(57)【要約】  本発明は、変化した空間配置を有し、有効性が高く、副作用の低い組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏｓ）とその等価物の様々な使用方法を提供する。これにより、大用量のｒＳＩＦＮ−ｃｏを用いることができる。ｒＳＩＦＮ−ｃｏの一つの特性は、薬理学的研究のインビトロ法で、ＨＢＶのＤＮＡ複製とＨＢｓ抗体とＨＢｅ抗体の分泌を抑制する能力を有することである。ｒＳＩＦＮ−ｃｏの細胞障害性の効果は、現在臨床的に利用可能であるインターフェロンの１／８倍のみであるが、抗ウイルス効果は約５−２０倍と高い。また、ｒＳＩＦＮ−ｃｏを生体内で用いた場合、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは臨床に広範囲に応用でき、生体フィードバック応答が長くなる。本発明は、さらに、高効率複合インターフェロンまたはその等価物、該ｒＳＩＦＮ−ｃｏとその等価物をコードするコドン選択を含む人工遺伝子の合成、該遺伝子と該ｒＳＩＦＮ−ｃｏを発現させる適切な発現系を備えるベクターを提供する。最後に、本発明は高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）とその等価物、その生成過程及びその使用方法を提供する。【選択図】図３
2008532995.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高効率複合インターフェロンの利用方法であって、
前記高効率複合インターフェロンが、抗ウイルス活性または抗腫瘍活性を持つことを特徴とする高効率複合インターフェロンの利用方法。
【請求項２】
請求項１記載の高効率複合インターフェロンであって、
前記ウイルス性疾患が、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、その他の型の肝炎、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エボラウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、その他のヘルペスウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、またはヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩが引き起こす感染症であることを特徴とする高効率複合インターフェロン。
【請求項３】
請求項１記載の高効率複合インターフェロンであって、
前記高効率複合インターフェロンが、Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡ複製とＢ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原とＨＢｅ抗原の分泌を抑制することを特徴とする高効率複合インターフェロン。
【請求項４】
請求項３記載の高効率複合インターフェロンであって、
前記高効率複合インターフェロンが、生体外でＢ型肝炎ウイルスのＤＮＡ複製とＢ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原とＨＢｅ抗原の分泌を抑制することを特徴とする高効率複合インターフェロン。
【請求項５】
請求項１乃至３いずれかに記載の高効率複合インターフェロンであって、
前記高効率複合インターフェロンが、さらに薬剤を含有するまたは薬剤によりカプセル化され、
前記インターフェロンの半減期または送達に影響を及ぼす能力をもつことを特徴とする高効率複合インターフェロン。
【請求項６】
請求項５記載の高効率複合インターフェロンであって、
前記薬剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする高効率複合インターフェロン。
【請求項７】
組換え高効率複合インターフェロンの有効量をナノグラム量からマイクログラム量含有することを特徴とする組成物。
【請求項８】
請求項７記載の組成物であって、
前記ウイルスが重症急性呼吸器症候群ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、エボラウイルス、またはインフルエンザウイルスであることを特徴とする組成物。
【請求項９】
請求項８記載の組成物であって、
前記ウイルスがヒト免疫不全ウイルスであって、
前記組成物の有効量が１ミリリットル当たり４ナノグラムまで低量であることを特徴とする組成物。
【請求項１０】
請求項８記載の組成物であって、
前記ウイルスがインフルエンザウイルスであって、
前記組成物の有効量が１ミリリットル当たり１０ナノグラムまで低量であることを特徴とする組成物。
【請求項１１】
組換え高効率複合インターフェロンと薬学的に許容可能な担体とを含有する医薬組成物であって、
前記組換え高効率複合インターフェロンの有効量がナノグラム量であることを特徴とする医薬組成物。
【請求項１２】
患者のウイルス性疾患または腫瘍を予防または治療する方法であって、
前記方法は、前記患者に請求項１１記載の組換え高効率複合インターフェロンを有効量投与する段階を備えることを特徴とする方法。
【請求項１３】
請求項１２記載の方法であって、
前記ウイルス性疾患が、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、その他の型の肝炎、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エボラウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、その他のヘルペスウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、またはヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩが引き起こす感染症であることを特徴とする方法。
【請求項１４】
請求項１２記載の方法であって、
前記腫瘍が、基底細胞癌、悪性黒色腫、肝癌、腎細胞癌、肝癌、上咽頭癌、前立腺癌、胃／腹腔内の癌、食道癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌と表在性膀胱癌、血管腫、子宮頸癌、乳癌、卵巣癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神経膠腫、急性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、リンパ節腫、多発性骨髄腫、真性赤血球増加症、カポジ肉腫であることを特徴とする方法。
【請求項１５】
請求項１２記載の方法であって、
前記高効率複合インターフェロンが、経口投与、静脈注射、筋肉注射、腹腔注射、皮下注射、鼻腔もしくは粘膜への投与、または呼吸機で吸入することにより投与されることを特徴とする方法。
【請求項１６】
請求項１２乃至１５いずれかに記載の方法であって、
前記方法は、さらに薬剤を含有するまたは薬剤によりカプセル化される段階を備え、
前記インターフェロンの半減期または送達に影響を及ぼす能力をもつことを特徴とする方法。
【請求項１７】
請求項１６に記載の方法であって、
前記薬剤が、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であることを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体工学分野に関連する。特に本発明は、変化した空間配置を有し、有効性が高く、副作用の少ない組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）またはその等価物に関連する。従って、ｒＳＩＦＮ‐ｃｏを大量に投与できる。また本発明は前記高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）、または前記高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）もしくはその等価物を含む医薬組成物を生産する過程にも関連しており、前記インターフェロンまたは組成物の抗ウイルスや抗腫瘍療法への利用方法に関連する。
【背景技術】
【０００２】
ＩＦＮ−ｃｏｎは遺伝子工学の方法を用い、天然ヒトIFN-αサブタイプ中で発見された最も一般的な保存アミノ酸で構築された新しいインターフェロン分子である。それについては米国特許第4,695,623号と第4,897,471号に記載されている。ＩＦＮ−ｃｏｎは広域スペクトラムＩＦＮ活性、ウイルス抑制、腫瘍抑制、そしてナチュラルキラー細胞活性を持つとことが証明されている。Amgen社の米国特許第5,372,808号はInfergen（登録商標）（インターフェロンアルファコン‐１）を用いた治療を検討している。Amgen社の中国特許第97193506.8はInfergen（登録商標）を用いたC型肝炎の再治療を検討している。Shenzhen  Jiusheng Bioengineering社の中国特許第98114663.5は組換えコンセンサスヒトインターフェロンαでのB型肝炎及びC型肝炎の治療を検討している。
【０００３】
米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は１９９７年末に、C型肝炎の臨床治療用にInfergen（登録商標）（インターフェロンアルファコン‐１）を大腸菌を用いて生産することをAmgen社に許可した。
【０００４】
ＨＢｓ抗原とＨＢｅ抗原が検出されると、Ｂ型肝炎患者であると特定できる。ＩＦＮ−αは一般に診療所でＢ型肝炎の治療に使われる。ＩＦＮ‐αは表面細胞膜受容体と結合する。このようにしてＤＮＡとＲＮＡ（リボ核酸）の複製を抑制し、酵素を誘発して肝炎に感染した細胞内のウイルスの複製を防止する。ＩＦＮｓは全てウイルスのＤＮＡ複製を抑制することが可能であるが、ｅ抗原やｓ抗原の発現を抑制することはできない。
【０００５】
本出願は２００５年３月９日提出の、米国特許出願番号第60/659,925の一部継続出願であり、その内容はそれらの全体を参照することにより本出願に含むこととする。
【０００６】
本出願中では、様々な出版物が文献として引用されている。本発明の関係する最新技術をさらに詳細に記述するため、これらの出版物の全体の公開は文献を参照することにより本出願に含むこととする。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）と呼ばれ中国広東省で最初に確認された新型肺炎の発生は、様々な国へ広がった。２００３年の２月と３月から香港、ベトナム、カナダの患者から同様の症例が検出された。世界保健機構（ＷＨＯ）はその疾病に対し世界的規模の警告を出した。２００３年３月中旬には、ＳＡＲＳは極東の重症呼吸器症候群患者のケアにあたった医療従事者や家族中に確認された。複数連鎖の感染によって、これらの症例のほとんどが、広東省出身のある医療従事者にたどりついた。彼は香港を訪問し、そこで肺炎のため入院し死亡した。２００３年４月下旬、世界２５カ国以上の国から何千ものＳＡＲＳの症例と何百ものＳＡＲＳに関連した死がＷＨＯに報告された。これらの症例のほとんどが家庭や医療環境でのＳＡＲＳ患者への暴露を通じて起こった。本発明はＳＡＲＳの予防及び／または治療方法を提供するものである。
【０００８】
本開示は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）、その生産方法及びその利用方法について述べている。特に、ここに開示されている高効率複合インターフェロンは、肝炎ウイルス、ＳＡＲＳウイルス、又はウイルス誘発性呼吸器疾患、鳥インフルエンザウイルスなどのインフルエンザウイルス、そしてエボラウイルスを抑制、予防及び／又は治療することが可能である。
【０００９】
さらに、他の入手可能なインターフェロンと比較して副作用が少ないｒＳＩＦＮ‐ｃｏは、ウイルス性疾患や腫瘍の予防及び／又は治療に効果的である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、変化した空間配置を有し、有効性が高く副作用の少ない組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）とその等価物を提供する。そのため、ｒＳＩＦＮ‐ｃｏを大量に投与することができる。
【００１１】
本発明は高効率複合インターフェロン又はその等価物をコードする遺伝子からなるベクターを含む発現系を提供する。本発明はまた組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）又はその等価物をコードする遺伝子からなるベクターを含む宿主細胞も提供する。前記宿主細胞は、真核生物又は大腸菌等の原核生物である。
【００１２】
本発明はウイルス性疾患の抑制、予防もしくは治療方法、または患者の腫瘍の抑制もしくは治療方法を提供する。前記治療方法は、有効量の高効率複合インターフェロンまたはその等価物を投与することを含む。
【００１３】
本発明は、高効率複合インターフェロンが、静脈注射、筋肉注射、腹腔注射、皮下注射、鼻腔もしくは粘膜への投与、または呼吸機によって経口投与される上記記載の方法を備える。
【００１４】
本発明はウイルス性疾患であるＡ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、他の型の肝炎、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エボラウイルス、重症急性呼吸気性症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスまたはその他のヘルペスウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスIIまたはヒトＴ細胞白血病ウイルスIIIによるウイルス感染を予防または治療する方法を提供する。
【００１５】
本発明はウイルス性疾患であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）やエボラウイルスを予防または治療する方法を提供する。
【００１６】
本発明は抗肝炎活性の方法を提供する。これは、ＨＢＶ‐ＤＮＡの複製とＨＢｓ抗原とＨＢｅ抗原の生産を抑制することができる。
【００１７】
本発明は、上部呼吸器感染疾患を予防または治療する方法を提供する。
【００１８】
本発明は、皮膚癌、基底細胞癌、悪性黒色腫、腎細胞癌、肝癌、甲状腺癌、上咽頭癌、固形癌、前立腺癌、胃／腹腔内の癌、食道癌、直腸癌、脾臓癌、乳癌、卵巣癌と表在性膀胱癌、血管腫、類表皮癌、子宮頸癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、神経膠腫、白血病、急性白血病と慢性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、リンパ節腫、多発性骨髄腫、真性赤血球増加症、もしくはカポジ肉腫である腫瘍もしくは癌の予防または治療方法を提供する。
【００１９】
本発明は、有効量の組換え高効率複合インターフェロンまたはその機能的等価物をウイルス誘発性疾患の患者に投与して、予防または治療する方法を提供する。
【００２０】
高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）は静脈注射、筋肉注射、腹腔注射、皮下注射、鼻腔もしくは粘膜への投与、または呼吸機によって経口投与される。
【００２１】
本発明は、ウイルス誘発性疾患の病原因子の抑制方法を提供する。前記方法は、病原因子が高効率複合インターフェロンまたはその等価物と接触することを含む。
【００２２】
本発明はまた、ウイルス誘発性疾患の抑制方法も提供する。前記方法は有効量の高効率複合インターフェロンが前記ウイルスまたは細胞と接触することを含む。この接触は直接的であってもよく、または間接的であってもよい。
【００２３】
本発明は、ウイルス誘発性疾患を抑制、予防または治療可能な有効量の高効率複合インターフェロンと、適切な担体からなる組成物を提供する。
【００２４】
本発明は、患者のウイルス誘発性疾患を抑制、予防、または治療する有効量の組換え高効率複合インターフェロンからなる医薬組成物と薬学的に許容可能な担体を提供する。
【００２５】
本発明は、患者に有効量の組換え高効率複合インターフェロンまたは機能的等価物を投与することを含む患者の腫瘍の予防または治療方法を提供する。
【００２６】
本発明は、病原因子を有効量の高効率複合インターフェロンまたはその等価物に接触させることを含む腫瘍の抑制方法を提供する。
【００２７】
本発明は、有効量の高効率複合インターフェロンを前記ウイルスまたは細胞と接触させることを含む腫瘍を抑制する方法を提供する。
【００２８】
本発明は、腫瘍を抑制、予防、または治療可能な有効量の高効率複合インターフェロンと適切な担体を含む組成物を提供する。
【００２９】
本発明は患者の腫瘍を抑制、予防或いは治療可能な有効量の組換え高効率複合インターフェロンと薬学的に許容される担体からなる医薬組成物を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
＜組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）＞
本発明は、変化した空間配置を有する組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）またはその等価物を提供する。本発明は、同じ一次配列を持つタンパク質が異なる生物学的活性を有する可能性を明らかにする。本出願で説明するように、同一のアミノ酸配列を持つタンパク質は異なった活性を有する。これらのタンパク質の有効性は時に高まることもあり、そして、変化した空間配置を有するタンパク質の新しい機能が明らかになることもある。Wei（２００５年；公開番号WO２００５／０２１７７  Ａ２；  国際出願番号  ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２８０６８）は、タンパク質の空間配置を調整する一連の方法を提供している。
【００３１】
ここに定義するように、等価物とは、複合インターフェロンと機能的に類似する分子である。等価物は元の配列の欠失、置換、または代替変異体でありうる。また、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）の模倣体を包含することも本発明の目的である。模倣体は、ペプチド、ポリペプチド、または小化合物でありうる。
【００３２】
ここに記述された組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）は、インターフェロンα、β、νまたはωを含むが、それに限定されるものではない。一実施形態では、ｒＳＩＦＮ‐ｃｏは、ＩＦＮ−１α、ＩＦＮ−２βまたは他の変異体である。
【００３３】
他の実施形態では、開示されている組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）は、インターフェロンα、β、ν、ωまたはそれらの組み合わせよりも有効性が高く、また米国特許第4,695,623号と第4,897,471号に開示されているインターフェロンと比較すると有効性が高い。この組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）は、特有の二次構造または三次構造を有すると考えられており、三次元変化はその生産過程における変化によるものである。Wei（２００４年；ＵＳ２００４／０２０２６４１  Ａ１；  米国識別番号第１０／６５０，３６５号）はまた、この組換え高効率複合について述べている。
【００３４】
ここで述べる組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）は、生産過程の変化の結果生じる空間構造変化を有する。
【００３５】
（低副作用）
前記組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）は、他のインターフェロンと比べて副作用が少ない。そのためインターフェロン治療が必要な患者に、より大量に投与できる。またこれらの副作用が少ないｒＳＩＦＮ‐ｃｏを他の病気の予防及び／または治療に用いることもできる。故に、本発明は患者に投与する時に、より副作用が少ない前記組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）を提供する。
【００３６】
本発明は、現在入手可能な全てのインターフェロンと比較して副作用が少ない組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）を提供する。
【００３７】
本発明は、さらに患者のウイルス性疾患や腫瘍の治療や予防の方法を提供する。前記発明は、現在利用可能な全てのインターフェロンと比較して副作用の少ない有効量のｒＳＩＦＮ‐ｃｏを患者に投与することを備える。従って、ｒＳＩＦＮ‐ｃｏを大量に投与することができる。一実施形態では、有効量の組換え高効率複合インターフェロンはナノグラム量である。
【００３８】
＜ｒＳＩＦＮ‐ｃｏの生産過程＞
（人工遺伝子）
本発明はまた、高効率複合インターフェロンまたはその等価物をコードする人工遺伝子を提供する。人工遺伝子を設計することは、通常の技術の範囲内である。ヌクレオチド配列を生成する様々な方法や他の分子生物学技術は、従来、述べられている。以下の例、Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｗ．  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  分子クローニング：研究室マニュアル、２０００年１２月、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ出版を参照。 
【００３９】
組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）はまた、その遺伝子により、大腸菌のコドン選択に準じた野生型によって配列が調整された人工合成ｃＤＮＡとして生産される。前記コドン使用頻度（選択）の広範囲にわたる議論は、米国特許第4,695,623中でなされている。例：６欄４１行目から７欄３５行目を参照。
【００４０】
（ベクター）
本発明は高効率複合インターフェロンまたはその等価物をコードする遺伝子からなるベクターを提供する。本発明は高効率複合インターフェロンまたはその等価物をコードする遺伝子からなるベクターを含む発現系を提供する。細胞は原核細胞や真核細胞を含むが、それに限定されるものではない。本発明は、また組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）またはその等価物をコードする遺伝子からなるベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００４１】
本発明は変化した空間配置と強化された抗ウイルス活性を持つ組換え高効率複合インターフェロンを生産する方法を提供し、その方法は以下の段階を備える。
（ａ）前記インターフェロンをコードする核酸分子を、発現用の優先コドンにより適切な宿主に導入する。
（ｂ）導入宿主を前記インターフェロンの発現が可能な状態にする。
本発明は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）を生産する方法を提供し、さらに発現したインターフェロンの再生を含む。
【００４２】
（発現系）
上記に述べた組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ）は、特別なプロモーター、エンハンサー、または他の調節要素を用いる高効率の発現系により生産されてもよい。一実施形態では前記プロモーターは誘導性である。前記誘導プロモーターはＰＢＡＤ、熱ショックプロモーターまたは重金属誘導性プロモーターを含むが、それに限定されるものではない。熱ショックプロモーターは物理的手段により活性化され、一方で他のプロモーターは、例えばＩＰＴＧやテトラサイクリンといった化学的手段により活性化される。ＩＰＴＧは下流の遺伝子を活性させるため細胞に加えられるか、遺伝子を不活性化させるため除去される。テトラサイクリンはプロモーターを誘発するため、またはプロモーターの強度を制御するために利用される。
http：／／bio.Davidson.edu／courses／genomics／method／plasmid＿inducible.html.を参照。
【００４３】
一実施形態では、前記プロモーターはＰＢＡＤである。１９世紀初期より、ＡｒａＣによるＰＢＡＤの発現メカニズムと抑制メカニズムは広く研究されており、その相互作用は分子レベルで分析されてきた。Ｓｃｈｌｅｉｆ，Ｒ．Ｓ．１９９２  ＤＮＡ  ｌｏｏｐｉｎｇ．  Ａｎｎｕ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ６１：１９９-２２３．を参照。ＡｒａＣタンパク質は正の調節因子であり負の調節因子である。ＡｒａＣタンパク質存在下では、ＰＢＡＤプロモーターからの転写が起こり、ＡｒａＣタンパク質非存在下では、非常に低い率で転写がおこる。Ｇｕｚｍａｎ，Ｌ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ（１９９５）Ｊ．  Ｂａｃｔ．１７７：４１２１−４１３０．を参照。ＰＢＡＤプロモーターの効率やメカニズムは、他の当業者に広く知られており、市販されている。http：／／www.invitrogen．com／content／sfs／Brochures・710  01619  pBAD  bro.pdfを参照。
【００４４】
市販されているインビトロジェン社の発現キットは、正確な発現量の調整を提供するためのｐＢＡＤのベクターを含む。ａｒａＢＡＤプロモーターは、遺伝子発現を開始する。これは、ａｒａＣ遺伝子の生成によって、正にも負にも制御される。前記ａｒａＣ遺伝子は、L‐アラビノースとの複合体を形成する転写制御因子である。アラビノースの非存在下で、ＡｒａＣ二量体はａｒａＢＡＤオペロンのＯ２とＩ１のハーフサイトに接触し、２１０ｂｐのＤＮＡループを形成する。転写活性化を最大限にするためには、２つの事象が必要である。まず、アラビノースがＡｒａＣへ結合する。タンパク質はＯ２サイトを離れ、Ｉ１サイトに隣接するＩ２サイトに結合する。これによりＤＮＡループが解放され転写を開始することができる。次に、ｃＡＭＰ活性化タンパク質（ＣＡＰ）−ｃＡＭＰ複合体はＤＮＡに結合し、ＡｒａＣのＩ１及びＩ２への結合を刺激する。グルコースを成長培地へ導入することにより、基本的発現量を抑制することができる。グルコースは、ｃＡＭＰを低下させることにより、次々にＣＡＰの結合を減少させる働きをする。ｃＡＭＰ量が低下すると、転写活性化は減少する。インビトロジェン社のｐＢＡＤベクターは、発現を最大限に、そして容易に使用できるよう特に設計されている。
【００４５】
現在利用可能な９つのｐＢＡＤベクターは、ｐＢＡＤ１０２／Ｄ‐ＴＯＰＯ（登録商標）、ｐＢＡＤ２０２／Ｄ‐ＴＯＰＯ（登録商標）、ｐＢＡＤ‐ＴＯＰＯ（登録商標）、ｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ‐ＴＯＰＯ（登録商標）、ｐＢＡＤ／Ｈｉｓ，ｐＢＡＤ／Ｍｙｃ‐Ｈｉｓ、ｐＢＡＤ‐ＤＥＳＴ４９、ｐＢＡＤ／ｇＩＩＩとｐＢＡＤ／Ｔｈｉｏ‐Ｅである。全てのｐＢＡＤベクターは次に続く特徴を持つ。
容量依存的な制御因子であるａｒａＢＡＤプロモーター
ａｒａＢＡＤプロモーターを厳格に管理するａｒａＣ遺伝子
翻訳効率を増加させる最適化リボソームの結合部位
効率的な転写をするためのｒｒｎＢ転写終端領域  
【００４６】
誘導プロモーターは、熱ショックプロモーターまたは重金属誘導プロモーターを含むが、それらに限定されるものではない。
【００４７】
本発明は組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の生産過程を提供する。前記生産過程は、特定コドン選択を用いて人工遺伝子を適切な宿主に導入する段階と、適切な条件で前記導入宿主を培養する段階と、複合インターフェロンを発現させ、発現した複合インターフェロンを採取する段階を備える。
【００４８】
前記過程は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）を培養基の抽出、封入体の収集、採取したタンパク質の変性と再生を含む。
【００４９】
前記過程は、例え組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）が薬剤と共に使用されたり、特定の濃度で使用されても、高い有効性を維持することができる。またその過程は組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の分離と精製も含む。さらにその過程は、精製された組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の凍結乾燥を含む。前記過程は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の液体注入剤の生産を含む。
【００５０】
一実施形態において、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は、組換え技術を用いて生産された。一定のアミノ酸配列の条件下で、大腸菌のコドン使用頻度によりＩＦＮ  ＤＮＡは再設計され、そしてｒＳＩＦＮ−ｃｏ遺伝子は人工的に合成した。ｒＳＩＦＮ−ｃｏ  ｃＤＮＡは、ＤＮＡ組換え技術により、大腸菌の高度発現ベクターにクローニングした。Ｌアラビノースの誘発／活性メカニズムを用いてＰＢＡＤプロモーターの転写を活性化することによって、ｒＳＩＦＮ−ｃｏが高度発現した。
【００５１】
通常の熱誘導と比較して、遺伝子工学のｐＨ誘導及びＩＰＴＧ誘導システム、アラビノース誘導／活性システムには次の利点がある。（１）共通のシステムが「抑圧解除」パターンを作ることにより、プロモーター機能を緩和する。するとプロモーターは下流遺伝子発現を誘発する。天候の変化及びｐＨの変化やＩＰＴＧの追加によって直接プロモーターを活性化できない。ここに開示されたシステムでは、Ｌ‐アラビノースは、非活性化及び抑制するだけでなく、ｒＳＩＦＮ−ｃｏの高度発現を誘発するＰＢＡＤプロモーターの転写も活性化させる。すなわち、アラビノース誘発／活性システムは、より効果的な発現系である。（２）外因投与量とＬ‐アラビノース投与量の関係は直線状にある。これは外来遺伝子の発現量を調整するためには、アラビノース濃度が変化する可能性があることを意味する。すなわち、大腸菌内の外来遺伝子発現量をアラビノースで調整することは、温度やｐＨ値を変化させることより容易である。この特性は封入体の形成に重要である。（３）Ｌ‐アラビノースは豊富であり、安価で安全である。しかし反対に、この点はＩＰＴＧのような他の誘発物には不利である。
【００５２】
この実施形態は、Ｌ‐アラビノース誘発／活性システムの菌株を操作し、効果的で耐久性のあるｒＳＩＦＮ−ｃｏを発現する大腸菌を作り出す。その菌株を好適な条件の下、培養、発酵し、細菌体を採取する。そしてバクテリアを破壊し、繰り返し洗浄して、封入体は精製される。
結果的に、本発明及び医学的治療のための、多量の高精製であるとともに空間配置が変化したｒＳＩＦＮ‐ｃｏタンパク質は、封入体の変性と再生、そして一連の精製工程から得られた。前記精製は精製タンパク質の生物活性に影響は及ぼさない。
【００５３】
上記に述べられた組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は、抗ウイルスまたは抗腫瘍活性を保持し、それ故、ウイルス疾患の抑制、予防または治療に、また腫瘍や癌の抑制または治療に有効である。
【００５４】
（ウイルス性疾患）
本発明は、患者のウイルス性疾患あるいは腫瘍を、治療もしくは予防する方法を提供する。前記方法は、患者に対し、組換え高効率複合インターフェロン（r-SIFN-co）またはその等価物を有効量投与する段階からなる。Wei (2005; 国際公報番号  WO 2005/034853Ａ２号)は、患者の重症急性呼吸器症候群を、予防もしくは治療する方法を提供する。
【００５５】
本明細書において、ウイルス性疾患には、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、その他の型の肝炎、エプスタイン・バーウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、エボラウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ）、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス、その他のヘルペスウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩ、ヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩ、またはヒトＴ細胞白血病ウイルスＩＩＩが引き起こす感染症が含まれるが、これらに限定されない。
【００５６】
一実施形態として、組換え高効率複合インターフェロンの有効量はナノグラム量である。他の実施形態として、ウイルスはヒト免疫不全ウイルスであり、組換え高効率複合インターフェロンの有効量は１ミリリットルあたり４ナノグラムまで低量である。また、他の実施形態として、ウイルスはインフルエンザウイルスであり、組換え高効率複合インターフェロンの有効量は１ミリリットルあたり１０ナノグラムまで低量である。
【００５７】
（Ｂ型肝炎ウイルスのＤＮＡ複製の抑制とＢ型肝炎ウイルスのＨＢｓ抗原とＨＢｅ抗原の分泌の抑制）
組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）はＤＮＡ複製とＢ型肝炎のＢ型肝炎表面抗原及びＢ型肝炎ｅ抗原の分泌を抑制する。
【００５８】
（重症急性呼吸器症候群ウイルス（ＳＡＲＳ））
本発明は、患者の重症急性呼吸器症候群または、ウイルス誘起の上部呼吸器感染疾患を予防もしくは治療する方法を提供する。前記方法は、患者に対し、組換え高効率複合インターフェロンの有効量または組換え高効率複合インターフェロンの機能的等価物の有効量を患者に投与する段階を備える。上記方法の一実施形態として、インターフェロンは、α、β、γ、εまたは、これらの組み合わせである。
【００５９】
組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は、経口投与、静脈注射、筋肉注射、腹腔注射、皮下注射、鼻腔もしくは粘膜への投与、またはスプレーもしくは呼吸機により吸引することで投与される。一実施形態として、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは皮下または筋肉内に、表面１平方メートルにつき１０００万国際単位（10 Million International Unit）と同等またはそれ以上の量が投与される。他の実施形態として、ｒＳＩＦＮ−ｃｏは皮下または筋肉内に、表面１平方メートルにつき２０００万国際単位（20 Million International Unit）と同等またはそれ以上の量が投与される。ある実施形態として、インターフェロンはスプレー装置によって送達される。ある特定の実施形態として、前記装置は図１１に記載されている。実施形態の中の一つとして、インターフェロンは凍結乾燥されている。
【００６０】
本発明は重症急性呼吸器症候群の病原因子またはウイルス誘起の上部呼吸器感染疾患を抑制する方法を提供する。この方法は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）またはその等価物の有効量を薬剤と接触させる段階を備える。
【００６１】
ＳＡＲＳの病原因子はウイルスであることが見出されている。Rota et al (2003), Characterization of a novel Coronavirus Associated with Severe Acute Respiratory Syndrome. Science 1085952 www.sciencexpress.org及びMarra, et al. (2003), The Genome Sequence of the SARS-Associated Coronavirus. Science 1085853 www. sciencexpress.org.を参照。
【００６２】
本発明は、また、重症急性呼吸器症候群ウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルスに感染した細胞、ウイルス誘起の上部呼吸器感染疾患または上部呼吸器感染疾患を誘起させることが可能なウイルスに感染した細胞を抑制する方法を提供する。この方法は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の有効量を上記ウイルスまたは細胞に接触させる段階を備える。この接触は直接的であっても、間接的であってもよい。
【００６３】
本発明は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）を有効量備えるとともに適切な担体を備える組成物を提供する。前記組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は、重症急性呼吸器症候群ウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルスに感染した細胞、ウイルス誘起の上部呼吸器感染疾患、あるいは上部呼吸器感染疾患を誘起させることが可能なウイルスに感染した細胞を、抑制することが可能である。
【００６４】
本発明は、組換え高効率複合インターフェロンを有効量備えるとともに適切な担体を備える組成物を提供し、前記組換え高効率複合インターフェロンは、患者の重症急性呼吸器症候群あるいは患者のウイルス誘起の上部呼吸器感染疾患を予防もしくは治療することが可能である。
【００６５】
本発明は組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）を有効量備えるとともに薬学的に許容可能な担体を備える医薬組成物を提供し、前記組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は、重症急性呼吸器症候群ウイルス、重症急性呼吸器症候群ウイルスに感染した細胞、ウイルス誘起の上部呼吸器感染疾患を抑制することが可能である。
【００６６】
本発明は組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）を有効量備えるとともに薬学的に許容可能な担体を備える医薬組成物を提供し、前記組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は、患者の重症急性呼吸器症候群、あるいは患者のウイルス誘起の上部呼吸器感染疾患を予防もしくは治療することが可能である。
【００６７】
本発明は装置を提供し、前記装置は上記医薬組成物を送達する。
【００６８】
好ましい実施形態としては、患者は人間である。容易に認められることだが、組換え高効率複合インターフェロンは他の動物もしくは哺乳類においても用いることが可能である。
【００６９】
本発明は人間の重症急性呼吸器症候群、ウイルス誘起の上部呼吸器感染疾患を予防する方法を提供し、前記方法は、スプレーで1日3回、組換え高効率複合インターフェロンを使用する段階を備える。前記スプレーは、２０マイクログラムのインターフェロンを含み、該インターフェロンは３ミリメートルあたり１０００万活性単位と同等である。
【００７０】
（ウイルス性上部呼吸器感染疾患(VURI)）
ウイルス性上部呼吸器感染疾患は、別の病名として、感冒、風邪と呼ばれる。これは上気道の伝染性のウイルス感染症であり、この伝染性の感染症は粘膜の炎症、くしゃみ、そして咽頭炎をもたらすといった特徴を有している。通常、この感染症は、２００以上の異なるウイルスによって引き起こされる。これらの２００以上の異なるウイルスは、ライノウイルスであることが知られている。風邪は、インフルエンザを引き起こすウイルスと同一のウイルスによって、引き起こされるのではない。風邪を患う人の咳の飛沫あるいはくしゃみの飛沫、もしくは風邪を患う人によって汚染された物に接触することで、風邪は広まる。風邪をひくのは、子供が最も多く、年齢を経るに従って、減少する。これは、風邪を引き起こすウイルスに対する免疫が、病気になった後、獲得されるからである。成人になると、次第に、風邪を引き起こす幅広いウイルスに対する免疫が発達していく。子供は1年に１０回風邪をひくが、大人は1年に３回風邪をひく。
【００７１】
もし、患者がウイルス性上気道感染（ＵＲＩ）を患っている場合、治療範囲は幅広く存在する。これらの感染の多くは自然寛解するので、臨床医は休養と水分補給を勧めることが一般的である。一方、他の治療法としては、環境治療（environmental therapy）、栄養治療、鬱血除去薬や抗ヒスタミン剤の一般用もしくは処方医薬品、抗ヒスタミンや抗コリンの新しい経鼻製剤、抗生剤を含む。
http://www.physsportsmed.com/issues/1998/02feb/swain.htm (2005)を参照。
【００７２】
（上部呼吸器感染疾患（ＵＲＩ）の予防及び治療）
約７０〜８０％のＵＲＩはＲＳウイルス（respiratory Syncytial virus）、アデノウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス（cox-sackie virus）、コロナウイルスやその変異体、Ａ型インフルエンザウイルスやその変異体、Ｂ型インフルエンザウイルスやその変異体、パラインフルエンザウイルスやその変異体、あるいはエンテロウイルスやその変異体などのウイルスによって引き起こされる。大人の発症するＵＲＩの主なる原因は、ライノウイルスによるものである。子供の発症するＵＲＩの主要な２つの原因は、ＲＳウイルスとパラインフルエンザウイルスによるものである。
【００７３】
組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は、ＵＲＩを引き起こすウイルスと戦う際に重要な役割を果たしている。高効率複合インターフェロンは、主に２つのメカニズムで抗ウイルス作用を得る。：
感受性細胞表面に付着させ、抗ウイルスタンパクの産出を誘導し、細胞内でウイルスの複製及び増殖を遮断する。
組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は免疫応答を調整する。この応答には、Ｔ細胞の免疫応答、NK細胞の活性、モノカリオンの食作用、さらに生体内での抗体産出が含まれる。
【００７４】
ＵＲＩの治療として、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は、スプレーまたは呼吸機を通して直接的に患部に使用される。この治療方法を用いることで、インターフェロンを標的細胞に直接到達させることができる。結果、経口あるいは注射よりも、スプレーとして供給品を市販する方が、インターフェロン投与には安全であり、効果的である。
【００７５】
（ＳＡＲＳの予防及び治療）
四川省（中華人民共和国における省）におけるＳＡＲＳの予防及び制御に取り組む作業グループの同意を得て、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の配付が２００３年５月に始まった。組換え高効率複合インターフェロンのスプレーは、ＳＡＲＳに感染する危険性が高い人口集中地域における病院の医者や看護士に割り当てられた。また、前記スプレーは、ＳＡＲＳの予防及び制御に取り組む国立研究グループに割り当てられた。２００３年１２月１９日現在、３０００人のスプレー使用者の中で、スプレー使用に関連した副作用の報告はなかった。さらに、この組換え高効率複合インターフェロンのスプレーを使用した医者や看護士、四川省の人、あるいは他の組織の人は、誰もＳＡＲＳには感染しなかった。
【００７６】
従って、本発明は、ウイルス複製あるいはウイルスに感染した細胞を抑制、予防または治療する方法を提供し、該方法は、前記ウイルスもしくはウイルスに感染した細胞に対し、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）またはその等価物を有効量接触させる方法である。
【００７７】
＜腫瘍の予防及び治療＞
この組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は次に示す癌もしくは腫瘍の抑制、予防、または治療に対し有用である。
2008532995.tif 000003
【００７８】
従って、本発明は、腫瘍あるいは癌細胞の成長を抑制する方法を提供する。該方法は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）あるいはその等価物を前記腫瘍もしくは癌細胞に接触させる方法である。
【００７９】
＜処方及び投与ルート＞
本発明はまた、上記過程を用いることで、組換え高効率複合インターフェロンの生成を提供する。
【００８０】
本発明は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）またはその等価物、及び適切な担体からなる組成物を提供する。
【００８１】
本発明は組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）またはその等価物、及び薬学的に許容可能な担体からなる医薬組成物を提供する。
【００８２】
本発明は上記方法を提供し、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は経口、静脈注射、筋肉注射、腹腔注射、皮下注射、鼻腔もしくは粘膜への投与、またはスプレーもしくは呼吸機で吸引することにより投与されることを特徴とする。
【００８３】
本発明は上記方法を提供し、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は、以下の注射の手順によって投与されることを特徴とする。この手順とは、９μg、１５μg、または２４μgを二日おきに、1週間で３回、24週間注射を行なう手順である。
【００８４】
組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の空間配置は変化するが、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）は、Ｂ型肝炎のＤＮＡ複製を抑制する製剤であるだけでなく、２．２．１５細胞におけるＨＢｓ抗原やＨＢｅ抗原の分泌を抑制する製剤である。このことは驚くべき発見である。
【００８５】
本発明の目的は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の製剤の提供により、直接的にＢ型肝炎ウイルスのＤＮＡ複製及び、Ｂ型肝炎におけるＨＢｅ抗原やＨＢｓ抗原の分泌を抑制することである。そして本発明の目的は、該製剤の提供により、これらを正常な量にまで減少させることである。
【００８６】
＜処方＞
以下に示すのは、いくつかのｒＳＩＦＮ−ｃｏの製剤である。錠剤、カプセル、経口摂取用の液体、ペースト剤、注射、スプレー、座薬、そして液剤があげられる。薬を皮下注射、あるいは静脈注射することが一般的である。この薬担体は、いかなる許容可能な薬担体であってもよい。例えば、炭水化物、セルロース、接着剤、崩壊剤、皮膚軟化剤、充填剤、付加溶解剤保存料、増粘剤、整合剤などがあげられる。
【００８７】
本発明はまた上記組成物と薬学的に許容可能な担体からなる医薬組成物を提供する。
【００８８】
本発明の趣旨として、「薬学的に許容可能な担体」とは、あらゆる一般的な医薬担体を意味する。例として示す適切な担体は、従来技術においてよく知られているが、あらゆる一般的な医薬担体が含まれる。例えば、一般的な医薬担体として、リン酸緩衝食塩水溶液やさまざまな湿潤剤などがあげられるが、これらに限定されるものではない。他の担体としては、錠剤、顆粒、カプセルなどで用いられる添加剤を含む。一般的に、これら担体は、賦形剤を含む。賦形剤としては、澱粉、牛乳、砂糖、特定の種類のクレー、ゼラチン、ステアリン酸、あるいはこれらの塩、マグネシウム、ステアリン酸、タルク、植物性脂肪あるいは植物油、樹脂、グリコール、他の既知の賦形剤が含まれる。これら担体はまた、香料、着色料あるいは他の成分が含まれる。これら担体からなる組成物は既知の従来の方法で処方される。
【００８９】
＜ｒＳＩＦＮ−ｃｏの半減期の増加＞
（ペグ化）
ペグ化は、ポリエチレングリコールの分子鎖が、タンパク薬物とペプチド薬に結合することにより薬物動態を向上させる過程である。この向上は、前記タンパク薬物やペプチド薬をタンパク分解酵素から遮断することにより達成される。Harris and Chess, Effect of pegylation on pharmaceuticals. Nat Rev Drug Discov. 2003 Mar; 2 (3):214-21を参照のこと。
【００９０】
ペグ化は、タンパク製剤とリポソーム製剤の循環半減期（circulating half-life）を、ポリエチレングリコールの大量の流体力学的容積を基に、増大させる安定した方法である。このポリエチレングリコールは、タンパク薬物とペプチド薬の腎クリアランス、酵素分解、及び免疫システムの認知を遮断する。従って、半減期は増大し、これら半減期は患者にとって、好ましいものとなる。Molineux, Pegylation: engineering improved pharmaceuticals for enhanced therapy. Cancer Treat Rev. 2002 Apr; 28 Suppl A: 13-6.を参照。著者は、ペグ化により癌患者はクオリティ・オブ・ライフ（Quolity of life）に有益な効果をもたらすと結論付けている。
【００９１】
インターフェロンのペグ化は、インターフェロンが体内に残留する時間を増大させる。この増大は、インターフェロン分子のサイズを大きくすることで達成され、分子サイズの増大は、インターフェロンの吸収率、半減期を長くし、インターフェロンのクリアランス率を長くすることで達成される。この結果、ペグ化インターフェロンを用いると、生物活性の存続期間は増加し、この存続期間は、非ペグ化インターフェロンを用いた生物活性の存続期間よりも増加する。よって、ペグ化インターフェロンは、より少ない頻度で投与されているにもかかわらず、非ペグ化インターフェロン以上の効果を提供し、非ペグ化インターフェロンと同程度の耐性をもたらす。著者は、ペグ化インターフェロンによる単剤治療を行なうと、いくらかの患者に対しては、良好な反応をもたらし、そしてその反応は、非ペグ化インターフェロンを処方する時の反応よりも良好であると述べている。Baker, Pegylated Interferons. Rev Gastroenterol Disord. 2001; 1 (2): 87-99を参照。
【００９２】
（持続放出または制御放出）
持続放出の送達マトリクス及び持続放出の送達リポソームは、ｒＳＩＦＮ−ｃｏとともに用いられ、持続放出製剤及び制御放出製剤を生成する。Robinson and Talmadge, Sustained Release of Growth Factors. In Vivo 2002 Nov-Dec; 16(6):535-40を参照。著者らは、ペグ化と持続放出の送達マトリクス及び持続放出の送達リポソームの両方が、組み換え分子の薬物速度論的特性と薬理学的特性を改善すると述べている。このようにしてこれらの臨床上の有用性を向上させることで、上記研究が患者の薬剤服用順守を増大させると述べている。
【００９３】
本発明は、組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）を提供する。該組換え高効率複合インターフェロンは、薬剤を含有するまたは薬剤によりカプセル化されており、該インターフェロンの半減期または送達に影響を及ぼす能力をもつ。一実施形態では、この薬剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００９４】
本発明は、さらに、患者に対するウイルス性疾患または腫瘍を予防または治療する方法を提供する。前記方法は、該患者に組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）またはその等価物の有効量を投与する段階を備える。前記インターフェロンまたはその等価物は、薬剤を含有するまたは薬剤によりカプセル化されており、前記インターフェロンの半減期または送達に影響を及ぼす能力をもつ。一実施形態では、この薬剤はポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
【００９５】
本発明は、下記に示す実施例によって、よりよく理解されることとなる。しかしながら、以下に論じるような特定の方法や結果は、この後続く請求の範囲において十分に記載されている本発明の単なる実例にすぎないということが、当業者にはすぐに理解できる。
【実施例】
【００９６】
（実施例の詳細）
ＩＦＮ−ｃｏｎは、新しいインターフェロン分子であって、遺伝子工学法を用いて、ヒトＩＦＮ−αのサブタイプの保存アミノ酸に準じて構築された。ＩＦＮ−ｃｏｎは、広域スペクトラムＩＦＮ活性を持つとして立証されている。前記ＩＦＮ活性とは、特にＣ型肝炎の治療に効果的である高い抗ウイルス性、腫瘍抑制活性などを示す。
【００９７】
大腸菌のコドンは、ｒＳＩＦＮ−ｃｏのｃＤＮＡの再設計に用いられた。そして、公表されているInfergen（登録商標）(インターフェロンアルファコンー１)のＤＮＡ配列と推定アミノ酸配列（図１）から、人工的にｒＳＩＦＮ−ｃｏのｃＤＮＡを合成した。
純粋なｒＳＩＦＮ−ｃｏのタンパク質を得るために、ｒＳＩＦＮ−ｃｏのｃＤＮＡを、大腸菌の高発現ベクターにクローニングした。そして、ベクターの強力なＰＢＡＤプロモーターを活性化できるＬ−アラビノースを用いて、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ遺伝子の高発現を誘発した。
【００９８】
［実施例１］
（エボラウイルスによる組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の効果）
背景：エボラウイルスは、恐ろしい症状を引き起こす致死性のウイルスとして有名であり、最も顕著な症状は、高熱と大量の内出血である。エボラウイルスは、感染者の９０％をも死に至らしめる。エボラウイルスは、出血（血液）熱を引き起こす能力を有するウイルスの一つである。この病気には具体的な治療法はない。現在、患者は支持療法を受けている。この療法は、患者の体液と電解質の平衡を保ち、酸素濃度と血圧を維持し、合併症を起こさないように治療する方法からなる。患者は症状の発現から１０日以内に死に至る。
【００９９】
材料
１．１  薬剤：四川バイオテクノロジーリサーチセンター（Sichuan Biotechnology Research Center）提供のｒＳＩＦＮ−ｃｏ
１．２  ウイルス：軍事医学科学院微生物流行病研究所（Military Medical Science，Institute of Microbiology Epidemiology）提供のエボラウイルス
１．３  実験の安全性レベル：ウイルス実験は、生物安全レベル３実験室で実施された。
１．４  動物：６０匹のＢＡＬＢ／Ｃマウス
【０１００】
方法
２．１  ６０匹のマウスは、無作為に６群に分類され、各群は、１０匹のマウスからなる。群１には、エボラウイルスの接種当日に、ｒＳＩＦＮ−ｃｏを１μｇ与えた。群２には、エボラウイルスの接種から１日後に、ｒＳＩＦＮ−ｃｏを１μｇ与えた。群に３は、エボラウイルスの接種から２日後に、ｒＳＩＦＮ−ｃｏを１μｇ与えた。群に４は、エボラウイルスの接種から３日後に、ｒＳＩＦＮ−ｃｏを１μｇ与えた。群５には、エボラウイルスの接種から４日後に、ｒＳＩＦＮ−ｃｏを１μｇ与えた。群６には、ｒＳＩＦＮ−ｃｏを与えず、これを対照群とした。
２．２  薬剤の投与：１μｇのｒＳＩＦＮ−ｃｏを、６日間連続して、１日に１回投与した。
【０１０１】
結果
群６（対照群）の１０匹のマウス全てが死亡した。群１、群２、群３の全てのマウスが、毒作用は観察されずに生存した。群４、群５においては、いくらかの毒作用が見られた。
結論
これらの結果から、エボラウイルスに対するｒＳＩＦＮ−ｃｏの有効性が明確に示された。
【０１０２】
［実施例２］
（組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の抗ＨＩＶ効果）
材料
１．１  野生型ＨＩＶ
１．２  薬剤耐性ＨＩＶ
１．３  ２９３−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞
１．４  ＤＭＥＭ培地  Ｇｉｂｃｏ製
１．５  ウシ胎仔血清  Ｇｉｂｃｏ製
１．６  四川バイオテクノロジーリサーチセンター（Sichuan Biotechnology Research Center）提供のｒＳＩＦＮ−ｃｏ
１．７  ９６ウェルプレート、ＮＵＮＣ製
１．８  二酸化炭素インキュベーター
１．９  層流フード
１．１０  蛍光光度計
１．１１  ＵＶ吸光光度計
１．１２  その他
【０１０３】
２．方法
２．１  指数増殖期（Ｌｏｇ）の２９３−ＣＤ４−ＣＣＲ５細胞を得て、０．２５％のパンクレアチンで消化し、トリパンブルー染色液で染色することにより細胞数を決定し、ＤＭＥＭ培地で、１ミリリットル当たり２．０×１０５個の細胞濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）まで希釈した。
２．２  ９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに、１００μｌ（マイクロリットル）の２９３−ＣＤ４−ＣＣＲ５ＤＭＥＭ培地の懸濁液を注入した。該プレートを５％二酸化炭素インキュベーターで３７℃下に放置した。次の日、ウェルの基底面積の７０％が再生していることが観察された。
２．３  浮遊物を取り除いた後、様々な濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏを、１００μｌ（マイクロリットル）ずつそれぞれのウェルに注いだ。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）用と培養基用として、対照群を２群用いた。
２．４  前記プレートを二酸化炭素インキュベーターで３７℃下に、約１８〜２０時間放置した。
２．５  試験ウェル：異なる濃度の野生型ＨＩＶと薬剤耐性ＨＩＶウイルスをそれぞれのウェルに１００μｌ（マイクロリットル）ずつ注入した。
対照ウェル：ウイルスは添加せず、それぞれのウェルに１００μｌ（マイクロリットル）ずつＤＭＥＭ培地のみを注いだ。
２．６  前記プレートを二酸化炭素インキュベーターで３７℃下に、約２４時間放置した。
２．７  ルシフェラーゼルーチン分析が行われ、浮遊物のタンパク質濃度が測定された。ルシフェラーゼはＲＬＵ／ｍｇ単位により測定された。
【０１０４】
結果
ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、１ミリリットル当たり４ナノグラム（ng/ml）以上の量でＨＩＶを抑制できる。表４と図１４−１５を参照。エクセル（Ｅｘｃｅｌ）を用いて、ルシフェラーゼをＹ軸、ｒＳＩＦＮ−ｃｏ濃度をX軸として用いた場合、１ミリリットル当たり４ナノグラム（ng/ml）以上の量である時、ルシフェラーゼ活性がＰＢＳと培地の対照群よりも明らかに低いことが明確に示されている。明らかな用量依存性の逆応答が示されている。
［表４]
2008532995.tif 000004
【０１０５】
４．結論：ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、野生型ＨＩＶ、薬剤耐性ＨＩＶの両方に対して効果的である。
【０１０６】
［実施例３］
（組換え高効率複合インターフェロン（ｒＳＩＦＮ−ｃｏ）の抗インフルエンザ効果）
材料
１．１  １０日齢のニワトリ胚膜細胞
１．２  四川バイオテクノロジーリサーチセンター（Sichuan Biotechnology Research Center）提供のＳＩＦＮ−ｃｏ
１．３  軍事医学科学院微生物流行病研究所 分子生物学部門（Molecular Biology Department of Institute of microbiology and epidemiology，Academy of Military Medical Science）提供のインフルエンザウイルス
１．４  ＤＭＥＭ培地  Ｇｉｂｃｏ製
１．５  新生ウシ胎仔血清
１．６  ９６ウェルプレート、ＮＵＮＣ製
１．７  二酸化炭素インキュベーター
１．８  層流フード
１．９  倒立顕微鏡
１．１０  その他
【０１０７】
２．方法
２．１  指数増殖期（Ｌｏｇ）中の１０日齢のニワトリ胚膜細胞を得て、０．２５％のパンクレアチンで消化し、トリパンブルー染色液で染色することにより細胞数を決定し、ＤＭＥＭ培地で、1ミリリットル当たり２．０×１０５個の細胞濃度（ｃｅｌｌ／ｍｌ）まで希釈した。
２．２  ９６ウェルプレートのそれぞれのウェルに、１００μｌ（マイクロリットル）の２９３−ＣＤ４−ＣＣＲ５ＤＭＥＭ培地の懸濁液を注入した。該プレートを二酸化炭素インキュベーターで３７℃下に放置した。次の日、細胞は単層細胞まで成長した。
２．３  浮遊物を取り除いた後、様々な濃度のｒＳＩＦＮ−ｃｏを１００μｌ（マイクロリットル）ずつ、それぞれのウェルに注いだ。ｒＳＩＦＮを添加しない対照群を２群用いた。
２．４  前記プレートを二酸化炭素インキュベーターで３７℃下に、約１８〜２０時間放置した。
２．５  試験ウェル：異なる濃度のインフルエンザウイルスをそれぞれのウェルに１００μｌ（マイクロリットル）ずつ注入した。
対照ウェル：インフルエンザウイルスは添加せず、それぞれのウェルに１００μｌ（マイクロリットル）ずつＤＭＥＭ培地のみを注いだ。
２．６  前記プレートを二酸化炭素インキュベーターで３７℃下に、約２４時間放置した。
２．７  倒立顕微鏡により細胞を観察した。
【０１０８】
３．結果
３．１  倒立顕微鏡によると、インフルエンザウイルスを添加してインターフェロンを加えていない対照ウェルにおける細胞は、明らかな細胞変性効果（ＣＰＥ）を有していた。前記ＣＰＥは、細胞の円形化、細胞壊死、反射光の減少及び細胞の剥離などを示す。
３．２  試験ウェルにおける細胞は、１ミリリットル当たり１０ナノグラム以上の濃度であるｒＳＩＦＮ−ｃｏを含んでおり、ＣＰＥを有しておらず、正常細胞に匹敵する形態であった。図１６を参照。
３．３  インフルエンザウイルスとインターフェロンが入っていない対照ウェルは、全くＣＰＥを有していなかった。
【０１０９】
４．結論
ｒＳＩＦＮ−ｃｏは、１ミリリットルあたり１０ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）以上の濃度でインフルエンザウイルスに対して効果的である。
【０１１０】
［実施例４］
（肺癌患者の臨床的観察）
患者には、２００５年１０月７日に非小細胞肺癌が認められた。化学療法による治療を１ヶ月行ったが、２００５年１０月２２日と２００５年１０月２５日の造影検査では、改善は見られなかった。２００６年１月４日の検査においても向上は見られなかった。患者は高効率複合インターフェロンにより１ヶ月治療した。投与計画は次のとおりである。患者は１日おきに注射を受けた。１回目は９マイクログラムの用量が与えられた。その後の注射の用量は全て２倍の１８マイクログラムとした。２００６年２月２３日の検査では急速な改善が示された。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】大腸菌のコドン使用頻度と推定ｒＳＩＦＮ−ｃｏアミノ酸配列により設計されたｒＳＩＦＮ‐ｃｏ  ｃＤＮＡの配列。
【図２−Ａ】他の高効率複合インターフェロンの配列。
【図２−Ｂ】他の高効率複合インターフェロンの配列。
【図３】ｒＳＩＦＮ‐ｃｏによる野生型ＨＩＶの抑制のグラフで、エクセルを使用し、Ｙ軸をルシフェラーゼ、Ｘ軸をｒＳＩＦＮ‐ｃｏ濃度とする。明らかな容量依存性の逆応答を示している。
【図４】ｒＳＩＦＮ‐ｃｏによる薬剤耐性ＨＩＶの抑制のグラフで、エクセルを使用し、Ｙ軸をルシフェラーゼ、Ｘ軸をｒＳＩＦＮ‐ｃｏ濃度とする。明らかな容量依存性の逆応答を示している。
【図５】ｒＳＩＦＮ‐ｃｏのインフルエンザウイルス抑制。左は、インフルエンザウイルスがあり、インターフェロンが添加されていない対照ウェルである。細胞は、細胞円形化、細胞壊死、反射光の減少、細胞の剥離等の明らかな細胞変性作用を示す。右は、インフルエンザウイルスとｒＳＩＦＮ‐ｃｏを含む試験ウェルで、ｒＳＩＦＮ‐ｃｏ濃度が１ミリリットルあたり１０ナノグラム（ng/ml）の濃度であり、正常細胞に匹敵する形態であった。
【図１】
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【図２−Ａ】
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【図２−Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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