(57)【要約】  本発明は、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質のモチーフとＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間の相互作用、および螢光偏光による前記相互作用の検出を含む、プログラム細胞死のモジュレーターを同定する方法に関する。前記方法に基づいて同定されたモジュレーターは、アポトーシス型および／またはオートファジー型のプログラム細胞死を引き起こすために癌患者に投与される。本発明はまた、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーと相互作用することができるＢｅｃｌｉｎタンパク質のモチーフ、および癌患者中でプログラム細胞死を引き起こすためのそれの使用に関する。
2008532486.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程：
ａ）  ベクリンタンパク質の
【表１】
2008532486.tif 000010
モチーフとＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間で相互作用が起こる工程；
ｂ）  相互作用を、テストする化合物の存在下でまたは非存在下で検出する工程
を含むことを特徴とする、プログラム細胞死のモジュレーターを同定する方法。
【請求項２】
次の工程：
ａ）螢光プローブでベクリンタンパク質の
【表２】
2008532486.tif 000011
モチーフをラベルする工程；
ｂ）前記モチーフに、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーを加える工程；
ｃ）テストする化合物の存在下または非存在下で、このシステムをインキュベーションする工程；
ｄ）螢光偏光度を測定する工程；および
ｅ）テストする化合物存在下の測定値と非存在下の測定値とを比較する工程
を含むことを特徴とする、請求項１記載のプログラム細胞死のモジュレーターを同定する方法。
【請求項３】
ベクリンタンパク質のモチーフとＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間の相互作用のモジュレーターが、螢光偏光度を減少させる阻害剤であることを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４】
ベクリンタンパク質のモチーフとＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間の相互作用のモジュレーターが、螢光偏光度を増加させる活性化剤であることを特徴とする、請求項１または２のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
螢光プローブがフルオレセインであることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーが、タンパク質Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬまたはＢｃｌ−Ｗであることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
ベクリンタンパク質のモチーフ
【表３】
2008532486.tif 000012
のアミノ酸配列（配列番号１）、およびそれの機能的変異体。
【請求項８】
抗アポトーシスタンパク質のＢｃｌ−２ファミリーと相互作用することを特徴とする、請求項７記載のアミノ酸配列。
【請求項９】
請求項７または８記載のベクリンタンパク質のモチーフをコードする、核酸配列  配列番号２：
【表４】
2008532486.tif 000013
【請求項１０】
請求項７記載のアミノ酸配列  配列番号１から遺伝子コードに従って導き出される核酸配列。
【請求項１１】
請求項９および請求項１０のいずれか１項記載の核酸配列を含むことを特徴とする、組換えベクター。
【請求項１２】
ベクリンタンパク質のモチーフの発現に必要な配列を含むプラスミド、コスミド、バクテリア人工染色体、またはバクテリオファージであることを特徴とする、請求項１１記載の組換えベクター。
【請求項１３】
ベクリンタンパク質のモチーフの発現に必要な配列が、転写および翻訳のプロモーター配列を含むことを特徴とする、請求項１２記載の組換えベクター。
【請求項１４】
請求項１１〜１３のいずれか１項記載の組換えベクターによって形質転換されたことを特徴とする、ホスト細胞。
【請求項１５】
バクテリア細胞または真核細胞であることを特徴とする、請求項１４記載のホスト細胞。
【請求項１６】
請求項７または８のいずれか１項記載のアミノ酸配列を含むことを特徴とする、ペプチド。
【請求項１７】
請求項９または１０のいずれか１項記載の核酸配列によってコードされることを特徴とする、請求項１６記載のペプチド。
【請求項１８】
活性成分として、請求項１６または１７のいずれか１項記載のペプチドを、１以上の薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項１９】
癌患者に、有効量の請求項１８記載の医薬組成物を投与することを含む、アポトーシス型および／またはオートファジー型のプログラム細胞死をもたらす方法。
【請求項２０】
活性成分として、請求項１〜６のいずれか１項記載の同定方法を用いて得られたモジュレーターを、１以上の薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせて含む、医薬組成物。
【請求項２１】
癌患者に、有効量の請求項２０記載の医薬組成物を投与することを含む、アポトーシス型および／またはオートファジー型のプログラム細胞死をもたらす方法。
【請求項２２】
癌の治療に用いるための、請求項１８または２０のいずれか１項記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌患者の治療におけるアポトーシス型および／またはオートファジー型のプログラム細胞死の調節に有用な、新しい薬剤を探索し発展させる分野にある。
【０００２】
本発明は、プログラム細胞死のモジュレーターを同定する新しい方法に関し、その方法は、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質のモチーフとＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間の相互作用、およびその相互作用の蛍光偏光による検出を含む。上述の方法によって同定されたモジュレーターは、癌患者に、それらの患者中でアポトーシス型および／またはオートファジー型のプログラム細胞死をもたらすために、投与される。
【０００３】
本発明は、特にＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーと相互作用することができるＢｅｃｌｉｎタンパク質モチーフ、および癌患者中でプログラム細胞死を引き起こすためのそれの使用に関する。
【０００４】
プログラム細胞死は、一方はアポトーシス、他方はオートファジー死から成る。アポトーシスの方がよく知られた現象である。この種の細胞死には、核凝縮およびＤＮＡ断片化などの形態学的変化、およびさらに、細胞の重要な構造成分を分解して細胞の分解と死を引き起こすカスパーゼの活性化などの生化学的現象、が含まれる。アポトーシスの過程の調節は複雑で、いくつかの細胞内シグナル伝達経路の活性化または抑制が含まれる。
【０００５】
オートファジー死は、プログラム細胞死の、第２のよく知られていない機構である。細胞のレベルで、オートファジーを３つの段階：最初のオートファジー胞（オートファゴソーム）の形成および、オートファゴソームの分解液胞への成熟、およびそれのリソソームとの融合、に纏めることができる。従ってオートファジー死は、オートファジー胞の蓄積によって特徴づけられ、カスパーゼ型調節経路に依存しない、リソソームでの分解過程を含む。
【０００６】
成長、生存、およびプログラム細胞死の間に存在する細胞の平衡の調節解除が、癌などの多数の病理の起源に存在する。
【０００７】
「癌」は、その通常の意味に従い、本発明の範囲内では、２つの主要な特性：外部信号によって調節されない細胞の成長および増殖；ならびに組織に侵入する能力、およびある場合にはまた、離れた部位に定着することにより転移を形成する能力、によって定義される。
【０００８】
これらの特性は、癌細胞の内因的性質、即ちそれらのゲノムおよび核型の不安定性、それらの制御されない増殖能および転移能、それらに伴う新しい表現型の獲得およびそれらの癌細胞中の癌遺伝子の活性化および抑制解除、の結果である。本発明の範囲では、従って「癌」とは、上記の特性を有する細胞の成長または増殖の任意の段階、特に原発性腫瘍および／または転移性腫瘍（２次腫瘍）の発症へと進行していく段階、であると理解する。
【０００９】
ある細胞を生存させ続け、またはその死をプログラムするためには、特にＢｃｌ−２ファミリーのタンパク質を含む、主要なシグナル伝達経路の調節を必要とする。
【００１０】
Ｂｃｌ−２ファミリーのタンパク質は、３つの主なクラスに分けられる。Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬおよびＢｃｌ−Ｗなどの抗アポトーシスタンパク質は、それらの４つのＢＨドメインに高度の相同性を有する。親アポトーシスタンパク質は２つのカテゴリーに分類される：一方は、ＢＡＸおよびＢＡＫなどの多重ドメインタンパク質、および他方は、単一の相同ドメインであるＢＨ３モチーフの存在によって特徴づけられる、ＢＩＤ、ＮＯＸＡ、ＰＵＭＡ、ＢＩＫ、ＢＩＭおよびＢＡＤなどの親アポトーシスタンパク質である（Cory and Adams, The Bcl-2 family: regulators of the cellular life-or-death switch Nature reviews vol.2 September 2002）。
【００１１】
ＢＨ３モチーフは、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリー中における配列同一性が比較的低い、両親媒性のα−へリックス領域である。さらに、あるタンパク質とＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの相互作用が可能となるためには、そのタンパク質中にＢＨ３モチーフの存在が必要である。実際に、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーの活性は、前記ファミリーの親アポトーシス遺伝子生成物により調節される。２つのタンパク質は会合してヘテロダイマーになる。その状態にある時は、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーは不活性であり、したがって、もはや抗アポトーシス活性を有しない。さらに、ＢＨ３モチーフの、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの特異的な相互作用は、特異的な方式でアポトーシス型プログラム細胞死を引き起こすように、モジュレーターによって修飾されることが可能である。
【００１２】
アポトーシスのシグナル伝達経路は、ウイルスの感染戦略によってもモジュレートされ得ることに、さらに注目するべきである。実際、多くのウイルスタンパク質がアポトーシス経路を、構造的相同性や機能的摸倣により、親アポトーシスおよび抗アポトーシスの信号変換のレベルにおいて妨害する。従って、あるウイルスは、ミトコンドリア経路を阻害するＢｃｌ−２の抗アポトーシス性類似体、またはエフェクター段階を遮断するカスパーゼ阻害剤、をコードする。感染細胞の早期アポトーシスは、ウイルス粒子の量を制限するためのホストの防御機構であり；対照的に、ホスト細胞の遅延性アポトーシスは、ウイルスが複製して拡散することを可能にする。
【００１３】
オートファジーは、細胞の生存機構に含まれ、またプログラム細胞死の進行にも関連している。多数の研究により、オートファジーはＢｅｃｌｉｎ、ＰＴＥＮ、およびＴＳＣ１などの腫瘍サプレッサー遺伝子の生成物の制御下にあることが確立された。それらの遺伝子の不活性化およびオートファジー能力の減少が、癌患者中の腫瘍の進行中の初期の事象である。Ｂｅｃｌｉｎは、オートファジー現象の初期のおよび中心の部分で、特にオートファジー胞またはオートファゴソームの形成において、役割を果たしている（Edinger et al. Defective autophagy leads to cancer, Cancer Cell December 2003）。
【００１４】
化学療法剤に対する腫瘍の耐性は、内科的腫瘍学の中心問題を構成する。獲得耐性の出現が発見され、それは、最初は化学療法に応答し、その後（多かれ少なかれ短期間の）治療に対する耐性を生じる腫瘍において明らかである。腫瘍細胞に存在するそのような耐性は、主要な現在の抗癌治療薬（細胞毒性剤）が作用するプログラム細胞死のカスパーゼ依存性経路、即ちアポトーシス経路の阻害に、一般に関連する。従って、抗癌治療薬をより有効にするためには、プログラム細胞死のアポトーシス経路に作用する治療薬に対して、もっぱらアポトーシスのみに作用する既知の治療薬の欠点を少なくとも一部分は克服する展望を有する代わりのおよび／または相補的な戦略を、提案しなければならない。本発明は、従って２重モジュレーターによって、オートファジー経路および／またはアポトーシス経路へ作用することを提案する。
【００１５】
従って、本発明で行なわれるカスパーゼ非依存経路即ちオートファジー経路のモジュレーションは、特異的にアポトーシス経路に作用する治療に代替する治療となる。
【００１６】
一方でアポトーシス過程におけるＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーの役割を考慮し、他方でオートファジー現象中のＢｅｃｌｉｎタンパク質の役割ならびに腫瘍進行における獲得耐性の重要性を考慮すると、抗癌治療との関係において、プログラム細胞死のオートファジー経路およびアポトーシス経路に同時に作用することの重要性が理解されよう。従って、Ｂｃｌ−２ファミリーの抗アポトーシスメンバーおよびＢｅｃｌｉｎタンパク質、の両方に作用することが可能なモジュレーターを同定することができることが、必須である。そのような２重モジュレーターのスクリーニングを促進し加速するために、発明者らは、一方でＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとＢｅｃｌｉｎタンパク質との間の構造的相互作用を立証すること、他方で、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーおよびＢｅｃｌｉｎタンパク質の両方に作用することが本来的に可能な、その相互作用のモジュレーターを探索すること、から成る戦略を展開した。従って、そのようにして選択された２重モジュレーターは、アポトーシス型のおよび／またはオートファジー型のプログラム細胞死を調節解除する病理と闘うための候補薬物を得るために理想的である。
【００１７】
Ｂｅｃｌｉｎタンパク質またはそれの特異的なモチーフと、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間のタンパク質相互作用のモジュレーターの選択および同定を、２−ハイブリッドシステムを用いて研究した。この２−ハイブリッドシステムは、Fields et al.(ＵＳ ５,２８３,１７３；ＵＳ ５,４６８,６１４；ＵＳ ５,６６７,９７３）によって最初に記述され、開発された。
【００１８】
はじめに、２−ハイブリッドシステムは、酵母中における２つの組換えタンパク質間のテストである。「餌」と呼ばれる第１のタンパク質は、タンパク質Ａの上流に結合されたＤＮＡ結合ドメイン（即ちＢＤ）を含む融合タンパク質である。第２のタンパク質もまた、タンパク質Ｂに結合された活性化ドメイン（即ちＡＤ）を含む、一般に「獲物」と呼ばれる融合タンパク質である。一般に用いられる結合ドメインおよび活性化ドメインは、Ｇａｌ４またはE.coli Lex Aのものである。タンパク質ＡおよびＢは、それぞれＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーおよびＢｅｃｌｉｎの特異的なモチーフである。タンパク質相互作用によるタンパク質ＡおよびＢの会合により、レポーター遺伝子の上流に存在し前記レポーター遺伝子の転写を保証する結合部位（即ちＢＳ）に結合することができる機能的ドメイン（ＢＤ−ＡＤ）が、相補性によって形成される。 
【００１９】
しかし、この従来の２−ハイブリッド法には限界がある。例えば、そのようなスクリーニング方法は偽陽性および／または偽陰性の結果となる場合があり、得られた結果の生化学的な確認が必要であることは周知である。２−ハイブリッドシステムによる偽陽性は特に頻繁に起こり、これは構造的相互作用ではなくむしろ機能的な相互作用を示すことの原因となる。
【００２０】
偽陽性および／または偽陰性を最小限にすることを可能にする、より有効な技術が国際特許出願ＷＯ９９／４２６１２または米国特許６,１８７,５３５に記述されており、それは「餌」および「獲物」ポリペプチドを含む組換えハプロイド酵母を用いる。このシステムによって、単一の「餌」を用いて多数の「獲物」を検出することが、この分野で用いられる他の従来方法よりも正確で再現性よく敏感な方式で、可能になる。
【００２１】
２−ハイブリッドシステムを用いて、本発明者らは、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーと、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質との間の構造的相互作用の存在を立証した。それらのパートナー間のこのタンパク質相互作用は、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗−および親−アポトーシスのパートナー間のアポトーシス現象の調節に存在するタンパク質相互作用に類似しており、プログラム細胞死の過程の平衡に関与している。
【００２２】
特に、本発明に関連して、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質の新しいモチーフが同定された。Ｂｅｃｌｉｎタンパク質のこのモチーフは、極めて特異的な方式でＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーと相互作用することができ、アポトーシスおよび／またはオートファジーの特異的なモジュレーターを選択するために用いられると期待される。相互作用のこの特異性は、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質の新しいモチーフの、配列、三次元構造、および／またはらせん構造と関係している。
【００２３】
この２６のアミノ酸を有するＢｅｃｌｉｎタンパク質の新しいモチーフは、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬおよび／またはＢｃｌ−Ｗとの相互作用の正確なドメインに実際に対応しており、ホモ２量体またはヘテロ２量体の形成を可能にする典型的な構造的基準を有する。
【００２４】
このモチーフは、その大きさの故に、Ｂｅｃｌｉｎペプチドと抗アポトーシスタンパク質との間の相互作用をモジュレートすることができる化合物を極めて効率的にスクリーニングすることが出来るテストを発展させるための、理想的な候補となる。タンパク質・タンパク質相互作用のモジュレーターをスクリーニングするための多数のテストが文献中に見出される。しかし、それらはしばしば感度および高速処理の実現可能性について限界を有する。通常用いられる方法は、高速処理スクリーニングとあまりよく適合しない複雑なツール（融合タンパク質、組換えタンパク質その他）の使用を必要とする。それらは非常に頻繁に高レベルのバックグラウンドノイズを生成し、定量的観点から見て信頼性が低い：それらは、テストする化合物の最適のスクリーニングが可能でない縮小された読み取り窓を提供するからである。
【００２５】
既存の利用できる方法の代わりに、本発明においては、蛍光偏光に基づく非常に効率的なスクリーニングテストを採用した（Owicki et al., Journal of Biomolecular Screening, 5, 2000, 297-306）。この技術は、例えば、蛍光団ラベルされたリガンドとレセプターとの間の相互作用の測定を可能にする。その原理は、フリーのリガンドによって放射される蛍光と比較した、リガンドがレセプターに結合したときに放射される蛍光の偏光度の増加を測定することより成る。フリーのリガンドの蛍光偏光度はその分子量に依存し、分子量が大きいほど大きい。従って、高度の固有蛍光偏光を有する高分子量のリガンドを用いてこのテストを行なう場合は、フリーのリガンドと結合したリガンドとの間の蛍光偏光度の差を高信頼度で評価するのは困難であろう。反対に最小分子量のリガンドを用いることにより、その差異が強調され、その結果、方法の精密さを増大させることが可能になるであろう。従って、ある化合物の実際の活性をよりよく評価し、高速処理スクリーニングを実行することが可能になるであろう。
【００２６】
Ｂｅｃｌｉｎモチーフ
【表５】
2008532486.tif 000003
に対応する本発明によるペプチドは、有利に、ＢｅｃｌｉｎモチーフとＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間のタンパク質相互作用を、その相互作用を活性化または阻害することによってモジュレートする化合物のスクリーニングに、用いることができる。
【００２７】
本発明は、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質の
【表６】
2008532486.tif 000004
モチーフと、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間の相互作用の工程、次にテストする化合物の存在下または非存在下で相互作用を検出する工程、を含む、プログラム細胞死のモジュレーターを同定する方法に関する。
【００２８】
有利には、プログラム細胞死のモジュレーターを同定する方法は、下記工程を含む：
ａ）Ｂｅｃｌｉｎタンパク質のモチーフ
【表７】
2008532486.tif 000005
を蛍光プローブでラベルする工程；
ｂ）前記モチーフへＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーを加える工程；
ｃ）テストする化合物の存在下でまたは非存在下で、ａ）およびｂ）に記述したパートナーをインキュベーションする工程；
ｄ）蛍光偏光度を測定する工程；および
ｅ）テストする化合物の存在下の測定値および非存在下の測定値を比較する工程。
【００２９】
「モジュレーター」とは、タンパク質−タンパク質相互作用、酵素活性または細胞レセプターへの結合などの特異的活性を増大させ、阻止し、あるいは少なくとも制限することができる任意の化合物であると理解する。本発明によれば、モジュレーターとは、パートナーであるＢｅｃｌｉｎとＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間のタンパク質相互作用の阻害剤または実際の活性化剤である。
【００３０】
本発明はまた、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質のモチーフとＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間の相互作用の阻害剤を同定する方法に関し、その阻害剤は、モジュレーターが存在しない場合のこの相互作用から成る対照と比較して、蛍光偏光度を減少させることができる。
【００３１】
本発明はまた、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質とＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間の相互作用の活性化剤を同定する方法に関し、その活性化剤は、モジュレーターが存在しない場合のこの相互作用から成る対照と比較して、蛍光偏光度を増大させることができる。
【００３２】
蛍光性リガンド、即ち蛍光性Ｂｅｃｌｉｎペプチドは、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスパートナーと結合した後には、対応するフリーのリガンドより低い回転定数を持ち、その結果結合したリガンドによって放射される蛍光は偏光することになる。それ故、フリーのリガンドと比較して、結合したリガンドによって放射される蛍光の偏光度の増加が観察される。
【００３３】
好ましい実施態様では、本発明によるスクリーニング方法中で用いられる蛍光プローブは、ボディピー、オレゴングリーン、または好ましくはフルオレセインである。
【００３４】
より詳細には、本発明によるスクリーニングおよび同定の過程において、相互作用のパートナーとして関与するＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーは、タンパク質Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、またはＢｃｌ−Ｗであり得る。
【００３５】
有利には、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーは融合タンパク質である。「融合タンパク質」とは、タンパク質Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬまたはＢｃｌ−Ｗの一つのドメインと、ＧＳＴ（グルタチオンＳ-トランスフェラーゼ）などのタンパク質の一つのドメインとの間の融合を指すものと理解する。
【００３６】
本発明は、アミノ酸配列
【表８】
2008532486.tif 000006
を有するＢｅｃｌｉｎモチーフ、およびその機能的変異体に関する。
【００３７】
「アミノ酸配列」とは、自然の環境から単離されたペプチド配列であると、特に単離された、化学的に合成されたおよび／または精製された、ならびにおそらく遺伝子工学によって修飾された配列であると、理解するべきである。
【００３８】
「機能的変異体」とは、保存的置換または保存的点突然変異を含み、配列番号１によってコードされるモチーフと実質的に同一の特性、すなわちＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーと相互作用する能力、を有するＢｅｃｌｉｎモチーフのアミノ酸配列であると理解する。配列番号１のアミノ酸配列の保存的置換または突然変異は、例えば：アラニンによるグリシンの（Ｇ−Ａ）、ロイシンによるバリンの（Ｖ−Ｌ）、グルタミン酸によるアスパラギン酸の（Ｄ−Ｅ）、グルタミンによるアスパラギンの（Ｎ−Ｑ）、イソロイシンによるロイシンの（Ｌ−Ｉ）、リジンによるアルギニンの（Ｒ−Ｋ）置換または突然変異である。
【００３９】
発明者らは、配列番号１のペプチド配列を有するＢｅｃｌｉｎモチーフが、Ｂｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬまたはＢｃｌ−ＷなどのＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーと相互作用することを観察した。
【００４０】
本発明はまた、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質の新しいモチーフをコードする核酸配列
【表９】
2008532486.tif 000007
に関する。本発明によるこの核酸配列を、Ｂｅｃｌｉｎモチーフのアミノ酸配列およびその変異体から出発して、遺伝子コードを用いて得ることができる。
【００４１】
その核酸配列の「変異体」は特に：
−  配列番号２の核酸配列と厳格な条件下でハイブリダイズすることができる配列またはそれに相補的な配列であって、配列番号１によってコードされるＢｅｃｌｉｎモチーフと実質的に同一の特性を有するポリペプチドをコードする配列、または 
−  ヒトから単離した配列番号２の配列に相同の哺乳動物種の配列、
である。
【００４２】
「厳格な条件」とは、２本の一本鎖ＤＮＡの配列の特異的なハイブリダイゼーションを、６５℃において、例えば６×ＳＳＣ、０.５％ＳＤＳ、５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液および１００μgの非特異的担体ＤＮＡの溶液中で、または等しいイオン強度の任意の他の溶液中で行い、そして例えば最大０.２×ＳＳＣおよび０.１％ＳＤＳ迄の溶液で、または等価なイオン強度の他の溶液で、６５℃で洗浄した後において、可能にする条件であると理解する。厳格条件を規定するパラメーターは、対になった鎖の５０％が解離する温度（Ｔｍ）に依存する。３０より多い塩基を含む配列については、Ｔｍは次の関係式によって定められる：Ｔｍ＝８１.５ ＋ ０.４１（％Ｇ＋Ｃ) ＋ １６.６Ｌｏｇ(陽イオン濃度）− ０.６３（％フォルムアミド）−（６００／塩基数）。長さが３０塩基未満の配列については、Ｔｍは、関係式：Ｔｍ ＝ ４(Ｇ＋Ｃ）＋ ２(Ａ＋Ｔ）により規定される。従って厳格条件は、当業者が配列の大きさ、ＧＣ含量、および他のパラメーターに依存して、特にSambrook et al., 2001 (Molecular Cloning : A laboratory Manual, 3rd Ed., Cold Spring Harbor, laboratory press, Cold Spring Harbor, New York）に記述されたプロトコルに従って、調整することができる。
【００４３】
「配列番号２の配列に相同の哺乳動物種の配列」とは、ヒト以外の哺乳動物種中の、特に霊長類、ラットまたはマウスにおける、配列番号２の配列と同様の構造の配列であって、実質的に同じ特性を有するポリペプチドをコードする配列であると理解する。２つの相同な配列間の機能領域中の百分率同一性は、一般に８０％より大きく、好ましくは９０％を越える。
【００４４】
本発明はまた、本発明によって権利請求される核酸配列を含む組換えベクターに関する。ベクターとは、ホスト細胞中への核酸配列の導入、および任意で核酸配列によってコードされるポリペプチドの（ホスト細胞中での）発現、を可能にする任意の型のベクターであると理解するべきである。
【００４５】
そのようなベクターは、例えば、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質のモチーフの発現に必要な配列を含む、プラスミド、コスミド、バクテリア人工染色体、またはバクテリオファージである。
【００４６】
好ましくは、本発明による組換えベクターは、権利請求されるＢｅｃｌｉｎタンパク質のモチーフの（ホスト細胞中での）発現に必要な配列を含む。これらの配列は、特にホスト細胞中での転写および翻訳のプロモーター配列およびまたターミネーター配列である。組換えベクターはまた、翻訳されたタンパク質の細胞外の環境への放出を可能にする分泌シグナルをコードする配列を含むことができる。
【００４７】
本発明はまた、本発明による組換えベクターによって形質転換されたホスト細胞に関する。特定の実施態様では、それらのホスト細胞は、例えば、 Escherichia coliおよびStreptococcusなどのバクテリア細胞であるか、または酵母細胞、糸状菌細胞、昆虫細胞、および好ましくは哺乳動物細胞などの真核細胞である。
【００４８】
本発明による核酸配列を含む組換えベクターによる適当なホスト細胞の形質転換が、権利請求されるＢｅｃｌｉｎタンパク質のモチーフの発現を可能にする。その後で、それらのホスト細胞中で発現されたタンパク質を、当業者に公知で、先行技術に豊富に記述された様々な方法を用いて精製することができる。例えば硫酸アンモニウムでの沈殿による、サイズ排除クロマトグラフィーによる、および好ましくはアフィニティークロマトグラフィーによる精製が挙げられる。
【００４９】
配列番号１のアミノ酸配列を有するペプチドを、Ｎｅｏｓｙｓｔｅｍに注文して化学的に合成することもできる。配列番号１およびその機能的変異体の化学合成が、「Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ４３０Ａ」ペプチド合成装置の助けを借り、Ｂｏｃ／ベンジル戦略を用いて、固体担体上の合成によって行なわれる。その合成は、望みの配列を樹脂上で組立てること、およびＮ末端とＣ末端のアミノ官能基を脱保護することに基づく。Ｂｏｃ／ベンジル戦略の場合には、ペプチド合成の間、アミノ酸Ｂｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ(Ｆｍｏｃ)−ＯＨを導入することが必要である。完全な配列を組み立てた後、アミノ官能基を脱保護し、強酸存在下で樹脂からペプチドを切断する。
【００５０】
本発明はまた、有効成分として、本発明によるＢｅｃｌｉｎの配列番号１のモチーフに対応するペプチドを、１つ以上の薬学的に許容され得る賦形剤と組み合わせて含む医薬組成物に関する。
【００５１】
本発明中では、医薬組成物の「賦形剤」とは、有効成分が治療されている患者の内部経路中に運ばれることを保証する任意の作用物質であると理解する。「有効成分」とは、医薬組成物の薬力学的特性または治療特性に責任を持つ任意の物質であると理解する。
【００５２】
無毒で薬学的に許容され得る賦形剤には、希釈剤、溶媒、保存剤、湿潤剤、乳化剤、分散剤、結合剤、膨潤剤、崩壊剤、遅延剤、滑沢剤、吸収剤、沈殿防止剤、着色剤または香味料を、例としてまた何の限定も意味することなく挙げることができる。 
【００５３】
本発明は、このように考慮し、上に規定した医薬組成物に関するだけでなく、その組成物の、本発明によるアポトーシス型および／またはオートファジー型のプログラム細胞死をもたらす方法中における使用にも関する。
【００５４】
本発明は、従って、患者への、特に癌患者への、配列番号１の配列を有するＢｅｃｌｉｎのペプチドを含む有効量の医薬組成物の投与を含む、アポトーシス型プログラム細胞死、即ちプログラム細胞死のカスパーゼ依存性経路、および／またはオートファジー型プログラム細胞死、即ちプログラム細胞死のカスパーゼ非依存性経路、をもたらす方法に関する。
【００５５】
本発明はまた、本発明によるモジュレーターを同定する方法を用いて同定された少なくとも１つのモジュレーター、即ち活性化剤または阻害剤を、有効成分として、１以上の薬学的に許容され得る賦形剤と組合せて含む、医薬組成物に関する。
【００５６】
本発明はまた、アポトーシス型（カスパーゼ依存性）プログラム細胞死および／またはオートファジー型（カスパーゼ非依存性）プログラム細胞死を、癌患者に有効な量の上に規定した組成物を投与することにより、もたらす方法に関する。
【００５７】
上述の医薬組成物は、アポトーシス型および／またはオートファジー型のプログラム細胞死に対する作用により、癌の治療への使用に適する。
【００５８】
本発明による組成物は、経口、非経口、鼻中、経皮、直腸中、舌下、眼中、呼吸、による投与のために適当な剤形であり、特に錠剤、糖衣錠、舌下錠、小袋、小包、カプセル、小粒剤、トローチ、坐剤、クリーム、軟膏、皮膚ゲル、および飲用または注射用アンプルである。
【００５９】
本発明を、以下の実施例および図面によって説明する。しかし本発明はそれによって制限されない。
【実施例１】
【００６０】
図１に記載されたペプチドの２−ハイブリッドシステムによる同定
３つのヒトｃＤＮＡ（胎座、脳、細胞系統ＣＥＭＣ７）バンクを、酵母中の２−ハイブリッド技術（Fields et al.）により、Legrain et al., Nature Genetics, 1997, vol.16, 277-282 (US 6,187,535) によって記述された接合プロトコルを用いてスクリーニングした。
【００６１】
１）「餌」および「獲物」の調製
【００６２】
ａ）用いる「餌」は次のとおりである： 
−  ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインへ融合された、Ｂｃｌ−ＸＬのＣ末端切断物（１〜２０９）（受入番号 Ｚ２３１１５）； 
−  ＬｅｘＡ ＤＮＡ結合ドメインへ融合されたＢｃｌ−２のＣ末端切断物（１〜２１１）（受入番号 ＸＭ_００８７３８）。
これらの餌を、Saccharomyces cerevisiae酵母の菌株L40Δgal4（MATa ade2, trp1-901, leu2-3, 112, lys2-801, his3Δ200, LYS2 (lexAop)4-HIS3, ura3-52 ::URA3 (lexAop)8-LacZ, GAL4 ::KanR）中で発現させ、３０℃で、トリプトファンを欠く合成培地（ＤＯ−Ｔｒｐ）中で、全体として吸光度ＯＤ600nm０.１〜０.５を得るまで前培養する。その前培養の稀釈液（ＯＤ600nm ＝０.００６）５０ｍｌを、３０℃で終夜インキュベーションする。
【００６３】
ｂ）  Ｇａｌ４転写活性化ドメインへ融合されたｃＤＮＡバンクを発現するプラスミドを含むSaccharomyces cerevisiae酵母の菌株YHGX13（MATα Gal4Δ Gal80Δ ade2-101 ::KanＲ, his3, leu2-3-112, trp1-901, ura3-52 URA3::UASGAL1-LacZ, Met)のコレクションを、形質転換およびそれに続くロイシンを欠く培地（ＤＯ−Ｌｅｕ）上での選択によって得る。これらの酵母を小分けにし、−８０℃で貯蔵する。
【００６４】
２）  接合
「餌」／「獲物」比：２を用いて、接合を実行する。５０単位のＯＤ600nmに対応する量の、工程１）ａ）中で得られた酵母「餌」細胞を、工程１）ｂ）中で得られた酵母「獲物」と混合する。遠心分離後、沈殿物をＹＰＧｌｕ培地に再懸濁し、ＹＰＧlｕ培養プレート上に広げ、３０℃で４時間３０分インキュベーションする。互いに相互作用することができる「餌」と「獲物」を含む接合した酵母の選択を、ＤＯ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ｈｉｓ培地中で実行する：ロイシンおよびトリプトファンの欠乏により、２つの型のプラスミド（「餌」／「獲物」）を含む酵母のみの成長を許す淘汰圧を維持することが可能になる；培地からヒスチジンを欠くことにより、互いに相互作用することができる「餌」プラスミドおよび「獲物」プラスミドを含む接合した酵母を選択することが可能になる：この相補性により、ヒスチジンの生合成に関係する酵素をコードするレポーター遺伝子であるＨＩＳ３遺伝子を活性化することが可能になるからである。
【００６５】
３）  陽性クローンの同定
項２）に記述した接合法により選択した酵母のコロニーの「獲物」断片を、そのコロニーの粗溶解物から出発するＰＣＲにより、「獲物」ベクターの特異的なプライマー：
【表１０】
2008532486.tif 000008
を用いて増幅する。次に、ＰＣＲ生成物を配列決定し、得られた配列を、データベースと比較して同定する。
【００６６】
４）  図１に記載されたペプチドの同定
テストされる各「餌」断片について、２−ハイブリッドシステムにより、複数の「獲物」断片の同定が可能である。この同定を、選択された「獲物」の配列をＢｌａｓｔｗｕｎのようなソフトウェアプログラムを用いて比較することにより実行する。そのプログラムはワシントン大学のウェブサイト：
http://bioweb.pasteur.fr/seqanal/interfaces/ blastwu.html
で利用可能である。
【実施例２】
【００６７】
実施例１に記載したペプチドとＢｃｌ−２、Ｂｃｌ−ＸＬ、および／またはＢｃｌ−Ｗとの間の相互作用の確認
【００６８】
１）  蛍光偏光を用いるＫｉの決定（図３）
蛍光偏光を用いるＫｉの決定は、親アポトーシスＢａｋペプチドとＢｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ＷのようなＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間の相互作用に対する、Ｂｅｃｌｉｎペプチドの拮抗的効果を測定する工程より成る。
【００６９】
次の試薬を、次に述べる順序で混ぜ合わせる：
ａ）最終濃度１nM〜１００μMの拮抗ペプチド；
ｂ）最終濃度１５nMの蛍光性ペプチドリガンド（Ｂａｋ ＢＨ３ カルボキシフルオレセイン）；
ｃ）Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーを、Ｂｃｌ−ＸＬについては最終濃度１００nM、ならびにＢｃｌ−２およびＢｃｌ−Ｗについては１μM。
【００７０】
これらの試薬を、相互作用緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４ ２０mM ｐＨ７.４、ＥＤＴＡ １mM、ＮａＣｌ ５０mMおよびプルロン酸Ｆ−６８ ０.０５％）中に溶解する。次に、周囲温度で３０分間その混合物をインキュベーションし、Ｆｕｓｉｏｎ装置（Packard）で蛍光偏光を測定する（４８５nmでの励起および５３０nmでの読み取り）。値をｍＰ（蛍光偏光の単位）で与える。
【００７１】
これらの蛍光偏光分析は、ＢａｋとＢｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−Ｗとの間のペプチド相互作用に対する、Ｂｅｃｌｉｎペプチドの拮抗的効果を実証した。これらの蛍光偏光テストの過程で得られたＫｉ値は、次のとおりである：
Ｂｃｌ−ＸＬ／Ｂａｋ／Ｂｅｃｌｉｎ   Ｋｉ＝１.１５μＭ
Ｂｃｌ−２／Ｂａｋ／Ｂｅｃｌｉｎ    Ｋｉ＝１.８μＭ
Ｂｃｌ−Ｗ／Ｂａｋ／Ｂｅｃｌｉｎ    Ｋｉ＝７.４μＭ
【００７２】
これらの分析は、Ｂｅｃｌｉｎペプチドの、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーに対する高い親和性を示す。
【００７３】
２）  突然変異Ｂｅｃｌｉｎペプチド（Ｌ１１６Ａ）の、蛍光偏光を用いるＫｉの決定
蛍光偏光を用いるＫｉの決定は、Ｂｅｃｌｉｎタンパク質の完全な配列の位置１１６がロイシンからアラニンへ突然変異されたＢｅｃｌｉｎペプチド（Ｌ１１６Ａ）の、親アポトーシスＢＡＫペプチドとＢｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ＷなどのＢｃｌ−２タンパク質ファミリー抗アポトーシスメンバーとの間の相互作用に対する、拮抗的効果を測定する工程より成る。
【００７４】
突然変異ペプチド（Ｌ１１６Ａ）の配列は以下のとおりである：
【表１１】
2008532486.tif 000009
【００７５】
蛍光偏光を用いるＫｉの決定のためのプロトコルは、上述のプロトコルと同じである。
【００７６】
蛍光偏光分析の結果の比較は、親アポトーシスＢａｋペプチドとＢｃｌ−ＸＬ、Ｂｃｌ−２またはＢｃｌ−ＷなどのＢｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーとの間のペプチド相互作用における、本発明によるＢｅｃｌｉｎペプチドと比較した、突然変異Ｂｅｃｌｉｎタンパク質（Ｌ１１６Ａ）の拮抗的効果の喪失を示す。
【００７７】
３）  共免疫沈殿（図４）
ｆｌａｇエピトープを所持するＢｃｌ−ＸＬタンパク質をコードする発現ベクターおよび野生型または突然変異（Ｌ１１６Ａ）Ｂｅｃｌｉｎタンパク質をコードする発現ベクターで、ＨｅＬａ細胞を共トランスフェクションする（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅキット、 Qiagen）。トランスフェクションの２４時間後に、溶解緩衝液（Ｈｅｐｅｓ １０mM ｐＨ７.５、ＫＣｌ １５０ｍM、ＭｇＣｌ２ ５mM、ＥＤＴＡ １mM、Ｔｒｉｔｏｎ ０.４％、抗プロテアーゼ、および抗ホスファターゼ）中に細胞を取り上げて、氷中でインキュベーションし、１００００rpmで遠心する。
【００７８】
次に、上清（細胞溶解物）を、抗Ｆｌａｇ抗体に結合させたアガロースビーズ（Ｆｌａｇ Ｍ２アガロース、Sigma）の存在下で２時間インキュベーションする。
【００７９】
次に、アガロースビーズを遠心し溶解緩衝液で洗浄し、次にＬａｅｍｍｌｉ緩衝液の中に取り上げ、抗Ｂｅｃｌｉｎ抗体によるウェスタンブロットによって分析する。
【００８０】
タンパク質・タンパク質相互作用による、抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−ＸＬの全Ｂｅｃｌｉｎタンパク質との共免疫沈殿は、Ｂｃｌ−ＸＬタンパク質とＢｅｃｌｉｎタンパク質間に確かに構造的相互作用が存在することを確認した。
【実施例３】
【００８１】
Ｂｃｌ−２および／またはＢｃｌ−ＸＬと実施例１で得られたペプチドとの間の相互作用を阻害することができる化合物の、スクリーニングテスト
【００８２】
１）  実施例１において得られたペプチドとＢｃｌ−ＸＬの間のＫＤの決定（図５）
実施例１において得られた、蛍光性の形（フルオレセインに結合された）であり、Ｎａ2ＨＰＯ４ ２０mM ｐＨ７.４、ＥＤＴＡ １mM、ＮａＣｌ ５０mM、プルロン酸Ｆ−６８ ０.０５％を含む緩衝液中に１５nM濃度で溶解されているペプチドを、融合タンパク質ＧＦＴ−Ｂｃｌ−ＸＬの増加する濃度（１０-9〜１０-5M）の存在下でインキュベーションし、次に蛍光偏光度をＥｎ Ｖｉｓｉｏｎ装置（Packard Perkin-Elmer）を用いて測定する。この相互作用のＫＤ ０.２μＭを決定することができた。
【００８３】
２）  Ｂｃｌ−ＸL−ペプチド相互作用の阻害剤の同定
テストする化合物を最終濃度１０μg/mlで、３８４ウエルプレート（Corning, 平底）に分配する。１つのウエルには、対照として使用するために、テスト化合物を含まない等量の緩衝液／溶媒を入れる。実施例１で得られたフルオレセインでラベルされたペプチドを、１〜１００nMの範囲の最終濃度を得るように各ウエルに加える。次に、融合タンパク質ＧＳＴ−Ｂｃｌ−ＸＬ、またはＧＳＴ−Ｂｃｌ−２、またはさらにＧＳＴ−Ｂｃｌ−Ｗを、Ｎａ２ＨＰＯ４ ２０mM ｐＨ７.４、ＥＤＴＡ １mM、ＮａＣｌ ５０mMおよびプルロン酸Ｆ−６８ ０.０５％を含む緩衝液中に、０.１〜１μMの最終濃度を得るように加える。次に、Ｅｎ Ｖｉｓｉｏｎ装置（Packard Perkin-Elmer）により、蛍光偏光を測定する。テスト化合物存在下で行なわれたテストで記録された蛍光偏光度の、テスト化合物無し（対照ウエル）で得られた偏光度と比較して、有意な減少によって、その化合物が阻害活性を有するという結論を下すことが可能になる。反対に、対照と比較して、テスト化合物存在下でのテストでの蛍光偏光度が有意に増加すれば、化合物が活性剤活性を有するという結論を下すことができる。
【００８４】
図６は、Ｂｃｌ−ＸＬのアンタゴニストである参照化合物（参照化合物１）： A.D. Hamilton et at, J. Am.Chem. Soc., 2002, 124, 11838-11839の化合物４、で得られた結果を示す。この化合物について、３.４μMのＩＣ５０を決定することができた。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーと相互作用するＢｅｃｌｉｎモチーフのアミノ酸配列：配列番号１。
【図２】Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリーの抗アポトーシスメンバーと相互作用するＢｅｃｌｉｎモチーフをコードする核酸配列：配列番号２。
【図３】親アポトーシスＢａｋペプチドと抗アポトーシスメンバーＢｃｌ−２，Ｂｃｌ−ＸＬおよびＢｃｌ−Ｗとの間の相互作用に関する、突然変異または非突然変異のＢｅｃｌｉｎ拮抗ペプチドのＫｉの、蛍光偏光を用いた決定。
【図４】Ｂｃｌ−ＸＬタンパク質とＢｅｃｌｉｎタンパク質との間の共免疫沈殿の結果。
【図５】Ｂｃｌ−ＸＬとＢｅｃｌｉｎペプチドとの間の相互作用のＫＤの決定。
【図６】対照Ｂｃｌ−ＸＬアンタゴニストのＩＣ５０の決定。
【図１】
2008532486.tif 000014
【図２】
2008532486.tif 000015
【図３】
2008532486.tif 000016
【図４】
2008532486.tif 000017
【図５】
2008532486.tif 000018
【図６】
2008532486.tif 000019
【配列表】
2008532486000001.app
【国際調査報告】
2008532486.tif 000020
2008532486.tif 000021
2008532486.tif 000022
2008532486.tif 000023
2008532486.tif 000024
2008532486.tif 000025
2008532486.tif 000026
2008532486.tif 000027
2008532486.tif 000028
2008532486.tif 000029
2008532486.tif 000030
2008532486.tif 000031