(57)【要約】  本発明は、第１型の抗原タンパク質および第２型のクラスＩＩのＭＨＣのリガンド・タンパク質からなる結合産物に関するものであり、前記２つのタンパク質型は生物環境中で１個または数個の安定した結合によって結合している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１クラスの抗原型タンパク質および第２クラスのクラスＩＩＭＨＣリガンド型タンパク質を備え、両クラスのタンパク質が生物環境中で１個または数個の安定した結合によって結合していることを特徴とする結合産物。
【請求項２】
両クラスのタンパク質が、連結された共有結合であることを特徴とする請求項１に記載の結合産物。
【請求項３】
両クラスのタンパク質がリンカーまたは連結分子を介して共有結合により間接的に連結していることを特徴とする請求項２に記載の結合産物。
【請求項４】
両クラスのタンパク質が融合タンパク質を形成していることを特徴とする請求項２または請求項３に記載の結合産物。
【請求項５】
前記第２クラスのタンパク質が、ｈＬＡＧ−３、その相同体、断片および誘導体、ならびにこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１から請求項４のいずれかに記載の結合産物。
【請求項６】
前記ＬＡＧ−３断片が可溶性断片であることを特徴とする請求項５に記載の結合産物。
【請求項７】
前記ＬＡＧ−３断片が、Ｄ１−Ｄ２およびＤ１−Ｄ４断片からなる群から選択されることを特徴とする請求項６に記載の結合産物。
【請求項８】
前記第１クラスの抗原型タンパク質が、その治療がＴリンパ球応答を必要とする疾患に特異的な抗原を含む群から選択されることを特徴とする請求項１から請求項７のいずれかに記載の結合産物。
【請求項９】
前記第１クラスの抗原型タンパク質が、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍抗原、寄生虫抗原、およびこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１から請求項８のいずれかに記載の結合産物。
【請求項１０】
前記第１クラスの抗原型タンパク質が、ＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶウイルスおよびこれらの混合物からなる群から選択されるウイルス抗原であることを特徴とする請求項９に記載の結合産物。
【請求項１１】
前記第１クラスの抗原型タンパク質が、ＨＰＶの抗原Ｅ７およびＨＩＶのｇａｇ−ｎｅｆ抗原からなる群から選択されることを特徴とする請求項１０に記載の結合産物。
【請求項１２】
前記第１クラスの抗原型タンパク質が、結核、ハンセン病およびリステリアの細胞内細菌の群から選択される細菌抗原であることを特徴とする請求項９に記載の結合産物。
【請求項１３】
前記第１クラスの抗原型タンパク質が、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ、ＰＳＡ、ＭＡＧＥ−３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＰＶのＥ６およびＥ７タンパク質からなる群から選択される腫瘍抗原であることを特徴とする請求項９に記載の結合産物。
【請求項１４】
薬剤として許容可能な賦形剤と任意で組み合わされた、請求項１から請求項１３のいずれかに記載の少なくとも１つの結合産物を備えることを特徴とするワクチン組成物。
【請求項１５】
感染疾患および／または癌を治療することを目的とする薬剤を調製するための、請求項１から請求項１３のいずれかに記載の結合産物の使用方法。
【請求項１６】
感染疾患および／または癌の治療がＣＤ８＋Ｔ細胞を介した免疫応答を含む請求項１５に記載の使用方法。
【請求項１７】
前記第２クラスのＭＨＣＩＩリガンド型のタンパク質が、Ｔ細胞を介した抗原特異的な免疫応答を誘導することが可能である請求項１５または請求項１６に記載の使用方法。
【請求項１８】
癌の免疫療法および感染疾患の免疫療法を目的とする薬剤を製造するための請求項１から請求項１３のいずれかに記載の結合産物の使用方法。
【請求項１９】
特異的なＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導することが可能である免疫原性組成物を調製するための請求項１から請求項１３のいずれかに記載の結合産物の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、治療ワクチンの分野に属する。本発明は、ＬＡＧ−３またはＣＤ４などのクラスＩＩＭＨＣリガンドと抗原との結合によって、この抗原の免疫作用を高めることが可能であるワクチンに関する。本発明は非常に詳細には、それに対する免疫の誘導が望ましい障害に特異的な少なくとも１つの抗原、および少なくとも１つのクラスＩＩＭＨＣリガンドを含む、特に融合タンパク質の形態の結合産物に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ２２３としても表されるＬＡＧ−３、またはＣＤ４などのクラスＩＩＭＨＣタンパク質の天然リガンドは、特にリンパ球および抗原提示細胞などのさまざまなリンパ球様細胞との相互作用のレベルで免疫認識に関与している。
【０００３】
国際公開第９９／０４８１０号パンフレットは、癌免疫療法用のワクチンを製造するための補助として、ＬＡＧ−３などのクラスＩＩＭＨＣリガンドを使用することを開示している。
【０００４】
本発明の文脈内で実施された試験は現在、ＬＡＧ−３および抗原からなる融合タンパク質による免疫化の顕著な有効性の実証を可能にしている。実際に本出願人は、抗原と、補助剤としてのＬＡＧ−３タンパク質とを含むワクチン組成物用に従来技術で使用された用量と比較して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで非常に低用量のＬＡＧ−３抗原結合産物を用いて得た非常に顕著なＣＤ８応答を観察した。
【０００５】
このような有効性は、従来のＬＡＧ−３Ｉｇ補助効果を提示細胞（樹状細胞）に対する抗原の標的効果（ベクター化）に加えることから生じ、これによってクラスＩＩＭＨＣ分子へのＬＡＧ−３結合抗原の内在化が可能となる。したがって、クラスＩＭＨＣの提示の経路に対する抗原の重要な「交差提示」現象はＴ細胞ＣＤ８応答の誘導を可能にするが、一方、ワクチン・タンパク質などの外来性抗原に関してはＣＤ４応答のみが予想される。
【０００６】
さらに、以下で報告する実験データは、共焦点顕微鏡によるＬＡＧ−３Ｉｇ／Ａｇ結合産物の３７℃における急速な内在化（１５分以内の内在化）を示す。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明の目的は、第１クラスの抗原型タンパク質および第２クラスのクラスＩＩＭＨＣリガンド型タンパク質からなり、生物環境中で安定している１個または数個の結合によって両クラスのタンパク質が結合している、好ましくは実質的にタンパク質性の結合産物である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
生物環境中で安定している結合によって、ただし非制限的に、共有結合（例えば、アミド結合またはジスルフィド結合）、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス結合、疎水性結合および任意のこれらの組合せを意味し、前記結合は生物環境中で本発明に係る結合産物の完全性を保つことを可能にする。
【０００９】
好ましくは、本発明に係る結合産物の両クラスのタンパク質は、水素結合または共有結合によって結合しており、特に好ましくは共有結合によって結合している。
第１の実施形態によれば、本発明の結合産物は、両クラスのタンパク質が水素結合によって結合している事実によって特徴付けられる。
【００１０】
第２の実施形態によれば、本発明の結合産物は、両クラスのタンパク質が共有結合によって結合している事実によって特徴付けられる。両クラスのタンパク質は、リンカーまたは連結分子を介して直接的あるいは間接的に、共有結合によって結合され得る。
【００１１】
直接的な共有結合は、本発明に係る第１クラスのタンパク質および第２クラスのタンパク質の原子の、１個または数個の電子の共有として定義される。
リンカーまたは連結分子の例としては、ポリペプチドまたはアミノ酸、多糖または単糖、ポリヌクレオチドまたは核酸、アルキル、シクロ−アルキルまたはアリル基が挙げられる。
【００１２】
本発明の有利な実施形態は、両クラスのタンパク質が１個または数個のペプチド結合によって直接的あるいは間接的に結合している融合タンパク質の形である結合産物である。融合タンパク質によって、結合産物は１つおよび同じ読み取り段階で本発明に係る両クラスのタンパク質を成熟および発現させることが可能であると考えられる。融合タンパク質の場合、クラスＩＩＭＨＣの抗原およびリガンドは、Ｎおよび／またはＣ末端で共有結合によって結合している。
【００１３】
したがって、その４−ドメインＩｇ（Ｄ１Ｄ４）または２−ドメインＩｇ（Ｄ１Ｄ２）形でＭＨＣリガンドとしてｈＬＡＧ−３を使用し、抗原として使用したウイルス抗原Ｅ７またはｇａｇ−ｎｅｆをｈＬＡＧ−３ＩｇのＮまたはＣ末端のいずれかに配置した、組換えタンパク質の異なる組合せを調製した。
【００１４】
第１クラスのタンパク質と第２クラスのタンパク質とが共有結合によって結合している結合産物の例として、以下の式（Ｉ）の結合産物を述べることが可能である。
［（Ａｇ）ｎ（Ｘ）ｍ（Ｙ）ｐ］ｑ
上式で、Ａｇは第１クラスのタンパク質の抗原を表し、ｎは結合産物中の抗原分子の数を表し、ｎは１〜５の整数であり、
Ｙは第２クラスのタンパク質のクラスＩＩＭＨＣリガンドを表し、ｐは結合産物中のクラスＩＩＭＨＣリガンドの数を表し、ｐは１〜２の整数であり、
ＸはＡｇとＹとの間の結合を表し、ｍは結合産物中のＡｇとＹとの間の結合の数を表し、ｍは１〜５の整数であり、
ｑは１〜５の整数である。
【００１５】
両クラスのタンパク質が共有結合によって直接的あるいは間接的に結合しているとき、Ｘは、前述で定義された共有結合、リンカーまたは連結分子を含む群において選択される。
【００１６】
したがって、本発明に係る結合産物中では、第１クラスのタンパク質は、１個の抗原または数個の異なる抗原もしくは同一の抗原を含んでもよい。好ましくは、本発明に係る結合産物は１個の抗原を含む。
【００１７】
同様に、本発明に係る結合産物中において、第２クラスのタンパク質は、１個のクラスＩＩＭＨＣリガンド、または数個の同一もしくは異なるクラスＩＩＭＨＣリガンドを含んでもよい。好ましくは、本発明に係る結合産物は１個のクラスＩＩＭＨＣリガンドを含む。
【００１８】
本発明に係る結合産物が数個の抗原および／またはクラスＩＩＭＨＣリガンドを含むとき、
各クラスのタンパク質は、抗原のモノマーまたはポリマーと共有結合によって結合したポリマー、例えばクラスＩＩＭＨＣリガンドの２量体の形で互いに分類されることができ、
抗原および／またはクラスＩＩＭＨＣリガンドが改変され、これらが反復単位のポリマーを形成することができる。
【００１９】
前述のタンパク質構築体は、組換えＤＮＡ技法または化学合成などの当業者に周知である任意の方法を使用することによって、融合タンパク質の形で調製されてもよい。組換えＤＮＡ技法は、本発明に係るタンパク質構築体をコードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡの調製に基づいている。
【００２０】
化学合成により本発明の結合産物が調製される場合、抗原およびクラスＩＩＭＨＣリガンドもまた、１個または数個のアミノ酸側鎖で共有結合によって結合されてもよい。アミノ酸側鎖を介した結合の場合、結合産物は高レベルの親和性で樹状細胞のクラスＩＩＭＨＣとの結合性を保ち、抗原を内在化させなければならない。
【００２１】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明に係る結合産物において、第２クラスのタンパク質は、ｈＬＡＧ−３、その相同体、断片および誘導体、ならびにこれらの混合物からなる群から選択される。
【００２２】
ＬＡＧ−３の相同体、断片および誘導体は、樹状細胞のクラスＩＩＭＨＣとの高い親和性での結合、および第１クラスのタンパク質の抗原の内在化を保証することができるものである。
【００２３】
相同体は、ヒト以外の種由来のタンパク質ＬＡＧ−３、例えばネズミＬＡＧ−３（ｍＬＡＧ−３）を意味するものである。タンパク質配列がヒトＬＡＧ−３のタンパク質配列と少なくとも７０％の相同性、好ましくは少なくとも８０％の相同性、およびより好ましくは少なくとも９０％の相同性を有することが有利である。２つのタンパク質配列間の相同性は、２本のタンパク質鎖中の同一または類似の位置に局在する同一アミノ酸の割合に相当する。相同性の割合は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリクスを使用して、ＮＣＢＩのサイト（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏ／）で入手可能なＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して計算される。
【００２４】
Ｌａｇ−３断片は、樹状細胞のクラスＩＩＭＨＣとの高い親和性での結合、および第１クラスのタンパク質の抗原の内在化を保証することができるＬＡＧ−３のタンパク質配列として定義され、当該タンパク質配列は、５０アミノ酸と２００アミノ酸の間の長さ、好ましくは６０アミノ酸と１７５アミノ酸の間の長さ、およびより好ましくは７５アミノ酸と１６０アミノ酸の間の長さを有する。
【００２５】
ｈＬＡＧ−３断片の例として、少なくとも２つのＩｇ型細胞外Ｎ末端ドメインを含む可溶性分画を特に述べることが可能である。これらのドメインは、特に国際公開公報第９１／１０８６２号パンフレットおよび国際公開公報第９５／３０７５０号パンフレット中に記載されている。本発明は特に、Ｄ１〜Ｄ２（配列番号１８および配列番号１９）ならびにＤ１〜Ｄ４（配列番号１８および配列番号１９、配列番号２０および配列番号２１）断片からなる群から選択されるＬＡＧ−３断片を結合産物中に含む。したがって、実験部分で報告される実施例では、ｈＬＡＧ−３は、その４−ドメイン（Ｄ１Ｄ４）または２−ドメイン（Ｄ１Ｄ２）形で使用され、２つのドメインＤ１〜Ｄ２は、樹状細胞のクラスＩＩＭＨＣとの高い親和性での結合、次に内在化を保証するのに充分である。
【００２６】
以下のＬＡＧ−３誘導体またはその断片は、１個または数個のアミノ酸の欠失、添加または置換によって修飾されているアミノ酸配列を含み、当該誘導体は、樹状細胞のクラスＩＩＭＨＣとの高い親和性での結合、および第１クラスのタンパク質の抗原の内在化を保証することができる。例えば、国際公開第９５／３０７５０号パンフレットおよび国際公開第９８／２３７４１号パンフレット中に記載されたのと同様の、グルタミン酸による位置７３、７５および／または７６での１個または数個のアルギニンの置換を述べることが可能である。それは、国際公開第９８／５８０５９号パンフレット中に記載されたのと同様のＬＡＧ−３のスプライシング変異体であってもよい。
【００２７】
ＬＡＧ−３の相同体、誘導体の断片が本発明の構想の範疇にあるかどうかを判定することが可能である結合試験の例として、以下のものを述べることが可能である。
クラスＩＩＭＨＣ分子を発現するＥＢＶによって形質転換されたＢ系を使用する、間接的免疫蛍光細胞標識。陽性対照が常に使用される（９．４９またはＩ３で表されるパン−クラスＩＩ抗体、次にＧＡＭ−ＦＩＴＣ）。マーカーの飽和度は、ＧＡＨ−ＦＩＴＣ（第２層）で染色されたＬＡＧ−３Ｉｇ（第１層）の３０μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬに達する。３または１μｇ／ｍＬのＬＡＧ−３Ｉｇでシグナルが常に検出される。これらの結果は、融合タンパク質ＬＡＧ−３Ｉｇ／Ａｇを用いて得られるはずである。
【００２８】
クラスＩＩＭＨＣタンパク質がスライドに結合し、ＬＡＧ−３ＩｇまたはＬＡＧ−Ｉｇ／Ａｇの結合親和性が測定される、Ｂｉｏａｃｏｒｅ型標識。「結合」の２つの型は同様のＫｄ値（解離定数）を有するはずであり、いずれの場合も５×１０−８未満であり、好ましくは３×１０−９未満である。
【００２９】
ＬＡＧ−３の相同体、断片、または誘導体が本発明の構想の範疇にあるかどうかを判定することが可能である内在化試験の例として、スライド上での標識および共焦点顕微鏡を用いた分析を述べることが可能である。以下の手順に従い精製されたヒト単球（ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦと共にｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養されたもの）から、６日以内で樹状細胞が得られる。
【００３０】
細胞の回収および計数、
１１００ｒｐｍでの５分間の遠心分離、
（３７℃での平衡状態後の）ＰＢＳ１Ｘ中での１００万個／ｍＬへの細胞の希釈、
３００μＬの細胞懸濁液をスライドに施し、３７℃において３０分間、ポリリシンにより被覆されたスライドに細胞を接着させる工程、
流体の除去、および３７℃において３０分間、５００μＬのＰＢＳ１Ｘ／０．１％ＮａＮ３／３％ミルクを用いた飽和、
氷上（４℃）にスライドを置き、１０〜１５分間冷却する工程、
流体の除去、および冷ＰＢＳ１Ｘを用いて軽く洗浄する工程、
ＰＢＳ１Ｘ／０．１％ＮａＮ３／３％冷ミルクに希釈された４００μＬの抗体（または３０μｇ／ｍＬでのｈＬＡＧ−３Ｉｇタンパク質）の施し、および３０分間、４℃でのインキュベート、
流体の除去、および冷ＰＢＳ１Ｘを用いて軽く洗浄する工程、
各他の標識（ＬＡＧ−３Ｉｇ標識に関するＧＡＨ−ＦＩＴＣ）に関する２つの最後の工程の反復、
（内在化を可能にするためにインキュベータ内で）１５〜２０分間、３７℃でスライドを放置する工程、
４００μＬの冷ＰＢＨ１×／２％冷ＰＦＡを施し、４℃で１５分間細胞を固定する工程、
流体の除去、および冷ＰＢＳ１×で軽く洗浄する工程、
２０〜３０μＬのＦｌｕｏｒｏｍｏｕｎｔ  Ｇを加え、カバー・スライドを注意深く置き、４℃に置く前に１〜２時間の間、室温において乾燥状態で放置する工程；
共焦点顕微鏡によるスライドの分析。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明に係る結合産物において、第１クラスの抗原型タンパク質は、その治療がＴ細胞応答を必要とする障害に特異的な抗原からなる群から選択される。より詳細には、ウイルス抗原、細菌抗原、腫瘍抗原、寄生虫抗原、およびこれらの混合物からなる群を述べることが可能である。
【００３２】
したがって、第１クラスの抗原型タンパク質は、好ましくはウイルスＨＰＶ、ＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶおよびこれらの混合物からなる群、および非常に好ましくはＨＰＶのＥ７抗原およびＨＩＶのｇａｇ−ｎｅｆ抗原からなる群から選択されるウイルス抗原である。実際、新しいワクチン・タンパク質を開発する目的で、ＬＡＧ−３は、ウイルス抗原（ＨＰＶ−１６由来のＥ７またはＨＩＶ−１由来のｇａｇ−ｎｅｆ）と融合された。その目的は、ＬＡＧ−３の補助（免疫刺激）効果に加えて、未成熟樹状細胞に対する抗原の標的化を達成することであった。これらの細胞はクラスＩＩＭＨＣ分子、ＬＡＧ−３リガンドを発現し、これらは細胞の内側に非常に速くリサイクルされ、これによってＬＡＧ−３と結合した抗原を引き込む。ｈＬＡＧ−３Ｉｇおよびウイルス抗原を含む融合分子はこのようにして構築され、哺乳動物細胞内で発現され、精製されて機能的に試験された。
【００３３】
第１クラスの抗原型タンパク質は、結核、ハンセン病およびリステリアの細胞内細菌の群から選択される細菌抗原でもよい。第１クラスの抗原型タンパク質は、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ、ＰＳＡ、ＭＡＧＥ−３、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＰＶ（頸部の癌）由来のＥ６およびＥ７タンパク質を含む群から選択される腫瘍抗原であることがさらに有利である可能性がある。
【００３４】
本発明は、ＬＡＧ−３の使用に基づく新しいワクチン戦略を提供し、これは抗体ではなく天然リガンドの使用に基づく。これは、注射されるＬＡＧ−３Ｉｇおよび抗原の用量の非常に顕著な低下を可能にするという利点を与え、したがって産業規模でのそれらを含む治療用ワクチン組成物のさらに容易な開発を可能にする。さらにこれらの組成物は、低用量の治療用ワクチンを用いてヒトにおいて誘導される高いＴ−細胞ＣＤ８応答を可能にする。ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ８応答を支持し、ＣＤ８応答を非常に高度で長期のものにし得る、すなわちウイルスまたは腫瘍細胞の保有宿主を破壊する際に有効にし得る、証明済みのＣＤ４応答の増大の有用性が強調されなければならない。
【００３５】
したがって、本発明はさらに、経口、皮膚、皮下、局所、筋肉内、静脈内または動脈内投与、あるいは身体の任意の液状部分への投与を可能にする形で薬剤賦形剤と組み合わされることが有利である、前に定義された結合産物などの少なくとも１つの結合産物を含むワクチン組成物に関する。
【００３６】
本発明の組成物は、０．１μｇ／ｍＬと１ｍｇ／ｍＬとの間、好ましくは０．１μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬとの間、より好ましくは０．１μｇ／ｍＬと１０μｇ／ｍＬとの間、および特に好ましくは０．１μｇ／ｍＬと１μｇ／ｍＬとの間の結合産物を含むことが有利である。これらの組成物は、ＥＬＩＳＡによって分析される。
【００３７】
本発明は、充分な量の前に定義された組成物などを第１クラスのタンパク質の抗原に応答する障害に罹患する個体に投与する工程を含む、個体の予防接種法にも言及する。
本発明はさらに、前に定義された結合産物などの結合産物の薬剤としての使用に関する。
【００３８】
有利なことに、本発明は、免疫を誘導することが可能である、好ましくは特異的なＴ細胞ＣＤ４および／またはＣＤ８応答を誘導することが可能である免疫原性組成物を調製するための、前に定義された結合産物などの結合産物の使用に関する。
【００３９】
実際、以下の実験項中で報告するデータは、タンパク質ＬＡＧ−３ＩｇのＣ末端位置における２つの異なるタンパク質（Ｅ７およびｇａｇｎｅｆ）の結合によって、ＴＣＤ４応答（クラスＩＩＭＨＣ分子による提示）とＣＤ８（クラスＩＭＨＣ分子による提示）の両方に関して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて非常に高レベルの免疫を得ることを示す。このｉｎ  ｖｉｔｒｏでの免疫原性は、健全なドナーのＰＢＭＣを用いて定義された。
【００４０】
タンパク質の形で提示され、したがってＰＢＭＣの樹状細胞によって取り込まれ、１１〜２０アミノ酸のペプチドの形のクラスＩＩＭＨＣ分子によって提示される、Ｅ７またはｇａｇ−ｎｅｆ抗原への４８日間の露出に応答して細胞内γ−インターフェロンを分泌する細胞を定量することによって、Ｅｌｉｓｐｏｔを使用してＣＤ４応答を試験した。
【００４１】
クラスＩＭＨＣ分子によって提示される９〜１０アミノ酸長のペプチドによる４８日間の刺激に応答して、γ−インターフェロンを分泌する細胞を定量することによって、Ｅｌｉｓｐｏｔを使用してＣＤ８応答を試験した。
【００４２】
いずれの場合も、抗原を用いた３回のｉｎ  ｖｉｔｒｏ刺激後に、ＴＣＤ４またはＣＤ８応答の事前増幅を得た。
Ｅｌｉｓｐｏｔを使用した、これらの高いＣＤ４およびＣＤ８応答（健全なＨＰＶ−１６−およびＨＩＶ−ボランティアでの非投薬Ｔ細胞の初回抗原刺激、または健全なＨＰＶ−１６＋およびＨＩＶ＋ボランティアでの追加抗原刺激による）は、Ｅ７またはｇａｇ−ｎｅｆ抗原を単独で加えるとき、およびＬＡＧ−３ＩｇとＥ７またはＬＡＧ−３Ｉｇとｇａｇ−ｎｅｆの混合物を低レベルで加えるときは得られない。
【００４３】
さらに有利なことに本発明は、感染疾患および／または癌を治療することを目的とする薬剤を製造するための、本発明の結合産物の使用も言及する。感染疾患の例として、ウイルス、細菌および寄生虫感染を述べることが可能である。感染疾患または癌の治療は、ＴＣＤ８＋細胞による細胞応答を含むことが好ましい。
【００４４】
本発明の特定の実施形態によれば、本発明の結合産物を使用して、本発明の第２クラスのクラスＩＩＭＨＣリガンド型タンパク質が、Ｔ細胞を介した抗原特異的な免疫応答を誘導することが可能である、感染疾患および／または癌を治療することを目的とする薬剤を製造する。
【００４５】
本発明の他の利点および特徴は、特に添付の図面と一緒に考えて以下の実施例から明らかになると思われる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４６】
１）発現ベクターの構築
哺乳動物細胞による異なる組換えタンパク質の発現および分泌を可能にするベクターを構築した。
【００４７】
１．１）使用したベクター
１．１．１）クローニング・ベクター
ＣＨＯ−Ｋ１細胞中で組換えタンパク質を発現させるために、２種の発現ベクターを選択した。
【００４８】
ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／抗原融合タンパク質を発現させるために、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＣＤＮＡ３．１（＋）を選択した。これらの組換えタンパク質はＮ末端にｈＬＡＧ−３リーダー配列を含んでおり、これによって培地におけるその分泌を可能にした。
【００４９】
ウイルス抗原／ｈＬＡＧ−３Ｉｇ融合タンパク質を発現させるために、インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのｐＳＥＣ−ｔａｇ２−ｈｙｇｒｏＡおよびｐＳＥＣ−ｔａｇ２−ｈｙｇｒｏＢを選択した。このベクターはプロモーターから上流にＩｇＫリーダー配列を含んでおり、タンパク質の分泌を可能にした。
【００５０】
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ融合タンパク質を発現させるために、ヘノジェン社（Ｈｅｎｏｇｅｎ）からのＤα−ＬＡＧ３−ＤＩＤ４ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１融合体を選択した。このベクターはｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇをコードする配列を含んでおり、その中で「Ｉｇ−ヒンジ−Ｆｃ」領域から上流に位置したイントロンＡは、スプライシングの曖昧さを除外するためにリンカー配列（ＤＤＤＤＫＧＳＧＳＧをコードする、配列番号１７）によって置換されていた。このベクターはｄｈｆｒ遺伝子も含んでおり、プラスミド配列がそれらのゲノムに組み込まれた細胞の選択、およびメトトレキサートの存在下でのこの配列の増幅を可能にした。
【００５１】
１．１．２）ｈＬＡＧ−３Ｉｇの供給源
開始プラスミドの確認および増幅：
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）ＩｇおよびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇを、それぞれｐＣＤＮＡ３−ｈＬＡＧ３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧ１およびｐＣＤＭ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇＧ１ベクターから増幅させた。
【００５２】
ｐＤＮＡ３−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧ１：ｈＬＡＧ−３Ｉｇ挿入体は、ｐＣＤＭ７−ｈＬＡＧ−３ＩｇからのｐＣＤＮＡ３中のＸｂａＩでサブ・クローニングした。
これらのプラスミドは、−８０℃でグリセロール中に保存された形質転換細菌のストック溶液から再増幅させた。異なる制限酵素による消化によって、プラスミドの性質を確認することが可能であった。
【００５３】
ｈＬＡＧ３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧ１およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇＧ１の配列決定：
ｈＬＡＧ３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧ１およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇＧ１の配列は、プロジェクトの開始時に依然として不完全に知られていたことから、ｐＣＤＮＡ３．１＋中でのサブ・クローニング後に、それらの配列を完全に決定した。
【００５４】
このようにして、（全てのイントロンが存在する）ＩｇＧ１中のイントロンの数およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）とＩｇＧ１との間のスプライシング配列に関する、全ての残りの不明確性を解決した。ＩｇＧ１Ａイントロンの位置＋４におけるＴの挿入以外に、ＩｇＧ１のＣＨ３領域中での２個のアミノ酸変化を含めた３個の突然変異も検出した。
【００５５】
これらの結果に基づいて、再構築ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧ１および再構築ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇＧ１と名付けた配列をまとめた。
１．２）ｈＬＡＧ−３ＩｇとＨＰＶ−１６Ｅ７の融合
非発癌性である突然変異形のＥ７を、前述した発現ベクター中のｈＬＡＧ−３Ｉｇ（Ｄ１Ｄ４またはＤ１Ｄ２）のＣまたはＮ末端でクローニングした。ＬＡＧ−３を含まないＥ７およびＩｇＧ１も、対照として融合させた。
【００５６】
１．２．１）Ｅ７の突然変異誘発
ＨＰＶ−１６Ｅ７を二重突然変異させて、Ｅ７の発癌活性を担う細胞タンパク質Ｒｂとの２量体化を防いだ（リーら（Ｌｅｅ  ａｔ  ａｌ）Ｎａｔｕｒｅ  １９９８  ｖｏｌ  ３９１  ｐ８５９；ブルグら（Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２００１  ｖｏｌ  １９  ｐ３６５２；ボウルシュネルら（Ｂｏｕｒｓｎｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ）Ｖａｃｃｉｎｅ  ｖｏｌ．１４ｐ．１４８５を参照）。
【００５７】
野生型のＥ７を含むプラスミドｐＥＦ６−Ｅ７（Ｔ／Ａでクローニング）を得た。
Ｅ７にストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）からのＱｕｉｃｋｃｈａｎｇｅキットを使用して部位特定突然変異誘発を施して、アミノ酸Ｃ２４をＧで置換し、Ｅ２６をＧで置換した。所望の突然変異を含むオリゴヌクレオチドの相補対を用いて、ＰＣＲによりプラスミドｐＥＦ６−Ｅ７を増幅させた。
【００５８】
オリゴ１、Ｅ７突然変異５’：
ＣＴＧＡＴＣＴＣＴＡＣＧＧＴＴＡＴＧＧＧＣＡＡＴＴＡＡＡＴＧＡＣＡＧＣ（配列番号１）
オリゴ２、Ｅ７突然変異３’：
ＧＣＴＧＴＣＡＴＴＴＡＡＴＴＧＣＣＣＡＴＡＡＣＣＧＴＡＧＡＧＡＴＣＡＧ（配列番号２）
ＰＣＲ産物をその後、メチル化部位に対してのみ活性がある酵素Ｄｐｎ１と共にインキュベートし、したがってＰＣＲ産物上の鋳型ＤＮＡを消化した。得られた産物をその後、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細菌に形質転換した。
【００５９】
このようにして得たプラスミドを、Ｅ７ｍｕｔＲｂ−挿入体の消化および配列決定によって確認した。配列決定の結果は、所望の突然変異が実際に存在することを示す。アミノ酸組成に影響を与えない３つの他の突然変異も、図１中に示すＥ７の理論上の配列に関して検出した。
【００６０】
１．２．２）発現ベクター中のｈＬＡＧ−３Ｉｇ−Ｅ７およびＥ７−ｈＬＡＧ−３Ｉｇのクローニング
Ｅ７／Ｒｂ−（本願では以下において、簡潔化のためにＥ７と表す）およびｈＬＡＧ−３Ｉｇ挿入体を、オリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲによって増幅させ、その両端に制限部位を加えることが可能であった。
【００６１】
ストラタジーン社（Ｓｔｒａｔａｇｅｎ）からの高い信頼性がある酵素Ｐｆｕ  ｔｕｒｂｏを、ＰＣＲ手順用に使用した。
クローニング戦略は図２中に要約する。
【００６２】
ｐＣＤＮＡ３．１へのｈＬＡＧ−３Ｉｇ−Ｅ７のクローニング：
以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、ｐＥＦ６＿Ｅ７／ｒｂ−からＥ７を増幅させた。
【００６３】
オリゴ９（Ｅ７５’−Ｘｈｏ１）：
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ（配列番号３）
Ｅ７のＸｈｏ１部位およびＡＴＧを含む。
【００６４】
オリゴ１０（Ｅ７３’−停止Ｘｂａ１）：
ＧＣＴＣＴＡＧＡＴＴＡＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＣＡＧ（配列番号４）
停止コドンおよびＸｂａＩ部位を有するＥ７の３’領域を含む。
【００６５】
精製前に、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩでＰＣＲ産物を消化した。
ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇＧ１およびＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧ１は、以下のオリゴヌクレオチド対を使用して、それぞれｐＣＤＭ７−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇＧ１およびｐＣＤＮ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧ１から増幅させた。
【００６６】
オリゴ７（Ｌａｇ３５’−ａｔｇＥｃｏＲＩ）：
ＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＣＡＧＡＣＣＡＴＡＧＧＡＧＡＧＡＴＧ（配列番号５）
ＥｃｏＲＩ部位、ｈＬＡＧ−３のＡＴＧ、および分泌シグナル・ペプチドを含む、
オリゴ８（ＩｇＧ１３’−ＸｈｏＩ）：
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧ（配列番号６）
停止コドンを含まないＩｇＧ１の３’領域を含む。
【００６７】
精製前に、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩでＰＣＲ産物を消化した。
ｐＣＤＮＡ３．１＋へのｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７の挿入を２工程で行った。最初に、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇを、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＣＤＮＡ３．１＋に連結させた。クローニング中間体ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇはこのようにして得た。その後、Ｅ７を、ＸｈｏＩおよびＸｂａＩで事前に消化したｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇに挿入した。
【００６８】
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７融合産物をｐＣＤＮＡ３．１＋にクローニングするために、２つの挿入体を最初に１つに連結させた。このようにして得たｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７断片をゲル上で精製し、ＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩで事前に消化したｐＣＤＮＡ３．１＋にその後直接挿入した。
【００６９】
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇプラスミドも、ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩで消化したｐＣＤＮＡ３．１＋にｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇを連結させることによって調製した。
【００７０】
これらの発現ベクターの挿入体を配列決定した。配列決定の結果によって、読み枠と一致した挿入体の正しい挿入を確認する。
ｐＳＥＣｔａｇ−ｈｙｇｒｏＡへのＥ７−ｈＬＡＧ−３Ｉｇのクローニング：
以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、ｐＥＦ６−Ｅ７／Ｒｂ−からＥ７を増幅させた。
【００７１】
オリゴ３（Ｅ７５’−ＡｓｃＩ）：
ＧＧＣＧＣＧＣＣＡＴＧＣＡＴＧＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣ（配列番号７）
Ｅ７のＡｓｃＩ部位およびＡＴＧを含む、
オリゴ１５（Ｅ７３’−Ｋｐｎ１）：
ＧＧＧＧＴＡＣＣＴＧＧＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＡＴＧ（配列番号８）
停止コドンを含まないＥ７の３’領域およびＫｐｎＩ部位を含む。
【００７２】
精製前に、ＡｓｃＩおよびＫｐｎＩでＰＣＲ産物を消化した。
ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇＧ１およびＬＡＧ３（Ｄ１Ｄ４）−Ｉｇを、以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、それぞれｐＣＤＭ７−ＬＡＧ−（Ｄ１Ｄ２）−ＩｇＧ１およびｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧ１から増幅させた。
【００７３】
オリゴ１６（Ｌａｇ３５’（−Ｄ１ＫｐｎＩ）：
ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧ（配列番号９）
シグナル・ペプチドを含まないドメイン１のＫｐｎＩ部位および５’領域を含む、
オリゴ１７（ＩｇＧＩ３’−停止Ｘｈｏｌ）：
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧ（配列番号１０）
停止コドンおよびＸｈｏＩ部位を有するＩｇＧ１の３’領域を含む。
【００７４】
精製前に、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩでＰＣＲ産物を消化した。
以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、（Ｅ７の３’端にｐＳＥＣにクローニングするため、Ｌａｇ３を含まない対照として使用するため）ｐＣＤＮＡ−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧ１からＩｇＧＩを増幅させた。
【００７５】
オリゴ１８（ＩｇＧ１５’Ｋｐｎ１）：
ＧＧＧＧＴＡＣＣＣＧＡＧＧＧＴＧＡＧＹＡＣＴＡＡＧＣ（配列番号１１）
ＩｇＧ１のＡイントロンのＫｐｎＩ部位および５’領域を含む、
オリゴ１９（ＩｇＧＩ３’−ｓｔｏｐＸｈｏＩ）：
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧ（配列番号１２）
停止コドンおよびＸｈｏＩ部位を有するＩｇＧＩの３’領域を含む。
【００７６】
精製前に、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩでＰＣＲ産物を消化した。
ｐＳＥＣｔａｇ−ｈｙｇｒｏＡへのＥ７−ｈＬＡＧ−３Ｉｇ融合産物の挿入を２工程で行った。
【００７７】
Ｅ７の消化ＰＣＲ産物を、ＡｓｃＩおよびＫｐｎＩで事前に消化したｐＳＥＣＥに連結させた。ｐＳＥＣ−Ｅ７と表すクローニング中間体は、このようにして得た。
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇおよびＩｇＧＩのＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＸｈｏＩで事前に消化したｐＳＥＣ−Ｅ７にその後連結させた。
【００７８】
これらの発現ベクターを制限酵素によって確認した。
Ｄα−ＬＡＧ３−Ｄ１Ｄ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１融合体へのＥ７のクローニング：
指定ベクターは、ヘノジェン社（Ｈｅｎｏｇｅｎ）からのベクター、Ｄα−ＬＡＧ３−ＤＩＤ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１融合体である。このベクター中では、ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇのコード配列が２つのＸｈｏＩ制限部位の間に挿入されている。前述のように、このベクターはＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇのコード配列を含み、その中でイントロンＡ（Ｉｇヒンジ領域由来の位置５’のイントロン）は、リンカー配列（ＤＤＤＤＫＧＳＧＳＧをコードする、配列番号１７）によって置換されていた。イントロンＡを含まないＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇのこのコード配列をＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／と表し、さらに同じ表記がこれらの構築体によってコードされるタンパク質に関して保たれると思われる。
【００７９】
Ｅ７をコードする断片は、プラスミドｐｃＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−Ｅ７に由来する。
Ｄα−ＬＡＧ３−Ｄ１Ｄ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１融合体へのＥ７のクローニングを２工程で行った。
【００８０】
第１工程では、ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−Ｉｇ／断片をｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７に挿入した。
Ｄα−ＬＡＧ３−Ｄ１Ｄ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１ベクターをＸｈｏＩによって切断し、その粘着末端を酵素Ｔ４ポリメラーゼによって平滑状態にした。ＸｈｏＩ平滑末端／ＸｈｏＩ平滑末端挿入体を含まないＤαベクターに対応する断片を、最終指定ベクターと同様に保った。ＸｈｏＩ平滑末端／ＸｈｏＩ平滑末端挿入体を、Ｉｇをコードする配列のＣイントロンのレベルで酵素ＢｓｒＧＩを用いて消化し、停止コドンを含むＩｇをコードする配列の最後の３００塩基対を除去した（ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ＸｈｏＩ平滑末端／ＢｓｒＧＩ挿入体）。
【００８１】
ｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７ベクターを酵素ＥｃｏＲＩで消化し（クローニング部位由来のｐＣＤＮＡ３上流のマルチ・クローニングサイト中に含まれるＥｃｏＲＩ部位）、その粘着末端を、Ｔ４ポリメラーゼを使用して平滑状態にした。このようにして線状にしたプラスミドを、酵素ＢｓｒＧＩを用いて切断し、ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）をコードする配列およびＩｇをコードする５’配列を除去して、Ｉｇをコードする最後の３００塩基対を保持した（ＥｃｏＲＩ平滑末端／ＢｓｒＧＩＩｇ−Ｅ７ｐｃＤＮＡ）。
【００８２】
ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ＸｈｏＩ平滑末端／ＢｓｒＧＩ挿入体を、ＥｃｏＲＩ平滑末端／ＢｓｒＧＩＩｇ−Ｅ７ｐＣＤＮＡ３に連結させた。
得られたクローンの制限分析の後、ｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７を含むクローンを選択した。
【００８３】
第２工程では、ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７構築体をＤαにクローニングした。
ｐＣＤＮＡ３中に含まれたＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７挿入体を酵素ＰｍｅＩによって切断し（ｐＣＮＤＡ３、平滑末端のマルチ・クローニングサイト周囲の２ＰｍｅＩ部位）、事前にＸｈｏＩ平滑末端／ＸｈｏＩ平滑末端を切断することによって調製して脱リン酸化させた挿入体を含まないＤαに連結させた。
【００８４】
Ｄα中で正しいセンス方向にＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７挿入体を含むクローンを制限分析によって選択した。
Ｄα−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７クローンの１つのＤＮＡをＤＨ５α系統に再度形質転換し、ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｅｎｄｏｆｒｅｅ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））によって調製し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞への一過性のトランスフェクションに使用して、プラスミドの翻訳産物を確認した。元のＤα−ＬＡＧ３−Ｄ１Ｄ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１融合体およびｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇベクターを陽性対照として使用し、ＸｈｏＩ、次に連結によってそこから挿入体を除去したＤα−ベクターを陰性対照として使用した。トランスフェクション後２４時間で、特異的ＥＬＩＳＡによって上清中のＬＡＧ−３を定量した。平行して、上清および細胞溶解物中に存在する組換えタンパク質をＡ−セファロース・タンパク質（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））により沈殿させ、抗ＬＡＧ３ウエスタン・ブロットにより分析して、それらの大きさを評価した。見かけの分子量は予想された分子量であった。
【００８５】
Ｄα−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７クローンのＤＮＡは、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞への安定したトランスフェクションに使用されるＤＮＡである。
１．３）ｈＬＡＧ−３ＩｇとＨＩＶ−１ｇａｇ−ｎｅｆとの間の融合
このＨＩＶ−１抗原を、Ｃ末端またはＮ末端のいずれかにおいてｈＬＡＧ−３Ｉｇ（Ｄ１Ｄ４またはＤ１Ｄ２）と結合させ、前述した発現ベクターにクローニングした。この抗原とＬＡＧ−３を含まないＩｇＧ１とも、対照として融合させた（図４）。
【００８６】
このワクチン組換えタンパク質を調製するために選択したＨＩＶ−１抗原は、ｇａｇｐ１７、ｇａｇｐ２４およびｎｅｆの一部分の最適融合産物である。
１．３．１）使用したＧａｇ−ｎｅｆ配列
ｇａｇｐ１７、ｇａｇｐ２４およびｎｅｆキメラ・タンパク質の配列を、ヨーロッパの患者（Ｂ系統）において検出される多大な可能性を有すると定義した。
【００８７】
これを行うために我々は、ウエブ・サイトｈｔｔｐ：／／ｈｉｖ−ｗｅｂ．ｌａｎｌ．ｇｏｖ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｈｉｖ−ｄｂ／ＣＯＮＳＥＮＳＵＳ／Ｍ  ＧＲＯＵＰ  ２００２−Ａｕｇ．ｈｔｍｌで得たペプチド配列をそれぞれのタンパク質に関して比較した。
【００８８】
以下の配列のアラインメントを図３中に示す。
Ｂ系統の祖先配列（進化系統樹に基づいて実施した、現在のＢ群のウイルスが由来する理論上の配列）。
【００８９】
Ｂ系統のコンセンサス配列（現在のＢ群の配列の全ての間で一致した配列、それらの表示は考慮しない）。
ＬＡＩ系統の配列（ヨーロッパで最初の単離体）。
【００９０】
それぞれのタンパク質ｐ２４、ｐ１７およびｎｅｆに関して選択した配列は、アミノ酸がＬＡＩおよびコンセンサス配列で異なるとき、これらの２つの配列がこのアミノ酸に関して同一であるとき以外、祖先配列に対応する。この場合、我々は、現在の群中に祖先配列以外のコンセンサスおよびＬＡＩ配列を発見する良い機会が存在すると考える（図３）。これらの３つのペプチド配列を、その後末端毎に配置させた。ｎｅｆの最初の６０個のアミノ酸を検出した。何故なら、それらは患者中で検出された如何なる主要なＴエピトープも含まず、ｎｅｆの細胞変性効果を担うわけではないからである。
【００９１】
ｇａｇ−ｎｅｆキメラに関してこのようにして得たペプチド配列に対応するＤＮＡ配列を、エーティージーバイオシンセシス社（ＡＴＧ−Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）によるハムスター細胞（ＣＨＯ−Ｋ１細胞）中での発現用に最適化した。ｇａｇｎｅｆの５’および３’端に制限部位を加えて、サブ・クローニングを可能にした。この遺伝子はその後エーティージーバイオシンセシス社（ＡＴＧ−Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）によって合成され、ｐＣＲ４ｔｏｐｏベクター中に供給された。
【００９２】
１．３．２）発現ベクター中へのｈＬＡＧ−３Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆおよびｇａｇｎｅｆ−ｈＬＡＧ−３Ｉｇのクローニング
クローニング戦略を図４中に要約する。
【００９３】
ｐＣＤＮＡ３．１へのｈＬＡＧ−３Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆのクローニング：
ｐＣＲ４ｔｏｐｏ−ｇａｇｎｅｆからＸｈｏＩとＸｂａＩとの間のｐＣＤＮＡ３．１−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）ＩｇおよびｐＣＤＮＡ３．１−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇベクターにＧａｇ−ｎｅｆをサブ・クローニングした。
【００９４】
ｐＣＤＮＡ３．１−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆおよびｐＣＤＮＡ３．１−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆ発現ベクターを、酵素による消化によって確認した。
【００９５】
ｐＳＥＣｔａｇ−ｈｙｇｒｏＢへのｇａｇｎｅｆ−ｈＬＡＧ−３Ｉｇのクローニング：
このクローニングを３工程で行った。
＊第１工程：ｐＣＲ４ｔｏｐｏ−ｇａｇｎｅｆからＨｉｎｄ３とＮｏｔ１との間のｐＳＥＣｔａｇ−ｈｙｇｒｏＢへのｇａｇ−ｎｅｆのサブ・クローニング。ｐＳＥＣ−ｇａｇｎｅｆクローニング中間体をこのようにして得た。
【００９６】
＊第２工程：ＸｈｏＩにおけるｐＳＥＣｔａｇｈｙｇｒｏＢへのｈＬＡＧ−３Ｉｇ（Ｄ１Ｄ４およびＤ１Ｄ２）のクローニング。この工程は、多量のＸｈｏＩ消化型挿入体を得るためのクローニング中間体を与える。実際、ＰＣＲ産物がＸｈｏＩによって直接消化された場合、多数の未消化断片はその後平滑末端がクローニングされ、除去することは不可能であるが配列決定によって可能である偽陽性がもたらされたと思われる。
【００９７】
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇおよびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）−Ｉｇを、以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、それぞれｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧＩおよびｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）−ＩｇＧＩからＰＣＲによって増幅させた。
【００９８】
オリゴ５（Ｌａｇ３５’−Ｄ１ＸｈｏＩ）：
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＧＣＣＡＧＧＧＧＣＴＧＡＧ（配列番号１３）
シグナル・ペプチドを含まないドメイン１のＸｈｏＩ部位および５’領域を含む。
【００９９】
オリゴ１７（ＩｇＧＩ３’−停止ＸｈｏＩ）：
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧ（配列番号１４）
停止コドンおよびＸｂａＩ部位を有するＩｇＧＩの３’領域を含む。
【０１００】
以下のオリゴヌクレオチド対を用いて、ｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−ＩｇＧ１からＩｇＧＩをＰＣＲによって増幅させた。
オリゴ１１（ＩｇＧ１５’ＸｈｏＩ）：
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＣＧＡＧＧＧＴＧＡＧＴＡＣＴＡＡＧＣ（配列番号１５）
ＩｇＧＩのＡイントロンのＸｈｏＩ部位および５’領域を含む。
【０１０１】
オリゴ１７（ＩｇＧ１３’−停止ＸｈｏＩ）：
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＴＴＴＡＣＣＣＧＧＧＧＡＣＡＧ（配列番号１６）
停止コドンおよびＸｂａＩ部位を有するＩｇＧＩの３’領域を含む。
【０１０２】
精製前にＸｈｏＩによってＰＣＲ産物を消化した。これらのＰＣＲ産物を、ＸｈｏＩによって事前に消化されたｐＳＥＣｔａｇ−ｈｙｇｒｏＢにその後連結させた。
＊第３工程：ｐＳＥＣ−ｇａｇｎｅｆへのｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）ＩｇおよびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｆのクローニング。
【０１０３】
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇおよびＩｇＧＩ挿入体を、ＸｈｏＩを用いた消化によってｐＳＥＣｔａｇ−ｈｙｂｒｏＢから除去し、５’粘着末端を、ＰＮＫを用いて平滑状態にした。ｐＳＥＣ−ｇａｇｎｅｆベクターを、ＮｏｔＩを用いて消化し、粘着末端もＰＮＫを用いて平滑状態にした。挿入体と精製ベクターとを連結させた。
【０１０４】
これらの発現ベクターの挿入体間のリンカー配列を配列決定して、読み枠の完全性を確認した。
Ｄα−ＬＡＧ３−Ｄ１Ｄ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１融合体へのｇａｇｎｅｆのクローニング：
指定ベクターは、ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ、Ｄα−ＬＡＧ３−Ｄ１Ｄ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１融合体を生成するためにヘノジェン社（Ｈｅｎｏｇｅｎ）によって使用されているベクターである。
【０１０５】
ｇａｇｎｅｆコード断片は、ｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆに由来する。
Ｄα−ＬＡＧ３−Ｄ１Ｄ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１融合体へのｇａｇｎｅｆのクローニングを２工程で行った。
【０１０６】
第１工程では、ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／断片をｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆに挿入した。
Ｄα−ＬＡＧ３−Ｄ１Ｄ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１ベクターをＸｈｏＩによって切断し、その粘着末端は酵素Ｔ４ポリメラーゼによって平滑状態にした。ＸｈｏＩ平滑末端／ＸｈｏＩ平滑末端挿入体を含まないＤαベクターに対応する断片を、最終指定ベクターと同様に保った。ＸｈｏＩ平滑末端／ＸｈｏＩ平滑末端挿入体を、ＢｓｒＧＩを用いて消化して、Ｉｇのコード配列のＣイントロンを切断し、停止コドンを含むＩｇコードする配列の最後の３００塩基対を除去した（ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ＸｈｏＩ平滑末端／ＢｓｒＧＩ挿入体）。
【０１０７】
ｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆベクターをＥｃｏＲＩで消化し（クローニング部位から上流のｐＣＤＮＡ３のマルチ・クローニングサイト中に含まれるＥｃｏＲＩ部位）、その粘着末端を、Ｔ４ポリメラーゼを用いて平滑状態にした。このようにして線状にしたプラスミドを、ＢｓｒＧＩを用いて切断し、ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）をコードする配列およびＩｇをコードする５’配列を除去してＩｇをコードする配列の最後の３００塩基対を保持した（ｐＣＤＮＡＥｃｏＲＩ平滑末端／ＢｓｒＧＩＩｇ−ｇａｇｎｅｆ）。ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ＸｈｏＩ平滑末端／ＢｓｒＧＩ断片をｐｃＤＮＡ３ＥｃｏＲＩ平滑末端／ＢｓｒＧＩＩｇ−ｇａｇｎｅｆに連結させた。
【０１０８】
得られたクローンを制限分析した後に、ｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆを含むクローンを選択した。
第２工程では、ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆをＤαにクローニングした。
【０１０９】
ｐＣＤＮＡ３中に含まれていたＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ挿入体全体を、ＰｍｅＩを用いた消化によって除去し（ｐＣＮＤＡ３、平滑末端のマルチ・クローニングサイト周囲の２つの部位）、事前に切断することによって調製され脱リン酸化されたＸｈｏＩ平滑末端／ＸｈｏＩ平滑末端挿入体を含まないＤαにクローニングした。
【０１１０】
Ｄα中で正しい方向にＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ挿入体を含むクローンを制限分析によって選択した。
Ｄα−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆクローンの１つのＤＮＡをＤＨ５α系統に再度形質転換し、ｍａｘｉｐｒｅｐ  Ｅｎｄｏｆｒｅｅ（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ））を使用して調製し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞への一過性のトランスフェクションに使用してプラスミドの翻訳産物を調べた。元のＤα−ＬＡＧ３−Ｄ１Ｄ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１融合体およびｐＣＤＮＡ３−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇベクターを陽性対照として使用し、ＸｈｏＩ次に再連結を使用してその挿入体を除去したＤα−ベクターを陰性対照として使用した。トランスフェクション後２４時間で、特異的ＥＬＩＳＡを使用してＬＡＧ−３の上清を分析した。平行して、上清および細胞溶解物中に存在する組換えタンパク質をＡ−セファロース・タンパク質（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））により沈殿させ、抗ＬＡＧ３ウエスタン・ブロットを用いて分析して、それらの大きさを評価した。見かけの分子量は予想された分子量であった。
【０１１１】
選択したＤα−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆクローンのＤＮＡは、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞の安定したトランスフェクションに使用されるＤＮＡである。
２）融合タンパク質を発現する安定したＣＨＯ細胞系の樹立
２．１）ｐＣＤＮＡ３およびｐＳＥＣベクター由来の融合タンパク質を発現する安定した系の樹立。
【０１１２】
ｐＣＤＮＡ３またはｐＳＥＣにおいて前に構築した発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトして、当該の組換えタンパク質を発現する安定した生成系を得た。
２．１．１）クローンのトランスフェクション法および単離
２．１．１．１）プラスミド消化
当該のタンパク質を発現する安定したトランスフェクタントを得る機会を最大にするために、トランスフェクション前に発現ベクターを線状にした。選択した制限酵素は、位置１でｐＣＤＮＡおよびｐＳＥＣベクターを消化するが、挿入体ｈＬＡＧ−３Ｉｇ、ｇａｇｎｅｆまたはＥ７のいずれも消化しないＢｇ１２であった。消化は１０μｇのベクターおよび３０Ｕの酵素を用いて行い、ＤＮＡをその後沈殿させ、２０μＬのＨ２Ｏ  ＵＰ中に採取した。
【０１１３】
しかしながら、比較試験は、この線状化工程は重要ではないことを示した、何故なら、得られた陽性の安定したトランスフェクタントの数は、それが線状であろうとなかろうとほとんど異ならないからである。
【０１１４】
２．１．１．２）トランスフェクション
８〜１４の幾つかの工程を有するトランスフェクションを、いずれもＣＨＯ−Ｋ１細胞（ＥＣＣＡＣ  Ｒｅｆ．Ｎｏ．８５０８１００５）において個別に３〜４回で行った。
【０１１５】
簡潔に言えば、セミコンフルエントのＣＨＯ−Ｋ１細胞を、５μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（ギブコ社（ＧＩＢＣＯ））を使用して、２μｇのプラスミドと共に６ウエル・プレートにトランスフェクトした。
【０１１６】
２．１．１．３）耐性クローンの選択
トランスフェクションの２４時間後、選択用抗生物質を含む培地の存在下において、細胞をトリプシンで溶解させ、１５０ｍｍの丸皿に接種した。選択用抗生物質はｐＣＤＮＡベクター用に０．５ｍｇ／ｍＬのＧ４１８、およびｐＳＥＣベクター用に０．４ｍｇ／ｍＬのヒグロマイシンＢである。単離した細胞クローンが出現するまで（１〜２週間）、培地を２〜３日毎に交換した。
【０１１７】
抗生物質に耐性があり、したがってプラスミドが組み込まれている細胞クローンを、Ｐ２００ピペットを用いて顕微鏡下において手作業で採取し、９６ウエル・プレートに移した。それぞれのクローンは当該のタンパク質の発現に関してその後試験し、陽性クローンを後に増幅させた。
【０１１８】
２．１．１．４）クローンの指定
クローンが生成したトランスフェクションの日付およびクローンが含むプラスミドの確認を可能にするコードに従い、クローンに名称をつけた。
【０１１９】
最初の２つの数字はトランスフェクションの日および月に対応し、次に文字はトランスフェクトしたプラスミド、次にクローンの数に対応する。例えば、ｐＣＤＮＡプラスミドを有する１月７日のトランスフェクションから得たクローンは、０７＿０１＿Ａｘと名付けられる（ｘはクローンの数である）。
【０１２０】
以下の命名に従い、それぞれのプラスミドに文字を割り当てた。
Ａ：ｐＣＤＮＡ
Ｂ：ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ
Ｃ：ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ
Ｄ：ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７
Ｅ：ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−Ｅ７
Ｆ：ｐＳＥＣ
Ｇ：ｐＳＥＣ−Ｅ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ
Ｈ：ｐＳＥＣ−Ｅ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ
Ｉ：ｐＳＥＣ−Ｅ７−ＩｇＧ１
Ｊ：ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆ
Ｋ：ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆ
Ｌ：ｐＳＥＣ−ｇａｇｎｅｆ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ
Ｍ：ｐＳＥＣ−ｇａｇｎｅｆ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ
Ｎ：ｐＳＥＣ−ｇａｇｎｅｆ−ＩｇＧ１
２．１．２）最大ｈＬＡＧ−３Ｉｇ−Ｅ７組換えタンパク質生成クローンの選択
トランスフェクトした最初の一連のプラスミドは、Ｅ７を含まない陽性対照としてのｐＣＤＮＡ−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）ＩｇおよびｐＣＤＮＡ−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇに加えて、ｐＣＤＮＡ−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−Ｉｇ−Ｅ７、ｐＣＤＮＡ−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−Ｅ７であった。
【０１２１】
２．１．２．１）一過性トランスフェクション効率の分析
細胞のトランスフェクション効率を、トランスフェクション後２４時間での抗ＬＡＧ３抗体（１７Ｂ４）を用いた細胞内標識の後に、ＦＡＣＳによって最初に評価した。一過性トランスフェクション効率は、プラスミドｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ、ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇおよびｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇＥ７（陽性細胞の４０％および５０％の間）に関しては良かったが、ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）−Ｉｇ−Ｅ７に関してはそれより低かったことが示された。
【０１２２】
２．１．２．２）安定してトランスフェクトしたクローンの試験
この一連のトランスフェクションを４回繰り返した（２００３年１月７日、２００３年１月１４日、２００３年１月２１日および２００３年３月２７日）。
【０１２３】
非希釈または適切に２回希釈した抗ＬＡＧ−３を用いて、それぞれのトランスフェクトした細胞クローンの上清をＥＬＩＳＡによって試験した。
それぞれのトランスフェクション系の最良クローンを増幅させ、クローン当たり２つのアンプルを凍結させた。これらのクローンの上清をその後ＥＬＩＳＡによって比較して、最大生成クローンのみを保存した。
【０１２４】
クローンを凍結させ、その後互いに比較した。
ｐＣＤＮＡに対しては：７−１−Ａ１、１４−１−Ａ２、２１−１−Ａ２
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇに対しては：７−１−Ｂ１、７−１−Ｂ３、７−１−Ｂ４、１４−１−Ｂ８、１４−１−Ｂ１４、２１−１−Ｂ１１、２７−６−Ｂ６
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇに対しては：７−１−Ｃ１、７−１−Ｃ２、１４−１−Ｃ１２、１４−１−Ｃ１６、２１−１−Ｃ８、２７−５−Ｃ５
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７に対しては：７−１−Ｄ３、１４−１−Ｄ４、１４−１−Ｄ８、２１−１−Ｄ１、２７−５−Ｄ３
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−Ｅ７に対しては：７−１−Ｅ１、７−１−Ｅ３、７−１−Ｅ５、１４−１−Ｅ９、１４−１−Ｅ１１、２１−１−Ｅ６、２７−５−Ｅ８。
【０１２５】
最良クローンを、それらの上清のウエスタン・ブロット分析によっても比較した。複合試験によって、増幅されて組換えタンパク質の生成細胞として働くと思われる、クローンの各トランスフェクトしたプラスミドを選択することが可能であった。
【０１２６】
組換えタンパク質生成系として選択したクローンは以下のものであった。
ｐＣＤＮＡに対しては：７−１−Ａ１
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇに対しては：７−１−Ｂ４
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇに対しては：２１−１−Ｃ８
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７に対しては：７−１−Ｄ３
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−Ｅ７に対しては：１４−１−Ｅ１１
予想通り、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７はｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇより若干高い位置で移動する（図５）。観察された２本のバンドはｈＬＡＧ−３１ｇの単量体形および２量体形に対応し、β−メルカプトエタノールの存在下での加熱による還元は充分に有効ではなかった。
【０１２７】
２．１．２．３）生成細胞塊の凍結
限られた数の実施後に凍結された２つのストックのアンプルの１つを解凍させ、１７５ｃｍ２フラスコ中でコンフルエントに達するまで再増幅させ、そこから２００３年３月３日に「マスター細胞塊」として５つのアンプルを凍結させた。したがって、クローンの単離以降の実施数は、系に従い５と７の間である。
【０１２８】
２００３年３月５日に、「作業用細胞塊」として、１７５ｃｍ２フラスコから５つの他のアンプルをその後凍結させた。
２．１．３）最大Ｅ７−ｈＬＡＧ−３１ｇ組換えタンパク質生成クローンの選択
２．１．３．１）一過性トランスフェクション効率の分析
細胞のトランスフェクション効率を、トランスフェクション後２４時間でのＦＩＴＣと結合した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた細胞内標識の後に、ＦＡＣＳによって最初に評価した。一過性トランスフェクションの効率は、ｐＳＥＣ−Ｅ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇまたはｐＳＥＣ−Ｅ７−ＩｇＧ１に関してよりもｐＳＥＣ−Ｅ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇに関して高い。ＤＮＡの調製物の質は良いが（シグマ社（ＳＩＧＭＡ）ｇｅｎｅｌｕｔｅキットをｍｉｄｉｐｒｅｐキアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ）キットに置き換えた）、ｐＳＥＣプラスミドの一過性トランスフェクションの効率は、ｐＣＤＮＡプラスミドに関して得られる効率未満である（１０％未満対５０％）。
【０１２９】
２．１．３．２）安定してトランスフェクトしたクローンの試験
この一連のトランスフェクションを４回繰り返した（２００３年４月２３日、２００３年５月７日、２００３年６月１９日および２００３年６月２７日）。
【０１３０】
ｐＳＥＣ−Ｅ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）ＩｇおよびｐＳＥＣ−Ｅ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇを用いてトランスフェクトした全細胞クローンの上清を、ＬＡＧ−３を用いたＥＬＩＳＡによって非希釈状態で試験した。Ｅ７−ＬＡＧ３を発現する細胞の上清のＯＤは、ＬＡＧ３−Ｅ７を発現する細胞のＯＤよりはるかに低かった。
【０１３１】
ＬＡＧ３を含まない融合産物を発現するｐＳＥＣ−Ｅ７−ＩｇＧ１を用いてトランスフェクトした細胞クローンを、ＥＬＩＳＡによって分析することは明らかに可能ではない。これらをいずれも、ＦＩＴＣと結合したヒト抗ＩｇＧ抗体を用いた細胞内標識の後にＦＡＣＳによって試験した。
【０１３２】
それぞれのトランスフェクション系の最良クローンを増幅させ、クローン当たり２つのアンプルを凍結させた。以下の凍結させたクローンを互いに比較した。
ｐＳＥＣに対しては：２３−０４−Ｆ４、０７−０５−Ｆ１
ｐＳＥＣ−Ｅ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇに対しては：２３−０４−Ｇ３、０７−０５−Ｇ２７、０７−０５−Ｇ３２、１９−０６−Ｇ８、１９−０６−Ｇ４０
ｐＳＥＣ−Ｅ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇに対しては：２３−０４−Ｈ１０、０７−０５−Ｈ１１
ｐＳＥＣ−Ｅ７−ＩｇＧ１に対しては：２３−０４−Ｉ１２、０７−０５−Ｉ１３、１９−０６−Ｉ４、１９−０６Ｉ１９。
【０１３３】
これらのクローンの上清を、その後ＥＬＩＳＡによって、あるいは細胞内標識によって互いに比較して、最大生成系のみを保存した。組換えタンパク質生成系として選択したクローンは以下のものであった。
ｐＳＥＣに対しては：０７−０５−Ｆ１、
ｐＳＥＣ−Ｅ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇに対しては：１９−０６−Ｇ８
ｐＳＥＣ−Ｅ７−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇに関しては：クローンを増幅させなかった。何故なら、その上清のＯＤは、Ｅ７−Ｄ１Ｄ４クローンと比較して低かったからである。それにもかかわらず、０７−０５−Ｈ１１の２つのアンプルを液体窒素中に保った、
ｐＳＥＣ−Ｅ７−ＩｇＧ１に対しては：０７−０５−Ｉ１３。
【０１３４】
２．１．３．３）生成細胞塊の凍結
２００３年５月１７日に、１７５ｃｍ２フラスコ由来の１９−０６−Ｇ８および０７−０５−Ｉ１３系の５つのアンプルを、「マスター細胞塊」としてコンフルエントで凍結させた。クローンの単離以降の実施数は、この場合考慮する系に従い５と８の間であった。
【０１３５】
２００３年７月２１日に「作業用細胞塊」として１７５ｃｍ２フラスコから、５つの他のアンプルをその後凍結させた。
２．１．４）最大ｈＬＡＧ−３Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆ組換えタンパク質生成クローンの選択
２．１．４．１）一過性トランスフェクション効率の分析
トランスフェクション効率を、一過的にトランスフェクトした細胞におけるＦＩＴＣと結合した抗ヒトＩｇＧ抗体を用いた細胞内標識の後にＦＡＣＳによって評価した。一過性トランスフェクション効率は約１０％である。
【０１３６】
２．１．４．２）安定してトランスフェクトしたクローンの試験
この一連のトランスフェクションを３回繰り返した（２００３年５月７日、２００３年６月１９日および２００３年６月２７日）。
【０１３７】
それぞれのトランスフェクトした細胞クローンの上清を、抗ＬＡＧ−３を用いてＥＬＩＳＡによって非希釈状態で試験した。
それぞれのトランスフェクション系の最良クローンを増幅させ、クローン当たり２つのアンプルを凍結させた。以下の凍結クローンをその後互いに比較した。
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆに対しては：０７−０５−Ｊ２、０７−０５−Ｊ２３、０７−０５−Ｊ５３、０７−０５−Ｊ７１、１９−０６−Ｊ１８、１９−０６−Ｊ３２、１９−０６−Ｊ４８
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆに対しては：０７−０５−Ｋ１９、０７−０５−Ｋ７１、１９−０６−Ｋ３３、１９−０６−Ｋ４３、１９−０６−Ｋ４４、１７−０６−Ｋ７
これらのクローンを、それらの上清のＥＬＩＳＡによって、あるいは細胞内標識によってその後互いに比較して、最大生成系のみを保存した。組換えタンパク質生成系として選択したクローンは以下のものであった。
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆに対しては：０７−０５−Ｊ５３
ｐＣＤＮＡ−ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆに対しては：０７−０５−Ｋ１９および２７−０６−Ｋ７。
【０１３８】
２．１．４．３）生成細胞塊の凍結
２００３年５月１７日に、「マスター細胞塊」としての１８５ｃｍ２フラスコ由来の２７−０６−Ｋ７の３つのアンプル以外に、１７５ｃｍ２フラスコ由来の０７−０５−Ｊ５３および０７−０５−Ｋ１９系の５つのアンプルを凍結させた。クローンの単離以降の実施数は、考慮する系に従い４と８の間であった。
【０１３９】
２００３年７月２１日に「作業用細胞塊」として、５つまたは３つの他のアンプルを同様に凍結させた。
２．２）Ｄαベクター由来の融合タンパク質を発現する安定した系の樹立。
【０１４０】
構築したＤα−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７およびＤα−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ発現ベクターを、ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞にトランスフェクトして、当該の組換えタンパク質を発現する安定した生成系を得た。
【０１４１】
２．２．１）クローンのトランスフェクション法および単離
２．２．１．１）トランスフェクション
Ｄαベクターにおける構築体のトランスフェクション用に使用したＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞（ＤＳＭＺ  ＡＣＣ１２６）を、リボヌクレオシドおよびデオキシリボヌクレオシドの存在下でインキュベートした（培地ＭＥＭα  ＲＮ／ＲｄＮ＋、ギブコ社（ＧＩＢＣＯ）２２５７１−０２０）。ＣＨＯ−ｄｈｆｒ−細胞を前日に２５ｃｍ２フラスコに接種し、２．５μＬのｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して１μｇのＤα−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７またはＤα−ＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆプラスミドを用いて、２００４年７月２５日にトランスフェクトした。元のＤα−ＬＡＧ−３−Ｄ１Ｄ４−ΔＥＫ−ｈＩｇＧ１融合体およびｐＥＧＦＰ（クローンテク社（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）ベクターのトランスフェクション体を、それぞれ陽性および陰性対照として使用した。トランスフェクションの６時間後、トランスフェクション培地をＭＥＭαＲＮ／ＲｄＮ＋培地と交換した。
【０１４２】
２．２．１．２）耐性細胞の選択
トランスフェクションの２日後、細胞をトリプシンで溶解させ、ＭＥＭαＲＮ／ＲｄＮ−選択培地（ギブコ社（ＧＩＢＣＯ）２２５６１−０２１）中に５０００細胞／ウエルで、４枚の９６ウエル・プレートにそれぞれのトランスフェクション用に接種した。約１週間後、それぞれ細胞のプールを表すそれぞれのウエルの上清を、抗ＬＡＧ−３を用いてＥＬＩＳＡにより分析した。最も生産的なプールを凍結用に増幅させ、メトトレキサートの存在下において培養物中に保ち、プラスミド由来配列（およびしたがって当該のタンパク質をコードする遺伝子）の増幅を可能にした。
【０１４３】
プールおよびクローンを選択し増大させるための全工程を、非エンドトキシンウシ胎児血清（ギブコ社（ＧＩＢＣＯ）１６０００−０４４）を含む培地において行い、透析して血清由来のヌクレオシドの汚染を回避した。
【０１４４】
２．２．２）最大ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７組換えタンパク質生成クローンの選択
２．２．２．１）最も生産的なｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７トランスフェクタントのプールの選択
抗ＬＡＧ−３を用いてＥＬＩＳＡにより試験した４００個のプールの中で、６個が他のものよりも一層強力な生産者であり、これらを選択した（プール番号３、４、９、１１、２０、２１）。これらのプールそれぞれの２つのアンプルを凍結させた。
【０１４５】
２．２．２．２）メトトレキサートによる遺伝子増幅
これらのプールを１５０．０００細胞／ウエルで６ウエル・プレートに接種し、５０ｎＭのメトトレキサートと共に培養した。プール９および１１の上清中のｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７の量は、メトトレキサートの存在下において増大した。メトトレキサートの用量は、したがって１５０および２５０ｎＭに増大した。
【０１４６】
プール９は２５０ｎＭのメトトレキサートに耐性があり、生成されたｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７の量は多量であった。したがって、限界希釈実験を、２００４年９月１１日にこれらの条件下において行った。このプール由来の２つのクローンを選択し（番号９−２３および９−２６）、２００４年１０月８日に凍結させた。
【０１４７】
プール１１は２５０ｎＭのメトトレキサートに耐性があり、生成されたｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７の量は多量であった。したがって、限界希釈実験を、２００４年９月３日にこれらの条件下において行った。このプール由来の５つのクローンを選択し（番号１１−１、１１−２、１１−５、１１−６、１１−１０）、２００４年１０月６日に凍結させた。
【０１４８】
２ｍＭの酪酸（組換えタンパク質の生成を増大させることが知られている分化促進物質）を補った（低レベルの外来性タンパク質を含む）化学的に定義された培地中でのこれらのクローンの適応を、生成されたｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７タンパク質の観点で評価した。無血清培地中でのその生成レベル、生成されたタンパク質の質（抗ＬＡＧ−３抗体を用いたウエスタン・ブロットおよび染色）、およびその増殖能力に基づいて、クローンｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７番号１１−５を選択した。このクローンの２０個のアンプルを２００４年１１月５日に凍結させた。
【０１４９】
２．２．３）最大ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ組換えタンパク質生成クローンの選択
２．２．３．１）ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆトランスフェクタントの最も生産的なプールの選択
抗ＬＡＧ−３を用いてＥＬＩＳＡにより試験した４００個のプールの中で２４個を選択し（１〜２４で番号処理したプール）、凍結させた。
【０１５０】
２．２．３．２）メトトレキサートによる遺伝子増幅
これらのプールを１５０．０００細胞／ウエルで６ウエル・プレートに接種し、５０ｎＭのメトトレキサートと共に培養した。５０ｎＭのメトトレキサートに耐性があった１１個のプールを、１５０および２５０ｎＭのメトトレキサートと共に培養した。
【０１５１】
プール１は２５０ｎＭのメトトレキサートに耐性があり、生成されたｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆの量は多量であった。したがって、限界希釈試験を、２００４年９月６日にこれらの条件下において行った。このプール由来の５つのクローンを選択し（番号１−１４、１−２１、１−４９、１−５６、１−１００）、２００４年１０月６日に凍結させた。
【０１５２】
プール６は２５０ｎＭのメトトレキサートに耐性があり、生成されたｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆの量は多量であった。したがって、限界希釈試験を、２００４年９月１１日にこれらの条件下において行った。５つのクローンを選択し（番号６−１５、６−５５、６−５７、６−５８、６−６５）、２００４年１０月５日に凍結させた。
【０１５３】
２ｍＭの酪酸を補った化学的に定義された培地中でのこれらのクローンの適応を、生成されたｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆタンパク質の観点で評価した。無血清培地中での生産性、生成されたタンパク質の質（抗ＬＡＧ−３抗体を用いたウエスタン・ブロットおよび染色）、および増殖能力に従い、クローンｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ番号１−２１を選択した。このクローンの２０個のアンプルを２００４年１１月２９日に凍結させた。
【０１５４】
３）融合タンパク質の生成および精製
ｈＬＡＧ−３Ｉｇ−Ｅ７、ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆタンパク質、ならびに対照としてｈＬＡＧ−３Ｉｇを生成させ、これらを精製した。
【０１５５】
３．１）融合タンパク質の生成
３．１．１）ｈＬＡＧ−３Ｉｇ−Ｅ７およびｈＬＡＧ−３Ｉｇ生成系からの多量の上清の生成
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ（ＣＨＯ７−１−ＢＡ）、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７（ＣＨＯ７−１−Ｄ３）、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ（ＣＨＯ２１−１−Ｃ８）およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−Ｅ７（ＣＨＯ１４−１−Ｅ１１）タンパク質を生成する細胞系を大規模に培養して、数ミリグラムのタンパク質を含む体積の上清を得た（タンパク質当たり１．３リットルと１．６リットルの間の上清）。
【０１５６】
全ての培養を、フラスコ当たり８０ｍＬの培地を含む１７５ｃｍ２フラスコ中でインキュベートした接着細胞を用いて行った。使用した培地は、いかなる選択用抗生物質も含まない１０％ＦＣＳ（バッチＳ１３５）を加えたＨａｍＦ１２（インビトロジェン社（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））であった。
【０１５７】
これらの細胞を１０分の１に希釈し４日間培養したか、あるいは３分の１に希釈し２日間培養した。したがって、上清の採取を、培地が過剰に黄色くなり細胞が脱着する前に行った。
【０１５８】
生成バッチ中の組換えタンパク質の濃度は以下の通りであった。
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ（ＣＨＯ  ７−１−ＢＡ）：１．４ｍｇ／Ｌ
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７（ＣＨＯ  ７−１−Ｄ３）：０．３３ｍｇ／Ｌ
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ（ＣＨＯ  ２１−１−Ｃ８）：４μｇ／Ｌ
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−Ｅ７（ＣＨＯ  １４−１−Ｅ１１）：５μｇ／Ｌ
したがって、ｈＬＡＧ−３のただ２つのＩｇドメインを含む組換えタンパク質の生成は、ｈＬＡＧ−３の４つのＩｇドメインを含む組換えタンパク質の生成より一層有効であった。
【０１５９】
３．１．２）ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７番号１１−５およびｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ番号１−２１クローンからの多量の上清の生成
ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７番号１１−５およびｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ番号１−２１クローンのバイオマスの増大を、血清の存在下において接着細胞を用いて得た。コンフルエントで、細胞をＰＢＳで洗浄し、３０℃において２５０ｎＭのメトトレキサートおよび２ｍＭの酪酸を補ったＰｒｏＣＨＯ４−ＣＤＭ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢＥ１２−０２９Ｑ）中で培養した。培地は２４または３６時間毎に回収した。数個の生成物をこのようにして得て、上清中の生成された量は一般に、この実験系ではｈＬＡＧ−３Ｉｇ−Ｅ７に関しては２ｍｇ／Ｌを超え、ｈＬＡＧ−３Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆ融合タンパク質に関しては１ｍｇであった。
【０１６０】
３．２）ｈＬＡＧ−３Ｉｇ−Ｅ７およびｈＬＡＧ−３Ｉｇ、ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆの精製
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−Ｅ７、ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ組換えタンパク質を、生成した上清のバッチからプロテインＡのカラムで精製した。
【０１６１】
３．２．１）使用した精製プロトコル
培養物の上清由来の組換えタンパク質の精製を、ＰＢＳを用いて平衡状態にしたプロテインＡのカラム（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）ｒｅｆ−１７−５０７９−０１）で行った。
【０１６２】
培養物の上清を０．２２μｍフィルターで濾過した。ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からのＦＰＬＣ系を使用して、ＰＢＳを用いて事前に平衡状態にしたプロテインＡのカラムに、それを充填した。ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−Ｅ７の精製中に、プロテインＡと結合しなかったタンパク質を１０ｍｌのＰＢＳで洗浄し、次いで組換えタンパク質を、０．１Ｍグリセリン・バッファー（４と２．７の間のｐＨ）の勾配を使用して溶出させた。１ｍｌの分画を回収した。
【０１６３】
勾配がｐＨ２．７のバッファーの約２０％に達したとき、ＵＶ検出器は溶出ピークの存在を示した。溶出概略は、４つの組換えタンパク質に関して同じであった。
精製タンパク質を含む分画を集め、脱塩カラム（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）からのＨｉ−ｔｒａｐ脱塩５ｍｌ）においてＰＢＳバッファー中で後に脱塩した。このようにして得たタンパク質を（機能性試験においてそれらを使用する前に）濃縮器で濃縮し（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ  ｒｅｆ．Ｖ５０２０１断片１０ｋＤａ）、ＳｐｉｎＸカラム（ｒｅｆ．Ｃｏｓｔａｒ８１６０）での濾過によって滅菌した。生成物を等分し、−８０℃で凍結させた。
【０１６４】
ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ組換えタンパク質を、ＰＢＳおよび０．１Ｍグリセリン・バッファー、ｐＨ４中で洗浄した後、タンパク質を０．１Ｍグリセリン・バッファー、ｐＨ２．７中に直接溶出させ、ＰＢＳに対して透析し、０．２μｍで濾過し、等分して−８０℃で保存した。
【０１６５】
３．２．２）精製工程の収率
それぞれの精製、脱塩およびＣｅｎｔｒｉｃｏｎ濃縮工程の生成物を、抗ｈＬＡＧ−３Ｉｇを用いてＥＬＩＳＡによって分析した。
【０１６６】
表１は、ＥＬＩＳＡによって得た濃度、およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇおよびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−Ｅ７組換えタンパク質のそれぞれの精製工程の収率を要約する。
【０１６７】
【表１】
2008501635.tif 000002
【０１６８】
プロテインＡカラムでのｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）ＩｇおよびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７の精製中に得られた収率は約７７％であり、それは比較的満足のいくものである。
【０１６９】
脱塩カラムでのバッファーの交換中の、１．５倍での生成物の希釈は通常のことである。
表２は、精製ｈＬＡＧ−３Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆタンパク質においてＬＡＬ（Ｃａｍｂｒｅｘ）によって推測したエンドトキシンの量に加えて、ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｅｒｂｉｏ）によって得られた量を要約する。
【０１７０】
【表２】
2008501635.tif 000003
【０１７１】
無血清培地を使用することによって、本発明を使用するためにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび動物中で樹上細胞に課される制限未満に、エンドトキシンのレベルを充分低下させることが可能であった。
【０１７２】
３．２．３）ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる精製産物の分析
４つのｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）ＩｇおよびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ２）Ｉｇ−Ｅ７組換えタンパク質の精製産物の性質および純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した。１０％アクリルアミドを含むゲルをクーマシー・ブルーで染色したか、あるいは抗ｈＬＡＧ３および抗Ｅ７を用いるウエスタン・ブロットによる分析用にニトロセルロースに移した（図５における例）。
【０１７３】
プロテインＡカラムで精製したｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇタンパク質を、精製ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇタンパク質と同じ形式で移動した（図５）。他方で、より小さなサイズの２つのタンパク質も、我々の精製産物中に多量に存在した。この２つのタンパク質は、細胞培養に使用した血清中に存在したウシ免疫グロブリンに相当する。
【０１７４】
Ｅ７と結合したｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇは、予想したよりわずかに遅く移動した。Ｅ７断片の存在を確認するために、抗Ｅ７抗体を用いるウエスタン・ブロット分析を行った。ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７融合体を示した。
【０１７５】
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆのそれぞれのバッチの精製産物の性質および純度を、クーマシー・ブルーを用いた染色および抗ＬＡＧ−３ウエスタン・ブロットによって分析した（図８における例）。
【０１７６】
予想したように、精製ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆタンパク質は、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇより明らかに大きな分子量を有していた。Ｅ７断片より大きなｇａｇｎｅｆ断片、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ融合タンパク質は、最も遅い移動度を有していた（図８）。無血清培地を使用することによって汚染タンパク質を除去することが可能であった。
【０１７７】
４）融合タンパク質の機能性試験
この方法で精製したｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）ＩｇおよびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７タンパク質を、クラスＩＩＭＨＣと結合するそれらの能力、樹状細胞によって内在化される樹状細胞の成熟を誘導するそれらの能力、および特異的なＣＤ４および／またはＣＤ８Ｔ細胞応答を誘導するそれらの能力に関して試験した。
【０１７８】
４．１）クラスＩＩＭＨＣとの結合
クラスＩＩＭＨＣと結合する組換えタンパク質の能力を、ＬＡＺ−５０９細胞（ＥＢＶによって形質転換されたヒトＢ細胞、クラスＩＩＭＨＣを強く発現する）とタンパク質との結合を測定することによって評価した。ＦＩＴＣと結合したヒト抗Ｉｇ抗体によって、結合が明らかになった。クラスＩＩＭＨＣおよび組換えタンパク質の結合と正比例した、ＬＡＺ−５０９細胞のＦＩＴＣ標識の強度をＦＡＣＳによって定量した（図６および９）。
【０１７９】
ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７融合タンパク質は、同じ条件下で生成および精製されたｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇと同様の方法でクラスＩＩＭＨＣと結合する（図６）。
【０１８０】
同様に、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆタンパク質の結合能力は、ｈＬＡＧ−３Ｉｇの結合能力と同等である（図９）。
【０１８１】
４．２）ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆによるヒト樹状細胞の成熟化
末梢血単核球（ＰＢＭＣ）から分化した未成熟樹状細胞を、（陰性刺激対照として）ヒトＩｇＧ１細胞、あるいはｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆまたはｈＬＡＧ−３Ｉｇ（１０μｇ／ｍＬ）タンパク質と共に２日間インキュベートした。樹状細胞の成熟化を誘導することが知られている可溶性ＣＤ４０リガンド（ｓＣＤ４０Ｌ、３μｇ／ｍＬ）を、陽性刺激対照として使用した。樹状細胞の活性化を、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３、およびＣＤ８６活性化マーカーの膜での発現によってその後評価した（図１０中の例）。ＬＡＧ−３／Ｅ７またはＬＡＧ−３／ｇａｇｎｅｆ融合タンパク質を、陽性対照、ＬＡＧ−３ＩｇおよびｓＣＤ４０Ｌと同様に樹状細胞の成熟化を誘導した。
【０１８２】
４．３）ヒト樹状細胞におけるｈＬＡＧ−３Ｉｇ−Ｅ７の内在化
樹状細胞におけるｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７融合タンパク質の内在化を試験した。
【０１８３】
ＰＢＭＣから精製した未成熟ヒト樹状細胞を、３０μｇ／ｍＬの組換えタンパク質と共に４℃においてインキュベートした。細胞はその後３７℃に１５分間置いた。これらの条件下では、ｈＬＡＧ３−Ｉｇは樹状細胞に内在化し、それらの成熟化を誘導することが知られている。
【０１８４】
共焦点顕微鏡による分析は、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７タンパク質が未成熟ヒト樹状細胞に効率よく内在化されることを示した（図１０）。３７℃に１５分間スライドを置いた後、これらの細胞は、樹状細胞において特異的に標識されたＬＡＧ−３Ｉｇ−Ｅ７タンパク質を内在化させ、これは４℃では見られない（陰性内在化対照）。
【０１８５】
４．４）Ｅ７およびｇａｇ−ｎｅｆ抗原に対するＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞応答
健全なドナーから新たに回収したＰＢＭＣ細胞を、標準的なＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（アマシャムファルマシアバイオテク社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）ＡＢ）を使用して精製した。
【０１８６】
５００Ｕ／ｍＬのＧＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．ＭＮ）および５００Ｕ／ｍＬのＩＬ−４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．ＭＮ）と共にＰＢＭＣを７日間培養することによって、樹状細胞を調製した。
【０１８７】
２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ４０抗体および１００ｎｇ／ｍＬのＰｏｌｙ  ＩＣ（シグマアルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下において２日間、樹状細胞をその後成熟化させた。
【０１８８】
精製したＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞を、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆ、Ｅ７、ｇａｇｎｅｆまたはｈＬＡＧ−３Ｉｇ（１０μｇ／ｍＬ）タンパク質を用いて２時間、樹状細胞と共に毎週刺激し、培地（ＣＭ：ＲＰＭＩ１６４０、１０％ヒトＡＢ血清、１０ｎＭのＬ−グルタミンおよびゲンタマイシンを含む）中に１０／１のＴ細胞／樹状細胞の比で、３５Ｇｙで照射した。１．１０３Ｕ／ｍＬのＩＬ−６および５Ｕ／ｍＬのＩＬ−１２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．ＭＮ）を培養の第１週中に加えた。２０Ｕ／ｍＬのＩＬ−２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．ＭＮ）および１０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−７（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．ＭＮ）を次の２週間中に加えた。
【０１８９】
Ｅｌｉｓｐｏｔアッセイを使用して、Ｅ７またはｇａｇ−ｎｅｆ抗原に応答してγ−インターフェロンを分泌するエフェクター細胞を定量した。
セルロース・エステル膜を有する９６ウエル・プレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎ  ＭＡＨＡ  Ｓ４５１０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を、抗γ−インターフェロン抗体（ＭＡＢ２８５）で一晩コーティングした。ウエルを洗浄し、１０％のヒトＡＢ血清を培地に加え、細胞を４つの異なる濃度で加えた。タンパク質をそれぞれのウエルに加え、プレートは一晩インキュベートした。翌日、培地を捨て、二次ビオチン化抗体（ＢＡＦ２８５−ビオチン）を加えることによってウエルを洗浄した。プレートを２時間インキュベートし、洗浄し、ストレプトアビジン−酵素複合体（ストレプトアビジン−ＡＰ；Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  ＧｍｂＨ）をそれぞれのウエルに加えた。プレートを室温で１時間インキュベートし、酵素のＢＣＩＰ−ＮＢＴ基質（Ｓ３７７１：プロメガ社フランス（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｆｒａｎｃｅ）をそれぞれのウエルの、アルカリホスファターゼ・バッファー、ｐＨ９．５（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２）中に加え、プレートを１０〜２０分間室温でインキュベートした。濃い青紫色の斑点が出現するやいなや、水で洗浄することによって反応を終了させた。斑点を、自動式画像分析装置ＥＬＩＳＰＯＴリーダー（ＡＩＤ  Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ、ドイツ）を使用して計数した。
【０１９０】
抗原に応答してγ−インターフェロンを分泌するＣＤ４またはＣＤ８Ｔエフェクター細胞の出現率は、抗ＣＤ８または抗ＣＤ４抗体を用いた免疫標識によって、リンパ球群中の斑点を形成する細胞の数およびＣＤ８またはＣＤ４Ｔ細胞の出現率に基づいて計算することが可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１９１】
【図１】Ｅ７ｗｔの理論上の配列と、部位特定突然変異誘発（２点突然変異）後の塩基配列決定後に得たＥ７Ｒｂの理論上の配列間の、核酸配列（Ａ）およびペプチド配列（Ｂ）のアラインメントを示す図。
【図２】発現ベクターｐＣＤＮＡ３、および組換えタンパク質ｈＬＡＧ−３Ｉｇ−Ｅ７、Ｅ７−ｈＬＡＧ−３Ｉｇおよび対照としてＥ７Ｒｂ−Ｉｇを発現するｐＳＥＣに関するクローニング戦略を要約する図。使用されたオリゴヌクレオチドは矢印によって表される。
【図３】ｇａｇタンパク質（パネルＡ）およびｎｅｆ（パネルＢ）に関する祖先群Ｂ、共通群ＢおよびＬＡＩ配列間の配列のアラインメントを示す図。ｇａｇ−ｎｅｆタンパク質を最適化するために、ｐ１７、ｐ２４およびｎｅｆ用に選択されたアミノ酸には下線が引かれる。
【図４】発現ベクターｐＣＤＮＡ３、および組換えタンパク質ｈＬＡＧ−３Ｉｇ−ｇａｇｎｅｆ、ｇａｇｎｅｆ−ｈＬＡＧ−３Ｉｇおよび対照としてｇａｇｎｅｆ−Ｉｇを発現するｐＳＥＣのクローニング戦略を要約する図。使用されたオリゴヌクレオチドは矢印によって表される。
【図５】精製されたｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）ＩｇおよびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図；精製されたｈＬＡＧ−３Ｉｇタンパク質も（０．７１ｍｇ／ｍＬで）参照として沈殿された。分子量マーカーは３つのゲルに関して同じである（バイオラッド社（Ｂｉｏｒａｄ）の広範囲マーカー）。Ａは、クーマシー・ブルー染色の図。Ｂは、１７Ｂ４モノクローナル抗体を用いたウエスタン・ブロットによる抗ｈＬＡＧ−３の図。
【図６】ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）ＩｇおよびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７と、ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞のクラスＩＩＭＨＣとの結合を示す図（陽性細胞の割合によって重み付けした平均蛍光値として表す：縦座標軸）。
【図７】（細胞内の数箇所の）免疫蛍光によって検出された、３７℃での未成熟ヒト樹状細胞におけるｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ−Ｅ７の内在化を示す図。
【図８】精製されたｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す図；タンパク質ｈＬＡＧ−３Ｉｇ（バッチＰＤＣ１２．０９６）も参照として沈殿された（バイオラッド社（Ｂｉｏｒａｄ）のＫａｌｅｉｄｏｓｃｏｐｅ分子量マーカー）。Ａは、クーマシー・ブルー染色の図。Ｂは、１７Ｂ４モノクローナル抗体を用いた抗ｈＬＡＧ−３ウエスタン・ブロットの図。
【図９】ＥＢＶ形質転換Ｂ細胞のクラスＩＩＭＨＣにおけるｈＬＡＧ−３Ｉｇ（バッチ、ヘノジェン社（Ｈｅｎｏｇｅｎ）Ｓ０１７／ＬＰＣ／０４１００８）、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７およびｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆの結合を示す図。（濃度に対する平均蛍光強度として表す）。
【図１０】ヒトＩｇＧ１、ｓＣＤ４０Ｌ、ｈＬＡＧ−３Ｉｇ（バッチ、ヘノジェン社（Ｈｅｎｏｇｅｎ）Ｓ０１７／ＬＰＣ／０４１００８）、ｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／Ｅ７またはｈＬＡＧ−３（Ｄ１Ｄ４）Ｉｇ／ｇａｇｎｅｆと共に２日間インキュベートされた樹状細胞の表面での、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６活性化マーカーの発現を示す図。膜における発現は蛍光強度に正比例する。
【図１】
2008501635.tif 000004
【図２】
2008501635.tif 000005
【図３】
2008501635.tif 000006
【図４】
2008501635.tif 000007
【図５】
2008501635.tif 000008
【図６】
2008501635.tif 000009
【図７】
2008501635.tif 000010
【図８】
2008501635.tif 000011
【図９】
2008501635.tif 000012
【図１０】
2008501635.tif 000013
【配列表】
2008501635000001.app
【国際調査報告】
2008501635.tif 000014
2008501635.tif 000015
2008501635.tif 000016
2008501635.tif 000017
2008501635.tif 000018
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