(57)【要約】本発明は、新規ハロヒドリンデハロゲナーゼ（ＨＨＤＨ）ポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。これらのポリペプチドは、４−置換−３−酪酸誘導体および近接シアノ，ヒドロキシル置換カルボン酸エステルの製造において有用である。本発明はさらに、関連するベクター、宿主細胞および方法を提供する。特定の適用において、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、エチル（Ｓ）４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（「ＥＣＨＢ」）をエチル（Ｒ）４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート（「ＨＮ」）へと変換することを触媒する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号７５０および配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列と少なくとも８６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２００および配列番号１９７８からなる群から選択される参照配列と少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２４９６の参照配列と少なくとも９４％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０、配列番号４７６、配列番号２８４６、配列番号２１３０、配列番号１９２６、配列番号２３４８、配列番号１９８４、および配列番号２４４６からなる群から選択される参照配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号１１６、配列番号４４８、配列番号２８３４、配列番号１８２０、配列番号２０４０、および配列番号２８３８からなる群から選択される参照配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｆ）
【化１４２−１】
2008537477.tif 000080
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｇ）
【化１４２−２】
2008537477.tif 000081
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
（ｈ）
【化１４３】
2008537477.tif 000082
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
からなる群から選択される単離または組換えＨＨＤＨポリペプチド。
【請求項２】
前記ポリペプチドが、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、前記ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、２７位のＡ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、前記ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、５位のＶ、４５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、９３位のＴ、１０３位のＴ、１１７位のＴ、１１８位のＳ、１２１位のＩまたはＬまたはＹ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、前記ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが７９位のＤ、１７５位のＰ、および１８７位のＹからなる群から選択されるアミノ酸残基をさらに含む、請求項２記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、６７位のＮ、７２位のＨ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＡ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２０５位のＹ、および２４６位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、前記ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸残基：６７位のＮ＋７２位のＨ＋１１７位のＴ＋１２１位のＲ＋１３５位のＳ＋１４６位のＡ＋１５４位のＡ＋１７７位のＡ＋１７９位のＤ＋２０１位のＷ＋２０５位のＹ＋２４６位のＶ、を含む、請求項６記載のポリペプチド。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、５４位のＩ、６０位のＶ、９１位のＥ、９３位のＴ、１００位のＭ、１７７位のＧ、１７８位のＭまたはＣ、２３８位のＲ、および２３９位のＦからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、前記ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記ポリペプチドが、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬ、８５位のＡ、９１位のＥ、９３位のＤ、９５位のＱまたはＧ、９６位のＮ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ、１２０位のＮ、１２１位のＥ、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ、１７８位のＶ、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１９４位のＬ、１９８位のＮ、１９９位のＭ、２１５位のＥ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、前記ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記ポリペプチドが、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、前記ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１１】
前記ポリペプチドが、実施例５Ａのアッセイで測定されると、配列番号２のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも２倍大きいＨＨＤＨ活性を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドが、実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも１．５倍大きいＨＨＤＨ活性を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記ポリペプチドが、エチル（Ｒ）４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート（ＨＮ）による阻害に対し耐性を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドが、エチル−４−クロロアセトアセテート（ＥＣＡＡ）に対する阻害に対し耐性を有する、請求項１記載のポリペプチド。
【請求項１５】
（ａ）配列番号２、配列番号２００、配列番号７３０、配列番号７５０、配列番号２０４０、配列番号２１３０、配列番号１９２６、配列番号２３４８、配列番号１９８４、および配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列であって、前記アミノ酸配列が５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有し、アミノ酸残基位置が、前記参照配列との最適アラインメントによって決定される、アミノ酸配列；および
（ｂ）配列番号１、配列番号１９９、配列番号７２９、配列番号７４９、配列番号２０３９、配列番号２１２９、配列番号１９２５、配列番号２３４７、配列番号１９８３、配列番号２８４７およびそれらの相補配列からなる群から選択される参照核酸配列に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列であって、前記コードされるポリペプチドが、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基位置が、前記コードされるポリペプチドの前記アミノ酸配列と、前記参照核酸配列によってコードされる参照アミノ酸配列との最適アラインメントによって決定され、
前記参照アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号２００、配列番号７３０、配列番号７５０、配列番号２０４０、配列番号２１３０、配列番号１９２６、配列番号２３４８、配列番号１９８４、および配列番号２８４７からなる群から選択される、前記アミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する、単離または組換えＨＨＤＨポリペプチド。
【請求項１６】
前記ポリペプチドが、２７位のＡ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドが、５位のＶ、４５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、９３位のＴ、１０３位のＴ、１１７位のＴ、１１８位のＳ、１２１位のＩまたはＬまたはＹ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記ポリペプチドが、７９位のＤ、１７５位のＰ、および１８７位のＹからなる群から選択されるアミノ酸残基をさらに含む、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ポリペプチドが、６７位のＮ、７２位のＨ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＡ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２０５位のＹ、および２４６位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記ポリペプチドが、以下のアミノ酸残基：６７位のＮ＋７２位のＨ＋１１７位のＴ＋１２１位のＲ＋１３５位のＳ＋１４６位のＡ＋１５４位のＡ＋１７７位のＡ＋１７９位のＤ＋２０１位のＷ＋２０５位のＹ＋２４６位のＶ、を含む、請求項１９記載のポリペプチド。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが、５４位のＩ、６０位のＶ、９１位のＥ、９３位のＴ、１００位のＭ、１７７位のＧ、１７８位のＭまたはＣ、２３８位のＲ、および２３９位のＦからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬ、８５位のＡ、９１位のＥ、９３位のＤ、９５位のＱまたはＧ、９６位のＮ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ、１２０位のＮ、１２１位のＥ、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ、１７８位のＶ、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１９４位のＬ、１９８位のＮ、１９９位のＭ、２１５位のＥ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基をさらに含むアミノ酸配列を有する、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基をさらに含むアミノ酸配列を有する、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが、実施例５Ａのアッセイで測定されると、配列番号２のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも２倍大きいＨＨＤＨ活性を有する、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが、実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも１．５倍大きいＨＨＤＨ活性を有する、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項２６】
前記ポリペプチドが、ＨＮによる阻害に対し耐性を有する、請求項１５記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記ＨＨＤＨポリペプチドが、ＥＣＡＡに対する阻害に対し耐性を有する、請求項１５記載のＨＨＤＨポリペプチド。
【請求項２８】
配列番号２と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有する単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドであって、前記ＨＨＤＨポリペプチドが、実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０に相当するＨＨＤＨポリペプチドと比較して少なくとも約１．５倍大きいＨＨＤＨ活性を有する、単離または組換えＨＨＤＨポリペプチド。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する、請求項２８記載のポリペプチド。
【請求項３０】
以下の配列番号：
【化１５１】
2008537477.tif 000083
【化１５２】
2008537477.tif 000084
【化１５３】
2008537477.tif 000085
からなる群から選択される配列中に１〜２０アミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入を有するアミノ酸配列を有する単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドであって、前記コードされるＨＨＤＨポリペプチドが：
（ａ）実施例５Ａのアッセイで測定されると、配列番号２のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも１．４倍大きいか；または
（ｂ）実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも１．５倍大きい
ＨＨＤＨ活性を有する、単離または組換えＨＨＤＨポリペプチド。
【請求項３１】
前記ポリペプチドが、実施例５Ａのアッセイで測定されると、配列番号２のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも２倍大きいＨＨＤＨ活性を有する、請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３２】
前記ポリペプチドが、ＨＮによる阻害に対し耐性を有する、請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３３】
前記ポリペプチドが、ＥＣＡＡに対する阻害に対し耐性を有する、請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３４】
前記ポリペプチドが、実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも１．５倍大きいＨＨＤＨ活性を有する、請求項３０記載のポリペプチド。
【請求項３５】
ＨＨＤＨポリペプチドをコードする単離または組換えポリヌクレオチドであって、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドが、
（ａ）配列番号７５０および配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列と少なくとも８６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号１９７８の参照配列と少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｃ）配列番号２４９６の参照配列と少なくとも９４％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｄ）配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０、配列番号４７６、配列番号２８４６、配列番号２１３０、配列番号１９２６、配列番号２３４８、配列番号１９８４、および配列番号２４４６からなる群から選択される参照配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｅ）配列番号１１６、配列番号４４８、配列番号２８３４、配列番号１８２０、配列番号２０４０、および配列番号２８３８からなる群から選択される参照配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｆ）
【化１５５−１】
2008537477.tif 000086
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；
（ｇ）
【化１５５−２】
2008537477.tif 000087
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；および
（ｈ）
【化１５５−３】
2008537477.tif 000088
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
からなる群から選択される、単離または組換えポリヌクレオチド。
【請求項３６】
前記コードされるポリペプチドが、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される、請求項３５記載のポリヌクレオチド。
【請求項３７】
ＨＨＤＨポリペプチドをコードする単離または組換えポリヌクレオチドであって、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドが、配列番号２、配列番号７３０、配列番号２０４０、配列番号２１３０、配列番号１９２６、配列番号２３４８、および配列番号１９８４からなる群から選択される参照配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有し、前記アミノ酸配列が、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有し、アミノ酸残基位置が、前記参照配列との最適アラインメントによって決定される、単離または組換えポリヌクレオチド。
【請求項３８】
配列番号１、配列番号１９９、配列番号７２９、配列番号７４９、配列番号２０３９、配列番号２１２９、配列番号１９２５、配列番号２３４７、配列番号１９８３、配列番号２８４７およびそれらの相補配列からなる群から選択される参照核酸配列に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする単離または組換えポリヌクレオチドであって、
前記コードされるポリペプチドがＨＨＤＨ活性を有し、
前記コードされるポリペプチドが、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含み、
アミノ酸残基位置が、前記コードされるポリペプチドの前記アミノ酸配列と、前記参照核酸配列によってコードされる参照アミノ酸配列との最適アラインメントによって決定され、
前記参照アミノ酸配列が、配列番号２、配列番号２００、配列番号７３０、配列番号７５０、配列番号２０４０、配列番号２１３０、配列番号１９２６、配列番号２３４８、配列番号１９８４、および配列番号２８４８からなる群から選択される、単離または組換えポリヌクレオチド。
【請求項３９】
ＨＨＤＨポリペプチドをコードする単離または組換えポリヌクレオチドであって、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドが、配列番号２と少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列を有し、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドが、実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０に相当するＨＨＤＨポリペプチドと比較して少なくとも約１．５倍大きいＨＨＤＨ活性を有する、前記単離または組換えポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記コードされたポリペプチドが、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基の位置が、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドと配列番号２との最適アラインメントによって決定される、請求項３９記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
ＨＨＤＨポリペプチドをコードする単離または組換えポリヌクレオチドであって、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：
【化１５８】
2008537477.tif 000089
【化１５９】
2008537477.tif 000090
【化１６０】
2008537477.tif 000091
【化１６１】
2008537477.tif 000092
からなる群から選択される配列中に１〜２０アミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入を有し、前記コードされたポリペプチドが：
（ａ）実施例５Ａのアッセイで測定されると、配列番号２のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも１．４倍大きい活性か；または
（ｂ）実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも１．５倍大きい活性
であるＨＨＤＨ活性を有する、単離または組換えポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項３５記載のポリヌクレオチドに機能可能に連結されているプロモーターを含む核酸構築物。
【請求項４３】
請求項３７記載のポリヌクレオチドに機能可能に連結されているプロモーターを含む核酸構築物。
【請求項４４】
請求項３８記載のポリヌクレオチドに機能可能に連結されているプロモーターを含む核酸構築物。
【請求項４５】
請求項４１記載のポリヌクレオチドに機能可能に連結されているプロモーターを含む核酸構築物。
【請求項４６】
請求項４２記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項４７】
請求項４３記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項４８】
請求項４４記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項４９】
請求項４５記載の核酸構築物を含む宿主細胞。
【請求項５０】
（ａ）  請求項３５記載のＨＨＤＨポリヌクレオチドを用いて形質転換された宿主細胞を、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドの発現に好適な条件下で、培養する工程；および
（ｂ）  培養培地、または前記形質転換され培養された宿主細胞から前記ＨＨＤＨポリペプチドを回収する工程
を含む、ＨＨＤＨポリペプチドの製造方法。
【請求項５１】
（ａ）請求項３５記載のＨＨＤＨポリヌクレオチドを用いて形質転換された宿主細胞を、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する工程；および
（ｂ）培養培地、または前記形質転換され培養された宿主細胞から前記ＨＨＤＨポリペプチドを回収する工程、
を含む、ＨＨＤＨポリペプチドの製造方法。
【請求項５２】
（ａ）請求項３７記載のＨＨＤＨポリヌクレオチドを用いて形質転換された宿主細胞を、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する工程；および
（ｂ）培養培地、または前記形質転換され培養された宿主細胞から前記ＨＨＤＨポリペプチドを回収する工程、
を含む、ＨＨＤＨポリペプチドの製造方法。
【請求項５３】
（ａ）請求項３８記載のＨＨＤＨポリヌクレオチドを用いて形質転換された宿主細胞を、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する工程；および
（ｂ）培養培地、または前記形質転換され培養された宿主細胞から前記ＨＨＤＨポリペプチドを回収する工程、
を含む、ＨＨＤＨポリペプチドの製造方法。
【請求項５４】
（ａ）請求項４１記載のＨＨＤＨポリヌクレオチドを用いて形質転換された宿主細胞を、前記コードされたＨＨＤＨポリペプチドの発現に好適な条件下で培養する工程；および
（ｂ）培養培地、または前記形質転換され培養された宿主細胞から前記ＨＨＤＨポリペプチドを回収する工程、
を含む、ＨＨＤＨポリペプチドの製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国特許出願第１１／０６７，３２３号（２００５年２月２３日出願）の一部継続出願であり、この出願は、米国特許出願第１０／９１７，１７９号（２００４年８月１１日出願、現在係属中）の一部継続出願であり、この出願は、米国特許出願第６０／５４６，０３３号（２００４年２月１８日出願）および米国特許出願第６０／４９４，３８２号（２００３年８月１１日出願）の優先権を主張する。これらの出願の全ては、本明細書中で参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、新規ハロヒドリンデハロゲナーゼポリペプチドおよびそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
ハロヒドリンデハロゲナーゼ（“ＨＨＤＨ”）、ハロヒドリン−水素−ハロゲン化物−リアーゼまたはハロヒドリンエポキシダーゼとも名付けられている［ＥＣ４．５．１］は、１，２−ハロヒドリンおよび相当する１，２−エポキシドの相互変換を触媒する：
【０００４】
【化１】
2008537477.tif 000002
米国特許第４，２８４，７２３号は、酸化プロピレンの生産に関するハロヒドリンエポキシダーゼの使用を記載する。米国特許第５，１６６，０６１号および第５，２１０，０３１号は、１，３−ジクロロプロパノール（ＤＣＰ）およびエピクロロヒドリン（ＥＣＨ）をそれぞれ４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（ＣＨＢＮ）へと変換するための本酵素活性の使用を記載する。アグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）およびコリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）由来のＨＨＤＨ酵素が、広範なハロゲン化基質において特徴付けられている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。
【０００５】
ＨＨＤＨはまた、塩素または臭素以外の求核試薬と共にエポキシドの開環を触媒する。アジド（Ｎ３−）、ニトリル（ＮＯ２−）およびシアン化物（ＣＮ−）がエポキシドの開環において塩素を置き換え得ることが立証されている（非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７参照）：
【０００６】
【化２−１】
2008537477.tif 000003
Ｎａｋａｍｕｒａら（非特許文献５）は、中間体としてエピクロロヒドリン（ＥＣＨ）を介した、ＤＣＰのクロロ−３−ヒドロキシ−ブチロニトリル（ＣＨＢＮ）への直接的変換に関するＨＨＤＨの使用を記述している：
【０００７】
【化２−２】
2008537477.tif 000004
数種のハロヒドリンデハロゲナーゼが特徴づけられている。例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＤｌ由来のＨＨＤＨは２８ｋＤサブユニットのホモテトラマーであり、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｎ−  １０７４は２つのＨＨＤＨ酵素を生産し、その一方は２８ｋＤサブユニット（Ｉａ）からなり、他方は３５および／または３２ｋＤ（Ｉｂ）の関連するサブユニットからなる。いくつかの供給源由来のＨＨＤＨは、サブユニットの解離を導く工程中、酸化条件下で容易に不活性化され、至適ｐＨ８〜９、かつ至適温度５０℃を有する（非特許文献８；非特許文献９）。ＨＨＤＨにより触媒されるエポキシド形成の至適ｐＨは８．０〜９．０であり、至適温度は４５℃〜５５℃であると報告されている（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。逆反応である、塩素による開環に関する至適ｐＨは、２つのＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．Ｎ−  １０７４酵素について報告されており、７．４（Ｉａ）または５（Ｉｂ）である。Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＤｌ  ＨＨＤＨにおける部位特異的突然変異導入研究は、システイン残基の酸化によってこの酵素の４次構造が破壊されるために、酸化的不活性化が起こることを示した（非特許文献８）。
【０００８】
異なる供給源に由来する精製ＨＨＤＨ酵素は１４６Ｕ／ｍｇ（Ｉｂ）〜２．７５Ｕ／ｍｇ（Ｉａ）の範囲のＤＣＰに対する特定の反応性を呈する（非特許文献２；非特許文献３）。Ｉｂ酵素の高い活性は、ＤＣＰからＲ−ＥＣＨを生成するための高いエナンチオ選択性により実現されており、一方、Ｉａ酵素はラセミ体ＥＣＨを生成する。
【０００９】
ＨＨＤＨをコードする遺伝子がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＤｌ（ｈｈｅＣ）、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ（ｈａｌＢ）、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ（ＩａをコードするｈｈｅＡおよびＩｂをコードするｈｈｅＢ）、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．（ｈｈｅＡＡＤ２、およびＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＧＰ１（ｈｈｅＢＧＰ１）において同定されている。全ての酵素は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で機能的に発現されている。
【００１０】
ＨＨＤＨの商業的な応用に関しては、この酵素が高度の量産性を有すること、反応が比較的短時間に完了し、最終産物の濃度が高いこと、高いエナンチオ選択性を有すること、および化学的な副生成物が形成されないことが非常に望ましい。酵素の広い特性を定義するために、プロセスにおけるこれらの特性が通常用いられる：基質に対する低いＫｍ、高いプロセス安定性、高い比活性、化学反応が進行しない条件下で基質および生産物阻害が起きないこと。現在入手可能なＨＨＤＨ酵素は、これらの基準を全て満たすものではない。例えば、ＨＨＤＨによる１，２−エポキシブタンおよびシアニドの３−ヒドロキシバレロニトリルへの変換は最大速度３ｍｍｏｌ／ｈｒで進行するが、この速度はわずか１０分間しか持続しない（非特許文献４）。ＤＣＰおよびＥＣＨの４−クロロ−３−ヒドロキシブチロニトリル（ＣＨＢＮ）への変換もまた、２−３ｍｍｏｌ／ｈｒの速度に限られる（Ｎａｋａｍｕｒａ，米国特許第５，１６６，０６１号および同第５，２１０，０３１号）。ＥＣＨからＣＨＢＮへの変換における深い分析において、ｈｈｅＢにコードされるＨＨＤＨ−Ｉｂ酵素が高い活性を有する一方で、高い生産性は、少なくとも５０倍遅い速度でさらなる変換が生じてからわずか２０分後の間しか維持されず、全体的な変換は６０％を超える程度であることがわかる（非特許文献５）。ＥＣＨを介してＣＨＢＮへと至るＤＣＰの直接的変換は、低下された速度で進行し、６５．３％の収率をもたらす。したがって、文献中に記述するＨＨＤＨは、商業的応用における触媒に関し所望される基準に適合しない。
【００１１】
従って、新規なハロヒドリンデハロゲナーゼが非常に望まれるであろう。
【非特許文献１】Ｖａｎ  Ｈｙｌｃｋａｍａ  Ｖｌｉｅｇら，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（２００１年）１８３：５０５８−５０６６
【非特許文献２】Ｎａｋａｍｕｒａら，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９９４年）６０：１２９７−１３０１
【非特許文献３】Ｎａｇａｓａｗａら，Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９２年）３６：４７８−  ４８２
【非特許文献４】Ｎａｋａｍｕｒａら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．（１９９１年）１８０：１２４−１３０
【非特許文献５】Ｎａｋａｍｕｒａ  ら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ（１９９４年）５０：１１８２１−１１８２６
【非特許文献６】Ｌｕｔｊｅ  Ｓｐｅｌｂｅｒｇら，Ｏｒｇ．Ｌｅｔｔ．（２００１年）３：４１−４３
【非特許文献７】Ｌｕｔｊｅ  Ｓｐｅｌｂｅｒｇら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ａｓｓｙｍ．（２００２年）１３：１０８３
【非特許文献８】Ｔａｎｇ，Ｅｎｚ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．（２００２年）３０：２５１−２５８
【非特許文献９】Ｓｗａｎｓｏｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９９年）１０：３６５−３６９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の概要）
本発明は、複数の態様を有する。一実施形態において、本発明は、配列番号：
【００１３】
【化４】
2008537477.tif 000005
【００１４】
【化５】
2008537477.tif 000006
【００１５】
【化６】
2008537477.tif 000007
【００１６】
【化７−１】
2008537477.tif 000008
からなる群から選択される参照配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドであって、そのアミノ酸配列がさらに５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸を含み、アミノ酸残基位置が、ＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列と参照配列との最適アラインメントによって決定される、前記ポリペプチドを提供する。
【００１７】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、以下の配列番号：
【００１８】
【化７−２】
2008537477.tif 000009
【００１９】
【化８】
2008537477.tif 000010
【００２０】
【化９】
2008537477.tif 000011
【００２１】
【化１０】
2008537477.tif 000012
およびその相補配列からなる群から選択される参照核酸配列に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるものを含み、コードされるポリペプチドが、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、参照核酸配列によってコードされるアミノ酸配列である参照アミノ酸配列との最適アラインメントによって決定される。
【００２２】
さらなる実施形態において、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、Ｉ５Ｖ、Ｔ２７Ａ、Ａ４５Ｖ、Ｅ４６Ｑ、Ｍ５４Ｉ、Ａ６０Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｔ６７Ｎ、Ｑ７２Ｈ、Ｖ７７Ｉ、Ｑ８７Ｓ、Ｋ９１Ｒ、Ａ９３Ｔ、Ｅ９５Ａ、Ｄ９６Ｅ、Ａ１００Ｍ／Ｑ、Ａ１０３Ｔ、Ｓ１１７Ｒ／Ｔ、Ｑ１１８Ｓ、Ｋ１２１Ｒ／Ｉ／Ｌ／Ｙ、Ｐ１３５Ｓ、Ｗ１３９Ｒ＋Ｎ１７６ＥまたはＷ１３９Ｄ＋Ｎ１７６Ｒ、Ｔ１４６Ａ、Ｃ１５３Ｎ、Ｙ１６６Ｈ、Ｙ１７７Ｇ／Ａ、Ｌ１７８Ｍ／Ｃ、Ｈ１７９Ｎ／Ｄ、Ｓ１８０Ｄ／Ｔ、Ｅ１８１Ｋ、Ｄ１８２Ｎ、Ｅ１９０Ｖ、Ｖ１９９Ａ、Ｈ２０１Ｗ／Ｙ、Ｖ２０５Ｙ、Ｖ２３６Ｌ、Ｗ２３８Ｔ／Ｒ、Ｌ２３９Ｆ、Ｉ２４６Ｖ、Ｇ２５１Ｅ／Ａ／Ｓ、およびＭ２５２Ｐからなる群から選択される１またはそれ以上の置換を有する、配列番号２の配列を有する。
【００２３】
特定の実施形態において、本発明はＨＨＤＨ活性を有する単離または組換えポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは以下：（ａ）配列番号７５０および配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列と少なくとも８６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）配列番号２００および配列番号１９７８からなる群から選択される参照配列と少なくとも９３％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）配列番号２４９６の参照配列と少なくとも９４％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｄ）配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０、配列番号４７６、配列番号２８４６、配列番号２１３０、配列番号１９２６、配列番号２３４８、配列番号１９８４、および配列番号２４４６の参照配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｅ）配列番号１１６、配列番号４４８、配列番号２８３４、配列番号１８２０、配列番号２０４０、および配列番号２８３８の参照配列と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｆ）配列番号１１０、配列番号１６２、配列番号２６２、配列番号４２２、配列番号４４０、配列番号５２０、配列番号１２７６、配列番号１７１０、配列番号１８２４、配列番号２５８２、配列番号１８１８、配列番号１１６４、配列番号１２０８、配列番号１７５０、および配列番号２８０８の参照配列と少なくとも９７％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｇ）
【００２４】
【化１１】
2008537477.tif 000013
【００２５】
【化１２−１】
2008537477.tif 000014
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９８％同一であるアミノ酸配列；および（ｈ）
【００２６】
【化１２−２】
2008537477.tif 000015
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００２７】
その他の態様において、本発明は、以下の配列番号：
【００２８】
【化１２−３】
2008537477.tif 000016
【００２９】
【化１３】
2008537477.tif 000017
【００３０】
【化１４】
2008537477.tif 000018
【００３１】
【化１５】
2008537477.tif 000019
の群から選択される配列中に１〜２０アミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入を有するアミノ酸配列を有する単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドに関し、コードされるＨＨＤＨポリペプチドは、野生型ＨＨＤＨ（配列番号２）のＨＨＤＨ活性よりも大きいＨＨＤＨ活性を有する。通常、ＨＨＤＨ活性は、実施例５Ａのアッセイにおいて測定した場合、配列番号２のＨＨＤＨポリペプチドより少なくとも１．４倍大きく；または、実施例５Ｄのアッセイにおいて測定した場合、配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドより少なくとも１．５倍大きい。
【００３２】
さらなる態様において、本発明は、実施例５Ａ中に記述されるアッセイにおいて測定した場合に配列番号２の野生型ＨＨＤＨに比較して改良されたＨＨＤＨ酵素活性を有するＨＨＤＨポリペプチドに関する。
【００３３】
その他の態様において、本発明は、実施例５Ｄ中に記述されるアッセイにおいて測定した場合に配列番号７３０の野生型ＨＨＤＨに比較して改良されたＨＨＤＨ酵素活性を有するＨＨＤＨポリペプチドに関する。
【００３４】
その他の態様において、本発明は、７９位のＤ、１７５位のＰおよび／または１８７位のＹから選択される少なくとも１つ以上の野生型アミノ酸残基と結合した、本明細書中で記述される少なくとも１つの新規な置換の組み合わせを有するＨＨＤＨポリペプチドを提供する。
【００３５】
さらなる態様において、本発明は、本発明のＨＨＤＨポリペプチドをコードする単離または組換えポリヌクレオチド提供する。
【００３６】
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチドに機能可能に連結されているプロモーターを含む核酸構築物、ならびに前記ＨＨＤＨポリペプチドの製造および使用方法に関する。
【００３７】
（コンパクトディスク上で提出された配列リストの参照による組み入れ）
同時に添付して提出された配列リストが、４通のコピーが作製されたコンパクトディスク上で提供され、それぞれにはファイル「０３５３．５１０ＷＯ．ｔｘｔ」（ディスク上のサイズは８，５８５，２１６バイトであり、作成日は２００６年２月１５日である）を含む。コピー１−４は同一物である。コンパクトディスク上の配列リストは、ここにその全体を参照により組み入れるものとする。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
（詳細な説明）
（ＨＨＤＨポリペプチド）
本発明は、ハロヒドリンデハロゲナーゼ（「ＨＨＤＨ」）活性を有する新規ポリペプチド、ならびにそれらをコードするポリヌクレオチドに関する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、例えば、２００３年８月１１日に代理人整理番号０３３９．２１０ＵＳとして出願され、「４−置換−３−ヒドロキシブチレート誘導体の酵素的生産方法（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ−３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」と題する特許出願である米国特許出願第１０／６３９，１５９号、および国際公開第２００４／０１５１３２号中に記載される方法を用いて、４−ハロ−３−ヒドロキシブチレート誘導体を４−置換−３−ヒドロキシブチレート誘導体に変換することを触媒するために好適であり、これらの両者を参照により本明細書中に組み入れるものとする。これらの発明のポリペプチドは、例えば２００４年２月１８日に代理人整理番号０３３９．３１０ＵＳとして出願され、「４−置換−３−ヒドロキシブチレート誘導体および近接シアノ，ヒドロキシ置換カルボン酸エステルの酵素的生産方法（Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ−３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｖｉｃｉｎａｌ  Ｃｙａｎｏ，  Ｈｙｄｒｏｘｙ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｅｓｔｅｒｓ）」と題する特許出願である米国特許出願第１０／７８２，２５８号、および国際公開第２００５／０１８５７９号中に記載される方法を用いて、近接するハロ、ヒドロキシ置換カルボン酸エステルを近接するシアノ、ヒドロキシ置換カルボン酸エステルへと変換することを触媒するためにも好適であり、これらの両者を参照により本明細書中に組み入れるものとする。本発明のポリペプチドは、ハロヒドリンを医薬中間体として有用であるシアノヒドリンに変換するための触媒として特に有用である。特定の適用において、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、エチル（Ｓ）４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（「ＥＣＨＢ」）をエチル（Ｒ）４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート（「ＨＮ」）へと変換することを触媒する。このような変換を示す実施例を以下に提供する。このような用途におけるより詳細な記述は、上述の「４−置換−３−ヒドロキシブチレート誘導体の酵素的生産方法」および「４−置換−３−ヒドロキシブチレート誘導体および近接シアノ，ヒドロキシ置換カルボン酸エステルの酵素的生産方法」と題する特許出願中に提供されている。同上。
【００３９】
本発明は複数の態様を有する。一実施形態において、本発明は配列番号：
【００４０】
【化１７】
2008537477.tif 000020
【００４１】
【化１８】
2008537477.tif 000021
【００４２】
【化１９】
2008537477.tif 000022
【００４３】
【化２０】
2008537477.tif 000023
からなる群から選択される参照配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドであって、そのアミノ酸配列がさらに５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸を含み、アミノ酸残基位置が、ＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列の参照配列との最適アラインメントによって決定される、前記ポリペプチドを提供する。時にはこれらのＨＨＤＨポリペプチドは、参照配列と少なくとも８１％同一、８２％同一、８３％同一、８４％同一、８５％同一、８６％同一、８７％同一、８８％同一、８９％同一、９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００４４】
通常、参照配列は、配列番号２、配列番号２００、配列番号７３０、配列番号７５０、配列番号１９２６、配列番号１９８４、配列番号２０４０、配列番号２１３０、配列番号２３４８および配列番号２８４８からなる群から選択される。
【００４５】
いくつかの実施形態において、上述のＨＨＤＨポリペプチドは、２７位のＡ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列によってコードされる。
【００４６】
特定の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、５位のＶ、４５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、９３位のＴ、１０３位のＴ、１１７位のＴ、１１８位のＳ、１２１位のＩまたはＬまたはＹ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＳ、および２５２位のＰからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列によってコードされる。その他の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、５４位のＩ、６０位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、９３位のＴ、１００位のＭ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＡまたはＧ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２０５位のＹ、２３８位のＲ、２３９位のＦおよび２４６位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、以下の組み合わせのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するものを含む：６７位のＮ＋７２位のＨ＋１１７位のＴ＋１２１位のＲ＋１３５位のＳ＋１４６位のＡ＋１７７位のＡ＋１７９位のＤ＋２０１位のＷ＋２０５位のＹ＋２３８位のＲ＋２３９位のＦ＋２４６位のＶ。その他の実施形態において、ＨＨＤＨポリペプチドは、５４位のＩ、６０位のＶ、９１位のＥ、９３位のＴ、１００位のＭ、１７７位のＧ、１７８位のＭまたはＣ、２３８位のＲ、および２３９位のＦからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。
【００４７】
上述のアミノ酸残基に加えて、段落０２４−０２７中に記載されるＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列はさらに、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、３８位のＱ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ（段落０２４−０２７からのものがＶでない場合）、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５２位のＩ、５４位のＶ（Ｉでない場合）、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７０位のＬ、７２位のＲ（Ｈでない場合）、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＡまたはＹ、８３位のＰ、８４位のＳまたはＬまたはＶ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ（Ｒでない場合）、９３位のＤ（Ｔでない場合）、９５位のＱまたはＧ（Ａでない場合）、９６位のＮ（Ｅでない場合）、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ（ＲまたはＴでない場合）、１２０位のＮ、１２１位のＥ（ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ（ＲまたはＤでない場合）、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ（Ａでない場合）、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７４位のＡ、１７７位のＦ（ＧまたはＡでない場合）、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９５位のＮ、１９８位のＮ、１９９位のＭ（Ａでない場合）、２０３位のＲ、２１５位のＥ、２２２位のＴ、２３６位のＧ（Ｌでない場合）、２３７位のＶ、２３８位のＬ（ＴまたはＲでない場合）、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ（Ｐでない場合）、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基位置が、ＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列と参照配列との最適アラインメントによって決定される。
【００４８】
段落０２４−０２７中に記載されるＨＨＤＨポリペプチドのいくつかはさらに、３７位のＨ、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、７５位のＩ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７４位のＡ、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８１位のＧ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、２２２位のＴ、および２４５位のＶからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。
【００４９】
段落０２４−０２７中に記載されるＨＨＤＨポリペプチドのいくつかはさらに、以下のサブグループのひとつから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含む：（１）２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ（Ｉでない場合）、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ（Ｉでない場合）、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ（Ｈでない場合）、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬ、８５位のＡ、９１位のＥ（Ｒでない場合）、９３位のＤ（Ｔでない場合）、９５位のＱまたはＧ（Ａでない場合）、９６位のＮ（Ｅでない場合）、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ（ＲまたはＴでない場合）、１２０位のＮ、１２１位のＥ（ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ（ＲまたはＤでない場合）、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ（Ａでない場合）、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ（ＧまたはＡでない場合）、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９８位のＮ、１９９位のＭ（Ａでない場合）、２１５位のＥ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ（ＴまたはＲでない場合）、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ（Ｐでない場合）、および２５４位のＶ；または（２）３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴ；または（３）３７位のＨ、７５位のＩ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８１位のＧ、１８６位のＹ、２２２位のＴ、および２４５位のＶ。上記段落中の挿入句（「Ｘでない場合」）は、アミノ酸残基Ｘが、その残基の位置に関して段落０２４−０２７から選択される場合、特定されたアミノ酸残基の位置から特定の残基が除外されるという条件をいう。
【００５０】
一実施形態において、本発明は配列番号：
【００５１】
【化２４】
2008537477.tif 000024
【００５２】
【化２５】
2008537477.tif 000025
【００５３】
【化２６】
2008537477.tif 000026
【００５４】
【化２７】
2008537477.tif 000027
からなる群から選択される参照配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドであって、そのアミノ酸配列が２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、３８位のＱ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５２位のＩ、５４位のＶ、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７０位のＬ、７２位のＲ、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＡまたはＹ、８３位のＰ、８４位のＳまたはＬまたはＶ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ、９３位のＤ、９５位のＱまたはＧ、９６位のＮ、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ、１２０位のＮ、１２１位のＥ、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７４位のＡ、１７７位のＦ、１７８位のＶ、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９５位のＳ、１９８位のＮ、１９９位のＭ、２０３位のＲ、２１５位のＥ、２２２位のＴ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ、および２５４位のＶから選択される１またはそれ以上のアミノ酸を含み、そのアミノ酸残基の位置がＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列の参照配列との最適アラインメントによって決定される、前記ポリペプチドを提供する。時にはこれらのＨＨＤＨポリペプチドは、参照配列と少なくとも８１％同一、８２％同一、８３％同一、８４％同一、８５％同一、８６％同一、８７％同一、８８％同一、８９％同一、９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％または９９％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５５】
通常、参照配列は、配列番号２、配列番号２００、配列番号７３０、配列番号７５０、配列番号１９２６、配列番号１９８４、配列番号２０４０、配列番号２１３０、配列番号２３４８、および配列番号２８４８からなる群から選択される。
【００５６】
通常、段落０３１−０３２中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列は、（１）２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬ、８５位のＡ、９１位のＥ、９３位のＤ、９５位のＱまたはＧ、９６位のＮ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ、１２０位のＮ、１２１位のＥ、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ、１７８位のＶ、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１９４位のＬ、１９８位のＮ、１９９位のＭ、２１５位のＥ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ、および２５４位のＶ；または（２）３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴ；または（３）３７位のＨ、７５位のＩ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７８位のＶ、１８１位のＧ、１８６位のＹ、２２２位のＴ、および２４５位のＶ、から選択される１つのサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。
【００５７】
段落０３１−０３３に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列中、（特定の位置に）２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、または２０以上の上記アミノ酸残基の任意の組み合わせを有し得る。
【００５８】
本明細書中で使用する場合、用語「単離された」とは、それが通常結合している成分（その他のタンパク質、核酸、細胞、合成試薬等）から部分的または完全に分離している核酸、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質、または、その他の成分を意味する。核酸（例えばポリヌクレオチド）またはポリペプチドは、それが合成もしくは操作されているか、または、合成もしくは操作されたタンパク質もしくは核酸から誘導される場合、「組換え体」である。例えば、ベクター、または、任意のその他の異種における位置、例えば、組換え生物のゲノム中に挿入され、天然に見られる場合には、通常隣接しているヌクレオチド配列と結合しないようなポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドである。組換えポリヌクレオチドからｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで発現したタンパク質は、組換えポリペプチドの例である。同様に、天然には現れないポリヌクレオチド配列、例えば、天然の遺伝子の変異体は組換え体である。
【００５９】
本明細書中で使用する場合、用語「ＨＨＤＨ活性」および「ハロヒドリンデハロゲナーゼ活性」は、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（「ＥＣＨＢ」）から、実施例５Ａに記述されるアッセイを用いて検出可能量のエチル（Ｒ）４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート（「ＨＮ」）への変換を触媒する能力を意味するものとして、本明細書中では同義的に使用される。用語「ＨＨＤＨポリペプチド」とは、本明細書中、ＨＨＤＨ活性を有するポリペプチドを意味する。用語「ＨＨＤＨポリヌクレオチド」とは、ＨＨＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを意味する。
【００６０】
用語「パーセント同一性」、「％同一性」、「パーセント同一である」および「％同一である」は、アラインメント中の完全一致の数を計数し、かかる完全一致数を参照配列の長さで割り、緩徐な／正確な対合最適アラインメントを達成するために、以下のデフォルトＣｌｕｓｔａｌＷパラメーター−Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：  １０；Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ：  ０．１０；  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：  Ｇｏｎｎｅｔ  ｓｅｒｉｅｓ；  ＤＮＡ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ：  ＩＵＢ；  Ｔｏｇｇｌｅ  Ｓｌｏｗ／Ｆａｓｔ対合最適アラインメント＝  ＳＬＯＷ  または  ＦＵＬＬ  アラインメントを用いる、ＣｌｕｓｔａｌＷ分析（ｖｅｒｓｉｏｎ  Ｗ  １．８、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫから入手可能）により得られるパーセントアミノ酸配列同一性を意味するものとして、本明細書中では同義的に使用される。
【００６１】
その配列対に関して可能な最高スコアに到達するように、規定されたアミノ酸置換マトリックス（例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２）、ギャップ存在ペナルティーおよびギャップ伸長ペナルティーを用いて相同性スコアに関してアラインメントされている場合、２つの配列は「最適にアラインメントされている」。２つの配列同士の相同性を定量する場合における、アミノ酸置換マトリックスおよびそれらの使用は、当技術分野において周知である。例えば、Ｄａｙｈｏｆｆら（１９７８），“Ａ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ”；“Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，”  Ｖｏｌ．５，Ｓｕｐｐｌ．３（Ｅｄ．Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ），ｐｐ．３４５−３５２，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｒｅｓ．Ｒｏｕｎｄ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；Ｈｅｎｉｋｏｆｆら（１９９２）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９を参照されたい。ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスは、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ  ２．０等の配列アラインメントプロトコールにおける、デフォルトスコア置換マトリックスとして使用される場合が多い。アラインメントされた配列の一つにおける単一のアミノ酸ギャップに対して、ギャップ存在ペナルティーは与えられ、ギャップ伸長ペナルティーは、すでに開いているギャップに挿入されるそれぞれの付加的な空いているアミノ酸位置に対して与えられる。アラインメントは、アラインメントが始まる位置および終わる位置のそれぞれの配列におけるアミノ酸位置、ならびに、場合によっては、最高に可能なスコアを達成するための、一方または両方の配列における一つまたは複数のギャップの挿入により規定される。最適アラインメントおよびスコアリングは手作業で行うこともできるが、コンピューターによって実施されるアラインメントアルゴリズム、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２に記述されているようなｇａｐ付ＢＬＡＳＴ  ２．０およびＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトに一般に公開されているもの等により、この工程は容易になる。マルチアラインメントを含む最適アラインメントは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ら（１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２に記述されるＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ等の容易に入手可能なプログラムを用いて準備することができる。
【００６２】
参照配列と共に最適にアラインメントされたアミノ酸配列に関しては、このアミノ酸残基は、アラインメント中で残基と対合している参照配列中の位置に「対応する」。この「位置」は、Ｎ−末端に対するその位置に基づいて、参照配列中の各アミノ酸を連続的に識別する数により示される。最適アラインメントを決定するときに考慮しなければならない、欠失、挿入、切断、融合等のため、一般的には、試験配列中のアミノ酸残基数は、Ｎ−末端から単純に数をかぞえることにより決定され、必ずしもこれは、参照配列中の対応する位置の数と同じである必要はない。例えば、整列させた試験配列中に欠失がある場合、参照配列中の位置に対応するアミノ酸は、欠失部位に存在しないであろう。整列させた参照配列中に挿入がある場合、その挿入は、参照配列中のいずれのアミノ酸位置にも対応しないであろう。切断または融合の場合、対応する配列中のいずれのアミノ酸にも対応しない参照またはアラインメント配列いずれかにおける一定の幅のアミノ酸が存在し得る。
【００６３】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号：
【００６４】
【化３１】
2008537477.tif 000028
【００６５】
【化３２】
2008537477.tif 000029
【００６６】
【化３３】
2008537477.tif 000030
【００６７】
【化３４】
2008537477.tif 000031
およびその相補配列からなる群から選択される参照核酸配列に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるものを含み、コードされるポリペプチドは、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、参照核酸配列（すなわち、配列番号：
【００６８】
【化３５】
2008537477.tif 000032
【００６９】
【化３６】
2008537477.tif 000033
【００７０】
【化３７】
2008537477.tif 000034
のそれぞれ）によりコードされる参照アミノ酸配列との最適アラインメントにより決定される。
【００７１】
いくつかの実施形態において、上述のＨＨＤＨポリペプチドは、２７位のＡ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列によりコードされる。
【００７２】
ある種の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、５位のＶ、４５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、９３位のＴ、１０３位のＴ、１１７位のＴ、１１８位のＳ、１２１位のＩまたはＬまたはＹ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＳ、および２５２位のＰからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列によりコードされる。別の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、５４位のＩ、６０位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、９３位のＴ、１００位のＭ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＡまたはＧ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２０５位のＹ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、および２４６位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列によりコードされる。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、６７位のＮ、７２位のＨ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＡ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２０５位のＹ、および２４６位のＶからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、以下の組み合わせのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するものを含む：６７位のＮ＋７２位のＨ＋１１７位のＴ＋１２１位のＲ＋１３５位のＳ＋１４６位のＡ＋１５４位のＡ＋１７７位のＡ＋１７９位のＤ＋２０１位のＷ＋２０５位のＹ＋２４６位のＶ。その他の実施形態において、ＨＨＤＨポリペプチドは、５４位のＩ、６０位のＶ、９１位のＥ、９３位のＴ、１００位のＭ、１７７位のＧ、１７８位のＭまたはＣ、２３８位のＲ、および２３９位のＦからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。
【００７３】
上述のアミノ酸残基に加えて、段落０４０−０４２中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、３８位のＱ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ（段落０４０−０４２からのものがＶでない場合）、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５２位のＩ、５４位のＶ（Ｉでない場合）、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７０位のＬ、７２位のＲ（Ｈでない場合）、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＡまたはＹ、８３位のＰ、８４位のＳまたはＬまたはＶ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ（Ｒでない場合）、９３位のＤ（Ｔでない場合）、９５位のＱまたはＧ（Ａでない場合）、９６位のＮ（Ｅでない場合）、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ（ＲまたはＴでない場合）、１２０位のＮ、１２１位のＥ（ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ（ＲまたはＤでない場合）、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ（Ａでない場合）、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７４位のＡ、１７７位のＦ（ＧまたはＡでない場合）、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９５位のＮ、１９８位のＮ、１９９位のＭ（Ａでない場合）、２０３位のＲ、２１５位のＥ、２２２位のＴ、２３６位のＧ（Ｌでない場合）、２３７位のＶ、２３８位のＬ（ＴまたはＲでない場合）、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ（Ｐでない場合）、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基をさらに含み得る。
【００７４】
段落０４０−０４２中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、以下のサブグループから選択される１つから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基をさらに含む：（１）２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ（Ｉでない場合）、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ（Ｉでない場合）、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ（Ｈでない場合）、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬ、８５位のＡ、９１位のＥ（Ｒでない場合）、９３位のＤ（Ｔでない場合）、９５位のＱまたはＧ（Ａでない場合）、９６位のＮ（Ｅでない場合）、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ（ＲまたはＴでない場合）、１２０位のＮ、１２１位のＥ（ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ（ＲまたはＤでない場合）、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ（Ａでない場合）、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ（ＧまたはＡでない場合）、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１９４位のＬ、１９８位のＮ、１９９位のＭ（Ａでない場合）、２１５位のＥ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ（ＴまたはＲでない場合）、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ（Ｐでない場合）、および２５４位のＶ；または（２）３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴ；または（２）３７位のＨ、７５位のＩ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８１位のＧ、１８６位のＹ、２２２位のＴ、および２４５位のＶ。上記段落中の挿入句「Ｘでない場合」とは、特定された残基の位置に関するアミノ酸残基Ｘが段落０４０−０４２から選択される場合に、特定された残基がアミノ酸残基の位置から除外される条件をいう。
【００７５】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、
配列番号：
【００７６】
【化４０】
2008537477.tif 000035
【００７７】
【化４１】
2008537477.tif 000036
【００７８】
【化４２】
2008537477.tif 000037
【００７９】
【化４３】
2008537477.tif 000038
からなる群から選択される参照核酸配列およびその相補的配列に相当する核酸の実質的全長にわたりストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるものを含み、そのコードされるポリペプチドが、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、３８位のＱ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５２位のＩ、５４位のＶ、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７０位のＬ、７２位のＲ、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＡまたはＹ、８３位のＰ、８４位のＳまたはＬまたはＶ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ、９３位のＤ、９５位のＱまたはＧ、９６位のＮ、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ、１２０位のＮ、１２１位のＥ、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７４位のＡ、１７７位のＦ、１７８位のＶ、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９５位のＳ、１９８位のＮ、１９９位のＭ、２０３位のＲ、２１５位のＥ、２２２位のＴ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、また、アミノ酸残基の位置が、参照核酸配列（すなわち、
配列番号：
【００８０】
【化４４】
2008537477.tif 000039
【００８１】
【化４５】
2008537477.tif 000040
【００８２】
【化４６】
2008537477.tif 000041
【００８３】
【化４７】
2008537477.tif 000042
のそれぞれ）によってコードされるアミノ酸配列である参照アミノ酸配列との最適アラインメントによって決定される。
【００８４】
通常、上記段落中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のサブグループから選択される１つから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基をさらに含む：（１）２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬ、８５位のＡ、９１位のＥ、９３位のＤ、９５位のＱまたはＧ、９６位のＮ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ、１２０位のＮ、１２１位のＥ、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ、１７８位のＶ、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１９４位のＬ、１９８位のＮ、１９９位のＭ、２１５位のＥ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ、および２５４位のＶ；または（２）３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴ；または（３）３７位のＨ、７５位のＩ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７８位のＶ、１８１位のＧ、１８６位のＹ、２２２位のＴ、および２４５位のＶ。
【００８５】
段落０４０−０４６に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列中、（特定の位置に）２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、または２０以上の上記アミノ酸残基の任意の組み合わせを有し得る。
【００８６】
段落０４０−０４６に記述されるＨＨＤＨポリペプチドには、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション下または極端に高度なストリンジェンシー条件下で参照配列とハイブリダイズするポリヌクレオチドによってコードされるものが含まれる。
【００８７】
通常、溶液中で会合する時、核酸は「ハイブリダイズ」する。核酸は、様々な十分に特徴づけられた物理化学的力、例えば、水素結合、溶媒排除、塩基の積み重ね等、によりハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲に及ぶ指針が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３）  “Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，”  Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中に見られる。
【００８８】
サザンおよびノーザンハイブリダイゼーション等の核酸ハイブリダイゼーション実験の状況においては、本明細書中で使用する場合、用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション洗浄条件」は、配列依存的であり、異なる環境パラメーター下では異なる。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範囲に及ぶ指針が、Ｔｉｊｅｓｓｅｎ（１９９３）  “Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，”  Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）中に見られる。
【００８９】
本発明の目的のため、「高度にストリンジェントな」（すなわち「高ストリンジェンシー」）ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、規定されたイオン強度およびｐＨ（以下に示されるように、高度にストリンジェントな条件とは比較用語としても参照され得る）条件下での特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃もしくはそれ以下であるように選択される。Ｔｍは、試験配列の５０％が、完全に一致するプローブとハイブリダイズする時の（規定されたイオン強度およびｐＨ条件下での）温度である。高度にストリンジェントな条件は、特定のプローブに対するＴｍと等しくなるように選択される。
【００９０】
核酸二本鎖のＴｍは、所定の条件下で二本鎖が５０％変性される時の温度を示し、核酸ハイブリッドの安定性の直接的尺度を表す。したがって、Ｔｍは、らせん構造からランダムコイルへ変化する時の中間点に相当する温度に対応し、ヌクレオチドの長さ、ヌクレオチド組成、および長い幅のヌクレオチドに対するイオン強度に左右される。
【００９１】
ハイブリダイゼーション後、ハイブリダイズしていない核酸物質は連続した洗浄により除去することができ、そのストリンジェンシーは所望される結果に応じて調整することができる。低ストリンジェンシー洗浄条件（例えば、より高濃度の塩、および、より低い温度を用いる）は、感受性を増大させるが、非特異的ハイブリダイゼーションシグナルおよび高いバックグラウンドシグナルを生じ得る（すなわち、特異性を喪失する）。より高いストリンジェンシー条件（例えば、ハイブリダイゼーション条件に近い、より低濃度の塩、および、より高い温度を用いる）は、バックグラウンドシグナルを低下させ、通常、わずかに特定のシグナルが残っているのみである（すなわち、特異性を増大させる）。Ｒａｐｌｅｙ，Ｒ．  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，Ｊ．Ｍ．Ｅｄｓ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｍｅｔｈｏｄｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．１９９８）を参照されたい。
【００９２】
ＤＮＡ−ＤＮＡ二本鎖のＴｍは、以下の式１を用いて推定することができる：
Ｔｍ（℃）＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−０．７２（％ｆ）−５００／ｎ、
式中、Ｍは一価カチオン（通常Ｎａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）はグアノシン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドのパーセンテージであり、（％ｆ）はホルムアミドのパーセンテージであり、および、ｎはハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち長さ）である。同上参照。
【００９３】
二本鎖のＴｍは、以下の式２を用いて推定することができる：
Ｔｍ（℃）＝７９．８℃＋１８．５（ｌｏｇ１０Ｍ）＋０．５８（％Ｇ＋Ｃ）−１１．８（％Ｇ＋Ｃ）２−０．５６（％ｆ）−８２０／ｎ、
式中、Ｍは一価カチオン（通常Ｎａ＋）のモル濃度であり、（％Ｇ＋Ｃ）はグアノシン（Ｇ）およびシトシン（Ｃ）ヌクレオチドのパーセンテージであり、（％ｆ）はホルムアミドのパーセンテージであり、および、ｎはハイブリッドのヌクレオチド塩基の数（すなわち長さ）である。同上参照。
【００９４】
式１および２は通常、約１００−２００ヌクレオチドより長いハイブリッド二本鎖に対してのみ正確である。同上。
【００９５】
５０ヌクレオチドよりも短い核酸配列のＴｍは、以下のようにして計算することができる：
Ｔｍ（０℃）  ＝  ４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）
式中、Ａ（アデニン）、Ｃ、Ｔ（チミン）、およびＧは対応するヌクレオチドの数である。
【００９６】
サザンまたはノーザンブロット中のフィルター上に１００個より多い相補的残基を有する、相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の例は、４２℃で１ｍｇのヘパリンを含む５０％ホルムアミドであり、ハイブリダイゼーションは一晩かけて行われる。ストリンジェントな洗浄条件の例は、０．２ｘ  ＳＳＣによる、６５℃、１５分間の洗浄である（ＳＳＣ緩衝液の記述については、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい）。バックグラウンドプローブシグナルを除去するために、高ストリンジェンシー洗浄よりも低ストリンジェンシー洗浄が先行して行われることが多い。低ストリンジェンシー洗浄の例は、２ｘ  ＳＳＣによる、４０℃、１５分間である。
【００９７】
一般的に、特定のハイブリダイゼーションアッセイにおいて関連しないプローブについて観察されるシグナル・ノイズ比と比較して２．５ｘ−５ｘ（またはそれ以上）のシグナル・ノイズ比は、特定のハイブリダイゼーションの検出を示す。本発明の状況において、２つの配列間の少なくともストリンジェントなハイブリダイゼーションの検出は、例えば、本明細書中で配列表に示される本発明の核酸に対する非常に高い構造類似性および相同性を示す。
【００９８】
前述したとおり、「高度にストリンジェントな」条件は、規定されたイオン強度およびｐＨ条件下での特定の配列の融点（Ｔｍ）よりも約５℃もしくはそれ以下であるように選択される。対象のヌクレオチド配列（例えば、「プローブ」）と密接に関連するまたは同一である標的配列は、高度にストリンジェントな条件下で同定することができる。より低いストリンジェンシー条件は、より相補性の低い配列に対して適当である。
【００９９】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション（ならびに、高度にストリンジェントな、極度に高度なストリンジェンシー、または超極度に高度なストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件）および洗浄条件は、任意の核酸について経験的に容易に決定することができる。例えば、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を決定する時、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件を（例えば、ハイブリダイゼーションまたは洗浄時において、温度を上昇させること、塩濃度を減少させること、界面活性剤濃度を増加させること、および／または、ホルムアミド等の有機溶媒の濃度を増大させることにより）選択された一連の基準を満たすまで徐々に増大させる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーおよび洗浄条件の強さは、配列番号：
【０１００】
【化５１】
2008537477.tif 000043
【０１０１】
【化５２】
2008537477.tif 000044
【０１０２】
【化５３】
2008537477.tif 000045
またはその相補的配列に相当するプローブが、完全に適合する相補的標的へと結合するまで徐々に増大する。完全一致する相補的標的に対するのと少なくとも１／２同様にハイブリダイズする時、すなわち、完全一致する相補的標的と完全一致するプローブとが結合する条件下、標的とプローブのハイブリダイゼーションの少なくとも１／２の大きさのシグナル・ノイズ比を示す時、試験核酸はプローブ核酸と特異的に結合すると言われる。
【０１０３】
極端に高度なストリンジェンシーハイブリダイゼーションおよび洗浄条件は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェンシーが、完全一致している相補的標的核酸に対するプローブの結合のシグナル・ノイズ比が少なくとも１０ｘまで増大しているときの条件である。完全一致している相補的標的核酸のシグナル・ノイズ比の少なくとも１／２を有する、かかる条件下でプローブとハイブリダイズする標的核酸は、極端に高度なストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言われる。
【０１０４】
同様に、さらに高いレベルのストリンジェンシーは、関連するハイブリダイゼーションアッセイのハイブリダイゼーションおよび／または洗浄条件のストリンジェンシーを徐々に増大させることにより決定することができる。例えば、完全一致している相補的標的核酸に対するプローブの結合のシグナル・ノイズ比が少なくとも１０ｘ、２０Ｘ、５０Ｘ、１００Ｘ、または５００Ｘである時まで、ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件のストリンジェンシーは増大する。完全一致している相補的標的核酸のシグナル・ノイズ比の少なくとも１／２を有する、かかる条件下でプローブとハイブリダイズする標的核酸は、超極端に高度なストリンジェンシー条件下でプローブと結合すると言われる。
【０１０５】
一態様において、本発明は、ＨＨＤＨ活性を有する単離または組換えポリペプチドおよび、配列番号：
【０１０６】
【化５４】
2008537477.tif 000046
【０１０７】
【化５５】
2008537477.tif 000047
【０１０８】
【化５６】
2008537477.tif 000048
からなる群から選択される参照配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を提供する。これらのＨＨＤＨポリペプチドは、参照配列と少なくとも８１％同一、８２％同一、８３％同一、８４％同一、８５％同一、８６％同一、８７％同一、８８％同一、８９％同一、９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％または９９％同一であると確信される。
【０１０９】
通常、段落０６４中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、上述されるＨＨＤＨポリペプチドは、２７位のＡ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列によりコードされる。特定の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、５位のＶ、４５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、９３位のＴ、１０３位のＴ、１１７位のＴ、１１８位のＳ、１２１位のＩまたはＬまたはＹ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＳ、および２５２位のＰからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列によりコードされる。その他の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、５４位のＩ、６０位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、９３位のＴ、１００位のＭ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＡまたはＧ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２０５位のＹ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、および２４６位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列によりコードされる。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、６７位のＮ、７２位のＨ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＡ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２０５位のＹ、および２４６位のＶからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、以下のアミノ酸残基の組み合わせ：６７位のＮ＋７２位のＨ＋１１７位のＴ＋１２１位のＲ＋１３５位のＳ＋１４６位のＡ＋１５４位のＡ＋１７７位のＡ＋１７９位のＤ＋２０１位のＷ＋２０５位のＹ＋２４６位のＶ、を含むアミノ酸配列を有するものを含む。その他の実施形態において、ＨＨＤＨポリペプチドは、５４位のＩ、６０位のＶ、９１位のＥ、９３位のＴ、１００位のＭ、１７７位のＧ、１７８位のＭまたはＣ、２３８位のＲ、および２３９位のＦからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。
【０１１１】
段落０６４中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、３８位のＱ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５２位のＩ、５４位のＶ、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７０位のＬ、７２位のＲ、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＡまたはＹ、８３位のＰ、８４位のＳまたはＬまたはＶ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ、９３位のＤ、９５位のＱまたはＧ、９６位のＮ、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ、１２０位のＮ、１２１位のＥ、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７４位のＡ、１７７位のＦ、１７８位のＶ、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９５位のＳ、１９８位のＮ、１９９位のＭ、２０３位のＲ、２１５位のＥ、２２２位のＴ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し得る。
【０１１２】
段落０６５−０６６中に記述されるアミノ酸残基に加えて、特定されたＨＨＤＨポリペプチドは、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、３８位のＱ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ（段落０６５−０６６からのものがＶでない場合）、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ（Ｉでない場合）、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７０位のＬ、７２位のＲ（Ｈでない場合）、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＡまたはＹ、８３位のＰ、８４位のＳまたはＬまたはＶ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ（Ｒでない場合）、９３位のＤ（Ｔでない場合）、９５位のＱまたはＧ（Ａでない場合）、９６位のＮ（Ｅでない場合）、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ（ＲまたはＴでない場合）、１２０位のＮ、１２１位のＥ（ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ（ＲまたはＤでない場合）、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ（Ａでない場合）、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ（ＧまたはＡでない場合）、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９５位のＳ、１９８位のＮ、１９９位のＭ（Ａでない場合）、２０３位のＲ、２１５位のＥ、２２２位のＴ、２３６位のＧ（Ｌでない場合）、２３７位のＶ、２３８位のＬ（ＴまたはＲでない場合）、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ（Ｐでない場合）、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基をさらに含むことができ、アミノ酸残基位置が、ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、３７位のＨ、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、７５位のＩ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７４位のＡ、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８１位のＧ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、２２２位のＴ、および２４５位のＶからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を、さらに有する。
【０１１３】
段落０６５−０６６中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、以下のサブグループから選択される１つから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基をさらに含む：（１）２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ（Ｉでない場合）、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ（Ｉでない場合）、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ（Ｈでない場合）、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ（Ｒでない場合）、９３位のＤ（Ｔでない場合）、９５位のＱまたはＧ（Ａでない場合）、９６位のＮ（Ｅでない場合）、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ（ＲまたはＴでない場合）、１２０位のＮ、１２１位のＥ（ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ（ＲまたはＤでない場合）、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ（Ａでない場合）、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ（ＧまたはＡでない場合）、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１９４位のＬ、１９８位のＮ、１９９位のＭ（Ａでない場合）、２１５位のＥ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ（ＴまたはＲでない場合）、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ（Ｐでない場合）、および２５４位のＶ；または（２）３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴ；または（３）３７位のＨ、７５位のＩ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８１位のＧ、１８６位のＹ、２２２位のＴ、および２４５位のＶ。上記段落中の挿入句（「Ｘでない場合」）は、アミノ酸残基Ｘが、その残基の位置に関して段落０６５−０６６から選択される場合、特定されたアミノ酸残基の位置から特定の残基が除外されるという条件をいう。
【０１１４】
段落０６５−０６９に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列中、（特定の位置に）２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、または２０以上の上記アミノ酸残基の任意の組み合わせを有し得る。
【０１１５】
特定の実施形態において、ＨＨＤＨ活性を有する単離または組換えポリペプチドは、ポリペプチドは以下：（ａ）配列番号７５０および配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列と少なくとも８６％同一（時には少なくとも８７％同一、８８％同一、８９％同一、９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、または９８％同一）であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｂ）配列番号２００および配列番号１９７８からなる群から選択される参照配列と少なくとも９３％同一（時には少なくとも９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一）であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｃ）配列番号２４９６の参照配列と少なくとも９４％同一（時には少なくとも９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一）であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｄ）配列番号２６４、配列番号２６６、配列番号４７０、配列番号４７６、配列番号２８４６、配列番号２１３０、配列番号１９２６、配列番号２３４８、配列番号１９８４、および配列番号２４４６の参照配列と少なくとも９５％同一（時には少なくとも９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一）であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｅ）配列番号１１６、配列番号４４８、配列番号２８３４、配列番号１８２０、配列番号２０４０、および配列番号２８３８の参照配列と少なくとも９６％同一（時には少なくとも９７％同一、９８％同一、または９９％同一）であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｆ）
【０１１６】
【化６２−１】
2008537477.tif 000049
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９７％同一（時には少なくとも９８％同一、または９９％同一）であるアミノ酸配列を含むポリペプチド；（ｇ）
【０１１７】
【化６２−２】
2008537477.tif 000050
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９８％同一（時には少なくとも９９％同一）であるアミノ酸配列；および（ｈ）
【０１１８】
【化６２−３】
2008537477.tif 000051
からなる群から選択される参照配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列、
からなる群から選択されるポリペプチドである。
【０１１９】
本発明はまた、ポリペプチド、典型的には、配列番号２の野生型ＨＨＤＨよりも大きなＨＨＤＨ活性を有し、配列番号４４２に対し少なくとも８９％同一；典型的には、配列番号４４２に対し少なくとも９３％同一；より典型的には、配列番号４４２に対し少なくとも９５％同一；時には配列番号４４２に対し少なくとも９７％同一；所望により配列番号４４２に対し９９％同一であるアミノ酸配列を有する単離または組換えポリペプチドをも提供する。
【０１２０】
その他の実施形態において、本発明は、ポリペプチド、典型的には、配列番号２の野生型ＨＨＤＨよりも大きなＨＨＤＨ活性を有し、配列番号７０２に対し少なくとも８８％同一；典型的には、配列番号７０２に対し少なくとも９３％同一；より典型的には、配列番号７０２に対し少なくとも９５％同一；時には配列番号７０２に対し少なくとも９７％同一；所望により配列番号７０２に対し９９％同一であるアミノ酸配列を有する単離または組換えポリペプチドに関する。
【０１２１】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１１６または４４８に対し少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を有するＨＨＤＨポリペプチドを提供する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号１１６または４４８に対し、少なくとも９７％同一、９８％または９９％同一である。
【０１２２】
本発明はさらに、本発明は、配列番号２６４、２６６、４７０または４７６に対し少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有するＨＨＤＨポリペプチドを提供する。本発明の望ましいＨＨＤＨポリペプチドには、配列番号２６４、２６６、４７０または４７６に対し、少なくとも９６％同一、９７％同一、９８％または９９％同一であるものを含む。
【０１２３】
いくつかの実施形態において、段落０７１−０７５中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される。いくつかの実施形態において、上述されるＨＨＤＨポリペプチドは、２７位のＡ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列によりコードされる。
【０１２４】
特定の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、５位のＶ、４５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、９３位のＴ、１０３位のＴ、１１７位のＴ、１１８位のＳ、１２１位のＩまたはＬまたはＹ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＳ、および２５２位のＰからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列によりコードされる。その他の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、５４位のＩ、６０位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、９３位のＴ、１００位のＭ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＡまたはＤ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２０５位のＹ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、および２４６位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列によりコードされる。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、６７位のＮ、７２位のＨ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＡ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２０５位のＹ、および２４６位のＶからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、以下の組み合わせのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するものを含む：６７位のＮ＋７２位のＨ＋１１７位のＴ＋１２１位のＲ＋１３５位のＳ＋１４６位のＡ＋１５４位のＡ＋１７７位のＡ＋１７９位のＤ＋２０１位のＷ＋２０５位のＹ＋２４６位のＶ。その他の実施形態において、ＨＨＤＨポリペプチドは、５４位のＩ、６０位のＶ、９１位のＥ、９３位のＴ、１００位のＭ、１７７位のＧ、１７８位のＭまたはＣ、２３８位のＲ、および２３９位のＦからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。
【０１２５】
段落０７１−０７５中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、３８位のＱ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５２位のＩ、５４位のＶ、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７０位のＬ、７２位のＲ、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＡまたはＹ、８３位のＰ、８４位のＳまたはＬまたはＶ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ、９３位のＤ、９５位のＱまたはＧ、９６位のＮ、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ、１２０位のＮ、１２１位のＥ、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７４位のＡ、１７７位のＦ、１７８位のＶ、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９５位のＳ、１９８位のＮ、１９９位のＭ、２０３位のＲ、２１５位のＥ、２２２位のＴ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し得る。
【０１２６】
上述のアミノ酸残基に加えて、段落０７６−０７７中に記載されるＨＨＤＨポリペプチドはさらに、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、３８位のＱ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ（段落０７６−０７７からのものがＶでない場合）、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５２位のＩ、５４位のＶ（Ｉでない場合）、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７０位のＬ、７２位のＲ（Ｈでない場合）、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＡまたはＹ、８３位のＰ、８４位のＳまたはＬまたはＶ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ（Ｒでない場合）、９３位のＤ（Ｔでない場合）、９５位のＱまたはＧ（Ａでない場合）、９６位のＮ（Ｅでない場合）、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ（ＲまたはＴでない場合）、１２０位のＮ、１２１位のＥ（ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ（ＲまたはＤでない場合）、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ（Ａでない場合）、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７４位のＡ、１７７位のＦ（ＧまたはＡでない場合）、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９５位のＮ、１９８位のＮ、１９９位のＭ（Ａでない場合）、２０３位のＲ、２１５位のＥ、２２２位のＴ、２３６位のＧ（Ｌでない場合）、２３７位のＶ、２３８位のＬ（ＴまたはＲでない場合）、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ（Ｐでない場合）、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基位置が、ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、３７位のＨ、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、７５位のＩ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７４位のＡ、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８１位のＧ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、２２２位のＴ、および２４５位のＶからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基をさらに含むアミノ酸配列を有する。
【０１２７】
段落０７６−０７７中に記載されるＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、さらに、以下のサブグループのひとつから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含む：（１）２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ（Ｉでない場合）、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ（Ｉでない場合）、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ（Ｈでない場合）、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬ、８５位のＡ、９１位のＥ（Ｒでない場合）、９３位のＤ（Ｔでない場合）、９５位のＱまたはＧ（Ａでない場合）、９６位のＮ（Ｅでない場合）、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ（ＲまたはＴでない場合）、１２０位のＮ、１２１位のＥ（ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ（ＲまたはＤでない場合）、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ（Ａでない場合）、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ（ＧまたはＡでない場合）、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９８位のＮ、１９９位のＭ（Ａでない場合）、２１５位のＥ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ（ＴまたはＲでない場合）、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ（Ｐでない場合）、および２５４位のＶ；（２）３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴ；または（３）３７位のＨ、７５位のＩ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８１位のＧ、１８６位のＹ、２２２位のＴ、および２４５位のＶ。上記段落中の挿入句（「Ｘでない場合」）は、アミノ酸残基Ｘが、その残基の位置に関して段落０２４−０２７から選択される場合、特定されたアミノ酸残基の位置から特定の残基が除外されるという条件をいう。
【０１２８】
段落０７６−０８０に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列中、（特定の位置に）２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、または２０以上の上記アミノ酸残基の任意の組み合わせを有し得る。
【０１２９】
さらなる実施形態において、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、１５Ｖ、Ｔ２７Ａ、Ａ４５Ｖ、Ｅ４６Ｑ、Ｍ５４Ｉ、Ａ６０Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｔ６７Ｎ、Ｑ７２Ｈ、Ｖ７７Ｉ、Ｑ８７Ｓ、Ｋ９１Ｒ、Ａ９３Ｔ、Ｅ９５Ａ、Ｄ９６Ｅ、Ａ１００Ｍ／Ｑ、Ａ１０３Ｔ、Ｓ１１７Ｒ／Ｔ、Ｑ１１８Ｓ、Ｋ１２１Ｒ／Ｉ／Ｌ／Ｙ、Ｐ１３５Ｓ、Ｗ１３９Ｒ＋Ｎ１７６ＥまたはＷ１３９Ｄ＋Ｎ１７６Ｒ、Ｔ１４６Ａ、Ｃ１５３Ｎ、Ｙ１６６Ｈ、Ｙ１７７Ｇ／Ａ、Ｌ１７８Ｍ／Ｃ、Ｈ１７９Ｎ／Ｄ、Ｓ１８０Ｄ／Ｔ、Ｅ１８１Ｋ、Ｄ１８２Ｎ、Ｅ１９０Ｖ、Ｖ１９９Ａ、Ｈ２０１Ｗ／Ｙ、Ｖ２０５Ｙ、Ｖ２３６Ｌ、Ｗ２３８Ｔ／Ｒ、Ｌ２３９Ｆ、Ｉ２４６Ｖ、Ｇ２５１Ｅ／Ａ／Ｓおよび２５２Ｐからなる群から選択される１またはそれ以上の置換を有する配列番号２の配列を有する。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、Ｔ２７Ａ、Ｅ４６Ｑ、Ｍ５４Ｉ、Ａ６０Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｑ８７Ｓ、Ｋ９１Ｒ、Ｅ９５Ａ、Ｄ９６Ｅ、Ａ１００Ｍ／Ｑ、Ｓ１１７Ｒ、Ｑ１１８Ｓ、Ｋ１２１Ｒ、Ｐ１３５Ｓ、Ｔ１４６Ａ、Ｃ１５３Ｎ、Ｌ１７８Ｃ、Ｈ１７９Ｎ、Ｄ１８２Ｎ、Ｅ１９０Ｖ、Ｖ１９９Ａ、Ｈ２０１Ｙ、Ｖ２０５Ｙ、Ｖ２３６Ｌ、Ｗ２３８ＴおよびＧ２５１Ｅ／Ａからなるサブグループから選択される１またはそれ以上の置換を含むアミノ酸配列によりコードされる。
【０１３１】
特定の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、１５Ｖ、Ａ４５Ｖ、Ｔ６７Ｎ、Ｑ７２Ｈ、Ｖ７７Ｉ、Ａ９３Ｔ、Ａ１０３Ｔ、Ｓ１１７Ｔ、Ｋ１２１Ｉ／Ｌ／Ｙ、Ｗ１３９Ｒ＋Ｎ１７６ＥまたはＷ１３９Ｄ＋Ｎ１７６Ｒ、Ｙ１６６Ｈ、Ｙ１７７Ｇ／Ａ、Ｌ１７８Ｃ、Ｈ１７９Ｄ、Ｈ２０１Ｗ、Ｗ２３８Ｒ、Ｌ２３９Ｆ、Ｉ２４６Ｖ、Ｇ２５１ＳおよびＭ２５２Ｐからなるサブグループから選択される１またはそれ以上の置換を含むアミノ酸配列によりコードされる。その他の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、Ｍ５４Ｉ、Ａ６０Ｖ、Ｔ６７Ｎ、Ｑ７２Ｈ、Ａ９３Ｔ、Ａ１００Ｍ、Ｓ１１７Ｔ、Ｋ１２１Ｒ、Ｐ１３５Ｓ、Ｔ１４６Ａ、Ｙ１７７Ａ／Ｇ、Ｌ１７８Ｍ／Ｃ、Ｈ１７９Ｄ、Ｈ２０１Ｗ、Ｖ２０５Ｙ、Ｗ２３８Ｒ、Ｌ２３９Ｆ、およびＩ２４６Ｖからなるサブグループから選択される１またはそれ以上の置換を含むアミノ酸配列を有する。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、Ｔ６７Ｎ、Ｑ７２Ｈ、Ｓｌ１７Ｔ、Ｋ１２１Ｒ、Ｐ１３５Ｓ、Ｔ１４６Ａ、Ｙ１７７Ａ、Ｈ１７９Ｄ、Ｈ２０１Ｗ、Ｖ２０５Ｙ、およびＩ２４６Ｖからなるサブグループから選択される１またはそれ以上の置換を含むアミノ酸配列を有する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、以下の組み合わせのアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するものを含む：Ｔ６７Ｎ＋Ｑ７２Ｈ＋Ｓ１１７Ｔ＋Ｋ１２１Ｒ＋Ｐ１３５Ｓ＋Ｔ１４６Ａ＋Ｔ１５４Ａ＋Ｙ１７７Ａ＋Ｈ１７９Ｄ＋Ｈ２０１Ｗ＋Ｖ２０５Ｙ＋Ｉ２４６Ｖ。その他の実施形態において、ＨＨＤＨポリペプチドは、Ｍ５４Ｉ、Ａ６０Ｖ、Ｋ９１Ｅ、Ａ９３Ｔ、Ａ１００Ｍ、Ｙ１７７Ｇ、Ｌ１７８Ｍ／Ｃ、Ｗ２３８Ｒ、およびＬ２３９Ｆからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を有する。
【０１３２】
上述のアミノ酸置換に加えて、段落０８２−０８４中に記載されるＨＨＤＨポリペプチドは、Ｓ２Ｔ、Ｔ３Ａ／Ｐ／Ｓ、Ａ４Ｖ、Ｖ６Ｄ、Ｖ９Ｉ／Ｆ、Ｋ１０Ｌ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１４Ｓ、Ｍ１５Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｓ１７Ｔ／Ｒ、Ｒ２０Ｃ／Ｓ／Ｋ、Ａ２４Ｔ、Ｈ２６Ｑ、Ｖ２８Ｆ、Ａ２９Ｔ、Ｃ３０Ａ、Ｈ３１Ｉ、Ｅ３３Ｇ、Ｓ３４Ｒ、Ｆ３５Ｌ、Ｋ３６Ｎ、Ｑ３７Ｈ、Ｋ３８Ｑ、Ｅ４０Ｄ、Ｆ４４Ｌ、Ａ４５Ｐ（段落０８２−０８４からのものがＡ４５Ｖでない場合）、Ｔ４７Ｐ／Ａ、Ｌ５１Ｎ、Ｋ５２Ｉ、Ｍ５４Ｖ（Ｍ５４Ｉでない場合）、Ｓ５５Ｒ、Ｅ５６Ｄ、Ｅ５８Ｋ、Ｅ６１Ｇ／Ｄ、１６３Ｖ、Ｙ７０Ｌ、Ｑ７２Ｒ（Ｑ７２Ｈでない場合）、Ｖ７５Ｉ、Ｌ７６Ｐ、Ｓ７８Ｃ、Ｄ８０Ｑ、Ｆ８２Ａ／Ｙ、Ａ８３Ｐ、Ｐ８４Ｓ／Ｌ／Ｖ、Ｅ８５Ａ、Ｆ８６Ｗ、Ｑ８７Ｒ、Ｋ９１Ｅ（Ｋ９１Ｒでない場合）、Ａ９３Ｄ（Ａ９３Ｔでない場合）、Ｅ９５Ｑ／Ｇ（Ｅ９５Ａでない場合）、Ｄ９６Ｎ（Ｄ９６Ｅでない場合）、Ｇ９９Ｄ、Ａ１００Ｔ、Ｒ１０７Ｋ、Ｖ１１２Ａ、Ａ１１４Ｔ／Ｓ／Ｇ、Ｖ１１５Ａ、Ｓｌ１７Ｐ（Ｓ１１７ＲまたはＴでない場合）、Ｋ１２０Ｎ、Ｋ１２１Ｅ（Ｋ１２１ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、Ｒ１２２Ｐ、Ｈ１２６Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ａ１３３Ｓ、Ｔ１３４Ａ／Ｖ、Ｆ１３６Ｌ／Ｗ／Ｖ、Ｗ１３９Ｈ（Ｗ１３９ＲまたはＤでない場合）、Ｌ１４２Ｉ／Ｒ、Ｔ１４４Ｓ、Ｔ１４６Ｓ（Ｔ１４６Ａでない場合）、Ａ１５２Ｔ、Ｔ１５４Ｓ／Ａ、Ｉ１６８Ｖ、Ｐ１６９Ｔ、Ｇ１７４Ａ、Ｙ１７７Ｆ（Ｙ１７７ＧまたはＡでない場合）、Ｌ１７８Ｖ（Ｌ１７８ＭまたはＣでない場合）、Ｓ１８０Ｉ、Ｅ１８１Ｇ／Ｉ、Ｐ１８４Ｋ、Ｆ１８６Ｙ、Ｔ１８９Ｓ、Ｔ１９４Ｌ、Ｎ１９５Ｓ、Ｈ１９８Ｎ、Ｖ１９９Ｍ（Ｖ１９９Ａでない場合）、Ｋ２０３Ｒ、Ｋ２１５Ｅ、Ａ２２２Ｔ、Ｖ２３６Ｇ（Ｖ２３６Ｌでない場合）、Ｆ２３７Ｖ、Ｗ２３８Ｌ（Ｗ２３８ＴまたはＲでない場合）、Ａ２４０Ｔ、Ｍ２４５Ｉ／Ａ／Ｖ、Ｗ２４９Ｙ、Ｍ２５２Ｖ／Ｉ（Ｍ２５２Ｐでない場合）、およびＥ２５４Ｖからなる群から選択される１またはそれ以上の置換をさらに含み、アミノ酸残基の位置は、ＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２との最適アラインメントによって決定される。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、Ｑ３７Ｈ、Ｋ３８Ｑ、Ｋ５２Ｉ、Ｙ７０Ｌ、Ｖ７５Ｉ、Ｆ８２Ａ、Ａ８３Ｐ、Ｐ８４Ｖ、Ｆ８６Ｗ、Ｑ８７Ｒ、Ｇ９９Ｄ、Ａ１００Ｔ、Ｒ１０７Ｋ、Ｖ１１２Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｔ１５４Ａ、Ｇ１７４Ａ、Ｌ１７８Ｖ（Ｌ１７８ＭまたはＣでない場合）、Ｅ１８１Ｇ、Ｆ１８６Ｙ、Ｔ１８９Ｓ、Ｎ１９５Ｓ、Ｋ２０３Ｒ、Ａ２２２Ｔ、およびＭ２４５Ｖからなるサブグループから選択される１またはそれ以上の置換をさらに含むアミノ酸配列を有する。
【０１３３】
段落０８２−０８４のＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、以下のサブグループのひとつから選択される１またはそれ以上の置換をさらに含む：（１）Ｓ２Ｔ、Ｔ３Ａ／Ｐ／Ｓ、Ａ４Ｖ、Ｖ６Ｄ、Ｖ９Ｉ／Ｆ、Ｋ１ＯＬ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１４Ｓ、Ｍ１５Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｓ１７Ｔ／Ｒ、Ｒ２０Ｃ／Ｓ／Ｋ、Ａ２４Ｔ、Ｈ２６Ｑ、Ｖ２８Ｆ、Ａ２９Ｔ、Ｃ３０Ａ、Ｈ３１ＬＥ３３Ｇ、Ｓ３４Ｒ、Ｆ３５Ｌ、Ｋ３６Ｎ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ４０Ｄ、Ｆ４４Ｌ、Ａ４５Ｐ（段落０８２−０８４からのものがＡ４５Ｉでない場合）、Ｔ４７Ｐ／Ａ、Ｌ５１Ｎ、Ｍ５４Ｖ（Ｍ５４Ｉでない場合）、Ｓ５５Ｒ、Ｅ５６Ｄ、Ｅ５８Ｋ、Ｅ６１Ｇ／Ｄ、Ｉ６３Ｖ、Ｑ７２Ｒ（Ｑ７２Ｈでない場合）、Ｖ７５Ｉ、Ｌ７６Ｐ、Ｓ７８Ｃ、Ｄ８０Ｑ、Ｆ８２Ｙ、Ｐ８４Ｓ／Ｌ、Ｅ８５Ａ、Ｋ９１Ｅ（Ｋ９１Ｒでない場合）、Ａ９３Ｄ（Ａ９３Ｔでない場合）、Ｅ９５Ｑ／Ｇ（Ｅ９５Ａでない場合）、Ｄ９６Ｎ（Ｄ９６Ｅでない場合）、Ｒ１０７Ｋ、Ｖ１１２Ａ、Ａ１１４Ｔ／Ｓ／Ｇ、Ｖ１１５Ａ、Ｓ１１７Ｐ（Ｓ１１７ＲまたはＴでない場合）、Ｋ１２０Ｎ、Ｋ１２１Ｅ（Ｋ１２１ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、Ｒ１２２Ｐ、Ｈ１２６Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ａ１３３Ｓ、Ｔ１３４Ａ／Ｖ、Ｆ１３６Ｌ／Ｗ／Ｖ、Ｗ１３９Ｈ（Ｗ１３９ＲまたはＤ）、Ｌ１４２Ｉ／Ｒ、Ｔ１４４Ｓ、Ｔ１４６Ｓ（Ｔ１４６Ａでない場合）、Ａ１５２Ｔ、Ｔ１５４Ｓ／Ａ、Ｉ１６８Ｖ、Ｐ１６９Ｔ、Ｙ１７７Ｆ（Ｙ１７７ＧまたはＡでない場合）、Ｌ１７８Ｖ（Ｌ１７８ＭまたはＣでない場合）、Ｓ１８０ＬＥ１８１Ｇ／ＬＰ１８４Ｋ、Ｆ１８６Ｙ、Ｔ１９４Ｌ、Ｈ１９８Ｎ、Ｖ１９９Ｍ（Ｖ１９９Ａでない場合）、Ｋ２１５Ｅ、Ｖ２３６Ｇ、Ｆ２３７Ｖ、Ｗ２３８Ｌ（Ｗ２３８ＴまたはＲでない場合）、Ａ２４０Ｔ、Ｍ２４５Ｉ／Ａ／Ｖ、Ｗ２４９Ｙ、Ｍ２５２Ｖ／Ｉ（Ｍ２５２Ｐでない場合）、およびＥ２５４Ｖ；または（２）Ｋ３８Ｑ、Ｋ５２Ｉ、Ｙ７０Ｌ、Ｆ８２Ａ、Ａ８３Ｐ、Ｐ８４Ｖ、Ｆ８６Ｗ、Ｑ８７Ｒ、Ｇ９９Ｄ、Ａ１００Ｔ、Ｇ１７４Ａ、Ｔ１８９Ｓ、Ｎ１９５Ｓ、Ｋ２０３Ｒ、およびＡ２２２Ｔ；または（３）Ｑ３７Ｈ、Ｖ７５Ｉ、Ｒ１０７Ｋ、Ｖ１１２Ａ、Ｔ１３４Ａ、Ｔ１５４Ａ、Ｌ１７８Ｖ（Ｌ１７８ＭまたはＣでない場合）、Ｅ１８１Ｇ、Ｆ１８６Ｙ、Ａ２２２Ｔ、およびＭ２４５Ｖ。Ｘでない場合」）は、アミノ酸残基Ｘが、その残基の位置に関して段落０８２−０８４から選択される場合、特定されたアミノ酸残基の位置から特定の残基が除外されるという条件をいう。
【０１３４】
本発明は、配列番号２と最適アラインメントされた場合に配列番号２と少なくとも８０％同一であって、さらにＳ２Ｔ、Ｔ３ＡまたはＴ３Ｐのいずれか、Ａ４Ｖ、Ｖ６Ｄ、Ｖ９ＩまたはＶ９Ｆのいずれか、Ｋ１ＯＬ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１４Ｓ、Ｍ１５Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｓ１７ＴまたはＳ１７Ｒのいずれか、Ｒ２０Ｓ、Ｒ２０ＣまたはＲ２０Ｋのいずれか、Ａ２４Ｔ、Ｈ２６Ｑ、Ｖ２８Ｆ、Ａ２９Ｔ、Ｃ３０Ａ、Ｈ３１Ｌ、Ｅ３３Ｇ、Ｓ３４Ｒ、Ｆ３５Ｌ、Ｋ３６Ｎ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ４０Ｄ、Ｆ４４Ｌ、Ａ４５Ｐ、Ｔ４７ＰまたはＴ４７Ａのいずれか、Ｋ５２Ｎ、Ｍ５４Ｖ、Ｓ５５Ｒ、Ｅ５６Ｄ、Ｅ５８Ｋ、Ｅ６１ＧまたはＥ６１Ｄのいずれか、Ｉ６３Ｖ、Ｑ７２Ｒ、Ｖ７５Ｉ、Ｌ７６Ｐ、Ｓ７８Ｃ、Ｆ８２Ｙ、Ｐ８４ＳまたはＰ８４Ｌのいずれか、Ｅ８５Ｑ、Ｋ９１Ｅ、Ａ９３Ｄ、Ｅ９５ＱまたはＥ９５Ｇ、Ｄ９６Ｎ、Ｒ１０７Ｋ、Ｖ１１２Ａ、Ａ１１４ＴまたはＡ１１４ＧまたはＡ１１４Ｓのいずれか、Ｖ１１５Ａ、Ｓ１１７Ｐ、Ｋ１２０Ｎ、Ｋ１２１Ｅ、Ｒ１２２Ｐ、Ｈ１２６Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ａ１３３Ｓ、Ｔ１３４ＡまたはＴ１３４Ｖ、Ｆ１３６ＬまたはＦ１３６ＷまたはＦ１３６Ｖ、Ｗ１３９Ｈ、Ｌ１４２ＩまたはＬ１４２Ｒ、Ｔ１４４Ｓ、Ｔ１４６Ｓ、Ａ１５２Ｔ、Ｃ１５３Ｓ、Ｔ１５４ＳまたはＴ１５４Ａのいずれか、Ｉ１６８Ｖ、Ｐ１６９Ｔ、Ｙ１７７Ｆ、Ｌ１７８Ｖ、Ｓ１８０Ｌ、Ｅ１８１ＧまたはＥ１８１Ｉ、Ｐ１８４Ｋ、Ｆ１８６Ｙ、Ｔｌ９４１、Ｈ１９８Ｎ、Ｖ１９９Ｍ、Ｋ２１５Ｅ、Ｖ２３６Ｇ、Ｆ２３７Ｖ、Ｗ２３８Ｌ、Ａ２４０Ｔ、Ｍ２５４ＩまたはＭ２４５ＡまたはＭ２４５Ｖのいずれか、Ｗ２４９Ｙ、Ｍ２５２ＶまたはＭ２５２Ｉ、およびＥ２５４Ｖからなる群から選択される１またはそれ以上の置換を有するＨＨＤＨポリペプチドを提供する。いくつかの実施形態において、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、少なくとも配列番号２と８５％同一であり、上述の置換の１以上を有する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドのあるものは、少なくとも配列番号２と９０％同一であり、あるものは少なくとも配列番号２と約９５％同一であり、またその他のものでは配列番号２と少なくとも９９％同一であって全てのものは上述の１またはそれ以上の置換を有する。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、少なくとも２以上の上述の置換を有し、これらのＨＨＤＨポリペプチドのあるものは、少なくとも３以上の上述の置換を有する。
【０１３５】
配列番号２と最適アラインメントされた場合に、本発明の特定のＨＨＤＨポリペプチドは、Ｓ２Ｔ、Ｔ３ＡまたはＴ３Ｐのいずれか、Ａ４Ｖ、Ｖ６Ｄ、Ｖ９ＩまたはＶ９Ｆのいずれか、Ｋ１ＯＬ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１４Ｓ、Ｍ１５Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｓ１７ＴまたはＳ１７Ｒのいずれか、Ｒ２０Ｓ、Ｒ２０ＣまたはＲ２０Ｋのいずれか、Ａ２４Ｔ、Ｈ２６Ｑ、Ｖ２８Ｆ、Ａ２９Ｔ、Ｃ３０Ａ、Ｈ３１Ｌ、Ｅ３３Ｇ、Ｓ３４Ｒ、Ｆ３５Ｌ、Ｋ３６Ｎ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ４０Ｄ、Ｆ４４Ｌ、Ａ４５Ｐ、Ｔ４７ＰまたはＴ４７Ａのいずれか、Ｋ５２Ｎ、Ｍ５４Ｖ、Ｓ５５Ｒ、Ｅ５６Ｄ、Ｅ５８Ｋ、Ｅ６１ＧまたはＥ６１Ｄのいずれか、Ｉ６３Ｖ、Ｑ７２Ｒ、Ｖ７５Ｉ、Ｌ７６Ｐ、Ｓ７８Ｃ、Ｆ８２Ｙ、Ｐ８４ＳまたはＰ８４Ｌのいずれか、Ｅ８５Ｑ、Ｋ９１Ｅ、Ａ９３Ｄ、Ｅ９５ＱまたはＥ９５Ｇ、Ｄ９６Ｎ、Ｖ１０ｌＩ、Ｒ１０７Ｋ、Ｖ１１２Ａ、Ａ１１４ＴまたはＡ１１４ＧまたはＡ１１４Ｓのいずれか、Ｖ１１５Ａ、Ｓ１１７Ｐ、Ｋ１２０Ｎ、Ｋ１２１Ｅ、Ｒ１２２Ｐ、Ｈ１２６Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ａ１３３Ｓ、Ｔ１３４ＡまたはＴ１３４Ｖ、Ｆ１３６ＬまたはＦ１３６ＷまたはＦ１３６Ｖ、Ｗ１３９Ｈ、Ｌ１４２ＩまたはＬ１４２Ｒ、Ｔ１４４Ｓ、Ｔ１４６Ｓ、Ａ１５２Ｔ、Ｔ１５４ＳまたはＴ１５４Ａのいずれか、Ｉ１６８Ｖ、Ｐ１６９Ｔ、Ｙ１７７ＦまたはＹ１７７Ａ、Ｌ１７８Ｖ、Ｓｌ８０１、Ｅ１８１ＧまたはＥ１８１Ｉ、Ｐ１８４Ｋ、Ｆ１８６Ｙ、Ｔ１９４１、Ｈ１９８Ｎ、Ｖ１９９Ｍ、Ｋ２１５Ｅ、Ｖ２３６Ｇ、Ｆ２３７Ｖ、Ｗ２３８Ｌ、Ａ２４０Ｔ、Ｍ２４５ＩまたはＭ２４５ＡまたはＭ２４５Ｖのいずれか、Ｗ２４９Ｙ、Ｍ２５２ＶまたはＭ２５２Ｉ、およびＥ２５４Ｖからなる群から選択される１またはそれ以上の置換を有する、配列番号２に相当する配列を有する。
【０１３６】
段落０８８中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列において上述のアミノ酸置換の２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、または２０以上の任意の組み合わせを有し得る。
【０１３７】
本発明の例示的なＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号１またはその相補物に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列であって、そのコードされるポリペプチドは、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基の位置は、配列番号２のアミノ酸配列との最適アラインメントによって決定される（段落０４０−０４４の記述を参照）。
【０１３８】
本発明はまた、配列番号１またはその相補物に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるＨＨＤＨポリペプチドを提供し、そのコードされるポリペプチドは、配列番号２と最適アラインメントされた場合に、２位（の残基）のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＬ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ、４７位のＰまたはＡ、５２位のＮ、５４位のＶ、５５位のＲ、５６位のＤ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲまたはＱ、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬ、８５位のＡ、９１位のＥ、９３位のＤ、９５位のＱまたはＧ、９６位のＮ、１０１位のＩ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ、１２０位のＮ、１２１位のＥ、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬ、ＷまたはＶ、１３９位のＨ、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ、１７８位のＶ、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１９４位のＬ、１９８位のＮ、１９９位のＭ、２１５位のＥ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１３９】
段落０９０−０９１中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列において上述のアミノ酸置換の２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、または２０以上の任意の組み合わせを有し得る。
【０１４０】
本発明の例示的なＨＨＤＨポリペプチドは、ＨＨＤＨ活性を有する単離または組換えポリペプチドを含み、このポリペプチドは、以下：（ａ）配列番号７３０と少なくとも８０％同一（時には少なくとも８１％同一、８２％同一、８３％同一、８４％同一、８５％同一、８６％同一、８７％同一、８８％同一、８９％同一、９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％または９９％同一）であるアミノ酸配列であって、そのアミノ酸配列が５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する；および（ｂ）配列番号７２９に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含み、（ａ）  および（ｂ）に関して、アミノ酸残基の位置は、配列番号７３０のアミノ酸配列との最適アラインメントによって決定される（段落０４０−０４４の記述を参照）。
【０１４１】
その他の実施形態において、本発明は、ＨＨＤＨ活性を有する単離または組換えポリペプチドに関し、このポリペプチドは、以下：（ａ）配列番号７３０と少なくとも８０％同一（配列番号７３０に対し、通常少なくとも８５％同一、より通常的には少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９７％同一、さらにより好ましくは少なくとも９８％同一、および最も好ましくは少なくとも９９％同一）であるアミノ酸配列であって、３８位のＱ、５４位のＩ、１００位のＭ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、２３８位のＴ、および２５１位のＥからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する配列；（ｂ）配列番号７２９に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドが、配列番号７３０と最適アラインメントされた場合に、５４位のＩ、１００位のＭ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、２３８位のＴ、および２５１位のＥからなる群から選択される少なくとも１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列、からなる群から選択される。
【０１４２】
その他の実施形態において、先の段落のポリペプチドは、５４位のＩ、１００位のＭ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、２３８位のＴ、および２５１位のＥからなる群から選択される少なくとも１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する。
【０１４３】
特定の実施形態において、段落０９４のＨＨＤＨポリペプチドは、３８位のＱ、５４位のＩ、１００位のＭ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、２３８位のＴ、および２５１位のＥからなる群から選択される少なくとも１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する。
【０１４４】
その他の実施形態において、本発明は、Ｍ５４Ｉ、Ｔ１００Ｍ、Ｋ１２１Ｒ、Ｐ１３５Ｓ、Ｓ１４６Ａ、Ｗ２３８ＴおよびＧ２５１Ｅからなる群から選択される少なくとも１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する配列番号７３０のポリペプチドに関する。
【０１４５】
段落０９４−０９７のＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列において上述のアミノ酸置換または（特定の位置における）アミノ酸残基の２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７または８の任意の組み合わせを有し得る。
【０１４６】
その他の態様において、本発明は、ＨＨＤＨ活性を有する単離または組換えポリペプチドを含み、このポリペプチドは、配列番号７５０または配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列と少なくとも８６％同一（時には少なくとも８７％同一、８８％同一、８９％同一、９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％または少なくとも９９％同一）であるアミノ酸配列を有する。
【０１４７】
段落０９９中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬ、８５位のＡ、９１位のＥ、９３位のＤ、９５位のＱまたはＧ、９６位のＮ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ、１２０位のＮ、１２１位のＥ、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ、１７８位のＶ、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１９４位のＬ、１９８位のＮ、１９９位のＭ、２１５位のＥ、２３６位のＧ、２３７位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ、および２５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。
【０１４８】
通常、段落０９９のＨＨＤＨポリペプチドは、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と前記参照配列との最適アラインメントによって決定される。ある実施形態において、上述のＨＨＤＨポリペプチドは、２７位のＡ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなる群から選択される。
【０１４９】
特定の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、５位のＶ、４５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、９３位のＴ、１０３位のＴ、１１７位のＴ、１１８位のＳ、１２１位のＩまたはＬまたはＹ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＣ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列によりコードされる。その他の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、５４位のＩ、６０位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、９３位のＴ、９３位のＴ、１００位のＭ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＧ、１７８位のＭまたはＣ、２３８位のＲ、２３９位のＦ、および２４６位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列によりコードされる。これらのＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、６７位のＮ、７２位のＨ、１１７位のＴ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１７７位のＡ、１７９位のＤ、２０１位のＷ、２０５位のＹ、および２４６位のＶからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、以下のアミノ酸残基：６７位のＮ＋７２位のＨ＋１１７位のＴ＋１２１位のＲ＋１３５位のＳ＋１４６位のＡ＋１５４位のＡ＋１７７位のＡ＋１７９位のＤ＋２０１位のＷ＋２０５位のＹ＋２４６位のＶ、を含む。その他の実施形態において、ＨＨＤＨポリペプチドは、５４位のＩ、６０位のＶ、９１位のＥ、９３位のＴ、１００位のＭ、１７７位のＧ、１７８位のＭまたはＣ、２３８位のＲ、および２３９位のＦからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する。
【０１５０】
上述のアミノ酸残基に加えて、段落０１０１−０１０２のＨＨＤＨポリペプチドは、２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ（段落０１０１−０１０２からのものがＶでない場合）、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ（Ｉでない場合）、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ（Ｈでない場合）、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬまたはＶ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ（Ｒでない場合）、９３位のＤ（Ｔでない場合）、９５位のＱまたはＧ（Ａでない場合）、９６位のＮ（Ｅでない場合）、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ（ＲまたはＴでない場合）、１２０位のＮ、１２１位のＥ（ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ（ＲまたはＤでない場合）、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ（Ａでない場合）、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ（ＧまたはＡでない場合）、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９５位のＮ、１９８位のＮ、１９９位のＭ（Ａでない場合）、２０３位のＲ、２１５位のＥ、２２２位のＴ、２３６位のＧ（Ｌでない場合）、２３７位のＶ、２３８位のＬ（ＴまたはＲでない場合）、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ（Ｐでない場合）、および２５４位のＶをさらに含み得、アミノ酸残基の位置は、配列番号２のアミノ酸配列との最適アラインメントによって決定される。これらのＨＨＤＨポリペプチドのあるものは、３７位のＨ、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、７５位のＩ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７４位のＡ、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８１位のＧ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、２２２位のＴ、および２４５位のＶからなるサブグループから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基をさらに含む。
【０１５１】
段落０１０１−０１０２のＨＨＤＨポリペプチドのあるものは、以下のサブグループのひとつから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基をさらに含む：（１）２位のＴ、３位のＡまたはＰまたはＳ、４位のＶ、６位のＤ、９位のＩまたはＦ、１０位のＬ、１３位のＳ、１４位のＳ、１５位のＫ、１６位のＣ、１７位のＴまたはＲ、２０位のＣまたはＳまたはＫ、２４位のＴ、２６位のＱ、２８位のＦ、２９位のＴ、３０位のＡ、３１位のＩ、３３位のＧ、３４位のＲ、３５位のＬ、３６位のＮ、３７位のＨ、４０位のＤ、４４位のＬ、４５位のＰ（Ｉでない場合）、４７位のＰまたはＡ、５１位のＮ、５４位のＶ（Ｉでない場合）、５５位のＲ、５６位のＤ、５８位のＫ、６１位のＧまたはＤ、６３位のＶ、７２位のＲ（Ｈでない場合）、７５位のＩ、７６位のＰ、７８位のＣ、８０位のＱ、８２位のＹ、８４位のＳまたはＬまたはＶ、８５位のＡ、８６位のＷ、８７位のＲ、９１位のＥ（Ｒでない場合）、９３位のＤ（Ｔでない場合）、９５位のＱまたはＧ（Ａでない場合）、９６位のＮ（Ｅでない場合）、９９位のＤ、１００位のＴ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１１４位のＴまたはＳまたはＧ、１１５位のＡ、１１７位のＰ（ＲまたはＴでない場合）、１２０位のＮ、１２１位のＥ（ＲまたはＩまたはＬまたはＹでない場合）、１２２位のＰ、１２６位のＲ、１３０位のＶ、１３３位のＳ、１３４位のＡまたはＶ、１３６位のＬまたはＷまたはＶ、１３９位のＨ（ＲまたはＤでない場合）、１４２位のＩまたはＲ、１４４位のＳ、１４６位のＳ（Ａでない場合）、１５２位のＴ、１５４位のＳまたはＡ、１６８位のＶ、１６９位のＴ、１７７位のＦ（ＧまたはＡでない場合）、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８０位のＩ、１８１位のＧまたはＩ、１８４位のＫ、１８６位のＹ、１８９位のＳ、１９４位のＬ、１９５位のＮ、１９８位のＮ、１９９位のＭ（Ａでない場合）、２０３位のＲ、２１５位のＥ、２２２位のＴ、２３６位のＧ（Ｌでない場合）、２３７位のＶ、２３８位のＬ（ＴまたはＲでない場合）、２４０位のＴ、２４５位のＩまたはＡまたはＶ、２４９位のＹ、２５２位のＶまたはＩ（Ｐでない場合）、および２５４位のＶ；または（２）３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴ；または（３）３７位のＨ、７５位のＩ、１０７位のＫ、１１２位のＡ、１３４位のＡ、１５４位のＡ、１７８位のＶ（ＭまたはＣでない場合）、１８１位のＧ、１８６位のＹ、２２２位のＴ、および２４５位のＶ。上記段落中の挿入句（「Ｘでない場合」）は、アミノ酸残基Ｘが、その残基の位置に関して段落０１０１−０１０２から選択される場合、特定されたアミノ酸残基の位置から特定の残基が除外されるという条件をいう。
【０１５２】
本発明の例示的なＨＨＤＨポリペプチドは、ＨＨＤＨ活性を有する単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドを含み、そのポリペプチドは、以下を含むポリペプチドからなる群から選択される：（ａ）配列番号７５０および配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列に対し少なくとも８０％同一（通常少なくとも８１％同一、８２％同一、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９８％、または少なくとも９９％同一）であるアミノ酸配列であって、その配列が５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰから選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する；および（ｂ）配列番号７４９、配列番号２８４７およびそれらの相補配列からなる群から選択される参照核酸配列に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列であって、前記コードされるポリペプチドが、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基位置が、ＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列と、配列番号７５０および配列番号２８４８（すなわち、参照核酸配列によってコードされるものに相当）からなる群から選択される参照アミノ酸配列との最適アラインメントによって決定される。（段落０４０−０４４中の記述参照）。
【０１５３】
特定の実施形態において、本発明は、ＨＨＤＨ活性を有する単離または組換えポリペプチドに関し、そのポリペプチドは以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する：（ａ）配列番号７５０および配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列と少なくとも８０％同一（配列番号７５０または配列番号２８４８に対して通常少なくとも８５％同一、より通常的には少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９７％同一、さらにより好ましくは少なくとも９８％または９９％同一）であり、その配列が２７位のＡ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有する；および（ｂ）配列番号７４９または配列番号２８４７に相当する参照核酸配列の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列であって、配列番号７５０または配列番号２８４８にそれぞれ相当する参照ポリペプチドと最適アラインメントされた場合に、そのコードされるポリペプチドが、２７位のＡ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５４】
さらにその他の実施形態において、本発明は、ＨＨＤＨ酵素活性を有する単離または組換えポリペプチドに関し、そのポリペプチドは以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する：配列番号７５０および配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列と少なくとも８０％同一（配列番号７５０または配列番号２８４８に対して通常少なくとも８５％同一、より通常的には少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９７％同一、さらにより好ましくは少なくとも９８％同一、および最も好ましくは９９％同一）であり、２７位のＡ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４４位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなる群から選択される２以上の残基を含む。
【０１５５】
その他の実施形態において、本発明はＨＨＤＨ活性を有する単離または組換えポリペプチドに関し、そのポリペプチドは以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む：（ａ）配列番号７５０および配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列と少なくとも８０％同一（配列番号７５０または配列番号２８４８に対して通常少なくとも８５％同一、より通常的には少なくとも９０％同一、好ましくは少なくとも９５％同一、より好ましくは少なくとも９７％同一、さらにより好ましくは少なくとも９８％同一、および最も好ましくは９９％同一）であり、２７位のＡ、３８位のＱ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４４位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなる群から選択される２以上の残基を含む；および（ｂ）配列番号７４９または配列番号２８４７に相当する参照核酸配列の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列であって、配列番号７５０または配列番号２８４８にそれぞれ相当する参照ポリペプチドと最適アラインメントされた場合に、そのコードされるポリペプチドが、２７位のＡ、３８位のＱ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４４位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなる群から選択される２以上の残基を有するアミノ酸配列を含む。より好ましい実施形態において、「２以上の残基」とは、３以上の残基である。さらにより好ましい実施形態において、３以上の残基とは以下の３残基である：１２１位のＲ、１３５位のＳ、および、１４６位のＡ。
【０１５６】
その他の実施形態において、本発明はまた、ＨＨＤＨ活性を有する単離または組換えポリペプチドに関し、そのポリペプチドは配列番号７５０または配列番号２８４８と少なくとも９７％同一であり、そのポリペプチドのアミノ酸配列が２７位のＡ、３８位のＱ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、８７位のＳ、９１位のＲ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１１７位のＲ、１１８位のＳ、１２１位のＲ、１３５位のＳ、１４４位のＳ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１７８位のＭ、１７９位のＮ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴ、および２５１位のＥまたはＡからなる群から選択される２以上の残基を有するアミノ酸配列を含む。
【０１５７】
段落０１０５−０１０９中に記述されるＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列において（特定の位置における）上述のアミノ酸残基の２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、または２０以上の任意の組み合わせを有し得る。
【０１５８】
本発明の例示的なＨＨＤＨポリペプチドには、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドを含む：（ａ）配列番号２０４０、配列番号２１３０、配列番号１９２６、配列番号２３４８、配列番号１９８４からなる群から選択される参照配列に対し少なくとも８０％同一（時には少なくとも８１％同一、８２％同一、８３％同一、８４％同一、８５％同一、８６％同一、８７％同一、８８％同一、８９％同一、９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９６％同一、９７％同一、９８％同一、または９９％同一）であるアミノ酸配列であって、そのアミノ酸配列が５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する；および（ｂ）配列番号２０３９、配列番号２１２９、配列番号１９２５、配列番号２３４７、配列番号１９８３およびそれらの相補配列からなる群から選択される参照核酸配列に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるアミノ酸配列であって、前記コードされるポリペプチドが、５位のＶ、２７位のＡ、４５位のＶ、４６位のＱ、５４位のＩ、６０位のＶ、６５位のＶ、６７位のＮ、７２位のＨ、７７位のＩ、８７位のＳ、９１位のＲ、９３位のＴ、９５位のＡ、９６位のＥ、１００位のＭまたはＱ、１０３位のＴ、１１７位のＲまたはＴ、１１８位のＳ、１２１位のＲまたはＩまたはＬまたはＹ、１３５位のＳ、１３９位のＲ＋１７６位のＥまたは１３９位のＤ＋１７６位のＲ、１４６位のＡ、１５３位のＮ、１６６位のＨ、１７７位のＧまたはＡ、１７８位のＭまたはＣ、１７９位のＮまたはＤ、１８０位のＤまたはＴ、１８１位のＫ、１８２位のＮ、１９０位のＶ、１９９位のＡ、２０１位のＷまたはＹ、２０５位のＹ、２３６位のＬ、２３８位のＴまたはＲ、２３９位のＦ、２４６位のＶ、２５１位のＥまたはＡまたはＳ、および２５２位のＰからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸を含むアミノ酸配列を有し、（ａ）および（ｂ）において、アミノ酸残基の位置が、ＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列と、参照核酸配列によってコードされるアミノ酸配列（すなわち配列番号２０４０、配列番号２１３０、配列番号１９２６、配列番号２３４８、配列番号１９８４のそれぞれ）との最適アラインメントによって決定される。（段落０４０−０４４参照）。
【０１５９】
特筆すべきことに、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、実施例５Ａ中に記述されるアッセイにおいて測定されるように、配列番号２の野生型ＨＨＤＨに対して改良された（すなわち、より大きい）ＨＨＤＨ酵素活性を有するものを含む。例えば、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、しばしば、実施例５Ａ中に記述されるアッセイにおいて測定されるように、配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＨＨＤＨよりも少なくとも１．４倍大きいＨＨＤＨ酵素活性を有する。
【０１６０】
本発明のいくつかのＨＨＤＨポリペプチド（例えば、本明細書中で記述される配列番号７４０、７４２、７２８、９０、９２、９４、９６、および多くのその他のものを含む）は、その酵素活性を実施例５Ａ中に記述されるアッセイにおいて測定した場合に、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＨＨＤＨ（配列番号２）のＨＨＤＨ活性より少なくとも２倍、およびしばしば少なくとも２．４倍〜１００倍大きいＨＨＤＨ活性を有し；本発明のＨＨＤＨポリペプチドはまた、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＨＨＤＨ（例えば、本明細書中に記述される配列番号１００、７３２、７３４、７３６および多くのその他のものを含む）のＨＨＤＨ活性より１００倍〜５００倍大きいＨＨＤＨ活性を有するものを含み；ＨＨＤＨポリペプチドのあるものは、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＨＨＤＨ（例えば、本明細書中に記述される配列番号７２６、７３０および多くのその他のものを含む）のＨＨＤＨ活性より５００倍〜１０００倍大きいＨＨＤＨ活性を有する。従って、本明細書中で記述される単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドは、その酵素活性を実施例５Ａ中に記述されるアッセイにおいて測定した場合に、配列番号２のアミノ酸配列を有する野生型ＨＨＤＨと比較して少なくとも１．４倍（通常、１．４倍〜１０，０００倍、より通常的には１．４倍〜１０００倍）大きいＨＨＤＨ活性を有するものを含む。
【０１６１】
特定の実施形態において、本発明は、通常、配列番号２の野生型ＨＨＤＨと比較して大きいＨＨＤＨ活性を有し、および配列番号４４２と少なくとも８９％同一であるアミノ酸配列を有し；通常、配列番号４４２と９３％同一であり；より通常的には配列番号４４２と９５％同一であり；さらに通常的には配列番号４４２と９７％同一であり；最も通常的には配列番号４４２と９９％同一である、単離または組換えポリペプチドに関する。
【０１６２】
その他の実施形態において、本発明は、通常、配列番号２を有する野生型ＨＨＤＨと比較して大きいＨＨＤＨ活性を有し、および配列番号７０２と少なくとも８８％同一であるアミノ酸配列を有し；通常、配列番号７０２と９３％同一であり；より通常的には配列番号７０２と９５％同一であり；さらに通常的には配列番号７０２と９７％同一であり；最も通常的には配列番号７０２と９９％同一である、単離または組換えポリペプチドに関する。
【０１６３】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１１６または４４８と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を有するＨＨＤＨポリペプチドを提供する。本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号１１６または４４８と少なくとも９７％同一、９８％同一、および９９％同一であるものを含む。
【０１６４】
本発明はさらに、本発明は、配列番号１１６または４４８と少なくとも９６％同一であるアミノ酸配列を有するＨＨＤＨポリペプチドを提供する。望ましくは、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号２６４、２６６、４７０または４７６と少なくとも９６％同一、９７％同一、９８％同一、および９９％同一であるアミノ酸配列を有するＨＨＤＨポリペプチドを含む。
【０１６５】
本発明は、商業的な関連プロセス条件下でＥＣＨＢのＨＮ生成物への変換を触媒するＨＨＤＨポリペプチドを含む。実施例５Ｄは、商業的な関連プロセス条件下で、ＥＣＨＢのＨＮ生成物への変換を触媒するＨＨＤＨポリペプチドの能力を評価するためのアッセイを提供する。本明細書中で記述するＨＨＤＨポリペプチドの多くは、実施例５Ｄのアッセイにおいて商業的な関連プロセス条件下でのすぐれたＨＨＤＨ活性を呈する。従って、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、実施例５Ｄのアッセイにおいて検出可能なＨＨＤＨ活性を呈するものを含む。本明細書中で記述するＨＨＤＨポリペプチドの多くは、実施例５Ｄのアッセイにおいて、配列番号７３０に相当する改良ＨＨＤＨポリペプチドよりすぐれたＨＨＤＨ活性を呈し、その配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチド自体は、実施例５Ｄのアッセイにおいて野生型ＨＨＤＨ（配列番号２）に対して優れた活性を呈する。従って、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、実施例５Ｄのアッセイにおいて、商業的な関連プロセス条件下で配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドよりも大きい活性を有するものを含む。多くのものは、実施例５Ｄのアッセイにおいて配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも１．５倍大きい活性を呈する。
【０１６６】
先の段落におけるＨＨＤＨポリペプチドのうちのあるものは、実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドと比較して少なくとも２倍、あるものは配列番号７３０に相当するＨＨＤＨポリペプチドと比較して少なくとも２．５倍、３倍、４倍から、約１０倍または１００倍のＨＨＤＨ活性を有する。
【０１６７】
特定の実施形態において、本発明は、配列番号２、配列番号７５０、配列番号１９２６、配列番号１９８４、配列番号２０４０、配列番号２１３０、配列番号２３４８、および配列番号２８４８からなる群から選択される参照配列に対し少なくとも７５％同一（時には参照配列に対し少なくとも７６％同一、７７％同一、７８％同一、７９％同一、８０％同一、８５％同一、８６％同一、８７％同一、８８％同一、８９％同一、９０％同一、９１％同一、９２％同一、９３％同一、９４％同一、９５％同一、９５％同一、９６％同一、９８％同一、または９９％同一）であるアミノ酸配列を含む単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドであって、そのＨＨＤＨポリペプチドは実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０に相当するＨＨＤＨポリペプチドと比較して少なくとも１．５倍のＨＨＤＨ活性を有する。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、段落０１２０のＨＨＤＨポリペプチドは、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有し、アミノ酸残基の位置は、ＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列と配列番号２との最適アラインメントによって決定される。これらのＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列において（特定の位置における）これらのアミノ酸残基のうち２以上、または３以上、または４以上、または５以上、または６以上、または７以上、または８以上、または９以上、または１０以上、または１１以上、または１２以上、または１３以上、または１４以上、または１５全ての任意の組み合わせを有し得る。特定の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、および２０３位のＲからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含む。これらのＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列において（特定の位置における）これらのアミノ酸残基のうち２以上、または３以上、または４以上、または５以上、または６以上、または７以上、または８以上、または９以上、または１０以上、または１１以上、または１２以上、または１３全ての任意の組み合わせを有し得る。
【０１６９】
その他の実施形態において、ＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号２の配列、および以下の２つの置換群のそれぞれから選択される１またはそれ以上の置換を含み：（ａ）Ｍ５４Ｉ、Ａ６０Ｖ、Ｋ９１Ｅ、Ａ９３Ｔ、Ａ１００Ｍ、Ｙ１７７Ｇ、Ｌ１７８Ｍ／Ｃ、Ｗ２３８Ｒ、およびＬ２３９Ｆ；および（ｂ）Ｓ２Ｔ、Ｔ３Ａ／Ｐ／Ｓ、Ａ４Ｖ、Ｉ５Ｖ、Ｖ６Ｄ、Ｖ９Ｉ／Ｆ、Ｋ１０Ｌ、Ｇ１３Ｓ、Ｇ１４Ｓ、Ｍ１５Ｋ、Ｇ１６Ｃ、Ｓ１７Ｔ／Ｒ、Ｒ２０Ｃ／Ｓ／Ｋ、Ａ２４Ｔ、Ｈ２６Ｑ、Ｔ２７Ａ、Ｖ２８Ｆ、Ａ２９Ｔ、Ｃ３０Ａ、Ｈ３１Ｉ、Ｅ３３Ｇ、Ｓ３４Ｒ、Ｆ３５Ｌ、Ｋ３６Ｎ、Ｑ３７Ｈ、Ｅ４０Ｄ、Ｆ４４Ｌ、Ａ４５Ｐ／Ｖ、Ｅ４６Ｑ、Ｔ４７Ｐ／Ａ、Ｌ５１Ｎ、Ｍ５４Ｖ／Ｉ、Ｓ５５Ｒ、Ｅ５６Ｄ、Ｅ５８Ｋ、Ａ６０Ｖ、Ｅ６１Ｇ／Ｄ、Ｉ６３Ｖ、Ａ６５Ｖ、Ｔ６７Ｎ、Ｑ７２Ｒ／Ｈ、Ｖ７５Ｉ、Ｌ７６Ｐ、Ｖ７７Ｉ、Ｓ７８Ｃ、Ｄ８０Ｑ、Ｆ８２Ｙ、Ｐ８４Ｓ／Ｌ、Ｅ８５Ａ、Ｑ８７Ｓ、Ｋ９１Ｅ／Ｒ、Ａ９３Ｄ／Ｔ、Ｅ９５Ｑ／Ｇ／Ａ、Ｄ９６Ｎ／Ｅ、Ａ１００Ｍ／Ｑ、Ａ１０３Ｔ、Ｒ１０７Ｋ、Ｖ１１２Ａ、Ａ１１４Ｔ／Ｓ／Ｇ、Ｖ１１５Ａ、Ｓ１１７Ｐ／Ｒ／Ｔ、Ｑ１１８Ｓ、Ｋ１２０Ｎ、Ｋ１２１Ｅ／Ｒ／Ｉ／Ｌ／Ｙ、Ｒ１２２Ｐ、Ｈ１２６Ｒ、Ｉ１３０Ｖ、Ａ１３３Ｓ、Ｔ１３４Ａ／Ｖ、Ｐ１３５Ｓ、Ｆ１３６Ｌ／Ｗ／Ｖ、Ｗ１３９ＨまたはＷ１３９Ｒ＋Ｎ１７６ＥまたはＷ１３９Ｄ＋Ｎ１７６Ｒ、Ｌ１４２Ｉ／Ｒ、Ｔ１４４Ｓ、Ｔ１４６Ｓ／Ａ、Ａ１５２Ｔ、Ｃ１５３Ｎ、Ｔ１５４Ｓ／Ａ、Ｙ１６６Ｈ、Ｉ１６８Ｖ、Ｐ１６９Ｔ、Ｙ１７７Ｆ／Ｇ／Ａ、Ｌ１７８Ｖ／Ｍ／Ｃ、Ｈ１７９Ｎ／Ｄ、Ｓ１８０Ｉ／Ｄ／Ｔ、Ｅ１８１Ｇ／Ｉ／Ｋ、Ｄ１８２Ｎ、Ｐ１８４Ｋ、Ｆ１８６Ｙ、Ｅ１９０Ｖ、Ｔ１９４Ｌ、Ｈ１９８Ｎ、Ｖ１９９Ｍ／Ａ、Ｈ２０１Ｗ／Ｙ、Ｖ２０５Ｙ、Ｋ２１５Ｅ、Ｖ２３６Ｇ／Ｌ、Ｆ２３７Ｖ、Ｗ２３８Ｌ／Ｔ／Ｒ、Ｌ２３９Ｆ、Ａ２４０Ｔ、Ｍ２４５Ｉ／Ａ／Ｖ、Ｉ２４６Ｖ、Ｗ２４９Ｙ、Ｇ２５１Ｅ／Ａ／Ｓ、Ｍ２５２Ｖ／Ｉ／Ｐ、およびＥ２５４Ｖ、そのＨＨＤＨポリペプチドは実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０に相当するＨＨＤＨポリペプチドと比較して少なくとも１．５倍のＨＨＤＨ活性を有する。
【０１７０】
上記段落中で記述されるＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列は、以下：（ａ）群の置換における２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、または１５全ての任意の組み合わせ；および、（ｂ）群中に挙げられる置換における２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、１６以上、１７以上、１８以上、１９以上、または２０以上の任意の組み合わせ、を有し得る。
【０１７１】
段落０１２０−０１２３のＨＨＤＨポリペプチドのいくつかは、配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドと比較して約２倍大きいＨＨＤＨ活性を有し、あるものは実施例５Ｄのアッセイで測定されると、配列番号７３０に相当するＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも２．５倍、３倍、４倍〜約１０倍または１００倍大きいＨＨＤＨ活性を有する。
【０１７２】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、
【０１７３】
【化８７】
2008537477.tif 000052
【０１７４】
【化８８】
2008537477.tif 000053
【０１７５】
【化８９】
2008537477.tif 000054
【０１７６】
【化９０】
2008537477.tif 000055
からなる群から選択される参照核酸配列およびそのから相補的配列なる群からなる参照核酸配列に相当する核酸の実質的全長に亘ってストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸によりコードされるものを含み、そのコードされるＨＨＤＨポリペプチドは配列番号２の野生型ＨＨＤＨよりも大きいＨＨＤＨ活性を有する。通常これらのＨＨＤＨポリペプチドは、以下：（ａ）実施例５Ａのアッセイで測定される場合に配列番号２のＨＨＤＨポリペプチドより少なくとも１．４倍大きい；または（ｂ）実施例５Ｄのアッセイで測定される場合に配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドより少なくとも１．５倍大きい、のいずれかであるＨＨＤＨ活性を有する。
【０１７７】
先の段落における（ｂ）で一部記述されたＨＨＤＨポリペプチドのあるものは、配列番号７３０に相当するＨＨＤＨポリペプチドより約２倍大きいＨＨＤＨ活性を有し、あるものは配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドより、少なくとも２．５倍、３倍、４倍〜約１０倍または１００倍大きいＨＨＤＨ活性を有する。
【０１７８】
段落０１２５における（ｂ）で一部記述されたＨＨＤＨポリペプチドは、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、８７位のＲ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、２０３位のＲ、および２２２位のＴからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を含み、アミノ酸残基位置が、ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と配列番号２との最適アラインメントによって決定され、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列において（特定の位置における）これらのアミノ酸残基のうち２以上、または３以上、または４以上、または５以上、または６以上、または７以上、または８以上、または９以上、または１０以上、または１１以上、または１２以上、または１３以上、または１４以上、または１５全ての任意の組み合わせを有し得る。特定の実施形態において、これらのＨＨＤＨポリペプチドは、３８位のＱ、５２位のＩ、７０位のＬ、８２位のＡ、８３位のＰ、８４位のＶ、８６位のＷ、９９位のＤ、１００位のＴ、１７４位のＡ、１８９位のＳ、１９５位のＳ、および２０３位のＲからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有する。これらのＨＨＤＨポリペプチドは、それらの配列において（特定の位置における）これらのアミノ酸残基のうち２以上、または３以上、または４以上、または５以上、または６以上、または７以上、または８以上、または９以上、または１０以上、または１１以上、または１２以上、または１３全ての任意の組み合わせを有し得る。
【０１７９】
段落０１２５中に記述されるコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸残基の位置は、参照アミノ酸配列との最適アラインメントによって決定される。参照アミノ酸配列は参照核酸配列によりコードされ、従って、配列番号：
【０１８０】
【化９１】
2008537477.tif 000056
【０１８１】
【化９２】
2008537477.tif 000057
【０１８２】
【化９３】
2008537477.tif 000058
【０１８３】
【化９４】
2008537477.tif 000059
からなる群からそれぞれ選択される。
【０１８４】
さらなる実施形態において、本発明は、生成物であるシアノヒドリン、例えばエチル（Ｒ）４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの存在下でＨＨＤＨ活性を呈するＨＨＤＨポリペプチド提供する。シアノヒドリンによる阻害に対し耐性を有するＨＨＤＨポリペプチドは、実施例５Ｂ中に記述されるアッセイを用いて容易に同定することができる。実施例５Ｂは、生成物阻害に関し強い耐性を有する酵素のアッセイ方法のプロトコールを記述する。実施例５Ｂ中に記述されるアッセイにおいて、生成物であるエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの存在下においても顕著なＨＨＤＨ活性を呈する例示的なＨＨＤＨポリペプチドには、配列番号：
【０１８５】
【化９５】
2008537477.tif 000060
【０１８６】
【化９６】
2008537477.tif 000061
【０１８７】
【化９７】
2008537477.tif 000062
に相当するＨＨＤＨポリペプチドを含む。
【０１８８】
実施例５Ｂのアッセイにおいて、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートをエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへと変換する能力を呈するポリペプチドはまた、実施例５ＡのアッセイにおけるＨＨＤＨ活性をも示す。配列リストにおいて上述されるポリペプチド配列の全ては、実施例５Ａのアッセイにおいて活性を呈する。
【０１８９】
エチル−４−クロロアセトアセテート（ＥＣＡＡ）は、ケトレダクターゼ（ＫＲＥＤ）／グルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）を用いてエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（ＥＣＨＢ）を生成するための共役縮合反応の基質である。国際公開第２００４／１５１３２号および国際公開第２００５／０１８５７９号参照、両者を参照により本明細書中に組み入れるものとする。次いでＥＣＨＢをＨＨＤＨ反応の基質として使用する。しかしＥＣＡＡ出発物質はＨＨＤＨの強力な阻害剤である（Ｋｉは約７０μＭ）。所望されるものが９９．９７％である代わりに、ＫＲＥＤ／ＧＤＨに触媒される反応が９９．９％完了し得るため、０．１％のＥＣＡＡがＥＣＨＢ材料の中に残留し得る。この０．１％のＥＣＡＡがＨＨＤＨ反応を阻害し得る。言い換えれば、第１の反応由来の残留基質が第２の反応の阻害物質である。すなわち、本発明のＨＨＤＨポリペプチドはＥＣＡＡによる阻害への耐性を有することが望ましい。
【０１９０】
出願人らは、ＥＣＡＡによる阻害に対し増大された耐性を示す本発明のＨＨＤＨを作製するために、配列番号２におけるアラインメントに関し以下の残基を作製できることを見出した：Ａ４Ｖ、Ａ８２Ｙ、Ａ１３４Ｖ、Ｇ１３６Ｗ、Ｇ１３６Ｖ、Ｌ１４２Ｒ、Ｌ１７８Ｖ、Ｗ２３８Ｌ、Ａ２４０Ｔ、Ｗ２４９Ｙ、Ｍ２５２Ｉ、Ｋ１０Ｌ、Ｅ１８１Ｉ／Ｋ、Ｈ１９８Ｎ、Ｋ２１５Ｅ、Ｓ１８０Ｉ／Ｄ／Ｔ、Ｗ１３９Ｈ、およびＭ５４Ｖ。従って、その他の実施形態において、本発明はＥＣＡＡによる阻害に対し耐性の、４位のＶ、８２位のＹ、１３４位のＶ、１３６位のＷ、１３６位のＶ、１４２位のＲ、１７８位のＶ、２３８位のＬ、２４０位のＴ、２４９位のＹ、２５２位のＩ、１０位のＬ、１８１位のＩまたはＫ、１９８位のＮ、２１５位のＥ、２８０位のＩまたはＤまたはＴ、１３９位のＨ、および５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する本発明のＨＨＤＨポリペプチドに関し、アミノ酸残基の位置は、ＨＨＤＨポリペプチドの前記アミノ酸配列と配列番号２との最適アラインメントによって決定される。いくつかの実施形態において、ＥＣＡＡによる阻害に対し耐性のＨＨＤＨポリペプチドは、１０位のＬ、１８１位のＩまたはＫ、１９８位のＮ、２１５位のＥ、１８０位のＤまたはＴ、１３９位のＨ、および５４位のＶからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する。ＥＣＡＡによる阻害に対し耐性の特定のＨＨＤＨポリペプチドは、１８０位のＤまたはＴおよび１８１位のＫからなる群から選択される１またはそれ以上のアミノ酸残基を有するアミノ酸配列を有する。ＥＣＡＡ存在下で本発明のＨＨＤＨポリペプチドを試験するための方法は、本明細書中で実施例５Ｃ中に開示されている。実施例５Ｃから得られる反応産物をスクリーニングするためのガスクロマトグラフィー法は、本明細書中で実施例６Ｂ中に開示されている。
【０１９１】
本発明の特定のＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号：
【０１９２】
【化９９】
2008537477.tif 000063
【０１９３】
【化１００】
2008537477.tif 000064
【０１９４】
【化１０１】
2008537477.tif 000065
【０１９５】
【化１０２−１】
2008537477.tif 000066
に相当するアミノ酸配列を有するものを含む。これらのＨＨＤＨポリペプチドの全ては、実施例５Ａ、５Ｂまたは５Ｄにおいて記述されるアッセイの少なくともひとつにおいて立証された活性を有する。
【０１９６】
これらのＨＨＤＨポリペプチドをコードする例示的なＨＨＤＨポリヌクレオチドが、本明細書中で、配列番号：
【０１９７】
【化１０２−２】
2008537477.tif 000067
【０１９８】
【化１０３】
2008537477.tif 000068
【０１９９】
【化１０４】
2008537477.tif 000069
【０２００】
【化１０５−１】
2008537477.tif 000070
としてそれぞれ提供される。
【０２０１】
本発明はまた、以下の配列番号：
【０２０２】
【化１０５−２】
2008537477.tif 000071
【０２０３】
【化１０６】
2008537477.tif 000072
【０２０４】
【化１０７】
2008537477.tif 000073
【０２０５】
【化１０８】
2008537477.tif 000074
の任意のひとつにおける１〜２０のアミノ酸残基の置換、欠失、および／または挿入を有するアミノ酸配列を有する単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドを提供する。これらのＨＨＤＨポリペプチドは、１〜２、または１もしくは２から３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０残基の置換、欠失、および／または挿入を有し得る。
【０２０６】
通常、段落０１３５のＨＨＤＨポリペプチドは、実施例５Ａのアッセイにおいて測定される場合に、配列番号２のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも１．４倍大きいＨＨＤＨ活性を有し；または（ｂ）実施例５Ｄのアッセイにおいて測定される場合に、配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドよりも少なくとも１．５倍大きいＨＨＤＨ活性を有する。
【０２０７】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドの変異体は、当業者によく知られた方法を用いて生成することができる。これらの変異体のライブラリーが作製され、実施例４Ａにおいて記述されるＨＨＤＨ活性の存在に関するハイスループットスクリーニングを用いてスクリーニングされ得る。いくつかの例においては、例えばエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート等のシアノヒドリン産物阻害剤の存在下で活性を呈するハロヒドリンデハロゲナーゼを同定することが望ましい場合があり得る。このような酵素を同定するためのハイスループットのスクリーニングが実施例４Ｂ中で提供される。生成物であるシアノヒドリンの存在下でＨＨＤＨ活性を呈する変異体を、実施例５Ｂ中に記述されるアッセイを用いてさらに特徴づけることができる。ＥＣＡＡ阻害に耐性を有する本発明のＨＨＤＨポリペプチドを同定することが望ましいであろう。ＥＣＡＡ阻害への耐性をスクリーニングする方法は、実施例５Ｃにおいて提供される。上述のように、非常に低スループットのスケールアップ反応におけるＨＨＤＨにより触媒される変換に対し、ＥＣＨＢをＨＮへと十分に完了させるための時間をアッセイする方法は、実施例５Ｄ中で提供される。
【０２０８】
変異体ライブラリーを生成する方法は当技術分野でよく知られている。例えば、本明細書中で記述する方法を用いて発現され、スクリーニングされ、およびアッセイされ得る変異体ライブラリーを生成するために、突然変異生成および指向進化法を、（例えば、野生型ＨＨＤＨをコードするポリヌクレオチドまたは本発明のポリヌクレオチド等の）ポリヌクレオチドに対して容易に適用することができる。突然変異生成および指向進化法は当技術分野でよく知られている。例えば、Ｌｉｎｇら，“Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：  ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，”Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４（２）：１５７−７８（１９９７）；Ｄａｌｅら，“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ，”Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５７：３６９−７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら，“Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，“Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，”Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３７：１−７（１９８６）；Ｋｒａｍｅｒら，“Ｐｏｉｎｔ  Ｍｉｓｍａｔｃｈ  Ｒｅｐａｉｒ，”Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｗｅｌｌｓら，“Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，”Ｇｅｎｅ，３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら，“Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３：２８４−２９０（１９９９）；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｆｏｒ  ＡＺＴ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｆａｍｉｌｙ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７：２５９−２６４（１９９９）；Ｃｒａｍｅｒｉら，“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ｄｉｖｅｒｓｅ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｅｓ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１；Ｃｒａｍｅｒｉら，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ａｒｓｅｎａｔｅ  ｄｅｔｏｘｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５：４３６−４３８（１９９７）；Ｚｈａｎｇら，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｆｕｃｏｓｉｄａｓｅ  ｆｒｏｍ  ａ  ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ａ���ｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４５−４−４５０９；Ｃｒａｍｅｒｉら，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｙ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１４：３１５−３１９（１９９６）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，“Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１（１９９４）；Ｓｔｅｍｍｅｒ，“ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｕ．Ｓ．Ａ．，９１：１０７４７−１０７５１（１９９４）；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；および国際公開第０１／７５７６７号参照。
【０２０９】
その他の実施形態において、本発明はまた、実施例５Ａのアッセイ中に記述されるようなＨＨＤＨ活性を有する、本明細書中で記述されるＨＨＤＨポリペプチドの断片を提供する。これらの断片を本明細書中で「ＨＨＤＨ断片」と称する。本明細書中で使用されるとき、用語「断片」は、カルボキシ末端、アミノ末端、または両方からの１〜１５アミノ酸残基の欠失を有するポリペプチドを称する。特定の実施形態において、欠失はカルボキシ末端、アミノ末端、または両方からの１〜１４残基である。いくつかの実施形態において、欠失はカルボキシ末端、アミノ末端、または両方からの１〜１０残基、または１〜５残基である。本発明のＨＨＤＨ断片は、実施例５ＡのアッセイにおけるＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．（野生型）ＨＨＤＨ（配列番号２）のＨＨＤＨポリペプチドのＨＨＤＨ活性よりも少なくとも１．４倍大きい活性を有する；または実施例５Ｄのアッセイにおける配列番号７３０のＨＨＤＨ活性よりも少なくとも１．５倍大きい活性を有するものを含む。
【０２１０】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、配列番号２の野生型ＨＨＤＨと比較して増強された熱安定性を有する単離および組換えＨＨＤＨポリペプチドを含む。増強された熱安定性は、５０℃で２時間のインキュベート時間を含む、実施例５Ｂのミディアムスループットアッセイにおいて、ＨＨＤＨポリペプチドのＨＨＤＨ活性を野生型ＨＨＤＨ（配列番号２）のものと比較することにより容易に調べることができる。増強された熱安定性を有するＨＨＤＨポリペプチドは、ヒスチジン残基を７２位に有するものを含み、アミノ酸の位置は、配列番号２（すなわち、Ｑ７２Ｈ突然変異）を有するＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列との最適アラインメントにより決定される。
【０２１１】
ＨＨＤＨポリペプチドに対する残基変化の各々は、配列変化と所望される機能（例えば、増加されたＨＨＤＨ酵素活性）との間に、あるとすればどのような関係が存在するかを調べるために評価された。そうするために、国際公開第００／４２５６１中に記述される方法により、および後述する突然変異生成方法により、作製される多数のライブラリー中の配列変化および得られるＨＨＤＨ活性を、２００３年３月３日に出願され、「機能性生分子を同定するための方法、システム、およびソフトウェア」と題し、参照により本明細書中に組み入れるものとする米国特許出願第１０／３７９，３７８号中に開示される方法により評価した。Ｒ．Ｆｏｘら，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２３４（２００５）およびＲ．Ｆｏｘら，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６（２００３）も参照、両者を参照により本明細書中に組み入れるものとする。この方法に基づいて、活性に対し有利に相関するように見える特定の位置に重要な残基をコードするコドンを同定し、続いて生成されるコンビナトリアルライブラリーにおけるポリヌクレオチドへと組み入れた。言い換えれば、所望される変化をコードするポリヌクレオチドを作製し、発現させ、次いでスクリーニングした。その方法を得られる配列に対し再度適用し、ＨＨＤＨ活性を特徴づける。その結果を、次のライブラリーへのプログラミングのためにＨＨＤＨ活性を向上させるそれらの残基変化を選択するために再度利用する。この方法を用いて、多様な配列変化の機能性が迅速な評価へと供される。野生型ＨＨＤＨに対して増強された酵素活性を提供する、多様な残基の位置における残基変異が、配列において、および、そうでなければ同定される位置における好ましい残基として、本明細書中で開示される。従って、実施例４のハイスループットスクリーニングおよび実施例５Ａのアッセイを利用する上記の指向進化法を、本明細書中で記述するＨＨＤＨポリペプチドのさらなる変異体を同定するために使用することができる。変異体ＨＨＤＨポリペプチドのさらなる特徴づけは実施例５Ｂ、５Ｃ、または５Ｄのアッセイを用いて行うことができ、それらは上記に詳述されている。
【０２１２】
配列−活性分析は、上述される突然変異が配列番号２の野生型ＨＨＤＨに対して活性を増加させることに関し、好ましいようにみえる。配列−活性分析は、国際公開第０３／０７５１２９号、２００３年３月３日に出願された米国特許出願第１０／３７９，３７８号、およびＲ．Ｆｏｘら，“Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６（８）：５８９−５９７（２００３）中に記述される方法により実行され、その両者を参照により本明細書中に組み入れるものとする。Ｒ．Ｆｏｘら，“Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｂｙ  ｍａｃｈｉｎｅ  ｌｅａｒｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．２３４（２）：１８７−１９９（２００５）も参照、参照により本明細書中に組み入れるものとする。この分析はまた、７９位のアスパラギン残基が本明細書中で記述されるＨＨＤＨポリペプチドと関連するＨＨＤＨ活性に関して有益であるようにみえることをも示す。したがって、本発明は、本明細書中で記述するＨＨＤＨポリペプチドの実施形態の任意の１つにおける特徴を有する、単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドを提供し、そのＨＨＤＨポリペプチドのアミノ酸配列は７９位のアスパラギン残基をさらに含む。同様に、１７５位のプロリンおよび１８７位のチロシンは、それらの位置における好ましい残基であるようにみえる。したがって、本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、本明細書中で記述する実施形態の任意の１つの単離および組換えＨＨＤＨポリペプチドを含み、さらに、１７５位のプロリンおよび１８７位のチロシンからなる群から選択されるアミノ酸残基を含む。
【０２１３】
本明細書中で記述される突然変異の構造解析は、それらがＨｈｅＣ構造中の結合生成物中の７．５Åの範囲内の活性部位に突然変異のいくつかを有するタンパク質全体に亘って分布することを示した。ＨＨＤＨの四次構造に関しては、Ｒ．Ｍ．ＤｅＪｏｎｇら，ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２２：４９３３（２００３）参照、参照により本明細書中に組み入れるものとする。生成物アナログまたはＣｌ−イオンと直接的に相互作用する１１残基のうち、４つは変異されている：（配列番号２の野生型ＨＨＤＨに関して）Ｆ１８６Ｙ、Ｔ１３４Ａ、Ｙ１７７Ａ／Ｇ、およびＬ１７８Ｃ／Ｍ／Ｖ。このセットにおける、変異を有さない接触位置のうちの２つ：１３２位のＳおよび１４５位のＹは、ＨＨＤＨポリペプチドの触媒トライアドの一部である。従って、本発明は、本明細書中で記述されるＨＨＤＨポリペプチドの実施形態における任意の１つの特徴を有する単離または組換えＨＨＤＨポリペプチドを提供し、そのＨＨＤＨポリペプチドはさらに、１３２位のセリンおよび／または１４５位のチロシンを含む。構造解析は、２つの残基、Ｗ１３９およびＮ１７６が、２つの中間体活性変異体：Ｗ１３９Ｒ／Ｎ１７６ＥおよびＷ１３９Ｄ／Ｎ１７６Ｒ（配列番号２を参照して）において明らかな塩橋へと変異されたことを示した。これらのタンパク質の両者は、野生型ＨＨＤＨ（配列番号２）に対して、より大きなＨＨＤＨ活性を呈する。進化的に関連するＳＤＲスーパーファミリー（ＤｅＪｏｎｇら，上掲参照）のＧＸ３ＧＸＧモチーフからグリシンを置換する野生型ＨＨＤＨ（配列番号２）中の残基Ｆ１２は、中立的効果を伴うＩ、ＬまたはＹにより置換され得る。
【０２１４】
本発明は、本明細書中で記述されるＨＨＤＨポリペプチドの保存的に変異された変異体を含む。これらの変異体は、それらのアミノ酸配列中に作られた保存的な置換を有する。保存的な置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジンおよびヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシン）、および小型アミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、プロリン、システインおよびメチオニン）の群の範囲内である。通常、特定の活性を変化させないアミノ酸置換は当技術分野で知られており、例えば、Ｈ．Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  ＲＸ．Ｈｉｌｌ，１９７９，“Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，”Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ中に記述されている。もっとも共通的に生じる交換はＡｌａ／Ｓｅｒ、Ｖａｌ／Ｉｌｅ、Ａｓｐ／Ｇｌｕ、Ｔｈｒ／Ｓｅｒ、Ａｌａ／Ｇｌｙ、Ａｌａ／Ｔｈｒ、Ｓｅｒ／Ａｓｎ、Ａｌａ／Ｖａｌ、Ｓｅｒ／Ｇｌｙ、Ｔｙｒ／Ｐｈｅ、Ａｌａ／Ｐｒｏ、Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ａｓｐ／Ａｓｎ、Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｌｅｕ／Ｖａｌ、Ａｌａ／Ｇｌｕ、ａｎｄＡｓｐ／Ｇｌｙならびにこれらの逆である。
【０２１５】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドにおける保存的な置換のバリエーションは、同様の保存的置換群における保存的に選択されたアミノ酸を伴う、ポリペプチド配列のアミノ酸における低い割合の置換、通常５％未満、より通常的には２％未満、およびしばしば１％未満の置換を含む。非機能的または非コード配列の添加等の、ＨＨＤＨポリヌクレオチドにおけるコードされる活性を変化させない配列の添加は、ＨＨＤＨポリヌクレオチドの保存的なバリエーションと考えられる。
【０２１６】
（ＨＨＤＨ  ポリヌクレオチド）
本発明は、上述されるＨＨＤＨポリペプチドの任意のものをコードする単離または組換えポリヌクレオチドを提供する。
【０２１７】
例示的なＨＨＤＨポリヌクレオチドは、配列番号：
【０２１８】
【化１１３】
2008537477.tif 000075
【０２１９】
【化１１４】
2008537477.tif 000076
【０２２０】
【化１１５】
2008537477.tif 000077
およびその相補的配列に相当するものを含む。
【０２２１】
遺伝情報の縮重により、本発明のＨＨＤＨポリペプチドをコードする多数の核酸配列が存在することを、当業者は容易に理解するであろう。表Ｉは、各アミノ酸に関する同義語コドンを提供するコドン表である。例えば、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、およびＣＧＵは全てアミノ酸アルギニンをコードする。したがって、本発明の核酸における各位置で、どこにアルギニンが存在するかはコドンによって特定化され、そのコドンは、コードされるポリペプチドを変化させることなく、上述のコドンに相当する任意のものに変化され得る。ＲＮＡ配列中のＵがＤＮＡ配列中のＴに相当することが理解される。
【０２２２】
（表１：コドン表）
【０２２３】
【化１１６】
2008537477.tif 000078
このような「サイレント変異」は、「保存的な」変異の一種である。当業者は、核酸における（メチオニンに対する元々唯一のコドンであるＡＵＧを除く）各コドンが標準的な手法によって修飾され、機能的に同一のポリペプチドをコードするようになることを認識するであろう。したがって、あるポリペプチドをコードする核酸における、任意の記述される配列の各サイレント変異が黙示される。本発明は、可能性あるコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより作製し得る本発明のポリペプチドをコードする、あらゆる可能性ある核酸配列配列を意図し、また提供する。本発明のポリヌクレオチド配列に適用される場合、これらの組み合わせは標準的なトリプレットコード（表１中で説明される）に従う。
【０２２４】
同じコンテクスト中で翻訳される場合、２以上の異なるコドンのグループは、全て同じアミノ酸をコードし、本明細書中で「同義語コドン」と称する。本発明のＨＨＤＨポリヌクレオチドは、所望の宿主微生物の最適コドン使用頻度と一致するようにポリヌクレオチドを修飾することにより、特定の宿主微生物における発現に対してコドンが最適化され得る。当業者は、広範な微生物に関する選択情報を提供する表およびその他の参考文献が容易に入手可能であることを認識するであろう、例えば、Ｈｅｎａｕｔ  ａｎｄ  Ｄａｎｃｈｉｎ、“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ”、Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら編，ＡＳＭ  Ｐｒｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．（１９９６），ｐｐ．２０４７−２０６６参照。
【０２２５】
本発明の例示的なＨＨＤＨ変異体ポリヌクレオチド配列は配列番号３１として提供され、Ｅ．ｃｏｌｉ中で良好に発現する。このポリヌクレオチドは、Ｅ．ｃｏｌｉ由来の配列番号２に相当するポリペプチドを、配列番号１（すなわち、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．由来の天然型ＨＨＤＨをコードする、ＨＨＤＨコーディングポリヌクレオチド）から発現される量よりも約４１／２倍高いレベルで発現する、配列番号１の変異体である。
【０２２６】
本発明のいくつかの実施形態において、本発明のＨＨＤＨポリペプチドにおいて以下の残基が用いられる場合に、特定のコドンが好ましい：５位のアミノ酸であるイソロイシンをコードするＡＴＴ；３６位のアミノ酸であるリジンをコードするＡＡＧ；６３位のアミノ酸であるイソロイシンをコードするＡＴＴ；９５位のアミノ酸であるイソロイシンをコードするＧＡＧ；および１８８位のアミノ酸であるイソロイシンをコードするＣＣＣ。上記に参照されるアミノ酸の位置は、本発明のＨＨＤＨポリペプチドが配列番号２とアラインメントされる場合の配列番号２における相当するアミノ酸の位置である。
【０２２７】
用語「保存的に修飾された変異」および「保存的な変異」は本明細書中で互換的に使用され、同一であるまたは本質的に同一であるアミノ酸配列をコードするそれらの核酸を称し、あるいは核酸がコーディング配列でない場合、この用語は同一である核酸を称する。当業者は、その変化が以下の１以上をもたらす場合に、コードされる配列中の１アミノ酸またはわずかな比率のアミノ酸を変化、付加または欠失させる個々の置換、欠失または付加が保存的に修飾された変異であることを認識するであろう：アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、または化学的に類似するアミノ酸とのアミノ酸の置換。１またはそれ以上のアミノ酸が影響を受ける場合、その割合は通常、コードされる配列の長さに渡るアミノ酸残基の５％未満、より通常的には２％未満である。互いに保存的な置換と考えられるアミノ酸を提供する参考文献が当技術分野でよく知られている。
【０２２８】
本発明のポリヌクレオチドは当技術分野でよく知られている方法を用いて調製することができる。通常、１２０塩基までのオリゴヌクレオチドを個々に合成し、次いで連結し（例えば、酵素的または化学的連結方法、またはポリメラーゼが介在する方法により）、本質的に任意の所望される連続的配列を形成する。例えば、本発明のポリヌクレオチドは、例えばＢｅａｕｃａｇｅ，ら（１９８１）  Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，２２：１８５９−６９，ｄ  ｂｙ  Ｍａｔｔｈｅｓら（１９８４）  ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：８０１−０５．により記述される方法、例えば通常自動合成装置において実践されるような、古典的なホスホロアミダイト法を用いて調製することができる。このホスホロアミダイト法に従って、例えば自動ＤＮＡ合成装置においてオリゴヌクレオチドが合成され、精製され、アニールされ、連結されて好適なベクターへとクローンされる。
【０２２９】
さらに、本質的に任意の核酸配列を、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ），ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）および多くの他社等、任意の多様な商業的供給元にカスタム発注できる。
【０２３０】
ポリヌクレオチドは、技術文献中に記述されるよく知られた技術により合成することもできる。例えば、Ｃａｒｒｕｔｈｅｒｓら，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４７：４１１−４１８（１９８２）およびＡｄａｍｓら，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０５：６６１（１９８３）参照。次いで、相補的な鎖を合成し、好適条件下でその鎖を共にアニールするか、または好適なプライマー配列と共にＤＮＡポリメラーゼを用いて相補的な鎖を付加するかのいずれかにより、二本鎖ＤＮＡ断片を取得する。
【０２３１】
ベクター、プロモーターおよび多くのその他の関係する話題を含む、本明細書中で有用である分子生物学的技術を記述する一般的なテキストには、Ｂｅｒｇｅｒ  ａｎｄ  Ｋｉｍｍｅｌ，Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  −  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄ．），Ｖｏｌ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（“Ｓａｍｂｒｏｏｋ”）ａｎｄ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  ｊｏｉｎｔ  ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９９を通じて補充）（「Ａｕｓｕｂｅｌ」）が含まれる。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、Ｑβ−レプリカーゼ増幅およびその他のＲＮＡポリメラーゼ介在手法（例えばＮＡＳＢＡ）を含む、当業者がｉｎ  ｖｉｔｒｏの増幅方法を導くために十分なプロトコールの例は、例えば、本発明の相同な核酸を生産するために、Ｂｅｒｇｅｒ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，およびＡｕｓｕｂｅｌならびに  Ｍｕｌｌｉｓら，（１９８７）  米国特許第４，６８３，２０２号；ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｉｎｎｉｓら編）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）（Ｉｎｎｉｓ）；Ａｒｎｈｅｉｍ  ＆  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ（Ｏｃｔｏｂｅｒ  １，１９９０）  Ｃ＆ＥＮ  ３６−４７；Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  ＮＩＨ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９１）  ３，８１−９４；（Ｋｗｏｈら，（１９８９）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６，１１７３；Ｇｕａｔｅｌｌｉら，（１９９０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，１８７４；Ｌｏｍｅｌｌら，（１９８９）  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ  ３５．１８２６；Ｌａｎｄｅｇｒｅｎら，（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１，１０７７−１０８０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ（１９９０）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８，２９１−２９４；ＷｕおよびＷａｌｌａｃｅ，（１９８９）  Ｇｅｎｅ  ４，５６０；Ｂａｒｒｉｎｇｅｒら．（１９９０）  Ｇｅｎｅ  ８９，１１７，およびＳｏｏｋｎａｎａｎおよびＭａｌｅｋ（１９９５）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：５６３−５６４中に見いだされる。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅された核酸をクローニングするための改良された方法は、Ｗａｌｌａｃｅら，米国特許第５，４２６，０３９号中に記述される。ＰＣＲによって大きな核酸を増幅するための改良された方法は、Ｃｈｅｎｇら，（１９９４）  Ｎａｔｕｒｅ  ３６９：６８４−６８５およびその中に引用された文献中にまとめられてお���、その中で４０ｋｂまでのＰＣＲ単位複製配列が生成される。当業者であれば、本質的に任意のＲＮＡを、制限酵素消化、および逆転写酵素およびポリメラーゼを用いたＰＣＲ増幅および配列解析にとって好適な二重鎖へと変換することができることを容易に理解するであろう。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＢｅｒｇｅｒ、上掲、を参照されたい。
【０２３２】
（ベクター、プロモーター、および発現系）
本発明はまた、概して上述のような１またはそれ以上のＨＨＤＨポリヌクレオチド配列を含む組換え構築物を含む。用語「構築物」または「核酸構築物」は、本明細書中で１本鎖または二本鎖のいずれかの核酸をいい、天然の遺伝子から単離されたものか、または修飾を受けて、核酸の天然には存在しないような核酸の部分を含むものをいう。用語「核酸構築物」は、本発明のＨＨＤＨコーディング配列の発現にとって必要とされる調節配列を含む場合には、用語「発現カセット」と同義である。
【０２３３】
本発明はまた、プロモーターに機能可能に連結されている本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。実施例１は、ハロヒドリンデハロゲナーゼを発現するための発現構築物における作製方法の記述を提供する。用語「調節配列」は、本明細書中で本発明のポリペプチドの発現にとって必要なまたは都合のよいあらゆる要素をいう。各調節配列は、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に対し、天然のまたは外来のものであることができる。このような調節配列は、限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。最低限、調節配列はプロモーター、転写および翻訳停止シグナルを含む。調節配列は、調節配列と、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のコーディング領域とを連結することを助ける特定の制限部位を導入する目的のためのリンカーを伴って提供される場合がある。
【０２３４】
用語「機能し得るように連結されている」は、本明細書中で、調節配列がポリペプチドの発現を行わせるように、ＤＮＡ配列におけるコーディング配列に対し、調節配列が適切な位置に配置される配置をいう。
【０２３５】
本明細書中で使用される場合、用語「コーディング配列」は、そのタンパク質産物のアミノ酸配列を直接的に特定するヌクレオチド配列をいうことが意図される。コーディング配列の結合は、通常、オープンリーディングフレームによって決定され、それは通常ＡＴＧの開始コドンで始まる。コーディング配列は通常ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、および／または組換えヌクレオチド配列を含む。
【０２３６】
本明細書中で使用される場合、用語「発現」は、ポリペプチドの生産における任意のステップを含み、限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含む。
【０２３７】
用語「発現ベクター」は、本明細書中で、本発明のポリペプチドをコードする部分を含む線状または環状のＤＮＡ分子をいい、それはその転写を提供するための付加的な部分と、機能し得るように連結されている。
【０２３８】
本明細書中で使用される場合、用語「宿主細胞」とは、核酸構築物を用いた形質転換の影響を受けやすい任意のタイプの細胞をいう。
【０２３９】
本発明の核酸構築物は、その中に本発明の核酸配列が正方向または逆方向に挿入されたプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、バクテリア、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）等のベクターを含む。本実施形態の好ましい態様において、この構築物はさらに、例えば、この配列へに機能可能に連結されているプロモーターを含む。多数の好適なベクターおよびプロモーターが当業者に知られ、市販されている。
【０２４０】
本発明のポリヌクレオチドを、ポリペプチドの発現に好適な各種発現ベクターへと組み込むことができる。好適なベクターには、非染色体性の、および合成のＤＮＡ配列を含む、例えばＳＶ４０の誘導体；細菌プラスミド；ファージＤＮＡ；バキュロウイルス；酵母プラスミド；プラスミドおよびファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、家禽ポックスウイルス、仮性狂犬病ウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよびその他等のウイルスＤＮＡを含む。遺伝物質を細胞へと導入する任意のベクターを、また、複製が所望される場合には適切な宿主中で複製可能かつ生存可能なベクターを、使用することができる。
【０２４１】
発現ベクター中へと組み込んだ場合に、本発明のポリヌクレオチドは、例えばＴ５プロモーター等の好適な転写調節配列（プロモーター）へに機能可能に連結されてｍＲＮＡ合成を導く。このような転写調節配列の例は、特に、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）およびゴマノハグサモザイクウイルス（ＦＭＶ）を含むトランスジェニック植物における使用に好適である。原核または真核細胞またはそれらのウイルスにおける遺伝子発現を調節することが知られ、本発明のいくつかの実施形態において使用可能なその他のプロモーターには、ＳＶ４０プロモーター、Ｅ．ｃｏｌｉのｌａｃまたはｔｉｐプロモーター、ファージのラムダＰＬプロモーター、ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーター等を含む。発現ベクターは、場合により、転写開始のためのリボソーム結合部位およびＰｉｎＩＩ等の転写ターミネーターを含む。ベクターはまた、所望により、例えばエンハンサー等の発現増幅のための適切な配列を含む。
【０２４２】
さらに、本発明の発現ベクターは、所望により、形質転換された宿主細胞を選択するための表現形質を提供するための１またはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。好適なマーカー遺伝子は、抗生物質であるスペクチノマイシンまたはストレプトマイシンに対する耐性（例えば、ａａｄａ遺伝子）に関しコードするもの、ストレプトマイシン耐性に関しコードするストレプトマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＳＰＴ）遺伝子、カナマイシンまたはゲンタマイシン耐性をコードするネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＰＴＩＩ）遺伝子、ハイグロマイシン耐性に関しコードするハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）遺伝子を含む。さらなる選択可能なマーカー遺伝子は、ジヒドロ葉酸還元酵素または真核細胞培養液に対するネオマイシン耐性、およびＥ．ｃｏｌｉにおけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性を含む。
【０２４３】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドの発現に関する例示的な発現ベクターを図１に示す。適切な宿主を形質転換し、その宿主に発明のタンパク質またはポリペプチドを発現するようにさせるために、本発明のベクターを利用することができる。好適な発現宿主の例としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ属等の細菌細胞が挙げられる。細菌の系において、多機能Ｅ．ｃｏｌｉクローニングおよび発現ベクター等の多数の発現ベクターを選択することができるだろう。
【０２４４】
本発明のＨＨＤＨポリヌクレオチドは、所望される細胞区画、膜または細胞オルガネラへとポリペプチドの発現を標的化し、またはペリプラズム空間または細胞培養培地へのポリペプチドの分泌を導くために、例えば分泌／局在配列をコードする核酸に対しインフレームで融合することもできる。このような配列は当業者に知られており、分泌リーダーペプチド、オルガネラ標的化配列（例えば、核局在配列、小胞体（ＥＲ）保留シグナル、ミトコンドリア通過配列、葉緑体通過配列）、膜局在／アンカー配列（例えば、輸送停止配列、ＧＰＩアンカー配列）等を含む。
【０２４５】
（発現宿主）
本発明はまた、本発明のベクターまたは構築物（例えば、発明のクローニングベクターまたは発明の発現ベクター）を導入される（形質転換されるまたは感染させられる）設計された宿主細胞、ならびに組換え手法による本発明のポリペプチドの生産に関する。ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルス粒子、ファージ等であることができる。したがって、本発明は、上述の本発明における任意のポリヌクレオチドを含む宿主細胞に関する。通常、このポリヌクレオチドは、宿主細胞における前記ポリヌクレオチドの発現を提供する１またはそれ以上のプロモーターおよび／またはエンハンサーへに機能可能に連結される。
【０２４６】
宿主細胞は、植物細胞等の真核細胞であることができる。あるいは、宿主細胞は、植物細胞等の原核細胞であることができる。構築物の宿主細胞への導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはその他の通常の手法により達成される（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．  ａｎｄ  Ｂａｔｔｅｙ，Ｉ．（１９８６）  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。設計された宿主細胞を、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、またはＨＨＤＨポリヌクレオチドを増幅するために好適なように改変した標準的な栄養培地中で培養する。温度、ｐＨ等は、先に発現に関して選択された宿主細胞のものと同様であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ，Ａｕｓｕｂｅｌ  およびＢｅｒｇｅｒ，ならびに例えばＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−  Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋおよびその中の引用文献を含む本明細書中で引用される文献において、当業者にとって明白であろう。
【０２４７】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、植物、酵母、菌類、細菌等の非動物細胞中で生産することができる。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ  およびＡｕｓｕｂｅｌに加えて、非動物細胞培養液に関する詳細はＰａｙｎｅら（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  ａｎｄ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）  および  Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．中に見出すことができる。宿主細胞は植物細胞等の真核細胞であることができる。あるいは、宿主細胞は細菌細胞等の原核細胞であることができる。ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、エレクトロポレーションまたはその他の通常の手法により達成される（Ｄａｖｉｓ，Ｌ．，Ｄｉｂｎｅｒ，Ｍ．およびＢａｔｔｅｙ，Ｉ．（１９８６）  Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）。
【０２４８】
（精製用融合ポリペプチド）
本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、コードされたＨＨＤＨポリペプチドの精製を助けるために融合ポリペプチドの一部として発現されることもできる。このような融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、精製を助けるための領域に対しインフレームで融合される本発明のＨＨＤＨポリヌクレオチドに相当する核酸配列を含む。本明細書中で使用される場合、用語「精製を助けるための領域」とは、融合される部分に対してポリペプチドの精製に介在する領域をいう。好適な精製領域は、金属キレートペプチド、固定化された金属における精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオン（例えばＧＳＴ）に結合する配列、血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ血球凝集素タンパク由来のエピトープに相当；Ｗｉｌｓｏｎら（１９８４）  Ｃｅｌｌ，３７：７６７）、マルトース結合タンパク質配列、ＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティー精製系において利用されるＦＬＡＧエピトープ（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）等を含む。精製領域およびＨＨＤＨポリペプチドの間へのプロテアーゼ開裂可能なポリペプチドリンカー配列の組み込みは、精製を助けるために有用である。１つの発現ベクターは構築物において使用されることを意図され、本明細書中で記述される方法は、エンテロキナーゼ開裂部位により分離されるポリヒスチジン領域へと融合される本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現を提供する。ヒスチジン残基はＩＭＩＡＣ（固定化金属イオンアフィニティークロマトグラフィー、Ｐｏｒａｔｈら．（１９９２）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ３：２６３−２８１中に記述される）上での精製を助け、一方、エンテロキナーゼ開裂部位は、融合タンパク質からＨＨＤＨポリペプチドを分離するための手段を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ；  Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）もまた、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパクとして外来ポリペプチドを発現するために使用可能である。通常、このような融合タンパク質は可溶性であり、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ−融合の場合、グルタチオン−アガロース）への吸着および、その後の遊離のリガンド存在下での溶出によって、溶解させた細胞から容易に精製することができる。
【０２４９】
（ＨＨＤＨポリペプチドの生産および回収）
本発明はＨＨＤＨ酵素活性を有するポリペプチドの作製方法に関し、この方法は、記述される本発明のＨＨＤＨポリヌクレオチドにおける任意の１つにより形質転換される宿主細胞を提供すること；その形質転換される宿主細胞を、前記ポリヌクレオチドがコードされるＨＨＤＨポリペプチドを発現するようにさせる条件下において培地中で形質転換すること；および、その発現されたＨＨＤＨポリペプチドを培地から、または形質転換され培養された宿主細胞から回収または単離することを含む。
【０２５０】
その他の実施形態において、本発明は、ＨＨＤＨ酵素活性を有するポリペプチドの作製する方法に関し、この方法は、上述される本発明のポリヌクレオチドの任意の１つにより宿主細胞を形質転換すること；その形質転換される宿主細胞を、前記ポリヌクレオチドがコードされるＨＨＤＨポリペプチドを発現するようにさせる条件下において培地中で形質転換すること；および、その発現されたＨＨＤＨポリペプチドを培地から、または形質転換され培養された宿主細胞から回収または単離することを含む。
【０２５１】
本発明はさらに、ＨＨＤＨポリペプチドの作製方法を提供し、前記方法はＨＨＤＨポリペプチドの生産のために好適な条件下でＨＨＤＨポリヌクレオチドにより形質転換された宿主細胞を培養すること；および、そのＨＨＤＨポリペプチドを回収することを含む。
【０２５２】
通常、回収または単離は、宿主細胞培地、宿主細胞、またはその両方から、後述するものを含む当技術分野でよく知られたタンパク質回収手法を用いて行われる。
【０２５３】
好適な宿主株の形質導入および、その宿主株の好適な細胞密度まで成育（育成または培養）させることに続いて、選択されたプロモーターを好適な手段（例えば、温度シフトまたは化学的誘導）により導入し、細胞をさらなる期間培養する。本明細書中で使用する場合、用語「培養」および「育成」は置き換え可能に使用される。細胞は通常、遠心分離により収穫し、物理的または化学的手段により破砕され、得られた粗抽出物をさらなる精製を実行する。タンパク質の発現に利用される微生物細胞は、凍結融解サイクリング、超音波処理、機械的破砕、または細胞溶解剤の使用もしくは当業者に知られたその他の方法を含む任意の簡便な方法により破砕することができる。
【０２５４】
記載されるように、細菌、植物、動物（特に哺乳類）および古細菌起源を含む多くの細胞における培養および生産のための多くの参考文献が入手可能である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ａｕｓｕｂｅｌ，およびＢｅｒｇｅｒ（全て上掲）ならびにＦｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）  Ｃｕｐｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−  Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  およびその中に引用される文献；Ｄｏｙｌｅ  およびＧｒｉｆｆｉｔｈｓ（１９９７）  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  Ｊｏｈｎ  ＷｉｌｅｙおよびＳｏｎｓ，ＮＹ；  Ｈｕｍａｓｏｎ（１９７９）  Ａｎｉｍａｌ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗ．Ｈ．ＦｒｅｅｍａｎおよびＣｏｍｐａｎｙ；およびＲｉｃｃｉａｒｄｅｌｌｉら，（１９８９）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２５：１０１６−１０２４参照。植物細胞の培養および再生に関しては、Ｐａｙｎｅら．（１９９２）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ  およびＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−  Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；Ｊｏｎｅｓ，編（１９８４）  Ｐｌａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ  およびＰｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９３）  Ｒ．Ｒ．Ｄ．Ｃｒｏｙ，編．Ｂｉｏｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕ．Ｋ．ＩＳＢＮ  ０  １２  １９８３７０  ６参照。一般的な細胞培養用培地は、Ａｔｌａｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｓ（編）  Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）  ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ中に説明されている。細胞培養に関するさらなる情報はＳｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）社（“Ｓｉｇｍａ−ＬＳＲＣＣＣ”）からのＬｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ（１９９８）および、例えば同様にＳｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｉｎｃ（Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）（“Ｓｉｇｍａ−ＰＣＣＳ”）からのＴｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅおよびその追補等の入手可能な商業的文献中に見出される。
【０２５５】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドは、硫安または溶媒（例えばエタノール、アセトン等）沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、セルロースリン酸クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー（例えば、本明細書中に記載される任意のタグシステムを用いて）、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、およびレクチンクロマトグラフィーを含む当技術分野でよく知られた任意の多くの方法により、組換え細胞培養液から回収／単離および所望により精製することができる。所望される場合、成熟タンパク質のタンパク質の構造を完成するために、リフォールディングステップを使用することができる。最終的に、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）  を最終的な精製ステップに使用することができる。上掲の文献に加えて、例えば、Ｓａｎｄａｎａ（１９９７）  Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇ  ら（１９９６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；  ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ（１９９０）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；ＨａｒｒｉｓおよびＡｎｇａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ（１９９３）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，ＮＹ；ＪａｎｓｏｎおよびＲｖｄｅｎ（１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−  ＶＣＨ，ＮＹ；およびＷａｌｋｅｒ（１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｏｎ  ＣＤ−ＲＯＭ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ中に説明されるような多様な精製方法が当技術分野で知られている。
【０２５６】
ある場合においては、本発明のＨＨＤＨポリペプチドを、工業的および／または商業的な目的のために好適な大スケールで製造することが望まれる場合がある。このような場合には、バルク発酵の手法が利用される。ＨＨＤＨ製造のための例示的なバルク発酵の手法は実施例２中に提供される。手短に言えば、ＨＨＤＨポリヌクレオチドを、例えば図１に示すようなベクター（ＰＣＫ１１０７００）等の発現ベクターへとクローンする。ポリヌクレオチドをベクターに挿入後、そのベクターを、例えば、標準的な方法を用いて、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１Ｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を通過後にＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）へと形質転換する。
【０２５７】
形質転換された細胞を、当技術分野で知られた方法を用いて、ポリペプチドの生産に好適な栄養培地中で培養する。例えば細胞は、振盪フラスコ培養、研究用または工業的な発酵装置内で、好適な培地中、ポリペプチドが発現され、および／または単離できる条件下での小スケールまたは大スケールの発酵（連続、バッチ、フィード式バッチまたは固相培養を含む）によって培養できる。培養は、当技術分野で知られた方法を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む好適な栄養培地中で行われる。好適な培地は商業的供給者から入手可能であるか、公表された組成（例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に従い調製することができる。分泌されたポリペプチドは、栄養（培養）培地から直接回収できる。
【０２５８】
得られるポリペプチドを、当技術分野で知られた方法により単離することができる。例えば、ポリペプチドは、限定されるものではないが、遠心分離、濾過、抽出、スプレードライ、減圧蒸留、または沈殿を含む標準的な方法により栄養培地から単離できる。単離されたポリペプチドを、限定されるものではないが、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動的手法（例えば、分取的等電点電気泳動）、溶解性の差異（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、または抽出（例えば、Ｂｏｌｌａｇら（１９９６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ（１９９６）  Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；およびＢｏｌｌａｇら（１９９６）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ参照）を含む、当技術分野で知られた各種の手法により精製してもよい。細胞溶解物からＨＨＤＨポリペプチドを回収する方法は実施例３に示されている。
【０２５９】
本発明ポリヌクレオチドを用いてＨＨＤＨポリペプチドを生産するために、無細胞転写／翻訳系を使用することもできる。このような系のいくつかは市販されている。翻訳プロトコールに対する一般的な手引きは、Ｔｙｍｍｓ（１９９５）  Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ３７，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，ＮＹ．中に見出される。
【０２６０】
（ＨＨＤＨポリペプチドの使用方法）
上述の通り、本発明のＨＨＤＨポリペプチドを、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸誘導体の４−求核試薬置換−３−ヒドロキシ酪酸誘導体への変換を触媒するために使用することができる。したがって、本発明はエチル（Ｒ）４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの製造方法を提供し、前記方法は：（ａ）ハロ置換が塩素、臭素、ヨウ素からなる群から選択される４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを提供すること；および（ｂ）４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを、４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステルを４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルへと変換するための反応混合液を生成するのに十分な条件下で、ハロヒドリンデハロゲナーゼおよびシアニドと接触させること、を含む。好適な４−ハロ−３−ヒドロキシ酪酸エステル／４−シアノ−３−ヒドロキシ酪酸エステルの組み合わせは、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートおよびエチル（Ｒ）４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートである。その方法は国際公開第２００４／０１５１３２号、「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ３−  Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」中に記述されており、参照により本明細書中に組み入れるものとする。エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートをエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへと変換するため、および後者を回収するための好適な条件の記述もまた、国際公開第２００４／０１５１３２号、「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ３−  Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ」中に記載されており、参照により本明細書中に組み入れるものとする。
【０２６１】
本発明のＨＨＤＨポリペプチドはまた、近接するハロ（すなわち、塩素、臭素、またはヨウ素）、ヒドロキシ置換カルボン酸エステルを、近接シアノ，ヒドロキシル置換カルボン酸エステルへと変換することを触媒するために有用である。したがって、本発明は、ヒドロキシ置換カルボン酸エステルからの近接シアノ，ヒドロキシル置換カルボン酸エステルの製造方法をも提供し、その方法は：（ａ）ハロ置換が塩素、臭素、およびヨウ素からなる群から選択される近接ハロ、ヒドロキシル置換カルボン酸エステルを提供すること；（ｂ）近接ハロ−ヒドロキシル置換カルボン酸エステルを、近接ハロ、ヒドロキシ置換カルボン酸エステルを近接シアノ，ヒドロキシ置換カルボン酸エステルへと変換するために反応混合物を形成するための好適な条件下で、本発明のＨＨＤＨポリペプチドおよびシアニドと接触させること、を含む。
【０２６２】
この方法は国際公開第２００５／０１８５９号「Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  ３−Ｈｙｄｒｏｘｙｂｕｔｙｒｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  Ｖｉｃｉｎａｌ  Ｃｙａｎｏ，Ｈｙｄｒｏｚｙ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｃａｒｂｏｘｙｌｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｅｓｔｅｒｓ」中に記述され、参照により本明細書中に組み入れるものとする。この参考文献は、近接するハロ、ヒドロキシル置換カルボン酸エステルを、近接するシアノ、ヒドロキシル置換カルボン酸エステルへと変換するために好適な条件の記述を提供する。
【０２６３】
本発明の新規ハロヒドリンデハロゲナーゼは、エナンチオ活性を有するエポキシドの混合物をハロヒドリンデハロゲナーゼ存在下でアニオン性求核試薬と共に反応させることにより、その混合物を酵素的に分離するプロセスにおいても有用であり、この酵素は、本明細書中に参照によりその全文を組み入れるものとする国際公開公開第０１／９０３９７号に開示されるような方法で、求核試薬と共にエポキシドエナンチオマーのひとつと優先的に反応し、得られるエナンチオマー的に富化された近接求核試薬−置換アルコールおよび、その他のエナンチオマー中に富化された未反応のエポキシドとの混合物を形成する。
【０２６４】
本発明の前述の、およびその他の態様を、以下の非限定的な実施例と関連させてよりよく理解できるであろう。
【実施例】
【０２６５】
（実施例１）
（ハロヒドリンデハロゲナーゼ発現用の発現構築物の構築）
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ハロヒドリンデハロゲナーゼのための遺伝子は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．からのハロヒドリンデハロゲナーゼのアミノ酸配列（配列番号２）に基づいて、Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化されたコドン（配列番号１）であった。この遺伝子は、６０量体オリゴマーを用いて合成し、Ｔ５プロモーターの制御下で発現ベクターＰＣＫ１１０７００（図１中に示す）中にクローニングした。ベクターは標準的方法を用いてプラスミドＤＮＡから調製したＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中へ入り形質転換を行った。次にこのプラスミドＤＮＡは、標準的方法を用いて、発現宿主であるＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）中へ入り形質転換を行った。活性ＨＨＤＨを発現しているクローンが発現ライブラリー中で見つけられた。このクローンからの遺伝子を配列決定して（配列番号１（ＨＨＤＨ．１）参照）、  Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＨＨＤＨ（配列番号２）をコードしていることが見いだされた。
【０２６６】
本発明のハロヒドリンデハロゲナーゼをコードするポリヌクレオチドを同様に、図１に示されるベクターＰＣＫ  １１０７００中にクローニングし、次に、標準的方法を用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０によって継代させた後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１を形質転換してから発現させた。
【０２６７】
（実施例２）
（ＨＨＤＨの生産）
［０１９３］  空気混入型攪拌発酵装置中で、０．５２８ｇ／Ｌ硫酸アンモニウム；  ７．５ｇ／Ｌのジカリウム硫化水素三水和物；３．７ｇ／Ｌのカリウム二水素リン酸塩；２ｇ／ＬのＴａｓｔｏｎｅ−１５４酵母抽出物；０．０５ｇ／Ｌの硫酸鉄；および、２ｇ／Ｌの塩化カルシウム二水和物を含む３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液、２．２ｇ／Ｌの硫酸亜鉛七水和物、０．５ｇ／Ｌの硫酸マンガン一水和物、１ｇ／Ｌの硫酸銅七水和物を含む３ｍｌ／Ｌの微量元素溶液：  ０．１  ｇ／Ｌのホウ酸ナトリウム十水和物および０．５ｇ／ＬのＥＤＴＡを含む１０．０Ｌの増殖培地を、３０℃の温度条件に供した。発酵装置には、実施例１に記述されるようなＨＨＤＨポリヌクレオチドを含むプラスミドを備えたＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）の後期指数関数培養液を発酵装置中に植菌し、次に、ＬＢ、１％グルコース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、および３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む振盪フラスコ中で、開始時の６００ｎｍにおける光学密度（ＯＤ６００）が０．５から２．０になるまで増殖させた。発酵装置は、５００−１５００  ｒｐｍで攪拌し、３０％飽和度またはそれ以上の溶存酸素レベルを維持するために、１．０−１５．０  Ｌ／分で発酵容器中へ空気が供給された。培養液のｐＨは２０％  ｖ／ｖ水酸化アンモニウムの添加により７．０に調節された。この培養液のＯＤ６００が４０に到達した後は、温度を３０℃に維持し、ハロヒドリンデハロゲナーゼの発現を、１ｍＭの最終濃度を得るようにイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することにより誘導した。培養液をさらに１５時間増殖させた。誘導後、遠心分離により細胞を回収し、１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ７．０で洗浄した。細胞ペーストを以降の回収工程に直接使用するか、または、使用するまで−８０℃で保存した。
【０２６８】
（実施例３）
（酵素の精製）
実施例２からの細胞ペーストは、湿重量で１倍容量の細胞ペーストを３倍容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／硫酸（ｐＨ７．２）中に懸濁し、次に、Ｓｏｒｖａｌ  １２ＢＰ中で５０００ｇ、４０分間遠心分離することにより洗浄した。洗浄された細胞ペーストは、２倍容量の１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／硫酸（ｐＨ  ７．２）中で懸濁した。一回目の通過に対しては１４，０００  ｐｓｉｇおよび二回目の通過に対しては８，０００  ｐｓｉｇの圧力を用いて、この懸濁液をホモジナイザーに二回通過させることにより、細胞から細胞内ＨＨＤＨが放出された。ホモジナイザーに通過させている間は、細胞溶解物を４℃に冷却した。溶解物を室温まで加温し、次に、２．５Ｍ  ＭｎＳＯ４（５０−３５０  ｍＭ  最終濃度）、または、１０％  ｗ／ｖのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）溶液、ｐＨ  ７．２、（０．６−１．０％  ｗ／ｖ  最終濃度）のいずれかを溶解物に添加し、３０分間攪拌した。標準的実験室用遠心分離機で５０００から１００００ｇの間で、３０から６０分間、ホモジネートを遠心分離した。上清は、脱塩し、限外濾過により濃縮し、浅い容器に分注して−２０℃で凍結し、次に、凍結乾燥して粉末状にして、それを−８０  ℃で保存した。
【０２６９】
発酵後の調製物の質を評価するために、発現されたハロヒドリンデハロゲナーゼ酵素を含む細胞溶解物を、以下のプロトコールにしたがってアッセイした。約５０μｌの清澄化された１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、１００ｍＭ  ＮａＣＮ、ｐＨ  ８．０中の細胞溶解物を、１０ｍＭ  エチル−（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（ＥＣＨＢ）（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と混合した。総反応容量は０．２  ｍｌであった。反応物を室温で３０分から１時間インキュベートした。この反応物を７倍容量の酢酸エチルで抽出し、有機層を１．８  ｍｌのガスクロマトグラフィー（ＧＣ）バイアル中に除去した。有機層をエチル−（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート生成物の存在についてＧＣにより分析した。生成された生成物の量は、同じ条件下で調製および分析された標準曲線と比較することにより測定された。
【０２７０】
（実施例４）
（ＨＨＤＨ活性の存在に関するハイスループットスクリーニング）
Ａ．  アガロース中にシアノヒドリンが存在しない場合
ＨＨＤＨ活性の存在を確かめるために以下のスクリーニングを用いた。第１日目、２００  ｍｌ  ＬＢ寒天＋１％グルコース、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含むＱ−ｔｒａｙ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）上で新たに形質転換されたコロニーを、培地（７０  μＬ／ウェル  ２ｘＹＴ＋ｌ％  グルコース、３０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を含む、浅い３８４ウェルのＮｕｎｃプレート中へ、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボットコロニーピッカー（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）を用いて分注して、３００℃、１分間あたり２５０回転（ｒｐｍ）、相対湿度（ＲＨ）８５％の条件下で一晩培養した。陰性対照（空のベクターを含むＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１）および陽性対照（ベクターＨＨＤＨ  Ｍｚ１／２Ｇ５、配列番号３１を含むＥ．ｃｏｌｉ）を含有させた。これらのマスターウェルプレート培養液は、微小孔性テープＡｉｒＰｏｒｅＴＭ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いてカバーした。
【０２７１】
第２日目、マスタープレート培養液は、ナイロン膜（Ｐａｌｌ  Ｂｉｏｄｙｎｅ  Ｂ  Ｎｙｌｏｎ  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｅ−ｃｕｔ  ｆｏｒ  Ｏｍｎｉｔｒａｙ，１１５  ｘ  ７６  ｍｍ，Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ＃２５０３８５）上で格子形成され、次に、２００  ｍｌ  ＬＢ寒天  ＋  １％  グルコース、３０  μｇ／ｍｌクロラムフェニコールを含むＱ−ｔｒａｙ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）上に配置された。Ｑ−ｔｒａｙｓは、増殖が検出されるまで、３００℃で８−１２時間インキュベートされた。それぞれのナイロン膜は、培地：  ２００  ｍｌ  ＬＢ  寒天  ＋  １ｍＭ  ＩＰＴＧ、３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコールを含むＱ−ｔｒａｙに移された。次に、Ｑ−ｔｒａｙｓを、２３℃または室温で一晩インキュベートした。
【０２７２】
第３日目、アッセイプレートを以下のとおり調製した：１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＳＯ４、ｐＨ  ７．０、および１．０％低融点アガロースの１５０ｍｌの溶液を調製し、約４５℃まで冷却した。５Ｍ  ＮａＣｌを添加して、５００ｍＭ  ＮａＣｌの最終濃度を得た。ブロム・クレゾール・パープル（ＢＣＰ）およびエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（ＥＣＨＢ）を、それぞれ、０．００４％および０．３％の最終濃度まで添加した。この溶液を、１５０  ｍｌ  Ｑ−ｔｒａｙに注ぎ入れ、凝固させた。
【０２７３】
コロニーを有するナイロン膜を、誘導培地を含むＱ  ｔｒａｙから取り除き、アッセイプレート上に裏返しにした。Ａｌｐｈａ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、４２０ｎｍ（＋／−  １０ｎｍ  フィルター）の絞り設定４を用いて、裏返したＱ−ｔｒａｙにより、この膜からイメージを取得した。イメージは、反応の初めの１時間中に取得した。それぞれイメージ化されたスポットに対する強度データを次に、陰性対照スポット撮像の値に対して正規化した。ある値よりも高い正規値はＨＨＤＨ活性の存在を示した。このスクリーニングからの活性クローンは、実施例５Ａに記述される方法を用いてさらに特徴づけられた。このスクリーニングからのクローンは、実施例５Ｂに記述されるミディアムスループットアッセイを用いてさらに特徴づけることもできる。
Ｂ．  アガロース中にシアノヒドリンが存在する場合
このハイスループットスクリーニングは、シアノヒドリン生成物、例えば、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの存在下で、ＨＨＤＨ活性を呈するＨＨＤＨポリペプチドに対するスクリーニングが所望される場合に使用される。第１日目と第２日目のプロトコールは、パートＡにおいて記述したものと同一である。第３日目、アッセイプレートを以下のとおり調製した：  １５０  ｍｌの低融点アガロース溶液を以下のとおり構成した：１０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．０、２．０％  低融点アガロース（電子レンジ中で融解される）、０．００４％  ブロム・クレゾール・パープル（１．２  ｍｌ／１５０  ｍｌ）。溶液を一晩、３７℃まで冷却した。第３日目、ＥＣＨＢ（０．４５  ｍｌ  ＥＣＨＢ／１５０  ｍｌ溶液）およびエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート（８．２６  ｍｌ  エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート  ／  １５０  ｍｌ溶液）を添加して、０．３％  ＥＣＨＢおよび４００  ｍＭ  エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート溶液を得た。溶液を混合し、１５０  ｍｌ  Ｑ−ｔｒａｙ中に注ぎ入れ、次に、パートＡに記述されるようにして凝固させた。
【０２７４】
コロニーを有するナイロン膜を、誘導培地を含むＱ−ｔｒａｙから取り除き、アッセイプレート上に裏返しにした。膜を上記パートＡに記述されるようにしてイメージを取得した。
【０２７５】
このスクリーニングからの活性クローンを、実施例５Ｂに記述されるガスクロマトグラフィー方法（ミディアムスループットアッセイ）を用いてさらに特徴づけた。
【０２７６】
（実施例５）
（ハロヒドリンデハロゲナーゼ活性の特徴づけ）
Ａ．  生成物であるエチル−（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの検出のためのガスクロマトグラフィー法
５００  ｍＭ  ＨＣＮ（リン酸を用いてｐＨ  ７．０  に調整された５００  ｍＭ  ＮａＣＮ）中のエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（１０ｍＭ−１００ｍＭ）の溶液に、同じ緩衝液中で予め溶解させたハロヒドリンデハロゲナーゼ酵素を添加した。ゆっくり時間をかけて、混合物のアリコートを取り除き、３倍容量の酢酸エチルを用いて抽出した。次に、有機層を、本明細書中の以下の実施例６に記述されるようなガスクロマトグラフィー（ＧＣ）により、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートについて分析した。様々な時点でサンプルを採取し、生成物であるシアノヒドリン、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートのピーク面積を時間の関数としてプロットした。サンプル採取時点は、生成物阻害の影響を回避するために、低変換、例えば、５％未満の変換時に選択される（例えば、０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、２．５％、３．０％等）。ピーク面積は、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートに対して用意された標準曲線を用いて、濃度単位に変換された。ハロヒドリンデハロゲナーゼの活性はμｍｏｌの単位で測定された（生成されたシアノヒドリン）／分／ｍｇ（合計のハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒）。クローンのうちいくつかの相対活性を、改良ＨＨＤＨ酵素の活性／Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐ．ＨＨＤＨ（配列番号２）の活性として計算して、表２に示す。
【０２７７】
（表２．  ＥＣＨＢ基質に対する改良ＨＨＤＨ酵素の相対ＨＨＤＨ活性）
【０２７８】
【化１３３】
2008537477.tif 000079
Ｂ．  シアノヒドリン産物の存在におけるミディアムスループットガスクロマトグラフィーアッセイ
プレスクリーニングマスターウェルプレート中の所望されるウェル（１０μＬの培養液）から該当しているものを選び出し、９６ウェルのＮＵＮＣ  プレートウェル（各ウェルは、２００μｌ  ＬＢ  ＋１％  グルコース、３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール（ｃａｍ）を含む）に移して、３００℃、１分間あたり２５０回転（ｒｐｍ）、相対湿度（ＲＨ）８５％の条件下で一晩培養した。陽性対照はプレスクリーニングマスターウェルプレートから選び出した。
【０２７９】
翌日、一晩培養物の１０μｌアリコートを、各ウェルが３００  μｌ  ２ｘＹＴ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ  ７、１  ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３０μｇ／ｍｌ  ｃａｍを含む、９６穴の深いウェルプレート中で二次培養した。これらのプレートを、細胞密度がＯＤ  ６００ｎｍ  ＝０．６に到達するまで、３０℃、２５０  ｒｐｍ、８５％  相対湿度、２−４時間の条件でインキュベートした。次に、プレートを、１ｍＭ  イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）（例えば、３４ｍＭ  ＩＰＴＧストック溶液をウェルあたり１０μｌ、または、１０ｍＭ  ＩＰＴＧストック溶液をウェルあたり３０μｌ）を用いて誘導し、３０℃で一晩、２５０  ｒｐｍ、８５％  相対湿度の条件下でインキュベートした。
【０２８０】
翌日、プレートを遠心分離（４０００  ｒｐｍ、１０分間、４℃）して、細胞をペレット化し、使用した培地を捨てた。このプレートは、細胞破壊を助けるために、−８０℃で１時間凍結させることができる。
【０２８１】
ペレット化された細胞は、２．０４  Ｍ  エチル−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレート（“ＨＮ”）（３２０ｇ／Ｌ）（ｆｗ＝１５７，ｄ  １．１９，２６．８  ｍｌ／１００ｍｌ  溶解混合物）および１μｌ／１０ｍｌ  ＤＮａｓｅ（〜２００Ｕ／μｌ）を含む２００  μＬのＢ−ＰＥＲ（登録商標）溶解溶液（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ＃  ７８２４３）を添加することにより溶解させた。細胞および溶解溶液の混合物をボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）にかけて細胞を再懸濁し、次に、２時間振盪しながら、５０℃でインキュベートした。
【０２８２】
反応溶液は、ドラフト内で、好ましくはプラスチック（ポリプロピレン）廃棄容器を用いて、調製した。反応溶液の容量はスクリーニングされるプレートの数によって決定した。１Ｍの最終濃度のＮａＣＮを有する反応溶液を調製するために、ＮａＣＮ（ｆｗ＝  ４９．０１、４．９ｇ／１００ｍＬ）を、所望される容量の１００  ｍＭ  リン酸ナトリウムｐＨ  ７に添加して、１．４７Ｍの濃度のＮａＣＮを得た。それぞれ６８ｍＬのＮａＣＮ溶液に、２４ｍＬの５ＭストックＮａＣｌおよび８ｍｌの濃ＨＣｌ（〜１０Ｍ）を添加して、所望される容量の１．２  Ｍ  ＮａＣｌ、８００  ｍＭ  ＨＣｌ、および１Ｍ  ＮａＣＮである反応混合物を生成した。反応混合物の最終ｐＨは７．０〜７．２であった。この溶液に、２０  ｍＭの最終濃度を得るように、反応混合物１００ｍＬあたり２８０μＬの条件でＥＣＨＢ（ｆｗ＝  １６６．６，ｄ＝１．１９）を添加した。反応混合物中の最終濃度は、１Ｍ  ＨＣＮ、２Ｍ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  リン酸ナトリウムｐＨ７．０〜７．２、２０ｍＭ  ＥＣＨＢである。
【０２８３】
２００μの反応混合物を各ウェル中の溶解細胞に添加した。プレートはＶｅｌｏｃｉｔｙ  １１  ＰｌａｔｅＬｏｃＴＭ  ヒートシーラーを用いて密閉した。次に、密閉されたプレートを、室温で１２０分間振盪した。振盪後、プレートの封をはがし、１ｍＬの１ｍＭ  チモール（酢酸エチル中に溶解）を各ウェルに添加した。プレートは再び、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１  ＰｌａｔｅＬｏｃＴＭ  ヒートシーラーを用いて密閉し、強く振盪して、次に、層が分かれるように約１分間静置した。
【０２８４】
上層の１５０μＬのアリコートを、ＨｙｄｒａＴＭ容積式液体処理装置（Ａｓｐ  ｍｏｄｅ，ＡＶ  １５０，ＡＨ  ２６５０，ＥＨ  ３７８００，ＷＨ  ３７３０，ＷＶ  ｆｕｌｌ，Ｗａｓｈ  ３）を用いて、Ｃｏｓｔａｒ丸浅底ウェルポリプロピレン（ＰＰ）反応プレート（カタログ＃  ３３６５）に移した。サンプルを深いウェルプレートから浅いウェルプレートに移した。
【０２８５】
これらのプレートは、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１  ＰｌａｔｅＬｏｃＴＭヒートシーラーを用いて密閉し、実施例６Ｂに記述したようなガスクロマトグラフィーによる分析まで−２０℃で保存した。
Ｃ．  エチル−４−クロロアセトアセテート（ＥＣＡＡ）の存在下での阻害のためのミディアムスループットガスクロマトグラフィーアッセイ
プレスクリーニングマスターウェルプレート中の所望されるウェル（１０μＬの培養液）から該当しているものを選び出し、９６ウェルのＮＵＮＣ  プレートウェル（各ウェルは、２００μｌ  ＬＢ  ＋１％  グルコース、３０μｇ／ｍｌ  クロラムフェニコール（ｃａｍ）を含む）に移して、３０℃、２５０ｒｐｍ、相対湿度８５％の条件下で一晩培養した。陽性対照はプレスクリーニングマスターウェルプレートから選び出した。
【０２８６】
翌日、一晩培養物の１０μｌアリコートを、各ウェルが３００  μｌ  ２ｘＹＴ、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４  ｐＨ  ７、１  ｍＭ  ＭｇＳＯ４、３０μｇ／ｍｌ  ｃａｍを含む、９６穴の深いウェルプレート中で二次培養した。これらのプレートを、細胞密度がＯＤ  ６００ｎｍ  ＝０．６に到達するまで、３０℃、２５０  ｒｐｍ、８５％  相対湿度、２−４時間の条件でインキュベートした。次に、プレートを、１ｍＭ  ＩＰＴＧ（例えば、３４ｍＭ  ＩＰＴＧストック溶液をウェルあたり１０μｌ、または、１０ｍＭ  ＩＰＴＧストック溶液をウェルあたり３０μｌ）を用いて誘導し、３００℃で一晩、２５０  ｒｐｍ、８５％  相対湿度の条件下でインキュベートした。
【０２８７】
翌日、プレートを遠心分離（４０００  ｒｐｍ、１０分間、４℃）して、細胞をペレット化し、使用した培地を捨てた。このプレートは、細胞破壊を助けるために、−８０℃で１時間凍結させることができる。
【０２８８】
ペレット化された細胞は、１μｌ／１０ｍｌ  ＤＮａｓｅ（〜２００Ｕ／μｌ）を含む２００  μＬのＢ−ＰＥＲ（登録商標）溶解溶液（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ＃  ７８２４３）を添加することにより溶解させた。細胞および溶解溶液の混合物をボルテックスにかけて細胞を再懸濁し、次に、２時間振盪しながら、５０℃でインキュベートした。
【０２８９】
反応溶液は、ドラフト内で、好ましくはプラスチック（ＰＰ）廃棄容器（容量：スクリーニングされるプレートの数によって決定）を用いて、調製した。１Ｍの最終濃度のＮａＣＮを有する反応溶液を調製するために、ＮａＣＮ（ｆｗ＝  ４９．０１、４．９ｇ／１００ｍＬ）を、所望される容量の１００  ｍＭ  リン酸ナトリウムｐＨ  ７に添加して、１．４７Ｍの濃度のＮａＣＮを得た。それぞれ６８ｍＬのＮａＣＮ溶液に、２４ｍＬの５ＭストックＮａＣｌおよび８ｍｌの濃ＨＣｌ（〜１０Ｍ）を添加して、所望される容量の１．２  Ｍ  ＮａＣｌ、８００  ｍＭ  ＨＣｌ、および１Ｍ  ＮａＣＮである反応混合物を生成した。反応混合物の最終ｐＨは７．０〜７．２であった。この溶液に、最終濃度１００ｍＭ（反応混合物１００ｍＬあたり１４００μＬ）までＥＣＨＢ（ｆｗ＝  １６６．６，ｄ＝１．１９）および最終濃度５ｍＭ（反応混合物１００ｍＬあたり１００μＬ）までＥＣＡＡ（ｆｗ＝  １６４．６，ｄ＝１．２１）を添加した。
【０２９０】
２００μの反応混合物を各ウェル中の溶解細胞に添加した。プレートはＶｅｌｏｃｉｔｙ  １１  ＰｌａｔｅＬｏｃＴＭ  ヒートシーラーを用いて密閉した。次に、密閉されたプレートを、室温で６０分間振盪した。振盪後、プレートの封をはがし、１ｍＬの１ｍＭ  チモール（酢酸エチル中に溶解）を各ウェルに添加した。プレートは再び、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１  ＰｌａｔｅＬｏｃＴＭ  ヒートシーラーを用いて密閉し、強く振盪して、次に、層が分かれるように約１分間静置した。
【０２９１】
上層の１５０μＬのアリコートを、ＨｙｄｒａＴＭ容積式液体処理装置（Ａｓｐ  ｍｏｄｅ，ＡＶ  １５０，ＡＨ  ２６５０，ＥＨ  ３７８００，ＷＨ  ３７３０，ＷＶ  ｆｕｌｌ，Ｗａｓｈ  ３）を用いて、Ｃｏｓｔａｒ丸浅底ウェルポリプロピレン（ＰＰ）反応プレート（カタログ＃  ３３６５）に移した。サンプルを深いウェルプレートから浅いウェルプレートに移した。これらのプレートは、Ｖｅｌｏｃｉｔｙ  １１  ＰｌａｔｅＬｏｃＴＭヒートシーラーを用いて密閉し、実施例６Ｂに記述したようなガスクロマトグラフィーによる分析まで−２０℃で保存した。
Ｄ．  触媒製造および使用の条件下で調製されるＨＨＤＨポリペプチドのＨＨＤＨ活性における第３次スクリーニング：
隔壁、磁気攪拌棒およびｐＨ統計装置に連結されたｐＨ電極棒を備えた１００ｍＬのジャケット付き丸底フラスコに、ＮａＣＮ（０．７５ｇ、１５ｍｍｏｌ）、次に、脱イオン水（２５ｍＬ）を入れた。容器を密閉し、濃Ｈ２ＳＯ４（約０．５ｍＬ）を用いてｐＨを７．６に調整した。ＨＨＤＨ粉末（上記実施例２（段落１９３）および３（段落１９４）に記述されるようにして製造される）を水溶液（５ｍＬの脱イオン水中７５ｍｇ）として入れ、反応混合物を４０℃まで加温した。本アッセイにおいて使用されるＨＨＤＨポリペプチドは、溶解した状態でも、または、精製された形態であってよく、当技術分野で知られた方法にしたがって調製することができる。１またはそれ以上のＨＨＤＨポリペプチドの性能を比較する場合、それらは同じ方法にしたがって調製する必要がある。反応混合物を４０℃に加温した後、エチル（Ｓ）４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（ＥＣＨＢ，５ｇ，３０ｍｍｏｌ）を、注射器を介して添加した。ｐＨ統計装置は２５％  ＮａＣＮと０．２５％  ＮａＯＨの添加により７．３＋／−０．１のｐＨを維持した。反応の進行は、酢酸エチル（１ｍＬ）が添加される０．１ｍＬの反応混合物の除去によりモニターした。混合物はボルテックスにかけ、層を分離させた。上部の有機層をＧＣにより分析した（実施例６Ａ）。実施例６Ａの方法にしたがってＧＣにより測定した時、ＨＮに対するＥＣＨＢのピーク面積比が１／２００である場合に、反応は完全であると見なした。全ての試薬が反応混合物中に添加された時から反応が完全（ＨＮに対するＥＣＨＢのピーク面積比が１／２００）であるとみなされた時までの時間を測定する。このプロトコールを用いて、参照ＨＨＤＨポリペプチドに対する向上倍率の点からみて相対活性を測定することができる。相対活性を測定する場合、ＨＮに対するＥＣＨＢのピーク面積比が１／２００に達するまでの時間、すなわち、ｔピーク面積１：２００，ＨＨＤＨポリペプチドのＥＣＨＢ：ＨＮ／ｔピーク面積１：２００，参照ポリペプチドのＥＣＨＢ：ＨＮが比較される（ＨＨＤＨ活性はμｍｏｌ単位でこのデータから測定することもできる（生成されたシアノヒドリン）／分／ｍｇ（合計のハロヒドリンデハロゲナーゼ触媒））。本明細書中で記述するＨＨＤＨポリペプチドの多くは、配列番号７３０のＨＨＤＨポリペプチドよりも１．５倍高い活性を呈する。
【０２９２】
（実施例６）
Ａ．  ガスクロマトグラフィーによるエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの検出
実施例５Ａにおいて生成されたエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートは、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）  ＨＰ−５ＴＭカラム、長さ３０ｍ、内径０．３２ｍｍ、フィルム０．２５μｍを使用し、以下のプログラム：１００℃で１分間、５℃／分を１０分；２５℃／分を２分；次に、２００℃で２分を用いる、炎イオン化（ＦＩＤ）検出によるガスクロマトグラフィーを用いて分析した。吸気口および排気口の温度は共に３００℃であり、流速は２ｍｌ／分であった。これらの条件下、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートは６．２５分で溶出し、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートは４．５分で溶出する。これらの種の化学的純度はガスクロマトグラフィー結果からの統合ピーク面積を用いて測定した。
【０２９３】
ハロヒドリンデハロゲナーゼ（ＨＨＤＨ）の鏡像異性体選択性に関して、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートは、Ｒｅｓｔｅｋ  ｇａｍｍａＤｅｘ  ＳＡＴＭカラム（長さ３０ｍ、内径０．３２）を使用し、以下のプログラム：１６５℃で２５分間、流速２ｍｌ／分を用いる、ガスクロマトグラフィーおよびＦＩＤ検出により測定した。吸気口および排気口の温度は共に２３０℃であった。これらの条件下、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートは１９．６分で溶出し、エチル（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートは１９．２分で溶出する。
Ｂ．  ガスクロマトグラフィーによる残留エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートの検出
実施例４Ｂのプレスクリーニング方法におけるシアノヒドリン生成物の存在下で活性を呈する本発明のハロヒドリンデハロゲナーゼは、実施例５Ｂに記述されるアッセイにおいてさらに特徴づけられた。実施例５Ｂからの反応混合物中に残存するエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートを、Ａｇｉｌｅｎｔ（登録商標）１９０９１Ｊ−４１３  ＨＰ−５ＴＭ  ５％  フェニルメチルシロキサンカラム、公称の長さ３０．０ｍ  ｘ  内径３２０μｍ  ｘ  ０．２５μｍ、および流速２．６ｍｌ／分によるガスクロマトグラフィーを用いて分析した。以下のプログラムを使用した：１００℃で１分間、５０℃／分を２分間、２分間維持、１０分間のサイクル時間で行う。検出装置の条件は以下の通りであった：３００℃、４０ｍｌ／分  Ｈ２、４５０ｍｌ／分  空気。これらの条件下、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートは３．１２分で溶出し、エチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートは３．０６分で溶出し、チモールは３．２１分で溶出する。活性は、抽出効率に対して正規化されたエチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート残存量、すなわち、ＥＣＨＢ面積／チモール面積により特徴づけることができる。水から酢酸エチルへの反応成分の抽出効率のための内部基準としてチモールは使用される。
【０２９４】
（実施例７）
（エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートからのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの製造）
［０２２３］  機械的攪拌装置を備え、ｐＨ電極および塩基を添加するための補給チューブによって自動滴定装置へと連結されたジャケット付きの３Ｌ容３つ首フラスコに、Ｈ２Ｏ（１２００ｍＬ）、ＮａＣＮ（３７．２５ｇ）およびＮａＨ２ＰＯ４（１２５ｇ）を入れ、溶液をｐＨ７にした。水循環装置を４０℃にセットした。１０分後、配列番号３２のハロヒドリンデハロゲナーゼを、細胞溶解物（２５０ｍＬ）として添加した。反応混合物を５分間攪拌した。添加用漏斗を用いて、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（４５ｇ）を１時間にわたりゆっくりと添加した。１０ＭのＮａＯＨ（２７ｍＬ）を自動滴添定装置によって１７時間にわたり添加することにより、ｐＨを７に維持した。その後、反応サンプルのガスクロマトグラフィーは、生成物への完全な変換を示した。ＣｅｌｉｔｅＴＭ（１６ｇ）をフラスコに添加し、次に、ＨＣＮを除去するために、その排気を５Ｍ  ＮａＯＨ（２００ｍＬ）中で泡立てるダイヤフラム・ポンプに連結した。混合物を１００ｍｍ  Ｈｇ圧力下で６０℃に加温した。１時間後、ＨＣＮの除去を助けるために、溶液中に水中エア・バブラーを入れた。３時間後、ＨＣＮ検出装置は、排気中、５ｐｐｍ未満のＨＣＮを示した。混合物を室温まで冷却し、次に、ＣｅｌｉｔｅＴＭパッドにより濾過した。濾過物は酢酸ブチルを用いて抽出し（３ｘ  ８００  ｍＬ）、合わせた有機層は、活性炭のパッドにより濾過した。ロータリー・エバポレータにより真空下で溶媒を除去し、２８．５ｇのエチル（Ｒ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートが提供された。純度はＨＰＬＣにより９８％（ｗ／ｗ）であり、鏡像異性体過剰率（ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｉｃ  ｅｘｃｅｓｓ）は＞９９％であった（キラルＧＣによる；Ｓ鏡像異性体は検出することができなかった）。本明細書中で使用する場合、用語「鏡像異性体過剰率」または「ｅ．ｅ．」とは、主（Ｆ（＋））および副（Ｆ（−））鏡像異性体のモルまたは重量の割合同士の絶対差（すなわち、｜  Ｆ（＋）  −  Ｆ（−）  ｜、式中、Ｆ（＋）  −  Ｆ（−）  ＝１）を意味する。パーセントｅ．ｅ．は１００  Ｘ  ｜  Ｆ（＋）  −  Ｆ（−）  ｜である。鏡像異性体の組成は、上記実施例６に記述されるガスクロマトグラフィー法を用いて、および当技術分野において知られている方法を用いて、容易に特性決定することができる。
【０２９５】
（実施例８−１２）
（エチル（Ｒ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートのエチル（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートへの変換）
実施例８−１２のそれぞれについて、ｐＨ電極および塩基を添加するための補給チューブにより自動滴定装置へと連結された１７０ｍＬの容器へ、ＮａＣＮ（１．５ｇ、３１ｍｍｏｌ）および水（５０ｍＬ）を入れた。容器を密閉し、ｐＨを濃硫酸（０．９ｍＬ）の添加により７に調整した。この反応混合物を４０℃に加温し、ハロヒドリンデハロゲナーゼ溶液（１０ｍＬの水中、０．４ｇ）を用いて処理した。これらの実施例で使用したハロヒドリンデハロゲナーゼは以下の配列番号で与えられるポリペプチド配列を有していた：
実施例  ８        配列番号３２
実施例  ９        配列番号９０
実施例  １０      配列番号９４
実施例  １１      配列番号９６
実施例  １２      配列番号９８
次いで、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレート（５．００ｇ、３０．１ｍｍｏｌ）を、注射器を介して添加した。自動滴定装置は、４ＭのＮａＣＮの添加によりｐＨを７に維持した。反応の進行は、添加したＮａＣＮ溶液の累積量を時間に対して記録することによりモニターした。
【０２９６】
図２は、これらの実施例に関する、エチル（Ｓ）−４−シアノ−３−ヒドロキシブチレートの変換率（添加したＮａＣＮの累積等量から計算）を時間に対して示す。実施例８は配列番号３２のアミノ酸配列を有するハロヒドリンデハロゲナーゼを使用し、このものは、配列番号３１に相当する新規核酸配列から発現されるアグロバクテリウム・ラジオバクター（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ）ＡＤ１由来の天然型ハロヒドリンデハロゲナーゼのアミノ酸配列（ｈｈｅＣ）を有していた。実施例９〜１２に関する時間に対する変換率を、実施例８に対するものと比較することにより、本発明の新規ハロヒドリンデハロゲナーゼがＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  ＡＤ１の天然型ハロヒドリンデハロゲナーゼ（ｈｈｅＣ）よりも高い活性を有していることが示される。
【０２９７】
本出願書類に引用される全ての刊行物、特許、特許出願、およびその他の文献を、各刊行物、特許、特許出願、またはその他の文献が、個別的にあらゆる目的に関し参照により組み入れられるのと同様に、あらゆる目的に関し、それらの全文を参照により組み入れるものとする。
【０２９８】
本発明の好ましい実施形態を説明し、記述したが、本発明の精神および範囲を逸脱しない多様な変更がその中になされ得ることは容易に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２９９】
【図１】図１は、ｐ１５Ａ複製起点（Ｐ１５Ａ  ｏｒｉ）、ｌａｃＩリプレッサー、Ｔ５プロモーター、Ｔ７リボソーマル結合部位（Ｔ７ｇ１０）、およびクロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｍＲ）を含む本発明の３９４４ｂｐの発現ベクター（ＰＣＫ１１０７００）である。
【図２】図２は、実施例８〜１２に記述される各種ハロヒドリンデハロゲナーゼ酵素の存在下における、エチル（Ｓ）−４−クロロ−３−ヒドロキシブチレートと水性シアン化水素との反応に関する、時間に対する変換率を表す。
【図１】
2008537477.tif 000093
【図２】
2008537477.tif 000094
【配列表】
2008537477000001.app