(57)【要約】細胞内の膜電位をモニターまたは調節するためのナノ構造の使用を開示する。リン脂質の被覆を有するナノ粒子が、膜への局在または誘引を促進しない他の被覆を有するナノ粒子に比べて、優れた応答を示すことが見出された。2008532522.tif 000003
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、膜電位差の変化を測定する方法：
細胞、細胞画分、または人工膜構造である少なくとも1つのターゲットを準備する工程；
該ターゲットを少なくとも1種類のナノ構造と接触させて、処理されたターゲットを形成する工程；
該処理されたターゲットを刺激する工程；
該ナノ構造からの発光を測定する工程；および
該発光を膜電位差の変化と相関させる工程。
【請求項２】
前記接触させる工程が、前記ナノ構造を前記ターゲットに導入することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記接触させる工程が、前記ナノ構造を前記ターゲットの細胞膜の中に導入することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項４】
前記接触させる工程が、前記ナノ構造を前記ターゲットの細胞膜の上または近傍に導入することを含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
前記接触させる工程の後で、しかし前記刺激する工程の前に、前記ナノ構造からの発光を測定することを更に含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記刺激する工程が、電気刺激、磁気刺激、化学的刺激、生物学的刺激、イオンチャンネルを活性化することができると思われる薬剤と前記ターゲットの接触、イオンチャンネルを阻害することができると思われる薬剤と前記ターゲットの接触、またはこれらの組み合わせを含む、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記電気刺激が、パッチクランプ法の使用または外部電場の印加を含む、請求項6記載の方法。
【請求項８】
前記化学的刺激が、前記ターゲットとカリウム塩またはナトリウム塩との接触を含む、請求項6記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的刺激が、前記ターゲットと光感受性イオンチャンネルとの接触を含む、請求項6記載の方法。
【請求項１０】
前記刺激する工程が、前記ターゲットを第1の膜電位の電圧値で保持し、第2の膜電位の電圧値で前記ターゲットを脱分極または過分極させ、前記ターゲットを第1の膜電位の電圧値に戻すことを含む、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記第2の膜電位の電圧値が、前記第1の膜電位の電圧値よりも正側の値である、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
前記第2の膜電位の電圧値が正で、かつ前記第1の膜電位の電圧値が負である、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
前記第1の膜電位の電圧値および前記第2の膜電位の電圧値のいずれか一方が約0mVである、請求項10記載の方法。
【請求項１４】
前記第1の膜電位の電圧値が約-70mVで、かつ前記第2の膜電位の電圧値が約+40mVである、請求項10記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞が、真核細胞、原核細胞、細菌細胞、グラム陽性菌細胞、グラム陰性菌細胞、真菌細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、卵母細胞、ハエ細胞、ゼブラフィッシュ細胞、線虫細胞、魚類細胞、両生類細胞、または哺乳類細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１６】
前記細胞が真核細胞である、請求項1記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞画分が、核、リボソーム、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、液胞、シナプス小胞、またはリソソームである、請求項1記載の方法。
【請求項１８】
前記人工膜構造が、リン脂質のミセルである、請求項1記載の方法。
【請求項１９】
前記ナノ構造が、ナノ結晶、薄膜、ナノワイヤー、パターン状物質、またはメッシュである、請求項1記載の方法。
【請求項２０】
前記ナノ構造が、半導体ナノ結晶である、請求項1記載の方法。
【請求項２１】
前記ナノ構造が、半導体コアシェル型ナノ結晶である、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
以下の工程を含む、膜電位差の変化を測定する方法：
少なくとも1個の細胞を準備する工程；
該細胞を少なくとも1個の半導体ナノ結晶と接触させて、処理された細胞を形成する工程；
該処理された細胞を光で刺激する工程；
該ナノ結晶からの発光を測定する工程；および
該発光を膜電位差の変化とを相関させる工程。
【請求項２３】
以下の工程を含む、ターゲットの膜電位差を光学的に制御する方法：
細胞または細胞画分である少なくとも1つのターゲットを準備する工程；
少なくとも1つのナノ構造を、細胞膜または細胞内膜との相互作用または膜への挿入に適した条件下で、該ターゲットを該ナノ構造と接触させて、処理されたターゲットを調製する工程；
該処理されたターゲットにエネルギーを送達する工程；および
該ターゲットの応答を検出する工程。
【請求項２４】
相互作用または挿入に適した前記条件が、エンドサイトーシスによる能動的取り込み、エレクトロポレーション、リポソームによる送達、プルロニックブロックコポリマーによる送達、細胞透過性ペプチドによる取り込み、タンパク質による取り込み、マイクロインジェクション、トランスフェクション、ウィルスによる送達、オプトポレーション、孔形成物質、膜インターカレーター、またはそれらの組み合わせを含む、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
前記エネルギーを送達する工程が、前記ナノ構造による吸収に適した波長または波長域の照射を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
前記エネルギーを送達する工程が、レーザー照射、水銀ランプによる照射、キセノンランプによる照射、ハロゲンランプによる照射、またはLEDによる照射を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
前記検出する工程が、カメラ、デジタルカメラ、ビデオカメラ、CCDカメラ、蛍光顕微鏡に取り付けたデジタルカメラ、光電子増倍管、蛍光光度計、ルミノメーター、顕微鏡の使用、または目視を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
前記検出する工程が、二次的な検出機構の使用を含む、請求項23記載の方法。
【請求項２９】
前記検出する工程が、単一の時点での検出、複数の時点での検出、または連続検出を含む、請求項23記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜電位差のモニターおよび操作に有用な組成物ならびに方法に関する。具体的には、ナノ粒子、および細胞膜電位差のモニターならびに操作へのそれらの使用を開示する。
【０００２】
本出願は、2005年3月8日に出願した米国仮特許出願第60/659,975号の優先権を主張するものである。
【背景技術】
【０００３】
全ての細胞は、二分子バリアーとして機能し、細胞含有物と細胞外環境とを隔てるためのリン脂質膜を有する。原形質膜の目的は、細胞内シグナル伝達に応じて、膜を通した物質の通過を制限しまたは可能にして、2つの区画間の必要な組成の相違を維持することにある。
【０００４】
個々の細胞は、通常不透過性であるリン脂質二分子膜を横断する方向に、いわゆる「電荷分離」に起因する静止膜電位を有する。細胞外および細胞内区画における、正および負に荷電したイオンの分布が不均等であるため、全ての生細胞は、-5mV〜-100mVの負の静止膜電位を有する。原形質膜のイオン透過性は、専らイオンの受動輸送を司る膜貫通タンパク質であるイオンチャンネルの存在によって決まる。膜電位は、活性化刺激への応答によって特定のイオンに対する透過性を変化させ、それにより電気化学的勾配に沿ってイオン流束を生じさせることにより変化させることができる。イオンチャンネルを介して膜を横断するイオンの輸送は、膜の両側のイオン濃度に対して存在する平衡を乱し、それにより、膜電位の変化をもたらす。
【０００５】
細胞は、膜電位の変化を通じて互いに信号を伝達授受している。したがって、細胞膜電位およびその変化をモニターすることにより、細胞の生死および機能をモニターすることが可能になる。
【０００６】
イオンチャンネルは、興奮性および非興奮性の両者の細胞に存在する膜貫通タンパク質である。イオンチャンネルは、電気化学的勾配に沿って、通常イオン透過性を有しない脂質二分子膜を横断するイオンの移動および伝達を許容および制御する。それらは、神経シグナルの伝達、心拍、脳の機能、感覚変換、および筋収縮等の重要な過程を制御する活動電位を生じる電気信号を生成する。静止膜電位を定め、細胞の興奮状態を制御することに加え、これらの膜貫通タンパク質は、細胞増殖、ホルモンの分泌、ならびに水分および電解質の恒常性に関与して、細胞の生理状態に作用する重要な役割を果たしている。
【０００７】
あらゆる機構によるイオンチャンネルの活性化は、細胞内/細胞外イオンの再分配(濃度の変化)およびそれによる細胞膜電位の変化をもたらす。したがって、膜電位の変化を記録することにより、イオンチャンネルの活性を直接モニターすることが可能になる。
【０００８】
典型的な生体は数百〜数千種類のイオンチャンネルを有しているのに対し、個々の細胞は10〜20種類のイオンチャンネルを有している。個々のイオンチャンネルは、1種類または数種類のイオン種に対し高い選択性を示す。
【０００９】
種々のイオンチャンネルのファミリーは、活性化刺激、種々のイオンに対する選択性、不活性化機構および薬理学的特性に基づいて分類される。イオンチャンネルには、電位差により活性化されるものとリガンドにより活性化されるものがある。電位差依存型ナトリウム、カリウム、カルシウムおよび塩化物イオンチャンネルの上科(スーパーファミリー)は、電気生理学的、薬理学的、および分子化学的手法を用いて定義されてきた。それらは、電位依存性の速度論的挙動または分子の同一性に関連した特定の陽イオンに対する選択的透過性によって命名される。リガンド依存型チャンネルの上科は、構造上の関連性がはるかに低く、サイクリックヌクレオチド依存型チャンネル、またはGABAチャンネルのように、活性化リガンドにちなんだ命名がなされている。
【００１０】
機能的には、イオンチャンネルの開閉は、イオンチャンネルの内部構造のコンホメーションを変化させ、空孔を開かせて細胞の内部または外部へイオン流束を生じさせる、シグナル伝達分子の結合(リガンド依存型チャンネルの場合)によって、膜電位の変化によって(電位差依存型)、または機械的刺激(機械受容型チャンネルの場合)によって制御または「開閉」することができる。
【００１１】
例えば、電位差依存型ナトリウムチャンネルは、静止電位が-60mVになると閉じ、膜が脱分極(膜電位がより正値にシフトすること)すると開く。
【００１２】
電位差依存型のナトリウム、カルシウム、およびカリウムチャンネルの構造は、共通の機能要素を有する。全てのイオンチャンネルは、活性化刺激に応答して開き、イオンが細胞に出入りできるようにする共通のイオン選択的な親水性の空孔の周囲に配置された、いくつかの相同な繰り返し単位を有する膜貫通タンパク質である。個々の繰り返し単位は、電位センサーの特別な役割を果たすS4ドメインを含む6つの膜貫通ドメイン(S1〜S6)からなる。チャンネルの開閉(「ゲーティング」)は、電場の変化に応答する荷電アミノ酸を含むタンパク質中に存在し、この電位差感受性を有するドメインによって制御される。電位差感受性ドメインの位置の変化により、チャンネル構造中のコンホメーション変化が起こり、導通(開いた/活性化された)または非導通(閉じた/不活性化された)状態が生じる。
【００１３】
リガンド依存型チャンネルは、それぞれの間で大きく異なっているが、2つの構造要素、すなわち、リガンド結合ドメインおよび空孔ドメインは、全てのチャンネルに存在する。特定のリガンドとの結合によってコンホメーション変化が誘起され、空孔ドメインが開いて、細胞の内部/外部へのイオン流束が生じ、それは膜電位差の変化に反映される。
【００１４】
イオンチャンネルの活性化における種々の状態は、より有効な薬剤の導入、例えば、非導通状態の(不活性化された)チャンネルにのみ結合する状態依存性の分子の開発等に対する比類のない機会をもたらす。望まれる目標は、薬剤が、電気的に異常な活性を示す組織のみをターゲットとし、活性な組織中の正常なチャンネルには何ら影響しないようにすることである。また、多くのバイオテクノロジー企業および学術研究機関の研究者により、新たなイオンチャンネルの同定、それらの活性の検討、および薬剤のターゲットとしての評価について近年多くの努力がなされている。
【００１５】
薬剤の探索におけるイオンチャンネル
イオンチャンネルは、医薬品産業において、2つの分野で特に重要である：薬剤のターゲットとしてのイオンチャンネル、およびイオンチャンネルの安全性に関する薬理学。イオンチャンネルは、薬剤探索過程における重要なターゲットであり、年間数十億ドルの売り上げをもたらす。イオンチャンネルの機能不全またはイオンチャンネルの発現の異常は、多くの医療分野(不整脈、高血圧、てんかん、疼痛等)とも関連している。これらの疾患に対するイオンチャンネル制御剤は、まだ開発の途上である。多くの医薬品企業で、活性イオンチャンネル剤の開発に関するプロジェクトや研究プログラムが行われている。更に、イオンチャンネル剤の開発に特化しているバイオテクノロジー企業または生物薬剤企業も多く存在する(ChanTest社、米国オハイオ州クリーブランド；BioFocus社、英国ケンブリッジ；Icagen社、米国ノースカロライナ州ダラム等)。
【００１６】
イオンチャンネルは、多くの生体機能に関与しており、生化学的制御、発現レベル、または構造変異に起因するイオンチャンネルの機能不全は、生体の健康状態に必ず影響を与える。ヒトにおいて、遺伝的または誘発的なイオンチャンネルの機能の変化は、健康状態に深刻な合併症をもたらす場合がある。いくつかの病的状態は、イオンチャンネルの機能不全に関連している。イオンチャンネルの異常は、嚢胞性線維症、種々の偏頭痛から、尿細管異常、および一過性運動失調に至る、臨床上様々な異常を引き起こす。
【００１７】
特に、イオンチャンネルは、不整脈、家族性周期性四肢マヒ、嚢胞性線維症、てんかん、糖尿病、喘息、狭心症、悪性高体温症、疼痛、高血圧、てんかん等に関与している。イオンチャンネルは、薬剤の探索における重要な分子ターゲットとしての役割を果たしている。医薬品およびバイオテクノロジー企業は、新規かつより有効な医薬品を創出するための努力において、イオンチャンネルをターゲットとすることに成功した。現在、種々のイオンチャンネルブロック剤または開孔剤が、種々の疾患に対する薬剤として使用または評価されている。
【００１８】
電位差依存型カルシウムイオンチャンネルは、多数の細胞機能に関与しており、明確な疾患表現型の発現にそれらが果たす役割は複雑である。ある種のカルシウムチャンネルは、痛覚および偏頭痛の病態生理において何らかの役割を果たしているかもしれない。人体医学においては、カルシウムチャンネルブロッカーについて、とりわけ、緑内障、深部静脈血栓、および肺高血圧の治療、腎移植、および灌流障害の予防に関する評価が行われている。
【００１９】
いくつかの電位差依存型カルシウムチャンネルブロッカーは、疼痛の予防に効果があることが示されている。更に、いわゆる非L型カルシウムチャンネルのブロックは、激しい疼痛および虚血発作に対し治療効果を示すことが見出された。
【００２０】
カリウムチャンネルの機能不全は、多くの神経疾患および周辺疾患(一過性運動失調、てんかん、神経性ミオトニー、パーキンソン病、先天性難聴、およびQT延長症候群)の病態生理に関連している。
【００２１】
通常、カリウムイオンチャンネルの活性化は、細胞の興奮性を低下させるため、カリウムチャンネル開孔剤は、てんかん、神経痛、および神経変性等の興奮性亢進に関連する疾患の治療について有力な薬剤の候補である。
【００２２】
最も注目すべき点は、心臓組織に発現したHERGカリウムイオンチャンネルの変異またはHERGチャンネルの妨害(ブロッキング)は、心臓疾患(Q-T延長症候群)の原因となり、心室性頻拍や突然死のリスクを増大させる。いくつかの薬剤は、これらのチャンネルに作用し、生命を脅かす不整脈を起こすおそれがある。こうした観点から、薬剤の探索を行う企業は、これらのチャンネルの阻害について、候補薬剤の評価を行うことが必要であることを認識している。したがって、多くの企業では、HERG試験を実施してからさらなる検討を行っている。
【００２３】
ナトリウムイオンチャンネルの発現の動的特性は、それらを疼痛の新規な治療法の探索において薬理学的操作のための重要なターゲットとする。例えば、ナトリウムチャンネルのαサブユニットの遺伝子コードの変異は、ヒトのてんかん、QT延長症候群、高カリウム性周期性四肢マヒ、ならびにマウスの運動終板疾患および小脳性運動失調等の発作性疾患と関連がある。電位差依存型のイオンチャンネルは、疼痛の病態生理において重要なメディエーターであることが示された。最も頻繁に用いられている麻酔薬の1つがリドカインであるが、これはナトリウムイオンチャンネルを阻害する。脳のナトリウムチャンネルの変化は中心性疼痛の原因となる場合があり、更に、ナトリウムチャンネル遺伝子の異常発現およびその一時知覚性ニューロンの興奮性亢進への関与について検討がなされている。最近、知覚性ニューロン特異的(SNS)抗TTXナトリウムチャンネルについて、痛覚および疼痛における役割が検討された。この研究の結果より、SNSの発現または機能をブロックすると無痛覚症が発症するおそれがあることが示唆された。
【００２４】
イオンチャンネル研究に対する実験的アプローチ
イオンチャンネルを研究するための好ましい方法はパッチクランプ法である(Neher, E. およびSakmann，B.，Nature 260(5554)：799-802(1976)；Hamill，O. P.，ら、Pflugers Arch．391(2)：85-100(1981))。
【００２５】
この方法は、清浄度の高いガラス製のマイクロピペット(直径約1μm)の先端に細胞を接触させ、穏やかに吸引して、ガラスと細胞表面との間に高い抵抗を有するシール(漏洩抵抗＞1GΩ、ギガシール)を形成することからなる。その後、強く吸引し、または高電圧を印加すると、ピペット内部に位置する部分の膜を破壊することができ、それにより、細胞の内部とピペット電極との間を電気的に接触することができる(全細胞型パッチクランプ法)。ピペット電極に異なる電圧を印加することができ、その際に測定される電流は細胞膜を通して測定される電流に相当し、存在するイオンチャンネルを通して流れる電流の積分値を含んでいる。
【００２６】
現在、パッチクランプ法は、イオンチャンネル活性をモニターするための業界標準であると考えられている。パッチクランプ法では、イオンチャンネルの活性を直接記録し、ミリ秒以下の時間分解能を有し、含まれる情報量が非常に多く、感度が高いため、「単一の」イオンチャンネルを測定する能力を有している。含まれる情報量が多いため、パッチクランプ法を用いたスクリーニング法では、「擬陰性」および「擬陽性」が発生する確率が非常に低い。
【００２７】
この手法により、イオンチャンネルの活性化、不活性化、ゲーティング、イオン選択性、および薬剤との相互作用について詳細な生物物理的評価を行うことができるが、スループットが非常に低く、操作が簡単なパッチクランプ装置は、大量スクリーニングを効率的に行うには、通常満足できるものではない。イオンチャンネルの高スループットスクリーニング(HTS)に対する要求としては、操作が十分に簡便であることと共に、堅牢な装置および高い信号-バックグラウンド比等が挙げられる。これまで、イオンチャンネルのHTSと言えは、含まれる情報量が小さいことの代名詞とみなされており、種々のタイプの細胞において、膜電位に関し、より有用な情報を収集することができる、新規な高速かつ簡便な方法の必要性が強調されている。
【００２８】
イオンチャンネルHTSの手法
従来、イオンチャンネルの一次スクリーニングに用いられているHTS法は、結合アッセイ、イオン流出アッセイ、および蛍光分析手法によっている。現在までのところ、これらの方法に対する最も重要な課題は、満足できる情報量および信頼性を有するHTSデータを生成することである。
【００２９】
イオンチャンネルの機能を調節する分子の研究は、HTS方式において、電気的に直接測定する方法がなかったことに阻まれてきた。細胞を用いたアッセイにおける膜の興奮性は、含まれる情報量の多いデータを得るために、高速で、高精度かつ正確な測定を行う必要がある動的現象である。イオンチャンネルの活性を正確に反映する膜電位差動態の同時測定は、細胞生理学に必須であるが、現在のHTS方式の方法では測定が困難である。
【００３０】
イオンチャンネルに対する、信頼性が高く確実な高HTSアッセイは、イオンチャンネルを用いた薬剤探索にとって重要である。イオンチャンネルは動的なタンパク質であるため、種々の機能的状態を「検知」することができるアッセイが必要とされる。競合結合アッセイは、他種のターゲットについては有効であるが、イオンチャンネルの特定の状態を調節するリガンドの同定については失敗することも多い。したがって、イオンチャンネルに対するHTSには、細胞を用いた機能アッセイが好ましい。
【００３１】
現在利用可能なアッセイ
イオンチャンネルのスクリーニングに用いられている最近の方法としては、結合アッセイ、イオン流束アッセイ、蛍光測定イメージングおよび電気生理学的アッセイ等が挙げられる。
【００３２】
細胞表面の受容体に対する結合アッセイは、スクリーニング開発および一次スクリーニングにおいて用いられている。この種のアッセイは、多くの場合、シンチレーション近接アッセイ(SPA)または蛍光検出法を用いて行われ、旧来の放射性標識リガンドとろ過を用いたアッセイに代わる方法となっている。SPA法は、ビーズの表面に固定化された受容体に、放射性標識されたリガンドが結合することによる、シンチラントを含むマイクロビーズの励起による。
【００３３】
蛍光発色団で標識されたリガンドと受容体との結合平衡の測定に、蛍光分光法が用いられている。残念ながら、結合アッセイでは、イオンチャンネルへの化合物の結合を測定することしかできず、イオンチャンネルの速度の調節等の、目的物の機能の変化を明らかにすることはできない。
【００３４】
HTSは適用範囲が広く、小型化および自動化の可能性があり、高感度化の可能性も有しているため、イオンチャンネルの機能の光学的な読み出しには、HTSが適している。
【００３５】
蛍光読み出しは、細胞内イオン濃度のモニターにも、膜電位の測定にも広く用いられている。例えば、イオンチャンネルの活性化による、過渡的なカルシウムイオン濃度の大幅な増大は、Fluo-3およびカルシウムグリーン等の蛍光プローブを用いてモニターすることができる。イオン選択的な蛍光指示薬以外にも、スチリル色素、ビスオキソノール色素、および蛍光共鳴エネルギー移動を用いた電位差感受性色素等の膜電位の変化に感受性を有する蛍光色素が存在する。
【００３６】
例えば、蛍光色素である、ビス-(1,3-ジブチルバルビツール酸)トリメチンオキソノール(DiBAC4(3))は、HTSにおける膜電位の測定に選択される試薬である。細胞における脱分極または過分極刺激に起因する細胞膜中の色素の分布の変化により、蛍光発光が変化する。しかし、DiBAC4(3)の使用には、速度が遅い(秒〜分の範囲に及ぶ)、温度および色素の濃度に応じて変動が生じる等のいくつかの制約が存在する。更に、ビスオキソノール色素を用いるスクリーニング実験は、多段階の実験操作が必要であり、色素の導入に30〜60分を要するため、忠実性を損なうおそれがあり、DiBAC4(3)を用いたスクリーニングアッセイのスループットを低下させる。
【００３７】
HTSパッチクランプ法
パッチクランプ法は、イオンチャンネルを通過する電流の測定に広く用いられている。全細胞パッチクランプ法は、現在、薬剤探索プロセスの後半の段階において、選択されたリード化合物の三次スクリーニングに用いられている。しかし、全細胞パッチクランプ法は、初期の高スループットスクリーニングには適していない。
【００３８】
非常に強力ではあるが、この手法は多大な労力を必要とするため、1日当たり測定が可能なデータポイントの数は、ごくわずかなものに限られる。このようにスループットが低いため、イオンチャンネルをターゲットとする高スループットスクリーニングには、特異性が低く、感度も低い他の方法が用いられてきた。
【００３９】
最適なHTSイオンチャンネルアッセイの必要条件
高スループットスクリーニングキャンペーン(200,000サンプル以上)では、スループットおよびコストの観点から、結合アッセイが依然として第1の選択肢である。この事実は、これらタイプのアッセイが技術的に容易に実行でき、そのため、自動化が可能であることを反映している。しかし、近年のイオンチャンネル薬剤探索スクリーニングにおいて、細胞を用いた機能アッセイが1次スクリーニングの手段として用いられる傾向にある。
【００４０】
細胞機能アッセイは、結合スクリーニングにより選別された化合物の機能の決定、および毒性の評価のために、1次または2次スクリーニングとして用いられる。これらのアッセイは、含まれる情報量が多いため、薬剤探索において大きな価値を有する可能性がある。
【００４１】
個々の化合物の効果に関する1回の実験で、可能な限り多くの知見を得ることにより、ターゲットおよび推定候補薬剤の同定を行うことが、最初のイオンチャンネルスクリーニングの最終目標である。
【００４２】
電位差感受性プローブ
近年用いられている電位センサー色素は、電位依存性の膜を通した蓄積および分布の変化に応答性を有するが、膜電位の定常状態アッセイにしか用いることができない。その理由は、これらの色素の蛍光応答が、膜電位が変化してから数分後に起こるためである。荷電を有するため、電位センサー色素は、イオン流に起因する膜電位に干渉する。このことが信号対雑音比に与える影響を減少させるためには、色素の濃度をある一定の値以下に保たなければならない。そのため、分布状態の変化を用いた電位センサー色素は、擬陰性を生じやすい傾向がある。更に、化合物と電位差検知用色素との相互作用により、高い割合で擬陽性を生じる場合がある。
【００４３】
細胞膜の内部に蓄積された、クマリン標識を有するリン脂質等の電位感受性蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)受容体は、標準的な電位センサーに関連する問題点を改善し、サブ秒での速度の決定が可能になる。高スループットスクリーニングFRETを用いた電位センサーを用いると、Aurora BioSciences社(現Vertex Pharmaceuticals社、マサチューセッツ州ケンブリッジ)により開発された製品であるVoltage Ion Probe Reader(VIPR(商標))で、1時間あたり96ウェルプレートを数枚のスループットでスクリーニングを行うことができる。
【００４４】
従来のパッチクランプ法で得られた結果と比較すると、VIPRアッセイは感度が低い。電位センサー色素を用いた、蛍光を用いたイオンチャンネルアッセイにおける時間分解能のため、解析可能な速度範囲は、パッチクランプ法を用いたイオンチャンネルアッセイに比べて減少する。
【００４５】
細胞内イオンに対するイオン特異的蛍光プローブは、イオンチャンネルスクリーニングに有用であることが示されている。用途に応じて、親和性の範囲の異なる種々の色素が多数市販されており、中でもカルシウム指示薬が最も広く用いられている。カルシウム色素を用いたイオンチャンネルアッセイの重大な欠点は、制御不能な、または予測不能な細胞過程により、細胞内カルシウム濃度の変化に対する速度分解能が低いことである。これにより、アッセイの結果が妨害されるおそれがある。高いスループットおよび低い雑音を達成するため、FLIPRタイプの蛍光リーダーが、カルシウム特異的色素と共に広く用いられている。今のところ、カルシウムチャンネルの活性または他の非選択的カチオンチャンネルの測定を含むアッセイのみが、効果的にHTSを行うための取り組みに対して十分に堅牢であることが立証されたに過ぎない。
【００４６】
まとめると、最適化されたHTSイオンチャンネルスクリーニング法は、高い時間分解能、高い感度、および高い情報量を有し、それにより、「擬陰性」および「擬陽性」の発生率が低くなると思われる。イオンチャンネルを研究するための物質や方法が存在するにもかかわらず、簡便で、堅牢で、かつ有用である、新規な物質および方法が求められている。
【００４７】
ナノ粒子またはナノ結晶
ナノ粒子およびその使用法に関する多くの研究が報告されている。半導体ナノ結晶は、Quantum Dot社(Invtrogen社(米国カリフォルニア州カールスバッド)の完全子会社である)の登録商標であるにもかかわらず、「Quantum Dot(量子ドット)」または「Q Dot(Qドット)」と呼ばれることがある。ナノ粒子は通常、球状またはほぼ球状で、中心部のコアと、それを取り囲むシェルと、必要に応じてキャッピング基、リンカー、および他の表面に結合した物質を有している。
【００４８】
半導体ナノ粒子は、電子正孔対が形成され閉じ込められた、数百〜数千原子の無機半導体材料からなるナノメートルスケールの結晶である。
【００４９】
ナノ粒子の特異的な光学的性質は、量子閉じ込めの機構に基づくものである。量子閉じ込めとは、電子または電子「正孔」(電荷キャリア)が、それらの量子的(波動的)なふるまいが、古典的(粒子的)なふるまいよりも顕著になるほど狭い空間内に捕捉されることをいう。
【００５０】
ナノ粒子中では、電子/正孔の運動が3次元空間中で強く制限されており、量子閉じ込めにより、バルク半導体材料に比べ、光励起エネルギーが非常に増大している。量子閉じ込めが起こるためには、閉じ込め素子または粒子の大きさが、それを構成する材料の、電子正孔ボーア半径と同程度である必要がある。光励起により、ナノ結晶のコア中で電子正孔対が形成されると、それらは再結合して、線幅が狭く、対称的で、結晶の大きさに直接依存する発光スペクトルを有する光を再放出する。ナノ粒子のコアが小さくなるほど、価電子帯と伝導帯とのバンドギャップは増大し、放出される光子はより短波長になり、大きなナノ粒子については、逆(より長波長の発光)になる。
【００５１】
市販されている半導体ナノ結晶は、コアと、無機格子マッチ結晶性シェル(ナノ結晶の光学的性質を向上させ、場合によっては細胞毒性を低下させる)、および単層または多層の被覆(水に対する適合性を付与し、生体高分子等の改質材との相互作用を増大させる)等のいくつかの層からなる。
【００５２】
ナノ結晶は、情報科学(量子コンピュータ)、発光ダイオード、レーザー、および通信機器、バーコード、光検知器、光スイッチ、および熱電素子において用いられている。近年、ナノ結晶が、細胞標識、細胞追跡、生体内イメージング、DNA検出、タンパク質標識、および他の検出方法で用いられている。
【００５３】
ナノ結晶は、サイズによって調節できる発光、狭いスペクトル幅、線幅の広い励起スペクトル、高い量子収率、高い2光子交差、および低い光漂白速度等の、生物学的光センサーとして優れた光学的性質を有している。
【００５４】
しかし、現在までナノ結晶の生物およびバイオテクノロジーにおける用途は、生物的過程の検出器としてよりも、殆どその生体標識への使用に限定されている。
【００５５】
産業におけるナノ結晶の用途としては、例えば、外部刺激に応答して種々の波長の光を放出することができ、印加電圧の変化によって素子から放出される光の色を変化させることができる、ナノ結晶を用いた光電子デバイス等が挙げられる。
【００５６】
多くの特許公報および特許出願公開公報において、ナノ結晶組成物、その調製法、およびその使用法が報告されている。これまでに行われた研究について、その一例を以下に示す。
【００５７】
米国特許第5,505,928号明細書(1996年4月9日発行)には、III-V族半導体ナノ結晶材料を調製する方法が記載されている。そのような材料の例としては、GaAs、GaP、GaAs-P、GaSb、InAs、InP、InSb、AlAs、AlP、およびAlSb等が挙げられる。製造された材料は、1〜6nmの大きさを有し、比較的単分散である。
【００５８】
米国特許第5,990,479号明細書(1999年11月23日発行)には、アフィニティ分子と結合したナノ結晶について記載されている。列挙されたアフィニティ分子としては、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、核酸、タンパク質、多糖、ならびに糖、ペプチド、薬剤およびリガンド等の低分子等が挙げられる。
【００５９】
米国特許第6,114,038号明細書(2000年9月5日発行)には、式HS(CH2)nX(式中Xはカルボキシル基である)で表されるキャッピング化合物を有する、水溶性で、官能基化されたナノ結晶について記載されている。このナノ結晶は、キャッピング化合物に動作可能に結合したジアミノカルボン酸も有している。
【００６０】
米国特許第号6,207,229明細書(2001年3月27日発行)には、CdX(X＝S、Se、またはTeである)からなる群より選択されるほぼ単分散のナノ粒子と、ZnY(Y＝S、またはSeである)のオーバーコーティングとを含み、発光能を有する、被覆されたナノ粒子について記載されている。ナノ結晶を調製する方法では、第1の半導体コアと、熱変換により、コアの表面を覆う被覆層を形成する第2の半導体材料に変換される前駆体とを用いる。
【００６１】
米国特許第6,207,392号明細書(2001年3月27日発行)には、1つまたは複数の結合剤が結合した半導体ナノ結晶について記載されている。ナノ結晶としては、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSe、BaTe、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、およびHgTe、ならびにそれらの混合組成物等のII-VI族半導体ナノ結晶、およびGaAs、InGaAs、InPおよびInAs等のIII-V族ナノ結晶等が挙げられる。
【００６２】
米国特許第6,251,303号明細書(2001年6月26日発行)、第6,319,426号明細書(2001年11月20日発行)、および第6,444,143号明細書(2002年9月3日発行)には、水溶性半導体ナノ結晶について記載されている。ナノ結晶の外層は、シェル層のオーバーコート層の分子に結合するための少なくとも1つの結合基と、必要に応じて、電荷移動を防止するのに適当な疎水性領域によって結合基から隔てられた、少なくとも1つの親水性基とを有する。
【００６３】
米国特許第6,274,323号明細書(2001年8月14日発行)には、免疫吸着法において半導体ナノ結晶を用いて、サンプル中のポリヌクレオチドを検出する方法について記載されている。
【００６４】
米国特許第6,306,610号明細書(2001年10月23日発行)には、多座配位子が結合した半導体ナノ結晶について記載されている。ナノ結晶は、タンパク質および核酸等の種々の生体分子と会合することができる。
【００６５】
米国特許第6,322,901号明細書(2001年11月27日発行)には、発光帯の半値全幅(FWHM)60nm以下のスペクトル域で発光する被覆された単分散ナノ結晶について記載されている。ナノ結晶のスペクトル域は、約470nm〜約620nmであり、ナノ結晶のコアの粒子径は、約20Å〜約125Åである。
【００６６】
米国特許第6,326,144号明細書(2001年12月4日発行)には、構造式HzX((CH2)nCO2H)yで表されるリンカーおよびその塩(式中、Xは、S、N、P、またはO＝Pであり、nは6以上の整数であり、zおよびyは、Xの原子価を満足するように決定される)を用いて種々の化合物に結合した半導体ナノ結晶について記載されている。
【００６７】
米国特許第6,423,551号明細書(2002年7月23日発行)、および第6,699,723号明細書(2004年3月2日発行)には、アフィニティ分子に結合することができる結合剤を有する水溶性半導体ナノ結晶について記載されている。列挙されたアフィニティ分子としては、モノクローナルおよびポリクローナル抗体、核酸(単量体およびオリゴ体)、タンパク質、多糖、ならびに糖、ペプチド、薬剤、およびリガンド等の低分子等が挙げられる。結合剤の例としては、N-(3-アミノプロピル)3-メルカプト-ベンズアミド、3-アミノプロピル-トリメトキシシラン、3-メルカプトプロピル-トリメトキシシラン、3-マレイミドプロピル-トリメトキシシラン、および3-ヒドラジドプロピル-トリメトキシシラン等が挙げられる。
【００６８】
米国特許第6,426,513号明細書(2002年7月30日発行)には、選択されたバンドギャップエネルギーを有する量子ドットと、量子ドットよりも大きなバンドギャップエネルギーを有する材料を含むオーバーコート層と、式SH(CH2)nX(式中、Xはカルボキシル基またはスルホン酸基であり、nは8以上の整数である)で表される化合物を含む外層とを含む水溶性半導体ナノ結晶について記載されている。
【００６９】
米国特許第6,500,622号明細書(2002年12月31日発行)には、ポリヌクレオチド配列が結合した半導体ナノ結晶について記載されている。ナノ結晶は、サンプル中のターゲット配列を決定するために用いることができる。ナノ結晶は、スペクトルコードを用いて同定することができる。
【００７０】
米国特許第6,548,168号明細書(2003年4月15日発行)には、絶縁体、半導体、および/または金属の被覆を用いて粒子を安定化する方法について記載されている。二官能性リガンドを含む粒子被覆混合物を用いて、粒子を被覆に結合させる。二官能性リガンドの例としては、3-メルカプトプロピルトリメトキシシラン(MPS)、1,3,-プロパンジチオール、3-アミノプロパンチオール(APT)、および3-アミノプロピルトリメトキシシラン(APS)等が挙げられる。
【００７１】
米国特許第6,576,291号明細書(2003年6月10日発行)には、金属MまたはMを含む塩を還元剤と接触させて、Mを含む前駆体(Mは、Cd、Zn、Mg、Hg、Al、Ga、In、またはTlである)を形成する工程と、Mを含む前駆体をX供与体(Xは、O、S、Se、Te、N、P、As、またはSbである)と接触させて混合物を形成させる工程と、混合物をアミンの存在下で加熱してナノ結晶を形成させる工程とを有するナノ結晶子の製造方法について記載されている。ナノ結晶子は、発光ダイオード(LED)、または交流薄膜電場発光素子(ACTFELD)等の光電子デバイスを含む多くの用途に用いることができる。
【００７２】
米国特許第6,649,138号明細書(2003年11月18日発行)には、半導体または金属材料よりなる内部コアと、内部コアを取り囲む水に不溶な有機被覆層と、少なくとも2つの疎水性領域と、少なくとも2つの親水性領域とを備え、多層積層した両親媒性分散剤分子を含み、水不溶性の有機被覆を取り囲む外層とを有する、水中に分散可能なナノ粒子について記載されている。ナノ粒子は、種々のアフィニティ分子と結合することができ、それにより、蛍光免疫細胞化学、蛍光顕微鏡観察、DNA配列解析、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション(FISH)、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)、フローサイトメトリー(蛍光活性化細胞選別装置、FACS)、および生体系の診断分析に用いることが可能になる。
【００７３】
米国特許第6,815,064号明細書(2004年11月9日発行)には、半導体コアの周囲の無機のシェル中に、第2族元素、第12族元素、第13族元素、第14族元素、第15族元素、第16族元素、Fe、Nb、Cr、Mn、Co、Cu、またはNiを含むナノ粒子について記載されている。コア材料とシェル材料との間の格子構造の不整合を相殺することにより、半導体コア上に、高品質で厚みのあるシェルを成長させるための組成物および調製方法が提案されている。
【００７４】
イオンチャンネルを研究するための物質や方法が存在するにもかかわらず、簡便で、堅牢で、かつ有用である、新規な物質および方法が求められている。更に、投与した物質の効果に関する研究を促進するために、細胞の膜電位を制御する方法が求められている。
【発明の開示】
【００７５】
発明の概要
細胞または細胞内の膜電位をモニターまたは調節するためのナノ構造の使用を開示する。細胞と会合したナノ構造は、膜電位の変化に応答し、容易にモニターすることができる。この方法は、外部から投与した薬剤が細胞の膜電位に及ぼす効果をモニターするために用いることができる。
【００７６】
発明の詳細な説明
組成物および方法は、種々の成分または工程を「有する」(「含むがそれに限定されない」という意味に解釈される)という用語で記載されているが、組成物および方法は、種々の成分および工程を「本質的に含んで」いても、または「含んで」いてもよく、これらの用語は、原則として閉じた集団を定義するものと解釈されるべきである。
【００７７】
膜電位差の変化を測定する方法
本発明の1つの態様は、膜電位差の変化を測定する方法を対象とする。本方法は、細胞、細胞画分、または人工膜構造のいずれかである少なくとも1つのターゲットを準備する工程と、前記ターゲットを少なくとも1種類のナノ構造と接触させて、処理されたターゲットを形成する工程と、前記処理されたターゲットを刺激する工程と、前記ナノ構造からの発光を測定する工程と、前記発光を膜電位差の変化と相関させる工程とを有していてもよい。ナノ構造からの発光を測定する任意の工程を、接触させる工程の後で、かつ刺激する工程の前に更に有していてもよい。追加の工程は、「対照」または「ブランク」測定としての役割を果たすことができる。
【００７８】
ターゲットは、1つまたは複数の完全細胞であってもよく、1つまたは複数の細胞画分であってもよく、または1つまたは複数の人工膜構造であってもよい。細胞画分の例としては、核、リボソーム、ミトコンドリア、小胞体、ゴルジ体、液胞、シナプス小胞、およびリソソーム等の任意の管腔状小器官等が挙げられる。人工膜構造の例としては、リン脂質のミセル、マイクロカプセルおよびナノカプセル、ならびに支持構造上の半流動膜等が挙げられる。接触させる工程は、ナノ構造をターゲット中に導入することを含んでいてもよい。または、接触させる工程は、ナノ構造を前記ターゲットの細胞膜の中に導入することを含んでいてもよい。ナノ構造を、ターゲットの細胞膜の上または近傍に導入してもよい。ターゲットの「近傍に」位置するナノ構造は、膜電位差の変化が検出できるように、十分に近接している。一例として、約100ミクロン以内の距離にあるナノ構造は、このような性質を発揮する上で、十分にターゲットに近接している。
【００７９】
ターゲットは、多様な方法で刺激することができる。そのような刺激の例としては、電気刺激、磁気刺激、化学的刺激、生物学的刺激、またはこれらの組み合わせ等が挙げられる。電気刺激の例としては、パッチクランプ法の使用および外部電場の印加等が挙げられる。化学的刺激の例としては、ターゲットとカリウム塩もしくはナトリウム塩との接触、または膜内孔形成分子との接触等が挙げられる。生物学的刺激の例としては、光感受性イオンチャンネルによるターゲットの活性化、またはイオンチャンネル活性の調節剤として作用する化学物質とのターゲットの接触等が挙げられる。磁気刺激の例としては、適当な周波数および強度を有する交流電磁場による活性化等が挙げられる。
【００８０】
ターゲットは、種々の方法により電気的に刺激することができる。ある刺激の手順(電圧の高さおよび刺激の継続期間)は、対象となるイオンチャンネルの活性化速度に基づいて選択されることが多い。例えば、ターゲットを第1の膜電位の電圧値で保持し、第2の膜電位の電圧値で脱分極パルスに付し、前記ターゲットを第1の膜電位の電圧値に戻してもよい。第2の膜電位の電圧値は、通常第1の膜電位の電圧値よりも正側の値であるが、第1の膜電位の電圧値が、第2の膜電位の電圧値よりも正側の値であってもよい。例えば、第1の膜電位の電圧値が負であってもよいが、第2の膜電位の電圧値が正であってもよい。第1の膜電位の電圧値については、例えば-70mVであり、第2の膜電位の電圧値については、例えば+40mVである。または、第1の膜電位の電圧値または第2の膜電位の電圧値は、0mVであってもよい。例としては、第1の膜電位の電圧値について-200mV、第2の膜電位の電圧値について0mV等が挙げられる。さらなる例としては、第1の膜電位の電圧値について0mV、第2の膜電位の電圧値について200mV等が挙げられる。第1の膜電位の電圧値および第2の膜電位の電圧値の具体例は、約-200mV、約-180mV、約-160mV、約-140mV、約-120mV、約-100mV、約-80mV、約-60mV、約-40mV、約-20mV、約0mV、約20mV、約40mV、約60mV、約80mV、約100mV、約120mV、約140mV、約160mV、約180mV、約200mV、およびこれらの値のうち任意の2つの間の範囲内から個別に選択してもよい。
【００８１】
または、本方法においてより複雑な電圧パターンを用いてもよい。本方法は、第2の膜電位の電圧の脱分極パルスを印加する前に、ターゲットに少なくとも1つのステップ電圧を加えることを更に含んでいてもよい。ステップ電圧は、第1の膜電位の電圧値と第2の膜電位の電圧値との中間の電圧である。ステップ電圧を用いて、リークによる差し引き分を測定することができる。例えば、第1の膜電位の電圧値として-80mV、ステップ電圧として-50mV、第2の膜電位の電圧値として20mVを用いてもよい。
【００８２】
通常、任意の長さの脱分極パルスを印加することができる。例えば、約5000秒までの脱分極パルスを印加することができる。長さの例としては、約10マイクロ秒、約1ミリ秒、約10ミリ秒、約100ミリ秒、約1秒、約2秒、約3秒、約4秒、約5秒、約10秒、約20秒、約30秒、約40秒、約50秒、約60秒、約70秒、約80秒、約90秒、約100秒、約500秒、約1000秒、約2000秒、約3000秒、約4000秒、約5000秒、およびこれらの値のうち任意の2つの間の範囲内の値等が挙げられる。
【００８３】
1つまたは複数の細胞としては、通常、膜および膜電位を有する任意のタイプの細胞を用いることができる。例えば、細胞は、細菌性(グラム陽性菌およびグラム陰性菌)細胞、真核細胞、原核細胞、真菌細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、爬虫類細胞、卵母細胞、ハエ細胞、ゼブラフィッシュ細胞、線虫細胞、魚類細胞、両生類細胞、または哺乳類細胞であってもよい。本方法では、人工膜、リポソームおよびリン脂質二分子膜等の非細胞物質を用いることもできる。主な哺乳類細胞の例としては、ヒト細胞、マウス細胞、ラット細胞、イヌ細胞、ネコ細胞、クマ細胞、ムース細胞、ウシ細胞、ウマ細胞、ブタ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞等が挙げられる。他の細胞種の例としては、免疫細胞(B-細胞、T-細胞等)、卵母細胞、赤血球、白血球、ニューロン、上皮細胞、グリア細胞、線維芽細胞、ガン細胞、および不死化細胞等が挙げられる。
【００８４】
ナノ構造は、種々の方法を用いてターゲット内に導入することができる。そのような方法の例としては、パッチピペットの使用、エンドサイトーシスまたは他の取り込み方法を用いた能動的または受動的取り込み、エレクトロポレーション、リポソームによる導入、プルロニックブロックコポリマーによる導入、細胞透過性ペプチドによる取り込み、タンパク質による取り込み、マイクロインジェクション、トランスフェクション、ウィルスによる導入、オプトポレーション、孔形成物質、膜インターカレーター、またはそれらの組み合わせ等が挙げられる。
【００８５】
ナノ構造を細胞膜(または上述した他の種類の膜)の内部に導入する方法としては、支持構造上に(例えば、マイクロタイタープレートのウェルの底部に)ナノ構造を固定化し、次いで、細胞を含む溶液を実験チャンバー(マイクロタイタープレートのウェル等)に加える方法等が挙げられる。
【００８６】
ナノ構造は、通常任意のナノ構造であってよい。ナノ構造の例としては、ナノ結晶、薄膜、ナノワイヤー、パターン状物質、およびメッシュ等が挙げられる。ナノ粒子は、通常任意のナノ粒子であってよい。半導体ナノ粒子またはナノ結晶は、通常、半導体コア、シェル、および必要に応じて1つまたは複数の表面処理層を有する。半導体ナノ粒子は、Quantum Dot社(Invitrogen社(米国カリフォルニア州カールスバッド)の完全子会社)およびEvident Technologies社(米国ニューヨーク州トロイ)等の会社から市販されている。また、ナノ粒子の調製については、多くの文献に記載がなされている。
【００８７】
半導体コアおよびシェルは、それぞれ元素周期律表の第2族または第12族元素、および元素周期律表の第16族元素を含む物質から製造されていてもよい。そのような材料の例としては、ZnS、ZnSe、ZnTe、CdS、CdSe、CdTe、HgS、HgSe、HgTe、MgS、MgSe、MgTe、CaS、CaSe、CaTe、SrS、SrSe、SrTe、BaS、BaSeおよびBaTe等が挙げられる。または、半導体コアおよびシェルは、それぞれ元素周期律表の第13族元素、および元素周期律表の第15族元素を含む物質から製造されていてもよい。そのような材料の例としては、GaN、GaP、GaAs、GaSb、InN、InP、InAs、およびInSb等が挙げられる。または、半導体コアおよびシェルは、それぞれ元素周期律表の第14族元素よりなる物質から製造されていてもよい。そのような材料の例としては、GeおよびSi等が挙げられる。または、半導体コアおよびシェルは、それぞれPbSまたはPbSe等の鉛系材料から製造されていてもよい。半導体コアおよびシェルは、上に列挙した任意の材料の合金または混合物から製造されていてもよい。
【００８８】
半導体ナノ結晶は、任意の大きさ(平均直径)であってよいが、通常約0.1nm〜約1000nmの大きさである。より狭い範囲の大きさとしては、約0.1nm〜約1nm、約1nm〜約50nm、および約1nm〜約20nm等が挙げられる。具体的な大きさとしては、約0.1nm、約0.5nm、約1nm、約2nm、約3nm、約4nm、約5nm、約6nm、約7nm、約8nm、約9nm、約10nm、約11nm、約12nm、約13nm、約14nm、約15nm、約16nm、約17nm、約18nm、約19nm、約20nm、約25nm、約30nm、約35nm、約40nm、約45nm、約50nm、およびこれらの値のうち任意の2つの間の範囲内の値等が挙げられる。
【００８９】
典型的な単色発光用のナノ粒子組成物は、好ましくはほぼ単一の大きさおよび形状を有する結晶である。ナノ結晶は、通常球状またはほぼ球状であると考えられているが、実際には任意の形状であってよい。または、ナノ結晶は非球状の形状であってもよい。例えば、ナノ結晶の形状は、より長波長の発光波長を得るためには偏球状に変形させることができる。少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、理想的には約100％の粒子が同一の大きさを有していることが好ましい。サイズの偏差は、直径の根二乗平均によって評価することができ、根二乗平均の約10％未満であることが好ましい。大きさの偏差は、根二乗平均の約10％未満、根二乗平均の約9％未満、根二乗平均の約8％未満、根二乗平均の約7％未満、根二乗平均の約6％未満、根二乗平均の約5％未満、またはこれらの値のうち任意の2つの間の範囲内の値であってもよい。このような粒子の集団は、「単分散」であると呼ばれることもある。
【００９０】
半導体ナノ結晶の(発光の)色は、ナノ結晶の大きさおよび組成を変化さえることにより「調整」できることがよく知られている。ナノ結晶は、好ましくは広い波長スペクトルの光を吸収し、狭い波長の光を放出する。励起波長と発光波長とは、通常異なっており、重なり合ってもいない。発光帯幅は、好ましくは、発光帯の半値全幅(FWHM)で約50nm未満、より好ましくは約20nm未満である。発光帯幅(FWMH)の例としては、約50nm、約40nm、約30nm、約20nm、および約10nm等が挙げられる。放出される光は、好ましくは対称的な波長の発光帯を有している。発光極大は、通常、約200nm〜約2000nmの間の任意の波長であってもよい。発光極大の例としては、約200nm、約400nm、約600nm、約800nm、約1000nm、約1200nm、約1400nm、約1600nm、約1800nm、約2000nm、およびこれらの値のうち任意の2つの間の範囲内の値等が挙げられる。
【００９１】
ナノ粒子は、金属製のコアを有していてもよく、金属製の周囲のシェル構造を有していてもよい場合もある。金属製のコアは、貴金属であってもよい。貴金属の例としては、銀、金、および銅等が挙げられる。
【００９２】
ナノ粒子は、種々の機能を付与する表面被覆層を有していてもよい。例えば、ナノ粒子は、脂質、リン脂質、脂肪酸、ポリ核酸、ポリエチレングリコール、一次抗体、二次抗体、抗体の断片、タンパク質または核酸を含むアプタマー、ビオチン、ストレプトアビジン、タンパク質、ペプチド、有機低分子、有機または無機色素、貴金属クラスターによって被覆されていてもよい。
【００９３】
または、ナノ粒子は、シリコン、アルミナ、ジルコニア、セリア、イットリアならびにスズおよび亜鉛の酸化物等の種々の無機材料より製造されていてもよい。例えば、シリコンナノ粒子は、サイズによって制御可能な可視領域のスペクトル等の、化合物半導体ナノ結晶の多くの有利な特徴を有している。更に、シリコンナノ粒子は、低毒性、高い生体適合性、効率よく安定な表面官能基化、および安価である可能性も有している。
【００９４】
イオンチャンネルアッセイへのナノ粒子の使用は、多くの望ましい特徴を有している。ナノ粒子は、応答時間が迅速であるため、特徴的な電圧依存性は、意図せぬ形で不活性化を受けにくく、ナノ粒子により、膜を横断する方向の電圧勾配を光学的に直接読み出すことが可能である。ナノ粒子は、低毒性、高い光感受性、多重化に応用可能な能力、および結合または会合した物質を用いてターゲッティングする能力も有している。
【００９５】
ナノ粒子のスペクトル特性は、通常、任意の適当な光測定装置または光蓄積装置を用いてモニターすることができる。そのような装置の例としては、CCD(電化結合素子)カメラ、ビデオ装置、CITイメージング、蛍光顕微鏡に取り付けたデジタルカメラ、光電子増倍管、蛍光光度計、ルミノメーター、顕微鏡の使用、更には目視等が挙げられる。発光は連続的に、または1つまたは複数の離散的な時点でモニターすることができる。ナノ粒子の有する光安定性および感度により、長期間にわたって電位の変化を記録することが可能になる。
【００９６】
ナノ構造からの発光を測定する他の方法としては、光強度、偏光、光吸収、発光色、発光寿命または半減期、または「点滅」パターンの測定等が挙げられる。
【００９７】
本発明の更なる態様は、リン脂質で被覆されたナノ粒子に係る。そのようなナノ粒子の例としては、市販のリン脂質で被覆されたMaple Red-Orange EviTag-T2ナノ結晶(Evident Technologies社、米国ニューヨーク州トロイ)等がある。また、脂質で被覆された半導体ナノ結晶材料の調製に関しては、多くの文献に記載がなされている。
【００９８】
細胞を励起させる方法
本発明の更なる態様は、細胞の膜電位差の制御へのナノ構造の使用を目的とする。非侵襲性であり使用も容易であるため、生体系への応用には光学的方法が興味深い。例えば、半導体材料の薄膜を用いて、ニューロン細胞を光によって電気的に興奮させることが示されている(Frohmherz, P．およびStett、A., Phys．Rev．Lett．75(8)：1670-1673(1995)；Starovoytov、A．ら、J．Neurophysiol．93(2)：1090-1098(2005))。ニューロン細胞を半導体材料の薄膜に付着させて、細胞外膜と半導体表面を密接に接触させる。基材をレーザー光で照射すると、半導体表面に付着した細胞が電気的に励起されることが示された。
【００９９】
光照射を受けたナノ粒子等のナノ構造は、周囲への局所的な電磁場の生成源として作用しうる。この効果は、遊離の電荷キャリア(ナノ粒子への光照射により生成した電子正孔対)の生成およびその後の電荷分離によると考えられている。この作用について近年提唱されている機構は、効果的にコンデンサを形成する細胞膜と半導体表面との静電的結合である。ナノ粒子が細胞の近傍に位置する場合、光により励起されたナノ粒子により生成される累積電磁場は、細胞膜を横断する電位差勾配と相互作用して、細胞の膜電位に影響を与える電磁場を形成する。細胞膜の一部を局所的に脱分極することは、細胞全体を脱分極させるのに十分であるかもしれない。
【０１００】
上述のナノ結晶の使用以外に、修飾したナノ結晶を用いて、強く、安定で、かつ制御可能な局所的電場を形成させることができる。そのような修飾には、高い表面荷電(CdTe/CdSeをコア/シェルの組み合わせとして用いる場合等)、一方の遊離の電荷キャリアの供与体または受容体として作用し、p型またはn型の表面トラップを有するナノ粒子を形成する物質によるナノ粒子のドーピング、電荷分離に寄与する分子との結合等が挙げられる。活性な細胞膜電位差の生成は、光を電力に変換することができるナノ粒子を用いることにより行うことができる。
【０１０１】
従来の太陽電池では、電子正孔対は、半導体コア中での光吸収によって、コア内部の電場の影響下での電荷分離および回収を伴って形成される。
【０１０２】
ナノ粒子は、細胞膜の厚さとほぼ同一であるため、膜の内部に挿入されると、細胞外および細胞内の空間にナノ粒子の両極が露出される。光照射すると、ナノ粒子は、膜を透過する遊離の電荷キャリアの経路となり、次いで電流を通して膜電位差に影響を与える。このようにして、細胞全体にわたる電圧の制御は、例えば、入射する光の強度および/または偏光を変化させることにより行うことができる。
【０１０３】
ナノ粒子は、球状、棒状、円盤状、三角形、ナノリング、ナノシェル、テトラポッド状等の様々な複雑な形状に合成することができる。これらの形状は、それぞれ固有の表面荷電の空間分布、入射光の偏光の方向依存性、および電場の空間的な広がり等の性質を有している。誘電体材料(リン脂質等)によるナノ粒子の不均一な被覆は、遊離の電荷キャリアを膜の一方から他方に導くのにも有用である。
【０１０４】
遊離の電荷キャリア濃度および移動度を制御するために、インジウム、リン、ホウ素、およびアルミニウム等の不純物でナノ粒子をドープしてもよい。ナノ粒子と有機ポリマーとの混合物は、ナノ粒子が高効率で電子を伝導するのに対し、ポリマーは正孔の伝導により優れているので、こうした用途について有利である。発色団による半導体ナノ粒子の官能基化することで、光吸収を遊離の電荷キャリアの輸送と分離することにより、この用途のために最適化できる可能性がある。
【０１０５】
したがって、ターゲットの膜電位差を光学的に制御する方法は、細胞または細胞画分である少なくとも1つのターゲットを準備する工程と、少なくとも1つのナノ構造を、細胞膜または細胞内膜との相互作用または膜への挿入に適した条件下で、ターゲットをナノ構造と接触させて、処理されたターゲットを形成する工程と、処理されたターゲットにエネルギーを送達する工程と、ターゲットの応答を検出する工程とを有する。
【０１０６】
細胞は、上述の細胞のうち任意のものであってよい。ナノ構造は、上述のナノ構造を含む任意のものであってよい。
【０１０７】
相互作用または挿入に適した条件には、種々の方法が含まれる。そのような方法の例としては、エンドサイトーシスを用いた能動的または受動的取り込み、エレクトロポレーション、リポソームによる送達、プルロニックブロックコポリマーによる送達、細胞透過性ペプチドによる取り込み、タンパク質による取り込み、マイクロインジェクション、トランスフェクション、ウィルスによる送達、オプトポレーション、孔形成物質、膜インターカレーター、またはそれらの組み合わせ等が挙げられる。
【０１０８】
エネルギーの送達には、光エネルギー、電位エネルギー、磁気エネルギーなどの送達が含まれる。エネルギーを送達する工程は、レーザー照射、水銀ランプによる照射、キセノンランプによる照射、ハロゲンランプによる照射、またはLEDによる照射等の、原則として任意の照射法によって行うことができる。照射する工程は、好ましくは、ナノ構造による吸収に適した波長または波長域で行われる。
【０１０９】
検出する工程は、任意の適当な光測定装置または光蓄積装置を用いる種々の方法を用いて行うことができる。そのような装置の例としては、カメラ、デジタルカメラ、ビデオカメラ、CMOSカメラ、CCDカメラ、蛍光顕微鏡に取り付けたデジタルカメラ、光電子増倍管、蛍光光度計、ルミノメーター、顕微鏡の使用、更には目視等が挙げられる。細胞の応答は、連続的に、または1つまたは複数の離散的な時点でモニターすることができる。
【０１１０】
または、検出する工程が二次的な検出機構の使用を含んでいてもよい。そのような二次的な検出機構の使用には、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)の使用が含まれる。FRETを用いると、ナノ構造はそのエネルギーを第2の分子に移動させ、その後検出可能な信号を放出することができる。更なる二次的な検出機構は、独立して観測可能な細胞の変化によるものである。例えば、細胞が溶解を起こしてもよい。または、細胞が、化学的変化、独立して測定可能な1つまたは複数の化学的または生化学的物質の濃度の増大または減少を起こしてもよい。
【０１１１】
少なくとも1種類の添加物質を、少なくとも1個の細胞または処理した細胞に加えて、その添加物質に対する細胞応答を分析してもよい。例えば、まず細胞を少なくとも1個のナノ粒子と接触させ、照射し、「対照」サンプルとして細胞応答を検出する。その後、処理した細胞を添加物質と接触させて物質で処理した細胞を調製し、照射後、検出を行う。この第2の細胞応答を、第1の(対照)細胞応答と比較してもよい。第1の細胞応答と第2の細胞応答との差は、添加物質が細胞の挙動に対して何らかの効果をもたらしているかを示す。別の添加物質、または同一の添加物質を更に加え、照射を行い、第3の細胞応答の検出を行ってもよい。この操作を、連続して任意の回数行うこともできる。例えば、投与量を増大させながら検出を行うこともでき、それによって第3の細胞応答、第4の細胞応答、第5の細胞応答、第6の細胞応答等が得られる。これらの一連の細胞応答を、プロットまたは他の方法により比較することにより、連続処理の効果を決定することができる。
【０１１２】
または、「対照」および「試験」サンプルは並行して行ってもよい。例えば、第1の細胞をナノ粒子と接触させ、照射を行い、対照となる細胞応答を検出する。それと並行して、連続的にまたは同時に、第2の細胞をナノ粒子および供試物質と接触させ、照射を行い、試験細胞応答を検出する。対照細胞応答と、試験細胞応答とを比較してもよい。
【０１１３】
少なくとも1種類の添加物質は、通常任意の物質であってよい。そのような物質の例としては、候補薬剤、細胞機能の調節剤、薬剤の送達を促進するための分子残基、分子プローブの候補等が挙げられる。
【０１１４】
分析用器具
本発明の更なる態様は、1つまたは複数の表面に堆積させたナノ構造の層を有する1つまたは複数の容器を目的とする。例えば、容器は、試験管、遠沈管、またはマイクロタイタープレート(96ウェルまたは384ウェル等)であってよい。管またはプレートのウェルの内面の全体が上述のナノ構造で被覆されていてもよい。または、管またはプレートのウェルの内面の下部または底面が上述のナノ構造で被覆されていてもよい。これらの分析用器具は、その後細胞または他の生体膜もしくは人工膜物質と共に用いるために保存することができる。
【０１１５】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例で開示された技術は、本発明者によって、本発明の実施に当たり十分機能することが見出された技術を表すもので、実施の好ましい形態を構成するものであることが、当業者によって認識される。しかし、当業者は、本明細書における開示に照らして、開示された特定の実施形態に対して多くの変更を加えることが可能であり、それでも本発明の範囲を逸脱することなく、類似または同様の結果を得ることができることを認識する。
【０１１６】
実施例
実施例1：カバースリップ上での細胞の調製
実験は、安定にM1ムスカリン作動性Gqタンパク質共役受容体を発現したA431(扁平上皮ガン細胞由来のヒト細胞株)またはCHO(チャイニーズハムスター卵巣)細胞上で、Quantum Dot社(Invitrogen社(米国カリフォルニア州カールスバッド)の完全子会社)またはEvident Technologies社(米国ニューヨーク州トロイ)から市販されているナノ粒子を用いて行った。細胞内(ピペット)溶液(pH7.3)は、140mM CsCl、10mM EGTA、10mM HEPESより構成された。細胞外溶液(pH7.4)は、140mM NaCl、5mM KCl、1.8mM CaCl2、1mM MgCl2、10mM EGTA、10mMグルコース、10mM HEPESより構成された。
【０１１７】
ナノ粒子の細胞外デリバリーを用いた実験では、市販されている数種類のナノ結晶を用いた。1つの実験系では、ストレプトアビジンで官能基化したQD605(Quantum Dot社)を、QDot(登録商標)キットに付属のバッファー溶液Bに加えた溶液を、濃度が25〜500μg/mlとなるように細胞外溶液に加えた。他の実験系では、官能基化していないMaple Red-Orange EviTag-T2(Evident Technologies社、米国ニューヨーク州トロイ)を、同様の濃度で用いた。
【０１１８】
ナノ粒子の細胞内導入を用いた実験では、ストレプトアビジンで官能基化したQD605(Quantum Dot社)を、濃度が25〜500μg/mlとなるようにピペット溶液に加えた。
【０１１９】
表面に細胞を載せたガラス製の18mm円形カバースリップを、special chamber 508SW(ALA Scientific Intruments社、米国ニューヨーク州ウェストバリー)に移した。対照実験用の細胞外溶液を、半導体ナノ結晶を含む細胞外溶液で置換した。室温で30分後、浮遊した過剰なナノ結晶が除去されるまでカバースリップをPBS溶液で洗浄した。洗浄により浮遊したナノ結晶がすべて除去されたことを目視により確認するために、カバースリップを顕微鏡下に置いた。励起が裸眼により確認された場合には、洗浄処理を更に2回繰り返した。
【０１２０】
洗浄処理が終了後、カバースリップを顕微鏡のチャンバーに載せ、実験の間、細胞をEBSS緩衝溶液中に保持した。以後の実験のために、ナノ粒子で標識された細胞のみを選択した。
【０１２１】
実施例2：パッチピペットの使用
パッチクランプ実験のためのガラス製のマイクロピペットは、ホウケイ酸ガラス製のキャピラリー(1.2mm no-capillaryガラス、Sutter Instruments社、米国カリフォルニア州ナヴァト)から、Sutter 2000(商標)ピペットプラー(model Sutter 2000、Sutter Instruments社、米国カリフォルニア州ナヴァト)を用い、予め記録されていたパッチピペット4段引きの手順を用いて引いた。ピペット先端の開口径は、1.5〜2.2μmで、抵抗値は2〜3MΩであった。マイクロピペットを細胞内溶液で満たした。
【０１２２】
実験は、全細胞パッチクランプ法の設定で、Axopatch200Bパッチクランプ増幅器(Molecular Devices社、米国カリフォルニア州サニーベール)を用いて室温で行った。ギガシールの形成に成功した後、短時間のパルス状の吸引を行い、細胞膜を破砕し、最細胞パッチクランプ法の設定が完了した。
【０１２３】
細胞の励起には、以下の試験手順を用いた。膜電位を-70mVに設定した。細胞を+40mVにするのに必要な脱分極パルスを、細胞の内側に2秒間印加し、その後膜電位を-70mVに戻した。
【０１２４】
実施例3：ストレプトアビジンで被覆したナノ粒子の外部からの導入
細胞の電圧刺激に応答して起こる、外部から導入したストレプトアビジンで官能基化したナノ粒子(QD605-ストレプトアビジン、Quantum Dot社)の発光強度を、コンピューターに接続した冷却型CCD Optronics Tec 470カメラ(Optronic Engineering社、米国カリフォルニア州ゴレタ)を用いて可視化した。細胞に接触したパッチピペットによって細胞膜に誘発された電圧変化は、これらの個々のナノ粒子について発光強度の変化をもたらさなかった。9個の細胞を連続して試験したが、上述の実施例に記載の手順による電圧刺激に対し、いずれも発光強度の変化を示さなかった。この実験で用いたナノ粒子に対するストレプトアビジンの被覆が、膜電位の勾配が最も高い位置である細胞膜の内部を狙ってナノ粒子を配置することを妨げていたのかもしれない。この実験で用いたナノ粒子に対するストレプトアビジンの被覆が、膜を横断する方向の電圧勾配を効率的にモニターできるように、ナノ結晶が細胞膜と会合するのを妨げていたのかもしれない。
【０１２５】
実施例4：ナノ粒子の細胞内への導入
この実験は、細胞膜を横断する方向の電圧変化に対する、細胞内に導入したナノ粒子の発光を分析するために企画された。
【０１２６】
光学信号を電圧で調節できるようにするために、ナノ粒子を細胞膜に近接して配置することが好ましい。電圧勾配の大部分は細胞質膜を横断する方向に存在するため、膜の近傍に位置するナノ粒子は、全電場勾配の大部分を受けていると思われる。
【０１２７】
実施例5：細胞内にナノ粒子を導入する手順
ナノ粒子を、濃度が200μg/mlとなるようにパッチピペット溶液に加えた。最初の実験は、ストレプトアビジンで被覆されたナノ粒子QD605(Quantum Dot社)を用いて行われた。ガラス製の18mm円形カバースリップに載せたA431細胞を、Zeiss Axiovert 100型顕微鏡に取り付けた電気生理学チャンバーに移した。
【０１２８】
全細胞型パッチクランプの設定を確立後、ピペットの内部に短時間のパルス状の陽圧を数回印加した。このようなピペット内部の圧力変化を用いて、半導体ナノ結晶を含む溶液を細胞内部に十分灌流させた。ナノ結晶を導入した後に、細胞の電圧刺激実験を行った。
【０１２９】
細胞の刺激には以下の試験手順を用いた。膜電位を-70mVに設定した。細胞を+40mVにするのに必要な脱分極パルスを、細胞の内側に1〜2秒間印加し、その後膜電位を-70mVに戻した。
【０１３０】
細胞を電圧刺激している間、ナノ粒子の発光を、CCD Optronic Tec 470カメラ(Optronic Engineering社、米国カリフォルニア州ゴレタ)を用いて連続的に記録した。ナノ粒子の発光強度に対する電圧刺激の効果を図1に示す。12個中10個の細胞が、半導体ナノ結晶の発光強度から明らかなように、電圧刺激の手順に対して応答を示した。このように、ナノ粒子は、光学的性質を変化させることにより膜電位差の変化に応答することが可能であった。
【０１３１】
実施例6：処理を行った半導体ナノ粒子の電圧センサーとしての使用
半導体ナノ粒子を用いた電位感受性アッセイに対し期待される用途の1つは、薬剤探索の高スループットスクリーニングである。HTSアッセイの重要な課題は、電圧指示薬の細胞内への導入が容易であることである。これらの実験に用いられる表面が修飾されたナノ粒子の一例として、リン脂質で被覆された量子ドットを選択した。
【０１３２】
この実験では、修飾されたナノ粒子(リン脂質で被覆したEviTag-T2(Evident Technologies社、米国ニューヨーク州トロイ)を、外部からA431細胞に導入した。ガラス製の18mm円形カバースリップに載せた細胞を、25〜500μg/mlの濃度のナノ粒子を含む細胞外溶液中で45〜60分間インキュベートした。
【０１３３】
インキュベーション後、カバースリップを、光学記録のためにCCDカメラを取り付けたZeiss Axiovert 100型顕微鏡に取り付けたspecial chamber 508SW(ALA Scientific Intruments社、米国ニューヨーク州ウェストバリー)に移した。上述の全細胞型パッチクランプの設定を前述のように確立後、電圧刺激実験を行った。
【０１３４】
細胞の刺激には以下の試験手順を用いた。膜電位を-70mVに設定した。細胞を+40mVにするのに必要な脱分極パルスを、細胞の内側に1〜2秒間印加し、その後膜電位を-70mVに戻した。
【０１３５】
細胞を電圧刺激している間、ナノ粒子の発光を、CCD Optronic Tec 470カメラ(Optronic Engineering社、米国カリフォルニア州ゴレタ)を用いて、記録した。電気生理学的刺激の効果を図2に示す。これらの実験条件化で試験した8個の細胞のうち、6個の細胞が、電圧刺激に対し、発光強度の過渡変化による応答を示した。
【０１３６】
これらの結果は、疎水性のリン脂質の被覆を有するナノ粒子が、細胞膜の内部または細胞膜上に局在化するため、細胞電位を読み出すことができる。この電圧感受性ナノ粒子の導入法は、高スループットスクリーニングのための細胞の調製方法として特に有利な手段を示すものである。
【０１３７】
実施例7：実施例1〜6の結果のまとめ
これらの結果は、ナノ粒子を、内蔵型の蛍光電圧指示薬として用いることができることを示している。ナノ粒子は、膜を横断する方向の電圧勾配の変化を直接光学的に検出するシステムとして用いることができる。導入法および表面修飾を最適化することにより、上述の方法におけるナノ粒子の有用性を更に改善することができる。
【０１３８】
実施例8：光学的に興奮した細胞からのパッチクランプ法による記録
発現したイオンチャンネルターゲットを有する細胞は、確立された細胞株の調製法を用いて調製することができる。ガラス製の18mm円形カバースリップに載せたCHOまたはA431細胞を、適当な濃度のナノ粒子を含む溶液中で15〜60分間室温でインキュベートする。インキュベーション後、カバースリップをPBS溶液で4回洗浄する。
【０１３９】
または、ガラス製のカバースリップまたはプレートのウェルを、ナノ粒子で予め被覆しておき、細胞をナノ粒子層の上に接種できるようにしておいてもよい。プレートのウェルを、適当な濃度のナノ粒子を含む溶液で満たす。プレートを、滅菌条件下で数時間保存してもよい。
【０１４０】
ナノ粒子を含む溶液を洗浄により除去した後、カバースリップを、special microscope chamber 508SW(ALA Scientific Intruments社、米国ニューヨーク州ウェストバリー)に移し、実験の間、EBSS緩衝溶液中に保持する。
【０１４１】
パッチクランプ実験のためのガラス製のマイクロピペットは、ホウケイ酸ガラス製のキャピラリー(1.2mm no-capillaryガラス)から、Sutter 2000(商標)ピペットプラー(model Sutter 2000、Sutter Instruments社、米国カリフォルニア州ナヴァト)を用い、予め記録されていたパッチピペット4段引きの手順を用いて引く。ピペット先端の開口径は、1.5〜2.2μmとなる。
【０１４２】
マイクロピペットを、140mMアスパラギン酸カリウム、5mM NaCl、および10mM HEPESを含む溶液(pH7.35)で満たす。電圧および電流は、Axopatch200Bパッチクランプ増幅器(Molecular Devices社、米国カリフォルニア州サニーベール)を用いて、室温で記録する。
【０１４３】
ギガシールの形成に成功した後、短時間のパルス状の吸引を行い、細胞膜を破砕し、最細胞パッチクランプ法の設定を完了させる。細胞の刺激には、以下の試験手順を用いる。短いパルスの励起光(レーザーまたは他の光源を用いて照射する)を用いて、パッチされた細胞を照射する。細胞膜を通した電圧または電流の変化を、全細胞パッチクランプ法で記録する。
【０１４４】
実施例9：光学的に励起させた細胞からの光学的記録
発現したイオンチャンネルターゲットを有する細胞は、確立された細胞株の調製法を用いて調製することができる。ガラス製の18mm円形カバースリップに載せたCHOまたはA431細胞を、適当な濃度の電位差検知用色素(半導体ナノ粒子を用いた電圧センサー等)と共に15〜60分間室温でインキュベートする。インキュベーション後、カバースリップをPBS溶液で4回洗浄する。
【０１４５】
第2工程では、供試細胞を、適当な濃度のナノ粒子を含む溶液中で15〜60分間室温でインキュベートする。インキュベーション後、カバースリップをPBS溶液で4回洗浄する。ナノ粒子を含む溶液を洗浄により除去した後、カバースリップを、顕微鏡のチャンバーに載せ、実験の間、EBSS緩衝溶液中に保持する。
【０１４６】
または、ガラス製のカバースリップまたはプレートのウェルを、ナノ粒子で予め被覆しておき、細胞をナノ粒子層の上に接種できるようにしておいてもよい。プレートのウェルを、適当な濃度のナノ粒子を含む溶液で満たす。プレートを、滅菌条件下で数時間保存してもよい。
【０１４７】
または、実験の最初に、細胞の懸濁液を、当別に調製した半導体ナノ粒子の懸濁液と共にインキュベートする。5〜60分間インキュベートした後、細胞をμタイタープレート(96、384、または836ウェルプレート等)のウェル中に分注する。実験のために、マイクロタイタープレートを顕微鏡のステージ上に載せる。
【０１４８】
電圧刺激は、短いパルスの励起光(レーザーまたは他の光源を用いて照射する)を用いて、細胞懸濁液を照射する事により行われる。ナノ粒子の発光を、コンピューターに接続した冷却式CCDカメラ(Optronics Tec 470(Optronic Engineering社、米国カリフォルニア州ゴレタ)、またはXR/MEGA-10Z(商標)fastカメラ(Stanford Photonics社、米国カリフォルニア州パロアルト))を用いて記録する。
【０１４９】
ナノ粒子の発光パターンの変化は、細胞表面の光励起されたナノ粒子による励起に対する細胞応答である。
【０１５０】
実施例10：ターゲット細胞のマイクロプレートのウェル中での第1の調製方法
官能基化されていないMaple Red EviTag-T2(Evident Technologies社、米国ニューヨーク州トロイ)またはストレプトアビジンで官能基化されたナノ粒子QD605(Quantum Dot社)を種々の濃度で含む溶液を、96ウェルマイクロプレート(Nunc社、デンマーク)に加えた。前処理されたプレートを、滅菌条件下で6時間保存し、溶液を乾燥させ、ウェルの底面にナノ粒子の層を残した。
【０１５１】
実験は、安定にM1ムスカリン作動性Gqタンパク質共役受容体を発現したCHO細胞上で行った。細胞の懸濁液をプレートに加え、二酸化炭素の存在下37℃で12〜24時間インキュベートした。
【０１５２】
インキュベーション後、浮遊した過剰な細胞およびナノ結晶が除去されるまで細胞を含むプレートをPBS溶液で洗浄した。洗浄により浮遊したナノ結晶がすべて除去されたことを目視により確認するために、プレートを顕微鏡下で目視により検査した。励起が裸眼により確認された場合には、洗浄処理を更に2回繰り返した。洗浄後、評価のため、プレートをPathwayNT screening station(BD Biosciences、米国カリフォルニア州サンホセ)に移した。
【０１５３】
実施例11：ターゲット細胞のマイクロプレートのウェル中での第2の調製方法
細胞を96ウェルプレートに捲種した。プレートは、底面がガラスのもの、またはL-リジンで被覆されたもの(Nunc社、デンマーク)のいずれかを用いた。Maple Red EviTag-T2ナノ粒子を、細胞を含む溶液に加えた。細胞を、ナノ粒子の存在下で15〜60分間インキュベートした。過剰なナノ粒子は全て洗浄により除去した。ナノ粒子で処理した細胞を含むプレートを、Pathway HT装置(BD Biosciences、米国カリフォルニア州サンホセ)の、環境により制御されたチャンバーの中に置いた。
【０１５４】
各ウェル中の細胞からの一連の画像の散りこみを、いくつかのセル毎に連続して、速度測定モードで行った。一連の画像のうち最初の10枚は、標識された細胞からの信号の安定性を確認するための対照画像として撮像した。ウェル中での塩化カリウム溶液の添加は、以下の工程により行った。塩化カリウム溶液の濃度として、塩化カリウム溶液の最終濃度が100mMとなり、細胞の膜電位を脱分極側にシフト(約0mVまで)させることができるような値を選択した。各ウェル中のナノ結晶で標識された細胞の脱分極刺激に対する光学的応答は、Pathway HT装置(BD Biosciences、米国カリフォルニア州サンホセ)を用いて記録した。
【０１５５】
分析後、MethaMorphソフトウェア(Molecular Devices社、米国カリフォルニア州サニーベール)を用いて、一連の画像を処理した。細胞膜の周辺または細胞外空間(対照)のいずれかより対象領域を選択した。
【０１５６】
実施例12：ハイコンテントスクリーニングにより検出した、細胞膜電位の変化に対する外部より導入したナノ粒子の感度
安定にM1ムスカリン作動性Gqタンパク質共役受容体を発現したCHO細胞を、底面がガラスの、またはポリL-リジンで被覆された96ウェルマイクロプレート(Nunc社、デンマーク)に捲種した。Maple Red EviTag-T2ナノ粒子を、細胞を含む溶液に加えた。細胞を、ナノ粒子の存在下で15〜60分間インキュベートした。過剰なナノ粒子は全て洗浄により除去した。ナノ粒子で処理した細胞を含むプレートを、Pathway HT(商標) screening station(BD Biosciences、米国カリフォルニア州サンホセ)の、環境により制御されたチャンバーの中に置いた。
【０１５７】
各ウェル中の細胞からの一連の画像の散りこみを、いくつかのセル毎に連続して、速度測定モードで行った。まず、数枚の一連の画像を、標識された細胞からの信号の安定性を確認するための対照画像として撮像した。次に、塩化カリウム溶液をウェルに加えた。塩化カリウム溶液の濃度として、塩化カリウム溶液の最終濃度が100mMとなり、細胞の膜電位を脱分極側にシフトさせることができるような値を選択した。各ウェル中のナノ結晶で標識された細胞の脱分極刺激に対する光学的応答は、Pathway HT(商標) screening station(BD Biosciences、米国カリフォルニア州サンホセ)を用いて記録した。
【０１５８】
実験後、MethaMorphソフトウェア(Molecular Devices社、米国カリフォルニア州サニーベール)を用いて、一連の画像を処理した。細胞膜の周辺または細胞外空間(対照)のいずれかより対象領域(ROI)を選択した。
【０１５９】
細胞外部から添加された塩化カリウムによる細胞の脱分極は、細胞からの光学的信号の過渡減少をもたらした。細胞外空間からの光学的信号も、若干の強度の減少を示すことに注意すべきである。しかし、塩化カリウムの細胞への添加効果は、それよりもはるかに高かった。例えば、1つの実験では、12個の細胞より得られた最大応答の変化は、349±56AUであったのに対し、細胞外空間における信号強度の変化は、わずか191±38AU(3ROI)であった。
【０１６０】
平均すると、バックグラウンドを差し引いた細胞の信号強度の減少は17.4±5.1％(実験数8)であった。図3は、高濃度の塩化カリウムへの曝露に対する、1つのウェル中のいくつかの細胞からの発光強度の過渡変化の一例を示す。
【０１６１】
これらの結果は、細胞膜に会合したナノ粒子から放出される光学的信号の強度の変化は、膜電位の変化を反映しており、ナノ粒子が細胞膜電位のセンサーとして作用しうることを証明するものである。
【０１６２】
本明細書で開示され、特許請求の範囲に記載された全ての組成物および/または方法および/またはプロセスおよび/または装置は、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく製造し、実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施態様に関して説明されているが、本明細書に記載の組成物および/または方法および/または装置および/またはプロセスならびに方法における工程および工程の順序には、本発明の主題および範囲を逸脱することなく変更を加えることができることは、当業者にとって明白である。より具体的には、化学的におよび生物学的に関連するある試薬を、本明細書に記載の試薬の代わりに用いてもよく、それによって同一のまたは同様の結果が得られることは明白である。このような同様の置換および改変は、当業者にとって明白であり、本発明の範囲および主題に含まれるとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
以下の図面は、本明細書の一部をなし、本発明の具体的な態様をより具体的に示すために本明細書に組み込まれる。これらの図面のうち1つまたは複数を、本明細書に示す特定の実施形態に関する詳細な説明と共に参照することにより、本発明をより深く理解することができる。
【図１】細胞内部にナノ粒子を含む細胞に対する電気生理学的刺激の効果を示す。上のトレースは、パッチクランプ法による膜電位差の変化に対する細胞内に存在する半導体ナノ結晶の蛍光強度の変化を示す。x軸は時間(秒)を表し、y軸は任意単位を表す。半導体ナノ結晶は、パッチピペットを介して細胞内に導入した。下部の出力波形は、同じ時間スケールで示した、対応する電圧刺激の手順を表す。
【図２】細胞内部に脂質で修飾したナノ粒子を含む細胞に対する電気生理学的刺激の効果を示す。上部の出力波形は、3つの対象領域(2個の細胞およびバックグラウンド)より得られた、パッチクランプ法による膜電位差の変化に対する、細胞内に存在するリン脂質で官能基化した半導体ナノ結晶の蛍光強度の変化を示す。第1の細胞には電圧刺激が加えられたが、第2の細胞には、電圧刺激が加えられなかった。半導体ナノ結晶は、細胞膜の細胞外側に導入した。下部の出力波形は、同じ時間スケールで示した、対応する電圧刺激の手順を表す。
【図３】高濃度の塩化カリウム(100mM)の添加による細胞内の過渡変化をモニターした結果を示す。円、菱形、三角形、および正方形は、異なる対象領域(ROI)を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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