(57)【要約】  真核細胞の培養のための化学的規定培地組成物が開示される。組成物は潅流バイオリアクターおよび他の容器における真核細胞培養のために有用である。
2008518597.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
培地が、次に示す成分を１リッター当たり次に示す量：
無水ＣａＣｌ２，  ５−２００ｍｇ；
無水ＭａＣｌ２，  １５−５０ｍｇ；
無水ＭｇＳＯ４，  ２０−８０ｍｇ；
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．０５−０．５０ｍｇ；
Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０１−０．０８ｍｇ；
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．４０−１．２０ｍｇ；
クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム，  ０．０４−２００ｍｇ；
ＫＣｌ，  ２８０−５００ｍｇ；
ＮａＣｌ，  ５０００−７５００ｍｇ；
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，  ３０−１００ｍｇ；
Ｎａ２ＨＰＯ４，  ３０−１００ｍｇ；
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，  ０．００１−０．００５ｍｇ；
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，  ０．００１−０．１０ｍｇ；
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ，  ０．００１−０．００５ｍｇ；
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，  ０．００００７０−０．００８０ｍｇ；
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ，  ０．００００２５−０．０００５ｍｇ；
Ｎａ２ＳｅＯ３，  ０．００４−０．０７ｍｇ；
Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０２−０．４ｍｇ；
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，  ０．００００２５−０．０００５ｍｇ；
ＮＨ４ＶＯ３，  ０．０００１−０．００２５ｍｇ；
Ｄ−グルコース，  ５００−８０００ｍｇ；
ピルビン酸ナトリウム，  ０．０−１０００ｍｇ；
ナトリウム・ヒポキサンチン，  ０．０−２０．０ｍｇ；
グリシン，  ０．０−１５０ｍｇ；
Ｌ−アラニン，  ０．０−１５０ｍｇ；
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ，  ２００−５０００ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ，  ４０−２５０ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン酸，  ２０−１０００ｍｇ；
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  ２５．０−２５０ｍｇ；
Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ，  １５−１５０ｍｇ；
Ｌ−グルタミン酸，  ０−１０００ｍｇ；
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  １００−５００ｍｇ；
Ｌ−イソロイシン，  ５０−１０００ｍｇ；
Ｌ−ロイシン，  ５０−１０００ｍｇ；
Ｌ−リジン・ＨＣｌ，  １００−１０００ｍｇ；
Ｌ−メチオニン，  ５０−５００ｍｇ；
Ｌ−オルニチン・ＨＣｌ，  ０−１００ｍｇ；
Ｌ−フェニルアラニン，  ２５−１０００ｍｇ；
Ｌ−プロリン，  ０−１０００ｍｇ；
Ｌ−セリン，  ５０−５００ｍｇ；
Ｌ−タウリン，  ０−１０００ｍｇ；
Ｌ−トレオニン，  ５０−６００ｍｇ；
Ｌ−トリプトファン，  ２−５００ｍｇ；
Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ，  ２５−２５０ｍｇ；
Ｌ−バリン，  １００−１０００ｍｇ；
ｄ−ビオチン，  ０．０４−１．０ｍｇ；
Ｄ−パントテン酸カルシウム，  ０．１−５．０ｍｇ；
塩化コリン，  １−１００ｍｇ；
葉酸，  １−１０ｍｇ；
ｉ−イノシトール，  １０−１０００ｍｇ；
ニコチンアミド，  ０．５−３０ｍｇ；
ｐ−アミノ安息香酸，  ０．１−２０ｍｇ；
リボフラビン，  ０．０５−５．０ｍｇ；
チアミン・ＨＣｌ，  ０．５−２０ｍｇ；
チミジン，  ０−３．０ｍｇ；
ビタミンＢ１２，  ０．０５−５．０ｍｇ；
リノール酸，  ０．０１−２．０ｍｇ；
ＤＬ−α−リポ酸，  ０．０３−１．０ｍｇ；
ピリドキシン・ＨＣｌ，  ０．５−３０ｍｇ；
プトレッシン・２ＨＣｌ，  ０．０２５−０．２５ｍｇ；および
エタノールアミン・ＨＣｌ，  ２−１００ｍｇ；
において含む、細胞培養培地を作成するために適当な可溶性組成物。
【請求項２】
５．９〜７．８のｐＫａを有する緩衝分子および細胞保護剤をさらに含む、請求項１の可溶性組成物。
【請求項３】
緩衝分子が培地容量の１リッター当たり１０４７−５２３０ｍｇの量におけるＭＯＰＳからなり、そして細胞保護剤が培地容量の１リッター当たり２５０−１５００ｍｇの量におけるＰｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８からなる、請求項２の可溶性組成物。
【請求項４】
培地が、次に示す成分を１リッター当たり次に示す量：
ＣａＣｌ２，  １００．９５ｍｇ；
ＭａＣｌ２，  ２４．７７ｍｇ；
ＭｇＳＯ４，  ４２．２４ｍｇ；
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．３６０７ｍｇ；
Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０４３２ｍｇ；
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．６２２５ｍｇ；
クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム，  ４３．２５ｍｇ；
ＫＣｌ，  ３８６．９ｍｇ；
ＮａＣｌ，  ５８６６．０ｍｇ；
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，  ５４．０７ｍｇ；
Ｎａ２ＨＰＯ４，  ６１．４４ｍｇ；
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，  ０．００３２８７ｍｇ；
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，  ０．００２０６０６ｍｇ；
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ，  ０．０００５３５ｍｇ；
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，  ０．００００８５７１ｍｇ；
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ，  ０．００００５１４ｍｇ；
Ｎａ２ＳｅＯ３，  ０．００７４８９ｍｇ；
Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０３６７１ｍｇ；
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，  ０．００００４８８ｍｇ；
ＮＨ４ＶＯ３，  ０．０００２５３０ｍｇ；
Ｄ−グルコース，  ３６８０．５２ｍｇ；
ピルビン酸ナトリウム，  １００ｍｇ；
ナトリウム・ヒポキサンチン，  ２．０６９ｍｇ；
グリシン，  １６．２３ｍｇ；
Ｌ−アラニン，  ７９．３１ｍｇ；
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ，  ６７４．８９ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ，  １８２．２５ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン酸，  ６７．２３ｍｇ；
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  ５７．６３ｍｇ；
Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ，  １０６．７０ｍｇ；
Ｌ−グルタミン酸，  ６．３６ｍｇ；
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  ２５０．５５ｍｇ；
Ｌ−イソロイシン，  ２４５．４３ｍｇ；
Ｌ−ロイシン，  ２６３．４２ｍｇ；
Ｌ−リジン・ＨＣｌ，  ２７６．４１ｍｇ；
Ｌ−メチオニン，  ８５．４０ｍｇ；
Ｌ−オルニチン・ＨＣｌ，  ２．４４ｍｇ；
Ｌ−フェニルアラニン，  １０４．２３ｍｇ；
Ｌ−プロリン，  １４．９４ｍｇ；
Ｌ−セリン，  １４６．３６ｍｇ；
Ｌ−タウリン，  ３．６４ｍｇ；
Ｌ−トレオニン，  １９９．０９ｍｇ；
Ｌ−トリプトファン，  ７０．７１ｍｇ；
Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ，  １９５．５８ｍｇ；
Ｌ−バリン，  １７４．３４ｍｇ；
ｄ−ビオチン，  ０．４３５９ｍｇ；
Ｄ−パントテン酸カルシウム，  １．９３９４ｍｇ；
塩化コリン，  １０．８００９ｍｇ；
葉酸，  ３．４３２９ｍｇ；
ｉ−イノシトール，  ８１．７９６５ｍｇ；
ニコチンアミド，  ３．１３４２ｍｇ；
ｐ−アミノ安息香酸，  ２．１６４５ｍｇ；
リボフラビン，  ０．５３５９ｍｇ；
チアミン・ＨＣｌ，  ２．３３７７ｍｇ；
チミジン，  ０．３１６ｍｇ；
ビタミンＢ１２，  ０．５８８７ｍｇ；
リノール酸，  ０．０３６４ｍｇ；
ＤＬ−α−リポ酸，  ０．０９０９ｍｇ；
ピリドキシン・ＨＣｌ，  ３．０４４２ｍｇ；
プトレッシン・２ＨＣｌ，  ０．０７０１ｍｇ；および
エタノールアミン・ＨＣｌ，  １４．３７ｍｇ；
において含む、細胞培養培地を作成するために適当な可溶性組成物。
【請求項５】
５．９〜７．８のｐＫａを有する緩衝分子および細胞保護剤をさらに含む、請求項５の可溶性組成物。
【請求項６】
緩衝分子が培地容量の１リッター当たり２７０９．６６ｍｇの量におけるＭＯＰＳからなり、そして細胞保護剤が培地容量の１リッター当たり８６５．８０ｍｇの量におけるＰｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８からなる、請求項５の可溶性組成物。
【請求項７】
ａ）最終培地容量を選択し；
ｂ）請求項２または請求項３の可溶性組成物を提供し；
ｃ）最終培地容量未満の水の容量において可溶性組成物を可溶化し；
ｄ）最終培地容量の１リッター当たりＬ−グルタミン１．０２２ｇを添加し；
ｅ）最終培地容量中０．０２０Ｍ〜０．０３０Ｍの重炭酸イオン濃度を生じるのに十分な重炭酸イオン提供物質を添加し；
ｆ）場合によっては、ミコフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチンまたは大豆加水分解物からなる群から選ばれる少なくとも１種の物質を添加し；
ｇ）溶液のｐＨをｐＨ５．９〜ｐＨ７．８に調節するのに十分な塩基の量を添加し；そして
ｈ）組成物の容量を選択された最終培地容量までもたらすのに十分な水を添加すること、を含む段階によって作成される細胞培養培地を含んでなる組成物。
【請求項８】
ａ）最終培地容量を選択し；
ｂ）請求項５または請求項６の可溶性組成物を提供し；
ｃ）最終培地容量未満の水の容量において可溶性組成物を可溶化し；
ｄ）最終培地容量の１リッター当たりＬ−グルタミン１．０２２ｇを添加し；
ｅ）最終培地容量中０．０２０Ｍ〜０．０３０Ｍの重炭酸イオン濃度を生じるのに十分な重炭酸イオン提供物質を添加し；
ｆ）場合によっては、ミコフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチンまたは大豆加水分解物からなる群から選ばれる少なくとも１種の物質を添加し；
ｇ）溶液のｐＨをｐＨ５．９〜ｐＨ７．８に調節するのに十分な塩基の量を添加し；そして
ｈ）組成物の容量を選択された最終培地容量までもたらすのに十分な水を添加すること、を含む段階によって作成される細胞培養培地を含んでなる組成物。
【請求項９】
最終培地容量中０．０２０Ｍ〜０．０３０Ｍの重炭酸イオン濃度を生じるのに十分な重炭酸イオン提供物質が、最終培地容量の１リッター当たりＮａＨＣＯ３の２．１ｇである、請求項７の組成物。
【請求項１０】
最終培地容量中０．０２０Ｍ〜０．０３０Ｍの重炭酸イオン濃度を生じるのに十分な重炭酸イオン提供物質が、最終培地容量の１リッター当たりＮａＨＣＯ３の２．１ｇである、請求項８の組成物。
【請求項１１】
培地容量の１リッター当たり次に示す量において添加される次に示す成分：
０．５ｍｇ  ミコフェノール酸；
２．５ｍｇ  ヒポキサンチン；および
５０ｍｇ  キサンチン
を含んでなる、請求項５の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、真核細胞の培養のための化学的規定培地組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
慣用の真核細胞培養培地の「外来（ａｄｖｅｎｔｉｔｉｏｕｓ）粒子」、例えば細菌、ウイルスまたはプリオン粒子による汚染は、生物学的製剤（ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、例えば抗体または治療タンパク質の工業生産において重大な潜在的問題である。生物学的製剤におけるそのような汚染は、患者の感染症および疾病を惹起することが可能であり、そして宿主の生産細胞系における代謝的負荷の増大により収量を制限するかもしれない。
【０００３】
変異型クロイツフェルト・ヤコブ病（ｖＣＪＤ）は、外来粒子の汚染によって惹起され得る患者の疾病の１例である。この疾病はヒトにおいて媒介されるプリオンであり、そして致命的な神経変性を特徴とする。ｖＣＪＤは、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）において致命的な神経変性性「狂牛病」を惹起するウシ（ｂｏｖｉｎｅ）海綿状脳症（ＢＳＥ）プリオンへの曝露に強く関連されている。
【０００４】
慣用の真核細胞培養培地の外来粒子汚染は、慣用の培地中に動物由来の成分およびタンパク質増殖因子の組み入れをもたらすことができる。そのような汚染は、動物由来の培地成分が、病原性細菌、ウイルスまたはプリオンを宿している動物から得られる場合に起きることがある。例えば、ＢＳＥに罹ったウシ（ｃｏｗ）から得られたウシ血清は、ヒトのｖＣＪＤを惹起することが可能なプリオンにより汚染されているかもしれない。そのような外来粒子汚染の究極の結末は、真核細胞培養物およびそのような培養物から調製される生物学的製剤の汚染となり得る。
【０００５】
外来粒子汚染は、動物成分を含有しない細胞培養培地において真核細胞を培養することによって回避できる。理想的には、そのような培地は、培地組成物が既知の化学的化合物のみを含有し、そしてすべてのタンパク質−−組み換えタンパク質のような動物起源でないタンパク質さえも含有しないように「化学的に規定」される。
【０００６】
生物学的製剤、例えば抗体の生産に最適な化学的規定培地組成物は、いくつかの異なる基準を満足しなければならない。第１に、そのような組成物は、生物学的製剤の製造のために典型的に使用されるバイオリアクター容器中で生じる剪断力および他の細胞を損傷する工程からもたらされる真核細胞の損傷を限定しなければならない。第２に、そのような組成物は、真核細胞培養物が、高い生存細胞密度（すなわち、生存細胞数／ｍｌ培地）と高い生存細胞パーセントを有することができるようにしなければならい。第３には、分泌される生物学的製剤産物の高いタイター（すなわち、抗体ｍｇ／Ｌ培地）と高い比生産力（すなわち、ｐｇ抗体／生存細胞／日）を可能にしなければならない。最後に、そのような組成物は、グルコースのもっとも効率的な細胞使用を可能にするよう培養真核細胞による乳酸生成を限定しなければならない。
【０００７】
かくして、これらの基準を満足し、そして生物学的製剤の生産のために最適化されている化学的規定培地組成物へのニーズが存在する。
【発明の開示】
【０００８】
本発明の１つの態様は、細胞培養培地を作成するために適当な可溶性組成物であり、ここで、培地は、次に示す成分を１リッター当たり次に示す量において含む：
無水ＣａＣｌ２，  ５−２００ｍｇ；
無水ＭａＣｌ２，  １５−５０ｍｇ；
無水ＭｇＳＯ４，  ２０−８０ｍｇ；
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．０５−０．５０ｍｇ；
Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０１−０．０８ｍｇ；
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．４０−１．２０ｍｇ；
クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム，  ０．０４−２００ｍｇ；
ＫＣｌ，  ２８０−５００ｍｇ；
ＮａＣｌ，  ５０００−７５００ｍｇ；
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，  ３０−１００ｍｇ；
Ｎａ２ＨＰＯ４，  ３０−１００ｍｇ；
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，  ０．００１−０．００５ｍｇ；
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，  ０．００１−０．１０ｍｇ；
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ，  ０．００１−０．００５ｍｇ；
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，  ０．００００７０−０．００８０ｍｇ；
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ，  ０．００００２５−０．０００５ｍｇ；
Ｎａ２ＳｅＯ３，  ０．００４−０．０７ｍｇ；
Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０２−０．４ｍｇ；
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，  ０．００００２５−０．０００５ｍｇ；
ＮＨ４ＶＯ３，  ０．０００１−０．００２５ｍｇ；
Ｄ−グルコース，  ５００−８０００ｍｇ；
ピルビン酸ナトリウム，  ０．０−１０００ｍｇ；
ナトリウム・ヒポキサンチン，  ０．０−２０．０ｍｇ；
グリシン，  ０．０−１５０ｍｇ；
Ｌ−アラニン，  ０．０−１５０ｍｇ；
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ，  ２００−５０００ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ，  ４０−２５０ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン酸，  ２０−１０００ｍｇ；
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  ２５．０−２５０ｍｇ；
Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ，  １５−１５０ｍｇ；
Ｌ−グルタミン酸，  ０−１０００ｍｇ；
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  １００−５００ｍｇ；
Ｌ−イソロイシン，  ５０−１０００ｍｇ；
Ｌ−ロイシン，  ５０−１０００ｍｇ；
Ｌ−リジン・ＨＣｌ，  １００−１０００ｍｇ；
Ｌ−メチオニン，  ５０−５００ｍｇ；
Ｌ−オルニチン・ＨＣｌ，  ０−１００ｍｇ；
Ｌ−フェニルアラニン，  ２５−１０００ｍｇ；
Ｌ−プロリン，  ０−１０００ｍｇ；
Ｌ−セリン，  ５０−５００ｍｇ；
Ｌ−タウリン，  ０−１０００ｍｇ；
Ｌ−トレオニン，  ５０−６００ｍｇ；
Ｌ−トリプトファン，  ２−５００ｍｇ；
Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ，  ２５−２５０ｍｇ；
Ｌ−バリン，  １００−１０００ｍｇ；
ｄ−ビオチン，  ０．０４−１．０ｍｇ；
Ｄ−パントテン酸カルシウム，  ０．１−５．０ｍｇ；
塩化コリン，  １−１００ｍｇ；
葉酸，  １−１０ｍｇ；
ｉ−イノシトール，  １０−１０００ｍｇ；
ニコチンアミド，  ０．５−３０ｍｇ；
ｐ−アミノ安息香酸，  ０．１−２０ｍｇ；
リボフラビン，  ０．０５−５．０ｍｇ；
チアミン・ＨＣｌ，  ０．５−２０ｍｇ；
チミジン，  ０−３．０ｍｇ；
ビタミンＢ１２，  ０．０５−５．０ｍｇ；
リノール酸，  ０．０１−２．０ｍｇ；
ＤＬ−α−リポ酸，  ０．０３−１．０ｍｇ；
ピリドキシン・ＨＣｌ，  ０．５−３０ｍｇ；
プトレッシン・２ＨＣｌ，  ０．０２５−０．２５ｍｇ；および
エタノールアミン・ＨＣｌ，  ２−１００ｍｇ。
【０００９】
本発明のその他の態様は、細胞培養培地を作成するために適当な可溶性組成物であり、ここで、培地は、次に示す成分を１リッター当たり次に示す量において含む：
ＣａＣｌ２，  １００．９５ｍｇ；
ＭａＣｌ２，  ２４．７７ｍｇ；
ＭｇＳＯ４，  ４２．２４ｍｇ；
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．３６０７ｍｇ；
Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０４３２ｍｇ；
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．６２２５ｍｇ；
クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム，  ４３．２５ｍｇ；
ＫＣｌ，  ３８６．９ｍｇ；
ＮａＣｌ，  ５８６６．０ｍｇ；
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，  ５４．０７ｍｇ；
Ｎａ２ＨＰＯ４，  ６１．４４ｍｇ；
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，  ０．００３２８７ｍｇ；
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，  ０．００２０６０６ｍｇ；
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ，  ０．０００５３５ｍｇ；
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，  ０．００００８５７１ｍｇ；
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ，  ０．００００５１４ｍｇ；
Ｎａ２ＳｅＯ３，  ０．００７４８９ｍｇ；
Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０３６７１ｍｇ；
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，  ０．００００４８８ｍｇ；
ＮＨ４ＶＯ３，  ０．０００２５３０ｍｇ；
Ｄ−グルコース，  ３６８０．５２ｍｇ；
ピルビン酸ナトリウム，  １００ｍｇ；
ナトリウム・ヒポキサンチン，  ２．０６９ｍｇ；
グリシン，  １６．２３ｍｇ；
Ｌ−アラニン，  ７９．３１ｍｇ；
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ，  ６７４．８９ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ，  １８２．２５ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン酸，  ６７．２３ｍｇ；
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  ５７．６３ｍｇ；
Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ，  １０６．７０ｍｇ；
Ｌ−グルタミン酸，  ６．３６ｍｇ；
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  ２５０．５５ｍｇ；
Ｌ−イソロイシン，  ２４５．４３ｍｇ；
Ｌ−ロイシン，  ２６３．４２ｍｇ；
Ｌ−リジン・ＨＣｌ，  ２７６．４１ｍｇ；
Ｌ−メチオニン，  ８５．４０ｍｇ；
Ｌ−オルニチン・ＨＣｌ，  ２．４４ｍｇ；
Ｌ−フェニルアラニン，  １０４．２３ｍｇ；
Ｌ−プロリン，  １４．９４ｍｇ；
Ｌ−セリン，  １４６．３６ｍｇ；
Ｌ−タウリン，  ３．６４ｍｇ；
Ｌ−トレオニン，  １９９．０９ｍｇ；
Ｌ−トリプトファン，  ７０．７１ｍｇ；
Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ，  １９５．５８ｍｇ；
Ｌ−バリン，  １７４．３４ｍｇ；
ｄ−ビオチン，  ０．４３５９ｍｇ；
Ｄ−パントテン酸カルシウム，  １．９３９４ｍｇ；
塩化コリン，  １０．８００９ｍｇ；
葉酸，  ３．４３２９ｍｇ；
ｉ−イノシトール，  ８１．７９６５ｍｇ；
ニコチンアミド，  ３．１３４２ｍｇ；
ｐ−アミノ安息香酸，  ２．１６４５ｍｇ；
リボフラビン，  ０．５３５９ｍｇ；
チアミン・ＨＣｌ，  ２．３３７７ｍｇ；
チミジン，  ０．３１６ｍｇ；
ビタミンＢ１２，  ０．５８８７ｍｇ；
リノール酸，  ０．０３６４ｍｇ；
ＤＬ−α−リポ酸，  ０．０９０９ｍｇ；
ピリドキシン・ＨＣｌ，  ３．０４４２ｍｇ；
プトレッシン・２ＨＣｌ，  ０．０７０１ｍｇ；および
エタノールアミン・ＨＣｌ，  １４．３７ｍｇ。
【００１０】
また、本発明は、本発明の可溶性組成物から作成することができる細胞培養培地を含んでなる組成物を提供する。
【００１１】
本明細書に引用される、限定されるものではないが特許および特許出願を含む、全ての公表物は、完全な記述を通して引用によって本明細書に組み入れられている。
【００１２】
本明細書および請求項において使用される用語「緩衝分子（ｂｕｆｆｅｒｉｎｇ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」は、ｐＨ５．９〜７．８に維持するために適当な緩衝範囲を有する分子を意味する。
【００１３】
本明細書および請求項において使用される用語「ｐＫａ」は、水溶液中の緩衝分子の酸解離定数（Ｋａ）の負の対数を意味する。ｐＫａは、一部分、緩衝分子が溶解される水溶液の温度の関数である。
【００１４】
本明細書および請求項において使用される用語「細胞保護剤（ｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）」は、真核細胞を損傷から保護する物質を意味する。そのような損傷は、例えば、バイオリアクター容器における剪断力または気泡分散の影響によって惹起されるかもしれない。
【００１５】
本発明は、真核細胞の培養において有用な化学的規定組成物を提供する。そのような真核細胞は、昆虫、鳥類、哺乳類または他の起源のものを有してもよい。これらの細胞は、抗体のようなタンパク質を分泌しても、または他の有用な生産物または最終産物（ｒｅｓｕｌｔｓ）を生産してもよい。これらのタンパク質、生産物または最終産物は、細胞によって構成的に生産されても、または核酸配列によるトランスフェクションの結果として生産されてもよい。細胞は懸濁培養物または付着培養物として液体培地において培養されてもよい。また細胞は、本発明の組成物を含んでなる半固体培地における懸濁によって培養されてもよい。
【００１６】
細胞は、例えば、潅流バイオリアクター、細胞バッグ、培養プレート、フラスコおよび当該技術分野において当業者には周知の他の容器を含む、種々の容器において培養されてもよい。細胞培養に適当な周囲条件、例えば温度および大気組成はまた、当該技術分野において周知である。また、細胞の培養方法も当該技術分野において周知である。
【００１７】
本発明の組成物は哺乳動物細胞の培養において特に有用である。哺乳動物細胞の例は、骨髄腫由来細胞、Ｂ細胞系統の非不死化細胞およびハイブリドーマのようなＢ細胞系統の不死化細胞を含む。骨髄腫由来の細胞系の例は、ＳＰ２／０（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ），Ｍａｎａｓａｓ，ＶＡ，ＣＲＬ−１５８１）、ＮＳＯ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（ＥＣＡＣＣ），Ｓａｌｉｓｂｕｒｙ，Ｗｉｌｔｓｈｉｒｅ，ＵＫ，ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ．８５１１０５０３）、ＦＯ（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６４６）およびＡｇ６５３（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８０）細胞系を含み、これらはマウスから得られた。Ｃ７４３Ｂ細胞系は、安定なトランスフェクションの結果としての完全にヒトの抗ＩＬ−１２ｍＡｂを生産するＳＰ２／０由来細胞系の例である。ＹＢ２／０細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６６２）は、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）から得られた骨髄腫由来細胞系の例である。ヒトから得られた骨髄腫由来細胞系の例は、Ｕ２６６細胞系（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−ＴＩＢ−１９６）である。若干の骨髄腫由来細胞系、例えばＮＳＯ、ＹＢ２／０およびＡｇ６５３細胞および関連する細胞系は、好結果の培養のために化学的に規定された脂質濃縮物または他の補足物を必要とすることがある。当業者は、他の骨髄腫細胞系および骨髄腫由来細胞系ならびにそのような細胞の好結果の培養のために要求されるいずれかの補足物を認識できる。
【００１８】
１つの態様では、本発明は、細胞培養培地を作成するために適当な可溶性組成物を提供し、ここで、培地は、次に示す成分を１リッター当たり次に示す量において含む：
無水ＣａＣｌ２，  ５−２００ｍｇ；
無水ＭａＣｌ２，  １５−５０ｍｇ；
無水ＭｇＳＯ４，  ２０−８０ｍｇ；
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．０５−０．５０ｍｇ；
Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０１−０．０８ｍｇ；
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．４０−１．２０ｍｇ；
クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム，  ０．０４−２００ｍｇ；
ＫＣｌ，  ２８０−５００ｍｇ；
ＮａＣｌ，  ５０００−７５００ｍｇ；
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，  ３０−１００ｍｇ；
Ｎａ２ＨＰＯ４，  ３０−１００ｍｇ；
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，  ０．００１−０．００５ｍｇ；
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，  ０．００１−０．１０ｍｇ；
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ，  ０．００１−０．００５ｍｇ；
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，  ０．００００７０−０．００８０ｍｇ；
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ，  ０．００００２５−０．０００５ｍｇ；
Ｎａ２ＳｅＯ３，  ０．００４−０．０７ｍｇ；
Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０２−０．４ｍｇ；
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，  ０．００００２５−０．０００５ｍｇ；
ＮＨ４ＶＯ３，  ０．０００１−０．００２５ｍｇ；
Ｄ−グルコース，  ５００−８０００ｍｇ；
ピルビン酸ナトリウム，  ０．０−１０００ｍｇ；
ナトリウム・ヒポキサンチン，  ０．０−２０．０ｍｇ；
グリシン，  ０．０−１５０ｍｇ；
Ｌ−アラニン，  ０．０−１５０ｍｇ；
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ，  ２００−５０００ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ，  ４０−２５０ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン酸，  ２０−１０００ｍｇ；
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  ２５．０−２５０ｍｇ；
Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ，  １５−１５０ｍｇ；
Ｌ−グルタミン酸，  ０−１０００ｍｇ；
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  １００−５００ｍｇ；
Ｌ−イソロイシン，  ５０−１０００ｍｇ；
Ｌ−ロイシン，  ５０−１０００ｍｇ；
Ｌ−リジン・ＨＣｌ，  １００−１０００ｍｇ；
Ｌ−メチオニン，  ５０−５００ｍｇ；
Ｌ−オルニチン・ＨＣｌ，  ０−１００ｍｇ；
Ｌ−フェニルアラニン，  ２５−１０００ｍｇ；
Ｌ−プロリン，  ０−１０００ｍｇ；
Ｌ−セリン，  ５０−５００ｍｇ；
Ｌ−タウリン，  ０−１０００ｍｇ；
Ｌ−トレオニン，  ５０−６００ｍｇ；
Ｌ−トリプトファン，  ２−５００ｍｇ；
Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ，  ２５−２５０ｍｇ；
Ｌ−バリン，  １００−１０００ｍｇ；
ｄ−ビオチン，  ０．０４−１．０ｍｇ；
Ｄ−パントテン酸カルシウム，  ０．１−５．０ｍｇ；
塩化コリン，  １−１００ｍｇ；
葉酸，  １−１０ｍｇ；
ｉ−イノシトール，  １０−１０００ｍｇ；
ニコチンアミド，  ０．５−３０ｍｇ；
ｐ−アミノ安息香酸，  ０．１−２０ｍｇ；
リボフラビン，  ０．０５−５．０ｍｇ；
チアミン・ＨＣｌ，  ０．５−２０ｍｇ；
チミジン，  ０−３．０ｍｇ；
ビタミンＢ１２，  ０．０５−５．０ｍｇ；
リノール酸，  ０．０１−２．０ｍｇ；
ＤＬ−α−リポ酸，  ０．０３−１．０ｍｇ；
ピリドキシン・ＨＣｌ，  ０．５−３０ｍｇ；
プトレッシン・２ＨＣｌ，  ０．０２５−０．２５ｍｇ；および
エタノールアミン・ＨＣｌ，  ２−１００ｍｇ。
この種の可溶性組成物は、「ＭＥＴ」と命名されており、そして典型的には粉末である。
【００１９】
その他の態様では、本発明は、細胞培養培地を作成するために適当な可溶性組成物を提供し、ここで、培地は、次に示す成分を１リッター当たり次に示す量において含む：
ＣａＣｌ２，  １００．９５ｍｇ；
ＭａＣｌ２，  ２４．７７ｍｇ；
ＭｇＳＯ４，  ４２．２４ｍｇ；
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．３６０７ｍｇ；
Ｆｅ（ＮＯ３）３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０４３２ｍｇ；
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ，  ０．６２２５ｍｇ；
クエン酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム，  ４３．２５ｍｇ；
ＫＣｌ，  ３８６．９ｍｇ；
ＮａＣｌ，  ５８６６．０ｍｇ；
ＮａＨ２ＰＯ４・Ｈ２Ｏ，  ５４．０７ｍｇ；
Ｎａ２ＨＰＯ４，  ６１．４４ｍｇ；
ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ，  ０．００３２８７ｍｇ；
ＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ，  ０．００２０６０６ｍｇ；
（ＮＨ４）６Ｍｏ７Ｏ２４・４Ｈ２Ｏ，  ０．０００５３５ｍｇ；
ＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ，  ０．００００８５７１ｍｇ；
ＮｉＳＯ４・６Ｈ２Ｏ，  ０．００００５１４ｍｇ；
Ｎａ２ＳｅＯ３，  ０．００７４８９ｍｇ；
Ｎａ２ＳｉＯ３・９Ｈ２Ｏ，  ０．０３６７１ｍｇ；
ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ，  ０．００００４８８ｍｇ；
ＮＨ４ＶＯ３，  ０．０００２５３０ｍｇ；
Ｄ−グルコース，  ３６８０．５２ｍｇ；
ピルビン酸ナトリウム，  １００ｍｇ；
ナトリウム・ヒポキサンチン，  ２．０６９ｍｇ；
グリシン，  １６．２３ｍｇ；
Ｌ−アラニン，  ７９．３１ｍｇ；
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ，  ６７４．８９ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン・Ｈ２Ｏ，  １８２．２５ｍｇ；
Ｌ−アスパラギン酸，  ６７．２３ｍｇ；
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  ５７．６３ｍｇ；
Ｌ−シスチン・２ＨＣｌ，  １０６．７０ｍｇ；
Ｌ−グルタミン酸，  ６．３６ｍｇ；
Ｌ−ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ，  ２５０．５５ｍｇ；
Ｌ−イソロイシン，  ２４５．４３ｍｇ；
Ｌ−ロイシン，  ２６３．４２ｍｇ；
Ｌ−リジン・ＨＣｌ，  ２７６．４１ｍｇ；
Ｌ−メチオニン，  ８５．４０ｍｇ；
Ｌ−オルニチン・ＨＣｌ，  ２．４４ｍｇ；
Ｌ−フェニルアラニン，  １０４．２３ｍｇ；
Ｌ−プロリン，  １４．９４ｍｇ；
Ｌ−セリン，  １４６．３６ｍｇ；
Ｌ−タウリン，  ３．６４ｍｇ；
Ｌ−トレオニン，  １９９．０９ｍｇ；
Ｌ−トリプトファン，  ７０．７１ｍｇ；
Ｌ−チロシン・２Ｎａ・２Ｈ２Ｏ，  １９５．５８ｍｇ；
Ｌ−バリン，  １７４．３４ｍｇ；
ｄ−ビオチン，  ０．４３５９ｍｇ；
Ｄ−パントテン酸カルシウム，  １．９３９４ｍｇ；
塩化コリン，  １０．８００９ｍｇ；
葉酸，  ３．４３２９ｍｇ；
ｉ−イノシトール，  ８１．７９６５ｍｇ；
ニコチンアミド，  ３．１３４２ｍｇ；
ｐ−アミノ安息香酸，  ２．１６４５ｍｇ；
リボフラビン，  ０．５３５９ｍｇ；
チアミン・ＨＣｌ，  ２．３３７７ｍｇ；
チミジン，  ０．３１６ｍｇ；
ビタミンＢ１２，  ０．５８８７ｍｇ；
リノール酸，  ０．０３６４ｍｇ；
ＤＬ−α−リポ酸，  ０．０９０９ｍｇ；
ピリドキシン・ＨＣｌ，  ３．０４４２ｍｇ；
プトレッシン・２ＨＣｌ，  ０．０７０１ｍｇ；および
エタノールアミン・ＨＣｌ，  １４．３７ｍｇ。
この可溶性組成物は、「ＭＥＴ１．５」と命名されており、そして典型的には粉末である。
【００２０】
１つの実施態様では、本発明の可溶性のＭＥＴおよびＭＥＴ１．５組成物は、５．９〜７．８のｐＫａを有する緩衝分子；および細胞保護剤を含む。５．９〜７．８のｐＫａを有する緩衝分子の例は、ＭＯＰＳ（２５℃においてｐＫａ７．２０；３７℃においてｐＫａ７．０２）、ＴＥＳ（２−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］アミノエタンスルホン酸；２５℃においてｐＫａ７．４０；３７℃においてｐＫａ７．１６）およびイミダゾール（２５℃においてｐＫａ６．９５）を含む。細胞保護剤の例は、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８のような非イオン性界面活性剤、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および硫酸デキストランである。当業者は、５．９〜７．８のｐＫａを有する他の緩衝分子および細胞保護剤を認識することができる。
【００２１】
本発明の可溶性ＭＥＴ組成物のその他の実施態様では、緩衝分子は、培地容量の１リッター当たり１０４７−５２３０ｍｇの量におけるＭＯＰＳからなり、そして細胞保護剤は、培地容量の１リッター当たり２５０−１５００ｍｇの量におけるＰｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８からなる。
【００２２】
本発明の可溶性ＭＥＴ１．５組成物のその他の実施態様では、緩衝分子は、培地容量の１リッター当たり２７０９．６６ｍｇの量におけるＭＯＰＳからなり、そして細胞保護剤は、培地容量の１リッター当たり８６５．８０ｍｇの量におけるＰｌｕｒｏｎｉｃ−Ｆ６８からなる。
【００２３】
本発明の可溶性組成物は種々の形態物において製造されてもよい。本発明の可溶性組成物は粉末の形態において製造されることが好ましい。本発明の可溶性組成物の粉末形態物は、可溶性組成物が製造された日から少なくとも３年間、細胞培養のために適当である。また、本発明の可溶性組成物は、例えば、１種以上のペレットまたは錠剤の形態において製造されてもよい。
【００２４】
本発明の可溶性組成物は水において可溶化することができる。典型的には、本発明の可溶性組成物を可溶化するために使用される水は、２５℃において１８．２ＭΩ・ｃｍの抵抗率、２０ｐｐｂ未満の総有機含量、１ｍｌ当たり１０個未満のコロニー形成単位の総微生物含量、０．０１ｐｐｍ未満の総重金属含量、０．０１ｐｐｂ未満の総珪酸塩含量および０．０３ｐｐｍ未満の総溶解固形物含量を有する。これらの性質を有する水は、Ｓｕｐｅｒ−Ｑ（ＴＭ）  Ｐｌｕｓ  Ｗａｔｅｒ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ，ＵＳＡ）を使用して製造することができる。また、本発明の可溶性組成物を可溶化するために使用される水は、微生物の除去のために適当なフィルターを通してろ過されてもよい。０．２２μＭのポアーサイズをもつフィルターがそのようなフィルターの例である。微生物および他の外来粒子もまた、当該技術分野で周知の他の手段によって除去または失活されてもよい。
【００２５】
１つの実施態様では、本発明は、最終培地容量を選択し、可溶性ＭＥＴ組成物を提供し、最終培地容量未満の水の容量において可溶性組成物を可溶化し、最終培地容量の１リッター当たりＬ−グルタミン１．０２２ｇを添加し、最終培地容量中０．０２０Ｍ〜０．０３０Ｍの重炭酸イオン濃度を生じるのに十分な重炭酸イオン提供物質を添加し、場合によっては、ミコフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチンまたは大豆加水分解物からなる群から選ばれる少なくとも１種の物質を添加し、溶液のｐＨをｐＨ５．９〜ｐＨ７．８に調節するのに十分な塩基の量を添加し、そして組成物の容量を選択された最終培地容量までもたらすのに十分な水を添加することを含む段階によって作成される細胞培養培地を含んでなる組成物を提供する。本発明のこの実施態様では、この方法の生産物である培地組成物は「ＭＥＴ培地」と命名された。典型的には、ＭＥＴ培地は液体培地である。
【００２６】
その他の実施態様では、本発明は、最終培地容量を選択し；可溶性ＭＥＴ１．５組成物を提供し、最終培地容量未満の水の容量中に可溶性組成物を可溶化し、最終培地容量の１リッター当たりＬ−グルタミン１．０２２ｇを添加し、最終培地容量中０．０２０Ｍ〜０．０３０Ｍの重炭酸イオン濃度を生じるのに十分な重炭酸イオン提供物質を添加し、場合によっては、ミコフェノール酸、ヒポキサンチン、キサンチンまたは大豆加水分解物からなる群から選ばれる少なくとも１種の物質を添加し、溶液のｐＨをｐＨ５．９〜ｐＨ７．８に調節するのに十分な塩基の量を添加し、そして組成物の容量を選択された最終培地容量までもたらすのに十分な水を添加することを含む段階によって作成される細胞培養培地を含んでなる組成物を提供する。本発明のこの実施態様では、この方法の生産物である培地組成物は「ＭＥＴ１．５培地」と命名された。典型的には、ＭＥＴ１．５培地は液体培地である。
【００２７】
本発明の１つの実施態様では、最終培地容量中０．０２０Ｍ〜０．０３０Ｍの重炭酸イオン濃度を生じるのに十分な重炭酸イオン提供物質は、最終培地容量の１リッター当たりＮａＨＣＯ３の２．１ｇである。最終培地容量の１リッター当たりＮａＨＣＯ３のこの量を添加することは、最終培地容量中０．０２５Ｍの重炭酸イオン濃度を生じる。
【００２８】
本発明の１つの実施態様では、ＭＥＴ１．５培地は、１リッター当たり次に示す量において添加される次に示す成分：
０．５ｍｇ  ミコフェノール酸；
２．５ｍｇ  ヒポキサンチン；および
５０ｍｇ  キサンチン
を含む。
【００２９】
本発明のＭＥＴ培地およびＭＥＴ１．５培地組成物は、典型的には、液体培地として細胞に提供される。本発明のＭＥＴ培地およびＭＥＴ１．５培地組成物のｐＨは、ｐＨ５．９〜ｐＨ７．８である。液体のｐＨは液体の温度の関数である。各培地組成物のｐＨは、真核細胞培養が実施される温度において７．１〜７．２５であることが好ましい。真核細胞培養は、３７℃前後の温度で実施されてもよいが、典型的には３７℃で実施される。
【００３０】
いくつかの応用では、液体ＭＥＴ培地および液体ＭＥＴ１．５培地は、半固体細胞培養培地の調製において使用されてもよい。例えば、メチルセルロースが、本発明の液体ＭＥＴ培地および液体ＭＥＴ１．５培地組成物を組み入れる半固体培地を生成するために使用されてもよい。そのような半固体培地は当業者に周知の方法によって調製されてもよい。真核細胞はそのような半固体培地中に懸濁され、そして当業者に周知の方法によって培養されてもよい。
【００３１】
細胞増殖または生産力を増進することができる他の物質がまた、本発明の可溶性ＭＥＴ、ＭＥＴ培地、可溶性ＭＥＴ１．５およびＭＥＴ１．５培地組成物に添加されてもよい。これらの物質は、脂質、ヌクレオシド、ペプチド鎖、コルチコステロイド、ステロイドなどであってもよい。そのような物質は、例えば：
アデノシン  好ましくは０−２０μＭ；
グアノシン  好ましくは０−２０μＭ；
シチジン  好ましくは０−２０μＭ；
ウリジン  好ましくは０−２０μＭ；
デオキシアデノシン  好ましくは０−２０μＭ；
デオキシグアノシン  好ましくは０−２０μＭ；
デオキシシチジン  好ましくは０−２０μＭ；
チミジン  好ましくは０−２０μＭ；
デキサメタゾン  好ましくは１０−１５０ｎＭ；
ヒドロコルチゾン  好ましくは０−１５０μＭ；
Ｌ−グリシン−Ｌ−リジン−Ｌ−グリシン（ＧＫＧ）ペプチド鎖  好ましくは０−２００μＭ；
Ｎ−アセチルシステイン  好ましくは０−５００ｍｇ／Ｌ；
ベタイン  好ましくは０−５００ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−リンゴ酸  好ましくは０−５００ｍｇ／Ｌ；
オキサロ酢酸  好ましくは０−５００ｍｇ／Ｌ；
グリシリジン酸  好ましくは０−５００ｍｇ／Ｌ；
グリシリジン酸アンモニウム塩  好ましくは０−５００ｍｇ／Ｌ；
α−ケトグルタル酸  好ましくは０−５００ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−ロイシン  好ましくは２４５−４９０ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−イソロイシン  好ましくは２２０−４４０ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−リジン・ＨＣｌ  好ましくは１８７−３６０ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−バリン  好ましくは１５５−３１０ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−メチオニン  好ましくは５７−１１４ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−フェニルアラニン  好ましくは７６−１５２ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−セリン  好ましくは３７−７４ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−トレオニン  好ましくは１０７−２１４ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−アルギニン・ＨＣｌ  好ましくは２００−３００ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−アスパラギン  好ましくは１１４−１７０ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−アスパラギン酸  （１０−２５ｍｇ／Ｌ）；
Ｌ−システイン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ  好ましくは４６−７５ｍｇ／Ｌ；
ヒスチジン・ＨＣｌ・Ｈ２Ｏ  好ましくは７５−１５０ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−チロシン  好ましくは４０−８０ｍｇ／Ｌ；
Ｌ−トリプトファン  好ましくは４１−８２ｍｇ／Ｌ；
ニコチンアミド  好ましくは０．９−１．８ｍｇ／Ｌ；および
エタノールアミン・ＨＣｌ  好ましくは１４−２０ｍｇ／Ｌ
であってもよい。
本発明の組成物に添加される各物質の量は、先に示されたように調製された単位培地容量当たりの好適なモル濃度または質量を達成するのに必要な量である。
【００３２】
本発明は次に示す実施例を参照してさらに記述される。これらの実施例は、本発明の種々の態様を単に具体的に説明するものであり、本発明を限定するよう意図されるものではない、
【実施例１】
【００３３】
ＭＥＴ１．５細胞培養培地における真核細胞の生存率
化学的に規定されたＭＥＴ１．５細胞培養培地は、高い細胞増殖と生存率を支持することができる（図１）。生存細胞数を試験するために、ＭＥＴ１．５培地が３Ｌ潅流バイオリアクターに供給された。次いで、バイオリアクターは、始発細胞密度が３ｘ１０６細胞／ＭＥＴ１．５培地ｍｌになるようにＣ７４３Ｂ細胞を接種された。Ｃ７４３Ｂ細胞系は完全にヒトの抗ＩＬ−１２ｍＡｂを産生し、そしてＳＰ２／０骨髄腫細胞由来の化学的に適合された細胞系である。Ｃ７４３Ｂ細胞はバイオリアクターにおいて２９日間増殖され、そして生存細胞密度がモニターされた。細胞培養培地は培養の最初の９日間は０．２ＭＮａ２ＣＯ３水溶液により、そして０．２ＭＮａ２ＣＯ３、０．００５４ＭＫ２ＣＯ３水溶液によって中和された。バイオリアクターにおける過度の細胞密度は、バイオリアクターからの生物細胞量（ｂｉｏｍａｓｓ）の除去によって防がれた；細胞除去は１５日目に開始し、そして２６日目まで徐々に増加された。バイオリアクターは１日当たりＭＥＴ１．５培地の１容量を用いて潅流された。生存細胞数は、ＣＥＤＥＸ細胞カウンター（Ｉｎｎｏｖａｔｉｓ  ＡＧ，Ｂｉｅｌｅｆｅｌｄ，ＤＥ）を用いて標準のトリパンブルー色素排除アッセイを介して決定された。生存細胞パーセントの算出のための総細胞数はＣＥＤＥＸの機器により決定された。各決定では、ＣＥＤＥＸ機器は製造者の指示にしたがって使用された。Ｏ２およびＣＯ２はバイオリアクター容器中に分散される気流としてバイオリアクターに供給された。実施例１、２および３に示されたデータはすべて同じバイオリアクター試行からのものである。
【実施例２】
【００３４】
ＭＥＴ１．５細胞培養培地における抗体タイターおよび比生産力
化学的に規定されたＭＥＴ１．５細胞培養培地は、高いモノクローナル抗体タイターおよび比生産力を支持することができる（図２）。細胞培養およびバイオリアクターの運転は先に記述されたとおりであった。完全にヒトの抗ＩＬ−１２ｍＡｂタイター（ｍｇ／Ｌ）は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ａｒｒａｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒを用いて標準比濁分析技術によって決定された。既知濃度の精製された完全ヒト抗ＩＬ−１２ｍＡｂが、比濁分析によるｍＡｂタイター決定用の標準曲線を作成するために使用された。比生産力の算出のための生存細胞数は前記のように決定された。実施例１、２および３に示されたデータはすべて同じバイオリアクター試行からのものである。
【実施例３】
【００３５】
ＭＥＴ１．５細胞培養培地における乳酸生産の減少
ＭＥＴ１．５培地における乳酸濃度は、生存細胞密度が増加する（図１）につれて減少する（図３）。細胞培養およびバイオリアクターの運転は先に記述されたとおりであった。バイオリアクター培養培地における乳酸濃度およびグルコース濃度は、標準アッセイを用いて決定された。実施例１、２および３に示されたデータはすべて同じバイオリアクター試行からのものである。
【００３６】
図３が示すように、バイオリアクターにおける総細胞密度を減少させるための生物細胞量の除去が始まった１６日目まで、ＭＥＴ１．５培地における乳酸濃度は徐々に減少した。同じ期間中、グルコース濃度は比較的一定に留まった（図３）。図１に対する図３の比較は、同じバイオリアクターにおける生存Ｃ７４３Ｂ細胞数が１６日目まで増加しつつあったことを表している。このデータはともに、ＭＥＴ１．５培地で培養されたＣ７４３Ｂ細胞による乳酸生産の減少およびＭＥＴ１．５培地で培養された細胞によるＤ−グルコースの一層効率的な代謝を示している。
【００３７】
本発明はここに完全に記述されているが、これに対して多くの変更および修飾が、添付される請求項の精神または範囲を逸脱することなく作成できることは、当業者には明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３８】
【図１】ＭＥＴ１．５細胞培養培地における真核細胞の生存率。
【図２】ＭＥＴ１．５細胞培養培地における抗体タイターおよび比生産力。
【図３】ＭＥＴ１．５細胞培養培地における乳酸生成の減少。
【図１】
2008518597.tif 000003
【図２】
2008518597.tif 000004
【図３】
2008518597.tif 000005