(57)【要約】  本発明は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）とタンパク質キナーゼＡアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）との相互作用を調節し、特に阻害する非ペプチド分子に関するとともに、該非ペプチド化合物、または例えば抗体やキレート剤等のような、該非ペプチド化合物を標的とする認識分子を含む宿主または標的生物に関する。本発明は更に、特にｃＡＭＰシグナル経路の異常に伴う疾病の治療のための医薬品に関する。該疾病としては特に、尿崩症、筋緊張亢進、膵性糖尿病、十二指腸潰瘍、ぜんそく、心不全、肥満、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、浮腫、肝硬変、統合失調症、その他の疾病が挙げられる。本発明は更に、新規性を有する分子の使用に関する。本発明の一は、表Ａによる非ペプチドタンパク質キナーゼＡ／タンパク質キナーゼＡアンカータンパク質分離剤。【特許請求の範囲】
【請求項１】
表Ａによる非ペプチドタンパク質キナーゼＡ／タンパク質キナーゼＡアンカータンパク質分離剤。
【請求項２】
分子量１５０〜６００g/mol、好ましくは１９０〜３００g/molを有し、分配係数ｌｏｇＰが１０以下、好ましくは８以下であって、最大１０個の水素結合供与体と最大１０個の水素結合受容体とを有し、可溶度値ｌｏｇＳｗが−４００〜０であって、原子結合数値が０〜７である非ペプチドタンパク質キナーゼＡ／タンパク質キナーゼＡアンカータンパク質分離剤。
【請求項３】
最大７個、好ましくは６個の水素結合供与体を有し、最大６個、好ましくは５個、より好ましくは４個の水素結合受容体を有し、および／またはｌｏｇＰ値が１以上８以下、好ましくは１以上５以下であることを特徴とする、請求項２に記載の分離剤。
【請求項４】
前記分離剤が、ＡＫＡＰとＰＫＡサブユニットとの相互作用を少なくとも４０％分、好ましくは少なくとも８０％分阻害することを特徴とする、前記請求項１〜３のいずれかに記載の分離剤。
【請求項５】
前記分離剤が表Ｂから選択されることを特徴とする、前記請求項１〜４のいずれかに記載の分離剤。
【請求項６】
該分離剤が表Ｃから選択されることを特徴とする、前記請求項１〜５のいずれかに記載の分離剤。
【請求項７】
前記分離剤が表Ｄから選択されることを特徴とする、前記請求項１〜６のいずれかに記載の分離剤。
【請求項８】
一般式Ｉに記載の前記分離剤が、メソメリズムを介して相互交換可能である（Ｒ２とＲ３は相互交換可能とみなされる）ことを特徴とする、前記請求項１〜７のいずれかに記載の分離剤。
式Ｉ
【化１】
2008540586.tif 000094
（式中、Ｘは非水素原子、好ましくは硫黄原子である。
Ｒ１はアルキル残基、またはアリール残基、好ましくは１−ナフチルメチル残基である。
Ｒ２とＲ３は水素原子、またはアルキル残基またはアリール残基であり、
Ｒ２とＲ３は好ましくは２つの水素原子、２つのメチル残基、１つのベンジル残基と１つのメチル残基、または１つのベンジル残基と１つのtert−ブチル残基である。
特に好ましくは、Ｒ２とＲ３は２−チアゾリジニル残基とメチル残基またはtert−ブチル残基であるか、または１−ナフチル残基と、イソプロピル残基、シクロヘキシル残基、ベンジル残基、またはメチル残基であるか、または一般式ＩＩによるものである。）
式ＩＩ
【化２】
2008540586.tif 000095
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は式Ｉと同じ意味を有する）
【請求項９】
該分離剤が、図１９による構造を含むことを特徴とする、前記請求項１〜８のいずれかに記載の分離剤。
【請求項１０】
該分離剤が、図２０による構造を含むことを特徴とする、前記請求項１〜９のいずれかに記載の分離剤。
【請求項１１】
ＡＫＡＰ１８タンパク質、好ましくはＡＫＡＰ１８デルタタンパク質および／またはＲＩアルファおよび／またはＲＩＩアルファおよび／またはＲＩベータおよび／またはＲＩＩベータの結合を阻害することを特徴とする、前記請求項１〜１０のいずれかに記載の分離剤。
【請求項１２】
ヒトまたは動物の身体の外科的および／または治療的処置に用いられる、および／またはヒトまたは動物の身体に対して行われる診断方法に用いられる、前記請求項１〜１１のいずれかに記載の分離剤。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれかに記載の少なくとも１つの分離剤と、更に少なくとも１つの製剤キャリアおよび／または補助薬を含む医薬品。
【請求項１４】
該キャリアが、溶加剤、崩壊剤、結合剤、保湿剤、増量剤、溶出抑制剤、吸収促進薬、湿潤剤、吸収剤および／または潤滑剤を含む群から選択されることを特徴とする、
前記請求項１３に記載の医薬品。
【請求項１５】
前記薬剤が、カプセル、タブレット、被覆タブレット、座薬、軟膏、クリーム、パッド、注射液および／または輸液であることを特徴とする、前記請求項１３又は１４のいずれかに記載の医薬品。
【請求項１６】
前記認識分子が、抗体、錯化剤および／またはキレート剤であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の分離剤を標的とする認識分子。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれかに記載の分離剤と、請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬品および／または請求項１６に記載の認識分子と、任意に、該キット成分の組合せおよび／または取扱いに関する情報を含むキット。
【請求項１８】
ＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用の改良、特に阻害のための前記請求項１〜１２のいずれかに記載の該分離剤および／または前記請求項１３〜１５のいずれかに記載の該医薬品の使用、および／または請求項１６に記載の認識分子の使用。
【請求項１９】
該相互作用の改良が細胞、細胞培養物、組織および／または標的生物において有効であることを特徴とする、前記請求項１８に記載の使用。
【請求項２０】
該相互作用の改良として、ＡＱＰ２のバソプレッシン誘導再分布を改良、特に阻害していることを特徴とする、前記請求項１９に記載の使用。
【請求項２１】
ＲＩアルファ、ＲＩＩアルファ、ＲＩベータおよび／またはＲＩＩベータＰＫＡサブユニットとＡＫＡＰとの該相互作用を改良、特に阻害することを特徴とする、前記請求項１８〜２０のいずれかに記載の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１７に記載の該医薬品が、ＡＫＡＰ、好ましくはＡＫＡＰ１８、より好ましくはＡＫＡＰ１８デルタに特異的に結合する、および／または該医薬品がＰＫＡ、好ましくはそのサブユニット、特に好ましくはＲＩＩサブユニットに特異的に結合すること
を特徴とする、前記請求項１８〜２１のいずれかに記載の使用。
【請求項２３】
該サブユニットが、ヒトおよび／またはネズミ科動物由来である、および／またはラット由来であることを特徴とする、前記請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
好ましくは区分化ｃＡＭＰ依存シグナル伝達に影響を及ぼす前記請求項１８〜２３のいずれかに記載の分離剤または医薬品のインビトロまたはインビボでの使用。
【請求項２５】
前記区分化ｃＡＭＰ依存シグナル伝達の欠陥に伴う以下の疾病を含む群から選択される疾病の予防または治療のための薬剤の製造のための前記請求項１８〜２４のいずれかに記載の分離剤または医薬品の使用：
任意の病因のぜんそく、すなわちアトピー性ぜんそく、非アトピー性ぜんそく、アレルギー性ぜんそく、ｌｇＥ媒介アトピー性ぜんそく、気管支ぜんそく、本態性ぜんそく、原発性ぜんそく、病理生理学的異常による内因性ぜんそく、環境要因による外因性ぜんそく、未知または不明な原因による本態性ぜんそく、非アトピー性ぜんそく、気管支ぜんそく、気腫性ぜんそく、ストレス誘導ぜんそく、職業ぜんそく、細菌／真菌／原虫／ウイルス感染性によるアレルギーぜんそく、非アレルギー性ぜんそく、初期ぜんそく、「喘鳴小児性症候群」からなる群のぜんそく、
慢性／急性気管支収縮、慢性気管支炎、小気道閉そく及び肺気腫、
任意の病因の気道の閉塞性／炎症性疾病、すなわちぜんそく、塵肺、慢性好酸球性肺炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、肺気腫または関連呼吸困難を含むＣＯＰＤ、気管の不可逆性進行性閉塞の特徴を有するＣＯＰＤ、ショック肺（成人呼吸器疾患症候群、ＡＲＤＳ）、他の医薬品による治療を原因とする気管過敏症の悪化からなる群の気道の閉塞性／炎症性疾病、
任意の病因の塵肺、すなわちアルミニウム肺症やアルミニウム肺塵、炭粉症（ぜんそく）、アスベスト肺症やアスベスト肺塵、カリコシス／石灰肺塵、ダチョウ羽毛塵の吸入によるプチロシス（ptilosis）、鉄微粒子の吸入による鉄沈着症、珪肺症またはポッターぜんそく、綿肺症または綿塵肺、滑石塵肺からなる群の肺塵、
任意の病因の気管支炎、すなわち急性気管支炎、急性喉頭気管支炎、ピーナツ誘発性気管支炎、気管支カタル、クループ性気管支炎、喀痰を伴わない気管支炎、感染性ぜんそく気管支炎、喀痰を伴う気管支炎、ブドウ球菌／連鎖球菌気管支炎、肺胞気管支炎からなる群の気管支炎、
任意の病因の気管支拡張症、すなわち円柱状気管支拡張症、嚢胞状気管支拡張症、紡錘状気管支拡張症、細気管支拡張症、嚢状気管支拡張症、喀痰を伴わない気管支拡張症、濾胞状気管支拡張症からなる群の気管支拡張症、
季節性アレルギー鼻炎、通年性アレルギー鼻炎、または任意の病因の副鼻腔炎、すなわち化膿性／非化膿性副鼻腔炎、急性／慢性副鼻腔炎、し骨蜂巣炎、前副鼻腔炎、上顎副鼻腔炎、ちょう形骨副鼻腔炎からなる群の副鼻腔炎、
任意の病因の関節リウマチ、すなわち急性関節炎、急性痛風性関節炎、原発性慢性多発性関節炎、骨関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、プログロディエント（progredient）関節炎、乾癬性関節炎、脊髄関節炎からなる群の関節リウマチ、
炎症を伴う痛風・発熱、または炎症を伴う疼痛、
任意の病因の好酸球関連病理学的異常、すなわち好酸球増加症、好酸球肺湿潤、レフラー症候群、慢性好酸球肺炎、熱帯性肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギルス腫、好酸球肉芽腫、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、チャーグ・ストラウス症候群、結節性多発性動脈炎（ＰＡＮ）、全身性壊死性血管炎からなる群の好酸球関連病理学的異常、
アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、またはアレルギー性／アトピー性湿疹、
任意の病因のじんましん、すなわち免疫関連じんましん、補体関連じんましん、じんましん誘発物質により誘発されたじんましん、物理的刺激により誘発されたじんましん、ストレス誘発性じんましん、突発性じんましん、急性じんましん、慢性じんましん、血管神経性浮腫、コリン性じんましん、常染色体優勢／獲得型寒冷じんましん、接触性じんましん、ジアンチーン（giantean）じんましん、丘疹状じんましんからなる群のじんましん、
任意の病因の結膜炎、すなわち照射性結膜炎、急性カタル性結膜炎、急性伝染性結膜炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性結膜炎、慢性カタル性結膜炎、化膿性結膜炎、春先の結膜炎からなる群の結膜炎、
任意の病因のブドウ膜炎、すなわちブドウ膜全体またはその一部の炎症、前部ブドウ膜炎、虹彩炎、毛様体炎、虹彩毛様体炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体過敏性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、脈絡膜炎、脈絡網膜炎、乾癬からなる群のブドウ膜炎、
任意の病因の多発性硬化症、すなわち原発性プログロディエント（progredient）多発性硬化症、突発性及び症状の寛解を伴う多発性硬化症からなる群の多発性硬化症、
任意の病因の自己免疫／炎症性疾患、すなわち自己免疫−血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、再生不能性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、全身性紅斑性狼そう、多発性軟骨炎、強皮症、ウェーゲナー肉芽腫症、光線障害、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティーブンス・ジョンソン症候群、突発性スプルー、自己免疫過敏結腸症、潰瘍性大腸炎、クローン病、内分泌眼病、バセドー氏病、サルコイドーシス、肺胞炎、慢性過敏性肺炎、原発性胆汁性肝硬変、インスリン欠乏性糖尿病または１型膵性メリティス、前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎または後部ブドウ膜炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎（蔓延性）、間質性肺線維症、肝硬変症、嚢胞性線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎（ネフローゼ性、非ネフローゼ性）、急性糸球体腎炎、突発性ネフローゼ、微小変化ネフロパシー、炎症性／過剰増殖性皮膚疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、家族性両性天ほうそう、紅斑性天ほうそう、落ち葉状天ほうそう、ブルガリス（vulgaris）天ほうそうからなる群の自己免疫／炎症性疾患、
臓器移植後の回種移植拒絶反応の予防、
任意の病因の過敏性腸炎（炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、すなわち潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、膠原性大腸炎、ポリープ性大腸炎、貫壁性大腸炎、クローン病（ＣＤ）からなる群の過敏性腸炎、
任意の病因の敗血性ショック、すなわち腎不全、急性腎不全、悪液質、マラリア悪液質、下垂体性悪液質、尿毒性悪液質、心臓悪液質、副腎悪液質またはアジソン病、癌性悪液質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染症から起こる悪液質からなる群の敗血性ショック、
肝臓障害
肺高血圧症、酸素欠乏に誘発される肺高血圧症、
骨希薄化、原発性骨粗しょう症、二次骨粗しょう症、
任意の病因の中枢神経系異常、すなわちうつ病、パーキンソン病、学習記憶障害、遅発性ジスケネジー、薬物依存症、動脈硬化症認知症、ハンチントン病の随伴症状としての認知症、ウィルソン病、激越性麻痺症、視床委縮からなる群の中枢神経系異常、
感染症、特にウイルス感染。該ウイルスは、宿主におけるＴＮＦ−αの生成を増大させる、または宿主におけるＴＮＦ−αの上方調節に感応するので、複製やその他の重要な活性を妨げる。該感染症のウイルスには、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、サイトメガロウイルス、ＣＭＶ、インフルエンザ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（帯状ヘルペスや単純ヘルペスを含む）が挙げられ、
イースト菌感染症と真菌感染症の該イーストと菌類は、宿主におけるＴＮＦ−αの上方調節に感応するまたはＴＮＦ−αの生成を誘発し、特に全身性イースト菌感染症と真菌感染症の治療用に他の薬剤とともに同時投与を行う場合は真菌性髄膜炎に有効で、該他の薬剤の例としては、ポリマイシン、好ましくはポリマイシンＢ、イミダゾール、好ましくはクロトリマゾール、エコナゾール、ミコナゾールおよび／またはケトコナゾール、トリアゾール、好ましくはフルコナゾールおよび／またはイトラナゾール、ならびにアンフォテリシン、好ましくはアンフォテリシンＢおよび／またはリポソームアンフォテリシンＢが挙げられる。
【請求項２６】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬品が、ゲル、パウドレージ（poudrage）、粉末、タブレット、持続放出タブレット、予混合剤、乳化剤、調合製剤、ドロップ剤、濃縮物、粒状、シロップ、ペレット、ボーラス、カプセル、エアロゾル、スプレーおよび／または吸入の形態にて調製され適用されることを特徴とする、前記請求項１８〜２５のいずれかに記載の使用。
【請求項２７】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬品が、濃度０．１〜９９．５wt％、好ましくは濃度０．５〜９５．０wt％、より好ましくは濃度２０．０〜８０．０wt％で製剤中に存在することを特徴とする、前記請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
該製剤が、経口投与、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与および／または局所性投与されることを特徴とする、前記請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の医薬品を、２４時間につき体重１kg当り総量０．０５〜５００mg、好ましくは５〜１００mg使用することを特徴とする、前記請求項１８〜２８のいずれかに記載の使用。
【請求項３０】
請求項１３〜１５のいずれかに記載の少なくとも１つの医薬品が、生物、好ましくはヒトまたは動物に接触することを特徴とする、前記請求項１８〜２９のいずれかに記載の使用。
【請求項３１】
接触ルートは、経口、注入、経局所、経膣、経直腸および／または経鼻であること
を特徴とする前記請求項１８〜３０のいずれかに記載の使用。
【請求項３２】
ぜんそく、筋緊張亢進、冠状動脈性心臓病、心臓肥大、十二指腸潰瘍、心不全、肝硬変、統合失調症、ＡＩＤＳ、膵性糖尿病、尿崩症、肥満、慢性閉塞性肺疾患および／または浮腫の予防または治療のための薬剤の製造における前記請求項１８〜３１のいずれかに記載の分離剤または医薬品の使用。
【請求項３３】
水利尿薬、避妊薬、抗感染症薬、抗不安薬および／または抗癌剤の形態をとることを特徴とする前記請求項１８〜３２のいずれかに記載の使用。
【請求項３４】
請求項１〜１２のいずれかに記載の分離剤および／または請求項１６に記載の認識分子を含む生物。
【請求項３５】
好ましくは前記認識分子が存在する結果として、該生物が、ぜんそく、筋緊張亢進、心臓肥大、冠状動脈性心臓病、十二指腸潰瘍、心不全、肝硬変、統合失調症、ＡＩＤＳ、膵性糖尿病、尿崩症、肥満、癌、慢性閉塞性肺疾患、学習障害、および／または浮腫を含む群から選択される疾病を示すこと
を特徴とする、前記請求項３４に記載の生物。
【請求項３６】
請求項２８に記載の生物を、組織および／または細胞特異的なＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用のモデルとして、特に尿崩症、膵性糖尿病、肥満、浮腫、慢性閉塞性肺疾患、ＡＩＤＳ、統合失調症、肝硬変、心不全、冠状動脈性心臓病、心臓肥大、学習向上、筋緊張亢進、十二指腸潰瘍および／またはぜんそくのモデルとして使用すること
を特徴とする、前記請求項１８〜３２のいずれかに記載の使用。
【請求項３７】
ＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用を改良、好ましくは阻害する方法であって、前記方法が、以下の工程：
（ａ）請求項１〜１３のいずれかに記載の分離剤および／または請求項１６に記載の認識
分子を生成する工程、および
（ｂ）前記工程（ａ）による少なくとも１つの生成物を、細胞、細胞培養物、組織および
／または標的生物に接触させる工程
を含む方法。
【請求項３８】
前記改良がＰＫＡの調節ＲＩＩサブユニットに作用することを特徴とする、前記請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＲＩＩサブユニットがＲＩＩアルファサブユニットおよび／またはＲＩＩベータサブユニットであることを特徴とする前記請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
特に組み合せた医薬品設計および／または構造に基づく医薬品設計を使用した医薬品の開発においてリード構造として働く請求項１〜１２のいずれかに記載の分離剤の使用。
【請求項４１】
医薬品を製造する方法であって、前記方法が、以下の工程：
（ａ）リード構造として請求項１〜１２のいずれかに記載の分離剤を生成する工程と、
（ｂ）好ましくは組み合せた医薬品設計および／または構造に基づく医薬品設計を使用し
て該リード構造の化学的改良を行うことによって物質を得る工程、および任意に
（ｃ）該ＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用に影響を及ぼす能力について該物質を試験する工程、
および医薬品として適切な物質を選択する工程
を含む方法。
【請求項４２】
該物質を、薬剤として許容可能な形態に調製することを含む、前記請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）とタンパク質キナーゼＡアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）との相互作用を調節し、特に阻害する非ペプチド分子に関するとともに、該非ペプチド化合物、または例えば抗体やキレート剤等のような、該非ペプチド化合物を標的とする認識分子を含む宿主または標的生物に関する。本発明は更に、特にｃＡＭＰシグナル経路の異常に伴う疾病の治療のための医薬品に関する。該疾病としては特に、尿崩症、筋緊張亢進、膵性糖尿病、十二指腸潰瘍、ぜんそく、心不全、肥満、ＡＩＤＳ（後天性免疫不全症候群）、浮腫、肝硬変、統合失調症、その他の疾病が挙げられる。本発明は更に、新規性を有する分子の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
外部からのシグナルを受けて該シグナルに応答する細胞の能力は、細胞が生存し機能を発揮する上で根本的に重要である。シグナルは、受容体によって検出され、細胞応答に変換される。該細胞応答には、常に化学プロセスが含まれる。
【０００３】
多数のシグナルと更に多数の反応が存在する可能性があるので、多数のシグナル経路が必要とされる。考えられるシグナル経路の１つは、ｃＡＭＰ依存シグナル経路である。該ｃＡＭＰ依存シグナル経路は、例えば神経伝達物質またはホルモン等の細胞外シグナルによるＧタンパク質共役型ヘプタヘリカル膜貫通受容体の活性化によって生じる。該シグナル経路に関する最良の調査例は、β−アドレナリン受容体システムである。該システムにおいて、Ｇタンパク質共役型β−アドレナリン受容体（ＧＰＣＲ）は、アドレナリンまたはノルアドレナリンによって活性化される。β−アドレナリン受容体は、サブタイプであるベータ１、ベータ２、ベータ３に分化される。これらのサブタイプは、組織分布やリガンド親和性の点で異なる。
【０００４】
このように活性化された受容体がシグナルをヘテロ三量体であるグアノシン三リン酸結合タンパク質（ＧＴＰ結合タンパク質またはＧタンパク質）に伝達すると、続いて該ヘテロ三量体グアノシン三リン酸結合タンパク質は結合ＧＤＰをＧＴＰに置換し同様に活性化される。
【０００５】
ＧＴＰ結合に続いて、三量体はアルファサブユニットとベータ−ガンマサブユニットとに解離する。両サブユニットは、アシル化により膜に結合する。各サブユニットは、自己のエフェクターの活性化と阻害とを行うことができる。
【０００６】
Ｇタンパク質は、固有ＧＴＰａｓｅ活性を有する。これによって結合ＧＴＰを開裂しＧタンパク質を再び非活性化することができるので、アルファサブユニットとベータ−ガンマサブユニットは三量体を再形成することができる。したがって、Ｇタンパク質は、分子スイッチの機能を担う。Ｇタンパク質は、複数の種類に分類される（Ｇｓ、Ｇｉ、Ｇｑ、Ｇｏｌｆ）。これらのサブユニットは、様々なエフェクターの活性化または阻害を行うことができる。上記エフェクターの例としては、Ｃａ２＋チャンネル、Ｋ＋チャンネル、ホスホリパーゼＣ−ベータ、アデニル酸シクラーゼ（ＡＣ）が挙げられる。
【０００７】
複数の変異形で発生する膜酵素同様に、アデニル酸シクラーゼはＧａｌｐｈａｓによって刺激される。これは、ＡＴＰを二次メッセンジャーであるｃＡＭＰに変換する。ｃＡＭＰは、細胞質ゾル中で自由に拡散可能であり、様々なエフェクターを活性化させることができる。該エフェクターとしては、ｃＡＭＰ結合において開閉する環状ヌクレオチドゲート（ＣＮＧ）陽イオンチャンネルと、いわゆるＥＰＡＣ（ｃＡＭＰによって活性化された交換タンパク質）であるグアニンヌクレオチド交換因子（ＧＥＦ）のファミリーとがある。後者は、Ｒａｓのサプレッサーとして働く小単量体ＴＧＰａｓｅであるＲａｐ−１、Ｒａｐ−２とを調節化する。ｃＡＭＰがＥＰＡＣに結合すると、構造変化が生じて、ＧＥＦ領域が露出され活性化される。このようにして、抑制効果は終了し、ＲａｓをＧＥＦ機能によって活性化できる。Ｒａｓは、様々なシグナルによって活性化されたＭＡＰキナーゼ（マイトジェン活性化タンパク質キナーゼ）シグナル経路に関係する（例：増殖または分化を誘発するサイトカインに基づく）。
【０００８】
更に、ｃＡＭＰは、ｃＡＭＰ−応答エレメント結合タンパク質（ＣＲＥＢ）による遺伝子発現に影響を及ぼし得る。ＣＲＥＢは、ＤＮＡのｃＡＭＰ−応答エレメント（ＣＲＥ）に結合するので、転写因子として作用する。
【０００９】
ただし、最も広範に説明され最良の特徴付けがなされたｃＡＭＰのエフェクターは、ｃＡＭＰ依存タンパク質キナーゼ（ＰＫＡまたはＡキナーゼ）である。不活性状態において、タンパク質は２つの調節サブユニット（Ｒ）と２つの触媒サブユニット（Ｃ）とから成るヘテロ四量体の形態をとる。該結合状態において、触媒サブユニットは不活性である。細胞内ｃＡＭＰ濃縮によって次に刺激が生じると、２つのｃＡＭＰ分子は各Ｒサブユニットに結合する。このようにして誘発された構造変化の結果として、触媒サブユニットは放出されてから、Ｓｅｒ残基及びＴｈｒ残基における近隣の標的タンパク質をリン酸化することによって、構造変化ひいては機能変化をも引き起こす。標的タンパク質の認識は、コンセンサス配列によって行われる。
【００１０】
多くの様々な細胞外刺激がｃＡＭＰ−ＰＫＡ経路に集中するという事実を考慮すると、またＰＫＡは広範な基質特異性を有する酵素であるという事実から見ると、どのようにしてこの多様な刺激が様々な特定の細胞応答を誘発することが可能なのか疑問が生じる。
【００１１】
ｃＡＭＰ−ＰＫＡシグナル経路における特異性に対してまず寄与するのは、ＲサブユニットとＣサブユニット（それぞれＲＩアルファ、ＲＩベータ、ＲＩＩアルファ、ＲＩＩベータ、Ｃアルファ、Ｃベータ、Ｃガンマ、ＰｒＫＸ）である。これらは、細胞の種類によって、様々なイソ型で存在し、凝集を経て機能的に異なるＰＫＡイソ型になる。一般にＲＩサブユニットは、ＲＩＩサブユニットに比べてｃＡＭＰへの親和性が高い。Ｒサブユニットは、ホモ二量体とヘテロ二量体との両方を形成することができるので、高い親和性を有する多くの組合せを実現することができる。
【００１２】
更に、局所的面は、シグナル経路の特異性において重要な役割を果たす。ｃＡＭＰは、Ｇタンパク質共役型受容体近隣の特定の部位におけるＡＣによって生成される。細胞質ゾルにおける自由拡散は、ｃＡＭＰを加水分解しアデノシン一リン酸を形成するホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）によって制限される。このようにして、細胞外刺激は、ＰＤＥによって局所的に活性が制限されたｃＡＭＰ領域内に位置するＰＫＡ四量体のみを活性化する。
【００１３】
キナーゼアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）は、上記のような活性の領域内のみならず、リン酸化される基質近隣においてもＰＫＡをアンカリングする重要な機能を担う。
【００１４】
ＡＫＡＰタンパク質は、現在のところ約５０のタンパク質から成るファミリーであり、個々のＡＫＡＰタンパク質はそれぞれ有意な配列相同性はないものの、同様な機能を有する。ＡＫＡＰタンパク質は、ＰＫＡのＲサブユニットに対する結合領域の特性によって規定される。この保存モチーフは、１４〜１８のアミノ酸から成る両親媒性アルファヘリックスであって、その疎水性側はＰＫＡの疎水ポケットと相互作用する。
【００１５】
疎水ポケットは、二量化ＲサブユニットのＮターミナスによって形成される。Ｎターミナスは、逆平行状に凝集し、２つのヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフから４つのヘリックス束を形成する。Ｎターミナスに最も近い各サブユニットのアルファヘリックスは、ＡＫＡＰ結合に必要な疎水ポケットを形成する。一方、Ｃターミナル方向の束状構造のアルファヘリックスは二量化が可能である。アルファヘリックスに寄与するアミノ酸とは別に、更にＮターミナルのアミノ酸の側鎖はＡＫＡＰタンパク質との相互作用に関係する。
【００１６】
ＲＩサブユニットとＲＩＩサブユニットのＮターミナル部分は、配列によって異なるので、ＡＫＡＰ結合特異性は多様である。大部分のＡＫＡＰタンパク質は、ＲＩＩサブユニット（Ｋｄ（ナノモル範囲））に結合する。この場合、低親和性ＡＫＡＰタンパク質と高親和性ＡＫＡＰタンパク質とに分かれる。１〜５０nMのＫｄ値を有するＡＫＡＰ−Ｌｂｃ／Ｈｔ３１であるＡＫＡＰ７９、ＡＫＡＰ９５は、高親和性ＡＫＡＰタンパク質に含まれる。エズリン／ラジキシン／モエシンのタンパク質ファミリーに含まれるＡＫＡＰタンパク質は、低親和性を有するＡＫＡＰタンパク質に含まれる（Ｋｄ値はミクロモル範囲）。更に、両方のＲタイプに結合する二重特異的ＡＫＡＰタンパク質（Ｄ−ＡＫＡＰ）もいくつか存在する。ＡＫＡＰＣＥ（シノラブディスエレガンス由来）、ＡＫＡＰ８２、ＰＡＰ７（末梢型ベンゾジアゼピン受容体（ＰＢＲ）（付随タンパク質７））、ｈＡＫＡＰ２２０のみが、現在既知であるＲＩ特異的ＡＫＡＰタンパク質である。ＡＫＡＰタンパク質の他の特徴的な領域は、各ＡＫＡＰタンパク質を特定の細胞内コンパートメントにアンカリングするいわゆる標的領域である。
【００１７】
ＰＫＡと細胞下構造の他に、ＡＫＡＰタンパク質は、他のシグナル分子と、ＰＤＥやホスファターゼ等のｃＡＭＰ−ＰＫＡシステム内の重要な酵素とを結合することができる。加水分解による後者の逆リン酸化反応によって、刺激効果を終了させることができる。このようにして、ＡＫＡＰタンパク質は、シグナルの開始と終了とに必要なすべてのタンパク質が集合可能である基質の近くで骨格を形成する。ＡＫＡＰ固定ＰＫＡによる基質リン酸化反応によって、原則として拡散しているＡＣ由来のｃＡＭＰシグナルは空間・時間的に集中する。
【００１８】
ＡＫＡＰタンパク質は、多くの細胞プロセスに大いに関係している。考えられる形態の１つは、細胞内におけるＡＫＡＰタンパク質の局在化である。したがって、イオンチャンネルＡＫＡＰタンパク質、細胞骨格関連ＡＫＡＰタンパク質、ミトコンドリア関連ＡＫＡＰタンパク質が存在する。他の考えられる形態は、ＡＫＡＰタンパク質の組織特異的発現によるものである。
【００１９】
細胞内の信号伝達経路に対するＡＫＡＰタンパク質の重要性を実証するため、３つのＡＫＡＰタンパク質、すなわちグラビン、ＡＫＡＰ７９、ＡＫＡＰ１８の機能について以下更に詳細に説明する。
【００２０】
グラビンはアクチン関連ＡＫＡＰである。重合アクチンは、細胞骨格の重要な成分である。グラビンは、多価足場タンパク質として働き、アクチンだけでなく、ＰＫＡとＣａ２＋依存タンパク質キナーゼ（ＰＫＣ）とに結合する。この合成物は、アゴニストによる刺激に続くβ２アドレナリン受容体（上記参照）の脱感作において重要である。静止状態において、グラビン合成物は受容体に結合する。例えばアドレナリン結合等による受容体の活性化によって、ｃＡＭＰが形成される（上記参照）。グラビンアンカーＰＫＡは、グラビン自体をリン酸化するその触媒サブユニットを放出し、リン酸化は初期に結合を推進する。アゴニストによる刺激が継続すると、グラビンも、同様にアンカリングされているＰＫＣによってリン酸化される。該リン酸化によって、グラビン合成物は受容体から解離する。代わりに、マウス二重微小２（ＭＤＭ２）ユビキチンリガーゼに結合するβ−アレスチンアダプタータンパク質が受容体に結合する。ＭＤＭ２触媒ユビキチン化は、β２アドレナリン受容体システムの脱感作によるプロテアソーム分解とエンドサイトーシスのための受容体を特徴付けるものである。
【００２１】
ＡＫＡＰ７９は、海馬におけるシナプス可塑性の調節に関係するイオンチャンネル関連ＡＫＡＰである。ＰＫＡの媒介により、α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチル−４−イソオキサゾリルプロピオン酸（ＡＭＰＡ）受容体によって誘発されたＮａ＋またはＣａ２＋のフラックスが増大する。ＡＭＰＡ受容体は、固有Ｃａ２＋／Ｋ＋チャンネル機能を有する。該増大は、リン酸化によってグルタミン酸受容体の活性を調節することによって達成される。ＡＫＡＰ７９は、ＡＭＰＡ受容体付近でＰＫＡをアンカリングする機能を担う。このため、ＡＫＡＰ７９は、Ｎターミナル基本領域を有するので、ホスファチジルイノシトール−４，５−ビスリン酸膜脂質への結合が可能となる。受容体に対するＡＫＡＰ７９の結合は直接行われず、むしろ、ＡＫＡＰ７９は、受容体に順に結合する膜結合グアニル酸キナーゼタンパク質（ＭＡＧＵＫ）に結合する。
【００２２】
ＡＫＡＰ１８は初め、１５kDAまたは１８kDAサイズの膜結合タンパク質とされた。この場合ＡＫＡＰ１８は、Ｃａ２＋チャンネルのＣターミナスと直接相互作用しながら、上皮細胞の側底細胞膜や、プラズマ細胞膜上のＬタイプＣａ２＋チャンネル付近の骨格筋細胞においてＰＫＡをアンカリングする。
【００２３】
このタンパク質は８１のアミノ酸から成り、ＰＫＡ結合両親媒性ヘリックスとＮターミナルミリストイルとプラズマ細胞膜上のＰＫＡ−ＡＫＡＰ合成物をアンカリングするパルミトイル脂質アンカーとを含む。ＡＫＡＰ１８とＣａ２＋チャンネルとの間の相互作用は、ロイシンジッパー状モチーフを含むチャンネルのアルファ１サブユニットのＣターミナル領域を介して生じる。このように、ＰＫＡは、アルファ１サブユニットにおける重要なリン酸化部位の近くに位置付けられる。これによって、特異的リン酸化が可能になる。リン酸化は、チャンネル開確率を増大させる。
【００２４】
更なる研究によって、複数のスプライシング変異体がＡＫＡＰ１８遺伝子から出現することがわかった。このため、上記ＡＫＡＰ１８タンパク質は、ＡＫＡＰ１８アルファ（またはＡＫＡＰ１５）とも呼ばれる。この他のスプライシング変異体は、ＡＫＡＰ１８ベータ、ＡＫＡＰガンマ、ＡＫＡＰデルタである。
【００２５】
ＡＫＡＰ１８ベータは、１０４のアミノ酸から成り、アルファ変異体と同じ膜結合領域を含む。２３のアミノ酸を含む追加領域は、タンパク質を、極性上皮細胞における頂端プラズマ細胞膜に方向付ける。ＡＫＡＰ１８ベータの機能は、現在までのところ不明確である。
【００２６】
大部分のＡＫＡＰタンパク質とは異なり、３２６のアミノ酸から成るＡＫＡＰ１８ガンマは、可溶性細胞分画にも局在化する。マウス卵母細胞において、ＡＫＡＰ１８ガンマは細胞核でＰＫＡ−ＲＩサブユニットをアンカリングする。これは、転写調節に関係することを示している。
【００２７】
ＡＫＡＰ１８デルタは、３５３のアミノ酸を含むタンパク質である。そのＲＩＩ結合領域は、アルファ−ガンマ変異体の該領域とほとんど同一である。ＡＫＡＰ１８デルタは、ＡＫＡＰ１８ガンマと大きく相同するタンパク質である。ＡＫＡＰ１８デルタは、アクアポーリン−２（ＡＱＰ２）水路が細胞内小胞から腎集合導管細胞の頂端プラズマ細胞膜へ転位すること（下記を参照）に関係するＡＫＡＰタンパク質の探索中に発見された。ＡＫＡＰ１８デルタは、ＡＱＰ２含有小胞に局在化することが実証されている。
【００２８】
更に、その分布は、ＡＱＰ２の分布と非常に似ている。また、引き続き起きる腎細胞の適切な刺激によって、ＡＱＰ２とともにプラズマ細胞膜に転位するので、ＡＱＰ２転位に関係すると推測される。
【００２９】
ＡＱＰ２転位は、抗利尿ホルモンであるアルギニン−バソプレッシン（ＡＶＰまたはＡＤＨ）によって誘導される。ホルモン形成と血流内に分泌されるその分泌物は、血液の浸透圧を常に監視する視床下部の浸透圧受容器によって制御される。例えば生物の水分摂取量が減少した結果として浸透圧が増大した場合、ＡＶＰが合成されて血流に分泌される。
【００３０】
ＡＱＰ２再分布の開始シグナルは、腎集合導管の主細胞の側底膜側においてＡＶＰがバソプレッシン受容体（Ｖ２Ｒ）に結合することによってなされる。ＧＰＣＲであるＶ２受容体は上記シグナルカスケードを作動させるので、ｃＡＭＰの形成が増大する。
【００３１】
ｃＡＭＰ結合によって引き起こされる構造変化の結果として、ＡＫＡＰ１８デルタによってＡＱＰ２含有分泌小胞にアンカリングされたＰＫＡは、近隣に位置するＡＱＰ２水路をリン酸化するその触媒サブユニットを放出する。該リン酸化によって、小胞が頂端プラズマ細胞膜に輸送されて融合がなされる。
【００３２】
このようにして、膜の透水性が増大し、増大した水量は集合導管の頂端膜の他方側に位置する一次尿から再吸収可能である。したがって、シグナルチェーンの初期刺激の影響が弱められる。
【００３３】
ＡＫＡＰ１８デルタだけでなく、他のタンパク質もＡＱＰ２小胞に関わっているが、これら他のタンパク質はＡＫＡＰ１８デルタと違って、プラズマ細胞膜に到達しない。これは、ＡＫＡＰ１８デルタによって小胞膜にアンカリングされたＰＫＡが、ＡＱＰ２リン酸化にとってだけでなく、例えばプラズマ細胞膜への輸送プロセスを調節するリン酸化にとっても必要である可能性を示している。この種の機能は、ＬタイプＣａ２+チャンネル関係ＡＫＡＰ７９についても実証されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００３４】
上記のとおり、ＰＫＡ結合領域の両親媒性ヘリックスを模した合成ペプチドによって、ＰＫＡのＡＫＡＰタンパク質への結合を阻害することが可能である。上記の阻害性ペプチドは、ＡＫＡＰタンパク質によるＰＫＡ区画化の生理学的意義を解明する上で重要な役割を果たすが、これらのペプチドには不利な点がある。ペプチドは、特に安定しているわけではなく、たとえば合成において費用がかかる。ＡＫＡＰタンパク質は、多くの細胞プロセスにおいて特異性を示し組織特異的に発現するので、ＡＫＡＰタンパク質は新しい医薬品にとって興味深い標的である。ただし、ＡＫＡＰタンパク質は新しい物質を開発する前に標的として検証しなければならない。結果として、ＡＫＡＰタンパク質とＰＫＡとの間の相互作用は、動物モデルにおいて除去される必要があり、次にヒトモデルにおいても除去される必要がある。しかしながら、ペプチドは、試験動物に投与することはできない。その理由は、ペプチドは胃腸管において分解するからである。ＡＫＡＰ機能の研究の他の重要なモデルは、細胞培養モデルである。ただし、膜透過性を保証するため、ペプチドは細胞培養で使用する場合アシル化しなければならない。
【課題を解決するための手段】
【００３５】
立体障害の結果として、またはより適切に相互作用する（疎水性）アミノ酸側鎖によって、従来技術のペプチドは、完全ＡＫＡＰタンパク質よりも調節ＰＫＡサブユニットの疎水ポケットに対してより強固にドッキングする。このようにして、ＡＫＡＰタンパク質によるＰＫＡ区画化を除去する生理学的効果を実験にて試験することができる。
【００３６】
最初に導入され現在まで最も頻繁に使用されているアンカーペプチド阻害剤は、２２〜２４のアミノ酸から成り、Ｈｔ３１ＡＫＡＰタンパク質のＰＫＡ結合領域由来であり、ＡＫＡＰ−Ｌｂｃとしても知られているＨｔ３１ペプチドである。
【００３７】
生物情報学の方法とペプチドアレイスクリーニングを使用した。これにおいて、まず様々なＡＫＡＰタンパク質から計算したＲＩＩサブユニットのコンセンセス結合部位からアミノ酸を体系的に置換して、結合実験用ペプチドをセルロース膜に結合させた。より強い阻害効果を有するペプチドであるＡＫＡＰＩＳ（シリコン内で）を生成することができた。２つのアミノ酸側鎖の位置が修正された結果として、ＲＩＩサブユニットと追加の疎水性相互作用が実現可能な１７ｍｅｒが存在し、これはその立体構造を安定化させる追加の塩橋を形成することができる。
【００３８】
高親和性ＡＫＡＰタンパク質内に含まれるＡＫＡＰ１８デルタのＲＩＩ結合領域を発端とすると、さらに高い親和性を有する阻害性ペプチドを発生させることができた。特にこれらは、低用量が可能であり、ペプチドの非特異的効果がより表れにくいという利点を有する。
【００３９】
ここで、ＡＫＡＰ１８デルタとＲＩＩとの結合領域を含む２５ｍｅｒのすべてのアミノ酸を、１つずつ、すべての種類の他の生体アミノ酸で置換した。高親和性を有するペプチドを根幹として、疎水ポケットにおけるペプチド結合の構造モデルに基づく更なるアミノ酸置換を行った。ただし、更に親和性を増大することはできなかった。結果として得られたペプチドは、その特異性と、ＡＫＡＰ−ＲＩＩ結合の広範阻害剤としての生物学的機能とについて試験した。
【００４０】
驚くべくことに、表Ａによる非ペプチド分子はＰＫＡとＡＫＡＰとの阻害剤または分離剤として、またはＰＫＡアンカリングをブロックする物質として使用可能であることが分かった。非ペプチド阻害剤は、新しい活性物質のリード構造でもある。一方では、該物質は、インビトロ実験においてＰＫＡアンカリングをブロックする新しいツールである。他方では、該物質は新しい種類の医薬品の基礎である。この新しい種類の医薬品とは、従来の医薬品とは異なり、酵素や受容体の活性よりもむしろタンパク質間の相互作用に影響を及ぼすものである。
【００４１】
すべてのこれらの分子は、ＰＫＡ−ＡＫＡＰ間の相互作用に関する非ペプチドブロッキング剤または分離剤である点で共通している。これらは、従来技術では開示されていない。すべてのこれらの物質は、ＰＫＡアンカリングをブロックするために使用することもできる。本明細書で請求した化合物は、ＡＫＡＰ−ＲＩＩ合成物の特異的阻害剤を提供する。驚くべきことに、本発明による物質の化学的特性や物理的特性によって、細胞培養、動物モデルだけでなく、霊長類やヒトの分野において直接使用することが可能になる。これにより、初めて、ＡＫＡＰタンパク質の機能についてインビボで研究することが可能になる。今日まで、従来技術においてＡＫＡＰタンパク質の機能に関するインビボ研究は論じられていない。このインビボ適合性は、本発明によるすべての化合物の共通特性である。
【００４２】
すべての新規性のある化合物が新しい構造成分を示すものではないが、このことは、本明細書の内容に単一性の欠如が存在することを意味するものではない。本明細書で請求した代替化合物は、共通の特性または効果を有する。
【００４３】
本発明の他の態様では、本明細書で請求した好ましい化合物は、驚くべきことに多様な共通の生理化学的特性を示す。該特性によって化合物は医薬品として非常に有用になる。該特性は、大いにLipinski's Rule（いわゆるRule of Five）に適合しているからである。本発明による化合物の上記共通の生理化学的または構造的な特性は、分子量１５０〜６００g/mol、好ましくは１９０〜３００g/molを有し、分配係数ｌｏｇＰが１０以下、好ましくは８以下、より好ましくは１以上５以下であって、最大１０個の水素結合供与体と最大１０個の水素結合受容体とを有し、可溶度値ｌｏｇＳｗが−４００〜０であって、原子結合数値が０〜７であって、ＡＫＡＰ１８デルタ−ＲＩＩ相互作用が好ましくは少なくとも４０％分阻害されるという特性である。この構造的な共通特性全体の結果として、ＰＫＡとＡＫＡＰの効果を阻害することと、ＰＫＡアンカリングをブロックすることが機能的関係を有するようになる。したがって、共通生理化学的特性は、任意の特性全体を意味するものではなく、化合物の良好なインビボにおける適切性を可能にし特徴付ける特許請求項の範囲にあるいわゆる「共通のフィンガープリント」を示す。特に好ましい態様では、本発明の分子は、ＰＫＡの調節サブユニット、特にＲＩアルファまたはＲＩＩアルファ及びＲＩＩアルファまたはＲＩＩベータにそれぞれ結合する。本発明の分子は、使用する種に基づいて、ＡＫＡＰ、好ましくはＡＫＡＰ１８、より好ましくはＡＫＡＰ１８デルタおよびＰＫＡの改良、阻害、または分離を可能なものにしている。簡単な通常試験を使用して、当業者は、本発明による分子を標的とする認識分子を容易に生成することができる。例えば、該認識分子は、抗体、キレート剤、錯化剤、または従来技術で周知の他の構造体であってよい。該認識分子は、その標的が既知なら（この場合は分離剤）、容易に生成される。例えば、分離剤は補剤とともに生物に投与されることにより、既知の方法によって収集可能な抗体が形成される。これらの認識分子、または本発明の分子を使用して、該生物を新規性のある分子または認識分子と接触させることによって、ＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用を組織特異的におよび／または細胞特異的に改良した生物を提供可能になる。
【００４４】
好ましい分離剤は、以下の特性を有する。すなわち、ｌｏｇＰ値が９、８、７、６、５未満、好ましくは４、より好ましくは３、特に好ましくは２未満である。水素結合供与体および／または水素結合受容体が最大で１０、９、８、７、６、好ましくは５、特に好ましくは４、３および／または２である。および／または原子結合数が特に１、２、３、４、５、または６である。および／またはｌｏｇＳｗ値が３５０、３００、２５０、２００、１５０、１００、または５０である。及び分子量が１５０〜５５０、１５０〜５００、１５０〜４５０、１５０〜４００、または１５０〜３５０である。
【００４５】
分離剤は、好ましくは最大６個の水素結合供与体、および／または最大４個の水素結合受容体、および／または１以上５以下の分配係数ｌｏｇＰを有する。
【００４６】
本発明の特に好ましい実施態様では、新規性のある分離剤は、ＡＫＡＰとＰＫＡサブユニットとの相互作用を少なくとも８０％阻害する。相互作用の阻害性が測定可能な適切な方法は、当業者にとっては周知である。例えば、Ｈｔ３１ペプチドを使用してＡＫＡＰ−ＰＫＡ結合の阻害を達成する方法を説明・開示した多くの文献が存在する。しかしながら本発明においては、阻害とは、２つの分子間の影響を受けない相互作用ではなく、ＡＫＡＰとＰＫＡとの相互作用の任意の改良形態を意味する。ＡＫＡＰとＰＫＡとの結合の阻害が好ましいものの、本発明によればＡＫＡＰとＰＫＡとの相互作用を増大させることも望ましい。
【００４７】
特に好ましい分離剤は、表Ａに示した。表Ａに記載の分離剤は、ＡＫＡＰとＰＫＡとの相互作用を阻害するだけでなく、標的生物における非常に良好な吸収につながる生理化学的特性を有するので、ｃＡＭＰ依存シグナル伝達の不安定や異常によって誘導された疾病を治療することができる。当業者ならば、現在の技術をもとに該疾病を熟知しているであろうし、どの種類の疾病が該当するか分かるであろう。周知の疾病とは例えば、尿崩症、膵性糖尿病、肥満、浮腫、慢性閉塞性肺疾患、ＡＩＤＳ、統合失調症、肝硬変、心不全、冠状動脈性心臓病、筋緊張亢進、および／またはぜんそくである。ただし、ｃＡＭＰ依存シグナル伝達における異常によって引き起こされた疾病についてはこれらの限りではない。下記の他の疾病は、本発明に記載の医薬品を用いた治療に対し大変効果のある疾病の中にも含まれている。
【００４８】
本発明による他の好ましい分子は、表Ｂに示した。こららの好ましい化合物は、共通する生理化学的特性を有する。該特性によって、ヒトまたは動物の身体の外科的および／または治療的処置において、及びヒトまたは動物の身体に対して行われる診断方法において、医薬的に許容可能なキャリアを任意選択的にともに使用して、該化合物を使用することが可能になる。有利なことに、化合物はLipinskiらによるRule of Fiveに適合する物質特性を有する（Lipinskiら、Adv. Drug Deliv. Rev. 46, 3-26 (2001)）。
【００４９】
本発明の他の好ましい実施形態は、表Ｃから選択される分離剤に関する。表Ｃに記載の好ましい化合物は、良好な膜透過性を有する。これにより、化合物はインビボで容易に使用可能である。すなわち、特に医薬品としてＰＫＡアンカリングをブロックし、またはＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用を調節し、特に阻害する。
【００５０】
本発明による有利な分子は、表Ａ、Ｂおよび／またはＣに開示されている。その生理化学的特性（すなわち、低分子量である特性、有利な分配係数、可溶性、原子結合数値を有する点、最大１０個の水素結合受容体、特に実質的には最大7個、好ましくは６個、より好ましくは５個の水素結合供与体を含む特性）によって、これらの医薬品は、標的生物（好ましくはヒト、または霊長類、ラット、マウス等の試験動物）等のインビボシステムでの予防、治療、フォローアップ、および／または診断において非常に有用である。他の好ましい分離剤は、表Ｄに開示している。
【００５１】
本発明の他の好ましい実施態様では、新規性のある分離剤は、一般式Ｉを有する。ここで、メソメリズム相互交換が生じる（Ｒ２とＲ３は相互交換可能とみなされる）。
式Ｉ
【化１】
2008540586.tif 000002
式中、Ｘは非水素原子、好ましくは硫黄原子である。Ｒ１はアルキル残基またはアリール残基、好ましくは１−ナフチルメチル残基である。Ｒ２とＲ３は水素原子またはアルキル残基またはアリール残基であり、Ｒ２とＲ３は好ましくは２つの水素原子、２つのメチル残基、１つのベンジル残基と１つのメチル残基、または１つのベンジル残基と１つのtert−ブチル残基である。特に好ましくは、Ｒ２とＲ３は２−チアゾリジニル残基とメチル残基またはtert−ブチル残基であるか、または１−ナフチル残基と、イソプロピル残基、シクロヘキシル残基、ベンジル残基、またはメチル残基である。したがって、本発明は、薬剤または医薬活性物質としての使用に用いられる一般式Ｉによる化合物にも関する。本発明の他の好ましい実施形態は、本明細書に開示した疾病の治療用の一般式Ｉによる化合物の使用にも関する。
【００５２】
本発明の他の好ましい実施態様では、新規性のある分離剤は、一般式ＩＩを有する。ここで、Ｒ１〜Ｒ３は上記式Ｉと同じ意味を有する。
式ＩＩ
【化２】
2008540586.tif 000003
【００５３】
比率１／５は、Ｒ３に隣接する窒素の塩基性に依存する。有利なことに、Ｒ２残基とＲ１残基との位置は構造２から相互交換可能である。例えば塩酸塩等のプロトン化した化合物は、ＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用の分離剤として特に好ましく使用される。例えば化合物ＪＧ５（表を参照）等のように複数の塩基中心を有する化合物の場合、二塩酸塩が特に好ましい。リード構造９９０が好ましい（表を参照）。
【化３】
2008540586.tif 000004
【００５４】
脂肪酸残基の大きさが増大するにつれて、ＩＣ値は減少する。また、ＪＧ３１（表を参照）の場合のように、アントラセンは追加の効果を示す。これは、アミジンへの電子シフトが大きく塩基性が大きいことを意味する。アミジン上の電子密度は特定の使用の場合に重要であるので、Ｒ１残基とＲ２残基とは電子供与体である（化合物６、７のオルト／パラ−メトキシフェニル、オルト／パラ−ジアミノフェニルを参照）。
【００５５】
本発明による分離剤の特定の分解産物も有利である。任意の条件下において、チオカルバミジン（例えばＮｏ．９９０）は、例えば疾病治療用にも使用可能なチオールとグアニジンとを形成するアミン等の求核試薬に対して不安定である。したがって好ましい実施態様では本発明は、特にＡＫＡＰとＰＫＡの分離剤として、及びインビボとインビトロとにおける基本研究におけるツールとしての薬剤において使用される、環状イミダゾール（６）とジヒドロイミダゾール（７）とに関する。Ｒ１残基とＲ２残基は、アリール残基または脂環式残基であることが好ましい（ＳＭ６１、ＳＭ６３、ＳＭ６５）。また、アミジンにおける６員環も好ましい（ＳＭ７１に基づく化合物８）。
【００５６】
アミジンが硫黄から分離して、ナフタチレン（化合物９）の２つの位置に付着する場合も有利である（化合物９）。有利な一実施態様では、距離Ｎ−Ｓは実質的に変わらないままである。Ｒ１はＳ−Ｒを含むのが好ましい。それにより、アミジン上の電子密度が活性化合物の電子密度と比較可能になるからである。Ｒはアルキル残基であることが好ましい。したがって、異性体１０も好ましい。
【化４】
2008540586.tif 000005
【化５】
2008540586.tif 000006
【００５７】
したがって、一般式１１、１２による分離剤が好ましい。
【化６】
2008540586.tif 000007
【００５８】
本発明の特許請求の範囲は、本質的に化合物、ならびにそのＨＣＬ塩が含まれる。好ましい実施態様では、Ｒ１とＲ２は、非依存的に以下であり得る。
‐    鎖の長さがＣ１〜Ｃ６である、非環式脂肪族化合物。
‐    環の大きさがＣ３〜Ｃ９であって、それぞれ独立的に含まれている１つ以上のＯまたはＮタイプのヘテロ原子を有する脂環式化合物。
‐    芳香族化合物（単環式、ヘテロアリール、１〜３置換単環式残基）。
【００５９】
電子供与基（例：ＯＭｅまたはＭＭｅ２）については上記に示した。複素環式芳香族化合物の使用は、バイオアベイラビリティに関して特に有利である。また、鎖の長さがＣ１〜Ｃ６であり互いに非依存的に形成されるＲ１とＲ２と同じ基を有するＲ３を有する、非環式脂肪族タイプのリンカー基として、Ｘを有する構造１２を使用することも有利である。
【００６０】
上記化合物の化学的性質については、以下のことに留意されたい。すなわち、硫黄および隣接する位置１０は、本発明の一部の実施態様では、酸化を受けやすい。硫黄のみが酸化される場合、活性体がリード構造の骨格を有さず（上記を参照）、スルホキシド２とスルホン３とのいずれかを有することが有利である。更に、位置１０は硫黄酸化後に酸性となり、脱プロトン化後に例えばクレイセン（Claisen）アルドールを添加することも考えられる。後者の反応は、化合物１６として酢酸成分を使用して例証される（下記を参照）。Ｒ２が水素原子である場合、分子内閉環も生じる。
【００６１】
有利なことには、上記の２つの位置（硫黄とＮｏ．１０）とは反応性が高い。
【００６２】
構造１１を有効にするには、位置１０を調節しないことが好ましい。上記のとおり、位置１０は酸性であり得るし、以下で述べるとおり、酸化を受けやすい可能性がある。バルキネスに有意な変化がないという有利な点があるので、この位置には、生理学的条件下の多様性を防止して活性を有利に維持するフッ素原子を置くことができる。したがって、特に構造１６は、早期喪失から保護される。
【化７】
2008540586.tif 000008
【化８】
2008540586.tif 000009
【００６３】
位置１０の酸化により生じた生成物（酸化生成物、化合物１８）の好ましい実施形態として、水を除去した後構造８としてのアセチル体を添加することによって得た生成物が２０で実証される（下記を参照）。有利なことに、位置１０は置換可能である。特に、これには、化合物２１に示したようにＲ３残基とＲ４残基とが含まれ、またこれはＲ１とＲ２とのエクステンションとしてＦであってもよい。ＮとＲ１／Ｒ２との間のスペーサに関する上記説明と硫黄の酸化に関する上記説明は、下記の化合物にも適用される。
【化９】
2008540586.tif 000010
【化１０】
2008540586.tif 000011
【００６４】
例えば、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４は、単独でアルキル残基及びアリール残基を表すことができる。
【００６５】
したがって、１−置換ナフタレンを使用することが好ましい。標的分子の親油性ポケットにおいて、例えば芳香二環ユニット等の親油性側基への親和性は、物質の受容性に有意に寄与する。したがって、化合物２２、２３、２４による一般式を有する化合物も好ましく、同等な親和性を有利に示す。
【化１１】
2008540586.tif 000012
【００６６】
有利な実施態様では、化合物２２〜２４による該二環ユニットにおいては、Ｘが酸素であるが、Ｎ、ＮＨ、またはＳであってもよい。三環システムも好ましい（表中の化合物ＳＭ３９、ＳＭ４４も参照）。
【００６７】
他の好ましい実施態様では、グアニジンが好ましい。このとき、Ｒ１とＲ２は、シアノである（例えば、化合物２５）。
【化１２】
2008540586.tif 000013
【００６８】
硫黄アミジンも好ましい。これは、インビボとインビトロでは異なる安定性を有することがある（化合物１１によるリード構造）。経口投与の場合、本発明による化合物は、１mg/mlの水溶性を有する。このときｐＨは２〜７であることが好ましい。１日投与量２００〜４００mgを注入する場合、注射器１本で溶液４００mlの注入を避けるために、水溶性はさらに高くされる。
【００６９】
したがって、ナフタレンがキノリンまたはイソキノリンで置換されている化合物であって、例えば水溶性を高めるためにＨＣＬ塩として投与可能な化合物も好ましい。
【化１３】
2008540586.tif 000014
【００７０】
したがって、一般式ＩＩＩの分離剤が好ましい、すなわち、構造１'と式２'（前者と平衡状態）による分離剤が好ましい。
【化１４】
2008540586.tif 000015
【００７１】
２'と２''がＳ−Ｃ単結合を中心として回転すると、１'と比較して、Ｒ２、Ｒ３の場合と同じく、二重結合と水素が一致する（逆の場合も同じ）。
【００７２】
他の好ましい分離剤は、図１９および／または図２０による一般式を有する。好ましい分離剤は、従来技術で既知のペプチド阻害剤または分離剤よりも多くの驚くような利点を有する。まず、まず、本発明による非ペプチド分離剤は、新たな分野の問題に対応すべく、従来技術とは異なるものである。本発明による構造は、これまで技術的に徒労を重ねてきた長く未解決のままの、緊急のニーズを満たすものである。特に、解決法の単純性は発明力を示しており、従来技術のより複雑な記述にとってかわるものである。上記及び下記の疾病の治療に関する科学技術の発達は、様々な方向において進んでいる。したがって、本発明の記述は、該発達を正当化し、問題解決において技術的に間違った考えを排除することが達成されることを意味する。より具体的には、本発明の記述によって達成された技術的進歩は、改善、性能向上、コスト削減、時間短縮、材料、作業工程、達成しにくいコストまたは原材料、信頼性向上、不具合の排除、すぐれた品質、メンテナンスフリー、高効率、高収率、技術範囲の拡大、更なる手段の提供、疾病治療における他の方法の提供、新しい分野の創出、初の問題解決、保管手段の提供、代替方法、合理化の範囲、自動化及び縮小化、有用薬剤の範囲の拡大においてみられる。したがって、本発明の記述は、様々な可能性から選択されたものの結果が予測不能である場合において好都合な選択である。本発明の記述は、技術的に称賛され、経済的成功とライセンス発行とにつながる新しい分野の技術である。特に、新規性のある分子は、ｃＡＭＰ依存シグナル伝達の異常または欠陥によって引き起こされる疾病の治療に使用可能である。上記の疾病に関する表現の特徴付けは、治療がなされる疾病の機能定義を行う目的ではない。むしろ、区分化ｃＡＭＰ依存シグナル伝達の変化または欠陥に関する疾病としての該表現は、本発明の意味における明確に定められた疾病群のための総称としての働きを有する。すなわち、当業者は、どの種類の疾病が総称による定義で網羅されるか、および本発明による内容に関する特許請求の範囲に含まれるかを予測できる。したがって、総称に含まれる個々の特定疾病を記述することは、試験を記載せずに説明可能なわずかな数の治療法を主張するものではなく、上記シグナル伝達の異常に関係する特許請求の範囲にある疾病を明確にし特定するものであるにすぎない。本発明の分子を使用して、上記のＡＫＡＰタンパク質とＰＫＡ分子との相互作用に影響を及ぼすことが可能である。具体的には、上記のＡＫＡＰ１８タンパク質とＰＫＡ分子との相互作用、特に上記ＡＫＡＰ１８デルタタンパク質とＰＫＡ分子との相互作用（ＰＫＡ分子との、特に、ＰＫＡ分子のサブユニットとの、特に好ましくはＲＩＩアルファおよび／またはＲＩＩベータ分子との）を調節可能である。すなわち、例えば、ＡＫＡＰ７９、グラビン、ＡＫＡＰ８２または上記他のＡＫＡＰ、特にＡＫＡＰ１８アルファ／ベータ／ガンマ／デルタ、特に好ましくはＡＫＡＰ１８デルタのＰＫＡとの間の相互作用を調節、特に阻害することができる。好ましい態様では、分離剤の阻害作用は１００％であるが、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％も好ましく、より好ましくは３０％、特に好ましくは２０％、特に１０％である。上記阻害率のそれぞれが好ましい。
【００７３】
一方において本発明の分離剤は新しい分子であり、他方において好ましい分子は、初めて発見された薬剤における発見使用として開示される化合物である。
【００７４】
本発明の他の好ましい実施態様では、新しい分子、特に薬剤分野における新しい分子は、疾病の治療用の分子である。該疾病は、発明の定義にしたがい、区分化ｃＡＭＰ依存シグナル伝達に関する疾病の総称の範囲に含まれる。
【００７５】
特に好ましい実施態様では、新しい分子は、尿崩症、膵性糖尿病、肥満、浮腫、慢性閉塞性肺疾患、ＡＩＤＳ、統合失調症、肝硬変、心不全、冠状動脈性心臓病、筋緊張亢進、十二指腸潰瘍および／またはぜんそくから選択される疾病に関する。
【００７６】
表Ｂ、好ましくは表ＣまたはＤによる化合物は、従来技術では説明されていない新しい分子である。開示される他の化合物（好ましくは表Ａに記載の化合物）は、治療法または診断法の分野において有用な化合物として開示されていない。ただし、実際これらの化合物は、該化合物がアーカイブまたはライブラリーに記録されているが未登録のため一般に未認証であるという事実によってのみその新規性が得られるとしても、完全に新しい化合物として解釈することができる（特に表Ａ、Ｂを参照）。
【００７７】
本発明は、本発明による非ペプチド分子を標的とする認識分子に関する。本発明の非ペプチド分子の開示によって、当業者は、過度な努力なく通常試験を使用して新規性のある非ペプチド分子の認識分子を得ることができる。したがって、認識分子は明確に完全に開示することができる。本発明によれば、認識分子は、抗体、錯体、キレート剤、またはペプチドであって、これらは、その生物学的活性、すなわちＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用の調節を損なわないようにして、非ペプチド分離剤と相互作用する。認識分子は、インビボまたはインビトロシステムにおける分離剤の検出を可能にする。このため、認識分子に検出プローブを付与することが有利である。該プローブは、当業者にとって周知である。
【００７８】
本発明は、細胞、細胞集合体、組織培養物、組織パッチを対象とする。更に本発明は、本発明の分離剤および／または本発明の認識分子を含むマウス、ラット、キャトル、ウシ、ロバ、ヒツジ、ラクダ、ヤギ、ブタ、ギニアピッグ、ハムスター、ネコ、サル、イヌ、ヒト等の生物を対象とする。これらの細胞、組織培養物、または生物を使用すれば、例えば疾病の原因や診断・治療の考えられる方法に関して様々な疾病の調査を行うことができる。好ましい疾病は、ぜんそく、筋緊張亢進、心臓肥大、冠状動脈性心臓病、十二指腸潰瘍、心不全、肝硬変、統合失調症、ＡＩＤＳ、膵性糖尿病、尿崩症、肥満、慢性閉塞性肺疾患、学習障害、浮腫（病理的水貯留）、感染症、および／または癌である。例えば、本発明の認識分子を有さないが本発明の分離剤または両方の構造を同時に有する疾病の調査において生物を使用することも好ましい。本発明の内容の開示に基づくと、当業者はどの種類の分離剤または認識分子をどの濃度で使用すべきか分かるであろう。理由は、後者は、通常試験を使用し、本発明に開示の技術内容と例えば参考文献等のような記載の従来技術から直ちに明らかに得られるからである。生物は、ＰＫＡ−ＡＫＡＰ相互作用を改良する、好ましくは分離する医薬品の開発にも使用可能である。明らかに、新規性のある分離剤自体を、医薬品用試験分子として使用することは可能であるが、医薬品開発の源であるリード構造として使用することも可能である。生物によって更に、ＰＫＡ−ＡＫＡＰ相互作用が重要な役割を果たす代謝プロセスについてのインビボ調査、あるいはＰＫＡ−ＡＫＡＰ相互作用が例えば細胞変性等の特定の病原性変化などの特定の事象に関係しているかどうかについてどのプロセスを明確にする必要があるかについてのインビボ調査、も可能になる。新規性のある分離剤または認識分子は、組み合わせ方法を用いた本発明による化合物から得た修飾分離剤または修飾認識分子であってもよい。本質的に、本発明の分子がリード構造として働くこのようにして得た構造は、本発明による分離剤と認識分子との機能的アナログである。「機能的アナログ」とは、同様にして得た相同構造が、ＡＫＡＰとＰＫＡとの相互作用または特定の疾病に対するそれらの有意性について結論を与えることを意味する。したがって、本発明において機能的アナログ分子は、本質的に同じ効果を有するものとして当業者が識別できる分子である。したがって、本発明は、本質的に同じルートで本質的に同じ機能を有する修飾分子であって、本質的に新規性のある分離剤または認識分子と同じ結果を与える修飾分子を対象としている。更に本発明は、特許請求の範囲にある分子と同じ効果を達成すると当業者にとって明らかな同等な化合物も対象とする。したがって、上記機能的アナログ構造は、リード構造として本発明の分離剤または認識分子を用いて得られる。構造に基づいて組み合わせた薬剤またはその他の薬剤の設計を利用して、機能的アナログを得ることができる。用語「薬剤の設計」の定義は、当業者には明らかである。例えば、参照として「Wirkstoffdesign. Der Weg zum Arzneimittel」、「Lehrbuch der klinischen Pharmazie」その他の標準文献が挙げられる。
【００７９】
したがって、本発明は、新規性のある分離剤、またはキレート剤、錯化剤または抗体の形態における分離剤を標的とする認識分子を含む医薬品に関する。これは任意選択として医薬的に許容可能なキャリアおよび／または助剤を含む。例えば、助剤はアジュバント、ふ形剤、またはその他である。例えばキャリアは、溶加剤、希釈剤、結合剤、保湿剤、崩壊剤、溶出抑制剤、吸収促進薬、湿潤剤、吸収剤および／または潤滑剤であり得る。この場合、すなわちもしキャリア、アジュバントおよび／またはふ形剤が（例：リポソーム）新規性のある分離剤またはその認識分子とともに存在する場合、これらは薬剤または医薬品と呼ばれる。
【００８０】
本発明の他の好ましい実施態様では、本発明による医薬品は、ゲル、ポウドレージ（poudrage）、粉末、タブレット、持続放出タブレット、予混合剤、乳化剤、調合製剤、ドロップ剤、濃縮物、粒状、シロップ、ペレット、ボーラス、カプセル、エアロゾル、スプレーおよび／または吸入の形態にて調製され、および／またはこの形態にて使用される。タブレット、被覆タブレット、カプセル、ピル、及び粒状は、従来のコーティングと膜を施すことができる（任意選択として乳白剤）。また、反応物質の放出が、エンド重合物質とろう状物質とが包埋剤として使用可能な、腸管の特定領域にのみ（任意には遅延的に）起きるようにして構成することもできる。
【００８１】
例えば、本発明の薬剤は、経口にて許容可能な容量の形態にて経口投与にて使用可能である。これには、カプセル、タブレット、水性懸濁液、溶液といった形態が含まれる。経口投与用のタブレットの場合、頻繁に使用されるキャリアの例としては、乳糖やコーンスターチが挙げられる。一般に、ステアリン酸マグネシウム等の潤滑剤も添加可能である。使用可能なカプセル、希釈剤の形態をとる経口投与には、乳糖、乾燥コーンスターチが含まれる。水性懸濁液の経口投与において、活性物質は、乳化剤と懸濁化剤と結合する。更に、特定の甘味料および／または着香量および／または着色剤を必要に応じて添加してもよい。
【００８２】
活性物質は、マイクロカプセル状にても存在可能である。任意選択として、１つ以上の上記のキャリア剤をともに用いてもよい。
【００８３】
活性物質に加えて、座薬は従来の水溶性／非水溶性キャリアを含むことができる。例としては、ポリエチレングリコール、脂肪（例：ココア脂、高級エステル（例えば、Ｃ１６脂肪酸を含むＣ１４アルコール）、またはこれらの物質の混合物が挙げられる。
【００８４】
活性物質に加えて、軟膏、ペースト、クリーム、ゲルは、従来のキャリアを含んでよい。
例としては、動物性脂肪、植物性脂肪、ワックス、パラフィン、スターチ、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコンベントナイト、シリカ、タルク、酸化亜鉛、またはこれらの物質の混合物が挙げられる。
【００８５】
活性物質に加えて、粉末やスプレーは、従来のキャリアを含んでもよい。例としては、乳糖、タルク、シリカ、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウム、ポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物が挙げられる。更に、スプレーは、クロロフルオロカーボン等の従来のスプレー用高圧ガスを含んでもよい。
【００８６】
活性物質に加えて、すなわち本発明による化合物に加えて、溶液と乳剤は、従来のキャリアを含んでよい。これらには溶媒、可溶化剤、乳化剤が挙げられる。これらの例としては、水、エチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、ベンジルベンゾエート、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、ジメチルホルムアミド、オイル（特に綿実油、ピーナツ油、コーン油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、グリセロールホルマール、テトラヒドロフルフリルアルコール、ポリエチレングリコール、ソルビタンの脂肪酸エステル、またはこれらの物質の混合物が挙げられる。非経口用としては、溶液と乳剤も、血液等張液において存在可能である。
【００８７】
活性物質に加えて、懸濁液は液体希釈剤等の従来のキャリアを含んでもよい。これは例えば水、エチルアルコール、プロピレングリコール、懸濁化剤等であって、例としては、エトキシレートイソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトール、ソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタ水酸化物、ベントナイト、寒天、トラガカント、またはこれらの物質の混合物が挙げられる。
【００８８】
薬剤は、水性滅菌注射液または油性懸濁液等の凍結乾燥滅菌注射可能製剤の形態にて存在可能である。該懸濁液は、適切な分散剤または湿潤剤（Tween 80等）や懸濁化剤を使用して、周知の方法を使用して調製することもできる。滅菌注射製剤は、滅菌注射液でもよいし、非毒性非経口許容希釈剤／溶媒中の懸濁液（例：１，３−ブタンジオール中溶液）であってもよい。使用可能な許容可能なふ形剤と溶媒としては、マンニトール、水、リンガー溶液、等張食塩水が挙げられる。更に、滅菌非揮発性油は、溶媒または懸濁化剤として従来使用されている。任意の低刺激性非揮発性油（合成モノ／ジグリセリドを含む）は、この用途で使用可能である。オレイン酸とそのグリセリド誘導体等の脂肪酸は、注射剤の製造において使用可能である。例としては、オリーブ油やヒマシ油等の天然で、医薬的に許容可能な油を特にポリオキシエチレン化した形態で使用可能である。該油性の溶液や懸濁液は、希釈剤や分散剤として、長鎖アルコールやその類似アルコールも含むことができる。
【００８９】
上記の製剤形態は、着色剤、保存剤、着香剤、風味付け添加剤も含んでよい。例えば、ペパーミント油、ユーカリ油、サッカリン等の甘味料が挙げられる。本発明による化合物は、混合物全体の約０．０１〜９９．９wt%、より好ましくは約０．０５〜９９wt%の濃度で上記製剤において存在すべきである。
【００９０】
上記化合物に加えて、上記製剤は更に、医薬活性物質を含んでもよく、該医薬活性物質に加えて、塩、緩衝剤、ビタミン、糖誘導体（特にサッカライド）、酵素、野菜抽出物、その他を含んでもよい。緩衝剤と糖誘導体とは、皮下投与中の疼痛を有利に軽減する。ヒアルロニダーゼ等の酵素は、効果を増大させる。上記の製剤は、周知の方法による通常の手段にて製造される。例えば、活性物質とキャリアとを混合させることによる。
【００９１】
上記の製剤は、ヒト及び動物に対して、経口、経直腸、非経口（静脈内、筋内、皮下）、嚢内、経膣、腹腔内、局所性（粉末、軟膏、ドロップ）等にて投与可能であり、下記の疾病の治療に使用される。注射液、経口治療用の溶液及び懸濁液、ゲル、ブルーアップ製剤、乳剤、軟膏、またはドロップは、適切な製剤として可能である。局所治療については、眼科薬、皮膚病薬、銀塩及び他の塩、点耳、眼軟膏剤、粉末または溶液を使用可能である。動物については、適切な製剤において、食物や水を介して摂取可能である。更に、薬剤はプラスチック（局所治療にはプラスチック鎖）、コラーゲン、または骨セメント等の他のキャリアに組み込むこともできる。
【００９２】
本発明の別の好ましい実施態様では、医薬品中に、化合物を濃度０．１〜９９．５wt％、好ましくは濃度０．５〜９５wt％、より好ましくは濃度２０．０〜８０wt％にて組み込む。すなわち、化合物は、上記医薬品（タブレット、ピル、粒状、その他）中に、好ましくは混合物全体の０．１〜９９．５wt%の濃度で組み込まれる。当業者であれば、活性物質の量、すなわちキャリア物質と結合して単回投与形態を形成するための新規性のある化合物の量が、治療を受ける患者と投与形態の種類によって変わることを承知しているであろう。患者の状態がいったん向上すると、医薬品中の活性化合物の比率は緩和することができ、疾病を停止させる維持量とすることができる。症状に応じて、続いて、投与の量や頻度、またはその両方を改善した状態が維持されるレベルまで減少させることができる。いったん症状が望ましいレベルまで軽減されると、治療は終了すべきである。ただし、疾病の症状が再発した場合には、患者が長期的に間欠的治療を必要とする場合もある。したがって、化合物の比率、すなわち、医薬品の混合物全体におけるその濃度、ならびにその組成または組合せは可変であり、当業者によって修正・適合可能である。
【００９３】
本発明の化合物は、様々なルートで生物、好ましくはヒトまたは動物に接触させることができることは、当業者であれば分かるであろう。更に、当業者であれば、特定の医薬品が様々な投与量で適用可能なことを熟知しているであろう。適用は、疾病を可能な限り効果的に撃退するように、あるいは該疾病の発病が予防的投与によって防止されるように行うべきである。適用における濃度と種類は、通常試験を使用して当業者が決定できる。本発明の化合物の好ましい適用は、粉末、タブレット、液体混合物、ドロップ、カプセル等の形態での経口投与、座薬、溶液等の形態での経直腸投与、注射、輸液、溶液の形態での非経口投与、軟膏、パッド、包帯、経膣等の形態での局所投与である。本発明による化合物の接触は、予防薬または治療薬において行われることが好ましい。
【００９４】
例えば、選択された適用形態、投与量、投与計画、アジュバントの選択等に関する適性は、患者すなわちヒトまたは動物由来の血清アリコートを採取し、治療手順の過程において疾病の指標の有無を試験することによって決定することができる。代替的にあるいは付随的に、腎臓・肝臓の状態、及びＴ細胞や免疫セステムの他の細胞の量、疾病・回復期の過程を特徴付け実証する他のマーカーの量は、従来方法で決定できる。これにより、患者の免疫構造、特に代謝にとって重要な組織の構造について一般的検査を行うことができる。更に、患者の臨床状態を、望ましい効果について観察することができる。治療効果が不十分であった場合、患者は、本発明の医薬品を使用して更に治療を受けることができ、構造全体を向上させると予測される他の既知の薬剤で任意に改善することができる。明らかに、医薬品のキャリアまたはふ形剤を修飾すること、または投与ルートを変更することも可能である。
【００９５】
経口摂取に加えて、例えば筋肉注射、皮下注射、血管内への注射を、本発明による化合物の他の好ましい治療投与ルートとして想定することができる。同時に、カテーテルまたは外科用チューブを介した投与を使用することができる。例えば、腎臓、肝臓、脾臓、腸、肺等の特定の臓器に直接つながるカテーテルを介した投与が挙げられる。
【００９６】
好ましい実施態様では、本発明による化合物は、２４時間につき体重１kg当り総量が好ましくは０．０５〜５００mg、より好ましくは５〜１００mg使用され得る。有利なことに、該量は、異常、または応答性・病的・生理学的状態の症状を予防または改善するために使用される治療用の量である。
【００９７】
明らかに投与量は、受け手の年齢、健康状態、体重、疾病の程度、必要な同時治療の種類、治療頻度、望ましい効果と副作用の種類による。好ましい結果をあげるためには、単回投与量または複数投与量として１日につき体重１kg当り０．００５〜５００mg、好ましくは０．０５〜５００mgを適用可能である。特に、医薬品は通常、１日につき約１〜１０回の投与回数、または代替的にあるいは追加的に持続注入される。該投与は、慢性用の治療または急性用の治療として適用可能である。単回投与形態を行うためのキャリア物質と組み合わされる活性物質の量が治療を受ける宿主と特定の投与形態とによって変化してもよい。好ましい態様では、１日当たりの投与量は、２〜５回の投与回数で、各投与につき体重１kg当り０．０５〜５００mgの活性物質含有量を含むタブレット１〜２錠で提供される。活性物質はより高含有量であってもよい（例えば、体重１kg当たり５０００mgの濃度を上限とする）。タブレットは、持続放出錠であってもよい。この場合、１日当たりの投与回数は、１〜３回に低減される。持続放出タブレットの活性物質含有量は３〜３０００mgであってよい。活性物質が上記のように注入によって投与される場合、宿主は、１日当たり１〜１０回本発明の化合物に接触させるか、持続注入を行うことが好ましい。この場合、１日につき１〜４０００mg量が好ましい。１日当たりの好ましい総量は、ヒト薬剤と動物薬剤との両方において有利なことが分かった。上記投与量を変えることが必要な場合もあり、これは治療を受ける宿主の性質と体重や、疾病の種類と深刻度や、薬剤の調製と適用の種類や、投与の時間間隔に依存する。したがって、上記量より低量を生物に接触させることが好ましい場合もあれば、上記の活性物質量を上回ることが好ましい場合もある。当業者は、各事例において必要な最適投与量と、活性物質の適用の種類を決定可能である。
【００９８】
本発明の他の特定の好ましい実施態様では、医薬品は、体重１kg当り１〜１００mg、特に２〜５０mgの単回投与量にて使用される。１日当たりの総量（上記）と同じく、単回投与量は、当業者によって変更可能である。同様に、本発明によって使用される化合物は、上記単一濃度・製剤を食餌や飼料配合や飲み水と組み合わせて動物薬において使用することも可能である。単回投与量は、１回の投与で提供される活性物質量であって、１日投与量全体、または１日投与量の半分、または１日投与量の３分の１、または１日投与量４分の１に通常対応する活性物質量を含むことが好ましい。したがって、投与単位には、１、２、３または４、またはそれ以上の単回投与量、または０．５、０．３、０．２５の単回投与量を含むことが好ましい。好ましい態様では、本発明の化合物の１日当たりの投与回数は、２〜１０回、好ましくは２〜７回、より好ましくは３〜５回である。言うまでもなく、本発明による医薬品の持続注入も可能である。
【００９９】
本発明の特に好ましい実施態様では、本発明の化合物の各経口投与において１〜２錠のタブレットを投与する。本発明によるタブレットは、当業者が周知のコーティングや膜を施して提供可能であり、または宿主の好ましい特定の領域にのみ活性物質が放出されるように構成することも可能である。
【０１００】
本発明の他の実施態様では、本発明による化合物が任意選択的に、複数が互いに結合していたり、キャリアに結合していたり、リポソームに密閉されていたりすることが好ましい。本発明の意味において、該リポソームにおける密閉は、本発明の化合物がリポソームの内部に存在することを必ずしも意味するものではない。例えば、化合物が外膜にアンカリングされている場合もあるように、本発明における「密閉」とは、本発明の化合物がリポソームの膜に接していることも意味する。リポソーム内やリポソーム上に新規性のある化合物がこのように存在することは、リポソームが免疫刺激効果を有するものとしてリポソームを当業者が選択する場合に、有利である。リポソームの免疫刺激効果を変更する様々な方法は、DE 198 51 282に開示の技術において当業者には周知であろう。脂質は、エステルやアミド等の通常の脂質でもよい。あるいはセレブロシド、ガングリオシドの糖脂質、スフィンゴ脂質やリン脂質等といった複合脂質でもよい。
【０１０１】
本発明による医薬品で治療可能な好ましい疾病は、以下の疾病から構成される群から選択される。すなわち、ＡＩＤＳ、ニキビ、タンパク尿症（タンパク尿）、アルコール禁断症候群、アレルギー、脱毛症（髪の喪失）、ＡＬＳ（筋委縮性側索硬化症）アルツハイマー病、レチナール黄斑老年性変性、貧血、不安症候群、炭そ病（milzbrand）、大動脈硬化、閉塞性動脈疾患、動脈硬化、動脈閉塞性疾患、側頭動脈炎、動静脈フィステル、関節炎、関節症、ぜんそく、呼吸不全、自己免疫疾患、房室ブロック、アシドーシス、脱出椎間板、風膜炎症、膵臓癌、ベッカー型筋ジストロフィー、良性前立腺過形症（ＢＰＨ）、膀胱癌、血友病、気管支腫瘍、乳癌、ＢＳＥ、バッドキアリ症候群、多食症、滑液包炎、バイラー症候群、バイパス、クラミジア感染症、慢性疼痛、肝硬変、脳振とう症、クロイツフェルトヤコブ病、腸癌、腸結核、うつ、尿崩症、真性糖尿病、若年性真性糖尿病、糖尿病性網膜症、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、十二指腸癌、進行性筋ジストロフィー、異栄養、エボラ、湿疹、勃起障害、肥満、繊維症、頸癌、子宮癌、脳内出血、脳炎、毛髪欠損、片麻痺、溶血性貧血、血友病、ペットアレルギー（獣毛アレルギー）、皮膚癌、帯状ヘルペス、心筋梗塞、心不全、心臓弁膜症、脳転移、脳卒中、脳腫瘍、睾丸癌、虚血、カーラー病（形質細胞腫）、ポリオ（急性肺白髄炎）、骨の希薄化、接触湿疹、麻痺、肝硬変、白血病、肺線維症、肺癌、肺水腫、リンパ節癌（ホジキン病）、リンパ肉芽腫症、リンパ腫、狂犬病、胃癌、乳癌、髄膜炎、嚢胞性線維症、多発性硬化症（ＭＳ）、心筋梗塞症、神経皮膚炎、神経線維腫症、神経腫瘍、腎臓癌、（腎臓細胞癌腫）、骨粗しょう症、膵臓癌、肺炎、多発性神経障害、性的能力異常、全身性進行性硬化（ＰＳＳ）、前立腺癌、じんましん、対麻痺症候群、外傷、直腸癌、胸膜炎、頭蓋大脳外傷、膣癌、副鼻腔炎、食道癌、振戦、結核、腫瘍疼痛、やけど、中毒、ウイルス性髄膜炎、更年期障害、軟部組織の肉腫、軟部組織の腫瘍、脳血液循環異常、および／またはＣＮＳ腫瘍から選択される。
【０１０２】
他の実施態様では、本発明の医薬品は、耳・鼻・喉領域、肺、縦隔、消化管、泌尿生殖器系、婦人科系、胸部、内分泌系、皮膚、骨と軟組織肉腫、中皮腫、メラノーマ、中枢神経系の新生物、幼児の癌性疾病または腫瘍疾病、リンパ腫、白血病、腫瘍随伴症候群、原発腫瘍の転移（ＣＵＰ症候群）、腹膜癌症、免疫抑制関連悪性腫瘍、および／または腫瘍転移といった癌性疾病または腫瘍疾病の群から選択された癌性疾病の治療にも使用可能である。
【０１０３】
更に具体的には、腫瘍は、以下の種類の癌を含む：乳腺腺癌、前立腺腺癌、結腸腺癌。気管支から発生する肺癌のすべての形態。骨髄癌、メラノーマ、ヘパトーマ、神経目細胞腫。乳頭腫。アプドーマ、コリストーマ、ブランキオーマ。悪性カルチノイド症候群。カルチノイド心疾患、癌腫（例えば、ウォーカー癌腫、基底細胞癌腫、鱗状基底細胞癌腫、ブラウン−ピアス癌腫、腺管癌腫、エールリッヒ腫瘍、上皮内癌腫、癌性−２癌腫、メルケル細胞癌腫、粘膜癌、非小細胞性気管支癌腫、燕麦細胞癌腫、乳頭癌腫、硬性癌腫、気管支肺胞癌腫、気管支癌腫、扁平上皮細胞癌腫、及び移行上皮癌腫）。組織球性機能障害、白血病（例えば、Ｂ細胞白血病、混合細胞白血病、ヌル細胞白血病、Ｔ細胞白血病、慢性Ｔ細胞白血病、ＨＴＬＶ−ＩＩ関連白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、マスト細胞白血病、骨髄性白血病）。悪性組織球増殖症、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、孤立性プラズマ細胞腫瘍。細胞内皮症、軟骨芽細胞腫。軟骨腫、軟骨肉腫。繊維肉腫。巨細胞腫。組織球腫。脂肪腫。脂肪肉腫。白血肉腫。中皮腫。粘液腫。粘液肉腫。骨腫。骨肉腫。ユーイング肉腫。滑液肉腫。腺繊維腫。腺リンパ腫。癌肉腫、脊索腫。頭蓋咽頭腫、未分化胚細胞腫、過誤腫。間葉腫。中腎腫、筋肉腫、エナメル上皮腫、セメント腫。歯牙腫。奇形腫。胸腺腫、じゅう毛芽細胞腫。腺癌、腺腫。胆管腫。コレステリン腫。円柱腫。嚢胞腺癌、嚢胞腺腫。粒状膜細胞腫。ギナドロ（gynadro）芽細胞腫。汗腺腫。島細胞腫。ライディグ細胞腫。乳頭腫。セルトリ細胞腫、卵胞膜細胞腫、平滑筋腫。平滑筋肉腫。筋肉芽細胞腫。筋腫。筋肉腫。横紋筋腫。横紋筋肉腫。上衣腫。神経節細胞腫、神経膠腫。髄芽腫、髄膜
腫。神経鞘腫。神経芽細胞腫。神経上皮腫、神経線維腫、神経腫、傍神経節腫、非クロム親和性傍神経節腫、角化血管腫、好酸球増加を伴う血管リンパ過形成。硬化血管腫。血管腫症。グロムス血管腫。血管内皮腫。血管腫。血管周囲細胞腫。血管肉腫。リンパ管腫、リンパ管筋腫、リンパ管肉腫。松果体腫。葉状嚢肉腫。血管肉腫。リンパ管肉腫。粘液肉腫、卵巣癌腫。肉腫（例えば、ユーイング肉腫、実験に基づきカポジ肉腫、マスト細胞肉腫）。新生物（例えば、骨新生物、胸部新生物、消化器系新生物、結腸直腸新生物、肝臓新生物、副膵新生物、下垂体新生物、睾丸新生物、眼窩内新生物、頭頸部新生物、中枢得神経の新生物、聴覚器官の新生物、骨盤の新生物、呼吸管や尿生殖路の新生物）。神経線維腫症と頸部扁平上皮異形成。
【０１０４】
他の好ましい実施態様では、治療または予防される癌性疾病または腫瘍は、以下の腫瘍の群から選択される：耳・鼻・喉領域の腫瘍（内鼻、副鼻腔、鼻咽頭、唇、口腔、中咽頭、喉頭、下咽頭、耳、唾液腺、傍神経節腫の腫瘍を含む）。肺の腫瘍（非小細胞性気管支癌、小細胞性気管支癌を含む）。縦隔の腫瘍。消化管の腫瘍（食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢、胆道、小腸、結腸の腫瘍、直腸癌、肛門癌を含む）。泌尿生殖器腫瘍（腎臓、尿感、膀胱、前立腺、尿道、陰茎、睾丸の腫瘍を含む）。婦人科系腫瘍（子宮頸、膣、外陰部、子宮癌、悪性トロホブラスト、卵巣の腫瘍を含む）。卵管の腫瘍（Tuba Faloppii）。腹腔の腫瘍。内分泌器官の腫瘍。乳癌。内分泌器官の腫瘍（甲状腺、副甲状腺、副腎皮質の腫瘍、脾臓内分泌部腫瘍、カルチノイド腫瘍、カルチノイド症候群、多発性内分泌腺腫。骨・軟組織肉腫。内皮腫、皮膚腫瘍、メラノーマ（皮膚、眼球内を含む）。中枢神経系の腫瘍。幼児期の腫瘍（網膜芽腫、ウィルムス腫瘍、神経線維腫症、神経芽細胞腫、ユーイング肉腫腫瘍ファミリー、横紋筋肉腫。リンパ腫（非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、中枢神経系の原発性リンパ腫、ホジキン病を含む）。白血病（急性白血病、慢性骨髄性白血病、リンパ性白血病を含む）。プラズマ細胞新生物。骨髄異形成症候群。腫瘍随伴症候群。未知の原発性腫瘍を伴う転移（ＣＵＰ症候群）。腹膜癌。免疫抑制関連悪性腫瘍（ＡＩＤＳ関連悪性腫瘍（例：カポジ肉腫）、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ＡＩＤＳ関連中枢神経系リンパ腫、ＡＩＤＳ関連ホジキン病、ＡＩＤＳ関連肛門性器腫瘍を含む）、移植関連悪性腫瘍。転移癌（脳転移癌、肺転移癌、肝臓転移癌、骨転移癌、肋膜・心膜転移癌を含む）。悪性腹水。
【０１０５】
他の好ましい実施態様では、治療または予防される癌性疾病または腫瘍は、以下の腫瘍の群から選択される：乳癌、胃腸腫瘍（結腸癌腫、胃癌腫、膵臓癌腫、結腸癌、小腸癌を含む）、卵巣癌腫、頸部癌腫、肺癌、前立腺癌、腎臓細胞癌腫、および／または転移。
【０１０６】
本発明の他の好ましい実施態様では、疾病は、本発明の意味において感染病と称され、区分化ｃＡＭＰ依存シグナル伝達の調節に伴う疾病から構成される群から選択される。すなわち、モンキーポックス、ＡＩＤＳ、炭そ病〔炭そ菌、ミルズブランド（milzbrand）〕、トリインフルエンザ、ボレリオ症、回帰熱ボレリア、ボツリヌス中毒症（クロストリジウム属）、ブルセラ症、カンピロバクター感染症、クラミジア感染症、コレラ（コレラ菌）、クロイツフェルトヤコブ病、Ｑ熱リケッチア、クリプトスポリジウムパルブーム（parvuum）（クリプトスポリジウム症）、デング熱、ジフテリア、エボラウイルス感染症、エキノコッカス（キツネサナダムシ、イヌサナダムシ）、ＥＨＥＣ感染症（ＳＴＥＣ感染症、ＶＴＥＣ感染症）、エンテロウイルス、腸チフス（発疹チフス）、野兎病菌（ツラレミア）、春夏髄膜脳炎、黄熱病、ランブル鞭毛虫症、リン病、流感（インフルエンザ）、ヘモフィラスインフルエンザ、ハンタウイルス、ヘリコバクターピロリ菌、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、ヘルペス、ＨＵＳ（溶血性尿毒症症候群）、流行性角結膜炎百日咳、ポリオ（急性肺白髄炎）、アタマジラミ寄生、疥癬虫寄生、クリミアコンゴ熱、ラッサ熱、食品関連疾病、レジオネラ症、リーシュマニア症、ハンセン病、レプトスプラ症、リステリア症、ライム病、鼠径リンパ肉芽腫、マラリア（プラスモジウム感染）、マールブルグウイルス感染症、はしか、類鼻そ症、髄膜炎菌、ＭＲＳＡ（ブドウ球菌）、おたふく風邪、真菌症（真菌感染症）、発生率が増大している新しい感染症、ノロウイルス、オルニトーシス（オウム病）、パピローマウイルス、パラチフス熱、ペスト（ペスト菌）、肺炎球菌感染症（肺炎連鎖球菌）、天然痘、旅行関連感染症、無鉤条虫感染、ロタウイルス、風疹、ＲＳＶ感染症、サルモネラ症、猩紅熱、重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）、性感染症、細菌性赤痢、破傷風、狂犬病、トキソプラズマ症、旋毛虫病、結核、腸チフス、水痘（水ぼうそう）、変異クロイツフェルトヤコブ病、ウイルス性出血熱、西ナイル熱、エルシニア症、および／またはダニ媒介病。本発明による医薬品は、上記の病原体、特にホスファターゼの酵素を必ずしも阻害する必要はない。医薬品は、膜かく乱効果やその他の効果を有する場合もある。本発明の意味において、好ましくは、病原体の病原性を減少させることが不可欠である。
【０１０７】
本発明の他の好ましい実施態様では、治療を受ける疾病は本質的に細菌によって誘導または同時誘導される。該細菌は、レジオネラ、連鎖球菌、ブドウ球菌、クレブシエラ菌、ヘモフィラスインフルエンザ、リケッチア（腸チフス）、マイコバクテリア、ウレアプラズマ、ナイセリア類（髄膜炎、ウォーターハウスフリーデリクセン症候群、リン病）、シュードモナス、ボルデテラ（百日咳）、コリネバクテリア（ジフテリア）、クラミジア、カンピロバクター（下痢）、大腸菌、プロテウス、サルモネラ、シゲラ菌、エルシニア、ビブリオ、腸球菌、クロストリジウム、リステリア、ボレリア、梅毒トレポネーマ、ブルセラ、野兎病菌、および／またはレプトスピラがある。
【０１０８】
更に本発明は、ＡＫＡＰ、好ましくはＡＫＡＰ１８、より好ましくはＡＫＡＰ１８デルタへの特異的結合、および／またはＰＫＡ、好ましくはそのサブユニット、より好ましくはＲＩＩサブユニットへの特異的結合のための分離剤の使用に関する。
【０１０９】
更に本発明は、ＰＫＡのＲＩアルファ、ＲＩＩアルファ、ＲＩベータおよび／またはＲＩＩベータサブユニットとＡＫＡＰとの相互作用の阻害に関する。ここで本発明の意味における「阻害」とは、任意の種類の修飾を意味する。
【０１１０】
本発明の特に好ましい実施態様では、分離剤は水利尿剤、避妊薬、抗感染症薬、抗不安薬、および／または抗癌剤として使用可能である。
【０１１１】
他の有利な実施態様では、疾病は、以下の疾病からなる群から選択される。
任意の病因のぜんそく、すなわちアトピー性ぜんそく、非アトピー性ぜんそく、アレルギー性ぜんそく、ｌｇＥ媒介アトピー性ぜんそく、気管支ぜんそく、本態性ぜんそく、原発性ぜんそく、病理生理学的異常による内因性ぜんそく、環境要因による外因性ぜんそく、未知または不明な原因による本態性ぜんそく、非アトピー性ぜんそく、気管支ぜんそく、気腫性ぜんそく、ストレス誘導ぜんそく、職業ぜんそく、細菌／真菌／原虫／ウイルス感染性によるアレルギーぜんそく、非アレルギー性ぜんそく、初期ぜんそく、「喘鳴小児性症候群」からなる群のぜんそく、
慢性／急性気管支収縮、慢性気管支炎、小気道閉そく及び肺気腫、
任意の病因の気道の閉塞性／炎症性疾病、すなわちぜんそく、塵肺、慢性好酸球性肺炎、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、慢性気管支炎、肺気腫または関連呼吸困難を含むＣＯＰＤ、気管の不可逆性進行性閉塞の特徴を有するＣＯＰＤ、ショック肺（成人呼吸器疾患症候群、ＡＲＤＳ）、他の医薬品による治療を原因とする気管過敏症の悪化からなる群の気道の閉塞性／炎症性疾病、
任意の病因の塵肺、すなわちアルミニウム肺症やアルミニウム肺塵、炭粉症（ぜんそく）、アスベスト肺症やアスベスト肺塵、カリコシス／石灰肺塵、ダチョウ羽毛塵の吸入によるプチロシス（ptilosis）、鉄微粒子の吸入による鉄沈着症、珪肺症またはポッターぜんそく、綿肺症または綿塵肺、滑石塵肺からなる群の肺塵、
任意の病因の気管支炎、すなわち急性気管支炎、急性喉頭気管支炎、ピーナツ誘発性気管支炎、気管支カタル、クループ性気管支炎、喀痰を伴わない気管支炎、感染性ぜんそく気管支炎、喀痰を伴う気管支炎、ブドウ球菌／連鎖球菌気管支炎、肺胞気管支炎からなる群の気管支炎、
任意の病因の気管支拡張症、すなわち円柱状気管支拡張症、嚢胞状気管支拡張症、紡錘状気管支拡張症、細気管支拡張症、嚢状気管支拡張症、喀痰を伴わない気管支拡張症、濾胞状気管支拡張症からなる群の気管支拡張症、
季節性アレルギー鼻炎、通年性アレルギー鼻炎、または任意の病因の副鼻腔炎、すなわち化膿性／非化膿性副鼻腔炎、急性／慢性副鼻腔炎、し骨蜂巣炎、前副鼻腔炎、上顎副鼻腔炎、ちょう形骨副鼻腔炎からなる群の副鼻腔炎、
任意の病因の関節リウマチ、すなわち急性関節炎、急性痛風性関節炎、原発性慢性多発性関節炎、骨関節症、感染性関節炎、ライム関節炎、プログレディエント（progredient）関節炎、乾癬性関節炎、脊髄関節炎からなる群の関節リウマチ、
炎症を伴う痛風・発熱、または炎症を伴う疼痛、
任意の病因の好酸球関連病理学的異常、すなわち好酸球増加症、好酸球肺湿潤、レフラー症候群、慢性好酸球肺炎、熱帯性肺好酸球増加症、気管支肺炎アスペルギルス症、アスペルギルス腫、好酸球肉芽腫、アレルギー性肉芽腫性脈管炎、チャーグ・ストラウス症候群、結節性多発性動脈炎（ＰＡＮ）、全身性壊死性血管炎からなる群の好酸球関連病理学的異常、
アトピー性皮膚炎、アレルギー性皮膚炎、またはアレルギー性／アトピー性湿疹、
任意の病因のじんましん、すなわち免疫関連じんましん、補体関連じんましんん、じんましん誘発物質により誘発されたじんましん、物理的刺激により誘発されたじんましん、ストレス誘発性じんましん、突発性じんましん、急性じんましん、慢性じんましん、血管神経性浮腫、コリン性じんましん、常染色体優勢／獲得型寒冷じんましん、接触性じんましん、ジアンティーン（giantean）じんましん、丘疹状じんましんからなる群のじんましん、
任意の病因の結膜炎、すなわち照射性結膜炎、急性カタル性結膜炎、急性伝染性結膜炎、アレルギー性結膜炎、アトピー性結膜炎、慢性カタル性結膜炎、化膿性結膜炎、春先の結膜炎からなる群の結膜炎、
任意の病因のブドウ膜炎、すなわちブドウ膜全体またはその一部の炎症、前部ブドウ膜炎、虹彩炎、毛様体炎、虹彩毛様体炎、肉芽腫性ブドウ膜炎、非肉芽腫性ブドウ膜炎、水晶体過敏性ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎、脈絡膜炎、脈絡網膜炎、乾癬からなる群のブドウ膜炎、
任意の病因の多発性硬化症、すなわち原発性プログレディエント（progredient）多発性硬化症、突発性及び症状の寛解を伴う多発性硬化症からなる群の多発性硬化症、
任意の病因の自己免疫／炎症性疾患、すなわち自己免疫−血液疾患、溶血性貧血、再生不良性貧血、再生不能性貧血、特発性血小板減少性紫斑病、全身性紅斑性狼そう、多発性軟骨炎、強皮症、ウェーゲナー肉芽腫症、光線障害、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、スティーブンス・ジョンソン症候群、突発性スプルー、自己免疫過敏結腸症、潰瘍性大腸炎、クローン病、内分泌眼病、バセドー氏病、サルコイドーシス、肺胞炎、慢性過敏性肺炎、原発性胆汁性肝硬変、インスリン欠乏性糖尿病または１型膵性メリティス、前部ブドウ膜炎、肉芽腫性ブドウ膜炎または後部ブドウ膜炎、乾性角結膜炎、流行性角結膜炎（蔓延性）、間質性肺線維症、肝硬変症、嚢胞性線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎（ネフローゼ性、非ネフローゼ性）、急性糸球体腎炎、突発性ネフローゼ、微小変化ネフロパシー、炎症性／過剰増殖性皮膚疾患、乾癬、アトピー性皮膚炎、接触性皮膚炎、アレルギー性接触性皮膚炎、家族性両性天ほうそう、紅斑性天ほうそう、落ち葉状天ほうそう、vulgaris天ほうそうからなる群の自己免疫／炎症性疾患、
臓器移植後の回種移植拒絶反応の予防、
任意の病因の過敏性腸炎（炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、すなわち潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、膠原性大腸炎、ポリープ性大腸炎、貫壁性大腸炎、クローン病（ＣＤ）からなる群の過敏性腸炎、
任意の病因の敗血性ショック、すなわち腎不全、急性腎不全、悪液質、マラリア悪液質、下垂体性悪液質、尿毒性悪液質、心臓悪液質、副腎悪液質またはアジソン病、癌性悪液質、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）による感染症から起こる悪液質からなる群の敗血性ショック、
肝臓障害
肺高血圧症、酸素欠乏に誘発される肺高血圧症、
骨希薄化、原発性骨粗しょう症、二次骨粗しょう症、
任意の病因の中枢神経系異常、すなわちうつ病、パーキンソン病、学習記憶障害、遅発性ジスケネジー、薬物依存症、動脈硬化症認知症、ハンチントン病の随伴症状としての認知症、ウィルソン病、激越性麻痺症、視床委縮からなる群の中枢神経系異常、
感染症、特にウイルス感染。該ウイルスは、宿主におけるＴＮＦ−αの生成を増大させる、または宿主におけるＴＮＦ−αの上方調節に感応するので、複製やその他の重要な活性を妨げる。該感染症のウイルスには、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＩＶ−３、サイトメガロウイルス、ＣＭＶ、インフルエンザ、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（帯状ヘルペスや単純ヘルペスを含む）が挙げられる。
イースト菌感染症と真菌感染症。該イーストと菌類は、宿主におけるＴＮＦ−αの上方調節に感応するまたはＴＮＦ−αの生成を誘発する。特に全身性イースト菌感染症と真菌感染症の治療用に他の薬剤とともに同時投与を行う場合は真菌性髄膜炎に有効である。該他の薬剤の例としては、ポリマイシン、好ましくはポリマイシンＢ、イミダゾール、好ましくはクロトリマゾール、エコナゾール、ミコナゾールおよび／またはケトコナゾール、トリアゾール、好ましくはフルコナゾールおよび／またはイトラナゾール、ならびにアンフォテリシン、好ましくはアンフォテリシンＢおよび／またはリポソームアンフォテリシンＢが挙げられる。
【０１１２】
更に本発明は、ＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用をを改良、特に阻害する方法において、
（ａ）本発明の分離剤または該分離剤を標的とする認識分子を生成する工程、および
（ｂ）前記工程（ａ）による少なくとも１つの生成物を、細胞、細胞培養物、組織、およ
び／または標的生物に接触させる工程
を含む方法に関する。
本発明の好ましい実施態様では、上記方法は、調節がＰＫＡの調節ＲＩＩサブユニット、好ましくはＲＩＩアルファサブユニットおよび／またはＲＩＩベータサブユニットであるＲＩＩサブユニットに有効であるという特徴を有する。
【０１１３】
更に本発明は、本発明の生成物、好ましくは分離剤及び前記分離剤を標的とする認識分子、および／または本発明による医薬組成物、及び任意選択にてキット内容の取扱いまたは組合せに関する情報（例：取扱説明レーフレットや、更に詳しい説明を掲載したホームページのインターネットアドレス等）を含んだ、キットに関する。例えば、キットの取扱いに関する情報は、上記疾病、特に好ましい疾病に関する治療投薬計画を備えてもよい。また、情報は、ＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用またはその分離に関して疾病を診断する上での本発明の生成物の使用に関する情報を備えてもよい。本発明のキットは、基本研究にも使用可能である。基本研究において、キットは、好ましくは代謝事象がＡＫＡＰとＰＫＡとの相互作用の有無を伴うかどうか検出するために使用可能である。更に具体的には、本発明のキットによって、ＡＫＡＰおよび／またはＰＫＡのどのサブユニットが上記２つの分子の相互作用または該相互作用の非発生について寄与するかを決定することができる。
【０１１４】
有利な一実施態様では、本発明による生成物は、ペプチド、ベクター、核酸、アミノ酸、炭水化物、または脂質を含むことができる。例えば、生成物を脂肪残基に結合させて、膜透過性を変化させることが好ましい場合がある。ＰＫＡ結合が異なる親和性で行われている複数の物質を比較することによって、生理学的プロセスの進行を保証するためにどの程度のＰＫＡ−ＡＫＡＰ相互作用が必要であるか規定する定量的表示が可能になる。特に、本発明のキットは、該生理学的プロセスの進行を調べるために使用可能である。有利なことに、本発明の分子は、ＰＫＡのＲＩＩサブユニットを、ＡＫＡＰ好ましくはＡＫＡＰ１８特にＡＫＡＰ１８デルタの典型的ＰＫＡ結合領域よりも強く結合させるように選択することが可能である。有利なことに、本発明の選択分子は、ＲＩＩアルファまたはＲＩＩベータまたは特定のＲＩサブユニットに特異的であるので、キットは、例えばこれらの分子の相互作用に関するより詳細な見識を得るために使用することができる。より具体的には、ＰＫＡの任意の調節サブユニットをＡＫＡＰタンパク質から分離させることによって、どのタイプのＰＫＡが、すなわちＩＩアルファタイプかＩベータタイプかＩタイプのいずれが調査対象である各プロセスに関与するかについて情報が得られる。
【０１１５】
本発明は、医薬品を製造する方法に関し、該方法は、以下の工程を含む。
（ａ）好ましくはリード構造の形態をとる、本発明による分離剤を生成する工程と、
（ｂ）好ましくは組み合せた医薬品設計および／または構造に基づく医薬品設計を使用し
てリード構造の化学的改良を行うことによって物質を得る工程、および任意に
（ｃ）前記ＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用に影響を及ぼす能力について前記物質を試験する工
程、および任意に
（ｄ）医薬品として適切な物質を選択する工程。
【０１１６】
本発明の好ましい実施態様では、上記方法は、試験物質を、医薬的に許容可能な形態に調製することも備える。
【０１１７】
本発明は、上記方法から直接得た加工生成物にも関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１１８】
以下、本発明の実施例に関して、より詳細に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。本発明の阻害剤または分離剤は、ＡＫＡＰとＰＫＡとの相互作用を調節する。以下、本発明をいくつか選択した実施例を挙げて詳細に説明する。
【０１１９】
１．  材料と方法
特に明記しない限り、使用した試薬と化学薬品は、Merck (Darmstadt)、Sigma (Deisenhofen)、またはCarl Roth (Karlsruhe)から購入した。
【０１２０】
１．１  培地及び緩衝剤
ＬＢ培地
トリプトン１０g/l
ＮａＣｌ１０g/l
酵母エキス５g/l
ｐＨ７．０
溶液は、よく撹拌してから加圧減菌処理した。
【０１２１】
ＬＢ寒天
ＬＢ培地に、寒天１５g/lを添加してから加圧減菌処理した。
寒天プレートを調製するため、すべての固形微粒子が溶解するまでＬＢ寒天を電子レンジで加熱した。
摂氏４０度まで冷却した後、必要な抗生物質を添加し、溶液をプレートに流し込んだ。
【０１２２】
アンピシリン
アンピシリンは、増殖細菌中の細胞壁合成を防ぐペニシリン誘導体である。原液の状態で（１００mg/ml）−２０℃で保管し、使用直前にＬＢ寒天またはＬＢ培地において濃度１００μg/mlまで希釈した。
【０１２３】
２０×トリス／酢酸／エチレンジアミンテトラアセテート（ＥＤＴＡ）緩衝剤（ＴＡＥ）
Ｈ２Ｏの０．５l中にトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）  ２４２g
０．５MのＥＤＴＡ  ４０ml、ｐＨ８
酢酸  ２２．８ml
Ｈ２Ｏ  １l
【０１２４】
臭化エチジウム溶液
臭化エチジウム  １g
Ｈ２Ｏ  １００ml
【０１２５】
６×デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）試験緩衝剤
ブロモフェノールブルー  ２５０mg
キシレンシアノール  ２５０mg
１５０mMトリス−ＨＣｌ  ３３ml、ｐＨ7.6
グリセロール  ６０ml
Ｈ２Ｏ  7ml
【０１２６】
イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ） (IPTG)）溶液
ＩＰＴＧ  １．７９g
Ｈ２Ｏ  ５０ml
【０１２７】
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）
Ｎａ２ＨＰＯ４×２Ｈ２Ｏ２８．５g
ＮａＨ２ＨＰＯ４×Ｈ２Ｏ５．５g
ＮａＣｌ１６４g
Ｈ２Ｏ１l
【０１２８】
プロテアーゼ阻害剤混合物
トラシロール（アプロチニン１．４μg/μl
ベンズアミジン０．５mM
ダイズトリプシン阻害剤（ＳＴＩ）３．２μg/μl
【０１２９】
フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）溶液（４０mM）
ＰＭＳＦ１４mg
エタノール（ethanol）２ml
【０１３０】
ジチオスレイトール（ＤＴＴ）原液（０．５M）
ＤＴＴ７７１mg
Ｈ２Ｏ１０ml
【０１３１】
溶菌緩衝剤
ＰＢＳ
プロテアーゼ阻害剤混合物（１：１２５）
ＰＭＳＦ溶液（１：８０）
ＤＴＴ原液（１：１００）
【０１３２】
リゾチーム溶液
リゾチーム１０mg
Ｈ２Ｏ１０ml
【０１３３】
グルタチオン溶出緩衝剤
還元グルタチオン４０mM
ＮａＣｌ２００mM
０．２％Tween 20
トリスＨｃｌ１００mM、ｐＨ８．５
【０１３４】
ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））サンプル緩衝剤
トリスＨｃｌ１００mM、ｐＨ６．８
４％ＳＤＳ
２０％グリセロール
１０％β−メルカプトエタノール
０．０２％ブロモフェノールブルー
ＤＴＴ３０mM
【０１３５】
分離ゲル（１０％）
下記の量は、ゲル２つ分の量
３０％アクリルアミド（０．８％ビスアクリルアミド含む）３．７５ml
トリスＨｃｌ０．７５M(５．６２５ml）、ｐＨ８．８
２０％ＳＤＳ５６．５μl
Ｈ２Ｏ２．５ml
１０％ペルオキソニ硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）７９μl
Ｎ，Ｎ，Ｎ'，Ｎ'−テトラメチルエチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）５．６５μl
【０１３６】
集合ゲル
下記の量は、ゲル２つ分の量
３０％アクリルアミド（０．８％ビスアクリルアミド含む）８３５μl
トリスＨｃｌ０．６２５M(６２５μl）、ｐＨ６．８
２０％ＳＤＳ２５μl
Ｈ２Ｏ３．５ml
１０％ＡＰＳ２５μl
ＴＥＭＥＤ５μl
【０１３７】
ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）泳動緩衝剤
グリシン２５０mM
トリス２５mM
０．１％ＳＤＳ
【０１３８】
クマシー染色液
クーマーシィブリリアントブルーＧ２５０（２g）
酢酸７５ml
メタノール５００ml
Ｈ２Ｏ１l
【０１３９】
脱染液
酢酸７５ml
エタノール１００ml
Ｈ２Ｏ１l
【０１４０】
半乾性トランスファー緩衝剤
トリス２５mM
グリシン１９０mM
２０％メタノール
【０１４１】
トリス緩衝食塩水（ＴＢＳ）
トリスＨｃｌ１０ｍM、ｐＨ８．０
ＮａＣｌ１５０ｍＭ
【０１４２】
TBS-Tween 20（ＴＢＳＴ）
ＴＢＳに同じ。ただし０．０１％Tween 20を含む。
【０１４３】
赤色Ｓ染色液
赤色Ｓ２g
トリクロロ酢酸３０g
スルホサリチル酸３０g
Ｈ２Ｏ１００ml
【０１４４】
ブロット
ＴＢＳＴ中に脱脂粉乳５０g/l
【０１４５】
ブラッドフォード試薬
クーマーシィブリリアントブルーＧ２５０（１００mg）
非変性エタノール５０ml
Ｈ２Ｏ８００ml
溶液は一晩置いてから、リン酸１００mlを添加。
Ｈ２Ｏ１l
溶液は撹拌し濾過する。
【０１４６】
結合緩衝剤
プロテアーゼ阻害剤混合物８０μl
ＰＭＳＦ溶液１２５μl
ＤＴＴ原液０．５M（２０μl）
ＰＢＳ１０ml
【０１４７】
ブロッキング溶液
脱脂粉乳１５０mg
ＤＴＴ原液０．５Ｍ（１００μl）
０．０５％Tween 20
ＰＭＳＦ溶液６２５μl
プロテアーゼ阻害剤混合物４００μl
ＰＢＳ５０ml
【０１４８】
ＰＢＳＴ
ＰＢＳ中０．０５％Tween 20
【０１４９】
１．２  プラスミドＤＮＡによるコンピテント細菌の形質転換
形質転換を行うため、ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテント大腸菌細胞を、CohenとWangの方法に従って生成した。
【０１５０】
−８０℃で保管した細菌を氷上で２回解凍し、形質転換させるプラスミドＤＮＡ２ngを細菌懸濁液５０μlに添加した。氷上で３０分間培養した後、プラスミドＤＮＡを得るために、細胞を４５秒間４２℃度で熱衝撃に暴露した。その後、３７℃に予熱しておいたＬＢ培地２５０μlを直ちに添加し、細胞を３７℃で１時間撹拌した。これにより、細胞はプラスミドによってコードされる抗生物質耐性を示した。
【０１５１】
その後、細胞懸濁液３０μlを除去し、抗生物質製剤を含むＬＢ寒天上で培養した。残余物は１分間８０００×gで遠心分離機にかけ、培地１００μl中で再懸濁して同様に培養した。寒天プレートは、一晩３７℃で培養した。次の日、コロニーを数えて、形質転換の効果を数量化した。
【０１５２】
１．３  プラスミドＤＮＡの調製
ＧＳＴ融合タンパク質を発現させるため、クローンタンパク質コード配列を含むｐＧＥＸ−４Ｔ３プラスミド（図１）を使用した。該ベクターは、細菌細胞に外来ＤＮＡを導入するために使用することができる。また、プラスミドＤＮＡは、例えば対照用に、細胞から再分離することができる。
【０１５３】
プラスミドＤＮＡ５〜１０μgを大腸菌から分離するため、ＬＢ培地２〜３mlに対して、寒天プレート由来の単一のコロニーを有する対応抗生物質を接種した。培養物は、一晩３７℃で撹拌して培養した。細胞は１３０００×gで遠心分離機にかけ、上澄みを可能な限り完全に廃棄した。細菌沈殿物からのプラスミド分離は、QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen GmbH, Hilden)のプラスミド少量調製手順書に従って実施した。
【０１５４】
タンパク質とタンパク質結合染色体ＤＮＡとを除去するため、細胞をアルカリ溶菌緩衝剤で溶解した。可溶性プラスミドＤＮＡは、高濃度食塩水の存在下でシリカゲル（カラム内にて）に結合させ、洗浄し、最後に低濃度食塩水を使用して溶出した。
【０１５５】
分離プラスミドＤＮＡは、制限エンドヌクレアーゼ消化とその後のアガロースゲル電気泳動法を用いて分析した。
【０１５６】
１．４  ＤＮＡの制限
（大腸菌から分離した）ＥｃｏＲＩ等の制限エンドヌクレアーゼは、配列で規定される特定部位においてＤＮＡを切断する。酵素は、該配列を認識し、結合し、加水分解によりＤＮＡを切断する。大腸菌等の微生物は、外来ＤＮＡを分解する制限エンドヌクレアーゼを有する。自己ＤＮＡと外来ＤＮＡとの間の区別は、ＤＮＡのメチル化パターンを変化させることによって可能である。
【０１５７】
様々なメーカー（New England BioLabs (NEB), Beverly, USA; Fermentas GmbH, St. Leon-Rot; Invtrogen GmbH, Karlsruhe）から購入したエンドヌクレアーゼは、メーカーの指示に従って使用した。
【０１５８】
一般に、ＤＮＡの制限（制限エンドヌクレアーゼによる処理）は、１時間、３７℃で実施した。典型的な反応バッチは、ＤＮＡ５μg、１０×酵素緩衝剤１μg、酵素溶液０．５μlを含み、滅菌水で満たして最終的な分量が１０μlとなるようにした。
【０１５９】
培養後、反応バッチ全体を、アガロースゲル電気泳動法を用いて分析した。
【０１６０】
１．５  アガロースゲル電気泳動法
電気泳動法において、電圧を印加することによって、分子は、ゲル中において大きさや電荷に従って分離される。
【０１６１】
１％アガロースゲルを使用した。調製を行うため、１％固形アガロースをＴＡＥ緩衝剤に入れ、電子レンジで沸騰させて溶解した。透明溶液を４５℃まで冷却し、アガロース溶液１００mlにつき臭化エチジウム（ＥｔＢｒ）溶液５μlを添加した。
【０１６２】
ＥｔＢｒは、核酸の塩基間のインターカレーションを行うので、紫外線光下での検出が可能になる。ＥｔＢｒ蛍光発光は、ＥｔＢｒによりインターカレーションされたＤＮＡのプリン塩基とピリミジン塩基との非局在化π電子システムによって増大される。
【０１６３】
次に液体ゲルをプラスチック型に流し込み、冷却重合させた。検査対象のＤＮＡサンプルに、サンプル緩衝剤、ＴＡＥ、グリセロール、ブロモフェノールブルーを添加した。グリセロールは、溶液密度を増大させるので、溶液がゲルポケットにより容易に届き、かつゲルポケットに保持されることが可能になる。ブロモフェノールブルーによって、サンプルは可視となる。
【０１６４】
サンプル中のＤＮＡ断片の大きさを測定するため、ＤＮＡ５μlの分子量標準をゲルにつき１レーンにおける規定の大きさのＤＮＡ断片を用いて分析した（HyperLadder I, Bioline GmbH, Luckenwalde、図２）。
【０１６５】
電気泳動法を、３０分間電圧１２０Vにて実施した。その後、ゲルをBoehringer MannheimのLumiImager F1で撮影し、同梱のLumi Analyst 3.0 Softwareで分析した。
【０１６６】
１．６  ＧＳＴ融合タンパク質の発現と精製
アンピシリンを含むＬＢ培地１５０mlに、寒天プレート由来の形質転換クローンの大腸菌細胞を接種した。培養液は、一晩３０℃で培養した（ＯＮ）（３７℃において、細胞成長が非常に急速になるので、培養は次の日には対数増殖期をすでに超える。更に、培養温度を上昇させるにつれて、融合タンパク質の基本的発現が増大する。これにより、不溶性封入体が形成された結果として精製が遅延する可能性がある）。
【０１６７】
次の日、一晩置いた培養物２０mlを、アンピシリンを含む新鮮ＬＢ培地５００mlに移した。３７℃における培養の間、細菌の成長を光学濃度（ＯＤ）６００nmで測定することによってモニタリングした。ＯＤ６００（約０．６）に達した後に、細菌は対数増殖期にあり、このときタンパク質の発現は最大であり、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質の発現は、最終濃度である１．５mMでＩＰＴＧを添加することによって誘導された。ＩＰＴＧは、乳糖オペロンの合成誘導原であって、リプレッサーに結合することにより、ＤＮＡへの結合を阻害する。３０分間３７℃における培養を行った後、細菌を、５０００×gと４℃で１０分間遠心分離機にかけて沈殿させた。
【０１６８】
この時点から先は、以降のすべての精製工程は、プロテアーゼの活性を低く抑えるために、氷上で実施した。沈殿物は、低温溶菌緩衝剤３０ml中で再懸濁させ、ＤＴＴを添加して最終濃度を５ｍＭとした。細胞懸濁液は、French Pressure Cell Press (「French press」)を使用して３回機械的に溶菌させた。この処理中に、細菌細胞壁は高圧の結果として破壊したので、次に行う浄化剤によるプラズマ細胞膜の溶菌が容易になった。
【０１６９】
浄化剤として、最終濃度１％のTriton X-100を使用した。懸濁液は、３０分間４℃で若干撹拌して、プラズマ細胞膜を溶解させてサイトゾルタンパク質を溶液に放出した。
【０１７０】
このようにして得た溶解物は、１７０００×gと４℃で１０分間遠心分離機にかけて、細胞残屑を除去した。上澄みは、ＧＳＴ融合タンパク質を含んでいた。ＧＳＴ融合タンパク質を精製するため、上澄みは、若干撹拌しながら室温で３０分間、Glutathione Sepharose 4B６００μl（融菌緩衝剤中の５０％懸濁液（Amersham GmbH & Co. KG, Brunswick社製））で培養した。
【０１７１】
インビボにおいて、ＧＳＴ酵素は、例えば肝細胞の細胞質ゾルにおいてグルタチオンの反応を様々な求電子疎水基質で触媒する等、解毒反応において重要な役割を果たす。タンパク質の精製において、所望のタンパク質で融合されたＧＳＴは、セファロースビーズに結合したグルタチオンに対して高親和性と高特異性をもって結合する。セファロースは、ビーズ状のアガロース由来基材で、架橋結合して三次元網目構造を形成する。その体積が大きいので、ビーズやビーズに結合する物質は、５００×gで５分間遠心分離機にかけて沈殿させることが可能である。
【０１７２】
この他、ＧＳＴ融合タンパク質は、グルタチオンセファロースで充填したカラム上における親和性クロマトグラフィーを使用して精製することもできる。通常この作用によって、高純度であるが低生産高なタンパク質が得られる。次にＧＳＴ融合タンパク質を含むセファロース沈殿物を、３回洗浄した。これは、各回において溶菌緩衝剤３mlで再懸濁し再び遠心分離機にかけることによって実施した。
【０１７３】
グルタチオンセファロースから精製タンパク質を溶出するため、ペレットに溶出緩衝剤３００μlを添加し、１０分間室温で撹拌した。溶出緩衝剤は遊離グルタチオンを過剰に含んでいたので、ＧＳＴ融合タンパク質からグルタチオンセファロースを競合的に除去した。５００×gで５分間遠心分離機にかけた後、融合タンパク質を含む上澄みを慎重にピペット操作して収集し、同量のサンプル分割単位量のグリセロールを添加して−２０℃で保管した。グリセロールは、タンパク質の分解を招く氷晶の形成を防ぐ（特に複数の凍結／解凍サイクル後）。
【０１７４】
精製プロセスのモニタリングを行うため、サンプルは手順における様々な段階で取り出して、ＳＤＡ  ＰＡＧＥ（以下を参照）を使用して分析した。すなわち、ＩＰＴＧによるタンパク質合成の誘導前後の段階、細胞溶解物の遠心分離前後の段階、グルタチオンセファロースの添加前後の段階、及びセファロース沈殿物の洗浄後の段階においてサンプルを取り出し分析した。
【０１７５】
１．７  ＳＤＳ  ＰＡＧＥ
タンパク質の精製と分子量とを分析するために使用した方法は、Laemmliによる、不連続ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）である。
【０１７６】
分子量を検出するため、ゲルにおけるタンパク質の移動率に及ぼす電荷と三次構造との影響を除去する必要がある。これにより、タンパク質の（対数）移動性がその分子量にのみ依存するようになる。
【０１７７】
この状態は、天然タンパク質をＳＤＳ浄化剤で変性させることによって実質的に達成可能である。これによって、オリゴマータンパク質がそのサブユニットに解離する。ＳＤＳのスルホン酸基の負電荷は、個々のアミノ酸側鎖の固有電荷にオーバレイしているので、タンパク質の均一な負電荷が得られる。
【０１７８】
ジスルフィド架橋は、ＳＤＳの他にサンプル緩衝剤に存在するＤＴＴとβメルカプトエタノールによって還元され開裂する。変性タンパク質は、大きさに従って、すなわちアミノ酸鎖の長さに従って、ＳＤＳに結合する。
【０１７９】
核酸のアガロースゲル電気泳動同様に、既知の分子量を有するタンパク質から成る分子量標準は、ゲルにも共通して適用される。このため、BenchMark Protein Ladder分子量標準（図3、Invitrogen GmbH, Karlsruhe社）を使用した。
【０１８０】
ＳＤＳ  ＰＡＧＥは、非連続な方法といわれる。その理由は、ゲルは２つの部分、すなわち収集ゲルと分離ゲルとから成り、これらはその孔径やｐＨ値において異なるからである。該非連続システムは、連続システムに比べて輪郭がはっきりとしたバンドが得られるので、タンパク質の大きさや分子量がより正確に測定できる。
【０１８１】
結合タンパク質を有するセファロースビーズは、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで直接使用可能である。その理由は、ＳＤＳサンプル緩衝剤は、還元力が大きいので、タンパク質がビーズから溶出するからである。
【０１８２】
ゲルの分離は、セクション２．１に記載した試薬を使用して行った。重合は、ピペット操作によりＴＥＭＥＤの添加後に開始し、溶液３．７５mlを専用プラスチックホルダーでクランプされたたグラスプレート間でピペット操作した。
【０１８３】
次にゲルは、２−プロパノールで被覆し、気泡を除去し、ゲルが空気に触れないようにした（酸素は重合反応を妨げるため）。２−プロパノールを重合完了後に除去し、収集ゲルを調製した（セクション１．１を参照）。分離ゲルを収集ゲルの層で被覆した後、サンプルポケットを形成するリッジをゲル溶液に入れた。
【０１８４】
タンパク質サンプルは、５分間９５℃にてサンプル緩衝剤中で沸騰させて変性させた。サンプルは、短時間遠心分離機にかけ、ハミルトン注射器を使用してゲルポケットに移した。
【０１８５】
約１５分間９０Vで泳動を実施後、タンパク質は分離ゲルに達し、電圧は１．５時間で１２０Vまで増大した。
【０１８６】
泳動完了後、ゲル中の分離タンパク質は、クマシーブリリアントブルーＧ２５０溶液で染色するか、またはウエスタンブロット分析を使用して更に調べた（下記を参照）。
【０１８７】
クマシー染色のために、ゲルは３０〜６０分まずクマシー染色液中で、次に脱染色液中で撹拌し、過剰な染料を除去した。非染色ゲルと染色タンパク質とのコントラストは十分大きかった。最後に、Bio-Rad ChemiDoc EQで撮影し、同梱のQuantity One softwareで分析した。
【０１８８】
１．８  ウエスタンブロッティング
ＳＤＳ  ＰＡＧＥによる分離に続いて行うウエスタンブロッティングにおいては、タンパク質は、電圧を用いてニトロセルロースまたはポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）の膜に転写され、特定の抗体（Ａｂ）を使用して検出される。Ａｂへの結合後、過剰なＡｂを洗浄除去し、膜は標識化され一次Ａｂを特異的認識する二次Ａｂで培養される。標識は、放射性同位体または染料形成反応を触媒する酵素から成る。
【０１８９】
最初に、イモビロンＰ−ＰＶＤＦ膜をゲルの大きさに切って、エタノールで１５秒、次に半乾性転写緩衝剤で少なくとも５分間湿らせる。ワットマンフィルタ紙も適切な大きさに切って、転写緩衝剤で湿らせる。
【０１９０】
ゲルから膜へのタンパク質転写は、２つのフィルタ、膜、ゲル、及びそれらの上に積層される別の２つのフィルタを有するBioRad TransBlot SD Semi Dry Transfer Cellを使用して実施した。気泡はタンパク質転写を阻害するので、除去した。転写緩衝剤４mlをピペット操作してスタック上に取り出した後、転移細胞は閉じ、タンパク質は１時間１０Vにて膜に転写された。
【０１９１】
次に、膜上のタンパク質をPonceau S溶液で染色した。このために、膜は水で洗浄して、２０分間室温でPonceau S溶液中で撹拌した。分子量標準のバンドを鉛筆で追跡し、膜を透明フィルムで覆って、LumiImager F1を使用して撮影した（露出は７秒、上面照明）。
【０１９２】
Ａｂ培養前に、膜上の自由結合部位をブロックしなければならない。さもないと、大量のＡｂが非特異的に該部位に付着して、特異的シグナルと干渉するおそれがあるからである。１時間ブロット内で撹拌することによって膜を飽和させた。
【０１９３】
一次Ａ１８デルタ３Ａｂは、すでに用意してあった。これは、ラビットに、ＡＫＡＰ１８デルタ配列のアミノ酸６０〜７６と同一な配列を有するペプチドの免疫を付与することによって生成した。これによって得られた抗血清は、Thiopropyl Sepharose 6B（Amersham GmbH & Co. KG, Brunswick）と組み合わせて免疫付与に使用されるペプチドを介して親和性クロマトグラフィーによって精製した。Ａ１８デルタ３Ａｂは、ＡＫＡＰ１８デルタとＡＫＡＰ１８ガンマとの両方に結合する。
【０１９４】
Ａｂ溶液は、ブロット内で１：５００に希釈した。Ａｂの所要量を減少させるため、膜を室温で２時間または４℃で一晩、気泡のないＡｂ溶液３mlを用いて培養袋中で撹拌した。
【０１９５】
５分間ＴＢＳＴで３回洗浄した後、膜はブロット内で二次Ａｂ（抗ラビットＦ（ａb)2フラグメント）の１：１０００希釈物中で１時間撹拌した。二次Ａｂは、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）（Dianova, Hamburg）に結合した。
【０１９６】
膜は１０分間ＴＢＳＴで３回洗浄した。検出を行うため、４mlのLumiLight Western Blotting Substrate（Roche Diagnostics GmbH, Mannheim）の溶液１、２を膜に添加し、室温で５分間撹拌した。検出溶液は、光（化学発光）を発生させるＡｂ結合ＰＯＤによって酸化されるルミノールを含む。透明フィルムで覆った膜の写真を撮影し、LumiImager F1上で「化学発光」を調節した（露出は１分）。
【０１９７】
１．９  タンパク質濃度のブラッドフォード測定
ブラッドフォード法は、グルタチオンセファロース溶出液中のタンパク質濃度の測定に最適である。これは、使用する色原体（クーマーシィブリリアントブルーＧ２５０）が、溶出液にも存在する過剰なグルタチオンに結合せず、陽イオン疎水性アミノ酸側鎖に特に結合するからである。
【０１９８】
測定のために、タンパク質含有サンプル（希釈溶出液）５０μlを２MのＮａＯＨ５０μlに添加し、１０分間６０℃で培養した。その後、ブラッドフォード試薬１mlを添加し、サンプルをキュベットに移し、５９５nmでの吸収レベルを測定した。
【０１９９】
タンパク質の濃度は、様々なオボアルブミン希釈物由来の一連の検定標準と比較して測定した。
【０２００】
１．１０  酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）
ＥＬＩＳＡは、抗原を特異的抗体で検出する方法である。検出は、結合パートナーの１つと共有結合する酵素によって行われ、酵素は色原体の変化を触媒する。これによって、例えば染色や化学発光等が定量的に発生する（ウエスタンブロッティングで記載のとおり）。２つの結合パートナーの１つは固定化するので、非結合抗体または非結合抗原の除去は非常に容易である。検出は、特別な読取り装置（ＥＬＩＳＡリーダー）内の光電子増倍管を使用して化学発光の強度（Ｉ）を観察することによって行われる。測定値の出力は、相対照度ユニット（ＲＬＵ）において行う。
【０２０１】
この場合、一方のタンパク質（ＰＫＡ）がもう一方（ＡＫＡＰ１８デルタ−ＧＳＴ）に結合することが、小有機分子の存在によって阻害されるかどうかを調べることが要点であった。したがって、サンドイッチＥＬＩＳＡ法が開発された。サンドイッチＥＬＩＳＡ法において、ＡＫＡＰタンパク質の結合先であるＲＩＩアルファＰＫＡサブユニットは３８４ウェルマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に結合した。
【０２０２】
高いタンパク質結合能力を有するポリスチレンから構成される白色ＭＴＰを使用した（384-Well White Flat Bottom Polystyrene High Bind Microplate、製品番号3703番、Corning GmbH, Wiesbaden）。白色は化学発光を反射することにより検出レベルを向上させ、同時に近隣のウェルの発光を防止する。自由結合部位は、結合後ブロックされる（下記を参照）。第２ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタタンパク質を、対照としての潜在的低分子量阻害剤とともに阻害性ペプチド（下記を参照）に添加した。続いて、結合ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタを抗体と化学発光とによって定量化した。ＥＬＩＳＡの原理を図４に示した。
【０２０３】
使用タンパク質の生理学的ｐＨ値を維持するため、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４）を緩衝系として使用した。タンパク質分解を遅らせるため、緩衝剤に、非特異的プロテアーゼ阻害剤としてプロテアーゼ阻害剤とＰＭＳＦとの混合物を添加した。更に、ＤＴＴを使用して、タンパク質が酸化しないようにした。ブロッキング溶液は更に０．３％脱脂粉乳を含んでいた。これは、そこに含まれる乳タンパク質でＭＴＰ非特異的結合部位を飽和するためである。
【０２０４】
結果に関するセクションでより詳細に説明するとおりＥＬＩＳＡを確立するため、ＰＫＡ−ＲＩＩアルファを検出するにあたり、上記及びセクション１．８（ウエスタンブロッティング）に記載のものに加えて、更に他の抗体が必要であった（市販のマウスＰＫＡＲＩＩａｌｐｈａ抗体（BD Biosciences, San Jose, USA）、及び抗マウスＰＯＤＡｂ（Dianova, Hamburg））。
【０２０５】
１．１１  結合曲線とＩＣ５０値の計算
実験で得られたデータの一部を、GraphPad Prism（GraphPad Software, San Diego, USA）を使用して評価した。
【０２０６】
結合曲線を測定値に適合させるために（結果を参照）、１つの部位の結合モデルを基本として使用し、このモデルをＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタのＲＩＩアルファへの結合に適用する。対応する式は以下のとおりである。
Ｙ＝Ｂｍａｘ・Ｘ／Ｋｄ＋Ｘ
【０２０７】
ＩＣ５０計算の測定値を、１つの部位の競合モデルに適合させた。マイナスの結合値に対する誤適応を除外するため、最小値漸近線は、０．０より大きくなければならない。使用した式は以下のとおりである。
Ｙ＝最小値＋（最大値−最小値）／１＋１０ｘ−ｌｏｇ／Ｃ50
【０２０８】
１．１２  物質ライブラリーのスクリーニング
スクリーニング、すなわち、ＡＫＡＰ１８デルタ−ＲＩＩアルファ結合の潜在的阻害剤を系統的・部分的に自動検索を行うために、ＦＭＰ２００００物質ライブラリーを用いた。ライブラリーには、２００６４の様々な市販の物質が含まれていた。これらの物質は、５７ＭＴＰ上のＤＭＳＯ中の原液１０mM中にあって、それぞれ３８４のウェルを有していた（ChemDiv, San Diego, USA）。ライブラリーの物質は、既知の薬理学的活性物質にも適用される特定基準に従って選択されている。該基準には、Lipinski's Ruleも含まれる（「考察」を参照）。
【０２０９】
スクリーニング用のＭＴＰを調製するため、３８０のウェルのそれぞれを、電子制御式２４チャンネルピペット（Eppendorf）を使用して濃度０．７５ng/μl（結合緩衝剤中）のＲＩＩアルファ溶液２０μlで充填した。ＡＫＡＰ１８デルタ−ＧＳＴ（８ng/l）１０μlをピペット操作して残りの４つのウェルそれぞれに入れ、検出の陽性対照を得た（表１．１のＭＴＰ占有分と、表１．２のピペット操作概要とを参照）。ＭＴＰを遠心分離機にかけてから（２５００×gで１分間）、ＭＴＰを少なくとも１時間室温で培養した。タンパク質溶液をタッピングにより除去してペーパースタック上に取り出した後、非特異的結合部位を、室温で少なくとも１時間ブロッキング溶液／ウェル１００μlでブロックした。
【０２１０】
表１．１  ＭＴＰ占有分。カラム１と２４は対照反応の場合を、カラム２〜２３は低分子量物質の場合を示す。表１．２のピペット操作概要も参照のこと
【表１．１】
2008540586.tif 000016
【０２１１】
ブロッキング溶液は、自動Power Washer 384（Tecan）を使用して除去した。すべてのウェルは、ＴＢＳＴで洗浄した。洗浄作業の完了後、なお残っている可能性がある溶液残留物をタッピングにより除去してペーパースタック上に取り出した。
【０２１２】
次の工程において、低分子量物質を自動ピペット操作するために、ＭＴＰを調製した。各ウェルに、ピペット操作概要（表１．２）に従ってピペット操作したブロッキング溶液または対照１０μlを加えた。阻害剤を含まず、ＡＫＡＰ１８デルタ−ＧＳＴ量のを徐々に増大させ（ウェルにつき０、８０、１６０ng）かつ阻害性Ｌ３１４Ｅペプチドと１８ｄ−ＰＰ対照ペプチド（最終濃度は２５mMと１μM）とを有するものの反応を対照として使用した。プレートは短時間、遠心分離機にかけた。
【０２１３】
同時に、以下のようにして、ピペット操作できるようにライブラリーＭＴＰを調製した。短時間、遠心分離機にかけた後で解凍（３７℃度で３０分間）し、溶液をプレート底に堆積させた。存在する可能性がある固体粒子を溶解するために、プレートを１分間超音波槽に浸漬した。プレートに付着した水を５分間３０℃でEppendorf Concentrator 5301中で処理して蒸発させ、保護膜を慎重に除去した。
【０２１４】
Sciclone ALH 3000 Workstation（Caliper LifeSciences, Hopkinton, USA）を使用して、各潜在的な低分子量阻害剤０．５μl（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の原液１０mM、最終濃度は２４４μM）をライブラリーＭＴＰからスクリーニングＭＴＰに移した。対照カラム１と２４にはそれぞれＤＭＳＯ０．５μlを添加し、他のサンプルと同量のＤＭＳＯが対照に添加されるようにした。スクリーニングＭＴＰを遠心分離機にかけた後で、ＡＫＡＰ１８デルタ−ＧＳＴ（ブロッキング溶液中８ng/μl)をピペット操作概要に従って添加し（表２．２）、室温で少なくとも３０分間培養した。
【０２１５】
Power Washer中にてＰＢＳＴで洗浄することによって過剰なタンパク質を除去した後、潜在的な阻害剤の存在下における結合ＡＫＡＰ１８デルタ−ＧＳＴの量を、各ウェルにつき、２０μlのＡ１８デルタ３（ブロッキング溶液中１：１０００、室温で少なくとも１時間、または４℃度で一晩中）、及び２０μlの抗ラビットＰＯＤ  Ａｂ（ブロッキング溶液中１：３０００、室温で少なくとも１５分間）を使用して検出した。Power Washerを使用してＰＢＳＴで洗浄することは、各ピペット工程間で行った。各ウェルにつき、２０μlのLumiLight Western blotting基質（Roche）をピペット操作し、室温で５分関培養することによって定量化を行った。Tecan Genios Pro MTP readerと同梱のMagellan 5.02(化学発光終点測定。積分時間は各ウェルにつき１０ms。Tecan Deutschland GmbH, Crailsheim）を使用して化学発光を検出した。
【０２１６】
表１．２  スクリーニングＭＴＰのピペット操作概要。カラム１と２４は対照反応の場合を、カラム２〜２３は低分子量物質反応の場合を示す。
＊１Ｅ、１Ｆ、２４Ｋ、２４Ｌにおいて、小分子のピペット操作後、ブロッキング緩衝剤１０μlを、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ２０μlで置換した。
【表１．２Ａ】
2008540586.tif 000017
【表１．２Ｂ】
2008540586.tif 000018
【表１．２Ｃ】
2008540586.tif 000019
【０２１７】
２．結果
２．１  組み換えＡＫＡＰ１８デルタの精製
２．１．１  ＡＫＡＰ１８デルタ−ＧＳＴ融合タンパク質をコードするプラスミド
ＧＳＴ融合タンパク質の発現（図１）に適しており、かつＡＫＡＰ１８デルタコード化配列を含むｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターは、すでに本研究チームが利用できるようにしてあった。１０５９塩基対を含むＡＫＡＰ１８デルタｃＤＮＡ断片は、ＧＳＴコード化配列の３'末端に位置したので、発現タンパク質におけるＧＳＴは、ＡＫＡＰ１８デルタのＮ−ターミナル末端に位置した。本作業を開始する前に、短時間配列決定を行うことによって、配列の正確性を確認した。
【０２１８】
発現のため、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ構造を、競合ＢＬ２１細胞に形質転換した。形質転換を確認するため、得られたクローンのうちの４つを由来とするプラスミドＤＮＡを分離し、ＤＮＡ制限を制限エンドヌクレアーゼＥｃｏＲＩとＸｈｏｌとを使用して行った。これらの酵素はクローニングにも使用されるので、ＡＫＡＰ１８デルタ挿入サイズ（１．０kb）と線状化ｐＧｅｘベクターのサイズ（４．９kb）を有する断片は、予測どおりアガロースゲル電気泳動法（図５）で検出された。
【０２１９】
２．１．２  ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタを発現する細菌溶解の最適化
ＩＰＴＧ含有培地中で培養することによって、ｐＧＥＸ−ＡＫＡＰ１８デルタベクターで形質転換された細菌が、組み換えタンパク質を発現可能になる。その後細菌細胞溶解を行ってから、溶液中に放出されたＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオンセファロースに結合させ、洗浄し、最後に余分のグルタチオンで溶出した。
【０２２０】
可能なかぎり高いタンパク質収率を達成するため、標準方法に基づき、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ精製の様々なパラメータを変化させた。このようにして確立した精製手順は、セクション１．６で説明されている。
【０２２１】
対照用に精製した精製組み換えＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの予想サイズは７５kDaであり、ＧＳＴのみの予想サイズは２５ｋＤａであった。
【０２２２】
ｐＧＥＸ−ＡＫＡＰ１８デルタプラスミドで競合大腸菌ＢＬ２１細胞の形質変換を行った後、細胞を成長させ、タンパク質合成をＩＰＴＧで誘導した。まず、様々な条件における細菌溶解がタンパク質収率に影響を及ぼすかどうか、またどのように影響を及ぼすかについて調べた。
【０２２３】
標準方法すなわちフレンチプレスによる溶菌という標準方法を変えるだけでなく、同じ誘導培養由来の細胞をリゾチームで溶解し、ＤＴＴを添加した。以下の異なる条件について調べた。
・１×フレンチプレス
・３×フレンチプレス
・１×フレンチプレス溶菌前にＤＴＴ５mMを添加
・室温で３０分間リゾチームを使用（１mg/ml）
・３７℃で３０分間リゾチームを使用（１mg/ml）
【０２２４】
上記追加の精製手順とグルタチオンセファロースへの結合（セクション１．６を参照）の次に、ビーズ５μlを各バッチから取り出して、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを使用してからクマシー染色を行って分析を行った（図７）。空ｐＧＥＸベクターで形質転換された細胞も対照として使用した。空ｐＧＥＸベクターにとってＧＳＴは予想される唯一の精製物であった。
【０２２５】
図６Ａ、６Ｂから分かるように、予想される大きさのタンパク質を検出することができた。
【０２２６】
溶菌前の細胞懸濁液にＤＴＴ５mMを添加することによって、高いタンパク質収率が得られた（図６Ａ）。
【０２２７】
クーマシィで染色されたゲルを目視で比較すると、細胞溶解においてリゾチームはフレンチプレスよりも有効性が低いことが分かった（図６Ａ）。
【０２２８】
高いタンパク質収率を、３０分間室温で培養して達成した（図６Ｂ）。
【０２２９】
２．１．３  ＧＳＴ融合タンパク質のグルタチオンセファロースへの結合効率の向上
ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタがグルタチオンセファロースに結合する効率を最適化することを試みた。これは、セファロースビーズによる細胞溶解物の培養時間と培養温度を変化させることによって行った（図６Ｂ）。３０分間室温で細胞溶解物の培養を行うと高いタンパク質収率を得られることが分かった。
【０２３０】
２．１．４  溶出条件の最適化
セファロースビーズからのＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの溶出は、標準条件下ではあまり有効でないことが分かったので、タンパク質収率を最大化するために溶出条件を適合化した。
【０２３１】
メーカーの指示（室温で１０分間）に対して溶出時間や溶出温度を変化させても、収率向上は達成できなかった。したがって、溶出緩衝剤の組成を変化させた。メーカーの推奨によれば、溶出緩衝剤の組成は、トリス−ＨＣＬ５０mM中グルタチオン（ＧＳＨ）１０mM（ｐＨ８．０）である。
【０２３２】
１００mMのＮａＣｌまたは０．１％トリトンＸ−１００を添加すると、効率は向上しないことが分かった（図７のＡ、Ｂ）。したがって、工程においてＧＳＨ濃度を４０mMまで増大させ、トリス濃度を１００mMまで増大させ、ｐＨ値を９．０まで増大させ、ＮａＣｌ濃度を２００mMまで増大させた。更に、溶出緩衝剤に０．２％Tween 20を添加した。最後に、試験を行って、タンパク質が複数の溶出によって得られたかどうか調べた（図７のＣ−Ｉ）。ウエスタンブロッティング（Ａ１８デルタ３と、ペルオキシダーゼ（ＰＯＤ）結合抗ラビットＡｂによる）を使用して、精製タンパク質をＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとして識別した（図７のＪ）。
【０２３３】
最適化前に実施されかつＥＬＩＳＡ確立のために使用された精製のタンパク質濃度は、ブラッドフォード分析を使用して測定され、０．４μg/μlであることがわかった。
【０２３４】
スクリーニングのため、組み換えＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタを別に精製する必要があった。この精製は上記の最適化された条件下で実施した。この精製から得た溶出物の濃度は、確立ＥＬＩＳＡを使用して最初の精製と比較して測定したところ、８μg/μlであることがわかった。
【０２３５】
２．２タンパク質間相互作用を定量化するためのＥＬＩＳＡの確立
ＰＫＡのＲＩＩアルファサブユニットとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとの間のタンパク質間結合の定量的検出を行うため、ＥＬＩＳＡに基づく検出を行った。これは、通常試験によって適切に最適化されたものであり、他のすべてのＡＫＡＰタンパク質とＰＫＡサブユニットに対して使用可能である。
【０２３６】
セクション１．１０ですでに説明したとおり、この方法の利点は特に、感度が高く取扱いが容易なことである。更に、必要な物質がすでに確立されていて、十分な量利用可能であることであった。抗ラビットＰＯＤＡｂと化学発光溶液は市販されているが、Ａ１８デルタ３ＡｂとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタは本研究チーム内で生成した（上記を参照）。
【０２３７】
まず、主たる問題は、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタを初めにマイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に結合させてからＲＩＩアルファのＭＴＰへの結合を検出すべきか、あるいはその逆であるべきかということであった。前者を選択すると、感度が低く、必要なタンパク質量が多くなり、必要なＰＫＡＲＩＩａｌｐｈａ抗体は自家生成できない。このことから、後者を選択するしかないことになる。すなわち、ＲＩＩアルファをＭＴＰに結合してから、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタのＭＴＰへの結合を検出することになる。これは、ＥＬＩＳＡ確立の初期段階後に行った。
【０２３８】
分析を行うにあたり、以下の重要な点を調べる必要があった。
・適切な結合またはブロッキング用の緩衝剤の組成
・ＭＴＰに結合するＲＩＩアルファタンパク質の量
・プレート結合ＲＩＩアルファに結合するＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの量
・検出用の抗体の適切な希釈
・ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）溶液がＥＬＩＳＡに及ぼす影響（ペプチドと有機物質はＤＭＳＯに溶解）
・対照反応の阻害性ペプチドの濃度
・ＲＩＩアルファ、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ、抗体、及び化学発光検出用溶液の培養時間
・結合タンパク質を有するＭＴＰの保管条件
・化学発光の検出
【０２３９】
上記の点を鑑みてＥＬＩＳＡの確立を以下に説明する。特に明記しないかぎり、ＥＬＩＳＡ確立上のすべての実験において二重測定を実施した。すなわち、同量のタンパク質を含む２つのウェルを、各回同じ条件下で調べた。
【０２４０】
各実験においてわずか２つの測定を実施しただけであったものの、各平均値について標準誤差を計算して、平均値の精度を測定した。データは、有意性を測定するためには使用すべきでない。図面中の誤差表示は、平均値の標準誤差を示す。場合によっては（図９Ａ等）、平均値の標準誤差はあまりに小さいので誤差表示は認められない。
【０２４１】
２．２．１  脱脂粉乳はＭＴＰ上の自由結合部位をブロックするために最適
脱脂粉乳、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、及びＥＬＩＳＡ用に特別に前処理を施したＢＳＡ（ＥＬＩＳ  ＢＳＡ）を、ブロッキング試薬として調べた（図８Ａ。単一測定）。
【０２４２】
ＢＳＡは、本明細書で実証するとおり、非特異的発光シグナルを起こす物質を含むことが多い。ただし、ＥＬＩＳＡ  ＢＳＡは多数の非特異的シグナルを示し、一方脱脂粉乳は実質的に化学発光を示さなかった。したがって、ＭＴＰ上の自由結合部位をブロックするため、結合緩衝剤中最終濃度０．３％で脱脂粉乳を使用した。
【０２４３】
２．２．２  ＭＴＰウェルはＰＫＡ−Ｒｌｌアルファ５０ngで飽和可能
ＲＩＩアルファ濃度を徐々に増大させた結合緩衝剤溶液をピペット操作してＭＴＰのウェルに入れた。自由結合部位を脱脂粉乳溶液でブロッキングした後、プレートに結合したタンパク質量をＰＫＡＲＩＩａｌｐｈａＡｂと抗マウスＰＯＤＡｂで検出した。この時点で最適な抗体濃度は既知でなかったので、１：５０００希釈物（ＰＫＡＲＩＩａｌｐｈａ）と１：１００００希釈物（抗マウスＰＯＤ）を使用した。測定した化学発光強度は、タンパク質濃度に関してグラフに表して、タンパク質によるウェルの飽和が達成されたかどうか、またその達成時期について決定した（図８Ｂ）。
【０２４４】
ウェルにつきＲｌｌアルファ４５ngから、結合能力が飽和した。次に、ウェルにつき４０ng及び２５ngのＲｌｌアルファ量を使用した試験を行った。
【０２４５】
２．２．３化学発光強度は、各ウェルでＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ２００ngのとき最大に達する
２５ngまたは４０ngのＲｌｌアルファ４を、各回２列のＭＴＰウェルに結合させた。ブロッキング後、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ濃度を徐々に増大させた（ウェルにつき０〜２００ng）ブロッキング緩衝剤溶液をピペット操作してウェルに入れた。以下、該試験アレイを「結合シリーズ」と呼ぶ。結合タンパク質の検出は、Ａ１８デルタ３と抗ラビットＰＯＤ  Ａｂとを使用して行った（それぞれ１：５０００、１：１００００）。測定シグナル強度は、ウェルごとにＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの量に関してグラフで表した（図８Ｃ）。
【０２４６】
ウェルにつきＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ２００ngを超えると、結合曲線が飽和に近接することが分かった。測定値の初期評価から、以下の結論が導かれた。すなわち、ウェルにつきＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ値が８０ngのとき、最大飽和の半分が達成される。結合が最大飽和の半分に達すると、可能な限り最大の感度が得られる。したがって、ウェルにつきＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ濃度８０ngを使用して以下の実験を実施した。
【０２４７】
測定値に対する単一部位結合モデル（セクション１．１１を参照）の適合を含む更なる評価を図８Ｃに示した。結果として、最大飽和の半分を達成するには、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの値はより低い値５０〜６０ngであるということが分かった。
【０２４８】
ＲＩＩアルファ２５ngで被覆したウェルの発光強度とＲＩＩアルファ４０ngで被覆したウェルの発光強度との間には有意な差はみられなかったので、以下の試験はタンパク質をセーブするためにウェルにつきＲＩＩアルファ２５ngの方を使用して行った。
【０２４９】
タンパク質をセーブするために、更に調査を行って、ウェルにつきＲＩＩアルファの量１５ngがスクリーニングにおいて十分な量であるかを調べた（図９Ａ）。同様に、発光強度の低下は観察されなかったので、上記量のタンパク質にてスクリーニングを行うことは可能であった。
【０２５０】
２．２．４  Ａ１８デルタ３抗体は１：１０００に希釈
上記試験のように、ＲＩＩアルファ−ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ結合シリーズを調製してから、様々なＡ１８デルタ３Ａｂ希釈物を使用して検出した（図９Ｂ）。最初、抗ラビットＰＯＤ  Ａｂの希釈物は１：１００００で維持した。
【０２５１】
希釈率１：５０００において、結合曲線より、すべてのＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ−ＲＩＩアルファ合成物が検出されるわけではないことが示された。濃度を５倍増大させた際に、著しく強いシグナルが得られた。同時に、背景シグナル、すなわちＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ  ０ngにおける発光強度は低値のままであったので、高感度が得られた。
【０２５２】
２．２．５  二次抗体の妥当な希釈率は１：３０００
前章と同じ試験を行った。この試験では、Ａ１８デルタ３一次抗体の希釈率は１：１０００であった（図９Ｃ）。同様に、希釈率を１：１００００から１：３０００まで減少させると、抗ラビットＰＯＤ  Ａｂの場合において、シグナル強度と感度の増大が観察された。
【０２５３】
したがって、上記のとおり定めたＡ１８デルタ３Ａｂの希釈率１：１０００、抗ラビットＰＯＤ  Ａｂの希釈率１：３０００を使用して、以下の実験と物質スクリーニングとを行った。
【０２５４】
２．２．６  ＤＭＳＯによるＥＬＩＳＡの機能低下はなし
有機溶媒ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）の、タンパク質間結合またはその検出に及ぼす影響を調べる必要があった。その理由は、対照として用いた阻害性ペプチドＬ３１４ＥとＨｔ３１、ならびに物質ライブラリー自体がＤＭＳＯ中で溶解したからである。
【０２５５】
最初の実験において、二次Ａｂの様々な希釈物と、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの様々な濃度とを同時に使用して反応量全体（２０μl）に対する１％ＤＭＳＯの影響を同様に試験した（図１０Ａ）。ＤＭＳＯは結果に対してなんら実質的な影響を及ぼさないことがわかった。ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの様々な濃度と様々なＡｂ希釈物について先に得られた結果は確認された。
【０２５６】
別の実験においては、ＲＩＩアルファとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの一定量に、ＤＭＳＯ濃度を最大２．５％まで徐々に増大させて添加した（図１０Ｂ）、得られたシグナルは、ほんの若干減少した。スクリーニングについても、ＤＭＳＯの最大濃度は２．５％であった。
【０２５７】
対照実験において、ＭＴＰに結合したＲＩＩアルファを、ＰＫＡＲＩＩａｌｐｈａと抗マウスＰＯＤ  Ａｂを使用して検出した（図１０Ａ、最後から２番目の値）。
【０２５８】
別の対照（同じく図１０Ａの最後の値）において、ＲＩＩアルファをプレートに結合せず、残りの分析を周知のとおり実施した。驚くべきことに、この場合、高い化学発光強度が測定された。これによって、測定シグナルが結合ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８量を反映するかどうかが問題となった。これを調べるため、別の実験を行った（次のセクションを参照）。
【０２５９】
２．２．７  ＲＩＩアルファ結合ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの検出は特異的
シグナル特異性を制御するため、ウェルにつき２５ngのＲＩＩアルファを一列のＭＴＰに結合させ、一方２列目のＭＴＰにはＲＩＩアルファを結合させなかった。非特異的結合部位をブロッキングした後、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの濃度を徐々に増大させた溶液をピペット操作して上記両列に入れ、特異的に結合したタンパク質を、抗体によって検出した（図１０Ｃ）。
【０２６０】
ＲＩＩアルファを含む列におけるシグナルは増大して最終的に飽和に達し、一方ＲＩＩアルファを含まない列においては、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの非特異的結合による若干の増大しか観察されなかった。この結果から、検出は特異的であることを示された。したがって、図１０Ａにおける対照である最後の値には、ピペット操作等の誤差がおそらく含まれている。
【０２６１】
２．２．８  阻害性ペプチドは、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタのＲＩＩアルファへの結合を防ぐ
周知のとおり、ＡＫＡＰとＰＫＡのＲサブユニットとの間の結合は、ＡＫＡＰ由来ペプチドによって特異的かつ競合的に阻害することができる。したがって、該ペプチドを、ペプチドによってＲＩＩアルファとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとの間の相互作用を防ぐ目的で、対照反応において使用した。この場合においても、可能な限り感度が高い検出を行うため、確立されたアンカーペプチド阻害剤Ｈｔ３１とＡＫＡＰ１８−Ｌ３１４ＥとのＩＣ５０値をまず測定した。ＩＣ５０値は、考えられる最大のタンパク質間合成物のうちわずか５０％が形成される場合におけるペプチド濃度である。
【０２６２】
これらの値を測定するため、ＲＩＩアルファをウェルにつき２５ngにてＭＴＰに結合させ、各回でＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ８０ngを添加した。その後、ピペット操作によりペプチドを徐々に濃度を増加させながら添加した。
【０２６３】
Ｌ３１４Ｅペプチドは、結合に対してより強い阻害効果を及ぼす。したがって、２５nMのＩＣ５０値の濃度における対照反応においてＬ３１４Ｅペプチドを使用した（図１１）。ペプチド阻害は特異的であった。理由は、プロリン含有対照ペプチド１８ｄ−ＰＰ、Ｈｔ３１−Ｐは、まったく阻害効果を示さないか示してもごくわずかであるからである。
【０２６４】
２．２．９  タンパク質間結合に十分な培養時間は３０〜６０分
時間要素は、物質ライブラリースクリーニングの計画と実施において少なからぬ役割を果たす。したがって、複数の追加実験を行って、必要な培養時間に関する情報を得た。まず、適切な化学発光強度を得るために十分なタンパク質合成物を形成する時間を試験した。このため、再び結合シリーズをピペット操作して、ＭＴＰ洗浄により１５分後、３０分後、６０分後に、タンパク質間結合の形成を妨害した。その後、結合ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの量を、Ａｂを用いて検出した（図１２）。
【０２６５】
わずか３０〜６０分後に、強い化学発光シグナルが検出された。
【０２６６】
２．２．１０  阻害性ペプチドにより阻害を行うために十分な時間は３０〜６０分
更に、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタのＲＩＩアルファへの結合を、競合阻害作用を有するＬ３１４Ｅペプチドと１８ｄ−ＰＰ対照ペプチドとの存在下で調べた。濃度０．０１μMまたは１０μMのペプチドを反応バッチに１５分、３０分、または６０分間入れてから、結合ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの量を検出した（図１３Ａ）。この場合も、先に測定された場合のように培養時間３０〜６０分で十分であることが分かった。
【０２６７】
２．２．１１  最適な抗体培養時間は６０分または１５分
抗体の抗原への結合は、時間依存的に進行し、最初、特異性は、培養時間を増大させるにつれて増大した。特異性は、例えば、タンパク質分解によってやがて後の時点で減少する可能性がある。高感度測定に必要な培養時間を得るため、ＲＩＩアルファ−ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ合成物にＡ１８デルタ３抗体と抗ラビットＰＯＤ抗体とを添加した。結合反応は、洗浄により１５分後、３０分後、６０分後に妨害した。この場合、一次抗体と二次抗体に関するすべての可能性がある培養時間の組合せを考慮した（図１３Ｂ）。
【０２６８】
両抗体ともに、培養時間６０分で最大のシグナル強度が得られることが分かった。ただし、一次抗体結合の場合に６０分ならば、二次抗体の培養時間を減少させてもよいと考えられる。
【０２６９】
２．２．１２  化学発光は８分間で検出可能
ルミノールの酸化による化学発光は、時間依存性反応である。強度は、反応過程において基質が消費され、ペルオキシダーゼが変性されたので、数分後に低下した。
【０２７０】
ここで使用したLumiLight溶液等の市販の製品において、強度低下を減速させる助剤を添加した場合であっても深刻な問題を生じなかった。測定を実施すべき時間枠である、基質溶液を反応バッチに添加した後の時間窓は、いずれにしても調べた。このために、結合シリーズをピペット操作し（上記を参照）、化学発光の測定を、LumiLight溶液を添加してから２分後、４分後、８分後に繰り返し行った。
【０２７１】
測定は、LumiLight添加後８分以内に可能であり、このときシグナル強度が劇的に低下するおそれはなかった。測定作業全体は、上記時間窓内に容易に完了した。
【０２７２】
２．２．１３  タンパク質被覆ＭＴＰは長時間保管可能
スクリーニングを迅速に行うためには、複数のＭＴＰをＲＩＩアルファで被覆し、将来使用する場合に備えて保管することが妥当であった。保管の結果タンパク質が分解しないことを確認するため、ＲＩＩアルファを上記のように２列のＭＴＰに結合させ、非特異的結合部位をブロックした。その後、１つの列を１時間室温で保管し、もう一方の列を６６時間４℃で保管した後、ＥＬＩＳＡを実施した。結合ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの量を検出した（図１４）。
【０２７３】
保管時間は、調査した時間窓内において結果に認識可能な影響を及ぼさなかった。
【０２７４】
その後、定めた濃度と培養時間とを使用して、物質ライブラリーのスクリーニングを行った。
【０２７５】
２．３  ＲＩＩアルファＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの相互作用の低分子量阻害剤を見つけるための物質ライブラリーのスクリーニング
いったんセクション１．１２に記載のようにＭＴＰをピペット操作して測定すると、測定化学発光強度が十分高いかどうか確かめるために初期試験がなされた。十分高い場合、各ウェルの化学発光を、Microsoft Excelの表計算プログラムを使用して、対照と比較したＲＩＩアルファ−ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ結合量の百分率値に変換した。このために、８０ngのＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタを有する対照の測定値の平均値（ウェルＣ１、Ｄ１、Ｍ２４、Ｎ２４。表１．１と１．２を参照）を１００％とした。目視評価を容易にするため、続いて結果は、自動色指定によって色指定を受けた（Microsoft Visual Basicに記載のプログラムを使用）。このとき、１０％間隔で様々な色を使用した。一例を挙げると、表２．１は、ＭＴＰの生データ（ＲＬＵにおける化学発光）と、色指定を伴う結合百分率変換とを示す。スクリーニングの完全なデータは、付録で参照可能である。
【０２７６】
表２．１
上：スクリーニングで使用したＭＴＰの測定から得た生データ。ＲＬＵにおける化学発光の強度を示す。
下：生データを使用して、対照（ウェルＣ１、Ｄ１、Ｍ２４、Ｎ２４．プレート占有分については表２．１も参照）と比較した潜在的阻害剤の存在下におけるＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとＲＩＩアルファとの間の結合百分率を計算し、下記のカラーチャートに従って色指定した。
【表２．１】
2008540586.tif 000020
【０２７７】
いったん色指定されると、ＭＴＰのいくつかは、区別可能な特性を示した。例えばプレートの特定領域に、多くの阻害剤候補が存在した。対照値の調査で、カラム１とカラム２４における１００％値が大きく異なると示された場合（差異が２０％を超える場合）、対応するＭＴＰは、プレートの各半分について該半分に関する対照値にのみ基づいて、再評価した（例えば、カラム１〜１２の場合、カラム１の対照値）。それでもなおプレート上に目立つ領域が残った場合、プレート全体をもう一度ピペット操作し、測定し、評価した。これは、プレート４、６、７、１３、２１、３８、５０の場合に必要であった。
【０２７８】
いわゆる化合物ＩＤをライブラリーの各物質に割り当てることによって、コンピュータに基づくデータ評価に役立てた。スクリーニングの完了に続いて、すべての測定値を表中の対応する化合物ＩＤに割り当てた。結果は、表２．２に記載の物質の結合百分率値の増大に基づいて分類した。これの物質を使用することにより、ＲＩＩアルファとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとの間のタンパク質間結合は、対照値の２０％以下まで阻害することができた。
【０２７９】
表２．２：２００６４の物質を備えたライブラリーのスクリーニング。物質濃度２４４μMにおいて、ＲＩＩアルファとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとの間の結合を対照値と比べて２０％以下まで阻害した１９の候補物質を示した。「プレートＩＤ」は、ライブラリーＭＴＰの番号を示す。「位置ＩＤ」は、候補物質を含むウェルの位置である。
【表２．２】
2008540586.tif 000021
【０２８０】
表２．３：ピペット操作と検証測定値。希釈シリーズを各潜在的阻害剤（Ａ７−Ｈ１５、Ｉ１−Ｐ１０、記載の化合物ＩＤ）と、ペプチド（Ａ３−Ｈ６，Ｉ１１−Ｐ１２）用に作製し、阻害効果の濃度依存性を調べた。更に、阻害剤を有さない結合シリーズを作製した（Ａ１−Ｈ２、Ｉ１３−Ｐ１４）。更に、発光強度を表３．１に記載のとおり百分率値に変換し、色標識化した（表３．４を参照）。「化合物ＩＤ」は化合物のＩＤを示す。「Ｉ」は強度を示す。表中の意味は以下；
Ohne:なし  、Substanz/Comp.ID:物質／化合物ＩＤ、〔Substanz〕/μM：〔物質〕／μM、〔Lumineszenz〕/RLU：〔発光〕／ＲＬＵ
【表２．３Ａ】
2008540586.tif 000022
【表２．３Ｂ】
2008540586.tif 000023
【０２８１】
２．４潜在的阻害剤の検証
物質ライブラリーのスクリーニングで見つかった潜在的阻害剤を検証するため、これらの潜在的阻害剤をライブラリーＭＴＰから選択して、表２．３に示したピペット操作概要に従って、対照反応とともに希釈シリーズを確立した。希釈シリーズは、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ−ＲＩＩアルファ結合の特異的阻害作用が存在する場合にのみに期待される、見つかった潜在的阻害剤の濃度依存性を実証するためのものである。確認データを使用して、これらの化合物（表２．４）のＩＣ５０値をセクション１．１１に記載のとおり計算した（図１５）。これらの値は、いずれの物質濃度において、考えられる最大阻害作用の半分が達成されるかを示す。物質量は限定されているので、単一測定を行ったが、対照以外では、図１５には誤差表示はみられない。
【０２８２】
識別物質の識別と純度は、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）によって確認した。さらに調べるため、物質は、ChemDiv（San Diego, USA）を使用し高量にて再編した。
【０２８３】
表２．４：表２．３の結果から計算された阻害分子（Ａ７−Ｈ１５、Ｉ１−Ｐ１０）の存在下、またはペプチド（Ａ３−H6，Ｉ１１−Ｐ１２）の存在下、または阻害剤を有さない場合（Ａ１−Ｈ２、Ｉ１３−Ｐ１４における結合シリーズ）におけるＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとＲＩＩアルファとの結合百分率。色コードは、表２．１のものに対応している。表中、Ohne:なし  、Substanz/Comp.ID:物質／化合物ＩＤの意味である。
【表２．４】
2008540586.tif 000024
【０２８４】
表２．５：上記検証における、ＲＩＩアルファ−ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ結合の濃度依存性阻害作用を示した９つの物質の特性。「ＭＷ」は、単位g/molでの分子量を示す。「logP」は、分配係数を示す。「水素結合受容体」は、水素結合中の受容体として働き得る原子数を示す。「水素結合供与体」は、水素結合中の供与体として働き得る原子数を示す。表中の意味は以下。Compound  ID:化合物ＩＤ、Internal  no.:内部番号、ID  No.:ＩＤ番号、ChemDiv  order  no.:ChemDiv社製造番号、Structure:構造、Empirical  formula:実験式、Plate  ID:プレートＩＤ、Pos  ID:位置ＩＤ、Barcode:バーコード、H  acceptor:水素結合受容体、H  doner:水素結合供与体
【表２．５Ａ】
2008540586.tif 000025
【表２．５Ｂ】
2008540586.tif 000026
【０２８５】
３．考察
タンパク質キナーゼＡアンカータンパク質（ＡＫＡＰ）は、ｃＡＭＰ依存シグナル経路において重要な役割を果たす。これらは、組織特異的に発現される。様々なＡＫＡＰタンパク質は、タンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）を、様々な細胞内コンパートメント上でアンカリングする。同時に、これらは、更なるシグナル経路の重要な成分のための足場タンパク質となり得る。
【０２８６】
とりわけ、低分子量の薬らしい物質のライブラリーをスクリーニングするためのＥＬＩＳＡを展開した。この方法を使用して、ＡＫＡＰ１８デルタ−ＲＩＩアルファ結合のｎ濃度依存的な有効な阻害剤が見つかった。
【０２８７】
ＰＫＡアンカリングの特異的阻害により、低分子量物質の特性と相まって、該物質は、新しい活性物質の潜在的標的としてＡＫＡＰタンパク質の検証において使用されるのみならず、その開発のためのリード構造でもある。
【０２８８】
３．１  ＲＩＩアルファ−ＡＫＡＰ１８デルタ結合の阻害剤は、薬理学的に興味深い特性を有する
活性物質に関する１つの重要な必要事項は、生体膜を通過可能なことである。細胞内における能力、ならびに事実上生物内と細胞培養モデル内との両方における能力は、該生体膜通過可能性に大きく依存する。膜透過性の前提条件は、物質の親油性である。一方、膜移動の推進力は、膜の一つの側における可能な限り高い濃度である。これは、親油性に反比例する水媒体における良好な可溶性によってのみ達成可能である。
【０２８９】
膜透過性を予測するための複数のモデルの１つは、１−オクタノール−水混合物における物質の分布である。分配係数Ｐは、この分布から以下のように計算することができる。
Ｐ＝［物質］１−ｏｃｔａｎｏｌ／［物質］ｗａｔｅｒ
【０２９０】
挙げているのは、通常、この値の対数：ｌｏｇＰである。表２．５に、有効な阻害剤のｌｏｇＰが示されている。値が１より大きいと、ほとんどの物質は有機相において堆積する。値が１より小さいと、ほとんどの物質は水相において堆積する。発見された物質は、１より大きいｌｏｇＰ値を有するので、それらすべてについて良好な膜透過性が期待される。
【０２９１】
有機分子の膜透過性に悪影響を及ぼす１つの要因は、水素結合を形成する能力である。この種の非共有結合により、分子を取り巻く水和物の膜ができるので、膜通過前にエネルギーを導入して、その膜を除去しなければならない。
【０２９２】
ただし、疎水性相互作用を別とすれば、水素結合は、最も重要な力を有する。この力によって、活性物質の標的構造への非共有結合、すなわちこの場合においては活性物質のＰＫＡのＲＩＩアルファサブユニットへのまたはＡＫＡＰ１８デルタへの非共有結合が生じる。
【０２９３】
水素結合を形成する能力を評価する１つの方法は、水素結合供与体と水素結合受容体とを単純に計数する方法である。水素結合供与体と水素結合受容体との数は、表２．５に記載されている。
【０２９４】
水素結合を形成する能力を評価する別の方法は、コンピュータに基づくモデルの確立である。したがって、例えば、特に結合全体における水素結合の寄与は、分子力学を考慮して結合パートナーの可能性のある移動方向を計算することによってＨＩＶ−１プロテアーゼ阻害剤について測定した。次に、自由エネルギー量を分析して、タンパク質−阻害剤合成物の結合を促進する力に関する情報を得た。
【０２９５】
細胞内の小分子の有用性に及ぼす別の特性は、その大きさである。分子の大きさは、その分子量によって近似可能である。胆汁による物質の吸収と排出との両方が分子量に依存することが分かった。低分子量の場合、胆汁による物質の吸収が増大しその排出が減少する。物質ライブラリーに含まれるすべての物質の１つの本質的な特性は、平均２５０mg/molといった比較的低分子量である点である（表２．５を参照）。
【０２９６】
上記方法のいずれによっても、単独では信頼可能な予測を立てることはできない。特に、水素結合の可能性は、親油性との関係で認識しなければならない。したがって、Lipinskiらは、いわゆるRule of Fiveを確立した。このルールは、物質のいずれの特性が低膜透過性を引き起こすかを以下の通り定義している。
・水素結合供与体数が５個を超える（ＯＨ基とＮＨ基との合計）
・水素結合受容体数が１０個を超える（Ｎ原子とＯ原子との合計）
・分子量が約５００g/mol
・分配係数ｌｏｇＰ＞５
【０２９７】
スクリーニングにより決定した活性物質は、上記のすべての条件に一致する（表２．５）。すなわち、これらは膜透過性を有する。
【０２９８】
いずれにせよ、新しい活性物質と発見したその構造の方法的改良に対して、有効性を向上させるため、可能ならこれらの値を低下させることが目的の１つでなければならない。本発明の好ましい構造は、該低下させられた値を有する。
【０２９９】
３．２  阻害剤を使用する分野は、その特異性によって決定される
スクリーニング後に検証を行い（表２．４、図２．１１、２．１２）、特定の阻害剤が、濃度依存的に、ＲＩＩアルファＰＫＡサブユニットとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとの結合を阻害することが分かった。
【０３００】
すべての識別された物質は、疎水芳香環システムを有するので、ＲＩＩサブユニットにより形成された疎水ポケットにおける結合が可能である。
一方、水素結合によるＡＫＡＰのＲＩＩ結合領域への直接結合も考えられる。
【０３０１】
選択物質は、ＡＫＡＰ１８デルタに特異的に結合するので、このシグナル経路の区画の懸濁結果をインビボで調べることもできる（下記を参照）。他の物質は他のＡＫＡＰタンパク質に特異的に結合するので、これらの物質を使用して他のシグナル経路を調べることができる。
【０３０２】
有利な物質は、特異的にＡＫＡＰ１８タンパク質、すなわちスプライシング変異体であるアルファ、ベータ、ガンマ、デルタのいずれかに結合する。したがって、これらについてはＲＩＩサブユニットとの相互作用が排除される。理由は、すべてのイソ型は、同じＲＩＩ結合領域を有するからである（図１５）。
【０３０３】
ただし、物質の１つがＲＩＩサブユニットに結合した場合、ＡＫＡＰタンパク質とＲＩＩサブユニットとの相互作用を一般に阻害することが可能なツールが適用される。
【０３０４】
結合部位は、コンピュータに基づくモデルの確立を使用して明らかにされ得る。ここで、発見された物質の構造は、可能性のある相互作用領域に関するＲＩＩアルファまたはＡＫＡＰ−ＲＩＩ結合領域の構造を用いて調べることができる。
【産業上の利用可能性】
【０３０５】
３．３  新しい活性物質のリード構造を示すＡＫＡＰ−ＰＫＡ阻害剤
ＲＩＩアルファＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ結合の阻害剤は、利点を有する新しい医薬品群として開発されている。
【０３０６】
新しい医薬品としてＰＫＡ−ＡＫＡＰ１８デルタ結合（ただし他のＡＫＡＰ分子にも結合）の阻害剤を使用する１つの方法は、ＡＱＰ２が腎集合管細胞の頂端膜へＡＶＰ誘導転座されること（ＡＱＰ２シャトル）に、ＰＫＡ−ＡＫＡＰ１８デルタを関与させることに基づく。
【０３０７】
このプロセスにおいて、ＡＫＡＰ１８デルタはＰＫＡをＡＱＰ２含有小胞上にアンカリングするので、ＡＶＰ刺激の後、触媒サブユニットは、特異的に水路タンパク質をリン酸化することができる。この結果、頂端プラズマ細胞膜を有する小胞への輸送とその融合が生じる。このようにして、膜の透水性は増大する。
【０３０８】
ラットモデルで実証されているように、発熱、肝硬変、高血圧等の特定の疾病において水滞留が発生し得る。特に妊娠期においては浮腫を生じる可能性がある。
【０３０９】
今日まで、水滞留は、いわゆる利尿薬で治療されていた。利尿薬は、一次尿から集合管上皮細胞に戻すようにイオンを通常輸送するＮａ＋イオン／Ｋ＋イオン／Ｃａ２＋イオン輸送体を阻害することによって腎臓経由で水分排出の増加を間接的に引き起こすものである。結果として、集合管におけるオスモル濃度は増大し、集合管上皮細胞の頂端細胞膜において構成的に存在するＡＱＰ２分子による浸透作用が生じる。水滞留以外に、利尿剤は、心不全や筋緊張亢進等においても使用される。ただし、電解質が大量に失われるために、望ましくない薬物効果（ＵＡＷ）が発生し得る。
【０３１０】
電解質損失により引き起こされたＵＡＷの医薬品欠損を埋めるものは、水利尿薬である。これらは、水排出を増大させるので、従来の利尿剤にかわる潜在的医薬品である。今日まで、バソプレッシン受容体拮抗薬が、水利尿効果を有すると知られている唯一の医薬品である。
【０３１１】
ＡＫＡＰ１８デルタのＡＱＰ２転座への関与の点から見て、ＲＩＩアルファ−ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ結合の阻害剤を更に開発して新規の水利尿薬を作ることが可能である。ＡＫＡＰ１８デルタ−ＰＫＡ結合の特異的阻害によって、ＰＫＡをＡＱＰ２ベアリング小胞から分離すること（セクション１．７）によって、ＡＶＰ媒介シグナルカスケードが妨害されるので、ＡＶＰ刺激にもかかわらず、膜におけるＡＱＰ２分子の結合が阻害される。このようにして、水の再吸収が増大不能になり、より多くの水が尿を介して排出される。この作用形態は、利尿剤の作用形態（上記）とは異なり、集合管上皮細胞へと戻るようイオンが輸送されることを妨げることはない。したがって、該特性を有する活性物質は、水利尿薬となり得る。この水利尿薬により、利尿を特異的に推進することが可能となり得る。
【０３１２】
医薬品開発の必須条件は、阻害分子を最適化することである。阻害分子は、低濃度で有効なので、水利尿薬として期待される効果を調べるために動物モデルにおいて同様に使用することができる。例えば、もしラットが、最適化抑制剤の投与時により多くの水を排出した場合、ＡＫＡＰタンパク質は、医薬品の潜在的標的として検証されたということになる。
【０３１３】
ＡＫＡＰ１８デルタは、腎臓にのみ発現するのではなく、その他の組織にも発現する。発現レベルは、他のＡＫＡＰタンパク質も重要な役割を担う心臓において特に高い。
【０３１４】
心筋細胞の細胞培養モデルにおいて実証されるように、ＡＫＡＰ媒介ＰＫＡアンカリングは、Ｌ−タイプＣａ２＋チャンネル（ＣａＶ１．２チャンネル）を介したＣａ２＋電流のβアドレナリン制御の必須条件である。
【０３１５】
ＡＫＡＰ１８アルファ（＝ＡＫＡＰ１５）は、ロイシンジッパーモチーフを介して、Ｃａ２＋チャンネルの孔形成アルファ１サブユニットのＣターミナスに結合する。βアドレナリン受容体／ｃＡＭＰシグナル経路の活性化に続いて、ＡＫＡＰタンパク質に結合したＰＫＡは触媒サブユニットを放出する。次に該触媒サブユニットは、チャンネルのアルファ１サブユニットにおけるセリン残基をリン酸化可能である。結果として、チャンネルの開特性が増大し、Ｃａ２＋インフラックスが増大した。これは、陽性変力・陽性変時作用を備えている。
【０３１６】
同じ研究により以下のことが実証された。すなわち、アンカーペプチド阻害剤Ｈｔ３１を使用すると、βアドレナリン受容体によって活性化されたＣａＶ１．２チャンネル活性のＰＫＡ依存性増大が一時停止される。本発明による低分子量阻害剤は、心筋細胞におけるβブロッカーと同じ効果を示す。
【０３１７】
βブロッカーは、各標的細胞のβアドレナリン受容体における神経伝達物質アドレナリン、ノルアドレナリンの活性を競合的に阻害する医薬品である。これらは、組織特異的に発現するベータ１受容体、ベータ２受容体、ベータ３受容体に分けられる。ノルアドレナリンは、ベータ１受容体に対してより大きく影響を及ぼし、ベータ２受容体に対してより少ない影響を及ぼす。心筋細胞に発現するのは圧倒的にベータ１受容体であって、この他ベータ１選択性（心選択性）βブロッカーと非選択性βブロッカーとがある。βブロッカーは、心臓に対して陰性変力作用と陰性変時作用とを有する。これによって、心筋の酸素需要量が減少するので、βブロッカーは冠状動脈性心臓病の治療に使用される。
【０３１８】
更に、βブロッカーは未知のメカニズムを介して血管筋に弛緩効果を及ぼす。したがって、βブロッカーは高血圧症の治療に使用される。
【０３１９】
ＲＩＩサブユニットに結合するＡＫＡＰの阻害剤は、βブロッカーの代替薬となり得る。ＡＫＡＰ１８アルファ依存シグナル経路を特異的にブロックすることによって、これらの阻害剤は、βブロッカーよりもさらに特異的効果を有する可能性がある。これは、後者が受容体下流のすべてのシグナル経路をブロックするからである。更に、ＡＫＡＰ１８阻害剤は、例えばぜんそく等の場合のようにβブロッカーが禁忌である場合に使用可能である。
【０３２０】
ただし、新しい活性物質は、骨格筋においてＵＡＷを引き起こす可能性がある。これは、ＬタイプＣａ２+チャンネルとＡＫＡＰ１８アルファもそこに発現するからである。
【０３２１】
心筋細胞以外に、ＣａＶ１．２チャンネルとＡＫＡＰ１８アルファとは、脳のニューロンの樹枝状結晶と細胞体とにも生じる。したがって、ＡＫＡＰ１８アルファは、ＣａＶ１．２チャンネルの調節にも関係する可能性がある。これは、阻害分子の別の使用分野となり得る可能性を示している。
【０３２２】
３．４  当該物質は、ＰＫＡアンカリングをブロックする新しいツール
今日まで、ＡＫＡＰタンパク質とＰＫＡのＲＩＩサブユニットとの間におけるタンパク質間相互作用は、セクション１．８に記載のとおりペプチド（Ｈｔ３1、ＡＫＡＰＩＳ）を使用して阻害されていた。しかし、ＡＫＡＰ−ＲＩＩ合成物の特異的阻害は、この方法では不可能である。理由は、ペプチドはＨｔ３１のＲＩＩ結合領域に対応する、あるいは様々なＡＫＡＰタンパク質から計算されたコンセンサス結合部位を起点として発生しているからである。したがって、システム内にみられるすべての調節サブユニットをブロックすることが研究されている。
【０３２３】
ＡＫＡＰタンパク質のＲＩＩ結合領域のすべては非常に似通っている。したがって、小分子によって、特定のＡＫＡＰ−ＰＫＡ合成物の特異的阻害が可能かどうかという点が問題である。一方、ＲＩＩ結合領域の若干の差異がある場合でも、物質を最適化した後、ＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用の特異的阻害が可能であると思われる（下記を参照）。
【０３２４】
該ペプチドの別の欠点は、膜浸透性の欠如である。例えば細胞培養モデルにおける膜透過性を要する実験において、ペプチドはアシル化しなければならなかった。
【０３２５】
この不利な点は、本明細書に記載の低分子量阻害剤によって克服できる。本発明による物質の化学的・物理的特性によって、動物モデルにおける場合と同様に細胞培養における直接使用も可能となる。したがって、ＡＫＡＰタンパク質の機能のインビボでの調査が初めて可能となった。
【０３２６】
更に、出発物質を識別した後、小有機分子の事実上無限の構造的多様性を使用して、タンパク質表面へのより強い結合、安定性の増大、非特異的副作用の減少、インビボでの有用性の増大といった目的において最適化することができる。
【０３２７】
好ましいＲＩＩアルファ−ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ相互作用の低分子量阻害剤は、その特性、その作用形態、その特異性に関する情報を提供する追加の実験が可能である。
【０３２８】
まずまず、該物質は、確立されたＥＬＩＳＡを使用して変性等、タンパク質に及ぼす非特異的効果について調べることができる。そのために、ＲＩＩアルファまたはＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタをＭＴＰに結合させ、物質の濃度を徐々に増大させながら添加することができる。続いて、ＰＫＡＲＩＩａｌｐｈａ抗体またはＡ１８デルタ３抗体を使用して、タンパク質を検出することができる。
【０３２９】
また、ＥＬＩＳＡは、ＲＩＩアルファをＭＴＰに結合させ、濃度を徐々に増大させた阻害剤の存在下で様々な組み換えＡＫＡＰタンパク質を添加することによって、低分子量阻害剤の特異性を最初に調べる上で使用することができる。すべてのＡＫＡＰ−ＲＩＩアルファ相互作用の阻害は、阻害剤がＲＩＩアルファに結合していることを示す。複数のＡＫＡＰの間における阻害レベルの差異は、阻害剤がＡＫＡＰタンパク質の若干異なるＲＩＩ結合領域に結合していることを示す。
【０３３０】
上記の調査とは別に、既知の試薬と方法とを用いて直ちに実施できる３つの追加実験について述べる必要がある。これら実験により、特に細胞が生物の一部である場合に、確認物質のいずれが、特に細胞に有効であるか、およびそれゆえ最適化できるかについても情報が与えられうる。
【０３３１】
最初に、ＡＱＰ２転座を促すため、ラットの腎臓の内部髄質由来の集合管細胞（ＩＭＣＤ細胞）にＡＶＰで物質の存在下と非存在下の両条件下で刺激を与えた。その後、免疫蛍光染色を実施することができる。これにおいて、培養後、細胞は固定され透過性になる。蛍光染料に結合した抗体を使用して、次にＡＱＰ２の細胞間局在を蛍光顕微鏡で決定することができる。このようにして、ＡＱＰ２のおそらくＡＫＡＰ１８デルタに依存する転座に及ぼす物質の影響を調べることができる。
【０３３２】
２つ目の実験は、パッチクランプ法を使用して初代培養済みの新生児ラット由来の初代培養心筋細胞において、ＬタイプＣａ２+チャンネルを通るＣａ２+電流を測定する実験である。このために、単一細胞の膜部分を緩衝剤充填ガラス毛管で固定し、膜全体に定電圧を印加する。電流パルスは、固定膜領域に位置する電圧依存ＬタイプＣａ２+チャンネルを通るＣａ２+電流の測定可能な増大をトリガ可能である。
【０３３３】
細胞を非特異的βアドレナリン受容体アゴニストイソプロテレノールで刺激した後、Ｃａ２+チャンネル電流が増大すると予測される。理由は、受容体の活性は、セクション３．３に記載のＡＫＡＰ１８アルファ依存シグナルカスケードをトリガするからである。結果として、ＬタイプＣａ２+チャンネルはリン酸化されるので、その開確率は増大する。該測定は、物質の存在下と非存在下の両方において実施可能であるので、シグナル経路に及ぼす効果は、測定された電流によって間接的に定量化することができる。
【０３３４】
最後に、３つ目の実験において上記の心筋細胞を使用することができる。この実験において、細胞はイソプロテレノールと上記物質とを用いて前培養する。その後、膜透過性蛍光Ｃａ２+指標を細胞に添加する。これにより、細胞内におけるＣａ２+分布が可視化され、レーザー走査型顕微鏡（ＬＳＭ）を使用してＣａ２+濃度の変化が時間分解的でも分析可能となる。物質の存在下において、物質がＡＫＡＰ−ＰＫＡ相互作用に阻害効果を有するとき、すなわち結果としてＣａ２+チャンネルのリン酸化に阻害効果を有するとき、Ｃａ２+濃度の変化はより少ないと思われる。
【０３３５】
これらの実験から、ＰＫＡとの相互作用に関するＡＫＡＰ１８デルタの特異的阻害または非特異的阻害が、細胞培養モデルにおける物質においても可能であることがわかった場合、濃度依存性有効性を向上させる目的で最適化を行うことができる。
【０３３６】
最適化の第一段階は、コンピュータに基づくモデルの確立である。これによって、分子のどの官能基がタンパク質のどのアミノ酸と相互作用するかについての概念が得られる。
【０３３７】
これに基づき、分子の官能基は、Lipinski's Rule（セクション３．１を参照）に従いながら、結合パートナーとの親和性を高めるために秩序だった方法で置換することができる。
【０３３８】
更に、阻害剤を組み合わせて使用することによって、追加効果またはシナジー効果が得られるかどうか確かめるために、試験を行うことができる。このようにして向上が達成され得るなら、最も効果的な相互作用を有する官能基を組み合わせた分子の標的合成を試みることができる。
【０３３９】
このようにして得た物質は、同じ効果を達成するより低い濃度であることを要する。これによって、より有利にインビボでの使用が可能となり、非特異的効果または毒性効果がより生じにくくなる。
【図面の簡単な説明】
【０３４０】
図面は以下の内容を示している。
【図１】ＧＳＴ融合タンパク質の発現に使用されるｐＧＥＸ−４Ｔ３ベクターの概略図である。図中の英語は、Thrombin:トロンビンglutationS-transferase:グルタチオンＳ−トランスフェラーゼStop  codons:終止コドン
【図２】HyperLadder IのＤＮＡマーカー分子量標準である。図中の英語は、SIZE：大きさ。
【図３】ＳＤＳ  ＰＡＧＥ用のInvitrogen BenchMark protein ladder分子量標準である。図中の英語は、Highlight:ハイライト
【図４】ＰＫＡ−ＲＩＩアルファとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとの間のタンパク質間結合の定量的検出を行うためのＥＬＩＳＡの概略図である。３８４ウェルＭＴＰ（図左）の各ウェルにおいて、以下の反応のいずれかが起きる。図４Ａ：阻害剤が存在しない場合、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタはプレート結合ＲＩＩアルファに結合するので、化学発光を介して抗体により検出することができる。図４Ｂ：２つの結合パートナーのうちの１つに結合する小分子を添加すると（ここではＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ）、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタと抗体との両方が次の洗浄工程中に除去されるので、化学発光が起きない。図４Ｃ：阻害性ペプチドによる結合の阻害についても上記と同様であるが、ただしこの場合は必ずＲＩＩアルファに結合する。図中符号の意味は以下。１：読取り装置における強度の検出（ＲＬＵによる）２：３８４ウェルＭＴＰ３：阻害剤なし４：ルミノール（「LumiLight」）５：発光６：二次Ａｂ：抗ラビットＰＯＤ７：一次８：阻害小分子９：「陽性対照」：阻害性ペプチドＡＫＡＰ１８−Ｌ３１４Ｅ
【図５】競合大腸菌細胞をｐＧＥＸ−ＡＫＡＰ１８デルタで形質転換し、４つのクローン由来のプラスミドＤＮＡを調製し、制限酵素での消化を行い、アガロースゲル電気泳動を使用して分析した。「クローン１non」は、クローン１由来の未処理プラスミドである。「クローン１〜４」は、クローン１〜４のＥｃｏＲＩ処理プラスミド及びＸｈｏｌ処理プラスミドである。消化プラスミドは、４．９kbと１kbの予測断片を示す。図中の語句の意味は以下。Marker:マーカーKlone  1  non:クローン１ nonKlone  1:クローン１Klone  2:クローン２Klone  3:クローン３Klone  4:クローン４
【図６】溶菌と結合の様々な条件下で精製した後で、組み換えＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ（７５kDa）またはＧＳＴ（２５ｋＤａ）が結合しているグルタチオンセファロースビーズ由来のＳＤＳ  ＰＡＧＥサンプル緩衝剤溶出液の分析である。クマシー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥを使用した。５μlのサンプル緩衝剤溶出液を各回適用した。図６Ａ：溶菌の条件を変化させた。「ＧＳＴ」は、空ｐＧＥＸベクターの生成物である。「ＧＳＴ−１８デルタ」は、ｐＧＥＸ−ＡＫＡＰ１８デルタの生成物である。「ＦＰ」は、フレンチプレスである。「ＤＴＴ」は、単一フレンチプレス溶菌前にＤＴＴを添加した場合である。「Ｌｙｓｏ」は、リゾチームを使用した溶菌である。「ＲＴ」は、室温である。「ＭＷ標準」は、分子量標準である。図６Ｂ：結合の条件を変化させた。各細菌の懸濁液は、フレンチプレスを使って３回溶解させた。図中の語句の意味は以下。MW  standard:ＭＷ標準30  min.:３０分60  min.:６０分
【図７】段階的に溶出緩衝剤の組成を変化させることによって、グルタチオン（ＧＳＨ）セファロースビーズ由来のＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの溶出を最適化することができた。表の最初と最後の欄には、クマシー染色したＳＤＳ  ＰＡＧＥ（Ａ〜Ｉ）とウエスタンブロッティング（Ｊ）によるセクションがそれぞれ示されている。最後の欄における矢印は、分析前のビーズで使用された種類の溶出条件を示す。各回、７０〜８０kDaのセクションが示されている。２番目と３番目の欄は、適用されたサンプル量を示す。最後から２番目の欄は、溶出分を示し、その他の欄は、溶出緩衝剤の組成を示す。「Ｖ」は量を示し、「Ｔ−Ｘ」はTriton X-100を示し、「Ｔ−２０」はTween 20を示し、「Ｅ」は溶出番号を示す。図中の語句の意味は以下。SDS-PAGE(A-I  Coomassie,  J  Western  Blot):ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（Ａ〜Ｉはクマシー染色、Ｊはウエスタンブロッティング）Sample:サンプルBeads  after  solution:溶出後のビーズ
【図８】図８Ａ：ＢＳＡ、ＢＳＡ−ＥＬＩＳＡ、及び脱脂粉乳を結合緩衝剤に入れた。化学発光基質を添加した後、非特異的シグナルの強度を測定した（単一測定）。図８Ｂ：ＲＩＩアルファ濃度を徐々に増大させた結合緩衝剤（全質量ｍ（ＲＩＩアルファ）として表示）をピペット操作してＭＴＰに入れた。非特異的結合部位をブロッキング緩衝剤でブロッキングし、結合タンパク質量をＰＫＡＲＩＩａｌｐｈａと抗マウスＰＯＤＡｂで検出した。図８Ｃ：ＲＩＩアルファ量を一定にした（ウェルにつきそれぞれ２５ngと４０ng）結合緩衝剤をピペット操作してＭＴＰに入れた。非特異的結合部位をブロッキング緩衝剤でブロッキングし、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ量を徐々に増大させたブロッキング緩衝剤を添加して、結合ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタをＡ１８デルタ３と抗ラビットＰＯＤ  Ａｂで検出した。「Ｉ」は強度を示し、「ＲＬＵ」は相対照度を示し、「ｍ」は質量を示す。図中の語句の意味は以下。I(chemiluminescence)  in  RLU：ＲＬＵにおけるｌ（化学発光）Skin  milk：脱脂粉乳m(RIIα)in  ng：m（ＲＩＩα）（単位：ng）m(GST-AKAP18δ)in  ng：m（ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８δ）（単位：ng）
【図９】図９Ａ〜図９Ｃ：結合シリーズを調製した（図８Ｃのとおり）。図９Ａ：それぞれ１５ng、２５ngの一定量のＲＩＩアルファを含む結合シリーズについて、化学発光強度を測定した。図９Ｂ：Ａ１８デルタ３の希釈率を変化させ、抗ラビットＰＯＤ  Ａｂの希釈率は一定にして結合シリーズを検出した。図９Ｃ：Ａ１８デルタ３の希釈率を一定にし抗ラビットＰＯＤ  Ａｂの希釈率を変化させて結合シリーズを検出した。図中の語句の意味は以下。I(chemiluminescence)  in  RLU：ＲＬＵにおけるｌ（化学発光）anti-rabbit  POD：抗ラビットＰＯＤm(GST-AKAP18δ)in  ng：m（ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８δ）（単位：ng）
【図１０】図１０Ａ：一定量のＲＩＩアルファに、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ０．８０ngと１６０ngとを添加した。一定の希釈率のＡ１８デルタ３と、希釈率１：３０００（３k）と１：１００００（１０k）である二次抗ラビットＰＯＤ  Ａｂを使用して検出を行った。各実験は、１％ＤＭＳＯの存在下（＋）または非存在下（−）において実施した。図１０Ｂ：一定量のＲＩＩアルファに対する一定量のＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの結合を、ＤＭＳＯ濃度を徐々に増大させて（０〜２．５％）検出した。図１０Ｃ：０ngと２５ngのＲＩＩアルファをそれぞれ含む結合シリーズを作製して検出し、シグナル特異性を識別した。図中の語句の意味は以下。I(chemiluminescence)  in  RLU：ＲＬＵにおけるｌ（化学発光）Dilution：希釈率（二次Ａｂ）m(GST-18δ)in  ng：m（ＧＳＴ−１８δ）（単位：ng）no  RIIα：（ＲＩＩアルファなし）c(DMSO)in  %：ｃ（ＤＭＳＯ）（単位：％）m(GST-AKAP18δ)in  ng：m（ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８δ）（単位：ng）25ng  of  RIIα  bound  to  MTP：ＲＩＩα２５ngをＭＴＰに結合no  RIIα  bound  to  MTP:ＭＴＰへのＲＩＩα結合なし
【図１１】ＩＣ５０値を計算するため、一定量のＲＩＩアルファとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとの間の結合を、ペプチド量を徐々に増大させて検出した。一部位結合モデルを測定値に適合させた（セクション１．１１を参照）。Ｌ３１４ＥとＨｔ３１は競合的な結合阻害性を示したが、１８ｄ−ＰＰとＨｔ３１−Ｐは、陰性対照として使用した。図中の語句の意味は以下。Binding  GST-AKAP18δ-RIIα  in  %：ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８δ−ＲＩＩαの結合率（単位：％）log(c(peptide)in  μM：ｌｏｇ（ｃ（ペプチド）（単位：μM））
【図１２】結合シリーズを作製した。ここで、洗浄によって、ＲＩＩアルファ−ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ相互作用の進行を１５分後、３０分後、６０分後に中断した。その後、結合ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの量を検出した。図中の語句の意味は以下。I(chemiluminescence)  in  RLU：ＲＬＵにおけるｌ（化学発光）m(GST-AKAP18δ)in  ng：m（ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８δ）（単位：ng）
【図１３】図１３Ａ：一定量のＲＩＩアルファとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとを、１５分、３０分、または６０分間、濃度０．０１μMまたは１０μMで、ペプチドＬ３１４Ｅと１８ｄ−ＰＰに接触させた。その後、結合ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの量を検出した。図１３Ｂ：一定濃度のＲＩＩアルファ−ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ合成物を、培養時間１５分、３０分、６０分の考えられるすべての組み合わせを用いてＡ１８デルタ３と抗ラビットＰＯＤ  Ａｂで検出した。本図において、誤差表示は不可能であった。図１３Ｃ：同じＲＩＩアルファ−ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ結合シリーズに、Ａｂと化学発光基質を添加した。化学発光強度は、２分後、４分後、８分後に測定した。図中の語句の意味は以下。I(chemilumineszenz)  in  RLU：ＲＬＵにおけるｌ（化学発光）Incubation  time  in  min.：培養時間（単位：分）c(peptides)in  μM：（ｃ（ペプチド）（単位：μM））peptide：ペプチドIncubation  time  1st  Ab  in  min.：一次Ａｂの培養時間（単位：分）Incubation  time  2nd  Ab  in  min.：二次Ａｂの培養時間（単位：分）m(GST-AKAP18δ)in  ng：m（ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８δ）（単位：ng）
【図１４】ＭＴＰを等量のＲＩＩアルファで１時間被覆した。次にブロッキング緩衝剤を添加し、ＭＴＰを１時間室温で、または６６時間４℃で培養した。次に、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタを徐々に濃度を増大させながら添加した。結合ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタの量をＡ１８デルタ３と抗ラビットＰＯＤ  Ａｂを使用して検出した。図中の語句の意味は以下。I(chemilumineszenz)  in  RLU：ＲＬＵにおけるｌ（化学発光）m(GST-AKAP18δ)in  ng：m（ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８δ）（単位：ng）
【図１５】図１５Ａ：ＲＩＩアルファ−ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタ結合曲線は、他の実験を示す。５０nMのＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタを使用して実施した各実験は、高感度な測定範囲内にあった。図１５Ｂ：阻害性ペプチドＬ３１４Ｅを使用した場合も、濃度依存的に結合が阻害された。図１５Ｃ：阻害剤の濃度を徐々に増大させた検証実験の概要。９つの対象データと比較用の非活性化合物２３４８を示す。図１５Ｄ〜図１６Ｌ：一部位結合モデルの（セクション１．１１を参照）測定値（単一測定なので誤差表示はなし）への適合に基づいて計算した、各単独の阻害剤、構造式、及びＩＣ５０値の濃度依存性効果（図１５Ｄ〜図１６Ｌ：単一測定）。図中の語句の意味は以下。Binding  in  %：結合率（単位：％）c(GST-AKAP18δ)in  nM：ｃ（ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８δ）（単位：nM）log(c(substance)in  μM：ｌｏｇ（ｃ（物質）（単位：μM））log(c(peptide)in  μM：ｌｏｇ（ｃ（ペプチド）（単位：μM））
【図１６】次ページに続く（図１６Ｈ〜図１６Ｌ）。図１６Ｈ〜図１６Ｌは、図１５からの続きとしての第２部。第１部と判例については図１５Ａ〜１５Ｇを参照。図中の語句の意味は以下。Binding  in  %：結合率（単位：％）log(c(substance)in  μM：ｌｏｇ（ｃ（物質）（単位：μM））log(c(peptide)in  μM：ｌｏｇ（ｃ（ペプチド）（単位：μM））
【図１７】ＰＫＡ−ＲＩＩアルファまたはＰＫＡ−ＲＩＩベータとＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとの間のタンパク質間結合の定量的検出を行うために使用したＥＬＩＳＡの概略図である（グルタチオンＳトランスフェラーゼのＡＫＡＰ１８デルタとの融合）。３８４ウェルＥＬＩＳＡプレートにおける低分子量物質の存在下または非存在下における相互作用である。一次抗ＡＫＡＰ１８デルタと二次ぺルオキシダーゼ結合抗体と化学発光とを使用して、タンパク質相互作用を検出した。図中の語句の意味は以下。Inhibitor：阻害剤Antibody：抗体RIIα  or  RIIβ：ＲＩＩαまたはＲＩＩβ
【図１８】特定の物質による腎臓主細胞におけるアクアポーリン−２（ＡＱＰ２）水路のバソプレッシン（ＡＶＰ）依存性再分布の阻害（表Ｂ、阻害剤濃度（単位：μM）を参照）。ラットの腎臓の内部髄質由来の一時培養主細胞（ＩＭＣD細胞）は、ＡＱＰ２のＡＶＰ誘発転座のモデルを示す。該再分布は、腎臓におけるＡＶＰ誘導水再吸収の分子基盤である。ＡＱＰ２は、レーザー走査型顕微鏡を使用して、未処理細胞（対照）とＡＶＰまたは物質で処理した細胞とにおける特異抗血清とＣｙ３標識二次抗体とを用いて検出した（Tammaら（２００３年）、Hennら（２００４年））。図中の語句の意味は以下。unbehandelt:未処理inhibitor:阻害剤
【図１９Ａ】ＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用を阻害する物質群。相互作用を阻害するすべての物質（表Ａ、Ｂを参照）の構造類似性について調べた。「構造１〜１８」表示の下にある番号は、化合物ＩＤ（表Ａ、Ｂを参照）に対応する。構造類似性は、物質１〜４、５と６との間、７〜９、１１と１２との間、１３と１４との間、１５と１６との間、１７と１８との間に見られた。物質１０は、相互作用を阻害する他の物質となんら類似性が見られなかった。これらの構造の一般化は、図２０に図示した。図中の語句の意味は以下。Strukturen：構造
【図１９Ｂ】同上
【図２０Ａ】図１９に示した構造１〜１７の一般化である。
【図２０Ｂ】同上
【図２０Ｃ】同上
【図２１】ＩＭＣＤ細胞におけるＡＱＰ２のＡＶＰ誘導再分布における、低分子量物質１８８８２、９９０、９９０誘導体ＳＭ６１、９９０誘導体ＳＭ６５の効果（図１８を参照）。物質の構造と化学特性は表Ａ、Ｂ、Ｃに記載した（阻害物質の濃度（単位μM））。ＡＱＰ２は、レーザー走査型顕微鏡を使用して、未処理細胞（対照）とＡＶＰまたは物質で処理した細胞とにおける特異抗血清とＣｙ３標識二次抗体とを用いて検出した（Tammaら（２００３年）、Hennら（２００４年））。低分子量物質９９０は、ＩＭＣＤ細胞においてＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用を阻害する。対応して、９９０は、ＡＱＰ２のＡＶＰ誘導再分布を妨げる。９９０誘導体である物質ＳＭ６１は、同様にＡＱＰ２のＡＶＰ誘導再分布を妨げる。対照的に、物質１８８８２と９９０誘導体である物質ＳＭ６５は、使用濃度におけるＡＱＰ２のＡＶＰ誘導再分布になんら影響を及ぼさない。
【図２２】低分子量物質９９０は、ＩＭＣＤ細胞においてＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用を阻害する。物質（表Ａ、Ｂ、Ｃを参照）は、図１７に示したＥＬＩＳＡに基づく試験アレイを使用して２００６４の化合物から構成される物質ライブラリーをスクリーニングして識別した。初代培養ＩＭＣＤ細胞は、未処理のまま（対照）か、または物質９９０（１００μM）か陰性対照としてのｃＡＭＰかで３０分間培養した。次に、細胞は溶菌され、ｃＡＭＰアガロース沈澱させた（Hennら、JBC279、26654、２００４年）。図２２Ａ：ＡＫＡＰ１８デルタは、溶解物中で、ならびにｃＡＭＰアガロース沈澱物（ｃＡＭＰアガロース）中で検出された（ウエスタンティングにおけるＡＫＡＰ１８デルタ特異抗体Ａ１８デルタ４を使用）（Hennら、２００４年）。陰性対照として、ｃＡＭＰをバッチに添加した。結果として、ＰＫＡの調節サブユニットのｃＡＭＰアガロースへの結合は、競合的に阻害された。このため、ＡＫＡＰは沈殿しなかった。結果として、ＡＫＡＰ１８デルタは、このサンプルでは検出されなかった。組み換え的に生成されたＡＫＡＰ１８デルタは、陽性対照として使用した。図２２Ｂ：溶解物中とｃＡＭＰアガロース沈澱物中とでＡＫＡＰを検出するため、ＲＩＩオーバレイを行った（Hennら、JBC279、26654、２００４年）。組み換え的に生成されたＡＫＡＰ１８デルタは、陽性対照として検出された。ＡＫＡＰ１８デルタは、図２２Ａと図２２Ｂにおいて矢印で示した。図中の語句の意味は以下。Lysates:溶解物cAMP  agarose：ｃＡＭＰアガロースKontrolle：対照
【図２３】低分子量物質１８８８２は、心筋細胞においてＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用を阻害する。一方、物質９９０は、この相互作用に何ら影響を及ぼさない。物質（表Ａ、Ｂ、Ｄを参照）は、図１７に示したＥＬＩＳＡに基づく試験アレイを使用して２００６４の化合物から構成される物質ライブラリーをスクリーニングして識別した。初代培養新生児心筋細胞は、未処理のまま（対照）か、または物質９９０、１８８８２（各回１００μM）か陰性対照としてのｃＡＭＰかで３０分間培養した。次に、細胞は溶菌され、ｃＡＭＰアガロース沈澱させた（Hennら、JBC279、26654、２００４年）。図２３Ａ：ＡＫＡＰ１８デルタは、溶解物中で、ならびにｃＡＭＰアガロース沈澱物（ｃＡＭＰアガロース）中で検出された（ウエスタンブロッティングにおけるＡＫＡＰ１８デルタ特異抗体Ａ１８デルタ４を使用）（Hennら、JBC279、26654、２００４年）。陰性対照として、ｃＡＭＰをバッチに添加した。結果として、ＰＫＡの調節サブユニットとｃＡＭＰアガロースとの結合は、競合的に阻害された。したがって、ＡＫＡＰは沈殿せず、結果としてＡＫＡＰ１８デルタはこのサンプルでは検出されない。組み換え的に生成されたＡＫＡＰ１８デルタは、陽性対照として使用した。図２３Ｂ：ウエスタンティングを使用して、ＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットを図２３Ａに記載と同じサンプルで検出した。予測通り、ｃＡＭＰを含むサンプルにおいては、ＲＩＩベータは検出されない（表Ａを参照）。予測通り、抗体はＡＫＡＰ１８デルタを認識しない。図２３Ｃ：溶解物中とｃＡＭＰアガロース沈澱物中とでＡＫＡＰを非選択的に検出するため、ＲＩＩオーバレイを行った（Hennら、JBC279、26654、２００４年）。組み換え的に生成されたＡＫＡＰ１８デルタは、陽性対照として検出された。図中の語句の意味は以下。Lysates:溶解物cAMP  agarose：ｃＡＭＰアガロースKontrolle：対照
【図２４】物質１８８８２によるＬタイプＣａ２+チャンネル電流の阻害。ＬタイプＣａ２+チャンネル電流は、パッチクランプ法を使用して新生児ラット心筋細胞において測定した。細胞は、−７０mVで保持し、０mVの試験電位まで繰り返し消極した（４００msで−３５mVまで増大後）。上図：物質１８８８２（表Ａ、Ｂを参照）と対照としての溶媒ＤＭＳＯとを規定濃度にて細胞に添加した。下図：物質９９０と９９０の誘導体ＳＭ６１（表Ｃを参照）とを規定濃度にて細胞に添加した。電流は、細胞構造全体が確立された後、４００秒間測定した。細胞を、規定回数イソプロテレノール（１μM、ＩＳＯ、β受容体アゴニスト）で刺激した。イソプロテレノールは、ＥＳ溶剤で洗浄した。図は、正規化電流の時間プロフィールを示す。（ｎは、測定細胞数に対応する。エラーバーは平均値±ＳＥＭを示す。）
【０３４１】
表Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄは、以下の内容を示す。
【０３４２】
表Ａ
ＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用を阻害する低分子量物質である。表は、少なくとも４０％分、相互作用を阻害する１４２の物質を示す。
「結合率（単位％）」：各物質の存在下における、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとＰＫＡ−ＲＩＩアルファとの相対結合の百分率を示す。これは、対照（各物質の非存在下における、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとＰＫＡ−ＲＩＩアルファとの結合）に基づく。これらの物質は、図１７に示したＥＬＩＳＡに基づく試験アレイを使用して２００６４の化合物から構成される物質ライブラリーをスクリーニングして識別した。物質の構造が示されている。物質は、その阻害効果に従って配列されている。リストは、ＰＫＡの調節ＲＩＩａサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用に最も潜在的阻害性を有する物質から順に配列されている。
「ＭＷ（g/mol）」：この値は、各物質の分子量を示す。分子量も、各物質の大きさの近似を示す。これは、バイオアベイラビリティに関して重要である（小分子は、より容易に細胞膜を通過可能）。
「化合物ＩＤ」：これらの数値は、Leibniz-Institut fur Molekulare Pharmakologieのシリアルコードを示す（合計２００６４）。
「プレートＩＤ」：物質が保管されている各物質ライブラリープレートの番号。
「位置ＩＤ」：物質が保管されている物質ライブラリープレートの位置。
「式」記載の経験公式は、各物質の元素組成を示す。
「ｌｏｇＰ」：この値は、各物質の分配係数の計算対数値である。これによって、極性相（水相）及び非極性相（膜性（脂質））における各物質の可溶性について予測可能となるので、細胞システムにおけるバイオアベイラビリティに関して初期情報が得られる。
「ｌｏｇＳｗ」：この値は、可溶性係数の計算対数値である。これによって、水中における各物質の可溶性について情報が得られる。
「水素結合受容体」：各物質における、水素結合受容体数（Ｎ原子とＯ原子）を示す。
「水素結合供与体」：各物質における、水素結合供与体数（ＮＨ基とＯＨ基）を示す。水素結合は、小分子とタンパク質との間の非共有結合の最も重要な種類である。したがって、水素結合供与体と水素結合受容体は、タンパク質と相互作用する物質の潜在能力を増大させる。
「原子結合数」：この値は、各物質の原子結合の数に対応する。これを中心として自由回転可能である。該結合数が大きいと、物質の構造的フレキシビリティが高まるので、タンパク質表面に適切に結合する確率も高まる。
要約すると、上記データによって、Lipinskiら(Lipinski, C.A., Lombardo, F., Dominy, B.W., Feeney, P.J., 「薬剤の発見・開発設定における可溶性と浸透性とを予測するための実験的コンピュータ使用に基づく方法」（Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings）. Adv. Drug Deliv. Rev. 46, 3-26 (2001)）によって実証された化学物質のバイオアベイラビリティに関する予測が可能になる。更に、これらの物質は、いわゆるRule of Fiveに適合するべきである。
・水素結合供与体数が最大５個（ＯＨ基とＮＨ基との合計）
・水素結合受容体数が最大１０個（Ｎ原子とＯ原子との合計）
・分子量が最大５００g/mol
・分配係数ｌｏｇＰは５以下
【０３４３】
表Ｂ
ＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用を阻害する選択された低分子量物質である。表は、少なくとも８０％分、相互作用を阻害する物質を表Ａから９つ選んで記載している。
「結合率（単位％）」：この値は、各物質の存在下における、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとＰＫＡ−ＲＩＩアルファとの相対結合の百分率を示す。これは、対照（物質の非存在下における、ＧＳＴ−ＡＫＡＰ１８デルタとＰＫＡ−ＲＩＩアルファとの結合）に基づく。
ＩＣ５０値は、各物質を滴定することによって測定した。相互作用阻害のＩＣ５０値は、図１７に記載のＥＬＩＳＡ実験を使用して測定した。
「ＭＷ（g/mol）」：この値は、各物質の分子量を示す。分子量も、各物質の大きさの近似を示す。これは、バイオアベイラビリティに関して重要である（小分子は、より容易に細胞膜を通過可能）。
「化合物ＩＤ」：これらの数値は、Leibniz-Institut fur Molekulare Pharmakologieのシリアルコードを示す（合計２００６４）。
「プレートＩＤ」：これらの数値は、物質が保管されている各物質ライブラリープレートの番号である。
「位置ＩＤ」：物質が保管されている物質ライブラリープレートの位置。
「式」記載の経験式は、各物質の元素組成を示す。
「ｌｏｇＰ」：この値は、各物質の分配係数の計算対数値である。これによって、極性相（水相）及び非極性相（膜性（脂質））における各物質の可溶性について予測可能となるので、細胞システムにおけるバイオアベイラビリティに関して初期情報が得られる。
「ｌｏｇＳｗ」：この値は、可溶性係数の計算対数値である。これによって、水中における各物質の可溶性について情報が得られる。
「水素結合受容体」：各物質における、水素結合受容体数（Ｎ原子とＯ原子）を示す。
「水素結合供与体」：各物質における、水素結合供与体数（ＮＨ基とＯＨ基）を示す。水素結合は、小分子とタンパク質との間の非共有結合の最も重要な種類である。したがって、水素結合供与体と水素結合受容体は、タンパク質と相互作用する物質の潜在能力を増大させる。
「原子結合数」：この値は、各物質の原子結合の数に対応する。これを中心として自由回転可能である。該結合数が大きいと、物質の構造的フレキシビリティが高まるので、タンパク質表面に適切に結合する確率も高まる。
【０３４４】
表Ｃ
ＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用を調節する低分子量物質である。物質は、表Ａ、Ｂに記載の物質９９０の誘導体である。これらの物質は、化学的改良により物質９９０から形成した。各物質の構造、実験式、分子量（ＭＷ）、ｌｏｇＰ値、水素結合受容体数、及び水素結合供与体数を示した（これらのパラメータについての説明は、表Ａ、Ｂの凡例を参照）。ＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用に対する各物質の阻害効果は、図１７に示したＥＬＩＳＡ実験において最高３回まで（スクリーニング番号１〜３）調べた。その結果からＩＣ５０（平均値。単位：μM）を測定した。誘導体と物質９９０とのＩＣ５０比を計算した（ＩＣ５０比（化合物／９９０））。値が１より大きい場合はより阻害性が高いことを反映し、値が１より小さい場合は元の物質に比べて相互作用阻害性が小さいことを反映する。ＩＣ５０平均値は、９９０のＩＣ５０平均値に関して行った実験から計算し、正規化した、ＩＣ５０平均値を示す。阻害性を示さない物質には「−」を記載した。
【０３４５】
表Ｄ
ＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用を阻害する低分子量物質ＳＭ−ＦＰと９９０である。物質ＳＭ−ＦＰは、表Ａ、Ｂに記載の物質９９０の誘導体である。ＳＭ−ＦＰは、蛍光基の存在によって特徴付けられる。各物質の構造、実験式、分子量（ＭＷ）、ｌｏｇＰ値、水素結合受容体数、及び水素結合供与体数を示した（これらのパラメータについての説明は、表Ａ、Ｂの凡例を参照）。ＰＫＡの調節ＲＩＩアルファサブユニットとのＡＫＡＰ１８デルタの相互作用に対する各物質の阻害効果は、図１７に示したＥＬＩＳＡ実験において最高３回まで（スクリーニング番号１〜３）調べた。その結果からＩＣ５０（平均値。単位：μM）を測定した。誘導体と物質９９０とのＩＣ５０比を計算した（ＩＣ５０比（化合物／９９０）。値が１より大きい場合はより阻害性が高いことを反映し、値が１より小さい場合は元の物質に比べて相互作用阻害性が小さいことを反映する。ＩＣ５０平均値は、９９０のＩＣ５０平均値に関して行った実験から計算し、正規化した、ＩＣ５０平均値を示す。阻害性を示さない物質には「−」を記載した。
【０３４６】
表Ａ：ＡＫＡＰ１８δ−ＲＩＩα相互作用を阻害するために使用される低分子量物質
表中英語の意味は以下；Structures:構造、Comp.  ID:化合物ＩＤ、PlateID  384:プレートＩＤ３８４、PosID384:位置ＩＤ３８４、Binding:結合率、H  acceptor:水素結合受容体、H  donor:水素結合供与体、B  rotN:原子結合数
【表Ａ１】
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【表Ａ２】
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【表Ａ３】
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【表Ａ４】
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【表Ａ５】
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【表Ａ６】
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【表Ａ７】
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【表Ａ８】
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【表Ａ９】
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【表Ａ１０】
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【表Ａ１１】
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【表Ａ１２】
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【表Ａ１３】
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【表Ａ１４】
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【表Ａ１５】
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【表Ａ１６】
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【表Ａ１７】
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【表Ａ１８】
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【表Ａ１９】
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【表Ａ２０】
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【表Ａ２１】
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【表Ａ２２】
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【表Ａ２３】
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【表Ａ２４】
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【表Ａ２５】
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【表Ａ２６】
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【表Ａ２７】
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【表Ａ２８】
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【表Ａ２９】
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【表Ａ３０】
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【表Ａ３１】
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【表Ａ３２】
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【表Ａ３３】
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【表Ａ３４】
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【表Ａ３５】
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【表Ａ３６】
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【表Ａ３７】
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【表Ａ３８】
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【表Ａ３９】
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【表Ａ４０】
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【表Ａ４１】
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【表Ａ４２】
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【表Ａ４３】
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【表Ａ４４】
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【表Ａ４５】
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【表Ａ４６】
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【表Ａ４７】
2008540586.tif 000073
【表Ａ４８】
2008540586.tif 000074
【表Ａ４９】
2008540586.tif 000075
【表Ａ５０】
2008540586.tif 000076
【表Ａ５１】
2008540586.tif 000077
【表Ａ５２】
2008540586.tif 000078
【０３４７】
表Ｂ：ＰＫＡ−ＲＩＩα−ＧＳＴ−ＡＫＡP１８δ相互作用の阻害剤（物質ライブラリーＦＭＰ２００００（ChemDiv社）表中の英語の意味は以下；
Comp.  ID:化合物ＩＤ、ID  No.:ＩＤ番号、Structure:構造、Formula:式、PlateID:プレートＩＤ、PosID:位置ＩＤ、Bar  ID:バーコード、Binding:結合率、H  acceptor:水素結合受容体、H  donor:水素結合供与体、B  rotN:原子結合数
【表Ｂ１】
2008540586.tif 000079
【表Ｂ２】
2008540586.tif 000080
【０３４８】
表Ｃ：物質９９０の誘導体
表中の英語の意味は以下；
Substance:物質
Structure:構造
Formula:式
H
IC50  in  Screening  no.1-3（μM）:スクリーニング番号１〜３におけるＩＣ５０（μM）
Ratio  IC50(comp./990)  in  Screening  no.  1-3（μM）:スクリーニング番号１〜３におけるＩＣ５０比（化合物／９９０）（μM）
Mean  IC50（μM）:ＩＣ５０平均値（μM）
H  acceptor:水素結合受容体
H  donor:水素結合供与体
【表Ｃ１】
2008540586.tif 000081
【表Ｃ２】
2008540586.tif 000082
【表Ｃ３】
2008540586.tif 000083
【表Ｃ４】
2008540586.tif 000084
【表Ｃ５】
2008540586.tif 000085
【表Ｃ６】
2008540586.tif 000086
【表Ｃ７】
2008540586.tif 000087
【表Ｃ８】
2008540586.tif 000088
【表Ｃ９】
2008540586.tif 000089
【表Ｃ１０】
2008540586.tif 000090
【表Ｃ１１】
2008540586.tif 000091
【表Ｃ１２】
2008540586.tif 000092
【０３４９】
表Ｄ：蛍光染料結合物質ＳＭ−ＦＰ（物質９９０の誘導体）
表中の英語は以下の意味；
表中の英語の意味は以下；
Substance:物質
Structure:構造
Formula:式
H
IC50  in  Screening  no.1-3（μM）:スクリーニング番号１〜３におけるＩＣ５０（μM）
Ratio  IC50(comp./990)  in  Screening  no.  1-3（μM）:スクリーニング番号１〜３におけるＩＣ５０比（化合物／９９０）（μM）
Mean  IC50（μM）:ＩＣ５０平均値（μM）
H  acceptor:水素結合受容体
H  donor:水素結合供与体、
【表Ｄ】
2008540586.tif 000093
【図１】
2008540586.tif 000096
【図２】
2008540586.tif 000097
【図３】
2008540586.tif 000098
【図４】
2008540586.tif 000099
【図５】
2008540586.tif 000100
【図６】
2008540586.tif 000101
【図７】
2008540586.tif 000102
【図８】
2008540586.tif 000103
【図９】
2008540586.tif 000104
【図１０】
2008540586.tif 000105
【図１１】
2008540586.tif 000106
【図１２】
2008540586.tif 000107
【図１３】
2008540586.tif 000108
【図１４】
2008540586.tif 000109
【図１５】
2008540586.tif 000110
【図１６】
2008540586.tif 000111
【図１７】
2008540586.tif 000112
【図１８】
2008540586.tif 000113
【図１９Ａ】
2008540586.tif 000114
【図１９Ｂ】
2008540586.tif 000115
【図２０Ａ】
2008540586.tif 000116
【図２０Ｂ】
2008540586.tif 000117
【図２０Ｃ】
2008540586.tif 000118
【図２１】
2008540586.tif 000119
【図２２】
2008540586.tif 000120
【図２３】
2008540586.tif 000121
【図２４】
2008540586.tif 000122
【手続補正書】
【提出日】平成20年1月23日(2008.1.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４６】
表Ａ：ＡＫＡＰ１８δ−ＲＩＩα相互作用を阻害するために使用される低分子量物質
表中英語の意味は以下；Structures:構造、Comp.  ID:化合物ＩＤ、PlateID  384:プレートＩＤ３８４、PosID384:位置ＩＤ３８４、Binding:結合率、H  acceptor:水素結合受容体、H  donor:水素結合供与体、B  rotN:原子結合数
【表Ａ１】
2008540586.tif 000123
【表Ａ２】
2008540586.tif 000124
【表Ａ３】
2008540586.tif 000125
【表Ａ４】
2008540586.tif 000126
【表Ａ５】
2008540586.tif 000127
【表Ａ６】
2008540586.tif 000128
【表Ａ７】
2008540586.tif 000129
【表Ａ８】
2008540586.tif 000130
【表Ａ９】
2008540586.tif 000131
【表Ａ１０】
2008540586.tif 000132
【表Ａ１１】
2008540586.tif 000133
【表Ａ１２】
2008540586.tif 000134
【表Ａ１３】
2008540586.tif 000135
【表Ａ１４】
2008540586.tif 000136
【表Ａ１５】
2008540586.tif 000137
【表Ａ１６】
2008540586.tif 000138
【表Ａ１７】
2008540586.tif 000139
【表Ａ１８】
2008540586.tif 000140
【表Ａ１９】
2008540586.tif 000141
【表Ａ２０】
2008540586.tif 000142
【表Ａ２１】
2008540586.tif 000143
【表Ａ２２】
2008540586.tif 000144
【表Ａ２３】
2008540586.tif 000145
【表Ａ２４】
2008540586.tif 000146
【表Ａ２５】
2008540586.tif 000147
【表Ａ２６】
2008540586.tif 000148
【表Ａ２７】
2008540586.tif 000149
【表Ａ２８】
2008540586.tif 000150
【表Ａ２９】
2008540586.tif 000151
【表Ａ３０】
2008540586.tif 000152
【表Ａ３１】
2008540586.tif 000153
【表Ａ３２】
2008540586.tif 000154
【表Ａ３３】
2008540586.tif 000155
【表Ａ３４】
2008540586.tif 000156
【表Ａ３５】
2008540586.tif 000157
【表Ａ３６】
2008540586.tif 000158
【表Ａ３７】
2008540586.tif 000159
【表Ａ３８】
2008540586.tif 000160
【表Ａ３９】
2008540586.tif 000161
【表Ａ４０】
2008540586.tif 000162
【表Ａ４１】
2008540586.tif 000163
【表Ａ４２】
2008540586.tif 000164
【表Ａ４３】
2008540586.tif 000165
【表Ａ４４】
2008540586.tif 000166
【表Ａ４５】
2008540586.tif 000167
【表Ａ４６】
2008540586.tif 000168
【表Ａ４７】
2008540586.tif 000169
【表Ａ４８】
2008540586.tif 000170
【表Ａ４９】
2008540586.tif 000171
【表Ａ５０】
2008540586.tif 000172
【表Ａ５１】
2008540586.tif 000173
【表Ａ５２】
2008540586.tif 000174
【国際調査報告】
2008540586.tif 000175
2008540586.tif 000176
2008540586.tif 000177
2008540586.tif 000178
2008540586.tif 000179
2008540586.tif 000180
2008540586.tif 000181
2008540586.tif 000182