(57)【要約】  本発明ではヒトの自閉症感受性遺伝子の同定について開示しており、該遺伝子を治療効果のある薬剤のスクリーニングの他、自閉症および関連する障害の診断、予防、治療に使用できる。本発明はより具体的には、３番染色体およびその特定の対立遺伝子が自閉症へのかかりやすさに関係し、治療的診療に対する新しい標的を示すことが開示されている。本発明は、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子内の特定の突然変異および発現産物、そしてこれらの突然変異に基づいた診断ツールおよびキットに関する。本発明を、アスペルガー症候群、広汎性発達障害、小児期崩壊性障害、精神遅滞、不安神経症、憂うつ、注意不足活動過多症障害、発語の遅れまたは言語障害、てんかん、代謝異常、免疫障害、双極性疾患、そして精神分裂症などの他の精神疾患および神経疾患の素因の診断、発見、予防および／または治療に使用することが可能である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の存在または素因を検出する方法であって、（ｉ）被験者から検体を提供すること、（ｉｉ）該検体のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項２】
被験者の自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害からの防御を検出する方法であって、該方法が（ｉ）被験者から検体を提供すること、（ｉｉ）該検体のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項３】
自閉症または関連する障害の治療に対する被験者の反応を評価する方法であって、該方法が（ｉ）被験者から検体を提供すること、（ｉｉ）該検体のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項４】
自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の治療に対する被験者への悪影響を評価する方法であって、該方法が（ｉ）被験者から検体を提供すること、（ｉｉ）該検体のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項５】
被験者の自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の予防方法であって、被験者からの検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出し、前記変化の存在が自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の素因の指標であること、および自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害に対する予防的治療を行うことを含む方法。
【請求項６】
ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在が、塩基配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、および／または選択的増幅によって検出される、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
前記変化が自閉症と関連する１個または数個のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである、請求項１〜５のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
自閉症と関連する前記ハプロタイプが、ＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３９、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ６１、ＳＮＰ７３、ＳＮＰ７４からなる群から選択される数個のＳＮＰを含む、請求項１〜７のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
自閉症と関連する前記ＳＮＰがＳＮＰ２２である、請求項１〜８のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害に対する生物活性化合物の選択方法であって、前記方法が、試験化合物とＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその遺伝子ないしその断片とを接触させること、およびＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたは遺伝子ないしその断片と結合する該試験化合物の能力を測定することを含む方法。
【請求項１１】
自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害に対する生物活性化合物の選択方法であって、前記方法が、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞と試験化合物とを接触させること、および前記ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドと結合するおよびＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド活性を調節する前記試験化合物の能力を測定することを含む方法。
【請求項１２】
自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害に対する生物活性化合物を選択する方法であって、前記方法が、試験化合物とＡＴＰ２Ｂ２遺伝子とを接触させること、および前記ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の発現を調節する前記試験化合物の能力を測定することを含む方法。
【請求項１３】
自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害に対する生物活性化合物を選択する方法であって、前記方法が、試験化合物と、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーター構築物を含む組み換え宿主細胞とを接触させること、および前記レポーター遺伝子の発現を調節する（例、促進または減少させる）試験化合物を選択することを含む方法。
【請求項１４】
前記ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはそのポリペプチドまたはその断片が、変化または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはポリペプチド、または変化または突然変異を含むその断片である、請求項１０〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記調節が活性化である、請求項１０〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
前記調節が阻害である、請求項１０〜１４のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
被験者の自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の治療または予防用の医薬組成物を製造するための、ＡＴＰ２Ｂ２のアゴニストまたはアンタゴニスト、ＡＴＰ２Ｂ２のアンチセンスまたはＲＮＡｉ、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドに特異的な抗体、断片、またはその誘導体からなる群から選択される化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して遺伝学および医学の分野に関する。
発明の背景
【０００２】
自閉症は、社会的相互作用および言語・非言語コミュニケーションの障害、限定的、かつよくある型のパターンの興味および活動、そして３歳までの発育障害の存在を特徴とする、神経精神病学的な発育障害である（Baileyら、1996年）。彼の小児自閉症に関する先駆的な記述において、Kanner（1943年）は以下の症状を挙げた：言語障害、アイコンタクトの欠如、社会的相互作用の欠如、反復行動、型にはまった行動を柔軟性なく要求すること。彼は、大半の症例において、該当の子供の行動が幼児期から異常であったことを指摘した。これに基づき、彼は、生まれつきの、恐らくは遺伝性の異常の存在を示唆した。１年後、ドイツのHans Aspergerは同様の患者について記述しており、この症状を「自閉的精神病質」と呼んだ。
【０００３】
自閉症については、疾患を診断するための特異的な生物学的マーカーはこれまで知られていないため、行動基準を利用して定義されている。自閉症の臨床像については、重症度において変動し、教育、能力、気質などの多くの因子によって変わる。さらに、臨床像は個人の発育過程においても変わる。また、自閉症は、注意欠陥障害、運動失調、心配や憂うつなどの精神科的症状といった他の障害と関連付けられることが多い。自閉症が、てんかん性、代謝性、そして免疫性障害も含みうるとの証拠が存在する。変動性に関する臨床上の認識と矛盾なく、知能全般、言語能力のすべてのレベルおよび全ての重症度にわたった個人を含めた、自閉症領域障害が存在するとの一般的な見解の一致が現在見られる。
【０００４】
自閉症領域の一部であるが、特別なサブグループと見なされているのが、アスペルガー症候群（ＡＳ）である。ＡＳは、自閉症領域障害（ＡＳＤ）の特徴である、社会的相互作用の障害および限られた反復行動、興味、活動の存在下での言語発達の臨床上の有意な遅れがない点で自閉性障害とは区別される。
【０００５】
ＡＳＤは広汎性発達障害（ＰＰＤ）の類型である。ＰＰＤ−ＮＯＳ（PPD，“not otherwise specified”「他に規定のない限り」）は、非定型自閉症を呈することによって、または２、３の重要な領域においてほぼ診断基準を満たすことによって、自閉症についての厳密な基準を満たさないが、自閉症に近い小児を分類するために使用される。
【０００６】
自閉症の診断を標準化するために、世界保健機構（国際疾病分類第１０改訂（ICD−10），1992）およびアメリカ精神医学協会(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 4th edition（DSM−IV），1994)は診断基準を定めた。自閉症診断インタビュー（ＡＤＩ）を作成した（Le Couteurら、1989； Lordら、1994）。ＡＤＩは、標準化され、厳しく検証され、そして広く一般に認識されているＡＳＤ診断のために利用可能な唯一の診断ツールである。ＡＤＩは、国際疾病分類第１０改訂および自閉症の診断に関するＤＳＭ−ＩＶ基準に基づく、採点方式による親の半構造化面接である。ここでは、３つの主要分野：社会的相互作用の質；コミュニケーションおよび言語；限定的かつ反復的で紋切り型の関心および行動；における行動に焦点を合わせる。これらの基準を利用した場合、自閉症が稀な障害であるとはもはや見なされない。Kannerの基準に基づき、１０，０００人に４−５症例という過去に報告された有病率（Folstein and Rosen−Sheidley，2001）と比較して、１０，０００人に１０−１２症例という高い有病率が最近の研究において報告された(Gillberg and Wing，1999)。全領域での自閉性障害の有病率に関する推定値は１．５〜２．５倍高い。女性と比較して、男性で４倍高い発生率という報告には矛盾がない。精神遅滞がＡＳＤ症例の２５〜４０％に存在する（Bairdら、2000； Chakrabarti and Fombonne，2001）。脳が関与する別の病状が、母集団の約１０％において認められる（Gillberg and Coleman，2000）。
【０００７】
自閉症の報告症例数の増加の根本的なメカニズムは不明である。この差は、自閉症の有病率の増加、診断基準の段階的変化、病気発現のより大きな変動性の認識、あるいは障害に関する意識の高まりを反映しているのか否かについては大いに議論の余地がある。また、見掛け上の増加が主に環境因子に起因するという広範囲に及ぶ一般の認識がある（Nelson，1991；Rodier and Hyman，1998）。しかし、有病率の上昇の大部分は、これら診断基準をより広範に利用することと組み合わせて、診断基準を広げることによって説明できる可能性は高いと思われる。
【０００８】
病気を改善させるための有効な処置が存在するが、利用可能な治療法はなく、治療の有益性は低くなる傾向がある。様々な行動・発育上の戦略を利用したいくつかのプログラムで有望な結果が得られている。最も有望なものに、応用行動分析（ＡＢＡ）に基づくプログラムがある。いくつかの薬物療法が自閉症と関連する様々な症状を改善して、それによって教育的介入および行動療法からの個人の受益能を高めると思われた。最も広範に研究されている薬剤はドーパミンアンタゴニストである。数例の研究によって、様々な選択的セロトニン再取り込み阻害薬の有用性が示唆されている。
【０００９】
自閉症の遺伝率を推定するために、双生児に関する研究３例を実施した(Folstein and Rutter, 1977: Baileyら,1995; Steffenburgら、1989)。地理的に規定した集団内で生活していた全ての双生児を探し出した。統合データにおいて、一卵性（ＭＺ）双生児３６人および二卵性（ＤＺ）双生児３０人について調査した。ＤＺ率０％と比較して、平均ＭＺ一致率は７０％である。ＭＺとＤＺとの一致率および約２〜４％と推定された兄弟での再発リスクから、９０％を越える遺伝率を算出した（Jordeら、1991 Szatmariら、1998）。自閉症ではない血縁者に関する研究によって、社交場での寡黙、コミュニケーションの難しさ、日常での嗜好、変化に対する困難を含めた、ＡＳＤのいくつかの特徴は、対照の親よりも、自閉症の子供達の親に頻繁に存在することを明らかにした（Folstein and Rutter, 1977）。発語開始の遅れおよび読みの困難も自閉症患者の家族においてより多く見られ、再発性の憂うつ、不安障害、血小板セロトニンの上昇、そして頭囲の増大も同様であった（Folstein and Rosen−Sheidley, 2001）。
【００１０】
自閉症の発生率は罹患した個人との血縁度の低下に応じて有意に低下しており、一遺伝子モデルによって大半の自閉症症例が説明される可能性は低いことを示している（Jordeら,1990）。報告された分離比解析は、多遺伝子性遺伝様式と最も一致していた（Jordeら,1991）。最も節減の遺伝モデルは、数個の遺伝子が自閉症表現型を生じるために互いに相互作用するモデルである（Folstein and Rosen−Sheidley, 2001）。
【００１１】
相当な状況証拠によって、自閉症における自己免疫の果たし得る役割が示されている。一例の研究では、対照である発端者と比較して、自閉症の発端者のいる家族に自己免疫疾患を患う家族の構成員がより多くいるのを認めた（Comiら, 1999）。２，３例の研究では、自閉症を患う一部の子供、または彼（彼女）らの母親に存在する主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）遺伝子座のハプロタイプによって、彼（彼女）らの自閉症の子供たちが自己免疫病にかかりやすくなると報告している（Burger and Warren，1998）。２例の研究では、ミエリン塩基性タンパク質、神経細線維タンパク質、血管上皮などの特定の脳組織およびタンパク質に対する自己抗体が、対照と比較して、自閉症の子供たちにより多くいるのを認めた（Singhら, 1993; Connollyら, 1999; Weizmanら, 1982）。
【００１２】
自閉症の大半の症例について、オリゴジェニシティ（oligogenicity）およびエピスタシス（epistasis）という提示されたメカニズムと矛盾はないが、少数については染色体異常および特定の病因を伴う障害と関連して認めた。Smalley（1997年）は、既知の遺伝性疾患または染色体異常を伴う５〜１４％を含めた、自閉症症例の約１５〜３７％が合併症を伴うと記述している。ヒト染色体ほぼ全ての関与する染色体異常が報告されている。これらには常染色体の異数性、性染色体異常、欠失、重複、転座、環状染色体、逆位、マーカー染色体が含まれる（Gillberg,1998）。１５番染色体上のプラダーウィリ／アンジェルマン症候群の領域の異常が最も多く見られる。自閉症とメンデル性疾患（Mendelian condition）または遺伝的症候群との関連には、未治療のフェニルケトン尿症、脆弱Ｘ症候群、結節性脳硬化症、神経線維腫症が含まれる。近年、Carneyら（2003）は、ＭＥＣＰ２遺伝子（メチルＣｐＧ−結合蛋白２）の突然変異が症例の８０％の原因となっている、レット症候群の症状を伴わない、自閉症を患う２人の女性のＭＥＣＰ２遺伝子の突然変異を同定した。
【００１３】
様々なグループが、自閉症またはＡＳＤのより広範な表現型に関するゲノムスキャンを実施している。この方法は、組織的でモデルを使用しないため、非常に有望と思われる。また、既に成功していることが示されている。このように比較的小さな試験群での解析によってでさえ、陽性の連鎖結果が得られている。より重要なことは、一部の知見が既に再現されていることである。最も一致した結果が染色体７ｑにおいて得られたが、染色体２ｑおよび１６ｐにもかなりの重複が認められる（Folstein and Rosen−Sheidley, 2001）。染色体領域の特定の重要な進歩が、同じく１５番染色体およびＸ染色体上においてなされている。ニューロリジンＮＬＧＮ３およびＮＬＧＮ４をコード化する２つのＸ連鎖遺伝子の突然変異を、自閉症領域障害を患う兄弟において同定した（Jamainら, 2003）。いくつかの証拠によって、ニューロリジンの突然変異が自閉性障害に関与しているという事実が裏付けられた。第一に、報告された突然変異は予測されたタンパク質の立体構造に重大な変化を生じる。第二に、ＮＬＧＮ４を含むＸｐ２２．３の欠失が数人の自閉症の小児において報告されている。第三に、ＮＬＧＮ４の突然変異が、１人の罹患者の母親においてデノボ（de novo）で現れた。
【００１４】
発明の概要
本発明では、治療効果のある薬剤のスクリーニングの他、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の診断、予防、治療のために利用可能なヒトの自閉症感受性遺伝子の同定について開示されている。
【００１５】
本発明では特に、治療効果のある薬剤のスクリーニングの他、自閉症および自閉症関連障害の診断、予防、治療のために利用可能なヒトの自閉症感受性遺伝子の同定について開示している。本発明は具体的には自閉症へのかかりやすさと関連しており、治療的診療のための新しいターゲットを示すＡＴＰａｓｅ，Ｃａ＋＋輸送細胞膜２（ＡＴＰ２Ｂ２）遺伝子の特定の対立遺伝子を開示している。本発明は、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子内の特定の突然変異および発現産物、そしてこれらの突然変異に基づいた診断ツールおよびキットに関する。本発明は、アスペルガー症候群、広汎性発達障害、小児期崩壊性障害、精神遅滞、不安神経症、憂うつ、注意不足活動過多症障害、発語の遅れまたは言語障害、てんかん、代謝異常、免疫障害、双極性疾患、そして精神分裂症などの他の精神疾患および神経疾患の素因の診断、検出、予防および／または治療に使用可能である。
【００１６】
本発明は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の素因の診断、防御、検出、予防および／または治療において使用可能であり、該方法は、被験者からの検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはポリペプチドの変化の存在を検出することを含み、前記変化の存在が自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の存在または素因の指標となる。前記変化の存在は自閉症からの防御においても指標となりうる。
【００１７】
特に本発明の目的は、被験者の自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の存在または素因を検出する方法にあり、該方法は、被験者からの検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含み、前記変化の存在が自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の存在または素因の指標となる。
【００１８】
特に本発明の別の目的は、被験者の自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害からの防御を検出する方法にあり、該方法は、被験者からの検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含み、該変化の存在が自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害からの防御の指標となる。
【００１９】
特に本発明の別の目的は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の治療に対する被験者の反応の評価方法にあり、該方法は、被験者からの検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含み、前記変化の存在が前記治療に対する特定の反応の指標となる。
【００２０】
本発明のさらなる特定の目的は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の治療に対する被験者への有害作用の評価方法にあり、該方法は、被験者からの検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含み、前記変化の存在が前記治療に対する有害反応の指標となる。
【００２１】
本発明は、被験者からの検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出し、前記変化の存在が自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の存在または素因の指標となること、および自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害に対する予防的治療の施行することからなる、被験者の自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の素因の予防方法にも関する。
【００２２】
好ましい一実施態様では、前記変化は、自閉症と関連する一つ以上のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。より好ましくは、前記ハプロタイプは、ＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３９、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ６１、ＳＮＰ７３、ＳＮＰ７４からなる群から選択される数個のＳＮＰを含む、あるいは数個のＳＮＰからなる。さらに好ましくは、前記ハプロタイプは、表４に開示されるハプロタイプから選択される。より好ましくは、自閉症と関連する前記ＳＮＰはＳＮＰ２２でありうる。
【００２３】
好ましくは、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の該変化を、ハイブリダイゼーション分析、シークエンシング分析、マイクロシークエンシング分析、対立遺伝子特異的増幅分析の実施によって判定する。
【００２４】
本発明の特定の態様は、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子を含むゲノム領域内の自閉症と関連する少なくとも一つのＳＮＰまたはハプロタイプを特異的に検出するように設計した、プライマー、プローブ、および／またはオリゴヌクレオチドを含むものの組成物、またはそれらを組み合わせたものにある。より好ましくは、自閉症と関連する前記ハプロタイプは、ＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３９、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ６１、ＳＮＰ７３、ＳＮＰ７４からなる群から選択される数個のＳＮＰを含む、あるいは数個のＳＮＰからなる。さらに好ましくは、前記ハプロタイプは、表４に開示されるハプロタイプから選択される。より好ましくは、自閉症と関連する前記ＳＮＰはＳＮＰ２２でありうる。
【００２５】
本発明は、ＡＴＰ２Ｂ２の発現または活性の調節を介した、被験者の自閉症および／または関連する障害の治療法にもある。該治療には、例えば、ＡＴＰ２Ｂ２の発現または活性を調節する、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド、ＡＴＰ２Ｂ２  ＤＮＡ配列（ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座を標的とするアンチセンス配列およびＲＮＡｉを含む）、抗ＡＴＰ２Ｂ２抗体または薬剤が使用される。
【００２６】
本発明は、遺伝子治療、タンパク製剤の補給療法、またはＡＴＰ２Ｂ２タンパク質の模倣薬および／または阻害剤の投与による、発症前治療または併用療法を含めた、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の有害対立遺伝子を有する個人の治療法にも関する。
【００２７】
本発明の別の態様は、自閉症または関連する障害に関わるＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の対立遺伝子、またはその遺伝子産物の調節または結合に基づく、自閉症または関連する障害の治療薬のスクリーニングにある。
【００２８】
本発明のさらなる態様には、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド断片に特異的な抗体および該抗体の誘導体、該抗体を分泌するハイブリドーマ、これらの抗体を含む診断キットが含まれる。より好ましくは、前記抗体は、変化を含むＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその断片に特異的であり、前記変化はＡＴＰ２Ｂ２の活性を改変する。
【００２９】
本発明は、変化を含むＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはその断片にも関するもので、前記変化はＡＴＰ２Ｂ２の活性を改変する。本発明は、変化を含むＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその断片にも関するものであり、前記変化はＡＴＰ２Ｂ２の活性を改変する。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明では、ヒトの自閉症感受性遺伝子としてＡＴＰ２Ｂ２の同定を開示している。自閉症を患う１１４の家族からの様々な核酸検体を、特別なＧｅｎｏｍｅＨＩＰプロセスに提出した。このプロセスによって、自閉症の被験者において変化している、前記母集団の特定の同一家系（identical-by-descent）内の断片が同定されることになった。ＩＢＤ断片のスクリーニングによって、自閉症および関連する表現型に対する候補として、染色体３ｐ２５．３上のＡＴＰａｓｅ  Ｃａ２＋輸送細胞膜２遺伝子（ＡＴＰ２Ｂ２）を同定した。この遺伝子は実際に重要な間隔で存在しており、自閉症での遺伝子調節と一致した機能的表現型を発現する。ヒトの被験者の自閉症と相関があるとして、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子のＳＮＰも同定した。ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座に位置するＳＮＰ２２が自閉症と関連があることを発見した。ＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３９、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ６１、ＳＮＰ７３、ＳＮＰ７４からなる群から選択される数個のＳＮＰを含む、表４に開示するハプロタイプを自閉症と関連があるものとして同定した。
【００３１】
このように本発明は、治療効果のある薬剤のスクリーニングの他、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の、診断、予防、治療のためにＡＴＰ２Ｂ２遺伝子および対応する発現産物を使用することを提案している。
【００３２】
定義
自閉症および自閉症領域障害（ＡＳＤ）：自閉症は通常、アスペルガー症候群（ＡＳ）および他の広汎性発達障害（ＰＰＤ）を含む自閉症領域（ＡＳＤ）の一部と特徴付けられる。自閉症は、健康が損なわれうる程度にまで、３歳までの行動、興味、活動の様式が限定的、反復的で、型にはめられている、社会的相互作用およびコミュニケーションが損なわれた状態と解釈される。ＡＳは、自閉症領域障害（ＡＳＤ）の特徴である、社会的相互作用の障害および限定された反復行動、興味、活動の存在下で、言語発達の臨床上の有意な遅れはないことにより、自閉性障害とは区別される。ＰＰＤ−ＮＯＳ（PPD，“not otherwise specified”「他に規定のない限り」）は、非定型自閉症を呈する、または２、３の重要な領域においてほぼ診断基準を満たすことによって、自閉症についての厳密な基準を満たさないが、自閉症に近い子供たちを分類するために使用される。
【００３３】
自閉症関連障害、疾患、病状として、具体的には代謝異常、免疫障害、てんかん、心配、憂うつ、注意欠陥多動性障害、発語の遅れまたは言語障害、運動失調、精神分裂症及び双極性疾患が挙げられる。
【００３４】
本発明は、様々な被験者、特に成人、子供、胎児を含めたヒトにおいて使用可能である。
【００３５】
本発明の文脈中で、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座は、ＡＴＰ２Ｂ２コード配列、ＡＴＰ２Ｂ２非コード配列（例、イントロン）、転写、翻訳（例、プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）、ＲＮＡおよび／またはタンパク質の安定性を調節するＡＴＰ２Ｂ２調節配列を含めた、細胞または生物内の全てのＡＴＰ２Ｂ２配列または産物、そしてＡＴＰ２Ｂ２  ＲＮＡ（例、ｍＲＮＡ）およびＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド（例、タンパク質前駆体および成熟タンパク質）などの対応する発現産物を示す。ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座は、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子内に位置するＳＮＰと連鎖不平衡にあるＳＮＰを含むＡＴＰ２Ｂ２の周辺配列も含む。
【００３６】
本出願において使用されているとおり、「ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子（ATP2B2 gene）」という用語は、自閉症および自閉症関連障害へのかかりやすさと関係する、ヒト染色体３ｐ２５．３上のATPase Ca2＋輸送細胞膜２遺伝子、そして対立遺伝子（例、生殖細胞系突然変異）を含めた、その変異体、類似体、断片を示す。ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の別名は、ＰＭＣＡ２である。
【００３７】
「遺伝子（gene）」という用語は、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、合成または半合成ＤＮＡ、対応する任意の形のＲＮＡを含めた、任意の種類のコード核酸を含むと解釈される。遺伝子という用語は特に、ＡＴＰ２Ｂ２をコード化する組み換え型核酸、つまり人工的に作成された（例、配列の組み立て、切断、連結、増幅による）非天然核酸分子を含む。
【００３８】
通常、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子は二本鎖であるが、一本鎖などの他の形も検討できる。ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子を、ＤＮＡライブラリーのスクリーニング、または様々な天然材料からの増幅など、様々な材料から、周知の様々な技術によって得ることができる。組み換え核酸を、化学合成、遺伝子工学、酵素技術、これらを組み合わせたものを含めて、従来の方法で調製できる。適切なＡＴＰ２Ｂ２遺伝子配列は、Unigene Cluster for ATP2B2（Hs．268942）およびUnigene Representative Sequence NM＿001001331などの遺伝子バンクに見出しうる。ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の特定の実施例は配列番号：１を含む。
【００３９】
「ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子（ATP2B2 gene）」という用語は、配列番号：１の変異体、断片、類似体、あるいは先に同定した任意のコード配列を含んでいる。該変異体には、例えば、個人間での対立遺伝子の変化に起因する天然の変異体（例、多型）、自閉症と関連する突然変異対立遺伝子、選択的スプライシング形態などが含まれる。変異体という用語には、別の材料または生物由来のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子配列も含まれる。変異体は、好ましくは配列番号：１とかなりの相同性を有しており、つまり配列番号：１と少なくとも約６５％、通常は少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８５％、より好ましくは少なくとも約９５％のヌクレオチド配列の同一性を示す。ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の変異体および類似体は核酸配列も含んでおり、これは厳しいハイブリダイゼーション条件下で先に定義した配列（またはその相補的鎖）にハイブリダイズする。
【００４０】
代表的に厳しいハイブリダイゼーション条件として、温度３０℃以上、好ましくは３５℃以上、より好ましくは４２℃以上、および／または塩分約５００ｍＭ未満、好ましくは２００ｍＭ未満が挙げられる。ハイブリダイゼーション条件は、温度、塩分および／またはＳＤＳ、ＳＳＣなどの他の薬剤の濃度を変えることで当業者によって調節可能である。
【００４１】
ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子断片は、先に開示した少なくとも約８個、好ましくは少なくとも約１５個、より好ましくは少なくとも約２０個、さらに好ましくは少なくとも約３０個の連続する核酸配列の任意の一部分を示す。断片には、ヌクレオチド８〜１００個、好ましくは１５〜１００個、より好ましくは２０〜１００個の全ての可能なヌクレオチド長を含む。
【００４２】
ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドは、先に開示したＡＴＰ２Ｂ２遺伝子によってコードされる任意のタンパク質またはポリペプチドを示す。「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸の伸長を含む任意の分子を示している。この用語は、ペプチドおよびタンパク質のなどの様々な長さの分子を含む。ポリペプチドは、グリコシル化および／またはアセチル化および／または化学反応または結合などによって改変可能であり、一つまたは数個以上の非天然型アミノ酸または合成アミノ酸を含みうる。ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドの特定の実施例には、配列番号：２（NP_001001331）の全体または一部を含む。
【００４３】
「治療に対する反応」という用語は、治療化合物を代謝する能力およびプロドラッグを活性薬剤へ変換する能力を含めるが、これらに限定されない治療効果、そして個人の薬剤の薬物動態（吸収、分布、排出）および薬力学（受容体関連）を示す。
【００４４】
「治療への有害作用」という用語は、薬剤の主な薬理作用の延長に起因する治療の有害作用、または薬剤と固有の宿主因子との相互作用に起因する特有の有害反応を示す。「治療に対する副作用」として、皮膚、血液、肝臓への毒性などの有害反応、さらに胃腸での潰瘍形成、血小板機能の障害、腎臓傷害、全身性のジン麻疹、気管支狭窄、低血圧、ショックが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４５】
診断
本発明では、今回、被験者のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座のモニタリングに基づく診断方法が提供されている。本発明の文脈中において、「診断」という用語は、成人、子供、胎児の初期、発症前、後期を含めた様々な段階での、該検出、モニタリング、投薬、比較などを含む。通常、診断には、予後、素因または発症リスクの評価、最適な治療を決めるための被験者の特性付け（薬理遺伝）などが含まれる。
【００４６】
本発明は、個人が、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害を発症するリスクがあるのか、あるいはＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の突然変異または多型に起因する自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害を患うか否かを判定するための診断方法を提供する。本発明はまた、個人が治療薬に対して正の応答を示す可能性があるのか否か、または個人が治療薬に対する有害作用を起こすリスクがあるのか否かを判定する方法をも提供する。
【００４７】
本発明の特定の目的は、被験者の自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の存在または素因を検出する方法にあり、該方法は被験者からの検体において、前記検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在の検出を含む。前記変化の存在は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の存在または素因の指標である。場合により、前記方法は被験者から検体を提供する前段階を含む。好ましくは、前記検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座内の変化の存在を、検体の遺伝子型決定によって検出する。
【００４８】
本発明の別の特定の目的は、被験者の自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害からの防御方法にあり、該方法は被験者からの検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在の検出を含み、前記変化の存在は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の存在または素因の指標である。
【００４９】
好ましい一実施態様では、該変化は、自閉症と関連する一つまたは数個のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。より好ましくは、自閉症と関連する前記ハプロタイプは、ＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３９、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ６１、ＳＮＰ７３、ＳＮＰ７４からなる群から選択される数個のＳＮＰからなるか、あるいは数種のＳＮＰを含む。さらに好ましくは、前記ハプロタイプは、表４に開示するハプロタイプから選択される。より好ましくは、自閉症と関連する前記ＳＮＰはＳＮＰ２２である。
【００５０】
本発明の別の特定の目的は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の治療に対する被験者の反応を評価する方法であり、該方法が（ｉ）被験者からの検体の提供、（ｉｉ）前記検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在の検出を含む。
【００５１】
本発明の別の特定の目的は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の治療に対する被験者の反応を評価する方法にあり、該方法は被験者からの検体において、前記検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在の検出を含む。前記変化の存在は、前記治療に対する特定の反応の指標である。好ましくは、前記検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座内の変化の存在は、検体の遺伝子型決定によって検出される。
【００５２】
本発明の別の特定の目的は、自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の治療に対する被験者の有害作用を評価する方法にあり、該方法は被験者の検体において、前記検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在の検出を含む。前記変化の存在は、前記治療に対する有害作用の指標である。好ましくは、前記検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座内の変化の存在は、検体の遺伝子型決定によって検出される。
【００５３】
好ましい一実施態様では、前記変化は、自閉症と関連する一つもしくは数個以上のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである。より好ましくは、自閉症と関連する前記ハプロタイプは、ＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３９、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ６１、ＳＮＰ７３、ＳＮＰ７４からなる群から選択される数個のＳＮＰを含む、あるいは数個のＳＮＰを含む。さらに好ましくは、前記ハプロタイプは、表４に開示されるハプロタイプから選択される。より好ましくは、自閉症と関連する前記ＳＮＰはＳＮＰ２２である。
【００５４】
さらなる一実施態様では、本発明は、被験者の自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の予防方法に関するものであり、被験者の検体のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在（自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害の素因の指標となる）の検出、および自閉症、自閉症領域障害、または自閉症関連障害に対する予防的治療の施行を含む。前記予防的治療は、薬物投与でありうる。
【００５５】
治療または薬剤に対する反応、あるいは治療または薬剤に対する副作用を解析・予測する診断法を利用して、個人を特定の治療薬で治療すべきか否かを判断できる。例えば、仮に診断によって個人が特定の薬物治療に対して正の応答を示す可能性が示される場合、その個人に薬剤を投与できる。反対に、仮に診断によって個人が特定の薬物治療に対して負の応答を示さない可能性がある場合、代替となる一連の治療を処方できる。負の応答とは、有効な反応がないこと、または有毒な副作用が存在することのいずれかとして定義できる。
【００５６】
臨床試験ではＡＴＰ２Ｂ２  ＳＮＰの別の用途が示される。上記の方法を利用して、薬剤への反応または薬剤への副作用の指標となる一つ以上のＡＴＰ２Ｂ２  ＳＮＰを同定することができる。その後、該薬剤の臨床試験に潜在的な参加者をスクリーニングして、該薬剤に良好な反応を示す可能性の最も高い個人を特定し、副作用を経験する可能性の高い個人を除外できる。このように、試験において正の応答を示す可能性の低い個人を含めた結果として、測定値を低下させることなく、また好ましくない安全性の問題という危険を冒すことなく、前向きな反応を示す個人で薬物療法の有効性を測定できる。
【００５７】
該変化を、ＡＴＰ２Ｂ２  ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリペプチドのレベルで判定できる。場合により、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の全体または一部分の塩基配列決定、またはＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の全体または一部分の選択的ハイブリダイゼーションまたは選択的増幅によって検出を行う。より好ましくは、変化の同定段階より前に、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子を特異的に増幅させる。
【００５８】
ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化は、単独または様々な組み合わせで、遺伝子座のコード領域および／または非コード領域内の突然変異、欠失、再配列および／または挿入の任意の形でありうる。突然変異はより具体的には点変化を含む。欠失は、２残基から遺伝子または遺伝子座全体までの、遺伝子座のコード部分または非コード部分内の２つ以上の残基の任意の領域を含むことができる。典型的な欠失は、約５０個未満の連続する塩基対のドメイン（イントロン）または反復配列または断片などの、小さな領域に影響を及ぼすが、より大きな欠失も起こりうる。挿入は、遺伝子座のコード部位または非コード部位内の１個または数個の残基の付加を含みうる。挿入は通常、遺伝子座内の１〜５０個の塩基対の付加を含みうる。再配列には配列の逆位が含まれる。ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化は、停止コドンの形成、フレームシフト変化、アミノ酸置換、特定のＲＮＡスプライシングまたはプロセシング、産物の不安定化、切断ポリペプチドの産生などを引き起こすことができる。該変化は、機能、安定性、標的、構造の変化したＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドの産生を引き起こすことができる。該変化は、タンパク質発現の減少、あるいは前記生産の増加の原因にもなりうる。
【００５９】
本発明に従った方法での特定の一実施態様では、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化は、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または対応する発現産物の点突然変異、欠失、挿入、より好ましくは点突然変異、欠失から選択される。該変化は、ＡＴＰ２Ｂ２  ｇＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリペプチドのレベルで判定されうる。
【００６０】
この点において、今回、本発明ではＡＴＰ２Ｂ２遺伝子内のＳＮＰおよび特定のハプロタイプを開示しており、これらには自閉症と関連するＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３９、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ６１、ＳＮＰ７３、ＳＮＰ７４からなる群から選択されるＳＮＰが含まれる。ＳＮＰは以下の表１において報告されている。
【００６１】
【表１】
2008537486.tif 000002
【００６２】
本発明に従った任意の方法では、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子内の一つまたは数個のＳＮＰおよびＡＴＰ２Ｂ２遺伝子内のＳＮＰを含む特定のハプロタイプ、より好ましくはＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３９、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ６１、ＳＮＰ７３、ＳＮＰ７４を、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害と関係している、また他の遺伝子内に存在する、別のＳＮＰまたはハプロタイプと併用することができる。
【００６３】
別の変異体では、該方法には、ＡＴＰ２Ｂ２ＲＮＡ発現の変化の存在の検出が含まれる。ＲＮＡ発現の変化には、ＲＮＡ配列の変化の存在、ＲＮＡスプライシングまたはプロセシングの変化の存在、ＲＮＡ量の変化の存在などが含まれる。これらは周知の様々な技術、例えば、ＡＴＰ２Ｂ２  ＲＮＡの全体または一部分の塩基配列決定、または前記ＲＮＡの全体または一部分の選択的ハイブリダイゼーションまたは選択的増幅によって検出できる。
【００６４】
別の変異体では、該方法には、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド発現の変化の存在の検出が含まれる。ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド発現の変化には、ポリペプチド配列の変化の存在、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド量の変化の存在、組織分布の変化の存在などが含まれる。これらは周知の様々な技術、例えば、配列決定および／または特定リガンド（抗体など）への結合によって検出可能である。
【００６５】
上記のとおり、配列決定、ハイブリダイゼーション、増幅および／または特定リガンド（抗体など）への結合など、周知の様々な技術を利用して、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはＲＮＡ発現または配列の変化を検出または定量できる。他の適当な方法には、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、対立遺伝子特異的増幅、サザンブロット法（ＤＮＡに対して）、ノーザンブロット法（ＲＮＡに対して）、一本鎖高次構造解析（ＳＳＣＡ）、ＰＦＧＥ、蛍光インシツ（in situ）ハイブリデーション法（ＦＩＳＨ）、ゲル移動、クランプ変性ゲル電気泳動法、ヘテロ二本鎖解析、ＲＮａｓｅプロテクション法、化学的ミスマッチ切断、ＥＬＩＳＡ、放射免疫分析（ＲＩＡ）、免疫酵素分析（ＩＥＭＡ）が含まれる。
【００６６】
これらの方法の一部（例、ＳＳＣＡおよびＣＧＧＥ）は、配列の変化の存在に起因する、核酸の電気泳動移動度の変化に基づいている。これらの技術に従って、配列の変化をゲル上での移動度の変化によって可視化させる。次に、断片の配列を決定して、変化を確認する。
【００６７】
他の一部は、被験者の核酸と野生型または変化したＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはＲＮＡに特異的なプローブとの特異的ハイブリダイゼーションに基づいている。プローブは、浮遊状態にするか、あるいは基材に固定できる。ハイブリッドの検出が容易になるように、プローブは通常、標識化する。
【００６８】
ノーザンブロット法、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡなどのこれらの方法の一部は、ポリペプチド配列または発現レベルの評価に特に適している、これらの後者では、ポリペプチドに特異的なリガンド、より好ましくは特異的抗体の使用が必要となる。
【００６９】
特に好ましい一実施態様では、方法には、被験者からの検体のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子発現プロファイルの変化の存在の検出が含まれる。上記のとおり、これは、より好ましくは、前記検体中に存在する核酸の配列決定、選択的ハイブリダイゼーションおよび／または選択的増幅によって達成可能である。
【００７０】
配列決定
自動シークエンサーを用いて、周知の技術を利用して配列決定を実施できる。完全なＡＴＰ２Ｂ２遺伝子、より好ましくは、通常、有害な突然変異または他の変化を有することが判明している、あるいは有することが疑われるＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の特異的ドメインについて配列決定を行える。
【００７１】
増幅
増幅は、核酸複製の開始に役立つ相補的な核酸配列間での特異的ハイブリッドの形成に基づいている。
【００７２】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列増幅（ＮＡＳＢＡ）などの周知の様々な技術に従って増幅を行うことができる。これらの技術は、市販の試薬およびプロトコールを利用して実施可能である。好ましい技術では、対立遺伝子特異的ＰＣＲまたはＰＣＲ−ＳＳＣＰが利用される。通常、増幅において、反応を開始させるために特異的な核酸プライマーの使用が必要である。
【００７３】
ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または遺伝子座からの配列の増幅に有用な核酸プライマーは、前記遺伝子座の標的領域に隣接するＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の一部に特異的にハイブリダイズ可能であり、前記標的領域は、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害を患う特定の個人において変化している。該標的領域の例を表１に示す。
【００７４】
表１で特定されるＳＮＰを含むＡＴＰ２Ｂ２標的領域を増幅させるために使用可能なプライマーを、配列番号：１の配列またはＡＴＰ２Ｂ２のゲノム配列に基づいて設計されうる。特定の一実施態様では、プライマーは配列番号：３−１０の配列に基づいて設計されうる。
【００７５】
本発明の別の特定の目的は、周辺領域を含めたＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または遺伝子座からの配列の増幅に有用な核酸プライマーにある。該プライマーは、好ましくはＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座内の核酸配列と相補的であり、特異的にハイブリダイズする。特定のプライマーは、前記遺伝子座の標的領域に隣接するＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の一部と特異的にハイブリダイズ可能であり、前記標的領域は、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害を患う特定の個人において変化している。
【００７６】
本発明は核酸プライマーとも関連しており、前記プライマーは自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害を患う特定の被験者において変化しているＡＴＰ２Ｂ２コード配列（例、遺伝子またはＲＮＡ）の一部と相補的であり、特異的にハイブリダイズする。この点について、本発明の特定のプライマーはＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはＲＮＡの変化した配列に特異的である。該プライマーを使用した増幅産物の検出は、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を示す。対照的に、増幅産物の非存在は、検体中に特定の変化が存在しないことを示す。
【００７７】
本発明の通常のプライマーは、約５〜６０ヌクレオチド長、好ましくは約８〜２５ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子である。配列は、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の配列に直接由来できる。高い特異性を保証するには、完全な相補性が好ましい。しかし、一定のミスマッチは許容できる。
【００７８】
本発明は、被験者の自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の存在または素因の検出方法、または自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の治療に対する被験者の反応の評価方法での上記の核酸プライマーまたは核酸プライマー対の使用にも関する。
【００７９】
選択的ハイブリダイゼーション
ハイブリダイゼーションの検出方法は、核酸配列の変化の検出に用いる相補的な核酸配列間での特異的ハイブリッドの形成に基づいている。
【００８０】
特定の検出方法には、野生型または変化したＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブの使用、そしてその後のハイブリッドの存在の検出が含まれる。プローブは、浮遊状態にするか、あるいは基材または支持体に固定できる（核酸アレイまたはチップ技術など）。ハイブリッドの検出が容易になるように、プローブは通常、標識化する。
【００８１】
この点について、本発明の特定の一実施態様には、被験者の検体と変化したＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座に特異的な核酸プローブとの接触、そしてハイブリッド形成の評価が含まれる。好ましい特定の一実施態様では、方法では、野生型ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座および野生型ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の様々な変化型に特異的な一連のプローブと検体との同時接触が含まれる。この実施態様では、検体中のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の様々な変化の存在を直接検出できる。また、様々な被験者の様々な検体を同時に処理できる。
【００８２】
本発明の文脈中では、プローブは、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはＲＮＡ（の標的部位）と相補的かつ特異的なハイブリダイゼーションが可能であり、また自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害に罹りやすくする、または関連するＡＴＰ２Ｂ２対立遺伝子と関連するポリヌクレオチド多型の検出に適したポリヌクレオチド配列を示す。プローブは好ましくはＡＴＰ２Ｂ２遺伝子、ＲＮＡ、またはその標的部位と完全に相補的である。通常、プローブは、８〜１，０００ヌクレオチド長、例えば１０〜８００、より好ましくは１５〜７００、普通は２０〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸を含んでいる。より長いプローブも使用可能であることを理解されたい。本発明の好ましいプローブは、８〜５００ヌクレオチド長の一本鎖核酸分子であり、これは変化を有するＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはＲＮＡの領域に特異的にハイブリダイズできる。
【００８３】
本発明の具体的な一実施態様は、変化（例、突然変異を起こした）ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはＲＮＡに特異的な核酸プローブ、つまり前記変化ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはＲＮＡに特異的にハイブリダイズするが、前記変化を欠くＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはＲＮＡには基本的にハイブリダイズしない核酸プローブである。特異性とは、標的配列へのハイブリダイゼーションが、非特異的ハイブリダイゼーションによって生じるシグナルとは区別可能な特異的シグナルを生じることを示している。本発明に従ったプローブを設計するためには、完全に相補的な配列が好ましい。一方で、特異的シグナルが非特異的シグナルと区別可能である限り、ある程度のミスマッチは許容可能であることを理解されたい。
【００８４】
該プローブの特別な例は、上記の表１に記載する点突然変異を有するＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはＲＮＡを含むゲノム領域の標的部位と相補的な核酸配列である。特にプローブは、配列番号：３−１０、またはＳＮＰまたはＳＮＰの相補的配列を含むその断片を含むグループから選択される配列を含むことができる。
【００８５】
該プローブの配列は、本出願で示すＡＴＰ２Ｂ２遺伝子およびＲＮＡの配列由来とすることができる。プローブの化学修飾の他、ヌクレオチドの置換も可能である。該化学修飾は、ハイブリッドの安定性の増大（例、基の挿入）またはプローブ標識化のために実施できる。標識化の典型例として放射能、蛍光、発光、酵素標識などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８６】
本発明は、被験者の自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の存在または素因の検出方法、または自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の治療に対する被験者の反応の評価方法における上記の核酸プローブの使用にも関する。
【００８７】
特異的なリガンド結合
上記のとおり、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化は、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド配列または発現レベルの変化のスクリーニングによっても検出可能である。この点において、本発明の具体的な一実施態様には、検体とＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド特異的なリガンドとの接触および複合体の形成が含まれる。
【００８８】
特異的抗体などの異なる種類のリガンドを使用することができる。具体的な一実施態様では、検体をＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド特異的抗体と接触させて、免疫複合体の形成を判定する。ＥＬＩＳＡ、放射免疫分析（ＲＩＡ）、免疫酵素分析（ＩＥＭＡ）などの免疫複合体を検出するための様々な方法を使用できる。
【００８９】
本発明の文脈中では、抗体は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、そして実質的に同じ抗原特異性を有するこれらの断片または誘導体を示す。断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’２、ＣＤＲ領域などが含まれる。誘導体には、一本鎖抗体、ヒト化抗体、多機能性抗体などが含まれる。
【００９０】
ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドに特異的な抗体は、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドに選択的に結合する抗体、つまりＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはそのエピトープを含む断片に対する抗体を示す。他の抗原に対する非特異的な結合も生じるが、標的であるＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドへの結合も生じて、非特異的な結合とは確実に識別可能である。
【００９１】
具体的な一実施態様では、該方法は、被験者の検体と変異型ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドに特異的な抗体（でコーティングされた支持体）との接触、および免疫複合体の存在の判定を含む。特定な一実施態様では、野生型および様々な変化型のＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドに特異的な様々な抗体（でコーティングされた支持体）と検体とを同時または並行して、または連続的に接触させることができる。
【００９２】
本発明は、被験者の自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の存在または素因の検出方法、または自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の治療に対する被験者の反応の評価方法における上記のリガンド、好ましくは抗体、断片またはその誘導体の使用にも関する。
【００９３】
本発明は、被験者からの検体のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはポリペプチド、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはポリペプチドの発現、および／またはＡＴＰ２Ｂ２活性の変化の存在を検出するための製品および試薬を含む診断キットとも関連している。本発明に従った前記診断キットは、本発明に記載のプライマー、プライマー対、核酸プローブおよび／またはリガンドを含む。本発明に従った前記診断キットはさらにハイブリダイゼーション、増幅、抗原‐抗体免疫反応を実施するための試薬および／またはプロトコールをさらに含むことができる。
【００９４】
インビトロ、エクスビボ、インビボ、好ましくはインビボまたはエクスビボで診断方法を実施できる。これら診断方法では、被験者の検体を用いて、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の状態を評価する。該検体は、核酸またはポリペプチドを含む、被験者由来の任意の生物検体が可能である。該検体の例として、体液、組織、細胞検体、器官、生検などが挙げられる。最も好ましい検体は、血液、血漿、唾液、尿、精液などである。例えば胎児細胞や胎盤細胞の検査によって出生前診断を実施することも可能である。従来の方法に従って検体を採取して、診断に直接使用するか、保存することが可能である。該試験において核酸またはポリペプチドの利用性を与える、あるいは向上させるために、該方法の実施前に検体を処理可能である。処理としては、例えば溶解（例、機械的、物理的、化学的など）、遠心分離などが挙げられる。また、核酸および／またはポリペプチドを従来の方法で前精製または濃縮する、および／または複雑性を低減させることができる。核酸およびポリペプチドに酵素処理、あるいは他の化学的処理または物理的処理を施して、その断片を作成することもできる。請求範囲に記載されている方法の高い感度を考慮すると、検査の実施にはごく微量の検体で十分である。
【００９５】
示したように、変化したＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の存在を評価するために、好ましくはプローブ、プライマー、リガンドなどの試薬を検体と接触させる。プレート、チューブ、ウェル、ガラスなどの適当な道具内で接触させることができる。具体的な実施態様では、核酸アレイまたは特異的リガンドアレイなど、試薬をコーティングさせた基材上で接触させることができる。該基材は、ガラス、プラスチック、ナイロン、紙、金属、ポリマーなどから成る任意の支持体といった固形または半固形基材でありうる。基材は、スライド、膜、ビーズ、カラム、ゲルなどの様々な形状および大きさでありうる。薬剤と検体の核酸またはポリペプチド間で複合体を形成するのに適したどのような条件下でも接触させることができる。
【００９６】
検体中の変化ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡに関する知見は、被験者の変化ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の存在の指標であり、これは自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の存在、素因、または進行の段階と相関する可能性がある。例えば、生殖細胞系にＡＴＰ２Ｂ２突然変異を有する個人では、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害を発症するリスクが増大している。被験者の変化ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の存在の判定によっても、より効果的で特別あつらえの、適当な治療的診療の計画が可能となる。また、発症前の段階でのこの判定によって、予防計画の適用が可能となる。
【００９７】
連鎖不平衡
第一のＳＮＰを目的のゲノム領域内、より具体的にはＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座内で同定したら、通常の技量を有する専門家であれば、最初のＳＮＰと連鎖不平衡にある追加のＳＮＰを容易に同定できる。実際に、自閉症または関連する障害と関係する第一のＳＮＰと連鎖不平衡にある任意のＳＮＰは、この特性と関連しうる。したがって、ひとたびあるＳＮＰと自閉症または関連する障害との関係を実証したら、この特定領域内においてＳＮＰ密度を増すために、この特性と関連するさらなるＳＮＰを発見することが重要となる。
【００９８】
あるＳＮＰと連鎖不平衡にある追加のＳＮＰの同定には、（ａ）複数の個人由来の第一のＳＮＰを含む、あるいは第一のＳＮＰの周辺のゲノム領域からの断片の増幅、（ｂ）第一の該ＳＮＰを含む、あるいは第一のＳＮＰの周辺のゲノム領域内の第二のＳＮＰの同定、（ｃ）第一のＳＮＰと第二のＳＮＰ間での連鎖不平衡解析の実施、（ｄ）第一の該マーカーと連鎖不平衡にあるものとしての第二の該ＳＮＰの選択が含まれる。（ｂ）および（ｃ）の段階を含むサブコンビネーションも検討される。
【００９９】
ＳＮＰを同定して、連鎖不平衡解析を実施するための方法は、必要以上の実験もなく、周知の方法によって当業者によって実施可能である。
【０１００】
連鎖不平衡にあるこれらのＳＮＰを、本発明に従った方法、特に本発明に従った診断方法においても使用可能である。
【０１０１】
例えば、クローン病の連鎖遺伝子座を、染色体５ｑ３１上の１８ｃＭに及ぶ広範な領域にマッピングした（Riouxら、2000 and 2001）。領域全体に及ぶマイクロサテライトマーカーおよびＳＮＰの高密度マップを利用して、連鎖不平衡（ＬＤ）の有力な証拠を発見した。ＬＤの証拠を発見したため、著者らは、超高密度ＳＮＰマップを作成して、このマップから選択されたマーカーのより高密度な一群について研究した。多遺伝子座解析によって、ＴＤＴを利用してそれぞれ個別に関連付けられた複数のＳＮＰを特徴とする共通した単一のリスクハプロタイプを明確にした。これらのＳＮＰはリスクハプロタイプに固有であり、互いにほぼ完全なＬＤにあるために、情報の内容は本来、同一である。これらＳＮＰの同等の特性によって、遺伝的証拠のみに基づいてこの領域内の原因となる突然変異の同定が不可能となる。
【０１０２】
原因となる突然変異
自閉症または関連する障害に関与するＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の突然変異を、自閉症または関連する障害を呈する患者と対照の個人由来のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の配列を比較することで同定できる。ＡＴＰ２Ｂ２のＳＮＰと自閉症または関連する障害との同定された関連に基づいて、同定された遺伝子座の突然変異をスキャンできる。好ましい一実施態様では、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子のエクソンおよびスプライシング部位、プロモーターなどの調節領域などの機能的領域の突然変異がスキャンされる。好ましくは、自閉症または関連する障害を呈する患者が、自閉症または関連する障害と関連することが示されている突然変異を有しており、対照の個人は自閉症または関連する障害と関連する突然変異または対立遺伝子を有していない。自閉症または関連する障害を呈する患者が、対照である個人よりも高い頻度で、自閉症または関連する障害と関連することが示される突然変異を有することもありうる。
【０１０３】
該突然変異を検出するために使用される方法は、通常、以下の段階を含む：自閉症または関連する障害を呈する患者および対照である個人由来のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子のＤＮＡ検体から、自閉症または関連する障害と関連するＳＮＰまたはＳＮＰ群を含むＡＴＰ２Ｂ２遺伝子領域の増幅；増幅された領域の配列決定；自閉症または関連する障害を呈する患者および対照である個人由来のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子のＤＮＡ配列の比較；自閉症または関連する障害を呈する患者に特異的な突然変異の決定。
【０１０４】
したがって、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の原因となる突然変異の同定は、必要以上の実験もなく、周知の方法によって当業者によって実施可能である。
【０１０５】
例えば、原因となる突然変異を、以下の実施例において型どおりの方法を利用して同定した。
【０１０６】
Hugotら（2001）は、ポジショナル・クローニング戦略を応用して、クローン病へのかかりやすさと関連していることを以前発見している１６番染色体の領域内においてクローン病へのかかりやすさの強い遺伝子変異体を同定した。潜在的な感受性遺伝子座の位置を狭めるために、２６種のマイクロサテライトマーカーについて遺伝子型を特定して、伝達不平衡試験（transmission disequilibrium test）を利用してクローン病との関連を調べた。マクロサテライトマーカーＤ１６Ｓ１３６の一つの対立遺伝子間においてボーダーライン上の有意な関連性（borderline significant association）を発見した。周辺領域から１１種の追加のＳＮＰを選択して、数個のＳＮＰが有意な関連性を示した。
【０１０７】
ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５遺伝子の一つのエクソン内に、この領域由来のＳＮＰ５−８が存在することを発見しており、非同義変化株であることが示されている。これによって、著者らによる５０人のＣＤ患者のこの遺伝子の完全コード配列の配列決定に弾みがついた。さらに２つの非同義変化（SNP12およびSNP13）を発見した。家系伝達不平衡試験（pedigree transmission disequilibrium test）を利用して、ＳＮＰ１３が最も有意に関連していた（ｐ＝６×１０−６）。別の独立した研究では、４人の対照と比較して、１２人の罹患者由来のこの遺伝子のコード領域の配列決定によっても同じ変異体を発見した（Oguraら、2001）。ＳＮＰ１３の稀な対立遺伝子は、ＮＯＤ２／ＣＡＲＤ１５タンパク質を切断することが予測される１ｂｐの挿入と一致した。この対立遺伝子は、対照と比較して頻度は有意に低いものの、健常な個人にも存在していた。
【０１０８】
同様に、Lesageら（2002）は、散発性症例１６６例および家族性症例２８７例を含むＣＤ患者４５３例、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）患者１５９例、健常な対照患者１０３例において、コード領域の系統的配列決定によってＣＡＲＤ１５の突然変異解析を実施した。同定した６７個の配列変化の内、９個はＣＤ患者で対立遺伝子頻度が５％以上であった。これらのうち６個は多型と考えられ、３個（SNP12−R702W、SNP8−G908R、SNP13−1007fs）はＣＤに対する感受性とは無関係に関連していることを確認した。２７個の稀な突然変異も潜在的な疾患の原因となる突然変異（DCM：disease−causing mutation）と見なされた。３つの主な変異体（R702W、G908R、1007fs）は、全てのＣＤ突然変異のそれぞれ３２％、１８％、３１％を示していたが、合計２７の稀な突然変異はＤＣＭの１９％を示していた。全体で、突然変異の９３％は、遺伝子の末端の１／３に位置していた。ＵＣと関連する突然変異は見出されなかった。対照的に、二重突然変異を有する１７％を含め、ＣＤ患者の５０％は少なくとも一つのＤＣＭを有していた。
【０１０９】
薬剤スクリーニング
本発明は、新しい標的および薬剤候補またはリード（lead）のスクリーニング方法も提供する。該方法には、結合解析および／または機能解析が含まれ、インビボ、細胞系、動物などにおいて実施できる。
【０１１０】
本発明の特定の目的は、生物活性化合物の選択方法にあり、前記方法は、試験化合物と本発明のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはポリペプチドとのインビボでの接触および前記試験化合物が前記ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはポリペプチドと結合する能力の測定を含む。前記遺伝子またはポリペプチドとの結合は、化合物が前記標的の活性を調節して、ひいては被験者の自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の原因となる経路に影響を及ぼす能力についての判断指標となる。好ましい一実施態様では、方法は、試験化合物と本発明に従ったＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその断片とのインビボでの接触および前記試験化合物が前記ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたは断片と結合する能力の測定を含む。該断片は好ましくは、該ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドの結合部位を含む。好ましくは、前記ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはポリペプチドまたはその断片は、変化ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはポリペプチドまたは変化または突然変異を含むその断片である。
【０１１１】
本発明の特定の目的は、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害に対して活性を有する化合物の選択方法にあり、前記方法は試験化合物と本発明のＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたは結合部位を含むその断片とのインビボでの接触、および前記試験化合物が前記ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその断片と結合する能力の測定を含む。好ましくは、前記ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその断片は、変化ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたは変化または突然変異を含むその断片である。
【０１１２】
別の特定な一実施態様では、該方法は、本発明に従ったＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞と試験化合物との接触、および前記試験化合物が前記ＡＴＰ２Ｂ２に結合してＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドの活性を調節する能力の測定を含む。好ましくは、前記ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその断片は、変化ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたは変化または突然変異を含むその断片である。
【０１１３】
該試験化合物の標識化、また標識化済み対照リガンドとの競合等、様々な方法によって結合を決定することができる。
【０１１４】
本発明のさらなる目的は、生物活性化合物の選択方法にあり、前記方法は、試験化合物と本発明のＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドとのインビボでの接触および前記試験化合物が前記ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドの活性を調節する能力の測定を含む。好ましくは、前記ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその断片は、変化ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたは変化または突然変異を含むその断片である。
【０１１５】
本発明のさらなる目的は、生物活性化合物の選択方法にあり、前記方法は、試験化合物と本発明のＡＴＰ２Ｂ２遺伝子とのインビボでの接触および前記試験化合物が前記ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドの発現も調節する能力の測定を含む。好ましくは、前記ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはその断片は、変化ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または変化または突然変異を含むその断片である。
【０１１６】
別の一実施態様では、本発明は、活性のある化合物、特に自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害に対して活性を有する化合物のスクリーニング、選択、同定の方法に関するものであり、該方法は、試験化合物と、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーター構築物を含む組み換え宿主細胞との接触、およびレポーター遺伝子の発現を調節（例、促進または低減）する試験化合物の選択を含む。好ましくは、該ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子プロモーターまたはその断片は、変化ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または変化または突然変異を含むその断片である。
【０１１７】
スクリーニング方法の特定な一実施態様では、調節は阻害である。スクリーニング方法の特定な別の実施態様では、調節は活性化である。
【０１１８】
上記のスクリーニング検査は、プレート、チューブ、ディッシュ、フラスコなどの適切などのような道具内において実施可能である。通常、検査はマルチウェルプレート内で実施する。数個の試験化合物を同時に検査可能である。さらに、試験化合物の由来、性質、組成は多様でありうる。単離された、あるいは他の物質との混合での、脂質、ペプチド、ポリペプチド、核酸、小分子などの有機物質または無機物質でありうる。化合物は、例えば製品のコンビナトリアルライブラリー（combinatorial library）の全体または一部でありうる。
【０１１９】
医薬組成物、治療
本発明のさらなる目的は、（ｉ）ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその断片、ＡＴＰ２Ｂ２ペプチドまたはその断片をコード化する核酸、上記のベクターまたは組み換え宿主細胞、および（ｉｉ）医薬的に許容可能な担体または賦形剤、を含む医薬組成物である。
【０１２０】
本発明は、被験者の自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害を治療または予防する方法にも関するもので、該方法は機能的（例、野生型）ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはこれをコード化する核酸の該被験者への投与を含む。
【０１２１】
本発明の別の一実施態様は、被験者の自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害を治療または予防する方法にあり、該方法は、本発明に従ったＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはタンパク質の発現または活性を調節する、好ましくは活性化するか、模倣する化合物の前記被験者への投与を含む。前記化合物は、ＡＴＰ２Ｂ２のアゴニストまたはアンタゴニスト、ＡＴＰ２Ｂ２のアンチセンスまたはＲＮＡｉ、本発明に従ったＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドに特異的な抗体または断片またはその誘導体が可能である。該方法の特定な一実施態様では、調節は阻害である。該方法の特定な別の実施態様では、調節は活性化である。
【０１２２】
本発明は概して、被験者の自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の治療または予防のための医薬組成物の製造において、機能的なＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド、これをコード化する核酸、あるいは本発明に従ったＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはタンパク質の発現または活性を調節する化合物の使用にも関する。前記化合物は、ＡＴＰ２Ｂ２のアゴニストまたはアンタゴニスト、ＡＴＰ２Ｂ２のアンチセンスまたはＲＮＡｉ、本発明に従ったＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドに特異的な抗体または断片またはその誘導体が可能である。該方法の特定な一実施態様では、調節は阻害である。該方法の特定な別の実施態様では、調節は活性化である。
【０１２３】
本発明によって、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害とＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座との相関が実証される。このように、本発明によって治療的診察の新しい標的が提供される。被験者、特に変化ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座を有する被験者のＡＴＰ２Ｂ２の活性または機能を回復または調節するための様々な方法を検討することができる。野生型の機能を該被験者に与えることで、自閉症、自閉症領域障害、病的細胞または生物の自閉症関連障害、の表現型の発現が抑制されることが期待される。該機能の供給は、遺伝子またはタンパク質治療、またはＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド活性を調節または模倣する化合物（例、上記のスクリーニング検定において同定したアゴニスト）の投与によって達成可能である。
【０１２４】
上記のベクターを利用して、野生型ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはその機能的部分を、これらを必要としている被験者の細胞内に導入できる。ベクターはウイルスベクターまたはプラスミドでありうる。該遺伝子を裸のＤＮＡとしても導入可能である。受容者の宿主細胞のゲノム内に組み入れるように、あるいは染色体外に残存するように、該遺伝子を供給することが可能である。組み込みは、ランダムに、または相同的組み換えなどによって、正確に定めた部位で生じうる。特に、相同的組み換えによって細胞内の変異体と引き換えに、機能的ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子のコピーを挿入できる。別の方法として、遺伝子銃、リポソーム媒介のトランスフェクション、陽イオン性脂質媒介のトランスフェクションなどが挙げられる。遺伝子治療は、直接の遺伝子注入によって、または機能的なＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドを発現するエクスビボで調製した遺伝子組み換え細胞の投与によって達成できる。
【０１２５】
ＡＴＰ２Ｂ２活性を伴う他の分子（例、ペプチド、薬剤、ＡＴＰ２Ｂ２アゴニスト、有機化合物）を使用して、被験者の機能的なＡＴＰ２Ｂ２活性を回復させる、あるいは細胞内の有害な表現型を抑制することが可能である。
【０１２６】
細胞内での機能的なＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の機能回復を利用して、自閉症、自閉症領域障害、自閉症関連障害の発症を予防する、あるいは前記疾患の進行を低下させることが可能である。該治療は、細胞、特に有害対立遺伝子を有する細胞の自閉症関連表現型を抑制することが可能である。
【０１２７】
本発明の別の態様および利点は、以下の実験の項で開示されており、これらは実例として見なすべきであり、本出願の範囲を限定しない。
【０１２８】
遺伝子、ベクター、組み換え細胞、ポリペプチド
本発明の別の態様は、診断、治療、スクリーニングに使用される新規な製品にある。これらの製品には、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその断片をコード化する核酸分子、これらを含むベクター、組み換え宿主細胞、発現ポリペプチドを含む。
【０１２９】
特に、本発明は、変化または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または前記変化または突然変異を含むその断片に関する。本発明は、変化または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたは前記変化または突然変異を含むその断片をコード化する核酸分子にも関する。前記変化または突然変異によってＡＴＰ２Ｂ２の活性が改変される。改変された活性は増加または減少でありうる。本発明はさらに、変化または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子または前記変化または突然変異を含むその断片、あるいは変化または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたは前記変化または突然変異を含むその断片をコード化する核酸分子を含むベクター、組み換え宿主細胞、発現ポリペプチドに関する。
【０１３０】
本発明の別の目的は、本発明に従ったＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドをコード化する核酸を含むベクターである。該ベクターとして、クローニングベクター、より好ましくは発現ベクター、つまりコンピテント宿主細胞内の前記ベクターからＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドを発現させる調節配列を含むベクターが可能である。
【０１３１】
これらのベクターを使用して、インビトロ、エクスビボ、インビボでＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドを発現し、トランスジェニックまたは「ノックアウト」動物を作成し、核酸を増幅し、アンチセンスＲＮＡを発現することなどが可能となる。
【０１３２】
本発明のベクターは通常、調節配列（例、プロモーター、ポリＡなど）と機能的に連結された、本発明に従ったＡＴＰ２Ｂ２コード配列を含む。「機能的に連結した（operably linked）」という用語は、コード配列および調節配列が機能的に関連しており、該調節配列がコード配列の発現（例、転写）を起こすことを示す。ベクターはさらに１個または数個の複製起点および／または選択マーカーを含みうる。プロモーター領域は、コード配列に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であり、インビボでの使用を含め、適切な任意の宿主細胞内において普遍的かつ構成的な、調節された、および／または組織特異的発現をもたらすことができる。プロモーターの例として、細菌プロモーター（Ｔ７、ｐＴＡＣ、Ｔｒｐプロモーターなど）、ウイルスプロモーター（ＬＴＲ、ＴＫ、ＣＭＶ−ＩＥなど）、哺乳動物遺伝子のプロモーター（アルブミン、ＰＧＫなど）などが挙げられる。
【０１３３】
ベクターは、プラスミド、ウイルス、コスミド、ファージ、ＢＡＣ、ＹＡＣなどが可能である。プラスミドベクターは、pBluescript、pUC、pBRなどの市販のベクターから調製可能である。ウイルスベクターは、周知の組み換えＤＮＡ技術に従って、バキュロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶなどから作成可能である。
【０１３４】
この点について、本発明の特別な目的は、先に定義されているＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドをコード化する組み換えウイルスにある。組み換えウイルスは、好ましくは複製能を欠いており、さらに好ましくは、Ｅ１および／またはＥ４欠損アデノウイルス、Ｇａｇ、ｐｏｌおよび／またはｅｎｖ欠損レトロウイルス、Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ欠損ＡＡＶから選択される。該組み換えウイルスは、パッケージング細胞へのトランスフェクション、またはヘルパープラスミドまたはウイルスの一過性トランスフェクションなどの周知の技術によって作成可能である。ウイルスのパッケージング細胞の典型例として、ＰＡ３１７細胞、ＰｓｉＣＲＩＰ細胞、ＧＰｅｎｖ＋細胞、２９３細胞などが挙げられる。複製能を欠損した該組み換えウイルスの作成のための詳細なプロトコールは、例えば国際出願９５／１４７８５、国際出願９６／２２３７８、米国特許第５，８８２，８７７号、米国特許第６，０１３，５１６号、米国特許第４，８６１，７１９号、米国特許第５，２７８，０５６号、国際出願９４／１９４７８において見ることができる。
【０１３５】
本発明の別の目的は、先の定義されている組み換えＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはベクターを含む組み換え宿主細胞にある。適当な宿主細胞として、原核生物細胞（細菌など）および真核生物細胞（酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞など）が挙げられるが、これらに限定されない。具体例として、大腸菌、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ酵母、哺乳動物細胞株（例、Ｖｅｒｏ細胞、ＣＨＯ細胞、３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞など）並びに哺乳動物の初代または確立した培養細胞（例、繊維芽細胞、胚細胞、上皮細胞、神経細胞、脂肪細胞などから作成）が挙げられる。
【０１３６】
本発明は、本発明に従ったＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞の作成方法とも関連しており、該方法には、（ｉ）コンピテント細胞への上記の核酸またはベクターのインビボまたはエクスビボでの導入、（ｉｉ）得られた組み換え宿主細胞のインビトロまたはエクスビボでの培養、（ｉｉｉ）場合により、ＡＴＰ２Ｂ２プロペプチドを発現する細胞の選択を含む。
【０１３７】
該組み換え宿主細胞は、下記のとおり、活性分子のスクリーニングの他、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドの生産に使用可能である。該細胞は、自閉症を研究するためのモデル系としても使用可能である。これらの細胞は、適切な培養器（プレート、フラスコ、ディッシュ、チューブ、ポーチなど）内で、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＨＡＭなどの適切な培地で維持可能である。
【実施例】
【０１３８】
１．３番染色体の感受性遺伝子を同定するためのＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットフォーム
自閉症の感受性遺伝子を迅速に同定するために、ＧｅｎｏｍｅＨＩＰプラットフォームを用いた。
【０１３９】
簡潔に言えば、該技術は、関係する個人でのＤＮＡ対形成からなる。各ＤＮＡを特異的標識で印を付けて、同定可能にする。次に、２つのＤＮＡ間でハイブリッドを形成させる。次に、特定のプロセス（国際出願００／５３８０２）を適用して、複数段階の手順で２つのＤＮＡから同一家系（ｉｄｅｎｔｉｃａｌ−ｂｙ−ｄｅｓｃｅｎｔ（ＩＢＤ））なすべての断片を選択する。次に、ＩＢＤフラクションの染色体ポジショニングを可能にするＢＡＣクローン由来のＤＮＡマイクロアレイに対して、残りのＩＢＤ濃縮ＤＮＡをスコアリングする。
【０１４０】
異なる多くの家族にこのプロセスを適用することで、各家族由来の各対についてＩＢＤフラクションのマトリクスがもたらされる。次に、統計解析によって、被験家族間で共有される最小ＩＢＤ領域が計算される。有意な結果（ｐ値）は、目的の特性（自閉症）を伴う陽性領域での連鎖の証拠である。有意なｐ値を示す最も遠い２つのクローンによって連鎖間隔の範囲を定めることが可能である。
【０１４１】
今回の研究では、厳密な自閉症（ＡＤＩ−Ｒにより定義）と一致する米国の１１４の家族（独立した１１４の血縁者組）をＧｅｎｏｍｅＨＩＰプロセスに提出した。次に、結果として得られたＩＢＤ濃縮ＤＮＡフラクションをＣｙ５蛍光色素で標識化し、平均間隔１．２Ｍｂｐのヒトゲノム全体をカバーする２，２６３個のＢＡＣクローンからなるＤＮＡアレイに対してハイブリダイズさせた。Ｃｙ３標識化した非選択ＤＮＡを使用して、各クローンのシグナル値および計算比率を標準化した。次に、比率結果のクラスタリングを実施して、各クローンおよび組のＩＢＤ状態を判定した。
【０１４２】
この手順を適用することで、自閉症との連鎖に関する有意な証拠（ｐ＝６．４ｅ−０５）を示すＢＡＣクローン（ＦＥ０ＤＢＡＣＡ１７ＺＧ０５ｖ）を同定した。連鎖の有意な証拠を示すＢＡＣクローンの近位および遠位のクローンによって定められる連鎖領域は３番染色体上の約２．１８Ｍｂｐに及んでいた（9283670bp〜11464577bp）。複雑な形質の全ゲノムスキャンについてKruglyak & Lander（1995年）が提示した連鎖の示唆的証拠として７．４Ｅ−０４のｐ値を利用した。
【０１４３】
表２：ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座内の３番染色体に関する連鎖結果：連鎖の証拠を有するＢＡＣクローンに対応する領域を示している。クローンの開始・停止位置は、染色体の開始位置（ｐ−ｔｅｒ）に関するＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ３４に基づくゲノム位置と一致する。
【０１４４】
【表２】
2008537486.tif 000003
【０１４５】
２．３番染色体上の自閉症感受性遺伝子の同定
連鎖している染色体領域内の上記の２．１８Ｍｂｐをスクリーニングすることで、自閉症および関連する表現型の候補として、ＡＴＰａｓｅ  Ｃａ＋＋輸送細胞膜２を同定した。この遺伝子は実際に重要な間隔で存在しており、上述のクローンによって区切られた連鎖の証拠を有する。
【０１４６】
ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子は、ＮＰ＿００１００１３３１（ｍＲＮＡ  ＮＭ＿００１００１３３１、６８２１ｂｐ）のアイソフォームで予測される１，２４３個のアミノ酸ポリペプチドをコード化しており、３８０ｋｂを超えるゲノム配列に広がる。この遺伝子については、異なるアイソフォームをコード化する選択的スプライシングを受けた転写変異体が同定されている。この遺伝子によってコード化されるタンパク質は陽イオン輸送ＡＴＰａｓｅ（Ｐ型）ファミリー、タイプＩＩＢサブファミリーの一員であり、反応サイクル中のアスパルチルリン酸の中間体の形成を特徴とする。これらの酵素は非常に大きな濃度勾配に対して真核生物細胞から二価カルシウムイオンを取り除き、細胞内カルシウムの恒常性に重要な役割を果たす。
【０１４７】
Zaccbariasら（1997）はin situ ハイブリダイゼーション法を利用して、ヒトの海馬の４つのヒトＰＭＣＡアイソフォームの発現パターンを決定した。ＰＭＣＡ１、３のｍＲＮＡが海馬形成によって弱く発現されていたのに対して、ＰＭＣＡ２、４のｍＲＮＡは部位によって差を示し、ＣＡ２と歯状回においてレベルが上昇していた。
【０１４８】
ＰＭＣＡ２の生理学的役割を分析するために、Kozelら（1998）は遺伝子ターゲティングによってＰＭＣＡ２欠損マウスを作成した。ホモ接合性ＰＭＣＡ２ヌルマウスは、ヘテロ接合性マウスや野生型マウスよりも成長が遅く、不安定な歩行とバランス維持が困難であった。突然変異マウスおよび野生型マウスの小脳と内耳の組織学的分析によって、ヌル変異マウスにおいてプルキンエ神経細胞（ＰＭＣＡ２が高発現される）の若干の増加、分子層の薄層化、前庭系での平衡砂の欠如、そしてコルチ器官の一連の異常が示された。聴覚誘発性の脳幹反応の解析によって、ホモ接合性突然変異マウスでの聴覚障害やヘテロ接合マウスでの深刻な難聴が示された。これらのデータは、ＰＭＣＡ２が平衡性と聴覚の両方に必要であることを実証しており、平衡砂の形成と維持に使用されるカルシウムの主な供給源でありうることを示唆した。
【０１４９】
Streetら（1998）は、細胞膜Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ２型ポンプ（ＡＴＰ２Ｂ２、別名ＰＭＣＡ２）をコード化する遺伝子が、ｄｆｗにおいて突然変異を生じていると報告した。ｄｆｗＤＮＡのＡ−＞Ｇヌクレオチド転位が高度に保存したアミノ酸部位のグリシンからセリンへの置換を起こすのに対して、２番目の対立遺伝子ｄｆｗ２Ｊの２塩基対の欠失が切断タンパク質を予測させるフレームシフトを起こす。蝸牛では、ＡＴＰ２Ｂ２タンパク質は野生型マウスの不動毛と有毛細胞の基底板に局在化しているが、ｄｆｗ２Ｊマウスでは検出されない。このことから、ＡＴＰ２Ｂ２の突然変異が、基底膜からの神経伝達物質の放出の他、不動毛での感覚変換に影響を及ぼすことで聴覚障害と平衡異常の原因となりうることが示される。
【０１５０】
Uenoら（2002）は、グルタミン酸をリシンに変えるＰＣＭＡ２遺伝子内のヌクレオチド転位を有するマウスを確認した。マウスは、重度の振戦、協調のない首の上下左右の身もだえなどの行動欠陥を示した。ＰＭＣＡ２は小脳において発現され、細胞内Ｃａ２＋ポンプとして細胞内Ｃａ２＋の恒常性維持に重要な役割を果たしているため、行動欠陥の原因は小脳のニューロンのＣａ２＋調節の欠陥にありうる。突然変異マウスのＣａ２＋の恒常性の欠陥を確認するために、小脳ニューロン内の細胞内Ｃａ２＋濃度（［Ｃａ２＋］ｉ）で高Ｋ＋誘発性の変化を測定した。高Ｋ＋誘発性の脱分極中での［Ｃａ２＋］ｉの立ち上り速度は有意に低下し、増加した［Ｃａ２＋］ｉの押し出し速度も低下した。これらの結果から、正常な恒常性に向かって［Ｃａ２＋］ｉを調節するために突然変異マウスにおいて電位依存性Ｃａ２＋チャネルが下方調節されたことが示された。［Ｃａ２＋］ｉのダイナミックな変化は様々な神経機能に重要でありうるため、行動欠陥の原因は下方調節されたＣａ２＋の恒常性にある。
【０１５１】
Kozelら（2002）は、ＰＭＣＡ２が騒音誘発性の難聴へのかかりやすさを増大させる既知の突然変異タンパク質産物の最初の遺伝子でありうるとの仮説を立てた。
【０１５２】
自閉症障害の症例において、顕著から深刻な両側性の聴力損失すなわち難聴を診断し、一般集団よりもかなり高い、精神遅滞を伴う母集団で認められる罹患率と同程度の罹患率を示した（Rosenhallら、1999）。適切な試験を行った人のうち、軽度から中程度の難聴を７.９％、そして片側性の難聴を１.６％で診断した。自閉症での聴覚欠損は知的機能全般において同程度の割合で発生するため、知能障害自体の共分散が自閉症での聴覚欠損の分散の全てを説明可能であるとは思えない。聴覚過敏はよく見られ、自閉症群の１８.０％が罹患するが、年齢を適合させた非自閉症の比較群では罹患しない。また、漿液性中耳炎（２３.５％）および関連する伝音難聴（１８.３％）の割合が自閉症障害で上昇すると思われた。
【０１５３】
Boddaertらが報告した自閉症の小児と成人における最近の知見（2003年、2004年）から、自閉症で典型的に認められる音に対する不適切な行動反応および言語機能障害が、聴覚野での異常処理に起因しうることが示される。
【０１５４】
Kurnellasらによる知見（2005）から、カルシウムクリアランスの遅延を引き起こす、ＰＭＣＡ２の濃度または活性の低下が、脊髄において神経細胞損害と喪失の原因となることが示される。
【０１５５】
まとめると、本出願で示す連鎖結果は、３番染色体上の自閉症関連遺伝子変化の重要な間隔内において、神経機能および難聴に関与するヒトＡＴＰ２Ｂ２遺伝子を同定しており、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはその調節配列内の変化（例、突然変異および／または多型）がヒトの自閉症の発症の一因となり、診断および治療診察に対する新しい標的を示しうると結論付ける。
【０１５６】
３．関連研究
伝達不均衡テスト（ＴＤＴ）を利用して、問題になっている特定の表現型（本明細書では自閉症）と遺伝子マーカーの対立遺伝子または特定マーカーの対立遺伝子を含むハプロタイプとの関連性を検証するために、連鎖試験で使用したのと同じ家族をまた使用した。ＴＤＴは、試験サンプルの母集団の層別化問題に左右されないため、強力な関連研究である。簡潔に言えば、ヘテロ接合性の親から罹患した子供の対立遺伝子の分離を試験した。伝達されない対立遺伝子と比較した、罹患した子供に伝達される対立遺伝子の部分を、ランダム分布下で予測される比率と比較する。期待値を超える有意に過剰の対立遺伝子の伝達は、各対立遺伝子と試験した自閉症表現型を伴うハプロタイプとの関連性の証拠となる。
【０１５７】
この分析結果から、ＡＴ２Ｂ２遺伝子の特定の対立遺伝子が自閉症と正に関連しており、ひいては疾患へのかかりやすさを高めることが示される。検査した母集団において、ＳＮＰ２２の対立遺伝子１（Ａ）は、ＴＤＴによって判定される自閉症と関連づけられる（p値＝０.０４７６）。対照的に、ＳＮＰ２２の対立遺伝子２（Ｇ）の自閉症の人への伝播は有意に低く、この対立遺伝子が疾患からの保護を助長することを示している。
【０１５８】
自閉症の人への対立遺伝子の伝達の例を、表３に示している。
【０１５９】
【表３】
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【０１６０】
また、ＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３９、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ６１、ＳＮＰ７３、ＳＮＰ７４についてハプロタイプを作成し、ＳＮＰすべてに対する様相を識別した。
【０１６１】
検査した母集団のこの分析の結果から、ＳＮＰ２１の対立遺伝子２（Ｔ）、ＳＮＰ２２の対立遺伝子１（Ａ）、またはＳＮＰ２８の対立遺伝子２（Ｔ）の存在を特徴とする特定のハプロタイプすべてが自閉症と有意に関連しており、対立遺伝子２（Ｔ）、１（Ａ）、２（Ｔ）をそれぞれ欠く特定のハプロタイプが選択的に自閉症患者に伝達されることはないことが示された。一例は、ＳＮＰ２１−ＳＮＰ４６のハプロタイプ２−１（Ｔ−Ｃ）である（ｐ＝０．００１６４４）。ＳＮＰ２１の対立遺伝子２（Ｔ）の代わりに対立遺伝子１（Ｃ）、あるいはＳＮＰ２８の対立遺伝子２（Ｔ）の代わりに対立遺伝子１（Ｃ）を運ぶハプロタイプは、自閉症患者において低い評価であるとの有意な証拠を示している。一例は、ＳＮＰ２８−ＳＮＰ６１のハプロタイプ１−１（Ｃ−Ａ）である（ｐ＝０．００８０８７）。
【０１６２】
自閉症患者に選択的に伝達される、伝達されないハプロタイプの例を表４に示す。
【０１６３】
【表４】
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【０１６４】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【０１６５】
【図１】Ｇｅｎｏｍｅ Ｈｙｂｒｉｄ Ｉｄｅｎｔｉｔｙ Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ（GenomeHIP）を利用した高密度マッピング
【図１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月22日(2007.11.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験者の自閉症または自閉症領域障害の存在または素因を検出するインビトロ方法であって、該方法が被験者からの検体におけるＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項２】
被験者の自閉症または自閉症領域障害からの防御を検出するインビトロ方法であって、該方法が被験者からの検体におけるＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項３】
自閉症または自閉症領域障害の治療に対する被験者の反応を評価するインビトロ方法であって、該方法が被験者からの検体におけるＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項４】
自閉症または自閉症領域障害の治療に対する被験者への有害作用を評価する方法であって、該方法が被験者からの検体におけるＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在を検出することを含む方法。
【請求項５】
ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子座の変化の存在が、塩基配列決定、選択的ハイブリダイゼーション、および／または選択的増幅によって検出される、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
前記変化が自閉症と関連する１個または数個のＳＮＰまたはＳＮＰのハプロタイプである、請求項１〜４のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
自閉症と関連する前記ハプロタイプが、ＳＮＰ２１、ＳＮＰ２２、ＳＮＰ２８、ＳＮＰ３９、ＳＮＰ４６、ＳＮＰ６１、ＳＮＰ７３、ＳＮＰ７４からなる群から選択される数個のＳＮＰを含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
自閉症と関連する前記ＳＮＰがＳＮＰ２２である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
自閉症または自閉症領域障害に対する生物活性化合物の選択方法であって、前記方法が、試験化合物とＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたはその遺伝子ないしその断片とを接触させること、およびＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドまたは遺伝子ないしその断片と結合する該試験化合物の能力を測定することを含む方法。
【請求項１０】
自閉症または自閉症領域障害に対する生物活性化合物の選択方法であって、前記方法が、ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドを発現する組み換え宿主細胞と試験化合物とを接触させること、および前記ＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチドと結合するおよびＡＴＰ２Ｂ２ポリペプチド活性を調節する前記試験化合物の能力を測定することを含む方法。
【請求項１１】
自閉症または自閉症領域障害に対する生物活性化合物を選択する方法であって、前記方法が、試験化合物とＡＴＰ２Ｂ２遺伝子とを接触させること、および前記ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子の発現を調節する前記試験化合物の能力を測定することを含む方法。
【請求項１２】
自閉症または自閉症領域障害に対する生物活性化合物を選択する方法であって、前記方法が、試験化合物と、ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子プロモーターの制御下にあるレポーター遺伝子を含むレポーター構築物を含む組み換え宿主細胞とを接触させること、および前記レポーター遺伝子の発現を調節する（例、促進または減少させる）試験化合物を選択することを含む方法。
【請求項１３】
前記ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはそのポリペプチドまたはその断片が、変化または突然変異ＡＴＰ２Ｂ２遺伝子またはポリペプチド、または変化または突然変異を含むその断片である、請求項９〜１２のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
前記調節が活性化である、請求項９〜１３のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
前記調節が阻害である、請求項９〜１３のいずれか一項記載の方法。
【国際調査報告】
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