(57)【要約】  本願発明は心血管細胞種の増殖、分化、接着、遊走、および接着を調節するための方法および組成物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生を促進する方法であって、当該方法が血管新生を促進するのに有効な量のポリペプチドを投与するステップを含み、当該方法において前記ポリペプチドがネトリンポリペプチドである、方法。
【請求項２】
請求項１に記載の方法であって、当該方法において、前記ネトリンポリペプチドが、65℃で0.2X の洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、当該方法において前記アミノ酸配列がネトリンレセプタに結合し、未変性ネトリンの生物学的活性を保持する、方法。
【請求項３】
請求項１に記載の方法であって、当該方法において、前記ネトリンポリペプチドが修飾ネトリンポリペプチドである、方法。
【請求項４】
請求項1に記載の方法であって、さらに1つ以上の血管新生因子を投与するステップを含む、方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法であって、当該方法において、前記血管新生因子が、VEGFポリペプチド、PDGFポリペプチド、FGFポリペプチド、またはアンギオポイエチンポリペプチドから選択される、方法。
【請求項６】
請求項5に記載の方法であって、当該方法において前記血管新生因子は前記ネトリンポリペプチドと相乗的に作用する、方法。
【請求項７】
請求項4に記載の方法であって、当該方法において、前記血管新生因子は前記ネトリンポリペプチドの投与と同時にまたは連続的に投与される、方法。
【請求項８】
血管新生を阻害する方法であって、当該方法において、血管新生を阻害するのに有効な量の作用物質を投与するステップを含み、当該方法において前記作用物質がネトリンポリペプチドの発現または活性を阻害する、方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、当該方法において前記作用物質が抗ネトリン抗体、Unc5hレセプタ、Unc5hレセプタ細胞外ドメイン、または抗ネオゲニン抗体の1つ以上から選択される、方法。 
【請求項１０】
内皮細胞または平滑筋細胞の遊走を促進する方法であって、当該方法が前記細胞を前記内皮細胞または平滑筋細胞の遊走を促進するのに有効な量のポリペプチドと接触させるステップを含み、当該方法における前記ポリペプチドがネトリンポリペプチドである、方法。
【請求項１１】
請求項１０に記載の方法であって、当該方法において、前記平滑筋細胞は血管平滑筋細胞である、方法。
【請求項１２】
幹細胞の増殖および／または遊走を促進する方法であって、当該方法が前記幹細胞の増殖およびまたは遊走を促進するのに有効な量のポリペプチドを投与するステップを含む、方法。
【請求項１３】
請求項12に記載の方法であって、当該方法において、前記幹細胞は胚性、胎性または成体幹細胞である、方法。
【請求項１４】
請求項13に記載の方法であって、当該方法において、前記幹細胞は造血幹細胞または内皮幹細胞である、方法。
【請求項１５】
請求項12に記載の方法であって、当該方法において、前記ネトリンポリペプチドが修飾ネトリンポリペプチドである、方法。
【請求項１６】
請求項12に記載の方法であって、当該方法において、前記ネトリンポリペプチドが、65℃で0.2Xの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、当該方法において前記アミノ酸配列がネトリンレセプタに結合し、未変性ネトリンの生物学的活性を保持する、方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法であって、当該方法が、損傷部位への幹細胞の遊走を促進するステップを含む、方法。
【請求項１８】
局所輸送のためのネトリンポリペプチドを提供する薬学的組成物であって、当該薬学的組成物を生体適合性支持体に結合するか、または生体適合性マトリックスに溶解したネトリンポリペプチドを含み、当該薬学的組成物が
(i)  血管新生の促進、
(ii)  血管平滑筋細胞の遊走の促進、または
(iii)  内皮細胞の遊走の促進、
のいずれかから選択されるネトリンポリペプチドの1つ以上の生物学的活性を保持する、薬学的組成物。
【請求項１９】
ネトリンポリペプチドの発現または活性を阻害する作用物質を提供する薬学的組成物であって、当該薬学的組成物が、生体適合性支持体に結合するか、または生体適合性マトリックスに溶解した作用物質を含み、当該薬学的組成物が前記作用物質のネトリン阻害活性を保持する、薬学的組成物。  
【請求項２０】
請求項18に記載の薬学的組成物であって、さらに1つ以上の血管新生因子を含む、薬学的組成物。
【請求項２１】
請求項20に記載の薬学的組成物であって、当該組成物において、前記血管新生因子が、VEGFポリペプチド、PDGFポリペプチド、FGFポリペプチド、またはアンギオポイエチンポリペプチドから選択される、薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項１８に記載の薬学的組成物であって、当該組成物において、前記生体適合性マトリックスが、救急絆、ガーゼパッド、包帯、または縫合糸である、薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１９に記載の薬学的組成物であって、当該組成物において、前記生体適合性マトリックスが、救急絆、ガーゼパッド、包帯、または縫合糸である、薬学的組成物。
【請求項２４】
請求項１８に記載の薬学的組成物であって、当該組成物において、前記生体適合性支持体が、腔内装置である、薬学的組成物。
【請求項２５】
請求項２４に記載の薬学的組成物であって、当該組成物において、前記腔内装置が、ステント、カテーテル、またはワイヤから選択される、薬学的組成物。
【請求項２６】
請求項１８に記載の方法であって、当該方法において、前記ネトリンポリペプチドが修飾ネトリンポリペプチドである、方法。
【請求項２７】
動物における虚血性症状を処置する方法であって、その必要がある動物に、請求項１８に記載の薬学的組成物を前記動物の虚血症を低減するのに有効な量投与するステップを含む、方法。 
【請求項２８】
請求項２７に記載の方法であって、さらに1つ以上の血管新生因子を投与するステップを含む、方法。
【請求項２９】
動物の炎症を低減させる方法であって、その必要のある動物に、請求項１９に記載の薬学的組成物を、前記動物の1つ以上の炎症細胞種の1つ以上の増殖または遊走を阻害するのに十分な量投与するステップを含み、当該方法において、前記作用物質がネトリンポリペプチドの発現または活性を阻害する、方法。
【請求項３０】
請求項２９に記載の方法であって、前記炎症細胞種は、マクロファージ、リンパ球、マスト細胞、血小板、または好酸球のいずれかから選択される、方法である。
【請求項３１】
創傷治癒を促進する方法であって、その必要がある動物に、請求項１８に記載の薬学的組成物を前記動物の血管新生を促進するのに有効な量投与することによって、創傷治癒を促進するステップを含む、方法。
【請求項３２】
腫瘍の成長または生存を阻害する方法であって、血管新生を阻害するのに有効な量の作用物質を投与することによって前記腫瘍の成長または生存を阻害するステップを含み、当該方法において前記作用物質がネトリンポリペプチドの発現または活性を阻害する、方法。  
【請求項３３】
請求項３２に記載の方法であって、当該方法において前記作用物質が抗ネトリン抗体、Unc5hレセプタ、Unc5hレセプタ細胞外ドメイン、または抗ネオゲニン抗体の1つ以上から選択される、方法。
【請求項３４】
腫瘍の成長または生存を阻害する方法であって、血管新生を阻害するのに有効な量の作用物質を投与することによって前記腫瘍の成長または生存を阻害するステップを含み、当該方法が、前記作用物質を請求項１９に記載の薬学的組成物として投与するステップを含む、方法。
【請求項３５】
外科手術または医療創傷の後の接着を阻害する方法であって、血管新生を阻害するのに有効な量の請求項１９に記載の薬学的組成物を投与することによって、外科手術または医療創傷後の瘢痕形成および接着を阻害するステップを含み、当該方法において前記作用物質がネトリンポリペプチドの発現または活性を阻害する、方法。
【請求項３６】
動物におけるニューロパシを処置する方法であって、それを必要とする動物に、前記動物におけるニューロパシを処置する、または予防的に処置するのに有効な量のポリペプチドを投与するステップを含み、当該方法において前記ポリペプチドがネトリンポリペプチドである、方法。
【請求項３７】
請求３６に記載の方法であって、当該方法において前記ニューロパシが末梢性ニューロパシである、方法。
【請求項３８】
請求３６に記載の方法であって、当該方法において前記ニューロパシが糖尿病性ニューロパシである、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2004年7月14日に提出された米国特許仮出願第60/587,796号の優先権の利益を主張する。前記仮出願の教唆するところは、引用をもってその内容全体を本願明細書に援用する。
【背景後術】
【０００２】
発明の背景
心血管系は胚形成中に発達して機能する最初の器官系である。その名称が示すとおり、心血管系には、複雑な血管、血管細胞（たとえば内皮細胞および血管平滑筋細胞）、血液細胞、免疫細胞、および機能熱をつくり出すのに必要な複数の細胞種（たとえば心筋、心内膜、心膜）が含まれる。
【０００３】
生物の生命そのものの維持だけでなく全身への酸素および栄養分の輸送における心臓と血管の重要な役割を考えて、血管成長および遊走を促進または調節する因子の同定に多大な資源が集中してきた。これらの因子には、線維芽細胞成長因子（FGF）ファミリ、血小板由来成長因子（PDGF）ファミリ、血管内皮成長因子（VEGF）ファミリ、およびアンジオポイエチンのメンバが含まれる。  
【０００４】
心血管研究の著しい進歩にもかかわらず、当業には、胎児および成人の発達過程全体における心血管および血管系の理解を向上させる必要性が相当残っている。心血管および血管の成長のさらなる理解とこれらの系の細胞の増殖、分化、遊走、生存および接着の1つ以上の調節に関与する分子シグナルの同定を通して、新血管系の細胞を調節するのに有用な方法および組成物をin vitroおよびin vivoの目的のために開発することができる。本願発明は、そのような方法および組成物を提供する。  
【０００５】
さらに、当業には、正常な心血管成長とふるまいがさまざまな症状および疾患状態に陥るメカニズムの理解を向上させる必要もある。心臓および血管の正常および病理学的な発達の基礎にある分子メカニズムのさらなる理解を通して、新血管系の細胞の増殖、分化、遊走、生存および接着の1つ以上を調節するのに有用な方法および組成物を開発することができる。本願発明は、そのような方法および組成物を提供する。  
【０００６】
発明の概要
本願発明は、ネトリン、ネトリンの発現および／もしくは活性、またはネトリンシグナル伝達を阻害するネトリン関連組成物および作用物質を用いた方法および組成物を提供する。本願発明は、ネトリンポリペプチドおよび軸索ガイダンスに役割があると知られているネトリンシグナル伝達は、血管細胞および内皮細胞の増殖および遊走を調節するようにも機能するという発見に基づいている。本発見に基づいて、本願発明は、さまざまな血管および内皮細胞種の増殖、分化、遊走、および接着に作用するネトリンおよびネトリン関連組成物を用いるための新規の方法および組成物、ならびに血管系の疾患および症状を処置する方法を提供する。  
【０００７】
第一の局面では、本願発明は血管新生を促進する方法を提供する。前記方法は、血管新生を促進する効果のある一定量のネトリンポリペプチドを投与するステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。  
【０００８】
さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、39、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、39、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%または99%超同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、39、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる。
【０００９】
前述の実施態様のいずれかにおいて、本願発明はさらに、1つ以上の血管新生因子を投与されるステップを意図する。ある実施態様では、前記血管新生因子は、血管内皮成長因子（VEGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、またはアンギオポイエチンポリペプチドから選択する。ネトリンポリペプチドと1つ以上の血管新生因子は、相加的または相乗的に作用してよく、連続または併用して投与してもよい。
【００１０】
第2の局面では、本願発明は血管新生を阻害する方法を提供する。前記方法は、血管新生を阻害するのに効果的な作用物質を一定量投与するステップであって、当該ステップにおいて前記作用物質がネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する、ステップを含む。ある実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、抗ネトリン抗体、Unc5hレセプタ、Unc5hレセプタ外部ドメイン、または抗ネオゲニン抗体から選択する。別の実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するRNAi、ネトリンの発現および／または活性を阻害するリボザイム、またはネトリンのネトリンレセプタへの結合を妨げることによってネトリンの発現および／または活性を阻害する小分子から選択される。
【００１１】
第3の局面では、本願発明は血管新生を促進するための薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの用途を提供する。  
【００１２】
第4の局面では、本願発明は、血管新生を阻害するための薬剤の製造における、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質の用途を提供する。  
【００１３】
第5の局面では、本願発明は、平滑筋細胞の増殖を促進する方法を提供する。前記方法は、前記平滑筋細胞の増殖を促進するのに効果的なある量のネトリンポリペプチドを、平滑筋細胞に接触させるステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。  
【００１４】
さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、39、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、39、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%または99%超同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、39、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる。
【００１５】
ある実施態様では、前記平滑筋細胞は血管平滑筋細胞である。
【００１６】
第6の局面では、本願発明は平滑筋細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。前記方法は、平滑筋細胞の増殖を阻害するのに有効なある量の作用物質を細胞に接触させるステップであって、当該ステップにおいて前記物質がネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する、ステップを含む。ある実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、抗ネトリン抗体、Unc5hレセプタ、Unc5hレセプタ外部ドメイン、または抗ネオゲニン抗体から選択する。別の実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するRNAi、ネトリンの発現および／または活性を阻害するリボザイム、またはネトリンのネトリンレセプタへの結合を妨げることによってネトリンの発現および／または活性を阻害する小分子から選択される。
【００１７】
ある実施態様では、前記平滑筋細胞は血管平滑筋細胞である。  
【００１８】
第7の局面では、本願発明は、平滑筋細胞の増殖を促進するための薬剤の製造における、ネトリンポリペプチドの用途を提供する。ある実施態様では、前記平滑筋細胞は血管平滑筋細胞である。  
【００１９】
第8の局面では、本願発明は、平滑筋細胞の増殖を阻害するための薬剤の製造における、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質の用途を提供する。ある実施態様では、前記平滑筋細胞は血管平滑筋細胞である。
【００２０】
第9の局面では、本願発明は内皮細胞の増殖を促進する方法を提供する。前記方法は、前記内皮細胞の増殖を促進するのに効果的なある量のネトリンポリペプチドを内皮細胞と接触させるステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。  
【００２１】
さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、39、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、39、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%または99%超同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、39、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、65℃で0.2 X SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる。
【００２２】
第10の局面では、本願発明は内皮細胞の増殖を阻害するための方法を提供する。前記方法は、前記内皮細胞の増殖を阻害するのに効果的なある量の作用物質を内皮細胞と接触させるステップであって、当該ステップにおいて前記作用物質がネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する、ステップを含む。ある実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、抗ネトリン抗体、Unc5hレセプタ、Unc5hレセプタ外部ドメイン、または抗ネオゲニン抗体から選択する。別の実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するRNAi、ネトリンの発現および／または活性を阻害するリボザイム、またはネトリンのネトリンレセプタへの結合を妨げることによってネトリンの発現および／または活性を阻害する小分子から選択される。
【００２３】
第11の局面では、前記発明は、内皮細胞の増殖を促進する薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの用途を提供する。  
【００２４】
第12の局面では、本願発明は、内皮筋細胞の増殖を阻害するための薬剤の製造における、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質の用途を提供する。  
【００２５】
第13の局面では、本願発明は内皮細胞の遊走を促進する方法を提供する。前記方法は、前記内皮細胞の遊走を促進するのに効果的なある量のネトリンポリペプチドを内皮細胞と接触させるステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。  
【００２６】
さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%または99%超同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる。
【００２７】
第14の局面では、本願発明は内皮細胞の遊走を阻害する方法を提供する。前記方法は、内皮細胞の遊走を阻害するのに効果的なある量の作用物質を前記細胞に接触させるステップであって、当該ステップにおいて、前記作用物質がネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する、ステップを含む。ある実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、抗ネトリン抗体、Unc5hレセプタ、Unc5hレセプタ外部ドメイン、または抗ネオゲニン抗体から選択する。別の実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するRNAi、ネトリンの発現および／または活性を阻害するリボザイム、またはネトリンのネトリンレセプタへの結合を妨げることによってネトリンの発現および／または活性を阻害する小分子から選択される。
【００２８】
第15の局面では、本願発明は内皮細胞の遊走を促進する薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの用途を提供する。  
【００２９】
第16の局面では、本願発明は内皮細胞の遊走を促進する薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質の用途を提供する。
【００３０】
第17の局面では、本願発明は内皮管の遊走を促進する方法を提供する。前記方法は、内皮管の遊走を促進するのに効果的なある量のネトリンポリペプチドを投与するステップであって、当該ステップにおいて前記ネトリンポリペプチドが、前記内皮管の前記ネトリンポリペプチドへの遊走を促進するための誘引性シグナルである、ステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。  
【００３１】
さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%または99%超同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる。
【００３２】
第18の局面では、本願発明は内皮管の遊走を阻害する方法を提供する。前記方法は、内皮管の遊走を阻害するのに効果的なある量のネトリンポリペプチドを投与するステップであって、当該ステップにおいて前記作用物質はネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質であって、前記作用物質は、前記内皮管の前記作用物質への遊走を阻害するための反発性シグナルである、ステップを含む。ある実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、抗ネトリン抗体、Unc5hレセプタ、Unc5hレセプタ外部ドメイン、または抗ネオゲニン抗体から選択する。別の実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するRNAi、ネトリンの発現および／または活性を阻害するリボザイム、またはネトリンのネトリンレセプタへの結合を妨げることによってネトリンの発現および／または活性を阻害する小分子から選択される。
【００３３】
第19の局面では、本願発明は内皮管の遊走を促進するための薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの用途を提供する。
【００３４】
第20の局面では、本願発明は内皮管の遊走を阻害するための薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質の用途を提供する。
【００３５】
第21の局面では、本願発明は幹細胞の増殖を促進する方法を提供する。前記方法は、前記幹細胞の増殖を促進するのに効果的なある量のネトリンポリペプチドを投与するステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。  
【００３６】
さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%または99%超同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる。
【００３７】
前述のいずれかにおいて、本願発明は、前記幹細胞が胚性、胎性、または成体幹細胞であってよいことを意図する。前記幹細胞は、in vitroにおいて培養および維持することができ、その場合、前記ネトリンポリペプチドをin vitroにおいて前記細胞に投与する。前記幹細胞は動物の体内の内因性幹細胞であってよく、その場合、前記ネトリンポリペプチドはin vivoにおいて幹細胞の増殖を促進するために動物に投与さする。  
【００３８】
ある実施態様では、前記幹細胞は造血性幹細胞または内皮幹細胞である。
【００３９】
第21の局面では、本願発明は幹細胞の遊走を促進する方法を提供する。前記方法は、前記幹細胞の遊走を促進するのに効果的なある量のネトリンポリペプチドを投与するステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。  
【００４０】
さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%または99%超同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる。
【００４１】
前述のいずれかにおいて、本願発明は、前記幹細胞が胚性、胎性、または成体幹細胞であってよいことを意図する。前記幹細胞は、in vitroにおいて培養および維持することができ、その場合、前記ネトリンポリペプチドをin vitroにおいて前記細胞に投与する。前記幹細胞は動物の体内の内因性幹細胞であってよく、その場合、前記ネトリンポリペプチドはin vivoにおいて幹細胞の遊走を促進するために動物に投与さする。  
【００４２】
ある実施態様では、前記幹細胞は造血性幹細胞または内皮幹細胞である。     
【００４３】
第23の局面では、本願発明は幹細胞の増殖を促進する薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの用途を提供する。
【００４４】
第24の局面では、本願発明は幹細胞の遊走を促進する薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの用途を提供する。
【００４５】
第25の局面では、本願発明は平滑筋細胞の接着を促進する方法を提供する。前記方法は、前記平滑筋細胞の接着を促進するのに効果的なある量のネトリンポリペプチドを、平滑筋細胞に接触させるステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。  
【００４６】
さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%または99%超同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる。
【００４７】
ある実施態様では、前記平滑筋細胞は血管平滑筋細胞である。
【００４８】
第26の局面では、本願発明は平滑筋細胞の接着を促進する薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの用途を提供する。
【００４９】
第27の局面では、本願発明は修飾ネトリンポリペプチド、またはその生物学的断片を含む薬学的組成物を提供する。前記修飾ネトリンポリペプチドは、N末端、C末端、または1つ以上の部分を有する内部アミノ酸残基のうち1つ以上を修飾することができる。各部分は独立に、例示的な疎水性または親水性部分から選択することができる。本願発明の方法に用いるために特に好ましい修飾ネトリンポリペプチドは、非修飾ネトリンポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する。さらに、特に好ましい修飾ネトリンポリペプチドは、非修飾ポリペプチドと比較して有益な生理化学的特性を1つ以上有する。  
【００５０】
修飾ポリペプチドは、1、2、3、4、または5倍以上修飾することができる。さらに、修飾ポリペプチドは、N末端アミノ酸残基、C末端アミノ酸残基、および／または内部アミノ酸残基を修飾することができる。ある実施態様では、前記修飾アミノ酸残基はシステインである。別の実施態様では、前記修飾アミノ酸残基はシステインではない。
【００５１】
前述のいずれかのある実施態様では、前記修飾組成物は1つ以上の疎水性部分がついているポリペプチドを含む。例示的な疎水性部分には、ステロール、脂肪酸、疎水性アミノ酸残基、および疎水性ペプチドが、それらに限定されずに含まれる。ポリペプチドに1つ以上の疎水性部分がついている場合、各疎水性部分がそれぞれ選択される。独立に選択される部分は、同一かまたは異なっていてよい。さらに、ポリペプチドに1つ以上の部分がついている場合、前記部分には疎水性部分および非疎水性部分が含まれていてもよい。
【００５２】
前述のいずれかの別の実施例では、前記修飾組成物は1つ以上の親水性部分がついているポリペプチドを含む。例示的な親水性部分には、部分を含むPEG、シクロデキストラン、またはアルブミンが、それらに限定されずに含まれる。ポリペプチドに1つ以上の疎水性部分がついている場合、各親水性部分がそれぞれ選択される。独立に選択される部分は、同一かまたは異なっていてよい。さらに、ポリペプチドに1つ以上の部分がついている場合、前記部分には親水性部分および非親水性部分が含まれていてもよい。
【００５３】
第28の局面では、本願発明はネトリンポリペプチド、修飾ネトリンポリペプチド、またはネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を提供する。そのような薬学的組成物には、任意に、生体適合性の支持体に結合させるか、または生体適合性のマトリックスに溶解してよい。本願発明の方法に用いるための好ましい薬学的組成物は、前記未変性組成物（たとえば未変性ネトリンなど）の生物学的活性を1つ以上保持する。 
【００５４】
ある実施態様では、前記生体適合性の支持体は腔内装置である。別の実施態様では、前記腔内装置はステント、カテーテル、またはワイヤである。
【００５５】
第29の局面では、本願発明は血管狭窄の予防または処置の方法を提供する。  
【００５６】
第30の局面では、本願発明は閉塞性血管疾患の処置の方法を提供する。ある実施態様では、前記閉塞性血管疾患は、アテローム性動脈硬化、再狭窄、血管バイパス移植片狭窄、移植動脈障害、動脈瘤、解離である。
【００５７】
第31の局面では、本願発明は狭窄の予防または治療の方法である。ある実施態様では、狭窄の部位は、総胆管、膵管、食道、尿道、膀胱、子宮、または卵管から選択される。
【００５８】
第32の局面では、本願発明は血管形成術、バイパス移植、または心臓カテーテル法の後に生じる再狭窄を減らす方法を提供する。  
【００５９】
第33の局面では、本願発明は動物の虚血性症状を処置するための方法を提供する。前記方法は、虚血症を減少させるのに有効なある量のネトリンポリペプチドをそれを必要とする患者に投与するステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。  
【００６０】
さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%または99%超同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる。
【００６１】
前述の実施態様のいずれかにおいて、本願発明はさらに、1つ以上の血管新生因子を投与されるステップを意図する。ある実施態様では、前記血管新生因子は、血管内皮成長因子（VEGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、またはアンギオポイエチンポリペプチドから選択する。ネトリンポリペプチドと1つ以上の血管新生因子は、相加的または相乗的に作用してよく、連続または併用して投与してもよい。
【００６２】
第34の局面では、本願発明は炎症を減らすための方法を提供する。前記方法には、1つ以上の炎症生細胞種の増殖および／または遊走を阻害するのに効果的なある量の作用物質を投与するステップであって、当該ステップにおいて前記作用物質がネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する、ステップを含む。ある実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、抗ネトリン抗体、Unc5hレセプタ、Unc5hレセプタ外部ドメイン、または抗ネオゲニン抗体から選択する。別の実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するRNAi、ネトリンの発現および／または活性を阻害するリボザイム、またはネトリンのネトリンレセプタへの結合を妨げることによってネトリンの発現および／または活性を阻害する小分子から選択される。
【００６３】
ある実施態様では、前記の1つ以上の炎症生細胞種は、マクロファージ、リンパ球、マスト細胞、血小板、または好酸球のいずれかから選択される。  
【００６４】
第35の局面では、本願発明は腫瘍の成長または生存を阻害するための方法を提供する。前記方法は、血管新生を阻害するのに効果的なある量の作用物質を投与し腫瘍の成長または生存を阻害するステップであって、当該ステップにおいて、前記作用物質がネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する、ステップを含む。ある実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、抗ネトリン抗体、Unc5hレセプタ、Unc5hレセプタ外部ドメイン、または抗ネオゲニン抗体から選択する。別の実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するRNAi、ネトリンの発現および／または活性を阻害するリボザイム、またはネトリンのネトリンレセプタへの結合を妨げることによってネトリンの発現および／または活性を阻害する小分子から選択される。
【００６５】
第36の局面では、本願発明は、創傷の治癒を促進するための方法を提供する。前記方法は、血管新生を促進して創傷の治癒を促進するのに効果的なある量のネトリンポリペプチドを投与するステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。  
【００６６】
さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも80%同一のアミノ酸配列を含む。別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも85%、90%、95%、97%、98%、99%または99%超同一のアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと同一であるアミノ酸配列を含む。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかである核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる。
【００６７】
前述の実施態様のいずれかにおいて、本願発明はさらに、1つ以上の血管新生因子を投与されるステップを意図する。ある実施態様では、前記血管新生因子は、血管内皮成長因子（VEGF）、線維芽細胞成長因子（FGF）、血小板由来成長因子（PDGF）、またはアンギオポイエチンポリペプチドから選択する。ネトリンポリペプチドと1つ以上の血管新生因子は、相加的または相乗的に作用してよく、連続または併用して投与してもよい。     
【００６８】
第37の局面では、本願発明は外科手術または医療創傷の後の接着を処置または予防するための方法を提供する。前記方法は、血管新生を阻害して外科手術または医療創傷の後の瘢痕形成および接着を阻害するのに効果的なある量の作用物質を投与するステップであって、当該ステップにおいて前記作用物質がネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する、ステップを含む。ある実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、抗ネトリン抗体、Unc5hレセプタ、Unc5hレセプタ外部ドメイン、または抗ネオゲニン抗体から選択する。別の実施態様では、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質は、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチド、ネトリンに結合してネトリンの発現および／または活性を阻害するRNAi、ネトリンの発現および／または活性を阻害するリボザイム、またはネトリンのネトリンレセプタへの結合を妨げることによってネトリンの発現および／または活性を阻害する小分子から選択される。   
【００６９】
第38の局面では、本願発明は虚血症の処置をするための薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの用途を提供する。第39の局面では、本願発明は炎症を減らすための薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質の用途を提供する。
【００７０】
第40の局面では、本願発明は腫瘍の成長または生存を阻害するための薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害する作用物質の用途を提供する。
【００７１】
第41の局面では、本願発明は創傷の治癒を促進するための薬剤の製造におけるネトリンポリペプチドの用途を提供する。
【００７２】
第42の局面では、本願発明は外科手術または医療創傷の後の接着を予防または減らすための薬剤の製造における、ネトリンポリペプチドの発現および／または活性を阻害作用物質の用途を提供する。 
【００７３】
第43の局面では、本願発明は、本願発明は、ポリペプチドのいずれかの突然変異、修飾ポリペプチド、または生物活性断片を同定、特徴付け、または最適化するためのスクリーニングのための方法を提供する。ある実施態様では、前記方法は、未変性または非修飾ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する修飾ポリペプチドを同定、特徴付け、または最適化するためのスクリーニングを含む。好ましい変異体は、未変性または非修飾ポリペプチドと比較して有利な生理化学的特性を1つ以上有する。
【００７４】
さらなる局面では、本願発明は動物におけるニューロパシを処置する方法を提供する。前記方法は、前記動物（たとえばヒト）においてニューロパシを処置するのに効果的な量のネトリンポリペプチドを投与するステップを含む。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。別の実施例では、前記ネトリンポリペプチドは、齧歯類（たとえばマウスまたはラット）ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2ポリペプチドである。さらに別の実施態様では、前記ネトリンポリペプチドはヒトまたは齧歯類ネトリン1ポリペプチドである。具体的には、前記ニューロパシは末梢性ニューロパシまたは糖尿病性ニューロパシである。
【００７５】
ある実施態様では、前記方法は、ネトリンの変異体、修飾ポリペプチド、またはその生物活性断片を同定、特徴付け、または最適化するためのスクリーニングのステップを含む。
【００７６】
前述の局面のいずれかには、本願発明はポリペプチドを含む組成物とともに核酸を含む組成物を投与するステップが意図される。一例として、ネトリンポリペプチドの投与を要する方法には、本願発明はさらにネトリンポリペプチドをコードする核酸配列の投与も意図する。ある実施態様では、前記核酸配列は、ネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2から選択されるヒトネトリンポリペプチドをコードする。別の実施例では、前記核酸配列は、ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、またはネトリンG2から選択されるマウスネトリンポリペプチドをコードする。別の実施態様では、前記核酸配列は、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一のポリペプチドをコードする。別の実施態様では、前記核酸配列は、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43である配列にハイブリダイズされる。さらに別の実施態様では、前記組成物は、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、43、またはその生物活性断片と少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一の核酸配列を含む。 
【００７７】
核酸を含む組成物の投与を目的とした前述の方法のいずれかでは、前記組成物は、ポリペプチドの投与のために概説した適切な方法論を用いて調製および投与することができる。
【００７８】
本願発明の前述の各局面には、前期実施態様のいずれか一つを適切な場合にその他の実施態様のいずれかと組み合わせてもよいということが意図される。
【００７９】
本願発明の実施には、他に指示のない限り、当業の技術の範囲内である細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、および組換えDNAの従来の技術を用いるだろう。そのような技術は文献に記載されている。 例えば、Molecular
Cloning: A Laboratory
Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor
Laboratory Press: 1989)、 DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985)、 Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984)、 Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195、 Nucleic
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Blackwell, eds., 1986)、 Manipulating the Mouse Embryo, (Cold
Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照。
【００８０】
本願発明のその他の特徴および利点は、以下の発明の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００８１】
発明の詳細な説明
(i)  概要
本願発明は心血管および血管系の細胞の増殖、分化、接着、および遊走を調節するための方法および組成物を提供する。具体的には、本願発明は、内皮細胞、血管平滑筋細胞、初期の血液および免疫細胞などの同一の系統に由来する細胞を含む初期の血管細胞のふるまいを調節する方法および組成物を提供する。これらの細胞種の増殖、分化、遊走、および接着を調節するのに有用な方法および組成物は、各種の疾患または症状を処置または予防する治療的な文脈の中での用途を含むある範囲のin vitroおよびin vivoの用途を有する。  
【００８２】
本願発明は、神経系の軸索ガイダンスに関与する特定のリガンドおよびレセプタが、初期の血管細胞の細胞のふるまいを調節するように機能するという発見に基づく。既報の研究では、軸索への反発的な合図を提供する特定のタンパク質も一部の血管細胞種に反発的な合図を提供しているということが示されている。しかし、本願発明者らが知るところでは、これは、誘引的な合図の役割が神経系と血管の間で保たれているという報告としては初めてのものである。  
【００８３】
ネトリンポリペプチドとネトリンシグナル伝達が平滑筋細胞および内皮細胞の血管新生とともに、増殖、遊走、および接着を促進することが可能であるという発見に基づいて、本願発明は、平滑筋細胞および内皮細胞を含む初期の血管細胞の増殖、分化、遊走、および接着の調節のための方法および組成物を提供する。本願発明の方法および組成物には、ネトリンの発現もしくは活性、またはネトリンシグナル伝達を促進する作用物質を用いた平滑筋細胞および内皮細胞の増殖、遊走、または接着を促進する方法が含まれる。例示的な作用物質には、ネトリンポリペプチド、修飾ネトリンポリペプチド、およびそれらの生物活性断片が含まれる。さらに、例示的な作用物質を本願明細書に記載する。  
【００８４】
本願発明の方法および組成物には、血管新生を阻害する方法とともに、平滑筋および内皮細胞の増殖、遊走、または接着を阻害する方法も含まれる。例示的な作用物質には、Unc5hレセプタ、ネオゲニン阻害抗体、ネオゲニンアンチセンスヌクレオチド、ネオゲニンRNAi構造体、ネオゲニンリボザイム、および各種小分子作用物質のすべてまたは一部分が含まれる。 
【００８５】
本願発明の方法および組成物をさらに詳細に概説する前に、本願発明者らはネトリンおよび各種ネトリンレセプタを簡単に概説する。ネトリンについての知識の多くは、ネトリンは軸索への誘引の合図として働くという、神経系についての研究から得られている。ネトリンポリペプチドは、軸索の成長を促進する能力のために、もともとヒヨコから生成された。たくさんの相同分子種がさまざまな生物種から分離されている。前記ヒト相同分子種には、ネトリン1、ネトリン2、ネトリン4、ネトリンG1、およびネトリンG2が含まれる。前記マウス相同分子種には、ネトリン1、ネトリン3、ネトリン4、ネトリンG1、およびネトリンG2であるが、マウスネトリン3とよばれるポリペプチドはヒトネトリン2のマウスのファミリメンバである。  
【００８６】
ネトリンポリペプチドの概略図を図1に提供する。完全長のネトリンポリペプチドは長さが約600アミノ酸残基であり、分子量は約70乃至80 kDaである。前記タンパク質はグリコシル化した形で認められることが多い。前記タンパク質のN末端側の2/3（ドメインVI、ならびにドメインv1、v2、およびv3）はラミニンのポリペプチド鎖（A、B1およびB2）のN末端に相同である。ドメインv1、v2、およびv3は、EGF-様リピートを包含し、ネトリンのネトリンレセプタDCCおよびネオゲニンへの結合を媒介する。ネトリンのC末端側の1/3は高度に塩基性で、少なくともある細胞種において、ネトリンとインテグリンの間の相互作用を媒介することもある。  
【００８７】
ネトリンは数種の異なるレセプタと相互作用できる。この神経系では、ネトリンの誘引活性はネオゲニンおよびDCC（直腸癌では消去される）によって媒介される。DCCおよびネオゲニンは両方とも、4つの免疫グロブリンドメインと6つのフィブロネクチンリピートを含む細胞外領域を有する膜貫通レセプタをコードする。DCCおよびネオゲニンの細胞質ドメインには明らかな触媒ドメインがないが、小さいGTPase、MAPキナーゼ、ホホリパーゼC、およびPI-3キナーゼを含む複数の経路が、トリンシグナル伝達に関連性が示されている。  
【００８８】
さらに、レセプタの少なくとも2ファミリがネトリンポリペプチドの反発活性を媒介する。前記神経系では、ネトリンの反発活性はレセプタのRoboおよびUnc5hファミリのメンバによって媒介される。  
【００８９】
本願明細書に記載の発見をふまえ、および神経系におけるネトリン活性の既知の媒体をかんがみて、本願発明は、ネトリン活性またはネトリンシグナル伝達を促進する組成物に基づく、またはネトリン活性またはネトリンシグナル伝達を阻害する（たとえばネトリンの誘引活性を阻害する）組成物に基づく各種方法を意図する。 
【００９０】
心血管細胞種のふるまいを調節するin vitroおよびin vivoにおける方法に加えて、本願方法および組成物は、(i) 特定の細胞種への、または特定のセットの細胞の状況もしくは外界の状況下における、ネトリンの活性を媒介するネトリンレセプタ、(ii)ネトリンシグナル伝達経路の成分、または(iii)ネトリンの生物学的活性を模倣またはアンタゴナイズする作用物質、を同定し特徴付けるためのさまざまなアッセイに有用である。
【００９１】
(ii)  定義
他に定義のない限り、すべての技術および科学用語は、本願発明が属する当業者によって普通に理解されるものと同じ意味を有する。
【００９２】
本願明細書で用いられる冠詞「a」および「an」は、その冠詞の文法上の物体1つまたは1つより多い（すなわち少なくとも1つ）を意味する。例として、「要素（an element）」は1つ以上の要素を意味する。
【００９３】
「マーカ」は細胞の状態を決定するために使用される。マーカは、形態学的であっても生化学的（酵素的）であっても、細胞種が発現する細胞種または分子に特有の特性である。マーカは、抗体のエピトープか、または当業で入手可能なその他の結合分子を有するタンパク質マーカなどの、タンパク質マーカであってよい。さらに、マーカは、タンパク質（ペプチドおよびポリペプチド）、脂質、多糖、核酸、およびステロイドを含むがそれらに限定されない、細胞中に認められる分子のいずれかから構成されてもよい。さらに、マーカは細胞の形態学的または機能的特徴を含んでもよい。形態学的形質の例には、形状、サイズ、および核対細胞質の比が、それらに限定されずに含まれる。機能的形質の例には、特定の基質に接着する能力、特定の色素を取り込むかまたは排除する能力、特定の条件下において遊走する能力、および特定の系統に沿って分化する能力が、それらに限定されずに含まれる。  
【００９４】
マーカは当業者が入手できるいずれかの方法によって検出することもできる。マーカ分子上の少なくとも一つのエピトープを認識して結合する抗体（およびすべての抗体誘導体）に加えて、マーカの検出は、タンパク質ドットブロット、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル法（SDS-PAGE）またはタンパク質を分離するその他のゲルシステムのいずれかとそれに続くマーカの可視化（ウェスタンブロットなど）、ゲルろ過、アフィニティカラム精製法など、形態学的には、蛍光活性化細胞分類（FACS）、マーカ分子と特異的な反応を有する色素による染色（ルテニウムレッドと細胞外マトリックス分子など）、特異的形態学的特徴（上皮の微絨毛、または線維芽細胞および間充組織などの遊走細胞の仮足／糸状仮足）など、および生化学的には、酵素産生物または中間体のアッセイ、およびタンパク質対脂質、脂質対糖もしくは2種類の特定の脂質または多糖の相互比などの細胞の全組成、などの分析技術を用いてもよい。核酸マーカの場合、いずれかの既知の方法を用いてもよい。そのようなマーカが核酸の場合、PCR、RT-PCR、in situ ハイブリダイゼーション、ドットブロットハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、サザンブロットなどを、好適な検出方法とともに用いてよい。そのようなマーカが形態学的および／または機能的形質の場合、好適な方法には、たとえば肉眼、立体顕微鏡、解剖顕微鏡、共焦点顕微鏡、または電子顕微鏡などを用いた目視検査が含まれる。    
【００９５】
「分化」は、もとの細胞種とは異なる1つ以上の特徴または機能の獲得または所有を表す。分化した細胞は、周囲の構造またはその細胞（同一の細胞であっても）の前駆体とは異なる特徴または機能を有するものである。分化のプロセスは、限られたセットの細胞（たとえば脊椎動物においては胚の３つの胚葉である、外胚葉、中胚葉、内胚葉）から細胞の多様性を生じさせ、個体を構成する数多くの特化された細胞種すべてをつくり出す。  
【００９６】
分化は、たとえば他の細胞種とは異なる1つ以上の特徴または機能を獲得するなど、細胞が特化された表現型を呈する発達プロセスである。ある場合では、分化した表現型とは、ある発達経路における成熟した時点の細胞表現型を意味する。すべてではないが多くの組織の場合、分化のプロセスは細胞サイクルからの退出点に結びつく。このような場合、前記細胞は典型的にはその増殖能力が失われるかかまたは大幅に限定され、そのような細胞は一般に「最終的に分化した」といわれる。しかし、本願発明者らは、「分化」または「分化した」という用語は、発達における前の時点よりもその運命または機能がより特化された細胞を意味し、最終的に分化した細胞と、最終的に分化していないが発達における前の時点よりも特化された細胞の両方が含まれることを指摘する。
【００９７】
「増殖」は、個体群の中での細胞分裂による細胞数の増加を意味する。細胞分裂は、多くの場合、成長因子またはその他の分裂促進因子に応答して、複数のシグナル伝達経路の協調した活性化によって生じる。細胞が細胞増殖を阻害または下方調節する細胞内または細胞外シグナルおよびメカニズムの作用から解放される場合、細胞増殖が促進される場合もある。細胞増殖の増加は、DNA合成の増加で検定することができる。
【００９８】
「ネトリン関連組成物」という用語は、ネトリンポリペプチド、修飾ネトリンポリペプチド、またはその突然変異種もしくは生物活性断片を含む組成物を意味する。前記用語は、本出願全体を通して、ネトリン組成物と同じ意味で用いられる。  「ネトリン関連ポリペプチド」という用語は、ネトリンアミノ酸配列、変異ネトリンアミノ酸配列、またはその生物活性断片を含む組成物を意味する。そのようなポリペプチドは、修飾されてもよく、非修飾であってもよい。本願発明の特に好ましいネトリン関連ポリペプチドは、ヒトおよびマウスネトリン関連ポリペプチド（たとえば、マウスネトリン1、ヒトネトリン1、ヒトネトリン2、マウスネトリン2、ヒトネトリ4、マウスネトリン4、マウスネトリンG1およびG2、ヒトネトリンG1およびG2、ならびにその変異体、生物活性断片、および修飾ポリペプチド）である。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも70%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一のアミノ酸配列を含む。前述のいずれかにおいて、本願発明のネトリン関連ポリペプチド又はネトリン関連組成物は、相当するネトリンポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する。ネトリンの例示的な生物学的活性には、以下が含まれる。(i) ネトリンレセプタと結合する、(ii)軸索の誘引を促進する、(iii)血管新生を促進する、(iv)細胞遊走を促進する、(v)細胞接着を促進する、(vi)細胞増殖を促進する。    
【００９９】
ある実施例では、ネトリン関連組成物は、ネトリン関連核酸組成物を意味する。そのような組成物は、ネトリン関連ポリペプチドをコードする核酸配列を含む。ネトリン関連核酸組成物は送達することができ、送達されたネトリン関連核酸組成物は1つ以上のネトリンの生物学的活性を保持するネトリン関連ポリペプチドをコードする。ある実施態様では、前記ネトリンポリペプチドは、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、43、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも70%、75%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一のアミノ酸配列を含む。さらなる例示的な核酸組成物は、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片のいずれかと少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または100% 同一のポリペプチドをコードする核酸配列を含む。よりさらなる例示的な核酸組成物は、65℃で0.2 x SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43のいずれかにある核酸配列にハイブリダイズされる核酸配列を含む。
【０１００】
完全長ネトリン関連ポリペプチドに加えて、本願発明は、完全長ネトリン関連ポリペプチドの1つ以上の生物学的活性を保持するネトリン関連ポリペプチドの生物活性断片の使用を意図する。例示的な生物活性断片は、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、または44の生物活性断片である。さらなる例示的な生物活性断片は、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、または44と少なくとも80%同一のポリペプチドの断片である。
【０１０１】
表１は、本願明細書に参照された例示的な配列を提供する。本出願に記載された核酸およびアミノ酸のジェンバンク受入番号を提供する。
【０１０２】
【表１】
2008506703.tif 000002
2008506703.tif 000003
【０１０３】
生物活性断片は、タンパク質の特定の部分が完全長タンパク質の1つ以上の機能的特性を維持することを意味する。本願発明の文脈において、生物活性断片は以下のいずれかをそれらに限定されずに含む完全長ネトリンの生物学的機能の1つ以上を保持し、ネトリンシグナル伝達を促進する能力を保持する。さらなる生物学的活性には、(i) ネトリンレセプタと結合する、(ii)軸索の誘引を促進する、(iii)血管新生を促進する、(iv)細胞遊走を促進する、(v)細胞接着を促進する、(vi)細胞増殖を促進する、が、それらに限定されずに含まれる。本願発明は、ネトリンの生物活性断片だけではなくペプチド模倣体（修飾断片）の使用も意図する。さらに、以下に概説するとおり、本願発明は修飾ネトリン関連ポリペプチド、およびその修飾生物活性断片を意図する。例示的な修飾ネトリン関連ポリペプチドおよびその修飾生物活性断片は、相当する未変性および／または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持する。   
【０１０４】
変異体は完全長かまたは完全長以外であってよい。本願発明の核酸またはタンパク質の変異体には、本願発明の核酸またはタンパク質と実質的に同一の領域を含む分子が、それらに限定されずに含まれる。さまざまな実施態様において、前記変異体は、同一のサイズの、または当業に公知のコンピュータ相同性プログラムによってアラインされた配列と比較した場合の、または、コードされた核酸が、ストリンジェントな、中程度にストリンジェントな、または低ストリンジェントな条件下において前述のタンパク質をコードする配列の相補体とハイブリダイズすることができる、核酸またはアミノ酸と少なくとも約70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%、または 99%超、同一である。。本願発明の方法および組成物に用いるための変異体は、未変性および／または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持する。
【０１０５】
本願発明の方法に用いるための例示的な変異体および断片に関して上に概説した定義の多くはネトリンポリペプチドに関して記述されているが、本願発明には他の作用物質のための組成物及び使用も含まれる。そのような作用物質はネトリンおよびネトリンシグナル伝達の発現および／または活性を調節するが、そのような作用物質はネトリンポリペプチドではない。前記発明は、その他の非ネトリンポリペプチドまたは核酸作用物質が用いられる場合、そのポリペプチドまたは核酸の変異体、生物活性断片、および修飾体は本願発明の範囲内である。    
【０１０６】
本願明細書に記載の「タンパク質」は、基本的に20アミノ酸のいずれかから成るポリマーである。「ポリペプチド」は比較的大きなポリペプチドに関して用いられることが多く、「ペプチド」は小さいポリペプチドに関して用いられることが多いが、当業におけるこれらの用語の用途は重複しており、変化する。
【０１０７】
「ペプチド」、「タンパク質」、「ポリペプチド」という用語は、本願明細書では同義的に用いられる。
【０１０８】
「ポリヌクレオチド配列」および「ヌクレオチド配列」という用語も、本願明細書では同義的に用いられる。
【０１０９】
本願明細書に記載の「組換え」は、タンパク質が原核生物または真核生物の発現システムに由来する、ということを意味している。
【０１１０】
「野生種」という用語は、タンパク質もしくはその部分、またはタンパク質配列もしくはその部分をそれぞれコードし、通常in vivoにおいて存在する、天然のポリヌクレオチド配列である。
【０１１１】
「突然変異体」という用語は、生物の遺伝作用物質におけるいずれかの変化を意味し、特に、野生種ポリヌクレオチド配列における変化（すなわち、消失、置換、付加、または交換）、または野生種タンパク質配列のいずれかの変化を意味する。「変異体」という用語は「突然変異体」と同義に用いられる。遺伝作用物質の変化がタンパク質の機能の変化を生じるということが推定される場合が多いが、「突然変異体」および「変異体」という用語は、変化によって前記タンパク質の機能が変化するか（たとえば新しい機能の増加、減少、障害）、または変化によって前記タンパク質の機能に影響がないか（たとえば突然変異または変異がサイレントである）にかかわらず、野生種タンパク質の配列に現れる変化を意味する。  
【０１１２】
本願明細書に記載の「核酸」という用語は、デオキシリボ核酸（DNA）および適宜、リボ核酸（RNA）などのポリヌクレオチドを意味する。この用語はまた、ヌクレオチド類似体から作製されたRNAまたはDNAのいずれかの等価物、類似体として、ならびに本願明細書に記載の実施態様に適用されるとおり、一本鎖（センスまたはアンチセンス）および二本鎖ポリヌクレオチドが含まれることも理解されるべきである。
【０１１３】
本願明細書に記載の「遺伝子」または「組換え遺伝子」という用語は、エキソンおよび（任意に）イントロン配列の両方を含むポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームを含む核酸を意味する。  
【０１１４】
本願明細書に記載の「ベクタ」という用語は、核酸分子であって、別の核酸と結合してそれを輸送することができる核酸分子を意味する。好ましいベクタは、それが結合している核酸の自律的な複製および／または発現が可能なベクタである。動作可能に結合している遺伝子の発現を方向付けることができるベクタを、本願明細書では「発現ベクタ」とよぶ。 
【０１１５】
ポリヌクレオチド配列（DNA、RNA）は、発現制御配列がそのポリヌクレオチド配列の転写および翻訳を制御および調節する場合、発現制御配列に「動作可能に」結合する。「動作可能に連結する」という文言には、発現するポリヌクレオチドの前にある好適な開始シグナル（たとえばATG）を有するステップと、発現制御配列の制御下においてポリヌクレオチド配列の発現を許容する正しいリーディングフレームを維持するステップと、前記ポリヌクレオチド配列によってコードされた望ましいポリペプチドを産生するステップが含まれる。
【０１１６】
「転写調節配列」は、本願明細書全体において使用される一般名称で、動作可能に結合しているタンパク質コード配列の転写を誘導または制御する開始シグナル、エンハンサおよびプロモータなどの核酸配列を意味する。
【０１１７】
ある例では、組換え遺伝子の転写は、発現が意図される細胞種における組換え遺伝子の発現を制御するプロモータ配列（またはその他の転写制御配列）の制御下にある。組換え遺伝子は、天然の状態のタンパク質の転写を制御する配列と同一の、またはそれとは異なる転写制御配列の制御下にあってよいことも理解されよう。
【０１１８】
本願発明に記載の「組織特異的プロモータ」という用語は、プロモータとして働く、すなわち前記プロモータに動作可能に結合した特定の核酸配列の発現を調節する核酸配列であって、例えば神経細胞など神経由来の細胞など、組織の特定の細胞における前記の特定の核酸配列の発現に影響する、核酸配列を意味する。前記用語はまた、主にある組織にある特定の核酸の発現を調節するが、他の組織における発現も引き起こす、いわゆる「漏れやすい」プロモータも包含する。
【０１１９】
「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、ポリペプチドをコードする第１のアミノ酸配列と、前記第１のポリペプチドのいずれの領域とも異なっていて実質的に相同ではない領域（たとえばポリペプチド部分）を定める第２のアミノ酸配列との融合体である。キメラタンパク質は、前記第１のタンパク質も発現する生物において認められる外来の領域（異なるタンパク質にもかかわらず）を提示してもよく、または異なる種類の生物が発現するタンパク質構造の「種間」、「遺伝子間」などの融合体であってもよい。
【０１２０】
一般に、「成長因子」は細胞の成熟および分化を方向付けることによって細胞の成長および発達を促進する物質である。成長因子は、組織の維持と修復も媒介する。成長因子は、細胞の表面上の特異的なレセプタに結合することによって細胞のふるまいに影響する。成長因子レセプタへのリガンドの結合は、たとえば細胞のふるまいなどに影響するシグナル伝達経路を活性化する。成長因子は典型的には、非常に低濃度で細胞に影響を与える。成長因子の数は、血管細胞において特定の効力を有するとして特異的に認識される。これらの成長因子には、線維芽細胞成長因子（FGF）ファミリ、血小板由来成長因子（PDGF）ファミリのメンバ、血管内皮成長因子（VEGF）ファミリのメンバ、およびアンギオポイエチンのメンバが含まれる。そのような成長因子は、同様に、本願明細書において「血管新生因子」、「血管新生成長因子」、および「血管成長因子」と同義であろう。
【０１２１】
「線維芽細胞成長因子」（Fgfs）は、短いポリペプチドの大規模ファミリーからなる成長因子の一種に属し、細胞外に放出されてヘパリンと結合して二量体化し、特異的なレセプタチロシンキナーゼ（Fgfrs）を活性化させる。Fgfシグナル伝達は哺乳類の創傷治癒および腫瘍の血管新生に関与し(Ortega et al., 1998; Zetter, 1998)、脚、歯、脳、および心臓の器官形成中の誘導および／またはパターン形成を含む、胚の発達に数多くの役割を有している(Crossley et al., 1996; Martin, 1998; Ohuchi et
al., 1997; Peters and Balling, 1999; Reifers et al., 1998; Vogel et al., 1996;
Zhu et al., 1996)。Fgfsは、機能的アッセイ(Baird and Klagsbrun, 1991; Moody, 1993) または抗体(Research
Diagnostics; Flanders, NJ or Promega, WI)のいずれかを用いて容易に検出することができる。
【０１２２】
「予防する」という用語は当業に公知であり、局部的再発（たとえば疼痛）などの症状、癌などの疾患、心不全などの複合的症候群、またはその他の医学的状態などに関連して使用される場合は当業に十分理解されており、症状の発症前に、組成物であって、当該組成物を投与されない被験体と比較して、被験体の医学的状態の症状の頻度を低減するか重篤度を低下させるか、または発症を遅らせる、組成物を投与するステップを含む。したがって、癌の予防には、たとえば、処置を受けない対照群と比較して、予防処置を受ける患者群において検出可能な癌成長の数を低減するステップ、および／または、未処置対照群と比較した処置群の検出可能な癌成長の出現を、たとえば統計学的および／または臨床的に有意な量、遅らせるステップが含まれる。感染症の予防には、たとえば、未処置対照群に対する処置群の感染の診断数を減少させるステップ、および／または未処置対照群に対する処置群の感染症の症状の発症を遅延させるステップが含まれる。疼痛の予防には、たとえば、未処置対照群と比較して、処置群の被験体が経験する疼痛の感覚の頻度を減少するステップか、重篤度を低下させるステップか、または代替的には遅延するステップが含まれる。
【０１２３】
「作用物質」という用語は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、および小有機分子を含む、本願発明の化合物を意味する。本願発明はネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害する作用物質（例えばプロ血管新生、ネトリンの誘引活性を阻害する作用物質）を意図する。本願発明はさらに、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を促進する作用物質（例えばプロ血管新生、ネトリンの誘引活性を促進する作用物質）を意図する。  
【０１２４】
「修飾する」という用語は、ポリペプチドの誘導体化であって、そのポリペプチドの1つ以上のアミノ酸残基に1つ以上の部分を付ける（たとえば共有結合または非共有結合相互作用によって結合させる）ことによる、1つ以上の部分を用いたポリペプチドの誘導体化を意味する。例示的な修飾には、親油性基および脂肪酸基などの疎水性基、グリコシル化、リン酸化が含まれる。さらなる例示的な修飾には、親水性修飾が含まれる。ネトリンポリペプチドを含めた本願発明の方法に用いるためのポリペプチドは、修飾することができる。本願発明の方法に用いるための修飾ポリペプチドは、未変性ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持し、好ましくはさらに、相当する未変性および／または非修飾ポリペプチドと比較して有利な生理化学的特性を1つ以上有する。ある実施態様では、本願発明は修飾ネトリン関連ポリペプチドを提供する。未変性ネトリンポリペプチドはグリコシル化されていることが多いということを指摘する。しかし、本願発明は、ある範囲の修飾および非修飾ポリペプチドの使用を意図する。一例として、本願発明は以下を意図する。(i)グリコシル化されていないまたはその他の形に修飾されていないネトリンポリペプチドの使用、(ii)グリコシル化されているがその他の形に修飾されていないネトリンポリペプチドの使用、(iii)グリコシル化されていないが、典型的にグリコシル化されたものと同一かまたは異なる残基上の1つ以上の化学基で修飾されたネトリンポリペプチドの使用、(iv)グリコシル化されていて典型的にグリコシル化されたものと同一かまたは異なる残基上の1つ以上の部分でさらに修飾されているネトリンポリペプチドの使用、である。上述の修飾または被修飾ネトリンポリペプチド、その断片、または本願発明の方法に用いるためのその他のポリペプチドの例のいずれかについて、好ましい修飾ポリペプチドまたは断片は、未修飾ポリペプチドの生物学的活性を保持しており、好ましくは1つ以上の有利な生化学活性を有する。      
【０１２５】
「付加された」という用語は、アミノ酸残基への1つ以上の部分の付加を意味する。前記用語は、任意のアミノ酸残基への任意の部分の付加を、それに限定されずに意味する。前記用語には共有結合または非共有結合相互作用の結合が含まれる。
【０１２６】
「N末端アミノ酸残基」という用語は、ポリペプチドまたはペプチドの最初のアミノ酸残基（アミノ酸1番）を意味する。
【０１２７】
「C末端アミノ酸残基」という用語は、ポリペプチドまたはペプチドの最後のアミノ酸残基（n=ペプチドまたはポリペプチドの残基の総数の場合、アミノ酸n番）を意味する。 
【０１２８】
「疎水性」という用語は、水やその他の極性原子とではなく、お互いに相互作用する非極性原子を有する部分の傾向を意味する。「疎水性」の作用物質は、ほとんど水に不溶である。疎水性の特徴を有する天然産生物には、脂質、脂肪酸、リン脂質、スフィンゴ脂質、アクリルグリセロール、ろう、ステロール、ステロイド、テルペン、プロスタグランジン、トロンボキサン、ロイコトリエン、イソプレノイド、レテノイド、ビオチン、ならびにトリプトファン、フェニルアラニン、イソロイシン、ロイシン、バリン、メチオニン、アラニン、プロリン、およびチロシンなどの疎水性アミノ酸が含まれる。非極性原子の存在によってその物理的特性が決定される場合、化学部分も疎水性であるか、または疎水性の特徴を有する。
【０１２９】
「親油基」という用語は、ポリペプチドに結合されるという文脈においては、炭化水素含有量が高いために前記部分の脂質相への親和性が高い部分を意味する。親油基は、たとえば、約7乃至30個の炭素を有する、比較的長い鎖のアルキルまたはシクロアルキル（好ましくはn-アルキル）基であってよい。前記アルキル基は、ヒドロキシまたは1級アミンの「尾部」で終了することがある。さらに具体的には、親油性分子には、天然および合成の、脂肪酸、エステルおよびアルコールなどの芳香族並びに非芳香族基、その他の脂質分子、アダマンタンおよびバックミンスターフラーレンなどのかご構造、ならびにベンゼン、ペリレン、フェナントレン、アントラセン、ナフタレン、ピレン、クリセン、およびナフタセンなどの芳香族炭化水素が含まれる。
【０１３０】
「内部アミノ酸」という用語は、N末端アミノ酸でもC末端アミノ酸でもないペプチド配列中のアミノ酸のいずれかを意味する。   
【０１３１】
ある実施態様では、本願発明の適用に用いられるアミノ酸は、タンパク質に認められる天然に存在するアミノ酸、またはアミノ基およびカルボキシル基を含むそのようなアミノ酸の同化もしくは異化産生物である。特に好適なアミノ酸側鎖には、以下のアミノ酸であって、グリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンの側鎖から選択された側鎖が含まれる。
【０１３２】
「アミノ酸残基」という用語にはさらに、本願明細書に記載の任意のアミノ酸の類似体、誘導体、および同属種、ならびにC末端またはN末端保護アミノ酸（たとえばN末端またはC末端保護基で修飾された）誘導体が含まれる。たとえば、本願発明は、側鎖が伸長または短縮されている一方で、カルボキシ基、アミノ基、または環化のためのその他の反応性前駆官能基を提供しているアミノ酸類似体、および適切な官能基を有する変異側鎖を有するアミノ酸類似体の使用を意図する。たとえば、当該化合物には、たとえばシアノアラニン、カナバニン、ジエンコル酸、ノルロイシン、3-ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、5-ヒドロキシトリプトファン、1-メチルヒスチジン、3-メチルヒスチジン、ジアミノピメリン酸、オルニチン、またはジアミノブチル酸が含まれてよい。本願明細書において好適な側鎖を有するその他の天然に存在するアミノ酸代謝物または前駆体は、当業に認識されるであろうし、本願発明に含まれる。  
【０１３３】
さらに、アミノ酸の構造が立体異性型を認める場合、そのようなアミノ酸の(D)および(L)立体異性体が含まれる。本願明細書のアミノ酸およびアミノ酸残基の立体配置は、その立体構造が、アミノ酸または残基が立体配置(d)、(l)または(dl)を有することができると指定していない場合、適切な記号(d)、(l)または(dl)によって指定される。本願発明の化合物の一部の構造には非対称炭素原子が含まれるという点には留意すべきだろう。そのような非対称性から生じる異性体が本願発明の範囲内に含まれることは、適宜に理解される。そのような異性体は、実質的には、従来の分離技術、および立体的に制御された合成によって純粋な形で得ることができる。この用途の目的のために、他に明らかに記載のない限り、命名されたアミノ酸は(d) または(l)の両方を含むよう解釈されるべきである。
【０１３４】
本願明細書に記載の「逆」または「レトロ」ペプチド配列は、共有結合したアミノ酸残基の配列全体のその部分であって、当該部分において、アミノ酸骨格におけるペプチド結合形成のカルボキシからアミノへの正常な方向が逆転して、左から右への従来の方向で読むと、前記ペプチドのアミノ部分が前記カルボキシル部分の前にくる（後ろではなく）ような、部分を意味する。たとえば、一般的にはGoodman, M.
and Chorev, M. Accounts of Chem. Res. 1979, 12, 423を参照。
【０１３５】
本願明細書に記載の逆配向ペプチドには、(a)1つ以上のアミノ酸残基が逆（rev）配向に転換した（その結果、分子の最も左側の部分に第2の「カルボキシル末端」となる）もの、(b)1つ以上のカルボキシル末端残基が逆（rev）配向した（その結果、分子の一番右側の部分が第2の「アミノ末端」となる）もの、が含まれる。ペプチド（アミド）結合は、正常な配向の残基と逆配向残基の間の接点に形成されることはない。
【０１３６】
したがって、本願発明のある逆ペプチド化合物は、好適なアミノ酸模倣基を用い、逆ペプチド（逆アミド）結合を用いて上述の配列の2つの結合部分に結合させることによって形成することができる。上述の(a)の場合、ジケト化合物の中央の残基は、2つのアミド結合を有する構造体に結合して、ペプチド模倣構造体をつくり出すために、都合よく用いることもできる。上述の(b)の場合、ジアミド化合物の中央の残基は、2つのアミド結合を有する構造体に結合して、ペプチド模倣構造体をつくり出すために、同様に有用であろう。
【０１３７】
そのような化合物の逆方向の結合は一般に、さらに、非逆ペプチドの側鎖に似た側鎖の空間配向を維持するために、逆アミノ酸残基の鏡像異性構造を逆転させる必要があるだろう。前記ペプチドの逆部分におけるアミノ酸構造は好ましくは(D)であり、非逆部分の構造は好ましくは(L)である。反対の構造または混合の構造は、結合活性を最適化するのに好適な場合には容認できる。
【０１３８】
本願発明のある化合物は、特定の幾何学的または立体異性形状で存在していてよい。本願発明は、シス-およびトランス-異性体、R-およびS-鏡像異性体、ジアステレオマー、(D)-鏡像異性体、(L)-鏡像異性体、それらのラセミ混合物、およびその他のそれらの混合物を含むすべての化合物が、本願発明の範囲内に入ることを意図する。アルキル基などの置換基には、さらなる非対称炭素原子が存在する。そのようなすべての鏡像異性体、およびその混合物は本願発明に含まれることを意図する。
【０１３９】
たとえば、本願発明の化合物の特定の鏡像異性体が望ましい場合、非対称合成、またはキラル補助基を用いた誘導によって調製してもよく、その場合、得られたジアステレオマー混合物を分離して補助基を切断し、純粋な望ましい鏡像異性体を得る。または、分子がアミノ基などの塩基性官能基、またはカルボキシル基などの酸性官能基を含む場合、適切な光学活性酸または塩基を用いてジアステレオマー塩を形成し、その後、当業に公知の分別再結晶法またはクロマトグラフィ法によって形成されたジアステレオマーを分割してから、純粋な鏡像異性体を回収する。  
【０１４０】
本願発明の目的のために、化学元素はPeriodic Table
of the Elements, CAS version, Handbook of Chemistry and Physics, 67th Ed.,
1986-87の内表紙に従って同定される。また、本願発明の目的のために、「炭化水素」という用語には、少なくとも1つの水素と1つの炭素原子を有する、すべての許容しうる化合物が含まれることが意図される。広い局面では、前記の許容しうる炭化水素には、非環式および環式、分岐および非分岐、炭素環およびヘテロ環、芳香族および非芳香族の、置換または非置換であってよい有機化合物が含まれる。
【０１４１】
本願明細書に記載の「非経口投与」および「非経口に投与した」という文言は、経腸および局所投与をのぞく投与形態で通常は注射による投与を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、心室内、眼窩内、嚢内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜内、クモ膜下、脊髄内、および胸骨内注射および輸液が、それらに限定されずに含まれる。 
【０１４２】
本願明細書に用いられる「全身投与」、「全身に投与した」、「末梢投与」および「末梢に投与した」という文言は、中枢神経への直接投与ではない、化合物、薬物、またはそのほかの作用物質の投与方法であって、その化合物、薬物、またはそのほかの作用物質が動物の全身に入り、代謝およびたとえば皮下投与などそのほかの同様のプロセスを経るような投与を意味する。 
【０１４３】
本願明細書に記載の「有効な量」という用語は、被験体にいくらかの望ましい効果を生じるのに有効な、本願明細書に記載の1つ以上の作用物質を含む1つ以上の作用物質、物質、または組成物の量を意味する。  
【０１４４】
「薬学的に許容な」という文言は、本願明細書では、適切な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題もしくは合併症のない、妥当なベネフィット／リスク比に見合った、ヒトおよび動物の組織との接触に用いるのに好適な、化合物、作用物質、組成物および／または投与剤形を意味するために用いられる。 
【０１４５】
本願明細書に用いられる「薬学的に許容な担体」という文言は、当該作用物質をある臓器または体の部分から別の臓器または体の部分へと運搬または輸送することに関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、または封入作用物質などの、薬学的に許容な作用物質、組成物または賦形剤を意味する。各担体は、製剤の他の成分と適合性があるという意味において「許容」でなければならない。  
【０１４６】
(iii)  例示的な組成物および方法
ポリペプチドおよびペプチド断片：本願発明は、ネトリン関連ポリペプチド、修飾ネトリン関連ポリペプチド、およびそれらの生物活性断片を含む組成物を提供する。本願明細書に概説されるとおり、例示的なネトリン関連ポリペプチドには、ネトリン1、ネトリン2/3、ネトリン4、ネトリンG1、およびネトリンG2関連ポリペプチド、修飾ネトリン関連ポリペプチド、およびそれらの生物活性断片が含まれる。以下に、本願発明者らは、本願発明の方法および組成物に用いるための各種ポリペプチドを説明する。本願発明は、以下に詳述するポリペプチドおよびポリペプチド断片のいずれかは、修飾ポリペプチドまたは修飾ポリペプチド断片をつくるために付加されてもよいことを意図する。
【０１４７】
さらに、本願発明者らは、本願発明の方法に用いるためのポリペプチドおよびペプチド断片は、ネトリンポリペプチドに限定されないことを特筆する。本願発明はさらに、ポリペプチドおよびペプチド作用物質を含む、各種作用物質も意図する。これらの作用物質を、本願明細書に詳述する。しかし、本願発明者らは、ネトリンポリペプチドは、修飾および変異ポリペプチドおよびそれらの生物活性断片の範囲の特定の例として提供されるが、本願発明は、ポリペプチドのその他の変異体および修飾体（たとえばネトリンの発現および／もしくは活性またはネトリンシグナル伝達を阻害または促進するポリペプチド作用物質）を含む方法および組成物も意図する。
【０１４８】
ある実施態様では、前記組成物はネトリン関連ポリペプチドまたはその生物活性断片を含む。そのようなポリペプチドまたは断片は、野生種ペプチド配列または変異配列のいずれかを含んでもよく、変異配列は容易に作成することができ、前記変異配列が前記未変性ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持していることを確認するためにテストすることができる。当業者は容易に、特定のポリペプチドと少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%または99% 同一なアミノ酸配列を含む変異体を作成することができ、ネトリンシグナル伝達を活性化し、前記未変性ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する変異体を同定することができる。さらに具体的には、本願発明は、ネトリンポリペプチド（配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、または44）と少なくとも60%、70%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100%同一のアミノ酸配列を含むネトリン関連ポリペプチドを意図する。さらに、本願発明は、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、または44とは1乃至10ヶ所（たとえば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヶ所）において異なるネトリン関連ポリペプチドを意図する  
【０１４９】
前述のいずれかにおいげ、本願発明は前記ネトリン関連ポリペプチドまたは修飾ネトリン関連ポリペプチドのいずれかの生物活性断片を含む組成物を意図する。例示的な生物活性断片には、完全長ネトリンポリペプチドの生物学的活性を保持する、ネトリンポリペプチド（たとえば配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、または44）のアミノ酸残基を少なくとも25、50、60、70、80、90、100、125、150、200、250、300、325、350、400、450、500、550、または600個以上の断片が含まれる。例示的な断片には、図1に詳細を概説するネトリンの領域が、それらに限定されずに含まれる。そのようなドメインには、N末端最大VIドメイン、v1、v2、v3（v1、v2、およびv3は単体または組み合わせて提供することができる）、およびC末端最大塩基性ドメインが含まれる。ネトリンの例示的な生物学的活性には、以下が含まれる。(i) ネトリンレセプタと結合する、(ii)軸索の誘引を促進する、(iii)血管新生を促進する、(iv)細胞遊走を促進する、(v)細胞接着を促進する、(vi)細胞増殖を促進する。   
【０１５０】
本願発明は、ネトリン関連ポリペプチド、修飾ネトリン関連ポリペプチド、およびそれらの生物活性断片を含む、広範囲の組成物および薬学的組成物を意図する。さらに、本願発明はネトリンの発現または活性またはネトリンシグナル伝達を促進または阻害する（例えばプロ血管新生、ネトリンの誘引活性を促進または阻害する作用物質）作用物質（ポリペプチドおよびペプチド作用物質を含む）を含む、広範囲の組成物および薬学的組成物を意図する。  
【０１５１】
ある実施態様では、本願発明がネトリンの発現もしくは活性、またはネトリンシグナル伝達を促進する作用物質（たとえばポリペプチド、ペプチド作用物質、または核酸）を提供する場合、そのような作用物質を本願明細書ではネトリンアゴニストとよぶ。具体的には、ネトリンアゴニストには、ネトリンポリペプチド、修飾ネトリンポリペプチド、ネトリンポリペプチドの模倣体または変異体、およびネトリンとネトリンレセプタの間の相互作用を増強する作用物質が、それらに限定されずに含まれる。    
【０１５２】
他の実施態様では、本願発明がネトリンの発現もしくは活性、またはネトリンシグナル伝達を阻害する作用物質（たとえばポリペプチド、ペプチド作用物質、または核酸）を提供する場合、そのような作用物質を本願明細書ではネトリンアンタゴニストとよぶ。具体的には、ネトリンアンタゴニストには、Unc5h レセプタ、ネトリンに結合するがネトリンシグナル伝達を媒介できない可溶性ネトリンレセプタ（たとえばネトリンレセプタ細胞外ドメイン）、ネトリンポリペプチドに対する抗体、ネトリンレセプタに対する抗体、ネトリンレセプタに結合するがネトリンシグナル伝達を活性化できないネトリンポリペプチドの突然変異体または変異体、ネトリンの発現を阻害する核酸（たとえば、アンチセンス核酸またはsiRNA）、ネトリンポリペプチドとネトリンレセプタの間の相互作用を阻害または遮断する作用物質が、それらに限定されずに含まれる。  
【０１５３】
前記対象ポリペプチド、修飾ネトリンポリペプチド、生物活性断片、組成物、および薬学的組成物は、本願明細書に詳しく概説されるであろう多様な用途を有する。しかし、一般に、本願発明は、1つのネトリン関連ポリペプチド（たとえば1つのネトリン関連ポリペプチド、1つの修飾ネトリン関連ポリペプチド、または1つの生物活性断片）を含む薬学的組成物とともに、2つ以上のネトリン関連ポリペプチド（たとえば、2、3、4、5つまたはそれ以上のネトリン関連ポリペプチド）を含む薬学的組成物を意図する。  
【０１５４】
同様に、本願発明は、ネトリンの発現もしくは活性、またはネトリンシグナル伝達を促進または阻害する1つの作用物質を含む薬学的組成物と、ネトリンの発現もしくは活性、またはネトリンシグナル伝達を促進または阻害する2つの作用物質（たとえば、2、3、4、5またはそれ以上の作用物質）を含む薬学的組成物を意図する。たとえば、本願発明は、ヒトネトリン1、ヒトネトリン3、ヒトネトリン4、ヒトネトリンG1、およびヒトネトリンG2から選択される2つ以上のポリペプチドなど、異なる種類の少なくとも2つのネトリン関連ポリペプチドを含む、ネトリン関連組成物を提供する。同様に、2つ以上の異なるポリペプチドは、マウスネトリン1、マウスネトリン2、マウスネトリン4、マウスネトリンG1、マウスネトリンG2から選択してよい。ネトリンアンタゴニストの場合、本願発明は2種類以上の異なるネトリンファミリメンバを阻害するための2つ以上のネトリンアンタゴニストを含む、ネトリン関連組成物を提供する。任意に、そのような組成物は異なる種類の2つ以上の可溶性ネトリンレセプタを含んでもよい。具体的には、2つ以上のネトリンアンタゴニストは、可溶性DCCレセプタ、可溶性ネオゲニンレセプタ、可溶性Roboレセプタ、および可溶性Unc5h2レセプタから選択される。同様に、2つ以上のネトリンアンタゴニストは、DCCレセプタに対する抗体、ネオゲニンレセプタに対する抗体、Roboレセプタに対する抗体、およびUnc5h2レセプタに対する抗体から選択することができる。さらに具体的には、2つ以上のネトリンアンタゴニストは、ヒトネトリン1に対する抗体、ヒトネトリン3に対する抗体、ヒトネトリン4に対する抗体、ヒトネトリンG1に対する抗体、およびヒトネトリンG2に対する抗体から選択してもよい。
【０１５５】
本願発明は、単体で、または1つ以上のさらなる作用物質とともに組み合わせて投与する組成物および薬学的組成物の使用を意図する。そのようなさらなる作用物質には、(i)成長因子、および(ii)血管新生因子が含まれる。さらに、本願発明は、処置される特定の疾患または症状を考慮して好適なその他の化合物または両方とともに、本願発明にしたがったポリペプチドを投与するステップを意図する。同様に、さらなる修飾ネトリン関連ポリペプチドを同定または特徴付けするためのスクリーニングの方法では、本願発明は、推定される修飾ポリペプチドを、単体で、または組み合わせでスクリーニングしてもよいということを意図する。  
【０１５６】
上に詳述したポリペプチドおよび断片に加えて、本願発明は前記ポリペプチドおよび断片をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸にも関連する。本願明細書に記載の核酸という用語は、断片も等価物として含むことを意図し、当該断片は実質的にそれが由来する完全長核酸配列と同一の機能を有する。同等のヌクレオチド配列には、対立遺伝子変異などの1つ以上のヌクレオチド置換、付加、または欠損が異なる配列も含まれ、したがって、たとえば野生種ネトリン（配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43）のヌクレオチド配列とは異なる配列が含まれる等価の配列には、遺伝子コードの縮重による既知の野生種配列または変異配列とは異なるものが含まれる。等価の配列は、ストリンジェントな条件下（つまり、約1Mの塩で形成されたDNA2本鎖の融点より約20乃至27℃下の温度に等しい）において、ネトリン関連ポリペプチドのヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列も含んでよい。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件のさらなる例には、65℃で0.2 X SSCの洗浄ステップが含まれる。本願発明のネトリン関連ポリペプチドの等価物の前述の例では、当業者は、等価の配列が未変性および／または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持するポリペプチドをコードするということを、認識するだろう。特に、前記ポリペプチドは以下の生物学的活性を1つ以上保持する。ネトリンの例示的な生物学的活性には、以下が含まれる。(i) ネトリンレセプタと結合する、(ii)軸索の誘引を促進する、(iii)血管新生を促進する、(iv)細胞遊走を促進する、(v)細胞接着を促進する、(vi)細胞増殖を促進する。    
【０１５７】
ある例では、本願発明は、65℃で0.2X SSCの洗浄ステップを含むストリンジェントな条件下で、配列番号1、3、5、7、9、11、37、39、41、または43の核酸配列にハイブリダイズされた核酸配列によってコードされる、またはコード可能な、ネトリン関連ポリペプチド、修飾ネトリン関連ポリペプチド、またはそれらの生物活性断片を意図する。
【０１５８】
本願明細書に記載の方法に用いるための等価なヌクレオチド配列には、特定のヌクレオチドと少なくとも60%同一の配列も含まれる。別の実施態様では、前記ヌクレオチド配列は、ネトリン関連ポリペプチドをコードし、ネトリン関連ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する未変性配列のヌクレオチド配列と、少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100% 同一である。
【０１５９】
遺伝子コードの縮重のために特定のネトリン関連ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と異なる配列を有する核酸も、本願発明の範囲内である。そのような核酸は、機能的に等価なペプチドをコードするが、遺伝子コードの縮重により当業に既知の野生種配列とは配列が異なる。たとえば、数多くのアミノ酸が2つ以上のトリプレットによって指定される。同一のアミノ酸を特定するコドン、つまりシノニム（たとえばCAUおよびCACはそれぞれヒスチジンをコードする）は、前記アミノ酸配列に作用を及ぼさない「サイレント」突然変異を生じることがある。しかし、アミノ酸に変化を生じるDNA配列多型も存在するであろうことは予測される。未変性ネトリン関連ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上有するポリペプチドをコードする核酸の1つ以上のヌクレオチドのこれらの変異は、天然の対立遺伝子変異により、特定の種の個体の中にも存在するかもしれないということは、当業者は理解するだろう。   
【０１６０】
本願発明の文脈において、ネトリン関連ポリペプチドを含む組成物は、組換えポリペプチドまたは組換えポリペプチドを含む組成物として投与することができる。さらに、ネトリン関連ポリペプチドを含む本願発明の組成物は、ネトリン関連ポリペプチドを発現および分泌する細胞から調製された条件培地として投与することができる。  
【０１６１】
ペプチド模倣体：他の実施態様では、本願発明は、ネトリン関連ポリペプチド、修飾ネトリン関連ポリペプチド、またはそれらの生物活性断片がペプチド模倣体（本願明細書では、同義的に模倣体またはペプチド模倣体とよぶ）であることを意図する。好ましいペプチド模倣体は、未変性ネトリン関連ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する。  ペプチド模倣体は、ペプチドおよびタンパク質に基づいた、または誘導された化合物である。本願発明のペプチド模倣体は、非天然アミノ酸、立体的な制約、および等比体積置換などを用いた、既知のネトリン関連ポリペプチド配列のアミノ酸配列の構造的修飾によって得ることができる。本ペプチド模倣体は、ペプチドと非ペプチド合成構造体の間の構造的空間の連続を構成する。本願発明に用いられるペプチド模倣体という用語は、1ヶ所以上に構造的修飾を含有するネトリン関連ポリペプチドのいずれにも適用されるだろう。たとえば、1、2、3、または4ヶ所以上が修飾された完全長ネトリン関連ポリペプチドはペプチド模倣体である。同様に、すべての箇所を修飾したネトリン関連ポリペプチドはペプチド模倣体である。さらに、1ヶ所以上を修飾したネトリン関連ポリペプチドの生物活性断片は、ネトリン関連ポリペプチドである。  
【０１６２】
例示的なペプチド模倣体は、非加水分解性（たとえばプロテアーゼ、または対応するペプチドを分解するその他の生理学的条件に対する高い安定性）であって、高い特異性および／または有効性を有し、および前記ペプチド模倣体の細胞内局在性のための高い細胞透過性などを有する、特質を有してよい。具体的な目的として、本願発明のペプチド類似体は、たとえば、ベンゾジアゼピン(たとえば Freidinger et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall
ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988参照)、置換ガンマラクタム環(Garvey et al. in Peptides:
Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden,
Netherlands, 1988, p123)、C-7模倣体(Huffman et al. in Peptides:
Chemistry and Biologyy, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands,
1988, p.105)、ケトメチレン擬ペプチド(Ewenson et al. (1986) J Med Chem 29: 295; and Ewenson et al.
in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American
Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985)、βターンジペプチド核(Nagai
et al. (1985) Tetrahedron Lett 26: 647; and Sato et al. (1986) J Chem
Soc Perkin Trans 1: 1231)、βアミノアルコール(Gordon et al.(1985) Biochem
Biophys Res Commun126:419; and Dann et al.(1986) Biochem Biophys Res
Commun 134:71)、ジアミノケトン (Natarajan et al.(1984) Biochem Biophys Res Commun 124:141)、およびメチレンアミノ修飾(Roark
et al. in Peptides:Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM
Publisher: Leiden, Netherlands, 1988, p134)を用いて生成することができる。また、一般的にはPeptides: Chemistry and Biology, G.R.Marshall ed., ESCOM Publisher:Leiden, Netherlands, 1988)の中の例示的実施態様の分析および合成方法を参照。
【０１６３】
本ペプチド模倣体の作成を行うことができる、各種の側鎖置換法に加えて、本願発明は特に、ペプチド2次構造の構造的に制限された模倣体の使用を意図する。ペプチドのアミド結合のための多数の代理物が開発されている。前記アミド結合にしばしば用いられる代替物には、以下の部分、(i)トランス-オレフィン、(ii)フルオロアルケン、(iii)メチレンアミノ、(iv)ホスホンアミド、および(v)スルホンアミドが含まれる。
【０１６４】
さらに、より実質的なペプチドの骨格の修飾に基づくペプチド模倣体も用いることができる。このカテゴリに属するペプチド模倣体には、(i)レトロ-インヴェルソ類似体、および(ii)N-アルキルグリシン類似体（いわゆるペプトイド）が含まれる。
【０１６５】
さらに、コンビナトリアル化学の方法は、たとえばPCT出願WO 99/48897号など、新規ペプチド模倣体の開発に関係づけられる。たとえば、いわゆる「ペプチドモーフィング」戦略のある実施例は、広範囲のペプチド結合置換基を含む、ペプチド類似体のライブラリのランダム生成を中心としている。
【０１６６】
ある例示的な実施例では、前記ペプチド模倣体は前記ペプチドのレトロ-逆類似体として誘導することができる。レトロ-インヴェルソ類似体は、Sisto
et al. 米国特許第 4,522,752号に記述されるような、当業に知られる方法に従って作製することができる。一般的な指針として、タンパク質分解に最も感受性のある部位は、典型的に、模倣体スイッチングのために選択される、感受性の低いアミド結合と置換する。最終生成物またはその中間体は、HPLCで精製することができる。
【０１６７】
別の例示的な実施例では、前記ペプチド模倣体は前記ペプチドのレトロ-エナチオ類似体として誘導することができる。このようなレトロ-エナンチオ類似体は、市販のD-アミノ酸（またはその類似体）、および標準固相または液相合成技術を用いて合成することができる。たとえば、好ましい固相合成方法では、好適なアミノ保護（t-ブチロキシカルボニル、Boc）残基（またはその類似物）はクロロメチル樹脂などの固体支持体に共有結合している。前記樹脂をジクロロメタン（DCM）で洗浄し、前記BOC保護基をDCM中でTFAで処理して除去する。前記樹脂を洗浄して中和し、次のジイソプロピルカルボジイミドと結合してBoc保護Dアミノ酸を導入する。前記樹脂を再び洗浄し、前述のサイクルを残りのアミノ酸のそれぞれについて順次繰り返す。保護されたレトロ-エナンチオペプチドの合成が完了してから、前記保護基を除去して、前記ペプチドをフッ酸／アニソール／硫化ジメチル／チオアニソールで処理して固相から切り離す。最終生成物をHPLCで精製し、純粋なレトロ-エナンチオ類似体を得る。
【０１６８】
さらに別の具体的な実施態様では、トランス-オレフィン誘導体で当該ポリペプチドのいずれかを作製することができる。トランスオレフィン類似体はY.K. Shue et al. (1987) Tetrahedron Letters
28:3225 の方法、および当業に知られる他の方法に従って合成することができる。本願明細書に引用する手段、またはその他の入手可能な手段は、使用した試薬の性質に従って変化させる必要があることもある。
【０１６９】
さらに、上述の方法によって合成された偽ジペプチドに結合し、アミド官能基の箇所にいくつかのオレフィン官能性を有するペプチド類似体を作成することもできる。  
【０１７０】
ペプチド模倣体誘導体のさらに他の種類には、ホスホン酸誘導体が含まれる。そのようなホスホン酸誘導体の合成は、既知の合成スキームを適応させることができる。たとえば、Loots et al. Peptides:Chemistry and Biology(Escom Science
Publishers, Leiden, 1988, p. 118)、Petrillo et al. in Peptides:Structure
and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium, Pierce
Chemical Co. Rockland, IL, 1985)を参照。
【０１７１】
多くのその他のペプチド模倣構造体が当業に知られており、ペプチド模倣体のデザインに用いるために容易に適応させることができる。具体的には、前記ペプチド模倣体は、1-アザビシクロ[4.3.0]ノナン代理物（Kim et al.(1997) J. Org. Chem. 62:2847参照）、またはN-アシルピペラジン酸（Xi et al.(1998) J. Am. Chem. Soc. 120:80参照）、または制限アミノ酸類似体として2-置換ピペラジン基（Williams
et al.(1996) J. Med. Chem. 39:1345-1348）を取り込んでもよい。さらに他の実施態様では、あるアミノ酸残基を、たとえば単環式または二環式芳香族またはヘテロ芳香族核、または二芳香族、芳香族、ヘテロ芳香族、もしくは二ヘテロ芳香族環核などのアリールおよび二アリール基で置換してもよい。
【０１７２】
本ペプチド模倣体を、たとえばハイスループットスクリーニング技術と組み合わせたコンビナトリアル合成技術などによって最適化することができ、さらに、前記ペプチド模倣体が未変性ネトリン関連ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持することを確認するために試験することもできる。前述のペプチド模倣体のいずれも、その他のネトリン関連ポリペプチドについて本願明細書に記載されたとおり、1つ以上の疎水性および／または親水性基で修飾することができる。例示的な修飾ネトリン関連ポリペプチドペプチド模倣体は、未変性ネトリン関連ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持し、さらに、有利な生理化学的特性を1つ以上有する。  
【０１７３】
疎水性修飾ポリペプチド
本願明細書に記載の通り、ポリペプチドおよびその生物活性断片を含むネトリン関連組成物の提供に加えて、本願発明は、修飾ネトリン関連ポリペプチドおよびその生物活性断片を含むある組成物が、未変性および／または非修飾の対応物と比較して他の利点も有するであろうことを認識する。そのような修飾ネトリンポリペプチド（完全長ポリペプチドおよび生物活性断片を含む）は、相当する未変性または非修飾ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持するだけでなく、未変性および／または非修飾ネトリンと比較して有利な生理化学的特性をさらに1つ以上有することもある。例示的な生理化学的特性には、長いin vitro 半減期、長いin vivo半減期、低い免疫原性、高い溶解度、高い有効性、高いバイオアベイラビリティ、および高い生体内分布が、それらに限定されずに含まれる。本願発明は修飾ネトリン関連ポリペプチドを含む組成物を意図する。たとえば、本願発明は修飾ネトリン関連ポリペプチドを意図する。修飾ネトリン関連ポリペプチドを含む組成物は、本願明細書では修飾ネトリン関連組成物ともよぶ。本願発明の方法に使用される例示的な修飾ネトリン関連組成物には、修飾ヒトネトリン1、修飾ヒトネトリン2、修飾ヒトネトリン4、修飾ヒトネトリンG1、修飾ヒトネトリンG2、修飾マウスネトリン1、修飾マウスネトリン3、修飾マウスネトリン4、修飾マウスネトリンG1、および修飾マウスネトリンG2が含まれる。さらなる例示的は修飾ネトリン関連組成物は、配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、44、またはその生物活性断片に表されるアミノ酸と少なくとも70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%同一のアミノ酸配列を含む。  
【０１７４】
本願発明は、未変性ネトリンポリペプチドがグリコシル化されていることが多いということを認識する。したがって、本願発明は、未変性または非修飾ネトリンポリペプチドの生物学的活性を保持する修飾および非修飾ネトリンポリペプチドの範囲を意図する。例示的なネトリン関連ポリペプチドには以下が含まれる。それは、(i)未変性グリコシル化を有するがその他は修飾されていないネトリンポリペプチド、(ii)修飾を有さないネトリンポリペプチド、(iii)未変性グリコシル化を有し、さらに1つ以上のさらなる修飾を有するネトリンポリペプチド、(iv)未変性グリコシル化を有さないがその他は修飾されているネトリンポリペプチド、である。  
【０１７５】
修飾ネトリンポリペプチドは、1つの本願発明の方法に用いられる修飾ポリペプチドの範囲の具体的な実施態様である。本出願は、本願発明の方法に使用されるポリペプチドまたはペプチドのいずれも、1つ以上の有利な生理化学的特性を与えるために修飾することができる。
【０１７６】
本願発明がネトリンアゴニストまたはアンタゴニストを提供するさらなる例として、ネトリンアゴニストまたはアンタゴニストには修飾ポリペプチドまたはその修飾生物活性断片が含まれる。任意に、修飾ポリペプチドまたは修飾生物活性断片は、未変性ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持し、好ましくは、未変性ポリペプチドと比較して有利な生理化学的活性を1つ以上有する。  
【０１７７】
ある実施態様では、前記修飾ネトリン関連ポリペプチドは疎水性修飾ネトリン関連ポリペプチドである。本願発明は、ネトリン関連ポリペプチドが、修飾ネトリン関連ポリペプチドを作製するための1つ以上の部分が付加されてもよいことを意図する。たとえば、修飾ネトリンポリペプチドは、1、2、3、4、または5つ以上の部分を付加してもよい。前記部分は同一であってもよく、異なってもよい。前記の1つ以上の部分が疎水性部分である場合、前記修飾ネトリン関連ポリペプチドは疎水性修飾ネトリン関連ポリペプチドとしても知られる。  
【０１７８】
さらに、本願発明は、1つ以上の部分（たとえば、1つ以上の独立して選択された疎水性部分）を、N末端アミノ酸残基、C末端アミノ酸残基、および／または内部アミノ酸残基に付加させることもできる。修飾ネトリン関連ポリペプチドに2つ以上の部分が付加されている場合、前記部分は同一のアミノ酸残基および／または異なるアミノ酸残基に付加されてもよい。さらに、上述のとおり、前記部分は同一または異なっていてよい。  
【０１７９】
本願発明は、修飾ネトリン関連ポリペプチド、およびこれらの修飾ネトリン関連ポリペプチドをin vitro およびin
vivoにおいて用いる方法を提供する。本願発明の修飾ネトリン関連ポリペプチドは、相当する未変性および／または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持するべきである。さらに、好ましい修飾ネトリン関連ポリペプチドは、未変性および／または非修飾ネトリンと比較して有利な生理化学的特性を1つ以上有する。  
【０１８０】
したがって、修飾ネトリン関連ポリペプチドは、in vitro または
in vivoにおけるネトリンシグナル伝達を操作するためのさらなる可能な組成物を提供するだけでなく、そのような修飾ネトリン関連ポリペプチドは、従来技術と比較して向上した特性を有するネトリン関連ポリペプチドも提供することができる。例示的な修飾ネトリン関連ポリペプチドには疎水性修飾ネトリン関連ポリペプチドが含まれる。  
【０１８１】
ポリペプチドまたはペプチドを修飾すると（すなわち、既存のアミノ酸残基に1つ以上の疎水性部分を付加（adding）または付加（appending）するか、またはアミノ酸を1つ以上の疎水性部分と置換する）と、前記ポリペプチドの生理化学的特性を、便利になるように変化させることができる。たとえば、そのような疎水性修飾ネトリン関連ポリペプチドは、未変性および／または非修飾ネトリン関連ポリペプチドと比較して、高い生物学的活性、高い安定性、長いin vivoまたはin vitro半減期、または低い免疫原性を有することもある。
【０１８２】
ポリペプチドの全体的な疎水性の特徴は、たくさんの方法のうちのいずれでも増やすことができる。前記ポリペプチドが疎水性を高めるためにどのように修飾されていても、当業者は、好ましい修飾ネトリン関連ポリペプチドが相当する未変性および／または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持することを認識するだろう。さらに、ある好ましい修飾ポリペプチドは、1つ以上の有利な生理化学的特性を有する。     
【０１８３】
簡単に説明すると、ポリペプチドの疎水性は、(a)アミノ酸残基を科学的に修飾する、または(b)アミノ酸残基を1つ以上の疎水性アミノ酸残基と置換する、ことによって高めることができる。さらなる例としては、ポリペプチドは、たくさんの方法のうちのいずれでも化学的に修飾することができる。化学部分は反応性アミノ酸残基を介して（たとえば、システイン残基のスルフヒドリルおよび／またはαアミンによる反応、または別の反応性アミノ酸残基による反応を介して）直接付加することができる。そのような反応性アミノ酸残基は、未変性ポリペプチド配列の中に存在することもでき、またはそのような反応性アミノ酸残基は未変性配列に付加して疎水性部分を付加する部位を提供することもできる。同様に、ポリペプチドの疎水性を、疎水性アミノ酸残基の付加によって高める場合、そのようなさらなる疎水性アミノ酸残基は、未変性ポリペプチドのアミノ酸残基と置換してもよく、またはそのようなアミノ酸残基を前記未変性アミノ酸残基に付加してもよい。  
【０１８４】
例示的な疎水性部分は、N-末端、C-末端、および／または1つ以上の内部アミノ酸残基に付加することもできる。ネトリン関連ポリペプチドに付加することができるある種類の疎水性部分には、脂肪酸部分およびステロール（たとえばコレステロール）などの脂質が含まれる。本願発明の誘導体化したタンパク質は、環式、非環式（つまり直鎖）、飽和または不飽和モノカルボン酸を含む。例示的な飽和脂肪酸は、一般式CH3 (CH2)n COOHを有する。以下の表2に、従来の化学方法を用いてネトリン関連ポリペプチドに便利に付加することができる脂肪酸の一部の例をあげる。
【０１８５】
【表２】
2008506703.tif 000004
【０１８６】
ネトリン関連ポリペプチドに付加できるその他の脂質には、ホスファチジルイノシトール（つまりホスファチジルイノシトール4-モノホスファート、およびホスファチジルイノシトール4,5-ビホスファート）、ホスファチジコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、および分鎖脂肪酸およびファルネシルまたはゲラニル基などのイソプレノイドなどの、分鎖脂肪酸およびリン脂質基のそれらが含まれる。  
【０１８７】
ネトリン関連ポリペプチドを誘導できる広範囲の疎水性部分がある。疎水性基は、たとえば、約7乃至30個の炭素を有する、比較的長い鎖のアルキルまたはシクロアルキル（好ましくはn-アルキル）基であってよい。前記アルキル基は、ヒドロキシまたは1級アミンの「尾部」で終了することがある。さらに具体的には、そのような分子には、天然および合成の、脂肪酸、エステルおよびアルコールなどの芳香族並びに非芳香族基、その他の脂質分子、アダマンタンおよびバックミンスターフラーレンなどのかご構造、ならびにベンゼン、ペリレン、フェナントレン、アントラセン、ナフタレン、ピレン、クリセン、およびナフタセンなどの芳香族炭化水素が含まれる。
【０１８８】
疎水性分子として特に有用なのは、脂環式炭化水素、飽和および不飽和脂肪酸、ならびにその他の脂質およびリン脂質部分、ロウ、コレステロール、イソプレノイド、テルペン、ならびにアダマンタンおよびバックミンスターフラーレンを含む多脂環式炭化水素、ビタミン、ポリエチレングリコール、またはオリゴエチレングリコール（C1-C18）アルキルリン酸ジエステル、-O-CH2-CH(OH)-O-(C12-C18)-アルキル、ならびに特にピレン誘導体との共役体である。前記疎水性部分は、ジフェニルヘキサトリエン、ナイルレッド、N-フェニル-1-ナフチルアミン、プロダン、ラウロダン、ピレン、ペリレン、ローダミン、ローダミンB、テトラメチルローダミン、テキサスレッド、スルホローダミン、1,1’-ジドデシル-3,3,3’,3’テトラメチルインドカルボシアニン過塩素酸塩、オクタデシルローダミンB、およびモレキュラー・プローブス社から入手可能なBODIPY色素がそれらに限定されずに含まれる、本願発明に使用するために好適な親油性色素であってよい。
【０１８９】
その他の例示的な親油性部分には、1-または2-アダマンチルアセチル、3-メチルアダマント-1-イルアセチル、3-メチル-3-ブロモ-1-アダマンチルアセチル、1-デカリンアセチル、ショウノウアセチル、カンファンアセチル、ノルアダマンチルアセチル、ノルボルナンアセチル、ビシクロ[2.2.2.]-オクト-5-エネアセチル、1-メトキシビシクロ[2.2.2.]-オクト-5-エン-2-カルボニル、シス-5-ノルボルネン-エンド-2,3-ジカルボニル、5-ノルボルネン-2-イルアセチル、(1R)-( -
)-ミルテンタンアセチル、2-ノルボルナンアセチル、アンチ-3-オキソ-トリシクロ[2.2.1.0<2,6>
]-ヘプタン-7-カルボニル、デカノイル、ドデセノイル、テトラデカジエノイル、デシノイル、またはドデシノイルが含まれる。
【０１９０】
上に詳細に概説したとおり、本願発明は、1つ以上の疎水性部分を含有する修飾ネトリン関連ポリペプチドを意図し、1つ以上の前記部分をN末端アミノ酸残基、C末端アミノ酸残基、および／または内部アミノ酸残基に付加できることも意図する。修飾ネトリン関連ポリペプチドに2つ以上の部分が付加される場合、これらの部分は同一または異なっていてもよい。さらに、そのような部分は同一のアミノ酸残基および／または異なるアミノ酸残基に付加されてもよい。  
【０１９１】
本願発明はさらに、ネトリン関連ポリペプチドが、1つ以上の疎水性アミノ酸残基が前記ポリペプチドに付加されるか、または1つ以上のアミノ酸残基が1つ以上の疎水性アミノ酸残基で置換されるかによって増えてもよいことを意図する。たとえば、フェニルアラニン、イソロイシンおよびメチオニンは、疎水性アミノ酸残基である。したがって、1つ以上のこれらの残基がネトリン関連ポリペプチドに付加すると、ネトリン関連ポリペプチドの疎水性が増すだろう。同様に、1つ以上の未変性ポリペプチドのアミノ酸残基を1つ以上のこれらのアミノ酸残基と置換すると、前記ネトリン関連ポリペプチドの疎水性を増すだろう。ある例では、未変性残基の疎水性アミノ酸残基の置換は、保存的な置換であってよく、したがって当業者は、前記置換によって前記ネトリンポリペプチドの機能を変化させることを期待しないだろう。さらに例示的な疎水性アミノ酸残基には、トリプトファン、ロイシン、バリン、アラニン、プロリン、およびチロシンが含まれる。  
【０１９２】
前述の例は、本願発明に意図される修飾ネトリン関連ポリペプチドの種類を説明している。これらの修飾ネトリン関連ポリペプチドはいずれも、当業に公知の技術を用いて合成することができ、これらの修飾ネトリン関連ポリペプチドはin vitroおよびin vivoにおけるアッセイを用いてテストし、(i)相当する未変性および／または非修飾ネトリンポリペプチドの生物学的活性を一つ以上維持し、(ii)前記未変性および／または非修飾ネトリンポリペプチドと比較して有利な生理化学的特徴を1つ以上有する、修飾組成物を同定することができる。
【０１９３】
本願発明は、ある未変性の形態のネトリン関連ポリペプチド（たとえば主形態または副形態）はグリコシル化されてもよいということを認識する。本願発明は、未変性グリコシル化パターンを有するかまたは有さない、疎水性かまたはその他の形態に修飾されたポリペプチドを意図する。さらに、本願発明は、典型的にグリコシル化されたものと同一かまたは異なる残基のいずれかにおいてポリペプチドを修飾するステップを意図する。     
【０１９４】
上に簡単に概説したとおり、当業に公知の数多くの方法のいずれも、ネトリン関連ポリペプチドを修飾するために用いることができる（たとえば、疎水性部分などの1つ以上の部分を1つ以上のアミノ酸残基に付加させるなど）。例示的な方法には、以下の方法がそれらに限定されずに含まれる。それは、(i)アミノ酸残基の誘導体化、(ii)反応性アミノ酸残基の誘導体化、(iii)反応性アミノ酸残基の未変性配列への付加、(iv)未変性アミノ酸残基中のアミノ酸残基の反応性アミノ酸残基との置換、および前記反応性アミノ酸残基の誘導体化、(v)疎水性アミノ酸残基または疎水性ペプチドの付加、および(vi)未変性配列中のアミノ酸残基と1つ以上のアミノ酸残基またはペプチドとの置換、である。   
【０１９５】
適切なアミノ酸を特定の位置に配置できない場合、部位特異的突然変異誘発法を用いて反応性アミノ酸をその位置に配置することができる。同様に、ネトリン関連ポリペプチドを合成する場合、適切な反応性アミノ酸を前記ポリペプチドに付加する（たとえば、N-末端もしくはC-末端、または内部に付加する）ことができる。もちろん、そのような変位配列はいずれも、前記変異体が相当する未変性および／または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持することを確認するためのアッセイを行わなければならない。反応性アミノ酸には、システイン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、チロシン、アルギニン、メチオニン、およびトリプトファンが含まれ、これらの反応性アミノ酸のいずれかに部分を付加するための多数の方法が当業に公知である。さらに、各種部分をその他のアミノ酸に付加させる方法論が存在し、当業者はアミノ酸残基に部分を付加させる適切な技術を容易に選択することができる。  
【０１９６】
反応性アミノ酸を含む多くのアミノ酸の修飾のための、具体的な化学的方法がある。したがって、修飾ネトリン関連ポリペプチドを合成するための経路によって、疎水性部分をネトリン関連ポリペプチドのアミノ酸に化学的に結合させることができるだろう。そのようなアミノ酸は反応性アミノ酸であってよい。そのようなアミノ酸は、未変性配列中に存在してもよく、または修飾前に前記未変性配列に結合させてもよい。適切なアミノ酸を望ましい位置に配置できない場合、特定の部位に部位特異的突然変異誘発法を用いることができる。反応性アミノ酸には、システイン、リシン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、スレオニン、チロシン、アルギニン、メチオニン、およびトリプトファンが含まれるだろう。したがって、修飾ネトリン関連ポリペプチドの生成の目的は、数多くの化学的な手段によって実現することができ、本願発明者らは特定の化学または修飾部位によって制限されることを望まない。当業者は、化学において公知の技術を用いて、広範囲の修飾ネトリン関連ポリペプチドを容易に作製することができ、当業者は容易に、in vitroまたはin vivoにおける数多くのアッセイのいずれかにおいて前記修飾ネトリンポリペプチドをテストし、相当する未変性および／または非修飾ネトリンポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する修飾ネトリン関連ポリペプチドを同定することができる。さらに、当業者は、相当する未変性および／または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持する修飾ネトリン関連ポリペプチドのどれが、有利な生理化学的特性も有するのかを、容易に評価することができる。   
【０１９７】
前記ポリペプチドは、化学結合手段または遺伝子操作によるものを含めた数多くの方法で前記疎水性部分に結合することができる。具体的には、当業に知られる数多くの化学的架橋剤がある。架橋剤のある種類は、ヘテロ二官能性架橋剤であって、ポリペプチドと疎水性部分に順番に使用することができる。ヘテロ二官能性架橋剤は、タンパク質に結合してホモタンパク質ポリマーなどの不必要な副反応の発生を減少させるための、より特異的な結合方法をデザインする能力を提供する。多様なヘテロ二官能性架橋剤が当業に知られている。これらには、スクシンイミジル4-(N-マレイミドメチル) シクロヘキサン- 1-カルボキシラート(SMCC)、m-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(MBS)、N-sスクシンイミジル(4-ヨードアセチル) アミノベンゾアート(SIAB)、スクシンイミジル4-(p-マレイミドフェニル) ブチラート (SMPB)、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル) カルボイミドヒドロクロリド(EDC)、4-スクシンイミジルオキシカルボニル- a-メチル-a-(2-ピリジルジチオ)-トルエン (SMPT)、N-スクシンイミジル3-(2-ピリジルジチオ) プロピオナート(SPDP)、スクシンイミジル6-[3-(2-ピリジルジチオ) プロピオナート] ヘキサノアート(LC-SPDP)が含まれる。  
【０１９８】
N-ヒドロキシスクシンイミド部分を有する架橋剤は、一般に水溶性が大きいN-ヒドロキシスルホスクシンイミド類似体として得ることができる。さらに、架橋鎖の中にジスルフィド架橋を有する架橋剤をアルキル誘導体として合成し、in vivoでの架橋切断の量を減らすのことができる。
【０１９９】
ヘテロ二官能性架橋剤に加えて、ホモ二官能性および光反応性架橋剤を含むその他の架橋剤が多数存在する。ジスクシンイミジルスベラート（DSS）、ビスマレイミドヘキサン（BMH）、ジメチルピメルイミダート2HCl（DMP）、は有用なホモ二官能性架橋剤であり、ビス-[β-(4-アジドサリシルアミド)エチル]ジスルフィド(BASED)、およびN-スクシンイミジル-6(4'-アジド-2'-ニトロフェニルアミノ)ヘキサノアート(SANPAH)は本願発明に用いられる有用な光反応性架橋剤である。タンパク質結合技術の最近の総説は、本願明細書に引用をもって援用するMeans et al.(1990) Bioconjugate Chemistry 1:2-12を参照のこと。 
【０２００】
上述のものを含むヘテロ二官能性架橋剤のある有用な種類は、1次アミン反応基、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、またはその水溶性類似体N-ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ-NHS）を含有する。アルカリ性pHの一次アミン（リシンε基）は保護されておらず、NHSまたはスルホ-NHSエステルを求核攻撃することによって反応する。この反応によって、アミド結合が形成され、NHSまたはスルホ-NHSが副生成物として放出される。 
【０２０１】
ヘテロ二官能性架橋剤の部分として有用な別の反応基は、チオール反応基である。一般的なチオール反応基には、マレイミド、ハロゲン、およびピリジルジスルフィドが含まれる。マレイミドは、わずかに酸性から中性の条件下において、数分のうちに遊離スルフヒドリル（システイン残基）と特異的に反応する。ハロゲン（ヨードアセチル基）は生理学的pHにおいてSH基と反応する。これらの反応基は両方とも、安定なチオエーテル結合を形成する。
【０２０２】
ヘテロ二官能性架橋剤の第3の成分は、スペーサアームまたは架橋である。架橋は2つの反応端を連結する構造である。架橋の最も明らかな特質は、立体障害への影響である。ある場合には、より長い架橋であれば、2つの複雑な生体分子を連結するのに必要な距離を、より容易に架橋することができる。たとえば、SMPBは長さ14.5Åである。 
【０２０３】
ヘテロ二官能性試薬を用いたタンパク質-タンパク質複合体の調製は、前記アミン反応とスルフヒドリル反応が関与する2段階プロセスである。第1のステップである前記アミン反応では、選択されたタンパク質は一次アミンを含有すべきである。これは、大半のタンパク質のN-末端に認められる、リシンεアミンまたは一次αアミンであってよい。前記タンパク質は遊離スルフヒドリル基を含有すべきではない。複合体を形成させるタンパク質が両方とも遊離スルフヒドリル基を含有する場合、あるタンパク質は、たとえばN-エチルマレイミドなどを用いてすべてのスルフヒドリルが遮断されるように、修飾することができる(Partis et al.(1983) J. Pro. Chem. 2:263参照)。エルマン試薬を用いて、ある特定のタンパク質におけるスルフヒドリルの量を計算することができる(たとえば、 Ellman et
al.(1958) Arch. Biochem. Biophys. 74:443 and Riddles et
al.(1979) Anal. Biochem. 94:75参照)。 
【０２０４】
反応バッファは、外来性のアミンおよびスルフヒドリルを含んではならない。反応バッファのpHは7.0乃至7.5であるべきである。このpH範囲は、マレイミド基をアミンとの反応からまもり、スルフヒドリルとの第2の反応のためにマレイミド基を保護する。 
【０２０５】
架橋剤を含有するNHSエステルは、限られた水溶性を有する。それは、架橋剤を反応混合物に導入する前に、最小量の有機溶媒（DMFまたはDMSO）に溶解させるべきである。前記の架橋剤／溶媒はエマルションを形成し、反応が起きるようにするだろう。
【０２０６】
スルホ-NHSエステル類似体の水溶性はより高く、反応バッファに直接加えることができる。高イオン強度のバッファは、スルホ-NHSエステルを塩析する傾向を有するために、避けるべきである。加水分解のために反応性を欠失することを避けるために、前記架橋剤は、前記タンパク質溶液を溶解直後、前記反応混合物に加える。
【０２０７】
前記反応は、濃縮されたタンパク質溶液中であれば、より効果的である。前記反応混合物のpHがよりアルカリ性であれば、反応速度はより速くなる。NHSとスルホNHSエステルの加水分解速度も、pHが高くなると速くなるだろう。温度が高いほど、加水分解とアシル化の両方の反応速度が速くなるだろう。
【０２０８】
前記反応が完了したら、今度は第1のタンパク質をスルフヒドリル反応性部分で活性化させる。前記活性化タンパク質は、単純なゲルろ過または透析によって反応混合物から分離することもできる。架橋の第2段階を実行するために、スルフヒドリル反応、マレイミドとの反応のために選択された親油基、活性化ハロゲン、またはピリジルジスルフィドは、遊離スルフヒドリルを含有しなければならない。代替的には、スルフヒドリルを付加して1次アミンを修飾してもよい。
【０２０９】
すべての場合において、前記バッファは、スルフヒドリル基の酸化の防止のために脱気するべきである。EDTAは、前記バッファに存在するかもしれない酸化金属のいずれもをキレートするために加えてもよい。バッファは、スルフヒドリル含有化合物のいずれも含んではならない。
【０２１０】
マレイミドは、わずかに酸性から中性のpH範囲（6.5乃至7.5）で、--SH基と特異的に反応する。中性pHはハロゲンおよびピリジルジスルフィドが関与する反応に十分である。これらの条件下において、マレイミドは一般に、数分のうちに--SH基と反応する。ハロゲンおよびピリジルジスルフィドにはより長い反応時間が必要である。 
【０２１１】
前記アミン反応で調製した第1のスルフヒドリル反応性タンパク質を、適切なバッファ条件下で、スルフヒドリル含有親油基と混合する。前記複合体は、ゲルろ過または透析などの方法によって反応混合物から分離することができる。
【０２１２】
複合体のための例示的な活性化親油基には、N-(1-ピレン)マレイミド、2,5-ジメトキシスチルベン-4'-マレイミド、エオシン-5-マレイミド、フルオレセイン-5-マレイミド、N-(4-(6-ジメチルアミノ-2-ベンゾフラニル)フェニル)マレイミド、ベンゾフェノン-4-マレイミド、4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4'-マレイミド (DABMI)、テトラメチルローダミン-5-マレイミド、テトラメチルローダミン-6-マレイミド、ローダミンレッドTM C2 マレイミド、N-(5-アミノペンチル)マレイミド、トリフルオロ酢酸塩、N-(2-アミノエチル)マレイミド、トリフルオロ酢酸塩、オレゴングリーンTM 488 マレイミド、N-(2-((2-(((4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ)ベンゾイル)アミノ)エチル)ジチオ)エチル)マレイミド
(TFPAM-SS1)、2-(1-(3-ジメチルアミノプロピル)-インドール-3-イル)-3-(インドール-3-イル) マレイミド (ビシンドリルマレイミド、GF
109203X)、BODIPY.RTM. FL N-(2-アミノエチル)マレイミド、N-(7-ジメチルアミノ-4-メチルクーマリン-3-イル)マレイミド (DACM)、アレキサTM 488 C5 マレイミド、アレキサTM 594 C5 マレイミド、ナトリウム塩N-(1-ピレン)マレイミド、2,5-ジメトキシスチルベン-4'-マレイミド、エオシン-5-マレイミド、フルオレセイン-5-マレイミド、N-(4-(6-ジメチルアミノ-2-ベンゾフラニル)フェニル)マレイミド、ベンゾフェノン-4-マレイミド、4-ジメチルアミノフェニルアゾフェニル-4'-マレイミド、1-(2-マレイミジルエチル)-4-(5-(4-メトキシフェニル)オキサゾール-2-イル)ピリジニウム メタンスルホナート、テトラメチルローダミン-5-マレイミド、テトラメチルローダミン-6-マレイミド、ローダミンレッドTM C2 マレイミド、N-(5-アミノペンチル)マレイミド、N-(2-アミノエチル)マレイミド、N-(2-((2-(((4-アジド-2,3,5,6-テトラフルオロ)ベンゾイル)アミノ)エチル)ジチオ)エチル)マレイミド、2-(1-(3-ジメチルアミノプロピル)-インドール-3-イル)-3-(インドール-3-イル) マレイミド、N-(7-ジメチルアミノ-4-メチルクーマリン-3-イル)マレイミド (DACM)、11H-ベンゾ[a]フルオレン、ベンゾ[a]ピレン、が含まれる。 
【０２１３】
上述のものを含むヘテロ二官能性架橋剤のある有用な種類は、1次アミン反応基、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、またはその水溶性類似体N-ヒドロキシスルホスクシンイミド（スルホ-NHS）を含有する。アルカリ性pHの一次アミン（リシンε基）は保護されておらず、NHSまたはスルホ-NHSエステルを求核攻撃することによって反応する。この反応によって、アミド結合が形成され、NHSまたはスルホ-NHSが副生成物として放出される。
【０２１４】
前述の方法は、当業者が広範囲の修飾ネトリン関連ポリペプチドの作製において容易に用いることができる技術を説明するためだけに提供されている。さらなる方法は、本願明細書に引用を保ってその全体を援用する、米国特許第6,444,793号に説明されている。  
【０２１５】
親水性修飾ポリペプチド
本願明細書に記載の通り、ポリペプチドおよびその生物活性断片を含むネトリン関連組成物の提供に加えて、本願発明は、修飾ネトリン関連ポリペプチドおよびその生物活性断片を含むある組成物が、未変性および／または非修飾の対応物と比較して他の利点も有するであろうことを認識する。そのような修飾ネトリンポリペプチド（完全長ポリペプチドおよび生物活性断片を含む）は、未変性または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持するだけでなく、未変性および／または非修飾ネトリンと比較して有利な生理化学的特性をさらに1つ以上有する。例示的な生理化学的特性には、長いin vitro 半減期、長いin vivo半減期、低い免疫原性、高い溶解度、高い有効性、高いバイオアベイラビリティ、および高い生体内分布が、それらに限定されずに含まれる。好ましい修飾ポリペプチドのある種類には、1つ以上のシクロデキストラン部分が付加したポリペプチド、1つ以上のPEG部分が付加したポリペプチド、1つ以上のラミニン部分が付加したポリペプチド、および1つ以上の抗体部分が付加したポリペプチドなどの親水性に修飾されたポリペプチドが含まれる。本願発明にしたがった修飾ポリペプチドおよび組成物のある好ましい種類は、ペグ化されたポリペプチドおよび組成物である。ペグ化されたネトリン関連ポリペプチドは、1つ以上のPEG（ポリ（エチレン）グリコールまたはポリ（エチレン）グリコール誘導体）を含むPEG含有部分が付加されている。  
【０２１６】
本願発明は、修飾ネトリン関連ポリペプチドを含む組成物およびこれらの修飾ネトリン関連ポリペプチドを用いる方法を提供する。ある実施態様では、前記修飾ネトリン関連ポリペプチドはペグ化されたネトリンポリペプチドである（たとえば前記ネトリン関連ポリペプチドは1つ以上のPEG含有部分が付加されている）。PEG含有部分をポリペプチドに付加するステップを用いて、前記未変性または非修飾ポリペプチドの生物学的特性を1つ以上保持する修飾組成物を得ることもできる。
【０２１７】
「PEG含有部分」および「1つ以上のPEG部分を含むPEG含有部分」という用語は、本願明細書全体において、本願発明の修飾ネトリン関連ポリペプチドを意味するために用いられる。PEG含有部分は1つ以上のPEG部分を含んでもよい。PEG部分は実質的にいずれのサイズのポリマーとして存在してもよく、本願発明は1、2、3、4、5、6、8、10、20、40、50、または100以上のPEG部分を含むPEG含有部分をネトリン関連ポリペプチドに付加することができることを意図する。さらに、本願発明はネトリン関連ポリペプチドに付加させるための反応基をさらに含有するPEG含有での修飾を意図する。  
【０２１８】
前記ポリマー骨格は水溶性で、実質的に非免疫原性ポリマーであって、好ましくはポリ（エチレン）グリコールである。しかし、本願明細書全体で用いられるように、「PEG」、「PEG部分」および「PEG含有部分」という用語は、ポリ（エチレングリコール）含有部分とともに、他の関連ポリマーを意味する。好適なポリマー骨格には、直鎖および分鎖ポリ（エチレングリコール）、直鎖および分鎖ポリ（アルキレンオキシド）、直鎖および分鎖ポリ（ビニルピロリドン）、直鎖および分鎖ポリ（ビニルアルコール）、直鎖および分鎖ポリオキサゾリン、直鎖および分鎖ポリ（アクリロイルモルホリン）、およびそれらの誘導体が、それらに限定されずに含まれる。さらに、PEG含有部分が2つ以上のPEG部分を含む場合、本願発明は、前記PEG部分が同一であってよい（たとえば各PEG部分がポリエチレングリコールである）か、または前記PEG部分は異なっていてよい（たとえば、1つ以上のポリエチレングリコール部分および1つ以上のポリビニルアルコール部分）。
【０２１９】
PEG部分は、非常に望ましい特性を有しており、一般にin vivoおよびin vitroにおいて生物学的用途に認可されているために、生物学的用途において有用である。PEGは典型的に無色透明、無臭、水溶性で、熱に安定であり、多くの化学剤に対して不活性であり、加水分解または劣化をせず、一般に無毒である。ポリ（エチレン）グリコールおよびその他のPEG関連ポリマーは生体適合性であると考えられており、PEGは生組織または害を生じない生物と共存することができるといわれている。さらに具体的には、PEGは非免疫原性であり、PEGは体に免疫応答を生じる傾向がないといわれている。体に望ましいある機能を有する分子、たとえば生物学的に活性な作用物質などと結合して複合体を形成する場合、PEGは前記作用物質を隠す傾向があり、免疫応答のいずれも低減または消去することができ、そのため生物が前記作用物質の存在を許容することができる。したがって、前記複合体は実質的に無毒である。PEG複合体は実質的な免疫応答を生じたり、または凝固もしくはその他の望ましくない作用を生じる傾向がない。  
【０２２０】
式、--CH2 CH2
--(CH2 CH2 O)n --CH2 CH2
--を有するPEGであって、nは約8乃至約4000である、PEGは、本願発明の実施に有用なポリマーの一つである。分子量約200乃至約100,000Daの好ましいPEGがポリマー骨格として用いられる。
【０２２１】
前記ポリマー骨格は直鎖または分鎖であってよい。分鎖ポリマー骨格は一般に当業に知られる。典型的には、分鎖ポリマーは中央の分鎖核部分と、前記中央分鎖核に結合した複数の直線状のポリマー鎖を有する。PEGは、一般に、酸化エチレンをグリセロール、ペンタエリスリトール、およびソルビトールなどの各種ポリオールに付加させることによって調製できる分鎖形態で用いられる。
【０２２２】
水溶性でPEGよりも実質的に非免疫原性のその他の数多くのポリマーも、本願発明に好適である。これらその他のポリマーは、直線状または分岐状のいずれかであってよく、ポリ（プロピレングリコール）（PPG）などのその他のポリ（アルキレンオキシド）、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーなど、ポリ（ビニルアルコール）（PVA）などが、それらに限定されずに含まれる。前記ポリマーは、ホモポリマーまたはランダムもしくはブロックコポリマー、および上述のモノマーを基礎とするターポリマーであって、直鎖または分鎖であってよい。
【０２２３】
好適なさらなるポリマーの具体例には、二官能性ポリ（アクリロイルモルホリン）（PAcM）、およびポリ（ビニルピロリドン）（PVP）が、それらに限定されずに含まれる。PVPおよびポリ（オキサゾリン）は当業に公知のポリマーで、その調製は当業者にはただちに明らかであるはずだ。PAcMおよびその合成と用途は、米国特許第5,629,384号および第5,631,322号に記載されている。前記ポリマー骨格の各鎖の分子量は変化することがあるが、典型的には約100乃至約100,000の範囲内であって、好ましくは約6,000乃至約80,000である。
【０２２４】
当業者は、実質的に水溶性の非免疫原性ポリマー骨格の前述のリストは決して完全なものではなく、単に具体例であって、上述の性質を有するすべてのポリマー物質が意図されることを認識するだろう。
【０２２５】
PEG部分に加えて、本願発明の好ましいPEG含有部分も、前記PEG含有部分の前記ネトリン関連ポリペプチドへの結合を容易にする反応基を含有する。前記反応基は、前記PEG含有部分がアミノ酸残基の遊離アミンに容易に付加できるように働く。たとえば、前記反応基を介して、PEG含有部分を、ネトリン関連ポリペプチドのN末端アミノ酸残基の1次アミンに付加させることができる。前記反応基を介して、PEG含有部分を、内部アミノ酸残基またはC末端アミノ酸残基を含むアミン含有アミノ酸残基に付加させることができる。アミン含有アミノ酸残基は、あるポリペプチドの中に天然に存在することもある。しかし、アミン含有アミノ酸残基が存在しない場合、アミン含有アミノ酸残基を、N末端、C末端、または内部のいずれかにおいてポリペプチドに付加することができ、この付加したアミン含有アミノ酸残基は、PEG含有部分を付加するための部位を供給することができる。アミン含有アミノ酸残基が付加してからも、前記ポリペプチドは前記未変性ポリペプチドの機能を保持すべきである。さらに、アミン含有アミノ酸残基が存在しない場合、アミン含有アミノ酸残基は、前記ポリペプチドにすでに存在する残基を置換してもよい。遊離アミンを含有しないアミノ酸残基をアミン含有アミノ酸残基と置換してからも、前記ポリペプチドは前記未変性ポリペプチドの活性を保持すべきである。   
【０２２６】
前記反応基（本願明細書では反応部分とも呼ぶ）は、たとえばタンパク質、ペプチドなどの生物学的に活性なさ用物質などの、別の分子の部分と反応することができる部分である。好適な反応部分の例には、活性エステル、活性炭酸塩、アルデヒド、イソシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、エポキシド、アルコール、マレイミド、ビニルスルホン、ヒドラジド、ジチオピリジン、N-スクシンイミジル、およびヨードアセタミドが、それらに限定されずに含まれる。遊離反応部分の選択は、前記遊離反応部分が反応する別の分子の部分によって決定される。たとえば、別の分子の部分はチオール部分で、前記活性化ポリマーの遊離反応部分としては、ビニルスルホン部分が好ましい。一方で、生物学的に活性な作用物質におけるアミノ部分に反応するためには、N-スクシンイミジル部分が好ましい。
【０２２７】
本願発明は多数の修飾ネトリン関連ポリペプチドのいずれも意図する。前記修飾ネトリン関連ポリペプチドは、PEG含有部分を含むPEG部分の数および／またはアイデンティティに関して、および前記PEG含有部分が前記ネトリン関連ポリペプチドに付加された反応基に関して、変化するだろう。しかし本願発明は、そのようなペグ化ネトリンポリペプチドはいずれも、未変性または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持するだけでなく、未変性または非修飾ネトリンと比較して有利な生理化学的特性を1つ以上有する、修飾ネトリン関連ポリペプチドを容易に作製し、同定のためにテストすることができることを意図する。特に有利なPEG含有部分、および前記PEG含有部分をネトリン関連ポリペプチドに付加するための方法を、たとえば、以下の発行済みの特許および公報にさらにまとめる。以下の各参考文献の開示は、その全体を引用することにより本願明細書に援用する：米国特許第6664331号、米国特許第6624246号、米国特許第6610281号、WO03/070805号、米国特許第6602952号、米国特許第6602498号、米国特許第6541543号、米国特許第6541015号、米国特許第6515100号、米国特許第6514496号、米国特許第6514491号、米国特許第6495659号、米国特許第6461603号、米国特許第6461602号、米国特許第6436386号、米国特許第5900461号、WO03/040211号、WO03/000777号、米国特許第6448369号、米国特許第6437025号、およびRoberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery
Reviews 54: 459-476である。
【０２２８】
さらに、本願発明によるペグ化ネトリン関連ポリペプチドは、以下の特性のいずれかを有してよい。ある実施態様では、ペグ化ネトリン関連ポリペプチドは、1つ以上のPEG部分（PEG関連）部分を含む部分で修飾される。そのような1つ以上のPEG部分は、前記ネトリン関連ポリペプチドに関して直線状に配列することもでき、または分岐状配置に配列することもできる。前記PEG含有部分は、前記ネトリン関連ポリペプチドのN末端アミノ酸残基の1次アミンに共有結合して付加してもよいが、本願発明はPEG部分のポリペプチドへの付加のためのその他の公知の方法を意図する。その他の好ましい実施態様には、遊離アミンを含む内部アミノ酸残基への1つ以上のPEG含有部分の付加、遊離アミンを含有するC末端アミノ酸残基への1つ以上のPEG含有部分の付加、または反応性リジンまたはシステイン残基（たとえばN末端、内部、またはC末端反応性リジンまたはシステイン残基）への1つ以上のPEG含有部分の付加が含まれる。本願発明者らは、あるポリペプチドは、1つ以上のPEG部分を付加するために有用な遊離アミンを含有しないこともあることを指摘する。したがって、本願発明はさらに、1つ以上のPEG含有部分の結合部位として働くポリペプチドへの、遊離アミン含有アミノ酸残基の付加または置換を意図する。アミノ酸残基のN末端、C末端、または内部への負荷または置換の後、前記変異ポリペプチドは、前記未変性ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持すべきである。前述のいずれにおいても、本願発明は、1つ以上のPEG含有部分が同一のまたは異なるアミノ酸残基へ付加することができることを意図する。  
【０２２９】
本願発明によるペグ化ネトリン関連ポリペプチドは、さらに数多くの形で記述することができる。たとえば、本願発明は、合計約5 kDa、10 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、60 kDa、または80 kDa以上のPEG含有部分を有するネトリン関連ポリペプチドの付加が意図される（たとえば、前記PEG含有部分は、前記ネトリンポリペプチドの分子量が、約5、10、20、30、40、60、または80 kDa以上、増加する）。  
【０２３０】
さらに、本願発明のペグ化ネトリン関連ポリペプチドは、PEG含有部分の多分散性に関して記述することができる。ある実施態様では、前記多分散性は約1.01乃至1.02MW/MN（分子量／分子数）である。別の実施態様では、前記多分散性は1.05 MW/MN未満である。さらに別の実施態様では、前記多分散性は1.05 MW/MN超である。
【０２３１】
本願発明は、PEG含有部分（たとえば1つ以上のPEGまたはPEG関連部分を含む部分）の、ネトリン関連ポリペプチドへの結合を意図する。たとえば、本願発明は、PEG含有部分を、N末端アミノ酸残基の1次アミンへのネトリン関連ポリペプチドの結合を意図する。本願発明はさらに、ネトリン関連ポリペプチドのアミン含有アミノ酸残基（たとえば、N末端、C末端、または内部アミン含有アミノ酸残基）への、PEG含有部分の結合を意図する。そのような結合は共有結合であってよく、そのような共有結合は前記PEG含有部分の活性基を介して生じてよい。たとえば、結合は活性エステル、活性アルデヒド、または活性炭酸塩を介して生じてもよい。PEG含有部分に共有結合的に付加するために用いられる反応基の例には、活性エステル、活性炭酸塩、アルデヒド、イソシアン酸塩、イソチオシアン酸塩、エポキシド、アルコール、マレイミド、ビニルスルホン、ヒドラジド、ジチオピリジン、およびヨードアセタミドが、それらに限定されずに含まれる。   
【０２３２】
前述のペグ化ネトリン関連ポリペプチドに加えて、本願発明は、前記修飾ネトリン関連ポリペプチドの親水性を上げるその他の部分で修飾したネトリン関連ポリペプチドを意図する。そのような親水性ネトリン関連ポリペプチドは、非修飾または未変性ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持し、好ましくは、非修飾および／または未変性ネトリン関連ポリペプチドと比較して有利な生理化学的特性を1つ以上有する。例示的な生理化学的特性には、長いin vitro 半減期、長いin vivo半減期、低い免疫原性、高い溶解度、高い有効性、高いバイオアベイラビリティ、および広い生体内分布が、それらに限定されずに含まれる。例示的な親水性ネトリン関連ポリペプチドには、1つ以上のシクロデキストラン部分が付加したネトリン関連ポリペプチド、またはその他の形式で1つ以上のグリコシル部分が付加したネトリン関連ポリペプチドが含まれる。ネトリン関連ポリペプチドが付加することができるその他の特に好ましい部分には、1つ以上のアルブミン部分、または1つ以上の抗体部分が含まれる。  
【０２３３】
前述のいずれにおいても、本願発明は修飾ネトリン関連ポリペプチドまたはその生物活性断片、および完全長ネトリンの模倣体またはネトリンの生物活性断片の模倣体を意図する。  
【０２３４】
上に詳細に概説したとおり、本願発明は多様な修飾ネトリン関連ポリペプチドであって、前記修飾ネトリン関連ポリペプチドが1つ以上の未変性または非修飾ネトリンポリペプチドの生物学的活性が1つ以上保持し、さらに有益な生理化学的特性を1つ以上有する、多様な修飾ネトリン関連ポリペプチドを意図する。修飾ネトリン関連ポリペプチドおよびそのようなポリペプチドを利用するための方法の別の例として、本願発明は1つ以上のアルブミン部分が付加した修飾ネトリン関連ポリペプチドを意図する。ペグ化ネトリン関連ポリペプチドを詳細に概説したとおり、アルブミン修飾ネトリン関連ポリペプチドは1つ以上のアルブミン部分で修飾することができ、そのようなアルブミン部分はN末端、C末端、および／または内部アミノ酸残基に付加することができる。アルブミンの詳細な説明、およびアルブミン部分をネトリン関連ポリペプチドへに付加するために用いることができる例示的な方法は、その全体を引用をもって本願明細書に引用する、米国特許出願第2004/0010134号に見つけることができる。 
【０２３５】
さらなる修飾ネトリン関連ポリペプチドも本願発明に意図され、1つ以上のアルブミン部分で修飾されたネトリン関連ポリペプチド、1つ以上の抗体部分（たとえば、IgG部分、IgM部分、IgE部分など）で修飾されたネトリン関連ポリペプチド、およびその親水性を高めるためにその他の形で修飾されたネトリン関連ポリペプチドが含まれる。1つ以上の部分をネトリン関連ポリペプチドに付加するために、多様な方法を用いることができ、例示的な方法は、その全体を引用により本願明細書に援用する、以下の参考文献に見つけられる。その参考文献は、米国特許出願第2004/0010134号、米国特許第6664331号、米国特許第6624246号、米国特許第6610281号、WO03/070805号、米国特許第6602952号、米国特許第6602498号、米国特許第6541543号、米国特許第6541015号、米国特許第6515100号、米国特許第6514496号、米国特許第6514491号、米国特許第6495659号、米国特許第6461603号、米国特許第6461602号、米国特許第6436386号、米国特許第5900461号、WO03/040211号、WO03/000777号、米国特許第6448369号、米国特許第6437025号、およびRoberts et
al. (2002) Advanced Drug Delivery Reviews 54: 459-476である。
【０２３６】
前述のいずれの場合にも、本願発明者らは、修飾ネトリンポリペプチドは、本願発明の方法に用いられる修飾ポリペプチドの範囲の、1つの具体的な実施態様にすぎないことを指摘する。本出願は、本願発明の方法に使用されるポリペプチドまたはペプチドのいずれも、1つ以上の有利な生理化学的特性を与えるために修飾することができる。本願発明がネトリンもしくはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害する作用物質（たとえばポリペプチドまたはペプチド作用物質）を提供するさらなる例として、そのような作用物質には、修飾ポリペプチドまたはその修飾生物活性断片が含まれる。修飾ポリペプチドまたは修飾生物活性断片は、未変性ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持し、好ましくは、未変性ポリペプチドと比較して有利な生理化学的活性を1つ以上有する。たとえば、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害する作用物質がUnc5hレセプタまたはUnc5hレセプタ細胞外ドメインである場合、本願発明は修飾Unc5hレセプタまたは修飾Unc5hレセプタ細胞外ドメインを意図する。
【０２３７】
修飾の種類
本願発明は修飾ポリペプチドを含む組成物を意図する。ある実施態様では、前記修飾ポリペプチドは親水性修飾ポリペプチドである。別の実施態様では、前記修飾ポリペプチドはペグ化ポリペプチドである。本願発明は、修飾ポリペプチドに、1つ以上の部分（または1つ以上のPEG含有部分）が付加してもよいことを意図する。前記部分は同一であってもよく、または異なっていてもよく、前記部分が直線状かまたは分岐状配置に配列されてもよい。ある実施態様では、前記修飾ポリペプチドは疎水性修飾ネトリン関連ポリペプチドである。 
【０２３８】
修飾ネトリン関連ポリペプチドを含む実施態様では、本願発明は、未変性グリコシル化パターンも有する修飾ポリペプチドとともに、未変性グリコシル化パターンを有さない修飾ポリペプチドを意図する。 
【０２３９】
本願発明は、前記ポリペプチドがN末端アミノ酸残基に部分を付加することによって（たとえば、前記N末端アミノ酸残基の1次アミンへPEG含有部分を付加することによって）修飾することができる。さらに、本願発明は、前記ポリペプチドが内部アミノ酸残基またはC末端アミノ酸残基にある部分を付加することによって修飾することができることを意図する。さらに、本願発明は、1つ以上のPEG含有部分の結合部位を提供するポリペプチドへの、遊離アミン含有アミノ酸残基の付加または置換を意図する。    
【０２４０】
本願発明は、修飾ポリペプチド、およびこれらの修飾ポリペプチドをin vitro およびin
vivoにおいて用いる方法を提供する。本願発明の修飾ポリペプチドは、非修飾および／または未変性ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持するべきである。さらに、好ましい修飾ポリペプチドは、未変性および／または非修飾ポリペプチドと比較して有利な生理化学的特性を1つ以上有する。したがって、修飾ポリペプチドは、in vitro または in vivoにおけるシグナル伝達を操作するためのさらなる可能な組成物を提供するだけでなく、そのような修飾ポリペプチドは、従来技術と比較して向上した特性を有するポリペプチドも提供することができる。例示的な修飾ポリペプチドには、ペグ化されたポリペプチドが含まれる。  
【０２４１】
本願発明は、数多くのPEG含有部分のいずれかのポリペプチドへの付加、およびそのようなPEG含有部分をN末端アミノ酸残基の1次アミン、アミン含有内部アミノ酸残基のアミン、および／またはアミン含有C末端アミノ酸残基のアミンに付加するための数多くの方法を意図する。さらに、本願発明は、システイン残基を含む反応性アミノ酸残基を介したPEG含有部分の付加を含有する。  
【０２４２】
各種のPEG含有部分が東京に知られている。たとえば、数社が、ペプチドをペグ化するために用いる各種PEG含有試薬の製造および販売している。ペグ化技術の初期の頃は、ペグ化はシステインなどの反応性アミノ酸残基を介して生じた。そのような方法論は、強力ではあったが、対象のペプチドがシステイン残基を含有している必要があるか、またはシステイン残基を対象のペプチドに突然変異させるか付加させる必要があった。そのような方法論は非常に有用であり、当業に公知である。たとえばネトリンポリペプチドなどのポリペプチドが数多くのシステイン残基を含有している場合、システイン残基を介した部分の付加の方法は、ポリペプチドへ部分を付加するための強力なアプローチとなりうる。  
【０２４３】
さらに、本願発明は、ペグ化ポリペプチドであって、当該ポリペプチドにおいてPEG含有部分が遊離アミン（たとえば、N末端アミノ酸残基の1次アミン、内部アミノ酸残基の遊離アミン、C末端アミノ酸残基の遊離アミンなど）を介して結合している、ペグ化ポリペプチドを説明する。  
【０２４４】
活性化PEG含有部分は、ペプチドの1次アミンへのPEG含有部分の結合を容易にする。したがって、本願発明の方法および組成物は特に、反応基を含むPEG含有部分（たとえば反応性PEG含有部分）を意図し、本願発明はさらに、前記ポリペプチドへの前記PEG含有部分の結合は前記反応基を介して生じることを意図する。  
【０２４５】
好ましい反応性PEG含有部分は、生理学的pH（たとえば、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、および9.5）、および室温で、ポリペプチドと容易に反応する。ある実施態様では、前記PEG含有部分をメトキシPEGでキャップする。したがって、本願発明はメトキシPEGを含んでよいPEG含有部分を意図する。  
【０２４６】
ある態様では、前記PEG含有部分はリジン活性PEG（活性エステル含有PEG部分とも呼ぶ）である。そのようなリジン活性PEG含有部分は、N末端アミノ酸残基の1次アミンへのPEG含有部分の付加、およびアミノ酸残基含有イミダゾール基またはヒドロキシル基（たとえばヒスチジン、チロシン）へのPEG含有部分の付加のいずれかに、特に有用である。例示的な活性エステルには、N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）活性エステル、プロピオン酸スクシンイミジル（SPA）活性エステル、およびブタン酸スクシンイミジル（SBA）活性エステルが、それらに限定されずに含まれる。リジン活性PEG含有部分の例には、PEG-N-ヒドロキシスクシンイミド（PEG-NHS）、PEGプロピオン酸のスクシンイミジルエステル（PEG-SPA）、PEGブタン酸のスクシンイミジルエステル（PEG-SBA）が、それらに限定されずに含まれる。  
【０２４７】
別の局面では、前記PEG含有部分はPEGアルデヒド（PEGチオエステルとも呼ぶ）である。PEGチオエステル含有部分は、特に、N末端への結合のためにデザインされ、好ましくはシステインまたはヒスチジンへの付加のためにデザインされる。  
【０２４８】
別の局面では、前記PEG含有部分はPEG二重エステルである。
【０２４９】
別の局面では、前記PEG含有部分はPEG炭酸ベンゾトリアゾール（PEG-BTC）である。そのようなPEG含有部分は、特に、穏やかな条件下で修飾タンパク質を産生するのに有用であって、安定なウレタン（カルバメート）結合を介した前記ポリペプチドへのPEG-BTC の結合を生じる。
【０２５０】
別の局面では、前記PEG含有部分はPEG-ButyrALDなどのアミン選択試薬である。そのような選択試薬によって、これまで達成可能だったものよりも安定な修飾組成物を得ることができる。しかし、本願発明は、アルデヒド基を有するその他のPEG含有部分の使用を意図する。部分を有するアルデヒドのある特別に意図される種類は、シアノホウ水素化ナトリウムの存在下において1次アミンと反応し、PEGアルデヒド、PEGアセトアルデヒド、およびPEGプロピオンアルデヒドが含まれる。
【０２５１】
別の局面では、前記PEG含有部分はPEGアセトアルデヒドジエチルアセタール（PEG-ACET）である。そのようなPEG含有部分は、アルドール縮合に対して特に安定である。
【０２５２】
別の局面では、前記PEG含有部分はスルフヒドリル選択PEGである。例示的なスルフヒドリル選択PEGには、PEGマレイミド（PEG-MAL）およびPEGビニルスルホン（PEG-VS）である。そのようなPEG含有部分は、チオール基との反応に特に有用である。  
【０２５３】
前述の例は、本願発明に意図される修飾ポリペプチドの種類を説明している。これらの修飾ポリペプチドはいずれも、当業に公知の技術を用いて合成することができ、これらの修飾ポリペプチドはin vitroおよびin vivoにおけるアッセイを用いてテストし、(i)相当する未変性および／または非修飾ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上維持し、(ii)前記未変性および／または非修飾ポリペプチドと比較して有利な生理化学的特徴を1つ以上有する、修飾組成物を同定することができる。   
【０２５４】
さらに、当業者は容易に、数多くのさらなるPEG含有部分から選択することができ、PEG含有部分をポリペプチドのN末端アミノ酸残基、内部アミノ酸残基、またはC末端アミノ酸残基を1つ以上付加するための適切なPEG化学を選択することができる。さらなるPEG含有部分およびPEG化学の例は、たとえば、本願明細書にその全体を引用をもって援用する、Roberts et al. (2002) Advanced Drug Delivery
Reviews 54: 459-476、米国特許第6664331号、米国特許第6624246号、米国特許第6610281号、WO03/070805号、米国特許第6602952号、米国特許第6602498号、米国特許第6541543号、米国特許第6541015号、米国特許第6515100号、米国特許第6514496号、米国特許第6514491号、米国特許第6495659号、米国特許第6461603号、米国特許第6461602号、米国特許第6436386号、米国特許第5900461号、WO03/040211号、WO03/000777号、米国特許第6448369号、米国特許第6437025号に説明されている。
【０２５５】
さらなる修飾ポリペプチド
前述の疎水性および親水性修飾ポリペプチドの例は、本願発明に意図される修飾ポリペプチドを説明することを意図した。本願明細書に提供された例からも明らかなように、本願発明の修飾ポリペプチドは、1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、または5つを超える部分を付加することができる。ポリペプチドに2つ以上の部分が付加されている場合、前記部分は同一のアミノ酸残基および／または異なるアミノ酸残基に付加されてもよい。ポリペプチドに2つ以上の疎水性部分が付加されている場合、前記部分は独立に選択される。部分の独立な選択には、併用して疎水性修飾ポリペプチドを作製するための各種疎水性部分、または併用して親水性修飾ポリペプチドを作製するための各種親水性部分だけが含まれるわけではない場合もある。本願発明は、疎水性および親水性部分の両方をポリペプチドに付加して混合修飾ポリペプチドを作製することも意図する。そのような修飾ポリペプチドは、相当する未変性および／または非修飾ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持することを確認するために容易に評価することができ、さらに前記修飾ポリペプチドが相当する未変性および／または非修飾ポリペプチドと比較して有利な生理化学的特性を1つ以上有するかどうかを調べるために評価することもできる。  
【０２５６】
作用物質
上に詳細に概説した本願発明の核酸およびポリペプチド組成物に加えて、本願発明は、本願発明の方法に用いることができるさらなる作用物質も意図する。ある実施態様では、前記作用物質はネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害する。別の実施態様では、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害するそのような作用物質（たとえばネトリンのプロ血管新生、プロ誘引活性を阻害する）が、以下のいずれかから選択される。(i)Unc5hポリペプチド、(ii)Unc5h核酸、(iii)Unc5hの修飾または生物活性断片、(iv)Unc5h細胞外ドメイン、(v)抗ネオゲニン抗体（たとえば、ブロッキング抗体）、(vi)ネオゲニンアンチセンスオリゴヌクレオチド、(vii)ネオゲニンRNAi構造体、(viii)ネオゲニンリボザイム、(ix)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性または発現を阻害する小分子、(x) ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を阻害するためにネオゲニンに結合する小分子、(xi)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を阻害するためにネトリンに結合する小分子、である。 
【０２５７】
別の実施態様では、前記作用物質は、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を促進する（例えばプロ血管新生、ネトリンの誘引活性を促進する）。別の実施態様では、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を促進するそのような作用物質は、以下のいずれかから選択される。(i)抗Unc5h抗体（ブロッキング抗体）、(ii)Unc5hアンチセンスオリゴヌクレオチド、(iii)Unc5h RNAiの作成物、(iv)Unc5hリボザイム、(v)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性または発現を促進する小分子、(vi)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を促進するためにネトリンに結合する小分子、(vii)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を阻害するためにネオゲニンに結合する小分子、(viii)Unc5hに結合して阻害し、ネトリン活性を促進する小分子、である。   
【０２５８】
本願発明は、本願発明の1つ以上の作用物質を含む組成物および薬学的組成物を意図する。本願発明は多数の作用物質を用いることができる本願発明の作用物質は、(i)リガンドネトリン自体、(ii)レセプタネオゲニン、(iii)ネトリン活性またはシグナル伝達のいずれかを促進するか、または陰性調節因子Unc5hのレベルにおいてネトリン活性を調節することにより、ネトリン活性またはシグナル伝達を促進するか、またはネトリン活性またはシグナル伝達を阻害するように作用する。治療物質などを含む、ネトリンシグナル伝達を促進または阻害する作用物質は、本願明細書に記載の通り、in vitroまたはin vivoで用いることができる。       
【０２５９】
A.  作用物質の種類
あるmRNAまたはタンパク質の発現および／または活性を阻害するための数々のメカニズムが存在する。理論に制限されることなく、本願発明は、あるmRNAの発現および／または活性を阻害するための数多くの方法のいずれも意図する。さらに、本願発明は、あるタンパク質の発現および／または活性を阻害するための数多くの方法のいずれも意図する。さらに、本願発明は、(i)あるmRNAまたはタンパク質の発現および／または活性を低下する2つ以上の阻害物質の使用、または(ii)あるmRNAまたはタンパク質の発現および／または活性を低下させる1つ以上の阻害物質の使用と、第2のmRNAまたはタンパク質の発現および／または活性を低下させる1つ以上の阻害物質の使用、のいずれかを含むコンビナトリアルな方法を意図する。  
【０２６０】
以下は、mRNAまたはタンパク質の発現および／または活性を阻害するための方法の具体例である。これらの例は制限することを全く意図せず、当業者は、発現および／または活性を阻害する既知の方法の中から容易に選択することができる。当業者は、阻害物質を用いて特定のタンパク質の活性を阻害し、シグナル伝達を阻害することができるということを、容易に認識するだろう。さらに、阻害物質を用いて、あるタンパク質を介したシグナル伝達を阻害するように内因的に機能するあるタンパク質の活性を阻害することができる。そのようなシナリオでは、阻害性タンパク質の拮抗作用は正味の陽性効果を有しており、あるタンパク質を介したシグナル伝達を促進する。     
【０２６１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、あるタンパク質をコードするmRNAのコード鎖（センス鎖）に相補的な（またはアンチセンスな）比較的短い核酸である。アンチセンスオリゴヌクレオチドは典型的にはRNAベースだが、DNAベースであってもよい。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドはその安定性を高めるために修飾されることが多い。  
【０２６２】
理論に制限されることなく、これらの比較的短いオリゴヌクレオチドがmRNAに結合すると、内因性RNAseによってメッセージの分解を引き起こす2本鎖RNAが誘導されると考えられている。さらに、前記オリゴヌクレオチドは、前記メッセージのプロモータの近くに結合するように特別にデザインされる場合もあり、このような環境下では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは前記メッセージの翻訳をさらに干渉する場合がある。アンチセンスヌクレオチドが機能する特定のメカニズムにかかわらず、細胞または組織にそれを投与すると、あるタンパク質をコードするmRNAが分解される。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドはあるタンパク質の発現および／または活性を低下させる。
【０２６３】
前記オリゴヌクレオチドはDNAもしくはRNAまたはキメラ混合物もしくは誘導体もしくはその修飾型であって、1本鎖または2本鎖であってよい。前記オリゴヌクレオチドは、たとえば分子、ハイブリダイゼーションなどの安定性を向上させるために、塩基部分、頭部分、またはリン酸塩骨格を修飾することができる。前記オリゴヌクレオチドには、ペプチド（たとえば宿主細胞レセプタをターゲティングするための）、または細胞膜全体の移動を容易にする作用物質(たとえば Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:6553-6556、 Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84:648-652;
PCT 公報第W088/09810号、
December 15, 1988発行参照)、または血液脳関門(たとえば PCT 公報第 W089/10134号、April
25, 1988発行、参照)、ハイブリダイゼーション誘発切断物質（たとえばKrol et al., 1988, BioTechniques 6:958- 976参照）、または挿入剤などの、その他の付加された化学基が含まれてよい。(たとえば Zon, 1988, Pharm. Res. 5:539-549参照)。この目的のために、前記オリゴヌクレオチドは別の分子に結合させてもよい。
【０２６４】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、5-フルオロウラシル, 5- ブロモウラシル, 5-クロロウラシル, 5-ヨードウラシル, ヒポキサンチン, キサンチン, 4-アセチルシトシン, 5-
(カルボキシヒドロキシトリエチル) ウラシル, 5-カルボキシメチルアミノメチル-2-チオウリジン, 5- カルボキシメチルアミノメチルウラシル, ジヒドロウラシル, β-D-ギャラクトシルケオシン, イノシン, N6- イソペンテニルアデニン, 1-メチルグアニン, 1-メチルイノシン, 2,2-ジメチルグアニン, 2-メチルアデニン, 2-メチルグアニン, 3-メチルシトシン, 5-メチルシトシン, N6-アデニン, 7-メチルグアニン, 5-メチルアミノメチルウラシル,
5-メトキシアミノメチル-2-チオウラシル, β-D- マンノシルケオシン, 5'-メトキシカルボキシメチルウラシル, 5-メトキシウラシル, 2-メチルチオ-N6- イソペンテニルアデニン, ウラシル-5-オキシ酢酸(v), ワイブトキソシン, 偽ウラシル, ケオシン, 2-チオシトシン, 5-メチル-2-チオウラシル, 2-チオウラシル, 4-チオウラシル, 5-メチルウラシル, ウラシル-5- オキシ酢酸メチルエステル, ウラシル-5-オキシ酢酸(v), 5-メチル-2-チオウラシル, 3-(3-アミノ-3-
N-2-カルボキシプロピル)ウラシル, (acp3)w, および2,6-ジアミノプリンがそれらに限定されずに含まれる化学基から選択される、少なくとも1つの修飾塩基部分を含んでよい。
【０２６５】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アラビノース、2-フルオロアラビノース、キシルロース、およびヘキソースがそれらに限定されずに含まれる化学基から選択される、少なくとも1つの修飾糖部分を含んでもよい。
【０２６６】
前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはまた、中性ペプチド様骨格を含むこともできる。そのような分子は、ペプチド核酸（PNA）オリゴマーとよばれ、たとえばPerry-O'Keefe et al.(1996) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
93:14670 and in Eglom et al.(1993) Nature 365:566に記述される。PNAオリゴマーのある利点は、DNAの中性骨格のために、媒質のイオン強度から基本的に独立に、相補DNAに結合することができる能力である。さらに別の実施態様では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホルアミドチオエート、ホスホルアミデート、ホスホルジアミデート、メチルホスホナート、アルキルホスホトリエステル、およびホルムアセタール、またはその類似体からなるグループから選択される、少なくとも1つの修飾ホスホネート骨格を含む。
【０２６７】
さらなる実施態様では、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドはアノマーオリゴヌクレオチドである。アノマーオリゴヌクレオチドは、相補RNAと特異的な2本鎖ハイブリッドを形成し、通常のユニットとは対照的に、その鎖はお互いに平行である（Gautier et al., 1987, Nucl.Acids
Res.15:6625-6641）。前記オリゴヌクレオチドは、2'-0-メチルリボヌクレオチド（Inoue et al., 1987, Nucl.Acids Res.15:6131-6148）、またはキメラRNA-DNA 類似体（Inoue et al., 1987, FEBS Lett.215:327-330）である。
【０２６８】
本願発明のオリゴヌクレオチドは、たとえば自動化DNA合成装置（バイオサーチ・アプライド・バイオシステムズ社などから販売されているものなど）の使用など、当業に知られる標準方法によって合成することもできる。例として、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドはStein et al. (1988, Nucl.Acids Res.16:3209)の方法によって合成することもでき、メチルホスホナートオリゴヌクレオチドは制御された細孔ガラスポリマー支持体の使用などによって調製することができる（Sarin et al., 1988, Proc. Natl.
Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451）。
【０２６９】
適切なオリゴヌクレオチドの選択は、当業者が容易に行うことができる。あるタンパク質をコードする核酸配列の場合、当業者は、そのタンパク質に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインし、in vitroまたはin vivoのシステムにおけるこれらのオリゴヌクレオチドについて、前記のあるタンパク質をコードするmRNAに結合して分解を媒介することを確認するためのテストを行うことができる。あるタンパク質に特異的に結合して分解を媒介するアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインするために、前記オリゴヌクレオチドによって認識される配列がそのあるタンパク質に固有であるか、または実質的に固有であることが重要である。たとえば、タンパク質全体に頻回に繰り返される配列は、あるメッセージを特異的に認識して分解するオリゴヌクレオチドのデザインには、理想的な選択ではないことがある。当業者は、オリゴヌクレオチドをデザインし、そのオリゴヌクレオチドの配列を、公表されているデータベースにある核酸配列と比較して、その配列があるタンパク質に特異的であるかまたは実質的に特異的であることを確認することができる。
【０２７０】
別の例では、1つ以上のメッセージに結合して分解を媒介するアンチセンスオリゴヌクレオチドをデザインするのが望ましいことがある。ある例では、前記メッセージはイソ型または機能的に冗長なタンパク質などの関連するタンパク質をコードすることがある。そのような場合には、当業者はこれらの関連するタンパク質をコードする核酸配列を並べ、両方のメッセージを認識するオリゴヌクレオチドをデザインすることができる。  
【０２７１】
アンチセンスDNAまたはRNAを細胞に輸送するために、数多くの方法が開発されており、たとえば、アンチセンス分子を、組織部位または修飾アンチセンス分子に直接注射し、望ましい細胞を標的とするようにデザインし（たとえば、標的細胞表面に発現するレセプタまたは抗原に特異的に結合するペプチドまたは抗体に結合するアンチセンス）、系統的に投与することができる。
【０２７２】
しかし、ある場合には、内因性mRNAの翻訳を抑制するのに十分な前記アンチセンスの細胞内濃度を達成することは困難なことがある。したがって、別のアプローチを、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドを強力なpol IIIまたはpo lIIプロモータの制御下に配置された組換えDNA作成物に用いる。たとえば、ベクタを、細胞に吸収されてアンチセンスRNAの転写が方向付けられるように、in vivoに導入することができる。そのようなベクタは、望ましいアンチセンスRNAを生じるように転写できるのであれば、エピソームのままであってもよく、または染色体に組み込まれてもよい。そのようなベクタは、当業では標準の組換えDNA技術法によって作製することができる。ベクタはプラスミド、ウイルス、または当業に知られるその他のものであって、哺乳類細胞の複製および発現に用いられるものであってよい。アンチセンスRNAをコードする配列の発現は、哺乳類、好ましくはヒト細胞の中で作用する、当業に知られるプロモータのいずれかによることができる。そのようなプロモータは誘導性、または構成的であってよい。そのようなプロモータには、以下の方法がそれらに限定されずに含まれる。それは、SV40初期プロモータ領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310）、ラウス肉腫ウイルスの3’末端反復配列に含まれるプロモータ（Yamamoto et al., 1980, Cell
22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:1441-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al, 1982, Nature 296:39-42）などである。プラスミド、コスミド、YAC、またはウイルスベクタのいずれかの種類を用いて、組織部位に直接導入できる組換えDNA作成物を調製することができる。代替的には、投与が別の経路によって達成される場合（たとえば系統的に）、望ましい組織に選択的に感染するウイルスベクタを用いることができる。
【０２７３】
RNAi作成物は、標的遺伝子の発現を特異的に遮断する2本鎖RNAを含む。「RNA干渉」または「RNAi」は、最初は植物および虫に認められる現象に用いられる用語で、2本鎖RNA（dsRNA）が特異的な転写後の様式で遺伝子発現を遮断する。理論に制限されることなく、RNAiはmRNAの分解に関与すると考えられているが、生化学的メカニズムは現在活発に研究されている分野である。作用メカニズムに関していくつか謎があるものの、RNAiはin vitroまたはin vivoにおける遺伝子発現を阻害する有用な方法を提供する。
【０２７４】
本願明細書に用いられるように、「dsRNA」という用語はsiRNA分子、または2本鎖の特徴を含み、ヘアピンRNA部分などの細胞中のsiRNAに処理することができるその他のRNA分子である。  
【０２７５】
対象のRNAi方によって阻害される遺伝子を意味する「機能喪失」という用語は、RNAi作成物がない場合のレベルと比較した場合、遺伝子の発現レベルの低下を意味する。 
【０２７６】
本願明細書に記載の通り、「媒介RNAi」という用語は、RNAiプロセスによって分解されるのはどのRNAなのかを区別する能力を意味（示）し、たとえば、分解は、たとえばPKR応答など、配列から独立したdsRNA応答によるのではなく、配列特異的な様式で生じる。 
【０２７７】
本願明細書に用いられるように、「RNAi作成物」という用語は、小さい干渉RNA（siRNA）、ヘアピンRNA、およびin vivoにおいて切断してsiRNAをつくることができるその他のRNA種を含む、一般的な用語として本願明細書全体に用いられる。本願明細書のRNAi作成物には、細胞中のdsRNAまたはヘアピンRNAを形成する転写物、および／またはin vivoにおいてsiRNAを生じさせることができる転写物を生じさせることができる発現ベクタも含まれる。
【０２７８】
「RNAi発現ベクタ」（本願明細書では「dsRNAコードプラスミド」ともよぶ）は、複製可能な核酸作成物であって、当該作成物が発現する細胞中にsiRNA部分を生じるRNAを発現（転写）させるために用いる核酸作成物を意味する。そのようなベクタには、(1)たとえばプロモータ、オペレータ、またはエンハンサなどの、遺伝子発現において調節の役割を有する遺伝子要素が、動作的に結合した、(2)転写されて2本鎖RNAを生じる「コード」配列（細胞内でアニーリングしてsiRNAをつくる2つのRNA部分、または処理してsiRNAにすることができる単一のヘアピンRNA）、および(3)適切な転写開始および終止配列、の組み合わせからなる転写ユニットを含む。プロモータおよびその他の調節要素の選択は、一般に、目的の宿主細胞にしたがって変化する。一般に、組換えDNA技術において有用な発現ベクタは、ベクタの状態では染色体に結合していない環状2本鎖DNAループを意味する「プラスミド」の状態であることが多い。本願明細書では、「プラスミド」および「ベクタ」は同義的に用いられるが、プラスミドはベクタの最も一般的に用いられる形状である。しかし、本願発明は、等価に機能し、本願明細書においてこれ以降も当業に知られる、発現ベクタのその他の形状が含まれることが意図される。
【０２７９】
RNAi作成物は、前記細胞の生理学的条件下において、阻害される遺伝子（つまり「標的」遺伝子）のmRNA転写物の少なくとも一部分の核酸配列にハイブリダイズする、ヌクレオチド配列を含有する。2本鎖RNAは、RNAiを媒介する能力を有する天然のRNAに十分類似していればよい。したがって、本願発明は、遺伝子突然変異、株多型、または進化の多様性により予想されうる配列の変化に耐えられるという利点を有する。前記標的配列と前記RNAi作成物配列の間の許容なヌクレオチドミスマッチの数は、5塩基対に1対、または10塩基対に1対、または20塩基対に1対、または50塩基対に1対より多くない。siRNA2本鎖の中央のミスマッチは最も重要で、基本的に前記標的RNAの切断を停止させることがある。反対に、前記標的RNAに相補的な前記siRNA鎖の3’末端のヌクレオチドは、標的認識の特異性に著しく寄与することはない。
【０２８０】
配列の同一性は、配列の比較と当業に知られる配列アルゴリズム（Gribskov and Devereux, Sequence Analysis
Primer, Stockton Press, 1991およびそこに囲繞される文献を参照）、ならびに、たとえばスミス-ウォーターマンアルゴリズムなどをデフォルトパラメタを用いたBESTFITソフトウェアプログラム（たとえばウイスコンシン大学遺伝子計算グループ）で実行してヌクレオチド配列間の差異の割合を計算して、最適化することもできる。 阻害RNAと前記標的遺伝子の部分の配列の同一性は、90%を超えるか、または100%が好ましい。代替的には、RNAの2本鎖領域は、機能的に、前記標的遺伝子転写物の一部分とハイブリダイズすることができる（たとえば400 mM NaCl、40 mM PIPES pH
6.4、1 mM EDTA、50 ℃または70 ℃ハイブリダイゼーションを12乃至16時間の後、洗浄）ヌクレオチド配列として定義することもできる。 
【０２８１】
RNAi作成物の作成は、化学合成法か、または組換え核酸技術によって行うことができる。処理された細胞の内因性RNAポリメラーゼはin vivoにおける転写を媒介することもでき、またはクローンRNAポリメラーゼはin vitroにおける転写に用いることができる。前記RNAi作成物には、たとえば細胞ヌクレアーゼへの感受性を低減し、バイオアベイラビリティを向上させ、製剤の特徴を向上させ、および／またはその他の薬物動態学的特性を変化させるなどのために、リン酸-糖骨格またはヌクレオチドのいずれかを修飾することが含まれることもある。たとえば、天然RNAのホスホジエステル結合を修飾して、少なくとも1つの窒素または硫黄ヘテロ原子を含めてもよい。特定の遺伝子を阻害する一方でdsRNAの一般的な応答を避けられるように、RNA構造の修飾を調整することができる。同様に、アデノシンデアミナーゼの活性を遮断するように、塩基を修飾してもよい。RNAi作成物は酵素的か、または部分的／全体的な有機合成によって作成することもでき、修飾リボヌクレアーゼはいずれも、in vitroの酵素または有機合成によって導入することもできる。
【０２８２】
RNA分子を化学的に修飾する方法は、RNAi作成物の修飾にも適用することができる（たとえば、 Heidenreich et al.(1997)  Nucleic Acids Res, 25:776-780;
Wilson et al. (1994) J Mol Recog 7:89-98; Chen et al. (1995) Nucleic
Acids Res 23:2661-2668; Hirschbein et al. (1997) Antisense Nucleic Acid
Drug Dev 7:55-61参照）。単に説明のために、RNAi作成物の骨格をホスホロチオエート、ホスホルアミデート、ホスホジチオエート、キメラメチルホスホネート-ホスホジエステル、ペプチド核酸、オリゴマまたは糖修飾（たとえば2’弛緩リボヌクレオシド、a-配置）を含有する、5-プロピニルピリミジン、で修飾することができる。
【０２８３】
2本鎖構造は、1つの自己相補性RNA鎖または2つの相補性RNAで形成してもよい。RNA2本鎖の形成は、細胞の内部または外部のいずれかで開始してよい。RNAは細胞1つにつき少なくとも1コピーを輸送することができる量、導入してよい。2本鎖物質の高投与量（たとえば細胞1つにつき少なくとも5、10、100、500または1000コピー）によってより効果的な阻害を得ることができるが、低投与量でも特定の用途に有用である場合がある。阻害は、RNAの2本鎖領域に相当するヌクレオチド配列が遺伝子阻害を標的とする場合に、配列特異的である。
【０２８４】
ある実施態様では、当該RNAi作成物は「小干渉RNA」または「siRNA」である。これらの核酸は長さ約19乃至30ヌクレオチドであって、より好ましくは長さ21乃至23ヌクレオチドであって、たとえばより長い2本鎖RNAのヌクレアーゼ「ダイシング」によって作製される断片の長さに相当する。siRNAは、ヌクレアーゼ複合体を導入し、特異的な配列と対になることによって前記複合体を標的mRNAに誘導すると理解されている。その結果、前記標的mRNAは、タンパク質複合体のヌクレアーゼによって分解される。ある実施態様では、前記21乃至23ヌクレオチドのsiRNA分子は3’ヒドロキシル基を含む。 
【０２８５】
本願発明のsiRNA分子は、当業者に知られる数多くの技術を用いて得ることができる。たとえば、前記siRNAは、当業に知られる方法を用いて、化学的に合成するか、または組換え的に産生することができる。たとえば、短いセンスおよびアンチセンスRNAオリゴマーを合成してアニーリングし、各末端の2-ヌクレオチドオーバーハングを有する2重鎖RNA構造をつくることができる（Caplen, et al.(2001) Proc Natl Acad Sci USA,
98:9742-9747、Elbashir, et al.(2001) EMBO J, 20:6877-88）。それから、後述のように、受動取り込みかまたは最適な輸送システムのいずれかによって、これらの2本鎖siRNA構造を細胞に直接導入することができる。 
【０２８６】
ある実施態様では、前記siRNA作成物は、たとえば酵素ダイマーの存在下において、より長い2本鎖RNAを処理することによって作製することができる。ある実施態様では、ショウジョウバエin vitroシステムを用いる。この実施態様では、dsRNAをショウジョウバエ胚に由来する可溶性抽出物と混合して、混合物を作製する。前記混合物は、前記dsRNAが約21乃至約23ヌクレオチドのRNA分子に処理される条件下に維持される。 
【０２８７】
前記siRNA分子は、当業者に知られる数多くの技術を用いて精製することができる。たとえば、ゲル電気泳動を用いてsiRNAを精製することができる。代替的には、非変性カラムクロマトグラフィなどの非変性方法を用いて、前記siRNAを精製することができる。さらに、クロマトグラフィ（たとえばサイズ排除クロマトグラフィ）、グリセロール勾配遠心分離、抗体を用いた親和性精製を用いてsiRNAを精製することができる。 
【０２８８】
ある好ましい実施態様では、前記siRNA分子の少なくとも1本の鎖は、長さ約1乃至約6ヌクレオチドの3’オーバーハングを有するが、長さ2乃至4ヌクレオチドであってもよい。さらに好ましくは、3’オーバーハングは長さ1乃至3ヌクレオチドである。ある実施態様では、3’オーバー半部を有する1本鎖、および平滑末端もしくはオーバーハングも有するその他の鎖。前記オーバーハングの長さは、それぞれの鎖について同一であっても異なっていてもよい。siRNAの安定性をさらに向上させるために、前記3’オーバーハングを分解に対して安定化させることができる。ある実施態様では、前記RNAを、アデノシンまたはグアノシンヌクレオチドなどのプリンヌクレオチドを含めることによって安定化させる。代替的には、たとえば2’デオキシチイニジンによるウリジンヌクレオチド3’オーバーハングの置換など、修飾類似体によるピリミジンヌクレオチドの置換は許容的であり、RNAiの効果に影響しない。2’ヒドロキシの欠如は、組織培養培地のオーバーハングのヌクレアーゼ耐性を著しく向上させ、in vitoにおいて有益な場合がある。 
【０２８９】
他の実施態様では、前記RNAi作成物は長い2本鎖RNAの形状である。ある実施態様では、前記RNAi作成物は少なくとも25、50、100、200、300 または400塩基である。ある実施態様では、前記RNAi作成物は400乃至800塩基である。前記2本鎖RNAは細胞内で消化され、たとえば前記細胞中にsiRNAを産生する。しかし、長い2本鎖RNAのin vivoにおける使用は常に実用的であるとは限らない。それはおそらく、配列に依存しないdsRNA応答によって生じる可能性がある有害効果のためである。そのような実施態様では、インターフェロンまたはPKRの影響を低減する局所輸送システムおよび／または作用物質の使用が好ましい。
【０２９０】
ある実施態様では、前記RNAi作成物はヘアピン構造の形状（ヘアピンRNAと命名されている）である。前記ヘアピンRNAは、細胞外で合成できるか、またはin vivoにおいてRNAポリメラーゼIIIプロモータから転写することによってつくることができる。哺乳類細胞において遺伝子サイレンシングのためのそのようなヘアピンRNAを作製し使用する例は、たとえばPaddison et al., Genes Dev, 2002, 16:948-58; McCaffrey et al., Nature,
2002, 418:38-9; McManus et al., RNA, 2002, 8:842-50; Yu et al., Proc
Natl Acad Sci U S A, 2002, 99:6047-52などに記述されている。好ましくは、そのようなヘアピンRNAは細胞内または動物の体内で操作され、確実に望ましい遺伝子を連続的で安定に抑制できる。当業には、siRNAは前記細胞中でヘアピンRNAを処理することによって産生することができることが知られている。 
【０２９１】
さらに他の実施態様では、プラスミドを用いて、前記2本鎖RNAをたとえば転写産生物として輸送する。そのような実施態様では、前記プラスミドは、RNAi作成物のセンスおよびアンチセンス鎖それぞれの「コード鎖」を含むようにデザインされる。前記コード鎖は、たとえば逆方向プロモータが隣接する同一の配列であってもよいし、またはそれぞれが別々のプロモータの転写制御下にある2つの別々の配列であってもよい。前記コード配列を転写してから、前記の相補的なRNA転写物を塩基対にして2本鎖RNAを形成する。 
【０２９２】
PTC出願第WO01/77350 号に、真核細胞の同一の組換え遺伝子のセンスおよびアンチセンスRNAの両方を得るための、組換え遺伝子の2方向性転写のための例示的なベクターが記述されている。したがって、ある実施態様では、本願発明は以下の固有な特徴を有する組換えベクタを提供する。それは、反対方向になるように配列された2つの重なる転写ユニットを有し、目的のRNAi作成物の組換え遺伝子に隣接するウイルスレプリコンであって、当該レプリコンにおいて、前記の2つの重なる転写ユニットが、宿主細胞の同一の組換え遺伝子断片からセンスおよびアンチセンスRNA転写物の両方が得られる、ウイルスレプリコンを含む。  
【０２９３】
RNAi作成物は、前記標的核酸配列に同一かまたは実質的に同一の長い2本鎖RNA、または前記標的核酸配列のある領域だけに同一かまたは実質的に同一な短い2本鎖RNAのいずれかを含むことができる。長いかまたは短いRNAi作成物のいずれかを作製し輸送する例示的な方法は、たとえば第WO01/68836号および第WO01/75164号に見つけることができる。
【０２９４】
ある遺伝子、またはある遺伝子ファミリを特異的に認識する例示的なRNAi作成物は、アンチセンスオリゴヌクレオチドの選択に関して、上に詳細に概説した方法論を用いて選択することができる。同様に、RNAi作成物の輸送の方法には、上に詳細に概説したアンチセンスオリゴヌクレオチドの輸送の方法が含まれる。  
【０２９５】
mRNA転写物を触媒的に分解するようにデザインされたリボザイム分子は、mRNAの翻訳を抑制するためにも用いることができる（See, e.g., 1990年10月4日発行のPCT 国際出願第
WO90/11364号、Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225および米国特許第5,093,246号）。部位特異的認識配列でmRNAを切断するリボザイムは、特定のmRNAを破壊するために用いることができるが、ハンマーヘッド型のリボザイムの使用が好ましい。ハンマーヘッド型リボザイムは、前記標的mRNAと相補的な塩基対を形成する隣接領域によって決定される位置においてmRNAを切断する。唯一の必要条件は、前記標的mRNAは以下の2つの塩基配列、5'-UG-3'を有する。ハンマーヘッド型リボザイムの作製および産生は、当業に公知であり、Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591により完全に記述されている。
【０２９６】
本願発明のリボザイムには、RNAエンドリボヌクレアーゼ（本願明細書では「Cech型リボザイム」とよぶ）であって、テトラヒメナ好熱菌に天然に生じるもの（IVSまたはL-19 IVS RNA）であって、Thomas
Cech らが幅広く記述しているものである(Zaug, et al., 1984, Science, 224:574-578、Zaug and Cech, 1986, Science, 231:470-475、Zaug, et al., 1986, Nature, 324:429-433、University Patents Incによる発行済み国際特許出願 WO88/04300号、Been
and Cech, 1986, Cell, 47:207-216)。Cech型リボザイムは、標的RNA配列とハイブリダイズして前記標的RNAを切断する8塩基対の活性部位を有する。本願発明は、8塩基対活性部位配列を標的とするCech型リボザイムを包含する。 
【０２９７】
アンチセンスアプローチにあるとおり、前記リボザイムは修飾オリゴヌクレオチドで構成することができ（たとえば高い安定性、ターゲティングなどのために）、およびin vitro またはin vivoにおいて細胞に輸送することができる。輸送の好ましい方法には、強力な構成的pol IIIまたはpol IIプロモータの制御下で前記リボザイムを「コード」するDNA作成物が関与する。その結果、形質移入細胞は標的メッセージを破壊し翻訳を阻害するのに十分な量の前記リボザイムを産生するだろう。リボザイムは、アンチセンス分子とは異なり、触媒性であって、有効性のためには分子内濃度が低くなければならない。
【０２９８】
抗体を、あるタンパク質（たとえば、ブロッキング抗体など）の活性の阻害物質として用いることができる。抗体は、特定のエピトープに著しい親和性と特異性を有することができる。特定のタンパク質に結合し、そのタンパク質上のエピトープに対する抗体への結合がそのタンパク質の機能を阻害することができる抗体。たとえば、抗体は、適切なタンパク質-タンパク質相互作用を立体的に障害する、または活性部位を占拠することによって、前記タンパク質の機能を阻害することもできる。代替的には、特定のタンパク質上のエピトープへの前記抗体の結合は、そのタンパク質の立体配置を変化させて適切に機能しないようにすることもできる。本願出願の文脈では、好ましい抗体は、細胞中のネトリンシグナル伝達に必要なレセプタに結合し、その機能を阻害することもできる。代替的には、前記抗体は、前記控訴状の異なる部位に結合して、機能に必要なタンパク質タンパク質相互作用を立体的に障害することもできる。さらに別の例では、前記抗体は前記タンパク質上の異なる部位に結合し、そのタンパク質の立体配置を変化させて、そのタンパク質が機能しないようにすることもできる。例示的な抗体には、抗ネオゲニン抗体（たとえば、ネオゲニンポリペプチドの全体または一部分に免疫応答性がある抗体）が含まれる。   
【０２９９】
モノクローナルまたはポリクローナル抗体は、標準プロトコルを用いて作製することができる（たとえば、Antibodies:A Laboratory Manual ed. by Harlow
and Lane (Cold Spring Harbor Press:1988)を参照）。マウス、ハムスター、ラット、ヤギ、またはウサギなどの哺乳類を、免疫原性の形状の前記ペプチドで免疫することができる。タンパク質またはペプチドに免疫原性を付与する技術には、担体との複合体化またはその他の当業に公知の技術が含まれる。
【０３００】
動物をポリペプチドの抗原性調剤で免疫した後、抗血清と、望ましい場合には血清から分離されたポリクローナル抗体を得ることができる。モノクローナル抗体を産生するために、抗体産生細胞（リンパ球）を免疫動物から収集し、標準的な体細胞融合法によって骨髄腫細胞などの不死化細胞と融合させてハイブリドーマ細胞を得ることができる。そのような技術は当業に公知で、たとえばハイブリドーマ技術（もともとはKohler and Milstein, (1975) Nature, 256:495-497によって開発された）、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術（Kozbar
et al., (1983) Immunology Today, 4:72）、およびヒトモノクローナル抗体を産生するEBVハイブリドーマ技術（Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer
Therapy, Alan R. Liss, Inc. pp. 77-96）が含まれる。ハイブリドーマ細胞は、あるポリペプチドに特異的に反応する抗体、およびハイブリドーマ細胞などからなる培養物から単離されたモノクローナル抗体の産生について、免疫化学的にスクリーニングすることができる。
【０３０１】
本願発明の文脈では、抗体をスクリーニングして、あるタンパク質の機能を阻害することができる抗体を同定するための試験をすることができる。当業者は、すべての抗体が、あるタンパク質に特異的に示す免疫応答が、そのタンパク質の機能を阻害するだろうということを認識するだろう。しかし、当業者は、抗体について、あるタンパク質の機能を遮断することができるものを同定するために容易に試験することができる。  
【０３０２】
本願明細書に用いられる抗体という用語は、あるポリペプチドにも特異的に反応性を示す、その断片も含むことが意図される。抗体は、従来技術、および完全抗体について上述したものと同一の方法への用途についてスクリーニングされた断片を用いて断片化することができる。たとえば、F(ab)2 断片は、ペプシンを有する抗体で処理することによって作製することができる。得られたF(ab)2 断片は、Fab断片をつくるために、ジスルフィド架橋を減らすように処理することができる。本願発明の抗体にはさらに、前記抗体のCDR領域の少なくとも1つによって付与されたあるタンパク質への親和性を有する、2特異性でキメラの分子を含まれることが意図される。
【０３０３】
あるポリペプチドに対するモノクローナルおよびポリクローナル抗体の両方とも（Ab）、ならびにFab、F(ab)2、FvおよびscFv などの抗体断片を用いて、あるタンパク質の作用を遮断することができる。そのような抗体は、生物学的プロセスにおけるあるタンパク質の役割をさらに理解する実験的な文脈において、または治療的な文脈において、用いることができる。
【０３０４】
前述の抗体の例のいずれにおいても、本願発明は、複数の種、および種に特異的な抗体の特定のタンパク質の機能を遮断することができる抗体を意図する。さらに、本願発明は、一部の抗体は特定のタンパク質に関係する複数のファミリメンバと交差反応する一方で、その他の抗体は単一のファミリメンバと特異的に反応することを意図する。  
【０３０５】
小さい有機分子は、あるタンパク質の機能をアゴナイズ、またはアンタゴナイズすることができる。小さい有機分子とは、分子量が2500amu未満、より好ましくは1500
amu未満、およびさらにより好ましくは750 amu未満である炭素含有分子を意味する。  
【０３０６】
小さい有機分子は、望ましい機能を有する化合物を同定するために、有機分子および／または化学化合物のライブラリをスクリーニングすることによって、容易に同定することができる。理論に制限されることなく、小さい有機分子は数多くの方法のいずれかにおいてその機能を発揮することもできる。  
【０３０７】
ある機能（たとえばネトリンシグナル伝達を促進または阻害する）を有する小さい有機分子を同定するための、容易に入手できるライブラリのスクリーニングに加えて、本願発明は小さい有機分子の合理的なデザイン、およびその試験を意図する。たとえば、ある酵素の結合部位の分子モデリングをもとに、当業者はその結合ポケットを占めることができる小さい分子をデザインすることができる。そのような小さい有機分子は、前記のある酵素の機能の阻害物質候補となりうる。  
【０３０８】
本願発明は、核酸、ペプチド、ポリペプチド、小さい有機分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、RNAi作成物、抗体、および阻害物質として機能するリボザイムベースの作用物質を含む、阻害物質として作用する多数の作用物質を意図する。そのような作用物質は、それらの標的によって、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を促進してもよく、またはそのような作用物質はネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または作用を阻害してもよい。  
【０３０９】
阻害物質として機能し、ネトリンを促進または阻害する作用物質は、本願発明のin vitroまたはin vivoの方法における方法のいずれにも用いることができる。理論に制限されることなく、本願発明の方法で使用するための阻害物質は、数多くの方法のいずれかにおいて機能することもできる。ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害する（たとえばネトリンのプロ血管新生、プロ誘引性活性を阻害する）例示的な作用物質には、以下が含まれてよい：(i)Unc5hポリペプチド、(ii)Unc5h核酸、(iii)Unc5hの修飾または生物活性断片、(iv)Unc5h細胞外ドメイン、(v)ネオゲニンに結合して活性を阻害する、抗ネオゲニン抗体（たとえば、ブロッキング抗体）、(vi)ネオゲニンに結合して活性を阻害する、ネオゲニンアンチセンスオリゴヌクレオチド、(vii)ネオゲニンに結合して活性を阻害する、ネオゲニンRNAi構造体、(viii)ネオゲニンに結合して活性を阻害する、ネオゲニンリボザイム、(ix)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性および発現を阻害する、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性または発現を阻害する小分子、(x)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を阻害するためにネオゲニンに結合する小分子、(xi)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を阻害するためにネトリンに結合する小分子、である。ネトリンシグナル伝達の阻害物質の機能をアンタゴナイズすることによって、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を促進する（たとえばネトリンのプロ血管新生、プロ誘引性活性を阻害する）例示的な作用物質には、以下が含まれてよい：(i)Unc5hに結合して活性を阻害する、抗Unc5h抗体（たとえばブロッキング抗体）、(ii)Unc5hに結合して活性を阻害する、Unc5hアンチセンスオリゴヌクレオチド、(iii)Unc5hに結合して活性を阻害する、Unc5h RNAi作成物、(iv)Unc5hに結合して活性を阻害する、Unc5hリボザイム、(v)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性または発現を促進する小分子、(vi)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を促進するためにネトリンに結合する小分子、(vii)ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を促進するためにネオゲニンに結合する小分子、(viii)Unc5hに結合して阻害し、ネトリン活性を促進する、小分子、である。  
【０３１０】
本願方法に用いるための作用物質のさらなる具体的な例を提供するために、本願発明は以下を意図する。ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害する例示的な作用物質には、以下が含まれる。(i) 配列番号14、16、18、20、22、24、またはその生物活性断片に表されるアミノ酸のすべてまたは一部分と少なくとも80%、85%、90%、95%、97%、98%、99%または100%同一のアミノ酸配列を含むUnc5hポリペプチド、(ii) 配列番号13、15、17、19、21、または23のいずれかと、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる核酸配列を含むUnc5h核酸、(iii) Unc5hの修飾または生物活性断片、(iv) Unc5h細胞外ドメイン、(v) ネオゲニンに結合して活性を阻害する抗ネオゲニン抗体（たとえばブロッキング抗体）（たとえば配列番号26、または28のいずれかのすべてまたは一部分と免疫反応性の抗体）、(vi) ネオゲニンに結合して活性を阻害するネオゲニンアンチセンスオリゴヌクレオチド（たとえば、配列番号25または27に表されるネオゲニン核酸の一部分に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする）、(vii) ネオゲニンに結合してその活性を阻害するネオゲニンRNAi作成物（たとえば、配列番号25または27に表されるネオゲニン核酸の一部分に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする）、(viii) ネオゲニンに結合してその活性を阻害するネオゲニンリボザイム（たとえば、配列番号25または27に表されるネオゲニン核酸の一部分に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする）、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性または発現を阻害する小分子、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を阻害するためにネオゲニンに結合する小分子、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を阻害するためにネトリンに結合する小分子、である。ネトリンシグナル伝達の阻害物質の機能をアンタゴナイズすることによってネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を促進する例示的な作用物質には、以下が含まれてよい：(i) Unc5hに結合して活性を阻害する抗Unc5h抗体（たとえばブロッキング抗体）（たとえば配列番号14、16、18、20、22、24のいずれかのすべてまたは一部分と免疫反応性の抗体）、(ii) Unc5hに結合して活性を阻害するUnc5hアンチセンスオリゴヌクレオチド（たとえば、配列番号13または15、17、19、21、23に表されるUnc5h核酸配列の一部分に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする）、(iii) Unc5hに結合して活性を阻害するUnc5h RNAi作成物（たとえば、配列番号13、15、17、19、21、23に表されるUnc5h核酸配列の一部分に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする）、(iii) Unc5hに結合して活性を阻害するUnc5h リボザイム（たとえば、配列番号13、15、17、19、21、23に表されるUnc5h核酸配列の一部分に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする）、(v) ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性または発現を促進する小分子、(vi) ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を促進するためにネトリンに結合する小分子、(vii) ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を促進するためにネオゲニンに結合する小分子、(viii) Unc5hに結合して阻害し、ネトリン活性を促進する、小分子、である。   
【０３１１】
(iv)  例示的な発現方法
本願明細書に記載のシステムおよび方法は、少なくとも1つの転写制御配列に動作的に連結するポリペプチドをコードする核酸を含有する発現ベクタも提供する。本願発明の方法に用いるためのポリペプチドをコードする例示的な核酸には、ネトリン関連ポリペプチド、ネトリン関連ポリペプチドの生物活性断片をコードする核酸、Unc5hレセプタをコードする核酸、およびUnc5hレセプタ細胞外ドメインをコードする核酸が、それらに限定されずに含まれる。したがって、本願発明は、ポリペプチド、修飾ポリペプチド、またはその断片の輸送とともに、ポリペプチドまたはその生物活性断片をコードする核酸配列の輸送を意図する。本願発明は、核酸配列を含む組成物の輸送、またはポリペプチドを含む組成物の輸送を用いて、in vivoまたはin vitroにおける心筋細胞種の増殖、遊走、接着、または分化に影響を与えることができる。さらに、本願発明は、核酸配列を含む組成物の輸送、またはポリペプチドを含む組成物の輸送を用いて、血管新生、幹細胞増殖および／または遊走などに影響を与える（たとえば促進または阻害する）ことができる。つまり、本願明細書に記載の方法および処置方法には、ポリペプチド組成物および薬学的組成物の輸送、および核酸組成物の輸送が含まれる。 
【０３１２】
制御配列は当業に認識されており、対象となるタンパク質の発現を方向付けるように選択される。したがって、転写制御配列という用語には、プロモータ、エンハンサ、およびその他の発現制御要素が含まれる。そのような制御配列は、Goeddel; Gene Expression Technology:Methods
in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)に記載されている。たとえば、広範囲の発現制御配列のいずれかをこれらのベクタに用いて、本願発明の作用物質をコードする核酸配列を発現させてもよい。そのような有用な発現制御配列には、たとえば、モロニーマウス白血病ウイルスのLTR、単純ヘルペスウイルス1のLTR、SV40の早期および後期プロモータ、アデノウイルスまたはサイトメガロウイルスの最初期プロモータ、lac システム、trpシステム、TACまたはTRCシステム、発現がT7 RNAポリメラーゼによって方向付けられたT7プロモータ、ファージλの腫瘍オペレータおよびプロモータ領域、fdコートタンパク質の制御領域、3-ホスホグリセリン酸キナーゼまたはその他の糖分解酵素のプロモータ、酸性ホスファターゼのプロモータ、酵母α接合型因子のプロモータ、バキュロウイルスシステムおよび原核もしくは真核細胞またはそのウイルスの遺伝子の発現を制御することで知られるその他の配列のポリへドロンプロモータ、およびそれらの各種組み合わせが含まれる。 前記発現ベクターのデザインは、形質転換される宿主細胞の選択条件、および／または発現が望ましいタンパク質のタイプなどの因子に依存してよいと理解されなければならない。さらに、そのベクタのコピー数、そのコピー数の制御能力、およびたとえば抗生物質マーカなど、前記ベクタによってコードされたその他のタンパク質のいずれかの発現も考慮されなければならない。
【０３１３】
さらに、前記遺伝子作成物を用いて、前記の対象ポリペプチドをコードする核酸を輸送することができる。したがって、本願発明の別の局面は、in vivoまたはin vitroにおけるトランスフェクション、ウイルス感染、およびある細胞種における対象ポリペプチドの発現のための発現ベクタを特徴とする。ある実施態様では、そのような組換え的に産生されたポリペプチドは、本願明細書に記載の標準技術、および当業に公知のその他の方法論を用いて修飾することができる。
【０３１４】
前記対象作用物質の発現作成物は、たとえば、in vivoまたはin vitroにおいて、組換え遺伝子を細胞へ効率的に輸送する能力がある製剤または組成物のいずれかなど、生物学的に有効な担体に入れて投与してもよい。アプローチには、組換えレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、単純ヘルペスウイルス1、レンチウイルス、哺乳類バキュロウイルスもしくは組換えバクテリア、または真核プラスミドを含む、ウイルスベクタの対象遺伝子の挿入が含まれる。ウイルスベクタは細胞に直接トランスフェクトし、プラスミドDNAは、たとえば陽性リポソーム（リポフェクチン）または誘導体（たとえば複合体化した抗体）、ポリリシン複合体、グラマシジンS、人工ウイルスエンベロープ、またはその他のそのような細胞内担体を用いて、および前記遺伝子作成物の直接注入、電気穿孔、またはCaPO4沈殿によって輸送することができる。当業者は、ある細胞種における、またはある条件下における発現を最適化するために、入手可能なベクタおよび輸送方法を、容易に選択することができる。   
【０３１５】
レトロウイルスベクタおよびアデノ関連ウイルスベクタは、細胞外遺伝子の移動のために用いられることが多い。これらのベクタは、遺伝子の細胞への効率的な輸送を提供し、移動させた核酸は前記宿主の染色体DNAに安定に組み込まれる。レトロウイルスを用いるための主な必要条件は、その使用の安全性の確保、特に細胞群の中に野生種のウイルスが広がる可能性に関する安全性の確保である。複製欠損レトロウイルスだけを産生する特化された細胞株の開発（「パッケージング細胞」と命名）により、レトロウイルスの遺伝子治療への有用性が高まり、欠損レトロウイルスは遺伝子治療目的の遺伝子転移に用いるためによく特徴付けされている。したがって、組換えレトロウイルスは、レトロウイルスコード配列（gag, pol, env）の一部を、前記レトロウイルスの複製を欠陥とする当該タンパク質の一つをコードする核酸で置き換えて作製することができる。その後、標的細胞に感染させるために用いることができる標準技術によって、前記複製欠陥レトロウイルスを、ヘルパーウイルスを使用してビリオンにパッケージする。組換えレトロウイルスを産生するプロトコルと、in vitroまたはin vivoにおいてそのようなウイルスに細胞を感染させるプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al.(eds.)Greene Publishing
Associates, (2000)およびその他の標準研究室マニュアルに見つけることができる。好適なレトロウイルスの例には、当業に知られるpBPSTR1、pLJ、pZIP、pWE およびpEMが含まれる。同種指向性および両種性のレトロウイルスシステムを両方調製するのに好適なパッケージングウイルス株の例には、ψCrip、ψCre、ψ2、ψAm、およびPA317が含まれる。 
【０３１６】
さらに、レトロウイルスとそれに続くレトロウイルスベースのベクタの感染スペクトラムを、ウイルス粒子の表面上のタンパク質を修飾することによって制限することができることが示されている。たとえば、レトロウイルスベクタの感染スペクトラムの修飾のための戦略は、細胞表面抗原に特異的な抗体をウイルスenvタンパク質に結合させるか、または細胞表面レセプタリガンドをウイルスenvタンパク質に結合させるステップが含まれる。結合は、タンパク質またはその他の種類との化学的な架橋の形状であってよく（たとえば前記env タンパク質をアシアロ糖タンパク質に転換させるラクトースなど）、および融合タンパク質を作製することによってもよい。この技術は、特定の組織種への感染を制限するか、そうでなければ方向付けるのに有用である一方で、同種指向性ベクタを両種性に転換するのに用いることもできる。
【０３１７】
さらに、レトロウイルス遺伝子輸送を使用すると、テトラシクリン抑制または活性などのレトロウイルスベクタの遺伝子の発現を制御する、組織または細胞特異的転写制御配列の使用によって、さらに強化することができる。
【０３１８】
利用されている別のウイルス遺伝子輸送システムは、アデノウイルス由来のベクタを使用している。アデノウイルスのゲノムを、目的の遺伝子産生物をコードおよび発現するが正常の細胞溶解性ウイルスのライフサイクルにおける複製の能力を不活化するように、操作することができる。アデノウイルス株Ad type 5 dl324 またはその他のアデノウイルス株（たとえばAd2、Ad3、Ad7など）に由来する好適なアデノウイルスベクタが、当業に知られている。組換えアデノウイルスは、気道上皮、内皮細胞、幹細胞、および筋細胞を含む広範囲の細胞種に感染させるために用いることができる特定の環境下において有利なことがある。さらに、前記ウイルス粒子は比較的安定で、精製および濃縮に影響されやすく、上述のとおり、伝染力のスペクトルに作用するように修飾することができる。  
【０３１９】
さらに別のウイルスベクタシステムは、アデノ関連ウイルス（AAV）である。アデノ関連ウイルスは、天然に存在する欠陥ウイルスで、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどの別のウイルスを効率的な複製および産生的なライフサイクルのヘルパーウイルスとして必要とする。（総説はMuzyczka et al. Curr. Topics in Micro. and
Immunol.(1992) 158:97-129を参照）。さらに、それはDNAを分割していない細胞に組み込むこともできる数種類のウイルスの1つで、安定な組み込みを頻回行うことができる。 
【０３２０】
別のウイルス輸送システムは単純ヘルペス1（HSV-1）を用いる。HSV-1ベースのベクタは、神経細胞などの分裂後細胞を含む各種細胞に感染することが示されている（Agudo et al. (2002) Human
Gene Therapy 13: 665-674; 
Latchman (2001) Neuroscientist 7: 528-537; Goss et al.
(2002) Diabetes 51: 2227-2232; Glorioso (2002) Current Opin
Drug Discov Devel 5: 289-295; Evans (2002) Clin Infect Dis 35:
597-605; Whitley (2002) Journal of Clinical Invest 110: 145-151;
Lilley (2001) Curr Gene Ther 1: 339-359）。  
【０３２１】
ウイルスベクタの上述の例は、決して包括的ではない。しかし、それらは当業者が公知のウイルスベクタから選択することができ、ある細胞種のあるタンパク質を発現させるための好適なベクタを選択することができるということを示すために提供されている。  
【０３２２】
上に説明したようなウイルス転移法に加えて、対象のポリペプチドを発現させるために非ウイルス性の方法を用いることができる。数多くの遺伝子転移の非ウイルス性の方法は、高分子の取り込みおよび細胞内輸送のための細胞に用いられる、正常なメカニズムに依存している。この種の例示的な遺伝子輸送システムには、リポソーム由来のシステム、ポリリシン複合体、および人工ウイルスエンベロープが含まれる。
【０３２３】
たとえば培養液中の細胞または動物体内の細胞など、細胞に直接核酸を導入することが望ましい場合もある。そのような投与は、核酸（たとえばDNA、RNAなど）を直接望ましい部位に注入することによって行うことができる。そのような方法は、ワクチンの分野、特に「DNAワクチン」の投与の分野で一般に使用されており、濃縮DNAが含まれる（米国特許第6,281,005号）。
【０３２４】
核酸の投与に加えて、本願明細書に記載のシステムおよび方法は、ポリペプチドを直接投与してもよいことを意図する。一部のタンパク質、たとえば成長因子など、細胞に接触させることによって細胞外で作用する因子などは、単純に前記タンパク質を細胞に接触させることによって投与することができる。たとえば、細胞の培養は、典型的にはFGF、TGFβ、インスリンなどの多数のタンパク質を添加した培地で行う。これらのタンパク質は、単純に細胞に接触させることによって、その細胞に作用を及ぼす。  
【０３２５】
別の実施態様では、ポリペプチドを細胞に直接導入する。ポリペプチドを細胞に直接導入する方法には、タンパク質形質導入およびタンパク質療法が、それらに限定されずに含まれる。たとえば、タンパク質形質導入ドメイン（PTD）をある作用物質をコードする核酸に融合することができ、その融合タンパク質が発現したら精製する。PTDを含有する融合タンパク質は細胞膜を透過することができるので、細胞を直接融合タンパク質と接触させることができる
（Derossi et al. (1994) Journal of Biological Chemistry 269:
10444-10450; Han et al. (2000) Molecules and Cells 6: 728-732; Hall et al. (1996) Current Biology 6: 580-587; Theodore et al. (1995) Journal
of Neuroscience 15: 7158-7167））。
【０３２６】
タンパク質形質導入を用いたいくつかの方法は、前記タンパク質を細胞に導入するのを媒介する配列への目的のポリペプチド融合に依存しているが、その他のタンパク質形質導入法には、目的のタンパク質を形質導入ドメインに共有結合させる必要はない。タンパク質の共有結合的修飾を必要としないタンパク質形質導入を媒介する市販の試薬は、少なくとも2種類ある(ChariotTM、Active Motif社製、www.activemotif.com、およびBioporter（登録商標） Protein Delivery Reagent、Gene Therapy
Systems社製、www.genetherapysystems.com)。  
【０３２７】
簡単に説明すると、これらのタンパク質形質導入試薬を用いて、タンパク質、ペプチド、および抗体を哺乳類細胞を含む細胞に直接輸送することができる。細胞へのタンパク質の直接輸送には、たくさんの利点がある。第1に、最近の遺伝子輸送技術の多くは、前記タンパク質が発現する前に細胞によって転写および／または翻訳されなければならない核酸配列の輸送を利用している。これにより、核酸の輸送とタンパク質の発現の間に時間差が生じる。タンパク質の直接輸送であれば、この遅延が減少する。第2に、タンパク質の輸送によって、細胞中に前記タンパク質が一時的に発現することがよくある。
【０３２８】
本願明細書に概説の通り、PTDのタンパク質への共有結合によって媒介されるタンパク質形質導入を用いて、タンパク質を細胞へ輸送することができる。これらの方法には、別個のタンパク質にPTD部分を共有的に付加する必要がある。反対に、ChariotTMおよびBioporter（登録商標）などの方法は、前記試薬と前記タンパク質の間の被共有結合的相互作用を形成することによって、形質導入が容易となる。理論に制限されることなく、これらの試薬は前記細胞膜の通過を容易にすると考えられ、細胞に内在化してから、前記試薬とタンパク質の複合体が解離して、前記タンパク質は遊離して前記細胞中で機能する。   
【０３２９】
別の局面では、本願明細書にはポリペプチド、修飾ポリペプチド、または生物活性断片である組成物が含まれる。本願発明の組換えポリペプチドには、ネトリンポリペプチド（配列番号2、4、6、8、10、12、38、40、42、または44）、およびネトリンポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持するその生物活性断片が、それらに限定されずに含まれる。本願発明のさらなる組換えポリペプチドには、Unc5hポリペプチドおよび細胞外領域（配列番号14、配列番号16、配列番号18、配列番号20、配列番号22、配列番号24）、またはその生物活性断片が、それらに限定されずに含まれる。本願発明はさらに、前記未変性タンパク質の生物学的機能を保持するようなタンパク質の変異体の使用を意図する。例示的な変異体は、上述の配列またはその生物活性断片のいずれかと、少なくとも60%同一であって、より好ましくは70%同一であって、および最も好ましくは80%同一である。さらなる好ましい実施態様には、上述の配列またはその生物活性断片のいずれかのアミノ酸配列と、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、または99%同一なアミノ酸配列を含む組換えポリペプチドが含まれる。     
【０３３０】
本出願は、当該ポリペプチドを産生するための方法も説明する。たとえば、当該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の発現を方向付けた核酸ベクタをトランスフェクトした宿主細胞は、ペプチドの発現が生じる適切な条件下において培養することができる。前記ポリペプチドは、細胞と組換えポリペプチドを含有する培地の混合物から分泌され、分離してもよい。代替的には、前記ペプチドは細胞質内で発現させてよく、前記細胞を収集、溶解して、前記タンパク質を分離してよい。細胞培養物には、宿主細胞、培地、およびその他の副産物が含まれる。細胞培養に好適な培地は、当業に公知である。前記組換えポリペプチドは、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から、イオン交換クロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィ、超ろ過、電気泳動法、およびそのようなペプチドに特異的な抗体を用いた免疫親和性精製法を含む、当業に公知のタンパク質精製の技術を用いて分離することができる。ある例では、前記組換えポリペプチドは、GST融合タンパク質などの、精製を容易にするドメインを含有する融合タンパク質である。別の例では、当該組換えタンパク質には、免疫検出、および精製などを容易にする1つ以上のさらなるドメインが含まれてよい。例示的なドメインには、HA、FLAG、GST、およびHisなどが含まれる。さらなる例示的なドメインには、細胞によるタンパク質の取り込みを容易にするタンパク質形質導入ドメイン（PTD）が含まれる。組換え的に発現させたタンパク質は、本願明細書に記載の方法、および当業に公知の方法を用いて修飾することができる。
【０３３１】
本出願は、当該ポリペプチドの組換え型を発現する宿主細胞も説明する。前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であってよい。したがって、完全長タンパク質の全体または選択された部分（拮抗する部分、または生物活性断片）をコードするタンパク質のクローニングから誘導されたヌクレオチド配列を用いて、最近または真核細胞プロセスを経てポリペプチドの組換え型を産生することができる。前記ポリヌクレオチド配列を発現ベクタなどの遺伝子作成物にライゲートするステップ、および真核細胞（酵母菌、トリ、昆虫、または哺乳類）または原核細胞（細菌細胞）のいずれかの宿主に形質転換または形質移入するステップは、たとえばインスリン、インターフェロン、ヒト成長ホルモン、IL-1、およびIL-2など、公知のその他のタンパク質を産生する際に用いられる標準的な手順である。同様の手順、またはその修飾を利用して、本願発明にしたがった微生物的な手段または組織-培養技術によって組換えポリペプチドを調製することができる。そのような方法を用いて、当該核酸の全体または一部分を含む、実験的に有用なタンパク質を産生する。たとえば、そのような方法を用いて、精製または免疫検出を容易にするドメインを含む融合タンパク質を産生し、タンパク質の組換え突然変異型を産生する。  
【０３３２】
前記組換え遺伝子は、タンパク質をコードする核酸、またはその部分を原核細胞、真核細胞、または両方のいずれかで発現させるのに好適なベクタにライゲートさせることによって産生することができる。当該ポリペプチドの組換え型の産生のための発現ベクタには、プラスミドおよびその他のベクタが含まれる。たとえば、前記ポリペプチドの発現に好適なベクタには、大腸菌など原核細胞に発現させるためのpBR322由来プラスミド、pEMBL由来プラスミド、pEX由来プラスミド、pGEX由来プラスミド、pTrc-His由来プラスミド、pBTac由来プラスミド および pUC由来プラスミドが含まれる。
【０３３３】
酵母菌における組換えタンパク質の発現用に、数多くのベクタがある。たとえば、YEP24、YIP5、YEP51、YEP52、pYES2、およびYRP17は、出芽酵母に遺伝子作成物を組み込むのに有用なクローニングおよび発現媒体である。  
【０３３４】
たくさんの哺乳類発現ベクタは、細菌中での前記ベクタの増殖を容易にするための原核性配列と、真核細胞中で発現する1つ以上の真核性転写ユニットの両方を含有する。pcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRc/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2-dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo、pBacMam-2、およびHyg由来ベクタは、真核細胞の形質移入に好適な哺乳類発現ベクタの例である。これらのベクタの一部は、原核細胞および真核細胞の両方における複製および薬剤耐性選択を容易にするために、pBR322などの細菌性プラスミドに由来する配列で修飾する。原核細胞および真核細胞の両方に好適なその他の発現システム、および一般的な組換え法は、Molecular Cloning A Laboratory Manual,
3rd Ed., ed. by Sambrook and Russell (Cold Spring Harbor Laboratory Press:2001)を参照のこと。
【０３３５】
ある場合には、バキュロウイルス発現システムの使用による組換えポリペプチドを発現することが望ましい場合がある。そのようなバキュロウイルス発現システムの例には、pVL由来ベクタ（pVL1392、pVL1393 およびpVL941など）、pAcUW由来ベクタ（pAcUW1など）、およびpBlueBac由来ベクタ（β-gal含有pBlueBac
IIIなど）が含まれる。
【０３３６】
本願発明は、他の細胞性または細胞外タンパク質から分離された、または実質的に遊離している、入手可能な分離ポリペプチドも作製する。「細胞性または細胞外タンパク質から実質的に遊離した」（本願明細書では「汚染タンパク質」ともいう）、または「実質的に純粋な、または精製された調製物」という文言は、20%未満（乾燥重量による）の汚染タンパク質、および好ましくは5%未満の汚染タンパク質を有する調製物を包含すると定義される。当該タンパク質の機能的な型は、本願明細書に記載の通り、クローニングされた遺伝子を使用して精製された調製物として調製することができる。「精製された」は、ペプチドまたは核酸配列を意味する場合、指示された分子は、その他のタンパク質など、その他の生物学的高分子が実質的に欠如している状態であることを意味する。本願明細書に記載の「精製された」という用語は、存在する同一種の生物学的高分子の、好ましくは乾燥重量で80%、さらに好ましくは重量で95乃至99%の範囲内、最も好ましくは重量で少なくとも99.8%であること（ただし水とバッファは存在してよい）を意味する。本願明細書に記載の「純粋な」という用語は、好ましくは、直前に記載した「精製された」と同一の数値的限界を有する。「分離された」および「精製された」は、未変性な状態の天然物質、または成分（たとえばアクリルアミドゲル中など）に分離されているが純粋な（たとえば、汚染タンパク質、またはアクリルアミドまたはアガロースなどの変性物質およびポリマーなどのクロマトグラフィ試薬を含まない）物質または溶液のいずれかとしては得られない天然物質のいずれも包含しない。 
【０３３７】
タンパク質の分離されたペプチジル部分は、そのようなペプチドをコードする核酸の相当する断片から組換え的に作製されたペプチドのスクリーニングによって得ることができる。さらに、断片は、従来のメリフィールド固相f-Mocまたはt-Boc化学などの当業者に知られる技術を用いて化学的に合成することができる。化学的に合成したタンパク質は、本願明細書に記載の方法、および当業に公知の方法を用いて修飾することができる。
【０３３８】
本願発明の組換えポリペプチドには、タンパク質分解的切断に耐性の種類のタンパク質も含まれる。 本願発明の変異体には、本物のタンパク質とは異なる形で転写後修飾されたタンパク質も含まれる。当該ポリペプチドの構造の修飾は、治療的または予防的有効性または安定性を（たとえば、ex vivoにおける保存期間、およびin vivoにおけるタンパク質分解性変性への耐性など）増強する目的であってよい。そのような修飾ペプチドは、前記タンパク質の天然型の少なくとも1つの活性を保持するようにデザインされた場合、本願明細書にさらなる詳細が記載されるポリペプチドと機能的に等価な物も考慮される。そのような修飾ペプチドは、たとえばアミノ酸置換、欠失、または付加によってつくることができる。
【０３３９】
たとえば、ある場合、ロイシンをイソロイシンまたはバリンと、アスパラギン酸基をグルタミン酸基と、テオニンをセリンと、それぞれ置換するか、またはアミノ酸を構造的に関連したアミノ酸と同様に置換することは、得られた分子の生物学的活性に大きく影響しないこともある。保護的置換は、アミノ酸の側鎖に関連するアミノ酸のファミリの中で生じるものである。遺伝子的にコードされたアミノ酸は4つのファミリに分割することができる。(1) 酸性＝アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、(2) 塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、(3) 非極性＝アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン、および(4) 非荷電極性＝グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシン、である。フェニルアラニン、トリプトファン、よびチロシンは、まとめて芳香族アミノ酸として分類されることもある。同様に、アミノ酸のレパートリは、(1) 酸性＝アスパラギン酸塩、グルタミン酸塩、(2) 塩基性＝リシン、アルギニン、ヒスチジン、(3) 脂肪族＝グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、ただし任意にセリンとスレオニンを脂肪族ヒドロキシルとして分類してもよい、(4)芳香族＝フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、(5) アミド＝アスパラギン、グルタミン、(6) 硫黄含有＝システインおよびメチオニン、と分類することもできる。（たとえば、, Biochemistry, 5th ed. by
Berg, Tymoczko and Stryer, WH Freeman and Co.:2002参照）。ペプチドのアミン酸配列中の変化によって機能的な変異が生じるかどうかは、前記変異ペプチドが細胞中に野生種タンパク質に類似するような反応を生じるか、または競合的にそのような反応を阻害する能力を評価することによって決定できる。2ヶ所以上を置換するポリペプチドは、同様に容易に試験することができる。  
【０３４０】
コンビナトリアル化学およびコンビナトリアル変異誘発の分野における進歩は、ポリペプチド変異体の作製を容易にした(Wissmanm et al. (1991) Genetics 128:
225-232; Graham et al. (1993) Biochemistry 32: 6250-6258; York et
al. (1991) Journal of Biological Chemistry 266: 8495-8500;
Reidhaar-Olson et al. (1988) Science 241: 53-57)。ポリペプチド変異体を試験するための1つ以上のアッセイでは、ある変異体が、相当する未変性ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持するかどうかを評価することができる。  
【０３４１】
さらに説明するために、本願発明はコンビナトリアル変異体および切断変異体のセットを作製する方法を意図し、特に、未変性ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する可能な変異配列を同定するために有用である。ある実施態様では、前記未変性ポリペプチドはネトリンポリペプチドである。そのようなコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする目的は、たとえば新規の変異体を作製するためである。  
【０３４２】
この方法のある局面は、あるポリペプチド群（たとえばネトリンポリペプチド）のアミノ酸配列を整列させて、好ましくはできる限り高い相同性を推進する。縮重したコンビナトリアル配列のセットをつくるために、整列させた配列の各位置に現れるアミノ酸を選択する。ある例では、変異体のまだら入りライブラリを、コンビナトリアル変異誘導によって核酸レベルで作製し、まだら入り遺伝子ライブラリによってコードする。たとえば、合成オリゴヌクレオチドの混合物は、見込みのある縮重した配列のセットが個別のポリペプチドとして発現可能となるように、または代替的にその配列のセットを含有する大きい融合タンパク質のセット（たとえばファージディスプレイ用など）として、酵素的に遺伝子配列にライゲートすることができる。
【０３４３】
見込みのある変異体のライブラリは、各種の方法を用いて、縮重オリゴヌクレオチド配列から作製することができる。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動化DNA合成器で行うことができ、その合成遺伝子を適切な発現ベクタにライゲートすることができる。縮重した遺伝子のセットのある目的は、1つの混合物中に、見込みのある変異配列の望ましいセットをコードするすべての配列を提供することである。縮重オリゴヌクレオチドの合成は当業に知られている。
【０３４４】
点突然変異によって作製したコンビナトリアルライブラリの遺伝子作成物のスクリーニングのための、およびある特性を有する遺伝子作成物のcDNAライブラリのスクリーニングのための、さまざまな技術が知られている。そのような技術は一般に、関連ポリペプチドのコンビナトリアル変異誘導によって作製された遺伝子ライブラリの迅速スクリーニングに適用できるだろう。このような技術は、その他の遺伝子ライブラリの迅速スクリーニングにも適用可能である。大規模な遺伝子ライブラリのスクリーニングに用いる技術の1つの例には、複製可能な発現ベクタへの前記遺伝子ライブラリのクローニング、得られたベクタのライブラリでの適切な細胞の形質転換、および望ましい活性の検出がその作成物が検出される前記遺伝子をコードするベクタの比較的容易な分離を促進する条件下でのコンビナトリアル遺伝子の発現が含まれる。
【０３４５】
(v)  スクリーニングの方法
本出願は、血管新生を促進し、平滑筋細胞および内皮細胞の増殖、遊走、および／または接着を促進し、各種の症状を処置するための方法および組成物を説明する。さらに、本願発明は、血管新生を阻害し、平滑筋細胞および内皮細胞の増殖、遊走、および／または接着を阻害し、各種の症状を処置するための方法および組成物を提供する。本願発明のある局面は、ネトリン関連ポリペプチド、またはネトリンもしくはネトリンシグナル伝達の発現もしくは活性を促進する作用物質を含む組成物に関連する。本願発明の別の局面は、またはネトリンもしくはネトリンシグナル伝達の発現もしくは活性を阻害する作用物質を含む組成物に関連する。  
【０３４６】
そのようなポリペプチドおよび作用物質には修飾ポリペプチドおよび作用物質が含まれる。本願発明に用いるための修飾ポリペプチドおよび作用物質は、未変性ポリペプチドまたは作用物質の生物学的活性を1つ以上保持し、未変性および／または非修飾ポリペプチドまたは作用物質と比較して有利な生理化学的特性も1つ以上有してよい。ネトリンポリペプチド、またはネトリンポリペプチドもしくはネトリンシグナル伝達の発現または活性を促進する作用物質の例示的な生物学的活性には、(i) ネトリンレセプタと結合する、(ii)軸索の誘引を促進する、(iii)血管新生を促進する、(iv)細胞遊走を促進する、(v)細胞接着を促進する、(vi)細胞増殖を促進する、が含まれる。ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害する作用物質の例示的な生物学的活性には、(i) 軸索の誘引を阻害する、(ii)血管新生を阻害する、(iii)細胞遊走を阻害する、(iv)細胞接着を阻害する、(v)細胞増殖を阻害する(vi)軸索の反発を促進する、(vii)遊走細胞の反発を促進する、が含まれる。 
【０３４７】
心筋系の多様な症状とともに血管新生を調節することによって処置できるその他の多様な症状を処置するための高度な方法および組成物を提供する重要性の観点から、ならびに、ある修飾ポリペプチドが未変性または非修飾ポリペプチドの機能的活性を保持するが有利な生理化学的特性を1つ以上有するという発見の観点から、本願発明はさらに、本願発明の方法に用いる修飾ポリペプチドを同定、特徴付け、および／または最適化するスクリーニングの方法を提供する。本願発明の方法によって同定される、特徴付けされる、および／または最適化される例示的な修飾ポリペプチドは、相当する未変性および／または非修飾ネトリンの以下の生物学的活性を1つ以上保持する。 
【０３４８】
たとえば、前記ポリペプチドがネトリンポリペプチド、またはネトリンポリペプチドもしくはネトリンシグナル伝達の発現または活性を促進する作用物質である場合、本願発明の方法に用いられる修飾ポリペプチドが保持する例示的な生物学的活性には、(i) ネトリンレセプタと結合する、(ii)軸索の誘引を促進する、(iii)血管新生を促進する、(iv)細胞遊走を促進する、(v)細胞接着を促進する、(vi)細胞増殖を促進する、が含まれる。前記ポリペプチドがネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害する作用物質である場合、本願発明の方法に用いられる修飾ポリペプチドが保持する例示的な生物学的活性には、(i) 軸索の誘引を阻害する、(ii)血管新生を阻害する、(iii)細胞遊走を阻害する、(iv)細胞接着を阻害する、(v)細胞増殖を阻害する(vi)軸索の反発を促進する、(vii)遊走細胞の反発を促進する、が含まれる。さらに、相当する未変性および／または非修飾ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する修飾ポリペプチドは、さらに相当する未変性および／または非修飾ポリペプチドと比較した1つ以上の有利な生理化学的活性を有する修飾ポリペプチドを同定するためにスクリーニングすることができる。 
【０３４９】
本願明細書に記載のスクリーニング方法を用いて、未変性または変異アミノ酸配列に付加された1つ以上の修飾を含むポリペプチドを同定することができる。本願発明は多数の修飾ポリペプチドのいずれもであって、当該修飾が前記ポリペプチドの親水性を上昇させる、修飾ポリペプチドのいずれもを意図する。例示的な修飾には、PEG含有部分が含まれる。さらに、例示的な修飾には、アルブミン部分、シクロデキストラン部分、抗体部分、またはそれらの組み合わせが含まれる。上述のいずれにおいても、本願発明の方法によって同定される、特徴付けされる、および／または最適化される好ましい修飾ポリペプチドは、相当する未変性および／または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持する。さらに、そのように同定された修飾ポリペプチドは、前記修飾ポリペプチドが未変性および／または非修飾ネトリンと比較して有利な生理化学的特性を1つ以上有するかどうかを決定するためにさらに調査することができる。  
【０３５０】
本願発明はさらに、多数の修飾ポリペプチドのいずれもであって、当該修飾が前記ポリペプチドの疎水性を上昇させる、修飾ポリペプチドのいずれもを意図する。例示的な修飾には、ステロール、脂肪酸、疎水性アミノ酸残基、および疎水性ペプチドが含まれる。上述のいずれにおいても、本願発明の方法によって同定される、特徴付けされる、および／または最適化される好ましい修飾ポリペプチドは、相当する未変性および／または非修飾ネトリンの生物学的活性を1つ以上保持する。さらに、そのように同定された修飾ポリペプチドは、前記修飾ポリペプチドが未変性および／または非修飾ネトリンと比較して有利な生理化学的特性を1つ以上有するかどうかを決定するためにさらに調査することができる。  
【０３５１】
さらに、本願発明は、親水性部分と疎水性部分の組み合わせを含有する多数の修飾ポリペプチドをいずれも意図する。本願発明のスクリーニング方法には、生物学的活性を保持する可能性のある修飾、または有利な生理化学的特性を付与する可能性のある部分に基づく偏向はない。したがって、本願発明のスクリーニング方法は、見込みのある修飾のいずれもを実質的に同定、特徴付け、および／または最適化する機会を提供する。 
【０３５２】
意図されるスクリーニング方法には、1つの候補修飾ポリペプチド、複数の修飾ポリペプチド、および修飾ポリペプチドのライブラリのスクリーニングが含まれる。核酸、ポリペプチド、化学化合物、および天然抽出物をテストする、数多くのスクリーニングプログラムにおいて、一定の時間内に調べる作用物質の数を増やすにはハイスループットアッセイが望ましい。無細胞システムにおいて行われる、精製または準精製タンパク質に由来してもよいアッセイは、テスト作用物質が媒介する分子標的中の変化の迅速な発達と比較的容易な検出のために作製することができる、「一次」スクリーンとして好まれることが多い。無細胞システムには、in vitroシステム（試験管、ペトリ皿などの中で混合するタンパク質および作用物質の調製）、および卵抽出物または網状赤血球ライセートから調製されるなどの無細胞システムが含まれる。さらに、テスト作用物質の細胞毒性および／またはバイオアベイラビリティの効果は、一般に、そのようなシステムでは無視されることがあるが、前記アッセイは主に前記作用物質の効果に注目することができる。したがって、本願発明の文脈では、多数の候補修飾ポリペプチドを無細胞アッセイでテストして、前記修飾ポリペプチドが相当する未変性ポリペプチドの生物学的活性を保持するかどうかを迅速にアッセイすることができる。ある例では、たとえばネトリンポリペプチドなどの修飾ポリペプチドを無細胞アッセイでテストして、そのレセプタまたはリガンドへの結合を測定することができる。  
【０３５３】
前記作用物質の有効性は、各種濃度の前記テスト作用物質を用いて得られたデータの用量反応曲線を作成して評価することができる。さらに、対照アッセイを行って、比較のためのベースラインを提供することもできる。そのような候補を、培養物中の細胞のある応答を促進または阻害する有効性について、さらにテストすることができる。以下にあげる例は、内皮細胞、平滑筋細胞、癌細胞株、および原発性癌組織サンプルを用いた、細胞ベースのアッセイを数多く提供し、そのような細胞ベースシステムはいずれも、修飾ポリペプチドが前記未変性ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持するかどうかを評価するための例示的システムを提供する。  
【０３５４】
前記の無細胞および細胞ベースアッセイは、相当する未変性および／または非修飾ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する修飾ポリペプチドを同定、特徴付け、および／または最適化するために、修飾ポリペプチドを迅速にスクリーニングするために用いることができる方法の例を提供する。さらに、相当する未変性および／または非修飾ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持する修飾ポリペプチドは、さらに、相当する未変性および／または非修飾ポリペプチドと比較した1つ以上の有利な生理化学的特性を有するかどうかを決定するためにテストすることができる。       
【０３５５】
さらに、本願発明者らは、スクリーニングの方法は野生種または突然変異動物のいずれかのin vivoにおいて行うことができることを指摘する。例示的な突然変異動物には、特定の癌の動物モデル（たとえばネトリンを発現する癌など）、心臓疾患の動物モデル、虚血症の動物モデル、脳梗塞の動物モデル、免疫欠損症の動物モデル、炎症の動物モデル、貧血症の動物モデルなどが含まれる。そのような動物は、ある突然変異についてホモ接合性またはヘミ接合性であってよい。例示的な野生種動物には、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、牧牛、および非ヒト霊長類などの非ヒト動物がそれらに限定されずに含まれる。
【０３５６】
修飾ポリペプチドを同定、特徴付け、および／または最適化するために用いる方法論にかかわらず、そのような修飾ポリペプチドはin vitroおよびin vivoにおけるさまざまな用途を有するだろう。たとえば、前記未変性ポリペプチドの生物学的活性を保持する修飾ポリペプチドは、in vitroおよびin vivoに使用するためのさらなる試薬を提供する。さらに、未変性および／または非修飾ポリペプチドの生物学的活性を1つ以上保持するある修飾ポリペプチドも、未変性および／または非修飾ポリペプチドと比較して有利な生理化学的特性を1つ以上有する。これらの修飾ポリペプチドは、特定の治療用または研究用に特によく向いていているかもしれない新種のポリペプチドである。したがって、本願発明はさらに、本願発明のスクリーニング方法で同定された修飾ポリペプチドの使用を意図する。同定されたポリペプチドを、単体で、または他の作用物質と組み合わせて用いてもよく、または薬物学的に許容の担体に入れて調合してもよい。前述のいずれものある実施態様では、前記修飾ポリペプチドは、未変性ネトリンポリペプチドの生物学的活性を1つ以上促進するために用いる、修飾ポリペプチド、またはその断片である。別の実施態様では、前記修飾ポリペプチドは、未変性ネトリンポリペプチドのまたはネトリンシグナル伝達の生物学的活性を1つ以上阻害するために用いる、修飾Unc5hポリペプチドである。別の実施態様では、前記修飾ポリペプチドは、未変性ネトリンポリペプチドのまたはネトリンシグナル伝達の生物学的活性を1つ以上阻害するために用いる、修飾Unc5h細胞外ドメインである。
【０３５７】
(vi)例示的な損傷および症状
本願発明の方法および組成物は、内皮細胞または平滑筋細胞の増殖、分化、接着、または遊走を調節することによって、完全にまたは部分的に処置することができる、広範囲の損傷および疾患のいずれかの処置を提供する。したがって、本願発明は虚血症、心筋梗塞、脳梗塞、閉塞性血管疾患（たとえば血管形成術後の再狭窄）、癌、創傷治癒、炎症、ニューロパシ、貧血および手術癒着の処置における使用を含む、広範囲の症状に幅広く適用することができる。さらに、本願発明は、幹細胞、特に初期血管細胞および内皮系統細胞をつくる幹細胞のふるまいを調節するのに、広く適用可能である。例示的な幹細胞には、造血幹細胞（HSC）が含まれる。  
【０３５８】
本出願全体に詳細に概説されるとおり、本願発明は本願発明のみの組成物、本願発明のその他の組成物との組み合わせ、または処置されるある症状に適切な多数のその他の因子または療法のいずれかとの組み合わせのいずれかの投与を意図する。複数の組成物を連続的にまたは同時に投与することもできる。
【０３５９】
特定の疾患または障害と関連して他に定義される以外には、「治療する」または「治療」は、(i)動物において疾患、障害、または症状の発症の予防であって、当該動物が前記疾患、障害、および／または症状の素因を有する可能性があるが、まだそれを有していると診断されていない、動物における予防、(ii)前記疾患、障害、または症状の阻害であって、すなわちその進展の停止、および／または(iii)前記疾患、障害、または症状の緩和であって、すなわち前記疾患、障害、および／または症状の回帰を引き起こすこと、を意味する。
【０３６０】
制限されない例として、本願発明者らは本願発明の方法および組成物を用いて処置できる例示的な症状の簡単な説明を提供する。  
【０３６１】
ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を上昇させることによって処置できる症状
本願発明の組成物（たとえばネトリン関連ポリペプチド）は、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を促進するために用いることができる。そのような組成物は、平滑筋細胞および内皮細胞の増殖、遊走、および接着を促進するために用いることができる。そのような組成物は血管新生を促進するためにも用いることができる。これらの活性の1つ以上を有する組成物は、たくさんの症状の予防および／または処置に有用である。例示的な症状を以下の表に説明する。    
【０３６２】
虚血症：虚血症は、組織への血流および／または酸素流が一定時間制限されることによって生じる。比較的短時間の血液および酸素の制限が、細胞および組織の損傷または死滅を生じる。そのような細胞損傷または死滅が、影響を受けた特定の臓器または臓器系の機能の低下を引き起こすことがある。  
【０３６３】
ある局面では、本願発明は血管新生を促進する方法および組成物を提供する。そのような組成物は、たくさんの虚血症症状のいずれかが引き起こした血液および酸素欠乏を低減させるために用いることができる。したがって、血管新生を促進する方法および組成物は、虚血症または虚血症症状の処置に用いることができる。例示的な虚血症症状を以下の表に説明する。
【０３６４】
心筋梗塞：心筋梗塞は長期にわたる虚血症のために生じる心筋細胞の死滅と定義される。細胞死は病理学的には凝固もしくは収縮帯壊死のいずれか、またはその両方として分類され、通常、壊死を介して進展するが、アポトーシスよりも低い程度で終わることもある。
【０３６５】
真菌性虚血症の発症後、細胞死はすぐにではなく有限な時間をかけて進展する（一部の動物モデルでは15分程度であるが、見積もりが大きすぎる可能性もある）。標準の巨視的または微視的検視によって心筋壊死が同定できるまで6時間かかる。危険な状態にあるすべての心筋細胞の完全な壊死には、虚血帯への付随的な血流の存在、持続性または間欠性冠動脈閉塞、および筋細胞の感受性によって、少なくとも4乃至6時間以上を要する。
【０３６６】
梗塞は通常、大きさによって微視的（巣状壊死）、小規模（左心室の<10%）、中規模（左心室も10%乃至30%）、または大規模（左心室の>30%）に分類され、さらに位置（前部、側部、下部、後部、もしくは中隔、または位置の組み合わせ）によっても分類される心筋壊死の病理学的な同定は、心外膜冠状動脈樹の形態学的変化または臨床歴を参照することなく行われる。
【０３６７】
病理学的文脈におけるMIという用語は、「急性、回復中、または回復した」という用語のあとに付くことがある。急性または進展性梗塞は、多形核白血球の存在によって特徴付けられる。梗塞の発症と死亡の間の時間は短く（たとえば6時間）、多形核白血球は最小限しか、または全く認められないことがある。単核細胞および線維芽細胞が存在し、多形核白血球が欠如していることが、回復中の梗塞の特徴である。回復した梗塞は、細胞浸潤のない瘢痕組織として現れる。回復した梗塞への全プロセスには、通常、5乃至6週間以上を要する。さらに、再灌流によって、収縮帯を有する筋細胞と大量に溢出した赤血球を生じることによって、壊死帯の肉眼的および微視的形態が変化する。
【０３６８】
梗塞は病理学的外見にしたがって、一時的に以下のように分類される：それは急性（6時間乃至7日間）、回復中（7乃至28日間）、回復（29日間以上）である。急性虚血性イベントの臨床およびECGのタイミングは、急性梗塞の病理学的タイミングとは同じとは限らない。たとえば、病理学的には梗塞が回復中フェーズにあっても、ECGにはまだST-T 変化の進展が認められていて、心トロポニンが上昇した状態である（梗塞が最近生じたことを示す）こともある。
【０３６９】
心筋壊死は、損傷した筋細胞によって循環に放出されたさまざまなタンパク質の血中への出現を引き起こし、それによって認識することができる。そのタンパク質には、ミオグロビン、心トロポニンTおよびI、クレアチンキナーゼ、乳酸デヒドロゲナーゼ、およびその他たくさんの種類がある。心筋梗塞は、心トロポニンおよびクレアチンキナーゼのMB画分（CK-MB）など、感受性のある特異的なバイオマーカの血中レベルが、急性虚血症の臨床設定において上昇する場合に診断される。これらのバイオマーカは心筋損傷を反映するが、そのメカニズムは示唆しない。したがって、虚血症の臨床エビデンスの欠如下における高値は、心筋炎など、心損傷のその他の原因の探索を促進するはずである。
【０３７０】
長期の虚血症の結果生じる心筋損傷の有無および量は、病理学的検査、血中の心筋タンパク質の測定、ECG（心電図）記録（ST-T波変化、Q波）、心筋灌流撮像法、心エコー検査、およびコントラスト寝室撮影法などの画像診断法を含む、多数のさまざまな手段によって評価することができる。これらの各技術では、勾配によって、最少量から少量の心筋壊死を大量の心筋壊死と区別することができる。一部の臨床医師は、心筋壊死を、あるバイオメーカのピーク値に基づいて、微視的、小規模、中規模、および大規模に分類する。心筋細胞損失を検出するために用いられるこれらの核技術の感度および特異性によって、この損失の量を測定し、一連の経時的なイベントが著しく異なることを認識する。本願発明者らは、心筋壊死という用語はその原因とは関係なく心筋細胞死のいずれもを意味することを指摘する。心筋梗塞は心筋壊死の原因の1つだが、その他の多くの症状が壊死を生じる。本願発明の方法および組成物を用いて血管新生を促進することができ、したがって虚血症によって生じた血液および酸素欠乏を減少させることができる。そのような方法は、心筋梗塞簿の心筋損傷を減少させるのに有用である。
【０３７１】
脳卒中：アメリカ国内では45秒に1人脳卒中にかかる。今年は約700,000人のアメリカ人が脳卒中にかかると予想されており、脳卒中はアメリカ国内でも世界中でも死亡および重篤で長期にわたる障害の主因である。
【０３７２】
脳卒中は心血管病の1種である。この病気は、脳に続く動脈および脳内の動脈に発症する。脳卒中は、脳に酸素と栄養を運ぶ血管が塞栓で遮断されるか破裂したときに生じる。発症すると、脳の領域で血液および酸素が欠乏し、これらの領域が死に始める。一般に神経の再生率が低いため、神経組織が損傷を受けるかまたは死滅すると、認識、運動、またはその他の神経学的技能が失われる。脳卒中または冠動脈イベントによって生じる損傷を減少させる1つの方法は、罹患部分への血流および酸素流の回復である。本願発明の方法および組成物はこの目的を達成し、脳卒中の効果的な処置を提供する。   
【０３７３】
脳卒中には2つの基本タイプがある。虚血性脳卒中は、塞栓が動脈を遮断することによって生じる。これは、最も一般的なタイプの脳卒中で、脳卒中全体の約88%を占める。出血性脳卒中は血管の破裂によって生じる。この2タイプの脳卒中は異なるメカニズムによって生じるが、それぞれ、脳全体または一部分への血液および酸素の欠乏を引き起こしうる。したがって、本願発明の方法および組成物は、虚血性または出血性脳卒中のいずれか、ならびに未知のまたは未同定の原因による脳卒中に有効な処置を提供する。
【０３７４】
広範囲な臨床および統計学的研究により、脳卒中のリスクを上げるいくつかの因子が同定された。これらのリスク因子の一部を修正して、脳卒中のリスクを下げることができる。したがって、本願発明の方法は、脳卒中の1つ以上のリスク因子をも解決するコンビナトリアルな治療法を意図する。これらのリスク因子の多くが他の冠動脈および心血管症状のリスクも上昇させるので、これらの因子のいずれかを減少させる方法を本願発明の方法の一部分として用いてもよいということを、本願発明者らは指摘する。
【０３７５】
以下の因子は脳卒中のリスクを上昇させる：
a.  高血圧（140/90 mmHg以上）は脳卒中の最も重要なリスク因子である。高血圧は特に症状が認められないことが多く、重症の心血管または冠状動脈イベントが発生するまで診断されないことが多い。
b.  喫煙（巻きタバコおよび刻みタバコなど）は、脳卒中の主要で予防可能なリスク因子である。タバコの煙に含まれるニコチンと一酸化炭素が血中酸素量を減少させる。さらに、これらの作用物質は、血管壁を損傷し、塞栓ができやすくなる。  
c.  糖尿病は、2回の空腹時血漿グルコース（血糖）測定値が126 mg/dL以上の場合と定義される。糖尿病は治療可能だが、それでも脳卒中のリスクを上昇させる。糖尿病患者の多くは、高血圧、高血中コレステロール、および過体重も呈する。これらの因子はそれぞれ、脳卒中のリスクをさらに上昇させる。
d.  頸部の頸動脈は脳に血液を供給する。アテローム性動脈硬化に起因する脂肪沈着物（動脈壁に蓄積するプラーク）によって狭められた頸動脈は、血栓によって遮断されることがある。頸動脈疾患は頸動脈狭窄ともよばれる。
e.  末梢動脈疾患は頸動脈疾患のリスクを上昇させ、脳卒中のリスクを上げる。末梢動脈疾患は、足や腕の筋肉へ血液を運ぶ血管の狭窄である。この病気は、動脈壁に蓄積されたプラークの脂肪蓄積物によって生じる。
f.  動脈細動は心拍障害で、脳卒中のリスクを上げる。心臓の上方室は効率的に鼓動するのではなく振動して、血液プールと塞栓を放出することがある。塞栓が壊れて血流中に入り、脳への動脈に詰まると、脳卒中が生じる。
g.  その他の心疾患が脳卒中のリスクを上昇させる。たとえば、冠動脈心疾患または心不全患者は、正常に働く心臓を有する人よりも脳卒中のリスクが高い。拡張型心筋症（心肥大）、心臓弁疾患および一部タイプの先天性の心臓欠陥も、脳卒中のリスクを上げる。
h.  一過性脳虚血発作（TIA）は、脳卒中様症状を生じるが損傷が長期に残らない「警告脳卒中」である。TIAを認識して処置すれば、主要な脳卒中のリスクを低減することができる。 
i.  特定の血液障害、特に高赤血球数を生じる障害は、脳卒中のリスクを上げることがある。高赤血球数は血液が濃くなり、塞栓が増えるので、脳卒中のリスクが上昇する。
j.  鎌状細胞貧血としても知られる鎌状細胞病は、主にアフリカ系アメリカ人が罹患する遺伝障害である。「鎌状」赤血球は、体組織および器官への酸素輸送能が低い。そのような赤血球は血管壁に付着しやすく、脳への動脈を遮断することがあり、脳卒中を引き起こす。
k.  血中総コレステロール高値（240 mg/dL 以上）は、心疾患および脳卒中の主要なリスク因子である。最近の研究では、LDL（悪玉）コレステロール高値（100
mg/dL超）およびトリグリセリド高値（血中脂肪が150 mg/dL 以上）であると、冠状動脈心疾患、虚血性脳卒中、または一過性脳虚血発作（TIA）を以前罹患した患者における脳卒中のリスクが上昇することがシメされている。HDL（善玉）コレステロールの低値（40 mg/dL未満）も脳卒中のリスクを上げることがある。
l.  運動不足、肥満、またはその両方によって、高血圧、高血中コレステロール、糖尿、心疾患、および脳卒中のリスクが上昇する可能性がある。
m.  アルコールの過剰摂取も脳卒中のリスクを上昇させる可能性がある。さらに、ある違法ドラッグも脳卒中のリスクを上昇させる可能性がある。そのようなドラッグには、コカイン、およびヘロインなどの静脈ドラッグが含まれる。  
【０３７６】
上述の脳卒中および心疾患のリスク因子は、各種の医薬品、ライフスタイルの改善、および非医学的療法で解決することができる。しかし、さらなる脳卒中および心血管疾患のリスク因子の多くは管理できない。これらには、加齢、性、および遺伝因子が含まれる。  
【０３７７】
創傷治癒：本願発明の方法および組成物を用いて、創傷治癒を促進することができる。理論に制限されることなく、創傷治癒のプロセスの重要な部分には、創傷部分の増殖および血管再生が関与する。本願発明の方法および組成物は、血管新生を促進し、さらに平滑筋および内皮細胞種の増殖を促進する。血管新生の促進を用いて、創傷部分の増殖および血管再生を促進し増加させることができる。したがって、本願発明の方法および組成物を用いて、創傷治癒を促進することができる。
【０３７８】
創傷は、火傷、切り傷、刺し傷、擦り傷、および鈍的外傷などが制限されずに含まれる、実質的にいずれの損傷のあとにも生じうる。さらに、創傷は組織が破壊、熱傷、中毒、切断、または裂かれる場合にはいつでも生じる可能性がある。たとえば、外科手術、放射線療法、化学療法、および装置の移植などの場合がある。例示的な装置には、歯科インプラント、ステント、カテーテル、ワイヤ、および補装具が、それらに限定されずに含まれる。本願発明の方法および組成物を用いて、創傷の位置または創傷が生じるメカニズムにかかわらず、いずれの創傷の治癒も促進することができる。  
【０３７９】
特定の外傷によって生じる創傷に加えて、慢性創傷は数多くの症状および病状に伴う重要な問題である。たとえば、慢性創傷（たとえば褥瘡）は、高齢者および寝たきりの患者がしばしば遭遇する問題で、外傷または病理的損傷によって生じる。慢性創傷の特徴には、従来のタイプの治療で治癒しない皮膚または下層組織の欠失が含まれる。慢性損傷のさらなる例には、糖尿病性潰瘍などの医学的な慢性症状、またはカテーテル部位感染症および大腸内視鏡検査患者、透析患者、長期の静脈内療法を受けている患者、もしくは長期の化学療法を受けている患者に関連するものである。  
【０３８０】
本願発明の方法および組成物は創傷治癒を促進する。この方法および組成物は、創傷が特定の症状（たとえば糖尿病または歯周病など）に起因する慢性創傷であるか、特定の外傷性損傷または単一の治療によって引き起こされる急性創傷であるかにかかわらず有用である。さらなる簡単な説明により、本願発明者らは、現段階でわかっている創傷治癒プロセスの要約を提供する。この要約は、創傷治癒に関する分野における広範囲な知識を説明するだけのために提供される。しかし、本願発明の方法および組成物の創傷治癒の促進における用途は、本願明細書に記載の通り、いずれの理論にも制限されない。
【０３８１】
治癒応答は、損傷の瞬間から始まり、損傷を受けてから最初の数日間は、その損傷への炎症応答によって特徴付けられることが多い。外科的または外傷性の損傷は、組織構造を破壊して出血を引き起こす。最初、血液が創傷欠陥をカバーし、前記損傷のコラーゲンがこの血液と接触すると、血小板の脱顆粒とハーゲマン因子の活性化が引き起こされる。これが、補体キニンを含む多数の生物学的増殖システムと凝固カスケードおよびプラスミン産生が始動する。これらが、初期の損傷シグナルを増殖させるように働き、創傷辺縁を結合させる凝血塊形成だけでなく、創傷部位において多数のマイトジェンおよび化学誘引物質の蓄積を引き起こす。
【０３８２】
キニンとプロスタグランジンの両方の産生により、創傷部分の血管拡張および証欠陥の透過性の上昇が引き起こされる。これが損傷部分に浮腫を生じ、損傷後初期に起きる疼痛と膨潤の原因となる。6時間以内に、循環免疫細胞が創傷に現れ始める。多形核白血球（PMN）が創傷部位に入る最初の血液白血球である。これは最初、損傷後すぐに損傷に現れ、次いでその数が徐々に増加して24乃至48時間経過後にピークとなる。その主な機能は、損傷中に創傷に入り込んだ細菌の貪食作用として現れる。損傷後の創傷におけるPMNの存在は、通常の創傷治癒が生じるには必須ではないようである。細菌汚染が生じていない場合、PMNが欠如しても治癒は正常に進む。感染がない場合、PMNは創傷では比較的短寿命で、その数は3日後に急激に減少する。
【０３８３】
創傷に入る次の細胞性の免疫要素は、マクロファージである。この細胞は、遊走と走化作用の組み合わせによって循環単球から誘導される。マクロファージは損傷後48乃至96時間いないに現れ、損傷後第3日目ごろにピークに達する。このマクロファージはPMNよりもはるかに長寿命で、治癒が完了するまで創傷に存続する。マクロファージの出現からいくらか遅れてTリンパ球が現れる。損傷後第5日目ごろに大量に現れて、損傷後第7日目ごろにその数がピークに達する。PMNとは対照的に、創傷のマクロファージおよびリンパ球の両方の存在および活性は、正常の治癒プロセスの進展に重要である。マクロファージは病理学的生物および組織片を貪食して消化する。さらに、マクロファージは、さらなる炎症細胞の補充を促してマクロファージの組織の汚染除去および創傷清拭を助ける、生物学的に活性な物質を数多く放出する。
【０３８４】
重要な感染症または汚染がない場合、炎症期は短く、創傷から失活した不必要な物質がきれいに消えた後、治癒の増殖期が始まる。増殖期は、創傷における顆粒組織の形成によって特徴付けられる。顆粒組織は、線維芽細胞および炎症生細胞を含む細胞要素と、コラーゲン、フィブロネクチンおよびヒアルロン酸のゆるい過剰な細胞マトリックスの中に埋め込まれている新しい毛細血管の組み合わせからなる。  
【０３８５】
線維芽細胞は最初、損傷後第3日目に創傷の中に大量に現れ、7日目ごろに数がピークに達する。創傷部位の線維芽細胞群の中での急速な拡大は、増殖と遊走の組み合わせによって生じる。線維芽細胞は、局所間葉細胞、特に血管外膜に関連するものに由来し、増殖するように誘導され、最初は血小板、次いでマクロファージとリンパ球が産生するサイトカインの組み合わせによって創傷に引き寄せられる。線維芽細胞は修復過程の主な合成要素で、組織再生中に用いられる構造タンパク質の大半の産生に関与する。特に、線維芽細胞は3本鎖糖タンパク質ファミリのコラーゲンを大量に産生する。これは細胞外創傷マトリックスの主成分をつくり、最終的に傷への抗張力の付与に関与する。  
【０３８６】
コラーゲンは損傷後第3日目ごろ最初に創傷で検出され、その後、その量が約3週間で急速に増大する。創傷形成後3ヶ月まで、より緩やかなペースで蓄積が続く。このコラーゲンは、最初はでたらめに見えるような状態に沈着し、その後、これらの個々のコラーゲン線維は架橋によって、治癒中の創傷において応力の線に沿って規則的に整列した束に再編成される。線維芽細胞は、フィブロネクチン、ヒアルロン酸、およびグリコサミノグリカンを含むその他のマトリックス構成物の産生にも関与する。線維芽細胞の増殖および合成活性の過程は線維増殖として知られる。
【０３８７】
創傷の血管再生は、線維増殖と並行して進む。毛細血管の芽が創傷に隣接する血管から現れ、創傷空間に伸展する。損傷後第2日目に、創傷に最も近い小静脈の側面の内皮細胞は、血管新生の刺激に応じて遊走をはじめる。これらの毛細血管の芽はいずれ先端が分岐し、接合して毛細血管のループができ、そこに血液が流れはじめる。その後、新しい芽がこれらのループから伸展して、毛細血管網状組織を形成する。血管新生に関与する可溶因子は完全に決定されていない。血管新生は増殖と遊走の組み合わせによって生じるように見える。内皮細胞成長および走化作用のためと想定されるメディエータには、血小板が産生するサイトカイン、創傷中のマクロファージおよびリンパ球、低酸素張力、乳酸、および生体アミンが含まれる。可能性のある血管新生のサイトカインメディエータの中で、塩基性線維芽細胞成長因子（bFGF）、産生FGF （aFGF）、トランスフォーミング増殖因子αおよびβ（TGF-αおよび-β）、および表皮成長因子（EGF）は、すべて新しい血管系壊死への強力な刺激となることが示されている。特に、FGFはin vivoにおける新血管形成の強力な誘導因子であることも示されている。
【０３８８】
これらのイベントが創傷深くまで進行する一方で、創傷表面では上皮の完全性の回復が進行する。創傷の上皮再形成は損傷から2時間以内に始まる。創傷床の中にある創傷辺縁部または残留する皮膚の上皮付属部のいずれかから生じる上皮細胞が、瘡蓋の下と、下にある生きている連結組織の上を遊走しはじめる。創傷辺縁に隣接する表皮は、損傷後24時間以内に肥厚化し始める。創傷の端にある辺縁基底細胞が下の皮膚への固い結合をゆるめて肥大化し、創傷を埋める一時的なマトリックスの表面全体を遊走し始める。切断端に近い固定された基底細胞には一連の迅速な細胞分裂が生じ、これらの細胞は、欠損部が覆われるまで、相互に飛び越えるように移動することによって遊走しているように見える。前記欠損部が架橋されたら、遊走している上皮細胞は平坦な外観をゆるめて円柱状になり、分裂活性が上昇する。上皮細胞の層化が回復し、表面層は最終的にケラチン化する。上皮再形成は、おおむねの切り傷の場合、48時間未満で完了するが、重大な組織欠損がある大きい創傷の場合には、それよりもかなり長時間かかる場合がある。分層皮膚移植のドナー部位に生じるなど、上皮のみが損傷した場合、修復には主に、線維増殖および顆粒組織形成が最小限または皆無の上皮再形成からなる。上皮再形成の刺激ははっきりと決定されていないままだが、この過程は、接触阻害の喪失、細胞外マトリックスの構成成分、特にフィブロネクチンへの曝露の組み合わせ、および免疫単核細胞によって産生されるサイトカインによって媒介されるようである。EGF、TGF-β、bFGF、血小板由来成長因子 （PDGF）、および特にインスリン様成長因子λ（IGF-λ）が上皮形成を促進することが明らかになっている。
【０３８９】
幹細胞の可動化：本願発明の方法および組成物を用いて、幹細胞、特に初期血液細胞、平滑筋細胞、および内皮細胞を含む初期血管細胞種のもとになる幹細胞の増殖および可動化を促進することができる。例示的な幹細胞には、造血幹細胞（HSC）、間葉幹細胞、および内皮幹細胞が含まれる。
【０３９０】
近年、幹細胞分野において顕著な進歩があった。現時点では、常在性の幹細胞が体内に存在すると、広く考えられている。そのような幹細胞は、損傷または疾患に応答して可動化することがあり、適切な指示のもとでは、そのような障害または疾患の治療に有用であることが証明されるかもしれない。本願発明の組成物が初期血管細胞の増殖および可動化を促進するとすると、本願発明は、前駆細胞の増殖および可動化の刺激へのその使用も意図する。  
【０３９１】
本願発明の方法および組成物は、in vitroまたはin vivoにおいて幹細胞を刺激するために用いることもできる。さらに、本願発明の方法および組成物は、いずれの哺乳類生物にも由来する胚性、胎性、または成人幹細胞を刺激するために用いることもできる。  
【０３９２】
幹細胞増殖および／または遊走の刺激は、数多くある用途のいずれにも有用であるかもしれない。制限されない例として、in vitroにおける幹細胞増殖の促進は、培養物中で幹細胞を維持するための高い実験技術を開発するのに有用であるかもしれない。さらなる制限されない例として、たとえば造血幹細胞増殖または間葉幹細胞増殖などの幹細胞増殖の促進は、幹細胞または骨髄移植後の回復および移植を改善または拡大するための貧血の治療、および免疫不全、リンパ腫もしくは白血病の治療に有用であるかもしれない。  
【０３９３】
ニューロパシ：本願発明の方法および組成物は、ニューロパシの治療のために用いることができる。「ニューロパシ」は神経の疾患または機能不全のいずれもを意味する。ニューロパシには、末梢性ニューロパシ、糖尿病性ニューロパシ、自律性ニューロパシ、および単ニューロパシが、それらに制限されずに含まれる。本願明細書に用いられる「末梢ニューロパシ」は、末梢神経系の一部分が罹患する障害を意味する。たとえば、本願発明の方法および組成物を、たとえばウイルス性感染症、糖尿病、炎症など全身性疾患に伴うニューロパシ、ならびにたとえばシャルコー・マリー・ツース病などの先天性（遺伝性）ニューロパシ、およびたとえばビンクリスチンなどの化学療法剤などの毒性物質によって生じるニューロパシ、挫滅神経などの外傷によるニューロパシを管理する治療計画の一部として用いることができる。
【０３９４】
さらに具体的に説明するために、当該方法および組成物は、糖尿病性ニューロパシなどの後天性ニューロパシ、たとえばギラン-バレー症候群（GBS）およびその変異種、慢性炎症性脱髄性多発神経障害（CIDP）、末梢神経に対する抗体による慢性多発ニューロパシ、末梢神経の血管炎または血管の炎症を伴うニューロパシ、腕または腰仙骨神経叢炎、およびモノクローナル免疫グロブリン異常症などの免疫媒介ニューロパシ、たとえば肺癌に伴う感覚性ニューロパシ、多発性骨髄腫を伴うニューロパシ、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症を伴うニューロパシ、慢性リンパ性白血病、またはB細胞リンパ腫などの腫瘍または新生物に伴うニューロパシ、アミロイドーシスに伴うニューロパシ、感染症によるニューロパシ、栄養不均衡によるニューロパシ、腎疾患のニューロパシ、甲状腺低下症ニューロパシ、アルコールおよび毒物によるニューロパシ、薬物によるニューロパシ、局所放射線照射の結果生じるニューロパシ、外傷または圧縮によるニューロパシ、特発性ニューロパシの治療に用いることができる。
【０３９５】
同様に、当該方法は、シャルコー・マリー・ツース病（CMT）などの遺伝性ニューロパシ、家族性アミロイドニューロパシ、およびその他の遺伝性ニューロパシ、ならびに遺伝性ポルフィリン症などの治療に用いることができる。
【０３９６】
別の実施態様では、当該方法および組成物を用いて、年齢関連ニューロパシを伴う神経変性イベントを阻害するかまたは遅延させることができる。
【０３９７】
ある実施態様では、当該方法および組成物を用いて糖尿病性ニューロパシを治療することができる。糖尿病は、最も一般的に知られるニューロパシの原因である。糖尿病患者の約10%に症状が現れる。ほとんどの場合、前記ニューロパシは主に感覚性であり、手と足の疼痛と感覚喪失を伴う。しかし、一部の糖尿病患者は、1つ以上の神経に衰弱が生じる単発神経炎もしくは多発単神経炎、または足に衰弱が生じる腰仙部神経叢障害もしくは筋萎縮症を有する。
【０３９８】
ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害することによって処置できる症状
本願発明は、ネトリンの活性を阻害する、またはネトリンシグナル伝達を阻害する作用物質を含む方法および組成物も提供する。そのような組成物は、平滑筋細胞および内皮細胞の増殖、遊走、および接着を阻害するために用いることができる。そのような組成物は血管新生を阻害するためにも用いることができる。これらの活性の1つ以上を有する組成物は、たくさんの症状の予防および／または処置に有用である。例示的な症状を以下の表に説明する。    
【０３９９】
癌：癌は、ほぼすべての組織が罹患する数多くの過剰増殖症状のいずれもを意味する包括的な言葉である。たとえば、乳癌、大腸癌、前立腺癌、卵巣癌、精巣癌、頸癌、食道癌、膵癌、骨癌、肺癌、脳癌、皮膚癌、肝癌、胃癌、および舌癌がよく知られる。よく知られる癌の例にはさらに、白血病およびリンパ腫などの血液の癌が含まれる。  
【０４００】
癌がもたらす危険は二要素からなる。第一に、ある組織の癌は成長し、ある器官または組織の正常な機能を阻害することがある。第二に、癌は体内の他の部分に転移し、複数の器官および組織の正常な機能を阻害することがある。  
【０４０１】
癌の進行を処置または阻害するための現在認識されている1角方法は、抗血管新生の概念に基づく。理論に制限されることなく、血管新生の阻害は、細胞の成長および生存を維持するのに必要な血液、酸素、および栄養をその細胞に与えないことによって腫瘍の成長および生存を抑制する。抗血管新生化合物の存在下では、腫瘍成長および転移は阻害される。そのような抗血管新生療法を、単体で、または癌の進行を処置および／または抑制する癌療法と組み合わせないで用いることができる。
【０４０２】
本願発明は、血管新生を阻害するための方法および組成物を提供する。数多くの種類の癌の処置における抗血管新生の公知の役割を鑑みて、本願発明は癌の処置のための方法および組成物を提供する。たとえば、本願発明は腫瘍または腫瘍細胞の成長、生存、または転移を阻害するための方法および組成物を提供する。  
【０４０３】
炎症：本願発明の方法および組成物は、炎症を低下させるために同様に用いることができる。炎症は、組織破損、損傷または炎症によって引き起こされる防御応答で、発赤、熱、膨潤および疼痛によって特徴付けられる。炎症の主な目的は、刺激物質を局在化および消失させ、周辺組織を復元することである。宿主の生存のために、炎症は必要で有益な過程である。しかしときどき、炎症応答が過反応して、実際にさらなる組織破損が生じることがある。たとえば、あるアレルギー応答において過免疫応答が見られる。さらなる過免疫応答には自己免疫応答が含まれる。したがって、炎症の有益な局面を認識しつつ、本願発明は、たとえば過免疫応答中などの過剰な炎症を防ぐための方法および組成物を意図する。  
【０４０４】
炎症を低下させるための改善された方法および組成物の開発の最終目的は、決して新しいものではない。アスピリン、タイレノール、およびアドビルは、靱帯捻挫、および関節炎を含む日常の炎症応答のために容易に入手できて昔からある治療薬である。本願発明は、炎症の治療のための新規の方法および組成物を提供し、本願発明の組成物のみ、または当業に知られる特定の適応症に適切なその他の抗炎症物質と組み合わせた本願発明の組成物の投与を意図する。  
【０４０５】
網膜症：抗血管新生および抗炎症特性の組み合わせに一部基づき、本願発明の方法および組成物は、網膜症の治療に用いることができる。本願発明者らは、以下に網膜症の2亜種、糖尿病性網膜症と未熟児網膜症（ROP）を簡単に概説する。   
【０４０６】
米国内で糖尿病を発症しているまたは発症するであろう1,000万人以上のうち、最終的に半分超がある程度失明するだろう。そのような失明の原因の大半は網膜症である。  
【０４０７】
血管壁、血液自体、および網膜の非常に特別な構造に生じる微小な変化のカスケードが中央の網膜組織に膨潤（黄班浮腫）を引き起こし、目のかすみが生じる患者が何百万人もいる。さらに重篤な異常が長期にわたると、破裂する可能性のある異常な弱い血管ができたり、瘢痕組織の足場となったりする。眼窩の中央（硝子体ゲル）にある高密度の血栓、または瘢痕組織を引っ張ることによる網膜剥離は、顕著な視力低下または完全失明を引き起こす可能性がある。顕著な網膜の変化は視力の変化に患者が気づく前に起きる可能性があるため、アトランタの連邦疾病管理センター（CDC）は年1回の眼科検診を推奨している。目のかすみ、ちらつきによる不快感の増加、および「飛蚊症」の発症は、視力障害の始まりの証拠である可能性がある。
【０４０８】
網膜症の検査には、基本的な視力検査、眼圧検査（緑内障を除外するため）、網膜の全視野と高倍率視野の療法を見るための瞳孔散大による検査が含まれる。特別な状態の過剰な漏れによる初期および後期の血管の変化の両方を同定する一般的に行われる蛍光血管造影法によるテストに加えて、黄斑組織損傷を特別な網膜電図（ERG）（心電図に似た原理）で測定することができ、小さい中央の盲点の変化は走査レーザ検眼鏡（SL0）、血液が充満した眼のかくれた変化はソナーに似た超音波エコーシステムで、そして網膜血管の微小な血液循環の変化はレーザドップラフローメータ（LDF）で測定することができる。
【０４０９】
本願発明の方法および組成物は、たとえば糖尿病性網膜炎の治療など、網膜炎の治療に用いることができる。そのような方法および組成物は単体で、またはその他の認識される網膜症の療法と組み合わせて用いることができる。そのような療法にはレーザ光凝固術および閉鎖硝子体茎切除術が含まれる。そのような療法には、たとえば血糖を安定させて頻繁な高血糖または低血糖状態を避ける方法など、糖尿病の管理も含まれる。  
【０４１０】
レーザ治療は硝子体茎切除術よりも一般的である。この治療は、診療室で患者がレーザ機器の前に座ったまま行われる。眼を麻酔滴で麻痺させて、特別なコンタクトレンズを目に配置し、レーザビームを当てる。そのビームは、不快感を最少にしつつ望ましい網膜の応答を生じるのに十分なエネルギを送るように変化させることができる。レーザ治療は、黄斑の膨潤を低下させるか、または異常で衰弱した血管からの出血のリスクを低減させるかのいずれかのために行う。  
硝子体茎切除術は、拡大する血管が自発的に消滅せずに眼の中にとどまっていたり、瘢痕組織が視力を破壊していたりする場合に必要である。 
【０４１１】
未熟児網膜症（ROP）は、眼の内部を覆う光感受性の膜、網膜の疾患である。これは、低体重の未熟児が罹患する。大半が正常な血管がまだ網膜内に成長していない領域に成長する異常な網膜血管からなる。ROPは1乃至5段階に分けられる。第1および2段階は通常治療を要しない。第3段階ROPに成長した一部の乳児は、通常レーザまたは凍結療法を含む治療を要する。  
【０４１２】
末梢網膜治療は、ROPが失明する可能性のある第4および5段階に進行する可能性を低減することはできるが除外することはできない。第4または5段階ROPに達すると、網膜は剥離してその他の療法を行う可能性がある。そのような療法の一つが強膜バックルで、眼球にシリコン帯を巻き、網膜への引張力を減らす。その他の療法には硝子体茎切除術（眼の裏側を満たす硝子体とよばれるゲル様物質の除去）が含まれる。硝子体茎切除術中に網膜表面からできるだけ引張力を除去するために、レンズの除去も必要な場合がある。レンズの除去は、網膜がレンズの裏側の表面に接触している場合に行う。
【０４１３】
手術接着：接着は、通常遊離している組織がともに傷つく場合に生じ、手術の結果生じることがある。組織間の異常な結合は、不妊や腸閉塞症など、各種の問題を生じうる。接着は典型的には手術後40乃至90%の確率で、典型的には手術を行った部位に生じる。 
【０４１４】
実質的にあらゆる種類の手術が原因で生じる縫合、切開、感染、異物、および外傷（組織損傷）の後で組織が治癒するときに、接着が生じることが多い。組織が治癒すると、瘢痕が残ることがある。手術後の好ましい転帰は、組織同士が接着せずに組織が治癒することである。瘢痕の残留には典型的に創傷組織の治癒が伴うが、好ましい手術の転帰はいずれの瘢痕にも接着が生じないことである。   
【０４１５】
接着は生命を脅かすことがあり、再手術が危険になり、順応および視認が妨げられかねない。接着を切開すると周囲の器官または血管に損傷を引き起こし、失血量を増やして、手術時間が延長することがある。接着は重篤な疼痛、不快感、限られた範囲の運動、および器官の機能不全を引き起こすことが多い。接着によって生じる疼痛を緩和するか障害物をなくすために、さらなる手術が接着を切開するのに必要かもしれない。接着は実質的にどの組織にも生じうる。だが、以下は接着といくつかの組織種の接着の影響の具体例である。
【０４１６】
接着は一般に骨盤痛に関連している。実際に、骨盤痛を罹患する女性の最高38%が接着を有している。通常離れている器官が瘢痕によって結合しているために、日常の体の動きでこの組織が伸縮すると痛みが生じうる。接着は女性の不妊症の主因でもある。ある婦人科手術の結果、卵巣と卵管の間の接着が形成されることがある。そのような瘢痕の残留は卵子と精子の移動を阻害して、妊娠しづらくなる可能性がある
【０４１７】
腸閉塞は腸が関与する接着によって生じ、手術直後または数年後にも生じることがある。そのような腸閉塞は、吐き気、嘔吐、衰弱痛を引き起こし、さらに死亡に至ることすらある。放置すると、最終的に大腸が破裂する。
【０４１８】
接着は部分的に、手術またはその他の損傷後の過増殖創傷治癒活性によって引き起こされる。本願発明の方法は、手術後の過増殖の速度または範囲を制限し、接着の発生回数または重篤度を低下させるために用いることができる。    
【０４１９】
閉塞性脈管疾患：「閉塞性脈管疾患」という用語は、脈管の閉塞を特徴とするある範囲の状態を意味する。例としては、閉塞性脈管疾患にはアテローム性動脈硬化および脈狭窄症が含まれる。さらなる例としては、閉塞性脈管疾患には、脈管形成術またはその他の腔内介入後に生じることが多い脈管の閉塞も含まれる。本願発明の方法および組成物は、閉塞性脈管疾患の治療または予防のために用いることができる。そのような組成物は、単体か組み合わせで送達することができ、閉塞部位または前進に直接送達することができる。  
【０４２０】
理論に制限されることなく、本願発明の方法および組成物は脈管を閉塞する内皮細胞の増殖および遊走を低減するために用いることができる。そのような脈管には血管だけでなく内皮管を含むその他の脈管も含まれる。閉塞するかもしれない例示的な内皮管には、腎管、総胆管、膵管、食道、尿道、尿管、膀胱、ファローピウス管、卵管、または膀胱が含まれる。        
【０４２１】
体重管理：肥満は、米国および世界中における慢性的な健康問題である。肥満およびその他の慢性体重問題は、社会的および心理学的な重大性を含む、さまざまな重大性を有する。さらに、肥満は、循環器疾患、脳卒中、高コレステロール、糖尿病、大腸癌、痛風、慢性関節痛、関節炎、および呼吸器系の問題をそれらに限定されずに含む疾患のリスクを高める主因子である。
【０４２２】
増加している肥満の問題を管理する努力において、さまざまなダイエット補助薬、ダイエット療法、および運動療法が、体重を管理し肥満を回避するのを促すために開発されている。本願発明の方法および組成物は、脂肪を減らして個人の体重増加を低減するために用いることができる別の道具を提供する。血管新生を阻害することにより、本願発明の組成物は、脂肪を減らすために用いることができる。そのような組成物は単体で、または個人の脂肪の減少を促すために用いるその他のダイエットおよび運動療法と組み合わせて用いることができる。  
【０４２３】
個人の脂肪を減らすためのダイエット療法の一部としての使用に加えて、本願発明の高血管新生組成物および方法はさらに、肥満によって悪化する症状の処置を補強するために用いてもよい。例示的な症状には、循環器疾患、脳卒中、高コレステロール、糖尿病、大腸癌、痛風、慢性関節痛、関節炎、および呼吸器系の問題がそれらに限定されずに含まれる。   
【０４２４】
前述の例は、本願発明の方法および組成物を用いて処置することができる多様なメカニズムの広範囲の疾患および損傷の具体例でしかない。一般に、本願発明は、内皮細胞もしくは平滑筋細胞の血管新生を増加させるか、または増殖、遊走、もしくは接着を促進することによって、完全にまたは部分的に処置することができる症状はいずれも、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を促進する本願発明の組成物を用いて処置してもよい。同様に、本願発明は、内皮細胞もしくは平滑筋細胞の血管新生を減少させるか、または増殖、遊走、もしくは接着を阻害することによって、完全にまたは部分的に処置することができる症状はいずれも、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の発現または活性を阻害する本願発明の組成物を用いて処置してもよい。  
【０４２５】
(vii)   薬学的組成物および投与方法
本願発明はさらに、ネトリンポリペプチド、およびネトリンポリペプチドの発現または活性を阻害する作用物質を含む薬学的組成物を意図する。例示的な薬学的組成物には、(i)ネトリンポリペプチド、(ii)ネトリンポリペプチドの活性断片、(iii)修飾ネトリンポリペプチド、または(iv)ネトリンポリペプチドの修飾活性断片、(v)抗ネトリン抗体、(vi)Unc5hレセプタまたは細胞外ドメイン、(vii)抗ネオゲニン抗体、であって、薬学的に許容な担体または賦形剤に調合されているものを含む、薬学的組成物が含まれる。さらに例示的な薬学的組成物には、ネトリンポリペプチド、修飾ネトリンポリペプチド、またはその生物活性断片の1つ以上を含む薬学的組成物が含まれる。  さらなる例示的な薬学的組成物には、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を促進する（例えばプロ血管新生、ネトリンの誘引活性を促進する）作用物質を1つ以上含む薬学的組成物が含まれる。さらなる例示的な薬学的組成物には、ネトリンまたはネトリンシグナル伝達の活性を阻害する（例えばプロ血管新生、ネトリンの誘引活性を阻害する）作用物質を1つ以上含む薬学的組成物が含まれる。よりさらに例示的な薬学的組成物には、ネトリンポリペプチド、修飾ネトリンポリペプチド、またはその生物活性断片の1つ以上、およびその他の作用物質を1つ以上含む薬学的組成物が含まれる。そのような作用物質には、血管新生因子がそれらに限定されずに含まれる。
【０４２６】
本願発明の薬学的組成物は、従来の薬学的配合技術にしたがって調合する。たとえば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing
Co., Easton, PA)を参照。本願発明の薬学的製剤は、活性ポリペプチドおよび／またはその薬学的に許容な塩を含有することができる。これらの組成物は、活性ポリペプチドおよび／または作用物質に加えて、薬学的に許容な賦形剤、担体、バッファ、安定剤、または当業に公知のその他の物質を含むことができる。そのような物質は無毒でなければならず、前記活性作用物質の有効性を阻害してはならない。好ましい薬学的組成物は非発熱性である。前記担体は、たとえば静脈内、血管内、経口、髄腔内、神経鞘、または非経口、経皮など、投与経路に応じた多様な形状であってよい。さらに、前記担体は、前記薬学的組成物が、たとえばカテーテル、ステント、ワイヤまたはその他の腔内装置などの生体適合性の装置を通して、全身に投与されるか、または局所に投与されるかに応じて、広く多様な形状であってよい。局所投与のさらなる方法には、生体適合性装置を通さない局所投与も含まれる。さらに、局部送達および／または局所送達は、たとえば救急絆、包帯、縫合糸、またはガーゼなどの生体適合性マトリックスを介してもよい。  
【０４２７】
好適な単体の具体的な例は、水、食塩水、デキストロース溶液、フルクトース溶液、エタノール、または動物、植物もしくは合成由来の油である。前記担体は、たとえば保存剤、懸濁物質、可溶化剤、およびバッファなど、その他の成分も含んでよい。
【０４２８】
ある実施態様では、前記薬学的組成物は徐放用に調合されている。例示的な徐放性組成物は、前記組成物が結合するかまたは前記組成物をカプセル封入する固体状生体適合性ポリマーの半透過性マトリックスを有する。好適なポリマーの例には、ポリエステル、ヒドロゲル、ポリ乳酸、Lグルタミン酸とエチル-L-グルタマーゼのコポリマー、非分解性エチレン酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、およびポリD+-ヒドロキシブチル酸が含まれる。
【０４２９】
ポリマーマトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどの望ましいいずれの形状でも作製することができる。
【０４３０】
その他の徐放性組成物には、リポソームに封入した修飾組成物が含まれる。この目的に好適なリポソームは、各種の脂質、リン脂質、および／または表面活性剤から構成されていてよい。これらの成分は典型的には二層構造に配列されており、生物学的な膜の脂質配置と似ている。本願発明の成分を含有するリポソームは、既知の方法によって調整することができる（たとえばEpstein, et al.(1985) PNAS USA 82:3688-92, and
Hwang, et al., (1980) PNAS USA, 77:4030を参照）。 
【０４３１】
本願発明にしたがった薬学的組成物には、インプラント、つまり体内の部位に直接輸送して、好ましくは局所化した輸送を提供するためにその部位に維持された、組成物または装置が含まれる。本出願に記載された薬学的組成物を含む組成物は、全身または局所的に投与してよい。局所的に投与した組成物は、たとえば、冠動脈を経由して心膜嚢、心膜、心内膜、心臓を取り巻く大血管（たとえば経脈管的に心臓へ）へ、または直接心筋へ輸送することができる。増殖を促進し損傷した心筋を修復するための心筋への輸送の場合、本願発明は、損傷部位への直接の輸送、または損傷部位からいくらか遠方の別の部位への輸送を意図する。全身または局所的な組成物の投与の例示的な方法は、本願明細書により詳細に説明されるだろう。   
【０４３２】
本願発明の組成物、およびその薬学的組成物には、生適合性支持体への組成物を含むインプラントも含まれる。生適合性支持体と組成物はin vivoにおいて前記組成物を輸送するために用いることができる。好ましい生適合性支持体には、ステント、ワイヤ、カテーテル、およびその他の腔内装置が、限定されずに含まれる。ある実施態様では、前記生体適合性の支持体は脈管内または静脈内で輸送することができる。  
【０４３３】
前記支持体は、ポリテトラフルオレチレン（PFTE）、ポリエチレンテレフタラート、ダクロンフトポリプロピレン、ポリウレタン、ポリジメチルシロキサム、フッ化エチレンプロピレン（FEP）、ポリビニルアルコール、ポリ（オルガノ）ホスファゼン（POP）、ポリ-l-乳酸（PLLA）、ポリグリコール酸／ポリ乳酸コポリマー、メタクリルホスホリルコリンとラウリルメタクリレートのコポリマー、ホスホリルコリン、ポリかプロラクトン、シリコーン炭化物、セルロースエステル、およびポリアクリル酸など、ならびにこれらの物質の組み合わせなどのgポリマーを含む、いずれの生物学的に適合可能な物質からも作ることができる。ステンレス鋼、ニチノール、チタン、およびタンタルなどの金属も、前記支持体として、または前記支持体の中に用いることができる。好ましくは、前記支持体は、前記支持体全体もしくは前記支持体外へ組成物もしくは産生物が拡散するのに十分多孔性である。  
【０４３４】
支持体は、望ましい物理的特性を有する本願発明の薬学的組成物を提供することができる。当業者は、特定の標的部位に維持すべきインプラントには、最小限の物理的完全性の必要条件があることを認識するだろう。
【０４３５】
たとえば、好ましい脈管内インプラントは、破裂または動脈瘤の形成なしに、血圧によって誘導される周方向応力に耐えなければならない。
【０４３６】
前記支持体のサイズおよび形状は、特定の用途によって決定される。前記支持体が脈管部位に維持される場合、管状の支持体の利用が便利である。  
【０４３７】
支持体への組成物の「付着」は、前記組成物を支持体表面に吸着させることによって簡単に行うことが出来る。しかし、たとえば共有結合または非共有結合などの付着の形状はいずれも意図される。ある実施態様では、前記組成物は、好ましくはウシ血清アルブミン（BSA）などの担体を含有する、溶液として調製する。この溶液は、グルタルアルデヒド、ガンマ線放射、または生体適合性エポキシ溶液などの作用物質を用いて架橋され、コーティングまたは浸漬によって前記支持体の表面に塗布される。
【０４３８】
代替的には、組成物は微孔性支持体（たとえばPTFE）に機械的に封入することができる。本方法に用いる組成物溶液は架橋されている必要がない。前記支持体を湿潤させたあと（たとえば100%エタノールで）、前記溶液を陽性または陰性圧力を用いて、前記支持体の孔に入れる。管状の支持体の場合、前記溶液を含有する注射器を前記管に付けて、前記溶液を管の内腔に入れ、管の内壁を通して外に出し、前記組成物を支持体表面の内側および外側に沈着させることができる。
【０４３９】
組成物を、上述のような生体適合性ポリマーマトリックスに溶解して懸濁させ、支持体または人工器官をコーティングすることが出来る。好ましくは、前記のポリマー化マトリックスは、前記組成物と細胞の相互作用をさせるのに十分多孔性である。
【０４４０】
脈管内に用いるための組成物マトリックス／支持体集合体は、管状支持体の外表面に付着させたマトリックスを有してもよい。前記マトリックスは、前記マトリックスが前記支持体に十分に固定できる場合は、前記支持体の内部に付着させることもできる。ゆるいマトリックスは脈管内流の障害になる傾向があり、その結果血栓を生じる場合もある。
【０４４１】
その他の実施態様では、前記組成物は生体適合性の腔内装置によって輸送されるが、前記組成物は架橋されたり、または前記装置の中で溶解したりすることはない。たとえば、本願発明は大量の組成物を輸送するためのカテーテルまたはその他の装置の使用を意図する。そのような実施態様では、前記組成物は前記カテーテルと関連している必要はないかもしれない。カテーテル、またはその他の機能的に類似する腔内装置を使用することによって、前記脈管を経た局所的な輸送が可能になる。たとえば、腔内装置を用いて、心筋、心内膜、または心膜／心嚢腔に直接、大量の組成物を輸送することができる。代替的には、腔内装置を用いて、大量の組成物を心組織に近い脈管の中に局所的に輸送することができる。
【０４４２】
すでに概説したとおり、本願に意図される各種の輸送方法に用いられる生体適合性の装置は、多数の物質のいずれからもできていてよい。前記生適合性装置には、ワイヤ、ステント、カテーテル、バルーンカテーテル、およびその他の腔内装置が含まれる。そのような装置は、意図される脈管、移植の寿命、処置される症状、および患者の全体の健康状態に応じて、さまざまなサイズおよび形状であってよい。当業の医師および心臓外科医は、特定の用途に基づく入手可能な装置の中から容易に選択できる。  
【０４４３】
さらなる具体的な説明としては、例示的な生体適合性腔内装置はCordis社、Boston Scientific社、Guidant社、およびMedtronic社を含む数社で現在作製されている（現在入手できるカテーテル、ステント、ワイヤなどの詳細な説明はwww.cordis.com、www.medtronic.com、www.bostonscientific.comで得られる）。
【０４４４】
本願発明は、本願発明の薬学的組成物および関連キットを含む製品も提供する。本願発明は、本願発明の薬学的組成物を含むいずれのタイプの製品も包含するが、前記製品は典型的には、好ましくはそこに入っている組成物を同定するラベルを有する容器である。
【０４４５】
前記容器は、中に入れた組成物と反応しない物質いずれからも作製されてよく、本出願用の組成物の使用を容易にするいずれもの形状またはその他の特徴を有してよい。経口投与用の本願発明の薬学的組成物のための容器は、たとえば皮下注射針で穴を開けることができる、栓を有する静脈溶液バッグまたはバイアルなど、滅菌されたアクセス口を有する。
【０４４６】
本願発明のキットには一般に、1つ以上のそのような製品が含まれ、および好ましくは使用説明書が含まれる。好ましいキットには、本願発明の薬学的組成物の標的部位への輸送を促進する1つ以上の装置が含まれる。 
【０４４７】
本願発明の方法に用いる組成物、および当該方法によって同定される組成物は、水、緩衝食塩水、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、またはそれらの好ましい混合物など、生物学的に許容な媒質を投与用に便利に調合してよい。例示的な修飾組成物には、疎水性修飾、親水性修飾、および混合修飾組成物が含まれる。そのような修飾組成物は、1つ以上の部分で修飾してよい。そのような1つ以上の部分は、N末端アミノ酸残基、C末端アミノ酸残基、および／または1つ以上の内部アミノ酸残基に付加してよい。修飾ネトリン組成物が2つ以上の部分で修飾される場合、本願発明は、前記部分が同一かまたは異なってよく、同一のアミノ酸残基または異なるアミノ酸残基に付加してよいことを意図する。  
【０４４８】
本出願のこの節全体において、作用物質という用語は、本願発明の方法に用いる1つ以上の組成物または修飾組成物を同義に意味するように用いられるだろう。  
【０４４９】
選択された媒質に入れた活性化成分の最適濃度は、医化学者に公知の方法に従って経験的に決定することができる。本願明細書に用いられる「生物学的に許容な媒質」には、1つ以上の作用物質の望ましい投与経路に好適であってよい、溶媒、および懸濁媒などが含まれる。薬学的に活性な物質へのそのような媒質の使用は、当業に公知である。従来の媒質または作用物質は、特定の作用物質または作用物質の組み合わせの活性と不適合な場合を除き、本願発明の薬学的調製へのその使用が意図される。好適な賦形剤およびその他のタンパク質を含めたその製剤は、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences (Remington's Pharmaceutical
Sciences.Mack Publishing Company, Easton, Pa., USA 1985)という本などに記載されている。これらの賦形剤には注射可能な「沈殿製剤」が含まれる。  
【０４５０】
導入の方法も、生体適合性の装置を介した輸送によって提供することができる。当該作用物質の輸送に好適な生体適合性装置には、ステント、ワイヤ、カテーテル、およびシースなどの腔内装置が含まれる。しかし、投与は生体適合性装置を介した輸送に限定されない。本願明細書に詳述の通り、本願発明は、数多くの投与経路および輸送方法のいずれもを意図する。さらに、作用物質を生体適合性装置によって輸送する場合、本願発明は前記作用物質が前記装置に架橋するか関連するかまたは溶解してよく、または関連していなくてもよいことを意図する。
【０４５１】
本願発明の方法を用いて同定した作用物質は、経口、非経口、または局所に投与してよい。もちろん、各投与経路に好適な剤形で投与される。たとえば、錠剤またはカプセル状、注射、吸入、軟膏、徐放性装置もしくはパッチ、または輸液によって投与する。 
【０４５２】
有効量または用量レベルは、用いられる特定の1つ以上の作用物質、投与経路、投与時間、使用された特定の作用物質の排出速度、治療の持続時間、特定の作用物質とともに用いたそのほかの薬物、化合物、および／または物質、動物の年齢、性別、体重、症状、健康状態、および既往歴、ならびに医療関連業者に公知の同様の各種要因によるだろう。  
【０４５３】
前記の1つ以上の作用物質は、そのまま、または薬学的に許容な、および／または滅菌した担体と混合して投与することができ、その他の化合物とともに投与することもできる。これらのさらなる化合物は、本願発明の方法に用いるための作用物質と連続して、または同時に投与してもよい。
【０４５４】
作用物質は担体で投与することもでき、または薬学的製剤（組成物）として投与することもできる。前記作用物質は、ヒトまたは動物薬に使用するために便利なように投与するために調剤することもできる。ある実施態様では、薬学的調製物に含まれる前記作用物質は、それ自体が活性であってもよく、または、たとえば生理学的設定において活性化合物に転換することができるなどのプロドラッグであってよい。
【０４５５】
したがって、本願発明の別の局面は、1つ以上の薬学的に許容な担体（添加物）および／または希釈剤とともに調合したものを含む、有効な量の1つ以上の作用物質を含む薬学的に許容な組成物を提供する。後述の通り、本願発明の薬学的組成物は、以下の項目に適応させたものを含む、固体状または液体状に投与用に特別に調合してよい。それは、(1) ステントまたはその他の生体適合性腔内装置による輸送、(2)たとえば水薬（水溶液もしくは非水溶液、または懸濁液）、錠剤、ボーラス剤、粉末剤、顆粒剤、舌に塗布するためのペーストなどの経口投与、(3)たとえば滅菌溶液または懸濁液などの皮下、筋肉内または静脈内注射による非経口投与、(4)たとえば皮膚に塗布するクリーム、軟膏、またはスプレーなどの局所投与、(5)たとえば網膜の損傷または破損後に投与するための眼投与、(6)心筋内、心膜内、または心内膜投与、(7)脈管内、静脈内または冠動脈経由、である。しかし、ある実施態様では、当該作用物質は、単純に滅菌水に溶解または懸濁させてもよい。ある実施態様では、前記薬学的調製物は非発熱性であって、すなわち患者の体温を上げない。
【０４５６】
用いることができる薬学的に許容な担体の物質のいくつかの例には、（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖類、（２）トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、（４）粉末状トラガカント、（５）モルト、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）カカオバター、および座剤用ロウなどの賦形剤、（９）ピーナツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、および大豆油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどのポリオール、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリル酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウム、および水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンガー溶液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝溶液、および（２１）薬学的製剤に用いられるその他の無毒性適合性物質、が含まれる。 
【０４５７】
ある実施態様では、1つ以上の作用物質は、アミノまたはアルキルアミノなどの塩基性官能基を含んでもよく、したがって、薬学的に許容な酸で薬学的に許容な塩を形成することができる。この場合の「薬学的に許容な塩」という用語は、本願発明の作用物質の比較的無毒な無機および有機酸付加塩を意味する。これらの塩は、本願発明の作用物質の最終分離および精製の間に、または遊離塩の状態である本願発明の精製された作用物質を好適な有機または無機酸と別々に反応させて、形成された塩を分離することによって、in situで調製することができる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、臭化塩素酸塩、硫酸塩、重硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリル酸塩、ベンゼン酸塩、乳酸園、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる。（たとえば、Berge et al.(1977) "Pharmaceutical Salts", J.
Pharm. Sci. 66:1-19参照）。
【０４５８】
前記作用物質の薬学的に許容な塩には、たとえば無毒性有機もしくは無機酸などの、当該作用物質の従来の無毒性塩または第４アンモニウム塩が含まれる。たとえば、そのような従来の無毒性塩には、塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、および硝酸などの無機から誘導された塩、ならびに酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パルミチン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、ベンゼン酸、サリシクリル酸、スルファニル酸、2-アセトキシベンゼン酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、オキサル酸、およびイソチオン酸などの有機酸から調製された塩が含まれる。 
【０４５９】
他の場合には、前記の1つ以上の作用物質は、1つ以上の酸性官能基を含んでよく、薬学的に許容な塩基で薬学的に許容な塩を形成することができる。この場合の「薬学的に許容な塩」という用語は、本願発明の作用物質の比較的無毒な無機および有機塩基付加塩を意味する。これらの塩は同様に、前記作用物質の最終分離および精製の間、または遊離酸の状態の前記の精製された作用物質を、薬学的に許容な金属カチオンの水酸塩、カルボン酸塩、もしくは二カルボン酸塩などの好適な塩基、アンモニア、または薬学的に許容な有機第１、第２もしくは第３アミンと別々に反応させてin situで調製することができる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムおよびアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、およびピペラジンが含まれる。（たとえば、Berge et al., supra参照）。
【０４６０】
ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの湿潤剤、乳化剤、および潤滑剤、ならびに着色剤、剥離剤、コーティング剤、甘味料、香味料および香料、保存料および抗酸化剤もまた、当該組成物に存在してよい。 
【０４６１】
薬学的に許容な抗酸化剤の例には、(1)アスコルビン酸、塩酸システイン、二硫化ナトリウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、および亜硫酸ナトリウムなどの水溶性抗酸化剤、(2)パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（BHA）、ブチル化ヒドロキシトルエン（BHT）、レシチン、没食子酸プロピル、およびアルファトコフェロールなど、(3)クエン酸、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、ソルビトール、酒石酸、およびリン酸などが含まれる。 
【０４６２】
本願発明の製剤は、便利のいいように単回投与剤形になっていてよく、薬学の当業に公知の任意の方法で調製されてよい。単回投与剤形をつくるために担体物質と混合することができる活性成分の量は、治療対象の宿主、特定の治療形態によって変化するだろう。単回投与剤形をつくるために担体物質と混合することができる活性成分の量は、一般に、治療効果を生じる作用物質の量であろう。一般に、100%のうち、この量は活性成分の約1乃至約99%であって、好ましくは約5乃至約70%であって、最も好ましくは約10乃至約30%の範囲内であろう。 
【０４６３】
これらの製剤または組成物の調製の方法には、作用物質を前記担体および任意で1種類以上の副成分と合わせるステップを含む。一般に、当該製剤は、本願発明の作用物質を液体担体もしくは細かく分断した固体担体、またはその両方と均一によく合わせるステップと、必要であればその生成物を形成するステップによって調製する。 
【０４６４】
経口投与に適する本発明の製剤の形状は、カプセル（capsule）、カプセル（cachet）、丸剤、錠剤、トローチ剤（通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントなどの着香基剤を用いる）、粉剤、顆粒、または水性液もしくは非水性液を用いた溶液もしくは懸濁液、または水中油もしくは油中水液体状乳剤、またはエリキシル剤もしくはシロップ剤、またはトローチ（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を用いる）、および／または洗口剤などでよく、それぞれ本願発明の化合物を活性成分としてあらかじめ定めた量含有する。本願発明の作用物質はまた、ボーラス、舐剤、またはペーストとして投与してもよい。 
【０４６５】
経口投与用の本願発明の固体状投与剤形（カプセル、錠剤、丸剤、糖衣錠、粉剤、顆粒など）の場合、活性成分を、クエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウムなどの薬学的に許容な担体、および／または以下に記載するもの、（1）デンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸などの充填剤または増量剤、（2）たとえばカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシアなどの結合剤、（3）グリセロールなどの保湿剤、（4）寒天、炭酸カルシウム、バレイショまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、炭酸ナトリウムなどの崩壊剤、（5）パラフィンなどの液体緩染剤、（6）第４級アンモニウム化合物などの吸収促進剤、（7）たとえばセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロールなどの湿潤剤、（8）カオリンおよびベントナイトクレイなどの吸収剤、（9）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体状ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物などの潤滑剤、並びに（10）着色剤のいずれかと混合する。カプセル、錠剤、および丸剤の場合、薬学的組成物はまた、緩衝剤も含んでもよい。同様の種類の固体状組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、および高分子ポリエチレングリコールなどの賦形剤を用いて、軟ゼラチンカプセルおよび硬ゼラチンカプセルの充填剤として用いてもよい。 
【０４６６】
本願発明の作用物質の経口投与用の液体状剤形には、薬学的に許容な乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップ剤、およびエリキシル剤が含まれる。液体状剤形は、活性成分に加えて、たとえば水またはそのほかの溶媒、たとえばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、1,3-ブチレングリコール、油（特に綿実油、ラッカセイ油、コーン油、胚種油、オリーブ油、ヒマシ油、およびゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコール、およびソルビタン脂肪酸エステル、並びにそれらの混合物などの可溶化剤または乳化剤など、当業で一般に用いられる不活性希釈剤を含有してよい。 
【０４６７】
経口組成物はまた、不活性希釈剤の他に、湿潤剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、着香剤、着色剤、芳香剤、および保存剤などのアジュバントを含んでもよい。 
【０４６８】
懸濁液は、活性作用物質に加えて、たとえばエトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、並びにそれらの混合物懸濁作用として、作用物質を含有してよい。 
【０４６９】
経皮パッチには、本願発明の作用物質を体内に制御送達するというもう一つの利点がある。このような剤形は、適切な溶媒中に当該作用物質を溶解または分散させてつくることができる。吸収促進剤も、作用物質の皮膚への流動を増加させるために用いることができる。このような流動の速度は、速度制御膜を備えるか、またはポリマーマトリックスまたはゲル中に作用物質を分散させることによって制御することができる。 
【０４７０】
非経口投与に好適な本願発明の薬学的組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、対象のレシピエントの血液と等張にするための溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含んでよい、１種類以上の薬学的に許容な滅菌等張水溶液もしくは非水溶液、分散液、懸濁液もしくは乳剤、または使用直前に注射可能な滅菌溶液もしくは分散液に再構築してよい滅菌粉末と混合した、本願発明の１種類以上の作用物質を含む。 
【０４７１】
本願発明の薬学的組成物に用いてよい好適な水性担体および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、およびオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルが含まれる。適切な流動性は、たとえばレシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合は所要の粒子サイズの維持、および表面活性剤の使用などによって維持することができる。 
【０４７２】
このような組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤および分散剤などのアジュバントも含んでよい。微生物の活動を確実に防ぐために、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの各種抗菌剤および抗真菌剤を含んでもよい。さらに、糖、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含ませることが望ましい。さらに、注射可能な剤形の吸収を持続させるために、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収遅延剤を含んでもよい。 
【０４７３】
あるケースでは、作用物質の効果を持続させるために、皮下または筋肉内注射からの作用物質の吸収を遅延させることが望ましい。これは、水への溶解度が低い結晶またはアモルファス物質の液体状懸濁液を使用することで実現してもよい。前記作用物質の吸収速度は溶解速度に依存し、したがって結晶サイズおよび結晶の形状に依存することがある。代替的には、非経口投与剤した作用物質の剤形の吸収は、前記作用物質を油状賦形剤に溶解または懸濁させると遅延させることができる。 
【０４７４】
前述のいずれにおいても、本願発明は新生児、青年、成人患者への投与を意図し、当業者は容易に投与方法および本願明細書に記載の用量を、前記患者の年齢、健康、サイズ、および特定の疾患の状況に基づいて変化させることができる。さらに、本願発明は罹患している胎児における症状を処置するための子宮への投与も意図する。
【実施例】
【０４７５】
本願発明はここまででは一般的に記述されているが、以下の例を参照することによってより容易に理解されるであろう。以下の例は、本願発明のある局面および実施態様を説明する目的のためだけに含まれているものであり、本願発明を制限することは意図しない。
例1：ネトリン1は胚および成人組織に発現する
平滑筋細胞および内皮細胞などの血管細胞種がネトリンおよびネトリンシグナル伝達の調節に応答しそうだということを確認するために、本願発明者らは胚および成体の発達中におけるネトリンファミリの1メンバの発現を調査した。図2にまとめられた本願発明者らの結果から、ネトリンが、心筋細胞種を含む細胞種のふるまいの調節における役割に一致するパターンで、胚および生体の発達中に発現することを確認している。ネトリンファミリメンバの発現は、そのような細胞種がネトリンポリペプチドおよびネトリンシグナル伝達を操作することによって調節することができることを示唆する。  
【０４７６】
簡単に説明すると、図2はマウス胚および成体組織におけるネトリン1の発現を示す。パネル（a-f）は、アンチセンスネトリン1プローブを用いたin situハイブリダイゼーションによるマウスE9-E10組織における、ネトリン1の発現を示す。 パネル（a-c）は、ネトリン1発現の全体を示し、パネル（d-f）はネトリン1発現の断面を示す。底板（黒矢印で示す）および体節（赤矢印で示す）にあるネトリン1の強い発現に注目されたい。  
【０４７７】
パネル（g-j）は成人胸部および脳組織の8ミクロンの断片におけるネトリン1タンパク質の発現を示す。断片はネトリン1タンパク質に免疫応答性の抗体（パネルgおよびi）、または内皮マーカCD31に免疫応答性の抗体（パネルhおよびj）で染色した。脳および胸部の血管を取り巻くネトリン発現、および胸の管状組織全体の発現に注目されたい。  
【０４７８】
例2：ネトリンは内皮細胞および平滑筋細胞の増殖を促進する
内皮および血管細胞種におけるネトリンポリペプチドの発現を考えて、本願発明者らはネトリンポリペプチドの分裂促進性を調査した。さらに、本願発明者らは、ネトリンポリペプチドの増殖能を既知の血管成長因子VEGFと比較した。数回の研究の結果を図3にまとめる。当該図は、ネトリンポリペプチド、ネトリン1が内皮細胞および平滑筋細胞の両方の増殖を促進したことを示す。さらに、これらの結果から、ネトリンポリペプチドが、既知の血管成長因子VEGFと同様の増殖能を促進したことが示された。
【０４７９】
簡単に、図3に以下の実験をまとめる。パネル（a-d）は、内皮細胞（EC）のネトリン1またはVEGFの作用を調べた実験をまとめる。パネル（e-h）は、血管平滑筋細胞（EC）のネトリン1またはVEGFの作用を調べた実験をまとめる。図3に提供したすべての実験は、無血清培地中でBSAで処理された細胞に対する、細胞数の増加倍数（細胞増殖の変化の測定値として）を測定した。図3に提供されたパネルは、実験ごとに3回繰り返した、少なくとも3回の独立した実験の結果を表す。  
【０４８０】
パネル（a-d）は、VEGFに類似するレベルの、内皮細胞のネトリン刺激増殖を示す。簡単には、処置から48時間後、ネトリン1（50
ng/ml）または既知の内皮成長因子VEGF（10 ng/ml）それぞれが、一次ヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）およびヒト大動脈内皮細胞（HAEC）の両方の増殖を刺激した（パネルa）。パネル（bおよびc）に提示されたグラフにまとめられているように、ネトリン1またはVEGFのいずれかで処置したあとの、内皮細胞、この場合はHMVECの増殖は、時間および用量依存性であった。これらの実験において、内皮細胞のネトリン処置への最適な応答は、48時間経過時点、および用量50 ng/mlの時点で認められた。パネル（d）は、ネトリン1またはBSAの指示量内で処置してから48時間後の、HMVECを含む細胞培養ウエルの代表的な領域を提供する。  
【０４８１】
パネル（e-h）は、PDGFに類似するレベルの、平滑筋細胞のネトリン刺激増殖を示す。簡単には、処置の48時間後、ネトリン1または既知の成長因子PDGFは、ヒトまたはラット血管平滑筋細胞（VSMC）の増殖を刺激した。パネル（e）は、ネトリン1（50 ng/ml）またはPDGF （30
ng/ml）のいずれかで処置してから48時間後、一次ラットおよびヒトVSMCの数は、BSA処置（対照）細胞と比較した場合、2倍に増加した。パネル（fおよびg）は、ネトリン1またはVEGFのいずれかで処置したあとの平滑筋細胞、この場合は血管平滑筋細胞の増殖は、時間および用量依存性であった。パネル（h）は、ネトリン1またはBSAの指示濃度で処置してから48時間後の、VSMCを含む細胞培養ウエルの代表的な領域を提供する。 
【０４８２】
例3：ネトリンは内皮細胞および平滑筋細胞の遊走を促進する
内皮および血管細胞種におけるネトリンポリペプチドの発現を考えて、本願発明者らは、改良型ボイデン・チャンバアッセイを用いてネトリンポリペプチドの化学走化性活性を調査した。さらに、本願発明者らは、ネトリンポリペプチドの化学走化性活性を既知の化学誘引物質（VEGFおよびPDGF）と比較した。数回の研究の結果を図4にまとめる。当該図は、ネトリンポリペプチド、ネトリン1が内皮細胞および平滑筋細胞の両方に走化性（前記因子の勾配に細胞が応答するように方向性の化学誘引物質）であることを示す。  
【０４８３】
図4にまとめた実験では、ネトリン1または既知の化学誘引物質に遊走した細胞の数を測定した。パネル（a-d）は内皮細胞（EC）を用いて行った実験をまとめており、パネル（e-h）は平滑筋細胞を用いて行った実験をまとめている。データは、BSAで処理した細胞に対する、テスト因子で処理した細胞に認められた遊走の相対増加量として提示されている。前記図は、実験ごとに3回繰り返した、少なくとも3回の独立した実験の結果を表す。 
【０４８４】
パネル（a-d）は、ネトリン1が内皮細胞に走化性で、ネトリン1の活性がVEGFに類似していることを示す。パネル（a）は、ネトリン1（50
ng/ml）およびVEGF（10 ng/m）が、それぞれ、改良型ボイデン・チャンバ・アッセイにおいて、HAECおよびHMVECの両方の遊走を誘導したことを示す。パネル（b）は、内皮細胞、この場合はHMVECの遊走が、ネトリン1の濃度に正比例していることを示す。パネル(c)は、各チャンバのネトリン1ポリペプチドが等モル量の場合（たとえばネトリン勾配をなくす）、ネトリン1が誘導した方向性の遊走（たとえば走化性）が内皮細胞遊走を低減させたことを示す。パネル（d）は、ネトリン1（50
ng/ml）またはVEGF （10 ng/ml）に応答して遊走する内皮細胞、この場合はHMVECの代表的な領域を提供する。パネル(d)の細胞を、可視化しやすくするためにDAPIで染色する。 
【０４８５】
パネル（e-h）は、ネトリン1が平滑筋細胞に走化性で、ネトリン1の活性がPDGFに類似していることを示す。パネル（e）は、ネトリン1（50
ng/ml）およびPDGF （30 ng/m）が、それぞれ、ラットおよびヒトVSMCの遊走を誘導したことを示す。パネル(f)は、ネトリン1への遊走が二相性で50ng/mlにピークがあることを示す。パネル(g)は、各チャンバのネトリン1が等モル量の場合（たとえばネトリン勾配をなくす）、ネトリン1が誘導した方向性の遊走（たとえば走化性）がVSMC遊走を低減させたことを示す。パネル（h）は、ネトリン1（50
ng/ml）またはPDGF （30 ng/ml）に応答して遊走する平滑筋細胞、この場合はVSMCの代表的な領域を提供する。パネル(d)の細胞を可視化しやすくするために、DAPIで染色する。
【０４８６】
例4：平滑筋細胞の接着を促進する
ネトリンは少なくともある細胞種の接着を促進する。理論に制限されることなく、ネトリンが媒介する接着はインテグリンまたはその他の細胞種特異的レセプタとの相互作用による場合がある。したがって本願発明者らは、ネトリンポリペプチドが1つ以上の心血管細胞種の接着を促進することができるかどうかを調べた。これらの実験の結果を図5にまとめる。当該図は、ネトリンポリペプチドネトリン1が平滑筋細胞、特に血管平滑筋細胞の接着を促進したが、HAECまたはHMVECのいずれの接着も促進しなかった。  
【０４８７】
図5のパネル（a-c）は、ネトリン1、フィブロネクチン（FN）、ラミニン、コラーゲンI、またはコラーゲンIVに応答する、血管平滑筋細胞（VSMC）および2種類の内皮細胞種（EC）の接着の定量分析を提供する。簡単には、細胞培養皿のウエルをネトリン1またはテストマトリックス成分（たとえばBSA、FN、ラミニ、コラーゲンIまたはコラーゲンIV）でコーティングした。内皮細胞または平滑筋細胞をコーティングしたウエルに播種して、30分間放置して接着させた。30分間のインキュベーション時間のあと、前記細胞を洗浄した。接着（たとえば前記細胞の接着を媒介する、あるコーティングの能力）を、テストコーティングに接着する細胞の数をBSAでコーティングしたウエルと比較することによって測定した。前記図は、実験ごとに3回繰り返した、少なくとも3回の独立した実験の結果を表す。 
【０４８８】
パネル(a)は、一次ラットおよびヒト平滑筋、特にVSMCがネトリン1コーティング皿とFNコーティング皿の両方に接着したことを示す。反対に、2種類の内皮細胞種、HAECおよびHMVECはネトリン1コーティング皿に接着しなかった。しかし、これらの内皮細胞種はFNでコーティングされたさらに接着しなかった。パネル（b）は、BSA、ネトリン1、またはFNのいずれかでコーティングした皿に接着するH&E 染色細胞の代表的な領域を提供する。  
【０４８９】
ネトリン1が促進する血管平滑筋細胞の接着を考えて、本願発明者らは、ネトリン媒介を既知のマトリックスタンパク質によって媒介される接着と比較した。パネル（c）は、VSMCのネトリン1への接着は、FN、ラミニン1、コラーゲンI、およびコラーゲンIVによって媒介される接着に匹敵することを示す。 
【０４９０】
例5：ネトリンレセプタネオゲニンは血管平滑筋のネトリンシグナル伝達を媒介する
本願発明者らは、平滑筋細胞および内皮細胞に、既知のネトリンレセプタが媒介するネトリンシグナル伝達がもしあれば同定しようと試みた。図6には、これらの細胞種のネトリンレセプタの同定を目的とした多数の実験の結果をまとめる。これらの結果は、前記ネトリンレセプタネオゲニンが血管平滑筋のネトリンシグナル伝達を媒介することを示す。しかし、ネオゲニンは内皮細胞のネトリンシグナル伝達は媒介しないようである。  
【０４９１】
パネル（aおよびb）は、血管平滑筋細胞および内皮細胞の各種ネトリンレセプタの発現の分析を提供する。パネル(a)は、RT-PCR 分析の結果を提供し、ネオゲニンmRNAは平滑筋細胞に発現し、内皮細胞では少なめであるということを示す。パネル（b）は、ネオゲニンタンパク質は血管平滑筋細胞に発現することを示すウエスタンブロット分析を提供する。ネオゲニンは内皮細胞には発現しないようである。しかし、内皮細胞に発現したネオゲニンは、VSMCでの発現を検知する能力のある同一の抗体に免疫応答しないという点で、相異する可能性がある。パネル（aおよびb）にまとめられた実験では、DCCレセプタ発現は内皮細胞にもVSMCにも検出されなかった。  
【０４９２】
VSMCにおけるネオゲニンの発現を考えて、本願発明者らはネオゲニン遮断抗体を用いた実験を行い、VSMCにおいてネオゲニンがネトリンシグナル伝達を媒介するかどうかを評価した。パネル（c）には、遊走アッセイの結果がまとめられており、ネオゲニン遮断抗体がVSMCのネトリン1媒介遊走を阻害したことを示している。しかし、前記ネオゲニン遮断抗体はPDGFが媒介するVSMCの遊走を阻害しなかった。さらに、前記ネオゲニン遮断抗体は、ネトリンが媒介するか、またはVEGFが媒介する内皮細胞の遊走を阻害しなかった。 
【０４９３】
さらに、本願発明者らは、ネオゲニン遮断抗体を用いた実験を行い、VSMCのネトリン媒介接着をネオゲニンが媒介するかどうかを評価した。パネル（d）には接着アッセイの結果がまとめられており、ネオゲニン遮断抗体がVSMCのネトリン1媒介接着を阻害したことを示している。しかし、前記ネオゲニン阻止抗体はVSMCのフィブロネクチン（FN）への接着を阻害しなかった。  
【０４９４】
例6：ネトリンはin vivoにおいて血管新生を促進する
上述の例は、ネトリンポリペプチドおよびネトリンシグナル伝達が心血管細胞種の増殖、遊走、および接着を調節することができることを実証する。本願発明者らはさらに、2種類のin vivo血管新生アッセイを用いて、ネトリンおよびネトリンシグナル伝達の操作がin vivoにおける細胞のふるまいを調節できるかどうかを調べた。図7にまとめられた結果は、ネトリンポリペプチドおよびネトリンシグナル伝達の操作がin vivoにおける血管新生を促進したことを示す。
【０４９５】
パネル（aおよびb）は、絨毛尿膜（CAM）アッセイを用いて行った実験の結果を示す。ネトリン1は、前記（CAM）アッセイにおいて、血管新生および血管の萌芽を誘導した。さらに、ネトリン1は既知の血管新生因子VEGFおよびbFGFに匹敵するレベルの血管新生を誘導した。簡単には、ネトリン1、VEGF、FGF、またはBSAをスポンジに染みこませ、ニワトリCAMの上に置いた。72時間後にスポンジに萌芽した血管の数を計数し、BSA処理したスポンジと比較した増加倍数として定量化した。各テスト因子のために、合計24 CAMアッセイを行った。  
【０４９６】
パネル（cおよびd）は、マウス角膜微小ポケットアッセイを用いて行った実験の結果を示す。ネトリン1はマウス角膜微小ポケットアッセイにおいて血管新生を誘導し、血管新生のネトリン媒介誘導のレベルはVEGFのものに匹敵した。さらに、本願発明者らはネトリン1とVEGFの併用投与の血管新生作用を評価し、2つの因子が相乗的に作用して血管新生を促進することがわかった。  
【０４９７】
簡単には、0.3nMのネトリン1またはVEGFのいずれかを含有するヒドロンペレットは、匹敵するレベルの血管成長を刺激した。しかし、ネトリン1およびVEGFを組み合わせると、前記の2因子は血管新生の相乗効果を有した。つまり、ネトリン1およびVEGFの組み合わせにより生じる応答は、それぞれ個別の因子への応答の合計よりも大きかった。単一の実験では、各テスト因子を6つの網膜の上に置いた。各実験は最低3回繰り返した。   
【０４９８】
材料および方法
以下の方法は、上述の例において概説された実験全体を通して用いられた。 
【０４９９】
マウス胚の発達段階の決定、およびin situハイブリダイゼーションは、標準方法に従った（たとえば、Urness et al., 2000参照）。In situハイブリダイゼーションのためのジゴキシゲニン（DIG）標識cRNAプローブは、標準方法を用いて調製した。   
【０５００】
RNAの単離のために、TRIZOL
(Gibco-BRL社)を用いて、完全RNAをHUVEC、HMVECおよびhAoSMCから単離した。脳のRNAは、BD Biosciences社から購入した。RNAは、RETROスクリプトキット(Ambion社)を用いて逆転写し、製造者の指示に従ってPCRに用いた。以下のプライマ対を用いた。
【０５０１】
ヒトDCC:                  フォワード 5’- acaggcctcaaaccaaacac-3’  (配列番号 29)
リバース
5’-acctccatctccatgacgac-3’  (配列番号 30)  
ヒトネオゲニン:       フォワード 5’-accccagcctgtgattagtg-3’  (配列番号 31)
リバース
5’-tgtgatggttcagagcttgc-3’  (配列番号 32)
ヒト Unc5h2:  フォワード 5’-agttgcctctcctcctcctc-3’  (配列番号 33) 
リバース
5’ctttgcctttttgcttttgg-3’  (配列番号 34)
GAPDH:                      フォワード 5’- acccagaagactgtggatgg-3’  (配列番号 35) 
リバース
5’-tgctgtagccaaattcgttg-3’.  (配列番号 36)  
【０５０２】
DCC、ネオゲニンおよびUnc5h2を増幅するために以下の条件を用いた。それは、94℃で30秒間変性、58℃で30秒間アニーリング、および72℃で45秒間伸長、を35サイクルである。GAPDHを増幅するために用いた条件は、94℃で30秒間変性、58℃で30秒間アニーリング、および72℃で45秒間伸長、を30サイクルである。 
【０５０３】
免疫組織学的分析およびウエスタンブロット分析は、記述の通り行った（たとえば、Urness et al., 2000参照）。ネトリン1（Oncogene社）、DCC（Oncogene社）、ネオゲニン（Santa Cruz Biotech社）、Unc5h2（Lindsay Hinck（米サンタクルズ）から寄贈）、およびCD31（Dako社）を認識する一次抗体を用いた。
【０５０４】
In vitroアッセイ
BSAおよびPDGF-BB はシグマ社から入手した。組換えヒトVEGF-165、FGF-2およびネトリン1はR&Dシステムズ社から購入した。フィブロネクチン、ラミニン-1、コラーゲンIおよびコラーゲンIVは、BDバイオサイエンシズ社から購入した。ヒト大動脈平滑筋（VSMC）、ヒト大動脈内皮細胞（HAEC）、およびヒト微小血管内皮細胞（HMVEC）を、製造者（Cambrex社）の指示にしたがって培養した。上述の生物学的アッセイはすべて、個別の処置について盲検化した個人によって行われた。各アッセイは、一次細胞の少なくとも2つの独立サンプルについて2回繰り返し、個別に3回再生した。さらに、実験範囲内の各条件は、3回繰り返して行った。  
【０５０５】
A.  増殖：in vitroアッセイにおける細胞分裂活性化の読み出しは、細胞数の変化である。これは、細胞分裂活性の最も直接的な測定法である。低継代の一次内皮細胞または血管平滑筋細胞を、24穴プレートに等濃度で16時間血清欠乏にして播種した。血清欠乏状態後、指示された濃度の因子（BSA、PDGF-BB、VEGF-165、ネトリン1）を加えた。処置から24、48、および72時間後、細胞数を、血球計、または固定染色細胞の係数のいずれかによって測定した。細胞数の増加倍数を、24時間経過時点でBSA処理ウエルと比較して計算した。細胞の代表的な領域をH&E（シグマ社）で染色し、撮影した。 
【０５０６】
B.  遊走：遊走を測定するアッセイのために、血管内皮細胞を一晩血清欠乏の状態においてから、トランスウエル挿入物の上に40,000細胞／ウエルの密度で播種した。テスト因子を無血清培地に加え、下方のチャンバに置いた。37℃で3時間インキュベーションした後、ザンボニ固定液でフィルタを固定し、DAPI染色キット（フィッシャー社）で染色した。遊走細胞の合計数を、5ヶ所の無作為の領域を400倍に拡大して計数して計算した。この遊走細胞の数は、増加倍数として表した。  
【０５０７】
血管平滑筋細胞の遊走を測定するアッセイを、内皮細胞について上述のとおり行ったが、異なる点が2点あった。30ng/ml PDGF-BB を、血管平滑筋細胞を用いた実験の陽性対照として用い、血管平滑筋細胞を播種する際に、内皮細胞の遊走を評価するために用いた5μmではなく、8μmのトランスウエル挿入物を用いた。  
【０５０８】
あるネトリンレセプタがネトリンの作用をブロックする能力を調べる実験のために、細胞を0.1μg/mlのネオゲニンまたはDCCで30分間前処理してから、情報のチャンバに加えた。  
【０５０９】
C.  接着：接着を測定するアッセイのために、96穴プレートをBSA、ネトリン1、フィブロネクチン、ラミニン-1、コラーゲンI、およびコラーゲンIVで、16乃至20時間、4℃でコーティングした。細胞の接着の前に、ウエルを、1%BSAを含有するPBS1で1時間、室温でブロックした。細胞をトリプシン処理で収集し、成長因子で中和して、2回洗浄し、0.5%BSAを含有する無血清DMEMに再懸濁させた。5 X 104細胞を各ウエルに加え、CO2インキュベータに37℃で30分間放置して接着させた。PBSで3回洗浄したあと、細胞を固定し、H&Eで染色して計数した。ブロッキング実験のために、細胞を10μg/mlのネオゲニン抗体で30分間前処理した。
【０５１０】
In vivoアッセイ
ネトリン関連組成物がin vivoにおいて血管新生を促進するか血管を調節する能力を調べるために、絨毛尿膜（CAM）アッセイを用いた。レグホン種ニワトリの受精卵を、37℃、一定の湿度（60%）の条件下でインキュベートした。卵を滅菌ポリエチレンラップのハンモックに割り入れて、37℃、2.0% CO2、および90%相対湿度でインキュベーション第6日までインキュベートした。テスト因子を吸着させたメチルセルローススポンジ（ゲルフォーム、Upjohn社、ミシガン州カラマズー）を、インキュベーション第6日にCAM上に置いた。BSAのみ、FGF-2、またはVEGFを含有するスポンジを対照として用いた。メッシュ（Tetko社）を前記スポンジの上に置き、その位置がわかるように印を付けた。前記CAMを37℃で72処置時間インキュベートし、4%パラホルムアルデヒド/2%グルタルアルデヒド/PBSの中で固定した。  
【０５１１】
処置後、移植したメッシュを取り囲む微小血管の平均数を、イメージJソフトウェアまたは盲検化レビューアのいずれかを用いて計算した。前記対照と比較した微小血管の数の変化を計算し、増加倍数で表した。
【０５１２】
ネトリン組成物が血管細胞種を調節する能力を調べるために、マウス網膜微小ポケットアッセイとよばれる2番目のin vivoアッセイも用いた。マウス網膜微小ポケットアッセイのために、スクラルファート（Sigma社）を含有するヒドロン（Hydro Med Sciences社）ペレット、および指示された成長因子を、既述のとおり調製した。前記ペレットを移植し、前記成長因子を含有するペレットによって誘導した血管新生度を評価した。  
【０５１３】
簡単には、7乃至8週齢オスC57BL/6マウスをアバーティン（Sigma-Aldrich社）の腹腔内注射で麻酔し、その目をプロパラカインで局所的に麻酔した。外科用メス10番で瞳孔の側方を切開し、フォングレーフェ・メス3番でこの切開から縁に向かって網膜微小ポケットを切除した。ペレットをこの微小ポケットに移植して、局所エリスロマイシンを適用した。前記ペレット移植の移植から5乃至6日後、血管新生を細隙灯顕微鏡で可視化して測定した。血管が新生した領域を、以下の式、2p/10 × 時間 × 血管の長さ (mm)で計算し、血管新生度を対照ペレットを移植した動物と比較した。
【０５１４】
例7：癌細胞株およびヒト腫瘍におけるネトリンの発現
腫瘍を維持して数多くの癌腫の成長および転移における血管新生の役割は公知である。事実、数種類の現在の癌療法は、血管新生を阻害して腫瘍の成長および成長を抑制することに基づく。本出願に詳細に概説されるとおり、ネトリンポリペプチドおよびネトリンシグナル伝達は血管新生を促進することができる。同様に、ネトリンの活性および発現を阻害する作用物質は、血管新生を阻害することができる。ネトリンの活性および発現を阻害して血管新生を阻害するような作用物質は、多くの種類の癌の治療に用いることができる。  
【０５１５】
本願発明のこの局面は、図8にまとめられる実験によってさらに支持される。簡単には、図8はネトリンポリペプチド、ネトリン1が数個の癌細胞株に発現することを示す。さらに、ネトリン1はヒト癌組織に発現する。癌細胞株および一次癌組織におけるネトリンの発現は、癌細胞および腫瘍がネトリンの調節に応答している可能性が高いことを示唆する。  
【０５１６】
簡単には、パネル（a）および（b）は各種癌細胞株におけるネトリン1発現のノーザンブロット分析を示す。パネル（A）では以下の細胞株、(1)前骨髄球性白血病HL-60、(2)ヘラS3、(3)慢性骨髄性白血病K-562、(4)リンパ芽球性白血病MOLT-4、(5)バーキットリンパ腫Raji、(6)結腸直腸腺癌SW480、(7)肺癌A549、および(8)黒色腫G-361、が調べられた。パネルBでは以下の細胞株、(1)急性T細胞白血病ジャーカット、(2)バーキットリンパ種CA46、(3)乳癌MDA-MB-453、(4)バーキットリンパ種namalwa、(5)表皮癌A-431、(6)子宮癌MES-SA、(7)バーキットリンパ種Raji、(8)骨肉腫MG-63、および(9)組織球性リンパ腫U-937、が調べられた。
【０５１７】
ノーザンブロット分析では、ネトリン1は、ヘラ63細胞（パネルA、レーン2）、結腸直腸腺癌（SW480、パネルA、レーン6）、表皮癌（A-431、パネルB、レーン5）、子宮癌（MES-SA、パネルB、レーン6）、および骨肉腫（MG-63、パネルB、レーン8）で強く発現した。ネトリン1は、程度は少ないが、リンパ芽球性白血病（MOLT-4、パネルA、レーン4）、肺癌（A549、パネルA、レーン7）、黒色腫（G-361、パネルA、レーン8）、急性T細胞白血病（ジャーカット、パネルB、レーン1）、およびバーキットリンパ種（CA46、パネルB、レーン2）でも検出された。
【０５１８】
本願発明者らは、ノーザンブロット分析はRT-PCRよりも感度が低いことを指摘する。したがって、さらなる細胞株は1つ以上のネトリンポリペプチドを発現してもよく、ノーザンブロット分析による強いシグナルの欠如は必ずしも発現の欠如を示唆するとは限らない。
【０５１９】
パネルCは、ネトリン1タンパク質が複数の細胞種に由来する各種のヒト一次腫瘍に発現することを示す。ヒト腫瘍組織の切片（脳癌、乳癌、および膵癌）を、ネトリン1に免疫応答性の抗体か、または内皮マーカCD31に免疫応答性の抗体のいずれかを用いた免疫組織化学によって分析した。ネトリン1は、3つすべてのヒト腫瘍組織に発現した。さらに、ネトリン1発現およびCD31発現の共局在化は、ネトリンがこれらの腫瘍の中にある血管系に発現することを示唆した。  
【０５２０】
例8：血管新生ネトリンレセプタの同定
前節では、本願発明者らはネトリン1およびネトリン4は内皮増殖および遊走を誘導することを示した。本願発明者らの予備研究では、Unc5h2以外の既知のネトリンレセプタの発現は、内皮細胞には実質的に認められないことを示した。これらの発見は、ネトリン1のプロ血管新生作用が未同定のレセプタによって媒介され、Unc5h2がネトリン1の誘引作用を遮断または低減するという、本願発明者らの仮定を支持する。
【０５２１】
ネトリンのプロ血管新生作用または誘引作用に関与する内皮レセプタを同定するために、本願発明者らの初期の実験は、アデノシンレセプタなどの明らかな候補レセプタの役割の研究に重点を置いた。アデノシンは、血管緊張、心筋細胞収縮性、神経伝達の調節、および細胞成長の制御に公知の役割を有する内因性ヌクレオシドである。アデノシンレセプタの4亜種をクローニングし、内皮細胞A1、A2A、A2B、およびA3に発現する。本願発明者らは、アデノシンレセプタがネトリン1への内皮応答を媒介すると仮定した。
【０５２２】
第1に、本願発明者らは、ネトリン1のA2B
レセプタへの結合を示した公開済みの報告を再現した。本願発明者らは、これらの実験を拡張して、ネトリン4がA2Bレセプタに結合しないことを明らかにした。第2に、本願発明者らは、アデノシンレセプタが、非選択性アデノシンレセプタ阻害因子、DPSPXを用いることに夜ネトリンシグナル伝達に重要かどうかを決定した。本願発明者らの初期の結果は、DPSPX阻害ネトリン1は内皮遊走を媒介し、VEGF媒介内皮遊走への影響は小さいことを示唆した。これらの予備発見は、A2B レセプタがネトリン1のプロ血管新生作用を媒介する可能性と一致する。候補A2B レセプタのいずれもがネトリンの内皮細胞への細胞分裂促進性および化走性に関与するかどうかを決定しなければならない。  
【０５２３】
さらに、内皮細胞のプロ血管新生ネトリンレセプタは、発現クローニングによって同定することができる。この目的のために、本願発明者らは、スクリーニングに理想的な平均cDNA長が2kbの内皮cDNA発現ライブラリを有している。本願発明者らはさらに、ビオチンまたはアルカリホスファターゼのいずれかでネトリン1を標識し、これらの修飾がその機能および結合特性に影響しないということを示した。標識したネトリン1は標準的なレセプタに結合し、内皮遊走アッセイに置いて活性である。これらの試薬およびアッセイによって、内皮発現ライブラリをスクリーニングすることができる。
【０５２４】
例9：「反発性」ネトリンレセプタUnc5h2の役割の特徴付け
まず、本願発明者らは、マウスの中に、Unc5h2の2つの突然変異対立遺伝子、ヌル対立遺伝子、および条件付きヌル対立遺伝子を作製した。これらの対立遺伝子の顕著な特徴は、(1)Unc5h2は、多くのリガンド結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および部分的またはドミナントネガティブ活性の確率を下げる細胞質シグナル伝達ドメインを含む、遺伝子の重要な部分が除去される欠失によって不活化され、これはUnc5h2ゲノム配列の3番および13番イントロンの挿入lox P部位によって達成された、および(2)いずれの対立遺伝子も、たとえば抗生物質耐性遺伝子などの、外来性のDNAの大きい管を含有せず、遺伝子発現に影響すると知られているcis作用を除外する、である。
【０５２５】
前記条件付き対立遺伝子、または前記条件付きおよびヌル対立遺伝子を含む化合物ヘテロ接合体にホモ接合性のマウスは、完全に生存可能で繁殖性である。しかし、前記ヌル対立遺伝子へのホモ接合性は胚の致死を引き起こす。Lu et al. の報告と一致して、本願発明者らは、Unc5h2-/- 胚の血管欠損が微小であって、わずかな割合のマウスしか心臓形成異常および心膜液貯留を発症しないことを発見した。Lu et al.とは対照的に、本願発明者らは、貧血、頭顔異常、脱色性視神経円板、神経管形成異常、および胚の第12.5日目での全身発達停止を含む、その他の欠損症であって、その他に認められた血管異常よりも重篤度が高い欠損症を認めた。これらの表現型のいずれがUnc5h2の欠如から直接生じたのかを確認するために、本願発明者らは、前記条件付き対立遺伝子を含有するマウスにおけるUnc5h2の欠損を一時的および空間的に制御することができるCreドライバマウスを多数集めた。  
【０５２６】
E12.5 Unc5h2 -/- 胚の欠陥はE11.5には存在せず、遺伝子型を隠された観測者がUnc5h2 -/- をUnc5h2 +/+ 胚と区別するために用いることはできない。現在、そのような観測者らがE11.5 の時点でUnc5h2 -/- マウスを+/+マウスから区別することができるような表現型の差異は、心拍数および血流の低下だけである。一瞥した心臓の形態の検査では、心筋細胞数の全体的な異常、心肥大、または逆転を示唆しない。  
【０５２７】
次に、本願発明者らはマウス胚（たとえばノックアウトマウスおよびその野生種仔）から分離したさまざまな一次細胞のネトリンレセプタの機能的役割を研究した。たとえば、本願発明者らは野生種胚から内皮細胞を分離し、内皮マーカの免疫染色を行い、前記細胞がネトリン1に遊走することを示した。ネトリンレセプタの機能的役割はこれから決定されるだろう。
【０５２８】
例10：幹細胞および心障害へのネトリンの作用の研究
ネトリンの治療可能性を確立するために、本願発明者らは、血管新生の促進と心臓機能の向上に関与する各前記細胞種（たとえば幹細胞および心筋細胞）へのネトリンの作用を調べた。まず、本願発明者らが公表した報告および予備データから、ネトリンが内皮萌芽を刺激することが証明された。次に、本願発明者らは、ネトリン1およびネトリン4がヒトCD34+造血幹細胞の遊走を誘導することを示した（図10）。骨髄由来幹細胞は、心臓に注射した場合、梗塞後心筋損傷を低減し、これらの細胞は新規に形成された血管細胞の中の内皮細胞の10乃至15%に寄与する。3番目に、ネトリン1またはネトリン4は、培養物中の心筋細胞の生存および成長を阻害（もしくは刺激）しない。これらの研究を合わせると、ネトリンは、血管新生を誘導し、循環幹細胞を心臓の虚血領域に回帰させることによる治療効果を有している可能性があることを示唆している。
【０５２９】
次に、本願発明者らは、ネトリンの過剰発現が血管新生を促進し、冠動脈94乃至96の慢性結紮後の心損傷を低減させることができるかどうかを調べる。本願発明者らは、確立された心筋梗塞モデルでのこのアッセイを確立した。本願発明者らの周術期死亡率は0%であるが、14日目の死亡率は10%である。死亡は心室破裂に続発し、冠動脈結紮から2乃至5日後に生じる。病理学的に測定した梗塞サイズは40%で、心室駆出分画は40%（正常値は70%）である。したがって、本願発明者らは心筋梗塞へのネトリンの作用をin vivoでアッセイすることができる。  
【０５３０】
次に、本願発明者らは、ネトリンの異所性発現を空間的および一時的に制御できるマウスを作製する。最初の注目点は成体心筋細胞におけるネトリン1の発現である（図11）。第1に、ネトリン1cDNAを含有する人工エキソンを、ROSA26遺伝子座の第1イントロンに向ける。この遺伝子座は、組換え頻度が高いので標的化しやすく、その他はパラクリン因子99の発現を誘導するプロモータを用いた。ネトリン1発現は、ネトリン1コード配列の前のloxP隣接転写停止シグナルの存在によってサイレンシングされる。ネトリン1発現は、CREリコンビナーゼの活性化後のこのシグナルの除去によって誘導することができる。DRE活性化可能lacZ遺伝子を含有するROSA 26の第2の対立遺伝子は入手可能で、このシステムの忠実性を評価するために用いられる。ROSA遺伝子座は、組換えの容易さと、パラクリン因子99の発現を誘導するプロモータの堅固性でよく知られている。ROSA遺伝子座を標的とするネトリン1またはネトリン4のいずれかを有する胚性幹細胞は、サザンブロット分析法によって短時間で同定することができるだろう。第2に、遺伝子架橋によって、2つのROSA 26対立遺伝子、ネトリン1（net）およびLac Z（lac）とともに、CREが(1)成熟心筋細胞に活性化されたMHCプロモータの転写制御下、および(2)タモキシフェン応答性エストロゲンレセプタ要素への融合による転写後制御下にある組換え遺伝子を含有するマウスを作製することができる。したがって、これらのROSA26 net/lac、MHC-CREer マウスは、心組織のみ、およびタモキシフェンへの曝露後のみにROSA26遺伝子座からネトリン1を発現することが予測されている。 
【０５３１】
例11：虚血性ニューロパシおよび後肢へのネトリンの作用の研究
アテローム性硬化症および／または糖尿病によって生じる末梢血管疾患は、齧歯類およびウサギを、手術で大腿動脈を結紮し、前記結紮部から遠方の動脈部分を除去して、モデルとすることができる。結紮によって生じさせた肢虚血も肢ニューロパシを生じることが知られている。健康な動物およびヒトの虚血性損傷は、その後前記の損傷組織の再生および回復を誘導する数多くの経路を活性化させる。たとえば、VEGFは後肢虚血に応答して誘導され、この虚血性損傷後に薬理学的に投与される場合、回復を速めることができる。本願発明者らは、ネトリンが動物およびヒトの肢虚血を調節し、ネトリン関連治療物質が、内因的および薬理学的背景の両方において血管再生および虚血性ニューロパシからの回復に有用である可能性を調べた。
【０５３２】
この目的のために、本願発明者らは、FVBマウス後肢虚血（HLI）モデル（非糖尿病性）、および糖尿病マウスモデル（突然変異マウスdb/db）などの動物モデルにおける研究を行うことができる。前記動物をネトリンで処置し、それからネトリンの糖尿病／虚血性ニューロパシおよび虚血性後肢（HLIモデル）への作用を評価する。代替的には、BMTモデル（Rosa26 BMT db/dbマウス）で研究を行うことができる。本願発明者らは、ネトリン処置後の、骨髄由来細胞の虚血部位への寄与を評価する。  
【０５３３】
前記動物モデルを、ネトリンをコードするプラスミドDNAなどの遺伝子、または組換えマウスネトリン1タンパク質などのタンパク質で処理（投与）することができる。
【０５３４】
前記動物モデルの評価は、1)感覚神経伝導速度（SNCV）、運動神経伝導速度（MNCV）、およびテールフリック試験などの神経生理学的測定、2)たとえば虚血肢（HLIモデル）のためのレーザドップラ画像法（LDI）、3)たとえば神経および筋肉など（FITC-BS1 レクチンによる毛細血管）のための組織学／蛍光染色、および4)イソレクチンB4/アクチニンおよびS100を併用した、eNOS、VEGFおよびネトリン1などによる二重免疫蛍光染色を含む方法によって行うことができる。
【０５３５】
さらに、本願発明者らは、たとえばネトリンで処理したマウス内皮細胞およびシュワン細胞などにおける、in vitro研究を行うことができる。ネトリンの作用は、遊走アッセイ、増殖アッセイ、接着アッセイ、アポトーシスアッセイ、管形成アッセイ、血管新生cDNA遺伝子アレイ、およびVEGF、eNOSおよびその他のマーカについてのウエスタンブロットを含む、各種のアッセイによって決定することができる。特に、本願発明者らは、以下のシグナル伝達経路、1)UNC5Bレセプタ（前記血管システムの形態形成を制御する内皮細胞の反発性ネトリンレセプタ）、2)MAP1B（微小管とアクチン線維の間の会話に示唆されるニューロン特異的微小管関連タンパク質）、および3)FAK（細胞接着および遊走の制御に示唆される病巣接着キナーゼ）、のうちの1つをネトリンが調節するかどうかを決定する。
【０５３６】
引用による援用
すべての公表物、特許および特許出願は、各公表物、特許、または特許出願が特異的および個別的に引用によりその全体を援用することを示唆されるのと同程度に、本願明細書にその全体を援用により引用される。
【０５３７】
等価物
本願発明の特定の実施態様が検討されているが、上述の明細書は具体例であって制限的ではない。本願発明のたくさんの変形物は、本願明細書および前述の請求項を精査の上、当業者に明らかになるであろう。  当業者であれば、ごく普通の実験を用いるのみで、ここに説明した本願発明の特定の実施態様の等価物を数多く認識し、または確認できることであろう。このような等価物は、添付の請求の範囲の包含するところである。
【図面の簡単な説明】
【０５３８】
【図１】完全長ネトリンポリペプチドのドメイン構造の代表的な図を示す。このドメイン構造は、ヒトおよび齧歯類を含む広範囲の生物から分離されたネトリンポリペプチド全体をカバーする。簡単には、完全長ポリペプチドは、長さ約600アミノ酸残基である。前記ポリペプチドは、グリコシル化されていることが多く、分子量は約70乃至80kDaである。前記ポリペプチドのN末端側の2/3（ドメインVI、ならびにドメインv1、v2、およびv3）はA、B1およびB2のラミニンのポリペプチド鎖のN末端に相同である。さらに、ドメインv1、v2、およびv3は、ネトリンとDCCおよびネオゲニンレセプタの結合を媒介する。 前記タンパク質の3分の1のカルボキシ末端は、高度に塩基性で、ネトリンとインテグリンの間の相互作用を媒介することがある。
【図２】マウス胚および成体組織におけるネトリン1の発現を示す。パネル（a-f）は、アンチセンスネトリン1プローブを用いたin situ胚ブリ題せーションによるマウスE9-E10組織における、ネトリン1の発現を示す。パネル（a-c）は、ネトリン1発現の全体を示し、パネル（d-f）はネトリン1発現の断面を示す。底板（黒矢印で示す）および体節（赤矢印で示す）にあるネトリン1の強い発現に注目されたい。パネル（g-j）は成人胸および脳組織の8ミクロンの断片におけるネトリン1タンパク質の発現を示す。断片はネトリン1タンパク質に免疫応答性の抗体（パネルgおよびi）、または内皮マーカCD31に免疫応答性の抗体（パネルhおよびj）で染色した。脳および胸の血管を取り巻くネトリン発現、および胸の管状組織全体の発現に注目されたい。
【図３】ネトリンが内皮細胞および平滑筋細胞を刺激したことと、ネトリンの増殖作用がVEGFの作用に匹敵することを示す。
【図４】ネトリンが内皮細胞および平滑筋細胞を誘導したことと、ネトリンの走化性効果がVEGFの作用に匹敵することを示す。
【図５】ネトリンが平滑筋細胞の接着を促進したことを示す。
【図６】レセプタネオゲニンが血管平滑筋のネトリンシグナル伝達を媒介することを示す。
【図７】ネトリンが、in vivoにおいて血管新生を促進することを示す。
【図８】各種腫瘍および腫瘍細胞株におけるネトリンの発現を示す。
【図９】Unc5h2についての条件付き対立遺伝子を有するマウスの作製を示す。パネルAはPCRプライマとゲノム型決定に用いられるサザンプローブを用いたターゲティング戦略を示す。相同性組換えがUnc5h2Neo対立遺伝子を生じる。ネオマイシンカセットはFrt部位に隣接し、Flpリコンビナーゼによって除去されて、Unc5h2C対立遺伝子が生じる。Unc5h2C対立遺伝子およびCreリコンビナーゼを有する細胞は、エキソン4乃至14を除去し、loxP部位間の領域がUnc5h2C対立遺伝子を有する。エキソン9にコードされた膜貫通ドメインに黒線で印を付ける。パネルBおよびCは、2匹の独立した創始キメラから生まれた仔をサザンブロットおよびPCR分析することで、生殖細胞系伝達が確認されることを示す。
【図１０】ネトリンがヒト造血幹細胞（HSC）への化学誘引物質であることを示す。磁気ビーズを用いてCD34発現のために、HSCを濃縮した。ネトリン1およびネトリン4は、血清由来因子1aおよびVEGFと同様に走化性であった。
【図１１】タモキシフェンで誘導した心臓におけるネトリン1の過剰発現マウスを作製する、作成物および交配を示す。左パネルは、Creリコンビナーゼの存在下のみに置いて、PGK-Neoカセットおよび停止シグナルを組換えによって除去することができ、ROSA26プロモータがネトリン1発現を誘導することを示す。右パネルは、ROSA26+/lacとMHC-CREERの間の適切な交配によって、タモキシフェンで処理した場合に心臓にネトリン1を発現するマウスを作製していることを示す。上述のベクタは、単一のクローニングステップで任意の特定のcDNAを挿入することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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