(57)【要約】活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞と活性物質とが提供される。開示される脂質小胞を用いて内皮細胞、組織及び器官を活性物質で装飾する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み、該テザー部分がニッケル、チオール、マレイミド、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される脂質小胞。
【請求項２】
官能化脂質が、リン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項１に記載の脂質小胞。
【請求項３】
官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項２に記載の脂質小胞。
【請求項４】
リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項２に記載の脂質小胞。
【請求項５】
活性物質のリガンド部が、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項１に記載の脂質小胞。
【請求項６】
活性物質が、ポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項１に記載の脂質小胞。
【請求項７】
活性物質が、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子である請求項１に記載の脂質小胞。
【請求項８】
治療用分子が、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項７に記載の脂質小胞。
【請求項９】
凍結乾燥されている請求項１に記載の脂質小胞。
【請求項１０】
少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項１に記載の脂質小胞。
【請求項１１】
(a) 安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b)   安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項１に記載の脂質小胞。
【請求項１２】
約1：1〜約500：1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項11に記載の脂質小胞。
【請求項１３】
安定小胞形成物質であるリン脂質又は安定小胞形成物質ではない極性脂質が、式(I)の構造：
X-L-(Z)2          (I)
（式中、XはH、Aであるか又は式(II)
【化１】
2008540341.tif 000018
の構造を有し；
Bは、カチオン又はアルキル基であり；
Aは、H又はアルキル基であり；
Lは、２つの水素原子をさらに失ったアルキル基であり；
各Zは独立して、H、E又は式(XI)
【化２】
2008540341.tif 000019
の構造であり、
ここでEは、アルキル又はアルケニルであり、かつ一方のZがHであるときに、他方のZはHではない）
を有する請求項11に記載の脂質小胞。
【請求項１４】
AがHであるか、又は式(III)、(IV)、(V)、(VI)及び(VII)：
【化３】
2008540341.tif 000020
（式中、nは0〜4の整数である）
からなる群より選択される構造を有し；
Lが、式(VIII)、(IX)又は(X)
【化４】
2008540341.tif 000021
からなる群より選択される構造を有し、
Eが、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)及び(XVII)
【化５】
2008540341.tif 000022
からなる群より選択される構造を有する、請求項13に記載の脂質小胞。
【請求項１５】
安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項11に記載の脂質小胞。
【請求項１６】
ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項14に記載の脂質小胞。
【請求項１７】
不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項11に記載の脂質小胞。
【請求項１８】
補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞。
【請求項１９】
官能化脂質が、リン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項18に記載の脂質小胞。
【請求項２０】
官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項19に記載の脂質小胞。
【請求項２１】
リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項19に記載の脂質小胞。
【請求項２２】
テザー部分がビオチンである請求項21に記載の脂質小胞。
【請求項２３】
テザー部分を含む官能化脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)からなる群より選択される請求項22に記載の脂質小胞。
【請求項２４】
テザー部分が、ビオチン、ニッケル、チオール、マレイミド、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される請求項18に記載の脂質小胞。
【請求項２５】
治療用分子のリガンド部が、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項18に記載の脂質小胞。
【請求項２６】
治療用分子が、ポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項18に記載の脂質小胞。
【請求項２７】
治療用分子が、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項18に記載の脂質小胞。
【請求項２８】
凍結乾燥されている請求項18に記載の脂質小胞。
【請求項２９】
少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項18に記載の脂質小胞。
【請求項３０】
(a) 安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b)   安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項18に記載の脂質小胞。
【請求項３１】
約1：1〜約500：1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項30に記載の脂質小胞。
【請求項３２】
安定小胞形成物質であるリン脂質又は安定小胞形成物質ではない極性脂質が、式(I)の構造：
X-L-(Z)2          (I)
（式中、XはH、Aであるか又は式(II)
【化６】
2008540341.tif 000023
の構造を有し、
Bは、カチオン又はアルキル基であり；
Aは、H又はアルキル基であり；
Lは、２つの水素原子をさらに失ったアルキル基であり；
各Zは独立して、H、E又は式(XI)
【化７】
2008540341.tif 000024
の構造であり、
ここでEは、アルキル又はアルケニルであり、かつ一方のZがHであるときに、他方のZはHではない）
を有する請求項30に記載の脂質小胞。
【請求項３３】
AがHであるか、又は式(III)、(IV)、(V)、(VI)及び(VII)：
【化８】
2008540341.tif 000025
（式中、nは0〜4の整数である）
からなる群より選択される構造を有し；
Lが、式(VIII)、(IX)又は(X)
【化９】
2008540341.tif 000026
からなる群より選択される構造を有し、
Eが、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)及び(XVII)
【化１０】
2008540341.tif 000027
からなる群より選択される構造を有する、請求項32に記載の脂質小胞。
【請求項３４】
安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項30に記載の脂質小胞。
【請求項３５】
ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項34に記載の脂質小胞。
【請求項３６】
不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項30に記載の脂質小胞。
【請求項３７】
テザー部分を含む官能化脂質を含み、該テザー部分が活性物質のリガンド部に結合し、該テザー部分がニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される、装飾された内皮細胞。
【請求項３８】
組織又は器官の内皮細胞である請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項３９】
テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合している請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項４０】
複数の異なる治療用分子で装飾されている請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項４１】
官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項４２】
官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項39に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項４３】
リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項39に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項４４】
活性物質のリガンド部が、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項４５】
活性物質が、ポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項４６】
活性物質が、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子である請求項37に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項４７】
治療用分子が、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項46に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項４８】
テザー部分を含む官能化脂質を含み、該テザー部分が、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子のリガンド部に結合している装飾された内皮細胞。
【請求項４９】
組織又は器官の内皮細胞である請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項５０】
テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合している請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項５１】
複数の異なる治療用分子で装飾されている請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項５２】
官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項５３】
官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項52に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項５４】
リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項52に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項５５】
テザー部分がビオチンである請求項54に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項５６】
テザー部分を含む官能化脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)からなる群より選択される請求項55に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項５７】
テザー部分が、ビオチン、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項５８】
治療用分子のリガンド部が、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項５９】
治療用分子がポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項６０】
治療用分子が、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項48に記載の装飾された内皮細胞。
【請求項６１】
(a)       活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞と、
(b)   リガンド部を含む活性物質と
を含む、内皮細胞を装飾するためのキット。
【請求項６２】
内皮細胞を装飾するための指示書をさらに含む請求項61に記載のキット。
【請求項６３】
脂質小胞が第1容器に収納され、治療用分子が第2容器に収納される請求項61に記載のキット。
【請求項６４】
(a) 細胞を、活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞と接触させ、ここでテザー部分はニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択され、
(b)   前記細胞を、テザー部分と結合するリガンド部を含む活性物質と接触させる
ことを含む、細胞膜を活性物質で装飾する方法。
【請求項６５】
細胞が内皮細胞である請求項64に記載の方法。
【請求項６６】
内皮細胞が、組織又は器官の内皮細胞である請求項65に記載の方法。
【請求項６７】
組織又は器官が、脂質小胞を含む第1組成物と活性物質を含む第2組成物とで潅流される請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
テザー部分が、活性物質のリガンド部に非共有結合型で結合する請求項64に記載の方法。
【請求項６９】
細胞膜が、複数の異なる活性物質で装飾される請求項64に記載の方法。
【請求項７０】
官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項64に記載の方法。
【請求項７１】
官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項70に記載の方法。
【請求項７２】
リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項70に記載の方法。
【請求項７３】
活性物質のリガンド部が、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項64に記載の方法。
【請求項７４】
活性物質が、ポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項64に記載の方法。
【請求項７５】
活性物質が、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子である請求項64に記載の方法。
【請求項７６】
治療用分子が、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項75に記載の方法。
【請求項７７】
脂質小胞が凍結乾燥されている請求項64に記載の方法。
【請求項７８】
脂質小胞が、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項64に記載の方法。
【請求項７９】
脂質小胞が、
(a)   安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b)   安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項64に記載の方法。
【請求項８０】
脂質小胞が、約1：1〜約500：1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項79に記載の方法。
【請求項８１】
安定小胞形成物質であるリン脂質又は安定小胞形成物質ではない極性脂質が、式(I)の構造：
X-L-(Z)2          (I)
（式中、XはH、Aであるか又は式(II)
【化１１】
2008540341.tif 000028
の構造を有し、
Bは、カチオン又はアルキル基であり；
Aは、H又はアルキル基であり；
Lは、２つの水素原子をさらに失ったアルキル基であり；
各Zは独立して、H、E又は式(XI)
【化１２】
2008540341.tif 000029
の構造であり、
ここでEは、アルキル又はアルケニルであり、かつ一方のZがHであるときに、他方のZはHではない）
を有する請求項79に記載の方法。
【請求項８２】
AがHであるか、又は式(III)、(IV)、(V)、(VI)及び(VII)：
【化１３】
2008540341.tif 000030
（式中、nは0〜4の整数である）
からなる群より選択される構造を有し；
Lが、式(VIII)、(IX)又は(X)
【化１４】
2008540341.tif 000031
からなる群より選択される構造を有し、
Eが、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)及び(XVII)
【化１５】
2008540341.tif 000032
からなる群より選択される構造を有する、請求項81に記載の方法。
【請求項８３】
安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項79に記載の方法。
【請求項８４】
ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項79に記載の方法。
【請求項８６】
(a) 細胞を、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子のリガンド部に対する親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞と接触させ、
(b)   前記細胞を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子と接触させる
ことを含む、細胞膜を治療用分子で装飾する方法。
【請求項８７】
細胞が内皮細胞である請求項86に記載の方法。
【請求項８８】
内皮細胞が、組織又は器官の内皮細胞である請求項87に記載の方法。
【請求項８９】
組織又は器官が、脂質小胞を含む第1組成物と治療用分子を含む第2組成物とで潅流される請求項88に記載の方法。
【請求項９０】
テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する請求項86に記載の方法。
【請求項９１】
細胞膜が、複数の異なる治療用分子で装飾される請求項86に記載の方法。
【請求項９２】
官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項86に記載の方法。
【請求項９３】
官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項92に記載の方法。
【請求項９５】
テザー部分がビオチンである請求項94に記載の方法。
【請求項９６】
テザー部分を含む官能化脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)からなる群より選択される請求項95に記載の方法。
【請求項９７】
テザー部分が、ビオチン、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される請求項86に記載の方法。
【請求項９８】
治療用分子のリガンド部が、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項86に記載の方法。
【請求項９９】
治療用分子がポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項86に記載の方法。
【請求項１００】
治療用分子が、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか又は合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項86に記載の方法。
【請求項１０１】
脂質小胞が凍結乾燥されている請求項86に記載の方法。
【請求項１０２】
脂質小胞が、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項86に記載の方法。
【請求項１０３】
脂質小胞が、
(a)   安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b)   安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項86に記載の方法。
【請求項１０４】
脂質小胞が、約1：1〜約500：1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項103に記載の方法。
【請求項１０５】
安定小胞形成物質であるリン脂質又は安定小胞形成物質ではない極性脂質が、式(I)の構造：
X-L-(Z)2          (I)
（式中、XはH、Aであるか又は式(II)
【化１６】
2008540341.tif 000033
の構造を有し、
Bは、カチオン又はアルキル基であり；
Aは、H又はアルキル基であり；
Lは、２つの水素原子をさらに失ったアルキル基であり；
各Zは独立して、H、E又は式(XI)
【化１７】
2008540341.tif 000034
の構造であり、
ここでEは、アルキル又はアルケニルであり、かつ一方のZがHであるときに、他方のZはHではない）
を有する請求項103に記載の方法。
【請求項１０６】
AがHであるか、又は式(III)、(IV)、(V)、(VI)及び(VII)：
【化１８】
2008540341.tif 000035
（式中、nは0〜4の整数である）
からなる群より選択される構造を有し；
Lが、式(VIII)、(IX)又は(X)
【化１９】
2008540341.tif 000036
からなる群より選択される構造を有し、
Eが、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)及び(XVII)
【化２０】
2008540341.tif 000037
からなる群より選択される構造を有する、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】
安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項103に記載の方法。
【請求項１０８】
ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項107に記載の方法。
【請求項１０９】
不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項103に記載の方法。
【請求項１１０】
(a) 組織又は器官を、脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、ここで該脂質小胞は治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み、該テザー部分はニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択され、
(b)   前記組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させる
ことを含む、対象における移植された組織又は器官の拒絶を阻害する方法。
【請求項１１１】
組織又は器官を、対象に移植する前に第1及び第2組成物と接触させる請求項110に記載の方法。
【請求項１１２】
テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する請求項110に記載の方法。
【請求項１１３】
官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項110に記載の方法。
【請求項１１４】
官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項113に記載の方法。
【請求項１１５】
リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項113に記載の方法。
【請求項１１６】
治療用分子のリガンド部が、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項110に記載の方法。
【請求項１１７】
治療用分子がポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項110に記載の方法。
【請求項１１８】
治療用分子が、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される請求項110に記載の方法。
【請求項１１９】
治療用分子が、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項118に記載の方法。
【請求項１２０】
脂質小胞が凍結乾燥されている請求項110に記載の方法。
【請求項１２１】
脂質小胞が、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項110に記載の方法。
【請求項１２２】
脂質小胞が、
(a)   安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b)   安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項110に記載の方法。
【請求項１２３】
脂質小胞が、約1：1〜約500：1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項122に記載の方法。
【請求項１２４】
安定小胞形成物質であるリン脂質又は安定小胞形成物質ではない極性脂質が、式(I)の構造：
X-L-(Z)2          (I)
（式中、XはH、Aであるか又は式(II)
【化２１】
2008540341.tif 000038
の構造を有し、
Bは、カチオン又はアルキル基であり；
Aは、H又はアルキル基であり；
Lは、２つの水素原子をさらに失ったアルキル基であり；
各Zは独立して、H、E又は式(XI)
【化２２】
2008540341.tif 000039
の構造であり、
ここでEは、アルキル又はアルケニルであり、かつ一方のZがHであるときに、他方のZはHではない）
を有する請求項122に記載の方法。
【請求項１２５】
AがHであるか、又は式(III)、(IV)、(V)、(VI)及び(VII)：
【化２３】
2008540341.tif 000040
（式中、nは0〜4の整数である）
からなる群より選択される構造を有し；
Lが、式(VIII)、(IX)又は(X)
【化２４】
2008540341.tif 000041
からなる群より選択される構造を有し、
Eが、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)及び(XVII)
【化２５】
2008540341.tif 000042
からなる群より選択される構造を有する、請求項124に記載の方法。
【請求項１２６】
安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項122に記載の方法。
【請求項１２７】
ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項126に記載の方法。
【請求項１２８】
不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項122に記載の方法。
【請求項１２９】
(a) 組織又は器官を、脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、ここで該脂質小胞は、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み、
(b)   前記組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させる
ことを含む、移植された組織又は器官の拒絶を阻害する方法。
【請求項１３０】
組織又は器官を、対象に移植する前に第1及び第2組成物と接触させる請求項129に記載の方法。
【請求項１３１】
テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する請求項129に記載の方法。
【請求項１３２】
官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項129に記載の方法。
【請求項１３３】
官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項132に記載の方法。
【請求項１３４】
リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項132に記載の方法。
【請求項１３５】
テザー部分がビオチンである請求項134に記載の方法。
【請求項１３６】
テザー部分を含む官能化脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)からなる群より選択される請求項135に記載の方法。
【請求項１３７】
テザー部分が、ビオチン、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される請求項129に記載の方法。
【請求項１３８】
治療用分子のリガンド部が、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項129に記載の方法。
【請求項１３９】
治療用分子がポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項129に記載の方法。
【請求項１４０】
治療用分子が、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか又は合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される請求項129に記載の方法。
【請求項１４１】
脂質小胞が凍結乾燥されている請求項129に記載の方法。
【請求項１４２】
脂質小胞が、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項129に記載の方法。
【請求項１４３】
脂質小胞が、
(a)   安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(b)   安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項129に記載の方法。
【請求項１４４】
脂質小胞が、約1：1〜約500：1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項143に記載の方法。
【請求項１４５】
安定小胞形成物質であるリン脂質又は安定小胞形成物質ではない極性脂質が、式(I)の構造：
X-L-(Z)2          (I)
（式中、XはH、Aであるか又は式(II)
【化２６】
2008540341.tif 000043
の構造を有し、
Bは、カチオン又はアルキル基であり；
Aは、H又はアルキル基であり；
Lは、２つの水素原子をさらに失ったアルキル基であり；
各Zは独立して、H、E又は式(XI)
【化２７】
2008540341.tif 000044
の構造であり、
ここでEは、アルキル又はアルケニルであり、かつ一方のZがHであるときに、他方のZはHではない）
を有する請求項143に記載の方法。
【請求項１４６】
AがHであるか、又は式(III)、(IV)、(V)、(VI)及び(VII)：
【化２８】
2008540341.tif 000045
（式中、nは0〜4の整数である）
からなる群より選択される構造を有し；
Lが、式(VIII)、(IX)又は(X)
【化２９】
2008540341.tif 000046
からなる群より選択される構造を有し、
Eが、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)及び(XVII)
【化３０】
2008540341.tif 000047
からなる群より選択される構造を有する、請求項145に記載の方法。
【請求項１４７】
安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項143に記載の方法。
【請求項１４８】
ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項147に記載の方法。
【請求項１４９】
不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項143に記載の方法。
【請求項１５０】
(a) 組織又は器官を、脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、ここで該脂質小胞は、補体阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み、
(b)   前記組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させる
ことを含む、組織又は器官への虚血再潅流障害を阻害する方法。
【請求項１５１】
テザー部分が、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する請求項150に記載の方法。
【請求項１５２】
官能化脂質がリン脂質又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む請求項150に記載の方法。
【請求項１５３】
官能化脂質が1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含み、テザー部分がニッケルである請求項152に記載の方法。
【請求項１５４】
リン脂質がホスホエタノールアミンである請求項152に記載の方法。
【請求項１５５】
テザー部分がビオチンである請求項154に記載の方法。
【請求項１５６】
テザー部分を含む官能化脂質が、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)からなる群より選択される請求項155に記載の方法。
【請求項１５７】
テザー部分が、ビオチン、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される請求項150に記載の方法。
【請求項１５８】
治療用分子のリガンド部が、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される請求項150に記載の方法。
【請求項１５９】
治療用分子がポリペプチド、アプタマー又は小分子である請求項150に記載の方法。
【請求項１６０】
治療用分子が、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、コンプスタチン、FUT-175、化合物4077、C1s-INH-248、化合物53、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)及びマトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)からなる群より選択される請求項150に記載の方法。
【請求項１６１】
脂質小胞が凍結乾燥されている請求項150に記載の方法。
【請求項１６２】
脂質小胞が、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である請求項150に記載の方法。
【請求項１６３】
脂質小胞が、
(e)   安定小胞形成物質であるリン脂質と、
(f)   安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質からなる群より選択される少なくとも１つの不安定小胞形成メンバーと
を含む、請求項150に記載の方法。
【請求項１６４】
脂質小胞が、約1：1〜約500：1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する請求項163に記載の方法。
【請求項１６５】
安定小胞形成物質であるリン脂質又は安定小胞形成物質ではない極性脂質が、式(I)の構造：
X-L-(Z)2          (I)
（式中、XはH、Aであるか又は式(II)
【化３１】
2008540341.tif 000048
の構造を有し、
Bは、カチオン又はアルキル基であり；
Aは、H又はアルキル基であり；
Lは、２つの水素原子をさらに失ったアルキル基であり；
各Zは独立して、H、E又は式(XI)
【化３２】
2008540341.tif 000049
の構造であり、
ここでEは、アルキル又はアルケニルであり、かつ一方のZがHであるときに、他方のZはHではない）
を有する請求項163に記載の方法。
【請求項１６６】
AがHであるか、又は式(III)、(IV)、(V)、(VI)及び(VII)：
【化３３】
2008540341.tif 000050
（式中、nは0〜4の整数である）
からなる群より選択される構造を有し；
Lが、式(VIII)、(IX)又は(X)
【化３４】
2008540341.tif 000051
からなる群より選択される構造を有し、
Eが、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)及び(XVII)
【化３５】
2008540341.tif 000052
からなる群より選択される構造を有する、請求項165に記載の方法。
【請求項１６７】
安定小胞形成物質であるリン脂質が、ホスファチジルコリンである請求項163に記載の方法。
【請求項１６８】
ホスファチジルコリンが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はその混合物である請求項167に記載の方法。
【請求項１６９】
不安定小胞形成メンバーが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である、請求項163に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、2005年4月29日にファイルされた米国仮特許出願第60/676,049号の利益を主張するものであり、その開示の全体は本明細書に参照により組み込まれる。
政府の権益
ここに開示される主題は、国立衛生研究所により承認番号第1 R41 HL079855-01の下で認められた米国政府の援助により行われた。よって、米国政府は本主題において所定の権利を有する。
【０００２】
技術分野
ここに開示される主題は、全般的に、活性物質で細胞を装飾する方法に関し、より具体的には、親和性により活性物質に結合する官能化脂質(functionalized lipid)を配合した融合性脂質小胞(fusogenic lipid vesicles)を用いて細胞を装飾する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
略号
ACI         =     オーガストとコペンハーゲン−アイリッシュ(ラット交雑株)
APC         =     抗原提示細胞
CABG        =     大動脈冠動脈バイパス移植
CPB         =     心肺バイパス
CR1         =     補体受容体1
CTLA4       =     細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4
DAF         =     崩壊促進因子
DGF         =     臓器移植後臓器機能障害(delayed graph function)
DOPC        =     1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン
DOPC-e      =     1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン
DOPE        =     1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン
DOPS        =     1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン]
DODAP       =     1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン
DOTAP       =     1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン
【０００４】
ECA         =     外頚動脈
EDTA        =     エチレンジアミン四酢酸
EJV         =     外頚静脈
FBS         =     ウシ胎児血清
FUV         =     融合性一枚膜小胞(fusogenic unilamellar vesicle)
GVHD        =     移植片対宿主疾患
HBSS        =     ハンクス液
HUVEC       =     ヒト臍帯静脈内皮細胞
ICAM        =     細胞間接着分子
IRI         =     虚血再潅流障害
LCR         =     リガーゼ連鎖反応
LPS         =     リポ多糖
MAC         =     膜侵襲複合体
MLR         =     混合リンパ球反応
【０００５】
NPY         =     神経ペプチドY
PBS         =     リン酸緩衝生理食塩水
PCR         =     ポリメラーゼ連鎖反応
PDPC        =     1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-                      ホスホコリン
PEG         =     ポリエチレングリコール
POPA        =     1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート
SA          =     ストレプトアビジン
SPICE       =     補体酵素の天然痘阻害剤(smallpox inhibitor of complement enzyme)
SUV         =     小さい一枚膜小胞
SA-VCP      =     ストレプトアビジン - VCP融合タンパク質
SVG         =     伏在静脈移植片
TNF         =     腫瘍壊死因子
tPA         =     組織プラスミノゲン活性化因子
UW          =     ウィスコンシン大学液
VCP         =     ワクシニアウイルス補体調節タンパク質
WF          =     ウィスター−フュルト(Wistar-Furth) (ラット)
【０００６】
背景
持続性の虚血及び再潅流障害(IRI)を受けた組織は、その他の毒の中でも酸素及び窒素のラジカルを産生し、炎症、動脈及び静脈における血栓形成活性の増加、並びに同種移植片の急性拒絶の割合の増加に導く内皮の損傷をもたらす。
【０００７】
虚血は、血管への外傷性損傷又は組織及び器官の移植を含む種々の臨床手順において意図的に誘導される血管閉塞に起因し得る。IRIは、二相性のプロセスであると考えられている。虚血は、エネルギーの喪失及び代謝産物の蓄積により損傷を発生させ、再潅流は、酸素フリーラジカル(Halliwell, B.ら, 1992, FEBS Lett., 307:108〜112; Kalayoglu, M.ら, 1988b, Lancet, 331:617〜619; Lominadze, D.ら, 1997, J.Nutr., 127:1320〜1327; Weisman, H. F.ら, 1990b, Science, 249:146〜151; Wink, D. A.ら, 1994, Environ. Health Perspect., 102 Suppl 3:11〜15)、補体の活性化(Hill, J. H.ら, 1971d, 133:885〜900)及び白血球(Krishnaswamy, G.ら, 2001, Front Biosci., 6:D1109〜D1127; Kvietys, P. R.ら, 2001, News Physiol Sci., 16:15〜19)を伴う炎症性反応を引き起こすことにより損傷を悪化させる。虚血性組織において血流が再び確立された後に、酸素が再び適用され、修復機構が作動できる状態になる。再潅流の間に、蓄積された毒性の代謝産物は全身の循環に放出され、遠く離れた器官及び／又は虚血性器官における再生プロセスに悪影響を与え得る。
【０００８】
蓄積された証拠は、再潅流障害の中心的なメディエイタとしての補体を示唆している(Amsterdam, E. A.ら, 1995, 268:H448〜H457; Hill, J. H.ら, 1971b, 133:885〜900; Smith, G. W.ら, 1983, J.Clin.Lab Immunol., 12:197〜199; Weiser, M. R.ら, 1996, 183:2343〜2348)。虚血性の心臓における補体の活性化は、Hillらにより1971年に最初に報告された(Hill, J. H.ら, 1971c, 133:885〜900)。それ以降、補体を活性化する少なくとも3つの別々の補体経路(第1経路、レクチン経路及び第2経路)が同定されている(Stahl, G. L.ら, 2003, 162:449〜455)。第1経路は、抗原−抗体相互作用により活性化され、次いで、補体成分C1qの活性化、続いて補体成分C2-及びC4-依存性の補体成分C3の切断、最後に、第1のC5コンバターゼ(C4b2a3b)の形成による補体成分C5の切断を導く。
第2経路は、リポ多糖(LPS)と、自発的に発生するある程度のC3bとの存在により活性化される。この経路において、C3bは因子Bに結合して複合体を形成し、これは因子Dにより切断されて第2のC3コンバターゼであるC3b(H2O)Bbを形成する。プロパージンは、増幅活性化因子として作用し、この複合体を安定化して、切断産物C3bがこれに結合することを可能にして、第2のC5コンバターゼ(C3b3bBb)を形成する。
よって、全ての経路は、C3を用い、C5を切断し、このことは強力な炎症誘発性切断産物であるC5a及びC5b-9 (膜侵襲複合体、MAC)をもたらす。補体活性化のこれらの2つの産物は、C5-欠損動物において確認されたように、IRIにおいて第一次の役割を演じると考えられており(Mollnes, T. E.ら, 2002, Trends Immunol., 23:61〜64)、これらはIRIのモデルにおいて遠隔及び局所の損傷を減少させた。
【０００９】
例えば伏在静脈移植片(SVG)を含む自家組織移植において、IRI後の内皮損傷は血栓形成を導くことができ、これは移植片閉塞を導き得る(Motwani, J. G.ら, 1998, Circulation, 97:916〜931)。SVGの急性血栓症は、大動脈冠動脈バイパス移植(CABG)後30日以内に患者の12%までで発生する(Bourassa, M. G., 1991, J.Am.Coll.Cardiol., 17:1081〜1083; Fitzgibbon, G. M.ら, 1996, J.Am.Coll.Cardiol., 28:616〜626)。回収の間のSVGの物理的取り扱い及び／又はIRIに関連する因子による内皮の破壊は、凝固カスケードの活性化に向けて大きく寄与する(Motwani, J. G.ら, 1998, 97:916〜931)。ここで再び、虚血は、エネルギーの喪失及び代謝廃棄産物の蓄積により損傷を作り出し、再潅流は、酸素フリーラジカル(Halliwell, B.ら, 1992, FEBS Lett., 307:108〜112; Kalayoglu, M.ら, 1988a, Lancet, 331:617〜619; Lominadze, D.ら, 1997, J.Nutr., 127:1320〜1327; Weisman, H. F.ら, 1990a, Science, 249:146〜151; Wink, D. A.ら, 1994, Environ.Health Perspect., 102 Suppl 3:11〜15)、補体の活性化(Hill, J. H.ら, 1971a, 133:885〜900)及び白血球接着(Krishnaswamy, G.ら, 2001, Front Biosci., 6:D1109〜D1127; Kvietys, P. R.ら, 2001, News Physiol Sci., 16:15〜1919)を伴う炎症性反応を引き起こすことにより損傷を悪化させる。さらに、CABGはそれ自体で、止血に影響する局所的因子を妨害するようであり、心肺バイパス(CPB)の間に血漿フィブリノゲンが上昇し、このことは血栓形成促進性応答に好ましい(Moor, E.ら, 1994, Thromb.Haemost., 72:335〜342)。CPBは、内皮の妨害にさらに寄与する炎症性メディエイタのカスケードのきっかけとなる(Gu, Y. J.ら, 1998, Ann.Thorac.Surg., 65:420〜424)。
【００１０】
SVG血栓症を防ぐ手術中の方策は、回収中の組織の取り扱いの「ノータッチ技術」(Tsui, J. C.ら, 2001, Br.J.Surg., 88:1209〜1215)、及び輸液の圧力が100 mmHgを決して超えないことを確実にすることによるSVG膨張の回避(Adcock, O. T., Jr.ら, 1984, Surgery, 96:886〜894)を含む。保存溶液を用いる回収後のSVGの保存を用いることもできるが、効果は議論の余地がある。しかし、器官の保存溶液は実験的に試され、ある程度成功している(Anastasiou, N.ら, 1997, J.Vasc.Surg., 25:713〜721)。ウィスコンシン大学液(UW)は、平滑細胞の機能(Cavallari, N.ら, 1997, Surgery, 121:64〜71)，及びSVGの内皮細胞生存性(Barner, H. B.ら, 1990, J.Thorac.Cardiovasc.Surg., 100:148〜149)を保護すると報告されている。UWは、虚血に対して組織を最初は保護するが、再潅流障害に対する効果はほとんど又は全くないことが観察されている(Gao, W.ら, 1992, Transpl.Int., 5 Suppl 1:S329〜S335)。SVGを保存するための低体温法(4℃)の使用は、特に生理的溶液を用いると内皮に有害であることが示されている。20℃にて保存された移植片は、著しくより少ない損傷を受けるようである(Solberg, S.ら, 1987, J.Cardiovasc.Surg., 28:571〜575)。SVGは、2時間以内に移植されるのであれば、室温で保存されるべきであるという、ある程度の共通認識がある。なぜなら、内皮は低温では壊れやすく(Solberg, S.ら, 1987, 28:571〜575)、内皮依存性の弛緩が弱められるからである(Ingemansson, R.ら, 1996, Ann.Thorac.Surg., 61:1413〜14171417)。
【００１１】
実質器官の同種移植片において、IRIは、臓器移植後臓器機能障害(DGF)の発生の危険因子として長らく関係してきた。DGFは、腎臓移植の約20%に影響し(Pirsch, J. D., 2002, Medscape Transplantation, 3:)、移植後関与の量を増加させ、入院を延長させる。さらに、持続性虚血は、ラットモデルの長期生存研究において、慢性同種移植片拒絶に寄与することが報告されている(Yilmaz, S.ら, 1992b, 53:823〜827)。肺移植において、保存技術は、早期の移植片機能不全を低減している。しかし、肺移植の10%より多くで、重篤なIRIがまだ発生する(Yilmaz, S.ら, 1992a, 53:823〜827)。IRIは、慢性同種移植片拒絶の発生に影響する同種抗原非依存性の因子として示唆されている(Tullius, S. G.ら, 1995, 59:313〜318)。また、虚血の持続期間及び急性移植不全は、心臓移植患者において、早期の死亡(Bonet, L. A., 2003, 35:1946〜1950)及び慢性拒絶(Baldwin, W. M., IIIら, 1999, 68:894〜900)に関係するいくつかの変数のうちの2つである。1987年にウィスコンシン大学液(UW)が導入されて以来、虚血性障害に対する類似又はよりよい保護を提供する臨床用の他の溶液は提供されておらず、UWは腹腔内器官の保存のためのゴールドスタンダードになり(Belzer, F. O.ら, 1992, Ann.Surg., 215:579〜583)、また、心臓を保護することも示されているが(Swanson, D. K.ら, 1988, 7:456〜467)、これは、虚血に対してしか組織を保護せず、上記のように、再潅流障害に対してはほとんど又は全く効果がない(Gao, W.ら, 1992, Transpl.Int., 5 Suppl 1:S329〜S335)。
【００１２】
移植された同種移植片の器管及び組織も、免疫系の拒絶に対して脆弱である。器官／組織の同種移植片において、移植拒絶には3つの異なった、しかし重複する相がある：超急性、急性及び慢性である。直接的同種応答は時間とともに衰退すると考えられるが、器官中のパッセンジャー白血球への提供者の抗原の継続的な供給により活気付けられる間接的同種応答は、限界がないようである。
【００１３】
超急性拒絶は、ほぼ即時であり(例えば最初の48時間の間)、移植片の内皮及び／又は血液型抗原(A、B、Rh)上のMHC-I分子に対して受容者で予め形成された抗原により媒介される。この種の拒絶は、異種移植に特に該当する。急性及び慢性の拒絶は、典型的に、移植後3日程度で開始し、何年も継続し得る。おそらく、器官が移植された後に、提供者の抗原提示細胞(APC)が器官を出て受容者のリンパ節に移動し、これが、最終的に、受容者のヘルパー及び細胞傷害性のT細胞中で提供者抗原に対する直接免疫応答を誘発する。急性拒絶を支配するこの応答は、多くの交差反応性ヘルパーT細胞を動員すると考えられ、該T細胞は自己-MHCの関係において種々の環境的抗原に対して初回感作される(Lombardiら, 1990, Int. Immunol. 2: 9〜13; Merkenschlagerら, 1991, Eur. J Immunol., 21:79〜88)。
【００１４】
間接的な同種応答は受容者のAPCにより媒介され、該APCは、排出リンパ節(draining lymph nodes)における死んでゆく提供者APCから提供者抗原を取り出すが、器官(いわゆるパッセンジャー白血球)からも取り出し、これらを最初に受容者のヘルパーT細胞に提示する。この間接的同種応答は、慢性拒絶を担っていると考えられている(Benichouら, 1999, J Immunol., 162:352〜358)が、最近の発見は、この応答が急性拒絶にも寄与し得ることを示唆するようである(Benhamら, 1995, Transplantation, 59:1028〜1032;及びBraunら, 2001, J Immunol., 166:4879〜4883)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
このようにして、偶然の又は誘発された虚血の間又はその後、並びに自家移植、同種移植片移植及び異種移植片移植の間及びその後の期間において、IRI及び免疫系拒絶から組織及び器官を保護できる物質に対する継続的な、まだ検討されていない必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
要約
この要約は、今回開示される主題のいくつかの実施形態を列挙し、多くの場合、これらの実施形態の変形及び置換を列挙する。この要約は、多数の種々の実施形態の単なる例示である。与えられる実施形態の1つ又は複数の代表的な特徴について述べることも、同様に例示である。このような実施形態は、典型的に、言及される特徴を有するか又は有さずに存在できる。同様に、これらの特徴は、この要約に列挙されるか否かに関わらず、今回開示される主題のその他の実施形態に適用できる。過剰な繰り返しを避けるために、この要約は、このような特徴の全ての可能な組み合わせについて列挙又は示唆しない。
【００１７】
本明細書で開示される主題のある実施形態において、活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分(tether moiety)を含む官能化脂質(functionalized lipid)を含む脂質小胞が提供される。
ある実施形態において、該官能化脂質は、リン脂質、例えばホスホエタノールアミン、又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む。
ある実施形態において、テザー部分は、ビオチン、ニッケル、チオール、マレイミド、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される。
ある実施形態において、活性物質のリガンド部は、アビジン、ストレプトアビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される。
ある実施形態において、活性物質は、ポリペプチド、アプタマー、又は小分子である。
【００１８】
さらに、ある実施形態において、活性物質は、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤(leukocyte infiltration inhibitor)、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質からなる群より選択される治療用分子である。
さらに、ある実施形態において、治療用分子は、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される。
【００１９】
ある実施形態において、脂質小胞は凍結乾燥されている。
ある実施形態において、脂質小胞は、少なくとも約20小胞融合(vesicle fusions)/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する融合性脂質小胞である。
【００２０】
さらに、ある実施形態において、脂質小胞は、安定小胞形成物質(stable vesicle former)であるリン脂質と、少なくとも1つの不安定小胞形成メンバーとを含み、ここで、該不安定小胞形成メンバーは、安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質(raft former)、及び融合タンパク質からなる群より選択される。
ある実施形態において、脂質小胞は、約1：1〜約500：1の安定小胞形成物質の官能化脂質に対する比を有する。
【００２１】
ある実施形態において、安定小胞形成物質であるリン脂質、又は安定小胞形成物質ではない極性脂質は、式(I)：
X-L-(Z)2          (I)
（式中、XはH、Aであるか、又は式(II)
【化１】
2008540341.tif 000002
【００２２】
の構造を有し；
Bは、カチオン又はアルキル基であり；
AはH又はアルキル基であり；
Lは、２つの水素原子をさらに失ったアルキル基であり；
各Zは独立して、H、E、又は式(XI)
【化２】
2008540341.tif 000003
【００２３】
の構造であり、
ここで、Eは、アルキル又はアルケニルであり、一方のZがHであるときに他方のZはHではない）
を有する。
AがHであるか、又は式(III)、(IV)、(V)、(VI)及び(VII)：
【化３】
2008540341.tif 000004
【００２４】
（式中、nは、0〜4の整数である）
からなる群より選択される構造を有し；
Lが、式(VIII)、(IX)又は(X)：
【化４】
2008540341.tif 000005
【００２５】
からなる群より選択される構造を有し、
Eが、(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)及び(XVII)：
【化５】
2008540341.tif 000006
からなる群より選択される構造を有する請求項13の脂質小胞。
【００２６】
ある実施形態において、安定小胞形成物質であるリン脂質はホスファチジルコリンであり、ある実施形態において、ホスファチジルコリンは、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン又はこれらの混合物である。
ある実施形態において、不安定小胞形成メンバーは、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)、及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)からなる群より選択される不安定小胞形成極性脂質である。
【００２７】
本明細書で開示される主題のある実施形態において、内皮細胞を装飾するためのキットが提供される。
ある実施形態において、該キットは、活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞と、リガンド部を含む活性物質とを含む。
ある実施形態において、該キットは、内皮細胞を装飾するための指示書を含む。
ある実施形態において、該脂質小胞は第１容器に収容され、治療用分子は第２容器に収容される。
【００２８】
本明細書で開示される主題のある実施形態において、活性物質を用いて細胞膜を装飾する方法が提供される。
ある実施形態において、該方法は、活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂肪小胞を細胞と接触させ、ここで該テザー部分は、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択され；及び該細胞を、テザー部分に結合するリガンド部を含む活性物質と接触させることを含む。
ある実施形態において、該細胞は内皮細胞である。
ある実施形態において、該内皮細胞は、組織又は器官の内皮細胞である。
ある実施形態において、該組織又は器官は、脂質小胞を含む第１組成物及び活性物質を含む第２組成物で潅流される(perfused)。
ある実施形態において、テザー部分は、活性物質のリガンド部に非共有結合型で結合する。
ある実施形態において、細胞膜は、複数の異なる活性物質で装飾される。
【００２９】
本明細書で開示される主題のある実施形態において、対象における移植された組織又は器官の拒絶を阻害する方法が提供される。
ある実施形態において、該方法は、組織又は器官を、脂質小胞を含む第１組成物と接触させ、ここで該脂質小胞は、治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み、該テザー部分は、ニッケル、マレイミド、チオール、アミン及びカルボン酸からなる群より選択され；及び該組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第２組成物と接触させることを含む。
ある実施形態において、該組織又は器官は、対象への移植の前に第１及び第２組成物と接触させる。
ある実施形態において、テザー部分は、治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する。
【００３０】
本明細書で開示される主題のある実施形態において、組織又は器官への虚血再潅流障害を阻害する方法が提供される。
ある実施形態において、該方法は、組織又は器官を、脂質小胞を含む第１組成物と接触させ、ここで該脂質小胞は、補体阻害剤、抗凝固物質及び血栓溶解物質から選択される治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含み；及び該組織又は器官を、テザー部分と結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第２組成物と接触させることを含む。
ある実施形態において、テザー部分は治療用分子のリガンド部に非共有結合型で結合する。
【００３１】
よって、本明細書で開示される主題の目的は、治療用分子で細胞表面を装飾する方法、及びそれに関連する組成物を提供することである。この目的は、本明細書に開示される主題により全体的又は部分的に達成される。
【００３２】
上記の本明細書に開示される主題の目的、その他の目的及び利点は、本明細書に開示される主題及び非限定的な実施例についての以下の記載を検討した後に、当業者には明確になる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
詳細な説明
本明細書に開示される主題の１つ又は複数の実施形態の詳細は、以下に続く説明に記載される。本明細書に開示される主題のその他の特徴、目的及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになる。本明細書に記載される全ての出版物、特許出願、特許及びその他の参考文献は、その全体が本明細書に参照により組み込まれる。争いの場合は、定義を含む本明細書が支配する。
【００３４】
細胞、組織及び器官は、虚血及び再潅流及び／又は自家移植、同種移植片移植若しくは異種移植片移植の後の免疫系拒絶の期間の間及びその後のIRIにより損傷され得る。本明細書で開示される主題は、IRI及び／又は移植による細胞、組織及び器官の損傷を阻害又は治療するための材料及び方法を提供する。本明細書で開示される主題は、外因性の治療用分子を、内因性の細胞膜に、テザー部分とテザー部分が結合親和性を有するリガンドとの間の強く及び／又は非共有結合型であり得る相互作用を利用することにより導入するための組成物及び方法を提供する。本明細書で開示される主題の方法及び材料は、外因性分子を脂質膜に直接組み込もうとするときに発生し得る問題を回避する。
【００３５】
ある実施形態において、本明細書で開示される主題は、特定のリガンドに対する結合親和性を有するテザー部分で修飾された脂質(すなわち「官能化脂質」)を含む脂質小胞を提供する。本明細書で開示される主題は、さらに、テザー部分がそれに対する結合親和性を有するリガンド部を有する治療用分子を提供する。細胞と接触したときに、該脂質小胞は、細胞の膜と融合し、それによりテザー部分を含む官能化脂質を細胞膜中に(細胞膜の内表面及び／又は外表面上に)組み込む。処理された細胞は、次いで、治療用分子と接触でき、これは、治療用分子のリガンド部により細胞膜外表面のテザー部分に特異的に結合し、細胞の外側の表面が治療用分子で装飾されることとなる。細胞は、組織又は器官の内皮細胞であり得、治療用分子は、虚血及び再潅流及び／又は移植による細胞及び周囲の組織への損傷に対する保護又は該損傷の治療を細胞(及び周囲の組織)に提供するように選択できる。
【００３６】
それ自体で、本明細書で開示される主題は、官能化脂質を含む脂質小胞、官能化脂質のテザー部分に対する結合特異性を有するリガンドを含む治療用分子、治療用分子で細胞を装飾する方法及びそれにより装飾された細胞、並びに移植された細胞、組織若しくは器官の拒絶を阻害する方法及び／又はIRIを阻害する方法を提供する。
【００３７】
I.    定義
以下の用語は、当業者によってよく理解されると考えられるが、以下の定義は、本明細書で開示される主題の説明を促進するために記載される。
そうでないと定義しない限り、本明細書において用いられる全ての技術的及び科学的用語は、本明細書で開示される主題が属する技術における当業者が通常理解するものと同じ意味を有する。本明細書に開示されるものに類似又は均等ないずれの方法、装置及び材料は、本明細書で開示される主題の実施又は試験において用いることができ、代表的な方法、装置及び材料をここに記載する。
【００３８】
長年の特許法の慣例に従って、用語「a」「an」「the」は、特許請求の範囲を含む本出願において用いる場合、「１つ又は複数」のことである。よって、「細胞(a cell)」(例えば「内皮細胞」)は、このような細胞の複数(例えば複数の内皮細胞)を含み、以下同じである。
【００３９】
そうでないと記載しない限り、明細書及び特許請求の範囲で用いられる成分の量、反応条件などを表す全ての数字は、用語「約」により全ての場合において修飾されると理解される。よって、反対であると記載しない限り、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数字のパラメータは、本明細書で開示される主題により得ようとする所望の特性に依存して変動し得る近似値である。
【００４０】
本明細書で用いる場合、値、又は質量、重量、時間、容量、濃度又はパーセンテージの量に言及する場合の用語「約」は、記載された量から、ある実施形態において±20%、ある実施形態において±10%、ある実施形態において±5%、ある実施形態において±1%、ある実施形態において±0.5%、及びある実施形態において±0.1%の変動を含むことを意味するが、これは、このような変動は開示される方法を実施するために適切であるからである。
【００４１】
本明細書において用いる場合、「アルキル」(又はアルキル-若しくはalk-)は、好ましくは1〜20個の炭素原子を含む置換又は非置換で、直鎖状、分岐鎖状若しくは環状の炭化水素鎖のことである。非置換のアルキル基の適切な例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、シクロプロピル、ブチル、イソ-ブチル、tert-ブチル、sec-ブチル、シクロブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシルなどを含む。アルキル鎖に沿って1つ又は複数の酸素、硫黄又は置換若しくは非置換の窒素原子が任意に挿入されることができる。「アルキルアリール」及び「アルキル複素環式」基は、それぞれ、アリール又は複素環式基に共有結合型で結合したアルキル基である。
【００４２】
「アルケニル」は、少なくとも1つの二重結合と好ましくは2〜22個の炭素原子を含む、置換又は非置換で直鎖、分岐鎖又は環状の不飽和炭化水素鎖のことである。非置換のアルケニル基の例は、エテニル(又はビニル)、1-プロペニル、2-プロペニル(又はアリル)、1,3-ブタジエニル、ヘキセニル、ペンテニル、1,3,5-ヘキサトリエニルなどを含む。好ましいシクロアルケニル基は、5〜8個の炭素原子と少なくとも1つの二重結合を含む。シクロアルケニル基の例は、シクロヘキサジエニル、シクロヘキセニル、シクロペンテニル、シクロヘプテニル、シクロオクテニル、シクロヘキサジエニル、シクロヘプタジエニル、シクロオクタトリエニルなどを含む。
【００４３】
「アルコキシ」は、置換又は非置換の-O-アルキル基のことである。アルコキシ基の例は、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、t-ブトキシなどを含む。
「アリール」は、好ましくは3〜10個の炭素原子の、いずれの一価の芳香族炭素環式又は複素芳香族の基のことである。アリール基は、二環式(すなわちフェニル(又はPh))又は多環式(すなわちナフチル)であり得、非置換又は置換であり得る。好ましいアリール基は、フェニル、ナフチル、フリル、チエニル、ピリジル、インドリル、キノリル又はイソキノリルを含む。
【００４４】
「アミノ」は、非置換又は置換の-NRR'基のことである。アミンは、置換基(R又はR')の数に応じて1級(-NH2)、2級(-NHR)又は3級(-NRR')であり得る。置換アミノ基の例は、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ、ジエチルアミノ、2-プロピルアミノ、1-プロピルアミノ、ジ(n-プロピル)アミノ、ジ(イソ-プロピル)アミノ、メチル-n-プロピルアミノ、t-ブチルアミノ、アニリノなどを含む。
【００４５】
「複素環式基」は、好ましくは5〜10個、より好ましくは5若しくは6個の原子を含む、安定で、飽和、部分的に不飽和又は芳香族の環のことである。環は、置換基で、1又は複数回(好ましくは1、2、3、4又は5回)置換され得る。環は、単環式、二環式又は多環式であり得る。複素環式基は、炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄からなる群より独立して選択される1〜3個のヘテロ原子とからなる。ヘテロ原子は、保護又は未保護であり得る。有用な複素環式基の例は、置換又は非置換で保護又は未保護のアクリジン、ベンザチアゾリン、ベンズイミダゾール、ベンゾフラン、ベンゾチオフェン、ベンズチアゾール、ベンゾチオフェニル、カルバゾール、シンノリン、フラン、イミダゾール、1H-インダゾール、インドール、イソインドール、イソキノリン、イソチアゾール、モルホリン、オキサゾール(すなわち1,2,3-オキサジアゾール)、フェナジン、フェノチアジン、フェノキサジン、フタラジン、ピペラジン、プテリジン、プリン、ピラジン、ピラゾール、ピリダジン、ピリジン、ピリミジン、ピロール、キナゾリン、キノリン、キノキサリン、チアゾール、1,3,4-チアジアゾール、チオフェン、1,3,5-トリアジン、トリアゾール(すなわち1,2,3-トリアゾール)などを含む。
【００４６】
「置換」は、その部分が少なくとも1つ、好ましくは1〜3の置換基を含むことを意味する。適切な置換基は、水素(H)、及びヒドロキシ(-OH)、アミノ(-NH2)、オキシ(-O-)、カルボニル(-CO-)、チオール、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、ハロ、ニトリル、ニトロ、アリール及び複素環式基を含む。これらの置換基は、任意に、1〜3の置換基でさらに置換され得る。置換された置換基の例は、カルボキサミド、アルキルメルカプト、アルキルスルホニル、アルキルアミノ、第4級窒素、ジアルキルアミノ、カルボキシレート、アルコキシカルボニル、アルキルアリール、アラルキル、アルキル複素環式などを含む。
【００４７】
用語「結合親和性」は、2つの分子間、例えばテザー部分とリガンドとの間の親和性のことである。つまり、本明細書で用いる場合、「結合親和性」とは、分子の混合物中でのある分子の別の分子との優先的な結合のことである。ある実施形態において、テザー部分へのリガンドの結合は、結合親和性が約1×104 M-1〜約1×106 M-1又はそれより大きい場合に、特異的であるとみなすことができる。「特異的(又は選択的)に結合する」及び「特異性を持って結合する」との節は、リガンド又はテザー部分の結合能力について言及する場合には、タンパク質及びその他の生物学的物質の不均質な集団における各標的の存在を決定できる結合反応のことである。
【００４８】
用語「阻害剤」は、分子、ポリペプチド(例えば補体成分)、又は細胞(例えばT細胞)の生物学的活性を阻害、すなわち不活性化又は低減する化学的又は生物学的物質のことである。
「官能化脂質」は、その天然の構造に加えて、分子の修飾又は付加を有する脂質である。付加は、共有結合型又は非共有結合型(例えばキレートによる)で付加できる。このような修飾は、小分子(例えばビオチン又はFITC)、多糖類、ヘパリン及び元素(例えばニッケル)の付加を含む。
【００４９】
用語「核酸」は、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド及び一本鎖又は二本鎖の形のそれらのポリマーのことである。具体的に限定しない限り、この用語は、参照核酸に類似の結合特性を有し、かつ天然に存在するヌクレオチドと類似の様式で代謝される天然ヌクレオチドの既知のアナログを含む核酸を含む。そうでないと記載しない限り、具体的な核酸配列は、明示的に記載される配列とともに、その保存的に改変された変異型(例えば縮重コドン置換)及び相補鎖も暗黙のうちに含む。特に、縮合コドン置換は、1つ又は複数の選択された(又は全ての)コドンの3番目の位置が、混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成できる(Batzerら (1991) Nucleic Acid Res 19:5081; Ohtsukaら (1985) J Biol Chem 260:2605〜2608; Rossoliniら (1994) Mol Cell Probes 8:91〜98)。用語「核酸」又は「核酸配列」は、遺伝子、オープンリーディングフレーム(ORF)、cDNA及び遺伝子にコードされるmRNAと交換可能に用いることができる。
【００５０】
本明細書において交換可能に用いられる用語「ポリペプチド」「タンパク質」及び「ペプチド」は、そのサイズ又は機能によらない20タンパク質アミノ酸又はアミノ酸アナログのポリマーのことである。「タンパク質」とはしばしば、比較的大きいポリペプチドについて用いられ、「ペプチド」とはしばしば、小さいポリペプチドについて用いられるが、当該技術におけるこれらの用語の使用は、重複し、変動する。本明細書において用いる場合、用語「ポリペプチド」は、そうでないと記載しない限りペプチド、ポリペプチド及びタンパク質のことである。用語「タンパク質」「ポリペプチド」及び「ペプチド」は、遺伝子産物に言及する場合、本明細書において交換可能に用いられる。つまり、例示的なポリペプチドは、遺伝子産物、天然に存在するタンパク質、ホモログ、オルソログ、パラログ、フラグメント並びにこれらのその他の均等物、変異型及びアナログを含む。
【００５１】
用語「形質転換された」「トランスジェニック」及び「組換え」は、異種核酸分子が導入された哺乳動物のような宿主生物の細胞に関する。核酸分子は、細胞のゲノムに安定的に組み込まれることができるか、又は核酸分子は、染色体外分子として存在することもできる。このような染色体外分子は、自己複製できる。形質転換された細胞、組織又は対象は、形質転換プロセスの最終産物だけでなく、そのトランスジェニックな子孫も含むと理解される。「非形質転換」「非トランスジェニック」又は「非組換え」宿主は、異種核酸分子を含まない野生型生物、例えば哺乳動物又はそれからの細胞のことである。
【００５２】
「移植体」は、提供者対象から受容者対象に移されるいずれの細胞、組織、付属器又は器官である。自家移植体の場合、提供者と受容者とは同じ対象である。移植体の例は、精子、卵子、血小板、血液、皮膚、筋肉、脂肪組織、神経組織、血管、リンパ、骨、靭帯、眼、舌、肺、気管、心臓、脾臓、胃、腸、腎臓、肝臓、手指、手、足指、足、腕及び下肢を含む。
【００５３】
II.   脂質小胞
本明細書で開示される主題のある実施形態において、興味のある活性物質(例えば治療用分子)を標的細胞の細胞膜、及びある実施形態においては標的細胞の細胞膜外表面に結合させるテザー部分の送達に用いることができる脂質小胞が提供される。テザー部分は、標的細胞膜にいったん組み込まれると、標的された送達及びテザー部分がそれに対して結合親和性を有する活性物質での細胞の「装飾」を提供する。さらに、細胞上の装飾の密度は、小胞の形成におけるテザー部分の濃度を変更するか、溶液中の小胞の数を変更するか、及び／又は溶液中の小胞の密度を変更することにより制御できる。
【００５４】
脂質小胞(例えばリポソーム)は、抗生物質及び抗癌剤のような例えば薬剤を含む分子を送達するために用いることができる。小胞は、種々の物質を充填でき、これらを、次いで、標的細胞に送達できる。この送達方法は有利であり得る。なぜなら、これは、細胞への送達まで分子を小胞内に封鎖でき、よって毒性である場合に(ある抗癌剤のように)封入された分子への曝露から非標的細胞を保護できるからである。さらに、脂質小胞は、一般的に、細胞膜に類似しているので非毒性である。これらは、その積荷が血液中で希釈されたり分解されたりすることから保護することもできる。
【００５５】
小胞は、水性溶液中に混合されたときに、閉鎖された流体が満たされた球体を形成するリン脂質(両親媒性分子)からなり得る。脂質小胞が形成されると、溶液中の水溶性分子は球体の内部の水性の空間に封入され、ここで溶液中の脂溶性分子は脂質二重層に組み込まれる。よって、脂質小胞の内部に分子を組み込むことに加えて、興味のある分子を小胞の脂質膜にも組み込むことができ、脂溶性分子及び両親媒性分子が標的細胞の細胞膜に送達されることとなる。
【００５６】
脂質小胞と細胞膜との間の相互作用は、いくつかの形をとることができる。脂質小胞は、ほぼ全ての種類の細胞に吸着できる。いったんこれらが吸着すると、球体は、ある細胞により、エンドサイトーシスにより取り込まれ得る。吸着した脂質小胞は、細胞膜と脂質を交換することもでき、細胞と融合できる場合もある。小胞の具体的な組成は、小胞が細胞膜と融合できるか否かに影響できる。「脂質小胞」との用語が本明細書において用いられる場合、細胞膜と融合する脂質小胞(すなわち「融合性小胞」)を含む。融合が起こる場合、小胞の膜は細胞膜に組み込まれ、脂質小胞の水性の内容物は、サイトソル内の流体と一体化する。個々の脂質小胞は何千もの治療用分子を保持できるので、この技術は、そうでなければ不透過性の物質の細胞への送達のために望ましいものであり得る。
【００５７】
脂質小胞は、種々の層及びサイズで作ることができる。多重膜小胞を構築でき、これは脂質及び水の多数の層を有するが、一枚膜小胞は、単独のリン脂質二重層を有する。それらの脂質膜を効率的に送達する小さい融合性小胞を作り出すためには、小胞は互いに融合してはならないが、標的細胞の膜とは融合できなければならない。細胞膜への小胞の融合を促進するために、脂質層においてリン脂質頭基の電荷が異なる領域を作り出すように操作できる。さらに、小胞の曲率半径を調整して、異なるレベルの貯蔵運動エネルギーを与えることができる。多重膜小胞は、一般的に、容易には融合性ではない。それは、小胞の曲率半径の貯蔵エネルギーが最小限であることが原因の一部分である。しかし、非常に厳密な曲率半径を有する小さい一枚膜小胞(SUV)は、非常に融合性である。理論により制限されることは望まないが、脂質の組成における変更が小胞−細胞膜の融合速度を劇的に変化できることが報告されており、小胞の曲率半径を厳密にすることにより、融合速度をさらに増加できることが決定されている。
【００５８】
融合性一枚膜小胞(FUV)を作る方法は、当該技術において知られている。FUVは、超音波処理、ホモジナイゼーション又は凍結融解法を含む種々の方法を用いて作ることができる。例えば、それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第2004/0213766号及び2003/0235611号；米国特許第6,417,326号、Szokaら, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980)；米国特許第4,186,183号、4,217,344号、4,235,871号、4,261,975号、4,485,054号、4,501,728号、4,774,085号、4,837,028号、4,946,787号；PCT出願WO 91/17424；Szoka & Papahadjopoulos, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 4194〜4198 (1978)；Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443: 629〜634 (1976)；Fraleyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3348〜3352 (1979)；Hopeら, Biochim. Biophys. Acta 812: 55〜65 (1985)；Mayerら, Biochim. Biophys. Acta 858: 161〜168 (1986)；Williamsら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 242〜246 (1988)；Liposomes, ch. 1 (Ostro編, 1983)；及びHopeら, Chem. Phys. Lip. 40: 89 (1986)を参照されたい。
【００５９】
本明細書で開示される主題は、テザー部分が連結された修飾脂質を含む脂質小胞を提供する。本明細書において「官能化脂質」ともよばれるテザー部分を含む修飾脂質は、脂質小胞の脂質成分として組み込まれることができる。テザー部分は、特異的リガンドに対する結合親和性を有する。リガンドは、活性物質(例えば治療用分子)が本来有する部分又は活性物質に組み込まれたもの(例えば融合又はキメラのポリペプチド)であり得る。それ自体で、官能化脂質は、官能化脂質上のテザー部分と活性物質のリガンド部とにより、親和性をもって活性物質に結合するように機能できる。よって、まず、修飾脂質を含む脂質小胞を細胞に接触させて小胞が細胞膜と融合して官能化脂質(及びテザー部分)が細胞膜中に組み込まれることを可能にし、次いで、活性物質を細胞と接触させることにより、活性物質を細胞膜表面に標的させることができる。治療用分子は、細胞膜に組み込まれたテザー部分に親和性をもって結合し、このことにより、目標にされた細胞表面が治療用分子で装飾される。次いで、活性物質は、装飾された細胞及び／又は該装飾された細胞の近傍の細胞、組織及び器官上で、意図したように機能できる。
【００６０】
標的細胞の膜中に官能化脂質を組み込むために脂質小胞を用いることにより、リガンドを含む活性物質は、テザー部分に特異的に結合し、かつ、細胞表面に分子を連結するために非特異的に結合したテザー(官能化脂質に組み込まれていない)を用いた場合に比べて著しくより長い期間細胞の表面につながれたままである。さらに、官能化脂質は、細胞骨格に連結していないので、これらは、細胞膜の外側の一片(leaflet)においてより多くの側方の自由を有する。このことにより、「浮遊する(floating)」官能化脂質が互いに近づきあい、活性物質が正しく機能するために必要なように自由に移動することが可能になる。例えば、FasLの機能化に必要な三量体化は、本明細書で開示される主題の脂質小胞を用いて標的細胞膜にテザー部分を組み込むことにより、かなり促進される。
【００６１】
テザー部分は、それに対してテザー部分が結合親和性を有するリガンドについての検討とともに、官能化脂質との適合性に基づいて選択される。例えば、そして今回の主題の範囲を限定することを意図せずに、ある実施形態において、テザーは、ビオチン、ニッケル(例えばニッケルをキレートする基N'',N''-ビス[カルボキシメチル]-L-リジン(ニトリロ酢酸) (NTA)を用いる)、又は脂質上の官能基、例えばN-[3-(2-ピリジルジチオ)プロピオネート]、N-[4-(p-マレイミドフェニル)ブチラミド]、N-ヘキサノイルアミン、N-(ドデカニルアミン)、N-(グルタリル)、N-(スクシニル)及びN-(ドデカノイル)を含む例えばチオール、マレイミド、アミン又はカルボン酸であり得る。
【００６２】
活性物質のリガンド部分は、活性物質が本来有する部分であり得、すなわち、さらなる操作を行わずに機能的な活性物質の成分として見出されるものであり得るか、又はリガンドは、活性物質に組み込まれることができる。例えば、活性物質が治療用ポリペプチドであれば、当業者により一般的に理解されるように、組換え遺伝子技術を用いて、治療用ポリペプチドにあるリガンドを組み込むことができる。ある実施形態において、活性物質のリガンド部は、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基である。上記のリガンドの例のそれぞれは、開示されるテザー部分に対して結合親和性を有する。その他の「錠と鍵」の分子相互作用も同様の様式で利用できるが、テザー部分が脂質に複合できる場合には、それに対してテザー部分が結合親和性を有する対の片方のリガンドが存在し、該リガンドは興味のある活性物質に組み込まれることができるか又はすでにその一部分である。
【００６３】
本明細書で開示される主題のある実施形態において、官能化脂質は、リン脂質、例えばホスホエタノールアミンを含む。本明細書で開示される主題において有用なリン脂質の例は、限定されないが、N-4-(p-マレイミドフェニル)-ブチリル ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン(MPB-DPPE)、N-4-(p-マレイミドフェニル)-ブチリルジミリストイルホスファチジルエタノールアミン(MPB-DMPE)、及びN-4-(p-マレイミドフェニル)-ブチリル 卵ホスファチジルエタノールアミン(MPB-EPE)を含む。ある具体的に実施形態において、テザー部分はビオチンであり、官能化脂質はホスホエタノールアミンである。ビオチンは、官能化脂質に共有結合型で結合できる。ビオチンテザー部分は、ストレプトアビジンリガンド及びアビジンリガンドに親和性をもって結合する。例えば、ある実施形態において、テザー部分を含む官能化脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、1,2-ジパルミトイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)、及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)である。これらの官能化脂質の例のそれぞれ、及びその他の匹敵する脂質は、Avanti Polar Lipids, Inc. (Alabaster, Alabama, U.S.A.)及び／又はMolecular Probes (Eugene Oregon, U.S.A.)から市販で入手可能である。
【００６４】
別の実施形態において、官能化脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]である。具体的な実施形態において、テザー部分を含む官能化脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル] (ニッケル塩) (Avanti Polar Lipids, Inc.)である。ニッケルテザー部分は、官能化脂質の親水性頭基にキレート化している。ニッケルテザー部分は、ポリヒスチジンリガンドに結合親和性を有し、これは治療用分子、例えば治療用ポリペプチドに組み込むことができる。
【００６５】
細胞は、本明細書において開示される脂質小胞を用いてテザー部分を標的細胞膜の表面上につなぎとめることにより、例えば治療用分子を含む多くの活性物質のいずれの1つで装飾できる。「治療用分子」とは、この用語を本明細書で用いる場合、IRI及び／又は器官移植による細胞の損傷を低減又は防止できる分子のことであり、例えばポリペプチド、アプタマー及び小分子を含む。例えば、補体媒介免疫応答及び白血球媒介免疫応答を含む免疫系の武器(arm)からの応答を減衰させることができる分子、並びに抗凝固物質及び血栓溶解物質は、全て、本明細書で開示される主題の治療分子の例である。つまり、本明細書で開示される主題の治療用分子を用いて、例えばIRI、超急性拒絶、臓器移植後臓器機能障害、慢性拒絶又は遅発移植不全を治療できる。IRI及び／又は器官及び組織の移植に関連する細胞の損傷を阻害、防止又は治療するために用いることができる治療用分子のクラスは、限定されないが、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカン、抗凝固物質、血栓溶解物質、及び新生内膜増殖阻害剤を含む。
【００６６】
例えば、新生内膜増殖阻害剤について、神経ペプチドY (NPY)は、心臓血管機能、平滑筋収縮及び平滑筋細胞増殖を調節する。NPY Y1受容体を、例えばBIBP3226 ((R)-N2-(ジフェニルアセチル)-N-[(4-ヒドロキシ-フェニル)メチル]-D-アルギニン-アミド)で遮断することにより、平滑筋細胞におけるマイトジェン活性化タンパク質キナーゼ(MAPK)活性が低減され、血管形成術後の新生内膜肥厚を低減する。細胞内シグナル伝達成分を有さない「ダミー」のNPY Y1受容体の提示は、NPYタンパク質に結合し、内因性のNPY Y1受容体の活性化を競合的に阻害し、よって、新生内膜肥厚が低減される。同様に、NPY Y2受容体の活性化は、NPY Y1よりも少ない程度ではあるが新生内膜肥厚にも関連するので、NPY Y2ダミー受容体の提示も、同じ目的のために用いることができる。
【００６７】
例えば、T細胞アポトーシス誘発分子を用いて、細胞を装飾できる。「アポトーシス誘発分子」は、細胞に接触したときに、その細胞においてアポトーシスを誘発する分子である。該分子は、ポリペプチド、有機分子、脂質、ホルモンなど又はこのような分子の組み合わせ(又はその部分若しくはフラグメント)であり得る。該分子は、その本来の状態から修飾され得る。例えば、アポトーシス誘発分子であるポリペプチドは、翻訳後修飾又は組換え技術を用いることにより修飾して、例えばキメラ(融合)分子を作り出すことができる。
【００６８】
Fas及びFasLは、相互作用して、最もよく定義されたアポトーシス(プログラムされた細胞死)経路の一つを活性化する2つのタンパク質である。Fas及びFasLはともに、TNF (腫瘍壊死因子)ファミリーのメンバーである。Fasは、膜貫通受容体ファミリーの一部分であり、FasLは、膜結合サイトカインファミリーの一部分である。FasLの3つの異なる形が知られている：膜結合型、可溶型及び小胞型である。それぞれは、アポトーシス及び免疫調節に関するそれらの役割について異なっている。アポトーシスは、最初に、小胞型及び膜結合型のFasLにより媒介されるが、可溶型はアポトーシスの媒介においては不活性であり、Fas受容体に対して膜に結合したFasLと競合することにより、抗アポトーシス因子として働く(Schneiderら, 1998, J.Exp.Med., 187:1205〜1213; Sudaら, 1993, Cell, 75:1169〜1178)。FasLのアポトーシス活性は、その三量体化により及び細胞と細胞との接触を介して最も効果的に媒介されるが、該三量体化と接触とは、可溶型の抗アポトーシス活性により平衡がとられている。アポトーシス促進性のFasLへのFasの結合の4つの既知の主な役割は：(1) CD4 T細胞がリンパ球恒常性を維持するため；(2) 細菌感染したマクロファージの死を引き起こすため；(3) アネルギーなB細胞を殺すため；及び(4) CD8 T細胞がウイルス感染した標的細胞を殺すためである(Janewayら, 2001, Immunobiology, Garland Publishing, New York, N. Y.)。いくつかの研究が、免疫調節アプローチとして遺伝子修飾により発現されたFasLを用いて、同種反応性応答の効果的な遮断、及び同種の肝臓、腎臓、甲状腺及び膵島の生存を証明している(例えば、その全体が本明細書に参照により組み込まれる米国特許出願公開第2004/0213766号を参照)。
【００６９】
補体活性化を遮断する治療用分子も、細胞を装飾するために用いることができる。補体活性化を遮断する代表的な治療用分子は、限定されないが、崩壊促進因子(DAF)、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、ワクシニアウイルスにより産生されるポリペプチド(それぞれが本明細書に参照により組み込まれる米国特許第5,157,110号及び第5,187,268号を参照)；補体受容体1 (CR1)、ヒト抗補体タンパク質；補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、天然痘ウイルスにより産生されるVCPのホモログ；及びコンプスタチン、C3阻害剤を含む。代表的な治療用小分子補体阻害剤は、限定されないが、補体溶血阻害剤FUT-175及び化合物4077、並びにC1s阻害剤C1s-INH-248及び化合物53を含む(3-Dimensional Pharmaceuticals, Yardley, Pennsylvania, U.S.A.)。例えばVCPは、補体活性化の第1及び第2経路の両方を阻害することが示されている。このような補体阻害分子は、炎症(IRIを含む)及び自己免疫疾患に対する治療用分子として貢献する。VCPは、28 kDaのタンパク質であり、補体調節ファミリーのヒトタンパク質(C4b-BP及びCR1)に構造的及び機能的に類似している。VCPは、コファクターIの存在下でC3b及びC4bに結合し、有効な白血球遊走因子C5aの合成及びMACの形成における重大な工程であるC3コンバターゼ複合体の形成を阻害する。VCPの他に、ポックスウイルスファミリーの他のメンバーは、限定されないがSPICEを含むVCPに対するホモログをコードし、これも、本明細書で開示される主題において治療用分子として用いることができる。
【００７０】
さらに、補助刺激遮断に関係する治療用分子(すなわちT細胞補助刺激遮断分子)を用いて、細胞を装飾できる。補助刺激遮断に関係する代表的な治療用分子は、限定されないが、CD28-B7経路を遮断する細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA4)、及びCD40-CD40L経路を遮断する抗-CD40Lを含む。
【００７１】
白血球の浸潤を妨げる代表的な治療用分子(すなわち白血球浸潤阻害剤)は、限定されないが、天然に存在するか又は合成の糖タンパク質及びプロテオグリカンである。糖タンパク質又はプロテオグリカンは、白血球の回旋運動、接着及び内皮を横切っての移動に必須なその他の細胞接着分子(例えばセレクチン、ICAM又はインテグリン)を被覆するか又はその上に存在することができる。白血球浸潤阻害剤として有用な糖タンパク質及びプロテオグリカンの例は、限定されないが、不活性特大レクチン(inactive oversized lectins) (例えばL、P及びEセレクチン)、及びα-1-酸糖タンパク質(AGP)を含む。AGPは、リンパ球増殖及び好中球活性化を、それらの細胞膜表面と相互作用することにより阻害する。
【００７２】
代表的な抗凝固物質は、限定されないが、組換え産生されたか又は天然起源から単離されたヒルジン、小分子因子Xa阻害剤：DPC-423、DPC-602、ラザキサバン、GSK 813893、オタミキサバン、DU-176b、KFA-1982、BAY-59-7939、DX-9065a、YM-150、LY-517717、MCM09；小分子トロンビン阻害剤：SSR-182289、LB-30057、LB-30870、BIBR-1048、L-374,087；及び因子IXaアプタマー阻害剤9.3tCを含む。
【００７３】
代表的な血栓溶解物質は、限定されないが、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA) (組換えtPAを含む)、及びマトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP) (例えば、ゼラチナーゼ(MMP-2,9)、コラゲナーゼ(MMP-1,8,13,14,18)及び膜結合型MMP (MMP-14,15,16,17,23,24,25)を含む)を含む。
【００７４】
ある実施形態において、脂質小胞は、安定小胞形成物質であるリン脂質と、少なくとも1つの不安定小胞形成メンバーと、本明細書に開示される官能化脂質とを含み、ここで、該不安定小胞形成メンバーは、安定小胞形成物質ではない極性脂質、PEG、ラフト形成物質及び融合タンパク質から選択される。不安定小胞形成メンバーは、小胞の安定性を低減させ、次いで小胞が細胞膜と融合する能力を有利に増加させる(例えば小胞の融合性を増加させる)ことができる分子である。
【００７５】
極性脂質は、疎水性末端と親水性末端とを有する有機分子であり、少なくとも6つの炭素原子を含有する。これらは、式(I)の構造を有し、ここで、Xは頭基であり、Lは主軸の基であり、各Zは脂肪性の基である。2つのZ基は、同じでも異なっていてもよい。リン脂質は、式(II)の頭基を有する極性脂質であり、ここでA及びBは頭基の置換基である。
X-L-(Z)2          (I)
【化６】
2008540341.tif 000007
【００７６】
本明細書で開示される小胞の脂質において、頭基Xはいずれの極性基であり得、好ましくはカチオン性、アニオン性若しくは両性の基又はHであり得る。より好ましくは、Xは式(II)の基である。Bは、カチオン、例えばNa+、K+若しくはテトラメチルアンモニウムイオン；又はアルキル基であり得る、Aは、H又はアルキル基であり得、ある実施形態において、Aは、アミンで置換されたアルキル基、例えば式(III)、(IV)、(V)、(VI)又は(VII)の基である。本明細書を通して、式はプロトン化された形の構造で示すが、プロトン化されていない形も含み(その逆も同じである)、いずれの構成にどちらの形が存在するかは、該構成の正確なpH、及び水及び／又は適切な対イオンの存在に依存することに注意すべきである。
【００７７】
【化７】
2008540341.tif 000008
【００７８】
主軸の基Lは、2つの水素原子をさらに失った(合計で3つの空いている連結点を提供するために)アルキルであり得、ある実施形態において、アルコキシ、又はアミノ置換されたアルキルであり得る。具体的な実施形態において、Lは、式(VIII)、(IX)又は(X)の基である。
【化８】
2008540341.tif 000009
【００７９】
脂肪性の基Zは、同じ又は異なることができ、H、E基又は式(XI)の構造であり、ここでEはアルキル又はアルケニルである。ある実施形態において、Eは、6〜26個の炭素原子の非置換の直鎖状アルキル又はアルケニルである。例えばEは、式(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)又は(XVII)の基であり得る。脂肪性の基の一方がHである場合、他方は異ならなければならない。二重結合が存在する場合、シス立体配置が好ましい。
【００８０】
【化９】
2008540341.tif 000010
【００８１】
安定小胞形成物質であるリン脂質(又は極性脂質)は、小胞を形成するリン脂質(又は極性脂質)であり、その少なくとも50%は、次のようにして調製した場合に少なくとも1時間は持続する：リン脂質をクロロホルムに溶解して、ガラス試験管に入れる。溶媒を、窒素の安定気流の下での蒸発、続いてサンプルを真空に12時間付すことによる空気除去により除去する。乾燥させた脂質材料は、次いで、10 mM Na2HPO4中で60分間、脂質相転移温度を超える温度にて再含水させる。所望の最終濃度は25 mg/mlである。次いで、脂質混合物を、40%デューティサイクルで用いるマイクロチップ450ワット超音波発生装置で超音波処理によりかき回す。
【００８２】
安定小胞形成物質であるリン脂質の他に、少なくとも1つのその他の極性脂質を脂質小胞に含むことができ(官能化脂質とともに)、これは不安定小胞形成メンバーである。
【００８３】
ラフト形成物質は、小胞を水溶液中に入れたときに小胞の脂質層の中にとどまり、小胞の壁の中で不連続の領域(ラフトとしても知られる)を形成するか又は形成を引き起こす配合物である。これらの不連続の領域は、小胞を不安定にする傾向があり、その融合性を増加させる。ラフト形成物質の例は、コレステロール、スフィンゴミエリン並びに膜結合性であると知られているタンパク質及びポリペプチドである。融合性は、標的細胞のGouey-Chapman層の電荷とは反対の(典型的には、Gouey-Chapman層は正に荷電されている)小胞上の表面荷電をもたらす極性脂質を選択することによっても促進できる。
【００８４】
ある具体的な実施形態において、安定小胞形成物質であるリン脂質又は安定小胞形成物質ではない極性脂質は、式(I)の構造を有し：
X-L-(Z)2          (I)
ここで、XはH、Aであるか、又は式(II)の構造を有し：
【００８５】
【化１０】
2008540341.tif 000011
Bは、カチオン又はアルキル基であり；
Aは、H又はアルキル基であり；
Lは、2つの水素原子をさらに失ったアルキル基であり(合計で3つの空いている連結点を与えるために)、ある実施形態において、Lは、アルコキシ又はアミノ置換されたアルキルであり；
各Zは独立して、H、E又は式(XI)の構造であり：
【００８６】
【化１１】
2008540341.tif 000012
ここで、Eは、アルキル又はアルケニルであり、一方のZがHである場合、他方のZはHではない。
【００８７】
ある実施形態において、AはHであるか、又は式(III)、(IV)、(V)、(VI)及び(VII)からなる群より選択される構造を有し：
【化１２】
2008540341.tif 000013
【００８８】
ここで、nは0〜4の整数であり；
Lは、式(VIII)、(IX)又は(X)からなる群より選択される構造を有し：
【００８９】
【化１３】
2008540341.tif 000014
Eは、式(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)及び(XVII)からなる群より選択される構造を有する：
【００９０】
【化１４】
2008540341.tif 000015
【００９１】
ある実施形態において、安定小胞形成物質であるリン脂質はホスファチジルコリンである。安定小胞形成メンバーとしての使用に適するホスファチジルコリン脂質の例は、限定されないが、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-ドコサヘキサエノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン(PDPC)、大豆ホスファチジルコリン、卵ホスファチジルコリン及びそれらの混合物を含む。
【００９２】
不安定小胞形成メンバーとしての本発明の主題における使用のための極性脂質の例は、限定されないが、1-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロ-3-ホスフェート(POPA)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-エチルホスホコリン(DOPC-e)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(DOPE)、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[ホスホ-l-セリン] (DOPS)、スフィンゴミエリン(コレステロールは、スフィンゴミエリンとDOPCとの混合物から形成された小胞に加えられたときにラフトを形成する)、1,2-ジミリストイル-sn-グリセロール、1-パルミトイル-2-ヒドロキシ-sn-グリセロ-3-ホスホコリン、1,2-ジオレオイル-3-トリメチルアンモニウム-プロパン(DOTAP)及び1,2-ジオレオイル-3-ジメチルアンモニウム-プロパン(DODAP)を含む。
【００９３】
不安定小胞形成メンバーとして本明細書で開示される主題の実施のために有用なその他の極性脂質は、ホスファチジルセリン(PS)、ホスファチジルグリセロール(PG)、混合鎖ホスファチジルコリン(MPC)、ホスファチジルエタノール(PE)、及びドコサヘキサエン酸を含有するリン脂質を含む。Cit-DOPC及びcit-DOPC-eは、不安定小胞形成メンバーとして有用な極性脂質の例である。sn-1及びsn-2の位置にドコサヘキサエン酸を有するもの(DHPC)を含むホスファチジルコリンを用いることができる。その他の二不飽和脂質、例えばジアラキドニルホスファチジルコリン(例えば20:4 DOPC : DArPC)、ジリノレノイルホスファチジルコリン(例えば18:3 DOPC : DLnPC)も有用である。例えば、DOPCは、小胞の調製の間にDLnPC、DArPC及びDHPCの漸増量と混合できる。有用な比は(DOPC:DLnPC、DArPC又はDHPC)、1〜1000:1、例えば1:1、並びに25:1、50:1、100:1及び500:1を含む25〜500:1の範囲である。大きい平均分子面積を有するリン脂質の組み合わせも用いることができ、例えばDOPC:DLnPC:DHPCである。層状でない相の脂質(non-lamellar phase lipid)であるジアシルグリセロールを、DOPCと混合することもできる。さらに、20リピートから4000リピートの重さのポリエチレングリコール(PEG)を用いることができる。
【００９４】
ある実施形態において、安定小胞形成物質リン脂質の安定小胞形成物質でない極性脂質に対する比は、1:1〜500:1、より好ましくは10:1〜100:1 (例えば50:1)である。その例は、DOPC/DOPC-e (1:1)：DOPC/POPA (50:1)及びDOPC/POPA (1:1)を含む。ある実施形態において、脂質小胞は、安定脂質形成物質の官能化脂質に対する比が約1:1〜約500:1であり、ある実施形態においては、約1:1〜約200:1の比であり、ある実施形態においては、約1:1〜約50:1の比である。
【００９５】
脂質小胞の融合速度(fusion rate)は、種々の因子、例えば温度、イオン、脂質濃度、脂質小胞の組成、流量、脂質小胞のサイズなどを変更することにより変えることができる。脂質小胞のリン脂質の処方を変えて、融合速度を最大にするとともに毒性を最小にすることができる。脂質の組成を操作することにより融合速度を変えるために4つの一般的なアプローチを用いることができる：
(1)   静電的相互作用の増大；
(2)   膜二重層の不安定化；
(3)   非二重層の相の増大；及び
(4)   異なる脂質の相の作製。
【００９６】
静電的相互作用を用いて、融合速度を増加させることができる。リン脂質は、それらの電荷に従って分類される(カチオン性、アニオン性及び両性)。PEのようなカチオン性リン脂質、及びホスファチジン酸(POPA)のようなアニオン性リン脂質の多くは、生理的pHにおいて閉鎖された小胞を形成しない。しかし、両性のホスファチジルコリンと混合したアニオン性及びカチオン性脂質は、生理的pHにおいて閉鎖された小胞を形成できる。
【００９７】
ほとんどの細胞の原形質膜は、実効負電荷を有する。この負電荷のために、反対平衡イオン、典型的にはカルシウム、マグネシウム、ナトリウム及びカリウムの層が存在し、これは実効正電荷を示す。リポソームと原形質膜との間の静電的相互作用の利点を用いて、実効負電荷を有するように脂質小胞を設計することができ、よって細胞−脂質小胞の融合を最大限にすることができる。しかし、細胞原形質膜がより多くのカチオン性脂質を含む場合があり、これはアニオン性イオンの層により平衡がとられている。これらの状況において、小胞は、細胞−脂質の融合を最大限にする実効正電荷を有するように設計される。
【００９８】
原形質膜は、特定の種の脂質に富む脂質ドメイン又はラフトを含有する。このような膜の境界において、ラフトは、異なる種の脂質の領域である。これらの領域は、不安定性の電位を有し、膜が他の膜とどのように相互作用するかに影響する。いくつかのリン脂質が、脂質ラフト形成を増加させることが知られており、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン及びコレステロールの混合物を含む。例えば、FUV調製の間にDOPC、18:0 スフィンゴミエリン及びコレステロールを1:1:1の比で混合できる。コレステロールは、スフィンゴミエリン相の中で優先的に分配され、DOPCに富みかつコレステロールに乏しい領域、及びスフィンゴミエリンに富みかつコレステロールに富む領域を作り出す。
【００９９】
融合の物理的パラメータ、温度、濃度、イオン強度を変更することにより、融合速度に影響を与えることができる。温度を変更することにより、系の自由エネルギー(G)が変わり、異なる速度の融合を導く。脂質小胞の濃度の増加も、特に非常に高い濃度においては、膜融合速度に影響を与える。融合期間(融合の長さ)及び融合期間の回数も、封入される内容物の量及びFUVにより送達される膜成分に影響を与える。
【０１００】
温度も融合速度に影響を与えることができる。小胞溶液の温度を増加することにより、小胞の運動エネルギーの増加を導き、よって融合の能力が増大する。温度は、小胞の自由拡散にも影響する。
【０１０１】
直感的には、濃度の増加は小胞の融合をある程度増加させると考えられるが、膜融合の速度は直線的ではない。利用可能な原形質膜表面の全体をFUV脂質が一旦占めると、さらなる融合は制限される。原形質膜との融合の程度は、膜の容量及び特性、例えばイオン透過性及び脂質構成に影響する。よって、FUVを投与する場合、FUV濃度は、標的細胞が効率的に処置されるように制御されなければならない。
【０１０２】
融合が起こることを可能にする時間の長さは、封入された物質が送達される程度を制御する助けになる。融合を停止するためには、小胞を取り除く(例えばバッファーで洗浄することにより)か、投与された小胞の濃度を、所望の時間の終点において小胞が枯渇するようにする。融合は、小胞の送達の合計が1回又は複数回の投与により制御されるようにも最適化できる。例えば、目標融合期間が120分である場合、2回の60分の期間を用いることができるか、又は4回の30分の期間、12回の10分間の期間若しくは24回の5分間の融合期間を用いることができる。適切な装置が利用可能であると仮定して、1分又はそれ未満の融合期間も達成できるが、このような期間は、しばしば、不便でありかつ技術的に困難である。
【０１０３】
ある実施形態において、融合性脂質小胞は、少なくとも約20小胞融合/秒/mm2-細胞膜の融合速度を有する。
【０１０４】
小胞からそれらが保持する選択された材料が実質的に失われることなく、かつ小胞が互いに意図されない融合をすることなく、脂質小胞を長期間貯蔵できる場合があることが望ましい。より具体的には、ある商業的な設定において有用であるように、脂質小胞調製物は、それらを容易に製造、輸送及び種々の温度条件下で仲介及び最終のユーザーが貯蔵することを可能にするのに充分長い貯蔵寿命を有するべきである。つまり、本明細書で開示される主題のある実施形態において、脂質小胞を凍結乾燥して、使用前の小胞の長期の貯蔵及び輸送のために、小胞を保存する。
【０１０５】
凍結乾燥による脂質小胞の保存技術は、一般的に、当該技術において知られている。例えば、そのそれぞれの全体が参照として組み込まれる米国特許第5,578,320号、第5,008,109号及び第4,857,319号、並びに米国特許出願公開第2006/0045910号を参照されたい。
【０１０６】
一般的に、小胞の凍結乾燥(例えば「フリーズドライ」)は、小胞の迅速な凍結、続いて真空下での小胞の融解(これにより処方から含有水分が除去される)を含み、これにより小胞を安定な形に保存する。本明細書で用いる場合、「凍結乾燥」は、単に減圧下に付すことによる予めの凍結なしの小胞の脱水のことでもある。
【０１０７】
小胞の再含水及び小胞の活性化の前の貯蔵期間は、例えば、その間の期間を含んで約10分から約5年までであり得る。
【０１０８】
小胞は、例えば-40℃又はそれ未満の温度まで非常に迅速に凍結でき、貯蔵時間は長くなり得るので、保護剤として付加的な成分を加えて、小胞をより効果的に保存する助けとすることができる。例えば、小胞の膜二重層及びその他の部分、例えば小胞の内側の空間は、糖を含み得る。つまり、膜二重層の内表面及び外表面は、糖で被覆できるが、内側の空間は糖を含み得る。ある実施形態において、糖は、安定小胞形成メンバーと約5:1〜1:5の比(m/m)、ある実施形態においては約1:1の比で小胞に組み込むことができる。
【０１０９】
ある実施形態において、糖は、単糖類、二糖類及び多糖類を含むいずれの水溶性の糖である。糖は、脂質小胞を保存できるとともに、所望の融合性を維持できるエナンチオマー、ジアステレオマー、誘導体及び1又は複数の糖類のラセミ混合物も含み得る。いずれの特定の理論により束縛されることを望まないが、糖は、脂質の極性頭基に結合し、水を置き換え、そして周囲を囲んで二重層の膜が自己融合することを防ぐガラスを作り出すことにより、脱水プロセスの間に小胞の融合を妨げると考えられている。再含水させる際に、糖は放出されるようであり、よって二重層の水の安定化を可能にする。
【０１１０】
保存手順において有用な単糖類の例は、限定されないが、マンノース、フラクトース又はリボースを含むが、グルコースでないことが好ましい。二糖類の例は、限定されないが、トレハロース、ラクトース、マルトース、スクロース又はツラノースを含む。多糖類の例は、限定されないが、ヒドロキシエチルスターチ、イヌリン又はデキストランを含む。好ましい糖は、二糖類のD-トレハロースである。
【０１１１】
III.  細胞を活性物質で装飾する方法
本明細書で開示される主題は、細胞、例えば細胞の細胞膜の外表面を、活性物質、例えばポリペプチド、アプタマー及び小分子を含む治療用分子で装飾する方法を提供する。細胞は、組織又は器官の細胞(例えば内皮細胞)であり得る。本明細書で開示される主題は、さらに、開示される方法に従って治療用分子で装飾された細胞を含む。
【０１１２】
上記の方法は、細胞を、官能化脂質を含む本明細書で開示される脂質小胞と接触させることを含む。官能化脂質は、活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む。細胞は、細胞を小胞と接触させるのと同時に又は連続的に、リガンド部を含む活性物質と接触させる。リガンドは、親和性をもってテザー部分と結合するので、活性物質で細胞が装飾される。
【０１１３】
ある具体的な実施形態において、上記の方法は、連結したテザー部分を有する官能化脂質を含む融合性脂質小胞を含む第1組成物を、組織又は器官に潅流させ、次いで、テザー部分が結合特異性を有するリガンド部を含む活性物質を含む第2組成物を、組織又は器官に潅流させることを含む。脂質小胞は、潅流される細胞の膜と融合し、このことにより官能化脂質とテザー部分とが細胞膜の中へ組み込まれることとなる。次いで、テザー部分は、細胞膜の外表面につなぎとめられる。組織が、活性物質を含む第2組成物で一旦潅流されると、活性物質は、親和性をもって(例えば非共有結合型のリガンド−テザー結合を介して)、埋め込まれたテザー部分を含む細胞に結合し、細胞膜が活性物質で装飾されることとなる。
【０１１４】
ある実施形態において、官能化脂質は、リン脂質、例えばホスホエタノールアミンを含む。他の実施形態において、官能化脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む。ある実施形態において、テザー部分は、ビオチン、ニッケル、チオール、マレイミド、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される。さらに、ある実施形態において、治療用分子のリガンド部は、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される。
【０１１５】
テザー部分及びリガンドは、互いの結合親和性に基づいて選択される。例えば、ある具体的な実施形態において、官能化脂質は、ビオチンに連結したホスホエタノールアミン、例えば1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)を含む。これらの実施形態において、リガンドは、ストレプトアビジン又はアビジンである。別の実施形態において、官能化脂質は、ニッケルとキレート化した1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む。これらの実施形態において、リガンドは、治療用分子、例えば治療用融合ポリペプチドに組み込まれたポリヒスチジンであり得る。
【０１１６】
さらに、本発明の方法は、それぞれが異なるテザー部分を含む複数の異なる官能化脂質の同時又は連続的な使用を提供する。これらの実施形態において、複数の異なる活性物質(それぞれが、テザー部分に対して結合親和性を有する異なるリガンドを含む)は、組織又は器官の細胞を標的することができ、それにより、所望により、異なる活性物質の多数で細胞を装飾することを可能にする。
【０１１７】
活性物質は、細胞、組織又は器官を、内皮細胞損傷及び／又は移植の場合は組織もしくは器官の免疫系拒絶によるIRI誘発補体活性化又は血栓形成から保護するために選択された治療用分子であり得る。治療用分子は、IRI又は免疫系拒絶の結果として損傷された細胞、組織又は器官を治療するためにも選択され得る。それ自体で、ある実施形態において、治療用分子は、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質又は血栓溶解物質であり得る。ある具体的な実施形態において、治療用分子は、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される。
【０１１８】
別の態様において、本明細書で開示される主題は、開示される方法及び組成物を用いて作製された装飾された細胞、組織又は器官を提供する。ある実施形態において、装飾された細胞(例えば内皮細胞)、組織及び器官は、リガンドに対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む。装飾された細胞、組織及び器官は、細胞の外側を装飾する活性物質をさらに含み、ここで活性物質は、テザー部分に結合したリガンド部を含む。ある実施形態において、細胞、組織又は器官は、同種移植片、異種移植片又は自己移植片である。つまり、組織又は器官は、ある対象から別の対象に移植されるか、又は取り出されて同じ対象へ同じか若しくは異なる位置に戻されることができる。
【０１１９】
IV.   治療方法
免疫寛容は、進行中の外因性免疫抑制の不在下で(例えば、その他の抗原に対する免疫応答は維持したまま)、特定の外来抗原に対する病原性の免疫応答が存在しないこととして定義できる。本明細書に記載される方法は、例えば移植された細胞、組織又は器官により産生される外来抗原に対する受容者対象の免疫応答を、安全かつ効果的にダウンレギュレーションする。さらに、本明細書に開示される方法は、IRIの原因である免疫系の成分、また、移植に関連する重要な懸念及び組織虚血をもたらすその他の手順の阻害を提供する。
【０１２０】
一般的に、本明細書に開示される細胞を装飾する方法は、移植された細胞、組織若しくは器官の拒絶を阻害するか、及び／又は細胞、組織若しくは器官に対するIRIを阻害する治療方法として用いることができる。ある実施形態において、これらの治療方法は、2つの組成物(例えば溶液)を用いることを含む。第1組成物は、本明細書に開示されるテザー部分を有する官能化脂質を含む脂質小胞を含む。治療される細胞、組織又は器官は、第1組成物で潅流され、その中の脂質小胞は、細胞膜との接触の際に、膜と融合する。融合性脂質小胞を含有する第1組成物は、例えば動脈内(インビボ又はエクスビボ)を潅流させることができるか、又は浸漬でき、小胞は細胞膜と相互作用することが可能になる。この時間の間に、小胞の少なくともいくらかは細胞膜と融合し、それにより官能化脂質をこれらの細胞の脂質二重層の中に取り込む。つまり、第1溶液は、細胞膜の外層をテザー部分で装飾できる。第2組成物は、テザー部分に結合親和性を有するリガンド部を含む治療用分子を含む。治療用分子は、細胞の外側の脂質二重層上で親和性をもってそのリガンドにてテザー部分に結合する。第2組成物も、例えば動脈内(インビボ又はエクスビボ)で潅流でき、装飾された細胞膜と相互作用することを可能にする。結果として、細胞、組織及び器官が治療用分子の多数のコピーで装飾される。
【０１２１】
治療用分子を細胞の中又は細胞上に組み込むことを試みるその他の系に比べてこの技術の利点は、例えば血液が流れている血管における装飾の長期化である。テザー部分は、小胞の官能化リン脂質に直接連結し、次いでこれが細胞膜の脂質二重層に組み込まれる。よって、細胞表面の治療用分子での装飾は、リン脂質が細胞膜内に残る限り存続できる。
【０１２２】
官能化脂質を含む融合性脂質小胞(例えば第1組成物)及びリガンドを有する治療用分子(例えば第2組成物)は、いずれの数の方法により投与できる。例えば、提供者対象からすでに回収された細胞、組織又は器官は、溶液中で潅流できる。さらに、受容者対象(提供者と同じ対象であり得る、例えばCABG)にすでに移植された細胞、組織又は器官は、溶液を受容者対象に静脈内投与することにより装飾できる。さらに、IRIが危険である場合(例えば血管損傷又は閉塞)、溶液は、虚血の部位に直接又は全身的、例えば静脈内で投与できる。投与は、一定の間隔で、移植耐性が誘導されるか又はIRIの危険性が実質的に消滅するまで(又はそのようになるならば)反復できる。
【０１２３】
ある実施形態において、活性化合物は、インプラント及びマイクロカプセル化送達系を含む制御放出処方のような体内からの迅速な消滅に対して化合物を保護する担体とともに製造される。生分解性及び生体適合性のポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸を用いることができる。このような物質は、ALZA Corporation (Mountain View, California, U.S.A.)及びNOVA Pharmaceuticals, Inc. (Lake Elsinore, California, U.S.A.)から購入できるか、又は当業者が製造できる。
【０１２４】
投与量は、異なる脂質組成、具体的な所望される治療効果及び投与経路によって変動する脂質小胞の独特の特徴に従い、かつそれに直接依存する。いずれの特定の対象又は投与についての具体的な投与量レベル及び頻度は、変動し得る。考慮されるべき因子は、(1) 投与が行われかつ融合が許容される温度；(2) 投与部位のイオン性環境及び脂質小胞組成物のイオン強度；及び(3) 融合が許容される時間の長さを含む。これらの因子を制御することは、官能化脂質が送達される程度を制御する助けになる。
【０１２５】
脂質小胞を投与する場合、小胞の濃度を制御して標的細胞を効率的に治療する一方で、小胞脂質で原形質膜を飽和することによりそれらの機能を阻害しない。脂質の組成、標的細胞の分散及び投与される容量に依存する脂質小胞の好ましい濃度は、0.5 mg/ml〜100 mg/ml、例えば0.5 mg/ml、1 mg/ml、5 mg/ml、10 mg/ml、20 mg/ml、30 mg/ml、40 mg/ml、50 mg/ml、60 mg/ml、70 mg/ml、80 mg/ml、90 mg/ml及び100 mg/mlであり得る。
【０１２６】
静電的相互作用によって起こる小胞の融合は、カルシウム及び／又はマグネシウムの濃度の変化により著しく、及びより小さい程度でナトリウム及び／又はカリウムの濃度の変化に影響される。脂質小胞の投与に用いられる組成物又は小胞の投与の前若しくは後に標的部位に投与される組成物のいずれかの中のこれらのイオンの濃度を変更することは、投与量についての考察に影響する。好ましくは、0.1 nM、1 nM、10 nM、100 nM、1000 nM、10マイクロモル/L及び100マイクロモル/Lを含む0.01 nM〜1 mMのイオン濃度が用いられる。これらの及びその他のイオンを組み合わせることもできる。
【０１２７】
上記のように、慢性投与又は単回投与の計画を用いることができ、治療の種類、投与経路及び小胞の種類に従って選択される。好ましい融合期間は、1〜180分、例えば1、5、10、30、60、120及び180分である。融合を停止するためには、小胞を除去する(例えばバッファーでの洗浄により)か、又は小胞の濃度を、所望の時間の終点において小胞が枯渇するようにする。融合は、小胞の送達の合計が1回又は複数回の投与により制御されるように最適化できる。例えば、融合期間が120分であれば、2回の60分の期間、4回の30分の期間、12回の10分の期間、又は24回の5分の融合期間を用いることができる。
【０１２８】
本明細書で開示される主題の治療方法について、好ましい対象は、脊椎動物対象である。好ましい脊椎動物は、恒温脊椎動物であり、好ましい恒温脊椎動物は、哺乳動物である。好ましい哺乳動物は、最も好ましくはヒトである。本明細書で用いる場合、用語「対象」は、ヒト及び動物の対象をともに含む。つまり、獣医学的な治療での使用が、本明細書で開示される主題に従って提供される。
【０１２９】
それ自体で、本明細書で開示される主題は、シベリアタイガーのように危険にさらされているので重要な哺乳動物；ヒトによる消費のために農場で飼養されている動物のように経済的に重要な哺乳動物；及び／又はペットとして若しくは動物園で飼育されている動物のようにヒトと社会的重要性がある動物とともに、ヒトのような哺乳動物の治療を提供する。このような動物の例は、限定されないが、ネコ又はイヌのような肉食動物；子ブタ(pig)、成長したブタ(hog)及びイノシシを含むブタ(swine)；畜牛(cattle)、雄牛(oxen)、ヒツジ、キリン、シカ、ヤギ、バイソン及びラクダのような反芻動物及び／又は有蹄動物；及びウマを含む。また、ヒトにとって経済的にも重要であるので、危険にさらされているか及び／又は動物園で飼育されている種類の鳥、並びに家禽、より具体的には家畜化されている家禽、すなわち飼鳥類、例えば七面鳥、鶏、アヒル、ガチョウ、ホロホロチョウなどの治療を含む鳥類の治療が提供される。つまり、限定されないが、家畜化されたブタ、反芻動物、有蹄動物、ウマ(競走馬も含む)、家禽などを含む家畜の治療も提供される。
【０１３０】
IV.A. 移植拒絶の阻害方法
本明細書で開示される主題の方法及び組成物は、例えば白血球浸潤及び活性化並びに補体の活性化を含む免疫応答の抑制により、自己移植片、異種移植片及び同種移植片における移植拒絶を予防するために用いることができる。
【０１３１】
受容者対象を傷つけるか又は予め処置することなく、自己移植片、同種移植片及び異種移植片の内皮を、選択された治療用分子からなる保護ベールで被覆する(すなわち装飾する)。例えばT細胞-アポトーシス誘発ポリペプチド、例えばFasLの場合、提供者及び受容者の活性化されたT細胞は、治療用分子に接触するとアポトーシスを受け、それにより拒絶を回避する。本明細書で開示される主題により、移植後の非特異的免疫抑制療法の、消滅でないとしても著しい低減が可能になる。
【０１３２】
その他の免疫拒絶療法に対する本明細書で開示される主題の代表的な利点は、次のことを含む：(1) 標的組織が迅速に処理され、1時間未満で機能的な外因性の治療用分子を「発現」できる；(2) 受容者対象は予め処置される必要がない；(3) 材料及び方法は、治療される組織及び受容者対象の両方にとって安全である；及び(4) 治療用分子は、細胞表面に少なくとも2週間、移植耐性の発生を可能にするのに充分長く残存できる。
【０１３３】
ある実施形態において、対象における移植された組織又は器官の拒絶を阻害する方法が提供される。ある実施形態において、該方法は、細胞、組織又は器官を、治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、該細胞、組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させることを含む。ある実施形態において、細胞、組織又は器官は、対象への移植の前に第1及び第2の組成物と接触させ、別の実施形態において、対象への移植の後に接触させる。
【０１３４】
ある実施形態において、官能化脂質は、リン脂質、例えばホスホエタノールアミンを含む。別の実施形態において、官能化脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む。ある実施形態において、テザー部分は、ビオチン、ニッケル、チオール、マレイミド、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される。さらに、ある実施形態において、治療分子のリガンド部は、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される。
【０１３５】
テザー部分及びリガンドは、互いの結合親和性に基づいて選択される。例えば、具体的な実施形態において、官能化脂質は、ビオチンに連結したホスホエタノールアミン、例えば1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)を含む。これらの実施形態において、リガンドは、ストレプトアビジン又はアビジンである。別の実施形態において、官能化脂質は、ニッケルとキレート化した1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む。これらの実施形態において、リガンドは、治療用融合ポリペプチドのような治療用分子に組み込まれたポリヒスチジンであり得る。
【０１３６】
さらに、本発明の方法は、それぞれが異なるテザー部分を含む複数の異なる官能化脂質の同時又は連続的な使用を提供する。これらの実施形態において、複数の異なる治療用分子(それぞれがテザー部分に対する結合親和性を有する異なるリガンドを含む)は、組織又は器官の細胞を標的することができ、それにより、所望により、多数の異なる治療用分子での細胞の装飾が可能になる。
【０１３７】
治療用分子は、移植時又は移植後の細胞、組織又は器官の免疫系拒絶から細胞、組織又は器官を保護するために選択できる。治療用分子は、免疫系拒絶の結果として損傷を受けた細胞、組織又は器官を治療するために選択することもできる。それ自体で、ある実施形態において、治療用分子は、T細胞アポトーシス誘発分子、補体阻害剤、T細胞補助刺激遮断分子、白血球浸潤阻害剤、新生内膜増殖阻害剤、抗凝固物質又は血栓溶解物質であり得る。ある具体的な実施形態において、治療用分子は、FasL、腫瘍壊死因子(TNF)受容体-1、TNF関連アポトーシス誘発リガンド(TRAIL)受容体DR4、TRAIL受容体DR5、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、コンプスタチン、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、細胞傷害性Tリンパ球関連タンパク質4 (CTLA-4)、抗-CD40L、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)、マトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)、神経ペプチドY (NPY)ダミー受容体、及び天然に存在するか若しくは合成の糖タンパク質又はプロテオグリカンからなる群より選択される。
【０１３８】
IV.B. 虚血-再潅流障害の阻害方法
本明細書で開示される主題は、さらに、対象における虚血-再潅流障害を予防、阻害又は治療する方法を提供する。IRIにおいて観察される免疫応答の初期段階、例えば補体活性化を阻害できる治療用分子、及び血栓形成を阻害又は血栓を溶解できる治療用分子は、細胞上を装飾して、IRIを防止、阻害又は治療することができる。ある実施形態において、該方法は、組織又は器官を、治療用分子のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む脂質小胞を含む第1組成物と接触させ、該組織又は器官を、テザー部分に結合するリガンド部を含む治療用分子を含む第2組成物と接触させることを含む。
【０１３９】
ある実施形態において、官能化脂質は、リン脂質、例えばホスホエタノールアミンを含む。別の実施形態において、官能化脂質は、1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む。ある実施形態において、テザー部分は、ビオチン、ニッケル、チオール、マレイミド、アミン及びカルボン酸からなる群より選択される。さらに、ある実施形態において、治療用分子のリガンド部は、ストレプトアビジン、アビジン、ポリヒスチジン、システインチオール基、ペプチドC-末端カルボキシ基及びペプチドN-末端アミノ基からなる群より選択される。
【０１４０】
テザー部分及びリガンドは、互いの結合親和性に基づいて選択される。例えば、ある具体的な実施形態において、官能化脂質は、ビオチンに連結したホスホエタノールアミン、例えば1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル)を含む。これらの実施形態において、リガンドは、ストレプトアビジン又はアビジンである。他の実施形態において、官能化脂質は、ニッケルとキレート化した1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル]を含む。これらの実施形態において、リガンドは、治療用融合ポリペプチドのような治療用分子に組み込まれたポリヒスチジンであり得る。
【０１４１】
さらに、本発明の方法は、それぞれが異なるテザー部分を含む複数の異なる官能化脂質の同時又は連続的な使用を提供する。これらの実施形態において、複数の異なる治療用分子(それぞれがテザー分子に対する結合親和性を有する異なるリガンドを含む)は、組織又は器官の細胞を標的することができ、それにより、所望により、多数の異なる治療用分子での細胞の装飾が可能になる。
【０１４２】
上記のように、治療用分子は、細胞、組織又は器官をIRIから保護、阻害又は治療するために選択できる。それ自体で、ある実施形態において、治療用分子は、補体阻害剤、抗凝固物質又は血栓溶解物質であり得る。ある具体的な実施形態において、治療用分子は、ワクシニアウイルス補体調節タンパク質(VCP)、補体受容体1 (CR1)、崩壊促進因子(DAF)、補体酵素の天然痘阻害剤(SPICE)、コンプスタチン、FUT-175、化合物4077、C1s-INH-248、化合物53、ヒルジン、小分子因子Xa阻害剤、小分子トロンビン阻害剤、因子IXaアプタマー阻害剤9.3tC、ウロキナーゼ、組織プラスミノゲン活性化因子(tPA)及びマトリクスメタロプロテイナーゼ(MMP)からなる群より選択される。
【０１４３】
V.    キット
本明細書で開示される主題は、さらに、内皮細胞を装飾するためのキットを提供する。ある実施形態において、キットは、活性物質のリガンド部に対する結合親和性を有するテザー部分を含む官能化脂質を含む本明細書に開示される脂質小胞と、リガンド部を含む活性物質とを含む。ある実施形態において、脂質小胞は第1容器に収納され、活性物質は第2容器に収納される。該容器は、希釈剤、バッファー及び防腐剤を含むその他の成分をさらに含み得る。
【０１４４】
小胞及び／又は活性物質は、例えば凍結乾燥により保存でき、使用前にキットの長期の貯蔵を提供できる。ある実施形態において、キットは、内皮細胞を装飾するために小胞及び活性物質を用いるための指示書も含む。
キットは、例えば移植に用いられる組織及び器官の内皮細胞を装飾するために用いることができるか、又は対象に直接投与される活性物質として用いることができる。
【実施例】
【０１４５】
実施例
以下の実施例は、説明のための実施形態を提供する。本開示及び当業者の一般的なレベルに照らして、当業者は、以下の実施例が説明のみを意図し、多数の変更、改変及び変化は、本願で請求する主題の範囲を越えずに用いることができることを認識する。
【０１４６】
実施例での材料及び方法
ビオチン融合性脂質小胞の製造。  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-オレオール-sn-グリセロール-3-ホスフェート(POPA)、及び／又はN-ビオチノイル-1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン (BDGP)を、クロロホルム中で一緒に混合する。クロロホルムを、窒素ガスに曝露することにより脂質材料から除去する。脂質フィルムは、12時間真空吸引して、微量のクロロホルムを除去する。脂質材料は、バッファー溶液(乳酸加リンゲル又は改変クレブス・ヘンゼライト)中で、25 mg/mlの濃度まで含水させる。バッファー及び脂質は、1分間ボルテックスして、多重膜小胞を作り、37℃の浴中に5分間おき、6回繰り返す。多重膜小胞は、氷浴中におき、パルス超音波処理(40%デューティサイクル)を5分間用いる。得られた小さい融合性の一枚膜小胞(FUV)は、軽く遠心分離して、超音波処理器のプローブからの微量のチタンを除去する。FUVサイズは、それらをエクストルーダを通して押し出すことにより均一にする。FUVを調製した後に、サンプルを採取して、FUVの流体力学半径の平均を、Proterion DYNAPROTM LSD粒子サイズアナライザ(Proterion Corp., Piscataway, New Jersey, U.S.A.)を用いて測定して、小胞のサイズを確認する。
【０１４７】
ニッケル融合性脂質小胞の製造。  1,2-ジオレオイル-sn-グリセロール-3-ホスホコリン(DOPC)、1-パルミトイル-2-オレオール-sn-グリセロール-3-ホスフェート(POPA)、及び／又は1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-[[N(5-アミノ-1-カルボキシペンチル)イミノ二酢酸]スクシニル] (ニッケル塩) (DOGS-NTA-Ni)を、クロロホルム中で一緒に混合する。クロロホルムを、窒素ガスに曝露することにより脂質材料から除去する。脂質フィルムは、12時間真空吸引して、微量のクロロホルムを除去する。脂質材料は、バッファー溶液(乳酸加リンゲル又は改変クレブス・ヘンゼライト)中で、25 mg/mlの濃度まで含水させる。バッファー及び脂質は、1分間ボルテックスして、多重膜小胞を作り、37℃の浴中に5分間おき、6回繰り返す。多重膜小胞は、氷浴中におき、パルス超音波処理(40%デューティサイクル)を5分間用いる。得られた小さい融合性の一枚膜小胞(FUV)は、軽く遠心分離して、超音波処理器のプローブからの微量のチタンを除去する。FUVサイズは、それらをエクストルーダを通して押し出すことにより均一にする。FUVを調製した後に、サンプルを採取して、FUVの流体力学半径の平均を、Proterion DYNAPROTM LSD粒子サイズアナライザ(Proterion Corp., Piscataway, New Jersey, U.S.A.)を用いて測定して、小胞のサイズを確認する。
【０１４８】
HUVEC系統の調製及びインキュベーション。  HUVEC (Bio Whittaker Corporation)を、12ウェルのディッシュに入れ、集密までClonetics (San Diego, California, U.S.A.)のEGM-2培地(改変MCDB 131, 5% FBS, 0.04% ヒドロコルチゾン, 0.4% hFGF, 0.1% VEGF, 0.1 % R3-IGF, 0.1 % アスコルビン酸, 0.1 % hEGF, 0.1 % GA-I 000, 0.1 % ヘパリン, pH 7.35)中で成長させる。培養培地は、毎日交換する。3〜5日後に、細胞を洗浄し、実験培地(改変MCDB 131 + 2% 熱不活化FBS)に入れ、24時間インキュベートする。細胞を、HBSS (pH 7.35)で3回洗浄する。エンドトキシンの混入の影響は、低エンドトキシンの使い捨ての細胞容器、培地及びバッファー、並びに適切なコントロール群を用いることにより低減する。
【０１４９】
虚血及び再潅流障害の研究のための後脚の調製。  動物に、ペントバルビタールナトリウム(60 mg/kg, i.p.)で麻酔をかけ、鼠蹊部を剃毛する。弁(flap)への接近は、標準的な鼠蹊部切開による。大腿動脈及び大腿静脈を、鼠蹊靭帯から下腹壁血管の分岐部まで解剖する。マーフィ枝を8/0ナイロンで結紮する。0.5 ccのヘパリン(1,000 UI/ml)を、ラットの陰茎静脈を通して投与する。10分後に、大腿骨及び神経以外の脚をラットの体から分ける。大腿動脈及び大腿静脈を、鼠蹊靭帯の近くにてクランプし、動脈を切開して24Gカテーテルを用いてカニューレを挿入する。静脈を切断し、脚を、ヘパリン処理乳酸加リンゲル溶液(1 UI/ml)で10分間潅流する。脚を、官能化脂質を有するか又は有さない種々のFUV処方を含む溶液で潅流し、インキュベーション期間の後に、FUV溶液を流す(flushed)。続いて、適切なリガンドを有する治療用分子を含む溶液で潅流する。溶液を、脚の中で特定の期間インキュベートし、乳酸加リンゲルで流す。動脈及び静脈を修復し、血流を再び流す。
【０１５０】
ラット後脚からの内皮細胞の単離。  内皮細胞を、コラゲナーゼを用いて後脚の循環から単離する。簡単に、血管をコラゲナーゼ(PBSに溶解した2%)で短く潅流し、遠位及び近位にてクランプし、20分間インキュベートする。遠位のクランプを開放し、コラゲナーゼ／細胞懸濁物を単離する。細胞へのコラゲナーゼの影響を阻害するために、10% FBS溶液を加えて単離する。単離物を200×gで10分間遠心分離して、細胞をペレットにする。細胞をPBS中で3回洗浄して、分析のためにプレートに入れる。
【０１５１】
ラットの心臓移植：提供者手術。  ラットに麻酔をかけ(ペントバルビタールナトリウム60 mg/kg, i.p.)、準備して剃毛し、100 VIヘパリンを肝下下大静脈に注入する。左右の側背の切開により胸部を開き、横隔膜を前胸壁から分離する。右の上大静脈を結紮し、結紮部の遠位側で切断する。大動脈の最初の枝を6-0絹縫合糸で結紮し、縫合糸を大動脈の最初の枝に保持する。左の上大静脈、肺動脈、肺静脈及び奇静脈を一緒に4-0絹縫合糸で結紮する。次いで、心臓を提供者から回収し、冷乳酸加リンゲル液中に貯蔵する。
受容者手術。  受容者の首を剃毛した後に、右の前外側首の切開を行う。移植された心臓を緩く収容するためのポケットを作るために、皮膚を皮下組織から分離する。頚静脈をその入ってくる枝から単離し、総頚動脈を、鎖骨下動脈から可能な限り遠くで離れて結紮する。移植した心臓の右の上大静脈と受容者の頚静脈、及び提供者の大動脈と受容者の総頚動脈との吻合は、10/0ナイロンを用いて行う。強力なクランプを全て除去し、鼓動している移植片がうっ血していないことを確認して、切開部を、連続抱合の一層を用いて閉じる。
【０１５２】
皮膚弁移植術：提供者外科手術。  ACIラット提供者からの遊離の上腹部の鼠蹊弁を、以前に記載されたようにして浮揚させる(Fernandez-Botranら, 2002, Transplantation, 74:623〜629)。弁は、5 cm2の大きさであり、皮膚、皮筋、皮下脂肪、上腹部脂肪褥、鼠蹊リンパ節及び大腿静脈を含んでいる。動物にペントバルビタールナトリウム(60 mg/kg, i.p.)で麻酔をかけ、鼠蹊部を剃毛する。弁への接近は、標準的な鼠蹊部切開による。大腿動脈及び大腿静脈を、鼠蹊部靭帯から下腹壁血管の分岐部まで解剖する。大腿血管の遠位末端を、8-0ナイロンを用いて結紮する。単離した弁を、ヘパリン処理乳酸加リンゲル液で、大腿動脈を通して10分間流す(静脈還流はさえぎらない)。流すことの最後に、大腿血管の近位末端をクランプし、弁を、上腹部血管及び脂肪褥とともにその全体で浮揚させる。
受容者外科手術。  ヌードラット受容者にイソフロラン(isoflourane) 2〜5%で麻酔をかけ、首領域の腹側の面を剃毛する。右の外頚動脈(ECA)及び外頚静脈(EJV)を露出させ、ECAを、頚部交感神経叢から注意して分離し、近位にてクランプし、切断する。EJVは遠位にてクランプし、切断する。次いで、弁を4つの支持縫合糸で首の領域におき、血管吻合術を、大腿動脈とECAとの間、及び大腿静脈とEJVとの間で行う。皮膚を6-0ナイロンを用いて閉じる。
【０１５３】
静脈血栓症ラットモデル。  麻酔の誘導の後に(2〜5%イソフロラン)、動物の右の鼠蹊部に、膝の方に向かって2 cm延びる長手方向の切開を作成する。この切開を通して、右の大腿静脈を、近位で鼠蹊部靭帯と遠位で浅枝上腹部枝との間で自由になるように、注意深く解剖する。右の大腿静脈に、FLV含有治療溶液の逆流注入のためのカニューレを挿入する。血管のクランプを、単離したセグメントの遠位末端において、治療溶液を捕捉する。溶液は、興味のあるセグメント内に所定の時間残存する。次いで、カニューレを通してシリンジを用いて溶液を吸引し、静脈を、通常の乳酸加リンゲル液で流す。静脈を流した直後に、カニューレを通してHN-SA含有溶液を静脈に注入し、30分間残存させる。次いで、溶液を吸引し、静脈をリンゲル液で流し、カニューレを取り除き、静脈を修復し、遠位の静脈のクランプを開放して、通常の血流を通らせる。再潅流の1時間後に、動物を、コンピュータに接続されたデジタルビデオカメラを備えた解剖顕微鏡の下に置く。心拍数及び血圧を監視する。動物の体温も、腹膜内温度計で監視し、調節可能な熱パッドを用いて36〜37℃に維持する。標準化された血栓形成性損傷を、1500 g/mm2のピンチ圧力を奏する特別に設計された鉗子を用いて静脈内に作成する。別の実験において、2.5%〜10%の塩化第二鉄溶液を静脈に局所的に適用して、血栓形成を誘発する。血栓形成のパターンを観察して測定するために、トランスイルミネータを静脈の下におき、PC中のビデオカードに接続されたImaging Source FireWireデジタルビデオカメラ(DFK 31F03)を備える三眼視立体顕微鏡(Carl Zeiss Jena)を用いて、イメージを視覚化して記録する。また、ドップラーフロープローブを大腿静脈の近位末端において、血流及び血管閉塞を監視する。血管閉塞を完全にする時間を測定する。
【０１５４】
実施例1
融合性脂質小胞
ここに記載されるFUVは、リン脂質1,2 ジオレオイル-sn-グリセロール- 3-ホスホコリン(DOPC)、l-パルミトイル-2-オレオイル-sn-グリセロール-3-ホスフェート(POPA)、及びジオレオイルエチルホスファチジルコリン(DOPC-E)を含む。FUVの細胞へのインビトロでの融合速度(FUVの種類当たりn=6)を決定した。DOPC単独、DOPC/DOPC-E又はDOPC/POPAを含む小さい一枚膜小胞を、1 mMカルボキシフルオレセイン含有溶液中で作製した。ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、カルボキシフルオレセインを装填した小胞とインキュベートし、時間に対する送達速度を定量した。結果は、カルボキシフルオレセインの細胞への送達の動態が、脂質小胞の組成に高く依存することを証明した。DOPC小胞は、対数送達速度を示し、最初の30分間はほとんど又は全く融合が観察されなかった。この種類の送達速度は、融合よりもエンドサイトーシスにより特徴的である。対照的に、DOPC/DOPC-Eは、初期の速度はより速いが、より遅い最終速度を示した。送達の最高速度は、DOPC/POPA FUVを用いて見出され、これは、カルボキシフルオレセインの著しい送達が5分以内に観察される指数送達速度を示した。この種類の送達速度は、エンドサイトーシスよりも融合に特徴的である。3種全ての小胞は、細胞の拡散蛍光染色を60分以内に達成することができた。DOPC/POPA混合物は、2分未満で完全拡散染色を達成した。
【０１５５】
実施例2
インビトロで潅流したときに内皮細胞膜に取り込まれる融合性小胞からの脂質
1 BDGP/ 5 DOPCリン脂質の比でDOPC/POPAとビオチン化脂質(N-ビオチノイル-1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン(BDGP); Molecular Probes, Eugene Oregon, U.S.A.)とからなる融合性小胞を調製した。HUVEC細胞培養物を融合性小胞と60分間インキュベートし、培養物を3回洗浄し、次いで培養物を1 mlの蛍光SA (0.5 mg/ml)と15分間インキュベートした。次いで、培養物を再び3回洗浄した。コントロールとして、ビオチン化リン脂質をDOPC/POPAから融合性小胞に組み込まずに同じ計画を行った。実験結果は、洗浄後に、ビオチン化FUVで処理した群の明るく輝く細胞に比べて、コントロールの細胞がほとんど蛍光を示さなかったことを示した。これらの結果は、ビオチンテザーがHUVEC細胞膜に取り込まれて、蛍光標識SAに結合できたことを明確に示す。
【０１５６】
実施例3
インビボで潅流したときに内皮細胞膜に取り込まれる融合性小胞からの脂質
微細血管の内皮細胞と融合するFUVの能力を、DOPC/POPA及び蛍光標識リン脂質である1,2-ジオレオイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(カルボキシフルオレセイン) (DOPE-CF)を用いて調べた。単離(単一の茎(pedicle))したラット精巣挙筋調製物及び蛍光生体内ビデオ顕微鏡を用いて、FUVの内皮細胞への融合を観察した。懸垂体を単離した後に、血液を塩水で流し出し、続いてDOPC/POPA/DOPE-CFで作られたFUVを注入した。注入の直後に、懸垂体の茎を20分間クランプした。微小クランプを取り除き、懸垂体を再潅流させた。遊離の蛍光FUVは血流により洗い流されるので、血管の端がハロ効果を示す可視の蛍光微小血管ツリーが残っており、このことは蛍光リン脂質が内皮細胞膜に取り込まれたことを示した。2時間の再潅流の後に、蛍光強度は変わらず、このことは、単に細胞表面上で凝集するよりはむしろ、細胞膜へのFUVの実際の融合が起こったことを示唆した。組織を切断して蛍光顕微鏡の下で観察したところ、内皮は、内皮の明確な蛍光染色により、周囲の組織から明らかに突出していた。また、より明確ではないが、血管の周囲の筋肉繊維は蛍光で染色され、融合性小胞がいくつかの点から脈管構造を出て行き、血管を取り囲む細胞と融合したことを示した。
【０１５７】
実施例4
融合性小胞を用いて、キメラ分子をインビボで内皮細胞表面に少なくとも14日間連結させることができる
ウィスターフュルト(WF)ラットに麻酔をかけ、外科手術の準備をした。大腿血管を解剖し、後脚を、骨及び神経(大腿及び坐骨)以外は体から分離した。動脈をクランプし、カニューレを挿入し、静脈をクランプし、クランプから遠位で切断した。脚にヘパリン処理乳酸加リンゲル液を10分間流した。脚に3 mlの乳酸加リンゲル溶液を潅流させ、血管を1時間クランプした。1時間後に、脚に乳酸加リンゲル液を10分間流し、次いで、脚に1mlの蛍光ストレプトアビジン(0.1 mg)を潅流させた。15分間のインキュベーションの後に、脚に乳酸加リンゲル溶液を10分間、再び流した。1a群(ネガティブコントロール)において、5%ホルマリンでの固定後に大腿動脈及び大腿静脈を回収した。血管を、5ミクロンの厚さの10の横断面で切断し、蛍光強度を定量した。1b群(ネガティブコントロール)において、血管を再び吻合し、後脚筋及び皮膚を外科的に再び連結した。動物を14日間追跡した。次いで、動物に麻酔をかけ、失血させ(exanguinated)、5%ホルマリン溶液を潅流させた。血管を解離させ、横断面で切断し、1a群のようにして分析した。
【０１５８】
2a群及び2b群は、ストレプトアビジンが非ビオチン化融合性小胞に曝露された内皮に結合しないことを示すコントロール群であった。ラットを、脚をDOPC/POPAのみを含有する(BDPGなし) 3 mlの融合性小胞で潅流した以外は、1a群及び1b群について上述したのと同じ方法で準備した。血管をクランプした。1時間後に、脚を上記のようにして流し、1mlの蛍光ストレプトアビジン(0.1 mg)を潅流させた。15分間のインキュベーションの後に、脚を再び流した。蛍光の量を、1a群及び1b群について記載したようにして測定した。両方の群について、ほとんど蛍光は観察されなかった。
【０１５９】
3a群及び3b群は、ストレプトアビジンがビオチン化融合性小胞に曝露された内皮に結合しないことを示す実験群であった。ラットを、脚を3 mlの融合性小胞で潅流した以外は、1a群及び1b群について記載したようにして準備した。血管をクランプした。1時間後に、脚を上記のようにして流し、1mlの蛍光ストレプトアビジン(0.1 mg)を潅流させた。15分間のインキュベーションの後に、脚を再び流した。蛍光の量を、1a群及び1b群について記載したようにして測定した。実験動物とコントロール動物との間に、著しい差が認められた。
【０１６０】
これらの知見は、ビオチン化リン脂質が融合性小胞の助けにより内皮細胞膜に効果的に組み込まれることの証明となる。これらのビオチン化リン脂質は、内皮をストレプトアビジン(SA)及びSAベースの融合又はキメラタンパク質で官能化するテザーとして用い得る。
【０１６１】
実施例5
ビオチン化の割合の最適化
融合性小胞中のビオチンの最適量を決定した。融合性小胞は、種々のレベルでビオチン化して調製し、培養内皮細胞に最大量のビオチン化リン脂質を組み込むことができる小胞を決定した。HUVEC細胞をペトリ皿中で準備し、5% CO2中で37℃にてインキュベートした。FUVを、表1で同定される組成で調製した。
【０１６２】
【表１】
2008540341.tif 000016
【０１６３】
3つの実験を、HUVEC単層で被覆した96ウェルプレートで行った。各実験において、4つのウェルを5つの処方のそれぞれに割り当てた。残ったウェルをコントロールとして用いた。HUVEC単層を、本明細書に記載される処方に従って調製した融合性小胞1mlに曝露し、20、40及び60分間インキュベートした。細胞をHBSS培地で3回洗浄し、1 mlの蛍光ストレプトアビジン (Molecular Probes, Eugene, Oregon, U.S.A.)(0.1mg/ml)で15分間インキュベートした。細胞を再び3回洗浄した。ウェル当たりの蛍光量を、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて測定した。手順を3回繰り返して、どの処方が内皮細胞膜にビオチン化脂質を取り込むのに最も効率的であるかを確立した。結果は、1/25 BDGP/DOPC組成が、40分間インキュベートしたときに、最大のビオチン化範囲を与えたことを示した。
【０１６４】
実施例6
ニッケル化の割合の最適化
融合性小胞中のニッケルの最適量を決定できる。融合性小胞は、種々のレベルでビオチン化して調製し、培養内皮細胞に最大量のビオチン化リン脂質を組み込むことができる小胞を決定する。HUVEC細胞をペトリ皿中で準備し、5% CO2中で37℃にてインキュベートできる。FUVを、表2で同定される組成で調製できる。
【０１６５】
【表２】
2008540341.tif 000017
【０１６６】
3つの実験を、HUVEC単層で被覆した96ウェルプレートで行う。各実験において、4つのウェルを5つの処方のそれぞれに割り当てる。残ったウェルをコントロールとして用いる。HUVEC単層を、本明細書に記載される処方に従って調製した融合性小胞1mlに曝露し、1時間インキュベートする。細胞をHBSS培地で3回洗浄し、1 mlの6×His (ポリヒスチジン)タグ付加GFP (緑色蛍光タンパク質[Qiagen])(0.1mg/ml)と15分間インキュベートする。細胞を再び3回洗浄する。ウェル当たりの蛍光量を、マイクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて測定する。手順を3回繰り返して、どの処方が内皮細胞膜にビオチン化脂質を取り込むのに最も効率的であるかを確立した。
【０１６７】
実施例7
キメラSA-FasLポリペプチドは、天然のストレプトアビジンのビオチン結合能力を維持する
SA-FasLが内皮膜においてビオチン化リン脂質に結合できるかを決定するために、HUVECを96ウェルプレートに入れ、単層にさせる。実験は、3回繰り返す。各実験において、6つのウェルを3つのビオチン化FUV処方に割り当て、残りのウェルはコントロールとして用いる。HUVEC単層を、ビオチン化FUVと1時間インキュベートする。インキュベーションの後に、細胞を3回洗浄し、1 mlのSA-FasL (100 ng - M.W. 32 kDa)と15分間インキュベートする。細胞を3回洗浄し、抗-FasL蛍光ポリクローナル抗体(Santa Cruz Biotech)と20分間インキュベートし、3回洗浄する。ウェル当たりの蛍光量をマクロプレートリーダー(Molecular Devices)を用いて測定する。結果を統計的に分析し、コントロールの値と比較する。コントロールとして、HUVEC単層をビオチン化HBSS、非ビオチン化融合性小胞、及びその両方とともに1時間インキュベートする。
【０１６８】
実施例8
結合したSA-FasLの有効性
内皮細胞上のリン脂質につながれたストレプトアビジン-FasL (SA-FasL)と接触する活性化T細胞は、アポトーシスを受けることができる。3つの実験群において、ACIで感作された WFラットからの脾細胞を回収して、インビトロで内皮ACI細胞に曝露する。次に、WF脾細胞を分離し、ヌード受容者ラット(PVG rnu/rnu)に養子細胞移入する。次いで、ヌードラットにACI血管新生化皮膚弁を移植し、拒絶を観察する。
【０１６９】
1群は、ネガティブコントロール群である。第-7日に、ACIラットに107 ACI脾細胞を注入する。第-4日に、ヌードラットに、首領域においてACT皮膚弁を移植する。第-4日に、脾細胞を自己感作されたACIラットから回収し、共培養反応においてACI内皮細胞に曝露する。第0日に、脾細胞を単離し、PI及びフローサイトメトリにおいてアネキシンV-FITCを用いてアポトーシスの表現型を評価する。1000万(107)の脾細胞を、ヌードラット受容者の陰茎静脈に注入する。ヌードラットを28日間追跡し、術後0、2、7及び14日で、又は拒絶若しくは移植片対宿主病(GVHD)の徴候が起こったときに、生検を採取する。第28日にラットを安楽死させ、皮膚弁、並びに舌、耳、肝臓及び小腸のサンプルを回収する。後者は、ヌードラット受容者におけるGVHDの発生の可能性を評価するのに貢献する。移植されたACI皮膚弁の拒絶は予想されない。
【０１７０】
2群は、ポジティブコントロール群である。第-7日に、WFラットに107 ACI脾細胞を注入する。第-4日に、ヌードラットに、首領域においてACT皮膚弁を移植する。また第-4日に、脾細胞を同種感作されたWFラットから単離し、共培養においてACI内皮細胞に曝露する。第0日に、脾細胞を回収し、107をヌードラット受容者の陰茎静脈に注入する。1群について記載したようにしてラットを追跡し、安楽死させる。移植されたACI皮膚弁の強い拒絶が予想される。
【０１７１】
3群は、実験群である。第-7日に、WFラットに107 ACI脾細胞を注入する。第-4日に、ヌードラットに、首領域においてACI皮膚弁を移植する。また第-4日に、脾細胞を同種感作されたWFラットから単離し、共培養において、本明細書に記載される手順を用いてSA-FasLで被覆されたACI内皮細胞に曝露する。第0日に、脾細胞を回収し、107脾細胞をヌードラット受容者の陰茎静脈に注入する。1群について記載したようにしてラットを追跡し、安楽死させる。
【０１７２】
実施例9
融合性小胞及びSA-FasLでの潅流は、移植されたラットの心臓の免疫拒絶を遅らせるか又は妨げる
異所(heterotopic)ラット心臓移植のモデルを用いて、ビオチン化リン脂質テザーを介してSA-FasLで被覆した心臓同種移植片の内皮が、インビボでの免疫拒絶に対して保護されるかを決定する。I群はコントロール群である。WF及びACIラットを調製し、第0日に麻酔をかける。心臓をACIドナーから回収し、以前に記載されたようにして調製し、冷乳酸加リンゲル液で潅流し、クランプし、1時間インキュベートし、WF受容者の首に皮下移植した。吻合に用いた血管は、頚動脈及び頚静脈である。受容者を12週間追跡する。拒絶は、首を触診し、心臓がまだ鼓動しているかを評価することにより監視する。12週間、又は心臓が拒絶されるならばそれより前に、受容者を安楽死させ、血液及び心臓を組織学的研究のために回収する。特に、組織拒絶の階級及び内皮上のSA-FasLの存在を評価する。
【０１７３】
2群は、実験群である。実験は、ACI心臓を潅流するのに用いる溶液以外は1群について記載したようにして行う。上記の冷乳酸加リンゲル液の代わりに、2群の心臓を、冷乳酸加リンゲル液中にビオチン化脂質を含む最適化された融合性小胞で潅流する。1時間のインキュベーションの後に、1mlのSA-FasL (100ng)を冠動脈に注入し、心臓の移植を完結させる。2群の移植された心臓は長期間生存するが、1群の移植された心臓は約9日で完全に拒絶されることが予想される。
【０１７４】
実施例10
6×His-VCPポリペプチドはニッケル結合能力を有する
本実施例は、6×His-VCPキメラポリペプチド中のポリヒスチジン部分がニッケル結合能力を有するか否かを決定することに関係する。実験は、培養されたHUVECを用いて行う。全部で12群を用いることができる。実験は、各群に8つのウェルを割り当てた96ウェルプレートを用いる。実験は3回繰り返す。細胞ベースの蛍光アッセイを用いて、2〜12群の処理の効果を定量する。2〜6群はネガティブコントロールであり、7〜12群は、ニッケル化内皮細胞を異なる濃度の6×His-VCPで処理する実験群である。細胞当たりの6×His-VCPの被覆の平均パーセントを算出する。
1群(細胞計数コントロール)。  1群を用いて、ウェル当たりの細胞数を決定する。各実験の最後に、96ウェル全てからの培地を回収し、プレートを凍結させる。24時間後にプレートを融解し、200μLのCyQUANT GR (登録商標)色素/細胞溶解バッファー(Molecular Probes)を1群のウェルに加える。次いで、プレートを完全な暗所で室温にて5分間インキュベートする。各ウェルの蛍光を、励起及び発光フィルタをそれぞれ約480 nm及び約520 nmに設定したプレートリーダーを用いて測定する。8つのウェルからの平均蛍光を決定して、これを用いて標準曲線からウェル当たりの細胞数を算出する。各プレート中の96ウェル全てが同じ細胞密度で播種されているので、1群は、ウェル当たりの平均細胞数を定量する役目を果たす。
【０１７５】
2〜6群。  2〜6群はネガティブコントロールであり、ニッケルテザーなしでの6×His-VCPの細胞への非特異的結合、又は6×His-VCPで処理されていない細胞への抗-VCP抗体の非特異的結合を決定する役目を果たす。細胞をHBSS、非ニッケル化FUV又はNi-FUVのいずれかとインキュベートする。
2群(未処理コントロール)。  HUVECをHBSSと30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、HBSSとさらに30分間インキュベートする。インキュベーション期間の最後に、一次抗-VCP抗体(200μL)を加え、30分間インキュベートする。次いで、二次蛍光抗体を加えて15分間インキュベートする。蛍光を定量する。2群は、抗-VCP抗体のNi-FUV又は6×His-VCPを受けていないHUVECへの非特異的結合を測定する役目を果たす。2群の細胞は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。この群の細胞はHBSSのみとインキュベートするが、これらを他の群と同じ実験手順に曝すためにこれらを30分洗浄することが記載される。
【０１７６】
3群(6×His-VCPコントロールの非特異的結合)。  3群の実験手順は、HUVECをHBSSと30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、200μLの100 ng/mL 6×His-VCP溶液と30分間インキュベートする以外は、2群の手順と同じである。3群は、6×His-VCPのHUVECへの非特異的結合を測定する役目を果たす。3群は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。
4群(FUVコントロールで処理された細胞への抗-VCPの非特異的結合)。  4群の実験手順は、HUVECを200μLの非ニッケル化FUV溶液と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、200μLのHBSSでさらに30分間インキュベートする以外は、2群の手順と同じである。3群は、非ニッケル化FUVで処理されたHUVECへの抗-VCPの非特異的結合を測定する役目を果たす。4群は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。
【０１７７】
5群(FUVコントロールで処理された細胞への6×His-VCPの非特異的結合)。  5群の実験手順は、HUVECを200μLの非ニッケル化FUV溶液と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、200μLの100 ng/ml 6×His-VCP溶液でさらに30分間インキュベートする以外は、2群の手順と同じである。5群は、非ニッケル化FUV及び6×His-VCPで処理したHUVECへの6×His-VCPの非特異的結合を測定する役目を果たす。5群は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。
【０１７８】
6群(Ni-FUVコントロールで処理した細胞への抗VCPの非特異的結合)。  6群の実験手順は、HUVECをNi-FUV溶液と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、HBSSでさらに30分間インキュベートする以外は、2群の手順と同じである。6群は、Ni-FUVのみで処理したHUVECへの抗-VCP抗体の非特異的結合を測定する役目を果たす。6群は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。
【０１７９】
7〜12群(実験群 - 6×His-VCPのニッケルへの特異的結合)。  7〜12群の実験手順は、HUVECを200μLのNi-FUV溶液と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、200μLの次の濃度の1つの6×His-VCP溶液と30分間インキュベートすること以外は、2群の手順と同じである：100 pg/mL (7群)、1 ng/mL (8群)、10 ng/mL (9群)、100 ng/mL (10群)、1μg/mL (11群)又は10μg/mL (12群)。これらの群は、細胞膜の最大のタンパク質被覆を得るために必要な6×His-VCPの最小濃度を決定する役目を果たす。
【０１８０】
実施例11
ストレプトアビジン-VCP融合タンパク質(SA-VCP)の構築
構築するポリペプチドは、ワクシニア補体調節タンパク質(VCP)と、ストレプトミセス・アビジニイ(Streptomyces avidinii)からのストレプトアビジン(SA)との融合である。VCPドメインは、キメラタンパク質の免疫調節効果を媒介し、SAドメインは、タンパク質を血管内皮上のビオチンテザーに標的させるために用いられる。SA-VCP融合タンパク質は、遺伝子レベルで構築した。865塩基対のDNAを含有する融合遺伝子は、VCP触媒ドメインとSA結合ドメインとを含有する融合タンパク質をコードする。まず、VCP及びSAタンパク質の構成性要素をコードする遺伝子配列を、NCBIのGenBankデータベースから得た。融合の結合及び発現ベクタークローニングのための適切な制限酵素の実行可能性の評価の際に、32個のオリゴヌクレオチドプライマーをInvitrogen, Inc.から注文した。プライマーは、13塩基対の重複を有する40マーのフォワード及びリバースを含む。プライマーは、共有結合型の連結の作製において、95%のフォワード反応においてT4-ポリヌクレオチドキナーゼ(PNK)で不可逆的にリン酸化される。Pfu DNAリガーゼを用いるその後のリガーゼ連鎖反応(LCR)において、重複セグメントは、特異的ヌクレオチドプライマーに挟まれた領域に沿った正しい順序でプライマーをアニールして連結させるように導いた。PCR (Taqポリメラーゼを用いる)を付加的に用いて、電気泳動での検出のために、LCR産物を増幅させた。
【０１８１】
この計画を用いて、遺伝子産物全体についての正しい塩基対の長さのセグメントを合成して回収する。PCR技術を用いて、VCPの4つの領域を全長構築物中に連結する。正しいクローニング配置を、DNA配列決定により確認した。遺伝子構築物を、ピキア・パストリス(Pischia pastoris)酵母細胞に、市販のpPIC9Kベクター(Invitrogen)を用いてクローニングした。発現の際に、タンパク質を培養培地から回収し、アフィニティクロマトグラフィーを用いて精製する。キメラタンパク質の適切な発現と精製プロセスを、ウェスタンブロット分析により確認した。
【０１８２】
実施例12
キメラSA-VCPポリペプチドは、天然のストレプトアビジンのビオチン結合能力を維持する
本実施例は、SA-VCPキメラポリペプチド中のストレプトアビジンがそのビオチン結合能力を保持するか否かを決定することに関係する。実験は、培養されたHUVECを用いて行う。全部で12群を用いることができる。実験は、各群に8つのウェルを割り当てた96ウェルプレートを用いる。実験は3回繰り返す。細胞ベースの蛍光アッセイを用いて、2〜12群の処理の効果を定量する。2〜6群はネガティブコントロールであり、7〜12群は、ビオチン化内皮細胞を異なる濃度のSA-VCPで処理する実験群である。細胞当たりのSA-VCPの平均パーセント被覆を算出する。
1群(細胞計数コントロール)。  1群を用いてウェル当たりの細胞数を決定する。各実験の最後に、96ウェル全てからの培地を回収し、プレートを凍結させる。24時間後にプレートを融解し、200μLのCyQUANT GR (登録商標)色素/細胞溶解バッファー(Molecular Probes)を1群のウェルに加える。次いで、プレートを完全な暗所で室温にて5分間インキュベートする。各ウェルの蛍光を、励起及び発光フィルタをそれぞれ約480 nm及び約520 nmに設定したプレートリーダーを用いて測定する。8つのウェルからの平均蛍光を決定して、これを用いて標準曲線からウェル当たりの細胞数を算出する。各プレート中の96ウェル全てが同じ細胞密度で播種されているので、1群は、ウェル当たりの平均細胞数を定量する役目を果たす。
【０１８３】
2〜6群。  2〜6群はネガティブコントロールであり、ビオチンテザーなしでのSA-VCPの細胞への非特異的結合、又はSA-VCPで処理されていない細胞への抗-VCP抗体の非特異的結合を決定する役目を果たす。細胞を、HBSS、非ビオチン化FLV又はBioFLVのいずれかとインキュベートする。
2群(未処理コントロール)。  HUVECをHBSSと30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、HBSSとさらに30分間インキュベートする。インキュベーション期間の最後に、一次抗-VCP抗体(200μL)を加え、30分間インキュベートする。次いで、二次蛍光抗体を加えて15分間インキュベートする。蛍光を定量する。2群は、抗-VCP抗体のBioFLV又はSA-VCPを受けていないHUVECへの非特異的結合を測定する役目を果たす。2群の細胞は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。この群の細胞はHBSSのみとインキュベートするが、これらを他の群と同じ実験手順に曝すためにこれらを30分洗浄することが記載される。
【０１８４】
3群(SA-VCPコントロールの非特異的結合)。  3群の実験手順は、HUVECをHBSSと30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、200μLの100 ng/mL SA-VCP溶液と30分間インキュベートする以外は、2群の手順と同じである。3群は、SA-VCPのHUVECへの非特異的結合を測定する役目を果たす。3群は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。
4群(FUVコントロールで処理された細胞への抗-VCPの非特異的結合)。  4群の実験手順は、HUVECを200μLの非ビオチン化FUV溶液と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、200μLのHBSSでさらに30分間インキュベートする以外は、2群の手順と同じである。3群は、非ビオチン化FUVで処理されたHUVECへの抗-VCPの非特異的結合を測定する役目を果たす。4群は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。
【０１８５】
5群(FUVコントロールで処理された細胞へのSA-VCPの非特異的結合)。  5群の実験手順は、HUVECを200μLの非ビオチン化FUV溶液と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、200μLの100 ng/ml SA-VCP溶液でさらに30分間インキュベートする以外は、2群の手順と同じである。5群は、非ビオチン化FUV及びSA-VCPで処理したHUVECへのSA-VCPの非特異的結合を測定する役目を果たす。5群は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。
【０１８６】
6群(ビオチン化FUVコントロールで処理した細胞への抗VCPの非特異的結合)。  6群の実験手順は、HUVECをビオチン化FUV溶液と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、HBSSでさらに30分間インキュベートする以外は、2群の手順と同じである。6群は、ビオチン化FUVのみで処理したHUVECへの抗-VCP抗体の非特異的結合を測定する役目を果たす。6群は、抗-VCP抗体の結合をほとんど又は全く示さないと予想される。
【０１８７】
7〜12群(実験群 - SA-VCPのビオチンへの特異的結合)。  7〜12群の実験手順は、HUVECを200μLのビオチン化FUV溶液と30分間インキュベートし、HBSSで3回洗浄し、200μLの次の濃度の1つのSA-VCP溶液と30分間インキュベートすること以外は、2群の手順と同じである：100 pg/mL (7群)、1 ng/mL (8群)、10 ng/mL (9群)、100 ng/mL (10群)、1μg/mL (11群)又は10μg/mL (12群)。これらの群は、細胞膜の最大のタンパク質被覆を得るために必要なSA-VCPの最小濃度を決定する役目を果たす。
【０１８８】
実施例13
ヒルジン-コアストレプトアビジン(HN-SA)タンパク質の構築
本実施例は、我々のビオチン化FUVと働くように設計された抗血栓キメラタンパク質の構築を説明する。構築されるタンパク質は、ヒルの唾液からの天然のHNと、ストレプトミセス・アビジニイからのコアストレプトアビジン(SA)との融合である。HNドメインは、キメラタンパク質の抗血栓効果を媒介でき、SAドメインは、タンパク質を血管内皮上のビオチンテザーに標的させるために用いられる。SAはビオチンに堅く結合し、これは、本明細書に開示されるビオチン化FUVにより血管内皮細胞の表面上に効率的に組み込まれ得る。HN-SA融合タンパク質は、遺伝子レベルで構築できる。SAドメインとHNドメインの順序が異なる遺伝子の2つの形を作成する。遺伝子の各バージョンは、長さ約700 DNA塩基対であり、フレキシブルリンカー(スタンダード(Gly4-Ser)3を用い得る)により分けられたHNドメインとSAドメインの両方を含有する。HN要素及びSA要素の配列はともに、NCBIのGene bankデータベースに開示される。コーディング配列は、ピキア・パストリスでの最適発現のために最適化されたコドンであり得る。さらに、ドメイン同士を交換し、コーディング配列全体をシャトル輸送するための制限部位を含む。合成の後に、両方のHN-SA融合遺伝子を、ピキアでの発現、ゲノムへの組込み、及び選択のための要素を含有する発現ベクターにクローニングする。形質転換の後に、最高発現レベルのクローンをタンパク質産生のために選択する。発現は、ウェスタンブロット分析により決定する(抗-SA抗体を用いる)。発現の際に、HN-SAタンパク質を上清から回収し、アフィニティクロマトグラフィーにより精製する(SAドメインについても)。2つの融合タンパク質のそれぞれのHN機能を野生型HNと比較する。HN-SAを精製した後に、融合タンパク質又は野生型HNの種々の濃度を1 mLの新しく採取したラットの血液と混合し、エカリン凝固時間(ECT)を、ECTテストカード(Pharmanetics Inc, Cary,North Carolina, U.S.A.)を用いて測定する。2つの異なるHN-SAタンパク質及び野生型HNを用いて作製した曲線を互いに比較する。
【０１８９】
実施例14
ヒルジン-ポリヒスチジン(HN-6×His)の構築
本実施例は、本明細書に開示されるニッケル化FUVと働くように設計された抗血栓キメラタンパク質の構築を説明する。構築されるタンパク質は、ヒルの唾液からの天然のHNと6ポリヒスチジンペプチド(6×His)との融合である。HNドメインは、キメラタンパク質の抗血栓効果を媒介でき、Hisドメインは、タンパク質を血管内皮上のニッケルテザーに標的させるために用いることができる。Hisはニッケルに堅く結合し、これが本明細書に開示されるニッケル化FUVにより血管内皮細胞の表面上に効果的に取り込まれ得る。HN-6×His融合タンパク質は、遺伝子レベルで構築できる。6×HisとHNドメインの順序が異なる遺伝子の2つの形を作成する。HN-6×His遺伝子は、長さ約220 DNA塩基対であり、フレキシブルリンカー(最初はスタンダード(Gly4-Ser)3が用いられる)により分けられている場合もあるHNと6×Hisドメインの両方を含有する。HNの配列は、NCBIのGene bankデータベースに開示される。コーディング配列は、ピキア・パストリスでの最適発現のために最適化されたコドンであり得る。さらに、ドメイン同士を交換し、コーディング配列全体をシャトル輸送するための制限部位を含む。合成の後に、両方のHN-6×His融合遺伝子を、ピキアでの発現、ゲノムへの組込み、及び選択のための要素を含有する発現ベクターにクローニングする。形質転換の後に、最高発現レベルのクローンをタンパク質産生のために選択する。発現は、ウェスタンブロット分析により決定する(抗-His抗体を用いる)。発現の際に、HN-6×Hisタンパク質を上清から回収し、アフィニティクロマトグラフィーにより精製する(Hisドメインについて)。2つの構築された融合タンパク質のそれぞれのHN機能を野生型HNと比較する。HN-6×Hisを精製した後に、融合タンパク質又は野生型HNの種々の濃度を1 mLの新しく採取したラットの血液と混合し、エカリン凝固時間(ECT)を、ECTテストカード(Pharmanetics Inc, Cary,North Carolina, U.S.A.)を用いて測定する。2つの異なるHN-6×Hisタンパク質及び野生型HNを用いて作製した曲線を互いに比較する。
【０１９０】
実施例15
HN-SAのビオチンテザーへの結合動態の決定
これらの実験において、HN-SAのビオチンテザーへの結合動態を定量する。タンパク質による細胞の最大の被覆に必要なHN-SAの最小濃度を、ビオチンテザーの最大数が培養HUVECの表面上に提示されるときに定量する。6つの実験群を含み得る。実験は、各群に8つのウェルを割り当てた96ウェルプレートを用いる。HUVECは、DOPC、POPA及び1,2-ジヘキサデカノイル-sn-グリセロ-3-ホスホエタノールアミン-N-(ビオチニル) (BDPG)の組み合わせで作製したビオチン化FUVを用いてビオチン化する。各実験群において、HUVECを異なる濃度のHN-SAで処理する。細胞ベースの蛍光アッセイを用いて、細胞に結合したHN-SAの量を定量する。細胞当たりのHN-SAの平均パーセント被覆を算出する。いくつかのコントロール群を含んで、HN-SAの非ビオチン化HUVECへの、又は抗-HN抗体の未処理の細胞へのいずれの非特異的結合の発生を決定する。各実験において、CyQUANT (登録商標)細胞増殖アッセイキット(Molecular Probes)を用いてウェル当たりの細胞の平均数を算出するのに8つのウェルを用いる。実験は、3重に繰り返す。HUVECをビオチン化FUV溶液と30分間インキュベートする。次いで、細胞を洗浄し、以下の濃度の1つのHN-SA溶液とさらに30分間インキュベートする：100pg/mL (1群)、1ng/mL (2群)、10ng/mL (3群)、100ng/mL (4群)、1μg/mL (5群)又は10μg/mL (6群)。これらの群は、細胞膜の最大のタンパク質での被覆を得るために必要なHN-SAの最小濃度を決定する役目を果たす。7、8及び9群は、ネガティブコントロールである。7群は、BioFLVもHN-SAも受けていないHUVECへの抗-HN抗体の非特異的結合を測定する。細胞を、HBSSのみとインキュベートし、次いでFITC-標識抗-HNモノクローナル抗体(mAb)とインキュベートする。8群は、非ビオチン化HUVECへのHN-SAの非特異的結合を測定する。細胞をHN-SA溶液のみとインキュベートし、次いでFITC-標識抗-HN mAbとインキュベートする。9群は、非ビオチン化FLVで処理したHUVECへのHN-SAの非特異的結合を測定する。細胞を非ビオチン化FLVで処理し、次いでHN-SA溶液で処理する。次いで、細胞をFITC-標識抗-HN mAbとインキュベートする。
【０１９１】
実施例16
HN-SA提示の抗血栓効果
第1日の大腿静脈は、本明細書に記載することと同様に、最大レベルのビオチン化FUV及びHN-SAで処理する。治療的投与の後に、静脈を修復し、処置したセグメントに2つの縫合糸で印をつける。皮膚を閉じ、動物を麻酔から回復させる。処置後第7、14、21又は30日に、「つまみ」損傷又は塩化第二鉄処置後の血栓の形成を、異なる動物の群において定量する。完全な血管の閉塞を決定するために、ドップラープローブを血栓の近位末端において、血流を監視する。全ての研究は、イソフロラン(2〜5%)の吸入により麻酔をかけたスプレーグ−ドーリーラットに対して行う。提示される種々の濃度のHN-SAの急性効果の研究についての実験設計は、2つの処置(ビオチン化FUV及び非ビオチン化FUV)×3つの曝露時間×2つの小胞濃度×1つのHN-SA濃度= 12個の実験群からなる。提示されるHN-SAの効果的な持続性の研究についての実験設計は、2つの処置(ビオチン化FUV及び非ビオチン化FUV)×4つの時間点(第7、14、21及び30日)×1つの曝露時間×1つの小胞濃度×1つのHN-SA濃度= 8つの実験群からなる。血栓形成研究の間に、ラットの血圧、心拍、呼吸及び体温を監視する。各実験の最後に、動物を安楽死させ、全身に5%ホルマリンを潅流させて、全ての組織を加圧固定(pressure-fix)する。処理した対側性の大腿静脈を、組織学的及び免疫組織化学的な分析のために回収する。
【０１９２】
実施例17
ヒト組織ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子-ポリヒスチジン(UK-6×His)の構築
本実施例は、本明細書に開示されるニッケル化FUVとともに働くように設計された血栓溶解性キメラタンパク質の構築を説明する。構築物は、ヒト組織ウロキナーゼプラスミノゲン活性化因子タンパク質(UK)及び6ポリヒスチジンペプチド(6×His)の高い発現が可能な核酸ベクターを含む。核酸ベクターは、ヒト組織UKと1つ又は複数の調節配列に機能可能に連結された増幅可能な優性選択マーカーとをコードする合成の又はcDNA由来のDNAフラグメントを含む。調節配列は、リーディングフレームを含むmRNA転写産物の発現を制御する。調節配列は、プロモーター、エンハンサー及びその他の発現制御要素を含む。発現ベクターは、哺乳動物宿主細胞におけるヒトUKの発現のために設計される。アデノウイルス2又はサイトメガロウイルスに由来する一般的に用いられるプロモーターを用いる。ベクター核酸は、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム、リポフェクション又はエレクトロポレーションを含む外来核酸を宿主細胞に導入するために用いられる通常の形質転換又はトランスフェクション法により、宿主細胞に導入できる。タンパク質のUKドメインは、キメラタンパク質の血栓溶解効果を媒介し、6×Hisドメインは、タンパク質を血管内皮上のニッケルテザーに標的させるために用いられる。6×Hisはニッケルに堅く結合し、これはニッケル化FUVにより血管内皮細胞の表面上に効率的に組み込まれ得る。UK-6×His融合タンパク質は、フレキシブルリンカー(スタンダード(Gly4-Ser)3)を介してN-末端及びC-末端のいずれかに連結した6×Hisを用いて構築される。6×Hisドメイン及びUKドメインの順序が異なる遺伝子の2つの形を作る。UK-6×His遺伝子は、長さ約1850 DNA塩基対であり、UKドメイン及び6×Hisドメインをともに含む。UKの配列は、NCBIのGenebankデータベースに開示される。コーディング配列は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞(例えばDG44又はDXB11)における最適発現のために最適化されたコドンである。さらに、ドメイン同士の交換及びコーディング配列全体のシャトル輸送のための制限部位を含む。形質転換の後に、最高の発現レベルのクローンをタンパク質産生のために選択する。発現は、ウェスタンブロット分析により決定する(抗-His抗体を用いる)。発現の際に、UK-6×Hisタンパク質を、溶解させたCHO細胞から回収し、カラムクロマトグラフィーにより精製する。2つの構築した融合タンパク質のそれぞれのUK機能を、天然のUKと比較する。2つのUK-6×Hisタンパク質を精製した後に、繊維素溶解活性をフィブリン-寒天プレートアッセイを用いて測定し、市販のUKと比較する。フィブリン-寒天試薬は、ダルベッコのリン酸バッファー中で調製する。TPAプロテアーゼを、0.5〜5.0μg/mLの範囲の濃度にてフィブリン-寒天プレート中で48時間インキュベートする。トロンビン(PBSバッファー中に36ユニット/mL)をプラスミノゲン(PBSバッファー中に2.5ユニット/mL)と47℃にて混合する。それぞれの30 mL FalconプレートにME-アガロース15 mL(PBSバッファー中に5.3 mg/mL)を加え、続いて5 mLのフィブリノゲン(PBSバッファー中に11 mg/mL)を加える。いくつかの3 mmプラグがプレート上に形成され、10μLのコントロールを含む試験溶液及び試験溶液を各プラグに加える。プレートを加湿した箱に入れ、溶液を48時間インキュベートする。溶解領域の直径を各サンプルについて測定する。標��曲線を、希釈の活性ユニットに対してプロットしたコントロールTPA溶液により作り出された溶解領域の直径を用いて構築する。次いで、標準曲線を用いて、UK-6×Hisサンプルの活性及び量を決定する。
【０１９３】
実施例18
UK-6×His提示の抗血栓効率
第1日の大腿静脈は、最大レベルのニッケル化FUV及びUK-6×Hisで処理する。治療的投与の後に、静脈を修復し、処置したセグメントに2つの縫合糸で印をつける。皮膚を閉じ、動物を麻酔から回復させる。処置後第7、14、21又は30日に、「つまみ」損傷又は塩化第二鉄処置後の血栓の形成を、異なる動物の群において定量する。完全な血管の閉塞を決定するために、ドップラープローブを血栓の近位末端において、血流を監視する。全ての研究は、イソフロラン(2〜5%)の吸入により麻酔をかけたスプレーグ−ドーリーラットに対して行う。提示される種々の濃度のUK-6×Hisの急性効果の研究についての実験設計は、2つの処置(ニッケル化FUV及び非ニッケル化FUV)×3つの曝露時間×2つの小胞濃度×1つのUK-6×His濃度= 12個の実験群からなる。提示されるUK-6×Hisの効果的な持続性の研究についての実験設計は、2つの処置(ニッケル化FUV及び非ニッケル化FUV)×4つの時間点(第7、14、21及び30日)×1つの曝露時間×1つの小胞濃度×1つのUK-6×His濃度= 8つの実験群からなる。血栓形成研究の間に、ラットの血圧、心拍、呼吸及び体温を監視する。各実験の最後に、動物を安楽死させ、全身に5%ホルマリンを潅流させて、全ての組織を加圧固定する。処理した大腿静脈と対側性の大腿静脈を、組織学的及び免疫組織化学的な分析のために回収する。
【０１９４】
本明細書で開示される主題の種々の詳細は、本明細書で開示される主題の範囲を逸脱することなく変更可能であることが理解される。さらに、上記の記載は説明のためのみであり、限定のためではない。
【国際調査報告】
2008540341.tif 000053