(57)【要約】  本発明は、結晶化ＨＤＭ２ペプチドならびに結晶のＸ線回折パターンの記述を含む。回折パターンは、ＨＤＭ２上のリガンド結合部位が同定できそしてＨＤＭ２アミノ酸残基とのリガンドの相互作用をモデル化できるような原子分解においてＨＤＭ２の三次元構造の決定を可能とする。かかるマップを用いて作成されたモデルは、ＭＤＭ２およびＨＤＭ２腫瘍タンパク質の阻害剤として作用するものを含み、それらに限定はされない活性作用物質として機能できるリガンドの設計を可能とする。
2008501315.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＤＭ２、もしくはそのフラグメント、またはその標的構造モチーフもしくは誘導体、および小分子阻害剤であるリガンドを含んでなる結晶。
【請求項２】
請求項１の結晶であって、該フラグメントまたは誘導体が、配列番号１（全長ＨＤＭ２のアミノ酸配列）、配列番号２（配列番号１のアミノ酸残基１７〜１１１）、配列番号３（配列番号１のアミノ酸残基２３〜１１４）、および配列番号４（Ｇｌｙ１６−配列番号２）から成る群から選択されるペプチドである、上記結晶。
【請求項３】
請求項１の結晶であって、Ｐ３２２１の三方晶系空間群およびＰ４３２１２の正方晶系空間群から成る群から選択される空間群を有する、上記結晶。
【請求項４】
請求項１の結晶であって、少なくとも約３．０Åの分解能まで、原子座標の決定のためのＸ線を効果的に回折する、上記結晶。
【請求項５】
請求項１の結晶であって、該リガンドが結晶形態にある、上記結晶。
【請求項６】
請求項１の結晶であって、該リガンドが、（４−クロロ−フェニル）−〔３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−酢酸；〔８−クロロ−３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−（４−クロロ−フェニル）−酢酸）；およびそれらの誘導体から成る群から選択される、上記結晶。
【請求項７】
請求項１の結晶であって、該ＨＤＭ２が、配列番号２に少なくとも９５％配列一致を有するペプチドを含んでなる、上記結晶。
【請求項８】
表１もしくは表２の座標を特徴とする原子構造を含んでなる、配列番号２を含んでなる結晶。
【請求項９】
約９８．６Å、９８．６Åおよび７４．７Åの寸法、およびほぼアルファ＝９０°、ベータ＝９０°およびガンマ＝１２０°；および、約５４．３Å、５４．３Åおよび８３．３Åの寸法、およびほぼアルファ＝９０°、ベータ＝９０°およびガンマ＝９０°から成る群から選択される寸法を有する単位セルを含んでなる、請求項１の結晶。
【請求項１０】
（ａ）計算機読み取り可能な記憶媒体中に記憶された、ＨＤＭ２、もしくはフラグメント、またはその標的構造モチーフもしくは誘導体および小分子阻害剤であるリガンドを含んでなる結晶の三次元構造に関する情報を含むデータベース、および
（ｂ）情報を閲覧するためのユーザーインターフェース
を含んでなる、計算機システム。
【請求項１１】
請求項１０の計算機システムであって、該情報が、配列番号２を含んでなる結晶から得られた回折データを含んでなる、上記計算機システム。
【請求項１２】
請求項１０の計算機システムであって、該情報が、配列番号２を含んでなる結晶形態の電子密度マップを含んでなる、上記計算機システム。
【請求項１３】
請求項１０の計算機システムであって、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、該情報が、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差
を含んでなる、表１もしくは表２の構造座標または相同構造座標を含んでなる、上記計算機システム。
【請求項１４】
請求項１３の計算機システムであって、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、該情報が、約０．７５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなるアミノ酸残基の構造座標を含んでなる、上記計算機システム。
【請求項１５】
請求項１０の計算機システムであって、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、該情報が、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、表１もしくは表２に従うアミノ酸Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２、およびＡｒｇ９７の構造座標、または該アミノ酸に類似の構造座標を含んでなる、上記計算機システム。
【請求項１６】
請求項１５の計算機システムであって、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、該情報が、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、表１もしくは表２に従うアミノ酸Ｖａｌ５３、Ｌｅｕ５４、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｎ５９、Ｉｌｅ６１、Ｍｅｔ６２、Ｔｙｒ６７、Ｇｌｎ７２、Ｈｉｓ７３、Ｉｌｅ７４、Ｖａｌ７５、Ｐｈｅ８６、Ｐｈｅ９１、Ｖａｌ９３、Ｌｙｓ９４、Ｇｌｕ９５、Ｈｉｓ９６、Ｉｌｅ９９、Ｔｙｒ１００、Ｉｌｅ１０３の構造座標、または該アミノ酸に類似の構造座標をさらに含んでなる、上記計算機システム。
【請求項１７】
（ａ）ＨＤＭ２を作用物質に暴露し、そして
（ｂ）ＨＤＭ２アミノ酸残基Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７への該作用物質の会合を検出しそれにより電位を評価する
ことを含んでなる、ＨＤＭ２と会合するための作用物質の電位の評価方法。
【請求項１８】
作用物質が仮想化合物である、請求項１７の方法
【請求項１９】
（ａ）ａａ１６−配列番号２を作用物質に暴露し、そして
（ｂ）ａａ１６−配列番号２への該作用物質の会合のレベルを検出し、それにより電位を評価する
ことを含んでなる、ａａ１６−配列番号２を有するペプチドと会合するための作用物質の電位の評価方法。
【請求項２０】
作用物質が仮想化合物である、請求項１９の方法
【請求項２１】
請求項１７の方法であって、該段階（ａ）が、化合物の原子構造とＨＤＭ２の三次元構造との比較を含んでなる、上記方法。
【請求項２２】
請求項１７の方法であって、該比較が、化合物とＨＤＭ２の少なくとも１個の結合部位との間のフィッティング操作を行う計算手段を使用することを含んでなる、上記方法。
【請求項２３】
請求項２２の方法であって、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、該結合部位が、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、表１もしくは表２に従うアミノ酸Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７の構造座標または該アミノ酸に類似の構造座標により規定される、上記方法。
【請求項２４】
請求項２３の方法であって、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、該結合部位が、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、表１もしくは表２に従うアミノ酸Ｖａｌ５３、Ｌｅｕ５４、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ
５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｎ５９、Ｉｌｅ６１、Ｍｅｔ６２、Ｔｙｒ６７、Ｇｌｎ７２、Ｈｉｓ７３、Ｉｌｅ７４、Ｖａｌ７５、Ｐｈｅ８６、Ｐｈｅ９１、Ｖａｌ９３、Ｌｙｓ９４、Ｇｌｕ９５、Ｈｉｓ９６、Ｉｌｅ９９、Ｔｙｒ１００、Ｉｌｅ１０３の構造座標または該アミノ酸に類似の構造座標によりさらに規定される、上記方法。
【請求項２５】
請求項１７の方法であって、該作用物質が結晶性配列番号２に暴露され、そして段階（ｂ）の検出が作用物質−配列２複合体の三次元構造を決定することを含んでなる、上記方法。
【請求項２６】
（ａ）可能性があるアゴニストまたはアンタゴニストの設計または選択のために小分子阻害剤と一緒に同時結晶化されるＨＤＭ２の三次元構造を使用する
ことを含んでなる、ＨＤＭ２に対する可能性があるアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法。
【請求項２７】
請求項２６の方法であって、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、該三次元構造が、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、表１もしくは表２の座標または類似の構造座標を特徴とする原子構造に相当する、上記方法。
【請求項２８】
（ｂ）可能性があるアゴニストまたはアンタゴニストを合成し、そして（ｃ）可能性があるアゴニストまたはアンタゴニストをＨＤＭ２と接触させる
段階をさらに含んでなる、請求項２６の方法。
【請求項２９】
（ａ）ＨＤＭ２の結晶のＸ線回折データを取得し、
（ｂ）ＨＤＭ２と阻害剤との複合体のＸ線回折データを取得し、
（ｃ）段階（ａ）で得られたＸ線回折データを段階（ｂ）で得られたＸ線回折データから差し引いてＸ線回折データにおける差異を取得し、
（ｄ）段階（ａ）で得られたＸ線回折データに相当する位相を取得し、
（ｅ）段階（ｄ）で得られた位相と段階（ｃ）で得られたＸ線回折データにおける差異とを用いて、阻害剤の差フーリエイメージを算出し、そして
（ｆ）段階（ｅ）で得られた算出結果に基づいてＨＤＭ２に対する阻害剤の付着部位を決定する
ことを含んでなる、ＨＤＭ２に対する阻害剤の付着部位の決定方法。
【請求項３０】
（ａ）ＨＤＭ２および阻害剤を含んでなる結晶を取得し、
（ｂ）結晶の原子座標を取得し、
（ｃ）原子座標および１種もしくはそれ以上の分子モデル化技術を用いて阻害剤とＨＤＭ２との相互作用をいかにして改変するかを決定し、そして
（ｄ）段階（ｃ）で得られた決定事項に基づいて阻害剤を変性して改変された阻害剤を作成する
ことを含んでなる、改変された阻害剤の取得方法。
【請求項３１】
請求項３０の方法であって、該結晶が、配列番号２を有するペプチド、配列番号３を有するペプチドおよび配列番号４を有するペプチドから成る群から選択されるペプチドを含んでなる、上記方法。
【請求項３２】
請求項３０の方法であって、該１種もしくはそれ以上の分子モデル化技術が、グラフィック分子モデル化および計算化学から成る群から選択される、上記方法。
【請求項３３】
請求項３０の方法であって、該段階（ａ）が、阻害剤とＨＤＭ２アミノ酸残基Ｓｅｒ１
７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７との相互作用を検出することを含んでなる、上記方法。
【請求項３４】
請求項３０の方法により同定されるＨＤＭ２阻害剤。
【請求項３５】
ＨＤＭ２アミノ酸残基Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７の構造座標により規定される結合ポケットまたは活性部位を含んでなる単離されたタンパク質フラグメント。
【請求項３６】
固体支持体に結合された請求項３５の単離されたフラグメント。
【請求項３７】
請求項３５のフラグメントをコードする単離された核酸分子。
【請求項３８】
請求項３７の核酸分子を含んでなるベクター。
【請求項３９】
請求項３８のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項４０】
フラグメントが発現される条件下で請求項３９の宿主細胞を培養することを含んでなる、タンパク質フラグメントの産生方法。
【請求項４１】
（ａ）請求項３５のタンパク質分子フラグメントを作用物質に暴露し、そして
（ｂ）フラグメントへの作用物質の会合のレベルを検出する
ことを含んでなる、ＨＤＭ２と会合する作用物質のスクリーニング方法。
【請求項４２】
請求項３５のタンパク質分子フラグメントを含んでなるキット。
【請求項４３】
（ａ）ＰＥＧおよびＮａＳＣＮを含んでなる適合する溶液中でＨＤＭ２ポリペプチドを該リガンドと接触させ、そして
（ｂ）ＨＤＭ２ポリペプチド−リガンドの該生成複合体を該溶液から結晶化させる
ことを含んでなる、ＨＤＭ２ポリペプチド−リガンドを含んでなる結晶複合体の作製方法。
【請求項４４】
請求項４３の方法であって、該ＨＤＭ２ポリペプチドが配列番号２を有するポリペプチドである、上記方法。
【請求項４５】
請求項４３の方法であって、該ＰＥＧが１００〜１０００の平均分子量範囲を有し、ここで該ＰＥＧが約０．５％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖの範囲で溶液中に存在しそして該ＮａＳＣＮが約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの範囲で溶液中に存在する、上記方法。
【請求項４６】
請求項４５の方法であって、該ＰＥＧが約４００の平均分子量を有しそして約２％ｗ／ｖで溶液中に存在しそして該ＮａＳＣＮが約１００ｍＭで溶液中に存在する、上記方法。
【請求項４７】
請求項４６の方法であって、該溶液が、約１．８〜２．４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４および約１００ｍＭ緩衝液をさらに含んでなる、上記方法。
【請求項４８】
可能性がある阻害剤と一緒に、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４から成る群から選択される配列を含んでなるペプチドを結晶化することを含んでなる、請求項１の結晶の作製方法。
【請求項４９】
ａ）表１もしくは表２による原子座標により規定されるＨＤＭ２の三次元構造を用い、
ｂ）該三次元構造中のＳｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７から選択される１個もしくはそれ以上のＨＤＭ２アミノ酸を異なるアミノ酸で置換して改変されたＨＤＭ２作製し、
ｃ）該三次元構造を用いて該可能性のある阻害剤を設計または選択し、
ｄ）該可能性のある阻害剤を合成し、そして
ｅ）該可能性のある阻害剤を基質の存在下で該改変されたＨＤＭ２と接触させて、ＨＤＭ２または該改変されたＨＤＭ２の阻害とに関して該可能性のある阻害剤の能力を試験することを含んでなる、ＨＤＭ２の可能性がある阻害剤の同定方法。
【請求項５０】
請求項４９の方法であって、１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基の該置換が、Ｖａｌ５３、Ｌｅｕ５４、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｎ５９、Ｉｌｅ６１、Ｍｅｔ６２、Ｔｙｒ６７、Ｇｌｎ７２、Ｈｉｓ７３、Ｉｌｅ７４、Ｖａｌ７５、Ｐｈｅ８６、Ｐｈｅ９１、Ｖａｌ９３、Ｌｙｓ９４、Ｇｌｕ９５、Ｈｉｓ９６、Ｉｌｅ９９、Ｔｙｒ１００、およびＩｌｅ１０３から成る群から選択される配列番号２のアミノ酸を置換することをさらに含んでなる、上記方法。
【請求項５１】
請求項４９の方法であって、該可能性のある阻害剤がデータベースから選択される、上記方法。
【請求項５２】
請求項４９の方法であって、該可能性のある阻害剤が新規に設計される、上記方法。
【請求項５３】
請求項４９の方法であって、該可能性のある阻害剤が既知の阻害剤から設計される、上記方法。
【請求項５４】
請求項４９の方法であって、該可能性のある阻害剤を設計または選択するために該三次元構造を使用する該段階が、
ａ）改変されたＨＤＭ２と会合できる化学的実体またはフラグメントを同定し、そして
ｂ）同定された化学的実体またはフラグメントを単一分子にアセンブルして該可能性のある阻害剤の構造を提供する
段階を含んでなる、上記方法。
【請求項５５】
可能性がある阻害剤が、配列番号４（Ｇｌｙ１６−配列番号２）の競合性阻害剤である、請求項４９の方法。
【請求項５６】
請求項４９の方法であって、該可能性のある阻害剤が、配列番号４（Ｇｌｙ１６−配列番号２）の不競合性または非競合性阻害剤である、上記方法。
【請求項５７】
請求項４９の方法により同定された阻害剤。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本願は、２００２年１０月１６日付出願の出願番号６０／４１８，３５０号の優先権を主張する。
【連邦政府援助研究開発に関する言明】
【０００２】
適用なし。
【技術分野】
【０００３】
本発明は、一般的に、合理的薬剤設計に基づく分子生物学、タンパク質結晶化、Ｘ線回折解析、三次元構造決定、分子モデル化（ｍｏｄｅｌｉｎｇ）および構造の分野に関する。本発明は、結晶化ＨＤＭ２ペプチドならびにＸ線回折パターンの記述を提供する。問題の結晶のＸ線回折パターンは、ＨＤＭ２の三次元構造が原子解像において決定でき、ＨＤＭ２上のリガンド結合部位が同定でき、そしてリガンドとＨＤＭ２アミノ酸残基との相互作用がモデル化できるために十分な分解能である。
【０００４】
本発明により提供される高分解能マップおよびかかるマップを用いて作成されるモデルは、活性作用物質として機能できるリガンドの設計も可能とする。従って、本発明は、限定はされるものではないが、ＭＤＭ２およびＨＤＭ２腫瘍タンパク質の阻害剤として使用されるものを含む、活性作用物質の設計のための用途を有する。
【発明の背景】
【０００５】
ＨＤＭ２：構造および機能
ＨＤＭ２（ヒト二重微小２タンパク質（ｈｕｍａｎ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ２
ｐｒｏｔｅｉｎ））は、軟組織肉腫、神経膠芽腫および乳癌を含むヒト腫瘍の下位群中で過剰発現される腫瘍遺伝子ｈｄｍ２の発現産物である（非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３）。
【０００６】
この腫瘍遺伝子の機能的特性研究は、ＨＤＭ２と、細胞成長阻止およびアポトーシスに中心的存在である腫瘍抑制遺伝子のｐ５３との間の相互作用を明らかにした（非特許文献４）。ＨＤＭ２はｐ５３の転写標的でありそしてそれ自体、ＨＤＭ２とｐ５３とが正確に調節されたループを形成する（非特許文献５）。ＨＤＭ２は、ユビキチン化によりおよび核に対してＨＤＭ２を隔離するＡｒｆとの複合体形成によりさらに調節される（非特許文献６、非特許文献７）。
【０００７】
ＨＤＭ２がｐ５３から独立して機能できると示唆する一連の証拠がある。ｐ５３結合ドメインを含まないＨＤＭ２のスプライス変種がヒト腫瘍中に発見されそして形質転換能力を有することが示された（非特許文献８）。生体内研究も、ＨＤＭ２を過剰発現するトランスジェニックマウス中で成長する腫瘍のスペクトルが、ｐ５３ヌルマウス中で見られるスペクトルとは異なることおよびＨＤＭ２がｐ５３ヌル動物中の肉腫形成を促進できることも証明した（非特許文献９）。最後に、ＨＤＭ２のその他の結合相手が、腫瘍形成経路、例えば、ＭＴＢＰ誘導でｐ５３から独立のＧ１阻止のＨＤＭ２阻害と一緒にＨＤＭ２を支援できた（非特許文献１０）。
【０００８】
アンチセンスヌクレオチドによるｈｄｍ２阻害に続く促進された腫瘍細胞死（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）およびＨＤＭ２結合性ミニタンパク質（非特許文献１４）の報告は、ＨＤＭ２の阻害がｐ５３を活性化しそして他方ではアポトーシスを発生させるという予測を実証した。このアイデアに従って、ＨＤＭ２のｐ５３結合グルーブに対して生成された小分子阻害剤が、２つのタンパク質の相互作用を防止しそしてｐ５３活性を誘導することが期待される。ｐ５３とＨＤＭ２との間の相互作用の阻害が新生物の処置における標準化学療法と付加的または相乗的に作用するであろうことがさらに示唆されそしてこれもアンチセンスＨＤＭ構築物として用いる研究により支持されている（非特許文献１５）。
【０００９】
ＭＤＭ２：構造および機能
ＨＤＭ２のネズミ相同体であるｍｄｍ２は、元々はマウス二重微小染色体上にみいだされそして腫瘍形成性細胞株内で増幅される３種の遺伝子の一つとして最初に同定された（非特許文献１６）。そのタンパク質産物は、温度感受性マウスｐ５３遺伝子で予めトランスフェクションされたラット繊維芽細胞細胞株（クローン６）内に最初に観察されたｐ５３と複合体を形成することが引き続いて発見された（非特許文献１７）。ラット細胞株は３７℃で良く生育したがしかし３２℃に低下されるとＧ１阻止を示し、それはｐ５３の立体配座（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）および活性において観察された温度依存性スイッチと完全に一致した。しかしｐ５３−ＭＤＭ２複合体は、３２℃でのみ多量に観察され、その温度でｐ５３は主として機能性、すなわち「野生型」形態が主体であった（非特許文献１８、非特許文献１９）。ラット細胞株を３２℃まで低下しそして新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）タンパク質合成を遮断することにより、「野生型」ｐ５３のみがｍｄｍ２遺伝子の発現を誘導し、それによりｐ５３転写活性に関して該複合体の差異的存在に関係することが示された（非特許文献２０）。この説明は、ｍｄｍ２遺伝子の最初のイントロン内の野生型ｐ５３のＤＮＡ結合部位の同定によりさらに発展された（非特許文献２１）。このｐ５３ＤＮＡ結合部位を使用するレポーター構築物は、野生型ｐ５３がＭＤＭ２と同時発現されるとそれらが不活性化されることを明らかにした。
【００１０】
ｐ５３の転写活性の阻害は、ＭＤＭ２がｐ５３および／またはＤＮＡ結合部位の活性化ドメインを遮断することにより起きるのであろう。その結果、ｍｄｍ２発現は、野生型ｐ５３の転写活性に対するＭＤＭ２タンパク質の阻害効果を介して自己調節されると提案された。このｐ５３−ｍｄｍ２自己調節フィードバックループは、細胞成長がｐ５３によりどのようにして調節されるかに関する新しい洞察をもたらした。ヒト肉腫の３分の１までがｍｄｍ２遺伝子の増幅によるｐ５３調節成長制御を克服すると考えられる（非特許文献２２）。従って、ｐ５３とＭＤＭ２との間の相互作用は、鍵となる可能性がある治療標的である。
【００１１】
ｐ５３：ＨＤＭ２およびＭＤＭ２との相互作用
ｐ５３は、アポトーシスによる細胞周期阻止または細胞死を起こす多数のタンパク質、例えばｐ２１、１４−３−３σ、およびｂａｘのための転写因子である。ｐ５３のレベルおよび転写活性は、細胞ＤＮＡへの損傷により増加する。ＭＤＭ２タンパク質は、ｐ５３の両親媒性Ｎ−末端らせんへの結合によりｐ５３機能を阻害し、ｐ５３と他のタンパク質との相互作用およびそのトランス活性化活性を妨げる。ＭＤＭ２との相互作用は、ユビキチン依存性タンパク質分解のためにｐ５３も標的とする。ＭＤＭ２は、細胞周期に対してもｐ５３とは独立した効果を示し、それはｐＲＢおよびＥＦ２のようないくつかの下流エフェクターとの直接相互作用によるのであろう（非特許文献２３中に総説）。
【００１２】
ｐ５３タンパク質の変異は、すべてのヒト癌の５０％中で起きる（非特許文献２４に総説、非特許文献２５、および非特許文献２６中に引用された文献）。正常な環境では、ｐ５３は潜在性で非常に壊れやすいタンパク質であり、それは数分間の非常に短い半減期で更新する（非特許文献２７）。ＤＮＡ損傷またはストレスは、ｐ５３の安定性に著しい上昇を誘導する（非特許文献２８）。さらに、それらのシグナルは、そのトランス活性化ドメインの自己調節阻害により正常では抑止されている機能である、アポトーシス機構の転写活性化因子としてのｐ５３の機能も活性化する。細胞内に存在するｐ５３の量は、ｐ５３と腫瘍遺伝子ｈｄｍ２との間の負フィードバックループにより緊密に調節される。
【００１３】
ｐ５３は細胞核内に位置しそしてそのトランス活性化ドメインを介してｈｄｍ２の発現を誘導する。引き続いて、発現されたｈｄｍ２は、ｐ５３トランス活性化ドメインの残基１９〜２６に結合してそれを不活性化し（非特許文献２９、非特許文献３０、非特許文献１９）、そして遺伝子発現のために必要な転写因子の補充を遮断する（非特許文献３１、非特許文献３２）。さらに、ｐ５３−ｈｄｍ２複合体は、分解が起きる細胞質に往復する。負フィードバックループによるこの緊密な調節は、生物体の生存のために重要である。ｈｄｍ２ノックアウトマウス内のｈｄｍ２の不活性化は、早期の胚の致死に導くが、しかしｐ５３の同時に起きる不活性化により完全に防止される（非特許文献３３、非特許文献３４）。反対に、ｈｄｍ２の過剰な発現は、ｐ５３の構成的抑制に導くことができそして癌を促進する。過剰のＨＤＭ２は、ｐ５３とは独立して癌も促進する（非特許文献３５、非特許文献３６）。
【００１４】
上記に考察したように、ＨＤＭ２とｐ５３との間の相互作用の阻害は癌治療の魅力的な標的である（非特許文献３７）。ｐ５３とＨＤＭ２との間の複合体形成の阻害は細胞内のｐ５３のレベルを上昇することが示された（非特許文献１４）。さらに、ｐ５３結合からＨＤＭ２を遮断することは、癌治療の前線として、ＨＤＭ２を過剰発現する細胞への細胞周期制御の回復のために治療的に有用であろう。さらに一般的には、ＨＤＭ２の阻害は、アポトーシスおよび生育阻止シグナル伝達経路を促進することによりｐ５３正常癌における化学治療および照射の有効性を増加するであろう。この方法は、機能性ｐ５３を含む癌細胞に対して化学治療剤にさらに可能性を与えるであろう。
【００１５】
ｐ５３／ＨＤＭ２タンパク質複合体の阻害剤を同定する一つの方法は、相互作用のためのモデルを確立するために結晶学によりＨＤＭ２結合ポケットのアミノ酸特異性を決定する方法である。この方法を用いて、クッシーら（Ｋｕｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．）は、ｐ５３に基づくペプチドアンタゴニストを同定した（非特許文献３８）。ＨＤＭ２の短縮形（残基１７〜１２５）およびｐ５３のＮ−末端トランス活性化ドメインから誘導される１５量体ペプチドの結晶構造は、クッシーらにより公開された（非特許文献３８）。クッシーらは、ＨＤＭ２に対して７１％一致を有するアフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）から誘導されたＭＤＭ２の結晶構造（残基１３−１１８）も公開した（非特許文献３８）。分子モデル化に基づいて、ガルシア−エチェベリアら（Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，ｅｔ  ａｌ．）は、ｈｄｍ２のＮ−末端ドメインに結合する、１５量体野生型ｐ５３ペプチドから誘導された、８量体ペプチド擬似体（ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ）のモデルを公開した（非特許文献３９）。例えば小分子阻害剤のような阻害性化合物、またはその他のペプチドを伴うＨＤＭ２の結晶構造は開示されていないと考る。
【００１６】
従って、ＨＤＭ２（およびその相同体）遺伝子とｐ５３のような天然結合リガンドとの間の相互作用を阻害する強力な小分子を設計および選択するモデル化システムの開発に対する要求がいまだに存在する。
【非特許文献１】Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５８（６３８１）：８０−８３（１９９２）
【非特許文献２】Ｒｅｉｆｅｎｂｅｒｇｅｒ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５３：２７３６−２７３９（１９９３）
【非特許文献３】Ｂｕｅｓｏ−Ｒａｍｏｓ，Ｃ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．Ｔｒｅａｔ．，３７（２）：１７９−１８８（１９９６）
【非特許文献４】Ｍｏｍａｎｄ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，６９：１２３７（１９９２）
【非特許文献５】Ｗｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，７：１１２６−１１３２（１９９２）
【非特許文献６】Ｔａｏ，Ｗ．ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９６（１２）：６９３７−６９４１（１９９９）
【非特許文献７】Ｗｅｂｅｒ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１（１）：２０−２６（１９９９）
【非特許文献８】Ｓｉｇａｌａｓ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２（８）：９１２−９１７（１９９６）
【非特許文献９】Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（２６）：１５６０８−１５６１２（１９９８）
【非特許文献１０】Ｂｏｙｄ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５（４１）：３１８８３−３１８９０（２０００）
【非特許文献１１】Ｃｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９５（１）：１９５−２００（１９９８）
【非特許文献１２】Ｃｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．５（１）：２１−３４（１９９９）；
【非特許文献１３】Ｔｏｒｔｏｒａ，Ｇ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，８８（５）：８０４−８０９（２０００）
【非特許文献１４】Ｂｏｔｔｇｅｒ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，７（１１）：８６０−８６９（１９９７）
【非特許文献１５】Ｗａｎｇ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃ．Ｒｅｓ．７（１１）：３６１３−３６２４（２００１）
【非特許文献１６】Ｃａｈｉｌｌｙ−Ｓｎｙｄｅｒ．，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．１３：２３５−２４４（１９８７）
【非特許文献１７】Ｍｉｃｈａｌｏｖｉｔｚ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６２：６７１−６８０（１９９０）
【非特許文献１８】Ｂａｒａｋ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：２１１５−２１２１（１９９２）
【非特許文献１９】Ｍｏｍａｎｄ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６９：１２３７−１２４５（１９９２）
【非特許文献２０】Ｂａｒａｋ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：４６１−４６８（１９９３）
【非特許文献２１】Ｗｕ，Ｘ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：１１２６−１１３２（１９９３）
【非特許文献２２】Ｏｌｉｎｅｒ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：８０−８３（１９９２）
【非特許文献２３】Ｚｈａｎｇ，Ｒ．ａｎｄ  Ｗａｎｇ，Ｈ．，Ｃｕｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．６：３９３−４１６（２０００）
【非特許文献２４】Ａｇｅｒｗａｌ．Ｍ．Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：１−４（１９９８）
【非特許文献２５】Ｌｅｖｉｎｅ，Ａ．Ｊ．，Ｃｅｌｌ  ８８：３２３−３３１（１９９７）
【非特許文献２６】Ｏｒｅｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３６０３１−３６０３４（１９９９）
【非特許文献２７】Ｒｏｇｅｌ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：２８５１−２８５５（１９８５）
【非特許文献２８】Ｋａｓｔａｎ，Ｍ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５１：６３０４−６３１１（１９９１）
【非特許文献２９】Ｃｈｅｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１６：２４４５−２４５２（１９９６）
【非特許文献３０】Ｈａｕｐｔ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１５：１５９６−１６０６（１９９６）
【非特許文献３１】Ｌｕ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９２：５１５４−５１５８（１９９５）
【非特許文献３２】Ｔｈｕｔ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６７：００−１０４（１９９５）
【非特許文献３３】Ｊｏｎｅｓ，Ｓ．Ｎ．ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：２０６−２０８（１９９５）
【非特許文献３４】Ｍｏｎｔｅｓ  ｄｅ  Ｏｃａ  Ｌｕｎａ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７８：２０３−２０６（１９９５）
【非特許文献３５】Ｌｕｄｇｒｅｎ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．１１：７１４−７２５（１９９７）
【非特許文献３６】Ｓｕｎ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：２２７０−２２７２（１９９８）
【非特許文献３７】Ｌａｎｅ，Ｄ．Ｐ．，ＴＩＢＳ  ２２：３７２−３７４（１９９７）
【非特許文献３８】Ｋｕｓｓｉｅ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４８−９５３（１９９）
【非特許文献３９】Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４３：３２０５−３２０８（２０００）
【発明の要約】
【００１７】
本発明は、ヒトＭＤＭ２タンパク質（ＨＤＭ２）およびＨＤＭ２と複合体を形成しｐ５３タンパク質との相互作用からＨＤＭ２を防止する阻害性化合物とから誘導される三次元構造情報を提示しそして使用する方法を含む。本発明は、阻害剤−ＨＤＭ２複合体の結晶を取得するための特定の結晶化条件も含む。該結晶は、引き続いてＸ線結晶学（またはＮＭＲ）を用いて複合体の三次元構造を得るために使用されそして得られたデータはＨＤＭ２と阻害剤との間の複合体形成を改善し、そして、ｐ５３へのＨＤＭ２の結合の阻害を改善する目的で合理的薬剤発見設計のために使用される。
【００１８】
本発明は、ＨＤＭ２、もしくはフラグメント、またはその標的構造モチーフもしくは誘導体、および小分子阻害剤であるリガンドを含む結晶を含む。他の態様では、結晶はＰ３２２１の三方晶系空間群およびＰ４３２１２の正方晶系空間群から成る群から選択される空間群を有する。本発明は、配列番号２と少なくとも９５％の配列一致を有するペプチドを含んでなるＨＤＭ２を含んでなる結晶も含む。
【００１９】
本発明の別の態様では、本発明は（ａ）計算機読み取り可能な記憶媒体中に記憶された、ＨＤＭ２、もしくはフラグメント、またはその標的構造モチーフもしくは誘導体、および小分子阻害剤であるリガンドを含んでなる結晶の三次元構造に関する情報を含むデータベース、および（ｂ）情報を閲覧するためのユーザーインターフェースを含んでなる計算機システムを含む。
【００２０】
本発明は、（ａ）ＨＤＭ２を作用物質に暴露し、そして（ｂ）ＨＤＭ２アミノ酸残基Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７への該作用物質の会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を検出し、それにより電位を評価することを含んでなる、ＨＤＭ２と会合するための作用物質の電位の評価方法も含む。
【００２１】
本発明は、（ａ）ａａ１６−配列番号２を作用物質に暴露し、そして（ｂ）ａａ１６−配列番号２への該作用物質の会合のレベルを検出しそれにより電位を評価することを含んでなる、ａａ１６−配列番号２を有するペプチドと会合する作用物質の電位の評価方法をさらに含む。
【００２２】
さらに本発明中に含まれるのは、（ａ）可能性があるアゴニストまたはアンタゴニストの設計または選択のために小分子阻害剤と共に同時結晶化されたＨＤＭ２の三次元構造を使用することを含んでなる、ＨＤＭ２に対する可能性があるアゴニストまたはアンタゴニストの同定方法をさらに含む。
【００２３】
本発明は、（ａ）ＨＤＭ２の結晶のＸ線回折データを取得し、（ｂ）ＨＤＭ２と阻害剤との複合体のＸ線回折データを取得し、（ｃ）段階（ａ）で得られたＸ線回折データを段階（ｂ）で得られたＸ線回折データから差し引いてＸ線回折データにおける差異を取得し、（ｄ）段階（ａ）で得られたＸ線回折データに相当する位相を取得し、（ｅ）段階（ｄ）で得られた位相と段階（ｃ）で得られたＸ線回折データにおおける差異とを用いて、阻害剤の差フーリエイメージを算出し、そして（ｆ）段階（ｅ）で得られた算出結果に基づいてＨＤＭ２に対する阻害剤の付着部位を決定することを含んでなる、ＨＤＭ２に対する阻害剤の付着部位の決定方法を含んでなる。
【００２４】
本発明は、（ａ）ＨＤＭ２および阻害剤を含んでなる結晶を取得し、（ｂ）結晶の原子座標を取得し、（ｃ）原子座標および１種もしくはそれ以上の分子モデル化技術を用いて阻害剤とＨＤＭ２との相互作用をいかにして改変するかを決定し、そして（ｄ）段階（ｃ
）で得られた決定事項に基づいて阻害剤を改変して改変された阻害剤を作製することを含んでなる、改変された阻害剤の取得方法をさらに含んでなる。
【００２５】
本発明の別の態様では、本発明は、ＨＤＭ２アミノ酸残基Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７の構造座標により規定される結合ポケットまたは活性部位を含んでなる単離されたタンパク質フラグメントを含む。
【００２６】
本発明の別の態様では、本発明は、ＨＤＭ２アミノ酸残基Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７の構造座標により規定される結合ポケットまたは活性部位を含んでなるフラグメントをコードする単離された核酸分子を含む。本発明の別の態様では、本発明は、（ａ）タンパク質分子フラグメントを作用物質に暴露し、そして（ｂ）フラグメントへの作用物質の会合のレベルを検出することを含んでなる、ＨＤＭ２と会合する作用物質をスクリーニングする方法を含む。本発明の別の態様では、本発明は、タンパク質分子フラグメントを含んでなるキットを含む。
【００２７】
本発明は、（ａ）ＰＥＧおよびＮａＳＣＮを含んでなる適合する溶液中でＨＤＭ２ポリペプチドを該リガンドと接触させ、そして（ｂ）ＨＤＭ２ポリペプチド−リガンドの該生成複合体を該溶液から結晶化させることを含んでなる、ＨＤＭ２ポリペプチド−リガンドを含んでなる結晶複合体の作製方法をさらに含んでなる。
【００２８】
本発明は、ＨＤＭ２、および可能性がある阻害剤と一緒に配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４から成る群から選択される配列を含んでなるペプチドを結晶化することを含んでなる、小分子阻害剤であるリガンドを含んでなる結晶の作製方法をさらに含む。
【００２９】
本発明は、ａ）表１もしくは表２による原子座標により規定されるＨＤＭ２の三次元構造を用い、ｂ）該三次元構造中のＳｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７から選択される１個もしくはそれ以上のＨＤＭ２アミノ酸を異なるアミノ酸で置換して改変されたＨＤＭ２を作成し、ｃ）該三次元構造を用いて該可能性のある阻害剤を設計または選択し、ｄ）該可能性のある阻害剤を合成し、そしてｅ）該可能性のある阻害剤を基質の存在下で該改変されたＨＤＭ２と接触させて、ＨＤＭ２または該改変されたＨＤＭ２の阻害に関して該可能性のある阻害剤の能力を試験することを含んでなる、ＨＤＭ２の可能性がある阻害剤を同定する方法を含む、さらに本発明は該方法により同定された阻害剤を含む。本発明にさらに含まれるのは、該方法により同定された阻害剤である。
【発明の詳細な説明】
【００３０】
定義
生物工学および化学の場合に一般的であるように、本発明の記述は当該技術分野の多数の用語の使用を必要とする。それを網羅的に行うのは実際的ではないが、いくつかのそれらの用語の定義を参照のためにここに定義する。別途に規定しない限り、本明細書中で使用される技術的よび科学的のすべての用語は、本発明が属する技術分野の通常の技術者により共通して理解されるものと同様の意味を有する。他の用語の定義は本明細書中の別の箇所にも見られるであろう。しかし、本箇所または本明細書中の別の箇所で提供される定義は、定義された用語の意図された範囲および意味を決定する場合に常に考えられるべきである。本明細書中に記載されたものと類似または等価のいずれかの方法または物質が本発明の実施の際に使用できるけれども、好ましい方法および物質が記載される。
【００３１】
本明細書中で使用される場合に、「原子座標」または「構造座標」の用語は、各原子に対して、Ｘ、Ｙ、ＺおよびＢを含む、タンパク質データバンク（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ）（ＰＤＢ）フォーマット中でＨＤＭ２の結晶中の原子の位置を記述する数
学的座標を指す。結晶から得られた回折データは、結晶の反復単位の電子密度マップを算出するために使用される。電子密度マップは、結晶内の個々の原子の位置（すなわち座標Ｘ、ＹおよびＺ）を確定するために使用されてもよい。当該技術分野の熟練者は、Ｘ線結晶学により決定された構造座標の組は標準偏差が避けられないと理解している。本発明の目的のために、表１または表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねられた場合に、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差（ｒｏｏｔ  ｍｅａｎ  ｓｑｕａｒｅ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ）を有するいずれかの出所からのＨＤＭ２の構造座標のいずれかの組は、本質的に同一または相同であると考えられる。さらに好ましい態様では、表１または表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねられた場合に、約０．７５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を有するいずれかの出所からのＨＤＭ２の構造座標のいずれかの組は、本質的に同一または相同であると考えられる。
【００３２】
「原子タイプ」の用語は、その座標が測定された化学元素を指す。表１の行の最初の文字は元素を定義するものである。
【００３３】
「Ｘ」、「Ｙ」および「Ｚ」の用語は、選択された結晶学的原点から測定された元素の結晶学的に定義された原子位置を指す。「Ｂ」の用語は、その平均位置に関して原子位置の平均偏差を評価する熱因子を指す。
【００３４】
本明細書中で使用される場合に、「結晶」の用語は、Ｘ線を回折する分子のいずれかの三次元配列アレイを指す。
【００３５】
本明細書中で使用される場合に、組成物内の「担体」の用語は、それと製品が混合される希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを指す。
【００３６】
本明細書中で使用される場合に、「組成物」の用語は、全体を形成するための個別の元素または成分の組合わせを指す。組成物は、１種もしくはそれ以上の元素または成分から成る。本発明の目的のために、組成物は担体をしばしば含むが、常にというわけではない。
【００３７】
本明細書中で使用される場合に、「ｍｄｍ２」の用語は、ネズミ二重微少２遺伝子（ｍｕｒｉｎｅ  ｄｏｕｂｌｅ  ｍｉｎｕｔｅ  ２  ｇｅｎｅ）および他の動物内で見いだされる相同遺伝子を意味するとして使用される。
【００３８】
本明細書中で使用される場合に、「ＭＤＭ２」は、ｍｄｍ２腫瘍遺伝子の発現の結果として得られるタンパク質を意味するとして使用される。該用語の意味の範囲内で、ＭＤＭ２は、ｍｄｍ２でコードされるすべてのタンパク質、それらの変異体、同類アミノ酸置換物、それらの代替スプライスタンパク質、およびそれらのリン酸化タンパク質を包含すると理解される。追加的に、本明細書中で使用される場合に、「ＭＤＭ２」の用語は他の動物のＭＤＭ２相同体を含むと理解される。
【００３９】
本明細書中で使用される場合に、「ｈｄｍ２」は、マウスｍｄｍ２遺伝子と相同であるヒト遺伝子を意味するとして使用される。
【００４０】
本明細書中で使用される場合に、「ＨＤＭ２」は、ｈｄｍ２腫瘍遺伝子の発現の結果として得られるタンパク質を意味するとして使用される。本用語の意味の範囲内で、ＨＤＭ２は、ｈｄｍでコードされるすべてのタンパク質、それらの変異体、同類アミノ酸置換、それらの代替スプライスタンパク質、およびそれらのリン酸化タンパク質を包含すると理解される。例として、ＨＤＭ２は、配列番号２のタンパク質および配列番号２に少なくとも約７０％のアミノ酸配列一致、もしくは好ましくは配列番号２に８０％、８５％、９０
％および９５％のアミノ酸配列一致、もしくはさらに好ましくは、配列番号２に少なくとも９５％もしくはそれ以上の配列一致を含んでなるその変種を含んでなるタンパク質を含む。
【００４１】
本明細書中で使用される場合に、構造−活性相関の省略である「ＳＡＲ」の用語は、化合物の活性／性質とその化学構造との間の相関に関する構造−活性／構造性質関係を集合的に指す。
【００４２】
本明細書中で使用される場合に、「分子構造」の用語は、特定の化合物の分子または分子の複合体の三次元配列を指す（例えばＨＤＭ２およびＨＤＭ２と相互作用するリガンドの三次元構造）。
【００４３】
本明細書中で使用される場合に、「分子モデル化（ｍｏｄｅｌｉｎｇ）」の用語は、分子の外観の現実的モデルを作成しそしてリガンドの構造活性相関に関する予測を立てるために、計算方法、好ましくは計算機支援方法の使用を指す。分子モデル化に使用される方法は、分子グラフィックスから計算化学までの範囲がある。
【００４４】
本明細書中で使用される場合に、「分子モデル」の用語は、共有結合により連結された分子の原子の三次元配列または１個を越える分子を含んでなる複合体、例えばタンパク質−リガンド複合体の原子の三次元配列を指す。
【００４５】
本明細書中で使用される場合に、「分子グラフィックス」の用語は、分子の３Ｄ表示、例えば計算機支援の計算方法を用いて作成された３Ｄ表示を指す。
【００４６】
本明細書中で使用される場合に、「計算化学」の用語は、分子の物理的および化学的性質の計算を指す。
【００４７】
本明細書中で使用される場合に、「分子置換」の用語は、未知結晶の観察された回折パターンを説明するために最善であるように、本発明中に記載の原子座標を配置および位置決定することによる、座標が未知のＨＤＭ２の結晶の予備的モデルを生成することを含む方法を指す。次いで、このモデルから位相を算出しそして観察された座標と組み合わせて、座標が未知の構造の近似的フーリエ合成を与えることができる。（Ｒｏｓｓｍａｎｎ，Ｍ．Ｇ．，編集，“Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄ”，Ｇｏｒｄｏｎ  ＆  Ｂｒｅａｃｈ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７２）。
【００４８】
本明細書中で使用される場合に、「相同体」の用語は、第二の出所からのタンパク質、コード核酸分子またはそれらのいずれかの機能性ドメインと、少なくとも約３０％、４０％、もしくは５０％の配列一致、または少なくとも約６０％、７０％、もしくは７５％の配列一致、または少なくとも約８０％の配列一致、またはさらに好ましくは少なくとも約８５％の配列一致、またはそれよりさらに好ましくは少なくとも約９０％の配列一致、そして最も好ましくは少なくとも約９５％、９７％、もしくは９９％のアミノ酸またはヌクレオチド配列一致を有する第一の出所からのＨＤＭ２タンパク質分子またはタンパク質、もしくは該タンパク質からの機能性ドメインをコードする核酸分子を指す。第二の出所は、一次アミノ酸もしくはヌクレオチド配列を変化させるいずれかの利用できる手段により遺伝子的に改変された第一の出所からの分子の一つの変形でであってもよくまたは第一の出所のものと同一もしくは異なる種からであってもよい。
【００４９】
本明細書中で使用される場合に、「活性部位」の用語は、ＨＤＭ２またはＨＤＭ２の機能もしくは活性に直接関与するＨＤＭ２の構造モチーフ上の領域を指す。
【００５０】
本明細書中で使用される場合に、「結合部位」または「結合ポケット」の用語は、ＨＤＭ２の一次アミノ酸配列および／もしくはその三次元形状の結果として、リガンドもしくは阻害剤を含む他の化学的実体もしくは化合物と都合よく会合するＨＤＭ２の領域またはＨＤＭ２を含んでなる分子複合体を指す。
【００５１】
本発明の目的で、ＨＤＭ２に対する、または表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を有するいずれかの出所からのＨＤＭ２の相同体に対する構造座標の組により規定されるいずれの活性部位、結合部位または結合ポケットも、本質的に一致または相同と考えられる。さらに好ましい態様では、ＨＤＭ２、または表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、約０．７５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を有するいずれかの出所からのＨＤＭ２の相同体に対する構造座標のいずれの組も本質的に一致または相同的と考えられる。
【００５２】
「二乗平均偏差」の用語は、平均からの偏差の二乗の算術平均の平方根を意味する。
【００５３】
本明細書中で使用される場合に、「アミノ酸」は、天然に存在するアミノ酸のＬ−異性体を指す。天然に存在するアミノ酸は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、メチオニン、トレオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、システイン、プロリン、ヒスチジン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン酸、グルタミン、γ−カルボキシルグルタミン酸、アルギニン、オルニチン、およびリシンである。特定して指定しない限り、本出願中で言及されるすべてのアミノ酸はＬ−形態である。
【００５４】
本明細書中で使用される場合に、「非天然アミノ酸」の用語は、タンパク質内に天然には見られないアミノ酸を指す。例えば、セレノメチオニンである。
【００５５】
本明細書中で使用される場合に、「正に荷電したアミノ酸」の用語は、正常な生理学的条件下で正に荷電した側鎖を有するいずれかのアミノ酸を含む。正に荷電した天然に存在するアミノ酸の例はアルギニン、リシンおよびヒスチジンである。
【００５６】
本明細書中で使用される場合に、「負に荷電したアミノ酸」の用語は、正常な生理学的条件下で正に荷電した側鎖を有するいずれかのアミノ酸を含む。負に荷電した天然に存在するアミノ酸の例はアスパラギン酸およびグルタミン酸である。
【００５７】
本明細書中で使用される場合に、「疎水性アミノ酸」の用語は、水に比較的不溶性である非荷電、非極性側鎖を有するいずれかのアミノ酸を含む。天然に存在する疎水性アミノ酸の例は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンである。
【００５８】
本明細書中で使用される場合に、「親水性アミノ酸」の用語は、水に比較的可溶性である非荷電、極性側鎖を有するいずれかのアミノ酸を指す。天然に存在する親水性アミノ酸の例は、セリン、トレオニン、チロシン、アスパラギン、グルタミンおよびシステインである。
【００５９】
本明細書中で使用される場合に、「水素結合」の用語は、ただ１個の原子に共有結合する水素を共有し、一方で他と相互作用する２個の親水性原子（ＯまたはＮ）を指す。
【００６０】
本明細書中で使用される場合に、「疎水性相互作用」の用語は、２個の疎水性残基または原子（例えばＣ）により行われる相互作用を指す。
【００６１】
本明細書中で使用される場合に、「共役系」の用語は、電子が全系内で完全に非局在化されている、互いに隣接する２個の二重結合を指す。これは芳香族残基も含む。
【００６２】
本明細書中で使用される場合に、「芳香族残基」の用語は、非局在化共役系を有する側鎖を有するアミノ酸を指す。芳香族残基の例は、フェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンである。
【００６３】
本明細書中で使用される場合に、「結合を阻害」の語句は、１個もしくはそれ以上の分子、ペプチド、タンパク質、酵素、もしくは受容体の直接もしくは間接的な会合を防止もしくは低下すること、または１個もしくはそれ以上の分子、ペプチド、タンパク質、酵素もしくは受容体の正常な活性を防止もしくは低下すること、例えばＨＤＭ２およびｐ５３の直接もしくは間接的な会合を防止もしくは低下することを指す。
【００６４】
本明細書中で使用される場合に、「競合的阻害剤」の用語は、ＨＤＭ２にその結合相手（例えばｐ５３）として同一部位に結合し、それにより直接的にそれらと競合する阻害剤を指す。競合的阻害は、いくつかの例では、基質濃度を増加することにより完全に逆転されることがある。
【００６５】
本明細書中で使用される場合に、「非（ｕｎ−）競合的阻害剤」の用語は、その基質、例えば（ｐ５３）が結合する部位とは異なる部位に結合することによりＨＤＭ２の機能的活性を阻害するものを指す。
【００６６】
本明細書中で使用される場合に、「不（ｎｏｎ−）競合的阻害剤」の用語は、ＨＤＭ２の遊離またはｐ５３結合形態のいずれかに結合できるものを指す。
【００６７】
当該技術分野の熟練者は、標準的方法を用いる計算機フィッティング酵素速度論的データにより競合的、非競合的または不競合的として阻害剤を同定できるであろう。例えばＳｅｇｅｌ，Ｉ．Ｈ．，Ｅｎｚｙｍｅ  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，（１９７５）参照。
【００６８】
本明細書中で使用される場合に、「ＲまたはＳ−異性体」の用語は、純粋および応用科学の国際連合（ＩＵＰＡＣ）により採択されたカーン−インゴルド−プレログ系（Ｃａｈｎ−Ｉｎｇｏｌｄ−Ｐｒｅｌｏｇ  Ｓｙｓｔｅｍ）に従ってキラル炭素の２種の可能な立体異性体を指す。キラル炭素に結合するそれぞれの基は、キラル炭素に直接結合する原子の原子番号に基づいて順位または優先ａ、ｂ、ｃ、またはｄに先ず割り当てられる。最高の原子番号を有する基が最高の順位ａを与えられ、つぎに高い原子番号を有する基が次の順位ｂを与えられ、以下同様である。次いで、最低の順位（ｄ）の基を対象から外す。ａからｂ次いでｃへの経路のトレースが反時計廻りの場合には、該異性体は（Ｓ）と命名される。反対方向、すなわち時計廻りの場合に異性体は（Ｒ）と命名される。
【００６９】
本明細書中で使用される場合に、「リガンド」の用語は、ＨＤＭ２、ＨＤＭ２のサブユニット、ＨＤＭ２のドメイン、ＨＤＭ２の標的構造モチーフまたはＨＤＭ２のフラグメントともしくはそれらに対して結合するいずれかの分子、または化学的実体を指す。従って、リガンドは例えば小分子阻害剤を含むがそれらに限定はされない。
【００７０】
本明細書中で使用される場合に、「小分子阻害剤」の用語は、測定可能なＭＤＭ２またはＨＤＭ２阻害活性を有する本発明で有用な化合物を指す。小さい有機分子に加えて、ペプチド、抗体、環状ペプチドおよびペプチド擬似体も開示された方法に有用であると考えられる。本発明から除外されるのは、クッシーら、ガルシア−エチェベリアらにより開示
されたｐ５３ペプチド、およびｐ５３へのｍｄｍ２の結合を阻害するファージディスプレイから誘導されるペプチド（Ｂｏｅｔｔｉｇｅｒ，Ｖ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  １３（１０）：２１４１−２１４７（１９９６））である。好ましい阻害剤は、好ましくは７００ダルトン以下そしてさらに好ましくは４５０ダルトン以下の小分子である。この性質を有する化合物の類の例は、米国仮出願番号６０／２７５，６２９号、米国仮出願番号６０／３３１，２３５号、米国仮出願番号６０／３７９，６１７号、および米国仮出願番号１０／０９７，２４９号の各明細書（それらの全体を本明細書中に編入する）中に開示された化合物を含む。
【００７１】
本明細書中で使用される場合に、原子、分子、または化学基の会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）に関連して使用された場合の「結合（ｂｉｎｄ）」、「結合（ｂｉｎｄｉｎｇ）」、「結合（ｂｏｎｄ）」、または「結合（ｂｏｎｄｅｄ）」の用語は、２個もしくはそれ以上の原子、分子、または化学基のいずれかの物理的接触または会合を指す。
【００７２】
本明細書中で使用される場合に、「共有結合」または「原子価結合」の用語は、結合分子により通常は対を形成して電子を共有して創成される分子内の２個の原子間の化学結合を指す。
【００７３】
本明細書中で使用される場合に、「非共有結合」の用語は、原子および／または分子の間の共有結合の形成に関与しない原子および／または分子の間の相互作用を指す。
【００７４】
本明細書中で使用される場合に、「本来のタンパク質」の用語は、その天然の出所または生物体から単離されたタンパク質のものと一致するアミノ酸配列を含んでなるタンパク質を指す。
【００７５】
特定の態様
詳細な態様
本発明は、ＨＤＭ２、もしくはフラグメント、またはそれらの標的構造モチーフまたは誘導体、および小分子阻害剤であるリガンドを含んでなる結晶を含む。一つの態様では、それらのフラグメントまた誘導体は、配列番号１（全長ＨＤＭ２のアミノ酸配列）、配列番号２（配列番号１のアミノ酸残基１７〜１１１）、配列番号３（配列番号１のアミノ酸残基２３〜１１４）、および配列番号４（Ｇｌｙ１６−配列番号２）から成る群から選択されるペプチドである。
【００７６】
別の態様では、該結晶は、Ｐ３２２１の三方晶系空間群およびＰ４３２１２の正方晶系空間群から成る群から選択される空間群である。異なる態様では、結晶は少なくとも約３．０Åの分解能まで原子座標の決定のためのＸ線を効果的に回折する。好ましい態様では、リガンドは結晶性形態である。非常に好ましい態様では、リガンドは、（４−クロロ−フェニル）−〔３−（４−クロロフェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−酢酸；〔８−クロロ−３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−（４−クロロ−フェニル）−酢酸）；および、それらの誘導体から成る群から選択される。
【００７７】
本発明は、配列番号２に少なくとも９５％配列一致を有するペプチドを含んでなるＨＤＭ２を含んでなる結晶も含む。好ましい態様では、配列番号２を含んでなる結晶は、表１もしくは表２の座標を特徴とする原子構造を含んでなる。別の好ましい態様では、結晶は、約９８．６Å、９８．６Åおよび７４．７Åの寸法、およびほぼアルファ＝９０°、ベータ＝９０°およびガンマ＝１２０°を有するセル；および約５４．３Å、５４．３Åおよび８３．３Åの寸法、およびほぼアルファ＝９０°、ベータ＝９０°およびガンマ＝９０°を有するセルから成る群から選択される単位セルを含んでなる。
【００７８】
本発明の別の局面では、本発明は（ａ）計算機読み取り可能な記憶媒体中に記憶された、ＨＤＭ２、もしくはフラグメント、またはその標的構造モチーフもしくは誘導体、および小分子阻害剤であるリガンドを含んでなる結晶の三次元構造に関する情報を含むデータベース、および（ｂ）情報を閲覧するためのユーザーインターフェース、を含んでなる計算機システムを含む。一つの態様では、情報は配列番号２を含んでなる結晶から得られた回折データを含んでなる。別の態様では、情報は配列番号２を含んでなる結晶形態の電子密度マップを含んでなる。別の態様では、情報が、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、表１もしくは表２の構造座標または相同構造座標を含んでなる。好ましい態様では、情報は、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、約０．７５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる構造座標を含んでなる。非常に好ましい態様では、情報が、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、アミノ酸Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７の表１もしくは表２従う構造座標をまたは該アミノ酸に類似の構造座標に含んでなる。別の態様では、情報が、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、アミノ酸Ｖａｌ５３、Ｌｅｕ５４、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｎ５９、Ｉｌｅ６１、Ｍｅｔ６２、Ｔｙｒ６７、Ｇｌｎ７２、Ｈｉｓ７３、Ｉｌｅ７４、Ｖａｌ７５、Ｐｈｅ８６、Ｐｈｅ９１、Ｖａｌ９３、Ｌｙｓ９４、Ｇｌｕ９５、Ｈｉｓ９６、Ｉｌｅ９９、Ｔｙｒ１００、Ｉｌｅ１０３の構造座標または該アミノ酸に類似の構造座標をさらに含んでなる。
【００７９】
本発明は、（ａ）ＨＤＭ２を作用物質に暴露し、そして（ｂ）ＨＤＭ２アミノ酸残基Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７への該作用物質の会合を検出しそれにより電位を評価することを含んでなる、ＨＤＭ２と会合するための作用物質の電位を評価する方法も含む。本発明の一つの態様では、作用物質が仮想（ｖｉｒｔｕａｌ）化合物である。本発明の別の態様では、段階（ａ）が化合物の原子構造とＨＤＭ２の三次元構造との比較を含んでなる。異なる態様では、比較が、化合物とＨＤＭ２の少なくとも１個の結合部位との間のフィッティング操作を行う計算手段を使用することを含んでなる。好ましい態様では、結合部位は、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、該アミノ酸の表１もしくは表２の類似の構造座標に従うアミノ酸Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７の構造座標により規定される。別の異なる態様では、結合部位は、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、表１もしくは表２に従うアミノ酸Ｖａｌ５３、Ｌｅｕ５４、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｎ５９、Ｉｌｅ６１、Ｍｅｔ６２、Ｔｙｒ６７、Ｇｌｎ７２、Ｈｉｓ７３、Ｉｌｅ７４、Ｖａｌ７５、Ｐｈｅ８６、Ｐｈｅ９１、Ｖａｌ９３、Ｌｙｓ９４、Ｇｌｕ９５、Ｈｉｓ９６、Ｉｌｅ９９、Ｔｙｒ１００、Ｉｌｅ１０３の構造座標または該アミノ酸に類似の構造座標によりさらに規定される。非常に好ましい態様では、作用物質が結晶性配列番号２に暴露され、そして段階（ｂ）の検出が作用物質−配列番号２複合体の三次元構造を決定することを含んでなる。
【００８０】
本発明は、（ａ）ａａ１６−配列番号２を作用物質に暴露し、そして（ｂ）ａａ１６−配列番号２への該作用物質の会合のレベルを検出しそれにより電位を評価することを含んでなる、ａａ１６−配列番号２を有するペプチドと会合する作用物質の電位を評価する方法をさらに含む。一つの態様では、作用物質は仮想化合物である。
【００８１】
本発明は、（ａ）可能性があるアゴニストまたはアンタゴニストの設計または選択のために小分子阻害剤と共に同時結晶化されたＨＤＭ２の三次元構造を使用することを含んでなる、ＨＤＭ２に対する可能性があるアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法を含む。一つの態様では、表１もしくは表２の相当する原子座標の非水素原子位置上に重ねた場合に、三次元構造が、約１．５Åより小さい非水素原子の二乗平均偏差を含んでなる、表１の構造座標または類似の構造座標を特徴とする原子座標に相当する。別の態様では、本方法は、（ｂ）可能性があるアゴニストまたはアンタゴニストを合成し、そして（ｃ）可能性があるアゴニストまたはアンタゴニストをＨＤＭ２と接触させる段階をさらに含んでなる。
【００８２】
本発明は、（ａ）ＨＤＭ２の結晶のＸ線回折データを取得し、（ｂ）ＨＤＭ２と阻害剤との複合体のＸ線回折データを取得し、（ｃ）段階（ａ）で得られたＸ線回折データを段階（ｂ）で得られたＸ線回折データから差し引いてＸ線回折データにおける差異を取得し、（ｄ）段階（ａ）で得られたＸ線回折データに相当する位相を取得し、（ｅ）段階（ｄ）で得られた位相と段階（ｃ）で得られたＸ線回折データとにおける差異を用いて、阻害剤の差フーリエイメージを算出し、そして（ｆ）段階（ｅ）で得られた算出結果に基づいてＨＤＭ２に対する阻害剤の付着部位を決定することを含んでなる、ＨＤＭ２に対する阻害剤の付着部位の決定方法を含んでなる。
【００８３】
本発明は、（ａ）ＨＤＭ２および阻害剤を含んでなる結晶を取得し、（ｂ）結晶の原子座標を取得し、（ｃ）原子座標および１種もしくはそれ以上の分子モデル化技術を用いて阻害剤とＨＤＭ２との相互作用をいかにして改変するかを決定し、そして（ｄ）段階（ｃ）で得られた決定事項に基づいて阻害剤を改変して改変された阻害剤を作成することを含んでなる、改変された阻害剤の取得方法をさらに含んでなる。一つの態様では、結晶が、配列番号２を有するペプチド、配列番号３を有するペプチドおよび配列番号４を有するペプチドから成る群から選択されるペプチドを含んでなる。異なる態様では、１種もしくはそれ以上の分子モデル化技術が、グラフィック分子モデル化および計算化学から成る群から選択される。好ましい態様では、段階（ａ）が、阻害剤とＨＤＭ２アミノ酸残基Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７との相互作用を検出することを含んでなる。本発明の別の態様では、本発明は、この方法により同定されるＨＤＭ２阻害剤を含む。
【００８４】
本発明の別の態様では、本発明は、ＨＤＭ２アミノ酸残基Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７の構造座標により規定される結合ポケットまたは活性部位を含んでなる単離されたタンパク質フラグメントを含む。一つの態様では、単離されたフラグメントが固体支持体に結合される。
【００８５】
本発明の別の局面では、本発明はＨＤＭ２アミノ酸残基Ｓｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７の構造座標により規定される結合ポケットまたは活性部位を含んでなるフラグメントをコードする単離された核酸分子を含む。一つの態様では、ベクターは核酸分子を含んでなる。別の態様では、宿主細胞がベクターを含んでなる。本発明のさらに別の態様では、本発明は、フラグメントが発現される条件下で宿主細胞を培養することを含んでなる、タンパク質フラグメントを産生する方法を含む。本発明の別の態様では、本発明は（ａ）タンパク質分子フラグメントを作用物質に暴露し、そして（ｂ）フラグメントへの作用物質の会合のレベルを検出することを含んでなる、ＨＤＭ２と会合する作用物質をスクリーニングする方法を含む。本発明の別の態様では、本発明はタンパク質分子フラグメントを含んでなるキットを含む。
【００８６】
本発明の別の態様では、本発明は、（ａ）ＰＥＧおよびＮａＳＣＮを含んでなる適合する溶液中でＨＤＭ２ポリペプチドを該リガンドと接触させ、そして（ｂ）ＨＤＭ２ポリペ
プチド−リガンドの該生成複合体を該溶液から結晶化させることを含んでなる、ＨＤＭ２ポリペプチド−リガンドを含んでなる結晶複合体の作製方法を含む。一つの態様では、ＨＤＭ２ポリペプチドが配列番号２を有するポリペプチドである。別の態様では、ＰＥＧが１００〜１０００の平均分子量範囲を有し、ここで該ＰＥＧが約０．５％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖの範囲で溶液中に存在しそして該ＮａＳＣＮが約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭの範囲で溶液中に存在する。好ましい態様では、ＰＥＧが約４００の平均分子量を有しそして約２％ｗ／ｖで溶液中に存在しそして該ＮａＳＣＮが約１００ｍＭで溶液中に存在する。非常に好ましい態様では、溶液が、約１．８〜２．４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４および約１００ｍＭ緩衝液をさらに含んでなる。
【００８７】
本発明は、可能性がある阻害剤と一緒に、配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４から成る群から選択される配列を含んでなるペプチドを結晶化することを含んでなる、ＨＤＭ２および小分子阻害剤であるリガンドを含んでなる結晶を作製する方法をさらに含む。
【００８８】
本発明は、ａ）表１に従う原子座標により規定されるＨＤＭ２の三次元構造を用い、ｂ）該三次元構造中のＳｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７から選択される１個もしくはそれ以上のＨＤＭ２アミノ酸を異なるアミノ酸で置換して改変されたＨＤＭ２を作製し、ｃ）該三次元構造を用いて該可能性のある阻害剤を設計または選択し、ｄ）該可能性のある阻害剤を合成し、そしてｅ）該可能性のある阻害剤を基質の存在下で該改変されたＨＤＭ２と接触させて、ＨＤＭ２または該改変されたＨＤＭ２の阻害に関して該可能性のある阻害剤の能力を試験することを含んでなる、ＨＤＭ２の可能性がある阻害剤を同定する方法を含む。一つの態様では、１個もしくはそれ以上のアミノ酸残基の置換が、Ｖａｌ５３、Ｌｅｕ５４、Ｐｈｅ５５、Ｌｅｕ５７、Ｇｌｙ５８、Ｇｌｎ５９、Ｉｌｅ６１、Ｍｅｔ６２、Ｔｙｒ６７、Ｇｌｎ７２、Ｈｉｓ７３、Ｉｌｅ７４、Ｖａｌ７５、Ｐｈｅ８６、Ｐｈｅ９１、Ｖａｌ９３、Ｌｙｓ９４、Ｇｌｕ９５、Ｈｉｓ９６、Ｉｌｅ９９、Ｔｙｒ１００、およびＩｌｅ１０３から成る群から選択される配列番号２アミノ酸を置換することをさらに含んでなる。別の態様では、可能性がある阻害剤はデータベースから選択される。好ましい態様では、可能性がある阻害剤は新規に合成される。別の好ましい態様では、可能性がある阻害剤は公知の阻害剤から設計される。非常に好ましい態様では、該可能性のある阻害剤を設計または選択するために該三次元構造を使用する段階が、ａ）改変されたＨＤＭ２と会合できる化学的実体またはフラグメントを同定し、そしてｂ）同定された化学的実体またはフラグメントを単一分子内にアセンブルして該可能性のある阻害剤の構造を提供する段階を含んでなる。一つの態様では、可能性がある阻害剤が、配列番号４（Ｇｌｙ１６−配列番号２）の競合性阻害剤である。異なる態様では、可能性がある阻害剤が、配列番号４（Ｇｌｙ１６−配列番号２）の不競合性または非競合性阻害剤である。さらに別の態様では、阻害剤が該方法により同定される。
【００８９】
Ａ．ＨＤＭ２の三次元構造のモデル化
表１、表２中で提供される原子座標データまたは相同タンパク質から誘導された座標データをＨＤＭ２の三次元モデルを構築するために使用してもよい。いずれかの利用できる計算方法を三次元モデルを構築するために使用してもよい。出発点として、ＨＤＭ２またはＨＤＭ２相同体の結晶性バージョンにおける分子または原子の集合体（ａｓｓｅｍｂｌａｇｅ）から得たＸ線回折パターンが、結晶学およびＸ線回折技術の技術分野の熟練者には周知のツールを用いて電子密度マップ構築に使用できる。次いで、公開された出版物中の回折データおよび／または補足実験からのいずれかから取り出した追加の位相情報を再構築を完成するために使用してもよい。
【００９０】
電子密度の構築のためのＸ線回折データを収集、解析、および利用する基本概念および手順に関して、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ
ａｌ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，Ｔｈｅ  Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｉｎｃ．，Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，ＣＡ；Ｃａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８０，Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐａｒｔ  ＩＩ：Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ；Ａ．Ｔ．Ｂｒｕｎｇｅｒ，１９９３，Ｘ−Ｆｌｏｒ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１：Ａ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ｘ−ｒａｙ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ  ａｎｄ  ＮＭＲ，Ｙａｌｅ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒ．，Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ，ＣＴ；Ｍ．Ｍ．Ｗｏｏｌｆｓｏｎ，１９９７，Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｘ−ｒａｙ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ；Ｊ．Ｄｒｅｎｃｈ，１９９９，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｘ−ｒａｙ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｘｔ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ），Ｓｐｒｉｎｇｅｒ
Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ；Ｔｓｉｒｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｏｎｄｉｎｇ  ｉｎ  Ｃｒｙｓｔａｌｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｘ−ｒａｙ  Ｄｉｆｆｒａｃｔｉｏｎ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｔａｔｅ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｉｎｓｔ．ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｃｓ  Ｐｕｂ．；米国特許第５，９４２，４２８号明細書、米国特許第６，０３７，１１７号明細書、米国特許第５，２００，９１０号明細書および米国特許第５，３６５，４５６号明細書（“Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｃｒｙｓｔａｌ”）参照のこと（これらそれぞれは、その全体を引用することにより本明細書に編入される）。
【００９１】
分子モデル化の基本情報として、例えばＭ．Ｓｃｈｌｅｃｈｔ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ
Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  ＰＣ，１９９８，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ：Ｇａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐａｌｓ  ｏｆ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，１９９６，Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂ．Ｃｏｒｐ．：Ｎ．Ｃ．Ｃｏｈｅｎ（編集者），Ｇｕｉｄｅｂｏｏｋ  ｏｎ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｏｄｅｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，１９９６，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；およびＷ．Ｂ．Ｓｍｉｔｈ，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，１９９６を参照のこと。分子モデル化の詳細な情報を提供する米国特許には、米国特許第６，０９３，５７３号、第６，０８０，５７６号、第６，０７５，０１４号、第６，０７５，１２３号、第６，０７１，７００号、第５，９９４，５０３号、第５，６１２，８９４号、第５，５８３，９７３号、第５，０３０，１０３号、第４，９０６，１２２号および第４，８１２，１２号の各明細書参照のこと（これらそれぞれは、その全体を引用することにより本明細書に編入される。
【００９２】
Ｂ．関係するリガンドを同定および設計するための原子座標の利用方法
本発明の原子座標、例えば表１、表２、表３に記載のものまたは表１、表２、もしくは表３のものと本質的に一致もしくは相同的な座標は、ＨＤＭ２の三次元モデルを作成するためならびにＨＤＭ２リガンド、阻害剤もしくはアンタゴニストもしくはアゴニスト分子を同定および設計するために利用できるいずれの方法と一緒に使用してもよい。
【００９３】
例えば、三次元モデル化は、Ｘ線回折パターンから誘導される実験的に決定される座標、例えば表１もしくは表２中のものを用いて実行してもよく、ここでかかるモデル化には、実際の構造の図の作図、実際の構造の物理的モデルの構築、および座標を用いる関連サブユニットおよびＨＤＭ２／リガンドおよびＨＤＭ２サブユニット／リガンドの構造の決定を含むがこれらに限定はされない。かかる分子モデル化は、ＨＤＭ２の三次元構造に相当する原子座標を生成するために公知のＸ線回折分子モデル化アルゴリズムまたは分子モデル化ソフトウエアを使用できる。
【００９４】
上記のように、分子モデル化は、公知の結晶構造に配列として同定できるように関連する分子の実際的なモデルを構築するために、計算方法、好ましくは計算機支援方法の使用を含む。それは、ＨＤＭ２およびまたは公知のリガンドもしくは阻害剤と複合したＨＤＭ２の構造から出発して、ＨＤＭ２に結合する新規の小分子阻害剤をモデル化することも含む。リガンドモデル化に使用される方法は、分子グラフィックス（すなわち３Ｄ表示）からリガンドの結合もしくはリガンドの活性に関する予測を立てるための計算化学（すなわち物理的および化学的性質の計算）に；新規のリガンドの設計に；および化学合成のための薬剤のようなリガンドを含む新規分子の予測に、集合的に合理的薬剤設計と呼ばれる方法にまで及ぶ。
【００９５】
合理的薬剤設計への一つの接近方法は、活性部位に結合するであろう既知分子構造の探索である。分子モデル化を用いて、合理的薬剤設計プログラムは、ある酵素の活性部位内に適合するであろう薬剤の一連の各種分子構造を調査でき、そしてどの構造か部位に実際に良く適合するかを決定できる三次元環境内で移動させることができる。例えば、米国特許出願番号６０／２７５，６２９号；６０／３３１，２３５号；６０／３７９，６１７号；および１０／０９７，２４９号の各明細書参照のこと。例えば表１、２および３内のデータも参照のこと。
【００９６】
別ではあるがしかし関連する合理的薬剤設計方法は、ＨＤＭ２と追加的に有利な相互作用を行うために努力して、小分子リガンドとの複合体の既知構造から出発しそして該小分子の改変されたをモデル化する。
【００９７】
本発明は、設計するための分子および計算機モデル化技術の使用および例えば小分子アゴニストもしくはアンタゴニストまたはＨＤＭ２と相互作用するその他の治療用作用物質の選択および設計を含む。かかる作用物質は、１，４ベンゾジアゼピン類およびそれらの誘導体を含むがこれらに限定はされない。例えば、本明細書中に記述する本発明は、ＨＤＭ２の活性部位もしくはその他の領域の全て、もしくはその一部分に結合することにより少なくとも１種のＨＤＭ２機能の競合的阻害剤として作用するリガンドの設計を含む。
【００９８】
本発明は、ＨＤＭ２の少なくとも１種の機能の非競合的阻害剤として作用する化合物の設計も含む。それらの阻害剤は、基質にすでに結合しているＨＤＭ２の活性部位もしくはその他の領域の全て、またはその一部分に結合してもよく、そしてＨＤＭ２活性部位に競合する競合的阻害剤よりもさらに強力でありそして非特異性が低くてもよい。同様に、他の化学的実体に結合されるかどうかにかかわらず、ＨＤＭ２に結合しそしてその少なくとも一つの機能を阻害する不競合性阻害剤は、本発明のＨＤＭ２またはＨＤＭ２を含んでなる複合体の原子座標を用いて設計してもよい。
【００９９】
本発明の原子座標は、候補阻害剤および／または活性化剤とＨＤＭ２との間の相互作用のための最適部位を決定するために、種々の化学的特徴からなる分子とのＨＤＭ２の結晶をプローブするために必要な情報も提供する。例えば、溶剤で飽和した結晶から得た高分解能Ｘ線回折データは、溶剤分子の各タイプが付着する場所の決定を可能とさせる。次いで、それらの部位に結合する小分子を設計および合成して阻害活性に関して試験できる（Ｔｒａｖｉｓ，Ｊ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６２：１３７４（１９９３））。
【０１００】
本発明は、ＨＤＭ２に全体としてまたは部分的に結合できる化学的実体、作用物質、リガンド、または化合物の小分子データベースおよびライブラリーを計算機によりスクリーニングする方法も含む。このスクリーニングにおいて、結合部位または複数の部位へのか
かる実体または化合物の適合の質は、形状相補性によりまたは推定された相互作用エネルギーのいずれかにより判定してもよい（Ｍｅｎｇ，Ｅ．Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍａ．Ｃｈｅｍ．１３：５０５−５２４（１９９２））。
【０１０１】
本発明によるＨＤＭ２の機能活性を促進または阻害するように結合する化合物の設計は、一般的に二つの因子への考慮を含む。第一には、化合物が、ＨＤＭ２と物理的および構造的に会合できなければならない。ＨＤＭ２と化合物との会合に重要な非共有結合分子相互作用は、水素結合、ファンデルワールスおよび疎水性相互作用を含む。第二には、化合物はＨＤＭ２との会合を可能とする立体配座を取ることができなければならない。化合物のある部分はＨＤＭ２との会合に直接的に関与しないけれども、それらの部分は分子の全体的立体配座に影響するであろう。一方、これは結合親和性、治療効力、薬剤類似品質および力価に著しく影響することもある。かかる立体配座の要求は、ＨＤＭ２の活性部位またはその他の領域のすべてまたは一部分と関連する化学的実体または化合物の全体的三次元構造および定位、またはＨＤＭ２と直接的に相互作用する数種の化学実体を含んでなる化合物の機能性基の間の間隔を含む。
【０１０２】
ＨＤＭ２上のリガンドまたはその他の化合物の電位、予測、阻害性アゴニスト、アンタゴニストまたは結合効果は、実際の合成および試験の前に計算機モデル化技術の使用により解析されてもよい。与えられた化合物の理論的構造がそれとＨＤＭ２との間の不十分な相互作用および会合を示唆する場合には、化合物の合成および試験を避けてもよい。しかし、計算機モデル化が強い相互作用を示す場合には、分子を合成しそしてＨＤＭ２と相互作用するその能力に関して試験されてもよい。この様式で、作用がない化合物の合成を回避してもよい。いくつかの場合には、ＨＤＭ２の特定部位と相互作用する化合物のためのＳＡＲ（構造−活性相関）を発展させるために、不活性化合物をモデル化で予測されたように合成しそして試験してもよい。
【０１０３】
当該技術分野の熟練者は、ＨＤＭ２と、さらに特定するとＨＤＭ２の個別結合ポケットまたは活性部位と会合するためのそれらの活性に関して化学的実体フラグメント、化合物または作用物質をスクリーニングするための数種の方法の一つを使用してもよい。このプロセスは、例えば、ＨＤＭ２またはリガンドと複合したＨＤＭ２の原子座標に基づく計算機スクリーン上の活性部位の目視検査から開始されてもよい。選択された化学的実体、化合物、または作用物質は、種々の定位で位置されるか、またはＨＤＭ２の個別結合ポケット内にドッキングされてもよい。ドッキングは、Ｑｕａｎｔａ  ａｎｄ  Ｓｙｂｙｌのようなソフトウエアを用い、次いで標準分子機構力場を用いるエネルギー最小化および分子力学、例えばＣＨＡＲＭＭおよびＡＭＢＥＲにより達成されてもよい。
【０１０４】
専門の計算機プログラムが化学的実体を選択するプロセス中で支援してもよい。それらには下記が含まれるがこれらに限定はされない：ＧＲＩＤ（Ｇｏｏｄｆｏｒｄ，Ｐ．Ｊ．，“Ａ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃａｌｌｙ  Ｆａｖｏｒａｂｌｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，”Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２８：８４９−８５７（１９８５）、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫから入手可能）；ＭＣＳＳ（Ｍｉｒａｎｋｅｒ，Ａ．ａｎｄ  Ｍ．Ｋａｒｐｌｕｓ，“Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ  Ｍａｐｓ  ｏｆ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅｓ：Ａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｃｏｐｙ  Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｍｅｔｈｏｄ．”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １１：２９−３４（１９９１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓから入手可能）；ＡＵＴＯＤＯＣＫ（Ｇｏｏｄｓｅｌｌ，Ｄ．Ｓ．ａｎｄ  Ａ．Ｊ．Ｏｌｓｅｎ，“Ａｕｔｏｍａｔｅｄ  Ｄｏｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  Ｓｉｍｕｌａｔｅｄ  Ａｎｎｅａｌｉｎｇ”Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：１９５−２０２（１９９０）、Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡから入手可能）；およびＤＯＣＫ（Ｋｕｎｔｚ，Ｉ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｇｅｏｍｅｔｒｉｃ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ−Ｌｉｇａｎｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６１：２６９−２８８（１９８２）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡから入手可能）。
【０１０５】
種々の官能基特性を有するプローブと巨大分子表面との間の可能性がある相互作用部位を決定するプログラムであるＧＲＩＤのようなソフトウエアの使用は、類似の阻害性タンパク質または化合物の構造を決定するために表面部位を解析するために利用される。プローブとして分子上の適当な阻害剤の基または化合物（例えばプロトン化一級アミン）を使用するＧＲＩＤ計算は、適切なエネルギー等高線レベルで接近可能な位置の周囲の電位ホットスポットを同定するために使用される。プログラムＤＯＣＫは、活性部位またはリガンド結合部位を解析しそして相補的立体性質を有するリガンドを示唆するために使用されてもよい。
【０１０６】
適合する化学的実体、化合物または作用物質が選択されると、それらは単一のリガンドまたは化合物または阻害剤または活性化剤内にアセンプルできる。アセンブリーは、三次元イメージ上でフラグメント相互の関連を目視検査して進めてもよい。これは、ＱｕａｎｔａまたはＳｙｂｙｌのようなプログラムを用いて手作業のモデル構築により続けてもよい。
【０１０７】
個別の化学的実体、化合物、または作用物質の連結を支援するために有用なプログラムは、下記を含むがこれらに限定はされない：ＣＡＶＡＥＴ（Ｂａｒｔｌｅｔｔ，Ｐ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｃａｖｅａｔ：Ａ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ｔｏ  Ｆａｃｉｌｉａｔｅ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．”Ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｂｌｅｍｓ，Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｐｕｂ．，Ｒｏｙａｌ  Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，７８，ｐｐ８２−１９６（１９８９））；三次元ＤＮＡベース、例えばＭＡＣＣＳ−３Ｄ（ＭＤＬ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ，ＣＡおよびＭａｒｔｉｎ，Ｙ．Ｃ．，“３Ｄ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｓｅａｒｃｈｉｎｇ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ”，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：２１４５−２１５４（１９９２）；およびＨＯＯＫ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓから入手可能）。
【０１０８】
ファーマコフォア（ｐｈａｒｍａｃｏｐｈｏｒｅ）仮説を試験しそしてスクリーニングのための化合物を選定する三次元データベースをサーチする数種の方法が利用できる。それらには、プログラムＣＡＶＥＡＴ（Ｂａｃｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２５：８４９−８５８（１９９２）が含まれる。例えば、ＣＡＶＥＡＴは、すでに活性位置にあるいずれかの数の化学的フラグメントを結合するための「スペーサー」として作用する環状化合物のデータベースを使用する。これは、緊密な結合に必要と既知または予想されるフラグメントを結合する数百の可能な方法を、当該技術分野の熟練者に迅速のために生成させる。
【０１０９】
上記のようにＨＤＭ２の阻害剤活性化剤、アゴニストまたはアンタゴニストを一回の一つの段階方法により化学的実体として構築に進む代わりに、かかる化合物は、空いた活性化部位または場合により既知化合物のある部分を含むかのどちからを用いて全体として、
または「新規に」設計されてもよい。それらの方法は下記を含む：ＬＵＤＩ（Ｂｏｈｍ，Ｈ．−Ｊ．，“Ｔｈｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｐｒｏｇｒａｍ  ＬＵＤＩ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅ  Ｎｏｖｏ  Ｄｅｓｉｇｎ  ｏｆ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”，Ｊ．ＣｏｍＲ．Ａｉｄ．Ｍｏｌｅｃ．Ｄｅｓｉｇｎ，６，ｐｐ．６１−７８（１９９２）、Ｂｉｏｓｙｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡから入手可能）；ＬＥＧＥＮＤ（Ｎｉｓｈｉｂａｔａ，Ｙ．ａｎｄ  Ａ．Ｉｔａｉ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４７：８９８５（１９９１）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎから入手可能）；およびＬｅａｐＦｒｏｇ（Ｔｒｉｐｏｌｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏから入手可能）。
【０１１０】
例えば、プログラムＬＵＤＩは、その中に水素結合および疎水性フラグメントの両者が位置する相互作用部位の表を決定できる。次いで、ＬＵＤＩは四つの異なる相互作用部位をフラグメントに結合するリンカーのライブラリーを使用する。次いで、より小さい「架橋」基、例えば−ＣＨ２−および−ＣＯＯ−がそれらのフラグメントを結合するために使用される。例えば、酵素ＤＨＦＲに対して、周知の阻害剤メトトレキセート（ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）内の鍵となる官能基の配置がＬＵＤＩにより再作成される。Ｒｏｔｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｕｒｃｋｏ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１７００−１７１０（１９９２）も参照のこと。
【０１１１】
その他の分子モデル化技術も本発明に従って使用してもよい。例えば、Ｃｏｈｅｎ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｏｄｅｌｉｎｇ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３３：８８３−８９４（１９９０）を参照のこと。Ｎａｖｉａ，Ｍ．Ａ．ａｎｄ  Ｍ．Ａ．Ｍｕｒｃｋｏ，“Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，”Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ
ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２，ｐｐ２０２−２１０（１９９２）も参照のこと。
【０１１２】
上記の方法により化合物が設計されるかまたは選択されると、化合物がＨＤＭ２と結合または会合するであろう親和性が、計算的評価によりおよび／または化合物を合成した後の生物学的活性の試験により試験および最適化されてもよい。阻害剤または化合物は、全体的結合エネルギーが類似する１個より多くの立体配座でＨＤＭ２と相互作用してもよい。それらの場合に、結合の変形エネルギーは、遊離化合物のエネルギーと、化合物がＨＤＭ２に結合した場合に観察される立体配座の平均エネルギーとの差と考えられる。
【０１１３】
ＨＤＭ２を結合または会合するとして設計または選択された化合物は、その結合状態において好ましくはＨＤＭ２との反発静電相互作用が欠失するように計算によりさらに最適化されてもよい。かかる非相補性（例えば静電性）相互作用は、反発性電荷−電荷、双極子−双極子および電荷−双極子相互作用を含む。特定すると、阻害剤が結合した場合の阻害剤とＨＤＭ２との間のすべての静電気相互作用の和は、好ましくは、結合エンタルピーに対して中立または有利な寄与となる。弱い結合性化合物は、ＳＡＲを決定するためにそれらの方法によっても設計される。例えば、米国特許出願番号６０／２７５，６２９号、６０／３３１，２３５号、６０／３７９，６１７号、および１０／０９７，２４９号の各明細書参照。
【０１１４】
特定の計算機ソフトウエアが化合物変形エネルギーおよび静電相互作用を評価するめに当該技術分野で利用できる。かかる使用のために設計されたプログラムの例は以下である：Ｇａｕｓｓｉａｎ９２、改定Ｃ（Ｍ．Ｊ．Ｆｒｉｓｃｈ，Ｇａｕｓｓｉａｎ  Ｉｎｃ．，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｐａ．，ＣＯＰＹＲＧＴ  １９９２）；ＡＭＢＥＲ、バージョン４．０（Ｐ．Ａ．Ｋｏｌｌｍａｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＯＰＹＲＧＴ  １９９４）；ＱＵＡＮＴＡ／ＣＨＡＲＭＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｍｕｌａｔｉｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｍａｓｓ．ＣＯＰＹＲＧＴ  １９９４）；およびＩｎｓｉｇｈｔ  ＩＩ／Ｄｉｓｃｏｖｅｒ（Ｂｉｏｓｙｓｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．ＣＯＰＹＲＧＴ  １９９４）。その他のハードウエア  システムおよびソフトウエアパッケージは当該技術分野の熟練者には公知である。
【０１１５】
ＨＤＭ２と会合する化合物が上記のようにして最適に選択または設計されると、その結合性を改善または変更するためにその原子または側鎖のいくつかで置換を行ってもよい。一般的に、最初の置換は、保存的、すなわち置換基が当初の基とほぼ同じ大きさ、形状、疎水性および電荷を有する。勿論、立体配座を改変すると当該技術分野では公知の成分は回避されることが理解されるべきである。次いで、かかる置換された化学化合物は、上記に詳細に記載したと同じ計算機的方法によりＨＤＭ２への適合の効率を解析されてもよい。
【０１１６】
Ｃ．ＨＤＭ２に対して調節された結合または活性を有するリガンドを設計するための相同構造モデル化の使用
本発明は、出発化合物、例えば（４−クロロ−フェニル）−〔３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−酢酸；〔８−クロロ−３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−（４−クロロ−フェニル）−酢酸；および標的酵素に対してさらに緊密に結合またはさらに特異的に相互作用するそれらの誘導体に対する改変されたを設計するためのＨＤＭ２および／または阻害剤と複合したＨＤＭ２の原子座標および構造の使用を含む。例えば、化合物１および２およびそれらの誘導体を開示する米国仮出願番号６０／２７５，６２９号、６０／３３１，２３５号、６０／３７９，６１７号、および１０／０９７，２４９号の各明細書（それらの全体を本明細書に編入する）を参照のこと。
【０１１７】
化合物１（３３８４３７）：（４−クロロ−フェニル）−〔３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−酢酸
【０１１８】
【化１】
2008501315.tif 000003
【０１１９】
化合物２（８７６２７３）：〔８−クロロ−３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−（４−クロロ−フェニル）−酢酸
【０１２０】
【化２】
2008501315.tif 000004
【０１２１】
ＨＤＭ２と出発化合物との複合体の構造は、適用できる工業界およびその他の使用物（例えば薬剤）のためのその他の望ましい性質、例えば化学的安定性、溶解度または膜透過性を有する新規化合物を作製するためにその化合物の改変されたを誘導するために使用できる。（Ｌｉｐｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．２３：３（１９９７））。
【０１２２】
結合性化合物、アゴニスト、アンタゴニストおよび当該技術分野で公知のものは、ｐ５３ペプチドおよび小分子アンタゴニストを含むが、これらに限定はされない。例えば、米国特許出願番号６０／２７５，６２９号、６０／３３１，２３５号、６０／３７９，６１７号および１０／０９７，２４９号の各明細書（その全体を引用することにより本明細書に編入する）参照のこと。かかる化合物は、ＨＤＭ２の安定化された結晶内に拡散またはそれで含浸して、Ｘ線回折データ採取のための複合体を形成できる。あるいは、当該技術分野で公知または未知の化合物は、沈降の前に化合物とＨＤＭ２とを混合してＨＤＭ２と共に共結晶化できる。
【０１２３】
用途に合わせた高親和性そして非常に特異性の化合物を作製するために、ＨＤＭ２の構造は、選択された非標的分子および非標的分子の同じ位置での残基に対するリガンドの結合部位で残基の構造を変化させて構成したハイブリッドの構造と比較できる。このモデル化が達成されるプロセスは相同性構造モデル化と称される。これは計算により既知構造の分子または標的の側鎖を除去しそして立体的にもっともらしい位置に置かれた未知構造の側鎖でそれらを置換して行われる。この方法で、標的および非標的分子の活性部位キャビティーの形状がどのように異なるかが理解できる。従って、このプロセスは、所望の標的分子に緊密にそして特異的に結合するがしかし同時に非標的分子への結合が立体的に阻止される化合物を作製するために、結合リガンドがいかに化学的に改変できるかに関する情報を提供する。同様に、溶剤に面する結合リガンドの部分の知識は、追加の製薬学的目的のための他の官能基の導入を可能とするであろう。非標的分子に対するよりもさらに緊密に標的分子に新たに結合する分子（リガンド）を設計するための相同構造モデル化の使用は、広範な適用性を有する。
【０１２４】
Ｄ．高処理量アッセイ
いずれの高処理量スクリーニングも、ＨＤＭ２と相互作用する能力を同定または設計される新規化合物を試験するために利用されてもよい。高処理量スクリーニングに関する一般的情報については、例えば、Ｄｅｖｌｉｎ，１９９８，Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ；および米国特許第５，７６３，２６３号明細書参照のこと。高処理量アッセイは、以下に記載するものを含みこれらに限定はされない１種もしくはそれ以上の種々のアッセイ技術を使用する。
【０１２５】
免疫診断および免疫アッセイ。それらの相補性抗原に対して適合させて調製および選択された抗体により示される特異性および高い親和性に依存する、生物学的液体のような複合体混合物の通常は低濃度の中の特定の生物化学物質の測定のために使用される技術のグループがある。測定される物質は、必要な場合には、抗原性もしくは免疫原性巨大分子ま
たはハプテン性小分子でなければならない。各試料に対して、既知で限定された量の特異性抗体が加えられそして、多くの場合に結合：遊離比として表される、それと結合する抗原の割合を推定し、それには指示薬として放射性同位元素（放射免疫アッセイ）、蛍光分子（蛍光免疫アッセイ）、安定な遊離基（スピン免疫アッセイ）、酵素（酵素免疫アッセイ）、またはその他の容易に識別できる標識を用いて標識された抗原の形態が用いられる。
【０１２６】
抗体は、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、化学発光免疫アッセイ（ＣＬＩＡ）、およびコロイド状金粒子を用いる抗体標識（免疫金法）を含む種々の方法で標識できる。
【０１２７】
通常のアッセイフォーマットは、サンドイッチアッセイ、競合または競争アッセイ、ラテックス凝固アッセイ、同種アッセイ、マイクロタイタープレートフォーマットおよびミクロ粒子アッセイを含む。
【０１２８】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）。ＥＬＩＳＡは、放射能化学の危険および蛍光検出系の経費を避ける免疫化学技術である。なかでも、該アッセイは酵素を指示薬として使用する。ＥＬＩＳＡは、不溶性担持面上に結合された抗体（または抗原）を使用し、それを次いで試験溶液中の関連する抗原（または抗体）を「捕捉」するために使用することに基づく定量的免疫アッセイの一つの形態である。次いで、予め抗原（または抗体）に共有結合で結合させた適切な酵素の活性を測定して抗原−抗体複合体を検出する。
【０１２９】
ＥＬＩＳＡ技術に関する情報については、例えば、Ｃｒｏｗｔｈｅｒ，（１９９５）ＥＬＩＳＡ−Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃｈａｌｌａｃｏｍｂｅ
＆  Ｋｅｍｅｎｙ，（１９９８）ＥＬＩＳＡ  ａｎｄ  Ｏｔｈｅｒ  Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｓ−Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｓｐｅｃｔｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ；Ｋｅｍｅｎｙ，（１９９１）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ＥＬＩＳＡ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｅｓｓ；Ｉｓｈｉｋａｗａ，（１９９１）Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  Ｒａｐｉｄ  Ｅｎｚｙｍｅ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照のこと。
【０１３０】
酵素の比色アッセイ。比色法は、多くの場合に比色計を用いて、化合物の標準および試験量の双方と試薬との反応により発生する色を比較して化合物の濃度または量を決定する定量的化学分析方法である。比色計は、目視または光電的に色強度または色強度の差異を測定する装置である。
【０１３１】
ベータ−ガラクトシダーゼ酵素活性の標準比色アッセイは、当該技術分野の熟練者には周知である（例えばＮｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：２８１−２９０（１９８５）参照）。比色アッセイは、標準比色ベータ−ガラクトシダーゼアッセイにおいて、基質としてＯ−ニトロフェニル−ベータ−Ｄ−ガラクトピラノシド（ＯＮＰＧ，Ｓｉｇｍａ）を用いる全細胞溶解物について行うことができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）。自動化された比色アッセイもベータ−ガラクトシダーゼ活性の検出に利用でき、これは米国特許第５，７３３，７２０号明細書中に記載されている。
【０１３２】
免疫蛍光アッセイ。免疫蛍光まさは免疫蛍光顕微鏡検査は、抗原または抗体が蛍光染料
への結合により蛍光性とされそして組織切片または塗抹標本中の相補性抗体または抗原と反応させる技術である。次いで、抗原または抗体の位置は、紫外光下の顕微鏡検査により蛍光を観察して決定できる。
【０１３３】
免疫蛍光技術の一般的情報としては、例えばＫｎａｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７８）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｓｔａｉｎｉｎｇ
Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；Ａｌｌａｎ，（１９９９）ＰｒｏｔｅｉｎＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ−Ａ
Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｔｈｅ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｓｅｒｉｅｓ）Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｃａｕｌ，（１９９３）Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓを参照のこと。本発明に適用できる免疫蛍光技術の詳細説明は、米国特許第５，９１２，１７６号明細書、米国特許第５，８６９，２６４号明細書、米国特許第５，８６６，３１９号明細書、および米国特許第５，８６１，２５９号明細書を参照のこと。
【０１３４】
Ｅ．データベースおよび計算機システム
ＨＤＭ２またはその一部分の計算機分子モデル化に有用なＨＤＭ２のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列および／またはＸ線回折データは、その使用を容易にするために種々の媒体中で「提供」され得る。本明細書中で使用される場合に、「提供」とは、例えば、本発明のアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列および／またはＸ線回折データから誘導される原子座標、例えばＨＤＭ２、その代表的なフラグメント、もしくはその相同体のアミノ酸またはヌクレオチド配列を含む作成を指す。かかる方法は、そのサブドメインも含めて、ＨＤＭ２または関連分子の三次元構造を解析および分子モデル化を熟練した技術者に可能とさせる形態でアミノ酸配列および／またはＸ線回折データを提供する。
【０１３５】
本態様の一つの適用では、本発明のＨＤＭ２、またはその少なくとも１個のサブドメイン、アミノ酸および核酸配列および／またはＸ線回折データに関連するデータを含んでなるデータベースが計算機で読み取り可能な媒体に記憶される。本明細書中で使用される場合に、「計算機で読み取り可能な媒体」とは、計算機により直接読み取りおよびアクセスできるいずれかの媒体を指す。かかる媒体には、それらに限定はされないが、磁気記憶媒体、例えばフロッピーディスク、ハードディスク記憶媒体、および磁気テープ；光記憶媒体、例えば光ディスクまたはＣＤ−ＲＯＭ、電気記憶媒体、例えばＲＡＭおよびＲＯＭ；およびそれらの分類のハイブリッド、例えば磁気／光記憶媒体を含む。熟練者は、いずれかの現在公知の計算機で読み取り可能な媒体が、本発明のアミノ酸配列および／またはＸ線回折データをその上に記録した計算機で読み取り可能な媒体を含んでなる作製物を創成するためにどのようにして使用できるかを容易に認めることができる。
【０１３６】
本明細書中で使用される場合に、「記録する」とは、計算機で読み取り可能な媒体上に情報を記憶するためのプロセスを指す。熟練者は、本発明のアミノ酸配列および／または原子座標／Ｘ線回折データ情報を含んでなる作製物を生成するために計算機で読み取り可能な媒体上に情報を記録する現在公知の方法のいずれかを容易に採用できる。
【０１３７】
本発明のアミノ酸配列および／または原子座標／Ｘ線回折データをその上に記録された計算機で読み取り可能な媒体を創成するために、熟練者には各種のデータ記憶構造物が利用できる。データ記憶構造体の選択は、記憶されたデータへのアクセスに選択される手段に一般的に基づく。さらに、種々のデータ処理プログラムおよびフォーマットが、計算機で読み取り可能な媒体上の本発明の配列およびＸ線回折データ情報を記憶するために使用できる。配列情報は、市場で利用できるソフトウエア、例えばＷｏｒｄＰｅｒｆｅｃｔお
よびＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  Ｗｏｒｄ中にフォーマットされたワード処理テキストファイルで表されるか、またはＡＳＣＩＩファイルの形態で表され、データベースアプリケーション、例えばＤＢ２、Ｓｙｂａｓｅ、Ｏｒａｃｌｅなど内に記憶されることができる。熟練者は、本発明の情報をその上に記録された計算機で読み取り可能な媒体を得るためにいずれかの数のデータ処理構築フォーマット（例えばテキストファイルまたはデータベース）を容易に採用できる。
【０１３８】
Ｘ線回折データに基づく配列および／または原子座標を有する計算機で読み取り可能な媒体を提供して、熟練者は、関連する分子、サブドメイン、擬似体、またはそのリガンドをモデル化するために配列および原子座標またはＸ線回折データに日常的にアクセスできる。計算機アルゴリズムは、計算機で読み取り可能な媒体中に提供されるこのデータにアクセスしそして分子モデル化および／またはＲＤＤ（合理的薬剤設計）のためにそれを解析することを熟練者に可能とさせるように公開され市場で入手できる。例えばＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒｙ，ＭａｒｙＡｎｎ  Ｌｉｅｂｅｒｔ  Ｐｕｂｌ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９５５）参照のこと。
【０１３９】
本発明は、本明細書中に記載の配列および／または回折データを含むシステム、特には計算機に基づくシステムをさらに提供する。かかるシステムは、ＨＤＭ２またはその少なくとも一つのサブドメインに対する構造決定およびＲＤＤを実行するために設計されている。限定ではない例は、Ｕｎｉｘ  ｂａｓｅｄ、Ｗｉｎｄｏｗｓ  ＮＴまたはＩＢＭ  ＯＳ／２オペレーティングシステムで機能するＳｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ＩｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄおよびＳｕｎ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓから入手できるマイクロ計算機ワークステーションである。
【０１４０】
本明細書中で使用される場合に、「計算機に基づくシステム」とは、本発明の配列および／またはＸ線回折データを解析するために使用されるハードウエア手段、ソフトウエア手段、およびデータ記憶手段を指す。本発明の計算機に基づくシステムの最低ハードウエア手段は、中央処理装置（ＣＰＵ）、入力手段、出力手段、およびデータ記憶手段を含んでなる。熟練者は、本発明において使用するために現在利用できる計算機に基づくどのシステムが適当であるかを容易に認めることができる。可視化システム、例えばモニターは、構造データを可視化するために場合により利用される。
【０１４１】
上記のように、本発明の計算機に基づくシステムは、本発明の配列および／または原子座標／Ｘ線回折データをその中に記憶したデータ記憶手段および解析手段を支援および実行するために必要なハードウエア手段およびソフトウエア手段を含んでなる。本明細書中で使用される場合に、「データ記憶手段」とは、本発明の配列もしくは原子座標／Ｘ線回折デーを記憶できる記憶媒体、または本発明の配列もしくはＸ線データをその上に記録した作製物にアクセスできる記憶媒体アクセス手段を指す。
【０１４２】
本明細書中で使用される場合に、「サーチ手段」または「解析手段」とは、標的配列または標的構造モチーフをデータ記憶手段内に記憶されている配列またはＸ線データと比較するための計算機に基づくシステムを実行する１種もしくはそれ以上のプログラムを指す。サーチ手段は、特定の標的配列または標的モチーフとマッチするタンパク質のフラグメントまたは領域を同定するために使用される。各種の公知アルゴリズムが公開して開示されそしてかかるサーチ手段を実行するために市場で入手できる各種のソフトウエアが存在しそして本発明の計算機に基づくシステムで使用できる。熟練者は、計算機解析を実行するために利用できるアルゴリズムまたは実行ソフトウエアパッケージのいずれもこの計算機に基づくシステムに使用されるために採用できることを容易に認めることができる。
【０１４３】
本明細書中で使用される場合に、「標的構造モチーフ」または「標的モチーフ」とは、
配列が標的モチーフの折り畳みで形成される三次元立体配座または電子密度マップに基づいて選択される配列のいずれかの合理的に選択れた配列または配列の組み合わせを指す。当該技術分野で公知の各種の標的モチーフがある。タンパク質標的モチーフは、それらに限定はされないが、酵素活性部位、阻害剤結合部位、構造サブドメイン、エピトープ、機能ドメインおよびシグナル配列を含む。同様のモチーフはＲＮＡに関しても公知である。入力および出力手段のための各種の構造フォーマットが、本発明の計算機に基づくシステム内の情報の入力および出力のために使用できる。
【０１４４】
各種の比較手段が、原子座標／Ｘ線回折データから一部誘導された構造モチーフまた電子密度マップを同定するために、標的配列もしくは標的モチーフとデータ記憶手段とを比較するために使用できる。熟練者は、公開で利用できる計算機モデル化プログラムのいずれか一つが、本発明の計算機に基づくシステムのためのサーチ手段として使用できることを容易に認めることができる。
【０１４５】
Ｆ．標的分子フラグメントおよび部分
ＨＤＭ２のフラグメント、例えばＳｅｒ１７、Ｉｌｅ１９、Ｌｅｕ８２およびＡｒｇ９７から成る群から選択される２個もしくはそれ以上のアミノ酸により決定される活性部位を含んでなるフラグメントは、合成および組換え手段を含むいずれかの利用できる手段により調製されてもよい。次いで、かかるフラグメントは、上記のアッセイ、例えばフラグメント内の予定作用物質と活性部位との間の相互作用を検出するための高処理量アッセイで使用されてもよい。
【０１４６】
本発明のフラグメントの組換え発現または産生のために、フラグメントをコードする核酸分子が調製されてもよい。本明細書中で使用される場合に、「核酸」とは、上記に定義されたタンパク質またはペプチドをコードするか、またはかかるペプチドをコードする核酸に相補性であるか、または適切なストリンジェンシー条件下でかかる核酸にハイブリダイズしそしてそれに安定して結合を続けるＲＮＡもしくはＤＮＡとして定義される。
【０１４７】
本発明のフラグメントをコードする核酸分子は、遺伝子コードの縮退の結果、配列が異なってもよく、またはアミノ酸配列が異なるタンパク質もしくはタンパク質フラグメントをコードするので配列が異なってもよい。２個またはそれ以上のかかる核酸分子間の相同性または配列一致は、配列類似性サーチのために適応されているプログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘ（Ｋａｒｌｉｎ
ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）およびＡｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６：２９０−３００（１９９３）、引用することにより全体を編入する）により使用されるアルゴリズムを用いるＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）解析により決定される。
【０１４８】
ＢＬＡＳＴプログラムにより使用される方法は、探索配列とデータベース配列との間の類似セグメントを最初に考慮し、次いで同定された完全マッチの統計的有意性を評価し、そして最後に事前に選択された有意性の閾値を満足するマッチを総合するものである。配列データベースの類似定サーチにおける基本的問題の考察に関しては、アルトシュルら（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．６，１１９−１２９（１９９４）、引用することにより全体を編入する）を参照のこと。ヒストグラム、デスクリプション、アラインメント、エクスペクト（すなわちデータベース配列に対するマッチを報告する統計的有意閾値）、カットオフ、マトリックスおよびフィルターのサーチパラメーターは、デフォールト設定である。ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘにより使用されるデフォールト評点マトリックスは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスである（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５−１０９１９（１９９２）、引用することにより全体を編入する）。４個のｂｌａｓｔｎパラメーターは以下のように調整される：Ｑ＝１０（ギャップ創成ペナルティー）；Ｒ＝１０（ギャップ延長ペナルティー）；ｗｉｎｋ＝１（探究に沿ってそれぞれのｗｉｎｋｔｈ位置でのワードヒットを生成する）、およびｇａｐｗ＝１６（ギャップド・アラインメントが生成されるウインドウ幅を設定する）。等価のＢｌａｓｔｐパラメーター設定は、Ｑ＝９；Ｒ＝２；ｗｉｎｋ＝１；およびｇａｐｗ＝３２である。ＧＣＧパッケージ・バージョン１０．０内で利用できる配列間のＢｅｓｔｆｉｔ比較は、ＤＮＡパラメーターＧＡＰ＝５０（ギャップ創成ペナルティー）およびＬＥＮ＝３（ギャップ延長ペナルティー）を使用し、そしてタンパク質比較における等価設定はＧＡＰ＝８およびＬＥＮ＝２である。
【０１４９】
「ストリンジェント」条件とは、（１）洗浄のための低イオン強度および高温、例えば０．０１５Ｍ  ＮａＣｌ／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ＳＤＳの５０℃における使用または（２）例えばホルムアルデヒドのような改変された剤、例えばｐＨ６．５の０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコル（Ｆｉｃｏｌｌ）／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の５０％アホルムアミドを７５０ｍＭ  ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸ナトリウムと一緒に４２℃でハイブリダイゼーションの間に使用するものである。別の例は、５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．５）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハート（Ｄｅｎｈａｒｄｔ）溶液、音波処理したサケ精液（５０ｍｇ／ｍｌ）、０．１％ＳＤＳおよび１０％硫酸デキストランを４２℃で使用し４２℃で０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳ中で洗浄するものである。熟練者は、透明で検出可能なハイブリダイゼーションシグナルを得るために適当なストリンジェンシー条件を容易に決定および変更できる。
【０１５０】
本明細書中で使用される場合に、核酸分子が核酸の出所とは別のポリペプチドをコードする混成核酸から本質的に分離されている場合に、核酸分子は「単離」されたと称される。
【０１５１】
本発明のコード核酸分子（すなわち合成オリゴヌクレオチド）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のためのプローブまたは特異性プライマーとして、または本発明のタンパク質をコードする遺伝子配列を合成するために使用されるものは、化学技術、例えば、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉら（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１０３：１８５−３１９１（１９８１）のホスホトリエステル法によりまたは自動化合成方法を用いて容易に合成できる。さらに、より大きいＤＮＡセグメントは、周知の方法、例えば遺伝子の種々の調節セグメントを規定するオリゴヌクレオチドの群の合成、引き続く完全な改変された遺伝子を構築するためのオリゴヌクレオチドの連結により容易に調製できる。
【０１５２】
本発明のコード核酸分子は、診断およびプローブの目的のための検出可能な標識を含むようにさらに改変されたされてもよい。各種のかかる標識は当該技術分野では公知でありそして本明細書中に記載のコード分子と共に容易に使用できる。適合する標識は、それらに限定はされないが、ビオチン、放射能標識ヌクレオチドなどを含む。熟練者は、標識されたコード核酸分子を得るためにいずれかの当該技術分野で公知の標識を利用できる。
【０１５３】
本発明は、上記のようなタンパク質フラグメントのコード配列を含む組換えＤＮＡ分子（ｒＤＮＡ）をさらに提供する。本明細書中で使用される場合に、ｒＤＮＡ分子は、分子操作されたＤＮＡ分子である。ｒＤＮＡ分子を生成する方法は当該技術分野では周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）を参照されたい。好ましいｒＤＮＡ分子において、コードＤＮＡ配列は、発現制御配列および／またはベクター配列に操作可能に連結さ
れている。
【０１５４】
本発明のタンパク質コード配列の一つが操作可能に連結されているベクターおよび発現制御配列の選択は、当該技術分野では周知のように、所望の機能的性質（例えばタンパク質発現、および形質転換される宿主細胞）に直接に依存する。本発明のベクターは、宿主染色体内への複製または挿入、および多分、ｒＤＮＡ分子中に含まれる構造遺伝子の発現も指令できる。
【０１５５】
操作可能に連結されるタンパク質コード配列の発現を調節するために使用される発現制御要素は、当該技術分野では公知でありそして、それらに限定はされないが、誘導体プロモーター、構成性プロモーター、分泌シグナル、およびその他の調節要素を含む。好ましくは、誘導可能なプロモーターは、例えば宿主細胞の媒体内の栄養物に応答するように容易に制御される。
【０１５６】
本発明は、本発明のタンパク質フラグメントをコードする核酸分子を用いて形質転換された宿主細胞もさらに提供する。宿主細胞は、原核性または真核性のいずれであってもよい。細胞系統が細胞培養方法と相容性でありそして発現ベクターの増殖および遺伝子産物の発現と相容性である限り、本発明のタンパク質の発現のために有用な真核細胞は限定されない。好ましい真核宿主細胞は、それらに限定はされないが、酵母、昆虫および哺乳動物細胞、好ましくは脊椎動物細胞、例えばマウス、ラット、サルまたはヒト細胞系統からのものである。好ましい真核宿主細胞は、ＡＴＣＣからＣＣＬ６１として入手可能なチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＡＴＣＣからＣＲＬ１６８５として入手可能なＮＩＨスイスマウス胚細胞ＮＩＨ−３Ｔ３、乳児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）などの真核組織培養細胞系統を含む。
【０１５７】
本発明の形質転換された宿主細胞は、組換えタンパク質の産生を可能とする条件下で培養されてもよい。場合により、組換えタンパク質は媒体からまたは細胞から単離される。タンパク質の回収および精製は、ある不純物が容認できるような場合には必要ではないであろう。
【０１５８】
場合により特定のアッセイ、例えば上記のようなアッセイに必要な試薬と共に包装した上記の核酸分子、タンパク質フラグメント、ベクターおよび／または宿主細胞のいずれかを用いてキットを調製してもよい。かかるキット中で、タンパク質フラグメントまたはその他の試薬は、固体担体、例えばガラスまたはプラスチックビーズに付着させてもよい。
【０１５９】
Ｇ．本発明を利用する総合手順
分子モデル化は、ＨＤＭ２の擬似体およびリガンドの合理的薬剤設計（ＲＤＤ）のために本発明により提供される。上記のように、薬剤設計の例では、タンパク質上の部位と相互作用することが期待される可能性がある擬似体およびリガンドを決定する計算機モデル化プログラムを使用する。次いで、可能性のある擬似体またはリガンドは、活性および／または結合および／または相互作用に関してスクリーニングされる。ＨＤＭ２関連擬似体またはリガンドに対して、スクリーニングの方法は、ＨＤＭ２の少なくとも１種の生物学的活性、例えば公知方法段階によるｐ５３結合の遮断のようなアッセイより選択できる。例えば、Ｋｕｓｓｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４８−９５３（１９９６）；Ｂｏｔｔｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：７４４−７５６（１９９７）参照のこと。
【０１６０】
従って、本発明にり提供されるツールおよび方法論は、標的と望ましい様式で結合するリガンドを同定および設計するための手順中に使用されてもよい。かかる手順は、リガンドが合成、試験および特性決定される反復方法を利用する。新規のリガンドは、最初のリ
ガンドの試験および特性決定で得られた情報に基づいて設計でき、次いでかかる新規に同定されたリガンドは、それ自体を試験および特性決定できる。この一連のプロセスは、所望の結合性質を有するリガンドが得られるまで必要に応じて何回反復されてもよい。
【０１６１】
下記の段階が全体手順の例である。
【０１６２】
１．標的の生物学的活性（例えばｐ５３への結合）を選択する。
【０１６３】
２．選択した生物学的活性となんらかの様式で会合すると考えられるリガンドを同定する（例えばリガンドは既知活性の阻害剤であってもよい）。リガンドの活性は、生体内および／または実験室内的方法により試験されてもよい。
【０１６４】
本発明のリガンドは、それらに限定はされないが、標識抗体として検出可能に標識できる、脂質、核酸、化合物、タンパク質、元素、抗体、糖類、異性体、炭水化物、イメージング剤、脂タンパク質、糖タンパク質、酵素、検出可能なプローブ、抗体もしくはそれらのフラグメント、またはそれらのいずれかの組み合わせから選択される少なくとも１種であることができる。かかる標識は、それらに限定はされないが、酵素標識、放射性同位元素もしくは放射性化合物もしくは元素、蛍光性化合物もしくは金属、化学発光化合物および生物発光化合物を含む。あるいは、いずれかの他の公知の診断または治療薬剤が、本発明の方法に使用できる。次いで、標的と関連させて活性に関して適合する化合物を試験する。
【０１６５】
ＨＤＭ２とリガンドの間の複合体は、同時結晶化またはさらに一般的には結晶内に小分子リガンドを拡散させるかのいずれかで作製される。複合体結晶からのＸ線回折データを測定しそして差電子密度マップを算出する。このプロセスは、標的分子上の結合リガンドの正確な位置をもたらす。差フーリエ（ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ  Ｆｏｕｒｉｅｒ）は、測定された回折幅と、座標から算出されたそれらの反射の位相を用いて算出される。
【０１６６】
３．本発明の方法の使用。電子密度マップおよび／またはリガンドと標的分子との相互作用の分子モデルの創成のためにＸ線結晶学が利用される。
【０１６７】
以上に考察した計算機プログラム内への標的の座標の入力で、巨大分子の最も可能性がある構造の算出が得られる。それらの構造を組み合わせそしてかかるプログラムを用いる追加の計算により精密化して、リガンドの可能もしくは実際の活性もしくは結合部位を含む標的の可能もしくは実際の三次元構造を決定する。リガンドまたは擬似体の合理的薬剤設計に有用なかかる分子モデル化（および関連する）プログラムも本発明により提供される。
【０１６８】
４．段階３で得られた電子密度マップおよび／または分子モデルを、リガンドを含まない標的の電子密度マップおよび／または分子モデルと比較し、そして観察／算出された差異を標的またはサブユニット上のリガンドの結合を特異的に位置決定するために使用する。
【０１６９】
５．モデル化ツール、例えば計算化学および計算機モデル化は、標的と追加または異なる相互作用を行えるようにリガンドの構造を調整または変更するために使用される。
【０１７０】
リガンド設計は、異なる分子が標的の種々の部位とどのように相互作用するかを算出する計算機モデル化プログラムを使用する。この手順は、可能性があるリガンドまたはリガンドの種々の擬似体を決定する。
【０１７１】
リガンド設計は、異なる分子が標的、サブユニット、またはそれらのフラグメントの種々の部位とどのように相互作用するかを算出する計算機モデル化プログラムを使用する。従って、この手順は、可能性があるリガンドまたはリガンド擬似体を決定する。
【０１７２】
６．段階５からの新規に設計されたリガンドは、上記に考察した高処理量スクリーニング法を含む適切な生体内または試験室内試験を用いてその生物学的活性を試験できる。
【０１７３】
次いで、可能性があるリガンドまたは擬似体をＨＤＭ２、または少なくともそのフラグメントに対する活性に関してスクリーニングする。かかるスクリーニング法は、本来の標的の少なくとも１種の生物学的活性に対するアッセイから選択される。
【０１７４】
本発明の方法により提供され、得られたリガンドまたは擬似体は、動物、例えば哺乳動物（ヒトを含む）および鳥類内の疾患の処置、スクリーニングまたは防止のために有用である。
【０１７５】
７．当然ながら、上記の段階それぞれは、意図する特定の目的に対して手順を精密化するように当該技術分野の熟練者により望みどおりに変更できる。また、手順のいずれの段階または相でも、追加のＸ線回折データをＨＤＭ２、ＨＤＭ２／リガンド複合体、ＨＤＭ２構造標的モチーフおよびＨＤＭ２サブユニット／リガンド複合体に関して収集してもよい。かかる追加の回折データは、所望の結合属性を有するリガンドの設計および選択をさらに支援するように電子密度マップおよび分子モデルを再構築するために使用できる。
【０１７６】
本発明は、本シリーズの選択された化合物、リガンドもしくは擬似体中の構造非対称の結果として生じる、立体異性体ならびに光学異性体、例えば鏡像異性体の混合物ならびに個別の鏡像異性体およびジアステレオマーを含むと考えられると理解されるべきである。
【０１７７】
本明細書中の方法により開示または発見された化合物または作用物質のいくつかは、１個もしくはそれ以上の不斉中心を含んでもよく、従って鏡像異性体、ジアステレオマー、およびその他の立体異性体形態を生成する。本発明は、すべてのかかる可能な形態ならびにそれらのラセミおよび分割された形態およびそれらの混合物も包含するとも意図する。本明細書中に記載または発見された化合物がオレフィン性二重結合またはその他の幾何学的不斉中心を含む場合、そして別途に特定しな限り、それはＥおよびＺ幾何異性体を含むと意図する。すべての互変異性体も同様に本発明に包含されると意図する。
【０１７８】
本明細書中に使用される場合に、「立体異性体」の用語は、空間内のそれらの原子の配置のみが異なる個別の分子のすべての異性体に対する一般用語である。それは、鏡像異性体および相互に鏡像ではない２個以上のキラル中心を有する化合物の異性体（ジアステレオマー）を含む。
【０１７９】
本明細書中に使用される場合に、「キラル中心」の用語は、４個の異なる基が結合している炭素原子を指す。
【０１８０】
本明細書中に使用される場合に、「鏡像異性体」または「鏡像異性体的」の用語は、その鏡像上に重ね合わすことができず従って光学的に活性な分子を指し、ここで鏡像異性体は一つの方向に偏光面を回転しそしてその鏡像は偏光面を反対方向に回転する。
【０１８１】
本明細書中に使用される場合に、「ラセミ体」の用語は、鏡像異性体の等量の混合物であってそして光学的に活性なものを指す。
【０１８２】
本明細書中に使用される場合に、「分割（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」の用語は、分子の
二つの鏡像異性体形態の一方の分離または濃縮または欠失を指す。本出願の範囲内で、「分解能（ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ）」の用語は、回折実験により分解できる細部の量も指す。言い換えると、タンパク質結晶回折パターンの本来的な不規則性は、いくらかの回折角度θｍａｘで消失するので、逆格子の相当する距離ｄｍｉｎはブラッグの法則により決定される。
【０１８３】
ｄｍｉｎ＝      λ      
２ｓｉｎθｍａｘ
タンパク質結晶学の実際では、タンパク質電子密度の見かけ分解能はｄｍｉｎ、すなわちデータがマップの算出に含まれる最小格子距離を用いて通常記述される。
【０１８４】
本発明の化合物は、ｐ５３とＭＤＭＸとの間の相互作用の阻害に有用でもある。ＭＤＭ４としても知られるＭＤＭＸは、細胞周期の調節に関与する細胞タンパク質である。例えば、Ｒｉｅｍｅｎｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９（２４）：６０９１−６０６９（１９９９）を参照のこと。
【０１８５】
これ以上記述しなくても、当該技術分野の通常の熟練者は、上記の記述および下記の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を作製および使用しそして特許請求する方法を実施できると考える。従って、下記の実際的な実施例は、本発明の好ましい態様を特定して指摘し、そして本開示の残部をいかなる様式でも限定すると考えてはならない。
【０１８６】
実施例
【実施例１】
【０１８７】
ＧＳＴ  ＨＤＭ２融合タンパク質構築および発現
ＨＤＭ２のｃＤＮＡコード残基１７〜１２５をクローニングしそして下記のように発現した：鋳型として部分ヒトＭＤＭ２配列および下記のプライマー：
前進：５’−ＣＴＣＴＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧ
逆行：５’−ＴＡＴＡＴＡＴＣＴＣＧＡＧＴＣＡＧＴＴＣＴＣＡＣＴＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＣＣＴＧＡＧ
を含むＡＴＣＣアイテム番号３８４９８８を用いてＰＣＲを行った。
【０１８８】
次いで、ＰＣＲ産物をＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌ（プライマー中に下線を付けた配列認識部位）を用いて消化、ゲル精製、そしてＢａｍＨＩおよびＸｈｏｌを用いて同様に消化したｐＧＥＸ４ｔ−３中に結合した。精製したプラスミドを大腸菌（Ｅ  ｃｏｌｉ）株ＢＬ２１中に形質転換した。８００ｍｌＬＢ（Ｌａｕｎａ  Ｂｅｒｔａｎｉ媒体）＋１００μｇ／ｍｌアンピシリンを含み、そして０．２％グリセロールを補足した２Ｌ振とうフラスコ中、３７℃でタンパク質が産生された。要約すると、媒体を一夜培養物１６ｍｌを用いて接種しそして６００における吸光度が０．６〜０．８ＯＤに達すると１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。誘導の５時間後に細胞を採取した。
【０１８９】
ＨＤＭ２  ２３−１１４に対して、使用したプライマーは下記である：
５’−ＣＧＡＣＧＧＡＴＧＧＡＴＣＣＧＡＡＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＧ
３’−ＧＧＣＴＡＣＴＡＣＴＣＣＧＡＧＴＣＡＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＴＧＡＣＴＡＣ
ＨＤＭ２  １７−１１１に対して、使用したプライマーは下記である：
５’−ＣＴＣＴＣＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＴＣＣＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧ
３’−ＴＴＣＡＧＣＡＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＡＴＴＧＡＣＴＡＣＴＡＣＣＡＡＧＴＴ
Ｃ。
【０１９０】
いくつかの例外を除いて以上のようにしてＰＣＲフラグメントをクローニングしそして発現した。大腸菌株ＢＬ２１  ＲＩＬを発現に使用した。Ａ６００が０．２に達するまで３７℃で培養し、次いで室温としそして０．１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて０．６〜０．８のＡ６００で誘導した。誘導の５時間後に細胞を採取し、遠心分離し、そしてＰＢＳ中に再懸濁して１０ｍｌ／ｇ細胞ペーストとした。
【０１９１】
タンパク質産生
細胞をアヴェスチン・マイクロフルイダイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ  ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）中で溶解し、遠心分離し、そして上清をグルタチオン・セファロース４Ｂ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合させた。樹脂をＰＢＳを用いて洗浄しそして関係するＨＤＭ２構築物を２μｇ／ｍｌトロンビン（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ）を添加してＧＳＴ樹脂から切断した。切断したＨＤＭ２をＳｅｐｈａｒｏｓｅ  ＳＰ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ樹脂（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）上の負荷し、そして２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ
ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて溶離した。グルタチオンを５ｍＭまで添加し、そしてタンパク質を−７０℃で保管した。得られたタンパク質は、アミノ酸１７（セリン）の前にＮ−末端グリシンを有している。
【０１９２】
結晶学のためのタンパク質調製
濃度０．７ｍｇ／ｍｌで透析して関係する化合物とＨＤＭ２  １７−１１１を複合させ、緩衝液は２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ．７．４、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴとし、０．０２μｍフィルターを用いて濾過し、そして１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。
【実施例２】
【０１９３】
結晶化およびデータ採取
典型的な結晶化実験において、化合物と複合化しそして約１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮したＨＤＭ２タンパク質１〜２μｇを、ウエル溶液（１．８〜２．４Ｍ（ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭ緩衝液ｐＨ６．５〜９．０、２％ＰＥＧ４００，１００ｍＭ  ＮａＳＣＮ）と比率１：１で混合しそしてガラス・カバー・スリップ上に置いた。カバー・スリップを裏返しそしてウエル溶液５００〜１０００μｌの容器上にシールしそして４℃でインキュベーションした。結晶は通常一晩で出現しそして３〜７日後に採取可能となった。結晶をナイロンループを用いて採取し、冷凍溶液（２．２Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、１００ｍＭビス−トリス−プロパンｐＨ７．５、２％ＰＥＧ４００，１００ｍＭ  ＮａＳＣＮ、１５％グリセロール）中に３０秒間以下置きそして液体窒素または液体プロパン中に浸漬して冷凍した。Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ  Ｍ０６ＸＣＥ回転陽極およびＳＭＡＲＴ  ６０００  ＣＣＤ検出装置上、１２０Ｋでデータを採取した。回折データは、Ｐｒｏｔｅｕｍスイート（Ｂｒｕｋｅｒ  ＡＸＳ）を用いて処理した。
【実施例３】
【０１９４】
アッセイ方法：ペプチド結合アッセイ
ｐ５３へのＭＤＭ２結合の阻害は、ＭＤＭ２残基１７−１２５に結合するｐ５３ペプチド類似体を用いて測定した。この複合体の公開された結晶構造（Ｋｕｓｓｉｅ，Ｐ．Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：９４８−９５３（１９９６））は、このフラグメントがｐ５３結合部位を含むことを確認し、そして我々は、ＭＤＭ２  ｐ５３相互作用のペプチド阻害剤として記載されているｐ５３ペプチド類似体ＭＰＲＦＭＤＹＷＥＧＬＮ（Ｂｏｅｔｔｇｅｒ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６９：７４４−７５６（１９９７））のＸ線構造を解明した。該アッセイは、Ｎ末端フルオレセインＲＦＭＤＹＷＥＧＬペプチド（Ｆｌ  ９量体）を用いる。５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭオクチルグルコシド中の３０ｎＭフルオレセインペプチドＦｌ  ９量体および１２０ｎＭ  ＨＤＭ２  １７−１２５と一緒に化合物を１５分間インキュベーションした。フルオレセイン標識の偏極を４８５ｎＭ励起および５３０ｎｍの発光で測定した。偏極は、Ｆｌ  ９量体を伴うＭＤＭ２がない場合を背景として、化合物対照がない場合に対する百分率として表した。
【実施例４】
【０１９５】
ＨＤＭ２原子座標：表１（化合物１）
表１には、化合物１（３３８４３７）（（４−クロロ−フェニル）−〔３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−酢酸と複合したＨＤＭ２および結合水の三次元原子座標を標準ｐｄｂフォーマットで記載する。関連する結晶学的データは表１の注記の部分に含まれる。非結晶学的対称性で関連されるＨＤＭ２の２分子は、非対称単位内に存在しそして第一の分子に対してはＡそして第二の分子に対してはＢのＣＨＡＩＮＩＤにより同定される。該化合物（化合物１）は、残基名称ＤＣＢで存在する。同じＣＨＡＩＮＩＤを共有する化合物１およびＨＤＭ２分子は複合体を形成する。
【実施例５】
【０１９６】
ＨＤＭ２原子座標：表２（化合物２）
化合物２〔８−クロロ−３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−（４−クロロ−フェニル）−酢酸（８７６２７３）およびＨＤＭ２タンパク質を上記の実施例２に記載のようにして同時結晶化した。表２は、化合物２（８７６２７３）（〔８−クロロ−３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−（４−クロロ−フェニル）−酢酸）と複合されたＨＤＭ２の三次元原子座標を記載する。関連する結晶学的データは表２の注記の部分に含まれる。データは上記のようにして採取された。三方晶系結晶型を得るために使用されたと同じ結晶化条件で異なる結晶形態も観察できる。
【実施例６】
【０１９７】
ＨＤＭ２原子座標：表３
表３は、化合物１（化合物３３８４３７、（（４−クロロ−フェニル）−〔３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−酢酸）と複合されたＨＤＭ２の構造に整列された正方晶系空間群の化合物２（化合物８７６２７３：〔８−クロロ−３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−（４−クロロ−フェニル）−酢酸）と同時結晶化されたＨＤＭ２の三次元原子座標を記載する。関連する結晶学的データは表３の注記の部分に含まれる。データは上記のようにして採取された。
【０１９８】
ｐｄｂフォーマットは、ウエブ上に種々のサイトに記載されている。プログラムに依存して、このフォーマットに対する結晶学的適用の小さい変更も見だされるであろう。良いプライマーは、ＣＣＰ４“ｗｗｗ．ｃｃｐ４．ａｃ．ｕｋ／ｈｔｍｌ／ｐｄｂｆｏｒｍａｔ．ｈｔｍｌ”のこのリンクにより提供される。より詳細な記述は、ＲＣＳＢホームページで見ることができる。
【実施例７】
【０１９９】
位相性：モデル構築および精密化
位相は、ＣＮＸ内のサーチモデルとして公開されたＨＤＭ２構造を用いて分子置換により得られた（Ｂｒｕｎｇｅｒ，Ａ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐ．Ｄ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ｄ５４：９０５−９２１（１９９８）：Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．）。構造精密化
およびモデル構築の交互サイクルは、ＣＮＸおよびＯを用いる標準プロトコールに従って実行した（Ｊｏｎｅｓ，Ｔ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ  Ａ４７：１０−１１９（１９９１）。
【実施例８】
【０２００】
ＨＤＭ２の構造的特徴
図１。化合物１（化合物３３８４３７、（（４−クロロ−フェニル）−〔３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−酢酸）に結合したＨＤＭ２のリボン表示。
【０２０１】
図２。分子表面として表したＨＤＭ２の活性部位内への化合物１（化合物３３８４３７、（（４−クロロ−フェニル）−〔３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−酢酸）のフィッティング。
【０２０２】
本発明を上記の実施例を参照して詳細に記述したけれども、本発明の精神から離れることなく種々の変更が可能であると理解される。引用されたすべての特許、特許出願および公開および本出願内に引用されたその他の文献は、その全体を引用することにより本明細書に編入される。
【０２０３】
表１：化合物３３８４３７、（（４−クロロ−フェニル）−〔３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−酢酸
注記  制限された個別のＢ因子精密化からの座標
注記  精密化分解能：５００．０−２．６Å
注記  出発  ｒ＝０．２３９８  ｆｒｅｅ＿ｒ＝０．２７６３
注記  最終  ｒ＝０．２３９０  ｆｒｅｅ＿ｒ＝０．２７６５
注記  結合主鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝１．３５８  標的＝１．５
注記  結合側鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝１．８８７  標的＝２．０
注記  角度主鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝２．３７１  標的＝２．０
注記  角度側鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝２．９６５  標的＝２．５
注記  ｒｗｅｉｇｈｔ＝０．１０００（ここでｗａ＝２．７１１８３）
注記  標的＝ｍｌｆ  段階数＝３０
注記  ｓｇ＝Ｐ３（２）２１  ａ＝９８．４８６  ｂ＝９８．４８６  ｃ＝７４．０３８
アルファ＝９０  ベータ＝９０  ガンマ＝１２０
注記  パラメーター・ファイル１：ＭＳＩ＿ＣＮＸ＿ＴＯＰＰＡＲ：ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｒｅｐ．ｐａｒａｍ
注記  パラメーター・ファイル２：ｄｃｂ．ｐａｒ
注記  パラメーター・ファイル３：ＭＳＩ＿ＣＮＸ＿ＴＯＰＰＡＲ：ｗａｔｅｒ＿ｒｅｐ．ｐａｒａｍ
注記  分子構造ファイル：ｃｙｃｌｅ８．ｐｓｆ
注記  入力座標：ｍｉｎｉｍｉｚｅ．ｐｄｂ
注記  反射ファイル＝．．／Ｍ３３８４３７＿ｐ３２２１．ｃｖ
注記  ｎｃｓ＝ｎｏｎｅ
注記  Ｂ−補正分解能：６．０−２．６
注記  ｆｏｂｓに適用された初期Ｂ−因子補正：
注記  Ｂ１１＝５．５０９  Ｂ２２＝５．５０９  Ｂ３３＝−１１．０１９
注記  Ｂ１２＝０．２６３  Ｂ１３＝０．０００  Ｂ２３＝    ０．０００
注記  座標アレイＢに適用されたＢ−因子補正：０．０３６
注記  バルク溶剤：（Ｍａｓｋ）密度レベル＝０．３７２６４９  ｅ／Ａ＾３、Ｂ−因子＝２５．２８４４Ａ＾２
注記  ｜Ｆｏｂｓ｜を有する反射／シグマ＿Ｆ＜０．０棄却
注記  ｜Ｆｏｂｓ｜を有する反射＞１００００＊ｒｍｓ（Ｆｏｂｓ）棄却
注記  分解範囲内の反射の理論的全数：１３０９０（１００．０％）
注記  非観察反射の数（入力なしまたは｜Ｆ｜＝０）：１７６（１．３％）
注記  棄却された反射の数：０（０．０％）
注記  使用した反射の全数：１２９１４（９８．７％）
注記  作業セット内の反射の数：１１９６４（９１．４％）
注記  試験セット内の反射の数：９５０（７．３％）  ＣＲＹＳＴ１  ９８．４８６  ９８．４８６  ７４．０３８  ９０．００  ９０．００  １２０．００  ｐ３２  ２  １
注記  ＦＩＬＥＮＡＭＥ＝“ｂｉｎｄｖｉｄｕａｌ．ｐｂｄ”
注記  ＣＮＸバージョン：２０００．１２により記述
【０２０４】
【表１】
2008501315.tif 000005
【０２０５】
【表２】
2008501315.tif 000006
【０２０６】
【表３】
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【０２０７】
【表４】
2008501315.tif 000008
【０２０８】
【表５】
2008501315.tif 000009
【０２０９】
【表６】
2008501315.tif 000010
【０２１０】
【表７】
2008501315.tif 000011
【０２１１】
【表８】
2008501315.tif 000012
【０２１２】
【表９】
2008501315.tif 000013
【０２１３】
【表１０】
2008501315.tif 000014
【０２１４】
【表１１】
2008501315.tif 000015
【０２１５】
【表１２】
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【０２１６】
【表１３】
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【０２１７】
【表１４】
2008501315.tif 000018
【０２１８】
【表１５】
2008501315.tif 000019
【０２１９】
【表１６】
2008501315.tif 000020
【０２２０】
【表１７】
2008501315.tif 000021
【０２２１】
【表１８】
2008501315.tif 000022
【０２２２】
【表１９】
2008501315.tif 000023
【０２２３】
【表２０】
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【０２２４】
【表２１】
2008501315.tif 000025
【０２２５】
【表２２】
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【０２２６】
【表２３】
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【０２２７】
【表２４】
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【０２２８】
【表２５】
2008501315.tif 000029
【０２２９】
【表２６】
2008501315.tif 000030
【０２３０】
【表２７】
2008501315.tif 000031
【０２３１】
【表２８】
2008501315.tif 000032
【０２３２】
【表２９】
2008501315.tif 000033
【０２３３】
【表３０】
2008501315.tif 000034
【０２３４】
【表３１】
2008501315.tif 000035
【０２３５】
【表３２】
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【０２３６】
【表３３】
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【０２３７】
【表３４】
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【０２３８】
【表３５】
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【０２３９】
【表３６】
2008501315.tif 000040
【０２４０】
【表３７】
2008501315.tif 000041
【０２４１】
【表３８】
2008501315.tif 000042
【０２４２】
【表３９】
2008501315.tif 000043
【０２４３】
【表４０】
2008501315.tif 000044
【０２４４】
【表４１】
2008501315.tif 000045
【０２４５】
【表４２】
2008501315.tif 000046
【０２４６】
【表４３】
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【０２４７】
【表４４】
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【０２４８】
【表４５】
2008501315.tif 000049
【０２４９】
【表４６】
2008501315.tif 000050
【０２５０】
【表４７】
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【０２５１】
【表４８】
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【０２５２】
【表４９】
2008501315.tif 000053
【０２５３】
【表５０】
2008501315.tif 000054
【０２５４】
【表５１】
2008501315.tif 000055
【０２５５】
【表５２】
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【０２５６】
【表５３】
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【０２５７】
【表５４】
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【０２５８】
【表５５】
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【０２５９】
【表５６】
2008501315.tif 000060
【０２６０】
【表５７】
2008501315.tif 000061
【０２６１】
【表５８】
2008501315.tif 000062
【０２６２】
表２：化合物８７６２７３：（〔８−クロロ−３−（４−クロロ−フェニル）−７−ヨード−２，５−ジオキソ−１，２，３，５−テトラヒドロ−ベンゾ〔ｅ〕〔１，４〕ジアゼピン−４−イル〕−（４−クロロ−フェニル）−酢酸）
注記  制限された個別のＢ因子精密化からの座標
注記  精密化分解能：２５−２．６Å
注記  出発  ｒ＝０．２５６３  ｆｒｅｅ＿ｒ＝０．２７８７
注記  最終  ｒ＝０．２５５３  ｆｒｅｅ＿ｒ＝０．２７６１
注記  結合主鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝１．４８３  標的＝１．５
注記  結合側鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝１．７４０  標的＝２．０
注記  角度主鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝２．５９３  標的＝２．０
注記  角度側鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝２．７８０  標的＝２．５
注記  ｒｗｅｉｇｈｔ＝０．１０００（ここでｗａ＝３．７１６９６）
注記  標的＝ｍｌｆ  段階数＝３０
注記  ｓｇ＝Ｐ４（３）２（１）２  ａ＝５４．３  ｂ＝５４．３  ｃ＝８３．３  アルファ＝９０  ベータ＝９０  ガンマ＝９０
注記  パラメーター・ファイル１：ＭＳＩ＿ＣＮＸ＿ＴＯＰＰＡＲ：ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｒｅｐ．ｐａｒａｍ
注記  パラメーター・ファイル２：．．／ｃｉｄ．ｐａｒ
注記  分子構造ファイル：ｒｅｃｙｃｌｅ．ｐｓｆ
注記  入力座標：ａｎｎｅａｌ＿９．ｐｄｂ
注記  反射ファイル＝．．／Ｍ８７６２７３＿２＿ｐ４３２１２．ｃｖ
注記  ｎｃｓ＝ｎｏｎｅ
注記  Ｂ−補正分解能：６．０−２．６
注記  ｆｏｂｓに適用された初期Ｂ−因子補正：
注記  Ｂ１１＝−１．１８９  Ｂ２２＝−１．１８９  Ｂ３３＝２．３７９
注記  Ｂ１２＝０．０００  Ｂ１３＝０．０００  Ｂ２３＝    ０．０００
注記  座標アレイＢに適用されたＢ−因子補正：−０．１１９
注記  バルク溶剤：（Ｍａｓｋ）密度レベル＝０．３４１９４５  ｅ／Ａ＾３、Ｂ−因子＝２２．３９２５Ａ＾２
注記  ｜Ｆｏｂｓ｜を有する反射／シグマ＿Ｆ＜０．０棄却
注記  ｜Ｆｏｂｓ｜を有する反射＞１００００＊ｒｍｓ（Ｆｏｂｓ）棄却
注記  分解範囲内の反射の理論的全数：４１７３（１００．０％）
注記  非観察反射の数（入力なしまたは｜Ｆ｜＝０）：９（０．２％）
注記  棄却された反射の数：０（０．０％）
注記  使用した反射の全数：４１６４（９９．８％）
注記  作業セット内の反射の数：３７３７（８９．６％）
注記  試験セット内の反射の数：４２７（１０．２％）  ＣＲＹＳＴ１  ５４．３００
５４．３００  ８３．３００  ９０．００  ９０．００  ９０．００  ｐ４３  ２１  ２注記  ＦＩＬＥＮＡＭＥ＝“ｂｉｎｄｖｉｄｕａｌ．ｐｂｄ”
注記  ＣＮＸバージョン：２０００．１２により記述
【０２６３】
【表５９】
2008501315.tif 000063
【０２６４】
【表６０】
2008501315.tif 000064
【０２６５】
【表６１】
2008501315.tif 000065
【０２６６】
【表６２】
2008501315.tif 000066
【０２６７】
【表６３】
2008501315.tif 000067
【０２６８】
【表６４】
2008501315.tif 000068
【０２６９】
【表６５】
2008501315.tif 000069
【０２７０】
【表６６】
2008501315.tif 000070
【０２７１】
【表６７】
2008501315.tif 000071
【０２７２】
【表６８】
2008501315.tif 000072
【０２７３】
【表６９】
2008501315.tif 000073
【０２７４】
【表７０】
2008501315.tif 000074
【０２７５】
【表７１】
2008501315.tif 000075
【０２７６】
【表７２】
2008501315.tif 000076
【０２７７】
【表７３】
2008501315.tif 000077
【０２７８】
【表７４】
2008501315.tif 000078
【０２７９】
【表７５】
2008501315.tif 000079
【０２８０】
【表７６】
2008501315.tif 000080
【０２８１】
【表７７】
2008501315.tif 000081
【０２８２】
【表７８】
2008501315.tif 000082
【０２８３】
【表７９】
2008501315.tif 000083
【０２８４】
【表８０】
2008501315.tif 000084
【０２８５】
【表８１】
2008501315.tif 000085
【０２８６】
【表８２】
2008501315.tif 000086
【０２８７】
【表８３】
2008501315.tif 000087
【０２８８】
【表８４】
2008501315.tif 000088
【０２８９】
【表８５】
2008501315.tif 000089
【０２９０】
【表８６】
2008501315.tif 000090
【０２９１】
表３  重ね：三方晶系および正方晶系結晶型
注記  ／ｘｒａｙ１／ｈｍｄｍ２／ＰＤＢ／Ｍ３３８４３７．ｐｄｂ上に重ねる
注記  １９原子は０．２４９ÅのＲＭＳ距離を有する
注記  ＲＭＳデルタＢ＝６．７２４Ａ２
注記  ２ランダムタンパク質に推定されたＲＭＳＤ＝５．３９８  Ａ
注記  相対ＲＭＳＤ                            ＝０．０４６２１
注記  正規化ＲＭＳＤ                          ＝１．４７１  Ａ
注記  制限された個別のＢ因子精密化からの座標
注記  精密化分解能：２５−２．６Å
注記  出発  ｒ＝０．２５６３  ｆｒｅｅ＿ｒ＝０．２７８７
注記  最終  ｒ＝０．２５５３  ｆｒｅｅ＿ｒ＝０．２７６１
注記  結合主鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝１．４８３  標的＝１．５
注記  結合側鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝１．７４０  標的＝２．０
注記  角度主鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝２．５９３  標的＝２．０
注記  角度側鎖原子に対する二乗平均Ｂ＝２．７８０  標的＝２．５
注記  ｒｗｅｉｇｈｔ＝０．１０００（ここでｗａ＝３．７１６９６）
注記  標的＝ｍｌｆ  段階数＝３０
注記  ｓｇ＝Ｐ４（３）２（１）２  ａ＝５４．３  ｂ＝５４．３  ｃ＝８３．３  アル
ファ＝９０  ベータ＝９０  ガンマ＝９０
注記  パラメーター・ファイル１：ＭＳＩ＿ＣＮＸ＿ＴＯＰＰＡＲ：ｐｒｏｔｅｉｎ＿ｒｅｐ．ｐａｒａ
注記  パラメーター・ファイル２：．．／ｃｉｄ．ｐａｒ
注記  分子構造ファイル：ｒｅｃｙｃｌｅ．ｐｓｆ
注記  入力座標：ａｎｎｅａｌ＿９．ｐｄｂ
注記  反射ファイル＝．．／Ｍ８７６２７３＿２＿ｐ４３２１２．ｃｖ
注記  ｎｃｓ＝ｎｏｎｅ
注記  Ｂ−補正分解能：６．０−２．６
注記  ｆｏｂｓに適用された初期Ｂ−因子補正：
注記  Ｂ１１＝−１．１８９  Ｂ２２＝−１．１８９  Ｂ３３＝２．３７９
注記  Ｂ１２＝０．０００  Ｂ１３＝０．０００  Ｂ２３＝    ０．０００
注記  座標アレイＢに適用されたＢ−因子補正：−０．１１９
注記  バルク溶剤：（Ｍａｓｋ）密度レベル＝０．３４１９４５  ｅ／Ａ＾３、Ｂ−因子＝２２．３９２５Ａ＾２
注記  ｜Ｆｏｂｓ｜を有する反射／シグマ＿Ｆ＜０．０棄却
注記  ｜Ｆｏｂｓ｜を有する反射＞１００００＊ｒｍｓ（Ｆｏｂｓ）棄却
注記  分解範囲内の反射の理論的全数：４１７３（１００．０％）
注記  非観察反射の数（入力なしまたは｜Ｆ｜＝０）：９（０．２％）
注記  棄却された反射の数：０（０．０％）
注記  使用した反射の全数：４１６４（９９．８％）
注記  作業セット内の反射の数：３７３７（８９．６％）
注記  試験セット内の反射の数：４２７（１０．２％）
注記  ＦＩＬＥＮＡＭＥ＝“ｂｉｎｄｖｉｄｕａｌ／ｐｄｂ”
注記  ＣＮＸバージョン：２０００．１２により記述
【０２９２】
【表８７】
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【０２９３】
【表８８】
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【０２９４】
【表８９】
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【０２９５】
【表９０】
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【０２９６】
【表９１】
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【０２９７】
【表９２】
2008501315.tif 000096
【０２９８】
【表９３】
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【０２９９】
【表９４】
2008501315.tif 000098
【０３００】
【表９５】
2008501315.tif 000099
【０３０１】
【表９６】
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【０３０２】
【表９７】
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【０３０３】
【表９８】
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【０３０４】
【表９９】
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【０３０５】
【表１００】
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【０３０６】
【表１０１】
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【図面の簡単な説明】
【０３０７】
【図１】化合物３３８４３７に結合したＨＤＭ２のリボン表示。
【図２】分子表面として表されたＨＤＭ２の活性部位内への化合物３３８４３７のフィット状態。
【図３】三方晶系内および正方晶系内のｈｄｍ２間の重なりのリボン表示。−アルファ原子位置の中のＲＭＳ偏差は０．２５Åである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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