(57)【要約】  本発明は、単離されたプロモーターＤＮＡ配列に関し、コード配列と作動可能に関連しているこれらのプロモーターを含むＤＮＡ構築物、ベクター、および宿主細胞に関する。本発明はまた、単離された新規なプロモーターを用いて、遺伝子を発現させるおよび／または生物学的化合物を生成するための方法に関する。本発明はまた、本発明の新規なプロモーターを用いて、転写レベルおよび／または内在性遺伝子の制御を変化させるための方法に関する。【選択図】図５
2008531031.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６に表されるようなＤＮＡ配列、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列に少なくとも５０％相同なＤＮＡ配列、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ配列のいずれかのバリアント、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれかの部分配列
等のプロモーターＤＮＡ配列。
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーターＤＮＡ配列、およびコード配列をプロモーターＤＮＡ配列の制御下で発現できるように前記プロモーターＤＮＡ配列と作動可能に関連しているコード配列を含む、ＤＮＡ構築物。
【請求項３】
請求項２に記載のＤＮＡ構築物を含む、宿主細胞、好ましくは真菌宿主細胞。
【請求項４】
宿主細胞がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属由来の細胞である、請求項３に記載の宿主細胞。
【請求項５】
宿主細胞が黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、クリソスポリウム・ルクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）種である、請求項４に記載の宿主細胞。
【請求項６】
（ａ）請求項２に記載のＤＮＡ構築物を提供すること、
（ｂ）適した宿主細胞を、前記ＤＮＡ構築物で形質転換すること、および
（ｃ）適した宿主細胞を、コード配列の発現を行うことができる培養条件下で培養すること
を含む、適した宿主細胞中でのコード配列の発現のための方法。
【請求項７】
（ａ）請求項２に記載のＤＮＡ構築物を提供すること、
（ｂ）適した宿主細胞を、前記ＤＮＡ構築物で形質転換すること、
（ｃ）適した宿主細胞を、コード配列の発現を行うことができる培養条件下で培養すること、ならびに場合により、
（ｄ）培養ブロスから生物学的化合物を回収すること
を含む、適した宿主細胞中での生物学的化合物の生成のための方法。
【請求項８】
生成される生物学的化合物がポリペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
生成されるポリペプチドが、請求項２に記載のＤＮＡ構築物中に存在するコード配列によってコードされる、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
生成される生物学的化合物が代謝産物である、請求項７に記載の方法。
【請求項１１】
請求項２に記載のＤＮＡ構築物中に存在するコード配列が、代謝産物の生成に関与する酵素をコードする、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［技術分野］
本発明は、ＤＮＡ配列、特に単離されたプロモーター、ならびにコード配列と作動可能に関連しているこれらのプロモーターを含むＤＮＡ構築物、ベクター、および宿主細胞に関する。本発明はまた、遺伝子を発現させるためおよび／または生物学的化合物を生成するための方法に関する。
［背景技術］
【０００２】
宿主細胞中での組み換え生物学的化合物の生成は、通常、宿主細胞に適したプロモーターに生物学的化合物をコードするＤＮＡが操作可能に連結している発現カセットを構築することによって、達成される。発現カセットは、プラスミド媒介性またはベクター媒介性形質転換によって宿主細胞に導入されてもよい。生物学的化合物の生成は、次いで、形質転換された宿主細胞を、発現カセットに含まれるプロモーターの適当な機能に必要な誘導条件下で培養することによって達成することができる。
【０００３】
各宿主細胞について、このコード配列によってコードされる組み換え生物学的化合物の形質転換および生成によって宿主に導入されているコード配列の発現は、機能的プロモーターの利用可能性を必要とする。多数のプロモーターが、種々の宿主細胞中で機能的であることがすでに公知である。真菌宿主細胞中のプロモーターの異種間使用の例がある。偽巣性コウジ菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）のプロモーター（偽巣性コウジ菌ｇｐｄＡ遺伝子は、黒色アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）（Ａ．ｎｉｇｅｒ）中で機能的であることが公知である）（ジャーナル・オブ・バイオテクノロジー（Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１９９１年１月、１７（１）１９〜３３頁。高発現偽巣性コウジ菌ｇｐｄＡ遺伝子の発現シグナルの制御下でのアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）におけるタンパク質の細胞内および細胞外生成（Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ｃｏｎｒｏｌ  ｏｆ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  ｇｐｄＡ  ｇｅｎｅ．）プント（Ｐｕｎｔ）ＰＪ、ゼゲルス（Ｚｅｇｅｒｓ）ＮＤ、ブッシャー（Ｂｕｓｓｃｈｅｒ）Ｍ、パウエルズ（Ｐｏｕｗｅｌｓ）ＰＨ、ファンデンホンデル（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）ＣＡ）。別の例は、アスペルギルスのキシラン分解酵素系の黒色アスペルギルスおよび偽巣性コウジ菌転写調節（Ａ．ｎｉｇｅｒ  ａｎｄ  Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｘｙｌａｎｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、ファンペイジュ（ｖａｎ  Ｐｅｉｊ）、ＮＮＭＥ、博士論文ワーヘニンゲン農業大学、オランダ、ＩＳＢＮ  ９０−５８０８−１５４−０、ならびにカレント・ジェネティクス（Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ．）１９８９年３月、１５（３）：１７７〜８０頁、ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ＩＮ、オリバー（Ｏｌｉｖｅｒ）ＲＰ、プント（Ｐｕｎｔ）ＰＪ、ファンデンホンデル（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）ＣＡ「産業的および植物病原性糸状菌における大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）β−グルクロニダーゼ遺伝子の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｂｅｔａ−ｇｌｕｃｕｒｏｎｉｄａｓｅ  ｇｅｎｅ  ｉｎ  ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  ａｎｄ  ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ）」に記載されているような黒色アスペルギルス、偽巣性コウジ菌およびクラドスポリウム・フラバ（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｆｕｌｖｕｍ）における大腸菌β−グルクロニダーゼ遺伝子の発現において使用されている黒色アスペルギルスβ−キシロシダーゼｘｌｎＤプロモーターである。
【０００４】
しかしながら、依然として、導入された遺伝子の発現の制御、内在性遺伝子の発現のレベルの制御、内在性遺伝子の発現の調節の制御、もしくは内在性遺伝子の不活性化の媒介、もしくはポリペプチドの生成、または前述の用途の組み合わせのための、改善されたプロモーターの必要性がある。これらの改善されたプロモーターは、例えば、これまで公知のものよりも強力な場合がある。これらはまた、特定の簡便な基質または化合物によって誘導可能な場合がある。いくつかの機能的プロモーターを知っていることもまた、単一の宿主中で種々の遺伝子を同時に過剰発現しようと構想する場合に、有利である。抑圧（特定の転写因子の滴定）を防ぐために、各遺伝子について１つの特定のプロモーターが発現される、複数の別個のプロモーターを使用することが好ましい。
［発明の詳細な説明］
【０００５】
本発明の第一の態様によると、
（ａ）以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６に表されるようなＤＮＡ配列、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列に少なくとも５０％相同であるＤＮＡ配列、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ配列のいずれかのバリアント、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれかの部分配列
等のプロモーターＤＮＡ配列が提供される。
【０００６】
本発明の文脈において、プロモーターＤＮＡ配列は、このプロモーターＤＮＡ配列がコード配列と作動可能に関連している場合にコード配列の発現を制御することができる、ＤＮＡ配列である。用語「作動可能に関連」は、本明細書中で、プロモーターＤＮＡ配列が、コード配列によってコードされる生成物の生成を指示するように、プロモーターＤＮＡ配列がコード配列に関して適当に配置されている配置として、定義される。
【０００７】
用語「コード配列」は、本明細書中で、適当な制御配列の制御下に置かれた場合にポリペプチドに翻訳されるｍＲＮＡに転写される、核酸配列として定義される。コード配列の境界は、一般に、通常ｍＲＮＡの５’末端のオープンリーディングフレームの開始であるＡＴＧ開始コドンおよびｍＲＮＡの３’末端のオープンリーディングフレームのちょうど下流に位置する転写ターミネーター配列によって、決定される。コード配列としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、合成、および組み換え核酸配列を挙げることができるが、これらに限定されない。
【０００８】
より具体的には、用語「プロモーター」は、本明細書中で、ＲＮＡポリメラーゼを結合させ、ポリメラーゼを、ポリペプチドをコードするコード配列の正しい下流転写開始部位に方向付けて、転写を開始させる、ＤＮＡ配列として定義される。ＲＮＡポリメラーゼは、コード領域の適当なＤＮＡ鎖に相補的なメッセンジャーＲＮＡの集合を効果的に触媒する。用語「プロモーター」はまた、ｍＲＮＡへの転写後の翻訳のための５’非コード領域（プロモーターと翻訳開始との間）、エンハンサー等のシス−作用転写調節因子、および転写因子と相互作用することができる他のヌクレオチド配列を含むと理解されよう。
【０００９】
好ましい実施形態において、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に示されるようなＤＮＡ配列である。
【００１０】
別の好ましい実施形態によると、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に示され、依然としてプロモーター活性を保持しているような、ＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列である。
【００１１】
本発明の文脈において、プロモーター活性は、好ましくは、プロモーターと作動可能に関連しているコード配列の発現の結果として生成されるタンパク質の濃度を測定することによって決定される。あるいは、プロモーター活性は、プロモーターと作動可能に関連しているコード配列によってコードされるタンパク質の酵素活性を測定することによって決定される。好ましい実施形態によると、プロモーター活性（およびその強度）は、ｌａｃＺレポーター遺伝子のコード配列の発現を測定することによって決定される（ルオ（Ｌｕｏ）（ジーン（Ｇｅｎｅ）１６３（１９９５年）１２７〜１３１頁中。別の好ましい実施形態によると、プロモーター活性は、緑色蛍光タンパク質をコード配列として使用することによって決定される（マイクロバイオロジー（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）１９９９年３月、１４５（第３部）：７２９〜３４頁、中。サンテール・ヘンリクセン（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ）ＡＬ、エヴェン（Ｅｖｅｎ）Ｓ、マラー（Ｍｕｌｌｅｒ）Ｃ、プント（Ｐｕｎｔ）ＰＪ、ファンデンホンデル（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）ＣＡ、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）Ｊ．シュトューディー（Ｓｔｕｄｙ））。また、プロモーター活性は、プロモーターの制御下で生じる転写産物のｍＲＮＡレベルを測定することによって決定することができる。ｍＲＮＡレベルは、例えば、ノーザンブロットによって測定することができる（Ｊ．サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴ．マニアタス（Ｍａｎｉａｔｕｓ）、１９８９年、モレキュラー・クローニング、ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）、第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク）。全ての、プロモーター活性を決定するための記載されたアッセイにおいて、プロモーターの活性を、例えば、同一のレポーター遺伝子またはコード配列を別個のプロモーターの制御下に置くこと、およびプロモーター活性を同一条件下で測定することによって、別のプロモーターの活性と比較することができる。
【００１２】
本発明は、非常に低いストリンジェンシー条件下、好ましくは低ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中ストリンジェンシー条件下、より好ましくは中〜高ストリンジェンシー条件下、さらにより好ましくは高ストリンジェンシー条件下、最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下で、
ａ．配列番号１もしくは配列番号２のヌクレオチド１〜２０００、好ましくはヌクレオチド１００〜１９９０、より好ましくは２００〜１９８０、さらにより好ましくは３００〜１９７０、さらにより好ましくは３５０〜１９５０、最も好ましくは３６０〜１９００、または
ｂ．配列番号３のヌクレオチド１〜１４９０、好ましくは１００〜１４８０、より好ましくは２００〜１４７０、さらにより好ましくは３００〜１４６０、さらにより好ましくは３５０〜１４４０、最も好ましくは３６０〜１４００、または
ｃ．配列番号４もしくは配列番号５のヌクレオチド１〜１９９７、好ましくはヌクレオチド１００〜１９８７、より好ましくは２００〜１９７７、さらにより好ましくは３００〜１９６７、さらにより好ましくは３５０〜１９５０、最も好ましくは３６０〜１９００、または
ｄ．配列番号６のヌクレオチド１〜９３７、好ましくは５０〜９２７、より好ましくは１００〜９１７、さらにより好ましくは１５０〜９０７、さらにより好ましくは２００〜８８７、最も好ましくは２５０〜８６７、または
ｅ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）もしくは（ｄ）の部分配列、または
ｆ．（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、もしくは（ｅ）の相補鎖
に対応する核酸プローブとハイブリダイズする、（単離された）プロモーターＤＮＡ配列を包含する。用語、相補鎖は、当業者に公知であり、Ｊ．サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８９年、モレキュラー・クローニング、ラボラトリーマニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）第２版、コールドスプリングハーバー、ニューヨークに記載されている。
【００１３】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６の部分配列は、少なくとも１００ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも３００ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも４００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも５００ヌクレオチドであってもよい。
【００１４】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６の核酸配列またはその部分配列を用いて核酸プローブを設計して、当該分野で周知の方法に従って、異なる属または種の株からＤＮＡプロモーターを同定およびクローニングしてもよい。具体的には、かかるプローブは、その中の対応する遺伝子を同定および単離するために、標準的なサザンブロッティング手順に従って、目的の属または種のゲノムまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションに使用することができる。かかるプローブは、配列全体よりも相当短いが、長さが少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、より好ましくは少なくとも３５ヌクレオチドであるべきである。また、かかるプローブを用いて、ＰＣＲによってＤＮＡプロモーターを増幅することができる。ＰＣＲによるプロモーターのクローニングの例は、本明細書中に記載されている（実施例１．３参照）。より長いプローブも使用することができる。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを使用することができる。プローブは、典型的には、対応する遺伝子を検出するために標識される（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、もしくはアビジンまたは蛍光マーカーで）。かかるプローブは、本発明に包含される。
【００１５】
したがって、かかる他の生物から調製されたゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、上述のプローブとハイブリダイズし、ポリペプチドをコードする、ＤＮＡについてスクリーニングしてもよい。かかる他の生物由来のゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースもしくはポリアクリルアミドゲル電気泳動法または他の分離技術によって分離してもよい。ライブラリー由来のＤＮＡまたは分離されたＤＮＡを、ニトロセルロースまたは他の適した担体物質に、転写または固定してもよい。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６またはその部分配列と相同なクローンまたはＤＮＡを同定するために、サザンブロットにおいて担体物質を使用してもよい。
【００１６】
本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションは、核酸配列が、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６に示される核酸配列、それらの相補鎖、またはその部分配列に対応する、標識された核酸プローブにハイブリダイズすることを示す。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えば、Ｘ線フィルムを用いて検出される。検出のための蛍光ならびに支持体としてのスライドガラスおよび／またはＤＮＡマイクロアレイを使用する技術等の、他のハイブリダイゼーション技術もまた、使用することができる。ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション検出の例は、ＦＥＭＳイースト・リサーチ（Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．）２００３年１２月、４（３）：２５９〜６９頁に示されている（ダラン−ラプジェイド（Ｄａｒａｎ−Ｌａｐｕｊａｄｅ）Ｐ、ダラン（Ｄａｒａｎ）ＪＭ、コッター（Ｋｏｔｔｅｒ）Ｐ、プティ（Ｐｅｔｉｔ）Ｔ、パイパー（Ｐｉｐｅｒ）ＭＤ、プロンク（Ｐｒｏｎｋ）ＪＴ．「オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用したサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）実験株Ｓ２８８ＣおよびＣＥＮ．ＰＫ．１１３−７Ｄの比較遺伝子型決定（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｔｒａｉｎｓ  Ｓ２８８Ｃ  ａｎｄ  ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ  ｕｓｉｎｇ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ）」。また、ハイブリダイゼーションのためのＰＮＡマイクロアレイの使用は、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．）２００３年１０月１日、３１（１９）：ｅ１１９頁に記載されている（ブラント（Ｂｒａｎｄｔ）Ｏ、フェルドナー（Ｆｅｌｄｎｅｒ）Ｊ、ステファン（Ｓｔｅｐｈａｎ）Ａ、シュレーダー（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）Ｍ、シュノルツァー（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ）Ｍ、アーリンガウス（Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ）ＨＦ、ホーハイゼル（Ｈｏｈｅｉｓｅｌ）ＪＤ、ジェイコブ（Ｊａｃｏｂ）Ａ．未標識ＤＮＡ試料のハイブリダイゼーションのためのＰＮＡマイクロアレイ（ＰＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ  ｆｏｒ  ｈｙｂｒｉｄｉｓａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｌａｂｅｌｌｅｄ  ＤＮＡ  ｓａｍｐｌｅｓ））。
【００１７】
好ましい実施形態において、核酸プローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６の核酸配列である。別の好ましい実施形態において、核酸プローブは、
ａ．配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のヌクレオチド２０〜１９８０、より好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のヌクレオチド５００〜１９５０、さらにより好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のヌクレオチド８００〜１９２０、最も好ましくは配列番号１、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号５のヌクレオチド９００〜１９００、または
ｂ．配列番号３のヌクレオチド２０〜１４７０、より好ましくは配列番号３のヌクレオチド５００〜１４４０、さらにより好ましくは配列番号３のヌクレオチド７００〜１４３０、最も好ましくは配列番号３のヌクレオチド８００〜１４００、または
ｃ．配列番号６のヌクレオチド２０〜９１７、より好ましくは配列番号６のヌクレオチド２００〜９０７、さらにより好ましくは配列番号６のヌクレオチド３００〜８９７、最も好ましくは配列番号６のヌクレオチド４００〜８８７
を有する核酸配列である。
【００１８】
別の好ましいプローブは、ＤＮＡ配列の転写開始部位の直前の部分である。
【００１９】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブについて、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件は、標準的なサザンブロッティング手順に従い、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌのせん断および変性されたサケ精子ＤＮＡ、ならびに、非常に低い、および低ストリンジェンシーでは２５％ホルムアミド、中および中〜高ストリンジェンシーでは３５％ホルムアミド、または高および非常に高いストリンジェンシーでは５０％ホルムアミド中のいずれかで、４２℃でのプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションとして定義される。
【００２０】
長さが少なくとも１００ヌクレオチドの長いプローブについては、担体物質は、最後に、それぞれ１５分間、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて、好ましくは少なくとも４５℃（非常に低いストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５０℃（低ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも５５℃（中ストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも６０℃（中〜高ストリンジェンシー）、さらにより好ましくは少なくとも６５℃（高ストリンジェンシー）、最も好ましくは少なくとも７０℃（非常に高いストリンジェンシー）で、３回洗浄される。
【００２１】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブについては、ストリンジェンシー条件は、標準的なサザンブロッティング手順に従い、０．９Ｍ  ＮａＣｌ、０．０９Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％  ＮＰ−４０、１×デンハルト溶液、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１ｍＭリン酸二水素ナトリウム、０．１ｍＭ  ＡＴＰ、および０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ／ｍｌ中、ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）およびマッカーシー（ＭｃＣａｒｔｈｙ）による計算を用いて計算されたＴｍよりも５℃〜１０℃下での、プレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、およびポストハイブリダイゼーション洗浄として定義される（１９６２年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ）４８：１３９０頁）。
【００２２】
長さが約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの短いプローブについて、担体物質は、６×ＳＳＣ＋０．１％ＳＤＳ中で１５分間１回、および計算されたＴｍよりも５℃〜１０℃下で６×ＳＳＣを用いてそれぞれ１５分間２回洗浄される。
【００２３】
別の好ましい実施形態によると、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６をまず用いて、天然の遺伝子、それと作動可能に関連しているそのコード配列またはその一部がクローニングされる。これは、上記で定義したような配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６、またはその部分配列で開始して、およびこの配列をプローブとして使用して、行うことができる。プローブは、所定の宿主、黒色アスペルギルスまたは本願において定義されるような任意の他の宿主の、ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーにハイブリダイズされる。一旦天然の遺伝子またはその部分がクローニングされると、これを、その後それ自体をプローブとして使用して、本明細書中に記載されているハイブリダイゼーション実験によって、他の真菌に由来するその相同遺伝子をクローニングすることができる。
【００２４】
本発明の文脈において、相同遺伝子とは、天然の遺伝子に少なくとも５０％相同（同一）な遺伝子を意味する。好ましくは、相同遺伝子は、天然の遺伝子に、少なくとも５５％相同、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％  好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、さらにより好ましくは約９５％、さらにより好ましくは約９７％、さらにより好ましくは約９８％、さらにより好ましくは約９９％、最も好ましくは約９９．５％相同である。
【００２５】
相同遺伝子のコード配列の上流の配列は、本発明に包含されるプロモーターである。あるいは、本発明のプロモーターに作動可能に関連している、天然の遺伝子の配列、コード配列またはその一部は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５もしくは配列番号６または上記で定義されるようなその部分配列を用いることによって同定して、例えば本明細書中に記載されているようなアラインメントまたはＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてゲノムデータベースを検索することができる。この、同定された配列をその後用いて、本願において定義される任意の他の宿主中のオルソログまたは相同遺伝子を同定することができる。同定されたオルソログまたは相同遺伝子のコード配列の上流の配列は、本発明に包含されるプロモーターである。
【００２６】
別の好ましい実施形態によると、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に少なくとも５０％相同（同一）な、（単離された）ＤＮＡ配列である。好ましくは、ＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６に、少なくとも５５％相同、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％  好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、さらにより好ましくは約９５％、さらにより好ましくは約９７％、さらにより好ましくは約９８％、さらにより好ましくは約９９％、最も好ましくは約９９．５％相同である。
【００２７】
本発明の目的のために、２つの核酸配列の間の相同性（同一性）の程度は、好ましくは、ＢＬＡＳＴプログラムによって決定される。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウエアは、全米バイオテクノロジー情報センターを通して公的に入手可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータ、Ｗ、Ｔ、およびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１の文字列長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列アラインメント（Ｂ）（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）およびヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、プロシーディングス・イン・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズＵＳＡ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）８９：１０９１５頁（１９８９年）参照）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６の部分配列であり、部分配列は、依然としてプロモーター活性を有する。部分配列は、好ましくは、少なくとも約１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２００ヌクレオチド、最も好ましくは少なくとも約３００ヌクレオチドを含む。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、部分配列は、５’および／または３’末端から１つ以上のヌクレオチドが欠失していることを除いて配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６によって包含される、核酸配列であり、前記ＤＮＡ配列は、依然としてプロモーター活性を有する。
【００３０】
別の好ましい実施形態において、プロモーター部分配列は、翻訳開始および／または転写開始の上流である、「トリムされた」部分配列、すなわち配列断片である。プロモーターのトリミングおよびその機能的分析の例は、ジーン（Ｇｅｎｅ）１９９４年８月５日、１４５（２）：１７９〜８７頁：黒色アスペルギルスグルコアミラーゼコード遺伝子の発現に対する複数コピーの上流領域の効果（ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｃｏｐｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｕｐｓｔｒｅａｍ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  ｇｌｕｃｏａｍｙｌａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ．）ヴェルドース（Ｖｅｒｄｏｅｓ）ＪＣ、プント（Ｐｕｎｔ）ＰＪ、スタウタマー（Ｓｔｏｕｔｈａｍｅｒ）ＡＨ、ファンデンホンデル（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）ＣＡ）に記載されている。
【００３１】
本発明の別の実施形態において、プロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６のバリアントである。
【００３２】
用語「バリアント」または「バリアントプロモーター」は、本明細書中で、親プロモーターの１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を含むヌクレオチド配列を有するプロモーターとして定義され、ここでバリアントプロモーターは、対応する親プロモーターよりも高い、または低いプロモーター活性を有する。用語「バリアントプロモーター」は、天然のバリアント、ならびに典型的な突然変異誘発法、部位特異的突然変異誘発法、およびＤＮＡシャフリング等の当該分野で周知の方法を用いて得られるインビトロで生成されたバリアントを包含する。バリアントプロモーターは、１つ以上の変異を有してもよい。各変異は、独立した、ヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入である。
【００３３】
好ましい実施形態によると、バリアントプロモーターは、少なくとも、最初に同定されたプロモーター配列（配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６）と比較して、修飾された調節部位を有するプロモーターである。かかる調節部位は、その全体を除くか、または上記で説明されたように特異的に変異させることができる。かかるプロモーターバリアントの調節は、例えばそれがグルコースによってもはや誘導されないように、このようにして改変される。かかるプロモーターバリアント、およびそれらをどのようにして得るかに関する技術の例は、ＥＰ６７３４２９号明細書または国際公開第９４／０４６７３号パンフレットに記載されている。
【００３４】
プロモーターバリアントは、対立遺伝子バリアントであってもよい。対立遺伝子バリアントは、同じ染色体遺伝子座を占める、２つ以上の代替形態の遺伝子のいずれかを意味する。対立遺伝子変化は、天然には変異を通じて生じ、集団内に多型を生じることがある。バリアントプロモーターは、（ａ）ＤＮＡを、非常に低い、低、中、中〜高、高、または非常に高いストリンジェンシー条件下で、（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６、（ｉｉ）（ｉ）の部分配列または（ｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）の相補鎖とハイブリダイズさせること、および（ｂ）ＤＮＡからバリアントプロモーターを単離することによって得てもよい。ストリンジェンシーおよび洗浄条件は、本明細書中に定義されている通りである。
【００３５】
本発明のプロモーターは、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのプロモーター配列のライゲーションを容易にする特定の制限酵素認識部位を導入する目的で配列がリンカーとともに提供されることがある、プロモーターであってもよい。
【００３６】
本明細書中に提供される配列情報は、誤って同定された塩基の包含を必要とすると狭く解釈されるべきではない。本明細書中に開示されている特定の配列を容易に用いて、元々のＤＮＡ配列を、好ましくは糸状菌、具体的には黒色アスペルギルスから、単離し、配列決定の誤りを同定するさらなる配列分析に供することができる。
【００３７】
他に示されなければ、本明細書中のＤＮＡ分子の配列決定によって決定される全てのヌクレオチド配列は、自動化ＤＮＡシーケンサーを用いて決定される。したがって、この自動化アプローチによって決定された任意のＤＮＡ配列について当該分野で公知のように、本明細書中で決定された任意のヌクレオチド配列は、いくつかの誤りを含むことがある。自動操作によって決定されたヌクレオチド配列は、典型的には、配列決定されたＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、少なくとも約９０％同一、より典型的には少なくとも約９５％〜少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該分野で周知の手作業のＤＮＡ配列決定法を含む他のアプローチによって、より正確に決定することができる。
【００３８】
当業者は、かかる誤って同定された塩基を同定することができ、かかる誤りをどのようにして修正するかを知っている。
【００３９】
本発明は、典型的にはそれが関わるプロモーターの生物学的機能を変化させない変異を含む、機能的プロモーター同等物を包含する。用語「機能的同等物」はまた、黒色アスペルギルスＤＮＡ配列のオルソログを包含する。黒色アスペルギルスＤＮＡ配列のオルソログは、他の生物、他の真菌種または菌株から単離することができ、類似した、または同一の生物学的活性を有する、ＤＮＡ配列である。
【００４０】
本発明のプロモーター配列は、任意の属の微生物から得てもよい。本発明の目的のために、用語「から得られる」は、所定の供給源と関連して本明細書中で使用される場合、ポリペプチドが、供給源によって、または供給源由来の遺伝子が挿入された細胞によって、生成されることを意味する。
【００４１】
プロモーター配列は、真菌供給源、好ましくはカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、またはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株等の酵母株、より好ましくはサッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ジアスタティクス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ドウグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）またはサッカロミセス・オビフォルミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）株から得てもよい。
【００４２】
別の好ましい実施形態において、プロモーター配列は、アクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）、アスペルギルス、オーレオバシジウム（Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）、フィリバシジウム（Ｆｉｌｉｂａｓｉｄｉｕｍ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）、マグナポルテ（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ）、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）、ネオカリマスティクス（Ｎｅｏｃａｌｌｉｍａｓｔｉｘ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペシロマイセス（Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、ピロミセス（Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ）、スエヒロタケ（Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）、サーモアスカス（Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ）、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）、トリポクラジウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）、またはトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）株等の糸状菌株、好ましくはアスペルギルス・アキュリエタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、偽巣性コウジ菌、黒色アスペルギルス、コウジカビ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ソーヤ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、クリソスポリウム・ルクノウエンス（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・レエセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）株から得られる。
【００４３】
別の好ましい実施形態において、プロモーター配列は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ケレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・クルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンディ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティキュラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サンブシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）株から得られる。
【００４４】
上述の種について、本発明が、それらが知られている種名にかかわらず、完全および不完全世代、ならびに他の分類学上の同等物、例えば不完全世代を包含することが、理解されよう。当業者は、適当な同等物の独自性を、容易に認識しよう。これらの種の株は、米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）、菌株保存機関（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）、および北部地方研究センター（ＮＲＲＬ）の農業研究部特許菌株保存機関等のいくつかの菌株保存機関において、容易に公的に入手可能である。
【００４５】
さらに、本発明によるプロモーター配列は、上述のプローブを使用して、自然界（例えば、土壌、培養土、水等）から単離された微生物を含む他の供給源から同定および得ることができる。天然の生育地から微生物を単離するための技術は、当該分野で周知である。次いで、核酸配列を、別の微生物のゲノムＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることによって抽出することができる。プロモーターをコードする核酸配列が一旦プローブで検出されると、配列を、当業者に公知の技術を利用することによって、単離またはクローニングしてもよい（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、前出参照）。
【００４６】
本発明において、プロモーターＤＮＡ配列はまた、１つ以上の本発明のプロモーターの部分；本発明のプロモーターの部分および別の公知のプロモーターの部分、例えば一方のプロモーターのリーダー配列および他方のプロモーター由来の転写開始部位；または１つ以上の本発明のプロモーターの部分および１つ以上の他のプロモーターの部分を含む、ハイブリッドプロモーターであってもよい。他のプロモーターは、バリアント、トランケートされた、およびハイブリッドプロモーターを含む最適な宿主細胞中で転写活性を示す任意のプロモーター配列であってよく、宿主細胞にとって同種または異種のいずれかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得てもよい。他のプロモーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって天然でも外来性でもよく、細胞にとって天然でも外来性でもよい。
【００４７】
好ましい実施形態として、同定されたプロモーターの重要な調節部分配列を他の「基本的な」プロモーターに融合させて、それらのプロモーター活性を促進することができる（例えばモレキュラー・マイクロバイオロジー（Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）１９９４年５月、１２（３）：４７９〜９０頁。アスペルギルス・チュビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）のキシラナーゼｘｌｎＡ遺伝子の調節（Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｘｙｌａｎａｓｅ−ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｘｌｎＡ  ｇｅｎｅ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）。デグラーフ（ｄｅ  Ｇｒａａｆｆ）ＬＨ、ファンデンブルーク（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ）ＨＣ、ファンオーイェン（ｖａｎ  Ｏｏｉｊｅｎ）ＡＪ、ヴィッサー（Ｖｉｓｓｅｒ）Ｊ．に記載されているような）。
【００４８】
本発明のプロモーターとのハイブリッドプロモーターの構築に有用な他のプロモーターの他の例としては、コウジカビＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）アスパラギン酸プロテイナーゼ、黒色アスペルギルス中性α−アミラーゼ、黒色アスペルギルス酸安定性α−アミラーゼ、黒色アスペルギルスまたはアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、黒色アスペルギルスｇｐｄＡ、黒色アスペルギルスグルコースオキシダーゼｇｏｘＣ、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、コウジカビアルカリプロテアーゼ、コウジカビトリオースリン酸イソメラーゼ、偽巣性コウジ菌アセトアミダーゼ、およびフザリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（黒色アスペルギルス中性α−アミラーゼおよびコウジカビトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびサッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られるプロモーター、ならびにその変異体、トランケートされた、およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、ロマノス（Ｒｏｍａｎｏｓ）ら、１９９２年、イースト（Ｙｅａｓｔ）８：４２３〜４８８頁によって記載されている。
【００４９】
本発明において、プロモーターＤＮＡ配列はまた、「タンデムプロモーター」であってもよい。「タンデムプロモーター」は、本明細書中で、それぞれがコード配列と作動可能に関連し、ｍＲＮＡへのコード配列の転写を媒介する、２つ以上のプロモーター配列として定義される。
【００５０】
タンデムプロモーターは、２つ以上の本発明のプロモーター、または代替的に、１つ以上の本発明のプロモーター、およびハイブリッドプロモーターの構築に有用である上記で例示されたようなもの等の、１つ以上の他の公知のプロモーターを含む。タンデムプロモーターの２つ以上のプロモーター配列が、核酸配列の転写を同時に促進してもよい。あるいは、タンデムプロモーターの１つ以上のプロモーター配列が、細胞の成長の異なる段階または菌糸体の形態的に異なる部分で、核酸配列の転写を促進してもよい。
【００５１】
本発明において、プロモーターは、生物学的化合物をコードするコード配列にとって外来性であってもよく、および／またはプロモーターは、宿主細胞にとって外来性であってもよい。本発明のバリアント、ハイブリッド、またはタンデムプロモーターは、野生型プロモーターがコード配列または宿主細胞にとって天然であっても、コードするコード配列にとって外来性であると理解されよう。
【００５２】
本発明のバリアント、ハイブリッド、またはタンデムプロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、または配列番号６を有するプロモーターの、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約１００％、さらにより好ましくは少なくとも約２００％、最も好ましくは少なくとも約３００％、さらに最も好ましくは少なくとも約４００％のプロモーター活性を有する。プロモーター活性は、好ましくは、明細書中で前述したように決定される。
【００５３】
本発明はさらに、（単数形（「ａ」）は、本明細書中で、「少なくとも１つの」として定義される）上記で定義されたようなプロモーターＤＮＡ配列、およびコード配列がプロモーターＤＮＡ配列の制御下で発現できるように前記プロモーターＤＮＡ配列に作動可能に関連しているコード配列を含む、ＤＮＡ構築物に関する。これは、任意の適した宿主細胞中で試験してもよい。あるいは、これは、適したインビトロ発現および／または翻訳系において試験してもよい。コード配列は、任意の原核、真核、または他の供給源から得てもよい。あるいは、コード配列は、合成、または部分的合成配列でもよい。合成遺伝子のコドン使用頻度は、宿主細胞種のコドン使用頻度に適合するよう最適化されて、コードされる生物学的物質の発現および／または分泌を改善されていてもよい。コドン使用頻度最適化の例は、国際公開第９７／１１０８６号パンフレットに記載されており、ここでは、植物ポリペプチドのコドンが、糸状菌細胞における発現に最大限活用されている。好ましくは、コード配列は、生物学的化合物をコードする。
【００５４】
あるいは、コード配列は、アンチセンスＲＮＡおよび／またはＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）構築物の発現をコードしてもよい。アンチセンスＲＮＡの発現の例は、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マイクロバイオロジー（Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）２０００年２月、６６（２）：７７５〜８２頁に示されている。（黒色アスペルギルスのタンパク質分泌経路における、フォルダーゼ、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼＡの特徴付け（Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｆｏｌｄａｓｅ，  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｉｓｏｍｅｒａｓｅ  Ａ，ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｐａｔｈｗａｙ  ｏｆ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）。ニャム（Ｎｇｉａｍ）Ｃ、ジェーネス（Ｊｅｅｎｅｓ）ＤＪ、プント（Ｐｕｎｔ）ＰＪ、ファンデンホンデル（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）ＣＡ、アーチャー（Ａｒｃｈｅｒ）ＤＢ）または（ズレンナー（Ｚｒｅｎｎｅｒ）Ｒ、ウィルミッツァー（Ｗｉｌｌｍｉｔｚｅｒ）Ｌ、ゾンネワルド（Ｓｏｎｎｅｗａｌｄ）Ｕ．ジャガイモウリジン二リン酸−グルコースピロホスホリラーゼの発現およびアンチセンスＲＮＡによるその阻害の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｔａｔｏ  ｕｒｉｄｉｎｅｄｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｇｌｕｃｏｓｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ）。プランタ（Ｐｌａｎｔａ．）（１９９３年）、１９０（２）：２４７〜５２頁）遺伝子の発現の完全な不活性化は、例えば、代謝経路の望ましくない側枝を制御する遺伝子を不活性化して、例えば（β−ラクタム）抗生物質またはカロテノイド等の特定の二次代謝産物の生成を増大させるのに、有用である。完全な不活性化はまた、毒性または望ましくない化合物の生成を減少させるのに有用である（ペニシリウム中のクリソゲニン、アスペルギルス中のアフラトキシン：マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ）ＫＤら、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）におけるペニシリンおよびクリソゲニン生成のヘテロカリオン研究および遺伝子制御（ｈｅｔｅｒｏｋａｒｙｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ  ａｎｄ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｉｎ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）。ジャーナル・オブ・ジェネラル・マイクロバイオロジー（Ｊ  Ｇｅｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）（１９６３年）３３：３７５〜８３頁）。完全な不活性化はまた、発酵プロセスまたは下流のプロセシングが改善されるように、生物の形態を変化させるのに有用である。
【００５５】
本発明の別の実施形態は、宿主細胞の広範な代謝再プログラミングまたはエンジニアリングに関する。完全な新しい経路の導入および／または望ましくない経路の改変は、タンパク質または代謝産物等の特定の生物学的化合物の生成に特に適合した細胞を提供する。
【００５６】
本発明の方法において、コード配列がポリペプチドをコードする場合、前記ポリペプチドとしては、別のポリペプチドがポリペプチドまたはその断片のＮ末端またはＣ末端に融合している、融合またはハイブリッドポリペプチドも挙げることができる。融合ポリペプチドは、１つのポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）を、別のポリペプチドをコードする核酸配列（またはその一部）に融合させることによって、生成される。融合ポリペプチドを生成するための技術は当該分野で公知であり、ポリペプチドをコードするコード配列を、それらがインフレームであり、融合ポリペプチドの発現が同じプロモーターおよびターミネーターの制御下にあるように、ライゲートすることを含む。ハイブリッドポリペプチドは、１つ以上が真菌細胞にとって異種であってもよい少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる、部分的または完全なポリペプチド配列の組み合わせを含んでもよい。
【００５７】
ＤＮＡ構築物は、制御配列と適合性のある条件下での適した宿主細胞中でのコード配列の発現を導くプロモーターＤＮＡ配列に加えて、１つ以上の制御配列を含んでもよい。発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの生成に関与する任意の工程を含むと理解されよう。１つ以上の制御配列は、コード配列または宿主にとって天然であってもよい。あるいは、宿主細胞中での制御配列の発現を改善するために、１つ以上の制御配列が、核酸配列にとって外来性の１つ以上の制御配列で置換されていてもよい。
【００５８】
「ＤＮＡ構築物」は、本明細書中で、天然に存在する遺伝子から単離されたか、または他では自然界に存在しないように組み合わせまたは並置された核酸のセグメントを含むよう修飾されている、一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子として定義される。用語、ＤＮＡ構築物は、ＤＮＡ構築物がコード配列、およびコード配列の発現に必要な全ての制御配列を含む場合、用語、発現カセットと同義である。
【００５９】
用語「制御配列」は、本明細書中で、本発明のプロモーターを含む、コード配列の発現に必要または有利な、全ての成分を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとって、天然でも外来性でもよい。かかる制御配列としては、リーダー、翻訳開始配列（コザック（Ｋｏｚａｋ）、１９９１年、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２６６：１９８６７〜１９８７０頁）、翻訳イニシエーターコード配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、上流の活性化配列、バリアント、断片、ならびにそれら由来のハイブリッドおよびタンデムプロモーターを含む本発明のプロモーター、転写ターミネーター、ならびに翻訳ターミネーターが挙げられるが、これらに限定されない。最低限、制御配列は、転写および翻訳停止シグナルならびに本発明のプロモーター（の一部）を含む。制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との制御配列のライゲーションを容易にする特定の制限酵素認識部位を導入する目的で、リンカーとともに提供されてもよい。
【００６０】
制御配列は、適した転写ターミネーター配列、すなわち、宿主細胞によって認識されて転写を終了させる配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするコード配列の３’末端と、作動可能に関連している。最適な宿主細胞中で機能的である、任意のターミネーターを、本発明において使用してもよい。
【００６１】
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、コウジカビＴＡＫＡアミラーゼ、黒色アスペルギルスグルコアミラーゼ、偽巣性コウジ菌アントラニル酸シンターゼ、黒色アスペルギルスα−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子、およびフザリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【００６２】
酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびサッカロミセス・セレビシエグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、ロマノス（Ｒｏｍａｎｏｓ）ら、１９９２年、前出によって記載されている。
【００６３】
制御配列はまた、適したリーダー配列、すなわち、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの５’非翻訳領域であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端と作動可能に関連している。最適な宿主細胞中で機能的である任意のリーダー配列を、本発明において使用してもよい。
【００６４】
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、コウジカビＴＡＫＡアミラーゼ、偽巣性コウジ菌トリオースリン酸イソメラーゼおよび黒色アスペルギルスｇｌａＡの遺伝子から得られる。
【００６５】
酵母宿主細胞のための適したリーダーは、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、サッカロミセス・セレビシエα−因子、およびサッカロミセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【００６６】
制御配列はまた、核酸配列の３’末端と作動可能に関連していて、転写されると宿主細胞によってシグナルとして認識されてポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加する配列である、ポリアデニル化配列であってもよい。最適な宿主細胞中で機能的である任意のポリアデニル化配列を、本発明において使用してもよい。
【００６７】
糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、コウジカビＴＡＫＡアミラーゼ、黒色アスペルギルスグルコアミラーゼ、偽巣性コウジ菌アントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼ、および黒色アスペルギルスα−グルコシダーゼの遺伝子から得られる。
【００６８】
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、クオ（Ｇｕｏ）およびシャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）、１９９５年、モレキュラー・セルラー・バイオロジー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）１５：５９８３〜５９９０頁に記載されている。
【００６９】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結したアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に導く、シグナルペプチドコード領域であってもよい。核酸配列のコード配列の５’末端は、本来、翻訳リーディングフレーム中で、分泌されるポリペプチドをコードするコドン領域のセグメントと天然に連結しているシグナルペプチドコード領域を含んでもよい。あるいは、コード配列の５’末端は、コード配列にとって外来性であるシグナルペプチドコード領域を含んでもよい。外来性シグナルペプチドコード領域は、コード配列が天然にシグナルペプチドコード領域を含まない場合、必要なことがある。あるいは、外来性シグナルペプチドコード領域は、単純に、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード領域を置換することがある。しかしながら、発現されたポリペプチドを最適な宿主細胞の分泌経路に導く任意のシグナルペプチドコード領域を、本発明において使用してもよい。
【００７０】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、コウジカビＴＡＫＡアミラーゼ、黒色アスペルギルス中性アミラーゼ、Ａ．フィキューム（Ａ．ｆｉｃｕｕｍ）フィターゼ、黒色アスペルギルスグルコアミラーゼ、黒色アスペルギルスエンドキシラナーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソレンスセルラーゼ、およびフミコラ・ラヌギノサリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域である。
【００７１】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、サッカロミセス・セレビシエα−因子およびサッカロミセス・セレビシエインベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、ロマノス（Ｒｏｍａｎｏｓ）ら、１９９２年、前出によって記載されている。
【００７２】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域であってもよい。得られたポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはいくつかの場合においてはチモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟した活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域は、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）アルカリホスファターゼ（ａｐｒＥ）、枯草菌中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、サッカロミセス・セレビシエα−因子、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、ミセリオフトラ・サーモフィララッカーゼ（国際公開第９５／３３８３６号パンフレット）および黒色アスペルギルスエンドキシラナーゼ（ｅｎｄｏ１）の遺伝子から得てもよい。
【００７３】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【００７４】
宿主細胞の増殖に関連するポリペプチドの発現の調節を可能にする調節配列を付加することもまた、望ましい場合がある。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的または物理的刺激に応答して、スイッチが入ったり切れたりする遺伝子の発現を引き起こすものである。原核系における調節系としては、ｌａｃ、およびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母においては、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系を用いてもよい。糸状菌においては、米国特許第５，５０３，９９１号明細書）に記載されているような、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、黒色アスペルギルスグルコアミラーゼプロモーター、コウジカビグルコアミラーゼプロモーター、Ａ．チュビゲンシスエンドキシラナーゼ（ｘｌｎＡ）プロモーター、黒色アスペルギルス硝酸レダクターゼ（ｎｉａＤ）プロモーター、トリコデルマ・レエセイセロビオヒドロラーゼプロモーターならびに偽巣性コウジ菌アルコールおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（それぞれａｌｃＡおよびａｌｄＡ）プロモーターを、調節配列として使用してもよい。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核系において、これらのものとしては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸還元酵素遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、調節配列と作動可能に関連している。
【００７５】
ｃｒｅＡ結合部位（ＥＰ６７３４２９号明細書にこれまでに記載されているような炭素異化産物抑制）の除去、ｐａｃＣおよびａｒｅＡの変化（ｐＨおよび窒素調節について）が重要な場合がある。
【００７６】
好ましくは、ＤＮＡ構築物は、本発明のプロモーターＤＮＡ配列、前記プロモーターＤＮＡ配列と作動可能に関連しているコード配列、ならびに
−以下の配列のリスト：ＴＡＡＧ、ＴＡＧＡおよびＴＡＡＡから選択される、５’から３’への方向に方向付けられた、１つの翻訳終止配列、好ましくはＴＡＡＡ、および／または
−以下の配列のリスト：
【化１】
2008531031.tif 000003
から選択される、５’から３’への方向に方向付けられた、１つの翻訳イニシエーターコード配列、好ましくは
【化２】
2008531031.tif 000004
および／または
−ヌクレオチドの多義性コード：ｍ（Ａ／Ｃ）、ｗ（Ａ／Ｔ）、ｙ（Ｃ／Ｔ）、ｋ（Ｇ／Ｔ）、ｈ（Ａ／Ｃ／Ｔ）を用いて以下の配列のリスト：
【化３】
2008531031.tif 000005
から選択される、１つの翻訳イニシエーター配列、好ましくは
【化４】
2008531031.tif 000006
等の翻訳制御配列を含む。
【００７７】
本発明の文脈において、用語「翻訳イニシエーターコード配列」は、ＤＮＡコード配列のオープンリーディングフレームのイニシエーターまたは開始コドンのすぐ下流の９つのヌクレオチドとして定義される。イニシエーターまたは開始コドンは、アミノ酸メチオニンをコードする。イニシエーターコドンは、典型的にはＡＴＧであるが、ＧＴＧ等の任意の機能的な開始コドンであってもよい。
【００７８】
本発明の文脈において、用語「翻訳終止配列」は、オープンリーディングフレームまたはヌクレオチドコード配列の３’末端の翻訳終止コドンから始まる３つまたは４つのヌクレオチドとして定義され、５’から３’への方向に方向付けられている。
【００７９】
本発明の文脈において、用語「翻訳イニシエーター配列」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームのイニシエーターまたは開始コドンのすぐ上流の１０個のヌクレオチドとして定義される。イニシエーターまたは開始コドンは、アミノ酸メチオニンをコードする。イニシエーターコドンは、典型的にはＡＴＧであるが、ＧＴＧ等の任意の機能的な開始コドンであってもよい。ウラシル、Ｕが、ＲＮＡ中で、デオキシヌクレオチドチミン、Ｔにとって代わることが、当該分野で周知である。
【００８０】
本発明はまた、本発明のプロモーター、ポリペプチドをコードするコード配列、ならびに転写および翻訳イニシエーターおよび終止シグナルを含む、組み換え発現ベクターに関する。
【００８１】
上記の種々のコードおよび制御配列を連結して、１つ以上の簡便な組み換え制限酵素認識部位を含んでかかる部位でのプロモーターおよび／またはポリペプチドをコードするコード配列の挿入または置換を可能にしてもよい、組み換え発現ベクターを生じてもよい。あるいは、コード配列およびプロモーターの融合は、例えば、ジーン（Ｇｅｎｅ）１９８９年４月１５日、７７（１）：５１〜９頁、ホー（Ｈｏ）ＳＮ、ハント（Ｈｕｎｔ）ＨＤ、ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）ＲＭ、ピューレン（Ｐｕｌｌｅｎ）ＪＫ、ピース（Ｐｅａｓｅ）ＬＲ「ポリメラーゼ連鎖反応を用いたオーバーラップエクステンションによる部位特異的突然変異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）」に記載されているような、ＰＣＲを用いた配列オーバーラップエクステンション（ＳＯＥ−ＰＣＲ）によって、またはゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）ＴＭクローニングシステム（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いてクローニングすることによって、行うことができる。あるいは、コード配列は、コード配列、またはプロモーターおよび／もしくはコード配列を含むＤＮＡ構築物を、発現のための適当なベクターに挿入することによって、発現してもよい。発現ベクターの作製において、コード配列は、コード配列が本発明のプロモーターおよび１つ以上の発現のための適当な制御配列と作動可能に関連するようにベクター中に配置される。
【００８２】
組み換え発現ベクターは、組み換えＤＮＡ手順に簡便に供することができ、コード配列の発現を実現することができる、任意のベクターであってよい（例えば、プラスミドまたはウイルス）。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞との、ベクターの適合性に依存する。ベクターは、線状でも閉環状プラスミドでもよい。
【００８３】
ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製から独立している、染色体外の実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体であってもよい。自己複製のために、ベクターは、問題の宿主細胞中でのベクターの自律的な複製を可能にする、複製起点を含んでもよい。酵母宿主細胞における使用のための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組み合わせ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組み合わせである。複製起点は、宿主細胞中でその機能を温度感受性にする変異を有するものであってもよい（例えば、エールリッヒ（Ｅｈｒｌｉｃｈ）、１９７８年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ）７５：１４３３頁参照）。糸状菌における、自律的に維持されたクローニングベクターの例は、ＡＭＡ１配列を含むクローニングベクターである。ＡＭＡ１は、アスペルギルスにおいて自律維持することができる、偽巣性コウジ菌から単離された６．０ｋｂのゲノムＤＮＡ断片である（例えば、アレクセンコ（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ）およびクラターバック（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ）（１９９７年）、フンガル・ジェネティクス・アンド・バイオロジー（Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．）２１：３７３〜３９７頁参照）。
【００８４】
あるいは、ベクターは、宿主細胞に導入されたときに、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体とともに複製されるものであってもよい。さらに、ともに宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを含む、単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミド、またはトランスポゾンを使用してもよい。
【００８５】
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする、１つ以上の選択マーカーを含む。宿主は、一方が選択マーカーを含む、少なくとも２つのベクターで、同時形質転換されてもよい。選択マーカーは、その産物が殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養素要求株に対する原栄養性等を提供する、遺伝子である。酵母宿主細胞のために適したマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの同等物が挙げられるが、これらに限定されない。例えばフレオマイシン、ハイグロマイシンＢまたはＧ４１８に対する耐性を与えるマーカーもまた、使用することができる。偽巣性コウジ菌またはコウジカビのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子ならびにストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子が、アスペルギルス細胞における使用に好ましい。ａｍｄＳマーカー遺伝子は、好ましくは、ＥＰ６３５５７４号明細書または国際公開第９７／０６２６号パンフレットに記載されている技術を適用して使用される。好ましい選択マーカー遺伝子は、偽巣性コウジ菌ｇｐｄＡプロモーターに融合した偽巣性コウジ菌ａｍｄＳコード配列である（ＥＰ６３５５７４号明細書）。他の糸状菌由来のａｍｄＳ遺伝子もまた、使用してもよい（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。
【００８６】
宿主細胞ゲノムへの組み込みのために、ベクターは、プロモーター配列および／またはポリペプチドをコードするコード配列または相同もしくは非相同組み換えによるゲノムへのベクターの安定した組み込みのためのベクターの任意の他の要素に依存してもよい。あるいは、ベクターは、相同組み換えによる組み込みを宿主細胞のゲノムに導くための、さらなる核酸配列を含んでもよい。さらなる核酸配列によって、ベクターを、染色体中の予め決定された標的遺伝子座で、宿主細胞ゲノムに組み込むことができるようになる。正確な位置での組み込みの可能性を増大させるために、組み込み要素は、好ましくは、相同組み換えの可能性を増強するための対応する標的配列と高度に相同な、３０〜１，５００塩基対、好ましくは１００〜１，５００塩基対、より好ましくは４００〜１，５００塩基対、より好ましくは８００〜１，５００塩基対、最も好ましくは少なくとも２ｋｂ等の、十分な数の核酸を含むべきである。組み込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列に相同な、任意の配列であってもよい。さらに、組み込み要素は、非コードまたはコード核酸配列であってもよい。標的とする組み込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に線状化される。線状化は、好ましくは、クローニングベクターの、少なくとも一方、好ましくは両方の末端が、標的遺伝子座に相同な配列で挟まれるように、行われる。
【００８７】
好ましくは、標的遺伝子座に相同な、クローニングベクター中の組み込み要素は、真菌宿主細胞中での高い発現レベルが可能な遺伝子に由来することを意味する、高発現遺伝子座に由来する。高い発現レベルが可能な遺伝子、すなわち高発現遺伝子は、本明細書中で、例えば誘導条件下で、そのｍＲＮＡが全細胞ｍＲＮＡの少なくとも０．５％（ｗ／ｗ）を構成する遺伝子、または代替的に、その遺伝子産物が全細胞タンパク質の少なくとも１％（ｗ／ｗ）を構成するか、もしくは分泌される遺伝子産物の場合、少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルまで分泌されることができる、遺伝子として定義される（ＥＰ３５７１２７Ｂ１号明細書に記載されているように）。いくつかの、好ましい高発現真菌遺伝子を、例として示す。アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）またはトリコデルマ由来の、アミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ遺伝子。これらの目的のための、最も好ましい、高発現遺伝子は、グルコアミラーゼ遺伝子、好ましくは黒色アスペルギルスグルコアミラーゼ遺伝子、コウジカビＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、偽巣性コウジ菌ｇｐｄＡ遺伝子、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６の遺伝子座、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６の黒色アスペルギルス遺伝子座、またはトリコデルマ・レエセイセロビオヒドロラーゼ遺伝子である。
【００８８】
一方、ベクターは、非相同組み換えによって、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【００８９】
生物学的化合物をコードする、１つより多いコピーの核酸配列を宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の生成を増大させてもよい。これは、好ましくはそのゲノムにＤＮＡ配列のコピーを組み込むことによって、より好ましくはＤＮＡ配列の組み込みを高発現遺伝子座、好ましくはグルコアミラーゼ遺伝子座または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、もしくは配列番号６の遺伝子座に標的化することによって、行うことができる。あるいは、これは、核酸配列を有する増幅可能な選択マーカー遺伝子を含むことによって、行うことができ、ここで増幅された選択マーカー遺伝子のコピー、およびそれによってさらなる核酸配列のコピーを含む細胞は、適当な選択物質の存在下で細胞を培養することによって、選択することができる。さらにより多く、過剰発現されるＤＮＡ配列のコピーの数を増大させるために、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載されているような遺伝子変換の技術を使用してもよい。相同組み換えによる、核酸構築物の、宿主細胞のゲノムへの、標的とする組み込み、すなわち予め決定された標的遺伝子座での組み込みの効率は、好ましくは、宿主細胞の、増大した相同組み換え能力によって増大する。細胞のかかる表現型は、好ましくは、国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットに記載されているように、ｈｄｆＡまたはｈｄｆＢ遺伝子の欠損を伴う。国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットは、標的とする組み込みの増大した効率を含む、糸状菌宿主細胞を得るための、好ましい方法を開示している。
【００９０】
上述の要素をライゲートして本発明の組み換え発現ベクターを構築するのに使用される手順は、当業者に周知である（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、１９８９年、前出）。
【００９１】
本発明はまた、コード配列と作動可能に関連している本発明のプロモーターＤＮＡ配列を含む、組み換え宿主細胞に関し、前記宿主細胞は、生物学的化合物の生成において有利に使用される。コード配列と作動可能に関連している本発明のプロモーターを含むベクターは、前述の染色体組み込み体（ｉｎｔｅｇｒａｎｔ）または自己複製染色体外ベクターとしてベクターが維持されるように、宿主細胞に導入される。用語「宿主細胞」は、増幅の間に起きる変異のために親細胞と同一でない、親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、大部分、コード配列の起源および本発明のプロモーターの起源に依存する。当業者は、最適な宿主細胞をどのようにして選択するかを知っているであろう。
【００９２】
本発明はまた、１つより多い本発明のプロモーターＤＮＡ配列を含み、各プロモーターがコード配列と作動可能に関連している、組み換え宿主細胞に関する。かかる宿主細胞は、少なくとも１つの生物学的化合物の組み換え生成において、有利に使用することができる。あるいは、本発明の組み換え宿主細胞は、当該分野で公知のプロモーターと組み合わせて、１つ以上の本発明のプロモーターを含んでもよい。当該分野で公知のかかるプロモーターとしては、Ａ．チュビゲンシスｘｌｎＡ  コウジカビＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイアスパラギン酸プロテイナーゼ、黒色アスペルギルス中性α−アミラーゼ、黒色アスペルギルス酸安定性α−アミラーゼ、黒色アスペルギルスもしくはアスペルギルス・アワモリグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、黒色アスペルギルスｇｐｄＡ、黒色アスペルギルスグルコースオキシダーゼｇｏｘＣ、リゾムコール・ミエヘイリパーゼ、コウジカビアルカリプロテアーゼ、コウジカビトリオースリン酸イソメラーゼ、偽巣性コウジ菌アセトアミダーゼ、およびフザリウム・オキシスポラムトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（黒色アスペルギルス中性α−アミラーゼおよびコウジカビトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、サッカロミセス・セレビシエエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびサッカロミセス・セレビシエ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、ならびにそれらの変異、トランケートされた、およびハイブリッドプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、ロマノス（Ｒｏｍａｎｏｓ）ら、１９９２年、イースト（Ｙｅａｓｔ）８：４２３〜４８８頁によって記載されている。好ましくは、少なくとも１つのプロモーターおよびその関連するコード配列が、ベクター上に存在する。ベクターは、染色体組み込み体として、および／または前述の自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、宿主細胞に導入される。
【００９３】
本発明の宿主細胞および本発明の方法論において使用される宿主細胞は、任意の宿主細胞であってよい。好ましくは、本発明の宿主細胞は、真菌細胞である。「真菌」は、本明細書中で使用される場合、子嚢菌門、端子菌門、ツボカビ門、および接合菌門を含む（ホークスワース（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）らによって、エーンズワース・アンド・ビスビーズ・ディクショナリー・オブ・ファンジャイ（Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｂｉｓｂｙ’ｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｆｕｎｇｉ）、第８版、１９９５年、ＣＡＢインターナショナル（ＣＡＢ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎｌ）、ユニバーシティ・プレス（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ）、英国ケンブリッジ中で定義されているような）、ならびに卵菌（ホークスワース（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）ら、１９９５年、前出、１７１頁に引用されているような）、および全ての栄養胞子形成菌（ホークスワース（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）ら、１９９５年、前出）を含む。
【００９４】
より好ましい実施形態において、真菌宿主細胞は、酵母細胞である。「酵母」は、本明細書中で使用される場合、有子嚢胞子酵母（エンドミケス目（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）、有担子胞子酵母、および不完全菌類に属する酵母（分芽菌（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｔｅｓ））を含む。酵母の分類は将来変化することがあるので、本発明の目的のためには、酵母は、バイオロジー・アンド・アクティビティーズ・オブ・イースト（Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｙｅａｓｔ）（スキナー（Ｓｋｉｎｎｅｒ），Ｆ．Ａ．、パスモア（Ｐａｓｓｍｏｒｅ），Ｓ．Ｍ．、およびダベンポート（Ｄａｖｅｎｐｏｒｔ），Ｒ．Ｒ．編、ソサイエティー・オブ・アプライド・バクテリオロジー・シンポジウム・シリーズ（Ｓｏｃ．Ａｐｐ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ）第９号、１９８０年）に記載されているように定義されるものとする。
【００９５】
さらにより好ましい実施形態において、酵母宿主細胞は、カンジダ、ハンゼヌラ、クルイベロミセス、ピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、またはヤロウィア細胞である。
【００９６】
最も好ましい実施形態において、酵母宿主細胞は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス、サッカロミセス・セレビシエ、サッカロミセス・ジアスタティクス、サッカロミセス・ドウグラシイ、サッカロミセス・クルイベリ、サッカロミセス・ノルベンシスまたはサッカロミセス・オビフォルミス細胞である。別の最も好ましい実施形態において、酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）細胞である。別の最も好ましい実施形態において、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）細胞である。
【００９７】
別の好ましい実施形態において、真菌宿主細胞は、糸状菌細胞である。「糸状菌」としては、全ての糸状形態の、真菌類および卵菌の亜門が挙げられる（ホークスワース（Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈ）ら、１９９５年、前出によって定義されるような）。糸状菌は、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、および他の複合多糖で構成される菌糸壁によって特徴付けられる。栄養成長は菌糸の伸長により、炭素異化は、絶対好気性である。対照的に、サッカロミセス・セレビシエ等の酵母による栄養成長は、単細胞性葉状体の出芽により、炭素異化は発酵性の場合がある。
【００９８】
好ましくは、糸状菌宿主細胞は、アクレモニウム、アスペルギルス、クリソスポリウム、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）、フミコラ、ムコール、ミセリオフトラ、ニューロスポラ、ペニシリウム、チエラビア、トリポクラジウム、またはトリコデルマ属、より好ましくは、アスペルギルス、クリソスポリウム、ペニシリウム、またはトリコデルマ属の細胞である。
【００９９】
より好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、アスペルギルス・アワモリ、アスペルギルス・フォエティダス、アスペルギルス・ジャポニクス、偽巣性コウジ菌、黒色アスペルギルス、Ａ．ソーヤ、またはコウジカビ細胞である。別の、より好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、クリソスポリウム・ルクノウエンス、フザリウム・バクトリジオイデス、フザリウム・ケレアリス、フザリウム・クルークウェレンス、フザリウム・クルモラム、フザリウム・グラミネアラム、フザリウム・グラミナム、フザリウム・ヘテロスポラム、フザリウム・ネグンディ、フザリウム・オキシスポラム、フザリウム・レティキュラタン（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｎ）、フザリウム・ロゼウム、フザリウム・サンブシナム、フザリウム・サルコクロウム、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム、フザリウム・トルロサム、フザリウム・トリコテシオイデス、またはフザリウム・ベネナタム細胞である。別の、より好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、フミコラ・インソレンス、フミコラ・ラヌギノサ、ムコール・ミエヘイ、ミセリオフトラ・サーモフィラ、アカパンカビ、ペニシリウム・パープロゲナム、ペニシリウム・クリソゲナム、チエラビア・テレストリス（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、トリコデルマ・ハルジアナム、トリコデルマ・コニンギ、トリコデルマ・ロンギブラキアタム、トリコデルマ・レエセイ、またはトリコデルマ・ビリデ細胞である。最も好ましい実施形態において、糸状菌宿主細胞は、黒色アスペルギルス、コウジカビ、アスペルギルス・ソーヤ、クリソスポリウム・ルクノウエンス、トリコデルマ・レエセイまたはペニシリウム・クリソゲナムからなる群より選択される種である。最も好ましい黒色アスペルギルス宿主細胞は、ＣＢＳ５１３．８８またはその派生物である。
【０１００】
いくつかの菌株の糸状菌が、米国微生物系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）、菌株保存機関（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）、および北部地方研究センター（ＮＲＲＬ）の農業研究部特許菌株保存機関、黒色アスペルギルスＣＢＳ５１３．８８、コウジカビＡＴＣＣ２０４２３、ＩＦＯ４１７７、ＡＴＣＣ１０１１、ＡＴＣＣ９５７６、ＡＴＣＣ１４４８８〜１４４９１、ＡＴＣＣ１１６０１、ＡＴＣＣ１２８９２、Ｐ．クリソゲナムＣＢＳ４５５．９５、ペニシリウム・シトリナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｉｔｒｉｎｕｍ）ＡＴＣＣ３８０６５、ペニシリウム・クリソゲナムＰ２、アクレモニウム・クリソゲナム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）ＡＴＣＣ３６２２５またはＡＴＣＣ４８２７２、トリコデルマ・レエセイＡＴＣＣ２６９２１またはＡＴＣＣ５６７６５またはＡＴＣＣ２６９２１、アスペルギルス・ソーヤＡＴＣＣ１１９０６、クリソスポリウム・ルクノウエンスＡＴＣＣ４４００６等のいくつかの菌株保存機関で、公的に容易に入手可能である。
【０１０１】
宿主細胞は、野生型糸状菌宿主細胞またはバリアント、変異または遺伝子組み換え糸状菌宿主細胞であってもよい。本発明の好ましい実施形態において、宿主細胞は、プロテアーゼ欠損またはプロテアーゼマイナス株である。これは、「ａｌｐ」と名づけられたアルカリプロテアーゼ遺伝子が欠損したプロテアーゼ欠損株コウジカビＪａＬ１２５（国際公開第９７／３５９５６号パンフレットまたはＥＰ４２９４９０号明細書に記載されている）、または国際公開第９６／１４４０４号パンフレットに開示されている黒色アスペルギルスのトリペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＴＲＡＰ）欠損株であってもよい。さらに、国際公開第０１／６８８６４号パンフレットに記載されているような、転写活性化因子（ｐｒｔＴ）の生成が減少した宿主細胞もまた、本発明に従って企図される。別の特に企図される宿主細胞は、コウジカビＢＥＣｈ２であり、ここで親株ＩＦ０４１７７中に存在する３つのＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子は不活性化されている。また、２つのプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼおよび中性メタロプロテアーゼ１１は、遺伝子破壊によって破壊されている。代謝産物シクロピアゾン酸およびコウジ酸を形成する能力は、変異によって破壊されている。ＢＥＣｈ２は、国際公開第００／３９３２２号パンフレットに記載されており、ここでも米国特許第５，７６６，９１２号明細書にＡ１５６０として開示されているＩＦ０４１７７の変異であった、ＪａＬ２２８に由来する（国際公開第９８／１２３００号パンフレットに記載されている）。
【０１０２】
場合により、糸状菌宿主細胞は、野生型細胞と比較して上昇した、小胞体ストレス応答（ＵＰＲ）を含み、目的のポリペプチドの生成能力を促進する。ＵＰＲは、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７０Ａ１号明細書および／または米国特許出願公開第２００１／００３４０４５Ａ１号明細書および／または国際公開第０１／７２７８３Ａ２号パンフレットおよび／または国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットに記載されている技術によって、増大させてもよい。より具体的には、ＨＡＣ１および／もしくはＩＲＥ１および／もしくはＰＴＣ２のタンパク質レベルが調節され、ならびに／または上昇したＵＰＲを有する宿主細胞を得るためにＳＥＣ６１タンパク質が遺伝子工学によって処理されている。
【０１０３】
代替的に、または上昇したＵＰＲと組み合わせて、目的のポリペプチドの生成能力を増強するために、宿主細胞を遺伝子組み換えして、野生型細胞と比較して、より低いプロテアーゼ発現および／またはプロテアーゼ分泌を示す表現型が得られる。かかる表現型は、プロテアーゼの発現の転写調節因子の欠失および／または修飾および／または不活性化によって得てもよい。かかる転写調節因子は、例えば、ｐｒｔＴである。ｐｒｔＴの調節によってプロテアーゼの発現を低下させることは、米国特許出願公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書およびＥＰ２００５／０５５１４５号明細書に記載されている技術によって行ってもよい。
【０１０４】
代替的に、または上昇したＵＰＲならびに／またはより低いプロテアーゼ発現および／もしくはプロテアーゼ分泌を示す表現型と組み合わせて、宿主細胞は、目的のポリペプチドの生成の収量を増強するために、シュウ酸塩欠損表現型を示す。シュウ酸塩欠損表現型は、国際公開第２００４／０７００２２Ａ２号パンフレットおよび国際公開第２０００／５０５７６号パンフレットに記載されている技術によって得てもよい。
【０１０５】
代替的に、または上昇したＵＰＲならびに／またはより低いプロテアーゼ発現および／もしくはプロテアーゼ分泌ならびに／またはシュウ酸塩欠損を示す表現型と組み合わせて、宿主細胞は、野生型細胞と比較して、表現型の違いを示し、目的のポリペプチドの生成の収量を増強する。これらの違いとしては、低下したグルコアミラーゼおよび／または中性α−アミラーゼＡおよび／または中性α−アミラーゼＢ、α−１，６トランスグルコシダーゼ、プロテアーゼ、およびシュウ酸ヒドロラーゼの発現が挙げられるが、これらに限定されない。宿主細胞によって示される、前記表現型の違いは、米国特許出願公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書に記載されている技術に従って、遺伝子組み換えによって得てもよい。
【０１０６】
代替的に、または本明細書中で上述した表現型と組み合わせて、相同組み換えによる宿主細胞のゲノムへの核酸構築物の、標的とする組み込み、すなわち予め決定された標的遺伝子座での組み込みの効率は、好ましくは、宿主細胞の、増大した相同組み換え能力によって増大する。かかる細胞の表現型は、好ましくは、国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットに記載されているような、ｈｄｆＡまたはｈｄｆＢ遺伝子の欠損を伴う。国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットは、標的とする組み込みの増大した効率を含む糸状菌細胞を得る、好ましい方法を開示している。
【０１０７】
真菌細胞は、それ自体公知であるように、プロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を伴うプロセスによって形質転換してもよい。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適した手順は、ＥＰ２３８０２３号明細書およびイェルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）ら、１９８４年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ）８１：１４７０〜１４７４頁に記載されている。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いたアスペルギルスおよび他の糸状菌宿主細胞の形質転換のための適した手順は、例えば、ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１９９８年９月、１６（９）：８３９〜４２頁に記載されている。ネイチャー・バイオテクノロジー（Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ）１９９８年１１月、１６（１１）：１０７４頁の正誤表。糸状菌のアグロバクテリウム・トゥメファシエンス媒介性形質転換（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｉ）。デグルート（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ）ＭＪ、バンドック（Ｂｕｎｄｏｃｋ）Ｐ、ホーイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ）ＰＪ、バイエルスバーガン（Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ）ＡＧ、ユニリーバ（Ｕｎｉｌｉｅｖｅｒ）研究所、オランダ、フラールディンゲン。フザリウム種を形質転換するための適した方法は、マラーディー（Ｍａｌａｒｄｉｅｒ）ら、１９８９年、ジーン（Ｇｅｎｅ）７８、１４７〜１５６頁および国際公開第９６／００７８７号パンフレットによって記載されている。酵母は、エイベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ），Ｊ．Ｎ．およびサイモン（Ｓｉｍｏｎ），Ｍ．Ｉ．編、ガイド・トゥ・イースト・ジェネティクス・アンド・モレキュラー・バイオロジー，メソッズ・イン・エンザイモロジー（Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第１９４巻、１８２〜１８７頁、アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク中のベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）およびグアレンテ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）；イトウ（Ｉｔｏ）ら、１９８３年、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）１５３：１６３頁；ならびにヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら、１９７８年、プロシーディングス・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンシーズＵＳＡ（Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ）７５：１９２０頁によって記載されている手順を用いて形質転換してもよい。
【０１０８】
本発明の別の態様において、
（ａ）上述のコード配列に操作可能に連結した本発明のプロモーターＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を提供すること、
（ｂ）適した宿主細胞を、前記ＤＮＡ構築物で形質転換すること、および
（ｃ）適した宿主細胞を、コード配列の発現を行うことができる培養条件下で培養すること
を含む、適した宿主細胞中でのコード配列の発現のための方法が提供される。
【０１０９】
本発明のさらなる態様において、
（ａ）上述のコード配列に操作可能に連結した本発明のプロモーターＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を提供すること
（ｂ）適した宿主細胞を、前記ＤＮＡ構築物で形質転換すること、および
（ｃ）適した宿主細胞を、コード配列の発現を行うことができる培養条件下で培養すること、ならびに、場合により、
（ｄ）培養ブロスから生物学的化合物を回収すること
を含む、適した宿主細胞中での生物学的化合物の生成のための方法が提供される。
【０１１０】
「生物学的化合物」は、任意の生体高分子または代謝産物であってもよい。生物学的化合物は、単一のコード配列または生合成もしくは代謝経路を含む一連のコード配列によってコードされてもよく、または単一のコード配列の生成物もしくは一連のコード配列の生成物の直接の結果であってもよい。生物学的化合物は、宿主細胞にとって天然でも、異種であってもよい。
【０１１１】
用語「異種の生物学的化合物」は、本明細書中で、所定の宿主細胞にとって天然でない生物学的化合物、または構造的修飾が行われて天然の生物学的化合物が変化している天然の生物学的化合物として、定義される。
【０１１２】
用語「生体高分子」は、本明細書中で、同一の、類似した、または異なるサブユニット（単量体）の鎖（またはポリマー）として定義される。生体高分子は、任意の生体高分子であってもよい。生体高分子は、例えば、ＲＮＡ等の核酸、ポリアミン、ポリオール、ポリペプチド（またはポリアミド）、または多糖であってもよいが、これらに限定されない。
【０１１３】
好ましい実施形態によると、生成される生物学的化合物はポリペプチドである。より好ましい実施形態によると、生成されるポリペプチドは、ＤＮＡ構築物中に存在するコード配列によってコードされ、前記ＤＮＡ構築物は、前記コード配列に操作可能に連結した本発明のプロモーターを含む。ポリペプチドは、目的の生物学的活性を有する、任意のポリペプチドであってもよい。用語「ポリペプチド」は、本明細書中で、特定の長さの、コードされる生成物を指すよう意図されず、したがって、ペプチド、オリゴペプチド、およびタンパク質を包含する。用語「ポリペプチド」はまた、組み合わされて、コードされる生成物を形成する、２つ以上のポリペプチドを包含する。ポリペプチドとしては、１つ以上が宿主細胞にとって異種であってもよい少なくとも２つの異なるポリペプチドから得られる部分的または完全なポリペプチド配列の組み合わせを含む、ハイブリッドポリペプチドも挙げられる。ポリペプチドとしては、さらに、上記のポリペプチドおよびハイブリッドポリペプチドの、天然に存在する対立遺伝子の、および遺伝子工学によって処理された、変化物が挙げられる。
【０１１４】
ポリペプチドは、所定の宿主細胞にとって、天然であっても異種であってもよい。用語「異種ポリペプチド」は、本明細書中で、所定の宿主細胞にとって天然でないポリペプチドとして定義される。あるいは、異種ポリペプチドは、修飾が行われて天然の配列が変化している、天然のポリペプチド、または、組み換えＤＮＡ技術による真菌細胞の操作の結果としてその発現が量的に変化している、天然のポリペプチドである。例えば、天然のポリペプチドを、例えばポリペプチドをコードする配列を本発明のプロモーターの制御下に置くことによって、組み換えによって生成して、ポリペプチドの発現を増強させ、シグナル配列の使用によって細胞外への目的の天然のポリペプチドの輸送を促進してもよく、通常細胞によって生成されるポリペプチドをコードする遺伝子のコピー数を増大させてもよい。
【０１１５】
ポリペプチドは、コラーゲンもしくはゼラチン、またはそのバリアントもしくはハイブリッドであってもよい。ポリペプチドは、抗体もしくはその一部、抗原、凝固因子、酵素、ホルモンもしくはホルモンバリアント、受容体もしくはその一部、調節タンパク質、構造タンパク質、レポーター、または輸送タンパク質、分泌プロセスに関与するタンパク質、折りたたみプロセスに関与するタンパク質、シャペロン、ペプチドアミノ酸輸送体、糖化因子、転写因子、合成ペプチドもしくはオリゴペプチド、細胞内タンパク質であってもよい。細胞内タンパク質は、プロテアーゼ、セラミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、アミノペプチダーゼ、アシラーゼ、アルドラーゼ、ヒドロキシラーゼ、アミノペプチダーゼ、リパーゼ等の酵素であってもよい。ポリペプチドは、細胞外に分泌される酵素であってもよい。かかる酵素は、オキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、ヒドロラーゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、リガーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、デキストラナーゼ、エステラーゼのグループに属してもよい。酵素は、カルボヒドラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、β−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、もしくはβ−グルコシダーゼ等のセルラーゼ、ヘミセルラーゼ、またはキシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチンリアーゼ、ペクチン酸リアーゼ、エンドポリガラクツロナーゼ、エキソポリガラクツロナーゼラムノーガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、アラビノキシランヒドロラーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼ、もしくはデンプン分解酵素等のペクチン分解酵素；ヒドロラーゼ、イソメラーゼ、もしくはリガーゼ、フィターゼ等のホスファターゼ、リパーゼ等のエステラーゼ、タンパク質分解酵素、オキシダーゼ等のオキシドレダクターゼ、トランスフェラーゼ、またはイソメラーゼであってもよい。酵素は、フィターゼであってもよい。酵素は、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、エンド−プロテアーゼ、メタロ−プロテアーゼ、セリン−プロテアーゼカタラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、ムタナーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペルオキシダーゼ、ホスホリパーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼ、またはグルコースオキシダーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼであってもよい。
【０１１６】
あるいは、本発明のプロモーターに操作可能に連結されている、コード配列は、例えばシャペロンまたは転写因子等の、細胞内タンパク質をコードしてもよい。この例は、アプライド・マイクロバイオロジー・アンド・バイオテクノロジー（Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．）１９９８年１０月、５０（４）：４４７〜５４頁に記載されている（「黒色アスペルギルスにおいて同種および異種タンパク質の分泌において主な小胞体シャペロンタンパク質をコードする、遺伝子ｂｉｐＡの役割の分析（Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅ  ｂｉｐＡ，ｅｎｃｏｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｊｏｒ  ｅｎｄｏｐｌａｓｍｉｃ  ｒｅｔｉｃｕｌｕｍ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ａｎｄ  ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｂｌａｃｋ  Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｉ）。プント（Ｐｕｎｔ）ＰＪ、ファンフェーメレン（ｖａｎ  Ｇｅｍｅｒｅｎ）ＩＡ、ドリント−クイフェンホーフェン（Ｄｒｉｎｔ−Ｋｕｉｊｖｅｎｈｏｖｅｎ）Ｊ、ヘッシング（Ｈｅｓｓｉｎｇ）ＪＧ、ファンムイジュルウィック−ハーテベルド（ｖａｎ  Ｍｕｉｊｌｗｉｊｋ−Ｈｅｒｔｅｖｅｌｄ）ＧＭ、ベイエルスバーゲン（Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ）Ａ、ベリプス（Ｖｅｒｒｉｐｓ）ＣＴ、ファンデンホンデル（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）ＣＡ）。これ使用して、例えば、タンパク質生産者として、または、シャペロンもしくは転写因子等のこのコード配列が、タンパク質もしくは代謝産物生成において限定する因子であることが公知である場合は代謝産物としての、宿主細胞の効率を改善することができる。
【０１１７】
生物学的化合物は、多糖であってもよい。多糖は、任意の多糖であってもよく、ムコ多糖（例えば、ヘパリンおよびヒアルロン酸）および窒素含有多糖（例えばキチン）を含むが、これらに限定されない。より好ましい選択肢において、多糖はヒアルロン酸である。
【０１１８】
あるいは、生物学的化合物は、代謝産物であってもよい。用語「代謝産物」は、一次および二次代謝産物の両方を包含する。代謝産物は、任意の代謝産物であってもよい。好ましい代謝産物はクエン酸である。
【０１１９】
別の好ましい実施形態によると、生成される生物学的化合物は、代謝産物である。より好ましい実施形態によると、ＤＮＡ構築物中に存在するコード配列は、代謝産物の生成に関与する酵素をコードし、前記ＤＮＡ構築物は、前記コード配列に操作可能に連結した、本発明のプロモーターを含む。
【０１２０】
あるいは、本発明のＤＮＡ構築物中に、いくつかのコード配列が存在してもよい。各コード配列は、代謝産物の生成につながる代謝または生合成経路に関与する、別個の酵素をコードしてもよい。一次代謝産物は、細胞の、一次または一般的な代謝の産物であり、これは、エネルギー代謝、増殖、および構造に関連する。二次代謝産物は、二次代謝の産物である（例えば、Ｒ．Ｂ．ヘルベルト（Ｈｅｒｂｅｒｔ）、バイオシンセシス・オブ・セカンダリー・メタボライツ（Ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ）、チャップマン・アンド・ホール（Ｃｈａｐｍａｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ）、ニューヨーク、１９８１年参照）。
【０１２１】
一次代謝産物は、アミノ酸、脂肪酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、糖、トリグリセリド、またはビタミンであってもよいが、これらに限定されない。好ましい一次代謝産物はクエン酸である。
【０１２２】
二次代謝産物は、アルカロイド、クマリン、フラボノイド、ポリケチド、キニーネ、ステロイド、ペプチド、またはテルペンであってもよいが、これらに限定されない。二次代謝産物は、抗生物質、摂食阻害剤、誘引物質、殺菌剤、殺真菌剤、ホルモン、殺虫剤、または殺鼠剤であってもよい。好ましい抗生物質は、セファロスポリンおよびβ−ラクタムである。
【０１２３】
生物学的化合物はまた、選択マーカーであってもよい。選択マーカーは、殺生物剤またはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、栄養素要求株に対する原栄養性等を提供する生成物である。選択マーカーとしては、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ｂｌｅ（フレオマイシン耐性タンパク質）、ならびにそれらの同等物が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２４】
本発明の生成方法において、細胞は、当該分野で公知の方法を用いて、ポリペプチドまたは代謝産物であってもよいがこれらに限定されない生物学的化合物の生成に適した栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、適した培地中およびコード配列の発現および／または生物学的化合物の単離を可能にする条件下で行われる、振とうフラスコ培養、実験室または産業的発酵槽中での小規模もしくは大規模発酵（連続、バッチ、供給バッチ、または固体発酵を含む）で培養してもよい。培養は、当該分野で公知の手順を用いて、炭素および窒素源ならびに無機塩を含む、適した栄養培地中で起こる。適した培地は、商業的供給業者から入手可能であるか、または、公開されている組成物（例えば、米国微生物系統保存機関の目録において）に従って調製してもよい。生物学的化合物は栄養培地中に分泌される場合、生物学的化合物は、培地から直接回収することができる。ポリペプチドまたは代謝産物であってもよいがこれらに限定されない生物学的化合物が、分泌されない場合、これは、細胞溶解物から回収することができる。
【０１２５】
ポリペプチドまたは代謝産物であってもよいがこれらに限定されない、得られた生物学的化合物は、当該分野で公知の方法によって回収してもよい。例えば、ポリペプチドまたは代謝産物は、遠心分離、ろ過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、または沈殿を含むがこれらに限定されない従来の手順によって、栄養培地から回収してもよい。
【０１２６】
ポリペプチドは、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性、クロマトフォーカシング、およびサイズ排除）、電気泳動手順（例えば、調製用等電点電気泳動）、可溶性の差（例えば、硫安塩析）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、または抽出を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知の種々の手順によって精製してもよい（例えば、プロテイン・ピューリフィケーション（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、Ｊ．−Ｃ．ヤンソン（Ｊａｎｓｏｎ）およびラーズ・ライデン（Ｌａｒｓ  Ｒｙｄｅｎ）、編者、ＶＣＨパブリッシャーズ（ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）、ニューヨーク、１９８９年参照）。ポリペプチドは、ポリペプチドに特異的な、当該分野で公知の方法を用いて検出してもよい。これらの検出としては、特異的抗体の使用、酵素生成物の形成、または酵素基質の消滅を挙げることができる。
【０１２７】
本発明はまた、真菌宿主細胞にとって内在性の、ポリペプチドをコードするコード配列の発現を変化させるための、ＤＮＡ構築物に関する。構築物は、内在性遺伝子の発現を変化させるために必要な最低限の数の成分を含んでもよい。
【０１２８】
ある実施形態において、核酸構築物は、好ましくは、（ａ）標的化配列、（ｂ）本発明のプロモーターＤＮＡ配列、（ｃ）エキソン、および（ｄ）スプライス供与部位を含む。核酸構築物を細胞に導入すると、構築物は、相同組み換えによって、内在性遺伝子部位で、細胞ゲノムに組み込まれる。標的化配列は、要素（ｂ）〜（ｄ）が内在性遺伝子と作動可能に関連するように、要素（ａ）〜（ｄ）の組み込みを内在性遺伝子に導く。
【０１２９】
別の実施形態において、核酸構築物は、（ａ）標的化配列、（ｂ）本発明のプロモーターＤＮＡ配列、（ｃ）エキソン、（ｄ）スプライス供与部位、（ｅ）イントロン、および（ｆ）スプライス受容部位を含み、ここで標的化配列は、要素（ａ）〜（ｆ）の組み込みを、要素（ｂ）〜（ｆ）が内在性遺伝子と作動可能に関連するように、導く。しかしながら、構築物は、選択マーカー等のさらなる成分を含んでもよい。使用することができる選択マーカーは、これまでに記載されている。
【０１３０】
両方の実施形態において、これらの成分の導入は、内在性遺伝子の発現が変化している、新しい転写単位の生成を生じる。本質において、新しい転写単位は、標的化構築物によって導入された配列および内在性遺伝子の融合生成物である。内在性遺伝子が変化している、ある実施形態において、遺伝子は活性化されている。この実施形態において、相同組み換えを用いて、調節配列の挿入を介して親細胞の内在性遺伝子と正常に関連している調節領域が置換、破壊、または無能力化され、これは、対応する親細胞中で明らかであるよりも高いレベルでの遺伝子の発現を引き起こす。
【０１３１】
標的化配列は、内在性遺伝子内にあってもよく、遺伝子にすぐ隣接してもよく、上流の遺伝子内にあってもよく、または内在性遺伝子の上流で離れていてもよい。１つ以上の標的化配列を使用することができる。例えば、環状プラスミドまたはＤＮＡ断片は、好ましくは、単一の標的化配列を使用するが、線状プラスミドまたはＤＮＡ断片は、好ましくは、２つの標的化配列を使用する。
【０１３２】
構築物は、内在性遺伝子の１つ以上のエキソンをさらに含む。エキソンは、ＲＮＡ中にコピーされ、エキソン配列が内在性遺伝子のコード領域とともにインフレームであるように成熟したｍＲＮＡ分子中に存在する、ＤＮＡ配列として定義される。エキソンは、場合により、１つ以上のアミノ酸をコードする、および／またはアミノ酸を部分的にコードする、ＤＮＡを含んでもよい。あるいは、エキソンは、５’非翻訳領域に対応するＤＮＡを含む。外来性の１つのエキソンまたは複数のエキソンが、１つ以上のアミノ酸および／またはアミノ酸の一部をコードする場合、核酸構築物は、第二のエキソン由来のｍＲＮＡの部分の適当なリーディングフレームが変化しないように、転写およびスプライシングの際に、内在性遺伝子のコード領域とともにリーディングフレームがインフレームであるように、設計される。構築物のスプライス供与部位は、１つのエキソンのスプライシングを別のエキソンに導く。典型的には、第一のエキソンは第二のエキソンの５’にあり、その３’側の第一のエキソンに重複している、および側面を接しているスプライス供与部位は、第二のエキソンの５’側の第二のエキソンに側面を接しているスプライス供与部位を認識する。スプライス受容部位は、スプライス供与部位のように、１つのエキソンのスプライシングを別のエキソンに導く配列である。スプライス供与部位と関連して作用して、スプライス装置は、スプライス受容部位を使用して、イントロンの除去をもたらす。
【０１３３】
所定のＤＮＡ配列の発現を変化させるための好ましい戦略は、所定のＤＮＡ配列の欠失、および／または本発明のプロモーター等の修飾されたプロモーターＤＮＡ配列による所定のＤＮＡ配列の内在性プロモーター配列の置換を含む。欠失および置換は、好ましくは、ＥＰ０３５７１２７号明細書に記載されている遺伝子置換技術によって行われる。遺伝子および／またはプロモーター配列の特異的欠失は、好ましくは、ＥＰ６３５５７４号明細書に記載されているように、ａｍｄＳ遺伝子をマーカー遺伝子として使用して行われる。ＥＰ６３５５７４号明細書に記載されているような、フルオルアセトアミド培地での対抗選択によって、得られた菌株は、選択マーカーフリーであり、さらなる遺伝子修飾に使用することができる。
【０１３４】
代替的に、または他の言及した技術と組み合わせて、糸状菌偽巣性コウジ菌における効率的遺伝子置換のための迅速な方法（Ａ  ｒａｐｉｄ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｇｅｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）（２０００年）シャベローク（Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅ），Ｍ−Ｋ．、ギコ（Ｇｈｉｃｏ），Ｊ−Ｍ．、およびダンフェール（ｄ’Ｅｎｆｅｒｔ）Ｃ、ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、第２８巻２２号に記載されているように、大腸菌におけるコスミドのインビボ組み換えに基づいた技術を使用することができる。この技術は、例えば黒色アスペルギルス等の、他の糸状菌に適用可能である。
【０１３５】
本明細書中に記載および特許請求されている本発明は、本明細書中に開示されている実施形態は本発明のいくつかの態様の例示として意図されるので、これらの特定の実施形態によって、範囲に限定されない。任意の同等の実施形態が、本発明の範囲内であると意図される。実際、本明細書中に示され、記載されているものの他の、本発明の種々の改変は、上記の記載から、当業者に明らかになろう。かかる改変はまた、添付の特許請求の範囲の範囲内に包含されるよう意図される。抵触する場合には、定義を含む本開示が優先される。
【０１３６】
本発明は、以下の実施例によってさらに説明されるが、これは、本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
［実施例］
【０１３７】
［実験情報］
菌株
ＷＴ１：
この黒色アスペルギルス株を、野生型株として使用する。この菌株は、ＣＢＳ機関に、受託番号ＣＢＳ５１３．８８で寄託されている。
【０１３８】
ＷＴ２：
この黒色アスペルギルス株は、グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）をコードする遺伝子の欠失を含む、ＷＴ１株である。ＷＴ２は、ＥＰ０６３５５７４号明細書に記載されているような「マーカー遺伝子フリー」アプローチを用いることによって構築した。この特許において、ＣＢＳ５１３．８８のゲノム中のｇｌａＡ特異的ＤＮＡ配列をどのようにして欠失させるかが、広範囲に記載されている。この手順によって、最終的には外来性ＤＮＡ配列を全く有さない、マーカー遺伝子フリーΔｇｌａＡ組み換え黒色アスペルギルスＣＢＳ５１３．８８株を生じた。
【０１３９】
グルコアミラーゼ活性アッセイ
国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載されているように、ｐ−ニトロフェニルα−Ｄ−グルコピラノシド（シグマ（Ｓｉｇｍａ））を用いてグルコアミラーゼ活性を測定した。
【０１４０】
実施例１
コード配列と作動可能に関連している本発明のプロモーターを含む、ＤＮＡ構築物の構築
この実施例は、コード配列と作動可能に関連している本発明のプロモーターを含む、発現構築物の構築を説明する。ここで使用するコード配列またはレポーター構築物は、黒色アスペルギルスグルコアミラーゼ酵素をコードするｇｌａＡ遺伝子である。グルコアミラーゼをレポーター酵素として使用して、本発明のプロモーターの活性を測定できるようにする。
【０１４１】
１．１  組み込みグルコアミラーゼ発現ベクター（ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ）の説明
黒色アスペルギルス由来のグルコアミラーゼプロモーターおよびグルコアミラーゼコード遺伝子ｇｌａＡを、国際公開９９／３２６１７号パンフレットに記載されている発現ベクター、ｐＧＢＴＯＰ−８にクローニングした。公知の原則および通法のクローニング技術に従って、クローニングを行い、プラスミドｐＧＢＴＯＰＧＬＡを生じた（図１参照）。本質において、この発現ベクターは、大腸菌ベクターの３’および３’’ｇｌａＡ標的化部位に挟まれた、グルコアミラーゼプロモーター、コード配列およびターミネーター領域を含む。
【０１４２】
１．２  多重クローニング部位を有する組み込みグルコアミラーゼ発現ベクター（ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２）の構築
配列番号７として同定されているオリゴヌクレオチド
【化５】
2008531031.tif 000007
および配列番号８として同定されている
【化６】
2008531031.tif 000008
ならびに鋳型としての１ｎｇのベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡを使用して、ｇｌａＡコード配列の一部を含む、ＰＣＲ断片を生じた。この断片をＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩで消化し、ＸｈｏＩおよびＢｇｌＩＩ消化ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡに導入し、ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２を生じた（図２参照）。多重クローニング部位（ＭＣＳ）およびｇｌａＡコード配列の一部を含む導入されたＰＣＲ断片の配列を、配列分析によって確認した。
【０１４３】
１．３  グルコアミラーゼコード配列と作動可能に関連している本発明のプロモーターを含む、組み込み発現ベクターの構築
ＣＢＳ５１３．８８株のゲノムＤＮＡを配列決定および分析した。下記で表１に同定されるようなオリゴヌクレオチドの組み合わせを、それらのそれぞれの配列番号および鋳型としてのＣＢＳ５１３．８８株のゲノムＤＮＡとともに使用して、ＰＣＲ増幅によって適当な制限酵素認識部位を本発明のプロモーターに結合させた。配列番号１、配列番号２または配列番号３で同定されるような配列は、下記の表１に示されるように、１．５〜２ｋｂの間の、得られた断片の配列を含む。３つ全ての、得られた断片を、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＡｓｃＩおよびＸｈｏＩ消化ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２に導入して、それぞれ、下記の表（ベクター名）に示されるように、ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−６、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−８、またはｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１１を生じた。他の本発明のプロモーターを、配列オーバーラップエクステンションＰＣＲ（ＳＯＥ−ＰＣＲ、ジーン（Ｇｅｎｅ）１９８９年４月１５日、７７（１）：５１〜９頁、ホー（Ｈｏ）ＳＮ、ハント（Ｈｕｎｔ）ＨＤ、ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）ＲＭ、ピューレン（Ｐｕｌｌｅｎ）ＪＫ、ピース（Ｐｅａｓｅ）ＬＲ「ポリメラーゼ連鎖反応を用いたオーバーラップエクステンションによる部位特異的変異誘発（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）。」に記載されているような）によってグルコアミラーゼコード配列に融合させた。配列番号９および配列番号１３として同定されているオリゴヌクレオチド、ならびに鋳型としての黒色アスペルギルスＷＴ１のゲノムＤＮＡを使用して、断片Ａとして同定される、本発明のプロモーターを、ＰＣＲによって増幅した。また、ＸｈｏＩ制限酵素認識部位を断片Ａの５’末端に結合させた。配列番号８および配列番号１４として同定されているオリゴヌクレオチド、ならびに鋳型としてのベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡを使用して、断片Ｂとして同定される、ｇｌａＡコード配列の一部を含むＰＣＲ断片を生じた。両方の、得られた断片、ＡおよびＢを、配列番号９および配列番号８として同定されているオリゴヌクレオチドならびに断片ＡおよびＢを使用して、ＳＯＥ−ＰＣＲによって融合させ、断片Ｃを生じた。この断片Ｃは、配列番号４として同定されるような本発明のプロモーター、およびｇｌａＡコード配列の一部を含む。断片ＣをＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ消化ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２に導入して、ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１２を生じた。グルコアミラーゼコード配列と作動可能に関連している、得られた本発明のプロモーター配列を、配列番号４として同定する。
【０１４４】
上記と同様にして、２つの他の本発明のプロモーターを、表１で後述するようなプライマーの組み合わせを使用した配列オーバーラップエクステンションＰＣＲによって、グルコアミラーゼコード配列に融合させた。ここでも、これらのプロモーター−グルコアミラーゼ断片を、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩで消化し、ＢｇｌＩＩおよびＸｈｏＩ消化ベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２に導入して、それぞれベクターｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１３、またはｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１４を生じた。グルコアミラーゼコード配列と作動可能に関連している、得られた本発明のプロモーター配列は、配列番号５または６として同定することができる（表１参照）。
【０１４５】
図３は、構築した６つ全てのｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−ベクターの配置の例示であるベクターを示す。本発明のプロモーターを含む、種々の導入されたＰＣＲ断片の配列を、配列分析によって確認した。
【０１４６】
【表１】
2008531031.tif 000009
【０１４７】
実施例２
ＤＮＡ構築物で形質転換された真菌宿主細胞
ＷＴ２においてｐＧＢＴＯＰＧＬＡ、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−６、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−８、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１１、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１２  ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１３またはｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１４ベクターを導入するために、形質転換、およびそれに続く形質転換体選択を、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットおよび国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されているように行った。原則として、全てのベクターの線状ＤＮＡを、ＮｏｔＩでの消化、およびｐＧＢＡＡＳ−１と呼ばれるａｍｄＳ選択マーカー遺伝子含有ベクター（ＥＰ６３５５７４号明細書に記載されているように構築した）との同時形質転換の後に単離した。両方のベクターは、黒色アスペルギルス宿主株のｇｌａＡ遺伝子座に相同な２つのＤＮＡドメインを含み、ＷＴ２においてトランケートされたｇｌａＡ遺伝子座に標的化を導く。標準的な手順に従って精製したアセトアミド培地およびコロニーに基づいて、形質転換体を選択した。フルオロ−アセトアミド培地に胞子を播種して、ａｍｄＳマーカーを失った菌株を選択した。増殖しているコロニーを、ｇｌａＡ遺伝子座での組み込みおよびコピー数について診断した。類似した推定コピー数を有するｐＧＢＴＯＰＧＬＡ、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−６、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−８、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１１、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１２  ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１３またはｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１４の形質転換体を選択した。好ましくは、単一のコピーまたは少量のコピーを有する形質転換体（１Ａ、１Ｂ、１Ｃ）を選択した。
【０１４８】
さらに、選択マーカー遺伝子、および本発明のプロモーターによって制御される目的の遺伝子を、単一の発現ベクター上に存在するよう構築した。かかるベクターの例を、図４に示す。
【０１４９】
実施例３
真菌宿主細胞において、本発明のプロモーターの制御下でｇｌａＡコード配列によってコードされるグルコアミラーゼポリペプチドの生成
上述のような、ＷＴ２の、いくつかの選択された形質転換体、ならびにＷＴ１およびＷＴ２株の両方を使用して、バッフル付５００ｍｌ振とうフラスコを用いたインキュベーターシェイカーにおいて、ＥＰ６３５５７４号明細書に記載されているような１００ｍｌの培地中、３４℃および１７０ｒｐｍで、振とうフラスコ実験を行った。３および４日間の発酵の後、試料を採取して、上述のように、グルコアミラーゼ活性を測定した。グルコアミラーゼ活性を３日目のＷＴ１の活性に対して標準化した。ＷＴ１、ＷＴ２、およびｐＧＢＴＯＰＧＬＡ、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−６、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−８、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１１、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１２  ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１３またはｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１４のいくつかの選択された形質転換体の標準化した活性を、図５に示す。
【０１５０】
グルコアミラーゼレポーターの、測定された活性から結論付けられるように、本発明は、真菌細胞における目的の遺伝子の高発現のための、強力なプロモーターおよびプロモーターバリアントを提供する。明らかに、１つより多いコピーの導入された構築物を含むことがある、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１ＢまたはｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１３−１Ｃ等の少数の「アウトライアー」株を、検出することができる。ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−６中で使用されるプロモーターは、明らかに、グルコアミラーゼプロモーター（ＷＴ１およびｐＧＢＴＯＰＧＬＡ形質転換体から結論付けられるように）および例えばｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−８に含まれるようなプロモーターよりも、強力である。また、バリアント転写イニシエーター配列
【化７】
2008531031.tif 000010
を有する、例えばｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１３等の、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−６中で使用されるプロモーターのバリアントは、明らかに、さらに改善された性能を示す。このように、本発明のプロモーターは、宿主細胞中での目的の遺伝子の高発現のための、代替的、およびさらなるプロモーターを提供する。
【０１５１】
実施例４
本発明のプロモーターを含むプロモーター置換構築物ｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡの構築
宿主細胞中での所定の遺伝子の発現レベルを変化させるために、本発明のプロモーターで、前記所定の遺伝子の内在性プロモーターを置換することができる。この実施例において、本発明のプロモーターで、真菌宿主細胞中でグルコアミラーゼコードｇｌａＡ遺伝子のプロモーターを置換する。実施例４、５および６は、このプロセスにおけるいくつかの異なる工程を説明する。
【０１５２】
グルコアミラーゼプロモーターのための置換ベクターを、公知の原理に従って設計し、通法のクローニング手順に従って構築した（図６参照）。本質において、ｇｌａＡプロモーター置換ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡは、予め決定されたゲノム標的遺伝子座での相同組み換えによって本発明のプロモーター（このプロモーターは、この実施例では配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５または配列番号６のいずれかで構成される）によって置換されるｇｌａＡプロモーター配列の、およそ１０００ｂｐのフランキング領域を含む。ここで使用するフランキング領域（図６参照）は、ｇｌａＡプロモーターの５’上流領域およびｇｌａＡコード配列の一部である。また、置換ベクターは、偽巣性コウジ菌二方向ａｍｄＳ選択マーカー、中間の直接反復を含む。この実施例で使用される直接反復は、ｇｌａＡコード配列の一部である。これらの欠失ベクターの一般的な設計は、ＥＰ６３５５７４号明細書および国際公開第９８／４６７７２号パンフレット中に、これまでに記載されている。
【０１５３】
実施例５
真菌宿主細胞における本発明のプロモーターによるｇｌａＡプロモーターの置換
ＮｏｔＩ消化欠失ベクターｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡの線状ＤＮＡを、単離し、使用して、ＷＴ１（ＣＢＳ５１３．８８）を形質転換した。この線状ＤＮＡは、ｇｌａＡ遺伝子座でゲノムに組み込むことができ、したがって、ｇｌａＡプロモーター領域を、ａｍｄＳおよび本発明のプロモーターを含む構築物で置換することができる（図７参照）。アセトアミド培地、および標準的な手順に従って精製したコロニーに基づいて、形質転換体を選択した。増殖しているコロニーを、ｇｌａＡ遺伝子座での組み込みについて、ＰＣＲによって診断した。ｇｌａＡプロモーターの欠失は、本発明のプロモーターに特異的なサイズおよびｇｌａＡプロモーターに特異的なバンドの喪失で、バンドの増幅によって検出可能であった。胞子を、フルオロ−アセトアミド培地に播種して、ａｍｄＳマーカーを喪失した菌株を選択した。候補菌株を、グルコアミラーゼプロモーターの適当な欠失および配列番号１〜配列番号６に包含されるような本発明のプロモーターによる置換についての、サザン分析を使用して試験した。ｄＰＧＬＡＡ株を、ｇｌａＡプロモーターが本発明のプロモーターによって置換されており、機能的ｇｌａＡコード配列が修復されている、代表的な菌株として選択した（図７参照）。
【０１５４】
実施例６
真菌宿主細胞における、本発明の置換されたプロモーターの制御下でｇｌａＡコード配列によってコードされるグルコアミラーゼポリペプチドの生成
選択したｄＰＧＬＡＡ株（実施例５で単離した、ＷＴ１の適当なｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡ形質転換体）およびＷＴ１株を使用して、バッフル付５００ｍｌ振とうフラスコを用いたインキュベーターシェイカーにおいて、ＥＰ６３５５７４Ｂ１号明細書に記載されているような１００ｍｌの培地中、３４℃および１７０ｒｐｍで、振とうフラスコ実験を行った。さらなる条件および活性測定は、実施例３に記載した通りであった。選択した、ＷＴ１のｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＬＡＡ形質転換体中のグルコアミラーゼ活性は、非形質転換ＷＴ１から測定された活性と比較して、発酵の両方の日で、増大した（データ示さず）。
【０１５５】
実施例７
真菌宿主細胞における、本発明のプロモーターの制御下でのさらなるｇｌａＡ遺伝子の付加
宿主細胞中での所定の遺伝子の発現レベルを変化させるために、複数のさらなるコピーの、前記本発明のプロモーターに作動可能に連結された遺伝子を、内在的に提供される遺伝子に付加することができる。この実施例において、配列番号１〜配列番号６に包含され、ｇｌａＡコード配列に作動可能に連結されている、本発明のプロモーターを、宿主細胞中で内在的に存在するグルコアミラーゼコードｇｌａＡ遺伝子の隣に導入した。実施例７および８は、このプロセスにおける工程を説明する。
【０１５６】
図８に示されるベクター構築物を、単離し、使用して、ＷＴ１（ＣＢＳ５１３．８８）を形質転換した。ベクター構築物は、ゲノムをｇｌａＡコード配列で組み込む能力を有し、したがって、選択マーカーａｍｄＳの隣の本発明のプロモーターの制御下に第二のｇｌａＡ遺伝子を付加する（図８参照）。形質転換体を、アセトアミド培地、および標準的な手順に従って精製したコロニーに基づいて、選択した。増殖しているコロニーを、ｇｌａＡ遺伝子座での組み込みについてのＰＣＲによって診断した。ｇｌａＡ遺伝子座での組み込みを、サザンブロット分析によって確認した。Ｐ２ＧＬＡＡ株を、ｇｌａＡ遺伝子座に組み込まれた、本発明のプロモーターの制御下に少なくとも１つの第二のｇｌａＡ遺伝子を有する、代表的な菌株として選択した。
【０１５７】
実施例８
真菌宿主細胞における、本発明のプロモーターおよび内在性ｇｌａＡプロモーターの制御下でｇｌａＡコード配列によってコードされるグルコアミラーゼポリペプチドの生成
実施例７で構築および単離した、選択したＰ２ＧＬＡＡ株、ならびにＷＴ１株を使用して、実施例３に記載されているように、１００ｍｌの培地中で、振とうフラスコ実験を行った。４および６日間の発酵の後、試料を採取して、培養物の上清中のグルコアミラーゼ活性を測定した。選択したＷＴ１のＰ２ＧＬＡＡ形質転換体中のグルコアミラーゼ活性は、４または５日間の発酵のいずれかの後のＷＴ１について測定したものと比較して、増大した。観察されたグルコアミラーゼレポーターの活性の増大は、本発明のプロモーターが、真菌細胞において強力なプロモーター下ですでに発現している目的の遺伝子の発現を、さらに増大させる手段を提供することを示す。さらに、結果は、本発明のプロモーターを、公知のプロモーターと組み合わせて使用してもよいことを含意する。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】組み込みグルコアミラーゼ発現ベクターであるｐＧＢＴＯＰＧＬＡのプラスミドマップを示す。
【図２】多重クローニング部位を有する組み込みグルコアミラーゼ発現ベクターである、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−２のプラスミドマップを示す。
【図３】グルコアミラーゼコード配列に作動可能に関連している本発明のプロモーターを含む組み込みグルコアミラーゼ発現ベクターである、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−６のプラスミドマップを示す。この絵はまた、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−８、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１１、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１２、ｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１３またはｐＧＢＴＯＰＧＬＡ−１４である、これらの実施例において構築された他の５つのｐＧＢＴＯＰＧＬＡベクターの配置の例示である。
【図４】単一の相同組み換えによる組み込みの概略図を示す。
【図５】種々のｐＧＢＴＯＰＧＬＡベクターのＷＴ１、ＷＴ２および形質転換体のグルコアミラーゼ活性。標準化した活性を示し、ここで３日目のＷＴ１の活性を１００％と設定した。
【図６】置換ベクターである、ｐＧＢＤＥＬ−ＰＧＧＬＡＡのプラスミドマップを示す。
【図７】プロモーター置換の概略図を示す。
【図８】相同組み換えによる組み込みの概略図を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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