(57)【要約】本発明は、一般的に、増殖因子受容体エピトープペプチド、特に、ＥＧＦファミリー受容体エピトープペプチドに関する。また、本発明は、抗腫瘍または抗癌活性を有する抗体を創製するにおける、または免疫学的応答を刺激するにおける該受容体ペプチドの使用に関する。本発明はさらに、その受容体ペプチドに対して特異的に配向する抗体に関する。免疫応答を生じさせるための方法、ならびに腫瘍および癌を処置するための方法もまた、提供される。
2008501308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜１４のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含む、単離された受容体ポリペプチドおよびその免疫原性フラグメント。
【請求項２】
アミノ酸配列
【化１】
2008501308.tif 000040
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項３】
アミノ酸配列
【化２】
2008501308.tif 000041
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項４】
アミノ酸配列
【化３】
2008501308.tif 000042
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列
【化４】
2008501308.tif 000043
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項６】
アミノ酸配列
【化５】
2008501308.tif 000044
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸配列
【化６】
2008501308.tif 000045
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項８】
アミノ酸配列
【化７】
2008501308.tif 000046
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列
【化８】
2008501308.tif 000047
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１０】
アミノ酸配列
【化９】
2008501308.tif 000048
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１１】
アミノ酸配列
【化１０】
2008501308.tif 000049
を有する、単離されたポリペプチド。
【請求項１２】
アミノ酸配列：
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５（配列番号１１）
を有し、ここで各残基は、独立して以下：
Ｘ１はＧ、Ｐ、ＮまたはＳであり；
Ｘ２はＡ、Ｐ、Ｔ、ＳまたはＬであり；
Ｘ３はＤ、ＨまたはＳであり；
Ｘ４はＳ、Ｙ、Ｔ、ＮまたはＫであり；
Ｘ５はＹ、ＱまたはＭであり；
Ｘ６はＭまたはＶであり；
Ｘ７はＥ、ＴまたはＤであり；
Ｘ８はＡまたは無しであり；
Ｘ９はＥまたはＫであり；
Ｘ１０はＤまたはＮであり；
Ｘ１１はＧまたはＡであり；
Ｘ１２はＶ、Ｉ、ＬまたはＴであり；
Ｘ１３はＲ、ＱまたはＫであり；
Ｘ１４はＲ、ＫまたはＭであり；
Ｘ１５はＣまたは無しである、
のように選択され得る、単離されたペプチド。
【請求項１３】
アミノ酸配列：
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５（配列番号１２）
を有し、ここで、各残基は独立して以下：
Ｘ１はＧ、Ｐ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＴであり；
Ｘ２はＡ、Ｐ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＩまたはＰであり；
Ｘ３はＤ、Ｅ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、ＳまたはＴであり；
Ｘ４はＳ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＫまたはＲであり；
Ｘ５はＹ、Ｆ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、Ｖ、Ａ、Ｌ、ＩまたはＰであり；
Ｘ６はＭ、Ｖ、Ａ、Ｌ、ＩまたはＰであり；
Ｘ７はＥ、Ｄ、ＴまたはＳであり；
Ｘ８はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍまたは無しであり；
Ｘ９はＤ、Ｅ、ＫまたはＲであり；
Ｘ１０はＤ、Ｅ、ＮまたはＱであり；
Ｘ１１はＧ、Ａ、Ｍ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＰであり；
Ｘ１２はＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ＳまたはＴであり；
Ｘ１３はＲ、Ｋ、Ｈ、ＱまたはＮであり；
Ｘ１４はＲ、Ｋ、Ｈ、Ｍ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＰであり；
Ｘ１５はＣまたは無しである、
のように選択され得る、単離されたペプチド。
【請求項１４】
アミノ酸配列：
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＥＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｃ（配列番号１３）
を有し、ここで各Ｘｎ残基は、独立して以下：
Ｘ１はＧまたはＡであり；
Ｘ２はＡまたはＫであり；
Ｘ３はＤまたはＡであり；
Ｘ４はＳまたはＡであり；
Ｘ５はＹまたはＡであり；
Ｘ６はＭまたはＡであり；
Ｘ７はＥまたはＡであり；
Ｘ８はＥまたはＡであり；
Ｘ９はＤまたはＡであり；
Ｘ１０はＶ、ＡまたはＫであり；
Ｘ１１はＲまたはＡであり；
Ｘ１２はＫまたはＡである、
のように選択され得る、単離されたペプチド。
【請求項１５】
アミノ酸配列：
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＥＸ６Ｘ７Ｘ８ＤＧＶＲＫＣ（配列番号１４）
を有し、ここで各Ｘｎ残基は独立して以下：
Ｘ１はＧまたはＡであり；
Ｘ２はＡまたはＫであり；
Ｘ３はＤまたはＡであり；
Ｘ４はＳまたはＡであり；
Ｘ５はＹまたはＡであり；
Ｘ６はＭまたはＡであり；
Ｘ７はＥまたはＡであり；
Ｘ８はＥまたはＡである、
のように選択され得る、単離されたペプチド。
【請求項１６】
配列番号１〜１４のいずれかに記載されたペプチドをコードする、単離された核酸。
【請求項１７】
該ペプチドは配列番号１〜１４のいずれかの１以上から選択される、免疫原性受容体ペプチドまたはその免疫原性フラグメント。
【請求項１８】
哺乳動物を免疫化する方法であって、該方法は、増殖因子受容体エピトープペプチドまたはその免疫原性フラグメントを投与する工程を包含し、それにより、異常発現または過剰発現された増殖因子受容体を発現する細胞上には露出されるが、野生型細胞には露出されないエピトープペプチドと免疫反応性の抗体が生産される、方法。
【請求項１９】
哺乳動物を免疫化する方法であって、該方法は、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦ受容体ペプチド、またはその免疫原性フラグメントを投与する工程を包含し、それにより、異常発現または過剰発現されたＥＧＦＲを発現する細胞上には露出されるが、野生型細胞では露出されないエピトープペプチドと免疫反応性である抗体が生産される、方法。
【請求項２０】
配列番号１〜１４のいずれかから選択された１以上のＥＧＦＲペプチド、および薬学的に受容可能なアジュバントを含む、ワクチン。
【請求項２１】
配列番号１〜１４のいずれかから選択された１以上のＥＧＦＲペプチド、および薬学的に受容可能なアジュバントを含む、免疫原性組成物。
【請求項２２】
配列番号１〜１４のいずれかの群から選択された１以上のＥＧＦファミリー受容体ペプチド、および薬学的に受容可能なアジュバントを含み、さらに、１以上のさらなる腫瘍抗原を含む、腫瘍ワクチンまたは抗癌ワクチン。
【請求項２３】
前記腫瘍抗原がＥＧＦ抗原またはＥＧＦＲ抗原である、請求項２２に記載のワクチン。
【請求項２４】
哺乳動物の治療用ワクチンであって、被験体は頭頸部癌、乳癌、または前立腺腫瘍および神経膠腫に罹患しており、該ワクチンは、配列番号１〜１４のいずれかの群から選択される１以上のＥＧＦファミリー受容体ペプチド、またはその免疫原性フラグメント、および薬学的に受容可能なアジュバントを含む、ワクチン。
【請求項２５】
前記ペプチドがキャリアに結合体化された、請求項に２４記載のワクチン。
【請求項２６】
配列番号１〜１４のいずれかから選択される１以上のペプチドから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２７】
配列番号１〜１４のいずれかから選択される１以上のペプチドと免疫反応性であるＥＧＦファミリー受容体ペプチド抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む、薬学的組成物。
【請求項２８】
配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドに対する、精製された抗体。
【請求項２９】
モノクローナル抗体である、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
検出可能な標識で標識された、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３１】
前記抗体が、治療または診断目的を有する１以上の他の分子または因子に共有結合されているかまたはそうでなければ会合している、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３２】
前記他の分子または因子が、異なる特徴を有する他の抗体または抗体フラグメント、トキシン、リガンド、放射性同位体および化学療法剤から選択される、請求項３１に記載の抗体。
【請求項３１】
異常発現または過剰発現されたＥＧＦＲを発現する細胞に露出されるが、野生型細胞では露出されないエピトープに免疫反応性である抗体を創製する方法であって、該方法は、配列番号１〜１４のいずれかからから選択されるＥＧＦ受容体ペプチドまたはそのフラグメントで動物を免疫化する工程、およびペプチド結合抗体を単離する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
異常発現または過剰発現されたＥＧＦＲを発現する細胞で露出されるが、野生型細胞では露出されないエピトープと免疫反応性である抗体を選択する方法であって、該方法は、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦ受容体ペプチドまたはそのフラグメントで、候補抗体、または抗体もしくは活性な抗体フラグメントを発現する細胞をスクリーニングする工程を包含する、方法。
【請求項３３】
特に配列番号１〜１４のいずれかから選択される免疫原性ＥＧＦファミリー受容体ペプチドをコードする核酸を含む、核酸ワクチンまたはＤＮＡワクチン。
【請求項３４】
腫瘍抗原または免疫調節分子ペプチドをコードする核酸をさらに含む、請求項３３に記載のワクチン。
【請求項３５】
配列番号１〜１４のいずれかの群から選択されるＥＧＦ受容体エピトープペプチドの存在または露出を検出することによって、頭頸部癌、乳癌、または前立腺腫瘍および神経膠腫を含む腫瘍および癌を測定およびモニターする方法。
【請求項３６】
前記ＥＧＦ受容体エピトープペプチドが：
ａ．配列番号１〜１４のいずれかからなる群より選択されるＥＧＦ受容体エピトープペプチドの存在または露出が疑われるサンプルと、該ＥＧＦ受容体ペプチドに対する抗体とを、該ペプチドの該抗体に対する結合を起こさせる条件下で接触させる工程；および
ｂ．該サンプル由来の該ＥＧＦ受容体エピトープペプチドと該抗体との間で結合が起こっているか否かを検出する工程、
によって測定され、
ここで、該結合の検出は、該サンプル中の該ＥＧＦ受容体エピトープペプチドの存在または露出を示す、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
被験体において免疫応答を誘導する方法であって、該被験体は、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫を含む腫瘍または癌を有し、該方法は、配列番号１〜１４のいずれかの群から選択されるＥＧＦ受容体エピトープペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物の一定量を被験体に投与し、それにより免疫応答を誘導する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般には、増殖因子受容体エピトープペプチド、特に、ＥＧＦファミリー受容体エピトープペプチドに関する。また、本発明は、抗腫瘍活性または抗癌活性を有する抗体の創製、または免疫学的応答の刺激における、その受容体ペプチドの使用に関する。本発明は、さらに、その受容体ペプチドに対して特異的に配向される抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
（治療のための標的としての表皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）およびｄｅ２−７  ＥＧＦＲ）
癌の免疫治療的処置は、疾患標的に対する高度に特異的であり得る点で、外科的処置、放射線療法および化学療法のような伝統的治療よりも優れた利点を有する。腫瘍特異的ｍＡｂは、癌細胞を標的とするのに用いることができ、潜在的標的としての腫瘍−関連抗原を同定し、つきとめる必要性を作り出す。ＥＧＦＲ、ＩＬ−２受容体およびｐ１８５  ＨＥＲ２のような増殖因子受容体の過剰発現は、しばしば、肺腫瘍、乳腫瘍、頭頸部腫瘍、および卵巣腫瘍のような腫瘍に関連付けられている。
【０００３】
ＥＧＦＲは、チロシンキナーゼ増殖因子受容体タンパク質のファミリーに属する。ＥＧＦＲは長い間研究の対象であり、最近、細胞外ドメイン（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）および細胞内キナーゼドメイン（非特許文献４）で行われた成功した構造決定研究がある。これは、受容体およびそのリガンドの挙動に対する重要な情報を提供した。ＥＧＦＲは細胞表面会合分子であり、これはＥＧＦおよびトランスフォーミング増殖因子アルファ（ＴＧＦα）のような高度に特異的なリガンドの結合を介して活性化される。リガンドの結合の後、受容体が二量体化し、その結果、細胞内チロシンキナーゼ領域がリン酸化される。これは下流シグナル伝達を導き、応答のカスケードを活性化し、その結果、細胞の成長および増殖がもたらされる。正常な細胞とは異なり、腫瘍細胞は機能についてＥＧＦＲに依存していることを考慮すると、そして細胞における増殖および分化のＥＧＦＲの調節制御を阻害するある程度の可能性のために、その受容体は治療のための共通の標的である。ＥＧＦＲは、通常は肝臓および皮膚で発現され、頭頸部、結直腸、膵臓、神経膠腫、膀胱および肺のような固体腫瘍ではしばしば活性が増大しており、それゆえ有用な予後マーカーとなっている。ＥＧＦＲの過剰発現には、しばしば、腫瘍に対してオートクリンループの増殖をもたらす、増大したＴＧＦα生産が伴う。さらに、いくつかの腫瘍で観察されるＥＧＦＲ遺伝子の増幅および再編成は、しばしばＥＧＦＲの変異体形態の発生に関連することが見出された（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。最も一般的な突然変異体の１つは、ＥＧＦＲ改変体（ＥＧＦＲｖＩＩＩまたはｄｅ２−７ＥＧＦＲ）である。ｄｅ２−７ＥＧＦＲは、８０１塩基対のイン−フレーム欠失（エクソン２〜７を欠く転写体の過剰発現に対応する）、および細胞外ドメインにおけるアミノ酸残基６〜２７３のかなりの大きさの欠失を有し、新規なグリシンがスプライス部位に挿入されている（非特許文献６；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。ＥＧＦＲのこの短縮形態はリガンド結合に依存せず、構成的に活性である。ｄｅ２−７ＥＧＦＲは、大きな割合（＞５０％）の悪性神経膠腫において発現され、ｄｅ２−７ＥＧＦＲを乳癌腫（２７％）、卵巣癌腫、前立腺癌腫および肺癌腫（１７％）に関係付ける報告もある（非特許文献６；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。
【０００４】
（抗ＥＧＦＲ抗体）
多くの研究は、ＥＧＦＲの細胞外領域に対する抗体の生産に焦点を当ててきた。創生されたｍＡｂは、主として、リガンド結合をブロックすることおよびまたシグナル伝達の破壊により、その抗腫瘍活性を媒介する。ＥＧＦＲを特異的に認識するＰｅｎｇら、１９９６（非特許文献１４）およびＭｅｎｄｅｌｓｏｎら、１９９７（非特許文献１５）によって最初に開発された、数個のｍＡｂが存在した。ｍＡｂ４２５、５２８  ＩｇＧ２ａおよび２２５  ＩｇＧ１は、頭頸部扁平細胞癌腫を有する患者を治療するために用いられた（非特許文献１６）。放射性標識を含む実験作業は、ｍＡｂ  ４２５が、神経膠腫を含む腫瘍増殖の有効な阻害剤であることを示した（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９）。ＩＭＣ−Ｃ２２５  ｍＡｂはＥＧＦＲを特異的に認識し、頭頸部癌、結直腸癌、膵臓癌および肺癌のような癌の治療においてかなりの潜在能力を有する。ｍＡｂ  ２５５は、ｐ２７  Ｋ１Ｐ１をアップレギュレートし、前立腺癌細胞系におけるＧ１停止を誘導する。引き続いて、マウス２２５抗体のキメラバージョン（ＥＲＢＩＴＵＸＴＭ（Ｉｍｃｌｏｎｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＮＹ）ＩＭＣ−Ｃ２２５）が、その治療能力を拡大するように開発された。このＩＭＣ−Ｃ２２５は、ＥＧＦＲに対して増大した結合親和性を有し、マウスにおける異種移植片の増殖を低下させるのにより効果的である。マウス抗体およびキメラ抗体のはいずれも、放射線（非特許文献２０）または化学療法（非特許文献２１）との併用療法において投与される場合、さらにより効果的である。ＩＭＣ−Ｃ２２５の作用の治療メカニズムとしては、効果的な受容体ブロッキング機能およびＡＤＣＣに対する能力が挙げられるようである。ＩＭＣ−２２５は、患者において腫瘍のサイズを低下させることができる。高用量のＩＭＣ−Ｃ２２５が、肝臓および皮膚の結合部位を飽和させるのに必要とされ、副作用は主としてざ瘡発疹および掻痒である。臨床試験は、シスプラチンと組み合わせた場合に、１１％と２２％との間の患者における腫瘍増殖の部分寛解率を示している。この抗体の前臨床および臨床進行はＢａｓｅｌｇａら、［４９］およびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎらによるレビューに取り上げられている（非特許文献２２；非特許文献２３）。
【０００５】
ｍＡｂ  Ｒ３は、ＥＧＦＲに対して惹起され、そして放射線免疫療法で用いるために最初に開発された（非特許文献２４；非特許文献２５）。Ｒ３のキメラ形態およびヒト化形態の両方が生産され、アフリカミドリザルで試験されている。Ｒ３のヒト化バージョンは、マウス抗体と同一の結合親和性を有し、キメラ抗体よりも２倍低い免疫原性であることが見出された。テクネチウム標識化マウスおよびヒト化ｍＡｂを用いるマウスにおける異種移植片の前臨床実験は、マウスよりもヒト化バージョンで、診断ツールとしてのより大きな潜在能力を示した。ラット抗ＥＧＦＲ  ｍＡｂであるＩＣＲ６２はリガンド結合について効果的に競合し、マウスにおいてヒト腫瘍異種移植片（扁平細胞癌腫）を根絶する。第Ｉ相臨床試験は、該抗体が扁平細胞癌腫を有する患者に安全に投与されたことを報告しており、それは、それ以来、頭頸部扁平細胞癌腫細胞系における増殖因子受容体およびそれらのリガンドのシグナル伝達経路を調べるのに用いられてきた（非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８）。
【０００６】
抗−ＥＧＦＲ  ｍＡｂ  １０８．４は、シスプラチンと組み合わせた場合、増強された抗腫瘍効果を示した（非特許文献２９）。同一の結果がＦａｂフラグメント単独で起こった。このことは、メカニズムが宿主補体系とＦｃとの相互作用に依拠しないことを示唆する。別の実施例において、併用療法の潜在能力が、抗体と受容体との間の基礎となるメカニズムの理解に関して、ｍＡｂ  ＲＧ  ８３８５２を用いて調べられた（非特許文献３０）。ｍＡｂ  ＲＧ  ８３８５２によるＥＧＦＲのアップレギュレーションは、腫瘍内の受容体のチロシンキナーゼ活性を増大させ、それにより、化学療法に対するその感受性を増加させることが示唆された。モノクローナル抗体による標的化照射は、癌の治療のための別のアプローチである。神経膠腫の処置における、数個の抗ＥＧＦＲ抗体を放射性標識する効果に対する多数の研究が、Ｋａｌｏｆｏｎｏｓによって試みられた（非特許文献３１）。これらの研究は、良好な標的化および最小の毒性を報告した。ＥＧＦＲにおけるリガンド結合をブロックするヒト化ｍＡｂ  ＥＭＤ  ７２０００は、現在臨床試験を受けている（非特許文献３２）。最後に、トランスジェニックマウスに由来する全長ヒト抗体ＡＢＸ−ＥＧＦもまた、ＥＧＦＲを効果的に標的化する（非特許文献３３）。
【０００７】
（抗ｄｅ２−７  ＥＧＦＲ抗体）
野生型ＥＧＦＲはほとんどの上皮細胞で発現される。従って、受容体を治療的に標的化する欠点は、正常組織だけでなく癌細胞に対する毒性の副作用である。加えて、放射性アアイソタイプまたは細胞傷害剤と結合体化させた場合のそのような抗体は、正常な組織に対して潜在的な害を引き起こし得る。理想的には、癌細胞上のＥＧＦＲを優先的に標的化するのが有利である。ｄｅ２−７ＥＧＦＲは魅力的な治療剤である。なぜならば、成人においては、それは癌細胞に対して高度に特異的だからである。ｄｅ２−７ＥＧＦＲに対する抗体で行われた実験があり、そこでは、癌細胞系における細胞成長の阻害が示されている。ｍＡｂ  ５２８（非特許文献１６；非特許文献３４）および４２５（前記）は、ｄｅ２−７ＥＧＦＲおよびＥＧＦＲ双方に結合する。スプライス部位におけるグリシンの挿入によって生じたｄｅ２−７ＥＧＦＲの独特の配列は、細胞外領域のＮ−末端近くに位置する新規なエピトープを作り出す（非特許文献３５；非特許文献３６）。融合接合に対して特異的ないくつかの抗体が生産されており、ｍＡｂ  Ｙ１０が挙げられる（非特許文献１２；非特許文献３７；非特許文献３８）。マウスにおける脳腫瘍異種移植片を治療するのに効果的に用いられたこの抗体は、細胞増殖を低下させることによって機構的に機能し、また、ＡＤＣＣおよびＣＤＣに対する能力も示した。融合接合に対して特異的な配列のペプチドに対して創製された抗体は、ファージディスプレイによって生じたＦｖフラグメントであるＭＲ１を含む（非特許文献３９）。Ｆｖは固体腫瘍に浸潤する能力を有し、免疫トキシンを送達するのに用いられてきた。ｄｅ２−７ＥＧＦＲの融合接合を標的化するいくつかの抗体が放射性標識されており：これらとしてはＬ８Ａ４、ＤＨ８．３およびＵａ３０：２が挙げられる（非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２）。放射性標識されたＤＨ８．３抗体は、ｄｅ２−７ＥＧＦＲを認識するが、正常なＥＧＦＲを認識せず、ヌードマウスにおいて腫瘍のサイズを低下させる。
【０００８】
（マウス抗−ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ−８０６）
マウスモノクローナル抗体ｍＡｂ−８０６（クラスＩｇＧ２ｂ）は、ｄｅ２−７ＥＧＦＲに結合するが、正常に発現された野生型ＥＧＦＲには結合しないことが示された（米国特許出願ＵＳＳＮ；非特許文献４３）。ｍＡｂ−８０６は正常な野生型受容体と反応しないが、それは、増幅されたＥＧＦＲ遺伝子を含有する腫瘍細胞上のある割合（〜１０％）の野生型ＥＧＦＲを認識した（非特許文献４３；非特許文献４４）。ｄｅ２−７ＥＧＦＲおよび増幅された野生型ＥＧＦＲの両方（いずれも腫瘍において顕著な頻度で起こる）を標的化するｍＡｂ−８０６の能力は、治療剤としてｍＡｂ−８０６に対してさらなる有効性を与えるはずである。
【０００９】
ｍＡｂ−８０６は、それがｄｅ２−７ＥＧＦＲの独特の融合接合を認識しない点で、ｄｅ２−７ＥＧＦＲを標的とする他の抗体とは異なる（非特許文献６；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）。ｍＡｂ−８０６の結合エピトープは、野生型ｄｅ２−７ＥＧＦＲおよび短縮型ｄｅ２−７ＥＧＦＲの両方に存在する。ｄｅ２−７ＥＧＦＲおよび増幅されたＥＧＦＲ双方に結合するｍＡｂ−８０６の能力、および正常に発現された野生型受容体への結合は存在しないことを考慮すると、そのエピトープは、立体配座的に依存すると推定される。臨床開発における野生型ＥＧＦＲに対する多くの抗体は、リガンド結合をブロックすることによって機能する。これは、非リガンド結合性ｄｅ２−７ＥＧＦＲおよび増幅されたＥＧＦＲ両方との結合の特徴、および正常な受容体との結合が存在しないことのため、ｍＡｂ−８０６の作用メカニズムではないように見える。このことは、ｍＡｂ−８０６が、リガンド結合または二量体化と干渉しないことを示す。
【００１０】
ｍＡｂ−８０６抗体は、Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７ＥＧＦＲ細胞系で発現されるｄｅ２−７ＥＧＦＲに結合するが、増幅されていない野生型ＥＧＦＲを含有する親細胞系（Ｕ８７ＭＧ）には結合しない。ｍＡｂ−８０６とＤＨ８．３  ｍＡｂとの有効性の比較において、ｍＡｂ−８０６は、腫瘍標的化においてより効果的であり、ＤＨ８．３よりも強い結合を有することが立証された（ＥＧＦＲ（非特許文献４３））。ｍＡｂ−８０６は、増幅されたＥＧＦＲ（非特許文献４３）ならびにＵ８７ＭＧ．ｄｅ２−７ＥＧＦＲを含有するＡ４３１細胞系を用いて、用量依存的にマウス異種移植片の増殖を阻害することが示された。再度、増殖阻害は、親Ｕ８７ＭＧ異種移植片で観察されなかった。重要なことには、低下した腫瘍増殖がまた、Ｕ８７ＭＧ．ｄｅ２−７ＥＧＦＲ、ＬＮ−Ｚ３０８．ｄｅ２−７ＥＧＦＲ、およびＡ１２０７．ｄｅ２−７ＥＧＦＲ異種移植片（全てｄｅ２−７ＥＧＦＲを発現する）へのｍＡｂ−８０６の適用の際に、頭蓋内に異種移植した神経膠芽細胞腫に対して示されたことである（非特許文献４５）。親Ｕ８７ＭＧ腫瘍、Ｕ８７  ＭＧ．ＤＫ腫瘍（キナーゼ不全ｄｅ２−７ＥＧＦＲを発現する）の異種移植片において有意な阻害は観察されず、小さな応答のみが、Ｕ８７ＭＧ神経膠腫においておこるだけである。脈管形成の低下およびアポトーシスの増加が、腫瘍増殖の低下と共に起こる。
【００１１】
その独特の特性により、ｍＡｂ−８０６抗体は、頭頸部癌および神経膠腫のような癌の治療のための、有望な治療剤である。ヒト化形態のｍＡｂ−８０６の開発は、その効率に対して多大な効果を有するであろう。そのような抗体は、ＨＡＭＡ応答を回避し、エフェクター機能を補充し、循環系におけるその半減期を増大させるその能力を改善させ、それゆえその臨床的な前途を大いに増強するはずである。
【００１２】
最初は、治療の特効薬としてのｍＡｂの使用に対して高い期待があったが、非ヒト抗体の臨床的使用を制限するいくつかの主な障害があることが間もなく認識された。非ヒトｍＡｂの複数用量の投与は、一般的に、望ましくない免疫応答を惹起し、それゆえこのことが、治療剤としてのそれらの使用を厳しく制限している。マウス抗体は、外来性タンパク質としてヒト免疫系によって認識され、その結果、ヒト抗−マウス抗体応答（すなわち、ＨＡＭＡ応答）として知られる免疫効果がもたらされる。ＨＡＭＡ応答は、抗体機能の中和および重篤なアレルギー様反応をもたらし得る。
【００１３】
ＨＡＭＡ応答のほとんどは、抗原結合部分（Ｆａｂ）に対して向けられ、ほとんど、抗体の定常領域（Ｆｃ）には向けられない。げっ歯類のｍＡｂの臨床適用から生じるさらなる問題は、Ｆｃ領域に関連する。ヒトＦｃは、特殊化されたＦｃ受容体に結合し、このことが、循環系に抗体を維持するのを助ける。その結果、げっ歯類ｍＡｂは、ヒトＩｇに対する１週間以上と比較して、短縮された半減期（通常１〜３日）を有する。別の制限は、ヒトＦｃ受容体へのＦｃの結合で開始される種々のエフェクター機能の補充の低下である。マクロファージ、単球および好中球のような特殊化されたエフェクター細胞のＦｃ受容体への結合は、免疫系を誘発し、抗体依存性細胞媒介細胞溶解（ＡＤＣＣ）として知られる応答を導く。Ｆｃ受容体は、補体カスケード（相互作用するタンパク質の群）の誘発も担っており、補体依存性細胞溶解応答（ＣＤＣ）を導く。これは、細胞溶解、および細菌感染と戦うための抗体の有効性の増大をもたらす。定常ドメインのクラスが、細胞溶解における抗体の効果を優先的に制御する。
【００１４】
抗体用量の迅速な注入および抗体フラグメントの使用のような、マウスｍＡｂの免疫原性を克服するために採られ得る種々のアプローチが存在する（例えば、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）；非特許文献４６；非特許文献４７およびその中の引用文献参照）。あるいは、全ＩｇＧが治療のために用いられる場合は、抗体工学の方法がＨＡＭＡ応答を低下させるのに使用されてきた。このアプローチは、半減期を増大およびエフェクター機能のより効果的な補充の、付加的な潜在的利点を有する。そのようなヒト化方法は当該分野で周知であり、例えば、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４および特許文献５（各々が、本明細書中に参考として援用される）に記載されている。
【００１５】
（ヒト抗体）
ｍＡｂにおける免疫原性の問題を克服する代替的なアプローチは、完全な（十分な）ヒト抗体の生産である。ファージディスプレイ技術を使用して、親和性富化（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）の方法を用いて、抗原に特異的に結合するある範囲のヒト抗体を選択することができる（非特許文献４８；非特許文献４９）。バクテリオファージは、細菌のみに感染するウイルスであり、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉにおいて複製される。ファージディスプレイプロセスは、ヒト遺伝子物質のファージゲノムへの挿入を包含する。フィラメント状ファージ系は独特の特性を有し、ここで、ファージ表面に提示されるリガンドの構造的および機能的情報（表現型）は、ファージゲノム内のリガンドの遺伝子的情報（遺伝子型）とリンクする。従って、フィラメント状ファージの表面上でＩｇ分子のライブラリーを創製および提示させることができ、結合親和性を示すものを選択する。この方法は、高い抗原親和性を有する多くの抗体の非常に迅速な同時スクリーニングという利点を有する。それは、抗体のヒト化においても、十分な結合活性を保存するのに必要とされる潜在的に重要な残基の組を含むコンビナトリアルライブラリーを創製することによって、首尾よく用いられている。次いで、その重要な残基の無作為な突然変異誘発によって、フレームワークが最適化され得る。
【００１６】
（トランスジェニックマウス）
近年、ヒトｍＡｂを生産するファージディスプレイ方法に対する代替的なアプローチが開発されており、ここで、十分にヒトのタンパク質配列を作り出すことができるヒト遺伝子が、トランスジェニックマウスを作製するマウスＤＮＡに挿入される。関係する方法のレビューについては、文献非特許文献５０；非特許文献５１；非特許文献５２参照）。従って、これらのマウスは、標的抗原での免疫化に応答してヒト抗体を生産することができる。作成された抗体は事実上ヒトのものであり、宿主免疫系によって拒絶されるとは予測されない。Ａｂｇｅｎｉｘによって生産されたＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（登録商標）は、ヒト重鎖遺伝子のほぼ８０％、および多数の軽鎖遺伝子を含有する。種々の株のマウスが生産されており、これらは、ある範囲の疾患を標的化することができる抗体の種々のクラスを含有している（非特許文献５３；非特許文献５４）。例えば、ＡＢＸ−ＭＡ１は、ＭＣＡＭ／ＭＵＣ１８（マウスにおけるヒトメラノーマ細胞での腫瘍の密集および転移に関連する糖タンパク質）を標的化する十分にヒトの抗体であり、メラノーマの治療において有望性を示す（非特許文献５５）。ＡＢＸ−ＥＧＦはＥＧＦＲを標的化し、現在、頭頸部癌腫、非小細胞肺癌腫、および結腸癌の治療において第Ｉ／ＩＩ相臨床試験中である。
【特許文献１】米国特許第５，２２５，５３９号明細書
【特許文献２】米国特許第５，５３０，１０１号明細書
【特許文献３】米国特許第５，５８５，０８９号明細書
【特許文献４】米国特許第５，８５９，２０５号明細書
【特許文献５】米国特許第６，７９７，４９２号明細書
【非特許文献１】Ｏｇｉｓｏ  Ｈら、Ｃｅｌｌ  ２００２，１１０：７７５−７８７
【非特許文献２】Ｇａｒｒｅｔｔ  ＴＰら、Ｃｅｌｌ  ２００２，１１０：７６３−７７３
【非特許文献３】Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ＫＭら、Ｃｅｌｌ  ２００３，１１：５０７
【非特許文献４】Ｓｔａｍｏｓ  Ｊら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００２，２７７：４６２６５−４６２７２
【非特許文献５】Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ  ＴＡら、Ｎａｔｕｒｅ  １９８５，  ３１３：１４４−１４７
【非特許文献６】Ｗｏｎｇ  ＡＪ，  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２，８９：２９６５−２９６９
【非特許文献７】Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００，６０：１３８３−１３８７
【非特許文献８】Ｓｕｇａｗａ  Ｎ．ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０，８７：８６０２−８６０６
【非特許文献９】Ｙａｍａｚａｋｉ  Ｈ．ｓら、Ｊｐｎ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９０，８１：７７３−７７９
【非特許文献１０】Ｅｋｓｔｒａｎｄ  ＡＪら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９２，８９：４３０９−４３１３
【非特許文献１１】Ｇａｒｃｉａ  ｄＰら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９３，５３：３２１７−３２２０
【非特許文献１２】Ｗｉｋｓｔｒａｎｄ  ＣＪら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９５，５５：３１４０−３１４８
【非特許文献１３】Ｍｏｓｃａｔｅｌｌｏ  ＤＫら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９５，５５：５５３６−５５３９
【非特許文献１４】Ｐｅｎｇ  Ｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９６，５６：３６６６−３６６９
【非特許文献１５】Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７，３：２７０３−２７０７
【非特許文献１６】Ｓｔｕｒｇｉｓ  ＥＭら、Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｈｅａｄ  Ｎｅｃｋ  Ｓｕｒｇ  １９９４，１１１：６３３−６４３
【非特許文献１７】Ｒｏｄｅｃｋ  Ｕら、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９８７，３５：３１５−３２０
【非特許文献１８】Ｂｒａｄｙ  ＬＷら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｒａｄｉａｔ  Ｏｎｃｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｐｈｙｓ  １９９１，２２：２２５−２３０
【非特許文献１９】Ｆａｉｌｌｏｔ  Ｔら、Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ  １９９６，３９：４７８−４８３
【非特許文献２０】Ｒｏｂｅｒｔ  Ｆら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２００１，１９：３２３４−３２４３
【非特許文献２１】Ｓｈｉｎ  ＤＭら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１，７：１２０４−１２１３
【非特許文献２２】Ｂａｓｅｌｇａ  Ｊら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  ２０００，１８：９０４−９１４
【非特許文献２３】Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ  Ｊ  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２００２，２０  補遺１：１Ｓ−１３Ｓ
【非特許文献２４】Ｗａｔｅｒｆｉｅｌｄ  ＭＤ，  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８２，２０：１４９−１６１
【非特許文献２５】Ｒａｍｏｓ−Ｓｕｚａｒｔｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．１９９９，４０：７６８−７７５
【非特許文献２６】Ｏ−ｃｈａｒｏｅｎｒａｔ  Ｐら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ２０００，１８：１５５−１６１
【非特許文献２７】Ｏ−ｃｈａｒｏｅｎｒａｔ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ２０００，８６：３０７−３１７
【非特許文献２８】Ｏ−ｃｈａｒｏｅｎｒａｔ  Ｐら、Ｏｒａｌ  Ｏｎｃｏｌ．２００２，３８：６２７−６４０
【非特許文献２９】Ａｂｏｕｄ−Ｐｉｒａｋ  Ｅら、ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ  １９８８，８０：１６０５−１６１１
【非特許文献３０】Ｐｅｒｅｚ−Ｓｏｌｅｒ  Ｒら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ  １９９４，１２：７３０−７３９
【非特許文献３１】Ｋａｌｏｆｏｎｏｓ  ＨＰら、Ｊ  Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ  １９８９，３０：１６３６−１６４５
【非特許文献３２】Ｂｉｅｒ  Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００１，４７：５１９−５２４
【非特許文献３３】Ｙａｎｇ  ＸＤら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｏｎｃｏｌ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２００１，３８：１７−２３
【非特許文献３４】Ｍａｓｕｉ  Ｈら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８４，４４：１００２−１００７
【非特許文献３５】Ｈｕｍｐｈｒｅｙ  ＰＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９０，８７：４２０７−４２１１
【非特許文献３６】Ｌｏｒｉｍｅｒ  ＩＡら、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９５，１：８５９−８６４
【非特許文献３７】Ｏｋａｍｏｔｏ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ．Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９６，７３：１３６６−１３７２
【非特許文献３８】Ｓａｍｐｓｏｎ  ＪＨ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２０００，９７：７５０３−７５０８
【非特許文献３９】Ｌｏｒｉｍｅｒ  ＩＡら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９６，９３：１４８１５−１４８２０
【非特許文献４０】Ｒｅｉｓｔ  ＣＪら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９７  ５７：１５１０−１５１５
【非特許文献４１】Ｈｉｌｌｓ  Ｄら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １９９５，６３：５３７−５４３
【非特許文献４２】Ｏｈｍａｎ  Ｌら、Ｔｕｍｏｕｒ  Ｂｉｏｌ  ２００２，２３：６１−６９
【非特許文献４３】Ｊｏｈｎｓ  ＴＧら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００２，９８：３９８−４０８
【非特許文献４４】Ｌｕｗｏｒ  ＲＢら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１，６１：５３５５−５３６１
【非特許文献４５】Ｍｉｓｈｉｍａ  Ｋら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２００１，６１：５３４９−５３５４
【非特許文献４６】Ｃａｒｔｅｒ  Ｐ  Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２００１，１：１１８−１２９
【非特許文献４７】Ｈｕｄｓｏｎ  Ｐら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  ２００３，９：１２９−１３４
【非特許文献４８】ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  Ｊら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９０，３４８：５５２−５５４
【非特許文献４９】Ａｚｚａｚｙ  ＨＭら、Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２，３５：４２５−４４５
【非特許文献５０】Ｌｉｔｔｌｅ  Ｍら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２０００，２１：３６４−３７０
【非特許文献５１】Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ  ＤＰら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｄｅｖｅｌ．２００１，４：１７２−１８５
【非特許文献５２】Ｉｓｈｉｄａ  Ｔら、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ  ２００２，６０：４３９−４４４
【非特許文献５３】Ｙａｎｇ  ＸＤら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９，５９：１２３６−１２４３
【非特許文献５４】Ｄａｖｉｓ  ＣＧら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ  １９９９，１８：４２１−４２５
【非特許文献５５】Ｍｉｌｌｓ  Ｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００２，６２：５１０６−５１１４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
従って、先行技術の方法に伴う上述の欠点、および疾患の診断、処置および予防における抗体の有用性および適用の認識に鑑みると、特にＥＧＦ受容体に関する、ヒト化抗体／十分なヒト抗体の調製および使用に対する必要性が当該分野において依然として存在するのは明らかである。ヒトにおける抗体免疫系の低下または非存在を示し、ＥＧＦＲの発癌性または活性化形態ならびにＥＧＦＲの増幅形態または過剰発現形態を認識する、ヒト化抗体／十分なヒト抗体に対して特に必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本明細書中における文献の引用は、それらが本発明における先行技術であるという自認として解釈されるべきではない。
【００１９】
本発明に従い、ＥＧＦＲ抗体ｍＡｂ８０６の抗腫瘍活性のユニークな特異性および態様に導くメカニズムを解明するために、ｍＡｂ８０６のＥＧＦＲ結合エピトープが決定された。エピトープ受容体ペプチド、ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号１）は、ｍＡｂ８０６エピトープを含む。この受容体ペプチドは、腫瘍形成性細胞、過剰増殖細胞または異常細胞において見出され、正常細胞または野生型細胞においては検出できないかまたは移行性であるＥＧＦＲを認識することができるＥＧＦＲ抗体を作成するのに適している（本明細書中で用いる用語「野生型細胞」では、内因性ＥＧＦＲを発現するが、ｄｅ２−７ＥＧＦＲを発現しない細胞が意図され、この用語は、ＥＧＦＲ遺伝子を過剰発現する細胞を具体的に排除する；用語「野生型」とは、異常細胞または腫瘍形成性細胞よりはむしろ正常な細胞に存在する遺伝子型もしくは表現型または他の特徴をいう）。
【００２０】
それゆえ、本発明は、抗腫瘍能力および活性を有する抗体を作成する際に、または抗腫瘍応答である免疫学的応答を刺激する際に利用できる受容体エピトープ、特に、増殖因子受容体エピトープを提供する。この増殖因子受容体エピトープは、ループエピトープを含む。このループエピトープは、増殖因子受容体の移行性形態で露出され、そしてその受容体の移行性形態を認識する抗体を作成することができ、それにより、それらの活性化（不活性から活性なリガンド−結合立体配座への変化を含む）を変調（防止または阻害を含む）する。本発明は、抗腫瘍能力および活性を有する抗体を作成する際に、または抗腫瘍応答である免疫学的応答を刺激する際に利用できる受容体エピトープ、具体的にはＥＧＦファミリー受容体エピトープ、最も具体的にはＥＧＦＲエピトープを提供する。一般的な局面において、本発明は、腫瘍形成性細胞、過剰増殖細胞または異常細胞で見出され、正常細胞または野生型細胞において検出不可能または移行性である受容体エピトープ、具体的にはＥＧＦ受容体エピトープまたはＥＧＦ受容体ファミリーエピトープを提供する。
【００２１】
本発明によると、抗腫瘍活性を有する抗体、特にモノクローナル抗体を作成することができる増殖因子受容体ペプチド、特にＥＧＦＲペプチドが提供される。
【００２２】
本発明によると、腫瘍形成性、過剰増殖または異常細胞で見出され、正常細胞または野生型細胞においては検出不可能または移行性であるＥＧＦＲを認識することができる抗体を作成することができる増殖因子受容体ペプチド、特にＥＧＦＲペプチドが提供される。
【００２３】
本発明の増殖因子受容体ペプチド、特にＥＧＦファミリー受容体ペプチドは、多数の腫瘍型、例えば、頭頸部腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍、膀胱腫瘍、結腸腫瘍または前立腺腫瘍および神経膠腫を、既知の増殖因子受容体（ＥＧＦＲを含む）抗体で観察され得る正常組織摂取に関する問題なく、同定、特徴付けおよび標的化するための、診断および治療的使用を提供する。
【００２４】
その最も広い局面において、本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する増殖因子受容体ペプチドのアミノ酸配列を含有する、単離されたポリペプチドを含む。１以上のそれらの組み合わせを含む単離されたペプチドは、増殖因子受容体を認識し、抗腫瘍活性を有する抗体の作成、および癌または腫瘍疾患を有する動物（具体的には哺乳動物、最も具体的にはヒト）の免疫化における使用に適している。
【００２５】
本発明は、配列番号１〜１４のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含む単離された受容体ポリペプチド、およびその免疫原性フラグメントに関する。
【００２６】
本発明は、アミノ酸配列
【００２７】
【化１１】
2008501308.tif 000003
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００２８】
本発明は、アミノ酸配列
【００２９】
【化１２】
2008501308.tif 000004
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００３０】
本発明は、アミノ酸配列
【００３１】
【化１３】
2008501308.tif 000005
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００３２】
本発明は、アミノ酸配列
【００３３】
【化１４】
2008501308.tif 000006
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００３４】
本発明は、アミノ酸配列
【００３５】
【化１５】
2008501308.tif 000007
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００３６】
本発明は、アミノ酸配列
【００３７】
【化１６】
2008501308.tif 000008
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００３８】
本発明は、アミノ酸配列
【００３９】
【化１７】
2008501308.tif 000009
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００４０】
本発明は、アミノ酸配列
【００４１】
【化１８】
2008501308.tif 000010
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００４２】
本発明は、アミノ酸配列
【００４３】
【化１９】
2008501308.tif 000011
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００４４】
本発明は、アミノ酸配列
【００４５】
【化２０】
2008501308.tif 000012
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００４６】
本発明は、アミノ酸配列：
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５
［式中、各Ｘｎ残基は以下のように独立して選択でき（配列番号１１）：
Ｘ１はＧ、Ｐ、ＮまたはＳであり；
Ｘ２はＡ、Ｐ、Ｔ、ＳまたはＬであり；
Ｘ３はＤ、ＨまたはＳであり；
Ｘ４はＳ、Ｙ、Ｔ、ＮまたはＫであり；
Ｘ５はＹ、ＱまたはＭであり；
Ｘ６はＭまたはＶであり；
Ｘ７はＥ、ＴまたはＤであり；
Ｘ８はＡまたは無しであり；
Ｘ９はＥまたはＫであり；
Ｘ１０はＤまたはＮであり；
Ｘ１１はＧまたはＡであり；
Ｘ１２はＶ、Ｉ、ＬまたはＴであり；
Ｘ１３はＲ、ＱまたはＫであり；
Ｘ１４はＲ、ＫまたはＭであり；
Ｘ１５はＣまたは無しである］
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００４７】
本発明は、アミノ酸配列：
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｘ１３Ｘ１４Ｘ１５
［式中、各Ｘｎ残基は以下のように独立して選択でき（配列番号１２）：
Ｘ１はＧ、Ｐ、Ｎ、Ｑ、ＳまたはＴであり、
Ｘ２はＡ、Ｐ、Ｔ、Ｓ、Ｌ、Ｍ、Ｖ、ＩまたはＰであり、
Ｘ３はＤ、Ｅ、Ｈ、Ｒ、Ｋ、ＳまたはＴであり、
Ｘ４はＳ、Ｙ、Ｆ、Ｗ、Ｔ、Ｎ、Ｑ、ＫまたはＲであり、
Ｘ５はＹ、Ｆ、Ｗ、Ｑ、Ｎ、Ｍ、Ｖ、Ａ、Ｌ、ＩまたはＰであり、
Ｘ６はＭ、Ｖ、Ａ、Ｌ、ＩまたはＰであり、
Ｘ７はＥ、Ｄ、ＴまたはＳであり、
Ｘ８はＡ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｍまたは無しであり、
Ｘ９はＤ、Ｅ、ＫまたはＲであり、
Ｘ１０はＤ、Ｅ、ＮまたはＱであり、
Ｘ１１はＧ、Ａ、Ｍ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＰであり、
Ｘ１２はＶ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ａ、Ｐ、ＳまたはＴであり、
Ｘ１３はＲ、Ｋ、Ｈ、ＱまたはＮであり、
Ｘ１４はＲ、Ｋ、Ｈ、Ｍ、Ａ、Ｖ、Ｌ、ＩまたはＰであり、
Ｘ１５はＣまたは無しである］
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００４８】
本発明はアミノ酸配列：
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＥＸ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９ＧＸ１０Ｘ１１Ｘ１２Ｃ
［式中、各Ｘｎは以下のように独立して選択でき（配列番号１３）：
Ｘ１はＧまたはＡであり、
Ｘ２はＡまたはＫであり、
Ｘ３はＤまたはＡであり、
Ｘ４はＳまたはＡであり、
Ｘ５はＹまたはＡであり、
Ｘ６はＭまたはＡであり、
Ｘ７はＥまたはＡであり、
Ｘ８はＥまたはＡであり、
Ｘ９はＤまたはＡであり、
Ｘ１０はＶ、ＡまたはＫであり、
Ｘ１１はＲまたはＡであり、
Ｘ１２はＫまたはＡである］
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００４９】
本発明は、アミノ酸配列：
ＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＥＸ６Ｘ７Ｘ８ＤＧＶＲＫＣ
［式中、各Ｘｎ残基は以下のように独立して選択でき（配列番号１４）：
Ｘ１はＧまたはＡであり、
Ｘ２はＡまたはＫであり、
Ｘ３はＤまたはＡであり、
Ｘ４はＳまたはＡであり、
Ｘ５はＹまたはＡであり、
Ｘ６はＭまたはＡであり、
Ｘ７はＥまたはＡであり、
Ｘ８はＥまたはＡである］
を有する単離されたペプチドを提供する。
【００５０】
本発明はさらに、配列番号１〜１４のいずれかに記載されたペプチドをコードする単離された核酸を提供する。
【００５１】
本発明は、特に、配列番号１〜１４のいずれかから選択される免疫原性受容体ペプチド、またはその免疫原性フラグメントに拡大される。また、本発明は、免疫原性受容体ペプチドに拡大され、ここで、そのようなポリペプチドは配列番号１〜１４のいずれかから選択される少なくとも１つの免疫原性受容体ペプチドの組み合わせ、またはその免疫原性ペプチドフラグメントを含む。
【００５２】
本発明は、増殖因子受容体エピトープまたはその免疫原性フラグメントを投与する工程を包含する、哺乳動物を免疫化する方法を提供し、それにより、野生型細胞には露出されないが、異常なまたは過剰発現された増殖因子受容体を発現する細胞に露出されるエピトープペプチドに対して免疫反応性である抗体が生産される。本発明はさらに、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦ受容体ペプチド、またはその免疫原性フラグメントを投与する工程を包含する哺乳動物を免疫化する方法を提供し、それにより、野生型細胞には露出されないが、異常または過剰発現されたＥＧＦＲを発現する細胞に露出されるエピトープペプチドに対して免疫反応性である抗体が生産される。本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦ受容体ペプチド、またはその免疫原性フラグメントを投与する工程を包含する、哺乳動物を免疫化する方法を提供し、それにより、ＥＧＦ受容体エピトープペプチドに対して免疫反応性である抗体が生産される。
【００５３】
さらなる局面において、本発明は、本明細書中に記載された受容体ペプチドに基づくワクチンおよび免疫原性組成物に拡大される。本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択される１以上のＥＧＦＲペプチド、および薬学的に受容可能なアジュバントを含むワクチンを提供する。本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択される１以上のペプチド、および薬学的に受容可能なアジュバントを含むワクチンを提供する。本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択される１以上のＥＧＦＲペプチド、および薬学的に受容可能なアジュバントを含む免疫原性組成物を提供する。本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択される１以上のペプチド、および薬学的に受容可能な免疫原性組成物を提供する。
【００５４】
本発明は、さらに、配列番号１〜１４のいずれかから選択される１以上のＥＧＦファミリー受容体ペプチドを含み、さらに、１以上のさらなる腫瘍抗原を含む、抗腫瘍ワクチンまたは抗癌ワクチンを提供する。本発明はさらに、配列番号１〜１４のいずれかからなる群から選択される１以上のＥＧＦファミリー受容体ペプチドを含み、さらに、１以上のさらなるＥＧＦまたはＥＧＦＲ抗原を含む、抗腫瘍ワクチンまたは抗癌ワクチンを提供する。
【００５５】
別の局面において、本発明は、免疫原性量の配列番号１〜１４のいずれかの群から選択される１以上のＥＧＦファミリー受容体ペプチドまたはその免疫原性フラグメントを含む、ＥＧＦＲ（またはＥＧＦＲファミリー受容体のいずれか）の異常発現を示す頭頸部癌、乳癌、肺、膀胱、結腸、または前立腺腫瘍および神経膠腫に罹患した哺乳動物、特にヒト被験体を処置するためのワクチンに関する。そのようなワクチンは、そのペプチドおよび薬学的に受容可能なアジュバントを含有し得る。そのようなワクチンは、さらに、キャリアに結合体化したそのペプチドを含有し得る。
【００５６】
本発明は、ＥＧＦファミリー受容体ループペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択される１以上のペプチドから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチド、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、ＥＧＦファミリー受容体ループペプチド抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択される１以上のペプチドに対して免疫反応性であるＥＧＦファミリー受容体ペプチド抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００５７】
なおさらなる局面において、本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドに対する精製された抗体を提供する。
【００５８】
本発明の単離されたポリペプチドに対する抗体としては、天然に惹起された抗体および組換えにより調製された抗体を含む。これらとしては、公知の遺伝子技術によって調製されたポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方、ならびに二特異的抗体、および診断または治療用途用のそれらに適合する他の機能を含む抗体が挙げられ得る。そのような抗体は、腫瘍を特徴付けるか、または癌（頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫が挙げられるが、これらに限定されない）を診断するために、免疫アッセイで使用され得る。その抗体は、腫瘍を低下させ、または癌（頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫が挙げられるが、これらに限定されない）を処置するための受動的免疫化のために、使用され得る。
【００５９】
検出可能な標識で標識された配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドに対する抗体がさらに提供される。特定の実施形態において、この標識は、酵素、蛍光を発する化学物質、および放射性元素よりなる群から選択され得る。同位体３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、８６Ｙ、９０Ｙ、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉ、９９Ｔｃおよび１８６Ｒｅのような放射性標識が使用される例においては、公知の現在利用可能なカウンティング手順が利用され得る。その標識が酵素である場合、当該分野で知られた現在利用される比色技術、分光光度技術、蛍光分光測定技術、アンペルメトリー技術またはガス定量技術のいずれかによって、検出が達成され得る。
【００６０】
本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドに対する１以上の抗体、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。本発明は、さらに、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドに対する少なくとも２つの抗体の組み合わせ、および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物を提供する。
【００６１】
さらなる実施形態において、本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドに対する抗体またはその活性なフラグメントの活性に基づくか、または同一の活性を有すると決定された因子または他の薬物に基づく、特定のの治療方法に関する。第一の治療方法は、限定されるものではないが、癌（頭頸部、肺、結腸、膀胱、乳房、前立腺および神経膠腫が挙げられる）の予防または処置に関連する。
【００６２】
特に、本発明の抗体、またはその活性なフラグメント、およびそれに由来するキメラ抗体または合成抗体は、癌の処置のような療法が適切である場合の投与のために、適切なビヒクル、キャリアまたは希釈剤を含む薬学的組成物中で調製することができる。そのような薬学的組成物は、ＰＥＧ化のような当該分野で知られた方法によって結合メンバー、抗体またはフラグメントの半減期を変調する方法もまた包含し得る。そのような薬学的組成物はさらに、さらなる抗体または治療剤を含むこともできる。それゆえ、本発明の組成物は、単独で、あるいは他の処置、治療剤または因子と組み合わせて、処置すべき疾患に応じて同時または順次に投与され得る。加えて、本発明では、本明細書中に記載された、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドに対する抗体、特に抗体またはそのフラグメント、および抗癌剤または治療剤、抗−ＥＧＦＲ剤または抗体、または免疫モジュレーターのような他の因子または治療剤を含む組成物が企図され、それらを含む。より一般的には、これらの抗癌剤は、ＡＧ１４７８、ＺＤ１８３９（ゲフィチニブ）またはＳＴ１５７１（イマチニブメシレート）リン酸化カスケード阻害剤、翻訳後モジュレーター、細胞増殖または分裂阻害剤（例えば、抗有糸分裂剤）、ＰＤＧＦＲ阻害剤またはシグナル変換阻害剤のようなチロシンキナーゼ阻害剤であり得る。他の処置または治療剤は、非ステロイド抗炎症薬物（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェンまたはケトプロフェン）のような苦痛救済薬物、またはモルフィンまたは抗嘔吐剤のようなオピエートの適当な用量の投与を含むことができる。それゆえ、これらの剤はＡＧ１４７８またはＺＤ１８３９のような抗−ＥＧＦＲ特異的剤であり得るか、あるいはより一般的な抗癌および新形成剤であり得、非限定的例としては、ドキソルビシン、カルボプラチンおよびシスプラチンが挙げられる。加えて、組成物は、免疫応答および癌細胞または腫瘍の低下または排除を刺激する、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）または他の増殖因子、サイトカイン、あるいはホルモン（例えば、デキサメタゾン）のような免疫モジュレーターと共に投与することができる。この組成物は、限定されるものではないが、抗−ＥＧＦＲ抗体５２８；２２５；ＳＣ−０３；１０８（ＡＴＣＣ  ＨＢ９７６４）米国特許第６，２１７，８６６号；１４Ｅ１（米国特許第５，９４２，６０２号）；ＤＨ８．３；Ｌ８Ａ４；Ｙ１０；ＨｕＭＡＸ−ＥＧＦｒ（Ｇｅｎｍａｂ／Ｍｅｄａｒｅｘ）；ＩＣＲ６２；およびＡＢＸ−ＥＧＦ（Ａｂｇｅｎｉｘ）を含む、他の抗−ＥＧＦＲ抗体との組み合わせで投与することができるか、あるいはこの組み合わせを含むことができる。
【００６３】
また、本発明は、治療または診断目的で用いるべき他の分子または因子に共有結合した、またはそうでなければそれらと会合した、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドに対する抗体、およびそのいずれかのフラグメントも含む。これらの他の分子または因子としては、異なる特徴を有する（他の抗体または抗体フラグメントを含む）分子、トキシン、リガンド、放射性同位体および化学療法剤が挙げられる。それらの中には、治療目的で使用される抗体に共有結合された、またはそうでなければそれに会合された、多くの公知の分子または因子がある。そのような分子または因子の例としては、カリケアミシン、マイタンチノイド、デュオカルマイシン、リシン、ジフテリアトキシンおよびシウドモナスエキソトキシンのようなトキシン；腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）のようなリガンド；９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、２１１Ａｔ、２２５Ａｃ、２１３Ｂｉおよび他のα、β、γを発する同位体のような放射性同位体；およびパクリタキセル（タキソール（登録商標））およびドキソルビシン（アドリアマイシン（登録商標））のような化学療法薬物が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６４】
本発明では、診断試験における本発明の受容体ペプチドおよびそれに対する抗体の使用、および頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫を含む腫瘍および癌を測定および／またはモニターする方法が企図される。
【００６５】
また本発明は、本発明の単離された増殖因子受容体ペプチドをコードし、またはポリペプチドの活性を競合的に阻害する、組換えＤＮＡ分子またはクローン化された遺伝子、その縮重改変体、その突然変異体、アナログまたはフラグメントのような単離された核酸に関する。本発明は、さらに、配列番号１〜１４いずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドをコードする、組換えＤＮＡ分子またはクローン化された遺伝子、またはその縮重改変体、その突然変異体、アナログまたはフラグメントのような単離された核酸に関する。本発明のさらなる実施形態において、組換えＤＮＡ分子またはクローン化された遺伝子のＤＮＡ配列は、適当な宿主に導入することができる発現制御配列に操作可能に連結させることができる。本発明は、従って、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む組換えＤＮＡ分子で形質転換された単細胞宿主に拡大される。
【００６６】
組換えＤＮＡ分子である、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドをコードすることができる核酸がさらに提供される。このＤＮＡ分子が発現制御配列に操作可能に連結されたそのような組換えＤＮＡ分子もまた、本明細書中に提供される。
【００６７】
本発明は、特に配列番号１〜１４のいずれかから選択される、免疫原性ＥＧＦファミリー受容体ペプチドをコードする核酸を含む核酸ワクチンまたはＤＮＡワクチンに関する。本発明は、少なくとも１つの他のポリペプチド、特に腫瘍抗原または免疫変調分子ペプチドと共に、配列番号１〜１４のいずれかから選択される１以上の免疫原性ＥＧＦファミリー受容体ペプチドをコードする核酸を含む、核酸ワクチンまたはＤＮＡワクチンに関する。
【００６８】
本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドをコードすることができる核酸、およびプロモーターを含むベクターを提供する。本発明では、そのプロモーターが、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物プロモーターであるベクターが企図される。本発明では、そのベクターが、プラスミド、コスミド、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、バクテリオファージまたは真核生物ウイルスＤＮＡであるベクターが企図される。
【００６９】
本発明は、さらに、適切な宿主細胞中の、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドをコードすることができるベクターを含むポリペプチドを生産するための、宿主ベクター系を提供する。適当な宿主細胞が原核生物または真核生物細胞を含む宿主ベクター系が提供される。配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドをコードすることができる組換えＤＮＡ分子またはベクターで形質転換された単細胞宿主が、それにより提供される。
【００７０】
本発明は、配列番号１〜１４のいずれかの群から選択されるＥＧＦ受容体エピトープペプチドの存在または露出を検出することによって、頭頸部癌、乳癌、または前立腺腫瘍および神経膠腫を含む腫瘍および癌を測定およびモニターする方法を包含する。特定のそのような方法において、ＥＧＦ受容体エピトープペプチドは：
ａ．配列番号１〜１４のいずれかの群から選択されるＥＧＦ受容体エピトープペプチドの存在または露出が疑われるサンプルを、ペプチドの抗体への結合が起こる条件下で該ＥＧＦ受容体ペプチドに対する抗体と接触させる工程；および、
ｂ．そのサンプル由来のＥＧＦ受容体エピトープペプチドとその抗体との間で結合が起こったか否かを検出する工程；
によって測定され、
ここで、結合の検出は、サンプル中でのＥＧＦ受容体エピトープペプチドの存在または露出を示す。
【００７１】
本発明は、本発明のＥＧＦ受容体エピトープペプチドの露出、またはＥＧＦＲ移行性状態の安定性を変調するのに有効な潜在的化合物をスクリーニングするためのアッセイ系を包含する。１つの例において、試験化合物、またはその化合物を含有する抽出物を、特定のＥＧＦＲを発現する細胞サンプルに投与して、本発明のＥＧＦ受容体エピトープペプチドの露出、またはコントロールとの比較によるＥＧＦＲ移行性状態の安定性に対する化合物の効果を測定することができる。
【００７２】
本発明のなおさらなる目的は、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫を含む腫瘍または癌に罹患した哺乳動物の処置方法を提供することにある。
【００７３】
本発明は、免疫原性的に有効な用量の、配列番号１〜１４のいずれかの群から選択されるＥＧＦ受容体エピトープペプチドを含むワクチンを被験体に投与する工程を包含し、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫を含む腫瘍または癌に罹患した哺乳動物の処置方法を提供する。
【００７４】
さらなる局面において、本発明は、配列番号１〜１４のいずれかの群から選択されたＥＧＦ受容体エピトープペプチドおよび薬学的に受容可能なキャリアを含むある量の薬学的組成物を被験体に投与し、それにより免疫応答を誘導する、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫を含む腫瘍または癌を有する被験体において免疫応答を誘導する方法を提供する。
【００７５】
他の目的および利点は、以下の例示的な図面を参照して進める、以下の記載のレビューから当業者に明らかとなる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７６】
（詳細な説明）
本発明に従って、当業者の技量内にある慣用的分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡ技術を使用することができる。そのような技術は文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”（１９８９）；“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｒ．Ｍ．，ｅｄ．（１９９４）］；“Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｉｓ，ｅｄ．（１９９４）］；“Ｃｕｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”  Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ−ＩＩＩ［Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｄ．（１９９４）］；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．１９８４）；“Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．（１９８５）］；“Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ”［Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，  ｅｄｓ．（１９８４）］；“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”［Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６）］；“Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ”［ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，（１９８６）］；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，“Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”（１９８４）。
【００７７】
従って、もし本明細書中に出現するならば、以下の用語は以下に記載されている定義を有すべきである。  
【００７８】
用語「増殖因子受容体ペプチド」、「受容体エピトープペプチド、「ＥＧＦファミリー受容体ペプチド」、「ＥＧＦ受容体ペプチド」、「ＥＧＦＲエピトープ」、「ＥＧＦＲペプチド」、および具体的にはリストされないいずれかの改変体は本明細書中においては互換的に用いることができ、本出願および特許請求の範囲を通じて用いられる場合、単一または複数ペプチドを含むペプチド物質をいい、本明細書中に記載され、および配列番号１〜１４のいずれか、および表１および２に提示されたアミノ酸配列データを有するペプチド、およびその改変体、および本明細書および特許請求の範囲に記載された活性のプロフィールまで拡大される。従って、実質的に同等のまたは改変された活性を呈するタンパク質もまた、企図される。これらの修飾は、例えば、部位特異的突然変異誘発を通じて得られた修飾のように慎重なものであってよく、あるいは複合体またはその命名されたサブユニットのプロデューサーである宿主における突然変異を通じて得られるもののように偶然のものであってよい。限定されるものではないが、部位特異的突然変異誘発またはランダム突然変異誘発を含む、その改変体を含む受容体エピトープペプチドの修飾を生じさせ、およびそれを試験する方法は当業者に良く知られており、本明細書中に記載され、例示され、およびその実施例３で供されるものを含む。また、用語「増殖因子受容体ペプチド」「受容体エピトープペプチド」、「ＥＧＦファミリー受容体ペプチド」、「ＥＧＦ受容体ペプチド」、「ＥＧＦＲエピトープ」、「ＥＧＦＲペプチド」は、本明細書中で具体的に引用されたタンパク質およびペプチド、ならびに全ての実質的に相同なアナログおよび対立遺伝子変動をその範囲内に含めることを意図する。
【００７９】
本明細書中に記載されたアミノ酸残基は「Ｌ」異性体形態であるのが好ましい。しかしながら、「Ｄ」異性体形態である残基は、免疫グロブリン−結合の所望の機能的特性が当該ポリペプチドによって維持される限り、いずれのＬ−アミノ酸残基に代えて置換することもできる。ＮＨ２とは、ポリペプチドのアミノ末端に存在する遊離アミノ基をいう。ＣＯＯＨとは、ポリペプチドのカルボキシ末端に存在する遊離カルボキシル基をいう。標準的なポリペプチド命名法（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３：３５５２−５９（１９６９））と歩調を合わせるのに、アミノ酸残基に対する略語を以下の対応表に示す：
【００８０】
【化２１】
2008501308.tif 000013
【００８１】
【化２２】
2008501308.tif 000014
全てのアミノ酸残基の配列は、本明細書中においては、その右側および左側の向きが、アミノ−末端からカルボキシ−末端への慣用的方向にある式によって表されることに注意すべきである。さらに、アミノ酸残基配列の開始または終わりにおけるダッシュは、１以上のアミノ酸残基のさらなる配列に対するペプチド結合を示すことに注意すべきである。前記表は、本明細書中においては交互に出現し得る３文字および１文字表記を相関させるために掲げる。
【００８２】
「レプリコン」は、イン・ビボにてＤＮＡ複製の自律単位として機能する、すなわち、それ自身の制御の下で複製できるいずれの遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、染色体およびウイルス）でもある。
【００８３】
「ベクター」は、もう１つのＤＮＡセグメントを付着させて、付着されたセグメントの複製を実行できるプラスミド、ファージまたはコスミドのようなレプリコンである。
【００８４】
「ＤＮＡ分子」とは、その一本鎖形態または二本鎖ラセンいずれかのデオキシリボヌクレオチド（アデニン、グアニン、チミンまたはシトシン）のポリマー形態をいう。この用語は分子の一次および二次構造のみをいうが、それをいずれかの特定の三次形態に制限しない。それゆえ、この用語は、とりわけ、線状ＤＮＡ分子（例えば、制限フラグメント）、ウイルス、プラスミドおよび染色体において見出される二本鎖ＤＮＡを含む。特定の二本鎖ＤＮＡ分子の構造を議論するにおいて、配列は、ＤＮＡの非転写ストランド（すなわち、ｍＲＮＡに対して相同な配列を有するストランド）に沿った５’〜３’方向の配列のみを与える通常の約束に従って本明細書中では記載できる。
【００８５】
「複製起点」とは、ＤＮＡ合成に参画するＤＮＡ配列をいう。ＤＮＡ「コーディング配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、イン・ビボにて転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。コーディング配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドンおよび３’カルボキシル末端における翻訳停止コドンによって決定される。コーディング配列は、限定されるものではないが、原核生物配列、真核生物ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、真核生物（例えば、哺乳動物）ＤＮＡからのゲノムＤＮＡ配列、および合成ＤＮＡ配列さえを含むことができる。ポリアデニル化およびシグナルおよび転写終止配列は、通常、コーディング配列に対して３’側に位置する。
【００８６】
転写および翻訳制御配列は、宿主細胞におけるコーディング配列の発現を供するプロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等のようなＤＮＡ調節配列である。
【００８７】
「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合でき、下流（３’方向）コーディング配列の転写を開始させることができるＤＮＡ調節領域である。本発明を規定する目的では、プロモーター配列は転写開始部位によってその３’末端が境界となり、上流（５’方向）に延びて、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルで転写を開始させるのに必要な最小数の塩基またはエレメントを含む。プロモーター配列内には、（便宜には、ヌクレアーゼＳ１でのマッピングによって規定される）転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見出される。真核生物プロモーターは、しばしば、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含むが、常には含まない。原核生物プロモーターは、−１０および−３５コンセンサス配列に加え、シャイン−ダルガルノ配列を含む。
【００８８】
「発現制御配列」は、もう１つのＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し、調節するＤＮＡ配列である。コーディング配列は、ＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、これがコーディング配列によってコードされたタンパク質に翻訳される場合に、細胞中の転写および翻訳制御配列の「制御下」にある。
【００８９】
「シグナル配列」はコーディング配列の前に含めることができる。この配列は、細胞表面へポリペプチドを向けるように宿主細胞に連絡する、ポリペプチドに対してＮ−末端側のシグナルペプチドをコードし、このシグナルペプチドはタンパク質が宿主を去る前に宿主細胞によってはずされる。シグナル配列は、原核生物および真核生物にとって天然である種々のタンパク質に会合して見出すことができる。
【００９０】
本発明のプロフィールをいうのに本明細書中で用いる用語「オリゴヌクレオチド」は、２以上のリボヌクレオチド、好ましくは３を超えるリボヌクレオチドよりなる分子と定義される。その正確なサイズは、オリゴヌクレオチドの最終的な機能および用途に依存する多くの因子に依存する。
【００９１】
本明細書中で用いる用語「プライマー」は、核酸ストランドに対して相補的であるプライマー延長産物の合成が、すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼのような誘導剤の存在下で、かつ適当な温度およびｐＨにおいて誘導される条件下に置かれた場合に、合成の開始点として作用することができる、精製された制限消化物におけるように天然のものであるか、または合成により生じるかを問わず、オリゴヌクレオチドをいう。プライマーは一本鎖または二本鎖いずれかであって良く、誘導剤の存在下で所望の延長産物の合成の起点となるように十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、温度、プライマーの源、および当該方法の用途を含む多くの因子に依存する。例えば、診断適用では、標的配列の複雑性に応じて、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、１５〜２５以上のヌクレオチドを含有するが、それはより少数のヌクレオチドを含有しても良い。
【００９２】
ここに、プライマーは、特定の標的ＤＮＡ配列の異なるストランドに対して「実質的に」相補的であるように選択される。これは、プライマーがそれらの各ストランドにハイブリダイズするのに十分に相補的でなければならないことを意味する。従って、プライマー配列は鋳型の正確な配列を反映する必要はない。例えば、非−相補的ヌクレオチドフラグメントをプライマーの５’末端に付着させることができ、プライマー配列の残りはストランドに相補的である。あるいは、非−相補的塩基またはより長い配列をプライマー中に入れることができるが、但し、プライマー配列はそれに対してハイブリダイズするのにストランド配列に対して十分な相補性を有し、それにより、延長産物の合成のための鋳型を形成するものとする。
【００９３】
本明細書中で用いるように、用語「制限エンドヌクレアーゼ」および「制限酵素」は、その各々が二本鎖ＤＮＡを特異的ヌクレオチド配列においてまたはその近くで切断する細菌酵素をいう。
【００９４】
ＤＮＡが細胞の内部に導入された場合に、細胞は外因性または異種ＤＮＡによって「形質転換」されている。形質転換ＤＮＡは、細胞のゲノムをなす染色体ＤＮＡに一体化（共有結合）しても、またはしなくても良い。原核生物、酵母、および哺乳動物細胞においては、例えば、形質転換ＤＮＡはプラスミドのようなエピソームエレメントに維持することができる。原核生物細胞に関しては、安定に形質転換された細胞は、形質転換ＤＮＡが、それが染色体複製を通じて娘細胞によって遺伝されるように染色体に一体化されるようになったものである。この安定性は、形質転換ＤＮＡを含む娘細胞の集団よりなる細胞系またはクローンを確立する真核生物細胞の能力によって示される。「クローン」は、有糸分裂によって対立細胞または共通の先祖に由来する細胞の集団である。「細胞系」は、多世代の間にイン・ビトロで安定な成長が可能な一次細胞のクローンである。
【００９５】
２つのＤＮＡ配列は、ヌクレオチドの少なくとも約７５％、好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）が、ＤＮＡ配列の所望の長さにわたってマッチする場合に「実質的に相同」である。実質的に相同である配列は、配列データバングにおいて、あるいは例えば、その特定の系につき規定されたストリンジェントな条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において入手できる標準的なソフトウェアを用いて配列を比較することによって同定することができる。適当なハイブリダイゼーション条件の規定は、当業者の技量内のものである。例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ  ら、．，前掲；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｓ．Ｉ＆ＩＩ，前掲；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，前掲参照。
【００９６】
配列番号１〜１４のいずれかと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードし、かつ相互に対して縮重できる本発明の受容体ペプチドをコードするＤＮＡ配列も本発明の範囲内にあることが認識されるべきである。「に対して縮重」とは、異なる３文字コドンを用いて特定のアミノ酸を特定することを意味する。以下のコドンを相互交換的に用いて、各特異的アミノ酸をコードできることは当該分野で良く知られている。
【００９７】
【化２２Ａ】
2008501308.tif 000015
前記での特定されたコドンはＲＮＡ配列のためのものであることが理解されるべきである。ＤＮＡについての対応するコドンはＵの代わりに置換されたＴを有する。
【００９８】
特定のコドンが、異なるアミノ酸をコードするコドンに変化するように、配列番号１〜１４のいずれかをコードするＤＮＡ配列において突然変異をなすことができる。そのような突然変異は、一般には、最も少数のヌクレオチド変化を可能とすることによってなされる。この類の置換突然変異を行って、（すなわち、特定のサイズを有するアミノ酸のグループ分けに属するアミノ酸からの、またはもう１つのグループ分けに属するアミノ酸に特徴的なコドンを変化させることによって）非保存的に、あるいは（すなわち、特定のサイズを有するアミノ酸のグループ分けに属するアミノ酸からの、あるいは同一グループ分けに属するアミノ酸に特徴的なコドンを変化させることによって）保存的に、得られたタンパク質におけるアミノ酸を変化させることができる。そのような保存的な変化は、一般的には、得られたタンパク質の構造および機能のより少ない変化に導く。非保存的変化は、得られたタンパク質の構造、活性または機能をより変化させるようである。本発明は、得られたタンパク質の活性または結合特徴を実質的に変化させない保存的変化を含む配列を含むと考えられるべきである。
【００９９】
以下に示すのはアミノ酸の種々のグループ分けの１つの例である：
（非極性Ｒ基を有するアミノ酸）
アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン
（非荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸）
グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、グルタミン
（（ｐＨ６．０において負に荷電した）荷電極性Ｒ基を有するアミノ酸）
アスパラギン酸、グルタミン酸
（（ｐＨ６．０において正に荷電した）塩基性アミノ酸）
リシン、アルギニン、ヒスチジン（ｐＨ６．０における）
もう１つのグループ分けはフェニル基を有するアミノ酸であり得る：
フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン
もう１つのグループ分けは分子量（すなわち、Ｒ基のサイズ）によるものであり得る：
グリシン          ７５
アラニン          ８９
セリン          １０５
プロリン        １１５
バリン          １１７
スレオニン      １１９
システイン      １２１
ロイシン        １３１
イソロイシン    １３１
アスパラギン    １３２
アスパラギン酸  １３３
グルタミン      １４６
リシン          １４６
グルタミン酸    １４７
メチオニン      １４９
（ｐＨ６．０における）ヒスチジン  １５５
フェニルアラニン１６５
アルギニン      １７４
チロシン        １８１
トリプトファン  ２０４
特に好ましいのは：
−正の電荷を維持することができるようなＡｒｇに代えてのＬｙｓ、およびその逆；
−負の電荷を維持することができるようなＡｓｐに代えてのＧｌｕ、およびその逆；
−遊離−ＯＨを維持することができるようなＴｈｒに代えてのＳｅｒ；および
−遊離ＮＨ２を維持することができるようなＡｓｎに代えてのＧｌｎ。
【０１００】
アミノ酸置換は、特に好ましい特性を有するアミノ酸を置換するために導入することもできる。例えば、Ｃｙｓは、もう１つのＣｙｓとのジスルフィドブリッジ用に潜在的部位に導入することができる。Ｈｉｓは特に「触媒的」部位として導入することができる（すなわち、Ｈｉｓは酸または塩基として作用することができ、生化学触媒における最も一般的なアミノ酸である）。Ｐｒｏは、タンパク質構造においてターンを含むその特に平面の構造のため導入することができる。
【０１０１】
２つのアミノ酸は、アミノ酸残基の少なくとも約７０％（好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０または９５％）が同一であるか、または保存的置換を表す場合に「実質的に相同」である。
【０１０２】
ＤＮＡ構築体の「相同」領域は、天然でのより大きな分子と会合して見出されないより大きなＤＮＡ分子内のＤＮＡの同定可能なセグメントである。
【０１０３】
それゆえ、異種領域が哺乳動物遺伝子をコードする場合、該遺伝子は、通常、源生物のゲノム中の哺乳動物ゲノムＤＮＡに近接しないＤＮＡによって近接される。異種コーディング配列のもう１つの例は、コーディング配列それ自体が天然では見出されない構築体（例えば、ゲノムコーディング配列はイントロンを含むｃＤＮＡ、または天然遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）である。対立遺伝子変異または天然に生じる突然変異事象は、本明細書中に規定されたＤＮＡの異種領域を生起させない。
【０１０４】
ＤＮＡ配列は、発現制御配列がそのＤＮＡ配列の転写および翻訳を制御し、調節する場合に、発現制御配列に「操作可能に」連結されている。用語「操作可能に連結した」は、発現すべきＤＮＡ配列の前に適当な開始シグナル（例えば、ＡＴＧ）を有すること、および正しいリーディングフレームを維持して、発現制御配列の制御下でのＤＮＡ配列の発現、およびＤＮＡ配列によってコードされる所望の産物の生産を可能とすることを含む。もし組換えＤＮＡ分子に挿入することを望む遺伝子が適当な開始シグナルを含まないならば、そのような開始シグナルを当該遺伝子の前に挿入することができる。
【０１０５】
用語「標準的ハイブリダイゼーション条件」とは、ハイブリダイゼーションおよび線状双方についての５×ＳＳＣおよび６５℃に実質的に同等な塩および温度条件をいう。しかしながら、当業者であれば、そのような「標準的ハイブリダイゼーション条件」は、緩衝液中でのナトリウムおよびマグネシウムの濃度、ヌクレオチド配列の長さおよび濃度、パーセントミスマッチ、パーセントホルムアルデヒド等を含む特定の条件に依存することを認識する。また、「標準的ハイブリダイゼーション条件」の決定で重要なのは、ハイブリダイズする２つの配列がＲＮＡ−ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡであるかである。そのような標準的ハイブリダイゼーション条件は、良く知られた処方に従って当業者によって容易に決定され、ここに、ハイブリダイゼーションは典型的には、所望であれば、より高いストリンジェンシーの洗浄を伴う予測されたまたは決定されたＴｍ未満の１０〜２０℃である。
【０１０６】
「抗体」は、特異的エピトープに結合する、抗体およびそのフラグメントを含むいずれかの免疫グロブリンである。該用語は、米国特許第４，８１６，３９７号および第４，８１６，５６７号にさらに詳細に記載された言及された最後のポリクローナル、モノクローナルおよびキメラ抗体を含む。
抗体は多数の方法で修飾できるため、用語「抗体」は、必要な特異性を有する結合ドメインを有するいずれかの特定の分子または物質を網羅すると解釈されるべきである。それゆえ、この用語は、天然または全部がまたは部分的に合成であるかを問わず、免疫グロブリン結合ドメインを含むいずれかのポリペプチドを含む、抗体フラグメント、誘導体、抗体の機能的同等体およびホモログをカバーする。もう１つのポリペプチドに融合した免疫グロブリン結合ドメインまたはその同等体を含むキメラ分子は従って含まれる。キメラ抗体のクローニングおよび発現はＥＰ−Ａ−０１２０６９４およびＥＰ−Ａ−０１２５０２３および米国特許第４，８１６，３９７号および第４，８１６，５６７号に記載されている。
【０１０７】
全抗体のフラグメントは結合性抗原の機能を実行できることが示されている。結合性フラグメントの例は（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインよりなるＦａｂフラグメント；（ｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインよりなるＦｄフラグメント；（ｉｉｉ）単一抗体のＶＬおよびＶＨドメインよりなるＦｖフラグメント；（ｉｖ）ＶＨドメインよりなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））；（ｖ）単離されたＣＤＲ領域；（ｖｉ）２つの連結されたＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（ｖｉｉ）単一鎖Ｆｖ分子（ｓｃＦｖ）、ここに、ＶＨドメインおよびＶＬドメインは、２つのドメインが会合して抗原結合部位を形成するペプチドリンカーによって連結されている（Ｂｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎら、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；（ｖｉｉｉ）多価抗体フラグメント（ｓｃＦｖダイマー、トリマーおよび／またはテトラマー（ＰｏｗｅｒおよびＨｕｄｓｏｎ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４２：１９３−２０４９（２０００）；（ｉｘ）二特異的単一鎖Ｆｖダイマー（ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５）および（ｘ）「ダイヤボディー」、遺伝子融合によって構築された多価または多特異的フラグメント（ＷＯ  ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，（１９９３））である。
【０１０８】
「抗体組み合わせ部位」は、特異的に抗原に結合する重鎖および軽鎖可変および超可変領域よりなる抗体分子のその構造部分である。
【０１０９】
本明細書中で用いるその種々の文法的形態における句「抗体分子」では、インタクトな免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分双方が企図される。
【０１１０】
例示的な抗体分子は、無傷免疫グロブリン分子、実質的に無傷の免疫グロブリン分子、パラトープを含有する免疫グロブリン分子の部分であり、その部分は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として当該分野で公知の部分を含み、その部分は本明細書中に記載する治療方法で用いるのに好ましい。抗体分子のＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２部分は、良く知られた方法による、実質的に無傷の抗体分子に対する、各々、パパインおよびペプシンのタンパク質分解反応によって調製される。例えば、Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕｓ  ら、．に対する米国特許第４，３４２，５６６号参照。Ｆａｂ’抗体分子部分も良く知られており、メルカプトエタノールでのような、２つの重鎖部分を連結するジスルフィド結合の関連、続いて、ヨードアセタミドのような試薬での得られたタンパク質メルカプタンのアルキル化によって、Ｆ（ａｂ’）２部分から生産される。無傷抗体分子を含有する抗体は本明細書中において好ましい。
【０１１１】
その種々の文法学的形態における句「モノクローナル抗体」とは、特定の抗原と免疫反応できる抗体組み合わせ部位のただ１つの種を有する抗体をいう。モノクローナル抗体は、それゆえ、典型的には、それが免疫反応するいずれかの抗原に対する単一結合親和性を呈する。モノクローナル抗体は、従って、各々が異なる抗原に対して免疫特異的である、複数の抗体組み合わせ部位を有する抗体分子、例えば、二特異的（キメラ）モノクローナル抗体を含むことができる。
【０１１２】
句「薬学的に受容可能な」とは、生理学的に許容され、典型的には、ヒトに投与された場合に、胃の不調、眩暈などのようなアレルギー性または同様な面倒な反応を生じない分子体および組成物をいう。
【０１１３】
句「治療上有効量」は、本明細書中においては、臨床的に有意な変化のサイズ、あるいは標的細胞塊のＳ相活性においては、例えば、抗体応答、Ｔ細胞またはＢ細胞応答、ＥＧＦＲ発現の低下のような病理学の他の特徴を、妨げ、好ましくは少なくとも約３０パーセントだけ妨げ、より好ましくは少なくとも約５０パーセントだけ、最も好ましくは少なくとも９０パーセントだけ妨げるのに十分な量を意味するように用いる。
【０１１４】
用語「アジュバント」とは、特に抗原に対する、免疫応答を増強させる化合物または混合物をいう。アジュバントは、抗原をゆっくりと放出する組織デポとして、また、免疫応答を非特異的に増強させるリンパ系アクチベータとして働くことができる（Ｈｏｏｄら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄ．，１９８４，Ｂｅｎｊａｍｉｎ／Ｃｕｍｍｉｎｇｓ：Ｍｅｎｌｏ  Ｐａｒｋ，  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ｐ．３８４）。しばしば、アジュバントの不存在においては、抗原単独での一次挑戦は、液性または細胞性免疫応答を誘導するのに失敗する。既に知られた利用されるアジュバントは、限定されるものではないが、フロイントの完全アジュバント、フロイントの不完全アジュバント、サポニン、水酸化アルミニウムのような鉱物ゲル、リソレシチンのような界面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油または炭水化物エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、およびＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｅ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍのような潜在的に有用なヒトアジュバントを含む。鉱物塩アジュバントは、限定されるものではないが、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、リン酸カルシウム、水酸化亜鉛および水酸化カルシウムを含む。好ましくは、アジュバント組成物は、さらに、約１０％（重量）植物油および約１〜２％（重量）ホスホリピッドを含む脂肪エマルジョンの脂質を含む。好ましくは、アジュバント組成物は、さらに、所望により、連続水性相に分散した油性粒子を有し、約０．２％（重量）〜約４９％（重量）の量のエマルジョン形成ポリオール、所望により、１５％（重量）までのエマルジョン−形成量の代謝可能油および、所望により、約５％（重量）までのエマルジョン−安定化量のグリコールエーテル−ベースの界面活性剤を有するエマルジョン形態を含む。アジュバントの他の例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ、ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ  Ｒｅ  ５９５リポ多糖の精製および酸化水分解後に入れられる同族体；ＱＳ２１（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）、Ｑｕｉｌｌｊａサポナリア抽出物から精製された純粋なＱＡ−２１サポニンを含むサポニン；ＰＣＴ出願ＷＯ  ９６／３３７３９（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ）に記載されたＤＱＳ２１；Ｑｕｉｌｌａｉａ  ｓａｐｏｎａｒｉａモリナ（ｍｏｌｉｎａ）樹木の樹皮から得られるＩＳＣＯＭ（ＣＳＬ  Ｌｔｄ．，Ｐａｒｋｖｉｌｌｅ，Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ａｕｓｔｒａｌｉａ）；ＱＳ−７、ＱＳ−１７、ＱＳ−１８、およびＱＳ−Ｌ１（Ｓｏら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌｓ  ７：１７８−１８６，１９９７）；モンタナイド；ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（例えば、Ｋｒｅｉｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−９，１９９５）；スクアレンおよび／またはトコフェロールのような生分解性油から調製した種々の油中水型エマルジョン；およびイミキミド（３Ｍ，Ｓｔ．Ｐａｕｌ，Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）のような皮膚の外側部分で見出されるある種の免疫細胞について細胞上の所謂「トール−様受容体７」によって摂取され��因子を含む。特に、該抗原はＤＱＳ２１／ＭＰＬの組み合わせと混合して投与できる。ＭＰＬに対するＤＱＳ２１の比率は、典型的には、約１：１０〜１０：１、好ましくは約１：５〜５：１、より好ましくは約１：１である。典型的には、ヒト投与では、ＤＱＳ２１およびＭＰＬは、約１μｇ〜約１００μｇの範囲のワクチン処方にて存在させることとなろう。他のアジュバントは当該分野で公知であり、本発明で用いることができる（例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，２ｎｄ  Ｅｄ．，１９８６）。ポリペプチドおよびアジュバントの混合物またはエマルジョンの調製するための方法は、免疫応答を誘導しおよび／または増強させる技術、およびワクチン接種の技術の分野における当業者に良く知られている。
【０１１５】
本明細書中で用いるように、「免疫モジュレーター」とは、免疫応答または免疫学的応答を変調することができる剤をいう。そのような変調は抗体生産の、液性応答の、細胞性免疫応答の増強を含む。免疫モジュレーターの例は、限定されるものではないが、アジュバント、サイトカイン、インターロイキン、ケモカインおよび増殖因子を含む。
【０１１６】
用語、免疫モジュレーターの「有効量」とは、細胞−媒介、液性または抗体−媒介であれ、ワクチン−誘導免疫応答を増強するのに十分な免疫もジュレーターの量をいう。免疫モジュレーターの有効量は、もし注射されるならば、約０．１〜１，０００μｇ、好ましくは１〜９００μｇ、より好ましくは５〜５００μｇの範囲、あるいはヒト被験体では、約０．０１〜１０．０μｇ／Ｋｇ被験体動物体重の範囲とすることができる。この量は、投与の態様に応じて幾分変化させることができるが、同一の一般的範囲にある。もし１を超える免疫モジュレーターを用いるならば、各々の１つはこれらの量で存在させることができるか、合計量をこの範囲内に入るようにすることができる。有効量の抗原は、免疫モジュレーターの不存在下における示すことができる免疫応答を誘導することができる量であり得る。用いるべき抗原の適当な量は、特異的抗原に依存し、これは当該分野でよく知られている。
【０１１７】
必要な正確な有効量は、被験体の種、年齢および一般的状態、治療すべき疾患の重症度、投与の態様などに依存して被験体間で変化する。それゆえ、正確な有効量を特定することは可能ではない。しかしながら、適当な有効量は、ルーチン的実験およびワクチン分野における先行する知識のみを用いて当業者によって決定され得る。
【０１１８】
抗原よりなる組成物またはワクチンに対する「免疫学的応答」は、注目する組成物またはワクチンに対する細胞−および抗体−媒介免疫応答の宿主における発生である。通常、そのような応答は、注目する組成物またはワクチンに含まれる抗原または複数抗原に特異的に向けられた抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞を生産する被験体よりなる。
【０１１９】
本明細書中で用いるように、「ｐｇ」はピコグラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「ｕｇ」または「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｕＬ」または「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味する。
【０１２０】
種々の文法的な形態における用語「異常発現」は、非過剰発現状態とはコントロール的に、タンパク質のより多くが存在し、あるいはいずれかの時点で検出できるように、増強された発現または翻訳、タンパク質のプロモーターまたはレギュレーターの変調、タンパク質についての遺伝子の増幅、または増強された半減期または安定性を含むいずれかの手段によって引き起こされた、組織におけるタンパク質のいずれの上昇したまたは改変された発現または過剰発現も、例えば、タンパク質の量の増大を意味し、それを含むことができる。異常な発現は、細胞中のタンパク質発現または翻訳後修飾マシーナリーが、タンパク質の増大した発現または増大したレベルまたは量のため負担がかけられた、またはそうでなければ破壊されたいずれのシナリオまたは改変も含み、それが考えられ、突然変異したタンパク質または改変体におけるように、配列の改変、欠失または挿入、または改変された折畳みのため改変されたタンパク質が発現される場合を含む。
【０１２１】
用語「異常な発現」は、本明細書中においては、その異常な量またはレベルの十分な原因にはかかわらず、異常な（通常は上昇した）タンパク質の量／レベルが存在する場合を含むように具体的に選択されていることを認識するのは重要である。それゆえ、タンパク質の異常な量は、遺伝子増幅の不存在下でのタンパク質の過剰発現に由来し得、これは、例えば、癌を有する被験体の頭頸部から採取された多くの細胞／組織サンプルで当てはまり、他方、他のサンプルは遺伝子増幅に帰せられる異常なタンパク質レベルを呈する。
【０１２２】
この後者の関係においては、本発明を説明するためにここに掲げられる本発明者らの業績のあるものは、そのあるものが、特にＥＧＦＲを含むＥＧＦファミリー受容体を含む、増殖因子受容体の増殖に由来する異常なタンパク質レベルを呈するサンプルの分析を含む。これは、従って、増幅に言及される実験的知見のここでの提示、および増殖因子受容体、ＥＧＦファミリー受容体、ＥＧＦＲの異常なレベルを記載するにおいて、用語「増幅／増幅された」などを用いることを説明する。しかしながら、それは、本発明の結合メンバーに頼ることによる臨床的介入が考えられる環境または状況を規定するタンパク質の異常な量またはレベルの観察であり、この理由で、本明細書は、用語「異常な発現」は、増殖因子受容体、ＥＧＦファミリー受容体、ＥＦＧＲレベルにおける対応する異常性を生じる原因環境をより広く捉えることを考える。
【０１２３】
従って、それらの種々の文法的形態における用語「過剰発現」および「増幅」は区別される技術的意味を有すると理解されるが、それらが、異常な増殖因子受容体、ＥＧＦファミリー受容体、ＥＦＧＲタンパク質レベルが本発明の意味で存在する状態を表す限り、それらは相互に同等と考えるべきである。その結果、用語「異常な発現」は、全ての用語が用いられる相互に対して同等であると考えることができるように、ここでの目的に対するその範囲内で用語「過剰発現」および「増幅」を包含すると考えられるように選択されている。
【０１２４】
本発明は、抗腫瘍能力および活性を有する抗体を作成するにおいて、あるいは抗腫瘍応答である免疫学的応答を刺激するにおいて利用することができる、受容体エピトープ、特に増殖因子受容体エピトープに関する。増殖因子受容体エピトープは、増殖因子受容体の移行性形態で露出され、かつ受容体の移行性形態を認識する抗体を作り出すことができ、それにより、不活性なリガンド−結合立体配座から活性なリガンド−結合立体配座への変化を含む、それらの活性化を、防止または阻害することを含めて変調するループエピトープを含む。本発明は、抗腫瘍能力および活性を有する抗体を作成するのに、あるいは抗腫瘍応答である免疫学的応答を刺激するにおいて利用することができる、受容体エピトープ、特にＥＧＦファミリー受容体エピトープ、最も特別にはＥＧＦＲエピトープを提供する。一般的態様において、本発明は、腫瘍形成性、過剰増殖または異常細胞で見出され、正常なまたは野生型細胞において検出できない、または移行性である受容体エピトープ、特にＥＧＦ受容体エピトープまたはＥＧＦ受容体ファミリーエピトープを提供する。
【０１２５】
本発明は、増殖因子受容体、特にＥＧＦＲにおいて、システインによって各Ｎ−末端およびＣ−末端に結合し、ジスルフィドループペプチドを形成するエピトープペプチド、特にループペプチドの存在および露出を記載する。このループペプチドは未連結の移行性立体配座で露出され、その存在または量は、オートクリンリガンド生産（リガンドは活性なダイマーに向けてＥＧＦＲを駆動する）、リガンド−非依存性受容体活性化（受容体を発現する細胞にかなり制限された事象）、未連結のレベル、またはこれらの可能性のいずれかの組み合わせを改変するグリコシル化における改変を含む場合に改変または増加される。
【０１２６】
ＥＧＦＲ  ｍＡｂ８０６ループ２８７−３０２エピトープの配列相同性（ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号１））は、ＥＧＦファミリーメンバーＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４において比較的低いが、システインループのサイズおよび位置は保存されている。さらに、完全に保存された２つのアミノ酸残基（Ｅ２９３およびＧ２９８）、および電荷が保存されたさらなる２つ（Ｅ２９５およびＲ３００）がある。最後に、ＥｒｂＢ３（および恐らくはＥｒｂＢ４）の総じての構造は、それが恐らくは活性化の間に連結解除される連結された立体配座を採用する点でＥＧＦＲのそれに非常に似ている（Ｃｈｏ，Ｈ．Ｓ．ａｎｄ  Ｌｅａｈｙ，Ｄ．Ｊ．（２００２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１３３０−１３３３）。それゆえ、ＥｒｂＢ３／Ｂ４における同等なシステインループに標的化された抗体が、ｍＡｂ８０６と同様な特性（すなわち、腫瘍に制限される特異性、および受容体活性化をブロックする能力）を有する点で有用なものとしてここに提供される。最も広くは、増殖因子受容体の移行性形態に対する抗体の作成は、抗−シグナル伝達活性を依然として保有する正常な組織標的化を低下させる新規な方法を表す。
【０１２７】
以下の表１は、ＥＧＦファミリーメンバーＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４のループ配列の比較を掲げる。
【０１２８】
【表１】
2008501308.tif 000016
アミノ酸の保存された物理化学的特性を有する位置が、全て囲まれている。
【０１２９】
加えて、ＥＧＦＲ  ｍＡｂ８０６ループ２８７〜３０２エピトープ（ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ（配列番号１））を利用するＧｅｎｂａｎｋ  ＢＬＡＳＴサーチにより、種々の哺乳動物ＥＧＦＲにおける天然対立遺伝子およびこのループエピトープペプチド配列の改変体を同定する（表２）。
【０１３０】
【表２】
2008501308.tif 000017
本発明に従うと、増殖因子受容体ペプチド、特にＥＧＦＲペプチドが提供され、これは抗腫瘍活性を有する抗体、特にモノクローナル抗体を作成することができる。
【０１３１】
本発明により、増殖因子受容体ペプチド、特にＥＧＦＲペプチドが提供され、これは、腫瘍形成性、過剰増殖または異常な細胞で見出され、かつ正常なまたは野生型細胞において検出できず、または移行性であるＥＧＦＲを認識することができる抗体を作成することができる。
【０１３２】
本発明の増殖因子受容体ペプチド、特にＥＧＦファミリー受容体ペプチドは、ＥＧＦＲ、抗体を含む、既に知られた増殖因子受容体で観察することができる正常な組織摂取に伴う問題なく、多数の腫瘍タイプ、例えば、頭頸部腫瘍、乳腫瘍、肺腫瘍、膀胱腫瘍、結腸腫瘍または前立腺腫瘍および神経膠腫を同定し、特徴付け、標的化する診断剤および治療剤用途を提供する。
【０１３３】
本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるアミノ酸配列を有する増殖因子受容体ペプチドのアミノ酸配列を含む単離されたポリペプチドを含む。本発明は、さらに、配列番号１〜１４のいずれかの改変体または突然変異体を含み、ここに、保存的または非保存的アミノ酸によることを含めて、１以上のアミノ酸が置換されている。ｍＡｂ８０６抗体、またはそれから誘導される組換えまたは合成抗体によって認識でき、または結合でき、あるいはｍＡｂ８０６の特徴を有する抗体（類）を作成することができるいずれの改変体または突然変異体ペプチドも本発明によって含まれる。特に、いずれのそのようなペプチドも、増殖因子受容体を認識し、かつ抗腫瘍活性を有する抗体を作成することができる。その１以上の組み合わせを含む単離されたペプチドは、増殖因子受容体を認識し、かつ抗腫瘍活性を有する抗体を作成するにおいて、および癌または腫瘍疾患を有する動物、特に哺乳動物、最も特別にはヒトを免疫化するにおいて用いるのに適している。
【０１３４】
前記したように、本発明は、配列番号１〜１４のいずれかに記載されたアミノ酸配列を有する増殖因子受容体エピトープ、またはその免疫原性フラグメントをコードする、組換えＤＮＡ分子またはクローン化された遺伝子、またはその縮重改変体；好ましくは、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体エピトープをコードする核酸分子、特に組換えＤＮＡ分子またはクローン化された遺伝子にも関する。
【０１３５】
先に議論したように、配列番号１〜１４のいずれかのＥＧＦ受容体エピトープから特に選択された、ＥＧＦファミリー受容体エピトープまたはその免疫原性フラグメントは、その治療のために腫瘍または癌を有する患者への種々の手段による投与用に、適当なキャリアと共に、かつ十分な強度にて薬学的組成物にて調製することができる。種々の投与技術、とりわけ、皮下、静脈内および腹腔内注射、カテーテル化などのような非蛍光技術を利用することができる。ペプチド（類）またはその免疫原性フラグメントの平均的量は変化させることができ、特に、資格のある医師または獣医の推奨および処方に基づくべきである。
【０１３６】
（抗体）
なおさらなる態様において、本発明は、配列番号１〜１４のいずれかから選択されるＥＧＦファミリー受容体ペプチドに対する精製された抗体を提供する。
【０１３７】
本発明の単離されたポリペプチドに対する抗体は、天然で生起されたおよび組換えにより調製された抗体を含む。これらは、公知の遺伝子技術によって調製されたポリクローナルおよびモノクローナル抗体双方、ならびに二特異的抗体、およびそれらを診断用途で適したものとする他の機能を含む抗体を含むことができる。そのような抗体は、限定されるものではないが、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫を含む、ＥＧＦＲまたはそのファミリーメンバーのいずれかの異常な発現を有する腫瘍を有する患者を治療するために治療的に用いることができる。また、そのような抗体は、限定されるものではないが、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫を含む腫瘍を特徴づけ、または癌を診断するために免疫アッセイで用いることもできる。該抗体は、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫を含む腫瘍を低下させ、または癌を治療するために受動免疫化で用いることもできる。
【０１３８】
また、ポリクローナルおよびモノクローナル双方の抗体を含む抗体、および受容体エピトープおよび／またはそれらのサブユニットの露出または活性を変調する薬物はある種の診断適用を保有することができ、例えば、ウイルス感染などのような疾患を検出しおよび／または測定する目的で利用することができる。例えば、受容体ペプチドまたはその免疫原性フラグメントを用いて、例えば、融合したマウス脾臓リンパ球および骨髄腫細胞を利用するハイブリドーマ技術のような公知の技術によって、種々の細胞培地中でポリクローナルおよびモノクローナル双方の抗体を生産することができる。同様に、本発明の受容体ペプチドまたはエピトープループの活性を模倣する、またはそれに拮抗する小分子を発見し、または合成することができ、および診断および／または治療プロトコルで用いることができる。
【０１３９】
受容体ペプチドに対して生じたモノクローナル抗体のパネルは種々の特性；すなわち、アイソタイプ、エピトープ、親和性などにつきスクリーニングすることができる。特に興味があるのは、受容体の活性を中和しまたは変調するモノクローナル抗体である。そのようなモノクローナルは、受容体活性またはシグナル伝達アッセイにおいて、または腫瘍形成性圧制において容易に同定することができる。ＥＧＦＲ、または構成的に活性な受容体を含む突然変異体増殖因子受容体の免疫アフィニティー精製が望まれる場合には、高親和性抗体も有用である。
【０１４０】
特に、本発明の診断方法で用いられる抗−受容体ペプチド抗体はアフィニティー精製されたポリクローナル抗体であり得る。より詳しくは、該抗体はモノクローナル抗体（ｍＡｂ）である。加えて、本明細書中において用いる抗−受容体ペプチド抗体分子は、全抗体分子のＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２またはＦ（ｖ）部分の形態であってよい。合成、ヒト化、組換えまたは十分にヒトの抗体は特に好ましく提供される。
【０１４１】
抗体の治療的用途は当該分野で良く知られている。公知の化学療法薬物と組み合わせた裸の抗体として、放射線免疫療法に対する放射性標識抗体として、または細胞傷害性薬物、トキシン、または他の毒性剤と結合体化させた／カップリングさせた抗体として治療目的で抗体を用いるいくつかの方法がある。
【０１４２】
放射性標識抗体およびそのフラグメント、特に放射線免疫結合体化は、特に、癌療法のための放射性標識抗体として放射線免疫療法で有用である。なおさらなる態様において、放射性標識された抗体およびそのフラグメントはラジオイミュノ−ガイデッド外科技術で有用であり、そこでは、それらは癌細胞、前癌性細胞、腫瘍細胞、および過剰増殖細胞の存在および／または位置を、そのような細胞を除去するための外科的処置に先立って、その間にまたはそれに続いて同定し、示すことができる。
【０１４３】
本発明の抗体およびそのフラグメントが他の分子または因子に結合体化された、または付着された本発明の免疫結合体化または抗体融合タンパク質は、さらに、限定されるものではないが、化学的切除剤、トキシン、免疫モジュレーター、サイトカイン、細胞傷害性剤、化学療法剤または薬物に結合体化された結合メンバーを含む。
【０１４４】
本発明の抗体、または抗体フラグメントは、治療すべき疾患に応じて、単独で、あるいは他の処置、治療剤または剤と組み合わせて同時にまたは順次に投与することができる。加えて、本発明では、本明細書中に記載された抗体またはそのフラグメント、および抗癌剤または治療剤、ホルモン、抗−ＥＧＦＲ剤または抗体、または免疫モジュレーターのような他の剤または治療剤を含む組成物が考えられ、それを含む。より一般的には、これらの抗癌剤はチロシンキナーゼ阻害剤またはリン酸化カスケード阻害剤、翻訳後モジュレーター、細胞増殖または分裂阻害剤（例えば、抗−有糸分裂剤）、またはシグナル変換阻害剤であってよい。他の処置または治療剤は、非−ステロイド抗−炎症薬物（例えば、アスピリン、パラセタモール、イブプロフェンまたはケトプロフェン）のような苦痛軽減薬物、またはモルホリン、または抗−嘔吐剤のようなオピエートの適当な用量の投与を含むことができる。組成物は（限定されるものではないが、ＡＧ１４７８およびＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ−７７４、ＳＵ−６６６８を含む）チロシンキナーゼ阻害剤、ドキソルビシン、テモゾロマイド、シスプラチン、カルボプラチン、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチン、ロムスチンおよび／または他の化学療法剤と組み合わせて（順次に（すなわち前または後）または同時に）投与することができる。それゆえ、これらの剤は抗−ＥＧＦＲ特異的剤、あるいはＡＧ１４７８、ＺＤ１８３９、ＳＴＩ５７１、ＯＳＩ−７７４またはＳＵ−６６６８のようなチロシンキナーゼ阻害剤であってよく、あるいはドキソルビシン、シスプラチン、テモゾロミド、ニトロソウレア、プロカルバジン、ビンクリスチン、ヒドロキシウレア、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド、シクロホスファミド、エピポドフィロトキシン、カルムスチンまたはロムスチンのようなより一般的な抗癌剤および抗−新形成剤であってよい。加えて、組成物はデキサメタゾンのようなホルモン、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、顆粒球マクロファージ−コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）または他の増殖因子のような免疫モジュレーター、あるいは免疫応答、および癌細胞または腫瘍の低下または排除を刺激するサイトカインと共に投与することができる。ＴＮＦのような免疫モジュレーターは、８０６ＥＧＦＲエピトープを認識し、ならびにＴＮＦ受容体に結合する二特異的抗体の形態で、本発明のメンバーと一緒に組み合わせることができる。また、組成物は、限定されるものではないが、抗ＥＧＦＲ抗体５２８、２２５、ＳＣ−０３、ＤＲ８．３、Ｌ８Ａ４、Ｙ１０、ＩＣＲ６２およびＡＢＸ−ＥＧＦを含む他の抗−ＥＧＦＲ抗体と共に投与することができ、あるいはそれとの組み合わせを含むことができる。
【０１４５】
既に、抗−ＥＧＦＲ抗体と組み合わせたドキソルビシンおよびシスプラチンのような薬物の使用は、抗腫瘍活性を増強させた（Ｆａｎら、１９９３；Ｂａｓｅｌｇａら、１９９３）。ドキソルビシンおよびｍＡｂ５２８の組み合わせの結果、確立されたＡ４３１異種移植片の全体的根絶がもたらされ、他方、いずれかの剤単独での処置は一時的なイン・ビボ成長阻害を引き起こしたに過ぎなかった（Ｂａｓｅｌｇａら、１９９３）。同様に、シスプラチンおよびｍＡｂ５２８または２２５いずれかの組み合わせもまたよく確立されたＡ４３１異種移植片の根絶に導き、これは、いずれかの剤での処置を用いた場合には観察されなかった（Ｆａｎら、１９９３）。
【０１４６】
先に示唆されたように、本発明の診断方法は、抗−受容体ペプチド抗体、好ましくはアフィニティー−精製ポリクローナル抗体、より好ましくはｍＡｂのような、受容体エピトープペプチドに対するアンタゴニストの有効量を含む、アッセイの手段によって細胞サンプルまたは培地を調べることを含む。先に議論したように、この方法から利益を受けることができる患者は腫瘍、癌、前−癌性病巣、または他の増殖因子受容体疾患に罹ったものを含む。抗−受容体ペプチド抗体を誘導する、および標的細胞、特に腫瘍または腫瘍形成性または癌細胞の調査、単離、認識または殺傷を助ける抗−受容体ペプチド抗体の能力を測定し、最適化する方法は当該分野で良く知られている。
【０１４７】
ポリクローナル抗−受容体ペプチド抗体を生産する方法は当該分野で良く知られている。Ｎｅｓｔｏｒ  ら、に対する米国特許第４，４９３，７９５号参照。典型的には、有用な抗体分子のＦａｂおよび／またはＦ（ａｂ’）２部分を含有するモノクローナル抗体は、ここに引用して援用する、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８８）に記載されたハイブリドーマ技術を用いて調製することができる。簡単に述べれば、モノクローナル抗体組成物がそれから生産されるハイブリドーマを形成するために、骨髄腫または他の自己−永続性細胞系を、受容体ペプチドまたはその免疫原性フラグメントで過剰免疫化させた哺乳動物の脾臓から得られたリンパ球と融合させる。
【０１４８】
脾臓細胞は、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）６０００を用いて骨髄腫細胞と融合させる。融合したハイブリッドはＨＡＴに対するそれらの感受性によって選択される。本発明を実施するのに有用なモノクローナル抗体を生産するハイブリドーマは、本発明の受容体ペプチドと免疫反応するそれらの能力、および特定の受容体ペプチドまたは受容体活性を標的細胞において阻害するそれらの能力によって同定される。
【０１４９】
本発明を実施するのに有用なモノクローナル抗体は、適当な抗原特異性の抗体分子を分泌するハイブリドーマを含有する栄養培地を含むモノクローナルハイブリドーマ培養を開始することによって生産することができる。該培養は、ハイブリドーマが抗体分子を培地に分泌するのに十分な条件下で、かつ十分な時間維持する。次いで、抗体−含有培地を収集する。次いで、抗体分子を良く知られた技術によってさらに単離することができる。
【０１５０】
これらの組成物の調製で有用な培地は当該分野で知られており、かつ商業的に入手可能であり、合成培養培地、同系繁殖体マウスなどを含む。例示的な合成培地は、４．５ｇｍ／Ｌグルコース、２０ｍｍグルタミン、および２０％胎仔ウシ結成を補足したダルベッコの最小必須培地（ＤＭＥＭ；Ｄｕｌｂｅｃｃｏら、Ｖｉｒｏｌ．８：３９６（１９５９））である。例示的な同系繁殖体マウス株はＢａｌｂ／ｃである。
【０１５１】
ハイブリドーマによってモノクローナル抗体を作成するための一般的な方法は良く知られている。不滅の抗体−生産細胞系は、Ｂリンパ球の癌形成性ＤＮＡでの直接的形質転換、またはエプスタイン−バールウイルスでのトランスフェクションのような、融合以外の技術によって作成することもできる。例えば、Ｍ．Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、“Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”（１９８０）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ”（１９８１）；Ｋｅｎｎｅｔｔら、“Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”（１９８０）参照；また、米国特許第４，３４１，７６１号；第４，３９９，１２１号；第４，４２７，７８３号；第４，４４４，８８７号；第４，４５１，５７０号；第４，４６６，９１７号；第４，４７２，５００号；第４，４９１，６３２号；第４，４９３，８９０号も参照。
【０１５２】
モノクローナル抗−受容体ペプチド抗体を生産する方法も当該分野で良く知られている。Ｎｉｍａｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８０：４９４９−４９５３（１９８３）。典型的には、本発明の受容体ペプチドまたはペプチドアナログは、抗−受容体ペプチドモノクローナル抗体を生産するための前記した手法における免疫原として、単独で用いるか、あるいは免疫原性キャリアに結合体化させる。ハイブリドーマは、受容体ペプチドと免疫反応する抗体を生産する能力につきスクリーニングさせる。
【０１５３】
伝統的なハイブリドーマ技術とは別に、モノクローナル抗体を作成するための多数の他の良く知られた技術がある。特に好ましいのは十分にヒトの抗体を作成する方法である。１つの方法は、アフィニティー豊富化の方法を用いて抗原に特異的に結合するある範囲のヒト抗体を選択するのに用いることができるファージディスプレイ技術である。ファージディスプレイは文献に徹底的に記載されており、ファージディスプレイライブラリーの構築およびスクリーニングは当該分野で良く知られている。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ら、．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：６２−７０（１９９７）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０（１９９８）；ＭｃＧｒｅｇｏｒら、Ｍｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，６：１５５−６２（１９９６）；およびＢｉｒｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）。十分にヒトの抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖および軽鎖の大きな部分を運ぶトランスジェニックマウスを免疫原で免疫化することによって調製することもできる。そのようなマウスの例は当該技術分野内で良く知られている。例えば、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅ（登録商標）（Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．）およびＨｕＭＡｂ−Ｍｏｕｓｅ（Ｍｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．）参照。また、米国特許第６，２０７，４１８号、第６，１５０，５８４号、第６，１１１，１６６号、第６，０７５，１８１号、第５，９２２，５４５号、第５，５４５，８０６号および第５，５６９，８２５号も参照。次いで、抗体は、標準的な技術、例えば、標準的なハイブリドーマ技術によって、あるいはファージディスプレイによって調製することができる。
【０１５４】
マウスのようなヒト以外のもう１つの種からハイブリドーマ技術によって誘導されたモノクローナル抗体をヒト化することができ、これは、ヒトと融合した場合にＨＡＭＡを回避するためによりヒトとなるように遺伝子的に作成された非−ヒト抗体を意味する。抗体のヒト化方法は当該分野で良く知られており、とりわけ、より一般的な方法は相補性−決定領域（ＣＤＲ）グラフティングおよびベニアリング（リサーフェイシングとしても知られている）である。これらの方法は文献および特許において広く記載されてきた。例えば、各々ここに引用して援用する、Ｋｉｎｇ“Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”  Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ，１９９８；米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号、第５，８５９，２０５号および第６，７９７，４９２号参照。
【０１５５】
エピトープおよび本明細書中に記載する対応する受容体に結合し／それをブロックし／それを標的とし、あるいは他の方法にて、それと相互作用する分子を開発するにおけるもう１つの可能性は、ペプチドを作成することによる。これらのペプチドはエピトープに対する親和性を有するいずれかのランダムペプチドであってよく、それらは免疫グロブリンファミリーのものである必要は必ずしもない。これらのペプチドは、しばしば、ファージディスプレイ抗体についての同様な技術によって単離される（Ｓｚａｒｄｅｎｉｎｇｓ，Ｊ  Ｒｅｃｅｐｔ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ  Ｒｅｓ．２００３；２３（４）：３０７−４９）。そのようなランダムペプチドライブラリーからのペプチドの使用は、抗体および抗体フラグメントと同様である。
【０１５６】
また、本発明は、本発明の受容体ペプチドによって媒介される活性を誘導するそれらの能力を参照することにより、さきに参照したポリペプチドのような刺激体の存在を検出することによる方法を含む、種々の診断適用に関する。先に述べたように、受容体ペプチドを用いて、種々の公知の技術によってそれ自体に対する抗体を生産することができ、次いで、そのような抗体を単離し、疑われる標的細胞における特定の活性の存在につきその試験におけるように利用することができよう。
【０１５７】
前記にて詳細に記載したように、受容体ペプチドに対する抗体は、良く知られたハイブリドーマ技術を含む標準的な方法によって生産し、単離することができる。便宜のために、受容体ペプチドに対する抗体は、本明細書中においては、Ａｂ１、およびＡｂ２としてもう１つの種で生起された抗体に言及する。後記から、Ａｂ２の特徴的な特性は、それがＡｂ１と反応することであることを理解する。本明細書および特許請求の範囲の目的では、Ａｂ１は一次または抗−受容体ペプチド抗体といい、Ａｂ２は二次または抗−Ａｂ１抗体という。
【０１５８】
細胞における露出された受容体エピトープペプチドの存在は、そのような測定に適用できる通常の免疫学的手法によって確認することができる。多数の有用な手法が知られている。特に有用な３つのそのような手法は、検出可能な標識で標識された受容体ペプチド、検出可能な標識で標識された抗体Ａｂ１、または検出可能な標識で標識された抗体Ａｂ２を利用する。該手法は以下の式によってまとめることができ、ここに、星印は該粒子が標識されることを示し、および「〜」は受容体ペプチドを示す：
【０１５９】
【化２３】
2008501308.tif 000018
上記手順およびそれらの適用は全て、当業者が精通しており、従って、本発明の範囲内で利用できる。「競合」手法（手法Ａ）は米国特許第３，６５４，０９０号および第３，８５０，７５２号に記載されている。手法Ｃ、「サンドイッチ」手法は米国特許第ＲＥ  ３１，００６号および第４，０１６，０４３号に記載されている。なお他の手法は、「二重抗体」または「ＤＡＳＰ」手法のように知られている。
【０１６０】
各場合に、受容体ペプチドは１以上の抗体または結合パートナーとで複合体を形成し、複合体の１つのメンバーは検出可能なレベルで標識される。複合体が形成されたという事実および、所望であれば、その量は、標識の検出に適用できる公知の方法によって決定することができる。
【０１６１】
これらの実験で最も通常に使用される標識は放射性元素、酵素、紫外光に露出された場合に蛍光を発する化学物質その他である。
【０１６２】
多数の蛍光物質が知られており、標識として利用することができる。これらは、例えば、フルオレセイン、ローダミン、オーラミン、テキサスレッド、ＡＭＣＡブルーおよびルシフェールイエローを含む。特別な検出物質は、ヤギで調製され、イソチオシアネートを通じてフルオレセインに結合体化された抗−ウサギ抗体である。
【０１６３】
また、受容体ペプチドまたはその結合パートナーは放射性元素で、または酵素で標識することもできる。放射性標識は現在利用可能なカウンティング手法のいずれかによって検出することができる。好ましい同位体は３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、９０Ｙ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、および１８６Ｒｅから選択することができる。
【０１６４】
酵素標識は同様に有用であって、現在利用される比色、分光測定、蛍光分光測定、アンペロメトリーまたはガソメトリー技術のいずれかによって検出することができる。酵素は、カルボジイミド、ジイソシアネート、グルタルアルデヒドなどのようなブリッジング分子との反応によって選択された粒子に結合体化される。これらの手法で用いることができる多くの酵素が知られており、利用することができる。好ましいのはペルオキシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、β−Ｄ−グルコシダーゼ、β−Ｄ−ガラクトシダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ＋ペルオキシダーゼおよびアルカリ性ホスファターゼである。米国特許第３，６５４，０９０号；第３，８５０，７５２号および第４，０１６，１４３号は、別の標識材料および方法のその開示のため例示的に言及する。
【０１６５】
本発明に従って開発され、利用される特定のアッセイ系は受容体アッセイとして知られている。受容体アッセイにおいては、アッセイすべき材料を適切に標識し、次いで、ある種の細胞試験コロニーを、ある量の標識されたおよび未標識の双方の物質で接種し、しかる後に、結合実験を行って、標識された物質が細胞受容体に結合する程度を測定する。このようにして、物質間の親和性の差を確認することができる。
【０１６６】
従って、精製された量の受容体ペプチドを放射性標識し、例えば、抗体またはそれに対する他の阻害剤と組み合わせ、しかる後に、結合実験を行う。次いで、種々の量の標識および未標識の組み合わされていない受容体ペプチドを含有する溶液を調製し、次いで、細胞サンプルを接種し、しかる後、インキュベートする。次いで、得られた細胞単層を洗浄し、可溶化し、次いで、＜５％の標準誤差を生じるのに十分な時間の間ガンマカウンターでカウントする。次いで、これらのデータをＳｃａｔｃｈａｒｄ分析に付し、その後、物質活性に関する観察および結論を引き出すことができる。前記したのは例であるが、それは、アッセイされた物質の細胞結合能力が識別特徴として働くことができる場合に、受容体アッセイを行い利用することができる方法を説明する。
【０１６７】
本発明に従う、有用であり、かつ企図されるアッセイは「シス／トランス」アッセイとして知られている。簡単に述べれば、このアッセイは２つの遺伝子構築体を使用し、その１つは、典型的には、適当な細胞系にトランスフェクトされた場合に、注目する特定の受容体を継続して発現するプラスミドであり、その第二のものはプラスミドであり、これは受容体／リガンド複合体の制御下でルシフェラーゼのような受容体を発現する。それゆえ、例えば、もし特定の受容体に対するリガンドとして化合物を評価するのが望ましければ、プラスミドの１つは、選択された細胞系において受容体の発現をもたらす構築体であり、他方、第二のプラスミドはルシフェラーゼ遺伝子に連結されたプロモーターを保有し、ここに、特定の受容体に対する応答エレメントが挿入されている。もし試験中の化合物が受容体に対するアゴニストであれば、リガンドは受容体とで複合体化し、得られた複合体は受容体エレメントに結合し、ルシフェラーゼ遺伝子の転写を開始させる。得られたケミルミネセンスを、次いで、分光光度的に測定し、用量応答曲線が得られ、公知のリガンドのものと比較する。前記したプロトコルは、当業者が参照する目的の、米国特許第４，９８１，７８４号およびＰＣＴ国際公開ＷＯ  ８８／０３１６８に詳細に記載されている。
【０１６８】
本発明のさらなる実施形態において、医学専門家による使用に適した商業的試験キットを調製して、異常な増殖因子受容体または露出された受容体エピトープペプチドの疑われる標的細胞における存在または不存在を測定することができる。先に議論した試験技術に従い、そのようなキットの１つのクラスは、標識された受容体ペプチドまたはその結合パートナー、例えば、それに対して特異的な抗体、および指示書を含み、勿論、これは選択された方法、例えば、「競合」、「サンドイッチ」、「ＤＡＳＰ」などに依存する。該キットは緩衝液、安定化剤などのような末梢試薬を含むこともできる。
【０１６９】
従って、ＥＧＦＲを含む所定の異常な増殖因子受容体の活性についての細胞存在または能力の証明のための試験キットを調製することができ、これは：
（ａ）検出可能な標識への、本発明の受容体ペプチドまたはそれに対する特異的な結合パートナーの直接的または間接的付着によって得られる、所定量の少なくとも１つの標識された免疫化学的に反応性の成分；
（ｂ）他の試薬；および
（ｃ）該キットの使用のための指示書；
を含む。
【０１７０】
より詳細には、診断試験キットは：
（ａ）免疫吸収剤を形成するための一般的には固相に結合した、あるいはあるいは、適当なタグ、あるいは複数のそのような最終産物など、（またはその結合パートナー）、各々１つに結合した前記した受容体ペプチド（または結合パートナー）の既知量；
（ｂ）必要であれば、他の試薬；および
（ｃ）該試験キットの使用のための指示書；
を含むことができる。
【０１７１】
さらなるバリエーションにおいて、試験キットを調製することができ、前記目的で用いることができ、これは所定のプロトコル（例えば、「競合」、「サンドイッチ」、「二重抗体」など）に従って操作され、これは：
（ａ）検出可能な標識に受容体ペプチドをカップリングさせることによって得られた標識された成分；
（ｂ）そのうち少なくとも１つの試薬がリガンドまたは固定化されたリガンドである１以上のさらなる免疫化学試薬、そのリガンドが：
（ｉ）標識された成分（ａ）と結合することができるリガンド；
（ｉｉ）標識された成分（ａ）の結合パートナーと結合することができるリガンド；
（ｉｉｉ）測定すべき成分の少なくとも１つと結合することができるリガンド；および
（ｉｖ）測定すべき成分の少なくとも１つの結合パートナーの少なくとも１つに結合することができるリガンド；
よりなる群から選択され；および
（ｃ）受容体ペプチドおよびそれに対する特異的な結合パートナーの間の免疫化学反応の１以上の成分の検出および／または測定のためのプロトコルの実施についての指示書；
を含む。
【０１７２】
前記に従い、受容体ペプチド、またはそれに対する抗体の活性を変調するのに効果的な潜在的薬物をスクリーニングするためのアッセイシステムを調製することもできる。受容体ペプチドまたは抗体を試験系に導入することができ、見込みのある薬物を得られた細胞培養に導入することもでき、しかる後、培養を調べて、見込みのある薬物単独の添加による、あるいは既知の受容体ペプチド、またはそれに対する抗体の追加された量の効果による、細胞の増殖因子受容体活性のいずれかの変化を観察する。
【０１７３】
（組成物）
本発明では、さらに、本発明の治療方法を実行するのに有用な治療用組成物が考えられる。対象のの治療用組成物は、薬学的に受容可能な賦形剤（キャリア）および、特に、有効成分としての、本明細書中に記載された、配列番号１〜１４のいずれかの配列を有するペプチドから選択される１以上の受容体ペプチド、またはその免疫原性フラグメントを混合して含む。
【０１７４】
有効成分としてポリペプチド、アナログまたは活性フラグメントを含有する治療用組成物の調製は当該分野で良く理解されている。典型的には、そのような組成物は液体溶液または懸濁液いずれかとしての注射剤として調製されるが、注射に先立って液体中の溶液、または液体中の懸濁液に適した固体形態を調製することもできる。その調製物はまた、乳化することもできる。活性な治療成分は、しばしば、薬学的に受容可能であり、かつ有効成分と適合する賦形剤と混合される。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびその組み合わせである。加えて、所望であれば、組成物は、少量の、有効成分の有効性を増強させる湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤のような補助物質を含有することができる。
【０１７５】
ポリペプチド、アナログまたは活性フラグメントは、中和された薬学的に受容可能な塩形態として治療用組成物に処方することができる。薬学的に受容可能な塩は（ポリペプチドまたは抗体分子の遊離アミノ基とで形成された）酸付加塩を含み、これは、例えば、塩酸またはリン酸のような無機酸、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸のような有機酸とで形成される。遊離カルボキシル基から形成された塩もまた、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化第二鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基に由来することもできる。
【０１７６】
治療用受容体ペプチドまたは免疫原性フラグメント含有組成物は、例えば、注射または単位用量の投与などによって、経口的に、筋肉内に、腹腔内に、または静脈内に投与することができる。用語「単位用量」は、本発明の治療用組成物に言及して用いる場合には、ヒトのための単位用量として適した物理的に別個の単位をいい、各単位は、必要な希釈剤、すなわち、キャリアまたはビヒクルと一緒になって所望の治療効果を生じることが計算された所定量の活性物質を含有する。治療用受容体ペプチドまたは免疫原性フラグメント含有組成物は、免疫化スケジュールにおけるように、一連に複数に投与することができる。
【０１７７】
組成物は、投薬の処方に適合し、かつ治療的に有効な量にて投与される。投与すべき量は治療すべき被験体、有効成分を利用する被験体の免疫系の能力、および増殖因子受容体結合および所望のシグナル伝達能力の阻害または中和の程度に依存する。投与するのに必要な有効成分の正確な量は、実施者の調整に依存し、各個人に特有なものである。しかしながら、適当な用量は、１日当たり個人の体重１ｋｇ当たり約０．１ミリグラム〜２０ミリグラム、好ましくは約０．５ミリグラム〜約１０ミリグラム、より好ましくは１ミリグラム〜数ミリグラムの有効成分の範囲であり、これは投与の経路に依存する。最初の投与および追加抗原注射のための適当なレジメンもまた変わり得るが、最初の投与、引き続いて注射または他の投与による１時間以上の間隔を空けた反復投薬が典型的である。あるいは、血液中に１０ナノモル濃度〜１０マイクロモル濃度を維持するのに十分な連続静脈内注射が企図される。
【０１７８】
治療用組成物は、さらに、有効量の受容体ペプチド、またはそれに対する抗体、および以下の有効成分：抗有糸分裂剤、化学療法剤、免疫モジュレーターの１以上を含むことができる。
【０１７９】
（核酸）
本発明の別の特徴は、本明細書中に開示された受容体ペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現である。当該分野で周知なように、ＤＮＡ配列は、適当な発現ベクター中で発現制御配列に操作可能に連結され、その発現ベクターを用いて適切な単細胞宿主を形質転換する。本発明のＤＮＡ配列の発現制御配列へのそのような操作可能な連結は、当然、そのＤＮＡ配列のすでに存在する部分でない場合は、ＤＮＡ配列の上流の正しいリーディングフレーム内の開始コドンＡＴＧの配置を包含する。
【０１８０】
広範に種々の宿主／発現ベクターの組み合わせが、本発明のＤＮＡ配列を発現させるために使用され得る。有用な発現ベクターは、例えば、染色体、非染色体および合成ＤＮＡ配列のセグメントから構成される。適したベクターとしては、ＳＶ４０の誘導体および公知の細菌プラスミド、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミド  ｃｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、ＲＰ４のようなプラスミド；ファージＤＮＡ（例えば、ファージλの多数の誘導体、例えば、ＮＭ９８９、および他のファージＤＮＡ、例えば、Ｍ１３、およびフィラメント状一本鎖ファージＤＮＡ）；２μプラスミドのような酵母プラスミドまたはその誘導体；昆虫または哺乳動物細胞において有用なベクターのような真核生物で有用なベクター；プラスミドとファージＤＮＡとの組み合わせに由来するベクター（例えば、ファージＤＮＡまたは他の発現制御配列を用いるように改変されているプラスミド）が挙げられる。
【０１８１】
広範に種々の発現制御配列（その発現制御配列に操作可能に連結したＤＮＡ配列の発現を制御する配列）のいずれも、これらのベクターで使用され、本発明のＤＮＡ配列を発現させる得る。そのような有用な発現制御配列としては、例えば、ＳＶ４０の初期プロモーターまたは後期プロモーター、ＣＭＶ、ワクシニア、ポリオーマまたはアデノウイルス、ｌａｃ系、ｔｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ＬＴＲ系、ファージλの主要オペレーターおよびプロモーター領域、ｆｄコートタンパク質の制御領域、３−ホスホグリセレートキナーゼまたは他の解糖酵素のためのプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター（例えば、Ｐｈｏ５）、酵母のα接合型因子のプロモーター、および原核生物または真核生物細胞またはそれらのウイルスの遺伝子の発現を制御することが既知である他の配列、およびそれらの種々の組み合わせを含む。
【０１８２】
広範に種々の単細胞宿主細胞もまた、本発明のＤＮＡ配列を発現させるのに有用である。これらの宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ株、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ株、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ株、酵母のような真菌、ならびにＣＨＯ、Ｒ１．１、Ｂ−ＷおよびＬ−Ｍ細胞、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ１、ＢＳＣ４０、およびＢＭＴ１０）のような動物細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９）、および組織培養におけるヒト細胞および植物細胞のような良く知られた真核生物および原核生物が挙げられ得る。
【０１８３】
全てのベクター、発現制御配列および宿主が同等に良く機能して、本発明のＤＮＡ配列を発現するのではないことが理解される。全ての宿主が同一の発現系において同等によく機能するというのでもない。しかしながら、当業者であれば、本発明の範囲を逸脱することなく所望の発現を達成するために、過度の実験をせずに、適切なベクター、発現制御配列、および宿主を選択し得る。例えば、ベクターの選択においては、宿主が考慮されなければならない。なぜなら、ベクターはその宿主内で機能しなければならないからである。ベクターのコピー数、そのコピー数を制御する能力、およびそのベクターによってコードされるいずれかの他のタンパク質（例えば、抗生物質マーカー）の発現も考慮される。
【０１８４】
発現制御配列の選択において、通常は種々の因子が考慮される。これらは、例えば、系の相対的強度、その制御可能性、および特に潜在的二次構造に関して、特定のＤＮＡ配列または発現させるべき遺伝子に対するその適合性を含む。適当な単細胞宿主は、例えば、選択されたベクターとのそれらの適合性、それらの分泌特徴、タンパク質を正しく折り畳むそれらの能力、およびそれらの発酵要件、ならびに発現されるべきＤＮＡ配列によってコードされる産物の宿主に対する毒性、および発現産物の精製の容易性によって選択される。
【０１８５】
これらおよび他の因子を考慮して、当業者であれば、発酵、または大規模な動物培養について本発明のＤＮＡ配列を発現する種々のベクター／発現制御配列／宿主の組み合わせを構築することができる。
【０１８６】
ペプチドアナログは、本発明の範囲内で誘導されたタンパク質複合体／サブユニットのヌクレオチド配列から調製され得ることが、さらに企図される。フラグメントのようなアナログは、例えば、ペプチドのペプシン消化を含むタンパク質分解消化によって生じさせることができる。ムテインのような他のアナログは、受容体ペプチドコーディング配列の標準的な部位特異的突然変異誘発によって生じさせることができる。小分子のような「受容体エピトープペプチド活性」を呈するアナログは、プロモーターまたは阻害剤として機能するか否かに関わらず、公知のインビボおよび／またはインビトロアッセイによって同定され得る。
【０１８７】
前記したように、受容体ペプチドをコードするＤＮＡ配列は、クローン化されるよりもむしろ合成によって調製することができる。そのＤＮＡ配列は、受容体ペプチドアミノ酸配列についての適切なコドンを用いて設計され得る。一般に、その配列が発現に使用される場合、意図した宿主についての適切なコドンを選択する。完全な配列は、標準的な方法によって調製されたオーバーラップするオリゴヌクレオチドから組み立てられ、完全なコーディング配列に組み立てられる。例えば、Ｅｄｇｅ，Ｎａｔｕｒｅ，２９２：７５６（１９８１）；Ｎａｍｂａｉｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２３：１２９９（１９８４）；Ｊａｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５９：６３１１（１９８４）。
【０１８８】
合成ＤＮＡ配列は、受容体ペプチドアナログまたは「ムテイン」を発現する遺伝子の簡便な構築を可能にする。あるいは、ムテインをコードするＤＮＡは、天然増殖因子受容体遺伝子またはｃＤＮＡの部位特異的突然変異誘発によって作成され得、ムテインは従来のポリペプチド合成を用いて直接作成することができる。
【０１８９】
非天然アミノ酸のタンパク質への部位特異的取り込みのための一般的方法は、Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｊ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐｅｔｅｒ  Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９年４月）に記載されている。この方法を用いて、非天然アミノ酸を有するアナログを作成することができる。
【０１９０】
（抗原およびワクチン）
Ｔ細胞によって認識される腫瘍抗原の特徴付けは、癌ワクチンアプローチを進化させ、よく規定された抗原を用いることによって、癌に対して患者を免疫化する機会を最初に提供した。メラノーマはプロトタイプの免疫原性腫瘍の１つであるため、多数の初期相臨床試験がメラノーマについて行われてきた。いくつかの腫瘍後退が、主として、転移性疾患を有する患者で報告されてきた。最近の進歩は、抗癌免疫応答のモニタリング、および頑強な抗メラノーマ免疫系を誘導すること目的とする、アジュバントの開発のための新しいツールを包含する。
【０１９１】
前立腺癌は、合衆国における男性での癌の死亡の第二の主要な原因である。ワクチンストラテジーは、新規の治療アプローチを代表する。前立腺癌ワクチンに対する１つの潜在的標的は、前立腺癌および正常な前立腺上皮細胞におけるその制限された発現に起因して、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）である。細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）を発現させることができ、次いで、ペプチド特異的ＣＴＬによって腫瘍標的の殺傷に至る、多数のＰＳＡ−特異的エピトープが同定されている。今日、ＲＮＡ−パルス樹状細胞ワクチン、組換えタンパク質ワクチン、およびワクチンの組換えウイルスベクター送達を用いる戦略が臨床試験で使用されてきた。Ｔ細胞活性化を増強する共刺激性分子を取り込む、より新しいアプローチもまた調査されている。
【０１９２】
樹状細胞（ＤＣ）は、動物およびヒトにおいて一次Ｔ細胞抗腫瘍免疫応答を刺激する能力を有する、強力な抗原提示細胞である。１９９５年における樹状細胞ワクチン接種の最初に公表された臨床試験以来、１０００を超えるワクチンを記載する９８の研究が、査読されたメディカルジャーナルで発表されるか、あるいはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、またはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙの年次集会で提示されてきた。試験は、１１５カ国で実施されている。試験は、２４個（２ダース）を超える腫瘍タイプを有する患者を含み；ほとんどの試験は、悪性メラノーマ、前立腺癌、結直腸癌腫、または多発性ミエローマを有する患者を、合成抗原またはイディオタイプ抗体でパルスした自己ＤＣを用いて研究した。ＤＣを、腫瘍溶解物またはＲＮＡでパルスすることによって、腫瘍ＤＮＡでのトランスフェクションによって、または腫瘍細胞／ＤＣ融合物を作製することによって、ＤＣワクチンもまた調製された。ワクチン細胞数、ワクチンプログラムの長さ、ワクチン接種の部位、ワクチンの凍結保存、およびＤＣのための成熟段階の使用に対する種々のアプローチが用いられた。ＤＣワクチン接種に関連する副作用は共通ではなく；ほとんどは軽度かつ自己限定的であり、深刻なものはなかった。臨床的応答が試験のほぼ半分で観察された。ＤＣワクチン接種は、ペプチドワクチンの限定された範囲および免疫原性を克服し得る、癌免疫療法に対する安全なアプローチを提供し得る。
【０１９３】
マウスおよびサルにおける任意の成功した研究の後、Ｇｏｎｚａｌｅｓら、（Ｇｏｎｚａｌｅｓ，Ｇ  ら、（２００３）Ａｎｎａｌｓ  Ｏｎｃｏｌ  １４：４６１−４６６）は、進行した段階の非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を有する患者における、キャリアタンパク質、Ｐ６４Ｋ  Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ外膜組換えタンパク質に結合体化された、ＥＧＦＲリガンドであるＥＧＦでのワクチン接種のヒトでの研究を報告した。良好な生存時間が、良好な抗ＥＧＦ抗体応答を有する患者において観察された。
【０１９４】
ワクチンを含む合成抗原は、必要に応じて他の腫瘍抗原を含む、本発明の受容体ペプチドを化学的に合成することによって調製され得る。これらのペプチド、ペプチドキャリアの組み合わせ、そのようなペプチドの脂質誘導体ならびに腫瘍抗原は、個々に使用されてもカクテルとして組み合わされてもよく、アジュバントと共に処方され、免疫原性組成物を提供し得る。本明細書中で企図されるように、抗原を糖脂質アナログに共有結合させて、別個の分子を提供し得る。この分子は、そのような共有結合の非存在下で達成可能なアジュバント化効果よりも大きな、抗原に対する増強されたアジュバント化効果を示す。これらの組成物を使用して、例えば、筋肉内経路または非経口経路によって、あるいはトキシンおよび抗体のような、ミクロ粒子、カプセル、リポソームおよび標的化分子を用いる粘膜表面への送達によって、哺乳動物を免疫化することができる。
【０１９５】
ペプチドを含むワクチンは、米国特許第４，６０１，９０３号；第４，５９９，２３１号；第４，５９９，２３０号；および第４，５９６，７９２号（これらの全てを、本明細書中に参考として援用する）によって例示されるように、当該分野で一般的に周知である。インビボでのペプチドの使用は、まず、それらの化学的修飾を必要とし得る。なぜなら、そのペプチド自体は、十分に長い血清半減期および／または組織半減期および／または十分な免疫原性を有さないかもしれないからである。加えて、立体配座的拘束をそれらに課すために、ペプチドを修飾するのが有利である。これは、例えば、誘導されるエフェクター免疫応答を最適化するために、天然タンパク質の関係でペプチドの天然に生じる立体配座を模倣するのに有用であり得る。
【０１９６】
本発明は、一定量の受容体ペプチド、またはその免疫原性フラグメント、およびそれらの組み合わせを含む免疫原性組成物を提供する。１つの実施形態において、その受容体ペプチドは、配列番号１〜１４から選択される。
【０１９７】
本発明は、一定量の受容体ペプチド、またはその免疫原性フラグメント、および適切なアジュバントを被験体に投与する工程を包含する、抗原特異的細胞媒介免疫応答を刺激または増強する方法を提供する。
【０１９８】
本発明は、腫瘍または癌を有する患者を処置する方法を提供し、この方法は、一定量の受容体ペプチド、および免疫モジュレーターとしての本発明のアジュバント組成物、および適切なキャリアまたは希釈剤を被験体に投与する工程を包含する。特に、癌を有する被験体が、受容体ペプチド−アジュバント組成物で処置され得る。そのような癌としては、頭頸部癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、膀胱癌、咽頭癌、扁平細胞癌腫、または前立腺腫瘍および神経膠腫が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
さらに、被験体は、化学療法剤、化学予防剤、または放射線療法と組み合わせて、受容体ペプチドまたはその免疫原性組成物で処置され得る。その受容体ペプチド組成物は、化学療法の介入または放射線療法の介入と組み合わせて使用され得ることが、本発明により企図される。別の実施形態において、受容体ペプチド組成物での処置は、数分〜数週間の範囲の間隔で、ＤＮＡ損傷剤の処置に先行または追随し得る。プロトコルおよび方法は、当業者に公知である。ＤＮＡ損傷剤またはＤＮＡ損傷因子は、当業者に公知であり、細胞に適用した場合にＤＮＡ損傷を誘発する任意の化学化合物または処置方法を意味する。そのような薬剤および因子としては、ＤＮＡ損傷を誘導する放射線および波（例えば、ガンマ照射、Ｘ線、ＵＶ照射、マイクロ波、電子発光など）が挙げられる。「化学治療剤」とも記載される種々の化学化合物は、ＤＮＡ損傷を誘導するように機能し、その全てが本明細書中に開示される併用療法で使用されることが企図される。使用されると考えられる化学療法剤としては、例えば、アドリアマイシン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、エトポシド（ＶＰ−１６）、カンプトテシン、アクチノマイシン−Ｄ、マイトマイシンＣ、シスプラチン（ＣＤＤＰ）および過酸化水素でさえもが挙げられる。Ｘ線とシスプラチンとの使用、またはシスプラチンとエトポシドとの使用のような、１以上のＤＮＡ損傷剤の組み合わせを、放射線ベースまたは現実の化合物であるか否かに関わらず、ＥＨＡと一緒に使用され得る。他の腫瘍性薬剤または毒性剤としては、各々の場合に、例えば、セファラスポリン（ＷＯ−Ａ９４  ０１  １３７およびＥＰ−Ａ−０  ３８２  ４１１参照）またはセファラスポリンマスタード（ＥＰ−Ａ−Ｏ  ４８４  ８７０参照）に連結させ得る、５−フルオロウラシル、メトトレキセートおよびアドリアマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２００】
受容体ペプチドまたは免疫原性組成物は、液体溶液またはエマルジョンとして、注射剤として調製され得る。抗原および免疫原性組成物は、それらと適合性の生理学的に受容可能なキャリアと混合され得る。これらとしては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせが挙げられ得る。ワクチンは、さらに、それらの有効性をさらに増強するために、湿潤剤または乳化剤またはｐＨ緩衝剤のような補助的物質を含み得る。ワクチンは、注射によって皮下または筋肉内に投与され得る。
【０２０１】
あるいは、本発明に従って形成された免疫原性組成物は、粘膜表面における免疫応答を誘導する様式で、処方および送達され得る。それゆえ、免疫原性組成物は、例えば、鼻腔または経口（胃内）経路によって、粘膜表面に投与され得る。あるいは、坐薬を含む他の投与形態が望ましいかもしれない。坐薬については、結合剤およびキャリアとしては、例えば、ポリアルキレングリコールおよびトリグリセリドが挙げられ得る。経口処方物は、通常使用される賦形剤（例えば、医薬グレードのサッカリン、セルロースおよび炭酸マグネシウム）を含み得る。
【０２０２】
投与の様式は、宿主動物の肉体の部位にアジュバントまたはアジュバント含有ワクチンを送達するための、任意の適切な手段および／または方法の使用を包含する。ここで、そのアジュバントおよび結合された抗原は、効率的に免疫を刺激する。送達態様としては、癌近傍、経粘膜、経皮、筋肉内、静脈内、皮内、皮下、腹腔内、心室内、頭蓋内および腫瘍内のような非経口投与方法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０３】
本発明は、本発明の例として提供される、以下の非限定的実施例を参照して良好に理解され得る。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態をより十分に示すために提示するものであって、本発明の広範な範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０２０４】
（実施例１）
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は多くの上皮癌で過剰発現され、観察はしばしば臨床結果の乏しいことに関連付けられている。ＥＧＦＲの過剰発現は通常はＥＧＦＲ遺伝子増幅によって引き起こされ、時々、その細胞外ドメインに内部欠失を保有する変異ＥＧＦＲ（ｄｅ２−７  ＥＧＦＲまたはＥＧＦＲｖＩＩＩ）の発現に関連付けられている。ＭＡｂ  ８０６は、過剰発現されると、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲおよび野生型（ｗｔ）ＥＧＦＲのサブセットを共に認識するが、正常な組織で発現されたｗｔ  ＥＧＦＲに結合しない有意な抗腫瘍活性を持つ新規なＥＧＦＲ抗体である。Ａ４３１腫瘍細胞で発現されたｗｔ  ＥＧＦＲのうちの小さな割合（約１０％）に結合するのみにもかかわらず、ｍＡｂ  ８０６はヌードマウスで増殖したＡ４３１異種移植片に対して、強い抗腫瘍活性を呈する。そのユニークな特異性および抗腫瘍活性の態様に導くメカニズムを解明するために、本発明者らは、ｍＡｂ  ８０６のＥＧＦＲ結合エピトープを決定した。酵母の表面に発現されたＥＧＦＲ断片、またはイムノブロット様式でのＥＧＦＲ断片のいずれかへのｍＡｂ  ８０６結合の分析から、ｍＡｂ  ８０６のエピトープを含むようであるジスルフィド結合ループ（アミノ酸２８７−３０２）を同定した。実際に、ｍＡｂ  ８０６は、これらのアミノ酸に対応する合成ＥＧＦＲペプチドに対して、見かけの高親和性（約３０ｎＭ）で結合した。ＥＧＦＲ構造の分析から、このジスルフィド結合ループは、ＥＧＦＲが不活性な係留された立体配座からリガンド結合した活性な立体配座へ変化する場合に起こる、遷移形態の受容体の場合にのみ、ｍＡｂ  ８０６が結合するために利用可能であることを示す。ｍＡｂ  ８０６は、小さな割合の一時の受容体に結合してその活性化を妨げ、次いで強力な抗腫瘍効果を生じるようである。最後に、発明者らの所見は、増殖因子受容体の遷移形態に対する抗体の作製が、正常組織の標的化を低下させ、依然として抗腫瘍活性を保持する、新規な方法を表し得ることを示唆する。
【０２０５】
（緒言）
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）は、多くの異なる細胞型の増殖および分化を指令することを担う１７０ｋＤａの膜結合型チロシンキナーゼである（１，２）。ＥＧＦＲの過剰発現は多くの上皮腫瘍で観察されており、ＥＧＦＲ発現レベルの増大は、通常は、臨床結果の乏しいことと関連付けられている（３−５）。受容体の過剰発現は、しばしば、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅によって引き起こされ、この増幅はＥＧＦＲ突然変異とリンクもされる事象である（６）。最も一般的なＥＧＦＲ突然変異は、神経膠腫で頻繁に発現される、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲ（またはＥＧＦＲｖＩＩＩ）として公知のＥＧＦＲの細胞外切断である（６−８）。この切断の結果、ＥＧＦＲの細胞外ドメインからの２６７アミノ酸の除去を生じ、そして新規なグリシンの挿入がもたらされ、このことは、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲのＮ末端近くでのユニークな接合ペプチドを生じさせる（６−８）。ｄｅ２−７  ＥＧＦＲは公知のリガンドのいずれにも結合することができないが、低レベルの構成的活性化を呈しており、ヌードマウスにおいて異種移植片として成長させた場合に神経膠腫および乳房細胞の腫瘍形成性を増強させる（９−１１）。
【０２０６】
ＥＧＦＲの阻害は、新しい癌治療剤の開発のための合理的な戦略である（１２）。潜在的な治療剤は抗ＥＧＦＲ抗体（１３）およびＥＧＦＲの小分子量チロシンキナーゼ阻害剤（１４）を含む。ＥＧＦＲの細胞外ドメインに向けられた多数の抗体が、今日、ＥＭＤ５５９００（１５）、ＡＢＸ−ＥＧＦ（１６）およびＣ２２５（セツキシマブ）（１７）を含めて臨床試験されており、その全ては患者においていくらかの抗腫瘍活性を呈している。これらの最も臨床上に進んだものはＣ２２５であり、これは、頭部および頸部、結直腸および非小細胞肺癌腫の処置に関して、現在第ＩＩ／ＩＩＩ相臨床試験でテストされており、最近、欧州で使用が認可された（１８）。これらの抗体の抗腫瘍活性は、主として、リガンド結合をブロックするそれらの能力に関連すると推定されているが、免疫エフェクター機能、受容体ダウンレギュレーション、不適切なシグナル伝達の誘導、ならびに受容体二量体化および／またはオリゴマー化の妨害のような、他の抗腫瘍メカニズムも役割を果たし得る。野生型（ｗｔ）ＥＧＦＲを標的とする抗体の１つの制限は、それらが肝臓および皮膚のような正常な組織において有意な取り込みを示す点である（１９，２０）。現在、正常なＥＧＦＲの標的化は皮膚発疹のような管理可能な副作用を引き起こすようであるが、これらの抗ＥＧＦＲ抗体が細胞傷害剤または放射性同位体と連関する場合、有意な肝臓損傷が予測されるであろう。
【０２０７】
ｍＡｂ  ８０６はｄｅ２−７  ＥＧＦＲを発現するマウス線維芽細胞に対して惹起され、ｗｔ  ＥＧＦＲを発現する正常組織に結合しない。これは、その抗体を癌療法に対して魅力的な候補とする（２１）。ユニークなｄｅ２−７  ＥＧＦＲ接合部ペプチドに対して全て特異的である（２４−２６）他のｄｅ２−７  ＥＧＦＲ特異的抗体とは異なり、ｍＡｂ  ８０６は異なる未知のエピトープを認識する（２７）。実際に、ｍＡｂ  ８０６は、ＥＧＦＲの変性後のイムノブロッティングによって、またはさらにＥＬＩＳＡプレートの表面でのコーティングすることによって、ｗｔ  ＥＧＦＲに頑強に結合し得る。ｍＡｂ  ８０６は大部分のｄｅ２−７  ＥＧＦＲを認識し、一方、この抗体は受容体を過剰発現する細胞においていくらかのｗｔ  ＥＧＦＲにも結合する（２７）。Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析は、ｍＡｂ  ８０６が、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲ接合部ペプチドに対して特異的な抗体であるｍＡｂ  ＤＨ８．３によって認識されるｄｅ２−７  ＥＧＦＲのうちの約５０％に結合することを明らかとした（２７）。対照的に、ｍＡｂ  ８０６は、ｗｔ  ＥＧＦＲ特異的ｍＡｂ  ５２８と比較した場合、Ａ４３１細胞で過剰発現されたｗｔ  ＥＧＦＲのうちの１０％未満に結合した。重要なことには、ｍＡｂ  ８０６はｗｔ  ＥＧＦＲを発現する正常な組織に結合しない。興味深いことに、ｍＡｂ  ８０６はまた、小胞体内に通常配置するＥＧＦＲの高マンノース形態を優先的に認識する。単一剤として用いた場合、ｍＡｂ  ８０６は、ｄｅ２−７または増幅されたＥＧＦＲいずれかを発現するヒト異種移植片に対して有意な抗腫瘍活性を示した。ｍＡｂ  ８０６結合エピトープの測定はその作用メカニズムを理解するのに、ならびに腫瘍特異的抗体を開発するための一般的戦略を提供するために重要であろう。２つの独立したアプローチを用い、本発明者らは、今回、ｍＡｂ  ８０６によって認識されるエピトープを同定する。最近記載されたＥＧＦＲについての結晶構造を利用し、本発明者らは、ｍＡｂ  ８０６のユニークな特異性、およびどのようにしてそれがその抗腫瘍活性を媒介するかを説明することもできた。
【０２０８】
（実験手順）
（抗体）
ＥＧＦＲに対して特異的なＩｇＧ２ｂモノクローナル抗体８０６およびＩｇＧ２ａ  ｍＡｂ５２８を以前に記載されているように（２７，２８）Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ（Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ）で生産し、精製した。
【０２０９】
（発現ベクター）
発現ベクターｐＥＥ１４／ｓＥＧＦＲ５０１およびｐＥＥ１４／ｓＥＧＦＲ５１３は従前に記載されており（２９）、ＥＧＦＲエクトドメインの、それぞれ、シグナルペプチド、ならびに最初の５０１アミノ酸および５１３アミノ酸、続いてｃ−ｍｙｃエピトープタグをコードし、全てヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターの制御下で転写される。発現ベクターｐＥＥ１４／ｓＥＧＦＲ３１０−５０１は、エクトドメインのアミノ酸残基３１０−５０１とインフレームで融合したＥＧＦＲのシグナルペプチドをコードし、エピトープタグで終結するｃＤＮＡを、含有する。
【０２１０】
残基２７４、残基２８２、残基２９０および残基２９８で開始し、全てアミノ酸５０１において終結する、一連の重複するＥＧＦＲ  ｃ−ｍｙｃタグ付きドエクトドメイン断片をＰＣＲによって作製した。配列決定に続き、その断片を、哺乳動物発現ベクターｐＳＧＨＶＯから発現されるヒト成長ホルモン（ＧＨ）遺伝子の３’末端にインフレームでクローニングした（３０）。残基２７８−２８６および残基２８５−２９３にわたる二本鎖オリゴヌクレオチドを、ＧＨおよびｃ−ｍｙｃタグの間にて同一ベクターにインフレームでクローニングした。
【０２１１】
（トランスフェクション）
ヒト２９３Ｔ胚性腎臓線維芽細胞を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）＋１０％胎児ウシ血清（ＦＣＳ）中に維持した。トランスフェクションの前日、細胞を、２ｍＬの培地を入れた６−ウェル組織培養プレート中にウェル当たり８×１０５にて播種した。製造業者の指示に従い、細胞に、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と複合体化させた３−４μｇのプラスミドＤＮＡをトランスフェクトした。トランスフェクションから２４時間−４８時間後、細胞培養を吸引し、細胞単層を２５０μｌの溶解緩衝液（１％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００、１０％グリセロール、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、１ｍＭ  ＥＧＴＡおよび完全プロテアーゼ阻害剤ミックス（Ｒｏｃｈｅ））に溶解させた。
【０２１２】
ＣＲ１−ループ（二量体化アーム）欠失は、アミノ酸２４４−２５９を除去し、それらを記載されるように単一のアラニン残基で置き換えることによって作製した。２９３Ｔ細胞にこの構築物をトランスフェクトし、ゲネティシンの存在下で安定なトランスフェクタントを選択した。
【０２１３】
（ウェスタンブロッティング）
細胞溶解物（１０−１５μＬ）のアリコートを、１．５％β−メルカプトエタノールを含有するＳＤＳ試料緩衝液と混合し、１００℃にて５分間加熱することによって変性し、１０％ＮｕＰＡＧＥ  ビス−トリスポリアクリルアミドゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で電気泳動した。次いで、試料をニトロセルロース膜に電気移動させ、これをＴＢＳＴ緩衝液（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）中で濯ぎ、２．５％スキムミルクを含有するＴＢＳＴ中で室温にて３０分間ブロックした。膜をブロッキング緩衝液中の０．５μｇ／ｍＬのｍＡｂ  ８０６と共に４℃にて一晩インキュベートした。平行膜をｍＡｂ  ９Ｂ１１（１：５０００，Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）で一晩プローブして、ｃ−ｍｙｃエピトープを検出した。フィルターをＴＢＳＴ中で洗浄し、１：５０００希釈のホースラディッシュペルオキシダーゼ結合体化ウサギ抗マウス免疫グロブリン（Ｂｉｏｒａｄ）を含有するブロッキング緩衝液中で室温にて２時間インキュベートした。次いで、ブロットをＴＢＳＴ中で洗浄し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｐｉｅｒｃｅ）とのインキュベーションに続いてオートラジオグラフィーフィルムを用いて現像した。ペプチド競合実験では、１００倍モル過剰の競合ペプチドの存在下で、ブロットをＭａｂ  ８０６で室温にて１時間プローブした。化学発光の検出に続いて、ブロットを９Ｂ１１で再度プローブした。
【０２１４】
（ＥＧＦＲ断片の酵母表面ディスプレイ）
ＥＧＦＲ断片をコードする適当な遺伝子を含有するように修飾されたｐＣＴ酵母ディスプレイプラスミドを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ａｐｐａｒａｔｕｓを用いるエレクトロポレーション（３３）によって酵母株ＥＢＹ１００（３２）に形質転換した。プラスミドは、ＤＮＡをそれらのゲノムに組み込んだ酵母につき選択するのに用いることができるｔｒｐ＋マーカーを含有する。酵母細胞表面でのＥＧＦＲタンパク質の発現は、従前に記載されているように行った（ＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ，２０００）。簡単に述べれば、形質転換されたコロニーを、酵母窒素塩基、カザミノ酸、デキストロース、およびリン酸化緩衝液ｐＨ７．４を含有する最小培地中で、５〜６のＯＤ６００に到達するまで、ほぼ１日間の振盪プラットフォームにて３０℃で増殖させた。次いで、ガラクトースを含有する最小培地へ移すことによって、酵母細胞をタンパク質ディスプレイにつき誘導し、振盪しつつ、３０℃にて２４時間インキュベートした。次いで、分析まで培養を４℃にて保存した。
【０２１５】
（酵母細胞表面での抗体標識実験）
ｃ−ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０を含有する生腹水液はＣｏｖａｎｃｅ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）から入手した。１×１０６個の酵母細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で洗浄し、抗ｃ−ｍｙｃ腹水液（１：５０希釈）、または５０μｌの最終容量中のヒトＥＧＦＲモノクローナル抗体（１０μｇ／ｍＬ）と共に４℃にて１時間インキュベートした。次いで、細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、光から保護された、５０μｌの最終容量中にてフィコエリスリン標識抗マウスＩｇＧ（１：２５希釈）と共に４℃にて１時間インキュベートした。酵母細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）で蛍光データを得、ＷｉｎＭＤＩサイトメトリーソフトウェア（Ｊ．  Ｔｒｏｔｔｅｒ，Ｓｃｒｉｐｐｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）で分析した。直線状エピトープ  対  立体配座エピトープの測定では、酵母細胞を８０℃にて３０分間加熱し、次いで、２０分間氷上で冷却し、その後抗体での標識した。
【０２１６】
（ＥＧＦＲ由来ペプチド）
推定ｍＡｂ  ８０６エピトープを含有するペプチド（２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ３０２（配列番号：１）、２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫ３０１（配列番号：２）および２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧ２９８（配列番号：１５））を、標準Ｆｍｏｃ化学を用いて合成し、マススペクトル分析によって確認した。アルカリ性条件での希薄ペプチド溶液の一晩の空気酸化によって環化ペプチドを調製した。線状（還元された）ペプチドは、合成ペプチドを１０ｍＭ塩酸に溶解させることによって調製した。２８７〜３０２ペプチドの試料を嫌気性下で７０％ギ酸中の臭化シアンと反応させて、Ｎ末端ペプチドおよびＣ末端ペプチドに対応する断片を生じさせた。０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の存在下で、アセトニトリルグラジエントを用い、ペプチドをＣ１８  ＶｙｄａｃカラムでのＨＰＬＣによって分離した。ペプチドの確実性は、引き続いて、マススペクトロメトリーおよびＮ末端配列決定によって特徴付けた。このペプチドを０．５Ｍ炭酸水素ナトリウムｐＨ８．６と反応させ、続いて、ヨードアセトアミドを添加することによって、Ｓ−カルボキシメチル化ペプチド（ＳＣＭ−ペプチド）の試料を生じさせた。ＳＣＭ−ペプチドを、引き続いて、前記したように、ＲＰ−ＨＰＬＣによって精製した。
【０２１７】
（ＥＬＩＳＡアッセイ）
白色ポリスチレン９６−ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｌｕｍｉｔｒａｃ  ６００）のウェルを、１０ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐＨ５．９）中、ヒトＦｃ定常領域と融合した変異型ｓＥＧＦＲ５０１である、５０１−Ｆｃ（Ｔ．Ａｄａｍｓ，未発表結果）の２μｇ／ｍｌでコーティングし、次いで、ＴＢＳ中の０．５％ニワトリオボアルブミンでブロックした。ＴＢＳＴでの洗浄の後、０．５μｇ／ｍＬのｍＡｂ８０６および種々の濃度のペプチド溶液（１００μｌ／ウェル）をウェルに加えた。プレートに結合したｍＡｂ８０６を、ヤギ抗マウス免疫グロブリン−ＨＲＰ（ＢｉｏＲａｄ）およびＷｅｓｔｅｒｎ  Ｐｉｃｏ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｃｅｎｔ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  （Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて検出し、Ｗａｌｌａｃ  Ｖｉｃｔｏｒ  １４２０カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて定量した。いくつかのアッセイにおいては、１−５０１  ＥＧＦＲで９６ウェルプレートをコーティングし、これを用いて、ｍＡｂ  ８０６の結合を従前に記載されているように分析した（Ｊｏｈｎｓら、Ｉｎｔｌ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９８：３９８−４０８，２００２）。
【０２１８】
（表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ））
ＢＩＡｃｏｒｅ３０００を全ての実験で用いた。ｍＡｂ８０６の推定エピトープを含有するペプチドを、５μｌ／分の流速にて、アミンカップリングまたはチオール−ジスルフィド交換カップリングを用いて、ＣＭ５センサーチップに固定化した（３４）。この８０６抗体を２５℃にて５μｌ／分の流速でセンサー表面上を通過させた。実行の間、１０μｌ／分の流速で１０ｍＭ  ＨＣｌを注入することによって、そのセンサー表面を調製した。
【０２１９】
（フローサイトメトリー分析）
異なるＥＧＦＲ構築物を発現する培養した２９３細胞を、ｍＡｂ５２８およびｍＡｂ８０６を用いてＥＧＦＲ発現について分析した。１％ＨＳＡを含有するＰＢＳ中、１×１０６細胞を５μｇ／ｍｌの一次抗体と共に４℃にて３０分間インキュベートした。ＰＢＳ／１％ＨＳＡで洗浄した後、ＦＩＴＣ−結合化ヤギ抗マウス抗体と共に、細胞をさらに４℃にて３０分間インキュベートした（１：１００希釈；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）。次いで、最小５，０００事象を観察することによって、Ｅｐｉｃｓ  Ｅｌｉｔｅ  ＥＳＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｈｉａｌｅａｈ、ＦＬ）で細胞を観察し、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）用のＥＸＰＯ（バージョン２）を用いて分析した。
【０２２０】
（結果）
（ＥＧＦＲ断片のイムノブロッティングによるｍＡｂ  ８０６エピトープの同定）
ｍＡｂ  ８０６エピトープの広範な位置を決定するために、１−５１３のｃ−ｍｙｃタグ付きＥＧＦＲ断片および３１０−５０１のｃ−ｍｙｃタグ付きＥＧＦＲ断片をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてｍＡｂ  ８０６を用いてイムノブロットした。ｍＡｂ  ８０６は１−５１３断片と強い反応性を示したが、この抗体はＥＧＦＲの３１０−５０１セグメントには全く結合しなかった（図１、左側パネル）。３１０−５０１断片は膜上に存在した。というのは、この断片は、ｃ−ｍｙｃタグに対して特異的なｍＡｂ  ９Ｂ１１を用いて検出できたからである（図１、右側パネル）。他の実験において、本発明者らは、ｍＡｂ  ８０６もまたウェスタンブロットにおいてｓＥＧＦＲ５０１断片に結合することを確立した（データは示さず）。ｍＡｂ  ８０６は、アミノ酸６−２７３が欠失されたｄｅ２−７  ＥＧＦＲ（２７）に結合すると仮定し、本発明者らは、ｍＡｂ  ８０６エピトープが残基２７４−３１０または残基５１０−５１３内に含まれるはずであると結論した。ｍＡｂ  ８０６のエピトープを表わすため、本発明者らは、全てアミノ酸５０１で終結する、一連のｃ−ｍｙｃタグ付きＥＧＦＲ断片を発現させた。ｍＡｂ  ８０６は２７４−５０１ＥＧＦＲ断片および２８２−５０１のＥＧＦＲ断片の両方と反応したが、アミノ酸２９０またはアミノ酸２９８において開始するセグメントには結合しなかった（図１、左側パネル）。全てのＥＧＦＲ構築物の存在を、ｃ−ｍｙｃ抗体を用いて確認した（図１、右側パネル）。従って、ｍＡｂ  ８０６エピトープはアミノ酸２８２−３１０内に含まれるはずである。さらに、エピトープはアミノ酸２９０を超えて延びることができるだろうが、２８２−２９０の領域は、この特定のイムノブロッティングアッセイにおいてｍＡｂ  ８０６反応性に対して決定的なアミノ酸残基のいくつかを含有するはずである。
【０２２１】
（酵母表面上でＥＧＦＲ断片の提示によるｍＡｂ  ８０６エピトープの同定）
本発明者らは、第二の独立したアプローチを用いて、ｍＡｂ  ８０６エピトープを決定した。ＥＧＦＲの異なるドメインを含む断片を酵母の表面で発現させ、ＦＡＣＳによってｍＡｂ  ８０６結合についてテストした。ｍＡｂ  ８０６は酵母の表面で発現された１−６２１および１−５０１断片を共に認識した（図２Ａ）。ｍＡｂ  ８０６は、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲの細胞外ドメインに対応する２７３−６２１  ＥＧＦＲ断片にも結合した（図２Ａ）。対照的に、ｍＡｂ  ８０６は２９４−５４３ＥＧＦＲ断片または４７５−６２１ＥＧＦＲ断片を認識することができ（図２Ａ）、これは、ｍＡｂ  ８０６エピトープの少なくともいくつかがアミノ酸２７４−２９４の間の領域内に含まれるはずであることを明瞭に示す（比較；上記で同定したアミノ酸２８２−２９０）。これらの２つの全く異なるアプローチがｍＡｂ  ８０６結合に対して重要である同一の領域を同定すると、本発明者らは、ＥＧＦＲのこのセクションがｍＡｂ  ８０６エピトープのエネルギー的に重要な部分を含有するはずであると確信した。興味深いことには、１−５０１エピトープの８０℃における熱変性はｍＡｂ  ８０６結合に対して効果を有さず、このことは、該エピトープが立体配座的というよりはむしろ直線状であることを示唆する（図２Ｂ）。この結果は、一旦受容体がＳＤＳ−ＰＡＧＥによって変性されるとｍＡｂ  ８０６が「ｐａｎ」ＥＧＦＲ抗体となることを示す本発明者らのデータと完全に一致する（２７）。
【０２２２】
（推定エピトープを含有するＥＧＦＲペプチドへのｍＡｂ  ８０６の結合）
ｍＡｂ  ８０６推定エピトープを含む可能性のあるシステインループに対応するペプチド（２８７ＣＧＡＤＳＹＥＭＥＥＤＧＶＲＫＣ３０２）を合成した。このペプチドは、イムノブロットにおいて、１−５０１  ＥＧＦＲ断片および２７４−５０１  ＥＧＦＲ断片へのｍＡｂ  ８０６の結合を阻害できた（図３Ａ、上側パネル）。イムノブロットの双方の部分でのＥＧＦＲ断片の存在は、ストリッピング、および抗ｍｙｃでの再プロービングによって確認した（図３Ａ、下側パネル）。溶液中の２８７−３０２  ＥＧＦＲペプチドもまた、ＥＬＩＳＡフォーマットを用いて、固定された１−５０１断片へのｍＡｂ  ８０６の結合を阻害することができた（図３Ｂ）。興味深いことには、より短いペプチド（アミノ酸２８７−２９８）は、テストした濃度においてはｍＡｂ  ８０６の結合を阻害しなかった（図３Ｂ）。従って、ｍＡｂ  ８０６エピトープは、ＥＧＦＲにおいてジスルフィドにより拘束されるループを形成する残基２８７−３０２の中に含まれるようである。
【０２２３】
また、本発明者らは、２８７−３０２  ＥＧＦＲペプチドが、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合した１−５０１  ＥＧＦＲ断片の二量体バージョンである固定された５０１−ＦｃへのｍＡｂ  ８０６の結合を阻害する能力をテストした。酸化され、還元されおよびエージングされた（すなわち、中程度に凝集された）ペプチドは、全て、用量依存的にｍＡｂ  ８０６が５０１−Ｆｃに結合するのを阻害した（図４Ａ）。還元されたシステイン残基およびＳ−カルボキシメチル化されたシステイン残基を含有するペプチドは、ｍＡｂ  ８０６の結合を阻害できず、これは、１または双方のシステイン残基がｍＡｂ  ８０６エピトープに寄与することを示す（図４Ｂ）。臭化シアン切断によって生じたＮ末端（ＣＧＡＤＳＹＥＭ）（配列番号：１６）ペプチド断片またはＣ末端（ＥＥＧＶＲＫＣ）（配列番号：１７）ペプチド断片は、ｍＡｂ  ８０６結合を阻害できず（図４Ｂ）、このことは、このエピトープが内側メチオニン残基にまたがることを示唆する。このデータは、ｍＡｂ  ８０６エピトープがＥＧＦＲ由来ペプチド２８７−３０２内に含まれるというさらなる確信を提供した。
【０２２４】
２８７−３０２  ＥＧＦＲペプチドを、末端システイン残基におけるチオール−ジスルフィド交換カップリングによってＣＭ５センサーチップにカップリングさせ、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡｃｏｒｅ）によってｍＡｂ  ８０６結合を分析した。ｍＡｂ  ８０６は、３０ｎＭの見掛けの親和性（図５Ａ）でもって用量依存的に（図５Ａ）固定化されたペプチドに結合し、これは、生きた細胞でのＳｃａｔｃｈａｒｄ分析を用いて得られた親和性と合致する（２７）。ブランクチャネル、システイン−ブロックドチャネルまたは無関係なペプチドに対するＭａｂ  ８０６の結合は、全て、２８７−３０２  ＥＧＦＲペプチドへの結合の１％未満であった（データは示さず）。このペプチドに対するｍＡｂ  ８０６の親和性はｄｅ２−７  ＥＧＦＲに対して示された親和性と同様であるため、このペプチドは、エピトープに寄与する主な決定基を全て含有するようである。このペプチドはチオール−カップリングを用いて固定化され、これにより分子内ジスルフィド結合を形成することができないため、この観察は、さらに、上記ループがｍＡｂ  ８０６結合のために環化される必要のないことを示す。また、本発明者らは、アミンカップリングを介して２８７−３０２  ＥＧＦＲペプチドを固定化し、ｍＡｂ  ８０６が依然として結合したことを示した（図５Ｂ）。
【０２２５】
次いで、本発明者らは、溶液中のいくつかのＥＧＦＲペプチドが、固定化された２８７−３０２  ＥＧＦＲペプチドへのｍＡｂ  ８０６の結合をブロックする能力をテストした。予測されるように、可溶性２８７−３０２  ＥＧＦＲペプチドは用量依存的にｍＡｂ  ８０６結合を阻害した（図５Ｂ、上側パネル）。本発明者らのＥＬＩＳＡデータ（図３Ｂ）と合致して、２８７−２９８  ＥＧＦＲペプチドは、大過剰で用いた場合でさえ、ｍＡｂ  ８０６の結合を妨げることができなかった（図５Ｂ、中央パネル）。Ｃ３０２（すなわち、アミノ酸２８７−３０１）を単純に欠失するさらなるペプチドは、用量依存的にｍＡｂ  ８０６結合を弱くにしか阻害できなかった（図５Ｂ、下側パネル）。これらの観察は、アミノ酸残基Ｃ３０２が高親和性のｍＡｂ  ８０６結合に対して必要であることを確認する。
【０２２６】
（ｍＡｂ  ８０６エピトープの構造分析およびＥＧＦＲ活性化に対するその関係）
いくつかの最近の結晶学的研究は、ＥＧＦＲ細胞外ドメインの構造を記載している。従って、本発明者らは、その構造位置についてｍＡｂ  ８０６エピトープを分析して、このことがそのエピトープのユニークな特異性を説明するのを助けることができるかどうかを判断した。ｍＡｂ  ８０６エピトープを含有するシステインループ（図６Ａ）は、システインリッチなＣＲ１ドメインのＣ末端部分に位置する（図６Ｂ、マゼンタ）。興味深いことには、ＥＧＦＲのこの領域は、構造中で特徴付けに最も乏しい領域の１つであり、相当な度合いの柔軟性を示唆する。２８７−３０２  ＥＧＦＲループのかなりの部分がＥＧＦＲ内に埋もれているが、２つの領域はより露出され、抗体によって潜在的に接近可能である。これらの第一のものはＤ２９０を中心とし（図６Ｃ、左側面図においてマゼンタで強調）、これらの第二のものはＤ２９７に焦点を当て、これは、当該分子が１８０°回転した場合に観察できる（図６Ｃ、右側面図においてはマジェンタで強調）。
【０２２７】
図６Ｃに描かれたＥＧＦＲの連結された（ｔｅｔｈｅｒｅｄ）形態は、レセプターの不活性な立体配座である。この状態において、ＥＧＦＲ  ＣＲ２ドメインは、二量体化アーム（ＣＲ１ドメイン内に含まれる小さなループ）が、他のＥＧＦＲ分子の二量体化アームと相互作用するのを妨げるように、ＣＲ１ドメインと相互作用する。ＥＧＦＲの非連結（ｕｎｔｅｔｈｅｒｉｎｇ）は受容体の延びた形態へと導き、そこでは、二量体化アームが暴露され（図６Ｄ、左側パネル）、受容体の二量体化が起こるのを可能とする（図６Ｂ）。本発明者らの現在の理解は、細胞表面での平衡状態の場合、ＥＧＦＲの９５％が連結された立体配座にあることを示唆する（３７）。残りのＥＧＦＲは活性なダイマーまたは延びた連結されない立体配座である。リガンドの添加は、この受容体のより多くをダイマー形態に駆動するであろう（図６Ｂ）。
【０２２８】
可能性のあるｍＡｂ  ８０６結合部位に関して、受容体の連結された形態においてのみ接近可能な残基は、Ｄ２９７を中心とするものである。しかしながら、受容体を過剰発現する細胞株において、ｍＡｂ  ８０６がＥＧＦＲの５〜１０％にのみ結合するとすれば、ｍＡｂ  ８０６は、細胞表面のＥＧＦＲの９５％を形成するＥＧＦＲの連結された形態に結合する可能性が非常に少ない。図６に掲げた構造情報に基づき、ＥＧＦＲの二量体化は、ｍＡｂ  ８０６エピトープ内のいずれのアミノ酸残基もさらに暴露することなく、従って、ｍＡｂ  ８０６結合に対する標的にはならない。抗体のサイズを仮定すれば、Ｄ２９０を中心とする露出されたアミノ酸のいずれも、連結された立体配座にもダイマー立体配座にもいずれにおいても、ｍＡｂ  ８０６に対して接近可能ではない。ＥＧＦＲは連結された立体配座から活性なダイマー状態に移動する場合、そのＥＧＦＲは遷移中の延びた状態を経過しなければならない。ＥＧＦＲのこの遷移形態（図６Ｄ）はモノマーであるか、あるいは恐らくは不活性なダイマーであり得、細胞表面では比較的稀であり、ｍＡｂ  ｍ８０６結合のレベルと合致する。重要なことには、受容体のこの遷移形態においては、Ｄ２９０の周りの残基ならびに多数の通常は埋もれたアミノ酸（例えば、Ｙ２９２およびＭ２９４）は抗体の結合に対して接近可能であろう。空間的に考慮すると、Ｄ２９０近くの領域へのｍＡｂ  ８０６の結合は、システインループの外側のアミノ酸との相互作用を必要とすることが強く示され、ｍＡｂ  ８０６エピトープ全体がシステインループ内に含まれることを示唆する本発明者らの親和性のデータと恐らくは合致しない。本発明者らが結合領域としてＤ２９０を除外する場合、エピトープはＤ２９７を含むようにさらに拡大できるが、ｍＡｂ  ８０６はＹ２９２／Ｍ２９４の周りの領域と相互作用しなければならない。一緒に併わせると、唯一の合致する結論は、ＥＧＦＲが二量体化を受ける前に、ｍＡｂ  ８０６はＥＧＦＲの延びた形態においてのみ露出されるアミノ酸に結合することである。
【０２２９】
（構成的に未連結にされた形態のＥＧＦＲへのｍＡｂ  ８０６の結合）
ｍＡｂ  ８０６が非二量体化／未連結にされたＥＧＦＲに優先的に結合するのを確認するために、本発明者らは、２９３細胞においてＣＲ１二量体化アームを欠失する（ｄｅＣＲ１−ループ）ＥＧＦＲの突然変異を安定に発現させた（３１）。この領域は、活性なＥＧＦＲダイマーを形成するにおけるその役割のため、およびＣＲ１二量体化アームが連結に関連するＣＲ１：ＣＲ２相互作用に総体的に関与するので、選択された。従って、ｄｅＣＲ１は、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲのように、構成的に未連結であるべきである。親２９３細胞は、ＦＡＣＳによるｍＡｂ  ５２８の結合によって明らかなように、低レベルの野生型ＥＧＦＲ（ほぼ１×１０４ＥＧＦＲ／細胞）を発現する（図７）。予測されるように、ｍＡｂ  ８０６はこれらの細胞で発現された内因性ＥＧＦＲに結合しない。ｄｅ２−７  ＥＧＦＲは、ｄｅＣＲ１−ループのように、連結できなかったはずであり、かつ二量体化を減少したはずである。２９３細胞のｄｅ２−７  ＥＧＦＲでのトランスフェクションは、他の細胞株において従前に示されたように、ｍＡｂ  ８０６の強力な結合を導いた（図７）。高度に立体配座依存性のｍＡｂ  ５２８がｄｅＣＲ１−ループＥＧＦＲに結合することにより、その立体配座への全体の変化がないことを確認する（図７）。実際に、本発明者らは、ｄｅＣＲ１−ループＥＧＦＲがリガンドに結合できることを先に示しており、これは、さらに、その全体的構造が無傷なままであるという考えを支持する（３１）。２つの独立したｄｅＣＲ１−ループＥＧＦＲを発現するクローンのフローサイトメトリー分析は、ｍＡｂ  ８０６の結合を明瞭に示した（図７）。従って、本発明者らの仮説と合致して、ｍＡｂ  ８０６は、ＥＧＦＲが活性なダイマーを形成する前に、遷移中の連結されていないＥＧＦＲに結合するようである。ｍＡｂ  ８０６はまた、連結に対して能力を下げられたＥＧＦＲ点突然変異体への結合の増大を示す（以下の実施例２参照）。
【０２３０】
（考察）
ｄｅ２−７  ＥＧＦＲを発現するマウス線維芽細胞を用いた免疫化に続いて、ｍＡｂ  ８０６を作製し、そしてｄｅ２−７  ＥＧＦＲに対する高い反応性、および野生型ＥＧＦＲに対する無視できる活性について、混合したヘム吸着アッセイによって選択した（２１）。さらなる特徴付けにより、ｍＡｂ  ８０６は、野生型ＥＧＦＲが過剰発現された場合、特に、ＥＧＦＲ遺伝子が増幅されたが、正常な組織はそうでなかった場合の細胞株および神経膠腫検体を認識できたことが、すぐに明らかとされた（２１）。最近、本発明者らは、ｍＡｂ  ８０６が、小胞体内に位置するｄｅ２−７  ＥＧＦＲおよび野生型ＥＧＦＲ双方の高マンノース形態に優先的に結合することを示した。さらに、本発明者らは、高マンノース型ｗｔ  ＥＧＦＲのいくつかが、細胞が受容体を過剰発現する場合に、細胞表面に誤って向けられることを示した。しかしながら、この仕事は、ｍＡｂ  ８０６エピトープを同定せず、またｍＡｂ  ８０６によって媒介される強力な抗腫瘍活性を適切に説明もしなかった。２つの独立した方法を用い、本発明者らは、ｍＡｂ  ８０６  エピトープを含有するシステインループ（アミノ酸２８７−３０２）を同定した。残基２８７−３０２を含む合成ペプチドに対するｍＡｂ  ８０６の親和性は、本発明者らが、ｄｅ２−７  ＥＧＦＲ発現細胞株を用いたＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって従前に測定した親和性と同様であるので（２７）、本発明者らは、それが完全なエピトープ配列を含むと確信する。明らかに、該ペプチドは、抗体結合のためのジスルフィド結合したループ内で限定される必要はない。というのは、ｍＡｂ  ８０６は溶液中の還元されたペプチド、チオール不動化ペプチドを認識し、そしてＣ３０２が欠失した可溶性ペプチドに弱く結合したためである。
【０２３１】
免疫沈澱およびＳｃａｔｃｈａｒｄ分析は共に、ｍＡｂ  ８０６が、ＥＧＦＲ遺伝子の増幅のため受容体を過剰発現する細胞株である、Ａ４３１細胞（２７）の表面に発現された野生型ＥＧＦＲの５−１０％の間を認識することを示した。低い割合の受容体に結合するにもかかわらず、ｍＡｂ  ８０６はヌードマウスで増殖させたＡ４３１異種移植片に対して強力な抗腫瘍活性を呈する（２２，２３）。ｍＡｂ  ８０６は非連結の（ｕｎｔｅｔｈｅｒ）ＥＧＦＲに優先的に結合するという本発明者らの観察が、この抗腫瘍活性についての可能性あるメカニズムを示唆する。ＥＧＦＲ分子が非連結にされる場合、このＥＧＦＲ分子は不活性な連結された状態と活性なダイマーとの間の遷移状態に入る（３７）。ｍＡｂ  ８０６によって結合されるのは、ＥＧＦＲのこの遷移中の非連結の形態である。次いで、ｍＡｂ  ８０６の結合は、シグナル伝達可能なＥＧＦＲダイマーの形成を妨げる（図８）。従って、所定のいずれの場合であっても、ｍＡｂ  ８０６はＥＧＦＲの小さなパーセンテージに結合するに過ぎないが、延長された時間にわたって、それは、ＥＧＦＲシグナル伝達の実質的な割合を阻害し得、これは次いでインビボで抗腫瘍効果を生じる。ｍＡｂ  ８０６が結合したＥＧＦＲの運命は未知であるが、本発明者らは、従前に、ｍＡｂ  ８０６／ｄｅ２−７  ＥＧＦＲ複合体が内部に移行されることを示している（２７）。あるいは、ＥＧＦＲに特異的な低分子量チロシンキナーゼ阻害剤を用いた細胞の処理に続く場合、ｍＡｂ  ８０６／ＥＧＦＲは不活性な形態で表面上に捕獲されたままであろう（２８，３８）。野生型ＥＧＦＲとは対照的に、ｍＡｂ  ８０６は、ＤＨ８．３（突然変異体受容体に対して特異的な抗体）と比較した場合、細胞表面に発現されるｄｅ２−７  ＥＧＦＲ分子のほぼ半分を認識する（２７）。ｄｅ２−７  ＥＧＦＲに対する、ｍＡｂ  ８０６の増大した反応性は、この突然変異体受容体がＣＲ１二量体化ループを欠き、従って、連結された立体配座を取ることができないという事実と合致する。
【０２３２】
ｍＡｂ  ８０６が正常であるが比較的低量のＥＧＦＲの遷移中の立体配座を認識するならば、なぜ、それは「平均」レベルのＥＧＦＲを発現する正常組織または細胞株に結合しないのであろうか。この観察は、ヨウ素化ｍＡｂ  ８０６が１×１０７細胞を含有するＵ８７ＭＧ神経膠腫（１×１０５ＥＧＦＲ／細胞）の細胞ペレットに結合しないことを本発明者らが示した以前の研究（これは、より小さなＡ４３１細胞ペレットに基づいて、低レベルの結合を測定するのに十分に感受性であった）におけるように、検出の感度には関係しないようである。本発明者らは、グリコシル化がｍＡｂ  ８０６の反応性に影響すること、およびｍＡｂ  ８０６が、小胞体内に通常は存在するＥＧＦＲの高マンノース形態を優先的に認識することを、決定した。さらに、ＥＧＦＲを過剰発現する細胞においては、この高マンノース型受容体のいくらかは細胞膜に誤って向けられる。
【０２３３】
ｍＡｂ  ８０６エピトープの配列相同性はＥｒｂＢ３／Ｂ４においては比較的低いにもかかわらず、システインループのサイズおよび位置は保存されている。さらに、完全に保存された２つのアミノ酸残基（Ｅ２９３およびＧ２９８）があり、電荷が保存されるさらに２つのアミノ酸（Ｅ２９５およびＲ３００）がある。最後に、ＥｒｂＢ３（および恐らくはＥｒｂＢ４）の全体的構造は、連結された立体配座をとる点でＥＧＦＲの全体構造と非常に似ており、この連結された構造は、恐らくは活性化の間に非連結にされる（４１）。併わせると、このことは、ＥｒｂＢ３／Ｂ４における同等なシステインループに標的化された抗体が、ｍＡｂ  ８０６と同様な特性（すなわち、腫瘍に限定される特異性および受容体活性化をブロックする能力）を有することを示唆する。より広義には、本発明者らのデータは、増殖因子受容体の遷移形態に対する抗体の作製は、正常な組織の標的化を低下させるが依然として抗シグナル伝達活性を保有する、新規な方法を表す。従って、活性な（リガンドが結合した）受容体の構造と、それらの不活性な対照物の構造との間の比較は、受容体の立体配座の変化の間に、一時的に露出されるアミノ酸を同定するはずである。最後に、ｍＡｂ  ８０６は、ＥＧＦＲの構成的に活性な突然変異を発現する細胞を用いて免疫し、そしてこの突然変異した受容体に対して特異的な抗体について選択することによって、作製された。従って、構成的に活性な受容体を用いた免疫化は、受容体の遷移形態を認識する抗体を同定する可能性を増大させる、一般化されたストラテジーを提供し得る。
【０２３４】
（参考文献）
【化２４】
2008501308.tif 000019
【０２３５】
【化２５】
2008501308.tif 000020
【０２３６】
【化２６】
2008501308.tif 000021
【０２３７】
【化２７】
2008501308.tif 000022
（実施例２）
（細胞表面の上皮増殖因子受容体の機能におけるＣＲ１／ＣＲ２ドメイン相互作用の分析）
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）の単離された細胞外ドメインについての最近の結晶学的データは、リガンドによるその活性化についてのモデルを提案した。本発明者らは、受容体活性化の調節に決定的であると考えられている細胞外ドメインの２つの領域（ＣＲ１およびＣＲ２）へ突然変異を導入することによって、細胞表面に提示される全長ＥＧＦＲに関して、このモデルをテストした。ＣＲ１およびＣＲ２ドメインにおける突然変異は、リガンド結合親和性、受容体二量体化、チロシンキナーゼ活性化およびシグナル伝達能力に対して拮抗作用を有する。Ｔｙｒ２４６はＣＲ１ループにおける決定的な残基であり、これは、リガンド結合後における受容体ダイマー接合面の位置決定および安定化に関係し：Ｔｙｒ２４６の突然変異は受容体の機能を損なうか、または廃止する。連結された状態に受容体を制限する相互作用を弱めるＣＲ２における突然変異は、リガンドに対する親和性を増大させることによって、ＥＧＦに対する応答性を増強させる。しかしながら、ＣＲ１／ＣＲ２相互作用の弱めた結果、受容体のキナーゼの自然発生的な活性化を生じない。本発明者らは、負に抑制された連結された状態と、十分に活性な背中合わせの（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ）ダイマー立体配座との間のＥＧＦ受容体の遷移状態を認識する、抗体（ｍＡｂ８０６）を用いて、リガンド結合後の野生型ＥＧＦ受容体および突然変異ＥＧＦ受容体における立体配座変化を追跡する。本発明者らの結果は、細胞表面上のＥＧＦＲは非連結にされ得るが、この形態は不活性であることを示唆し；従って、受容体の非連結にされることは活性化のためには十分ではなく、そしてリガンド結合は、キナーゼ活性化を達成するための２つのサブユニットの正しい位置決定のために必須である。
【０２３８】
（緒言）
過去２０年以上にわたり、ＥＧＦ受容体は、受容体関連細胞内チロシンキナーゼのリガンド活性化を研究するための重要な機会を提供してきた（１−３）。最近、いくつかのＥＧＦ受容体ファミリーメンバー（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ−２およびＥｒｂＢ−３）についての細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の三次元構造が報告されている（４−９）。これらの構造は、ＥＧＦ受容体ＥＣＤについての２つの有意に異なる立体配座を明らかとした（４；５；９）。ＴＧＦ−αと複合体化したＥＧＦＲの可溶性切断型ＥＣＤの結晶構造（４）またはＥＧＦと複合体化したＥＧＦＲの可溶性切断型ＥＣＤの結晶構造（５）において、リガンドはＬ１ドメインとＬ２ドメイン（リガンド結合ドメイン）との間でサンドイッチとなっており、ＥＣＤは、２つのインターロックされたＣＲ１（システインリッチ）ドメインを主に介して、背中合わせのダイマーを形成し；対照的に、ＥＧＦとの複合体における自動阻害型ＥＧＦＲの結晶構造においては、リガンドはＬ１ドメインに結合しているに過ぎず、ダイマーは存在せず、そしてモノマー受容体の主な分子内相互作用はＣＲ１ループおよびＣＲ２ドメインの間で起こる（９）。この構造においては、Ｌ１とＬ２との間の距離が１分子のＥＧＦへの同時結合を可能とするには大き過ぎるのみならず、またＬ２がＬ１に結合したＥＧＦから離れて回転されてもいる。従って、２つの決定的特徴は、非連結の形態（ダイマーの不存在、および高親和性でリガンドに結合する能力無し）のＥＧＦ受容体のＥＣＤから、自動阻害された（連結された）形態を区別する。興味深いことには、切断されたＥｒｂＢ−２  ＥＣＤの立体配座（８）および全長ＥｒｂＢ−２  ＥＣＤの立体配座（７）は、背中合わせのＥＧＦＲダイマーと似ており（４）、他方、リガンドの不存在におけるＥｒｂＢ−３  ＥＣＤ（６）は、連結されたＥＧＦＲ−ＥＣＤ（９）と同様の立体配座を有する。
【０２３９】
全長細胞ＥＧＦＲについての業績は、ＥＧＦＲ二量体化、高親和性結合および受容体キナーゼ活性化の間で強力な連携を確立しており；他方、単離されたＥＣＤの結晶構造は、キナーゼおよびＥＧＦＲの膜貫通ドメインもまた二量体化に寄与する細胞環境における、これらの観察の理解のための改善されたフレームワークを提供する（すなわち、リガンドはより高い親和性で受容体の「非連結の」形態に結合し、これによって、モノマーの自動阻害された受容体から離れるように平衡をシフトさせて、活性なダイマーの形成（９）を支持する）。事実、細胞表面ダイマー（またはオリゴマー）はリガンドの不在下で検出され得るが、連結されていないダイマーはチロシンキナーゼ活性を有しない（１０−１６）。従って、全長の細胞表面ＥＧＦ受容体において、リガンドの結合は二量体化を駆動するためのみならず、キナーゼ活性立体配座の形成のために必要である。
【０２４０】
断片またはさらに全長ＥＧＦ受容体のＥＣＤの構造およびリガンド結合特性は、細胞表面に提示された受容体からのシグナル伝達の複雑性を解決できない。この報告において、リガンド結合、受容体立体配座変化、受容体オリゴマー化およびキナーゼ活性の調節を決定するプロセスにおける、ＣＲ１−ＣＲ２相互作用の本発明者らの理解を向上させるために、本発明者らは、無処置の哺乳動物（Ｂａｆ／３）細胞において、全長ＥＧＦ受容体突然変異体を発現した（１７；１８）。ＢａＦ／３細胞は内因性ＥＧＦ受容体も、検出可能なレベルのリガンド（これは、組換え（突然変異体）受容体を混乱させ得、そして／または活性化し得る）も発現しない。ＣＲ１ループ突然変異体およびＣＲ２  ＥＧＦＲ突然変異体のアベイラビリティー、ならびに立体配座特異的な抗体ｍＡｂ５２８（１９）およびｍＡｂ８０６（２０−２３）のアベイラビリティーにより、本発明者らが、連結の決定基をプローブするのを可能にし、そしてリガンドが受容体に結合する場合の主要な立体配座の遷移を検出することを可能にした。
【０２４１】
（実験手法）
（試薬）
ＥＧＦＲに対する抗体であるｍＡｂ５２８（１９）およびｍＡｂ８０６（２０；２１）を、ＭｅｌｂｏｕｒｎｅのＬｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  ＲｅｓｅａｒｃｈのＧＭＰ施設において生産し、精製した。抗ｆｌａｇ抗体Ｍ２をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、抗ホスホチロシン（クローン４Ｇ１０）および抗ＥＧＦＲ（ヒツジポリクローナル）は、Ｕｐｓｔａｔｅ（Ｌａｋｅ  Ｐｌａｃｉｄ，ＮＹ）から購入し；抗ホスホｐ４４／ｐ４２  ＭＡＰＫ抗体および抗ＭＡＰＫ抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）から購入した。ＨＲＰ結合化ウサギ抗マウスＩｇおよびＨＲＰ結合化ウサギ抗ヒツジＩｇを、各々、ＢｉｏＲａｄ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）およびＤａｋｏ（Ｆｏｒｔ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，ＣＯ）から得た。Ａｌｅｘａ  ４８８標識化抗マウス免疫グロブリンを、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲから購入した。フェニルアルシンオキシド（ＰＡＯ）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。水溶性ホモ二官能性架橋剤ＢＳ３（スペーサーアーム長：１１．４Å）およびＳｕｌｐｈｏ−ＥＧＳ（スペーサーアーム長：１６．１Å）をＰｉｅｒｃｅ（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）から得た。
【０２４２】
（ＥＧＦＲ突然変異構築物の作製）
野生型ＥＧＦＲの単一点突然変異を、部位特異的突然変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を用いて作製した。各突然変異誘発のための鋳型は、記載されているように（４）、哺乳動物発現ベクターｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中に、リーダー配列、続いて、ＦＬＡＧタグコード配列を含有するヒトＥＧＦＲ  ｃＤＮＡ（２４）であった。各構築物の自動ヌクレオチド配列決定を行って、各ＥＧＦ受容体突然変異の完全性を確認した。ＥＧＦＲ発現構築物を２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で一過性に発現させ、５２８抗体およびＭ２抗体で染色することによって、受容体タンパク質の存在を測定し、細胞表面における発現を確認し、タンパク質のフォールディングが適切に起こったことを確認した（データは示さず）。
【０２４３】
（ＥＧＦＲ構築物のトランスフェクションおよび安定な細胞株の作製）
従前に記載されているように（２５）、野生型ＥＧＦＲ構築物および突然変異体ＥＧＦＲ構築物をＩＬ−３依存性のネズミ造血細胞株ＢａＦ／３にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞をＧ４１８において１０日間選択した。ｆｌａｇタグに対する抗体（Ｍ２；ＰＢＳ／５％ＦＣＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ中１０μｇ／ｍｌ）、および／またはＥＧＦＲ細胞外ドメインに対する抗体（ｍＡｂ５２８：ＰＢＳ／５％ＦＣＳ／５ｍＭ  ＥＤＴＡ中１０μｇ／ｍｌ）、続いてＡｌｅｘａ４８８標識化抗マウスＩｇ（１：４００最終希釈）を用いた、ＦＡＣＳｔａｒ（Ｂｅｃｋｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）でのＦＡＣＳ分析によって、生細胞をＥＧＦＲ発現についてスクリーニングした。バックグラウンド蛍光を、細胞を無関係でクラスのマッチした一次抗体と共にインキュベートすることによって測定した。陽性プールを、ＦＡＣＳ−ＤＩＶＡ（Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて、適切なレベルのＥＧＦＲ発現に対して区分した。最終的な選択の後、ｍＲＮＡを各細胞株から単離し、そしてＥＧＦＲにおける全ての突然変異をＰＣＲ分析によって確認した。全ての細胞を、ルーチン的に、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ／１０％ＷＥＨＩ３Ｂ馴化培地（２６）および１．５ｍｇ／ｍｌのＧ４１８において、継代した。
【０２４４】
（リガンド結合）
マウス下顎腺（２７）から精製されたネズミＥＧＦを、Ｉｏｄｏｇｅｎ（２８）を用いて５〜８×１０５ｃｐｍ／ピコモルの特定の放射能（ａｃｔｉｖｉｔｙ）までヨウ素化した。コールドの飽和実験によって、内部移行阻害剤のフェニルアルシンオキサイド（ＰＡＯ）（２９）の存在下で、野生型ＥＧＦＲまたは突然変異体ＥＧＦＲを発現する細胞に結合するリガンドを室温で測定した。簡単に述べると、漸増量の未標識ＥＧＦ（２０ｐＭ〜５．１２ｎＭ）の有りまたは無しにて、一定量（３００ｐＭ）の１２５Ｉ  ＥＧＦと共に、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／３０μＭ  ＰＡＯ中で、細胞をインキュベートした。１２５Ｉ−ＥＧＦよりも５００倍過剰の未標識ＥＧＦを用い、非特異的結合を測定した。全ての実験点は三連で調製した。インキュベーションの最後に、細胞をペレット化し、氷冷ＰＢＳ中で２回洗浄し、その後、Ｗａｌｌａｃ  ＷＩＺＡＲＤγ−カウンター（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）での計数のために新鮮なチューブに移した。リガンド結合親和性および受容体の数についてのＳｃａｔｃｈａｒｄプロットおよび見積もりは、Ｒａｄｌｉｇプログラム（ＢｉｏＳｏｆｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｅ，ＵＫ）を用いて得られた。
【０２４５】
（受容体の架橋、チロシンリン酸化、ＭＡＰＫ活性化）
野生型ＥＧＦＲまたは突然変異ＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞を、ＩＬ−３およびＦＣＳを含まない培地中で３時間インキュベートした。細胞を遠心分離によって収集し、ＰＢＳ中で２回洗浄し、ＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）の有りまたは無しにて、室温にてＰＢＳ中で１０分間インキュベートした。架橋実験において、ＰＢＳ処理またはＥＧＦ処理の後に、細胞を１．３ｍＭ  ＢＳ３またはスルホ−ＥＧＳ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）中で室温にて２０分間インキュベートした。細胞を、還元剤（１００ｍＭ  β−メルカプトエタノール）の有りまたは無しにて、細胞をＳＤＳ／ＰＡＧＥ試料緩衝液中で溶解させた。全細胞溶解物を、３〜８％トリス／アセテートゲルまたは４〜１２％ビス／トリス勾配ゲル（Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって直接分析し、そしてＰＶＤＦ膜に移し、その後、抗ホスホチロシン抗体（４Ｇ１０、ＵＢＩ、１：１０００最終希釈）、抗ＥＧＦＲ抗体（ヒツジ抗ＥＧＦＲ、ＵＢＩ、１：１０００の最終希釈）または抗ホスホＭＡＰＫ抗体（１：１０００の最終希釈）、続いて、各々、ＨＲＰ結合化抗マウスＩｇ、ＨＲＰ結合化抗ヒツジＩｇ、またはＨＲＰ結合化抗ウサギＩｇ（全て１：３０００の最終希釈）を用いて免疫検出した。反応性バンドをＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて可視化した。ＥＧＦＲの特異的チロシンリン酸化を測定するために、抗ホスホチロシン抗体でプローブした膜を０．１Ｍグリシンの溶液（ｐＨ２．１）でストリップし、抗ＥＧＦＲまたは抗ホスホＭＡＰＫ抗体で再度プローブした。フィルムをＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ走査デンシトメーター（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で走査し、幅広線ピーク積分（ｗｉｄｅ−ｌｉｎｅ  ｐｅａｋ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）を用いてバンド定量をＩｍａｇｅＱｕａｎｔで行った。
【０２４６】
（ＥＧＦに対するマイトジェニック応答）
対数相において増殖する細胞を収集し、３回洗浄して残存するＩＬ−３を除去した。細胞をＲＰＭＩ  １６４０＋１０％ＦＣＳに再度懸濁し、２００μｌ当たり２×１０４細胞にてＢｉｏｍｅｋ  ２０００（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて９６ウェルプレートに播種し、１０％ＣＯ２中で３７℃にて４時間インキュベートした。ＥＧＦを最初の力価測定点まで加え、９６ウェルプレートにわたって２倍希釈とした二連で力価測定した。コントロールのウェルには、５％（ｖ／ｖ）の最終濃度のＷＥＨＩ−３Ｂ馴化培地を与えた。３Ｈ−チミジン（０．５μＣｉ／ウェル）を加え、プレートを５％ＣＯ２中で３７℃にて２０時間インキュベートし、その後、自動ハーベスター（Ｔｏｍｔｅｃ，Ｃｏｎｎｅｃｔｉｃｕｔ，ＵＳＡ）を用いてニトロセルロースフィルターに収集した。そのマットをマイクロ波で乾燥し、プラスチックの計数バックに入れ、シンチラント（１０ｍＬ）を加えた。β線カウンター（１２０５  Ｂｅｔａｐｌａｔｅ，Ｗａｌｌａｃ，Ｆｉｎｌａｎｄ）を用いて取り込まれた３Ｈ−チミジンを測定した。
【０２４７】
（立体配座特異的抗体との反応性）
抗体染色およびＦＡＣＳ分析に先立って、細胞を抗体、ＥＧＦまたはコントロール培地と共にプレインキュベートした。抗体（ｍＡｂ５２８、ｍＡｂ８０６またはクラス適合性の無関係な抗体、全て１０μｇ／ｍｌ）でのプレインキュベーションは、ＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳ中で３７℃にて３０分〜１６時間の範囲の時間で行った。ＥＧＦ（氷冷ＦＡＣＳ緩衝液中１００ｎｇ／ｍｌ）とのプレインキュベーションを氷上で２０分間行った。プレインキュベーションの後に、細胞を遠心分離によって収集し、コントロール抗体またはテスト抗体（全て、氷上でＦＡＣＳ緩衝液中１０μｇ／ｍｌで２０分間、その後ＦＡＣＳ緩衝液中で洗浄）、続いて、Ａｌｅｘａ４８８−抗マウスＩｇ（１：４００の最終希釈、氷上で２０分）で染色して、一次抗体を検出した。細胞を氷冷ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、遠心分離によって収集し、ＦＡＣＳｃａｎで分析し；ピーク蛍光チャネルおよびメジアン蛍光を、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  ａｎｄ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）での統計学的ツールを用いて各試料につき測定した。バックグラウンド（ネガティブコントロール）蛍光を全ての測定から差し引いた。メジアン蛍光値を最も代表的なピーク形状および蛍光強度として選択し、これを用いて、ｍＡｂ８０６の結合  対  ｍＡｂ５２８の結合の比率を導いた。
【０２４８】
（結果および考察）
この研究の目的は、細胞表面に発現した全長ＥＧＦＲの立体配座の優先度、活性化のメカニズムおよびシグナル伝達能力についてのＣＲ１−ループ／ＣＲ２相互作用の役割を決定することである。本発明者らは、ＣＲ１／ＣＲ１相互作用および／またはＣＲ１／ＣＲ２相互作用を乱すと予測され、その結果、ＥＧＦＲの連結された状態、非連結の状態、不活性状態および／または活性状態の間のバランスを変更すると予測される点突然変異を、ＣＲ１ドメインおよびＣＲ２ドメインに導入した。これらの構築物は、内因性ＥｒｂＢファミリーメンバーを欠いた、造血細胞株であるＢａＦ／３で発現させた。本発明者らは、結合動力学、二量体化、リガンド依存性チロシンリン酸化およびシグナル伝達、ならびにＥＧＦ依存的にＤＮＡ合成を誘導する能力を測定することによって、ＥＧＦＲの機能に対する突然変異の効果を分析した。しかしながら、これらのパラメーターは受容体オリゴマー化、立体配置変化または立体配座変化の間接的尺度であり；したがって、本発明者らは、ＥＧＦＲの「休止」立体配座に対し、かつリガンド誘導性の立体配座変化および立体配置変化のダイナミクスに対する、突然変異の効果を評価するツールとして、２つの立体配座的に特異的な抗ＥＧＦＲ抗体、ｍＡｂ５２８（１９）およびｍＡｂ８０６（２０；２３；３０）の結合も用いた。
【０２４９】
（受容体発現および予備的特徴付け）
６つの点突然変異を詳細に分析した（図９Ａ、９Ｂ参照）：Ｔｙｒ２４６における３つのＣＲ１突然変異（Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＡｓｐ）および３つのＡｓｐ５６３（Ｈｉｓへ）、Ｇｌｕ５７８（Ｃｙｓへ）およびＶａｌ５３８（Ａｓｐへ）におけるＣＲ２置換。ＣＲ１／ＣＲ２相互作用をジスルフィド連結させる試みにおいて、本発明者らは、ＣＲ１およびＣＲ２の各々において置換を持つ突然変異体を調製した（ＣｙｓへのＬｅｕ２４５、およびＣｙｓへのＧｌｕ５７８）。組換えＥＧＦＲを造血細胞株ＢａＦ／３において発現させ、これは、ＥＧＦＲの生化学的特徴付けで理想的である（１８；２５）。トランスフェクションおよびＧ４１８における選択後、抗ｆｌａｇ抗体Ｍ２ならびにモノクローナル抗体５２８（ＥＧＦＲの細胞外ドメインに向けられて、リガンド結合をブロックし（１９）、かつ受容体の天然形態のみを認識すると報告されている）を用いて、受容体発現をモニターした。これらの抗体との反応性に基づいて、全ての突然変異体受容体は正しくフォールディングされ、細胞表面で発現されるようである。多数ラウンドのＦＡＣＳソーティングの後、本発明者らは、同様なレベル（２０〜４０，０００Ｒ／細胞）の突然変異体ＥＧＦＲまたは野生型ＥＧＦＲを発現する細胞系を得た（図１０）。受容体の発現が１００，０００受容体／細胞未満であるのは必須であり：一過性発現実験は、通常、高レベルの細胞表面ＥＧＦＲ（＞１０５／細胞）を生じるが、これらのレベルの発現においては、しばしば、ＥＧＦＲの自然発生的な活性化（すなわち、リガンド非依存性チロシンリン酸化）が存在する。活性化に対する理由は明らかではないが、受容体のオリゴマー化、不正確なプロセッシングまたは誤ったフォールディングのためであろう；本発明者らは、＜５０，０００Ｒ／細胞を発現する細胞株を作製することによって、この複雑性を回避しようとした。
【０２５０】
（ＥＧＦＲ突然変異体によるリガンド結合）
ＥＧＦＲの連結されたＥＣＤの結晶構造（９）および非連結のＥＣＤの結晶構造（４；５）から、２つの形態に対するリガンド親和性はかなり異なるであろうと仮定された。非連結の立体配座においては、リガンドはＬ１ドメインおよびＬ２ドメイン双方と接触を行うことができ、他方、連結された立体配座では、リガンドはＬ１ドメインまたはＬ２ドメインに結合できるに過ぎない。Ｆｅｒｇｕｓｏｎら（９）は、ＣＲ１ループおよびＣＲ２ループの間の相互作用の弱化はＥＧＦに対するＥＧＦＲ−ＥＣＤの見掛けの親和性を増大させると報告している；しかしながら、ＣＲ１ループおよびＣＲ２ドメインの連結と、リガンド結合親和性との間の関連は、単離されたＥＧＦＲ−ＥＣＤのＢＩＡｃｏｒｅ分析によって得られたデータに基づく（９；３１）。細胞表面における全長ＥＧＦＲについての動力学的結合データは、ＥＧＦＲ−ＥＣＤについての２０〜３５０ｎＭと比較して、少なくとも２オーダーの大きさより低い２０ｐＭ−２ｎＭである親和性定数を生じる。細胞関連におけるそのリガンドへのＥＧＦＲの結合動力学は、局所的受容体密度、オリゴマー化状態、およびサイトゾル要素または細胞骨格要素との相互作用のような、構造非依存性因子によって複雑化される（３２−３４）。全長受容体の関係では、キナーゼ、膜貫通ドメインおよび／またはＣ末端ドメインにおける修飾もまたそのリガンドに対するＥＧＦＲの親和性に影響する（３５−３９）。従って、無処理の細胞における受容体のリガンド結合親和性、オリゴマー化状態およびシグナル伝達（後記参照）に対するＣＲ１突然変異およびＣＲ２突然変異の効果を測定するのは重要である。生理学的温度におけるリガンド結合を評価しつつ内部移行を妨げるためには、３０μＭのフェニルアルシンオキシドの存在下で親和性測定を行った（２９）：これらのアッセイ条件下で、ＥＧＦＲの内部移行は１％未満まで低下した（データは示さず）。野生型ＥＧＦＲおよび突然変異体ＥＧＦＲに対するＥＧＦ結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析の結果を表３および図１１に示し、以下にまとめる。
【０２５１】
【表３】
2008501308.tif 000023
１２５Ｉ−ＥＧＦ結合は「材料および方法」に記載されたように行った。データは、「Ｋｅｌｌ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）」ＲａｄＬｉｇプログラムを用いて分析した。
（ａ）：細胞当たりの受容体の数は、各リガンド結合実験におけるＢｍａｘおよびチューブ当たりの細胞数から計算した。結果は少なくとも３つの別々の実験の平均および標準誤差である。
（ｂ）Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析によって測定された受容体数（Ｂｍａｘ）はＦＡＣＳによって、またはイムノブロッティングによって見積もられた受容体数の１０％未満である。
【０２５２】
ＣＲ２突然変異：Ｖ５８３Ｄ突然変異およびＤ５６３Ｈ突然変異は、ＣＲ２／ＣＲ１ループ相互作用を破壊するように設計された。連結された立体配座において、Ｖ５８７側鎖のγ−メチル基はＹ２４６との密なファンデルワールス力で接触している：Ａｓｐ  γ−カルボキシルの置換はＣＲ１／ＣＲ２接合面を破壊するはずである。同様に、Ｄ５６３のγ−カルボキシルは連結された立体配座においてＹ２４６に水素結合し、アスパラギン酸のカルボキシル基をＨｉｓのイミダゾールで置換することは相互作用を弱化させるであろう。Ｖ５８３Ｄを発現する細胞においては、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞と比較して、高親和性ＥＧＦ結合部位の割合について有利な増加が存在する（各々、１２．６％  対  ２．６％）。この傾向はまた、Ｄ５６３Ｈ突然変異体で観察されるが、この場合には、野生型からの差異は統計学的に有意ではなかった（表３）。高親和性部位の割合の増加は、受容体の未連結状態に向かう平衡シフトの指標であり、これは、Ｖ５８３Ｄ突然変異体およびＤ５６３Ｈ突然変異体がＣＲ１／ＣＲ２相互作用を弱化させるという推定を支持する。ＣＲ１およびＣＲ２を共有結合により結合させるジスルフィド結合を創製する可能性を調べるために、本発明者らは、連結された立体配座において適切な距離および側鎖の向きを有する２つの残基：Ｌｅｕ２４５およびＧｌｕ５７８を同定した。最初に、本発明者らは単一突然変異Ｅ５７８Ｃを作製し、次いで、二重突然変異Ｌ２４５Ｃ／Ｅ５７８Ｃを作製した。興味深いことには、Ｅ５７８側鎖はＬ２４５およびＰ２４８の側鎖に近く、従って、Ｅ５７８Ｃ置換は、これらの残基との疎水性相互作用を増加させることによって、ＣＲ１ループ／ＣＲ２接合面のパッキングを改良すると予測され得る。実験的には、Ｅ５７８Ｃ突然変異は、低親和性部位の数に影響することなく高親和性ＥＧＦ結合を完全に消去する（表３）。この位置におけるシステインの導入は、いずれかまたは双方のシステインに富んだドメインのフォールディングに影響しないようである：立体配座依存性抗体ｍＡｂ５２８は突然変異体受容体に結合し、そのリン酸化およびシグナル伝達は依然としてＥＧＦに依存する（後記参照）。
【０２５３】
ＣＲ１ループ突然変異：本発明者らは、Ｔｙｒ２４６に代わる３つの異なるアミノ酸置換（Ｐｈｅ、ＴｒｐおよびＡｓｐ）を導入した。結晶構造は、Ｙ２４６がＣＲ１／ＣＲ１相互作用およびＣＲ１／ＣＲ２相互作用双方につき決定的であることを示唆する（図９Ｂ、９Ｃ）。連結された立体配置において、ＣＲ１ループはＣＲ２ドメインと密接に相互作用し；Ｔｙｒ２４６はＡｓｐ５６３のカルボキシル側鎖と水素結合する。Ａｓｐ５６３はＬｙｓ５８５のε−アミノとの弱い架橋によって所定の場所に保持される。Ｔｙｒ２４６のＰｈｅ突然変異はＨ結合を除去し、従って、その連結はより弱くなる。Ｔｒｐ２４６突然変異体はＣＲ２結合部位に嵌合するには大き過ぎ、事実、それはＬｙｓ５８５−Ａｓｐ５６３の塩橋を破壊するであろう。Ｔｙｒ２４６のＡｓｐでの置き換えは、疎水性パッキングの喪失、ならびにＡｓｐ２４６およびＡｓｐ５６３の間の強い反発を導く。従って、全ての突然変異は連結された立体配座を余り好都合でなくさせるはずである。ＥＧＦＲキナーゼを活性化させるため、Ｔｙｒ２４６のヒドロキシルが対向鎖に水素結合するように、背中合わせのダイマーが形成されなければならない（図９）。事実、リガンドの存在下では、このヒドロキシルはＳｅｒ２６２残基、Ｇｌｙ２６４残基およびＣ２８３残基における骨格にＨ結合する。これらの３つの水素結合はＰｈｅ２４６突然変異体およびＡｓｐ２４６突然変異体においては失われる。Ｔｙｒ２４６および対向鎖の間のパッキングは密であり、Ｔｒｐ残基に対する余地は無い：Ｔｒｐ２４６ダイマーは、密にパッキングされないと予測される。実験的には、全ての３つの突然変異は高親和性ＥＧＦ結合の喪失をもたらし（表３および図１１）、これは、ＣＲ１／ＣＲ２結合の連結解除によって代償されないＣＲ１／ＣＲ１相互作用の著しい障害を示唆する。
【０２５４】
一緒に併わせると、これらの観察は、ＥＧＦＲの「連結された」形態へのリガンド結合が低い親和性で起こることを確認し；低親和性ＥＧＦ結合はＬ１ドメインおよびＬ２ドメインの相対的位置決定とは無関係であるようである。結晶構造の精査は、双方のドメインのリガンド結合表面が連結された立体配座および連結されていない立体配座双方において利用でき、従って、低親和性結合は、恐らくは、いずれかの部位、または双方の部位への結合を独立して反映することを示す。明らかに、未連結であることは、高親和性で結合するために利用できる受容体の割合を増加させ得る。高親和性立体配座は、恐らくは、ダイマー複合体におけるＬ１およびＬ２の近接配置に影響することによって、ＣＲ１ループを必要とすることに注意するのは興味深い。
【０２５５】
受容体二量体化：受容体の細胞外ドメインへのＥＧＦ結合は、キナーゼ活性なＥＧＦＲの形成または安定化に導く。リガンド誘導性ＣＲ１／ＣＲ１相互作用は、活性なＥＧＦＲ複合体の形成に必要であり：ＣＲ１ループの欠失は、全長ＥＧＦＲの関係においてさえ、ＥＧＦＲ−ＥＣＤが二量体化する能力を消去する（４）。明らかに、ＣＲ１ループおよびＣＲ２ループにおける突然変異は、ＥＧＦ結合親和性に対して有意な効果を有し；（図１１および表３）：本発明者らは、基底の二量体化およびリガンド媒介性二量体化、ならびに基底のキナーゼ活性化およびリガンド媒介性キナーゼ活性化に対するこれらの突然変異の効果を測定することに興味を抱いた。ＥＧＦおよびホモ二官能性の細胞非浸透性の架橋剤ＢＳ３を用いて、細胞を室温にて３０分間処理した。細胞溶解物をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、抗ＥＧＦＲ抗体または抗ホスホチロシン抗体いずれかでイムノブロットした。結果を図４に示し、以下にまとめる。
【０２５６】
「ＣＲ１ループ突然変異体」はリガンド依存性二量体化を低下させ；特に、Ｙ２４６Ｄ突然変異はリガンド依存性二量体化を完全に無くした。しかしながら、基底の二量体化はわずかに影響されたのみであった：これは自然発生二量体化およびリガンド媒介性二量体化の接合面におけるＹ２４６の立体配座における異なる役割を示す。ＣＲ１ループの全体が欠失されるΔ−ＣＲ１ル−プ受容体（４）における検出可能なダイマーの完全の欠如を仮定すれば、このループにおける他の領域は連結無しの（ｕｎｌｉｇａｔｅｄ）ダイマーの形成に寄与する可能性がある。Ｙ２４６突然変異体受容体モノマーおよびＹ２４６突然変異体受容体ダイマー双方のホスホチロシン含有量も低下され、これは、ダイマーが形成される場合でさえ、ＥＣＤ立体配座がキナーゼ活性化を可能としないことを示唆し：Ｙ２４６Ｗ突然変異体においていくらかの自然発生的ダイマーが検出できるが、リガンドの不存在下では、実質的にダイマーのリン酸化はない。明らかに、ＥＣＤ架橋可能なダイマーの形成は、全てのＹ２４６突然変異体において低下する。ＥＧＦ刺激後におけるＹ２４６突然変異体モノマーのホスホチロシン含有量が特に影響されること（図１２Ｃ）に注意するのは、興味深い；これらのモノマーは、おそらくは、架橋できなかったダイマーから生じるため、それらモノマーはダイマー複合体における改変された（より弱い）相互作用を持つ分子の部分集団を反映し得る。Ｙ２４６突然変異がダイマーの安定性に全体的に影響し、キナーゼ活性化に必要なダイマーサブユニットの再配向またはより高次のオリゴマーの形成を妨げるか否かは、本発明者らの実験系では直接取り組むことができない。
【０２５７】
「ＣＲ２突然変異体」は、正常レベルの基底の二量体化およびリガンド依存性二量体化を有した。本発明者らは、ＣＲ１／ＣＲ２連結が弱化された突然変異体ＥＧＦＲについてのダイマーの割合の有意な増加を検出せず、これは、突然変異が未連結を導く場合でさえ、ＢＳ３で架橋可能なダイマー複合体の形成が、リガンドの結合に依存することを示唆する。Ｅ５７８のＣへの突然変異は未対合システインを導入し、概念的にはジスルフィド結合ダイマーの形成に導くことができた。本発明者らは、異なるスペーサー−アームの長さ（ＢＳ３；１１．３Åおよびスルホ−ＥＧＳ、１６．１Å）の架橋剤を用い、ならびに還元条件下および天然条件下で非架橋ダイマーを分析して（データは示さず）、この可能性を調べた：本発明者らは、Ｅ５７８Ｃ突然変異体の自然発生二量体化の証拠を見出さず、Ｃｙｓ５７８は鎖間ジスルフィド結合の形成に導かないと結論する。
【０２５８】
（リガンド依存性チロシンリン酸化およびＭＡＰＫシグナル伝達）
ＣＲ１−ループ／ＣＲ２相互作用はＥＧＦＲのキナーゼ不活性な立体配座を安定させ、自然発生な活性化を妨げるようである（９）。本発明者らは、突然変異体受容体を発現する細胞において、基底時およびＥＧＦ依存性のチロシンリン酸化、ならびにＭＡＰＫ活性化をモニターした。結果を図１３に示す。リガンド結合は、ほとんどの突然変異体受容体分子のホスホチロシン含有量におけるいくらかの増加を引き起こす；しかしながら、個々の突然変異体の特異的活性化は有意に変化した（チロシンリン酸化  対  受容体タンパク質の比率によって、およびＭＡＰＫの特異的活性化によって測定した：図１３Ｂ、および１３Ｃ）。全てのＣＲ２突然変異体は、リガンドによって、野生型受容体と同様なレベルに活性化される。低い親和性の部位のみを有し、よって、連結された（不活性な）形態で優勢に存在するＥ５７８Ｃでさえ、高濃度のＥＧＦ（１６ｎＭ）において完全に刺激され得る。本発明者らは、細胞を漸増性濃度のＥＧＦ（３０ｐＭ〜１００ｎＭ）に細胞を暴露し、チロシンリン酸化およびＭＡＰＫ活性化の誘導をモニターすることによって、リガンド結合親和性およびＣＲ２突然変異体受容体のシグナル伝達の間の相関をテストした（図１４）。Ｅ５７８Ｃ−ＥＧＦＲ発現細胞において、ＥＧＦＲおよびシグナルトランスジューサーＳｈｃおよびＭＡＰＫのリン酸化のピークは、野生型と比較して有意により高い濃度のＥＧＦにおいてのみ達成された。対照的に、Ｖ５８３Ｄ−ＥＧＦＲ発現細胞およびＤ５６３Ｈ−ＥＧＦＲ発現細胞についての受容体活性化は、野生型ＥＧＦＲよりもより低い濃度のＥＧＦにおいて起こった（図１４Ｂ、１４Ｃ）。これらの結果は、ＣＲ２ドメインにおける突然変異が結合親和性に影響するが、受容体機能を惹起する後発事象に影響しないという考えを支持する。飽和量のＥＧＦにおいてさえ、全てのＴｙｒ２４６突然変異は受容体チロシンリン酸化およびＭＡＰＫ活性化を著しく低下させ（図１３）：増殖性のＣＲ１／ＣＲ１ループ相互作用を形成する能力は、キナーゼ活性化のために決定的である。ＣＲ１ループまたはそのドッキング領域への他の点突然変異（Ｙ２５１Ａ、Ｆ２６３Ａ）は、ＥＧＦＲシグナル伝達に対して最小効果を有したように見える（５）。しかしながら、ＣＲ１ループおよびそのドッキング部位が共に破壊される場合（例えば、Ｙ２５１Ａ／Ｒ２８５Ｓ二重突然変異体：（５））、シグナル伝達は完全に破壊される。これらの著者は、リガンド結合のレベルの低下も報告しており、これは、二量体化ドッキング部位の結合が、Ｌ１ドメインおよびＬ２ドメインがＥＧＦに応答して再度配向する能力に影響し得ることを示唆する。
【０２５９】
ＥＧＦＲ突然変異体からの分裂促進的シグナル伝達。最終的に、ＥＧＦＲの機能性は、生物学的応答を刺激するその能力によって測定される。これらの応答は、リガンド結合の親和性、キナーゼ活性化の強度、キナーゼ活性化の大きさ、シグナル伝達の持続時間を含めた、多くのパラメーターに依存する。本発明者らは、［３Ｈ］チミジン取り込みアッセイを用い、漸増性濃度のＥＧＦへの暴露に続いて、「デノボ」ＤＮＡ合成を誘導するそれらの能力について、ＥＧＦＲ突然変異体をテストした。結果を図１５および表４に示す。まず、細胞系のいずれもリガンド非依存性［３Ｈ］チミジン取り込みを呈しなかった：ＣＲ１ループおよびＣＲ２の間の連結体が弱化された場合においてさえ、分裂促進シグナル伝達は受容体の活性化のためにＥＧＦ結合を必要とすることは明らかである。一般的には、ＥＧＦについてのＥＣ５０は高親和性な受容体の占有率と相関するが（表３および表４参照）、Ｅ５７８Ｃの場合には、最大［３Ｈ］チミジン取込みの半分のために必要とされるＥＧＦの濃度と、受容体の最大占有の半分のために必要とされるＥＧＦの濃度との間には、１０倍の差がある。本発明者らは、野生型ＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞系において、細胞当たり５００ＲほどがＥＧＦに対する最大応答の半分を達成するのに活性化されなければならないことを確立し（方法については、Ｗａｌｋｅｒら、１９９８参照）：この閾値は、野生型ＥＧＦＲについては約１５ｐＭのＥＧＦで到達し、Ｅ５７８Ｃ細胞については約８０ｐＭのＥＧＦで到達する（表４）。（細胞当たりの受容体の合計数および各ＥＧＦ濃度における占有割合に基づく）同一計算を用い、本発明者らは、Ｙ２４６Ｗ突然変異体が約６０ｐＭのＥＧＦ濃度において最大応答の半分に到達し、Ｙ２４６Ｄ突然変異体は、約４００ｐＭの濃度において到達すると見積もった。分裂促進アッセイにおけるこれらの突然変異体のＥＧＦに対する応答の完全な欠如は、リガンド結合親和性の単純な喪失よりはむしろ増殖性シグナル伝達ユニットを形成するこれらのＥＧＦＲの能力の無いことを反映する。
【０２６０】
【表４】
2008501308.tif 000024
野生型ＥＧＦＲまたは突然変異体ＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞を、実験手法に詳細に記載されたように、漸増性濃度のＥＧＦ（０〜１０ｎｇ／ｍｌ、０〜１．７ｎＭ）に暴露し、ＤＮＡ合成を［３Ｈ］チミジン取込みによって測定した。
ａ）１ｎＭ  ＥＧＦにおける野生型ＥＧＦＲ−ＢａＦ／３細胞の応答は最大として取られた。ｂ）ＥＣ５０は図７に示される用量応答曲線から決定された。ｃ）細胞当たり５００Ｒを占有するのに必要なＥＧＦの濃度は、受容体占有率  対  ＥＧＦ濃度のプロットを用いてＳｃａｔｃｈａｒｄ分析から得られたＫｄおよびＢｍａｘデータから計算した。ＥＧＦの各濃度における占有されたＥＧＦＲの数は、式：
（［Ｌ］／［Ｌ］＋Ｋｄｌ）×Ｒ１＋（［Ｌ］／［Ｌ］＋Ｋｄ２）×Ｒ２
（式中、［Ｌ］＝ＥＧＦ濃度；Ｋｄ１およびＫｄ２＝平衡結合定数；Ｒ１およびＲ２＝高親和性受容体および低親和性受容体の数）
から計算した。
データは、少なくとも３つの別々の実験の代表である。
【０２６１】
ＥＧＦＲ立体配座の抗体モニタリング。示された結果は、これまで、ＣＲ１ループおよびＣＲ２ドメインの間の相互作用がＥＧＦＲを低親和性に連結し（キナーゼ不活性状態（９））、そしてＣＲ１／ＣＲ１ループ相互作用がＥＧＦＲのリガンド誘導性キナーゼ活性化に必要であるモデルを支持する（４；５）。「中間」状態もまた（Ｆｅｒｇｕｓｏｎらによって提案されているとおり（９））存在するかどうか、およびその特性は何であり得るかは依然として不明確である。本発明者らは、受容体のこの形態が未連結、より高い親和性、ダイマーおよびキナーゼ不活性であると予測する。リガンドの不存在において、正しいＣＲ１−ＣＲ１相互作用は形成されないようであるか、あるいはキナーゼ活性化を行うには余りにも一時的である。
【０２６２】
モノクローナル抗体５２８（１９）は、ヒトＥＧＦ受容体へのＥＧＦ結合についての競合的抗体として用いられてきた。ｍＡｂ５２８についての正確なエピトープは依然としてマッピングされていないが、ｍＡｂ５２８はΔ２−７ＥＧＦＲ（Ｌ１およびほとんどのＣＲ１ドメインを欠く：（４０））と反応し、野生型ＥＧＦＲへのリガンド結合を妨害し、従って、本発明者らは、このエピトープがＬ２ドメインに存在すると推定する。抗体はヒトＥＧＦＲに対して特異的であって、正しくフォールディングされた受容体のみを認識する（すなわち、それはウェスタンブロットにおいてｈＥＧＦＲの還元された形態と反応しない）。この実験で用いた全ての突然変異体とｍＡｂ５２８との反応性は損なわれず、ｍＡｂ５２８を用いるＦＡＣＳ分析、または１２５Ｉ−ＥＧＦを用いるＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって測定された受容体の数は通常合致する。先に述べたように、Ｌ２４５Ｃ／Ｅ５７８Ｃ突然変異体は、十分にｍＡｂ５２８と反応性であるが、予測された数の低親和性ＥＧＦ結合部位の１０％のみを有する。
【０２６３】
モノクローナル抗体８０６はΔ２−７切断形ＥＧＦＲならびに受容体を過剰発現する細胞における野生型ＥＧＦＲの部分集団を認識する（２３；３０）。ｍＡｂ８０６は、Δ２−７ＥＧＦＲを発現する神経膠芽腫異種移植片または野生型ＥＧＦＲを過剰発現する癌腫において抗腫瘍剤として活性である（２２；４１；４２）。この抗体は、受容体の活性化形態を選択的に認識すると仮定された（４３）。ＥＧＦＲの単離されたＥＣＤについての研究は、ｍＡｂ８０６がＣＲ２ドメインを欠く、ＥＣＤの表面固定化されるＣ末端切断形態（ａａ１−５０１）と反応するが、Ｎ末端切断形態（ａａ３０３−６２１）とは反応しないことを示した。これは、このエピトープがＣＲ１ドメインのＣ末端部分に向かって位置することを示唆する（Ｊｏｈｎｓら、原稿投稿中）。ｍＡｂ８０６は、細胞当たり約４０，０００個の野生型ＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞の表面と弱く反応するが、しかしながら（Ｌ１ドメインおよびほとんどのＣＲ１ドメインを欠く）同等数のΔ２−７受容体を発現するＢａＦ／３細胞はｍＡｂ８０６に強く結合する（図１６）。興味深いことには、ΔＣＲ１ループ突然変異体（これは、ａａ２４４−２５９を欠く：（４））は強いｍＡｂ８０６反応性を有する。ｍＡｂ５２８が細胞表面の正しくフォールディングされたＥＧＦＲを全て認識できると仮定し、ＦＡＣＳ分析を用い、ｍＡｂ８０６  対  ｍＡｂ５２８の中央値の蛍光の比率を計算することによって、ｍＡｂ８０６に反応性のＥＧＦＲの割合を計算することが可能である：直接的比較は可能である。なぜならば、本発明者らは、飽和濃度において双方の抗体を用い、結合は同一の二次抗体（Ａｌｅｘａ４８８結合化抗マウスＩｇ）によって検出され、ＦＡＣＳ検出は使用範囲において線形であるからである。この分析を用い、ｍＡｂ８０６と反応性の受容体の割合は、野生型ＥＧＦＲについての６〜８％から、Δ２−７およびΔＣＲ１ループＥＧＦＲについての７０〜９０％まで変化する（０．０６〜０．０８および０．０６９〜０．９８のｍＡｂ５２８結合に対するｍＡｂ８０６結合の比率：図１４、データは示さず）。一緒に考え併せると、単離されたＥＣＤおよび細胞受容体についてのデータは、エピトープがＣＲ１ドメインのほとんどのＣ末端部分に存在し、野生型受容体の本来の立体配座によってマスクされ得るが、ＣＲ１ループの欠失によって露出され得ることを示唆する。事実、ＥＧＦＲ−ＥＣＤの結晶構造へのｍＡｂ８０６エピトープのマッピングは、それがＣＲ１ループのＣ末端からすぐのところに位置することを示し（図９Ｂ、９Ｃ参照）：従って、ｍＡｂ８０６エピトープは、背中合わせの二量体形態におけるＣＲ１／ＣＲ１接合面に埋もれている可能性がある。また、ｍＡｂ８０６エピトープは、受容体の連結形態において、部分的に埋もれている。推定の「中間体」においてのみ、ＣＲ１ループ／ＣＲ２またはＣＲ１／ＣＲ１ループ相互作用によってそれがマスクされない場合の、受容体の未連結形態は、利用できる可能性のあるｍＡｂ８０６エピトープである。この抗体は、従って、連結されたＥＧＦＲ複合体、未連結のＥＧＦＲ複合体、および十分に活性なＥＧＦＲ複合体を分析するための感受性のある立体配座プローブを��供し得る。この仮説を検定するために、本発明者らは、ｍＡｂ８０６またはＥＧＦとのプレインキュベーションの前および後における、野生型ＥＧＦＲを発現する細胞とｍＡｂ８０６との反応性をモニターした。ｍＡｂ８０６が受容体の中間体形態を認識し、中間体形態が連結された（ＣＲ１ループ／ＣＲ２）およびＣＲ１／ＣＲ１未連結状態と動的な平衡にあり、抗体とのプレインキュベーションが平衡をこの種に向けてシフトするはずであり、よって、反応性を増大させるはずである。ＣＲ１／ＣＲ１接合面の形成を支持することによって、ＥＧＦとのインキュベーションは感受性を減少させるはずである。野生型ＥＧＦＲ／Ｂａｆ細胞を、３７℃（系のエネルギーを最大化させるため）において内部移行阻害剤フェニルアルシンオキサイド（２９）の存在下でｍＡｂ８０６に暴露させて、または４℃でＥＧＦに暴露させて、キナーゼ活性状態の形成を可能とするが、内部移行を完全に排除した。ｍＡｂ８０６処理は（１２５Ｉ−ＥＧＦ結合によって測定されるように）ＥＧＦＲの合計数を変化させず、双方の条件下で、９５％を超えるＥＧＦＲが、細胞表面に存在した（データは示さず）。ｍＡｂ８０６、ＥＧＦまたはコントロール緩衝液での予備処理後に、ｍＡｂ５２８、ｍＡｂ８０６またはコントロール抗体との野生型ＥＧＦＲ反応性を、ＦＡＣＳ分析によって測定した。表５は、ｍＡｂ８０６またはＥＧＦでの予備処理によって引き起こされた中央値の蛍光チャネルの変化、ならびにｍＡｂ８０６反応性とｍＡｂ５２８反応性との間の比率を示す。データを提示するこの方法を選択して、絶対中央蛍光値（これは、レーザー電流および検出器の設定の小さな変化に対して非常に感受性である）において、実験の間の変動を克服し、実験データのプーリングを可能とした。１０ｕｇ／ｍｌのｍＡｂ８０６との３７℃における１時間の細胞のプレインキュベーションは、ｍＡｂ５２８の反応性に影響することなくｍＡｂ８０６との反応性を２倍より大きくし；従って、２つの抗体の間の比率は有意に上昇した。同一条件下でのｍＡｂ５２８とのプレインキュベーションは、引き続いてのｍＡｂ５２８の結合にもｍＡｂ８０６の結合にも効果を有しなかった（データは示さず）。別の実験において、本発明者らは、第二のインキュベーションの間のｍＡｂ８０６の濃度の増加（１０μｇ／ｍｌから５０μｇ／ｍｌ）または暴露の時間の増加（２０分から１時間）は、無視できる効果を有した（データは示さず）ため、増強されたｍＡｂ８０６結合は飽和の欠如に起因しないことを証明した。ｍＡｂ８０６とのプレインキュベーションの効果は、時間依存性および温度依存性であり、３７℃でのプレインキュベーションから３時間後に最大に到達した（データは示さず）。これらの結果は、ｍＡｂ８０６による一時的な未連結形態のＥＧＦＲ受容体のトラッピングに適合する。逆に、ＥＧＦにおける細胞のプレインキュベーションは、ｍＡｂ８０６との反応性を劇的に減少させる。これらの条件下での受容体の内部移行化は５％未満であり、よって、ｍＡｂ８０６結合の減少に有意に寄与することができない。これらの実験において、立体障害またはエピトープのマスキングいずれかを介するＥＧＦの結合後に、ｍＡｂ５２８との���応性は約２０％低下した。考え併わせると、これらの結果は、未連結の未結合形態の受容体についての、ｍＡｂ８０６による選択的認識を指摘する。
【０２６４】
【表５】
2008501308.tif 000025
野生型ＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞を、対照緩衝液、ｍＡｂ８０６（３７℃における１時間の１０μｇ／ｍＬ：（ａ））、またはＥＧＦ（４℃における１５分間の１０ｎｇ／ｍＬ（ｂ））と、プレインキュベートした。次いで、実験手法に記載したように、細胞を（共に１０μｇ／ｍＬにおいて）ｍＡｂ８０６またはｍＡｂ５２８のいずれかでプローブし、続いて、Ａｌｅｘ４８８標識抗マウスＩｇでプローブした。細胞をＦＡＣＳｃａｎで分析し、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔにおける統計学的分析プログラムを用いてメジアン蛍光値を得た。モックプレインキュベーション後におけるメジアン蛍光値はｍＡｂ５２８については１１２＋／−２１、ｍＡｂ８０６については７＋／−１．９、そしてコントロールの（クラスがマッチした）無関係な抗体については０．５＋／−０．３であった。ネガティブコントロール値は全てのデータから差し引いた。結果を、モック試料と比較したテスト試料についてのメジアン蛍光のプラスまたはマイナスへのパーセント変化として表す。ｍＡｂ８０６およびｍＡｂ５２８についてのメジアン蛍光の間の比率も提示される。データは３つの別々の実験の平均および標準誤差である。
【０２６５】
ＣＲ１−ループまたはＣＲ２突然変異体へのｍＡｂ８０６結合の分析（表４）は、以下：ｍＡｂ８０６反応性は、弱化されたＣＲ１−ループ／ＣＲ２相互作用を持つ突然変異体（Ｖ５３８ＢおよびＤ５６３Ｈ）における野生型ＥＧＦＲの少なくとも２倍であり、ＣＲ１／ＣＲ１相互作用を形成できない受容体（Ｙ２４６突然変異体）についての野生型ＥＧＦＲよりも３倍程度高かったこと、を支持する。ＥＧＦとのインキュベーションは、２つのクラスの突然変異体に対して反対の効果を有し：ＥＧＦは活性ダイマーを形成できる受容体（野生型およびＣＲ２突然変異体の全て）のｍＡｂ８０６との反応性を低下させ、他方、ｍＡｂ８０６との反応性は、ＣＲ１−ループ突然変異体について変化しないか、または増強された。これらの突然変異体に対するＥＧＦの効果は、ＣＲ１／ＣＲ１ループ相互作用を形成できないことに伴う、弱いＣＲ１−ループ／ＣＲ２ループ相互作用のＥＧＦ媒介性非連結と合致する。ＥＧＦによるｍＡｂ８０６反応性の変調は、チロシンリン酸化およびＤＮＡ取り込みによって測定された場合（図１５および表６参照）、ＥＧＦＲキナーゼを活性化する突然変異体ＥＧＦＲの能力、またはそれができないことによく相関する。本発明者らのデータは、ｍＡｂ８０６が、未だバックツーバック（ｂａｃｋ−ｔｏ−ｂａｃｋ）ダイマー立体配座に配置されるべき、ＥＧＦＲの非連結形態を優先的に認識するモデルと合致する。従って、ｍＡｂ８０６をツールとして用いて、リガンド結合の際の受容体内の立体配座変化をモニターすることができる。ＥＧＦＲの一過性、非連結性および非結合性の立体配座は、いずれの時点においても、全ＥＧＦＲの小さな割合が、文献に報告されているように、受容体を過剰発現する細胞に検出可能な量で存在する（２２；２３；３０）。また、我々のデータは、腫瘍形成を抑制するｍＡｂ８０６の能力を説明するのを助けることもできる：Δ２−７ＥＧＦＲを発現する細胞において、抗体の結合は受容体複合体キナーゼの活性立体配座の形成を立体的に妨げ、他方、野生型ＥＧＦＲを過剰発現する細胞においては、それは非連結ＥＧＦＲ形態を捕獲し、ＣＲ１−ループ間の相互作用およびその後の活性化を妨げることができる。この仮説は、ｍＡｂ８０６での処理後の、Δ２−７ＥＧＦＲのキナーゼ活性化における、報告された減少と合致する（４２）。
【０２６６】
【表６】
2008501308.tif 000026
野生型または突然変異体ＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞を、表３に記載されたように処理した。メジアン蛍光値およびｍＡｂ８０６およびｍＡｂ５２８反応性の間の比率を、表３に記載したように計算した。別々の実験の各々における緩衝液処理された野生型ＥＧＦＲについてのｍＡｂ８０６／ｍＡｂ５２８の比率を１とし、全ての他の比率を野生型ＥＧＦＲ値で割って、突然変異体間および別々の実験間の直接的比較を可能とした。データは、少なくとも４つの別々の実験の平均および標準誤差である。
【０２６７】
（結論）
全長の細胞ＥＧＦＲにおける受容体内および受容体間連結の役割を試験するために設計された突然変異（４；６；９）は、以下を示す。１）高親和性ＥＧＦ結合部位の数は、ＣＲ１−ループ／ＣＲ２連結によって強く影響され、恐らくは、Ｌ１およびＬ２ドメインの相対的な配置を反映する。ＣＲ１／ＣＲ２連結の弱化は、高親和性部位の割合を増大させ、ＣＲ１−ループ／ＣＲ２連結の強化は、高親和性結合を根絶する（表３）。全長細胞受容体と単離されたＥＣＤとの間のリガンド結合親和性における有意な差にもかかわらず、ＣＲ１およびＣＲ２相互作用は、２つの分子において同一の相対的変化を起こす（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（９）および本発明者らのデータ参照）。ＥＧＦＲの近接膜またはキナーゼドメインの修飾に寄与する細胞内成分によるＥＧＦＲ親和性の変調（３６；４４−４６）は、従って、連結状態と非連結状態の間の改変されたバランスを反映するはずである。ＥＧＦＲの細胞内部分の修飾がどのようにして細胞外ドメインの立体配座の改変に導くかは明らかでなく、これは、将来の興味深い挑戦であろう。２）ＥＧＦＲのリガンド独立性二量体化（またはオリゴマー化）は、ＣＲ１−ループまたはＣＲ２ドメインにおける突然変異によって有意には影響されない。ＣＲ１−ループ／ＣＲ２連結の弱化は構成的な二量体化を導かないし、連結の強化がそれを減少させもしない（図１２）：従って、ＣＲ１−ループが（表４中のｍＡｂ８０６結果によって示唆されるように）受容体間相互作用に利用できる場合でさえ、（ホスホチロシン含有量によって間接的に評価された）生産的二量体化および活性化は、リガンド結合なしでは起こらない。しかしながら、リガンド媒介性ＥＧＦＲ二量体化および活性化はＣＲ１ループにおける突然変異によって影響されない。これらの結果は、構成的およびリガンド誘導ダイマーは同等ではなく、リガンド結合は、受容体サブユニットおよび結果としてのキナーゼ活性化の正しい配置に厳格に必要であることを示す（１６）。ＣＲ１−ループにおけるＴｙｒ２４６は、活性化された複合体の形成のために非常に重要なようである。Ｔｙｒ２４６の全ての突然変異が、連結された立体配座における受容体をロックするのは名目上可能ではあったが、立体配座特異的ｍＡｂ８０６を用いて得られた本発明者らの結果（表６）は、Ｔｙｒ２４６突然変異体がダイマー複合体を正しく配位させることができないことを代わりに示した。３）本発明者らは、抗体であるｍＡｂ８０６（こでは、ＥＧＦＲの非連結形態を選択的に認識するが、不活性形態を認識しないようである）を用いて、ＥＧＦＲの立体配座の有意な変化をモニターすることができた。ＣＲ１／ＣＲ２相互作用の破壊は、ｍＡｂ８０６反応性を増加させ、他方、リガンド結合はそれを減少させる（表６）。興味深いことには、Ｄ５６３ＨおよびＶ５８３Ｄ突然変異ならびにＹ２４６突然変異は共に、ＣＲ１／ＣＲ２相互作用を弱化させ、ｍＡｂ８０６との高い反応性に導く。さらに、Ｔｙｒ２４６の突然変異を有する突然変異体は、（トリトファンおよびアスパラギン酸に対する）ＣＲ１／ＣＲ１相互作用を最も破壊するようであり、ＥＧＦ結合後のｍＡｂ８０６反応性の有意な増加を示し、このことに��り、活性化されたＣＲ１／ＣＲ１配位が妥協される（ｃｏｍｐｒｏｍｉｓｅ）ことを確認する。４）活性ダイマーを形成する能力が維持される場合は常に、ＥＧＦに対する応答は、親和性および受容体数の間のバランスによってのみ決定される。本発明者らは、リガンドを活性化可能なＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞において、５００個ほどの受容体／細胞が最大の半分の（ｈａｌｆ−ｍａｘｉｍａｌ）ＤＮＡ合成を刺激するのに占有される必要があり（表４）、そしてこれは、ＳｈｃおよびＭＡＰＫのような下流シグナル伝達エフェクターの閾値刺激に相関する（図１３）ことを示した。従って、ＥＧＦＲリン酸化それ自体は、受容体の占有（従って、リガンド依存性二量体化および活性化）に伴って継続的に増加するが、シグナル伝達経路はずっと低いリガンド濃度において十分に活性化され；実際に、マイトジェンの刺激がＥＧＦの複数濃度において起こり、ここで、ＳｈｃおよびＭＡＰＫのリン酸化は容易に検出可能であるが、ＥＧＦＲリン酸化は容易には検出可能ではない。
【０２６８】
ＥＧＦＲは複数の状態で存在することができ、各々は異なるリガンド結合特徴およびリガンドによる活性化についての潜在能力を持ち：特に、どれくらい少ない受容体が下流シグナル伝達カスケードを十分に誘発するために活性化される必要があるのかを考慮すると、これらの形態間の平衡における些細なシフトが、ＥＧＦＲ生物学についての有意な提示を有することができることが明らかになりつつある。本発明者らは、図１７において、ＥＧＦＲの代替の立体配座、および受容体活性化におけるそれらの役割についての、本発明者らの理解をまとめた。
【０２６９】
（参考文献）
【化２８】
2008501308.tif 000027
【０２７０】
【化２９】
2008501308.tif 000028
【０２７１】
【化３０】
2008501308.tif 000029
【０２７２】
【化３１】
2008501308.tif 000030
【０２７３】
【化３２】
2008501308.tif 000031
（実施例３）
（ランダム突然変異誘発および酵母表面ディスプレイによる抗上皮増殖因子受容体抗体の詳細なエピトープマッピング）
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）に対する治療的に関連するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の詳細なエピトープマッピングを、ランダム突然変異誘発および酵母表面ディスプレイによって達成した。ＥＧＦＲ外部ドメイン断片（残基２７３−６２１）の単一点突然変異体が酵母表面にディスプレイされたライブラリーをランダム突然変異誘発によって構築し、そのライブラリーを目的のｍＡｂに対する結合を減少させることについて分類した。ＥＧＦＲ突然変異体がｍＡｂへの結合の喪失を示す場合、これは、突然変異した残基が潜在的に接触残基であることを示唆する。この方法を用い、本発明者らは、ＥＧＦＲへのｍＡｂ８０６の結合でエネルギー的に重要な鍵となる残基を同定した。ｍＡｂ８０６エピトープは、Ｃｙｓ２８７−Ｃｙｓ３０２からなるループの一表面に突き止められ、ジスルフィド結合および２つの塩橋によって連結される。本明細書中で同定されるように、ｍＡｂ８０６エピトープは自己抑制性ＥＧＦＲモノマー立体配座において十分に接近可能ではなく、これは、ＥＧＦＲが自己抑制性モノマーから拡大されたモノマーへ変化するように、ＥＧＦＲの移行型形態へのｍＡｂ８０６結合に一致する。
【０２７４】
（緒言）
エピトープマッピングは、抗体−抗原相互作用を媒介することに関与する抗原残基の決定である。エピトープマッピングの以前の方法は、その後の抗体結合分析と共に、バクテリオファージ（１）、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（２）、または酵母（３）の表面でのペプチド断片の発現を伴っていた。抗体結合のマッピングもまたＳＰＯＴ合成を通じて達成され、ここで、合成ペプチドがセルロース膜にスポットされ、抗体結合についてアッセイされる（４）。ファージディスプレイおよびＳＰＯＴ技術は、ＥｒｂＢ受容体ファミリーメンバーに対する種々の抗体のエピトープを決定するのに利用されてきた（５，６，７）。しかしながら、ペプチドベースの方法は連続した非立体配座エピトープを同定できるに過ぎない。不連続エピトープを同定するために、Ｈ／Ｄ−交換質量分析法を用いて、エピトープが不連続なタンパク質分解断片に限局されている（８）。
【０２７５】
タンパク質−タンパク質相互作用を分析するのに有用なツールはアラニンスキャニングであり、これは、目的の残基をアラニンに突然変異させ、その後の結合における変化を測定する方法である（９）。これは、可溶性タンパク質の発現、および適切な折畳みを確実にするための各突然変異体の特徴づけを必要とする。ショットガンスキャニング突然変異誘発は、ファージディスプレイライブラリーを用いるアラニンスキャニングのハイスループットな方法であり、パラトープマッピングおよびタンパク質−タンパク質相互作用をマッピングするために用いられてきた（１０，１１）。しかしながら、この方法の非真核生物発現系は、２５個のジスルフィド結合および１０個のＮ−結合グリコシル化部位を含有する、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）外部ドメインのような複雑な真核生物糖タンパク質のエピトープマッピングに従わない可能性がある（１２）。
【０２７６】
ＥＧＦＲは、細胞の増殖および分化の調節に関与する１７０ｋＤａの膜貫通糖タンパク質および受容体チロシンキナーゼである（１３，１４）。ＥＧＦＲ（ＥｒｂＢ１，ＨＥＲ１）は、ＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２，Ｎｅｕ）、ＥｒｂＢ３（ＨＥＲ３）、およびＥｒｂＢ４（ＨＥＲ４）も含むＥｒｂＢ受容体ファミリーのメンバーである。上皮増殖因子（ＥＧＦ）およびトランスフォーミング増殖因子−α（ＴＧＦ−α）を含む多数のリガンドが、細胞外領域のドメインＩおよびＩＩＩに結合して、二量体化を通じてＥＧＦＲを活性化する。細胞外領域のドメインＩＩは二量体化接触の媒介に関与し、また、モノマー状態におけるドメインＩＶとの自己抑制性接触を形成する（（１５）でレビューされた構造）。ＥＧＦＲ過剰発現は、頭部および頸部、乳房、膀胱、前立腺、腎臓、および非小細胞肺癌を含む広範な悪性疾患で観察されてきた（１６）。この過剰発現は、しばしば、低下した生存率および腫瘍再発に相関し、それゆえ、患者の予後指標としての役割を果たす（１７）。加えて、アミノ酸残基６−２７３が欠失され、かつ新規なグリシンが接合部に挿入される、ＥＧＦＲ  ｖＩＩＩとして公知のＥＧＦＲの突然変異体形態は、神経膠芽細胞腫多形のような癌で観察されてきた（１８）。従って、ＥＧＦＲは癌治療のための重要な標的として出現し、ＥＧＦＲ細胞外ドメインに結合する種々の抗体がその機能を阻害するために開発されてきた。
【０２７７】
ＭＡｂ８０６は前臨床開発段階であり、野生型ＥＧＦＲよりもｖＩＩＩおよび増幅されたＥＧＦＲを優先的に認識することが示されている（１９；２２）。ｍＡｂ８０６は、ｖＩＩＩまたは増幅されたＥＧＦＲのいずれかを発現する腫瘍異種移植片の成長を阻害することが示されている（２３）。
【０２７８】
最近、Ｊ．Ｒ．Ｃｏｃｈｒａｎらは、ＥＧＦＲの酵母表面にディスプレイされた断片を用いるドメインレベルエピトープマッピングのための方法を報告した（２７）。大きな断片（いくらかはＥＧＦＲの複数ドメインを含む）は酵母の表面で発現し、適切に折り畳まれる。これらの断片は、連続および不連続エピトープの両方についてのＥＧＦＲの特定のドメインへの抗体結合を突き止めるのに用いられた。酵母表面ディスプレイは、それにより、目的のタンパク質が酵母Ａｇａ２タンパク質への融合として酵母の表面に発現される方法である。真核生物宿主は、酵母分泌経路を介するタンパク質のトランジットがもたらし、これは、十分なジスルフィド異性化および小胞体質制御を可能とする（２８）。酵母表面ディスプレイは、単鎖抗体断片を親和性成熟させ（２９，３０）、タンパク質安定性および発現を操作し（３１，３２）、種々の抗原およびハプテンに対してスクリーニングするための非免疫ヒト抗体ライブラリーをディスプレイするのに用いられてきた（３３）。
【０２７９】
最近の研究において、本発明者らは、ドメインレベルエピトープマッピングから発展させ、抗体−抗原結合相互作用のより詳細な残基レベルの分解能について酵母表面ディスプレイを利用する。また、以前の研究は、ｍＡｂ８０６が、ＥＧＦＲ残基２７３−６２１につきとめられたエピトープに結合することを示した（３４）。この断片で出発し、ＥＧＦＲ２７３−６２１の単一点突然変異体の酵母表面でディスプレイされたライブラリーを、ランダム突然変異誘発を用いて作成した。そのライブラリーを、ｍＡｂ８０６への結合の喪失について分類し、それらのクローンを配列決定し、分析した。ＥＧＦＲ突然変異体がｍＡｂ８０６への結合の喪失をディスプレイする場合、これは、抗原−抗体接触が突然変異において失われたことを示唆する。従って、突然変異した残基が恐らくは接触残基である。このドメイン方法を用い、本発明者らは、治療的に関連するｍＡｂ８０６のＥＧＦＲへの結合についてエネルギー的に重要な鍵となる残基を同定した。
【０２８０】
（結果）
（エピトープマッピングライブラリーの構築および分類）
ＥＧＦＲ断片２７３−６２１の低突然変異率エラープローンＰＣＲランダム突然変異誘発を用いて、優れたエピトープマッピングライブラリーを構築した。この断片は、酵母表面における成功したＥＧＦＲ突然変異体ディスプレイの検出用のＣ末端ｃ−ｍｙｃタグを含有した。最初のライブラリーのサイズは５×１０５クローンであり、１００の未選択クローンの配列決定は、７２％が野生型ＥＧＦＲであり、１７％が単一アミノ酸突然変異体であり、そして１１％が複数突然変異またはフレームシフトであることを示した。これは関連ライブラリーサイズ８．５×１０４を与え、これは、この３４９残基断片の単一アミノ酸突然変異体の最大理論的多様性よりも大きいオーダー（６．６×１０３）であり、１．０×１０３の可能な単一ヌクレオチド突然変異よりもほぼ２倍のオーダーである。このライブラリーサイズを考えると、単一ヌクレオチド突然変異による遺伝コードでアクセスできる各アミノ酸はライブラリーにおいて十分に表されるはずである。このライブラリーを酵母に形質転換し、酵母Ａｇａ２タンパク質への融合として細胞表面にＥＧＦＲ突然変異体をディスプレイするように誘導した。ライブラリーを高い濃度（野生型の見掛けの解離定数よりも少なくとも大きいオーダー）のｍＡｂで標識し、野生型結合と親和性の喪失との間の識別を可能とする。細胞をニワトリ抗ｃ−ｍｙｃ  ＩｇＹで標識して、ＥＧＦＲ  ２７３−６２１発現を検出した。酵母の表面にディスプレイされたが、ｍＡｂへの親和性の喪失を示した突然変異体を単離した（図１８Ａ−図１８Ｂ）。著しく誤って折り畳まれた突然変異体は分泌質制御装置によって認識され保持されると予測され（３１；３５）、その結果、有意に低下されたこれらの突然変異体の細胞表面ｃ−ｍｙｃ免疫蛍光をもたらした。十分な集団の富化が観察された後、単一ＥＧＦＲ突然変異体クローンを配列決定し、特徴付けた。
【０２８１】
（ｍＡｂ８０６エピトープの同定）
ｍＡｂ８０６のエピトープマッピングのために、ライブラリーを、分類１では１０ｎＭ  ８０６で分類し、分類２および３では７５ｎＭ  ８０６で分類し、個々のクローンを分類２および３の後に配列決定する。１００の配列決定されたクローンのうち、ほぼ２０％が複数の突然変異を含み、その後の分析から除外された。ｍＡｂ８０６への結合の喪失についてライブラリーから単離された単一突然変異体を、表７の左欄に示す。全ての突然変異は、以前に測定されているように（３４）、システイン２８７と３０２との間のジスルフィド結合ループに突き止められる。しかしながら、残基レベルの分解能およびｍＡｂ８０６エピトープについてのさらなる情報が、本発明の方法を用いて得られている。ｍＡｂ８０６への結合の喪失を伴う突然変異体は、７５ｎＭ  ８０６における野生型（図１８Ｄ）と比較した場合、結合の完全または部分的のいずれかの喪失を示す（図１８Ｂ−図１８Ｃ）。突然変異体を７５ｎＭ  ８０６における結合の程度に従ってスコア付けし、＋＋は野生型結合を示し、＋は結合の部分的喪失、そして結合の完全な喪失を示す（表７、左欄）。優れたエピトープマッピングライブラリーからの結果を確認するために、部位特異的突然変異誘発（ＳＤＭ）を介するアラニンスキャニングを全ループ２８７−３０２で行った（表７、右欄）。アラニンスキャニングによる結合の喪失を持つ全ての部位（２８７、２９３、２９８、および３０２）は、ライブラリーから単離された突然変異体に対応する。逆に、アラニン以外の残基の置換の際にのみｍＡｂ結合の喪失を持つ部位（Ｄ２９７Ｙ、Ｒ３００Ｃ、Ｒ３００Ｐ、およびＫ３０１Ｅ）は、アラニンスキャニングによって同定可能ではなく、未だ明瞭ではないが、ｍＡｂ  ８０６エピトープのエネルギー的に重要な成分を形成する。平均６〜７のアミノ酸置換が単一ヌクレオチド突然変異誘発によって利用可能であるため、より大きな範囲の物理化学的多様性が、アラニンスキャニングと比較してサンプリングできる。しかしながら、７５ｎＭにおける低下したｍＡｂ  ８０６標識を除いて、未変化ｃ−ｍｙｃ免疫蛍光標識強度を持つ突然変異体は、抗体に対する低下した親和性を有すると推定することができる。７５ｎＭにおけるｍＡｂ８０６標識を特定の親和定数と定量的に相関させるために、酵母の表面の力価測定を３つのＥＧＦＲ断片で行って、野生型２７３−６２１（＋＋）、Ｃ２８７Ｒ（＋）、およびＥ２９３Ｋ（−）についてｍＡｂ８０６の見掛けの解離定数を測定した。結果を図１９に示す。酵母表面にディスプレイされた野生型２７３−６２１についてのｍＡｂ８０６の解離定数は２．１３ｎＭ（１．８３ｎＭ〜２．５０ｎＭの６８％信頼区間）であり、これは、ＥＧＦＲ  ｖＩＩＩを発現する細胞へのｍＡｂ  ８０６結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析によって見出された親和性と一致する（１９）。Ｃ２８７Ｒ置換はこの解離定数を１２７ｎＭまで上昇させ（１０３ｎＭ〜１６０ｎＭの６８％信頼区間）、これは、野生型と比較した場合に＋２．４ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔΔＧ値を与え、アラニンスキャニング項目においては、結合の中間的な喪失である（３６）。Ｅ２９３Ｋ置換は、＋５．７ｋｃａｌ／ｍｏｌのΔΔＧに対応する少なくとも３０ｍＭのＫｄ値に導き、これは、結合に対する「ホットスポット」を示す。前記ΔΔＧ値は、これらの突然変異の相対的エネルギー的重要性を用いて、７５ｎＭ  ８０６におけるそれらの結合スコア（＋＋、＋、または−）に基づいて他の突然変異体のエネルギー的重要性を大まかに見積もることができる。
【０２８２】
【表７】
2008501308.tif 000032
（ｍＡｂ  ８０６エピトープは連結される）
ｍＡｂ  ８０６結合についてエネルギー的に重要なものとして同定された残基を図２０に示す。これらの残基は、ループ２８７−３０２の１つの面でクラスターを形成し、これは、これらの残基がｍＡｂ  ８０６エピトープであることを示す。興味深いことには、Ｖａｌ２９９はこれらの残基の中央に位置するが、ライブラリーまたはアラニンスキャンにおいて同定されなかった。それゆえ、Ｖ２９９ＫおよびＶ２９９Ｄ部位特異的突然変異体を作成し、エピトープは影響無くリシン残基を収容できるが、アスパラギン酸置換は検出可能な結合を除去する（表７）。これはさらに、ｍＡｂ  ８０６がループ２８７−３０２のこの面に接触するようであることを示す。ｍＡｂ  ８０６は熱およびＳＤＳ変性ＥＧＦＲに結合し（３４）、これは直線状エピトープを意味し；しかしながら、そのエピトープはライブラリー分析によって示されるように配列中で全部が連続的ではない。これは、Ｇｌｕ２９３の側鎖が他の推定接触面に対してループの一方側から突出することを示す、ループ２８７−３０２の構造の調査によって説明される。ｍＡｂ  ８０６エピトープはジスルフィド結合および２つの塩橋、Ｇｌｕ２９３−Ａｒｇ３００およびＡｓｐ２９７−Ｌｙｓ３０１によって連結される（図２０Ｃ）。これらの連結に関与する全ての６つの残基を、ｍＡｂ  ８０６への結合の喪失のためにライブラリーから単離し、エピトープの連結された性質の重要性を強調する。位置２８７におけるシステインは、結合の中間的喪失をもたらす広範な置換を許容し（表７）、これは、エピトープに対するそのエネルギー的寄与が、抗体に接触することよりもループを連結することから生じ得ることを示す。しかしながら、位置３０２におけるシステインは接触残基である可能性が高く、なぜならば、そのシステインは芳香族性質を持つより大きな残基への置換を許容するのみだからである。自己抑制性ＥＧＦＲモノマー構造の文脈におけるｍＡｂ  ８０６エピトープを図２０Ｄに示す。抗体結合部位は、この立体配座におけるエピトープから部分的にブロックされるようであり、これは、ｍＡｂ  ８０６が可溶性ＥＧＦＲに結合しないが、自己抑制性の立体配座から乱された「非連結」ＥＧＦＲ突然変異体に結合するという観察と一致する（３４）。
【０２８３】
（考察）
本研究は、酵母細胞表面でディスプレイされたランダムに突然変異誘発された抗原のスクリーニングを用いる、優れたエピトープマッピングの新規な方法を記載する。この方法は、潜在的な接触残基に関する事前の知識なしに複雑な真核生物タンパク質への抗体結合の非直線状エピトープを同定することができる。これらは、ペプチドエピトープマッピング法およびアラニンスキャニングに対するいくつかの利点がある。酵母表面ディスプレイプラットフォームは、各個々の突然変異体を可溶性発現し、精製する必要性を有さずにタンパク質発現を容易にする。突然変異体の特徴付けおよび力価測定もまた酵母の表面で効果的に行われる。この方法は、そのエピトープが三次構造依存性でないｍＡｂ  ８０６についてのエピトープを明確に同定することができた。このため、ｍＡｂ  ８０６への結合の喪失のためのライブラリーから単離された全ての単一突然変異は、単一の可能な抗体接触表面につきとめられた。
【０２８４】
このエピトープマッピング方法を用いて、ｍＡｂ  ８０６は、接触残基として作用するＡｓｐ２９７−Ｃｙｓ３０２、Ｇｌｕ２９３、および恐らくはＣｙｓ２８７を持つ連結されたジスルフィドループ２８７−３０２の１つの面に突き止められた。そのような構造的モチーフは、以前、システインヌースとして記載され、これは、結合特異性において重要なジスルフィド連結された表面露出ループである（３７）。システインヌースは、ウシ呼吸器系シンシチウムウイルスのプロテインＧおよび麻疹ウイルスヘマグルチニンタンパク質を含めた種々のタンパク質についての主な抗原性エピトープとしても同定されている（３８；３９）。これは、ジスルフィド連結ループが好都合な抗原性構造であることを示唆する；それは既に連結されているので、抗原結合の際により小さなエントロピーコストがある。それゆえ、ＥＧＦＲにおける多数の他のジスルフィドループは抗体結合のための潜在的エピトープ標的である。ｍＡｂ  ８０６は、ドメインＩＩ二量体化アームを欠く細胞でのＥＧＦＲへの増大した結合をディスプレイすることが示されている。従って、ｍＡｂ  ８０６は、それが自己抑制性の立体配座から延長されたモノマー立体配座に変化するので受容体の移行性形態に結合すると仮定された（先の実施例および（３４）参照）。ｍＡｂ  ８０６結合の際に、ＥＧＦＲモノマーはもはや二量体化し、受容体を活性化できないと考えられ、これは、その抗腫瘍活性を説明する。ここに示されたｍＡｂ  ８０６エピトープはこの仮説と一致する。そのエピトープは、隣接ドメインＩＩ残基によって不明瞭とされた残基Ｇｌｕ２９３およびＣｙｓ３０２を持つ、自己抑制性のモノマー構造において部分的に接近可能であるに過ぎない（図１９Ｄ）。これらの残基は、立体配座遷移に際して暴露されるようになり得、ｍＡｂ  ８０６の結合を可能にする。１つのＥＧＦＲモノマーのｍＡｂ  ８０６エピトープは、ＥＧＦＲダイマー構造における他のモノマーに隣接しており、このエピトープへの抗体結合は立体的にＥＧＦＲ二量体化を妨げることができた。
【０２８５】
（材料および方法）
（エピトープマッピングライブラリーの構築および発現）
Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＧｅｎｅＭｏｒｐｈ（登録商標）ランダム突然変異誘発キットを用いてエピトープマッピングライブラリーを構築して、低突然変異誘発率を得た。ライブラリー構築で用いた鋳型は、酵母ディスプレイのために挿入された、ジスルフィド誤対合を妨げるためのＣ２８３Ａ突然変異を持つ、ＥＧＦＲ断片２７３−６２１を含有するｐＣＴ３０２骨格であった（２７）。Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｉａｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用い、ＰＣＲ産物をゲル精製し、抽出した。ライブラリーを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）遺伝子Ｐｕｌｓｅｒトランスフェクション装置を用いるエレクトロポレーション（４０）および相同組換え（４１）によってＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  Ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株ＥＢＹ１００（２８）に形質転換した。最終的なライブラリーは、ＺｙｍｏｐｒｅｐＴＭ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いるプラスミド回収および１００ライブラリークローンの配列決定（ＭＩＴ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって示されるように、ＥＧＦＲ断片に対するアミノ酸変化の大まかなポアソン分布を含んだ。酵母表面を用いるライブラリーの成長および発現は以前に記載されているように行った（２８）。
【０２８６】
（ライブラリーの標識および分類）
抗ヒトＥＧＦＲマウスモノクローナル抗体８０６は、一般に、Ｌｕｄｗｉｇ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈによって提供された。抗ｃ−ｍｙｃニワトリＩｇＹ画分を、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）から購入した。適当な数の酵母細胞（少なくとも１０×ライブラリーサイズ）をＦＡＣＳ緩衝液（１ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含有するリン酸緩衝化生理食塩水）で処理した。細胞を４μｇ／ｍＬの抗ｃ−ｍｙｃニワトリＩｇＹおよび適当な濃度のｍＡｂと共に２５℃にて３０分間インキュベートした。次いで、細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１：２５希釈フィコエリスリン標識したヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ）および１：１００希釈Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）と共に４℃にて３０分間インキュベートした。標識された細胞を濯ぎ、ＭＩＴフローサイトメトリーコア施設においてＭｏＦｌｏ  ＦＡＣＳマシーンを用いて細胞ライブラリーを分類した。
【０２８７】
（単一クローンの同定および試験）
分類されたライブラリー集団からのプラスミドを、ＺｙｍｏｐｒｅｐＴＭを用いて回収し、ＭＩＴ  Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙにおいて配列決定した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）部位特異的突然変異誘発（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて部位特異的突然変異体を作成した。ＥＺ酵母形質転換（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を用いて単一クローンを酵母に形質転換し、最小培地（酵母窒素塩基、カゼイン加水分解物、デキストロース、およびリン酸緩衝液ｐＨ７．４）中で一晩増殖させた。酵母表面タンパク質の発現を、ガラクトースを含む最小培地に移し、一晩インキュベートすることによって誘導した。各クローンについては、抗ｃ−ｍｙｃニワトリＩｇＹ、適当なｍＡｂおよび二次蛍光抗体で、上記のように、１×１０６細胞を標識した。蛍光データは、Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて得られ、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  ＳｕｍｍｉｔＴＭソフトウェアを用いて分析した。
【０２８８】
（ｍＡｂ８０６に対するＥＧＦＲ断片の力価測定）
細胞を上記のように増殖させ、誘導した。１×１０６細胞は、上記のように、適当な濃度のｍＡｂ  ８０６、抗ｃ−ｍｙｃニワトリＩｇＹ、および二次蛍光抗体を用いて標識した。ｃ−ｍｙｃ陽性酵母の蛍光データはＣｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ  ＸＬフローサイトメーターを用いて得られ、最大および最小平均蛍光強度によって正規化した。結合相互作用は、リガンド欠失のない単一部位結合モデルであると推定された。力価測定データは方程式：
【０２８９】
【化３３】
2008501308.tif 000033
（式中、ｆｍＡｂは酵母表面でディスプレイされたＥＧＦＲ２７３−６２１へのｍＡｂ  ８０６の部分的結合であり、［ｍＡｂ］はｍＡｂ  ８０６の濃度であり、Ｋｄは見掛けの解離定数である）
にフィットさせた。これらのデータセットの全体的フィットはＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌを用いて行い、６８％信頼区間は（４２）に従って計算した。
【０２９０】
（タンパク質イメージおよび表面積の計算）
全てのＥＧＦＲタンパク質イメージは、ＰｙＭＯＬソフトウェア（ｐｙｍｏｌ．ｏｒｇにおけるＤｅＬａｎｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＬＬＣ）を用いて作成した。ＥＧＦＲ（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＮＱＬ）の各残基の溶媒接近可能表面積はＧｅｔａｒｅａ  １．１（ｓｃｓｂ．ｕｔｍｂ．ｅｄｕ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ｇｅｔ ａ ｆｏｒｍ．ｔｃｌにおけるＳｅａｌｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｘａｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｒａｎｃｈ）を用いて計算した。１．０のウォータープローブサイズを用いて、表面にあるＥＧＦ接触残基の正しい同定を可能とした。２０以上の値を持つ残基を表面残基とみなした。
【０２９１】
（参考文献）
【０２９２】
【化３４】
2008501308.tif 000034
【０２９３】
【化３５】
2008501308.tif 000035
【０２９４】
【化３６】
2008501308.tif 000036
【０２９５】
【化３７】
2008501308.tif 000037
【０２９６】
【化３８】
2008501308.tif 000038
【０２９７】
【化３９】
2008501308.tif 000039
本発明は、その精神または本質的特徴を逸脱することなく、他の形式で具体化でき、他の方法で実施することができる。従って、本開示は、全ての態様において例示的であると考えられ、限定するものではなく、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によって示され、等価物の意味および範囲内にある全ての変更は、そこに含まれることを意図する。種々の文献が本明細書全体にわたって引用されるが、その各々はその全体が参考として本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０２９８】
【図１】ｍＡｂ８０６とＥＧＦＲのフラグメントとの反応性。ＥＧＦＲの可溶性フラグメント（１〜５１３および３１０〜５０１）、または増殖ホルモン／ＥＧＦＲフラグメント融合タンパク質（ＧＨ−２７４−５０１、ＧＨ−２８２−５０１、ＧＨ−２９０−５０１およびＧＨ−２９８−５０１）を含有する細胞溶解物を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、膜に移動し、ｍＡｂ８０６（左側パネル）または抗−ｍｙｃ抗体９Ｂ１１（右側パネル）で免疫ブロットした。
【図２Ａ】ｍＡｂ８０６と、酵母上にディスプレイされたＥＧＦＲのフラグメントとの反応性。Ａ、酵母ディスプレイＥＧＦＲフラグメントのｍＡｂ８０６標識の平均蛍光シグナルを示す代表的なフローサイトメトリーヒストグラム。酵母ディスプレイでは、あるパーセンテージの細胞はそれらの表面にタンパク質を発現せず、その結果、２つのヒストグラムピークがもたらされる。ｍＡｂ８０６は、誘導されないネガティブコントロールに結合しない。
【図２Ｂ】ｍＡｂ８０６と、酵母でディスプレイされたＥＧＦＲのフラグメントとの反応性。Ｂ、１〜５０１ＥＧＦＲフラグメントは、酵母ペレットを３０分間で８０℃まで加熱することによって変性した。１〜５０１フラグメント上の直線ｃ−ｍｙｃ  Ｃ−末端は依然として９Ｅ１０抗体によって認識され、これは、加熱処理が酵母表面ディスプレイフラグメントを含まないことを示す。立体配座感受性ｍＡｂ２２５を用いて、変性を確認した。
【図３Ａ】ＥＧＦＲ誘導ペプチドとのｍＡｂ８０６結合の阻害。Ａ、１〜５０１およびＧＨ−２７４−５０１ＥＧＦＲフラグメントを、２８７−３０２ＥＧＦＲペプチドの存在下または非存在下において、図１に記載したようにｍＡｂ８０６で免疫ブロットした（上方パネル）。ＥＧＦＲフラグメントの存在は、膜をストリップし、抗−ｍｙｃで再度プローブすることによって、ｍＡｂ８０６免疫ブロッティング後に確認した。
【図３Ｂ】ＥＧＦＲ誘導ペプチドとのｍＡｂ８０６結合の阻害。Ｂ、ＥＬＩＳＡプレートを１〜５０１ＥＧＦＲフラグメントでコートし、次いで、増大させる濃度の２８７〜３０２または２８７〜２９８ＥＧＦＲペプチドの存在下でｍＡｂ８０６と共にインキュベートした。データは平均Ａ４０５±ＳＤとして表す。
【図４】化学修飾された２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチドとのｍＡｂ８０６結合の阻害。Ａ、ＥＬＩＳＡプレートを５０１−Ｆｃでコーティングし、次いで、増大させる濃度の酸化された、還元されたおよびエージングした（実験手法に記載したように調製）２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチドの存在下でｍＡｂ８０６と共にインキュベートした。データは平均パーセンテージ阻害±ＳＤとして表す（誤差棒は非常に小さいので見えない）。Ｂ、ＥＬＩＳＡプレートを５０１−Ｆｃでコーティングし、次いで、増大させる濃度のＳ−カルボキシメチル化２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチド、または２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチドのＣＮＢｒ切断から生じたＮ−末端（ＣＧＡＤＳＹＥＭ）（配列番号：）およびＣ−末端（ＥＥＧＶＲＫＣ）（配列番号：）ペプチドの存在下でｍＡｂ８０６と共にインキュベートした。データは平均パーセンテージ阻害±ＳＤとして表す（誤差棒は余りにも小さいので目で見えない）。
【図５】ＢＩＡｃｏｒｅによるペプチドへのｍＡｂ８０６結合の分析。Ａ、２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチドをチオールカップリングによって表面に固定化し、ｍＡｂ８０６抗体を濃度を増大させつつ通過させた（３１．２５、６２．５、１２５、２５０、５００および１０００ｎＭ）。次いで、Ｓｃａｔｃｈａｒｄ分析によって結合親和性を測定した（インサート）。Ｂ、２８７〜３０２ＥＧＦＲペプチドをアミンカップリングによって表面に固定化し、５００ｎＭの濃度のｍＡｂ８０６抗体を、２８７〜３０２（上方パネル）、２８７〜２９８（中央パネル）または２８７〜３０１（下方パネル）ＥＧＦＲペプチド（５および１０μＭ）の存在下で表面を通過させた。
【図６】ＥＧＦＲ構造内でのｍＡｂ８０６エピトープのつきとめ。Ａ、ｍＡｂ８０６エピトープを含有するシステインループの構造を示す炭素追跡。Ｂ、ＥＧＦＲのリガンド−結合ダイマー形態の空間充填モデル。ダイマーは、各ＥＧＦＲ分子のＣＲ１−ループでつきとめられた２つの二量体化アームによって圧倒的に安定化される。Ｃ、二量体化を妨げる、ドメインＣＲ１およびＣＲ２の間の自動阻害相互作用を示すＥＧＦＲの連結された形態。Ｄ、毒され、隣接分子上の第二のループとの相互作用の準備ができたＣＲ１−ループの二量体化アーム（左側図面）を明瞭に示すＥＧＦＲの拡張された（移行性）形態。色：ＥＧＦリガンドはオレンジ色で示され；アミノ酸５７９におけるグリコシル化部位は赤色で示され、ｍＡｂ８０６エピトープは紫色で示される。ＥＧＦＲ構造（３１、３５、３６）および可能な受容体活性化メカニズムは既に詳細に記載されている。
【図７】ＥＧＦＲのＣＲ１−ループ欠失を発現する２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。少量の内因性野生型ＥＧＦＲを発現する親２９３細胞をｄｅ２−７ＥＧＦＲまたはｄｅＣＲ１−ループＥＧＦＲ（２つの独立したクローン）でトランスフェクトし、無関係ＩｇＧ２ｂ抗体（塗り潰ぶしていないヒストグラム）、ｍＡｂ５２８（黒色ヒストグラム）、またはｍＡｂ８０６（灰色ヒストグラム）いずれかで染色した。
【図８Ａ】Ａ、ｍＡｂ８０６の可能な抗腫瘍メカニズム。ｍＡｂ８０６は不活性なＥＧＦＲに結合できないが、受容体が連結解除されるにつれ、ｍＡｂ８０６エピトープは露出されるようになり、抗体に結合できる。受容体へのｍＡｂ８０６の結合はほとんど確実に二量体化を妨げ、よって、ＥＧＦＲシグナル伝達を妨げ、ＥＧＦＲ内在化を誘導することができる。
【図８Ｂ】Ｂ、ＥｒｂＢ３およびＥｒｂＢ４においてシステインループを含有するｍＡｂ８０６のホモロジー。ＥｒｂＢ１に保存されたアミノ酸は赤色で示され、電荷の保存を呈する残基は緑色で示される。
【図８Ｃ】Ｃ、ＣＲ１−ＣＲ２ダイマー界面。Ｎ５７９に付着した第一の炭水化物部位は結晶構造中に明瞭に目に見え、ＣＲ１−ＣＲ２ダイマー界面に位置する。ＥＧＦＲを過剰発現する細胞においては、この部位は経時的に８０％グリコシル化されるに過ぎない。グリコシル化の差は連結のダイナミックス、よって、ｍＡｂ８０６の反応性に影響し得る。
【図９】Ａ）ｈＥＧＦＲドメイン構造の、および本発明研究のために構築された突然変異の模式図。略語：Ｌ、リガンド結合ドメイン；ＣＲ、システイン−リッチのドメイン；ＪＭ、膜近接ドメイン；Ｃ−Ｔ、カルボキシ−末端ドメイン。Ｂ）上方パネル：（Ｇａｒｒｅｔｔ  ら、．，２００２からの）ＴＧＦαを有する複合体におけるＥＧＦＲ  ＥＣＤ（１〜５０１）の未連結ダイマー形態のリボンダイヤグラム。ＥＧＦＲ分子は、青色および緑色に着色され；結合したＴＧＦα分子は紫色に着色される。（後に記載する）ｍＡｂ８０６に対するエピトープはピンク色に着色される。下方パネル：（Ｆｅｒｇｏｓｏｎら、２００３からの）ＥＧＦＲ  ＥＣＤ（１〜６２１）の連結形態のリボンダイヤグラム。ＣＲ２ドメイン（ａａ５０１〜６２１）は黄色で示される。双方のパネルにおいて、インサートは未連結立体配座のＣＲ１−ループの間、または未連結立体配座におけるＣＲ１−ループおよびＣＲ２ドメインの間の相互作用を強調する。構築体において突然変異したアミノ酸はインサートにおいて示される。密接したファンデルワールス接触した原子は点線によって結合され、Ｈ−結合はダッシュ線によって表される。
【図１０】野生型または突然変異体ＥＧＦＲを安定に発現するＢａＦ／３細胞系のＦＡＣＳ分析。実験手法に詳細に記載したように、細胞をｍＡｂ５２８と共にインキュベートし、続いて、Ａｌｅｘａ４８  ８標識抗マウスＩｇと共にインキュベートした。プロットは横軸の蛍光強度、および縦軸の蛍光チャネル当たりの細胞数を表す。ネガティブコントロール（無関係抗体）蛍光は明るい茶色の重なりとして各パネルでプロットされる。
【図１１】野生型および突然変異体受容体に対するＥＧＦ結合のＳｃａｔｃｈａｒｄ分析。リガンド結合親和性は、未標識ＥＧＦとの競合によって固定した濃度の１２５Ｉ−ＥＧＦにおいて測定した（実験手法参照）。プロットは、ＲａｄＬｉｇプログラム（ＢｉｏＳｏｆｔ）の「Ｋｅｌｌ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）」バージョンを用いて生データから作成した。
【図１２】野生型および突然変異体ＥＧＦＲの二量体化、および受容体複合体の特異的ホスホチロシン含有量。休止細胞をＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ，１６ｎＭ）またはコントロール緩衝液で処理した。ホモ二機能的細胞−不浸透性架橋剤ＢＳ３を直ちに加え、室温にてインキュベーションを３０分間継続した。反応をクエンチした後、細胞を溶解させ、細胞タンパク質をＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分離し、免疫ブロッティング用のＰＶＤＦ幕に移した。Ａ）ＥＧＦＲタンパク質（頂部）およびホスホチロシン（底部）の免疫検出。ＰＶＤＦ膜をホスホチロシン抗体への露出の後にストリップし、抗−ＥＧＦＲ抗体で再度プローブした。Ｂ）実験手法に記載した定量的走査デンシトメトリーによって測定された、ＥＧＦ刺激の有りおよび無しでの合計ＥＧＦＲ（ダイマー＋モノマー）に対するダイマーの比率。Ｃ）前記した定量的走査デンシトメトリーによって決定された、ＥＧＦＲモノマーおよびダイマータンパク質に対するホスホチロシン含有量の比率。
【図１３】リガンド−依存性チロシンリン酸化およびＭＡＰＫ活性化。Ａ）休止細胞を室温にてＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍＬ）に１０分間露出し、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液中で直接溶解させた。タンパク質を４〜１２％ゲルで分離し、ＰＶＤＦ膜に移し、ホスホチロシン（頂部）またはホスホ−ＭＡＰＫ（底部）に対する抗体でプローブした。ブロットをストリップし、各々抗−ＥＧＦＲ抗体（抗ＭＡＰＫ抗体で再度プローブして（示さず）、実験手法に記載した特異的タンパク質リン酸化の測定を可能とした。Ｂ）野生型および突然変異体受容体についてのＥＧＦＲタンパク質に対するホスホチロシンの比率。Ｃ）合計ＭＡＰＫタンパク質に対するホスホ−ＭＡＰＫの比率。
【図１４】ＣＲ２突然変異体におけるＥＧＦＲ活性化の用量応答。野生型またはＣＲ２−突然変異体受容体を発現させる細胞を増殖因子血清回収によって静止させ、次いで、コントロール緩衝液、または増大させる濃度のＥＧＦ（０．０３〜１００ｎＭ）に露出した。Ａ）：合計細胞溶解物は４〜１２％グラジエントゲルでのＳＤＳ／ＰＡＧＥ、続いて、抗−ホスホチロシン、抗−ＥＧＦＲまたは抗−ホスホ−ＭＡＰＫ抗体での免疫ブロッティングによって分析した。Ｂ）およびＣ）：フィルムを反応性バンドのデンシトメーター定量につき走査し、ホスホ−Ｓｈｃおよびホスホ−ＭＡＰＫデータはＥＧＦ濃度に対する％最大バンド強度としてプロットした。記号は：塗り潰ぶした丸、野生型ＥＧＦＲ；暗い三角、Ｄ５６３Ｈ−ＥＧＦＲ；明るい三角形、Ｖ５３８Ｄ−ＥＧＦＲ；塗り潰ぶしていない四角形、Ｅ５７８Ｃ−ＥＧＦＲ。
【図１５】野生型または突然変異体ＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞のＥＧＦに対するマイトジェニック応答。コントロール緩衝液（白丸）または増大させる濃度のＥＧＦ（黒丸）で処理した細胞への［３Ｈ］チミジン取り込みは実験手法に記載したように測定した。
【図１６】ＣＲ１−ループを欠くＥＧＦＲを発現するＢａＦ／３細胞へのｍＡｂ５２８およびｍＡｂ８０６抗体結合の比較。野生型、Δ２−７またはΔ−ＣＲ１−ループＥＧＦＲを発現する細胞を、図２に記載したようにｍＡｂ５２８（暗い線）またはｍＡｂ８０６（塗り潰ぶした灰色）いずれかで染色し、ＦＡＣＳｃａｎで分析した。各ピークについてのメジアン蛍光チャネルは、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔにおいて統計学的分析ソフトウェアを用いて決定し、これを用いて、２つの抗体の間の比率を計算した。無関係のクラスがマッチした抗体のコントロール蛍光は、点線の重なりとして表す。
【図１７】ＥＧＦＲの立体配座および活性化。ＥＧＦＲは低親和性から高親和性状態への転移の間における主な立体配座変化を受ける。低親和性立体配座（Ａ）は、２つのシステイン−リッチのドメインＣＲ１およびＣＲ２の間の分子内相互作用によって連結される。連結されたモノマー（Ａ）は連結されたダイマー（Ｂ）または高親和性未連結モノマー（Ｆ）いずれかと平衡している。膜貫通（ＴＭ）および／またはキナーゼドメインは、連結されたダイマー（Ｂ）および未連結ダイマー（Ｃ）の形成を駆動するようである。連結されたダイマー（Ｂ）はＥＣＤおよびキナーゼドメインの間の分子間接触を有するイラストで示す。受容体の連結された形態は低親和性である。未連結モノマーおよびダイマーはより高い親和性を示す。未連結ダイマーの細胞内キナーゼドメインは、リガンド（例えば、ＥＧＦまたはＴＧＦ−α結合がダイマー−リガンド複合体（Ｄ）におけるさらなる再配位を誘導するまで活性化されない。受容体−リガンド複合体は、より高次のオリゴマー（例えば、テトラマーＥ）を形成できる。リガンド結合親和性は内から外へのシグナル伝達（例えば、ＡＴＰ）によってさらに変調される。リガンド結合および二量体化／オリゴマー化は、キナーゼ活性化および基質のリン酸化に導くが、受容体のシグナル伝達もまた内在化、分解および脱リン酸化によってやはり調節される。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｄは、酵母表面にディスプレイされたＥＧＦＲフラグメント２７３〜６２１へのｍＡｂ８０６結合についてのフローサイトメトリーデータを示す。ｃ−ｍｙｃタグによって検出されるＥＧＦＲディスプレイ蛍光は縦軸に示され、ｍＡｂ８０６結合は横軸に示される。（Ａ）ソート１（１０ｎＭ  ｎＡｂ８０６）およびソート２（７５ｎＭ）であり、ソートゲートは実線で示される。（Ｂ）〜（Ｄ）７５ｎＭにおける（Ｂ）、＋（Ｃ）および＋＋（Ｄ）結合、および陽性およびネガティブコントロールの代表的突然変異体。ＷＴ＝野生型ＥＧＦＲ２７３〜６２１。
【図１９】図１９は、酵母表面にディスプレイされたＥＧＦＲ２７３〜６２１および突然変異体に対するｍＡＢ８０６の力価測定を示す。黒色、野生型（＋＋）；暗い灰色、Ｃ２８７Ｒ（＋）；明るい灰色、Ｅ２９３Ｋ（−）。単一部位結合モデルへの全体的フィットは、データの３つの独立した組で行った（四角形、三角形および菱形は別々の組を表す）。
【図２０】ｍＡｂ８０６エピトープ。（Ａ〜Ｂ）ＥＧＦＲ−ＥＧＦダイマー構造の鎖におけるエピトープの前面図および逆面図（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＩＶＯ）。ダイマー構造が用いられる。なぜならば、Ｇｌｕ２９３はモノマー構造では分解されないからである。（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＮＱＬ）。色で示した残基は、結合の喪失のためにライブラリーから単離された突然変異体である。赤色、アラニン置換に際して結合の喪失をやはり引き起こす残基；オレンジ色、引き起こさない残基；灰色、ライブラリーから単離されず、アラニン置換に際して結合の喪失を呈しない残基。（Ｃ）エピトープはジスルフィド結合および２つの塩ブリッジによって拘束される（Ｇｌｕ２９３−Ａｒｇ３００およびＡｓｐ２９７−Ｌｙｓ３０１）。負に荷電した残基、赤色；正、青色；システイン、黄色。イメージは、ダイマー構造における双方のＥＧＦＲ分子上の残基２８７〜３０２を含む（ＰＤＢ  ＩＤ  １ＩＶＯ）。（Ｄ）（Ａ）におけるように着色した自動阻害されたＥＧＦＲモノマーにおけるｍＡＢ８０６エピトープ、ＥＧＦＲの残りは青色である。
【図１】
2008501308.tif 000050
【図２Ａ】
2008501308.tif 000051
【図２Ｂ】
2008501308.tif 000052
【図３Ａ】
2008501308.tif 000053
【図３Ｂ】
2008501308.tif 000054
【図４】
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【図５】
2008501308.tif 000056
【図６】
2008501308.tif 000057
【図７】
2008501308.tif 000058
【図８Ａ】
2008501308.tif 000059
【図８Ｂ】
2008501308.tif 000060
【図８Ｃ】
2008501308.tif 000061
【図９】
2008501308.tif 000062
【図１０】
2008501308.tif 000063
【図１１】
2008501308.tif 000064
【図１２】
2008501308.tif 000065
【図１３】
2008501308.tif 000066
【図１４】
2008501308.tif 000067
【図１５】
2008501308.tif 000068
【図１６】
2008501308.tif 000069
【図１７】
2008501308.tif 000070
【図１８】
2008501308.tif 000071
【図１９】
2008501308.tif 000072
【図２０】
2008501308.tif 000073
【配列表】
2008501308000001.app
【国際調査報告】
2008501308.tif 000074
2008501308.tif 000075