(57)【要約】組織再生の領域における足場特性を有する活性薬剤の送達系としての、有機または無機の賦形材料、生分解性ポリマー、および水溶性ポリマー性可塑剤を含有しているインサイチュー硬化ペーストが開発された。硬化したペーストは、骨および軟骨の置換マトリックスとして使用するために十分な機械的安定性を有している。全ての成分が、完全に生体適合性であり、好ましくは生体吸収性であり、非経口適用のため認可されている。ペプチドおよびタンパク質の徐放は、組成および工程の設計によって調節され得る。本発明は、本発明のペーストを含む薬学的組成物を包含し、骨強化、骨欠損の処置、変性性および外傷性の板疾患の処置、骨裂開の処置のために使用される、またはサイナス・フロア・エレベーション（sinus floor elavation）のために使用される薬学的組成物の調製のための該ペーストの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
パッケージ内では注射可能であり、かつ安定しているが、水性媒体または体液と接触することにより、インサイチューで硬化して固体インプラントを形成することができる、
（a）水溶性または水混和性の生体適合性有機液体である可塑剤、
（b）生体適合性、生分解性、かつ／または生体吸収性であり、かつ可塑剤に可溶性である水不溶性ポリマー、
（c）可塑剤に不溶性である水不溶性固体賦形剤
を含むインサイチュー硬化ペースト。
【請求項２】
有効量の水溶性孔構築賦形剤をさらに含む、請求項1記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項３】
インプラントが、100μm以上の直径を有する相互に接続されている孔を有する、請求項1または2のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項４】
活性薬剤をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項５】
水不溶性固体賦形剤へとコーティングされた活性薬剤を含む、請求項1〜4のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項６】
水不溶性固体賦形剤が、300μm以上である粒子サイズを有するアルファ-リン酸三カルシウムである、請求項1〜5のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項７】
水不溶性固体賦形剤と水不溶性ポリマーとの比率が1：1と5：1の間である、請求項1〜6のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項８】
水不溶性ポリマーがPLGAである、請求項1〜7のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項９】
水不溶性ポリマーがエンド・キャップト・ポリマー（end-capped polymer）である、請求項8記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項１０】
組成物の水不溶性ポリマー含有量が40wt％以下である、請求項1〜9のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項１１】
ペースト組成物の密度が1,21g/ml以上である、請求項1〜10のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項１２】
可塑剤が、ポリエチレングリコール（PEG）、好ましくはPEG400である、請求項1〜11のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項１３】
可塑剤含有量が40〜95wt％である、請求項1〜12のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項１４】
水溶性固体孔構築賦形剤が、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩である、請求項2〜13のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項１５】
組成物の水溶性固体孔構築賦形剤含有量が10wt％未満である、請求項2〜14のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項１６】
水溶性固体孔構築賦形剤が25〜1000μmの粒子サイズを有する、請求項2〜15のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項１７】
活性薬剤が、骨誘導性または軟骨誘導性のタンパク質である、請求項4〜16のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペースト。
【請求項１８】
請求項1〜3または6〜17のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペーストの作製のための方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）水不溶性ポリマーを含む成分Bを、可塑剤を含む成分Aに溶解させることにより、成分Aと成分Bとを混合し、粘性の液体を提供する工程；および
（b）（a）において入手された該粘性の液体を水不溶性固体賦形剤と混合し、ペーストを調製する工程。
【請求項１９】
請求項4〜17のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペーストの作製のための方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）水不溶性ポリマーを含む成分Bを、可塑剤を含む成分Aに溶解させることにより、成分Aと成分Bとを混合し、粘性の液体を提供する工程；
（b）活性薬剤を該粘性の液体に溶解させる工程；および
（c）（b）において入手された該粘性の液体を水不溶性固体賦形剤と混合し、ペーストを調製する工程。
【請求項２０】
請求項4〜17のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペーストの作製のための方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）水不溶性ポリマーを含む成分Bを、可塑剤を含む成分Aに溶解させることにより、成分Aと成分Bとを混合し、粘性の液体を提供する工程；および
（b）（a）において入手された該粘性の液体を水不溶性固体賦形剤（該水不溶性固体賦形剤は、該固体賦形剤にコーティングされた活性薬剤を含む）と混合し、ペーストを調製する工程。
【請求項２１】
骨強化のため使用される薬学的組成物の調製のための、請求項1〜17のいずれか一項記載のインサイチュー硬化ペーストの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
インサイチューで硬化した後、足場特性を示す、安定な注射可能かつ成型可能な製剤としての、有機溶媒である水溶性または水混和性の可塑剤、有機または無機の水不溶性賦形材料、および水不溶性ポリマーを含有しているインサイチュー硬化ペーストが開発された。そのペーストは、さらに、組織再生の領域において、活性薬剤の送達系として使用され得る。
【０００２】
抗被膜形成（anti-skin forming）剤としての水溶性孔構築賦形剤の添加は、細胞浸潤のために十分な直径の孔サイズを有する孔の形成を増加させる。
【０００３】
硬化したペーストは、骨および軟骨の置換マトリックスとして、そして靱帯、張力の再生、または歯周病の処置のために使用するために十分な機械的安定性を有している。全ての成分が、完全に生体適合性であり、好ましくは生体吸収性であり、非経口適用のため認可されている。ペプチドおよびタンパク質の徐放は、組成および工程の設計によって調節され得る。
【０００４】
本発明は、本発明のペーストを含む薬学的組成物を包含し、骨強化、骨欠損の処置、変性性および外傷性の板疾患の処置、骨裂開の処置のために使用される、またはサイナス・フロア・エレベーション（sinus floor elevation）、歯周修復を含む靱帯および張力の再生のために使用される薬学的組成物の調製のための該ペーストの使用に関する。最後に、本発明は、本発明のペーストを含むキットに関する。
【背景技術】
【０００５】
背景技術
医薬技術の領域において、様々な材料が、材料が満たすべき広範囲の要件のため、骨置換材料（骨移植片）として使用するために、既に評価されており、かつ／またはさらに改良されている途中である。適応症に依って、理想的な骨移植代用物は、以下の特性を有するべきである。まず、成型可能であり成形および投与が容易であるが、骨欠損部の架橋、空洞の充填、または骨強化のための内因性の骨に類似した長期的な機械的安定性を有しており、好ましくは、材料は、最小侵襲適用により適用可能であるためにインサイチューで硬化することができるべきである。材料は、生体適合性、好ましくは生分解性かつ生体吸収性でなければならず、細胞の接着および増殖を促進しなければならない。それは、周囲の骨組織との結合を可能にするための細胞の内部成長を可能にするため、相互に接続されたポロシティを有するべきである（骨伝導性（osteoconductivity））。さらに、材料は、骨形成を導入する骨成長因子（BMP）の放出制御のための、これらのタンパク質の担体として作用することができるべきである（骨誘導性（osteoinductivity））。理想的には、材料内のタンパク質は、移植の部位における流失およびタンパク質分解から保護される。最後に、材料は、感染および免疫学的反応を回避するために合成起源であるべきであり、入手可能であり、かつ再現性のある質を有しているべきである。理想的には、合成骨置換材料は、治癒過程を調査し、新たな骨形成の量および嵩を決定するため、X線撮影検査によって明瞭に可視であるべきである。
【０００６】
にもかかわらず、好ましい材料のこれらの要件を全て満たすことができる材料は、現在のところ存在しない。人工骨移植の医学的な必要性および自己骨の限られた利用可能性のため、種々の材料が一般的に使用されている。最も顕著なものは、リン酸カルシウムおよびPLGA型の生体吸収性ポリマーである。
【０００７】
リン酸カルシウムに基づく材料
ベータ-リン酸三カルシウム（Ca3(PO4)2）（ベータ-TCP）、アルファ-リン酸三カルシウム（アルファ-TCP）、およびハイドロキシアパタイト（Ca10(PO4)6(OH)2）（HA）のような様々なリン酸カルシウムが、骨置換材料として有効であることが示されている。ベータ-TCPは、例えば、骨欠損の処置のため、様々な顆粒（granulates）としても、小片（塊）においても適当である。リン酸カルシウムを含有している骨置換材料は、通常、骨の再生が全く不可能であるか、または可能ではあるが困難を伴う場合にのみ使用される。さらに、骨置換材料は、付加的な骨の形成が、その後のインプラントの設置のための先行条件である場合に、使用される。リン酸カルシウムは、骨伝導効果を示し、即ち、近隣の骨からの細胞の遊走を容易にする不活性の構造を表す。しかしながら、骨または種々の間葉系細胞の存在が、新たな骨の形成のための前提条件となる。
【０００８】
自己骨チップの添加は、リン酸カルシウムの効果を有意に増加させ得る。これらの骨チップは、骨伝導性であるのみならず、骨誘導性でもあり、即ち、未分化の間葉系幹細胞の骨芽細胞および軟骨細胞への転換を引き起こす。安全性の理由のため、自己骨チップは、同種異系または異種の調製物より好ましい。しかしながら、自己骨の使用は、患者にとっては不快であり、利用が制限される、第二の外科的手技を必然的に含む。さらに、自己骨移植材料の生検は、術後の疼痛および移植片採取合併症を含むいくつかの短所を有する。
【０００９】
前記の固体の塊および顆粒に加え、リン酸カルシウム・セメント（CPC）は、リン酸カルシウムに基づく材料のさらに巨大なクラスを表す。それらは、成型可能なペーストとして注射またはスクレイパーを介して骨欠損部へと送達され、欠損部位に適応させられ、ある期間の後、固体になる（Driessens et al., 2002）。
【００１０】
第一の自己硬化CPCのうちの一つは、リン酸四カルシウム（TTCP）および無水リン酸二カルシウム（dicalcium phosphate anhydrous）（DCPA）からなる（Chow et al., 2000）。これらの成分は、水の存在下で反応して、セメント凝固反応の最終生成物としてハイドロキシアパタイトを形成する。その反応は、吸熱性または発熱性である。発熱性反応は、骨形成性タンパク質を変性させるのに十分な熱を発生させるが、吸熱性の凝固反応は、周囲組織の熱による損傷を防止する。
【００１１】
ハイドロキシアパタイトは水性環境において形成されるため、高温過程により形成されたハイドロキシアパタイトよりむしろ生物学的アパタイトに類似している。結果として、CPCは、骨伝導性であり、容易に骨統合される（osteointegrates）（Cherng et al., 1997）。
【００１２】
CPCは、現在使用されているリン酸カルシウム・バイオマテリアルと比べていくつかの利点を有しているようであるが、明白な限界は、以下に説明される流失効果と結び付いた比較的長い硬化時間である（Cherng et al., 1997）。近年、アルファ-リン酸三カルシウム（アルファ-TCP）および炭酸カルシウム（CaCO3）、リン酸一カルシウム（MCPA）、リン酸一カルシウム一水化物（MCPM）、脱水リン酸二カルシウム（dicalcium phosphate dehydrate）（DCPD）またはDCPAおよびCa(OH)2を含有しているさらなるCPCが開発されている（Takagi et al., 2003）。しかしながら、昨年開発された市販されているCPCの大部分が、初期粉末相の種々の粒子サイズを有する主反応物としてアルファ-TCPを有している。市販されている生成物には、Biobon（登録商標）（α-BSM）、Biocement DおよびH、Biofill（登録商標）、Bonesource（登録商標）、Calcibon（登録商標）、Cementek（登録商標）、Mimics Biopex（登録商標）、ならびにNorian（登録商標）SRS（登録商標）が含まれる（Driessens et al., 2002）。
【００１３】
Alpha-BSM（ETEX Corporation, Cambridge, MA）は、二つのリン酸カルシウムから主として構成されており、そのうちの一つは、1,54のCa/P比を有する無定形リン酸カルシウム（ACP）であり、もう一つは、脱水リン酸二カルシウム（DCPDまたはブラッシャイト（brushite））である。その材料は、体温（37℃）において水または生理食塩水溶液と混合された後およそ20分以内に硬化して、不十分に結晶性のハイドロキシアパタイト相を形成する注射可能な骨置換物である。
【００１４】
もう一つのCPCペーストは、骨格の回復または強化において損なわれた海綿質の領域における欠損部を充填するために使用されている、注射可能な、迅速に硬化する炭酸化（carbonated）アパタイト・セメントであるNorian（登録商標）SRS（登録商標）（Skeletal Repair System）である。Norian SRSは、硬化して、骨の鉱質相を精密に複製するダーライト（dahlite）を形成し、破骨細胞吸収および新たな骨形成を介して体内の骨へと徐々にリモデリングする。このCPCは、適用前に、特別な採用された装置において予備混合される必要がある。
【００１５】
これらの入手可能なCPC製剤の大部分が、混合された場合に反応し硬化する二つの成分から構成されている（Seeherman et al. 2002）。粉末成分は、適用直前に加速剤または促進剤（例えば、リン酸水素二ナトリウム、Na2HPO4）を含む何らかの水性溶液と混合される。この予備混合手法は、使用前の操作に依る最終生成物の質の偏り、例えば不均質な懸濁物を与える。従って、この予備混合手法は、インプラントの機械的安定性を減少させ、従って再現性に関する問題を呈し得る。
【００１６】
これらの製剤のもう一つの限界は、粉末が水性成分と混合されると、混合物が固体化し始め、従って、セメントが投与され得る時間枠がわずか数分に制限されるという点である。臨床的な状況において、外科医は、適切にセメントを混合し、次いで、規定された時間以内に欠損部にセメント・ペーストを配置しなければならず、それが、最適な結果を達成するための重大な要因となる。
【００１７】
注射器内では安定しており、水に曝された後にのみ硬化する予備混合されたCPCペーストは、TTCP＋DCPA粉末およびセメント液としてのグリセロールを含有している。しかしながら、CPC-グリセロール・ペーストは、湿った開かれた領域へ適用された場合、良好な流失抵抗性を有していなかった（Takagi et al., 2003）。
【００１８】
この流失効果は、CPCペーストが生理学的液体と接触した場合、またはいくつかの場合には止血を達成するのが困難であるために出血が起こった場合、生じる。そのようなペーストは、しばしば、体液またはその他の水性溶液と接触するやいなや、部分的もしくは完全に崩壊するか、または不均質な挙動を示すことも見出されている（米国特許第6,206,957号およびその中の参照）。さらに、そのようなペーストは、注射器からの押し出しの間に容易に分離し、より多くの液体部分が注射器から排出され、より多くの固体部分が注射器に残存し、より高い圧力によってすら除去され得ない。従って、分離の結果として、意図された目的にもはや適していない材料が入手されるかもしれない。
【００１９】
CPCの特質を改良するため、いくつかの試みが過去になされている。Cherngらは、CPCの操作特性を改良するため、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（HPMC）、カルボキシメチルセルロース（CMC）、およびキトサンをセメント液へ添加した（Cherng et al., 1997）。しかしながら、HPMCおよびCMCの添加により硬化時間が遅延し、キトサン・ラクテートまたはキトサン・アセテートいずれかの添加により機械的強度が弱まった。例えば、液体-粉末比の増加、クエン酸イオンの添加、および液体成分へのポリマー性薬物の添加による、CPCの注射可能性を改良するためのその他の試みもなされている（Bohner and Baroud, 2004）。しかしながら、これらの改良は、いずれも、安定な予備混合されたCPCペーストをもたらさなかった。
【００２０】
CPCのもう一つの主要な問題は、それらが、マイクロメートル未満〜数マイクロメートルの孔サイズを有するミクロポア（micropores）のみを示すことである。ハイドロキシアパタイト・インプラントを用いた以前の研究は、約100μm〜数百μmの孔サイズ（マクロポア（macropores））が、骨内部成長に必要とされることを示した（del Real et al., 2002）。マクロポアは、細胞浸潤および組織内部成長を容易にするために有益であることが示されている。しかしながら、マクロポロシティ（macroporosity）は、必ず、機械的強度を有意に減少させる（Chow, 2000）。
【００２１】
その他のグループは、例えば、材料のポロシティを増加させることにより、CPCの吸収挙動を改良することを試みた（del Real et al., 2002）。最も大規模な実験は、マンニトールまたはショ糖のような高度に可溶性かつ非毒性の化合物の正確な寸法の結晶と、CPCを混合することにより行われた。その短所は、インビボ環境におけるセメントの硬化中にポロシティが作出され得ないという点である。ショ糖またはマンニトールの添加は、マクロポロシティを得るため、適用後のこれらの成分の溶解および骨欠損部におけるセメントの硬化を必要とする。マクロポアを作出するためのもう一つの方法は、出発セメント粉末へのNaHCO3の添加および二つの異なる液体の使用からなる（del Real et al., 2002）。
【００２２】
マクロポアを形成させつつ、CPCの強度を増加させることが、例えば、マンニトール結晶またはアラミド繊維を使用することにより試みられた（Xu et al., 2001）。天然バイポリマー（bipolymer）であるキトサンの取り込みも、CPCの強度を増加させることが見出されたが、キトサン含有CPCにマクロポアは構築されなかった（Takagi et al., 2003；Xu et al., 2002）。
【００２３】
一般に、CPCは、比較的低い機械的安定性（例えば、圧縮強度、脆性）およびマクロポロシティ、例えば骨伝導性の欠如を欠点とし、整形外科におけるその適用可能性は、荷重がかからない（non load-bearing）適用のみに制限されている。異なるセメント反応によって、改変された吸収時間をもたらす、変動する結晶化度の状態を有するハイドロキシアパタイトが形成される。マクロポロシティが欠如しており、従って骨伝導性が欠如しているため、セメント製剤の多くが、骨形成性増殖因子のための不十分な担体である。
【００２４】
生理活性分子の送達媒体として生分解性ポリマー（例えば、ポリ（DL-ラクチドーコーグリコール酸、PLGA）の微粒子を添加することにより、CPCを改良するさらなる試みがなされている（Ruhe et al., 2003）。タンパク質PLGA微粒子がCPC粉末に添加され、適用直前に組成物に添加される液体としてNa2HPO4の水性溶液が使用された。
【００２５】
可能性のある臨床適用を広げるためにCPCがさらなる改良を必要とすることは、一般に認められている。しかしながら、材料特性のさらなる改良は、最小侵襲手術技術（Bohner, 2001に引用されたMIST）による、外科医が骨セメントを適用する方式を考慮して行われるべきである。この意味において、さらなる材料改良は、ある種の臨床適用のために考慮されるもの、最適なセメントの注射可能性、迅速な凝固挙動、マクロポロシティ、および機械的強度の折衷において考慮されるべきである。
【００２６】
最近、これらのCPC系は、特に、骨形成タンパク質と組み合わせられて、関心を集めている（Seeherman et al., 2003）。
【００２７】
合成PLGAに基づく材料
骨組織工学の領域において主要な役割を果たしているもう一つの重要なバイオマテリアル・クラスは、生体吸収性ポリマーである（Vert, 1989）。特に、ポリ（ヒドロキシ酸）の化合物クラスは、固有の生分解性のため興味深い適用の見込みを有している。ポリ（グリコール酸）（PGA）およびポリ（乳酸）（PLA）が最も顕著なものであるこれらの材料は、湿潤環境において加水分解による鎖切断（分解）を受ける。継続的な分解によって、最終的には、対応するヒドロキシ酸単位となる。これらの加水分解最終生成物の大部分が、多くの細菌および細胞表現型の代謝生成物として生じる。
【００２８】
分解可能性および機械的特性は、医学的技術におけるテンポラリー（temporary）インプラントのための基質として使用するための適用を提示する。異なる組織における様々なポリマーの研究は、医学的デバイスとしての商業的なインプラントの開発のための基礎を形成するインビボのこれらの化合物の生体適合性を立証している（Middleton et al, 2000）。
【００２９】
臨床外科において、ポリエステルは、おそらく、骨の固定、強化、および置換に関して最も重要な役割を果たしている。スクリュー、プレート、アンカー、またはピンのようなデバイスは、骨の損失または傷害の後の骨断片の位置付けおよび固定に役立つ。適用におけるこれらの吸収可能ポリマーの主要な特質は、除去作業の必要がないことである。もう一つの重要な点は、ポリマー性固定デバイスに有利である：骨組織へのインプラントの機械的組み込み。
【００３０】
完全にポリエステルに基づくインプラントにおける重要な欠点は、特に固体非多孔性インプラントが使用され、分解がバルク分解メカニズムに従って進んだ場合の、細胞障害性レベルに達する可能性のある分解生成物の蓄積、および、それに伴う、pHを低下させる酸性モノマー放出によるインプラント部位の酸性化である（Li et al., 1990）。
【００３１】
局所pH減少により引き起こされるそのような負の結果を回避するため、インプラントは、例えば、バルク分解を回避し、従って酸性モノマーの蓄積を回避し、ポリマーの正味の量を低下させるための塩浸出法によりポロシティを示さなければならない。さらに、PLA/PGAインプラントに塩基性塩を組み込むことが提唱されている（Agrawal et al., 1997）。その他のアプローチは、局所pH値の平衡を保ち、かつ機械的安定性を増加させるため、ポリエステルのための賦形剤としてリン酸カルシウムのような塩基性セラミックスを利用している（Schiller et al., 2003）。ハイドロキシアパタイトおよびPLA/PLGA（ポリラクチド-コ-グリコリド）の複合物も作製されている（Durucan et al., 2000）。そのような複合物の加工は、熱処理およびポリマー成分のクロロホルム溶液の使用を必要とする（Ignjatovic et al., 1999）。別法として、ポリ（ヒドロキシ酪酸）のようなより高い加水分解安定性を有するポリマーを使用することもできる。
【００３２】
骨置換物としてこれらのポリマーを使用のための一般的な戦略は、治癒過程を可能にし、かつ術後の移植部位において、初期段階の間、強度を保持するという機能を一時的に果たすインプラントを設計することである。その後、インプラントの強度および係数の損失は、損傷を受けた組織の増加する強度と調和しているべきである（Tormala et al., 1995）。分解の進行は、重大な宿主組織の内部成長により隙間を充填する回復過程のための空間を作出する。現在、大きい欠損部において新たな均質な骨を形成するための、この要件に充分に適合する充填材料は、入手可能ではない（Rueger et al., 1996）。
【００３３】
バイオマテリアルおよび骨誘導性タンパク質
骨誘導効果を達成するための自家骨の使用に代わる別法は、GDF-5または種々の骨形成タンパク質（BMP）のような、特別な骨の成長および分化のための因子の使用である。これらのタンパク質因子が、タンパク質放出を減速させ、従って欠損部位におけるタンパク質の有効滞留時間を増加させる担体と組み合わせられた場合には、この骨誘導効果が大きく増加し、最終的に液体製剤緩衝液と比較して骨治癒が加速されることを、多数の動物研究が明白に示している（Seeherman et al., 2003）。文献中には、担体として、リン酸カルシウム、コラーゲン、ミネラル化コラーゲン（リン酸カルシウムを含有しているコラーゲン）および生体吸収性ポリマー、ハイドロキシアパタイトおよびベータ-TCP（Hotz et al., 1994）、藻類抽出物由来のヒドロキシル（hydroxylic）アパタイト（Gao et al., 1996）、骨抽出物（Gombotz et al., 1996）、コラーゲン（Friess et al., 1999）、ならびにポリ（アルファ-ヒドロキシ）酸（Hollinger et al., 1996）が記載されている。
【００３４】
文献に記載されているコーティングされた担体の効力の分析は、均一な像を提示せず、選択された担体型またはコーティング法のいずれかの結果である有意な変動を示す（Terheyden et al., 1997）。様々な方法が記載されている。
【００３５】
WO98/21972においては、まず有機溶媒にGDF-5を溶解させ、次いで、水の添加によってそれを沈殿させることにより、GDF-5のベータ-TCPへの迅速な沈殿によるコーティングが達成されている。しかしながら、多くの溶媒の毒性のため、そのような過程は薬学的組成物の作製にとっては好ましくない。Lindら（1996）は、保護タンパク質としての（通常、ウシまたはブタの骨から入手される）ゼラチンの存在下で、様々なリン酸カルシウム・セラミックスのコーティングを実施している。しかしながら、感染および免疫原性反応の増加したリスクのため、薬学的組成物および薬用生成物の作製のための、動物性物質の使用は回避されるべきである。Friessら（1999）およびGaoら（1996）は、BMP-2によるコラーゲンのコーティングを記載している。しかしながら、コラーゲンの低い圧縮強度のため、そのような担体は、多くの適応症に適していない。これは、新たに形成された骨が、後の圧力負荷を支持しなければならない適応症に、特に当てはまる。さらに、薬学的品質のコラーゲンは、現在のところ、動物起源からしか入手可能でない。最後に、最先端技術の生成物（例えば、rhBMP-2およびコラーゲン・スポンジ）における増殖因子の速い分解速度および放出のため、薬物物質の含有量が、しばしば、骨組織における生理学的レベルより劇的に高い。
【００３６】
有利なことに、WO03/043673に開示されるように、生物学的活性を有する非凝集骨誘導性タンパク質による、ベータ-TCPまたはその他のリン酸カルシウムのような複合担体の均質な分布が実現され得るデバイスにおいて、対象、好ましくはヒトへの移植後のインビボの改良された確実な骨誘導特性および骨伝導特性が達成されることが、本発明者らによって見出された。そのような凝集は、微小沈殿を引き起こし、それが、先行技術、例えばWO98/21972の他のデバイスについて記載されたような少なくとも有意に減少した骨誘導特性をもたらす不均質な分布の理由である。さらに、移植後の対象の炎症および毒性反応のような望ましくない副作用が、毒性不純物または感染性夾雑物のないWO03/043673のデバイスによって回避され得ることが見出された。特に、溶解性メディエーターとしての（例えば、ゼラチンのような）保護タンパク質の使用は、WO03/043673のデバイスにとっては全く不要である。しかしながら、そのようなデバイスは、活性薬剤の放出遅延を必要とする適用には適していない。
【００３７】
骨強化の領域において、インプラント部位からの分散または分解のいずれかによる、骨誘導に関するヒト体内におけるタンパク質またはペプチドの短い半減期を考慮すると、特に、放出遅延系が必要とされる。骨形成タンパク質の放出遅延を達成するための第一の試みにおいて、そのようなタンパク質が生体吸収性ポリマーと組み合わせられたデバイスが開示された。Hollingerら（1996）は、BMP-2のための担体としてのポリ（アルファ-ヒドロキシ酸）の使用を発表した。骨形成性のタンパク質またはペプチドと組み合わせられたこれらのポリマーは、活性薬剤の放出制御の達成に関して特に興味深い。Wangら（2000）は、骨再生のための生理活性高分子を組み込み送達することができる生分解性の足場の製作のための、PLA塩化メチレン溶液により開始するエマルション凍結乾燥法を開示している。Schmidmaierら（2000）は、インプラントのコーティングにおいて、骨誘導性の因子IGF-IおよびTGF-ベータ1と共にPLAのクロロホルム溶液を使用することを開示している。
【００３８】
WO02/070029は、不均一な材料を形成するために、OP-1（osteogenic protein 1、骨形成タンパク質）が封入されたPLGAマイクロスフェアと任意で混和される多孔性ベータ-TCPマトリックスを開示している。WO03/043673とは対照的に、WO02/070029におけるベータ-TCPマトリックスは、相互に接続された孔ではなく単一の別々の空隙を示す。このマトリックスの孔には、ポリマーおよび／または活性薬剤成分の均質なコーティングを装備することができない。そのマイクロスフェアは、Alkmeres, Incにより作製され、封入された活性薬剤の微小凝集を許容する20〜500μmの直径を示す。そのようなマイクロスフェアの作製のためには、ポリマー成分の塩化メチレン溶液が、タンパク質と共に、強冷エタノール中に噴霧され凍結させられるが（Herbert et al., 1998、例えば、米国特許出願第6,726,860号参照）、いずれの工程も、タンパク質に化学的ストレスおよび機械的ストレスを与える二つの異なる有機溶媒と組み合わせられる。
【００３９】
流動可能な生分解性ポリマーに基づく送達系
インプラントおよびその他の固体物体のような医学的デバイスの体内への配置は、高頻度に、外科的手技を含む。しかしながら、いくつかの適用、例えば、薬物送達または最小侵襲のため、生分解性ポリマーに基づく送達系が、リン酸カルシウム・セメントに類似した流動可能製剤として体内に導入され得ることが記載されている（例えば、EP0436667、EP0537559、EP0539751、EP0754032、EP0862416、EP1126822、EP1147781、EP1404294、US6,461,631、US5,780,044、およびUS5,278,202、ならびにAtrix Laboratories, Inc.に譲渡された外国対応特許を参照のこと）。
【００４０】
タンパク質が周囲の媒体と直接接触する担体内または担体上にある、やはり流動可能であるCPCとは対照的に、ポリマー含有担体（例えば、ポリ（アルファ-ヒドロキシ酸）内のタンパク質は、保護および／または安定化され得る。さらに、リン酸カルシウム・セメントからは、拡散によってのみタンパク質またはペプチドが放出されるが、ポリマー・マトリックス内のタンパク質またはペプチドは、ポリマーの増加する分解および／またはポリマー・マトリックスからの拡散によって放出される。従って、放出動力学が、純粋なリン酸カルシウム・セメントの場合より容易に微調整され得る。
【００４１】
これらの組成物は、体液または水性液体への曝露により体内でインサイチューの生分解性の固体インプラントを形成するための、生体適合性の水混和性の有機溶媒の中に水不溶性の生分解性ポリマーを含み、体内で有機溶媒の消散または分散によりインサイチューで固体マトリックスを形成するため、注射器を使用して液体として投与される。水との接触により、ほぼ無孔性の表面に囲まれた高度に多孔性の内側コア構造を有する足場が形成される。
【００４２】
この無孔性表面は、内側コアへの細胞遊走を阻害し、従って、これらの材料は骨伝導特性を示さない。これらのインプラントは、補綴デバイスおよび／または生物学的活性を有する薬剤の制御された送達系として使用される。
【００４３】
この型の材料クラスのもう一つの欠点は、材料が十分な機械的安定性を示すまでの長い硬化時間である。しかしながら、ポリマーのその後のインビボ分解は、従来のポリマーに基づく足場に関して既に記載されたような類似した問題を引き起こす。それらは、機械的特性を損失させ、局所pHを細胞障害性レベルへと低下させる分解を示す。結果として、これは、炎症性の異物応答を生じさせ得る。
【００４４】
さらに、それらは、上記のリン酸カルシウム系と同一の生理活性および骨伝導特性を保有していない。
【００４５】
従って、生物への負荷（ポリマー含有量）を低下させつつ、バイオマテリアルを骨構造と置換するため、加速された硬化挙動を有する、細胞の浸潤および遊走のための相互接続性の多孔性足場をインビボで提供する、改良された注射可能かつ生体適合性かつ生分解性の組成物の必要が存在する。
【００４６】
本発明の基礎となるもう一つの目的は、パッケージ内では安定しており、必要であれば材料の形状を欠損部サイズへと調整するための十分な時間により、欠損部に配置された後にのみ硬化する、良好な流失抵抗性を有する予備混合されたインサイチュー硬化ペーストを有することである。
【００４７】
本発明のもう一つの目的は、欠損部に配置された後に足場の表面および内部の至る所でマクロポア性（macroporous）の足場を形成することができる、組成物による骨強化を必要とする対象への移植に適しているインサイチュー硬化ペーストの提供である。
【００４８】
本発明の基礎となるもう一つの目的は、十分な機械的強度を有し、かつ／またはポリマー分解により誘導される局所pH減少に関連した問題を回避する、骨強化を必要とする対象への移植に適しているインサイチュー硬化ペーストの提供である。
【００４９】
本発明の基礎となるもう一つの目的は、注射、成型、充填、または圧縮による、骨強化を必要とする対象への移植に適しているインサイチュー硬化ペーストの提供である。インサイチューで、活性薬剤を含むペーストは、好ましくは該活性薬剤の最適化された局所活性と共に、マトリックスに付着した活性薬剤の放出遅延を可能にするべきである。
【００５０】
本発明の基礎となるもう一つの目的は、付着した活性薬剤の放出遅延を可能にし、ポリマー分解により誘導される局所pH減少に関連した問題を回避する、注射による骨強化を必要とする対象への移植に適しているインサイチュー硬化ペーストの提供である。
【００５１】
本発明の基礎となるもう一つの目的は、付着した活性薬剤の放出遅延を可能にし、毒性副作用および／または炎症性応答を回避する、注射による骨強化を必要とする対象への移植に適しているインサイチュー硬化ペーストの提供である。
【００５２】
本発明の基礎となるもう一つの目的は、付着した活性薬剤の放出遅延を可能にし、従来のデバイスと比較してより低い活性薬剤の用量を可能にする、注射による骨強化を必要とする対象への移植に適しているインサイチュー硬化ペーストの提供である。
【００５３】
本発明の基礎となるもう一つの目的は、骨および軟骨の欠損部の充填のための機械的に安定でかつ多孔性の足場を形成することができる、注射による付着した活性薬剤の放出遅延を可能にする、骨を必要とする対象への移植に適しているインサイチュー硬化ペーストの提供である。
【００５４】
本発明の基礎となるもう一つの目的は、生理学的条件下で硬化し、手術を介して移植される従来のデバイスに取って代わることができる、注射による付着した活性薬剤の放出遅延を可能にする、骨を必要とする対象への移植に適しているインサイチュー硬化ペーストの提供である。
【発明の開示】
【００５５】
発明の概要
驚くべきことに、本発明者らは、これらの目的を満たすインサイチュー硬化ペーストおよび該ペーストの作製のための対応する方法を提供することができた。
【００５６】
それにより、本発明者らは、ヒトまたは動物のような生物への高いポリマー含有量の負荷を低下させつつ、水、生理学的溶液、細胞培養培地（例えば、FCS）、または体液のような水性液体との接触の後に硬化し、湿った開かれた領域へ移植された場合ですら、改良された機械的強度およびインプラント部位における流失に対する抵抗性を示す、安定な予備混合されたペーストである、可塑剤、水不溶性ポリマー、および水不溶性固体賦形剤を含むインサイチュー硬化ペーストを提供する。さらに、本発明者らは、改良されたマクロポロシティを有する、可塑剤、水不溶性ポリマー、水不溶性固体賦形剤、および水溶性孔構築賦形剤を含むインサイチュー硬化ペーストを提供する。
【００５７】
高い機械的強度のみならず、ポロシティ、好ましくは約100μm以上の孔サイズを有するマクロポロシティ、および生存細胞の内部成長にとって十分な相互に接続されている多孔性足場の形成が、組成物により充填された空隙における新たな骨形成を支持する。
【００５８】
本発明の態様は、以下の通りである。
【００５９】
（1）パッケージ内では注射可能であり、かつ安定しているが、水性媒体または体液と接触することにより、インサイチューで硬化して固体インプラントを形成することができる、（a）水溶性または水混和性の生体適合性有機液体である可塑剤、
（b）生体適合性、生分解性、かつ／または生体吸収性であり、かつ可塑剤に可溶性である水不溶性ポリマー、
（c）可塑剤に不溶性である水不溶性固体賦形剤
を含むインサイチュー硬化ペースト。
【００６０】
（2）有効量の水溶性孔構築賦形剤をさらに含む、（1）記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００６１】
（3）インプラントが、100μm以上の直径を有する相互に接続されている孔を有する、（1）または（2）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００６２】
（4）活性薬剤をさらに含む、（1）〜（3）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００６３】
（5）水不溶性固体賦形剤へとコーティングされた、または可塑剤に溶解もしくは懸濁した、好ましくは水不溶性固体賦形剤へと均質にコーティングされた活性薬剤を含む、（1）〜（4）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００６４】
（6）水不溶性固体賦形剤が、
a）無機化合物、
b）有機化合物
である、（1）〜（5）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００６５】
好ましい態様において（6a）、該無機化合物は、酸化マグネシウム；水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、または二酸化ケイ素である。
【００６６】
または（6b）、該無機化合物は、カルシウム化合物、好ましくは硫酸カルシウムまたは炭酸カルシウム、より好ましくはリン酸カルシウムであり；最も好ましくはリン酸三カルシウム、ベータ-リン酸三カルシウム、アルファ-リン酸三カルシウム、アパタイト、リン酸カルシウム含有セメント、またはリン酸四カルシウムである。
【００６７】
さらなる態様において（6c）、該有機化合物は、キトサン、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）、ヒアルロン酸もしくはその誘導体、セルロースもしくはその誘導体、またはデンプンもしくはその誘導体である。
【００６８】
（6a）、（6b）、および（6c）の一つ以上の化合物の組み合わせも、包含される（6d）。
【００６９】
（7）無機化合物が、300μm以上である粒子サイズを有するアルファ-リン酸三カルシウムである、（6）記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００７０】
（8）好ましくは、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、またはハイドロキシアパタイトの群より選択される、少なくとも一つのさらなるカルシウム含有水不溶性固体賦形剤を含む、（1）〜（7）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００７１】
（9）水不溶性固体賦形剤と水不溶性ポリマーとの比（即ち、重量比）が、1：1と5：1の間、好ましくは1：1と3：1の間、より好ましくはおよそ1,5：1であり、混合物が、50wt％未満、好ましくは30〜36wt％の水不溶性固体賦形剤、および40wt％未満、好ましくは20〜25wt％の水不溶性ポリマーを含有している、（1）〜（8）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００７２】
（10）水不溶性ポリマーが、ポリ（アルファ-ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、ポリ（アミノ酸）、ポリグリコール酸（PGA）、ポリ乳酸（PLLA）、ポリ（D,L）-乳酸（PDLLA）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）（PLGA）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）ポリエチレングリコール（PLGA-PEG）コポリマー、ポリ（3-ヒドロキシ酪酸）（P（3-HB））、ポリ（3-ヒドロキシ吉草酸）P（3-HV）、ポリ（p-ジオキサノン）（PDS）、ポリ（イプシロン-カプロラクトン）（PCL）、ポリ無水物（PA）ポリオルトエステル、ポリエチレン（PE）、ポリプロピレン（PP）、ポリエチレンレフタレート（polyethylenerephtalate）（PET）、ポリグラクチン、ポリアミド（PA）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリヒドロキシメチルメタクリレート（PHEMA）、ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリエトラフルオレチレン（polyetrafluorethylene）（PTFE）、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）、ポリスルホン（PSU）、ポリビニルピロリドン、ポリウレタン、ポリシロキサン、またはそれらのコポリマー、テルポリマー、ブロックコポリマー、組み合わせ、混合物である、（1）〜（9）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。これらのポリマーは生体適合性である。
【００７３】
（11）水不溶性ポリマーがPLGAである、（1）〜（10）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００７４】
（12）水不溶性ポリマーがエンド・キャップト・ポリマー（end-capped polymer）である、（11）記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００７５】
（13）組成物の水不溶性ポリマー含有量が40wt％以下である、（1）〜（12）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００７６】
（14）ペースト組成物の密度が1,21g/ml以上、好ましくは1,3g/mlと1,5g/mlの間である、（1）〜（13）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００７７】
（15）可塑剤が、ポリエチレングリコール（PEG）400、PEG200、PEG300、PEG600、1,3-ブタンジオール、ヒマシ油、N-メチル-2-ピロリドン、2-ピロリドン、C2〜C6アルカノール、プロピレングリコール、ソルケタール（solketal）、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、乳酸エチル、メチルエチルケトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、テトラヒドロフラン、カプロラクタム、デシルメチルスルホキシド、オレイン酸、プロピレンカーボネート、トリアセチン、N,N-ジエチル-m-トルアミド；1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、またはそれらの混合物である、（1）〜（14）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００７８】
（16）可塑剤含有量が40〜95wt％、好ましくは40〜55wt％である、（1）〜（15）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００７９】
（17）（1）〜（16）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストにおいて、水溶性固体孔構築賦形剤が、
（a）膨張剤、好ましくはセルロース誘導体；
（b）界面活性剤、好ましくはPluronics（登録商標）もしくはTween（登録商標）80のような、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマー；または
（c）トレハロース、マンニトール、ショ糖、ソルビトール、生理学的アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アルギニン、クエン酸ナトリウム、コハク酸ナトリウム、およびリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ポリビニルピロリドン（PVP）、PEG4000、PEG10000のような固体PEG、炭酸水素ナトリウム、硫酸カルシウム、もしくはキトサンのような孔形成剤；または
（d）炭酸カルシウムもしくは炭酸水素ナトリウムのような気体もしくは気体形成剤
のうちの一つまたは複数を含む、インサイチュー硬化ペースト。
【００８０】
（18）水溶性固体孔構築賦形剤が、カルボキシメチルセルロース塩、好ましくはカルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩である、（17）記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００８１】
（19）組成物の水溶性固体孔構築賦形剤含有量が10wt％未満、好ましくは5 wt％未満、より好ましくは2,5 wt％未満、最も好ましくは1 wt％以下である、（17）および（18）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００８２】
（20）水溶性固体孔構築賦形剤が、1000μm未満、好ましくは25〜1000μm、好ましくは50〜500μm、最も好ましくは100〜300μmの粒子サイズを有する、（17）〜（19）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００８３】
（21）以下のものを含む（1）〜（20）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト：
（a）PEG400
（b）PLGA
（c）リン酸カルシウム含有セメント、炭酸カルシウム、ハイドロキシアパタイト、リン酸水素カルシウム、およびアルファ-リン酸三カルシウム、またはそれらの混合物の群より選択されるリン酸カルシウム；ならびに
（d）膨張剤、好ましくは、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩。
【００８４】
（22）以下のものを含む（1）〜（21）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト：
（a）PEG400：40〜50wt％、好ましくは40〜45wt％；
（b）PLGA：20〜25wt％、好ましくは22〜25％；
（c）リン酸カルシウム含有セメントおよびアルファ-リン酸三カルシウムの群より選択されるリン酸カルシウム：25〜40wt％、好ましくは30〜35wt％；ならびに
（d）カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩：10wt％以下、好ましくは5wt％以下、より好ましくは2,5wt％未満、最も好ましくは1wt以下。
【００８５】
（23）骨誘導特性および／または骨伝導特性、軟骨または歯周靱帯を再生させる特性をインビボで有する、（1）〜（22）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００８６】
（24）活性薬剤が、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、抗生物質、および低分子からなる群より選択される、（4）〜（23）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００８７】
（25）活性薬剤が、副甲状腺ホルモン（PTH）および／またはPTH1-34ペプチドである、（4）〜（24）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００８８】
（26）活性薬剤が、骨誘導性または軟骨誘導性のタンパク質である、（4）〜（25）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００８９】
（27）活性薬剤が、TGF-ベータ・ファミリーのメンバーまたはBMPファミリーのメンバーである、（26）記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００９０】
（28）活性薬剤が、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15、またはBMP-16である、（26）記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００９１】
（29）活性薬剤が、GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-4、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、またはGDF-11である、（26）記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００９２】
（30）活性薬剤が、軟骨再生軟骨由来レチノイン酸感受性タンパク質（cartilage regenerating cartilage derived-retinoic acid-sensitive protein）（CD-RAP）である、（26）記載のインサイチュー硬化ペースト。
【００９３】
（31）（1）〜（3）または（6）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの作製のための方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）水不溶性ポリマーを含む成分Bを、可塑剤を含む成分Aに溶解させることにより、成分Aと成分Bとを混合し、粘性の液体を提供する工程；および
（b）（a）において入手された該粘性の液体を水不溶性固体賦形剤と混合し、ペーストを調製する工程。
【００９４】
（32）（4）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの作製のための方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）水不溶性ポリマーを含む成分Bを、可塑剤を含む成分Aに溶解させることにより、成分Aと成分Bとを混合し、粘性の液体を提供する工程；
（b）活性薬剤を該粘性の液体に溶解させる工程；および
（c）（b）において入手された該粘性の液体を水不溶性固体賦形剤と混合し、ペーストを調製する工程。
【００９５】
この方法は、上記粘性の液体に可溶性の活性薬剤に適している。
【００９６】
（33）（4）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの作製のための方法であって、以下の工程を含む方法：
（a）水不溶性ポリマーを含む成分Bを、可塑剤を含む成分Aに溶解させることにより、成分Aと成分Bとを混合し、粘性の液体を提供する工程；および
（b）（a）において入手された該粘性の液体を水不溶性固体賦形剤（該水不溶性固体賦形剤は、該固体賦形剤にコーティングされた、好ましくは該賦形剤に均質にコーティングされた活性薬剤を含む）と混合し、ペーストを調製する工程。
【００９７】
この方法は、上記粘性の液体に不溶性の活性薬剤にも適している。
【００９８】
（34）水溶性孔構築賦形剤を添加する工程をさらに含む、（31）〜（33）のいずれか記載の方法。
【００９９】
（35）（1）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストを含む薬学的組成物。
【０１００】
（36）骨強化のため使用される薬学的組成物の調製のための、（1）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの使用。
【０１０１】
好ましい態様において（36a）、骨強化は、外傷性、悪性、もしくは人工的な欠損の後のものであるか、またはインプラントのその後の設置のための先行条件である。骨強化に関するさらなる態様を、以下に挙げる。
【０１０２】
（37）骨欠損の処置のための薬学的組成物の調製のための、（1）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの使用。
【０１０３】
好ましい態様において（37a）、骨欠損は、長骨欠損、顎顔面部における欠損、または根尖切除、嚢胞もしくは腫瘍の摘出、抜歯、もしくは保持されている歯の外科的除去の後の骨欠損である。
【０１０４】
（38）変性性、外傷性の板疾患の処置、脊椎固定術、椎体骨折、椎骨形成術（vertebroplastie）、および脊柱後湾形成術（kyphoplastie）のための薬学的組成物の調製のための、（1）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの使用。
【０１０５】
（39）骨裂開の処置のための薬学的組成物の調製のための、（1）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの使用。
【０１０６】
（40）サイナス・フロア・エレベーションまたは萎縮した上顎堤もしくは下顎堤の強化のため使用される薬学的組成物の調製のための、（1）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの使用。
【０１０７】
（41）歯周病学における空洞の充填（filling cavities）および／またはサポート誘導組織再生（support guided tissue regeneration）のための薬学的組成物の調製のための、（1）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの使用。
【０１０８】
（42）軟骨形成を促進するための薬学的組成物の調製のための、（1）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの使用。
【０１０９】
（43）少なくとも一つの骨疾患の処置のために使用される薬学的組成物の調製のための、（1）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストの使用。
【０１１０】
好ましくは、該骨疾患は、軟骨形成分化が関与している以下の疾患から選択される：骨関節炎；慢性関節リウマチ、外傷による関節軟骨の損傷、自己軟骨細胞移植における軟骨細胞表現型の維持、耳、気管、もしくは鼻における軟骨の再構築、離断性骨軟骨炎、椎間板もしくは半月板の再生、骨折、および／または軟骨からの骨形成。
【０１１１】
（44）（1）〜（30）のいずれか記載のインサイチュー硬化ペーストを含むキット。そのキットは、インサイチュー硬化ペースト、注射器、アプリケーター、インジェクター・ガン、アタッチメント・デバイス、ケージ、デバイス、最小侵襲適用デバイス、スパチュラ、またはそれらの組み合わせのような適用のための装置を含有し得る。
【０１１２】
好ましい態様の詳細な説明
本発明の原理の理解を促進するため、それらのある種の態様およびそれらを記載するために使用される特別な言語が言及される。にもかかわらず、本発明の範囲はそれらによって制限されるものではなく、本発明と関係がある技術分野の当業者に通常想到されるであろう、本明細書中に例示されるような本発明の原理の改変、さらなる適用、および修飾が企図されることが理解されるであろう。
【０１１３】
インサイチュー硬化ペースト
上に示されたように、本発明は、一般に、少なくとも三つの成分：水溶性または水混和性の生体適合性の有機液体である可塑剤、生体適合性、生分解性、かつ／または生体吸収性であり、可塑剤に可溶性である水不溶性ポリマー、および可塑剤に不溶性である水不溶性固体賦形剤を含むインサイチュー硬化ペースト組成物（ペーストは、パッケージ内では注射可能であり安定しており、欠損部に配置された後に硬化する）を提供する。水性媒体または体液と接触した後、インサイチュー硬化ペーストは、インサイチューで硬化して固体インプラントを形成することができる。好ましくは、予備混合されたペーストのパッケージ内での安定性は、少なくとも数週間、より好ましくは数ヶ月、最も好ましくは少なくとも1年である。安定性とは、長期的なコンシステンシーの劇的な改変のない予備混合されたインサイチュー硬化ペーストのコンシステンシーおよび成型可能性として理解され得る。パッケージは、薬学的適用において非経口適用のために一般的に使用されているような一般的に使用されている防水性のパッケージである。
【０１１４】
インサイチュー硬化ペースト、インサイチュー形成足場（IFS）、インサイチュー形成ペースト、IFS、IFS組成物、セラミック／ポリマー複合ペースト、およびペーストという用語は、本発明において交換可能に使用される。
【０１１５】
「インサイチュー硬化」という用語は、本発明において使用されるように、エクスビボ、およびヒトまたは動物のような生物の身体または組織において、有機溶媒の周囲への消散または溶解の後、水、生理学的溶液、または体液のような水性媒体との接触の後に、固体インプラントが形成されることをさす。適応症およびペーストの使用に依って、そのような固体インプラントには、例えば、歯周修復のためのインサイチュー硬化ペーストの場合のように、周囲の体液と接触した後、適用前のペーストより高い機械的強度を少なくとも有するインプラントも包含されるであろう。
【０１１６】
「ペースト」という用語は、本発明に従い使用されるように、前記のような少なくとも三つの成分、好ましくは少なくとも四つの成分、最も好ましくは少なくとも五つの成分を含む、注射器または最小侵襲適用を使用して投与可能な、柔軟な滑らかな濃厚な混合物もしくは材料、またはペースト様のエンティティをさす。ペーストは、外科的な欠損部充填、組織再生、または骨強化に適している。もう一つの態様において、ペーストは、移植後の活性物質の放出制御のための薬物送達系として使用される。
【０１１７】
好ましい態様において、本発明のペーストは、毒性物質を含まない。好ましくは、そのような毒性物質の生成は、作製過程の間に必要とされる除去工程のための付加的な経費を必要とし、高感度の化学分析に必要な高価な手段を必要とするため、それらは、作製過程において既に回避される。
【０１１８】
「毒性物質」という用語には、特に、ICHによりクラス2溶媒（ICH Topic Q 3 C Impurities: Residual Solvents）として分類されている、当技術分野において記載されている方法により使用される毒性の有機溶媒および添加剤、例えば、塩化メチレンが包含される。該物質は、該物質を含有しているデバイスの移植後、全身的もしくは局所的な毒性効果、炎症、および／またはその他の反応を引き起こし得る。該先行技術のデバイスは、当技術分野において記載されている従来のコーティング法では回避され得ない該望ましくない副作用のため、治療的許容性が低い。さらに、治療用タンパク質の開発のための国際的ガイダンスは、製造工程において、有害かつ毒性の物質が回避されることを必要としている（詳細に関しては、International Conference on Harmonization(ICH), Topic Q3C；www.emea.eu.int/を参照のこと）。しかしながら、本発明のペースト、または本発明の方法により入手可能なペーストは、有利にも、該クラス1に分類される毒性物質を含まない。さらに、本発明は、ICH Topic Q 3Cによりクラス3として分類された溶媒のみを含有しており、従って、治療的によく許容され、規制当局の要件を満たす。好ましくは、本発明のインサイチュー硬化ペーストの可塑剤、水不溶性固体賦形剤、および／または水溶性孔構築賦形剤に関しても、溶媒と共通の同要件が妥当である。
【０１１９】
「密度」という用語は、生物への適用前かつ硬化前のペースト状製剤の密度を意味する。それは、実施例23に従って計算される。本発明のペースト組成物の密度は、1,21mg/ml以上である。
【０１２０】
さらに、本発明のペーストまたは方法のさらなる好ましい態様において、該ペーストは感染性材料を含まない。
【０１２１】
毒性物質に加え、先行技術のデバイスに含まれる感染性材料は、デバイスが移植された対象において重度の感染を引き起こし得る。しかしながら、ウシまたはブタの骨に由来する感染性である可能性があるゼラチンは、多くの最先端技術の方法において保護タンパク質として使用されている（Lind et al., 1996）。
【０１２２】
本発明のインサイチュー硬化ペーストの成分の濃度の変動は、注射可能ペーストのコンシステンシー、インサイチューにおける硬化時間、最終インプラントのポロシティおよび機械的特性の変化による特定の医学的適用への適応をもたらす。さらに、これらのパラメーターの変動は、水不溶性ポリマーの変化した分解挙動による活性薬剤の放出動力学の適応における強力な手段である。
【０１２３】
B  可塑剤
本発明による「可塑剤」という用語は、薬学的に許容される水溶性もしくは水混和性の有機の液体もしくは溶媒、またはそれらの混合物を意味する。活性薬剤の特質に依存して、可塑剤の機能は、水不溶性の生分解性、生体適合性、かつ／もしくは生体吸収性のポリマーを溶解させること、または水不溶性の生分解性、生体適合性、かつ／もしくは生体吸収性のポリマーを溶解させ、かつ活性薬剤を溶解もしくは懸濁させること；水不溶性固体賦形材料を懸濁させること；または不溶性ポリマーを溶解させ、さらに水不溶性固体賦形剤を懸濁させることである。水性媒体または体液との接触によるインサイチュー硬化の間、可塑剤はペーストから拡散し、孔を残し、安定な複合デバイスまたはインサイチュー・インプラントを形成させる。従って、可塑剤は、水溶性または水混和性の溶媒でなければならず、液体、好ましくは水溶性のポリマーである。好ましくは、可塑剤は、インサイチューで硬化したインプラントにおける水不溶性ポリマーのガラス転移温度に低い影響を及ぼし、活性薬剤と適合性である。水不溶性ポリマーに依って、凝固後のポリマーのガラス転移温度に対する最低の影響を有する、以下にさらに定義される可塑剤の群から選択される可塑剤が使用されるべきである。
【０１２４】
「溶解させる」という用語は、液体内の物質の均質な分布を与える、物質の液体への溶解または懸濁を意味する。
【０１２５】
好ましくは、該可塑剤は生体適合性である。より好ましくは、該可塑剤は、ポリエチレングリコール（PEG）400、PEG200、PEG300、PEG600、1,3ブタンジオール、ヒマシ油、C2〜C6アルカノール、プロピレングリコール、ソルケタール、アセトン、酢酸メチル、酢酸エチル、乳酸エチル、メチルエチルケトン、ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ジメチルスルホン、テトラヒドロフラン、カプロラクタム、デシルメチルスルホキシド、オレイン酸、プロピレンカーボネート、トリアセチン、N,N-ジエチル-m-トルアミド、1-ドデシルアザシクロヘプタン-2-オン、またはそれらの混合物からなる群より選択される。
【０１２６】
最も好ましくは、該可塑剤は、ポリマー成分のTgに対する比較的低い影響（図8、9）、N-メチルピロリドンを含むものと比較して加速されたポリエチレングリコールを含むペーストの硬化過程（図13）、およびポリエチレングリコールのタンパク質との高い適合性（図17）のため、ポリエチレングリコールである。
【０１２７】
好ましくは、本発明のインサイチュー硬化ペーストは、60％未満、より好ましくは55％未満、より好ましくは50％未満、さらに好ましくは45％以下、かつ40％超、最も好ましくは40％と45％の間の可塑剤を含有している。そのような量のPEGを含有している本発明のインサイチュー形成足場は、改良された機械的特性を示す（図4）。
【０１２８】
「生体適合性の」という用語は、特定の適用における適切な宿主応答を伴って、材料が奏功する能力を意味する（Wintermantel E. et al., 2002）。「生体適合性の」という用語は、材料が、毒性を示さず、適用後に免疫学的反応または炎症反応を誘導しないことを意味する。
【０１２９】
「生分解性の」という用語は、消散を含む高分子分解によりインビボで破壊されるが、身体からの排除の証拠が存在しない材料、例えば、ポリマーを意味する。体内の生分解性材料の量の減少は、宿主組織内の物理化学的条件（例えば、湿度、pH値）により触媒される受動的な過程の結果である。
【０１３０】
「生体吸収性の」という用語は、インビボで分解およびさらなる吸収を受けたポリマー性材料のような材料；即ち、分解副生成物の単純なろ過により、またはそれらの代謝の後、天然経路を通って排除されるポリマーを意味する。従って、生体吸収とは、初期の外来材料の完全な排除を反映する概念である。本発明のペーストまたは方法の好ましい態様において、該生体吸収性ポリマーは、水性環境における高分子分解による鎖切断を受けるポリマーである。「吸収」という用語は、常に、能動的な過程を記載するものであることが記述されなければならない。
【０１３１】
C  水不溶性ポリマー
「水不溶性ポリマー」という用語は、水に可溶性でなく、即ち、水と混和された場合に均質な相を形成せず、可塑剤に可溶性であり、周囲組織への可塑剤の除去により、水性媒体において固体化して水不溶性固体賦形剤が取り込まれた固体インプラントを形成することができるポリマーを意味する。好ましくは、該水不溶性ポリマーは、「生体適合性」、「生分解性」、かつ／または「生体吸収性」のポリマーである。より好ましくは、該水不溶性ポリマーは脂肪族ポリマーであり、好ましくは純粋なポリマー物質の35℃超のガラス転移温度を有する。本発明のポリマーのインヘレント粘度（25℃、クロロホルム中0.1％で測定された粘度）は、約0.1dl/g〜5dl/g、好ましくは約0.1dl/g〜1dl/gの範囲であろう。
【０１３２】
または、該水不溶性ポリマーは、ポリエチレン（PE）、ポリプロピレン（PP）、ポリエチレンレフタレート（polyethylenerephthalate）（PET）、ポリグラクチン、ポリアミド（PA）、ポリメチルメタクリレート（PMMA）、ポリヒドロキシメチルメタクリレート（PHEMA）、ポリ塩化ビニル（PVC）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリテトラフルオレチレン（polytetrafluorethylene）（PTFE）、ポリエーテルエーテルケトン（PEEK）、ポリスルホン（PSU）、ポリウレタン、ポリシロキサン、またはそれらの混合物からなる群より選択される。これらのポリマーは、少なくとも生体適合性である。
【０１３３】
より好ましくは、該ポリマーは、ポリ（アルファ-ヒドロキシ酸）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（無水物）、ポリ（アミノ酸）、ポリグリコリド（PGA）、ポリラクチド（PLLA）、ポリ（D,L-ラクチド）（PDLLA）、ポリ（D,L-ラクチド−コ−グリコリド）またはポリ（L-ラクチド−コ−グリコリド）（PLGA）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）ポリエチレングリコール（PLGA-PEG）コポリマー、ポリ（3-ヒドロキシ酪酸）（P(3-HB)）、ポリ（3-ヒドロキシ吉草酸）（P(3-HV)）、ポリ（p-ジオキサノン）（PDS）、ポリ（イプシロン-カプロラクトン）（PCL）、ポリ無水物（PA）、これらのコポリマー、テルポリマー、ブロックコポリマー、組み合わせ、混合物からなる群より選択される。これらのポリマーは、少なくとも生体適合性かつ生分解性である。
【０１３４】
「組成物のポリマー含有量」という用語は、組成物の全重量に対する製剤中に含有されているポリマーの重量割合を意味する。本発明のインサイチュー硬化ペーストは、好ましくは、40wt％以下のポリマー、より好ましくは35wt％以下のポリマー、さらに好ましくは33wt％以下、最も好ましくは20〜25wt％のポリマー含有量を有する。選択された量のポリマーを含むこれらの組成物は、本発明に係るインサイチュー硬化ペーストの最適な機械的特性を示す（図2〜4）。
【０１３５】
より好ましくは、該ポリマーは、PLGA、最も好ましくはPLGA（50：50）である。乳酸：グリコール酸比率を変化させることにより、ポリマー鎖内のグリコール酸組成を0と100mol％（m％）の間のグリコール酸の間で変動させることにより、分解の速度を、特定の適用または使用にとって必要とされるものへと調整することが可能であり、好ましいのは、ポリマー鎖内50m％（50：50）である。ポリマーの分解挙動を微調整するためのもう一つの可能なパラメーターは、乳酸の対掌体（d-体またはl-体）の比率の選択である。PLGA（50：50）とは、約1：1のポリマー鎖内の乳酸：グリコール酸モノマー比率を意味する。本発明によると、図10に示されるように、より低分子量のポリマーRG 502と比較された、より高分子量のポリマーRG 503について観察されたような、より高い長期的な機械的安定性を有するインプラントは、より高い分子量を有するPLGAによってもたらされる。従って、好ましくは、より高い分子量を有するポリマーが望ましい。
【０１３６】
本発明のもう一つの態様において、水不溶性ポリマーは、エンド・キャップト・ポリマーである。「エンド・キャップト・ポリマー」という用語は、例えばポリマーRG 503Hに存在するような直鎖状ポリマー鎖の遊離のカルボン酸基が、アルコールによりエステル化されていることを意味する。エンド・キャップト・ポリマーを使用し、ポリマー内の遊離カルボン酸基の量を調節することにより、ポリマーの分解速度が、本発明のインサイチュー硬化ペーストの適用に依って、調節され得る。本発明者らは、大規模な分解研究において、RG 503のようなPLGA（50：50）について示されたように（図10）、エンド・キャップト・ポリマーが使用された場合、水性媒体におけるインプラントの長時間の機械的安定性が、有意に増強され得ることをさらに見出した。分解は、例えば、ポリマーのガラス転移温度（Tg）の減少を調査することにより証明され得る（図12）。さらなる分析的実験は、実施例において決定されたような、ポリマーのガラス転移温度と機械的安定性との関係をインビトロで示している。低いガラス転移温度は、インサイチュー形成足場の減少した機械的安定性をもたらす。さらに、これらの分解生成物（例えば、オリゴマー）は、残余のポリマー・エンティティに対する可塑化効果を発揮し、機械的強度を低下させ得る。
【０１３７】
本発明のもう一つの態様において、水不溶性ポリマーは、PLGA-PEGコポリマー、好ましくはPLGA-PEGジブロックまたはトリブロック-コポリマーである。図11に示されるように、ポリマー成分がPLGA-PEGジブロック-コポリマーである適当なインサイチュー硬化ペーストも作製され得る。ポリマー鎖内のPLGA/PEG比率の改変により、これらのポリマーは、分解挙動のさらなる調整を可能にする。PEGを含まない従来のPLGAポリマーの代わりに、これらの材料は、組み込まれた活性薬剤の拡散による放出を可能にする。本発明により示されたように、PLGA-PEGジブロック-コポリマー製剤は、ポリマー成分としてPLGAを含有している製剤と比較可能な機械的特性を示す。実際、使用されたPLGA-PEGジブロック-コポリマーは、ポリエチレングリコールにほとんど可溶性でなかった。そのような場合には、ジメチルスルホキシド（DMSO）のようなもう一つの可塑剤を選択する必要がある。
【０１３８】
D  水不溶性固体賦形剤
「水不溶性固体賦形剤」という用語は、水にも可塑剤にも不溶性、即ち、水または可塑剤と混和された場合に均質な相を形成しない化合物を意味する。水不溶性固体賦形剤は、ペースト内のマトリックスとして機能し、ペーストが硬化した後は、インビボで形成された足場内の活性薬剤の担体として機能する。さらに、水不溶性固体賦形剤は、生体適合性（例えば、細胞付着）をさらに増加させ、ポリマーの分解の間、局所pHを安定化することができる。
【０１３９】
好ましくは、該水不溶性固体賦形剤は、無機または有機の化合物である。
【０１４０】
好ましくは、無機化合物は、酸化マグネシウム、水酸化マグネシウム、炭酸マグネシウム、二酸化ケイ素、またはカルシウム化合物の群より選択される。該水不溶性固体賦形剤は、水不溶性ポリマー内で無機マトリックスを形成する。該無機マトリックスは、セラミックスからなり、硬化状態において、足場の骨伝導特性および機械的性能を改良する。水不溶性固体賦形材料を使用することにより、足場の全体的な挙動を減少させることなく、水不溶性ポリマーの量を低下させることが可能である。より好ましくは、該水不溶性固体賦形剤は、リン酸カルシウム；硫酸カルシウムまたは炭酸カルシウム、最も好ましくはリン酸三カルシウム、ベータ-リン酸三カルシウム（β-TCP）、アルファ-リン酸三カルシウム（α-TCP）、アパタイト、リン酸カルシウム含有セメント、もしくはリン酸四カルシウム、または上記の様々な異なる無機化合物、好ましくはカルシウム含有化合物の混合物である。
【０１４１】
「リン酸カルシウム」という用語には、カルシウム・イオン（Ca2+）、リン酸イオン（PO33-）を含み、ヒドロキシル・イオン（OH-）、炭酸イオン（CO32-）、もしくはマグネシウム・イオン（Mg2+）、または本発明の水不溶性固体賦形剤に適しているその他のイオンのようなさらなるイオンを任意で含む組成物が包含される。本発明に従って使用されるようなリン酸カルシウムは、上に示されたような本発明のペーストに適している三次元構造を有する結晶である。リン酸カルシウムは、本発明のペーストのための担体として特に好適である。それらのインビボ特性は、Hotz, 1994, Gao, 1996、およびWO98/21972に記載されている。好ましい周知のリン酸カルシウムのリストは上に与えられる。
【０１４２】
リン酸カルシウム含有セメント（CPC）には、例えば、アパタイトCPC、ブラッシャイトCPC、リン酸四カルシウム（TTCP）と無水リン酸二カルシウム（DCPA）との混合物、アルファ-TCPとハイドロキシアパタイトとの混合物、または62.5重量％のアルファ-リン酸三カルシウム、26,8重量％の無水リン酸二カルシウム（DCPA）、8,9重量％の炭酸カルシウム（CaCO3）、および1.8重量％のハイドロキシアパタイト（HA）の混合物からなるCalcibon（登録商標）セメント（Biomet Merck Darmstadt）が含まれるが、これらに制限はされない。CPCのさらなる例は、上および下に記載されている。リン酸カルシウム含有セメントは、一つまたは複数の無機水不溶性賦形剤と組み合わせられてもよい。
【０１４３】
好ましくは、有機化合物は、キトサン、コラーゲン、アルギン酸カルシウム、ポリ（2-ヒドロキシエチルメタクリレート）、ヒアルロン酸もしくはその誘導体、セルロースもしくはその誘導体、もしくはデンプンもしくは誘導体、および／またはそれらの任意の組み合わせより選択される。
【０１４４】
有機賦形剤、例えばコラーゲンは、インプラントの生体付着（bioadhesion）を増加させるために添加され得る。そのような成分は、さらに、繊維強化のような天然骨内のコラーゲンの機能と比較可能なインプラントの最終的な機械的特性（例えば、張力、捻転）に影響を与え得る。
【０１４５】
本発明のインサイチュー硬化ペーストは、ヒトおよび動物のような生物において使用するのに有効であり、ここで、組成物は骨内部成長を支持するための永続的な鉱質足場を提供する。従って、本発明の特質は、例えば空隙充填剤として、または骨強化のため有用な、予備混合された安定な組成物の提供である。
【０１４６】
本発明によると、複合マトリックスは、好ましくは、ベータ・リン酸三カルシウム、アルファ-リン酸三カルシウム、アパタイト、ハイドロキシアパタイト、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、および／もしくはリン酸カルシウム含有セメント、またはそれらの混合物であるリン酸カルシウムに基づく。
【０１４７】
そのような複合材料において、リン酸カルシウムは、優れた局所緩衝能を示し、浸透性の複合構造が、ポリマーがインビボで分解された際の局所pH減少すら回避する。従って、ポリマーの分解による細胞障害性の副作用は、低下するか、または回避される。好ましくは40wt％未満、より好ましくは35wt％未満のPLGAのようなポリマー、さらに好ましくは33wt％以下のPLGA、最も好ましくは20〜25wt％を含有している本発明のセラミック／ポリマー複合材料の主な要素は、セラミック材料であるため、これは特に妥当である。
【０１４８】
本発明の好ましい態様において、本発明のインサイチュー硬化ペーストにおける水不溶性固体賦形剤の含有量は、50wt％未満、25wt％と50wt％の間、好ましくは28wt％と38wt％の間、最も好ましくは30wt％と36wt％の間である。さらに、水不溶性固体賦形剤の含有量は、好ましくは、水不溶性ポリマーに依って選択され、例えば、水不溶性固体賦形剤と水不溶性ポリマーとの比率は、1,2：1〜4：1、好ましくは1,2：1〜2：1、より好ましくは1,2：1〜1,8：1、最も好ましくは1,5：1である。本発明は、約15wt％以上の範囲の水不溶性固体賦形剤および40wt％未満の水不溶性ポリマーを含有している本発明に係るインサイチュー硬化ペーストが、1日以内に、CPC、CPCおよび可塑剤、または従来のポリマー／有機溶媒系（PLGA/PEG）のような他の系より高い機械的強度を有するというさらに驚くべき結果に基づく（図2）。図2および3に示されるように、20％超の範囲の水不溶性固体賦形剤および38％未満の水不溶性ポリマーを含有しているインサイチュー硬化ペーストは、24日間にわたり、CPCまたはCPCおよび可塑剤と比較可能な硬度を有し、PLGA/PEG単独より有意に改良された硬度を有する。例えば、図3に示されるように、様々なインサイチュー硬化ペーストの硬度に対する時間の関数としてのリン酸カルシウムの比率の影響も、分析された。選択された例は、約1,5：1の水不溶性固体賦形剤と水不溶性ポリマーとの比率を含有している理想的な機械的強度を有する好ましい組成物を示した（図3中の灰色バー）。
【０１４９】
さらに驚くべきことに、本発明者らは、α-TCP（62.5wt％）、CaHPO4（26.8wt％）、CaCO3（8.9wt％）、ハイドロキシアパタイト（1.8wt％）からなるリン酸カルシウム・セメントのようなリン酸カルシウム・セメント、様々な濃度のハイドロキシアパタイトを含むα-TCP、またはα-TCPが、β-TCPのみを無機賦形剤として含有している製剤と比較して、インサイチュー硬化ペーストの機械的特性をさらに改良し得ることを見出した（図5、6）。これは、種結晶としてのハイドロキシアパタイトの量が少なくとも0％と2％の間で変動させられ得、強い機械的特性を有するIFSをもたらすことも含む。
【０１５０】
さらなる態様において、インサイチュー硬化ペーストのアルファ-リン酸三カルシウム粒子サイズは、300μm以上、より好ましくは500μm以上、最も好ましくは500μmと1000μmの間である。
【０１５１】
予想外にも、本発明者らは、リン酸三カルシウムの粒子サイズが、インサイチュー硬化ペーストの機械的性能にさらなる影響を及ぼし（図7）、α-TCPの粒子サイズの増加が、インサイチュー硬化ペーストの機械的特性をさらに改良することを見出した。300μm以上への粒子サイズの増加は、さらに機械的特性を増加させる。
【０１５２】
E  水溶性孔構築賦形剤
「水溶性孔構築賦形剤」という用語は、インサイチュー硬化ペーストに添加された場合、エクスビボおよび生物体内で、インサイチュー硬化固体インプラント内のミクロポアおよびマクロポアの数およびサイズを増加させる、薬学的に許容され、水または体液のような水性液体中で膨張可能または可溶性の化合物を意味する。形成された固体インプラントのポロシティは、使用された水溶性孔構築賦形剤の量に依存して増加するであろう。使用された水溶性孔構築賦形剤は、インサイチュー硬化固体インプラントの内部、好ましくはインプラントの外層において、孔の数を増加させ、好ましくは、生存細胞の内部成長にとって十分なサイズのマクロポアを増加させる。
【０１５３】
好ましい態様において、水溶性孔構築賦形剤は、インサイチュー硬化ペーストが欠損部に配置され、水性液体または体液と接触した際の、硬化するペーストの周囲の被膜形成を低下させるか、または排除する薬剤のような抗被膜形成剤である。「水溶性孔構築賦形剤」という語句には、細胞の内部成長および新たな骨形成による材料の置換も可能にするため、インサイチューで形成された足場の内部のみならず、外表面または被膜においてもマクロポアが形成されることが含まれるものとする。
【０１５４】
水溶性孔構築賦形剤には、インサイチュー・インプラントから消散し、それによりインプラント内に孔形成をもたらす薬学的に許容される化合物が含まれる。
【０１５５】
一つの態様において、水溶性孔構築賦形剤は膨張剤である。水性媒体と接触すると、これらの賦形剤は、容量を増加させ、周囲の液体へと溶解し、多孔性の相互に接続された構造を残す。異なる量の水溶性孔構築賦形剤を使用することにより、インサイチュー硬化ペーストのポロシティが採用され得、孔の量およびサイズが調節され得る。塩（例えば、塩化ナトリウム）のような孔構築賦形剤と比較して、水溶性孔構築賦形剤として膨張剤を使用することの利点は、容量が水の取り込みにより増加するため、低下した量のこれらの材料が有効であるという点である。本発明に係るその他の膨張剤は、錠剤の製造から当業者に公知のブラスティング剤（blasting agent's）である。
【０１５６】
本発明の膨張剤には、アルギン酸ナトリウム、アミラーゼ、アミロペクチン（amylopectine）、デンプン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸ナトリウム、ゼラチン、コラーゲン、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース・カルシウム塩、カルボキシメチルセルロース・カルシウム塩、ヒドロキシルプロピル・メチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、ヒドロキシルエチルセルロース、またはメチルヒドロキシルエチルセルロースのようなものが含まれる。
【０１５７】
もう一つの態様において、水溶性孔構築賦形剤は、界面活性剤、好ましくは、Pluronics（登録商標）またはTween（登録商標）80のような、エチレンオキシド／ソルビタンおよびプロピレンオキシドのブロックコポリマー（例えば、Polysorbate80；Montanox（登録商標）80；ポリオキシエチレン・ソルビタン・モノオレアート）である。これらの孔構築賦形剤は、塩化ナトリウムに類似した水性媒体への溶解によりポロシティを導入し（塩リーチング（leeching）効果）、形成される多孔性構造を安定化することもできる。この効果は、それらの両親媒（amphipathic(amphiphilic)）性および表面活性と関係があり、従って、これらの材料は、泡安定化剤として広く使用されている。
【０１５８】
もう一つの態様において、本発明において使用され得る適当な水溶性孔構築賦形剤には、インサイチューでインプラントに溶解した場合に孔を提供しうる結晶サイズの糖または塩のような孔形成性の物質が含まれる。
【０１５９】
その他の孔形成剤は、CO2気泡を形成し、それにより、インプラントから移動したときに孔を残す。
【０１６０】
当業者は、上記の孔構築賦形剤を用いて、100μm超、好ましくは100〜500μmの孔サイズを実現するために如何なるパラメーターが設定され得るかを承知している。これらの孔サイズは、インプラントの部位における細胞周囲の細胞の内部成長を可能にするため、相互に接続されている孔に存在するのみならず、インサイチュー硬化ペーストの表面にも存在する（図15）。
【０１６１】
好ましくは、水溶性孔構築賦形剤の重量割合は、10wt％未満、より好ましくは5wt％未満、さらに好ましくは2,5wt％未満、最も好ましくは1wt％未満である。
【０１６２】
より好ましくは、水溶性孔構築賦形剤は、カルボキシメチルセルロース塩であり、最も好ましくはカルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩であり、最適には1000μm未満の粒子サイズ、より好ましくは25と1000μmの間の粒子サイズを有する。好ましくは、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩の重量割合は、10wt％未満、より好ましくは5wt％未満、さらに好ましくは2,5wt％未満、最も好ましくは1wt％以下である。
【０１６３】
本発明による「粒子サイズ」という用語は、レーザー回析により決定され得る、ミクロン（μm）単位のリン酸三カルシウムおよびカルボキシメチルセルロースのような材料のサイズ直径の平均分布を意味する。材料の特定の粒子サイズ範囲は、例えば、篩過により達成され得る。
【０１６４】
カルボキシメチルセルロースが、非マクロポア性の外被膜形成の障害を克服し、好ましくは、25〜1000μmの粒子サイズ直径を有するカルボキシメチルセルロースが、表3に示されるように、水性媒体との接触の後、インサイチューで硬化したペーストの外表面における200μm超のマクロポアの数を有意に増加させたことはさらに予想外であった。被膜におけるポロシティに関するさらなる予想外の観察は、水溶性孔構築賦形剤と組み合わせて使用された有機溶媒に関係している。図14に提示されたデータは、NMPと比較して、PEG400のようなPEGを可塑剤として使用した場合の、被膜における有利なポロシティを証明している。異なる濃度の孔構築賦形剤を使用することにより、インサイチュー硬化ペーストの適用に依って、マクロポアの数が調整され得る。
【０１６５】
もう一つの態様において、インサイチュー硬化ペーストは、100μm以上の直径を有する相互に接続されている孔を有する。
【０１６６】
「相互に接続されている孔」という用語は、インプラント全体におけるミクロポアおよびマクロポアを含む孔および孔チャンネルのネットワークを意味し、最も好ましくは、マクロポアおよびマクロチャンネルが、骨細胞または前駆細胞のような細胞の浸潤にとって十分な孔サイズを有するポロシティを作出している。本発明によって、新たな骨形成のための生存細胞の内部成長を支持する、そのような相互に接続されている孔のネットワークを有するインサイチュー硬化ペーストが開発され得た（図15）。
【０１６７】
F  活性薬剤
「活性薬剤」という用語には、水不溶性固体賦形剤上に固定化され、かつ／または可塑剤に溶解もしくは懸濁させられるポリペプチドまたは低分子薬物が含まれる。好ましくは、該ポリペプチドまたは薬物は、リン酸カルシウム含有担体上および／またはポリマー内に均質に分布させられる。
【０１６８】
本発明の「コーティングされた」という用語は、本質的に同一の量のタンパク質が該担体の表面のあらゆる領域に存在するよう、水不溶性固体賦形剤の表面が、活性薬剤により完全にコーティングされていることを意味する。本発明による均質にコーティングされた担体は、好ましくは、その表面上に骨誘導タンパク質による最大の被覆を示す。骨誘導性ポリペプチドは凝集しておらず、沈殿または微小沈殿によって部分的または完全に不活化されていないことを理解されたい。
【０１６９】
「均質にコーティングされた」または「均質に分布させられた」という用語は、活性薬剤が、態様（32）および（33）の方法の説明に一致するそれぞれの相に均質に分布していることを意味する。これは、水溶性ポリマーに溶解すか、または水不溶性賦形剤に吸着し、水溶性ポリマー中のコーティングされた水不溶性賦形剤の懸濁物をもたらす活性薬剤の特徴によって達成され得る。均質な分布は、移植部位における組織周囲への活性薬剤の効率的な放出および活性の先行条件である。さらに、活性薬剤は凝集しておらず、沈殿または微小沈殿によって部分的または完全に不活化されておらず、むしろ、生物学的活性を有する非凝集タンパク質の付着が均質なコーティングによって達成されるべきであることを理解されたい。
【０１７０】
該活性薬剤による担体の均質なコーティング、および水不溶性ポリマーへの担体の同時の、かつ／または付加的な分布は、二つの様式で：活性薬剤の保護として、そして徐放を達成するためタンパク質またはペプチドの溶解を遅くする拡散障壁として、作用する構造を達成する。記載された方法（（32）および（33）参照）は、図17に示されるように、骨誘導性の活性薬剤の担体中および／または担体上への均質な分布および固定化、ならびにポリマー成分による活性薬剤の徐放を可能にする。
【０１７１】
コーティング過程の効率は、さらに、サイズのため溶液を孔へと吸い込むことができる、多数の、好ましくは相互に接続されたマクロポアおよびミクロポアの存在に起因する毛細管力によって、担体により支持される。
【０１７２】
さらに、当技術分野において、例えばWO98/21972に記載されている他の方法とは対照的に、本発明の方法によると、活性薬剤は、均質なコーティングを達成するため、可溶性状態からの担体への付着により適用される。
【０１７３】
本発明の基礎となる所見は、本明細書に記載されたような適当な添加剤の使用により、三成分系においてタンパク質の凝集が回避され得ることを証明している。重要な前提条件は、溶媒、即ち水性および／または有機の溶媒の性質、pH値、イオン強度、および存在する表面に依存性の、骨誘導性の活性薬剤の可溶性についての知識である。方法（33）に関しては、活性薬剤が、担体上に均質に存在する。この均質な分布は、例えば、水性の溶液および緩衝液を使用して、WO03/043673に記載されたようにして実施される。「水性溶液」という用語は、水を含む任意の溶液をさす。アルカリ性の様式で反応する担体中のリン酸カルシウムとのコーティング溶液の接触により引き起こされるpH増加の減速は、特に、コーティングにおいて重要な役割を果たす。
【０１７４】
本発明の方法（32）および（33）は、担体材料の内部表面全域に活性薬剤を均質に分布させ、該タンパク質の沈殿がコーティング溶液内で起こる前の、表面への結合を可能にする。方法Bに関しては、リン酸カルシウムのコーティングの間に起こるpH増加が、酢酸のような弱酸の使用により十分に減速させられることが証明され得る。さらに、エタノールまたはショ糖のような有機化合物の添加が、さらに有利であることが判明する。さらに、低いイオン強度は、リン酸カルシウムへのタンパク質またはペプチドのコーティングの成功のための重要な前提条件である。さらに、我々のテストは、コーティング溶液（活性薬剤および／またはポリマーを含有している溶液）の容量も、両方のコーティングの質に対して相当の効果を及ぼすことを示している。
【０１７５】
「骨伝導性の」という用語は、血管進入細胞浸潤および付着、軟骨形成、ならびに石灰化組織沈着にとって好都合な多孔性の足場を提供する基質をさす。骨伝導性の材料は、足場効果を介して骨の生成を支持し得る（Kenley et al., 1993）。
【０１７６】
「骨誘導性の」という用語は、間葉系幹細胞の骨芽細胞および軟骨細胞への変換の能力をさす。骨誘導のための先行条件は、上記の骨芽細胞前駆細胞が活性化される周囲組織へとペーストにより分布させられるシグナルである。本明細書において使用されるような骨誘導には、間葉系細胞の骨前駆細胞、骨芽細胞への分化が包含される。さらに、骨誘導には、該骨芽細胞の骨細胞、骨の成熟した細胞への分化も含まれる。さらに、間葉系細胞の軟骨細胞への分化も、骨誘導に包含される。特に長骨においては、骨の軟骨膜に存在する軟骨芽細胞および軟骨細胞も、骨細胞へと分化することができる。従って、骨誘導は、未分化または低分化の細胞の、骨を形成することができる骨細胞への分化を必要とする。従って、骨誘導のための先行条件は、上記の骨細胞前駆細胞が一般的に存在している周囲組織へとペーストにより分布させられるシグナルである。上記のように、本発明に従って使用される骨誘導性のタンパク質またはペプチドは、ペーストが移植後にインサイチューで硬い足場を形成した後、ペーストから徐放され、その後、骨誘導性のタンパク質またはペプチドは、図17に示されるように、周囲の組織に効率的に分布する。
【０１７７】
「骨形成性の」という用語は、骨芽細胞による新たな骨の合成を記載する。本発明によると、硬化過程の間に特に形成される硬化したペーストの構造を、細胞（例えば、骨細胞）が付着し得るマトリックスとして使用して、ペーストの移植の側の周囲の既存の骨が、硬化したペーストへと成長する。
【０１７８】
本発明のインサイチュー硬化ペーストに包含されるタンパク質およびペプチドは、インビボの骨誘導特性を有する。例えば、トランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）スーパーファミリーに、骨誘導特性を有するメンバーが包含されていることは、当技術分野において周知である。特に良好な骨誘導特性を有する該TGF-βスーパーファミリーの個々のメンバーは、以下に挙げられる。結論として、本発明のペーストの骨誘導性のタンパク質またはペプチドは、担体から放出された後、ペーストの移植の側の周囲の組織の骨細胞前駆細胞のための骨誘導シグナルとして機能する。
【０１７９】
「骨誘導性のポリペプチド」という用語は、骨誘導特性を有する、トランスフォーミング増殖因子-β（TGF-β）スーパーファミリーのメンバーのようなポリペプチドをさす。
【０１８０】
本発明のペーストまたは方法のさらなる好ましい態様において、該骨誘導性タンパク質はTGF-βファミリーのメンバーである。
【０１８１】
増殖および分化のための因子のTGF-βファミリーは、骨形成を含む多数の生物学的過程に関与していることが示されている。該ファミリーの全てのメンバーが、特徴的なドメイン構造を含む分泌型ポリペプチドである。最もN末端側に、TGF-βファミリー・メンバーは、シグナル・ペプチドまたは分泌リーダーを含む。この配列のC末端側には、プロドメイン（prodomain）および成熟ポリペプチドの配列が続く。成熟ポリペプチドの配列は、七つの保存されたシステインを含み、そのうちの六つは、分子内ジスルフィド結合の形成に必要とされ、一つは、二つのポリペプチドの二量体化に必要とされる。生物学的活性を有するTGF-βファミリー・メンバーは、二量体、好ましくは二つの成熟ポリペプチドから構成された二量体である。TGF-βファミリー・メンバーは、通常、成熟配列に加えてプロドメインを含むタンパク質として分泌される。プロドメインは、細胞外で切断除去され、シグナリング分子の一部ではない。
【０１８２】
本発明に関して、「TGF-βファミリー・メンバー」という用語または以下に言及される該ファミリーのタンパク質には、全ての該タンパク質またはメンバーの生物学的活性を有するバリアント、および全てのバリアントが含まれ、それらの不活性の前駆体も包含される。従って、成熟配列のみを含むタンパク質、ならびに成熟タンパク質およびプロドメインを含むタンパク質、または成熟タンパク質、プロドメイン、およびリーダー配列を含むタンパク質のみならず、それらの生物学的活性を有する断片も、本発明の範囲内である。TGF-βメンバーの断片が生物学的活性を有するか否かは、例えば、Katagiri T, Yamaguchi A, lkeda T, Yoshiki S, Wozney JM, Rosen V, Wang EA, Tanka H, Omura S, Suda T,(1990): The non-osteogenic mouse pluripotent cell line, C3H10T1/2, is induced to differentiate into osteoblastic cells by recombinant human bone morphogenetic protein-2. Biochem. Biophys. Res. Commun. 172: 295-299、またはNishitoh H, Ichijo H, Kimura M, Matsumoto T, Makishima F, Yamaguchi A, Yamashita H, Enomoto S, Miyazono K (1996): Identification of type serine/ threonine kinase receptors for growth/ differentiation factor-5. J. Biol. Chem. 271: 21345-21352に記載された生物学的アッセイにより容易に決定され得る。
【０１８３】
好ましくは、添付の実施例に記載されるようなインビボ・モデルが、本発明により、生物学的活性を決定することができる。さらに、TGF-βファミリーのメンバーのアミノ酸配列と少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも96％、少なくとも97％、少なくとも98％、または少なくとも99％同一のアミノ酸配列を有するTGF-βメンバーのバリアントが、本発明に包含される。
【０１８４】
TGF-βスーパーファミリーのメンバーの概要は、Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin Orthop 346: 26-37に与えられている。TGF-βファミリーのメンバーのアミノ酸配列は、インターネット（http://www.expasy.ch/sprot/sprot-top.html）を介してSwiss-Protのような周知のデータベースから入手され得る。特に高い骨誘導能を有するTGFファミリーのメンバーBMP-2、BMP-7、およびGDF-5のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：1〜3にも示される。特に高い骨誘導能を有するTGFファミリーのメンバーBMP-2、BMP-7、およびGDF-5のアミノ酸配列は、それぞれ、配列番号：1〜3にも示される。
【０１８５】
より好ましくは、該TGF-βスーパーファミリーのメンバーは、BMPサブファミリーのメンバーである。骨形成タンパク質（Bone Morphogenetic Protein）（BMP）サブファミリーのメンバーは、とりわけ、骨組織の誘導およびリモデリングに関与していることが示されている。BMPは、最初、骨マトリックスから単離された。これらのタンパク質は、異所性の部位において新たな骨形成を誘導する能力を特徴とする。様々なインビボ研究が、BMPによる前駆細胞の骨形成および軟骨形成の促進を証明しており、各BMP分子が骨格発達において別個の役割を有している可能性を示している。BMPの分子的および生物学的な特性についてのさらなる詳細は、Wozney JM, Rosen V (1998): Bone morphogenetic protein and bone morphogenetic protein gene family in bone formation and repair. Clin Orthop 346: 26-27、Schmitt J, Hwang K, Winn, SR, Hollinger J (1999): Bone morphogenetic proteins: an update on basic biology and clinical relevance. J Orthop Res 17: 269-278、およびLind M (1996): Growth factors: possible new clinical tools. A review. Acta Orthop Scand 67: 407-17に記載されている。
【０１８６】
本発明の骨誘導性ポリペプチドは、好ましくは、BMP-1、BMP-2、BMP-3、BMP-4、BMP-5、BMP-6、BMP-7、BMP-8、BMP-9、BMP-10、BMP-11、BMP-12、BMP-13、BMP-14、BMP-15、およびBMP-16からなる群より選択される。最も好ましくは、該BMPファミリーのメンバーは、BMP-2またはBMP-7である。
【０１８７】
BMP-2のプレプロ型のアミノ酸配列は、Swiss-Protアクセッション番号P12643の下で寄託されており、下に示される。アミノ酸1〜23がシグナル配列に相当し、アミノ酸24〜282がプロペプチドに相当し、アミノ酸283〜396が成熟タンパク質に相当する。BMP-7のプレプロ型のアミノ酸配列は、Swiss-Protアクセッション番号P18075の下で寄託されているか、または配列番号：2に示される。アミノ酸1〜29がリーダー配列に相当し、アミノ酸30〜292がプロ型に相当し、アミノ酸293〜431が成熟タンパク質に相当する。好ましくは、BMP-2またはBMP-7とは、それぞれ、プレプロ型、プロ型、または成熟型のBMP-2またはBMP-7ペプチドをさす。さらに、本質的に同一の生物学的活性、好ましくは骨誘導特性を有する該タンパク質の断片も、包含される。BMP-2およびBMP-7のさらなる配列情報は下に提供される。
【０１８８】
または、本発明の骨誘導性ポリペプチドは、もう一つのTGF-βファミリー、即ち、GDFファミリーより選択される。
【０１８９】
増殖分化因子（Growth and Differentiation Factor）（GDF）も、とりわけ、骨組織の誘導およびリモデリングに関与していることが示されている。軟骨由来形態形成タンパク質（cartilage-derived morphogenetic protein）1（CDMP-1）としても公知の増殖分化因子（Growth Differentiation Factor）5（GDF-5）は、他の関連タンパク質、好ましくは、GDF-6およびGDF-7も含むBMPファミリーのサブグループのメンバーである。成熟型のタンパク質は、27kDaのホモダイマーである。様々なインビボおよびインビトロの研究が、哺乳動物の骨格における異なる形態学的特質の形成におけるGDF-5の役割を証明している。GDF-5の変異は、四肢の長骨の長さの減少、四肢および胸骨における異常な関節発生を含む骨格異常の原因となる（Storm & Kingsley (1999), Development Biology, 209, 11-27）。マウスおよびヒトの間でアミノ酸配列は高度に保存されている。
【０１９０】
好ましくは、本発明の骨誘導性ポリペプチドは、GDF-1、GDF-2、GDF-3、GDF-4、GDF-5、GDF-6、GDF-7、GDF-8、GDF-9、GDF-10、およびGDF-11からなる群より選択される。最も好ましくは、該GDFサブファミリーのメンバーはGDF-5である。GDF-5のプレプロ型のアミノ酸配列は、Swiss-Protアクセッション番号P43026の下で寄託されているか、または配列番号：3に示される。アミノ酸1〜27がリーダー配列に相当し、アミノ酸28〜381がプロ型に相当し、アミノ酸382〜501が成熟タンパク質に相当する。好ましくは、GDF-5とは、プレプロ型、プロ型、または成熟型のGDF-5ペプチドをさす。さらに、本質的に同一の生物学的活性、好ましくは骨誘導性特性を有するGDF-5の断片も包含される。好ましくは、該断片は、配列番号：3に示された配列のアミノ酸383〜501を含む。
【０１９１】
以下の表は、BMP-2、BMP-7、およびGDF-5のアミノ酸配列を示す：
【０１９２】
2008501455.tif 000002
【０１９３】
参照
[1]
核酸からの配列。
MEDLINE＝89072730；PubMed＝3201241；Wozney J.M., Rosen V., Celeste A. J., Mitsock L.M., Whitters M.J., Kriz R. W., Hewick R.M., Wang E.A.; "Novel regulators of bone formation: molecular clones and activities ."; Science 242:1528-1534(1988)。
[2]
292〜396のX線結晶学（2.7オングストローム）。
MEDLINE＝99175323；PubMed＝10074410；Scheufler C., Sebald W., Huelsmeyer M.; "Crystal structure of human bone morphogenetic protein-2 at 2.7 A resolution."; J. Mol. Biol. 287:103-115 (1999)。
【０１９４】
2008501455.tif 000003
【０１９５】
2008501455.tif 000004
【０１９６】
参照
[1]
核酸からの配列および部分配列。
組織＝胎盤；MEDLINE＝90291971；PubMed＝2357959；Oezkaynak E., Rueger D.C., Drier E.A., Corbett C., Ridge R.J., Sampath T.K., Oppermann H.; "OP-1 cDNA encodes an osteogenic protein in the TGF-beta family."； EMBO J. 9：2085-2093 (1990)。
[2]
核酸からの配列。
MEDLINE＝91088608；PubMed＝2263636; Celeste A.J., lannazzi J.A., Taylor R.C., Hewick R.M., Rosen V., Wang E.A., Wozney J.M.; "Identification of transforming growth factor beta family members present in bone-inductive protein purified from bovine bone."; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 87: 9843-9847 (1990)。
[3]
293-431のX線結晶学（2.8オングストローム） 。
MEDLINE＝96149402；PubMed＝8570652；Griffith D.L., Keck P.C., Sampath T.K., Rueger D.C., Carlson W.D.; "Three-dimensional structure of recombinant human osteogenic protein 1: structural paradigm for the transforming growth factor beta superfamily."; Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 93:878-883 (1996)。
【０１９７】
2008501455.tif 000005
【０１９８】
2008501455.tif 000006
【０１９９】
参照
[1]
核酸からの配列。
組織＝胎盤；MEDLINE＝95071375；PubMed＝7980526；Hoetten G., Neidhardt H., Jacobowsky B., Pohl J.; "Cloning and expression of recombinant human growth/differentiation factor 5."; Biochem. Biophys. Res. Commun. 204: 646-652 (1994)。
[2]
核酸からの配列。
組織＝関節軟骨；MEDLINE＝95050604；PubMed＝7961761；Chang S., Hoang B., Thomas J.T., Vukicevic S., Luyten F.P., Ryba N.J.P., Kozak C.A., Reddi A.H., Moos M.; "Cartilage-derived morphogenetic proteins. New members of the transforming growth factor-beta superfamily predominantly expressed in long bones during human embryonic development."; J. Biol. Chem. 269: 28227-28234 (1994)。
【０２００】
また、該活性薬剤が、ホルモン、サイトカイン、増殖因子、抗生物質、およびステロイド、プロスタグランジン等のようなその他の天然および／または合成の薬物物質から選択される態様も、本発明に包含される。
【０２０１】
好ましくは、該活性薬剤は、副甲状腺ホルモン（PTH）および／またはPTH1-34ペプチドである。
【０２０２】
本発明のもう一つの態様において、活性薬剤は「軟骨誘導性」または「軟骨再生性」のタンパク質である。好ましい軟骨誘導性タンパク質は、MIA/CD-RAP（MIA, melanoma inhibitory activity, cartilage derived-retinoic acid-sensitive protein）であり、より好ましくはヒトMIA/CD-RAPである。
【０２０３】
MIA/CD-RAPのプレプロ型のアミノ酸配列は、Swiss-Protアクセッション番号Q16674の下で寄託されているか、または配列番号：4に示される。アミノ酸1〜24がシグナル配列に相当し、アミノ酸25〜131がコーディング配列に相当する。
【０２０４】
以下の表は、MIA/CD-RAPのアミノ酸配列を示す：
【０２０５】
2008501455.tif 000007
【０２０６】
G  特定の調製物および任意の要素
本発明のペーストは、任意で、付加的な増量剤を含んでいてもよい。これらの増量剤は、タンパク質またはペプチドの安定化（例えば、糖類、アミノ酸、ポリオール、界面活性剤）、またはpHの維持（例えば、緩衝物質）に役立つ。インサイチュー形成ペーストのその他の要素は、リン酸ナトリウム、Na2HPO4、またはクエン酸ナトリウムのような硬化促進剤、およびさらに上に記載されたものであり得る。
【０２０７】
本発明の方法（31）〜（34）は、毒性の有機溶媒（以下参照）の使用、例えばジメチルスルホキシド、アニソール、または氷酸（glacial acid）の使用を可能にしない。しかしながら、毒性の溶媒は、当技術分野において記載されている方法においてルーチンに使用されている。通常、それらは、接触の間、かつ／または特に乾燥の間にタンパク質に傷害を与えるが、驚くべきことに、本発明の特別な乾燥技術を使用すれば、活性薬剤が無機固体担体へ吸着／または付着するため、そのような傷害は回避される。
【０２０８】
本発明の方法（33）の好ましい態様において、該緩衝液は、吸着過程の間の活性薬剤の十分な可溶性を達成し、かつ単相カルシウム・セラミック・ベータ-TCPの修飾を回避するため、10mmol/lの緩衝剤濃度を有する。溶液のpH値のシフトは、コーティングおよび乾燥の過程の間、pH3〜pH7に制御される。pHシフトは、TCP上に均質に限定（defined）された骨成長因子の可溶性の低下を引き起こす。
【０２０９】
「粘性の液体」という用語は、水と比較して減少した流動可能性を有する液体を意味する。例えば、本発明による粘性の液体は、単純な投与を可能にする環境温度における蜂蜜様のコンシステンシーに関する。
【０２１０】
本発明の方法のさらなる好ましい態様において、方法（33）のための緩衝剤含有溶液は、ポリオールおよび／またはアルコールを含む。適当なアルコールまたはポリオールは、当技術分野において周知であり、Rompp, dictionary of chemistryのような標準的な教科書に記載されている。より好ましくは、該アルコールはエタノールであり、該ポリオールはマンニトールである。
【０２１１】
より好ましい態様において、ポリオールおよびまたはアルコールの濃度は、0と10％（w/v）の間である。
【０２１２】
「糖類」という用語には、単糖、二糖、および多糖が包含される。単糖、二糖、および多糖の構造および組成は、当技術分野において周知であり、Rompp, dictionary of chemistryのような標準的な教科書に記載されている。
【０２１３】
より好ましくは該糖類は二糖である。最も好ましくは、該二糖はショ糖またはトレハロースである。
【０２１４】
活性薬剤の均質な分布の制御、定量化、および特徴決定のためのさらなる手段および方法は、添付の実施例に記載される。
【０２１５】
驚くべきことに、活性薬剤、特に驚くべきことにタンパク質は、セラミック賦形剤／担体の表面上に吸着させられた場合、遊離型で有機溶液に溶解もしくは懸濁させられたタンパク質、または二相エマルション系に組み込まれたタンパク質より、有機溶媒によって引き起こされる分解に対してはるかに抵抗性である。従って、本発明のこの局面は、単相または多相の有機系におけるポリペプチドの変性および／または修飾のない、タンパク質のためのポリマーに基づく薬物送達系を作製する新たな可能性を開く。
【０２１６】
本発明の二つの方法のうちの一つのため活性薬剤として適しているのは、全てのタンパク質、ポリペプチド、および低分子薬物である。特に、無機担体マトリックスに対する親和性が低いか、または全くないそのような活性薬剤が、ポリマー-リン酸カルシウム複合材料において固定化され得る。好ましくは、該活性薬剤の担体との結合は可逆性である。
【０２１７】
それにより、ペーストが、骨空洞のよう適当なインビボ環境、または筋肉内もしくは皮下の水性環境に移された後、該活性薬剤の溶解が可能となる。インサイチュー硬化ペーストは、水不溶性ポリマーからの可塑剤の拡散により硬化し、水性の体液が、水不溶性ポリマーへと拡散する。従って、ポリマーは、水への不溶性のため固体化する（Shively et al., 1995）。
【０２１８】
より好ましくは、該固定化された化合物の溶解は、硬化したペーストの周囲の組織への活性薬剤の拡散を可能にする徐放である。従って、硬化したペーストは、徐々に放出され、それにより、効率的に周囲の組織へ分布するか、または固定化された型で効果を有する、例えば、骨誘導性のタンパク質、ペプチド、抗生物質、または低分子薬物のためのインビボ起源として機能するのに適している。
【０２１９】
水不溶性ポリマーおよび賦形剤が、可塑剤と共に、本発明の担体／ポリマー複合ペースト材料を形成し、それが、活性薬剤と結合して、水性の体液がポリマーへと拡散する間の水溶性ポリマーからの拡散（可塑剤）により、数分〜数時間以内にペーストが硬化した後、インビボでの該活性薬剤の徐放を可能にする本発明のペーストをもたらす。従って、ポリマーは、水への不溶性のため固体化する（Shively et al., 1995）。完全な機械的安定性に到達するまでの時間は、インプラント材料の要素の変動により制御され得る。
【０２２０】
「均質なコーティング」を可能にするために十分な時間、活性薬剤を水性溶液に溶解させておくのを補助する「緩衝剤」という用語は、骨誘導性の活性薬剤が効率的に溶液に溶解し維持されることを可能にする成分をさす。この緩衝剤は、タンパク質が、例えばpH増加のため、直ちに沈殿しないよう、溶液がリン酸カルシウム担体と接触することにより引き起こされるpHの増加を回避するか、または平衡を保つことができる。該緩衝剤は、（pHおよびイオン強度に依る）骨誘導性タンパク質の可溶性、および担体が該緩衝剤含有溶液と接触した後の該パラメーターに対する担体の影響を考慮して、当業者により決定され得る。本発明により、担体、例えばリン酸カルシウムの表面への活性薬剤の均質な分布には、適当な緩衝剤が必要とされることが見出されており、該緩衝剤には、好ましくは、弱酸、アルコール、および糖類が含まれる。
【０２２１】
H  薬学的適用
本発明は、本発明のペーストまたは本発明の方法により入手可能なペーストを含む薬学的組成物を包含する。
【０２２２】
本発明の生成物は、薬学的組成物または医学的デバイスとして製剤化され得る。該生成物の組成は、安定剤、緩衝物質、およびその他の増量剤のような付加的な化合物を含み得る。患者に適用される本発明の生成物の量は、主治医およびその他の臨床的な因子により；好ましくは、上記の方法のうちのいずれかによって決定されるであろう。医学分野において周知であるように、患者に適用される量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、性別、投与の時間および経路、全身健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物を含む多くの要因に依る。進行は、定期的な評価によってモニタリングされ得る。本発明のおかげで、ペースト様材料の移植部位への最適な適応により、そして同時に活性薬剤の放出制御により、歯科的または整形外科的な欠損を治療することを可能にする系を有することが可能である。
【０２２３】
好ましくは、適用方法は、最小侵襲性のものであり、さらに好ましくは、適用は注射により適用される。
【０２２４】
本発明のおかげで、大きな空洞を含む様々な骨欠損を新たな様式で処置することが可能である。特に、大きな空洞は、効率的には処置され得ないか、または自己骨材料を使用しなければ効率的に処置され得なかった。しかしながら、本発明のペースト、または本発明の方法により入手され得るデバイスの確実で効率的な骨誘導および／または骨伝導特性のため、大規模な骨の強化または修復を必要とする骨欠損の処置が、今や、第二の手術なしに可能になった。
【０２２５】
本発明には、骨強化のための薬学的組成物の調製のための、本発明のペースト、または本発明の方法により入手可能なペーストの使用も包含される。
【０２２６】
「骨強化」という用語は、骨欠損、骨内の空洞を処置するために、または骨組織の欠損を伴う疾患および障害を処置するために、または後のインプラントの設置に備えるために指示される、誘導された骨の形成をさす。以下に記載される疾患および障害は、当技術分野において周知であり、PschyrembelまたはStedmanのような標準的な医学教科書に詳細に記載されている。
【０２２７】
好ましくは、該骨強化は、外傷性の、悪性の、または人工的な欠損の後のものである。
【０２２８】
本発明のもう一つの態様は、骨欠損の処置のための本発明のペーストの使用、または薬学的組成物の調製に関する。
【０２２９】
より好ましくは、骨欠損には、橈骨骨折および脛骨骨折のような骨折、非骨折修復、脊椎固定術、長骨欠損、または根尖切除、嚢胞または腫瘍の摘出、抜歯、または保持されている歯の外科的除去の後の骨欠損が含まれる。
【０２３０】
本発明は、歯周病学における空洞の充填および／またはサポート誘導組織再生のための本発明のペーストの使用にも関する。
【０２３１】
本発明のもう一つの態様は、サイナス・フロア・エレベーション、萎縮した上顎堤および下顎堤の強化、ならびにイミディエート（immediate）インプラントの安定化のための薬学的組成物の調製のための本発明のペーストの使用に関する。
【０２３２】
本発明のペーストを薬学的に許容される形態で対象へ投与する工程を少なくとも含む、本発明の使用により、言及された疾患のうちの一つまたは複数を処置する方法も、本発明の範囲内である。好ましくは、該対象はヒトである。
【０２３３】
最後に、本発明は、本発明のペーストを含むキットに関する。キットの要素はさらに上に記載されている。
【０２３４】
本発明のキットの部品は、それぞれの要素に依ってバイアルまたはその他の適切な手段で個々にパッケージングされてもよいし、または適当な容器もしくは多重容器（multicontainer）単位で組み合わせられてパッケージングされてもよい。キットの製造は、好ましくは、当業者に公知の標準的な手法に従う。
【０２３５】
I）本発明のインサイチュー硬化ペーストの恩典
本発明によって、硬化が完了する前に、CPC含有ペーストのような予備混合されたペーストが湿環境（例えば、重度の出血を伴う適応症）において安定的に形成されることを可能にする、迅速な凝固による優れた流失抵抗性を有するインサイチュー硬化ペーストが開発され得た。これらの本発明による予備混合されたペーストは、適用および調節のための時間が制限されず、不溶性固体賦形剤を含有しているポリマーが、周囲の組織からの水または体液に曝されるようになった後、硬化し始めるという利点を有する。
【０２３６】
本発明のおかげで、CPC組成物の脆性のような短所を欠き、従来のCPC組成物より良好な機械的特性を有する、成型可能、好ましくは注射可能、自己硬化性、かつ吸収性のインサイチュー硬化ペーストが作製され得る。
【０２３７】
好ましくは、PEG、DMSO、またはグリセロールのような可塑剤の選択により、可塑剤の消散の後の機械的強度は、さらに改良され得る。本発明者らは、使用されるポリマーに依って、可塑剤が、硬化したインプラントにおけるポリマーのガラス転移温度に影響を及ぼし、それが、インサイチュー硬化ペーストの機械的強度に影響することを見出した。この影響は、使用される異なる可塑剤によって異なる。驚くべきことに、PEGは、使用されたポリマーに対する最も低い影響を有する可塑剤であった（図9）。ブロックコポリマーを溶解させるための好ましい可塑剤であるDMSOは、可溶性特徴のため、ポリマーのガラス転移温度の低下に対する影響に関して、従ってインサイチュー硬化ペーストの機械的強度に対する影響に関してPEGと比較可能である。
【０２３８】
さらに、本発明のセラミック／ポリマー複合ペーストは、放出遅延のためのポリマー・マトリックスを使用した従来の流動系と比較して改良された機械的安定性を示す。好ましくは、インサイチュー硬化ペーストは、水性媒体との接触の後1時間以内に20％、より好ましくは1時間後に30％、最も好ましくは1時間以内に40％という、当業者に周知であり、実施例12にさらに記載される方法により決定される硬度を有する。
【０２３９】
本発明により、インサイチュー硬化ペーストは、図13に示されるように、水性媒体または体液と接触した後1時間以内の初期の機械的強度に関して、CPC（図13、白色バー）またはリン酸カルシウムを含まないポリマー系（図13、灰色バー）のような従来の流動系より優れている。
【０２４０】
本発明のセラミック／ポリマー複合担体材料は、放出遅延のためのポリマー性マトリックスを使用した従来の系と比較して改良された機械的安定性を示す。多孔性の態様において、複合マトリックスは、多孔性の系による、特に相互に接続された孔を含まない先行技術の系と比較して改良された骨伝導特性を可能にする。
【０２４１】
本発明のセラミック／ポリマー複合担体材料は、放出遅延にとって重要な従来の封入ポリマー性顆粒に取って代わるのに適当である。系（セラミック担体＋ポリマー・コーティング）のセラミック担体の含有量のため、ポリマーの量は、ポリマー性マトリックスを使用した完全にポリマーに基づく従来の流動系と比較して有意に低下する。ポリマーの量の低下によって、細胞障害性のリスクが低下する。本発明のさらなる面は、完全にポリマーに基づく足場と比較して増加した複合材料の機械的安定性である。
【０２４２】
以下、実施例を参照しながら本発明を説明するが、実施例は、例示的なものに過ぎず、本発明の範囲を制限するものではない。
【０２４３】
実施例
実施例1：rhGDF-5によるベータ-TCP粉末のコーティング
333mgのベータTCPおよび147μlのrhGDF-5を含む10mM HCI（3,4mg/ml）を、ベータ-TCP上にピペットで移し、吸収させた。湿っている粉末を25℃で約1時間インキュベートし、その後の凍結乾燥工程において乾燥させた。
【０２４４】
実施例2：IFS（rhGDF-5／ベータTCP／PLGA／PEG400）の調製
167μlのPEG400および83mgのPLGAを温和に加温しながら溶解させ、粘性の溶液を得た。室温で冷却した後、333mgのコーティングされたrhGDF-5ベータ-TCP粉末を、絶えず攪拌しながら添加し、均質なペーストを得た。
【０２４５】
実施例3：IFS（ベータ-TCP／PLGA／PEG400）の調製
1mlのPEG400および500mgのPLGAを温和に加温しながら溶解させ、粘性の溶液を得た。室温で冷却した後、2000mgのベータ-TCP粉末を、絶えず攪拌しながら添加し、均質なペーストを得た。
【０２４６】
実施例4：
固定化されたタンパク質の抽出
（工程A）
ポリマーを溶解させるための1mlのクロロホルム溶液への417mgの硬化したテスト試料の抽出（4℃で1時間）。クロロホルム-ポリマー溶液を除去した後、残余のクロロホルムを真空下でデシケーターで除去した。
【０２４７】
（工程B）
ベータ-TCPからの固定化されたタンパク質の抽出のため、工程Aから得られた試料（コーティングされたポリマーなしの顆粒）を、4℃で1時間、8M尿素、10mMトリス、100mM EDTAに浸漬した。その後の工程において、溶液を遠心分離した（9300*g、3分）。上清中のタンパク質含有量および分解生成物を、RP-HPLCにより定量化した。
【０２４８】
実施例5：テスト試料の調製
テスト試料の硬化は、PEGの体液由来の水との置換により起こる。シミュレートされた生理学的条件の下では、体液は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）によって表された。ペーストを中空鋳型へと鋳造した後、テスト試料からのPEGの拡散を支持するため、PBSを温和に撹拌しながら、中空鋳型内でPBS中でインキュベートすることにより、ペーストを硬化させた。室温において、3時間後には既に最終的な硬度に到達した。
【０２４９】
実施例6：ベータ-TCP粒度の変動により改良された機械的特性
異なる粒度を使用した：
・ベータ-TCP  およそ10〜100μm
・ベータ-TCP  およそ100〜300μm
・ベータ-TCP  およそ10μm
【０２５０】
実施例7：ポリマー含有量の変動により改良された機械的特性
異なるペーストを、実施例3に記載された方法の変法により調製する。テスト試料を製造するため、ペーストを実施例5に従い硬化させた。機械的安定性を、実施例9に記載されるようにして決定した。
【０２５１】
（表1）ペーストの組成：
2008501455.tif 000008
【０２５２】
（表2）硬化したテスト試料の組成：
2008501455.tif 000009
【０２５３】
実施例8：ポリマー含有量の変動により改良された機械的特性
異なるPLGAの質を、テスト体を製造するために使用した。
2008501455.tif 000010
【０２５４】
実施例9：孔サイズおよび孔方向の決定
実施例5によるテスト試料の硬化の間、構造化されたポロシティが形成される。孔サイズおよび孔方向は、水溶性可塑剤の含有量によるペーストの組成により決定された。様々な製剤を試験し分析した。孔のサイズおよび構造を、テスト試料の様々な横断面の光学顕微鏡検およびラスター電子顕微鏡検により分析した。構造化された相互に接続されている孔は、周囲の組織への方向で形成された。孔サイズを決定した。構造化された孔は、加鉛細胞が足場のコアへと迅速に移動し、新たな組織による置換および加速された血管新生を支持することを可能にする。
【０２５５】
実施例10：選択された異なる分析されたIFSの組成物
2008501455.tif 000011
2008501455.tif 000012
【０２５６】
RG 503H；PLGA；ポリマー組成：48〜52mol％D,L-ラクチドおよび48〜52mol％グリコリド；インヘレント粘度：0,32-0,44dl/g、25℃、CHCl3中0,1％；（Boehringer, Ingelheim）
RG 502H；PLGA；ポリマー組成：48〜52mol％D,L-ラクチドおよび48〜52mol％グリコリド；インヘレント粘度：0,16-0,24dl/g、25℃、CHCl3中0,1％：（Boehringer, Ingelheim）
RG 503；PLGA；ポリマー組成：48〜52mol％D,L-ラクチドおよび48〜52mol％グリコリド；インヘレント粘度：0,32-0,44dl/g、25℃、CHCl3中0,1％；（Boehringer, Ingelheim）
RG 502；PLGA；ポリマー組成：48〜52mol％D,L-ラクチドおよび48〜52mol％グリコリド；インヘレント粘度：0,16-0,24dl/g、25℃、CHCl3中0,1％；（Boehringer, Ingelheim）
【０２５７】
実施例11：IFSの調製
最初に、必須（obligate）量の有機溶媒をポーセレン・クルーシブル（porcelain crucible）において計量した。第二工程において、ポリマーを添加した。これら二つの成分を均質化し、ポリマーが有機溶媒に完全に溶解するまで、ほぼ60℃の温度で加熱した。その後、無機賦形剤（例えば、TCP、または例えば62.5重量％のアルファ-リン酸三カルシウム、26.8重量％の無水リン酸二カルシウム（DCPA）、8.9重量％の炭酸カルシウム（CaCO3）、および1.8重量％のハイドロキシアパタイト（HA）、ならびに、任意で、その他の増量剤（例えば、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩のような孔形成剤）からなるリン酸カルシウム・セメントを、ポリマー溶液に分散させた。
【０２５８】
実施例12：IFSの機械的試験（および関連系）
実施例11に記載されたようにして調製されたペースト状のIFSを、注射器に移した。それにより、96穴プレートのウェルへの製剤の充填が容易になった。その後、ペースト状のIFS標本（1ウェル当たり150〜200mg）を含有している96穴プレートを、生理学的条件をシミュレートするため常に37℃に維持され、PBS緩衝液がインキュベーション媒体として用いられたインキュベーション浴に移した。あらかじめ定義された時点で、96穴プレートを、機械的試験を実施するため、インキュベーション浴から取り出した。標本の硬度を、TH2730（Fa Thuemler）を使用することにより試験した。実質的には、この機械は、標本に圧縮力を適用することを可能にする金属製のパンチング・ツール（punching tool）、および適用された力を制御し測定し、かつ測定中にカバーされた距離を決定するよう機能するLVDTトランスデューサーからなる。異なる標本を試験する前に、標本を含有していないウェルの高さ（h1）を定義しなければならない。従って、以下の測定のためのパンチング・ツールの出発点を固定した。標本の硬度の実際の決定は、二つの工程を包含している。第一の測定においては、特定の標本の高さ（h2）を確認しなければならず、パンチング・ツールのクロスヘッド速度は毎分40mmであり、適用された力は0.2Nに制限された。第二の測定は、適用された力を20Nに一定に維持し、30秒間、標本内のパンチング・ツールによりカバーされた距離（d）を決定するために実施された。標本の硬度は、以下の様式で計算した：
硬度［％］＝(h2 - d) / h2 * 100％
記載された方法は、Shore（DIN 53505）による硬度の決定に基づいていた。
【０２５９】
実施例13：（無菌条件を必要とするインビトロ・テストのための活性薬剤を含む）IFSの調製
原材料は、適切な方式で滅菌されなければならない。最初に、500mgのα-TCP（100〜350μmの顆粒サイズ）を、2R-ガラス内に乾燥形態で置いた。rhGDF-5のストック溶液（10mM HCl中3.4mg/ml）を、対応するコーティング緩衝液により0.54μg/mlに希釈した。そのようにして入手されたrhGDF-5溶液475μlを、α-TCP上にピペットで移し、吸収させた。湿っている顆粒を、25℃で1時間インキュベートし、次いで、凍結乾燥させた。α-TCP単独が無機賦形剤として使用された場合には、コーティングされた顆粒を、生分解性ポリマー（例えば、PLGA RG 503H）の溶液に、直接かつ正確に分散させた。そうでない場合には、コーティングされた顆粒を他のカルシウム化合物と合わせてCPCを形成させ、次にそれを、生分解性ポリマーの溶液に正確に分散させた。
【０２６０】
実施例14：異なる有機溶媒におけるrhGDF-5およびrhBMP-2でコーティングされた顆粒の安定性試験
ポリエチレングリコール400、N-メチルピロリドン（NMP）、およびアセトンのような溶媒を使用した。500μg/g β-TCPの最終濃度を達成するため、500mgのβ-TCPをそれぞれのタンパク質（rhGDF-5またはrhBMP-2）によりコーティングすることにより、試料および参照を調製した。その後、425μlのそれぞれの溶媒を各試料に添加し、参照は未処理のままにした。25℃の温度における24時間のインキュベーションの後、pHレベルが塩酸により6.7に調整された尿素（8M）、トリス（10mM）、およびEDTA（100mM）からなる抽出緩衝液3mlにより4℃で1時間、試料および参照の両方を抽出した。この抽出工程の後、全ての試料および参照を、4500rpmで3分間遠心分離した。その後、上清を1：1の比率で溶媒A（水中0.15％トリフルオロ酢酸および20％アセトニトリル）で希釈した。溶媒Bは、水中0.15％トリフルオロ酢酸および84％アセトニトリルから構成されていた。タンパク質の特徴決定を、0.3ml/分の流速でVydac C18（2.1×250mm）を使用して実施した。溶出プロフィールを、220nmにおける吸光度を測定することにより記録した。rhGDF-5、rhBMP-2、およびそれらの分解生成物の量を、220nmにおけるピーク面積から計算した。
【０２６１】
実施例15：rhGDF-5の放出研究
重量が明確な（150〜300mg）プレインキュベートされた標本（実施例11に記載された調製物）を、48mlの媒体（10％FCSを含むα-MEM）を含有している50mlのチューブに移した。放出研究を、4℃の温度において実施した。プレインキュベーション工程は、製剤からのrhGDF-5放出の速度に対する表面の改変の影響を排除するため、一定の形状の標本を入手するために必要であった。
【０２６２】
実施例16：rhGDF-5放出の定量化
rhGDF-5放出を、ELISAによって定量化した。最初に、rhGDF-5に対する抗体aMP-5をマイクロタイター・プレートの表面に固定化した。遊離の結合部位を飽和した後、プレートをrhGDF-5を含有している試料と共にインキュベートした。その後、結合したrhGDF-5を、抗体aMP4と共にインキュベートし、それをストレプトアビジンPODによる免疫反応によって定量化した。
【０２６３】
実施例17：固定化されたrhGDF-5の抽出
固定化されたrhGDF-5を、尿素（8M）、トリス（10mM）、およびEDTA（100mM）からなる抽出緩衝液により抽出した。pHレベルを塩酸によりpH6.7に調整した。500mgのコーティングされたTCP-顆粒（500mg rhGDF-5/g TCP）を15mlチューブに移し、3mlの抽出緩衝液に懸濁させた。その後、顆粒を4℃で60分間インキュベートした。最後に、上清を遠心分離し、1：1の比率で溶媒Aにより希釈した。この溶液は、RP-HPLCを介したrhGDF-5の特徴決定および定量化のため使用される。
【０２６４】
実施例18：RP-HPLCによる溶液中のrhGDF-5の定量化
rhGDF-5含有量を、逆相（RP-HPLC）分析により決定した。一定分量の試料を、Porous 10 R1 C4カラム（自己充填）を使用して分析した。0.4ml/分の流速で、水中0.045％トリフルオロ酢酸（溶媒A）および84％アセトニトリル中0.025％トリフルオロ酢酸（溶媒B）を溶媒として使用した。溶出プロフィールを、220nmにおける吸光度を測定することにより記録した。rhGDF-5の量を、標準曲線を使用して、220nmにおけるピーク面積から計算した。
【０２６５】
実施例19：RP-HPLCによる溶液中のrhGDF-5の特徴決定
rhGDF-5およびその可能性のある修飾の特徴決定を、RP-HPLCにより実施した。一定分量の試料を、Vydac C18（2.1×250mm）を使用して分析した。0.4ml/分の流速で、水中0.1％トリフルオロ酢酸（溶媒A）および0.15％トリフルオロ酢酸アセトニトリル（溶媒B）を溶媒として使用した。溶出プロフィールを、220nmにおける吸光度を測定することにより記録した。rhGDF-5の相対含有量を、220nmにおけるピーク面積から計算した。
【０２６６】
実施例20：走査型電子顕微鏡検（SEM）によるIFSの分析
硬化した真空乾燥させた標本を、炭素によりスパッター（sputtered）した。それにより、およそ10-4mbarの真空を適用した。これらの分析のための標的構造は、特定のIFS標本の表面およびコア、特にこれらの構造により示されたポロシティであった。
【０２６７】
実施例21：示差走査熱量測定（DSC）によるIFSの分析
標本を真空乾燥させた。10〜20mgの標本を正確に計量し分析し、加熱および冷却の速度は、10と30K/分の間であった。冷却は、液体窒素により実施した。
【０２６８】
実施例22：光学顕微鏡検によるIFSの分析
少なくとも48時間、ペースト状のIFS製剤をPBS緩衝液中でインキュベートすることにより、標本を調製した。硬化したIFS標本の再現性のある形状を達成するため、（1標本当たり）1.5gのペースト状製剤を24穴プレートのウェルに投入した。インキュベーションの完了後、標本を特定のウェルから取り出し、真空乾燥させた。これらの分析のための標的構造は、特定のIFS標本の表面およびコア、特にこれらの構造により示されたポロシティであった。孔の数を計数した。計数された孔の孔サイズを、いわゆるSoft Imaging Systems（登録商標）ソフトウェアにより測定した。これらの日付を、平均孔サイズ、関連する標準偏差の計算、および孔サイズ分布の決定のため使用した。
【０２６９】
表3は、IFSの表面およびコアにおける孔サイズ分布に対するカルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩（NaCMC）の異なる粒子サイズの影響を示す。
【０２７０】
2008501455.tif 000013
IFS-組成（NaCMCなし）：PLGA RG 503H（22.2wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）
IFS-組成（NaCMCあり）：PLGA RG 503H（22wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33wt％）、ポリエチレングリコール400（44wt％）、NaCMC（1wt％）
【０２７１】
実施例23：IFSの密度の決定および関連系
明確な容量を有する中空鋳型に、特定の製剤を充填した。従って、必要とされる製剤破砕の質量を決定した。このようにして、密度を、質量と容量との比率（g/ml）として計算した。データは、表3に示される。インサイチュー硬化ペーストに無機賦形剤を添加することにより、欠損部容量に対する水不溶性ポリマーの量が、従来のポリマーに基づくインプラントとは対照的に約3分の1へと相当低下し得る。これは、組織または欠損部位における局所pH値に影響を及ぼし、体内のポリマーの分解の間のpHの減少による有害なまたは毒性の部位反応を回避する。
【０２７２】
表4は、明確な欠損部容量におけるPLGA含有量の決定を示す。
2008501455.tif 000014
1.IFS：PLGA RG 503H（22.2wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）
2.IFS（CMC）；PLGA 503H（22.0wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.0wt％）、ポリエチレングリコール400（44.0wt％）、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩（1.0wt％）
3.CaPなしのポリマー溶液：PLGA RG 756（45.0wt％）、N-メチルピロリドン（55.0wt％）
4.CaPなしのポリマー溶液（CMC）：PLGA RG 756（44.6wt％）、N-メチルピロリドン（54.4wt％）、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩（1.0wt％）、＊適用前の製剤中、＊＊硬化後
【０２７３】
参照：
2008501455.tif 000015
2008501455.tif 000016
2008501455.tif 000017
2008501455.tif 000018
【図面の簡単な説明】
【０２７４】
【図１】比率に依る、コンシステンシー、ポロシティ、および硬化特徴に関するインサイチュー硬化ペーストの要素の影響を示す。
【図２】多様なポリマーとリン酸カルシウム・セメントとの比を有する、本発明のインサイチュー硬化ペーストのための様々なインサイチュー形成足場（IFS）組成物または候補組成物、および三つの異なる時点（1、9、および24日後）における異なる組成物の硬度［％］を示す。黒色：ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（55.5wt％）濃灰色：PLGA RG 503H（11.0wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（44.5wt％）淡灰色：PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）白色：PLGA RG 503H（38.8wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（16.7wt％）灰色点付き白色：PLGA RG 503H（38.9wt％）、ポリエチレングリコール400（61.2wt％）白色点付き灰色：リン酸カルシウム・セメント（対照）リン酸カルシウム・セメントは、α-TCP（59.0wt％）、CaHPO4（24.0wt％）、CaCO3（8.5wt％）、ハイドロキシアパタイト（8.5wt％）から構成されている。
【図３】時間（1、72、および168h後）の関数としての異なるポリマーとリン酸カルシウムとの比率を有する様々なIFS組成物の硬度［％］を示す（ここで、0は、IFS標本が37℃においてPBS緩衝液へ移された時点であり、硬度は下記実施例に従って決定された）。使用されたリン酸カルシウム・セメントの組成は、図6に記載される。黒色：PLGA RG 503H（19.4wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（36.1wt％）灰色：PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）白色：PLGA RG 503H（25.0wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（30.5wt％）
【図４】異なる含有量のポリエチレングリコール400（PEG400）を可塑剤として有するIFS組成物の硬度［％］を示す。使用されたリン酸カルシウム・セメントの組成は、図6に記載される。黒色：PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）灰色：PLGA RG 503H（20.0wt％）、ポリエチレングリコール400（50.0wt％）、リン酸カルシウム・セメント（30.0wt％）白色PLGA RG 503H（16.0wt％）、ポリエチレングリコール400（60.0wt％）、リン酸カルシウム・セメント（24.0wt％）図2〜4は、組成、例えば、ポリマー／無機賦形剤の比率および有機溶媒含有量が、本発明のインサイチュー硬化ペーストの機械的特性にどのように影響を与えるかを示している。これらの実施例における最も高い機械的安定性は、1.5：1という無機賦形剤／ポリマーの比率で観察された。本発明の安定性要件を満たす好ましい態様は、上に記載されている。さらなる詳細は下に記載される。  最大の機械的安定性を達成するための組成物の最適な可塑剤含有量を評価する実験結果が、図4に示されている。44.5％〜60％未満の範囲内で、改良された機械的安定性が、これらの分析された試料において達成され得た。
【図５】時間の関数としての、IFSの硬度［％］に対する、無機相としてのリン酸カルシウム・セメント（CPC、黒色）対β-TCP（白色）の影響を示す。使用されたリン酸カルシウム・セメントの組成は、図6に記載される。黒色：PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）白色PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、β-リン酸三カルシウム（33.3wt％）
【図６】時間（1、48、168h）の関数としての、様々なリン酸カルシウム含有組成物の硬度［％］を示す。各製剤は、PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、および無機成分（33.3wt％）を含む。異なる製剤の無機成分は、以下のように使用された：黒色：α-TCP（62.5wt％）、CaHPO4（26.8wt％）、CaCO3（8.9wt％）、ハイドロキシアパタイト（1.8wt％）からなるリン酸カルシウム・セメント灰色：α-TCP白色：α-TCP（99.0wt％）、ハイドロキシアパタイト（1.0wt％）灰色点付き白色：α-TCP（98.0wt％）、ハイドロキシアパタイト（2.0wt％）
【図７】時間（1、48、および144h）の関数としての、α-TCPの粒子サイズに依存性のIFSの硬度［％］を示す。各製剤は、PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、およびリン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）を含む。リン酸カルシウム・セメントは、α-TCP（62.5wt％）、CaHPO4（26.8wt％）、CaCO3（8.9wt％）、ハイドロキシアパタイト（1.8wt％）からなる。α-TCPの粒子サイズを以下のように変動させた：黒色：α-TCP顆粒の粒子サイズ→300〜500μm灰色：α-TCP顆粒の粒子サイズ→500〜700μm白色：α-TCP顆粒の粒子サイズ→700〜1000μm灰色点付き白色：α-TCP顆粒の粒子サイズ→＜300μm  図7において、本発明者らは、インサイチュー硬化ペーストの機械的特性に対する分析された無機賦形剤の粒子サイズの影響を示しており、300μm以上の粒子サイズを有する賦形剤を使用した場合に、機械的安定性は改良された。
【図８】長期的なIFS組成物の硬度に対する異なる有機溶媒の影響を示す。黒色：PLGA RG 503H（22.2wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）。使用されたリン酸カルシウム・セメントの組成は、図6に記載される。灰色：PLGA（22.2wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）、N-メチルピロリドン（NMP）（44.5wt％）白色：リン酸カルシウム・セメント（42.8wt％）、N-メチルピロリドン（57.2wt％）  本発明の好ましい可塑剤は、PEGまたはDMSOのような非毒性物質である（図11参照）。PLGA（50/50）のため図8に示されたように、PEG400のようなPEGは、（「deutschen Gefahrstoffstoffverordnung」において「Xi」および「Giftklasse(CH)5」として分類されているが、先行技術において高頻度に使用されている薬学的ポリマー液体である）NMPと比較して、長期的（1〜98h）な機械的安定性の増加を与える。
【図９】PLGA RG 503Hを含むIFS混合物における異なる有機溶媒の可塑化効果を示す（実施例21に従いDSCによるガラス転移温度（Tg）の減少を測定することにより決定）。使用された有機溶媒に依存して、ポリマーのTgが改変され、Tgの低下は、IFSの機械的特性に負の影響を及ぼす。黒色：PLGA RG 503H／ポリエチレングリコール400（1：2）灰色：PLGA RG 503h／N-メチルピロリドン（1：2）白色：PLGA RG 503H／ジメチルスルホキシド（1：2）白点付き灰色：PLGA RG 503H
【図１０】異なるPLGA型に依存性の硬度［％］を示す。結果は、IFSの成分として適当なポリマーの選択のため、いくつかの特質を考慮に入れなければならないことを明らかにしている。ポリマー鎖を含む乳酸／グリコール酸の比率およびインヘレント粘度の両方が、硬化したIFSの機械的特性に影響を及ぼす。使用されたリン酸カルシウム・セメントの組成は図6に記載される。黒色：PLGA RG 756（22.2wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、灰色：PLGA RG 503（22.2wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、白色：PLGA RG 502（22.2wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、白点付き灰色：PLGA RG 503H（22.2wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、  本発明のインサイチュー硬化ペーストの適用により、ペーストの機械的特性はポリマー型の選択によって調整され得る（図10）。本発明のおかげで、本発明者らは、水性媒体におけるインプラントの長時間の機械的安定性が、75：25未満の乳酸／グリコール酸の比率を有するポリマーが使用された場合、有意に増強され得、75：25（RG 756H）と比較して、好ましくは、50：50（RG 503H）が使用されることを見出した。図10および12に示されたRG 503H（エンド・キャップされていない）と比較してRG 503について示されたように、エンド・キャップト・ポリマーを使用した場合、機械的安定性のさらなる改良が達成され得る。さらに、機械的特性は、増加した分子量を有するポリマーを使用した場合、改良される（RG 502と比較してRG 503）。
【図１１】IFSの硬度［％］に対するPLGA-PEGジブロック-コポリマーの影響を示す。黒色：ジブロック-コポリマー（11.4wt％）、ジメチルスルホキシド（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（44.1wt％）灰色：ジブロック-コポリマー（7.6wt％）、ジメチルスルホキシド（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（47.9wt％）白色：ジブロック-コポリマー（3.8wt％）、ジメチルスルホキシド（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（51.7wt％）  PLGAが本発明のインサイチュー硬化ペーストの製造のための適当なポリマーとして使用され得るのみならず、ジメチルスルホキシドのような、ポリマーが可溶性の可塑剤と共に使用された場合、PLGA-PEGジブロック-コポリマーも、3と12wt％の間のポリマー濃度の80％超の硬度を有するペーストをもたらす。
【図１２】実施例21に記載されるようなDSCによる時間の関数としてのガラス転移温度（Tg）を測定することにより決定されるような、エンド・キャップト・PLGAコポリマーを使用することによるIFSの持続的な分解を示す。使用されたリン酸カルシウム・セメントの組成は図6に記載される。黒色曲線：PLGA RG 503（22.2wt％、エンド・キャップされている）、PEG400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）白色曲線：PLGA RG 503H（22.2wt％、エンド・キャップされていない）、PEG400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）
【図１３】他の関連する自己硬化性デバイスと比較して改良されたIFS組成の長期的な機械的強度（硬度［％］）を示す。使用されたリン酸カルシウム・セメントの組成は、図6に記載される。  本発明のおかげで、リン酸カルシウム・セメント（白色バー）またはPLGAおよびN-メチルピロリドンからなるポリマーに基づく系（灰色バー）と比較して、より高い機械的強度を、インサイチューにおけるペーストの硬化後1時間以内に有するインサイチュー硬化ペーストが開発され得た。さらに、96時間後の機械的強度は、リン酸カルシウム・セメントの機械的特性より高かった。黒色：PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、およびリン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）からなるIFS灰色：PLGA RG 756（45.0wt％）およびN-メチルピロリドン（55.0wt％）からなるポリマー溶液白色：アルファ-TCP（62.5wt％）、リン酸水素カルシウム（26.8wt％）、炭酸カルシウム（8.9wt％）、およびハイドロキシアパタイト（1.8wt％）からなるリン酸カルシウム・セメント
【図１４】IFSの外表面における孔形成能に対する異なる濃度のカルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩の孔形成能を示す。本発明のおかげで、インサイチュー硬化ペースト周囲の被膜形成は、水性環境において膨張特性を示すカルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩のような孔形成剤の添加により防止され得る。カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩がIFS製剤に導入された場合、IFSの内部構造への細胞遊走を容易にする孔サイズで、適用（インサイチュー硬化）後にIFS組成の表面において孔形成過程が起こる。しかしながら、十分なマクロポロシティは、例えば、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩の本発明の組成物への添加の後にのみ達成され得、NMPを含むもののようなその他の組成物は、インサイチュー形成マトリックスの外側構造における多孔性が低い。A）PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）B）PLGA RG 503H（21.6wt％）、ポリエチレングリコール400（43.4wt％）、リン酸カルシウム・セメント（32.5wt％）、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩（2.5wt％）C）PLGA RG 503H（21.1wt％）、ポリエチレングリコール400（42.3wt％）、リン酸カルシウム・セメント（31.6wt％）、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩（5.0wt％）D）PLGA RG 756（45.0wt％）、N-メチルピロリドン（55.0wt％）E）PLGA RG 756（43.9wt％）、N-メチルピロリドン（53.6wt％）、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩（2.5％）F）PLGA RG 756（42.8wt％）、N-メチルピロリドン（52.2wt％）、カルボキシメチルセルロース・ナトリウム塩（5.0wt％）
【図１５】硬化したペーストの高度のマクロポアおよび相互に接続されている孔を示す、IFSのSEM顕微鏡写真を提示する。Aは、実施例20に従って得られたIFSのSEM顕微鏡写真を示す。示された標本は、90°の角度の二つの横断面の結果である。孔形成が足場の至る所で起こった二つの主な方向は、相互に接続されている孔（ミクロポアおよびマクロポア）の三次元ネットワークをもたらす。IFSの組成：PLGA RG 503H（22.2wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）Bは、IFSの相互に接続されている孔を示す。光学顕微鏡検査により作成された写真は、以下の組成のIFS標本の横断面を示す：PLGA 503H（22.2wt％）、リン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）。本発明のおかげで、海綿（spongiosa）に類似しているマクロポア性の足場が作製され得た。矢印は、形成されたインサイチューの足場の全体に存在する、本発明のインサイチュー硬化ペースト内に作製された孔の相互接続性を示す領域を表す。
【図１６】長期的（日数単位）なIFS組成からのrhGDF-5の放出を示す。使用されたIFSは、PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）；rhGDF-5でコーティングされたα-TCP顆粒（62.5wt％）を含むリン酸カルシウム・セメント（33.3wt％）から構成されていた；得られたrhGDF-5濃度：104μg/g IFS。タンパク質の放出は、4℃において、実施例15に記載されるようにして決定された。本発明のおかげで、7日間にわたる活性薬剤の持続的な放出が示され得た。7日後、活性薬剤の60％のみが送達された。
【図１７】非無菌条件下で実施例14に従って決定された様々な有機溶媒（A−アセトン、B−NMP、C−PEG 400）におけるrhGDF-5でコーティングされたα-TCP顆粒の安定性を示す。Dは、対照としての有機溶媒で処理されていないrhGDF-5でコーティングされたα-TCP顆粒を示す。タンパク質の安定性は、コーティングされたα-TCP顆粒からの抽出後の天然rhGDF-5の量による相対ピーク面積として決定された。例示的な活性薬剤としてrhGDF-5を使用して、最も高い安定性は、分析されたその他の有機溶媒より、PEG400で達成され得た。無菌条件、不活性ガスの下での製造、または安定剤の添加のように、製造条件がさらに改良される場合、安定性はさらに増加し得る。
【図１８】Heraeus Kulzerから購入されたOstim（登録商標）ハイドロキシアパタイト・ペースト（A）およびMerckから購入されたCalcibon（登録商標）リン酸カルシウム・セメント（C）のような他の最先端技術の系を、本発明のIFS（C）と比較した、ペーストの純水への適用後のIFSの流失抵抗性を示す。使用されたインサイチュー硬化ペーストは、PLGA RG 503H（22.2wt％）、ポリエチレングリコール400（44.5wt％）、ならびにα-TCP（62.5wt％）、リン酸水素カルシウム（26.8wt％）、炭酸カルシウム（8.9wt％）、およびハイドロキシアパタイト（1.8wt％）を含有しているリン酸カルシウム・セメント（100％になるまで）から構成されていた。アッセイは環境温度で実施された。Ostim（登録商標）は、水性媒体に直接注入された。Calcibon（登録商標）は、セメント粉末1gおよびセメント液0.32mlを合わせることにより予備混合された。5分後、得られたペースト状のセメント混合物を、水性媒体中に置いた。IFSは、分析された他の標本とは対照的に、水に浸漬されている間、優れた流失抵抗性を示し、安定したままであり、硬化することが観察され得た。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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