(57)【要約】本発明は、ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ−３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）に結合しない、プロガストリンに特異的なプロガストリン結合分子を提供する。さらに、本発明は、ガストリン前駆体分子であるプロガストリンのＮ−末端及びＣ−末端で配列に選択的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）、及びこれらのＭＡｂを産生するハイブリドーマを提供する。また、免疫検出及び免疫定量アッセイにおけるプロガストリン及びガストリンホルモン種の検出及び定量に有用なＭＡｂのパネルも提供する。これらのアッセイは、ガストリン促進性の疾患若しくは状態を診断しモニターするのに、又は治療の経過の進行をモニターするのに有用である。本発明は、生検試料又は組織スライス等の固体試料におけるガストリン種を検出し、可視化するのに適する免疫組織化学（ＩＨＣ）及び免疫蛍光（ＩＦ）アッセイを含む、固相アッセイをさらに提供する。プロガストリン結合分子は、プロガストリン促進性の疾患又は状態におけるプロガストリンに対する受動免疫に治療上有用である。また、アミノ酸約１０個から約３５個のペプチド鎖である代用参照標準（ＳＲＳ）分子も提供し、ＳＲＳ分子は、アミノ酸約５０個を超える対象のタンパク質に見出されるエピトープを少なくとも２つ含む。このようなＳＲＳ分子は、対象の真正タンパク質の代わりに、標準として有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ−３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）に結合せず、プロガストリンに選択的に結合するプロガストリン結合分子。
【請求項２】
抗体結合領域を含む、請求項１に記載のプロガストリン結合分子。
【請求項３】
抗体である、請求項１又は２のいずれか一項に記載のプロガストリン結合分子。
【請求項４】
モノクローナル抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロガストリン結合分子。
【請求項５】
単鎖抗体である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のプロガストリン結合分子。
【請求項６】
前記抗体は、哺乳動物の抗体である、請求項１〜５のいずれか一項に記載のプロガストリン結合分子。
【請求項７】
前記哺乳動物の抗体は、マウス抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロガストリン結合分子。
【請求項８】
前記哺乳動物の抗体は、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項１〜６のいずれか一項に記載のプロガストリン結合分子。
【請求項９】
アミノ酸配列ＳＷＫＰＲＳＱＱＰ（配列番号６）内のエピトープに選択的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項１０】
ハイブリドーマ４９０−１によって産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
アミノ酸配列ＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号７）内のエピトープに選択的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項１２】
ハイブリドーマ４９１−１によって産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する、請求項１１に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１３】
アミノ酸配列ＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号８）内のエピトープに選択的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項１４】
ハイブリドーマ４９５−１によって産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する、請求項１３に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１５】
配列番号６のアミノ酸配列内のエピトープでプロガストリンのＮ−末端に選択的に結合する抗体、配列番号７のアミノ酸配列内のエピトープでプロガストリンのＮ−末端に選択的に結合する抗体、及び配列番号８のアミノ酸配列内のエピトープでプロガストリンのＣ−末端に選択的に結合する抗体、からなる群から選択される２以上の抗体を含む、モノクローナル抗体のパネル。
【請求項１６】
ハイブリドーマ４９０−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１８９）。
【請求項１７】
ハイブリドーマ４９１−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９０）。
【請求項１８】
ハイブリドーマ４９５−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９１）。
【請求項１９】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体及び薬学的に許容できる担体、を含む医薬組成物。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体は、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
ａ）プロガストリンをアッセイするための試料を得るステップと、
ｂ）抗体が結合し、存在する任意のプロガストリンにプロガストリン−モノクローナル抗体複合体を形成させるのに適した条件下で、プロガストリンに特異的に結合するが、ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）には結合しないモノクローナル抗体を、試料に接触させるステップと、
ｃ）プロガストリン−モノクローナル抗体複合体の存在又は非存在を検出するステップ、及び／又は免疫検出方法により試料におけるプロガストリン−モノクローナル抗体複合体の量を決定するステップと、
を含む、プロガストリンの免疫アッセイ。
【請求項２２】
前記モノクローナル抗体は、アミノ酸配列ＳＷＫＰＲＳＱＱＰ（配列番号６）内のエピトープ、アミノ酸配列ＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号７）内のエピトープ、又はアミノ酸配列ＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号８）内のエピトープに選択的に結合する、請求項２１に記載のプロガストリンの免疫アッセイ。
【請求項２３】
前記モノクローナル抗体は、４９０−１、４９１−１、及び４９５−１、からなる群から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する、請求項２１又は２２のいずれか一項に記載のプロガストリン免疫アッセイ。
【請求項２４】
前記免疫検出方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、免疫蛍光（ＩＦ）アッセイ、凝集アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、スロットブロットアッセイ、又は表面プラズモン抵抗検出法である、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載のプロガストリン免疫アッセイ。
【請求項２５】
患者からの生体液の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、
前記試料におけるプロガストリンのレベルを、１つ若しくは複数の対照の個体からの生体液の試料におけるプロガストリンのレベル又は参照標準と比較するステップと、
を含む、患者におけるガストリン促進性の疾患又は状態を診断する方法。
【請求項２６】
請求項１９の医薬組成物を、それを必要とする患者に投与するステップを含む、ガストリン促進性の疾患又は状態を予防又は治療する方法。
【請求項２７】
最初の時点で、ガストリン促進性の疾患又は状態に罹患している患者又はその危険のある患者からの生体液の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、
様々な時点で、前記患者からの生体液の１つ又は複数の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、
それによりガストリン促進性の疾患又は状態をモニターするステップと、
を含む、患者におけるガストリン促進性の疾患又は状態をモニターする方法。
【請求項２８】
ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ−３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）に結合せず、プロガストリンに選択的に結合するモノクローナル抗体と、適切な容器と、を含む、免疫アッセイを行うためのキット。
【請求項２９】
アミノ酸約５０個を超える対象のタンパク質に存在する少なくとも２つのエピトープの各々の免疫模倣物を含み、本質的に、アミノ酸約１０個から約３５個のペプチド鎖を含む、代用参照標準（ＳＲＳ）分子。
【請求項３０】
前記対象のタンパク質は、ペプチドホルモン又はペプチドホルモン前駆体である、請求項２９に記載の代用参照標準（ＳＲＳ）分子。
【請求項３１】
合成ペプチドである、請求項２９又は３０のいずれか一項に記載の代用参照標準（ＳＲＳ）分子。
【請求項３２】
組換えペプチドである、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の代用参照標準（ＳＲＳ）分子。
【請求項３３】
前記ペプチドホルモン前駆体は、プロガストリンである、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の代用参照標準（ＳＲＳ）分子。
【請求項３４】
第１及び第２のエピトープを含むアミノ酸約５０個を超える対象のタンパク質に対するサンドイッチ免疫アッセイを標準化する方法であって、
対象のタンパク質の前記第１及び第２のエピトープの免疫模倣物を含み、本質的に、アミノ酸約１０個から約３５個のペプチド鎖を含む代用参照標準（ＳＲＳ）分子、の標準量を用いた免疫アッセイで生成されるシグナルを検出するステップ又は測定するステップを含む、方法。
【請求項３５】
標準量の代用参照標準（ＳＲＳ）分子を用いた免疫アッセイで生成されたシグナルを、未知量の対象のタンパク質を含む試料を用いた免疫アッセイで生成されたシグナルと比較する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
標準量の代用参照標準（ＳＲＳ）分子を用いた免疫アッセイで生成されたシグナルを、既知量の対象のタンパク質を含む試料を用いた免疫アッセイで生成されたシグナルと比較する、請求項３４又は３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、免疫蛍光（ＩＦ）アッセイ、凝集アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、スロットブロットアッセイ、又は表面プラズモン抵抗検出法である、請求項３４〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記対象のタンパク質は、ペプチドホルモン又はペプチドホルモン前駆体である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ペプチドホルモン前駆体は、プロガストリンである、請求項３４〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記代用参照標準（ＳＲＳ）分子は、［プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸］−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１０）、［プロガストリンの６〜１４番目のアミノ酸］−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＱＱＰＤＡＰＬＧＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１１）、［プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸］−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＧＧＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１２）、［プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸］−Ｐｒｏ−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１３）、［プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸］−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＰＧＧＰＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１４）、及び［プロガストリンの６〜１４番目のアミノ酸］−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＱＱＰＤＡＰＬＧＰＰＧＧＰＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１５）からなる群から選択される、請求項３４〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、動物、特にヒトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏで見出された、ガストリンホルモン前駆体である、プロガストリンの特定の領域に対する抗体に関する。本発明は、これらのモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の、ガストリン促進性の疾患及び状態の検出、診断、及びモニターへの適用、並びに本発明のＭＡｂのガストリン促進性の疾患及び状態の予防及び治療のための使用方法にさらに関する。本発明は、また、代用分子、及び免疫アッセイにおける参照標準としてのその代用分子の使用、特にペプチドホルモンに適用した際の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒトプロガストリンは、アミノ酸１０１個のペプチドであり、ガストリン遺伝子の主要な翻訳産物であり、以下の構造：
ＭＱＲＬＣＶＹＶＬＩＦＡＬＡＬＡＡＦＳＥＡＳＷＫＰＲＳＱＱＰＤＡＰＬＧＴＧＡＮＲＤＬＥＬＰＷＬＥＱＱＧＰＡＳＨＨＲＲＱＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭ  ＤＦＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号１）
を有する。
【０００３】
プロガストリンは、プレプロガストリンから最初の２１個のアミノ酸（単一のペプチドを構成する）の切断により形成される。アミノ酸８０個の長さのプロガストリンの鎖は、切断及び修飾酵素により、ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ−３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）を含む、いくつかの生物学的に活性を有するガストリンホルモンの形態にさらにプロセシングされる。
【０００４】
成熟Ｇ１７は、アミノ末端及びカルボキシ末端の残基の両方で修飾され、Ｎ−末端のグルタミン酸は環化されてピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）を形成し、Ｃ−末端フェニルアラニン残基の遊離のカルボキシル基は、酵素であるぺプチジルα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）によりアミド化されてＣ−末端のＰｈｅ−ＮＨ２を形成する。成熟Ｇ３４は、そのＣ−末端が同じくアミド化されてＣ−末端Ｐｈｅ−ＮＨ２を形成する（Ｄｏｃｋｒａｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００１年）、６３巻、１１９〜１３９頁）。
【０００５】
ヒトにおける「リトル」ガストリンの優勢型である、成熟Ｇ１７は、アミノ酸配列：ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号２）を有する。Ｇ１７−Ｇｌｙは、健常ヒト対象で「リトル」ガストリンの少数の構成要素として見出される、ガストリンの不完全にプロセシングされた形態であり、アミノ酸配列：ｐＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号３）を有する。
【０００６】
ガストリン−３４は、ヒトにおける「ビッグ」ガストリンの優勢型であり、アミノ酸配列：ｐＥＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号４）を有する。グリシン延長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）は、Ｃ−末端にグリシン残基を有し、アミノ酸配列：ｐＥＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＥＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号５）を有する。
【０００７】
ガストリンは、ガストリン放出ペプチド（ＧＲＰ）に反応して、胃の幽門洞のＧ細胞によって分泌され、胃酸、及びいくつかのペプチドホルモンの、最も顕著にはソマトスタチンのパラクリン作用により抑制される。ガストリンペプチドは健常個体の胃で酸の分泌を刺激する機能をすることは長い間認められていたが、これらのペプチドが胃腸（ＧＩ）系で様々な細胞タイプの増殖、分化、及び成熟の制御もすることは最近示されているにすぎない。
【０００８】
プロガストリンは、通常、ガストリンホルモンの形態に完全にプロセシングされる。プロガストリンは、過剰に産生されると、少なくとも部分的にプロセシングされて、胃腸系に作用してガストリン促進性の腫瘍の形成を増強し得る１つ又は複数の形態のガストリンホルモンとなる。場合によっては、プロガストリンは血中を循環し、プロガストリン促進性の疾患又は状態に罹患している患者の尿中で検出することができる。
【０００９】
Ｇ１７及びより少ない程度でＧ１７−Ｇｌｙは、ＧＩ系におけるそれらの局所活性の他に血流中に放出され、胃がん、結腸直腸がん、及び膵臓がん等の胃腸の障害及び疾患に罹患している患者の血清で増加することが見出されている。これらのガストリン種は、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）及び肝臓に転移した腫瘍等、胃腸管と関連のない他の疾患に関連することも、より最近では見出されている。例えば、「Ｇａｓｔｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ：ａ  ｕｎｉｆｙｉｎｇ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ」、Ｓ．Ｎ．Ｊｏｓｈｉら、Ｄｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（１９９６年）、１４巻、３３４〜３４４頁、並びに「Ｇａｓｔｒｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  Ｃａｎｃｅｒ」、Ｓｍｉｔｈ，Ａ．Ｍ．及びＷａｔｓｏｎ，Ｓ．Ａ．、（２０００年）、Ａｌｉｍｅｎｔａｒｙ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、１４巻（１０）、１２３１〜１２４７頁を参照されたい。
【００１０】
抗体は、医薬、獣医学、及び他の免疫検出の分野で用いられる多くのアッセイ技術における主要な試薬である。このような試験には、例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）、免疫蛍光（ＩＦ）アッセイ等、多くの日常的に用いられる免疫アッセイ技術が含まれる。
【００１１】
抗ガストリンポリクローナル抗体は、ガストリン活性を阻害するのに有効であることが示されており（「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｎ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｂｙ  ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｅｔｒａｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｉｎ」、Ｊａｆｆｅら、Ｓｕｒｇｅｒｙ、（１９６９年）、６５巻（４）、６３３〜６３９頁）、非ヒト抗ガストリンポリクローナル抗体は、摂食による刺激なしに過剰のガストリンが産生される病態であるゾリンジャー  エリソン症候群に罹患している患者における治療に適用されている。Ｈｕｇｈｅｓらの「Ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  Ｇａｓｔｒｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｚｏｌｌｉｎｇｅｒ−Ｅｌｌｉｓｏｎ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ」、ＨｕｇｈｅｓらのＤｉｇｅｓｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ、（１９７６年）、２１巻（３）、２０１〜２０４頁を参照されたい。しかし、これらのウサギ抗ガストリン抗体は、「この患者において、良くてもせいぜい短期の効果」を有するものであった（Ｈｕｇｈｅｓ、２０４頁）。米国特許第５８８６１２８号、及び第５７８５９７０号は、ガストリンホルモンペプチド複合体で免疫されることによって、その成長が、ガストリンホルモンに依存するか又はそれに刺激される潰瘍又は腫瘍、を治療する方法を開示している。
【００１２】
今までに、感度よく検出することができ、プロガストリンをプロセシングされた形態のガストリンホルモンと正確に区別することができるＭＡｂは入手できなかった。さらに、本発明までは、例えば、生体液の試料等の試料でプロガストリンの量を正確に測定することはできなかった。本発明のＭＡｂは、正常状態及び疾患状態においてプロガストリンの生物学を精密に規定するための、臨床検査のためのアッセイで用いることができる。本発明は、薬剤の使用のためのＭＡｂ組成物、及びプロガストリン促進性の疾患及び状態の予防及び治療のための方法も提供する。
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ−３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）に結合せず、プロガストリンに選択的に結合するプロガストリン結合分子を提供する。プロガストリン結合分子は、モノクローナル抗体、抗体結合領域、又は単鎖抗体等の抗体分子であってよい。
【００１４】
一態様では、本発明は、プロガストリンのアミノ酸配列の１〜９番目のアミノ酸、すなわちＳＷＫＰＲＳＱＱＰ（配列番号６）内のエピトープでプロガストリンに選択的に結合するモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を提供する。プロガストリンのアミノ酸配列の１〜９番目のアミノ酸、すなわちＳＷＫＰＲＳＱＱＰ（配列番号６）内のエピトープでプロガストリンに選択的に結合するＭＡｂを産生するハイブリドーマも提供する。
【００１５】
別の一態様では、本発明は、アミノ酸配列の６〜１４番目のアミノ酸、すなわちＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号７）内のエピトープでプロガストリンに選択的に結合するＭＡｂを提供する。アミノ酸配列の６〜１４番目のアミノ酸からなるＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号７）内のエピトープでプロガストリンに選択的に結合するＭＡｂを産生するハイブリドーマも提供する。
【００１６】
さらに別の一態様では、本発明は、プロガストリンのアミノ酸配列の７２〜８０番目のアミノ酸からなるＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号８）内のエピトープでプロガストリンに選択的に結合するＭＡｂを提供する。アミノ酸配列の７２〜８０番目のアミノ酸からなるＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号８）内のエピトープでプロガストリンに選択的に結合するＭＡｂを産生するハイブリドーマも提供する。
【００１７】
本発明によると、上記分子がガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ−３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）に結合しないため、プロガストリンの２つ以上の組合せを、プロガストリン結合分子のパネルに用いることができる。
【００１８】
また、薬学的に許容できる担体と組み合わせても、プロガストリン結合分子がガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ−３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）に結合しない、プロガストリン結合分子の医薬組成物を提供する。詳しい一態様では、本発明は、（１）プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸からなるＳＷＫＰＲＳＱＱＰ（配列番号６）に対応するアミノ酸配列内のエピトープでプロガストリンに、（２）アミノ酸配列の６〜１４番目のアミノ酸からなるＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号７）内のエピトープでプロガストリンに、又は（３）アミノ酸配列の７２〜８０番目のアミノ酸からなるＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号８）内のエピトープでプロガストリンに、選択的に結合するＭＡｂを、薬学的に許容できる担体と組み合わせた医薬組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、プロガストリンの免疫アッセイをさらにまた提供する。この方法は、最初にプロガストリンをアッセイする試料を得るステップと、結合し、存在する任意のプロガストリンにプロガストリン−プロガストリン結合分子複合体を形成させるのに適した条件下で、ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）に結合しないプロガストリン結合分子を、試料に接触させるステップと、次いで、プロガストリン−プロガストリン結合分子複合体の存在又は非存在を検出するステップ、及び／又は免疫検出法により試料におけるプロガストリン−プロガストリン結合分子複合体の量を決定するステップと、を含む。
【００２０】
本発明は、患者からの生体液の試料におけるプロガストリンのレベルを決定すること、及び試料におけるプロガストリンのレベルを、１つ又は複数の対照の個体からの生体液の試料におけるプロガストリンのレベル又は参照標準と比較することにより、患者におけるガストリン促進性の疾患又は状態を診断する方法をさらに提供する。このようなガストリン促進性の疾患又は状態は、（１）プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸からなるＳＷＫＰＲＳＱＱＰ（配列番号６）に対応するアミノ酸配列内のエピトープで、プロガストリンに、（２）プロガストリンのアミノ酸配列の６〜１４番目のアミノ酸からなるＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号７）内のエピトープでプロガストリンに、又は（３）プロガストリンのアミノ酸配列の７２〜８０番目のアミノ酸からなるＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号８）内のエピトープでプロガストリンに選択的に結合するプロガストリン結合分子を含む医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することにより、予防又は治療することができる。
【００２１】
患者におけるガストリン促進性の疾患又は状態をモニターする方法も提供する。この方法は、最初の時点で、ガストリン促進性の疾患又は状態に罹患している患者、又はその危険のある患者からの生体液の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、１つ又は複数の異なる時点で、患者からの生体液の１つ又は複数の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、異なる時点で測定したプロガストリンのレベルを比較するステップと、それによりガストリン促進性の疾患又は状態をモニターするステップとを含む。
【００２２】
本発明は、抗プロガストリン結合分子、及び適切な容器を含む、免疫アッセイを行うためのキットをさらに提供する。プロガストリン結合分子は、プロガストリンに選択的に結合するが、ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ−３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）に結合しない。
【００２３】
また、本質的に、アミノ酸約１０個から約３５個のペプチド鎖を含む代用参照標準（ＳＲＳ）分子を提供する。ＳＲＳ分子は、アミノ酸約５０個を超える対象のタンパク質に見出される少なくとも２つのエピトープの免疫模倣物を含む。
【００２４】
本発明は、第１及び第２のエピトープを含む、アミノ酸約５０個を超える対象のタンパク質に対するサンドイッチ免疫アッセイを標準化する方法もさらに提供し、この方法は、標準量の代用参照標準（ＳＲＳ）分子を用いた免疫アッセイで生成されるシグナルを検出するステップ又は測定するステップを含む。ＳＲＳ分子は、本質的に、対象のタンパク質の第１及び第２のエピトープの免疫模倣物を含む、アミノ酸１０個から約３５個の間のペプチド鎖からなる。
【発明の詳細な説明】
【００２５】
以下に、本明細書で用いられる用語及び成句の定義を提供する。
【００２６】
本明細書で用いる「プレプロガストリン」は、アミノ酸１０１個の、ガストリン遺伝子の主要な翻訳産物であり、Ｎ−末端の２１個のアミノ酸のシグナル配列、プロ−ペプチド配列、及びガストリンホルモン配列を含む。
【００２７】
本明細書で用いる「プロガストリン」は、プレプロガストリンから２１個のアミノ酸シグナル配列が切断された後に形成される、アミノ酸８０個の産物である。「プロガストリン」は、ガストリンホルモンの生物学的に活性な形態全ての主要な前駆体である。
【００２８】
本明細書で用いる「プロガストリン−免疫模倣物」は、プロガストリンに結合し、抗プロガストリン抗体が結合する抗体を誘発する部分である。本明細書で用いるプロガストリン免疫模倣物部分は、Ｃ−末端がアミド化されていても遊離のＣ−末端を有していてもガストリン−１７（Ｇ１７）に結合せず、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、Ｃ−末端がアミド化された形態及び遊離のＣ−末端を有する形態の両方を含むガストリン−３４（Ｇ３４）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）に結合しない。
【００２９】
本明細書で用いる「ガストリンホルモン」又は「ガストリンホルモン形態」は、交換可能に用いられ、任意の生物学的に活性があり、及び／又は免疫学的に交差反応性のあるガストリンホルモンペプチドを意味する。ガストリンホルモンの主要な形態には、それだけには限定されないが、ガストリン−１７（Ｇ１７）（Ｃ−末端がアミド化されていても遊離のＣ−末端を有していても）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、Ｃ−末端がアミド化された形態及び遊離のＣ−末端を有する形態の両方を含むガストリン−３４（Ｇ３４）、グリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）が含まれる。
【００３０】
本明細書で用いる「生体液」は、生物起源の材料を含む任意の液体を意味する。本発明で用いるための好ましい生体液には、動物、例えば哺乳動物、好ましくはヒト対象の体液が含まれる。体液は、それだけには限定されないが、血液、血漿、血清、リンパ液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、唾液、汗、及び尿を含む、任意の体液であってよい。
【００３１】
本明細書で用いる「保存剤」は、生体液の試料、又は生物学的構成成分を含む液体試料における時間依存性のガストリンの劣化を低減する任意の物質、サプリメント、又は添加剤を意味する。本発明を実施するのに有用な保存剤は、それだけには限定されないが、一般的な化学的保存剤、例えば、アジ化ナトリウム、ＥＤＴＡ、並びにプロテアーゼ阻害薬、例えば、ＰＭＳＦ（フェニルメチルスルホニルフルオリド）、及びアプロチニン（例えば、Ｔｒａｓｙｌｏｌ）、又は、例えばヘパリン等の生物学的保存剤を含む、当技術分野ではよく知られている多くの保存剤が含まれる。
【００３２】
本明細書で用いる「プロガストリン結合分子」は、プロガストリンに結合するが、ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ−３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）には結合しない任意の分子であってよい。
【００３３】
本明細書で用いる「ガストリン促進性の疾患又は状態」は、ガストリン及び／又はプロガストリンが刺激的役割を担う任意の疾患又は状態を意味する。例えば、ガストリンは多くの形態の腫瘍、特に胃腸の腫瘍、例えば結腸直腸腫瘍の成長及び増殖を刺激することがよく知られている。Ｍｉｃｈａｅｌｉらへの米国特許第６５４８０６６号を参照されたい。
【００３４】
本発明のプロガストリン結合分子は、例えば、抗体分子又は受容体分子等の任意のプロガストリン結合分子であってよい。抗体分子は、モノクローナル抗体等の任意の抗体であってよい。抗プロガストリン抗体分子は、単鎖の抗体分子、又は抗体フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、又はプロガストリン結合領域を含む任意の他の抗体フラグメントであってよい。好ましくは、本発明の抗プロガストリン抗体分子は、ウサギ、マウス、又はヒトの抗体分子等、哺乳動物の抗体分子である。本発明の抗プロガストリン抗体分子は、ヒト／非ヒトキメラ抗体（例えば、ヒト／マウスキメラ）、ヒト化の、又は完全にヒトの抗体であってよい。
【００３５】
モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、多くの点でポリクローナル抗血清より優れ、これらのアッセイの多くで用いる場合にポリクローナル抗血清から精製した抗体より優れるものとする独特の特徴を有する。これらの属性には、標的抗原に対する一決定基の特異性（すなわち、単一のエピトープに対する特異性）、様々な抗体調製物の間での不変の特異性、並びに経時的に不変の親和性及び化学組成が含まれる。さらに、ＭＡｂは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法により、不確定に、及び無制限の量で産生され得る。これらの特性は、関連する生物学的変異性が不可避で、免疫化した動物の寿命にわたって抗体の産生能力に制限があるｉｎ  ｖｉｖｏの免疫化方法、を必要とするポリクローナル抗体の特性、と際立って対照的である。
【００３６】
このような利点があるにもかかわらず、ＭＡｂは同一のエピトープに特異的であっても、個々のＭＡｂ間には相違が存在する。例えば、単一の抗原のエピトープ領域で免疫化することにより誘導されたＭＡｂ間の相違が、以下の特徴のいずれか又は全てに関して生じることがある：１）分子組成及びエピトープの４次構造に対する精巧な特異性、２）抗体のイディオタイプ、３）抗体の親和性、４）抗体のアロタイプ、及び５）抗体のアイソタイプ。これらの特徴的な相違は、特定の免疫アッセイでＭＡｂの挙動に影響を及ぼすことがあり、その結果、同一の抗原の領域に対して生じた様々なＭＡｂ単離物が、所与のアッセイで異なって挙動することがある。したがって、ＭＡｂには、特定の免疫アッセイで試薬として用いる場合に、同一のエピトープに結合する他のものより優れるものがある。
【００３７】
本発明の抗プロガストリン結合分子、特に抗プロガストリンＭＡｂは、免疫アッセイで特に有用である。免疫アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫拡散アッセイ、又は免疫検出アッセイ、例えば表面プラズモン抵抗アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標））アッセイ）、ＥＬＩＳＰＯＴ、スロットブロット、又はウエスタンブロットであってよい。このような技術の一般的な手引きとして、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（編集）、（１９８７年）、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州を参照されたい。
【００３８】
特に有用な実施形態では、本発明のプロガストリン結合分子を、組織試料においてガストリンホルモンの形態を可視化するための、免疫組織化学（ＩＨＣ）染色アッセイ又は免疫蛍光（ＩＦ）手順等の免疫アッセイで用いることができる。例えば、「Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ」、（１９９１年）、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｐ．Ｐｒｉｃｅ及びＤａｖｉｄ  Ｊ．Ｎｅｏｍａｎ（編集）、Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、ニューヨーク州を参照されたい。
【００３９】
免疫組織化学染色は、腫瘍の検出及び診断で大きな価値があり、例えば、Ｂｏｄｅｙ，Ｂ．、「Ｔｈｅ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｎｅｏｐｌａｓｍｓ」、（２００２年）、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ．、２巻（４）、３７１〜９３頁を参照されたい。Ｏｓｉｎ  ＰＰ、Ｌａｋｈａｎｉ  ＳＲ．、（１９９９年）、Ｔｈｅ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｆａｍｉｌｉａｌ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ：  Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１巻（１）３６〜４０頁も参照されたい。
【００４０】
抗プロガストリンモノクローナル抗体
特定の適用で使用するのに最適なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）の選択は、特定の意図する適用において、個々の候補のＭＡｂ各々の性能を評価することにより実現することが好ましい。この理由から、意図する適用において、最適の機能性に関して候補のＭＡｂを試験することは、意図する使用に最適であるＭＡｂを誘導する選択過程の一部である。この選択ステップは、標的にした抗原への結合と、持続的な細胞の成長及び分化、並びに不確定の期間にわたる一貫した非制限の抗体の産生を含む、ハイブリドーマ細胞系の本質的な特徴の安定性を確実するためにＭＡｂを産生するハイブリドーマの連続的なクローニングと、を含む、ＭＡｂを誘導するのに通常行われる選択ステップに加えて行われる。
【００４１】
本明細書で用いる、プロガストリンの特定の標的のエピトープに対して「選択的」である抗体は、任意の他のガストリンエピトープよりも少なくとも約１０倍高い、好ましくは任意の他のガストリンエピトープよりも１００倍高い、最も好ましくは任意の他のガストリンエピトープよりも少なくとも約１０００倍高いＫａで、プロガストリンの特定の標的のエピトープに抗体が結合することを意味する。
【００４２】
一態様では、本発明は、ＭＡｂが優れた特性を有する、プロガストリンのＮ−末端及びＣ−末端に選択的なＭＡｂを同定する方法を提供する。これらのＭＡｂは、液体、特に生体液におけるガストリンホルモンの特定の形態を測定するようにデザインされている免疫酵素測定アッセイ（一般的に「ＥＬＩＳＡ」又は酵素結合免疫吸着アッセイと呼ばれる）における使用に特に適している。
【００４３】
本発明のＭＡｂは、免疫検出アッセイ、例えば、ＥＬＩＳＰＯＴ、ラジオイムノアッセイ、抗体ベースのサンドイッチ捕獲アッセイ、表面プラズモン抵抗検出法（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）タイプのシステム）、ドットブロット、スロットブロット、及びウエスタンブロットアッセイ、並びに免疫蛍光アッセイ及び免疫組織化学アッセイでガストリンホルモンを検出し、及び／又は定量するのにも適している。
【００４４】
別の一態様では、本発明は、プロガストリンのアミノ酸配列の１〜９番目のアミノ酸（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰ、配列番号６）、すなわちアミノ酸２１個のシグナル配列形態のプレプロガストリン（ガストリン遺伝子の主要な翻訳産物）の切断後に形成される産物内のエピトープでプロガストリンに選択的に結合するＭＡｂを提供する。
【００４５】
さらに別の一態様では、本発明は、プロガストリンのアミノ酸配列の６〜１４番目のアミノ酸（ＳＱＱＰＤＡＰＬＧ、配列番号７）、すなわちアミノ酸２１個のシグナル配列形態のプレプロガストリン（ガストリン遺伝子の主要な翻訳産物）の切断後、プロガストリンのアミノ酸１〜５がさらに除去された後に形成される産物内のエピトープでプロガストリンに選択的に結合するＭＡｂを提供する。
【００４６】
さらなる一態様では、本発明は、プロガストリンＣ−末端領域のアミノ酸配列の７２〜８０番目のアミノ酸（ＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号８）、すなわちアミノ酸２１個のシグナル配列形態のプレプロガストリン（ガストリン遺伝子の主要な翻訳産物）の切断後に形成される産物内のエピトープでプロガストリンに選択的に結合するＭＡｂを提供する。
【００４７】
またさらなる一態様では、本発明は、プロガストリンに選択的に結合するＭＡｂを提供する。これらのＭＡｂは、プロガストリンに結合するが、プロセシングされたガストリンホルモンの形態である、Ｇ１７、Ｇ３４、Ｇ１７−Ｇｌｙ、及びＧ３４−Ｇｌｙには結合しない。プロガストリンに選択的な本発明のＭＡｂは、ヒトプロガストリンのＣ−末端領域に結合するＭＡｂを含む。ヒトプロガストリンのＣ−末端に結合するこれらのＭＡｂは、それからプロガストリン及びガストリンが引き続きプロセシングされるアミノ酸１０１個のペプチド鎖からなるプレプロガストリンにも結合する。しかし、プレプロガストリンのプロセシングは、急速であり、それが合成される小胞体（ＥＲ）で起こる。プロガストリンに結合する本発明のＭＡｂは、試料におけるプロガストリンを検出し、定量するための、本明細書に記載するアッセイに有用である。
【００４８】
本発明のＭＡｂは、当技術分野ではよく知られ、確立されている技術により、キメラ化又はヒト化することができる。例えば、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｉｎ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ」というタイトルのＣａｂｉｌｌｙへの米国特許第４８１６５６７号、及び「Ｌａｂｅｌｅｄ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉ−ＣＤ−１８  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｋｉｔｓ」というタイトルのＷａｌｄｍａｎらへの米国特許第６６８９８６９号、及び「Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｍａｋｉｎｇ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」というタイトルのＣａｒｔｅｒらへの米国特許第６６３９０５５号を参照されたい。ヒト化抗体を作り変えて、オリジナルのマウスＭａｂの結合親和性に、より緊密にマッチさせることができる。例えば、「Ｒｅ−ｓｈａｐｅｄ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉ−ＨＭ１．２４抗体」というタイトルのＯｎｏらへの米国特許第６６９９９７４号を参照されたい。
【００４９】
本発明は、プロガストリン試料の、特に、生体液及び細胞、組織、生検試料、並びに臓器切片等の生物学的試料の検出のための方法も提供する。本発明は、罹患している組織における、又は正常の組織及び細胞におけるプロガストリンの存在を決定することにより、患者におけるガストリン促進性の疾患又は状態を診断する方法をさらに提供する。この方法は、患者からの生体液の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、患者の試料におけるプロガストリンのレベルを、１つ又は複数の対照の個体からの生体液の試料におけるプロガストリンのレベルと比較するステップとを含む。対照の個体からの試料は、健常個体からのプール生体液とすることができる。あるいは、患者の試料におけるプロガストリンのレベルを、参照標準と比較できる。参照標準は、健常個体におけるプロガストリンの正常範囲内にキャリブレーションした標準とすることができる。このような対照試料は、当業者であれば必要以上の実験を行わずに容易に調製することができる。代用参照標準については、また、以下を参照されたい。
【００５０】
これらの検出及び診断の方法は、本発明の抗プロガストリンＭＡｂを用いて、生検検体を免疫組織化学的に染色することにより実現できる。抗プロガストリンＭａｂの組織試料への結合は、例えば、蛍光、免疫金、又は酵素が促進する染色等の免疫組織化学法により可視化することができる。診断手順における免疫組織化学の一般的な再考には、例えば、Ｍｉｌｌｅｒら、Ｆｉｘａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  ｉｎ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：ａ  ｃｏｎｃｉｓｅ  ｒｅｖｉｅｗ  ｗｉｔｈ  ｐｒａｃｔｉｃａｌ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎｓ．、Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍ．Ｍｏｌ．Ｍｏｒｐｈｏｌ．、（２０００年）、８巻（３）、２２８〜２３５頁を参照されたい。
【００５１】
このような方法により、当業者であれば、本発明の抗プロガストリンＭａｂを利用して、プロガストリンの存在及び分布に関して、罹患している、癌性の、又は前癌状態の組織を含めた組織を評価することができる。この情報は診断に有用であることができ、診断されたガストリン促進性の又はプロガストリン促進性の疾患及び状態に対して適切な治療を選択するのにも有用であり得る。
【００５２】
代用参照標準
抗原により発現される２つの別々のエピトープに対する抗体の結合に頼るアッセイ系において、抗原が検出され、又は測定される、抗原に対する抗体ベースのアッセイは、ある状況下では実用性で制限され得る。試験試料におけるその抗原に対して定量をするアッセイのための参照抗原を容易に得ることができず、又は合成することができない場合がそうである。例えば、本出願に記載するプロガストリンサンドイッチＥＬＩＳＡでは、既知濃度の参照抗原の溶液の段階希釈を用いて検量線を作成する。
【００５３】
したがって、プロガストリンを定量するためのアッセイを行って、プロガストリンの希釈系列を用いて検量線を確立することができる。生成されたシグナルに対するプロガストリン濃度を測定するための検量線は、試験試料で得られたシグナルを比較し、検量線からプロガストリンの濃度を読むことにより、試験試料におけるプロガストリンの定量を可能にさせる。この手順の限界は、いくつかの抗原は、純粋な形態で、及び臨床で使用するための実際的なアッセイを生成するのに十分な量で得るのが困難であり、又は過剰に高価であることがあるということである。例えば、精製したプロガストリン（アミノ酸８０個のプロホルモン）は、生成するのに費用がかかり、正確に合成するのが困難である。これらの制約は、分子の２つの末端への抗体の結合に頼る、プロガストリンに対する捕獲ＥＬＩＳＡの実用性を厳しく制限するものである。
【００５４】
この問題に対する解決は、天然の分子の代わりに代用参照標準（ＳＲＳ）を代用することである。ＳＲＳは、免疫アッセイに必要とされる、天然の分子により発現されるエピトープを両方含み、ＳＲＳに結合する抗体の捕獲及び検出の両方を可能にするものである。しかし、ＳＲＳでは、天然分子の介在領域（及び／又は各エピトープから末端までの領域）は除去され、置き換わり、又は短縮されており、その結果、ＳＲＳは天然の分子よりも著しく短く、したがって、妥当な費用で容易に合成することができる。
【００５５】
アミノ酸の長さ約３５個までのペプチドは、現存するペプチド合成方法により、容易に、かつ経済的に合成することができる。したがって、ＳＲＳの２つのエピトープを連結する、アミノ酸１個から約２０個までのリンカーの付加は実際的である。特定の実施形態では、リンカーは、アミノ酸の長さ約４個から約１５個まで、又はアミノ酸の長さ約８個から約１２個までとすることができる。リンカーは、ＳＲＳが参照標準として働く特定の免疫アッセイにおいて最適の性能のための好適な長さ及び性質（例えば、剛性又は柔軟性、親水性又は疎水性等）のリンカーを選択することによりアッセイ性能を増強するようにデザインできる。
【００５６】
代用参照標準の概念は、より単純な合成化合物が、より複雑な天然化合物の代用として働くことができるアッセイにおいて、幅広く応用可能である。したがって、抗原がある特異的抗体によって捕獲され、第２の特異的抗体によって検出されるサンドイッチＥＬＩＳＡの場合には、ＳＲＳは一般構造：
［Ｘ−エピトープ１−Ｌ−エピトープ２−Ｙ］
を有し、この場合、エピトープ１及びエピトープ２は、天然分子の異なるエピトープの免疫模倣物であり、その結果、エピトープ１又はエピトープ２に結合する抗体は、天然分子の対応するエピトープにも結合する。ＳＲＳ分子の長さは、アミノ酸約１０個と３５個の間である。エピトープ１及びエピトープ２は、ペプチドリンカー若しくは非ペプチドリンカーであるＬにより、リンカーで結合していてもよく、あるいは、Ｌは共有結合であってもよい。Ｘ及びＹは、各々、アミノ酸、ペプチド配列、又はブロック基とすることができる。あるいは、Ｘ若しくはＹのいずれか、又は両方とも、それぞれ、ＳＲＳのＮ−末端又はＣ−末端の水素原子とすることができる。
【００５７】
本発明を実施するのに有用なリンカーには、任意のリンカー部分が含まれる。このような部分は、当技術分野ではよく知られている。例えば、有用なペプチドリンカー部分には、Ｌａｄｄらによって発行された米国特許第５７５９５５１号、９列６４行目に記載されているｇｌｙ−ｇｌｙ、Ｗｉｅｎｈｕｅｓらによって発行された米国特許第６６１３５３０号、３列３８〜４７行目の不活性ペプチド、及びＳｈｅｎらによって発行された米国特許第５６８３６９５号に開示されているプロリンリッチな柔軟なヒンジスペーサーが含まれる。さらに、非ペプチドのスペーサー部分も有用であり、それらは一般的にプロテアーゼ抵抗性であるというさらなる特徴を有している。Ｃｏｈｅｎらによって発行された米国特許第５７３６１４６号及び第５８６９０５８号に開示されているように、そのどちらもが、このような部分に、例えば、−Ｏ−Ｒ−ＣＯ−、−ＮＨ−Ｒ−ＣＯ−、−ＮＨ−Ｒ−ＮＨ−、−Ｏ−Ｒ−ＮＨ−、又は−ＮＨ−Ｒ−ＣＨ２−が含まれ、式中、Ｒは、１個又は複数の芳香族基又はヘテロ原子、例えば、窒素原子、酸素原子、又はイオウ原子により場合により置換され及び／又は割り込まれている飽和又は不飽和の炭化水素鎖である。Ｗａｎｇによって米国特許第６７８０９６９号に開示されている非ペプチドの化学リンカーも、本発明を実施するのに有用である。
【００５８】
プロガストリンは、多量に精製するのが困難で高価な、アミノ酸８０個の大型ペプチドである。ＳＲＳは、プロガストリンのＮ末端エピトープ（例えば、プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸）からなり、場合により短いリンカーが続き、プロガストリンＣ末端のエピトープ（例えば、７２〜８０番目のアミノ酸）に付着しており、固相ペプチド合成等の日常的な方法により合成することができる。リンカーは、例えば、アミノ酸、ペプチド、又は非ペプチドのリンカー等の任意のリンカーであってよい。ＳＲＳは、プロガストリン免疫アッセイを標準化するのに有用である。
【００５９】
特定の一実施形態では、プロガストリンＳＲＳは、場合によっては２つのペプチド間をリンカー配列により結合された、各々がアミノ酸９個のエピトープ含有ペプチドを２つ含んでいる。ＳＲＳの全長がアミノ酸残基約３５個の長さを超えず、それぞれの同種のエピトープに対する抗体の十分な結合が十分なアッセイ性能を保持しているのであれば、エピトープ含有ペプチドの配列の長さは、短くても長くても置換できる。
【００６０】
上記のように、ペプチドリンカーが２つのプロガストリンのエピトープの間に含まれている場合は、プロガストリンＳＲＳペプチドの長さは、リンカーの長さにより増大する。例えば、−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−又は−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−のリンカーにより、ペプチドの全長は、アミノ酸１８個から２０個に増大する。長い方のアミノ酸リンカーを置換することができ、プロガストリンＳＲＳとして使用するのに最適の配列が選択される。好ましい実施形態では、リンカーは、例えば、−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ（配列番号９）等のプロリンとグリシンとの組合せを含むペプチドである。アミノ酸約３５個までの長さのこのようなペプチドは、標準の方法により妥当な費用で高レベルの純度で、容易に大量に合成することができる。例えば、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、（１９９７年）、２８９巻、３〜１３頁、また、Ｗａｄｅ＆Ｔｒａｇｅａｒ、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、Ａｕｓｔｒａｌａｓ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、（１９９３年）、３巻（６）、３３２〜６頁を参照されたい。
【００６１】
プロガストリンのＳＲＳを、以下のように、真正プロガストリンの参照標準の代わりに用いることができる。プロガストリンＳＲＳの溶液を、プロガストリンが参照標準であった場合に用いるのと同モルのペプチドの濃度で調製する。この溶液の段階希釈を調製し、次いで、参照曲線（モル濃度対シグナル、例えば吸収）を確立するためのアッセイで用いる。
【００６２】
プロガストリンそれ自体の溶液と免疫測定の応答が同一であれば、プロガストリンＳＲＳ溶液をモルベースで調製でき、プロガストリンＳＲＳで、真正プロガストリンで得たのと類似の、又は同一の検量線が得られる。ヒト血漿等、プロガストリンを含む実際の試験試料から得られた吸光度値を、次いで、ＳＲＳ検量線と比較して試験試料におけるプロガストリンの濃度を決定する。プロガストリンＳＲＳ標準のプロガストリン標準に対する比較は、１回行う必要があるだけであり、引き続き正確度をチェックする必要があるだけである。
【００６３】
あるいは、ＳＲＳを用いて、真正の参照標準分子に対してキャリブレートする必要のない、任意の検量線を生成することができる。次いで、結果を全て、便利な標準の濃度のＳＲＳとの比較に基づいて、任意の単位として表す。
【００６４】
リンカーエレメントは、それが適用される特定のアッセイ方法に望まれるＳＲＳの属性に応じて、必要とされることも、されないこともある。プロガストリンＥＬＩＳＡで使用するのに適切なプロガストリンＳＲＳペプチドの例には、
［プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸］−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１０）、
［プロガストリンの６〜１４番目のアミノ酸］−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＱＱＰＤＡＰＬＧＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１１）、
［プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸］−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＧＧＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１２）、
［プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸］−Ｐｒｏ−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１３）、
［プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸］−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＰＧＧＰＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１４）、
［プロガストリンの６〜１４番目のアミノ酸］Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−［プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］（ＳＱＱＰＤＡＰＬＧＰＰＧＧＰＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ、配列番号１５）、
が含まれる。
【００６５】
プロガストリンＳＲＳペプチドのさらなる可能な配列は、当業者であれば不必要な実験を行わずに容易に決定できる。任意の特定の免疫アッセイに最適なプロガストリンＳＲＳは、免疫アッセイシステムで候補のＳＲＳペプチドを試験し、アッセイの条件下（例えば、温度及びイオン強度、並びに２価陽イオン濃度等の）で対象の濃度範囲における真正プロガストリンを擬するＳＲＳペプチドを選ぶことにより選択できる。
【００６６】
抗プロガストリンモノクローナルのパネル
本発明は、試料におけるプロガストリン及びガストリンを、明確に同定し、定量することができる抗プロガストリン及び抗ガストリンのＭＡｂのパネルを、初めて提供するものである。本発明のＭＡｂを用いることができる日常の免疫アッセイには、それだけには限定されないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、表面プラズモン抵抗タイプのアッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（登録商標）タイプのアッセイ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦ）、免疫組織化学アッセイ（ＩＨＣ）、免疫拡散アッセイ等が含まれる。例えば、日常の診断アッセイ方法の例として、「Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ  １，５，６，８，１１，１６，１８，３１，３３  ａｎｄ  ５６  ｕｓｅｆｕｌ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｐｕｒｐｏｓｅｓ」というタイトルのＤｉｌｌｎｅｒらへの米国特許第５９３２４１２号を参照されたい。
【００６７】
ＭＡｂのパネルを、特定のガストリンホルモン種に選択的に結合する１つ又は複数のさらなるＭＡｂで補うことで、試料におけるプロガストリンの他に、１つを超えるガストリンホルモン種（プロガストリンのプロセシングにより生成される）の特有の同定及び定量の能力がもたらされる。例えば、成熟Ｇ１７形態のＮ−末端に選択的なＭＡｂを抗体の上記パネルに加えることにより、本発明の抗プロガストリンＭＡｂによるプロガストリンの同定及び定量に加えて、試料における成熟Ｇ１７ホルモンの特有の同定及び定量がさらに可能になる。同様に、本発明の抗プロガストリンＭＡｂ及びＧ３４のＮ−末端に選択的なＭＡｂも含むＭＡｂのパネルにより、試料におけるＧ３４の特有の同定及び定量も可能になる。したがって、上記したように、任意の特定のガストリンホルモンの形態に選択的なＭＡｂをそのパネルに追加することにより、本発明の抗プロガストリンＭＡｂで得たプロガストリンに関する情報に加えて、試料における特定のガストリンホルモン形態の性質及び量に関するさらなる情報を得ることができる。
【００６８】
他の形態のガストリンホルモンを同定し、定量し、モニターするためのＭＡｂのパネルに有用なＭａｂの他の組合せは、当業者であれば直ちに明らかであろう。本発明は、本発明のそのようなＭＡｂの対を全て、及び本発明のＭＡｂの２つ以上の組合せを包含する。
【００６９】
本発明のＭＡｂは、ガストリンホルモンが促進する疾患及び状態に対する素因を評価するための、及びそれらに罹患している患者におけるそのような疾患及び状態を検出し診断するための、プロガストリン／ガストリンホルモン形態の量及び比率を正確に決定する手段を提供する。例えば、本発明の抗ガストリンＭＡｂを、プロガストリン、並びにＧ１７、Ｇ３４、及びＧ１７−Ｇｌｙ、及びＧ３４−Ｇｌｙのガストリンホルモン形態の任意の１つ又は全てに対して患者の血清及び他の生体液を大規模スクリーニングするためのＥＬＩＳＡアッセイに組み入れることができる。
【００７０】
本発明のＭＡｂ、本発明のＭＡｂから選択されたＭＡｂの対の組合せ、及び本発明のＭＡｂのパネルは、ハイスループットの方法に適用した場合に特に有用である。このような方法には、ガストリンホルモンの抗原を検出するマイクロチップ及びマイクロアレイの方法が含まれ、したがって、多くの試料を、マイクロプレート若しくはスライド、又は他のアッセイ基質、例えば、仮想ウェルのあるプレート（例えば、Ｇａｒｙａｎｔｅｓらへの米国特許第６５６５８１３号に記載されているもの等）等の上で試験できる。結合の検出は、現在入手可能な多くの最先端の検出システムの任意の１つによって可能となる。結合の検出は、例えば、抗原−抗体結合等、特定の生物分子の反応によって引き起こされる表面プラズモン抵抗（ＳＰＲ）の変化によって可能となる。酵素アッセイへのこの技術の適用については、例えば、Ｔａｒｅｍｉらへの米国特許第５９８１１６７号を参照されたい。この技術は、継続的なフローモードで適用でき、ガストリンホルモン等、表面が固定化されたペプチド又はタンパク質への抗体の結合を検出するのに、又はガストリン−抗体複合体を検出するのに同様に適用できる。後者の複合体は、それに対する結合が複合体の抗体によって立体障害を受けないガストリンホルモンの形態（Ｇ１７、Ｇ３４、Ｇ１７−Ｇｌｙ、又はＧ３４−Ｇｌｙ）のエピトープに特異的な表面を固定化した抗体への結合により検出できる。さらに、この技術は、ハイスループットの適用可能性、及び放射標識を必要としない高感度という利点を有する。
【００７１】
本発明のＭＡｂは、例えば生検材料等からの、組織試料の免疫組織化学（ＩＨＣ）及び免疫蛍光（ＩＦ）アッセイにも有用である。このような分析を用いて異常レベルの個々のガストリン−ホルモン形態を検出し、したがってガストリンホルモンが促進する疾患及び状態を診断することができる。
【００７２】
本発明のＭＡｂは、プロガストリンホルモンが促進する疾患及び状態の予防、診断、及び治療にも有用である。本発明の抗プロガストリンＭＡｂを、特定のガストリンホルモン形態に対して受動免疫化するための医薬組成物に配合できる。例えば、「Ａｎｔｉ−ｆａｃｔｏｒ  ＩＸ／ＩＸａ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」というタイトルのＢｌａｃｋｂｕｒｎらの米国特許第６３９１２９９号（以後‘２９９特許と呼ぶ）を参照されたい。例えば、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、及び、それらに向けられているガストリンホルモン形態に結合する能力を保持する任意のフラグメント（フラグメントの記載については‘２９９特許を参照されたい）等の、本発明のＭＡｂの機能上のフラグメントも、医薬組成物中に組み入れ、治療に適用できる。有用な医薬組成物については、‘２９９特許を参照されたい。本発明の医薬組成物の好ましい投与経路には、皮下、筋肉内、及び静脈内等の、非経口の投与経路が含まれる。さらに、ある種の疾患、特に、食道又は胃の潰瘍性疾患等、胃腸管の疾患を治療するために、経口の経路を用いることができる。
【００７３】
あるいは、本発明の医薬組成物を、経鼻的に送達できる。このような医薬組成物は、ガストリンホルモンが促進する疾患又は状態になる可能性が高い予後を有する患者におけるそのような疾患又は状態の予防又は治療や、すでにこのような疾患又は状態に罹患している患者の治療に有効な量で投与する場合に特に有用である。本発明の医薬組成物は、症状の軽減、及びプロガストリン促進性の疾患及び状態の進行の阻止にも有用である。
【００７４】
抗ガストリンＭＡｂ、特に、ガストリン促進性の疾患又は状態を治療するための本発明のヒト化抗ガストリンＭＡｂの、完全な、又は機能上のフラグメントを含む、医薬組成物の有効量は、疾患又は状態の発症を予防し、又は進行の速度を緩める量と定義され、より好ましくは、有効量は疾患又は状態を安定化させる量であり、さらにより好ましくは、有効量は疾患又は状態の緩解を引き起こす量である。最も好ましくは、有効量は、疾患又は状態を完全に治療する量である。
【００７５】
さらに、本発明のＭＡｂを、ガストリンホルモンが促進する疾患及び状態の進行をモニターするための免疫アッセイに適用でき、この場合、プロガストリンのレベル又は量は、治療又は治療の成功の指標、又は疾患若しくは状態の進行の指標を提供する。
【００７６】
さらに、本発明のＭＡｂは、ガストリンホルモンが促進する疾患又は状態に罹患している患者の、プロガストリンホルモン阻害治療を評価する方法に有用である。この方法には、
ａ）治療の前又は初期段階に、患者から生体液の第１の試料を得るステップと、
ｂ）免疫アッセイ法により、第１の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、
ｃ）その時間内に治療が効果を有する適切な時間後に、患者から生体液の第２の試料を得るステップと、
ｄ）免疫アッセイ法により、第２の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、
ｅ）プロガストリン結合治療又は阻害治療の有効性を決定するために、第１の試料における決定量のプロガストリンを、第２の試料におけるプロガストリンの量と比較するステップと、
が含まれる。
【００７７】
患者におけるプロガストリン結合治療又は阻害治療を評価するために適用する上記に記載した方法は、ある治療レジメンで進めるか、又は別の治療レジメンで進めるかの決定のタイミングが、患者に対する成果に決定的であり得る場合に、臨床で実施するのに特に価値がある。本発明の方法は、これらの臨床上の決定の根拠を何に置くかについての情報を提供するものである。この方法は、治療の前又は初期段階のプロガストリンの量の測定値を提供し、治療開始後１つ又は複数の期間に、特に、治療が功を奏し始めることが予測されるときに、プロガストリンの１つ又は複数の測定値を提供する。
【００７８】
プロガストリン阻害治療は、患者に対する抗プロガストリン抗体の受動的投与であることができる。プロガストリン阻害物質は、それだけには限定されないが、抗プロガストリン抗体、特に、ヒト／非ヒトキメラ抗体、ヒト化の、若しくは完全なヒトの抗プロガストリンモノクローナル抗体、又はプロガストリンに結合するのに機能的な任意の他の分子を含む、任意のプロガストリン阻害物質であってもよい。
【００７９】
本発明は、プロガストリンを含むことが疑われる試料をスクリーニングするための組成物、方法及びキットも提供する。このようなスクリーニングは、そのようなポリペプチドを含み、又は産生することが疑われる患者の試料又は検査室の試料で行うことができる。キットは、本発明の抗体を含むことができる。キットは、試料と本発明の抗体との間の相互作用を検出するのに適するバッファー及び試薬を含むことができる。提供する試薬は、本発明の抗体と結合又は相互作用することができる、放射標識され、蛍光的に標識され、又は酵素的に標識された物質であるとすることができる。
【００８０】
キットの試薬は、液体の溶液として提供され、固体の支持体に付着しており、又は乾燥粉末として提供される。試薬が液体の溶液で提供される場合は、液体の溶液は水溶液であるのが好ましい。試薬が固体の支持体に付着して提供される場合は、固体の支持体はクロマトグラフィーの媒体、複数のウェルを有するテストプレート、又はスライドガラスとすることができる。提供される試薬が乾燥粉末である場合は、粉末は、提供され得る適切な溶剤を加えることにより再構成できる。
【００８１】
本発明のキットは、その中に抗体、抗原、又は検出試薬を配置でき、好ましくは適切に等量にされているバイアルを一般的に含む容器で提供できる。本発明のキットは、市販用に、抗体、抗原、及び試薬容器を含むための手段も、典型的に含む。このような容器には、その中に望ましいバイアルが保持されるプラスチック製の容器、並びに、クロマトグラフィーの材料、溶剤及び溶離液、試験管、界面活性剤、抗体、及び検出反応用の化学物質等の、１つ又は複数の必要な化学物質が含まれ得る。
【００８２】
またさらなる実施形態では、本発明は、免疫検出方法及び関連するキットに関する。プロガストリン又はそのペプチドフラグメントを使用して、それとの反応性を有する抗体を検出することができ、あるいは、本発明により調製した抗体を使用して、プロガストリン、プロガストリン模倣分子、又はプロガストリンエピトープ含有ペプチドを検出し得ることが提唱されている。一般的には、これらの方法は、最初にこのような前駆体、ペプチド、又は抗体を含むことが疑われる試料を得るステップと、免疫複合体を形成させるのに有効な条件下で、試料を、本発明による抗体又はペプチドと接触させるステップと、次いで免疫複合体の存在を検出するステップと、を含む。
【００８３】
例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、免疫ブロット（例えば、ドットブロット、スロットブロット、ウエスタンブロット等）、間接免疫蛍光技法、及び、例えば表面プラズモン抵抗等の物理的パラメータにおける変化の検出に頼る方法等、免疫複合体の形成の広範囲な検出方法が、当技術分野ではよく知られている。一つの広く用いられている方法では、免疫複合体の形成が、放射標識又は酵素タグ（例えば、アルカリホスファターゼ、又は西洋ワサビのペルオキシダーゼ）等の標識の使用により検出される。当技術分野ではよく知られている方法による、第２の抗体、又はビオチン化したリガンドに結合するためにアビジン結合している分子等、第２の結合性リガンドの使用により、さらなる利点が生じることがある。
【実施例】
【００８４】
実施例１．ヒトプロガストリンのＮ−末端に対するＭＡｂの産生
ヒトプロガストリンのアミノ酸配列の１〜９番目のアミノ酸：ＳＷＫＰＲＳＱＱＰ（配列番号１７）を含み、ヒトプロガストリンのＮ−末端エピトープを形成し、リンカー配列−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−が続くペプチドＳＷＫＰＲＳＱＱＰＰＣ（「ｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（１〜９）−ＰＣ、配列番号１６」を、標準の固相ペプチド合成方法により工業的に合成した。
【００８５】
以下のように、ペプチドを免疫原中に組み入れて、ヒトプロガストリンのＮ−末端に対する抗体を誘発した：ペプチドを最初にジフテリア毒素（「ＤＴ」）に共有結合させてペプチド−担体複合体を生成させた。各ＤＴ担体上で置換したペプチドユニットの数を決定し、最後に複合体を免疫原として配合した。用いた技術は、Ｇｅｖａｓらの米国特許第５６２２７０２号に記載された通りであった。
【００８６】
手短に述べると、ペプチドをヘテロ二官能性の架橋剤であるε−マレイミドカプロン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ε−ＭＣＳ）を、担体に化学的に複合させた。複合体を、０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝食塩水、ｐＨ７．３（ＰＢＳ）に対して透析することにより精製し、タンパク質濃度をＬｏｗｒｙ法により決定した。複合体のアミノ酸分析により、ＤＴ上のペプチドの置換レベル（ＤＴの分子量１０００００Ｄａあたり１４．７個のペプチド）を、モルベースで決定した。次いで、溶解した複合体を免疫原とし、アジュバントとして、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３（ＳＥＰＰＩＣ、フランス）とＭｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３油とを３０／７０の比（複合体溶液／アジュバントの重量／重量）で含む複合体溶液を混合することにより配合した。混合は、各液体の好適な体積をシリンジ中に引き込み、次いで溶液を、インターロックハブを通してこのシリンジと第２のシリンジ間をすばやく往復させ通過させることにより実現した。
【００８７】
マウスを、最初に、０．１ｍＬの体積のペプチド−ＤＴ複合体免疫原／Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３  ０．１ｍｇをｉ．ｐ．注射することにより免疫化した。同じ投与量の第２の注射を、第１の注射の３週間後に投与した。
【００８８】
ヒトプロガストリンのＮ−末端に選択的なＭＡｂを産生するハイブリドーマを作り出すために、当業者にはよく知られている標準の技術により、免疫化したマウスからの脾臓細胞を標準マウスミエローマ融合パートナー細胞系と融合させた。例えば、Ｋａｐｒｏｗｓｋｉらへの米国特許第４１９６２６５号、Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ；「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第１７章：Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ、Ｂ．Ｍｉｓｈｅｌｌ  ａｎｄ  Ｓ．Ｓｈｉｉｇｉ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、サンフランシスコ、１９８０年）；Ｈａｒｌｏｗｅ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８８年；Ｚｏｌａ、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ、フロリダ州、１９８７年を参照されたい。上記に記載したペプチド−ＤＴ複合体０．１ｍｇのＰＢＳ溶液のｉ．ｐ．注射で、免疫化したマウスを追加免疫し、４日後にそれらの脾臓細胞を細胞融合用に収集した。Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉが記載しているように、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンを補った培地を用いて、ハイブリッド細胞の最初の選択を行った。この融合物はＦ４９０と呼ばれた。
【００８９】
ヒトプロガストリンのＮ−末端に対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを単離するための最初の選択ステップは、標的のペプチドに対する抗体の産生し、ハイブリッド細胞系が安定している細胞を選択することであった。抗体を産生する細胞の選択は、ヒトプロガストリンのＮ−末端に対する抗体の単一のクローンを含む組織培養ウェルから得た細胞培養液をスクリーニングすることにより行った。免疫学的担体としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、末端システイン−１１により連結している合成ペプチドｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（１〜９）−ＰＣの複合体を標的抗原として用いて、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。適切なＥＬＩＳＡ技術は、当業者には知られており、そのいくつかの例を以下に列挙する。ＥＬＩＳＡ試験でｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（１〜９）−ＰＣ−ＢＳＡ複合体に結合した抗体を産生した各ハイブリッドを２回クローニングすることにより、安定な細胞系を得た。これらの方法により、ヒトプロガストリンのＮ−末端に対するＭＡｂを産生する８つのハイブリッド細胞系を得た。これらのハイブリッド系は、４９０−１、４９０−２、４９０−３、４９０−４、４９０−５、４９０−６、４９０−７、及び４９０−８と呼ばれた。
【００９０】
実施例２．ヒトプロガストリンのＮ−末端領域に対するＭＡｂの産生
ヒトプロガストリンのアミノ酸配列の６〜１４番目のアミノ酸からなるＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号１９）を含み、ヒトプロガストリンのＮ−末端領域のエピトープを形成し、その後にリンカー配列−ＰＰＣが続くペプチドＳＱＱＰＤＡＰＬＧＰＰＣ（「ｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（６〜１４）−ＰＰＣ、配列番号１８」を、標準の固相ペプチド合成方法により工業的に合成した。
【００９１】
ＳＱＱＰＤＡＰＬＧＰＰＣペプチド（配列番号１８）を、上記実施例１に記載したように、免疫原中に組み入れて、ヒトプロガストリンのＮ−末端領域に対する抗体を誘発した。Ｆ４９１と呼ばれた融合物の免疫化及び単離は、やはり上記に記載したように行った。
【００９２】
ヒトプロガストリンのＮ−末端領域に対するＭＡｂを産生するハイブリドーマの選択は、ヒトプロガストリンのＮ−末端領域に対する抗体に対する単一のクローンを含む組織培養ウェルから得た細胞培養液をスクリーニングすることにより行った。免疫学的担体としてのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）にシステイン−１２により連結している合成ペプチドｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（６〜１４）−ＰＰＣを含む複合体を標的抗原として用いて、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。ＥＬＩＳＡでｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（６〜１４）−ＰＰＣ−ＢＳＡ複合体に結合した抗体を産生した各ハイブリッドを２回クローニングすることにより、安定した細胞系を得た。ヒトプロガストリンのＮ−末端領域に対するＭＡｂを産生する３つのハイブリッドの細胞系を得た。これらのハイブリッド細胞系は、４９１−１、４９２−２、及び４９１−３と呼ばれた。
【００９３】
実施例３．ヒトプロガストリンのＣ−末端に対するＭＡｂの産生
ヒトプロガストリンのアミノ酸配列の７２〜８０番目のアミノ酸からなるＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号２１）をＣ−末端に有しリンカー配列ＣＰＰ−が先行するペプチドＣＰＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（「ｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（７２〜８０）−ＰＰＣ、配列番号２０」を、標準の固相ペプチド合成方法により工業的に合成した。上記実施例１及び２に記載したように、ペプチドを免疫原中に組み入れて、ヒトプロガストリンのＣ−末端に対する抗体を誘発した。
【００９４】
マウスを、最初に、０．１ｍＬの体積のペプチド−ＤＴ複合体免疫原／Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ  ７０３  ０．１ｍｇをｉ．ｐ．注射することにより免疫化した。同じ投与量の第２の注射を、第１の注射の３週間後に投与した。
【００９５】
ヒトプロガストリンのＣ−末端に選択的なＭＡｂを産生するハイブリドーマを作り出すために、上記に記載した標準の技術により、免疫化したマウスからの脾臓細胞を、標準マウスミエローマ融合パートナー細胞系と融合して、Ｆ４９５と呼ばれる融合体を生成した。
【００９６】
ヒトプロガストリンのＣ−末端に対するＭＡｂを産生するハイブリドーマを単離するための最初の選択ステップは、標的のペプチドに対する抗体を産生し、ハイブリッド細胞系が安定している細胞を選択することであった。抗体を産生する細胞の選択は、ヒトプロガストリンのＣ−末端に対する抗体に対する単一のクローンを含む組織培養ウェルから得た細胞培養液をスクリーニングすることにより行った。免疫学的担体としてウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）に、システイン−１により連結した合成ペプチドｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（７２〜８０）−ＰＰＣを含む複合体を標的抗原として用いて、ＥＬＩＳＡによりスクリーニングを行った。ＥＬＩＳＡでｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（７２〜８０）−ＰＰＣ−ＢＳＡ複合体に結合した抗体を産生した各ハイブリッドを２回クローニングすることにより、安定な細胞系を得た。ヒトプロガストリンのＣ−末端に対するＭＡｂを産生した４つのハイブリッド細胞系を得た。これらのハイブリッド系は、４９５−１、４９５−２、４９５−３、及び４９５−４と呼ばれた。
【００９７】
実施例４．プロガストリンの特異的な領域に対するＥＬＩＳＡの抗体の力価
この分析方法の目的は、ＥＬＩＳＡにより、試験試料における抗プロガストリン抗体を検出し、力価を決定することである。本発明の抗プロガストリン抗体ＥＬＩＳＡは、抗体（ポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよい）の、プロガストリンペプチド−ＢＳＡ複合体への特異的な結合に基づくものである。ＥＬＩＳＡにおけるペプチドの結合により、抗体が複合体のプロガストリンペプチド配列内のプロガストリンエピトープに特異的に結合することが確認されている。
【００９８】
試験したプロガストリン−ＢＳＡ複合体には、実施例１、２、及び３に列挙した３つの複合体、すなわち、（それぞれ）ｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（１〜９）−ＰＣ−ＢＳＡ、ｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（６〜１４）−ＰＰＣ−ＢＳＡ、及びｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（７２〜８０）−ＰＰＣ−ＢＳＡが含まれていた。複合体は、上記に記載したように、架橋試薬ε−ＭＣＳを用いて、ＤＴ−連結した免疫原を作成するために用いたのと同じプロガストリンペプチドを用いて調製した。
【００９９】
ＥＬＩＳＡの最初のステップで、複合体は、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルに結合した。９６ウェルプレートウォッシャーを用いて洗浄ステップにより、遊離の複合体を除去した。次いで、試験（又は対照）の抗血清を加えた。抗原上に存在するプロガストリンペプチドエピトープのおかげで、試験血清に存在する抗プロガストリンＡｂは、複合体に結合した。次いで、検出される抗プロガストリン抗体に特異的な種である抗ＩｇＧ−アルカリホスファターゼ試薬を加えることにより、結合している抗体を検出した。例えば、Ａｂ検出試薬として、マウスの抗プロガストリンＡｂに結合するウサギ抗マウスＩｇＧ−アルカリホスファターゼ複合体（「ＲＡＭ−ＡＰ」）を用いて、マウスの抗プロガストリン抗体を検出した。抗Ｉｇ−ＡＰ複合体のＡＰ部分は、引き続き、基質の着色生成物（ｐ−ニトロフェノール）への変換を触媒した。色の発色を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーで４０５ｎｍの吸光度として測定した。
【０１００】
プールしたマウスの抗プロガストリン血清（抗プロガストリンハイブリドーマの産生に対して免疫化したマウスから収集した）又はマウスの抗プロガストリンＭＡｂを含む腹水を、抗体を誘発するために用いたプロガストリンのエピトープを標的とするＥＬＩＳＡの陽性対照として用いた。試験試料と同じ動物種からの血清を、陰性対照として用いた（例えば、正常の血清、又は免疫前の血清等）。
【０１０１】
直線範囲における色の発色の大きさは、標的抗原に結合している抗プロガストリンＡｂの量に直接比例していた。陽性標準（抗プロガストリン）血清の希釈系列対吸光度値のプロットを用いて、結合曲線を生成した。次いで、試験試料の抗プロガストリンＡｂの力価を、同じ希釈の陰性対照で得た吸光度と区別することができる吸光度を生成する最大希釈から決定した（限界希釈分析）。
【０１０２】
試薬溶液：
この分析方法で調製するように指定された試薬及び溶液の量は、利便性のためだけに選択されたものであり、例として提供されたものであって、限定的なものとして理解すべきではない。実際の量は、必要に応じて見積もることができる。
【０１０３】
１．  ０．０２％ＮａＮ３を含む炭酸塩バッファー（「炭酸塩バッファー」）は、１．５９ｇのＮａ２ＣＯ３及び２．９３ｇのＮａＨＣＯ３を約７５０ｍｌの蒸留水に溶解し、マグネチックスターラーで撹拌して調製した。４ｍｌの５％ＮａＮ３溶液を加えて撹拌した。溶液を、水で１．０リットルに調節した。ｐＨを測定し（９．６±０．２でなければならない）、必要であれば１．０Ｍ  ＮａＯＨ又は１．０Ｍ  ＨＣｌで調節した。バッファーは、必要時まで冷蔵庫で貯蔵した。
【０１０４】
２．  ０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０及び０．０２％ＮａＮ３を含むＦＴＡ（ＰＢＳ）（「ＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎ」）は、９．２３ｇのＦＴＡを、約７５０ｍｌの精製水に溶解して調製した。０．５ｍｌのＴｗｅｅｎ−２０及び４ｍｌの５％ＮａＮ３を加え、水で１．０００リットルに調節した。
【０１０５】
３．  １％ＢＳＡのＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎ溶液（「ＢＳＡ／ＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎ」）は、１０ｇのＢＳＡを１０００ｍｌのＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎに溶解して調製した。
【０１０６】
４．  基質バッファー：５０ｍｇのＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏを精製水４４８ｍｌに溶解した。５０ｍｌのＤＥＡ及び２ｍｌの５％ＮａＮ３を加え、濃塩酸でｐＨを９．８に調節した。バッファーは、室温で、光から保護して貯蔵した。
【０１０７】
５．  ＰＢＳ、ｐＨ７．２：固体のＦＴＡ（ＦＴＡ赤血球凝集バッファー（「ＦＴＡ」）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｃｏｃｋｅｙｓｖｉｌｌｅ、メリーランド州）から調製した。
【０１０８】
ＥＬＩＳＡ手順：
抗原でのコーティング：プロガストリン−ＢＳＡ複合体標的抗原の１μｇ／ｍｌの炭酸塩バッファー溶液を調製した。各プレートをコーティングするのに、最低５．２ｍｌの抗原溶液が必要とされた。炭酸塩バッファーで１ｍｇ／ｍｌ複合体貯蔵溶液の１：１０００希釈を作成することにより抗原溶液を調製した。プレートは、例えば、Ｍｉｃｒｏｔｉｔｅｒ（登録商標）免疫アッセイプレート、硬質スチレン製（例えば、Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）２「Ｕ」底９６ウェルプレート、Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、バージニア州；又は平底９６ウェルプレート、ポリスチレン製；例えば、Ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ、ＮＵＮＣ、業者ＶＷＲ）等、ＥＬＩＳＡアッセイに適する任意のプレートであればよい。Ｉｍｍｕｌｏｎ（登録商標）２「Ｕ」底プレートは、抗原溶液を１ウェルあたり５０μｌ加えることにより、抗原でコーティングする。プレートを、水分の損失を防ぐために湿潤室（例えば、湿ったペーパータオルを入れた密閉容器）に貯蔵し、冷蔵庫で（２°〜８℃）で一夜インキュベートした。
【０１０９】
血清希釈液の調製：
任意の好都合な希釈系列が許容できる。例えば、表１に示すように、陽性標準及び陰性対照及び試験血清の１／１００．５の連続的な希釈系列を用いた。試料を、平底９６ウェルプレートで、ＢＳＡ／ＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎ溶液で希釈した（１２チャンネルマルチピペッターにより最高１２個の血清の同時希釈が可能である）。
【０１１０】
【表１】
2008513536.tif 000002
【０１１１】
各試料希釈の十分な体積を調製して、最小の作用体積である２００μｌとした。試料の力価に応じて、列Ａにおいて、各試料の１／１００希釈（低力価の試料に対して）又は１／１０００希釈（高力価の試料に対して）で始まる希釈を作成し、次いで、各カラムを列Ｈまで段階希釈を進め（表９を参照されたい）、各試料の全８希釈を生成した。陰性対照の希釈系列を、１／１００希釈で開始して調製した。陽性標準の抗体、及び前採血（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）／陰性対照の抗体の希釈系列の試料は、各プレート上に２回ずつ繰り返して作成した。
【０１１２】
プレート洗浄：
プレートウォッシャー（例えば、Ｕｌｔｒａｗａｓｈ  Ｐｌｕｓ、若しくはＤｙｎａ  Ｗａｓｈｅｒ  ＩＩ（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ、バージニア州）又は同等物）を用いて、コーティングしたプレートを、各々、ＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎで４回洗浄し、次いでプレートをペーパータオル上に「たたきつけて」残留した溶液を除去した。
【０１１３】
抗体の結合：
以下の表２に示すような試料のプレート希釈系列に従って、５０μｌ／ウェルとなるように希釈した試料を、抗原でコーティングした「Ｕ」プレートの対応するウェルに移した。プレートを、湿潤室で１時間、室温でインキュベートした。
【０１１４】
【表２】
2008513536.tif 000003
【０１１５】
抗体検出試薬：
好適に希釈した抗Ｉｇ−アルカリホスファターゼ複合体を、ＦＴＡ／Ｔｗｅｅｎで調製した。アッセイでは、１プレートあたり最低５．２ｍｌが必要とされた。上記に記載したようにプレートを洗浄した。５０μｌ／ウェルのＲＡＭ−ＡＰ溶液（抗Ｉｇ−アルカリホスファターゼ複合体、例えば、試験するマウス抗プロガストリン抗体、ウサギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−アルカリホスファターゼ（Ｚｙｍｅｄ））を「Ｕ」プレートの全てのウェルに加え、湿潤室で１時間、室温でインキュベートした。
【０１１６】
マウス以外の種から得た血清における抗プロガストリン抗体を検出するためには、試験血清を産生した種に特異的な抗Ｉｇ−ＡＰ複合体を使用しなければならない（例えば、ヒト抗プロガストリン抗体は、抗ヒトＩｇＧ−ＡＰ試薬を試薬の各ロットに対して確立した希釈で用いて検出する）。陽性標準及び陰性対照の血清は、試験血清と同じ種から得なければならない。
【０１１７】
基質溶液：
ｐ−ＮＰＰ錠剤（ホスファターゼ基質錠剤、Ｓｉｇｍａ１０４（「ｐ−ＮＰＰ」）（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州）として提供されるｐ−ニトロフェニルリン酸）を冷凍庫から出し室温に放置して暖める。使用する直前に、室温で、ｐ−ＮＰＰの錠剤１個にＤＥＡ基質バッファー５ｍｌを加えて、ｐ−ＮＰＰの１ｍｇ／ｍｌ溶液を調製した。アッセイプレート１枚に、基質溶液の各５ｍｌのアリコートで十分であった。基質溶液を、使用するまで暗所に貯蔵した。
【０１１８】
基質の添加：
上記に記載したようにプレートを洗浄した。カラム１から開始し、列Ａから開始するように８（又は１２）チャンネルマルチピペッターで、全ウェルに対して、ｐ−ＮＰＰ溶液を５０μｌ／ウェルの用量で同時に添加した。
【０１１９】
反応のモニター：
基質溶液の発色を、１０〜１５分後に停止した。
【０１２０】
反応の停止：
８（又は１２）チャンネルピペッターで、各ウェルに１．０Ｍ  ＮａＯＨ５０μｌを加えることにより反応を停止した。ＮａＯＨ溶液をウェルに、基質溶液を添加したのと同じ順番、かつ同じタイミングで加えた。カウンタートップ上でプレートを注意深く振盪することにより、試薬を穏やかに混和した。
【０１２１】
吸光度測定：
プレート全体をＥＬＩＳＡリーダーで読んだ。ＥＬＩＳＡリーダーは、ｐ−ニトロフェノールに対してＡ４０５ｎｍで測定するように設定した。
【０１２２】
データ分析：
各血清の抗体の力価を以下のように決定した：片対数のグラフ目盛り上に、各試料について得られた吸光度を、縦軸（均等目盛り）上にプロットし、それに対し、陽性標準を含む各血清について（１／希釈）を横軸（対数目盛り）上にプロットした。希釈の逆数をプロットすることにより、力価をＸ軸上で直接読むことができた。場合によっては、吸光度値は、特定の血清に関して結合曲線を明らかにはずれ（異常値ポイント）、このような値は曲線から除外した。各血清の力価を、吸光度値を基に同じ希釈の陰性対照試料と区別することができる試験抗体の最終希釈として決定する。一般的に、２つの結果の間の差の限界は、０．２５吸光度単位以上の（アッセイにおける試料同士のばらつきに応じて）吸光度である。
実施例５．阻害ＥＬＩＳＡによる抗体特異性の決定
【０１２３】
上記の実施例と同じ方法を、ペプチド阻害ＥＬＩＳＡに対してならったが、以下に記載する例外があった。
【０１２４】
阻害物質の調製：
好適な標的ホルモンのペプチド、この場合はプロガストリンのエピトープを表すペプチドを、１μｍｏｌ／ｍｌ（１０００μＭ）のワーキングストックとして調製した。ワーキングストック溶液から、阻害の希釈系列を、希釈比１：２から１：１０まで調製し、プレートの配置に応じて全部で８又は１２希釈を作成した。
【０１２５】
試料希釈の調製：
試料の一連の力価測定を行い、その後、阻害アッセイを行って５０％最大結合で抗体試料の希釈を確立した。次いで、等体積のペプチド阻害物質と混合するために、及び阻害アッセイにおける対照としてのバッファーと混合するために、試料を２×（２倍）の５０％結合濃度に調製した。試料混合物を湿潤室で約３０分間インキュベートし、次いで、洗浄したコーティングしたＥＬＩＳＡプレートに加え、湿潤室で約１時間インキュベートした。阻害剤入りの試料から得られた吸光度を、阻害剤なしの試料対照から得られた吸光度で除して、この値に１００を乗じることにより、吸光度の読み（バックグラウンドから差し引いた）から、結合パーセントを決定した。最後に、１００％から結合パーセントを差し引くことにより、阻害パーセントを決定した。
【０１２６】
このアッセイで用いるための試験試料は、血清、細胞培養上清におけるＭＡｂ、腹水、又はアフィニティー精製した抗体（Ａｂ）であることができる。プロガストリンのアミノ末端以外の標的抗原に対するＡｂに対しては、好適な標的のホルモンの抗原及び阻害物質を用いる。関連のないペプチド阻害物質を、陰性対照として含まれなければならない。
【０１２７】
実施例６．ＥＬＩＳＡによるアイソタイプ及び特異性に関する抗プロガストリンＭＡｂ
実施例１（Ｆ４９０）、実施例２（Ｆ４９１）、及び実施例３（Ｆ４９５）に記載した抗プロガストリンＭＡｂを、ＥＬＩＳＡにより、アイソタイプ及び特異性に関して特徴づけた。各ＭＡｂに対する標的抗原は、実施例１から３に記載したものと同じであった。したがって、融合物４９０からのＭＡｂはｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（１〜９）−ＰＣ−ＢＳＡに対して試験し、融合物４９１からのＭＡｂはｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（６〜１４）−ＰＰＣ−ＢＳＡに対して試験し、融合物４９５からのＭＡｂはｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（７２〜８０）−ＰＰＣ−ＢＳＡに対して試験した。実施例４の方法によりアイソタイプを決定し、この場合第２のウサギ抗マウスＩｇ試薬は、マウス抗体のアイソタイプに特異的であった。実施例５の方法により、以下のペプチドを阻害物質として用いて特異性を決定した：ｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（１〜９）−ＰＣ、ｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（６〜１４）−ＰＰＣ、ｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（７２〜８０）−ＰＰＣ、ヒトＧ１７、ヒトＧ３４、ヒトＧ１７−グリシン延長、及び陰性対照として黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）。
【０１２８】
これらの試験の結果を表３に示す。表に示すように、ＭＡｂは全てＩｇＧ１のサブクラスであり、例外として抗体４９１−２及び４９５−２の両者がＩｇＧ２ａサブクラスであった。表は、個々のＭＡｂが、各々、免疫化のために用いたエピトープに特異的であったことも示している。したがって、４９０シリーズのＭＡｂは全てプロガストリンのエピトープ配列１〜９に特異的であり、４９１シリーズのＭＡｂは全てプロガストリンのエピトープ配列６〜１４に特異的であり、４９５シリーズのＭＡｂは全てプロガストリンのエピトープ配列７２〜８０に特異的であった。これらのＭＡｂは、液体のいずれか（例えば、血漿、リンパ液、腹水、唾液等）からなる生物学的試験試料において、及び組織検体（例えば、正常組織若しくは腫瘍起源の、又はそのような組織から脱落した細胞の生検検体等）において、プロガストリンを検出し、測定するようにデザインされた試験に適すると考えられている。
【０１２９】
【表３】
2008513536.tif 000004
【０１３０】
実施例７．免疫アッセイによりプロガストリンを測定するためのプロガストリン代用参照標準（ＳＲＳ）の合成
ＳＲＳの有用性を実証するために、２つのプロガストリンＳＲＳペプチドを、固相ペプチド合成により合成した。使用した合成方法は、一般的に工業的に利用されているものであり、当業者にはよく知られている。
【０１３１】
ヒトプロガストリン１〜８０を検出し、定量するためのアッセイで使用するために、プロガストリンＳＲＳ１を合成した。プロガストリンＳＲＳ１ペプチドは、以下の構造を有していた：［プロガストリンの１〜９番目のアミノ酸−（ＰＧＧＰＰ）−プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］。ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＷＫＰＲＳＱＱＰＰＧＧＰＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号１４）であった。このペプチドの質量は２５３５．１であり、このペプチドの純度はＨＰＬＣで試験した場合９０％を超えていた。
【０１３２】
ヒトプロガストリン６〜８０を検出し、定量するためのアッセイで使用するために、プロガストリンＳＲＳ２を合成した。プロガストリンＳＲＳ２ペプチドは、以下の構造を有していた：［プロガストリンの６〜１４番目のアミノ酸−（ＰＰＧＧＰＰ）−プロガストリンの７２〜８０番目のアミノ酸］。ペプチドのアミノ酸配列は、ＳＱＱＰＤＡＰＬＧＰＰＧＧＰＰＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号１５）であった。このペプチドの質量は２４３２．４であり、このペプチドの純度はＨＰＬＣで試験した場合９０％を超えていた。
【０１３３】
実施例８．プロガストリンを測定するための、抗プロガストリンＭＡｂ及びプロガストリンＳＲＳペプチドを利用する免疫酵素測定アッセイ
以下の分析方法（免疫酵素測定アッセイ）で、ヒト血漿等の生体液に存在する遊離の（複合していない）ヒトプロガストリン１〜８０又はヒトプロガストリン６〜８０を、アッセイされるプロガストリンの特定の分子形態のＮ−末端又はＣ−末端に対するモノクローナル抗体及び／又はポリクローナル抗体を用いて決定した。あるいは、分子のＮ−末端又はＣ−末端に対するポリクローナル抗体の組合せを、それぞれ分子のＣ−末端又はＮ−末端に対するモノクローナル抗体と組み合わせて用いることができる。
【０１３４】
１．プレートコーティング：
試験する特定のヒトプロガストリン分子形態のＮ末端に選択的な抗体を、最適な濃度でテストプレートのマイクロウェルの表面上にコーティングした。ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ、Ｆ９６  ＥＬＩＳＡプレート（カタログ番号４３９４５４）テストプレートを使用し、抗体コーティング溶液をホウ酸ナトリウムバッファー（２０ｍＭ、ｐＨ８．０、０．１％アジ化ナトリウムを含む）で調製する。コーティング溶液におけるアフィニティー精製したＭａｂの濃度は、好ましくは約５μｇ／ｍＬであった。１ウェルあたり１００μＬのＭａｂ溶液を加え、湿潤密封箱中４℃で一夜、コーティングを進行させた。アッセイで検量線を確立するためのＳＲＳ１を用いて、プロガストリン１〜８０を検出するために、アフィニティー精製した４９０−１Ｍａｂでプレートをコーティングした。アッセイで検量線を確立するためのＳＲＳ２を用いて、プロガストリン６〜８０を検出するために、アフィニティー精製した４９１−１Ｍａｂでプレートをコーティングした。
【０１３５】
２．プレート洗浄：
コーティング溶液を除去し、洗浄バッファー（１ウェルあたり約４００μｌ）を加え、その後除去した。この洗浄サイクルは、必要に応じて多くの回数繰り返し、通常は全部で３回又は４回の洗浄であった。洗浄バッファーは、０．００２７Ｍ塩化カリウム及び０．１３７Ｍ塩化ナトリウムを含む、ｐＨ７．４の０．０１０Ｍリン酸塩バッファーで、０．０１％ｗ／ｖＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含んでいた。プレート洗浄は自動化してもよい。
【０１３６】
３．プレートの阻害：
タンパク質及び界面活性剤を含む阻害バッファー（コーティングバッファー中、１％ＢＳＡ／０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）をマイクロウェルに加え（２００μＬ／ウェル）、プレートを、湿潤箱で１時間、室温でインキュベートした。プレートを、この状態で、約４℃で冷蔵貯蔵した。
【０１３７】
４．試料及び標準の添加：
上記のようにプレートを洗浄した。参照標準（例えば、ＳＲＳ１、ＳＲＳ２、若しくは真正プロガストリン形態、又は、ガストリン１７等の陰性対照ペプチド）を、希釈系列として調製して検量線を生成した。この実施例の試験では、ＳＲＳ１及びＳＲＳ２を１０μＭの濃度で調製し、１：１０の希釈系列で１００ｆＭまで希釈した。標準及び試験試料を、アッセイバッファー（１％ＢＳＡ、０．１％ウシγ−グロブリンを洗浄バッファーで調製）で調製した。次いで、溶液を各ウェルに加えた（１００μＬ／ウェル）。湿潤箱で２時間、室温で反応を進行させた。
【０１３８】
アッセイする形態の既知濃度のプロガストリンＳＲＳを用いて検量線を生成することにより、最適の抗原濃度を決定し、検量線は、必要とされる有用な濃度範囲にわたって必要とされる感度及び精度を有していた。プロガストリン（１〜８０も、６〜８０も）では、アッセイの有用なプロガストリン濃度範囲は、一般的にバックグラウンド（約１ｐＭ又はそれ未満）から約１００ｎＭまでであった。１：２希釈系列のような、より狭い範囲の希釈系列の参照標準を用いることにより、より大きな正確度を達成することができる。
【０１３９】
アッセイの感度及び精度は、ウェルのコーティング又は酵素標識に関する特定のＭａｂの選択、試薬の濃度、バッファーの組成、酵素−基質系の選択、インキュベーション時間、及びアッセイの必要条件に適するように改変し得る他のパラメータ等、他のアッセイパラメータの変更により容易に改変又は向上され得ることが、直ちに認識されよう。必要とされる範囲にわたる好適な感度及び精度は、当業者であれば必要以上の実験を行わずに容易に決定することができる。
【０１４０】
５．複合体の添加：
洗浄後、（酵素標識と複合させた）アッセイするプロガストリン形態のＣ−末端に特異的なモノクローナル抗体又はポリクローナル抗体を含むアッセイバッファーを、各ウェルに加えた。この実施例の場合は、プロガストリンのＣ−末端に対するＭＡｂをアフィニティー精製し、次いで、西洋わさびのペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合させた。ＭＡｂは、プロガストリンのＣ末端に対する結合性を保持し、ＨＲＰ活性を有することが示された。４５８−１〜４５８−４の４つのＭａｂの各々で、別々の複合体を作成した。この試験の目的のため、複合体を別々に使用し、混合しなかった。複合体は、６３０μｇ／ｍＬの保存溶液の１：２０００希釈で用い、１ウェルあたり１００μを加えた。反応を、少なくとも１時間、室温（通常＋２２℃）で進行させた。
【０１４１】
６．基質の添加：
上記のようにウェルを洗浄し、各ウェルにＴＭＢ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ）基質溶液を１００μＬ加えた。反応を３０分間進行させ、次いで、各ウェルに０．２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４の停止溶液を１００μＬを加えた。検出化合物の発色で使用するのに適する酵素基質の例には、アルカリホスファターゼに対するニトロフェニルリン酸、又は西洋わさびのペルオキシダーゼに対するテトラメチルベンチジンスルホネート（ＴＭＢＳ）が含まれる。吸光度の単位で読む（ＡＵ、ＴＮＢＳの場合は４５０ｎｍで、ｐ−ニトロフェノールの場合は４０５ｎｍで読む）色の発色の度合いは、試験試料に存在するプロガストリンの量を示しており、実際の濃度は、既知濃度のＳＲＳで生成した検量線に対して、又は真正プロガストリンで生成した検量線に対して、試験試料の吸光度を読むことにより決定できる。
【０１４２】
７．読み：
十分なアッセイシグナルを達成した場合、マイクロプレートリーダー／分光光度計を用いてシグナルを測定した。
【０１４３】
８．データの加工：
ＳＲＳ（又はプロガストリン）形態の既知の標準溶液で得たアッセイシグナルを用いて、較正曲線（シグナル対濃度）を構築した。較正曲線を用いて、試験試料におけるガストリンホルモン形態の濃度を補間した。
【０１４４】
実施例９．プロガストリン１〜８０を測定するようにデザインされた免疫酵素測定アッセイ
プロガストリン１〜８０に対するアッセイの結果を表４に示す。このアッセイに関する一般的な方法は、実施例８に記載してある。この試験では、プロガストリンのＮ末端に特異的な、アフィニティー精製したＭａｂ４９０−１でウェルをコーティングした。用いた検出複合体は、Ｍａｂ４９５−１−ＨＲＰ複合体であった。データが示すように、ＳＲＳ１は１００ｐＭまで低い濃度で検出されたが、緊密に関連するＳＲＳ２は１００ｎＭまでしか検出されなかった。したがって、プロガストリン１〜８０に対するこのアッセイの作用範囲は、１００ｎＭ未満であるが１０ｐＭを超える。陰性対照のペプチドであるガストリン１７は検出されなかった。この実施例は、プロガストリンのＭａｂを用いて、プロガストリン１〜８０に対するアッセイができることを実証している。この実施例は、ＥＬＩＳＡによりプロガストリン１〜８０を測定するための標準の分子としてのＳＲＳ１の有用性も実証している。
【０１４５】
【表４】
2008513536.tif 000005
【０１４６】
実施例１０．プロガストリン６〜８０を測定するようにデザインされた免疫酵素測定アッセイ
プロガストリン６〜８０に対するアッセイの結果を表５に示す。このアッセイに関する一般的な方法は、実施例８に記載してある。この試験では、プロガストリンのＮ末端領域（６〜１４番目のアミノ酸）に特異的な、アフィニティー精製したＭａｂ４９１−１でウェルをコーティングした。用いた検出複合体は、Ｍａｂ４９５−１−ＨＲＰ複合体であった。データが示すように、ＳＲＳ２は１００ｐＭまで低い濃度で検出されたが（この濃度における吸光度はベースラインより上であり、アッセイは１００ｐＭ未満を検出できた）、緊密に関連するＳＲＳ１は１００μＭまでしか検出されなかった。したがって、プロガストリン６〜８０に対するこのアッセイの作用範囲は、１００μＭ未満であるが１０ｐＭを超える。陰性対照のペプチドであるガストリン１７は検出されなかった。この実施例は、プロガストリンのＭａｂを用いて、プロガストリン６〜８０をアッセイができることを実証している。この実施例は、プロガストリン６〜８０を測定するためのＳＲＳ２の有用性も実証している。
【０１４７】
【表５】
2008513536.tif 000006
【０１４８】
実施例１１．特定の適用に対する最適のＭａｂの選択
一定のエピトープに対する異なるＭａｂは、一定のエピトープに対して特異性を共有しているが、特定の適用においてそれらの性能が異なることがある。したがって、特定の適用で使用するのに最適の性能のＭＡｂを選択するために、Ｍａｂを、各状況下におけるその活性に関して比較しなければならない。この実施例は、プロガストリンのＣ末端に特異的なＭＡｂが、プロガストリンに対する免疫酵素測定アッセイでプロガストリン検出抗体として働くその能力においてどのように異なり、最適の製剤をどのように提供するかを実証するものである。
【０１４９】
プロガストリンに対する定量アッセイにおける検出抗体試薬（実施例８に記載）は、ＨＲＰに連結しているプロガストリンのＣ末端のエピトープに対するＭａｂである。プロガストリンのＣ末端エピトープに特異的な４つのＭａｂは、上記の融合体である４９５からクローニングすることにより単離した。これらは、Ｍａｂ４９５−１、４９５−２、４９５−３、及び４９５−４であった。これらのＭａｂのＨＲＰ複合体を調製するために、我々の独特の構成成分を主要なステップで市販のキットと組み合わせて使用することにより、当業者が精通している方法論に従った。したがって、４９５−１から−４の各ＭＡｂは、マウスで腹水ＭＡｂとして別々に産生された（Ｍｉｓｈｅｌｌ及びＳｈｉｉｇｉ、第１７章に記載された通り）。腹水におけるＭＡｂの存在を、上記のように、標的抗原ｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（７２〜８０）−ＰＰＣ−ＢＳＡに対する直接結合ＥＬＩＳＡにより確認した。
【０１５０】
Ｐｉｅｒｃｅ  Ｓｕｌｆｏｌｉｎｋ  Ｋｉｔで提供される指示に従って、スルホリンクゲル（Ｐｉｅｒｃｅ）に連結しているｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（７２〜８０）−ＰＰＣによるカラムクロマトグラフィーで、グリシンバッファーで溶離することにより、腹水からＭＡｂをアフィニティー精製した。ＭａｂをＡｍｉｃｏｎろ過ユニットで透析することによりさらに精製し、Ａ２８０の測定により、タンパク質の最終濃度を決定した。４つの精製したＭＡｂ調製物の各々を、Ｐｉｅｒｃｅ  ＥＺ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｐｌｕｓキットを用いてＨＲＰに複合させた。精製後、各Ｍａｂ−ＨＲＰ複合体のＨＲＰ及び抗原結合性活性を、ｈＰｒｏＧａｓｔｒｉｎ（７２〜８０）−ＰＰＣ−ＢＳＡ標的抗原に対する直接結合ＥＬＩＳＡにより確認し、全て活性であることが見出された。４つの複合体の最終濃度を、０．６３から０．６８ｍｇ／ｍＬに設定した。
【０１５１】
プロガストリンに対する免疫酵素測定アッセイにおいて４つのＭＡｂ−ＨＲＰ複合体の性能を比較するために、ＳＲＳ１を用いて実施例９に記載した通りに、及びＳＲＳ２を用いて実施例１０に記載した通りに、アッセイを行った。４９５ＭＡｂ−ＨＲＰ複合体の各々は、捕獲したＳＲＳ１及びＳＲＳ２の検出試薬として、個々のアッセイで、それぞれで別々に試験した。ＭＡｂ−ＨＲＰ複合体を、保存溶液から１：２０００希釈して用いた。ＳＲＳ２を検出するためのアッセイ（プロガストリン６〜８０に対して）では、プレートをＭＡｂ４９１−１でコーティングし、それにより、ＳＲＳ２が捕獲されたことからも、捕獲されたＳＲＳ２の検出に最適な複合体は、４９１−１−ＨＲＰであった。これは、表６で見てとることができ、４５８−１−ＨＲＰは１００ｐＭの濃度でＳＲＳ２を検出する。他の３つの複合体は、それほど有効性がなく、ＳＲＳ２を１ｎＭまで検出した。したがって、４９５−１−ＨＲＰ複合体は、この実施例の条件下で行う際、ＳＲＳ２を用いて、プロガストリン６〜８０に対する免疫酵素測定アッセイにおける検出試薬として用いられる。
【０１５２】
【表６】
2008513536.tif 000007
【０１５３】
プロガストリン１〜８０に対するＳＲＳ１のアッセイで、４つの４９５−ＨＲＰ  ＭＡｂ複合体を試験した場合にも同様の結果が得られ、これらのアッセイにおいて４９５−１−ＨＲＰ複合体が優れていることが実証された。
【０１５４】
ハイブリドーマ細胞系の寄託
以下のハイブリドーマが、２００４年９月１日に、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州）に寄託された：
１．  ＭＡｂ４９０−１を産生するハイブリドーマ４９０−１は、受託番号ＰＴＡ−６１８９に割り当てられた。
２．  ＭＡｂ４９１−１を産生するハイブリドーマ４９１−１は、受託番号ＰＴＡ−６１９０に割り当てられた。
３．  ＭＡｂ４９５−１を産生するハイブリドーマ４９５−１は、受託番号ＰＴＡ−６１９１に割り当てられた。
【０１５５】
参照による組み入れ
本明細書に引用される米国特許の明細書及び各参考文献の本文は、その全文が参照として本明細書に組み入れられる。
【配列表】
2008513536000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月23日(2007.5.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ−３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）に結合せず、プロガストリンに選択的に結合するプロガストリン結合分子、を含む医薬組成物。
【請求項２】
前記プロガストリン結合分子は、抗体結合領域を含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記プロガストリン結合分子は、抗体である、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記抗体は、モノクローナル抗体である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗体は、単鎖抗体である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗体は、哺乳動物の抗体である、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記哺乳動物の抗体は、マウス抗体、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記抗体は、アミノ酸配列ＳＷＫＰＲＳＱＱＰ（配列番号６）、ＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号７）、又はＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号８）、のエピトープに選択的に結合する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項９】
アミノ酸配列ＳＷＫＰＲＳＱＱＰ（配列番号６）、ＳＱＱＰＤＡＰＬＧ（配列番号７）、又はＧＲＲＳＡＥＤＥＮ（配列番号８）、のエピトープに選択的に結合する、モノクローナル抗体。
【請求項１０】
ハイブリドーマ４９０−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１８９）、ハイブリドーマ４９１−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９０）、又は（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９１）、によって産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１１】
マウス抗体、ヒト／マウスキメラ抗体、ヒト抗体、又はヒト化抗体である、請求項９に記載のモノクローナル抗体。
【請求項１２】
請求項９に記載のモノクローナル抗体の中から選択された２つ以上のモノクローナル抗体を含む、組合せ。
【請求項１３】
１つ又は複数の抗ガストリンモノクローナル抗体をさらに含む、請求項１２に記載の組合せ。
【請求項１４】
前記抗ガストリンモノクローナル抗体は、ガストリン−１７（Ｇ１７）及びガストリン−３４（Ｇ−３４）の中から選択されるガストリンホルモン種に選択的に結合する、請求項１３に記載の組合せ。
【請求項１５】
ハイブリドーマ４９０−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１８９）、ハイブリドーマ４９１−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９０）、及びハイブリドーマ４９５−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９１）、の中から選択される、ハイブリドーマ。
【請求項１６】
請求項９〜１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、及び薬学的に許容できる担体、を含む、医薬組成物。
【請求項１７】
ガストリン促進性の疾患又は状態を治療するための医薬品を製剤するための、請求項１〜８のいずれか一項又は請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１８】
ガストリン促進性の疾患又は状態を治療するための、請求項１〜８のいずれか一項又は請求項１６に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１９】
ａ）抗体が結合し、存在する任意のプロガストリンにプロガストリン−モノクローナル抗体複合体を形成させるのに適する条件下で、プロガストリンに特異的に結合するが、ガストリン−１７（Ｇ１７）、ガストリン−３４（Ｇ３４）、グリシン延長ガストリン−１７（Ｇ１７−Ｇｌｙ）、及びグリシン延長ガストリン−３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）、には結合しないモノクローナル抗体を、プロガストリンをアッセイするための試料に接触させるステップであって、前記モノクローナル抗体は、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の中から選択されるものである、ステップと、
ｂ）免疫検出法により、プロガストリン−モノクローナル抗体複合体の存在又は非存在を検出するステップと、
を含む、プロガストリン免疫アッセイ。
【請求項２０】
前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ４９０−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１８９）、ハイブリドーマ４９１−１（ＡＴＣＣ  ＰＴＡ−６１９０）、及びハイブリドーマ４９５−１（ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６１９１）、の中から選択されるハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体が結合するエピトープに結合する、請求項１９に記載のプロガストリン免疫アッセイ。
【請求項２１】
前記免疫検出方法は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、免疫蛍光（ＩＦ）アッセイ、凝集アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、スロットブロットアッセイ、又は表面プラズモン抵抗検出法である、請求項１９又は２０に記載のプロガストリン免疫アッセイ。
【請求項２２】
（ａ）ヒトプロガストリンのＮ−末端に選択的である一次抗体を支持体に固定化するステップと、
（ｂ）プロガストリンをアッセイするための試験試料を、固定化した前記一次抗体に接触させて、前記試験試料中の任意のプロガストリンと固定化した前記一次抗体との複合体を形成させるステップと、
（ｃ）前記複合体を、プロガストリンのＣ−末端に特異的である二次抗体に接触させるステップと、
（ｄ）前記試験試料に存在するプロガストリンの量を表すものとして、前記支持体に結合した前記二次抗体の量を検出するステップと、
を含む、免疫酵素測定アッセイ。
【請求項２３】
前記支持体は、テストプレートである、請求項２２に記載のアッセイ。
【請求項２４】
（ａ）請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の免疫アッセイを行って、患者からの生体液の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、
（ｂ）前記試料におけるプロガストリンのレベルを、１つ又は複数の対照の個体からの生体液の試料におけるプロガストリンのレベル又は参照標準と比較し、違いがある場合には、疾患又は状態を診断するステップと、
を含む、患者におけるガストリン促進性の疾患又は状態を診断する方法。
【請求項２５】
（ａ）請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の免疫アッセイ方法により、ガストリン促進性の疾患又は状態に対する治療前の患者又はその初期段階の患者から得た第１の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、
（ｂ）請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の免疫アッセイ方法により、治療後の患者から得た第２の試料におけるプロガストリンのレベルを決定するステップと、
（ｃ）前記第１の試料におけるプロガストリンの量を、前記第２の試料におけるプロガストリンの量と比較し、変化を評価し、それにより治療をモニターするステップと、
を含む、患者におけるガストリン促進性の疾患又は状態の治療をモニターする方法。
【請求項２６】
プロガストリンポリペプチドにおける少なくとも２つのエピトープの各々の免疫模倣物ペプチドを含み、アミノ酸約１０個から約３５個のペプチド鎖を含む、代用参照標準（ＳＲＳ）分子。
【請求項２７】
前記免疫模倣物ペプチドは、リンカー配列により結合されている、請求項２６に記載の代用参照標準（ＳＲＳ）。
【請求項２８】
配列番号１０〜１５のいずれかに記載したアミノ酸配列を有するペプチドの中から選択される、請求項２６又２７に記載の代用参照標準（ＳＲＳ）。
【請求項２９】
請求項２６〜２８のいずれか一項に記載の代用参照標準（ＳＲＳ）分子の標準量による免疫アッセイで生成されたシグナルを検出又は測定するステップと、
前記シグナルに基づいて標準参照曲線を生成するステップと、
を含む、対象のタンパク質に対するサンドイッチ免疫アッセイを標準化する方法。
【請求項３０】
標準量の代用参照標準（ＳＲＳ）分子を用いた免疫アッセイで生成されたシグナルを、未知量の対象のタンパク質又は既知量の対象のタンパク質、を含む試料を用いた免疫アッセイで生成されたシグナルと比較する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫アッセイは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、免疫組織化学（ＩＨＣ）アッセイ、免疫蛍光（ＩＦ）アッセイ、凝集アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、ドットブロットアッセイ、スロットブロットアッセイ、及び表面プラズモン抵抗検出法の中から選択される、請求項２９又３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記代用参照標準（ＳＲＳ）分子は、配列番号１０〜１５のいずれかに記載したアミノ酸配列を有するペプチドの中から選択される、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
成熟Ｇ１７は、アミノ末端及びカルボキシ末端の残基の両方で修飾され、Ｎ−末端のグルタミンは環化されてピログルタミン酸（ｐＧｌｕ）を形成し、Ｃ−末端フェニルアラニン残基の遊離のカルボキシル基は、酵素であるぺプチジルα−アミド化モノオキシゲナーゼ（ＰＡＭ）によりアミド化されてＣ−末端のＰｈｅ−ＮＨ２を形成する。成熟Ｇ３４は、そのＣ−末端が同じくアミド化されてＣ−末端Ｐｈｅ−ＮＨ２を形成する（Ｄｏｃｋｒａｙら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．（２００１年）、６３巻、１１９〜１３９頁）。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
ガストリン−３４は、ヒトにおける「ビッグ」ガストリンの優勢型であり、アミノ酸配列：ｐＥＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦ−ＮＨ２（配列番号４）を有する。グリシン延長ガストリン３４（Ｇ３４−Ｇｌｙ）は、Ｃ−末端にグリシン残基を有し、アミノ酸配列：ｐＥＬＧＰＱＧＰＰＨＬＶＡＤＰＳＫＫＱＧＰＷＬＥＥＥＥＥＡＹＧＷＭＤＦＧ（配列番号５）を有する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１１】
各試料希釈の十分な体積を調製して、最小の作用体積である２００μｌとした。試料の力価に応じて、列Ａにおいて、各試料の１／１００希釈（低力価の試料に対して）又は１／１０００希釈（高力価の試料に対して）で始まる希釈を作成し、次いで、各カラムを列Ｈまで段階希釈を進め（表１を参照されたい）、各試料の全８希釈を生成した。陰性対照の希釈系列を、１／１００希釈で開始して調製した。陽性標準の抗体、及び前採血（ｐｒｅｂｌｅｅｄ）／陰性対照の抗体の希釈系列の試料は、各プレート上に２回ずつ繰り返して作成した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
【表３】
2008513536.tif 000008
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008513536000001.app
【国際調査報告】
2008513536.tif 000009
2008513536.tif 000010
2008513536.tif 000011
2008513536.tif 000012