(57)【要約】  癌等の病的状態を治療するための、デスレセプターリガンド、例えばＡｐｏ-２リガンド／ＴＲＡＩＬポリペプチド、又はデスレセプター抗体、例えばＥＧＦＲインヒビターの使用方法を提供する。本発明の実施態様は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体、例えばＤＲ５抗体又はＤＲ４抗体を、ＥＧＦＲインヒビター、例えばタルセバＴＭと組み合わせて使用する方法を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを亢進させる方法において、有効量のデスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビターに前記細胞をさらすことを含んでなる方法。
【請求項２】
前記細胞が、デスレセプターアゴニストとＥＧＦＲインヒビターに逐次さらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、デスレセプターアゴニストにさらされる前にＥＧＦＲインヒビターにされされる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記デスレセプターアゴニストがＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記細胞が、ＥＧＦＲインヒビター及びデスレセプターアゴニストに同時にさらされる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記デスレセプターアゴニストが、ＤＲ４アゴニスト抗体又はＤＲ５アゴニスト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記ＥＧＦＲインヒビターが、一般式Ｉ
【化１】
2008532937.tif 000014
[上式中：
Ｘはハロ又はヒドロキシであり；
ｍは１、２又は３であり；
各Ｒ１は独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアミノ、カルボキシ、ニトロ、グアニジノ、ウレイド、シアノ、トリフルオロメチル、及び-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)-Ｗ-(フェニル)からなる群から選択され、ここでＷは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；又は
各Ｒ１は独立して、シアノで置換されたＣ１-Ｃ４アルキル及びＲ９から選択され、Ｒ９はＲ５、-ＯＲ６、-ＮＲ６、Ｒ６、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、-ＮＨＯＲ５、-ＯＣ(Ｏ)Ｒ６、シアノ、Ａ及び-ＹＲ５からなる群から選択され；Ｒ５はＣ１-Ｃ４アルキルであり；Ｒ６は独立して、水素又はＲ５であり；Ｒ７はＲ５、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６であり；Ａはピペリジノ、モルホリノ、ピロリジノ、４-Ｒ６-ピペラジン-１-イル、イミダゾール-１-イル、４-ピリドン-１-イル、-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)(ＣＯ２Ｈ)、フェノキシ、フェニル、フェニルスルファニル、Ｃ２-Ｃ４アルケニル、及び-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ６から選択され；ＹはＳ、ＳＯ又はＳＯ２であり；Ｒ５、-ＯＲ６及び-ＮＲ６Ｒ６中のアルキル部分は１ないし３のハロ置換基で置換されていてもよく、Ｒ５、-ＯＲ６及び-ＮＲ６Ｒ６中のアルキル部分は１又は２のＲ９基で置換されていてもよく、該任意置換基中のアルキル部分は、ハロ又はＲ９で置換されていてもよく、但し、２つのヘテロ原子は同じ炭素原子には結合しておらず；又は
各Ｒ１は独立して、-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４)-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノから選択され、Ｒ１０は、ハロ、-ＯＲ６、Ｃ２-Ｃ４アルカノイルオキシ、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、及び-ＮＲ６Ｒ６から選択され；前記-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノのＲ１基は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルキル、シアノ、メタンスルホニル及びＣ１-Ｃ４アルコキシから独立して選択される１又は２の置換基で置換されていてもよく；又は
２のＲ１基は、それらが結合している炭素と共同して、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１又は２のヘテロ原子を含む、５-８員環を形成し；
Ｒ２は、水素、又はハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒ５から独立して選択される１ないし３の置換基で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルであり；
ｎは１又は２であり、各Ｒ３は独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、-ＮＲ６Ｒ６、及びＣ１-Ｃ４アルコキシから選択され、該Ｒ３基中のアルキル部分は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒから独立して選択される１ないし３の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ４はアジド又は-(エチニル)-Ｒ１１であり、Ｒ１１は、水素、又はヒドロキシ、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルである]
を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記ＥＧＦＲインヒビターが、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＥＧＦＲインヒビターがタルセバＴＭである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが配列番号１のポリペプチドの断片である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ断片が、配列番号１のポリペプチドの細胞外ドメインを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記デスレセプターアゴニストが、配列番号１の細胞外ドメインと少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド変異体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記断片が配列番号１のアミノ酸１１４−２８１を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体が、配列番号１の細胞外ドメインと少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有している、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
配列番号１のアミノ酸１１４−２８１を含む前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ断片が、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)分子に結合している、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物における増殖性疾患の治療方法において、前記哺乳動物にＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＥＧＦＲインヒビターを投与することを含んでなる方法。
【請求項１７】
前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＥＧＦＲインヒビターが同時に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、前記ＥＧＦＲインヒビターの前に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記ＥＧＦＲインヒビターが、前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの前に投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記増殖性疾患が癌である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌が、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、及び膵臓癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌が、結腸癌、結腸直腸癌、小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＥＧＦＲインヒビターが、一般式Ｉ：
【化２】
2008532937.tif 000015
[上式中：
Ｘはハロ又はヒドロキシであり；
ｍは１、２又は３であり；
各Ｒ１は独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアミノ、カルボキシ、ニトロ、グアニジノ、ウレイド、シアノ、トリフルオロメチル、及び-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)-Ｗ-(フェニル)からなる群から選択され、ここでＷは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；又は
各Ｒ１は独立して、シアノで置換されたＣ１-Ｃ４アルキル及びＲ９から選択され、Ｒ９はＲ５、-ＯＲ６、-ＮＲ６、Ｒ６、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、-ＮＨＯＲ５、-ＯＣ(Ｏ)Ｒ６、シアノ、Ａ及び-ＹＲ５からなる群から選択され；Ｒ５はＣ１-Ｃ４アルキルであり；Ｒ６は独立して、水素又はＲ５であり；Ｒ７はＲ５、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６であり；Ａはピペリジノ、モルホリノ、ピロリジノ、４-Ｒ６-ピペラジン-１-イル、イミダゾール-１-イル、４-ピリドン-１-イル、-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)(ＣＯ２Ｈ)、フェノキシ、フェニル、フェニルスルファニル、Ｃ２-Ｃ４アルケニル、及び-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ６から選択され；ＹはＳ、ＳＯ又はＳＯ２であり；Ｒ５、-ＯＲ６及び-ＮＲ６Ｒ６中のアルキル部分は１ないし３のハロ置換基で置換されていてもよく、Ｒ５、-ＯＲ６及び-ＮＲ６Ｒ６中のアルキル部分は１又は２のＲ９基で置換されていてもよく、前記任意置換基中のアルキル部分は、ハロ又はＲ９で置換されていてもよく、但し、２つのヘテロ原子は同じ炭素原子に結合しておらず；又は
各Ｒ１は独立して、-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１−Ｃ４)-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノから選択され、Ｒ１０は、ハロ、-ＯＲ６、Ｃ２-Ｃ４アルカノイルオキシ、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、及び-ＮＲ６Ｒ６から選択され；前記-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノのＲ１基は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルキル、シアノ、メタンスルホニル及びＣ１-Ｃ４アルコキシから独立して選択される１又は２の置換基で置換されていてもよく；又は
２のＲ１基は、それらが結合している炭素と共同して、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１又は２のヘテロ原子を含む、５-８員環を形成し；
Ｒ２は、水素、又はハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒ５から独立して選択される１ないし３の置換基で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルであり；
ｎは１又は２であり、各Ｒ３は独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、-ＮＲ６Ｒ６、及びＣ１-Ｃ４アルコキシから選択され、該Ｒ３基中のアルキル部分は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒから独立して選択される１ないし３の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ４はアジド又は-(エチニル)-Ｒ１１であり、Ｒ１１は、水素、又はヒドロキシ、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルである]
の化合物である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
ＥＧＦＲインヒビターが、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＥＧＦＲインヒビターがタルセバＴＭである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
癌細胞の治療方法において、相乗的有効量のデスレセプターアゴニストとＥＧＦＲインヒビターに、哺乳動物の癌細胞をさらすことを含んでなる方法。
【請求項２７】
前記デスレセプターアゴニストが、抗ＤＲ５又は抗ＤＲ４レセプターモノクローナル抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記デスレセプターアゴニストがＡｐｏ-２／ＴＲＡＩＬポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌細胞が、前記相乗的有効量のデスレセプターアゴニストとＥＧＦＲインヒビターにインビボでさらされる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記デスレセプター抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
デスレセプター抗体がヒト抗体である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記デスレセプターアゴニストが、１を越えるＡｐｏ-２リガンドレセプターと交差反応する抗体である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌細胞が、結腸癌細胞、結腸直腸癌細胞、小細胞肺癌細胞、又は非小細胞肺癌細胞である、請求項２６に記載の方法。
【請求項３４】
一又は複数の増殖阻害剤に癌細胞をさらすことをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３５】
放射線に細胞をさらすことをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＲ５抗体が、１０８Ｍ−１ないし１０１２Ｍ−１のＤＲ５レセプター結合親和性を有している、請求項２７に記載の方法。
【請求項３７】
前記デスレセプターアゴニストが、ＣＨＯ細胞、酵母細胞及び大腸菌からなる群から選択される組換え宿主細胞中で発現される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＥＧＦＲインヒビターがタルセバＴＭである、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(関連出願)
この出願は、その内容を出典明示によりここに援用する２００５年２月１８日出願の米国出願第１１/０６１２５８号に基づく優先権を主張する。
【０００２】
(発明の分野)
本発明は、デスレセプターアゴニスト分子及びＥＧＦＲインヒビターの使用方法に関する。特に本発明は、Ａｐｏ-２リガンド／ＴＲＡＩＬ又はＤＲ４又はＤＲ５アゴニスト抗体及びＥＧＦＲインヒビター等の分子の、種々の病的疾患、例えば癌の治療への使用方法に関する。
【０００３】
(発明の背景)
哺乳動物の細胞数の制御は、細胞増殖と細胞死の間のバランスによって部分的に決定されると考えられる。時に壊死細胞死と称される細胞死の一形態は、典型的には、いくつかの外傷又は細胞損傷から生じる細胞死の病的な形態に特徴がある。対照的に、通常は規則的な又は制御された形で進行する細胞死の「生理的」形態がある。この細胞死の規則的又は制御された形態は、しばしば「アポトーシス」と称される[例としてBarrら, Bio/Technology, 12:487-493 (1994)；Stellerら, Science, 267:1445-1449 (1995)を参照]。アポトーシス性細胞死は、胚発生及び免疫系のクローン選択を含む多くの生理的過程において自然に生じる[Itoh 等, Cell, 66:233-243 (1991)]。
【０００４】
様々な分子、例えば腫瘍壊死因子-α(「ＴＮＦ-α」)、腫瘍壊死因子-β(「ＴＮＦ-β」又は「リンホトキシン-α」)、リンホトキシン-β(「ＬＴ-β」)、ＣＤ３０リガンド、ＣＤ２７リガンド、ＣＤ４０リガンド、ＯＸ-４０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド(Ｆａｓリガンド又はＣＤ９５リガンドとも称される)、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ又はＴＲＡＩＬとも称される)、Ａｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫとも称される)、ＡＰＲＩＬ、ＯＰＧリガンド(ＲＡＮＫリガンド、ＯＤＦ又はＴＲＡＮＣＥとも称される)、及びＴＡＬＬ-１(ＢｌｙＳ、ＢＡＦＦ又はＴＨＡＮＫとも称される)が、サイトカインの腫瘍壊死因子(「ＴＮＦ」)ファミリーのメンバーとして同定されている［例えば、Gruss及びDower, Blood, 85：3378-3404(1995)；Schmidら, Proc. Natl. Acad. Sci., 83:1881 (1986)；Dealtryら, Eur. J. Immunol., 17:689(1987)；Pittiら, J. Biol. Chem., 271：12687-12690(1996)；Wileyら, Immunity, 3：673-682(1995)；Browningら, Cell, 72:847-856(1993)；Armitageら, Nature, 357:80-82(1992), １９９７年１月１６日公開の国際公開第９７／０１６３３号；１９９７年７月１７日公開の国際公開第9７／２５４２８号；Marstersら, Curr. Biol., 8:525-528(1998)；Chicheporticheら, Biol. Chem., 272:32401-32410(1997)；Hahneら, J. Exp. Med., 188:1185-1190(1998)；１９９８年７月２日公開の国際公開第９８／２８４２６号；１９９８年１０月２２日公開の国際公開第９８／４６７５１号；１９９８年５月７日公開の国際公開第９８／１８９２１号；Mooreら, Science, 285:260-263(1999)；Shuら, J. Leukocyte Biol., 65:680(1999)；Schneiderら, J. Exp. Med., 189:1747-1756(1999)；Mukhopadhyayら, J. Biol. Chem., 274:15978-15981(1999)参照］。これらの分子のなかでも、ＴＮＦ-α、ＴＮＦ-β、ＣＤ３０リガンド、４-１ＢＢリガンド、Ａｐｏ-１リガンド、Ａｐｏ-２リガンド(Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ)及びＡｐｏ-３リガンド(ＴＷＥＡＫ)が、アポトーシス性細胞死に関与していることが報告されている。
【０００５】
Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬはサイトカインのＴＮＦファミリーのメンバーとして数年前に同定された。［例えばWileyら, Immunity, 3:673-682(1995)；Pittiら, J. Biol. Chem.,271:12687-12690(1996))；２００１年９月４日発行の米国特許第６２８４２３６号を参照］。完全長天然配列ヒトＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドは２８１アミノ酸長のＩＩ型膜貫通型タンパク質である。いくつかの細胞は、ポリペプチドの細胞外領域の酵素による切断を通して、そのポリペプチドの天然の可溶型を生じうる［Marianiら, J. Cell. Biol., 137:221-229(1997)］。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型の結晶学的研究は、ＴＮＦ及び他の関連タンパク質の構造に類似したホモ三量体構造を明らかにしている［Hymowitzら, Molec. Cell, 4:563-571(1999)；Hymowitzら, Biochemistry, 39:633-644 (2000)］。しかし、他のＴＮＦファミリーメンバーとは異なり、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、(ホモ三量体の各サブユニットの２３０位で)３つのシステイン残基が共に一つの亜鉛原子に配位結合している独特の構造的特徴を有しており、亜鉛の結合が三量体の安定性と生物学的活性のために重要であるということが分かった。［上掲のHymowitzら；Bodmerら, J. Biol. Chem., 275:20632-20637(2000)］。
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、リウマチ様関節炎などの自己免疫疾患を含む免疫系の調節に役割を担っている可能性があることが文献において報告されている［例えば、Thomasら, J. Immunol., 161:2195-2200(1998)；Johnsenら, Cytokine, 11:664-672(1999)；Griffithら, J. Exp. Med., 189:1343-1353(1999)；Songら, J. Exp. Med., 191:1095-1103(2000)を参照］。
【０００６】
Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型はまた大腸、肺、乳房、前立腺、膀胱、腎臓、卵巣及び脳腫瘍を含む様々な癌細胞並びに黒色腫、白血病、及び多発性骨髄腫においてアポトーシスを誘導することがインビトロで報告されている［例えば、上掲のWileyら；上掲のPittiら；Riegerら, FEBS Letters, 427:124-128(1998)；Ashkenaziら, J. Clin. Invest., 104:155-162(1999)；Walczakら, Nature Med., 5:157-163(1999)；Keaneら, Cancer Research, 59:734-741(1999)；Mizutaniら, Clin. Cancer Res., 5:2605-2612(1999)；Gazitt, Leukemia, 13:1817-1824(1999)；Yuら, Cancer Res., 60:2384-2389(2000)；Chinnaiyanら, Proc. Natl. Acad. Sci., 97:1754-1759(2000)を参照のこと］。さらに、マウス腫瘍モデルでのインビボの研究は、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、単独で又は化学療法又は放射線療法と組み合わせて、かなりの抗腫瘍効果を発揮することを示唆している［例えば上掲のAshkenaziら；上掲のWalzcakら；Gliniakら, Cancer Res., 59:6153-6158(1999)；上掲のChinnaiyanら；Rothら, Biochem. Biophys. Res. Comm., 265:1999(1999)を参照のこと］。多くのタイプの癌細胞とは対照的に、殆どのタイプのヒト正常細胞はＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬのリコンビナントの特定の型によるアポトーシスの誘導に対して耐性があるように思われる［上掲のAshkenaziら；上掲のWalzcakら］。Ｊｏらは、ポリヒスチジンタグしたＡｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬの可溶型が単離されたヒト正常肝細胞においてインビトロにてアポトーシスを誘導したが、非ヒト正常肝細胞では誘導しなかったことを報告している［Joら, Nature Med., 6:564-567(2000)；またNagata, Nature Med., 6:502-503(2000)を参照のこと］。ある型のリコンビナントＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ調製物は、例えばタグ分子の有無、亜鉛含有量、及び三量体の含有％に応じて、異常細胞に対するかあるいは正常細胞に対する生化学的性質及び生物学的活性に関して変動しうると考えられている。［Lawrenceら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:383-385(2001)；Qinら, Nature Med., Letter to the Editor, 7:385-386(2001)］。
【０００７】
リンホトキシン-αを除き、今日までに同定されているＴＮＦファミリーのリガンドは、ＩＩ型の膜貫通型タンパク質であり、そのＣ末端は細胞外にある。これに対して、今日までに同定されているＴＮＦレセプター(ＴＮＦＲ)ファミリーのほとんどのレセプターはＩ型の膜貫通型タンパク質である。しかしながら、ＴＮＦリガンド及びレセプターファミリーの双方において、ファミリーメンバー間で同定された相同性は、主として細胞外ドメイン(「ＥＣＤ」)において見出されている。ＴＮＦ-α、Ａｐｏ-１リガンド及びＣＤ４０リガンドを含むＴＮＦファミリーサイトカインのいくつかは、細胞表面においてタンパク分解的に切断され；それぞれの場合に得られるタンパク質は、典型的には、可溶性サイトカインとして機能するホモ三量体分子を形成する。また、ＴＮＦレセプターファミリーのタンパク質は、通常、タンパク分解的に切断され、同族のサイトカインの阻害剤として機能し得る可溶性レセプターのＥＣＤを放出する。
【０００８】
Panらは、「ＤＲ４」と称されるＴＮＦレセプターファミリーのメンバーを開示している［Panら, Science, 276：111-113(1997)］。ＤＲ４は細胞自殺機構に関与可能な細胞質デスドメインを含むと報告されている。Panらは、ＤＲ４がＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬとして知られているリガンドに対するレセプターであると考えられることを開示している。
Sheridanら, Science, 277: 818-821(1997)及びPanら, Science, 277: 815-818(1997)においては、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬに対するレセプターと思われる他の分子が記載されている［１９９８年１１月１９日に公開の国際公開第９８／５１７９３号；１９９８年９月２４日公開の国際公開第９８／４１６２９号もまた参照のこと］。その分子は、ＤＲ５と呼ばれる(あるいは、Ａｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている［Screatonら, Curr. Biol., 7：693-696(1997)；Walczakら, EMBO J., 16：5386-5387(1997)；Wuら, Nature Genetics, 17:141-143 (1997)；１９９８年８月２０日公開の国際公開第９８／３５９８６号；１９９８年１０月１４日公開の欧州特許出願公開第８７０８２７号；１９９８年１０月２２日公開の国際公開第９８／４６６４３号；１９９９年１月２１日公開の国際公開第９９／０２６５３号；１９９９年２月２５日公開の国際公開第９９／０９１６５号；１９９９年３月１１日公開の国際公開第９９／１１７９１号]。ＤＲ４と同様に、ＤＲ５は細胞質デスドメインを含み、アポトーシスをシグナル伝達可能であると報告されている。Ａｐｏ-２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＤＲ５の間に形成される複合体の結晶構造はHymowitzら, Molecular Cell, 4：563-571(1999)に記載されている。
【０００９】
最近同定されたＴＮＦＲファミリーメンバーのさらなるグループは、「デコイレセプター」と称され、シグナル伝達のトランスデューサーというよりはむしろ阻害剤として機能すると考えられている。このグループには、ＤＣＲ１(ＴＲＩＤ、ＬＩＴ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ３とも称される)［Panら, Science, 276：111-113(1997)；Sheridanら, Science, 277：818-821(1997)；McFarlaneら, J. Biol. Chem., 272：25417-25420(1997)；Schneiderら, FEBS Letters, 416：329-334(1997)；Degli-Espostiら, J. Exp. Med., 186：1165-1170(1997)；及びMongkolsapayaら, J. Immunol., 160：3-6(1998)］及びＤＣＲ２(ＴＲＵＮＤＤ又はＴＲＡＩＬ-Ｒ４とも称される)［Marstersら, Curr. Biol., 7：1003-1006(1997)；Panら, FEBS Letters, 424：41-45(1998)；Degli-Espostiら, Immunity, 7：813-820(1997)］が含まれ、両者とも細胞表面分子であり、更にＯＰＧ［Simonetら, 上掲］及びＤＣＲ３［Pittiら, Nature, 396:699-703(1998)］も含まれ、これら両者は分泌性の可溶性タンパク質である。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬはＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称されるレセプターに結合すると報告されている。
【００１０】
Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは細胞表面「デスレセプター」ＤＲ４及びＤＲ５を通して作用してカスパーゼ、又は細胞内細胞死プログラムを実施する酵素を活性化させると考えられている[例えばSalvesenら, Cell, 91:443-446(1997)を参照]。リガンド結合の際、ＤＲ４とＤＲ５は、双方共、ＦＡＤＤ／Ｍｏｒｔ１と称されるデスドメイン含有アダプター分子を通してアポトーシス発動因子であるカスパーゼ-８を独立して補充し活性化することによってアポトーシスを惹起しうる［Kischkelら, Immunity, 12:611-620(2000)；Sprickら, Immunity, 12:599-609(2000)；Bodmerら, Nature Cell Biol., 2:241-243 (2000)］。ＤＲ４及びＤＲ５とは対照的に、ＤｃＲ１及びＤｃＲ２レセプターはアポトーシスをシグナル伝達しない。
【００１１】
ＤＲ４及び／又はＤＲ５レセプターに結合するある種の抗体が文献に報告されている。例えば、ＤＲ４レセプターに対し、ある種の哺乳動物細胞において、アゴニスト活性又はアポトーシス活性を有する抗ＤＲ４抗体が、例えば１９９年７月２９日に公開された国際公開第９９／３７６８４号；２０００年７月１２日に公開された国際公開第００／７３３４９号；２００３年８月１４日に公開された国際公開第０３／０６６６６１号に記載されている。また、 Griffithら, J. Immunol., 162：2597-2605(1999)；Chuntharapaiら, J. Immunol., 166:4891-4898(2001)；２００２年１２月２日に公開された国際公開第０２／０９７０３３号；２００３年５月２２日に公開された国際公開第０３／０４２３６７号；２００３年５月８日に公開された国際公開第０３／０３８０４３号；２００３年５月８日に公開された国際公開第０３／０３７９１３号を参照。同様に、ある種の抗ＤＲ５抗体は、例えば１９９８年１１月８日に公開された国際公開第９８／５１７９３号；Griffithら, J. Immunol., 162：2597-2605(1999)；Ichikawaら, Nature Med., 7:954-960(2001)；Hylanderら, 「An Antibody to DR5 (TRAIL-Receptor 2) Suppresses the Growth of Patient Derived Gastrointestinal Tumors Grown in SCID mice」, Abstract, 2d International Congress on Monoclonal Antibodies in Cancers, Aug. 29-Sept. 1, 2002, Banff, Alberta, Canada；２００３年５月８日に公開された国際公開第０３／０３８０４３号；２００３年５月８日に公開された国際公開第０３／０３７９１３号に記載されている。さらに、ＤＲ４及びＤＲ５レセプターの双方との交差反応性を有するある種の抗体も開示されている(例えば、２００１年６月２６日に公表された米国特許第６２５２０５０号を参照)。
【００１２】
サイトカインのＴＮＦファミリー及びそれらのレセプターの概説については、Ashkenazi及びDixit, Science, 281：1305-1308(1998)；Ashkenazi及びDixit, Curr. Opin. Cell Biol., 11:255-260(2000)；Golstein, Curr. Biol., 7:750-753(1997)；上掲のGruss及びDower；Nagata, Cell, 88：355-365(1997)；Locksleyら, Cell, 104：487-501(2001)；Wallach, 「TNF Ligand and TNF/NGF Receptor Families」, Cytokine Reference, Academic Press, 377-411頁(2000)を参照。
【００１３】
上皮成長因子レセプター(ＥＧＦＲ)は、細胞増殖、分化及び生存における重要な役割を担っている、成長因子レセプターの１型チロシンキナーゼファミリーのメンバーである。典型的にはこれらのレセプターの活性化は、特異的なリガンド結合を介して起こり、レセプターファミリーメンバーの間でヘテロ又はホモ二量体化を生じ、その後にチロシンキナーゼドメインの自己ホスホリル化が伴う。この活性化は、細胞増殖(ｒａｓ／ｒａｆ／ＭＡＰキナーゼ経路)と生存(ＰＩ３キナーゼ／Ａｋｔ経路)の双方に関与している細胞内シグナル伝達経路のカスケードを誘発する。ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２を含むこのファミリーメンバーは、細胞形質転換に直接関連している。
【００１４】
多くのヒト悪性腫瘍は、ＥＧＦＲの異常又は過剰発現、及び／又はその特異的リガンド、例えばトランスフォーミング増殖因子α(Gullick, Br Med Bull 1991, 47：87-98； Modijtahedi and Dean, Int J Oncol 1994, 4：277-96； Salomonら, Crit Rev Oncol Hematol 1995；19：183-232)の過剰発現に関連している。ＥＧＦＲの過剰発現は、ＮＳＣＬＣを含む、多くのヒト癌における予後不良に関連している。いくつかの例では、腫瘍ＥＧＦＲの過剰発現は、化学耐性及び予後不良の双方に相関している(Leiら, Anticancer Res 1999； 19：221-8；Vealeら, Br J Cancer 1993；68：162-5)。
【００１５】
(発明の概要)
本発明は、有効量のデスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビターと、細胞を接触させることを含む、哺乳動物細胞においてアポトーシスを亢進させる方法を提供する。場合によっては、デスレセプターアゴニストはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドである。
他の実施態様では、有効量のデスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビターを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における癌等の疾患を治療する方法を提供する。
さらなる実施態様では、種々の病理学的疾患の治療に有用な、例えばＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド及びＥＧＦＲインヒビターを含む製造品及びキットを提供する。
【００１６】
さらなる特定の実施態様では、限定するものではないが、以下の例示的な組成物及び方法が提供される：
１．細胞を有効量のデスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビターにさらすことを含む、一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを亢進させる方法。
一又は複数の哺乳動物細胞においてアポトーシスを亢進させる方法において、有効量のデスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビターに前記細胞をさらすことを含んでなる方法。
２．前記細胞が、デスレセプターアゴニストとＥＧＦＲインヒビターに逐次さらされる、請求項１に記載の方法。
３．前記細胞が、デスレセプターアゴニストにさらされる前にＥＧＦＲインヒビターにされされる、請求項１に記載の方法。
４．前記デスレセプターアゴニストがＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチドを含んでなる、請求項１に記載の方法。
５．前記細胞が、ＥＧＦＲインヒビター及びデスレセプターアゴニストに同時にさらされる、請求項１に記載の方法。
６．前記デスレセプターアゴニストが、ＤＲ４アゴニスト抗体又はＤＲ５アゴニスト抗体である、請求項１に記載の方法。
７．前記ＥＧＦＲインヒビターが、一般式Ｉ
【化１】
2008532937.tif 000002
[上式中：
Ｘはハロ又はヒドロキシであり；
ｍは１、２又は３であり；
各Ｒ１は独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアミノ、カルボキシ、ニトロ、グアニジノ、ウレイド、シアノ、トリフルオロメチル、及び-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)-Ｗ-(フェニル)からなる群から選択され、ここでＷは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；又は
各Ｒ１は独立して、シアノで置換されたＣ１-Ｃ４アルキル及びＲ９から選択され、Ｒ９はＲ５、-ＯＲ６、-ＮＲ６、Ｒ６、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、-ＮＨＯＲ５、-ＯＣ(Ｏ)Ｒ６、シアノ、Ａ及び-ＹＲ５からなる群から選択され；Ｒ５はＣ１-Ｃ４アルキルであり；Ｒ６は独立して、水素又はＲ５であり；Ｒ７はＲ５、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６であり；Ａはピペリジノ、モルホリノ、ピロリジノ、４-Ｒ６-ピペラジン-１-イル、イミダゾール-１-イル、４-ピリドン-１-イル、-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)(ＣＯ２Ｈ)、フェノキシ、フェニル、フェニルスルファニル、Ｃ２-Ｃ４アルケニル、及び-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ６から選択され；ＹはＳ、ＳＯ又はＳＯ２であり；Ｒ５、-ＯＲ６及び-ＮＲ６Ｒ６中のアルキル部分は１ないし３のハロ置換基で置換されていてもよく、Ｒ５、-ＯＲ６及び-ＮＲ６Ｒ６中のアルキル部分は１又は２のＲ９基で置換されていてもよく、該任意置換基中のアルキル部分は、ハロ又はＲ９で置換されていてもよく、但し、２つのヘテロ原子は同じ炭素原子には結合しておらず；又は
各Ｒ１は独立して、-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４)-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノから選択され、Ｒ１０は、ハロ、-ＯＲ６、Ｃ２-Ｃ４アルカノイルオキシ、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、及び-ＮＲ６Ｒ６から選択され；前記-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノのＲ１基は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルキル、シアノ、メタンスルホニル及びＣ１-Ｃ４アルコキシから独立して選択される１又は２の置換基で置換されていてもよく；又は
２のＲ１基は、それらが結合している炭素と共同して、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１又は２のヘテロ原子を含む、５-８員環を形成し；
Ｒ２は、水素、又はハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒ５から独立して選択される１ないし３の置換基で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルであり；
ｎは１又は２であり、各Ｒ３は独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、-ＮＲ６Ｒ６、及びＣ１-Ｃ４アルコキシから選択され、該Ｒ３基中のアルキル部分は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒから独立して選択される１ないし３の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ４はアジド又は-(エチニル)-Ｒ１１であり、Ｒ１１は、水素、又はヒドロキシ、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルである]
を有する、請求項１に記載の方法。
８．前記ＥＧＦＲインヒビターが、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンである、請求項７に記載の方法。
９．前記ＥＧＦＲインヒビターがタルセバＴＭである、請求項７に記載の方法。
１０．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが配列番号１のポリペプチドの断片である、請求項１に記載の方法。
１１．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ断片が、配列番号１のポリペプチドの細胞外ドメインを含む、請求項１０に記載の方法。
１２．前記デスレセプターアゴニストが、配列番号１の細胞外ドメインと少なくとも約９０％のアミノ酸配列同一性を有するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド変異体である、請求項１に記載の方法。
１３．前記断片が配列番号１のアミノ酸１１４−２８１を含む、請求項１０に記載の方法。
１４．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ変異体が、配列番号１の細胞外ドメインと少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有している、請求項１２に記載の方法。
１５．配列番号１のアミノ酸１１４−２８１を含む前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ断片が、一又は複数のポリエチレングリコール(ＰＥＧ)分子に結合している、請求項１３に記載の方法。
１６．哺乳動物における増殖性疾患の治療方法において、前記哺乳動物にＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＥＧＦＲインヒビターを投与することを含んでなる方法。
１７．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬとＥＧＦＲインヒビターが同時に投与される、請求項１６に記載の方法。
１８．前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬが、前記ＥＧＦＲインヒビターの前に投与される、請求項１６に記載の方法。
１９．前記ＥＧＦＲインヒビターが、前記Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの前に投与される、請求項１６に記載の方法。
２０．前記増殖性疾患が癌である、請求項１に記載の方法。
２１．前記癌が、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、結腸癌、結腸直腸癌、及び膵臓癌からなる群から選択される、請求項２０に記載の方法。
２２．前記癌が、結腸癌、結腸直腸癌、小細胞肺癌、又は非小細胞肺癌である、請求項２１に記載の方法。
２３．前記ＥＧＦＲインヒビターが、一般式Ｉ：
【化２】
2008532937.tif 000003
[上式中：
Ｘはハロ又はヒドロキシであり；
ｍは１、２又は３であり；
各Ｒ１は独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアミノ、カルボキシ、ニトロ、グアニジノ、ウレイド、シアノ、トリフルオロメチル、及び-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)-Ｗ-(フェニル)からなる群から選択され、ここでＷは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；又は
各Ｒ１は独立して、シアノで置換されたＣ１-Ｃ４アルキル及びＲ９から選択され、Ｒ９はＲ５、-ＯＲ６、-ＮＲ６、Ｒ６、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、-ＮＨＯＲ５、-ＯＣ(Ｏ)Ｒ６、シアノ、Ａ及び-ＹＲ５からなる群から選択され；Ｒ５はＣ１-Ｃ４アルキルであり；Ｒ６は独立して、水素又はＲ５であり；Ｒ７はＲ５、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６であり；Ａはピペリジノ、モルホリノ、ピロリジノ、４-Ｒ６-ピペラジン-１-イル、イミダゾール-１-イル、４-ピリドン-１-イル、-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)(ＣＯ２Ｈ)、フェノキシ、フェニル、フェニルスルファニル、Ｃ２-Ｃ４アルケニル、及び-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ６から選択され；ＹはＳ、ＳＯ又はＳＯ２であり；Ｒ５、-ＯＲ６及び-ＮＲ６Ｒ６中のアルキル部分は１ないし３のハロ置換基で置換されていてもよく、Ｒ５、-ＯＲ６及び-ＮＲ６Ｒ６中のアルキル部分は１又は２のＲ９基で置換されていてもよく、前記任意置換基中のアルキル部分は、ハロ又はＲ９で置換されていてもよく、但し、２つのヘテロ原子は同じ炭素原子に結合しておらず；又は
各Ｒ１は独立して、-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１−Ｃ４)-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノから選択され、Ｒ１０は、ハロ、-ＯＲ６、Ｃ２-Ｃ４アルカノイルオキシ、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、及び-ＮＲ６Ｒ６から選択され；前記-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノのＲ１基は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルキル、シアノ、メタンスルホニル及びＣ１-Ｃ４アルコキシから独立して選択される１又は２の置換基で置換されていてもよく；又は
２のＲ１基は、それらが結合している炭素と共同して、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１又は２のヘテロ原子を含む、５-８員環を形成し；
Ｒ２は、水素、又はハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒ５から独立して選択される１ないし３の置換基で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルであり；
ｎは１又は２であり、各Ｒ３は独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、-ＮＲ６Ｒ６、及びＣ１-Ｃ４アルコキシから選択され、該Ｒ３基中のアルキル部分は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒから独立して選択される１ないし３の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ４はアジド又は-(エチニル)-Ｒ１１であり、Ｒ１１は、水素、又はヒドロキシ、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキルである]
の化合物である、請求項１６に記載の方法。
２４．ＥＧＦＲインヒビターが、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンである、請求項１６に記載の方法。
２５．前記ＥＧＦＲインヒビターがタルセバＴＭである、請求項１６に記載の方法。
２６．癌細胞の治療方法において、相乗的有効量のデスレセプターアゴニストとＥＧＦＲインヒビターに、哺乳動物の癌細胞をさらすことを含んでなる方法。
２７．前記デスレセプターアゴニストが、抗ＤＲ５又は抗ＤＲ４レセプターモノクローナル抗体である、請求項２６に記載の方法。
２８．前記デスレセプターアゴニストがＡｐｏ-２／ＴＲＡＩＬポリペプチドである、請求項２６に記載の方法。
２９．前記癌細胞が、前記相乗的有効量のデスレセプターアゴニストとＥＧＦＲインヒビターにインビボでさらされる、請求項２６に記載の方法。
３０．前記デスレセプター抗体がキメラ抗体又はヒト化抗体である、請求項２７に記載の方法。
３１．デスレセプター抗体がヒト抗体である、請求項２７に記載の方法。
３２．前記デスレセプターアゴニストが、１を越えるＡｐｏ-２リガンドレセプターと交差反応する抗体である、請求項２６に記載の方法。
３３．前記癌細胞が、結腸癌細胞、結腸直腸癌細胞、小細胞肺癌細胞、又は非小細胞肺癌細胞である、請求項２６に記載の方法。
３４．一又は複数の増殖阻害剤に癌細胞をさらすことをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
３５．放射線に細胞をさらすことをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
３６．前記ＤＲ５抗体が、１０８Ｍ−１ないし１０１２Ｍ−１のＤＲ５レセプター結合親和性を有している、請求項２７に記載の方法。
３７．前記デスレセプターアゴニストが、ＣＨＯ細胞、酵母細胞及び大腸菌からなる群から選択される組換え宿主細胞中で発現される、請求項２６に記載の方法。
３８．前記ＥＧＦＲインヒビターがタルセバＴＭである、請求項２６に記載の方法。
【００１７】
(好ましい実施態様の詳細な説明)
特に定義しない限り、ここで使用される専門用語、表記及び他の科学的用語のすべては、この発明に関連する当業者に共通して理解される意味を持つものである。いくつかの場合には、共通して理解される意味を持つ用語を明確化のため及び／又は参照を容易にするためにここで定義するが、ここにそのような定義を含めることが、当該分野で一般的に理解されることに対して実質的な差異を表すものと必ずしも解釈されるものではない。ここに記載され又は参照される技術及び手順は一般的に十分理解されるものであり、例えばSambrook 等,Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd. edition (1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.に記載の広く利用される分子クローニング方法論などの、当業者による一般的な方法論を用いて通常行われるものである。適切ならば、市販のキットや試薬の使用を伴う手順は、特に明記しない限り、製造者が定めたプロトコール及び／又はパラメータに従って一般的に実施される。
本方法、キット及びそれらの使用を記載する前に、この発明は、このように記載の特定の方法論、プロトコール、細胞株、動物種や属、コンストラクト及び試薬に限定されるものではなく、変更されてもよいことを理解されたい。また、ここで用いる用語は特定の実施態様のみを開示することを目的としており、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される本発明の範囲を限定するものでないことを理解されたい。
【００１８】
ここで用いられ添付の特許請求の範囲に記載の単数形「ａ」、「ａｎｄ」及び「ｔｈｅ」には、明らかな記載がない限り複数形も含まれる。
ここに記載するすべての刊行物は、その刊行物が引用される方法及び／又は材料を開示及び記載するために、出典明示によってここに援用される。ここで引用する刊行物は、本出願の出願日前の開示について引用されるものである。ここで、早い優先日又はより前の発明日によって刊行物に先行する権利が発明者にはないことを自認していると解釈されるべきではない。さらに、実際の刊行日は示されているものと異なり得、個々に実証が必要であろう。
【００１９】
Ｉ．定義
「Ａｐｏ−２リガンド」、「Ａｐｏ-２Ｌ」、「Ａｐｏ２Ｌ」、「Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ」、「Ａｐｏ-２リガンド／ＴＲＡＩＬ」及び「ＴＲＡＩＬ」という用語は、ここでは図１に示されたアミノ酸配列(配列番号１)のアミノ酸残基１１４−２８１、９５−２８１、残基９２−２８１、残基９１−２８１、残基４１−２８１、残基３９−２８１、残基１５−２８１、又は残基１−２８１、並びに上記配列の生物学的に活性な断片、欠失、挿入、又は置換変異体を含むポリペプチド配列を意味するものとして互換可能に使用される。一実施態様では、ポリペプチド配列は図１(配列番号１)の残基１１４−２８１を含む。場合によっては、ポリペプチド配列は、図１(配列番号１)の残基９２−２８１又は残基９１−２８１を含む。Ａｐｏ-２Ｌポリペプチドは、図１(配列番号２)に示された天然ヌクレオチド配列によってコードされていてもよい。場合によっては、残基Ｐｒｏ１１９(図１；配列番号２)をコードするコドンは「ＣＣＴ」又は「ＣＣＧ」でありうる。場合によっては、断片又は変異体は生物学的に活性であり、上記の配列の何れか一と少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらにより好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。この定義には、その天然のアミノ酸の少なくとも一がアラニン残基などの他のアミノ酸によって置換されているＡｐｏ-２リガンドの置換変異体が包含される。任意の変異体は、図１(配列番号１)に示す天然配列のＡｐｏ-２リガンドポリペプチド配列と異なるアミノ酸配列を含んでもよく、図１(配列番号１)の残基位置で一又は複数の次のアミノ酸置換：Ｓ９６Ｃ；Ｓ１０１Ｃ；Ｓ１１１Ｃ；Ｒ１７０Ｃ；Ｋ１７９Ｃを有する。また、定義には、Ａｐｏ-２リガンド源から単離され、又は組換え又は合成法によって調製された天然配列Ａｐｏ-２リガンドもまた包含される。本発明のＡｐｏ-２リガンドは１９９７年１月１６日公開の国際公開第９７／０１６３３号、１９９７年７月１７日公開の国際公開第９７／２５４２８号、１９９９年７月２２日公開の国際公開第９９／３６５３５号、２００１年１月４日公開の国際公開第０１／００８３２号、２００２年２月７日公開の国際公開第０２／０９７５５号、及び２０００年１２月１４日公開の国際公開第００／７５１９１号に開示されたＡｐｏ-２リガンド又はＴＲＡＩＬと称されるポリペプチドを含む。本用語は、一般に、ポリペプチドの単量体、二量体、三量体、六量体又はより高次のオリゴマーを含むＡｐｏ-２リガンドの形態を意味するものとして使用される。Ａｐｏ-２Ｌ配列において言及されているアミノ酸残基の全ての番号付けは、特に他の定義を述べない限り、図１(配列番号１)における番号付けを使用している。例えば、「Ｄ２０３」又は「Ａｓｐ２０３」は図１(配列番号１)に与えられた配列中、２０３位のアスパラギン酸残基を指す。
【００２０】
ここで使用する「Ａｐｏ-２リガンド選択的変異体」という用語は、天然Ａｐｏ-２リガンド配列に一又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ４レセプター又はＤＲ５レセプターのいずれかに対して選択的な結合親和性を有するＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを意味する。一実施形態では、Ａｐｏ-２リガンド変異体はＤＲ４レセプターに対して選択的結合親和性を有し、天然Ａｐｏ-２リガンド配列の１８９、１９１、１９３、１９９、２０１、又は２０９位のいずれか一に一又は複数のアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、Ａｐｏ-２リガンド変異体はＤＲ５レセプターに対して選択的結合親和性を有し、天然Ａｐｏ-２リガンド配列の１８９、１９１、１９３、２６４、２６６、２６７、又は２６９位のいずれか一に一又は複数のアミノ酸置換を含む。
【００２１】
好ましいＡｐｏ-２リガンド選択的変異体は、一又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ４レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ-２リガンド結合親和性以上(≧)のＤＲ４レセプターに対する結合親和性を示し、さらに好ましくは、Ａｐｏ-２リガンド変異体は、ＤＲ５レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ-２リガンドがＤＲ５に対して示す結合親和性より小さい(＜)結合親和性を示す。このようなＡｐｏ-２リガンド変異体のＤＲ４レセプターに対する結合親和性が、天然配列Ａｐｏ-２リガンドと比較した場合、ほぼ等しい(変わらない)か、それよりも大きく(増大している)、Ａｐｏ-２リガンド変異体のＤＲ５レセプターに対する結合親和性が、天然配列Ａｐｏ-２リガンドと比較した場合、小さいか、殆ど消滅しているとき、ここでの目的のため、Ａｐｏ-２リガンド変異体の結合親和性はＤＲ４レセプターに対して「選択的」であると考えられる。好ましい本発明のＤＲ４選択的Ａｐｏ-２リガンド変異体は、ＤＲ５レセプターに対して(天然配列Ａｐｏ-２リガンドと比較した場合)少なくとも１０倍少ない結合親和性を有し、さらに好ましくは、ＤＲ５レセプターに対して(天然配列Ａｐｏ-２リガンドと比較した場合)少なくとも１００倍少ない結合親和性を有する。Ａｐｏ-２リガンド変異体それぞれの結合親和性を決定し、当該技術分野で知られているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより(１１４−２８１型のような)天然Ａｐｏ-２Ｌの結合特性と比較することができる。本発明の好ましいＤＲ４選択的Ａｐｏ-２リガンド変異体は、少なくとも１種類の哺乳動物細胞(好ましくは癌細胞)においてアポトーシスを誘導し、そのようなアポトーシス活性をアラマーブルー又はクリスタルバイオレットアッセイ等の既知の方法により測定することができる。ＤＲ４選択的Ａｐｏ-２リガンド変異体は、Ａｐｏ-２Ｌのデコイレセプターのいずれかに対して変化した結合親和性を有していても又はいなくともよく、それらデコイレセプターを当該技術分野でＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称する。
【００２２】
さらなる好ましいＡｐｏ-２リガンド選択的変異体は、一又は複数のアミノ酸変異を含み、ＤＲ５レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ-２リガンドがＤＲ５レセプターに対して示す以上(≧)の結合親和性を示し、さらに好ましくは、そのようなＡｐｏ-２リガンド変異体は、ＤＲ４レセプターに対し、天然配列Ａｐｏ-２リガンドがＤＲ４に対して示すより小さい(＜)結合親和性を示す。このようなＡｐｏ-２リガンド変異体のＤＲ５レセプターに対する結合親和性が、天然配列Ａｐｏ-２リガンドと比較した場合、ほぼ等しい(変わらない)か、それよりも大きく(増大している)、Ａｐｏ-２リガンド変異体のＤＲ４レセプターに対する結合親和性が、天然配列Ａｐｏ-２リガンドと比較した場合、それより小さいか、殆ど消滅しているとき、ここでの目的のため、Ａｐｏ-２リガンド変異体の結合親和性は、ＤＲ５レセプターについて「選択的」であると考えられる。好ましい本発明のＤＲ５選択的Ａｐｏ-２リガンド変異体は、ＤＲ４レセプターに対して(天然配列Ａｐｏ-２リガンドと比較した場合)少なくとも１０倍少ない結合親和性を有し、さらに好ましくは、ＤＲ４レセプターに対して(天然配列Ａｐｏ-２リガンドと比較した場合)少なくとも１００倍少ない結合親和性を有する。Ａｐｏ-２リガンド変異体の各結合親和性を測定し、当該分野で知られているＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、及び／又はＢＩＡｃｏｒｅアッセイにより(１１４−２８１型等の)天然Ａｐｏ２Ｌの結合特性と比較することができる。本発明の好ましいＤＲ５選択的Ａｐｏ-２リガンド変異体は、少なくとも一タイプの哺乳動物細胞(好ましくは癌細胞)にアポトーシスを誘導し、そのようなアポトーシス活性をアラマーブルー又はクリスタルバイオレットアッセイ等の既知の方法により決定することができる。ＤＲ５選択的Ａｐｏ-２リガンド変異体は、Ａｐｏ-２Ｌのデコイレセプターのいずれかに対して変化した結合親和性を有していても有していなくともよく、それらデコイレセプターを当該分野でＤｃＲ１、ＤｃＲ２及びＯＰＧと称する。
【００２３】
ここで記載されるＡｐｏ-２リガンド変異体を略記するために、数字は、推定天然Ａｐｏ-２リガンドのアミノ酸配列に沿ったアミノ酸残基位置を指すことに留意のこと(図１参照)。
ここでアミノ酸の標記にはアミノ酸の一文字アルファベット、すなわち、
Ａｓｐ  Ｄ  アスパラギン酸              Ｉｌｅ  Ｉ  イソロイシン
Ｔｈｒ  Ｔ  スレオニン                  Ｌｅｕ  Ｌ  ロイシン
Ｓｅｒ  Ｓ  セリン                      Ｔｙｒ  Ｙ  チロシン
Ｇｌｕ  Ｅ  グルタミン酸                Ｐｈｅ  Ｆ  フェニルアラニン
Ｐｒｏ  Ｐ  プロリン                    Ｈｉｓ  Ｈ  ヒスチジン
Ｇｌｙ  Ｇ  グリシン                    Ｌｙｓ  Ｋ  リジン
Ａｌａ  Ａ  アラニン                    Ａｒｇ  Ｒ  アルギニン
Ｃｙｓ  Ｃ  システイン                  Ｔｒｐ  Ｗ  トリプトファン
Ｖａｌ  Ｖ  バリン                      Ｇｌｎ  Ｑ  グルタミン
Ｍｅｔ  Ｍ  メチオニン                  Ａｓｎ  Ｎ  アスパラギン
を用いる。
【００２４】
「デスレセプター抗体」は、アポトーシスをシグナル伝達することができるデスドメインを含み、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーにおけるレセプターに対する抗体又は抗体群を一般的に意味するためにここで使用され、このような抗体にはＤＲ５抗体及びＤＲ４抗体が含まれる。
「ＤＲ５レセプター抗体」、「ＤＲ５抗体」又は「抗ＤＲ５抗体」は広義で使用され、ＤＲ５レセプター又はその細胞外ドメインの少なくとも一形態に結合する抗体を意味する。場合によっては、ＤＲ５抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合する。好ましくは、異種性配列は、抗体がより高次の又はオリゴマー複合体を形成するのを許容するか又は形成を補助する。場合によっては、ＤＲ５抗体はＤＲ５レセプターに結合するが、任意のさらなるＡｐｏ-２Ｌレセプター(例えばＤＲ４、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２)と結合又は交差反応をしない。場合によっては、抗体はＤＲ５シグナル伝達活性のアゴニストである。
場合によっては、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定して約０．１ｎＭから約２０ｍＭの範囲の濃度でＤＲ５レセプターに結合する。場合によっては、本発明のＤＲ５抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定して約０．６ｎＭから約１８ｍＭのＩｃ５０値を示す。
【００２５】
「ＤＲ４レセプター抗体」、「ＤＲ４抗体」又は「抗ＤＲ４抗体」は広義で使用され、ＤＲ４レセプター又はその細胞外ドメインの少なくとも一形態に結合する抗体を意味する。場合によっては、ＤＲ４抗体は異種性配列又は分子に融合又は結合する。好ましくは、異種性配列は、抗体がより高次の又はオリゴマー複合体を形成するのを許容するか又は形成を補助する。場合によっては、ＤＲ４抗体はＤＲ４レセプターに結合するが、任意のさらなるＡｐｏ-２Ｌレセプター(例えばＤＲ５、ＤｃＲ１又はＤｃＲ２)と結合又は交差反応をしない。場合によっては、抗体はＤＲ４シグナル伝達活性のアゴニストである。
場合によっては、本発明のＤＲ４抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定して約０．１ｎＭから約２０ｍＭの範囲の濃度でＤＲ４レセプターに結合する。場合によっては、本発明のＤＲ４抗体は、ＢＩＡｃｏｒｅ結合アッセイで測定して約０．６ｎＭから約１８ｍＭのＩｃ５０値を示す。
【００２６】
「アゴニスト」なる用語は、最も広義で用いられ、インビトロ、インサイツ又はインビボでＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４又はＤＲ５の一又は複数の生物学的活性を、部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化する任意の分子を含む。Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、ＤＲ４又はＤＲ５の生物学的活性の例には、アポトーシス並びに文献に更に報告されているものが含まれる。アゴニストは直接的又は間接的な形で機能しうる。例えば、アゴニストは、レセプター活性化又はシグナル伝達を生じるＤＲ４又はＤＲ５への直接的結合の結果としてインビトロ、インサイツ又はインビボでＤＲ４又はＤＲ５の一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するように機能しうる。また、アゴニストは、例えば、ＤＲ４又はＤＲ５の活性化又はシグナル伝達を引き起こす他のエフェクター分子を刺激する結果としてインビトロ、インサイツ又はインビボでＤＲ４又はＤＲ５の一又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に亢進、刺激又は活性化するように間接的に機能しうる。アゴニストは、ＤＲ４又はＤＲ５の活性化又は活性を亢進又は増強するように間接的に機能するエンハンサー分子として作用しうることが考えられる。例えば、アゴニストは哺乳動物中において内因性のＡｐｏ-２Ｌの活性を亢進しうる。例えば、これは、ＤＲ４又はＤＲ５を前もって複合体化することによって、あるいはＤＲ４又はＤＲ５レセプターとの各リガンドの複合体を安定化することによって、達成することができる(Ａｐｏ-２ＬとＤＲ４又はＤＲ５との天然複合体型を安定化するなど)。
【００２７】
ここで使用される「ＤＲ４」及び「ＤＲ４レセプター」という用語は、Panら, Science, 276:111-113(1997)；１９９８年７月３０日公開の国際公開第９８/３２８５６号；２００２年１月２９日発行の米国特許第６３４２３６３号；及び１９９９年７月２９日公開の国際公開第９９／３７６８４号に記載されているレセプターの完全長可溶性細胞外ドメイン型を意味する。ＤＲ４レセプターの完全長アミノ酸配列をここの図２に提供する。
ここで使用される「ＤＲ５」及び「ＤＲ５レセプター」という用語は、Sheridanら, Science, 277:818-821(1997)；Panら, Science, 277:815-818(1997)、２０００年６月６日発行の米国特許第６０７２０４７号；米国特許第６３４２３６９号；１９９８年１１月１９日公開の国際公開第９８／５１７９３号；１９９８年９月２４日公開の国際公開第９８／４１６２９号；Screatonら, Curr. Biol., 7:693-696(1997)；Walczakら, EMBO J., 16:5386-5387(1997)；Wuら, Nature Genetics, 17:141-143(1997)；１９９８年８月２０日公開の国際公開第９８／３５９８６号；１９９８年１０月１４日公開の欧州特許出願公開第８７０８２７号；１９９８年１０月２２日公開の国際公開第９８／４６６４３号；１９９９年１月２１日公開の国際公開第９９／０２６５３号；１９９９年２月２５日公開の国際公開第９９／０９１６５号；１９９９年３月１１日公開の国際公開第９９／１１７９１号に記載されているレセプターの完全長可溶性細胞外ドメイン型を意味する。ＤＲ５レセプターは当該分野においてＡｐｏ-２；ＴＲＡＩＬ-Ｒ、ＴＲ６、Ｔａｎｇｏ-６３、ｈＡＰＯ８、ＴＲＩＣＫ２又はＫＩＬＬＥＲとも呼ばれている。ここで使用されるＤＲ５という用語には、図３Ａに提供された完全長４１１アミノ酸ポリペプチド及び図３Ｂ−Ｃに提供された完全長４４０アミノ酸ポリペプチドが含まれる。
【００２８】
ここで使用される場合の「ポリオール」という用語は、広く多価アルコール化合物を意味する。ポリオールは例えば任意の水溶性ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーであり得、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには、一又は複数のヒドロキシル位置に化学基、例えば１から４の炭素を有するアルキル基で置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、好ましくはポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)である。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを、ここでＰＥＧについて記載した抱合技術を使用して用いることができることが分かるであろう。本発明のポリオールには、当該分野でよく知られたもの及び公的に入手可能なもの、例えば商業的に利用可能な供給源からのものが含まれる。
「抱合(コンジュゲート)」という用語は、ここではその最も広い定義に従って使用され、共に接合(joined)又は結合(linked)されていることを意味する。分子は、それらが接合されているように作用又は機能する場合、「抱合」されている。
【００２９】
「細胞外ドメイン」又は「ＥＣＤ」という用語は、膜貫通及び細胞質ドメインを本質的に持たないリガンド又はレセプターの形態を意味する。通常、可溶型ＥＣＤは、そのような膜貫通及び細胞質ドメインを１％未満、好ましくはそのようなドメインを０．５％未満だけ有する。
【００３０】
「二価金属イオン」という用語は、二つの正電荷を有する金属イオンを意味する。本発明において使用される二価金属イオンの例には、限定されるものではないが、亜鉛、コバルト、ニッケル、カドミウム、マグネシウム、及びマンガンが含まれる。用いることができるかかる金属の特定の形態には、塩形態(例えば、薬学的に許容可能な塩形態)、例えば、上述の二価金属イオンの塩化物、酢酸塩、炭酸塩、クエン酸塩及び硫酸塩形態が含まれる。本発明で使用される好ましい二価金属は、亜鉛、より好ましくは塩の形態、硫酸亜鉛である。ここに記載の二価金属イオンは、好ましくは、例えば、(１)所望の期間にわたってＡｐｏ-２Ｌ三量体の貯蔵安定性を高め、(２)組換え細胞培養又は精製法においてＡｐｏ-２Ｌ三量体の産生又は収量を高め、(３)Ａｐｏ-２Ｌ三量体の溶解性を高め(又は凝集性を低下させ)、又は(４)Ａｐｏ-２Ｌ三量体の生成を高めるのに十分な濃度又は量(例えば有効量)で用いられる。
【００３１】
「単離された」は、ここで開示された種々のタンパク質を記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたタンパク質を意味する。その自然環境の汚染成分とは、タンパク質の診断又は治療的な使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、タンパク質は、(１)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分なほど、あるいは、(２)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一になるまで充分なほど精製される。Ａｐｏ-２リガンドの自然環境の少なくとも一の成分が存在しないため、単離されたタンパク質には、組換え細胞内のインサイツでのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたタンパク質は少なくとも一の精製工程により調製される。
「単離された」核酸分子は、同定され、核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離されたＡｐｏ-２リガンド核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離されたＡｐｏ-２リガンド核酸分子は、天然の細胞中に存在するＡｐｏ-２リガンド核酸分子とは区別される。しかし、単離されたＡｐｏ-２リガンド核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるＡｐｏ-２リガンドを通常発現する細胞に含まれるＡｐｏ-２リガンド核酸分子を含む。
【００３２】
ここで同定されている配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、必要ならば最大のパーセント配列同一性を得るために間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした後の、Ａｐｏ-２リガンド配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法で達成可能であり、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要なアルゴリズムをあてがうことを含み、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。ここでの目的のために、パーセントアミノ酸同一性値は、ジェネンテック社によって作成され、ソースコードが米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号ＴＸＵ５１００８７の下で登録されている配列比較コンピュータプログラムＡＬＩＧＮ-２を用いて得られる。ＡＬＩＧＮ-２プログラムはジェネンテック社、South San Francisco, CAを通して公に入手可能である。全ての配列比較パラメーターはＡＬＩＧＮ-２プログラムにより設定され、変化しない。
【００３３】
「コントロール配列」という用語は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現させるために必要なＤＮＡ配列を意味する。原核生物に好適なコントロール配列は、例えばプロモーター、場合によってはオペレーター配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
【００３４】
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に寄与するプレタンパク質として発現されているならば、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるならば、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合する」とは、結合されたＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにある。しかし、エンハンサーは必ずしも近接しているわけではない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、通常の手法にしたがって、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００３５】
「抗体依存性細胞媒介性障害活性」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異的細胞障害性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞を溶解する細胞媒介性反応を意味する。ＡＤＣＣを媒介する一次細胞であるＮＫ細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現する一方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血性細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch及びKinet, Annu.Rev.Immunol., 9:457-92(1991)の４６４頁の表３に要約されている。対象分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５５００３６２号又は５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイが実施されうる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ)細胞を含む。あるいは、又は付加的に、対象分子のＡＤＣＣ活性は、例えばClynesら PNAS(USA), 95:652-656(1998)に開示されたような動物モデルにおいて、インビボで評価されうる。
【００３６】
「ヒトエフェクター細胞」は、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が好ましい。
【００３７】
「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するために使用される。好適なＦｃＲは、天然配列ヒトＦｃＲである。さらに好適なＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(γレセプター)に結合し、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含むものであり、これらのレセプターの対立遺伝子変異体及び選択的スプライシング型を含む。ＦｃγＲＩＩレセプターは、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害レセプター」)を含み、それらは、主としてその細胞質ドメインにおいて異なる類似のアミノ酸配列を有する。活性化レセプターＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシン−ベース活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害レセプターＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメインに、免疫レセプターチロシンベースの阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234(1997)参照)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capelら, Immunomethods 4:25-34 (1994)；及びde Haasら, J. Lab. Clin. Med. 126:330-41(1995)において概説されている。将来同定されるものも含む他のＦｃＲが、ここにおける「ＦｃＲ」なる用語によって包含される。この用語は胎児への母性ＩｇＧの移動の原因である新生児レセプターＦｃＲｎもまた含む(Guyerら, J. Immumol. 117:587(1976)及びKimら, J. Immunol. 24:249 (1994))。ここでのＦｃＲはＦｃγＲＩＩＩａをコードする遺伝子内に遺伝的二形性などの多型を含有し、それによってＩｇＧ１に結合するレセプターの領域内に位置するアミノ酸位置１５８がフェニルアラニン(Ｆ)又はバリン(Ｖ)となる。ホモ接合体バリンＦｃγＲＩＩＩａ(ＦｃγＲＩＩＩａ-１５８Ｖ)は、ホモ接合体フェニルアラニンＦｃγＲＩＩＩａ(ＦｃγＲＩＩＩａ-１５８Ｆ)又はヘテロ(ＦｃγＲＩＩＩａ-１５８Ｆ／Ｖ)レセプターと比較してヒトＩｇＧ１に対して高い親和性を有し、インビトロでのＡＤＣＣ媒介を増加することが示されている。
【００３８】
「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力を意味する。補体活性化経路は補体系(Ｃｌｑ)の第１成分が、同族抗原と結合した分子(例えば抗体)に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoroら, J. Immunol. Methods 202:163(1996)に記載されているようにして実施することができる。
【００３９】
ここで「抗体」なる用語は、最も広義で用いられ、特に無傷のモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷の抗体から形成した多特異性抗体(例えば、二重特異性抗体)、及び所望の生物学的活性を有する限りにおける抗体断片の範囲にわたる。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ(ａｂ')２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。
【００４０】
「天然抗体」は、通常、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、その他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００４１】
「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体間で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞媒介性障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与を示す。
【００４２】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を架橋することができる。
【００４３】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００４４】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
【００４５】
任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられうる。
【００４６】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、抗体は異なるクラスに割り当てられる。無傷の抗体には５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、更にそれらのいくつかは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
【００４７】
「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは単一のポリペプチド鎖に存在する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。ｓｃＦｖの概説については、The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)のPlueckthunを参照のこと。
【００４８】
「ダイアボディ」なる用語は、二つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を意味し、その断片は同一のポリペプチド鎖(ＶＨ-ＶＬ)内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる。短すぎて同一鎖上で二つのドメインの対形成が可能でないリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補ドメインと強制的に対形成させ、二つの抗原結合部位を創製する。ダイアボディは、例えば、欧州特許出願公開第４０４,０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollingerら, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448(1993)により詳細に記載されている。
【００４９】
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる自然に生じる可能性がある突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物に対し、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他のイムノグロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要とすると解釈されてはならない。例えば、本発明によって使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohlerら, Nature, 256:495(1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)及びMarksら, J. Mol. biol. 222: 581-597(1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００５０】
ここでのモノクローナル抗体は、重鎖及び／又は軽鎖の一部が特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に一致するか又は相同であり、鎖の残りが、他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体における対応する配列に一致するか又は相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれらが所望の生物学的活性を示す限り、そのような抗体の断片を特に含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む(米国特許第５６９３７８０号)。
【００５１】
非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)からの高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲが、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。更なる詳細については、Jonesら, Nature 321:522-525(1986)；Riechmannら, Nature 332:323-329(1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596(1992)を参照のこと。
【００５２】
ここで使用されるところの「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabatら, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」からの残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917(1987))を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５３】
関心ある抗原、例えばＤＲ４又はＤＲ５等のデスレセプターに「結合する」抗体とは、抗体が抗原発現細胞を標的とした治療薬として有用となるように十分な親和性及び／又は結合活性をもって抗原に結合することができるものである。
ここでの目的のための「免疫治療」とは、抗体を用いた哺乳動物(好ましくはヒト患者)の治療方法を意味し、その抗体は未コンジュゲートのもの又は「そのままの」抗体でもよいし、あるいは一又は複数の細胞障害性剤などの薬剤や異種性分子とコンジュゲート又は融合して、それによって「免疫コンジュゲート」を生成してもよい。
【００５４】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分は、抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様では、抗体は、(１)ローリー(Lowry)法により定量して、抗体が９５重量％より多くなるほど、最も好ましくは９９重量％より多くなるまで、(２)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、Ｎ末端あるいは内部アミノ酸配列の少なくとも１５の残基を得るのに充分な程度まで、あるいは、(３)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるようになるまで精製される。抗体の自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離された抗体には、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも一の精製工程により調製される。
「有効量」という表現は、同時に投与されようと逐次投与されようと、問題の疾患又は症状を予防、寛解又は治療するために効果的なデスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビターの組合せ量を意味する。特定の実施態様では、有効量は、アポトーシスを被った細胞の傾向(例えば相乗的)を高め、そうでなければ増加させ、腫瘍体積を低減し、又は癌の哺乳動物の生存を長引かせるのに十分な、デスレセプターアゴニストとＥＧＦＲインヒビターの組合せ量である。
【００５５】
ここで補助治療として用いる「免疫抑制剤」という用語は、ここで治療される哺乳動物の免疫系を抑制し又は遮断するように作用する物質を意味する。これは、サイトカイン産生を抑制し、自己抗原の発現を下方制御又は抑制し、あるいはＭＨＣ抗原を遮断する物質を含む。そのような薬剤の例には、２-アミノ-６-アリール-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号参照；非ステロイド性抗炎症剤(ＮＳＡＩＤｓ)；アザチオプリン；シクロフォスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタルアルデヒド(米国特許第４１２０６４９号に記載のようにＭＨＣ抗原を遮断する)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イデオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；糖質ステロイドなどのステロイド、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、及びヒドロコルチゾン；メトトレキサート(経口又は皮下)；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカイン又はサイトカインレセプターアンタゴニスト、例として抗インターフェロン-γ、-β、又は-α抗体、抗腫瘍壊死因子α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦαイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子β抗体、抗インターロイキン２抗体、及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性抗リンパ球グロブリン；ｐａｎ-Ｔ抗体、好ましくは、抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶型ペプチド(１９９０年７月２６日公開の国際公開第９０／０８１８７号)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ(streptodornase)；宿主由来のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン(deoxyspergualin)；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター (Cohenら, 米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offnerら, Science 251:430-432(1991)；国際公開第９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341：482(1989)；及び国際公開第９１／０１１３３号)；及びＴ１０Ｂ９などのＴ細胞レセプター抗体(欧州特許出願公開第３４０１０９号)を含む。
【００５６】
ここで使用する「細胞障害性剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を意味する。その用語は、放射性同位体(例として、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素、又はそれらの断片を含むことを意図する。
【００５７】
ここで目的とする「相乗的活性」又は「相乗作用」又は「相乗効果」又は「相乗的な有効量」とは、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体とＥＧＦＲインヒビターとを組み合わせて用いた場合に観察される効果が、(１)Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、デスレセプター抗体又はＥＧＦＲインヒビターを単独(又は別々に)用いる場合に達する効果よりも大きく、及び(２)Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体とＥＧＦＲインヒビターとの合計付加(付加的な)効果よりも大きいことを意味する。そのような相乗作用又は相乗効果は、当業者に知られている様々な方法によって測定することができる。例えば、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ又はデスレセプター抗体及びＥＧＦＲインヒビターの相乗効果は、腫瘍細胞数又は腫瘍体積の減少を測定するインビトロ又はインビボアッセイ様式で観察することができる。
【００５８】
「アポトーシス」及び「アポトーシス活性」という用語は広義に使用され、典型的には、細胞質の凝縮、原形質膜の微絨毛の喪失、核の分節化、染色体ＤＮＡの分解又はミトコンドリア機能の喪失を含む一又は複数の特徴的な細胞変化を伴う、哺乳動物における細胞死の規則的な又は制御された形態を意味する。この活性は、当該分野でよく知られた方法、例えば細胞生死判別アッセイ、ＦＡＣＳ分析又はＤＮＡ電気泳動法を用いて、アネキシンＶの結合、ＤＮＡの断片化、細胞収縮、小胞体の拡張、細胞断片化、及び／又は膜小胞(アポトーシス体と呼ばれる)の形成を決定し測定することができる。
【００５９】
「癌」、「癌性」及び「悪性」という用語は、典型的には未調節細胞増殖を特徴とする哺乳動物の生理学的状態を意味するか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、メラノーマ、肉腫及び白血病などの癌腫が含まれる。このような癌のより具体的な例には、扁平上皮細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌(ＮＳＣＬＣ)、胃腸癌、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫、膵癌、神経膠芽腫、膠腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝臓癌、例えば肝腫瘍及び肝細胞癌(hepatoma)、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜上皮癌、骨髄腫(例えば多発性骨髄腫)、唾液腺上皮癌、腎臓癌、例えば腎臓細胞上皮癌及びウィルムス腫瘍、基底細胞癌、メラノーマ、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、精巣癌、食道癌、及び様々な種類の頭頸部癌が含まれる。
【００６０】
「免疫関連疾患」という用語は、哺乳動物の免疫系の成分が、哺乳動物の病的状態の原因であるか、媒介又は寄与するものである疾患を意味する。また、免疫反応の刺激又は介在により疾患の進行に改善された効果が付与される疾患も含まれる。この用語には、自己免疫疾患、免疫媒介炎症疾患、非免疫媒介炎症疾患、感染症、及び免疫欠損症が含まれる。そのうちの一部が免疫又はＴ細胞媒介であり、本発明によって治療することが可能な免疫関連及び炎症性疾患の例には、全身性エリテマトーデス、リウマチ様関節炎、若年型慢性関節炎、脊椎関節症、全身性硬化症(強皮症)、特発性炎症性筋疾患(皮膚筋炎、多発性筋炎)、シェーグレン症候群、全身性血管炎、サルコイドーシス、自己免疫性溶血性貧血(免疫性汎血球減少症、発作性夜間ヘモグロビン尿症)、自己免疫性血小板減少症(溶血性血小板減少性紫斑病、免疫媒介血小板減少症)、甲状腺炎(バセドウ病、橋本甲状腺炎、若年型リンパ球性甲状腺炎、萎縮性甲状腺炎)、糖尿病、免疫媒介腎疾患(糸球体腎炎、尿細管間質性腎炎)、中枢及び末梢神経系の脱髄疾患、例えば多発性硬化症、特発性脱髄多発神経障害又はギラン・バレー症候群、及び慢性炎症性脱髄性多発神経障害、肝胆道疾患、例えば感染性肝炎(Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ型肝炎、及び他の非肝親和性ウイルス)、自己免疫性慢性活動性肝炎、原発性胆汁性肝硬変、肉芽腫性肝炎、及び硬化性胆管炎、炎症性腸疾患等の炎症性及び線維性肺疾患(潰瘍性大腸炎：クローン病)、グルテン過敏性腸疾患、及びウィップル病、水疱性皮膚病を含む自己免疫又は免疫媒介皮膚疾患、多形滲出性紅斑及び接触性皮膚炎、乾癬、アレルギー性疾患、例えば喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎、食物過敏症及び蕁麻疹、肺の免疫疾患、例えば好酸球性肺炎、特発性肺線維症及び過敏性肺炎、拒絶反応及び移植片対宿主病を含む移植関連疾患が含まれる。感染症疾患には、ＡＩＤＳ(ＨＩＶ感染)、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ及びＥ型肝炎、細菌感染症、真菌感染症、原虫感染症及び寄生虫症が含まれる。
【００６１】
「Ｂ細胞悪性腫瘍」は、Ｂ細胞が関与している悪性腫瘍である。例として、リンパ球優性ホジキン病(ＬＰＨＤ)を含むホジキン病；非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；濾胞性中心の細胞(ＦＣＣ)リンパ腫；急性リンパ球性白血病(ＡＬＬ)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；有毛細胞白血病；プラズマ細胞性リンパ球リンパ腫；マントル細胞リンパ腫；エイズ又はＨＩＶ関連のリンパ腫；多発性骨髄腫；中枢神経系(ＣＮＳ)リンパ腫；移植後のリンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症(リンパ形質細胞性リンパ腫)；粘膜関連リンパ系組織(ＭＡＬＴ)リンパ腫；及び周辺帯リンパ腫／白血病などがある。
【００６２】
非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)は、限定するものではないが、低悪性度／濾胞性ＮＨＬ、再発性又は抵抗性ＮＨＬ、フロントライン低悪性度ＮＨＬ、ステージＩＩＩ／ＩＶのＮＨＬ、化学療法耐性ＮＨＬ、小リンパ球(ＳＬ)ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度広範性ＮＨＬ、広範性大細胞リンパ腫、侵攻性ＮＨＬ(侵攻性フロントラインＮＨＬ及び侵攻性再発性ＮＨＬを含む)、自己由来の幹細胞移植の後に再発したＮＨＬ又はその移植に抵抗性のＮＨＬ、高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球ＮＨＬ、高悪性度小型非開裂細胞ＮＨＬ、巨大(bulky)疾患ＮＨＬ等を含む
【００６３】
ここでの「自己免疫疾患」とは、個体自身の組織に対して起こる疾患又は障害、あるいはその同時分離したものないしは徴候又は結果として生じる症状である。自己免疫疾患又は障害の例には、限定するものではないが、関節炎(関節リウマチ、若年性関節リウマチ、骨関節症、乾癬性関節炎及び強直性脊椎炎)、乾癬、アトピー性皮膚炎を含む皮膚炎；慢性特発性蕁麻疹、例えば慢性自己免疫蕁麻疹、多発性筋炎／皮膚筋炎、中毒性表皮剥離症、全身強皮症及び硬化症、炎症性腸疾患(ＩＢＤ)(クローン病、潰瘍性大腸炎)と関連している応答、及び膿皮症壊疽の同時分離を伴うＩＢＤ、結節性紅斑、原発性硬化性胆管炎、及び／又は上強膜炎)、成人呼吸窮迫症候群(ＡＲＤＳ)を含む呼吸窮迫症候群、髄膜炎、ＩｇＥ媒介性疾患、例えばアナフィラキシー及びアレルギー性鼻炎、ラスマッセン脳炎のような脳炎、ブドウ膜炎、大腸炎、例えば顕微鏡的大腸炎及び膠原性大腸炎、糸球体腎炎(ＧＮ)、例えば膜性ＧＮ、特発性膜性ＧＮ、Ｉ型及びＩＩ型及び急速進行性ＧＮを含む膜性増殖性ＧＮ(ＭＰＧＮ)、アレルギー症状、湿疹、喘息、Ｔ細胞の浸潤が関与している症状及び慢性炎症反応、アテローム性動脈硬化症、自己免疫心筋炎、白血球癒着不全、皮膚ＳＬＥのような全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、ループス(腎炎、脳炎、小児科、非腎臓、ジスコイド、脱毛症を含む)、若年型糖尿病、脊髄視覚ＭＳなどの多発性硬化症(ＭＳ)、アレルギー性脳脊髄炎、サイトカイン及びＴリンパ球によって媒介される急性及び遅発性過敏症と関連している免疫応答、結核、サルコイドーシス、ヴェゲナー肉芽腫症を含む肉芽腫症、無顆粒球症、脈管炎(大動脈管炎(リウマチ性多発筋痛症及び巨細胞(高安)動脈炎を含む)、中脈管炎(川崎病及び結節性多発性動脈炎を含む)、ＣＮＳ脈管炎、及び脈管炎関連ＡＮＣＡ、例えばチャーグ・ストラウス脈管炎又は症候群(ＣＳＳ))、無形成性貧血、クームス陽性貧血症、ダイアモンド・ブラックファン(Blackfan)貧血症、自己免疫溶血性貧血(ＡＩＨＡ)を含む免疫溶血性貧血、悪性貧血、純粋な赤血球形成不全(赤芽球癆)、第ＶＩＩＩ因子欠乏症、血友病Ａ、自己免疫好中球減少症、汎血球減少症、白血球減少症、白血球血管外遊出が関与している疾患、ＣＮＳ炎症性障害、多器官損傷症候群、重症筋無力症、抗原抗体複合体媒介性疾患、抗糸球体基底膜疾患、抗リン脂質抗体症候群、アレルギー性神経炎、ベーチェット病、キャッスルマン症候群、グッドパスチュア症候群、ランバート・イートン筋無力症候群、レイノー症候群、シェーグレン症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、固形臓器移植拒絶反応(高い試験板反応性の抗体価、組織のＩｇＡ沈澱物及び腎移植、肝移植、腸移植、心臓移植に起因している拒絶などのための前処置を含む)、移植片対宿主病(ＧＶＨＤ)、類天疱瘡水疱、天疱瘡(尋常性、落葉状及び天疱瘡粘液膜類天疱瘡を含む)、自己免疫多腺性内分泌障害、ライター症候群、スティッフマン症候群、免疫複合体腎炎、ＩｇＭ多発性神経炎又はＩｇＭ媒介性神経病、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓症血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫血小板減少を含む血小板減少(例えば心筋梗塞患者に発現)、自己免疫精巣炎及び卵巣炎を含む精巣及び卵巣の自己免疫疾患、原発性甲状腺機能低��症；自己免疫性甲状腺炎を含む自己免疫内分泌性疾患、慢性甲状腺炎(橋本甲状腺炎)、亜急性の甲状腺炎、特発性の甲状腺機能低下症、アジソン病、バセドウ病、自己免疫多腺性症候群(又は多腺性内分泌障害症候群)、小児ＩＤＤＭを含むインシュリン依存性真正糖尿病(ＩＤＤＭ)とも称されるＩ型糖尿病、及びシーハン症候群；自己免疫肝炎、リンパ系間質性肺炎(ＨＩＶ)、閉塞性細気管支炎(非移植)対ＮＳＩＰ、ギランバレ症候群、ベルジェ病(ＩｇＡネフロパシ)、原発性胆管萎縮症、脂肪便症(グルテン腸疾患)、同時分離疱疹状皮膚炎を有する抵抗性スプルー、クリオグロブリン血症、アミル栄養側索硬化症(ＡＬＳ；筋萎縮性側索硬化症)、冠状動脈疾患、自己免疫内耳疾患(ＡＩＥＤ)、自己免疫聴力障害、眼球クローヌス筋硬直症候群(ＯＭＳ)、抵抗性多発性軟骨炎のような多発性軟骨炎、肺胞蛋白症、アミロイドーシス、巨細胞肝炎、強膜炎、不明な／未知の重大なモノクローナル免疫グロブリン増多症(ＭＧＵＳ)、末梢神経障害、腫瘍随伴症候群、チャンネル病、例えば癲癇、片頭痛、不整性、筋疾患、難聴、失明、周期性麻痺及びＣＮＳのチャンネル病；自閉症、炎症性筋疾患及び巣状分節状糸球体硬化症(ＦＳＧＳ)が含まれる。
【００６４】
この出願で用いられる「プロドラッグ」という用語は、親薬剤に比較して癌細胞に対する細胞障害性が低く、より活性な親形態に酵素的に活性化され又は変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14：375-382頁, 615th Meeting, Belfast(1986)、及びStellaら, 「Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267頁, Humana Press (1985)参照。プロドラッグは、親物質よりも大きな生物学的利用能を有し、インビボで親化合物に転化される製薬的に活性な親物質の前駆体又は誘導体を意味する。例えば、プロドラッグは、経口摂取時に、親物質と比較して、より多い血流中への吸収度を有しうる。この発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスフェート含有プロドラッグ、チオホスフェート含有プロドラッグ、スルフェート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、置換されていてもよいフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は置換されていてもよいフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞障害性剤の例には、以下の化学療法剤が含まれる。
【００６５】
ここで使用する「細胞障害性剤」なる用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し、及び／又は細胞破壊をもたらす物質を意味する。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び細菌、真菌、植物、又は動物起源の酵素活性毒素又は小分子毒素などの毒素(それらの断片及び／又は変異体を含む)を含むことを意図する。
【００６６】
「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロスホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin)(合成類似体KW-2189及びCBI-TM1を含む)；エリュテロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスウレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、及びラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１（例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照)；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；クロドロネート(clodronate)などのビスホスホネート(bisphosphonates)；エスペラマイシン(esperamicin)；並びにネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン (モルフォリノ-ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン(mitomycins)、ミコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、スト��プトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)のようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル(eniluracil)；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダンモール(mopidanmol)；ニトラエリン(nitraerine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖類複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリジンＡ(roridin A)及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばタキソール(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、ABRAXANETM クレモフォール(Cremophor)を含まないアルブミン操作パクリタキセルナノ粒子製剤(American  Pharmaceutical  Partners, Schaumberg, Illinois)及びタキソテア(登録商標)ドキセタキセル、(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；ミトキサントン；ビンクリスチン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド類；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの何れかの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【００６７】
また、この定義には、腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲンレセプターモジュレーター(ＳＥＲＭ)、例えばタモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTONトレミフェン；アロマターゼ酵素を阻害するアロマターゼ阻害物質で、副腎でのエストロゲン産生を調節するもの、例えば４(５)-イミダゾール類、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)メゲストロールアセテート、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、ホルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール(vorozole)、FEMARA(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常細胞増殖に関係するシグナル伝達経路における遺伝子の発現を抑制するもの、例えばＰＫＣ-アルファ、ラルフ及びＨ-Ｒａｓ；ＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばANGIOZYME(登録商標)リボザイム)及びＨＥＲ２発現インヒビターなどのリボザイム；遺伝子治療ワクチンなどのワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン及びVAXID(登録商標)ワクチン；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ-２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ABARELIX(登録商標)rmRH；並びに上記のものの何れかの製薬的に許容可能な塩、酸又は誘導体が含まれる。
【００６８】
ここで用いられる「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロかインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期においてそのような遺伝子を過剰発現する細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の場所で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘導する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド及びブレオマイシンを含む。Ｇ１を停止する薬剤は、Ｓ期停止にも溢流し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel編, Chapter 1, 表題「Cell cycle reguration, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakamiら, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。
【００６９】
「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。このようなサイトカインの例としては、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンを挙げることができる。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)のような糖タンパク質ホルモン、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)；肝臓成長因子；繊維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミュラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ-αあるいはＴＧＦ-βのような形質転換増殖因子(ＴＧＦ)；インスリン様増殖因子-Ｉ及び-ＩＩ；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン-α、-β、及び-γのようなインターフェロン；マクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)のようなコロニー刺激因子(ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、 ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、 ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２等のインターロイキン(ＩＬ)；ＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。
【００７０】
ここで使用される「治療する」、「治療」、及び「療法」とは、治癒的療法、予防的療法及び防護的療法を称する。
ここで使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、ウシ、ウマ、イヌ及びネコを含む哺乳動物に分類されるあらゆる動物を意味する。本発明の好ましい実施態様では、哺乳動物はヒトである。
【００７１】
「ＥＧＦＲ」なる用語は、Ullrichら, Nature(1984)309：418425に記載されているレセプターチロシンキナーゼポリペプチド上皮成長因子レセプターを意味するか、又はＨｅｒ-１及びｃ-ｅｒｂＢ遺伝子産物、並びにその変異体、例えばＥＧＦＲｖＩＩＩを意味する。また、ＥＧＦＲの変異体には、欠失、置換及び挿入変異体、例えばLynchら(New England Journal of Medicine 2004, 350：2129)、Paezら(Science 2004, 304：1497)、Paoら(PNAS 2004, 101：13306)に記載されているものが含まれる。
【００７２】
「ＥＧＦＲインヒビター」なる用語は、ＥＧＦＲに結合するか、そうでなければ直接相互作用し、そのシグナル伝達活性を防止又は低減させる化合物を意味し、別の場合には「ＥＧＦＲアンタゴニスト」とも称される。ＥＧＦＲインヒビターには、抗体、例えばセツキシマブ及びエルビトゥックス(登録商標)(ImClone Systems Inc.)とも称されるキメラ抗体Ｃ２２５、完全長ヒトＡＢＸ-ＥＧＦ(パニツムマブ(panitumumab)、Abgenix Inc.)、並びにＥ１.１、Ｅ２.４、Ｅ２.５、Ｅ６.２、Ｅ６.４、Ｅ２.１１、Ｅ６.３及びＥ７.６.３として知られており、米国特許第６２３５８８３号に記載されている完全長ヒト抗体；ＭＤＸ-４４７(Medarex Inc)が含まれる。ＥＧＦＲアンタゴニストには、小分子、例えば米国特許第５６１６５８２号、米国特許第５４５７１０５号、米国特許第５４７５００１号、米国特許第５６５４３０７号、米国特許第５６７９６８３号、米国特許第６０８４０９５号、米国特許第６２６５４１０号、米国特許第６４５５５３４号、米国特許第６５２１６２０号、米国特許第６５９６７２６号、米国特許第６７１３４８４号、米国特許第５７７０５９９号、米国特許第６１４０３３２号、米国特許第５８６６５７２号、米国特許第６３９９６０２号、米国特許第６３４４４５９号、米国特許第６６０２８６３号、米国特許第６３９１８７４号、国際公開第９８１４４５１号、国際公開第９８５００３８号、国際公開第９９０９０１６号、国際公開第９９２４０３７号、米国特許第６３４４４５５号、米国特許第５７６００４１号、米国特許第６００２００８号、米国特許第５７４７４９８号に記載されている化合物が含まれる。特定の小分子ＥＧＦＲアンタゴニストには、ＯＳＩ-７７４(ＣＰ-３５８７７４、エルロチニブ(erlotinib)、OSI Pharmaceuticals)；ＰＤ１８３８０５(ＣＩ １０３３、２-プロペンアミド、Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-７-[３-(４-モルホリニル)プロポキシ]-６-キナゾリニル]-、ジヒドロクロリド、Pfizer Inc.)；Iressa(ZD1389、ゲフィチニブ、４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)キナゾリン、AstraZeneca)；ＺＭ１０５１８０((６-アミノ-４-(３-メチルフェニル-アミノ)-キナゾリン、Zeneca)；ＢＩＢＸ-１３８２(Ｎ８-(３-クロロ-４-フルオロ-フェニル)-Ｎ２-(１-メチル-ピペリジン-４-イル)-ピリミド[５,４-ｄ]ピリミジン-２,８-ジアミン、Boehringer Ingelheim)；ＰＫＩ-１６６((Ｒ)-４-[４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-１Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン-６-イル]-フェノール)；(Ｒ)-６-(４-ヒドロキシフェニル)-４-[(１-フェニルエチル)アミノ]-７Ｈ-ピロロ[２,３-ｄ]ピリミジン)；ＣＬ-３８７７８５(Ｎ-[４-[(３-ブロモフェニル)アミノ]-６-キナゾリニル]-２-ブチンアミド)；及びＥＫＢ-５６９(Ｎ-[４-[(３-クロロ-４-フルオロフェニル)アミノ]-３-シアノ-７-エトキシ-６-キノリニル]-４-(ジメチルアミノ)-２-ブテンアミド)が含まれる。
【００７３】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲインヒビターは、米国特許第５７５７４９８号に従い、次の一般式Ｉ：
【化３】
2008532937.tif 000004
[上式中：
Ｘはハロ又はヒドロキシであり；
ｍは１、２又は３であり；
各Ｒ１は独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、ヒドロキシアミノ、カルボキシ、ニトロ、グアニジノ、ウレイド、シアノ、トリフルオロメチル、及び-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)-Ｗ-(フェニル)からなる群から選択され、ここでＷは単結合、Ｏ、Ｓ又はＮＨであり；又は
各Ｒ１は独立して、シアノで置換されたＣ１-Ｃ４アルキル及びＲ９から選択され、Ｒ９はＲ５、-ＯＲ６、-ＮＲ６、Ｒ６、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、-ＮＨＯＲ５、-ＯＣ(Ｏ)Ｒ６、シアノ、Ａ及び-ＹＲ５からなる群から選択され；Ｒ５はＣ１-Ｃ４アルキルであり；Ｒ６は独立して、水素又はＲ５であり；Ｒ７はＲ５、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６であり；Ａはピペリジノ、モルホリノ、ピロリジノ、４-Ｒ６-ピペラジン-１-イル、イミダゾール-１-イル、４-ピリドン-１-イル、-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)(ＣＯ２Ｈ)、フェノキシ、フェニル、フェニルスルファニル、Ｃ２-Ｃ４アルケニル、及び-(Ｃ１-Ｃ４アルキレン)Ｃ(Ｏ)ＮＲ６Ｒ６から選択され；ＹはＳ、ＳＯ又はＳＯ２であり；Ｒ５、-ＯＲ６及び-ＮＲ６Ｒ６中のアルキル部分は１ないし３のハロ置換基で置換されていてもよく、Ｒ５、-ＯＲ６及び-ＮＲ６Ｒ６中のアルキル部分は１又は２のＲ９基で置換されていてもよく、該任意の置換基中のアルキル部分は、ハロ又はＲ９で置換されていてもよく、但し、２のヘテロ原子は同じ炭素原子に結合しておらず；又は
各Ｒ１は独立して、-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４)-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノから選択され、Ｒ１０は、ハロ、-ＯＲ６、Ｃ２-Ｃ４アルカノイルオキシ、-Ｃ(Ｏ)Ｒ７、及び-ＮＲ６Ｒ６から選択され；該-ＮＨＳＯ２Ｒ５、フタルイミド-(Ｃ１-Ｃ４-アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホニルアミノ、３-フェニルウレイド、２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、及びＲ１０-(Ｃ２-Ｃ４)-アルカノイルアミノのＲ１基は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルキル、シアノ、メタンスルホニル及びＣ１-Ｃ４アルコキシから独立して選択される１又は２の置換基で置換されていてもよく；又は
２のＲ１基は、それらが結合している炭素と共同して、Ｏ、Ｓ及びＮから選択される１又は２のヘテロ原子を含む５−８員環を形成し；
Ｒ２は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒ５から独立して選択される１ないし３の置換基で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキル又は水素であり；
ｎは１又は２であり、各Ｒ３は独立して、水素、ハロ、ヒドロキシ、Ｃ１-Ｃ６アルキル、-ＮＲ６Ｒ６、及びＣ１-Ｃ４アルコキシから選択され、該Ｒ３基中のアルキル部分は、ハロ、Ｃ１-Ｃ４アルコキシ、-ＮＲ６Ｒ６、及び-ＳＯ２Ｒから独立して選択される１ないし３の置換基で置換されていてもよく；
Ｒ４はアジド又は-(エチニル)-Ｒ１１であり、Ｒ１１は、ヒドロキシ、-ＯＲ６又は-ＮＲ６Ｒ６で置換されていてもよいＣ１-Ｃ６アルキル又は水素である]
を有する。
【００７４】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲインヒビターは、
(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-[３-(３'-ヒドロキシプロピン-１-イル)フェニル]-アミン；[３-(２'-(アミノメチル)-エチニル)フェニル]-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-ニトロキナゾリン-４-イル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(４-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-２-メチルフェニル)-アミン；(６-アミノキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニルアミノキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６,７-メチレンジオキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-６-メチルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(７-ニトロキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(４'-トルエンスルホニルアミノ)キナゾリン-４-イル]-アミン；(３-エチニルフェニル)-{６-[２'-フタルイミド-eth-１'-イル- スルホニルアミノ]キナゾリン-４-イル}-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-グアニジノキナゾリン-４-イル)-アミン； (７-アミノキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(７-メトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(６-カルボメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(７-カルボメトキシキナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；[６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)キナゾリン-４-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン； (３-アジドフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-アジド-５-クロロフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(４-アジドフェニル)-(６,７-ジメトキシキナゾリン-４-イル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニル-キナゾリン-４-イル)-アミン；(６-エタンスルファニル-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン； (６,７-ジメトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジメトキシ-キナゾリン-４-イル)-[３-(プロピン-１'-イル)-フェニル]-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(５-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-４-フルオロ-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-クロロ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；[６-(２-クロロ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-アセトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-７-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-６-イルオキシ]-エタノール；[６-(２-アセトキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン； [７-(２-クロロ-エトキシ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；[７-(２-アセトキシ-エトキシ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール；２-[４-(３-エチニル-��ェニルアミノ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-６-イルオキシ]-エタノール；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール；[６-(２-アセトキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-(３-エチニル-フェニル)-アミン；(３-エチニル-フェニル)-{６-(２-メトキシ-エトキシ)-７-[２-(４-メチル-ピペラジン-１-イル)-エトキシ]-キナゾリン-４-イル}-アミン；(３-エチニル-フェニル)-[７-(２-メトキシ-エトキシ)-６-(２-モルホリン-４-イル)-エトキシ)-キナゾリン-４-イル]-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジブトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジイソプロポキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-アミン； [６,７-ビス-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；２-[４-(３-エチニル-フェニルアミノ)-６-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-７-イルオキシ]-エタノール；(６,７-ジプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-５-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-フルオロ-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(５-エチニル-２-メチル-フェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-４-メチル-フェニル)-アミン；(６-アミノメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニル-フェニル)-アミン；(６-アミノメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-エトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-エトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-イソプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-プロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルメチル-７-メトキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６-アミノカルボニルエチル-７-イソプロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；及び(６-アミノカルボニルエチル-７-プロポキシ-キナゾリン-４-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(６,７-ジエトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-[６-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-７-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-アミン；[６,７-ビス-(２-ヒドロキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン；[６,７-ビス-(２-メトキシ-エトキシ)-キナゾリン-１-イル]-(３-エチニルフ��ニル)-アミン；(６,７-ジメトキシキナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミン；(３-エチニルフェニル)-(６-メタンスルホニルアミノ-キナゾリン-１-イル)-アミン；及び(６-アミノ-キナゾリン-１-イル)-(３-エチニルフェニル)-アミンからなる群から選択される式Ｉの化合物である。
【００７５】
特定の実施態様では、式ＩのＥＧＦＲインヒビターは、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンである。特定の実施態様では、ＥＧＦＲインヒビター、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンはＨＣｌ塩形態である。他の特定の実施態様では、ＥＧＦＲインヒビター、Ｎ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンは、ほぼ６．２６、１２．４８、１３．３９、１６．９６、２０．２０、２１．１０、２２．９８、２４．４６、２５．１４及び２６．９１で、２θ度で表される特性ピークを有するＸ線粉末回折図形を示す実質的に均質な結晶多形形態(国際公開第０１／３４５７４号に多形体Ｂとして記載)である。このような多形形態のＮ-(３-エチニルフェニル)-６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)-４-キナゾリンアミンは、タルセバTM、並びにＯＳＩ-７７４、ＣＰ-３５８７７４及びエルロチニブと呼ばれる。
【００７６】
式Ｉの化合物、その製薬的に許容可能な塩及びプロドラッグ(以下、活性化合物)は、化学的に関連した化合物の調製に適用可能であることが知られている任意のプロセスにより調製することができる。一般的に、活性化合物は、米国特許第５７４７４９８号に開示されている一般スキームＩに示されているように、適切に置換されたアミンを使用し、適切に置換されたキナゾリンから調製することができる：
【化４】
2008532937.tif 000005
【００７７】
スキームＩに示されているように、Ｘが適切な置換可能な離脱基、例えばハロ、アリールオキシ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、例えばトリフルオロメタンスルホニルオキシ、アリールスルフィニル、アリールスルホニル、シロキシ、シアノ、ピラゾロ、トリアゾロ、又はテトラゾロ、好ましくは４-クロロキナゾリンである適切な４-置換キナゾリン２を、Ｒ４が上述したもので、ＹがＢｒ、Ｉ、又はトリフルオロメタン-スルホニルオキシである適切なアミン又はアミンヒドロクロリド４又は５と、溶媒、例えば(Ｃ１-Ｃ６)アルコール、ジメチルホルムアミド(ＤＭＦ)、Ｎ-メチルピロリジン-２-オン、クロロホルム、アセトニトリル、テトラヒドロフラン(ＴＨＦ)、１-４ジオキサン、ピリジン、又は他の非プロトン性溶媒中において反応させる。反応は、塩基、好ましくはアルカリ又はアルカリ土類金属の炭酸塩又は水酸化物、又は第３級アミン塩基、例えばピリジン、２,６-ルチジン、コリジン、Ｎ-メチル-モルホリン、トリエチルアミン、４-ジメチルアミノ-ピリジン又はＮ,Ｎ-ジメチルアニリンの存在下でなされうる。これらの塩基を、以後、適切な塩基と称する。反応混合物を、残存する４-ハロキナゾリンが実質的に検出されなくなるまで、典型的には約２〜約２４時間、ほぼ周囲温度から溶媒の還流温度まで、好ましくは約３５℃から還流温度までの温度に維持する。好ましくは、反応は、ドライ窒素等の不活性雰囲気下で実施される。
【００７８】
一般的に、反応物は、化学量論的に混合される。アミン４又は５の塩(典型的にはＨＣｌ塩)が使用される化合物に対してアミン塩基が使用される場合、過剰のアミン塩基、一般的には更に一当量のアミン塩基を使用するのが好ましい。(あるいは、アミン塩基が使用されないならば、過剰のアミン４又は５が使用されうる)。
立体障害のアミン４(例えば、２-アルキル-３-エチニルアニリン)又は非常に反応性の４-ハロキナゾリンが使用される化合物に対しては、溶媒としてＤＭＦ又はＮ-メチルピロリジン-２-オン等の極性非プロトン性溶媒又はｔ-ブチルアルコールを使用することが好ましい。
【００７９】
あるいは、Ｘがヒドロキシル又はオキソである(また、２-窒素が水素化されている)４-置換キナゾリン２を、例えば四塩化炭素、クロロホルム、ジクロロエタン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、又は他の非プロトン性溶媒、又はそれらの混合物等の溶媒中において、場合によっては不活性ポリマー(例えば、樹脂１グラム当たり３ｍｍｏｌのリンを含む２％のジビニルベンゼン架橋ポリスチレンであるAldrichカタログ番号36,645-5のトリフェニルホスフィンに支持)上に支持されていてもよい置換されていてもよいテトラアリールホスフィン及び四塩化炭素と反応させる。反応混合物を、ほぼ周囲温度から還流まで、好ましくは約３５℃から還流までの温度で、２〜２４時間維持する。この混合物を、直接か又は例えば真空蒸発による溶媒の除去、及び別の溶媒、例えば(Ｃ１-Ｃ６)アルコール、ＤＭＦ、Ｎ-メチルピロリジン-２-オン、ピリジン又は１-４ジオキサンの添加後に、適切なアミン又はアミンヒドロクロリド４又は５と反応させる。ついで、反応混合物を、周囲温度から溶媒の還流温度まで、好ましくは約３５℃からほぼ還流温度までの温度に、実質的に完全な生成物の形成が達成されるまで、典型的には約２〜約２４時間、維持する。好ましくは、反応は、ドライ窒素等の不活性雰囲気下で実施される。
【００８０】
キナゾリン２との反応における出発物質として、ＹがＢｒ、Ｉ、又はトリフルオロメタンスルホニルオキシである化合物４が使用される場合、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＹが上述したものである式３の化合物が生成される。化合物３を、ジメチルアミン又はトリエチルアミン等の溶媒中において、適切なルイス酸、例えば塩化第一銅、及び適切なアルキン、例えばトリメチルシリルアセチレン、プロパルギルアルコール、又は３-(Ｎ,Ｎ-ジメチルアミノ)-プロピンの存在下、適切なパラジウム試薬、例えばテトラキス(トリフェニルホスフィン)パラジウム又はビス(トリフェニルホスフィン)パラジウムジクロリドと反応させることにより、Ｒ４がＲ１１エチニルで、Ｒ１１が上述したものである式Ｉの化合物に転化される。ＹがＮＨ２である化合物３を、ジアゾ化剤、例えば酸及び亜硝酸塩(例えば酢酸及びＮａＮＯ２)で化合物３を処理し、続いてアジド、例えばＮａＮ３で得られた生成物を処理することにより、Ｒ４がアジドである化合物１に転化させることができる。
【００８１】
Ｒ１がアミノ又はヒドロキシアミノ基である式Ｉの化合物の生成に対しては、Ｒ１がニトロである対応する式Ｉの化合物の還元が用いられる。
還元は、このような転換に対して知られている多くの手順の何れかにより、簡便に実施することができる。還元は、例えば適切な金属触媒、例えばパラジウム、白金又はニッケルの存在下、反応不活性な溶媒中におけるニトロ化合物の水素化によって、実施されうる。さらなる適切な還元剤は、例えば活性化鉄(塩酸等の酸の希釈液で鉄粉を洗浄することにより生成)等の活性化金属である。よって、例えば還元は、水とアルコール、例えばメタノール又はエタノールとの混合物のような溶媒中において、例えば５０℃〜１５０℃の範囲の温度、簡便には７０℃又はその近傍で、濃塩酸を用い、ニトロ化合物と活性化金属の混合物を加熱することにより、実施されうる。他の適切なクラスの還元剤は、アルカリ金属の亜ジチオン酸塩、例えばジチオン酸ナトリウムであり、これは、(Ｃ１-Ｃ４)アルカン酸、(Ｃ１-Ｃ６)アルカノール、水又はそれらの混合物中で使用されうる。
【００８２】
Ｒ２又はＲ３が(キナゾリンと反応することを意図したアミノ基以外の)第１級又は第２級アミノ部分を含んでいる式Ｉの化合物の製造に対して、このような遊離のアミノ基は、好ましくは上述した反応の前に保護され、その後４-(置換)キナゾリン２との上述の反応の後に、脱保護する。
いくつかのよく知られている窒素保護基を使用することができる。このような基には、(Ｃ１-Ｃ６)アルコキシカルボニル、置換されていてもよいベンジルオキシカルボニル、アリールオキシカルボニル、トリチル、ビニルオキシカルボニル、Ｏ-ニトロフェニルスルホニル、ジフェニルホスフィニル、ｐ-トルエンスルホニル、及びベンジルが含まれる。窒素保護基の添加は、第３級アミン塩基、例えばトリエチルアミン、ジイソプロピルエチルアミン又はピリジン、好ましくはトリエチルアミンの存在又は不在下で、約０℃〜約５０℃、好ましくはほぼ周囲温度で、塩化炭化水素溶媒、例えば塩化メチレン又は１,２-ジクロロエタン、又はエーテル溶媒、例えばグリム、ジグリム又はＴＨＦ中において実施することができる。あるいは、保護基は、ショッテン-バウマン(Schotten-Baumann)条件を使用して簡便に結合させる。
【００８３】
化合物２及び５の上述したカップリング反応の後、保護基を、当業者に知られている脱保護方法、例えばtert-ブトキシカルボニル保護生成物に対しては塩化メチレン中でのトリフルオロ酢酸を用いた処理により、除去することができる。
保護基及びそれらの使用についての記載は、T. W. Greene及びP. G. M. Wuts, 「Protective Groups in Organic Synthesis」, 第2版, John Wiley & Sons, New York, 1991を参照のこと。
【００８４】
Ｒ１又はＲ２がヒドロキシである式Ｉの化合物の製造に対しては、Ｒ１又はＲ２が(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシである式Ｉの化合物の開裂が好ましい。
開裂反応は、このような転換に対して知られている多くの手順の任意のものにより、簡便に実施することができる。１５０℃〜１７５℃での、溶融ピリジンヒドロクロリド(２０-３０当量)を用いての保護された式Ｉ誘導体の処理を、Ｏ-脱アルキル化に対して用いることができる。あるいは、開裂反応は、例えば、保護されたキナゾリン誘導体をアルカリ金属(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルフィド、例えばエタンチオラートナトリウムで処理するか、又はアルカリ金属ジアリールホスフィド、例えばジフェニルホスフィドリチウムで処理することにより、実施することができる。また開裂反応は、簡便には、三ハロゲン化ホウ素又はアルミニウム、例えば三臭化ホウ素を用いて、保護されたキナゾリン誘導体を処理することにより、実施することができる。このような反応は、好ましくは、反応不活性な溶媒の存在下で適切な温度で実施される。
【００８５】
Ｒ１又はＲ２が(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルフィニル又は(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルホニル基である式Ｉの化合物は、好ましくは、Ｒ１又はＲ２が(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルファニル基である式Ｉの化合物の酸化により調製される。スルファニルのスルフィニル及び／又はスルホニルへの酸化に対して当該技術分野で、適切な酸化剤が知られており、例えば白金の存在下、過酸化水素、過酸(例えば３-クロロペルオキシ安息香酸又はペルオキシ酢酸)、ペルオキシ硫酸アルカリ金属(例えばペルオキシモノ硫酸カリウム)、三酸化クロム又は酸素ガスである。酸化は、一般的に、他の官能基にダメージを与えたり、過度に酸化される危険性を低減するために、化学量論的量の酸化剤を使用して、できるだけ穏やかな条件下で実施される。一般的に、反応は適切な溶媒、例えば塩化メチレン、クロロホルム、アセトン、テトラヒドロフラン又はtert-ブチルメチルエーテル中において、約−２５℃〜５０℃、好ましくは周囲温度又はその近傍、すなわち１５℃〜３５℃の範囲の温度で実施される。スルフィニル基を担持する化合物が所望されている場合、簡便には酢酸又はエタノール等の極性溶媒中において、メタ過ヨウ素酸ナトリウム又はカリウム等、より穏和な酸化剤を使用するべきである。(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルホニル基を含む式Ｉの化合物は、対応する(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルフィニル化合物並びに対応する(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルファニル化合物を酸化することにより得ることができる。
【００８６】
Ｒ１が置換されていてもよい(Ｃ２-Ｃ４)アルカノイルアミノ、ウレイド、３-フェニルウレイド、ベンズアミド又はスルホンアミドである式Ｉの化合物は、Ｒ１がアミノである対応する化合物をアシル化又はスルホニル化することにより調製することができる。適切なアシル化剤は、アシルハロゲン化物等のアシルアミノにアミノをアシル化させるために当該技術分野で知られている任意の薬剤、例えば、(Ｃ２-Ｃ４)アルカノイルクロリド又はブロミド又はベンゾイルクロリド又はブロミド、無水アルカン酸又は混合無水物(例えば、適切な塩基の存在下、(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシカルボニルクロリド等の(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシカルボニルハライドとアルカン酸とを反応させることにより形成される無水酢酸又は混合無水物）である。Ｒ１がウレイド又は３-フェニルウレイドである式Ｉの化合物の製造に対しては、適切なアシル化剤は、例えばシアネート、特にシアン酸ナトリウム等のアルカリ金属のシアネート、又はイソシアネート、例えばイソシアン酸フェニルである。Ｎ-スルホニル化は、第３級アミン塩基の存在下、適切なスルホニルハロゲン化物又はスルホニル無水物を用いて実施されうる。一般的に、アシル化又はスルホニル化は、反応不活性な溶媒中において、約−３０℃〜１２０℃の範囲、簡便には周囲温度又はその近傍の温度で実施される。
【００８７】
Ｒ１が(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシ又は置換(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシであるか、又はＲ１が(Ｃ１-Ｃ４)アルキルアミノ又は置換モノ-Ｎ-又はジ-Ｎ,Ｎ-(Ｃ１-Ｃ４)アルキルアミノである式Ｉの化合物は、好ましくは適切な塩基の存在下、それぞれＲ１がヒドロキシ又はアミノである対応する化合物をアルキル化することにより調製される。適切なアルキル化剤には、適切な塩基の存在下、反応不活性な溶媒中における、約１０℃〜１４０℃の範囲、簡便には周囲温度又はその近傍の温度での、アルキル又は置換アルキルハロゲン化物、例えば置換されていてもよい(Ｃ１-Ｃ４)アルキルの塩化物、臭化物又はヨウ化物が含まれる。
【００８８】
Ｒ１がアミノ-、オキシ-又はシアノ-置換(Ｃ１-Ｃ４)アルキル置換基である式Ｉの化合物の製造に対しては、Ｒ１がアミノ-、アルコキシ-又はシアノ基で置き換え可能な基を担持する(Ｃ１-Ｃ４)アルキル置換基である対応する化合物が、適切なアミン、アルコール又はシアニドと、好ましくは適切な塩基の存在下で反応させられる。反応は、好ましくは、反応不活性な溶媒又は希釈剤中において、約１０℃〜１００℃、好ましくは周囲温度又はその近傍の温度で、実施される。
【００８９】
Ｒ１がカルボキシ置換基又はカルボキシ基を含む置換基である式Ｉの化合物は、Ｒ１が(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシカルボニル置換基又は(Ｃ１-Ｃ４)アルコキシカルボニル基を含む置換基である対応する化合物を、加水分解することにより調製される。加水分解は塩基性条件下、例えばアルカリ金属水酸化物の存在下で簡便に実施され得る。
【００９０】
Ｒ１がアミノ、(Ｃ１-Ｃ４)アルキルアミノ、ジ-[(Ｃ１-Ｃ４)アルキル]アミノ、ピロリジン-１-イル、ピペリジノ、モルホリノ、ピペラジン-１-イル、４-(Ｃ１-Ｃ４)アルキルピペラジン-１-イル、又は(Ｃ１-Ｃ４)アルキルスルファニルである式Ｉの化合物は、適切な塩基の存在下、Ｒ１がアミン又はチオール置換可能な基である対応する化合物と、適切なアミン又はチオールを反応させることにより調製されうる。反応は、好ましくは、反応不活性な溶媒又は希釈剤中において、約１０℃〜１８０℃の範囲、簡便には１００℃〜１５０℃の範囲の温度で、実施される。
【００９１】
Ｒ１が２-オキソピロリジン-１-イル又は２-オキソピペリジン-１-イルである式Ｉの化合物は、適切な塩基の存在下、Ｒ１がハロ-(Ｃ２-Ｃ４)アルカノイルアミノ基である対応する化合物を環化することにより調製される。反応は、好ましくは、反応不活性な溶媒又は希釈剤中において、約１０℃〜１００℃の範囲、簡便には周囲温度又はその近傍の温度で、実施される。
【００９２】
Ｒ１がカルバモイル、置換カルバモイル、アルカノイルオキシ又は置換アルカノイルオキシである式Ｉの化合物の製造に対しては、Ｒ１がヒドロキシである対応する化合物をカルバモイル化又はアシル化するのが簡便である。
【００９３】
ヒドロキシアリール部分をアルカノイルオキシアリール基にアシル化するための当該分野で知られている適切なアシル化剤には、例えば(Ｃ２-Ｃ４)アルカノイルハロゲン化物、(Ｃ２-Ｃ４)アルカノイル無水物、及び上述したような混合無水物が含まれ、典型的には適切な塩基の存在下で、適切なそれらの置換誘導体が使用されうる。あるいは、(Ｃ２-Ｃ４)アルカン酸又は適切に置換されたそれらの誘導体は、Ｒ１がヒドロキシである式Ｉの化合物と、縮合剤、例えばカルボジイミドの補助によりカップリングしていてもよい。Ｒ１がカルバモイル又は置換カルバモイルである式Ｉの化合物を製造するためには、適切なカルバモイル化剤は、例えば典型的には適切な塩基の存在下での、シアナート類又はアルキルもしくはアシルイソシアナート類である。あるいは、適切な中間体、例えばＲ１がヒドロキシである式Ｉの化合物のカルボニルイミダゾリル誘導体又はクロロホルマートは、例えばホスゲン(又はホスゲン等価物)又はカルボニルジイミダゾールを用いて、前記誘導体を処理することにより生じせしめてよい。ついで、得られた中間体は、適切なアミン又は置換アミンと反応させ、所望のカルバモイル誘導体を生成させることができる。
【００９４】
Ｒ１がアミノカルボニル又は置換アミノカルボニルである式Ｉの化合物は、Ｒ１がカルボキシである適切な中間体のアミノ分解により生成することができる。
【００９５】
Ｒ１がカルボキシである式Ｉの化合物の活性化及びカップリングは、当業者に知られている様々な方法により実施されうる。適切な方法には、カルボキシル、例えば酸ハロゲン化物、アジド、対称的又は混合無水物、又は活性エステルで、所望するアミンとのカップリングに対し適切な反応性を有するものの活性化が含まれる。このようなタイプの中間体の具体例、及びそれらの製造、及びアミンとのカップリングにおけるそれらの使用は、文献；例えばM. Bodansky及びA. Bodansky, 「The Practice of Peptide Synthesis」, Springer-Verlag, New York, 1984に、広く見出すことができる。得られた式Ｉの化合物は、標準的な方法、例えば溶媒除去及び再結晶化又はクロマトグラフィーにより、分離し精製することができる。
【００９６】
記載した反応スキームＩの出発物質(例えば、アミン類、キナゾリン類、及びアミン保護基)は、容易に入手可能であるか、又は従来からの有機合成法を使用し、当業者が容易に合成することができる。例えば、２,３-ジヒドロ-１,４-ベンゾオキサジン誘導体の調製は、R. C. Elderfield, W. H. Todd, S. Gerber, Ch. 12 「Heterocyclic Compounds」,Vol. 6, R. C. Elderfield編, John Wiley and Sons, Inc., N.Y., 1957に記載されている。置換２,３-ジヒドロベンゾチアジニル化合物は、R. C. Elderfield及びE. E. Harrisにより、Elderfield 「Heterocyclic Compounds」の第６巻第１３章に記載されている。
【００９７】
他の好ましい実施態様では、ＥＧＦＲインヒビターは、米国特許第５４５７１０５号に記載されているような、一般式ＩＩ：
【化５】
2008532937.tif 000006
[上式中；
ｍは１、２又は３であり；
各Ｒ１は独立して、６-ヒドロキシ、７-ヒドロキシ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、ウレイド、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル、Ｎ-(１-４Ｃ)アルキルカルバモイル、Ｎ,Ｎ-ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]カルバモイル、ヒドロキシアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシアミノ、(２-４Ｃ)アルカノイルオキシアミノ、トリフルオロメトキシ、(１-４Ｃ)アルキル、６-(１-４Ｃ)アルコキシ、７-(１-４Ｃ)アルコキシ、(１-３Ｃ)アルキレンジオキシ、(１-４Ｃ)アルキルアミノ、ジ-１[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ、ピロリジン-１-イル、ピペリジノ、モルホリノ、ピペラジン-１-イル、４-(１-４Ｃ)アルキルピペラジン-１-イル、(１-４Ｃ)アルキルチオ、(１-４Ｃ)アルキルスルフィニル、(１-４Ｃ)アルキルスルホニル、ブロモメチル、ジブロモメチル、ヒドロキシ-(１-４Ｃ)アルキル、(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシ-(１-４Ｃ)アルキル、カルボキシ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル-(１-４Ｃ)アルキル、カルバモイル-(１-４Ｃ)アルキル、Ｎ-(１-４Ｃ)アルキルカルバモイル-(１-４Ｃ)アルキル、Ｎ,Ｎ-ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]カルバモイル-(１-４Ｃ)アルキル、アミノ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルキルアミノ-(１-４Ｃ)アルキル、ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ-(１-４Ｃ)アルキル、ピペリジノ-(１-４Ｃ)アルキル、モルホリノ-(１-４Ｃ)アルキル、ピペラジン-１-イル-(１-４Ｃ) アルキル、４-(１-４Ｃ)アルキルピペラジン-１-イル-(１-４Ｃ) アルキル、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ-(１-４Ｃ)アルキル、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルキルチオ-(１-４Ｃ)アルキル、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルキルチオ-(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルキルチオ-(１-４Ｃ)アルキル、フェノキシ-(１-４Ｃ)アルキル、アニリノ-(１-４Ｃ)アルキル、フェニルチオ-(１-４Ｃ)アルキル、シアノ-(１-４Ｃ)アルキル、ハロゲノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ、(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ、カルボキシ-(１-４Ｃ)アルコキシ、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル-(１-４Ｃ)アルコキシ、カルバモイル-(１-４Ｃ)アルコキシ、Ｎ-(１-４Ｃ)アルキルカルバモイル-(１-４Ｃ)アルコキシ、Ｎ,Ｎ-ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]カルバモイル-(１-４Ｃ)アルコキシ、アミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、(１-４Ｃ)アルキルアミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ、フェニル-(１-４Ｃ)アルコキシ、フェノキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ、アニリノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、フェニルチオ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ピペリジノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、モルホリノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ピペラジン-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、４-(１-４Ｃ)アルキルピペラジン-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、ハロゲノ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、(２-４Ｃ)アルカノイルオキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、カルボキシ-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、カルバモイル-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、Ｎ-(１-４Ｃ)アルキルカルバモイル-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、Ｎ,Ｎ-ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]カルバモイル-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、アミノ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、(１-４Ｃ)アルキルアミノ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、ジ-１(１-４Ｃ)アルキル]アミノ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、フェニル-(１-４Ｃ)アルキルアミノ、フェノキシ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、アニリノ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、フェニルチオ-(２-４Ｃ)アルキルアミノ、(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニルアミノ、(１-４Ｃ)アルキルスルホニルアミノ、ベンズアミド、ベンゼンスルホンアミド、３-フェニルウレイド ２-オキソピロリジン-１-イル、２,５-ジオキソピロリジン-１-イル、ハロゲノ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、ヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、カルボキシ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、カルバモイル-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、Ｎ-(１-４Ｃ)アルキルカルバモイル-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、Ｎ,Ｎ-ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]カルバモイル-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、アミノ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、(１-４Ｃ)アルキルアミノ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ又はジ-[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ-(２-４Ｃ)アルカノイルアミノであり、ここで前記ベンズアミド又はベンゼンスルホンアミド置換基、又はＲ１基における任意のアニリノ、フェノキシ又はフェニル基は、一又は二のハロゲノ、(１-４Ｃ)アルキル又は(１-４Ｃ)アルコキシ置換基を担持していてもよく；
ｎは１又は２であり；
各Ｒ２は独立して、水素、ヒドロキシ、ハロゲノ、トリフルオロメチル、アミノ、ニトロ、シアノ、(１-４Ｃ)アルキル、(１-４Ｃ)アルコキシ、(１-４Ｃ)アルキルアミノ、ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ、(１-４Ｃ)アルキルチオ、(１-４Ｃ)アルキルスルフィニル又は(１-４Ｃ)アルキルスルホニル；又はその製薬的に許容可能な塩である]
を有し、４-(４'-ヒドロキシアニリノ)-６-メトキシキナゾリン、４-(４,-ヒドロキシアニリノ)-６,７-メチレンジオキシキナゾリン、６-アミノ-４-(４'-アミノアニリノ)キナゾリン、４-アニリノ-６-メチルキナゾリン、又はその塩酸塩を除き、４-アニリノ-６,７-ジメトキシキナゾリン又はその塩酸塩を除く。
【００９８】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲインヒビターは、次の：
４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６,７-ジメトキシキナゾリン; ４-(３',４'-ジクロロアニリノ)-６,７-ジメトキシキナゾリン;６,７-ジメトキシ-４-(３'-ニトロアニリノ)-キナゾリン;６,７-ジエトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;６-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン; ４-(３'-クロロアニリノ)-６-メトキシキナゾリン;６,７-エチレンジオキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;６-アミノ-７-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン; ４-(３'-メチルアニリノ)-６-ウレイドキナゾリン;６-(２-メトキシエトキシメチル)-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;６,７-ジ-(２-メトキシエトキシ)-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;６-ジメチルアミノ-４-(３'-メチルアニリノ)キナゾリン;６-ベンズアミド-４-(３'-メチルアニリノ)キナゾリン;６,７-ジメトキシ-４-(３'-トリフルオロメチルアニリノ)-キナゾリン;６-ヒドロキシ-７-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;７-ヒドロキシ-６-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;７-アミノ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;６-アミノ-４-(３'-メチルアニリノ)キナゾリン;６-アミノ-４-(３'-クロロアニリノ)-キナゾリン;６-アセトアミド-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;６-(２-メトキシエチルアミノ)-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;７-(２-メトキシアセトアミド)-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;７-(２-ヒドロキシエトキシ)-６-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;７-(２-メトキシエトキシ)-６-メトキシ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリン;６-アミノ-４-(３'-メチルアニリノ)-キナゾリンからなる群から選択される式ＩＩの化合物である。
【００９９】
式ＩＩのキナゾリン誘導体又はその製薬的に許容可能な塩は、化学的に関連した化合物の調製に適用可能であることが知られている任意のプロセスにより調製することができる。適切なプロセスは、例えば米国特許第４３２２４２０号で使用されているものを例示することができる。必須の出発物質は商業的に入手可能であるか、又は有機化学の標準的手順により得ることができる。
【０１００】
(ａ)簡便には適切な塩基の存在下での、Ｚが置換可能な基であるキナゾリン(ｉ)とアニリン(ｉｉ)との反応。
【化６】
2008532937.tif 000007
適切な置換可能な基Ｚは、例えばハロゲノ、アルコキシ、アリールオキシ又はスルホニルオキシ基、例えばクロロ、ブロモ、メトキシ、フェノキシ、メタンスルホニルオキシ又はトルエン-ｐ-スルホニルオキシ基である。
【０１０１】
適切な塩基は、例えば有機アミン塩基、例えばピリジン、２,６-ルチジン、コリジン、４-ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、モルホリン、Ｎ-メチルモルホリン、又はジアザビシクロ[５.４.０]ウンデセ-７-エン、又は例えばアルカリもしくはアルカリ土類金属の炭酸塩又は水酸化物、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである。
【０１０２】
反応は、好ましくは適切で不活性な溶媒又は希釈剤、例えばアルカノール又はエステル、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール又は酢酸エチル、又はハロゲン化溶媒、例えば塩化メチレン、クロロホルム又は四塩化炭素、エーテル、例えばテトラヒドロフラン又は１,４-ジオキサン、芳香族溶媒、例えばトルエン、又は双極非プロトン性溶媒、例えばＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ-ジメチルアセトアミド、Ｎ-メチルピロリジン-２-オン又はジメチルスルホキシドの存在下で実施される。反応は、例えば１０℃〜１５０℃の範囲、好ましくは２０℃〜８０℃の範囲の温度で、簡便に実施される。
【０１０３】
式ＩＩのキナゾリン誘導体は、このプロセスから、遊離の塩基の形態で得られうるか、あるいはＺが上述した意味を有する式Ｈ-Ｚの酸との塩の形態で得られてもよい。塩から遊離の塩基を得ることが望まれる場合、塩は、一般的な手順を使用し、上述した適切な塩基で処理することができる。
【０１０４】
(ｂ)Ｒ１又はＲ２がヒドロキシである式ＩＩの化合物の製造に対しては、Ｒ１又はＲ２が(１-４Ｃ)アルコキシである式ＩＩのキナゾリン誘導体の切断。
切断反応は、このような変換に対して知られている多くの手順の何れかにより、簡便に実施されうる。反応は、例えばアルカリ金属の(１-４Ｃ)アルキル硫化物、例えばエタンチオラートナトリウムでキナゾリン誘導体を処理するか、又は例えばアルカリ金属のジアリールリン化物、例えばジフェニルホスフィドリチウムで処理することにより実施することができる。また切断反応は、例えばホウ素又はアルミニウムのトリハロゲン化物、例えば三臭化ホウ素でキナゾリン誘導体を処理することにより、簡便に実施することができる。このような反応は、好ましくは上述したような適切で不活性な溶媒又は希釈剤下、適切な温度で実施される。
【０１０５】
(ｃ)Ｒ１又はＲ２が(１-４Ｃ)アルキルスルフィニル又は(１-４Ｃ)アルキルスルホニル基である式ＩＩの化合物の製造に対しては、Ｒ１又はＲ２が(１-４Ｃ)アルキルチオ基である式ＩＩのキナゾリン誘導体の酸化。
適切な酸化剤は、チオのスルフィニル及び／又はスルホニルへの酸化に対して当該技術分野で知られている任意の薬剤、例えば、白金の存在下、過酸化水素、過酸(例えば３-クロロペルオキシ安息香酸又はペルオキシ酢酸)、アルカリ金属ペルオキシ硫酸塩(例えばペルオキシ一硫酸カリウム)、三酸化クロム又は酸素ガスである。酸化は、一般的に過剰な酸化及び他の官能基へダメージを与える危険性を低減するために、必要な化学量論的量の酸化剤を用い、できるかぎり穏やかな条件下で実施される。一般的に、反応は適切な溶媒又は希釈剤、例えば塩化メチレン、クロロホルム、アセトン、テトラヒドロフラン又はtert-ブチルメチルエーテル中において、例えば−２５℃〜５０℃、簡便には周囲温度又はその近傍、すなわち１５℃〜３５℃の範囲の温度で実施される。スルフィニル基を担持する化合物が必要とされる場合、簡便には、酢酸又はエタノール等の極性溶媒中において、メタ過ヨウ素酸ナトリウム又はカリウム等、より穏和な酸化剤を使用することができる。(１-Ｃ４)アルキルスルホニル基を含む式ＩＩの化合物が必要とされる場合、それは、対応する(１-４Ｃ)アルキルスルフィニル化合物、並びに対応する(１-４Ｃ)アルキルチオ化合物の酸化により得ることができることが理解される。
【０１０６】
(ｄ)Ｒ１がアミノである式ＩＩの化合物の製造に対しては、Ｒ１がニトロである式Ｉのキナゾリン誘導体の還元。
還元は、このような変換で公知の任意の多くの手順により、便宜的に実施されてよい。還元は、パラジウム又は白金等の適切な金属触媒の存在下、上述した不活性な溶媒又は希釈液において、ニトロ化合物溶液を水素化することにより実施されてよい。さらなる適切な還元剤は、例えば活性化金属、例えば活性化鉄(塩酸等の酸の希釈液で鉄粉を洗浄することにより生成)である。よって、例えば還元は、適切な溶媒又は希釈液、例えば水とアルコール、例えばメタノール又はエタノールとの混合物において、例えば５０℃〜１５０℃の範囲の温度、便宜的には７０℃又はその近傍で、ニトロ化合物と活性化金属の混合物を加熱することにより実施されてもよい。
【０１０７】
(ｅ)Ｒ１が(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ又は置換(２-４Ｃ)アルカノイルアミノ、ウレイド、３-フェニルウレイド又はベンズアミドであり、Ｒ２がアセトアミド又はベンズアミドである式ＩＩの化合物の製造に対しては、Ｒ１又はＲ２がアミノである式ＩＩのキナゾリン誘導体のアシル化。
適切なアシル化剤は、アシルアミノにアミノをアシル化させるための当該技術分野で知られている任意の薬剤、例えば、アシルハロゲン化物、例えば簡便には上述した適切な塩基の存在下での、(２-４Ｃ)アルカノイルクロリド又はブロミド又はベンゾイルクロリド又はブロミド、無水アルカン酸又は混合無水物、例えば(２-４Ｃ)アルカン酸無水物、例えばアルカン酸と例えば(１-４Ｃ)アルコキシカルボニルクロリド等の(１-４Ｃ)アルコキシカルボニルハライドとを、上述した適切な塩基の存在下で反応させることにより形成される無水酢酸又は混合無水物である。Ｒ１がウレイド又は３-フェニルウレイドである式ＩＩの化合物の製造に対しては、適切なアシル化剤は、例えばシアナート、特にシアン酸ナトリウム等のアルカリ金属シアナート、又はイソシアナート、例えばイソシアン酸フェニルである。一般的に、アシル化は、上述した適切で不活性な溶媒又は希釈剤中において、例えば−３０℃〜１２０℃の範囲、便宜的には周囲温度又はその近傍の温度で実施される。
【０１０８】
(ｆ)Ｒ１が(１-４Ｃ)アルコキシ又は置換(１-４Ｃ)アルコキシであり、又はＲ１が(１-４Ｃ)アルキルアミノ又は置換(１-４Ｃ)アルキルアミノである式ＩＩの化合物の製造に対しては、適切であるならばＲ１がヒドロキシ又はアミノである式ＩＩのキナゾリン誘導体の、好ましくは上述した適切な塩基の存在下でのアルキル化。
適切なアルキル化剤は、アルコキシ又は置換アルコキシへのヒドロキシのアルキル化に対して、又はアルキルアミノ又は置換アルキルアミノへのアミノのアルキル化に対して当該技術分野で知られている任意の薬剤、例えば上述した適切な塩基の存在下、上述した適切で不活性な溶媒又は希釈剤中において、例えば１０℃〜１４０℃の範囲、簡便には周囲温度又はその近傍の温度での、アルキル又は置換アルキルハロゲン化物、例えば(１-４Ｃ)アルキルの塩化物、臭化物又はヨウ化物、又は置換(１-４Ｃ)アルキルの塩化物、臭化物又はヨウ化物である。
【０１０９】
(ｇ)Ｒ１がカルボキシ置換基又はカルボキシ基を含む置換基である式ＩＩの化合物の製造に対しては、Ｒ１が(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル置換基又は(１-４Ｃ)アルコキシカルボニル基を含む置換基である式ＩＩのキナゾリン誘導体の加水分解。
加水分解は、簡便には、例えば塩基性条件下で実施されうる。
【０１１０】
(ｈ)Ｒ１がアミノ-、オキシ-、チオ-又はシアノ-置換(１-４Ｃ)アルキル置換基である式ＩＩの化合物の製造に対しては、好ましくは上述した適切な塩基の存在下での、Ｒ１が上述の置換可能な基を担持する(１-４Ｃ)アルキル置換基である式ＩＩのキナゾリン誘導体と、適切なアミン、アルコール、チオール又はシアニドとの反応。
反応は、好ましくは上述した適切で不活性な溶媒又は希釈剤中において、例えば１０℃〜１００℃、簡便には周囲温度又はその近傍の温度で実施される。
式ＩＩのキナゾリン誘導体の製薬的に許容可能な塩が必要とされる場合、例えば前記化合物を、例えば一般的な手順を使用して適切な酸と反応させることにより、得ることができる。
【０１１１】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲインヒビターは、米国特許第５７７０５９９号に開示されている次の式ＩＩ'：
【化７】
2008532937.tif 000008
[上式中、
ｎは１、２又は３であり；
各Ｒ２は独立して、ハロゲノ又はトリフルオロメチルであり；
Ｒ３は(１-４Ｃ)アルコキシであり；及び
Ｒ１は、ジ-[(１-４Ｃ)アルキル]アミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ピロリジン-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、ピペリジノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、モルホリノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、ピペラジン-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、４-(１-４Ｃ)アルキルピペラジン-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、イミダゾール-１-イル-(２-４Ｃ)アルコキシ、ジ-[(１-４Ｃ)アルコキシ-(２-４Ｃ)アルキル]アミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、チアモルホリノ-(２-４Ｃ)アルコキシ、１-オキソチアモルホリノ-(２-４Ｃ)アルコキシ又は１,１-ジオキソチアモルホリノ-(２-４Ｃ)アルコキシであり、Ｎ又はＯ原子に結合していないＣＨ２(メチレン)基を有する上述したＲ１置換基の任意のものは、該ＣＨ２基上にヒドロキシ置換基を担持していてもよい]
の化合物、又はその製薬的に許容可能な塩である。
【０１１２】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲインヒビターは、
４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(２-ピロリジン-１-イルエトキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(２-モルホリノエトキシ)-キナゾリン;４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(３-ジエチルアミノプロポキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-ピロリジン-１-イルプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(３-ジメチルアミノプロポキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(３',４'-ジフルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-ピペリジノプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(２-ジメチルアミノエトキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(２',４'-ジフルオロアニリノ)-６-(３-ジメチルアミノプロポキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(２',４'-ジフルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(２-イミダゾール-１-イルエトキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(３-イミダゾール-１-イルプロポキシ)-７-メトキシキナゾリン； ４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(２-ジメチルアミノエトキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(２',４'-ジフルオロアニリノ)-６-(３-ジメチルアミノプロポキシ)-７-メトキシキナゾリン；４-(２',４'-ジフルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)-キナゾリン；４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(２-イミダゾール-１-イルエトキシ)-７-メトキシキナゾリン；及び４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-６-(３-イミダゾール-１-イルプロポキシ)-７-メトキシキナゾリンからなる群から選択される式ＩＩ'の化合物である。
【０１１３】
特定の実施態様では、ＥＧＦＲインヒビターは、４-(３'-クロロ-４'-フルオロアニリノ)-７-メトキシ-６-(３-モルホリノプロポキシ)-キナゾリン、又はＺＤ１８３９、ゲフィチニブ及びIressaＴＭと称される式ＩＩ'の化合物である。
式ＩＩ'のキナゾリン誘導体又はその製薬的に許容可能な塩は、化学的に関連した化合物の調製に適用可能なことが知られている任意のプロセスにより調製することができる。適切なプロセスには、例えば米国特許第５６１６５８２号、米国特許第５５８０８７０号、米国特許第５４７５００１号及び米国特許第５５６９６５８号に例証されているものが含まれる。特に記載しない限りは、ｎ、Ｒ２、Ｒ３及びＲ１は、式ＩＩ'のキナゾリン誘導体に対して上述した意味の何れかを有する。必須の出発物質は商業的に入手可能であるか、又は有機化学の標準的手順により得ることができる。
【０１１４】
(ａ)簡便には適切な塩基の存在下での、Ｚが置換可能な基であるキナゾリン(ｉｉｉ)とアニリン(ｉｖ)との反応。
【化８】
2008532937.tif 000009
適切な置換可能な基Ｚは、例えばハロゲノ、アルコキシ、アリールオキシ又はスルホニルオキシ基、例えばクロロ、ブロモ、メトキシ、フェノキシ、メタンスルホニルオキシ又はトルエン-ｐ-スルホニルオキシ基である。
【０１１５】
適切な塩基は、例えば有機アミン塩基、例えばピリジン、２,６-ルチジン、コリジン、４-ジメチルアミノピリジン、トリエチルアミン、モルホリン、Ｎ-メチルモルホリン、又はジアザビシクロ[５.４.０]ウンデセ-７-エン、又は例えばアルカリもしくはアルカリ土類金属の炭酸塩又は水酸化物、例えば炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウム、水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムである。また適切な塩基は、例えばアルカリ金属又はアルカリ土類金属のアミド、例えばアミドナトリウム又はビス(トリメチルシリル)アミドナトリウムである。
【０１１６】
反応は、好ましくは適切で不活性な溶媒又は希釈剤、例えばアルカノール又はエステル、例えばメタノール、エタノール、イソプロパノール又は酢酸エチル、ハロゲン化溶媒、例えば塩化メチレン、クロロホルム又は四塩化炭素、エーテル、例えばテトラヒドロフラン又は１,４-ジオキサン、芳香族溶媒、例えばトルエン、又は双極非プロトン性溶媒、例えばＮ,Ｎ-ジメチルホルムアミド、Ｎ,Ｎ-ジメチルアセトアミド、Ｎ-メチルピロリジン-２-オン又はジメチルスルホキシドの存在下で実施される。反応は、例えば１０℃〜１５０℃の範囲、好ましくは２０℃〜８０℃の範囲の温度で、簡便に実施される。
【０１１７】
式ＩＩ'のキナゾリン誘導体は、このプロセスから、遊離の塩基の形態で得られうるし、又はＺが上述した意味を有する式Ｈ-Ｚの酸との塩の形態で得られうる。塩から遊離の塩基を得ることが所望されている場合、塩は、一般的な手順を使用し、上述した適切な塩基で処理されうる。
【０１１８】
(ｂ)Ｒ１がアミノ置換(２-４Ｃ)アルコキシ基である式ＩＩ'の化合物の製造に対しては、簡便には、Ｒ１がヒドロキシ基である式ＩＩ'のキナゾリン誘導体の、上述した適切な塩基の存在下でのアルキル化。
適切なアルキル化剤は、例えばアミノ置換アルコキシへのヒドロキシのアルキル化に対して当該分野で知られている任意の薬剤、例えばアミノ置換アルキルハロゲン化物、例えば上述した適切な塩基の存在下、上述した適切で不活性な溶媒又は希釈剤中において、例えば１０℃〜１４０℃の範囲、簡便には８０℃又はその近傍の温度での、アミノ置換(２-４Ｃ)アルキルの塩化物、臭化物又はヨウ化物である。
【０１１９】
(ｃ)Ｒ１がアミノ置換(２-４Ｃ)アルコキシ基である式ＩＩ'の化合物の製造に対しては、簡便には上述した適切な塩基の存在下での、Ｒ１がヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ基である式ＩＩ'の化合物、又はその反応性誘導体と、適切なアミンとの反応。
Ｒ１がヒドロキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ基である式ＩＩ'の化合物の適切な反応性誘導体は、例えばハロゲノ-又はスルホニルオキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ基、例えばブロモ-又はメタンスルホニルオキシ-(２-４Ｃ)アルコキシ基である。
反応は、好ましくは、上述した適切で不活性な溶媒又は希釈剤の存在下、例えば１０℃〜１５０℃の範囲、簡便には５０℃又はその近傍の温度で実施される。
【０１２０】
(ｄ)Ｒ１がヒドロキシ-アミノ-(２-４Ｃ)アルコキシ基である式ＩＩ'の化合物の製造に対しては、Ｒ１が２,３-エポキシプロポキシ又は３,４-エポキシブトキシ基である式ＩＩ'の化合物と、適切なアミンとの反応。
反応は、好ましくは、上述した適切で不活性な溶媒又は希釈液の存在下で、例えば１０℃〜１５０℃の範囲、簡便には７０℃又はその近傍の温度で実施される。
式ＩＩ'のキナゾリン誘導体の製薬的に許容可能な塩、例えば式ＩＩ'のキナゾリン誘導体の一酸又は二酸との付加塩が必要とされる場合、それは、例えば一般的な手順を使用して適切な酸と、前記化合物を反応させることにより、得ることができる。
【０１２１】
ＩＩ．本発明の組成物及び方法
ＴＮＦリガンドファミリーに関連したサイトカインであって、ここにおいて「Ａｐｏ-２リガンド」又は「ＴＲＡＩＬ」と特定したサイトカインは記載されている。ヒト天然Ａｐｏ-２リガンドの予測成熟アミノ酸配列は、２８１個のアミノ酸を含み、約３２．５ｋＤａの計算上の分子量を有する。シグナル配列が存在せず内部疎水性領域が存在することは、Ａｐｏ-２リガンドがＩＩ型膜貫通型タンパク質であることを示唆している。また、可溶性細胞外ドメインＡｐｏ-２リガンドポリペプチドは記載されている。例えば１９９７年７月１７日に公開の国際公開第号９７／２５４２８を参照。Ａｐｏ-２Ｌ置換変異体がさらに記載されている。アラニンスキャンニング技術が、生物学的活性を有する種々の置換変異体分子を同定するために利用されてきた。Ａｐｏ-２リガンドの特定の置換変異体は、少なくとも一つのアミノ酸がアラニン残基等の別のアミノ酸残基によって置換されているものを含む。これら置換変異体は、例えば「Ｄ２０３Ａ」、「Ｄ２１８Ａ」及び「Ｄ２６９Ａ」として同定されている。この命名法は、２０３、２１８、及び／又は２６９位(図１に示した番号を使用)のアスパラギン酸残基がアラニン残基によって置換されているＡｐｏ-２リガンド変異体を特定するために使用されている。場合によっては、本発明のＡｐｏ-２Ｌ変異体は一又は複数のアミノ酸置換を含んでもよい。場合によっては、このようなＡｐｏ-２Ｌ変異体はＤＲ４又はＤＲ５レセプター選択的変異体である。
下記の説明は、核酸をコードするＡｐｏ-２リガンドを含むベクターで形質転換又は形質移入された宿主細胞を培養し、細胞培養物からポリペプチドを回収することによる、Ａｐｏ-２リガンド変異体を含むＡｐｏ-２リガンドを製造する方法に関する。
【０１２２】
Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡは、Ａｐｏ-２リガンドｍＲＮＡを有し、これを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製された任意のｃＤＮＡライブラリーから得ることできる。従って、ヒトＡｐｏ-２リガンドＤＮＡは、国際公開第９７／２５４２８号に記載されているヒト胎盤ｃＤＮＡのバクテリオファージライブラリーのような、ヒト組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることが可能である。また、Ａｐｏ-２リガンドコード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又はオリゴヌクレオチド合成によって得ることもできる。
【０１２３】
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計された(Ａｐｏ-２リガンドに対する抗体又は少なくとも約２０-８０塩基のオリゴヌクレオチド等の)プローブによってスクリーニングすることができる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrookら, Molecular Cloning：A Laboratory Manual(New York：Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。Ａｐｏ-２リガンドをコードする遺伝子を単離する他の方法はＰＣＲ法を使用するものである［Sambrookら,上掲；Dieffenbachら, PCR Primer：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)］。
【０１２４】
Ａｐｏ-２リガンドのアミノ酸配列断片又は変異体は、Ａｐｏ-２リガンドＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入するか、所望のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを合成することにより調製することができる。このような断片又は変異体は、完全長Ａｐｏ-２リガンドについて図１に示したアミノ酸配列の、又は細胞内領域、膜貫通領域、又は細胞外領域の内部あるいは一方又は両方の末端に残基の挿入、置換及び／又は欠失を示す。挿入、置換及び／又は欠失の何れかを組み合わせて、ここに定義するような所望の生物活性、例えばアポトーシス活性を有する最終のコンストラクトに到達するように作製することができる。好ましい実施態様では、断片又は変異体は、Ａｐｏ-２リガンドの細胞内、膜貫通、又は細胞外領域についてここで同定した配列、あるいはＡｐｏ-２リガンドの完全長配列に対して、少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくとも約９０％の配列同一性、さらに好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する。また、アミノ酸の変化により、グリコシル化部位の数と位置の変化、又は膜係留特性(膜アンカー特性)の改変のように、Ａｐｏ-２リガンドの翻訳後プロセスを改変し得る。
【０１２５】
上述したＡｐｏ-２リガンド配列における変異は、米国特許第５３６４９３４号に記載された保存的あるいは非保存的突然変異に関する技術とガイドラインの任意のものを使用して生じさせることができる。これらは、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)突然変異誘発、アラニンスキャニング、及びＰＣＲ突然変異誘発を含む。
【０１２６】
近接配列に沿った一又は複数のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析法を使用することができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性アミノ酸である。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。変異体の主鎖構造をあまり改変することなく、ベータ炭素を越えた側鎖が除去されるため、典型的にはアラニンがこの群のなかで好ましいスキャニングアミノ酸である［Cunninghamら, Science, 244：1081(1989)］。またアラニンは最も一般的なアミノ酸であることにおいても好ましい。さらに、アラニンは埋没及び露出位置の双方に頻繁に見出される［Creighton, The Proteins,(W.H. Freeman ＆ Co., NY)；Chothia, J. Mol. Biol., 150：1(1976)］。
【０１２７】
アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される(Biochemistry, 第２版., pp.73-75, Worth Publishers, New York(1975)中のA. L. Lehninger)：
(１)非極性：Ala(A), Val(V), Leu(L), Ile(I), Pro(P), Phe(F), Trp(W), Met(M)
(２)非荷電の極性：Gly(G), Ser(S), Thr(T), Cys(C), Tyr(Y), Asn(Ｎ), Gln(Q)
(３)酸性：Asp(D), Glu(E)
(４)塩基性：Lys(K), Arg(R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づいてグループ分けすることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン, Met, Ala, Val, Leu, Ile；
(２)中性親水性：Cys, Ser, Thr, Asn, Gln；
(３)酸性：Asp, Glu；
(４)塩基性：His, Lys, Arg；
(５)鎖配向に影響する残基：Gly, Pro；
(６)芳香族：Trp, Tyr, Phe。
【０１２８】
【表１】
2008532937.tif 000010
【０１２９】
また、本発明の範囲に含まれるＡｐｏ-２リガンド配列の変異体は、アミノ末端誘導体又は修飾型にも関連する。このようなＡｐｏ-２リガンド配列は、ポリペプチド配列のＮ末端にメチオニン又は修飾メチオニン(例えばホルミルメチオニル又は他のブロックされたメチオニル種など)を有するここに記載した任意のＡｐｏ-２リガンドポリペプチドを含む。
【０１３０】
天然又は変異体Ａｐｏ-２リガンドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、さらなるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入されうる。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、次のものの一又は複数が含まれる：シグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサー成分、プロモーター、及び転写終結配列であり、それぞれを以下に説明する。用いられるであろう任意のシグナル配列、複製開始点、マーカー遺伝子、エンハンサーエレメント及び転写終結配列は当該分野で知られており、国際公開第９７／２５４２８号にさらに詳しく記載されている。
【０１３１】
発現及びクローニングベクターは、通常、宿主生物によって認識され、Ａｐｏ-２リガンド核酸配列に作用可能に連結したプロモーターを含む。プロモーターは、作用可能に連結したＡｐｏ-２リガンド核酸配列のような特定の核酸配列の転写及び翻訳を制御する構造遺伝子(一般に約１００ないし１０００塩基対)の開始コドンの上流側(５')に位置する未翻訳配列である。このようなプロモーターは典型的には、誘発的及び構成的なクラスの２つのクラスに属する。誘発的なプロモーターは、例えば、栄養分の存在あるいは不存在、温度変化などの培養条件のある変化に対応してその制御の下でＤＮＡからの転写レベルを上昇させるプロモーターである。現時点において多種の可能な宿主細胞により認識される非常に多くのプロモーターがよく知られている。これらのプロモーターは、制限酵素の消化によって供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、ベクターに単離したプロモーター配列を挿入することで、Ａｐｏ-２リガンドをコードするＤＮＡに作用的に結合している。天然のＡｐｏ-２リガンドプロモーター配列及び多くの異種性プロモーターはいずれもＡｐｏ-２リガンドＤＮＡの直接増幅及び／又は発現に用いることができる。
原核生物及び真核生物宿主を用いての使用に適したプロモーターは当該分野で知られており、国際公開第９７／２５４２８号にさらに詳しく記載されている。
【０１３２】
大腸菌における可溶性Ａｐｏ-２Ｌの生産の好ましい方法には、生産物発現の制御のための誘発的プロモーターが用いられる。制御可能な誘発的なプロモーターの利用は、生産物発現の誘発、及び宿主によって十分には耐えることのできないかなりの量の生産物の蓄積の前に、所望する細胞密度への培養増殖を可能にする。
【０１３３】
Ａｐｏ-２Ｌ(１１４−２８１形態)の発現のために、いくつかの誘発的なプロモーター系(Ｔ７ポリメラーゼ、ｔｒｐ及びアルカリホスファターゼ(ＡＰ))が出願人によって評価されている。これら三つのプロモーターのそれぞれの利用は、収集細胞ペーストから回収されたかなりの量の可溶性で生物学的に活性なＡｐｏ-２Ｌ三量体を結果として生じた。しっかりとしたプロモーターコントロール、及び収集細胞ペーストにおいて到達したより高い細胞密度及び力価のために、試験されたこれら三つの誘発的なプロモーター系の中でＡＰプロモーターが好ましい。
【０１３４】
一又は複数の上に列挙した成分を含む適切なベクターの構築には、標準的なライゲーション技術を用いる。単離されたプラスミド又はＤＮＡ断片を開裂させ、整え、そして必要とされるプラスミドの生成のために望ましい形態に再びライゲーションする。
作成されたプラスミドが正しい配列であることを確認する分析のために、ライゲーション混合物を用いて、大腸菌Ｋ１２菌株２９４(ＡＴＣＣ３１,４４６)を形質転換し、適当な場合にはアンピシリン又はテトラサイクリン耐性によって、形質転換細胞を好適に選択する。形質転換細胞からプラスミドを調製し、制限エンドヌクレアーゼ消化により分析し、及び／又は当該分野で知られている標準的技術を利用して配列を決定する［例えば、Messingら,Nucleic Acids Res., 9:309(1981)；Maxamら, Methods in Enzymology, 65：499(1980)を参照のこと］。
【０１３５】
Ａｐｏ-２リガンドをコードしているＤＮＡの哺乳動物細胞における一過性発現をもたらす発現ベクターを使用することができる。一般に、一過性発現は、宿主細胞が発現ベクターの多くのコピーを蓄積し、次にその発現ベクターによってコードされている所望のポリペプチドを高レベルで合成するように、宿主細胞中で効果的に複製できる発現ベクターを使用することを含む［Sambrookら, 上掲］。一過性発現系は、適切な発現ベクターと宿主細胞を含むが、クローニングされたＤＮＡによりコードされているポリペプチドの簡便で確実な同定並びに所望の生物学的又は生理学的性質についてのポリペプチドの迅速なスクリーニングを可能にする。したがって、一過性発現系は、本発明において、生物学的に活性なＡｐｏ-２リガンドであるＡｐｏ-２リガンドの類似物及び変異体を同定する目的に特に有用である。
【０１３６】
組換え脊椎動物細胞培養でのＡｐｏ-２リガンドの合成に適応化させるのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gethingら, Ｎature, 293：620-625(1981)；Manteiら, Nature, 281：40-46(1979)；欧州特許出願公開第１１７０６０号；及び欧州特許出願公開第１１７０５８号に記載されている。
【０１３７】
ここのベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びにバシラス、例えば枯草菌及びバシラス・リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシラス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきである。
【０１３８】
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、Ａｐｏ-２リガンドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。グリコシル化Ａｐｏ-２リガンドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。ＣＨＯ細胞を含む全てのこのような宿主細胞の例は、さらに国際公開第９７/２５４２８号に記載されている。
【０１３９】
宿主細胞を形質移入し、好ましくはＡｐｏ-２リガンド産生のための上述した発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修飾された栄養培地で培養する。
形質移入は、如何なるコード配列が実際に発現されるか否かにかかわらず、宿主細胞による発現ベクターの取り込みを称する。多数のトランスフェクションの方法が当業者に知られており、例えば、ＣａＰＯ４及びエレクトロポレーションである。このベクターの操作のあらゆる徴候が宿主細胞内で生じたときに成功したトランスフェクションが一般に認められる。
【０１４０】
形質転換は、染色体外の成分としてであろうと染色体成分によってであろうと、ＤＮＡが複製可能であるように生物体中にＤＮＡを導入することを意味する。用いられる宿主細胞に応じて、そのような細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrookらにより記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般的に用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shawら, Gene, 23：315(1983)及び１９８９年６月２９日公開の国際公開第８９/０５８５９号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。加えて、１９９１年１月１０日に公開された国際公開第９１/００３５８号に記載されているように、超音波処理を用いて植物をトランスフェクションすることもできる。
【０１４１】
このような細胞壁のない哺乳動物細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52：456-457(1978)のリン酸カルシウム沈殿法を使用してもよい。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な側面は米国特許第４,３９９,２１６号に記載されている。酵母中の形質転換は、典型的には、Van Solingenら, J. Bact., 130：946(1977)及びHsiaoら, Proc.Ｎatl. Acad. Sci. USA, 76：3829(1979)の方法によって実施する。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keownら, Methods in Enzymology, 185：527-537(1990)及び Mansourら, Nature, 336：348-352(1988)を参照のこと。
【０１４２】
Ａｐｏ-２リガンドを生産するために用いられる原核細胞は、前掲のSambrookらにより一般的に記載されているような適切な培地で培養される。大腸菌の培養に用いることができる培養培地の特定の形態は、後述の実施例でさらに説明する。Ａｐｏ-２リガンドを生産するために使用される哺乳動物宿主細胞は、種々の培養培地において培養することができる。
【０１４３】
市販培地の例としては、ハム(Ｈａｍ)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地(「ＭＥＭ」、シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地(「ＤＭＥＭ」、シグマ)が含まれる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシンＴＭ薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【０１４４】
一般に、哺乳動物の細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコル、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology： A Practical Approach, M. Butler編(IRL Press, 1991)に見出すことができる。
本発明の一側面では、宿主細胞の培養又は発酵のために、典型的には一又は複数の二価金属イオンが培養培地へ添加されるかあるいは含まれる。二価金属イオンは、好ましくは、貯蔵安定性を増すため、溶解性を増すため、又は一又は複数の亜鉛イオンによって調整される安定なＡｐｏ-２Ｌ三量体の形成を補助するために十分な濃度レベルで培養培地に存在するかあるいは添加される。添加されうる二価金属イオンの量は、一部は培養中の宿主細胞密度又はこのような二価金属イオンへの潜在的な宿主細胞感受性に依存する。培養におけるより高い細胞密度では、二価金属イオンの濃度を増すことは有益である。宿主細胞による生産物の発現中又は発現後に二価金属イオンが添加される場合は、宿主細胞による産物の発現が増加するのに応じて二価金属イオン濃度を調節又は増加させることが望ましい。典型的な普通に入手可能な細胞培養培地に存在しうる微量レベルの二価金属イオンは、安定な三量体形成には十分ではないと一般的に考えられている。従って、ここに開示するように、さらなる量の二価金属イオンの添加が好ましい。
【０１４５】
培養中の宿主細胞の成長期の間に二価金属イオンが添加される場合は、二価金属イオンは、逆に又は負の方向に宿主細胞成長へ影響しない濃度で培養培地へ添加されるのが好ましい。振盪フラスコ培養では、１ｍＭより高い濃度でのＺｎＳＯ４の添加は、結果として低い宿主細胞密度を生じる可能性があることが観察されている。当業者であれば、細菌細胞は、細胞マトリックスと金属イオン複合体を形成することで、効果的に金属イオンを隔離することが可能であることが分かる。従って、細胞培養では、成長期の後(所望する宿主細胞密度に達した後)又は宿主細胞による生産物発現の直前に、選択された二価金属イオンを培地に添加することが好ましい。十分な量の二価金属イオンが存在していることを確かめるために、更なる二価金属イオンを、生産物発現期の間に細胞培養培地へ添加又は供給してもよい。
【０１４６】
培養培地の二価金属イオン濃度は、宿主細胞に対して有害又は毒性でありうる濃度を越えてはならない。宿主細胞として大腸菌を用いる本発明の方法では、培養培地の二価金属イオンの濃度が約１ｍＭ(好ましくは≦１ｍＭ)を越えないことが好ましい。さらにより好ましくは、培養培地の二価金属イオン濃度は、約５０マイクロモルから約２５０マイクロモルである。最も好ましくは、このような方法で使用される二価金属イオンは硫酸亜鉛である。金属イオン及びＡｐｏ-２リガンド三量体が１対１モル比で存在することが可能である量の二価金属イオンを細胞培養へ添加することが望ましい。
【０１４７】
二価金属イオンは、細胞培養へ如何なる許容可能な形態でも添加が可能である。例えば、金属イオンの溶液は水を使って調製することが可能であり、次に、二価金属イオン溶液は培養培地へ添加又は供給することが可能である。
【０１４８】
Ａｐｏ-２Ｌの発現は、例えば、ここに記載された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、従来からのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77：5201-5205(1980))、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインシトゥハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。種々の標識を用いることができ、最も一般的なものは放射性同位元素、特に３２Ｐである。しかしながら、他の方法、例えばポリヌクレオチド中への導入のためのビオチン修飾ヌクレオチドを用いる方法もまた使用することができる。ついで、このビオチンは、例えば放射性核種、蛍光剤又は酵素等のような広範囲の標識で標識することができるアビジン又は抗体への結合部位となる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖及びＤＮＡ-ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、検定を実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液の検定によって測定することもできる。免疫組織化学的染色技術では、細胞試料を、典型的には脱水と固定によって調製し、結合した遺伝子産物に対し特異的な標識化抗体と反応させるが、この標識は通常は視覚的に検出可能であり、例えば酵素的標識、蛍光標識、ルミネセンス標識等である。
【０１４９】
試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳類において調製することができる。簡便には、抗体は、天然Ａｐｏ-２リガンドポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＡｐｏ-２リガンドＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【０１５０】
Ａｐｏ-２リガンドは、好ましくは培養培地から分泌されたポリペプチドとして回収されるが、分泌シグナル無しで直接産生される場合は宿主細胞溶菌液から回収してもよい。Ａｐｏ-２リガンドが膜結合性である場合は、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて膜から放出させるか、又は酵素的切断によりその細胞外領域を放出させてもよい。
【０１５１】
Ａｐｏ-２リガンドがヒト起源のもの以外の組換え細胞でつくられる場合は、Ａｐｏ-２リガンドはヒト起源のタンパク質又はポリペプチドを含まない。しかしながら、Ａｐｏ-２リガンドに関して実質的に相同である調製物を得るには、組換え細胞タンパク又はポリペプチドからＡｐｏ-２リガンドを回収又は精製することが通常必要である。第一段階として、培地又は溶菌液を遠心分離して粒状の細胞屑を除去することができる。ついで、Ａｐｏ-２リガンドを、汚染した可溶性タンパク質及びポリペプチドから、適切な精製手順の例である次の手順により精製される：イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ又はＣＭにおけるクロマトグラフィー；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過；及びＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラムである。
【０１５２】
好ましい実施態様では、Ａｐｏ-２リガンドはアフィニティークロマトグラフィーによって精製される。残基が欠失され、挿入され、又は置換されたＡｐｏ-２リガンド断片又は変異体は、その変異によってしばしば惹起される実質的な性質変化を考慮に入れて、天然Ａｐｏ-２リガンドと同じようにして回収することができる。例えば、他のタンパク質又はポリペプチド、例えば細菌性もしくはウイルス性抗原とのＡｐｏ-２リガンド融合体の調製は精製を容易にする；抗原に対する抗体を含む免疫アフィニティーカラムを、融合ポリペプチドを吸着させるために使用することができる。
【０１５３】
例えばフェニルメチルスルホニルフルオライド(ＰＭＳＦ)のようなプロテアーゼインヒビターもまた精製の間のタンパク分解を阻害するのに有用であり、偶発的な汚染物質の成長を防止するために抗生物質を含めることができる。天然Ａｐｏ-２リガンドに適切な精製方法は、組換え細胞培養の発現の際におけるＡｐｏ-２リガンド又はその変異体の特性の変化の起因となる改変が必要となることは、当業者であれば分かるであろう。
このような任意の精製工程では、回収されたＡｐｏ-２Ｌを二価金属イオン含有溶液又は一又は複数の二価金属イオンを含有する精製物質(例えばクロマトグラフィー媒体又は支持体)へ曝露することが望ましいであろう。好ましい実施態様では、二価金属イオン及び／又は還元剤は、Ａｐｏ-２Ｌの精製又は回収の間に使用される。場合によっては、ＤＴＴ又はＢＭＥのような二価金属イオン及び還元剤の両方を、Ａｐｏ-２Ｌの精製又は回収の間に使用してもよい。精製又は回収の間に二価金属イオンを使用することは、Ａｐｏ-２Ｌ三量体の安定性を提供するか、あるいは細胞培養段階の間に形成されるＡｐｏ-２Ｌ三量体を維持すると考えられる。
【０１５４】
また、以下の記載は一又は複数の化学基に共有的に結合した(以下「抱合された(conjugated)」)Ａｐｏ-２リガンドを製造する方法に関する。本発明のＡｐｏ-２Ｌ抱合体に使用するのに適した化学基は好ましくは有意に毒性又は免疫原性ではない。化学基は場合によっては保存することができ保存に適した条件下で使用できるＡｐｏ-２Ｌ抱合体を製造するために選択される。ポリペプチドに抱合されうる様々な例示的化学基が当該分野で知られており、例えば糖タンパク質に天然に生じる炭水化物のような炭水化物、ポリグルタミン、及び非タンパク様ポリマー、例えばポリオールが含まれる(米国特許第６２４５９０１号を参照)。
【０１５５】
例えばポリオールは、上掲の国際公開第９３/００１０９号に開示されているように、リジン残基を含む一又は複数のアミノ酸残基においてＡｐｏ-２Ｌなどのポリペプチドに抱合されうる。用いられるポリオールは任意の水溶性ポリ(アルキレンオキシド)ポリマーとでき、直鎖又は分枝鎖を有しうる。好適なポリオールには一又は複数のヒドロキシル位置で１から４の炭素を有するアルキル基のような化学基が置換されているものが含まれる。典型的には、ポリオールはポリ(アルキレングリコール)、例えばポリ(エチレングリコール)(ＰＥＧ)であり、よって記載を簡単にするために、以下の議論においては、用いるポリオールがＰＥＧである例示的な実施態様に関するものとし、ポリペプチドにポリオールを抱合させる方法を「ペグ化(pegylation)」と称する。しかし、当業者であれば、他のポリオール、例えばポリ(プロピレングリコール)及びポリエチレン-ポリプロピレングリコールコポリマーを、ＰＥＧに対してここに記載した抱合法を使用して用いることができることは理解できるであろう。
【０１５６】
Ａｐｏ-２Ｌのペグ化に用いられるＰＥＧの平均分子量は変動し得、典型的には約５００から約３００００ダルトン(Ｄ)の範囲でありうる。好ましくは、ＰＥＧの平均分子量は約１０００から約２５０００Ｄであり、より好ましくは約１０００から約５０００Ｄである。一実施態様では、ペグ化は約１０００Ｄの平均分子量を持つＰＥＧを用いて実施される。場合によっては、ＰＥＧホモポリマーは未置換であるが、一端にアルキル基が置換されていてもよい。好ましくは、アルキル基はＣ１−Ｃ４アルキル基、最も好ましくはメチル基である。ＰＥＧ調製物は商業的に入手可能であり、典型的には本発明において使用するのに適したＰＥＧ調製物は平均分子量に応じて販売されている非均一調製物である。例えば、市販のＰＥＧ(５０００)調製物は典型的には分子量が僅かに変動し、通常は±５００Ｄの分子を含む。
【０１５７】
本発明のＡｐｏ-２リガンドは単量体形態又は三量体形態(３つの単量体を含む)等、様々な形態でありうる。場合によっては、Ａｐｏ-２Ｌ三量体は、ＰＥＧ分子が三量体Ａｐｏ-２Ｌを構成する三の単量体の一、二、又はそれぞれに結合又は抱合されるようにペグ化される。そのような実施態様では、用いられるＰＥＧは約１０００から約５０００Ｄの平均分子量を有するのが好ましい。また、Ａｐｏ-２Ｌ三量体は「部分的に」ペグ化され得、つまり、三量体を構成する三の単量体の一又は二だけがＰＥＧに結合又は抱合される。
【０１５８】
タンパク質をペグ化するための様々な方法が当該分野で知られている。ＰＥＧに抱合したタンパク質を製造するための特定の方法には、米国特許第４１７９３３７号、米国特許第４９３５４６５号及び米国特許第５８４９５３５号に記載された方法が含まれる。典型的には、タンパク質は、主に反応条件、ポリマーの分子量等々に応じて、ポリマーの末端反応性基にタンパク質のアミノ酸残基の一又は複数を介して共有的に結合される。反応性基を有するポリマーはここでは活性化ポリマーと命名する。反応性基はタンパク質の遊離のアミノ又は他の反応性基と選択的に反応する。ＰＥＧポリマーは無作為又は部位特異的方式の何れかでタンパク質上のアミノ又は他の反応性基に結合しうる。しかし、最適な結果を得るために、選択される反応性基のタイプと量、並びに用いられるポリマーのタイプは、反応性基がタンパク質上の余りに多くの特に活性な基と反応することを避けるために用いられる特定のタンパク質又はタンパク質変異体に依存するものと理解される。これは完全に避けることができないであろうため、タンパク質１モル当たり一般に約０．１から１０００モル、好ましくは２から２００モルの活性化ポリマーを、タンパク質濃度に応じて用いることが推奨される。タンパク質１モル当たりの活性化ポリマーの最終量は、最適な活性を維持し、同時に可能ならばタンパク質の循環半減期を最適化するためのバランス量である。
さらに、本明細書中に記載のＡｐｏ２Ｌは、当分野に公知の技術を用いてロイシンジッパー配列に結合又は融合させてもよいと考えられる。
【０１５９】
また、デスレセプター抗体の産生方法をここに記載する。抗体の製造又はスクリーニングのために用いる抗原は、例として所望のエピトープを含む抗原又はその一部の可溶性形態であってもよい。あるいは又はさらに、抗原をその細胞表面上に発現する細胞を抗体の製造又はスクリーニングに用いることができる。抗体の製造に有用な抗原の他の形態は当業者に明らかである。好ましくは、抗原はＤＲ４又はＤＲ５レセプターである。
【０１６０】
(ｉ)ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、好ましくは、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物に産生される。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターに関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基による抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲにより抱合させることが有用である。
【０１６１】
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【０１６２】
(ｉｉ)モノクローナル抗体
モノクローナル抗体は実質的に同種の抗体の集団から得られる、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、一般にわずかながら存在する自然に生じる突然変異体を除いて同一である。よって、「モノクローナル」との修飾詞は、別個の抗体の混合物ではなく、抗体の特性を示すものである。
例えば、モノクローナル抗体は、Kohlerら,  Ｎature, 256：495(1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法を用いて作製でき、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作製することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスターを上記したようにして免疫し、免疫化に用いられるタンパク質と特異的に結合する抗体を生産するか又は生産することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次に、リンパ球を、ポリエチレングリコールのような適当な融剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する(Goding, Monoclonal Antibodies： Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を好ましくは含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニジンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。
【０１６３】
好ましい骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの生産を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫系、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、San Diego, California USAから入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及びアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニア、合衆国から入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されたものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133：3001(1984)；Brodeurら, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
【０１６４】
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。
モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunsonら, Anal. Biochem., 107：220(1980)のスキャッチャード分析法によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、該クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies： Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地には、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地が包含される。加えて、該ハイブリドーマ細胞は、動物において腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【０１６５】
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、又はアフィニティークロマトグラフィーのような従来からの免疫グロブリン精製法により、培地、腹水、又は血清から好適に分離される。
【０１６６】
モノクローナル抗体をコードしているＤＮＡは、一般的な手順(例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に単離され配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、そうしないと免疫グロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中にトランスフェクトし、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を達成することができる。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現に関する概説論文には、Skerraら, Curr. Opinion in Immunol., 5：256-262(1993)及びPlueckthum, Immunol. Revs., 130：151-188(1992)が含まれる。
【０１６７】
更なる実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCaffertyら, Nature, 348：552-554(1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから単離することができる。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)及び Marksら, J. Mol. Biol., 222：581-597(1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の単離を記述している。続く刊行物は、鎖シャッフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生産(Marksら, Bio/Technology, 10：779-783(1992))、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouseら, Nuc. Acids. Res.,21：2265-2266(1993))を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
【０１６８】
ＤＮＡはまた、例えばヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード化配列を、相同的マウス配列に代えて置換することにより(米国特許第４８１６５６７号；Morrisonら, Proc.Natl. Acad. Sci.,USA, 81：6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることで修飾できる。
典型的には、このような非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインに置換され、又は抗体の一つの抗原結合部位の可変ドメインに置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。
【０１６９】
(ｉｉｉ)ヒト化抗体
非ヒト抗体をヒト化する方法は当該技術分野でよく知られている。好ましくは、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入されている。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と呼ばれる。ヒト化は、本質的にはヒト抗体の該当する高頻度可変領域配列を置換することによりウィンターと共同研究者の方法(Jonesら, Nature, 321：522-525(1986)；Riechmannら, Nature, 332：323-327(1988)；Verhoeyenら, Science, 239：1534-1536(1988))に従い実施することができる。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の該当する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４８１６５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は、典型的にはいくつかの高頻度可変領域残基及び場合によってはいくらかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似部位からの残基によって置換されているヒト抗体である。
【０１７０】
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方の可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列をヒト化抗体のヒトフレームワーク領域(ＦＲ)として受け入れる(Simsら, J. Immunol., 151：2296(1993)；Chothiaら, J. Mol. Biol., 196：901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carterら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89：4285(1992)；Prestaら, J. Immunol., 151：2623(1993))。
【０１７１】
更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性の増加のような、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、高頻度可変領域残基は、直接的かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【０１７２】
(ｉｖ)ヒト抗体
ヒト化のための別法により、ヒト抗体を生産することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが今は可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovitsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90：2551(1993)；Jakobovitsら, Nature 362：255-258(1993)；Bruggermanら, Year in Immuno.,７：33(1993)；米国特許第５５９１６６９号、同第５５８９３６９号及び同第５５４５８０７号を参照されたい。
【０１７３】
あるいは、ファージディスプレイ技術(McCaffertyら, Nature 348：552-553(1990))を、未免疫化ドナーからの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産出させるために使用することができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子は、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きいか又は小さいコートタンパク質遺伝子の何れかにインフレームでクローニングし、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片としてディスプレイされる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖のＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択により、これらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択がなされる。よって、ファージはＢ細胞の特性のいくつかを模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照のこと。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源がファージディスプレイのために使用可能である。Clacksonら, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化されたマウス脾臓から得られたＶ遺伝子の小ランダム組合せライブラリーからの抗オキサゾロン抗体の異なった配列を単離した。非免疫化ヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構成可能で、抗原(自己抗原を含む)とは異なる配列の抗体を、Marksら, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffithら, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に本質的に従って単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同第５５７３９０５号を参照のこと。
またヒト抗体は、活性化Ｂ細胞によりインビトロで生産してもよい(例えば米国特許第５５６７６１０号及び同第５２２９２７５号を参照)。
【０１７４】
(ｖ)抗体断片
抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されていた(例えば、Morimotoら, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)及びBrennanら, Science,229：81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、抗体断片は上述において検討した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してＦ(ａｂ')２断片を形成することができる(Carterら, Bio/Technology 10：163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')２断片を組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の生産のための他の方法は当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦＶ)である。国際公開第９３/１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。このような直鎖状抗体の断片は単特異的又は二重特異的であってもよい。
【０１７５】
(ｖｉ)二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する抗体である。二重特異性抗体は全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')２二重特異性抗体)として調製することができる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millsteinら, Nature, 305：537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、むしろ煩わしく、生成物収率は低い。同様の手順が国際公開第９３/８８２９及びTrauneckerら, EMBO J. 10：3655-3659(1991)に開示されている。
【０１７６】
異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとの融合である。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、コンストラクトに使用される三つのポリペプチド鎖の等しくない比率が最適な収率をもたらす態様において、三つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性が与えられる。しかし、少なくとも二つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率が特に重要性を持たないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
【０１７７】
このアプローチ法の好適な実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４/０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSureshら, Methods in Enzymology, 121：210(1986)を参照されたい。
米国特許第５７３１１６８号に記載された他のアプローチ法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体定常ドメインのＣＨ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
【０１７８】
二特異性抗体とは架橋抗体や「ヘテロ抱合抗体」を含む。例えば、ヘテロ抱合体の一方の抗体がアビジンと結合し、他方はビオチンと結合していてもよい。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせること(米国特許第４６７６９８０号)及びＨＩＶ感染の治療(国際公開第９１／００３６０号、国際公開第９２／２００３７３号及び欧州特許出願公開第０３０８９号)等が提案されている。ヘテロ抱合抗体は任意の簡便な架橋方法を使用することによって生成できる。当該技術分野においては、適切な架橋剤はよく知られており、多くの架橋法と共に米国特許第４６７６９８０号に開示されている。  
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennanら, Science, 229：81(1985)；Shalabyら, J. Exp. Med., 175：217-225(1992)。
【０１７９】
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し単離する様々な方法もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生産される。Kostelnyら, J. Immunol., 148(5)：1547-1553(1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させた。抗体ホモダイマーはヒンジ領域で還元されてモノマーを形成し、ついで再酸化させて抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生産に対して使用することができる。Hollingerら, Proc. Ｎatl. Acad. Sci. USA, 90：6444-6448(1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするのに十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶＨ及びＶＬドメインは他の断片の相補的ＶＬ及びＶＨドメインと強制的に対形成させられ、２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーを使用する他の二重特異性抗体断片製造方策もまた報告されている。Gruberら, J. Immunol., 152：5368(1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tuttら J. Immunol. 147：60(1991)。３又はそれ以上の抗原結合部位を有する抗体は、国際公開第０１/７７３４２号(Miller及びPresta)に記載されている。
【０１８０】
ここでの方法に用いる又は製造品に具備される抗体は場合によって細胞障害性剤とコンジュゲートされる。
そのような抗体-細胞障害性剤コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は前述している。
また、抗体と一又は複数の小分子毒素のコンジュゲート、例えばカリケアマイシン(calicheamicin)、マイタンシン(maytansine)(米国特許第５２０８０２０号)、トリコテン(trichothene)及びＣＣ１０６５もここにおいて考慮される。本発明の一実施態様では、抗体は、一又は複数のマイタンシン(maytansine)分子(例えば、抗体分子当たり約１から約１０のマイタンシン分子)とコンジュゲートしている。マイタンシンは、例えばＭａｙ-ＳＨ３へ還元されるＭａｙ-ＳＳ-Ｍｅへ変換され、修飾抗体(Chariら，Cancer Research 52：127-131(1992))と反応してマイタンシノイド(maytansinoids)-抗体コンジュゲートを生じる。
【０１８１】
あるいは、抗体は、一又は複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートする。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で、二重鎖ＤＮＡの割れ目を作ることができる。使用されるであろうカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinmanら, Cancer Research 53：3336-3342(1993)及びLodeら，Cancer Research 58：2925-2928(1998))を含む。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(Restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開の国際公開第９３/２１２３２号を参照のこと。
【０１８２】
本発明は、更に、抗体と核酸分解性活性(例えば、リボムクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮＡ分解酵素)を有する化合物との抗体コンジュゲートについて考慮する。
種々の放射性同位元素が放射性コンジュゲートアンタゴニスト又は抗体の生成に利用できる。具体例にはＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ90、Ｒｅ１8６、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位元素が含まれる。
抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシインミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシレート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238：1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)がアンタゴニスト又は抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４/１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤を放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸性の易動性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chariら Cancer Research 52： 127-131(1992))を用いてもよい。
【０１８３】
あるいは、抗体及び細胞障害性剤を含んでなる融合タンパク質を、例えば組換え技術又はペプチド合成によって製造してもよい。
また、本発明の抗体を、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開第８１/０１１４５号を参照)を活性な抗癌剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートさせてもよい。例えば国際公開第８８/０７３７８号及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。
そのようなコンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
この発明の方法に有用な酵素には、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含むプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた知られている酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328：457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞個体群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【０１８４】
この発明の酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(例えばNeubergerら, Nature 312：604-608(1984)参照。
抗体の他の修飾がここで考慮される。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性(nonproteinaceous)のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーの一つに結合させてもよい。
抗体の血清半減期を延長するために、例として米国特許第５７３９２７７号に記載されているように抗体(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込んでもよい。ここで用いる「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。あるいは、又はさらに、変化したＦｃＲｎ結合を有する変異体を作製するために抗体のＦｃ領域のアミノ酸配列を変更することによって、血清半減期を延長又は短縮してもよい。変化したＦｃＲｎ結合及び／又は血清半減期を有する抗体は国際公開第００/４２０７２号(Presta, L.)に記載されている。
【０１８５】
また、デスレセプターアゴニストとＥＧＦＲインヒビターを含有する製剤が、本発明により提供される。このような製剤は、治療的投与のみならず、特に貯蔵に適していると考えられる。製剤は、既知の技術で調製することが可能である。例えば、製剤はゲル濾過カラムでのバッファー交換によって調製することが可能である。
典型的には、適量の許容可能な塩類が、製剤を等浸透圧にするために製剤に使用される。製薬的に許容可能な担体の例には、生理食塩水、リンガー液及びデキストロース液が含まれる。製剤のｐＨは、好ましくは約６〜約９、さらに好ましくは約７〜約７．５である。例えばデスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビターの濃度及び投与経路よっては、ある種の担体がより好ましいことは、当業者には明らかである。
【０１８６】
治療用組成物は、凍結乾燥製剤、水溶液又は水性懸濁液の形態で、場合によっては製薬的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16版, A. Osol, A.編(1980))と、適切な純度を有する所望の分子を混合することにより調製することができる。許容される担体、賦形剤、又は安定剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、トリス(Ｔｒｉｓ)、ＨＥＰＥＳ、ＰＩＰＥＳ、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤、アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(例えば、オクタデシルジメチルベンジル塩化アンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮＴＭ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭ、又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【０１８７】
このような担体の更なる例は、イオン交換体、アルミナ、ステアリン酸アルミニウム、レシチン、血清タンパク質、例えばヒト血清アルブミン、緩衝物質、例えばグリシン、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、飽和植物脂肪酸の部分的グリセリド混合物、水、塩、又は電解質、例えば硫酸プロタミン、リン酸水素二ナトリウム、リン酸水素カリウム、塩化ナトリウム、コロイダルシリカ、マグネシウムトリシリケート、ポリビニルピロリドン、及びセルロースベースの物質を含む。局所又はゲルベースの形態用の担体は、ナトリウムカルボキシメチルセルロース又はメチルセルロース等の多糖類、ポリビニルピロリドン、ポリアクリレート、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレンブロックポリマー、ポリエチレングリコール、及びモクロウアルコールを含む。あらゆる投与について、従来のデポー形態が好適に用いられる。このような形態は、例えば、マイクロカプセル、ナノカプセル、リポソーム、硬膏剤、吸入形態、鼻スプレー、舌下錠、及び徐放性製剤を含む。
【０１８８】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、凍結乾燥及び再構成の前又は後に、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。製剤は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液で貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、典型的には使用時に適当な希釈剤と再構成するために他の成分と組み合わせて製剤化される。液体製剤の例は、皮下注射用の単回投与バイアルに充填された無菌の、透明な、無色の保存料未添加(unpreserved)溶液である。
【０１８９】
治療用製剤は、一般的に無菌のアクセスポート、例えば、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針で貫通可能なストッパーを備えたバイアルに入れられる。製剤は、好ましくは静脈内(ｉ.ｖ.)、皮下(ｓ.ｃ.)、筋肉内(ｉ.ｍ.)の繰り返し注射又は注入として、あるいは鼻内又は肺内送達に適したエアロゾル製剤として投与される(肺内送達については、例えば欧州特許出願公開第２５７９５６号参照)。
【０１９０】
また、ここに開示された分子は、徐放性調製物の形態で投与することも可能である。徐放性調製物の適切な例には、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスが含まれ、このマトリクスは、例えばフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langerら, J. Biomed. Mater. Res. 15：167-277(1981)及びLanger, Chem. Tech. 12：98-105(1982)に記載されたポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第３７７３９１９号、欧州特許出願公開第５８４８１号)、Ｌ-グルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー(Sidmanら,  Biopolymers 22：547-556(1983))、非分解性エチレン-酢酸ビニル(Langerら, 上掲)、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLupron Depot(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能な微小球)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸(欧州特許出願公開第１３３９８８号)が含まれる。
【０１９１】
ここに記載されたデスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビターは、様々な治療的用途に用いることができる。これらの用途は、種々の癌の治療の方法である。ここに記載した様々な病理状態の哺乳動物における診断は、熟練した実務者によって行うことが可能である。例えば、哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断と検出を可能にする診断技術は、当該分野で利用可能である。例えば、癌は、限定されるものではないが、触診(法)、血液分析、Ｘ線、ＮＭＲ等々を含む技術を通して同定され得る。また、免疫関連疾患は容易に同定できる。全身性エリテマトーデスでは、疾患の中心媒介物は、自己タンパク質／組織に対する自己反応性抗体と、引き続き起こる免疫媒介炎症の発生である。腎臓、肺、骨格筋系、皮膚と粘膜、眼、中枢神経系、心臓血管系、胃腸管、骨髄及び血液を包含する複数の臓器と系が、臨床的に影響を受ける。リウマチ様関節炎(ＲＡ)は、主に複数の関節の滑膜に係る慢性全身性自己免疫疾患であり、結果として関節軟骨に傷害が生じる。病原はＴリンパ球依存であり、リウマチ因子、自己ＩｇＧに対する自己抗体の生成を伴い、結果として関節体液及び血液において高レベルに達する免疫複合体が形成される。関節におけるこれらの複合体は、滑膜へのリンパ球及び単球の顕著な浸潤と、続いての顕著な滑膜変化を誘発しうる；多数の好中球の添加により同様の細胞で浸潤されるならば関節空間／体液でもである。影響を受けている組織は、多くの場合、対称的パターンで、主に関節である。しかしながら、２つの主な形態の関節外疾患も生じる。一方の形態は進行中の進行性関節疾患及び肺線維症の局部的障害、血管炎、及び皮膚潰瘍を伴う関節外障害の発達である。関節外疾患の第２の形態はいわゆるフェルティー症候群であり、ＲＡ疾患経路の末期、時々は関節疾患が鎮静した後に生じ、好中球減少、血小板減少及び脾腫大の存在に関与する。これは、梗塞、皮膚潰瘍及び壊疽の形成を伴う多数の器官及び血管炎に付随する。しばしば患者では、発病している関節上にある皮下組織にリウマチ様小結節が発達し；小結節は、混合炎症細胞浸潤に包囲された壊死性中心を有する。ＲＡで生じる可能性のある他の徴候には、心外膜炎、胸膜炎、冠動脈炎、肺線維症を伴う間質性肺炎、乾性角結膜炎、及びリウマチ様小結節が含まれる。
【０１９２】
デスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビターは、既知の方法に従い、ボーラスとしての静脈内投与、又は一定期間にわたる連続的な注入、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、骨液内、くも膜腔内、経口、局所的、又は吸入の経路により投与できる。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプでの注入によって実施することもできる。
デスレセプターアゴニストの投与の有効な投薬量とスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。単一又は複数回用量が使用されうる。単独で使用されるデスレセプターアゴニストの効果的な投薬量又は量は一日当り約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重あるいはそれ以上までの範囲であると現在は考えられる。投薬量の種間スケーリングは、例えば、Mordentiら, Pharmaceut. Res.,8：1351(1991)に開示されているような当該分野で知られている方法で実施することができる。
【０１９３】
デスレセプターアゴニストのインビボ投与が用いられる場合、正常な投与量は、投与経路に応じて、哺乳動物の体重当たり１日に約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日である。特定の用量及び送達方法の指針は文献に与えられている；例えば、米国特許第４６５７７６０号、第５２０６３４４号、又は第５２２５２１２号を参照。異なる製剤が異なる治療用化合物及び異なる疾患に有効であること、例えば一の器官又は組織を標的とする投与には、他の器官又は組織とは異なる方式で輸送することが必要であることが予想される。当業者であれば、投与されなければならないデスレセプターアゴニストの用量は、例えば、デスレセプターアゴニストを受入れる哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬剤又は治療法に依存して変わりうることは理解できるであろう。
【０１９４】
本発明の方法において、ＥＧＦＲインヒビターが組換えヒト化モノクローナル抗体抗ＥＧＦＲ、例えばＣ２２５(セツキシマブ)又はＡＢＸ-ＥＧＦである場合、一般的に用いられる治療過程は、体表面の約１〜約１０００ｍｇ／Ｍ２；特に約６０〜約６００ｍｇ／Ｍ２、さらには約１５０〜約５００ｍｇ／Ｍ２である。特定の実施態様では、使用される治療コースは、約４００ｍｇ／Ｍ２の負荷用量、続いて１週間に約１８０−２５０ｍｇ／Ｍ２の維持用量からなる。特定の実施態様では、患者には、用量を段階的に増やしていく４週間のプロトコルで、週として２００ｍｇ／Ｍ２までの用量で抗体の注射がなされる。病気が安定したならば、さらに８週間のコースが始まる。主題となる発明の方法において、小分子ＥＧＦＲインヒビター、例えばＯＳＩ-７７４及びＺＤ-１８３９の投与のために、一般的に使用される治療コースは約１〜約１０００ｍｇ／日である。特定の実施態様では、小分子ＥＧＦＲインヒビターが、約１０〜約７５０ｍｇ／日；約５０〜約５００ｍｇ／日；又は約１００〜２５０ｍｇ／日の量で投与される。
【０１９５】
更なる治療法を本方法において使用することも考えられる。一又は複数の他の治療法には、これらに限定されるものではないが、当該技術分野において既知であり、前述のセクションＩにおいてさらに詳細に定義された、放射線療法、サイトカイン、成長阻害剤、化学治療剤、細胞障害性剤、チロシンキナーゼ阻害因子、ラスファルネシルトランスフェラーゼ阻害因子、血管形成阻害因子、及びサイクリン依存性キナーゼ阻害因子の投与が含まれる。
【０１９６】
化学治療剤の調合法及び投薬スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務家により経験的に決定されうる。また、そのような化学療法の調合法及び投薬スケジュールはChemotherapy Service, M.C. Perry編, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD(1992)にも記載されている。化学療法剤は、Ａｐｏ２Ｌ変異体の投与に先行し、又はその後に行い、又はそれらと同時に投与されてもよい。
しばしば、一又は複数のサイトカイン又は成長阻害剤を投与するのが有用なことも多い。
デスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビター(及び一又は複数の他の治療剤)は同時に(一斉に)又は経時的に投与されてもよい。特定の実施態様では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びＥＧＦＲインヒビターは同時に投与される。他の実施態様では、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬは、ＥＧＦＲインヒビターの投与の前に投与される。他の実施態様では、ＥＧＦＲインヒビターはＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬの前に投与される。投与の後、インビトロで処理された細胞を分析することができる。インビボでの治療がなされた場合、治療された哺乳動物は熟練した実務家にとって周知の様々な方法によりモニターすることができる。例えば、壊死をアッセイするために癌細胞を病理検査することができ、又は血清の免疫系応答を分析することができる。
【０１９７】
ここに記載した疾患の治療に有用な、デスレセプターアゴニスト及びＥＧＦＲインヒビターを含むキットなどの製造品は、少なくとも一の容器とラベルを含む。好適な容器には、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及びテスト用チューブ等が含まれる。容器は、ガラス又はプラスチック等の様々な材料から形成されうる。容器上又はそれに附随したラベルは、製剤が選択した症状の治療のために使用されることを示している。さらに、製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を収容する容器をさらに有してもよい。さらに、製造品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のための指示を有するパーケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料をさらに有してもよい。また製造品は、上述した他の治療剤を収容した容器をさらに含んでいてよい。
以下の実施例は例示するためにのみ提供されるものであって、決して本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
本明細書において引用した全ての特許及び参考文献を、その全体について出典明示によりここに援用する。
【実施例】
【０１９８】
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ＡＴＣＣ受託番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、バージニアである。
【０１９９】
実施例１−式４の化合物の調製
【化９】
2008532937.tif 000011
次の物質を、式４の化合物の合成に使用した：
物質                        量        単位    当量／容量
式３の化合物              ８８．０    ｋｇ    １当量
塩化チオニル              ８９．０    ｋｇ    ２．５当量
ジメチルホルムアミド      １１        ｋｇ    ０．５当量
塩化メチレン            ８８０．０    Ｌ      １０Ｌ／ｋｇ
５０％ＮａＯＨ溶液        必要量      Ｌ      １当量
ヘプタン                ８８０．０    Ｌ      １０Ｌ／ｋｇ
【０２００】
以下の手順は、式４の化合物を合成する手順の例である：
８８．０ｋｇの式３の化合物、８８０．０Ｌの塩化メチレン、１１．０ｋｇのジメチルホルムアミドを、窒素雰囲気下、清浄で乾燥したガラスライニング容器に充填した。充填中、３０℃未満の温度に維持しながら、８９ｋｇの塩化チオニルを混合物に添加した。ついで、反応容器の内容物を、反応完了のサンプリング前に、還流温度で最小５時間加熱し、必要に応じて、５０％ＮａＯＨを使用し、ｐＨを７．０〜８．０が維持されるように調節し、反応混合物の温度を２５℃未満に維持する。二相混合物を１５〜２０分攪拌し、最小３０分静置する。層を分離させ、塩化メチレンを除去することにより、有機層をその容量の１／３まで濃縮した。留出液が６５〜６８℃の温度に達するまで、残存した塩化メチレンの蒸留を続けながら、８８０Ｌのヘプタンを添加した。ついで、数時間かけて混合物を１０〜１５℃に冷却し、最小１時間で粒状にし、固形物を濾過で単離し２２０Ｌのヘプタンで洗浄した。固形物(式４の化合物)を、４５〜５０℃の真空ドライヤーで乾燥させた。
【０２０１】
実施例２−式４の化合物の別の調製
実施例１に示す反応において、この実施例に示すように、水酸化ナトリウムの代わりに重炭酸ナトリウムを成功裏に使用することができる。
物質                        量        単位    当量／容量
化合物３                  ３０．０    ｋｇ    １当量
塩化チオニル              ３６．４    ｋｇ    ３当量
ジメチルホルムアミド      ３．７５    ｋｇ    ０．５当量
塩化メチレン              ３００      Ｌ      １０Ｌ／ｋｇ
５０％ＮａＯＨ溶液        必要量      Ｌ 
ヘプタン                  ３７５      Ｌ      １２．５Ｌ／ｋｇ
ヘプタン(洗浄)            ９０        Ｌ      ３Ｌ／ｋｇ
重炭酸ナトリウム          ６４．２    ｋｇ    ７．５当量
【０２０２】
３０．０ｋｇの式３の化合物、３００．０Ｌの塩化メチレン、３．７５ｋｇのジメチルホルムアミドを、窒素雰囲気下、清浄で乾燥したガラスライニング容器に充填した。
充填中、３０℃未満の温度で維持しながら、３６．４ｋｇの塩化チオニルを混合物に添加した。ついで、反応容器の内容物を、反応完了のサンプリング前に、還流温度で１３時間加熱した。反応混合物を２０−２５℃まで冷却し、４℃まで冷却した水２７４Ｌ及び重炭酸ナトリウム６４．２ｋｇの攪拌溶液にゆっくりと添加し、温度を１０℃未満に維持した。混合物の最終ｐＨを、必要に応じて、５０％水酸化ナトリウム水溶液を使用し、７．０〜８．０の範囲に調節した。二相性混合物を１５〜２０分攪拌し、最小３０分、１０−２０℃で静置する。層を分離させ、塩化メチレンを除去することにより、有機層をその容量の１／３まで濃縮した。留出液が６５〜６８℃の温度に達するまで、残存した塩化メチレンの蒸留を続けながら、３７５Ｌのヘプタンを添加した。ついで４時間以上かけて、混合物を０〜５℃に冷却し、最小で１時間粒状にし、固形物を濾過することにより単離し、９０Ｌのヘプタンで洗浄した。固形物(式４の化合物)を、５０℃の真空ドライヤーで乾燥させた。
【０２０３】
実施例３−化合物６及び２の調製(工程２)
【化１０】
2008532937.tif 000012
次の物質を、中間生成物としての式６の化合物と、式２の化合物の合成に使用した：
物質                  量        単位    当量／容量
化合物５            ６１．１    ｋｇ    １．２当量
トルエン            ４８９      Ｌ      ８Ｌ／ｋｇ(化合物５に対し)
ＮａＯＨペレット    ４．５      ｋｇ    ０．１６当量
濾過助剤            ０．５      ｋｇ    ０．０１７ｋｇ／ｋｇ(化合物５に対し)
化合物４            ９０．８    ｋｇ    １．０当量
アセトニトリル      ７３２      Ｌ      １２Ｌ／ｋｇ(化合物５に対し)
【０２０４】
以下の手順は、式２の化合物及び式６の中間化合物の合成において従う手順の例である：
６１．１ｋｇの式５の化合物、４．５ｋｇの水酸化ナトリウムペレット、４８９Ｌのトルエンを、窒素雰囲気下、清浄で乾燥した反応容器に充填し、反応温度を１０５〜１０８℃に調節する。トルエンを添加して、式５の化合物１ｋｇ当たり最小容量６Ｌの溶媒を維持しながら、大気圧蒸留により４時間かけてアセトンを除去した。ついで、反応混合物を還流温度で加熱し、反応が完了するまで、ポットに留出液を戻した。ついで、４０．０Ｌのトルエンと０．５ｋｇの濾過助剤のスラリーを反応混合物に添加し、その時点で、混合物を２０℃〜２５℃まで冷却し、混合物を１０〜１５分攪拌した。得られた物質を濾過して濾過助剤を除去し、そのケーキを３０Ｌのトルエンで洗浄する(式６の化合物)。
【０２０５】
濾液(式６の化合物)を、窒素雰囲気下、清浄で乾燥した反応容器に配し、９０．８ｋｇの式４の化合物を、７３２Ｌのアセトニトリルと共に反応容器に添加した。反応容器を還流温度まで加熱し、よく攪拌した。重い固形物が現れたところで、攪拌機の速度を低下させた。反応が完了した時点で、反応容器の内容物を３〜４時間以上かけて２５℃まで冷却させ、２０〜２５℃で少なくとも１時間、内容物を攪拌した。ついで、固形物(式２の化合物、多形体Ａ、又は多形体Ａ及びＢの混合物)を濾過により分離し、濾過ケーキを、５０Ｌのアセトニトリルで２回洗浄し、４０〜４５℃の温度で減圧下で乾燥させた。
【０２０６】
多形体Ａの生成では、トルエンに対してアセトニトリルの量を少なくすることが好ましいことが分かり、特にアセトニトリルの代わりにイソプロパノールを使用することが好ましいことが分かった。しかしながら、所望のエチニルフェニルアミノ部分の代わりに、キナゾリンの４-炭素とアルコールの酸素の間にエーテル結合が形成される傾向があるため、共溶媒としてイソプロパノール又は他のアルコールを使用することは好ましくない。さらに、ｐＨ１〜ｐＨ７、特にｐＨ２〜ｐＨ５、例えばｐＨ２．５〜ｐＨ４、例えばｐＨ３に反応のｐＨを調節すると、反応速度が改善されることも発見された。
【０２０７】
実施例５−式２の化合物(多形体Ａ型又は多形体Ａ及びＢの混合物でありうる)の多形体Ｂへの再結晶化(工程３)
【化１１】
2008532937.tif 000013
次の物質を、式２の化合物の多形体Ｂに多形体Ａ(又は多形体Ａ及びＢの混合物)を転化させるのに使用した。
物質                        量        単位    当量／容量
多形体Ａ(化合物２)      １１７．６    ｋｇ    １当量
２Ｂ-エタノール       １８８１．６    Ｌ      １６Ｌ／ｋｇ
水                      ４７０．４    Ｌ      ４Ｌ／ｋｇ
【０２０８】
以下の手順は、式２の化合物の熱力学的により安定した多形体Ｂへ多形体Ａ(又は多形体Ａ及びＢの混合物)を転化するのに使用される手順の例である。
１１７．６ｋｇの多形体Ａ(又は多形体Ａ及びＢの混合物)を、窒素雰囲気下、１８８１．６Ｌの２Ｂ-エタノール及び４７０．４Ｌの水と共に、清浄で乾燥した反応容器に添加した。温度を還流(−８０℃)まで調節し、固形物が溶解するまで、混合物を攪拌した。溶液を６５〜７０℃まで冷却し、濾過により浄化した。低速で攪拌しつつ、最小で２時間以上かけて、溶液をさらに５０〜６０℃まで冷却し、沈殿物をこの温度で２時間、粒状にした。さらに、最小で４時間以上かけて、混合物を０〜５℃まで冷却し、この温度で最小で２時間粒状にした。固形物(多形体Ｂ)を濾過により分離し、少なくとも１００Ｌの２Ｂ-エタノールで洗浄した。固形物は、実質的に多形体Ａを含まない[６,７-ビス(２-メトキシエトキシ)キナゾリン-４-イル]-(３-エチニルフェニル)-アミン塩酸塩の結晶性多形体Ｂであると決定された。この方法により得られた固形物は、多形体Ａに対して、実質的に均質な多形体Ｂの結晶形態である。本方法により、多形体Ａの重量に対し、少なくとも７０重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９８重量％の量で、多形体Ｂの生成が可能になる。ここで記載された方法は、例示のためだけであって、化合物の所望する保存、取り扱い、製造用途に応じて、様々な粒状化度及び収率で多形体Ｂを製造することを可能にする上述したパラメータにおける変動を排除することを意図しているわけではないことが理解される。固形物を５０℃以下の温度で真空乾燥させ、得られた生成物を粉砕し、使用に適した形態の多形体Ｂが得られる。
多形体Ｂは、約６．２６、１２．４８、１３．３９、１６．９６、２０．２０、２１．１０、２２．９８、２４．４６、２５．１４及び２６．９１で、２θ度で表される特性ピークを有するＸ線粉末回折パターンを示す。
【０２０９】
実施例５−Ｈ４６０細胞株におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬレセプター及びＥＧＦＲの発現の分析
ヒト非小肺癌細胞株におけるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬレセプター(ＤＲ４、ＤＲ５)及びＥＧＦＲの細胞表面発現を調べるために、Ｈ４６０細胞株(ＡＴＣＣ)を、ＤＲ４に対して特異的なモノクローナル抗体(ｍＡｂ ４Ｈ６.１７.８；ＡＴＣＣ ＨＢ-１２４５５)、ＤＲ５(ｍＡｂ ３Ｈ３.１４.５；ＨＢ-１２５３４)、及びＥＧＦＲを使用し、ＦＡＣＳにより分析した。細胞は、図４に示すように、タルセバＴＭ、タキソール(登録商標)で前処理するか、又は前処理しなかった。図４の棒グラフはそれぞれのレセプターの発現レベルを示している。
【０２１０】
実施例６−インビトロでの癌細胞の増殖に対するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、タルセバＴＭ、又は併用処理の効果
Ｈ４６０、ＳＫＭＥＳ１、Ｇ１４２、及びＨ３３２Ｔ細胞の連続希釈を、９６ウェル組織培養プレート(Falcon)で実施した。Ａｐｏ-２リガンド(ＰＣＴ ＵＳ００／１７５７９に記載のアミノ酸１１４−２８１)及びタルセバＴＭの効果を、図５Ａ−５Ｄに記載されたようにして、試験した。プレートを３７℃で２４時間インキュベートした。アラマーブルー(Trek Diagnostic Systems, Inc.)を、２４時間のインキュベーション時間の最後の３時間、ウェルに添加した。５３０ｎｍの励起及び５９０ｎｍの発光で９６ウェル蛍光光度計を使用して、蛍光を読み取った。結果を相対的蛍光単位(ＲＦＵ)で表す。データ分析のために、４-パラメータ曲線適合プログラム(Kaleidagraph)を使用した。
バイオアッセイの結果を図５Ａ−５Ｄに示す。
【０２１１】
実施例７−インビボでのＨ４６０腫瘍異種移植片の成長に対するＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ、タルセバＴＭ、又は併用処置の効果
マウスに、Ｈ４６０非小肺癌細胞(ＡＴＣＣ)(マウス１匹当たり５００万細胞)を皮下注射した。ついで、マウスを６つの研究グループ(１グループ当たり６匹のマウス)に分け、図６に提供されたように、ビヒクル、タルセバＴＭ(Genentech, Inc.)、Ａｐｏ２Ｌ.０(図１のアミノ酸１１４−２８１からなるＡｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬポリペプチド(Ashkenaziら, J. Clin. Invest., 104：155-162(1999))、又はそれらの併用で処置した。ビヒクル処置されたマウスの腫瘍は急速に成長したが、Ａｐｏ２Ｌ／ＴＲＡＩＬ及びタルセバＴＭ処置では、腫瘍の成長が顕著に遅延化された。
【図面の簡単な説明】
【０２１２】
【図１】ヒトＡｐｏ-２リガンドｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号２)とその誘導されたアミノ酸配列(配列番号１)を示す。４４７位のヌクレオチドの「Ｎ」は、ヌクレオチド塩基が「Ｔ」又は「Ｇ」であってよいことを示すために使用される。
【図２Ａ】全長ヒトＣＲ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号４)とその誘導されたアミノ酸配列(配列番号３)を示す。ヒトＤＲ４のそれぞれのヌクレオチド及びアミノ酸配列はまたPanら, Science, 276：111(1997)に報告されている。
【図２Ｂ】全長ヒトＣＲ４のｃＤＮＡのヌクレオチド配列(配列番号４)とその誘導されたアミノ酸配列(配列番号３)を示す。ヒトＤＲ４のそれぞれのヌクレオチド及びアミノ酸配列はまたPanら, Science, 276：111(1997)に報告されている。
【図３Ａ】１９９８年１１月１９日に国際公開第９８／５１７９３号中に公開されているヒトＤＲ５の４１１アミノ酸配列(配列番号５)を示す。ヒトＤＲ５の転写スプライス変異体は従来から知られている。このＤＲ５スプライス変異体は、１９９８年８月２０日に国際公開第９８／３５９８６号中に公開され、図３Ｂ及び３Ｃに示されるヒトＤＲ５の４４０アミノ酸配列(配列番号６)をコードしている。
【図３Ｂ】ヒトＤＲ５のアミノ酸配列(配列番号６)である。
【図３Ｃ】ヒトＤＲ５のアミノ酸配列(配列番号６)である。
【図４】タルセバＴＭ又はタキソール(登録商標)での前処理を伴うか又は伴わないＨ４６０細胞中でのそれぞれのレセプターの発現レベル(ＤＲ４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ)を示す。
【図５Ａ】インビトロでの種々の癌細胞株に対するＡｐｏ２リガンド及びタルセバＴＭ処置の効果を示す。
【図５Ｂ】インビトロでの種々の癌細胞株に対するＡｐｏ２リガンド及びタルセバＴＭ処置の効果を示す。
【図５Ｃ】インビトロでの種々の癌細胞株に対するＡｐｏ２リガンド及びタルセバＴＭ処置の効果を示す。
【図５Ｄ】インビトロでの種々の癌細胞株に対するＡｐｏ２リガンド及びタルセバＴＭ処置の効果を示す。
【図６】インビボでのＨ４６０癌細胞に対するＡｐｏ２リガンド及びタルセバＴＭ処置の効果を示す。
【図１】
2008532937.tif 000016
【図２Ａ】
2008532937.tif 000017
【図２Ｂ】
2008532937.tif 000018
【図３Ａ】
2008532937.tif 000019
【図３Ｂ】
2008532937.tif 000020
【図３Ｃ】
2008532937.tif 000021
【図４】
2008532937.tif 000022
【図５Ａ】
2008532937.tif 000023
【図５Ｂ】
2008532937.tif 000024
【図５Ｃ】
2008532937.tif 000025
【図５Ｄ】
2008532937.tif 000026
【図６】
2008532937.tif 000027
【配列表】
2008532937000001.app
【国際調査報告】
2008532937.tif 000028
2008532937.tif 000029
2008532937.tif 000030
2008532937.tif 000031