(57)【要約】  高信号強度、高緩和度および高固有磁気を有する造影剤を提供するために有用な超常磁性ナノスケール粒子が、開示されている。該開示された造影剤は、実用性および磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）および関連する技法を有するであろう。【特許請求の範囲】
【請求項１】
約０．５から５０nmの間の平均サイズを有するガドリニウム酸化物を含む、超常磁性ナノスケール粒子。
【請求項２】
生体適合性および／または生体特異的被覆を有する、請求項１に記載の粒子。
【請求項３】
ジエチレングリコール（ＤＥＧ）および／またはクエン酸を含む被覆を有する、請求項２に記載の粒子。
【請求項４】
葉酸を含む被覆を有する、請求項２に記載の粒子。
【請求項５】
被覆が、葉酸に結合したポリエチレングリコールを含む、請求項４に記載の粒子。
【請求項６】
ジエチレングリコール（ＤＥＧ）を含む被覆を有する、約５nmの平均サイズの、請求項１に記載の粒子。
【請求項７】
請求項１から６のいずれかに記載の粒子を含む、組成物。
【請求項８】
０．０１から５００mM、好ましくは０．０１から２．５mMのガドリニウム濃度を有する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
身体部位への投与に適合された、請求項７または８に記載の組成物。
【請求項１０】
非経口的に投与可能なビヒクルを含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
プロトンに富む環境における隣接する水素核の緩和時間Ｔ１および／またはＴ２を、ガドリニウムのイオン錯体の組成物によって得られたＴ１および／またはＴ２の値未満に減少させる能力を有する、請求項７から１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
０．１mMから１．５mMの濃度範囲におけるナノスケール酸化鉄粒子によって得られるよりもより高い信号強度有する、請求項７から１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
請求項７から１２に記載のいずれかの組成物を含む、造影剤。
【請求項１４】
水よりも少なくとも５００％、好ましくは７００％より大きい、より良好な信号強度を有する、請求項１３に記載の造影剤。
【請求項１５】
分子相互作用または細胞プロセスの研究のための、請求項１３または１４のいずれかに記載の造影剤を投与することを含む、ＭＲＩ（磁気共鳴画像法）を行う方法。
【請求項１６】
陽性造影剤の調製における、請求項１から１２のいずれかに記載の、超常磁性粒子または組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、超常磁性ガドリニウム酸化物ナノ粒子、ならびに選択的組織画像化および細胞または分子分析におけるそれらの有用性に関する。
【背景技術】
【０００２】
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、高空間解像力、および軟部組織を識別する特有の能力によって、臨床用画像診断に対する最も重要な手段の１つになった。ＭＲＩ造影剤の存在は、水素核の緩和時間Ｔ１およびＴ２を変えることにより、画像に影響を及ぼす。異なる組織における異なる水素緩和時間は、ＭＲＩにおける画像コントラストを引き起こす。ＭＲＩにおける水素緩和時間には、Ｔ１およびＴ２の２つの型が存在する。Ｔ１は、縦緩和時間と呼ばれ、磁場パルスによる摂動の後の平衡への磁化の回復を決定する。Ｔ２は、横緩和時間と呼ばれ、磁気モーメントの間の相互作用による信号の脱位相を決定する。更に、Ｔ２＊（「Ｔ２星印」）は、磁場不均一性による効果も含む実際の横緩和時間である。Ｔ１を減少させることの効果は信号増加であり、Ｔ２を減少させることの効果は信号減少である。造影剤の存在下において信号が増加するかまたは減少するかに応じて、造影剤を、陽性または陰性の造影剤のいずれかとして分類できる。
【０００３】
全ての造影剤は、両方の緩和時間に影響するが、いくつかの造影剤は、Ｔ１またはＴ２のいずれかにおいて卓越した効果を有する。造影剤の常磁性元素のいくつかの特性は、ＭＲ画像のコントラストに影響を及ぼす。最も重要な特性は、磁気モーメント、電子緩和時間、および内または外の配位圏のいずれかにおける水を配位する能力である。常磁性造影剤の循環、拡散および水交換はまた、重要な機構である。スキャニング条件の機能としてのスピンエコーシーケンスからの信号は、以下の式のように表すことが出来る。
【０００４】
【数１】
2008513053.tif 000002
（式中、ρ＝スピン密度、ＴＥ＝エコー時間、およびＴＲ＝繰り返し時間である。）式１から、緩和時間が信号に高度に影響を及ぼすことを見受けることが出来る。２つの緩和時間の間には競合的関係が存在し、これは、観察された造影剤濃度に対する信号におけるピークを説明する。観察された緩和率（１／Ｔｉ、ｉ＝１、２）は、造影剤の濃度（Ｃ）に対し比例する：
【０００５】
【数２】
2008513053.tif 000003
（式中、１／Ｔｉ（観察された）は、造影剤の存在下における緩和時間であり、１／Ｔｉ（固有の）は、固有組織緩和時間であり、ｒｉは、緩和定数である。）
【０００６】
Ｇｄ３＋のイオン錯体（キレート）は、その磁気特性ゆえに、臨床用ＭＲＩにおける造影剤として一般に使用されている。しかし、そのような造影剤の弱い信号強度増強は、分子画像化に対して不十分である。より良好なコントラスト、異なる組織のより良好な描写に対する増加する要望によって、より大きい信号強度増強を有する造影剤に対する、増加する要求が存在する。動脈硬化性プラークまたは肺塞栓症の選択的画像化は、広範な疾患の早期診断に対する大きな可能性を有する新規のＭＲＩ適用の例である。ＭＲＩ造影剤の新たな世代のものの中で、特有の磁気特性を有する生体適合性のナノ粒子は、非常に興味深い開発対象である。超常磁性ナノ粒子は、分子結合部位につき、より高度な緩和性を有するので、キレートと比較して、分子画像化に対する有利な特性を有する。従って、超常磁性ナノ粒子による磁気追跡のための新たな方法は、インビボ細胞および分子ＭＲＩに対する新たな可能性を提供する（Ｊａｆｆｅｒ  ＦＡ  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＭＡ，２００５；２９３：８５５−８６２；Ｇｉｌｌｉｅｓ  ＲＪ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２；３９：２３１−２３８；Ｄｉｊｋｈｕｉｚｅｎ  ＲＭ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  ａｎｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２００３；２３：１３８３−１４０２；ａｎｄ  Ｗｉｃｋｌｉｎｅ  ＳＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２００２；Ｓ３９：９０−９７を参照）。超常磁性酸化鉄（ＳＰＩＯ）粒子は、新規の臨床適用および分子画像化のために、調査された（Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０：８１６（２００２））。ＳＰＩＯは、非常に高いＴ２緩和効果を有するので、細胞および分子相互作用のＴ２‐マッピングにふさわしい。しかしながら、ＳＰＩＯｓは、磁化率アーチファクトによる信号損失を引き起こす。これらのアーチファクトは、組織空隙から識別することが出来ない信号空隙として、画像中で示される。このようなアーチファクトはまた、組織中の微細構造の描写を妨げる可能性がある。これらは陰性造影剤の主な不利な点である。
【０００７】
米国特許出願第２００４／０１５６７８４号（Ｈａａｓｅ  ｅｔ  ａｌ．）は、リン酸ガドリニウムから作成された粒子を記載し、これは、水と比較して１００から２００％改善された信号強度を示す。しかし、粒子サイズ制御のためのキャッピング方法がそこでは示唆されないので、この方法によって、超常磁性特性のために必要な１から１０nmの十分に小さい粒子サイズを得ることが困難であるようである。
【０００８】
ガドリニウムを含む粒子のもう１つのタイプは、Ｍｏｒａｗｓｋｉらによって、Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５１：４８０（２００４）において考察され、ここで、ガドリニウムが充填されたペルフルオロカーボンナノ粒子を使用する臨床用ＭＲＩ装置によって、単一細胞中のピコモル濃度における分子エピトープの量を定量することが示唆されている。しかし、これらの粒子は、比較的大きいサイズ（〜２５０nm）を有し、超常磁性を示さない。
【０００９】
磁気粒子画像法（ＭＰＩ）は、高解像度画像化のための技法として新たに提起された。この技法は、造影剤それ自身の磁気特性に直接作用し、プロトン緩和時間（これは従来の造影剤の機構である）への間接的な影響に作用しない。ＭＰＩは、高空間解像度および高感度の両方に対して可能性を有する。実用的な使用はまだ調査されていないが、ＭＰＩ（Ｎａｔｕｒｅ，Ｊｕｎｅ  ２００５）の原理の証明が示されている。将来のＭＰＩは、強度の固有の磁気を有する磁気粒子の検出に依存し、超常磁性は望ましい特性であろう。
【００１０】
上で述べられた理由のために、高信号強度、高緩和性、および高固有磁気を有する造影剤の必要性が存在する。本発明は、言及された要求を満たす造影剤として使用することが出来る、生体適合性、超常磁性希土類ナノ粒子を提供する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、超常磁性粒子を提供することであり、超常磁性粒子は、磁気共鳴影像法において、活性物質の低濃度を有する組成物中で使用する場合に、優れたコントラスト増強を可能にする。
【００１２】
分子画像化または細胞プロセスの画像化が許容されるために、造影剤のコントラスト特性を改良することも、本発明の目的である。
【００１３】
本発明のもう１つの目的は、所望の組織での造影剤蓄積を可能にするために、組織特異的リガンドで標識することに適した生体適合性ナノ粒子を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
以下の段落に記載の本発明は、言及された要求を満たす、ガドリニウムに基づくナノ粒子製剤を提供することを目的とする。一般に、本発明は、５０nm未満、好ましくは約０．１から５０nm、およびより好ましくは、約１から１５nmの平均サイズを有する希土類金属酸化物を含む超常磁性ナノスケール粒子に関する。このような粒子は、通常、示されたサイズの範囲内で、粒子の１つまたはいくつかの分画を含み得る。好ましい希土類金属酸化物は、ガドリニウムおよびジスプロシウムの酸化物を含む。ガドリニウム酸化物、詳細にはＧｄ２Ｏ３を含む粒子が、特に好ましい。本発明の言及された粒子は、それらの特性を修飾するために、鉄材料などの付加的な材料の小さな分画を更に含んでよい。以下の実験の段落中で記載される、ガドリニウム酸化物ナノ粒子の合成方法は、約４nmの中間サイズを有する、約０．５から１５nmの間のサイズの粒子を生じる。サイズ分別の方法によって、狭い分布を有する分画:１から３nm、３から６nm、６から９nm、９から１５nmが得られる。
【００１５】
超常磁性は、材料が非常に小さい結晶構造（およそ１から１５nm）から構成される場合に起こる。材料の双極子は、同じ方向を有し、全体の微結晶の得られた磁気モーメントは、外部の磁場と並ぶであろう。この場合、温度がキュリー温度またはネール温度未満であっても、また熱エネルギーが、隣接する原子の間のカップリング力を克服するには低すぎても、熱エネルギーは、完全な微結晶の磁化の方向を変えるのには十分高い。最も重要なことに、本発明によるナノスケール粒子、および該粒子を含む組成物は、超常磁性特性を示す。本発明の粒子は、好適には生体適合性および／または生体特異的な被覆を有する。被覆の導入は、一般に粒子製造過程の一部であり、いくつかのこのような過程は、該適用の以下の実験の部で明示される。該被覆は、より大きな単位への粒子の凝塊形成、および超常磁性の結果として起こる損失を防ぎ、粒子を、選択された生物学的環境において適合可能とし、および／または一定の生体分子特異性の導入を可能にする、役目を果たす。適した被覆剤は、ジエチレングリコール（ＤＥＧ）、ポリエチレングリコール、クエン酸、オレイン酸、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸、１６−アミノヘキサデカン酸、ヘキサデシルアミン、またはトリオクチルホスフィンオキシド（ＴＯＰＯ）を含むが、限定されない。より好ましくは、該被覆は、ジエチレングリコール（ＤＥＧ）および／またはクエン酸を含む。好ましい実施形態において、該粒子は約５nmの平均サイズを有し、ジエチレングリコール（ＤＥＧ）を含む被覆を有する。もう１つの特異的な実施形態に従って、該被覆は、葉酸に結合した（例えば、アミド結合でまたはスペーサー基で）ポリエチレングリコールを含み、それにより、腫瘍組織に対する増加した特異性を有する粒子を提供する。本発明はまた、言及された超常磁性粒子を含む組成物に関する。該組成物は、通常、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）に対する造影剤としての有用性を有するであろう。該組成物は、ｐＨ調整剤、等張性調整剤、および／または全身、特定の体の部位もしくは組織試料への投与（例えば、非経口投与による）に適したほかの薬剤を限定されずに含む、適切なアジュバントまたは賦形剤を含む。適切には、そのような組成物中のガドリニウムの濃度は、０．０１から５００mMの範囲、好ましくは約０．０１から５mMの間、およびより好ましくは約０．０１から２．５mMの間である。投与される該造影剤の濃度は、特定の適用のために望ましいおよび必要である用量に大きく依存し、この理由のために広い範囲が与えられる。しかし、濃度および提供された用量を、本発明によって、有意に減少させることが出来ることが予想される。
【００１６】
本発明のガドリニウム酸化物に基づいた超常磁性粒子を含む組成物は、ガドリニウムのイオン錯体の組成物によって得ることが出来るＴ１および／またはＴ２の値未満に、プロトンに富む環境における隣接する水素核の緩和時間Ｔ１および／またはＴ２を減少させる能力を有する。更に、言及された組成物に基づく造影剤は、水よりも、少なくとも５００％、好ましくは７００％より大きい、より大きい信号強度を有し、０．１mMから１．５mMの濃度範囲におけるナノスケール酸化鉄粒子によって得られるよりも、より高い信号強度を提供する。この比較は、以下により詳細に説明されることになる参照としての、市販の鉄に基づく製剤を使用する比較可能な金属粒子サイズを用いて、同様の濃度範囲（金属原子のmol）に亘って行われる。
【００１７】
本発明の以下の実例の記載は、本発明のナノサイズ粒子、およびこのような粒子を含む組成物が、当分野の現状（イオン錯体）と比較して、高いコントラスト増強および有意に改良された緩和性を提供することが出来ることを示す。従って、本発明のナノ粒子およびその組成物は、ガドリニウム濃度に関して高い識別性での細胞追跡に対する有用性を見出すことが出来、分子相互作用または細胞プロセスの研究のためのＭＲＩ（磁気共鳴画像法）を行う方法における使用を見出す。更に、本発明の超常磁性粒子および超常磁性粒子を含む組成物は、動脈硬化の早期の診断、塞栓症の診断、移植された細胞の追跡、並びに他の病的状態（広がった損傷が事実となるまで診断および治療することが今までのところ困難または不可能である。）の早期の開始機序の追跡を助けるために、血管中の斑を研究するための方法論の発展を可能にする。特に、本発明は、早い病期の病的状態を識別する、および治療学的効能を決定するための補助ツールとしての選択された療法の開発を調査するのに有用である。これは、投与された治療薬の用量を最適化し、および選ばれた療法を取り替えるか、または補う必要性の早期の指示を提供する可能性を向上させる。
【００１８】
（本発明の詳細なおよび例示する記載）
【実施例１】
【００１９】
ジエチレングリコール（ＤＥＧ）で被覆されたＧｄ２Ｏ３ナノ結晶の合成
ナノ結晶性ガドリニウム酸化物を、ポリオール法によって合成した（Ｆｅｌｄｍａｎｎ  Ｃ．Ｐｏｌｙｏｌ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｓｃａｌｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ａｄｖ．Ｆｕｎｃｔ．Ｍａｔｅｒ．２００３；１３：１０１−１０７；Ｂａｚｚｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｓｕｂ−５−ｎｍ  ｌａｎｔｈａｎｉｄｅ  ｏｘｉｄｅｓ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ．２００３；１０２−１０３：４４５−４５０；およびＳｏｄｅｒｌｉｎｄ，Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｄ２Ｏ３  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｓ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｂｙ  ｏｒｇａｎｉｃ  ａｃｉｄｓ，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃｉ．，２８８：１４０−１４８  （２００５）で、前に記載のように）。
【００２０】
Ｇｄ（ＮＯ３）３６Ｈ２Ｏ（２mmol）、固体ＮａＯＨ（２．５mmol）および脱イオン水（数滴）を、ジエチレングリコール１５ml（（ＨＯＣＨ２ＣＨ２）２Ｏ、ＤＥＧ）中に溶解し、該混合物を１４０℃に加熱する。該反応物が完全に溶解したならば、該温度を１８０℃に上げ、４時間一定に保ち、暗黄色のコロイドを得る。該コロイドを脱イオン水で稀釈し、ガドリニア濃度を既定の値（例えば、２．５mM）に調整する。試料を、注意深く清潔にしたＰｔるつぼ中で７００℃で３時間、加熱することにより、熱重量分析法で濃度を確認した。Ｘ線粉末回折および透過型電子顕微鏡によってあらかじめ確認されたように、ＤＥＧでキャップされたＧｄ２Ｏ３ナノ結晶は、１から１５nmの範囲におけるサイズを有する結晶程度の大きさである。これらの結晶は、狭い分布を有する配合された分画である：１から３nm、３から６nm、６から９nm、９から１５nmは、結合されたフィルター／遠心分離（Ａ−フィルターＡＢ  Ｖａｔｒａ  Ｆｒｏｌｕｎｄａ，ＳＥから得られたＶＩＶＡＳＰＩＮ  フィルター）によって得られる。
【実施例２】
【００２１】
他の試剤で被覆されたＧｄ２Ｏ３ナノ結晶の合成または代替合成
Ｇｄ（ＮＯ３）３６Ｈ２Ｏ（２mmol）およびＮａＯＨ（６mmol）を、２つの分離ビーカー（それぞれ、ＤＥＧ１０mlを含む）中に溶解した。該２つの溶液を混合し、約２１０℃に加熱し、攪拌下、３０分間その温度を保持した。熱い溶液に、ＤＥＧ中のオレイン酸（５ml中１．６mmol）を加え、茶色がかったシロップを得た。洗浄およびメタノール中での数回の遠心分離の後、オフホワイト色の粉末を収集した。オレイン酸を、それぞれクエン酸、１６−ヒドロキシヘキサデカン酸、１６−アミノヘキサデカン酸、またはヘキサデシルアミンで置換した。全ての場合において、ＤＥＧ５ml中の１．６mmolの酸／アミンを使用した。
【００２２】
Ｇｄ２Ｏ３ナノ結晶をまた、やや異なる方法（燃焼方法と、適切に呼ばれる方法）で調製することが可能であり［Ｗ．Ｚｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｐｔｉｃａｌ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌｌｉｎｅ  Ｙ２Ｏ３：Ｅｕ  ｄｅｐｅｎｄｉｎｇ  ｏｎ  ｉｔｓ  ｏｄｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”，Ｊ．Ｃｏｌｌｏｉｄ  ａｎｄ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ  Ｓｃ．，２６２（２００３）５８８−５９３］、以下の方法で行った。Ｇｄ（ＮＯ３）３およびアミノ酸グリシン（それぞれ０．１Ｍ）の等量（１０ml）を、フラスコ中で混合し、乾燥近くまで沸騰させた。更なる加熱の１分または２分後、茶色のべとついた物は自己発火し、微細な白色の粉末を形成した。
【実施例３】
【００２３】
Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）による特性決定
組成物および粒子の結合エネルギーを研究することにより、正確なＧｄ２Ｏ３ナノ結晶が調製されたことを確認するために、ＸＰＳスペクトルを、単色化されていないＡｌＫα光子（１４８６．６ｅＶ）およびＣＬＡＭ２分析計を使用しＶＧ機器上で記録した。Ｘ線銃の粉体は、３００Ｗであった。該スペクトルは、基体表面の法線に関して３０°の取り出し角を有する光電子に基づいた。測定の間、分析チャンバー中の圧力は、３＊１０−１０mbar、温度は２９７Ｋであった。ＶＧＸ９００データ分析ソフトウェアを使用して、ピークの位置を分析した。ケイ素（ＳｉＯｘ）基体を清潔にするために、該表面を、ＭｉｌｌｉＱ水：ＨＣｌ（３７％）：Ｈ２Ｏ２（２８％）の６：１：１混合物で５から１０分間、８０℃で第一に洗浄し、次いで、ＭｉｌｌｉＱ水：ＮＨ３（２５％）：Ｈ２Ｏ２（２８％）の５：１：１混合物で５から１０分間、８０℃で洗浄した。それぞれの洗浄段階の後、該ケイ素表面を、ＭｉｌｌｉＱ水で注意深く濯いだ。ジエチレングリコール（Ｇｄ２Ｏ３−ＤＥＧ）でキャップされたガドリニウム酸化物ナノ粒子を、塩基性のＭｉｌｌｉＱ水と混合し、２０００rpmの速度で、新しく清潔にされたケイ素（ＳｉＯｘ）基体上で回転被覆し、次いでＸＰＳ機器中に直ちに配置した。
【００２４】
ケイ素基体上に回転被覆されたＧｄ２Ｏ３−ＤＥＧナノ粒子の広いスキャンスペクトルを、図１ａ中に示す。最も強い光電子ピークは、１１２０ｅＶおよび１１８８ｅＶで見受けられる。これらの２つのピークは、それぞれ、Ｇｄ（３ｄ３／２）およびＧｄ（３ｄ５／２）に起因する。該ピークの位置は、Ｇｄ２Ｏ３に対する酸化レベルと一致する［Ｒａｉｓｅｒ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．：Ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＸＰＳ  ｐｈｏｔｏｅｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｓｏｍｅ  ｇａｄｏｌｉｎｉｕｍ  ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ．  Ｊ  Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．１９９１；５７：９１−９７］。これは、試料の酸化レベルを実証している。５３２ｅＶで見受けられるＯ（１ｓ）ピークは、３つの異なる成分（すなわち、Ｇｄ２Ｏ３、キャッピング分子ＤＥＧおよびケイ素（ＳｉＯＸ）基体）からの酸素から成る。ナノ粒子へのキャッピング分子の配位における、より詳細な分析は、進行中である。１５１ｅＶおよび９９ｅＶにおける２つのピークは、基体からの寄与として、Ｓｉ（２ｓ）およびＳｉ（２ｐ）に起因する。回転被覆されたＧｄ２Ｏ３−ＤＥＧの塗膜は薄く、従って、ＸＰＳ測定の間の試料の補充を最小限にする。９７８ｅＶで見受けられる顕著なピークは、Ｏ（ＫＬＬ）オージェ線に起因する。
【００２５】
燃焼方法で作成された、またはオレイン酸もしくはクエン酸でそれぞれキャップされたＧｄ２Ｏ３ナノ粒子の試料（調製方法は、前に開示された手順と一致する。）をまた、同じ手順で、Ｘ線光電子分光法にて調査した。ＳｉＯＸ基体上に回転被覆された、オレイン酸をキャップされたＧｄ２Ｏ３ナノ結晶のＧｄ（３ｄ）スペクトルを、図１ｂに示す。Ｇｄ（３ｄ）レベルは、それぞれ、１１８７．７ｅＶおよび１２２０．３ｅＶでのＧｄ（３ｄ５／２）およびＧｄ（３ｄ７／２）ピークを有する、スピン軌道分裂二重項から成り立つ。線形およびピークの位置は、インシート（Ｉｎ  ｓｈｅｅｔ）中に圧縮されたＧｄ２Ｏ３粉末について先に公開されたデータと良く一致し、これはこの試料がＧｄ２Ｏ３から成り立つことを確認する（Ｄ．Ｒａｉｓｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏｎ．Ｓｐｅｃ．５７（１９９１）９１−９７）。クエン酸でキャップされた粒子、および燃焼方法で作成された粒子に対するＧｄ（３ｄ）スペクトルは、驚くにはあたらないが、オレイン酸でキャップされた粒子と一致した。
【００２６】
オレイン酸でキャップされた粒子のＣ（１ｓ）スペクトルは、３つの異なるピークを示す（図１ｃ）。２８５ｅＶにおける主なピークは、オレイン酸における脂肪族炭素に帰する。約２８７におけるピークは、炭化水素に帰する可能性があり、ジエチレングリコールにおける末端炭素に対応する。２８９．１ｅＶにおけるピークは、オレイン酸におけるカルボキシル基に対応する。オレイン酸でキャップされた粒子のＯ（１s）スペクトルは、３つのピークを示す（図１ｄ）。５３１．１ｅＶにおけるピークは、Ｇｄ２Ｏ３酸化物における酸素に対応し、５３２．１ｅＶにおける顕著なピークは、予想されるように、ＳｉＯＸ基体からの寄与である。５３３ｅＶにおける該ピークは、ＤＥＧにおけるＣ−Ｏ−ＣおよびＣ−ＯＨと一緒になってオレイン酸の末端基におけるカルボニル炭素に起因する。クエン酸でキャップされた粒子のＯ（１ｓ）スペクトルは、３つのピークを示す（図１ｅ）。５３１．２および５３２．３ｅＶにおけるピークは、それぞれ、ガドリニア酸素、およびクエン酸のカルボニル基（Ｃ＝Ｏおよび／またはＯ−Ｃ＝Ｏ）に対応する。５３３．９ｅＶにおける第３のピークは、エステル基（Ｃ−Ｏ−Ｃ＝Ｏ）における酸素に関係する。合成がアルコールおよびカルボキシル酸を含むので、エステル形成は、合成の間に起こる可能性がある。燃焼合成からの試料のＯ（１ｓ）スペクトルはまた、３つのピークを示す（図１ｆ）。上のように（図１ｄおよび１ｅ）、５３１．２ｅＶにおけるピークは、ガドリニア酸素に対応する。５３２．３における顕著なピーク、および５３５．６ｅＶにおけるより小さいピークは、興味深い。前者は、カルボニル酸素（Ｃ＝Ｏおよび／またはＯ−Ｃ＝Ｏ）に帰する可能性があり、後者は、最も近い隣接物として窒素を有する酸素に帰することができる。これらのピークに対するソースは、未反応反応物（グリシン、硝酸ガドリニウム）および／またはカルボニルならびに反応生成物を含む窒素のいずれかである。
【実施例４】
【００２７】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）による特性決定
ＴＥＭ調査を、２００kV.で操作されるＰｈｉｌｉｐｓ  ＣＭ２０電子顕微鏡で行った。ＤＥＧルートで調製されたＧｄ２Ｏ３ナノ粒子のサイズは、図３のＨＲＥＭ顕微鏡写真にみられるように、約５nmであった。コントラストが不十分であるが、（２２２）平面（ｄ＝３．１Å）は可視である。オレイン酸による合成において得られるナノ結晶のＨＲＥＭ顕微鏡写真（およそ直径１５nm）を図４に示す。キャッピング層（キャッピング層がある場合）からのコントラストは存在しないが、結晶を通り抜ける、乱されていない（２２２）平面が見られる可能性がある。燃焼合成において得られるナノ結晶のＴＥＭ画像は、図５で示される。少なくとも３つのナノ結晶の凝集は、可視であり、サイズは約１０nm以下である。ＴＥＭからの結果は、一様に結晶のナノ粒子が得られたことを示した。
【実施例５】
【００２８】
試料調製
実施例１からのＧｄ２Ｏ３−ＤＥＧの試料（約５nmの平均粒子サイズおよび約１から１５nmの範囲の粒子サイズを有する）およびＧｄ−ＤＴＰＡ（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（登録商標））を、Ｈ２Ｏを有する１０mmのＮＭＲ試験管内で、０．１から２．５mMの９つの異なるＧｄ濃度で調製した。測定において、試験管を、生理食塩水を有するボウル中で、２２から２３℃（これはスキャナー室の温度であった）で浸漬した。
【実施例６】
【００２９】
緩和時間測定および磁気共鳴画像法
Ｔ１およびＴ２緩和時間を、頭部用コイルを使用して１．５Ｔ  Ｐｈｉｌｉｐｓ  Ａｃｈｉｅｖａ全身スキャナーで測定した。マルチエコーＩＲシーケンスで交互配列された２Ｄ混合マルチエコーＳＥを、測定のために使用した［ｋｌｅｅｆ＿ｍｒｍ＿１９８７］。画像化時間パラメーターを変化させて、緩和時間計算における標準偏差を最小限にした：ＴＥ＝３０ms、ＴＲ（ＳＥ）＝５００ms、ＴＩ＝１５０msおよびＴＲ（ＩＲ）＝１１５０ms（セット１）；ＴＥ＝５０ms、ＴＲ（ＳＥ）＝７６０ms、ＴＩ＝３７０msおよびＴＲ（ＩＲ）＝２２９０ms（セット２）。他のＭＲパラメーターは、ＦＯＶ＝２３ｃｍ、スライスの厚み＝７mm、エコーの数＝４であった。
【００３０】
Ｇｄ−ＤＴＲＡと比較して、Ｈ２Ｏ中のガドリニウムナノ粒子に対するプロトン緩和性における実質的な増加が、得られた。表１は、Ｇｄ２Ｏ３の緩和性が、Ｇｄ−ＤＴＲＡ：ｒ１（Ｇｄ２Ｏ３）／ｒ１（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）＝１．８９、ｒ２（Ｇｄ２Ｏ３）／ｒ２（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）＝１．９４に対する値のほぼ２倍であった。図５ａおよび５ｂ中の１／Ｔｉ対ガドリニウム濃度のプロットは、式２に従う良好な適合を有する直線関係（ｒ１、ｒ２＞０．９９、表１）を示す。
【００３１】
【表１】
2008513053.tif 000004
【００３２】
信号強度の分析は、緩和時間測定のために使用されたシーケンスのスピンエコー部分における第１のエコーからのデータ（ＴＥ＝３０ms、ＴＲ＝５００ms（図６））を使用して、Ｇｄ−ＤＴＰＡと比較して、Ｇｄ２Ｏ３試料の低濃度において、より高い信号強度を示した。より高濃度（＞０．９mM）において、強いＴ２効果は、ナノ粒子試料に対する信号を弱めた。すなわち、Ｇｄ２Ｏ３試料は、このシーケンスにおけるおよそ１．２mMで頂点に達するＧｄ−ＤＴＰＡ信号強度と比較して、より低濃度（０．６mM）における信号強度ピークに到達した。
【００３３】
該分析は、Ｇｄ−ＤＴＰＡと比較して、Ｈ２ＯにおけるＧｄ２Ｏ３に対する緩和性においてかなりの増加を示した。これらの実験のもう１つの興味深い特徴は、顕著なＴ１減少効果、および低濃度でみられる、結果として起こる信号増加であった。血漿における０．６mM未満の濃度範囲は、臨床適用に対して最も関連性のあるものである。Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ０．１mmol／kgの用量において（製造業者によって推奨されるような）、Ｇｄの検出された血漿濃度は、注射後の３分において０．６mM、注射後の６０分において０．２４mMである（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ａｇｅｎｃｙ  ｏｆ  Ｓｗｅｄｅｎ，ＦＡＳＳにより提供されたデータ）。
【００３４】
図６に示されたスピンエコーシーケンスにおけるＧｄ２Ｏ３に対する信号強度は、両方とも、Ｇｄ−ＤＴＰＡ信号よりも、より急激に上昇および降下した。低濃度（＜０．６mM）における急激な信号強度の増加を、高いＴ１緩和性により説明することが出来る。しかし、高濃度において、Ｔ２低下効果は、Ｇｄ２Ｏ３粒子に対して、より明白であった。より早い信号降下は、粒子部位における磁場不均一性による磁化率効果によって引き起こされる可能性がある。
【００３５】
更に、Ｇｄ２Ｏ３−ＤＥＧおよびＲｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）の試料を、上のような同様の条件下で調製し、試験した。０．１と１．５mMの間の、６つの異なるＧｄおよびＦｅ濃度が存在した。Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）は、超常磁性酸化鉄ナノ粒子（ＳＰＩＯ）のフェルカルボトラン（ｆｅｒｒｏｃａｒｂｏｔｒａｎ）コロイドゾルに基づいている。該粒子は、４nmの鉄心上の、６０nmの流体力学的直径を有する。緩和率および信号強度は、図８、９および１０に示されている。これらの結果は、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）が、Ｇｄ２Ｏ３−ＤＥＧと比較してより高いＴ１およびＴ２緩和率を有することを実証する。曲線を比較する場合、Ｒｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）が、有意により高いＴ２緩和率を有することは明らかである。これは、Ｒｅｓｏｖｉｓｔが、Ｇｄ２Ｏ３−ＤＥＧ（これは陽性コントラストを提供する。）と比較して陰性コントラストを提供することを意味する（図１０における信号強度曲線を参照）。従って、Ｇｄ２Ｏ３−ＤＥＧ粒子は、ＳＰＩＯに基づくものに対して補完的な特性を有する造影剤を可能にする。
【００３６】
Ｇｄ２Ｏ３信号強度と、水の信号強度との比較に対して、図１１で示すように、信号強度は、スピンシーケンス（ＴＥ＝３０ms、ＴＲ＝５００ms）緩和時間測定における第１のエコーで達成された。該試験管を、生理食塩水中に浸漬することにより、水およびＧｄ２Ｏ３試料における信号強度を同時に測定した。
【実施例７】
【００３７】
単球調査
単球実験について、ＴＨＰ−１細胞を、Ｌ−グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えて、１０％ウシ胎児血清（ＧＩＢＣＯ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を有するＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。細胞を計数し、９７％生存可能であることが見出された。細胞を、０．１、０．３、０．６および０．９mMの濃度におけるＧｄ２Ｏ３−ＤＥＧまたはＧｄ−ＤＴＰＡで処理した。１つのウェルの細胞を、未処理のままにしておいた。対照系列を、Ｇｄ２Ｏ３−ＤＥＧ粒子の濃度だけを変えて、細胞培養培地で調製した。それぞれ２４ウェルの２つのプレートを、上記のように調製した；１つのプレートを、Ｇｄ２Ｏ３−ＤＥＧおよびＧｄ−ＤＴＰＡで２時間インキュベートし、もう一方のプレートを、８時間、３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞をファルコンチューブ（Ｆａｌｃｏｎ  ｔｕｂｅ）に移し、媒質で２回洗浄し、１１００rpmで８分間遠心分離した。単球実験は、洗浄手順の後のナノ粒子が、細胞に付着しているかまたは細胞によって内在化されるかのいずれかであることを示した。Ｇｄ−ＤＴＰＡは、洗浄の後の細胞懸濁液中に存在しなかった。Ｔ１およびＴ２緩和時間の両方は、より高いＧｄ２Ｏ３濃度、およびまたより長いインキュベーション時間で減少した（データは示されない。）。８時間の培養から得られたＴ１マップを、図７で示す。
【００３８】
Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ（Ｇｄ−ＤＴＰＡ）が製造され、細胞外空間中に残された。図４ｂにおいて、Ｇｄ−ＤＴＰＡは、試料から効果的に洗い出されたことが見られる。対照的に、Ｇｄ２Ｏ３は、洗浄後に細胞培地中に残ったままであった（図４ａ）。マクロファージなどの一定の細胞タイプが、食菌作用を通して小さい粒子を内在化することが出来ることが示された［Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ  Ｒ，ｅｔ  ａｌ．：Ｍａｇｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｌａｂｅｌｌｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｃａｎ  ｂｅ  ｄｅｔｅｃｔｅｄ  ｂｙ  ＭＲ  ｉｍａｇｉｎｇ，Ｊ  Ｍａｇｎ  Ｒｅｓ  Ｉｍａｇ．１９９７；７：２５８−２６３］。酸化鉄ナノ粒子でインキュベートされたＴＨＰ−１についての先行の研究は、細胞取り込みおよび用量／インキュベーション時間の間の直線関係を示す［Ｂｏｗｅｎ  ＣＶ，ｅｔ  ａｌ．：Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｔａｔｉｃ  ｄｅｐｈａｓｉｎｇ  ｒｅｇｉｍｅ  ｔｈｅｏｒｙ  ｔｏ  ｓｕｐｅｒｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｒｏｎ−ｏｘｉｄｅ  ｌｏａｄｅｄ  ｃｅｌｌｓ，Ｍａｇｎ  Ｒｅｓ  Ｍｅｄ．２００２；４８：５２−６１］。これらの先行の結果は、本実験においてまた、Ｇｄ−粒子が、細胞によっておそらく取り入れられた可能性があることを示す。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１ａ】図１ａから１ｆは、ケイ素基体上に回転被覆された、合成された異なるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子のワイドスキャンＸＰＳスペクトルを示す。
【図１ｂ】図１ａから１ｆは、ケイ素基体上に回転被覆された、合成された異なるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子のワイドスキャンＸＰＳスペクトルを示す。
【図１ｃ】図１ａから１ｆは、ケイ素基体上に回転被覆された、合成された異なるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子のワイドスキャンＸＰＳスペクトルを示す。
【図１ｄ】図１ａから１ｆは、ケイ素基体上に回転被覆された、合成された異なるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子のワイドスキャンＸＰＳスペクトルを示す。
【図１ｅ】図１ａから１ｆは、ケイ素基体上に回転被覆された、合成された異なるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子のワイドスキャンＸＰＳスペクトルを示す。
【図１ｆ】図１ａから１ｆは、ケイ素基体上に回転被覆された、合成された異なるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子のワイドスキャンＸＰＳスペクトルを示す。
【図２】ＤＥＧでキャップされたＧｄ２Ｏ３ナノ結晶のＨＲＥＭ顕微鏡写真である。
【図３】可視（２２２）平面を有するオレイン酸でキャップされたＧｄ２Ｏ３ナノ結晶のＨＲＥＭ顕微鏡写真である。
【図４】燃焼合成からのＧｄ２Ｏ３ナノ結晶のＨＲＥＭ顕微鏡写真である。
【図５ａ】図５ａおよび５ｂは、本発明品およびＧｄ−ＤＴＰＡ（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ）によるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子についての、１／Ｔｉ対ガドリニウム濃度のプロットの形態における緩和度を示す。
【図５ｂ】図５ａおよび５ｂは、本発明品およびＧｄ−ＤＴＰＡ（Ｍａｇｎｅｖｉｓｔ）によるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子についての、１／Ｔｉ対ガドリニウム濃度のプロットの形態における緩和度を示す。
【図６】図５ａおよび５ｂの緩和時間測定のために使用されたスピンエコーシーケンスにおける、第１のエコー（ＴＥ＝３０ms、ＴＲ＝５００ms）からの信号強度を示す図である。
【図７】０．１、０．３、０．６および０．９mM  Ｇｄで８時間インキュベートされた単球のＴｉ‐マップを示す図である：ａ）Ｇｄ２Ｏ３、ｂ）Ｇｄ−ＤＴＰＡ。
【図８】本発明品およびＲｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）によるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子についての、１／Ｔｉ対濃度のプロットの形態における緩和度を示す図である。
【図９】本発明品およびＲｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）によるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子についての、１／Ｔｉ対濃度のプロットの形態における緩和度を示す図である。
【図１０】本発明品およびＲｅｓｏｖｉｓｔ（登録商標）によるＧｄ２Ｏ３ナノ粒子の緩和時間測定のために使用されたスピンエコーシーケンスにおける第１のエコー（ＴＥ＝３０ms、ＴＲ＝５００ms）からの信号強度を示す図である。
【図１１】図１１は、０．１から１．５mM  Ｇｄの濃度における水およびＧｄ２Ｏ３ナノ粒子の信号強度における比較を示す。
【図１ａ】
2008513053.tif 000005
【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図１ｄ】
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【図１ｅ】
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【図１ｆ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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