blueなど）内でベクターを増幅して大量に産生する場合、ベクターは、大腸菌中で増幅するための「複製起点（ori）」、および、形質転換された大腸菌を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、カナマイシン、クロラムフェニコールなどの薬剤によって選択される薬剤耐性遺伝子）を有する必要がある。例えばM13系ベクター、pUC系ベクター、pBR322、pBluescript、pCR-scriptなどを使用することができる。さらに、pGEM-T、pDIRECT、およびpT7も、cDNAおよび上述のベクターのサブクローニングおよび抽出に使用することができる。
【０１１５】
ベクターを使用して本発明のポリペプチドを作製する場合は、発現ベクターが特に有用である。例えば大腸菌内で発現させる発現ベクターは、大腸菌内で増幅するための上記の特徴を有する必要がある。JM109、DH5α、HB101、またはXL1Blueなどの大腸菌を宿主細胞として用いる場合、ベクターは、例えば、lacZプロモーター(Ward et al., Nature 341: 544-6, 1989; FASEB J 6: 2422-7, 1992)、araBプロモーター(Better et al., Science 240: 1041-3, 1988)、またはT7プロモーターなどの、大腸菌内で所望の遺伝子を効率的に発現できるプロモーターなどを有する必要がある。この点に関して、例えばpGEX-5X-1（Pharmacia）、「QIAexpressシステム」（Qiagen）、pEGFP、およびpET（この場合、宿主は好ましくはT7 RNAポリメラーゼを発現するBL21である）を上記ベクターの代わりに使用することができる。さらに、ベクターは、タンパク質分泌のためのシグナル配列を含んでもよい。大腸菌の周辺質へのタンパク質分泌を指令するシグナル配列の一例は、pelBシグナル配列である(Lei et al., J Bacteriol 169:4379-83, 1987)。ベクターを標的宿主細胞に導入するための手段には、例えば、塩化カルシウム法およびエレクトロポレーション法が含まれる。
【０１１６】
大腸菌に加え、例えば、哺乳動物由来の発現ベクター（例えば、pcDNA3（Invitrogen）およびpEGF-BOS（Mizushima S and Nagata S., Nucleic Acids Res 18: 5322, 1990）、pEF、pCDM8）、昆虫細胞由来の発現ベクター（例えば「Bac-to-BACバキュロウイルス発現系」（GIBCO BRL）、pBacPAK8）、植物由来の発現ベクター（例えば、pMH1、pMH2）、動物ウイルス由来の発現ベクター（例えば、pHSV、pMV、pAdexLcw）、レトロウイルス由来の発現ベクター（例えば、pZIpneo）、酵母由来の発現ベクター（例えば、「Pichia Expression Kit」（Invitrogen）、pNV11、SP-Q01）、およびバチルス・ズブチリス（Bacillus subtilis）由来の発現ベクター（例えば、pPL608、pKTH50）が、本発明のポリペプチドを作製するために使用され得る。
【０１１７】
CHO、COS、またはNIH3T3細胞のような動物細胞においてベクターを発現させるためには、ベクターは、そのような細胞における発現のために必要なプロモーター、例えば、SV40プロモーター（Mulligan et al., Nucleic Acids Res 277: 108, 1979）、MMLV-LTRプロモーター、EF1αプロモーター（Mizushima et al., Nucleic Acids Res 19: 5322, 1990）、CMVプロモーター等を有する必要があり、好ましくは、形質転換体を選択するためのマーカー遺伝子（例えば、薬物（ネオマイシン、G418等）によって選択される薬剤耐性遺伝子）を有する必要がある。これらの特徴を含む公知のベクターの例には、例えば、pMAM、pDR2、PBK-RSV、pBK-CMV、pOPRSV、およびpOP13が含まれる。
【０１１８】
前述のように、発現させるべきポリペプチドがFAbおよび(Fab')2断片のような抗体断片またはscFvである場合には、細菌、例えば、大腸菌およびその他の微生物の系が適切に使用される。または、真核宿主細胞発現系、例えば、哺乳動物宿主細胞発現系は、CDRグラフト抗体産物および完全抗体分子のような、より大きな本発明のポリペプチドの作製のため、特に使用され得る。適当な哺乳動物宿主細胞には、CHO細胞および骨髄腫またはハイブリドーマ細胞系が含まれる。
【０１１９】
IV. 薬学的組成物
本発明は、抗DSC2抗体が、抗体エフェクター機能を通してDSC2発現細胞を障害する（即ち、細胞を死滅させるか、細胞に対して毒性であるか、またはさもなくば細胞の増殖もしくは分裂を阻害する）、抗DSC2抗体を活性成分として含む薬学的組成物を提供する。
【０１２０】
薬学的組成物は、DSC2の発現に関連した任意の病理学的状態を処置するために使用され得る。典型的な態様において、本発明の薬学的組成物によって障害される細胞は、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の細胞のような癌細胞である。より具体的には、非小細胞肺癌（NSCLC）、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳管癌、胃の管状腺癌、肝細胞癌（HCC）が、本発明の組成物を使用して処置され得る。
【０１２１】
抗体エフェクター機能を示す限り、上記「I-2. 抗体」の項に記載された天然の抗体および修飾された抗体のうちの任意のものが、本発明の薬学的組成物のために採用され得る。単離または精製された抗体を本発明の組成物のために使用することが好ましい。本発明の薬学的組成物に含有される抗体は、典型的には、モノクローナル抗体である。しかしながら、本発明はそれに制限されず、所望のエフェクター機能を含む限り、任意の抗体が本発明の薬学的組成物のために使用され得る。好ましいエフェクター機能には、ADCC、CDC、および両方が含まれる。例えば、IgA、IgE、またはIgGのFc領域を含む抗体は、ADCCの発現のために不可欠である。同様に、IgMまたはIgGの抗体Fc領域は、CDCの発現のために好ましい。組成物に含まれる特に好ましい抗体は、IgG1の免疫グロブリンクラスに属するものである。組成物がヒトを処置するために使用される場合には、これらのクラスに属するヒト由来の抗体が、本発明において特に好ましい。
【０１２２】
さらに、一部の態様において、本発明の薬学的組成物に含まれる抗体は、公知の技術によって細胞障害性物質に連結されてもよい。多くの細胞障害性物質が当技術分野で公知であり、本発明において使用可能なものには細胞障害性薬物、毒物、およびそのような毒物の活性断片が含まれるが、これらに限定されない。適した毒物およびそれらの対応する断片は、ジフテリアA鎖、外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、クルシン、クロチン、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)、オウリスタチン(auristatin)などを含む。細胞障害性物質はまた、放射性同位体を抗体に共役することによって、または抗体に共有結合したキレート剤に放射性核種を結合させることによって作製された放射化学物質も含む。そのような結合体を調製する方法は当技術分野において周知である。
【０１２３】
本発明の薬学的組成物は、ヒトまたはその他動物に投与可能である。本発明において、組成物を投与するヒト以外の動物には、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーが含まれ得る。
【０１２４】
組成物は、既知の薬学的製剤化法を用いて剤形に製剤化される。例えば必要に応じて、水または他の任意の薬学的に許容される液体で無菌性溶液もしくは懸濁液にすることによって、非経口的に投与されうる注射可能な形態へと調製することができる。例えば、薬学的組成物に含まれるべき抗体を、許容される担体または溶媒、具体的には滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、溶剤、保存剤、結合剤などと混合して、薬剤としての使用に必要な一般に許容される単位用量にすることができる。「薬学的に許容される」という用語は、その物質が不活性であり、かつ薬物用の希釈剤またはビヒクルとして使用される従来物質を含むことを示す。適切な賦形剤およびその製剤は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed. (1980) Mack Publishing Co., ed. Oslo et al.に記載されている。
【０１２５】
生理食塩水、グルコース、およびアジュバント（D-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、および塩化ナトリウムなど）を含む他の等張性溶液を、注射用水溶液として使用することができる。これらは、アルコール、具体的にはエタノールおよびポリアルコール（例えばプロピレングリコールおよびポリエチレングリコール）、ならびに非イオン性界面活性剤（例えばポリソルベート80（商標）またはHCO-50）などの適切な可溶化剤とともに使用することができる。
【０１２６】
ゴマ油またはダイズ油を油性液体として用いることができ、これらと共に可溶化剤として安息香酸ベンジルまたはベンジルアルコールを用いてもよい。緩衝液（リン酸緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液など）、鎮痛薬（塩酸プロカインなど）、安定剤（ベンジルアルコール、フェノールなど）、および抗酸化剤を製剤に用いることができる。調製した注射液は適切なアンプルに充填することができる。
【０１２７】
または、抗体またはそれらの機能性誘導体をコードする配列を含む核酸が、遺伝子治療によって、膵臓癌、肺癌、結腸癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌のような、DSC2発現細胞に関連した疾患を処置または予防するために投与される。遺伝子治療とは、発現されたまたは発現可能な核酸を対象に投与することによって実施される治療を指す。本発明のこの態様において、核酸は、予防的または治療的な効果を媒介するコードされた抗体または抗体断片を産生する。
【０１２８】
当技術分野において利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法を、以下に記載する。
【０１２９】
遺伝子治療の方法の一般的な概説に関しては、Goldspiel et al., Clin Pharm 2: 488-505, 1993；Wu and Wu, Biotherapy 3: 87-95, 1991；Tolstoshev, Ann Rev Pharmacol Toxicol 32: 573-96, 1993；Mulligan, Science 260: 926-32, 1993；Morgan and Anderson, Ann Rev Biochem 62: 191-217, 1993；Trends Biotechnol 11(5): 155-215, 1993を参照のこと。使用され得る組み換えDNA技術の分野において一般に公知の方法は、Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY, 1993；Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY, 1990に記載されている。
【０１３０】
好ましい局面において、本発明の組成物は、抗体をコードする核酸を含み、該核酸は、適当な宿主において抗体を発現する発現ベクターの一部である。特に、そのような核酸は、抗体コーディング領域に機能的に連結されたプロモーター、好ましくは異種プロモーターを有し、該プロモーターは、誘導可能または構成性であり、任意で、組織特異的である。別の特定の態様において、ゲノム中の所望の部位における相同的組み換えを促進しかつ従って抗体コーディング核酸の染色体内発現を提供する領域が、抗体コーディング配列および任意のその他の所望の配列に隣接している、核酸分子が使用される（Koller and Smithies, Proc Natl Acad Sci USA 86:8932-5, 1989；Zijlstra et al., Nature 342:435-8, 1989）。特定の態様において、発現された抗体分子は単鎖抗体であり；または、核酸配列は、抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする配列、またはそれらの断片を含む。
【０１３１】
対象内への核酸の送達は直接的であってよく、この場合、対象が、核酸または核酸を保持しているベクターに直接曝露され、または、間接的であってもよく、この場合、細胞が、まずインビトロで核酸により形質転換され、次いで対象へ移植される。これらの二つのアプローチは、それぞれインビボまたはエクスビボの遺伝子治療として公知である。
【０１３２】
特定の態様において、核酸配列は、直接インビボ投与され、そこで、コードされた産物が産生されるよう発現される。これは、当技術分野において公知の多数の方法のうちのいずれかにより、例えば、適切な核酸発現ベクターの一部としてそれらを構築し、これらが細胞内に入るように投与することによって、例えば、欠陥もしくは弱毒化レトロウイルスベクターもしくはその他のウイルスベクターを使用した感染によって（米国特許第4,980,286号参照）、または裸DNAの直接注射によって、または微粒子銃（例えば、遺伝子銃；Biolistic,Dupont）の使用によって、または脂質もしくは細胞表面受容体もしくはトランスフェクション剤によるコーティングによって、リポソーム、微粒子、もしくはマイクロカプセルへの封入によって、または核に入ることが公知のペプチドと連結させて投与することによって、または受容体媒介性エンドサイトーシスを受けるリガンドと連結させて投与すること（例えば、Wu and Wu, J Biol Chem 262: 4429-32, 1987参照）（これは受容体を特異的に発現している細胞型を標的とするために使用され得る）等によって、達成され得る。別の態様において、核酸がリソソーム分解を回避することを可能にする、エンドソームを破壊するための融合性（fusogenic）ウイルスペプチドがリガンドに含まれている、核酸-リガンド複合体が形成され得る。さらに別の態様において、核酸は、特定の受容体を標的とすることにより、細胞特異的な取り込みおよび発現のためにインビボで標的化され得る（例えば、PCT公報WO 92/06180、WO 92/22635、WO92/20316、WO93/14188、WO 93/20221参照）。または、核酸は細胞内に導入され、相同的組み換えによって発現のため宿主細胞DNAに組み込まれてもよい（Koller and Smithies, Proc Natl Acad Sci USA 86:8932-5, 1989；Zijlstra et al., Nature 342:435-8, 1989）。
【０１３３】
特定の態様において、本発明の抗体をコードする核酸配列を含有しているウイルスベクターが使用される。例えば、レトロウイルスベクターが使用され得る（Miller et al., Methods Enzymol 217: 581-99, 1993参照）。これらのレトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正確なパッケージングおよび宿主細胞DNAへの組み込みのために必要な成分を含有している。遺伝子治療において使用すべき抗体をコードする核酸配列は、対象への遺伝子の送達を容易にする一つまたは複数のベクターへクローニングされる。レトロウイルスベクターに関するさらなる詳細は、幹細胞を化学療法に対してより耐性にするために造血幹細胞へとmdr1遺伝子を送達するためのレトロウイルスベクターの使用を記載しているBoesenら（Biotherapy 6: 291-302, 1994）に見出され得る。遺伝子治療におけるレトロウイルスベクターの使用を例示しているその他の参考文献は、以下の通りである：Clowes et al., J Clin Invest 93: 644-51, 1994；Kleim et al., Blood 83: 1467-73, 1994；Salmons and Gunzberg, Hum Gene Ther 4: 129-41, 1993；Grossman and Wilson, Curr Opin Genet Dev 3: 110-4, 1993。
【０１３４】
アデノウイルスは、遺伝子治療において使用され得るその他のウイルスベクターである。アデノウイルスは、呼吸上皮に遺伝子を送達するために、特に魅力的な媒体である。アデノウイルスは、天然に呼吸上皮に感染し、そこで軽度の疾患を引き起こす。アデノウイルスに基づく送達系のその他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞、および筋肉である。アデノウイルスは、非分裂細胞に感染可能という利点を有する。KozarskyおよびWilson（Curr Opin Genet Dev 3: 499-503, 1993）は、アデノウイルスに基づく遺伝子治療の概説を提示している。Boutら（Hum Gene Ther 5: 3-10, 1994）は、アカゲザルの呼吸上皮へと遺伝子を移入するためのアデノウイルスベクターの使用を示している。遺伝子治療におけるアデノウイルスの使用のその他の事例は、Rosenfeld et al., Science 252: 431-4, 1991；Rosenfeld et al., Cell 68: 143-55, 1992；Mastrangeli et al., J Clin Invest 91: 225-34, 1993；WO94/12649；Wang et al., Gene Ther 2: 775-83, 1995に見出され得る。好ましい態様において、アデノウイルスベクターが使用される。
【０１３５】
アデノ随伴ウイルス（AAV）もまた、遺伝子治療における使用が提唱されている（Walsh et al., Proc Soc Exp Biol Med 204: 289-300, 1993；米国特許第5,436,146号）。
【０１３６】
遺伝子治療のための別のアプローチは、エレクトロポレーション、リポフェクション、リン酸カルシウムにより媒介されるトランスフェクション、またはウイルス感染のような方法によって組織培養物中の細胞に遺伝子を移入することを含む。通常、移入の方法は、細胞への選択可能マーカーの移入を含む。次いで、移入された遺伝子を取り込みかつ発現している細胞を単離するために、細胞が、選択下に置かれる。次いで、それらの細胞が対象に送達される。
【０１３７】
この態様において、核酸は、得られた組換え細胞のインビボ投与の前に細胞へ導入される。そのような導入は、トランスフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、核酸配列を含有しているウイルスベクターまたはバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体により媒介される遺伝子移入、微小核体により媒介される遺伝子移入、スフェロプラスト融合等を含む当技術分野において公知の任意の方法によって実施され得るがこれらに制限されない。細胞への外来遺伝子の導入のための多数の技術が、当技術分野において公知であり（例えば、Loeffler and Behr, Methods Enzymol 217: 599-618, 1993；Cotten et al., Methods Enzymol 217: 618-44, 1993；Cline MJ, Pharmacol Ther 29: 69-92, 1985参照）、レシピエント細胞の必要な発達的および生理学的な機能が破壊されないことを条件として、本発明に従って使用され得る。本技術は、核酸が細胞によって発現可能であり、好ましくは遺伝性であり、その細胞子孫によって発現可能であるような、細胞への核酸の安定的な移入を提供するべきである。
【０１３８】
得られた組換え細胞は、当技術分野において公知の様々な方法によって対象に送達され得る。組換え血球（例えば、造血幹細胞または前駆細胞）が、好ましくは、静脈内に投与される。使用が想定される細胞の量は、所望の効果、患者の状態等に依り、当業者によって決定され得る。
【０１３９】
核酸が遺伝子治療の目的のために導入され得る細胞には、任意の所望の利用可能な細胞型が包含され、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、繊維芽細胞、筋細胞、肝細胞；Tリンパ球、Bリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球のような血球；様々な幹細胞または前駆細胞、特に、例えば、骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓等から入手されるような造血系の幹細胞または前駆細胞が含まれるが、これらに制限されない。好ましい態様において、遺伝子治療のために使用される細胞は、対象に対して自己由来である。
【０１４０】
組換え細胞が遺伝子治療において使用される態様においては、抗体をコードする核酸配列が、細胞またはそれらの子孫によって発現され得るように細胞へ導入され、次いで、組換え細胞が、治療効果のためインビボ投与される。特定の態様において、幹細胞または前駆細胞が使用される。単離されてインビトロで維持され得る任意の幹細胞および/または前駆細胞が、本発明のこの態様に従って使用され得る可能性を有する（例えば、WO 94/08598；Stemple and Anderson, Cell 71: 973-85, 1992；Rheinwald, Methods Cell Biol 21A: 229-54, 1980；Pittelkow and Scott, Mayo Clin Proc 61: 771-7, 1986参照）。
【０１４１】
特定の態様において、遺伝子治療の目的のために導入される核酸は、適切な転写誘導剤の存在または欠如を調節することにより核酸の発現が制御可能であるようにコーディング領域と機能的に連結された、誘導可能プロモーターを含む。
【０１４２】
薬学的組成物は、薬学的に有効な量の活性成分（本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド）を含む。化合物の「薬学的に有効な量」とは、DSC2の発現が重要な役割を果たしている障害を処置および/または予防するのに十分な量である。薬学的に有効な量の例は、患者に投与された場合に癌性組織の中のDSC2発現細胞の数を減少させ、それにより障害を処置または予防するために必要な量であり得る。減少は、例えば、少なくとも約5％、10％、20％、30％、40％、50％、75％、80％、90％、95％、99％、または100％の減少であり得る。または、薬学的に有効な量は、対象における腫瘍のサイズ、蔓延、または転移の可能性の減少に至る量であり得る。
【０１４３】
本発明の抗体のそのような薬学的に有効な量を決定するための査定は、組織病理学的な診断を含む標準的な臨床プロトコルを使用して、または慢性の咳、嗄声、喀血、体重減少、食欲不振、息切れ、喘鳴、気管支炎もしくは肺炎の反復的な発作、および胸痛のような症候性の異常の同定を通してなされ得る。
【０１４４】
利用される用量は、対象の年齢および性別、処置される正確な障害、ならびにその重篤度を含む多数の要因に依るであろう。また、投与経路も、状態およびその重篤度に依って変動し得る。しかしながら、同定された化合物の有効用量範囲の決定は、特に、本明細書に提供された詳細な開示を考慮すれば、十分に当業者の能力の範囲内にある。化合物の薬学的にまたは予防的に有効な量（用量）は、細胞培養アッセイ法および/または動物モデルから最初に推定され得る。
【０１４５】
必要であれば、抗体を含む薬学的組成物は、抗体のインビボのエフェクター機能を阻害しない限り、任意のその他の治療用物質を活性成分として含み得る。具体的に既に記述された成分に加え、製剤は、問題としている製剤の型を考慮した上で、当技術分野において慣習的なその他の薬剤を含み得ることが理解されるべきである。
【０１４６】
本発明の一つの態様において、抗体を含む薬学的組成物は、対象の病理学的状態を処置するために有用な材料を含有している製品およびキットに含まれ得る。製品は、ラベルを含む化合物のうちのいずれかの容器を含み得る。適当な容器には、ボトル、バイアル、および試験管が含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックのような多様な材料から形成されていてよい。容器表面のラベルは、疾患の一つまたは複数の状態を処置または予防するために組成物が使用されることを示しているべきである。ラベルは、投与のための説明等も示し得る。
【０１４７】
上記の容器に加え、抗体を含む薬学的組成物を含むキットは、任意で、薬学的に許容される希釈剤を収納している第二の容器を含み得る。これは、その他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、注射器、および使用のための説明を含む包装挿入物を含む、商業上および使用者の見地から望ましいその他の材料をさらに含んでいてもよい。
【０１４８】
望むならば、薬学的組成物を、活性成分を含む一つまたは複数の単位用量剤形を含みうるパックまたはディスペンサー装置内に提供してもよい。パックは例えば、金属またはブリスタパックのようなプラスチックホイルを含んでもよい。パックまたはディスペンサー装置には、投与のための説明書を添付してもよい。
【０１４９】
V. DSC2発現細胞を障害するための方法
本発明はまた、DSC2発現細胞を障害するための方法を提供する。具体的には、本方法は、DSC2発現細胞と抗DSC2抗体とを接触させる段階を含む。抗体の接触を通して、細胞は、抗体のエフェクター機能によって障害されることが予想される。
【０１５０】
本発明の方法によって、任意のDSC2発現細胞は障害されるかまたは死滅する。例えば肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の細胞は、本発明のDSC2発現細胞として好ましい。これらのうちで、非小細胞肺癌(NSCLC)、結腸直腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳管癌、胃の管状腺癌、肝細胞癌(HCC)、または細胞が好ましい。
【０１５１】
細胞と抗体はインビボまたはインビトロで接触させることができる。癌細胞をDSC2発現細胞としてインビボで標的にする場合、本発明の方法は実際には癌に対する治療法または予防法である。具体的には、本発明は、以下の段階を含む癌に対する治療法を提供する：
1) DSC2に結合する抗体を癌患者に投与する段階；および
2) 患者の癌細胞に結合した抗体のエフェクター機能によってこれらの細胞を障害する段階。
【０１５２】
上記「I-2. 抗体」の項に記載された天然の抗体および修飾抗体のいずれも、抗体エフェクター機能を示す限り、本発明の方法のために使用することができる。本発明の方法のために単離または精製された抗体を使用するのが好ましい。または、上記「IV. 薬学的組成物」の項に記載された薬学的組成物のいずれも、本発明の方法のために採用することができる。
【０１５３】
本発明において、ヒトまたは、マウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーを含むヒト以外の動物が、処置され得る。
【０１５４】
本発明において、抗体または薬学的組成物は、例えば動脈内、静脈内、もしくは経皮内、または鼻腔内、経気管支、局所、もしくは筋肉内投与によって患者に投与することができる。点滴または注射による血管内（静脈）投与は、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の患者への全身投与のための一般的な方法の例である。投与された薬剤を、肺における原発巣または転移巣に局所集積させる方法には、気管支鏡を用いた局所注入(気管支鏡検査法)、およびCTガイド下または胸腔鏡による局所注入が含まれる。薬剤を、肝臓における原発巣または転移巣に局所集積させる方法には、肝臓門脈内投与または動脈内注入を用いた局所注入が含まれる。さらに、癌細胞に栄養を供給する動脈付近まで動脈内カテーテルを挿入し、抗癌剤を局所注入する方法は、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の原発巣と同様に転移巣の局所制御治療としても有効である。
【０１５５】
用量および投与方法は、患者の体重および年齢ならびに投与方法に応じて変化するが、当業者であればこれらを日常的に選択することができる。例えば、抗DSC2抗体を、DSC2発現細胞に対するエフェクター機能に基づく細胞障害性が確認できる量で生体に投与することができる。例えば、症状によってある程度の差があるものの、抗DSC2抗体の用量は、1日当たり、0.1 mg〜250 mg/kgである。通常、成人（体重60kg）当たりの用量は、5 mg〜17.5 g/日、好ましくは5 mg〜10 g/日、およびより好ましくは100 mg〜3 g/日である。投与スケジュールとしては、2日〜10日間隔で1〜10回であり、例えば3〜6回の投与後に経過が観察される。
【０１５６】
VI. 免疫原性組成物
本発明により、抗DSC2抗体の投与が、抗体のエフェクター機能を通して、癌細胞を障害することが発見された。従って、本発明者らは、エフェクター機能を有するDSC2抗体を誘導する組成物は、エフェクター機能を有する抗体を含む本発明の薬学的組成物と等しい治療効果を有すると考えた。そのような予防接種効果は、DSC2ポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現する核酸分子を投与することによって達成され得ると予想される。従って、本発明は、DSC2発現細胞に対する少なくとも一つのエフェクター機能を有する抗体をインビボで誘導するための免疫原性組成物を提供する。本組成物は、典型的には、DSC2ポリペプチドまたは該ポリペプチドを発現する核酸分子を、活性成分として含む。ポリペプチドまたは核酸分子は、単離または精製された物質であることが好ましい。
【０１５７】
本発明の免疫原性組成物は、DSC2発現細胞に関連した疾患に対するワクチン治療において特に有用である。
【０１５８】
本発明の免疫原性組成物は、例えば、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌の治療のためのワクチン組成物として有効である。それらは、ヒト、ならびにマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、サル、ヒヒ、およびチンパンジーを含むその他の動物に対して使用され得る。
【０１５９】
本発明の免疫学的組成物に含まれるDSC2ポリペプチドは、完全なDSC2タンパク質であってもよいし、または、DSC2を認識しかつエフェクター機能を有する抗体をインビボで誘導する能力を保持している限り、それらの断片であってもよい。以下、そのような断片を、免疫学的活性断片と呼ぶ。
【０１６０】
DSC2ポリペプチドは、従来の精製技術を通して、任意の種から、好ましくは、ヒト、マウス、またはラットのような哺乳動物から、より好ましくは組成物によって処置されるべきヒトから、得られ得る。さらに、ヒトDSC2のヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は公知である（DSC2 2b型（GenBankアクセッション番号NM_004949；SEQ ID NO: 1）およびDSC2 2a型（GenBankアクセッション番号NM_024422；SEQ ID NO: 2）のcDNAヌクレオチド配列；対応するアミノ酸配列は、それぞれSEQ ID NO: 3（GenBankアクセッション番号NP_004940）および4（GenBankアクセッション番号NP_077740）に記載される）。従って、DSC2ポリペプチドを入手するためには、これらの配列情報に基づき、ポリペプチドを化学合成してもよいし、または遺伝学的に作製してもよい。例えば、当業者は、目的のヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを日常的に単離または構築し、適当な発現ベクターにその遺伝子を挿入して適当な宿主細胞を形質転換し、ポリペプチドの発現のための適当な条件の下で宿主細胞を培養することにより細胞または培養上清から標的アミノ酸配列を含むタンパク質を入手することができる。
【０１６１】
完全DSC2タンパク質の免疫学的活性断片も、上記の配列情報に基づき調製され得る。DSC2のN末端の1〜32位の領域は、シグナル配列に相当すると予測されているため（Greenwood MD. et al., Genomics 44（3): 330-5, 1997 Sep.15）、断片のためにはこの領域を回避することが好ましい。細胞外ドメイン（DSC2の144〜540位）は、本発明の組成物に含まれる免疫学的活性断片として特に好ましい。しかしながら、本発明はそれらに制限されず、はるかに短いポリペプチドが、免疫学的活性断片として採用されてもよい。
【０１６２】
さらに、DSC2ポリペプチドは、修飾された分子が、DSC2を認識しかつエフェクター機能を有する抗体をインビボで誘導する能力を有している限り、天然のDSC2タンパク質から修飾されたタンパク質であってもよい。そのような修飾には、本発明の抗体に関して既に記述されたものが含まれる。
【０１６３】
免疫原性タンパク質（完全DSC2ポリペプチド、それらの免疫学的活性断片、およびそれらの修飾された分子）に加え、本発明の免疫原性組成物は、薬学的に許容される担体を含み得る。本発明の薬学的組成物に関して言及されたものと類似の物質が、本発明の免疫原性組成物のための薬学的に許容される担体として利用され得る。必要であれば、組成物は、アジュバントと組み合わせられてもよい。死滅した結核菌、ジフテリアトキソイド、およびサポニン等が、アジュバントとして使用され得る。
【０１６４】
あるいは、免疫原性タンパク質をコードするDNA、または発現可能な状態でそれらのDNAを保持している細胞が、本発明の免疫原性組成物の活性成分として使用され得る。免疫原として標的抗原を発現するDNA、いわゆるDNAワクチンを使用する方法は、当技術分野において周知である。例えば、DNAワクチンは、完全なDSC2ポリペプチド、それらの免疫学的活性断片、またはそれらの修飾された分子をコードするDNAを、適切な発現ベクターに挿入することにより、入手され得る。
【０１６５】
ベクターとしては、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、センダイウイルスベクターなどを利用することができる。さらに、免疫原性タンパク質をコードするDNAをプロモーターの下流に機能的に連結したDNAを裸のDNAとして直接細胞に導入し、発現させることも可能である。裸のDNAは、リボソームまたはウイルスエンベロープベクターに封入して細胞に導入することができる。
【０１６６】
免疫原性タンパク質をコードするDNAまたはそれによって形質転換された細胞を、本発明の免疫原性組成物として利用する場合、これらを、免疫原性タンパク質、およびそれらの免疫原性を強化する担体タンパク質と組み合わせることができる。より詳細には、抗体またはその機能的誘導体をコードする配列を含む核酸を含有する薬学的組成物の説明を参照することができる。
【０１６７】
所与のポリペプチドまたはポリヌクレオチドがインビボにおいて該ポリペプチドに対する抗体を誘導するかどうかは、実際に動物を免疫し、誘導される抗体の活性を確認することによって判定することができる。同様に、ポリペプチドによる抗腫瘍免疫の誘導は、該ポリペプチドで免役された動物における腫瘍に対する抗体産生の誘導を観察することにより確認できる。例えば、ポリペプチドによって免疫された実験動物において該ポリペプチドに対する抗体を誘導させた場合、腫瘍細胞増殖の抑制によって、該ポリペプチドが抗腫瘍免疫の誘導能を有することが示される。ポリペプチドの抗体誘導能および、誘導された抗体の特性の確認は、例えば実施例に記載の方法によって実施することができる。
【０１６８】
VII. 免疫応答の誘導
更に本発明は、インビボにおいてDSC2発現細胞に対する少なくとも一つのエフェクター機能を有する抗体を誘導する方法を提供する。詳細には、本方法は、上述した本発明の免疫原性組成物を対象に投与する段階を含む。例えば、本発明の免疫原性組成物を、一日あたり0.1 mg〜250 mg/kgで、経口または非経口的に投与することができる。非経口投与には、皮下注射および静脈注射が含まれる。成人1人あたりの投与量は、通常、5 mg〜17.5 g/日、好ましくは5 mg〜10 g/日、およびより好ましくは100 mg〜3 g/日である。
【０１６９】
本方法は、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、または肝臓癌などの、DSC2発現細胞に関連する疾患を処置するために使用されうる。
【０１７０】
更に、DSC2ポリペプチドおよび該ポリペプチドをコードする核酸分子を、DSC2ポリペプチドに対する抗体の産生以外に、インビボにおける免疫応答の誘導のために用いることもできる。すなわち、インビボまたはエクスビボのいずれにおいても、あるタンパク質に特異的な細胞障害性Tリンパ球（CTL）を、抗原提示細胞（APC）を介してT細胞に該タンパク質を提示することによって誘導できることが知られている。したがって、同様に、CTLを誘導するために、インビボまたはエクスビボのいずれかにおいてDSC2ポリペプチドをT細胞に提示してもよい。そのような免疫応答の誘導のためには、精製または単離されたポリペプチドまたは核酸分子を使用することが好ましい。
【０１７１】
例えば、末梢血単核球(PBMC)のような患者の血液細胞を収集し、免疫原性タンパク質を発現するベクターで形質転換し、患者に戻すことができる。形質転換された血液細胞は、患者の体内で免疫原性タンパク質を産生し、目的の抗体を誘導する。
【０１７２】
または、患者のPBMCを採取し、該細胞をエクスビボで免疫原性タンパク質に接触させ、APCまたはCTLの誘導後、APCまたはCTLを対象に投与してもよい。さらに、必要ならば、インビトロで誘導されたAPCまたはCTLを、投与前にクローニングすることができる。標的細胞を障害する活性の高い細胞をクローニングして増殖させることで、細胞免疫療法を、より効果的に実施することができる。さらに、このようにして単離されたAPCおよびCTLを、細胞が由来する個体に対してのみならず、類似のタイプの腫瘍を有する他の個体に対する細胞免疫療法のために用いてもよい。
【０１７３】
一般的に、細胞免疫療法のためにポリペプチドを用いる場合、異なる構造を有する複数のポリペプチドを混合し、APC、特に樹状細胞に接触させることによって、CTL誘導効率が増加することが知られている。したがって、APCをタンパク質断片によって刺激する場合、複数のタイプの断片の混合物を用いることが有利である。
【０１７４】
本明細書において引用された全ての先行技術文献は、その全体が参照により組み入れられる。
【０１７５】
発明の実施のための最良の形態
以下、実施例に基づいて本発明をさらに説明する。しかし、本明細書記載の材料、方法などは、単に本発明の局面を説明するものであり、決して本発明の範囲を制限することを意図するものではない。よって、本明細書記載の方法および材料などと類似したまたは同等である材料および方法などを、本発明の実施または試行において使用してもよい。
【０１７６】
(1）細胞系
ヒトの肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌の細胞系を、10%ウシ胎仔血清を添加した適切な培地中で、単層として増殖させた。実験に用いた細胞系を表1に示す。
【０１７７】
【表１】
2008539693.tif 000002
2008539693.tif 000003
*1 F-12栄養混合物(HAM)
*2 ダルベッコ改変イーグル培地
*3 イーグル最低必須培地
*4 ライボビッツL-15培地
*5 マッコイ改変5A培地
*6 東北大学 加齢医学研究所 医用細胞資源センター
【０１７８】
さらに、抗DSC2抗体によるADCCアッセイ法において以下の細胞系を用いた：
非小細胞肺癌(NSCLC): NCI-H358;
結腸腺癌: HT-29;
膵臓癌: KLM-1;
前立腺癌: LNCap FGC;
乳管癌: T47D;
胃管腺癌: MKN-7;および
肝細胞癌(HCC): HepG2。
【０１７９】
(2) 抗体の作製
(2-1) ポリクローナル抗体
標準のプロトコールに従い、細菌内で発現させたHisタグ付加融合タンパク質を免疫原として用いて、個々のタンパク質特異的ポリクローナル抗体を産生させた。これらの融合タンパク質は、該タンパク質の特異的部分（144〜540残基）に相当するタンパク質部分を含んだ。
【０１８０】
(2-2）モノクローナル抗体
まず、モノクローナル抗体を入手するため、それぞれDSC2のドメイン（アミノ酸1〜901に相当する）および細胞外ドメイン（即ち、アミノ酸1〜688に相当する分泌型抗原DSC2-s）をコードする抗原コーディング遺伝子を、正常な肺cDNAから増幅した。プライマーは、以下のように設計された：
DSC2に対して
5'-AATATTAATTAACTCCATGGAGGCAGCCC-3' (SEQ ID NO: 5) および
5'-ATCGGGATCCTCTCTTCATGCATGCTTCTGCTA-3' (SEQ ID NO: 6);
DSC2-sに対して
5'-AATATTAATTAACTCCATGGAGGCAGCCC-3' (SEQ ID NO: 5) および
5'-AATAGGATCCTCCACCGCCAATCC-3' (SEQ ID NO: 7)。
【０１８１】
PCR産物を、それぞれ、発現ベクターpQCXIP（Clontech）で修飾されたpQCXmHIPG（myc-Hisドメイン、EGFP、およびIRES-ピューロマイシンドメインを含む）へサブクローニングした。プラスミドを、それぞれ、DSC2に関してはpQC/DSC2mH/IPG、DSC2-sに関してはpQC/DSC2-s/IPGと名付けた。
【０１８２】
DSC2の組換えタンパク質を作製するため、製造業者の説明書に従ってLipofectamine 2000（Invitrogen）を使用して、293T細胞をプラスミドpQC/DSC2mH/IPGにより一過性トランスフェクションし、48時間のインキュベーションの後、293T細胞を採集した。
【０１８３】
他方、分泌型組換えタンパク質DSC2-sを作製するため、製造業者の説明書に従ってPantropic Retroviral Expression System（Clontech）を使用して、細胞系を確立した。具体的には、GP2-293細胞を、pQC/DSC2-s/IPGおよびpVSV-G（Clontech）により同時トランスフェクションした。48時間のインキュベーションの後、ウイルスを含有している上清を遠心分離した。沈殿物をTNE溶液（Tris-HCl（pH7.8）、130mM NaCl、1mM EDTA）に再懸濁させることにより、レトロウイルスベクター溶液を調製した。10％FBSが補足された8μg/mL臭化ヘキサジメトリン（SIGMA）含有DMEMによって希釈されたレトロウイルスベクター溶液を使用して、293T細胞をpQC/DSC2-s/IPGによりトランスフェクションした。pQC/DSC2-s/IPGによりトランスフェクションされた293T細胞すなわちDSC2-s/293Tの選択を、5μg/mLピューロマイシン（SIGMA）を使用して実施した。DSC2-s/293T培養上清中のHisタグ付加タンパク質を、TALON精製キット（Clontech）を使用して精製した。
【０１８４】
DSC2による動物の免疫化は、PBSに懸濁した、DSC2によりトランスフェクションされた293T細胞2.5×106個を、4週齢雌BALB/cマウスへと免疫化することにより達成された。細胞免疫化の前に、完全フロイントアジュバント（Mitsubishi Kagaku Iatron, Inc.）中に乳化されたPBSによりマウスを免疫化した。または、DSC2-sによる免疫化のため、4週齢雌BALB/cマウスを、完全フロイントアジュバント中に乳化されたDSC2-s精製抗原により免疫化した。
【０１８５】
それぞれ、2日間隔の3回の免疫化の後、DSC2によりトランスフェクションされた293T細胞またはDSC2-s精製抗原を含むPBSにより、マウスを免疫化した。次いで、免疫化されたマウスのリンパ節から細胞を採集し、骨髄腫細胞系P3U1と融合させた。フローサイトメトリーを使用した選択およびその後の限界希釈による単細胞クローニングによって、ハイブリドーマをサブクローニングした。単離されたハイブリドーマの細胞培養物上清の中の抗体を、免疫沈降分析によって確認した。陽性クローンからの抗体含有上清を、DSC2過剰発現細胞系H358上に発現されたDSC2細胞外ドメインに対する相対結合親和性に関してELISAによって試験した。DSC2に対する抗体（アミノ酸1〜901に相当する）を48-5と設計し、DSC2-sに対する抗体（アミノ酸1〜688に相当する）をs10-4と設計した。
【０１８６】
(2-3）ヒト化キメラ抗体
それぞれ、マウスモノクローナル抗体48-5およびs10-4に基づくヒト化キメラ抗体ch48-5およびchs10-4を、以前に報告された方法（Alvin Y Liu et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 3439-43, 1987；Mitchel E Reff et al., Blood 83(2): 435-45, 1994）に従って調製した。具体的には、RNeasy Mini Kit（QIAGEN, 74104）によって、マウス48-5またはs10-4ハイブリドーマ細胞から全RNAを抽出し、次いで、GenenRacer（商標）キット（Invitrogen, L1502-02）を使用して、一本鎖cDNAへと逆転写した。鋳型としてのこのcDNAおよび以下のプライマーセットを使用したPCRによって、抗体の可変領域（Fab）をコードする遺伝子を決定した：
5'プライマー: GeneRacer（商標）キットの5'プライマー ; ならびに
3'プライマー: CH1(IgG2a)に対する5'-AATTTTCTTGTCCACCTTGGTG-3' (SEQ ID NO: 24) および
CL1(κ)に対する5'-CTAACACTCATTCCTGTTGAAGCTCT-3' (SEQ ID NO: 25)。
入手された産物を、クローニングし、配列分析に供した。
【０１８７】
その結果、マウスIg L鎖可変領域およびH鎖可変領域のアミノ酸配列が、以下のように決定された：
48-5のH鎖可変領域: MDSRLNLVFLVLILKGVQCDVQLVESGGGLVQPGGSRKLSCAASGFTFSSFGMHWVRQAPEKGLEWVAYISSGSSTIYYADTVKGRFTISRDNPKNTLFLQMTSLRSEDTAMYYCARVHYYYFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 20)、および
L鎖可変領域: MRPSIQFLGLLLFWLHGAQCDIQMTQSPSSLSASLGGKVTITCKASQDINKYIAWYQHKPGKGPRLLIHYTSTLQPGIPSRFSGSGSGRDYSFSISNLEPEDIATYYCLQYDNLWTFGGGTKL (SEQ ID NO: 21); ならびに
s10-4のH鎖可変領域: MAWVWTLLFLMAAAQSIQAQIQLVQSGPELKKPGETVKISCKASGYTFTDYSMHWVKQAPGKGLKWMGWINTETGEPTYADDFKGRFAFSLETSASTAYLQINNLKNEDTATYFCARWLLFDYWGQGTTLTVSS (SEQ ID NO: 22)、および
L鎖可変領域: MESQTQVLMFLLLWVSGACADIVMTQSPSSLAMSVGQKVTMSCKSSQSLLNSSNQKNYLAWYQQKPGQSPKLLVYFASTRESGVPDRFIGSGSGTDFTLTISSVQAEDLADYFCQQHYSTPLTFGAGTKL (SEQ ID NO: 23)。
【０１８８】
可変領域の各々に対応する遺伝子をPCRによって増幅し、NotI-BamHIブラケットを使用して、抗体発現カセットベクターへとクローニングした。可変領域遺伝子の発現がCMVプロモーターによって制御されるレトロウイルスベクターを、抗体発現カセットベクターとして使用した。H鎖発現のためのベクターは、ハイグロマイシン耐性遺伝子（SEQ ID NO: 85）を含有しており、L鎖発現のためのベクターは、ピューロマイシン耐性遺伝子（SEQ ID NO: 86）を含有していた。
【０１８９】
48-5およびs10-4それぞれについて、H鎖およびL鎖を発現するベクターを、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）細胞へと同時トランスフェクションした。細胞を、500μg/mlハイグロマイシンおよび10μg/mlピューロマイシンを含有しているF-12培地を使用して選択し、培地を無血清培地（CHO-S-SFM；GIBCO, 12052-098）に交換し、培養上清中に含有されていたキメラ抗体を、プロテインAカラムを介して精製した。
【０１９０】
(2-4）ヒト抗体
(i）培養細胞を使用したファージ発現ライブラリのスクリーニング
DSC2に対するヒトscFV抗体のスクリーニングを、抗体研究所（IFA；名古屋、日本）において作製されたヒトscFV抗体をコードするファージライブラリを使用して達成した。具体的には、DSC2に対するヒトscFV抗体のスクリーニングが、JP-A 2005-185281に記載された方法に従い、ヒトscFV抗体をコードするファージライブラリAIMS4（WO 01/062907）を使用して実施された。
【０１９１】
より具体的には、一次スクリーニングを以下のように実施した。DSC2の高発現を示すMIAPaca-2細胞を、15cmディッシュ上で培養し、2mg/mlコラゲナーゼIおよび細胞解離緩衝液（いずれも、Gibco BRL）の添加により採集し、冷PBSにより洗浄した。ヒト抗体ファージライブラリ（2×1013cfu）の溶液を細胞4×107個と混合し、BSAおよびNaN3/MEMを、それぞれ1％および0.1％の最終濃度で添加し、最終容量を1.6mlに調整した。その混合物を、4℃で4時間、穏和に撹拌し、2本のチューブへ等しい容量で分配し、有機溶液（フタル酸ジブチル：シクロヘキサン＝9：1）へ注入し、3,000rpmで2分間遠心分離した。上清を除去し、ペレット（細胞）を0.7mlの1％BSA/MEMに再懸濁させ、等しい容量の低極性溶媒で遠心分離した。この工程を2回繰り返した。上清を除去し、細胞を0.3mlのPBSに再懸濁させ、液体窒素により凍結させ、細胞内のファージを入手するために37℃で融解させた。
【０１９２】
これらのファージを、20mlの大腸菌DH12S（OD＝0.5）に1時間感染させた。感染細胞を、600mlの2×YTGA培地（2×YT、200μg/ml硫酸アンピシリン、1％グルコース）に移し、30℃で一晩培養した。その10mlアリコートを、200mlの2×YTA培地（2×YT、200μg/ml硫酸アンピシリン）に添加し、37℃で1.5時間培養した。さらなるインキュベーションの後、1×1011個のヘルパーファージKO7を添加し、37℃で1時間さらに培養した。800mlの2×YTGAK（2×YT、200μg/ml硫酸アンピシリン、0.05％グルコース、50μg/mlカナマイシン）を添加し、30℃で一晩培養した。培養物を8,000rpmで10分間遠心分離し、上清を200mlのPEG液（20％ポリエチレングリコール6000、2.5M NaCl）と混合し、8,000rpmで10分間遠心分離した。ファージはペレットに含有されており、ペレットを、10mlのPBSに懸濁させ、その一部を、ファージにより感染された大腸菌の数を調査するために使用した。
【０１９３】
二次スクリーニングは、0.8mlの反応溶液（1％BSA、0.1％NaN3/MEM）、培養細胞2×107個、および一次スクリーニングにおいてスクリーニングされた1×1010個のファージを使用して、一次スクリーニングと同様に実施された（混合物の全容量は、一次スクリーニングにおいて使用されたものの半分であった）。
【０１９４】
三次スクリーニングは、DSC2によりトランスフェクションされた293T細胞2×107個および二次スクリーニングにおいてスクリーニングされたファージが使用されたことを除き、二次スクリーニングと同様に実施された。
【０１９５】
(ii）DNA配列決定および発現確認
スクリーニングされた大腸菌を希釈し、100μg/mlのアンピシリンが補足された寒天培地上で培養した。入手されたコロニーを選出し、2×YTGA培地中で30℃で一晩インキュベートした。
【０１９６】
1. 配列決定のため、PI-50（Kanebo）により培養物からDNAを入手し、ヌクレオチド配列をジデオキシ法によって決定した。
【０１９７】
2. タンパク質の発現は、cp3融合タンパク質の発現として検出された。具体的には、0.05mlの培養物を、1.2mlの2×YTAI（2×YT、200μg/ml硫酸アンピシリン、0.5mM IPTG）に添加し、30℃でインキュベートした。上清を、15,000rpmで5分間の遠心分離によって収集し、37℃で2時間、Maxisorp（商標）high protein-binding capacity ELISAプレート（NUNC）上で反応させた。プレート上の溶液を吸引した後、プレート上の抗体を、37℃で2時間5％BSAによりブロッキングし、ブロッキング溶液を除去した。0.05％Tween/PBSにより1：2,000に希釈されたウサギ抗cp3抗体（MBL）をプレートに添加し、室温で1時間反応させ、プレートをPBSにより洗浄した。同様に、0.05％Tween/PBSにより1：2,000に希釈されたHRPタグ付加ヤギ抗ウサギIgG抗体（MBL）をプレートに添加し、室温で1時間反応させ、プレートをPBSにより洗浄した。100μlのOPD溶液をプレートに添加し、室温で15分間反応させ、2M硫酸アンモニウムの添加によって反応を止めた。SPECTRAmax340PC（Molecular Devices）により492nmで吸光度を測定することにより、融合タンパク質を検出した。
【０１９８】
(iii）フローサイトメトリー
フローサイトメトリー分析により、ヒトscFV抗体の二つのクローンである、クローン332および545が、抗原に陽性に反応することが確認された。これらの二つのクローンは、以下のアミノ酸配列からなっていた：
クローン332の重鎖: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGNYWSWIRQPPGKGLEWIGEINHSGNTKYNPSLKSRVAISADTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARVPFDWFHPPGEPPFYYYYGMDVWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO:16)、および軽鎖: HVILTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGTAPKLLIYGNSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGWVFGGGTKLTVPG (SEQ ID NO:17); ならびに
クローン545の重鎖: QVQLQQWGAGLLKPSETLSLTCAVYGGSFSGYFWSWIRQAPGKGLEWIGEINHSGSTSYNPSLKSRVTMTIDTSRKQFSLKLSSVTAADAAVYYCARGQGYYSSLDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO:18)、および軽鎖: SYELTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNTVNWYQQLPGTAPKLLIYSNNQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLQSEDEADYYCAAWDDSLNGVVFGGGTKLTVLG (SEQ ID NO:19)。
これらのヒトscFV抗体は、IFAにおいて完全なIgG型に変換された。
【０１９９】
(3) DSC2およびc-erbB2に対する半定量的RT-PCR
全RNAはRNeasy(登録商標)キット(QIAGEN)を用いて細胞系から抽出した。さらに、、オリゴ(dT)-セルロースカラム(Amersham Biosciences)によって全RNAからmRNAを精製し、SuperScript First-Strand Synthesis System (Invitrogen)を用いて、逆転写(RT)によってファーストストランドcDNAへと変換した。GAPDHを定量対照としてモニタリングすることにより、その後のPCR増幅のために各ファーストストランドcDNAの適切な希釈物を調製した。用いたプライマー配列は以下の通りである：
DSC2に対して
5'-GTGCCTGTCTTCAATTCACAA-3' (SEQ ID NO:8) および
5'-TCTGATTCAGGGAGTGCGAA-3' (SEQ ID NO:9)、
c-erbB2に対して
5'-GTATTTGATGGTGACCTGGGAAT-3' (SEQ ID NO:10) および
5'-CCCCTGGGTCTTTATTTCATCT-3' (SEQ ID NO:11)、
GAPDHに対して
5'-GTCAGTGGTGGACCTGACCT-3' (SEQ ID NO:12) および
5'-GGTTGAGCACAGGGTACTTTATT-3' (SEQ ID NO:13)、ならびに
β-アクチンに対して
5'-GAGGTGATAGCATTGCTTTCG-3' (SEQ ID NO:14) および
5'-CAAGTCAGTGTACAGGTAAGC-3' (SEQ ID NO:15)。
【０２００】
全てのPCR反応が、94℃で2分の最初の変性、94℃で30秒、58℃で30秒、および72℃で1分のサイクル、ならびにアニーリング工程を含んでおり、これらはGeneAmp PCRシステム9700（PE Applied Biosystems）で実施された。反応は、GAPDHおよびc-erbB2についてそれぞれ21および32のサイクルを含んでおり、これらの遺伝子についてアニーリング温度は、62℃から58℃へと徐々に低下させた。β-アクチンについては、反応は20サイクルを含んでおり、アニーリング温度は62℃から57℃へと徐々に低下させ、DSC2については、反応は30サイクルであり、62℃から56℃に徐々に低下させた。
【０２０１】
DSC2の過剰発現は、肺癌細胞系NCI-H358に見出された（図1A）。さらに、様々な癌に対する抗DSC2ポリクローナル抗体（BB049）の効力を解明するために、DSC2の発現を確認した。DSC2の過剰発現は、結腸癌細胞系HT-29、膵臓癌細胞系KLM-1、前立腺癌細胞系LNCap FGC、乳癌細胞系T47D、胃癌細胞系MKN7、および肝臓癌細胞系HepG2において検出された（図1B〜G）。
【０２０２】
(4）フローサイトメトリー分析
癌細胞（5×106個）を、精製されたポリクローナル抗体（pAb：BB049）、モノクローナル抗体（mAb）、ウサギIgG（pAbの対照）、またはマウスIgG（mAbの対照）と共に4℃で30分間インキュベートした。細胞を、リン酸緩衝液（PBS）により洗浄し、次いでFITC標識Alexa Fluor 488の中で4℃で30分間インキュベートした。細胞をPBSで再び洗浄し、フローサイトメーター（FACSCalibur（登録商標）, Becton Dickinson）で分析し、次いで、BD CellQuest（商標）Proソフトウェア（Becton Dickinson）によって分析した。平均蛍光強度（MFI）を、フローサイトメトリー強度の比率（各タンパク質特異的抗体による強度/ウサギIgGによる強度）として定義した。
【０２０３】
DSC2過剰発現細胞を使用して、細胞表面に対する抗DSC2抗体の結合割合を調査した。その結果、NCI-H358、HT-29、KLM-1、LNCap FGC、T47D、MKN7、およびHepG2細胞の表面に対する抗DSC2ポリクローナル抗体BB049の結合割合（それぞれMFI：82.8、56.8、47.8、15.8、92.2、51.8、および20.7）は、ウサギIgG（対照）の結合割合よりも高かった。さらに、NCI-H358細胞表面上の抗DSC2マウスモノクローナル抗体48-5およびs10-4の結合割合（それぞれMFI：10.0および11.1）は、マウスIgG（対照）の結合割合よりも高く、NCI-H358細胞表面上の抗DSC2ヒト-マウスキメラ抗体ch48-5およびchs10-4の結合割合（それぞれMFI：34.3および54.8）は、マウスIgG（対照）の結合割合よりも高く、かつNCI-H358細胞表面に対する抗DSC2ヒト抗体332および545の結合割合（それぞれMFI：9.48および5.52）は、ヒトIgG（対照）の結合割合よりも高かった。
【０２０４】
(5) ADCCアッセイ法
標的細胞を、37℃で30分間、0.8μMのカルセインアセトキシメチルエステル(カルセイン-AM、DOJINDO)に曝露した。カルセイン-AMは、蛍光性誘導体カルセインを産生する細胞性エステラーゼによるカルセイン-AMの開裂後に、蛍光性となる。アッセイ法に加える前に標的癌細胞を2回洗浄し、その後、96ウェルU底プレートに播種した（4×103細胞/ウェル）。ヒト末梢血単核細胞（PMBC）を健常人から採取し、Ficoll-Paque(Amersham Biosciences)密度勾配遠心分離により分離し、その後、エフェクター細胞として使用した。BB049抗DSC2ポリクローナル抗体（2μg/ウェル）または対照抗体Herceptin（2μg/ウェル；Roche）と共に、標的癌細胞(T)およびエフェクター細胞(E)を、様々なE:T比（200:1、100:1、50:1、25:1、12.5:1、および6.25:1）で、96ウェルプレート内、AIM-V培地250μl中で同時インキュベーションした。このインキュベーションは、250μLのAIM-V培地(Life Technologies, Inc)中で、37℃で6時間、3通り行った。対照アッセイ法には、抗DSC2ポリクローナル抗体BB049またはエフェクター細胞のみと標的細胞とのインキュベーションを含んだ。Herceptinは、いくつかの実験における対照として用いた。
【０２０５】
これらの細胞に対する抗DSC2ポリクローナル抗体(BB049)のADCC作用を、IN Cell Analyzer 1000(Amersham Bioscience)を用いて迅速入手可能な生細胞の蛍光画像に基づいて評価した。蛍光性物質を計数することによって、またはDeveloper tool ver.5.21ソフトウェア(Amersham Bioscience)を用いることによって、これらの画像を生細胞数(MKN7に関しては細胞面積)として数値的に変換した。
【０２０６】
Herceptinは、いくつかの実験において対照として用いた(図2Aおよび2B)。BB049抗DSC2ポリクローナル抗体自身によるNCI-H358、HT-29、KLM-1、LNCap FGC、T47D、MKN7、およびHepG2細胞の直接細胞障害性は観察されなかった。しかし、BB049は、DSC2を低発現したSK-LU-1細胞に対して何の効果も生じなかった(図3H)にもかかわらず、DSC2を過剰発現したNCI-H358、HT-29、KLM-1、LNCap FGC、T47D、MKN7、およびHepG2細胞におけるADCCを誘導した（図3A〜G）。
【０２０７】
DSC2過剰発現細胞系NCI-H358に対する抗DSC2マウスモノクローナル抗体48-5およびs10-4のADCC効果を評価した。上述のように、標的細胞およびエフェクター細胞を調製した。E：T比100：1という条件下で、様々な濃度（48-5については0、0.5、1.0、5.0、10.0、および21.0μg/ウェル；s10-4については0、0.5、2.0、8.0、16.0、および35.0μg/ウェル）で、48-5およびs10-4は、NCI-H358細胞においてADCCを誘導した（図4）。抗DSC2モノクローナル抗体（48-5およびs10-4）によるNCI-H358細胞への直接的な細胞障害性は観察されなかった。
【０２０８】
DSC2過剰発現細胞系NCI-H358に対する抗DSC2ヒト-マウスキメラ抗体ch48-5およびchs10-4のADCC効果を評価した。上述のように、標的細胞およびエフェクター細胞を調製した。E：T比100：1という条件下で、様々な濃度（0、0.05、0.1、5.0、および0.15μg/ウェル）で、ch48-5およびchs10-4は、NCI-H358細胞におけるADCCを誘導した（図5）。抗DSC2ヒト-マウスキメラ抗体（ch48-5およびchs10-4）によるNCI-H358細胞への直接的な細胞障害性は観察されなかった。
【０２０９】
DSC2過剰発現細胞系NCI-H358に対する抗DSC2ヒト抗体332および545のADCC効果を評価した。上述のように、標的細胞およびエフェクター細胞を調製した。E：T比100：1という条件下で、様々な濃度（0.001、0.01、0.1、1.0、10、および100μg/ウェル）で、332および545はNCI-H358細胞におけるADCCを誘導した（図6）。抗DSC2ヒト抗体（332および545）によるNCI-H358細胞への直接的な細胞障害性は観察されなかった。
【０２１０】
産業上の利用可能性
本発明は、抗体の細胞障害性を利用することにより、DSC2発現細胞を障害することができるとの発見に、少なくとも一部基づくものである。DSC2遺伝子の強い発現は、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌において、本発明者らによって同定された。本明細書において、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌の細胞系に対する抗DSC2抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞障害性（ADCC）の効果を証明する結果が提示されている。従って、本発明の抗体、組成物、および方法は、DSC2発現に関連する疾患、例えば、肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、乳癌、胃癌、および肝臓癌を処置するための新規のアプローチを提供する。
【０２１１】
本発明は、特定の態様に関して詳細に記載されたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく、様々な変更および修飾がなし得るものであり、本発明の境界および範囲は添付の特許請求の範囲によって設定されることが、当業者にとっては明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１】癌細胞におけるDSC2遺伝子に関する半定量的RT-PCR分析の結果を示す。パネルA：肺癌細胞系；パネルB：結腸癌細胞系；パネルC：膵臓癌細胞系；パネルD：前立腺癌細胞系；パネルE：乳癌細胞系；パネルF：胃癌細胞系；パネルG：肝臓癌細胞系。乳癌に対するHerceptin標的遺伝子c-erbB2遺伝子の発現量が、陽性対照としてパネルAに示されている。
【図２】NCI-H358により過剰発現されたc-erbB-2遺伝子（A）およびSK-LU-1により低発現されたc-erbB-2遺伝子（B）に対するHerceptinを使用したADCCアッセイ法の結果を示す。
【図３】それぞれ、DSC2を過剰発現している肺癌細胞系NCI-H358（A）、結腸癌細胞系HT-29（B）、膵臓癌細胞系KLM-1（C）、前立腺癌細胞系LNCap FGC（D）、乳癌細胞系T47D（E）、胃癌細胞系MKN-7（F）、および肝臓癌細胞系HepG2（G）、ならびにDSC2を低発現している肺癌細胞系SK-LU-1（H）に対する、抗DSC2ポリクローナル抗体BB049を使用したADCCアッセイ法の結果を示す。
【図４】DSC2を過剰発現している肺癌細胞系NCI-H358に対する、抗DSC2マウスモノクローナル抗体48-5（A）および抗体s10-4（B）を使用したADCCアッセイ法の結果を示す。
【図５】それぞれDSC2を過剰発現および低発現している肺癌細胞系であるNCI-H358およびSK-LU-1に対する、Herceptinならびに抗DSC2ヒト-マウスキメラ抗体ch48-5およびs10-4を使用したADCCアッセイ法の結果を示す。
【図６】それぞれDSC2を過剰発現および低発現している肺癌細胞系であるNCI-H358およびSK-LU-1に対する、Herceptinならびに抗DSC2ヒト抗体332および545を使用したADCCアッセイ法の結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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