(57)【要約】  プロポフォールを選択的に結合することができるポリマーは、１以上の好適なモノマー（例えば、N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレート）及び架橋剤から調製される。ポリマーの要素（７）は、基板（２）上の閉じ込め構造（３）内に配置されたプロポフォールセンサー（１）において使用することができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレート（DEAEM）、アクリルアミド、2-(トリフルオロメチル)アクリル酸（TFMAA）、イタコン酸及びエチレングリコールメタクリレートホスフェート（EGMP）の少なくとも１つ以上から選ばれるモノマーと、架橋剤とからなる、プロポフォールと結合するためのポリマーを含むセンサー。
【請求項２】
前記架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート（EDMA）、グリセロールジメタクリレート（GDMA）、トリメチルアクリレート（TRIM）、ジビニルベンゼン（DVB）、（特にアシルアミドを架橋するために好適である）メチレンビスアクリルアミド及びピペラジンビスアクリルアミド、フェニレンジアミン、ジブロモブタン、エピクロロヒドリン、トリメチロールプロパン トリメタクリレート、及びN,N'-メチレンビスアクリルアミドから選ばれる、請求項１記載のセンサー。
【請求項３】
モノマー対架橋剤のモル比が1：1〜1：15である、請求項１又は２記載のセンサー。
【請求項４】
前記ポリマーが、プロポフォールと結合することができる分子インプリントポリマーである、請求項１〜３のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項５】
前記ポリマーが、プロポフォールでインプリントされた分子インプリントポリマーである、請求項４記載のセンサー。
【請求項６】
基板；基板上に配置された閉じ込め構造、ここで、当該閉じ込め構造はポリマーを含むための第１の内部空間を特定する少なくとも１つの第１の境界構造（limiting structure）を含み；及び第１の内部空間に近接したトランスデューサ、を更に含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項７】
N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレート（DEAEM）、アクリルアミド、2-(トリフルオロメチル)アクリル酸（TFMAA）、イタコン酸、エチレングリコールメタクリレートホスフェート（EGMP）及びそれらの混合物から選ばれるモノマーと、プロポフォールと結合するための架橋剤とからなるポリマーの使用。
【請求項８】
前記架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート（EDMA）、グリセロールジメタクリレート（GDMA）、トリメチルアクリレート（TRIM）、ジビニルベンゼン（DVB）、（特にアシルアミドを架橋するために好適である）メチレンビスアクリルアミド及びピペラジンビスアクリルアミド、フェニレンジアミン、ジブロモブタン、エピクロロヒドリン、トリメチロールプロパン トリメタクリレート、及びN,N'-メチレンビスアクリルアミドから選ばれる、請求項７記載の使用。
【請求項９】
モノマー対架橋剤のモル比が1：1〜1：15である、請求項７又は８記載の使用。
【請求項１０】
前記ポリマーが、プロポフォールと結合することができる分子インプリントポリマーである、請求項７〜９のいずれか１項記載の使用。
【請求項１１】
N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレート（DEAEM）、アクリルアミド、2-(トリフルオロメチル)アクリル酸（TFMAA）、イタコン酸及びエチレングリコールメタクリレートホスフェート（EGMP）から選ばれるモノマーと、架橋剤とからなるプロポフォールでインプリントされた分子インプリントポリマー。
【請求項１２】
前記架橋剤が、エチレングリコールジメタクリレート（EDMA）、グリセロールジメタクリレート（GDMA）、トリメチルアクリレート（TRIM）、ジビニルベンゼン（DVB）、（特にアシルアミドを架橋するために好適である）メチレンビスアクリルアミド及びピペラジンビスアクリルアミド、フェニレンジアミン、ジブロモブタン、エピクロロヒドリン、トリメチロールプロパン トリメタクリレート、及びN,N'-メチレンビスアクリルアミドから選ばれる、請求項１１記載の分子インプリントポリマー。
【請求項１３】
モノマー対架橋剤のモル比が1：1〜1：15である、請求項１１又は１２記載の分子インプリントポリマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、合成受容体、特に麻酔剤プロポフォールに選択的に結合することができる合成ポリマーに関する。
【背景技術】
【０００２】
現代の健康管理は、診断及び疾患の管理を可能にするための、様々な体液に関する化学的及び生物化学的分析的検査の範囲に専ら依拠している。医学的及び技術的進歩は、過去数十年の間に診断的検査の範囲をかなり拡げてきた。更に、人体に対する理解の増加、及び発展する技術、例えばマイクロシステム及びナノテクノロジー、の出現は、診断技術に対する意味深い影響を有すると期待される。
【０００３】
病院において増えている診断的検査は、特に、迅速な対応が第一に考慮すべき事項であり、迅速に治療的決定をする必要がある場合においては、ポイント・オブ・ケア（PoC）で行われる。PoC検査における最近の進歩にも関わらず、いくつかの切実な要求が満足されていない。現在利用できる診断的検査の多くは、洗練された生物的受容体、例えば酵素、抗体及びDNAの使用に依拠する。それらの生物学的派生に因り、これらの生体分子は、典型的には、センシング適用において使用されるときに、多くの限界、例えば、低い再現性、製造中の不安定性、環境因子への感受性、例えばpH、イオン強度、温度等、及び殺菌プロセスに関連する問題、に直面している。
【０００４】
これらの問題を解決するための有望なルートは、合成的ポリマー-系受容体、例えば分子インプリントポリマー（MIP）によって提供される。合成受容体は、生物的受容体に関連する多くの不利点を回避する。例えば、分子インプリントは、高い親和性及び高い特異性に頑健性（robustness）及び低製造費を組み合わせた、合成受容体を調製するための一般的かつ費用効果的な技術である。加えて、MIP受容体材料は、非常に多くの臨床的に関連する化合物及び診断マーカーについて既に実証されてきた。生物的受容体とは対照的に、合成受容体、特にMIPは、典型的には、低値から高値までのpH、圧力及び温度に安定であり、安価で、調製し易く、有機溶媒に寛容であり、実際には任意の検体用に調製することができ、ミクロ機械加工及びマイクロ加工技術と充分に適合し得る。
【０００５】
分子インプリント法は、材料における（結合する又は触媒的）特異的認識部位の鋳型-誘導形成のプロセスとして定義することができ、そこでは、鋳型は、自己-組織化機構により材料の構造的成分の位置付け及び方向を指定する。材料それ自体は、オリゴマー性、重合性（例えば、有機MIP及び無機インプリントシリカゲル）、又は2-次元の表面アセンブリ（グラフト型単層）でよい。
【０００６】
多くの適用において、例えば、受容体が適用間で意義深い再生なしで繰り返し使用される場合には、特にセンシング適用において、いわゆる非共有結合型MIPの使用が一般的に好ましい。鋳型/検体は、これらの受容体材料への非共有結合性相互作用により弱く結合されているに過ぎないので、新規測定のために再生された合成受容体及びセンサーから比較的簡便に取り除くことができる。一般的に、非共有結合型インプリント法は実施するのが容易であり、広い範囲の鋳型に適用可能である。
【０００７】
非共有結合型MIPにおいて、ポリマー内に含まれるモノマー（複数）は、非共有結合性相互作用、例えば、水素結合、静電気的相互作用、配位結合形成等を介して鋳型と相互作用する。図１は、鋳型すなわち、標的検体又はその構造的類縁体に対して特異性を有する結合部位を有するポリマーを形成するための、モノマー性の出発物質からのMIPの自己組織化、及びその後の鋳型の溶出又は抽出、の略図を示す。
【０００８】
この技術は、小分子（最高1200 Da）、例えば小さな有機分子（例えば、グルコース）及び薬物から大きなタンパク質及び細胞に至るまでの広い範囲の化学物質について、成功的にMIPを創製するために採用されてきた。得られたポリマーは頑強、安価であり、多くの例では、診断的適用に適した親和性及び特異性を有する。MIPの高特異性及び安定性は、MIPに、検出技術における使用のための酵素、抗体及び天然型受容体に代わる有望な代替を与える。
【０００９】
例えば、WO 02/00737は、静脈麻酔剤プロポフォールの検出装置を開示する。特に、プロポフォールに結合できる非共有結合型MIPの合成が記載されている。このMIPは、モノマーとしてのメタクリル酸（MAA）と、架橋剤としてのエチレンジメチルアクリル酸（EDMA）とからなる。当該文献は、メタノールを用いる血液試料からのプロポフォールの抽出、及び当該抽出物からのプロポフォールのMIPへの吸着を含む、血液試料中のプロポフォール濃度を測定する方法を開示する。MIPへの吸着の後に、プロポフォールは、ポリマーから抽出され、プロポフォール濃度はHPLC又は光学的技術を用いて決定される。しかしながら、開示された方法は、オフラインであること、実行するには厄介であること、血液試料からのプロポフォールの抽出にメタノールを使用する必要があること、分析プロセスに追加の化学物質の使用を必要とすること、及び一般的に使用に時間がかかることを含む、多くの欠点を有する傾向がある。
【００１０】
MIPを含む合成ポリマー-系受容体を、臨床的に関連する検体の分析用装置に導入するための多くの方法論が提案されてきたが、今日まで制限的成功を収めたに過ぎなかった。MIPアッセイ及びセンサーの開発に関連する主な限界の１つは、MIP調製の一般的手段が存在しなかったことである。典型的には、ポリマー組成物の選択は、類似の装置の動作に関する文献、化学者の個々の経験、及び過度な実験的試験から得られる情報に基づいており、そのため最適状態には及ばないことがよくある。特定されたポリマー組成物は、典型的には合成され、試料中に存在することがあるそれらの性質、例えば、鋳型及び他の化合物に対する結合親和性、に関して研究室で試験される。実験的結果に基づいて、ポリマー組成物は更に精製されて、掌握下の適用のための好適な結合性を有する合成受容体を得ることができる。
【００１１】
MIPの設計のためのより進んだプロトコールは、コンビナトリアル法を含み、それにより、最良の組成物が、小スケールで調製された数十〜数百のインプリントポリマーの同時合成及び試験に基づいて選択される。
【００１２】
手段の一部として最適化することができる性質は、結合親和性、能力、反応速度、再生、他の検体に対する交差感度及び/又は実際の試料、溶媒又は媒体、例えば水又は血液、中での操作を含むが、これらに限定されない。
【００１３】
しかしながら、当該分野では、選択的にプロポフォールに結合することができる材料の要求が依然としてある。
【発明の開示】
【００１４】
従って、本発明は、N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレート（DEAEM）、アクリルアミド、2-(トリフルオロメチル)アクリル酸（TFMAA）、イタコン酸及びエチレングリコールメタクリレートホスフェート（EGMP）の少なくとも１つ以上から選ばれるモノマーと、架橋剤とからなる、プロポフォールと結合するためのポリマーを含むセンサーを提供する。
【００１５】
本発明はまた、プロポフォールを結合するための上記のポリマーの使用、及び上記の成分を有する、プロポフォールを用いて（すなわち、プロポフォールの存在下で合成された）インプリントされた分子インプリントポリマーを提供する。
【００１６】
本発明は、添付図面を参考に記載する。
【００１７】
本発明は、臨床的に関連する標的検体であるプロポフォールの検出用のポリマー組成物に関する。特に、本発明は実際の試料での使用について、すなわち、血液又は生理的溶液、高結合親和性、高結合速度及び意義のある試料調製の必要のない簡便な再生について最適化されポリマー組成物に関する。これらの材料は、分子インプリントポリマー（MIP）及び非-インプリントポリマー（NIP）の形態で製造することができる。
【００１８】
MIP又はNIP、例えばアクリレート、アミド、ビニル及びアリルモノマー、ウレタン、フェノール、ボロネート、有機シロキサン、炭酸エステル、スルホン酸等の合成に使用することができる、非常に多くの可能性のあるモノマーが存在する。例えば、M. Komiyama et al. Molecular Imprinting: From Fundamentals to Applications, Wiley-VCH Verlag GmbH & Co KGaA, Weinheim (2003), G. Wulff Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 34, 1812 (1995)、及びS. Subrahmanyam et al. Biosensors & Bioelectronics 16, 631 (2001)参照。本明細書に記載のポリマー組成物は、統計的及び実験的方法を用いる、検体、可能性のある干渉物質及び他の関連する物質に対する結合について、これらのモノマーの性質の注意深い研究により、定義され及び最適化された。同様に、ポリマーの性質は、分析を行い又は相互作用が起こる溶媒又は媒体の機能として、分析され得る。医療用途については、試料が血液試料、尿試料、血液透析液、唾液試料等として主に存在する場合には、これらの試料中で直接に試料分析及び診断試験を行うことが通常好ましい。よって、MIP又はNIPが、水性媒体中で、典型的には生理的条件下での操作について最適化されることが好ましい。
【００１９】
本分析の結果に基づいて、多数のモノマーは、プロポフォール用の合成受容体の合成の好適な候補として特定された。本発明は、N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレート（DEAEM）、アクリルアミド、2-(トリフルオロメチル)アクリル酸（TFMAA）、イタコン酸及びエチレングリコールメタクリレートホスフェート（EGMP）の少なくとも１つ以上から選ばれるモノマーを用いて調製された合成受容体を提供する。
【００２０】
合成受容体とは、特異的検体と選択的に結合することができる合成ポリマーを意味する。
【００２１】
これらのモノマーの各々又はその混合物は架橋剤と共に使用されて、プロポフォール用の合成受容体を調製することができる。合成受容体は、インプリントポリマー又は非-インプリントポリマーの形態で調製することができる。これらの材料の合成用のプロトコールの例を、以下に記載する。
【００２２】
加えて、ポリマーの性質を調整するために、他のモノマーをポリマーに組み込んでもよい。例えば、結合されるべき検体に対して優れた結合親和性を有するが、単純な方法で再生することもできる、ポリマーを構築することが好ましい。すなわち、プロポフォールに選択的に結合することができるが、プロポフォールがポリマーの再使用を可能にするために次にはポリマーから除くことができる、ポリマーである。更に、特定の適用のために最適化されるポリマーを合成するために、対象の検体に対する結合親和性及び再生の容易性に加えて、他のポリマーの性質、例えば機械的安定性、他の化合物への結合又は感度、特定の環境（例えば、使用される溶媒）での操作特性、ポリマーと支持体又はセンサーとの一体化、表面の生物学的適合性等を考慮することが望ましい。本目的は、本明細書で特定された高結合親和性を有するモノマーを含むモノマーと、低結合親和性を有する別のモノマーとの混合物を好適な比で用いることにより、達成することができる。代替的には、混合物中の様々なモノマーは、所望の効果を提供するために互いに協力することがある、例えば、結合されるべき検体又は分子の周囲の異なった部位又は場所において追加の結合を付与することがある。この効果は、例えば、ポリマーへの分子の結合を増加させるために、又は試料中に含まれ得る他の物質との結合において交差-感度を改善するために使用することができる。更に、混合物への追加のモノマーの添加はまた、表面の生物学的適合性を変えることがある。この方法でのポリマー混合物の使用は、ポリマーの性質を、特定の適用要件に調整することができる。
【００２３】
機能性モノマー（すなわち、N,N-ジエチルアミノエチルメタクリレート（DEAEM）、アクリルアミド、2-(トリフルオロメチル)アクリル酸（TFMAA）、イタコン酸及び/又はエチレングリコールメタクリレートホスフェート（EGMP））は、総モノマー含有量基準で、好ましくは最低で5 mol%、より好ましくは10 mol%、最も好ましくは20 mol%で存在し、最高で100 mol%、より好ましくは95 mol%及び最も好ましくは90 mol%で存在する。
【００２４】
本明細書で開示されるMIP及びNIPの合成は、架橋剤としてEGDMAを用いて行われてきたが、好適な合成受容体を調製するために他の架橋剤が使用することができる。
【００２５】
所望の構造において鋳型-結合部位を強固に固定する架橋剤、及びMIP又はNIPの多孔性に影響を与える架橋剤を含み得る。架橋剤は、モノマーと反応してポリマーを架橋できなければならず、架橋剤は好ましくはモノマーに対する同様な反応性を有するものでなければならない。好適な架橋剤は、エチレングリコールジメタクリレート（EDMA）、グリセロールジメタクリレート（GDMA）、トリメチルアクリレート（TRIM）、ジビニルベンゼン（DVB）、メチレンビスアクリルアミド及びピペラジンビスアクリルアミド、フェニレンジアミン、ジブロモブタン、エピクロロヒドリン、トリメチロールプロパン トリメタクリレート、及びN,N'-メチレンビスアクリルアミドを含むがこれらに限定されない。モノマー対架橋剤のモル比は、好ましくは1:1〜1:15である。モノマーと架橋剤との混合物も使用することができる。
【００２６】
この方法で作製されたポリマーは、例えば、WO 02/00737に記載されているモノマーとしてのメタクリル酸（MAA）に基づくインプリントポリマーよりも、プロポフォールに対するその結合親和性の点で優れた能力を示した。
【００２７】
ポリマー組成物及び合成のために使用されるべき最適なモノマー対鋳型比も特定した。２つの特定のポリマーについての本分析から得られる好ましい比を、表１に示す。
【００２８】
【表１】
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【００２９】
単にモノマー-鋳型複合体の結合親和性を分析することに加えて、ポリマーの性質の分析は、他のポリマーのパラメータにまで及び、他のポリマーの性質を最適化するために使用することができる。当業者は、例えば、試料中に存在することがあり、そして計画した測定又はプロセスに干渉物質（interferent）として働くことがある、検体に対して特定されたモノマーを選別することができる。そのため、当業者は、標的検体、すなわちプロポフォールには強く結合するが、仮にあったとしても試料中に存在する他の物質、例えばモルヒネ、グルコース又はアルブミンとは弱くしか結合しないか又は弱くしか相互作用しない、モノマーを選択することができる。
【００３０】
プロポフォールが標的検体である場合には、我々は、例えば、EGMPがプロポフォール及びアルフェンタニルに強く結合することを見出した。そのため、モノマーとしてEGMPを含むポリマーは、プロポフォール及びアルフェンタニルの合成受容体として働くことができる。対照的に、DEAEMは、プロポフォールと強く相互作用し、アルフェンタニルとは弱く相互作用するだけである。DEAEMをモノマーとして含むポリマーは、そのため、プロポフォールと強く相互作用し、一方、アルフェンタニルには交差-感度をほとんど示さないか又は全く示さないだろう。このDEAEM-含有ポリマーは、そのため、プロポフォールとアルフェンタニルとを、２つの検体を含む溶液中で識別することができる。
【００３１】
MIPは好ましくはプロポフォールの存在下で合成されるが、プロポフォール類縁体の存在下でも合成することができる。当該類縁体は、プロポフォールそれ自体に結合することができるMIPを与えるために、プロポフォールに立体電子的に充分に類似していなければならない。
【００３２】
本発明の好ましい実施態様は、プロポフォールの受容体材料としての非-インプリントポリマー（NIP）の創製に関する。特に、これらのNIPは、モノマーとしての、DEAEM、EGMPもしくはアクリルアミド又はその混合物と、架橋剤としてのEGDMAとからなり、例えば本明細書に概説した手段を用いて合成される。
【００３３】
上で特定されたモノマーは、対象の標的検体、すなわちプロポフォールと強く結合する。更に、これらのモノマーと溶液中に存在することがある他の検体との相互作用もまた、同様な方法を用いて評価することができる。そのため、標的検体、例えばプロポフォールと強く相互作用するが、試験される試料中の他の検体とは弱く相互作用する、モノマーを選択することができる。これらのモノマー及び好適に選択された架橋剤は、そのため、対象の検体に対する合成受容体として働く、非-インプリントポリマー（NIP）を合成するために使用することができる。これらのポリマーは、プロポフォールに対する高結合親和性、及び試料中に存在することがある多数の検体、例えばアルブミン及びモルヒネに対する低結合を示した。
【００３４】
標的検体又は鋳型が重合中に混合物中に存在しないことを除いて、非-インプリントポリマーは、対応するMIPとして同一の組成物及び合成手段を有する。そのため、ポリマーから鋳型を（部分的に又は完全に）取り除くためのその後の洗浄ステップも必要としない。よって、NIPの合成は、対応する分子インプリントポリマー（MIP）に比べて、一般的に、ほとんど複雑でなく、低コストである。
【００３５】
NIPは、上記のモノマーを利用し、以下の組成物：
5 g DMF (ジメチルホルムアミド)
1 g モノマー
4 g 架橋剤（EGDMA）
0.1 g 開始剤（1,1'-アゾビス（カルボニトリル））
から合成することができる。
【００３６】
ポリマーは、非-インプリントポリマー（NIP）として、すなわち、重合プロセスの間に鋳型の不存在下で、合成された。化学物質を混合し、Honle社の100 UVランプ（強度 0.157 W/cm2）を用いて20分間、UVで重合を行った。次いで、混合物を80℃で１日間、維持した。
【００３７】
組成物及び様々なルートにおいて他の変更も可能であり、当業者には知られている。
【００３８】
原則として、本研究で特定されたモノマーの全ては、好適な架橋剤、例えばEGDMAと共に使用して、特に、水系又は水溶性試料、例えば臨床的診断的適用において典型的に使用されるものの中で、NIPがプロポフォールに結合するための合成受容体を調製することができる。
【００３９】
NIPの結合性に関してNIPを特徴付けるために、重合の後に、ポリマーを破砕し、メタノールで篩にかけた。25 μm〜106 μmの分画を集めた。各ポリマーの10 mgを1 mlの固相抽出カートリッジに詰め、各カラムの結合能を測定することによりプロポフォールの各ポリマーへの結合を評価した。
【００４０】
ポリマーの結合性をプロポフォールの133 μg/ml濃度の水溶液で試験した。結合前に、カートリッジを2 ml水で調整した。充填された濃度の50%ブレイクスルーがUV（紫外線）分光計（272 nmの波長）で観察される時に、カートリッジの浸潤が観察されるまで、プロポフォールを含む溶液（2 ml又は4 mlのアリコート）を、各カートリッジ通過させた。
【００４１】
本試験で特定されたモノマーは、高結合能、及びそれによる関連する標的検体への強い結合親和性を示す。従って、これらのモノマーは、合成受容体、例えばプロポフォール用のMIP又はNIPの製造において使用するためによく適している。
【００４２】
表２は、各ポリマーの結合能を、開始ポリマー重量の割合として示す。例えば、アクリルアミドポリマーについて、50%ブレイクスルーが観察された時に1.3 mgのプロポフォールが10 mgのカートリッジに結合した。これは、（133 μg/ml水溶液から）13%の結合能を与えた。
【００４３】
【表２】
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【００４４】
架橋剤のみにより作製されたポリマー（すなわち、モノマーの不存在下で）は、試験中に鋳型への結合は示さなかった。架橋剤（EGDMA）から作製されたポリマーへの鋳型の結合の不存在の観察は、架橋剤がモノマー-鋳型複合体を妨害しないだろうことを示す。
【００４５】
本明細書で特定されたモノマー、すなわちDEAEM、アクリルアミド、イタコン酸、EGMP、2-(トリフルオロメチル)アクリル酸は、高結合能及びそれによる関連標的検体への強い結合親和性を示す。従って、これらのモノマーは、合成受容体、例えばプロポフォール用のNIP及びMIPの製造において使用するためによく適している。特に、プロポフォールについて特定されるポリマーは、先に示唆されている（WO 02/00727参照）モノマーとしてのMAAに基づくポリマーよりも、プロポフォールに強い結合親和性を示した。そのため、プロポフォールに強い結合親和性を有する合成受容体を創製するために、水系での受容体として使用するためのMIP又はNIP中のモノマーとしての、DEAEM、アクリルアミド、イタコン酸、EGMP、2-(トリフルオロメチル)アクリル酸又はそれらの混合物の使用は、メタクリル酸より好ましい。
【００４６】
例えば、使用のpH、使用される溶媒もしくは試料媒体、又は測定を妨害する他の種の存在に基づいて、特定の検体又は試料についての受容体の性質を最適化するために、ポリマー合成において１つのモノマーのみを使用するよりもむしろ、特定の合成受容体中でいくつかのモノマーの混合物を使用する方が有利であり得る。
【００４７】
本発明の更なる実施態様は、インプリントポリマーの作製に関する。
【００４８】
原則として、本明細書で特定されたモノマーの全ては、好適な架橋剤、例えばEGDMAと共に使用して、合成受容体特にMIPを調製し、水系又は水性試料、例えば臨床的診断適用において典型的に使用されるものの中でプロポフォールと結合することができる。
【００４９】
本発明の好ましい実施態様の例であるポリマー合成の一般的原則を以下に記載し、合成中に用いられるモノマー対鋳型比の例を表１に詳述する。
【００５０】
モノマー及び鋳型濃度は、反応物の総重量の20%であり、架橋剤EGDMAは、合成されたポリマーの残りの80%である。同一量の溶媒（DMF）を、反応混合物に重量で添加した。モノマー：鋳型：架橋剤組成物の総量にラジカル開始剤（アゾビスイソブチロニトリル、AIBN）を１重量%加えた。
【００５１】
鋳型としてのプロポフォールでポリマーM1及びM2をインプリントした。M1を除いて重合を80℃で１日間行った。この重合は、Honle 100 UVランプ（強度 0.157 W/cm2）を用いて60分間、UVで行い、次いで80℃で１日間維持した。
【００５２】
鋳型をメタノールによる広範囲の洗浄により抽出した。当業者に公知の他の方法、例えば電気透析法により鋳型を除くこともできる。
【００５３】
ポリマーを破砕し、メタノールで篩にかけた。25 μm〜106 μmの分画を集め、各ポリマーの10 mgをSPEカートリッジカラムに詰めた。次いで、UV分光計用いてポリマーを分析し、結合実験の前に周りに付く鋳型がないことを確実にした。これは、メタノール、水及びリン酸緩衝生理食塩水であるPBS（140 mM NaCl、3mM KCl及び10mM リン酸緩衝液の水溶液、pH 7.4）からの洗液の吸収を測定することにより行い、鋳型の検出の吸収及び波長が結合実験の開始の前の基準線レベルにあることを確実にした。
【００５４】
12.5 mg/mlのプロポフォールを加えた生理的濃度のPBS中で、結合実験を行った。結合前に2 ml PBSでカートリッジを調整した。プロポフォール溶液（2 mlの体積）を各カートリッジ中を通過させ、好適な波長での初期溶液及び溶出液中のUV吸収を監視することにより結合を、観察した。2 mlのアリコートのUV吸収をSPEカートリッジへの充填の前後と比較して、最初の濃度についてポリマーに結合した割合を計算した。同様な方法により、他の物質に対する交差-反応性を測定した。表３に、結合試験の結果を纏める。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
M1は、プロポフォールに最大の結合を示す。更に、当該ポリマーは、アルフェンタニル、モルヒネ及びアルブミンへの交差-反応性を示さなかったか、又は僅かに交差-反応性を示したに過ぎなかった。同様に、ポリマーM2もまた、M1より弱いが、プロポフォールに対して高い結合親和性を示した。しかし、モルヒネ及びアルブミンとは僅かに交差-反応性を示すか又は全く交差-反応性を示さなかった。アルフェンタニルへのM2の交差-反応性は、M1よりも僅かに高いが、依然として低い（<25%のプロポフォールが17 μl/mlのプロポフォール濃度で結合した）。
【００５７】
表４は、溶液でのアルフェンタニルの濃度が低くなると、アルフェンタニルへのMIP M1及びM2の交差-反応性が顕著に下がる、ことを示している。この結果は、プロポフォール-インプリントポリマーの選択性が、ポリマー組成物中での変化により増加し得る、ことを示唆している。アルフェンタニル濃度が低下すると、非-特異性結合材料の量は顕著に減少する。ポリマーの組成及び得られるポリマーの量を変えることにより、溶液中の干渉種の所与の濃度について同一の効果が得られる。
【００５８】
【表４】
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【００５９】
ポリマーM1及びM2の能力はまた、WO 02/00737に開示された従来のプロトコールを用いて合成された非-共有結合型MIPと比較した。この方法は、モノマーとしてメタクリル酸及びポロゲンとしてヘキサンを使用する。これらのポリマーM1及びM2を、（12.5 μg/mlのプロポフォールのPBSでの濃度で、10 mg SPEカートリッジを用いて）同一の条件下で試験した。
【００６０】
WO 02/00737に開示されているMIPは、SPEカートリッジ上に装填する前に溶液中に存在するプロポフォールの50%と結合した。一方、ポリマーM1は、存在するプロポフォールの72%と結合した。M2は、カラムに装填する前の溶中に存在するプロポフォールの55%と結合した。これらの結果は、プロポフォール用に製造されたポリマーM1及びM2がWO 02/00737に開示されたものより性能が優れている、ことを証明している。WO 02/00737に開示されているポリマーの機械的安定性が非常に低かったことも観察された。このことは、センサープラットフォーム上にポリマーを一体化する（integrate）時に問題を引き起こすと予想される。対照的に、ポリマーM1及びM2は、かなり剛直で機械的に安定である。加えて、MIP M1及びM2への検体の結合速度は、非常に高かった（１分未満）。
【００６１】
本明細書に開示されている合成受容体は、様々な適用において使用することができる。特に、分離及びクロマトグラフィーカラムにおける吸着剤として、又はセンサー中の受容体材料として、これらの新規な受容体を組み込む装置、及びこれらの新規な受容体を用いる方法及び適用は、本発明の対象である。本発明の１つの好ましい実施態様は、上記の方法に従って合成された合成材料のトランスデューサ要素上への配置によって構成される、体液試料中のプロポフォールの濃度の測定用センサーに関する。
【００６２】
本発明の別の実施態様では、合成受容体は、固相抽出又は濾過用の吸着剤として使用される。更に、HPLCカラム中の吸着剤としても使用することができる。これらの目的のために、MIP又はNIPは、典型的に、プラスチックとして形成され、次いでより小さな粒子に破砕され、所望のサイズを選択するために篩いにかけられ、カラムに詰められる。MIP又はNIPは、ミクロスフェア又は膜の形態で調製することもできる。更に、膜又は他の支持体に結合することができる。
【００６３】
合成受容体は、化学センサーにおいて採用することもできる。１つの実施態様では、合成受容体は、試料又はその抽出物から検出される検体を抽出するための吸着媒体として使用される。検体は、次いで、更なる抽出ステップにおいて合成受容体から脱着され、検出される。この方法の典型的な例はWO 02/00737に記載され、本発明のMIP及びNIPはこの方法で適用することができる。
【００６４】
インプリントポリマーの形態又は非-インプリントポリマーの形態のいずれかで本明細書に開示されている合成受容体は、試料中の１以上の標的検体の検出、濃度測定又は監視のためのトランスデューサと直接一体化することもできる。この方法の例は、例えば、GB 2 337 332号に記載されている。他の一体化方法は当業者に公知である。これらの実施態様では、標的検体（複数）の合成受容体（複数）は、MIP又はNIPの形態で、トランスデューサ要素と近接するように位置付けられる。試料と接触する際に、標的検体がもし試料中に存在するならば、標的検体は（ある程度）受容体と相互作用し及び/又は結合する。この相互作用又は結合はトランスデューサにより検出され、測定可能なシグナル、例えば電気的又は光学的シグナルに変換される。２〜３例を挙げると、電気化学的（例えば、電流滴定測定、電気伝導度測定又は電位差測定、特にISFET（イオン選択性電界効果トランジスタ）、光学的（例えば、蛍光分析、発光分析、吸収分析、分光分析的等）、重量測定、共鳴的、磁気的、熱的、表面音波、歪み、位置もしくは置換、又は飛行時間型技術を含む、様々な変換技術が知られている。
【００６５】
本明細書に記載のプリント又は非-インプリントポリマーは、対象の検体を検出、濃度測定又は監視のための装置を構築するために、ミクロ機械加工センサーを用いて一体化することもできる。センサーは、上記の変換原理ならいずれも使用することができる。センサーのサイズを小さくさせ、又は堅牢性を増すために、トランスデューサの近傍にポリマーを位置付け、そしてセンサー構造においてトランスデューサ又は基板の表面へのポリマーの接着を増す手段を含むことは有利である。従って、本願はまた、センサーであって、（典型的に平面の）基板；基板上に配置される閉じ込め構造、ここで、当該閉じ込め構造は第１の内部空間を定義する少なくとも１つの第１の境界構造を含む；第１の内部空間に近接するトランスデューサ；及び、閉じ込め構造内の、第１の検体に選択的に結合することができる合成ポリマー、を含む、ここで、当該合成ポリマーは本明細書に記載のポリマーである、当該センサーを提供する。かかる閉じ込め構造の例及びその製造の標準的な方法は、例えば、米国特許第5,376,255号明細書及び同第6,440,296号明細書に開示されている。
【００６６】
センサーの可能な構造を図２に示す。参照数字は以下のとおりである：好ましくは本明細書に開示されたインプリント又は非-インプリントポリマーの形態において、センサー１、基板２、閉じ込め構造３、第１の境界構造４、第１の内部空間５、トランスデューサ６、及び合成受容体７。
【００６７】
第１の境界構造と同様に、閉じ込め構造は、第２の内部空間を特定する第２の境界構造、ここで第２の内部空間は第１の内部空間を含む、を更に含むことがある。閉じ込め構造は、１以上の更なる内部空間を特定する１以上の更なる境界構造、内部空間を含む１以上の更なる内部空間の各々を更に含んでもよい。閉じ込め構造、及び第１の、第２の及び更なる境界構造は、任意の形状でよいが、好ましくは環状である。
【００６８】
加えて、センサーは、更なる検体、他の受容体材料（例えば、酵素、抗体等）又は参照材料と選択的に結合することができるポリマーを含む、追加のトランスデューサ要素及び/又は閉じ込め構造を含んでもよい。
【００６９】
本発明はまた、本明細書の上で定義されたセンサーを含む、標的種を含む又は含むと予想される試料を用いる、試料中の標的種を検出する方法を提供する。
【００７０】
支持体上への合成受容体の固定を促進するために、支持体を修飾することができる。例えば、二重結合を含むシラン又はチオールの結合によりポリマー接着を促進する薬剤で、支持体/トランスデューサの表面を修飾することができる。これらの基は、次いで、重合の前後のいずれかに、合成受容体の構成成分と反応して、受容体とトランスデューサ間の化学結合を提供する。
【００７１】
センサー表面への充分な機能性基又はフリーラジカル開始剤の固定化は、基板表面に接着する分子と結合させることにより実現化することができる。次いで、基板へのMIP又はNIPの共有結合型接着は、化学的に修飾された表面とMIP又はNIPとのカップリング反応により達成される。
【００７２】
固定化は、様々な化学を用いて、様々な材料、例えばシリコン、酸化ケイ素、窒化ケイ素及び金属上で行うことができる。例えば、Bartlett PN Modification of sensor surfaces, Handbook of chemical and biological surfaces, Taylor RF and Schultz JS, Institute of Physics Publishing (1996)編集を参照。２つの簡便なルートの例は、シリコン又はチオールを用いる。このレベルでの更なるMIPの重合は、センサーの安定的かつ頑強な製造を確実にする。
【００７３】
センサーの反応速度又は感度を改善するために、ポリマーの重合の前に、重合性ポロゲン、例えばポリビニル酢酸及びポリエチレングリコールを重合化混合物に添加することができる。例えば、Sergeyeva T. A., et al. (2003), Macromolecules, 36, 7352-7357、及びSchmidt R. H. et al. (2004), Advanced Materials, 16, 719-722参照。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１】図１は、MIPの製造プロセスの略図である。
【図２】図２は、合成受容体を組み込んだセンサーの構造を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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