(57)【要約】  本発明は、増強されたレベルの蛋白質およびアミノ酸を持つトウモロコシ植物および種子に関する。また、本発明は、アスパラギンシンテターゼ酵素の遺伝子組換えトウモロコシ細胞における発現を供するＤＮＡ構築体に関する。ＤＮＡ構築体は、遺伝子組換えトウモロコシ植物および種子を生成する、ならびに増強されたレベルの蛋白質およびアミノ酸を持つ植物および種子を選択する方法に用いられる。
2008539784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異種アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種ＤＮＡ構築体をそのゲノムに含む増加した蛋白質レベルを持つ遺伝子組換えトウモロコシ種子であって、ここに、該種子はそのゲノムに該ＤＮＡ構築体を含まない同一品種の種子の蛋白質レベルに対し増加した蛋白質レベルを有する該トウモロコシ種子。
【請求項２】
該ポリヌクレオチドが、 
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６または配列番号：１７の配列を含む核酸配列；
（ｂ）  配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のポリペプチド配列をコードする核酸配列；および
（ｃ）約０.２×ＳＳＣおよび６５℃の高ストリンジェンシー条件下、（ａ）もしくは（ｂ）の配列またはその相補体にハイブリダイズする核酸配列よりなる群から選択される核酸配列を含む請求項１記載の遺伝子組換えトウモロコシ種子。
【請求項３】
該異種アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドが、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８を含む請求項１記載の遺伝子組換えトウモロコシ種子。
【請求項４】
該ポリヌクレオチドが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６または配列番号：１７の核酸配列を含む請求項１記載の遺伝子組換えトウモロコシ種子。
【請求項５】
該異種アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドが、トウモロコシＡｓｎＳ２ポリペプチドである請求項１記載の遺伝子組換えトウモロコシ種子。
【請求項６】
該プロモーターがコメアクチン１プロモーターである請求項１記載の遺伝子組換えトウモロコシ種子。
【請求項７】
異種アスパラギンシンテターゼをコードするポリヌクレオチドに作動可能に連結されたプロモーターを含む異種ＤＮＡ構築体をそのゲノムに含む増加したアスパラギンレベルを持つ遺伝子組換えトウモロコシ植物であって、ここに、該植物はそのゲノムに該ＤＮＡ構築体を含まない同一品種の植物のアスパラギンレベルに対し増加したアスパラギンレベルを有する該トウモロコシ植物。
【請求項８】
異種アスパラギンシンテターゼをコードする該ポリヌクレオチドが、
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６または配列番号：１７の配列を含む核酸配列；
（ｂ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のポリペプチド配列をコードする核酸配列；および
（ｃ）約０.２×ＳＳＣおよび６５℃の高ストリンジェンシー条件下、（ａ）もしくは（ｂ）の配列またはその相補体にハイブリダイズする核酸配列よりなる群から選択される核酸配列を含む請求項７記載の遺伝子組換えトウモロコシ植物。
【請求項９】
該アスパラギンシンテターゼが、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８を含む請求項７記載の遺伝子組換えトウモロコシ植物。
【請求項１０】
該ポリヌクレオチドが、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６または配列番号：１７の配列を含む請求項７記載の遺伝子組換えトウモロコシ植物。
【請求項１１】
該プロモーターが、コメアクチン１プロモーターである請求項７記載の遺伝子組換えトウモロコシ植物。
【請求項１２】
ａ）アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結されたトウモロコシ細胞に機能的なプロモーター分子を含む異種ＤＮＡ構築体でトウモロコシ細胞を形質転換し；
ｂ）トウモロコシ細胞を無傷のトウモロコシ植物に再生し；
ｃ）該ＤＮＡ構築体で形質転換しないトウモロコシ植物組織に対し組織における増加したアスパラギンを有するトウモロコシ植物を選択し；
ｄ）トウモロコシ植物を成熟まで生長させ；次いで、
ｅ）トウモロコシ植物から種子を収穫することを含むことを特徴とする増加したアスパラギンを持つ遺伝子組換えトウモロコシ植物の生成方法。
【請求項１３】
該ＤＮＡ分子が、
（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６または配列番号：１７の配列を含む核酸配列；
（ｂ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のポリペプチド配列をコードする核酸配列；および
（ｃ）約０.２×ＳＳＣおよび６５℃の高ストリンジェンシー条件下、（ａ）もしくは（ｂ）の配列またはその相補体にハイブリダイズする核酸配列よりなる群から選択される核酸配列を含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
該アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドが、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のアミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
該ＤＮＡ分子が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６または配列番号：１７の核酸配列を含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１６】
さらに、ｆ）増加した蛋白質を持つ種子を選択する工程を含むことを特徴とする請求項１２記載の方法。
【請求項１７】
コーンミールが、異種アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子に作動可能に連結されたプロモーター分子を含む異種ＤＮＡ構築体を含む他のコーンミールに対し増加した蛋白質を持つコーンミール。
【請求項１８】
該トウモロコシアスパラギンシンテターゼ・ポリペプチドが、トウモロコシＡｓｎＳ２ポリペプチドである請求項１７記載のコーンミール。
【請求項１９】
該ＤＮＡ分子が、配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１０、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、配列番号：１５、配列番号：１６または配列番号：１７の配列を含む請求項１７のコーンミール。
【請求項２０】
該ＤＮＡ分子が、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６または配列番号：８のポリペプチドをコードする請求項１７記載のコーンミール。
【請求項２１】
請求項１６記載のコーンミールから調製された動物飼料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００５年５月１６日に出願された米国仮出願シリアル番号６０／６８１，３４８の優先権を主張し、その全開示をここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
本発明は、一般的に植物バイオテクノロジーの技術分野に関し、より詳細には、トウモロコシ植物および種子におけるアスパラギンおよび蛋白質を増強することに関する。
【背景技術】
【０００２】
農業従事者および消費者は、増加した収穫、増加した種子蛋白質生成および改善された栄養組成物のごとき改善された農業形質を持つ作物植物を望む。作物植物の望ましい栄養成分は、特に、繊維、ビタミンＥのごとき酸化防止剤、セレン、鉄、マグネシウム、亜鉛、ビタミンＢ、リグナン、フェノール酸、必須アミノ酸およびフィトエストロゲンを含む。植物育種における相当な努力はこれらの所望の形質におけるいくらかの増加を提供したが、植物ゲノムへ特定の非宿主ＤＮＡを導入する能力は、これらの形質を持つ植物の生成のためにさらなる機会を提供する。特に、従来のトウモロコシの収穫はこの数年にわたって着実に増加しているが、窒素をより効率的に同化するかまたは種子蛋白質含量を増加させるトウモロコシ植物の可能性において同様の増加は有しなかった。
【０００３】
窒素の有効性は、植物生産性、バイオマス、および種子蛋白質の生成を含めた作物収穫にかなりのポジティブな影響を及ぼす。植物において、無機窒素は土壌から吸収され、アンモニアに還元され、窒素を輸送するアミノ酸のアスパラギン、グルタミン、アスパラギン酸およびグルタミン酸の形態で有機窒素に組み込まれる。アスパラギン（Ａｓｎ）は、その高い窒素−対−炭素比（２Ｎ：４Ｃ−対−２Ｎ：５Ｃ）のため、およびそれが比較的不活性であるために、好ましいアミド輸送分子である。また、Ａｓｎおよび他のアミノ酸は、ビルディングブロックとしてタンパク質合成に用いられる。
【０００４】
植物において、Ａｓｎは、酵素アスパラギンシンテターゼ（ＡｓｎＳ）によって触媒される反応において、グルタミン、アスパラギン酸塩およびＡＴＰから合成される。グルタミン酸塩、ＡＭＰおよびピロリン酸塩は副産物として形成される。ＡｓｎＳの２つの形態：グルタミン依存性形態およびアンモニア依存性形態が記載されている。グルタミンは好ましい窒素源であるが、グルタミン依存性ＡｓｎＳはグルタミン依存性およびアンモニア依存性の反応の双方を触媒できる。
【０００５】
高濃度の蛋白質は、ダイズ、トウモロコシおよび小麦を含めた大部分の主要作物について重要な質形質と考えられる。例えば、高蛋白質のトウモロコシ、小麦およびダイズの品種は従来の育種を介して同定された。しかしながら、この方法で開発された大部分の高蛋白質系は、収穫障壁または他の作物学的不利を有する。ヒトの消費、および動物飼料における生成物の使用の双方に対して、作物、特に、トウモロコシの蛋白質含量が、現在利用可能なレベルを超えて増加できれば望ましいであろう。これは、作物がヒトおよび動物のための食物および飼料として用いられる場合に、非常に増強された栄養価の利益を提供するであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、トウモロコシ植物および種子におけるアスパラギンおよび蛋白質を増強することに関する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、植物における蛋白質およびアミノ酸含量を増加させるように、作物および他の植物生産物の処理のための方法および組成物を提供する。その方法および組成物は、トウモロコシ組織、特に、種子における遊離アミノ酸および蛋白質のレベルを増加させる。より詳細には、アスパラギンの増加および蛋白生合成の増加に関与する遺伝子産物を発現する異種ＤＮＡ組成物をそのゲノムに含む遺伝子組換えトウモロコシ植物および種子が提供される。その産物の発現は、食物トウモロコシおよび飼料トウモロコシ源、および、遺伝子組換えトウモロコシ種子またはその器官から誘導された加工製品の栄養価を増強する。
【０００８】
１つの態様において、本発明は、トウモロコシ植物における蛋白質含量を増加させる方法を提供する。配列番号１、３、５、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７よりなる群から選択されるポリヌクレオチド配列を含むＤＮＡ構築体、ここに、アスパラギンシンテターゼ・ポリペプチド、またはアスパラギンシンテターゼ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子も含む。
【０００９】
１つの具体例において、本発明は、配列番号：４と同定されたアスパラギンシンテターゼをコードする異種ＤＮＡ組成物で形質転換されたトウモロコシ植物細胞を含む。より詳細には、遺伝子組換えトウモロコシ植物における異種トウモロコシＡｓｎＳ２（アスパラギンシンテターゼ・アイソザイム２）ポリヌクレオチド分子の発現の結果、異種トウモロコシＡｓｎＳ２ポリヌクレオチド分子を発現しない同一品種のトウモロコシ植物と比較して、トランスジェニック植物、例えば、トウモロコシ植物の種子における、アスパラギンおよび蛋白質のレベルが上昇する。
【００１０】
また、本発明は、増加した蛋白質またはアミノ酸含量を持つ前記の種子を含む動物飼料、またはかかる種子の加工製品、例えば、ミールに関する。従って、また、本発明は、トウモロコシ・アスパラギンシンテターゼ酵素をコードするＤＮＡ分子を含む異種ＤＮＡ構築体の発現によって生成されたアスパラギンシンテターゼ酵素を含むトウモロコシ種子を包含する。かかる種子の１つの具体例は収穫された粒であり、また、本発明は、かかる粒から調製されたミール、グルテンおよび他の小麦製品を包含する。
【００１１】
本発明は、配列番号１８〜４５の１以上を含む単離された核酸プライマー配列、またはその相補体を含む。本発明は、形質転換された植物またはその子孫のゲノムにおいて、配列番号１８〜４５よりなる群から選択されるポリヌクレオチド分子を含む、本発明の植物ＡｓｎＳポリペプチドまたはＡｓｎＳ活性を有する植物ポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチド分子を検出または同定する方法を含み、ここに、前記ポリヌクレオチド分子はＤＮＡ増幅方法におけるＤＮＡプライマーとして用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
（図面の簡単な記載）
図１は、ｐＭＯＮ７９７０６のプラスミド地図を示す。
図２は、ｐＭＯＮ６６２２９のプラスミド地図を示す。
図３は、ｐＭＯＮ６６２３０のプラスミド地図を示す。
図４は、ｐＭＯＮ６６２３１のプラスミド地図を示す。
図５は、ｐＭＯＮ６６２３９のプラスミド地図を示す。
図６  ｐＭＯＮ７９７０６事象における導入遺伝子発現。誤差バーは、遺伝子組換え事象につきｎ＝５および同系繁殖系対照につきｎ＝１０での、９５％の信頼区間を表わす。
図７  ｐＭＯＮ９２８７０事象における導入遺伝子発現。誤差バーは、遺伝子組換え事象につきｎ＞３および同系繁殖系対照につきｎ＝１０植物での、９５％の信頼区間を表わす。
【００１３】
（核酸およびポリペプチド配列の説明）
配列番号：１はZea mays ＡｓｎＳ１をコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：２はZea mays ＡｓｎＳ１ポリペプチドである。
配列番号：３はZea mays ＡｓｎＳ２をコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：４はZea mays ＡｓｎＳ２ポリペプチドである。
配列番号：５はZea mays ＡｓｎＳ３をコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：６はZea mays ＡｓｎＳ３ポリペプチドである。
配列番号：７はGlycine max ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：８はGlycine max ＡｓｎＳポリペプチドである。
配列番号：９はXylella fastidiosa ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：１０はXanthomonas campestris ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：１１はBacillus halodurans ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：１２はOryza sativa ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：１３はGaldieria sulphuraria ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：１４はGaldieria sulphuraria ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：１５はGaldieria sulphuraria ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：１６はGaldieria sulphuraria ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：１７はSaccharomyces cerevisiae ＣＧＰＧ３９１３ ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列である。
配列番号：１８は順方向（ｆ）ＡｓｎＳ ＰＣＲプライマー配列である。
配列番号：１９は順方向（ｆ）ＡｓｎＳ ＰＣＲプライマー配列である。
配列番号２０〜４３は、Gatewayクローニング手順を用いた一次および二次の順方向（ｆ）ならびに逆方向（ｒ）ＡｓｎＳ ＰＣＲプライマー配列である。
配列番号：４４ 順方向（ｆ）ＡｓｎＳ ＰＣＲプライマー配列．
配列番号：４５ 順方向（ｆ）ＡｓｎＳ ＰＣＲプライマー配列．
配列番号：４６ ＺｍＡＳセンスプライマー
配列番号：４７ ＺｍＡＳアンチセンスプライマー
配列番号：４８ トウモロコシＡｓｎＳ３順方向プライマー
配列番号：４９ トウモロコシＡｓｎＳ３逆方向プライマー
【００１４】
（発明の詳細な記載）
以下は、本発明の実施において当業者を援助するために提供された本発明の詳細な説明である。本明細書に特記されない限りは、用語は、関連技術分野における当業者により従来の用法により理解されるべきものである。また、分子生物学における共通の用語の定義は、Riegerら, 1991;およびLewin, 1994に見出すこともできる。３７ＣＦＲ§１．８２２で記載されたＤＮＡ塩基についての命名法が用いられる。アミノ酸残基についての標準的な１および３文字の命名法が用いられる。本願明細書に記載された具体例における修飾および変形は、本発明の精神または範囲から逸脱することなくして、当業者によってなされ得る。
【００１５】
本発明は、トランスジェニック植物細胞において、ＡｓｎＳポリペプチドを発現する異種ポリヌクレオチドをトウモロコシ植物細胞のゲノムに導入することによるトウモロコシ植物における蛋白質含量を増加させる方法を提供する。本発明は、所望により葉緑体輸送ペプチドに作動可能に連結されたＡｓｎＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子、またはポリヌクレオチド分子のセグメントを含む（含むは、「限定されるものではないが、．．．を含む」を意味する）ＤＮＡ構築体を提供する。
【００１６】
ＡｓｎＳポリペプチドまたはそのアナログもしくは対立遺伝子をコードするポリヌクレオチド分子、あるいは輸送ペプチドをコードするポリヌクレオチド分子またはマーカー／レポーター遺伝子は、それらがｉｎ ｖｉｔｒｏにて少なくとも部分的に調製された点で「単離される」、例えば、その天然の状態から、細胞から単離され、精製され、増幅され、例えば、それらが、それらの天然の状態においてそれらと関連して通常見出されるものに異種の遺伝子エレメントと組み合わせる。本明細書に用いた、宿主細胞に導入されたＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド分子を含む異種ＤＮＡ構築体は、その天然の形質転換されていない状態における細胞に存在するいずれのポリヌクレオチド分子にも好ましくは同一でなく、宿主細胞のゲノムに生じる他のＤＮＡ分子に関して単離される。
【００１７】
本明細書に用いた、形質転換された植物、植物組織または植物細胞におけるアスパラギンの「改変または増加した」レベルは、本発明のＤＮＡ構築体を含まない対応する植物、植物組織または植物細胞において判明したレベルより高レベルである。
【００１８】
また、本発明の剤は組み換えし得る。本明細書に用いた、組換えなる用語は、いかに間接的であろうとも、ポリヌクレオチド分子のヒトの操作からものであるいずれの作用物質（例えば、ＤＮＡ、ペプチド等）または結果も意味する。
【００１９】
好ましい態様において本明細書に用いた、種子の栄養価における増加、例えば、種子蛋白質含量の増加は、植物が、蛋白質または栄養価のかかる増加がない種子よりも高い収率の蛋白質または栄養成分を有する種子を生成する能力により決定される。本発明の特に好ましい態様において、栄養価における増加は、本発明の植物が、本明細書中の異種ＤＮＡ構築体において記載された蛋白質またはそのフラグメントを発現または過剰発現することを除いて、栄養的に増強された植物に同様の遺伝的背景を持つ植物に対して測定される。
【００２０】
ポリヌクレオチド分子
本発明は、トウモロコシ・アスパラギンシンテターゼ（Ｚｍ．ＡｓｎＳ２）酵素をコードする異種ＤＮＡ分子を含む導入遺伝子をそれらのゲノムに含む遺伝子組換えトウモロコシ植物および種子を含みかつ提供し、ここに、そのＤＮＡ分子は、例えば、配列番号：３および機能的なアスパラギンシンテターゼ活性を持つかかる配列に少なくとも９０％、９５％または９９％の同一性を有する配列を含む。
【００２１】
本発明のさらなる態様は、アスパラギンシンテターゼ酵素をコードする異種ポリヌクレオチド分子、例えば、配列番号１、３、５、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７を提供するＤＮＡ構築体をトウモロコシ細胞に導入することによりトウモロコシ植物における蛋白質を増加させる方法である。ポリヌクレオチドは、それがコードするポリペプチドを改変することなく、これらの例のいずれとも異なり得る。例えば、かかる保存的なアミノ酸置換をコードできるコドンが当該技術分野において知られていることが理解される。加えて、本発明は、アスパラギンシンテターゼ機能を変更することなく、１以上のアミノ酸が欠失、置換または付加されたポリペプチドを本発明に用いることができることを考える。
【００２２】
本発明の１つの態様において、本発明のポリヌクレオチドは、導入されたポリヌクレオチド分子であると言及される。ポリヌクレオチド分子は、どれだけ間接的であろうと、それがヒトの操作の結果として細胞または生物に挿入されるならば、導入されると言及される。導入されたポリヌクレオチド分子の例は、制限なくして、形質転換、トランスフェクション、注入および射出を介して細胞に導入されたポリヌクレオチド、および接合、取込、食作用等を介して生物に導入されたものを含む。好ましくは、ポリヌクレオチドは細胞のゲノムに挿入される。
【００２３】
本発明のポリヌクレオチド分子の１つのサブセットは、フラグメントポリヌクレオチド分子である。フラグメントポリヌクレオチド分子は、特に開示されたもののごとき、大部分の、または実際に大部分の本発明のポリヌクレオチド分子よりなり得る。あるいは、フラグメントは、より小さなオリゴヌクレオチド（約１５から約４００のヌクレオチド残基、より好ましくは、約１５から約３０のヌクレオチド残基、または約５０から約１００のヌクレオチド残基、または約１００から約２００のヌクレオチド残基、または約２００から約４００のヌクレオチド残基、または約２７５から約３５０のヌクレオチド残基を有する）を含み得る。本発明の１以上のポリヌクレオチド分子のフラグメントは、プローブおよび特にＰＣＲプライマー分子で有り得る。ＰＣＲプライマーは、もう一つのポリヌクレオチドとの二本鎖の構造にある間、ポリメラーゼ活性を開始できるポリヌクレオチド分子である。ＰＣＲプローブの構造を決定する種々の方法およびＰＣＲ技術が当該技術分野において存在する。
【００２４】
本明細書に用いた、２つのポリヌクレオチド分子は、その２つの分子が逆平行の二本鎖のポリヌクレオチド構造を形成できるならば、互いに特異的にハイブリダイズできると言及される。
【００２５】
ポリヌクレオチド分子はそれらが完全な相補性を示すならば、もう一つのポリヌクレオチド分子の「相補体」であると言及される。本明細書に用いた分子は、分子のうちの１つのすべてのヌクレオチドがその他のヌクレオチドに相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言及される。２つの分子は、それらが少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにそれらがアニーリングされたままであることを可能にするように十分に安定性を持ち互いにハイブリダイズできるならば、「最小に相補的」であると言及される。同様に、その分子はそれらが従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニーリングされたままとすることを可能にするように十分な安定性を持ち互いにハイブリダイズできるならば、「相補的」であると言及される。従来のストリンジェンシー条件は、Sambrookら, (2001)およびHaymesら, (1985)によって記載されている。従って、かかる逸脱が二本鎖の構造を形成する分子の能力を完全に排除しない限りは、完全な相補性からの逸脱は許容できる。かくして、ポリヌクレオチド分子がプライマーまたはプローブとして機能するために、使用された特定の溶媒および塩濃度下の安定した二本鎖の構造を形成できるように配列において、単に十分に相補的であればよい。
【００２６】
ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適当なストリンジェンシー条件は、例えば、約４５℃の６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）に続いて２０〜２５℃での２．０×ＳＳＣの洗浄は、当業者に知られているか、またはAusubel,ら, eds. (1989), セクション 6.3.1−6.3.6に見出すことができる。例えば、洗浄工程における塩濃度は、５０℃での約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから６５℃での約０.２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択できる。加えて、洗浄工程における温度は、室温、約２２℃での低ストリンジェンシー条件から約６５℃での高ストリンジェンシー条件に増加し得る。温度および塩の双方は変更でき、または温度または塩濃度のいずれかは、核酸が、例えば、約２．０×ＳＳＣで、かつ６５℃での適度にストリンジェントな条件下、配列番号１、３、５、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７および１８−４５記載の１以上のポリヌクレオチド分子およびその相補体に特異的にハイブリダイズするように、一定に保持し得る。
【００２７】
本発明の方法の１つの具体例において、本発明のいずれかのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列、またはどちらかのフラグメントは、関連する配列を探索するために用いることができる。本明細書に用いた「関連する配列の検索」は、限定されるものではないが、配列相同性を比較する検索：例えば、単一のポリペプチド配列に対する関連性についてのデータベースのＰＢＬＡＳＴ検索を含めた２つの配列間の関連性を決定するいずれの方法も意味する。他の探索は、サウスダコダ州立大学, ＳＤにより維持されるＨＭＭ(Hidden Markovモデル) ＭＥＴＡ−ＭＥＭＥおよび医学国立衛生研究所医療図書館の全米バイオテクノロジー情報センター(NCBI)により維持されるＢＬＡＳＴのごときプロフィールベースの方法を用いて導かれ得る。
【００２８】
ポリヌクレオチド分子は、実質的に同一または実質的に相同性のポリペプチド分子をコードできる。同一性または相同性の程度は、WISCONSIN PACKAGE Gap Programのごときコンピューターソフトウェアの使用により決定できる。Genetics Computer GroupからのWISCONSIN PACKAGEバージョン10.0−UNIXにおけるＧａｐプログラムは、Needleman and Wunsch, 1970の方法に基づいている。ＢＬＡＳＴ  ２．２．１ソフトウェアパッケージソフト(Altschulら, (1997, ＴＢＬＡＳＴＮプログラムを用いるか、またはＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス(Henikoff and Henikoff, 1992)を用いる。また、本発明のポリヌクレオチド分子は、同族体ポリペプチドをコードできる。本明細書に用いた同族体ポリペプチド分子またはそのフラグメントは、第２の種（例えば、トウモロコシルビスコ・小サブユニットはArabidopsis ルビスコ小サブユニットの同族体である）における対応物蛋白質分子またはそのフラグメントである。また、同族体は、分子進化またはＤＮＡシャフリングの技術によって生成でき、その結果、分子は元のポリペプチドの少なくとも機能的または構造的特性を保持する（例えば、米国特許第５，８１１，２３８号参照）。
【００２９】
好ましい具体例において、本発明のいずれのポリヌクレオチド分子も、ｍＲＮＡの分子の生成をもたらすために植物細胞中で機能するプロモーター領域に作動可能に連結でき、そのプロモーターに連結されるポリヌクレオチド分子はそのプロモーターに関して異種である。本明細書に用いた「異種」ＤＮＡは、隣接するＤＮＡの次に天然に見出されていないいずれかのＤＮＡ配列である。「天然」とは自然発生の核酸配列をいう。「異種」配列は、しばしば外来性の源または種から始まるか、または同じ源からならば、ゲノムにおけるその本来の形態および／または位置から変更される。
【００３０】
本明細書に用いた、「蛋白質」、「ペプチド分子」または「ポリペプチド」なる用語は、５以上のアミノ酸を含むいずれかの分子を含む。蛋白質、ペプチドまたはポリペプチド分子が、限定されるものではないが、ジスルフィド結合形成、グリコシレーション、リン酸化またはオリゴマー形成のごとき翻訳後修飾を含めた修飾を受けることもできる。このように、本明細書に用いた「蛋白質」、「ペプチド分子」または「ポリペプチド」なる用語は、いずれかの生物学的または非生物学的方法によって修飾されるいずれの蛋白質も含む。「アミノ酸」および「アミノ酸群」なる用語は、すべての自然発生のＬ−アミノ酸をいう。この定義は、ノルロイシン、ノルバリン、オルニチン、ホモシステインおよびホモセリンを含むことを意味する。
【００３１】
「蛋白質フラグメント」は、アミノ酸配列がその蛋白質のアミノ酸配列のサブセットを含むペプチドまたはポリペプチドの分子である。その蛋白質から誘導されない１以上のさらなるペプチド領域を含む蛋白質またはそのフラグメントは、「融合」蛋白質である。かかる分子を誘導体化して、炭水化物または他の部位（キーホールリンペットヘモシニアンのごとき）を含み得る。本発明の融合蛋白質またはペプチドの分子は、組換え手段を介して好ましくは生成される。
【００３２】
植物構築体および植物形質転換体
アスパラギンシンテターゼをコードする本発明の１以上のＤＮＡ構築体は、植物形質転換またはトランスフェクションに用い得る。外来性の遺伝子物質は、植物細胞に転移でき、その植物細胞は、全体、稔性または無菌の植物に再生し得る。外来性の遺伝子物質は、天然発生するか、またはいずれかの生物に挿入できるいずれかの源からのいずれかの遺伝子物質である。
【００３３】
また、本発明のさらなる態様において、本発明のポリヌクレオチド配列は、細胞内の局在化、輸出または翻訳後修飾に関与するペプチド、例えば、葉緑体輸送ペプチドをコードする。
【００３４】
本明細書に用いた「遺伝子」なる用語は、植物中で機能するプロモーターを含む転写の調節を提供する核酸分子、５’非翻訳分子、例えば、イントロン、リーダー配列、転写された核酸分子および３’転写終了分子を含む。
【００３５】
本発明のポリペプチドをコードするポリ核酸分子は、種々の方法で他の非天然または異種の配列と組み合せ得る。「異種」配列により、例えば、一緒に結合することが天然に見出されない同一植物からのヌクレオチド配列の組合せを含めた本発明のポリペプチドをコードする核酸配列に結合されることが天然に見出されないいずれかの配列、または２つの配列が２つの異なる種が起源であることを意味する。「作動可能に連結した」なる用語は、作動可能に連結した構造的ポリヌクレオチド分子の調節された発現を引き起こす物理的および機能的配置の調節および構造的ポリヌクレオチド分子に関して用いられる。
【００３６】
ＤＮＡ構築体または導入遺伝子の発現は、本発明のポリヌクレオチド分子から誘導されたセンスもしくはアンチセンスＲＮＡまたは蛋白質の転写および安定な蓄積、あるいはその翻訳を意味する。「センス」ＲＮＡは、ｍＲＮＡを含み、従って、細胞によるポリペプチドまたは蛋白質に翻訳できるＲＮＡ転写体を意味する。「アンチセンスＲＮＡ」は、標的の第一の転写またはｍＲＮＡのすべてまたは一部分に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を意味する（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第５，１０７，０６５号）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、いずれの部分の特定の遺伝子転写物に関するものであってもよく、すなわち、５’非コード配列、３’非翻訳配列、イントロンまたはコード配列についてであってもよい。「ＲＮＡ転写物」は、ＤＮＡ配列のＲＮＡポリメラーゼで触媒された転写に起因する産物を意味する。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物というか、または一次転写物の転写後プロセシングから誘導されたＲＮＡ配列であり得、成熟ＲＮＡという。
【００３７】
本明細書に用いた植物発現カセットなる用語は、植物細胞における発現を提供するように標的分子に作動可能に連結された必要なＤＮＡ調節分子を含む構築体をいう。
【００３８】
本発明のＤＮＡ構築体は、１つの具体例において、本発明のポリペプチドの過剰発現を引き起こすプロモーターを含むことができ、ここに、「過剰発現」は、該ポリペプチドの発現をコードする内因性遺伝子から通常発現されるより高レベルにて、宿主細胞に通常存在しないか、または該宿主細胞に存在するどちらかのポリペプチドの発現を意味する。本発明のポリペプチドの過剰発現を引き起こすことができるプロモーターは、当該技術分野において一般的に知られており、構成的発現パターンを提供するものの例は、カリフラワーモザイクウィルス１９Ｓプロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス３５Ｓプロモーター（米国特許第５，３５２，６０５号）、ゴマノハグサモザイクウイルス３５Ｓプロモーター（米国特許第６，０５１，７５３号）、サトウキビ桿菌状ウイルスプロモーター（米国特許第５，９９４，１２３号）、ツユクサ黄色斑紋ウイルスプロモーター(Medberryら, 1992)、リブロース−１,５−ビスリン酸カルボキシラーゼプロモーターの小サブユニット、コメ細胞質ゾルのトリオースリン酸イソメラーゼプロモーター、アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ・プロモーター、コメアクチン１プロモーター（米国特許第５，６４１，８７６号）、トウモロコシユビキチンプロモーター、マンノピン合成酵素プロモーターおよびオクトピン合成酵素プロモーターを含む。
【００３９】
かかる遺伝子構築体は、限定されるものではないが、アルファルファ、リンゴ、アラビドプシス（Arabidopsis）、バナナ、アブラナ（Brassica campestris）、キャノーラ、キャスターの実（castor bean）、コーヒー、トウモロコシ、綿、綿実、キク、ハマナ（crambe）、キュウリ、デンドロビウム（Dendrobium）種、ディオスコリア（Dioscorea）種、ユーカリ、ウシノケグサ（fescue）、アマ、グラジオラス、リリアセア（liliacea）、リンシード、アワ（millet）、マスクメロン、カラシ、オート麦、アブラヤシ、アブラナ、ピーナッツ、多年生ライグラス、インゲンマメ属（Phaseolus）、菜種、コメ、モロコシ、ダイズ、ライ麦、トリトデアム（tritordeum）、ターフグラス、小麦、ベニバナ、ゴマ、テンサイ、サトウキビ、クランベリー、パパイヤ、ベニバナおよびヒマワリを含めた単子葉または双子葉植物のいずれかに転移し得る(Christou, 1996)。好ましい具体例において、遺伝子物質はトウモロコシ細胞に転移される。
【００４０】
蛋白質をコードするポリヌクレオチド分子の転移の結果、形質転換細胞またはトランスジェニック植物のそのポリペプチドを発現または過剰発現できる。本発明のポリヌクレオチド分子によりコードされた蛋白質またはそのフラグメントの１以上は、形質転換細胞または形質転換された植物において過剰発現し得る。
【００４１】
１つの具体例において、本発明のＤＮＡ構築体は、配列番号１、３、５、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６および１７よりなる群から選択されるポリペプチド配列をコードするポリヌクレオチド分子を含む。本発明は、形質転換されたトウモロコシ細胞を提供し、ここに、かかるＤＮＡ構築体がない形質転換されないトウモロコシ植物に対し、細胞は増強されたアスパラギンレベルを有する。
【００４２】
もう一つの具体例において、本発明のＤＮＡ構築体は、トウモロコシ・アスパラギンシンテターゼコード配列、例えば、配列番号：１、３または５に作動可能に連結された異種ＤＮＡ分子を含み、そのＤＮＡ構築体は、トウモロコシ細胞を形質転換させる。好ましい具体例において、配列番号：３を含む本発明のＤＮＡ構築体は、形質転換されたトウモロコシ細胞において提供され、ＤＮＡ構築体の発現は、そのＤＮＡ構築体で形質転換されないトウモロコシ植物に対し、増加したアスパラギンを持つトウモロコシ植物組織、または増加した蛋白質を持つトウモロコシ植物種子を提供する。
【００４３】
いくつかの具体例において、ＡｓｎＳの１以上の生成物のレベルは、植物の全体にわたって増加されるか、または植物の１以上の特定の器官または組織に局在化され得る。本発明の範囲を限定することなく、いくつかのプロモーター配列は、前記の酵素の遺伝子を発現するのに有用である。例えば、トウモロコシＣ４タイプＰＰＤＫプロモーター(Glackinら, 1990)、トウモロコシＣ４タイプＰＥＰＣプロモーター(Hudspeth および Grula, 1989)、コメルビスコ・小サブユニットプロモーター(Kyozukaら, 1993)、集光性クロロフィルａ／ｂ結合蛋白質プロモーター(Sakamotoら, 1991)、Ｐ−ＦＤＡプロモーター（ＵＳ２００４０２１６１８９Ａ１、そのポリヌクレオチド配列をここに出典明示して本明細書の一部とみなす）およびＰ−ＲＴＢＶプロモーター（米国特許第５，８２４，８５７号、そのポリヌクレオチド配列をここに出典明示して本明細書の一部とみなす）。例えば、アスパラギンまたは蛋白質のレベルは、限定なくして、根、塊茎、茎、葉、幹、果実、液果、ナッツ、樹皮、鞘、種子および花を含めた１以上の植物の組織および器官において増加させ得る。好ましい器官は種子である。
【００４４】
葉、種子、根または茎のごとき植物のソース組織における発現の目的のために、利用されたプロモーターがこれらの特定の組織で比較的高い発現を有することが好ましい。本発明の蛋白質の組織特異的発現は、特に好ましい具体例である。
【００４５】
また、ＤＮＡ構築体またはベクターは、注目するコード領域で、全体または部分的に作用するポリヌクレオチド配列を含み、その領域の転写を終了し得る。Ｔ−ＮＯＳ ３'領域を含めた多数のかかる配列が単離された(Ingelbrechtら, 1989; Bevanら, 1983)。同様に、調節転写終了領域は、本発明の植物発現構築体において提供できる。転写終了領域は、注目する遺伝子または、異なった遺伝子源から誘導された便利な転写終了領域、例えば、転写開始領域に天然に関係している転写終了領域をコードするＤＮＡ配列によって提供できる。当業者は、植物細胞における転写を終了できるいずれの便利な転写終了領域も本発明の構築体において使用できることを認識するであろう。
【００４６】
また、ベクターまたは構築体は、イントロンのごとき調節エレメントを含み得る。かかるものの例は、Ａｄｈイントロン１(Callisら, 1987)、スクロースシンターゼ・イントロン(Vasilら, 1989)、ｈｓｐ７０イントロン（米国特許第５，８５９，３４７号）およびＴＭＶオメガエレメント(Gallieら, 1989)を含む。これらおよび他の調節エレメントを適当な場合に含み得る。
【００４７】
また、ベクターまたは構築体は、選択マーカーを含み得る。また、選択マーカーを用いて、外来性の遺伝子物質を含む植物または植物細胞を選択し得る。かかるものの例は、限定されるものではないが、ｎｅｏ遺伝子(Potrykusら, 1985)、それはカナマイシン抵抗性をコードし、カナマイシン、ｎｐｔＩＩ、Ｇ４１８、ｈｐｔ等を用いて選択できる；バー遺伝子、それはバイアラホス（bialaphos）抵抗性をコードする；変異体ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子(Hincheeら, 1988; Reynaertsら, 1988; Jonesら, 1987)、それはグリホサート抵抗性をコードする；ブロモキシニルに対する抵抗を与えるニトリラーゼ遺伝子(Stalkerら, 1988)；イミダゾリノンまたはスルホニル尿素抵抗性を与える変異体アセトラクテート合成酵素遺伝子（ＡＬＳ）（米国特許第４，７６１，３７３号）；D'Halluinら, 1992；およびメトトレキサート抵抗性ＤＨＦＲ遺伝子(Thilletら, 1988)を含む。
【００４８】
植物形質転換
植物細胞の形質転換のための最も一般的に用いられている方法は、Agrobacterium媒介ＤＮＡ転移プロセスおよび遺伝子銃（biolistics）または微粒子銃媒介プロセス（すなわち、遺伝子銃）である。典型的には、核形質転換が望ましいが、葉緑体またはアミロプラストのごとき色素体を特に形質転換することが望ましいならば、植物色素体を、所望のポリヌクレオチドの遺伝子銃媒介形質転換を利用して形質転換し得る。
【００４９】
Agrobacterium媒介形質転換により植物に導入遺伝子を導入する方法は、導入遺伝子の遺伝子エレメントを組込み、植物のゲノムにそれらの遺伝子エレメントを転移するＴ−ＤＮＡ（転移Ｔ‐ＤＮＡ）を利用する。一般的に、右境界ＤＮＡ分子（ＲＢ）および左境界ＤＮＡ分子（ＬＢ）により隣接した導入遺伝子（群）は、単一の遺伝子座で植物ゲノムに転移される。「Ｔ−ＤＮＡ分子」は、Agrobacterium媒介形質転換方法を介して植物ゲノムに組み込まれるＤＮＡ分子をいう。Ｔ−ＤＮＡ分子の末端は、Agrobacterium ＴｉプラスミドからのＴ−ＤＮＡの境界領域によって隣接して挟まれると本発明において規定される。これらの境界領域は右境界（ＲＢ）および左境界（ＬＢ）領域と一般的にいい、Agrobacteriumのノパリンまたはオクトピン生成株から誘導されるかに依存して、ヌクレオチド配列および長さにおける変化として存在する。植物に導入遺伝子を転移させるために設計されたＤＮＡ構築体において一般的に用いた境界領域は、しばしば長さが数百のポリヌクレオチドであり、エンドヌクレアーゼがそのＤＮＡを消化して、植物のゲノムへの挿入のための部位を提供するニック部位を含む。Ｔ−ＤＮＡ分子は、一般的に１以上の植物発現カセットを含む。
【００５０】
微粒子銃（米国特許第５，５５０，３１８号；第５，５３８，８８０号；および第５，６１０，０４２号；その各々をここに出典明示してその全てを本明細書の一部とみなす）に関して、粒子はポリヌクレオチドで覆われ、推進力によって細胞へ送達される。典型的な粒子は、タングステン、白金、好ましくは金で構成されたものを含む。粒子加速により植物細胞へＤＮＡを送達する有用な方法は、Biolistics Particle Delivery System (BioRad, Hercules, California)であり、それを用いて、ステンレス鋼またはＮｙｔｅｘスクリーンのごときスクリーンを通って、懸濁物中で培養された単子葉植物細胞で覆われていたフィルタ表面上に、ＤＮＡまたは細胞で覆われた粒子を推進できる。微粒子銃技術は広く適用でき、それを用いて、いずれの植物種も事実上形質転換し得る。微粒子銃によって形質転換された種の例は、一般的に、トウモロコシ（ＰＣＴ公開ＷＯ９５／０６１２８）、大麦、小麦（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第５，５６３，０５５号）、コメ、オート麦、ライ麦、サトウキビおよびモロコシのごとき単子葉植物種；ならびにタバコ、ダイズ（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第５，３２２，７８３号）、ヒマワリ、ピーナッツ、綿、トマトおよびマメ科植物（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第５，５６３，０５５号）を含めた多数の双子葉植物を含む。
【００５１】
形質転換方法にかかわらず形質転換された植物細胞を選択またはスコアするために、細胞へ導入されたＤＮＡは、他の有毒な化合物に対する植物組織抵抗性を与える化合物を生成するように再生可能な植物組織において機能する遺伝子を含む。選択、スクリーニング、スコア可能なマーカーとしての使用につき注目する遺伝子は、限定されるものではないが、ＧＵＳ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）および抗生物質または除草剤の耐性遺伝子を含む。抗生物質抵抗性遺伝子の例は、カナマイシン（およびネオマイシン、Ｇ４１８）およびブレオマイシンに対する抵抗性を与えるものを含む。
【００５２】
種々の形質転換された外植片からの植物の再生、形成および栽培は、当該技術分野においてよく文書化されている。この再生および成長プロセスは、典型的には、形質転換細胞を選択し、胚発生の通常のステージを介し、根付いた小植物ステージを介してそれらの個別化された細胞を培養する工程を含む。遺伝子組換えの胚および種子は同様に再生される。得られた遺伝子組換えの根付いた苗条は、土壌のごとき適当な植物生育媒体中にその後植えられる。選択的な剤に対する曝露で生存する細胞、またはスクリーニングアッセイにおいてポジティブにスコアされた細胞を、植物の再生を支持する培地中で培養し得る。成熟用の温室またはグロースチャンバへの移動に先立ち、生育している小植物を無土壌の植物成長ミックスに移し、外に慣れさせた。
【００５３】
本発明は、いずれの形質転換性の細胞または組織でも用いることができる。本明細書に用いた形質転換性のにより、植物を生起させるようにさらに増殖できる細胞または組織を意味する。当業者は、多数の植物細胞または組織が形質転換性であり、外来性ＤＮＡの挿入および適当な培養条件の後、植物細胞または組織を分化型の植物に形成できることを認識している。これらの目的に適している組織は、限定されるものではないが、未成熟胚、胚盤組織、懸濁細胞培養物、未成熟花序、苗条分裂組織、結節外植片、カルス組織、胚軸組織、子葉、根および葉を含むことができる。
【００５４】
いずれの適当な植物培養基も用いることができる。適当な培地の例は、限定されるものではないが、オーキシン、サイトカイニン、ＡＢＡおよびジベレリンを含めたさらなる植物成長調節物で補足されたＭＳベースの培地(Murashige and Skoog, 1962)またはＮ６ベースの培地(Chuら, 18:659, 1975)を含むであろう。当業者は組織培養基の種類に精通し、それらは、適切に補足された場合、植物組織成長および発生を支持し、植物形質転換および再生に適している。これらの組織培養基は、商用調製物として購入できるか、またはカスタム調製および修飾できる。形質転換および再生に用いた培地および栄養および成長調節物質のごとき培地補足物ならびに培養中の光強度、ｐＨおよび培養温度のごとき他の培養条件は、注目する特定の品種に最適化できることを当業者は知っている。
【００５５】
本発明のポリヌクレオチド分子のいずれも、ベクター、プロモーター、エンハンサー等ののごとき他の遺伝子エレメントと組み合わせて永久または一時的な方法で植物細胞に導入し得る。さらに、本発明のポリヌクレオチド分子のいずれも、そのポリヌクレオチド分子によってコードされた蛋白質またはそのフラグメントの発現または過剰発現を可能とする方法で植物細胞に導入し得る。
【００５６】
また、本発明は、本発明の植物の器官、特に、再生または貯蔵器官を提供する。植物の器官は、限定なくして、種子、内乳、胚珠、花粉または塊茎を含む。本発明の特に好ましい具体例において、植物の器官はトウモロコシの種子である。１つの具体例において、トウモロコシ種子（または粒）は動物飼料の構成要素である。
【００５７】
好ましい具体例において、トウモロコシ種子からのトウモロコシ飼料もしくはコーンミールまたは蛋白質は、家畜動物またはヒト、または双方のために設計される。飼料、ミールおよび蛋白質を生成する方法は当該技術分野において知られている。例えば、米国特許第４，９５７，７４８号；第５，１００，６７９号；第５，２１９，５９６号；第５，９３６，０６９号；第６，００５，０７６号；第６，１４６，６６９号；および第６，１５６，２２７号参照。好ましい具体例において、蛋白質調製物は、高蛋白質調製物である。かかる高蛋白質調製物は、好ましくは約５％（ｗ／ｖ）、より好ましくは１０％（ｗ／ｖ）、さらに好ましくは１５％（ｗ／ｖ）を超える蛋白質含量を有する。
【００５８】
異なった形質および作物に一般的に用いられる育種方法の説明は、いくつかの参考図書（例えば、Hayward, 1993；Richards, 1997; Allard, 1999)の１つに見出すことができる。
【００５９】
他の生物
本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞、哺乳動物、サカナ細胞、サカナ、トリ細胞、トリ、藻類細胞、藻類、真菌細胞、真菌または細菌細胞のごときいずれの細胞または生物にも導入し得る。本発明の蛋白質は、適当な細胞または生物において生成され得る。好ましい宿主および形質転換体は、Aspergillusのごとき真菌細胞、酵母、哺乳動物、特にウシおよびブタ、昆虫、細菌および藻類を含む。特に好ましい細菌は、Agrobacterium tumefaciensおよびE. coliである。
【００６０】
本発明の態様において、本発明の１以上の核酸分子を用いて、植物（好ましくは、キャノーラ、トウモロコシ、Brassica campestris、アブラナ、菜種、ダイズ、ハマナ、カラシ、キャスターの実、ピーナッツ、ゴマ、綿実、アマニ、ベニバナ、油ヤシ、アマまたはヒマワリ）における発現レベル（すなわち、試料中のｍＲＮＡ濃度等）を決定するか、または本発明の１以上のポリヌクレオチド分子により部分的または全体にコードされた蛋白質の発現のパターン（発現のキネティクス、分解速度、安定性プロフィール等）を決定する。多数の方法を用いて、細胞または組織の２以上の試料間の発現を比較できる。これらの方法は、ノーザン、ＲＮＡａｓｅ保護アッセイおよびインサイツハイブリダイゼーションのごときハイブリダイゼーションアッセイを含む。あるいは、その方法はＰＣＲタイプのアッセイを含む。好ましい方法において、発現は、２以上の試料からの複数のポリヌクレオチドを一連のポリヌクレオチドにハイブリダイズさせることにより評価される。配列は、試料の細胞もしくは組織中に存在することが知られているか、または疑われる複数の疑わしい配列を含む。
【００６１】
以下の実施例は、本発明の態様を示すために含まれ、当業者は、本開示に徴して、多数の変形を開示された特定の態様になすことができ、本発明の精神および範囲から逸脱することをなく同様または類似の結果を依然として得ることができることを認めるであろう。
【００６２】
実施例
当業者は、本発明により提供される方法および組成物の多数の利点を理解するであろう。以下の実施例は本発明の好ましい具体例を示すために含まれる。以下の実施例において示された技術が、本発明の実行において良好に機能する発明者により発見された技術を表わし、かくして、その実施についての好ましい様式を構成すると考えることができることは当業者により十分に理解されるであろう。しかしながら、当業者ならば、本開示に徴して、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、多数の変形が、開示された特定の具体例においてなすことができ、依然として、同様または類似する結果を得ることができることを認識するであろう。本願明細書に引用された全ての参考文献は、それらが本明細書に使用された方法、技術または組成物についての背景を補足、説明、提供するか、あるいはそれらを教示する範囲までここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００６３】
実施例１
トウモロコシおよびダイズ植物ｃＤＮＡならびにゲノムライブラリーの構築。
この実施例は、本発明のトウモロコシＡｓｎＳおよびダイズポリヌクレオチド配列が単離されたトウモロコシおよびダイズ植物組織から作成されたｃＤＮＡライブラリーの生成を記載する。ｃＤＮＡライブラリーは、当該技術分野において知られた技術、例えば、Alba, 2004を用いて、Zea maysおよびGlycine maxの組織から生成された。トウモロコシｃＤＮＡライブラリーは２つの異なった組織から生成された。ライブラリーは、同系繁殖系９０ＤＤＤ５からの遷延（dilatory）相にて収穫された初期の核から生成した。第２のトウモロコシｃＤＮＡライブラリーは、トウモロコシ同系繁殖系Ｈ９９からのシルキング成長段階でシルク組織およびトウモロコシ同系繁殖系ＭＯ１７からの発芽用花粉をから作成した。ダイズ（Glycine max）からのｃＤＮＡライブラリーの構築については、分裂組織および胚軸の一部を、品種Ａ３２３７（Asgrow）の再水和した乾燥ダイズ種子から切り取った。外植片は、まず、１８時間の光／日、２８℃で６日間固体組織培養基上で表面が殺菌された種子を発芽させ、次いで、少なくとも２４時間４℃に発芽した種子を移すことにより調製した。ライブラリー調製物に用いた組織については、子葉を除去して、注目するその特定の組織を富化した。０.５〜２グラムの組織を合計ＲＮＡおよびポリＡ＋ＲＮＡの調製に用いた。全ｃＤＮＡライブラリーについては、植物組織を収穫し、液体窒素中で直ちに冷凍した。収穫した組織は、合計ＲＮＡの調製まで−８０℃にて貯蔵した。合計ＲＮＡを、製造者によって推奨されるように、実質的に、Invitrogen Corporation (Invitrogen Corporation, Carlsbad, California, U.S.A.)からのTrizol試薬を用いて精製した。ポリＡ＋ＲＮＡ（ｍＲＮＡ）は、製造者(Dynabeads, Dynal Biotech, Oslo, Norway)によって推奨されるように、実質的に、磁気的オリゴｄＴビーズを用いて精製した。
【００６４】
植物ｃＤＮＡライブラリーの構築は当該技術分野においてよく知られ、多数のクローニング戦略が存在する。多数のｃＤＮＡライブラリー構築キットが商業的に入手可能である。ｃＤＮＡライブラリーは、Superscript IIｃＤＮＡライブラリー合成プロトコールに記載したようにｃＤＮＡ合成用のSuperscriptTM Plasmid SystemおよびPlasmid Cloning (Invitrogen Corporation)を用いて調製した。ｃＤＮＡライブラリーをチェックして、適当な挿入断片：ベクター比を確認した。
【００６５】
ゲノムＤＮＡライブラリーは、後記の修飾したゲノムＤＮＡ単離プロトコールを用いて、Zea maysから単離したゲノムＤＮＡを用いて構築した(Dellaportaら, 1983)。トウモロコシ実生を土壌またはペトリ皿において成長させ、収穫し、抽出まで液体窒素中で凍結しておいた。組織は、液体窒素で凍結させたまま、乳鉢および乳棒を用いて細粉まで粉砕した。その粉末組織を２００ｍＬの冷（０℃）ＤＮＡ抽出緩衝液（３５０ｍＭソルビトール；１００ｍＭトリス；５ｍＭ  ＥＤＴＡ；ＨＣｌで７．５のｐＨ；亜硫酸水素ナトリウム、３．８ｍｇ／ｍＬ）を含むワーリングブレンダーに移し、それを使用直前に添加し、３０〜６０秒間高速でホモジナイズした。ホモジェネートをチーズクロスの層を通して濾過し、遠心分離ボトル中に集めた。次いで、試料を２０分間２５００×ｇで２０分間遠心し、上清およびいずれの緩い緑色物質も廃棄した。次いで、ペレットをＤＮＡ抽出緩衝液の１．２５ｍＬ中に再懸濁し、５０ｍＬポリプロピレンチューブに移した。次いで、核溶解緩衝液（２００ｍＭトリス；５０ｍＭ ＥＤＴＡ；２Ｍ ＮａＣｌ；２．０％（ｗ／ｖ） ＣＴＡＢを含む１．７５ｍＬ；ｐＨはＨＣｌで７．５に調整した）を添加した後、０.６ｍＬの５％（ｗ／ｖ）サルコシルを添加した。チューブを緩やかに混合し、試料を６５℃で２０分間インキュベートした。等量のクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）を添加し、チューブを再度緩やかに混合した。次いで、チューブを１５分間２５００×ｇで遠心し、得られた上清をきれいなチューブに移した。等量の冷イソプロパノールを試料に注ぎ、沈澱物が形成するまで、試料を数回反転させた。沈殿物をガラスピペットを用いて溶液から取出し、沈澱物を２〜５分間空気乾燥するのを可能にすることにより残存するアルコールを除去した。沈殿物を４００μＬ ＴＥ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、８．０に調節したｐＨ）中に再懸濁した。
【００６６】
実施例２
連結独立（ligation independent）およびGatewayクローニング法によるＡｓｎＳポリヌクレオチド配列の単離およびトウモロコシ形質転換。
この実施例は、連結独立およびGatewayＲクローニング法を用いた、ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド分子の単離ならびに本発明のＤＮＡ構築体の構築を示し、その構築体は、表１に記載した様々な植物および微生物源から単離したＡｓｎＳポリペプチドをコードするポリヌクレオチド分子を含む。連結したＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド分子の発現を駆動するために用いたプロモーター分子は、コメアクチン１プロモーター、Ｐ−Ｏｓ．Ａｃｔ１（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第５，６４１，８７６号）；Zea mays ＰＰＤＫ(Matsuokaら, 1993)、Ｐ−ＲＴＢＶ−１（ここに出典明示して本明細書の一部とみなす米国特許第５，８２４，８５７号）、およびＰ−Ｚｍ．ＮＡＳ（トウモロコシからのニコチアナミン合成酵素２ポリペプチドをコードするゲノム領域のプロモーター分子）である。
【００６７】
【表１】
2008539784.tif 000003
【００６８】
ＰＣＲ産物をクローニングするために、連結独立クローニングを開発し、このクローニング法は非回帰性の単鎖末端のアニーリングに基づく。ＬＩＣは効率的なクローニング法であり、それは、限定部位または制限酵素消化または連結反応の必要性により限定されなく、シームレス結合を残す(Aslanidis およびde Jong, 1990)。
【００６９】
末端の単鎖ＤＮＡセグメントを「ニッキングエンドヌクレアーゼ」および制限エンドヌクレアーゼの使用を介してベクター中で生成する。ニッキングエンドヌクレアーゼは、クローニングベクターに単鎖尾部を創製するための二本鎖のポリヌクレオチドの単鎖をニックするエンドヌクレアーゼである。そのベクターを、標準的制限エンドヌクレアーゼで最初に線形化する。次いで、その後、ニッキングエンドヌクレアーゼで消化する。熱処理後、末端の単鎖ＤＮＡセグメントをベクター中で生成する。およそ５５％のＧＣ含量が、下流のＰＣＲ増幅および効率的なアニーリングために薦められる。プロモーター、タグまたは他の配列エレメントは、ＰＣＲで増幅した生成物の５’および３’末端に付加して、下流の適用に用いることができる線形の構築体を創製できる。
【００７０】
ＤＮＡ構築体ｐＭＯＮ９２８７０を、ベースベクター、ｐＭＯＮ８２０６０、および配列番号５として提供したＡｓｎＳポリペプチドをコードするトウモロコシＡｓｎＳ３ポリヌクレオチド分子から組み立てた。プラスミド骨格ｐＭＯＮ８２０６０を制限エンドヌクレアーゼ、ＨｐａＩを用いて線形化した。次いで、プラスミド骨格をニッキングエンドヌクレアーゼ Ｎ．ＢｂｖＣ ＩＡ(New England Biolabs, Beverly, MA)で処理した。消化後、反応物を６５℃に加熱した。これは、ＤＮＡのニックされた鎖をそれらの相補的ＤＮＡ鎖から分離させる。得られた線形化したプラスミド骨格は、組立に利用可能な２つの末端の単鎖ＤＮＡセグメントを残す。
【００７１】
ポリメラーゼ鎖反応を使用して、ＡｓｎＳをコードするＤＮＡ分子において末端の単鎖ＤＮＡセグメントを生成した。ＡｓｎＳポリペプチドをコードするトウモロコシＡｓｎＳ３ポリヌクレオチド配列（配列番号：５）を、順方向ＰＣＲプライマー（配列番号：４８）および逆方向ＰＣＲプライマー（配列番号：４９）： 
配列番号：４８：GCAGTCGCTGTCGTTACCCGGCATCATGTGTGGCATC
配列番号：４９：GCGAGTACCGCTGGGTTCTAACGTACTCTCGTCAGACCGCG
の設計に用いた。
【００７２】
ポリメラーゼ鎖反応増幅を、ハイファイサーマル・ポリメラーゼ、ＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ(Novagen, Madison, WI)を用いて行なった。ポリメラーゼ鎖反応は、１ＸＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼ緩衝液、１Ｍベタイン(Sigma, St. Louis, MO)、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４、２５０μＭ ｄＮＴＰｓ、各プライマーの５ｐｍｏｌおよび１単位のＫＯＤホットスタートＤＮＡポリメラーゼを含有する２５μＬ容積中で行った。ポリメラーゼ鎖反応は、以下のサイクラーパラメーターを用いて、ＰＴＣ−２２５ ＤＮＡ Engine TetradTMサーマルサイクラー(MJ Research Inc., Waltham, MA)中で行った：
１．  ９４℃で２分間
２．  ９４℃で１５秒間
３．  ７０℃で３０秒間（１サイクル当たり-１℃）
４．  ７２℃で５分間
５．  工程２に行く、９回
６．  ９４℃で１５秒間
７．  ６０℃で３０秒間
８．  ７２℃で５分間
９．  工程６に行く、２４回。
１０.  ７２℃で１０分間
１１．  １０℃保持
１２．  終了
【００７３】
ポリメラーゼ鎖反応の第２ラウンドは、末端の単鎖ＤＮＡセグメントを生成した領域でウリジン残基を導入するために行った。多数のＤＮＡポリメラーゼが、ＤＮＡの鋳型鎖におけるウリジン残基を読むことができないか、またはウリジン残基を用いて、鎖を重合することができない。従って、ポリメラーゼ鎖反応は、ウリジンを組込み読むことができる酵素を用いて行った(Expand High FidelityTMプラス PCR System; Roche, Indianapolis, IN)。この方法の修飾、および予期した結果を提供する他の方法の使用は、当業者に知られている。
【００７４】
組み立てたＤＮＡ構築体は、ElectroMAXTM DH10B E. coli コンピテント細胞(Invitrogen, Carlsbad, CA)に形質転換した。組立反応からの０.５μＬ（マイクロリットル）アリコート標本を２０μＬのElectroMAXTM DH10Bコンピテント細胞と氷上で混合し、エレクトロポレーション用のMicroPulser ０.２ｍｍ エレクトロポレーション キュベット(Bio-Rad Laboratories Inc., Hercules CA)に負荷した。細胞を１６５−２１００ MicroPulser Electroporator (Bio-Rad Laboratories Inc.)を用いて、１．８ｋＶでエレクトロポレーションに付した。エレクトロポレートした細胞を、３７℃で１時間、１８０μＬのＳＯＣ培地(Invitrogen Inc.)中で培養した。次いで、細胞をスペクチノマイシン（７５ｍｇ／Ｌ）を含むＬＢ寒天平板上にプレートし、３７℃で一晩成長させた。コロニーを、３７℃で一晩、ＬＢ培地中で選択および増殖させた。プラスミドＤＮＡ構築体をQIAprepR Spin Miniprep Kit (QIAgen Sciences, Valencia, CA)を用いて単離した。ＤＮＡ配列決定はBigDyeRターミネーター（Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、ＡＢＩ ３７３０ｘｌ ＤＮＡアナライザーで行った。
【００７５】
トウモロコシＡｓｎＳ２、ダイズＡｓｎＳおよび酵母ＡｓｎＳ１ ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列のクローニングは、製造者(Invitrogen Corp.)によって記載されるような「GatewayRクローニング方法」を用いて達成した。GatewayRクローニング法の目標は発現クローンを作成することである。この２工程プロセスは、まず、エントリー・ベクター中への注目する遺伝子のクローニングに続いて、ディスティネーション・ベクター中へのエントリー・ベクターからの注目する遺伝子をサブクローニングして、発現ベクターを生成することを含む。クローニング技術は、E. coli染色体へそのＤＮＡの組込むためにラムダファージによって用いられる部位特異的組換えシステムに基づく。
【００７６】
引き続いての組換えクローニングに用いるＤＮＡ構築体の２つのａｔｔＢまたはａｔｔＲの組換え配列を、スペクチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗性遺伝子（ＳＰＣ／ＳＴＲ）およびＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列に隣接して挟まれる組換えベクターにクローニングした。ＡｓｎＳをコードするポリヌクレオチド配列を、第一および第二のプライマー配列（配列番号２０〜４３）を用いて、それらのそれぞれの種から作成されたｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーから単離した。近接するａｔｔＢ１／Ｒ１、ＳＰＣ／ＳＴＲ遺伝子、ＡｓｎＳ遺伝子およびａｔｔＢ２／Ｒ２配列を、単一のポリヌクレオチド分子として、植物細胞中での発現用の組換え構築体、ｐＭＯＮ７９７０６（Zea mays ＡｓｎＳ２）、ｐＭＯＮ７９７００（Glycine max ＡｓｎＳ）またはｐＭＯＮ７９６５３（Saccharomyces cerevisiae ＡｓｎＳ）と指定された二本鎖ＤＮＡプラスミドに移した。これらのＤＮＡ構築体は、Agrobacteriumの右境界（Ｏ−ＯＴＨ．−ＲＢ）領域および左境界（ＬＢ）領域、ならびにHerrera-Estrellaら, 1983; Bevan, 1984; Kleeら, 1985により開示され他のもの、ｅ３５Ｓプロモーター (P-CAMV.35S, タンデムに複製したエンハンサー 米国特許第５，３２２，９３８号)、ａｔｔＢ１／Ｒ１遺伝子エレメント (O-Lam.attB1/R1)、ＳＰＣ／ＳＴＲ遺伝子、各々のＡｓｎＳコード領域(CR)、ａｔｔＢ２／Ｒ２遺伝子エレメント (O-Lam.attB2/R2), ジャガイモプロテアーゼ阻害剤ＩＩターミネーター (St.Pis)、AgrobacteriumＮＯＳプロモーター(P-AGRtu..nos, Fraleyら, 1983)、Agrobacterium 左境界(O-OTH.-LB)、カナマイシン抵抗性遺伝子(CR-OTH.-Kan, 米国特許第６，２５５，５６０号)およびE. coliオリジンの複製 (Ec.ori.ColE)を含む。
【００７７】
ＤＮＡ構築体は、ｐＭＯＮ７９７０６、ｐＭＯＮ７９７００またはｐＭＯＮ７９６５３についてのクロラムフェニコール選択（２５μｇ／ｍＬ）およびカナマイシン選択（５０μｇ／ｍＬ）下のLibrary EfficiencyR DB3.1TM 細胞(Invitrogen Corporation)において増幅した。ベクターＤＮＡは、QIAGEN Plasmid Kit (QIAGEN Inc.)を用いて、細菌培養物から精製した。
【００７８】
ｐＭＯＮ７９７００、ｐＭＯＮ７９７０６およびｐＭＯＮ７９６５３についてのＤＮＡは、放電粒子加速遺伝子送達装置を用いて、米国特許第５，０１５，５８０号に記載されるようにトウモロコシ胚に導入した。ＬＨ５９の前培養した未成熟胚の微粒子銃については、３５％〜４５％の最大電圧を好ましくは用いた。微粒子銃の後、トウモロコシ組織を２７℃の暗所にて培養した。本発明のトランスジェニック植物を作成するための形質転換の方法および材料、、例えば、様々な培地、受容体標的細胞、未成熟胚の形質転換および稔性なトランスジェニック植物の引き続いての再生は、米国特許第６，１９４，６３６号および第６，２３２，５２６号、ならびに米国特許出願公開２００４０２１６１８９に開示されており、それらをここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【００７９】
稔性の遺伝子組換えトウモロコシ植物は、適当な再生培地上で形質転換したカルスを生長させることにより、形質転換したトウモロコシ細胞から生成して、苗条発育および小植物形成を開始させる。小植物は、（培地に移して約４〜６週間後に）高さ約３インチで、根を所有した場合に土壌に移した。植物は２６℃にてグロースチャンバ中で２週間維持した後、温室中のミストベンチに２週維持した。植物は、５ガロンのポットに引き続いて移し、温室中で成熟まで成長させた。相互受粉は、トウモロコシＬＨ５９同系繁殖系で成した。種子をトウモロコシ植物から集め、蛋白質およびさらなる育種活性の分析に用いた。
【００８０】
実施例３
ＡｓｎＳポリヌクレオチド配列でのトウモロコシのベクター構築および形質転換
トウモロコシＡｓｎＳ２（配列番号：３、ｐＭＯＮ７９７０６、図１）をＰＣＲ（ポリメラーゼ鎖反応）の使用により増幅した。ＰＣＲ反応用の反応条件は、製造者のプロトコール(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)に従った。前記のように調製した約１００ｎｇのトウモロコシＤＮＡを、各３０ナノモルの順方向（ｆ）プライマー（配列番号：３２）および逆方向（ｒ）プライマー（配列番号：３３）ならびに各１０ミクロモルのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびＴＴＰ、LA PCR Buffer II (Takara Bio INC, Shiga, Japan)中の２．５ユニットのTaKaRaLA Taqを用いて増幅した。９４℃で１分間の最初のインキュベーション後、３５サイクルのＰＣＲを９４℃にて４５秒間行った後、６０℃で４５秒間のアニーリングに続けて、７２℃で１分１５秒間、７２℃で７分間の１サイクルを行った。
【００８１】
５つのＡｓｎＳ２  ＤＮＡ構築体を作成した。最初のトウモロコシＡｓｎＳ２構築体は、前記のごときＰＣＲによってｐＭＯＮ７９７０６から１８２１塩基対のＡｓｎＳ２フラグメントを単離した後、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩの制限酵素で制限消化することにより作成した。得られたＡｓｎＳ２遺伝子は、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＭＯＮ６１５６０に連結した。得られたシャトルベクター（ｐＭＯＮ６６２４６）をＮｏｔＩで消化し、ＰＰＤＫプロモーターおよびＲＧＬＵＴ１ターミネーターとの作動可能な連結において、ＡｓｎＳ２遺伝子を含む挿入断片をＮｏｔＩで消化したｐＭＯＮ３０１６７に連結した、これも。ＥＰＳＰＳ遺伝子を含むｐＭＯＮ３０１６７プラスミドは、グリホサートでの選択を供する。得られた最終プラスミドをｐＭＯＮ６６２３０（図３）と指定した。
【００８２】
第２のＡｓｎＳ２構築体を前記のＡｓｎＳ２（ｐＭＯＮ７９７０６）遺伝子を用いて作成した。その構築体は、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＭＯＮ６１５６２にＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ消化したＡｓｎＳ２遺伝子を挿入した結果、ＡｓｎＳ２遺伝子を、ＮＡＳプロモーターおよびＲＧＬＵＴ１ターミネーターと作動可能に連結することにより作成した。得られたプラスミドは、ＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩで消化したｐＭＯＮ３０１６７に連結した。得られたプラスミドはｐＭＯＮ６６２２９（図２）と指定した。
【００８３】
第３のＡｓｎＳ２構築体は、前記のＡｓｎＳ２遺伝子（ｐＭＯＮ７９７０６）を用いて作成した。この構築体に用いたＰ−ＦＤＡプロモーターをＮｏｔＩおよびＸｂａＩの制限酵素での消化によってｐＭＯＮ７８８１０から単離した。次いで、Ｐ−ＦＤＡプロモーターは、ＮｏｔＩおよびＸｂａＩで先に消化してそのＰＰＤＫプロモーターを除去したｐＭＯＮ６６２４６に連結した。得られたプラスミドをＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩで消化したｐＭＯＮ３０１６７に連結した。得られたプラスミドをｐＭＯＮ６６２３１（図４）と指定した。
【００８４】
第４のＡｓｎＳ２構築体を前記のＡｓｎＳ２遺伝子（ｐＭＯＮ７９７０６）を用いて作成した。この構築体中で用いたＰ−ＲＴＢＶプロモーターをｐＭＯＮ７４５７６からのＰＣＲにより生成した。７２１ｂｐのフラグメントをＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化し、先にＮｏｔＩおよびＸｂａＩで消化したｐＭＯＮ６６２４６に連結した。Ｐ−ＲＴＢＶプロモーターおよびＲＧＬＵＴ１ターミネーターとの作動可能な連結においてＡｓｎＳ２遺伝子を含む得られたプラスミドをＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩで消化されたｐＭＯＮ３０１６７に連結した。得られたプラスミドはｐＭＯＮ６６２３９（図５）と指定した。
【００８５】
第５のＡｓｎＳ２構築体を前記のＡｓｎＳ２遺伝子（ｐＭＯＮ７９７０６）を用いて作成した。ＺｍＡＳセンス  5'TCCTAGACATGTCCGGCATACTTGCTG3' (配列番号：46)、および 
ＺｍＡＳアンチセンス  5'TGCAGAATTCTATCCCTCGATGG; (配列番号：47)
のプライマー対を用いて、ｐＭＯＮ６６２４０からのトウモロコシＡｓｎＳ２を増幅した。ＰＣＲセットアップは以下の通りである：５０μｌ  ＰＣＲ反応の全容積中で、１μｌの１０ｍＭのＺｍＡＳセンスおよびＺｍＡＳアンチセンスの各プライマー、ｐＭＯＮ６６２４０の０.２〜０.５μgのプラスミドＤＮＡ（１μｌ）、５μｌの１０Ｘ  AccuPrime Tm Pfx Reaction Mix、１μｌのACCuPrime Tm Pfx DNA Polymerase (Invitrogen)、および４１μｌの蒸留水。ＰＣＲ反応は、以下のサイクル・パラメーターで行った：９４℃で１分間後、変性のための９４℃１５秒間の３０サイクル；アニーリングの５８℃１５秒間、および６８℃４分間に続いて；６８℃での１０分間の伸長。ＰＣＲ産物をQIAGEN (QIAGEN Inc.)からのＰＣＲ精製キットを用いて精製した。ＰＣＲトウモロコシＡｓｎＳ２生成物のアリコートをＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩ制限酵素で消化し、ＰＣＲ産物のもう一つのアリコートをＡｆｌＩＩＩおよびＮｃｏＩで消化した。次いで、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩフラグメントをｐＭＯＮ９４９０１のＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩサイトにクローニングした。トウモロコシＡｓｎＳ２のＡｆｌＩＩＩおよびＮｃｏＩ  ５’末端フラグメントをＮｃｏＩサイトにてトウモロコシＡｓｎＳ２フラグメントのＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩにクローニングした。ｅ３５ＳプロモーターおよびＨｓｐ１７ターミネーターとの作動可能な連結においてトウモロコシＡｓｎＳ２を含む得られたプラスミド（ｐＭＯＮ７４９４０）をＮｏｔＩで消化し、ＮｏｔＩで消化したｐＭＯＮ５３６１６に連結してｐＭＯＮ７４９４６を構築した。
【００８６】
前記の各構築体は、遺伝子組換え事象を選択する手段としてのグリホサート非感受性タイプＩＩ  ＥＰＳＰＳの発現用の発現カセットを含んだ（米国特許第５，６３３，４３５号）。各構築体の核酸配列をPE Applied Biosystems BigDye ターミネーター v.3.0 (PE Applied Biosystems, Foster City, CA)に記載された標準方法を用いて決定し、クローニング結合の完全性を確認した。ｐＭＯＮ６６２２９、ｐＭＯＮ６６２３０、ｐＭＯＮ６６２３１、ｐＭＯＮ６６２３９およびｐＭＯＮ７４９４６ベクターを、トウモロコシ細胞の引き続いての形質転換、および無傷のトウモロコシ植物中へのこれらの細胞の再生に用いた。注目する構築体を、例えば、米国特許出願公開２００５００４８６２４に記載されたAgrobacterium媒介形質転換法によりトウモロコシ系ＬＨ２４４からの未成熟胚に導入した。
【００８７】
実施例４
トウモロコシ種子試料の蛋白質およびアミノ酸の分析。
この実施例は、ＨＰＬＣおよび近赤外線の測定を用いて、増加したアスパラギンおよび蛋白質を持つ本発明の種子を選択するための蛋白質およびアミノ酸の分析方法を記載する。種子蛋白質分析については、各処理につき５０〜１００種子よりなる小さなバルク試料を、近赤外線透過率分光法(Infratec model 1221, Tecator, Hoganas Sweden)を用いて測定した。この手順は、近赤外線の吸収と、典型的な種子試料中に含まれた化学成分量との間に線形関係が存在するという観察に基づいた。未知の試料を分析するのに先立ち、スペクトルデータをキャリブレーション試料で集め、一次分析技術を用いて、引き続いて分析した。用いた一次技術は、窒素燃焼（Murray and Williams, 1987）であった。多変数のモデルを、分光計からのスペクトルのデータおよび一次データを用いて開発した。このケースにおいて、ＰＬＳ−１（部分的最小二乗法回帰タイプＩ）の多変数モデルを１５２のキャリブレーション試料を用いて構築した。未知の各試料を分光計で少なくとも５回スキャンし、その蛋白質含量は各走査で予測した。試料をスキャンした各回にて、それを試料キュベットに戻して加えて、テストした試料の正確な表示を提供した。予測した蛋白質の値を複数の走査につき平均し、次いで、各試料につき報告した。
【００８８】
遊離アミノ酸分析をＨＰＬＣによりトウモロコシ組織で行った。各試料について、２０〜５０ｍｇの凍結乾燥した組織を、２ｍＬの微量遠心チューブ中の１．５ｍＬの１０％トリクロロ酢酸で抽出した。試料を緩やかな振盪で室温にて一晩抽出した。抽出した試料を遠心分離によって澄明とし、上清をさらなる分析のために取り出した。遊離アミノ酸分析を、Zorbax Eclipse AAA C18カラム（４．６×７５ｍｍ、３．５ミクロン、Agilent Technologies, Palo Alto, CA）およびZorbax Eclipse AAA分析用ガードカラム（４．６×１２．５ｍｍ、５ミクロン）を装備した蛍光検出器および９６−ウェルオートサンプラーを持つAgilent Series 1100 HPLCでのＨＰＬＣにより行った。試料を分離の直前にｏ−フタルアルデヒドで予め誘導体化した。遊離アミノ酸を、４０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ７．６／メタノール／アセトニトリル勾配での溶解に続いて、３４０ｎｍ／４５０ｎｍ（励起／発光）で蛍光検出した。遊離アミノ酸量は、外部アミノ酸基準に基づいて定量し、ピークをChemStation software (Agilent)で積算した。相対的な標準偏差は典型的には８％未満であった。
【００８９】
実施例５
遺伝子組換えトウモロコシ植物におけるアスパラギンレベルおよび粒蛋白質含量の圃場評価。
この実施例は、形質転換したトウモロコシ植物および種子におけるアスパラギンおよび蛋白質のレベルに対するトウモロコシＡｓｎＳ構築体（ｐＭＯＮ７９７０６およびｐＭＯＮ９２８７０）の効果；および粒蛋白質含量に対するトウモロコシＡｓｎＳ構築体（ｐＭＯＮ７９７００およびｐＭＯＮ７９６５３）の効果の圃場評価の結果を記載する。トウモロコシ組織中の遊離アスパラギンの相対的な濃度は、ｐＭＯＮ７９７０６またはｐＭＯＮ９２８７０で形質転換したＲ０トウモロコシ植物から誘導した同系繁殖系から得た。ｐＭＯＮ７９７０６については、Ｒ０形質転換体を親の同系繁殖系ＬＨ５９に戻し交配して、ＢＣ１種子を作成した。導入遺伝子で分離するＢＣ１種子を圃場苗床に植え、個々の植物をＮＰＴＩＩマーカー遺伝子の存在につきスコアした。葉組織を、遊離アミノ酸分析のための個々の遺伝子組換え事象について、導入遺伝子ポジティブおよび導入遺伝子ネガティブな植物からの遊離アミノ酸分析のために集めた。ｐＭＯＮ７９７０６トランスジェニック植物の葉遊離アミノ酸を、各事象内のネガティブな等値線（isoline）の植物と比較し、JMP 5.1 ソフトウエア(SAS Institute, Cary, NC)スチューデントｔ検定により統計的に分析した。ｐＭＯＮ９２８７０について、Ｒ０形質転換体を親の同系繁殖系ＬＨ２４４に戻し交配して、ＢＣ１種子を創製した。ＢＣ１種子を圃場苗床で植え、自家受粉して、ＢＣ１Ｓ１種子を創製し、引き続いて第２の同系繁殖系の苗床に植えた。導入遺伝子ポジティブの植物をＮＰＴＩＩマーカー遺伝子の存在につきスコアリング後に、各遺伝子組換え事象につき同定した。葉組織を苗床で等間隔に植えられた導入遺伝子ポジティブのＢＣ１Ｓ１植物および親の同系繁殖系の試験区画（plot）から集めた。ｐＭＯＮ９２８７０についての葉遊離アミノ酸は、分散分析を行ないＳＡＳ ９．１ソフトウェアを用いて、スチューデントｔ検定を行なうことにより親対照に対する導入遺伝子のエントリーを比較することにより統計的に分析した。双方の構築体についての遊離アミノ酸分析について、葉組織は開花期に上部の十分に伸長した葉を取り出した後、ドライアイスで凍結することにより集めた。葉試料を冷凍粉砕し、凍結乾燥し、ＨＰＬＣにより遊離アミノ酸含量を測定した。
【００９０】
ｐＭＯＮ７９７０６およびｐＭＯＮ９２８７０の複数の遺伝子組換え事象は、葉アスパラギン含量における実質的増加を示すことが観察された（表２）。テストされたｐＭＯＮ７９７０６の７事象のうちの４つが、葉アスパラギン濃度における有意な増加を示し、それは０.０５以下のｐ値によって示された。第２のトウモロコシ・アスパラギンシンテターゼ遺伝子を発現しているｐＭＯＮ９２８７０の遺伝子組換え事象において、５事象のうちの４つは、葉アスパラギンレベルの有意な増加を示した（表２）。これらのデータは、ｐＭＯＮ７９７０６およびｐＭＯＮ９２８７０におけるコメアクチン・プロモーター下の、各々、トウモロコシＡｓｎＳ２およびトウモロコシＡｓｎＳ３の導入遺伝子の発現の結果、遊離アスパラギンを特異的に増加させ、それは活発なアスパラギンシンテターゼの過剰発現と一致していることを示した。
【００９１】
トウモロコシ種子における蛋白質の相対的な濃度は、ｐＭＯＮ７９７０６またはｐＭＯＮ９２８７０で形質転換したＲ０トウモロコシ植物から誘導した同系繁殖系から得た。ｐＭＯＮ７９７０６（前記）のＢＣ１トランスジェニック植物を自家受粉し、得られたＢＣ１Ｓ１粒を成熟まで生長させ、単一の穂ごとの蛋白質含量につき測定した。蛋白質を０％湿度での乾重量のパーセンテージとして測定した。ｐＭＯＮ７９７０６トランスジェニック植物についての粒蛋白質を各事象内の負の等値線植物と比較し、ＳＡＳ ９．１ソフトウェアでのスチューデントｔ検定によって統計的に分析した。ｐＭＯＮ９８２７０について、ＢＣ１Ｓ１植物を自家受粉し成熟まで生長させ、単一の穂ごとの蛋白質含量を測定した。ｐＭＯＮ９２８７０についての粒蛋白質は、バイローケーション（by-location）分析を行うことにより、カスタム開発空間方法（custom developed spatial method）で統計的に分析した。バイローケーション分析は二工程プロセスである。その分析における第１の工程は、圃場（すべての６番目の試験区画）において系統的に配置されたすべたの空間チェック試験区画を用いて、異方性の球状のセミ−バリオグラムモデルを適合することにより、圃場における空間的自己相関の見積りを含んだ。分析の第２のステージは、分析の第１ステージで見積もられた空間的自己相関構造を用いて、空間的可変性についての導入遺伝子のエントリーの値を調整することを含んでいた。空間的自己相関についての調整後、導入遺伝子のエントリーの平均値を親対照と比較して、導入遺伝子および対照平均間の差の統計的有意差をテストした場合に、平均比較を行った。
【００９２】
ｐＭＯＮ７９７０６およびｐＭＯＮ９２８７０の双方の複数の事象は、同系繁殖系の粒蛋白質含量における有意な増加を示した（表３）。統計的に分析したｐＭＯＮ７９７０６の５事象のうちの３つは、粒蛋白質含量の有意な増加（ｐ＜０.０５）を示し、２つの他の事象が、有意な増加への傾向（ｐ＜０.１５）を示した。２つの事象が統計分析についての十分な穂数に戻らなかった。ｐＭＯＮ９２８７０の４つの遺伝子組換え事象のうちの３つは、粒蛋白質含量における有意な増加（ｐ＜０.１）を示し、１つの事象は、分析に対する不十分な穂数により試験されなかった。これらのデータは、ｐＭＯＮ７９７０６およびｐＭＯＮ９２８７０が葉アスパラギン含量を増加させることに加えてトウモロコシ中の粒蛋白質含量を増加させる遺伝子組換え事象を生成することを確認する。
【００９３】
【表２】
2008539784.tif 000004
【００９４】
【表３】
2008539784.tif 000005
【００９５】
高いアスパラギンおよび粒蛋白質発現型ｐＭＯＮ７９７０６を第２の試験における複数の組織中で確認した。ＢＣ１世代後、ｐＭＯＮ７９７０６の５つの事象を２つの以下の苗床において自家受粉して、導入遺伝子につき同型接合性であったＢＣ１Ｓ３種子を生成した。ｐＭＯＮ７９７０６構築体の発現から起因するアスパラギンの相対的な濃度を同型接合性のＢＣ１Ｓ３およびＬＨ５９トウモロコシ品種対照の比較によりトウモロコシＶ８成長段階での研究において決定した（表４）。トランスジェニックエントリーおよび対照を、圃場試験区画における５つの複製ブロックで無作為化完全ブロック計画（randomized complete block design）で植えた。２つの植物の上部の十分に伸長した葉および茎部分をサンプリングし、プールし、ドライアイス上に置き、粉砕し、凍結乾燥し、ＨＰＬＣにより遊離アミノ酸含量を測定した。値に続く「＊」は、ＬＨ５９対照（ダンネットの片側検定；(SAS 9.1, Cary, NC)からの有意差を示す。Ｖ８成長段階およびＲ１世代の双方で得られたアスパラギン測定は、５つのｐＭＯＮ７９７０６事象からの植物が遊離アスパラギンにおける有意な増加を有することを示した。Ｖ８葉組織における相対的な遊離アスパラギンレベルは、ＬＨ５９品種対照における３．４％と比較して、１３．９％まで増加し、茎アスパラギンは、その対照における９．６と比較して、３９％まで増加した（表４）。粒蛋白質分析については、１０の穂を１つの試験区画当たりサンプリングし、殻を除去し、粒蛋白質濃度を分析した。また、粒蛋白質は、ｐＭＯＮ７９７０６の５つの事象において有意に増加した（表４）。その結果は、一般的傾向として、アスパラギンにおける有意な増加を生成する事象が核蛋白質における有意な増加として生成することを示す（表２〜４）。
【００９６】
【表４】
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【００９７】
コメアクチン・プロモーター下でアスパラギンシンテターゼ遺伝子を発現する３種の異なる構築体について、ハイブリッド粒蛋白質における有意な増加が観察された。同型接合性のトウモロコシ同系繁殖系は、まず、Ｒ０の遺伝子組換え事象を反復親ＬＨ５９に戻し交配させるのに続いて、ＮＰＴＩＩ選択マーカーを用いて接合状態をスコアして、２つの引き続いての同系繁殖系の苗床における導入遺伝子ポジティブの選択の自家受粉を行い、ｐＭＯＮ７９７０６（トウモロコシＡｓｎＳ２）、ｐＭＯＮ７９７００（ダイズＡｓｎＳ）およびｐＭＯＮ７９６５３（酵母ＡｓｎＳ１）のＲ０遺伝子組換え事象から生成した。次いで、各構築体についての同型接合性の事象を雌性の同系繁殖系との交配における雄性花粉ドナーとして用いて、Ｆ１ハイブリッドを創製した。そのＦ１ハイブリッド種子は複数の位置の試験で植え、各構築体についての遺伝子組換え事象を、最終の粒蛋白質につき分析し、圃場の全体にわたって通常の間隔で植えた対照ハイブリッドにおける粒蛋白質に基づいた空間的補正分析に従い、反復親ハイブリッド対照と比較した。粒は、各試験区画から収穫し、殻を除去し、蛋白質含量を分析した。データは、バイローケーションおよびアクロスローケーション分析を行うことによりカスタム開発空間的方法を用いて分析した。バイローケーション分析は、二工程プロセスである。その分析における第１の工程は、圃場（すべての第３の試験区画）における系統的に配置された全ての空間的チェック試験区画を用いて、異方性の球状のセミ−バリオグラムモデルに適合することにより、圃場における空間的自己相関の見積りを含んだ。分析の第２のステージは、分析の第１のステージにおいて見積もられた空間的自己相関構造を用いて、空間的可変性への導入遺伝子のエントリーの値を調整することを含んでいた。各位置における空間的自己相関についての調整後に、トランスジェニックエントリーの平均値を親対照と比較して、導入遺伝子および対照の平均間の差の統計的有意差（Ｐ＝０.２０）をテストした場合に、アクロスロケーション分析を行った。ｐＭＯＮ７９７０６の５つの事象のすべてが、ハイブリッド試験における粒蛋白質の有意な増加を示し、それは、この構築体の遺伝子組換え事象の同系繁殖系において、粒蛋白質が増加したという観察と一致した（表５）。また、他の２つのアスパラギンシンテターゼ構築体、ｐＭＯＮ７９７００（ダイズＡｓｎＳ）およびｐＭＯＮ７９６５３（酵母ＡｓｎＳ）は、各々、５事象のうちの２つおよび２事象のうちの２つに粒蛋白質レベルにおける有意な増加を示した。
【００９８】
【表５】
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【００９９】
実施例６
ｐＭＯＮ７９７０６およびｐＭＯＮ９２８７０による導入遺伝子発現およびアスパラギンシンテターゼ酵素活性の圃場評価
導入遺伝子発現を、ｐＭＯＮ７９７０６およびｐＭＯＮ９２８７０の遺伝子組換え事象において確認した。また、ｐＭＯＮ７９７０６については、ＢＣ１Ｓ３同型接合性同系繁殖系での圃場試験における葉アスパラギン含量の決定に用いた組織を、開花期でのｐＭＯＮ７９７０６からの３’−ターミネーター配列（Ｓｔ.Ｐｉｓ４）からの発現の測定に基づいた導入遺伝子発現の決定に用いた。２つの葉試料が、５つの各複製試験区画（同系繁殖系対照については１０）から収穫し、プールし、ドライアイス上で凍結した。次いで、葉試料を発現分析のために粉砕凍結した。ＲＮＡ抽出については、５０ｍｇの凍結組織を９６ウェルプレートに等分した。各試料をＡＢＩ核酸溶菌液(Applied Biosystems, Foster City, CA)−対−１Ｘ ＰＢＳ ｐＨ７．４（ＭｇＣｌまたはＣａＣｌが無い）の１：１溶液を含有する５００ｍｌの溶解緩衝液で抽出した。ＲＮＡを粗製溶解物から核酸を捕らえるための濾板を用いて、新鮮な凍結組織試料から抽出し、５０μｌのＡＢＩ溶離緩衝液を用いて、境界ＲＮＡを溶出した。定量的ＰＣＲは、５μｌのＡＢＩ一工程ＲＴ−ＰＣＲ試薬と共に５μｌのＲＮＡ鋳型を用いて行った。その反応はＡＢＩ Ｔａｑｍａｎ ７９００ ＰＣＲ装置で４０のＰＣＲサイクルを行い、サイクリングパラメーターは、４８℃３０分間、９５℃１０分間、９５℃１０秒、６０℃１分間であった。蛍光性の測定値は、ジャガイモプロテアーゼ阻害剤ＩＩ（Ｓｔ.Ｐｉｓ４）から誘導したターミネーター配列および内因性対照（ユビキチン）の双方につき各４０サイクルにて各ウェルから得た。試料のサブセットは逆転写酵素なくして試行して、ＤＮＡ汚染をモニターした。試料を、内因性対照のサイクル閾値からＳｔ.Ｐｉｓ４についてのサイクル閾値を減じることにより、相対的な発現をスコアした。サイクル閾値（Ｃｔ）を決定し、デルタＣｔを、内因性対照値を引いたＳｔ.Ｐｉｓ４から計算した。インサイツ野生型を、平均の内因性対照シグナルを計算し、４０にてＳｔ.Ｐｉｓ４シグナル値をセットすることにより創製した。未知試料のデルタＣｔは、インサイツ野生型のデルタＣｔから引いた。最終データは、野生型に対しｐｉｎＩＩ（Ｓｔ.Ｐｉｓ４）発現として報告した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、ｐＭＯＮ７９７０６の６事象のうちの６つからの導入遺伝子の過剰発現を確認した（図６）。
【０１００】
また、導入遺伝子発現は、ｐＭＯＮ９２８７０を含む同系繁殖系事象で確認した。ＲＮＡ発現は、まず、各植物（１事象当たり４〜８の植物）から上部の伸長した葉を収穫し、ドライアイスで凍結させることにより、圃場苗床において生長した同系繁殖系植物の開花期での葉組織から測定した。導入遺伝子ポジティブの植物は、ＮＰＴＩＩマーカー遺伝子の存在に基づいて、従前に同定した。葉組織を凍結しつつ粉砕し、ｐＭＯＮ９２８７０の３’−ターミネーター配列（Ｓｔ.Ｐｉｓ４）からの発現につき分析した。定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析は、同系繁殖系対照と比較して、ｐＭＯＮ９２８７０を含む６事象のうちの５つが増加した導入遺伝子発現を示すことを示した（図７）。ｐＭＯＮ９２８７０事象ＺＭ＿Ｍ１０３３１６における低ＲＮＡ発現は、この事象における、低い葉アスパラギン含量および粒蛋白質含量と一致している。
【０１０１】
アスパラギンシンテターゼ活性に対するアスパラギンシンテターゼ遺伝子の発現の効果は、ｐＭＯＮ７９７０６およびｐＭＯＮ９２８７０の遺伝子組換え事象において測定した。凍結粉砕した葉組織を、予め冷却した９６ディープウェルプレートに等分した（２００〜４００ｍｇ）。蛋白質を緩衝液Ａ（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＯＨ、ｐＨ８．０、０.１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭアスパラギン酸塩、０.５ｍＭ ＤＴＴ、６７ｍＭメルカプトエタノール、２０％（ｖ／ｖ）グリセロール、０.１ｍＭ ＡＴＰ、１％（ｖ／ｖ）Ｐ９５９９（Sigma Company）、２５ｍＭ ＫＣｌ）中で抽出した。少量の砂を各ウェルに加えた。次いで、緩衝液Ａを４：１（緩衝液：組織）の比にてウェル中の葉組織に加えた。次いで、プレートを２分間塗料振盪機中で振盪させ、試料を混合し、次いで、１０分間５０００×ｇで遠心した。上清（１００〜２００μＬ）を、緩衝液Ａ中で平衡化された９６ウェルマクロスピンプレート(SNS S025L, The Nest Group Inc., Southboro, MA)中で脱塩した。次いで、上清を直ちにアッセイするか、または液体窒素中で凍結させ、使用まで−８０℃にて維持した。アスパラギンシンテターゼ活性をアッセイするために、脱塩した蛋白質抽出物（１０〜５０μＬ）を、１００μＬアッセイ溶液（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、２ｍＭアスパラギン酸塩、５ｍＭ ＤＴＴ、１０ｍＭ ＡＴＰ、１ｍＭアミノ（オキシ）酢酸（アスパルテートアミノトランスフェラーゼ阻害物質）、１ｍＭアスパラギン酸セミアルデヒド（アスパラギナーゼ阻害物質））を含有するウェルに加えた。反応を開始するために、グルタミン（標準アッセイにつき２ｍＭの最終濃度）を溶液に加え、次いで、混合した。次いで、アッセイ混合物を１〜２時間インキュベートした。次いで、その反応を等量の２０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸の添加により停止させた。次いで、その混合物を濾過して、沈澱物を除去し、アスパラギンをＨＰＬＣにより測定した。試料サイズはＨＰＬＣにつき０.５μｌから２．５μｌに増加させ、励起波長を３４０ｎｍから２３５ｎｍに低下させ、蛍光計増幅率は１０から１３に増加させた。この結果、０.５〜１００μＭアスパラギンの検出の感度を生じ、百マイクロ単位での活性レベルの測定を可能にする。
【０１０２】
ｐＭＯＮ７９７０６について、葉アスパラギンシンテターゼ酵素活性の決定に用いた組織は、Ｖ７成長段階にて収穫したＢＣ１Ｓ３同型接合性同系繁殖系での圃場試験からのものであった。ｐＭＯＮ７９７０６の事象は、増加した葉アスパラギンシンテターゼ活性を呈することが示された（表６）。アスパラギンシンテターゼ活性は、同系繁殖系の品種対照の５倍まで増加した。また、アスパラギンシンテターゼ酵素活性は、開花の時点にて同系繁殖系の圃場苗床のｐＭＯＮ９２８７０の遺伝子組換え事象につき決定した。また、５つのｐＭＯＮ９２８７０事象のうちの４つは、増加した酵素活性を示した（表６）。コメアクチン・プロモーター下のトウモロコシＡｓｎＳ２（ｐＭＯＮ７９７０６）およびトウモロコシＡｓｎＳ３（ｐＭＯＮ９２８７０）を発現するトウモロコシ植物における増加したアスパラギンシンテターゼ酵素活性は、遺伝子発現における増加、およびこれらの構築体で観察された葉のアスパラギン増加と一致している。
【０１０３】
【表６】
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【０１０４】
実施例７
アスパラギンおよび粒蛋白質含量に対するｐＭＯＮ６６２３１、ｐＭＯＮ６６２３９およびｐＭＯＮ７４９４６の効果の圃場評価
トウモロコシ組織における遊離アスパラギンの相対的含量は、トウモロコシＡｓｎＳ２がトウモロコシＦＤＡプロモーターの制御下にあるｐＭＯＮ６６２３１（図４）で形質転換されたＲ０トウモロコシ植物（ＬＨ２４４バックグラウンド）から誘導されたハイブリッド系から得た。ハイブリッドは、雄性同系繁殖系ＬＨ５９にＲ０植物を交配させることにより作成し、それは分離する（１：１）Ｆ１集団を創製する。得られたＦ１種子は、各位置にて２複製で３つのミッドウェスト位置に植えた。試験区画にＶ３成長段階にてグリホサートを噴霧して、ヌル（null）分離個体を消失させた。ハイブリッド対照は、境界線内に植え、比較はハイブリッド対照に対して成した。上葉を３つの場所すべてで、日没２時間後に、開花時点にて各試験区画内の３つの植物から集め、プールした。葉を直ちにドライアイス上に置き、次いで、処理まで−８０℃で貯蔵した。葉を凍結粉砕し、一部分をＨＰＬＣによる遊離アミノ酸分析のために凍結乾燥した。データは、Bonferroni調整のｐ値を用いて、削除されたスチューデント化された残余につきツー・パス方法で外れ値につきスクリーニングした。分散分析計算が開始される前に、外れ値を同定し、データセットから除去した。データは、アクロスロケーション無作為化完全ブロック計画（across-locations randomized complete block design）により分析した。構築体−事象組合せは、固定された効果でモデル化し、位置および位置内の代表（rep）を無作為効果でモデル化した。処理比較は、構築体−事象組合せの最小二乗法の対比を行うことによりなした。相対的な葉アスパラギンは、ｐＭＯＮ６６２３１の１２の事象のうち１１において有意に増加し、対照における３％と比較して、１６％の高さのアスパラギンレベルであった（表７）。また、成熟粒蛋白質は、試験区画当たり１０の穂の収穫後に測定し、各試験区画の種子の殻を除去し、プールし、次いで、粒蛋白質含量を測定した。１２事象のうちの９つは、ＬＨ２４４／ＬＨ５９のハイブリッド対照を超えて、成熟粒において蛋白質含量を有意に増加させることが判明した。
【０１０５】
【表７】
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【０１０６】
トウモロコシ組織における遊離アスパラギンの相対的含量は、トウモロコシＡｓｎＳ２が、各々、ＲＴＢＶまたはｅ３５Ｓプロモーター制御下にあるｐＭＯＮ６６２３９およびｐＭＯＮ７４９４６で形質転換したＲ０トウモロコシ植物（ＬＨ２４４バックグラウンド）から誘導したハイブリッド系から得た。ハイブリッドは、雄性同系繁殖系ＬＨ５９にＲ０植物を交配させることにより作成し、それは分離する（１：１）Ｆ１集団を創製する。得られたＦ１種子は、各遺伝子組換え事象につき３複製でハワイにおける１つの位置に植えた。試験区画にＶ３成長段階にてグリホサートを噴霧して、ヌル分離個体を消失させた。トウモロコシＡｓｎＳ２遺伝子を欠失したハイブリッド対照を比較のために含ませた。上葉を、日没２時間後に、開花時点にて各試験区画内の３つの植物から集め、プールした。葉を直ちにドライアイスに置き、次いで、処理まで−８０℃で貯蔵した。葉を凍結粉砕し、一部分をＨＰＬＣによる遊離アミノ酸分析のために凍結乾燥した。データは、まず、Bonferroni調整のｐ値を用いて、削除されたスチューデント化された残余につきツー・パス方法で外れ値につきスクリーニングした。分散分析計算が開始される前に、外れ値を同定し、データセットから除去した。データは、無作為化完全ブロック計画により分析した。構築体−事象組合せは、固定された効果でモデル化し、位置および位置内の代表を無作為効果でモデル化した。処理比較は、構築体−事象組合せの最小二乗法の対比を行うことによりなした。相対的な葉アスパラギンは、ｐＭＯＮ７４９４６の１３の事象のうち１０において有意に増加し、対照における２％と比較して、１６％の高さのアスパラギンレベルであった（表８）。また、成熟した粒蛋白質は、試験区画当たり全ての穂の収穫後に測定し、各試験区画の種子の殻を除去し、プールし、次いで、粒蛋白質含量を測定し、葉アスパラギン形質につき統計的に分析した。１３事象のうちの１０は、ハイブリッド対照に比較して成熟粒中で有意に蛋白質含量の増加を保有することが判明し、増加した葉アスパラギンを持つその１０事象も、ハイブリッド試験において増加した蛋白質を示した。ｐＭＯＮ６６２３９の遺伝子組換え事象について、１５事象のうちの１１は、葉アスパラギン含量における増加を示し、１５事象のうちの３つは、さらなる５つの遺伝子組換え事象はｐ＜０.０５にて増加した蛋白質を示したが、その０.０５アルファ・レベルにて粒蛋白質の有意な増加を示し、これはＲＴＢＶプロモーター（ｐＭＯＮ６６２３９）下のトウモロコシＡｓｎＳ２の発現が葉アスパラギン含量および核蛋白質含量を増加できるが、ｅ３５ｓプロモーター（ｐＭＯＮ７４９４６）下でよりも小さい範囲までであった（表８）。
【０１０７】
【表８−１】
2008539784.tif 000010
【表８−２】
2008539784.tif 000011
【０１０８】
* * * * 
刊行物、特許および特許出願のすべては、個々の公開または特許出願が参照によって組込まれるように具体的にかつ個々に示されるかのごとき同程度までここに出典明示して本明細書の一部とみなす。
【０１０９】
参考文献
以下の参考文献は、それらが本願明細書に記載されるものに補助的な典型的な手順または他の細部を提供する程度まで、ここに出典明示して具体的に本明細書の一部とみなす：
米国特許第4,761,373号
米国特許第4,957,748号
米国特許第5,100,679号
米国特許第5,219,596号
米国特許第5,322,783号
米国特許第5,322,938号
米国特許第5,538,880号
米国特許第5,550,318号
米国特許第5,563,055号
米国特許第5,610,042号
米国特許第5,633,435号
米国特許第5,936,069号
米国特許第6,005,076号
米国特許第6,146,669号
米国特許第6,156,227号
米国特許第6,194,636号
米国特許第6,232,526号
米国特許出願公開20040216189A1
米国特許出願公開20050048624A1
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【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】図１は、ｐＭＯＮ７９７０６のプラスミド地図を示す。
【図２】図２は、ｐＭＯＮ６６２２９のプラスミド地図を示す。
【図３】図３は、ｐＭＯＮ６６２３０のプラスミド地図を示す。
【図４】図４は、ｐＭＯＮ６６２３１のプラスミド地図を示す。
【図５】図５は、ｐＭＯＮ６６２３９のプラスミド地図を示す。
【図６】ｐＭＯＮ７９７０６事象における導入遺伝子発現。誤差バーは、遺伝子組換え事象につきｎ＝５および同系繁殖系対照につきｎ＝１０での、９５％の信頼区間を表わす。
【図７】ｐＭＯＮ９２８７０事象における導入遺伝子発現。誤差バーは、遺伝子組換え事象につきｎ＞３および同系繁殖系対照につきｎ＝１０植物での、９５％の信頼区間を表わす。
【図１】
2008539784.tif 000012
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2008539784000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月16日(2008.1.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008539784000001.app
【国際調査報告】
2008539784.tif 000049
2008539784.tif 000050
2008539784.tif 000051