(57)【要約】  本発明は、RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドを提供する。本発明は、RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドをさらに提供する。加えて、本発明は、関連した核酸、ベクター細胞および方法を提供する。【選択図】      図1【特許請求の範囲】
【請求項１】
RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチド。
【請求項２】
RAGEがヒトRAGEである、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
ポリペプチドが単離されている、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項４】
（a）RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部と（b）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項５】
RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチド。
【請求項６】
ポリペプチドがDiaphanousのFH1ドメインの全てまたは一部から本質的になる、請求項5に記載のポリペプチド。
【請求項７】
DiaphanousがヒトDiaphanousである、請求項5に記載のポリペプチド。
【請求項８】
ポリペプチドが単離されている、請求項5に記載のポリペプチド。
【請求項９】
（a）RAGEの細胞質ドメインに結合するDiaphanousの一部と（b）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１１】
RAGEがヒトRAGEである、請求項10に記載の核酸。
【請求項１２】
核酸が単離されている、請求項10に記載の核酸。
【請求項１３】
RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドをコードする核酸。
【請求項１４】
ポリペプチドがDiaphanousのFH1ドメインの全てまたは一部から本質的になる、請求項13に記載の核酸。
【請求項１５】
DiaphanousがヒトDiaphanousである、請求項13に記載の核酸。
【請求項１６】
核酸が単離されている、請求項13に記載の核酸。
【請求項１７】
RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター。
【請求項１８】
請求項17に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項１９】
細胞が細菌、両生類、酵母、真菌、昆虫または哺乳動物細胞である、請求項18に記載の細胞。
【請求項２０】
RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousのドメインから本質的になるポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクター。
【請求項２１】
請求項20に記載の発現ベクターを含む細胞。
【請求項２２】
細胞が、細菌、両生類、酵母、真菌、昆虫または哺乳動物細胞である、請求項21に記載の細胞。
【請求項２３】
DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害するための方法であって、DiaphanousおよびRAGEの細胞質ドメインを、適切な条件下で、それらの間の結合を阻害する薬剤と接触させることを含む方法。
【請求項２４】
薬剤がRAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドである、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
RAGEがヒトRAGEである、請求項23に記載の方法。
【請求項２６】
薬剤がRAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドである、請求項23に記載の方法。
【請求項２７】
ポリペプチドがDiaphanousのFH1ドメインの全てまたは一部から本質的になる、請求項26に記載の方法。
【請求項２８】
DiaphanousがヒトDiaphanousである、請求項23に記載の方法。
【請求項２９】
薬剤が（i）RAGEの細胞質ドメインの全てもしくは一部から本質的になるポリペプチド、または、（ii）RAGEの細胞質ドメインに結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドの擬態である、請求項23に記載の方法。
【請求項３０】
DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害する薬剤を同定するための方法であって、：
（a）DiaphanousおよびRAGEの細胞質ドメインを、薬剤の非存在下であればDiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を可能にするであろう条件下で、薬剤と接触させることと；
（b）適切な期間の後、RAGEの細胞質ドメインに結合したDiaphanousの量を決定することと；および、
（c）工程（b）において決定されたRAGEの細胞質ドメインに結合したDiaphanousの量を、薬剤の非存在下でRAGEの細胞質ドメインに結合したDiaphanousの量と比較することとを含み、それにより、薬剤の存在下における結合の量が低いほど、薬剤がDiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害することを示す方法。
【請求項３１】
薬剤がポリペプチド、核酸および有機分子からなる群より選択される、請求項30に記載の方法。
【請求項３２】
RAGE関連障害を、それにかかった被験体において治療するための方法であって、DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害する薬剤の治療上有効な量を被験体に投与することを含む方法。
【請求項３３】
RAGE関連障害が、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、敗血症、移植拒絶反応、喘息、関節炎、腫瘍成長、癌、転移、糖尿病による合併症、網膜症、神経障害、腎症、性交不能、創傷治癒障害、胃不全麻痺、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、新生内膜形成、アミロイド血管障害、炎症、糸球体障害および発作により誘導されるニューロン損傷からなる群より選択される、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
被験体がヒトである、請求項32に記載の方法。
【請求項３５】
薬剤がRAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドである、請求項32に記載の方法。
【請求項３６】
RAGEがヒトRAGEである、請求項35に記載の方法。
【請求項３７】
薬剤が、RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドである、請求項32に記載の方法。
【請求項３８】
ポリペプチドがDiaphanousのFH1ドメインの全てまたは一部から本質的になる、請求項37に記載の方法。
【請求項３９】
DiaphanousがヒトDiaphanousである、請求項37に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【出願の経緯】
【０００１】
本出願は、2005年3月17日に出願された米国仮出願第60/662,618号の利益を主張し、その内容は、参照により本明細書によって本出願に援用される。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所からの米国政府助成金番号CA87677およびHL60901の援助によりなされた。従って、米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
本出願の全体にわたって、種々の刊行物が参照されている。これらの刊行物の完全な引用は、特許請求の範囲の直前に見つけられるであろう。これらの刊行物の開示は、本明細書に記述されおよび主張された本発明の日付の時点の技術水準をより完全に記述するために、本明細書により、参照によって本出願に援用される。
【発明の背景】
【０００４】
哺乳動物のDiaphanousタンパク質は、最初にハエの細胞質分裂の媒介におけるその重要な役割について記述された、ショウジョウバエの遺伝子Diaphanousの産物の相同分子種である。Lynchおよび共同研究者らは、哺乳動物の相同分子種を同定して、ヒトDiaphanousをコードする遺伝子の突然変異が無症候性聴覚障害を引き起こすことを示した。現在まで、これは、本分子が関係したことを記載する唯一のヒト「疾患」である。
【０００５】
Diaphanousの生物学は、タンパク質Diaphanousを構成するドメインに基づく。最初に、自己活性化ドメインがあり；これにRho結合ドメインが続き、続いてFH1、最後にFH2ドメイン（FH = formin相同性）が続く。これらのドメインの機能に基づいたDiaphanousの重要な生物学的性質を以下に記述してある。
【０００６】
最初に、Diaphanousは、プロフィリンのリガンドであり、Rho GTPaseの標的であり-これらの経路の重要な役割は、活性化細胞骨格の重合に関係している。これらの考察は、この分子の必須な機能が、細胞の運動性および遊走に関与するシグナル経路（Rho GTPase）を架橋することであることを示している。
【０００７】
第2に、最近の研究は、アクチン細胞骨格におけるこれらの役割に加えて、Diaphanousの具体的機能が微小管の制御であることを示唆している。微小管は、細胞の安定化およびさらにアクチン細胞骨格との相互作用という基本的側面において中心的役割を果たす。微小管は、（適応免疫応答における炎症細胞などとの）細胞-細胞接触の重要な生物学的機能に関与する。
【０００８】
第3に、Diaphanousは、Rho結合ドメインを含む。これらのRho GTPaseの一つは、rac 1である。Rac 1は、アクチン細胞骨格との相互作用に関与するだけでなく、それは酵素NADPH酸化酵素の重要な構成成分でもある。この酵素は、複数の成分を含み、それが作用するためには、これらが細胞表面で完全に構築されなければならない。NADPH酸化酵素は、活性酸素種を発生することによって機能する。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドを提供する。
【００１０】
また、本発明は、（a）RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部と（b）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００１１】
本発明は、RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドをさらに提供する。
【００１２】
本発明は、（a）RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部と（b）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドをコードする核酸をさらに提供する。
【００１４】
本発明は、RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部分から本質的になるポリペプチドをコードする核酸をさらに提供する。
【００１５】
本発明は、RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターをさらに提供する。
【００１６】
本発明は、RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousのドメインから本質的になるポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターをさらに提供する。
【００１７】
本発明は、DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害するための方法であって、DiaphanousおよびRAGEの細胞質ドメインを、適切な条件下でそれらの間の結合を阻害する薬剤と接触させることを含む方法をさらに提供する。
【００１８】
本発明は、DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害する薬剤を同定するための方法であって、（a）DiaphanousおよびRAGEの細胞質ドメインを、薬剤の非存在下であればDiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を可能にするであろう条件下で、薬剤と接触させることと、（b）適切な期間の後、RAGEの細胞質ドメインに結合したDiaphanousの量を決定することと、（c）工程（b）で決定されたRAGEの細胞質ドメインに結合したDiaphanousの量を、薬剤の非存在下でRAGEの細胞質ドメインに結合したDiaphanousの量と比較することとを含み、それにより、薬剤存在下における結合量が低いほど、その薬剤がDiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害することを示す方法をさらに提供する。
【００１９】
最後に、本発明は、RAGE関連障害を、それにかかった被験体において治療するための方法であって、DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害する薬剤の治療上有効な量を被験体に投与する方法を提供する。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
用語
薬剤を「投与すること」は、当業者に公知の、種々の方法および送達系のいずれを使用しても行うことができる。投与することは、たとえば静脈内に、経口的に、経鼻的に、脳脊髄液を介して、移植組織を介して、経粘膜的に、経皮的に、筋肉内に、および皮下に行うことができる。多数の日常的に使用される薬学的に許容される担体を使用する以下の送達系は、本方法に従って組成物を投与するために想定される多くの態様の一例に過ぎない。
【００２１】
注射可能な薬剤送達系は、溶液、懸濁液、ゲル、微粒子および重合体の注射剤を含み、また溶解度を変化させる薬剤（たとえば、エタノール、プロピレングリコールおよびショ糖）および重合体（たとえば、ポリカプリルラクトンおよびPLGA）などの賦形剤を含むことができる。移植可能な系は、ロッドおよびディスクを含み、また、PLGAおよびポリカプリルラクトンなどの賦形剤を含むことができる。
【００２２】
経口送達系は、錠剤およびカプセルを含む。これらは、結合剤（たとえば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルピリロドン、その他のセルロース系材料およびデンプン）、希釈剤（たとえば、乳糖およびその他の糖、デンプン、リン酸二カルシウムおよびセルロース系材料）、崩壊剤（たとえば、デンプン重合体およびセルロース系材料）および滑沢剤（たとえば、ステアラートおよびタルク）などの賦形剤を含むことができる。
【００２３】
経粘膜送達系には、パッチ、錠剤、坐薬、膣座薬、ゲルおよびクリームを含み、また可溶化剤および増強剤（たとえば、プロピレングリコール、胆汁酸塩およびアミノ酸）およびその他の媒体（たとえば、ポリエチレングリコール、脂肪酸エステルおよび誘導体、並びにヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびヒアルロン酸などの親水性重合体）などの賦形剤を含むことができる。
【００２４】
経皮送達系は、たとえば水性および非水系のゲル、クリーム、多層乳剤、ミクロエマルジョン、リポソーム、軟膏、水性および非水系の溶液、ローション、エアロゾル、炭化水素基材および粉末を含み、また可溶化剤、浸透増強剤（たとえば、脂肪酸、脂肪酸エステル、脂肪アルコールおよびアミノ酸）および親水性ポリマー（たとえば、ポリカルボフィルおよびポリビニルピロリドン）などの賦形剤を含むことができる。一つの態様において、薬学的に許容される担体は、リポソームまたは経皮増強剤である。
【００２５】
再構成可能な送達系のための溶液、懸濁液および粉末は、懸濁剤（たとえば、ゴム質、ザンタン（zanthans）、セルロース化合物および糖）、湿潤剤（たとえば、ソルビトール）、可溶化剤（たとえば、エタノール、水、PEGおよびプロピレングリコール）、界面活性物質（たとえば、ラウリル硫酸ナトリウム、スパン（Spans）、ツイーン（Tween）およびセチルピリジン）、防腐剤および抗酸化剤（たとえば、パラベン、ビタミンEおよびCおよびアスコルビン酸）、固化防止剤、被覆剤、並びにキレート薬（たとえば、EDTA）などの媒体を含む。
【００２６】
「薬剤」は、グリコ構造単位、タンパク質、抗体、レクチン、核酸、小分子およびこれらのいずれかの組み合わせを含むが、これらに限定されるわけではない、任意の化学実体を意味するものとする。可能性のある薬剤の例は、リボザイム、DNAzymeおよびsiRNA分子を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００２７】
「抗体」は、例えば、天然に存在する、および非天然に存在する抗体の両者を含むだろう。具体的には、この用語には、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体、並びにこれらの抗原結合性断片（たとえば、Fab断片）を含む。さらに、この用語には、キメラ抗体（たとえば、ヒト化した抗体）および完全合成抗体、並びにこれらの抗原結合性断片が含まれる。
【００２８】
「細菌細胞」は、任意の細菌細胞を意味するものとする。細菌細胞の１つの例は、大腸菌（E. coli）である。
【００２９】
一つの態様において、RAGEの細胞質ドメインに関し、「本質的になる」は、RAGEの膜貫通もしくは細胞外ドメインのいずれをも含まないことを意味する。もう一つの態様において、DiaphanousのFH1ドメインに関し、この用語は、Diaphanousの他のいかなる部分も含まないことを意味する。
【００３０】
「サイトゾル」および「細胞質」は、RAGEに関して同義的に使用され、RAGEの末端部分、すなわちヒトRAGEアミノ酸配列のアミノ酸残基364〜404に対応するドメイン（配列QRRQRRGEERKAPENQEEEEERAELNQSEEPEAGESSTGGPの配列を有する；配列番号8）をいう。
【００３１】
「ドメイン」は、ポリペプチドの領域に関して、「部分」と同義的に使用される。
【００３２】
「DNAzyme」は、DNAであるかまたはその触媒成分がDNAであり、DNAまたはRNAでありうる異なる標的核酸配列を特異的に認識して切断する触媒核酸を意味するものとする。それぞれのDNAzymeは、触媒成分（また、「触媒ドメイン」とも呼ばれる）および触媒ドメインの両側に一つずつある2つの結合ドメインからなる標的配列結合成分を有する。
【００３３】
「発現ベクター」は、その核酸が細胞内に配置されると、関心対象の核酸またはタンパク質を発現することができる、関心対象の核酸および／または関心対象のタンパク質をコードする核酸を意味するものとする。たとえば、細菌発現ベクターは、lacプロモーターなどのプロモーター、並びに転写開始のために、シャイン-ダルガーノ配列および開始コドンAUGを含む。同様に、真核生物発現ベクターは、RNAポリメラーゼIIに対する異種または相同プロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンAUGおよびリボソームの分離のための終止コドンを含む。このようなベクターは、商業的に得られてもよく、または当技術分野において周知の方法に記述された配列から構築してもよい。
【００３４】
DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を「阻害すること」は、このような結合の程度を少なくすること、または完全に結合を防げることのいずれかを意味するものとする。一つの態様において、DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害することは、完全に結合を防げることを意味する。
【００３５】
「単離された核酸」は、一つの態様において、その他の核酸を含まない核酸を意味する。もう一つの態様において、RAGEの細胞質ドメインの全てまたはその一部分から本質的になるポリペプチドをコードする被験体核酸は、それが異なるポリペプチドをコードするいずれの核酸も含まないときに単離されている。単離された核酸は、公知の方法を使用して得ることができる。
【００３６】
「哺乳動物細胞」は、任意の哺乳動物細胞を意味するものとする。哺乳動物細胞は、正常な、異常な、および形質転換された細胞を含むが、これらに限定されるわけではなく、およびニューロン、上皮細胞、筋細胞、血液細胞、免疫細胞、幹細胞、骨細胞、内皮細胞および芽球によって例証される。
【００３７】
「核酸」は、DNA（たとえば、cDNA）、RNAおよびこれらのハイブリッドを含む任意の核酸分子を意味するが、これらに限定されるわけではない。核酸分子を形成する核酸塩基は、塩基A、C、G、TおよびU、並びにこれらの誘導体であることができる。これらの塩基の誘導体は、当技術分野において周知であり、PCR Systems, Reagents and Consumables（Perkin Elmer Catalogue 1996-1997, Roche Molecular Systems, Inc., Branchburg, New Jersey, USA）に例証されている。
【００３８】
「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において交換可能に使用され、それぞれ、アミノ酸残基の重合体を意味する。アミノ酸残基は、天然に存在することができ、またはこれらの化学物質類似体であることができる。また、ポリペプチドおよびタンパク質は、グリコシル化、脂質付加、硫酸化、ヒドロキシル化およびADPリボシル化などの修飾を含むことができる。
【００３９】
「RAGE」は、高度に糖化した最終産物のための受容体を意味するものとする。RAGEは、たとえばヒトまたはこのタンパク質を産生するその他の種由来であることができる。RAGEの核酸およびタンパク質（アミノ酸）配列は、公知である（それぞれ、Genbank番号、M91211およびAAA0357）。また、以下の参照文献は、とりわけ、これらの配列を提供する：Schmidt et al, J. Biol. Chem., 267：14987-97（1992）；およびNeeper et al, J. Biol. Chem., 267：14998-15004（1992）。さらなるRAGE配列（DNA配列および翻訳物）は、GenBankから入手可能である。
【００４０】
「RAGE関連疾患」は、原因または症候が、全体的にあるいは部分的に、RAGEによって媒介される任意の疾患を意味する。
【００４１】
「リボザイム」は、RNAであるかまたは触媒成分がRNAであり、DNAまたはRNAでありうる異なる標的核酸配列を特異的に認識して切断する触媒核酸を意味するものとする。それぞれのリボザイムは、触媒成分（また「触媒ドメイン」とも呼ばれる）および触媒ドメインの両側に一つずつある2つの結合ドメインからなる標的配列結合成分を有する。
【００４２】
「siRNA」は、小さな干渉リボ核酸を意味するものとする。標的タンパク質の発現を減少させるためにsiRNAをデザインし、産生する方法は、当技術分野において周知である。
【００４３】
「被験体」は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、モルモットまたはウサギといった任意の動物を意味するものとする。
【００４４】
「治療上有効な量」は、疾患または疾患と関連する合併症にかかった被験体を治療するために十分な量を意味する。治療上有効な量は、治療される被験体、治療される状態、送達される薬剤および送達経路によって変化する。当業者であれば、日常的な滴定実験を行ってこのような量を決定することができる。送達される薬剤に応じて、薬剤の治療上有効な量は、連続ポンプなどにより連続的に、または周期的間隔に（たとえば、一つまたは複数の別々の機会に）送達することができる。特定の薬剤の複数量の所望の時間間隔は、当業者によって過度の実験なしに決定することができる。一つの態様において、治療上有効な量は、1投薬あたり、約1mgの薬剤／被験体〜約1gの薬剤／被験体である。もう一つの態様において、治療上有効な量は、約10mgの薬剤／被験体〜500mgの薬剤／被験体である。さらなる態様において、治療上有効な量は、約50mgの薬剤／被験体〜200mgの薬剤／被験体である。さらなる態様において、治療上有効な量は、約100mgの薬剤／被験体である。さらなる態様において、治療上有効な量は、50mgの薬剤／被験体、100mgの薬剤／被験体、150mgの薬剤／被験体、200mgの薬剤／被験体、250mgの薬剤／被験体、300mgの薬剤／被験体、400mgの薬剤／被験体および500mgの薬剤／被験体から選択される。
【００４５】
疾患を「治療すること」とは、疾患の進行を遅らせ、止め、または逆転させることを意味するものとする。好ましい態様において、疾患を治療することは、疾患の進行を、理想的には疾患自体を除去する程度まで逆転させることを意味する。
【００４６】
本発明の態様
RAGEシグナリングは、細胞活性化において（たとえば、糖尿病性脈管構造において）重要な過程である。そのデータを本明細書に記載した実験では、RAGEの末端部分（すなわち、RAGEの細胞質ドメイン）が、シグナリングおよび運動性に関与する重要な分子であるDiaphanousと相互作用することを証明した。実験には、免疫沈降および共焦点顕微鏡の観察を含む。
【００４７】
具体的には、本発明は、RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドを提供する。好ましい態様において、RAGEは、ヒトRAGEである。もう一つの態様において、ポリペプチドは、単離されている。一つの態様において、RAGEの細胞質ドメインの部分は、長さが少なくとも4アミノ酸残基および好ましくは長さが７アミノ酸残基以上である。もう一つの態様において、一部は、41アミノ酸残基のヒトRAGEの細胞質ドメインの以下の断片の1つから本質的になる（この例の場合のみ、残基番号は、１〜41であり、番号１は、細胞質ドメインのアミノ末端を表す）：（a）1〜5；（b）6〜10；（c）11〜15；（d）16〜20；（e）21〜25；（f）26〜30；（g）31〜35；（h）36〜41；（i）1〜 10）；（j）11〜20；（k）21〜30；（l）31〜41；（m）1〜14；（n）15〜28；（o）29〜41；（p）1〜21；および（q）22〜41。
【００４８】
本発明は、さらに（a）RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部と（b）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。
【００４９】
さらに、本発明は、RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドを提供する。一つの態様において、ポリペプチドは、DiaphanousのFH1ドメインの全てまたは一部から本質的になる。DiaphanousのFH1ドメインは、ヒトDiaphanousアミノ酸配列の残基570〜735に対応する。一つの態様において、DiaphanousのFH1ドメインの部分は、少なくとも4アミノ酸の長さであり、好ましくは長さが７アミノ酸残基以上である。DiaphanousのFH1ドメインの一部の例には、アミノ酸残基570〜610、アミノ酸残基611〜660、アミノ酸残基661〜700およびアミノ酸残基701〜735を含むが、これらに限定されるわけではない。好ましい態様において、Diaphanousは、ヒトDiaphanousである。もう一つの態様において、ポリペプチドは、単離されている。
【００５０】
本発明は、（a）RAGEの細胞質ドメインに結合するDiaphanousの一部と（b）薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物をさらに提供する。
【００５１】
本発明は、RAGEの細胞質部分の全てまたは一部から本質的になるポリペプチドをコードする核酸をさらに提供する。好ましい態様において、RAGEはヒトRAGEである。もう一つの態様において、核酸は、単離されている。
【００５２】
本発明は、RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousのドメインから本質的になるポリペプチドをコードする核酸をさらに提供する。一つの態様において、ポリペプチドは、DiaphanousのFH1ドメインの全てまたは一部から本質的になる。好ましい態様において、Diaphanousは、ヒトDiaphanousである。もう一つの態様において、核酸は、単離されている。
【００５３】
本発明は、RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターをさらに提供する。本発明は、発現ベクターを含む細胞をさらに提供する。一つの態様において、細胞は、細菌の、両生類の、酵母の、真菌の、昆虫の、または哺乳類の細胞である。
【００５４】
本発明は、RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousのドメインから本質的なるポリペプチドをコードする核酸を含む発現ベクターをさらに提供する。本発明は、発現ベクターを含む細胞をさらに提供する。一つの態様において、細胞は、細菌の、両生類の、酵母の、真菌の、昆虫の、または哺乳類の細胞である。
【００５５】
本発明は、DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害するための方法であって、DiaphanousおよびRAGEの細胞質ドメインを、適切な条件下でそれらの間の結合を阻害する薬剤と接触させることを含む方法をさらに提供する。
【００５６】
一つの態様において、薬剤は、RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドである。好ましい態様において、RAGEは、ヒトRAGEである。もう一つの態様において、ポリペプチドは、単離されている。
【００５７】
もう一つの態様において、薬剤は、RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドである。もう一つの態様において、ポリペプチドは、DiaphanousのFH1ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドである。好ましい態様において、Diaphanousは、ヒトDiaphanousである。もう一つの態様において、ポリペプチドは、単離されている。
【００５８】
もう一つの態様において、薬剤は、（i）RAGEの細胞質ドメインの全てもしくは一部から本質的になるポリペプチド、または（ii）RAGEの細胞質ドメインに結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドの擬態である。擬態は、RAGEの細胞質ドメインの全てもしくは一部から本質的になるポリペプチドの低分子擬態、またはRAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドの低分子擬態であることができるが、これらに限定されるわけではない。擬態は、増大された安定性、有効性、能力および生物学的有用性を有していてもよい。さらに、擬態は、また、減少された毒性、および／または増強された粘膜腸管透過性を有していてもよい。擬態は、合成で調製されてもよい。
【００５９】
本発明は、DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害する薬剤を同定するための方法であって、（a）DiaphanousおよびRAGEの細胞質ドメインを、薬剤の非存在下であればDiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を可能にするであろう条件下で、薬剤と接触させることと、（b）適切な期間の後、RAGEの細胞質ドメインに結合したDiaphanousの量を決定することと、および（c）工程（b）において決定されたRAGEの細胞質ドメインにに結合したDiaphanousの量を、薬剤の非存在下でRAGEの細胞質ドメインに結合したDiaphanousの量と比較することとを含み、それにより、薬剤の存在下における結合の量が低いほど、薬剤がDiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害することを示す方法をさらに提供する。
【００６０】
一つの態様において、薬剤は、ポリペプチド、核酸および有機分子からなる群より選択される。
【００６１】
DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害する薬剤を同定するための方法の一例を以下に記載してある。
【００６２】
エピトープタグの付いた全長Diaphanousおよび次いでFH1ドメインなどのDiaphanousのドメインには、たとえばHisタグでタグを付けることができる。同時に、GST標識されたRAGE細胞質ドメインおよび次いで細胞質ドメインのサブコンポーネントを作製することができる。たとえば、これらの材料は、細菌で作製することができる。Hisタグは、ニッケルカラムと結合し、Hisタグの付いたDiaphanousおよびDiaphanousのドメインを発現させて、ニッケルカラムに結合させることができる。GST RAGEの細胞質ドメインまたはサブドメインを発現する細菌可溶化液を、Hisタグの付いたDiaphanous構築物を含むニッケルカラム上でクロマトグラフすることができる。非特異的結合を除去するために洗浄した後、Hisタグの付いたエピトープおよびそれらの結合物質をニッケルカラムから遊離させることができ、GSTに対する抗体を使用するゲル／ウエスタンブロットにより、RAGEの細胞質ドメインのHis- Diaphanousに対する結合を同定することができる。ネガティブ対照は、空のhisおよび空のGSTタグを含むことができる。
【００６３】
最後に、本発明は、RAGE関連障害を、それにかかった被験体において治療するための方法であって、DiaphanousとRAGEの細胞質ドメインとの間の結合を阻害する薬剤の治療上有効な量を被験体に投与することを含む方法を提供する。一つの態様において、疾患は、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、敗血症、移植拒絶反応、喘息、関節炎、腫瘍成長、癌、転移、糖尿病のための合併症、網膜症、神経障害、腎症、性交不能、障害された創傷治癒、胃不全麻痺、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、新生内膜形成、アミロイド血管障害、炎症、糸球体障害および発作誘導性神経障害からなる群より選択される。好ましい実施例において、被験体は、ヒトである。
【００６４】
もう一つの態様において、薬剤は、RAGEの細胞質ドメインの全てまたは一部から本質的になるポリペプチドである。好ましい態様において、RAGEは、ヒトRAGEである。もう一つの態様において、ポリペプチドは、単離されている。
【００６５】
もう一つの態様において、薬剤は、RAGEの細胞質ドメインと結合するDiaphanousの一部から本質的になるポリペプチドである。一つの態様において、ポリペプチドは、DiaphanousのFH1ドメインの全てまたは一部から本質的になる。好ましい実施例において、Diaphanousは、ヒトDiaphanousである。
【００６６】
参照文献
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【図面の簡単な説明】
【００６７】
【図１】RAGEが多くの細胞型によって発現される多様なリガンドの受容体であることを示す模式図を示す
【図２】apoEヌルの糖尿病マウスにおけるRAGEの遮断を示す実験結果を示す（23）。
【図３】ARGEの遮断が糖尿病db／dbマウス（24）におけるアルブミン尿症を減弱させることを示す実験結果を示す。
【図４】ヒト頸動脈血管内膜切除術試料（25）における、増強された程度のRAGEの発現を表わす。
【図５】AGEの細胞質ドメインが除去されているとき（すなわち、いわゆるDNまたはドミナントネガティブRAGE）に、どのようにRAGEシグナリングが抑制されるかという概略図を示す。
【図６】MAPキナーゼのリガンド-RAGE活性化に関する実験データを示す。対照的に、BSA =アルブミンのときは、RAGEシグナリングに対する影響はない。
【図７】アクチン細胞骨格のイメージを示す。全長の機能的RAGEを発現する細胞（真ん中のパネル）は、アクチン細胞骨格と関連した組織化された構造を有する。対照的に、DN RAGEを発現する（RAGEシグナリング無し）細胞は、非常に無秩序な細胞骨格を有する（右パネル）。
【図８】SMCにおいてDN RAGEを発現するトランスジェニックマウスでは、動脈の損傷により、新生内膜膨張が減少したことを示すデータを示す。
【図９】RAGEシグナリングを炎症、細胞増殖および細胞骨格の制御に関連づける概略図を示す。
【図１０】酵母2ハイブリッド実験で得られた配列の結果を示す（配列番号：1〜3）。
【図１１】Diaphanousおよびそのドメイン（RBD、FH1およびFH2）の概略図を示す。
【図１２】Hisタグの付いたRAGEの末端部分およびMycタグの付いたDiaphanousを構築し、次いで、細胞にトランスフェクトした。抗his IgG（左パネル）および抗myc IgG（右パネル）を使用して単純なウエスタンブロット（WB）を行った。パネルは、his-RAGEの末端部分およびmyc-Diaphanousが細胞内で発現していることを示す。それぞれのゲルにおいて、マーカーレーンは、レーン1である。
【図１３】RAGEの末端部分がDiaphanousと相互作用することを示すデータを示す。上段：細胞には、his-RAGEの末端部分（レーン1）、his-RAGEの末端部分+ myc Diaphanous（レーン2）およびmyc-Diaphanous（レーン3）をトランスフェクトした。IPを抗his IgGで行い、抗myc IgGでウエスタンブロットした。レーン2のバンドは、RAGEの細胞質ドメインがDiaphanousと相互作用することを示す。レーン1および3は、ネガティブ対照である。下段：細胞には、his-RAGEの末端部分をトランスフェクトし、IPを抗his IgGで行った。このパネルは、his-RAGEの末端部分がレーン1および2において発現していることを示す（上段パネルの同じレーンに関連している）。
【図１４】全長ヒトRAGEまたはDN RAGEをトランスフェクトした細胞を示す。レーン1および2では、IPを抗RAGE IgGで行い、抗Diaphanous IgGでウエスタンブロットした。バンドは、レーン１に存在したが、DN RAGE（末端部分が無い）のレーンには存在しなかった。これは、Diaphanousがその他の領域でなくRAGE の末端部分と相互作用することを示す。パネルの右面は、全長RAGEまたはDN RAGEをトランスフェクトした細胞においてDiaphanousがよく発現していることを示す。DN RAGEは、Diaphanous発現を変化させない。
【図１５】RAGEの末端部分がDiaphanousと相互作用することをさらに示す共焦点顕微鏡観察からの結果を示す。上段３レーン：偽ベクター（RAGEが存在しない）をトランスフェクトした細胞は、内因性に発現している少量のRAGEを示す。上段右パネルにおいて、Diaphanousを発現する細胞は、DiaphanousとRAGEの共局在を示す。真ん中の３レーン：全長のRAGEをトランスフェクトした細胞は、より強いRAGEの染色およびDiaphanousとの共局在を示す。下段３レーン：DN RAGE（末端部分が無い）をトランスフェクトした細胞は、非常に少ないDiaphanousとの共局在を表示している。
【図１６】RAGEの末端部分の変異体を作製し、細胞に発現させた。Fullは、正常な末端部分を有する全長RAGEを発現する細胞を示す。3/4は、RAGEの末端部分の3/4のみをもつｍRAGEを発現する細胞を示す。1/2は、RAGEの末端部分の1/2のみをもつRAGEを発現する細胞を示す。1/4は、RAGEの末端部分の1/4のみをもつRAGEを発現する細胞を示す。DNは、RAGEの末端部分をもたないRAGEを発現する細胞を示す。
【図１７】現在までに発生されたDiaphanous変異体のドメインを示すデータを示す。
【図１８】RAGEリガンドが活性酸素種の発生を刺激することを示すデータを示す。より少ない刺激がDN RAGE細胞において観察され、RAGEシグナリングがリガンド刺激された活性酸素種のために必須であることを示している。
【図１９】ヒトRAGEをコードする完全な核酸配列（Genbank番号M91211）を示す（配列番号：4）。
【図２０】ヒトRAGEの完全なアミノ酸配列（Genbank番号AAA03574）を示す（配列番号：5）。
【図２１−１】図21AおよびBは、ヒトDiaphanousの完全な核酸配列（Genbank番号AF051782）を示す（配列番号：6）。
【図２１−２】図21CおよびDは、ヒトDiaphanousの完全な核酸配列（Genbank番号AF051782）を示す（配列番号：6）。
【図２２】ヒトDiaphanousのアミノ酸配列（Genbank番号AACA05373）を示す（配列番号：7）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２２】
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【配列表】
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