(57)【要約】  カハラリド化合物類の新規な合成方法を提供する。これらは、オルトゴナルな保護スキームを用いる収束アプローチに基づいていて、中間体の制御がより良く行われる。カハラリドＦまたはカハラリドＦ模倣体を、例えば反応（１）にしたがって、環状部分を側鎖フラグメントとカップリングさせることにより合成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状部分を側鎖フラグメントとカップリングさせる工程を含む、カハラリドＦまたはカハラリドＦ模倣体の合成方法。
【請求項２】
前記環状部分が、側鎖のアミノ酸の少なくとも１個を既に含んでいる、請求項１に記載の合成方法。
【請求項３】
得られる化合物が、以下の式：
【化１】
2008506633.tif 000009
で示されるカハラリドＦである、請求項１または２に記載の合成方法。
【請求項４】
得られる化合物が、カハラリドＦの模倣体であり、構造的に、カハラリドＦに合致しているが以下の点：
−１から７個、特に１から３個、より特別には１または２個、とりわけ１個のアミノ酸が、親化合物のアミノ酸と同じではない点；
−１から１０個、特に１から６個、より特別には１から３個、とりわけ１または２個の付加的なメチレン基が、親化合物の側鎖のアシル基に存在する点；
−１から１０個、特に１から６個、より特別には１から３個、とりわけ１または２個のメチレン基が、親化合物の側鎖のアシル基から省略されている点；
−１から６個、特に１から３個、より特別には１または３個の置換基が、親化合物の側鎖のアシル基に付加されている、または親化合物の側鎖のアシル基から省略されている点；
−5-メチル置換基が、前記側鎖のアシル基から省略されている点；および、
−前記側鎖のアシル基が省略されている点、
の１つ以上において異なっている、請求項１または２に記載の合成方法。
【請求項５】
得られる化合物が、側鎖の末端に4(S)-メチルヘキサノイル基を有する、請求項４に記載の合成方法。
【請求項６】
前記環状部分と側鎖フラグメントとの間のカップリングが、D-Pro-9とL-Orn-8との間で起こる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項７】
前記環状部分と側鎖フラグメントとの間のカップリングが、L-Orn-8 と D-Allo-Ile-7 との間で起こる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項８】
前記環状部分と側鎖フラグメントとの間のカップリングが、D-Val-10とD-Pro-9との間で起こる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項９】
前記環状部分と側鎖フラグメントとの間のカップリングが、D-Allo-Ile-7 と D-Allo-Thr-6 との間で起こる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項１０】
前記環状部分と側鎖フラグメントとの間のカップリングが、L-Val-11とD-Val-10との間で起こる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の合成方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、カハラリド化合物類および関連化合物の新規な合成経路を対象とする。
【背景技術】
【０００２】
カハラリド化合物類は、ハワイの草食性海洋種である軟体動物Elysia rufescensと、その餌である緑藻Bryopsis種から単離されたペプチド類である。カハラリドＦは、Hammanら、J. Am. Chem. Soc.、1993、115、5825-5826に記載されている。
【０００３】
カハラリドＡ〜Ｇは、Hamann, M.ら、J. Org. Chem、1996、61、6594-6600: 「Kahalalides: bioactive peptides from a marine mollusk Elysia rufescens and its algal diet Bryopsis sp.」に記載されている。カハラリドＦは、以下の構造を有する：
【化１】
2008506633.tif 000002
【０００４】
カハラリドＨおよびカハラリドＪは、Scheuer P.J.ら、J. Nat. Prod. 1997、60、562-567: 「Two acyclic kahalalides from the sacoglossan mollusk Elysia rufescens」に記載されている。
【０００５】
カハラリドＯは、Scheuer P.J.ら、J. Nat. Prod. 2000、63(1) 152-4: 「A new depsipeptide from the sacoglossan mollusk Elysia ornata and the green alga Bryopsis species」に記載されている。
【０００６】
カハラリドＫについては、Kan, Y.ら、J. Nat. Prod. 1999 62(8) 1169-72: 「Kahalalide K: A new cyclic depsipeptide from the Hawaiian green alga bryopsis species」を参照されたい。
【０００７】
関連の報告については、Goetzら、Tetrahedron、1999、55; 7739-7746: 「The absolute stereochemistry of Kahalalide F」; Albericio, F.ら、Tetrahedron Letters、2000、41、9765-9769: 「Kahalalide B. Synthesis of a natural cyclodepsipeptide」; Becerroら、J. Chem. Ecol. 2001、27(11)、2287-99: 「Chemical defenses of the sarcoglossan mollusk Elysia rufescens and its host Alga bryopsis sp.」も参照されたい。
【０００８】
カハラリド化合物類のうち、カハラリドＦおよびその類似体（下記式１）はその抗腫瘍活性から最も期待されているものである。その構造は、複雑であり、環状部分としての６個のアミノ酸と、末端の脂肪族系酸／脂肪酸基を有する７個のアミノ酸の環外鎖とを含んでいる。
【化２】
2008506633.tif 000003
【０００９】
より興味深い活性の化合物として、Ｒが5-メチルヘキサノイル基であるもの、またはＲが4(S)-メチルヘキサノイル基である異性体がある。
【００１０】
カハラリドＦの、ヒト肺癌Ａ−５４９およびヒト結腸癌ＨＴ−２９のin vitroでの細胞培養物に対する活性については、欧州特許第６１００７８号に報告されている。また、カハラリドＦは、乾癬の処置に有効であるだけでなく、抗ウイルス性および抗真菌性も有することが証明されている。
【００１１】
国際公開第０２／３６１４５号には、カハラリドＦを含有する医薬組成物および癌治療におけるこの化合物の新規な用途が記載されている。なお、この出願は参照によりその全体を本明細書に援用する。
【００１２】
国際公開第０３／３３０１２号には、カハラリド化合物の腫瘍学における臨床使用が記載されている。なお、この出願は参照によりその全体を本明細書に援用する。
【００１３】
天然および合成のカハラリド化合物類の合成と細胞障害活性は、国際公開第０１／５８９３４号に記載されている。なお、この出願は参照によりその全体を本明細書に援用する。国際公開第０１／５８９３４号には、カハラリドＦの合成について、および、類似構造を有する模倣化合物（アミノ酸が他のアミノ酸で置き換えられた、あるいは末端脂肪酸鎖が他の脂肪酸で置き換えられた化合物）の合成についても記載されている。特に、下記スキーム： 
【化３】
2008506633.tif 000004
（式中、種々の基は、国際公開第０１／５８９３４号において付与された意味を持つ）
に従った、カハラリドＦ（Ｉ）および誘導体および類似体の固相合成が記載されている。固相合成は、部分的に保護された開鎖化合物を生成するために採用され、開鎖化合物はその後、切断され、環化され、さらに脱保護される。
【００１４】
国際公開第２００４／０３５６１３号は、上述した4(S)-メチルヘキサノイル異性体および他の化合物に関する。
【００１５】
国際公開第２００５／０２３８４６号には、カハラリドＦの類似構造を有するさらなる模倣体（アミノ酸が他のアミノ酸で置き換えられた、あるいは末端脂肪酸鎖が他の脂肪族系酸／脂肪酸で置き換えられた化合物）の合成が記載されている。ここでは、国際公開第０１／５８９３４号の合成経路が使われている。国際公開第２００５／０２３８４６号は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【特許文献１】国際公開第０１／５８９３４号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０２３８４６号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
カハラリド化合物類の合成経路の提供が、依然として求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明者らは、カハラリド類似体の合成のための、いくつかの新規な改良経路を見出した。以前の戦略は、部分的に保護されたカハラリドの開鎖の逐次的固相合成、その後に続く溶液中で行われる環状化反応、および、最終的なこれも溶液中での保護基の除去、に基づいていた。
【００１８】
新規な経路は、より多くの反応を溶液中で行い、したがって中間体の特徴付けをより多く行って、中間体の制御をより良く行う収束アプローチに基づいている。
【００１９】
本発明は、元となる親化合物の新規な類似体の合成方法も対象とする。
【００２０】
このように、本発明は、天然のカハラリド類、特にカハラリドＦ、および天然のカハラリド類の模倣体の合成経路を提供する。この模倣化合物は、１個以上のアミノ酸、および／または１個以上のアシル側鎖の構成要素において異なっていてよい。
【００２１】
適切には、本発明の模倣体は、元となる天然に存在するカハラリドと区別するための以下の点を少なくとも１つ有する：
−１から７個、特に１から３個、より特別には１または２個、とりわけ１個のアミノ酸が、親化合物のアミノ酸と同じではない点；
−１から１０個、特に１から６個、より特別には１から３個、とりわけ１または２個の付加的なメチレン基が、親化合物の側鎖のアシル基に存在する点；
−１から１０個、特に１から６個、より特別には１から３個、とりわけ１または２個のメチレン基が、親化合物の側鎖のアシル基から省略されている点；
−１から６個、特に１から３個、より特別には１または３個の置換基が、親化合物の側鎖のアシル基に付加されている、または親化合物の側鎖のアシル基から省略されている点；
−5-メチル置換基が、前記側鎖のアシル基から省略されている点；および、
−前記側鎖のアシル基が省略されている点。
【００２２】
とりわけ、本模倣体は、カハラリドＦとして知られている異性体混合物ではない、カハラリドＦの一誘導体であることが好ましい。このような誘導体は、式（Ｉ）：
【化４】
2008506633.tif 000005
から派生する環状部分と側鎖部分とを有する構造を持っていてよい。
この誘導体は、以下の点の１つ以上において式（Ｉ）と異なる：
−１または２個のアミノ酸が、式（Ｉ）の構造中のアミノ酸と同じではない点；
−１から１０個の付加的なメチレン基が、式（Ｉ）の構造の側鎖のアシル基に存在している点；
−１から５個のメチレン基が、式（Ｉ）の構造の側鎖のアシル基から省略されている点；
−１から３個の置換基が、式（Ｉ）の構造の側鎖のアシル基に付加されている点；
−5-メチル置換基が、前記側鎖のアシル基から省略されている点；および、
−前記側鎖のアシル基が省略されている点。
【００２３】
例えば、本化合物は、以下の点の１つ以上において式（Ｉ）と異なる：
−１個のアミノ酸が、式（Ｉ）の構造中のアミノ酸と同じではない点；
−１個の付加的なメチレン基が、式（Ｉ）の構造の側鎖のアシル基に存在する点；
−１個のメチレン基が、式（Ｉ）の構造の側鎖のアシル基から省略されている点；
−１個の置換基が、式（Ｉ）の構造の側鎖のアシル基に付加されている点；
−5-メチル置換基が、前記側鎖のアシル基から省略されている点。
【００２４】
この１個または２個の、式（Ｉ）の構造中のアミノ酸と同じではないアミノ酸は、省略されたアミノ酸であってよい。構造中の環状部分からの省略があってもよい。
【００２５】
１つの態様において、各アミノ酸は、式（Ｉ）のアミノ酸と同様である。その側鎖は、5-MeHex-D-Val-L-Thr-L-Val-D-Val-D-Pro-L-Orn-D-allo-Ile の同族体であってよい。例えば、5-MeHex は、末端の、アルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、ヘテロアルキル、または脂環式基、特に末端アルキル基で置き換えられてよい。このような基は、４個から１０個の炭素原子を有していてよい。末端アルキル基は、適切には、分子の残りの部分への結合位置の遠位で分枝している、１個以上のメチル基またはエチル基、好ましくは単一の分枝メチル基を有する。
【００２６】
末端アルキル基は、１個以上の、ハロゲン、ヒドロキシ、アルコキシ、アミノ、カルボキシ、カルボキサミド、シアノ、ニトロ、アルキルスルホニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アリールアルキルアリール、複素環、脂環式、アリール、アラルキル基で置換されていてよい。
【００２７】
置き換えられた末端基において鏡像異性が存在していてよく、本発明は、個々の異性体だけでなく、ラセミ混合物を含むそれらの混合物も包含する。
【００２８】
好適な定義および典型的な化合物のさらなる詳細は、参照により本明細書に援用されている、国際公開第０１／５８９３４号および国際公開第２００５／０２３８４６号の本文に記載されている。本発明者らは、現在のところ、側鎖中の末端アシル基として、5-メチルヘキサノイル、4-メチルヘキサノイル、またはとりわけ4(S)-メチルヘキサノイルを選択している。特に、カハラリドＦとして上述した式の模倣体であるが4(S)-メチルヘキサノイル基を有するものが好ましい。
【００２９】
本発明の方法は、環状部分を側鎖フラグメントとカップリングさせる工程を含む。この環状部分は、それ自体、少なくとも１個の側鎖アミノ酸を含んでいてよい。あるいは、側鎖フラグメントは、所望の化合物の完全な側鎖に相当していてよい。
【００３０】
環状部分は、カハラリドＦまたは上述した模倣体の環状部分であることが好ましく、所望の化合物の側鎖に存在するアミノ酸を１個以上含んでいてよい。カップリングの直接生成物は、任意に、所望の最終生成物（カハラリドＦまたは模倣体）の保護された形態であることが好ましい。したがって、好ましい反応は、カップリング工程、および所望の化合物を与えるその次の脱保護工程からなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、カハラリド化合物類への新規な合成経路を発見した。これらは、オルトゴナルな保護スキームを用いる収束アプローチに基づいていて、中間体の制御がより良く行われる。
【００３２】
収束的な戦略は、ペプチドフラグメントを互いに連結して所望の目標分子を生成する戦略として定義される。ペプチドフラグメントを縮合することにより、中間体の単離および精製においてより問題が少なくなるはずである。所望の縮合生成物と断片自体との間の（分子の大きさおよび化学的性質の点での）相違は、これらの比較的容易な分離を可能にするのに十分に顕著であるはずである（Lloyd- Williams, P.; Albericio, F.; Giralt, R. "Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins". CRC Press. Boca Raton (FL), 1997）。
【００３３】
オルトゴナルな保護スキームは、各クラスの基が、任意の順番で、他の種類の保護基のいずれの存在下でも除去可能であるような、完全に異なる種類の保護基に基づくスキームとして定義されている（Barany, G.; Albericio, F. J. Am. Chem. Soc, 107, 4936 (1985)）。
【００３４】
保護されたペプチドの合成は、溶液中および／または固相で行うことができ、軟体動物または藻類のいずれかから単離された、あるいは発酵により得られた、天然のカハラリドＦからも同様に調製できる。保護されたペプチドの組み立ては、溶液中で行うことが好ましい。中間体は全て特性決定し、必要に応じて精製することができる。
【００３５】
本発明に包含される戦略の例を、以下のスキームＩに示す：
【化５】
2008506633.tif 000006
（式中、AAAは、脂肪族系酸／脂肪酸、または脂肪族系酸／脂肪酸アシルアミノ、またはペプチドであり、BBB、CCC、DDDおよびEEEは、アミノ酸またはペプチドである。アミノ酸は、独立して、L-配置またはD-配置の天然または非天然アミノ酸から選択され,
適用する場合、CCCは、ペプチドEEEのC-末端アミノ酸のカルボキシル官能基と共有結合（好ましくはエステル、チオエステル、またはアミド）を形成することができる３官能性のアミノ酸を含む。CCC、DDDおよびEEEは、環の一部を形成し、この工程は環外鎖を延長する工程を含む。
【００３６】
好ましい態様において、本発明は、環外鎖のアミノ酸BBBを、CCC、DDDおよびEEEが環を形成する化合物の環状部分に付加する工程からなる合成戦略を含む。アミノ酸は、一個ずつ、または、末端脂肪族系酸／脂肪酸であるAAAを含む２個以上のアミノ酸を含むフラグメントで付加することができる。
【００３７】
好ましい合成においては、２つのフラグメントは、例えば固相合成を用いて、別々に構築され、１つのフラグメントは任意選択で１個以上の側鎖アミノ酸を有する環状部分を少なくとも含み、１つのフラグメントは１個以上の側鎖アミノ酸に結合した末端の酸を少なくとも含む。フラグメントは、固相から切断して連結することができる。
【００３８】
とりわけ、式（Ｉ）の化合物の合成を考慮することができる：
【化６】
2008506633.tif 000007
（式中、ＲＣＯは末端アシル基であり、Ｒは、好ましくは分枝アルキル基、特に、単一のメチル分枝を有する、６個〜８個の炭素原子のアルキル基である）。
ＲＣＯの例は、5-メチルヘキサノイルまたは4(S)-メチルヘキサノイルである。
【００３９】
最も好ましい戦略は、D-Pro-9 とL-Orn-8 との間を連結する工程を含む。可能な他の候補戦略として、例えば、L-Orn-8 と D-Allo-Ile-7、D-Val-10とD-Pro-9、D-Allo-Ile-7 と D-Allo-Thr-6、またはL-Val-11とD-Val-10 等がある。
【００４０】
いずれの分子のカップリングの後でも、所望の最終化合物を得るために、さらに脱水反応および脱保護反応を行うことができる。
【００４１】
環状部分を含むフラグメントを生成させるための別の可能性は、天然のＫＦから出発し、これをトリプシンで処理する（トリプシンはOrnで切断する）ことである。したがって、天然のフラグメントと非天然のフラグメント（アシル基を有するフラグメント）とを用いてカップリングを行うことができる。
【００４２】
本発明の合成方法の好ましい実施態様は、スキームＩＩに最も良く表され、これは4(S)-メチルヘキサン末端酸を有する目標化合物の形成に向けられている。
【００４３】
【化７】
2008506633.tif 000008
【００４４】
カハラリド類似体の経済的で安全な合成のために最適化した方法の主要な工程では：(i)２個の保護ペプチドをクロロトリチルクロロ-ポリスチレン樹脂または関連する樹脂上に合成し；(ii)Ｎ末端保護ペプチドにおけるＣ末端残基は、カップリング反応中に最もラセミ化する傾向が小さいProであり；(iii)両保護ペプチドの逐次合成に関しては、保護されたアミノ酸および脂肪族系カルボン酸を逐次的に組み込むために、HATU-DIPEAの代わりにDIPCDI-HOBtのカップリング方法を用い；(iv) 最終生成物中にPd(0)が存在するのを防止するためAlloc除去後にジエチル-ジチオカルバミン酸ナトリウムを使用し；(v) 環化工程では、CH2Cl2中におけるDIPCDI/HOBt/DIPEAを用い（これらの条件は２つの副反応、活性化に伴うVal残基のエピマー化、および、Pheまたはその置換体のトリフルオロアセチル化を回避する）；(vi)Fmoc基の除去は、環状部分を変化させないような条件で行い；(vii)必要に応じて、両保護ペプチドを精製し；(viii)両保護ペプチドをPyAOP/DIEAを用いてカップリングする。
【００４５】
上のスキームＩＩに示すように、カハラリドＦ類似体を合成的形成のための好ましい方法は、Fmoc/tBu 戦略に基づくオルトゴナルな保護スキーム（例えば、Lloyd- Williams, P.らの「Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins」CRC Press, Boca Raton (FL), 1997 を参照）を用いる、収束的な、固相法（保護フラグメント合成）および溶液法（環化、フラグメントの縮合、および最終的な脱保護）に基づいている。
【００４６】
スキームＩＩの方法は以下の逐次的工程を含む：
〔保護フラグメントＩ〕
(a)クロロトリチルクロロ樹脂上にFmoc-D-Val-OHを組み込み、エステル結合を形成し；
(b)Fmoc/tBu戦略を用い、３個のアミノ酸［DaIle,DaThr(遊離OH),DaIle］によりペプチド鎖を延長し；
(c)Allocを保護基として用いて［Val(1)］を組み込み；
(d)Fmoc-Orn(Boc)-OHを組み込み；
(e)溶液中で結合し脱水した、ジペプチドAlloc-Phe-ZDhb-OHを組み込み；
(f)Alloc基またはその代替を除去する一方で、ペプチドはまだ固体支持体に結合させておき；
(g)固体支持体から側鎖の保護ペプチドを切断し；
(h)溶液中でペプチドを環化し；
(i)OrnのFmoc基を除去する。
【００４７】
あるいは、保護フラグメントを以下から出発して合成することができる：
(a’) 溶液中で結合し脱水した、Alloc-Phe-ZDhb-OHをクロロトリチルクロロ樹脂上に組み込み、エステル結合を形成し；
(b’) ５個のアミノ酸［Fmoc- DVaI-OH, Fmoc-Dalle-OH, Fmoc-DaThr-OH (遊離 OH), Fmoc-Dalle-OH, および Alloc-Orn(Boc)-OH］によりペプチド鎖を延長し；
(c’) Fmocを保護基として用いて［Val(1)］を組み込み；
(d’) Fmoc基を除去する一方で、ペプチドはまだ固体支持体に結合させておき；
(e’) 固体支持体から側鎖の保護ペプチドを切断し；
(g’) 溶液中でペプチドを環化し；
(h’) OrnからAlloc基を除去する。
【００４８】
この代替的な戦略には以下の利点がある：
(i) クロロトリチルクロロ樹脂上への組み込みは、保護されたビルディングブロックが完全に取り込まれるものではない（欠陥が生じる）ため、高価なAlloc-Phe-ZDhb-OHの使用量が第一の戦略と比較してより少なく、
(ii) Fmoc -Phe-ZDhb-OHを合成する（Pd処理を回避する）ことができ、
(iii)環状化反応中のラセミ化を最小化または排除し、かつ、
(iv) Alloc基を除去（工程(h’)）するために使用したPd(0)へのサイクルが安定である。
【００４９】
〔保護フラグメントＩＩ〕
(a) クロロトリチルクロロ樹脂上にFmoc-DPro-OHを組み込み、エステル結合を形成し；
(b) Fmoc/tBu戦略を用いてペプチド鎖を延長し；
(c) 固体支持体から側鎖の保護ペプチドを切断する。
【００５０】
〔最終工程〕
(i)フラグメントを縮合し、
(ii)最終的な脱保護をする。
【００５１】
したがって、本方法は、以下のように行うことができる。
【００５２】
Alloc-Phe-OH および H-Thr-OtBuからEDC HClを用いて溶液中で合成した後、あらかじめ脱水し、TFAで処理した、 Fmoc-DVal-OH または Alloc-Phe-ZDhb-OHを、好ましくはクロロトリチルポリスチレン樹脂に組み込む（Barlos, K.; Gatos, D.; Schafer, W. Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 1991, 30, 590〜593頁参照）。
【００５３】
Fmoc基の除去は、ピペリジン-DMF（２：８、ｖ／ｖ）により行うことができる（１×２分、２×１０分）。Fmoc-aa-OH（４〜５当量）（aa はアミノ酸を意味する）のカップリングはDIPCDI-HOBt（カルボン酸成分に対しそれぞれ等モル量）またはPyBOP-DIPEA（等モル量のPyBOPおよび２倍量のDIPEA）を用い、DMFまたはDMF-トルエン（１：１）中、９０分間で行うことができる。カップリング後、ニンヒドリンまたはクロラニル試験を行い、陽性の場合は同一の条件でカップリングを繰り返すか、工程を継続する。脱保護、カップリング、および再度の脱保護の工程の間に、DMF（５×０．５分）およびCH2Cl2（５×０．５分）で、例えば各回に溶媒を１０ｍＬ／ｇ樹脂使用して洗浄することができる。
【００５４】
Alloc-Val-OH（５当量）の組み込みは、等モル量のDIPCDIおよび１０％のDMAPを用いて行うことができる。このカップリングは少なくとも２回繰り返す。
【００５５】
Alloc基の除去はPhSiH3（１０当量）の存在下、Pd(PPh3)4（０．１当量）を用いて行うことができ（Gomez-Martinez, P.;Thieriet, N.; Albericio, F.; Guibe, F. J. Chem. Soc. Perkin I 1999, 2871〜2874頁参照）、樹脂をDMF中のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム０．０２Mにより洗浄する（３×１５分）。
【００５６】
第一の戦略において、ジペプチドAlloc-Phe-ZDhb-OH（４当量）を、DIPCDI-HOAt（それぞれ４当量）を用いて５時間から一晩で、樹脂に固定されたVal(1)残基に連結することができる。
【００５７】
樹脂からの保護ペプチドの切断は、TFA-CH2Cl2（１：９９）により行うことができる（５×３０秒）。
【００５８】
環状化工程は、CH2Cl2中、DIPCDI/HOBt/DIPEAにより行うことができる。これらの条件は２つの副反応：活性化に伴うVal残基のエピマー化、および、Pheまたはその置換体のトリフルオロアセチル化を回避する。
【００５９】
第一の戦略において、２０当量のジメチルアミンを用いてOrn残基からFmoc基を除去することにより、環状部分の開環を最小限にすることができる。
【００６０】
フラグメントの縮合は、PyAOP-DIPEA（等モル量のPyAOPおよび３当量のDIPEA）を用いて行うことができる。１時間後に、もう１当量のPyAOPを使用する（縮合が完結するまで）。
【００６１】
最終の脱保護は、TFA-H2O（９５：５）を用いて１時間で行うことができる。
【００６２】
保護基の特別な選択は重要でなく、他の選択が広く可能であることが理解されよう。例えば、Bzl型の基をtBu/Bocに置き換えることができ；Fmocの代わりにBocに；OrnのFmocの代わりにpNZに； Allocの代わりにFmocに；Fmocの代わりにAllocに；クロロトリチルの代わりにWang樹脂に置き換えることができる。これらの保護基および樹脂は、Greene and Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley 8s Sons, Inc, New York, 1999、および、Goodman,M. ed. Houben-Weyl, Methods of Organic Chemistry, Vol. E 22A, Synthesis of Peptides and Peptidomimetics, Thieme, Stuggart-New York, 2001 に記載されている。
【００６３】
合成についてのさらなる詳細は、実施例に記載する。
【００６４】
本発明の方法は、構築される分子がすべての合成操作中において不溶性支持体に結合される固相合成法を利用して、出発物質から、エナンチオ-制御および立体制御され、かつ迅速な手段により実施することができる。
【実施例】
【００６５】
（一般的手順）
Cl-TrtCl-樹脂、保護されたFmoc-アミノ酸誘導体、HOBt、HOAtは、ABI(Framingham, MA)、Bachem(Bubendorf, Switzerland)、NovaBiochem(Laufelfingen, Switzerland)、およびIRIS Biotech (Marktredwitz, Germany)から、入手した。4(S)-MeHex誘導体はNarchemから入手した。
【００６６】
Alloc-アミノ酸は基本的にDanglesらによる記載（J. Org. Chem. 1987, 52, 4984〜4993頁参照）およびCruz らによる記載 (Org. Proc. Res. Develop. 2004, 8, 920-924頁参照)に従って調製した。Alloc-Z-Dhb-Phe-OHは国際公開第０１／５８９３４号の記載に従って調製し、DIPEA、DIPCDI、EDC-HCl、ピペリジン、TFAはアルドリッチ(Milwaukee, WI)から入手した。DMFおよびCH2Cl2はSDS(Peypin, France)から入手した。ACN(HPLCグレード)はScharlau(Barcelona, Spain)から入手した。すべての市販試薬および溶媒は、CH2Cl2を除き入荷したものを用い、CH2Cl2は酸性不純物を除くためアルミナカラムを通した。
【００６７】
固相合成は、ポリエチレン多孔性ディスクが取り付けられたポリプロピレンシリンジ（１０〜５０ｍＬ）内で行った。溶媒および可溶性試薬は吸引濾過により除去した。Fmoc基の除去はピペリジン-DMF（２：８、ｖ／ｖ）を用いて行った(１×２分、２×１０分)。脱保護、カップリング、再度の脱保護工程の間の洗浄は、各回に溶媒を１０ｍＬ／ｇ樹脂用いて、DMF（５×０．５分）およびCH2Cl2（５×０．５分）で行った。ペプチド合成の転換および洗浄は２５℃で行った。固相上で行われる合成は、一定量（約２ｍｇ）のペプチジル樹脂をTFA-H2O（１：９９）で１分間切断した後に得られた中間体のＨＰＬＣにより制御した。ＨＰＬＣ逆相カラムSymmetry(登録商標)C18  4,6x150mm、5μm(カラムＡ)、およびSymmetry300(登録商標)C18  4,6x50mm、5μm(カラムＢ)はWaters(Ireland)から入手した。分析用ＨＰＬＣは、２つの溶媒吐出ポンプ(Waters 1525)、自動注入装置(Waters 717 自動試料採取装置)、二波長検出器(Waters 2487)、およびシステムコントローラ(Breeze V3.20)を備えたWaters装置、ならびに、２つの溶媒吐出ポンプ(G1311A)、自動注入装置(G1329A)、DAD(G1315B)を備えたAgilent 1100装置により行った。ＵＶ検出は、２１５ｎｍまたは２２０ｎｍにおいて、CH3CN(+0.036%TFA)の水(+0.045%TFA)中への直線的勾配(linear gradient)（１５分間で３０％から１００％まで）で行った。
ペプチド試料のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析およびＥＳ−ＭＳ分析は、ACHマトリックスを用いたPerSeptive Biosystems Voyager DE RP、ならびにWaters Micromass ZQスペクトロメータおよびAgilent Ion Trap 1100 Series LC/MSDTrapにより行った。ペプチド-樹脂試料は１２Ｎ HCl水溶液-プロピオン酸（１：１）中、１５５℃で１〜３時間加水分解し、ペプチドを有しない試料は６Ｎ HCl水溶液中、１５５℃で１時間加水分解した。その後のアミノ酸分析はBeckman System 6300自動分析装置により行った。
【００６８】
環状ペプチドおよび前駆体に用いる命名法は、Spenglerらによる記載に従った（Spengler J., Jimenez J.C., Burger K., Giralt E., Albericio, F. "Abbreviated nomenclature for cyclic and branched homo- and hetero-detic peptides". J. Peptide Res. 2005, on line publication: 13-Apr-2005参照）。記号「&」を、環状のペプチドおよび前駆体の命名において使用した。一行の化学式の所与の位置に現れる「&」は、化学結合の一方の末端が所在する位置を表し、二番目の「&」は、この結合が付く位置を示す。したがって、「&」は、複雑な化学式をより簡単に視覚化する目的で、「切断」された化学結合の開始または終わりを表す。このように、２つの記号「&」は、１つの化学結合を表す。
【００６９】
［実施例１］：Fmoc-Orn(Boc)-OHからの[H-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D- allo-Ile-D-Val-OH][H-Phe- (Z)Dhb-Val&]
【００７０】
〔工程１〕：H-D-Val-O-TrtCl-樹脂
Cl-TrtCl-樹脂(1g、1.64mmol/g)をポリエチレンフィルターディスクを取り付けた20mLのポリプロピレンシリンジ内に設置した。次に樹脂をCH2Cl2で洗浄し(5x0.5分)、Fmoc-D-Val-OH(238mg、0.7mmol、0.43当量)およびDIPEA(0.41mL)のCH2Cl2(2.5mL)溶液を加え、混合物を15分間撹拌した。その後、追加のDIPEA(0.81mL、合計で7mmol)を添加し、混合物をさらに45分間撹拌した。反応は、MeOH(800μL)の添加により、10分間撹拌した後に終了した。Fmoc-D-Val-O-TrtCl-樹脂を、CH2Cl2(3x0.5分)、DMF(3x0.5分)、一般的手順の記載に従ったピペリジン、およびDMF(5x0.5分)で洗浄／処理した。Fmoc測定により算出されたローディング量は0.50mmol/gであった。
【００７１】
〔工程２〕：[Fmoc-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂] [Alloc-Val&]
Fmoc-D-allo-Ile-OH(707mg、2mmol、4当量)、Fmoc-D-allo-Thr-OH(遊離の水酸基)(683mg、2mmol、4当量)、およびFmoc-D-allo-Ile-OH(707mg、2mmol、4当量)を、DMF(2.5mL)中のDIPCDI(310μL、2mmol、4当量)およびHOBt(307mg、2mmol、4当量)を用いて、上述により得られたH-D-Val-O-TrtCl-樹脂に順次加えた。すべての場合において、90分間のカップリング後、ニンヒドリン試験は陰性であった。Fmoc基の除去および洗浄は、一般的手順の記載に従って行った。Alloc-Val-OH(502mg、2.5mmol、5当量)は、DMAP(30.6mg、0.25mmol、0.5当量)およびDIPEA(88μL、0.5mmol、1当量)の存在下、45分間DIPCDI(387mg、2.5mmol、5当量)とカップリングさせた。このカップリングは同一の条件で２回繰り返した。ペプチジル-樹脂の一定量をTFAで処理し、蒸発後に得られた粗生成物のHPLC(tR14.2分、カラムＡ)は、98%より高い純度を示した。
ESMS、C45H63N5O11に対する計算値は、849.45である。実測値:m/z 850.1[M+H]+ , 871.9 [M+Na]+。
【００７２】
〔工程３〕：[Fmoc-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂] [Alloc-Val&]
上述のペプチジル-樹脂（工程２）のFmoc基を除去し、Fmoc-Orn(Boc)-OH(912mg、2mmol、4当量)を、DIPCDI(2.0mmol、4当量に対し310μL;2.5mmol、5当量に対し388μL)およびHOBt(2.0mmolおよび4当量に対し307mg;2.5mmol、5当量に対し395mg)を用いて、９０分の間加えた。組み込み後のニンヒドリン試験は陰性であった。ペプチジル-樹脂の一定量をTFAで処理し、蒸発後に得られた粗生成物のHPLC(tR12.8分、カラムＡ)は、90%の純度を示した。
ESMS、C56H81N7O14に対する計算値は、1,063.58である。実測値:m/z 1,086.77 [M+Na]+。
【００７３】
〔工程４〕：[Fmoc-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-O-TrtCl-樹脂] [Alloc-Phe-ZDhb-Val&]
上述のペプチジル-樹脂（工程３）のAlloc基を、PhSiH3(617μL、5mmol、10当量)の存在下でPd(PPh3)4(58mg、0.05mmol、0.1当量)により除去した後、ジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム0.02Mにより洗浄した（3x15分）。Alloc-Phe-Z-Dhb-OH(666mg、2mmol、4当量)およびHOAt(273mg、2mmol、4当量)をDMF(1.25mL)中に溶解し、ペプチジル樹脂に加えた。次いでDIPCDI(310μL、2mmol、4当量)を加え、混合物を５時間撹拌したところ、ニンヒドリン試験は陰性であった。DMFおよびCH2Cl2により洗浄後、ペプチジル樹脂の一定量をTFA-H2O(1:99)で１分間処理し、生成物の特性決定をMALDI-TOF-MSにより行った。
MALDI-TOF-MS、C68H95N9O16に対する計算値は、1,293.69である。実測値:m/z 1,294.35[M+H]+ , 1,316.39 [M+Na]+ , 1,333.34 [M+K]+。
【００７４】
〔工程５〕：[Fmoc-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-OH][H-Phe-ZDhb-Val&]
上述のペプチジル-樹脂（工程４）のAlloc基を、PhSiH3(617μL、5mmol、10当量)の存在下でPd(PPh3)4(58mg、0.05mmol、0.1当量)により除去した。この樹脂をDMF中のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム0.02Mにより洗浄し（3x15分）、保護ペプチドをTFA-CH2Cl2(1:99)により樹脂から切断した(5x30秒)。ろ液をH2O(4mL)に集め、H2Oを減圧下で一部除去した。次いでACNを加え、H2O除去中に析出した固体を溶解し、溶液を凍結乾燥し、700mg(578μmol、収率99%)の標題化合物をHPLC（カラムＡ、tR8.59分）による試験で91%より高い純度で得た。
MALDI-TOF-MS、C64H91N9O14に対する計算値は、1,209.67である。実測値:m/z 1,210.45[M+H]+ , 1,232.51 [M+Na]+ , 1,248.45 [M+K]+。
【００７５】
〔工程６〕：Fmoc-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
保護されたペプチド（工程５）(700mg、578μmol)をCH2Cl2(580mL、1mM)に溶解し、HOBt(137mg、2.3mmol)（HOBtの溶解に必要な最少量のDMFに溶解したもの）、DIPEA(302μL、1.73mmol、3当量)、およびDIPCDI(356μL、2.3mmol、4当量)を加えた。混合物を１時間撹拌し、次いで環状化工程の経過をHPLCにより調べた（カラムＡ、tR12.4分）。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。
MALDI-TOF-MS、C64H89N9O13に対する計算値は、1,191.66である。実測値:m/z 1,092.17[M+H]+ , 1,214.14 [M+Na]+ , 1,230.10 [M+K]+。
【００７６】
〔工程７〕：H-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
保護されたペプチド（工程６）(50mg, 42μmol)をDMF(5ml)に溶解した後、ジエチルアミン(130μL, 30当量)を添加し、混合物を１時間３０分攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。粗生成物を、水(+0.05%TFA)中の30%から75%(15分)のACN(+0.05%TFA)の直線的勾配、20mL/h、220nmでの検出によるHPLC(Symmetry C8 5μm, 30×100mm)によって精製した。生成物はHPLCで特性決定をした(tR8.7分、カラムＡ)。MALDI-TOF-MSについては、C49H79N9O11に対する計算値969.59に対し、実測値:m/z 970.87[M+H]+ , 870.78 [M-Boc]+であった。
【００７７】
［実施例２］：NZ-Orn(Boc)-OH からの[H-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-OH][H-Phe- (Z)Dhb-Val&]
実験手順は、工程３においてFmoc-Orn-OHをpNZ-Orn-OHに置き換えた以外、実施例１に記載と同様である。
【００７８】
保護されたペプチド(14.7mg, 12.8μmol)を、DMF(10ml)中の1.6M HClに溶解し、SnCl2(3.8g, 20mmol)を添加し、混合物をHPLC（カラムＡ）により反応の完結が示されるまで攪拌した（１時間）。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。粗生成物を、水(+0.05%TFA)中の30%から75%(15分)のACN(+0.05%TFA)の直線的勾配、20mL/h、220nmでの検出によるHPLC(Symmetry C8 5μm, 30×100mm)によって精製して、標題生成物(4.8mg, 4.9μmol, 収率40%)を得た。この生成物をHPLC(tR8.2分、カラムＡ)およびMALDI-TOF-MSで特性決定した。
MALDI-TOF-MS、C49H79N9O11に対する計算値は、969.59である。実測値:m/z 992.35 [M+Na]+ , 870.34 [M-Boc]+ , 892.34 [M+Na -Boc]+。
【００７９】
［実施例３］：Alloc-Orn(Boc)-OH からの[H-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-OH][H-Phe- (Z)Dhb-Val&]
【００８０】
〔工程１〕：H-Phe-(Z)Dhb-O-TrtCl-樹脂
Cl-TrtCl-樹脂(1g、1.64mmol/g)をポリエチレンフィルターディスクを取り付けた20mLのポリプロピレンシリンジ内に設置した。次に樹脂をCH2Cl2で洗浄し(5x0.5分)、Alloc- Phe-(Z)Dhb-OH (232mg、0.7mmol、0.43当量)とDIPEA(0.41mL)とのCH2Cl2(2.5mL)溶液を加え、混合物を15分間撹拌した。追加のDIPEA(0.81mL、合計で7mmol)を添加し、混合物をさらに45分間撹拌した。反応は、MeOH(800μL)の添加により、10分間撹拌した後に終了した。Alloc- Phe-(Z)Dhb-O-TrtCl-樹脂を、CH2Cl2(3x0.5分)、DMF(3x0.5分)で洗浄し、Alloc基を、CH2Cl2中、PhSiH3(617μL、5mmol、10当量)の存在下でPd(PPh3)4(58mg、0.05mmol、0.1当量)により除去した。この樹脂を一般的手順の記載に従って洗浄した。Fmoc測定により算出されたローディング量は0.68mmol/gであった。
【００８１】
〔工程２〕：[Alloc-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-αllo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-(Z)Dhb- OH][H-VaI&]
Fmoc-D-VaI-OH(678mg、2mmol、4当量)、Fmoc-D-allo-Ile-OH (707mg、2mmol、4当量)、およびFmoc-D-allo-Thr-OH(遊離の水酸基) (683mg、2mmol、4当量)、Fmoc-D-allo-Ile-OH (707mg、2mmol、4当量)、およびAlloc-Orn(Boc)-OH(630mg、2mmol、4当量)を、DMF(2.5mL)中のDIPCDI(310μL、2mmol、4当量)およびHOBt(307mg、2mmol、4当量)を用いて、上述により得られたH-Phe-(Z)Dhb-O-TrtCl-樹脂に順次加えた。すべての場合において、90分間のカップリング後、ニンヒドリン試験は陰性であった。Fmoc基の除去および洗浄は、一般的手順の記載に従って行った。Fmoc -Val-OH(848.2mg、2.5mmol、5当量)は、DMAP(30.6mg、0.25mmol、0.5当量)およびDIPEA(88μL、0.5mmol、1当量)の存在下、45分間DIPCDI(387mg、2.5mmol、5当量)とカップリングした。このカップリングは同一の条件で2回繰り返した。Fmoc基を一般的手順の記載に従って除去した後、保護ペプチドをTFA-CH2Cl2(1:99)により樹脂から切断した(5x30秒)。ろ液をH2O(4mL)に集め、H2Oを減圧下で一部除去した。次いでACNを加え、H2O除去中に析出した固体を溶解し、溶液を凍結乾燥し、650mg(606μmol、収率90%)の標題化合物をHPLC（カラムＡ、tR9.93分）による試験で75%より高い純度で得た。
ESMS、C53H85N9O14に対する計算値は、1072.29である。実測値:m/z 1074.4[M+H]+。
【００８２】
〔工程３〕：Alloc-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
保護ペプチド（工程２）(250mg、0.233mmol)をCH2Cl2(240mL, 1mM)に溶解し、HOAt(126mg、9.325mmol, 4当量)（HOAtの溶解に必要な最少量のDMFに溶解したもの）、およびDIPCDI(143μL、9.325mmol、4当量)を加えた。混合物を２４時間撹拌し、次いで環状化工程の経過をHPLCにより調べた（カラムＡ、tR12.82分）。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。
MALDI-TOF-MS、C53H83N9O13に対する計算値は、1,054.28である。実測値:m/z 1,056.4[M+H]+。
【００８３】
〔工程４〕：H-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
保護ペプチド（工程３）(244mg、231μmol)を10mlのCH2Cl2に溶解し、次いで  
PhSiH3(94μL、743.6μmol、3.3当量)の存在下でPd(PPh3)4(8mg、6.94μmol、0.03当量)を添加し、混合物を１時間３０分攪拌した。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去した。粗生成物を、水(+0.05%TFA)中の20%から80%(15分)のACN(+0.05%TFA)の直線的勾配、20mL/h、220nmでの検出によるHPLC(Symmetry C8 5μm, 30×100mm)によって精製した。生成物はHPLCにより特性決定をした(tR9.19分、カラムＡ)。MALDI-TOF-MSについては、C49H79N9O11に対する計算値970.21に対し、実測値:m/z 972.1[M+H]+であった。
【００８４】
［実施例４］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-OH
【００８５】
〔工程１〕：H-D-Pro-O-TrtCl-樹脂
Cl-TrtCl-樹脂(1g、1.64mmol/g)をポリエチレンフィルターディスクを取り付けた20mLのポリプロピレンシリンジ内に設置した。次に樹脂をCH2Cl2で洗浄し(5x0.5分)、Fmoc-D-Pro-OH(237mg、0.7mmol、0.43当量)とDIPEA(0.41mL)とのCH2Cl2(2.5mL)溶液を加え、混合物を15分間撹拌した。追加のDIPEA(0.81mL、合計で7mmol)を添加し、混合物をさらに45分間撹拌した。反応は、MeOH(800μL)の添加により、10分間撹拌した後に終了した。Fmoc-D-Pro-O-TrtCl-樹脂を、CH2Cl2(3x0.5分)、DMF(3x0.5分)、一般的手順の記載に従ったピペリジン、およびDMF(5x0.5分)で洗浄／処理した。Fmoc測定により算出されたローディング量は0.27mmol/gであった。    
【００８６】
〔工程２〕：(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-OH
Fmoc-D-Val-OH(458mg、1.32mmol、5当量)、Fmoc- D-Val-OH (360mg、1.06mmol、4当量)、Fmoc- Thr(tBu)-OH(527mg、1.32mmol、5当量)、Fmoc- D-Val-OH (360mg、1.06mmol、4当量)、および(4S)-MeHex-OH(138mg、1.06mmol、4当量)を、DIPCDI(1.06mmol、4当量に対し165μL;1.32mmol、5当量に対し205μL)およびHOBt(1.06mmolおよび4当量に対し162mg;1.32mmol、5当量に対し203mg)を用いて、上述により得られたぺプチジル-樹脂（工程１）に順次９０分間加えた。すべての場合において、９０分間のカップリング後、ニンヒドリン試験は陰性であった。Fmoc基の除去および洗浄は、一般的手順の記載に従って行った。
【００８７】
この部分的に保護されたペプチドをTFA-CH2Cl2(1:99)により樹脂から切断した(5x30秒)。ろ液をH2O(4mL)に集め、H2Oをロータベーパーにより一部除去した。次いでACNを加えてH2O除去中に析出した固体を溶解し、溶液を凍結乾燥し、154.4mg(226μmol、収率88.5%)の標題化合物をHPLC（カラムＡ、tR12.13分）による試験で94%より高い純度で得た。溶媒留去後に得られた粗生成物の純度は、94%より高かった。生成物はエレクトロスプレー法で特性を決定した。
C35H63N5O8に対する計算値681.9に対し、実測値:m/z 682.15であった。
【００８８】
［実施例５］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D- allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
実施例１からのペプチド(8.25mg, 8.5μmol)および実施例４からのペプチド(7mg, 10.2μmol, 1.2当量) をDMF(10ml)に溶解し、PyAOP(5.32mg, 10.2μmol, 1.2当量)およびDIPEA(5.3μl, 30.6μmol, 3.6当量)を室温で添加した。混合物を１時間攪拌した後、追加のPyAOP(5.32mg, 10.2μmol, 1.2当量)を添加した。混合物を室温で攪拌して、HPLC（カラムＡ）が反応の完結を示すまで２時間反応させた。溶媒留去後に得られた粗生成物は、75%より高い純度を示した。
粗生成物を、水(+0.05%TFA)中の30%から100%(15分)のACN(+0.05%TFA)の直線的勾配、20mL/h、220nmでの検出によるHPLC(Symmetry C8 5μm, 30×100mm)によって精製して、標題生成物(6.9mg, 4.2μmol, 収率49%)を得た。  
MALDI-TOF-MS、C84H140N14O18に対する計算値は、1,663.05である。実測値:m/z 1,534.33 [M-Boc]+ , 1,556.26 [M-Boc+Na]+ , 1,656.33 [M+Na]+。
【００８９】
［実施例６］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
保護された環状ペプチド（実施例５）をTFA-H2O(19:1、85mL)に溶解し、混合物を１時間撹拌した。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去し、ジオキサン(245μL)を加えた。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去し(このプロセスを３回繰り返した)、次にH2O(1mL)を加え、凍結乾燥した。粗生成物を、水(+0.05%TFA)中の44%ACN(+0.05%TFA)の定組成溶離、20mL/h、220nmでの検出によるHPLC(Symmetry C8 5μm, 30×100mm)によって精製して、標題生成物(5mg, 3.4μmol, 収率80%、93.3%)を得た。HPLCは、カップリング工程中の両保護ペプチド間のラセミ化を示唆することになる、エピマーペプチド(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-Pro-Orn-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D- allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&（実施例７）の存在を示さなかった。
MALDI-TOF-MS、C75H124N14O16に対する計算値は、1,476.93である。実測値:m/z 1,478.17[M+H]+ , 1,500.14 [M+Na]+ , 1,516.12 [M+K]+。
【００９０】
［実施例７］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-Pro-Orn-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D- allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
実施例４の工程１において Fmoc-D-Pro-OH を Fmoc-Pro-OH に置き換えた以外、実施例１、４、５、および６に記載の実験手順と同様にした。生成物は、HPLC（tR11.23分、カラムＡ）およびMALDI-TOF-MSにより特性を決定した。
MALDI-TOF-MS、C75H124N14O16に対する計算値は、1,476.93である。実測値:m/z 1,500.23[M+Na]+ , 1,515.97 [M+K]+。
【００９１】
［実施例８］：H-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-(Z)Dhb-Val&
[Fmoc-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-O- TrtCl-樹脂][Alloc-Val&]（実施例１、工程２）から出発し、Alloc基を、PhSiH3(617μL、5mmol、10当量)の存在下でPd(PPh3)4(58mg、0.05mmol、0.1当量)により除去し、DMF中のジエチルジチオカルバミン酸ナトリウム0.02Mにより洗浄した（3x15分）。Alloc-Phe-Z-Dhb-OH(666mg、2mmol、4当量)およびHOAt(273mg、2mmol、4当量)をDMF(1.25mL)中に溶解し、ペプチジル樹脂に加えた。次いでDIPCDI(310μL、2mmol、4当量)を加え、混合物を５時間撹拌したところ、HPLCにより反応の完結が認められた(tR7.09分、カラムＡ)。
【００９２】
Fmoc基を除去し、追加のDMF洗浄を行った後、DMF中のBoc2O(546mg, 5当量)およびDIPEA(0.87mL, 10当量)を添加して２時間反応させたところ、ニンヒドリン反応が陰性であった。DMF洗浄を行った後、Alloc基を上述のように除去し、保護ペプチドをTFA-CH2Cl2(1:99)により樹脂から切断した(5x30秒)。ろ液をH2O(4mL)に集め、H2Oを減圧下で一部除去した。次いでACNを加え、H2O除去中に析出した固体を溶解し、溶液を凍結乾燥した。
【００９３】
環状化反応を、実施例１の工程６と同様に行い、次いで、Boc基をTFA-H2O(19:1)で除去した（１時間）。減圧下で溶媒を除去し、ジオキサンを加えた(246μL)。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去し(このプロセスを３回繰り返した)、次にH2O(1mL)を加え、凍結乾燥した。粗生成物を、水(+0.05%TFA)中の44%ACN(+0.05%TFA)の定組成溶離、20mL/h、220nmでの検出によるHPLC(Symmetry C8 5μm, 30×100mm)によって精製して、標題生成物(207mg, 273μmol, 収率55%、93.3%)を得た。
生成物は、HPLC(tR7.27分、カラムＡ)およびMALDI-TOF-MSで特性決定した。
MALDI-TOF-MS、C39H61N7O8に対する計算値は、755.46である。実測値:m/z 756.56[M+H]+ , 788.55 [M+Na]+ , 794.53 [M+K]+。
【００９４】
［実施例９］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-OH
ペプチド合成をFmoc-Orn(Boc)- OHのCl-TrtCl-樹脂への組み込みにより開始したこと以外、実施例４に記載の実験手順と同様にした。生成物は、HPLC（tR13.27分、カラムＡ）およびエレクトロスプレー法により特性を決定した。
生成物は、HPLC(tR13.27分、カラムＡ)およびエレクトロスプレー法で特性決定した。
C36H65N7O9に対する計算値は、739.48である。実測値:m/z 740.65。
【００９５】
［実施例１０］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D- allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
実施例５において、実施例１からのペプチドを実施例８からのペプチドに置き換え、実施例４からのペプチドを実施例９からのペプチドに置き換えた以外、実施例５および６に記載の実験手順と同様にした。最終生成物のHPLCは、カップリング工程中の両保護ペプチド間のラセミ化を示唆することになる、エピマーペプチド(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-Pro-Orn-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D- allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&（実施例１１）の存在を示した(4.1%)。生成物は、HPLC（tR10.5分、カラムＡ）により特性を決定した。
MALDI-TOF-MS、C75H124N14O16に対する計算値は、1,476.93である。実測値:m/z 1,477.99[M+H]+ , 1,499.97 [M+Na]+ , 1,515.93 [M+K]+。
【００９６】
［実施例１１］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-D-Orn-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)- D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
Fmoc-Orn(Boc)-OH を Fmoc-D-Orn(Boc)-OH に置き換えた以外、実施例１０に記載の実験手順と同様にした。生成物は、HPLC（tR9.89分、カラムＡ）により特性を決定した。
MALDI-TOF-MS、C75H124N14O16に対する計算値は、1,476.93である。実測値:m/z 1,478.06[M+H]+ , 1,500.15 [M+Na]+ , 1,516.04 [M+K]+。
【００９７】
［実施例１２］：H-D-alIo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-(Z)Dhb-Val&
Fmoc-D-allo-Thr-D-allo-Ile-D-Val-Phe-Z-Dhb-O- TrtCl-樹脂（実施例３、工程２）から出発し、Fmoc基を除去し、追加のDMF洗浄を行った後、DMF中のBoc2O(546mg, 5当量)およびDIPEA(0.87mL, 10当量)を添加して２時間反応させたところ、ニンヒドリン反応が陰性であった。DMF洗浄を行った後、Fmoc-Val-OH (848.2mg、2.5mmol、5当量)は、DMAP(30.6mg、0.25mmol、0.5当量)およびDIPEA(88μL、0.5mmol、1当量)の存在下、45分間DIPCDI(387mg、2.5mmol、5当量)とカップリングさせた。このカップリングは同一の条件で２回繰り返した。一般的手順に記載と同様にFmoc基を除去した後、保護ペプチドをTFA-CH2Cl2(1:99)により樹脂から切断した(5x30秒)。ろ液をH2O(4mL)に集め、H2Oをロータベーパーにより一部除去した。次いでACNを加え、H2O除去中に析出した固体を溶解し、溶液を凍結乾燥し、57mg(75μmol、収率90%)の標題化合物をHPLC（カラムＡ、tR7.95分）による試験で95%より高い純度で得た。
ESMS、C38H60N6O10に対する計算値は、760.44である。実測値:m/z 762.3[M+H]+。
【００９８】
環状化反応を、実施例１の工程６と同様に行い、次いで、Boc基をTFA-H2O(19:1)で除去した（１時間）。減圧下で溶媒を除去し、ジオキサンを加えた(246μL)。溶媒を減圧下で蒸発させることにより除去し(このプロセスを３回繰り返した)、次にH2O(1mL)を加え、凍結乾燥した。粗生成物を、水(+0.05%TFA)中の30%ACN(+0.05%TFA)の定組成溶離、20mL/h、220nmでの検出によるHPLC(Symmetry C8 5μm, 30×100mm)によって精製して、標題生成物(50.2mg, 67.6μmol, 収率90%)を得た。
生成物は、HPLC(tR10.61分、カラムＡ)で特性決定した。MALDI-TOF-MSについては、C38H58N6O9に対する計算値は、742.43である。実測値:m/z 743.40[M+H]+ , 765.43 [M+Na]+ , 781.43[M+K]+。
【００９９】
［実施例１３］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-D-allo-Ile-OH
ペプチド合成をFmoc- D-allo-Ile - OHのCl-TrtCl-樹脂への組み込みにより開始したこと以外、実施例４に記載の実験手順と同様にした。生成物は、HPLC（tR10.25分、カラムＡ）により特性を決定した。MALDI-TOF-MSについては、C51H92N8O12に対する計算値は、1,008.68である。実測値:m/z 1,009.8。
【０１００】
［実施例１４］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D- allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
実施例５において、実施例１からのペプチドを実施例１２からのペプチドに置き換え、実施例４からのペプチドを実施例１３からのペプチドに置き換えた以外、実施例５および６に記載の実験手順と同様にした。最終生成物のHPLCは、カップリング工程中の両保護ペプチド間のラセミ化を示唆することになる、エピマーペプチド(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo- Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&（実施例１５）の存在を示した。生成物は、HPLC(tR7.92分、カラムＡ)で特性決定した。MALDI-TOF-MSについては、C75H124N14O16に対する計算値は、1,476.93である。実測値:m/z 1,478.5[M+H]+ , 1,501.4 [M+Na]+ , 1,517.6[M+K]+。
【０１０１】
［実施例１５］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo- Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&
Fmoc- Ile -OH を Fmoc- D-allo-Ile-D-OH（実施例１３）の代わりに用いた以外、実施例１２〜１４に記載の実験手順と同様にした。
(4S)-MeHex-D-Val-Thr(tBu)-Val-D-Val-D-Pro-Orn(Boc)-Ile-OH：（tR10.25分、カラムＡ、および、MALDI-TOF-MS、C51H92N8O12に対する計算値は、1,008.68である。実測値:m/z 1,009.5。）
最終生成物は、HPLC(tR8.02分、カラムＡ)で特性決定した。
MALDI-TOF-MS、C75H124N14O16に対する計算値は、1,476.93である。実測値:m/z 1,478.2[M+H]+ , 1,501.1 [M+Na]+ , 1,517.3 [M+K]+。
【０１０２】
［実施例１６］：(4S)-MeHex-D-Val-Thr-Val-D-Val-D-Pro-Orn- D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)- D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-D-Val&
Fmoc- D- Val -OH を Fmoc- Val -OH（実施例３）の代わりに用いた以外、実施例３、４、および５に記載の実験手順と同様にした。
Alloc-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&：（tR12.52分、カラムＡ、MALDI-TOF-MS、C53H83N9O13に対する計算値は、1,054.28である。実測値:m/z 1,056.6[M+H]+。）
H-Orn(Boc)-D-allo-Ile-D-allo-Thr(&)-D-allo-Ile-D-Val-Phe-ZDhb-Val&：（tR9.23分、カラムＡ、MALDI-TOF-MS、C49H79N9O11に対する計算値は、970.21である。実測値:m/z 972.4[M+H]+。）
最終生成物は、HPLC(tR9.23分、カラムＡ)で特性決定した。
MALDI-TOF-MS、C75H124N14O16に対する計算値は、1,476.93である。実測値:m/z 1,479.6[M+H]+ , 1,502.5 [M+Na]+ , 1,518.7 [M+K]+。
【国際調査報告】
2008506633.tif 000010
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