(57)【要約】  本発明は、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを包含する再構成複合体を提供し、ここで再構成複合体はヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）に対してヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性を有する。再構成複合体は、ＲｂＡｐ４８、ＡＥＢＰ２、あるいはそれらの両方をさらに含むことができる。再構成複合体の製造方法、再構成複合体のＨＴＭａｓｅ活性を阻害する化合物を識別する方法、及び、癌を治療するための候補化合物を識別する方法も開示する。再構成複合体を包含する試薬及びキットも更に提供される。
2008506367.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体であって、該再構成複合体がヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）に対してヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性を有する再構成複合体。
【請求項２】
ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とが哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質又はこれらの組み合わせである請求項１に記載の再構成複合体。
【請求項３】
ＲｂＡｐ４８、またはＡＥＢＰ２、あるいはこれらの両方をさらに含み、ＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２が、哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質又はこれらの組み合わせである請求項１に記載の再構成複合体。
【請求項４】
前記再構成複合体が、ネイティブの複合体の酵素活性に匹敵する酵素活性を有する請求項１に記載の再構成複合体。
【請求項５】
前記再構成複合体が、ネイティブの複合体の基質特異性に匹敵する基質特異性を有する請求項１に記載の再構成複合体。
【請求項６】
前記再構成複合体が、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）の純度レベルを有する請求項１に記載の再構成複合体。
【請求項７】
ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とから実質的になる再構成複合体であって、該再構成複合体がヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）に対して特異的なヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性を有する再構成複合体。
【請求項８】
（ａ）ＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列と、
（ｂ）ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列と、
（ｃ）ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列と
を含む宿主細胞を準備するステップと、
タンパク質の発現及び再構成複合体の生産に十分な条件下で該宿主細胞を培養するステップと
を含む請求項１に記載の再構成複合体の製造方法。
【請求項９】
前記培養された宿主細胞又は前記培養された宿主細胞由来の培地から発現された前記再構成複合体を単離するステップをさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現された再構成複合体を単離するステップが、前記発現された再構成複合体を固体支持体に結合させるステップを含む請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記固体支持体が、ニッケル、グルタチオン又は前記発現された再構成複合体に対する抗体を含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記固体支持体から前記発現された再構成複合体を溶出させるステップをさらに含む請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記発現された再構成複合体が、精製タグを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
前記宿主細胞が、（ａ）ＲｂＡｐ４８タンパク質をコードする核酸配列、または（ｂ）ＡＥＢＰ２タンパク質をコードする核酸配列、あるいは（ｃ）これらの両方をさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が昆虫細胞である請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記昆虫細胞がＳｆ９細胞である請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記宿主細胞が、前記（ａ）〜（ｃ）の異種核酸配列により安定に形質転換される請求項８に記載の方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞が、前記（ａ）〜（ｃ）の異種核酸配列を含む１つ以上の組み換えベクターを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１９】
前記ベクターがバキュロウイルスベクターである請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上のベクターが、前記ＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列を含むベクターと、前記ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列を含む別個のベクターと、及び、ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列を含むさらに別個のベクターとを含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上のベクターにより、前記宿主細胞を形質転換するステップをさらに含む請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）ＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列と、
（ｂ）ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列と、
（ｃ）ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列と
を含む宿主細胞。
【請求項２３】
前記宿主細胞が昆虫細胞である請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２４】
前記昆虫細胞がＳｆ９細胞である請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、前記（ａ）〜（ｃ）の異種核酸配列により安定に形質転換される請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２６】
前記宿主細胞が、前記（ａ）〜（ｃ）の異種核酸配列を含む１つ以上の組み換えベクターを含む請求項２２に記載の宿主細胞。
【請求項２７】
前記ベクターがバキュロウイルスベクターである請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２８】
前記１つ以上のベクターが、前記ＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列を含むベクターと、前記ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列を含む別個のベクターと、前記ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列を含むさらに別個のベクターとを含む請求項２６に記載の宿主細胞。
【請求項２９】
ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体のヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）に対するヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性をモジュレートする化合物を識別する方法であって、
被験化合物の存在下で、該再構成複合体をヒストン基質に接触させるステップと、
Ｈ３−Ｋ２７メチル化するために十分な条件下で、Ｈ３−Ｋ２７メチル化のレベルを検出するステップと
を含み、該被験化合物非存在下におけるＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較した場合のＨ３−Ｋ２７メチル化の変化が、該被験化合物が該再構成複合体のＨ３−Ｋ２７ＨＴＭａｓｅ活性のモジュレーターであることを示す方法。
【請求項３０】
ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とが、哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質又はこれらの組み合わせである請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記再構成複合体が、ＲｂＡｐ４８、またはＡＥＢＰ２、あるいはそれらの両方をさらに含み、ＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２が、哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質又はこれらの組み合わせである請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験化合物の非存在下におけるＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較した場合のＨ３−Ｋ２７メチル化の低下は、前記被験化合物が、前記再構成複合体のＨ３−Ｋ２７  ＨＭＴａｓｅ活性の阻害剤であることを示す請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記被験化合物の非存在下におけるＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較した場合のＨ３−Ｋ２７メチル化の上昇は、前記被験化合物が、前記再構成複合体のＨ３−Ｋ２７  ＨＭＴａｓｅ活性の活性化剤であることを示す請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヒストン基質が、コアヒストン、ヒストンオクタマー、モノヌクレオソーム、ジヌクレオソーム又はオリゴヌクレオソームである請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒストン基質が、ジヌクレオソームである請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が細胞系の方法である請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
前記方法が無細胞系の方法である請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
被験化合物の存在下で、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＵＺ１２とを含む再構成複合体をヒストン基質に接触させるステップと、
Ｈ３−Ｋ２７をメチル化するために十分な条件下で、ヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のヒストンメチル化のレベルを検出するステップと
を含む癌の治療のための候補化合物を識別する方法であって、該被験化合物の非存在下におけるＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較した場合のＨ３−Ｋ２７メチル化の低下は、該被験化合物が癌の治療のための候補化合物であることを示す、候補化合物を識別する方法。
【請求項３９】
前記ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とが、哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質又はこれらの組み合わせである請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記再構成複合体が、ＲｂＡｐ４８、またはＡＥＢＰ２、あるいはそれらの両方をさらに含み、ＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２が、哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質又はこれらの組み合わせである請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体のＨ３−Ｋ２７ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性の阻害剤に細胞を接触させるステップを含むヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のメチル化を抑制する方法。
【請求項４２】
前記細胞が、培養細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞が、対象中のインビボの細胞である請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体と、
任意選択的に、懸濁培地と
を含む、ヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のメチル化の検出の感度を上昇させるための試薬。
【請求項４５】
前記ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とが、哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質、又はこれらの組み合わせである請求項４４に記載の試薬。
【請求項４６】
前記再構成複合体が、ＲｂＡｐ４８、またはＡＥＢＰ２、あるいはそれらの両方をさらに含み、ＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２が、哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質、又はこれらの組み合わせである請求項４４に記載の試薬。
【請求項４７】
ヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のヒストンメチル化の阻害を検出するためのキットであって、該キットが、
（ａ）ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体と、
（ｂ）該再構成複合体のＨ３−Ｋ２７メチルトランスフェラーゼ（ＨＴＭａｓｅ）活性の阻害を測定するステップを含むＨ３−Ｋ２７メチル化の抑制を測定するための方法に関する取扱説明書と、
任意選択的に、ＨＴＭａｓｅ活性の阻害を測定するための方法を実施するための別の試薬又は装置と
を含むキット。
【請求項４８】
前記ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とが、哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質又はこれらの組み合わせである請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
前記再構成複合体が、ＲｂＡｐ４８、またはＡＥＢＰ２、あるいはそれらの両方をさらに含み、ＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２が、哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質又はこれらの組み合わせである請求項４７に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の情報］
本出願は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする２００４年６月１日出願の米国仮出願６０／５７５，８８０からの優先権を主張する。
【０００２】
［政府の利益］
本発明は部分的に米国国立衛生研究所からの認可番号ＧＭ６８８０４及び５−Ｒ０１−ＧＭ６３０６７−０１の下の政府支援により実施した。合衆国政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
［発明の分野］
本発明は再構成ヒストンメチルトランスフェラーゼ複合体及びそのモジュレーターの識別方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
ポリコーム群（ＰｃＧ）及びトリソラックス群（ｔｒｘＧ）のタンパク質は細胞記憶系の部分であることがわかっている（Ｆｒａｎｃｉｓ  ａｎｄ  Ｋｉｎｇｓｔｏｎ（２００１）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２：４０９−４２１；Ｓｉｍｏｎ  ａｎｄ  Ｔａｍｋｕｎ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１２：２１０−２１８）。両群のタンパク質は一過性に発現されるセグメント化遺伝子による胚性発生の早期に樹立されるホメオボックス（Ｈｏｘ）遺伝子発現の空間的パターンの維持に関与している。一般的にＰｃＧタンパク質は「オフ状態」を維持する転写リプレッサーであり、そしてｔｒｘＧタンパク質は「オン状態」」を維持する転写活性化因子である。ＰｃＧ及びｔｒｘＧタンパク質のメンバーは内因性のヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性を含有するため、ＰｃＧ及びｔｒｘＧタンパク質はコアヒストンのメチル化を通じて細胞記憶に関与していると考えられる（Ｂｅｉｓｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１９：８５７−８６２；Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３；Ｃｚｅｒｍｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１８５−１９６；Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２８９３−２９０５；Ｍｉｌｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １０：１１０７−１１１７；Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１９７−２０８；Ｎａｋａｍｕｒａ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １０：１１１９−１１２８）。
【０００５】
生化学及び遺伝子の研究により、ショウジョウバエのＰｃＧタンパク質は、複合体の組成は動的であるものの、少なくとも２つの異なるタンパク質複合体、ポリコーム抑制複合体１（ＰＲＣ１）及びＥＳＣ−Ｅ（Ｚ）複合体において機能しているという証拠が得られている（Ｏｔｔｅ  ａｎｄ  Ｋｗａｋｓ（２００３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１３：４４８−４５４）。ショウジョウバエ（Ｃｚｅｒｍｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１８５−１９６；Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１９７−２０８）及び哺乳類細胞（Ｃａｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３；Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２８９３−２９０５）における試験はＥＳＣ−Ｅ（Ｚ）／ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体が内因性ヒストンメチルトランスフェラーゼ活性を有することを示している。種々のグループにより単離された複合体の組成は若干異なるが、それらは一般的にＥＥＤ、ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２及びＲｂＡｐ４８又はそのショウジョウバエホモログを含有する。
【０００６】
Ｈｏｘ遺伝子サイレンシングに加えて、ＥＥＤ−ＥＺＨ２媒介ヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化がＸ不活性化に関与していることがわかっている（Ｐｌａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３１−１３５；Ｓｉｌｖａ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ４：４８１−４９５）。ＸｉへのＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体のリクルートメント及びその後のヒストンＨ３−Ｋ２７上のトリメチル化はＸ不活性化の開始段階の間に起こり、そしてＸｉｓｔＲＮＡに依存している。更に又、ＥＺＨ２及びその関連ヒストンＨ３−Ｋ２７のメチルトランスフェラーゼ活性は多能性の原外胚葉細胞及び分化した栄養外胚葉を示差的にマークすることがわかっている（Ｅｒｈａｒｄｔ，ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：４２３５−４２４８）。多能性の原外胚葉細胞の後成的な修飾パターンを維持することにおけるＥＺＨ２の役割と一貫して、ＥＺＨ２のＣｒｅ媒介の欠失はこれらの細胞におけるヒストンＨ３−Ｋ２７の消失をもたらす（Ｅｒｈａｒｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：４２３５−４２４８）。更に又、前立腺癌及び乳癌の細胞系統及び組織における研究はＥＺＨ２及びＳＵＺ１２の量とこれらの癌の侵襲性との間の強い相関を明らかにしており（Ｂｒａｃｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２２：５３２３−５３３５；Ｋｉｒｍｉｚｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２：１１３−１２１；Ｋｌｅｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：１１６０８−１１６１１；Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１９：６２４−９）、ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の機能障害が癌の一因となることを示している。
【０００７】
ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体媒介ヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化が種々の重要な課程に関与しているとすれば、この複合体の活性を調節する物質及びそれを識別するための方法が当分野で必要とされている。
【発明の開示】
【０００８】
本発明はＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２の存在下又は非存在下におけるＥＺＨ２、ＥＥＤ及びＳＵＺ１２を含む再構成複合体の内因性ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性を明らかにしており、ここで、再構成複合体はホメオボックス（Ｈｏｘ）遺伝子サイレンシングを促進し、Ｘ不活性化に関与し、生殖細胞系統の発生において役割を果たし、及び／又は幹細胞の多能性において役割を果たしている。天然の複合体は癌にも関連している。従って、本発明の方法は癌を治療するための化合物及び／又はＨｏｘ遺伝子サイレンシング、Ｘ不活性化、ゲノムインプリンティング、幹細胞多能性及び／又は生殖細胞系統の発生を調節する化合物を識別するために実施することができる。
【０００９】
転写調節にヒストンメチル化が関与する機序はＨＭＴａｓｅ  ＳＵＶ３９Ｈ１及びその機能的パートナーＨＰ１により最も良好に説明される。ＳＵＶ３９Ｈ１及びそのＳ．ｐｏｍｂｅホモログＣｌｒ４がヒストンＨ３のリジン９をメチル化し、これにより、そのクロモドメインを介したＨＰ１の後のリクルートメントのための結合部位を形成するモデルが示唆されている（Ｂａｎｎｉｓｔｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１２０−１２４；Ｌａｃｈｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１１６−１２０；Ｌａｃｈｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０：１１６−１２０；Ｎａｋａｙａｍａ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：１１０−１１３；Ｒｅａ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：５９３−５９９）。同様に、本発明者らはＥＳＣ−Ｅ（Ｚ）／ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体のヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化は、ポリコーム（Ｐｃ）タンパク質（Ｃａｏ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ（２００４）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．１４：１５５−１６４）、ＰＲＣ１複合体のコア成分のクロモドメインによるヒストンＨ３のメチル化リジン２７の特異的認識を介してＰＲＣ１複合体のリクルートメントを支援することを提案している（Ｆｒａｎｃｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  ８：５４５−５５６）。４系統の証拠がこの示唆と合致している。第１にインビトロ試験によればＰｃクロモドメインは非メチル化の対応物質と比較した場合にリジン２７メチル化ヒストンペプチドに対して高値の親和性を有していることが示されている（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３；Ｃｚｅｒｍｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１８５−１９６；Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２８９３−２９）。第２に、ＲＮＡｉ実験と組み合わせたクロマチン免疫沈降（ＣｈｌＰ）によれば、Ｕｂｘ遺伝子のポリコーム応答性エレメント（ＰＲＥ）上のＥＳＣ−Ｅ（Ｚ）結合の消失はヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化及び同時に起こるＰｃ結合の消失と相関することが示されている（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３）。第３に、構造試験によれば、リジン２７の前のヒストンＨ３のアミノ酸がＰｃクロモドメインによるメチル化リジン２７の特異的認識に寄与していることがわかっている（Ｆｉｓｃｈｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：１８７０−１８８１；Ｍｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１７：１８２３−１８２８）。更に又、Ｅ（Ｚ）ＨＭＴａｓｅ活性を根絶させるアミノ酸置換もまたｗｉｎｇ  ｉｍａｇｉｎａｌ  ｄｉｓｃにおけるＵｂｘ遺伝子のＰｃＧサイレンシングに寄与するその能力を排除する（Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１９７−２０）。総合すれば、これらのデータはＥ（Ｚ）のＨＭＴａｓｅ活性はＰＲＣ１複合体のリクルートメント並びにＨｏｘ遺伝子のサイレンシングにおいて重要な役割を果たしていることを示している。
【００１０】
本発明の実施形態はＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体であって、再構成複合体がヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）に対してヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性を有する再構成複合体を提供する。代表的な実施形態において、再構成複合体は更にＲｂＡｐ４８、ＡＥＢＰ２又は両方を含む。更に別の実施形態において、再構成複合体はＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とから実質的になるものであり、再構成複合体がヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）に対してヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性を有する。
【００１１】
本発明は更に、（ａ）ＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列と、（ｂ）ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列と、（ｃ）ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列とを含む宿主細胞を準備するステップと、タンパク質の発現及び再構成複合体の生産に十分な条件下で宿主細胞を培養するステップとを含む再構成複合体の製造方法を提供する。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は（ａ）ＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列と、（ｂ）ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列と、（ｃ）ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列とを含む宿主細胞を提供する。代表的な実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞である。更に別の実施形態においては、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００１３】
本発明は更に、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体のヒストンＨ３のリジン（lysine）２７（Ｈ３−Ｋ２７）に対するヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性をモジュレートする化合物を識別する方法を提供する。ここでこの方法は、被験化合物の存在下にヒストン基質に再構成複合体を接触させるステップと、Ｈ３−Ｋ２７メチル化をもたらすために十分な条件下でＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルを検出するステップとを含み、被験化合物非存在下におけるＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較した場合のＨ３−Ｋ２７メチル化の変化は、被験化合物が再構成複合体のＨ３−Ｋ２７ＨＴＭａｓｅ活性のモジュレーターであることを示す。一部の実施形態においては、識別された化合物はＨＴＭａｓｅ活性の阻害剤である。別の実施形態においては、識別された化合物はＨＴＭａｓｅ活性の活性化剤である。
【００１４】
更に別の実施形態において、本発明は、被験化合物の存在下にヒストン基質にＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体を接触させるステップと、Ｈ３−Ｋ２７メチル化をもたらすために十分な条件下でヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のヒストンメチル化のレベルを検出するステップとを含む癌の治療のための候補化合物を識別する方法を提供し、ここで、被験化合物非存在下におけるＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較した場合のＨ３−Ｋ２７メチル化の低下は、被験化合物が癌の治療のための候補化合物であることを示す。
【００１５】
本発明は更に、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体のＨ３−Ｋ２７ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性の阻害剤に細胞を接触させることを含むヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のメチル化を抑制する方法を提供する。代表的な実施形態においては、細胞は培養された細胞である。別の代表的実施形態においては、細胞は対象中のインビボの細胞である。
【００１６】
本発明の実施形態は更に、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体を、任意選択的に懸濁培地と中に含む、ヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のメチル化の検出の感度を上昇させるための試薬を提供する。
【００１７】
本発明は更に、被験化合物の存在下にヒストン基質にＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体を接触させること、及び、Ｈ３−Ｋ２７メチル化をもたらすために十分な条件下でヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のヒストンメチル化のレベルを検出することを含む、Ｈｏｘ遺伝子（例えばＨｏｘＡ９）の発現を抑制する化合物を識別する方法を提供する。ここで、被験化合物非存在下におけるＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較した場合のＨ３−Ｋ２７メチル化の低下は、被験化合物がＨｏｘ遺伝子抑制のための候補化合物であることを示す。
【００１８】
本発明のこれら及び他の態様は以下の詳細な説明においてより詳細に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明を、本発明の実施形態を示す添付の図面を参照しながらより詳細に記載する。しかしながら、本発明は種々の形態で実施してよく、そして、本明細書に記載する実施形態に限定されない。むしろ、これらの実施形態は開示が十分で完全なものとなるように、そして、当業者に本発明の範囲を十分伝達するために呈示する。
【００２０】
特段の記載が無い限り、本明細書において使用する全ての技術的及び学術的な用語は本発明が属する分野の通常の当業者により共通して理解されるものと同様の意味を有する。本明細書に記載した本発明の説明において使用する用語は特定の実施形態を説明する目的のためのものであり、本発明を限定するものではない。本明細書において言及した全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする。
【００２１】
本発明の説明及び添付する請求の範囲において使用する場合、特段に明示しない限り単数と複数を区別しない。更に又、本明細書においては、「及び／又は」とは関連する列挙されたアイテムの１つ以上の何れか及び全ての可能な組み合わせ並びに代替（「又は」）において解釈される場合は組み合わせの欠如を包含するものとする。「約」という用語は、本明細書においては、タンパク質の量、用量、時間、温度、酵素活性又は他の生物学的活性等のような測定可能な値を指す場合は、特定された量の２０％、１０％、５％、１％、０．５％更には０．１％の変動を包含する意味を有する。
【００２２】
特段の記載がない限り、当業者に既知の標準的な方法を遺伝子のクローニング、核酸の増幅及び検出等のために使用してよい。このような手法は当業者に既知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ「Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。
【００２３】
クロマチン構造は遺伝子の調節及び後成的な遺伝において役割を果たしている。ヒストンの翻訳後の修飾は、より高次のクロマチン構造の樹立及び維持に関与している。更に又特定のコアヒストンのテール部をアセチル化、メチル化、リン酸化、リボシル化及びユビキチン化により修飾することができることも報告されている。本発明はメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性を示すタンパク質複合体の再構成に部分的に基づいている。
【００２４】
［Ｉ．再構成タンパク質複合体］
ある実施形態によれば、本発明は再構成複合体がヒストンＨ３のリジン残基に対してヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性を有するＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含むか、これらから実質的になるか、又はこれらからなる、再構成複合体を提供する。特定の実施形態においては、再構成複合体はヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）に対してＨＭＴａｓｅ活性を有する。一部の実施形態においては、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体は、ＲｂＡｐ４８、ＡＥＢＰ２あるいはこれらの両方を更に含む。従って、再構成複合体はＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２の存在下又は非存在下で、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含むことができる。特定の実施形態においては、複合体はＲｂＡｐ４８を含まない。
【００２５】
代表的な実施形態においては、再構成複合体はＨ３−Ｋ２７に対して特異的なＨＭＴａｓｅ活性を有している。このことは、観察されるＨＭＴａｓｅ活性の実質的に全て（例えば少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上）がＨ３−Ｋ２７に指向されていることを意味する。本発明の一部の実施形態においては、Ｈ３−Ｋ２７以外の部位では検出可能なメチル化は皆無、又は実質的に皆無である。更に別の実施形態においては、一部のメチル化（例えば５％又は１０％未満）が他の部位、例えばＨ３−Ｋ９において検出される。
【００２６】
本明細書においては、「再構成」という用語は個別の単離された成分から製剤された組み換え複合体を指す。本明細書においては、「組み換え体」とは、組み換え技術により形成された、即ち当分野で周知の遺伝子工学の手法を利用して作成された産物を指す。
【００２７】
本明細書においては、「単離された」とはある成分が関連している天然に存在する複合体の他の成分又は関連要素の少なくとも一部から分離された、又は実質的にこれらを含有しないその成分を指す。
【００２８】
「ＥＥＤ」、「ＥＺＨ２」、「ＳＵＺ１２」、「ＲｂＡｐ４８」及び／又は「ＡＥＢＰ２」は本明細書に記載する場合は、種々の生物由来のホモログ類を包含する。特定の実施形態においては、ＥＥＤ、ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、ＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２は哺乳類（例えばヒト、サル、ラット、マウス、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ等）のタンパク質、ショウジョウバエタンパク質（例えばＥＳＣ、Ｅ（Ｚ）、Ｓｕ（Ｚ）１２及びｐ５５）、線虫タンパク質（例えばＭＥＳ−２、ＭＥＳ−３及びＭＥＳ−４）、植物タンパク質又はその組み合わせであってよい。上記したタンパク質の「その組み合わせ」とは、少なくとも１つのタンパク質がある生物から誘導され得、そして少なくとも１つのタンパク質が異なる生物から誘導され得ることを指す。例えば、ＥＥＤは哺乳類タンパク質であってよく、そしてＥＺＨ２は植物タンパク質であってよい。
【００２９】
ＥＥＤ、ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、ＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２という用語は当業者の理解する通り、機能的又は生物学的に活性なその変異体、アイソフォーム、誘導体、フラグメント等を包含することができる。本明細書においては、「変異体」とはアミノ酸１つ以上により改変されるアミノ酸配列を指す。変異体は「保存的な」変化を有してよく、その場合置換されたアミノ酸は同様の構造的又は化学的特性を有する。特に、このような変化は、アミノ酸を本質的に同様の機能的特性を有する他のアミノ酸と置換できるようにする電荷密度、疎水性／親水性、大きさ及び配置のような物理的特徴におけるアミノ酸間の既知の同様性を指針とするものである。例えば、ＡｌａはＶａｌ又はＳｅｒで置き換えてよく；ＶａｌはＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ又はＩｌｅ、好ましくはＡｌａ又はＬｅｕで置き換えてよく；ＬｅｕはＡｌａ、Ｖａｌ又はＩｌｅ、好ましくはＶａｌ又はＩｌｅで置き換えてよく；ＧｌｙはＰｒｏ、又はＣｙｓ、好ましくはＰｒｏで置き換えてよく；ＰｒｏはＧｌｙ、Ｃｙｓ、Ｓｅｒ又はＭｅｔ、好ましくはＧｌｙ、Ｃｙｓ又はＳｅｒで置き換えてよく；ＣｙｓはＧｌｙ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ又はＭｅｔ、好ましくはＰｒｏ又はＭｅｔで置き換えてよく；ＭｅｔはＰｒｏ又はＣｙｓ、好ましくはＣｙｓで置き換えてよく；ＨｉｓはＰｈｅ又はＧｌｎ、好ましくはＰｈｅで置き換えてよく；ＰｈｅはＨｉｓ、Ｔｙｒ又はＴｒｐ、好ましくはＨｉｓ又はＴｒｙで置き換えてよく；ＴｙｒはＨｉｓ、Ｐｈｅ又はＴｒｐ、好ましくはＰｈｅ又はＴｒｐで置き換えてよく；ＴｒｐはＰｈｅ又はＴｙｒ、好ましくはＴｙｒで置き換えてよく；ＡｓｎはＧｌｎ又はＳｅｒ、好ましくはＧｌｎで置き換えてよく；ＧｌｎはＨｉｓ、Ｌｙｓ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ又はＳｅｒ、好ましくはＡｓｎ又はＳｅｒで置き換えてよく；ＳｅｒはＧｌｎ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｃｙｓ又はＡｌａで置き換えてよく；ＴｈｒはＧｌｎ又はＳｅｒ、好ましくはＳｅｒで置き換えてよく；ＬｙｓはＧｌｎ又はＡｒｇで置き換えてよく；ＡｒｇはＬｙｓ、Ａｓｐ又はＧｌｕ、好ましくはＬｙｓ又はＡｓｐで置き換えてよく；ＡｓｐはＬｙｓ、Ａｒｇ又はＧｌｕ、好ましくはＡｒｇ又はＧｌｕで置き換えてよく；そしてＧｌｕはＡｒｇ又はＡｓｐ、好ましくはＡｓｐで置き換えてよい。変化があった場合は、その後にそれを日常的にスクリーニングすることにより機能に対するその作用を調べることができる。
【００３０】
或いは、変異体は「非保存的」変化（例えばグリシンとトリプトファンの置換）を有していてもよい。類似の僅かな変異はまたアミノ酸の欠失又は挿入、あるいはこれらの両方を包含してよい。生物学的活性を根絶させること無く置換、挿入又は欠失させることができるアミノ酸残基を調べる場合の指針は、例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ（商標）ソフトウエアのような当分野で周知のコンピュータープログラムを使用して得ることができる。特定の実施形態においては、「機能的変異体」は目的の化合物に通常備わっている生物学的活性の少なくとも１つ（例えばＨ３−Ｋ２７ＨＭＴａｓｅ活性）を保持している。特定の実施形態においては、「機能的変異体」は天然の成分に通常は伴っている生物学的活性（例えばＫ２７特異的ＨＭＴａｓｅ活性）の少なくとも約４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％以上を保持している。
【００３１】
本明細書においては、「誘導体」とは化学修飾に付されている成分を指す。タンパク質成分の誘導体化はアセチル基、アシル基、アルキル基、アミノ基、ホルミル基又はモルホリノ基による水素の置換を包含してよい。誘導体分子は天然に存在する分子の生物学的活性を保持することができるが、より存続期間が長いこと、又は活性が増強されていることのような利点を与えることができる。
【００３２】
特定の実施形態においては、再構成複合体のタンパク質成分の何れかの生物学的活性な変異体又は誘導体は天然に存在するタンパク質のアミノ酸配列と、少なくとも約６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％以上のアミノ酸配列の類似性（similarity）又は一致性（identity）を有する。
【００３３】
本明細書においては、「フラグメント」とは、ある成分に通常備わっている生物学的活性の少なくとも１つ（例えばＨ３−Ｋ２７ＨＭＴａｓｅ活性）を保持しているその成分の部分を指し、完全長のタンパク質と比較して少なくとも約５０％、７０％、８０％、９０％以上の生物学的活性を有することができるか、或いは、さらなる生物学的活性を有する。例えば、特定の実施形態においては、ＥＺＨ２のフラグメントは触媒ドメイン、ＳＡＭ結合部位及び／又はＳＥＴドメインを含む。一般的に、フラグメントは複合体形成に関与する能力を保持している。代表的な実施形態においては、フラグメントは完全長タンパク質の少なくとも約５０、１００、１５０、２００、２５０又は５００連続アミノ酸を含む。
【００３４】
再構成複合体の成分のアイソフォームは当分野で周知である。例えば、Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １４（２）：１８３−９３（２００４）及びＰａｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ３：２２−２６（２００４）はＥＥＤアイソフォームを記載している。更に、例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４５６及びＮＰ＿００４４４７（ＥＺＨ２、ヒトアイソフォームａ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５２９９８及びＮＰ＿６９４５４３（ＥＺＨ２、ヒトアイソフォームｂ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７９７及びＮＰ＿００３７８８（ＥＥＤ、ヒトアイソフォームａ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５２９９１及びＮＰ＿６９４５３６（ＥＥＤ、ヒトアイソフォームｂ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４３８０２及びＮＰ＿６５２０５９（ＳＵ（Ｚ）１２、キイロショウジョウバエ由来のアイソフォームａ）：及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１６８８２６及びＮＰ＿７３０４６５（ＳＵ（Ｚ）１２、キイロショウジョウバエ由来のアイソフォームｂ）も参照できる。
【００３５】
別の実施形態においては、本発明の再構成複合体はネイティブの複合体の酵素活性に匹敵する（comparable）酵素活性を有する（例えば少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％以上）。他の実施形態においては、再構成複合体はネイティブ複合体の基質特異性に匹敵する基質特異性を有する（例えばヌクレオソーム型においてＨ３に対する選択性（preference）、そしてモノヌクレオソーム型と比較した場合にジヌクレオソーム又はオリゴヌクレオソームに対して更に選択性を有する）。特定の実施形態においては、ヒストン基質はコアヒストン又はヒストン複合体である（即ちＤＮＡを含まない、又はＤＮＡを実質的に含まない）。一部の実施形態においては、ヒストン基質はヌクレオソーム中で存在する（即ち再構成複合体はヒストン基質を含むヌクレオソームと接触する）。更に詳細には、ヒストン基質はコアヒストン、ヒストンオクタマー又はヌクレオソーム、モノヌクレオソーム、ジヌクレオソーム又はオリゴヌクレオソームであり得るが、これらに限定されない。特定の実施形態においては、ヒストン基質はジヌクレオソームである。
【００３６】
本発明は、本発明の再構成複合体の製造方法を更に提供する。この方法は、再構成複合体のタンパク質をコードする異種核酸配列を含む宿主細胞を準備するステップと、タンパク質の発現及び再構成複合体の生産のために十分な条件下で宿主細胞を培養するステップとを含むか、これらから実質的になるか、又はこれからなるものである。特定の実施形態においては、再構成複合体の製造方法においては、宿主細胞は（ａ）ＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列と、（ｂ）ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列と、（ｃ）ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列とを含み、そしてタンパク質の発現及び再構成複合体の生産に十分な条件下で宿主細胞を培養する。一部の実施形態においては、宿主細胞は更に（ｄ）ＲｂＡｐ４８タンパク質をコードする核酸配列、（ｅ）ＡＥＢＰ２タンパク質をコードする核酸配列、又は（ｆ）それらの両方を含む。
【００３７】
本明細書においては、「核酸」とはＲＮＡ及びＤＮＡの両方、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成（例えば化学合成）ＤＮＡ及びＲＮＡ及びＤＮＡのキメラを包含する。核酸は２本鎖又は１本鎖であってよい。１本鎖の場合は、核酸はセンス鎖又はアンチセンス鎖であってよい。核酸はオリゴヌクレオチドの類似体又は誘導体（例えばイノシン又はホスホロチオエートヌクレオチド）を用いて合成してよい。このようなオリゴヌクレオチドは例えば、改変された塩基対形成能力又は増大したヌクレアーゼ耐性を有する核酸を調製するために使用できる。
【００３８】
「異種核酸」という用語は当分野で周知であり、それが導入されている宿主細胞内には通常は存在しない核酸であることは、業者が容易に理解するものであり、及び／又は宿主細胞内に通常は存在しない調節エレメントの制御下に発現される核酸である。本発明の異種核酸はまた、核酸が導入されている細胞内に存在する量とは通常異なる量において存在するか、そのような量において発現される核酸であることができる。異種核酸は典型的には宿主細胞内に天然に存在しない配列のものである。或いは、再構成複合体の成分をコードする異種核酸は適切な発現制御配列、例えば転写／翻訳制御シグナル及びポリアデニル化シグナルを伴うことができる。
【００３９】
所望の量及び組織特異的な発現に応じて、種々のプロモーター／エンハンサーのエレメントを使用できることが理解される。プロモーターは所望の発現のパターンに応じて構成性又は誘導性（例えば、メタロチオネインプロモーターまたはホルモン誘導プロモーター）であることができる。プロモーターはネイティブ又は外来性であることができ、そして天然又は合成の配列であることができる。外来性とは、プロモーターが導入される野生型の宿主内にプロモーターが検出されないことを意図している。プロモーターは、それが目的の標的細胞内で機能するように選択する。更に又、挿入されたタンパク質コーディング配列の効率的な翻訳のためには特定の開始シグナルが一般的に必要である。ＡＴＧ開始コドン及び隣接する配列を含むことができるこれらの翻訳制御配列は種々の起源、天然及び合成の両方であることができる。再構成複合体の成分をコードする異種核酸が転写すべき別の配列を含む本発明の実施形態において、転写単位は別個のプロモーターと、又は単一の上流のプロモーター及び１つ以上の下流の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）配列（例えばピコルナウイルスＥＭＣ  ＩＲＥＳ配列）と作動可能に結合することができる。
【００４０】
適当な宿主細胞は当分野で周知である。例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）を参照できる。例えば、宿主細胞は原核生物又は真核生物の細胞であることができる。更に、ポリペプチド及び／又はタンパク質は大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（例えばバキュロウイルス発現系）、酵母細胞、植物細胞又は哺乳類細胞（例えばヒト、ラット、マウス、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、サル等）中で発現することができる。宿主細胞は培養細胞、例えば初代細胞系統又は不死化細胞系統の細胞であることができる。宿主細胞はバイオリアクターとして実質的に使用される微生物、動物又は植物における細胞であることができる。本発明の特定の実施形態においては、宿主細胞は周知の発現ベクターの複製を可能にする何れかの昆虫細胞である。例えば、宿主細胞はＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ由来、例えばＳｆ９又はＳｆ２１細胞系統、ショウジョウバエ細胞系統又はカの細胞系統、例えばヒトスジシマカ誘導細胞系統であることができる。異種タンパク質の発現のための昆虫細胞の使用は、核酸、例えばベクター、例えば昆虫細胞適合ベクターをそのような細胞に導入する方法及び培養物としてそのような細胞を維持する方法のように、多く報告されている。例えばＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄ．Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ（１９９５）；Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｏｘｆｏｒｄ，Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ（１９９４）；Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６３：３８２２−Ｂ（１９８９）；Ｋａｊｉｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８：４６４６−５０（１９９１）；Ｒｕｆｆｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６６：６９２２−３０（１９９２）；Ｋｉｍｂａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒ．２１９：３７−４４（１９９６）；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒ．２７２：３８２−９３（２０００）；及びＳａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，の米国特許第６，２０４，０５９号を参照できる。本発明の特定の実施形態においては、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００４１】
一部の実施形態においては、再構成複合体の製造方法は培養宿主細胞又は培養宿主細胞由来の培地から発現された再構成複合体を単離することを含む。単離された再構成複合体は所望の量のタンパク質及び純度レベルを得るための操作法の組み合わせ及びその反復を包含することができる周知のタンパク質の単離及び精製手法に従って単離及び精製することができる。
【００４２】
従って、一部の実施形態においては、再構成複合体の製造方法は、発現した再構成複合体を固体支持体に結合することを含む。固体支持体は粒子、ビーズ、ゲル又はプレートのような当分野で知られた何れかの適当な形態の、砂、シリカ、ケイ酸塩、シリカゲル、ガラス、ガラスビーズ、ガラス繊維、アルミナ、ジルコニア、チタン、ニッケル及び適当な重合体物質（アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリエチレングリコール、ポリスチレンにグラフト重合又は共有結合したポリエチレングリコール（ＰＥＧポリスチレンとも称する）を含むがこれらに限定されない）を含む無機及び／又は有機の粒状支持体物質であることができる。固体支持体は発現された再構成複合体に結合するために使用することができる当分野で知られたような部分、例えば発現された再構成複合体に向けられたニッケル、抗体または酵素基質（例えばグルタチオン）を含むことができる。検出は市販の検出可能な物質を含む適切な検出可能な物質に、所望のタンパク質又はタンパク質に向けられた抗体をカップリング又はタギング（即ち物理的に連結）することにより促進することができる。検出可能な物質の例は、種々の抗体、酵素、ペプチド及び／又はタンパク質タグ、補欠分子族、蛍光物質、ルミネセント物質、バイオルミネセント物質及び放射性物質を含むがこれらに限定されない。適当な抗体、例えばＥＺＨ２及びＳＵＺ１２に対する抗体はＣａｏ，ｅｔ．ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３（２００２）、Ｐｅｔｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：１５７７−１５８９（２００２）；及びＰｌａｔｈ  ｅｔ．ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３１−１３５（２００３）に記載されている。適当な酵素の例は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビパーオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼを含むがこれらに限定されない。ペプチド及び／又はタンパク質タグの例は、ポリヒスチジンペプチドタグ、ＦＬＡＧペプチドタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、チオレドキシン（Ｔｒｘ）及びカルモジュリン結合ペプチドを含むがこれらに限定されない。適当な補欠分子族の例は、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンを含むがこれらに限定されない。適当な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリド又はフィコエリスリンを含むがこれらに限定されない。ルミネセント物質の例はルミナールを含む。発光性物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンを含むがこれらに限定されない。適当な放射性物質の例は、125Ｉ、131Ｉ、35Ｉ及び3Ｈを含むがこれらに限定されない。特定の実施形態においては、発現された再構成複合体は精製タグを含む（例えば成分の何れかの１つ以上をタグ付けすることができる）。一部の実施形態においては、本発明の再構成複合体は少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％以上（ｗ／ｗ）の純度レベルを有する。
【００４３】
本発明の別の実施形態においては、宿主細胞は上記したタンパク質をコードする異種核酸配列で安定に形質転換することができる。「安定な形質転換」とは本明細書においては、一般的に、宿主細胞に導入された異種核酸配列が宿主細胞のゲノム内に組み込まれない「一過性の形質転換」とは対照的な、宿主細胞のゲノム内への異種核酸配列の組み込みを指す。「安定な形質転換」という用語は更にエピソーム（例えばエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ））の安定な発現も指すことができる。
【００４４】
特定の実施形態においては、宿主細胞は、ＥＥＤタンパク質、ＥＺＨ２タンパク質及びＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列で安定に形質転換される。任意選択的に、宿主細胞は、ＲｂＡｐ４８タンパク質及び／又はＡＥＢＰ２タンパク質、あるいはこれらの両方をコードする異種核酸配列で安定に形質転換される。
【００４５】
一部の実施形態においては、宿主細胞は上記したタンパク質、特にＥＥＤタンパク質、ＥＺＨ２タンパク質及びＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列を含む組み換えベクター１つ以上を含む。本明細書においては、「組み換えベクター」とはヌクレオチド配列（即ちトランスジーン）１つ以上、例えば２、３、４、５以上の異種ヌクレオチド配列を含むウイルス性又は非ウイルス性のベクターを指す。特定の実施形態においては、一以上のベクターは、（ｉ）ＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列を含むベクターと、（ｉｉ）ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列を含む別個のベクターと、（ｉｉｉ）ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列を含む更に別個のベクターとを含む。他の実施形態においては、再構成複合体の製造方法は更に１つ以上のベクターで宿主細胞を形質転換することを含む。再構成複合体の成分は、各々別個のベクターから発現されうる。或いは、単一のベクターが再構成複合体の１以上の成分をコードすることができる。
【００４６】
適当なベクターは、ウイルスベクター（例えばバキュロウイルス、レトロウイルス、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス又は単純疱疹ウイルス）、脂質ベクター、ポリリジンベクター、核酸分子とともに使用される合成ポリアミノ重合体ベクター、例えばプラスミド等を含む。送達ベクター類はセクションＩＶにおいてより詳細に記載する。
【００４７】
別の実施形態においては、本発明は再構成複合体のタンパク質の各々をコードする異種核酸配列を含むか、これから実質的になるか、又はこれからなる、宿主細胞を提供する。特定の実施形態においては、宿主細胞は、（ａ）ＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列と、（ｂ）ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列と、（ｃ）ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列とを含むか、これから実質的になるか、又はこれからなる。さらに、任意選択的に、宿主細胞は、（ｄ）ＲｂＡｐ４８タンパク質をコードする異種核酸配列、（ｅ）ＡＥＢＰ２タンパク質をコードする核酸配列、又は（ｆ）それらの両方を含むか、これらから実質的になるか、又はこれらからなる。適当な宿主細胞は上記の通りである。一部の実施形態においては、宿主細胞は昆虫細胞である。特定の実施形態においては、昆虫細胞はＳｆ９細胞である。
【００４８】
さらに、宿主細胞は、再構成複合体のタンパク質をコードする異種核酸配列、例えばＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列、ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列、ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列により安定に形質転換できる。さらに、任意選択的に、宿主細胞は、ＲｂＡｐ４８タンパク質をコードする異種核酸配列、ＡＥＢＰ２タンパク質をコードする核酸配列、又はそれらの両方により安定に形質転換できる。一部の実施形態においては、宿主細胞は上記した異種核酸配列を含む組み換えベクター１つ以上を含む。更に別の実施形態においては、１つ以上のベクターは（ｉ）ＥＥＤタンパク質をコードする異種核酸配列を含むベクターと、（ｉｉ）ＥＺＨ２タンパク質をコードする異種核酸配列を含む別個のベクターと、（ｉｉｉ）ＳＵＺ１２タンパク質をコードする異種核酸配列を含む更に別個のベクターとを含む。適当なベクターは本明細書に記載する通りである。本発明の実施態様によれば、ベクターはバキュロウイルスベクターであることができる。
【００４９】
ＥＺＨ２、ＥＥＤ、ＳＵＺ１２、ＡＥＢＰ２及びＲｂＡｐ４８の核酸及びアミノ酸配列は当分野で知られており、例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５；３８（１）：３０−７（ＥＺＨ２）；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １５；５４（１）：７９−８８（ＥＥＤ）；Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １４（２）：１８３−９３（ＥＥＤ）；Ｐａｓｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  ３：２２−２６（ＥＥＤ）；Ｂｉｒｖｅ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２８：３３７１−３３７９（ＳＵＺ１２）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ２６４：６４８−６５２（ＲｂＡｐ４８）；Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １５：５７−６７  ａｎｄ  Ｚａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３：１９２４−１９３５（バキュロウイルス発現哺乳類ＲｂＡｐ４８）；Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１：２７４（２１）：１４６７８−８４（ＡＥＢＰ２）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００４４５６及びＮＰ＿００４４４７（ＥＺＨ２、ヒトアイソフォームａ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５２９９８及びＮＰ＿６９４５４３（ＥＺＨ２、ヒトアイソフォームｂ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０７９２９７及びＮＰ＿５２４０２１（Ｅ（Ｚ）、キイロショウジョウバエ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００３７９７及びＮＰ＿００３７８８（ＥＥＤ、ヒトアイソフォームａ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５２９９１及びＮＰ＿６９４５３６（ＥＥＤ、ヒトアイソフォームｂ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０５８０８３及びＮＰ＿４７７４３１（ＥＳＣ、キイロショウジョウバエ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿０１５３５５及びＮＰ＿０５６１７０（ＳＵＺ１２、ヒト）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１４３８０２及びＮＰ＿６５２０５９（ＳＵ（Ｚ）１２、キイロショウジョウバエ由来のアイソフォームａ）：及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１６８８２６及びＮＰ＿７３０４６５（ＳＵ（Ｚ）１２、キイロショウジョウバエ由来のアイソフォームｂ）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００５６１０及びＮＰ＿００５６０１（ＲｂＡｐ４８、ヒト）；及びＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿１５３２０７及びＮＰ＿６９４９３９（ＡＥＢＰ２、ヒト）を参照することができる。
【００５０】
［ＩＩ．スクリーニング法］
本発明は更に本明細書に記載した再構成複合体のヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性をモジュレートする化合物、又は、ヒストンＨ３及び／又はヌクレオソームへの再構成複合体の結合をモジュレートする化合物を識別する方法を提供する。本明細書においては、「モジュレートする」又は「モジュレーション」とは特定の活性における増強（例えば増大）又は抑制（例えば低減）を指す。「増強」、「増強する」又は「増強すること」という用語は特定のパラメーターの増大（例えば少なくとも約１．１倍、１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、又は１５倍以上の増大）を指す。「抑制する」又は「低減する」という用語又はその文法上の変化形は、本明細書においては、少なくとも約１０％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％以上の特異的活性の低減又は減衰を指す。特定の実施形態においては、抑制又は低減は僅かであるか、又は実質的に皆無である検出可能な活性をもたらす（最大でも有意でない量、例えば約１０％、更には５％未満）。
【００５１】
一部の実施形態においては、本発明はＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体のヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）に対するＨＭＴａｓｅ活性をモジュレートする化合物を識別する方法を提供し、本方法は、被験化合物の存在下にヒストン基質に再構成複合体を接触させること、及び、Ｈ３−Ｋ２７メチル化をもたらすために十分な条件下でＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルを検出することを含むか、これから実質的になるか、又はこれからなるものであり、ここで、被験化合物非存在下のＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較してＨ３−Ｋ２７メチル化が変化していることは、被験化合物が再構成複合体のＨ３−Ｋ２７ＨＴＭａｓｅ活性のモジュレーターであることを示している。一部の実施形態においては、再構成複合体は、ＲｂＡｐ４８、ＡＥＢＰ２あるいはこれらの両方をさらに含む。ここで、ＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２は、哺乳類タンパク質、ショウジョウバエタンパク質、線虫タンパク質、植物タンパク質あるいはこれらの組み合わせである。特定の実施形態においては、被験化合物非存在下のＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較してＨ３−Ｋ２７メチル化が低減していることは被験化合物が再構成複合体のＨ３−Ｋ２７ＨＭＴａｓｅ活性の阻害剤であることを示している。「阻害剤」とは、本明細書においては、被験化合物の非存在下の活性の量と比較して特定の活性を被験化合物が低減する能力を指す。一部の実施形態においては、被験化合物は被験化合物の非存在下のＨＴＭａｓｅ活性の量と比較して、少なくとも約１０％、２５％、３５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％、９５％以上ＨＴＭａｓｅ活性を低減又は減衰させる。特定の実施形態においては、僅かであるか、又は実質的に皆無である検出可能な活性となる（最大でも有意でない量、例えば約１０％、更には５％未満）。別の実施形態においては、被験化合物非存在下のＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較してＨ３−Ｋ２７メチル化が増大していることは化合物が再構成複合体のＨ３−Ｋ２７ＨＭＴａｓｅ活性の活性化剤であることを示している。「活性化剤」とは、本明細書においては、被験化合物の非存在下の活性の量と比較して特定の活性を被験化合物が増大させる又は低減を防ぐ能力を指す。一部の実施形態においては、約１．１倍、１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、８倍、１０倍、１２倍、又は１５倍以上の増大）のＨＴＭａｓｅ活性の増大となる。
【００５２】
再構成複合体のＨＭＴａｓｅ活性のモジュレーションは、当分野で知られた何れかの方法により、例えば放射標識メチルドナー、例えばＳ−アデノシル−Ｌ−メチオニン（ＳＡＭ）を反応混合物に添加することにより、又は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８５３−８５７（２００１）に記載の通り、ヒストンＨ３リジン２７のメチル化形態を特異的に認識する標識抗体（例えば蛍光標識抗体）を用いたＥＬＩＳＡによりヒストンＨ３リジン２７メチル化をモニタリングすることにより、測定することができる。スクリーニングの第１ラウンドにおいて識別された阻害剤又は活性化剤を、本明細書に開示したＨＭＴａｓｅ試験を用いてＩＣ50及び特異性を調べるための試験において、個別に分析することができる。低値のＩＣ50を有し、ＥＥＤ−ＥＺＨ２酵素に対する特異性を示す化合物は更に、組織培養において分析することにより、Ｈ３−Ｋ２７メチル化、細胞生育（例えばトリプシン処理及びトリパンブルー染色）及び／又は毒性に対するそのインビボの作用を調べることができる。
【００５３】
本明細書に記載した方法によってスクリーニングされる被験化合物は、多くの化学クラスを包含し、合成または半合成の化学物質、精製された天然産物、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチドアプタマー、核酸、オリゴヌクレオチド、炭水化物、脂質又は他の小型又は大型の有機又は無機の分子を含むがこれらに限定されない。小分子は、そのような分子が経口吸収後により容易に吸収され、そして潜在的な抗原決定基が少ないことから、望ましい。非ペプチド物質又は小分子のライブラリは一般的に合成方法により調製されるが、酵素を使用した生合成方法における近年の進歩により、他の方法では化学合成が困難であった化学ライブラリを調製できるようになった。小分子ライブラリはまた種々の市販品、例えばＳＰＥＣＳ及びＢｉｏＳＰＥＣ  Ｂ．Ｖ．（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ、Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、Ｍａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ，ＵＫ）及びＡｓｉｎｅｘ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）から得ることもできる。
【００５４】
特定の実施形態においては、記載した再構成複合体のＨＴＭａｓｅ活性をモジュレートする化合物を識別する方法は細胞系の方法（cell-based method）、又は、無細胞系の方法（cell-free method）である。他の実施形態においては、方法は再構成複合体のモジュレーターを識別するための高スループットのスクリーニング能力を与える。例えば、本明細書に記載した方法に従って使用するための細胞系の高スループットスクリーニング試験はＳｔｏｃｋｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（（１９９９）Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏ．６：７１−８３）により開示されており、そこでは、ＤＮＡ合成及び翻訳後のプロセシングのような生合成過程が小型化された細胞系の試験によりモニタリングされる。例えば、内因性ＨＭＴａｓｅ活性の阻害剤を識別するための細胞形の試験は、ＨＭＴａｓｅによりターゲティングされることがわかっているＨｏｘ遺伝子のような標的遺伝子の上流領域に作動可能に連結したルシフェラーゼのようなレポーター遺伝子の使用を包含する。レポーター構築物を発現する細胞を被験化合物に曝露し、レポーター遺伝子の発現をモニタリングすることができる。阻害剤が再構成複合体を特異的にターゲティングすることを確認するためには、再構成複合体を使用した二次的なインビトロスクリーニングを用いる。或いは、再構成複合体の成分を、内因性複合体を欠失した細胞において発現させ、そしてモジュレーターを得るためのスクリーニングのために直接使用することができる。
【００５５】
候補タンパク質結合分子の小分子ライブラリをスクリーニングするための高スループット無細胞系の方法は当分野で周知であり、そして再構成複合体の成分少なくとも１つに結合し、そしてＨＭＴａｓｅの活性又はヒストンへの結合をモジュレートする分子を識別するために使用できる。例えば、ＨｅＬａ細胞から精製したヌクレオソームヒストン基質（例えばジヌクレオソームヒストン）をマルチウエルプレート又は他の適当な表面にコーティングし、そして再構成酵素複合体を含有する反応混合物を基質に添加する。再構成複合体の添加の前、同時又は後に、被験化合物を、基質を含有するウェル又は表面に添加することができる。生理学的状態を実質的に反映した溶液で反応混合物を洗浄することにより未結合又は弱く結合した被験化合物を除去することができる。或いは、被験化合物を固定化し、そして再構成複合体の溶液をカラム、フィルター又は他の表面に接触させることができる。再構成複合体のヒストンへの結合をモジュレートする被験化合物の能力を標識（例えば放射標識又はケミルミネセンス）又は競合ＥＬＩＳＡ試験により測定することができる。
【００５６】
ライブラリスクリーニングは多重の反応の迅速な調製及び処理を可能にする何れかのフォーマットにおいて実施できる。被験物質並びに試験成分の保存溶液を手作業により調製し、その後の全てのピペッティング、希釈、混合、洗浄、インキュベート、試料の読み取り及びデータ収集は試験により生じたシグナル、即ち、市販のロボット式のピペッティング装置、自動化ワークステーション及びヒストンＨ３リジン２７のメチル化を検出するための分析機器を用いて行う。
【００５７】
種々の他の試薬は本発明のスクリーニング試験において包含させることができる。これらには最適なタンパク質−タンパク質結合及び／又はＨＭＴａｓｅ活性を促進するため、及び／又は、非特異的又はバックグラウンドの相互作用を低減するために使用することができる塩類、天然のタンパク質、例えばアルブミン、洗剤等のような試薬が包含される。更に又、試験の効率を向上させる試薬、例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗微生物剤等を使用してよい。成分の混合物は必要な結合及び／又はＨＭＴａｓｅ活性をもたらす何れかの順序で添加することができる。
【００５８】
本発明はまた、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体を被験化合物の存在下にヒストン基質と接触させること、及び、Ｈ３−Ｋ２７メチル化をもたらすために十分な条件下でヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のヒストンメチル化のレベルを検出することを含むか、これから実質的になるか、又はこれからなる、増殖亢進性の障害、例えば腫瘍、癌及び新生物障害、並びに、前悪性及び非新生物性又は非悪性の増殖亢進性の障害を治療するための候補化合物を識別する方法を提供し、ここで、被験化合物非存在下におけるＨ３−Ｋ２７メチル化のレベルと比較した場合のＨ３−Ｋ２７メチル化の低下は、被験化合物が増殖亢進性の障害、例えば腫瘍、癌及び新生物障害、並びに、前悪性及び非新生物性又は非悪性の増殖亢進性の障害の治療のための候補化合物であることを示す。
【００５９】
特定の実施形態においては、本発明は、癌を治療するための候補化合物を識別する方法を提供する。例示される癌は悪性障害、例えば乳癌；骨肉種；血管肉腫；腺維肉腫及び他の肉腫；白血病；リンパ腫；洞腫瘍；卵巣、子宮、膀胱、前立腺及び他の泌尿器の癌；結腸、食堂及び胃の癌及び他の胃腸の癌；肺癌；黒色腫；膵臓癌；肝癌；腎臓癌；内分泌癌；皮膚癌；及び脳又は中枢及び末梢の神経（ＣＮＳ）系の腫瘍、悪性又は良性のもの（神経膠腫及び神経芽細胞腫を含む）を包含する。「癌を治療すること」又は「癌の治療」という用語では、癌の重症度を低下させるか、癌を少なくとも部分的に消失させることを意図する。
【００６０】
一部の実施形態においては、被験化合物として機能する化合物は、ＳＥＴ７阻害剤を含むがこれらに限定されない、ＳＥＴドメイン含有タンパク質を得るためのスクリーンから誘導することができる。ＳＥＴドメインは、タンパク質メチルトランスフェラーゼ中に存在するシグネチャーモチーフであってよい保存された配列モチーフである。タンパク質メチルトランスフェラーゼでは、ヒストンメチル化を包含するメチルトランスフェラーゼ活性を幾つかのタンパク質が保有している。Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ：  ｉｎｔｅｒｐｌａｙ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｖａｌｅｎｔ  ｍｏｄｉｆｉｃａｉｔｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｒｅ  ｈｉｓｔｏｎｅ  ｔａｉｌｓ，Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １５：２３４３−２３６０（２００１）を参照できる。
【００６１】
［ＩＩＩ．別の用途及び対象］
上記スクリーニング法の他に、例えばヒストン機能の試験のためのＨＴＭａｓｅ活性をモジュレートするための化合物を識別するための研究用試薬として本発明の再構成複合体を使用することができる。例えば、Ｈ３−Ｋ２７ＨＭＴａｓｅ活性を増大させる化合物の識別は、Ｈ３−Ｋ２７ＨＭＴａｓｅ活性の調節物質としての修飾の機能を試験するために使用できる。
【００６２】
他の実施形態によれば、本発明は、ヒストンメチル化を抑制する方法をさらに提供する。特に、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体のＨ３−Ｋ２７ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴａｓｅ）活性の阻害剤に細胞を接触させるステップを含むか、これから実質的になるか、又はこれからなる、ヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のメチル化の抑制方法である。再構成複合体は、ＲｂＡｐ４８、ＡＥＢＰ２、あるいはこれらの両方をさらに含むことができる。一部の実施形態においては、細胞は培養細胞である。別の実施形態においては、細胞は対象におけるインビボの細胞である。
【００６３】
本発明を実施する対象は、適切には、トリ及び哺乳類を包含するがこれらに限定されない。哺乳類が好ましい。「トリ」という用語は、本明細書においては、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、シチメンチョウ及びキジを包含するがこれらに限定されない。一部の実施形態においては、ヒト対象が好ましい。ヒト対象は雌雄及び発達のいずれかの段階（即ち、新生児、小児、幼児、青年、成人）にある対象を包含する。本発明の一部の実施形態は主にヒト対象に関する実施に関わるものであるが、本発明は動物対象、特に哺乳類対象、例えば非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス等に対して実施してよい。本発明は獣医科医療目的のため、薬剤スクリーニング及び薬剤開発の目的のために動物に対して実施される。
【００６４】
別の実施形態においては、本発明は上記の再構成複合体の阻害剤及び製薬上許容し得る担体を含む医薬品製剤を提供する。本発明は更に医薬の調製のための上記の再構成複合体の阻害剤又は本発明に記載したスクリーニング試験の使用を提供する。
【００６５】
本発明の実施形態は更に、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体を含むか、これから実質的になるか、又はこれからなる、ヒストンメチル化、特にヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のメチル化の検出の感度を上昇させるための試薬を提供する。試薬は更に懸濁培地を含むことができる。再構成複合体は、ＲｂＡｐ４８、ＡＥＢＰ２あるいはこれらの両方をさらに含むことができる。一部の実施形態においては、試薬を凍結乾燥する。特定の実施形態においては、試薬は癌の診断薬である。
【００６６】
更に別の実施形態においては、本発明はヒストンメチル化の阻害を測定するためのキットを提供する。キットは、（ａ）ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体と、（ｂ）再構成複合体のヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＴＭａｓｅ）活性の阻害を測定することを含むヒストンメチル化の抑制を測定するための方法に関する取扱説明書、及び、任意選択的に、ＨＴＭａｓｅ活性の阻害を測定するための方法を実施するための別の試薬又は装置を含むか、これから実質的になるか、又はこれからなる。再構成複合体は更にＲｂＡｐ４８、ＡＥＢＰ２、あるいはこれらの両方を含むことができる。特定の実施形態においては、方法は（ａ）ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含む再構成複合体と、（ｂ）再構成複合体のＨ３−Ｋ２７メチルトランスフェラーゼ（ＨＴＭａｓｅ）活性の阻害を測定することを含むＨ３−Ｋ２７メチル化の抑制を測定するための方法に関する取扱説明書と、任意選択的に、ＨＴＭａｓｅ活性の阻害を測定するための方法を実施するための別の試薬又は装置を含むか、これから実質的になるか、又はこれからなる、ヒストンＨ３のリジン２７（Ｈ３−Ｋ２７）のヒストンメチル化の阻害を検出することに関する。一部の実施形態においては、再構成複合体は更にＲｂＡｐ４８、ＡＥＢＰ２、あるいはこれらの両方を含むことができる。
【００６７】
［ＩＶ．送達ベクター］
当分野で知られている何れかのウイルスベクターを本発明において使用することができる。このようなウイルスベクターの例は、アデノウイルス科；バキュロウイルス科；ビルナウイルス科；ブンヤウイルス科；カリシウイルス科、カピロウイルス群；カリアウイルス群；カルモウイルス群；カウルモウイルス群；クロステロウイルス群；コメリナ黄斑ウイルス群；コモウイルス群；コロナウイルス科；ＰＭ２ファージ群；コルシコウイルス科；クリプティックウイルス群；クリプトウイルス群；ククモウイルス群のファミリー；［ＰＨｇｒ］６ファージ群；サイシオウイルス科；カーネーション輪状斑点群；ジアントウイルス群；ブロードビーン立ち枯れ病群；ファバウイルス群；フィロウイルス科；フラビウイルス科；フロウイルス群；ジャミニウイルス群；ジアルダウイルス群；ヘパドナウイルス科；ヘルペスウイルス科；ホルデイウイルス群；イラルウイルス群；イノウイルス科；イリドウイルス科；レビウイルス科；リポスリキシウイルス科；ルテオウイルス群；マラフィウイルス群；トウモロコシ萎化矮小化ウイルス群；イクロウイルス科；ミオウイルス科；ネクロウイルス科；ネポウイルス群；ノダウイルス科；オルトミクソウイルス科；パポヴァウイルス科；パラミクソウイルス科；パースニップ黄斑ウイルス群；パルティティウイルス科；パルボウイルス科；エンドウマメエネーションモザイクウイルス群；フィコドナウイルス科；ピコマウイルス科；プラズマウイルス科；プロドウイルス科；ポリドナウイルス科；ポテキスウイルス群；ポタイウイルス；ポキシウイルス科；レオウイルス科；レトロウイルス科；ラブドウイルス科；リジジオウイルス群；シホウイルス科；ソベモウイルス群；ＳＳＶ１型ファージ；テクチウイルス科；テヌイウイルス科；テトラウイルス科；トバモウイルス群；トブラウイルス群；トガウイルス科；トンブシウイルス群；トロウイルス群；トチウイルス科；タイモウイルス群；及び植物ウイルス関連由来のベクターを含むがこれらに限定されない。
【００６８】
組み換えウイルスベクターを製造するため、及び核酸送達のためにウイルスベクターを使用するためのプロトコルは、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，（１９８９）及び他の標準的な実験室マニュアル）（例えばＶｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７）に見出される。
【００６９】
本発明の特定の実施形態においては、送達ベクターは、バキュロウイルスベクターである。
【００７０】
「バキュロウイルス」という用語は、本明細書においては、全てのバキュロウイルスを包含することを意図している。バキュロウイルスは、非包埋バキュロウイルス（non-occluded baculoviruses:ＮＯＶ）、顆粒病ウイルス（ＧＶ）及び核多角体病ウイルス（ＮＰＶ）を包含する３つのサブファミリーに分割される。特定のＧＶ及びＮＯＶは慎重に検討されているが、ＮＰＶはバキュロウイルスサブファミリーで最も十分にキャラクタリゼーションされている。ＮＰＶの例はオートグラファ・カリフォルニカＮＰＶ、スポドプテラ・エキシグアＮＰＶ、ヘリオシス・アルミゲラＮＰＶ、ヘリコベルパ・ジーＮＰＶ、スポドプテラ・フルグルペルダＮＰＶ、トリコプルシア・ニーＮＰＶ、マメストラ・ブラシカＮＰＶ、リマントリア・ジスパーＮＰＶ、スポドプテラ・リツラリスＮＰＶ、シングラファ・ファクルフェラＮＰＶ、クロリストネウラ・フムルフェラナＮＰＶ、アンチカルシア・ゲマタルスＮＰＶ及びヘリオシス・ビレセンスＮＰＶを包含する。
【００７１】
種々の外来遺伝子エレメントを有する操作されたバキュロウイルスを得るための標準的操作法は当分野で周知である。組み換えバキュロウイルスを昆虫又はその細胞に導入するための操作法も当分野で周知である。例えばＰｆｅｉｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ  １８８：１８３−１９０；及びＣｌｅｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：６７５９−６７６２を参照できる。バキュロウイルス発現哺乳類ＲｂＡｐ４８はＣａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １５：５７−６７（２００４）及びＺｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １３：１９２４−１９３５（１９９９）に記載されている。
【００７２】
「アデノウイルス」という用語は、本明細書においては、マスタデノウイルス（Mastadenovirus）及びアビアデノウイルス（Aviadenovirus）の属を含む全てのアデノウイルスを包含することを意図している。今日まで少なくとも４７のヒト血清型のアデノウイルスが識別されている（例えばＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｃｈａｐｔｅｒ  ６７（３ｄ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照）。好ましくは、アデノウイルスは血清群Ｃのアデノウイルスであり、より好ましくは、アデノウイルスは血清型２（Ａｄ２）又は血清型５（Ａｄ５）である。
【００７３】
アデノウイルスゲノムの種々の領域がマッピングされており、そして当業者により理解されている（例えばＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｃｈａｐｔｅｒｓ  ６７  ａｎｄ  ６８（３ｄ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照）。種々のＡｄ血清型のゲノム配列並びにＡｄゲノムの特定のコーディング領域のヌクレオチド配列は当分野で知られており、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＮＣＢＩから入手することができる（例えばＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０９１７、Ｍ７３２６０、Ｘ７３４８７、ＡＦ１０８１０５、Ｌ１９４４３、ＮＣ００３２６６及びＮＣＢＩアクセッション番号ＮＣ００１４０５、ＮＣ００１４６０、ＮＣ００２０６、ＮＣ００４５４を参照）。
【００７４】
当業者の知る通り、本発明のアデノウイルスベクターはＤｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：１５７４；Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，への米国特許第５，９２２，３１５号；Ｗｉｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，への米国特許第５，７７０，４４２号；及び／又はＷｉｃｋｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，への米国特許第５，７１２，１３６号に記載の通り修飾又は「ターゲティング」することができる。
【００７５】
アデノウイルスベクターゲノム又はｒＡｄベクターゲノムは典型的にはＡｄ末端リピート配列及びパッケージングシグナルを含む。「アデノウイルス粒子」又は「組み換えアデノウイルス粒子」は、アデノウイルスカプシド内にパッケージされたアデノウイルスベクターゲノム又は組み換えアデノウイルスベクターゲノムをそれぞれ含む。一般的にアデノウイルスベクターゲノムは約２８ｋｂ〜３８ｋｂ（天然ゲノムサイズの約７５％〜１０５％）のサイズにおいて最も安定となる。より大きい欠失及び比較的小さい目的の異種核酸を含有するアデノウイルスベクターの場合は、「スタッファーＤＮＡ」を使用することにより当分野で知られた方法により所望の範囲内にベクターの全体サイズを維持することができる。
【００７６】
通常は、アデノウイルスはウイルス表面の線維タンパク質のノブドメインを介して感受性細胞の細胞表面受容体（ＣＡＲ）に結合する。線維ノブ受容体はグリコシル化及びホスホリル化の両方のための潜在的部位を有する４５ｋＤａの細胞表面タンパク質である（Ｂｅｒｇｅｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７５；：１３２０−１３２３）。アデノウイルスの進入のための二次的方法は細胞表面に存在するインテグリンを介する。アデノウイルスペントン塩基タンパク質のアラニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列は細胞表面のインテグリンに結合する。
【００７７】
アデノウイルスゲノムは、目的の核酸をコードして発現するが、正常な溶解性のウイルスの生命周期において複製するその能力については不活性化されるように操作することができる。例えばＢｅｒｋｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６；Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５２：４３１−４３４；及びＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ  ６８：１４３−１５５を参照できる。アデノウイルス株Ａｄ型５ｄ１３２４又は他の株のアデノウイルス（例えばＡｄ２、Ａｄ３、Ａｄ７等）から誘導された代表的なアデノウイルスベクターは当分野で知られている。
【００７８】
組み換えアデノウイルスは、それらが非分裂細胞を感染させることができない点において特定の状況下に好都合であることができ、そして上皮細胞を含む広範な種類の細胞型を感染させるために使用できる。更に又、ウイルス粒子は比較的安定であり、精製及び濃縮に適しており、そして、感染性のスペクトルに影響するように修飾することができる。更に又導入されたアデノウイルスＤＮＡ（及びそこに含有される外来性ＤＮＡ）は宿主細胞のゲノム内に組み込まれないが、エピソームとして残存し、これにより、導入されたＤＮＡが宿主ゲノムに組み込まれる状況において挿入突然変異の結果として生じる（例えばレトロウイルスＤＮＡを用いた場合に生じる）可能性がある潜在的な問題を回避することができる。更に又、外来性ＤＮＡに対してアデノウイルスゲノムの担持能力は他の送達ベクターと相対比較すれば大きい（Ｈａｊ−Ａｈｍａｎｄ  ａｎｄ  Ｇｒａｈａｍ（１９８６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５７：２６７）。
【００７９】
特定の実施形態においては、アデノウイルスゲノムは、アデノウイルスゲノムの領域の少なくとも１つが機能的タンパク質をコードしないように、その内部に欠失を含有する。例えば第１世代のアデノウイルスベクターは典型的にはＥ１遺伝子について欠失があり、そしてＥ１タンパク質を発現する細胞（例えば２９３細胞）を用いてパッケージされる。Ｅ３領域もまた、その欠失を補う必要が無いことから、頻繁に欠失される。更に又、Ｅ４、Ｅ２ａ、タンパク質ＩＸ及び線維タンパク質領域における欠失も例えばＡｒｍｅｎｔａｎｏ  ｅｔ  ａｌ，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：２４０８，Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７０：８９３４，Ｄｅｄｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７１：４６２６，Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：３９３，Ｇｒｅｇｏｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，への米国特許第５，８８２，８７７号により記載されている（これらの開示は、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。好ましくは、欠失はパッケージング細胞に対する毒性を回避するように選択する。Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：３９３はパッケージング細胞系統によるＥ４及びＥ１遺伝子の構成的同時発現に由来する毒性を記載している。毒性は構成プロモーターではなく誘導プロモーターによりＥ１及び／又はＥ４遺伝子産物の発現を調節することにより回避することができる。宿主細胞に対する毒性又は他の有害作用を回避する欠失の組み合わせは当業者が通常通り選択することができる。
【００８０】
更に別の例として、特定の実施形態においては、アデノウイルスはポリメラーゼ（ｐｏｌ）、前末端タンパク質（ｐＴＰ）、ＩＶａ２及び／又は１００Ｋ領域において欠失している（例えば米国特許第６，３２８，９５８号；ＰＣＴ公開ＷＯ００／１２７４０；及びＰＣＴ公開ＷＯ０２／０９８４６６；Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．５：４３６；Ｈｏｄｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５：５９１３；Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １２：９５５を参照でき；これらの開示は遺伝子送達のための欠失アデノウイルスベクターの作成及び使用方法の記述に関して、引用することにより本明細書の一部をなすものとする）。
【００８１】
「欠失（deleted）」アデノウイルスという用語は、本明細書においては、アデノウイルスゲノムの指定された領域から少なくとも１つのヌクレオチドが省かれていることを指す。欠失は、約１、２、３、５、１０、２０、５０、１００、２００又更には５００ヌクレオチド超であることができる。アデノウイルスゲノムの種々の領域における欠失は指定された領域の少なくとも約１％、５％、１０％、２５％、５０％、７５％、９０％、９５％、９９％以上であることができる。或いは、アデノウイルスゲノムの全領域が欠失している。好ましくは、欠失は領域からの機能的タンパク質の発現を防止又は本質的に防止することになる。一般的に、より大きい欠失は、それらが目的の異種ヌクレオチド配列に対する欠失アデノウイルスの担持能力を増大させることになるという別の好都合な点を有していることから、好ましいものである。アデノウイルスゲノムの種々の領域がマッピングされており、当業者に理解される（例えばＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｃｈａｐｔｅｒ  ６７、６８（３ｄ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ）を参照）。
【００８２】
当業者の知るとおり、典型的には、Ｅ３遺伝子を除き、何れの欠失も別のウイルスを増殖（複製及びパッケージ）するためには、例えばパッケージング細胞の相互補償によるなどの補償を必要とする。
【００８３】
本発明は本質的に全てのアデノウイルスゲノム配列が欠失している「ｇｕｔｔｅｄ」アデノウイルスベクター（その用語は当分野で知られており、例えばＬｉｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０：８９４４−６０を参照）を用いて実施することもできる。
【００８４】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）もまた核酸送達ベクターとして使用されている。論文としてはＭｕｚｙｃｚｋａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏ．ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９２）１５８：９７−１２９を参照できる。ＡＡＶはパルボウイルスであり、直径１８〜２６ナノメートル小型の正二十面体のビリオンを有し、そして４〜５キロ塩基の大きさの１本鎖ゲノムＤＮＡ分子を含有する。ウイルスはＤＮＡ分子のセンス又はアンチセンスの鎖の何れかを含有し、そして何れかの鎖がビリオンに取り込まれる。２つのオープンリーディングフレームが一連のＲｅｐ及びＣａｐポリペプチドをコードしている。Ｒｅｐポリペプチド（Ｒｅｐ５０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８及びＲｅｐ７８）は、全４Ｒｅｐポリペプチドの非存在下において有意な活性が観察されているものの、ＡＡＶゲノムの複製、レスキュー及び組み込みに関与している。Ｃａｐタンパク質（ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３）はビリオンカプシドを形成する。ゲノムの５’及び３’末端においてｒｅｐ及びｃａｐのオープンリーディングフレームにフランキングしているものは１４５塩基対のインバーテッド末端リピート（ＩＴＲ）であり、その最初の１２５塩基対はＹ又はＴ型の二重らせん構造を形成することができる。ＩＴＲはＡＡＶゲノムの複製、レスキュー、パッケージング及び組み込みに必要な最小のシス配列を呈することがわかっている。典型的には、組み換えＡＡＶベクター（ｒＡＡＶ）においては、全ｒｅｐ及びｃａｐコーディング領域を切り出し、目的の異種核酸と置き換える。
【００８５】
ＡＡＶはそのＤＮＡを非分裂細胞内に組み込むことができる数少ないウイルスに属しており、そして高い頻度のヒト染色体１９内への安定な組み込みを示す（例えばＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７：３４９−３５６；Ｓａｍｕｉｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．６３：３８２２−３８２８；及びＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６２：１９６３−１９７３参照）。種々の核酸がＡＡＶベクターを用いて異なる細胞型に導入されている（例えばＨｅｒｍｏｎａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６４６６−６４７０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８５）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ，Ｂｉｏｌ．４：２０７２−２０８１；Ｗｏｎｄｉｓｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２：３２−３９；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６１１−６１９；及びＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７６１−３７９０を参照）。
【００８６】
ｒＡＡＶベクターゲノムは典型的にはＡＡＶ末端リピート配列及びパッケージングシグナルを含んでいる。「ＡＡＶ粒子」又は「ｒＡＡＶ粒子」は、ＡＡＶカプシド内にパッケージされたＡＡＶベクターゲノム又はｒＡＡＶベクターゲノムをそれぞれ含んでいる。ｒＡＡＶベクターそのものはカプシド及びＲｅｐタンパク質をコードするＡＡＶ遺伝子を含有する必要はない。本発明の特定の実施形態においては、ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子はＡＡＶゲノムから欠失している。代表的な実施形態においては、ｒＡＡＶベクターは組み込み、切り出し、複製に必要な末端ＡＶＶ配列（ＩＴＲ）のみを保持している。
【００８７】
ＡＡＶカプシド遺伝子の原料は血清型ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３（３ａ及び３ｂを含む）、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７、ＡＡＶ−８並びにウシＡＡＶ及びトリＡＡＶ、及び、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  ｏｆ  Ｖｉｒｕｓｅｓ（ＩＣＴＶ）によりＡＡＶと分類される何れかの他のウイルスを包含することができる（例えば、ＢＥＲＮＡＲＤ  Ｎ．ＦＩＥＬＤＳ  ｅｔ  ａｌ．，ＶＩＲＯＬＯＧＹ，ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｃｈａｐｔｅｒ  ６９（４ｔｈ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照）。
【００８８】
パッケージングの限界のため、ｒＡＡＶゲノムの総サイズは好ましくは約５．２ｋｂ、４．８ｋｂ、４．６ｋｂ、４．５ｋｂ又は４．３ｋｂ未満の大きさである。
【００８９】
当分野で既知の何れかの適当な方法を用いて本発明の複合体の成分をコードする核酸を発現するＡＡＶベクターを作成することができる（方法の説明は、例えば米国特許第５，１３９，９４１号；米国特許第５，８５８，７７５号；米国特許第６，１４６，８７４号を参照）。１つの特定の方法においては、ヘルパーアデノウイルスを感染させたヒト細胞へのＡＡＶパッケージング機能をコードするｒｅｐ／ｃａｐベクター及びＡＡＶ  ｖＤＮＡをコードする鋳型の同時トランスフェクションによりＡＡＶ保存株を製造することができる（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６３：３８２２）。
【００９０】
他の特定の実施形態においては、アデノウイルスヘルパーウイルスはＡＡＶのＲｅｐ及び／又はカプシドタンパク質をコードするハイブリッドヘルパーウイルスである。ＡＡＶのｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子を発現するハイブリッドヘルパーＡｄ／ＡＡＶベクター及びこれらの試薬を用いてＡＡＶ株を製造する方法は当分野で知られている（例えば米国特許第５，５８９，３７７号；及び米国特許第５，８７１，９８２号、米国特許第６，２５１，６７７号；及び米国特許第６，３８７，３６８号を参照）。好ましくは本発明のハイブリッドＡｄは、ＡＡＶカプシドタンパク質（即ちＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３）を発現する。これに代わって、又はこれに加えて、ハイブリッドアデノウイルスはＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質（即ちＲｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８及び／又はＲｅｐ７８）の１つ以上を発現することができる。ＡＡＶ配列は組織特異的又は誘導プロモーターと作動可能に連結することができる。
【００９１】
或いは、ＡＡＶ  ｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子は遺伝子を安定に発現する細胞をパッケージングすることにより提供することもできる（例えばＧａｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：２３５３；Ｉｎｏｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：７０２４；米国特許第５，８３７，４８４号；ＷＯ９８／２７２０７；米国特許第５，６５８，７８５号；ＷＯ９６／１７９４７を参照）。
【００９２】
本発明において使用するための別のベクターは、単純疱疹ウイルス（ＨＳＶ）を含む。単純疱疹ビリオンは全体の直径１５０〜２００ｎｍ及び長さ１２０〜２００キロ塩基の２本鎖ＤＮＡ分子１個からなるゲノムを有している。糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）は、宿主細胞へのウイルスの進入を媒介するＨＳＶエンベロープの構造的成分である。細胞表面ヘパリンスルフェートプロテオグリカンとのＨＳＶの初期の相互作用は別の糖タンパク質、糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）及び／又は糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）により媒介される。その後、細胞受容体を有するウイルス糖タンパク質の１つ以上との相互作用が起こる。ＨＳＶの糖タンパク質Ｄは宿主細胞のヘルペスウイルス進入媒介物質（ＨＶＥＭ）に直接結合することが解っている。ＨＶＥＭは腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーである（Ｗｈｉｔｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：６０８３−６０９３）。最後に、ｇＤ、ｇＢ及びｇＨとｇＬの複合体は個別に、又は共同して、宿主細胞原形質膜へのウイルスエンベロープのｐＨ非依存性の融合を誘発する。ウイルスそのものは直接的な接触により伝達され、そしてＨＳＶが特に向性を示す神経系の細胞を感染するよりも前に皮膚又は粘膜内で複製する。溶解性及び潜伏性の機能の両方を示す。溶解性のサイクルはウイルスの複製及び細胞死をもたらす。潜伏性の機能は極めて長時間に渡り宿主内にウイルスを維持させる。
【００９３】
ＨＳＶは長期遺伝子維持のための潜伏性機能のみを示すベクターを製造することにより細胞への核酸の送達のために修飾することができる。ＨＳＶベクターは、２０キロ塩基以下の、又は２０キロ塩基超の大型ＤＮＡの挿入を可能にし、極めて高い力価で製造することができ、そして溶解性サイクルが起こらない限り中枢神経系において長期間核酸を発現することがわかっていることから、核酸送達のために有用である。
【００９４】
本発明の他の特定の実施形態においては、目的とされる送達ベクターはレトロウイルスである。レトロウイルスは、通常はウイルス特異的な細胞表面受容体、例えばＣＤ４（ＨＩＶの場合）；ＣＡＴ（ＭＬＶ−Ｅ；エコトロピックネズミ白血病ウイルスＥの場合）ＲＡＭ１／ＧＬＶＲ２（ネズミ白血病ウイルス−Ａ；ＭＬＶ−Ａの場合）ＧＬＶＲ１（テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）及びネコ白血病ウイルスＢ（ＦｅＬＶ−Ｂ）の場合）に結合する。単に複製欠損レトロウイルスを与える特殊化された細胞系統（「パッケージングされた細胞」と称する）の開発は遺伝子療法のためのレトロウイルスの利用性を増大させ、そして欠損レトロウイルスは遺伝子療法目的のための遺伝子転移において使用するためにキャラクタライズされている（概説について、Ｍｉｌｌｅｒ，（１９９０）Ｂｌｏｏｄ  ７６：２７１参照）。複製欠損レトロウイルスは標準的手法によりヘルパーウイルスの使用を介して標的細胞を感染させるために使用することができるビリオン内にパッケージすることができる。
【００９５】
更に別の適当なベクターはポックスウイルスベクターである。これらのウイルスは極めて複雑なものであり、ウイルスの詳細な構造は現時点では不明であるが、１００タンパク質超を含有する。ウイルスの細胞外の形態は２つの膜を有するが、細胞内の粒子は内膜のみを有する。ウイルスの外表面は両凹のコアを包囲する脂質及びタンパク質より構成される。ポックスウイルスは抗原的には複雑であり、感染後には特異性及び交差反応性の抗体の両方を含んでいる。ポックスウイルス受容体は現時点では知られていないが、広範な細胞に対するポックスウイルスの向性を鑑みれば１つより多くが存在する可能性がある。ポックスウイルスの遺伝子発現は、核酸の発現のためのベクターとしてワクシニアウイルスを使用することに関心があることから十分に研究されている。
【００９６】
上記したもののようなウイルス転移法の他に、非ウイルス法も使用できる。核酸転移のための多くの非ウイルス法は巨大分子の取り込み及び細胞内輸送のために哺乳類細胞により使用されている通常の機序に依存している。特定の実施形態においては、非ウイルス核酸送達系は標的細胞による核酸分子の取り込みのための細胞内経路に依存している。この型の例示される核酸送達系はリポソーム誘導系、ポリリジンコンジュゲート及び人工ウイルスエンベロープを包含する。
【００９７】
本発明の実施においては、プラスミドベクターを使用できる。ネイキッドプラスミドを組織へ注射することにより筋肉細胞内に導入することができる。発現は陽性細胞の数が典型的には低値となるが、数ヶ月に渡って持続される（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：２４７）。カチオン性の脂質は培養中の一部の細胞内への核酸の導入を示すことがわかっている（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｉｎｇｏｌｄ，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３３７：３８７）。マウスの循環系へのカチオン性脂質プラスミドＤＮＡ複合体の注入は肺におけるＤＮＡの発現をもたらすことがわかっている（Ｂｒｉｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２９８：２７８）。プラスミドＤＮＡの１つの利点は非複製細胞内へそれが導入できる点である。
【００９８】
［Ｖ．再構成複合体のための発現系］
上記の通り、再構成複合体の成分は、種々の目的（例えばＨＴＭａｓｅ活性又は癌をモジュレートするための化合物を識別するためのスクリーニング試験、癌の検出、大規模タンパク質製造及び／又は研究目的）のために複合体のタンパク質をコードする異種核酸１つ以上を発現する培養された細胞又は生物中で生産、そして場合によりそれより精製することができる。
【００９９】
一般的に、単離された核酸は発現ベクター（上記の通りウイルス性又は非ウイルス性）内に取り込まれる。種々の宿主細胞に適合する発現ベクターは当分野で周知であり、核酸の転写及び翻訳のための適当なエレメントを含有している。典型的には、発現ベクターは「発現カセット」を含有し、これは、５’から３’の方向に、プロモーター、プロモーターに作動可能に連結したＥＥＤ、ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、ＲｂＡｐ４８及び／又はＡＥＢＰ２サブユニットをコードするコーディング配列、及び、任意選択的に、ＲＮＡポリメラーゼに対する停止シグナル及びポリアデニラーゼに対するポリアデニル化シグナルを含む終止配列を含む。
【０１００】
発現ベクターは原核生物又は真核生物の細胞におけるポリペプチドの発現のために設計することができる。例えばポリペプチドは大腸菌のような細菌細胞、昆虫細胞（例えばバキュロウイルス発現系における）、酵母細胞又は哺乳類細胞において発現することができる。一部の安定な宿主細胞はＧｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）において更に考察されている。酵母Ｓ・セレビシアエにおける発現のためのベクターの例は、ｐＹｅｐＳｅｃｉ（Ｂａｌｄａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）及びｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）を包含する。培養昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）においてタンパク質を製造するための核酸の発現のために使用できるバキュロウイルスベクターは上記の通りであり、そしてｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ，Ｖ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ，Ｍ．ｄ．（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１７０：３１−３９）を包含する。
【０１０１】
哺乳類発現ベクターの例は、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７），ＥＭＢＯ  Ｊ．６：１８７−１９５）を包含する。哺乳類細胞内で使用する場合は、発現ベクターの制御機能はウイルスの調節エレメントにより与えられる場合が多い。例えば、一般的に使用されているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス及びシミアンウイルス４０から誘導される。
【０１０２】
ベクターは従来の形質転換又はトランスフェクションの手法を介して原核生物又は真核生物の細胞内に導入できる。本明細書においては、「形質転換」及び「トランスフェクション」という用語は宿主細胞内に外来性核酸（例えばＤＮＡ）を導入するための種々の当分野で知られた手法を指し、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム同時沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、ＤＮＡをロードしたリポソーム、リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理、高速マイクロプロジェクタイルを使用する遺伝子ボンバードメント、及びウイルス媒介トランスフェクションが挙げられる。宿主細胞を形質転換又はトランスフェクトするための適当な方法はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｐｒｅｓｓ（１９８９））及び他の実験室マニュアルに見出される。
【０１０３】
安定に形質転換される細胞を製造するためには、一部のみの細胞（特に哺乳類細胞）がそのゲノム内に外来性ＤＮＡを組み込む場合が多い。これらの組み込み体を識別するためには、選択可能なマーカー（例えば抗生物質への耐性）をコードする核酸を目的の核酸と共に宿主細胞内に導入することができる。好ましい選択マーカーはＧ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキセートのような薬剤への耐性を付与するものを包含する。選択可能なマーカーをコードする核酸は、目的の核酸を含むものと同じベクター上で宿主細胞に導入することができ、或いは、別個のベクター上で導入することもできる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞は薬剤選択により識別することができる（例えば選択マーカー遺伝子を取り込んだ細胞は生存でき、そうでないものは死滅する）。
【０１０４】
組み換えタンパク質はまたタンパク質をコードする単離された核酸が核又はプラスチドのゲノムに挿入されているトランスジェニック植物内で生産することもできる。植物の形質転換は当分野で知られている。一般的にＭｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１５３（「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  Ｐａｒｔ  Ｄ」１９８７，Ｗｕ  ａｎｄ  Ｇｒｏｓｓｍａｎ  Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ及び欧州特許出願ＥＰ６９３５５４を参照。
【０１０５】
外来性の核酸は数種の方法により植物細胞又はプロトプラストに導入できる。例えば核酸はマイクロピペットの使用による植物細胞内への直接マイクロインジェクションにより機械的に転移させることができる。外来性核酸はまた細胞により取り込まれる遺伝子物質と沈殿複合体を形成するポリエチレングリコールを用いることにより植物細胞内に転移させることができる（Ｐａｓｚｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８４）ＥＭＢＯ  Ｊ．３：２７２１−２２）。外来性核酸はエレクトロポレーションにより植物細胞に導入できる（Ｆｒｏｍｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：５８２４）。この手法においては、植物のプロトプラストを、該当遺伝子構築物を含有するプラスミド又は核酸の存在下にエレクロトポレーションに付す。高電場強度の電気インパルスが生体膜を可逆的に透過性とし、プラスミドの導入を可能とする。エレクトロポレーションに付された植物プロトプラストは細胞壁を再形成し、分裂し、植物カルスを形成する。外来性核酸を含む形質転換された植物細胞の選択は表現型マーカーを用いて行うことができる。
【０１０６】
カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）を植物細胞に外来性核酸を導入するためのベクターとして使用できる（Ｈｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｔｕｍｏｒｓ」，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．５４９−５６０；Ｈｏｗｅｌｌ，米国特許第４，４０７，９５６号）。細菌内で増殖できる組み換えＤＮＡ分子を形成する親細菌プラスミド内にＣａＭＶのウイルスＤＮＡゲノムを挿入する。組み換えプラスミドは所望のＤＮＡ配列の導入により更に修飾できる。次に組み換えプラスミドの修飾されたウイルス部分を親細菌プラスミドから切り出して植物細胞又は植物に接種するために使用する。
【０１０７】
小粒子による高速弾道貫通（ｈｉｇｈ  ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｂａｌｌｉｓｔｉｃ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ）を用いて植物細胞内に外来性核酸を導入することができる。核酸は小型のビーズ又は粒子のマトリックスの内部又は表面に配置させる（Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３）。典型的には新しい核酸セグメントの単回導入のみが必要となるが、この方法は多重導入も可能とする。
【０１０８】
核酸は、該核酸で形質転換されたアグロバクテリウム・ツメファシエンスによる植物細胞、外植片、分裂組織または種子の感染により植物細胞内に導入することができる。適切な条件下、形質転換された植物細胞を成育させて新芽、根を形成させ、更に発育させて植物とする。核酸は例えばアグロバクテリウム・ツメファシエンスのＴｉプラスミドを用いることにより植物細胞内に導入できる。Ｔｉプラスミドはアグロバクテリウム・ツメファシエンスによる感染により植物細胞に伝達され、植物ゲノム内に安定に組み込まれる（Ｈｏｒｓｃｈ  ｅ  ａｌ．（１９８４）「Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｒｅｉｇｎ  Ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔｓ」，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３３：４９６４９８；Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：４８０３）。
【０１０９】
本発明は以下の非限定的な実施例において更に詳細に説明する。
【実施例１】
【０１１０】
［材料及び方法］
［組み換えＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体及びサブ複合体の精製］
Ｅｚｈ２  ｃＤＮＡを、ＦＬＡＧ（登録商標）を有しないｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮＴＭ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングした。ＥＥＤ  ｃＤＮＡはＮ末端ＦＬＡＧ（登録商標）タグベクターｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）のＥｃｏＲＩ及びＸｈｏＩ部位にクローニングした。ＳＵＺ１２及びＡＥＢＰ２のｃＤＮＡは同じベクターのＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ部位に挿入した。ＲｂＡｐ４８用のバキュロウイルスは当分野で確立されている（Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１３：１９２４−１９３５）。異なる成分を発現する各バキュロウイルスを作成し、製造元のプロトコルに従って増幅させた。組み換えＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体を精製するために、種々のバキュロウイルスを用いてＳＦ９細胞を同時感染した。感染２日の後、細胞を収集し、プロテイナーゼ阻害剤を含有するＦ溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９、５００ｍＭ  ＮａＣｌ、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．４ｍＭ  ＥＤＴＡ、２ｍＭ  ＤＴＴ、２０％グリセロール、０．１％  ＮＰ−４０）中に再懸濁した。細胞を３０分間乳鉢で３回ホモゲナイズ（各１０ストローク）した。１０分間１１，０００ｒｐｍで遠心分離することにより上澄みを回収した。希釈緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９、１０％グリセロール）を添加することにより上澄みを３００ｍＭ  ＮａＣｌに調節した。次に、４℃で４時間、Ｆ溶解緩衝液で平衡化したＭ２α−ＦＬＡＧ（登録商標）アガロース（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と共にインキュベートした。Ｆ洗浄緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．９、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＤＴＴ、１５％グリセロール、０．０１％ＮＰ−４０）で未結合のタンパク質を全て除去した後、結合タンパク質を室温で２０分間ＦＬＡＧ（登録商標）ペプチド（０．２ｍｇ／ｍｌ）で溶出し、次に、溶出した複合体を更にゲル濾過Ｓ２００又はＳＵＰＥＲＯＳＥ（登録商標）６カラムを通して精製した。このプロトコルを用いながら、再構成複合体のミリグラム量を作成した。更に又、同時発現は活性な再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体をもたらすが、各成分の個別の発現（即ち個々の細胞）とその後の混合は活性な複合体を生成しないことがわかった。
【０１１１】
［ＨＭＴａｓｅ試験、基質調製及び抗体］
ヒストンメチル化試験は十分確立された方法に従って実施した（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９３：８５３−８５７）。ＨＭＴａｓｅ試験用の基質、例えば、オリゴヌクレオソーム、モノヌクレオソーム及びコアヒストンは確立されたプロトコルを用いてニワトリ血液から精製した（Ｆａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３７７：２１３−２２６）。野生型及び突然変異体の組み換えヒストンＨ３は既知の方法に従って発現させて精製した（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３）。ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、２ｍＫ２７、３ｍＫ２７、３ｍＫ９及び１ｍＫ２７に対する抗体は知られている（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３；Ｐｅｔｅｒｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：１５７７−１５８９；Ｐｌａｔｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３００：１３１−１３５）。
【０１１２】
［プラスミド及びＧＳＴプルダウン試験］
完全長ＡＥＢＰ２  ｃＤＮＡをＨｅＬａ  ｃＤＮＡライブラリからＰＣＲ増幅によりクローニングし、配列をＤＮＡ配列分析により確認した。Ｅｚｈ２、ＥＥＤ、ＳＵＺ１２、ＲｂＡｐ４８、ＡＥＢＰ２に関する完全長ｃＤＮＡ及びその欠失物を製造元（ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標），Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の説明書に従ってウサギ網状赤血球溶解物キットを用いてインビトロ翻訳用のｐＣＩＴＥ（登録商標）ベクター内に挿入した。ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＲｂＡｐ４８及びＡＥＢＰ２に関する完全長ｃＤＮＡはまた、ＧＳＴ融合タンパク質の製造のためのｐＧＥＸ−ＫＧベクター内にクローニングした。約３μｇのＧＳＴ又はＧＳＴ融合タンパク質をグルタチオン固定化アガロースビーズ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１０μＬに結合し、１５０ｍＭのＫＣｌ及び０．０５％ＮＰ−４０を含有する緩衝液Ａ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール、０．２ｍＭフェニルメチルスルホニルフルオリド、１０％グリセロール）５００μＬ中でインビトロ翻訳産物と共にインキュベートした。４℃で２時間インキュベートした後、ビーズを３００ｍＭのＫＣｌ及び０．０５％ＮＰ−４０を含有する緩衝液Ａで３回、次に、５０ｍＭのＫＣｌを含有する緩衝液Ａで１回洗浄し、その後ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフ分析に付した。
【０１１３】
［ＳＵＺ１２  ノックダウン細胞系統及び生育分析］
ＨｅＬａ細胞を１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）含有ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。ＳＵＺ１２をターゲティングする所望の６４ｂｐのオリゴヌクレオチドをｐＨＴＰｓｉＲＮＡベクター内にクローニングした（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：４７５−４８７）。ＳＵＺ１２をターゲティングするステム−ループＲＮＡを形成する際に使用した２つのオリゴヌクレオチドは５’−ＧＡＴ  ＣＣＣ  ＣＧＴ  ＣＧＣ  ＡＡＣ  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＧＴＴ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＧＡ  ＧＡＴ  ＴＡＡ  ＣＴＧ  ＧＴＣ  ＣＧＴ  ＴＧＣ  ＧＡＣ  ＴＴＴ  ＴＴＧ  ＧＡＡ  Ａ−３’（配列番号１）及び５’−ＴＣＧ  ＡＴＴ  ＴＣＣ  ＡＡＡ  ＡＡＧ  ＴＣＧ  ＣＡＡ  ＣＧＧ  ＡＣＣ  ＡＧＴ  ＴＡＡ  ＴＣＴ  ＣＴＴ  ＧＡＡ  ＴＴＡ  ＡＣＴ  ＧＧＴ  ＣＣＧ  ＴＴＧ  ＣＧＡ  ＣＧＧ  Ｇ−３’（配列番号２）であり、ここでステム構造は下線を付した。ＳＵＺ１２ｓｉＲＮＡベクターはＥＦＦＥＣＴＥＮＥ（登録商標）（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）によりＨｅＬａ細胞内にトランスフェクトした。安定なトランスフェクション体は２μｇ／ｍｌのピューロマイシンの存在下に選択した。これらのトランスフェクション体から誘導した細胞をウエスタンブロット分析及びリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析のために使用した。細胞の成育分析のためには、４×１０4個の細胞を１２穴プレートに播種した。培養２４、４８及び９６時間の後、細胞をトリプシン処理し、３連で採集し、トリパンブルー染色により計数した。
【０１１４】
［リアルタイムＰＣＲ及びチップ分析］
リアルタイムＰＣＲはＳＹＢＲ（登録商標）グリーンＰＣＲマスターミックス及びＡＢＩプリズム７９００配列検出システムを用いながら３連で実施した。定量的ＰＣＲ反応を各プライマーにつき標準化された条件下に実施した。標準曲線は標準プラスミドの１０倍希釈物を用いて作成した。種々の試料中の標的の相対量を比較するために、全数値を適切に定量されたＧＡＰＤＨ対照に対して規格化した。定量的ＰＣＲのために使用したプライマーは、ＳＵＺ１２ｃＤＮＡプライマー５’−ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＡＡＴ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＧＡＴ  ＧＧ−３’（配列番号３）及び５’−ＣＣＡ  ＴＴＴ  ＣＣＴ  ＧＣＡ  ＴＧＧ  ＣＴＡ  ＣＴ−３’（配列番号４）；ＨｏｘＣ６ｃＤＮＡプライマー５’−ＣＣＡ  ＧＧＡ  ＣＣＡ  ＧＡＡ  ＡＧＣ  ＣＡＧ  ＴＡ−３’（配列番号５）及び５’−ＧＧＴ  ＣＴＧ  ＧＴＡ  ＣＣＧ  ＣＧＡ  ＧＴＡ  ＧＡ−３’（配列番号６）；ＨｏｘＣ８ｃＤＮＡプライマー５’−ＣＴＣ  ＡＧＧ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＣＣ−３’（配列番号７）及び５’−ＧＡＧ  ＣＣＣ  ＣＡＴ  ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＣＴ  ＧＴ−３’（配列番号８）；及びＨｏｘＡ９ｃＤＮＡプライマー５’−ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  Ｇ−３’（配列番号９）及び５’−ＧＴＡ  ＧＧＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＧＴＧ  ＡＴＧ  ＧＴ−３’（配列番号１０）であった。
【０１１５】
チップ分析用には、１５０ｍｍディッシュ中、約２×１０6個のＨｅＬａ細胞を１０分間１％のホルムアルデヒド含有ＤＭＥＭで処理した。クロスリンクは１０分間、０．１２５Ｍのグリシンを添加することにより停止した。リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で２回洗浄した後、細胞を細胞溶解緩衝液（１０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．９、０．５％ＮＰ−４０、１。５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、１０ｍＭ  ＫＣｌ、０．５ｍＭ  ＤＴＴ）３００μＬに再懸濁し、１０分間氷上に保持した。その後、細胞を５分間４０００ｒｐｍで遠心分離し、プロテアーゼ阻害剤を含有する核溶解緩衝液（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．９、２５％グリセロール、０．５％ＮＰ−４０、０．４２Ｍ  ＮａＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2、０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ）に再懸濁し、２０分間、４℃でインキュベートすることにより核タンパク質を抽出した。抽出されたクロマチンを超音波処理して、平均の長さ０．５〜３ｋｂのフラグメントとした。１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、上澄みを等容量の１％ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００，２ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＮａＣｌ及びプロテアーゼ阻害剤を含有する希釈緩衝液中に希釈した。次にチップ試験を指定の抗体を用いて実施した。チップＤＮＡはＨｏｘＡ９における４種の異なる領域に対する以下のプライマー対、即ち、Ａ、５’−ＴＣＣ  ＡＣＣ  ＴＴＴ  ＣＴＣ  ＴＣＧ  ＡＣＡ  ＧＣＡ  Ｃ−３’（配列番号１１）及び５’−ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＧＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＡＡＧ−３’（配列番号１２）；Ｂ、５’−ＴＣＧ  ＣＣＡ  ＡＣＣ  ＡＡＡ  ＣＡＣ  ＡＡＣ  ＡＧＴ  Ｃ−３’（配列番号１３）及び５’−ＡＡＡ  ＧＧＧ  ＡＴＣ  ＧＴＧ  ＣＣＧ  ＣＴＣ  ＴＡＣ−３’（配列番号１４）；Ｃ、５’−ＣＴＣ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＡＧＧ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＡＧ−３’（配列番号１５）及び５’−ＡＧＣ  ＣＴＡ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＡＣＡ  ＧＴＴ  ＧＴＧ  Ｃ−３’（配列番号１６）；Ｄ、５’−ＧＡＡ  ＣＧＧ  ＣＣＡ  ＣＡＡ  ＣＴＴ  ＣＧＧ  ＡＧＧ−３’（配列番号１７）及び５’−ＣＣＧ  ＧＧＧ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  ＣＧＴ  ＧＧＡ  Ｇ−３’（配列番号１８）を用いた標準的なＰＣＲを用いて検出した。
【実施例２】
【０１１６】
［再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の酵素活性及び基質特異性］
ＨｅＬａ細胞及びショウジョウバエ胚から精製した多重サブユニットＥＥＤ−ＥＺＨ２／ＥＳＣ−Ｅ（Ｚ）複合体は、リジン２７においてヌクレオソームヒストンＨ３をメチル化することがわかっている（Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３；Ｃｚｅｒｍｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１８５−１９６；Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２８９３−２９０５；Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１９７−２０８）。ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体はＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、ＥＥＤ、ＲｂＡｐ４８及びＡＥＢＰ２より構成されることがわかっている（Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３）。個々のサブユニットの機能を分析する（dissect）ため、及び、詳細な機能分析のための大量の精製酵素複合体を得るために、組み換えタンパク質を用いて酵素活性を再構成できるかどうか調べた。この目的のために、Ｓｆ９細胞を、ＦＬＡＧ（登録商標）−ＥＥＤ、ＥＺＨ２、ＳＵＺ１２、ＲｂＡｐ４８及びＡＥＢＰ２を発現するバキュロウイルスで同時感染させた。ＦＬＡＧ（登録商標）−ＥＥＤ及び関連タンパク質はアフィニティークロマトグラフィー、次いで遊離のＦＬＡＧ（登録商標）−ＥＥＤ及び部分的複合体が５成分の複合体から分離されるゲル濾過により精製した（図１Ａ）。ヒストンメチルトランスフェラーゼ試験及びカラム画分を含有するＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルの銀染色によれば、５成分は約４００ｋＤａのタンパク質複合体として酵素活性と共に同時精製されることがわかった（図１Ｂ）。ネイティブのＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体と相対比較した場合の再構成複合体のＨＭＴａｓｅ活性を試験するために、５０と５３の間の画分をプールし、種々の量のプールした組み換え複合体を固定量のネイティブＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体と比較した。図１Ｃに示す結果によれば、再構成複合体及びネイティブの複合体は等量の酵素を比較した場合に同等のＨＭＴａｓｅ活性を有していた（レーン１とレーン３及び４）。再構成複合体を更にキャラクタリゼーションするために、異なる形態のヒストンＨ３をメチル化した。ネイティブ複合体の場合（Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３）と同様、再構成酵素複合体のための好ましい基質はオリゴヌクレオソーム形態のヒストンＨ３であった（図１Ｄ）。更に又、他のイソフォームのＥＥＤを含有する再構成複合体（Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １４（２）：１８３−９３）もＨＭＴａｓｅ活性を示している。従って、再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体及びネイティブの複合体は同様の酵素活性及び基質特異性を有している。
【実施例３】
【０１１７】
［ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の成分間の物理的関係］
複合体中に存在する５成分のうち、ＥＺＨ２は、それがＳＥＴドメイン含有タンパク質であることから触媒性サブユニットであると考えられている。ＥＺＨ２とＥＥＤは直接相互作用することが既知である（Ｓｅｗａｌｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：３５８６−３５９５；ｖａｎ  Ｌｏｈｕｉｚｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：３５７２−３５７９）。従って、複合体及びサブ複合体の成分間の厳密な空間的関係を調べた。この目的のために、大腸菌中で発現できないＥＺＨ２を除き、個々の成分をＧＳＴ融合タンパク質として発現させ、ＧＳＴプルダウン試験において使用した。以前の報告（Ｓｅｗａｌｔ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：３５８６−３５９５；ｖａｎ  Ｌｏｈｕｉｚｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１８：３５７２−３５７９）と一致して、ＥＺＨ２はＥＥＤと強力に相互作用するが、これらの試験条件下では他のサブユニットの何れとも直接接触しないと考えられた（図２Ａ、パネル２）。ＥＺＨ２に加えて、ＥＥＤもまた、ＳＵＺ１２及びＡＥＢＰ２と相互作用した（図２Ａ、レーン３）。ＲｂＡｐ４８はＳＵＺ１２（図２Ａ、最終パネル、レーン２）とは強力に、そしてＡＥＢＰ２及びＥＥＤ（図２Ａ、パネル４及び５、レーン４）とは弱く相互作用するように観察された。意外にも、ＡＥＢＰ２は自己会合可能であり（図２Ａ、パネル５、レーン５）、そしてこの能力は、固定化ＧＳＴ−ＲｂＡｐ４８がＡＥＢＰ２をプルダウンできた（図２Ａ、パネル４、レーン４）が、自己会合しない固定化ＧＳＴ−ＡＥＢＰ２はＲｂＡｐ４８をプルダウンできなかった（図２Ａ、最終パネル、レーン５）ことから、そのＲｂＡｐ４８との相互作用のために重要であると考えられた。ＧＳＴ単独を用いたパラレルなプルダウン試験では、相互作用は検出されなかった（図２Ａ、レーン６）ことから、上記相互作用は全て特異的であった。これらの相互作用試験によれば、ＥＺＨ２が他の成分と会合する場合にはＥＥＤを介し、これが次に相互作用する相手がＳＵＺ１２及びＡＥＢＰ２であり、これらはともにＲｂＡｐ４８と相互作用することができる（図２Ｂ）。
【０１１８】
ＡＥＢＰ２は転写リプレッサーとして当初識別された亜鉛フィンガータンパク質である（Ｈｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：１４６７８−１４６８４）。これは精製されたＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の不可欠な構成要素として識別されたが（Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３）、同様に精製された複合体には存在していなかった（Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２８９３−２９０５）。複合体内に取り込まれ（図１Ｂ）、そして複合体の多重サブユニットと相互作用（図２Ａ、パネル５）する能力があるとして、ＡＥＢＰ２とＳＵＺ１２及びＲｂＡｐ４８の相互作用を更にキャラクタリゼーションした。ＡＥＢＰ２のインビトロ転写／翻訳の完全長及び欠失突然変異体を用いたＧＳＴプルダウン試験によれば、ＡＥＢＰ２のＮ末端領域（残基１〜８７）がＲｂＡｐ４８の相互作用に関与（図２Ｃ、中央２パネルを比較）していたのに対し、Ｃ末端領域（残基１４４〜１９８）はＳＵＺ１２の相互作用に関与していた（図２Ｃ、最初の２パネルを比較）。これらの試験は、本明細書に開示した機能試験と組み合わせれば、ＡＥＢＰ２がＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の不可欠な構成要素であることを示している。
【実施例４】
【０１１９】
［ＡＥＢＰ２はＨＭＴａｓｅ活性を刺激し、そしてＳＵＺ１２はＨＭＴａｓｅ活性のために必要である］
５成分の間の空間的関係を定義した後、酵素活性に必要な最低の成分を調べた。Ｅｚｈ２及びＥｅｄが共にインビボのヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化のために必要（Ｅｒｈａｒｄｔ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １３０：４２３５−４２４８；Ｓｕ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ４（２）：１２４−３）であると仮定し、そして図２に定義した物理的相互作用に基づいて、ＡＥＢＰ２、ＲｂＡｐ４８及びＳＵＺ１２を個々に除くことにより、又は組み合わせてサブ複合体を再構成した。図１Ａに示したものと同様の２工程の精製手法を用いて、４つ（ＡＥＢＰ２を除く）、３つ（ＡＥＢＰ２及びＲｂＡｐ４８を除く）及び２つ（ＡＥＢＰ２、ＲｂＡｐ４８及びＳＵＺ１２を除く）の成分を有するＥＥＤ−ＥＺＨ２サブ複合体を再構成した。銀染色によれば、これらの再構成サブ複合体は、ほぼ均質（homogeneity）であった（図３Ａ）。これらの精製された複合体の相対的ＨＭＴａｓｅ活性を評価するために、ＥＺＨ２のウエスタンブロット分析（図３Ｂ、最上パネル）に示される通り等モル量の複合体を用いて、等量のヌクレオソーム基質をメチル化した（図３Ｂ、第２パネル）。図３Ｂに示す結果（最下２パネル）によれば、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とを含有する最低限の３成分がＨＭＴａｓｅ活性に必要であることがわかった（レーン３と４を比較）。３成分の複合体にＲｂＡｐ４８を加えたところ、ＳＵＺ１２の取り込みが増大し（図３Ａ、レーン２と３を比較）、特に高い酵素濃度において酵素活性の増大がもたらされた（図３Ｃ）。４成分複合体にＡＥＢＰ２を加えたところ、ＨＭＴａｓｅ活性は有意に増大した（図３Ｂ、レーン１と２を比較）。ＥＥＤ、ＥＺＨ２及びＲｂＡｐ４８の同時感染では安定な複合体を形成することができず（データ示さず）、複合体へのＲｂＡｐ４８の取り込みが、そのＳＵＺ１２との相互作用に依存していることが示された（図２Ａ）。更に又、ＳＵＺ１２が欠落すると４成分複合体を形成することはできない。
【０１２０】
再構成複合体のＨＭＴａｓｅ活性を広範な酵素濃度を用いて評価した（図３）。５成分の複合体を使用した場合は、顕著なＨＭＴａｓｅ活性が５ｎＭの酵素濃度で検出されたが、２成分の複合体を使用した場合は１６０ｎＭの酵素濃度のレベルでも活性は検出されなかった。５成分と４成分の複合体を比較すると酵素活性の有意差が観察された。即ち、ＥＥＤと、ＥＺＨ２と、ＳＵＺ１２とはＨＭＴａｓｅ活性に必要な最低成分であり、ＡＥＢＰ２は４成分ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体のＨＭＴａｓｅ活性を刺激する。
【実施例５】
【０１２１】
［再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体はリジン２７においてヌクレオソームヒストンＨ３をメチル化する］
ＥＥＤ−ＥＺＨ２／ＥＳＣ−Ｅ（Ｚ）ＨＭＴａｓｅ複合体の独立した精製及びキャラクタリゼーションが行われている（Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３；Ｃｚｅｒｍｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１８５−１９６；Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２８９３−２９０５；Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１９７−２０８）。しかしながら、これらの精製された酵素複合体の特性は幾分相違点を有していると考えられる。例えば、１つの精製されたＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体はオクタマー基質よりもオリゴヌクレオソームに対する明らかな選択性を有しているが（Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３）、ＡＥＢＰ２を有さない同様のＨｅＬａ複合体は相反する選択性を有していることが解っている（Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２８９３−２９０５）。複合体内のＡＥＢＰ２の存在が基質の選択性を改変するかどうか調べるために、ＡＥＢＰ２を有さない再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体を用いて基質選択性を分析した。図４Ａに示す結果によれば、ＡＥＢＰ２含有複合体（図１Ｄ）と同様、４成分ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体もまたオクタマーよりもオリゴヌクレオソームに対して明確な選択性を示している。同様の基質選択性が、３成分ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の場合も観察されている（データ示さず）。従って、ＡＥＢＰ２及びＲｂＡｐ４８の何れも基質特異性の決定に関与していないが、ＥＺＨ２又はそれと会合しているＥＥＤ及びＳＵＺ１２はこの過程に関与していると考えられる。
【０１２２】
基質選択性のほかに、酵素複合体がメチル化するリジン残基に関しても一部の矛盾点がある。ヒトＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体及びショウジョウバエのＥＳＣ−Ｅ（Ｚ）相当部分はヒストンＨ３−Ｋ２７のみをメチル化すると報告されている（Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３；Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１９７−２０８）が、ヒストンＨ３−Ｋ９  ＨＭＴａｓｅ活性もまた同じ複合体について報告されている（Ｃｚｅｒｍｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１８５−１９６；Ｋｕｚｍｉｃｈｅｖ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１６：２８９３−２９０５）。この矛盾は、複合体の組成の僅かな相違、例えばＡＥＢＰ２の有無の結果であるか、又は、僅かなヒストンＨ３−Ｋ９  ＨＭＴａｓｅの活性が汚染によるものであった可能性がある。これらの２つの可能性を区別するために、どのリジン残基が種々の再構成複合体によりメチル化されるかを調べた。この目的のために、３段階の組み換え野生型又は突然変異体のヒストンＨ３を５成分、４成分又は３成分を含有する酵素複合体を用いたヒストンメチルトランスフェラーゼ試験に付した。ネイティブ複合体の場合（Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３）と同様、Ｋ２７における突然変異は、５成分複合体に対して検出不可能なＨＭＴａｓｅ活性をもたらした（図４Ｂ、左コラム）。４成分又は３成分の複合体を用いた場合も同様の結果が得られた（図４Ｂ、中央２パネル）。従って、ＡＥＢＰ２はヒストンＨ３−Ｋ９をメチル化する４成分ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の能力を制限しないが；ヒストンＨ３−Ｋ９上の突然変異は再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体に対する基質として作用するヒストンＨ３の能力の僅かな低下を確かにもたらしているように観察された。
【実施例６】
【０１２３】
［ＳＵＺ１２はインビボのヒストンＨ３−リジン２７のトリメチル化に寄与する］
インビトロにおけるヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化におけるＳＵＺ１２の役割が明確化されたため、インビボの機能を分析した。安定なＳＵＺ１２ノックダウン細胞系統はベクター系のｓｉＲＮＡ法を用いて形成した（例えばＷａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：４７５−４８７参照）。細胞系統のキャラクタリゼーションによれば、約７５％のノックダウンがタンパク質レベルで達成された（図５Ａ、レーン３と５を比較）。定量的ＲＴ−ＰＣＲによれば約６５％のノックダウンがｍＲＮＡレベルで達成された（図５Ａ、右パネル）。ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体のＥＺＨ２及びＥＥＤ成分に関するｓｉＲＮＡトランスフェクション（Ｂｒａｃｋｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）ＥＭＢＯ  Ｊ．２２：５３２３−５３３５；Ｖａｒａｍｂａｌｌｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｎａｔｕｒｅ  ４１９：６２４−９）と同様、ベクター系のＳＵＺ１２ノックダウンは細胞の形態及び成育において変化をもたらした（図５Ｂ）。インビボのヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化に対するＳＵＺ１２ノックダウンの作用を評価するために、ＳＵＺ１２ノックダウン細胞及びパラレルな空のベクタートランスフェクションで得られた細胞から単離した、等しい量のヒストンをヒストンＨ３のメチル化されたリジン９又はリジン２７に対して特異的な抗体を用いたウエスタンブロット分析に付した。図５Ｃに示す結果によれば、ＳＵＺ１２ノックダウンはトリメチルＫ−２７の量の顕著な低下をもたらしたが、トリメチル−Ｋ９の量には殆ど影響しなかった（図５Ｃ、第３及び第４パネル）。意外にも、モノメチル−Ｋ２７の増大及びジメチル−Ｋ２７の中等度の減少もまた観察されている（図５Ｃ、最上２パネル）。ＳＵＺ１２ノックダウンがＥＺＨ１２の量に影響しなかったという事実（図５Ａ）は、インビトロのヒストンＨ３−Ｋ２７メチルトランスフェラーゼのためのＳＵＺ１２の必要性（図３Ｂ）と組み合わせると、ＳＵＺ１２はヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化に直接寄与していることを示している。
【実施例７】
【０１２４】
［ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体のＳＵＺ１２媒介サイレンシング］
ショウジョウバエにおける研究によりＨｏｘ遺伝子サイレンシングにおけるヒストンＨ３−Ｋ２７のメチル化のための役割が明らかにされた（Ｃａｏ，ｅｔ．ａｌ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９８：１０３９−１０４３；Ｍｕｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｅｌｌ  １１１：１９７−２０８）。本明細書に記載するデータは、ＳＵＺ１２がインビトロ及びインビボのヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化のために重要であることを示している。ヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化がショウジョウバエの場合と同様に哺乳類細胞においてもＨｏｘ遺伝子のサイレンシングに関与しているかどうかを調べるために、ＳＵＺ１２ノックダウン細胞におけるＥＥＤ−ＥＺＨ２標的遺伝子の発現を評価した。ノックダウン細胞及びパラレルな対照細胞における数種のＨｏｘ遺伝子、ＨｏｘＣ６、ＨｏｘＣ８及びＨｏｘＡ９を含む発現の量を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで調べた。図６Ａに示す結果によればＳＵＺ１２ノックダウンはＨｏｘＣ８及びＨｏｘＡ９に対しては抑制解除をもたらしたが、ＨｏｘＣ６に対して殆ど作用を示さなかった。
【０１２５】
ＳＵＺ１２ノックダウンはＨｏｘＡ９に対して劇的な作用を有していたため、ＳＵＺ１２ノックダウン、ヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化及びＨｏｘＡ９抑制解除の間の関係を調べた。従って、ヒトＨｏｘＡ９遺伝子の種々の位置におけるＳＵＺ１２結合及びヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化をＳＵＺ１２及びトリメチル−Ｋ２７に対する抗体を用いたクロマチン免疫沈降（ＣｈｌＰ）により分析した。Ｃｈｌｐ試験用及び抗体特異性用の対照としては、等量のＩｇＧ及び抗ヒストンＨ３−ジメチル−Ｋ４抗体を含んだ。プロモーター（Ｂ）、イントロン（Ｃ）及び遺伝子の下流（Ｄ）を包含する代表的な領域を分析した。更に又、ヒトとマウスの遺伝子の間で高い配列相同性を示す転写開始部位の約４ｋｂ上流の領域（Ａ）も分析した。図６Ｂに示す結果によれば、ＳＵＺ１２及び３ｍｋ２７は、モックノックダウン細胞（mock knock-down cells, 最上パネル）における領域Ｃ（レーン１４及び１５）及びＤ（レーン１９及び２０）の存在と比較した場合に、領域Ａ（レーン４及び５）及びＢ（レーン９及び１０）に選択的に存在することがわかる。ヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化におけるＳＵＺ１２の役割と合致して、ノックダウンＳＵＺ１２は、領域Ａ及び領域Ｂ、特に領域ＡにおけるヒストンＨ３−３ｍＫ２７の消失と同時にＳＵＺ１２結合の有意な減少をもたらした（図６Ｂ、レーン４及び５、最上及び最下のパネルを比較）。３つのＹＹ１結合部位が領域Ａにおいて識別されているため、この領域はショウジョウバエのポリコーム応答エレメント（ＰＲＥ）と同様の機能を有していると考えられる。従って、直接のＳＵＺ１２の結合の消失はヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化の消失及びＨｏｘＡ９の抑制解除に相関している。遺伝子活性化のマーカーと考えられているヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化には殆ど変化が無いことが観察された。総括すれば、データはＳＵＺ１２がＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の酵素活性及びサイレンシング機能にとって不可欠であることを示している。
【実施例８】
【０１２６】
［再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の阻害剤］
ヒストン基質を９６穴プレートにコーティングし、再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体及び被験化合物を含有する反応混合物をウェルに添加した（図７）。ウェルを洗浄し、Ｈ３−ｍＫ抗体を添加し、そして、被験化合物が再構成複合体のＨＭＴａｓｅ活性を阻害するかどうか調べるためにＥＬＩＳＡを行った。この一次スクリーニングにおいては、スクリーニングした２０，０００化合物中２２化合物が阻害活性を示した。２２化合物は更に、他のＨＭＴａｓｅと比較した場合の再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体に対する特異性に関しても試験した。
【０１２７】
上記は本発明を説明するものであり、本発明を限定するものであると解釈すべきものではない。本発明は添付する請求の範囲及びそれに包含される請求項の均等物により定義される。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体がネイティブの複合体と同様の酵素活性及び基質特異性を有していることを示している。図１ＡはＥＥＤ−ＥＺＨ２再構成に関与する工程の略図である。図１Ｂは銀染色ポリアクリルアミドＳＤＳゲル（最上パネル）、及びＳＵＰＥＲＯＳＥ（登録商標）６ゲル濾過カラムから誘導した画分のＨＭＴａｓｅ活性試験（第２パネル）を示す。組み換えＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の５成分を「*」で示す。矢印はウエスタンブロット分析により確認されたＥＺＨ２の分解産物を示す（第３パネル）。タンパク質マーカーの溶離特性は最上部に示す。タンパク質サイズマーカーの位置は左側に示す。ウエスタンブロット分析により確認した組み換えＡＥＢＰ２（３５ｋＤａ）の遊走（第４パネル）はネイティブの複合体（６５ｋＤａ）中に存在する場合とは異なっている。図１Ｃは等しい量のヌクレオソームヒストンを使用した場合（第３パネル）の種々の量の再構成複合体（レーン３〜５）（上２パネル）とのネイティブ複合体（レーン１）のＨＭＴａｓｅ活性（最下パネル）の比較を示す。使用した複合体の量は記載したとおりＥＺＨ２及びＳＵＺ１２のウエスタンブロット分析により定量した。図１Ｄは組み換えＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の基質特異性の特性である。等量の組み換え酵素複合体を使用して等量のヒストンＨ３単独、又は、オクタマー、モノ及びオリゴヌクレオソームの形態のものをメチル化した（最下パネル）。最上パネルは最下パネルのオートラジオグラフである。最上パネルの定量は２つの独立した実験から得たエラーバーと共に中央のパネルに示す。
【図２】ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体の成分間のタンパク質−タンパク質相互作用を示す。図２Ａは等量のＧＳＴ融合タンパク質（最上パネル）及び右側に示したインビトロ翻訳されたＳ35−標識タンパク質（最下パネル）を用いたＧＳＴプルダウン試験を示す。「Ｉｎ」は総投入量の１０％を示す。図２Ｂは図２Ａに示した相互作用の略図である。図２ＣはＳＵＺ１２及びＲｂＡｐ４８の相互作用に関与するＡＥＢＰ２上の領域のマッピングを示す。異なる欠失構築物（最上パネル）をインビトロ転写／翻訳した後にＧＳＴプルダウン試験において使用した（最下パネル）。ＡＥＢＰ２上の３つの亜鉛フィンガーを示す。相互作用の強度は最上パネルの右側にまとめる。「＋＋」、「＋」及び「−」はそれぞれ強、弱及び相互作用非存在を示す。
【図３】ＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体及びサブ複合体の特性を示す。図３Ａは精製された組み換え複合体及びサブ複合体を含有する銀染色ポリアクリルアミドＳＤＳゲルである。（ＥＥＤ−ＥＺＨ２）5は全５成分を含有する。（ＥＥＤ−ＥＺＨ２）4はＡＥＢＰ２を含有しない。（ＥＥＤ−ＥＺＨ２）3はＡＥＢＰ２及びＲｂＡｐ４８を含有しない。（ＥＥＤ−ＥＺＨ２）2はＥＥＤ及びＥＺＨ２のみを有している。ＦＬＡＧ（登録商標）−ＥＥＤはウエスタンブロット分析により確認した。図３Ｂは５成分、４成分、３成分及び２成分の種々の組み換え複合体の酵素活性の比較を示す。使用した複合体は、各反応が等量のＥＺＨ２及びニワトリオリゴヌクレオソームを含有するように規格化した（上２パネル）。反応は、酵素／基質比１：２０で実施した。酵素活性（第３パネル）及び定量（最下パネル）を２つの独立した実験から得られたエラーバーと共に示す。図３Ｃはパネル最上部に示した酵素濃度の広範な範囲による種々の組み換え複合体の酵素活性の比較を示す。各反応において使用したオリゴヌクレオソーム基質は約２００ｎＭであった。最上パネル上のデータの定量は最下パネルに示す。
【図４】再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２酵素複合体の基質選択性及び部位特異性を示す。図４ＡはＡＥＢＰ２存在下又は非存在下のＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体が同じ基質選択性を有することを示している。等量の４成分組み換え酵素複合体を用いて等量のヒストンＨ３単独、又は、オクタマー、モノ及びオリゴヌクレオソームの形態のものをメチル化した（最下パネル）。最上パネルは最下パネルのオートラジオグラフである。最上パネルの定量は２つの独立した実験から得たエラーバーと共に中央のパネルに示す。図４ＢはヒストンＨ３−Ｋ２７が５成分、４成分及び３成分を有する組み換え酵素複合体に対する標的部位であることを示している。野生型又は突然変異体のヒストンＨ３の３段階の量（パネル最上に示す）を酵素／基質比１：２０で種々の再構成複合体によりメチル化した。活性はオートラジオグラフで示した（最初の３列）。
【図５】ＳＵＺ１２が細胞生育及びインビボのヒストンＨ３−Ｋ２７メチル化のために重要であることを示している。図５ＡはＳＵＺ１２の安定なノックダウン細胞系統及びパラレルなモックノックダウン細胞系統のウエスタンブロット（左パネル）及び定量的ＲＴ−ＰＣＲ（右パネル）分析を示す。チューブリンは、ウエスタンブロット分析のローディング対照として機能している。ＧＡＰＤＨは定量的ＲＴ−ＰＣＲの規格化のための対照として使用した。図５ＢはＳＵＺ１２ノックダウン細胞における形態学的変化及び細胞生育の抑制を示す。最上パネルは２週間の選択の後の対照及びノックダウンのＨｅＬａ細胞の形態学的変化を示す。最下パネルは対照及びノックダウンのＨｅＬａ細胞の生育曲線を示す。生存細胞は４×１０4個の初期播種の後の種々の時間においてトリパンブルー染色により計数した。図５Ｃはモノ、ジ又はトリメチル化Ｋ２７及びトリメチル化Ｋ９に特異的な抗体を用いて対照及びノックダウンのＨｅＬａ細胞から抽出したヒストンのウエスタンブロット分析を示す。ヒストンＨ３の等量ローディングを平行ゲルのＣＯＯＭＡＳＳＩＥ（登録商標）染色により確認した。
【図６】ＳＵＺ１２ノックダウンがＨｏｘ遺伝子発現の抑制解除及びＨｏｘＡ９遺伝子上のＨ３−Ｋ２７メチル化の低下した量をもたらすことを示している。図６ＡはＳＵＺ１２ノックダウン及びモックノックダウン細胞におけるＨｏｘＣ６、ＨｏｘＣ８及びＨｏｘＡ９の発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＧＡＰＤＨを規格化のための対照として使用した。定量はエラーバーを伴った２つの独立した実験の平均である。図６ＢはＨｏｘＡ９遺伝子に及ぶ選択された領域のクロマチン免疫沈降（ＣｈｌＰ）分析を示す。最上パネルは２つのエクソンを２つの箱で示したＨｏｘＡ９遺伝子のダイアグラムである。転写開始部位に相対的な分析領域（Ａ〜Ｄ）の位置を示す。各領域は約５００ｂｐに及ぶ。ＳＵＺ１２又はモックノックダウン細胞を用いたＣｈｌＰ試験においては３抗体（抗２ｍＫ４、−３ｍＫ２７及び−ＳＵＺ１２）及びＩｇＧ対照を使用した。ＣｈｌＰの結果はＰＣＲ増幅されたＣｈｌＰのＤＮＡを含有するアガロースゲルの臭化エチジウム染色により明らかにされた。
【図７】高スループットのスクリーニング試験における阻害剤を識別するための再構成ＥＥＤ−ＥＺＨ２酵素複合体の使用を示す。特に図７はＥＥＤ−ＥＺＨ２複合体阻害剤に関する高スループット試験に包含される工程の略図である。
【図１Ａ−１Ｂ】
2008506367.tif 000003
【図１Ｃ−１Ｄ】
2008506367.tif 000004
【図２Ａ−２Ｂ】
2008506367.tif 000005
【図２Ｃ】
2008506367.tif 000006
【図３Ａ−３Ｂ】
2008506367.tif 000007
【図３Ｃ】
2008506367.tif 000008
【図４】
2008506367.tif 000009
【図５Ａ−Ｂ】
2008506367.tif 000010
【図５Ｃ】
2008506367.tif 000011
【図６Ａ】
2008506367.tif 000012
【図６Ｂ】
2008506367.tif 000013
【図７】
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【国際調査報告】
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