(57)【要約】  本発明は生殖障害を改善する方法に向けられる。より具体的には、本発明は、不妊症に関連した多様な欠陥の治療にIL-17 を使用するための方法及び組成物について述べる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の妊孕性関連障害の治療方法であって、該妊孕性関連障害の症状を軽減するのに有効な量のIL-17を含む組成物を該哺乳動物に投与することを含んで成る方法。
【請求項２】
哺乳動物の子宮内膜症の治療方法であって、該哺乳動物の子宮内膜症の少なくとも一つの症状を軽減するのに有効な量のIL-17を含む組成物を該哺乳動物に投与することを含んで成る方法。
【請求項３】
前記IL-17が、脱落した子宮内膜組織の周囲組織に対する細胞接着を抑制するのに有効な量において投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
IL-17の該投与が前記哺乳動物の子宮内膜病変の数を減少させる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
TNF-α又はその受容体の産生、活性、又は発現を抑制する作用剤を投与することをさらに含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
作用剤が抗TNF抗体又はそのフラグメントである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
子宮内膜症を治療する作用剤を投与することをさらに含んで成る、請求項１又は５に記載の方法。
【請求項８】
子宮内膜組織の外科的切除との組合せにおいてIL-17を含んで成る前記組成物が投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
該外科的切除の前、後、又は最中にIL-17を含んで成る前記組成物が投与される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ホルモン療法を行うことを更に含んで成る、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
前記ホルモン療法が、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）アゴニストを投与することを含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
GnRHアゴニストが酢酸ナファレリン、酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン及び酢酸ブセレリンからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
IL-17を含む前記組成物が、前記GnRHアゴニストと同時に投与されるか、又はGnRH アゴニストの休止時に投与されることを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
子宮内膜症の症状を予防するために十分な期間、毎日プロゲスチン作用剤と共にエストロゲン作用剤を個体に投与することを更に含んで成る、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
エストロゲン作用剤が約5〜約35 μgのエチニルエストラジオールと生物学的に等価のレベルで投与され、そしてプロゲスチン作用剤が約0.2〜約1.5 mgの酢酸ノルエチンドロンと生物学的に等価のレベルで投与される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
エストロゲン作用剤及びプロゲスチン作用剤が経皮的又は経口的に同時投与される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
単相性錠剤又はカプセルとしてエストロゲン作用剤及びプロゲスチン作用剤が経口投与される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
哺乳動物中の子宮内膜間質細胞の脱落膜化を促進する方法であって、前記組成物の投与前の哺乳動物の細胞と比較して、該哺乳動物の子宮内膜間質細胞に着床を受入れさせるための有効量において、該哺乳動物にIL-17を含んで成る組成物を投与することを含んで成る方法。
【請求項１９】
前記細胞の脱落膜化の促進が、IGFBP-1発現の増加、IL-1β発現の増加、活性化COX-2発現、細胞内cAMPの増加、減少した平滑筋アクチン発現、PGE2生成の増加、プロラクチン生成の増加、卵母細胞着床の量の増加及び該IL-17投与に応答した子宮内膜間質細胞の膨張からなる群から選択される特性を使ってモニターされる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記哺乳動物が子宮内膜症を患い、そして前記IL-17の投与が子宮内膜細胞の子宮内膜表現型を胚着床を受入れる表現型に逆転させる、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
TNF-α誘発子宮内膜細胞接着を抑制する作用剤をスクリーニングする方法であって、
i）    TNF-αの存在下において培養中の子宮内膜細胞と固体支持体との結合性を測定する工程、
ii）  IL-17の存在下のTNF-αの存在下において培養中の子宮内膜細胞と固体支持体との結合性を測定する工程、
iii）  TNF-α、IL-17及び候補作用剤の存在下において培養中の子宮内膜細胞と固体支持体との結合性を測定し、そして工程（ii）の結合と工程（iii）の結合性を比較する工程、ここで工程（ii）と工程（iii）の間での結合性の減少は該作用剤がTNF-α誘発の子宮内膜細胞接着の抑制剤であることを示す、
を含んで成る方法。
【請求項２２】
不妊症の治療における使用のためのIL-17を含んで成る組成物。
【請求項２３】
子宮内膜症の治療における使用のためのIL-17を含んで成る組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般に不妊症の治療に関する。より具体的には、本発明は、IL-17を用いた不妊症の治療に関する。
【背景技術】
【０００２】
米国のみで600万を越える不妊症に悩む夫婦がいると推定されている。女性において不妊症に至る主要な要因は子宮内膜症であり、これは生殖年齢の五人の女について約一人、妊症問題を持つ二人の女につき一人に影響する障害である（Brosens, Am. J. Obstet. Gynecol. 176:263-7, 1997; Child and Tan, Drugs 61:1735, 2001）。子宮内膜症は、女性中で二番目に一般的な疾患であり、子宮の外側における子宮内膜細胞の発生を特徴とする。子宮の外側におけるこれらの細胞の存在は、性交中及び性交後ならびに月経時期に進行性、無能化する月経困難症の痛みと骨盤の痛みに至る。月経困難症の痛みには、腰痛、下痢、めまい、頭痛、及び悪心が含まれる。
【０００３】
子宮内膜は、子宮の内面の裏層粘膜である。通常の状況下では、子宮内膜は子宮にのみ見出される。しかしながら、子宮内膜症では、月経の際に子宮内膜組織はファロピウス管 を通して流され、これは“月経の経卵管逆流”と呼ばれ、この組織は腹膜腔の多様な部位に着床し、子宮内膜塊のカルスに成長する（ここでは、子宮内膜細胞増殖巣又はカルスと呼ばれる）。生殖器官の外表面上の着床部位には、子宮、卵巣、子宮仙骨靭帯、ペルビック腹膜、直腸膣中隔、子宮頚部、膣及びファロピウス管が含まれる。なお、細胞接着はまた腸上の腹腔、膀胱、胸膜、リンパ節及び膵臓でも起ることがある。子宮外に位置する子宮外子宮内膜細胞増殖巣はなお女性周期のホルモンにより影響され、これらのホルモンレベルに応答して出血し、子宮内膜症に関連する痛みを起す体積変化をする。なお、子宮内膜症の女性の卵巣とファロピウス管に細胞接着が増加すると、これらの女性は自発的不妊症に至る。
【０００４】
子宮外に子宮内細胞が存在すると、子宮内膜症の女性では炎症性応答を起す。この炎症性応答はまた、子宮内膜症と関連する痛みをさらに起す。子宮内膜症の女性の子宮液は、高濃度の多様な炎症性サイトカインを有することが判った。子宮内膜症炎症反応に伴う幾つかのこの様なマクロファージ分泌産物の一つは、腫瘍壊死因子（TNF、カケクチンとしても知られる、Overton et al., Hum. Reprod. 11, 380-386, 1996）である。TNFは活性化T細胞及びマクロファージにより放出された多面発現性サイトカインである。これは、インターフェロン、インターロイキン及びコロニー刺激因子サイトカインネットワークのメンバーである。この因子のネットワークは、多くの感染性の疾患及び炎症性の疾患の病理発生に至るシグナル伝達系における重要な役割を果たす。TNFは、他のサイトカイン及び接着分子の生成を含む多くの炎症性変化を引起す（Fiers, FEBS Lett. 285, 199-212, 1991）。腹膜腔における高レベルのマクロファージ及びTNF-αは、子宮内膜症と関連がある（Horning et al., Am J Pathol. 2001 Jun; 158 (6): 1949-54; Rana et al., Fertil Steril. 1996 May; 65 (5): 925-30）。子宮内膜症の女性の腹水中に高濃度で見出された他のマクロファージ分泌産物には、RANTES （Hornung et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 1621-1628, 1997）、インターロイキン-6（Harada et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 176, 593-597, 1997）、インターロイキン-8（Arici et al., Mol. Hum. Reprod. 2, 40-45, 1996）、単球走化性蛋白質-1（Arici et al., Fertil. Steril. 67, 1065-1072,1995）が含まれる。顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子（GMF-CMS）は、腺筋症の子宮内膜及び子宮内膜症組織において高い（対応する生検からの病変していない子宮内膜に対し）ことが判り、また月経周期の分泌期の際に高いことが判っている（Props et al., 2002; Sidell et al., 2002; Sharpe-Times et al., 1994）。子宮内膜症の女性において、免疫の変化が示された（Rana et al., Fertil Steril. 65, 925-930, 1996）。TNF-αに応答して、子宮内膜症の上皮細胞は、MCP-1を生成し、高レベルのIL-6,IL-8を発現し、また高レベルのN-カドヘリンを発現することが示されたが、他方、正常部位の子宮内膜細胞はこれらの条件下で低い量のMCP-1及びN-カドヘリンを発現する。なお、TNF-αはまた子宮内膜間質細胞の増殖を刺激し、その効果はIL-8によって仲介されることが示された。
顆粒球/マクロファージコロニー刺激因子（GMF-CMS）は、腺筋症の子宮内膜及び子宮内膜症組織において高い（対応する生検からの病変していない子宮内膜に対し）ことが判り、また月経周期の分泌期の際に高いことが判っている（Props et al., 2002; Sidell et al., 2002; Sharpe-Times et al., 1994）。
【０００５】
同時に、子宮内膜症の病理に重要な役割をしながら、TNF-αはヒトの子宮内膜を着床受入れ表現型への転換と関連がある、すなわち、TNF-αは、間質上皮細胞を脱落膜化して間質細胞が着床を受入れ可能にする。TNF-αは、ヒトの子宮内膜間質細胞からHB-EGFの生成を促進し、これは着床の期間（window of implantation）と関連する。TNF-αならびに幾つかのサイトカイン及びケモカインは、in vitroにおいて脱落膜化したヒトの子宮間質膜細胞中で高レベル化されることが発見されている（Provici et. al., Endocrinology. 2000 Sep; 141 (9): 3510-3, 2000）。TNF-αはまた、サイクルの黄体周期の際に得られるヒトの子宮間質細胞と共に培養された子宮内膜上皮細胞からのプロスタグランジン生成を増加させることが示された（着床期間と同時に起る）。子宮内膜症で高レベルになっていると報告されているサイトカインの中で、IL-6、IL-8、GM-CSF-1もまた胚着床に適切な受容性のある子宮内膜と強く関連していることが示された。白血病阻害因子（LIF）及びIL-11は着床しなかった患者の間では子宮分泌液中に見られるTNF-α及びLIFレベルの着床と結びついた高度化を容易にする明白な役割を有すると主張されているが、これに対して妊娠した女性は低レベルのTNF及びLIFを有していた（Ledee Bataille et al., Hum Reprod. 17 (1): 213-8, 2002）。
【０００６】
形態学的には、子宮内膜症の病巣自身は、進行的であり、最初は透明な小疱として現れ、これが次いで赤くなり、次いで数年かけて黒い繊維症の病巣に進む（MacSween, Muir’s Textbook of pathology, 13th ed. (Ed. Whaley K), 1024-1025, 1993）。したがって、最初は、場所を変えた子宮内膜細胞の存在は、骨盤の腹膜の裏層上、又は上部腹部の横隔膜の様な骨盤外の部位に顕微鏡により確認できるのみである（Murphy et al., Fert. and Sterility 46: 522-524 (1986)）。しかしながら、時間と共に、子宮内膜の細胞増殖巣の部位での規則的な月経の出血は以前には何も見られなかった場所での血管形成と目視できる病巣の成長に至る。痛みと不妊は、これらの場所での出血及びこれらの場所への出血の流入から広がる（Brosens, Am. J. Obstet. Gynecol. 176: 263-7, 1997）。子宮内膜症の症状は、通常は妊娠及び授乳の際、閉経前期的去勢の後、及び閉経周辺期の低エストロゲン血症が進展するにつれておさまる。それでも、子宮内膜症は、抵抗のないエストロゲン療法により何歳になっても刺激される再発症状を生じる一生の病理的状態である。
【０００７】
異所性子宮内膜組織はエストロゲンに鋭敏なので、子宮内膜症の主な非外科的治療は、エストロゲン作用又は合成の妨害を伴う。下垂体によるゴナドトロピン分泌を減少させ、ついで卵巣のエストロゲン生成を減少させるGnRHアゴニストの使用は、FDAにより子宮内膜症の六ヶ月コースの治療として認可された（Henzl et al., N. Eng. J. Med. 318: 385-9, 1988）。繰返しの治療は、この様な繰返される治療が閉経期状の状態を引起し、骨を失い骨粗鬆症に至り得るという事実により妨げられる。さらに、GnRHアゴニスト治療終了後5年以内に50%以上の患者に子宮内膜症の症状と徴候が繰返される（Waller et al., Fertility and Sterility 59: 511-515, 1993; Regidor et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 73: 153-60, 1997）。
【０００８】
GnRHアゴニストに加えて、他のホルモン治療には、偽妊娠を模倣する高投薬量の経口避妊薬ピル（高投薬量のエストロゲン及びプロゲステロンを用いる）、及びダナゾール（エチステロンのアンドロゲン誘導体）が含まれる。これらのホルモン治療は、痛みに対して若干の改善効果を有するが、長期の治療は他の副作用により妨げられる。たとえ高投薬量でも組織がプロゲステロンに応答できないので、例えば、高投薬量の経口避妊薬は子宮内膜の組織を刺激し増殖させる。このように、経口避妊ピルの救済は限られている（Dawood, Int. J. Gynaecol. Obstet. 40 (Suppl.), S29-42, 1993）。プロゲステロンは、うつ、体重増加及び体液貯留を伴う不規則出血を起す傾向がある。ダナゾールは、血清中の可溶性TNF-α、インターロイキン-1β及びCD8のレベルの減少（Matalliotakis, Int. J. Fertil. Womens. Med. 42, 211-214, 1997; Mori, Am. J. Reprod. Immunol. 24, 45-50, 1990）、新規ステロイド産生及び受容体からのエストラジオールの移動の抑制を含む多様な応答を引起す子宮内膜症を抑制する。ダナゾールは、約66ないし100%の痛みに苦しむ患者で症状を改善するが、4年以内に40-50%の症例で疾患の再発がある。なお、ダナゾール療法は体重増加及びアンドロゲンの副作用を起し、この副作用は80%以下の患者をしてこの療法を放棄させる（Barbieri, N. Engl. J. Med. 318, 512-514, 1988）。
【０００９】
子宮内膜症のホルモン療法に代わるものは外科的処置の介在である。子宮内膜症が重篤な場合には、子宮、卵管及び卵巣の除去が必要とされる。疾患がそれほどひどくない場合にはより少ない侵襲的な子宮内膜ポリープの外科的切除を行なうことができるが、制限された外科的治療でも妊娠率の大きな低下をもたらす。手術後の妊娠率は一般に35ないし65%の範囲にわたり、通常の生殖能を達成するのにARTを必要とする多くの患者を残す（Koninckx and Martin, Curr. Opin. Obstet. Gynecol. 6, 231.241, 1994）。さらに、子宮内膜の病巣の開腹や切除の後でさえも、5年以内に40%以下の患者がさらなる外科的処置の介在を必要とする子宮内膜症の再発を経験する。実際、より強烈な外科的処置の介在を受ける患者の中でさえも、子宮内膜症の再発が続く。それゆえに、この疾患を治すには、手術のみでは不十分である（Revelli et al., Obstet. Gynecol. Surv. 50, 747-754, 1995）。
【００１０】
従って、一般に不妊症の治療についての現在の療法は若干の改善効果はあるが、再発しかつ長年にわたる障害の長期の治療に対してはこれらの療法は不十分である。したがって、子宮内膜症や他の不妊症障害の治療についてのさらなる療法に対する需要がある。
【発明の開示】
【００１１】
本発明は、IL-17を用いた生殖障害を改善する方法を提供する。より具体的には、ある実施態様において、哺乳動物の妊孕性関連障害の治療方法であって、該妊孕性関連障害の症状を軽減するのに有効な量のIL-17を含む組成物を該哺乳動物に投与することを含んで成る、哺乳動物の妊孕性関連障害の治療方法が提供される。特に好ましい実施態様において、本発明の方法は、子宮内膜症の治療に有効である。哺乳動物の子宮内膜症の治療方法であって、該哺乳動物の子宮内膜症の少なくとも一つの症状を軽減するのに有効な量のIL-17を含む組成物を該哺乳動物に投与することを含んで成る、哺乳動物の子宮内膜症の治療方法が本明細書において意図される。本明細書において意図される子宮内膜症の治療方法において、該IL-17は脱落する子宮内膜組織が周囲の組織へ細胞接着するのを抑制するのに有効な量が投与される。ある実施態様において、IL-17の投与の効果は、該哺乳動物の子宮内膜病変の数を減少させることである。
【００１２】
上記治療方法は、IL-17のみ、又はIL-17を子宮内膜症のような妊症障害の治療に有効な別の作用剤と組み合わせた投与を伴うことがある。ある実施態様において、この方法は、TNF-α又はその受容体の生成、活性又は発現を抑制する作用剤の投与をさらに含む。例えば、この方法は、該作用剤が抗TNF抗体又はそのフラグメントの投与を含む。他の実施態様において、作用剤は、非ステロイド抗炎症作用剤の様な抗炎症作用剤である。
【００１３】
具体的な実施態様において、IL-17を、子宮内膜症を治療する作用剤との組み合わせで投与する併用療法が意図される。例えば、IL-17を含む組成物を子宮内膜組織の外科的切除との組合せで投与される。典型的には、外科的切除の前、後又は最中にIL-17を含む該組成物が投与される。本発明の方法はさらに、例えば、ゴナドトロピン放出ホルモン（GnRH）アゴニストを投与する投与ホルモン療法を行うことを含む。GnRHアゴニストが酢酸ナファレリン、酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン及び酢酸ブセレリンからなる群から選ぶことができる。IL-17を含むこの組成物が、GnRHアゴニストと同時に投与されるか又はGnRH アゴニストの投与休止時に投与される。
【００１４】
ホルモン治療の方法は、子宮内膜症の症状を防ぐのに十分な期間、毎日プロゲスチン作用剤と共にエストロゲン作用剤を女性に投与することを含む。エストロゲン作用剤を約5ないし約35 μgのエチニルエストラジオールと生物学的に等価のレベルで投与され、プロゲスチン作用剤を約0.2ないし約1.5 mgの酢酸ノルエチンドロンと生物学的に等価のレベルで投与される。エストロゲン作用剤及びプロゲスチン作用剤は経皮的又は経口的に同時投与される。単相性錠剤又はカプセルとしてエストロゲン作用剤及びプロゲスチン作用剤が経口投与される。
【００１５】
本発明の別の観点は、哺乳動物中の子宮内膜間質細胞の脱落膜化を促進する方法であって、該哺乳動物にIL-17を含む組成物を、該哺乳動物の子宮内膜間質細胞が該組成物の投与前と比較して着床を受入れさせる様にするのに有効な量を投与することを特徴とする哺乳動物中の子宮内膜間質細胞の脱落膜化を促進する方法に関する。該細胞の脱落膜化の促進は、例えば、IGFBP-1発現の増加、IL-1β発現の増加、活性化COX-2発現、細胞内cAMPの増加、減少した平滑筋アクチン発現、PGE2生成の増加、プロラクチン生成の増加、卵母細胞着床の量の増加及び該IL-17投与に応答した子宮内膜間質細胞の膨張からなる群から選ばれる特性を使ってモニターする技術を含む常套的な技術によりモニターできる。具体的な実施態様において、子宮内膜症を患う哺乳動物において、脱落膜化を効果的に増加させ、該IL-17の投与は子宮内膜細胞の子宮内膜表現型を胚着床を受入れる表現型に逆転させる。
【００１６】
本発明の他の要旨は、TNF-α誘発の子宮内膜細胞接着を抑制する作用剤をスクリーニングする方法について記載し、この方法は、
i）    TNF-αの存在下に培養中の子宮内膜細胞と固体支持体との結合性を測定する工程、
ii）   TNF-α及びIL-17の存在下に培養中の子宮内膜細胞と固体支持体との結合性を測定する工程、
iii）  TNF-α、IL-17及び候補作用剤の存在下に培養中の子宮内膜細胞と固体支持体との結合性を測定し、そして工程（ii）の結合と工程（iii）の結合性を比較する工程、ここで工程（ii）と工程（iii）の間での結合性の減少はこの作用剤がTNF-α誘発の子宮内膜細胞接着の抑制剤であることを示す、
を含んで成る。
【００１７】
本発明はまた、不妊症を治療するのに用いるIL-17を含んで成る組成物を意図する。本発明はさらに不妊症の治療に有効な医薬の製造のためのIL-17の使用を意図する。本発明はさらに子宮内膜症を治療するのに用いるIL-17を含んで成る組成物を意図する。本発明はさらに子宮内膜症の治療に有効な医薬の製造のためのIL-17の使用を意図する。
【００１８】
本発明の他の特徴及び長所は、以下の詳細な説明から明らかとなる。しかしながら、詳細な説明及び特定の実施例は、発明の好ましい実施態様を示すが、説明のためにのみ示されているが、当業者はこの詳細な記述から本発明の精神と範囲内で多様な変更と修正が自明であることを理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
米国ならびにその他の世界において、不妊症関連の障害の治療に対する新しい方法に対する不変的な要求がある。不妊症は、幾つかの生理学上の要因の一つ又は二つ以上の要因によってもたらされる多要因の状態である。一つのこの様な要因は、子宮内膜症の症状である。この障害は、子宮の裏層以外の子宮内膜組織の接着を特徴とする（子宮内膜組織の自然な位置）。子宮内膜症は、女性の健康を悪化させるだけでなく不妊症の主原因でもある付随する肉体的ならびに心理的な痛みを伴う。子宮内膜症の現在の治療方法は、この疾患の衝撃的な影響を克服するには不十分である。
【００２０】
本発明は、子宮内膜症及び他の不妊症障害を治療する新しい方法と組成物に関する。ここに呈する議論の多くは子宮内膜症に関するが、本発明の方法は一般に不妊症の治療に使用できることを理解すべきである。従って、ある観点において、本発明の方法は、不妊症障害の治療に使用できるが、特にTNF-αの異常発現又は過剰発現の結果として現れる障害の治療に使用できる。これらの障害には、子宮内膜症（生殖器官の末端の部位で起る子宮内膜症の発症を含む）が含まれるが、これには限られない。本明細書全体を通じて論じられるように、本発明の方法は、子宮腺筋腫症及び月経困難症の症状を含む子宮内膜症の一つ又は二つ以上の徴候又は症状を軽減するのに使用できる。
【００２１】
ある観点において、ここに提示するデータは、インターロイキン17（IL-17）が、TNF-αにより引起されるフィブロネクチンが塗布された物質の子宮内膜細胞への結合を抑制し、これによりIL-17がTNF-αに関連する子宮内膜症の影響を抑制することが示される。本発明の発見はまた、子宮内膜症の進行を変更するであろうさらなる作用剤の同定についてのスクリーニングアッセイを容易にする。
【００２２】
ここに提供されるさらなる実施例は、子宮内膜症の表現型から着床に適合する子宮内膜への形質転換に関連のある子宮内膜におけるIL-17の生理的応答を示す。子宮内膜の生物学における難問は、TNF-αはしばしば不妊症に至る子宮内膜症のような疾患の過程と明白に関連することがあるが、しかし同時にTNF-αは着床に対する子宮内膜の準備（ preparation ）に対して決定的ある。現在の文献の簡潔な概要は、他の局所モジュレーターがTNFに対する応答に影響し、子宮内膜の表現型に向うか又は脱落膜化状態に向うかの子宮内膜の運命を決めることを示唆する。疾患の子宮内膜と病んでいない（ unaffected ）子宮内膜の多くの比較研究は、間質細胞に焦点を合わせていたが、子宮内膜の上皮細胞の変化には殆ど注意を向けて来なかった。ここで行なう研究の目的は、先ずIL-17の子宮内膜症細胞及び子宮内膜細胞の上皮細胞応答に及ぼす影響を調べ、次に子宮内膜間質細胞機能の変化が上皮細胞で測定される変化と不適合性（ comparable ）であるか適合性（ compatible ）であるかを確認することであった。
【００２３】
ここに提供されるさらなる研究において、IL-17とTNF-αの組み合わせは、ヒトの子宮内膜上皮細胞によるGM-CSFの生成の劇的増大を引起すことが示された。さらに、ここでIL-17とTNF-αの相乗的な組み合わせはまた脱落膜化と関連する事象に似る子宮内膜間質細胞の生化学的形質転換を促進することが示される。間質細胞においては、IL-17及びTNF-αは、GM-CSF生成に付加的な影響を及ぼし、IL-6及びIL-8 の生成に相乗的な影響を及ぼす。上皮細胞からのGM-CSFの生成と、IL-6及びIL-8 の生成は、すべて着床と適合する受容的な子宮内膜の公開された標識である。これらの結果は、局所的に生成されたTNF-αと組み合わせたIL-17が、着床により適合したヒトの子宮内膜細胞の形質転換を促進することを示唆する。これらの結果はさらに、子宮内膜症の女性及び繰返し着床失敗をした女性における着床率をIL-17が向上できることを示す。
【００２４】
上記議論から、TNF-αが、子宮内膜組織の機能を調節するのに二つの役割を有することが明らかである。一方で、TNF-αは、明らかに子宮内膜症表現型と結びついている。逆に、TNF-α機能はまた子宮内膜間質細胞を胚の着床に受容的にする様にするのに必要とされる。ここでは、IL-17が、TNF-αの機能を調節して、子宮内膜症においてIL-17を子宮内膜症表現型を妨げるか又は抑制するのに使用できるようにすることができ、他方他の状況下ではIL-17を使用して、子宮内膜をして、着床がより可能である様にする（すなわち、着床により受容的）ことができることが示される。以下に、これらの発見を利用する方法と組成物をさらに詳細に述べる。
【００２５】
TNF-αの作用に及ぼすIL-17の影響
以下の実施例でさらに詳細に述べるように、IL-17は、TNF-αで引起された固体支持体の子宮内膜細胞への結合の抑制における陽性の蛋白質として確認された。かくして、この状況において、IL-17はTNF-αの有害な影響の抑制剤又はアンタゴニストとして作用する。以下に議論するように、以前にIL-17はTNF-α放出を活性化することが示された（U.S. Patent No. 6,569,645、特に実施例２８及び３０を参照されたい）ので、この発見のみは驚くべきで思いもよらなかった。本節は、IL-17及びTNF-αの記述と、ここに述べる多様な方法のためのIL-17組成物を作る方法と組成物を提供する。
【００２６】
IL-17は、Rouvierらにより１９９３年にCTLA-8と呼ばれるcDNA（相補的DNA）として記載されたサイトカインである（J. Immunol. 150: 5445; 1993）。サイトカインは、免疫応答又は炎症応答の多様な様相を制御するホルモン様の分子である。サイトカインは、特に細胞上に存在する受容体と結合し、細胞に対しシグナルを変換することによりその影響を及ぼす。IL-17は、他のサイトカインの発現を刺激する前炎症性のサイトカインとして述べられて来た。特に、多くの報告が、IL-17が前炎症性サイトカインIL-1β及びTNF-αの生成と発現を刺激すること（Jovanoic et al., J Immunol 160: 3513-3521, 1998; U.S. Patent No. 6,569,645）ならびにin vivoにおいて顆粒球形成を起すこと（Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593-2603, 1996 （関連するGenBank Acc. No. Z58820を参照されたい）; Schwarzenberger et al., J. Immunol. 161: 6383-6389, 1998; Schwarzenberger et al., J. Immunol. 164: 4783-4789, 2000）及びCXCケモカインを引起す（Laan et al., J. Immunol. 162: 2347-2352, 1998）ことを示した。
【００２７】
本出願ははじめてIL-17を使用してフィブロネクチン及び特に子宮内膜細胞の細胞結合に及ぼすTNF-αの作用を抑制することについて述べる。この発見により、IL-17又はIL-17アゴニスト又は刺激子を含む組成物は、TNF-αの影響、特に生殖器の疾患において、抑制をするのに有効である。
【００２８】
IL-17蛋白質の配列及びこの様な蛋白質をコードする核酸は、当業者には既知である。例えばGenbank Acc. No. AY460616は、ホモサピエンスIL-17遺伝子の完全なcds配列を提供する。 Genbank Acc. No. BD 265544、Genbank Acc. No. BD 265545、Genbank Acc. No. BD 265546、Genbank Acc. No. BD 265547、Genbank Acc. No. BD 265548、Genbank Acc. No. BD 265549、Genbank Acc. No. BD 265550、Genbank Acc. No. BD 265551、Genbank Acc. No. BD 265552、Genbank Acc. No. BD 265553、Genbank Acc. No. BD 265554、Genbank Acc. No. BD 265555、Genbank Acc. No. BD 265556、Genbank Acc. No. BD 265557、Genbank Acc. No. BD 265558、Genbank Acc. No. BD 265559は、IL-17 に関連する哺乳綱の哺乳動物のサイトカイン配列及び日本特許第2002534122号（ここに参考文献として入れる）にさらに詳細に記載されているのと同じものをコードするポリヌクレオチドを提供する。ヒトIL-17の完全なmRNA配列もまたGenbank Acc. No. U32659に示され、さらにYaoら（J. Immunol. 155(12), 5483-5486 (1995)）に記載されている。U32659からのIL-17配列は、ここにSEQ ID NO:1（核酸配列）及びSEQ ID NO:2（蛋白質配列）として再現される。しかしながら、当業者はこれらの分子の配列を知っているので、IL-17サイトカインの性質を有する限り、任意のIL-17蛋白質又は遺伝子配列変異体を使用できる。
【００２９】
IL-17の配列を記載する多くの参考文献に加えて、ヒト、ラット及びヘルペスウイルスヘルペスIL-17蛋白質及び核酸組成物について記載しているU.S. Patent No. 6,043,344に提供されている教示をここではそのまま参考として組み入れる。U.S. Patent No. 6,043,344からのSEQ ID NO:1及びSEQ ID NO:2を、この特許で教えるこれらの配列の変異を作成する方法の教示及びそこに記載される多様なアッセイでの組成物を試験する方法の教示として特にここで参考として組み入れる。U.S. Patent No. 6,074,849もまたここで参考に入れる。U.S. Patent No. 6,569,645もまたここでIL-17と同族のポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸分子の教示を提供するとして参考に入れておく。本出願に有用であるIL-17の他の変異には、U.S. Patent No. 6,579,520に記載されているIL-17Eポリヌクレオチド及びIL-17E-コード化ポリヌクレオチドが含まれる。
【００３０】
例示的な実施態様において、本明細書に記載される方法に使用されるIL-17組成物は次の配列を有する、SEQ ID NO:3: GITIPRNPGC PNSEDKNFPR TVMVNLNIHN RNTNTNPKRS SDYYNRSTSP WNLHRNEDPE RYPSVIWEAK CRHLGCINAD GNVDYHMNSV PIQQEILVLR REPPHCPNSF RLEKILVSVG CTCVTPIVHH VAHHHHHH; SEQ ID NO:4: MIVKAGITIP RNPGCPNSED KNFPRTVMVN LNIHNRNTNT NPKRSSDYYN RSTSPWNLHR NEDPERYPSV IWEAKCRHLG CINADGNVDY HMNSVPIQQE ILVLRREPPH CPNSFRLEKI LVSVGCTCVT PIVHHVA;又はSEQ ID NO:5: GITIPRNPGC PNSEDKNFPR TVMVNLNIHN RNTNTNPKRS SDYYNRSTSP WNLHRNEDPE RYPSVIWEAK CRHLGCINAD GNVDYHMNSV PIQQEILVLR REPPHCPNSF RLEKILVSVG CTCVTPIVHH VANPAFLYKV VDIHHHHHH。しかしながら、これらは単に例示的な配列であり、当業者は本明細書記載される方法において他の変異体を使用できるであろう。
【００３１】
SEQ ID NO: 2; 3, 4又は5のアミノ酸残基の保存的な置換が行なわれ、それでもこれらの蛋白質の三次元立体配置構造が維持され、及び/又はこれらの蛋白質の機能的サイトカイン活性が維持されることが特に意図される。好ましい実施態様においては、維持されるべき活性は、TNF-αにより仲介された、以下の実施例に述べられるBEND アッセイのようなアッセイにおけるフィブロネクチンを塗布した固体支持体の子宮内膜細胞への結合を抑制し、減らし、相殺し又は減少させる活性であるべきである。流されたヒトの子宮内膜細胞（Koks et al., Mo. Hum. Reprod. 6:17-177, 2000）及びヒトの腹膜中皮からの細胞、子宮内膜症の際に子宮内膜細胞が結合する細胞の型、はフィブロネクチンに対するインテグリン受容体（細胞接着に伴われるリガンド）を発現する（Witz et al., Fertil. Steril. 74:579-584, 2000）。インテグリンを特定の抗体でブロックすると、ヒトの子宮内膜細胞のフィブロネクチンへの結合性を減らすことができ（Kocks et al.,）、ヒトの子宮内膜症細胞をTNF-αで処理すると、フィブロネクチンへの接着を著しく増大させる（Sillem et al., Eur. J. Obstet. Gynecol. Reprod. Biol. 87:123-127, 1999）。BENDアッセイにおいて、ウシの子宮内膜細胞はTNF-αで処理され細胞接着の尺度としてのフィブロネクチン塗布の蛍光ビーズの結合を増加させる。ビーズの蛍光は、フィブロネクチン結合の測定を容易にする。TNF-αは子宮内膜症を持つ女性の腹水中の知られた存在と疾患への関り合いの故にTNF-αはフィブロネクチン結合の誘導物質として使用される（Bullimore, Med. Hypotheses 60:84-88, 2003）。
【００３２】
ここに使われている“保存的な置換”なる語は、疎水性、親水性、カチオン電荷、アニオン電荷、形状、極性などについて別の生物学的に類似の残基によるアミノ酸残基の置換を意味する。保存的な置換の例には、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシン又はメチオニンなどの一つの疎水性残基を別の残基との置換、又は一つの極性残基を別の残基との置換、例えばアルギニンをリジンへ置換、又はグルタミン酸をアスパルチン酸へ置換、グルタミンをアスパラギンへ置換などが含まれる。別のアミノ酸と置換できる中性の親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン及びスレオニンが含まれる。“保存的置換”なる語にはまた、置換又は修飾されたアミノ酸を未置換親アミノ酸の代わりに使用すること（ただし置換ポリペプチドに対して培養された抗体もまた未置換ポリペプチドと免疫反応する）が含まれる。“置換（された）”又は“修飾（された）”なる語により本発明には、天然で発生するアミノ酸から変更又は修飾されたアミノ酸が含まれる。
【００３３】
したがって、本発明の状況において、当該技術においては保存的な置換は一つのアミノ酸を類似の性質を有する別のアミノ酸で置換すると認識されていることを理解すべきである。典型的な保存的置換を実施例に示す。又は、保存的アミノ酸はLehninger（Biochemistry, Second Edition; Worth Publishers, Inc. NY: NY (1975), pp. 71-77）に記載されている様にグループ化できる。当業者は、具体的な保存的置換を示す多くの表を知っている。一つの典型的なこの様な表を下に示す。
【表１】
2008501035.tif 000002
【００３４】
SEQ ID NO:2, 3, 4又は5の任意の配列の任意のいかなる保存的な変異体も、その蛋白質又は蛋白質のフラグメントがTNF-αで仲介されるin vitro又はin vivoにおいて子宮内膜細胞の結合の抑制剤であるという性質を保持する限り本発明にとって有用な蛋白質である。この様な活性は、以下に述べる様に直ちにアッセイできる。
【００３５】
ペプチドの塩基性アミノ酸構造に加えて、IL-17から得られる蛋白質/ペプチドは修飾して、この様な蛋白質/ペプチドを含む組成物をより療法的に効果にするためにこれらの取り込み、循環及び/又は他の修飾を高める様にできることを意図する。例えば、ここではIL-17蛋白質は所定の支持体の子宮内膜細胞への結合を抑制する有益な効果を有することが発見された。したがって、IL-17に基づく組成物は、子宮内膜細胞/組織の子宮外の部位での細胞接着を抑制するのに使用されることが意図されている。したがって、IL-17ペプチド/蛋白質のこの様な子宮内膜細胞が存在するか付着しそうな任意の部位への標的/取り込みを可能にする修飾は有用である。
【００３６】
いくつかの例において、蛋白質の影響を延長するために、IL-17蛋白質/ペプチドの分解を防ぐのが望ましい。当該技術で知られている非加水分解性ポリペプチドをこの様な結合を含むペプチドの合成操作法と共に使用することは、この様な結合を含まない天然のIL-17よりも分解により抵抗性のあるIL-17 蛋白質を調製するのに用いることができる。非加水分解性結合には、-[CH2NH]-（還元アミドペプチド結合）、-[COCH2]-（ケトメチレンペプチド結合）、-[CH(CN)NH]-（（シアノメチレン）アミノペプチド結合）、-[CH2CH(OH)]-（ヒドロキシエチレンペプチド結合）、-[CH2O]-（ペプチド結合）及び-[CH2S]-（チオメチレンペプチド結合）が含まれる（例えば、U.S. Patent No. 6,172,043を参照されたい）。
【００３７】
本発明に有用なIL-17蛋白質は、線状、円状又は天然の方法又は合成法により環化されていてよい。システイン残基の間のジスルフィド結合はペプチド配列を環化する。二官能性試薬を用いて、ペプチドの二つ又は三つ以上のアミノ酸の間に結合を設けることができる。Anwerらにより記載されている（Int. J. Pep. Portein Res. 36:392-399, 1990）様なペプチドの環化の他の方法及びRivera-Baezaらにより記載されている（Neuropepites 30:327-333, 1996）様なペプチドもまた、当業界では知られており、長期間の効果を有し得るIL-17 組成物を製造するのに使用できる。
【００３８】
合理的な薬物設計を使用して、現在知られている生物学的に活性なIL-17から得られた蛋白質の構造的な類似体を生成させることができる。この様な類似体を作ることにより、天然の分子よりもより活性が有るか、又は安定であり、変更に対し異なる感受性を有するか、又は多様な他の分子の機能に影響し得る関連する蛋白質を作ることが可能である。一つの方法において、IL-17から得られた注目の蛋白質又はそのフラグメントに対する三次元構造を発生させるであろう、例えば、これは、X-線結晶学、コンピューターモデリング又は両方法の組み合わせにより達成できる。代わりの方法である“アラニン走査”は、分子全体の残基のアラニンとのランダム置換と決定される機能についての結果としての影響を伴う。
【００３９】
従って、改良されたIL-17由来の蛋白質活性を有するか又は刺激子又はアゴニストIL-17として作用する薬物を設計できる。クローン化IL-17配列が入手し易いために、十分な量の多様なIL-17由来の蛋白質が調製され、結晶学的研究をすることができる。なお、ポリペプチド配列の知識は、構造‐機能関係をコンピューターを用いた予想を可能にする。
【００４０】
さらに、安定化構造又は減少した生物分解を提供するIL-17由来の非ペプチド類似体もまた期待される。注目の蛋白質の一つ又は二つ以上のアミノ酸残基を非ペプチド部分により置換することにより、周知の蛋白質配列に基いてペプチドまがいの類似体を調製できる。好ましくは、この非ペプチド部分がペプチドをして自然のコンファメーション（ confirmation ）を保持するか、又は好ましい、例えば、生物活性、コンファメーション（ confirmation ）、を安定化させる。ペプチドからの非ペプチドまがいの類似体の調製法の一つの例がNachman et al., Regul. Pept. 57:359-370 (1995)に記載されている。ここに使われているペプチドは先のすべてのものを包含する。
【００４１】
特定の実施態様において、本発明の治療法に使われるIL-17由来の蛋白質は、その治療効力を向上させるために修飾することが意図される。治療化合物のこの様な修飾は、毒性を減少させ、循環時間を増加させ、又は体内分布を変更させるために使用できる。例えば、潜在的に重要な治療化合物の毒性は、体内分布を変更する多様な薬物担体ビヒクルとの組み合わせにより著しく減らすことができる。ここで使われるIL-17由来の蛋白質は、子宮内膜組織/細胞又は周りの組織に治療効果を及ぼす様に意図され、この様な部位でのTNF-αの作用を抑制し、その部位に子宮内膜細胞接着の有益な抑制を生じさせる様にする。かくして、このペプチドが取込まれ子宮内膜細胞が接着している部位で効果を持つ様にする修飾は有用である。ここで論じられているように、この様な部位には、例えば、卵巣、子宮仙骨靭帯、骨盤の腹膜、直腸膣中隔、子宮頸部、膣、ファロピウス管、陰門及び腸、肺、膀胱、皮膚、胸膜、リンパ節及び膵臓の様な腹腔における子宮内膜症細胞接着の卵巣外の部位が含まれる。
【００４２】
薬物の活性を向上させる戦略は、水溶性ポリマーの利用である。多様な水溶性ポリマーは、体内分布を変更し、細胞の取込みのモードを改良し、生理学上のバリアーに対する透過性を変え、体からのクリアランスの速度を修飾することを示した（Greenwald et al., Crit Rev Therap Drug Carrier Syst. 2000; 17: 101-161; Kopeck et al., J Controlled Release., 74: 147-158, 2001）。標的効果又は徐放効果を達成するために、端末基として、骨格の一部として又はポリマー鎖上の側基として薬物部分を含む水溶性ポリマーが合成された。
【００４３】
高度の生体適合性と修飾の容易さが有るので、ポリエチレングリコール（PEG）は薬物担体として広範に使用されている（Harries et al., Clin Pharmacokinet. 2001;40 (7):539-51）。多様な薬物、蛋白質及びリポゾームへの付着は、滞留時間を向上させ、毒性を減少させることが示された（Greenwald et al., Crit Rev Therap Drug Carrier Syst. 2000; 17: 101-161; Zalipsky et al., Biocnjug Chem. 1997; 8: 111-118）。PEGは鎖の端にあるヒドロキシル基により及び他の化学的方法により活性な作用剤と結合できる。しかしながら、PEG自身は、せいぜい分子当り二つの活性剤に限られる。異なる方法では、PEGとアミノ酸の共重合体は、PEGの生体適合の性質を保持し、分子当り多数の付着点の付加された利点を有し（より大きな薬物負荷を提供する）、多様な応用に適合する様に合成的に設計できる新規な生体物質として調査された（Nathan et al., Macromolecules. 1992; 25: 4476-4484; Nathan et al., Bioconj Chem. 1993; 4: 54-62）。
【００４４】
当業者は、薬物の効果的な修飾のためのPEG化技術を知っている。例えば、PEGとリジンの様な三官能基モノマーの交互のポリマーからなる薬物送達ポリマーはVectraMed（Plainsboro NJ）により使用された。PEG鎖（典型的には、2000ダルトン以下）は、安定なウレタン結合によりリジンのα-アミノ基及びε-アミノ基に結合されている。この様な共重合体は、ポリマー鎖に沿って厳密に制御されかつ所定の間隔で反応性側基（リジンのカルボン酸基）を提供しながら、PEGの望ましい性質を保持する。反応性側基は、誘導体化、架橋又は他の分子との結合に使用できる。これらのポリマーは、ポリマーの分子量、PEGセグメントの分子量及び薬物とポリマー間の切断可能な結合を変化させることにより安定で長期循環プロ薬物を調製するのに有用である。PEGセグメントの分子量は、薬物/結合基錯体の間隔及び配合体の分子量当りの薬物量に影響する（小さなPEGセグメントは大きな薬物負荷を提供する）。一般に、ブロックコポリマー配合体の最終分子量を増加させると、配合体の循環の半減期を増加させる。それにも拘らず、配合体は直ちに分解可能か、糸球体濾過の限界閾値より低い分子量（例えば、45 kDaより低い）を有するかでなければならない。かくして、分子量が20ないし35 kDaの範囲のポリエチレングリコール化蛋白質が有用であろう。
【００４５】
なお、循環半減期と体内分布を維持するのに重要なポリマー骨格に対し、治療作用剤を特定のトリガーにより、典型的には標的組織中の酵素の作用により骨格ポリマーから放出されるまでプロ薬物の形で維持するためにリンカーを使用できる。例えば、このタイプの組織活性化薬物送達系は、体内分布の特定の部位への送達が要求され、治療作用剤が病理の部位又は部位の近くで放出される場合に特に有効である。活性化薬物送達に用いるリンキング基ライブラリーは、当該技術に精通している者には周知であり、酵素反応速度論、活性酵素の広まり、及び選択された疾患に特化した酵素の切断特性に基づくことができる（例えば、VectraMed, Plainsboro, NJにより確立された技術を参照されたい）。この様なリンカーは、治療送達用にここで述べるIL-17由来の蛋白質を修飾するのに使用できる。
【００４６】
蛋白質の製造方法
本発明は、不妊症治療用の薬剤に用いる蛋白質及びペプチドを提供する。この様な蛋白質又はペプチドは通常の自動化ペプチド合成法又は組換え発現により製造される。蛋白質の設計及び製造についての一般的な原理は当業者には周知である。
【００４７】
Ａ．   自動化された固体相ペプチドの合成
IL-17蛋白質又はこれらのフラグメントは、通常の技術にしたがって溶液中又は固体支持体上で合成できる。多様な自動合成装置は、商業的に入手でき、周知のプロトコルにしたがって使用できる。例えば、Stewart and Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2d. ed., Pierce Chemical Co., (1984); Tam et al., J Am. Chem. Soc., 105:6442, (1983); Merrifield, Science, 232: 341-347, (1986); 及びBarany and Merrifield, The peptides, Gross and Meienhofer, eds, Academic Press, New York, 1-284, (1979)、これら各々はここに参考文献として入れる。蛋白質は、直ちに合成され、次いで最初の選別としてIL-17受容体結合/活性アッセイにおいてスクリーニングされ、生じた蛋白質がIL-17のような活性を有するかどうかを測定される。この蛋白質/フラグメントはまた実施例で述べているBENDアッセイの様な典型的な子宮内膜症アッセイで試験され、蛋白質が子宮内膜細胞のTNF-αで誘起された細胞接着の作用を抑制する有益な効果を有するかどうかが評価される。TNF-αのこの作用を抑制する少なくとも幾らかの効果を有するIL-17由来の蛋白質は有効と考慮される。
【００４８】
蛋白質又はそのフラグメントは、Applied Biosystems Inc.製のモデル433Aなどの典型的なペプチド合成装置を用いて固相技術により合成できる。自動化ペプチド合成又は組換え法により生成した所定の蛋白質の純度は、逆相HPLC 分析を用いて測定できる。各ペプチドの化学的真正度は、当業者に周知の方法により確定できる。好ましい実施態様においては、真正度は質量分析法により確定できる。なお、ペプチドは、マイクロウエーブ加水分解が行われるアミノ酸分析法を用いて、定量化できる。この様な分析法では、GEM CorporationのMDS 2000マイクロウエーブオーブンの様なマイクロウエーブオーブンを使用できる。ペプチド（約2 μg蛋白質）は、例えば6 N HCl（Pierce Constant Boiling、例えば約4 ml）と接触させ、約0.5%（v/v）フェノール（Mallinckrodt）と接触させる。加水分解の前に、試料は真空処理とN2によるフラッシング（flushing）を交互に行なう。二段階工程により蛋白質の加水分解を行う。第一段階の際は、ペプチドは約100℃の反応温度に加熱され、同温度に1分間維持される。この段階の直後に、温度を150℃に上げ、同温度に約25分間維持する。冷却後、試料を乾燥させ、加水分解ペプチドからのアミノ酸をカルバミン酸6-アミのキノリル-N-ヒドロキシ琥珀酸イミジルを使って誘導体化させ、395 nmで蛍光を発する安定な尿素類を生じる（Waters AccQ Tag Chemistry Package）。試料は逆相HPLC により分析でき、定量化は高度の組込み装置を使って達成できる。
【００４９】
B.     組換え蛋白質の製造
自動化ペプチド合成の代替として、組換えDNA技術を用いることができ、この技術では、選択した蛋白質をコードするヌクレオチドの配列を発現ベクターに挿入し、適切な宿主細胞に形質転換させ又はトランスフェクトし、以下に述べる様に発現に適当な条件下で培養する。組換え法は、より長いポリペプチドを生成させるのに特に好まれる。
【００５０】
多様な発現ベクター/宿主系は利用され、ペプチド又は蛋白質コード配列を含みかつ発現する。これらには、組換えバクテリオファージで形質転換された細菌、プラスミド又はコスミドDNA発現ベクターなどの微生物、酵母発現ベクターで形質転換された酵母（Giga-Hama et al., Biotechnol Appl Biochem., 30(Pt 3): 235-44, 1999）；ウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系（例えば、バキュロウイルス、Gosh et al., Mol Ther. 6(1): 5-11, 2002を参照されたい）；ウイルス発現ベクターでトランスフェクトした植物細胞系（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、CAMV；タバコモザイクウイルス、TMV）又は細菌発現ベクターで形質転換された植物細胞系（例えば、Ti又はpBR322プラスミド；例えば、Babe et al., Biotechnol Genet Eng Rev.; 17:213-52, 2000を参照されたい）又は動物細胞系が含まれるが、これらに限られない。当業者は、哺乳動物蛋白質の発現を最適化する多様な技術を知っている（例えば、Kaufman, Mol Biotechnol. 16(2): 151-60, 2000; Colosimo et al., Biotechniques, 29(2): 314-8, 2000を参照されたい）。
【００５１】
組換え蛋白質製造に有用な哺乳動物の細胞には、VERO細胞、HeLa細胞、Chinese hamster卵巣（CHO）細胞系、COS細胞（COS-7など）、W138細胞、BHK細胞、HepG2細胞、3T3細胞、RIN細胞、MDCK細胞、A549細胞、PC12細胞、K562細胞及び293細胞が含まれるが、これらには限られない。細菌、酵母及び他の無脊椎動物中のペプチド基質又は融合ポリペプチドの組換え発現についての典型的なプロトコルは、当業者には周知であり、以下に簡単に述べる。U.S. Patent No. 6,569,645, U.S. Patent No. 6,043,344, U.S. Patent No. 6,074,849及びU.S. Patent No. 6,579,520は、IL-17関連蛋白質の組換え生産についての具体的な例を提供するが、これらの特許をここに明白にこれらの教示の参考文献として入れる。
【００５２】
一般に、原核生物宿主に用いる発現ベクターは、一つ又は二つ以上の表現型の選択可能なマーカー遺伝子を含む。この様な遺伝子は一般に、例えば、抗生物質耐性を与え、又は栄養要求性必要なもの（requirement）を供給する蛋白質をコードする。広範な多様なこの様なベクターは、市場から容易に得られる。例としては、pSPORTベクター、pGEMベクター（Promega）、pPROEXベクター（LTI, Bethesda, MD）、Bluescriptベクター（Stratagene）、pETベクター（Novagen）及びpQEベクター（Qiagen）が挙げられる。注目の所定の蛋白質（例えば、IL-17）をコードするDNA配列は、PCRにより増幅され、この様なベクター、例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ（GST）を含む融合蛋白質を生成する様に設計され、ベクターによりコード化されたpGEX-3X（Pharmacia, Piscataway, NJ）、及びベクターのクローン化部位に挿入されるDNAフラグメントによりコード化される蛋白質、にクローン化される。PCRに対するプライマーを生じさせ、例えば、適切な切断部位を含む。トロンビン又は因子Xa（Pharmacia, Piscataway, NJ）で組換え融合蛋白質を処理すると、融合蛋白質が切断され、GST部分から注目のポリペプチドが放出されることが期待される。PGEX-3X/IL-17コンストラクトは、大腸菌XL-1 Blue細胞に形質転換され（Stratagene, La Jolla CA）、個別の形質転換体は単離され、生育される。個別の形質転換体からのプラスミドDNAが精製され、自動化配列装置を用いて部分的に配列され、望ましいポリペプチドコード化核酸の存在を確認し、適正な方位に挿入する。GST/IL-17融合蛋白質が細菌中に可溶性蛋白質として作られるならば、GST精製モジュール（Pharmacia Biotech）を使って、この蛋白質は精製できる。
【００５３】
別の方法として、融合ポリペプチドを含む予想された基質をコードするDNA配列は、望ましいプロモーター、及び任意的にリーダー配列含むプラスミドにクローン化できる（例えば、Better et al., Science, 240: 1041-43, 1988）。この構造体の配列は、自動化シーケンス法により確認できる。次いで、プラスミドは、CaCl2培養を用いる標準の操作及び細菌のヒートショック処理を用いて、大腸菌に形質転換する（Sambrook et al.、上記）。形質転換された細菌を、カルベニシリンを追加したLB培地中で成長させ、発現された蛋白質の産生は、適当な培地中の成長により誘起される。存在するならば、リーダー配列は、成熟したIL-17ペプチド又は蛋白質の分泌に影響し、分泌中に切断される。分泌された組換え蛋白質は、標準蛋白質精製技術を用いて細菌の培養培地から精製される。
【００５４】
酵母宿主細胞中の組換え蛋白質のための系は、容易に市販品、例えば、製造者の説明書に従い、Pichia Expression System（Invitrogen, San Diego, CA）が得られる。別の代わりの組換え生産は、昆虫系を用いて達成できる。蛋白質発現のための昆虫系は当業者には既知である。一つのこの様な系では、オートグラファカリフォルニカ核多角体ウイルス（AcNPV）をベクターとして使用し、ヨトウガ細胞中又はイラクサギンウワバ幼虫に異質の遺伝子を発現させる。IL-17 蛋白質コード配列をウイルスのポリヘドリン遺伝子等の必須でない領域にクローン化させ、ポリヘドリンプロモーターの制御下に置く。IL-17を首尾よく挿入すると、ポリヘドリン遺伝子を不活性にし、コート蛋白質コートを欠く組換えウイルスを生じる。次いで、この組換えウイルスを使って、IL-17が発現されているヨトウガ細胞又はイラクサギンウワバ幼虫を感染させる（Smith et al., J Virol 46: 584, 1983; Engelhard et al., Proc Nat Acad Sci 91: 3224-7,1994）。
【００５５】
組換え蛋白質の発現のための哺乳動物宿主系もまた当業者には周知である。宿主細胞株は、発現された蛋白質を処理したり、蛋白質活性を提供するのに有効な一定の翻訳後修飾を生じさせる特殊な能力のために選択される。ポリペプチドのこの様な修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化及びアシル化が含まれるが、これらには限られない。蛋白質の“プレプロ”型を切断する翻訳後処理はまた、正しい挿入、折りたたみ、及び/又は機能に重要である。CHO、HeLa、MDCK、293、WI38などの異なる宿主細胞は特定の細胞マシナリ及びこの様な翻訳後作用のための特徴的なメカニズムを有し、導入された異質の蛋白質の正確な修正とプロセシングを確保するために選ばれる。
【００５６】
形質転換された細胞が長期にわたり高収率の蛋白質生成に使用されることが好ましく、この様な安定な発現が望ましい。この様な細胞が、望ましい発現カセットと一緒に選択可能なマーカーを含むベクターと共に一旦形質転換されると、これらの細胞は、選択的な培地に切替えられる前に富栄養培地で一日ないし二日間成長させることができる。選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を与えるように設計され、このマーカーが存在すると、導入された配列を成功的に発現する細胞の成長及び回収を許容する。安定に形質転換された細胞の耐性のある凝集塊は、細胞に適切な組織培養技術を用いて、増殖できる。
【００５７】
多くの選択系を使用して組換え蛋白質生成のために形質転換された細胞を回収させることができる。この様な選択系には、tk細胞、hgprt細胞又はaprt 細胞について、それぞれHSVチミジンキナーゼ、ヒポキサンチン‐グアニンフォスフォリボシルトランスフェラーゼ及びアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子が挙げられるが、これらに限られる訳ではない。また、代謝拮抗薬耐性が、メトトレキセートに対する耐性を与えるdhfr、ミコフェノール酸に耐性を与えるgpt、アミノグリコキシドG418に耐性を与えるneo、クロロスルフロに耐性を与えるals、及びハイグロマイシンに耐性を与えるhygroに対する選択の基礎として使用できる。さらなる選択可能で有効な遺伝子には、細胞にトリプトファンの代わりにインドールを利用させるtrpB、又は細胞にヒスチジンの代わりにヒスチノールを利用させるhisD が含まれる。形質転換体の確定に目視できる指示を与える標識には、アントシアニン、β-グルクロニダーゼ及びその基質であるGUS及びルシフェラーゼ及びその基質であるルシフェリンが含まれる。
【００５８】
C.     組換え蛋白質生成用の発現コンストラクト
本発明のIL-17由来の蛋白質の組換え生成において、IL-17由来の蛋白質をコードするポリヌクレオチド分子を含むベクターの使用が必要であろう。この様なベクターの調製とこの様なベクターで形質転換された宿主細胞を生成させる方法は、当業者には周知である。この様な試みで用いられるポリヌクレオチド分子は宿主中での増殖のためにベクターに連結でき、このベクターは一般に選択可能なマーカー及び複製起点を含む。発現コンストラクトのこれらの要素は、当業者には周知である。一般に、発現ベクターには、哺乳動物、微生物、ウイルス又は昆虫の遺伝子から得られる様な適当な転写又は翻訳調節配列に操作可能的に結合されている所定の蛋白質をコードするDNAが含まれる。調節配列の例には、転写のプロモーター、オペレーター又はエンハンサー、mRNAリボゾーム結合部位及び転写及び翻訳を制御する適切な配列が含まれる。
【００５９】
“発現ベクター”、“発現コンストラクト”又は“発現カセット”なる語は本明細書全体に互換性を持って使用され、配列をコードする核酸の一部又は全体が転写できる遺伝子産物のためにコードする核酸を含む任意のタイプの遺伝子作成物が含まれる。
【００６０】
本発明のペプチド又はポリペプチドの発現のための適当な発現ベクターの選択は、当然に使用される特定の宿主細胞に依存し、当業者の範囲内にある。哺乳動物発現ベクターの作成方法は、例えば、Okayama and Berg（Mol. Cell. Biol. 3: 280 (1983)）; Cosmann et al.（Mol. Immunol. 23: 935 (1986)）; Cosman et al.（Nature 312: 768 (1984)）; EP-A-0367566; 及びWO 91/18982 に開示されている。発現ベクターを生成することについての他の考慮は、例えば、Makrides et al., Protein Expr Purif., 17(2): 183-202; 1999; Kost et al., Curr Opin Biotechnol., 10(5): 428-33, 1999に詳しい。 Wurm et al., Curr Opin Biotechnol. 10(2): 156-9, 1999はここに、組換え蛋白質生成用の哺乳動物中の大規模一過性発現を考慮するための教示因子として入れる。
【００６１】
発現コンストラクトはさらに、ペプチド又はポリペプチドの発現の検出に備える選択可能なマーカーを含む。通常は、薬物選択マーカーが入ると、クローン化及び形質転換体、例えば、ネオマイシン、ピューロマイシン、ハイグロマイシン、DHFR、ゼオシン及びヒスチジノール、の選択を助ける。代わりに、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（tk）（真核の）、β-ガラクトーシダーゼ、ルシフェラーゼ又はクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）（原核の）などの酵素を使用できる。免疫マーカーもまた使用できる。例えば、FLAG系（IBI, New Haven, CT）、HA及び6xHis系（Qiagen, Chatsworth, CA）が使用できる。なお、グルタチオンS-トランスフェラーゼ（GST）系（Pharmacia, Piscataway, NJ）又はマルトース結合蛋白質系（NEB, Beverley, MA）もまた使用できる。使用される選択可能なマーカーは、遺伝子産物をコードする核酸と同時に発現できる限り、重要とは思われない。選択可能なマーカーのさらなる例は、当業者には周知である。
【００６２】
発現は、宿主細胞中の注目の核酸の発現を駆動するのに使えるウイルス源及び哺乳動物源からのエンハンサー/プロモーターなどのベクター中に適切なシグナルが提供されることを要求する。通常は、発現中の核酸は、プロモーターの転写調節下にある。“プロモーター”は、細胞の合成マシナリー又は導入された合成マシナリーにより認識され,遺伝子の特定の転写を開始することが要求されているDNA配列を指す。調節配列が注目の蛋白質をコードするDNAに機能的に関連する時は、ヌクレオチド配列は操作可能に結合されている（すなわち、IL-17、変異体など）。かくして、プロモーターヌクレオチド配列は、もし配列の転写に向うならば、所定のDNA配列に操作可能的に結合される。
【００６３】
同様にして、“転写調節の下で”なる句は、核酸に対しプロモーターが正しい位置及び方向にあり、RNAポリメラーゼ開始と遺伝子の発現を調節することを意味する。核酸の発現を駆動する任意のプロモーターを使用できる。注目の核酸の配列を発現するのを調節するのに用いる特殊なプロモーターは、プロモーターが標的細胞中の核酸の発現を支配できる限りは、重要ではないと信じられている。かくして、ヒトの細胞が標的にされる場合は、ヒトの細胞中に発現できるプロモーターに隣接していて、プロモーターの調節下にある核酸コード領域に位置させるのが好ましい。一般的に言えば、この様なプロモーターはヒト又はウイルスのプロモーターを含んでよい。通常のプロモーターには、例えば、ヒトのサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスの長い末端反復配列、β-アクチン、ラットインシュリンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼプロモーター及びグリセルアルデヒド-3-燐酸デヒドロゲナーゼプロモーター（これらはすべて当業者には周知のプロモーターであり、容易に入手できる）を使用でき、注目のコード配列の高レベルの発現が得られる。発現のレベルが注目の蛋白質の回収できる収率を生じさせるのに十分であるならば、当該技術では周知の他のウイルスのプロモーター又は哺乳動物の細胞プロモーター又は細菌のファージプロモーターを使用して注目のコード配列の発現を達成することもまた意図されている。周知の性質を有するプロモーターを用いて、トランスフェクション又は形質転換の後に続く注目の蛋白質の発現のレベルとパターンを最適化できる。誘導プロモーターもまた使用できる。
【００６４】
蛋白質発現に使われる別の調節因子はエンハンサーである。これらは、DNAの同じ分子上の離れた位置にあるプロモーターからの転写を増加させる遺伝要素である。発現コンストラクトがcDNA 挿入を用いる場合、ポリアデニル化シグナル配列を含めさせ、遺伝子転写産物の適正なポリアデニル化を行なうことが典型的には望まれる。ヒト又はウシ成長ホルモン及びSV40 ポリアデニル化シグナルなどの選ばれたトランスジェニック動物種の細胞により認識された任意のポリアデニル化シグナル配列は、本発明の実施に適当である。
【００６５】
ターミネーターもまた発現カセットの因子として意図される。これらの因子は、メッセージレベルを増強し、カセットから他の配列への読み過しを最小にする。本発明で予想される応用に対する終結領域は比較的に互換性がある様に思われるので、基本的に用いられる終結領域は便宜的に選択される。終結領域は、転写開始に従うか、注目のDNA配列に従うか、又は別源から得られる。
【００６６】
さらに、核酸分子のポリヒスチジル化は、核酸の細胞質送達を達成するのに有用であり、ヒスチジル化ポリリジンとpDNAの間のイオン錯体は、非ウイルス遺伝子送達系の開発に魅力的である（Midoux et al., Somat Cell Mol Genet. 2002 Nov; 27(1-6): 27-47）。
【００６７】
D.     部位特異的突然変異誘発
部位特異的突然変異誘発は、本発明の方法で使用される個々のIL-17由来の蛋白質の調製に有用なもう一つの技術である。この技術は、基礎をなすDNA（修飾のために標的とされているアミノ酸配列をコードする）の特異的突然変異誘発を用いる。この技術は、一つ又は二つ以上のヌクレオチド配列変化をDNAに導入することにより、一つ又は二つ以上の前記の考慮を入れて、配列変異体を調製し試験するすぐ使える能力をさらに提供する。部位特異的突然変異誘発は、望ましい突然変異のDNA配列をコードする特異的オリゴヌクレオチド配列ならびに十分な数の隣接するヌクレオチドを使用することにより突然変異株の生成を可能にし、十分なサイズと横断される欠失結合の両側に安定な二本鎖を形成する配列複雑性のプライマー配列を提供する。代表的には、長さが約17ないし25ヌクレオチドで変更される配列の結合の両側で約5ないし10残基を有するプライマーが好ましい。
【００６８】
この技術は、典型的には一本鎖形及び二本鎖形の両方で存在するバクテリオファージを用いる。部位特異的なの突然変異誘発に有用な代表的なベクターには、M13ファージなどのベクターが含まれる。これらのファージベクターは、商業的に入手でき、その使用は当業者には周知である。二本鎖プラスミドもまた部位特異的な突然変異誘発に慣習的に使われ、注目の遺伝子をファージからプラスミドに移す工程を省く。
【００６９】
一般に、部位特異的な突然変異誘発は、最初に一本鎖ベクターを得ること、又は配列に望ましい蛋白質をコードするDNA配列を含む二本鎖ベクターの二本鎖を解くことにより行なわれる。望ましい突然変異配列を有しているオリゴヌクレオチドプライマーを合成的に調製する。このプライマーは次いで、ハイブリダイゼーション（アニーリング）条件を選択する時にミスマッチの程度を考慮に入れて、一本鎖DNA調製と共にアニールし、突然変異保有の鎖の完全な合成を完成させるために、大腸菌ポリメラーゼI Klenow フラグメントなどのDNA重合酵素にさらす。かくして、ヘテロ二本鎖が形成され、一本の鎖は原非突然変異の配列をコード化し、第二の鎖は望ましい突然変異を有する。このヘテロ二本鎖ベクターは次いで大腸菌細胞などの適切な細胞を形質転換させるのに使用され、突然変異配列配置を有する組換えベクターを含むクローンが選択される。
【００７０】
当然に、部位特異的な突然変異誘発に対する上述の方法は、潜在的に有用な突然変異株ペプチド種を発生させる唯一の方法ではなく、この方法は制限的ではない。本発明はまた、例えば、ヒドロキシルアミンなどの突然変異作用剤で注目の遺伝子を有する組換えベクターを処理するなどの突然変異誘発を達成する他の方法を意図している。
【００７１】
E.     蛋白質精製
本発明のペプチドは精製するのが望ましい。蛋白質の精製技術は、当業者には周知である。これらの技術には、一つのレベルにおいて、ポリペプチドフラクション及び非ポリペプチドフラクションへの細胞環境の粗分別が含まれる。他の蛋白質から本発明のペプチド又はポリペプチドを分離してから、注目のポリペプチド又はペプチドは、クロマトグラフ技術及び電気泳動技術を用いてさらに精製して部分的又は完全な精製（又は均一性に至るまでの精製）を達成できる。純ペプチドの調製に特に適した分析方法には、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、等電点電気泳動及びキャピラリー電気泳動が含まれる。特に効率的なペプチド精製の方法は高速蛋白質液体クロマトグラフィー（FPLC）又は高速液体クロマトグラフィー（HPLC）である。
【００７２】
本発明の若干の要旨は精製に関り、特定の実施態様において、コード化ポリペプチド、蛋白質又はペプチドの実質的な精製に関る。本明細書に使用される“精製したポリペプチド、蛋白質又はペプチド”なる語は、他の成分から単離された組成物を指す様に意図しており、ここにポリペプチド、蛋白質又はペプチドは天然で得られる状態に対して任意の程度で精製されている。したがって、精製されたポリペプチド、蛋白質又はペプチドはまた、天然で発生し得る細胞環境にはないポリペプチド、蛋白質又はペプチドを指す。
【００７３】
一般に、“精製された”なる語は、多様な他の成分を除くために分画にかけたポリペプチド、蛋白質又はペプチド組成物を指し、その組成物は実質的にその発現された生物活性を実質的に保持する。“実質的に精製された”なる語が使用される場合は、その指示（designation）は、ポリペプチド、蛋白質又はペプチドが組成物の主要な成分、例えば、約50%、約60%、約70%、約80%、約90%、約95%又は95%又はそれ以上の組成物中の蛋白質、を構成する組成物を指す。
【００７４】
蛋白質精製の使用に適当な多様な技術は、当業者には周知である。これらには、例えば、硫酸アンモニウム、PEG、抗体などによる沈殿又は熱変性による沈殿と続けて行なう遠心分離、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー及びアフィニティクロマトグラフィー、等電点電気泳動、ゲル電気泳動、及びこれらや他の技術の組み合わせが含まれる。当該技術には一般に知られている様に、多様な精製工程を行なう順序を変えられること、又は若干の工程を省け、なお実質的に精製されたポリペプチド、蛋白質又はペプチドの適当な調製方法となるということが信じられている。
【００７５】
治療プロトコル（観察記録）の効力測定のアッセイ
本明細書全体を通して論じたように、IL-17及びIL-17のアゴニスト又はIL-17受容体を含む組成物は、TNF-αが関連する子宮内膜症及び他の不妊が関連する障害を治療するのに有効である。上で論じた様に、当業者には周知の多くのIL-17の製剤がある。この様な製剤はすべて試験して、例えば、TNF-α誘発の細胞接着などの細胞接着を抑制する治療効果を生じるこれらの作用剤の効力を測定できる。この様な細胞接着のいかなる抑制も、その作用剤が子宮内膜症の治療に有効であるという有用な指標である。この様な測定は、子宮内膜症のin vitroモデル及び/又はin vivoモデルを用いて可能であろう。
【００７６】
A.     子宮内膜症のin vitro アッセイ
細胞培養の中の子宮内膜細胞は、これらの細胞の接着に及ぼす多様な組成物の影響を測定するのに使用できる。子宮内膜細胞は、当業者に周知の技術を用いて動物から単離された初代細胞で良い。例えば、子宮内膜の生検からの細胞を取り、初代細胞培養として確定できる、又は培養中で長期にわたり成長させて細胞系を生じさせることができる。この様な動物細胞培養を確定し維持する技術は当業者には周知である（例えば、R. Ian Freshney/Culture of Animal Cells: A manual of Basic Technique, 4th Edition, Publ. Wilely & Sons, 1998を参照されたい）。初代細胞は、ヒト、霊長動物、ウシ、ヒツジ、ブタなどを含む任意の哺乳動物由来でよい。
【００７７】
ウシ、ブタ、マウス、ラットなどの様な試験動物からの子宮内膜組織から初代細胞培養を得るためには、生殖機能を除き、層流フードの下で無菌の鋏を使って子宮内膜を曝す。ピンセットを使って、子宮内膜を持上げ、鋏で切除し、下にある子宮筋層から除く。採集の際、子宮内膜のストリップを適切な緩衝溶液を含む100 mmペトリ皿に入れる。小刀とピンセットを使い、子宮内膜を約2ないし3 mm3の移植片に切断する。移植片を古い培地を吸出し、新鮮な培地を加え、穏やかに回転させて移植片を洗滌する。この工程は、調整された培地の処理と分析を干渉するかも知れない血清蛋白質で培地を汚染することを低下させる。血清蛋白質の汚染を最大に低下するために、培地を新鮮な培地で置き換える前に、移植片を培地中で2時間培養する。必要な量の培地を清浄なペトリ皿に加え、細胞を37℃でロッキングプラットフォーム上で50:45:5 N2:O2:CO2（v/v/v）の雰囲気中37℃ で培養することにより初代培養を調製する。この雰囲気ガスは、特注するか、又は等体積の100% N2と90:10 O2:CO2との混合物を混合することにより調製する。
【００７８】
他の実施態様において、子宮内膜細胞系を使用して細胞培養を行なうことができる（ set up ）できる。再び、この様な細胞系の源は、任意の哺乳動物源で良い。ある典型的な実施態様においては、細胞系はウシの子宮内膜（BEND）細胞系である。確立されたBEND細胞は、当業者には周知である（例えば、Johnson et al., Endocrine 10:243 (1999); Perry et al., Mol. Endocrinol. 13: 1197 (1999); Austin et al., Endocrinology 140: 542 (1999)を参照されたい）。多様な子宮内膜細胞系は、American Type Culture Collection (Bethesda, MD)などの銀行（depositories）から商業的に入手可能である。この様な細胞系には、例えば、ATCC細胞系、CRL-1622（ヒト子宮内膜細胞）、ATCC細胞系CRL-1671（ヒト子宮内膜細胞）、ATCC細胞系CRL-2398（ウシ子宮内膜細胞）、ATCC細胞系CRL-2674（ミンク子宮内膜細胞）、ATCC細胞系CRL-2675（ミンク子宮内膜細胞）が含まれる。これらの細胞系の各々には培養におけるこれらの細胞系を培養するための典型的なプロトコルが付けられる。
【００７９】
ある実施態様において、ここで提供される実施例において、BEND ATCC細胞系CRL-2398を用いる。細胞は解凍され、例えば、ATCCからの細胞系を供えたプロトコルを使って、培養を確立する。細胞は、例えば、2 x 105細胞/mlの適切な密度の成長培地に懸濁させる。約20,000細胞を96 ウェル培養プレートの各ウェルに入れ、24時間成長させる。24時間の培養期間後、細胞は培養プレート上で単層として成長している。培養培地は、血清が0.1% BSA及び試験蛋白質及び/又はTNF-αと置換された培地に変えられ、3日間培養される。これらの細胞に、アリコート（例えば、0.04% (v/v) フィブロネクチンが塗布された蛍光ビーズを含む50 μlの培地）が添加される。例えば、60分の培養時間の後、培地が吸出され、プレートの総蛍光が測定される。この操作法は、緩衝溶液のみ、TNF-αのみ、又はBEND細胞に結合したTNF-α誘発されたフィブロネクチンが塗布されたビーズの抑制剤としての活性についての試験がなされた一つ又は二つ以上の試験化合物とTNF-αの組み合わせで培養された細胞について行なわれる。TNF-αの存在下でなされた結合、及びTNF-αの不存在下でなされた結合を比較することにより、TNF-αで誘起された結合の量が明らかになる。その値とTNF-α及び試験抑制化合物の両方の存在下で誘起された結合とを比較して、結合の抑制剤として作用する化合物を同定する。この様にして、IL-17がこの様な抑制化合物であることが決定された。
【００８０】
上記の議論は、フィブロネクチンが塗布されたビーズのBEND細胞への結合を述べているが、任意のフィブロネクチンが塗布された固体支持体への結合が使用できることを理解すべきである。同様にして、固体支持体には、子宮内膜細胞又は中皮細胞の細胞接着に絡んでいるフィブロネクチン以外の分子を塗布できる。
【００８１】
B.     子宮内膜症のin vivoアッセイ
上記in vitroアッセイの代わり及び/又はこれに加えて、寛解、子宮内膜症細胞増殖巣の大きさ又は数の減少に影響し、又は子宮内膜症の症状を軽減するために投与されるIL-17関連の組成物の効果を子宮内膜症の確立された実験モデルで試験できる。この様なモデルは、当業者には周知である（例えば、U.S. Patent No. 6,663,865; Jones, Acta Endocrinol. (Copenh.) 114, 379-382, 1987; Dudley et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 167, 1774-1780, 1992; Sharpe et al., Prog. Clin. Biol. Res. 323, 449-58, 1990を参照されたい）。このモデルでは、ラット、例えば、雌のSprague-Dawleyラット（250-275 g）は次の様にして実験的な子宮内膜症にする。ラットに麻酔をかけ、子宮内膜組織の自己由来のフラグメント（1 cm長さ）を右子宮角から切除し、37℃のPBSに置く。縦の切り込みにより、子宮の部分を開き、5 x 5 mmのセクションを、非吸収性絹の縫合糸を使って四隅で子宮筋層を除去せずに腹壁内面に移植する。
【００８２】
子宮内膜症を起して数週間後（例えば、3週間）、異所性子宮内膜組織の寸法と活性を評価するために腹壁切除術（予備処理腹壁切除術）により動物を検査する。ノギスを使って、表面積（長さx幅）を測定し記録する。移植片が活性のある動物を治療の効力測定用の動物モデルとして選ぶ。典型的には、治療プロトコル開始前の腹壁切除術後、回復期間が始まる。上記の操作法は、ラットモデルについて概略を述べたが、この操作法は容易に他の動物に適合させることができる。
【００８３】
試験治療プロトコルにおいて、生理食塩水のみを受ける対照群を用いてよい。別の群は、子宮内膜症を軽減する効果が試験されている治療作用剤を受ける。好ましい実施態様においては、作用剤はIL-17、IL-17のアゴニスト又はIL-17の内因性生成を刺激する作用剤である。治療プロトコルは、投与経路及び作用薬が送達される部位又は標的に依存して、一日当り10 ng/kgないし100 mg/kg哺乳動物体重又はそれを以上の当量（equivalent）、好ましくは約1 μg/kg/日ないし10 mg/kg/日 の等量を使用できる。指示された犠牲時間（sacrifice times）で、動物は麻酔をかけられ、腹部大動脈から血液試料が採取され、子宮内膜症を示す循環因子の存在を測定する（例えば、抗子宮内膜自己抗体の存在、子宮内膜組織と関連するホルモンその他の存在）。一方、卵巣、子宮仙骨靭帯、骨盤の腹膜（pelvic peritoneum）、直腸膣中隔、子宮頸部、膣、ファロピウス管、大腸、膀胱、胸膜、リンパ節及び膵臓からの組織生検は、子宮内膜症様の細胞増殖巣の存在について調べられる。ここに述べる任意の組成物の投与の結果としての任意のこれらの部位におけるこれらの細胞増殖の大きさと数の減少は、この様な組成物が治療的に有用であることを示す。かくして、この様なモデルを使用すると、当業者はIL-17及び関連した組成物の子宮内膜症関連の不妊症の治療への使用を評価できる。
【００８４】
C.     他の機能のアッセイ
上記子宮内膜症関連のアッセイに加えて、当業者は多くの評価の何れかを用いて、所定のIL-17がIL-17様の活性を有するかどうかを測定することを望むことができる。IL-17はサイトカインで、サイトカイン活性をモニターするアッセイは当業者には周知である。特に、IL-17が炎症性サイトカインであることが以前に記載されている。したがって、IL-17のこの様な炎症性効果をモニターする任意のアッセイが使用できる。この様なアッセイは、例えば、Fossiez et al., Int. Rev. Immunol., 16: 541-551 1998; U.S. Patent No. 6,569,645; Javanoic et al., J. Immunol 160: 3513-3521, 1998に記載されている。顆粒球形成を引起す能力は、IL-17について特徴的である。この様な活性は、Fossiez et al., J. Exp. Med. 183: 2593-2603, 1996に記載されているアッセイを用いて測定できる。
【００８５】
幾つかの例において、皮膚血管透過性アッセイを使用して、IL-17ポリペプチド又はその変異体が動物の注射部位で免疫応答を刺激して単核細胞、好酸球及びPMN浸潤を引起すことにより炎症を引起すことができるか否かを評価するのに用いられる。この様なアッセイにおいては、動物は、ケタミン（75-80 mg/kg）及び5 mg/kgキシラジンを筋肉内に（IM）麻酔にかけ、試験ポリペプチドの試料又は調整培地試験試料を注射部位当り100 μl試験動物の背中に皮内注射する。多重、例えば動物当り10-30、注射部位を使用できる。1 mlのエバンスブルー染料（緩衝生理食塩水中1%）を心臓内注射する。注射部位におけるきず（blemishes）を、注射後1時間、6時間及び24時間に測定する（mm径）。動物は、注射後6時間で犠牲にする。各皮膚注射部位は生検され、パラフォルムアルデヒド中で固定される。次いで皮膚は、組織病理学的な評価に供える。各部位は、皮膚中への炎症細胞浸潤について評価される。目視できる炎症性細胞炎症の有る部位は、陽性（positive）と評点される。炎症性細胞は、好中球性、好酸球性、単球又はリンパ球細胞である。
【００８６】
IL-17受容体はまた当業者には周知であり、ここに各々参考文献として入れるU.S. Patent No. 6,096,305, 6919104; US. Patent No. 6,100,235; U.S. Patent No. 6,072,033及びU.S. Patent No. 5,869,286は、IL-17受容体を発現する細胞を作成する方法を教示する。細胞の表面上に発現されている受容体をコードする発現コンストラクトを有する細胞、例えば、哺乳動物細胞、にトランスフェクトする方法は、当該技術では周知である（例えば、U.S. Patent No. 5,053,337; U.S. Patent No. 5,155,218; U.S. Patent No. 5,360,735; U.S. Patent No. 5,472,866; U.S. Patent No. 5,476,782; U.S. Patent No. 5,516,653; U.S. Patent No. 5,545,549; U.S. Patent No.5,556,753; U.S. Patent No. 5,595,880; U.S. Patent No. 5,602,024; U.S. Patent No. 5,639, 652; U.S. Patent No. 5,652,113; U.S. Patent No. 5,661,024; U.S. Patent No. 5,766,879; U.S. Patent No. 5,786,155; 及びU.S. Patent No. 5,786,157を参照されたい、これらの開示はここにそのまま本出願に参考文献として入れる）。IL-17受容体含有細胞、例えば、この様なトランスフェクションにより産生した細胞、は容易に任意のIL-17誘導体又は変異体を試験するのに使用でき、誘導体又は変異体がIL-17受容体結合活性を有し及び／又は受容体のアゴニストとして機能するかどうかを決定する。この様な決定は、当該技術では常套的であり、例えば、U.S. Patent Nos. 5,053,337; 5,155,218; 5,360,735; 5,472,866; 5,476,782; 5,516,653; 5,545,549; 5,556,753; 5,595,880; 5,602,024; 5,639,652; 5,652,113; 5,661,024; 5,766,879; 5,786,155;及び5,786,157を参照されたい（これらの各々はそのまま本出願に参考文献として入れる）。
【００８７】
“アゴニスト”なる語を使用して、IL-17由来の蛋白質、ペプチド又は対象発明の任意のIL-17受容体の活性を増加させるIL-17由来の蛋白質化合物擬態ペプチドを示す。好ましくは、この様な作用剤はまた、子宮内膜細胞のTNF-α由来の結合による子宮内膜症カルス/細胞増殖巣を形成するのを抑制するのに役立つ。
【００８８】
典型的には、受容体結合活性は、受容体-リガンド結合許容される条件下において、トランスフェクトされ、そして受容体を発現する細胞又は膜調製物を調製すること、又は試験されるIL-17由来の蛋白質と共に、当該受容体を発現することが知られている細胞から、細胞又は膜調製物を獲得することにより測定される。
【００８９】
患者の選択とモニタリング
治療の実施態様において、治療の介入を必要とする患者を確定し、また投与されている治療計画の効力の予後の指標を提供するのが望ましい。本発明の治療を受ける患者は、TNF-α誘発の細胞接着により起された不妊症関連の障害の徴候を明示している任意の患者である。代表的には、この様な患者は、年齢が20ないし50歳の女性の患者で、子宮内膜症の一つ又は二つ以上の症状を明示する。例えば、この症状を持つ最も普通の女性は、過剰で重い又は長引く月経の出血及び痛みの期間を経験する（月経困難症）。月経困難症の苦痛には、腰痛、下痢、めまい、頭痛及び悪心が含まれる。また、子宮筋肉の広範な関り合いは筋肉の正常な収縮性を妨げ、過剰な出血に至ることがある。多くの場合、月経が非常に陰鬱である。出血の量と痙攣の量は通常子宮内膜組織の子宮壁への関り合いの程度と浸透の深さと関連する。痛みと出血は、最初の疾患の程度と適用する治療の効力の試験において、臨床医によりモニターできる特徴である。
【００９０】
子宮腺筋腫症又は“子宮の内膜症”は、子宮内膜症の通常の形態であり、ここで子宮内膜細胞は子宮の後壁（後ろの側）で子宮筋肉（子宮筋層）内に深く浸透している。これは拡張し、拡張した硬い子宮という結果に至る。疾患は、十分に明白な境界で局所化されているか、又は限界又は境界無しで広がることがある。局所化された疾患であれば、この疾患は子宮腺筋腫と呼ばれる。これらの子宮腺筋腫は子宮筋肉の異なったレベルに位置することがあり、子宮腔に浸透し、粘膜下腫瘍となることがある。
【００９１】
子宮内膜症の検出は、骨盤検査で可能であり、子宮腺筋腫症の場合は、検査で非常に硬く触手で痛い拡張した子宮が明らかになることがある。又は、拡張法及び焼灼法では、子宮内膜組織を明らかにし、繊維腫様の塊又はポリープの存在についてこの組織を組織学的に評価する。子宮内膜症が分離性塊として存在する場合は、核磁気共鳴画像法（MRI）及び膣超音波技術もまた使われる。当業者は、典型的には、検査すべき部位の腹腔鏡下検査を使い、子宮内膜症を診断し、針を子宮内膜細胞カルスの部位に挿入し、病理学的試験用の組織試料を取出すことにより長針生検を行なう（Wolf and Singh Obstet Gynecol Surv., 44: 89-956, 8 1989）。
【００９２】
子宮内膜症は、繊維症、固体塊、嚢子、液体浸出及び炎症反応を生じる。すべてのこれらの特性は、モニターしている何れの器官（例えば、子宮、卵巣、内臓、肺、腎臓など）の超音波画像も歪ませる。この様な測定は、一つ又は二つ以上の次の特徴を明らかにする。子宮及び卵巣を囲むより多くの間期（インターフェーズ）、子宮及び卵巣の周囲のより高いエコー源性、強エコー源性組織により囲まれた低コントラスト、散乱性低エコー領域、子宮位置異常（後屈、後傾、後退、横変位（単独又は組み合わせ））、子宮筋層（子宮腺筋腫層）内の小さな低レベルエコー領域、低エコー又は混合パターンの嚢子、ポリ嚢子性又は小嚢子性卵巣、固定された子宮及び卵巣（経膣超音波法）、盲腸異常浸出、卵巣拡大、低エコー卵巣及び骨盤血管密集。したがって、一つ又は二つ以上のこれらのパラメータをアッセイするために超音波検査を行なうことができ、患者が子宮内膜症を有するかどうかを決定し、行なわれている治療の治療効力の経過を提供する。
【００９３】
コンピューター断層撮影（CT）走査を使い、特に病巣が小さい場合に子宮内膜症を診断して来た（Grassi et al., J Comput Tomogr., 9: 157-159, 1985）。子宮内膜症の他の症状と徴候及び子宮内膜症を決定する方法は、当業者には周知である。例えば、Brosens, Am. J. Obstet. Gynecol. 176: 263-7, 1997; Chatterjee et al., Obstet Gyencol., 56: 81-84, 1980; Ural and Badway, Hospital Physician, 33: 47-48, 1987を参照されたい。U.S. Patent No. 6,645,725は、治療計画のための患者を認定するのに有用な子宮内膜症を検出する免疫アッセイに基づく方法を記載する。なお、Mid-South Fertility Institute (Knoxville, TN)は、子宮内膜抗原に対する自己抗体の存在について患者の血液を試験するのに使う市販の抗子宮内膜抗体（AEA）を提供する。これらの抗体の存在は子宮内膜症が存在するという指標であり、他方その不存在は子宮内膜症が存在しないことを示す。
【００９４】
女性の生殖障害の治療のための大抵の患者の選択と同様に、患者は治療前と治療中に骨盤の解剖学の評価を含む完全な女性生殖系の検査及び内分泌学の評価を受ける。ガンの塊の存在は除去し、また患者は妊娠していないことを確実にすべきである。
【００９５】
なお、本治療法が排卵の増加に至ることを意図している。妊娠以外の排卵の臨床上の表れは、プロゲステロン生成の直接測定又は間接測定により得られる。この様な徴候には、基礎体温の上昇、血清プロゲステロンの増加、体温のシフトに続く月経が含まれる。プロゲステロン生成の上記指標と一緒に、卵巣の超音波可視化を行い排卵が起きたかどうかを決定するのを助けることができる。この様なモノグラフ的モニタリングには、盲腸における体液の評価、卵巣の徴候及び崩壊した卵胞の存在が含まれる。
【００９６】
なお、本治療法が着床の頻度と効率が増加する結果となることを意図している。ここに示される様に、IL-17はまた子宮内膜間質細胞の脱落膜化を増加させるのに使われ、子宮内膜が胚の着床を受入れるようにする。脱落膜化は、子宮内膜間質繊維芽細胞の脱落膜細胞への形質転換を伴う。これが、妊娠後の霊長動物に起る主な変化である。このプロセスで、子宮内膜間質細胞は、妊娠の確定にしたがって脱落膜細胞へ特殊化する。脱落膜細胞は、着床に重要な役割を演じ、胚に栄養の支持を提供する。脱落膜化細胞はまた、トロホブラスト侵入を抑制し、母性の免疫拒絶から胚を守る因子を生じさせると信じられている。霊長動物における脱落膜化のプロセスの際に、繊維芽細胞様間質細胞は多角細胞へ形態学的に変化し、特定の脱落膜蛋白質を発現し始める。平滑筋アクチン発現及びインスリン様成長因子結合蛋白質-1（IGFBP-1）の誘起によりこれは明示される。脱落膜化間質繊維芽細胞におけるIGFBP-1遺伝子発現は、ホルモン及びcAMPの両方の存在を必要とする。この誘起は、in vivo及びin vitro平滑筋アクチン発現の随伴する減少と関連する。増大する脱落膜化における他の変化には、例えば、増大するIL-1β発現、活性COX-2発現（これはまたEP2及びEP4受容体の活性化により細胞内cAMP を増加できるPGE-2を増加し得る）が含まれる。これらの変化の何れも、増大する脱落膜化の標識として、容易にモニターできる。増加するスーパーオキシドディスムターゼ発現もまた増加する脱落膜化の標識である。プロラクチン生成もまた、増加する脱落膜化と共に見られる。脱落膜化の別の特徴は、間質繊維芽細胞は非妊娠前駆体と比較して拡大されているということである。脱落膜化は、遺伝子発現レベルをモニターする十分に確立されたプロセスと方法であり、脱落膜化と関連する他の形態学的な変化は当業者には周知である（例えば、Daly et al., Am J. Obstet. Gynecol., 145: 672-678, 1983; Sugino et al., Mo. Human Reprod. 6(2): 178-184, 2000; Zoumakis et al., Mol. Human Reprod., 6(4): 344-351, 2000を参照されたい）。この様な方法には、例えば、サイトケラチンの免疫蛍光測定、化学発光を使用したプロラクチンの存在の測定、放射性免疫アッセイを使用したPGE2 存在の測定、標準ELISA技術（例えば、Zoumakis et al., Mol. Human Reprod. 6(4): 344-351, 2000を参照されたい）を使用したインターロイキン及びケモカイン（例えば、IL-6, IL-8, IL-11, GM-CSF）の存在の測定が含まれる。
【００９７】
TNF-α誘発の子宮内膜細胞の結合に影響するさらなる作用剤を確定する方法
本発明はまた、IL-17のアゴニストとして、間質細胞の特徴を有する構造へのTNF-α誘発の子宮内膜細胞の結合を抑制する様に作用するさらなる作用剤を確定することを意図している。ここに示す様に、IL-17はこの作用を抑制する。これを行なうために、本発明者らはBEND細胞を用いて評価法を確立して、TNF-αのみ又はTNF-αとIL-17の組み合わせの存在下及び不存在下でフィブロネクチンを塗布されたビーズのBEND細胞への結合を測定した。TNF-αはビーズのBEND細胞への結合を増加させた。これは、子宮内膜症に悩む患者の腹水が高レベルのこれ及び他のマクロファージ分泌産物を含むということを示したin vivo観察と相互に関連する（Fiers, FEBS Lett. 285, 199-212, 1991: Hornung et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 82, 1621-1628, 1997; Harada et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 176, 593-597, 1997; Arici et al., Mol. Hum. Reprod. 2, 40-45, 1996; Arici, et al., Fertil. Steril. 67, 1065-1072, 1997）。本発明は、IL-17が子宮内膜細胞の細胞接着の性質に及ぼすTNF-αの影響を抑制し、したがってIL-17を子宮内膜症を治療する治療作用剤として使えるという驚くべき発見を示す。この発見をさらに利用して、IL-17のこの効果を増大させ、高め、又は刺激するさらなる作用剤を確定することができる。このセクションでは、この様な化合物を確定するためのスクリーニングアッセイについて述べる。本発明のスクリーニングアッセイにおいては、候補物質は最初に基本的な生化学活性、例えば、IL-17受容体へのin vitro結合、又はIL-17などのこの結合性質の強化、についてふるいわけされる。この作用剤は次いで、ここに述べるBEND子宮内膜症アッセイにおいて、TNF-α誘発のBEND細胞の固体支持体への結合を抑制する効果について解析され、次いで、作用剤は、細胞レベル、組織レベル又は全動物レベルでの観察により、子宮内膜症の症状を減らすか軽減する能力について試験される。この意味で、子宮内膜症の動物モデルは周知であり、本明細書の他の箇所で論じた。
【００９８】
本発明は、子宮内膜組織中のTNF-α活性に及ぼすIL-17の抑制効果を増大させる作用剤をスクリーニングする方法を提供する。この様なスクリーニング技術が、子宮内膜細胞の細胞接着性質を抑制するか弱めかくして子宮内膜症の治療に有用な化合物の確定に有用と判明することを意図している。さらに、この様な化合物は、動物の生殖域及び他の域での子宮内膜の細胞増殖巣（foci）の程度を除くか減らすので、この様な化合物は不妊症の治療に対するプロトコルに有用である。これらの実施態様において、本発明は、TNF-α誘発の子宮内膜細胞の固体支持体への結合に及ぼすIL-17の影響を調節する候補物質の能力を測定する方法に関し、一般に次の工程
i）    TNF-αの存在下に培養中の子宮内膜細胞と固体支持体との結合性を測定すること、
ii）   TNF-α及びIL-17の存在下に培養中の子宮内膜細胞と固体支持体との結合性を測定すること、及び
iii）  工程（i）における結合と工程（ii）における結合を比較すること、を含む。
この最初のアッセイは、IL-17のTNF-α誘発の子宮内膜細胞結合に及ぼす抑制効果を明らかにする。IL-17の候補モジュレーターの存在下又は不在下で工程（iii）を行なうと、この抑制をさらに増大させる作用剤を確定する。過剰のIL-17でTNF-α誘発の子宮内膜細胞結合をさらに抑制する作用剤は、ここに記載されている様な、in vivoモデルで試験できる候補治療作用剤として有用な作用剤である。
【００９９】
候補物質を上記アッセイでIL-17の効果を調節できると確定するために、添加候補物質の不在下で結合を測定又は決定する。次いで、候補物質をそのセル又は平行アッセイに添加し、候補物質の存在下で応答を測定する。IL-17と共に行なうアッセイと比較して、子宮内膜細胞結合をさらに抑制する候補物質もまた有効である。本発明のin vivoスクリーニングアッセイにおいて、化合物がモデル動物にある期間にわたり多様な用量で投与され、子宮内膜症と関連する徴候及び症状の軽減をモニターする。一つ又は二つ以上のこれらの徴候又は症状の改善は、その候補物質がIL-17活性の有効なアゴニストであることを示す。
【０１００】
本明細書に使われている“候補物質”なる語は、IL-17のアゴニストとして潜在的に作用できる分子を指す。ある観点において、候補物質は、蛋白質又はそのフラグメント、小さな分子刺激剤又は核酸分子でさえある。他に、有効な薬理学的化合物は、IL-17の他の周知のアゴニストと構造的に関連する化合物であるか、又はTNF-αのアンタゴニストでさえある化合物である。U.S. Patent No. 6,663,865はこの後者の点で特に関心が持たれ、この特許はここにおける多様な組み合わせ治療に有効であり得るTNFの多様なアンタゴニストを教示する。合理的な薬物設計には、IL-17の周知のモジュレーター、その受容体などとの比較だけでなく、標的分子の構造と関連する予測が含まれる。
【０１０１】
他方、多様な市販源から、有効な化合物の同定を“総当り攻撃する”試みの中で、有効な薬物についての基本規準を満たすと信じられる小分子のライブラリーを簡単に獲得できる。組み合わせ的に生じたライブラリー（例えば、ペプチドライブラリー）を含むこの様なライブラリーのスクリーニングは、多数の関連した（及び関連しない）化合物を活性についてスクリーニングする急速で効率的な方法である。組み合わせ的な方法はまた、これらをして活性があるが他には望ましくない化合物から作られた第二、第三及び第四世代化合物の創造による潜在的な薬物へ急速な進化をさせる。ここで提供されるBENDアッセイの確定がなされると、当業者は、この様なライブラリーの大量のスクリーニングを直ちに行なうことができる。
【０１０２】
候補化合物には天然に発生する化合物のフラグメント又は部分が含まれてよく、又は候補化合物は他には不活性な周知の化合物の活性の有る組み合わせとして発見される。動物、細菌、真菌、葉及び幹を含む植物源及び海の試料などの天然の源から単離された化合物は潜在的に有効な薬剤が存在する候補としてアッセイされることを提案する。スクリーニングされた薬剤はまた、化学組成物又は人工化合物から得られるか合成される可能性があることが理解されるであろう。かくして、本発明により同定される候補物質は、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、小分子抑制剤又はIL-17活性の周知の活性化物質から出発した合理的な薬物設計により設計される任意の他の化合物であってよい。
【０１０３】
ある状況下での“有効な量”は、IL-17の効果を再現性良く増加させるのに効果的な、これらの量である。候補作用剤は、子宮内膜又は他の生殖の組織中でIL-17の発現を増加させる（この様な化合物の不在下でこの発現のレベルと比較して）ものであってよい。IL-17の活性及び/又は発現の著しい適切な変化を達成する化合物を使用する。
【０１０４】
活性及び/又は発現の著しい変化は、約30ないし40%以上の活性の変化、ある観点においては約50%以上の変化で表される変化であり、勿論より大きな値も可能である。
【０１０５】
さらなるアッセイにおいて、候補物質は、IL-17の変異体又は誘導体であり、野生型のIL-17よりもより大きな抑制効果を有する。
【０１０６】
医薬組成物
本発明による投与用の医薬組成物は、一つ以上のIL-17由来の蛋白質（例えば、SEQ ID NO: 2, 3, 4又は5のペプチド、その変異体又は類似体、又は子宮内膜細胞に及ぼすTNF-αの作用を抑制する及び/又は子宮内膜カルス塊形成を減らす任意の他のIL-17由来の蛋白質）を含むことができる。
【０１０７】
この医薬組成物はまた、他の治療作用剤を含んでよい。例えば、本発明は、不妊症治療におけるIL-17 組成物の治療効力の独自の発見に由来するが、IL-17は単独で投与できるだけでなく、不妊症一般の治療に設計された治療処方との組み合わせならびに特に子宮内膜症治療に設計された治療との組み合わせで投与できることが意図されている。上で論じた様に、子宮内膜症は一般にGnRH アゴニスト（例えば、酢酸ナファレリン、酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン及び酢酸ブセレリン）で治療され、ホルモン療法には、偽妊娠をまねる高用量の経口避妊薬ピル（高用量のエストロゲン及びプロゲステロンを用いる）、及びダナゾールが含まれる。なお、U.S. Patent No. 6,663,865は、子宮内膜症治療に抗TNF抗体及びアンタイド（antide）の使用を記載する。任意のこの様な組成物は、IL-17と組み合わせて使用でき、子宮内膜症及び関連の不妊障害の治療の併用療法をもたらす。なお、IL-17に基づいた治療と組み合わせた一つ又は二つ以上のこれらの治療、又はIL-17に基づいた治療のみを外科的介入と組み合わせることができる。なお、本発明のIL-17に基づく療法は、排卵誘発に用いられる任意の作用剤又はART（ゴナドトロピン放出の刺激（例えば、クロミフェン及びレトロゾールならびに多様なゴナドトロピン類による））に用いられる他の療法介入と組み合わせることができ、排卵誘発及び/又は卵胞成熟を増加させる。この様なゴナドトロピン類には、例えば、FSH及び/又はLHが含まれる。
【０１０８】
治療製剤の各々は、好ましくは、医薬的に許容される形態で提供され、必要ならば医薬的に許容される担体と組み合わせた形である。これらの組成物は、その意図された目的を達成する任意の手段で投与される。本発明の方法を使って不妊症の治療用の組成物の投与のための個別化された量と用法は、本明細書に提供されるガイダンスを使って当業者により容易に決定でき、動物モデルにおける用量の効力を測定し、次いで高等な哺乳動物に対し容量を増加する。ダナゾール、避妊ホルモン、GnRHアゴニスト及びセロフェン（商品名）、クロミド（商品名）、フェルチネックス（商品名）、ゴナルF （商品名）、ブラベル（商品名）などの他の妊症関連の作用剤は当業者には周知であり、容易に医師用卓上参考書中で見付けることができる。この資料は、FSHの投与に使用できる処方のタイプ、投与のルート及び治療用法についての例示的な案内を提供する。ここに記載されるプロトコル、処方、投与のルートなどは、本発明における使用のために容易に修正できる。
【０１０９】
本発明の範囲内にある組成物には、TNF-α誘発の子宮内膜細胞の結合の作用を抑制するその意図された目的を達成するのに有効な量に処方され、本質的にはTNF-αアンタゴニストとして作用する少なくとも一つのIL-17を含むすべての組成物が含まれる。本発明の方法に用いられる活性作用剤は、通常この様な投与に用いられる任意の手段で投与できる。最も好ましくは、本発明に用いられるIL-17由来の蛋白質組成物は、注射により、ローション、ゲル又は軟膏として、又は経口的に投与される。
【０１１０】
本発明の組成物の適当な用量は、レシピエントの年齢、健康及び体重、もし有れば同時に行なう治療、治療の頻度及び望まれる効果の性質に依存することが理解される。しかしながら、最も好ましい用量は、不適当な実験なしに当業者に理解され、決定される様に、個々の被験者に適合する様に変えることができる。これは典型的には、標準用量の調整、例えば、患者が低体重ならば用量の減少、を伴う。
【０１１１】
各治療に要求される全用量は、多重用量又は単一用量で投与される。組成物は単独で投与できるか、又はその疾患に向けられるか又はその疾患の他の症状に向けられる他の治療法と一緒に投与できる。
【０１１２】
本発明の組成物は、適当な医薬組成物に、すなわち、不妊障害の治療の介入におけるin vivo適用に適切な形態で処方されるべきである。一般に、これは、本質的に発熱物質ならびに人間又は動物に有害であり得る他の不純物のない、好ましくは経口投与用の組成物の調製を伴う。ホルモン製剤は、現在入手できるホルモン製剤と同質に処方される。ペプチド/蛋白質製剤は、他の小蛋白質組成物と同様に処方される。好ましくは、これらの製剤は、経口投与である。しかしながら、他の投与のルートが意図されている（例えば、注射、脊髄内の投与など）。生殖器官が子宮内膜症と関係のある部位なので、生殖器官への送達用の軟膏又はローションは有効であると意図されている。経皮パッチもまた使用できる。
【０１１３】
適切な塩及び緩衝液を用いて組成物を安定にし、標的部位で組成物の取込みを可能にすることが一般に望まれる。一般に本発明の蛋白質組成物は、投与前に、戻されるべき脂質化された形態で提供される。組成物の戻し用の緩衝液と溶液は、薬剤処方と一緒に提供され、投与用の本発明の水性組成物を作る。この様な水性組成物は、医薬的に許容される担体又は水性媒体中に溶解又は分散された使用される各治療作用剤の有効な量を含む。この様な組成物はまた、接種材料と呼ばれる。“薬剤的に又は薬理学的に受入れられる”なる句は、動物又は人に投与された時に、逆の、アレルギー性の反応又は他の不適当な反応を生じない分子的存在物及び組成物を指す。ここに使われている様に、“医薬的に許容される担体”には、任意のそしてすべての溶媒、分散系媒体、被覆物、抗細菌性及び抗真菌性作用剤、等電点作用剤及び吸収遅延作用剤などが含まれる。薬剤的に活性な物質用のこの様な媒体及び作用剤の使用は、当該技術では周知である。通常の媒体又は作用剤は、治療組成物と配合禁忌なものを除いて、治療組成物中に使用することを意図している。補足的な活性成分もまた組成物に組入れられる。
【０１１４】
治療投与用の蛋白質及びペプチドを処方する方法もまた、当業者には周知である。本発明のこれらの組成物の投与は、任意の通常のルートによる（そのルートで標的の組織が得られる限り）。最も普通には、これらの組成物は、経口投与用に処方される。しかしながら、特に経口投与に問題がある場合には、他の通常の投与のルート、例えば、皮下の、静脈内の、皮内の、筋肉の、乳房内の、腹膜内の、脊髄内の、眼内の、眼球後の、肺内の（例えば、期間放出）、エアロゾルの、舌下の、鼻の、肛門の、膣の又は経皮の送達、又は特定の部位における外科着床による投与をすることができる。治療は、ある期間にわたって、単一用量又は複数の用量からなる。
【０１１５】
活性化合物は投与用に遊離塩基又は薬理学的に受入れられる塩の水溶液（ヒドロキシプロピルセルロースなどの表面活性剤と適当に混合される）として調製できる。分散系もまた、グリセロール中、液体ポリエチレングリコール中及びこれらの混合物中及びオイル中で調製できる。貯蔵と使用の通常の条件下で、これらの製剤は微生物の成長を防ぐ保存料を含む。
【０１１６】
注入可能な使用に適当な薬剤の形態には、無菌の水溶液又は水性分散系、及び無菌の粉末（無菌の注射用溶液又は分散系の必要に応じて調合される製剤用の）が含まれる。すべての場合に、形態は無菌で、容易な注入可能性が存在するという程度に流体でなければならない。形態は、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して守らなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコールなど）、これらの適当な混合物及び植物油、を含む溶媒又は分散系でよい。適正な流動性は、例えば、レシチンの様な被覆膜の使用により、分散系の場合必要な粒子寸法の維持により、及び界面活性剤の使用により、維持できる。微生物の作用の防止は、多様な抗細菌作用剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなど、によりもたらされる。多くの場合、等電点作用剤、例えば、砂糖又は塩化ナトリウムを含めるのが好ましい。注入可能な組成物の長引く吸収は、吸収遅延作用剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチン、を組成物中に使用することによりもたらすことができる。
【０１１７】
滅菌した注射用溶液は、適切な溶媒中の必要な量の活性化合物を上に列挙した多様な他の成分と共に、要求される様に組入れ、次いで濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散系は、多様な滅菌した活性成分を、基本的分散媒体及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌したビヒクル中に入れることにより調製される。滅菌した注射用溶液調製用の滅菌した粉末の場合、調製の好ましい方法は、先の滅菌濾過したこれらの溶液から活性成分プラス任意の付加的な望ましい成分の粉末を生じる真空乾燥及び凍結乾燥の技術である。
【０１１８】
ここに使用されている様に、“医薬的に許容される担体”には、任意のそしてすべての溶媒、分散媒体、被覆膜、抗細菌剤、抗真菌性作用剤、等電点作用剤及び吸収遅延作用剤などが含まれる。薬剤活性物質用のこの様な媒体及び作用剤の使用は、当該技術では周知である。通常の媒体又は作用剤は、活性成分と配合禁忌なものを除いて、治療組成物への使用が意図されている。補足的な活性成分もまた組成物に入れられる。
【０１１９】
本発明の組成物は、中性又は塩の形で処方される。医薬的に許容される塩には、酸付加塩（蛋白質の遊離アミノ基とで形成される）が含まれ、これは、例えば、塩酸又は燐酸などの無機酸、又は酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデリン酸などの有機酸で形成される。遊離カルボキシル基で形成された塩もまた、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム又は水酸化第二鉄などの無機塩、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなどの有機塩から得ることができる。
【０１２０】
処方すると、溶液を用量処方と調和するように、治療上有効な量で投与される。製剤は、注射可能な溶液、薬物放出カプセルなどの様な多様な剤形で容易に投与される。水溶液の非経口投与のためには、例えば、必要ならば、溶液は適当に緩衝液で処理し、液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等脹性にする。これらの特定の水溶液は、静脈投与、筋肉投与、皮下投与及び腹膜投与に特に適している。
【０１２１】
“単位用量”とは、分離した量の適当な担体中に分散された治療組成物と定義される。治療化合物の非経口投与は最初の丸塊とこれに続ける連続注入により行なわれ、薬物製品の治療循環レベルを維持する。当該技術を普通に熟達した者は、良好な医療実施と個々の患者の臨床条件により決定される効果的な用量と投与計画を容易に最適化する。
【０１２２】
投薬の頻度は作用剤の薬物動態パラメータ及び投与のルートに依存する。最適の薬剤処方は、投与のルート及び望ましい用量に依存し、当該技術に精通した者により決定される。この様な処方は、身体の状態、安定性、投与作用剤のin vivo放出速度及びin vivoクリアランス速度に影響し得る。投与のルートに依存して、適当な用量は、体重、体表面積又は器官寸法にしたがって計算できる。適切な治療用量を決定するのに必要な計算のさらなる改善は、不適切な実験無しに当該技術に普通に熟達する者により、ここに開示される用量情報及びアッセイならびに動物又は人の臨床試験で観察される薬剤動態データに照らして常套的になされる。
【０１２３】
適切な投与量は、適切な用量応答データと結び付けた血液レベルを測定する確立されたアッセイの使用により確かめることができる。最終的な投与量処方は、世話をする医師により決定されるが、医師は薬物の作用を修飾する因子、例えば、薬物の具体的な作用、傷害の重大さ及び患者の反応性、患者の年齢、状態、体重、性及び飲食物、感染の重大さ、投与の時刻及び他の臨床因子、を考慮する。調査が進むにつれて、適切な投与量レベル及び具体的な疾患と状態に対する治療期間に関するさらなる情報が現れる。
【０１２４】
本発明の医薬組成物及び治療法は医学及び獣医学の分野で有効であることが理解されるであろう。かくして、治療の対象は、哺乳動物、好ましくは人間及び他の動物である。獣医の目的では、対象には、例えば、牛、羊、豚、馬及び山羊を含む農場の動物、犬及び猫などの愛玩動物、外来及び/又は動物園の動物、マウスやラット、兎、ギニーピッグ及びハムスターを含む実験動物、鶏、七面鳥、アヒル及びガチョウなどの家禽が含まれる。
【０１２５】
本発明はまた、妊症傷害の治療用のキットを意図している。この様なキットには、医薬的に許容される担体中の上に記載されたIL-17に基づく蛋白質/ペプチドを含む第一組成物が少なくとも含まれる。別の成分は、医薬的に許容される担体中のART（例えば、FSH/LHなど）に使われる作用剤である。キットは付加的に第一組成物及び第二組成物の送達を達成するための溶液又は緩衝溶液をさらに含むことができる。キットはさらにダナゾール、OCPsなどの作用剤を含む付加的な組成物を含んで良い。キットはさらに本発明の方法に用いられる一つ又は二つ以上の組成物の送達用のカテーテル、注射器又は他の送達デバイスを含んでいて良い。キットはさらに治療処方用の投与プロトコルを含む説明書を含んでいて良い。
【実施例】
【０１２６】
以下の実施例は本発明の好ましい実施態様を示すために記載する。当業者は、以下の実施例で開示される技術は、本発明者により本発明の実施に良く機能すると発見された技術を代表し、したがって本発明の実施のための好ましい態様を構成すると考慮されるということを理解すべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される具体的な実施態様に多くの修飾を行なうことができ、本発明の精神と範囲から逸脱することなしに同様な又は類似の結果を得られることを理解すべきである。
【０１２７】
実施例１  典型的なBEND アッセイ
次の実施例は、ここに使用される子宮内膜症のBENDアッセイの典型的な説明を提供する。当業者は、このアッセイに使われる培養条件ならびに子宮内膜細胞源は変更でき、なおアッセイの有益な結果を生じさせることを理解するであろう。
【０１２８】
すべての培養プレートとアッセイプレートは、37℃、5% CO2及び95%空気下の加湿チェンバーを有するインキュベーター中に保持された。ウシ子宮内膜細胞（BEND cells ATCC CRL-2398）が、単にこれらが容易に得られる普通の子宮内膜細胞系であるという理由で、本実施例で使用された。BEND細胞培養は、連続的で穏やかな撹拌を伴う37℃の水浴中で急速に解凍された冷凍バイアル（各々は2 x 106細胞/mlを含む）から開始した。各バイアルの内容物を10 mlの補足された-DMEM/F12を含む75 cm2フラスコ（Falcon cat# 353024）に移した。この培地は、10%ウマ血清（HyClone cat# SH30074.03）、10% 認定ウシ胎仔血清（cFBS; Hyclone cat# SH30071.3）及び各25 U/mlのペニシリン及びストレプトマイシン（Gibco BRL cat# 15070063）を含むDMEM/F12培地（Gibco BRL cat# 11320033）からなっていた。
【０１２９】
一晩の培養後、培地を補足されたDMEM/F12と置換し、フラスコをインキュベーターに戻した。トリプシン-ベルセン混合物（Gibco BRL cat# 25300054）を使って、単一層が100%コンフルエントである場合、BEND細胞の培養を1:3又は1:4に分割した。簡単に、単一層を15 mlのPBS（Gibco cat# 14190144）で洗滌し、次いで5 mlのトリプシン-ベルセンを添加した。単一層の細胞が一団に集まり始めた時、フラスコをタップして単層をさらに移し、15 mlの補足されたDMEM/F12を加えた。次いで細胞を有する培地を50 mlの円錐チューブ（Falcon cat# 352074）に移し、細胞を200xgで5分間小球形にした。細胞を再懸濁し、培養維持又は子宮内膜症アッセイのために置いた。
【０１３０】
受領（receipt）の後で20 継代 passages 以内のBEND 細胞を使って、子宮内膜症アッセイを行なった。トリプシン化後、細胞を10 mlの補足されたDMEM/F12中に再懸濁し、15 mlの円錐チューブ（Falcon cat# 352095）に移した。血球計を使って細胞数の測定のために、20 μlの細胞懸濁液を使用した。補足されたDMEM/F12培地で細胞密度を2 x 105細胞/mlに調整後、細胞懸濁液（100 μl, 2000細胞/ウェル）のアリコートを、平底96ウェルブラックプレート（Costar cat# 3603）の各ウェルに加えた。24時間後、培地を吸出し、単一層を0.1% BSA（Sigma Chemical Co., St. Louis MO cat# A2058）で補足された100 μl DMEM/F12で一度洗滌した。
【０１３１】
1 ml（2% v/v溶液）0.5 μ カルボキシル化ポリスチレンビーズ（Molecular Probes cat# F8813）と300 μl H2O 及び200 μl の100 mM MES （2-モルホリノエタンスルホン酸Sigma cat# M3171）pH 6.8 に溶解した3 mgの重合化フィブロネクチン（Sigma cat# F8141）をカプリングさせて、フィブロネクチンを塗布したビーズを20 ml ガラスシンチレーションバイアル（Fisher cat# 03-337-14）を調製した。100 μl の100 mg/ml EDAC（Sigma cat# E7750）でカップリングを開始し、絶えず振蕩させながら、室温で2時間進行させた。ビーズを50 ml円錐チューブに移し、2500xg で15 分間の遠心分離により45 mlのPBS 中で洗滌した。ペレットを5 mlの100 mMグリシン（Sigma cat# G7403）中に再懸濁し、室温で30分間培養した。2500xg で15 分間の遠心分離によりビーズを45 mlのPBS 中で洗滌した。ペレットを5 ml のPBS中に再懸濁させた。
【０１３２】
アッセイのために、100 μlの新鮮なDMEM/F12 + 0.1% BSA（TNF-α 15 ng/ml (R&D Systems cat# 210-TA)のみを含む、又は試験蛋白質の希釈）を各ウェルに加えた。３日間培養後、0.04% (v/v)フィブロネクチンが塗布されたビーズを含む50 μlの培地を各ウェルに加えた。60分間の培養の後、培地を吸出した。次いで各ウェルを100 μlのPBSで３回洗滌した。最終の100 μlのPBSを加え、Analyst HT （LJL Biosystems, Sunnyvale, CA）を使って、総蛍光（490 nm励起/515 nm放射）についてプレートを読んだ。マイクロソフトエクセルソフトウエア及びオリジンソフトウエア（version 7, OriginLab Corporation）を使って、データを解析した。
【０１３３】
試験蛋白質を3レベルの希釈（1:50, 1:500, 1:5000）（各々は二重で）でふるいわけした。ビーズ結合に対するTNF-αの作用を抑制する蛋白質は陽性と考慮し、次のアッセイで確認した。陽性と確認されたものは、四重ウェル（quadruplicate wells）中で、用量応答活性用の試験蛋白質の順次の希釈で試験した。すべての実験は、DMEM/F12 + BSAの陰性対照、15 ng/ml TNF-αの対照及びTNF-α 15 ng/ml + 10 μg/ml TBPの陽性対照と共に行なった。
【０１３４】
実施例２：  IL-17は支持体細胞への子宮内膜細胞のTNF-αで誘起された結合を抑制する
BENDアッセイを使用して、IL-17の子宮内膜細胞に及ぼす影響を測定した。実施例１に記載されたアッセイを使用して、TNF-αがフィブロネクチン塗布ビーズのBEND細胞への結合を用量に依存する様子で増加させることを示した（図１）。TNF-α（15 ng/ml）で処理する際にTBPを添加すると、ビーズのBEND細胞への結合を用量に依存する様子で減少させた（図１）。
【０１３５】
さらなる調査において、インターロイキン(IL)-17 GITIPRNPGC PNSEDKNFPR TVMVNLNIHN RNTNTNPKRS SDYYNRSTSP WNLHRNEDPE RYPSVIWEAK CRHLGCINAD GNVDYHMNSV PIQQEILVLR REPPHCPNSF RLEKILVSVG CTCVTPIVHH VAHHHHHH (SEQ ID NO:3)は、TNF-αで誘起されたフィブロネクチン塗布ビーズのBEND細胞への結合の抑制における陽性の蛋白質として確定された。このアッセイでIL-17が陽性と確認された後で、用量応答効果について試験された。IL-17の次の三つの異なる製剤が試験された。Il-17-6HIS GITIPRNPGC PNSEDKNFPR TVMVNLNIHN RNTNTNPKRS SDYYNRSTSP WNLHRNEDPE RYPSVIWEAK CRHLGCINAD GNVDYHMNSV PIQQEILVLR REPPHCPNSF RLEKILVSVG CTCVTPIVHH VAHHHHHH (SEQ ID NO:3: 図２), Met-IVKA IL-17 MIVKAGITIP RNPGCPNSED KNFPRTVMVN LNIHNRNTNT NPKRSSDYYN RSTSPWNLHR NEDPERYPSV IWEAKCRHLG CINADGNVDY HMNSVPIQQE ILVLRREPPH CPNSFRLEKI LVSVGCTCVT PIVHHVA (SEQ ID NO:4: Peprotecch cat# 200-27 から得た、図３) 及びIl-17 ATT-6HIS GITIPRNPGC PNSEDKNFPR TVMVNLNIHN RNTNTNPKRS SDYYNRSTSP WNLHRNEDPE RYPSVIWEAK CRHLGCINAD GNVDYHMNSV PIQQEILVLR REPPHCPNSF RLEKILVSVG CTCVTPIVHH VANPAFLYKV VDIHHHHHH (SEQ ID NO:5: 図４)
【０１３６】
単一の実験の中で、インターロイキン-17及びMet-IVKA IL-17は、フィブロネクチン塗布ビーズのTNF-α処理BEND細胞への結合を減らすのに類似の効力を有していて（図5）、陽性の対照TBPと比較して結合を抑制するのに四乗倍大きい効力（four-log greater efficacy ）を示した。第三製剤（IL-17 ATT-6HIS）を、未知の濃度の保存溶液の希釈剤として試験した（図４）。IL-17の全製剤は、TNF-αのフィブロネクチン塗布ビーズの結合に及ぼす影響を用量依存の様子で抑制した。下表は、TNF-α誘発のフィブロネクチン-ビーズのBEND細胞への結合を抑制した蛋白質のIC50濃度を提供する。
【表２】
2008501035.tif 000003
【０１３７】
上記データから、IL-17が、TNF-αに誘起されたフィブロネクチンビーズのBEND細胞への結合を抑制するのに効果的であることが示される。これらのデータは、IL-17が子宮内膜症に対して治療効果を有することを示す、なんとなればIL-17が子宮内膜細胞が接着している細胞上に通常見出される作用剤への子宮内膜細胞の結合を減少させることが示されるから。
【０１３８】
実施例３  子宮内膜間質細胞の脱落膜化を増加させるIL-17 の効力
上記実施例は、IL-17が子宮内膜症表現型に対し効果的であることを示す。ここでは、さらに、IL-17を使用して子宮内膜間質細胞の脱落膜化を増加させ、この様な細胞の表現型が胚着床が可能な子宮内膜細胞により同種（akin ）であるようにすることができることが示される。最初の実験の組（set）では、12Z子宮内膜症細胞からのサイトカイン生成に及ぼす効果についてIL-17が評価された。図６に示す結果は、TNF-αの12Z 子宮内膜症上皮細胞の培養への添加は、GM-CSFの生成に最小の影響を有していることを示す。IL-17A-Fイソフォルムの添加もまた、IL-17Aイソフォルムを例外として、GM-CSF生成に最小の影響を有していた。IL-17A及びTNF-αの組み合わせは、GM-CSF生成に相乗的高揚を起した。これらの結果は、IL-17Aの影響は、TNFへの細胞の感度を増大すること、また、12Z細胞からの最大のGM-CSF生成を増加させることの両方であることを示す。
【０１３９】
図７及び８に示す結果は、TNF-αによってIL-6及びIL-8の最大量の生成が達成できることを説明する。図７において、12Z子宮内膜症上皮細胞の細胞培養へのTNF-αの添加は、1 ng/mlを超える濃度でIL-6 の生成を増加させる。図７において、IL-17アイソフォームの影響は、この組合せでの最大量のIL-6生成のさらなる増加なしに、TNF-αに対する上皮細胞の感度を増加させることである。IL-17の増感効果は、IL-17A及びIL-17Fアイソフォームについて観察され、IL-17B-Eアイソフォームについては検出できる影響はなかった。これらの結果は、TNF-αがそれ自身でIL-6 生成を著しく高めることを示し、IL-17の影響は、細胞のTNF-αの影響に対する細胞の感度を増加させることである。
【０１４０】
図８では、TNF-αの12Z子宮内膜症上皮細胞の細胞培養への添加は、1 ng/mlの低い濃度で、IL-8生成の著しい増加を起す。この組合せでは、IL-8生成に及ぼすIL-17の検出できる影響はない。
【０１４１】
子宮内膜症上皮細胞について行なった実験からの結果は、GM-CSF生成におけるTNF-αと相乗するIL-17の明瞭な影響を示す。GM-CSF生成における感度の増加と最大の応答は、IL-6及びIL-8生成の応答と比較してこの応答を区別する。先に、GM-CSFについての役割は、間質細胞のパラ分泌調節に対して確立され、着床期間（window）の際に、脱落膜化のプロセスに影響する。したがって現在のデータは、先ず、IL-17は、子宮内膜症上皮細胞又は腺筋症上皮細胞を正常の子宮内膜細胞（脱落膜化したかも知れなかった）に逆転し（reverse）得るという証拠を提供する。腺筋症の場合、脱落膜化プロセスの刺激は、転換の正常プロセスを容易にできるかも知れず、次いで月経の際のこれらの細胞が除去され得る。子宮内膜症の場合、細胞の類似の逆転（reversion）が起ると考えられるが、腹腔における不適切な位置の故に、GM-CSFにより起される逆転は、免疫認識と病巣に貢献する細胞の除去を容易にし、疾患の深刻さを軽減する。
【０１４２】
間質細胞においては、二つの前炎症サイトカイン、TNF-α及びIL-1β、はサイトカインのような生化学的メデイエーターの生成により、子宮内膜の形態学的脱落膜化を容易にすることが示された。脱落膜化は、IL-6、IL-8、IL-11、プロラクチン及びIGF-BP-1を生じる転換細胞群（ population ）の結果となる。IL-17及びTNF-αならびにIL-1βの影響をHuF6 細胞において調べた。これらの細胞は、脱落膜化及び着床を囲む形態学的及び生化学的メカニズムの調査に有用なモデルであることが前に示されたヒトの子宮内膜間質細胞である（Fazleabas ）。下に呈示する結果は、GM-CSF、IL-6及びIL-8の生成に及ぼすIL-17及びTNF-αの相乗的影響を示す。IL-1β及びIL-17の組み合わせの結果は、IL-1β及びIL-17の間には、GM-CSF、IL-6又はIL-8サイトカインの最大量の生成には相乗効果がないことを示唆する。これらの結果はまた、生体化学的脱落膜化について、TNF-α及びIL-1βの間の明瞭な効力差と最大の応答差を説明するが、これは以前の文献には報告されなかった観察である。実際、もしIL-1βが子宮内膜における脱落膜化の正常なメデイエーターを代表するならば、これは重要な特質で有り得る。TNF-αのみの存在で観察される応答は、脱落膜化と着床を受ける能力においてコンプロマイズされている子宮内膜の応答を表している。ここで図に示される間質細胞及び上皮細胞におけるIL-17の影響は、損なわれている子宮内膜の中央における脱落膜化の正常なプロセスを容易にするメカニズムを表している。
【０１４３】
図９において、GM-CSF生成に及ぼすIL-17及びTNF-α又はIL-1βの組み合わせた影響が示される。この図から、GM-CSF生成が最大の増加をするのに必要なIL-1βの濃度は、TNF-αの濃度よりも著しく低いことが明らかである。なお、IL-1βによって達成されるGM-CSF生成に及ぼす最大の影響は、TNF-αによる最大の応答よりも大きい。矢張りTNF-αを含む培養へのIL-17の添加は、TNF-αに対する細胞の感度を増大させ、TNF-αの存在下で生成したGM-CSFの最大量を増加させた。IL-17及びTNF-αに対するGM-CSF生成の応答の最大レベルは、IL-1β又はIL-1β及びIL-17の組み合わせで得られる最大レベルと類似であった。IL-17 の影響に対する濃度応答曲線は、このセットの準備的結果においては不完全ではあるが、影響は認識できる。IL-1β刺激によるGM-CSF生成に及ぼすIL-17の影響は、TNF-αによるよりも、劇的でない。50 pg/mlのIL-1βの存在下でのIL-17の添加は、GM-CSF生成の20%増加を刺激し、これはこの限られたセットの結果において、IL-1βに対する細胞の感度を減少させる様に思われた。
【０１４４】
図１０には、ＩＬ-6生成に及ぼすIL-17及びTNF-α又はIL-1βの組み合わせの影響が示される。この図から再び、IL-6生成が最大の増加をするのに必要なIL-1βの濃度は、TNF-αの用量よりも著しく低いことが明らかである。なお、IL-6生成に及ぼすIL-1βの最大の効果はTNF-αについての最大の応答より大きい。矢張り IL-17の 10 ng/ml TNF-αの量の培養への添加は、TNF-αに対する細胞の感度を劇的に増大させ、TNF-αの存在下での生成したIL-6の最大量を著しく増加させた。IL-17及びTNF-αに対するIL-6生成応答の最大量のレベルは、IL-1β又はIL-1β及びIL-17の組み合わせについて得られる最大量のレベルと類似であった。IL-1β刺激によるIL-6生成に及ぼすIL-17の検出可能な影響はなかった。
【０１４５】
図１１において、IL-8生成に及ぼすIL-17及びTNF-α又はIL-1βの組み合わせた影響が示される。この図から、IL-8生成の最大増加に必要なIL-1βの濃度は、TNF-αの用量よりも著しく低いということが再び明らかである。なお、IL-8 に及ぼすIL-1βの最大の影響は、TNF-αについての最大の応答よりも大きいということが終始一貫して明らかである。10 ng/mlのTNF-αを含む培養へのIL-17の添加は、細胞のTNF-αに対する感度を増大させた様に見え、TNF-αの存在下で生成したIL-8 の最大量を確かに増大させた。IL-17及びTNF-αに応答したIL-8生成の最大量のレベルはIL-1β又はIL-1β及びIL-17の組み合わせで得られた最大量のレベルに類似であった。IL-1β刺激のIL-8生成に及ぼすIL-17の検出可能な影響はなかった。
【０１４６】
この示された結果は、TNF-α及びIL-17の間の重要な相互作用を示す。現在の結果は、IL-17が細胞のTNF-αに対する応答を修飾する重要な能力を有するということを示唆する。子宮内膜症の場合、データは、IL-17又はTNF-αに向けられた抗体の影響は、子宮内膜上皮細胞及び間質細胞の運命を変更することにより疾患の進行を防ぐことを示唆する。着床の場合は、IL-17が、胚着床を受入れるためのこれらの細胞の形質転換を通常は妨害する炎症性サイトカインの存在下脱落膜化を容易にすると信じられている。実際、上に示した様に、IL-17（ IL-1βと反対に）は弱体化された（ compromised ）子宮内膜組織での脱落膜化を容易にすることができるということであり、それでIL-17は、子宮内膜症を患った又は弱体化された（ compromised ）子宮内膜組織に着床を容易にするのに効果的であろう。この様にして、IL-17組成物は、子宮内膜の生理の異常から生じる不妊症、特に子宮内膜症に悩む哺乳動物における不妊症の治療用の組成物として有用である。
【０１４７】
実施例４：  動物のIL-17による治療
当業者は子宮内膜症についての動物モデルを知っている（例えば、U.S. Patent No. 6,663,865; Jones, Acta Endocrinol. (Copenh.) 1: 14, 379-382, 1987; Dudley et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 167, 1774-1780, 1992; Sharpe et al., Prog. Clin. Biol. Res. 323, 449-58, 1990 (上で論じた)、などの調査を参照されたい）。この様な動物モデルを使って、子宮内膜症の治療作用剤としてIL-17 組成物のin vivoにおける効力を試験する。これらの調査における動物は、治療を受けない対照とIL-17に基づく治療を受ける試験動物に分けられる。
【０１４８】
多様な濃度のIL-17を子宮内膜症の治療用の治療組成物としてこれらの動物に投与する。IL-17の用量は、適用のルートにしたがって変えることができる。適用のルートは、サイトカインを投与するのに常套的に使われる任意のルートでよい。
【０１４９】
子宮内膜症の症状は、治療の前後でモニターされる。組織試料（上で述べたように、例えば、針生検により得られる）は、子宮内膜組織/その中の小胞の全体の様子（外見）について治療の前後に評価される。治療の効果を測定する付加的な方法には、超音波技術が含まれる。
【０１５０】
本発明の組成物は、典型的には、標準で周知の非毒性生理学上受入れられる担体、添加剤及び望ましいビヒクルを含む投薬単位製剤で経口的又は非経口的に投与される。ここに使われている非経口なる語には、皮下注射、静脈注射、筋肉注射、動脈注射又は注入技術が含まれる。治療法は、注射、経口による投与か、又は経皮的適用（例えば、パッチ又は膣クリームによる）として局所的に投与されるか、又は適切な徐放組成物での移植による投与でよい様に特に意図されている。組成物は動物のみに送達されるか、又は全体で論じられている任意の他の療法と実際に組み合わせて送達される。代表的治療法は、毎日送達される多重用量、一日数回送達される多重用量が含まれる。
【０１５１】
これらの動物モデルを使って、最初の用量範囲を確定し、霊長動物、特に人間などの高等哺乳動物の治療用のプロトコルを確定する。この様な高等動物においては、臨床医は、長期にわたり、例えば、数週間又は数ヶ月にわたり続けられる投薬計画を選択してよい。
【０１５２】
治療されている試験動物対象及びヒト対象両方の臨床応答は、子宮内膜症を示す受入れられる尺度により明らかにされる。例えば、完全な応答は、一ヶ月以上の全測定可能な子宮内膜位置膨張の消失により明らかにされる。然るに、部分応答は、その位置における50%以上の減少により明らかにされる。動物調査の発見をガイドラインとして使い、3 級（ grade 3 ）レベル未満の毒性の場合の用量として選ばれる出発用量を使って、ヒトの試験を行なうことができる。薬物関連の2 級（ grade 2 ）毒性が検出されるまで、100% 増量で用量増大を行い、その後容量増大を停止する。
【０１５３】
もちろん上記治療体制は、臨床試験から得られる知識にしたがって変更できる。当業者は、本明細書に開示される情報を使い、臨床試験及び動物調査に基づく治療体制を最適化できる。
【０１５４】
一度この様な用量が確定されると、ヒトの試験を開始できる。この様な試験で、子宮内膜症の古典的な症状を示す女性の群が治療から募集される。子宮内膜症の症状と徴候は１２ヶ月以下モニターされる。痛みの評点は、次の様にして、決定される。患者は自身の月経困難症、性交疼痛症及び月経と無関係の痛みを0ないし3（なし、穏やか、中程度及びきつい）の尺度で評価する。なお、研究者は、硬化と圧痛について同じ尺度を使う。患者と研究者の評点を合わせて、症状と徴候のつぎのプロフィールを作る。なし（0）、穏やか（1ないし2）、中程度（3ないし5）、きつい（6ないし10）及び非常にきつい（11ないし15）。かくして、最大の評点は15である。これらの数字は例示的で任意のスケールを形成し、調査が、互いに比較されるすべての参加者について同じ尺度を使う限り他のスケールを使用できる。治療の投与なしで評点を決めて、治療法を開始し、少なくとも月ベースで、治療の効果を試験の期間を通じて評点する。子宮の位置の超音波モニタリング、CT走査、組織の針生検など、などのパラメーターを使って、子宮内膜症の軽減の他の指標もまたモニターできる。この様にして、投薬処方の量と頻度を確定できる。
【０１５５】
ここに開示され、特許請求されるすべての組成物及び/又は方法は、本開示に照らして、不適当な実験なしに作りそして実施することができる。本発明の組成物及び方法は、好ましい実施態様により述べたが、当業者には、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなしに、ここに述べる組成物及び/又は方法及び方法の工程又は工程のシーケンスに変更が行なえることは明らかである。より具体的には、化学的及び生理学的に関連する若干の作用剤を、ここに述べる作用剤と置換でき、同じ又は類似の結果が達成されるであろうことは明らかである。当業者には明らかなすべてのこの様な類似の置換物及び修飾は、添付した特許請求の範囲により明確にされた本発明の概念、精神及び範囲内にあるとみなされる。
【０１５６】
本明細書全体で引用された文献は、ここで述べる詳細を捕捉する例示的な操作の詳細又は他の詳細を提供するという範囲で、すべてここで特に参考文献として入れる。
【０１５７】
以下の図面は、本明細書の一部であり、本発明の要旨をさらに説明するために加える。本発明は、ここに呈示される具体的な実施態様の詳細な記述と一緒に図面を参照すると、本発明はより良く理解できる。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】TNF-α又はTNF-α (15 ng/ml) + TNF-α結合蛋白質（TBP）で処理されたBEND 細胞への蛍光フィブロネクチンを塗布されたビーズの結合。
【図２】IL-17-6Hisの用量応答。
【図３】MET-IVKA-IL-17の用量応答。
【図４】IL-17-ATT-6Hisの用量応答。
【図５】陽性の対照TBPと比較した二つの別々のIL-17製剤の用量応答。
【図６】12Z子宮内膜上皮細胞からのGM-CSF生成に及ぼすIL-17及びTNF-αの影響。
【図７】12Z子宮内膜症上皮細胞からのIL-6生成に及ぼすIL-17及びTNF-αの影響。
【図８】12Z子宮内膜症上皮細胞からのIL-8生成に及ぼすIL-17及びTNF-αの影響。
【図９】ヒトの子宮内膜間質細胞（HuF6細胞）からのTNF-α又はIL-1β刺激GM-CSF生成に及ぼすIL-17の影響。
【図１０】IL-1β及びIL-1βとIL-17の組み合わせと比較したTNF-α刺激によるIL-6 生成に及ぼすIL-17の特異な影響。
【図１１】IL-1β及びIL-1βとIL-17の組み合わせと比較したTNF-α刺激によるIL-8 生成に及ぼすIL-17の特異な影響。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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