(57)【要約】  フルオラスタグ付けプローブをアレイ化する新規な手段が開示される。該方法は、プローブをフルオラスタグ付けするステップと、該プローブをフルオラス表面を有する基板に結合させるステップとを含む。次に、標的分子が該マイクロアレイへの結合に続いて同定され、かつ分析される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルオラスタグ付けされたプローブに非共有結合することが可能なフルオラス表面を有する基板を含んでなる、フルオラスタグ付けされたプローブを検出するためのマイクロアレイ。
【請求項２】
前記フルオラスタグ付けされたプローブが、タンパク質、タンパク質断片、ヌクレオチド、炭水化物、分子複合体、反応性複合体、脂質、脂肪酸、ステロイド、薬物、細胞、組織、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
前記基板が、シリカ、ガラス、金属、プラスチック、およびポリマーからなる群より選択される、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
前記基板がテフロンでコーティングされている、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
前記基板が、スライド、プレート、およびウェルからなる群より選択される、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
少なくとも１種のフルオラスタグ付けされたプローブをさらに含む、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
前記プローブが、フルオラスレブリナート（fluorous levulinate）およびフルオラスアリルリンカーからなる群より選択される化合物を用いてタグ付けされている、請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
フルオラス基を有する化合物を基板表面で反応させて、プレートまたはスライド上にフルオラス表面を形成させるステップ；および該フルオラス表面にフルオラスタグ付けしたプローブを結合させるステップを含む、マイクロアレイの形成方法。
【請求項９】
前記基板をフルオラス溶液に浸漬する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記フルオラス溶液がRf8試薬である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Rf8試薬がRf8-エチル-SiCl3である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
フルオラス表面を有する基板を用意するステップ；フルオラスタグ付けしたプローブをスポット領域中に固定化することにより、マイクロアレイを用意するステップ；前記プローブと、標的物質を含有するサンプルとを接触させることにより、該プローブと該標的物質とを反応させるステップ；および該標的物質と該プローブとの反応を検出するステップを含む、標的物質の検出方法。
【請求項１３】
前記プローブが、タンパク質、タンパク質断片、ヌクレオチド、炭水化物、分子複合体、反応性複合体、脂質、脂肪酸、ステロイド、薬物、細胞、組織、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
フルオラスレブリナートを含む化合物の合成およびアレイ化を促進するために用いる化合物。
【請求項１５】
フルオラスアリルリンカーを含む化合物の合成およびアレイ化を促進するために用いる化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、フルオラスタグ付けプローブをアレイ化する新規な手段に関する。該方法は、プローブをフルオラスタグ付けするステップと、該プローブをフルオラス表面を有する基板に結合させるステップとを含む。次に、標的分子が該マイクロアレイへの結合に続いて同定され、かつ分析される。
【背景技術】
【０００２】
マイクロアレイは、基板上の所定の位置に固定された生物学的または化学的サンプル（プローブ）のスポットの配列（アレイ）である。各々のスポットは、単一の生物学的または化学的物質の多数の分子を含む。アレイを分析するために、マイクロアレイは、１種以上の生物学的または化学的サンプルを含む液体に浸されるが、該サンプルの要素は、典型的にはマイクロアレイ上の１種以上の相補的プローブと相互作用する。標的中の分子鎖は、プローブのマイクロアレイにおける相補的ストランドとハイブリダイズする。ハイブリダイズしたマイクロアレイを、マイクロアレイリーダーで検査し、これにより標的分子の存在を検出する。プローブは、マイクロアレイの所定かつ既知の位置に配置されるので、液体中の標的配列の存在および量は、蛍光または放射が検出される位置と蛍光または放射の強度によって明らかになる。
【０００３】
最小量の物質による生物学的スクリーニングにおいてＤＮＡマイクロアレイおよびタンパク質マイクロアレイが成功を収めたことにより、炭水化物−タンパク質相互作用を調べるための、関連するチップに基づくアプローチがもたらされている。一般に、炭水化物マイクロアレイは、化学的に修飾された糖類の、適切に誘導化された表面に対する部位特異的共有結合によって作製される。例えば、マレイミドまたはヒドラジド結合炭水化物は、チオールまたはエポキシド誘導化ガラススライドと反応可能であり、そしてシクロペンタジエン含有炭水化物は、ディールス・アルダー反応によってベンゾキノンコーティング金表面に固定され得る。残念なことに、かかる共有結合による戦略では、固定化条件、例えばｐＨ、時間、および温度の冗漫な最適化が必要である。炭水化物の非共有結合による固定化は、ニトロセルロースコーティングガラススライドを用いて行われている。しかしながら、かかる方法では、大きなオリゴ糖を必要とし、これにより表面における糖の配向を制御することが不可能である。
【０００４】
近年、炭水化物マイクロアレイは、他の種類の非共有的相互作用に基づき作製されてきた。かかる実験は、非共有的なフルオラス−フルオラス相互作用を簡素化された精製だけではなく化合物の表面パターン形成に使用可能であることの最初の証明となった。実際に、単一のＣ８Ｆ１７フルオラス尾部は、フッ素化固体担体上にアレイとして炭水化物をパターン形成させ、そして炭水化物結合タンパク質（例えば植物レクチン）に対する常套的なスクリーニング中に化合物を保持するのに十分である。しかしながら、このような当初の実験では、簡素な単糖類だけを用いていた。
【０００５】
マイクロアレイは極めて大多数の分子を含むこと、およびマイクロアレイの寸法が小さいことという両方の理由から、マイクロアレイは非常に有効である。従って、大多数の分子を迅速に精査する必要がある場合か、または調査すべきサンプルが少量である場合、マイクロアレイは有用である。例えば、マイクロアレイを用いて、単一のサンプルにおける遺伝子の発現を分析するか、または２種類の相互に異なる細胞タイプまたは組織サンプル、例えば健康な組織および病変組織での遺伝子の発現を比較することが可能である。マイクロアレイを使用して、数百または数千の分子の発現を一度に調査することが可能であることから、これらの分子が調査および研究される方法に大変革を起こすことが促進される。更に情報が蓄積されると、科学者は、マイクロアレイを用いて、益々複雑な課題に答え、そして更に複雑な実験を行うことが可能となるであろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の主たる目的は、生物学的なスクリーニング法で使用され得るマイクロアレイを形成する簡素な手段を提供することである。
【０００７】
本発明の他の目的は、糖類、タンパク質、およびこれらの組み合わせをスクリーニングするための改良された技術を開発することである。
【０００８】
本発明の更に別の目的は、マイクロアレイを使用して分子を生物学的にスクリーニングする方法を提供することである。
【０００９】
これらの目的および他の目的は、以下の本発明の詳細な説明から明らかとなるであろう。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、フルオラスタグ付けされたプローブを合成するための新規なマイクロアレイおよびマルチウェルプレートアレイ、ならびにこれらの形成方法について記載する。マイクロアレイは、フルオラスタグ付けされたプローブに非共有結合することが可能なフルオラス表面を有するスライド、ウェル、または他の基板を含む。結合すると、標的の分子は、プローブに結合し、その後、一般的な手段を用いて検出することができる。本発明は、非共有的なフルオラス化学に基づく相互作用を用いる直接的なアレイ形成を可能にする点で従来のマイクロアレイに対して有利である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は、非共有的なフルオラス化学に基づく相互作用に基づいてマイクロアレイを形成する比較的簡素な方法を提供する。複数の溶液相ならびに脱保護および誘導ステップを必要とし、固相で製造される化合物からのマイクロアレイの製造と対照的に、本発明により、直接的なアレイ形成、すなわち固相上でのオリゴマーの合成方法、あるいは脂質またはポリエチレングリコールのタグを用いるオリゴマーの合成方法は用いない特性を可能にする。
【００１２】
マイクロアレイの基板は、フルオラスタグ付けされた化合物に非共有結合するフルオラス表面を有するように作製される。本発明の基板は、種々の材料から製造可能である。基板は、使用される特定のプローブを固定化可能であることが必要とされるか、あるいは基板は、かかる固定化を可能にするように改変（例えば、コーティングにより）することが可能である必要がある。本発明の基板に好ましい材料は、シリカ、ガラス、金属、プラスチック、およびポリマーである。フルオラス表面を有するマイクロアレイの基板は、いずれも本発明での使用に好適であり、例えばテフロン（登録商標）コーティングスライド（例えば、Precision Lab Products社製のスライド）または他のテフロン（登録商標）コーティング表面が挙げられる。本明細書中で用いる「フルオラス表面」なる用語は、水が基板の表面に玉を形成するのに十分なフルオロカーボンとして、および／または使用者により選択されるフルオラスタグと結合するのに十分なフルオロカーボンを有する表面として定義される。
【００１３】
あるいは、フッ素化された表面を有する基板は、容易に製造され得る。好ましくは、スライドまたは他の基板を、エタノールまたは他の一般的な手段で最初に洗浄する。その後、基板をフルオラス溶液に浸漬して、基板をコーティングし、その後、乾燥および洗浄する。好ましい製造方法では、基板を、Ｒｆ８試薬、例えばＲｆ８−エチル−ＳｉＣｌ３の溶液に少なくとも１回浸漬させる。最も好ましい方法では、スライドを複数回に亘って浸漬させ、かつ３回が最も好ましいが、その間に、それぞれ数分間の乾燥時間を含める。
【００１４】
本発明の他の方法であるものの、それほど好ましくない方法では、市販のフルオラスアミンを、基板の表面で無水マレイン酸と反応させることが可能である。あるいは、対応のフルオラスチオールを、市販のマレイミド活性化プレートと反応させて、以下に示すように、フルオラス表面を有するガラスのスライドまたはウェルを製造することが可能である。上述したように、適正にコーティングされた場合、水は、フルオラス表面上で玉になるであろう。
【化１】
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【００１５】
マイクロアレイの基板が製造されると、フルオラスタグ付けされた分子（プローブ）が、コーティング基板に対してスポットされる。フルオラスタグは、ほとんどの有機溶媒、例えばＤＭＦ、ＴＨＦ、ＣＨ２Ｃｌ２等に溶解する通常の保護基の過フルオロアルキル修飾型である。タグは、必要な逐次反応条件に耐え、更に所望により除去される必要がある。本発明で使用する場合に好適なフルオラスタグとしては、限定するものではないが、Ｆ−Ｂｏｃ−ＯＮ、Ｆ−チオール、Ｆ−Ｃｂｚ−ＯＳｕ、Ｆ−シラン、フルオラスベンジルアルコール、Ｆ−Ｆｍｏｃ−Ｏｓｕ、Ｆ−ＰＭＢ−ＯＨ、ＦｌｕｏＭａｒ（登録商標）、フルオラストリチルクロリド、フルオラスｔ−ブタノール（すなわち、Ｃ４Ｆ９、Ｃ６Ｆ１３等）、４−［３−（ペルフルオロオクチル）プロピル−１−オキシ］チオフェノール、フルオラス−ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルシリル、フルオラス−ｐ−メトキシベンジル、フルオラス−フルオレニルメトキシカルボニル、ＯＴｆ（Ｆ−ＴＢＤＰＳトリフルオロメタンスルホネート）、フルオラスレブリネート（Ｆ−Ｌｅｖ）、フルオラスアリル基（Ｆ−Ａｌｌｙｌ）、およびフルオラストリチルアルコールが挙げられる。フルオラスタグは、当該技術分野で周知であり、Fluorous Technologies Incorporated(FTI)などから市販されている。フルオラスタグは、一般式Ｒ−ＣｘＦ（２ｘ＋１）［但し、Ｒは１個以上のアルキル基を含み、ｘは整数である。］で表されるのが好ましい。Ｃ８Ｆ１７タグは、便宜上の理由、すなわち容易に利用可能な商業的入手性により好ましい。
【００１６】
更に本発明は、特有のフルオラスタグ、フルオラスレブリネート（Ｆ−Ｌｅｖ）およびフルオラスアリル（Ｆ−Ａｌｌｙｌ）を含む。Ｆ−Ｌｅｖは、２−（ペルフルオロヘキシル）エチルヨーダイドからグリニャール試薬を形成し、次に、無水コハク酸を添加することによって合成することができる。
【００１７】
アリル基は、標準的なトリクロロアセトイミデートのカップリング条件および脱保護条件で良好に働く。穏やかな塩基条件下でのｃｉｓ−１，４−ブテンジオールと１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルヨーダイドとの反応により（Ｍａｎｚｏｎｉ ２００４）、グリコシル化で使用する場合に必須のアルケンスペーサーを有するアルコールを製造する。本発明者らは、このタグの改変型を大規模で合成する手段を開発した。脱離基と電子求引性のフルオロアルカンとの間の追加のメチレンスペーサーを添加して、脱離基に対するベータ水素の酸度を低減した。このために、市販の３−（ペルフルオロオクチル）プロパノールを、メタンスルホニルクロリドと混合して、メシレート誘導体を定量的に形成した。その後、かかる求電子試薬を、ｃｉｓ−１，４−ブテンジオールと反応させて、フルオラスタグ付けされたアルコールを７０％の収率で製造し、次のグリコシル化反応に使用した。
【００１８】
保護基を有する分子にタグ付けする処理は、当該技術分野で周知である。条件は、選択されるタグ、使用される基板等に基づいて変更するであろう。これに関する具体例および周知の文献は、T. W. Green, P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, Wiley-Interscience, New York, 1999であり、その記載内容を、参照により本明細書中に具体的に組み入れる。かかる書籍では、選択される保護基に応じて用いられるタグ付け条件／処理に関して、当業者に対して詳細な情報を提供している。
【００１９】
タグ付けされた分子または「プローブ」は、本発明による基板に対して非共有結合によって固定化される。プローブは、検出対象の標的物質に特異的に結合し、タンパク質、タンパク質断片、ヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ等）、あるいは炭水化物（すなわち、多糖類、オリゴ糖、または単糖類）、分子複合体（例えば、核酸ハイブリッド、タンパク質複合体、細胞成分）、反応性複合体（例えば、化学反応または酵素反応を受ける複合体）、脂質および脂肪酸、ステロイド、薬物、細胞、組織、ならびに他の小型分子（すなわち、約１００００ダルトン以下の分子量を有する分子）であってもよいものの、これらに限定されない。更に詳細には、プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、抗体、抗原、リガンド、基質、またはインヒビターであってもよい。選択されるプローブのセットは、装置の使用に基づいて決められる。例えば、装置がプローブとしてポリヌクレオチドを使用する場合、配列分析を行うときには、ｎ−ｍｅｒの完全なまたはほぼ完全なセットを選択するであろう；かかるセットの使用法は、米国特許第５，７００，６３７号および同第６，０５４，２７０号に更に十分に記載され、これらの記載内容全体を参照により本明細書中に組み入れる。他方、該装置が遺伝子または遺伝子セットにおける突然変異または多型を分析するものである場合、突然変異における完全なまたは選択されたセットを示すポリヌクレオチド、例えば置換、欠失、および挿入突然変異が、目的の特定の遺伝子の部分に対して好ましい場合がある。かかる例示は、特定の装置に関して選択される、プローブの種々の専用セットを示し、かつポリヌクレオチドに対して焦点を当てている。なぜなら、これらは、現在最も普通に用いられているタイプのプローブであるからである；他の種類のプローブおよび他のポリヌクレオチドのセットは、当業者に容易に明らかとなることを理解すべきである。
【００２０】
本明細書に開示されている技術を用いてマイクロアレイの基板上に配置されるサンプルは、ロボット化されたピンによって、またはキャピラリーを通じて輸送され得るいずれかの物理的な形態によって取り込まれ、または運搬され得る。例えば、流体、ゲル、ペースト、ビーズ、粉末および液体に懸濁された粒子が挙げられるが、これらに限定されない。確立されたロボット化スポット技術では、特に設計された機械的なロボットを使用し、これにより、ピンの頂部をオフラインで合成されたＤＮＡまたは他の分子を含む流体に浸し、その後、これをスライドの所定の位置にスポットすることによってマイクロアレイ上にプローブスポットを形成する。異なるプローブをマイクロアレイにスポットする前に、ピンを洗浄し、そして乾燥させる必要がある。そのようなロボットシステムの現在の設計では、スポットピン、および／またはマイクロアレイの基板を運搬するステージは、基板の制御された位置にサンプルを配置するために協調してＸＹＺ軸に沿って移動する。確立されたロボット化スポット技術に加えて、開発中の多数のマイクロアレイ製造技術が存在する。それらとしては、インクジェット技術およびキャピラリースポットが挙げられる。
【００２１】
フルオラスタグ付けされた分子を適当な溶媒に溶解して、溶液を形成させ、その後、上述の手段によってフッ素化された基板にスポットするのが好ましい。その後、基板を加湿チャンバー内か、または他の一般的な乾燥手段によって乾燥させる。マイクロアレイ中のサンプルスポットのサイズは、直径２００ミクロン未満であるのが一般的であり、各々のアレイは、通常、数千のスポットを含む。
【００２２】
プローブが基板と結合すると、標的物質を含むサンプルが、一般的にはサンプルをタグ付けされた基板に単に注ぐことによって、プローブと接触させられる。一般に、液相のサンプルは、標的物質とプローブとの間で反応を誘導するのに適当な条件でプローブと接触させられる。例えば、炭水化物の標的物質を検出する場合、プローブおよび標的の炭水化物を、最適な温度および塩濃度の条件下でインキュベートし、これにより、炭水化物と炭水化物結合タンパク質との結合を誘導することができる。
【００２３】
標的物質とプローブとの間の特異的な反応が終了すると、未反応の反応材料を、洗浄または他の一般的な手段によって除去することができる。
【００２４】
マイクロアレイのアッセイからデータを生成するために、アッセイされた化合物またはイベントの存在、不存在、配列、または量を示すシグナルを検出する。標的物質とプローブとの間の反応の検出は、種々の方法、例えば共焦点蛍光スキャナー、微弱蛍光性検出器、アイソトープイメージャー等によって行うことができる。光学的、電気的、または呈色シグナルを検出する方法を用いてもよい。光学的検出方法によると、標的物質を、光学的に検出可能な要素で標識するのが一般的である。標的物質とプローブとの間の反応結果は、励起光の照射により標的物質とプローブの反応生成物から放出される光を測定することによって検出することが可能である。更に本発明は、未だ開発されていない技術および検出方法を包含するものと意図される。
【００２５】
フルオラス化学に基づくマイクロアレイ方法により、フルオラスタグ付けされた合成によって製造される合成炭水化物による植物科学および他の科学に用いる一定範囲の炭水化物チップを容易に製造することが可能となる。このアプローチは、現在の確定している共有結合を用いた戦略を複雑にする求核原子を含む化合物、例えばグリコサミノグリカン断片を含むアレイを製造する場合に特に価値がある。
【００２６】
以下の実施例は本発明を説明するものであり、本発明を限定するものではない。従って、以下の実施例は、種々の変更が可能であり、それらも依然として本発明の精神に含まれることが理解される。
【実施例】
【００２７】
実施例１
マイクロアレイの形成のための準備での四糖類の合成および基板表面のフルオラスコーティング
以下に示すように、１と２のカップリングは、触媒量のトリメチルシリルトリフレート（ＴＭＳＯＴｆ）またはトリフルオロメタンスルホン酸（triflic acid）を促進剤として用いて行われた。反応が不完全であった場合でも、所望の二糖類３を、最適条件下での自動化フルオラスフラッシュクロマトグラフィーによって残りの材料から分離可能である。その後、３のアセテート（Ａｃ）基をナトリウムメトキシドによって除去して４を得て、これを逆相ＳＰＥ、またはフルオラスフラッシュクロマトグラフィーによって精製した。グリコシル受容体としての二糖類４を用いて、同一のグリコシル化−脱保護反応を２回以上繰り返して、四糖類５を得た。
【化２】
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【００２８】
実施例２
マイクロアレイの合成および試験
四糖類５、ならびに対応する単糖類、二糖類、および三糖類の中間体を、Ｐｄ／Ｃを用いた水素化によって脱保護した。これらの化合物をメタノール水溶液に取り込み、そして液滴を、フルオラス相の９６ウェルマイクロタイタープレートに配置した。その後、疎水性ウェルとの脂質相互作用に関して報告されているように（Fazio 2002）、メタノールをゆっくりと蒸発させることによって除去して、フルオラスタグ付けされた化合物と、表面の炭水化物部分とのアライメントを促進させた。その後、マンノースに結合することが知られている（例えば、Weatherman, 1996を参照）市販のレクチンであるコンカナバリンＡを、ウェルに添加した。水素化されたアリルリンカーを、当初の対照化合物として使用した。溶液を水性バッファーで洗浄した後、結合しているタンパク質の量を、ブラッドフォードアッセイ（Bradford, 1976）によって測定した。レクチンは、マンノース糖類を含むウェルに結合していた。これらの実験は、オリゴ糖アレイの作製で第２相研究の基礎としてのフルオラスタグを使用して化合物アレイを形成する場合の実験パラメータを確立するのに役立つ。
【００２９】
実施例３
フルオラス化学に基づく炭水化物マイクロアレイの作製
一般的な材料および方法
反応溶媒を、ジクロロメタンに関しては水素化カルシウムから、そしてジエチルエーテルに関してはナトリウム金属およびベンゾフェノンから蒸留した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ１５イオン交換樹脂を使用前にメタノールで繰り返し洗浄した。全ての他の市販の試薬および溶媒を、更に精製することなく購入したままの状態で使用した。反応をモニタリングし、０．２５ｍｍのＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅシリカゲルプレート（６０Ｆ−２５４）での分析用薄層クロマトグラフィー（ｔｌｃ）を用いてＲｆ値を測定した。得られたｔｌｃプレートを、ｐ−アニスアルデヒド溶液に浸漬し、次に、ホットプレートで加熱することによって可視化した。３２〜６３ｍｍの粒径のＳｅｌｅｃｔｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃシリカゲルを用いてシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーを行った。ペルフルオロオクチルエチルシリル鎖と結合したシリカゲルを含むフルオラス固相抽出カートリッジ（Fluorous Technologies, Inc.; Pittsburgh, PA）を用いてフルオラス相クロマトグラフィーを行った。全ての他のフルオラス試薬もまた、Fluorous Technologies, Incから入手した。全ての感湿反応は、窒素雰囲気下、火力またはオーブン乾燥ガラス器具において行った。マイクロ波照射無しの全ての実験の場合に、浴温度を用いて反応温度を記録した。全ての反応物質を、別に示さない限り、周囲温度で、マグネチックスターラーを用いて撹拌した。マイクロ波加熱は、ＣＥＭ−Ｄｉｓｃｏｖｅｒの連続波マイクロ波を用いて行われた。１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、それぞれ４００ＭＨｚおよび１６２ＭＨｚにてＢｒｕｃｋｅｒ ＤＲＸ４００を用いて得た。１７Ｆスペクトルは、３７６ＭＨｚでＶａｒｉａｎ ＶＸＲ４００を用いて得た。１Ｈスペクトルは、内部参照としてのＣＤＣｌ３（７．２７ｐｐｍ）に対して１００万（δ）毎に分けて報告した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７７．２３ｐｐｍ）またはＣＤ３ＯＤ（４９．１５ｐｐｍ）に対して１００万（δ）毎に分けて報告した。１９Ｆスペクトルは、ヘキサフルオロベンゼンＣ６Ｆ６（０．００ｐｐｍ）に対して１００万（δ）毎に分けて報告した。
【００３０】
マイクロアレイの作製およびスクリーニング
ガラススライドの洗浄。ガラススライドは、ＮａＯＨを含む６０％のエタノール（１０ｇ／１００ｍＬ）に２時間浸漬することにょって洗浄した。スライドを蒸留水で２回洗浄し、その後、９５％のエタノール中に沈めた。
【００３１】
フルオラス誘導化ガラススライドの形成。洗浄されたスライドを、Ｒｆ８−エチル−ＳｉＣｌ３溶液（１００ｍＬのメタノール中の３％溶液）に３回浸漬し、その後、数分間乾燥し；かかる処理を２回以上繰り返した。その後、スライドを、ＭｉｌｌｉＱ−ろ過水での浸漬によって２回洗浄し、その後、室温条件下、乾燥器中で乾燥させた。
【００３２】
炭水化物マイクロアレイの形成。フルオラスタグ付けされた炭水化物化合物を、６０％メタノール（水中）に溶解し、そして、３０％の湿度で、ロボット化スポッター（Cartesian PixSys 5500 Arrayer, Cartesian Technologies, Inc., Irvine, CA）を用いてフッ素化ガラススライド上にスポットした。ガラススライドを、３０％の湿度で、加湿チャンバー内で２時間乾燥させた。
【００３３】
タンパク質−炭水化物結合の検出。ＣｏｎＡの場合、ＨＥＰＥＳバッファーのＦＩＴＣ標識ＣｏｎＡ（ｐＨ＝７．５、１０ｍＭ）、１ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｎＣｌ２、１００ｍＭのＮａＣｌ、１％のＢＳＡ（ｗ／ｖ）またはＢＳＡ無し、そしてＥＣＡの場合、ＰＢＳバッファー中のＦＩＴＣ標識ＥＣＡ（ｐＨ＝６．８）、１．０％のＴＷＥＥＮ２０、ＥＣＡ（２５μｇ／ｍＬ；EY Laboratories, Inc., San Mateo, CA）をタンパク質−炭水化物相互作用の検出に用いた。タンパク質のインキュベーションのために、０．５ｍＬのタンパク質溶液を、プリントされたガラススライドに載せた。アレイを、ＰＣ５００ Ｃｏｖｅｒ Ｗｅｌｌ培養チャンバー（Grace Biolabs, Bend, OR）を用いてインキュベートし、そして５分毎に３０分間に亘って穏やかに振盪した。その後、スライドをインキュベーションバッファーで３回洗浄し、次に、蒸留水で３回洗浄した。次いで、スライドを暗条件加湿チャンバー内で３０分間に亘って乾燥させた。ガラススライドを、４８８ｎｍに設定したGeneral Scanning ScanArray 5000を用いてスクリーニングした。
【００３４】
合成手順
【化３】
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【００３５】
ｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニルアルコール
ｃｉｓ−１，４−ブテンジオール（１４０ｍｇ、１．５９ミリモル）を、ＤＭＦ（２０ｍＬ）で溶解した。この溶液に、ＴＢＡＢ（１５３ｍｇ、４８．０ミリモル）および１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルヨーダイド（１．８ｇ、３．１８ミリモル）を添加した。反応混合物を５０℃で１０分間加熱し；その後、ＫＯＨ（２６７ｍｇ、４．７７ミリモル）を混合物中に添加した。反応混合物を７０℃で３０分間加熱した。反応混合物を氷水に注いだ。有機層をジエチルエーテルで抽出し（１００ｍＬ×２）、そしてＭｇＳＯ４で乾燥させた。混合物をろ過し、そして溶媒を減圧下に除去した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。粗生成物をＤＭＦ（０．５ｍＬ）に溶解して、フルオラス固相抽出カートリッジにロードした。粗生成物をカラムに吸収させ、その後、８０％ＭｅＯＨ／水（１０ｍＬ）を用いて、非フルオラス化合物をカラムを通して洗浄した。１００％ＭｅＯＨでの溶出によって所望の生成物を得て、溶媒の除去により、アルコールを無色の油状物として得た（１．１２ｇ、２．１ミリモル、６７％）。
【００３６】
Rf: 0.46 (酢酸エチル／ヘキサン:2/3).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 5.87-5.81 (m, 1H), 5.69-5.65 (m, 1H), 4.26-4.24(m, 2H), 4.26-4.20 (m, 4H), 2.40-2.35 (m, 2H).
13C NMR (CDCl3, 160 MHz): δ (ppm) 132.8, 127.5, 66.2, 61.9, 61.8, 58.7, 46.8.
19F NMR (CDCl3, C6F6, 376 MHz): δ (ppm) 80.9, 49.3, 44.0, 40.3, 39.8, 39.0, 35.6.
MS (ESI) m/z = 535 [M+H]+。
【００３７】
ｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α／β−Ｄ−マンノピラノシドトリクロロアセトイミデート（１６５．０ｍｇ、０．３４ミリモル）およびｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニルアルコール（１４０．０ｍｇ、０．２５ミリモル）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した溶液に、粉末化された４Åのモレキュラーシーブ（１０ｍｇ）を添加し、そして混合物を１５℃に冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（４０μＬ、０．１７ミリモル）を添加し、反応混合物を−１５℃で３０分間撹拌した。反応物をトリエチルアミン（０．１ｍＬ）でクエンチングし、そして濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を８０％のＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％のＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去し、１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシドを無色の油状物として得た（２０７．１ｍｇ、２４．０ミリモル、９３％）。
【００３８】
Rf: 0.26 (酢酸エチル／ヘキサン:2/3).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 5.74-5.69 (m, 2H), 5.32 (dd, 1H, J = 10.0, 3.2Hz), 5.26 (t, 1H, J = 9.6 Hz), 5.21-5.20 (m, 1H), 4.83-4.81 (m, 1H), 4.26-4.18 (m, 3H), 4.10 - 4.02 (m, 5H), 3.99-3.95 (m, 1H), 2.14 (s, 3H), 2.07 (s, 3H), 2.01 (s, 3H), 1.97 (s,3H).
13C NMR (CDCl3, 160 MHz): δ (ppm) 171.4, 170.9, 170.2, 170.0, 129.7, 128.9, 98.5, 71.6, 69.3, 68.5, 66.3, 66.2, 63.1, 62.4, 62.0, 21.0, 20.9(2), 20.8.
MS (ESI) m/z = 887 [M + Na]+。
【００３９】
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブタニル−α−Ｄ−マンノピラノシド
ｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−マンノピラノシド（１８４．０ｍｇ、０．２１ミリモル）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、そして５％Ｐｄ／Ｃ（１０ｍｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下に置き、１時間撹拌した。その後、セライトでろ過し、エタノールを減圧下に除去して、水素化生成物を定量的収率で得た。得られた化合物（１８４．０ｍｇ、２１．３ミリモル）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解した溶液に、Ｋ２ＣＯ３（１１７．０ｍｇ、０．８５ミリモル）を添加し、反応混合物を２時間撹拌した。その後、混合物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５イオン交換樹脂で中性化し、そしてろ過した。溶媒を減圧下に除去し、そして所望の生成物を白色の固体として得た（１４６ｍｇ、０．２１ミリモル、１００％）。
【００４０】
Rf: 0.36 (メタノール／酢酸エチル／ヘキサン:2/2/3).
1H NMR (MeOD, 400 MHz): δ (ppm) 4.71 (br, 1H), 3.80 (dd, 1H, J = 12.0, 2.4 Hz), 3.75-3.72 (m, 2H), 3.70 (d, 1H, J = 5.6 Hz), 3.67-3.65 (m, 1H), 3.62-3.60 (m, 2H), 3.58-3.53 (m, 2H), 3.50-3.47 (m, 2H), 3.45-3.40 (m, 1H), 2.06-2.01 (m, 2H), 1.64-1.58 (m,4H).
13C NMR (MeOD, 160 MHz): δ (ppm) 100.2, 73.3, 71.3, 70.9, 70.5, 67.2, 66.9, 61.4, 61.3, 27.4 (2), 26.1(2).
MS (ESI) m/z = 721 [M + Na]+。
【００４１】
ｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−アセチルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシド
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−アセチルアミノ−α／β−Ｄ−グルコピラノシドトリクロロアセトイミデート（１４８．８ｍｇ、０．３０ミリモル）およびｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニルアルコール（１１０．０ｍｇ、０．２５ミリモル）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した溶液に、粉末化された４Åのモレキュラーシーブ（１０ｍｇ）を添加し、混合物を−１５℃に冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（３４μＬ、０．１５ミリモル）を添加し、反応混合物を−１５℃で３０分間撹拌した。反応物をトリエチルアミン（０．１ｍＬ）でクエンチングし、そして濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を８０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％ＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去し、そして所望の生成物を無色の油状物として得た（１５０．３ｍｇ、０．１７ミリモル、８６％）。
【００４２】
Rf: 0.26 (酢酸エチル／ヘキサン:2/3).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 5.82-5.63 (m, 2H), 5.25 (dd, 1H, J = 10.0, 9.6Hz), 5.03 (t, 1H, J = 10.0 Hz), 4.68 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 4.35-4.30 (m, 1H), 4.25-4.18 (m,4H), 4.12-4.08 (m, 1H), 4.00-3.98 (m, 2H), 3.85-3.78 (m, 1H), 3.67-3.63 (m, 1H), 2.04(s, 3H), 1.99 (s, 3H), 1.98 (s, 3H), 1.90 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3, 160 MHz): δ (ppm) 170.9, 170.7, 170.3, 169.4, 129.3, 128.9, 99.6, 72.3, 71.9, 68.6, 66.4, 64.4, 62.1, 61.9(2), 54.7, 23.3, 20.7(2), 20.6.
MS (ESI) m/z = 886 [M+ Na]+。
【００４３】
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブタニル−２−デオキシ−２−アセチルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシド
ｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−アセチルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシド（１３８．０ｍｇ、０．１６ミリモル）をＭｅＯＨ（５ｍＬ）に溶解し、そして５％Ｐｄ／Ｃ（１０ｍｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下に置き、１時間撹拌した。その後、セライトでろ過し、エタノールを減圧下に除去して、水素化生成物を定量的収率で得た。得られた化合物（１３８．０ｍｇ、０．１６ミリモル）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解した溶液に、Ｋ２ＣＯ３（６６．０ｍｇ、０．４８ミリモル）を添加し、反応混合物を２時間撹拌した。その後、混合物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５イオン交換樹脂で中性化し、そしてろ過した。溶媒を減圧下に除去し、そして所望の生成物を白色の固体として得た（１１８ｍｇ、０．１６ミリモル、１００％）。
【００４４】
Rf: 0.23 (メタノール／酢酸エチル／ヘキサン:2/2/3).
1H NMR (MeOD, 400 MHz): δ (ppm) 4.41 (d, 1H, J = 8.4 Hz), 3.89-3.83 (m, 2H), 3.84(dd, 1H, J = 12.4, 1.6 Hz), 3.67-3.63 (m, 2H), 3.47-3.38 (m, 5H), 3.24-3.21 (m, 2H), 2.08-2.01 (m, 2H), 1.95 (s, 3H), 1.61-1.52 (m, 4H).
13C NMR (MeOD, 160 MHz): δ (ppm) 172.3, 101.4, 78.2, 77.9, 77.6, 74.7, 70.7, 64.2, 61.4, 56.0, 25.9, 25.8, 21.6(2).
MS (ESI) m/z = 762 [M + Na]+。
【００４５】
ｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α／β−Ｄ−ガラクトピラノシドトリクロロアセトイミデート（７７．０ｍｇ、０．１６ミリモル）およびｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニルアルコール（６９．０ｍｇ、０．１３ミリモル）をジクロロメタン（２ｍＬ）に溶解し、混合物を−１５℃に冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（１２μＬ、０．０６５ミリモル）を添加し、反応混合物を−１５℃で３０分間撹拌した。反応混合物をトリエチルアミン（０．１ｍＬ）でクエンチングし、そして濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を８０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％ＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去し、そして所望の生成物を無色の油として得た（９９ｍｇ、０．１１ミリモル、９０％）。
【００４６】
Rf: 0.52 (酢酸エチル／ヘキサン:1/1)
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 5.69-5.74 (m, 2H), 5.38 (d, 1H, J = 3.3 Hz, H-1), 5.21 (dd, 1H, J = 10.5, 2.7 Hz), 5.01 (dd, 1H, J = 10.5, 3.3 Hz), 4.48 (d, 1H, J = 7.8 Hz), 4.36-4.41 (m, 1H), 4.04-4.26 (m, 6H), 3.86-3.91 (m, 1H), 2.14 (s, 3H), 2.04 (s, 3H), 2.05(s, 3H), 1.97 (s, 3H).
13C NMR (CDCl3, 160 MHz): δ (ppm) 170.5, 170.4, 170.3, 169.6, 129.4, 128.9, 100.3, 71.1, 70.9, 68.9, 67.2, 66.5, 64.9, 62.1, 62.1, 61.4, 20.9, 20.8(2), 20.7.
MS (ESI) m/z = 887 [M + Na]+。
【００４７】
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブタニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド
ｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（５０ｍｇ、０．０５８ミリモル）をエタノール（３ｍＬ）に溶解し、５％Ｐｄ／Ｃ（１０ｍｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下に置き、１時間撹拌した。その後、セライトでろ過し、エタノールを減圧下に除去して、水素化生成物を定量的収率で得た。得られた化合物（４５ｍｇ、０．０５２ミリモル）をメタノール（３ｍＬ）に溶解した溶液に、Ｋ２ＣＯ３（４ｍｇ、０．０３ミリモル）を添加し、反応混合物を２時間撹拌した。その後、混合物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ−１５イオン交換樹脂で中性化し、そしてろ過した。溶媒を減圧下に除去し、所望の生成物を白色の固体として得た（４０．０ｍｇ、０．０５８ミリモル、１００％）。
【００４８】
Rf: 0.23 (メタノール／酢酸エチル／ヘキサン:2/2/3).
1H NMR (MeOD, 400 MHz): δ (ppm) 4.17 (d, 1H, J = 5.4 Hz), 3.44-3.91 (m, 12H), 2.01(m, 2H), 1.60-1.70 (m, 4H).
13C NMR (MeOD, 160 MHz): δ (ppm) 103.6, 75.2, 73.7, 71.2, 69.2, 69.1, 68.9, 61.4, 61.3, 28.8 (2), 25.9(2).
MS (ESI) m/z = 721 [M + H]+。
【００４９】
アリル−２−Ｏ−ベンジル−３，４−ジ−Ｏ−カルボキシベンジル−α−Ｄ−フコピラノシド
アリル−２−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−フコピラノシド（９１７ｍｇ、３．１２ミリモル）を塩化メチレン（１５ｍＬ）に溶解し、０℃に冷却した。ＴＭＥＤＡ（４３４ｍｇ、３．７４ミリモル）およびベンジルクロロホルメート（１．２０ｇ、６．８６ミリモル）を添加した。反応混合物を０℃で４５分間撹拌し、そして水（１０ｍＬ）でクエンチング処理した。有機層を分離し、水層を塩化メチレンで抽出し（２×４０ｍＬ）、ＨＣｌ（２Ｎ、２０ｍＬ）、ブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥させた。減圧下での溶媒の除去後、粗生成物を、溶出液として２５％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いてシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物を、透明な油状物として得た（１．７ｇ、３．０ミリモル、９２％）。
【００５０】
Rf: 0.48 (酢酸エチル／ヘキサン:1/1)
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.25-7.40 (m, 15 H), 5.88-5.94 (m, 1H), 5.15, 5.36 (m, 8H), 4.82 (d, 1H, J = 4 Hz, H-1), 4.70 (d, 1H, J = 12 Hz), 4.53 (d, 1H, J = 12 Hz), 4.13 - 4.17 (m, 2H), 3.98 (dd, 1H, J = 12.8, 6.4 Hz), 3.90 (dd, 1H, J = 9.6, 3.6 Hz), 1.17 (d, 3H, J = 6.8 Hz). 
13C NMR (CDCl3, 160 MHz): δ (ppm) 155.3, 154.4, 138.2, 135.3, 135.1, 133.7, 128.6, 128.6, 128.5, 128.5, 128.4, 128.1, 127.9, 127.8, 117.9, 96.3, 75.6, 74.3, 73.7, 73.4, 69.9, 69.9, 68.6, 64.3, 15.8.
MS (ESI) m/z = 585[M + Na]+。
【００５１】
２−Ｏ−ベンジル−３，４−ジ−Ｏ−カルボキシベンジル−α−Ｄ−フコピラノース
塩化パラジウム（６８５ｍｇ、３．８７ミリモル）および酢酸ナトリウム（６３５ｍｇ、７．７４ミリモル）を、ＡｃＯＨ／水の混合物（５：１、３６ｍＬ）に溶解した。混合物を市販のマイクロ波オーブン中で８０℃にて５分間加熱した。その後、反応物を８０℃の油浴中に置き、ＡｃＯＨ中のアリル−２−Ｏ−ベンジル−３，４−ジ−Ｏ−カルボキシベンジル−α−Ｄ−フコピラノシド（１．４５ｇ、２．５８ミリモル）をゆっくり添加した。反応混合物を５分間加熱し、そして周囲温度まで冷却した。混合物を水に注ぎ、エーテルで抽出した（２×６０ｍＬ）。有機層を集めて、ＮａＨＣＯ３（２×４０ｍＬ）、水（４０ｍＬ）およびブライン（２０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下に除去し、粗生成物を、溶出液として３２％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いるてシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物を、アノマーの混合物として得た（１．１９ｇ、２．２７ミリモル、８８％）。
【００５２】
Rf: 0.44 (酢酸エチル／ヘキサン:1/1)
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.15-7.36 (m, 19H), 5.12-5.22 (m, 8H), 4.81-4.90(m, 1H), 4.50-4.74 (m, 3H), 4.31-4.49 (m, 0.5H), 3.82-4.24 (m, 3H), 1.21 (d, 0.6H, J =6.4 Hz), 1.15 (t, 3H, J = 6.4 Hz).
13C NMR (CDCl3, 160 MHz): δ (ppm) 137.7, 135.2, 129.2, 129.2, 128.7, 128.7, 128.7, 128.7, 128.7, 128.7, 128.6, 128.6, 128.5, 128.5, 128.5, 128.5, 128.4, 128.4, 128.3, 128.3, 128.3, 128.3, 128.2, 128.1, 128.0, 128.0, 128.0, 97.8, 91.8, 75.6, 75.5, 75.5, 75.2, 74.7, 74.5, 74.3, 74.2, 74.1, 73.9, 73.6, 73.6, 72.7, 70.2, 70.2, 70.2, 70.1, 69.1, 65.0, 64.7, 64.6, 62.6, 43.4, 26.8, 21.9, 16.1, 16.0.
MS (ESI) m/z = 523 [M + H]+。
【００５３】
２−Ｏ−ベンジル−３，４−ジ−Ｏ−カルボキシベンジル−α／β−Ｄ−フコピラノシドトリクロロアセトイミデート
２−Ｏ−ベンジル−３，４−ジ−Ｏ−カルボキシベンジル−α／β−Ｄ−フコピラノース（１．１７ｇ、２．２４ミリモル）をジクロロメタン（１０ｍＬ）に溶解した溶液に、粉末化された４Åのモレキュラーシーブ（１００ｍｇ）およびトリクロロアセトニトリル（２．２ｍＬ、２２．４ミリモル）を添加した。反応物を３０分間撹拌し、そしてＣｓ２ＣＯ３（８０２ｍｇ、２．４６ミリモル）を添加した。反応混合物を更に４５分間撹拌し、そしてセライトでろ過した。溶出液を濃縮し、粗生成物を、溶出液として２８％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いてシリカゲルでのフラッシュカラムクロマトグラフィーによって精製し、生成物を白色の固体として得た（１．４３ｇ、２．１ミリモル、９２％）。
【００５４】
Rf: 0.46 (酢酸エチル／ヘキサン:1/1)
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 8.68 (s, 1H), 7.19-7.39 (m, 15H), 5.78 (d, 1H, J =8.1 Hz), 5.15-5.29 (m, 6H), 4.96 (dd, 1H, J = 9.9, 3.3 Hz), 4.83 (d, 1H, J = 11.0 Hz), 4.67(d, 1H, J = 11.0 Hz), 3.94-4.00 (m, 1H), 1.27 (d, 3H, J = 6.3 Hz).
13C NMR (CDCl3, 160 MHz): δ (ppm) 161.3, 155.4, 154.5, 137.9, 135.2, 135.1, 128.8, 128.8, 128.8, 128.81, 128.8, 128.5, 128.5, 128.4, 127.9, 127.9, 98.1, 77.1, 75.6, 75.4, 74.5, 70.4, 70.3, 69.9, 16.2.
MS (ESI) m/z = 667 [M + H]+。
【００５５】
ｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニル−２−Ｏ−ベンジル−３，４−ジ−Ｏ−カルボキシベンジル−α−Ｄ−フコピラノシド
２−Ｏ−ベンジル−３，４−ジ−Ｏ−カルボキシベンジル−α／β−Ｄ−フコピラノシドトリクロロアセトイミデート（１８５．０ｍｇ、０．２８ミリモル）およびｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニルアルコール（１２３．０ｍｇ、０．２３ミリモル）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した溶液に、粉末化された４Åのモレキュラーシーブ（１０ｍｇ）を添加し、混合物を１５℃に冷却した。ＴＭＳＯＴｆ（４２μＬ、０．２３ミリモル）を添加し、反応混合物を−１５℃で３０分間撹拌した。反応混合物をトリエチルアミン（０．１ｍＬ）でクエンチングし、そして濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を８０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％ＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去し、生成物を無色の油状物として得た（２１５ｍｇ、２０．７ミリモル、９０％）。
【００５６】
Rf: 0.26 (酢酸エチル／ヘキサン:2/3).
1H NMR (CDCl3, 400 MHz): δ (ppm) 7.26-7.36 (m, 15H), 5.72-5.84 (m, 2H), 5.15-5.23(m, 6H), 4.44-4.81 (m, 4H), 4.05-4.23 (m, 6H), 3.66-3.78 (m, 1H), 1.15-1.27 (dd, 3H, J =6.4 Hz).
13C NMR (CDCl3, 160 MHz): δ (ppm) 155.3, 154.4, 138.1, 135.2, 135.1, 128.9, 128.7, 128.6, 128.6, 128.6, 128.4, 128.3, 128.3, 128.2, 128.0, 127.8, 127.7 (2), 96.5, 73.3, 75.5, 74.2, 73.6, 73.5, 70.0, 69.9, 66.4, 64.4, 63.2, 61.9 (2), 26.12), 15.7.
MS (ESI) m/z = 1061 [M + Na]+。
【００５７】
１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブタニル−α−Ｄ−フコピラノシド
ｃｉｓ−１Ｈ，１Ｈ，２Ｈ，２Ｈ−ペルフルオロデシルオキシブテニル−２−Ｏ−ベンジル−３，４−ジ−Ｏ−カルボキシベンジル−α−Ｄ−フコピラノシド（８１ｍｇ、０．０７８ミリモル）をエタノール（３ｍＬ）に溶解し、５％Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下に置き、一晩撹拌した。その後、混合物をセライトでろ過し、エタノールを減圧下に除去して、水素化生成物を定量的収率で得た（８１ｍｇ、０．０７８ミリモル、１００％）。
【００５８】
Rf: 0.28 (メタノール／酢酸エチル／ヘキサン:2/2/3).
1H NMR (MeOD, 400 MHz): δ (ppm) 4.15-4.31 (m, 1H), 3.45-3.98 (m, 11H), 1.62-1.68(m, 4H), 1.23 (dd, 3H, J = 16.8, 6.4 Hz).
13C NMR (MeOD, 160 MHz): δ (ppm) 99.1, 72.3, 70.6, 70.3, 68.6, 67.4, 66.1, 64.3 (2), 26.1(2), 15.2.
MS (ESI) m/z = 705 [M] + Na]+。
【００５９】
実施例４
炭水化物マイクロアレイの作製
この研究では、ラビノース、ラムノース、ラクトース、マルトース、およびグルコサミンの、単一のＣ８Ｆ１７尾部でのタグ付け、かかるタグの拡張炭水化物マイクロアレイへの組み込み、そしてフルオラス化学に基づくマイクロアレイ法の範囲を試験するためのこのマイクロアレイの２種類のレクチンに対するスクリーニングについて説明する。
【００６０】
フレキシブルなグルコサミン部分を得るために、Ｎ−ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニル保護グルコサミンドナー１２を選択した。かかるドナーは、容易に得られ、水素化分解によって簡単に脱保護されて、遊離アミンを形成し、そして更に、水素化分解反応中に無水酢酸を添加することにより、ワンポットで所望のＮ−アセトアミド修飾アナログに直接変換され得る。従って、３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノ）−α／β−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミデート（１２）とフルオラスアルコールとの、活性剤としてトリメチルシリルトリフレートを用いたグリコシル化反応により、所望のフルオラスタグ付け化合物（１３）を８４％の収率で得た。化合物１３を塩基性条件下に脱アセチル化して化合物１４を得て、これにより、メタノール中での水素化分解時に、３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−２−デオキシ−２−アミノ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４）を９４％の収率で得た（スキーム２）。あるいは、メタノール中で無水酢酸を用いて行う場合、１４の水素化分解により、３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−２−デオキシ−２−アシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）を８２％の収率で得た（スキーム２）。
【化４】
2008532045.tif 000005
【００６１】
同様に、フルオラスアルコール３のグリコシル化反応は、Ｄ−マンノース１５［１９］、Ｄ−ガラクトース１６［２０］、Ｌ−アラビノース１７［２１］、Ｌ−ラムノース１８［２２］、Ｄ−ラクトース１９［２３］、およびＤ−マルトース２０［２４］の公知のトリクロロアセトイミデートドナーを用いて行われ、これによりフルオラスタグ付けされたグリコシド２１〜２６を得た。全ての中間体のアルケン水素化後、全体を脱アシル化して、マイクロアレイの形成に用いられる所望の化合物６〜１１を得た（スキーム３）。
【化５】
2008532045.tif 000006
【００６２】
フルオラスタグ付けされた炭水化物を用いて、繰り返しの洗浄後でさえガラススライドの表面に対して単糖類および二糖類を固定する単一のＣ８Ｆ１７尾部の能力を試験した。フルオラスタグ付けされた炭水化物４〜１１を８０％メタノール／水に溶解し、ＤＮＡアレイ化に使用される標準的なロボットを用いてフルオロアルキルシラン誘導化ガラススライドにスポットした。その後、スライドを、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳバッファー）（０．２５Ｍ）中のTriticum vulgaris由来の市販のＦＩＴＣ（フルオレセインイソチオシアネート）標識レクチン（麦芽、ＦＩＴＣ−ＷＧＡ）およびＰＢＳバッファー（０．５Ｍ）中のArachis hypogaea由来の市販のＦＩＴＣ標識レクチン（ラッカセイ、ＦＩＴＣ−ＰＮＡ）と共に３０分間インキュベートし、そしてアッセイバッファーで繰り返しリンスし、次に蒸留水でリンスした。乾燥後、スライドを４８８ｎｍにて標準的な蛍光スライドスキャナーでスキャンして、これら２種類のレクチンの炭水化物結合特異性を明らかにした。予想される通り、麦芽のレクチンであるＷＧＡは、フルオラスタグ付けＮ−アセチルグルコサミン（５）だけに結合した。対照的に、ラッカセイのレクチンであるＰＮＡは、アレイ実験においてガラクトース（７）とラクトース（１０）の両方に結合した。このレクチンは、ガラクトースに、単独で、およびラクトースの二糖類と関連しての両方にて結合することが知られている。この実験から、二糖類は、炭水化物結合特異性に関するタンパク質のスクリーニングに必要な条件下で、フルオラス誘導化ガラススライド上に保持されることが明確に示される。
【００６３】
結論として、フルオラス誘導化ガラススライドにおける炭水化物の非共有的な固定化による、炭水化物マイクロアレイの容易な製造のための本明細書に記載の新規な方法は、単糖類にも拡張可能であることは明らかである。２種類のレクチンに対する炭水化物マイクロアレイのスクリーニングでは、非共有的なフルオラス−フルオラス相互作用が生物学的アッセイ条件下で単糖類および二糖類を保持するのに十分であることを実証している。更に、フルオラスタグは、合成中に精製を容易にするので、このようなマイクロアレイのアプローチは、合成炭水化物ライブラリーのスクリーニングに対して特に価値がある。
【００６４】
実験
一般的な実験手順
ジクロロメタンを使用前に水素化カルシウムから蒸留した。Ａｍｂｅｒｌｙｓｔ１５イオン交換樹脂を使用前にメタノールで繰り返し洗浄した。全ての他の市販の試薬および溶媒を、更に精製することなく購入したままの状態で使用した。
【００６５】
反応をモニタリングし、０．２５ｍｍのＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅシリカゲルプレート（６０Ｆ−２５４）での分析用薄層クロマトグラフィー（ｔｌｃ）を用いてＲｆ値を測定した。得られたｔｌｃプレートを、ｐ−アニスアルデヒド溶液に浸漬し、次に、ホットプレートで加熱することによって可視化した。３２〜６３μｍの粒径のＳｅｌｅｃｔｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃシリカゲルを用いてフラッシュクロマトグラフィーを行った。フルオラス相クロマトグラフィーを、ペルフルオロオクチルエチルシリル鎖と結合したシリカゲルを含むフルオラス固相抽出カートリッジ（Fluorous Technologies, Inc.; Pittsburgh, PA）を用いて行った。全ての他のフルオラス試薬もまた、Fluorous Technologies, Incから入手した。全ての感湿反応は、窒素雰囲気下、火力またはオーブン乾燥ガラス器具において行った。浴温度を用いて、反応温度を記録した。全ての反応物質を、別に示さない限り、周囲温度で、マグネチックスターラーを用いて撹拌した。
【００６６】
１Ｈ ＮＭＲおよび１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、それぞれ４００ＭＨｚ、１００ＭＨｚおよび１６２ＭＨｚにてＢｒｕｃｋｅｒ ＤＲＸ４００を用いて取得した。１Ｈスペクトルは、内部参照としてのＣＤＣｌ３（７．２７ｐｐｍ）またはＣＤ３ＯＤ（４．８０ｐｐｍ）に対して１００万（δ）毎に分けて報告した。１３Ｃ ＮＭＲスペクトルは、ＣＤＣｌ３（７７．２３ｐｐｍ）またはＣＤ３ＯＤ（４９．１５ｐｐｍ）に対して１００万（δ）毎に分けて報告した。
【００６７】
マイクロアレイの作製およびスクリーニング
フルオラスタグ付けされた炭水化物化合物を８０％メタノール／水に溶解し（２ｍＭ）、そして３０％の湿度で、ロボット化スポッター（Cartesian PixSys 5500 Arrayer, Cartesian Technologies, Inc., Irvine, CA）を用いて清浄なフッ素化ガラススライドにスポットした。ガラススライドを、３０％の湿度で、加湿チャンバー内で２時間乾燥させた。
【００６８】
ＰＢＳバッファー（ｐＨ＝７．３〜７．４、２．３５ｍＭのＣａＣｌ２、０．８５ｍＭのＭｇＣｌ２、１１４ｍＭのＮａＣｌ、４ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、１５ｍＭのＮａＨＣＯ３、１１．１ｍＭのグルコース；ＰＮＡの場合には０．５ＭおよびＷＧＡの場合には０．２５Ｍ）中のＦＩＴＣ標識ＰＮＡまたはＷＧＡ（EY Laboratories, Inc., San Mateo, CA）を、タンパク質−炭水化物相互作用の検出に用いた。アレイを、ＰＣ５００ ＣｏｖｅｒＷｅｌｌインキュベーションチャンバー（Grace Biolabs, Bend, OR）を用い、タンパク質溶液（０．１ｍＬ）と共にインキュベートし、５分毎に３０分間に亘って穏やかに振盪した。その後、スライドをインキュベーションバッファーで３回洗浄し、次に、蒸留水で３回洗浄した。次いで、スライドを暗条件加湿チャンバー内で３０分間に亘って乾燥させた。スライドを、４８８ｎｍに設定したGeneral Scanning ScanArray 5000を用いてスクリーニングした。
【００６９】
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルメチルスルホネート（２）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパノール１（２．０ｇ、４．２ミリモル）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した溶液に、トリエチルアミン（１．２０ｍＬ、８．３６ミリモル）を添加し、混合物を０℃に冷却した。塩化メシル（０．６４ｍＬ、８．４ミリモル）を５分間かけて滴下し、反応物を２時間で周囲温度まで暖めた。反応物をジクロロメタン（１００ｍＬ）で希釈し、水（４０ｍＬ）、ＨＣｌ（２Ｎ、４０ｍＬ）、およびブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下に除去して、２（２．３２ｇ、１００％）を固体として得た。
【００７０】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 2.05-2.13 (m, 2H), 2.20-2.36 (m, 2H), 3.04 (s, 3H), 4.31 (t, J = 6 Hz, 2H)。
【００７１】
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニルアルコール（３）の合成
ｃｉｓ−１，４−ブテンジオール（０．４８ｇ、５．４ミリモル）、３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルメチルスルホネート（２．３ｇ、４．１６ミリモル）、およびテトラブチルアンモニウムブロミド（０．２７ｇ、０．８３ミリモル）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解した溶液に、粉末化したＫＯＨ（０．４７ｇ、８．３２ミリモル）を添加した。反応混合物を７０℃で１時間加熱し、その後、水（２０ｍＬ）に注いだ。水層を酢酸エチル（２×６０ｍＬ）で抽出し、水（３０ｍＬ）およびブライン（３０ｍＬ）で洗浄し、そしてＭｇＳＯ４で乾燥した。溶媒を減圧下に除去した。粗生成物を、溶出液として２７％ＥｔＯＡｃ／ヘキサンを用いてシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィーによって精製して、３（１．５７ｇ、７０％）を黄色の油状物として得た。
【００７２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.78-1.88 (m, 2H), 2.04-2.19 (m, 2H), 2.99 (s, 1H), 3.45 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 4.0 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 4.13 (d, J = 6.3 Hz, 2H), 5.57-5.65 (m, 1H), 5.70-5.78 (m, 1H). 13C NMR (75, MHz, CDCl3): δ 20.8, 28.0, 58.4, 66.4, 68.9, 127.9, 132.3。
【００７３】
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノ）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１３）の合成
３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノ）−α／β−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミデート（１２）（１．６８ｇ、２．７ミリモル）および３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニルアルコール（３）（１．０ｇ、１．８ミリモル）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した溶液に、ＴＭＳＯＴｆ（０．１６ｍＬ、０．９ミリモル）を−１５℃にて添加した。反応混合物を−１５℃で３０分間撹拌した。反応物をトリエチルアミン（０．２ｍＬ）でクエンチングし、そして濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を８０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％ＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去して、１３（１．５３ｇ、８４％）を固体として得た。
【００７４】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.50 - 2.40 (m, 4H), 1.98, 2.02, 2.08 (3s, 9H), 3.50 (t, J = 6.0Hz, 2H), 4.00 (d, 1H, J = 5.0 Hz, 2H), 4.04 - 4.40 (m, 4H), 4.66 (s, 1H), 4.94 (s, 1H), 5.06 (t, J = 9.4 Hz, 1H), 5.14 - 5.30 (m, 3H), 5.50 - 5.70 (m, 2H), 7.48 (d, J = 8.3 Hz, 2H), 8.20 (d, J = 8.8 Hz, 2H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 20.6, 20.7, 20.8, 20.9, 28.0, 56.3, 62.3, 65.4, 66.5, 68.9, 69.0, 71.9, 72.3, 99.7, 123.8, 128.0, 130.5, 144.1, 147.7, 155.6, 169.6, 170.8. MS (ESI) m/z 1037 (M+Na)+。
【００７５】
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２−デオキシ−２−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノ）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１４）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−３，４，６−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノ）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１３）（１．４ｇ、１．４ミリモル）をメタノール（１５ｍＬ）に溶解した溶液に、ＮａＯＭｅ（７０ｍｇ）を添加し；反応混合物を周囲温度で３時間撹拌した。反応物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５イオン交換樹脂で中性化し、そしてろ過した。溶媒を減圧下に除去して、１４（１．２ｇ、９８％）を固体として得た。
【００７６】
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.70 - 1.90 (m, 2H), 2.10 - 2.40 (m, 2H), 3.10 - 3.50 (m, 7H), 3.54 - 3.66 (m, 1H), 3.90 (d, J = 10.4 Hz, 1H), 4.06 (d, J = 5.0 Hz, 1H), 4.20 - 4.50 (m, 3H), 5.10 - 5.40 (m, 2H) 5.50 - 5.80 (m, 2H), 7.60 (d, J = 8.2 Hz, 2H), 8.20 (d, J = 8.5 Hz, 2H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 21.0, 28.0, 58.1, 61.9, 64.7, 65.1, 66.7, 68.8, 71.3, 75.1, 77.2, 101.0, 123.6, 128.1, 128.6, 130.0, 145.4, 147.9, 157.7, 169.5. MS (ESI) m/z 911 (M+Na)+。
【００７７】
４．７  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−２−デオキシ−２−アミノ−β−Ｄ−グルコピラノシド（４）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２−デオキシ−２−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノ）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１４）（６０ｍｇ、０．０７ミリモル）をメタノール（２ｍＬ）に溶解した溶液に、５％Ｐｄ／Ｃ（７ｍｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下で周囲温度にて２時間撹拌した。その後、反応物をセライトでろ過し、溶媒を減圧下に除去して、４（４５ｍｇ、９４％）を固体として得た。
【００７８】
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.60 - 1.90 (m, 6H), 2.10 - 2.40 (m, 2H), 2.50 - 2.80 (m, 2H), 3.30 - 3.70 (m, 12H), 3.86 (d, J = 11.4 Hz, 1H), 3.92 - 4.08 (m, 1H), 4.34 (d, J = 8.2 Hz, 1H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 20.7, 26.2, 26.3, 27.7, 57.2, 61.5, 68.8, 69.3, 70.5, 70.6, 76.5, 76.9, 103.5. MS (ESI) m/z 734 (M+Na)+。
【００７９】
４．８  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−２−デオキシ−２−アシルアミノ−β−Ｄ−グルコピラノシド（５）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２−デオキシ−２−（ｐ−ニトロベンジルオキシカルボニルアミノ）−β−Ｄ−グルコピラノシド（１４）（４０ｍｇ、０．０４ミリモル）をメタノール（０．５ｍＬ）および無水酢酸（１．０ｍＬ）に溶解した溶液に、５％Ｐｄ／Ｃ（４ｍｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下で周囲温度にて１３時間撹拌した。その後、反応混合物をセライトでろ過し、そして溶媒を減圧下に除去して、５（２８ｍｇ、８２％）を固体として得た。
【００８０】
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.40 - 1.74 (m, 4H), 1.80 - 1.90 (m, 2H), 1.98 (s, 3H), 2.10 - 2.40 (m, 4H), 3.20 - 3.80 (m, 14H), 3.80 - 4.10 (m, 2H), 4.38 (d, J = 8.4 Hz, 1H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD): δ 20.7, 21.8, 26.0, 26.1, 26.2, 27.7, 29.2, 56.2, 61.6, 61.7, 68.8, 68.9, 69.1, 70.5, 70.6, 70.9, 74.9, 76.8, 101.5, 172.8。
【００８１】
４．９  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２−Ｏ−アセチル−３，４，６−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（２１）の合成
２−Ｏ−アセチル−３，４，６−Ｏ−ベンジル−α／β−Ｄ−マンノピラノシルトリクロロアセトイミデート（１５）（０．３７ｇ、０．５８ミリモル）および３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニルアルコール（３）（０．２１ｇ、０．３８ミリモル）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解した溶液に、ＴＭＳＯＴｆ（１４μＬ、０．０７７ミリモル）を５℃にて添加した。反応混合物を５℃で３０分間撹拌した。反応物をトリエチルアミン（０．０５ｍＬ）でクエンチングし、そして濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を８０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％ＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去して、２１（０．３６ｍｇ、９２％）を粘稠な黄色の油状物として得た。
【００８２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.80-1.88 (m, 2H), 2.11-2.27 (m, 2H) (s, 3H), 3.43 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.75-3.92 (m, 4H), 4.01-4.04 (m, 3H), 4.07-4.15 (m, 1H), 4.19-4.26 (m, 1H), 4.45-4.58 (m, 3H), 4.70 (dd, J = 9.9 Hz, 12.0 Hz, 2H), 4.88 (dd, J = 6.6 Hz, 8.4 Hz, 2H), 5.35-5.41 (m, 1H), 5.64-5.77 (m, 2H), 7.15-7.36 (m, 15H). 13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 20.1, 61.7, 65.4, 67.6, 67.7, 67.9, 70.5, 70.7, 72.4, 73.3, 74.2, 77.2, 95.8, 126.6, 126.7, 126.8, 126.8, 126.9, 126.9, 127.0, 127.3, 127.4, 129.3, 136.9, 137.1, 137.2, 169.4。
【００８３】
４．１０  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−３，４，６−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（２７）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２−Ｏ−アセチル−３，４，６−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（２１）（０．３６ｇ、０．３５２ミリモル）をメタノール（４ｍＬ）に溶解した溶液に、ＮａＯＭｅ（４０ｍｇ）を添加し、反応混合物を周囲温度で１時間撹拌した。反応物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５イオン交換樹脂で中性化し、そしてろ過した。溶媒を減圧下に除去して、２７（０．３５ｇ、１００％）を黄色の油状物として得た。
【００８４】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.78-1.87 (m, 2H), 2.08-2.23 (m, 2H), 2.53 (s, 1H), 3.40 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.68-3.92 (m, 5H), 4.0-4.12 (m, 4H), 4.18-4.24 (m, 1H), 4.50 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.53-4.65 (m, 2H), 4.68 (d, J = 2.4 Hz, 2 H), 4.82 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 4.92 (d, J = 1.6 Hz, 1H), 5.60-5.75 (m, 2H), 7.15-7.34 (m, 15H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 20.8, 28.0, 62.5, 66.4, 68.3, 68.7, 69.0, 71.2, 72.0, 73.5, 74.3, 75.2, 80.2, 98.3, 127.6, 127.7, 127.8, 128.0, 128.1, 128.3, 128.4, 128.6, 130.2, 137.9, 138.2。
【００８５】
４．１１  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−α−Ｄ−マンノピラノシド（６）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−３，４，６−Ｏ−ベンジル−α−Ｄ−マンノピラノシド（２７）（６０ｍｇ、０．０６１ミリモル）をメタノール（３ｍＬ）に溶解した溶液に、１０％Ｐｄ／Ｃ（２０ｍｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下で周囲温度にて１２時間撹拌した。その後、反応混合物をセライトでろ過し、溶媒を減圧下に除去して、６（４４ｍｇ、１００％）を固体として得た。
【００８６】
1H NMR (400 MHz, CD3OD): δ 1.60-1.69 (m, 4H), 1.80-1.89 (m, 2H), 2.18-2.33 (m, 2H), 3.40-3.88 (m, 12H), 4.74 (m, 1H). 13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 20.8, 26.2, 26.4, 27.6, 61.6, 67.1, 67.4, 68.8, 70.5, 71.1, 71.4, 73.5, 101.2。
【００８７】
４．１２  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２２）の合成
２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α／β−Ｄ−ガラクトピラノシルトリクロロアセトイミデート（１６）（１００ｍｇ、０．２０ミリモル）および３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニルアルコール（３）（７５ｍｇ、０．１４ミリモル）をジクロロメタン（３ｍＬ）に溶解した溶液に、ＴＭＳＯＴｆ（５μＬ、０．０２７ミリモル）を−１５℃にて添加した。反応混合物を−１５℃で３０分間撹拌した。反応物をトリエチルアミン（０．０５ｍＬ）でクエンチングし、そして濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を８０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％ＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去して、２２（９７ｍｇ、８０％）をシロップとして得た。
【００８８】
1H NMR (400 MHz, CDCl3,): δ 1.82-1.89 (m, 2H), 1.95, 2.02, 2.03 (3s, 9H), 2.08-2.24 (m, 2H) (s, 3H), 3.46 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.86 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.01 (t, J = 5.2 Hz, 1H), 4.10-4.23 (m, 4H), 4.34 (dd, J = 5.6, 10.0 Hz, 1H), 4.75 (d, J = 8 Hz, 1H), 4.99 (dd, J = 3.6, 10.4 Hz, 1H), 5.19 (dd, J = 8.0, 10.4 Hz, 1H), 5.36 (d, J = 3.6 Hz, 1H), 5.60-5.76 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 20.5, 20.6, 20.7, 20.8, 20.9, 61.2, 64.7, 66.5, 67.0, 68.7, 68.8, 70.7, 70.9, 76.7, 100.1, 127.8, 130.2, 169.4, 170.1, 170.2, 170.3。
【００８９】
４．１３  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（７）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（２２）（９７ｍｇ、０．１１０ミリモル）をメタノール（３ｍＬ）に溶解した溶液に、５％Ｐｄ／Ｃ（２５ｍｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下で周囲温度にて２時間撹拌した。その後、反応混合物をセライトでろ過し、溶媒を減圧下に除去した。生成物を、次の工程で直接使用した。３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド（９７ｍｇ、０．１１０ミリモル）をメタノール（３ｍＬ）に溶解した溶液に、ＮａＯＭｅ（１５ｍｇ）を添加し、そして反応混合物を周囲温度で２時間撹拌した。反応物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５イオン交換樹脂で中性化し、そしてろ過した。溶媒を減圧下に除去して、７（７５ｍｇ、９８％）を固体として得た。
【００９０】
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.62-1.71 (m, 4H), 1.79-1.87 (m, 2H), 2.11-2.36 (m, 2H), 3.22-3.34 (m, 1H), 3.41-3.63 (m, 6H), 3.70-3.74 (m, 3H), 3.81-3.99 (m, 2H), 4.20 (d, J = 6.9 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 26.1, 26.2, 26.3, 53.3, 61.9, 69.2, 69.3, 69.4, 71.1, 72.6, 74.1, 76.2, 114.4。
【００９１】
４．１４  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−アラビノピラノシド（２３）の合成
２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α／β−Ｌ−アラビノシルトリクロロアセトイミデート（１７）（０．２７ｇ、０．６４ミリモル）および３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニルアルコール（３）（０．１５ｇ、０．２８ミリモル）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した溶液に、ＴＭＳＯＴｆ（０．０２５ｍＬ、０．１４ミリモル）を周囲温度にて添加した。反応混合物を周囲温度で１５分間撹拌した。反応物をトリエチルアミン（０．５ｍＬ）でクエンチングし、そして濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を５０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％ＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去して、２３（０．２ｇ、８９％）を固体として得た。
【００９２】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.80 - 1.95 (m, 2H), 2.0 - 2.3 (m, 2H), 2.00, 2.02, 2.11 (3s, 9H), 3.46 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.61 (d, J = 1.9 Hz, 1H), 3.97 - 4.03 (m, 3H), 4.20 (dd, J = 6.3, 12.6 Hz 1H), 4.36 (dd, J = 5.7, 12.6 Hz, 1H), 4.41 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 5.02 (dd, J = 3.6, 9.3 Hz, 1H), 5.13 (dd, J = 4.2, 6.6 Hz, 1H), 5.23 (m, 1H), 5.60 - 5.75 (m, 2H). 13C NMR (75MHz, CDCl3): δ 20.9, 21.0, 21.1, 19.9, 61.6, 64.7, 66.7, 67.8, 69.0, 69.3, 70.3, 91, 92, 100.0, 128.2, 130.1, 169.7, 170.4, 170.6。
【００９３】
４．１５  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−α−Ｌ−アラビノピラノシド（８）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−アラビノピラノシド（２３）（０．１ｇ、０．１２ミリモル）をメタノール（１０ｍＬ）に溶解した溶液に、５％Ｐｄ／Ｃ（０．２５ｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下で周囲温度にて２時間撹拌した。その後、反応混合物をセライトでろ過し、そして減圧下に部分的に濃縮した。この溶液に対して、Ｋ２ＣＯ３（６７ｍｇ）を添加し、混合物を周囲温度で３時間撹拌した。反応混合物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５イオン交換樹脂で中性化し、そしてセライトでろ過した。溶媒を減圧下に除去して、８（６８ｍｇ、８０％）を固体として得た。
【００９４】
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.80 - 1.95 (m, 2H), 2.1 - 2.3 (m, 2H), 3.4 - 3.9 (m, 14H), 4.17(d, J = 4.8 Hz, 1H). 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 13.2, 19.6, 20.6, 21.5, 48.8, 56.7, 60.3, 66.7, 67.8, 69.0, 69.3, 102.8. MS (ESI) m/z 682, M+H)+。
【００９５】
４．１６  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−ラムノピラノシド（２４）の合成
２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α／β−Ｌ−ラムノピラノシルトリクロロアセトイミデート（１８）（０．２ｇ、０．４６ミリモル）および３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニルアルコール（３）（０．１３ｇ、０．２３ミリモル）を乾燥ジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した溶液に、ＴＭＳＯＴｆ（０．０２ｍＬ、０．１１ミリモル）を周囲温度にて添加した。反応混合物を１５分間撹拌した。反応物をトリエチルアミン（０．５ｍＬ）でクエンチングし、減圧下に濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を５０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％ＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去して、２４（０．１５ｇ、７６％）を固体として得た。
【００９６】
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 1.24 (d, J = 6.3, 3H), 1.80 - 1.95 (m, 2H), 2.0 - 2.3 (m, 2H), 1.98, 2.04, 2.14 (3s, 9H), 3.46 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.9 (m, 1H), 4.05 (d, J = 5.1 Hz, 2H), 4.06 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 4.15 (dd, J = 4.9, 11.7 Hz, 1H), 4.74 (d, J = 3.0 Hz, 1H), 5.06 (t, J = 9.9 Hz, 1H), 5.21 (m, 1H), 5.28 (dd, J = 0.2, 3.6 Hz, 0.2 1H), 5.65 - 5.8 (m, 2H). 13C NMR (75MHz, CDCl3): δ 17.6, 20.9, 21, 21.01, 21.1, 63.3, 66.6, 66.7, 69.3, 69.5, 70.5, 71.2, 97, 128, 130.5, 170.2, 170.4。
【００９７】
４．１７  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−α−Ｌ−ラムノピラノシド（９）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−２，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−α−Ｌ−ラムノピラノシド（２４）（０．１ｇ、０．１２ミリモル）をメタノール（５ｍＬ）に溶解した溶液に、５％Ｐｄ／Ｃ（２５０ｍｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下で周囲温度にて２時間撹拌した。その後、反応混合物をセライトでろ過し、そして部分的に濃縮した。この溶液に対して、Ｋ２ＣＯ３（６６ｍｇ）を添加し、混合物を周囲温度で３時間撹拌した。反応混合物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５イオン交換樹脂で中性化し、そしてセライトでろ過した。溶媒を減圧下に除去して、９（７０ｍｇ、８２％）を固体として得た。
【００９８】
1H NMR (300 MHz, CD3OD): δ 1.20 (d, J = 6.3 Hz, 3H), 1.80-1.95 (m, 2H), 2.1 - 2.3 (m, 2H), 2.9 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 3.0 (d, J = 7.2, 1H), 3.30 - 3.70 (m, 11H), 3.75 (m, 1H), 4.65 (m, 1H). 13C NMR (75 MHz, CD3OD): δ 16.7, 26.2, 26.4, 67.2, 68.6, 68.9, 70.5, 71.1, 71.2, 72.7, 100.4; MS (ESI) m/z 696 (M+H)+。
【００９９】
４．１８  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（２５）の合成
４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミデート（１９）（０．１７ｇ、０．２２ミリモル）および３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニルアルコール（３）（０．１ｇ、０．１７ミリモル）をジクロロメタン（５ｍＬ）に溶解した溶液に、ＴＭＳＯＴｆ（０．１６ｍＬ、０．９ミリモル）を−１５℃にて添加した。反応混合物を−１５℃で３０分間撹拌した。反応物をトリエチルアミン（０．２ｍＬ）でクエンチングし、そして濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を８０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％ＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去して、２５（０．１２ｇ、５２％）を固体として得た。
【０１００】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.80 - 1.90 (m, 2H), 1.93, 1.98, 2.00, 2.02, 2.08, 2.11 (7s, 21H), 1.90-2.30 (m, 2H), 3.44 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.52 - 3.60 (m, 1H), 3.76 (t, 1H, J = 9.2 Hz, 1H), 3.83 (t, J = 6.8 Hz, 1H), 3.94 - 4.20 (m, 6H), 4.30 (dd, J = 5.6, 12.8 Hz, 1H), 4.42 - 4.52 (m, 3H), 4.85, 4.87 (2d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.92 (dd, J = 3.2, 10.4 Hz, 1H), 5.06, 5.08 (2d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.15 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 5.30 (d, J = 2.8 Hz, 1H), 5.56 - 5.78 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 20.2, 20.3, 20.4, 20.5, 20.6, 20.7, 20.8, 27.9, 60.8, 61.9, 64.8, 66.5, 66.5, 69.1, 70.6, 71.0, 71.6, 72.7, 72.8, 76.2, 76.7, 99.3, 101.1, 127.8, 130.3, 169.1, 169.6, 169.8, 170.1, 170.18, 170.3, 170.4。
【０１０１】
４．１９  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−４−Ｏ−β−Ｄ−ガラクトピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１０）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル）−β−Ｄ−ガラクトピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（２５）（０．１ｇ、０．１ミリモル）をメタノール（５ｍＬ）に溶解した溶液に、５％Ｐｄ／Ｃ（２５０ｍｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下で周囲温度にて２時間撹拌した。その後、反応混合物をセライトでろ過し、減圧下で部分的に濃縮した。この溶液に、Ｋ２ＣＯ３（６６ｍｇ）を添加し、混合物を周囲温度で３時間撹拌した。反応混合物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５イオン交換樹脂で中性化し、セライトでろ過した。溶媒を減圧下に除去して、１０（７５ｍｇ、９９％）を固体として得た。
【０１０２】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.50 - 1.70 (m, 4H), 1.80- 1.90 (m, 2H), 2.10-2.40 (m, 2H), 3.10 - 4.00 (m, 20H), 4.26 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.33 (d, J = 7.2 Hz, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 25.9, 26.1, 27.4, 60.6, 61.1, 68.6, 68.9, 69.2, 70.3, 71.1, 73.4, 73.5, 75.0, 75.1, 75.7, 102.8, 103.7。
【０１０３】
４．２０  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（２６）の合成
４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシルトリクロロアセトイミデート（２０）（０．１６ｇ、０．１８ミリモル）および３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニルアルコール（３）（１．０ｇ、１．８ミリモル）をジクロロメタン（２０ｍＬ）に溶解した溶液に、ＴＭＳＯＴｆ（０．１３ｍＬ、０．１５ミリモル）を−１５℃にて添加した。反応混合物を−１５℃で３０分間撹拌した。反応物をトリエチルアミン（０．２ｍＬ）でクエンチングし、減圧下に濃縮した。粗生成物を、フルオラス固相抽出カートリッジを用いて固相抽出することによって精製した。非フルオラス化合物を８０％ＭｅＯＨ／水で溶出し、所望の生成物を１００％ＭｅＯＨによって溶出した。溶媒を減圧下に除去して、２６（０．１２ｇ、５４％）を固体として得た。
【０１０４】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.80 - 1.90 (m, 2H), 1.96, 1.97, 1.98, 1.99, 2.00, 2.06, 2.10 (7s, 21H), 1.94-2.40 (m, 2H), 3.45 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.60 - 3.70 (m, 1H), 3.84 - 34.08 (m, 5H), 4.10 - 4.26 (m, 3H), 4.30 (dd, J = 5.6, 12.8 Hz, 1H), 4.46 (dd, J = 2.4, 12.0 Hz, 1H), 4.52 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.74 - 4.86 (m, 2H), 5.02 (t, J = 10.0 Hz, 1H), 5.20 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 5.38 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 5.40 - 5.80 (m, 2H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 20.2, 20.3, 20.4, 20.5, 20.6, 20.7, 20.8, 20.9, 27.7, 27.9, 61.5, 62.7, 64.7, 66.5, 68.0, 68.5, 68.8, 69.3, 70.0, 72.0, 72.1, 72.2, 72.6, 75.4,76.7, 95.5, 99.0, 127.6, 130.4, 169.4, 169.6, 169.9, 170.2, 170.4, 170.5。
【０１０５】
４．２１  ３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブタニル−４−Ｏ−β−Ｄ−グルコピラノシル−β−Ｄ−グルコピラノシド（１１）の合成
３−（ペルフルオロオクチル）プロパニルオキシブテニル−４−Ｏ−（２，３，４，６−テトラ−Ｏ−アセチル−α−Ｄ−グルコピラノシル）−２，３，６−トリ−Ｏ−アセチル−β−Ｄ−グルコピラノシド（２６）（０．１２ｇ、０．１ミリモル）をメタノール（５ｍＬ）に溶解した溶液に、５％Ｐｄ／Ｃ（０．２５ｇ）を添加した。反応混合物を水素雰囲気下で周囲温度にて２時間撹拌した。その後、反応混合物をセライトでろ過し、そして減圧下で部分的に濃縮した。この溶液に、Ｋ２ＣＯ３（６６ｍｇ）を添加し、そして混合物を周囲温度で３時間撹拌した。反応混合物をＡｍｂｅｒｌｙｓｔ１５イオン交換樹脂で中性化し、セライトでろ過した。溶媒を減圧下に除去して、１１（９０ｍｇ、９８％）を固体として得た。
【０１０６】
1H NMR (400 MHz, CDCl3): δ 1.52 - 1.70 (m, 4H), 1.74- 1.90 (m, 2H), 2.10-2.40 (m, 2H), 3.10 - 3.38 (m, 4H), 3.40 - 3.70 (m, 12H), 3.72 -4.00 (m, 4H), 4.24 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 5.12 (d, J = 3.2 Hz, 1H). 13C NMR (100 MHz, CDCl3): δ 20.4, 25.9, 26.1, 27.4, 27.6, 60.8, 61.3, 68.6, 69.2, 70.1, 70.3, 72.7, 73.3, 73.4, 75.2, 76.4, 79.9, 101.5, 102.9。
【０１０７】
上述した理由から、本発明は、少なくとも全ての上述した目的を達成することが提示される。
【０１０８】
特定の組成物ならびに方法、効果の理論等を参照しつつ本発明を説明してきたが、本発明はそのような例示的な実施形態またはメカニズムに限定されないことが意図され、そして添付の請求の範囲によって規定される本発明の範囲または精神から逸脱することなく、変更を加えることが可能であることは当業者には明らかであろう。全てのこのように明白な変更および変形は、添付の請求の範囲に規定されている本発明の範囲内に含まれることが意図される。特許請求の範囲は、記載された構成要素およびステップを、そこで意図される目的を満足するのに有用であるいずれの順序においても包含することを意味する。
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月10日(2007.10.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
フルオラスタグ付けされたプローブに非共有結合することが可能なフルオラス表面を有する基板を含んでなる、フルオラスタグ付けされたプローブを検出するためのマイクロアレイ。
【請求項２】
前記フルオラスタグ付けされたプローブが、タンパク質、タンパク質断片、ヌクレオチド、炭水化物、分子複合体、反応性複合体、脂質、脂肪酸、ステロイド、薬物、細胞、組織、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項３】
前記基板が、シリカ、ガラス、金属、プラスチック、およびポリマーからなる群より選択される、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項４】
前記基板がテフロンでコーティングされている、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項５】
前記基板が、スライド、プレート、およびウェルからなる群より選択される、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項６】
少なくとも１種のフルオラスタグ付けされたプローブをさらに含む、請求項１に記載のマイクロアレイ。
【請求項７】
前記プローブが、フルオラスレブリナート（fluorous levulinate）およびフルオラスアリルリンカーからなる群より選択される化合物を用いてタグ付けされている、請求項６に記載のマイクロアレイ。
【請求項８】
フルオラス基を有する化合物を基板表面で反応させて、プレートまたはスライド上にフルオラス表面を形成させるステップ；および該フルオラス表面にフルオラスタグ付けしたプローブを結合させるステップを含む、マイクロアレイの形成方法。
【請求項９】
前記基板をフルオラス溶液に浸漬する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記フルオラス溶液がRf8試薬である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記Rf8試薬がRf8-エチル-SiCl3である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
フルオラス表面を有する基板を用意するステップ；フルオラスタグ付けしたプローブをスポット領域中に固定化することにより、マイクロアレイを用意するステップ；前記プローブと、標的物質を含有するサンプルとを接触させることにより、該プローブと該標的物質とを反応させるステップ；および該標的物質と該プローブとの反応を検出するステップを含む、標的物質の検出方法。
【請求項１３】
前記プローブが、タンパク質、タンパク質断片、ヌクレオチド、炭水化物、分子複合体、反応性複合体、脂質、脂肪酸、ステロイド、薬物、細胞、組織、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
フルオラスレブリナートを含む化合物の合成およびアレイ化を促進するために用いる化合物。
【請求項１５】
フルオラスアリルリンカーを含む化合物の合成およびアレイ化を促進するために用いる化合物。
【請求項１６】
１以上のフルオラスタグ付けされたプローブに非共有結合することが可能なフルオラス表面を有する基板であって、該フルオラスタグ付けされたプローブが炭水化物である基板を含んでなる、フルオラスタグ付けされたプローブを検出するための炭水化物マイクロアレイ。
【請求項１７】
表面上で空間的に分離した様式で、１以上のフルオラスタグ付けされたプローブに非共有結合することが可能なフルオラス表面を有する基板を含んでなる、フルオラスタグ付けされたプローブを検出するためのマイクロアレイ。
【請求項１８】
前記フルオラスタグ付けされたプローブが、タンパク質、タンパク質断片、ヌクレオチド、炭水化物、分子複合体、反応性複合体、脂質、脂肪酸、ステロイド、薬物、細胞、組織、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項１９】
前記基板が、シリカ、ガラス、金属、プラスチック、およびポリマーからなる群より選択される、請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２０】
前記基板が、スライド、プレート、およびウェルからなる群より選択される、請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２１】
少なくとも１種のフルオラスタグ付けされたプローブをさらに含む、請求項１７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２２】
前記プローブが、フルオラスレブリナート（fluorous levulinate）およびフルオラスアリルリンカーからなる群より選択される化合物を用いてタグ付けされている、請求項２１に記載のマイクロアレイ。
【請求項２３】
フルオラスタグ付けされたプローブに非共有結合することが可能なフルオラス表面を有する基板であって、該プローブの各々が単一のフルオラスタグを有する基板を含んでなる、フルオラスタグ付けされたプローブを検出するためのマイクロアレイ。
【請求項２４】
前記フルオラスタグ付けされたプローブが、タンパク質、タンパク質断片、ヌクレオチド、炭水化物、分子複合体、反応性複合体、脂質、脂肪酸、ステロイド、薬物、細胞、組織、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項２３に記載のマイクロアレイ。
【請求項２５】
前記基板が、シリカ、ガラス、金属、プラスチック、およびポリマーからなる群より選択される、請求項２３に記載のマイクロアレイ。
【請求項２６】
前記基板が、スライド、プレート、およびウェルからなる群より選択される、請求項２３に記載のマイクロアレイ。
【請求項２７】
少なくとも１種のフルオラスタグ付けされたプローブをさらに含む、請求項２３に記載のマイクロアレイ。
【請求項２８】
前記プローブが、フルオラスレブリナート（fluorous levulinate）およびフルオラスアリルリンカーからなる群より選択される化合物を用いてタグ付けされている、請求項２７に記載のマイクロアレイ。
【請求項２９】
フルオラス基を有する化合物を基板表面で反応させて、プレートまたはスライド上にフルオラス表面を形成させるステップ；および該フルオラス表面に、空間的に分離した様式でフルオラスタグ付けしたプローブを結合させるステップを含む、マイクロアレイの形成方法。
【請求項３０】
前記基板をフルオラス溶液に浸漬する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記フルオラス溶液がRf8試薬である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記Rf8試薬がRf8-エチル-SiCl3である、請求項３１に記載の方法。
【国際調査報告】
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