(57)【要約】  本発明はアベリノ角膜ジストロフィー治療剤に係り、さらに詳しくは、ＴＧＦ−βに対する抗体を有効成分として含有するアベリノ角膜ジストロフィー治療用の医薬組成物に関する。本発明による医薬組成物は、紫外線などの強い光への露出により誘導されたＴＧＦ−βによりアベリノ角膜ジストロフィーの進んだ患者の症状を改善させることができる。
2008533000.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＧＦ−βに対する抗体を有効成分として含有するアベリノ角膜ジストロフィー治療用の医薬組成物。
【請求項２】
緩衝剤、抗菌性保存剤、界面活性剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、防腐剤、増粘剤及び粘度改質剤よりなる群から選択された何れか一つ以上の補助制をさらに含む請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
溶液、懸濁液、エマルジョン、ゲル及び粉末よりなる群から選択された剤形を持つことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アベリノ角膜ジストロフィー治療剤に係り、さらに詳しくは、ＴＧＦ−βに対する抗体を有効成分として含有するアベリノ角膜ジストロフィー治療用の医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
アベリノ角膜ジストロフィー（Avellino corneal dystrophy）とは、目の角膜中にヒアリンという真っ白い物質が斑点を形成しながら角膜を混濁させて次第に視力を弱くして失明に至らせる遺伝病である。この疾病は、βＩＧ−Ｈ３遺伝子中の１２４番のアミノ酸に相当するコドンＣＧＣ（アルギニン）がＣＡＣ（ヒスチジン）へと点突然変異されて発病する（Munier, F.L. et al., Nat. Genet., 15:247, 1997）。このような異常遺伝子を保有する限り、１００％症状が現れ、ほとんどの場合青少年期から症状が現れ始める。最近にはレイシック手術がより一般的になり且つ紫外線などにより角膜が損なわれる場合が頻繁になるに伴いその症状が現れる時点が早くなり、しかも、その発病頻度が多くなるに伴い広く知られるようになった。
【０００３】
アベリノ角膜ジストロフィーは１９８８年に初めて知られた後（Holland, E.J. et al., Ophthalmology,99:1564, 1992; Kennedy, S.M. et al., Br. J. phthalmol., 80:489, 1996; Dolmetsch, A.M. et al., Can. J. Ophthalmol. 31:29, 1996; Afshari N. A. et al., Arch. Ophthalmol., 119:16, 2001; Stewart H.S., Hum. Mutat., 14:126, 1999）、最近になって始めてβＩＧ−Ｈ３蛋白質に関する生化学的な研究結果が報告されている（Kim, J.E. et al., Investigative Ophthalmology & Visual Science, 43:3, 2002; Park, S.J. et al., Peptides, 25:199, 2004）。しかしながら、これまでこれといった治療剤が開発されていないのが現状である。さらに、本発明者の調査により、レイシック手術を受けた患者がアベリノ角膜ジストロフィーのヘテロ接合体（Heterozygote）である場合、発病したり症状が急進展することが初めて判明されている（Kim, E.K. et al., Cornea, 21:223, 2002; Kim, E.K. et al., Ophthalmology, 111:463, 2004）。
【０００４】
このため、アベリノ角膜ジストロフィーが治療可能な薬物及び／または治療法の開発が至急求められているのが現状であるが、これまでこれについての報告はなされていない。
【０００５】
そこで、本発明者らは、アベリノ角膜ジストロフィーが治療可能な方案を見出すために鋭意努力した結果、角膜間質細胞をＴＧＦ−βで処理した場合にβＩＧ−Ｈ３蛋白質の発現が増加され、前記ＴＧＦ−βの発現の増加によりアベリノ症が悪化するということを究めると共に、ＴＧＦ−βに対する抗体で前記角膜間質細胞を処理した場合に増加されたβＩＧ−Ｈ３蛋白質の発現を正常に回復させることができるということを見出し、本発明を完成するに至った。
【発明の要約】
【０００６】
本発明の目的は、アベリノ角膜ジストロフィー患者の角膜に投与して症状を緩和させることのできるアベリノ角膜ジストロフィー治療用の医薬組成物を提供することにある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を達成するために、本発明は、ＴＧＦ−βに対する抗体を有効成分として含有するアベリノ角膜ジストロフィー治療用の医薬組成物を提供する。
【０００８】
本発明の他の特徴及び実施態様は、後述する詳細な説明及び特許請求の範囲から一層明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】レイシック切開刀が通過した角膜切片の表面に位置する角膜間質細胞の電子顕微鏡写真である。
【図２】ヒト線維芽細胞に紫外線（ＵＶ−Ｂ）を照射した場合におけるＴＧＦ−β量の増大を示すグラフである。
【図３】ホモ接合体の角膜間質細胞から生成されたβＩＧ−Ｈ３蛋白質の染色写真である。
【図４】正常人の角膜間質細胞とアベリノ角膜ジストロフィーホモ接合体の角膜間質細胞におけるβＩＧ−Ｈ３の発現量の変化をウェスタンブロットにより示す図である（左：正常人の角膜間質細胞、右：アベリノ角膜ジストロフィーホモ接合体の角膜間質細胞、レーン１：無処理群、レーン２：ＴＧＦ−β処理群、レーン３：ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−βに対する抗体処理群）。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明においては、アベリノ角膜ジストロフィーが紫外線などの光刺激により激しくなることに着目し、紫外線照射により細胞内のＴＧＦ−β量が増大され、前記ＴＧＦ−βがアベリノ症の原因となる突然変異βＩＧ−Ｈ３蛋白質の発現を増大させて細胞内に蓄積されることを確認している。また、角膜間質細胞にＴＧＦ−βとＴＧＦ−βに対する抗体を一緒に処理することにより、ＴＧＦ−βにより増大されていたβＩＧ−Ｈ３蛋白質の発現が低減することを確認している。
【００１１】
これにより、ＴＧＦ−βに対する抗体がアベリノ角膜ジストロフィーの治療に有用であるということを確認している。そこで、本発明は、ＴＧＦ−βに対する抗体を有効成分として含有するアベリノ角膜ジストロフィー治療用の医薬組成物を提供する。
【００１２】
本発明のさらなる観点によれば、本発明は、眼科的に許容される担体と共に、薬剤学的にＴＧＦ−βに対する抗体を有効成分として含有することを特徴とする医薬組成物を提供する。
【００１３】
本発明の医薬組成物において、ＴＧＦ−βに対する抗体の含量は、治療に有用である限り、その制限がないが、通常、全体の組成物に対して０．００００００１〜１０重量％含有することが好ましい。
【００１４】
本発明の医薬組成物は、緩衝剤、抗菌性保存剤、界面活性剤、さらなる薬剤、酸化防止剤、浸透圧調整剤、防腐剤、増粘剤または粘度改質剤などを含む補助制などの成分を含有することができる。
【００１５】
本発明において、前記緩衝剤は、眼科用の液剤の他の成分と調和し合い、目を損傷させうる有害な特性または毒性を示さない適切な緩衝剤であれば、制限なしに使用することができる。適切な緩衝剤の例としては、ホウ酸、ホウ酸ナトリウム、リン酸ナトリウム（１塩基性リン酸ナトリウム１水化物、２塩基性リン酸ナトリウム７水化物などの１、２及び３塩基性リン酸塩及びこれらの混合物を含む。）が挙げられる。眼科用の液剤に許容される生理学的なｐＨを与えるように眼科用の液剤のｐＨを安定化させるために、いかなる他の適切な緩衝剤も制限なしに使用することができる。前述の緩衝剤は単なる例示に過ぎず、これらの緩衝剤は眼学分野において周知であるため、当業者は本発明の組成物に使用可能な緩衝剤を好適に選択することができるであろう。
【００１６】
本発明において、前記抗菌性保存剤の好適な例としては、ベンザルコニウム・クロリド、チメロサール(thimerosal)、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデテートジソジウム、ソルビン酸、オナメルM（ONAMER M）などが挙げられる。上記の如き保存剤は、通常、組成物の全体に対して約０．００１重量％〜１．０重量％使用することが好ましい。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、当業者が容易に認知可能に、溶液、懸濁液、エマルジョン、ゲル及び固形の目への挿入物などいかなる種々の剤形に製造することができる。
【００１８】
本発明の医薬組成物のｐＨは、点眼液のｐＨ値にほとんど同値にしたり、いかなる不便さまたは炎症も起こさないつつ目が耐性を有するように、ｐＨ６．８〜８．０であることが好ましく、さらに好ましくは、約ｐＨ７．０〜７．８である。眼科用の液剤を所望のｐＨで安定化させるために、有効な少量の前記緩衝剤を混入する。約６．８〜８のｐＨで眼科用の液剤を緩衝させるために使用する緩衝剤の有効な投入量は広範に変動可能であり、使用される特定の緩衝剤及び医薬組成物の化学的な組成により決まる。しかしながら、許容される生理学的なｐＨでこの液剤を安定化させるために、眼科用の水溶液剤中に混入される緩衝剤の量が約０．０５〜約１重量／容量％の緩衝剤であるときに好適な結果を得ることができる。
【００１９】
本発明の医薬組成物の浸透圧（π）は、通常、約１ｍＯｓＭ〜約４００ｍＯｓＭであることが好ましく、より好ましくは、２６０〜３４０ｍＯｓＭである。必要に応じて、浸透圧は適量の生理学的及び眼科的に許容される塩または賦形剤を用いて調整することができる。塩化ナトリウムが生理液に接近させるのに適しており、添加される塩化ナトリウムの量は、組成物の全体の重量を基準として約０．０１〜１重量％であることが好ましく、より好ましくは、約０．０５〜０．４５重量％の範囲で添加されることが好ましい。前記範囲内の浸透濃度を達成するために、塩化ナトリウムと一緒に、または、塩化ナトリウムに代えて、カリウム、アンモニウムなどのカチオン及びクロリド、シトレート、アスコルビン酸、ボレート、ホスファート、ビカーボネート、サルファート、チオサルファート、ビサルファート、ソジウムビサルファート、アンモニウムサルファートなどのアニオンにより構成される等価量の１以上の塩も使用可能である。また、浸透濃度を調整する目的で、マンニトール、デキストロス、ソルビトール、グルコースなどの糖も使用可能である。
【００２０】
実施例
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明をより具体的に説明するためのものであり、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されないことは当業界における通常の知識を有する者にとって明らかである。
【００２１】
実施例１：アベリノ角膜ジストロフィー患者の角膜切片観察
レイシック手術後に得られたアベリノ角膜異栄養症患者の角膜切片を走査電子顕微鏡及び共焦点電子顕微鏡により病変を観察した場合、間質細胞が異常肥大化しており、非正常蛋白質が細胞内において分泌できずに渋滞していることを確認した（図１）。図１は、レイシック切開刀が通過した角膜切片の表面に位置している角膜間質細胞の電子顕微鏡写真であり、Ａの細胞（右側）とほぼ同じサイズの嚢胞（左側）が見られ、前記嚢胞は異常蛋白質が細胞内において蓄積されて生成されたものであると認められる。図１Ｂは、図１Ａの嚢胞が破裂される瞬間の電子顕微鏡写真であり、細胞膜と破裂された細胞膜を通じて露出されている異常蛋白質が見られている。
【００２２】
以上の結果から、アベリノ角膜ジストロフィーの原因は蛋白質が細胞外に正常に分泌できずに発生するトラフィシング（Trafficing）であることが確認できた。トラフィシングとは、アルツハイマー病などを誘発する機序として知られており、まだ具体的には研究されていない。
【００２３】
また、５００名以上のアベリノ角膜ジストロフィー患者の病変を観察した結果、全てのアベリノ角膜ジストロフィーの症状は光刺激に対する反応であり、目をしかめた時にも露出される角膜部位から始まることが確認できた。これは、アベリノ角膜ジストロフィーが外部の刺激要因により悪化されるということを意味する。
【００２４】
実施例２：ＵＶ−Ｂ刺激によるＴＧＦ−βの発現変化
本実施例においては、光の成分のうち最も細胞に毒性が強いＵＶ−Ｂ（紫外線Ｂ）を細胞に照射してＴＧＦ−βの発現が増大するかどうかを確認した。すなわち、ＵＶ−ＢをｈＴＥＲＴ不活化したヒト角膜間質細胞（Jaster, JV et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 44:1850, 2003）に１０、１５及び３０ｍＪ／ｃｍ２ＵＶＢの強度にて照射した後、経時によるＴＧＦ−β１蛋白質の発現量を測定した。
【００２５】
その結果、図２に示すように、ＵＶ−Ｂの照射により角膜間質細胞においてＴＧＦ−βの発現が誘発されることを確認することができた。図２中、ｙ軸はＵＶ−Ｂ照射後のｈＴＥＲＴ不活化したヒト角膜間質細胞培養の上清中のＴＧＦ−β１の濃度である。ＥＬＩＳＡにより検定した結果、１０、１５及び３０ｍＪ／ｃｍ２ＵＶ−Ｂ（ＡＮＣＯＶＡ：ｐ＜０．０５）照射後に２４及び４８時間経過した場合、ＴＧＦ−β１蛋白質の発現は対照群に比べて増大していることが分かった。
【００２６】
実施例３：角膜間質細胞株の確立
紫外線刺激により増大されたＴＧＦ−βが角膜間質細胞のβＩＧ−Ｈ３蛋白質の発現に及ぼす影響を確認するために、アベリノ角膜ジストロフィー患者のホモ接合体（homozygote）及び正常患者の角膜切片から角膜間質細胞を分離して１次培養を行った。
【００２７】
レイシック手術後に患者から得られた角膜切片からフォーセップを用いて内皮細胞層を除去し、内皮層の除去された角膜切片を補充液（２５ｍｇの小脳下垂体抽出物及び２．５μｇのｈｒＥＧＦ；Invitrogen-Gibco、ＵＳＡ）入り角膜間質細胞用の無血清培地（Ｋ−ＳＦＭ；Invitrogen-Gibco、ＵＳＡ）で繰り返し洗浄した後、０．５ｍＬのディスペイズ（dispase；２５Ｕ／ｍＬ；Ｒｏｃｈｅ、ＵＳＡ）溶液により４℃で一晩中反応させた。
【００２８】
反応後、フォーセプトを用いて内皮層を除去し、間質層を細かく切り出した後、３ｍＬのＫ−ＳＦＭ及び１０００Ｕ／ＭＬのコラゲネイズタイプＩＩ入り溶液により２０分〜２時間反応させた。反応が終わった組織は２０％の牛胎児血清、１×antibiotic-antimycotic（Invitrogen-Gibco、ＵＳＡ）、１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１．５％のソジウムビカーボネート、０．００４Ｎソジウムヒドロキシド及び０．２μｇ／ｍＬのカナマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ＵＳＡ）を添加した３ｍＬのＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ）入り７５ｃｍ２組織培養フラスコに分注した。細胞をフラスコに一杯になるように成長させた後、これを１０％の牛胎児血清が添加されたＤＭＥＭ入り２５ｃｍ２フラスコに分注してフラスコが８０％程度に満たされるまで培養して、アベリノ角膜ジストロフィーホモ接合体の角膜間質細胞株及び正常角膜間質細胞株を確立した。
【００２９】
実施例４：角膜間質細胞でβＩＧ−Ｈ３蛋白質の分布
実施例３において培養されたアベリノ角膜ジストロフィーホモ接合体の角膜間質細胞におけるβＩＧ−Ｈ３蛋白質分布を確認するために、ＦＩＴＣにより標識されたβＩＧ−Ｈ３蛋白質抗体を用いてβＩＧ−Ｈ３蛋白質を染色した。
【００３０】
その結果、図３に示すように、βＩＧ−Ｈ３蛋白質は分泌小嚢の分布と類似する分布を示していることを確認した。なお、図３Ｂは、図３Ａの細胞の一部は破損されてβＩＧ−Ｈ３蛋白質が絡んだままで露出されていることを示し、破損されていない細胞内においてβＩＧ−Ｈ３蛋白質も見られた。
【００３１】
この結果から、細胞内βＩＧ−Ｈ３蛋白質のトラフィシングが分泌小嚢において起こりうるということを確認することができた。
【００３２】
実施例５：ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−βに対する抗体処理による角膜間質細胞におけるβＩＧ−Ｈ３の発現変化
ＴＧＦ−β及びＴＧＦ−βに対する抗体の処理による角膜間質細胞におけるβＩＧ−Ｈ３蛋白質の発現を確認するために、実施例３において確立された正常角膜間質細胞とアベリノ角膜ジストロフィーホモ接合体の角膜間質細胞を血清が含まれていないＤＭＥＭ培地において２４時間全培養した。
【００３３】
それぞれの間質細胞を無処理群、ＴＧＦ−β処理群及び（ＴＧＦ−β＋ＴＧＦ−βに対する抗体）処理群に分け、ＴＧＦ−β処理群及び（ＴＧＦ−β＋ＴＧＦ−βに対する抗体）処理群は１０ｎｇ／ｍＬ濃度にてＴＧＦ−β（ＲＮＤ、ＵＳＡ）を処理し、ＴＧＦ−βに対する抗体（ｈｕｍａｎ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ＴＧＦ−β ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＲＮＤ、ＵＳＡ）は１０μｇ／ｍＬの濃度にて処理した。処理された全ての細胞は血清が含まれていない培地において２４時間反応させた。
【００３４】
反応が終わった角膜間質細胞を得、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル中で電気泳動した後、ＰＶＤＦメンブレインに移し、βＩＧ−Ｈ３抗体を用いてウェスタンブロットを行った。
【００３５】
その結果、図４に示すように、ＴＧＦ−βを処理した場合、正常角膜間質細胞とアベリノ角膜ジストロフィーホモ接合体の角膜間質細胞の両方においてβＩＧ−Ｈ３蛋白質の発現が増加されていることを確認することができた。また、（ＴＧＦ−β＋ＴＧＦ−βに対する抗体）を一緒に処理した場合、ＴＧＦ−β処理により増大されたβＩＧ−Ｈ３の発現が低減することを確認することができた。
【００３６】
この結果から、ＴＧＦ−βに対する抗体がＴＧＦ−βによりβＩＧ−Ｈ３の発現が増大されることを抑えるということが分かった。結局、アベリノ角膜ジストロフィー患者で紫外線などの外部刺激によりＴＧＦ−βが増大しても、ＴＧＦ−βに対する抗体を投与することによりこのような刺激による症状の重症化を防ぐことができるということを確認することができた。
【００３７】
以上、本発明の特定の内容部分を詳細に記述したところ、当業者にとって、このような具体的な技術は単に好ましい実施例であり、これによって本発明の範囲が制限されないという点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、特許請求の範囲及びそれらの等価物によって定義される。
【産業上の利用可能性】
【００３８】
以上述べたように、本発明は、アベリノ角膜ジストロフィー患者の角膜に投与して症状を緩和させることのできるアベリノ角膜ジストロフィー治療用の医薬組成物を提供するという効果がある。本発明による医薬組成物は、紫外線などの強い光の露出により誘導されたＴＧＦ−βによりアベリノ角膜ジストロフィーが重症化した患者の症状の改善に有用である。
【図１】
2008533000.tif 000003
【図２】
2008533000.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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