(57)【要約】  異なる核酸配列単位を有する標的ポリヌクレオチドを解析する方法であって：（ｉ）多数の反復標的ポリヌクレオチド配列を有するコンカテマーである第一ポリヌクレオチドを形成させ；（ｉｉ）当該第一ポリヌクレオチドの一部を第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、その結果ハイブリダイズした部分、又はハイブリダイズしていない部分が前記標的上の少なくともある配列単位に対応し、そして当該標的上の当該配列単位を決定すること、を含んで成る方法。
2008532508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異なる核酸配列単位を有する標的ポリヌクレオチドを解析する方法であって：
（ｉ）多数の反復標的ポリヌクレオチド配列を有するコンカテマーである第一ポリヌクレオチドを形成させ；
（ｉｉ）ハイブリダイズする部分、又はハイブリダイズしない部分が少なくとも前記標的上の配列単位に対応するように、前記第一ポリヌクレオチドの一部を第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、そして当該標的上の当該配列単位を決定すること、
を含んで成る方法。
【請求項２】
異なる核酸配列単位を有する標的ポリヌクレオチドを、１又は複数の当該異なる核酸配列単位を分離する核酸配列を有するポリヌクレオチドに変換する方法であって：
（ｉ）予め定めた順序で規定の第一配列と第二配列を有する第二ポリヌクレオチドを形成させ；
（ｉｉ）第二ポリヌクレオチド上に、一連の標的ポリヌクレオチドから構成された第一ポリヌクレオチドを形成させること、ここで、第一配列単位と第二配列単位の順序により、第一ポリヌクレオチドと第二ポリヌクレオチドとの特異的な相互作用が可能となり、その結果、第二ポリヌクレオチド上の異なる核酸配列単位が、相互作用の程度によって他の異なる単位と区別されるようになり；そして、任意に
（ｉｉｉ）前記相互作用に基づいて異なる配列単位の配列及び／又は順序を決定し、それにより前記標的ポリヌクレオチド上の１又は複数の特定の配列単位を決定すること、
を含んで成る、方法。
【請求項３】
コンカテマーが、標的ポリヌクレオチドを環化し、そして鋳型として環状標的ポリヌクレオチドを用いてポリメラーゼ反応を実施することで形成される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
環状標的ポリヌクレオチドが追加の核酸配列を含んで成る、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
標的ポリヌクレオチドが、当該標的ポリヌクレオチドの５’及び３’領域を、５’及び３’末端が近接するように第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、そして当該５’及び３’末端をライゲーションすることで環化される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項６】
標的ポリヌクレオチドが、当該標的の５’及び３’領域の両方と相補的なオリゴヌクレオチドを当該標的ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて５’及び３’末端を近接させ、そして当該５’及び３’末端をライゲーションすることで環化される、請求項３又は４に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドがポリメラーゼ反応前にエキソヌクレアーゼによって除去される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｉｉ）が、第一ポリヌクレオチドと第二ポリヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーションによって実施され、当該第一ポリヌクレオチドが、第二ポリヌクレオチドの第一配列単位と相互作用するが、第二配列単位に対してはしない配列単位を含んで成り、そして第一配列単位と第二配列単位の順序が、標的ポリヌクレオチド上の配列単位の予め定めた順序を表している、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
標的ポリヌクレオチド上の核酸配列単位が、第一の規定の配列又は第二の規定の配列のものである、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
標的ポリヌクレオチド上の各単位が、少なくとも４個のヌクレオチド、好ましくは少なくとも６個のヌクレオチドを含んで成り、そして第一配列が第二配列と２個のヌクレオチド異なる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第二ポリヌクレオチドが、ローリングサークルポリメラーゼ反応によって形成される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
標的ポリヌクレオチドが少なくとも４０個、好ましくは少なくとも５０個の核酸配列単位を含んで成る、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
標的上の配列単位がその単位の位置にとって独特である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
第二ポリヌクレオチドが、第一ポリヌクレオチドの各標的ポリヌクレオチドとはハイブリダイズするが、各標的上の予め定めた配列単位とはハイブリダイズしないように設計され、その結果、ハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズしていない１又は複数の標的ポリヌクレオチド内に１つの配列単位が存在する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ハイブリダイズしていない１又は複数の標的ポリヌクレオチド内の配列単位が決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
二本鎖ポリヌクレオチドの形成方法であって：
（ｉ）第一ポリヌクレオチドを形成させ；
（ｉｉ）当該第一ポリヌクレオチドと結合したプライマー分子からローリングサークル増幅反応を実施することを含んで成り、当該増幅反応が、当該第一ポリヌクレオチドの反復単位と少なくとも部分的に相補的な配列を有する環状ポリヌクレオチド分子を利用する、方法。
【請求項１７】
環状ポリヌクレオチドが、一本鎖ポリヌクレオチドの５’及び３’領域を第一ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせて５’及び３’末端が近接するようにし、そして当該５’及び３’末端をライゲーションすることで環化される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
環状ポリヌクレオチドが、当該ポリヌクレオチドの５’及び３’領域両方と相補的なオリゴヌクレオチドを、当該ポリヌクレオチドの一本鎖形態とハイブリダイズさせて５’及び３’末端が近接するようにし、そして当該５’及び３’末端をライゲーションすることで環化される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドの解析をより容易に実施できるようにポリヌクレオチドを修飾するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子の研究の進展は、部分的に、分子又はそれらの生体反応を特徴付けるために使用される技術の向上によってもたらされてきた。特に、核酸ＤＮＡ及びＲＮＡの研究は、配列解析及びハイブリダイゼーションイベントの研究に使用する技術の進展から恩恵を受けている。
【０００３】
ＷＯ−Ａ−００／３９３３３は、標的ポリヌクレオチドの配列を、規定の配列及びそこに含まれる位置情報を有する第二ポリヌクレオチドに変換することで、当該ポリヌクレオチドの配列を決定する方法を記載している。かかる標的の配列情報は、第二ポリヌクレオチドにおいて「拡大された(magnified)」と言われており、これが標的分子上で個々の塩基間の識別をより容易にしている。これは、予め定めた核酸単位である「拡大(magnifying)タグ」を用いて実現されている。標的分子上の塩基、アデニン、シトシン、グアニン及びチミンは、個々の拡大タグで表されており、これが元(original)の標的配列を拡大配列に変換している。常用の技術を使用して拡大タグの順序を決定することもでき、それにより標的ポリヌクレオチドの特定の配列を決定することもできる。
【０００４】
好ましい配列決定方法において、各拡大タグは、同定可能で、且つ使用されることで拡大タグを特徴付けることが可能な標識、例えば蛍光標識を含んで成る。
【０００５】
ＷＯ−Ａ−０４／０９４６６４は、ＷＯ−Ａ−００／３９３３３で開示されている変換方法の改変について記載している。いずれの方法において、各拡大タグは、異なる２つの配列単位を含んで成ることが好ましいとされ、これは、一方の単位が「０」を表し、そして他方が「１」を表す、二進法として使用することができる。標的上の各塩基は、、２つの単位の組み合わせによって表すことが可能であり、例えば、アデニンは「０」＋「０」、シトシンは「０」＋「１」、グアニンは「０」＋「１」、そしてチミンは「１」＋「１」で表すことが可能である。
【０００６】
従来の方法に伴う１つの困難として、最終的な読み出しステップがしばしば異なるタグ同士又は単位同士を識別する必要によって妨害されることである。従って、識別が実施可能となるような改良法を見出すことが望まれている。
【０００７】
本発明の要約
本願発明は、ポリヌクレオチド、好ましくは異なるポリヌクレオチド配列単位であって、それぞれが特有の特性を表しているもので形成されているポリヌクレオチド、を解析する方法を提供する。当該方法は、標的ポリヌクレオチドのコンカテマーを利用するものであり、すなわち、標的ポリヌクレオチドの配列を繰り返し、そして追加のポリヌクレオチドをこの上に形成させ、ハイブリダイズした配列又はハイブリダイズしなかった配列を同定することができるように、当該追加のポリヌクレオチドがかかる標的の特定の部分でハイブリダイズされ、ハイブリダイゼーション（又は非ハイブリダイゼーション）の程度が標的ポリヌクレオチドの単位の同一性及び／又は順序を明らかにする。本発明は、好ましくは、前記コンカテマー上の各標的ポリヌクレオチドの一単位を連続的に同定するものである。このように、同定されるべき単位は、元の標的ポリヌクレオチドが配列決定される場合よりもより分離がなされる。分離が増大すると、最終的な読み出し技術が単位同士を識別することが可能となり、それにより、最終的な配列決定／同定ステップの効率が向上する。あるいは、当該方法は、標的ポリヌクレオチドが、標的を離して配置する役割を果たす追加の核酸配列によって分離されるように、その結果解析が実施できるように行われる。
【０００８】
本発明の第一の観点によると、異なる核酸配列単位を有する標的ポリヌクレオチドを解析する方法は：
（ｉ）多数の反復標的ポリヌクレオチド配列を有するコンカテマーである第一ポリヌクレオチドを形成させ；
（ｉｉ）第一ポリヌクレオチドの一部を第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズさせ、ハイブリダイズした部分、又はハイブリダイズしなかった部分が、標的上の少なくともある配列単位に対応するようにし、そして当該標的上の配列単位を決定すること、
を含んで成る。
【０００９】
本発明の第二の観点において、前記コンカテマーは、予め定めた順序で規定の第一核酸配列単位及び第二核酸配列単位を有している第二のポリヌクレオチド上に直接形成される。第二のポリヌクレオチドは、標的上の特異的な配列単位とハイブリダイズするよう設計される。コンカテマーと第二のポリヌクレオチドとの特異的な相互作用は、配列単位の同一性を解明するために照合することができるハイブリダイズ部分が存在するように生じる。
【００１０】
本発明の第二の観点によると、異なる核酸配列単位を有する標的ポリヌクレオチドを、１又は複数の異なる核酸配列単位を分離する核酸配列を有するポリヌクレオチドに変換するための方法は：
（ｉ）予め定めた順序で規定の第一配列単位及び第二配列単位を有する第二ポリヌクレオチドを形成すること；
（ｉｉ）当該第二ポリヌクレオチド上に、一連の標的ポリヌクレオチドで構成されている第一ポリヌクレオチドを形成すること、ここで、第一配列単位と第二配列単位の順序が、第一ポリヌクレオチドと第二ポリヌクレオチドとの特異的な相互作用を可能にし、その結果、第一核酸上の異なる核酸配列単位が、相互作用の程度によって他の異なる単位から区別することができる；及び、任意に
（ｉｉｉ）かかる相互作用に基づいて異なる配列単位の配列及び／又は順序を決定し、それにより標的ポリヌクレオチド上の１又は複数の配列単位を決定すること、
を含んで成る。
【００１１】
本発明の第三の観点によると、二本鎖ポリヌクレオチドの形成のための方法は：
（ｉ）第一ポリヌクレオチドを形成すること；
（ｉｉ）第一ポリヌクレオチドと結合したプライマー分子に由来する、ローリングサークル増幅反応であって、第一ポリヌクレオチドの反復単位と相補的な配列を有する環状ポリヌクレオチド分子を利用する増幅反応、を実施すること、
を含んで成る。
【００１２】
本発明の説明
用語「ポリヌクレオチド」は当業界で周知であり、一連の連結した核酸分子、例えばＤＮＡ又はＲＮＡを指すために使用される。核酸の模倣物、例えばＰＮＡ、ＬＮＡ（ロックされた核酸）及び２’−Ｏ−メス(meth)ＲＮＡも本発明の範囲内である。
【００１３】
本明細書での塩基Ａ、Ｔ（Ｕ）、Ｇ及びＣについての言及は、ヌクレオチド塩基であるアデニン、チミン（ウラシル）、グアニン及びシトシンに関するものであり、これは当業界で理解されているとおりのものである。ウラシルは、ポリヌクレオチドがＲＮＡである場合にチミンと置き換わり、または、ｄＵＴＰを用いてＤＮＡ内に取り込まれることもあるが、これも当業界で理解されているとおりのものである。
【００１４】
用語「第一ヌクレオチド」は、本明細書では、コンカテマー化した標的ポリヌクレオチドを指すために使用され、すなわち、第一ポリヌクレオチドは、反復標的ポリヌクレオチド配列を含んで成る。当該標的ポリヌクレオチドは連続して連結されていてもよく、あるいは、当該標的ポリヌクレオチドを分離する追加の核酸配列が存在していてもよい。
【００１５】
用語「第二ポリヌクレオチド」は、第一ポリヌクレオチドの領域とハイブリダイズすることが意図されるポリヌクレオチドを指すために本明細書では使用される。当該第二ポリヌクレオチドは、これとハイブリダイズする第一ポリヌクレオチドのそれらの領域の照合を防ぐ働きをするためにマスキングポリヌクレオチドとも称されることがある。ハイブリダイズしていない第一ポリヌクレオチドの領域は、「マスキングされていない」と言われる。
【００１６】
本発明の方法は、異なる核酸配列単位を有する標的ポリヌクレオチドをポリヌクレオチドに変換するために使用され、ここで、当該異なる標的核酸配列単位は、標的のものよりもより隔てられた間隔で照合することができる。これは前記単位を分離して最終的な読み出しステップがより正確で且つより識別されるように実施されることを可能にするという利点を有する。本発明は、選択した単位に対してのその後の照合を実施可能にする標的ポリヌクレオチドのコンカテマーの形成に依拠する。照合された単位は標的ポリヌクレオチドの異なる単位の代表である。
【００１７】
コンカテマーが形成されると、標的ポリヌクレオチドの異なる単位は種々の方法で照合され、１又は複数の当該単位の同定が明らかにされ、あるいは標的上に存在する特定の配列の存在が同定される。
【００１８】
コンカテマーを照合する好ましい方法は、コンカテマーを、規定の配列の１又は複数の第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズして、当該第二ポリヌクレオチドがコンカテマーの部分をマスキングし、同時に、アンマスキング部分（配列単位）を、照合、例えば当該部分に特異的な標識ポリヌクレオチドを用いた照合について利用可能にしたままにさせることである。標識ポリヌクレオチドの同定は、配列単位の同定を明らかにする。コンカテマーの標的ポリヌクレオチドのそれぞれの上にある異なる配列単位は、このように同定することができる。
【００１９】
本発明の方法は、規定の核酸配列「単位」を含んで成る標的ポリヌクレオチドの使用に依拠しており、ここで、各単位は先の分子について固有の特徴を表している。例えば、各単位は、配列が未知である元のポリヌクレオチド分子上にある特定の塩基を表していることがある。各単位は、好ましくは２又はそれ以上のヌクレオチド塩基、好ましくは２〜５０塩基、より好ましくは５〜２０塩基、最も好ましくは５〜１０塩基、例えば６塩基含んで成る。好ましくは、各単位内に少なくとも２つの異なる塩基が含まれている。当該単位の設計は、「読み出し」ステップの間に異なる単位を識別することが可能となるように行われ、例えば、検出可能に標識されたヌクレオチドを重合反応内、又は相補的なオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションに取り込むことを伴う。ある分子が標的ポリヌクレオチドへと変換される方法は当業界で周知であり、例えば、ＷＯ−Ａ−００／３９３３３及びＷＯ−Ａ−０４／０９４６６４に記載されている。これらの内容はそれぞれ引用することで本明細書に取り入れられる。しかしながら、単位は、必要に応じて一塩基であってもよい。
【００２０】
好ましい態様において、標的ポリヌクレオチドは、一連の異なる単位を含んで成り、これらの組み合わせが配列又は他の情報を賦与する。例えば、２単位は、二進法として使用されることがあり、一方の単位は「０」を表し、そして他方は「１」を表す。異なる単位の組み合わせは、配列決定される元のポリヌクレオチド上の塩基を表すことがある。これはＷＯ０−Ａ−０４／０９４６６４において開示されている。
【００２１】
従って、コンカテマーは核酸配列の反復単位を含んで成る。
【００２２】
標的ポリヌクレオチドは、各「単位」の一部が研究中の元の分子の特性を表すように設計されることがあるが、その各単位はまた、配列が既知の核酸配列を含んで成る。この既知の配列は、解析前に、標的の少なくとも一部の配列が知られているため、各単位ごとに異なることもできる。これにより、第二ポリヌクレオチドを標的とのハイブリダイゼーションのために設計できることとなる。このことは、図４と５により詳細に示されており、ここでは、標的上に各単位の位置につき２つの考えられる単位配列が存在している。各単位は、２つのヌクレオチドの配列によって、「０」又は「１」を表すことがある。しかしながら、残りの８つのヌクレオチドは、各位置につき「０」又は「１」について同じであるが、次の単位の位置とは異なる。このように、最終的な照合は、特異的な単位とのハイブリダイゼーションが、特定の位置にある単位をハイブリダイズしていないまま実施できるように設計することができ、それにより、ハイブリダイズされなかった単位の照合が可能のとなる。１つの態様において、コンカテマーの各標的ポリヌクレオチド上の異なる単位一を照合することが意図されており、それにより、当該単位の更なる分離が可能になり、そして最終的な読み出しステップが配列単位間を識別する能力が向上する。
【００２３】
あるいは、標的配列が知られていない場合、この標的ポリヌクレオチドは、コンカテマー化の前に既知の配列とライゲーションされることがあり、その結果、コンカテマーは標的配列と既知の配列の両方を含んで成り、ハイブリダイゼーションは、コンカテマーと第二ポリヌクレオチドとの間で生じうる。この態様において、既知の配列は第二ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションが起きるような十分な長さのものであるべきである。例えば、既知の配列は、１００超のヌクレオチド、好ましくは５００超のヌクレオチドであるべきである。これにより、ハイブリダイズした配列とハイブリダイズしていない（標的）配列との分離がもたらされ、これはその後照合することができる。
【００２４】
本発明の方法を実施するのに必要な条件、例えば温度、ｐＨ、緩衝液の組成などは、当業者にとって自明であろう。
【００２５】
本発明の方法は、３つの必須のステップをたどる：
ｉ．標的ポリヌクレオチドのコンカテマー化；
ｉｉ．コンカテマーと規定の既知の配列を有する追加（第二）のポリヌクレオチドとのハイブリダイズ；
ｉｉｉ．ハイブリダイズされるコンカテマー、好ましくはハイブリダイズされていないコンカテマー上の単位の同定
【００２６】
コンカテマーは、任意の適当な方法で形成されうる。好ましい態様において、標的ポリヌクレオチドは環化され、そしてポリメラーゼ反応が実施されてコンカテマーが形成される。
【００２７】
環化
標的は、任意な常用の方法で環化されうる。１つの態様において、一本鎖標的は第二ポリヌクレオチドの３’末端とハイブリダイズされる。標的分子の５’及び３’末端の両方が第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズし、そして一緒にライゲーションされて一本鎖の環を形成する。サークルライゲーションの効率は相補性の増大とともに遥かに良くなり、そして少なくとも６個の相補的なヌクレオチド、好ましくは少なくとも９個の相補的なヌクレオチドを第二ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションに使用するのが好ましい。リガーゼは、任意の利用可能なリガーゼでありうるが、好ましくはＴ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｅ．コリ(E. coli)ＤＮＡリガーゼ又はＴａｑ  ＤＮＡリガーゼである。
【００２８】
別の方法において、サポートオリゴヌクレオチドを使用して標的とハイブリダイズし、そして第二ポリヌクレオチドにライゲーションすることができる。この一態様において、ハイブリダイズは、第二ポリヌクレオチドの３’末端と相補的なオーバーハングと部分的に二本鎖の分子を形成する。かかるサポートオリゴヌクレオチドは、続いて、３’末端で第二ポリヌクレオチドとライゲーションすることができる。標的の５’末端は第二ポリヌクレオチドとも相補的であり、そのため、当該標的は第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズして当該標的の２つの末端をリガーゼの位置に連れて行き、当該標的の２つの末端を結びつけることで、環が形成する。サポートオリゴヌクレオチドは、コンカテマー化の準備として、第二ポリヌクレオチドの位置にたった今環化した標的を保持するのを助ける働きをする。
【００２９】
別の態様において、サポートオリゴヌクレオチドはスプリントオリゴヌクレオチドとして使用される。スプリントオリゴヌクレオチドは、標的の３’及び５’領域と相補的であり、これらの２つの末端を接近させ、リガーゼ反応を起こさせる。たった今環化した標的とスプリントオリゴとのハイブリッドは、続いて、第二ポリヌクレオチドと接触させられ、そして、標的は、スプリントオリゴヌクレオチドを第二ポリヌクレオチドに接近させるように設計された方法で、第二ポリヌクレオチドの末端でハイブリダイズする。続いて、スプリントオリゴと第二ポリヌクレオチドとのライゲーションが続いて起こることができ、これは、環状の標的が次のラウンドの増幅前にハイブリダイズすることができる十分な数の塩基を提供することで、その後のポリメラーゼ増幅を補助する。
【００３０】
サポートオリゴヌクレオチドは、標的とのハイブリダイゼーション及び環化を補助するのに十分なサイズのものであろう。
【００３１】
第三の別の方法において、スプリントオリゴが使用される。当該スプリントオリゴは、標的の３’及び５’末端と相補的な短い一本鎖の分子である。従って、スプリントオリゴは、リパーゼの位置に標的末端を運び、２つの末端を連結させて環を形成させる。当該スプリントは、続いて、エキゾヌクレアーゼ、例えばエキソヌクレアーゼＩ及びエキソヌクレアーゼＩＩＩを用いてスプリントオリゴを消化することで除去されうる。
【００３２】
コンカテマー化
標的ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ反応を用いてコンカテマー化することができる。１つの態様において、環化した標的ポリヌクレオチドは、ポリメラーゼ反応の鋳型として働く。当該鋳型は環状分子である場合、使用する技術はローリングサークル増幅（ＲＣＡ）として一般的に知られているものである。Richardson et al., Genetic engineering, 25, 51-63において概説されているように、この方法の複数の改良版が存在している。直鎖ＲＣＡは、１つのプライマーを利用して、各鋳型から１つのコンカテマーを生成させる。指数関数的ＲＣＡは、２つのプライマーを利用し、ここで、一方は増幅される標的と相補的であり、他方は第一プライマーによって生成される産物と相補的である。従って、第二プライマーは多数のコンカテマー化したコピーの合成を１つの標的ポリヌクレオチドから開始する。マルチプライ−プライムド（multiply−primed）ＲＣＡは一組のランダムヘキサマーをプライマーとして利用する。これらのプライマーは、多数のコンカテマー化したコピーの合成を１つの標的ポリヌクレオチドから開始する。第二の非特異的なプライミングイベントは、その後、最初のＲＣＡ段階の置換された生成物の鎖上で生じることができる。ポリメラーゼ活性は、第二ポリヌクレオチドの３’末端で開始することができる。複数のポリメラーゼを使用することができ、例えば、セクエナーゼ(sequenase)、Ｂｓｔ  ＤＮＡポリメラーゼ（大フラグメント）、クレノー  エキソＤＮＡポリメラーゼであり、これらは全て３７℃で作用し、そしてコンカテマーを作るのに必要である、重要な鎖を置換する能力を示すものである。また、熱安定性ベントエキソ(Vent exo-)ＤＮＡポリメラーゼを使用することもできる。しかしながら、文献において環状鋳型に対して作用するのが最も効率的であることが示された酵素はｐｈｉ２９ポリメラーゼであり、そしてこれが好ましい。
【００３３】
あるいは、コンカテマー化は、標的分子の多数のコピーをライゲーションして１つの連続の一本鎖分子を形成させることで行われる。この方法では、環化した標的ポリヌクレオチドは不要である。
【００３４】
介在している核酸配列はまた、図６に示すように存在していることもある。これは、当該介在核酸配列が既知の配列のものであることがあり、これが第二ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションを補助するため、しばしば望ましい。
【００３５】
マスク（第二）ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション
第二ポリヌクレオチドに対するハイブリダイゼーションは、コンカテマーが生成され、又は一本鎖のブロッキング分子が使用されることがあり、そしてコンカテマー化が実現された後にエキソヌクレアーゼと一緒に除去されうるため、直接実施されうる。従って、第二ポリヌクレオチドは、コンカテマーの形成の間存在しうる。これは以下のように説明される。
【００３６】
コンカテマーと第二ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーションは、ポリメラーゼ反応がコンカテマー上で進行するのとともに起こりうる。この態様において、環状の標的は、上述のとおり第二ポリヌクレオチドと結合（ライゲーション）されることがあり、その結果、ポリメラーゼ生成物は、第二ポリヌクレオチドの近傍に形成されてハイブリダイゼーションを補助する。
【００３７】
別の態様において、ハイブリダイゼーションは、相補的な分子を用いて第二ポリヌクレオチドを「ブロッキング」することで、コンカテマー化反応から分離することもできる。当該ブロッキング分子は、別の反応で合成してコンカテマー化反応の前に第二ポリヌクレオチドとアニーリングすることもできる。あるいは、当該ブロッキング分子は、短いプライマーを用いることにより、第二ポリヌクレオチド上で直接ポリメラーゼによって合成することができる。コンカテマー化反応後、ブロッキング分子はエキソヌクレアーゼを用いて除去することができ、そして第二ポリヌクレオチドは続いてコンカテマー化した標的分子及びそのポリマー化した生成物とのハイブリダイゼーションに利用可能となる。
【００３８】
第二ポリヌクレオチドは、コンカテマーに対し少なくとも部分的な相補性を有する。このことは、標的上の配列単位の部分配列の知識により、又は相補配列を形成済みのコンカテマーに組み込むことにより達成される。この目的は、照合可能なハイブリダイズされていない部分が存在するように、標的を第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズすることである。あるいは、当該方法は、ハイブリダイズした部分を解析することで実施されうる。例えば、当該方法は、完全なハイブリダイゼーションが第二ポリヌクレオチドの選択領域で起こる場合に制限酵素の基質部位が形成されて、この二本鎖を制限酵素で処理できるように設計されうる。任意の開裂産物をモニタリングすることで、相補配列が標的上に存在していたかが明らかになり、それによって元の分子の特徴も明らかと成る。このことを図１０〜１３に示す。
【００３９】
好ましくは、第二ポリヌクレオチドは、第一配列単位と第二配列単位とを既定の順序で含んで成ると言える。この目的は、第一配列単位と第二配列単位を使用して第一ポリヌクレオチド上の配列をマスキングして、第一ポリヌクレオチドの選択的照合が生じるようにすることである。１つの態様において、第二ポリヌクレオチドは、第一ポリヌクレオチド上の選択単位をマスキングし、それにより第一ポリヌクレオチド上の単位を分離して、照合をより簡単に生じさせるために使用される。第一ポリヌクレオチドの「マスキングされていない」単位は、元の標的ポリヌクレオチド上の単位の順序を表す順序であってもよく、又はこれを使用して標的ポリヌクレオチド上の特定の配列を表す単位の新しい順序を作り出してもよい。例えば、図２を参照すると、第一ポリヌクレオチドと第二ポリヌクレオチドとの相互作用は、第一ポリヌクレオチドと第二ポリヌクレオチド上の完全に相補的な配列間で生じた制限酵素部位を明らかにするために実施されている。ハイブリダイゼーションは非相補的部分間（太字の配列を参照のこと）で生じているが、これは、制限酵素消化を生じさせない。
【００４０】
完全なハイブリダイゼーションが生じると、制限酵素基質が開裂されうる。１又は複数のミスマッチが生じると、開裂は生じない。制限酵素によっては、１又は２つのミスマッチが存在している場合にも基質を開裂することができる。これらの酵素が標的ポリヌクレオチドを特徴付けるために使用されるものである場合、第二ポリヌクレオチドは２又はそれ以上のミスマッチが存在するように設計される。
【００４１】
あるいは、図３に示すとおり、第一ポリヌクレオチドと第二ポリヌクレオチドとの間の相互作用は、ハイブリダイゼーションしていない単位をもたらし、これはその後のオリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションによって照合することができない。これは下文で更に詳細に説明する。
【００４２】
複数の第二ポリヌクレオチドをアドレッサブルアレイで使用することもでき、ここでは、コンカテマーは、ハイブリダイゼーションイベントの同定を可能にするその後の照合部位と一緒に複数の第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズされる。このことは図７に示してあり、下文で更に詳細に説明される。
【００４３】
標的ポリヌクレオチドの解析
上文で説明したように、標的ポリヌクレオチドは、特定の特徴（例えば元の分子の配列情報）を表す核酸配列「単位」を含んで成る。本発明の方法を使用することで、当該単位が同定され、それにより元の分子の特徴が決定される。コンカテマーは、解析が１つの標的ポリヌクレオチドに対して実施された場合に達成可能であるものよりも間隔が隔てられた単位を同定するために使用される。このことを達成するために、コンカテマー上の標的ポリヌクレオチドの各コピー上の単位を「選択的に」マスキングするのが好ましい。ここで、マスキングされていない単位は照合され、そして同定されている。
【００４４】
マスキングは、第一ポリヌクレオチド上の各標的ポリヌクレオチド（アドレス）の多くをマスキングし（これらとハイブリダイズし）、そして各アドレスには１つの具体的なビット位置をマスキングさせない第二ポリヌクレオチドの使用によって達成される。アドレス１はビット位置１などをマスキングしない。各ビット位置の内容を解明するための手順は、ビットとパドロックプローブとを、例えばシグナル部分を有するパドロックプローブとをライゲーションさせ、ポリメラーゼフィルイン反応を検出可能な標識ヌクレオチドで実施することで行ってもよい。ビット位置全てが適切に標識されている場合、読み出しステップは、各ビットを特徴付けるために実施することができる。この手順は以下更に詳細に説明する。
【００４５】
ステップ１
この例において、標的ポリヌクレオチドは、解析されべき天然の（元の）ＤＮＡ配列をコードしている、少なくとも４０「ビット」の核酸配列を含んで成る。各ビット位置は、２つの値：０又は１のいずれかを持つことができる。各位置について考えられる２つのビットは、少なくとも１０ｂｐ長であり、ここで、２つの塩基は独特のものである。これらの２つの塩基は、ビットコード配列のどこにでも配置することができ、そしてビットの値を決定することができる。残りの塩基（少なくとも８個）は、各位置の２つのビット値について同一であるのが好ましいが、図４で説明するように各ビット位置で異なる。
【００４６】
マスク分子（第二ポリヌクレオチド）は、少なくとも４０コピーの標的ポリヌクレオチド又は相補配列を含む一本鎖分子である。各標的ポリヌクレオチドはビット値配列に関して異なるため、マスク（第二ポリヌクレオチド）は０又は１のビット配列を含まないが、「ユニバーサルビット」は図４に示されているように値をコードするビットと１塩基対異なっている。
【００４７】
標的ポリヌクレオチドがコンカテマー化された後、ポリメラーゼ反応が実施される。
【００４８】
ステップ２
マスクとコンカテマーとの間で生じたハイブリッドは、ビット配列毎に１つのミスマッチを有する二本鎖ＤＮＡから成る。しかしながら、マスクの設計に起因して、標的ポリヌクレオチドのコピー１におけるビット位置１はハイブリダイズしないが、当該ビット配列をむき出しにしておく。更に、標的ポリヌクレオチドコピーのビット位置２もハイブリダイズしないが、位置２のビット配列をむき出しにしておく。この機構を使用することで、図８に示すように元の標的ポリヌクレオチドの全てのビット配列が明らかにされる。また、明らかにされたビット値は、ある標的ポリヌクレオチド長さによって物理的に分離され、シグナル鎖を少なくとも４０倍に拡大する。第二ポリヌクレオチドは、照合されるべきビット（単位）位置でのハイブリダイゼーションが起こらないように設計されることがある。そのため。例えば、標的１のビット位置１では、第二ポリヌクレオチド上の配列は、相補的な領域を全く持っていないことがある。同様に、標的２のビット位置２では、相補鎖が存在しないことがある。このことは、照合されるべきビット位置を分離するのに役立つ。
【００４９】
ステップ３
生じたハイブリッドの照合は、任意な常用の読み出し技術を用いて実施することができる。１つの態様において、パドロック技術を使用するのが好ましい(Nilsson et al., Science, 1994; 265(5181 ):2085-8及びBaner et al., Curr.Opin. Biotechnol., 2001 ; 12(1):11-15)。パドロックプローブは、適切なポリヌクレオチド配列の存在下でのＤＮＡライゲーションによって環化し始めるオリゴヌクレオチドである。この反応は、オリゴヌクレオチドの２つの末端が標的上の隣接オリゴヌクレオチドとハイブリダイズしてライゲーションを生じさせることを必要とする。従って、これは非常に特異的である。各ビットの値が２つの隣接塩基対によってコードされているので、これらの２つの塩基対を利用して、図９に示すようなマスキングされていないビットに対するパドロックプローブの配列特異的なライゲーションを実施することができる。ビット位置１が値１をコードしている場合、１特異的プローブのみがその２つの末端塩基とハイブリダイズすることでき、そしてライゲーション反応に利用可能である。０特異的プローブが１ビットとハイブリダイズする場合、パドロックプローブはライゲーション反応に利用可能ではなく、その結果、洗い流されることがある。全てのビット位置がその相当のパドロックプローブと連結している場合、生じた分子は、標準的な画像収集システムによって読み取ることができる。但し、０特異的パドロックプローブと１特異的パドロックプローブは、０又は１特異的フルオロフォアで標識される。
【００５０】
一旦変換方法が実施されると、「読み出しステップ」が実施され、中にコードされている配列情報が得られる。
【００５１】
読み出しステップは、任意の適当な技術を用いて実施することができ、これは、例えばＷＯ−Ａ−００／３９３３３及びＷＯ−Ａ−０４／０９４６６３に記載されている。
【００５２】
検出可能に標識された短いオリゴヌクレオチドを使用して、変換したポリヌクレオチド（第一又は第二ポリヌクレオチド）上の単位とハイブリダイズし、そして任意のハイブリダイゼーションイベントを検出する読み出しストラテジーが存在している。この短いオリゴヌクレオチドは、変換されたポリヌクレオチドの特定の単位と相補的な配列を有する。これを図７（ａ）に示す。
【００５３】
実施例
「ロールバック」原理を実証するために、１１４塩元の一本鎖分子を第二ポリヌクレオチド基質として使用し、そして３８ｂｐの環状標的分子を使用した。基質分子は、ビオチンを用いて、１μＭのストレプトアビジンをコーティングした常磁性ビーズ上に固定し、第二ポリヌクレオチドを「係留（アンカー）」した。
【００５４】
標的分子は第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズされ、そしてｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼが添加される。当該ポリメラーゼは、鋳型として前記標的を用いて伸長反応を実施する。伸長された鎖は、第二ポリヌクレオチドと相補的であり、そして、ロールバック理論に従い、第二ポリヌクレオチドとハイブリダイズして１１４ｂｐの二本鎖分子を形成する。標的の配列によっては、二本鎖分子はある制限エンドヌクレアーゼについての認識部位を含む（図１０、１１及び１２）。
【００５５】
図１０に示すとおり、単位配列０１００を有する標的は、第二の標的ポリヌクレオチドの第二のビット位置においてＢａｍＨ１についての認識部位を作り出す。コピー１及び３におけるこの第二のビット位置は、当該認識部位における２つの単一の塩基対のミスマッチハイブリダイゼーションによって不活性化される。但し、ロールバックが実際に生じている場合、ＢａｍＨ１による消化は６４ｂｐの分子を生成させ、これはゲル上で可視化することができる。
【００５６】
図１１に示すとおり、単位配列００１０を有する標的は、第三の標的コピーにおける第三のビット位置におけるＨｉｎｄＩＩＩについての認識部位を作り出す。コピー１及び２における第三のビット位置は、当該認識部位において、単一の塩基対のミスマッチによって不活性化される。但し、ロールバックが実際に生じていると、ＨｉｎｄＩＩＩによる消化は９６ｂｐの分子を生成させ、これはゲル上で視覚化されうる。
【００５７】
図１２に示す通り、単位配列０１１０を有する標的は、ＢａｍＨ１及びＨｉｎｄＩＩＩの両方についての認識部位を、第二の標的コピーにおける第二の位置及び第三の標的における第三の位置において、それぞれ作り出す。コンカテマーにおけるその他の潜在的な制限部位は、標的０１００及び００１０について記載のように不活性化される。
【００５８】
結果
標的０１００は、全ての実験において、６０ｂｐマーカー周辺のバンドがゲル上で見える（図１３のレーン３を参照のこと）。
【００５９】
標的００１０の場合、全ての実験において、ＨｉｎｄＩＩＩで消化した場合、１００ｂｐマーカー周辺のバンドがゲル上で見える。しかしながら、予想される９６ｂｐのバンドに加え、他のバンドも５０と４０ｂｐ周辺に出現している（図１３のレーン４を参照のこと）。これらの結果は、ＨｉｎｄＩＩＩ消化が１つの塩基対のミスマッチによって完全に阻害されることを示唆している。部分的な消化が第二の標的コピーにおいて生じる場合、予想される分子は９６、５４及び３８であろう。第一の標的コピーの消化は３８と１６塩基対の２つのバンドを生じさせるはずである。ゲル上にあるこれらのバンドは、制限部位が前記分子の末端に近すぎて検出可能な程度にまで開裂することができないであろうという事実は、我々には分からない。しかしながら、５４と３８塩基対のバンドの検出が見られるという事実は、二本鎖ＤＮＡがロールバックプロセスの間に形成しているということを示唆している。
【００６０】
標的０１１０の場合、全ての実験において、標的０１００及び００１０についてそれぞれ見られるように、ＢａｍＨ１ｗＨｉｎｄＩＩＩで切断した場合、同じ制限パターンが見られる（図１３のレーン５及び６を参照のこと）。
【００６１】
本明細書で引用する全ての刊行物の内容が引用によって本明細書に組み入れられる。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１（ａ）は、「０」又は「１」といういずれかの特性を表すための異なる核酸配列であって、当該配列とハイブリダイズするか、又はしない第二ポリヌクレオチド上の配列についての使用を説明する。図１（ｂ）は、ロールバックＰＣＴの図解である。
【図２】図２は、標的ポリヌクレオチドのマスキング又はアンマスキングを説明する。
【図３】図３は、「マスキングされていない」核酸配列の照合におけるパドロックプローブの使用を説明する。
【図４】図４は、標的ポリヌクレオチドと第二ポリヌクレオチドのデザインを説明する。
【図５】図５は、規定した核酸配列単位を有する標的ポリヌクレオチドの形成を図解する。
【図６】図６は、標的と追加の介在核酸配列とのコンカテマー化を図解する。
【図７】図７（ａ）は、標的ポリヌクレオチドを捕捉して特徴付けるために使用される第二ポリヌクレオチドのアレイの使用を図解する。図７（ｂ）は、標的ポリヌクレオチドを照合するためのパドロックプローブの使用を図解する。
【図８】図８は、コンカテマー化したポリヌクレオチドと第二ポリヌクレオチドとのハイブリダイゼーション及びミスマッチの（マスキングされていない）配列を図解する。
【図９】図９は、コンカテマー化した標的ポリヌクレオチドのマスキングされていない領域とハイブリダイズするためのパドロックプローブの使用を図解する。
【図１０】図１０は標的ポリヌクレオチドを照合するための制限酵素基質配列の使用を図解する。
【図１１】図１１は標的ポリヌクレオチドを照合するための制限酵素基質配列の使用を図解する。
【図１２】図１２は標的ポリヌクレオチドを照合するための制限酵素基質配列の使用を図解する。
【図１３】図１３は図１０〜１２に示したハイブリッドの制限酵素消化産物を示す電気泳動ゲルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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