(57)【要約】  本発明は、患者の乳癌を分類するための材料および方法を提供する。特に、ホルモン療法（例えばタモキシフェン）および化学療法を含めて、治療への応答を予測するサインとして作用する新規の遺伝子発現サインを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
乳癌患者における治療への応答を予測する方法であって、該患者由来の乳房腫瘍サンプルにおける遺伝子セットの発現レベルに基づいて、該患者に予測を割り当てることを含み、該遺伝子セットが表２から選択される少なくとも10種の遺伝子を含む、上記方法。
【請求項２】
遺伝子セットが表２の遺伝子の少なくとも20種、25種、30種または全てを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
遺伝子セットが表２ａに挙げられた最初の5種の遺伝子を少なくとも含む、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
乳癌患者から得られる乳房腫瘍サンプルにおける遺伝子セットの発現プロファイルに基づいて該乳癌患者における治療への応答を予測するための、表２から選択される少なくとも10種の遺伝子を含む遺伝子セットの使用。
【請求項５】
遺伝子セットが表２の遺伝子の少なくとも20種、25種、30種または全てを含む、請求項３記載の使用。
【請求項６】
遺伝子セットが表２ａに挙げられた最初の5種の遺伝子を少なくとも含む、請求項４または５記載の使用。
【請求項７】
以下の段階：
腫瘍における上記遺伝子セットの発現レベルを表示する発現プロファイルを提供すること、
その発現プロファイルに基づいて、該患者に予測および／または治療計画を割り当てること、
を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
乳癌患者の予後および／または治療計画を決定する方法であって、以下の段階：
(a)該患者から得られた乳房腫瘍サンプルにおける、表２から選択される少なくとも10種の遺伝子を含む遺伝子セットの発現レベルを測定すること、
(b)腫瘍における該遺伝子セットの発現レベルを表示する発現プロファイルを提供すること、
(c)その発現プロファイルに基づいて患者に予後および／または治療計画を割り当てること、
を含む、上記方法。
【請求項９】
段階(b)が、サンプルから得られる発現産物を、該発現産物と結合可能な結合メンバーと接触させることを含み、該結合メンバーが遺伝子セットの発現を示すものであって、この結合が測定可能である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
発現産物がMRNA、cDNA、cRNAまたは発現されたポリペプチドからなる群から選択される、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
結合メンバーが相補的な核酸配列もしくは特異的抗体である、請求項９または１０記載の方法。
【請求項１２】
発現産物が検出のために標識される、請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
結合メンバーが検出のために標識される、請求項９〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
段階(c)が、患者の乳房腫瘍サンプルから得られた発現プロファイルを、先に得られた発現プロファイルと比較し、かつ／または特定の予後に特徴的および／もしくは予測される治療応答に特徴的な先に決定された標準的プロファイルと比較することを含む、請求項７〜１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
先に得られたプロファイルがプロファイルのデータベースとして保存されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
治療の前と後の乳房腫瘍サンプルにおける遺伝子セットの発現レベルを比較して、予後の改善もしくは悪化を示す発現プロファイルの変化を検出することを更に含む、請求項７〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
乳房腫瘍サンプルの発現プロファイルによって、腫瘍がER+腫瘍サブグループであると既に決定されている、請求項７〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１８】
治療がホルモン療法および／または化学療法である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
乳房腫瘍サンプルの治療への応答を予測するための装置であって、複数の結合メンバーが固定された固相支持体を含み、各結合メンバーは遺伝子セットの一つの発現産物と特異的にかつ独立して結合可能であって、該遺伝子セットが表２からの少なくとも10種の遺伝子を含む、上記装置。
【請求項２０】
遺伝子セットが表２の遺伝子の少なくとも20種、25種、30種または全てを含む、請求項１９記載の装置。
【請求項２１】
遺伝子セットが表２ａに挙げられた最初の5種の遺伝子を少なくとも含む、請求項１９または２０記載の装置。
【請求項２２】
固相支持体が、その上に表２において同定される遺伝子の発現産物と特異的にかつ独立して結合し得る結合メンバーのみを固定している、請求項１９または２０記載の装置。
【請求項２３】
結合メンバーが核酸配列である核酸マイクロアレイを構成する、請求項１７〜２２のいずれか１項記載の装置。
【請求項２４】
治療がホルモン療法および／または化学療法である、請求項１９〜２３のいずれか１項記載の装置。
【請求項２５】
ホルモン療法がタモキシフェンである、請求項２４記載の装置。
【請求項２６】
乳癌患者における治療への応答を予測するためのキットであって、遺伝子セットの発現産物と特異的に結合し得る複数の結合メンバーおよび検出試薬を含み、遺伝子セットが表２から選択される少なくとも10種の遺伝子を含む、上記キット。
【請求項２７】
複数の結合メンバーを標識するための手段を更に含む、請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
遺伝子セットが表２の遺伝子の少なくとも20種、25種、30種または全てを含む、請求項２６または２７記載のキット。
【請求項２９】
遺伝子セットが表２ａに挙げられた最初の5種の遺伝子を少なくとも含む、請求項２６〜２８のいずれか１項記載のキット。
【請求項３０】
更にデータ解析ツールを含み、該データ解析ツールがコンピュータープログラムである、請求項２６〜２９のいずれか１項記載のキット。
【請求項３１】
データ解析ツールが、予測された応答をする腫瘍の発現プロファイルを識別するのに適合したアルゴリズムを含む、請求項３０記載のキット。
【請求項３２】
既知の治療応答をする乳房腫瘍サンプルから得られた発現プロファイル、および／または特定の治療応答に特徴的な発現プロファイルを含む、請求項２６〜３１のいずれか１項記載のキット。
【請求項３３】
請求項１９〜２５のいずれか１項記載の装置を含む、請求項２６〜３２のいずれか１項記載のキット。
【請求項３４】
治療がホルモン療法および／または化学療法である、請求項２６〜３３のいずれか１項記載のキット。
【請求項３５】
ホルモン療法がタモキシフェンである、請求項３４記載のキット。
【請求項３６】
乳房腫瘍サンプルのための核酸発現プロファイルの作成方法であって、以下の段階：
(a)乳房腫瘍サンプルから発現産物を単離すること、
(b)表２から選択される少なくとも10種の遺伝子を含む遺伝子セットの発現レベルを同定すること、
(c)該発現レベルから、該乳房腫瘍サンプルのための発現プロファイルを作成すること、
を含む、上記方法。
【請求項３７】
遺伝子セットが表２の遺伝子の少なくとも20種、25種、30種または全てを含む、請求項３６記載の方法。
【請求項３８】
遺伝子セットが表２ａに挙げられた最初の5種の遺伝子を少なくとも含む、請求項３６または３７記載の方法。
【請求項３９】
遺伝子発現プロファイルデータベースに上記発現プロファイルを追加することを含む、請求項３６または３８記載の方法。
【請求項４０】
上記発現プロファイルを、特定の治療応答に特徴的な第二の発現プロファイルおよび／または複数の発現プロファイルと比較することを更に含む、請求項３６〜３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
特定の治療応答に特徴的な第一および第二のおよび／または複数の発現プロファイルを表示する標準的発現プロファイルを作成する段階を更に含む、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
以下の段階：
(a)第一の乳房腫瘍サンプルから発現産物を単離し；該発現産物を、遺伝子セットの発現産物と特異的にかつ独立して結合し得る複数の結合メンバーと接触させ；そして腫瘍サンプルにおける該遺伝子セットの発現レベルから第一の発現プロファイルを作成すること、
(b)予後が既知である第二の乳房腫瘍サンプルから発現産物を単離し；該発現産物を、段階(a)の遺伝子セットの発現産物と特異的にかつ独立して結合し得る複数の結合メンバーと接触させて、乳房腫瘍サンプルの比較可能な第二の発現プロファイルを作成すること、
(c)第一および第二の発現プロファイルを比較して、第一の乳房腫瘍サンプルの治療応答を決定すること、
を含む、請求項４０または４１記載の方法。
【請求項４３】
乳房腫瘍サンプルの複数の遺伝子発現プロファイルを含む発現プロファイルデータベースであって、該遺伝子発現プロファイルが遺伝子セットの発現レベルに由来するものであり、該遺伝子セットが表２から選択される少なくとも10種の遺伝子を含み、データベースがデータキャリア上に取り出し可能に保持されている、上記発現プロファイルデータベース。
【請求項４４】
遺伝子セットが表２の遺伝子の少なくとも20種、25種、30種または全てを含む、請求項４３記載の発現プロファイルデータベース。
【請求項４５】
遺伝子セットが表２ａに挙げられた最初の5種の遺伝子を少なくとも含む、請求項４３または４４記載の発現プロファイルデータベース。
【請求項４６】
発現プロファイルが核酸発現プロファイルである、請求項４３〜４５のいずれか１項記載の発現プロファイルデータベース。
【請求項４７】
腫瘍の分子サブタイプを決定する方法であって、以下の段階：
(a)複数の腫瘍サンプルから遺伝子発現産物を取得すること、
(b)予め規定された閾値を超える、予め選択された複数の遺伝子の遺伝子発現産物の量に基づいて、該腫瘍サンプルをグループに分けること、
(c)遺伝子発現プロファイルに基づいて該腫瘍グループに分子サブタイプを割り当てること、
を含む、上記方法。
【請求項４８】
予め選択されたより高い閾値を用いて段階(b)を繰り返すことによって、上記腫瘍サンプルを細分割することを更に含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
表２から選択される少なくとも10種の遺伝子の発現産物と特異的にかつ独立して結合し得る複数の結合メンバーを含む診断ツールであって、該複数の結合メンバーが固相支持体に固定されている、上記診断ツール。
【請求項５０】
遺伝子の少なくとも20種、25種、30種または全てが表２から選択される、請求項４９記載の診断ツール。
【請求項５１】
遺伝子セットが表２ａに挙げられた最初の5種の遺伝子を少なくとも含む、請求項４９または５０記載の診断ツール。
【請求項５２】
結合メンバーが核酸配列である、請求項４９〜５１のいずれか１項記載の診断ツール。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、乳癌を分類するための材料および方法に関する。特に、限定するものではないが、本発明は、遺伝子発現データに基づく乳癌の分類に関する。この分類は、患者の予後（治療への応答を予測することを含む）、診断および治療に関して重要な情報を提供する。
【背景技術】
【０００２】
多くの癌タイプの分子的表現型の性状解析を行うために、研究者達は、DNAマイクロアレイやSAGEのようなゲノムワイドのプロファイリング技術をますます用いるようになっている。乳癌においては、本発明者等を含むいくつかのグループが、既に遺伝子発現データを用いて、乳房腫瘍の様々な「分子サイン」（molecular signatures）を同定し、臨床的に関連する腫瘍サブタイプを決定している（1-5）。この主題に関して多くの研究が報告されているにも関わらず、これまでの研究の多くは一般的に、階層的クラスタリング（HC）および主成分分析（PCA）のような標準的な解析技術を使用して、腫瘍または遺伝子のグループを定義するものであった。
【０００３】
本発明者等は以前、乳癌の固有の遺伝子発現の違いのかなりの割合が、明確に区別される「分子サブタイプ」に属する個別の腫瘍（例えばER+およびER-、およびERBB2+腫瘍）に帰せられることを示した。
【０００４】
これらの研究は疑いなく成功しているが、これらの標準的アルゴリズムの多くはまた、よく知られた制限を伴う（6,7）。例えば、伝統的なHCアルゴリズムは一般に、実際には腫瘍の特定のサブセットでは特定の遺伝子のみが強い制御を示し、他のサブセットでは弱い〜最小の制御を示す場合に、データセット中の全サンプル（腫瘍）にわたるそれらの全体的挙動に基づいて遺伝子をクラスタリングしている（1）。更に、標準的な技術では、種々の分子サイン間の関係を規定しないことが多く、従ってこれらの間の潜在的相互作用を同定することができない。こうした制限のために、相当量の新たな生物学的情報が今なおこれらの大規模なデータセットの中に深く埋もれたままであり、もしこれらが発掘されれば、乳癌生物学への我々の洞察を更に深め、予後および治療の改善につながるものと、本発明者等は考えている。
【発明の開示】
【０００５】
近年、Barkai等のグループが、伝統的クラスタリングの問題を克服するために特別に設計された新規な解析アプローチであるシグネチャー解析（signature analysis: SA）を報告した（6,7）。発現データセットに応用した場合、SAは「転写モジュール」（TMs）と呼ばれる独立したユニットを同定し、これは共制御パターンを有する、特定の実験条件において緊密に共制御された遺伝子のグループからなる（6）。全てのクラスターを同時に最適化することによって遺伝子をグループ分けする多くのクラスタリング手法と対照的に、このSA法は遺伝子を、状況に依存しかつ潜在的に重複するTMに割り当てる。SAおよびその変法は、遺伝子の機能を予測し、生物学的関連性を明確にする上で、伝統的クラスタリングのアルゴリズムに勝るものであることが示された（6,7）。
【０００６】
本発明者等は初めて、乳癌発現プロファイルのインハウスセットにSAを応用した。本発明者等は、SAによって腫瘍および遺伝子を明確なモジュール（SAの癌への特殊な応用を反映して「腫瘍モジュール」(TuMs)と呼ぶ）にグループ分けし、その多くがこれまで報告されている乳癌の発現サインおよび分子サブタイプに合致していることを見出した。例えば、参照として本明細書に組み入れるPCT/GB2004/004195を参照されたい。この原理の証明（proof-of-principle）の結果のほかに、驚くべきことに、SAはいくつかの新規な知見をもたらした。第一に、SAは、以前には均一なサインを、独立したモジュールにうまく分解したが、このことは、前者が実際には複数の関連した、しかしおそらくは独立した生物学的プログラムからなりうることを示唆する。第二に、SAは、エストロゲン受容体（ER+）腫瘍における新規なアポトーシス関連遺伝子サインを明らかにしたが、このサインは低い組織学的グレードと有意な相関性がある（P<0.001）が、ER状態とは無関係であった。このサインの信頼性は、２つの独立したデータセットにおいて低い組織学的グレードとの関連性を更に実証することで確認された。第三に、SAは、腫瘍モジュール間の関連性を規定し、そしてERBB2+腫瘍と免疫系との予想外の正の相関性をあばいたが、このことは、これらの２つの組織型間に相当なクロストーク（cross-talk）が存在することを示唆する。
【０００７】
これらの結果は、これまでの十分な解析の後でさえ、相当量の新たな生物学的情報がこれらの大規模なデータセットの中に埋もれたままであり、適切な解析技術を用いてそれを明らかにすることができることを示している。
【０００８】
具体的には、本発明者等は初めて、SAを用いて乳房腫瘍発現プロファイルのデータセットを特徴づけた。乳癌において以前報告された多くの遺伝子発現サインを再発見することに加え、SAによって新規な遺伝子発現サイン（TuM1）が同定されたが、このサインはアポトーシスと関連する遺伝子に顕著に富み、ER状態と無関係な低い組織学的グレードと相関する。従って、このTuM1サインは、ER状態と関連した遺伝子（例えばGATA3）を含む傾向があった（4）、低い組織学的グレードの以前に報告された発現サインとは明確に区別される。
【０００９】
重要なこととして、本発明者等は更に、この新規な発現サインが、乳癌におけるホルモン療法への応答の予測的なサインとして機能することを確認した。更に、アポトーシス関連遺伝子の過剰発現は、このような腫瘍が化学療法に対して増大した感受性を有するであろうことを示す。
【００１０】
従って、最も一般的には、本発明は、シグネチャー解析、特に反復的シグネチャー解析（Iterative Signature Analysis；ISA）を使用して、乳房腫瘍をその分子的サブタイプおよびモジュールに分類するための材料および方法；そして該腫瘍の発現プロファイルのSAおよびISAに基づいて、乳房腫瘍患者に予後および／または治療計画を割り当てるための材料および方法、を提供する。
【００１１】
本発明は更に、異なって発現する遺伝子のセットを引き出すための方法を提供する。本発明は、乳房腫瘍サンプルにおいて遺伝子のセットを同定し、かつ乳房腫瘍サンプルにおける該遺伝子の一部または全部の発現レベルを、該サンプルの由来となった患者に予後および／または治療計画（例えばホルモン療法または化学療法）を割り当てるために使用することを提供する。
【００１２】
第一の態様において、本発明は、乳癌患者の予後を決定するための方法を提供する。この方法は、該患者の乳房腫瘍における遺伝子セット（以下、「予後セット」と呼ぶ）の発現レベルに基づいて、患者に対して予後を割り当てることを含み、ここで、この予後セットは表２に示すTuM1からの複数の遺伝子を含む。
【００１３】
本発明は更に、乳癌患者の予後および／または治療計画の決定における予後セットの使用を提供する。好ましくは、本発明は、乳房腫瘍患者の予後および／または治療の決定における発現プロファイルの使用を提供し、この発現プロファイルは予後セットの遺伝子の腫瘍における発現レベルを示す。
【００１４】
「予後」とは、最も一般的な意味で用いられ、かつ量的または質的であり得る。それは、予後が「良い」または「悪い」等の、一般的な用語で表すことができ、かつ／また、例えば無再発生存期間（DFS）、規定された期間の生存の見込み、および／または規定された期間内の遠隔部位への転移の可能性等の、起こり得る臨床結果を示す用語で表すことができる。予後の量的尺度は、一般には確率論的であろう。加えて、またはこれとは別に、特に予後を医師に伝えるか、もしくは医師間で伝える場合には、ノッティンガム予後指数（NPI）スケールのような、別の予後指示値によって予後を表すことができる。
【００１５】
一般に、「予後の良い」腫瘍を有する患者は、おそらくは慣例的な治療計画で治療されるであろう。「予後の悪い」腫瘍の患者は、選択的もしくはより攻撃的な計画で治療され得る。「予後の悪い」患者は通常、より攻撃的な計画に移行する前に慣例的な治療計画が失敗するのを待つ必要はない。更に、その疾患の起こり得る臨床経過を理解することによって、患者は今後のための現実的な治療計画を準備することが可能となり、これは社会にとって癌治療の重要な側面である。
【００１６】
上記のように、本発明者等は、患者がホルモン療法および化学療法に対して良好な応答を示すことが、TuM1発現サインによって予測され得ることを確認した。従って、上記の予後セットを使用して、治療、特にホルモン療法（例えばタモキシフェンまたは実際にはエストロゲン受容体の任意の選択的モジュレーター）または化学療法に対する応答を予測することができる。
【００１７】
疑いをなくすために、用語「決定する」は予後における絶対的な確実性を意味する必要はない。むしろ、腫瘍における予後セットの発現レベルは一般に、患者の起こり得る予後を示すものである。
【００１８】
発現レベルは、一般的に数値で表される。従って発現プロファイルは一般に数値のセットを含み、各数値は予後セットの一遺伝子の発現レベルを表す。
【００１９】
本発明の第一の態様に従う方法は、以下の段階を含み得る：
予後セットの遺伝子の腫瘍における発現レベルを示す発現プロファイルを提供し、そして
その発現プロファイルに基づいて、患者に対して予後および／または治療計画を割り当てる。
【００２０】
上記の提供段階は、他の発現レベル（例えば腫瘍での他の遺伝子の発現レベルを示すデータ）をも含み得る既存のデータセットから、予後セットの遺伝子の発現レベルに関する情報を抽出することを含んでいてもよい。あるいはまた、実験的に発現レベルを決定することを含んでいてもよい。
【００２１】
上記の決定段階は、以下の段階を含み得る：
(a)患者から乳房腫瘍サンプルを取得し、
(b)予後セットの遺伝子のサンプルにおける発現レベルを測定する。
【００２２】
ある遺伝子の発現レベルの測定、そして特に発現プロファイルでのその表示は、絶対的なものであってもよいし、あるいは、何か他の要因に対して相対的なものであってもよく、例えば、限定するものではないが、もう一つの遺伝子の発現に対して、またはそのサンプル内のもしくはサンプル群にわたる遺伝子群（好ましくは予後セット以外の遺伝子であるが、予後セットの遺伝子を含んでもよい）の発現レベルの平均値、中央値もしくは最多値に対して相対的でありうる。例えば、ある遺伝子の発現を、そのサンプル中の複数の遺伝子の発現平均値の倍数もしくは倍率として測定または表示することができる。好ましくは、発現は平均値に対する発現の増加または減少を示すために発現プロファイル中でプラスまたはマイナスとして表示される。
【００２３】
好ましくない実施形態では、数値のセットの形態の発現プロファイル情報を、予後セットの遺伝子のランク付けしたリスト（遺伝子が発現レベルの順にランク付けされる）に変換し、その後、個々の遺伝子のランク順位を（遺伝子の発現値の代わりに）解析においてパラメーターとして使用する。
【００２４】
好ましくは、段階(b)は、サンプルから得られた発現産物を、予後セットの遺伝子の発現の指標となる発現産物に結合可能な複数の結合メンバーと接触させることを含み、その結合を測定することができる。
【００２５】
一般に、結合メンバーは、発現産物の存在を検出できるだけでなく、その相対的な量（すなわち利用可能な産物の量）を検出することができる。予後セットの発現産物に結合可能な結合メンバー（例えば、mRNA、対応するcDNAもしくはcRNA、または発現ポリペプチド）を使用して、発現プロファイルを決定することができる。発現産物または結合メンバーのいずれかを標識することによって、発現産物の相対量または比率を同定し、予後セットの発現プロファイルを決定することが可能である。結合メンバーは、相補的核酸配列または特異的抗体でありうる。
【００２６】
予後を割り当てる段階は、検査中の発現プロファイルを、以前に得られた他のプロファイル（既知の予後と関連する）と、および／または以前に決定された「標準」プロファイル（特定の予後に特徴的である）と、比較することによって実施することができる。特定の予後のための標準プロファイルは、その予後の複数の腫瘍からの発現プロファイルより作成することができる。
【００２７】
比較は一般的にはコンピューターで行うか、またはコンピューターの助けを借りて実施する。
【００２８】
好ましくは、発現プロファイルを、知られている様々な予後の既知プロファイルまたは標準プロファイル（好ましくは標準プロファイル）と比較する。患者に割り当てるべき予後は、検査中の発現プロファイルが最も近似している既知もしくは標準プロファイルのものである。比較用の標準プロファイルを用いて、治療計画を割り当てることもできる。
【００２９】
好ましくは、比較を行うには、２つの異なる予後、例えば「良い」および「悪い」、つまり高いおよび低い（好ましくは3.8と4.6の間にカットオフを有する）に分類される既知または標準プロファイル（好ましくは標準プロファイル）を用いる。既知または標準プロファイルは、予後が知られているサンプルから作成されたものであり、予後は簡便な方法で、例えばサンプルの除去後の患者の実際の臨床結果（すなわち治療応答）によって、または他の予後を示す技法（例えばNPIスケールを用いた組織病理学的方法）によって決定され得る。
【００３０】
既知または標準プロファイルはまた、特定の治療計画（例えばホルモン療法および／または化学療法）を受けたサンプル（臨床結果が知られているもの）から作成されたものでありうる。
【００３１】
有利には、予後および／または治療計画を割り当てるための遺伝子発現プロファイルの使用は、腫瘍サンプルに予後を割り当てるために用いる臨床的処置の主観性を減少させるか、あるいは排除さえし得る。本方法は分子レベルでの発現産物の評価、好ましくは量的な評価を必要とするため、本方法は、予後を割り当てるためのより客観的な方法、それゆえおそらくはより信頼性のある方法を提供する。予後セットは乳房腫瘍サンプルを明確なモジュールに分けることができ、従って、臨床的な予後割り当ての主観的分析を減少させるか、あるいは排除さえもする。更に、予測に信頼性を与えることができ、従って予後の「強さ」に応じて、患者の治療に関するインフォームド・チョイス（informed choice）を行うことができる。
【００３２】
予後セットの発現プロファイルは、予後が類似した独立したサンプル間でわずかな違いがあり得る。しかしながら、本発明者等は、予後セットを構成する特定の遺伝子の発現プロファイルは、組み合わせて使用したとき、腫瘍サンプルにおけるある発現パターン（発現プロファイル）を提供し、このパターンが腫瘍の予後に特徴的であることに気づいた。
【００３３】
本発明の予後セット（TuM1(表２および表２ａ)）はER+腫瘍のサブグループである。TuM1発現サインは、ER状態と無関係の、低い組織学的グレードのER+腫瘍に特異的な分子特徴であるようである。
【００３４】
予後セットを用いて患者から得られる発現プロファイルは、予後のためだけでなく、可能な治療計画のためにも貴重な情報を提供する。
【００３５】
治療は化学療法および／またはホルモン療法、例えばタモキシフェンもしくは他のエストロゲン受容体の選択的モジュレーターであり得る。
【００３６】
本発明の方法は、乳房腫瘍サンプルにおける予後セットの発現レベルを治療の前後で比較し、予後の改善または悪化の指標となる発現プロファイルの変化を検出することを含み得る。
【００３７】
発現プロファイルは、腫瘍における遺伝子群の発現レベルを表す。個々の発現プロファイルの遺伝子は同一である必要はないが、各発現プロファイルの遺伝子間で十分に重複していて、発現プロファイルの比較およびグループ分けを可能とすべきである。
【００３８】
結合メンバーは、当分野で公知の標準的な方法を使用して、検出のために標識することができる。あるいはまた、発現産物を検査中のサンプルから単離した後に標識してもよい。好ましい検出手段は、光度計で検出できる蛍光標識の使用である。別の検出手段は電気的シグナリングの利用である。例えば、モトローラ社（Motorola、Pasadena、California）のe-センサーシステムは２つのプローブ、すなわち自由に浮遊する「捕捉プローブ」と、電極表面としての役割もある固相表面に固定された「シグナリングプローブ」を有する。これらのプローブはいずれも発現産物に対する結合メンバーとして機能する。結合が生じると、双方のプローブが互いに近接することになり、結果として検出可能な電気信号が発生する。
【００３９】
しかしながら、近年は定量のために「標識フリー」技術、例えばXagros社（Mountain View、California）によって作られたもの等を利用する多くのより新しい技術が生まれてきている。プライマーおよび／または増幅核酸には標識がまったくなくても良い。定量は、標的発現産物への２つのプライマーのドッキングと、その後のポリメラーゼによる伸長の結果として生じる電気抵抗の変化を測定することによって評価することができる。
【００４０】
上記のように、結合メンバーは、遺伝的識別子の発現産物の数を特異的に増幅するためにPCR（例えばマルチプレックスPCR）で使用するためのオリゴヌクレオチドプライマーでありうる。発現産物は次いでゲル上で分析される。しかしながら、好ましくは結合メンバーは固相支持体に固定された単一の核酸プローブまたは抗体である。次いで発現産物を固相支持体の上を通過させ、それによって結合メンバーと接触させることができる。固相支持体はガラス表面、例えば顕微鏡のスライド；ビーズ（Lynx）；または光ファイバーであって良い。ビーズの場合には、各結合メンバーを個々のビーズに固定することができ、次いでこれらを溶液中で発現産物と接触させる。
【００４１】
特定の遺伝子セットの発現プロファイルを決定するための種々の方法が当技術分野に存在しており、これらを本発明に応用することができる。例えば、ビーズを用いるアプローチ（Lynx）や分子的バーコード（Surromed）は公知の技術である。これらの場合、各結合メンバーは、個々に読み取り可能でありかつ自由に浮遊して発現産物との接触が容易であるビーズまたは「バーコード」に結合される。発現産物（標的）への結合メンバーの結合は溶液中で行い、その後、タグ付けしたビーズまたはバーコードをデバイス（例えばフローサイトメーター）中を通過させて、読み取る。
【００４２】
発現プロファイルを決定するための更なる公知の方法は、Illumina社（San Diego、California）によって開発された計測装置、すなわち光ファイバーである。この場合、各結合メンバーを光ファイバーケーブルの先端の特定の「アドレス」に固定させる。結合メンバーへの発現産物の結合によって蛍光変化が誘導され、この変化は光ファイバーケーブルの他端にあるデバイスによって読み取り可能である。
【００４３】
第二の態様において、本発明は、乳房腫瘍サンプルに対して予後および／または治療計画を割り当てるための装置、好ましくはマイクロアレイを提供し、この装置は複数の結合メンバーが固定された固相支持体を含み、各結合メンバーは、予後セットの遺伝子の発現産物と特異的に結合することができる。好ましくは、固相支持体に固定される結合メンバーは、表２で同定される少なくとも5種の遺伝子、より好ましくは少なくとも10種もしくは少なくとも15種の遺伝子、そして最も好ましくは少なくとも20種もしくは30種の遺伝子の発現産物と特異的にかつ独立して結合することができる。固相支持体に固定される結合メンバーは、表２で同定される20〜30種の遺伝子の発現産物と特異的に結合し得るものでありうる。
【００４４】
一実施形態においては、表２で同定される全ての遺伝子の発現産物と特異的にかつ独立して結合し得る結合メンバーを固相支持体に固定する。支持体には、表２で同定される遺伝子、あるいはそれ由来の予後セットの遺伝子の発現産物と特異的にかつ独立して結合し得る結合メンバーのみが固定されていても良い。
【００４５】
好ましくは、結合メンバーは核酸配列であり、装置は核酸マイクロアレイである。
【００４６】
表２の遺伝子は、UnigeneデータベースのUnigeneアクセッション番号と共に列挙される。従って、各遺伝子の配列は米国立保健研究所（National Institute of Health: NIH）のUnigeneデータベース：（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=unigene）から検索することができる。
【００４７】
表２ａは、表２の遺伝子を重要度の順に列挙している。従って、本発明の全ての態様では、表２から選択される遺伝子のセットは、表２ａに挙げた最初の5種の遺伝子を少なくとも含むことが好ましく、表２ａに挙げた最初の6種、7種、8種、10種、12種、15種、17種、20種、25種、30種の遺伝子を少なくとも含むことがさらに好ましい。
【００４８】
従って、本発明の好ましい実施形態において、遺伝子セットは表２から選択される少なくとも10種の遺伝子を含み、それらの遺伝子のうち少なくとも5種は表２ａに挙げられる最初の5種の遺伝子である。
【００４９】
遺伝子セットは、表２から選択される少なくとも15種、20種、25種または30種の遺伝子を含み、それらの遺伝子のうち少なくとも5種、10種、15種、20種または25種が表２ａに挙げられる最初の5種、10種、15種、20種または25種の遺伝子であるようにしても良い。
【００５０】
更に、全ての遺伝子のために、Affymetrix社（Santa Clara、California）（www.affymetrix.com）はプローブの配列を含むプローブセット（すなわちオリゴヌクレオチド配列の形態の結合メンバー）の例を提供し、プローブセットは固相支持体上で使用したとき遺伝子の発現を検出することができる。
【００５１】
典型的には、高密度の核酸配列（通常はcDNAまたはオリゴヌクレオチド）を、固相支持体の非常に小さな個々のエリアもしくはスポット上に固定する。固相支持体は、基質でコーティングされた顕微鏡用スライドガラスまたはメンブレンフィルター（すなわち「チップ」）であることが多い。核酸配列は、通常ロボットを利用したシステムによって、コーティング固相支持体上に運ばれ（またはプリントされ）、次いで支持体上に固定化される。
【００５２】
好ましい実施形態において、サンプル由来の発現産物は、典型的には蛍光標識を用いて標識され、次いで固定化された核酸配列と接触させる。ハイブリダイゼーションの後、高解像度レーザースキャナー等の検出器を用いて蛍光マーカーを検出する。別法として、発現産物を非蛍光標識、例えばビオチンでタグ付けすることができる。ハイブリダイゼーションの後、第一の非蛍光標識に結合する蛍光色素（例えばビオチンに結合する蛍光標識ストレプトアビジン）でマイクロアレイを「染色」することができる。しかしながら、発現産物は上述のように標識フリーであってもよい。
【００５３】
遺伝子発現のパターン（発現パターンもしくはプロファイル）を示す結合プロファイルは、個々のスポットから発せられるシグナルを、デジタル画像化ソフトウェアで解析することにより得られる。実験サンプルの遺伝子発現のパターンは、次いで、差示的解析のために標準プロファイル（すなわち、例えば予後の良し悪しが知られているか、または既知のNPI値もしくは既知のNPI値範囲を有する組織サンプルから得られる発現プロファイル）と比較することができる。
【００５４】
標準は、特定の予後（例えば、予後が「悪い」もしくは「良い」）および／または特定のNPI値の範囲（例えば、高いおよび／または低いNPI値および／または１以上のNPI値もしくはNPI値の１以上の範囲）に特徴的であると以前に判定された１以上の発現プロファイルから誘導することができる。標準は、特定のNPI値またはNPI値の範囲（または予後スケールにおいて他に規定される値）に特徴的であると以前に判定された１以上の発現プロファイルから誘導することができる。標準は、正常サンプルに特徴的な発現プロファイルを含み得る。これらの／この標準発現プロファイルは、データベースの一部としてデータキャリアに検索可能に保存され得る。
【００５５】
ほとんどのマイクロアレイでは1種または2種の蛍光色素が利用される。2色アレイにおいて、最も一般に用いられる蛍光色素はCy3（緑色チャネル励起）およびCy5（赤色チャネル励起）である。マイクロアレイ画像解析の目的は、各発現産物からのハイブリダイゼーションシグナルを抽出することである。1色アレイにおいては、シグナルは所定の標的のための絶対強度として測定される（特に単一サンプルにハイブリダイズさせるアレイの場合）。2色アレイにおいては、シグナルは異なる蛍光標識を有する2種の発現産物（例えばサンプルと対照(対照は「基準」としても知られる)）の比として測定される。
【００５６】
本発明に従う装置は、好ましくは複数の個別のスポットを含み、各スポットは1種以上のオリゴヌクレオチドを含む。各スポットは表２から選択される遺伝子の発現産物のための異なる結合メンバーを提示する。一実施形態において、マイクロアレイは表２に挙げられる各遺伝子のためのスポットを有する。各スポットは、表２の遺伝子の発現産物（例えばmRNAまたはcDNA）にそれぞれ結合し得る複数の同一オリゴヌクレオチドを含む。各遺伝子は、好ましくは複数の異なるオリゴヌクレオチドによって提示される。
【００５７】
本発明の第三の態様においては、乳癌患者に予後および／または治療計画を割り当てるためのキットであって、予後セットの遺伝子の発現産物と特異的に結合し得る複数の結合メンバー、および検出試薬を含むキットが提供される。キットは、好ましくはコンピュータープログラムの形態のデータ解析ツールを含み得る。データ解析ツールは、好ましくは予後が異なる腫瘍の発現プロファイル間の識別に適合したアルゴリズムを含む。
【００５８】
一実施形態において、キットは本発明の第二の態様の装置を含む。
【００５９】
好ましくは、キット中の1種以上の結合メンバー（抗体の結合ドメインまたは核酸配列、例えばオリゴヌクレオチド）は、１以上の固相支持体、例えばマイクロアレイもしくは光ファイバーアッセイのための単一の支持体、またはビーズのような複数の支持体に固定させる。検出手段は、好ましくは検査中のサンプルの発現産物を標識するための標識（放射性物質または色素、例えば蛍光色素）である。キットはまた、検査中の発現産物の結合プロファイルを検出・解析するための試薬を含み得る。
【００６０】
あるいはまた、結合メンバーは、表２で同定される遺伝子の発現産物に結合可能であり、これをPCRで増幅することができるようなヌクレオチドプライマーであり得る。プライマーは更に、検出手段（すなわち、増幅配列を同定し、かつ他の増幅配列に対比したその存在量を測定するために使用できる標識）を含んでいてもよい。
【００６１】
乳房腫瘍サンプルは、切除的乳房生検または微細な針による吸引物として得ることができる。
【００６２】
第四の態様においては、乳房腫瘍サンプルの核酸発現プロファイルの作成方法が提供され、この方法は以下の段階：
(a)乳房腫瘍サンプルから発現産物を単離すること、
(b)遺伝子の予後セットの発現レベルを同定すること、
(c)その発現レベルから該乳房腫瘍サンプルの発現プロファイルを作成すること、
を含む。
【００６３】
発現プロファイルは、遺伝子発現プロファイルデータベースに追加することができる。この方法は更に、発現プロファイルを第二の発現プロファイル（または複数の第二の発現プロファイル）と比較する段階を含んでいても良い。第二の発現プロファイル（１または複数）は実質的に同じ予後セットを用いて第二の乳房腫瘍サンプル（１または複数）から作成することができ、その際第二のサンプル（１または複数）については予後がすでに割り当てられているか、または決定されている。第二の発現プロファイル（１または複数）は、特定の予後（例えば予後が「良い」もしくは予後が「悪い」、またはNPIが高いもしくは低い、または少なくとも１つの特定のNPI値もしくは少なくとも１つのNPI値範囲）に特徴的な標準プロファイル（１または複数）であって良い。これとは別に、または同様に、標準プロファイル（１または複数）は特定の治療計画を示すものでありうる。
【００６４】
好ましくは、予後は、予後尺度の形態をしており、好ましくはNPIのような臨床的に受け入れられている予後分類システムである。この場合も、予後は、遺伝子発現データから予測することができ、組織病理学的方法等の臨床技術から得ることができ、あるいは、第二のプロファイルの由来となったサンプル（１または複数）を提供した患者の疾患結果に基づく第二の発現プロファイルに遡及的に割り当てることができる。
【００６５】
予後セットに関する知識を用いて、特定の試験サンプル中の遺伝子の発現パターンまたはプロファイルを決定するための多くの方法を考案することが可能である。例えば、発現された核酸（RNA、mRNA）を標準的な分子生物学的技法を用いてサンプルから単離する。次いで、表２に挙げる遺伝的識別子の遺伝子メンバーに対応する発現核酸配列を、発現配列に特異的な核酸プライマーを用いてPCRで増幅する。単離した発現核酸がmRNAである場合には、標準的な方法を使用して、PCR反応のためにcDNAに変換することができる。
【００６６】
プライマーは、増幅核酸の同定ができるように、増幅核酸中に標識を都合よく導入することができる。理想的には、標識は、増幅反応後に存在する核酸配列の相対量または比率を示すことができ、これは元の試験サンプル中に存在する相対量または比率を反映している。例えば、標識が蛍光または放射性物質である場合、シグナルの強度は、発現配列の相対量／比率、あるいは絶対量さえも示すであろう。それぞれの遺伝的識別子の発現産物の相対量または比率は、試験サンプルについての特定の発現プロファイルを確立するであろう。
【００６７】
発現プロファイルの分類は、試験する遺伝子発現レベルの数が大きいほど信頼性が高い。公知のマイクロアレイおよび遺伝子チップの技術は、多数の結合メンバーの利用を可能とする。従って、より好ましい方法は、表２の全ての遺伝子を提示する結合メンバーを用いるものであろう。しかしながら、当業者であれば、これらの遺伝子の一部が省略されても良く、それでもこの方法を、信頼性があり、統計的に正確なやり方で実施できることを認識するであろう。
【００６８】
本発明のいかなる態様においても、予後セットは、表２の遺伝子の全て、または実質的に全てからなるか、これらを含み得る。遺伝子の予後セットは、本発明の態様によって、その内容および数が独立して変動し得る。
【００６９】
予後セットは表２の遺伝子の少なくとも5種、10種、20種、30種または全てを含み得る。
【００７０】
予後セットの提供によって、診断ツール、例えば核酸マイクロアレイがカスタムメイドになり、腫瘍を予測し、診断し、もしくはサブタイプに分けるために用いることが可能となる。更に、こうした診断ツールは、診断ツール（例えばマイクロアレイ）を用いて得られる発現プロファイルを決定し、かつ上述のようにこれを「標準」発現プロファイルまたは「既知」の予後の発現プロファイルのデータベースと比較するように、プログラムされたコンピューターと組み合わせて使用することができる。そうすることで、コンピューターは、患者における腫瘍の存在またはタイプを診断するために用い得る情報を使用者に提供するだけでなく、同時に、コンピューターは「標準」発現プロファイルを決定するための更なる発現プロファイルを取得し、それ自身のデータベースを更新することができる。
【００７１】
従って、本発明は初めて、予後セットに対応するプローブを含むように特殊化したチップ（マイクロアレイ）の作成を可能とする。アレイの正確な物理的構造はさまざまであり、二次元の固相基体に結合したオリゴヌクレオチドプローブから、独特の標識（例えば「バーコード」）で個々に「タグ付け」された、自由に浮遊するプローブまでの幅があり得る。
【００７２】
予後が知られている発現プロファイルのデータベースへの照会は、直接もしくは間接的な方法で行うことができる。「直接」的方法は、患者の発現プロファイルを、データベースの他の個々の発現プロファイルと直接比較して、どのプロファイル（従ってどの予後および／または治療計画）が最も良くマッチするかを決定するものである。
【００７３】
本発明の態様および実施形態を、添付の図面を参照しながら、例として以下に説明する。当業者には、更なる態様および実施形態が明らかであろう。本明細書において言及した全ての文献は、参照として組み入れる。
【００７４】
材料および方法
乳房組織および臨床情報
計96個の浸潤性乳癌を、シンガポール国立がんセンター（NCC）組織保存機関（Tissue Repository）から、NCCの保存倫理委員会から適切な承認を得た後に入手した。プロファイルしたサンプルは少なくとも50％の腫瘍含量を有していた。技術およびパラメーターを含めて、サンプルの採集、保存、および腫瘍の組織学的評価の詳細については、既に報告されている（5）。
【００７５】
サンプル調製およびマイクロアレイハイブリダイゼーション
トライゾール（Invitrogen、Carlsbad、CA）試薬を用いて組織からRNAを抽出し、取扱説明書に従ってU133Aジーンチップを用いるAffymetrix Genechip （Affymetrix Inc.、Santa Clara、CA）ハイブリダイゼーションのための処理をした。
【００７６】
データ処理
生のジーンチップスキャンは、GeneData（商標）Refiner（Genedata、Basel、スイス）を用いて品質管理し、中央データ保存機関に登録した。発現データは、全てのサンプルを通して発現がなかった遺伝子（すなわち「Ａ」コール）を除くことで予め処理し、残りの遺伝子（9116プローブ）をlog2変換し、サンプルの中央値センタリングによって正規化した。
【００７７】
シグネチャーアルゴリズム（SA）および反復的シグネチャーアルゴリズム（ISA）
SA方法論の詳細な説明は参考文献6にあり、これを参照として本明細書に組み入れる。簡単に説明すると、SAは次のように操作する：１）選択された「インプット遺伝子」のセットをSAアルゴリズムに入力する；２）SAは、インプット遺伝子の平均的発現が予め規定された閾値を越える腫瘍を選択する；３）次いでこれらの選択された腫瘍の全体のプロファイルを調べ、平均発現が遺伝子閾値を越える他の遺伝子を選択する。SAのアウトプットは「腫瘍モジュール」（TuM）であり、これは特定の腫瘍群内で特定の遺伝子閾値を越える発現レベルを示す遺伝子セットを含む。本発明者等は、SAの延長である、反復的シグネチャーアルゴリズム（ISA）を利用するが、これは初期のインプット遺伝子として多数のランダムな遺伝子セットを利用し、次にSAを複数回反復的に行ってTuMをリファインする（7）。インプットされる遺伝子はランダムであるので、ISAは予め情報を必要とせず、従って完全に管理されない解析アプローチを構成する。これまでの報告に基づき、更なる綿密な解析のための最適な閾値として遺伝子閾値3.0を選択した（6）。各TuM内の遺伝子のリストは補足情報（Supplementary Information）中に含まれている。腫瘍モジュール間の相関性は（6）に記載されるとおりに算出した。
【００７８】
SAソフトウェアは、http://barkai-serv.weizmann.ac.il/GroupPage/software.htmで入手可能である。
【００７９】
TuMと臨床データとの関連性
カイ２乗検定を用いて、各TuMと次の臨床パラメーターとの関係を計算した：患者の年齢、リンパ節（LN）の状態、エストロゲン受容体（ER）の状態、プロゲステロン受容体（PR）の状態、腫瘍サイズ、組織学的グレード、およびリンパ血管内浸潤（LVI）。それぞれの関連の有意性を、超幾何学的確率密度関数解析によっても確認した。
【００８０】
技術
ヒト乳房組織はNCC組織保存機関から、NCCの保存倫理委員会から適切な承認を得た後に入手した。サンプルを外科的切除直後に手術室で大まかに切り、液体窒素中で瞬間凍結した。サンプルは手術前には化学療法を受けていない。腫瘍および腋窩リンパ節の組織学的評価のために、ホルマリン固定したパラフィン包埋腫瘍組織を用い、腫瘍サブタイプ（WHO分類）、組織学的グレード、およびリンパ血管内浸潤について調べた。浸潤成分のみに基づいて腫瘍サイズを肉眼で評価し、顕微鏡で確認した。小さい腫瘍では、この組織学的切片でサイズを測定した。ER状態は免疫組織化学によって確認し、少なくとも＋２の強度の核反応性を示す＞10％の癌細胞を陽性の結果とした。ERBB2免疫組織化学では、Dako分類系を用いて、０および１＋のスコアを陰性とし、２＋および３＋を陽性とした。良性の乳房上皮で免疫反応性がある場合には不確定な結論とした。プロファイルされたサンプルは少なくとも50％の腫瘍含量を有していた。
【００８１】
ISA作業スキーム
反復的シグネチャーアルゴリズム（ISA）は、遺伝子発現データを全体的に分解するために使用される基本的なシグネチャーアルゴリズムの延長である。一般に、ISAは自動送りシステムであり、次のように用いられる：１）（十分に）大きなインプットシードのサンプルを作成する；２）複数回の反復を通して各シードに対応して（SAと同様に）強力なモジュールを同定する。図４は、ISAの概要を示す。ISAの詳細な技術的報告は、Bergmann等、2003, Mar；67（3 Pt 1）：031902に見ることができる。使用したパラメーターを以下に示す。各パラメーターの定義は、http://barkai-serv.weizmann.ac.il/GroupPage/software.htmで見ることができる。
【００８２】
2008534002.tif 000002
【００８３】
グレードのER状態への相関性
グレードとER状態との関係を調べるために、本発明者等は４つの乳癌のデータセットを調査した：１）スタンフォードデータセット（参考文献3）；２）NCIデータセット（参考文献4）；３）ロゼッタデータセット（参考文献10）；４）それらのインハウスデータセット。図７は、各乳房腫瘍のグレードおよびER状態を示した。ER陰性腫瘍は高いグレードであるという傾向が明らかである。
【００８４】
細胞培養およびタモキシフェン処理
MCF-7乳癌細胞はAmerican Type Culture Collectionセンター（Manassas、VA）から入手し、細胞は10％ウシ胎児血清（FBS）、100U/mLペニシリン、100U/mLストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを添加したダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）（Gibco、Grand Island、NY）中で培養した。タモキシフェン処理の前に、細胞をPBSで3回洗浄し、5％デキストランチャコール分離FBS（HyClone Laboratories、Pittsburgh、PA）を含むフェノールレッド不含DMEM中で24時間維持した。次に細胞を10μMのタモキシフェン（Sigma）で処理し、48時間で回収した。対照の姉妹培養物（sister culture）は等容量のビヒクル（0.1％エタノール）で処理した。
【００８５】
遺伝子セット濃縮解析
GSEAを用いて、腫瘍モジュール遺伝子の発現がタモキシフェン処理によって影響されるか否かを調べた。４種の対照サンプルおよび２種の処置後のサンプル（「材料と方法」欄参照）をGSEA解析に用いた。MCF7細胞系において発現された遺伝子の数が十分でなかったため（＜10）、３種のモジュール（TuM4、5および6）を除外した。TuM1は対照サンプルとの有意な相関性を示した唯一のモジュールである（すなわち、処置されたMCF7細胞系においてダウンレギュレートされていた、表および図１０参照）。
【００８６】
2008534002.tif 000003
【００８７】
RLN2のsiRNA媒介阻害およびタモキシフェン誘導性アポトーシスの解析
MCF-7細胞（ATCC）は、10％ウシ胎児血清（FBS）、100U/mLペニシリン、100U/mLストレプトマイシン、および2mM L-グルタミンを添加したDMEM増殖培地中で維持した。MCF-7細胞に、オリゴフェクタミントランスフェクション試薬（Invitrogen、Life Technologies）を用いて20nMのRLN2特異的siRNA （Ambion）または対照siRNAをトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、5％DCCを含むDMEM中で24時間維持し、1μMタモキシフェンまたはビヒクルで処理した。48時間後、処理を停止し、細胞を5％DCC含有DMEM中で72時間維持した。RLN2サイレンシングされた細胞および対照細胞を1μMタモキシフェンまたは等量のビヒクルで48時間処理し、次に培地を5％DCC含有DMEMに変えることで処理を停止した。72時間後、細胞をトリプシン処理し、アネキシン-V-フルオレセインおよびヨウ化プロピジウムでメーカー（Roche）の推奨通りに染色し、フローサイトメーター（Beckman-Coulter）で分析した。アネキシン-V陽性細胞集団をアポトーシス細胞のパーセンテージの表示として計数した。
【００８８】
72時間の時点で、対照およびRLN2サイレンシングされたMCF-7細胞からRNAを単離した。等量のRNAを、オリゴ-ＴプライミングによってsuperscriptII逆転写酵素を用いて逆転写し、RLN2特異的オリゴを用いてRT-PCRを実施して、RLN2サイレンシングの効率を評価した。（RT-PCRに用いたオリゴ：RLN2-F: TGCCATCCTT CATCAACAAA, RLN2-R: CAACCAACATGGCAAC ATTT, アクチン-F: CGGGAAAT CGTGCGTGACATTAAG, アクチン-R: TGATCTCCTT CTGCATCCTGTCGG）。
【００８９】
結果
乳癌におけるTuMの同定および分解
本発明者等は、基本的SAの延長であるISAを、96種の乳癌遺伝子発現プロファイルのセットに応用した。ISAにおいて鍵となるパラメーターは、共制御のストリンジェンシーを反映する距離関数(metric)である「遺伝子閾値」である。遺伝子閾値が高いほど、各TuMにおける個々の遺伝子間の相関性がより密接である。一連の変化する遺伝子閾値のもとで行うと、ISAは異なる分解度で遺伝子発現データのモジュール分解を生じる（7）。図１ａは、この概念をモジュール系統樹の形態で示している。低い遺伝子閾値において、２〜３のTuMがまず同定され、この場合に各TuMは多数のゆるく相関する腫瘍と遺伝子から構成される。より高い分解度では、発現データはより多数のTuMに分解され、この場合各TuMはいまや、密接に相関する腫瘍と遺伝子のより小さいセットを含んでいる。遺伝子閾値3.0では、８種のTuMが生成し、そのうち３種は同じ枝から派生していた。ISAアプローチによって規定されるTuMが伝統的な階層的クラスタリングによって規定されるクラスターと明確に区別されることは注目する価値がある。後者と違って、異なるTuMが共通の遺伝子および腫瘍を共有することがある（図１ｂにおける矢印）。
【００９０】
本発明者等は、８種のTuMのそれぞれの遺伝子含量を、乳癌における種々の分子サインを記載した従来の報告と比較した。最初の３種のモジュール（TuM1、TuM2およびTuM3）は、ESR1、GATA3、およびBCL2のようなER+腫瘍で高度に発現していると先に報告された数種の遺伝子を含む単一のより大きなモジュールから共通して由来するものであった（1-4）。このより大きなモジュールは、以前は他の研究では均質なものとして扱われてきたが、より小さな明確な単位に分解できたことで、このより大きなモジュールは実際には、明確で、おそらくは独立して作用する複数の生物学的プログラムを含んでいることが示唆される。具体的には、30遺伝子のTuM2および38遺伝子のTuM3が、BCL2およびSTC2等のERによって制御されることが知られる種々の遺伝子の実質的な重複（〜50％）を共有するのに対し、34遺伝子のTuM1モジュールの遺伝子の＞80％はTuM2にもTuM3にも見られない（TuM1については以下の項でより詳細に説明する）。
【００９１】
TuM4〜8はまた、乳癌において先に規定された多くの遺伝子発現サインと相関している可能性がある。すなわち、TuM4は免疫グロブリン遺伝子、Ｔ細胞受容体サブユニット、およびTNFファミリーメンバーを含む、免疫機能に関与する遺伝子の大きなセットから構成され（1）、一方、FBLN1、SPARCおよび種々のコラーゲンのイソ型を含むTuM5は間質細胞集団からの寄与を提示している可能性がある（1）。TuM6はケラチン5、ケラチン17、およびSFRP1を含み、Basal/ER-分子サブタイプに属する乳癌の発現サインに相当していた（1-4）。そしてTuM7は、ノッティンガム予後指数（8）の分子的代理として先に同定された、NPI-ES発現サインに属する相当数の遺伝子（p＜10-4）、並びに細胞増殖に関与する数種の遺伝子（例えばMAD2L1、CDC2）を含んでいた。TuM7は85種の遺伝子を含み、NPI-ESは62種の遺伝子を含む。16種の遺伝子が双方の遺伝子セットで共通していた。このオーバーラップの有意性を評価するために、本発明者等は、以下の方法でランダム順列試験を実施した： 85種の遺伝子および62種の遺伝子のセットをランダムに選択し、２つのセットで重複する遺伝子の数を計算する；次いでこのプロセスを10,000回繰り返した。図５はランダムセットにおける最大の重複は４であることを示している。従って、TuM7とNPI-ES間の重複の有意性は0.0001未満であると見積もることができる。最後に、TuM8は17q21座に物理的にリンクされた数種の遺伝子（例えばv-erb-b2、GRB7、PNMT）を含み、先に報告されたERBB2クラスターに一致する（1-4）。これらの結果から示されるように、ISAは、完全に管理されない解析アプローチであるにもかかわらず、乳癌について以前に報告されている主要な遺伝子発現サインの（全部ではないにしても）多くを再発見するのに非常に有効であるようである。
【００９２】
TuM1はアポトーシスおよびER+腫瘍の低い組織学的グレードと関連した新規な発現サインを含む
以前に報告されたこれらのサインを同定するほかに、ISAはまた、TuM1において新規な発現サインを発見した。TuM1は、プログラムドセルデス４（programmed cell death 4）、ミトコンドリアリボソームタンパク質S30およびβ-TrCP1を含めて、アポトーシスに関係すると想定される遺伝子が非常に多く（超幾何分布によればP=0.01）、また、乳癌のグレードと関連することが近年報告されたPCM1のような遺伝子（9）、GJA1およびIL6STのような細胞−細胞シグナリング遺伝子、および生体異物代謝酵素NAT1およびFMO5をコードする遺伝子をも含む。TuM1サインの高発現を示す腫瘍の臨床的重要性を検討するために、本発明者等は、これらの腫瘍を種々の既知の臨床的および組織病理学的パラメーターと相関させた。比較のための土台を提供するために、他のTuMについても同様の解析を実施した。表１Ａに見られるように、TuMと種々の臨床的特徴の間には多くの有意な関係が明らかになった。本発明者等は、TuM1、2および3で示される相関性に注目した。しかしながら、他のTuMについて報告された関連性の詳細な考察を以下に示す。
【００９３】
本発明者等は、TuM1、2および3がER状態と有意に正に相関していることを見出した（ｐ＜0.001；表１Ａ）。この観察と一致して、これら３種のTuMに属する腫瘍は、標準的な免疫組織化学において全てER+であった。しかしながら、TuM2および3と異なり、TuM1のみが低い組織学的グレードと強い正の相関性を示し（p<0.001、TuM2のp=0.024およびTuM3のp=0.037との比較）、TuM1発現サインはER+の低グレード腫瘍に特有な分子特徴であり得ることが示唆された。しかしながら、ER+腫瘍は一般にER-腫瘍よりもより低い組織学的グレードと関係するので（下記参照）、本発明者等はまた、TuM1発現と低グレードとの相関性が単にこれらのモジュール内でER+腫瘍が優勢であるためであるという可能性も考慮した。この可能性に対処するため、全ての腫瘍を用いた表１Ａのこれまでの解析と対照的に、本発明者等は研究対象集団としてER+腫瘍のみを用いた関連性研究を繰り返した。表１Ｂに示すように、全ての非ER+腫瘍を除いた後においても、TuM1は低グレードと有意に相関したままであり（p=0.001）、一方TuM2およびTuM3は相関しなかった（それぞれp=0.24およびp=0.21）。これらの結果から、TuM1発現サインは、ER状態とは無関係に低い組織学的グレードと有意に相関していることが示される。
【００９４】
TuM1発現サインは２つの独立したデータセットにおいて低い組織学的グレードと有意に相関する
次いで本発明者等は、２つの独立した公に入手可能な乳癌のデータセットに応用することで、TuM1発現サインの一般的応用性を試験した。第一のデータセット（「ロゼッタデータセット」）は、オリゴヌクレオチドに基づくマイクロアレイを用いてプロファイリングされた117種の乳房腫瘍（71種のER+腫瘍）から構成され（10）、第二のデータセット（「スタンフォードデータセット」）は、cDNAマイクロアレイを用いてプロファイリングされた122種の乳房組織サンプル（82種のER+腫瘍）から構成される（3）。本研究において同定された34種のTuM1遺伝子（表２参照）の中で、20種および13種の遺伝子がロゼッタおよびスタンフォードマイクロアレイ上でそれぞれ見出された。本発明者等のインハウスシリーズと一致して、ロゼッタおよびスタンフォードデータセットの双方において、TuM1サインは、ER+腫瘍を、高レベルまたは低レベルのTuM1発現サインを発現する２つの明確なサブグループに分け、TuM1サインを高発現する腫瘍が双方のデータセットで低い組織学的グレードと有意に関連している（双方でp<0.001）ことを見出した。これらの結果から、TuM1発現サインは広範囲の患者集団において低い組織学的グレードと関連し、従って乳癌の一般的分子特徴を反映している可能性があることが示される。興味深いことに、双方のデータセットにおいて、全てではないがほとんどの、従来「Luminal A」と規定されているサブタイプの腫瘍（3）は、TuM1の34種のうちたった1種の遺伝子（NAT1）がこの腫瘍サブタイプで発現されると先に報告されていたけれども、高レベルのTuM1サインを発現した。
【００９５】
ロゼッタおよびスタンフォードの患者集団では臨床の追跡データも入手可能であるので、本発明者等はこれら２つの患者集団においてTuM1サインが臨床結果を予測できるかを試験した。本発明者等は、スタンフォードのシリーズにおいて、TuM1発現ER+腫瘍を有する患者が、TuM1が発現していないER+腫瘍を有する患者と比較して、より良好な生存の結果を示すことを見出した（全体の生存についてp=0.0001；再発なしの生存はp=0.0036、図２ａ）。対照的に、ロゼッタシリーズにおいては、TuM1発現ER+腫瘍を有する患者は、TuM1が発現していないER+腫瘍を有する患者と比較して改善された臨床結果を示さなかった（p=0.34）。これら２つの集団におけるこの差異を説明し得る理由は、２つの集団の異なる臨床的特徴にあるかも知れない。ロゼッタシリーズは一般には全身的な補助的治療を受けていない初期（ステージＩ）の患者を含んでいるのに対し、スタンフォードシリーズは主に、（その腫瘍がER+であれば）手術後の補助的内分泌治療を受けている、局所的に進行した疾患を有する後期の患者から構成されている。従って、TuM1サインの存在は、転移という腫瘍固有の性質よりも、むしろ補助的治療に対する腫瘍の感受性を反映しているということが考えられる（「考察」参照）。
【００９６】
種々のTuM間の相関性解析はERBB2+腫瘍と免疫系との予想外の関係を明らかにする
SAの主な長所は、種々のモジュール間のより高次の相関性を明らかにできることである（5）。腫瘍生物学の分野において、種々のTuM間の関係を同定する上で、そしてまた、特定の腫瘍内で異なる分子サインの発現が独立的に、あるいは非独立的に起こっているかを決定するために、このことは非常に有用である。本発明者等は、種々のTuM間の相関値を算出して（下記参照）、TuMにわたる個別の腫瘍の関係を説明するヒートマップ（heat-map）として結果を表した（図３）。例えば、TuM1、2および3は高度に重複する（しかし同一ではない）「腫瘍サイン」（図３Ａ）を示し、TuM1サインを発現する腫瘍がTuM2およびTuM3サインも同様に発現し得ることが示される。同様に、NPI-ES/細胞増殖モジュールであるTuM7はTuM6（「basal」モジュール）と正の相関があったが、TuM1とは負の相関があった（図３Ｂ）。これらの知見は乳癌の従来知られた性質と一致している。例えば、ER-または「basal」サブタイプの腫瘍は一般的に高い組織学的グレードを有し、Ki67のような増殖マーカーの発現が増大していることが知られている（1-4）。しかしながら、これらの予測された知見に加え、TuM間の相関性解析から、予想外の知見も明らかとなった。具体的には、TuM4「免疫」モジュールはERBB2+モジュールTuM8と相関することが見出され（図３Ｃ）、その相関の強さは図３で強調される他の関係に匹敵するものであった。この相関性から、免疫細胞とERBB2+分子サブタイプの腫瘍細胞との実質的なクロストークの存在が示唆され、これを「考察」において更に追及する。特に、共通のTuM4(+)TuM8(+)の「腫瘍サイン」を示す腫瘍は、TuM4(+)またはTuM8(+)のみである腫瘍と異なり、リンパ血管内浸潤（LVI）の増大との弱いが有意な相関性を有していた(p=0.03；カイ2乗解析)。この結果から、TuM4とTuM8サインの双方を発現する腫瘍は、いずれかのサインを単独で発現する腫瘍とは明確に異なる臨床的特徴と関係し得ることが示唆される。
【００９７】
TuMと臨床パラメーターとの関連性
腫瘍モジュールは腫瘍のセットと関係する。それぞれの腫瘍の重大性はスコアによって特徴づけられる。正または負のスコアは、この腫瘍において遺伝子がアップレギュレートまたはダウンレギュレートされていることを示す。ここで本発明者等は、負のスコアをもつ腫瘍が十分になかったため（３つのモジュールのみが負のスコアの腫瘍を有していた；図６参照）、正のスコアをもつ腫瘍のみを調べている。腫瘍スコアの低いある種の腫瘍は明らかに他と異なることが見出された（長方形中のもの）。これらの腫瘍を「信頼性の低い」サンプルとして扱い、それらを以後の相関性解析から除外した（表１Ａ）。
【００９８】
次に、統計的アプローチを用いて、これらの転写モジュールの臨床的意義を発見した。その結果から、モジュールと臨床的特徴とのいくつかの有意な関係が明らかになった。全体的には、本発明者等の結果（特に厳格な有意性閾値のもとで：p<0.01、表１Ａ）から、ER/PR状態および腫瘍グレードのみが遺伝子発現データと関連し得ることが示唆され、このことは参考文献４でも観察されていた。免疫クラスターであるTuM4はERと負の相関性があり、また高グレードと正の相関性がわずかにあった（p=0.02）。この結果は、免疫グロブリン遺伝子が「ER-」遺伝子の多くを含んでいるという報告（Iwko等、2002）と一致している。主として間質細胞クラスターであるTuM5はいずれの臨床パラメーターとも関連がなかった。予想されたように、それぞれER-/BasalおよびERBB2+を提示するTuM6およびTuM8はERと有意な負の相関があった（p<0.001）。TuM8（ERBB2+）については、ERBB2 IHCが機能していた14種の腫瘍全てがIHCによって同様にERBB2+であった。細胞増殖クラスターであるTuM7は、高い組織学的グレードと有意な相関性があるが、ER状態とは相関していなかった。
【００９９】
TuM間の相関性
Bergmann等、2004によって与えられた指示に従い、本発明者等は図３に対応して、TuM間の相関値を算出した。
【０１００】
TuM1発現は低い組織学的グレードと関連する
多変量解析を用い、TuM1発現と低腫瘍グレード間の相関性が単にそれらのER状態との関係の結果であるのか、あるいはTuM1発現と低腫瘍グレード間の関係はERと無関係であるのかを試験した。この解析において、TuM1発現はERと関係なくグレードと相関していたが（p<0.001）、もう1つの腫瘍モジュールであるTuM2と低グレードとの関係は相関がなかった（ｐ＝0.9）（表５）。
【０１０１】
TuM1モジュールはin vitroでタモキシフェン処理によりダウンレギュレートされる
TuM1はER+腫瘍のサブセットにおいて発現するという観察によって、このモジュールの発現が、少なくとも部分的には、ER活性およびシグナル伝達に依存し得るという可能性が提起される。TuM1発現およびERシグナリングの関係を調べるために、我々はin vitro系を用いてTuM1のER活性に対する応答性を試験した。第一に、乳癌および胃癌の細胞系のセットをプロファイリングすることによって、我々は、TuM1モジュールがER+乳癌細胞系MCF7において過剰発現していることを見出した（図１１）。第二に、我々はERの阻害剤であるタモキシフェンでMCF7細胞を処理し、遺伝子セット濃縮解析（GSEA、16）を用いて、tam-処理MCF7細胞系では、対照と比較してTuM1が有意にダウンレギュレートされていることを更に見出した（FDR=0.05）。対照として、他のTuMはいずれもタモキシフェン処理による影響を受けなかったが、タモキシフェン処理とわずかに相関していたTuM2（FDR=0.19）を除く。この解析の詳細は「材料と方法」の項に記載する。この結果から、少なくともin vitroにおいては、TuM1発現は活発なERシグナリングに依存する可能性があり、従ってER活性の「分子サイン」を提示し得ることが示唆された。
【０１０２】
TuM1発現および臨床結果の予想される関係
TuM1モジュールの発現が活発なERシグナリングに依存するという我々の知見により、我々は、原発性腫瘍におけるこのモジュールの存在が、活発なER活性の分子的バイオマーカーとして機能し得るかを調べ、かつタモキシフェンまたは他の抗ホルモン療法に応答すると思われる腫瘍を同定した。我々は、３つのデータセットにおいてTuM1の予後診断能を試験した。スタンフォード大学から入手した第一のデータセットでは、TuM1、グレード、年齢、リンパ節および腫瘍サイズの多変量解析において、TuM1は生存結果の独立した予測因子としてふるまったが、グレードの予測因子としては機能せず、このことはTuM1がグレード状態よりも患者の生存の直接的な予後因子として機能することを実証している（表６）。第二に、我々は、予め選択されたタモキシフェン応答性および耐性のER+腫瘍のセットを含むMaデータセット（28）を試験した。この場合においても、TuM1を過剰発現する患者はTuM1が低い患者よりも有意に良好な結果を示した（p=0.048、図１２ｂ）。多変量Cox回帰解析により、TuM1は唯一の独立した予後定因子であった（p=0.03、表６）。なぜなら、Ma患者集団ではグレード、腫瘍サイズ、リンパ節および年齢がコントロールされているからである（28）。この観察はまた、遺伝子セット濃縮解析（GSEA）を用いても調べられ、TuM1発現がタモキシフェン応答と有意に関連することが確認された（p=0.024）。第三に、TuM1の予後診断能を、単剤療法としてタモキシフェンを投与された67名のER+の患者の独立した患者集団であるウプサラ（Uppsala）セット（29）に対して試験した。この場合も、TuM1発現腫瘍を有する患者は、TuM1低発現の患者と比較して有意に改善された全体的な生存結果を出した（p=0.025、図１２ｃ）。多変量Cox回帰解析により、TuM1は生存との有意な関連性を保持し（p=0.024）、一方、グレード、腫瘍サイズ、およびリンパ節の状態とは関連していなかった（表６）。
【０１０３】
TuM1モジュール遺伝子のリラキシン２のノックダウンはタモキシフェンに対するMCF7応答を低下させる
TuM1サインと、抗ホルモン療法に対する腫瘍の応答との関係を機能的に調べるために、代表的なTuM1遺伝子であるリラキシン２（RLN2）の役割を、ER+乳癌細胞モデルにおいて評価した。RLN2遺伝子はMCF-7細胞系においてsiRNA媒介ノックダウンによってサイレンシングした。RLN2がサイレンシングされた細胞および対照細胞を1μMのタモキシフェンで48時間処理し、アポトーシス細胞のパーセンテージを72時間後に分析した。フローサイトメトリー分析から、タモキシフェン処理した対照MCF-7細胞では細胞の約73％がアネキシン-V染色で陽性であったが、RLN2サイレンシングしたMCF-7集団では、細胞の約23％がアポトーシスを起こしていることが明らかになった。このことは、RLN2サイレンシング細胞系のタモキシフェン感受性の低下によって明らかなように、RLN2の高レベルの発現によって、乳癌細胞系モデルにおいてタモキシフェン応答性が何らかの形で与えられていることを示す。TuM1遺伝子が抗ホルモン療法に対する応答性を付与している未知の分子的メカニズムは、詳細な研究に値する。
【０１０４】
考察
本発明者等は、近年報告された解析方法論であるシグネチャー解析(SA)を利用して、乳房腫瘍の発現プロファイルのインハウスデータセットを性状解析した。乳癌においてこれまで報告されていた多くの遺伝子発現サインを再発見することに加え、SAによって、アポトーシスに関連する遺伝子に有意に富み、かつ３つの独立したデータセットにおいて低い組織学的グレードと相関する新規な遺伝子発現サイン（TuM1）が同定された。TuM1サインと低い組織学的グレードの関係がER状態と無関係であると実証されたことは注目に値する。従ってTuM1サインは、低い組織学的グレードについて以前に報告された発現サイン（GATA3のようなER状態に関連する遺伝子を含む傾向にあり（4）、これはER陰性腫瘍が高グレードでありやすいという周知の観察を反映しうる）とは明確に区別される。
【０１０５】
TuM1で同定された共制御される遺伝子の多くはアポトーシスに関連づけられてきたものである。その中で、プログラムドセルデス４（PDCD4）は腫瘍細胞の増殖を抑制することが示されている（11）。SCF（SKP1-cullin-F-box）ユビキチンタンパク質リガーゼ複合体の構成成分であるβ-TrCP1（BTRC；FbwlaまたはFWD1としても知られている）はNF-カッパB（NFκB）経路を活性化することによって複数の転写プログラムにおいて機能し、これが結果として細胞増殖を抑制する（12）。そして熱ショック70kDaタンパク質２（HSPA2）はアポトーシスからの細胞保護をもたらすことができる（13）。興味深いことに、ヒト癌におけるPDCD4の不活化は、in vitroで乳癌におけるタモキシフェンに対する感受性のみならず、ゲルダナマイシン細胞毒性に対する感受性も低下させると報告されており（14）、一方、もう1つのTuM1遺伝子であるNAT1は、乳癌再発の独立した予後因子として、またタモキシフェン応答の潜在的予測因子として報告されている（15）。この後者の観察から、TuM1サインは乳癌のホルモン療法への応答のための予測サインとして機能することが示唆される。この可能性と一致して、TuM1サインは、補助的なホルモン治療を受けている患者集団（スタンフォード集団）における臨床結果と強く関連していたが、そうした治療を受けていない患者集団（ロゼッタ集団）における臨床結果とは関連しなかった。注目すべきことに、アポトーシス関連遺伝子が過剰に発現している乳房腫瘍は化学療法に対して増大した感受性を示し得ることも近年報告されている（16）。
【０１０６】
TuM1を同定することに加え、SAにより、本発明者らが種々のTuM間の相関性を規定して、これらの共制御される遺伝子群間の高次の制御関係を探索することも可能となった。本発明者等は、免疫関連遺伝子を含むTuM4と、ERBB2関連遺伝子を含み、従ってERBB2+腫瘍サブタイプを代表するTuM8間の著しい正の相関性を発見した。この結果から、ERBB2+腫瘍細胞と免疫系の細胞との間で実質的なクロストークが生じている可能性が提起される。現時点において、本発明者等は、このプロセスの背景にある可能な分子メカニズムを予測し得るにすぎない。しかしながら、可能性のある鍵は、遺伝子発現データを調べることによって見出すことができる可能性がある。TuM4遺伝子の中で、GBP1およびISG20は、炎症性サイトカイン、ケモカイン、免疫受容体、および細胞接着分子の発現を制御する免疫応答経路（19）の鍵となる成分であるNF-カッパBの標的遺伝子として先に報告されている（17、18）。更に、Biswas等は近年、乳房腫瘍のER陰性/ERBB2陽性サブグループにおいて、活性化されたNFκBが多く見られることを報告している（20）。従って、本発明者等は、TuM4（免疫応答）およびTuM8（ERBB2）との正の関係が、少なくとも部分的には、特にERBB2+腫瘍細胞におけるNFκBの活性化に起因し、次いでこれが免疫応答の活性化を媒介するものと考えている。興味深いことに、本発明者等は、TuM4およびTuM8サインの双方を発現する腫瘍がLVIと有意に相関していることを見出した。このように、腫瘍細胞と免疫系とのクロストークは、これらの腫瘍が増大した血管新生および転移傾向（どちらもNFKB活性に関係している(21)）を示すことの一因となりうる。
【０１０７】
結論として、本発明者等は、癌の発現データに対してSAを実施することの実行可能性を証明し、また、以前に十分な解析を受けたデータセットについても、SA解析によって新規な生物学的知見が得られることを示した。従って、SAは、遺伝子をクラスタリングし、かつ外部の臨床情報を遺伝子発現データと統合するための強力な代替法を提供する。更に、SAによって規定されたTuMは、乳癌で起こっている高レベルの分子的関係の我々の理解を促進し、また、重要な診断、予後および治療計画の決定を行うことを可能にする。
【０１０８】
表１Ａは、カイ２乗解析および超幾何学確率密度関数解析を用いた腫瘍モジュールと臨床パラメーターの関連性を示す。双方の解析で確認された有意なp値（＜0.05）のみを強調した。太字の値は最も有意な相関（＜0.001）を示す。LN：リンパ節、ER：エストロゲン受容体の状態、PR：プロゲステロン受容体、およびLVI：リンパ血管内浸潤
【表１Ａ】
2008534002.tif 000004
【０１０９】
表１Ｂは、ER+腫瘍のみにおけるTuM1、2、3と組織学的グレードとの関連性を示す。各モジュールにつき２つのカラムがある。第一のカラムは腫瘍モジュールに属する腫瘍である。第二のカラムは残りの全てのER+腫瘍を示す。
【表１Ｂ】
2008534002.tif 000005
【０１１０】
【表２】
2008534002.tif 000006
【０１１１】
【表２ａ】
2008534002.tif 000007
【０１１２】
【表３】
2008534002.tif 000008
【０１１３】
2008534002.tif 000009
【０１１４】
2008534002.tif 000010
【０１１５】
【表４】
2008534002.tif 000011
【０１１６】
【表５】
2008534002.tif 000012
【０１１７】
【表６】
2008534002.tif 000013
【０１１８】
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【図面の簡単な説明】
【０１１９】
【図１】乳癌の腫瘍モジュールを示す図である。Ａ）種々の分解レベルでのISAによって同定された腫瘍モジュール（TuM）のモジュール系統樹を示す。各節（青の長方形）は転写モジュールを示す。枝は、ある範囲の閾値を超える同じ根から派生したTuMを示す。Ｂ）腫瘍モジュール内の遺伝子発現パターンの全体図を示す。各列は１つの遺伝子を示し、各カラムは１つの腫瘍を示す。８つの対角線上のブロック（黄色のグリッドで仕切られている）は図１Ａ）の（遺伝子閾値3.0未満の）８つのモジュールを示す。８つのモジュールの凡例を記載する。対角線から外れたブロックは、１つのモジュールの遺伝子が他のモジュールでいかに機能するかを表す。赤の矢印は、異なるモジュール間で共有され得る遺伝子および腫瘍の例を示す。
【図２】２つの独立した患者群における疾患結果のKaplan-Meier解析を示す図である。Ａ）スタンフォードデータセットからの82名のER+患者の全体の生存を示す。Ｂ）ロゼッタデータセットからの71名のER+患者の転移フリーの生存を示す。緑の線は、TuM1遺伝子を高発現するER陽性腫瘍を有する患者を示し、ピンクの線は全ての他のER+腫瘍を有する患者を示す。
【図３】異なるモジュールの腫瘍サイン間の相関性を示す図である。各列は腫瘍を示し、線の色はその腫瘍に割り当てられたスコアに従って異なる（色帯）。Ａ）８種のTuM間の共制御の全体的可視化を示す。対角線上のボックスは対応する腫瘍を有するモジュールである。対角線を外れたボックス内の線は、他のモジュールと共有される腫瘍を示す。対角線上のボックス中の1つの線の色を、対角線を外れたボックスと比較することで、２つのモジュール間の相関の程度が明らかになる。TuM1、TuM2およびTuM3を青の長方形で強調してある。Ｂ）TuM1（低グレード）およびTuM7（細胞増殖）腫瘍間の相関を示す。Ｃ）TuM4（免疫応答）およびTuM8（ERBB2+）腫瘍を示す。
【図４】反復的シグネチャーアルゴリズム（ISA）のワークフローを示す図である。
【図５】TuM7およびNPI-ES間で重複する遺伝子を示す図である。
【図６】転写モジュールの腫瘍スコアを示す図である。腫瘍を腫瘍スコアによって分類する。Ｙ軸は腫瘍スコアである。Ｘ軸は腫瘍指数であり、モジュールごとに変化する。
【図７】種々の乳癌データセットにおけるグレードおよびER状態の分布を示す図である。濃い線はグレードを、明るい線はER状態を示す。Ｙ軸はグレード（１−３）を示す。ER陽性は１、ER陰性は０とした。サンプルをグレードにより、その後ERにより分類した。
【図８】スタンフォードデータセット（ER陽性腫瘍のみ）を示す図である。
【図９】ロゼッタデータセット（ER陽性腫瘍のみ）を示す図である。
【図１０】遺伝子セット濃縮分析を示す図である。対照および処理細胞系に対してシグナル対ノイズ（S2N）比で遺伝子をランク付けする。S2N比（ランク）が高いほど、対照と比較して処理細胞系における発現値が低い。
【図１１】TuM1遺伝子の発現プロファイリングに基づく種々の細胞系の階層的クラスタリングを示す図である。この解析ではピアソン相関距離関数を用いる平均連鎖階層的クラスタリングを用いた。MCF7におけるTuM1遺伝子の過剰発現を黄色の長方形中に強調してある。
【図１２】最初の事象としての死亡（ウプサラ(Uppsala)およびスタンフォード）または転移（Ma）のための危険因子の多変量解析を示す図である。表６も参照のこと。
【図１３】Ａ．  MCF-7細胞におけるRLN2遺伝子サイレンシングを示す図である。MCF-7細胞を、該遺伝子の３つの異なる領域を提示するRLN2特異的siRNAでトランスフェクトし、72時間の時点でRLN2のmRNA量を分析した。有効なsiRNA（Ｃ）をsiRNA（Ｂ）と組み合わせて用いて、タモキシフェン応答性アッセイにおいてRLN2をノックダウンした。Ｂ．  RLN2サイレンシングをしたMCF-7細胞におけるタモキシフェン感受性のフローサイトメトリック分析を示す図である。RLN2サイレンシングをした細胞および対照細胞を1μMのタモキシフェンまたは等量のビヒクルで48時間処理した後、処理を停止した。72時間後、アネキシン-V染色陽性細胞をフローサイトメトリーで記録した。これはタモキシフェン誘導性アポトーシスの尺度である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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