(57)【要約】  本発明は、他の抗癌剤や放射線療法のような追加の薬剤もしくは治療法有りもしくは無しで、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンとを使用することを特徴とする、腫瘍または腫瘍転移の治療のための薬剤の製造方法を提供する。本発明はまた、医薬として許容される担体と組合せたEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せからなる医薬組成物を包含する。本発明の実施に使用できるEGFRキナーゼインヒビターの好適な例は、化合物塩酸エルロチニブ（タルセバ（Tarceva）（登録商標）としても知られている）である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として許容される担体中にEGFRキナーゼインヒビター及びゲムシタビンを含んでなる、特に癌における使用のための医薬組成物。
【請求項２】
EGFRキナーゼインヒビターがエルロチニブである、請求項1に記載の医薬組成物。
【請求項３】
組成物中のエルロチニブが塩酸塩として存在する、請求項2に記載の医薬組成物。
【請求項４】
1つ以上の他の抗癌剤をさらに含んで成る、請求項1〜3のいずれか1項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
EGFRキナーゼインヒビター及びゲムシタビンが使用されることを特徴とする、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤を製造するための方法。
【請求項６】
薬剤が癌を対象としている、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
EGFRキナーゼインヒビター及びゲムシタビンが同じ製剤中に含有される、請求項5または6に記載の方法。
【請求項８】
EGFRキナーゼインヒビター及びゲムシタビンが異なる製剤中に含有される、請求項5または6に記載の方法。
【請求項９】
EGFRキナーゼインヒビター及びゲムシタビンが、同じ経路による患者への投与を対象としている、請求項5〜8に記載のいずれか1項の方法。
【請求項１０】
EGFRキナーゼインヒビター及びゲムシタビンが、異なる経路による患者への投与を対象としている、請求項5〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
EGFRキナーゼインヒビターであるエルロチニブが使用される、請求項5〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
エルロチニブが、非経口または経口投与による患者への投与を対象としている、請求項5〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
ゲムシタビンが、非経口投与による患者への投与を対象としている、請求項5〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
1つ以上の他の抗癌剤をさらに含んで成る、請求項5〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
他の抗癌剤が、アルキル化剤、シクロホスファミド、クロランブシル、シスプラチン、ブスルファン、メルファラン、カルムスチン、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン、マイトマイシンC、代謝拮抗剤、メソトレキセート、エトポシド、6-メルカプトプリン、6-チオグアニン、シタラビン、5-フルオロウラシル、カペシタビン、デカルバジン、抗生物質、アクチノマイシンD、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アルカロイド、ビンブラスチン、パクリタキセル、糖質コルチコイド、デキサメタゾン、コルチコステロイド、プレドニソン、ヌクレオシド酵素インヒビター、ヒドロキシ尿素、アミノ酸除去酵素、アスパラギナーゼ、ロイコボリン、および葉酸誘導体から選択される、請求項5〜14のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１６】
ゲムシタビンをEGFRキナーゼインヒビターと組合せることを含んで成る、患者の腫瘍または腫瘍転移を治療するのに有用な医薬組成物の調製方法。
【請求項１７】
EGFRキナーゼインヒビターがエルロチニブである、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
医薬として許容される担体をゲムシタビンおよびエルロチニブと組合せることをさらに含んでなる、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
ゲムシタビン及びEGFRキナーゼインヒビターを含んで成る容器を含んで成るキット。
【請求項２０】
無菌希釈剤をさらに含んで成る、請求項19に記載のキット。
【請求項２１】
EGFRキナーゼインヒビターがエルロチニブである、請求項19に記載のキット。
【請求項２２】
患者の腫瘍、腫瘍転移または他の癌を治療するための方法として、患者へのゲムシタビン及びエルロチニブの併用治療の使用を指示する印刷された説明を含んで成る添付文書をさらに含んで成る、請求項19〜21のいずれか1項に記載のキット。
【請求項２３】
1つ以上の他の抗癌剤をさらに含んでなる、請求項1に記載の組成物。
【請求項２４】
他の抗癌剤が、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管インヒビター、ポドフィロトキシン、抗生物質、ニトロソ尿素、ホルモン療法、キナーゼインヒビター、腫瘍細胞アポトーシスのアクチベーター、および抗血管形成剤から成る群から選択されるメンバーである、請求項23に記載の組成物。
【請求項２５】
癌の治療が必要な対象に、(i) 第1の有効量のEGFRキナーゼインヒビター、またはその医薬として許容される塩；及び(ii) 第2の有効量のゲムシタビンを投与することを含んで成る、癌の治療のための方法。
【請求項２６】
癌の治療が必要な対象に、(i) 治療量以下の第1の量のEGFRキナーゼインヒビター、またはその医薬として許容される塩；及び(ii) 治療量以下の第2の量のゲムシタビンを投与することを含んで成る、癌の治療のための方法。
【請求項２７】
EGFRキナーゼインヒビターがエルロチニブである、請求項25または26に記載の癌の治療のための方法。
【請求項２８】
治療される腫瘍または腫瘍転移が結腸直腸腫瘍または腫瘍転移である、請求項5に記載の方法。
【請求項２９】
(i) 第1の有効量のEGFRキナーゼインヒビター、またはその医薬として許容される塩；及び(ii) 第2の有効量のゲムシタビンを含んで成る、特に癌における使用のための医薬組成物。
【請求項３０】
(i) 治療量以下の第1の量のEGFRキナーゼインヒビター、またはその医薬として許容される塩；及び(ii) 治療量以下の第2の量のゲムシタビンを含んで成る、特に癌における使用のための医薬組成物。
【請求項３１】
EGFRキナーゼインヒビターがエルロチニブである、請求項29または30に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
薬剤としての使用、特に癌における使用のためのEGFRキナーゼインヒビター及びゲムシタビン。
【請求項３３】
薬剤としての使用、特に癌における使用のためのエルロチニブ及びゲムシタビン。
【請求項３４】
腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤を製造するための、EGFRキナーゼインヒビター及びゲムシタビンの使用。
【請求項３５】
EGFRキナーゼインヒビターがエルロチニブである、請求項34に記載の使用。
【請求項３６】
本明細書に記載の新規化合物、プロセス、医薬組成物、方法、および使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌の治療を目的とした医薬を製造するための組成物と方法に関する。特に本発明は、ゲムシタビン（gemcitabine）と表皮増殖因子受容体（EGFR）キナーゼインヒビターとを含む医薬を製造するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌は、無秩序な増殖、分化の欠如、および局所組織へ侵襲し転移する能力を特徴とする広範囲の細胞性悪性腫瘍の総称である。これらの新生物悪性腫瘍は、種々の程度の広がりをもって、体のすべての組織や臓器を冒す。
【０００３】
種々のタイプの癌の治療のために過去数十年間にわたって多くの治療薬が開発されてきた。最も一般的に使用されるタイプの抗癌剤には以下がある：DNA−アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド）、代謝拮抗剤（例えば、メソトレキセート、葉酸アンタゴニスト、および5-フルオロウラシル、ピリミジンアンタゴニスト）、微小管破壊物質（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、パクリタキセル）、DNAインターカレーター（例えば、ドキソルビシン、ダウノルビシン、シスプラチン）、およびホルモン療法（例えば、タモキシフェン、フルタミド）。
【０００４】
国立癌研究所（National Cancer Institute）によると、肺癌はアメリカ合衆国における癌死亡の単一の最大の原因であり、この国の癌による死亡数のほぼ30％を占める。世界保健機構（World Health Organization）によると、肺癌と気管支癌は世界中で毎年120万を超える症例が有り、毎年約110万人の死亡を引き起こしている。NSCLCは肺癌の最も一般的な型であり、全症例のほとんど80％を占める。肺癌治療の選択肢は、癌の種類とステージにより、手術、放射線療法、化学療法の単独または組合せがある。進行性のNSCLCについて活性があることが証明されている薬剤には、シスプラチン、カルボプラチン、パクリタキセル、ドセタキセル、トポテカン、イリノテカン、ビノレルビン、ゲムシタビン（例えば、ゲムザール（gemzar）（登録商標））、およびEGFRキナーゼインヒビターであるゲフィチニブ（gefitinib）とエルロチニブ（erlotinib）がある。シスプラチン含有およびカルボプラチン含有併用化学療法は、単一薬剤化学療法で達成されるものより高い客観的応答率を与えることが証明されている（Weic, J.K.ら、(1991) J. Clin. Oncol. 9(7):1157-1162）。パクリタキセルはステージIVの患者で単一薬剤活性を有し、その応答率は21％〜24％の範囲であることが報告されている（Murphy W.K.ら、(1993) J. Natl. Cancer Inst. 85(5):384-388）。パクリタキセル併用は比較的高い応答率、有意な1年生存率、および肺癌症状の緩和を示した（Johnson D.H.、(1996) J. Clin. Oncol. 14(7):2054-2060）。パクリタキセルとカルボプラチン処方では、応答率は27％〜53％であり、1年生存率は32％〜54％を示した。しかしかかる治療法の効力は、現在は標準的治療法と見なされている特定の処方は存在しないという程度である。
【０００５】
表皮増殖因子受容体（EGFR）キナーゼまたはそのリガンドTGF-アルファの過剰発現は、しばしば多くの癌（乳癌、肺癌、結腸直腸癌、および頭頚部癌を含む）を引き起こし（Salomon D.S.ら、(1995) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19:183-232；Wells, A. (2000) Signal, 1:4-11）、これらの腫瘍の悪性増殖に寄与すると考えられている。EGFR遺伝子の特異的な欠失変異はまた、細胞性腫瘍原性を増強させることがわかった（Halatsch, M-Eら、(2000) J. Neurosurg. 92:297-305；Archer, G.E.ら、(1999) Clin. Cancer Res. 5:2646-2652）。EGFR刺激シグナル伝達経路の活性化は、癌促進性（例えば、増殖、血管形成、細胞運動性、および浸潤）、アポトーシスの低下、および薬剤耐性の誘導の可能性のある多くのプロセスを促進する。EGFRのキナーゼ活性を直接阻害する化合物、ならびにEGFR活性化を阻止することによりEGFRキナーゼ活性を低下させる抗体の、抗腫瘍剤としての開発は、集中的に研究されている分野である（de Bono J.S.とRowinsky, E.K. (2002) Trends in Mol. Medicine 8:S19-S26；Dancey, J.とSausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313）。一部のEGFRキナーゼインヒビターは、いくつかの他の抗癌剤または化学療法剤または治療法と併用すると、腫瘍細胞または新生物死滅を改善することを、いくつかの研究が証明し開示した（例えば、Raben, D.ら、(2002) Semin. Oncol. 29:37-46；Herbst, R.S.ら、(2001) Expert Opin. Biol. Ther. 1:719-732；Magne, Nら、(2003) Clin. Can. Res. 9:4735-4732；Magne, Nら、(2002) British Journal of Cancer 86:819-827；Torrance, C.J.ら、(2000) Nature Med. 6:1024-1028；Gupta, R.A.とDuBois, R.N. (2000) Nature Med. 6:974-975；Tortoraら、(2003) Clin. Cancer Res. 9:1566-1572；Solomon, B.ら、(2003) Int. J. Radiat. Oncol. Biol. Phys. 55:713-723；Krishnan, S.ら、(2003) Frontiers in Bioscience 8, e1-13；Huang, S.ら、(1999) Cancer Res. 59:1935-1940；Contessa, J.N.ら、(1999) Clin. Cancer Res. 5:405-411；Li, M.ら、(2002) Cancer Res. 8:3570-3578；Ciardiello, F.ら、(2003) Clin. Cancer Res. 9:1546-1556；Ciardiello, F.ら、(2000) Clin. Cancer Res. 6:3739-3747；Grunwald, V.とHidalgo, M.、(2003) J. Nat. Cancer Inst. 95:851-867；Seymour L.、(2003) Current Opin. Investig. Drugs 4(6):658-666；Khalil, M.Y.ら、(2003) Expert Rev. Anticancer Ther. 3:367-380；Bulgaru, A.M.ら、(2003) Expert Rev. Anticancer Ther. 3:269-279；Dancey, J.とSausville, E.A.、(2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313；Kim, E.S.ら、(2001) Current Opinion Oncol. 13:506-513；Arteaga, C.L.とJohnson, D.H. (2001) Current Opinion Oncol. 13:491-498；Ciardiello, F.ら、(2000) Clin. Cancer Res. 6:2053-2063；特許公報US2003/0108545号；US2002/0076408号；およびUS2003/0157104号；および国際特許公報WO99/60023号；WO01/12227号；WO02/055106号；WO03/088971号；WO01/34574号；WO01/76586号；WO02/05791号；およびWO02/089842号）。
【０００６】
抗新生物薬剤は理想的には、非悪性細胞に対する毒性と比較して広い治療指数で癌細胞を選択的に死滅させるであろう。またこれは、薬剤に長時間曝露した後でも、悪性細胞に対する効力を保持するであろう。残存ながら現在のいずれの化学療法もかかる理想的なプロフィールは持っていない。その代わり多くは非常に狭い治療指数を有する。さらにわずかに致死濃度以下の化学療法剤に曝露された癌細胞は、しばしばかかる薬剤に対する耐性が出現し、しばしば他のいくつかの抗新生物剤に対して交差耐性が出現する。
【０００７】
すなわち、新生物や他の増殖性疾患のより有効な治療法に対するニーズがある。既存の薬剤の治療効力を増強させるための方策には、その投与のスケジュールの変化、また他の抗癌剤または生物化学的調節物質との組合せがある。併用療法は、各薬剤単独の治療的用量の使用と比較してより大きな効力と小さな副作用を与える方法として知られている。ある場合には、薬剤併用の効果は付加的（組合せの効力は各薬剤単独の効果の合計にほぼ等しい）であるが、別の場合では、相乗的（組合せの効力は各薬剤単独投与の効果の合計より大きい）である。
【０００８】
しかし、肺癌および他の癌の改良された治療法に対する緊急のニーズがある。本発明は、効力に必要な個々の成分の用量を低下させた抗癌併用療法を提供し、こうして治療効果を維持または増強しながら、各薬剤が引き起こす副作用を低下させる。本明細書に記載の発明は、肺癌および他の癌の治療における新しい薬剤の組合せと薬剤組合せの使用方法を提供する。
【発明の開示】
【０００９】
発明の概要
本発明は、EGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンとを使用することを特徴とする、腫瘍または腫瘍転移の治療のための薬剤の製造方法を提供する。好ましくは治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せは、他の抗癌剤や放射線療法のような追加の薬剤または治療法有りまたは無しで、同時にまたは連続的に患者に投与することを目的とする。
【００１０】
本発明はまた、医薬として許容される担体と組合せたEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せからなる医薬組成物を包含する。
【００１１】
本発明の実施に使用できるEGFRキナーゼインヒビターの好適な例は、化合物塩酸エルロチニブ（タルセバ（Tarceva）（登録商標）としても知られている）である。
【００１２】
表の簡単な説明
表1：非担癌メスnu/nu無胸腺マウスにおけるエルロチニブ20mg/kgと100mg/kgの単回投与薬物動態。
【００１３】
表2：14日間治療した非担癌無胸腺ヌードマウスにおける最大許容用量の評価（n＝5）。
【００１４】
発明の詳細な説明
動物の「癌」という用語は、癌を引き起こす細胞に典型的な特徴（無秩序な増殖、不死性、転移能力、急速な増殖と増殖速度）およびいくつかの形態的特徴を有する細胞の存在を意味する。癌細胞はしばしば腫瘍の形であるが、かかる細胞は動物内に単独で存在するか、または独立した細胞（例えば白血球細胞）として血流中を循環する。
【００１５】
本明細書において「異常な細胞増殖」は、特に明記しない場合は、正常な制御機構（例えば、接触阻害の消失）に依存しない細胞増殖を意味する。これは：(1) 変異チロシンキナーゼを発現することによりまたは受容体チロシンキナーゼの過剰発現により増殖する腫瘍細胞（腫瘍）；(2) 異常チロシンキナーゼ活性化が起きる、他の増殖性疾患の良性および悪性の細胞；(4) 受容体チロシンキナーゼにより増殖する任意の腫瘍；(5) セリン／スレオニンキナーゼ活性化により増殖する任意の腫瘍；および(6) 異常なセリン／スレオニンキナーゼ活性化が起きる他の増殖性疾患の良性および悪性細胞、の異常増殖を含む。
【００１６】
本明細書において用語「治療する」は、特に明記しない場合は、患者の腫瘍、腫瘍転移、または他の癌を引き起こす細胞もしくは新生物細胞の、進行を逆転、緩和、阻害すること、またはその増殖を部分的もしくは完全に防止することを意味する。本明細書において用語「治療」は、特に明記しない場合は、治療する行為を意味する。
【００１７】
本明細書において用語「治療方法」またはその同等語は、例えば癌に適用される時、動物の癌細胞の数を減少または排除するように、または癌の症状を緩和するように設計された操作または行為の過程を意味する。癌または他の増殖性疾患を「治療する方法」は、癌細胞または他の障害が実際に排除されたり、細胞または障害の数が実際に減少したり、癌または他の障害の症状が実際に緩和されたりすることを必ずしも意味しない。癌を治療する方法はしばしば、成功の確率が低い場合も行われるが、動物の病歴や推定平均余命を与えられる場合、全体的に有益な行為の過程と見なされる。
【００１８】
「治療的に有効な物質」という用語は、研究者、獣医、医者、または他の臨床家が求める組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する組成物を意味する。
【００１９】
用語「薬剤を製造する方法」は、本明細書の適応症、特に腫瘍、腫瘍転移、または一般に癌で使用するための薬剤の製造に関する。この用語は、記載の適応症において、いわゆる「スイス型」請求項に関する。
【００２０】
用語「治療的有効量」または「有効量」は、研究者、獣医、医者、または他の臨床家が求める組織、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を誘発する対象化合物または組合せの量を意味する。
【００２１】
本明細書の以下の実施例に記載のデータは、ゲムシタビンとEGFRキナーゼインヒビターとの同時投与が、進行癌、例えば結腸直腸癌の治療に有効であることを示す。従って本発明は、患者の腫瘍、腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用されることを特徴とする方法を提供する。好ましくはかかる組合せは、患者への同時または連続的な投与を企図する。ある実施態様において治療される腫瘍または腫瘍転移は、結腸直腸腫瘍または腫瘍転移である。
【００２２】
好ましくはかかる物質は、患者に同時にまたは連続的に投与することを企図する。従って本発明はさらに、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、患者への同時または連続的投与を特徴とする方法を提供する。好ましくはさらに、1つ以上の細胞障害性物質、化学療法剤、もしくは抗癌剤、またはかかる物質の作用を増強する化合物が使用される。
【００２３】
本明細書において追加の他の細胞障害剤、化学療法剤、もしくは抗癌剤、またはかかる物質の作用を増強する化合物には、例えば：アルキル化剤又はアルキル化作用を有する薬剤、例えばシクロホスファミド（CTX；例えばシトキサン（cytoxan）（登録商標））、クロランブシル（CHL；例えばロイケラン（leukeran）（登録商標））、シスプラチン（CisP；例えばプランチノール（platinol）（登録商標））、ブスルファン（例えば、ミレラン（myleran）（登録商標））、メルファラン、カルムスチン（BCNU）、ストレプトゾトシン、トリエチレンメラミン（TEM）、マイトマイシンCなど；代謝拮抗剤、例えばメソトレキセート（MTX）、エトポシド（VP16；例えばベペシド（vepesid）（登録商標））、6-メルカプトプリン（6MP）、6-チオグアニン（6TG）、シタラビン（Ara-C）、5-フルオロウラシル（5-FU）、カペシタビン（例えば、ゼロダ（Xeloda）（登録商標））、デカルバジン（DTIC）など；抗生物質、例えばアクチノマイシンD、ドキソルビシン（DXR；例えばアドリアマイシン（登録商標））、ダウノルビシン（ダウノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシンなど；アルカロイド、例えばビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン（VCR）、ビンブラスチンなど；および他の抗腫瘍剤、例えばパクリタキセル（例えばタキソール（登録商標））およびパクチタキセル誘導体、細胞静止剤、糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾン（DEX；例えばデカドロン（decadron）（登録商標））、およびコルチコステロイド、例えばプレドニソン、ヌクレオシド酵素インヒビター（例えばヒドロキシ尿素）、アミノ酸除去（ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）酵素、例えばアスパラギナーゼ、ロイコボリン、葉酸、および他の葉酸誘導体、および同様の多用な抗腫瘍剤がある。以下の物質もまた追加の物質として使用される；アルニフォスチン（例えばエチオール（ethyol）（登録商標））、ダクチノマイシン、メクロレタミン（ナイトロジェンマスタード）、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、ロルヌスチン（CCNU）、ドキソルビシンリポ（例えばドキシル（doxil）（登録商標））、ダウノルビシンリポ（例えばダウノキソーム（daunoxome）（登録商標））、プロカルバジン、マイトマイシン、ドセタキセル（例えばタキソテレ（登録商標））、アルデスロイキン（aldesleukin）、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、CPT11（イリノテカン）、10-ヒドロキシ7-エチル-カンプトテシン（SN38）、フロキスリジン、フルダラビン、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メラファラン、メルカプトプリン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルゲーズ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロランブシル。
【００２４】
また、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、患者への同時または連続的投与を特徴とし、1つ以上の抗ホルモン剤がさらに使用される方法が好適である。本明細書において用語「抗ホルモン剤」は、腫瘍へのホルモンの作用を制御もしくは阻害するように作用する天然のもしくは合成の有機もしくはペプチド化合物を含む。
【００２５】
抗ホルモン剤には例えば以下がある：ステロイド受容体アンタゴニスト、抗エストロゲン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害4(5)-イミダゾール、他のアロマターゼインヒビター、42-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、LY117018、オナプリストン、およびトレミフェン（例えばファレストン（Fareston）（登録商標））；抗アンドロゲン剤、例えばフルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン；および上記の任意の医薬として許容される塩、酸、または誘導体；糖タンパク質ホルモンのアゴニストおよび／またはアンタゴニスト、例えば卵胞刺激ホルモン（FSH）、甲状腺刺激ホルモン（TSH）、および黄体形成ホルモン（LH）およびLHRH（黄体形成ホルモン放出ホルモン）；LHRHアゴニストである酢酸ゴセレリン、ゾラデックス（Zoladex）（登録商標）（アストラゼネカ（AstraZeneca））として市販されている；LHRHアンタゴニストD-アラニンアミドN-アセチル-3-(2-ナフタレニル)-D-アラニル-4-クロロ-D-フェニルアラニル-3-(3-ピリジニル)-D-アラニル-L-セリル-N6-(3-ピリジニルカルボニル)-L-リジル-N6-(3-ピリジニルカルボニル)-D-リジル-L-ロイシル-N6-(1-メチルエチル)-L-リジル-L-プロリン（例えばアンチド（Antide）（登録商標）、アレスセローノ（Ares-Seron））；LHRHアンタゴニストである酢酸ガニレリックス；ステロイド性抗アンドロゲンである酢酸シプロテロン（CPA）と酢酸メゲストロール、メガス（Megace）（登録商標）として市販されている（ブリストルマイヤーズオンコロジー（Bristol−MyersOncology））；非ステロイド抗アンドロゲンであるフルタミド（2-メチル-N-[4,20-ニトロ-3-(トリフルオロメチル)フェニルプロパンアミド）、ユレキシン（Eulexin）（登録商標）として市販されている（シェーリング社（Shering Corp.）；非ステロイド抗アンドロゲンであるニルタミド、(5,5-ジメチル-3-[4-ニトロ-3-(トリフルオロメチル-4'-ニトロフェニル)-4,4-ジメチル-イミダゾリジン-ジオン）；および他の非許容性受容体のアンタゴニスト、例えばRAR、RXR、TR、VDRなどのアンタゴニスト。
【００２６】
化学療法で使用される上記の細胞障害剤および他の抗癌剤の使用は癌治療の分野で一般に充分解析されており、その本発明での使用は、若干の変更はあるが耐性や有効性を追跡するためのおよび投与経路や用量を制御するための同じ考慮事項に入る。例えば細胞障害剤の実際の用量は、組織培養法を使用して測定される患者の培養細胞応答により変わる。一般に用量は、追加の他の物質が存在しない場合に使用される量と比較して少ないであろう。
【００２７】
有効な細胞障害剤の典型的な用量は製造業者の推奨する範囲でもよく、インビトロ応答または動物モデルでの応答により示される場合、約1オーダーまで濃度または量を低下させることができる。すなわち実際の用量は、医師の判断、患者の状態、および初代培養悪性細胞または組織培養された組織試料のインビトロ応答または適切な動物モデルで観察される応答に依存する。
【００２８】
本発明において、上記の追加の他の細胞障害剤、化学療法剤、または抗癌剤は化合物シスプラチンとカルボプラチンが好ましい。
【００２９】
また、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、患者への同時または連続的投与を特徴とし、1つ以上の血管形成インヒビターがさらに使用される方法が、より好適である。
【００３０】
抗血管形成剤には例えば以下がある：VEGFRインヒビター、例えばSU-5416とSU-6668（アメリカ合衆国カリフォルニア州南サンフランシスコのスゲン社（Sugen Inc.））、または例えば国際特許出願WO99/24440号、WO99/62890号、WO95/21613号、WO99/61422号、WO98/50356号、WO99/10349号、WO97/32856号、WO97/22596号、WO98/54093号、WO98/02438号、WO99/16755号、およびWO98/02437号、および米国特許第5,883,113号、第5,886,020号、第5,792,783号、第5,834,504号、および第6,235,764号に記載のもの；VEGFインヒビター、例えばIM862（アメリカ合衆国ワシントン州カークランドのシトラン社（Cytran Inc.））；アンギオザイム、リボザイム（Ribozyme）（ボールダー、コロラド州）からの合成リボザイム；およびVEGFに対する抗体、例えばベバシズマブ（例えばアバスチン（Avastin）（登録商標）、ジェネンテク（Genentech）、南サンフランシスコ、カリフォルニア州）、VEGFに対する組換えヒト化抗体；インテグリン受容体アンタゴニストおよびインテグリンアンタゴニスト、例えばαvβ3、αvβ5およびαvβ6インテグリン、およびこれらのサブタイプ、例えばシレンギチド（EMD121974）、または抗インテグリン抗体、例えばαvβ3特異的ヒト化抗体（例えばビタキシン（Vitaxin）（登録商標））；IFN-アルファのような因子（米国特許第41530,901号、第4,503,035号、および第5,231,176号）；アンギオスタチンおよびプラスミノーゲン断片（例えばクリングル1-4、クリングル5、クリングル1-3（O'Reilly, M.S.ら、(1994) Cell 79:315-328；Caoら、(1996) J. Biol. Chem. 271:29461-29467；Caoら、(1997) J. Biol. Chem. 272:22924-22928）；エンドスタチン（O'Reilly, M.S.ら、(1997) Cell 88:277；および国際特許公報WO97/15666号）；トロンボスポンジン（TSP-1；Frazier, (1991) Curr. Opin. Cell. Biol. 3:792）；血小板因子4（PF4）；プラスミノーゲンアクチベーター／ウロキナーゼインヒビター；ウロキナーゼ受容体アンタゴニスト；ヘパリナーゼ；フマギリン類似体、例えばTNP-4701；スラミンとスラミン類似体；血管形成阻害ステロイド；bFGFアンタゴニスト；flk-1およびflt-1アンタゴニスト；抗血管形成剤、例えばMMP-2（マトリックスメタロプロテイナーゼ2）インヒビター、およびMMP-9（マトリックスメタロプロテイナーゼ9）インヒビター。マトリックスメタロプロテイナーゼインヒビターの例は、国際特許公報WO96/33172号、WO96/27583号、WO98/07697号、WO98/03516号、WO98/34918号、WO98/34915号、WO98/33768号、WO98/30566号、WO90/05719号、WO99/52910号、WO99/52889号、WO99/29667号、およびWO99/07675号、ヨーロッパ特許公報第818,442号、第780,386号、第1,004,578号、第606,046号、および第931,788号；英国特許公報第9912961号、米国特許第5,863,949号、および第5,861,510号に記載されている。好適なMMP-2およびMMP-9インヒビターは、MMP-1を阻害する活性がほとんどまたは全く無いものである。さらに好ましくは、他のマトリックスメタロプロテイナーゼと比較してMMP-2および／またはMMP-9を選択的に阻害するものである（すなわちMMP-1、MMP-3、MMP-4、MMP-5、MMP-6、MMP-7、MMP-8、MMP-10、MMP-11、MMP-12、およびMMP-13）。
【００３１】
また、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、患者への同時または連続的投与を特徴とし、1つ以上の腫瘍細胞アポトーシス促進物質またはアポトーシス刺激物質がさらに使用される方法が、より好適である。
【００３２】
また、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、患者への同時または連続的投与を特徴とし、1つ以上のシグナル伝達インヒビターがさらに使用される方法が、より好適である。
【００３３】
シグナル伝達インヒビターには例えば以下がある：erbB2受容体インヒビター、例えばerbB2受容体に結合する有機分子または抗体、例えばトラスツズマブ（例えばヘルセプチン（Herceptin）（登録商標））；他のタンパク質チロシンキナーゼのインヒビター、例えばイミチニブ（例えばグリーブ（Gleevec（登録商標））；rasインヒビター；rafインヒビター；MEKインヒビター；mTORインヒビター；サイクリン依存性キナーゼインヒビター；プロテインキナーゼCインヒビター；およびPDK-1インヒビター（かかるインヒビターのいくつかの例および癌治療のための臨床治験でのこれらの使用の説明については、Dancey, J.とSausville, E.A. (2003) Nature Rev. Drug Discovery 2:92-313を参照）。
【００３４】
ErbB2受容体インヒビターには以下がある：ErbB2受容体インヒビター、例えばGW-282974（グラクソウェルカム社（Glaxo Wellcome plc））、AR-209（アメリカ合衆国テキサス州ウッドランドのアロネクスファーマシューチカルズ社（Aronex Pharmaceuticals Inc.））のようなモノクローナル抗体、および国際特許公報WO98/02434号、WO99/35146号、WO99/35132号、WO98/02437号、WO97/13760号、およびWO95/19970、および米国特許第5,587,458号、第5,877,305号、第6,465,449号、および第6,541,481号に記載されているerbB2インヒビター。
【００３５】
また、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、患者への同時または連続的投与を特徴とし、抗HER2抗体またはその免疫治療活性断片がさらに使用される方法が、より好適である。
【００３６】
また、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、患者への同時または連続的投与を特徴とし、1つ以上の追加の抗増殖剤がさらに使用される方法が、より好適である。
【００３７】
追加の抗増殖剤には例えば以下がある：酵素ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼのインヒビター、および受容体チロシンキナーゼPDGFRのインヒビター、米国特許第6,080,769号、第6,194,438号、第6,258,824号、第6,586,447号、第6,071,935号、第6,495,564号、第6,150,377号、第6,596,735号、第6,479,513号、および国際特許公報WO01/40217号に開示され特許請求されている化合物を含む。
【００３８】
また、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、患者への同時または連続的投与を特徴とし、COXII（シクロオキシゲナーゼII）インヒビターがさらに使用される方法が、より好適である。有用なCOX-IIインヒビターの例には、アレコキシブ（例えば、セレブレクス（Celebrex）（登録商標））、バルデコキシブ、およびロフェコキシブがある。
【００３９】
また、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、患者への同時または連続的投与を特徴とし、放射性薬剤がさらに使用される方法が、より好適である。放射性薬剤を加える代わりにまたは追加的に、放射線による治療が行われる。
【００４０】
放射線源は、治療されている患者にとって体外でも体内でもよい。線源が患者の体外である時、治療法は体外放射線照射法（EBRT）として知られている。線源が患者の体内である時、治療法は近接照射療法（BT）と呼ばれる。本発明で使用される放射線原子は、特に限定されないが、ラヂウム、セシウム-137、イリジウム-192、アメリシウム-241、金-198、コバルト-57、銅-67、テクネチウム-99、ヨウ素-123、ヨウ素-131、およびインジウム-111よりなる群から選択される。本発明のEGFRキナーゼインヒビターが抗体である場合、抗体をかかる放射活性アイソトープで標識することができる。
【００４１】
放射線療法は、切除不可能なまたは手術不可能な腫瘍および／または腫瘍転移を抑制するための標準的治療法である。放射線療法を化学療法と組合せると、結果の向上が見られる。放射線療法は、標的部位に高用量の放射線を照射すると、腫瘍組織と正常組織の両方で再生性細胞が死滅するという原理に基づく。放射線照射法は、一般にラド（radiation absorbed dose）（Gy）、時間、および分割照射で規定され、腫瘍学者により注意深く管理されなければならない。患者が受ける放射線量は種々の考慮事項に依存するが、最も重要な2つは、体の決定的に重要な構造または臓器に対する腫瘍の位置と、腫瘍の広がりの程度である。放射線療法を受けている患者の典型的な治療過程は、1〜6週間の治療スケジュールで、10〜80Gyの総用量を、1日に1回約1.8〜2.0Gyの分割で週に5日間患者に投与する。本発明の好適な実施態様において、本発明の治療法と放射線の併用により患者を治療すると相乗作用がある。すなわち本発明の併用を含む薬剤による腫瘍増殖の阻害は、放射線、場合により追加の化学療法剤または抗癌剤を組合せると増強される。補助放射線療法のパラメータは、例えば国際特許公報WO99/60023号に含まれている。
【００４２】
また、腫瘍または腫瘍転移を治療するための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、患者への同時または連続的投与を特徴とし、抗腫瘍免疫応答を増強することができる1つ以上の薬剤がさらに使用される方法が、より好適である。
【００４３】
抗腫瘍免疫応答を増強することができる薬剤には例えば以下がある：CTLA4（細胞障害性リンパ球抗原4）抗体（例えばMDX-CTLA4）、およびCTLA4を阻止できる他の薬剤。本発明で使用できる具体的なCTLA4抗体には、米国特許第6,682,736号に記載されたものがある。
【００４４】
また、腫瘍または腫瘍転移の治療により引き起こされる副作用を低下させるための薬剤の製造方法であって、治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの組合せが使用され、付加的または超付加的または相乗的抗腫瘍効果を与えるのに有効な、かつ腫瘍の増殖を阻害するのに有効な量で、患者へ同時または連続的に投与することを特徴とする方法が、より好適である。
【００４５】
本発明はさらに癌の治療法であって、かかる治療の必要な対象に、(i) 第1の有効量のEGFRキナーゼインヒビター、またはその医薬として許容される塩；及び(ii) 第2の有効量のゲムシタビンを投与することを含む治療法を提供する。
【００４６】
本発明はまた癌の治療法であって、かかる治療の必要な対象に、(i) 治療量以下の第1の量のEGFRキナーゼインヒビターであるエルロチニブ、またはその医薬として許容される塩；及び(ii) 第2の量のゲムシタビンの治療量以下を投与することを含む治療法を提供する。
【００４７】
さらに本発明は、医薬として許容される担体中にEGFRインヒビターとゲムシタビンとを含む医薬組成物を提供する。
【００４８】
本発明はさらに、特に癌で使用される医薬組成物であって、(i) 第1の有効量のEGFRキナーゼインヒビター、またはその医薬として許容される塩；及び(ii) 第2の有効量のゲムシタビンを含む組成物を提供する。かかる組成物は場合により、医薬として許容される担体および／または賦形剤を含む。
【００４９】
本発明はさらに、特に癌で使用される医薬組成物であって、(i) 治療量以下の第1の量のEGFRキナーゼインヒビターであるエルロチニブ、またはその医薬として許容される塩；及び(ii) 第2の量のゲムシタビンの治療量以下を含む組成物を提供する。かかる組成物は場合により、医薬として許容される担体および／または賦形剤を含む。
【００５０】
好ましくはEGFRキナーゼインヒビターはエルロチニブである。
【００５１】
本明細書において用語「患者」は好ましくは、何らかの目的のためにEGFRキナーゼインヒビターによる治療が必要なヒト、さらに好ましくは癌、前がん状態または病変を治療するためのかかる治療法が必要なヒトを意味する。しかし用語「患者」はまた、好ましくは特にEGFRキナーゼインヒビターによる治療が必要な哺乳動物（例えば、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、および非ヒト霊長類）を意味する。
【００５２】
好適な実施態様において患者は、癌、前がん状態または病変の治療が必要なヒトである。癌は好ましくは、EGFRキナーゼインヒビターの投与により部分的にまたは完全に治療可能な任意の癌である。癌は例えば、肺癌、非小細胞肺（NSCL）癌、細気管支肺胞上皮肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭頚部癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部位の癌、胃癌（stomach cancer）、胃癌（gastric cancer）、結腸癌、乳癌、子宮癌、輪卵管の癌、子宮内膜癌、子宮頚部癌、膣癌、外陰癌、ホジキン病、食道癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓または尿管癌、腎細胞癌、腎盂癌、中皮腫、肝細胞癌、胆道癌、慢性または急性白血病、リンパ性白血病、中枢神経系（CNS）の新生物、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性神経膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、脳室上衣細胞腫、髄芽細胞腫、髄膜腫、扁平上皮細胞癌、下垂体腺腫、上記癌の任意の抵抗性のもの、または上記癌の1つ以上の組合せでもよい。前癌症状または病変には、例えば口腔白板、紫外線角化症（日光性角化症）、結腸または直腸の前癌ポリープ、胃上皮形成異常、腺腫状形成異常、遺伝性非ポリープ性結腸癌症候群（HNPCC）、バレット食道、膀胱形成異常、および前癌性頚部症状がある。好ましくは癌は結腸癌であり、最も好ましくは結腸直腸癌である。また好ましくは癌は肺癌であり、最も好ましくは非小細胞肺癌（NSCL）である。
【００５３】
本発明の目的において、ゲムシタビンのEGFRキナーゼインヒビター（いずれも以後「2つの活性物質」と呼ぶ）との「同時投与」または「同時投与する」は、2つの活性物質が併用療法の利益を得るように設計された適切な投与法の一部として投与される場合、別々にまたは一緒に投与することを意味する。すなわち2つの活性物質は、同じ医薬組成物の一部として、または別々の医薬組成物で投与することができる。ゲムシタビンは、EGFRキナーゼインヒビターの投与の前、同時、または後に、または何らかの組合せで投与することができる。EGFRキナーゼインヒビターが繰り返し間隔（例えば治療の標準コース）で患者に投与される場合、ゲムシタビンは、EGFRキナーゼインヒビターの各投与の前、同時、または後に、または何らかの組合せで、またはEGFRキナーゼインヒビター治療に関して異なる間隔で、またはEGFRキナーゼインヒビターによる治療コースの前、同時、または後に、単回投与で投与することができる。
【００５４】
EGFRキナーゼインヒビターは、当該分野で公知のように、または国際特許公報WO01/34574号に開示されているように、典型的には患者が治療されている癌の最も有効な治療（効力と安全性の両方で）を与える投与法で患者に投与される。本発明の治療法の実施においてEGFRキナーゼインヒビターは、治療されている遺伝子の種類、使用されているEGFRキナーゼインヒビターの種類（例えば、小分子、抗体、RNAi、またはアンチセンス構築体）、および例えば公表された臨床試験の結果に基づき担当医師の医学的判断により、当該分野で公知の任意の有効な方法、例えば経口、局所的、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、皮下、鼻内、眼内、膣内、直腸内、または皮内経路で投与することができる。
【００５５】
投与されるEGFRキナーゼインヒビターの量およびEGFRキナーゼインヒビター投与のタイミングは、治療される患者のタイプ（種、性、年齢、体重など）および症状、治療される疾患または症状の重症度、および投与経路に依存する。例えば小分子EGFRキナーゼインヒビターは、1日または1週当たり0.001〜100mg/kg体重の用量で単回投与もしくは分割投与で、または連続的注入により患者に投与することができる（例えば国際特許公報WO01/34574号参照）。特に塩酸エルロチニブは、1日当たり5〜200mg/kg体重または1週当たり100〜1600mg/kg体重の用量で単回投与もしくは分割投与で、または連続的注入により患者に投与することができる。好適な用量は150mg/日である。抗体ベースのEGFRキナーゼインヒビター、またはアンチセンス、RNAiまたはリボザイム構築体は、1日または1週当たり0.1〜100mg/kg体重の用量で単回投与もしくは分割投与で、または連続的注入により患者に投与することができる。ある場合には、上記範囲の下限以下の用量レベルでも充分であり、別の場合には、有害な副作用を引き起こすことなくさらに高用量が使用されるが、ただしそのような高用量は、まず1日の投与のための数回の小用量に分割すべきである。
【００５６】
EGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンは、別々にまたは一緒に、同じかまたは異なる経路により、かつ種々の異なる剤形で投与することができる。例えばEGFRキナーゼインヒビターは、好ましくは経口的または非経口的に投与され、一方ゲムシタビンは好ましくは非経口的に投与される。EGFRキナーゼインヒビターが塩酸エルロチニブ（タルセバ（Tarceva）（登録商標））である時、経口投与が好ましい。
【００５７】
EGFRキナーゼインヒビターは、種々の医薬として許容される不活性担体とともに、錠剤、カプセル剤、ロゼンジ、トローチ剤、硬いキャンディ、散剤、噴霧剤、クリーム剤、軟膏剤、坐剤、ゼリー、ゲル、ペースト、ローション剤、軟膏剤、エリキシル剤、シロップ剤などの形で投与することができる。各剤形の投与は、単回投与または多回投与でもよい。担体には、固体の希釈剤または増量剤、無菌水性媒体、および種々の非毒性有機溶媒などがある。経口医薬組成物は、適切に甘味付けおよび／または風味付けされる。
【００５８】
EGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンは、種々の医薬として許容される不活性担体と組合せて、噴霧剤、クリーム剤、軟膏剤、坐剤、ゼリー、ゲル、ペースト、ローション剤、軟膏剤などの形で投与することができる。このような剤形の投与は、単回投与または多回投与でもよい。担体には、固体の希釈剤または増量剤、無菌水性媒体、および種々の非毒性有機溶媒などがある。
【００５９】
タンパク質性EGFRキナーゼインヒビターを含むすべての製剤は、インヒビターの変性および／または分解および生物活性の消失を避けるように選択すべきである。
【００６０】
EGFRキナーゼインヒビターを含む医薬組成物の調製法は当該分野で公知であり、例えば国際特許公報WO01/34574号に記載されている。ゲムシタビンを含む医薬組成物の調製法は当該分野で公知である。本発明の教示を参照すると、EGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンの両方を含む医薬組成物の調製法は、上記刊行物や他の文献、例えばレミントンの薬剤科学（Remington's Pharmaceutical Sciences）（マックパブリッシング社（Mack Publishing Company）、イーストン、ペンシルバニア州）、第18版（1990）から明らかであろう。
【００６１】
EGFRキナーゼインヒビターの経口投与のために、活性物質の1つまたは両方を含有する錠剤は、例えば微結晶セルロース、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸二カルシウム、およびグリシンのような種々の賦形剤と、種々の崩壊剤、例えばデンプン（および好ましくはトウモロコシ、ジャガイモまたはタピオカデンプン）、アルギン酸、およびいくつかのケイ酸複合体と、造粒結合剤（例えばポリビニルピロリドン、ショ糖、ゼラチンおよびアラビアゴム）とともに組合わされる。さらにステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクのような滑沢剤は、錠剤化目的に非常に適している。同様のタイプの固体組成物もまたゼラチンカプセルで充填剤として使用される；この点で好適な物質はまた、乳糖またはミルク糖ならびに高分子量ポリエチレングリコールがある。水性懸濁物および／またはエリキシル剤が経口投与に好ましい時、EGFRキナーゼインヒビターは、種々の甘味剤または香味剤、着色剤または色素と組合わされ、所望であれば、乳化剤および／または懸濁剤とも組合わされ、水、エタノール、ポリエチレングリコール、グリセリンおよび種々の同様の組合せと一緒にされる。
【００６２】
活性物質のいずれかまたは両方の非経口投与には、ゴマ油またはピーナッツ油中の溶液または水性ポリエチレングリコールが使用され、ならびに活性物質を含む無菌水溶液または対応する水溶性の塩が使用される。かかる無菌水溶液は好ましくは適切に緩衝化され、また好ましくは、例えば充分な食塩水またはグルコースにより等張にされる。これらの具体的な水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内注射目的に特に適している。関節内、筋肉内、および皮下注射目的には、油性溶液が適している。これらの溶液の無菌条件下での調製は、当業者に公知の標準的製薬技術により容易に行われる。タンパク質性EGFRキナーゼインヒビターの投与のために選択される任意の非経口製剤は、インヒビターの生物活性の消失を避けるように選択すべきである。
【００６３】
さらに、典型的には活性物質のいずれかまたは両方を例えばクリーム、ローション剤、ゼリー、ゲル、ペースト、軟膏剤（ointments）、軟膏剤（salves）などにより、標準的製薬法に従って投与することができる。例えばEGFRキナーゼインヒビターまたはゲムシタビンを約0.1％(w/v)〜約5％(w/v)濃度で含有する局所製剤を調製することができる。
【００６４】
獣医学的目的には活性物質は、上記の任意の型および任意の経路を使用して、別々にまたは一緒に動物に投与される。好適な実施態様においてEGFRキナーゼインヒビターは、カプセル剤、巨丸剤、錠剤、水薬の形で、注射または埋め込みにより投与される。あるいはEGFRキナーゼインヒビターは動物の飼料とともに投与することができ、この目的には濃縮飼料添加物またはプレミックスが通常の動物飼料に調製される。ゲムシタビンは好ましくは水薬の形で注射または埋め込みにより投与される。かかる製剤は、標準的獣医学的方法に従って従来法で調製される。
【００６５】
本発明はさらに、EGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンとを含有する単一の容器を含むキットを提供する。本発明はさらに、EGFRキナーゼインヒビターを含有する第1の容器とゲムシタビンを含有する第2の容器とを含むキットを提供する。好適な実施態様においてキットの容器は、医薬として許容される担体をさらに含む。キットはさらに無菌希釈剤を含み、これは好ましくは別の追加の容器に保存される。キットはさらに、癌の治療法として併用治療の使用を指示する印刷された説明を含む添付文書を含む。
【００６６】
本明細書において用語「EGFRキナーゼインヒビター」は、当該分野で現在公知であるかまたは将来同定されるであろうEGFRキナーゼインヒビターを意味し、患者に投与すると、患者のEGF受容体の活性化に関連する生物活性（その天然のリガンドのEGFRへの結合に起因する任意の下流の生物学的作用を含む）を阻害する任意の化学物質を含む。かかるEGFRキナーゼインヒビターは、EGFR活性化または患者の癌の治療に関連したEGFR活性化の下流の任意の生物学的作用を阻止することができる任意の物質を含む。かかるインヒビターは、受容体の細胞内ドメインに直接結合してキナーゼ活性を阻害することにより作用する。あるいはかかるインヒビターは、EGFR受容体のリガンド結合部位またはその一部を占めることにより作用して、こうして受容体がその天然のリガンドに近づけなくして、正常な生物活性が妨害されるかまたは低下する。あるいはかかるインヒビターは、EGFRポリペプチドのダイマー化またはEGFRポリペプチドと他のタンパク質との相互作用を調節して作用するか、またはEGFRのユビキチン化およびエンドサイトーシスによる分解を増強する。EGFRキナーゼインヒビターには、特に限定されないが、低分子量インヒビター、抗体または抗体断片、アンチセンス構築体、低分子阻害性RNA（すなわちdsRNAによるRNA干渉；RNAi）、およびリボザイムがある。好適な実施態様においてEGFRキナーゼインヒビターは、ヒトEGFRに特異的に結合する小有機分子または抗体である。
【００６７】
EGFRキナーゼインヒビターは、例えばキナゾリンEGFRキナーゼインヒビター、ピリド−ピリミEGFRキナーゼインヒビター、ピリミド−ピリミジンEGFRキナーゼインヒビター、ピロロ−ピリミジンEGFRキナーゼインヒビター、ピラゾロ−ピリミジンEGFRキナーゼインヒビター、フェニルアミノ−ピリミジンEGFRキナーゼインヒビター、オキシンドールEGFRキナーゼインヒビター、インドロカルバゾールEGFRキナーゼインヒビター、フタラジンEGFRキナーゼインヒビター、イソフラボンEGFRキナーゼインヒビター、キナロンEGFRキナーゼインヒビター、およびトリホスチンEGFRキナーゼインヒビター（例えば以下の特許公報に記載されたもの）、および該EGFRキナーゼインヒビターのすべての医薬として許容される塩と溶媒和物を含む：国際特許公報WO96/33980号、WO96/30347号、WO97/30034号、WO97/30044号、WO97/38994号、WO97/49688号、WO98/02434号、WO97/38983号、WO95/19774号、WO95/19970号、WO97/13771号、WO98/02437号、WO98/02438号、WO97/32881号、WO98/33798号、WO97/32880号、WO97/3288号、WO97/02266号、WO97/27199号、WO98/07726号、WO97/34895号、WO96/31510号、WO98/14449号、WO98/14450号、WO98/14451号、WO95/09847号、WO97/19065号、WO98/17662号、WO99/35146号、WO99/35132号、WO99/07701号、およびWO92/20642号；ヨーロッパ特許出願EP520722号、EP566226号、EP787772号、EP837063号、およびEP682027号；米国特許第5,747,498号、5,789,427号、5,650,415号、および5,656,643号；およびドイツ特許出願第DE19629652号。低分子量EGFRキナーゼインヒビターのさらなる非限定例には、Traxler, P., 1998, Exp. Opin. Ther. Patents 8(12):1599-1625に記載された任意のEGFRキナーゼインヒビターがある。
【００６８】
本発明で使用可能な低分子量EGFRキナーゼインヒビターの具体的な好適例には、[6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)-4-キナゾリン-4-イル]-(3-エチニルフェニル)アミン（OSI-774、エルロチニブ、またはタルセバ（Tarceva）（登録商標）（塩酸エルロチニブ）としても知られている）；オーエスアイファーマシューチカルズ（OSI Pharmaceuticals）／ジェネンテク（Genentech）／ロシュ（Roche））（米国特許第5,747,498号；国際特許公報WO01/34574号、およびMoyer, J.D.ら、(1997) Cancer Res. 57:4838-4848）；CI-1033（以前はPD183805として知られていた；ファイザー（Pfizer））；AG-1478（カリフォルニア大学）；CGP-59326（ノバルティス（Novartis）；PKI-166（ノバルティス（Novartis））；EKB-569（ワイエス(Wyeth））；GW-2016（GW-572016またはラパチニブジトシレートとしても知られている；ジーエスケー（GSK））；およびゲフィチニブ（ZD1839またはイレッサ（登録商標）としても知られている；アストラゼネカ（AstraZeneca））（Woodburnら、1997, Proc. Am. Assoc. Cancer Res. 38:633）がある。本発明で使用可能な特に好適な低分子量EGFRキナーゼインヒビターは、[6,7-ビス(2-メトキシエトキシ)-4-キナゾリン-4-イル]-(3-エチニルフェニル)アミン（すなわちエルロチニブ）、その塩酸塩（すなわち塩酸エルロチニブ、タルセバ（Tarceva）（登録商標））、または他の形の塩（例えばメシル酸エルロチニブ）である。
【００６９】
抗体ベースのEGFRキナーゼインヒビターには、その天然のリガンドによるEGFR活性化を部分的または完全に阻止することができる抗EGFR抗体または抗体断片がある。抗体ベースのEGFRキナーゼインヒビターの非限定例には、Modjtahedi, H.ら、1993, Br. J. Cancer 67:247-253；Teramoto, T.ら、1996, Cancer 77:639-645；Goldsteinら、1995, Clin. Cancer Res. 1:1311-1318；Huang, S.M.ら、1999, Cancer Res. 15:59(8);1935-40；およびYang, X.ら、1999, Cancer Res. 59:236-1243に記載されたものがある。すなわちEGFRキナーゼインヒビターは、モノクローナル抗体Mab E7.6.3（Yang, X.D.ら、(1999) Cancer Res. 59:1236-43）またはMab C225（ATCC受け入れ番号HB-8508）、または抗体もしくはその結合特異性を有する抗体断片でもよい。適当なモノクローナル抗体EGFRキナーゼインヒビターには、特に限定されないが、IMC-C225（セツキシマブ（cetuximab）またはエルビツクス（Erbitux）（登録商標）としても知られている；イムクローンシステムズ（Imuclone Systems））、ABX-EGF（アブジェニクス（Abgenix））、EMD72000（メルクKgaA（Merck KgaA）、ダルムシュタット）、RH3（ヨークメディカルバイオサイエンス社（York Medical Bioscience Inc.））、およびMDX-447（メダレックス（Medarex）／メルクKgaA（Merck KgaA））がある。
【００７０】
例えばブタ、ウシ、ウマ、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、およびマウスから選択される宿主動物に適切な抗原またはエピトープを投与することにより、本発明に従ってさらなる抗体ベースのEGFRキナーゼインヒビターを作成することができる。抗体産生を増強するために、当該分野で公知の種々のアジュバントを使用することができる。
【００７１】
本発明を実施するのに有用な抗体はポリクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体が好ましい。EGFRに対するモノクローナル抗体は、連続的細胞株の培養により抗体分子を産生する任意の方法を使用して調製し単離することができる。産生と単離法には、特に限定されないが、元々KohlerとMilstein（Nature, 1975, 256:495-497）により記載されたハイブリドーマ法；ヒトB細胞ハイブリドーマ法（Kosborら、1983, Immunology Today 4:72；Coteら、1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030）；およびEBV-ハイブリドーマ法（Coleら、1985, 「モノクローナル抗体と癌治療（Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy）」、アランアールリス社（Alan R. Liss, Inc.）、77-96頁）がある。
【００７２】
あるいは1本鎖抗体の産生について記載された方法（例えば米国特許第4,946,778号を参照）を改変して、抗EGFR1本鎖抗体を産生することができる。本発明を実施するのに有用な抗体ベースのEGFRキナーゼインヒビターはまた、特に限定されないが、F(ab')2断片（これは、完全な抗体分子のペプシン消化により生成することができる）およびFab断片（これは、F(ab')2断片のジスルフィド結合を還元することにより生成することができる）を含む抗EGFR抗体断片を含む。あるいは、Fabおよび／またはscFv発現ライブラリーを構築（例えばHuseら、1989, Science 246:1275-1281を参照）して、EGFRに対する所望の特異性を有する断片を迅速に同定することができる。
【００７３】
モノクローナル抗体および抗体断片の産生と単離のための方法は当該分野で公知であり、HarlowとLane, 1988、「抗体：実験室マニュアル（Antibodies: A Laboratory Manual）」、コールドスプリングハーバーラボラトリー（Cold Spring Harbor Laboratory）、およびJ.W. Goding, 1986, 「モノクローナル抗体：原理と実際（Monoclonal Antibodies: Principles and Practice）」、アカデミックプレス（Academic Press）（ロンドン）に記載されている。ヒト化抗EGFR抗体および抗体断片はまた、Vaughn, T.J.ら、1998, Nature Biotech. 16:535-539、およびそこに引用された文献に記載のような公知の方法により調製できるか、またはかかる抗体もしくはその断片は本発明を実施するのに有用である。
【００７４】
本発明で使用されるEGFRキナーゼインヒビターはまた、アンチセンスオリゴヌクレオチド構築体に基づくことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド（アンチセンスRNA分子およびアンチセンスDNA分子を含む）は、EGFR mRNAに結合することによりその翻訳を直接阻止するように作用し、こうして細胞中のEGFRキナーゼタンパク質のレベルおよび活性を低下させる。例えば従来のホスホジエステル法により、少なくとも約15塩基であり、EGFRをコードするmRNA転写体配列のユニークな領域に相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを合成し、静脈内注射または注入により投与することができる。その配列が公知である遺伝子の発現を特異的に阻害するアンチセンス法を使用する方法は、当該分野で公知である（例えば、米国特許第6,566,135号；6,566,131号；6,365,354号；6,410,323号；6,107,091号；6,046,321号；および5,981,732号を参照）。
【００７５】
低分子阻害性RNA（siRNA）はまた、本発明で使用されるEGFRキナーゼインヒビターとして機能することができる。EGFRの発現が特異的に阻害される（すなわちRNA干渉またはRNAi）ように、腫瘍、対象または細胞に低分子2本鎖RNA（dsRNA）または低分子2本鎖RNAの産生を引き起こすベクターもしくは構築体に接触させることにより、EGFR遺伝子発現を低下させることができる。その配列が公知である遺伝子について、適切なdsRNAまたはdsRNAをコードするベクターを選択する方法は当該分野で公知である（例えば、Tuschi, T.ら、(1999) Genes Dev. 13(24):3191-3197；Elbashir, S.M.ら、(2001) Nature 411:494-498；Hannon, G.J. (2002) Nature 418:244-251；McManus, M.T.とSharp, P.A. (2002) Nature Reviews Genetics 3:737-747；Bremmelkamp, T.R.ら、(2002) Science 296:550-553；米国特許第6,573,099号と6,506,559号；および国際特許公報WO01/36646号、WO99/32619号、およびWO01/68836号を参照）。
【００７６】
リボザイムもまた、本発明で使用されるEGFRキナーゼインヒビターとして機能することができる。リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒することができる酵素性RNA分子である。リボザイム作用の機構は、相補的な標的RNAへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーションと、次のエンドヌクレアーゼ切断とを含む。従ってEGFR mRNA配列のエンドヌクレアーゼ分解を特異的かつ効率的に触媒する遺伝子操作したハンマーヘッドモチーフのリボザイム分子は、本発明の範囲において有用である。RNA標的候補内の特異的リボザイム切断部位は、まずリボザイム切断部位（これは典型的には、配列GUA、GUUおよびGUCを含む）について標的分子をスキャンすることにより同定される。いったん同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約15〜20リボヌクレオチドの短いRNA配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適なものにすることができると予測される構造的特徴（例えば、2次構造）について評価することができる。標的候補の適切性はまた、例えばリボヌクレオチド保護アッセイを使用して相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへの近づき安さを試験することにより評価することができる。
【００７７】
EGFRキナーゼインヒビターとして有用なアンチセンスオリゴヌクレオチドとリボザイムの両方とも、公知の方法により調製することができる。これらには、化学合成、例えば固相ホスホラミダイト化学合成がある。あるいはアンチセンスRNA分子は、RNA分子をコードするDNA分子のインビトロまたはインビボ転写により作成することができる。かかるDNA配列は、T7またはSP6ポリメラーゼプロモーターのような適当なRNAポリメラーゼプロモーターを取り込む種々のベクター中に取り込むことができる。本発明のオリゴヌクレオチドへの種々の修飾を、細胞内適切性と半減期とを上昇させるための手段として導入することができる。可能な修飾には、特に限定されないが、分子の5'末端および／または3'末端へのリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのフランキング配列の付加、またはオリゴヌクレオチド骨格内のホスホジエステラーゼ結合よりホスホロチオエートもしくは2'-O-メチルの使用がある。
【００７８】
本発明はまた、医薬として許容される担体と組合せたEGFRキナーゼインヒビターとゲムシタビンからなる医薬組成物を包含する。
【００７９】
好ましくは組成物は、医薬として許容される担体と非毒性の治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビター化合物とゲムシタビンの組合せ（これらの各成分の医薬として許容される塩を含む）からなる。
【００８０】
さらに、好適な実施態様において本発明は、その使用が新生物細胞増殖、良性もしくは悪性腫瘍、または転移の阻害を引き起こす、疾患の治療のための医薬組成物であって、医薬として許容される担体と非毒性の治療的有効量のEGFRキナーゼインヒビター化合物とゲムシタビンの組合せ（これらの各成分の医薬として許容される塩を含む）からなる組成物を包含する。
【００８１】
用語「医薬として許容される塩」は、医薬として許容される非毒性塩基または酸から調製される塩を意味する。本発明の化合物が酸性である時、その対応する塩は医薬として許容される非毒性塩基（無機塩基および有機塩基を含む）から便利に調製することができる。かかる無機塩基から得られる塩には、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩（第2銅塩および第1銅塩）、第2鉄塩、第1鉄塩、リチウム塩、マグネシウム塩、マンガン塩（第二マンガン塩および第一マンガン塩）、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩および類似の塩がある。特に好適なものは、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、およびナトリウム塩である。有機の非毒性塩基から得られる塩には、1級、2級、および3級アミン、ならびに環状アミン、置換アミン（例えば天然に存在するアミンおよび合成置換アミン）の塩がある。塩を形成することができる他の有機の非毒性塩基には、イオン交換樹脂、例えばアルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、N',N'-ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、2-ジエチルアミノエタノール、2-ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、N-エチルモルホリン、N-エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リジン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどがある。
【００８２】
本発明の化合物が塩基性である時、その対応する塩は医薬として許容される非毒性の酸（無機酸および有機酸を含む）から便利に調製することができる。かかる酸には、例えば酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、樟脳スルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、ムチン酸、硝酸、パモイン酸、パントテン酸、リン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、p-トルエンスルホン酸などがある。特に好適な酸は、クエン酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、および酒石酸である。
【００８３】
本発明の医薬組成物は、活性成分としてEGFRキナーゼインヒビター化合物とゲムシタビンの組合せ（各成分の医薬として許容される塩を含む）、医薬として許容される担体、および任意に他の治療用成分または補助剤を含む。他の治療薬は、細胞障害剤、化学療法剤、もしくは抗癌剤、または上記したような物質の作用を増強する物質を含む。該組成物は、経口投与、直腸投与、局所的投与、および非経口（皮下、筋肉内、および静脈内を含む）投与に適した組成物を含むが、ある特定の症例で最も適切な経路は、具体的な宿主、および活性成分が投与される症状の性質と重症度に依存するであろう。医薬組成物は、単位投与剤型で便利に提供され、薬剤学の分野で公知の任意の方法により調製される。
【００８４】
実際、本発明のEGFRキナーゼインヒビター化合物とゲムシタビンの組合せ（各成分の医薬として許容される塩を含む）で示される化合物は、従来の薬剤配合法に従って薬剤担体との均質混合物にされた活性成分として組合せることができる。担体は、例えば経口または非経口（静脈内を含む）投与を含む投与に所望の調製物の形に依存して種々の形を取ることができる。すなわち本発明の医薬組成物は、所定量の活性成分を含有するカプセル剤、カシェ剤、または錠剤のような経口投与に適した個別の単位として調製することができる。さらに該組成物は、散剤、顆粒剤、液剤、水性液体中の懸濁剤、非水性液剤、水中油エマルジョン、または油中水液体エマルジョンとして提供することができる。上記の一般的な剤形以外に、EGFRキナーゼインヒビター化合物とゲムシタビンの組合せ（各成分の医薬として許容される塩を含む）はまた、制御放出手段および／または送達装置により投与してもよい。組合せ組成物は、薬剤学の任意の方法により調製される。一般にこのような方法は活性成分を、1つ以上の必要な成分を構成する担体と一緒にする工程を含む。一般に該組成物は、活性成分を液性担体または微粉固体担体または両方と均一かつ完全に混合することにより調製される。次に生成物は、所望の形に便利に成形することができる。
【００８５】
すなわち本発明の医薬組成物は、医薬として許容される担体およびEGFRキナーゼインヒビター化合物とゲムシタビンの組合せ（各成分の医薬として許容される塩を含む）を含む。EGFRキナーゼインヒビター化合物とゲムシタビンの組合せ（各成分の医薬として許容される塩を含む）はまた、1つ以上の他の治療活性化合物との組合せで医薬組成物中に含まれる。他の治療活性化合物には、細胞障害剤、化学療法剤、または抗癌剤、または上記したような物質の作用を増強する物質がある。
【００８６】
すなわち本発明のある実施態様において医薬組成物は、EGFRキナーゼインヒビター化合物とゲムシタビンとを抗癌剤との組合せで含み、ここで該抗癌剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、微小管破壊物質、ポドフィロトキシン、抗生物質、ニトロソ尿素、ホルモン療法、キナーゼインヒビター、腫瘍細胞アポトーシスのアクチベーター、および抗血管形成剤よりなる群から選択されるメンバーである。
【００８７】
使用される薬剤担体は、例えば固体、液体、または気体でもよい。固体担体の例には、乳糖、白土、ショ糖、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウム、およびステアリン酸がある。液体担体の例は、糖シロップ、ピーナツ油、オリーブ油、および水である。気体担体の例には、二酸化炭素と窒素がある。
【００８８】
経口剤形の組成物の調製において、任意の便利な薬剤媒体が使用される。例えば、懸濁剤、エリキシル剤、および液剤のような経口液体調製物を生成するのに水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などが使用される；一方、散剤、カプセル剤、および錠剤のような経口固体調製物を生成するのに、デンプン、糖、微結晶セルロース、希釈剤、造粒剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤などが使用される。投与の容易さから錠剤とカプセル剤が、固体の薬剤担体が使用される好適な経口投与単位である。場合により錠剤は、標準的な水性または非水性法によりコーティングされる。
【００８９】
本発明の組成物を含有する錠剤は、圧縮または成形により、場合により1つ以上の付属成分または補助剤を用いて調製される。圧縮錠剤は、適当な機械で流動性型の活性成分（例えば粉末または顆粒）中の活性成分を、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤、表面活性剤または分散剤と混合して圧縮調製される。成形錠剤は、適当な機械で、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末化合物の混合物を成形することにより作成される。各錠剤は好ましくは、約0.05mg〜約5gの活性成分、および各カシェ剤またはカプセル剤は好ましくは、約0.05mg〜約5gの活性成分を含む。
【００９０】
例えばヒトへの経口投与を目的とした製剤は、約0.5mg〜約5gの活性物質を、総組成物の約5〜約95パーセントで変動する適切かつ便利な量の担体物質と混合して含有する。単位投与剤型は一般に、約1mg〜約2gの活性成分、典型的には25mg、50mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、800mg、または1000mgを含む。
【００９１】
非経口投与に適した本発明の医薬組成物は、水中の活性化合物の溶液または懸濁液として調製される。適当な界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース）が含まれる。分散剤はまた、グリコール、液体ポリエチレングリコール、および油中のこれらの混合物で調製することができる。さらに微生物の有害な増殖を防ぐために保存剤を含めてもよい。
【００９２】
注射として使用するのに適した本発明の医薬組成物には、無菌の水溶液または分散液がある。さらに組成物は、かかる無菌の水溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末の形でもよい。すべての場合に、最終的な注射型は無菌で、シリンジで容易に使用できるように有効に流動性でなければならない。医薬組成物は、製造と保存条件下で安定でなければならない；すなわち、細菌や真菌のような微生物の汚染作用に対して保存できなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール）、植物油、およびこれらの適当な混合物を含有する溶媒または分散媒体でもよい。
【００９３】
本発明の医薬組成物は、局所的用途に適した形、例えばエアゾル剤、クリーム剤、軟膏剤、ローション剤、散布剤などでもよい。さらに組成物は、経皮的装置で使用するのに適した形でもよい。これらの製剤は、本発明のEGFRキナーゼインヒビター化合物とゲムシタビンの組合せ（各成分の医薬として許容される塩を含む）を使用して従来の処理法により調製される。例えばクリーム剤または軟膏剤は、親水性物質と水を、約5重量％〜約10重量％の化合物と混合して、所望の粘度を有するクリーム剤または軟膏剤を作成することにより調製される。
【００９４】
本発明の医薬組成物は、担体が固体である直腸投与に適した形でもよい。混合物は単位投与坐剤を生成することが好ましい。適当な担体には、カカオバターおよび当該分野で一般的に使用される他の物質がある。坐剤は、まず組成物を軟化または溶融担体と混合し、次に冷却および鋳型で成形することにより便利に形成される。
【００９５】
上記担体成分以外に、記載の製剤は、希釈剤、緩衝剤、香味剤、結合剤、界面活性剤、増粘剤、滑沢剤、保存剤（抗酸化剤を含む）などの1つ以上の追加の担体成分を適宜含有してもよい。さらに製剤を目的の受容者の血液と等張にするために、他の補助剤を含めてもよい。EGFRキナーゼインヒビター化合物とゲムシタビンの組合せ（各成分の医薬として許容される塩を含む）を含有する組成物はまた、粉末または液体濃縮型で調製してもよい。
【００９６】
本発明の組合せの化合物の投与レベルは、ほぼ本明細書に記載したもの、またはこれらの化合物について当該分野で記載されているものである。しかし、特定の患者の特定の投与レベルは、年齢、体重、全身の健康、性、食事、投与時間、投与経路、排泄速度、薬剤併用、および治療を受けている具体的な疾患の重症度を含む種々の要因に依存する。
【００９７】
本発明は以下の実験の詳細からさらによく理解されるであろう。しかし、記載の具体的な方法や結果は、以後の請求項でより詳細に説明される本発明を単に例示するものであり、決して本発明を限定するものではないことを当業者は理解するであろう。
【実施例】
【００９８】
実験の詳細：
【００９９】
序論
【０１００】
癌細胞特異的な表皮増殖因子受容体（HER1/EGFR）は、癌治療法の有用な分子標的である（Ciardiello，FとTortora G. (2002) Expert Opin. Investig. Drugs 11:755-768）。多くの癌はHER1/EGFRを過剰発現する；頭頚部扁平上皮癌（70〜100％）、非小細胞肺癌（NSCLC）（50〜90％）、前立腺癌（40〜70％）、神経膠腫（10〜50％）、胃癌（30〜60％）、乳癌（35〜70％）、結腸直腸癌（45〜80％）、膵臓癌（30〜50％）、および卵巣癌（35〜60％）（Ciardiello，FとTortora G. (2002) Expert Opin. Investig. Drugs 11:755-768）；Salomon D.S.ら、(1995) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19:183-232）。Salomonらはまた、過剰発現されたHER1/EGFRと、疾患が進行した、転移を有する、かつ予後の悪い患者との関連を強調した。
【０１０１】
NSCLCは最も一般的な肺癌である。疾患の程度に従って治療アプローチは異なる。疾患の早期ステージでは、手術が唯一の治療法であり、化学療法／放射線療法を用いる多用なアプローチは、改善された結果に関連する。進行した疾患では、化学療法が主要な選択肢であり、これは全体的生存率の小さな改善を与える。すなわちNSCLCでは、より有効で良好な許容される方法を探索する医学的ニーズが高い。多くの古典的な細胞障害剤（ビンデスチン、カルボプラチン、エトポシド、イホスファミド、シクロホスファミド、ビンクリスチン、およびマイトマイシンとシスプラチンを含む）がNSCLCの単独療法として使用されている（Rajkumar S.V.とAdjei A.A.、(1998) Cancer Treat Rev. 24:35-53）。これらの薬剤による単独療法はわずかな改善しかもたらさないが、ランダム化治験ではシスプラチンとの併用療法が患者の疾患を軽減させ、患者の生活の質を改善した（Bunn P.A. ジュニアとKelly K.、(1998) Clin Cancer Res. 4(5):1087-1100）。
【０１０２】
ゲムシタビンは1990年代に開発され、リボヌクレアーゼ還元酵素を阻害する。ゲムシタビン単独療法は腫瘍応答のより大きな確率を有し、標準的シスプラチン／エトポシド化学療法より患者の生活の質を改善した（脱毛、吐き気と嘔吐、および食欲消失の低下）（ten Bokkel W.W.ら、(1999) Lung Cancer 26(2):85-94）。
【０１０３】
癌研究と治療のヨーロッパ機構（European Organization for Research and Treatment of Cancer；EORTC）による併用治験は、シスプラチン＋テニポシドを、シスプラチン＋パクリタキセルと比較した（Giaccone G.ら、(1998) J. Clin. Oncol. 16:2133-2141）。後者の併用が進行したNSCLCについて良好な緩解を与えた（明確な生存率の利点は無かったが）ため、進行性NSCLC患者の標準的な治療の1つとして推奨されている。さらにゲムシタビンとシスプラチンとの併用は、インビトロで相乗的に作用し、インビボで少なくとも付加的に作用することが証明された（Peters G.J.ら、(1995) Semin. Oncol. 22 (4 Suppl. 11): 72-79）。フェーズII治験では、ゲムシタビンとシスプラチンの応答速度は47％であり、生存中央値は57週間であり、1年生存率は48％であった（Bunn P.A. ジュニアとKelly K. (1998) Clin. Cancer Res. 4(5):1087-1100）。
【０１０４】
癌の新しい治療法は癌細胞特異的アプローチを取り、古い細胞障害剤より毒性が低いであろう。癌細胞特異的標的は疾患の原因のほんの一部であり、標的化薬剤と従来の薬剤を組合せることが相乗作用を有するであろう。NSCLCの最適な治療法は、EGFRインヒビターと従来の化学療法の組合せからなる可能性が高い。
【０１０５】
エルロチニブ（タルセバ（Tarceva）（登録商標）、OSI-774）は、HER1/EGFRチロシンキナーゼドメインの選択的な経口で利用できる小分子インヒビターである。これは、頭頚部癌と外陰癌の前臨床動物モデルで強力な抗腫瘍活性を有する（Pollack V.A.ら、(1999) J. Pharmacol. Exp. Ther. 291:739-48）。エルロチニブはインビトロでアポトーシスを誘導し、種々のEGFR発現性ヒト腫瘍異種移植片に対してインビボで活性がある（Moyer J.D.ら、(1997) Cancer Res. 57:4838-4848）。白金ベースの化学療法が成功しなかったNSCLC患者のオープンラベルのフェーズII試験（Perez-Soler R.ら、(2001) Proc. Soc. Clin. Oncol. 20:310a (抄録 1235））において、エルロチニブは有望な抗癌活性を有した。
【０１０６】
この試験で我々は、NSCLC異種移植片を有する無胸腺ヌードマウスモデルでエルロチニブとシスプラチンまたはゲムシタビンとの併用が、腫瘍増殖の阻害において相乗的にまたは拮抗的に作用するかどうかを調べた。H460aとA549 NSCLC腫瘍モデルは、細胞当たり70,000〜80,000の結合部位でEGFRを明らかに発現するため、選択された（Bianco, C.ら、(2002) Clin. Cancer Res. 8(10):3250-3258；Lee, M.ら、(1992) J. Nat. Cancer Inst. Monogr. (13):117-123）。A549は増殖が遅く、H460aはより攻撃的で増殖が速い。
【０１０７】
材料と方法
【０１０８】
動物
【０１０９】
約10〜12週齢で体重23〜25gのメスの無胸腺nu/nu-nuBRヌードマウス（チャールズリバーラボズ（Charles River Labs）、ウィルミントン、アメリカ合衆国）を使用した。マウスの健康は、観察と共用の棚ラックの歩哨動物から取った血液試料の分析により毎日評価した。すべての動物を馴化させ、輸送に関連するストレスから1週間回復させた。
【０１１０】
オートクレーブした水と放射線照射食物（5058-ms ピコラブ（Pico Lab）[マウス]飼料、プリナミルズ（Purina Mills）、リッチモンド、インディアナ州）を自由に与え、動物を12時間の明暗サイクルで飼育した。ケージ、ベッドおよび水のビンは使用前にオートクレーブし、毎週交換した。すべての動物実験は、ロシュ動物飼育と使用委員会（Roche Animal Care and Use Committee）が認可したプロトコールに従って行った。
【０１１１】
細胞培養と動物試験
【０１１２】
H460a細胞（Jack Roth医学博士より供与された、アンダーソン（Anderson））を10％胎児牛血清（FBS）を補足したダルベッコー改変イーグル培地（DMEM）で増殖させた。A549細胞（アメリカンタイプカルチャーコレクション［マナサス（Manassas）、バージニア州］）をロズウウェルパークメモリアル研究所培地（Roswell Park Memorial Institute medium）（RPMI）1640＋10％ FBSで培養した。インプラントの細胞濃度は、H460aについて1×107細胞／0.2mlでA549について7.5×106細胞／0.2mlであった。
【０１１３】
細胞をリン酸緩衝化生理食塩水に懸濁し、各マウスの右わき腹の皮下に埋め込んだ。いったん触知可能な腫瘍が確立されたら、動物をランダムに分類し、すべての群が同様の出発平均腫瘍容積100〜150mm3となるようにした。腫瘍の測定とマウスの体重測定は、週に3回行った。実験中、動物は個々に追跡した。
【０１１４】
試験物質と薬剤治療
【０１１５】
エルロチニブ（オーエスアイファーマシューチカルズ（OSI Pharmaceuticals）、ユニオンデール（Unioondale）、ニューヨーク州）を、注射用水でカルボキシメチルセルロースナトリウムとトゥイーン80との微細懸濁物として調製した。1mlのシリンジと18ゲージのガバージュ針を使用して、エルロチニブ（0.2ml／動物）を経口投与した。すべての群を3週間毎日治療した。
【０１１６】
ラベルの指示に従って無菌食塩水を用いて、プレパッケージしたバイアルに凍結乾燥ゲムシタビン（ゲムザー（Gemzar）（登録商標）、リリーリサーチセンター社（Lilly Research Center Ltd））を調製して、38mg/mlの活性化合物を含有する溶液を得た。各投与群について、全試験について必要な薬剤からなるストックバイアル溶液のアリコートを取り、無菌食塩水でさらに希釈して、各動物について0.5ml投与容量の溶液を得た。3mlのシリンジと26ゲージ針を使用してゲムシタビンを腹腔内（i.p.）投与した。すべての群を3日毎に3週間治療した（全部で6回の注射）。
【０１１７】
計算と統計解析
【０１１８】
体重の減少は、以下の式を使用して群平均体重のパーセント変化として計算した：
【０１１９】
((W-W0)/W0)×100
【０１２０】
ここで、「W」は特定の日の治療群の平均体重であり、「W0」は治療開始時の同じ群の平均体重である。体重の最大の喪失もまた上記式を使用して、特定の群について全実験の任意の時点で失われた体重の最大パーセントを得た。治療の効果は腫瘍増殖の阻害により評価した。治療群の腫瘍容積は、以下の式を使用して対照群の腫瘍容積のパーセント（％T/C）として得た：
【０１２１】
100×((T−T0)/(C−C0))
【０１２２】
ここで、「T」は実験の特定の日の治療群の平均腫瘍容積であり、「T0」は治療の第1日の同じ群の平均腫瘍容積であり、Cは実験の特定の日の対照群の平均腫瘍容積であり、C0は治療の第1日の同じ群の平均腫瘍容積である。
【０１２３】
腫瘍増殖の阻害は以下の式を使用して計算した：
【０１２４】
100−％T/C
【０１２５】
腫瘍容積（mm3）は楕円式を使用して計算した：
【０１２６】
(D×(d2))/2
【０１２７】
ここで「D」は腫瘍の長径であり、「d」は短径である。ある場合には、腫瘍退縮および／または腫瘍容積のパーセント変化は以下の式を使用して計算した：
【０１２８】
((T-T0)/T0)×100
【０１２９】
ここで、「T」は特定の日の治療群の平均腫瘍容積であり、「T0」は治療開始時の同じ治療群の平均腫瘍容積である。
【０１３０】
統計解析は、順位和検定、一元配置分散分析（ANOVA）、および事後Bonferroni t検定（シグマスタット（SigmaStat）、バージョン2.03、ヤンデルサイエンティフック（Jandel Scientific）、サンフランシスコ、カリフォルニア州）により行った。有意水準はp≦0.05とした。
【０１３１】
薬物動態分析
【０１３２】
単回投与薬物動態（PK）のために、1時点につき3匹のマウスから、投与後5、15、30、60分、および2、4、8、16、24時間に心臓穿刺により血液試料を採取した。長期に治療された動物では、各時点について2匹または3匹のマウスの後眼窩洞から1時間と6時間に血液試料を採取した。採血管は抗凝固剤としてエチレンジアミン四酢酸（EDTA）を含有した。試料を-70℃で保存した。エルロチニブの血漿濃度は、液体クロマトグラフィーとタンデム質量スペクトル（LC-MS/MS）法を使用して、定量限界1ng/mlで測定した。PKパラメータは、合成データの非コンパートメント分析により、PK評価プログラムであるウィンノンリンプロ（WinNonlin PRO）（登録商標）バージョン3.1（ファーサイト社（Pharsight Inc.））を使用して推定した。ある試験では、エルロチニブ腫瘍（H460a）濃度は、定量限界1ng/g 組織の選択的LC-MS/MS法を使用して測定した。
【０１３３】
病理／剖検
【０１３４】
試験の最後に、すべての残りの群から1つの治療につき5匹のマウスの完全な剖検を行った。血液学検査と臨床化学検査のために、これらのマウスから全血も採取した。
【０１３５】
腫瘍試料を10％亜鉛ホルマリンに浸漬して固定し、次にTissue-Tek（登録商標）VIP（サクラ（Sakura））で処理し、パラフィン包埋した。免疫組織化学検査用の切片を5μに切った。免疫前のウサギまたはヤギ血清（ダコ社（Dako Ltd））を陰性対照として使用した。切片を標的回収溶液（Target Retrieval Solution）（ダコ社（Dako Ltd））に浸漬し、スチーマー（グラックアンドデッカー（Black & Decker）で94℃で20分間加熱した。内因性ペルオキシダーゼ活性をメタノール中6％ H2O2で15分間クエンチした。
【０１３６】
非特異的組織結合部位をブロックするために、二次抗体を作成した種からの10％正常血清により切片をブロックした。切片を、Ultra-V（ラブビジョン（Lab Vision））で調製した血清で室温で20分インキュベートした。
【０１３７】
血小板内皮細胞接着分子（PECAM-1、CD31）抗原とEGFR抗原について、切片を、抗体希釈剤（ダコ社（Dako Ltd））で1：800希釈したポリクローナルヤギ抗PECAM-1 IgG（サンタクルツバイオテクノロジー（Santa Cruz Biotechnology）、サンタクルツ（Santa Cruz）、カリフォルニア州）または抗体希釈剤（ダコ社（Dako Ltd））で1：50希釈したポリクローナルウサギ抗EGFR IgG（バイオジェネクス（BioGenex）、サンラモン（San Ramon）、カリフォルニア州）とともに、室温で一晩インキュベートした。切片をベクタスタチンエリート（Vectastain Elite）ABC-ペルオキシダーゼ（ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories））と室温で45分間インキュベートした。
【０１３８】
Ki-67抗原について、切片を抗体希釈剤（ダコ社（Dako Ltd））で1：2,000希釈したポリクローナル抗Ki-67 IgG（ネオマーカーズ（NeoMarkers）、フレモント（Fremont）、カリフォルニア州）と室温で1時間インキュベートし、次に西洋ワサビペルオキシダーゼ標識ストレプトアビジン複合体を30分間加えた。
【０１３９】
アポトーシスを検出するために、TUNEL TdT-FragEL（登録商標）DNA断片化検出キット（オンコジーンリサーチプロダクツ（Oncogene Research Products）、サンジエゴ、カリフォルニア州）を製造業者の推奨するように使用した。すべての4つの抗原について、ベクターノバレッド（Vector Nova Red）（ベクターラボラトリーズ（Vector Laboratories））が最終色素であり、ヘマトキシリンで核対比染色した。
【０１４０】
結果と考察
【０１４１】
結果
【０１４２】
NSCLC異種移植片中のEGFR免疫組織化学染色
【０１４３】
H460aとA549腫瘍のEGFR発現パターンを免疫組織化学により試験した。両方の細胞株は、EGFRの染色について同様の膜性パターンを有した（データは示していない）。これは、これらの2つの細胞株中のEGFRの同等の発現を示す過去の結果を確認する（Bianco, C.ら、(2002) Clin. Cancer Res. 8(10):3250-3258；Lee, M.ら、(1992) J Natl. Cancer Inst. Monogr. (13):117-123）。
【０１４４】
無胸腺ヌードマウスにおけるエルロチニブの単回投与および長期投与PK評価
【０１４５】
非担腫瘍マウスにおいて
【０１４６】
メスのnu/nu無胸腺マウスに胃管栄養法によりエルロチニブ20mg/kgと100mg/kgを投与した。この用量は、活性薬剤（遊離塩基）含量が91.5％の塩酸塩を意味する。調製物は、エルロチニブをそれぞれ2.5mg/mlと12.5mg/ml含有するカルボキシメチルセルロースナトリウム懸濁物であった。各時点で3匹の動物をPKデータについて評価した（図4）。
【０１４７】
100mg/kgを投与されたマウスは、エルロチニブに対する全身性曝露が大きく、AUClast値は約196,000 h*ng/mlであった。20mg/kg投与後のAUClastは33,500 h*ng/mlであった。曝露（AUC）は用量比例的であった。最大血漿濃度の平均は100mg/kg投与後は24,000ng/mlで、20mg/kg投与後は9,100ng/mlであった。最大血漿濃度は投与後0.5〜1.0時間であった。見かけの最終半減期の平均は約4時間であり、平均滞留時間は約7時間であった。
【０１４８】
担腫瘍マウスにおいて
【０１４９】
無胸腺マウスに6.3、12.5、25.0、100.0、および150.0mg/kgのエルロチニブを経口投与した後、投与後1時間と6時間では血漿濃度はそれぞれ16,700ng/mlと8,870ng/mlであった（図1a）。150mg/kgを経口投与し、血漿試料と同じ時点でサンプリングした各平均腫瘍濃度は、4,800と3,090ng/g組織であった。
【０１５０】
血漿濃度の個体間変動は小さく、相対的標準偏差（RSD）は約35〜40％（範囲：5.2〜120％）であった。曝露は用量依存性であり、用量の増加とともに用量比例的であった。この試験では、腫瘍濃度は血漿濃度とよく相関した（図1b）。
【０１５１】
無胸腺ヌードマウスにおける最大許容用量（MTD）の測定
【０１５２】
エルロチニブMTD
【０１５３】
エルロチニブのMTDは100mg/kgであった（図6）。毒性の兆候を示すマウスはすべて、同様の病変を有した。皮膚と消化管に著しい毒性が見られた。400mg/kg群の1匹のマウスが死んだ。この群の残りの動物は、病的状態のために安楽死させた。しかし我々の以前の効力試験は、製剤中のエルロチニブ150mg/kgはまた、3週間充分許容されることを示している（著者、未公表観察結果）。
【０１５４】
ゲムシタビンMTD
【０１５５】
ゲムシタビンを投与したヌードマウスの2週間MTD試験では、いずれの治療群にも明らかな毒性の兆候（体重減少または顕著な臨床症状）は無かった。ゲムシタビンの主毒性は骨髄抑制である（Hoang, T.ら、(2003) Lung Cancer 42(1):97-102；Philip P.A. (2002) Cancer 95(4 Suppl);908-911；Tripathy, D. (2002) Clin. Breast Cancer 3 (Suppl 1):8-11）。完全な血球計数用の末梢血試料を採取しなかったため、投与群のいずれかに骨髄抑制があったかどうかは不明である。
【０１５６】
これらの知見と文献（Rajkumar S.V.とAdjei A.A.、(1998) Cancer Treat Rev. 24:35-53；Bunn P.A. Jr.とKelly K. (1998) Clin. Cancer Res. 4(5):1087-1100；ten Bokkel W.W.ら、(1999) Lung Cancer 26(2):85-94）中のデータに基づき、我々は後の効力試験で最大用量として3日毎に120mg/kgを使用することに決定した。担腫瘍マウスについて異なる感受性が示され、許容レベルが腫瘍株特異的であった（Merriman, R.L.ら、(1996) Invest. New Drugs 14(3):243-247）ため、我々は注意深く高用量を使用した。
【０１５７】
確立されたNSCLC異種移植片に対するエルロチニブの作用
【０１５８】
H460aの用量応答試験
【０１５９】
H460a NSCLC異種移植片の試験の最後（腫瘍移植後28日目）に、単独療法としてのエルロチニブは有意な用量依存性効力を有した。100mg/kg群では、61％の増殖阻害があった（ビヒクル対照に対してp≦0.001）。
【０１６０】
他の群は以下の増殖阻害を有した：25mg/kg：46％（ビヒクル対照に対してp≦0.001）；12.5mg/kg：36％（ビヒクル対照に対してp≦0.003）；6.25mg/kg：28％（ビヒクル対照に対してp≦0.014）（図2）。部分的なまたは完全な退縮はなかった。
【０１６１】
H460a中のエルロチニブとゲムシタビンの併用活性
【０１６２】
28日目の終点で、エルロチニブ100mg/kgは腫瘍増殖を71％有意に阻害した（p＝0.002）（図3）。エルロチニブ25mg/kgは、30％の最適以下の効力を有した。
【０１６３】
120mg/kgのMTDで3日毎、および4分の1のMTD（30mg/kg）で3日毎に、ゲムシタビン単独療法を試験した。3日毎のゲムシタビン120mg/kgは腫瘍増殖を有意に阻害した（93％、p≦0.001）。少量のMTDでは腫瘍増殖阻害は64％であった（p≦0.001）。
【０１６４】
3日毎のゲムシタビン120mg/kgと経口エルロチニブ100mg/kgの併用は致死的であり、腫瘍移植の5日後に毒性の兆候があった。腫瘍移植の25日後までにすべてのマウスは死亡した（治療15日目）。
【０１６５】
3日毎のゲムシタビン30mg/kgとエルロチニブ25mg/kgの併用は、腫瘍増殖を86％阻害した（ビヒクル対照に対してp≦0.001）。部分的なまたは完全な退縮はなかった。25％のMTDで投与されたゲムシタビンまたはエルロチニブより有意に優れていることはなかったため、この阻害は付加的ではなかった。この併用はまた、エルロチニブ100mg/kgまたはゲムシタビン120mg/kgより有意に良好ということもなかった。
【０１６６】
A549中のエルロチニブとゲムシタビン併用活性
【０１６７】
試験の最後（腫瘍移植後47日目、治療19日目）に、エルロチニブ100mg/kgは腫瘍増殖を87％有意に阻害した（p≦0.001）（図5）。2つの部分的退縮があった（16％と17％）。以前の試験と同様に、エルロチニブ25mg/kgは最適以下の48％腫瘍増殖阻害の効力を示した（p＝0.004）。
【０１６８】
ゲムシタビン120mg/kgは腫瘍増殖を75％有意に阻害（p≦0.001）し、1つの部分的退縮（5％）があった。ゲムシタビン30mg/kgは腫瘍増殖を42％阻害した（p＝0.001）。以前の試験で毒性があったため、ゲムシタビンとエルロチニブを高用量で併用しなかった。ゲムシタビン30mg/kgとエルロチニブ25mg/kgの併用は、すべてのマウスにより充分許容され、有意な体重減少や全体的な毒性兆候はなかった。この併用は腫瘍増殖を103％有意に阻害（ビヒクル対照に対してp≦0.001）し、6つの部分的退縮があった（範囲：5％〜67％）。この腫瘍増殖の阻害は付加的であり、MTDの4分の1で投与されたゲムシタビンまたはエルロチニブより有意に良好であった（p≦0.05）。この併用は、エルロチニブ100mg/kgまたはゲムシタビン120mg/kgより有意に良好ということはなかった。
【０１６９】
正常組織と腫瘍組織に対して治療関連作用
【０１７０】
単独療法を受けた動物の剖検
【０１７１】
エルロチニブ単独療法を受けた動物では、血液学パラメータまたは臨床化学パラメータに変化は無かった（データは示していない）。皮膚に、治療関連の肉眼で見える変化があった。マウスは顕著な赤化と、皮膚のEGFRの高レベルの発現のためと思われる鼻づらの皮膚の痂皮形成があった（図7）。これらの病変は一過性であり、治療の継続で消失した。治療関連の抗腫瘍作用は、両方のNSCLC異種移植腫瘍モデルでエルロチニブ100mg/kgでKi-67増殖指数のわずかの低下であった（図8）。治療された異種移植の腫瘍細胞のアポトーシスの頻度に大きな差は無く、内皮細胞マーカーであるCD31についての免疫組織化学染色により微小血管密度（MVD）により測定すると、血管形成に対する明らかな作用は無かった。
【０１７２】
エルロチニブ／ゲムシタビン併用を受けた動物の剖検
【０１７３】
MTDの4分の1のエルロチニブとゲムシタビンを投与されたマウスについては、組織学的に評価した主要な臓器系に目立った知見はなかった。血液学パラメータと血清化学パラメータに対する治療関連の作用は小さかった。本試験の条件下では、治療関連の毒性の証拠はほとんどなかった。従ってエルロチニブ25mg/kg＋ゲムシタビン30mg/kgは明らかな抗新生物作用を有したが、毒性を上昇させることは無いようであった。併用群における増殖に対する作用（Ki67染色により評価した）は、エルロチニブ単独療法で治療したマウスと似ていた（図8b）。
【０１７４】
考察
【０１７５】
これらの結果は、HER1/EGFRの強力な経口で利用可能な選択的小分子インヒビターであるエルロチニブが、同様の数のHER1/EGFRを発現するヒトNSCLC異種移植モデルで、単独療法としておよび従来の化学療法剤との併用で、強い抗腫瘍活性を有することを示す。
【０１７６】
異種移植モデルH460aでは、これは優れた用量応答関係を有し、腫瘍濃度は血漿濃度によく相関した。
【０１７７】
2つのヒトNSCLC細胞株は無胸腺マウス中で皮下腫瘍として増殖させると、異なる腫瘍増殖動力学を有し、倍加時間はH460aでは5日間でA549では10日間であった。100mg/kgのエルロチニブ単独療法は、H460a異種移植モデルの腫瘍増殖を有意に阻害した。
【０１７８】
MTDの25％で投与されたゲムシタビン／エルロチニブ併用により、増殖の遅いA549腫瘍で、有意な腫瘍増殖の阻害と部分的鎮静があった（＞100％）。ゲムシタビンと併用したエルロチニブによる腫瘍増殖の阻害は、エルロチニブ単独療法と比較して有意に上昇した（p≦0.05）。より増殖の速いH460a腫瘍では、いずれかの化合物のMTDの4分の1を使用して、ゲムシタビン／エルロチニブ併用により実質的な腫瘍増殖の阻害があった（86％）。しかしこの併用による腫瘍増殖の阻害は、単独療法によるものと有意に異ならなかった。A549は増殖が遅く、従って血管形成により多く依存すると考えられた。エルロチニブは、間接的な抗血管形成剤であると考えられ（Kerbel, R.とFolkman, J. (2002) Nat. Rev. Cancer 2(10):727-39）、従ってA549に対するより大きな効力を有することは驚くべきことではない。エルロチニブはHER1/EGFRの細胞内チロシンキナーゼドメインへのアデノシン三リン酸（ATP）の結合を阻害し、受容体リン酸化と関連する下流のシグナル伝達を阻止する（Moyer J.D.ら、(1997) Cancer Res. 57:4838-4848）。その結果は、腫瘍増殖と進行に関連する細胞プロセス（例えば、増殖、血管形成、転移、およびアポトーシスからの防御）の阻害である（Moyer J.D.ら、(1997) Cancer Res. 57:4838-4848）。残念ながら、おそらくアッセイが充分に高感度ではなかったため、エルロチニブにより治療した腫瘍で、MVDによる抗血管形成作用は検出されなかった。
【０１７９】
両方のNSCLCモデルでは、MTDの4分の1で投与したゲムシタビン（30mg/kg）とエルロチニブ（25mg/kg）は充分許容され、体重減少は全くもしくはほとんど無く、副作用のリスクが小さいまま効力を維持しており、患者の生活の質の大きな向上を示唆している。これに対して個々の最大許容用量でのエルロチニブと従来の薬剤の高用量併用は許容されなかった。これは、支持療法を前臨床的に使用することができないという事実に関連しているかも知れない。
【０１８０】
造血幹細胞を有するヒトでのゲムシタビンおよびシスプラチンと、またはカルボプラチンおよびパクリタキセルと併用したエルロチニブのフェーズIII治験は、生存率の決定的な利点が証明されなかったため、失望させるものである。それにもかかわらずここに報告された前臨床試験は、化学療法と組合せたエルロチニブは、腫瘍増殖の阻害において付加的作用を有することを明瞭に証明した。これらの知見は、他の化学療法剤との連続的使用のような種々の臨床の場での、および選択された患者集団での、エルロチニブの作用のさらなる試験の必要性を支持する。さらにHER1/EGFRは多くの癌（頭頚部癌、前立腺癌、神経膠腫、胃癌、乳癌、子宮頚癌、膵臓癌、および卵巣癌を含む）で過剰発現されている（Ciardiello，FとTortora G. (2002) Expert Opin. Investig. Drugs 11:755-768）；Salomon D.S.ら、(1995) Crit. Rev. Oncol. Hematol. 19:183-232）。従ってゲムシタビンと組合せたエルロチニブは、HER1/EGFRを発現する固形細胞腫瘍を有する他の癌で効力を有する可能性がある。
【０１８１】
結論としてNSCLCでは、同様のレベルのEGFR発現を有する異種移植腫瘍中のエルロチニブの抗腫瘍活性は、単独療法としてもゲムシタビンとの組合せでも、強固である。癌治療におけるこの有望な新しい方法を完全に評価するために、さらなる研究が必要である。
【０１８２】
文献の参照
【０１８３】
すべての特許、公表された特許出願、および本明細書に開示された他の文献は、引用文献により明確に本明細書に組み込まれる。
【０１８４】
同等物
【０１８５】
当業者は、1つ以上の日常的実験を使用して、本明細書に具体的に記載した発明の具体例に多くの同等物があることを認識するか、または確認するであろう。かかる同等物は、以下の請求の範囲に包含されると考えられる。
【０１８６】
【表１】
2008501652.tif 000002
【０１８７】
【表２】
2008501652.tif 000003
【図面の簡単な説明】
【０１８８】
【図１】エルロチニブの経時的血漿濃度  (A) 用量依存性血漿濃度 (B) 腫瘍薬剤濃度と血漿薬剤濃度との相関。担癌マウスにエルロチニブを0、6.3、12.5、25.0、100.0または150.0mg/kgで、21日間毎日経口投与した。腫瘍移植後28日目に、投与の1時間後と6時間後に血液（後眼窩洞から）と腫瘍試料を採取した。エルロチニブの濃度は、LC-MS/MSを使用して測定した。値は平均±SD（n＝3）である。
【図２】H460a NSCLC異種移植モデルにおける平均腫瘍容積に及ぼすエルロチニブの影響。マウスにH460a NSCLC細胞を移植した。触知可能な腫瘍が確立されたら、各群の平均出発腫瘍容積が100〜150mm3になるように動物をランダムに分けた。マウスにエルロチニブを0、6.3、12.5、25、または100mg/kgで、21日間毎日経口投与した。週に3回腫瘍サイズを測定した。値は平均（n＝10）である。
【図３】H460a NSCLC異種移植モデルにおける平均腫瘍容積に及ぼすエルロチニブとゲムシタビン単独および組合せの影響。マウスにH460a NSCLC細胞を移植した。触知可能な腫瘍が確立されたら、各群の平均出発腫瘍容積が100〜150mm3になるように動物をランダムに分けた。マウスを、ビヒクル、25または100mg/kg/日の経口エルロチニブ単独、3日毎に30または120mg/kgの腹腔内ゲムシタビン単独、または3日毎に25mg/kg/日のエルロチニブと30mg/kgのゲムシタビンを用いて、21日間治療した。週に3回腫瘍サイズを測定した。値は平均（n＝10）である。
【図４】A549 NSCLC異種移植モデルにおける平均腫瘍容積に及ぼすエルロチニブとゲムシタビン単独および組合せの影響。マウスにA549 NSCLC細胞を移植した。触知可能な腫瘍が確立されたら、各群の平均出発腫瘍容積が100〜150mm3になるように動物をランダムに分けた。マウスを、ビヒクル、25または100mg/kg/日の経口エルロチニブ単独、3日毎に30または120mg/kgの腹腔内ゲムシタビン単独、または3日毎に25mg/kg/日のエルロチニブと30mg/kgのゲムシタビンを用いて、21日間治療した。週に3回腫瘍サイズを測定した。値は平均（n＝10）である。
【図５】エルロチニブを投与されたマウスの皮膚病変。剖検で皮膚試料を10％緩衝化ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、5μの切片を作成し、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。100mg/kg/日のエルロチニブを21日間投与されたマウスでは、皮膚病変は赤く薄片状であることが顕著に特徴的であった。組織学的には病変は、びまん性の軽度〜中程度の表皮肥厚、表皮角質増殖、巣状焼痂形成、および真皮へのほとんど急性の炎症性細胞浸潤があった。病変は一過性であり、治療を継続することにより消失した。
【図６】異種移植モデルにおけるNSCLCの免疫組織化学染色の光学顕微鏡写真。ヌードマウスの腫瘍の切片を、抗原Ki67について染色して、対照マウス(A)と100mg/kg/日のエルロチニブで21日間治療したマウス(B)の細胞増殖を検出した。暗い部分は、増殖活性を示すKi67染色である。
【図１】
2008501652.tif 000004
【図２】
2008501652.tif 000005
【図３】
2008501652.tif 000006
【図４】
2008501652.tif 000007
【図５】
2008501652.tif 000008
【図６】
2008501652.tif 000009
【国際調査報告】
2008501652.tif 000010
2008501652.tif 000011
2008501652.tif 000012
2008501652.tif 000013
2008501652.tif 000014
2008501652.tif 000015