(57)【要約】  本発明は、ポリヌクレオチドワクチンのための新規アジュバントを提供し、具体的には、本発明は、免疫応答を誘導することができる抗原をコードするポリヌクレオチドと、免疫刺激量のジェミニ界面活性剤、またはその誘導体を含むアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。本発明はさらに、ジェミニ界面活性剤化合物を含む組成物を含むか、またはそれと共に投与されるポリヌクレオチドワクチンを含む。本発明のポリヌクレオチドワクチンは、免疫応答を生じることが望ましい抗原をコードするワクチンであり、具体的には、このポリヌクレオチドワクチンはDNAワクチンであってよい。また、本発明は、前記ポリヌクレオチドワクチンによりコードされる特定の抗原に対する免疫応答を増強するためのポリヌクレオチドワクチン組成物の製造における、ジェミニ界面活性剤の使用である。ワクチン組成物、別々の投与または同時的投与のための別々のポリヌクレオチド組成物およびアジュバント組成物を含むキット、ワクチンおよびキットの製造方法、ならびに本発明の免疫原性組成物およびワクチンを用いた個体の治療方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫応答を誘導することができる抗原をコードするポリヌクレオチドと、免疫刺激量のジェミニ界面活性剤、またはその誘導体を含むアジュバントとを含む免疫原性組成物。
【請求項２】
前記アジュバントが、スペルミンに基づく親水性頭部基に連結された2個の炭化水素鎖を含むもの；スペルミジンに基づく親水性頭部基に連結された2個の炭化水素鎖を含むもの；ペンタミンに基づく親水性頭部基に連結された2もしくは3個の炭化水素鎖を含むもの、および親水性頭部基にエステル結合により連結された2個の炭化水素鎖を含むものから選択されるジェミニ界面活性剤である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
前記アジュバントが、親水性頭部基に連結された2個の炭化水素鎖を含むジェミニ界面活性剤である、請求項１または２に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
前記アジュバントが、エステル結合により親水性頭部基に連結された2個の炭化水素鎖を含むジェミニ界面活性剤である、請求項１、２または３に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記アジュバントが、GS092AおよびGS543Aから選択されるジェミニ界面活性剤である、請求項１、２または３に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、Nef、Gag、RT、Pol、Envまたはその免疫原性誘導体もしくは断片から選択される抗原をコードする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む、該個体における免疫応答を誘導する方法。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を含むワクチン。
【請求項９】
(a)抗原をコードするポリヌクレオチドを含む組成物、および(b)免疫刺激量のジェミニ界面活性剤、またはその誘導体を含むアジュバントを含むキットであって、必要に応じて、2つの組成物を同時に、または別々に投与するための説明書をさらに含む、前記キット。
【請求項１０】
HIVの軽減または治療のための医薬の製造における、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫原性組成物を、HIVに感染した個体に投与することを含む、該個体を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリヌクレオチドワクチンのための新規アジュバントを提供し、具体的には、本発明は、免疫応答を誘導することができる抗原をコードするポリヌクレオチドと、免疫刺激量のジェミニ(gemini)界面活性剤、またはその誘導体を含むアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。
【０００２】
本発明はさらに、ジェミニ界面活性剤化合物を含む組成物を含むか、またはそれと共に投与されるポリヌクレオチドワクチンを含む。本発明のポリヌクレオチドワクチンは、免疫応答を生じることが望ましい抗原をコードするワクチンであり、具体的には、ポリヌクレオチドワクチンはDNAワクチンであってよい。また、本発明は、前記ポリヌクレオチドワクチンによりコードされる特定の抗原に対する免疫応答を増強するためのポリヌクレオチドワクチン組成物の製造におけるジェミニ界面活性剤の使用も提供する。ワクチン組成物、別々のポリヌクレオチド組成物および別々か、または同時の投与のためのアジュバント組成物を含むキット、該ワクチンおよびキットの製造方法、ならびに本発明の免疫原性組成物およびワクチンを用いて個体を治療する方法が提供される。
【背景技術】
【０００３】
ワクチンは、長年に渡って、免疫応答の規模もしくは質を変化させるか、または増加させるような、「アジュバント」と呼ばれる、免疫系に対する直接的または間接的刺激作用を有する物質を含んでいた。アジュバントの使用に関する一般的情報は、Powell, M.F. & Newman, M.J. (編) (1995) Vaccine Design - The Subunit and Adjuvant Approach. Plenum Press, New York and Londonに提供されている。
【０００４】
タンパク質もしくはポリサッカリドワクチン、または一般的には、抗原自身を含むワクチンのためのアジュバントは、1920年代以来知られており、開発されてきた。対照的に、ワクチンが抗原をコードするポリヌクレオチドを含み、ワクチン受容者の宿主細胞における産生を容易にするポリヌクレオチドワクチンは、それ自身、比較的最近開発されたものである。従って、ポリヌクレオチドワクチンアジュバントに関しては必然的にあまり知られていない。ポリヌクレオチドワクチンに関するアジュバント戦略は、サイトカインなどの免疫改変物質と、抗原との同時発現を含むことが多い。最近記載されたポリヌクレオチドワクチンアジュバントとしては、ツセラソール(WO 00/12121)、イミダゾキノリンアミン(WO 02/24225、WO 03/077944)および誘導性一酸化窒素合成酵素(iNOS)阻害剤(WO 03/030935)などの小分子が挙げられる。
【０００５】
界面活性剤は、低い濃度でも液体の表面特性に顕著に影響する物質である。例えば、界面活性剤は、水または水性溶液に溶解した場合、表面張力を有意に低下させ、2つの液体間または液体と固体の間の界面張力を低下させるであろう。界面活性分子のこの特性は、工業、特に、洗剤工業および石油工業において広く活用されてきた。1970年代には、疎水性架橋により連結された極性頭部を有する2つの疎水性鎖を特徴とする、新しいクラスの界面活性分子が報告された(Deinega,Yら、Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974)。「ジェミニ」と呼ばれたこれらの分子(Menger, FMおよびLittau, CA, J.Am.Chem.Soc. 113, 1451, 1991)は、それらのモノマー等価物よりも非常に望ましい特性を有する。例えば、それらは、油と、水に基づく液体との間の界面張力を低下させるのに高度に有効であり、非常に低い臨界ミセル濃度を有する(Menger, FMおよびKeiper, JS, Angewandte. Chem. Int. Ed. Engl., 2000, 39, 1906)。
【０００６】
陽イオン性界面活性剤は、特に、培養中の細胞へのポリヌクレオチドのトランスフェクションに用いられてきたが、遺伝子技術に関与する科学者にとって商業的に入手可能なそのような薬剤の例が存在する(例えば、Promega Corp. WI, USAから入手可能な真核細胞のトランスフェクションのための試薬Tfx(商標)-50)。
【０００７】
遺伝子治療またはアンチセンス治療のための、in vivoでの細胞へのDNAの効率的送達は、数年に渡って主要な目標であった。多くの注目が、送達ビヒクルとしてのウイルス、例えば、嚢胞性線維症(CF)の矯正的遺伝子治療を目的とした気管中の上皮細胞のためのアデノウイルスの使用に対して集中してきた。しかしながら、CF患者における遺伝子導入の成功のいくつかの証拠にも拘らず、アデノウイルス経路は、炎症性副作用および導入された遺伝子の限定的な一過性発現に起因して依然として問題が多い。陽イオン性界面活性剤を用いる研究などの、in vivoでの遺伝子送達のためのいくつかの代替的方法が調査されてきた。Gao, Xら、Gene Ther. 2, 710-722, 1995は、陽イオン脂質を担持するアミンを用いてCFマウスの気道上皮にCF膜貫通伝導性調節因子(CFTR)を導入するための正常なヒト遺伝子を用いるこの手法の実現可能性を証明した。このグループは、リポソームCF遺伝子治療試験をフォローアップし、部分的に成功したに過ぎないが、ヒトにおけるこの手法の可能性を証明した(Caplen, NJ.ら、Nature Medicine, 1, 39-46, 1995)。より最近では、他のグループが、遺伝子送達のための他の陽イオン脂質(Miller, A, Angew. Int. Ed. Engl., 37, 1768-1785, 1998)、例えば、コレステロール誘導体(Oudrhiri, Nら、Proc.Natl.Acad.Sci. 94, 1651-1656, 1997)の可能性を調査してきた。この限定的な研究により、in vitroおよびin vivoの両方において上皮細胞への遺伝子の導入を容易にすることによって、この一般的手法の正当性を支援させるこれらのコレステロールに基づく化合物の能力が証明された。
【０００８】
これらの研究、および他の研究は、細胞に基づく実験におけるトランスフェクションのためにはin vitroで、遺伝子治療およびアンチセンス治療のためにはin vivoで、その両方で細胞へのポリヌクレオチドの効率的導入を容易にする低毒性界面活性分子の開発のための方法をもたらした。システイン(WO 99/29712)またはスペルミン(WO 00/77032)またはジアミン(WO 00/76954)に基づくジェミニ界面活性剤は、以前に作製されている。ジェミニ界面活性剤の他の例は、WO 00/27795、WO 02/30957、WO 02/50100およびWO 03/82809に見出される。ポリヌクレオチドベクターとしてのジェミニ界面活性剤の使用は、最近概説されている(A. J. Kirby, P. Camilleri, J. B. F. N. Engberts, M. C. Feiters, R. J. M. Nolte, O. Soderman, M. Bergsma, P. C. Bell, M. L. Fielden, C. L. Garcia Rodriguez, Philippe Guedat, A. Kremer, C. McGregor, C. Perrin, G. Ronsin and M. C. P. van Eijk, Angew. Chem. Int. Ed., 2003, 42, 1448、また、R. ZanaおよびJ. Xia, Gemini Surfactants, Marcel Dekker, NY, 2004も参照)。
【発明の開示】
【０００９】
本発明は、免疫応答を誘導することができる抗原をコードするポリヌクレオチドと、免疫刺激量のジェミニ界面活性剤、またはその誘導体を含むアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。
【００１０】
本発明の一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、(a)免疫応答を生じることが望ましい抗原をコードするポリヌクレオチドワクチン成分、および(b)免疫刺激量のジェミニ界面活性剤、またはその誘導体を含むアジュバント組成物を含むポリヌクレオチドワクチンの形態にある。
【００１１】
本発明の内容においては、ワクチン抗原をコードするポリヌクレオチドワクチンは、宿主ワクチン受容者の細胞中での該抗原の発現を指令することができる任意のポリヌクレオチドまたはベクターである。このベクターは、前記ワクチン抗原をコードする外来配列を送達する生ウイルスもしくは弱毒化ウイルスベクターまたは細菌ベクターであってよい。
【００１２】
本発明の一態様においては、前記ワクチンは、DNAプラスミドベクターであるポリヌクレオチドベクターを含む。本発明のこの態様においては、プラスミドベクターを、液体形態、もしくは皮膚への弾道送達にとって好適な濃厚マイクロビーズの形態でワクチン受容者に送達するか、または皮膚への弾道送達にとって好適な濃厚マイクロビーズの表面上で製剤化するか、または極微針上にコーティングすることができる。
【００１３】
本発明の他の実施形態においては、本発明のワクチンは、前記ポリヌクレオチドが「乾燥」形態にあり、ジェミニと共に製剤化することができるように、固体の形態にあってもよい。例えば、ポリヌクレオチド抗原およびジェミニは、固体、またはガラス質のマトリックス内の乾燥固体溶液中にあってもよい。そのような実施形態においては、固体マトリックスは、固体形態の炭水化物、または糖であってよい。
【００１４】
本発明の一形態においては、前記ポリヌクレオチドおよびジェミニ化合物を、表皮への弾道送達にとって好適なマイクロビーズの表面上に提供する。
【００１５】
本発明の関連する態様においては、固体ワクチン製剤は、タンパク質抗原およびジェミニ化合物を含んでもよい。さらに、本発明のこの関連する態様においては、タンパク質をジェミニ化合物と共に製剤化することにより、その凍結乾燥形態などの乾燥状態で該タンパク質を安定化する方法が提供される。この製剤および方法は、前記抗原により生じた免疫応答を増強させるさらなる利点を有する。
【００１６】
本発明のワクチンにおけるジェミニ化合物の用量は、前記抗原に対する免疫応答を増強するのに十分である。
【００１７】
本発明のワクチンは、本明細書に記載のアジュバントを含む製剤により、細胞を介する免疫応答などの高度に強力な免疫応答の提供に特に適合している。さらに、本発明のワクチンは、ワクチン中のポリヌクレオチドの安定性が、ジェミニ界面活性剤の存在により増強されるという点で、高度に安定な組成物でもある。本発明のさらなる利点は、ワクチンの体内での潜在的に毒性的なアジュバントの持続に関連する毒性の問題を有さないワクチン／アジュバント組成物の提供である。
【００１８】
本発明のさらなる態様においては、前記免疫原性組成物は、サポニン、または例えば、CpGと共に、1種以上のさらなるアジュバント、例えば、IL-2、GM-CSFもしくはIFN-γなどの免疫刺激性サイトカイン、または例えば、イミキモッド、または例えば、Toll様受容体(TLR)4リガンドを含んでもよい。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明は、免疫応答を誘導することができる抗原をコードするポリヌクレオチドと、免疫刺激量のジェミニ界面活性剤、またはその誘導体を含むアジュバントとを含む免疫原性組成物を提供する。
【００２０】
本発明の一実施形態においては、本発明の免疫原性組成物は、(a)免疫応答を生じることが望ましい抗原をコードするポリヌクレオチドワクチン成分、および(b)免疫刺激量のジェミニ界面活性剤またはその誘導体を含むアジュバント組成物を含むポリヌクレオチドワクチンの形態にある。
【００２１】
本発明の免疫原性組成物および／またはワクチンの一部を形成するポリヌクレオチドエレメントは、好適な形態でワクチンに投与した場合、該ワクチンの細胞中での抗原の発現を駆動することによって、該抗原に対する免疫応答を生成するベクターである。
【００２２】
免疫応答を生じることが望ましい抗原をコードする、本発明の免疫原性組成物および／またはワクチンのベクターまたはポリヌクレオチドエレメントを、宿主細胞によるコード配列の発現を提供することができる制御配列に機能し得る形で連結する、すなわち、該ベクターは発現ベクターである。用語「機能し得る形で連結された」とは、記載の成分がその意図される様式で機能することを許容する関係にある並列を指す。コード配列に「機能し得る形で連結された」プロモーターなどの調節配列は、該コード配列の発現が調節配列と互換性のある条件下で達成されるように配置される。
【００２３】
前記ベクターは、例えば、プラスミド、人工染色体、生もしくは弱毒化細菌、ウイルスまたはファージベクターであってよい。
【００２４】
好適なウイルスベクターの例としては、単純ヘルペスウイルスベクター、ワクシニアまたはアルファウイルスベクターおよびレトロウイルス、例えば、レンチウイルス、ヒトおよびサルアデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスが挙げられる。
【００２５】
本発明の重要な態様においては、前記ポリヌクレオチドは、プロモーター領域およびコード領域を有する発現カセットを含むDNAプラスミドの形態にある。
【００２６】
任意の好適なプロモーターを、本発明のポリヌクレオチドにおいて用いることができる。前記ポリヌクレオチドベクターの一部を形成するプロモーターおよび他の発現調節シグナルを、発現が望ましい宿主細胞と適合するように選択することができる。
【００２７】
例えば、哺乳動物プロモーターとしては、カドミウムなどの重金属に応答して誘導することができるメタロチオネインプロモーター、およびβアクチンプロモーターが挙げられる。SV40ラージT抗原プロモーターなどのウイルスプロモーター；例えば、WO 02/36792に記載のように、エクソン1を含むHCMV IE遺伝子の5'非翻訳領域が含まれる、ヒトサイトメガロウイルス(CMV)極初期(IE)プロモーター；ラウス肉腫ウイルスLTRプロモーター；アデノウイルスプロモーター；またはHPVプロモーターが挙げられ、特に、HPV上流調節領域(URR)を用いることもできる。これらのプロモーターは全て、よく記載されており、当業界では容易に利用可能である。
【００２８】
前記コード領域は、一度、ワクチン受容者の宿主細胞中で発現されたら、免疫応答を生じる抗原をコードする。本発明の一実施形態においては、前記ポリヌクレオチドは、Nef、Gag、RT、Pol、Env、P501、Mage-3、Her-2/Neuのうちの1つ以上またはその免疫原性誘導体もしくは断片をコードし、例えば、一実施形態においては、該ポリヌクレオチドは、1つ以上のHIV抗原、例えば、Gag、Nef、PolもしくはEnv、またはその免疫原性誘導体もしくは断片をコードする。
【００２９】
必要に応じて、前記コード領域、または追加のコード領域は、さらなるアジュバント、例えば、IL-2、GM-CSFまたはIFN-γなどの免疫刺激サイトカインをコードしてもよい。
【００３０】
本発明の一態様においては、ジェミニ界面活性剤またはその塩、溶媒和物、もしくは生理学的に機能的な誘導体、および免疫応答を生じることが望ましい抗原をコードするポリヌクレオチドを含むワクチン組成物が提供される。
【００３１】
本明細書で用いられる、用語「ジェミニ」、「ジェミニ化合物」または「ジェミニ界面活性剤」とは、以下の特性：
(a)それぞれ1個以上のアミノ酸もしくはアミンを含む1または2個の基を含む親水性頭部基；およびそれに連結された、
(b)最大24個の炭素の2または3個の疎水性炭化水素鎖、
を有する化合物を指す。そのようなジェミニ化合物の例は、
a)ペプチドに基づく親水性頭部基(例えば、WO 99/29712に開示されたもの)；
b)炭水化物に基づく親水性頭部基(例えば、WO 00/76854に開示されたもの)；
c)スペルミンに基づく親水性頭部基(例えば、WO 00/77032に開示されたもの)；
d)ジアミンに基づく親水性頭部基(例えば、WO 00/76954に開示されたもの)；
e)ジアミノジカルボン酸誘導体に基づく親水性頭部基(例えば、WO 02/50100に開示されたもの)；
f)ジアミノ酸ポリアミン親水性頭部基(例えば、WO 03/82809に開示されたもの)、
のいずれかに連結された2個の炭化水素鎖を有する化合物である。
【００３２】
そのようなジェミニ化合物のさらなる例としては、スペルミジンに基づく親水性頭部基に連結された2個の炭化水素鎖を含むもの、ペンタミンに基づく親水性頭部基に連結された2または3個の炭化水素鎖を含むもの、およびエステル結合により親水性頭部基に連結された2個の炭化水素鎖を含むものが挙げられ、その例は以下に記載されている。
【００３３】
本発明の一実施形態においては、前記アジュバントは、スペルミンに基づく親水性頭部基に連結された2個の炭化水素鎖を含むもの、スペルミジンに基づく親水性頭部基に連結された2個の炭化水素鎖を含むもの、ペンタミンに基づく親水性頭部基に連結された2個または3個の炭化水素鎖を含むもの、およびエステル結合により親水性頭部基に連結された2個の炭化水素鎖を含むものから選択されるジェミニ界面活性剤であり、例えば、ここで、ジェミニ界面活性剤は親水性頭部基に連結された2個の炭化水素鎖を含み、例えば、炭化水素鎖はエステル結合により親水性頭部基に連結される。本発明の一実施形態においては、ジェミニ界面活性剤はGS092AおよびGS543Aから選択される。
【００３４】
一態様においては、本発明は、本発明の免疫原性組成物を含むワクチンを提供する。そのようなワクチンは、治療または予防設定において有用であり得る。
【００３５】
本発明はさらに、本発明の免疫原性組成物を哺乳動物被験体に投与することを含む、該個体における免疫応答を誘導する方法、例えば、ヒト被験者における免疫応答を誘導する方法を提供する。本発明の一態様においては、該方法は、治療上有効な免疫応答を誘導するためのものである。別の態様においては、該方法は、防御免疫応答を誘導するためのものである。
【００３６】
一実施形態においては、本発明は、HIV、HPV、HCVまたは癌に感染した個体に、本発明による免疫原性組成物を投与することを含む、該個体を治療する方法を提供する。
【００３７】
一実施形態においては、本発明は、HIV、HPV、HCVまたは癌の軽減または治療のための医薬の製造における本発明による免疫原性組成物の使用を提供する。
【００３８】
本発明のさらなる実施形態においては、1種以上のアジュバントまたはアジュバントをコードするポリヌクレオチドを、本発明の免疫原性組成物と同時投与することができる。好適なアジュバントの例としては、GM-CSFおよびイミキモッドなどのTLRアゴニストが挙げられる。イミキモッドは、Aldara(商標)クリーム(3M)として市販されている。これらのアジュバントおよびこれらの2つのアジュバント成分の組合せは、WO2005025614に記載されている。他の好適なアジュバントは、サポニンと組み合わせた、Toll様受容体(TLR)4リガンドを含んでもよい。Toll様受容体(TLR)4リガンドは、例えば、リピドA誘導体、具体的には、モノホスホリルリピドAまたはより具体的には、3-脱アシル化モノホスホリルリピドA(3D-MPL)などのアゴニストであってよい。3D-MPLは、Corixa Corporationにより商標MPL(登録商標)の下で販売されており、主にIFN-g(Th1)表現型を有するCD4+ T細胞応答を促進する。それを、GB 2220211Aに開示された方法に従って製造することができる。化学的には、それは3-脱アシル化モノホスホリルリピドAと3、4、5または6アシル化鎖との混合物である。本発明の一実施形態においては、小粒子3D-MPLを用いることができる。小粒子3D-MPLは、0.22μmフィルターを通して滅菌濾過することができるような粒子径を有する。そのような調製物は、PCT特許出願WO 9421292に記載されている。
【００３９】
また、前記アジュバントは、限定されるものではないが、
PCT特許出願WO 95/14026に記載されたOM174 (2-デオキシ-6-o-[2-デオキシ-2-[(R)-3-ドデカノイルオキシテトラ-デカノイルアミノ]-4-o-ホスホノ-β-D-グルコピラノシル]-2-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]-α-D-グルコピラノシルリン酸二水素)、
WO 9964301およびWO 00/0462に記載されたOM 294 DP (3S,9R)-3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9(R)-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1,10-ビス(リン酸二水素)、
OM 197 MP-Ac DP (3S-, 9R)-3-[(R)-ドデカノイルオキシテトラデカノイルアミノ]-4-オキソ-5-アザ-9-[(R)-3-ヒドロキシテトラデカノイルアミノ]デカン-1,10-ジオール,1-リン酸二水素10-(6-アミノヘキサノエート) (WO 01/46127)、
などのTLR4アゴニストであることが知られているリピドAの1種以上の合成誘導体を含んでもよい。
【００４０】
用いることができる他のTLR4リガンドとしては、限定されるものではないが、WO 9850399もしくは米国特許第6,303,347号(AGPの調製のためのプロセスも開示されている)に開示されたものなどのアルキルグルコサミニドホスフェート(AGP)、または米国特許第6,764,840号に開示されたようなAGPの製薬上許容し得る塩が挙げられる。いくつかのAGPはTLR4アゴニストであり、いくつかはTLR4アンタゴニストである。両方とも本発明の組成物における1種以上のアジュバントとして用いることができる。あるいは、そのような免疫原性組成物は、CpGオリゴヌクレオチドのみ、またはアルミニウム塩と共にCpGオリゴヌクレオチドをさらに含む。
【００４１】
免疫刺激剤の別の例は、非メチル化CpGジヌクレオチドを含む免疫刺激オリゴヌクレオチド(「CpG」)である。CpGは、DNAに存在するシトシン-グアノシンジヌクレオチドモチーフの省略形である。CpGは、全身経路および粘膜経路の両方により投与した場合、アジュバントであるとして当業界で公知である(WO 96/02555, EP 468520, Davisら、J.Immunol, 1998, 160(2):870-876; McCluskieおよびDavis, J.Immunol., 1998, 161(9):4463-6)。歴史的には、BCGのDNA画分は抗腫瘍作用を示すことが観察された。さらなる研究において、BCG遺伝子配列から誘導された合成オリゴヌクレオチドが、免疫刺激作用を誘導することができる(in vitroおよびin vivoの両方において)ことが示された。これらの研究の著者らは、中央CGモチーフなどの特定のパリンドローム配列がこの活性を担持すると結論付けた。免疫刺激におけるCGモチーフの中心的な役割は、Krieg, Nature 374, p546, 1995による刊行物中で後に解明された。詳細な分析により、CGモチーフが特定の配列コンテクストになければならず、そのような配列は細菌DNA中では一般的であるが、脊椎動物DNA中では稀であることが示された。免疫刺激配列は、プリン、プリン、C、G、ピリミジン、ピリミジンであることが多く、ここで、CGモチーフはメチル化されていないが、他の非メチル化CpG配列は免疫刺激的であることが知られており、本発明において用いることができる。
【００４２】
6個のヌクレオチドの特定の組合せ中には、パリンドローム配列が存在する。1個のモチーフの反復または異なるモチーフの組合せとしての、これらのモチーフのうちのいくつかが、同じオリゴヌクレオチド中に存在してもよい。1種以上のこれらの免疫刺激配列を含むオリゴヌクレオチドの存在は、ナチュラルキラー細胞(インターフェロンを産生し、細胞溶解活性を有する)およびマクロファージ(Wooldrigeら、Vol 89(no.8), 1977)などの様々な免疫サブセットを活性化することができる。このコンセンサス配列を有さない他の非メチル化CpG含有配列も、現在では免疫調節的であることが示されている。
【００４３】
ワクチン中に製剤化した場合、CpGを、一般的には、遊離抗原と共に遊離溶液中で投与する(WO 96/02555; McCluskieおよびDavis、上掲)か、または抗原に共有結合させる(WO 98/16247)か、または水酸化アルミニウムなどの担体と共に製剤化する((肝炎表面抗原) Davisら、上掲；Brazolot-Millanら、Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1998, 95(26), 15553-8)。
【００４４】
上記のそのような免疫刺激剤を、例えば、リポソーム、水中油乳濁液、および／またはアルミニウム塩(水酸化アルミニウムなど)などの金属塩などの担体と共に製剤化することができる。例えば、3D-MPLを、水酸化アルミニウム(EP 0 689 454)もしくは水中油乳濁液(WO 95/17210)と共に製剤化することができる；有利には、QS21を、コレステロール含有リポソーム(WO 96/33739)、水中油乳濁液(WO 95/17210)もしくはミョウバン(WO 98/15287)と共に製剤化することができる；CpGを、ミョウバン(Davisら、上掲；Brazolot-Millan、上掲)もしくは他の陽イオン担体と共に製剤化することができる。
【００４５】
本明細書で用いられる用語「生理学的に機能的な誘導体」とは、哺乳動物への投与に際して、それ自身、該ポリヌクレオチドによりコードされた抗原に対する免疫応答を増強することができるか、または体への投与後に、in situで誘導体から形成された分解産物の作用を介して間接的にそうすることができる、本発明のアジュバントの任意の製薬上許容し得る誘導体(例えば、ジェミニ化合物の酸化された窒素原子への、アルキル基、アルケニル基、アルキニル基、アリール基もしくはポリサッカリド基の付加により形成される)を指す。そのような誘導体は、過度の実験を行うことなく、また、生理学的に機能的な誘導体を教示する程度まで、参照により本明細書に組み入れられるものとするBurger's Medicinal Chemistry And Drug Discovery、第5版、Vol 1: Principles and Practiceの教示を参照すれば、当業者には明らかである。
【００４６】
本明細書で用いられる用語「溶媒和物」とは、溶質(本発明においては、ジェミニ化合物またはその塩もしくは生理学的に機能的な誘導体)および溶媒により形成された様々な化学量の複合体を指す。本発明の目的のためのそのような溶媒は、溶質の生物活性を阻害しなくてもよい。
【００４７】
好適な溶媒の例としては、限定されるものではないが、水、メタノール、エタノールおよび酢酸が挙げられる。一実施形態においては、溶媒和物はホウ酸である。
【００４８】
典型的には、本発明の塩は製薬上許容し得る塩である。用語「製薬上許容し得る塩」内に包含される塩とは、本発明の化合物の非毒性塩を指す。本発明の化合物の塩は、式(I)の化合物中の置換基上の窒素から誘導された塩を含んでもよい。代表的な塩としては、以下の塩が挙げられる：酢酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、安息香酸塩、炭酸水素塩、重硫酸塩、重酒石酸塩、ホウ酸塩、臭化物、エデト酸カルシウム、カンシル酸塩、炭酸塩、塩化物、クラブラン酸塩、クエン酸塩、ジヒドロクロリド、エデト酸塩、エジシル酸塩、エストレート、エシレート、フマル酸塩、グルセプテート、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、グリコリラルサニレート、ヘキシルレゾルシネート、ヒドラバミン、ヒドロブロミド、ヒドロクロリド、ヒドロキシナフトエート、ヨウ素、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリン酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、臭化メチル塩、硝酸メチル塩、硫酸メチル塩、マレイン酸一カリウム、ムコ酸塩、ナプシル酸塩、硝酸塩、N-メチルグルカミン、シュウ酸塩、パモ酸塩(エンボナート)、パルミチン酸塩、パントテン酸塩、リン酸塩／二リン酸塩、ポリガラクツロン酸塩、カリウム、サリチル酸塩、ナトリウム、ステアリン酸塩、塩基性酢酸塩、コハク酸塩、テナート、酒石酸塩、テオクラート、トシラート、トリエチオダイド、トリメチルアンモニウム、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタンおよび吉草酸塩。
【００４９】
ジェミニ化合物、またはその誘導体の好適な塩としては、ナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛などの多くの金属が挙げられる。アンモニウム塩およびグアニジニウム塩も知られている。これらの塩を、水と溶媒和させることができる。
【００５０】
本発明の一実施形態においては、ジェミニ界面活性剤は対称性ジェミニである。対称性ジェミニは、2個のアミノ酸またはアミン含有基が親水性頭部基に存在する場合、両方の基が互いに同じであり、全ての疎水性鎖が互いに同じである化合物である。本発明の他の実施形態においては、ジェミニ界面活性剤は非対称形態で存在する。非対称性ジェミニは、2個のアミノ酸またはアミン含有基が親水性頭部基に存在する場合、この2個の基が互いに異なり、例えば、一方の基が、あるアミノ酸に基づくものであり、他方の基が、別のアミノ酸に基づくものであるか、またはあるいは、疎水性炭化水素鎖が異なり、例えば、一方の炭化水素鎖がオレイン酸に由来するものであり、他方がステアリン酸に由来するものである化合物である。非対称性ジェミニはまた、両方のアミノ酸／アミン基が異なり、また両方の疎水性鎖が異なる化合物も包含する。ジェミニ界面活性剤は、その塩、溶媒和物または他の生理学的に活性な誘導体として存在してもよい。
【００５１】
本発明の別の実施形態においては、前記ワクチンアジュバント成分は、2個以上のジェミニ界面活性剤の組合せを含む。従って、2個の成分が存在する場合、アジュバント組成物は2個の対称性もしくは2個の非対称性または1個の対称性と1個の非対称性ジェミニ化合物の組合せを含んでもよい。
【００５２】
一実施形態においては、ジェミニ化合物は、式(I)：
【化１】
2008546733.tif 000002
【００５３】
［式中、R1およびR3は水素であり、同じか、もしくは異なっていてもよいR2およびR4は、水素または
一般式(II)：
【化２】
2008546733.tif 000003
【００５４】
(式中、p1は0〜5であり、p2は1〜5、例えば、1であり；同じか、もしくは異なっていてもよいp3およびp4の値は0〜5、例えば、0であり；
同じか、もしくは異なっていてもよいA1、A3およびA4は、セリン、リジン、オルニチン、トレオニン、ヒスチジン、システイン、アルギニン、チロシン、ジアミノ酪酸(dab)およびジアミノプロピオン酸(dap)から選択されるアミノ酸であり；ならびに
A2は、リジン、オルニチンおよびヒスチジンから選択されるアミノ酸である)
を有する、線状もしくは分枝状の様式で、アミド(CONH)結合により、一緒に連結され、さらに、アミド結合によりスペルミン主鎖に連結された1個以上のアミノ酸から形成されたペプチド基であり；
ならびに同じか、もしくは異なっていてもよいR5およびR6は、最大24個の炭素原子を有し、アミドもしくはアミン(NCH2)結合によりスペルミン主鎖に連結された飽和もしくは不飽和炭化水素基であるか；
または
R1およびR3は水素であり、同じか、もしくは異なっていてもよいR2およびR4は、最大24個の炭素原子を有し、アミドもしくはアミン結合によりスペルミン主鎖に連結された飽和もしくは不飽和炭化水素基であり、ならびに同じか、もしくは異なっていてもよいR5およびR6は、アミド結合によりスペルミン主鎖に連結された式(II)のペプチド基である］
のスペルミンに基づく化合物、またはその塩、例えば、製薬上許容し得る塩である。
【００５５】
本発明の一実施形態においては、R5およびR6は、最大24個の炭素原子を有し、アミドもしくはアミン(NCH2)結合によりスペルミン主鎖に連結された飽和もしくは不飽和炭化水素基であり；R1およびR3は水素であり、R2およびR4は両方ともリジンである。
【００５６】
さらなる実施形態においては、R5およびR6は、最大24個の炭素原子を有し、アミドもしくはアミン(NCH2)結合によりスペルミン主鎖に連結された飽和もしくは不飽和炭化水素基であり；R1、R3およびR2は水素であり、R4はリジンである(p1は1であり、p2、p3およびp4は全て0であり；A1はリジンである)。
【００５７】
さらなる実施形態においては、R5およびR6は、最大24個の炭素原子を有し、アミドもしくはアミン(NCH2)結合によりスペルミン主鎖に連結された飽和もしくは不飽和炭化水素基であり；R1、R3およびR2は水素であり、R4はセリン-リジンである(p1およびp2は両方とも1であり、p3およびp4は両方とも0であり；A1はセリンであり、A2はリジンである)。
【００５８】
本発明における使用のためのスペルミンジェミニを作製する方法は、WO 00/77032に開示されている。
【００５９】
非対称性スペルミンに基づくジェミニを作製するための一般的なスキームを、図26に示す。
【００６０】
別の実施形態においては、ジェミニ化合物は、式(III)：
【化３】
2008546733.tif 000004
【００６１】
(式中、
mは1〜6であり；
qは1〜6であり；
nは1〜10であり；
pは1〜10であり；
R1、R2、R3、R4およびR5は、同じか、もしくは異なっていてもよく、それぞれ水素、RW、もしくは(Aa)xから選択され；
ここで、RWは、そのアミド誘導体として連結された最大24個の炭素原子を有する飽和もしくは不飽和、分枝状もしくは非分枝状脂肪族カルボン酸であり、少なくとも2個のRW基が該分子中に存在し；
それぞれの出現において同じか、もしくは異なっていてもよい(Aa)xは、線状もしくは分枝状の様式で連結された一連のx個の天然もしくは非天然アミノ酸であり；
xは0〜6である)
のペンタミンに基づく化合物、またはその塩、例えば、製薬上許容し得る塩である。
【００６２】
一実施形態においては、mは2または3、例えば、3である。
【００６３】
別の実施形態においては、qは2または3、例えば、3である。
【００６４】
さらなる実施形態においては、nは3〜6、例えば、4である。
【００６５】
さらに別の実施形態においては、pは3〜6、例えば、3である。
【００６６】
(Aa)は、例えば、塩基性アミノ酸である。塩基性アミノ酸の例としては、[H2N(CH2)3]2N(CH2)CO2H、(H2NCH2)2CHCO2H、またはSer、Lys、Orn、Dab (ジアミノ酪酸)もしくはDap (ジアミノプロピオン酸)のLもしくはDエナンチオマーが挙げられる。例えば、アミノ酸(Aa)は、その側鎖中にアミノ基(もしくは必要に応じて、OH基)を含み、合計12個以下の炭素原子、例えば、合計10個以下の炭素原子を含むアミノ酸であってよい。
【００６７】
一実施形態においては、xは1〜4であり、例えば、xは1であってよい。
【００６８】
一実施形態a)においては、R1およびR5は両方ともRWであり、R2、R3およびR4は全て(Aa)x：
【化４】
2008546733.tif 000005
【００６９】
(式中、R1およびR5は独立に、上記で定義されたRWであり、R2、R3およびR4は独立に上記で定義された(Aa)xである)
である。そのような実施形態においては、R1およびR5は、例えば、同じRWであってもよく、R2、R3およびR4は、例えば、同じ(Aa)xであってもよい。
【００７０】
別の実施形態b)においては、R2およびR4はRWであり、R3は水素であり、R1およびR5は(Aa)x：
【化５】
2008546733.tif 000006
【００７１】
(式中、R2およびR4は独立に上記で定義されたRWであり、R1およびR5は独立に上記で定義された(Aa)xである)
である。そのような実施形態においては、R2およびR4は、例えば、同じRWであってもよく、R1およびR5は、例えば、同じ(Aa)xであってもよい。
【００７２】
別の実施形態c)においては、R2およびR4はRWであり、R1、R3およびR5は全て水素または全て(Aa)x：
【化６】
2008546733.tif 000007
【００７３】
もしくは
【化７】
2008546733.tif 000008
【００７４】
(式中、R2およびR4は独立に上記で定義されたRWであり、R1、R3およびR5は全てHもしくは全て独立に上記で定義された(Aa)xである)
である。そのような実施形態においては、R2およびR4は、例えば、同じRWであってよい。R1、R3およびR5は、例えば、同じ(Aa)であってよい。
【００７５】
別の実施形態d)においては、R2、R3およびR4はRWであり；R1およびR5は両方とも水素または両方とも(Aa)x：
【化８】
2008546733.tif 000009
【００７６】
もしくは
【化９】
2008546733.tif 000010
【００７７】
(式中、R2、R3およびR4はRWであり、R1およびR5は両方とも水素であるか、もしくは両方とも上記で定義された(Aa)xである)
である。そのような実施形態においては、R2、R3およびR4は、例えば、同じRWであってもよく、R1およびR5は、例えば、同じ(Aa)xであってもよい。
【００７８】
さらなる実施形態においては、そのアミド誘導体として連結された最大24個の炭素原子のRw飽和もしくは不飽和、分枝状もしくは非分枝状脂肪族カルボン酸は、10個以上の炭素原子、例えば、12個以上、例えば、14個以上、例えば、16個以上の炭素原子を有する。さらなる実施形態においては、そのアミド誘導体として連結された最大24個の炭素原子のRw飽和もしくは不飽和、分枝状もしくは非分枝状脂肪族カルボン酸は、
-C(O)(CH2)10CH3
-C(O)(CH2)12CH3
-C(O)(CH2)14CH3
-C(O)(CH2)16CH3
-C(O)(CH2)18CH3
-C(O)(CH2)20CH3
-C(O)(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3天然混合物
-C(O)(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3天然混合物
-C(O)(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3シス
-C(O)(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3シス
-C(O)(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3トランス
-C(O)(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3トランス
-C(O)(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3
-C(O)(CH2)7(CH=CHCH2)3CH3
-C(O)(CH2)3CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3
-C(O)(CH2)7CHCH(CH2)7CH3
-C(O)CH2CH(CH3)[CH2CH2CH2CH(CH3)]3CH3
または-C(O)(CH2)22CH3
から選択される。
【００７９】
本発明の一実施形態においては、前記基を、CO(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3天然混合物、-CO(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3シスおよび-CO(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3トランスから選択する。
【００８０】
ペンタミンジェミニ化合物の例は、ペンタミンジェミニ化合物を調製するための方法と共に、WO 06/053783に開示されている。
【００８１】
ペンタミンジェミニ化合物を、当業者にはよく知られた合成化学を用いて、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。図12に示されるスキームは、本発明の化合物の合成のための中間体5の合成のための一般的スキームを示す。
【００８２】
図13の一般的スキームに示されるように、中間体5を保護し、還元して、R2、R3およびR4位置が保護され、R1およびR5位置は遊離NH2基である、進化したペンタミン中間体7を得ることができる。Rw基を付加するR1およびR5位置でのアミノ基のさらなる反応、ならびにR2、R3およびR4位置の脱保護、次いで、好適な条件下での(Aa)x基の付加により、本発明の実施形態a)に従う置換パターンを有する分子作製することができる。
【００８３】
図15の一般的スキームに示されるように、中間体5を還元して、R3位置のみが保護され、R1、R2、R4およびR5位置が遊離アミノ基である、異なる進化したペンタミン中間体12を得ることができる。次いで、R1およびR5位置の一次アミノ基の保護、R2およびR4位置でのRW基の付加、次いで好適な条件下でのR1およびR5での脱保護および(Aa)x基の付加、ならびにR3位置での最終的な脱保護により、本発明の実施形態b)に従う置換パターンを有する分子を作製することができる。R1およびR5位置での(Aa)x基の付加を省略する場合、本発明の実施形態c)に従う置換パターンを有する分子を、同様の様式で作製することができる。(Aa)x基の付加の前にR5位置での脱保護を行う場合、本発明の実施形態c)の第2の代替に従う置換パターンを有する分子を、同様の様式で作製することができる。
【００８４】
図16の一般的スキームに示されるように、中間体12から作製することができ、R1、R3およびR5位置で保護される進化した中間体13を、R3位置で脱保護した後、R2、R3およびR4位置の各々へのRW基の付加により官能化することができる。次いで、好適な条件下でのR1およびR5位置のアミノ基の脱保護、ならびに(Aa)x基の付加、ならびに最終的な脱保護により、本発明の実施形態d)に従う置換パターンを有する分子を作製することができる。R1およびR5位置の(Aa)x基の付加を省略する場合、R1およびR5位置に一次アミノ基を有する本発明の実施形態d)の代替に従う置換パターンを有する分子を、同様の様式で作製することができる。
【００８５】
様々な代替的な保護および脱保護戦略が当業者によく知られており、好適な戦略を、任意の特に望ましい最終置換パターンのために考案することができる。非対称的置換パターンのためには、生成物または中間体の物理的分離が必要であろう。好適な分離方法、例えば、クロマトグラフィー方法が、当業者にはよく知られている。
【００８６】
本発明に従う分子の塩を、例えば、図17および18のスキームに示されるような標準的な技術により調製することができる。図17に示されるスキームにおいては、塩形成工程は脱保護工程でもある。
【００８７】
別の実施形態においては、ジェミニ化合物は、式(X)：
【化１０】
2008546733.tif 000011
【００８８】
［式中、Yは、(Aa)xまたは
【化１１】
2008546733.tif 000012
【００８９】
(式中、
R1およびR2は、同じか、もしくは異なっていてもよく、飽和もしくは不飽和の、最大24個の炭素原子の線状もしくは分枝状炭化水素鎖であり；
mは1〜10であり；
nは1〜10であり；
(Aa)xは、それぞれの出現において同じか、もしくは異なっていてもよく、線状もしくは分枝状の様式で連結されたx個の天然もしくは非天然のアミノ酸であり、
xは1〜6であり；
pは0〜6であり；
qは1〜6であり；
rは1〜6であり；
sは1〜6であり；
XはN、CHもしくはCであり、XがNである場合、zは0もしくは1であり、XがCHである場合、zは0であり、XがCである場合、zは1である)
である］
のスペルミジンに基づく化合物、またはその塩、例えば、製薬上許容し得る塩である。
【００９０】
一実施形態においては、mは3〜6、例えば、4である。
【００９１】
別の実施形態においては、nは3〜6、例えば、3である。
【００９２】
さらなる実施形態においては、(Aa)は塩基性アミノ酸である。塩基性アミノ酸の例としては、[H2N(CH2)3]2N(CH2)CO2H、(H2NCH2)2CHCO2H、またはSer、Lys、Orn、Dab(ジアミノ酪酸)もしくはDap(ジアミノプロピオン酸)のLもしくはDエナンチオマーが挙げられる。塩基性アミノ酸の例としては、側鎖中に少なくとも1個のNH2基(または必要に応じてOH基)を含み、1〜12個、例えば、1〜10個の炭素原子を含むアミノ酸が挙げられる。
【００９３】
さらなる実施形態においては、xは1〜4、例えば、1である。
【００９４】
さらに別の実施形態においては、pは1である。
【００９５】
別の実施形態においては、qは1または3である。
【００９６】
さらに別の実施形態においては、rは1または3である。
【００９７】
別の実施形態においては、sは1または3である。
【００９８】
一実施形態a)においては、Yは(Aa)xである。そのような実施形態においては、R1およびR2は、例えば、同じであってもよい。
【００９９】
別の実施形態b)においては、Yは、
【化１２】
2008546733.tif 000013
【０１００】
である。
【０１０１】
そのような実施形態においては、Xは、例えば、Nであってよい。そのような実施形態においては、q、rおよびsは、例えば、同じであってもよく、R1およびR2は、例えば、同じであってもよい。一実施形態においては、XはNまたはCである。
【０１０２】
さらなる実施形態においては、最大24個の炭素原子の飽和もしくは不飽和、線状もしくは分枝状の炭化水素鎖R1もしくはR2は、10個以上の炭素原子、例えば、12個以上、例えば、14個以上、例えば、16個以上の炭素原子を有する。さらなる実施形態においては、最大24個の炭素原子の飽和もしくは不飽和、線状もしくは分枝状の炭化水素鎖R1もしくはR2は、
-(CH2)10CH3
-(CH2)12CH3
-(CH2)14CH3
-(CH2)16CH3
-(CH2)18CH3
-(CH2)20CH3 
-(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 天然混合物
-(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3天然混合物
-(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3 シス
-(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 シス
-(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3 トランス
-(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3 トランス
-(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3
-(CH2)7(CH=CHCH2)3CH3
-(CH2)3CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3
-(CH2)7CHCH(CH2)7CH3
-CH2CH(CH3)[CH2CH2CH2CH(CH3)]3CH3
または-(CH2)22CH3
から選択される。
【０１０３】
一実施形態においては、前記炭化水素鎖は、(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3天然混合物、(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3シスおよび(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3トランスから選択される。
【０１０４】
スペルミジンジェミニ化合物の例は、スペルミジンジェミニ化合物を調製するための方法と共に、WO06/053782に開示されている。
【０１０５】
スペルミジンに基づくジェミニ化合物を、当業者にはよく知られた合成化学を用いて、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。図19は、本発明の化合物の合成のための中間体6の合成のための一般的スキームを示す。図20は、本発明の化合物の合成のための保護された例(Aa)基9の合成のための一般的スキームを示す。図21は、本発明の化合物の合成のための保護された例(Aa)基14の合成のための一般的スキームを示す。
【０１０６】
図22の一般的スキームに示されるように、好適な条件下での(Aa)x基の付加、次いで脱保護による中間体6の反応により、本発明の実施形態a)に従う置換パターンを有する分子が生成される。
【０１０７】
図23は、本発明の化合物の合成のための進化した中間体18への中間体6の変換のための一般的スキームを示す。図24の一般的スキームに示されるように、中間体18を用いて、好適な条件下での(Aa)x基の付加、次いで、脱保護により、本発明の実施形態b)に従う置換パターンを有する分子を作製することができる。
【０１０８】
様々な代替的戦略が当業者にはよく知られており、好適な戦略を、任意の特に望ましい最終的な置換パターンのために考案することができる。非対称的な置換パターンのためには、生成物または中間体の物理的分離が必要であろう。好適な分離方法、例えば、クロマトグラフィー方法が、当業者にはよく知られている。
【０１０９】
本発明に従う分子の塩を、例えば、図22および24のスキームに示されるような標準的な技術により調製することができる。図22および24に示されるスキームにおいては、塩形成工程は脱保護工程でもある。
【０１１０】
別の実施形態においては、ジェミニ化合物は、式(XIII)：
【化１３】
2008546733.tif 000014
【０１１１】
(式中、YはHもしくは(Aa)xであり、(Aa)は塩基性アミノ酸であり、xは1〜6であり；
R1およびR2は、同じか、もしくは異なっていてもよく、最大24個の炭素原子の飽和もしくは不飽和、線状もしくは分枝状の炭化水素鎖であり；
nは1〜10であり；および
pは1〜6である)
のエステル結合したジェミニ化合物、またはその製薬上許容し得る塩である。
【０１１２】
一実施形態においては、最大24個の炭素原子の飽和もしくは不飽和、線状もしくは分枝状の炭化水素鎖R1またはR2は、10個以上の炭素原子、例えば、12個以上、例えば、14個以上、例えば、16個以上の炭素原子を有する。
【０１１３】
さらなる実施形態においては、最大24個の炭素原子の飽和もしくは不飽和、線状もしくは分枝状の炭化水素鎖R1またはR2は、
-(CH2)10CH3
-(CH2)12CH3
-(CH2)14CH3
-(CH2)16CH3
-(CH2)18CH3
-(CH2)20CH3 
-(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3天然混合物
-(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3天然混合物
-(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3シス
-(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3シス
-(CH2)7CH=CH(CH2)5CH3トランス
-(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3トランス
-(CH2)7CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3
-(CH2)7(CH=CHCH2)3CH3
-(CH2)3CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3
-(CH2)7CHCH(CH2)7CH3
-CH2CH(CH3)[CH2CH2CH2CH( CH3)] 3CH3
または-(CH2)22CH3
から選択される。
【０１１４】
本発明の一実施形態においては、炭化水素鎖は、-(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3天然混合物、-(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3シスおよび-(CH2)7CH=CH(CH2)7CH3トランスから選択される。
【０１１５】
一実施形態においては、nは3〜6であり、例えば、nは4であってよい。
【０１１６】
さらなる実施形態においては、pは1〜4であり、例えば、pは2であってよい。
【０１１７】
さらに別の実施形態においては、Yは(Aa)である。
【０１１８】
(Aa)xは、それぞれの出現において同じか、もしくは異なっていてもよく、線状もしくは分枝状の様式で連結されたx個の天然もしくは非天然アミノ酸であり；(Aa)は塩基性アミノ酸、例えば、セリン(ser)、リジン(lys)、オルニチン(orn)、ジアミノ酪酸(dab)もしくはジアミノプロピオン酸(dap)のLもしくはDエナンチオマーである。
【０１１９】
xは1〜6、例えば、1〜3であり、例えば、xは1であってもよい。基(Aa)は、アミノ酸残基上のNおよびカルボキシ基の間のペプチド(アミド)結合により、式(I)中のNに連結されている。
【０１２０】
一実施形態においては、エステルジェミニは、
【化１４】
2008546733.tif 000015
【化１５】
2008546733.tif 000016
【化１６】
2008546733.tif 000017
【０１２１】
および
【化１７】
2008546733.tif 000018
【０１２２】
からなる群より選択される。
【０１２３】
エステル結合したジェミニ化合物の例は、エステル結合したジェミニ化合物を調製する方法と共に、PCT/EP2006/000998に開示されている。
【０１２４】
エステル結合したジェミニ化合物を、当業者にはよく知られた合成化学を用いて、容易に入手可能な出発材料から調製することができる。図25は、pが2である本発明の化合物の合成のための一般的スキームを示す。pが1または3〜6である化合物については、当業界でよく知られた技術、例えば、pが1である場合、Jaine, Nら; Journal of Inorganic Biochemistry 1994, 53(2), 79-94; pが3である場合、Reppeら; JLACBF; Justus Liebigs Ann. Chem.; 596; 1955; 1,215、およびpが4である場合、Gautier; Renault; Recl.Trav.Chim.Pays-Bas; 69; 1950; 421, 426を用いて、他のジカルボン酸(図25中の中間体3)を出発材料として用いることができる。
【０１２５】
様々な代替的戦略が当業者にはよく知られており、任意の特に望ましい最終的な置換パターンのために好適な戦略を考案することができる。非対称的な置換パターンのためには、生成物または中間体の物理的分離が必要であろう。好適な分離方法、例えば、クロマトグラフィー方法が、当業者にはよく知られている。
【０１２６】
エステル結合したジェミニ分子の塩を、標準的な技術により調製することができる。
【０１２７】
別の実施形態においては、ジェミニ化合物は、
GSC103-L-リジン
GSC103-L-リジン、オレイン酸／ステアリン酸;
GSC103-D-リジン、オレイン酸／ステアリン酸;
GSC103-L-ジアミノ酪酸、オレイン酸、オレイン酸;
GSC103-L-オルニチン、オレイン酸、ステアリン酸; 
GSC170-リジン;
GSC170-オルニチン;
GS064A; 
GS062A;
GS092A;および
GS543A
からなる群より選択される。
【０１２８】
さらなる実施形態においては、ポリヌクレオチドワクチンは、該ポリヌクレオチドワクチンのポリヌクレオチドの標的細胞へのトランスフェクションの効率を増加させ、および／またはジェミニ化合物のアジュバント効果を増加させ得る1種以上の補給物をさらに含んでもよい。そのような補給物を、例えば、
(i)中性の担体、例えば、ジオレイルホスファチジルエタノールアミン(DOPE)(Farhood, H.,ら、(1985) Biochim. Biophys. Acta 1235 289)；
(ii)錯体化試薬、例えば、市販のPLUS(商標)試薬(Life Technologies Inc. Maryland, USA)；または
(iii)ポリリジンもしくはポリオルニチンペプチドなどのペプチドまたは主に、排他的ではないが、リジン、オルニチンおよび／もしくはアルギニンなどの塩基性アミノ酸を含むペプチド(例えば、Henner, W.Dら、(1973) J.Virol. 12(4) pp741-747を参照されたい)
から選択することができる。上記の一覧は、包括的であると意図されるものではなく、トランスフェクションの効率および／またはジェミニのアジュバント効果を増加させる他の補給物も本発明の範囲内にあると取られる。
【０１２９】
本出願に従うワクチン化方法および組成物を、例えば、ウイルス、細菌または寄生虫感染、癌、アレルギーおよび自己免疫障害などの様々な疾患状態に対する哺乳動物の保護または治療のために適合させることができる。
【０１３０】
抗原性応答を誘導するために哺乳動物系内で発現させようとする、本出願において言及されるポリヌクレオチド配列は、タンパク質全体、または単に抗原性応答を開始させることができるより短いペプチド配列をコードしてもよい。本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、語句「抗原性ペプチド」または「免疫原」は、関係する動物内で免疫応答を誘導することができる全てのペプチドまたはタンパク質配列を包含することが意図される。しかしながら、本発明の一実施形態においては、動物系内での完全長タンパク質の発現は天然の抗原提示を模倣する可能性がより高く、従って、完全な免疫応答を誘発するため、ポリヌクレオチド配列は疾患状態と関連する完全長タンパク質をコードするであろう。
【０１３１】
ヒト病原体に対する免疫応答を誘導することができる抗原としては、抗原または抗原性組成物が、様々なウイルス、細菌、寄生虫および酵母起源のいずれかから誘導されるものが挙げられる。ウイルス抗原起源としては、HIV-1(gag、p17、p24、p41、p40、nef、pol、RT、p66、env、gp120もしくはgp160、gp40、p24、gag、vif、vpr、vpu、rev、tatなど)、もしくはその組合せ、例えば、WO03/025003に記載のgag、RTおよびNefの組合せ；ヒトヘルペスウイルス(gH、gL、gM、gB、gC、gK、gEもしくはgDもしくはその誘導体、またはHSV1もしくはHSV2に由来するICP27、ICP47、ICP4、ICP36などの極初期タンパク質など)；特に、ヒトサイトメガロウイルス(gBもしくはその誘導体など)；エプスタイン・バーウイルス(gp350もしくはその誘導体など)；水疱瘡ウイルス(gpI、II、IIIおよびIE63など)；B型肝炎ウイルスなどの肝炎ウイルス(例えば、B型肝炎表面抗原もしくは肝炎コア抗原もしくはpol)またはC型肝炎およびE型肝炎ウイルス抗原；ならびにパラミクソウイルス、例えば、呼吸器合胞体ウイルス(FおよびGタンパク質もしくはその誘導体など)、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、ヒトパピローマウイルス(例えば、HPV6、11、16、18、および抗原L1、L2、E1、E2、E3、E4、E5、E6、E7)、フラビウイルス(例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス)およびインフルエンザウイルス細胞(HA、NP、NA、もしくはMタンパク質、またはその組合せなど)などの他のウイルス病原体が挙げられる。細菌起源としては、N.gonorrheaおよびN.meningitidisなどのナイセリア亜種(例えば、トランスフェリン結合タンパク質、ラクトフェリン結合タンパク質、PilC、アドヘシンなど)；S.pyogenes(例えば、Mタンパク質もしくはその断片、またはC5Aプロテアーゼ)；S.agalactiae、S.mutans；H.ducreyi；M.catarrhalisなどのモラクセラ亜種(ブランハメラ・カタラリス(Branhamella catarrhalis)としても知られる；抗原としては、高分子量および低分子量アドヘシンおよびインベイシンが挙げられる)；B.pertussis(例えば、ペルタクチン、ペルツシス毒素もしくはその誘導体、線維性ヘマグルチニン、アデニル酸シクラーゼ、線毛)、B.parapertussisおよびB.bronchisepticaなどのボルデテラ亜種；M.tuberculosis(例えば、ESAT6、85A、85Bもしくは85C抗原、MPT44、MPT59、MPT45、HSP10、HSP65、HSP70、HSP75、HSP90、PPD 19kDa[Rv3763]、PPD 38kDa[Rv0934])、M.bovis、M.leprae、M.avium、M.paratuberculosisおよびM.smegmatisなどのマイコバクテリウム亜種；L.pneumophilaなどのレジオネラ亜種；エンテロトキシン産生大腸菌(例えば、コロニー形成因子、熱不安定性毒素もしくはその誘導体、熱安定性毒素もしくはその誘導体)、腸管出血性大腸菌および病原性大腸菌(例えば、シガ毒素様毒素もしくはその誘導体)などのエシェリキア亜種；V.cholera(例えば、コレラ毒素もしくはその誘導体)などのビブリオ亜種；S.sonnei、S.dysenteriaeおよびS.flexneriiなどのシゲラ亜種；Y.enterocolitica(例えば、Yopタンパク質)、Y.pestisおよびY.pseudotuberculosisなどのYersinia亜種；C.jejuni(例えば、毒素、アドヘシンおよびインベイシン)およびC.coliなどのCampylobacter亜種；S.typhi、S.paratyphi、S.choleraesuisおよびS.enteritidisなどのサルモネラ亜種；L.monocytogenesなどのリステリア亜種；H.pylori(例えば、ウレアーゼ、カタラーゼ、空胞化毒素)などのヘリコバクター亜種；P.aeruginosaなどのシュードモナス��種；S.aureusおよびS.epidermidisなどのスタフィロコッカス亜種；E.faecalisおよびE.faeciumなどのエンテロコッカス亜種；C.tetani(例えば、テタヌス毒素およびその誘導体)、C.botulinum(例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)、およびC.difficile(例えば、クロストリジウム毒素AもしくはBおよびその誘導体)などのクロストリジウム亜種；B.anthracis(例えば、ボツリヌス毒素およびその誘導体)などのバチルス亜種；C.diphtheriae(例えば、ジフテリア毒素およびその誘導体)などのコリネバクテリウム亜種；B.burgdorferi(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.garinii(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.afzelli(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、B.andersonii(例えば、OspA、OspC、DbpA、DbpB)、およびB.hermsiiなどのボレリア亜種；E.equiなどのエールリヒア亜種ならびにヒト顆粒球エールリヒア症の作用因子；R.rickettsiiなどのリケッチア亜種；C.trachomatis(例えば、MOMP,ヘパリン結合タンパク質)、C.pneumoniae(例えば、MOMP、ヘパリン結合タンパク質)、およびC.psittaciなどのクラミジア亜種；L.interrogansなどのレプトスピラ亜種；ならびにT.pallidum(例えば、稀な外膜タンパク質)、T.denticolaおよびT.hyodysenteriaeなどのトレポネマ亜種が挙げられる。寄生虫起源としては、P.falciparumなどのプラスモジウム亜種；T.gondii(例えば、SAG2、SAG3、Tg34)などのトキソプラズマ亜種；E.histolyticaなどのエンタモエバ亜種；B.microtiなどのバベシア亜種；T.cruziなどのトリパノソーマ亜種；G.lambliaなどのジアルジア亜種；L.majorなどのレーシュマニア亜種；P.cariniiなどのニューモシスティス亜種；T.vaginalisなどのトリコモナス亜種；S.mansoniなどのシゾストーマ亜種が挙げられる。酵母起源としては、C.albicansなどのカンジダ亜種；およびC.neoformansなどのクリプトコッカス亜種が挙げられる。
【０１３２】
(i)M.tuberculosisの特異的抗原の他の例は、例えば、Rv2557、Rv2558、RPFs: Rv0837c、Rv1884c、Rv2389c、Rv2450、Rv1009、aceA (Rv0467)、PstS1、(Rv0932)、SodA (Rv3846)、Rv2031c 16kDal.、Tb Ra12、Tb H9、Tb Ra35、Tb38-1、Erd 14、DPV、MTI、MSL、mTTC2およびhTCC1 (WO 99/51748)である。M.tuberculosisのタンパク質としては、M.tuberculosisの少なくとも2個、または少なくとも3個のポリペプチドがより大きいタンパク質に融合された融合タンパク質およびその変異体も挙げられる。そのような融合物の例としては、Ra12-TbH9-Ra35、Erd14-DPV-MTI、DPV-MTI-MSL、Erd14-DPV-MTI-MSL-mTCC2、Erd14-DPV-MTI-MSL、DPV-MTI-MSL-mTCC2、およびTbH9-DPV-MTI (WO 99/51748)が挙げられる。
【０１３３】
(ii)クラミジアの抗原の例としては、例えば、高分子量タンパク質(HWMP)(WO 99/17741)、ORF3(EP 366 412)、および推定膜タンパク質(Pmps)が挙げられる。ワクチン製剤の他のクラミジア抗原を、WO 99/28475に記載された基から選択することができる。
【０１３４】
ストレプトコッカス亜種に由来する細菌抗原の例としては、S.pneumoniae(例えば、PsaA、PspA、ストレプトリシン、コリン結合タンパク質)およびタンパク質抗原ニューモリシン(Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins, J.B.ら(1998) Microbial Pathogenesis 25: 337-42)、ならびにその突然変異解毒誘導体(WO 90/06951; WO 99/03884)、PhtD、PhtA、PhtB、PhtEおよびCbpAが挙げられる。ヘモフィルス亜種に由来する抗原の他の例としては、B型H.influenzae(例えば、PRPおよびそのコンジュゲート)、分類不可能なH.influenzae(例えば、OMP26、高分子量アドヘシン、P5、P6、Dタンパク質およびリポタンパク質D、ならびにフィンブリンおよびフィンブリン由来ペプチド(米国特許第5,843,464号)または複数コピーの変異体もしくはその融合タンパク質)が挙げられる。
【０１３５】
本発明において用いることができる抗原は、マラリアを引き起こす寄生虫から誘導された抗原をさらに含む。例えば、プラスモジウム・ファルシパルム(Plasmodium falciparum)に由来する抗原としては、RTS、SおよびTRAPが挙げられる。RTSは、B型肝炎表面抗原のpreS2部分の4個のアミノ酸を介してB型肝炎ウイルスの表面(S)抗原に連結されたP. falciparumのスポロゾイト周囲(CS)タンパク質のC末端部分を実質的に全部含むハイブリッドタンパク質である。その完全な構造は、英国特許出願第9124390.7号から優先権を主張するWO 93/10152の下で公開された、国際特許出願第PCT/EP92/02591号に開示されている。酵母中で発現される場合、RTSはリポタンパク質粒子として産生され、HBV由来S抗原と共に発現される場合、それはRTS,Sとして知られる混合粒子を産生する。TRAP抗原は、WO 90/01496の下で公開された国際特許出願第PCT/GB89/00895に記載されている。一実施形態においては、本発明は抗原性調製物がRTS,SとTRAP抗原の組合せを含むマラリアワクチンである。多段マラリアワクチンの成分となる候補である可能性が高い他のプラスモジウム抗原は、P.falciparumのMSP1、AMA1、MSP3、EBA、GLURP、RAP1、RAP2、セクエストリン、PfEMP1、Pf332、LSA1、LSA3、STARP、SALSA、PfEXP1、Pfs25、Pfs28、PFS27/25、Pfs16、Pfs48/45、Pfs230および他のプラスモジウム亜種におけるそれらの類似体である。
【０１３６】
本発明は、抗腫瘍抗原の使用を意図し、癌の免疫療法的治療にとって有用であるかもしれない。例えば、前立腺癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌、膵臓癌、腎臓癌または黒色腫のものなどの腫瘍拒絶抗原である。例示的な抗原としては、MAGE1、MAGE3およびMAGE4、またはWO99/40188に開示されたような他のMAGE抗原、PRAME、BAGE、Lage(NY Eos 1としても知られる)、SAGEおよびHAGE(WO 99/53061)またはGAGE(Robbins, P.F. & Kawakami, Y. (1996) Current Opinion in Immunology 8: 628-36; Van den Eynde, B.J.& Boon, T. (1997) International Journal of Clinical and Laboratory Research 27: 81-6. Correale, P.ら(1997) Journal of the National Cancer Institute 89: 293-300)が挙げられる。実際、これらの抗原は、黒色腫、肺癌、肉腫および膀胱癌などの様々な腫瘍型において発現される。
【０１３７】
本発明における使用のためのMAGE抗原を、発現エンハンサーまたは免疫学的融合パートナーとの融合タンパク質として発現させることができる。具体的には、MAGEタンパク質を、B型インフルエンザ菌(Haemophilus influenzae B)に由来するDタンパク質に融合させることができる。特に、融合パートナーは、Dタンパク質の最初の3分の1を含んでもよい。そのような構築物は、WO 99/40188に開示されている。癌特異的エピトープを含んでもよい融合タンパク質の他の例としては、bcr/abl融合タンパク質が挙げられる。
【０１３８】
一実施形態においては、前立腺特異的抗原(PSA)、PAP、PSCA(Reiter, R.E.ら(1998) PNAS USA 95: 1735-40)、PSMAまたはプロスターゼとしても知られる抗原などの前立腺抗原を用いる。プロスターゼは、前立腺特異的セリンプロテアーゼ(トリプシン様)であり、Nelson, P.S.ら(1999; PNAS USA 96: 3114-9)により記載されている。ヌクレオチド配列および成熟タンパク質の推定されるポリペプチド配列、ならびに相同体が、(PNAS USA (1999) 96: 3114-9)および国際特許出願WO 98/12302 (および対応する米国特許第5,955,306号)、WO 98/20117 (ならびに対応する米国特許第5,840,871号および同第5,786,148号) (前立腺特異的カリクレイン)およびWO 00/04149 (P703P)に開示されている。
【０１３９】
本発明は、前立腺タンパク質ならびにその断片および相同体(「誘導体」)に基づく前立腺タンパク質融合物を含む抗原を提供する。そのような誘導体は、前立腺腫瘍の治療にとって好適である治療用ワクチン製剤における使用にとって好適である。典型的には、この断片は、上記で参照された特許および特許出願に開示された、少なくとも20個、例えば、50個、または例えば、100個の連続したアミノ酸を含むであろう。
【０１４０】
前立腺抗原のさらなる例は、WO98/37814の配列番号113であるP501Sとして知られている。上記で参照された特許出願に開示された少なくとも20個、例えば、50個、または例えば、100個の連続したアミノ酸を含むその遺伝子によりコードされる免疫原性断片および部分が意図される。具体的な断片はPS108(WO 98/50567)である。
【０１４１】
他の前立腺特異的抗原は、WO98/37418、およびWO/004149から公知である。別のものはSTEAP (Hubert, R.S.ら(1999) PNAS USA 96: 14523-8)である。
【０１４２】
本発明の内容において有用な他の腫瘍関連抗原としては、Plu-1 (Lu, P.J.ら(1999) Journal of Biological Chemistry 274: 15633-45)、HASH-1、HasH-2、Cripto (Salomon, D.S.ら(1999) Bioessays 21: 61-70; 米国特許第5,654,140号)、およびCriptin (米国特許第5,981,215号)が挙げられる。さらに、癌の治療におけるワクチンに特に関連する抗原は、チロシナーゼおよびスルビビンも含む。
【０１４３】
本発明は、Muc-1、Muc-2、EpCAM、HER 2 / Neu、マンマグロビン(米国特許第5,668,267号)またはWO 00/52165、WO99/33869、WO99/19479、WO 98/45328に開示されたものなどの乳癌抗原と組合わせても有用である。HER/2 neu抗原は、特に、米国特許第5,801,005号に開示されている。一実施形態においては、HER/2 neuは、細胞外ドメイン全体(約1〜645アミノ酸を含む)、またはその断片、および細胞内ドメイン全体の少なくとも免疫原性部分(約580個のC末端アミノ酸)を含む。具体的には、細胞内部分はリン酸化ドメインまたはその断片を含むべきである。そのような構築物はWO00/44899に開示されている。そのような構築物の例としては、ECD PDとして知られる構築物が挙げられる；第2のものはECD ΔPDとして知られる(WO/00/44899)。本明細書で用いられるHER/2 neuは、ラット、マウスまたはヒトに由来するものであってよい。
【０１４４】
前記抗原はまた、腫瘍支援機構(例えば、血管新生、腫瘍侵襲)に関連するものであってよく、例えば、tie2が挙げられる。
【０１４５】
また、本発明のワクチンを、アレルギー、癌または感染症に加えて慢性障害の予防または治療に用いることもできる。そのような慢性障害は、喘息、アテローム性動脈硬化症、ならびにアルツハイマー病および他の自己免疫障害などの疾患である。避妊薬としての使用のためのワクチンも考慮することができる。
【０１４６】
アルツハイマーの神経変性疾患に罹りやすいか、または罹患している患者の予防および治療に関連する抗原は、特に、β-アミロイド前駆体タンパク質のN末端の39〜43アミノ酸断片およびより小さい断片である。この抗原は、国際特許出願第WO 99/27944(Athena Neurosciences)に開示されている。
【０１４７】
自己免疫障害のためのワクチンまたは避妊用ワクチンとして含有させることができる潜在的な自己抗原としては、サイトカイン、ホルモン、増殖因子または細胞外タンパク質、例えば、4-ヘリカルサイトカイン、例えば、IL-13が挙げられる。サイトカインとしては、例えば、IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL20、IL21、TNF、TGF、GM-CSF、MCSFおよびOSMが挙げられる。4-ヘリカルサイトカインとしては、IL2、IL3、IL4、IL5、IL13、GM-CSFおよびMCSFが挙げられる。ホルモンとしては、例えば、黄体形成ホルモン(LH)、卵胞刺激ホルモン(FSH)、絨毛性ゴナドトロピン(CG)、VGF、GHrelin、アグーチ、アグーチ関連タンパク質およびニューロペプチドYが挙げられる。
【０１４８】
本発明のワクチンは、持続的な感染の治療だけでなく、慢性症状および癌などの疾患の免疫療法的治療にとって特に好適である。従って、本発明のワクチンは、結核(TB)、AIDSなどのHIV感染、およびB型肝炎(HepB)ウイルス感染などの感染症の免疫療法にとって特に好適である。
【０１４９】
そのような抗原をコードするポリヌクレオチドは、全抗原よりもむしろ、その免疫原性誘導体または免疫原性断片をコードしてもよい。
【０１５０】
本発明に含まれるポリヌクレオチド配列の全部について、これらのものは、必ずしも完全長タンパク質または天然タンパク質をコードする配列である必要はないことが理解されるであろう。トランケートされたか、またはさもなければ変化したものなどの免疫原性誘導体、例えば、突然変異されたタンパク質も意図され、同様に少なくとも1個のエピトープ、例えば、CTLエピトープ、典型的には、少なくとも8個のアミノ酸のペプチドをコードする断片も意図される。少なくとも8個、例えば、8〜10個のアミノ酸または最大20個、50個、60個、70個、100個、150個もしくは200個の長さのアミノ酸の断片をコードするポリヌクレオチドは、コードされるオリゴもしくはポリペプチドが抗原性を示す、すなわち、主要なCTLエピトープが該オリゴもしくはポリペプチドにより保持される限り、本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１５１】
本発明に従うポリヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチド分子は、天然タンパク質の、例えば50％の長さの断片であってよく、その断片は突然変異を含んでもよいが、少なくとも1個のエピトープを保持し、抗原性を示す。同様に、本発明に従う免疫原性誘導体は、抗原性を示すはずである。免疫原性誘導体は、酵素活性(例えば、RT)、またはCD4下方調節(例えば、Nef)などのワクチン抗原において望ましくない天然タンパク質の機能の低下または除去などの天然タンパク質を超えるいくつかの潜在的な利点を提供し得る。
【０１５２】
前記ポリヌクレオチド配列を、哺乳動物細胞に関してコドン最適化することができる。そのようなコドン最適化は、WO05/025614に詳細に記載されている。
【０１５３】
本発明の一実施形態においては、前記構築物はN末端リーダー配列を含む。シグナル配列、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは、個々に全て必要に応じて存在するか、または欠失される。本発明の一実施形態においては、これらの領域の全部が存在するが、改変される。
【０１５４】
本発明のワクチンのポリヌクレオチドおよびアジュバントを、同時に、または別々に投与することができる。例えば、ポリヌクレオチドおよびアジュバントを、単一の組成物中に共に製剤化するか、またはあるいは、異なる組成物中に別々に製剤化することができる。後者の例においては、少なくとも2つの組成物を、機能的協働において投与し、実質的に同時に投与するか、またはあるいは、異なる実施形態においては、30分〜1時間置きに、もしくは1〜2時間置きに、もしくは12〜36時間置きに、例えば、24時間置きに、異なる時点で別々に投与するか、または2つの組成物を、実質的に2日後に投与することができる。少なくとも2つの組成物を異なる状況で投与する場合、ポリヌクレオチドをアジュバントの前に投与することができる。
【０１５５】
従って、個別の投与または同時的投与のための、2つの組成物、ポリヌクレオチドを含有する組成物およびアジュバントを含有する組成物を含むキットが提供される。本内容においては、個別の投与を、投与部位もしくは投与時間、またはその両方により分離することができる。このキットはまた、2つの組成物を同時に、または個別に投与するための説明書を含んでもよい。
【０１５６】
本発明の一実施形態においては、ワクチンのプラスミドを、哺乳動物ワクチン受容者内で複製すること、および宿主の染色体DNA内に組込まれることから防ぎ、このプラスミドを、例えば、真核細胞において機能的である複製起点を用いずに作製することができる。
【０１５７】
抗原性ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むベクターを含む免疫原成分を、様々な様式で投与することができる。そのベクターを、裸の形態(すなわち、リポソーム製剤、ウイルスベクターもしくはトランスフェクションを容易にするタンパク質と結合させずに裸のヌクレオチド配列として)で、好適な媒質、例えば、PBSなどの緩衝生理食塩水溶液中に懸濁した後、筋肉内、皮下、腹腔内または静脈内注入することにより投与することができる(いくつかの初期データは、筋肉内または皮下注入が好ましいことを示唆している；Brohmら(1998) Vaccine 16: 949-54、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み入れられるものとする)。さらに、前記ベクターを、上記の経路に加えて、経口、鼻または肺経路を介する投与のために、例えば、リポソームによるか、またはポリラクチドコグリコリド(PLG)粒子内に封入することができる。
【０１５８】
本発明の一実施形態に従えば、例えば、遺伝子銃(特に、粒子ボンバードメント)投与技術の使用を介する、免疫原性分の皮内投与も可能である。そのような技術は、金ビーズなどの濃厚マイクロビーズ上に免疫原成分をコーティングした後、例えば、Haynes, J.R.ら(1996; Journal of Biotechnology 44: 37-42)に記載のように、表皮中に高圧下で投与することを含んでもよい。本内容においては、前記アジュバント成分を、濃厚マイクロビーズ上で、もしくは別々の集団のマイクロビーズ上で同時に製剤化するか、またはポリヌクレオチドワクチンを、マイクロビーズ上で弾道的に投与し、該アジュバントを、全身もしくは局所送達を介して、おそらく、皮内もしくは皮下注入によるポリヌクレオチド送達の部位で別々に投与することができる。
【０１５９】
本発明の代替的な実施形態においては、その外部表面が固体貯蔵媒質でコーティングされた、長さ30〜1000マイクロメートルの範囲である複数の針を含むパッチが提供される。本内容における固体貯蔵媒質は、固体形態の本発明のワクチンを含むであろう。この形態の微小針はWO 02/07813およびWO 03/061636に記載されており、その内容は本明細書に組み入れられ、特に、その特許請求の範囲は、本開示の内容においてジェミニ界面活性剤の添加と共に読まれることが意図されるものとする。
【０１６０】
本発明のアジュバントおよびワクチンを、筋肉内、皮下、腹腔内、皮内、または局所経路などの、様々な投与経路を介して投与することができる。アジュバントまたはポリヌクレオチド成分を、皮下、皮内または局所経路を介して投与することができる。一実施形態においては、両成分、ポリヌクレオチドおよびアジュバントの投与は、同じ経路によるものである。別の実施形態においては、ポリヌクレオチドを、弾道送達(遺伝子銃)により、表皮または真皮に投与し、アジュバント成分を、局所的に、または皮内もしくは皮下注入により、該ポリヌクレオチドの近辺に送達する。
【０１６１】
アジュバントの投与量も変化するであろうが、例えば、約5μg/ml〜約5 mg/mlの液体形態のワクチンであってもよく、25μg/ml〜約1 mg/mlであってもよく、50〜500μg/mlであってもよい。液体形態においては、0.5〜1 mlのワクチンをヒトワクチン受容者に投与することができる。
【０１６２】
乾燥形態のワクチンにおいては、前記アジュバントの総量は用量あたり5μg〜約5 mgの範囲にあってもよく、用量あたり25μg〜約1 mgであってもよく、用量あたり50〜500μgであってもよい。
【０１６３】
アジュバントの投与を、ヌクレオチド配列のそれぞれ後に続くか、または追加の投与と共に反復することができる。
【０１６４】
医薬組成物の投与は、例えば、同じポリヌクレオチドを含有するジェミニの反復用量として、または本発明の組成物を他の好適な形態の投与を用いるスケジュールで、例えば、アデノウイルスベクターなどのウイルスベクターを用いて投与するか、もしくは、例えば、裸のDNAの投与により投与する異種「初回-追加」ワクチン接種計画において、1回または2回以上の個々の用量の形態を取ってもよい。異種初回-追加計画は、初回免疫および追加免疫において異なる形態のワクチンの投与を用いるものであり、その各々はそれ自身、2回以上の投与を含んでもよい。初回組成物および追加組成物は、一般的には少なくとも1個の抗原を有するであろうが、それは必ずしも同一の形態の抗原である必要はなく、異なる形態の同じ抗原であってもよい。
【０１６５】
本発明の免疫原組成物を用いる使用の初回-追加計画は、異種ポリヌクレオチドを含有するジェミニ界面活性剤およびポリヌクレオチドを含有するアデノウイルスベクターもしくは裸のDNA初回-追加、例えば、ポリヌクレオチドを含有するジェミニ界面活性剤の初回用量、次いで、アデノウイルスベクターの追加、または例えば、アデノウイルスベクターの初回もしくは裸のDNAの初回、次いで、1種以上のポリヌクレオチドを含有するジェミニ界面活性剤の追加の形態を取ってもよい。そのようなポリヌクレオチドを含有するジェミニ界面活性剤またはDNA初回もしくは追加用量を、DNAの筋肉内もしくは皮内投与によるか、または粒子加速技術により送達することができる。あるいは、そのような初回-追加計画は、例えば、初回用量がタンパク質を含み、追加用量がポリヌクレオチドを含有するジェミニ界面活性剤を含むか、または例えば、初回用量がポリヌクレオチドを含有するジェミニ界面活性剤を含み、追加用量がタンパク質を含む場合、本発明に従うタンパク質用量およびジェミニ界面活性剤用量を含んでもよい。
【０１６６】
前記抗原をコードするポリヌクレオチドの用量は、投与経路に依存するであろうし、当業者であれば容易に決定することができるであろう。遺伝子銃適用に関して従来通りに言えば、その用量は投与あたり0.5〜100μgであり、「裸の」DNAの筋肉内投与については、投与あたり10〜2000μgであろう。
【０１６７】
本明細書を通して、開示中の用語「含む」の使用は、それぞれの開示の要素の内容において、用語「含む」がその包括的な意味で読まれるべきであるという点、他の要素も含まれ、また、その排他的な意味において、該開示がこれらの要素に限定され、従って、それぞれの用語「含む」を用語「からなる」と置換することができるという点の両方の意味の用語で読まれることを意図している。
【０１６８】
本発明を、以下の実施例により例示するが、本発明はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【０１６９】
1)非対称性スペルミンに基づくジェミニ
説明1: 2,2,2-トリフルオロ-N-(3-{4-[3-(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-プロピルアミノ]-ブチルアミノ}-プロピル)-アセトアミドトリフルオロ酢酸塩
【化１８】
2008546733.tif 000019
【０１７０】
アセトニトリル(200 mL)中のスペルミン二水和物(10.0 g, 41.9 mmol)の攪拌溶液に、トリフルオロ酢酸エチル(29.8 g, 209 mmol)および水(1.0 ml)を添加した。反応混合物を18時間還流下で加熱した後、室温まで冷却させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣の固体をCH2Cl2 (2 x 100 mL)で磨砕したところ、白色の固体(23.0 g, 88%)としてビス(トリフルオロアセトアミド)が得られた。
【０１７１】
LC-MS (ESI): tR = 1.213分(m/z = 395.2 [M+H]+)。
【０１７２】
説明2: (4-{tert-ブトキシカルボニル-[3-(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-プロピル]-アミノ}-ブチル)-[3-2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化１９】
2008546733.tif 000020
【０１７３】
THF (165 mL)中のビス-トリフルオロ酢酸塩(説明1) (16.5 g, 26.6 mmol)およびジイソプロピルエチルアミン (13.9 mL, 79.7 mmol)の攪拌溶液に、ジ-tert-ブチルジカルボナート (12.2 g, 55.8 mmol)を添加した。混合物を室温で16時間攪拌した後、減圧下で濃縮し、EtOAc (300 mL)で希釈した。有機溶液を5％水性NaHCO3 (2 x 80 mL)、5％水性KHSO4 (2 x 80 mL)、および塩水 (2 x 80 mL)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)した後、減圧下で蒸発させて、白色の固体(11.4 g, 72%)としてビス-カルバメートを得た; mp 108-110℃(ジエチルエーテルから)。
【０１７４】
説明3: (3-アミノプロピル)-{4-[(3-アミノプロピル)-tert-ブトキシカルボニル-アミノ]-ブチル}-カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化２０】
2008546733.tif 000021
【０１７５】
メタノール(600 mL)中のトリフルオロアセトアミド (説明2) (28.6 g, 48.1 mmol)、炭酸カリウム (33.2 g, 240 mmol)、および水 (100 mL)の攪拌混合物を、還流下で2時間加熱した。混合物を-10℃に冷却し、濾過した後、減圧下で濃縮した。残渣をEtOAc (500 mL)およびメタノール (100 mL)で希釈し、有機溶液を塩水 (1 x 100mL)で洗浄した。水性洗浄液を5％水性水酸化ナトリウムで塩基性化し、クロロホルムで抽出した(4 x 100 mL)。全ての有機相を合わせ、塩水(1 x 100 mL)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で蒸発させたところ、淡黄色のゴムとして表題のアミン(16.4 g, 85％)が得られた。
【０１７６】
TLC (SiO2): Rf=0.50 [90:10] EtOH:0.88 NH3。
【０１７７】
説明4: オレイン酸ペンタフルオロフェニルエステルの調製
【化２１】
2008546733.tif 000022
【０１７８】
ペンタフルオロフェノール(50.0 g, 271 mmol)およびトリフルオロ酢酸無水物 (85.0 g, 404 mmol)の混合物を、40℃で18時間攪拌した。得られた混合物を少量ずつ蒸留したところ、無色の液体(75.2 g, 99％)としてトリフルオロ酢酸; bp 122-125℃が得られた。無水DMF (100 mL)中のオレイン酸 (30.0 g, 106 mmol)の溶液を、無水DMF (100 mL)中のペンタフルオロフェノールトリフルオロ酢酸 (32.7 g, 116 mmol)の溶液に添加した後、ピリジン(9.16 g, 116 mmol)をゆっくりと添加した。得られた混合物を室温で18時間攪拌した後、酢酸エチル(200 mL)で希釈し、0.1N塩酸 (1 x 100 mL)、飽和水性炭酸水素ナトリウム(1 x 100 mL)、および塩水 (1 x 50 mL)で連続的に洗浄した。有機溶液を乾燥 (MgSO4)し、減圧下で濃縮したところ、無色の粘性液体(45.0 g, 95％)としてオレイン酸ペンタフルオロアセテートが得られた。
【０１７９】
説明5: (3-アミノ-プロピル)-{4-[tert-ブトキシカルボニル-(3-オクタデカ-9-エノイルアミノ-プロピル)-アミノ]-ブチル}-カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化２２】
2008546733.tif 000023
【０１８０】
ジクロロメタン中の説明3のジアミン (3.50 g, 8.69 mmol)およびトリエチルアミン(5.26 mL, 38.0 mmol)の攪拌溶液を、-78℃で維持し、ジクロロメタン(100 mL)中のオレイン酸ペンタフルオロフェニルエステル(3.89 g, 8.69 mmol)の溶液で3時間滴下処理した。添加の完了後、冷却バスを静置し、18時間に渡って攪拌しながら温度を室温まで温めた。溶媒を蒸発させたところ、褐色のゴムが得られ、これを酢酸エチル：メタノール：アンモニア(98:2:2)の混合物で溶出するシリカゲル上での絡むクロマトグラフィーにより精製したところ、無色のゴム(3.08 g, 53％)として所望のモノアシル化カルバメートが得られた。
【０１８１】
TLC (SiO2): Rf=0.25 [96:2:2] EtOAc:MeOH:0.88 NH3。
【０１８２】
説明6: 非対称性カルボキシアミドの調製
【化２３】
2008546733.tif 000024
【０１８３】
ステアリン酸(255 mg, 0.90 mmol)、TBTU (288 mg, 0.90 mmol)、およびHOBt (121 mg, 0.90 mmol)の混合物を、室温で5分間、ジクロロメタン (18 mL)中で攪拌した。ジクロロメタン (5.0 mL)中の説明5のアミン(0.50 g, 0.79 mmol)の溶液を添加した後、ジイソプロピルエチルアミン (0.78 mL, 4.50 mmol)を添加し、攪拌を18時間継続した。有機溶液を5％水性クエン酸(5 mL)、2M水性炭酸ナトリウム溶液 (10 mL)、および水 (10 mL)で洗浄した後、乾燥(MgSO4)し、減圧下で濃縮したところ、無色のゴム(526 mg, 71％)として表題のカルボキシアミドが得られた。
【０１８４】
説明7: 非対称性塩酸アミンの調製
【化２４】
2008546733.tif 000025
【０１８５】
説明6のカルバメート(520 mg, 0.56 mmol)を、ジエチルエーテル(10 mL)中に溶解し、ジエチルエーテル中のHClの溶液(2M, 5 mL)で、攪拌しながら室温で処理した。2時間後、溶媒を窒素流下で沈殿物になるまで蒸発させ、ジエチルエーテル(2 x 10 mL)で洗浄した後、減圧下で乾燥したところ、白色の固体(410 mg, 定量的)として表題の塩酸アミンが得られた。
【０１８６】
説明8: 実施例1〜3のジェミニ界面活性剤塩酸塩の調製のための一般的手順
【化２５】
2008546733.tif 000026
【０１８７】
ジクロロメタン(10 mL)中の説明7の塩酸アミン(80 mg, 0.11 mmol)、TBTU (75 mg, 0.23 mmol)、HOBt (32 mg, 0.23 mmol)およびBoc保護されたアミノ酸 (0.23 mmol)の攪拌混合物を、室温にてジイソプロピルエチルアミン (0.10 mL, 0.60 mmol)で処理した。混合物を追加のジクロロメタン(10 mL)で希釈し、1M水性クエン酸 (5 mL)、5％水性炭酸水素ナトリウム (5 mL)および塩水(5 mL)で洗浄した後、乾燥(Na2SO4)し、有機溶液を減圧下で濃縮したところ、ゴムとしてカルバメートを濃縮した。ゴムをジエチルエーテル(10 mL)中で溶解し、ジエチルエーテル(2M, 5 mL)中のHClの溶液で処理した。混合物を室温で2時間攪拌した後、溶媒を窒素流中で蒸発させた。残渣の固体をさらなるジエチルエーテル(2 x 5 mL)で洗浄し、減圧下で乾燥した後、0.1％ TFAを含む水(5〜95％)中のアセトニトリルの混合物で溶出する逆相HPLCにより精製したところ、白色の固体としてトリフルオロ酢酸塩が得られた。この固体をジオキサン中のHClの溶液(4M, 2 mL)中に溶解した後、減圧下で濃縮したところ、固体が得られ、これをジエチルエーテル (2 x 5 mL)で磨砕したところ、白色の固体(20-35％)としてジェミニ界面活性剤塩酸塩が得られた。
【０１８８】
実施例1: GSC103 L-Lys、オレイン酸、ステアリン酸
【化２６】
2008546733.tif 000027
【０１８９】
HRMS (ESI): tR = 11.74分; m/z 計算値 (C58H117N8O4) 989.9198、実測値989.9199 [M+H]+。
【０１９０】
実施例2: GSC103 D-Lys、オレイン酸、ステアリン酸
【化２７】
2008546733.tif 000028
【０１９１】
HRMS (ESI): tR = 11.79分; m/z 計算値 (C58H117N8O4) 989.9198、実測値989.9206 [M+H]+。
【０１９２】
実施例3: GSC103 L-Orn、オレイン酸、ステアリン酸
【化２８】
2008546733.tif 000029
【０１９３】
HRMS (ESI): tR = 11.80分; m/z 計算値(C56H113N8O4) 961.8885、実測値961.8873 [M+H]+。
【０１９４】
2) ペンタミンに基づくジェミニ化合物
説明9: N1,N8-ビス(トリフルオロアセチル)-スペルミジントリフルオロ酢酸トリフルオロ酢酸塩
【化２９】
2008546733.tif 000030
【０１９５】
CH3CN (150 mL)および水 (2.0 mL)中のスペルミジン(m = 3, n = 4; 8.0 g, 55.0 mmol)の溶液に、トリフルオロ酢酸エチル(33.0 mL, 275 mmol)を添加し、混合物を還流下で3時間加熱した。室温まで冷却した後、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣の固体をCH2Cl2 (2 x 150 mL)で磨砕したところ、白色の固体(21.0 g)として表題のトリフルオロ酢酸塩が得られた。
【０１９６】
LC-MS (ESI): tR = 1.10分(m/z = 338.1 [M+H]+)。
【０１９７】
説明10: N4-(tert-ブトキシカルボニル)-N1,N8-ビス(トリフルオロアセチル)-スペルミジン
【化３０】
2008546733.tif 000031
【０１９８】
THF (25 mL)中のジ-tert-ブチルジカルボネート (11.3 g, 51.3 mmol)およびトリエチルアミン (75.0 mL, 54.0 mmol)の溶液を、窒素雰囲気下で説明9のN1,N8-ビス(トリフルオロアセチル)スペルミジントリフルオロアセテート (21.0 g, 46.7 mmol)に添加した。室温で18時間後、溶媒を減圧下で蒸発させ、EtOAc (500 mL)を添加した。溶液を、5％水性NaHCO3 (2 x 150 mL)および塩水(150 mL)で連続的に洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で蒸発させたところ、白色の固体 (20.0 g)としてBocカルバメートが得られた。
【０１９９】
LC-MS (ESI): tR = 4.09分 (m/z = 438.3 [M+H]+)。
【０２００】
説明11: N4-(tert-ブトキシカルボニル)-スペルミジン
【化３１】
2008546733.tif 000032
【０２０１】
水酸化ナトリウム水溶液 (100 mL x 0.5N)を、10℃にてMeOH (500 mL)中の説明10のN4-(tert-ブトキシカルボニル)-N1,N8-ビス(トリフルオロアセチル)-スペルミジン (20.0 g, 45.7 mmol)の攪拌溶液に添加した。冷却バスを取り除き、混合物を18時間攪拌した後、MeOHを減圧下で蒸発させた。得られた水性懸濁液を[9:1] CHCl3-MeOH (5 x 300 mL)で抽出し、合わせた有機抽出物を乾燥(Na2SO4)し、減圧下で蒸発させたところ、無色の油 (10.0 g)としてBocカルバメートが得られた。
【０２０２】
LC-MS (ESI): tR = 2.15分 (m/z = 246.2 [M+H]+)。
【０２０３】
説明12: [4-(2-シアノ-エチルアミノ)-ブチル]-[3-(2-シアノ-エチルアミノ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化３２】
2008546733.tif 000033
【０２０４】
アクリロニトリル(2.15 mL, 32.6 mmol)を、0℃に維持したMeOH (50 mL)中の説明11のBocカルバメート (4.0 g, 16.3 mmol)の攪拌溶液に、2時間かけてゆっくりと添加した。得られた混合物をさらに18時間室温で維持した後、減圧下で濃縮した。得られた残渣をMeOH:EtOAc [10:90]で溶出するカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)により精製したところ、無色の粘性油 (5.00 g)として表題のビス-ニトリルが得られた。
【０２０５】
LC-MS (ESI): tR = 2.15分 (m/z = 352.1 [M+H]+)。
【０２０６】
説明13: {4-[tert-ブトキシカルボニル-(2-シアノ-エチル)-アミノ]-ブチル}-{3-[tert-ブトキシカルボニル-(2-シアノ-エチル)-アミノ]-プロピル}-カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化３３】
2008546733.tif 000034
【０２０７】
THF (15 mL)中のジ-tert-ブチルジカルボネート (3.40 g, 15.64 mmol)の溶液を、窒素雰囲気下でTHF (10 mL)とトリエチルアミン (15 mL)の混合物中の説明12のビス-ニトリル (2.5 g, 7.11 mmol)の溶液に添加した。室温で18時間後、溶媒を減圧下で蒸発させ、EtOAc (100 mL)を添加した。有機溶液を5％水性NaHCO3溶液 (2 x 50 mL)および塩水 (50 mL)で連続的に洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で蒸発させたところ、淡黄色の液体(3.9 g)としてtris-Bocカルバメートが得られた。
【０２０８】
1H-NMR (CDCl3): δH1.45(m, 31H), 1.75(m, 2H), 2.60(m, 4H), 3.16(m, 4H), 3.26(m, 4H), 3.45(m, 4H)。
【０２０９】
説明14: {4-[(3-アミノ-プロピル)-tert-ブトキシカルボニル-アミノ]-ブチル}-{3-[(3-アミノ-プロピル)-tert-ブトキシカルボニル-アミノ]-プロピル}-カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化３４】
2008546733.tif 000035
【０２１０】
95％エチルアルコール (30 mL)中の説明13のtris-Bocニトリル (3.90 g, 7.06 mmol)、NaOH (0.45 g, 11.2 mmol)およびラネーニッケル (2.1 g)の混合物を、水素雰囲気(1気圧)下で18時間、室温で攪拌した。触媒を濾過により除去し、濾液を減圧下で10 mLまで濃縮し、40％水性NaOH溶液(20 mL)およびMeOH (10 mL)で処理した。分離された油をCHCl3(2 x 100 mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮したところ、淡黄色の油 (3.90 g)として表題のジアミンが得られた。
【０２１１】
1H-NMR (CDCl3): δH1.45 (brs, 31H), 1.63(m, 4H), 1.73 (m, 2H), 2.67 (m, 4H), 3.20 (m, 12H)。
【０２１２】
説明15: オクタデカ-9-エノイン酸(3-アミノ-プロピル)-(4-{3-[(3-アミノ-プロピル)-オクタデカ-9-エノイル-アミノ]-プロピルアミノ}-ブチル)-アミドtris-トリフルオロ酢酸塩
【化３５】
2008546733.tif 000036
【０２１３】
THF (50 mL)中のオレイン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル (2.78 g, 7.32 mmol)の溶液および水(10 mL)中の炭酸カリウム (1.08 g, 7.86 mmol)の溶液を、THF (40 mL)中の説明14 (632 mg, 2.58 mmol)の溶液に添加した。得られた混合物を室温で18時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣を酢酸エチル(300 mL)中に溶解し、水(150 mL x 2)で洗浄した後、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮したところ、無色の粘性油としてtris-Bocカルバメートが得られた。油をCH2Cl2 (25 mL)に溶解し、トリフルオロ酢酸(15 mL)で処理した。得られた混合物を室温で2時間攪拌した後、減圧下で濃縮し、残渣をジエチルエーテル(200 mL)を用いて共蒸発したところ、白色の固体(3.72 g)として表題のtris-トリフルオロ酢酸塩が得られた。
【０２１４】
LC-MS (ESI): tR = 3.94分 (m/z = 788.7 [M+H]+)。
【０２１５】
説明16: N1,N8-ジオレイル-N4-tris-(Aa)x-ペンタミン塩酸塩を調製するための一般的手順
【化３６】
2008546733.tif 000037
【０２１６】
N-末端保護されたアミノ酸((PG)y(Aa)x: 3.5 mol当量)、TBTU (298 mg, 0.93 mmol)、HOBt (125 mg, 0.93 mmol)およびジイソプロピルエチルアミン (0.20 g 1.59 mmol)を、CH2Cl2 (15 mL)中の説明15 (300 mg, 0.27 mmol)から得たtris-アミンの溶液に添加した。室温で18時間攪拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をEtOAc (10 mL)中に溶解した。有機溶液を水(2 x 10 mL)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮したところ、油が得られ、これをMeOH:CH2Cl2 [5:95]で溶出するカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)により精製したところ、油として中間体Bocカルバメートが得られた。このカルバメートをジエチルエーテル(2 mL)に溶解し、ジオキサン中のHClの溶液(4M, 4 mL)で処理した。室温で18時間攪拌した後、得られた白色の沈殿を濾過により回収し、無水ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥したところ、白色の粉末(11-77％)としてペンタミン塩酸塩が得られた。
【０２１７】
実施例4: (Aa)x = L-Lys
【化３７】
2008546733.tif 000038
【０２１８】
LC-MS (ESI): tR = 10.97分 (m/z = 1173.1 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C67H134N11O5) 1173.0569、実測値1173.0542 [M+H]+。
【０２１９】
実施例5: (Aa)x = D-Lys
【化３８】
2008546733.tif 000039
【０２２０】
LC-MS (ESI): tR = 10.93分(m/z = 1173.1 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C67H134N11O5) 1173.0569、実測値1173.0540 [M+H]+。
【０２２１】
実施例6: (Aa)x = L-Orn
【化３９】
2008546733.tif 000040
【０２２２】
LC-MS (ESI): tR = 11.12分 (m/z = 1131.0 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z計算値(C64H128N11O5) 1131.0100、実測値1131.0087 [M+H]+。
【０２２３】
実施例7: (Aa)x = L-Ser
【化４０】
2008546733.tif 000041
【０２２４】
LC-MS (ESI): tR = 12.94分 (m/z = 1049.9) [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C58H113N8O8) 1049.8681、実測値1049.8662 [M+H]+。
【０２２５】
説明17: [4-(3-アミノ-プロピルアミノ)-ブチル]-[3-(3-アミノ-プロピルアミノ)-プロピル]-カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化４１】
2008546733.tif 000042
【０２２６】
95％エチルアルコール(30 mL)中の説明12のビス-ニトリル(3.10 g, 8.81 mmol)、NaOH (0.3 g, 7.5 mmol)およびラネーニッケル (1.5 g)の混合物を、水素雰囲気(1気圧)下で18時間、室温で攪拌した。触媒を濾過により除去し、濾液を10 mLまで減圧下で濃縮し、40％水性NaOH溶液 (20 mL)およびMeOH (10 mL)で処理した。分離した油をCHCl3 (2 x 100 mL)で抽出した。合わせた有機抽出物を乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮したところ、淡黄色の油 (2.90 g)として表題のアミンが得られた。
【０２２７】
1H-NMR (MeOH): δH1.42-1.61 (m, 13H), 1.62-1.80 (m, 6H), 2.52-2.75 (m, 12H), 3.18-3.33 (m, 4H)。
【０２２８】
説明18: {4-[3-(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-プロピルアミノ]-ブチル}-{3-[3-(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-プロピルアミノ]-プロピル}-カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化４２】
2008546733.tif 000043
【０２２９】
CH3CN (100 mL)中の説明17のアミン (2.98 g, 8.23 mmol)の溶液に、トリフルオロ酢酸エチル (5.88 mL, 49.39 mmol)および水(2.0 mL)を添加した。反応混合物を還流下で3時間加熱した後、室温で冷却し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣の固体を最初にCH2Cl2 (50 mL)で磨砕した後、無水ジエチルエーテル (100 mL)で磨砕したところ、淡黄色の固体(6.0 g)としてビス-トリフルオロ酢酸塩が得られた。
【０２３０】
1H-NMR (DMSO): δH1.35(s, 9H), 1.45(m, 4H), 1.78 (m, 6H), 2.88 (m, 8H), 3.07-3.19 (m, 4H), 3.25(m, 4H), 8.48(brs, 4H), 9.50(m, 2H)。
【０２３１】
説明19: {4-[(3-アミノ-プロピル)-オクタデカ-9-エノイル-アミノ]-ブチル}-{3-[(3-アミノ-プロピル)-オクタデカ-9-エノイル-アミノ]-プロピル}-カルバミン酸tert-ブチルエステル
【化４３】
2008546733.tif 000044
【０２３２】
CH2Cl2 (40 mL)およびDMF (10 mL)の混合物中のオレイン酸(1.60 g, 5.66 mmol)および説明18のジアミン (2.00 g  2.57 mmol)の溶液に、TBTU (1.81g, 5.66mmol)、HOBt (0.76 g, 5.66 mmol)およびDIEA (1.99 g  15.42 mmol)を添加した。室温で18時間攪拌した後、反応混合物を減圧下で濃縮した。残渣をCH2Cl2 (100 mL)中に再溶解し、5％水性KHSO4 (25 mL)、5％水性K2CO3 (2 x 25 mL)および塩水 (50 mL)で洗浄した。有機溶液を乾燥 (Na2SO4)し、減圧下で濃縮したところ、ゴムが得られ、これをMeOHおよびCHCl3 [3:97]の混合物で溶出するカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)により精製したところ、無色のゴムとして中間体トリフルオロ酢酸が得られた。ゴムをMeOH (10 mL)に溶解し、水 (2 mL)およびK2CO3 (1.13 g, 8.12 mmol)を添加した。得られた混合物を室温で18時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣をCH2Cl2 (100 mL)に溶解し、5％水性K2CO3 (2 x 25 mL)および塩水(50 mL)で連続的に洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で蒸発させたところ、無色のゴム (1.30 g)として表題のジアミンが得られた。
【０２３３】
LC-MS (ESI): tR = 4.51分(m/z = 888.8 [M+H]+)。
【０２３４】
説明 20: 保護されたN-ヒドロキシスクシンイミジルアミノ酸(PG)y(Aa)xOSucを調製するための一般的手順
【化４４】
2008546733.tif 000045
【０２３５】
THF (15 mL)中のジシクロヘキシルカルボジミド(1.05当量)の溶液を、無水THF(10 mL)中のN-ヒドロキシスクシンイミド(1.1当量)およびN-末端保護アミノ酸(1当量)の混合物に攪拌しながら室温で添加した。混合物を室温で18時間攪拌した後、濾過して沈降した固体を除去した。残渣をCH2Cl2 (10 mL)中に再溶解し、さらに2回濾過した。最後に、溶媒を減圧下で蒸発させたところ、白色の粉末としてN-ヒドロキシスクシンイミドエステルが得られた。
【０２３６】
(Aa)x(PG)y = D-Lys(Boc)2、LC-MS (ESI): tR = 3.88分 (m/z = 345.1 [M-OSuc]+)。
【０２３７】
(Aa)x(PG)y = L-Orn(Boc)2、LC-MS (ESI): tR = 3.79分 (m/z = 331.1 [M-OSuc]+)。
【０２３８】
(Aa)x(PG)y = L-Ser(OtBu)(Boc)、LC-MS (ESI): tR = 3.02分(m/z = 204.1 [M-OSuc]+)。
【０２３９】
(Aa)x(PG)y = L-Ser(OtBu)-L-Lys(Boc)2、LC-MS (ESI): tR = 3.61分 (m/z = 433.1 [M-OSuc]+)。
【０２４０】
(Aa)x(PG)y = [BocHN(CH2)3]2NCH2CO2H、LC-MS (ESI): tR = 3.12分(m/z = 388.1 [M-OSuc]+)。
【０２４１】
説明21: ビス-オレイルペンタミン塩酸塩を調製するための一般的手順
【化４５】
2008546733.tif 000046
【０２４２】
THF (30 mM)中の保護されたN-ヒドロキシスクシンイミドアミノ酸エステル(PG)y(Aa)xOSuc (2.2当量)と説明19のジアミン(1.0当量)の溶液を、水(2.2当量、0.2M)中のK2CO3の溶液で室温で処理した。混合物を18時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣をEtOAc (15 mM)で希釈し、半量の水で洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、溶媒を減圧下で除去してゴムにし、これをMeOHとCHCl3 [10:90]の混合物で溶出するカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)により精製したところ、ゴムとして中間体Bocカルバメートが得られた。このゴムを、室温で18時間、窒素下で、ジエチルエーテル中のHClの溶液(2M, 50 mM)で処理し、沈降した固体を濾過により回収し、ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥したところ、白色の粉末(66-88％収率)として表題のビス-オレイルペンタミン塩酸塩が得られた。
【０２４３】
実施例8: (Aa)x = L-Lys
【化４６】
2008546733.tif 000047
【０２４４】
LC-MS (ESI): tR = 10.17分(m/z = 1044.96 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C61H122N9O4) 1044.9606、実測値1044.9626 [M+H]+。
【０２４５】
実施例9: (Aa)x = D-Lys
【化４７】
2008546733.tif 000048
【０２４６】
LC-MS (ESI): tR = 10.24分(m/z = 1044.96 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z計算値(C61H122N9O4) 1044.9620、実測値1044.9630 [M+H]+。
【０２４７】
実施例10: (Aa)x = L-Orn
【化４８】
2008546733.tif 000049
【０２４８】
LC-MS (ESI): tR = 10.25分(m/z = 1016.93 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z計算値(C59H118N9O4) 1016.9307、実測値1016.9313 [M+H]+。
【０２４９】
実施例11: (Aa)x = L-Ser
【化４９】
2008546733.tif 000050
【０２５０】
LC-MS (ESI): tR = 11.71分(m/z = 962.8364 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C55H108N7O6) 962.8361、実測値962.8364 [M+H]+。
【０２５１】
実施例12: (Aa)x = L-Ser-L-Lys
【化５０】
2008546733.tif 000051
【０２５２】
LC-MS (ESI): tR = 10.39分(m/z = 1219.03 [M+H]+)、HRMS (ESI) m/z 計算値(C67H132N11O8) 1219.0260、実測値1219.0258 [M+H]+。
【０２５３】
実施例13: (Aa)x = [H2N(CH2)3]2NCH2CO2H
【化５１】
2008546733.tif 000052
【０２５４】
LC-MS (ESI): tR = 9.96分(m/z = 1131.05 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C65H132N11O4) 1131.0464、実測値1131.0470 [M+H]+。
【０２５５】
説明22: 2,2,2-トリフルオロ-N-[3-(4-{3-[3-(2,2,2-トリフルオロ-アセチルアミノ)-プロピルアミノ]-プロピルアミノ}-ブチルアミノ)-プロピル]-アセトアミド tris-トリフルオロ酢酸塩
【化５２】
2008546733.tif 000053
【０２５６】
トリフルオロ酢酸 (10 mL)を、CH2Cl2 (10 mL)中の説明18由来のBocカルバメートの攪拌溶液 (4.00 g, 5.14 mmol)に室温で添加した。18時間後、混合物を減圧下で濃縮し、残渣を無水ジエチルエーテル(100 mL)で処理した。得られた沈降物をフィルター上に回収し、無水ジエチルエーテル(50 mL)で洗浄したところ、白色の粉末(4.00 g)として表題のtris-トリフルオロ酢酸塩が得られた。
【０２５７】
1H-NMR (MeOH): δH1.75(m, 4H), 1.95(m, 4H), 2.10(m, 2H), 3.05(m, 8H), 3.15(m, 4H), 3.38(m, 4H)。
【０２５８】
説明23: オクタデカ-9-エノイン酸{4-[(3-アミノ-プロピル)-オクタデカ-9-エノイル-アミノ]-ブチル}-{3-[(3-アミノ-プロピル)-オクタデカ-9-エノイル-アミノ]-プロピル}-アミド
【化５３】
2008546733.tif 000054
【０２５９】
CH2Cl2 (100 mL)中のオレイン酸(3.00 g, 10.6 mmol)、説明22 (2.50 g, 3.21 mmol)の化合物の溶液に、TBTU (4.12 g, 12.8 mmol)、HOBt (1.73 g, 12.8 mmol)およびジイソプロピルエチルアミン (4.15 g 32.1 mmol)を添加した。室温で18時間攪拌した後、混合物を減圧下で濃縮し、残渣をCH2Cl2 (100 mL)中に再溶解し、5％水性KHSO4 (25 mL)、5％水性K2CO3 (2 x 25 mL)、および塩水 (50 mL)で連続的に洗浄した。有機溶液を乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮し、油にし、これをMeOHとCHCl3 [3:97]の混合物で溶出するカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)により精製したところ、無色のゴムとしてトリフルオロアセトアミドが得られた。
【０２６０】
このゴムをMeOH (10 mL)および水(2 mL)の混合物に溶解し、K2CO3 (1.13 g, 8.12 mmol)を添加した。この混合物を窒素下で18時間、室温で攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣をCH2Cl2 (100 mL)で希釈し、有機溶液を5％水性K2CO3 (2 x 25 mL)および塩水(50 mL)で連続的に洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で蒸発したところ、無色のゴム(1.50 g)として表題のビス-アミンが得られた。
【０２６１】
LC-MS (ESI): tR =8.98分(m/z = 1053.4 [M+H]+)。
【０２６２】
説明24: tris-オレイル、ビス-(Aa)x -ペンタミン塩酸塩を調製するための一般的手順
【化５４】
2008546733.tif 000055
【０２６３】
THF (20 mM)中の保護されたN-ヒドロキシスクシンイミドアミノ酸エステル(PG)y(Aa)xOSuc (2.2当量)および説明23のジアミン(1.0当量)の溶液を、室温で水(2.2当量、0.2M)中のK2CO3の溶液で処理した。混合物を窒素下で18時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣をEtOAc (10 mM)で希釈し、半量の水で洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、溶媒を減圧下で蒸発させてゴムにし、これをMeOHおよびCHCl3 [10:90]の混合物で溶出するカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)により精製したところ、ゴムとして中間体Bocカルバメートが得られた。このゴムを、窒素下で18時間、室温でジエチルエーテル中のHClの溶液(2M, 50 mM)で処理し、沈降した固体を濾過により回収し、無水ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥したところ、白色の粉末(41-56％収率)として表題のtris-オレイルペンタミン塩酸塩が得られた。
【０２６４】
実施例14: (Aa)x = L-Lys
【化５５】
2008546733.tif 000056
【０２６５】
LC-MS (ESI): tR = 12.94分(m/z = 1309.20 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C79H154N9O5) 1309.2073、実測値1309.2070 [M+H]+。
【０２６６】
実施例15: (Aa)x = D-Lys
【化５６】
2008546733.tif 000057
【０２６７】
LC-MS (ESI): tR = 12.94分(m/z = 1309.20 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z計算値(C79H154N9O5) 1309.2073、実測値1309.2075 [M+H]+。
【０２６８】
実施例16: (Aa)x = L-Orn
【化５７】
2008546733.tif 000058
【０２６９】
LC-MS (ESI): tR = 12.97分(m/z = 1281.17 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C59H118N9O5) 1281.1760、実測値1281.1759 [M+H]+。
【０２７０】
実施例17: (Aa)x = L-Ser
【化５８】
2008546733.tif 000059
【０２７１】
LC-MS (ESI): tR = 17.28分(m/z = 1227.08 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C73H140N7O7) 1227.0814、実測値1227.0814 [M+H]+。
【０２７２】
実施例18: (Aa)x = L-Ser-L-Lys
【化５９】
2008546733.tif 000060
【０２７３】
LC-MS (LC-TOF): tR = 3.17分(1484.60 [M+H]+)。
【０２７４】
実施例19: (Aa)x = [H2N(CH2)3]2NCH2CO2H
【化６０】
2008546733.tif 000061
【０２７５】
LC-MS (LC-TOF): tR = 3.83分(m/z = 1396.75 [M+H]+)。
【０２７６】
実施例20: ビス-オレイルペンタミン塩酸塩の調製
【化６１】
2008546733.tif 000062
【０２７７】
説明19 (90.0 mg, 0.10 mmol)中のモノ-Bocジアミン中間体を、ジエチルエーテル中のHClの溶液(2M, 5 mL)で処理し、窒素下で3時間、室温で攪拌した。溶媒を窒素流下で蒸発させ、残渣の固体を無水ジエチルエーテル(2 mL)で洗浄し、減圧下で乾燥したところ、白色の粉末 (85.0 mg)として表題のtris-塩酸塩が得られた。
【０２７８】
LC-MS (ESI): tR = 12.28分(m/z = 788.77 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C49H98N5O2) 788.7721、実測値788.7710 [M+H]+。
【０２７９】
実施例21: tris-オレイルペンタミン塩酸塩の調製
【化６２】
2008546733.tif 000063
【０２８０】
説明23のtris-オレイン酸塩 (85.0 mg, 81.0μmol)を、ジエチルエーテル中のHClの溶液(1.5M, 5 mL)で処理し、窒素下で3時間、室温で攪拌した。溶媒を窒素流下で蒸発させ、残渣の白色固体を無水ジエチルエーテル(2 mL)で洗浄し、減圧下で乾燥したところ、白色の粉末 (70.0 mg)として表題のビス塩酸塩が得られた。
【０２８１】
LC-MS (ESI): tR = 17.63分(m/z = 1053.01 [M+H]+); HRMS (ESI) m/z 計算値(C67H130N5O3)  1053.0174、実測値1053.0181 [M+H]+。
【０２８２】
3) スペルミジンに基づくジェミニ
説明25: N1,N8-ビス(トリフルオロアセチル)-スペルミジントリフルオロアセテート
【化６３】
2008546733.tif 000064
【０２８３】
CH3CN (150 mL)中のスペルミジンの溶液(m = 4, n = 3; 9.70 g, 66.8 mmol)に、トリフルオロ酢酸エチル(39.8 mL, 330 mmol)および水(2.8 mL, 18 mmol)を添加した。反応混合物を還流下で18時間加熱した後、室温まで冷却させ、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣の固体をCH2Cl2 (2 x 150 mL)で磨砕したところ、白色の固体(28.9 g)として表題のビス(トリフルオロアセトアミド)が得られた。
【０２８４】
LC-MS (ESI): tR = 1.10分 (m/z = 338.1 [M+H]+)。
【０２８５】
説明26: N4-(tert-ブトキシカルボニル)-N1,N8-ビス(トリフルオロアセチル)-スペルミジン
【化６４】
2008546733.tif 000065
【０２８６】
ジイソプロピルエチルアミン (16.7 mL, 95.7 mmol)およびTHF (100 mL)中のジ-tert-ブチルジカルボネート(14.63 g, 67.0 mmol)の溶液を、THF (280 mL)中のN1,N8-ビス(トリフルオロアセチル)スペルミジントリフルオロアセテート(説明25; 28.8 g, 63.8 mmol)の溶液に、窒素雰囲気下で添加した。室温で18時間後、溶媒を減圧下で蒸発させ、EtOAc (700 mL)を添加した。溶液を5％NaHCO3 (2 x 150 mL)、塩水(150 mL)、5％KHSO4 (2 x 150mL)および塩水(2 x 150 mL)で連続的に洗浄し、Na2SO4上で乾燥し、蒸発させたところ、白色の固体(28.0 g)として表題のBocカルバメートが得られた。
【０２８７】
LC-MS (ESI): tR = 4.09分(m/z = 438.3 [M+H]+)。
【０２８８】
説明27: N4-(tert-ブトキシカルボニル)-スペルミジン
【化６５】
2008546733.tif 000066
【０２８９】
水酸化ナトリウム水溶液 (280 mL x 0.5N)を、10℃で攪拌しながら、メタノール(400 mL)中のN4-(tert-ブトキシカルボニル)-N1,N8-ビス(トリフルオロアセチル)-スペルミジン(説明26; 28.0 g, 64.0 mmol)の溶液に添加した。冷却バスを除去し、混合物を18時間攪拌し、メタノールを減圧下で蒸発させた。得られた水性懸濁液を[9:1]のCHCl3-MeOH (5 x 300 mL)で抽出し、合わせた有機抽出液を乾燥(Na2SO4)し、減圧下で蒸発させたところ、無色の油 (15.5 g)として表題のアミンが得られた。
【０２９０】
LC-MS (ESI): tR = 0.56分(m/z = 246.2 [M+H]+)。
【０２９１】
説明28: N1,N8-ジオレイル-スペルミジントリフルオロアセテート
【化６６】
2008546733.tif 000067
【０２９２】
THF (90 mL)に溶解したオレイン酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(2.10 g, 5.40 mmol)の溶液および水(14 mL)中の炭酸カリウム(890 mg, 6.40 mmol)の溶液を、THF (90 mL)中の N4-(tert-ブチルオキシカルボニル)-スペルミジン (説明27; 632 mg, 2.58 mmol)の溶液に添加した。得られた混合物を室温で16時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣をCHCl3 (300 mL)に溶解し、5％水性クエン酸 (50 mL)および塩水 (2 x 50 mL)で洗浄した後、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮した。得られた油を、ヘキサン-EtOAc [75:25]、次いでヘキサン-EtOAc [75:25]で溶出するフラッシュクロマトグラフィーにより精製したところ、褐色の油として中間体Bocカルバメートが得られた。この油をCH2Cl2 (6.0 mL)に溶解し、0℃に冷却し、トリフルオロ酢酸(6.0 mL)で処理した。得られた混合物を室温までゆっくりと温め、さらに1.5時間攪拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をジエチルエーテルと共に蒸発させたところ、白色の固体 (1.94 g)として表題のトリフルオロ酢酸塩が得られた。
【０２９３】
LC-MS (ESI): tR = 19.03分(m/z = 674.6564 [M+H]+, 100%); HRMS (ESI) m/z 計算値 (C54H107N8O4) 674.6564、実測値674.6564 [M+H]+)。
【０２９４】
説明29: 2,2,2-トリフルオロ-N-{3-[3-(2,2,2-トリフルオロアセチルアミノ)-プロピルアミノ]プロピル}-アセトアミドトリフルオロアセテート
【化６７】
2008546733.tif 000068
【０２９５】
トリフルオロ酢酸エチル (27.0 g, 190 mmol)を、[99:1]のアセトニトリル：水 (150 mL)中のN1-(3-アミノプロピル)プロパン-1,3-ジアミン (m = n = 3; 5.00 g, 38.2 mmol)の溶液に添加し、混合物を還流下で攪拌しながら3時間加熱した。室温まで冷却した後、CH2Cl2 (50 mL)を添加し、得られた沈降物を回収し、CH2Cl2 (50 mL)で洗浄したところ、白色の粉末 (16.6 g)として表題のトリフルオロ酢酸塩が得られた。
【０２９６】
LC-MS (ESI): tR = 2.05分(m/z = 323.0 [M+H+])。
【０２９７】
説明30: {ビス-[3-(2,2,2-トリフルオロアセチルアミノ)プロピル]-アミノ}-酢酸エチルエステル
【化６８】
2008546733.tif 000069
【０２９８】
エチルブロモアセテート (7.30 g, 43.7 mmol)を、ジイソプロピルエチルアミン (15.0 g, 86.3 mmol)および無水アセトニトリル(150 mL)中のトリフルオロ酢酸塩(説明29; 15.0 g, 34.5 mmol)の溶液に添加した。得られた混合物を室温で18時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。得られた残渣を水 (100 mL)で希釈し、CH2Cl2 (2 x 60 mL)で抽出した。合わせた有機抽出液を乾燥(Na2SO4)し、減圧下で蒸発させたところ、淡黄色の油 (14.1 g)として表題のエチルエステルが得られた。
【０２９９】
LC-MS (ESI): tR = 3.0分(m/z = 410 [M+H+])。
【０３００】
説明31: ビス-(3-tert-ブトキシカルボニルアミノ-プロピル)-アミノ]-酢酸
【化６９】
2008546733.tif 000070
【０３０１】
説明30のエチルエステル (14.1 g, 34.5 mmol)、水酸化ナトリウム (6.0 g, 40.0 mmol)、水 (35 mL)およびエタノール (175 mL)の混合物を、室温で20時間攪拌した。Boc無水物 (15.1 g, 68.8 mmol)を添加し、攪拌をさらに3時間継続した後、10％塩酸を添加することにより、混合物を中性のpHに調整した。水(100 mL)を添加し、溶液をCH2Cl2 (4 x 50 mL)で抽出した。合わせた有機抽出液を乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮したところ、白色の粉末(3.5 g)として表題のカルボン酸が得られた。
【０３０２】
LC-MS (ESI): tR = 3.05分(m/z = 390.3 [M+H+])。
【０３０３】
説明32: メチルジシアノアセテートカリウム塩
【化７０】
2008546733.tif 000071
【０３０４】
THF (9.0 mL)中のマロニトリル(4.00 g, 60.6 mmol)およびメチルクロロ蟻酸 (4.95 mL, 64.2 mmol)の溶液を、0.5時間に渡って、40℃未満の温度を維持しながら、水(6.0 mL)中の水酸化カリウム (6.80 g, 121 mmol)の攪拌溶液に添加した。混合物を室温でさらに2時間攪拌し、得られた沈降物を濾過により回収し、最初に冷水 (10 mL)で、次いでエタノール (10 mL)で洗浄したところ、白色の固体 (3.31 g)として表題のカリウム塩が得られた。
【０３０５】
1H-NMR (D2O): δH3.58 (s, 3H)。
【０３０６】
説明33: メチル3-アミノ-2-(アミノメチル)プロピオネートビス-塩酸塩
【化７１】
2008546733.tif 000072
【０３０７】
濃塩酸(32％、2.0 mL)を含むメタノール(100 mL)中のジシアノ酢酸メチル (1.00 g, 6.20 mmol)のナトリウム塩の溶液中の炭素上の10％パラジウム(2.0 g)の攪拌懸濁液を、5気圧、室温で24時間水素化した。触媒を濾過により除去し、溶媒を減圧下で蒸発させた。残渣をメタノール(50 mL)で処理し、沈降した塩化ナトリウムを濾過により除去した。溶液を減圧下で少量まで濃縮した後、EtOAcを添加して、灰白色の固体 (1.20 g)として表題のビス-塩酸塩を沈降させた。
【０３０８】
1H-NMR (d6 DMSO): δH8.40 (brs, 6H), 3.65 (s, 3H), 3.25 (m, 1H), 3.15 (m, 4H)。
【０３０９】
説明34: 3-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ-メチル)プロピオン酸メチルエステル
【化７２】
2008546733.tif 000073
【０３１０】
Boc無水物(0.62 g, 2.83 mmol)を、DMF (8.0 mL)中のジイソプロピルエチルアミン (0.95 mL, 5.40 mmol)および説明33のビス-塩酸塩(255 mg, 1.35 mmol)の攪拌溶液に添加した。室温で18時間攪拌した後、沈降した固体を濾過により除去し、濾液を減圧下で蒸発させた。残渣の油をEtOAc (30 mL)に溶解した後、水(2 x 5 mL)で洗浄し、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で蒸発させたところ、粘性の無色の油 (430 mg)として表題のビス-Bocカルバメートが得られた。
【０３１１】
1H-NMR (CDCl3): δH5.20 (brs, 2H), 3.68 (s, 3H), 3.55 (m, 2H), 3.20 (m, 2H), 2.73 (m, 1H), 1.42 (s, 18H)。
【０３１２】
説明35: 3-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ-メチル)プロピオン酸
【化７３】
2008546733.tif 000074
【０３１３】
水性の2N水酸化ナトリウム (2.48 mL, 4.96 mmol)を、THF (7.5 mL)中の説明34 (0.41 g, 1.24 mmol)のメチルエステルの攪拌溶液に添加し、混合物を室温で24時間攪拌した。水 (15 mL)を添加し、溶液を5％クエン酸で酸性化した。混合物をCHCl3 (3 x 25 mL)で抽出し、合わせた有機抽出液を塩水 (30 mL)で洗浄し、乾燥 (Na2SO4)し、減圧下で蒸発させたところ、粘性の無色の油(280 mg)として表題の酸が得られた。
【０３１４】
1H-NMR (d6 DMSO): δH12.2 (brs, 1H), 6.70 (brs, 2H), 3.05 (m, 4H), 2.50 (m, 1H), 1.35 (s, 18H)。
【０３１５】
説明36: (Boc)2Lys.(tBuO)SerOH
THF (60.0 mL)中のビス-Boc L-リジン N-ヒドロキシスクシンイミド(2,54 g, 5.72 mmol)の溶液を、水(12.0 mL)中のL-セリンtert-ブチルエーテル (1.02 g, 6.30 mmol)および炭酸カリウム (1.03 g, 7.44 mmol)の攪拌混合物に添加した。混合物を室温で18時間攪拌した後、減圧下で濃縮した。残渣をCHCl3 (140 mL)および水 (140 mL)で希釈し、1N塩酸でpH2に調整した。有機相を分離し、水相をCHCl3 (2 x 140 mL)で抽出した。合わせた有機相を乾燥(Na2SO4)した後、減圧下で蒸発させたところ、白色の気泡 (2.84 g)としてジペプチドが得られた。
【０３１６】
LC-MS (ESI): tR = 3.80分 (m/z = 490.3 [M+H]+)。
【０３１７】
説明37: N1,N8-ジオレイル-N4-(Aa)-スペルミジンを調製するための一般的手順
N末端保護されたアミノ酸((Aa)x-(PG)y: 1.1当量)、HCTU (1.1当量)、およびジイソプロピルエチルアミン (3.2当量)を、DMF (60 mM)中のN1,N8-ジオレイル-スペルミジントリフルオロ酢酸(説明28)の溶液に添加した。混合物をN2下で室温にて18時間攪拌し、等量のEtOAcを添加した。有機混合物を、5％水性KHSO4溶液 (3 x)、5％水性K2CO3溶液 (3 x)および塩水(1 x)で連続的に洗浄した後、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮した。残渣をEtOAc (10 mM)に溶解し、等量のEtOAc中の5.0N HClを添加した。反応物を室温で2時間攪拌した後、減圧下で濃縮し、残渣をジエチルエーテルで磨砕したところ、非晶質の白色固体が得られ、これを調製的MS-指向的RP-HPLC (C-18, 5μm; 溶離剤A:水 + 0.1％蟻酸、溶離剤B: MeCN:水 [95:5] + 0.1％蟻酸; 流速: 40 mL/分; 検出剤 (ESI-MS);方法: 15分に渡ってA中の5-30％のB)により精製した。生成物を含む画分を蒸発させ、残渣をメタノールに溶解し、2.0N HClで処理し、ジエチルエーテルを添加した。10分後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を凍結乾燥したところ、白色の固体として表題の界面活性剤ヒドロクロリドが得られた。
【０３１８】
実施例22: Aa = L-Dap
【化７４】
2008546733.tif 000075
【０３１９】
LC-MS (ESI): tR = 7.50分(m/z = 674.6 [M-Dap]+ (100%), 760.7 [M+H]+ (20%)); HRMS (ESI) m/z 計算値(C46H90N5O3) 760.7044、実測値760.7028 [M+H]+。
【０３２０】
実施例23: Aa = L-Dab
【化７５】
2008546733.tif 000076
【０３２１】
LC-MS (ESI): tR = 6.70分(m/z = 774.7 [M+H]+ (50%)); HRMS (ESI) m/z 計算値 (C47H92N5O3) 774.7200、実測値774.7197 [M+H]+。
【０３２２】
実施例24: Aa = L-Orn
【化７６】
2008546733.tif 000077
【０３２３】
LC-MS (ESI): tR = 6.64分(m/z = 788.7 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C48H94N5O3) 788.7357、実測値788.7350 [M+H]+。
【０３２４】
実施例25: Aa = L-Lys
【化７７】
2008546733.tif 000078
【０３２５】
LC-MS (ESI): tR = 6.68分 (m/z = 802.8 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値(C49H96N5O3) 802.7513、実測値802.7517 [M+H]+。
【０３２６】
実施例26: Aa = D-Lys
【化７８】
2008546733.tif 000079
【０３２７】
LC-MS (ESI): tR = 6.78分(m/z = 802.8 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値(C49H96N5O3) 802.7513、実測値802.7524 [M+H]+。
【０３２８】
実施例27: Aa = L-Ser
【化７９】
2008546733.tif 000080
【０３２９】
LC-MS (ESI): tR = 18.41分(m/z = 761.7 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C46H89N4O4) 761.6884、実測値761.6888 [M+H]+。
【０３３０】
実施例28: Aa = L-Ser-L-Lys
【化８０】
2008546733.tif 000081
【０３３１】
LC-MS (ESI): tR = 14.89分(m/z = 889.8 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C52H101N6O5) 889.7833、実測値889.7829 [M+H]+。
【０３３２】
実施例29: Aa = L-Ser-D-Lys
【化８１】
2008546733.tif 000082
【０３３３】
LC-MS (ESI): tR = 14.94分(m/z = 889.8 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C52H101N6O5) 889.7833、実測値889.7842 [M+H]+。
【０３３４】
実施例30: Aa = (説明35)
【化８２】
2008546733.tif 000083
【０３３５】
LC-MS (ESI): tR = 6.33分(m/z = 774.7 [M+H]+ (100%))。
【０３３６】
実施例31: Aa = (説明31)
【化８３】
2008546733.tif 000084
【０３３７】
TBTU (530 mg, 1.68 mmol)およびジイソプロピルエチルアミン (1.5 mL 8.40 mmol)を含むCH2Cl2(15 mL)中の説明31 (660 mg, 1.68 mmol)のビス-Bocカルボン酸の溶液を、N1,N8-ジオレイル-スペルミジンビス(トリフルオロ酢酸)(説明28; 1.00 g, 1.40 mmol)に添加した。混合物を室温で18時間攪拌した後、減圧下で濃縮し、残渣をCH2Cl2 (100 mL)中に取り、5％水性KHSO4溶液 (25 mL)、5％水性K2CO3溶液 (2 x 25 mL)および塩水( 50 mL)で連続的に洗浄した。有機相を乾燥(Na2SO4)し、減圧下で蒸発させたところ、油が得られ、これを、CHCl3-MeOH [90:10]の混合物で溶出するカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)により精製したころ、無色のゴムとして中間体ビス-Bocカルバメートが得られた。このゴムをCH2Cl2 (25 mL)に溶解し、EtOAc (10 mL)中の5N HClで処理した。得られた混合物を室温で2時間攪拌し、沈降した固体を濾過により回収し、無水ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥したところ、白色の粉末として表題の化合物が得られた。
【０３３８】
LC-MS (ESI): tR = 12.65分(m/z = 845.8 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C51H101N6O3) 845.7935、実測値845.7938 [M+H]+。
【０３３９】
説明38: N1,N8-ジオレイル-N4-[(説明35)-Aa]-スペルミジンを調製するための一般的手順
N末端保護されたアミノ酸(2.6当量)、HCTU (2.6当量)、およびDIEA (7.5当量)を、DMF (80 mM)中の実施例30の溶液に添加した。混合物をN2下で18時間、室温で攪拌した後、等量のEtOAcを添加した。有機混合物を、5％水性KHSO4溶液 (3 x)、5％水性K2CO3溶液 (3 x)および塩水(1 x)で連続的に洗浄した後、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮した。残渣をEtOAc (10 mM)に溶解し、EtOAc中の等量の5.0N HClを添加した。反応物を室温で2時間攪拌した後、減圧下で濃縮し、残渣をジエチルエーテルで磨砕したところ、非晶質の白色固体が得られ、これを調製的MS-指向的RP-HPLC (C-18, 5μm; 溶離剤A: 水 + 0.1％蟻酸、溶離剤B: MeCN:水 [95:5] + 0.1％蟻酸; 流速: 40 mL/分; 検出剤 (ESI-MS);方法: 15分に渡って、A中の30-50％のB)により精製した。生成物を含む画分を蒸発させ、残渣をメタノールに溶解し、ジエチルエーテル中の2.0M HClで処理した。10分後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を凍結乾燥したところ、白色の固体として表題の塩酸塩が得られた。
【０３４０】
実施例32: Aa = L-Dab
【化８４】
2008546733.tif 000085
【０３４１】
LC-MS (ESI): tR = 12.65分(m/z = 974.8 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値(C55H108N9O5) 974.8473、実測値974.8473 [M+H]+。
【０３４２】
実施例33: Aa = L-Lys
【化８５】
2008546733.tif 000086
【０３４３】
LC-MS (ESI): tR = 12.47分(m/z = 1030.9 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C59H116N9O5) 1030.9099、実測値1030.9108 [M+H]+。
【０３４４】
実施例34: Aa = L-Ser-L-Lys
【化８６】
2008546733.tif 000087
【０３４５】
LC-MS (ESI): tR = 12.46分(m/z = 603.0 [M+2H]2+ (100%), 1205.0 [M+H]+ (85%)); HRMS (ESI) m/z計算値(C65H126N11O9) 1204.9740、実測値1204.9755 [M+H]+。
【０３４６】
説明39: N1,N8-ジオレイル-N4-[(説明31)-Aa]-スペルミジンを調製するための一般的手順
実施例31のアミン塩酸塩(1.0当量)を、室温で、CH2Cl2 (約20 mM)中のN-末端保護されたアミノ酸 ((Aa)x(PG)y; 2.2当量)、1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミドヒドロクロリド(2.2当量)およびジイソプロピルエチルアミン (6.0当量.)の攪拌溶液に添加した。18時間後、反応混合物を減圧下で濃縮し、残渣をCH2Cl2に溶解し、水、5％水性K2CO3溶液、および塩水で連続的に洗浄した。有機相を乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮したところ、油が得られ、これを、0.2％トリエチルアミンを含むMeOH:CHCl3 [97:3]の混合物で溶出するカラムクロマトグラフィー(シリカゲル)により精製したところ、無色のゴムとして中間体カルバメートが得られた。このゴムをEtOAc (5 mM)中の5N HClに溶解し、得られた溶液を室温で2時間攪拌した。得られた固体を濾過により回収し、無水ジエチルエーテルで洗浄し、減圧下で乾燥したところ、白色の粉末として表題の塩酸塩が得られた。
【０３４７】
実施例35: Aa = L-Dap
【化８７】
2008546733.tif 000088
【０３４８】
LC-MS (ESI): tR = 12.65分(m/z = 1017.9 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C57H113N10O5) 1017.8895、実測値1017.8915 [M+H]+。
【０３４９】
実施例36: Aa = L-Dab
【化８８】
2008546733.tif 000089
【０３５０】
LC-MS (ESI): tR = 12.04分(m/z = 1045.9 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C59H117N10O5) 1045.9208、実測値1045.9229 [M+H]+。
【０３５１】
実施例37: Aa = L-Lys
【化８９】
2008546733.tif 000090
【０３５２】
LC-MS (ESI): tR = 11.81分(m/z = 1101.9 [M+H]+ (80%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C63H125N10O5) 1101.9834、実測値1101.9818 [M+H]+。
【０３５３】
実施例38: Aa = D-Lys
【化９０】
2008546733.tif 000091
【０３５４】
LC-MS (ESI): tR = 11.94分(m/z = 1101.9 [M+H]+ (80%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C63H125N10O5) 1101.9834、実測値1101.9835 [M+H]+。
【０３５５】
実施例39: Aa = L-Ser
【化９１】
2008546733.tif 000092
【０３５６】
LC-MS (ESI): tR = 13.25分(m/z = 1019.8 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C57H111N8O7) 1019.8576、実測値1019.8560 [M+H]+。
【０３５７】
実施例40: Aa = L-Ser-L-Lys
【化９２】
2008546733.tif 000093
【０３５８】
LC-MS (ESI): tR = 11.91分(m/z = 1276.0 [M+H]+ (100%), HRMS (ESI) m/z計算値 (C69H135N12O9) 1276.0475、実測値1276.0447 [M+H]+。
【０３５９】
実施例41: Aa = (説明31)
【化９３】
2008546733.tif 000094
【０３６０】
LC-MS (ESI): tR = 11.66分(m/z = 1188.0 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z 計算値(C67H135N12O5) 1188.0678、実測値1188.0686 [M+H]+。
【０３６１】
4) エステル結合したジェミニ 
説明40: N,N'-ビス-(2-シアノエチル)-1,4-ジアミノブタン
【化９４】
2008546733.tif 000095
【０３６２】
メタノール (50 mL)中の1,4-ジアミノブタン (n = 4; 25.0 g, 0.28 mol)の溶液に、メタノール (25 mL)中のアクリロニトリル (31.6 g, 0.60 mmol)の溶液を滴下しながら、0℃で添加した。添加後、混合物を室温まで持って行った後、18時間攪拌した。最後に、溶媒を減圧下で除去したところ、淡黄色の液体 (57.0 g, 量)として表題のジアミンが得られた。
【０３６３】
Rfシリカ: 0.60 (MeOH-0.88NH3 95:5)。
【０３６４】
1H-NMR (CDCl3): δH2.88 (m, 4H), 2.60 (m, 4H), 2.46 (m, 4H), 1.45 (m, 4H)。
【０３６５】
説明41:  N,N'-ビス-(2-カルベトキシエチル)-1,4-ジアミノブタンジヒドロクロリド
【化９５】
2008546733.tif 000096
【０３６６】
6N HCl (80 mL)中の説明40 (n = 4; 10.0 g, 51.5 mmol)の溶液を還流下で18時間加熱した後、室温まで冷却し、溶媒を減圧下で部分的に蒸発させた。残渣を溶液に、EtOH (40 mL)を添加し、沈降した固体を濾過除去し、EtOH (10 mL)で洗浄したところ、白色の固体(17.4 g, 量)として表題のジ-カルボン酸が得られた。
【０３６７】
1H-NMR (d6 DMSO): δH12.70 (brs, 2H), 3.05 (t, J = 7.5, 4H), 2.88 (m, 4H), 2.72 (t, 4H), 1.65 (m, 4H)。
【０３６８】
説明42: N,N'-ビス-(2-カルベトキシエチル)-N,N'-ビス-(tert-ブトキシカルボニル)-1,4-ジアミノブタン
【化９６】
2008546733.tif 000097
【０３６９】
1N NaOH (350 mL)中の説明41 (n = 4; 19.9 g, 65.3 mmol)の溶液に、ジオキサン(350 mL)中のジ-tert-ブチルジカルボネート (57.0 g, 261 mmol)の溶液を添加した。混合物を室温で18時間攪拌した後、半量まで濃縮した。残渣をpH 3-4に調整した後、ジクロロメタン(250 mL x 3)で抽出した。合わせた有機抽出物を塩水(150 mL)で洗浄し、乾燥 (Na2SO4)し、減圧下で濃縮したところ、白色の粉末(24.4 g, 87％)として表題のカルバメートが得られた。
【０３７０】
Rfシリカ: 0.31 (EtOAc-MeOH 2:1)。
【０３７１】
LC-MS (ESI): tR = 4.04分(m/z = 433.1 [M+H+])。
【０３７２】
説明43: 3-(tert-ブトキシカルボニル-{4-[tert-ブトキシカルボニル-(2-オクタデカ-8-エニルオキシカルボニル-エチル)-アミノ]-ブチル}-アミノ)-プロピオン酸オクタデカ-8-エニルエステル
【化９７】
2008546733.tif 000098
【０３７３】
ジクロロメタン(200 mL)中の説明42のN-保護されたアミノ酸 (n = 4; 15.2 g, 35.1 mmol)、ジメチルアミノピリジン (1.70 g, 14.0 mmol)およびオレイルアルコール (18.4 g, 68.4 mmol)の溶液に、ジクロロメタン(50 mL)中のEDCI (13.1 g, 68.4 mmol)の溶液を0℃で添加した。得られた混合物を室温まで温めた後、N2下で18時間攪拌した。ジクロロメタン(250 mL)を添加し、混合物を塩水 (4 x 200 mL)で洗浄し、乾燥 (Na2SO4)し、減圧下で濃縮したところ、油が得られ、これをヘキサン中のCH2Cl2 (50-90％)の溶媒勾配で溶出するカラムクロマトグラフィーにより精製したところ、無色の油 (13.0 g, 40％)として表題のエステルが得られた。
【０３７４】
Rfシリカ: 0.61 (Hex-EtOAc 7:3)。
【０３７５】
1H-NMR (CDCl3): δH5.32 (m, 4H), 4.05 (t, J = 7.0, 4H), 3.42 (brs, 4H), 3.18 (brs, 4H), 2.53 (brs, 4H), 1.98 (m, 8H), 1.60 (m, 6H), 1.42 (m, 22H), 1.40-1.20 (m, 40H), 0.86 (t, J = 7.0, 6H)。
【０３７６】
説明44 : 3-[4-(2-オクタデカ-9-エニルオキシカルボニル-エチルアミノ)-ブチルアミノ]-プロピオン酸オクタデカ-9-エニルエステルビス塩酸塩
【化９８】
2008546733.tif 000099
【０３７７】
説明43のエステル(n = 4, R = オレイル; 13.0 g, 13.9 mmol)を、CH2Cl2 (70 mL)に溶解し、EtOAc中の4M HCl (140 mL)で処理した。得られた混合物を室温で2時間攪拌した後、溶媒を減圧下で除去し、残渣を無水ジエチルエーテル(150 mL)で磨砕したところ、固体が得られ、これを減圧下で乾燥したところ、白色の粉末 (10.23 g, 91％)としてビス塩酸塩が得られた。
【０３７８】
Rfシリカ: 0.46 (MeOH-0.88NH3 97:3)。
【０３７９】
LC-MS (ESI): tR = 8.07分(m/z = 733.6 [M+H+])。
【０３８０】
説明45：実施例42〜45のジェミニ界面活性剤を調製するための一般的手順
N-末端保護されたアミノ酸 (0.41 mmol, 2.6当量)、HCTU (168 mg, 0.41 mmol, 2.6当量)、およびジイソプロピルエチルアミン (0.19 mL, 1.10 mmol, 7.0当量)を、DMF-CH2Cl2 [1:1] (4.0 mL)中の説明44のアミン塩酸塩(n = 4, R = oleyl; 150 mg, 0.156 mmol)の溶液に添加した。混合物をN2下で18時間、室温で攪拌した後、混合物を少量まで濃縮し、EtOAc (30 mL)を添加した。有機溶液を5％水性KHSO4溶液 (3 x 8 mL)、5％水性K2CO3溶液(3 x 8 mL)および塩水 (3 x 10 mL)で連続的に洗浄した後、乾燥(Na2SO4)し、減圧下で濃縮した。残渣を、水中のMeOHの溶媒勾配 (50-100％)で溶出する逆相カラムクロマトグラフィー、次いで、ヘキサン中のEtOAcの溶媒勾配 (20-40％)で溶出するシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。残渣をEtOAc (2.0 mL)に溶解し、EtOAc (3.0 mL)中の5.0N HClを添加した。得られた混合物を室温で2時間攪拌した後、減圧下で濃縮し、固体の残渣をジエチルエーテル(5.0 mL)で磨砕したところ、白色の粉末 (75-93％)として実施例42〜45のジェミニ界面活性剤が得られた。
【０３８１】
実施例42
【化９９】
2008546733.tif 000100
【０３８２】
LC-MS (ESI): tR = 12.18分 (m/z = 933.8 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値 (C54H105N6O6) 933.8096、実測値933.8096 [M+H]+。
【０３８３】
実施例43
【化１００】
2008546733.tif 000101
【０３８４】
LC-MS (ESI): tR = 12.15分(m/z = 961.8 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値(C56H109N6O6) 961.8409、実測値933.8400 [M+H]+。
【０３８５】
実施例44
【化１０１】
2008546733.tif 000102
【０３８６】
LC-MS (ESI): tR = 12.18分 (m/z = 989.9 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値(C58H113N6O6) 989.8722、実測値989.8718 [M+H]+。
【０３８７】
実施例45
【化１０２】
2008546733.tif 000103
【０３８８】
LC-MS (ESI): tR = 12.20分(m/z = 989.9 [M+H]+ (100%)); HRMS (ESI) m/z計算値(C58H113N6O6) 989.8722、実測値989.8729 [M+H]+。
【０３８９】
5)遺伝子送達
説明46-プラスミド調製および製剤
プラスミドpGL3CMVは、CMV極初期プロモーターがルシフェラーゼ発現を駆動するpGL3 Basic(Promega Corporation., Madison, Wisconsin, USA)に基づくルシフェラーゼ発現ベクターである。プラスミドpGL3CMVを、マウス皮膚生検における全ての遺伝子発現試験において用い、WO03/061636に記載されている。
【０３９０】
プラスミドp7313ieは、CMV極初期プロモーターがコードされた抗原の産生を駆動する真核発現ベクターである(WO03/025003)。
【０３９１】
プラスミドp7313iTrngは、CMV極初期プロモーターが、HIV逆転写酵素、nefおよびgag遺伝子の一部からなる融合抗原RNGの発現を駆動するベクターである。プラスミドp7313iTrngを、マウスにおける全ての免疫応答試験において用いた(WO03/025003)。
【０３９２】
スーパーコイルプラスミドDNA(低内毒素)を、アルカリSDS溶解、超遠心および陰イオン交換カラムクロマトグラフィーの組合せを用いて、約100 mg収量の大規模で高純度まで精製した。プラスミドを、1μg/μlで、TE(10 mM TrisHCl、1 mM EDTA)、pH8.0に再懸濁したところ、アガロースゲル電気泳動による分析の際に95％を超えるスーパーコイルであると決定された。
【０３９３】
プラスミドを、標準的なエタノール沈降手順(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook, J.ら、第2版、1989, CSH Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA、第1章を参照)の後に、高純度Milli Q (Millipore)濾過水中で製剤化するか、またはTE中のプラスミドDNAをOptimem(登録商標)I(GIBCO Invitrogen)中に直接希釈した。DNAを、0.4μg/μlの濃度で、水性製剤溶液中に直接再懸濁した。
【０３９４】
一般的な水性緩衝化DNA製剤をかなり超えるこの改善された遺伝子発現が記載されている(Chesnoy, S & Huang, L (Mole. Therapy (2002) 5: 57-62)が、ジェミニ界面活性剤を含まない、送達のために製剤化されたDNA(以後「裸のDNA」と呼ぶ)を、皮内経路を介するin vivoでの送達のために2 x PBS中で製剤化した。
【０３９５】
説明47-ジェミニ界面活性剤およびリポプレックスの調製および製剤
全てのジェミニ界面活性剤を、4℃で保存した1 mg/mlの保存濃度の純水中にボルテックス再懸濁することにより、凍結乾燥保存物から調製した。ジェミニ界面活性剤を純水中に希釈するか、または即時使用のためにOptimem(登録商標)I(GIBCO Invitrogen)中に直接希釈した。ジェミニ界面活性剤をDOPEなどの他の補助液体と共に製剤化した場合、これらを1：1(w/w)の比で共に凍結乾燥し、同様に4℃で保存した1 mg/mlの保存濃度の純水中にボルテックス再懸濁した。
【０３９６】
混合物をボルテックスミキサー(Mini Vortexer, VWR)を用いて混合しながら、希釈したジェミニ界面活性剤製剤(OPTIMEM中の)を希釈したプラスミドDNA製剤(OPTIMEM中の)に室温で滴下しながら添加することにより、ジェミニ界面活性剤をプラスミドDNAと混合した。プラスミドDNAに対するジェミニ界面活性剤の比率を、1回の送達あたり50μlの最終容量について、製剤が正確な比率でジェミニ界面活性剤と共に10μgのプラスミドDNAを含むように、0.2：1(w/w)〜4：1(w/w)に変化させた。ジェミニ：DNA混合物または複合体を、混合後15分間室温に静置して形成させた後、15〜30分以内に動物に送達した。市販の陽イオン脂質DMRIE-C(Invitrogen Life Technologies)を、同様にDNAと共に製剤化した。
【０３９７】
説明48-PEIおよびMan-PEI製剤ならびにDNAとの複合体
トランスフェクション剤、in vivo-jetPEIまたはin vivo-jetPEI-Man (Polyplustransfection, Qbiogene)を、N/P比5で製造業者の説明書の通りに用いた。簡単に述べると、混合物をボルテックスミキサー(Mini Vortexer, VWR)を用いて混合しながら、希釈したPEI(5％グルコースw/v中の)を希釈したプラスミドDNA製剤(5％グルコースw/v中の)に室温で滴下しながら添加することにより、プラスミドDNAと共に複合体を形成させた。1回の送達あたり50μlの最終容量について、前記製剤は正確な比率でPEIと共に10μgのプラスミドDNAを含んでいた。複合体を混合後15分間室温に静置して形成させた後、15〜30分以内に動物に送達した。
【０３９８】
説明49-皮内注入によるin vivoでの送達およびルシフェラーゼアッセイ
プラスミドDNAを、Balb/c x C3H F1雌マウスの皮膚に送達した。皮内(ID)送達のために、マウスをイソフルオランで麻酔し、30Gの皮下注射針を腹部内の皮膚の予め毛剃りした領域に挿入した。10μgのプラスミドDNAを、標準的なID手順により50μl容量で注入した。8〜10匹の動物の群(または2つの注入部位を有する4〜5匹の動物)を、皮膚の遺伝子発現について分析した。マウスを犠牲にし、サンプルをプラスミド送達の24時間後に除去し、液体窒素中で簡易凍結した。
【０３９９】
皮膚サンプルを室温まで解凍し、IKA Labortechnic Ultra turrax T8 polytronを用いて500μlのPassive Lysis Buffer(商標)(Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA)中で分離させた。ルシフェラーゼ酵素活性を、ルシフェラーゼアッセイキット(Promega)を用いて決定した。50μlの溶解物(2回)を、96穴の黒および白のイソプレートプレート(Wallac, Perkin Elmer)中で250μlのルシフェラーゼアッセイ試薬(Promega)と共にアッセイした。ルシフェラーゼ活性(RLU)を、ルミネッセンスプログラム上のVictor 2 1420マルチラベルHTSカウンター(Wallac, Perkin Elmer)上で1分あたりの計数として測定した。総タンパク質濃度を、製造業者のプロトコルを用いて、Coomassie Plusタンパク質アッセイ試薬キット(Perbio)により算出した。簡単に述べると、1〜5μlの細胞溶解物を、96穴の平底プレート(Costar)中で145〜149μlの水(Sigma)および150μlのCoomassie Plusタンパク質アッセイ試薬と共にアッセイした。吸光度をMolecular Devices Spectra Max 340上で595 nmで測定した。ルシフェラーゼ活性を、相対発光量(RLU)／総タンパク質mgとして表した。
【０４００】
説明50-皮内エレクトロポレーションおよび遺伝子銃(PMED)送達
実施する場合、エレクトロポレーションを、製造業者の説明書の通りに、1 cm x 1 cmキャリパー電極を備えたBTX(Genetronics)T830方形波エレクトロポレーターを用いて、皮内DNA注入後すぐに適用した。簡単に述べると、電極を、以下の条件を用いる1 mmギャップ装置と共に用いた：電流反転を用いて100Vを20ミリ秒間3回適用、およびさらに3回のパルスを適用、パルス間遅延は10秒であった。
【０４０１】
遺伝子銃のためのカートリッジの調製、XR1遺伝子導入装置を備えた粒子媒介性表皮送達(PMED) (PowderMed)は以前に記載されている(Eisenbraunら、DNA and Cell Biology (1993) 12(9):791-797; Macklinら、Methods in Molecular Medicine, vol 29, DNA Vaccines: Methods and Protocols, Lowrie, D.およびWhalen, R.(編)、(2000) Humana Press Inc., USA )。簡単に述べると、プラスミドDNAを、2μmの金粒子(DeGussa Corp., South Plainfield, N.J., USA)上にコーティングし、Tefzelチューブ中に載せ、続いてカートリッジとして役立つように1.27 cmの長さに切断し、使用するまで4℃で保存乾燥した。典型的なワクチン接種においては、各カートリッジは、合計0.5μgのDNA/カートリッジでコーティングされた0.5 mgの金を含んでいた。プラスミドを、粒子媒介性遺伝子導入(0.5μgのDNA/カートリッジ)により、マウスの皮膚に投与した。プラスミドを、500 lb/in2でXR1遺伝子導入装置を用いて、1つのカートリッジからBalb/Cマウス(Charles River United Kingdom Ltd, Margate, UKから購入)の腹部皮膚の毛剃りした標的部位に送達した(WO 95/19799)。
【０４０２】
実施例46-ジェミニ界面活性剤はマウス皮膚における遺伝子送達および／または遺伝子発現を容易にする
in vitroの細胞系において増強されたDNAトランスフェクション活性を示した、ジェミニ界面活性剤：GSC103-L-Lys +/- DOPE(+/-はDOPEを含むか、または含まないことを意味する)、GSC170-LysおよびGSC170-Orn(Castroら、(2004) Org.Biomol.Chem. 2:2814-2820)を、マウス皮膚への皮内注入後にin vivoでDNAトランスフェクションを増強する能力について試験した。ジェミニ界面活性剤およびDNAを、マウス皮膚への皮内送達の前に、以下のようなジェミニ：DNA比：
GSC103-L-Lys         0.5:1
GSC103-L-Lys+DOPE    0.4:1、0.5:1および0.6:1
GSC170-Lys           0.5:1
GSC170-Orn           0.5:1
を有する10μgのpGL3CMVプラスミドDNAを含む注入1回あたり最終容量50μlまでOPTIMEM中に希釈した。次いで、遺伝子発現に対する効果を、ルシフェラーゼ活性(相対単位／mgタンパク質)として測定し、バックグラウンド、未処理のマウス皮膚(「陰性」)、裸のDNA(「DNA」)ならびに代替的トランスフェクション剤DMRIE-C、JetPEIおよびJetPEI-Manならびに全て、0.5μgのプラスミドDNAを送達する場合、PMEDとは別に10μgのプラスミドを送達する代替的DNA送達方法BTX CE(エレクトロポレーション)およびPMED(「遺伝子銃」)から得られたものと比較した。その結果を図1および2に示す。図1は、0.5：1のジェミニ：DNA比のGSC103-L-Lys+DOPEが、裸のDNAのみよりもマウス皮膚における遺伝子送達および／または発現を増強することを示す。図2は、0.4：1、0.5：1および0.6：1の比で、DNAと共にOPTIMEM中で製剤化されたGSC103-L-Lys+DOPEが、裸のDNAのみよりも遺伝子送達および／または発現を増強することを示す。DOPE共脂質製剤は、効果の増強にとって必須ではないようである。
【０４０３】
GSC103-L-Lys(スペルミンに基づくジェミニ-WO00/77032を参照)
【化１０３】
2008546733.tif 000104
【０４０４】
GSC170-Lys(WO03/82809)
【化１０４】
2008546733.tif 000105
【０４０５】
GSC170-Orn(WO03/82809)
【化１０５】
2008546733.tif 000106
【０４０６】
実施例47-他のクラスのジェミニ界面活性剤はマウス皮膚における遺伝子送達および／または発現を容易にする
さらなる実験を実施して、0.5：1(w/wジェミニ：DNA)の比で、OPTIMEM中で製剤化された、様々なクラスのジェミニ界面活性剤：GSC103-L-Lys+/-DOPE(スペルミンに基づく)、GS064A(スペルミジンに基づく)、GS062A(スペルミジンに基づく)、GSC103-L-Lys-オレイン酸／ステアリン酸非対称(GSC103-D-Lys,Ol,St)、GSC103-L-dab-オレイン酸／オレイン酸(GSC103-L-dab,Ol,St)の皮内送達について、裸のDNAを超える遺伝子送達および／または発現の増強を評価した。この実験から得られたデータを、図3に示す。このデータは、この実験においては、GSC103-L-Lys+DOPEおよびGSC103-D-Lys-オレイン酸／ステアリン酸非対称以外の全てのジェミニ界面活性剤が、市販の脂質DMRIE-Cと共に同様に製剤化されたか、またはエレクトロポレーションによりブーストされた場合のDNAよりも高いレベルの遺伝子送達および／または発現を容易にしたことを示す。
【０４０７】
GS064A(実施例25)
【化１０６】
2008546733.tif 000107
【０４０８】
GS062A(実施例24)
【化１０７】
2008546733.tif 000108
【０４０９】
GSC103-L-Lysオレイン酸、ステアリン酸非対称(実施例1)
【化１０８】
2008546733.tif 000109
【０４１０】
GSC103-D-Lysオレイン酸、ステアリン酸非対称(実施例2)
【化１０９】
2008546733.tif 000110
【０４１１】
GSC103-L-dabオレイン酸、オレイン酸(WO00/77032)
【化１１０】
2008546733.tif 000111
【０４１２】
GSC103-L-ornオレイン酸、ステアリン酸(実施例3)
【化１１１】
2008546733.tif 000112
【０４１３】
実施例48-マウス皮膚に皮内送達されたジェミニ界面活性剤は、プラスミドにコードされた抗原に対する細胞性および体液性免疫応答を裸のDNAを超えて増強することができる
A)ID免疫化
慣れた6〜8週齢の雌のBalb/cマウスを、尾の基部上の予め毛剃りされた下側の背部への皮内注入による適用のために酸素に制御された吸入されたイソフルオランマスクを用いて全身麻酔下に維持した。必要に応じて、マウスを、1:10に希釈された5 mg/Kgの皮下用量の麻酔剤としてRimadyl(Carprofen)を与え、20μl／マウスで送達した。ジェミニ界面活性剤を含むか、または含まない最大50μlの新しく製剤化されたDNAを、BDを介して、29g針を用いて0.5 mlのインスリンシリンジで与えた。
【０４１４】
B)ELISPOTによる細胞傷害性T細胞応答の分析
マウスを頚椎脱臼により殺傷し、脾臓を氷冷PBS中に回収した。脾臓細胞をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)中に裂き入れた後、赤血球を溶解させた(155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、0.1 mM EDTAからなるバッファー中で1分間)。PBS中で2回洗浄して粒子状物質を除去した後、単一細胞懸濁液中の細胞の濃度を、Guavaフローサイトメーター中で計数することにより評価した。細胞を、捕捉IFN-γまたはIL-2抗体で予めコーティングされたELISPOTプレート中にアリコートし、培養培地(RPMI 1640＋10％熱不活化ウシ胎仔血清および好適な抗体)中でCD8またはCD4-制限同族ペプチドで刺激した。一晩培養した後、IFN-γまたはIL2を産生する細胞を、抗マウスIFN-γ-ビオチンまたはIL2-ビオチン標識された抗体(Pharmingen)、次いで、ストレプトアビジン結合アルカリホスファターゼの適用により可視化し、画像分析を用いて定量した。
【０４１５】
C)ELISAによる体液性応答の分析
体液性応答を、初回および追加免疫の後に回収された血清サンプル中の抗原特異的全IgG抗体レベル(例えば、HIV RNG融合タンパク質に対する)を測定することにより評価した。マイクロタイタープレート(Nunc Immunoplate F96 maxisorp, Life Technologies)を、4℃で一晩インキュベートすることにより10μg/ml抗原でコーティングし、洗浄バッファー(5％Tween 20を含むPBS)で4回洗浄した。次いで、これを、ブロッキングバッファー中に連続希釈した血清サンプルと共に20℃で1時間インキュベートした。さらに4回洗浄(上記のように)して未結合の抗体を除去した後、プレートを、ブロッキングバッファー中に希釈したペルオキシダーゼ結合抗マウスIgG抗体(AMS Southern Biotechnology)と共に1時間インキュベートした。さらに4回洗浄(上記のように)した後、TMB基質溶液(T-8540-Sigma)を添加した後、結合した抗体の量を決定した。20℃で30分間、光から防御した後、反応を1M硫酸で停止させ、吸光度を450 nmで読み取った。力価を、0.2のODに到達する最も高い希釈率として定義する。
【０４１６】
試験したジェミニ界面活性剤
GS092A-エステル結合したDab(実施例42)
【化１１２】
2008546733.tif 000113
【０４１７】
GS543A-ペンタミンに基づくL-Orn(実施例16)
【化１１３】
2008546733.tif 000114
【０４１８】
代表的な3クラスのジェミニ界面活性剤を、皮内経路を介するマウス皮膚への送達に際して細胞性および体液性免疫応答の両方を誘導するその能力について評価した。この実験において評価されたジェミニ界面活性剤の例およびクラスは、GSC103-L-Lys(スペルミンに基づく)、GS092A(エステル結合)、GS064A(スペルミジンに基づく)およびGS543A(ペンタミン)であった。この実験のために用いた免疫化計画は、マウスをPMEDによりDNAを用いてプライミングし(図4)、次いで初回免疫応答がバックグラウンドレベルに落ちるまで140日間放置することを含んでいた。次いで、異種追加後の比較可能な免疫応答を、インターフェロン-γのELISPOT(図5、7および9)およびインターロイキン-2のELISPOT(図6、8および10)により、追加免疫後の以下の時点、8日目、14日目および21日目に細胞性応答(図5〜10)について評価した。この実験において試験した全てのジェミニ化合物は、裸のDNAのみを注入することにより誘導されたものと比較して細胞性応答の増加を示した。
【０４１９】
血清全IgGとしての、RNG融合ペプチド(WO03/025003)に対する体液性応答を、追加免疫後14日目にモニターした(図11)。製剤中のジェミニ界面活性剤を用いずに免疫されたものよりも製剤中のジェミニ界面活性剤を用いて処理された免疫されたマウスにおける抗体レベルの増加は、体液性応答に対するジェミニ界面活性剤の増強作用を示す。
【０４２０】
ジェミニ界面活性剤(GSC103-L-Lysを含む)の皮内送達により誘導される細胞性および体液性免疫応答の両方のレベル(図5〜11)は、追加免疫時にPMEDにより誘導されたものと比較可能である。相対的免疫応答レベルは、相対遺伝子発現レベルよりも、ジェミニ界面活性剤(例えば、GSC103-L-Lys)間でより近い(例えば、GSC103-L-LysとPMEDを比較、図2および3を参照)。
【０４２１】
従って、ジェミニ界面活性剤は、in vivoでのDNAトランスフェクション増強のみから予測できるものよりもかなり多いDNAワクチン接種に対する免疫応答の利益となり、従って、さらなるアジュバント効果を示す。
【０４２２】
説明51-in vitroでのリポプレックス特性評価のためのプラスミド調製および製剤
プラスミドpdpSC18は、2コピーのCMV極初期プロモーターが、B型肝炎コアおよび表面抗原(S-Ag)の発現を別々に駆動するベクターである(WO0236792)。プラスミドpdpSC18を、ジェミニ界面活性剤およびプラスミドDNA複合体化試験の最適化のために「一般的プラスミド」として用いた。
【０４２３】
説明52-準弾性光散乱(QELS)による粒子径の決定
ジェミニ界面活性剤およびプラスミドDNAとのその複合体により形成された粒子の大きさを、準弾性光散乱(QELS)により測定した(Finsy, R., Advances in Colloid and Interface Science (1994) 52 (9月19日):79-143; Gittings, M.R.,およびSaville, D.A., Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects (1998) 141: 111-117)。サンプル(50μl)を、製造業者の説明書に従って、Brookhaven Instruments Corporationの粒子径分析装置(BIC 90 Plus)を用いて分析した：サンプルあたり、それぞれ10回の走査からなる10個の測定値を取得した。生の光散乱データを自動的に収集し、Stokes-Einsteinの方程式を用いて前記器具により操作した。次いで、それを、相関曲線、対数正規粒子分布および多数モデル粒子分布の形態で表した。粒子分布を、光散乱強度ならびに粒子数の式としてプロットした。平均粒子径を、前記器具により生データから自動的に誘導し、平均流体力学直径(nm)として表した。
【０４２４】
実施例49-水性液体として4℃で保存した際のジェミニ界面活性剤の安定性
保存の際のジェミニ界面活性剤の安定性の尺度を提供するために、水性溶液中に保存したジェミニ界面活性剤のコロイド特性を調査した。新しく調製されたジェミニ界面活性剤溶液(水中に1 mg/ml)を、4℃で4ヶ月保存された界面活性剤溶液と比較した。この比較を、QELSにより任意のコロイド粒子の形成を検出することにより実施した。この比較により、界面活性剤が保存に際して不安定であるが、それらは徐々に粒子を形成するようであることが示された。新鮮なジェミニ界面活性剤溶液は、粒子状構造物を含まないことがわかったが、保存された溶液はQELSにより検出可能な粒子を含んでいた(図27)。しかしながら、これは、新鮮な懸濁液および保存された懸濁液の両方において粒子形成を示したGS543Aについての事例ではなかった。しかしながら、粒子の大きさは、新鮮な溶液と保存された溶液の間で有意に異なっておらず、これはこの事例におけるコロイドの安定性を示唆している。
【０４２５】
ジェミニ界面活性剤溶液のコロイド特性を、時間に渡ってモニターして、より詳細にその見かけの不安定性を分析した。ジェミニ界面活性剤の新鮮な溶液を4℃で保存し、その粒子径を週2回の間隔で測定した。10週間の試験後に得られた結果を、図28に示す。図が示すように、全てのジェミニ界面活性剤溶液は、試験の最初の2週間、安定であった。2週間の保存後、界面活性剤GS064AおよびGSC103-L-Lysは粒子状構造を形成し始めた。ジェミニ界面活性剤GS092Aは、6週間までは安定なままであったが、その後粒子形成を示した。界面活性剤GS543Aの溶液は、試験の開始から小さい粒子を示した。この粒子は保存期間を通して安定なままであるようであったが、これは、GS543Aが調査した保存条件下でコロイドとして安定であることを示唆している。
【０４２６】
説明53-電気泳動光散乱(ELS)による粒子ゼータ電位の決定
ジェミニ界面活性剤およびそのDNA複合体により形成された粒子の表面電荷を、電気泳動光散乱(ELS)により決定した(McNeil-Watsonら、Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects (1997) 140: 53-57; Gittings, M.R.,およびSaville, D.A., Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects (1998) 141: 111-117)。ゼータ電位を、Brookhaven Instruments Corporationの粒子径分析装置(BIC 90 Plus、ゼータ電位機能、参照ビームモード)を用いて、様々な媒体中で測定した。各サンプルを、一連の10回の自動測定により分析し、表面電荷をゼータ電位(ミリボルト(mV))として表した。必要な場合、この器具を用いて、リポプレックス懸濁液および関連する媒体のpHを、ガラス電極により決定した。
【０４２７】
実施例50-ジェミニ界面活性剤はプラスミドDNAとの複合体を形成する
プラスミドDNAとの複合体を形成するジェミニ界面活性剤の能力を、Optimem(登録商標)I培地 (GIBCO Invitrogen)中の界面活性剤の懸濁液と、同じ培地中のプラスミドDNA (pdpSC18)の溶液とを混合することにより調査した。この複合体を、説明47中の手順に従って形成させた。複合体の形成を確認するために、混合物をQELSにより分析した。図29に示されるように、試験した全てのジェミニ界面活性剤は、プラスミドDNAと複合体を形成することができ、OPTIMEM培地中で測定した場合、ジェミニ界面活性剤のみのコロイド製剤よりも大きいナノ粒子が得られた。
【０４２８】
実施例51-プラスミドDNAとのジェミニ界面活性剤複合体は負の表面電荷を有する
ジェミニ界面活性剤とプラスミドDNA(pdpSC18)との複合体の形成を、希釈したOPTIMEM培地中でELSによりその表面電荷を測定することによって確認した。全てのサンプルを水中で3倍に希釈して、OPTIMEM培地からの干渉を防止した。ジェミニ界面活性剤-DNA複合体は、陽イオンである遊離のジェミニ粒子製剤と違って、負に荷電していることがわかった(図30)。複合体と遊離の界面活性剤との間の表面電荷におけるこの減少は、負に荷電したプラスミドDNAとの関係に起因する。
【０４２９】
実施例52-ジェミニ界面活性剤は、プラスミドDNA添加の数分以内に安定な複合体を形成する
プラスミドDNAとのジェミニ界面活性剤複合体の安定性を、典型的には、複合体化反応後最大50分である、複合体形成の時点から、in vivoでの送達の時点まで調査した。この試験の目的は、複合体の粒子径が形成の時点からin vivoでの投与まで有意に変化しないことを確認するためのものであった。
【０４３０】
ジェミニ界面活性剤を、OPTIMEM中でプラスミドDNA(pdpSC18)と複合体化させ、粒子径を10分間隔でQELSによりモニターした。得られた結果を図31に示す。結果に示されるように、ジェミニ-DNA複合体の粒子径は、調査した時間に渡って有意に変化しなかったが、これは、全てのジェミニ界面活性剤が、安定な複合体を迅速に形成した後、in vivoでの投与の時点まで維持することを示唆している。
【０４３１】
実施例53-複合体の大きさに対するジェミニ界面活性剤：DNA比の効果
プラスミドDNA(pdpSC18)との複合体を形成するのに用いることができるジェミニ界面活性剤比の範囲を調査した。複合体を、0.5:1〜8:1(w/w)の範囲のジェミニ界面活性剤：DNA比でOPTIMEM中で形成させ、その大きさをQELSにより決定した。この試験において用いたジェミニ界面活性剤は、図32中に提示された結果を生成したペンタミンGS543Aであった。得られた結果は、この界面活性剤が最大で2:1(w/w)の比で小さいサイズ(200 nm未満)の安定なリポプレックスを形成することができることを示唆している。より大きいジェミニ界面活性剤：DNA比(4:1 w/wを超える)で、得られる複合体は不安定であり、直径1μmを超える大きい凝集物の形成をもたらし、これはin vivoでの送達にとって好ましくない。従って、界面活性剤GS543Aを、in vivoでの送達のために最大2:1(w/w)の比でプラスミドDNAとの複合体化に潜在的に用いることができる。
【０４３２】
実施例54-ジェミニ界面活性剤-DNA複合体のpH感受性の調査
DNA送達系としてのジェミニ界面活性剤の効率は、そのpH感受性に依存すると考えられる(Fieldenら、European Journal of Biochemistry (2001) 268: 1269-1279; Kirby, A.J.ら、Angew. Chem. Int. Ed. (2003) 42: 1448-1457)。最も一般的には、ミセル形成の形態の、リポプレックスのコンフォメーションの変化を誘発するpHに対する感受性は、載せられたプラスミドDNAの効率的な送達にとって必要であると考えられる(Fieldenら、European Journal of Biochemistry, (2001) 268: 1269-1279)。それが分解から安全であり、細胞の核に到達することができる場合、それは酸性エンドソーム区画から細胞質へのプラスミドDNAの逃避を可能にする(Zabnerら、Journal of Biological Chemistry (1995), 270: 18997-19007; XuおよびSzoka, Biochemistry (1996) 35: 5616-5623; Singhら、Chemistry & Biology (2004) 11 (May): 713-723)。ジェミニ界面活性剤により形成されたリポプレックスのpH感受性を決定するために、酸性pHでミセルを形成するその能力(小さい粒子径により特性評価される)を調査した。ジェミニ界面活性剤-DNA複合体を形成させた後、初期のエンドソーム段階(pH 6.5)から後期のエンドソーム-リソソーム段階(pH 4.5)までの、エンドソームのpHの範囲をカバーするバッファー中でインキュベートした(Simoesら、Advanced Drug Delivery Reviews (2004) 56: 947-965)。ミセルの形成を検出するために、変化するpHに対するリポプレックスの応答を、粒子径の形態で測定した。
【０４３３】
試験の結果を、図33に示す。全てのジェミニ界面活性剤は、pH感受性を示すリポプレックスを形成することがわかったが、pH感受性のパターンは界面活性剤間で異なっていた。一般的には、特に、GSC103-L-Lysの場合、粒子径はpHの下落に従って変動した(図33)。最も低いpHに曝露した場合、全てのリポプレックスは粒子径の下落を受けた。サイズの減少は、GS092AおよびGS543Aの場合に最も顕著であり、9 nmの平均流体力学直径の粒子を示した。このサイズはミセル粒子の形成を示唆するのに十分小さい(Fieldenら、European Journal of Biochemistry (2001) 268: 1269-1279; AsokanおよびCho, Biochimica et Biophysica Acta (2003) 1611: 151-160)。このデータは、ジェミニ界面活性剤GS092AおよびGS543AはpH 4.3でこの試験においてミセルを形成することができることを示唆している。
【０４３４】
実施例55-リポプレックスのサイズに対する複合体化媒体の効果
ジェミニ界面活性剤はpH感受性であることがわかったので、界面活性剤のコロイド特性に対する種々の媒体の効果を調査することが必要であった。本明細書に記載された研究は、水およびOPTIMEMにおけるジェミニ界面活性剤のコロイド特性を比較する。ジェミニ界面活性剤溶液を、水中でQELS(1 mg/ml)により分析した後、水性溶液を、複合体化反応のための調製において同じ様式でOPTIMEM中で希釈した。次いで、得られる溶液を、QELSにより分析し、結果を比較した(図34)。
【０４３５】
その結果は、GS543Aを除くジェミニ界面活性剤が水中でコロイド粒子を形成しないことを示唆している。対照的に、全ての界面活性剤はOPTIMEM媒体中で粒子を形成する。GS543Aの場合、粒子は水中のものよりも大きいサイズのものである。
【０４３６】
複合体化反応において用いられたOPTIMEM媒体は、重炭酸塩で緩衝化されており、結果として、該媒体が空気に晒され、その平衡が破壊されるにつれて、保存と共にそのpHが徐々に増加する(データは示さない)。OPTIMEM媒体の新鮮に開封されたボトルのpHは7.17であることがわかったが、3ヶ月前に開封されたボトル(「古い」)のpHは7.68まで増加した。ジェミニ界面活性剤はpHの変化に対して感受性であることがわかったので、リポプレックス形成に対するOPTIMEMのpH可変性の効果を調査することが必要であった。古い(3ヶ月)、および新しい(新しく開封されたボトル)OPTIMEMを媒体として用いて、ジェミニ界面活性剤とプラスミドDNA(pdpSC18)の間でリポプレックスを形成させた。次いで、得られるリポプレックスの粒子径を、QELSにより測定した。比較の結果を、図35に示す。OPTIMEM媒体のpHの増加は、リポプレックスのサイズに有意に影響しないGS543Aを除いて、形成されたリポプレックスのサイズに大きく影響することがわかった。
【０４３７】
一般的には、OPTIMEM媒体は、その不安定性が、変化する粒子径のリポプレックスをもたらすと共に不安定であることがわかった。OPTIMEMを用いるさらなる欠点は、それが動物由来の物質を含み、かくして、製品開発にとって不適当であることである。かくして、さらなる研究は、それを、開発にとって好適であり、より安定である代替的な媒体と置換することに焦点を当てた。一連の潜在的なバッファー：
1. Invitrogen Corporation社製のEarle's平衡塩溶液(EBSS)
2. Sigma Aldrich社製のTris緩衝生理食塩水(TBS)
3. Sigma Aldrich社製のN-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)(HEPES)バッファー
4. Invitrogen Corporation社製のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)
を、試験のために選択した。
【０４３８】
OPTIMEMに最も近い代替物としてEBSSを選択した。それは、その塩含量および重炭酸含量においてOPTIMEMと類似しており、かくして、pHの点で同様に不安定である。しかしながら、EBSSは空気への曝露に際してそのpHを急速に安定化させ、例えば、2 ml容量は、10分間の空気への曝露に際して、pH 7.4〜pH 8.0-8.1で安定化される(データは示さない)。EBSSは、それが動物由来の産物を含まず、同様に開発にとって好適であるという点でOPTIMEMより優れている。残りのバッファーを、pHおよび保存安定性のさらなる利点を有するものとして選択した。
【０４３９】
リポプレックスを、OPTIMEMと同じ手順に従って、かつ複合体のためにジェミニ界面活性剤GS543AおよびプラスミドpdpSC18を用いて形成した。次いで、得られる複合体の粒子径を、QELSにより分析した。得られた結果を図36に示す。結果が示すように、リポプレックスは全てのバッファーにおいて成功裏に形成された。リポプレックスの粒子径は、実質的に媒体間で異なっていなかった。最大のサイズはOPTIMEM、TBSおよびEBSS(それぞれ113、109および108 nm)について得られたが、HEPESおよびPBSはより小さい複合体(それぞれ87および96 nm)を与えるようであった。
【０４４０】
実施例56-アガロースゲル電気泳動によるジェミニ界面活性剤：プラスミドDNAリポプレックスの調製および分析
ジェミニ界面活性剤およびプラスミドDNAのリポプレックスを、説明47に記載のように調製した。ジェミニ界面活性剤とプラスミドDNAとの比を、0.5:1(w/w)に維持し、バッファーをOPTIMEM(OPT)から、EBSS(Invitrogen Corporation)または1 x PBS, pH 7.2(CaCl2およびMgCl2を含まない、Invitrogen Corporation)まで変化させた。10μl(1μg DNA)、または20μl(2μg DNA)、アリコートのリポプレックスを、アガロースゲル上で分析し、ジェミニ界面活性剤を含まないバッファー中の1μgのプラスミドDNAと比較した。アガロースゲル電気泳動を、製造業者の説明書に従って、E-Gel PowerBase(Invitrogen Corporation)を用いて、1.2％ Agarose E-Gels(登録商標)(Invitrogen Corporation)上で、20〜30分間実施した。DNAおよびリポプレックスを、Epi Chemi II Darkroonおよびccdカメラに基づくゲル画像化系(UVP Laboratory Products)を用いて、紫外線下で可視化した。画像を、Lab Works TM Bioimaging System(UVP)を用いて分析した。
【０４４１】
そのような分析の例を図37に示すが、ここでは、1μgのプラスミドDNAのゲル遅延が、OPTIMEM(レーン1とレーン2を比較)、EBSS(レーン4とレーン5を比較)、およびPBS(レーン7とレーン8を比較)を用いるGS543の存在下で、リポプレックス形成を緩衝化することが認められる。ゲル遅延を標準的なアッセイとして用いて、それぞれ、プラスミドDNAと陽イオン脂質または陽イオンポリマーの間で、リポプレックスおよびポリプレックス形成の両方を確認した(Huang, CYら、Chemistry & Biology 5, 345, 1998; Kim, YHら、J. Controlled Release 103, 209, 2005)。
【０４４２】
実施例57-プラスミドにコードされる抗原に対する細胞性免疫応答を裸のDNAを超えて増強する能力に関するジェミニ界面活性剤の保存されたバッチおよび新鮮なバッチの分析
ジェミニ界面活性剤保存液を、説明47に記載のように調製した。この実施例についての「古い」として記載された保存液を、液体の1 mg/ml保存液として4℃で77日間保存した。この実施例についての「新しい」として記載された保存液を、投与の1日前に新しく調製し、4℃で一晩保存した。
【０４４３】
ジェミニ界面活性剤およびプラスミドDNAのリポプレックスを、説明47に記載のように調製し、実施例48(A)に記載のようにBalb/cマウスに皮内投与(ID)した。実施例48(A)に記載のように、PMEDによりマウスをDNAでプライミングすることを含む同様の免疫化計画を用いたが(図4を参照)、しかしながら、この実施例における初回免疫と追加免疫の間の時間の間隔は50日であった。マウスを、裸のDNAもしくはPMED、または陰性対照としてPBSを用いて追加免疫し、応答を、3つのクラスのジェミニ界面活性剤の「古い」または「新しい」保存液を用いて作製されたリポプレックスで追加免疫した後に生成されたものと比較した。実施例48に記載のように、相対的な細胞性免疫応答を、追加免疫後、7/8日目、14日目および21日目に評価した。この実験から得られたデータの一例を、図38(追加免疫後14日目のインターフェロンγのELISPOT)、および図39(追加免疫後14日目のインターロイキン-2のELISPOT)に示す。
【０４４４】
このデータは、新しく調製された(「新しい」)または保存された(「古い」)GS543A保存液を用いて形成されたGS543A：DNAリポプレックスが、皮内経路を介するマウスの免疫化に際して、非常に類似する細胞性免疫応答を生成したことを示している。
【０４４５】
実施例58-GS543:DNAリポプレックスを、OPTIMEMまたはEBSSを用いて緩衝化した場合に細胞性免疫応答を増強する能力に関するGS543Aの保存されたバッチおよび新鮮なバッチの分析
ジェミニ界面活性剤保存液を、説明47に記載のように調製した。この実施例について(FEB)として記載された保存液を、液体の1 mg/ml保存液として、4℃で289日間(9ヶ月を超える)保存した。この実施例について(SEP)として記載された保存液を、4℃で2ヶ月間保存した。
【０４４６】
ジェミニ界面活性剤およびプラスミドDNAのリポプレックスを、この実施例においてOPTで標識された(すなわち、OPTIMEMで緩衝化された)サンプルについて説明47に記載のように調製した。また、ジェミニ界面活性剤およびプラスミドDNAのリポプレックスを、この実施例においてEBSSで標識されたサンプルについて実施例55に記載のようにEBSSを用いて調製した。複合体を、実施例48(A)に記載のようにBalb/cマウスに皮内(ID)投与した。実施例48(A)に記載のように、PMEDによりマウスをDNAでプライミングすることを含む同様の免疫化計画を用いたが(図4を参照)、しかしながら、この実施例における初回免疫と追加免疫の間の時間の間隔は168日であった。マウスを、リポプレックスもしくはPMED、または陰性対照としてOPTIMEMを用いて追加免疫し、応答を、異なるGS543A保存液から、異なるバッファー：OPTIMEMまたはEBSSを用いて形成されたリポプレックスについて比較した。実施例48に記載のように、相対的な細胞性免疫応答を、追加免疫後、7/8日目、14日目および21日目に評価した。この実験から得られたデータの一例を、図40(追加免疫後14日目のインターフェロンγのELISPOT)、および図41(追加免疫後14日目のインターロイキン-2のELISPOT)に示す。
【０４４７】
このデータは、9ヶ月を超えて保存された保存液から調製された、およびバッファー：OPTIMEMまたはEBSSを用いて調製された、異なる保存液を用いて形成されたGS543A：DNAリポプレックスが、皮内経路を介するマウスの免疫化に際して非常に類似する細胞性免疫応答を生成したことを示している。
【０４４８】
実施例59-マウス皮膚に皮内送達されたGS543Aは、相同的な投与計画においてプラスミドにコードされる抗原に対する免疫応答を裸のDNAを超えて増強させることができ、プライミングするように作用し、アデノウイルスにコードされる抗原に対する追加免疫での応答を増強する
A)筋肉内注入
筋肉内(i.m./IM)投与によるプラスミドDNAの投与を、0.33 mm(29g) x 12.7 mm針(BD Micro-Fine)を備えた0.5 mlインスリンシリンジを用いて実施した。2回用量の50μlを、各場合についてBalb/cマウスの後肢上の2つの別々の部位に投与した。筋肉を、大腿二頭筋および大腿四頭筋から選択し、それぞれその後の免疫化の際にそれぞれの間で交代させた。製剤化されたワクチンの必要な容量を、各シリンジ中に汲み上げ、軽く弾くことにより気泡を除去した。50μlの注入を5秒間かけて行い、浅い角度で筋肉中に針を3〜4 mm挿入することにより行った。表面の毛細血管からの少量の出血が生じた場合、これを圧迫により停止させた後、動物をそのケージに戻した。
【０４４９】
B)Q調製プロトコルを用いるテトラマーの染色
クエン酸三ナトリウム(Merck 102424L)を水に溶解させて、3.8％(w/v)溶液を得た。100μlを、標識された1.5 mlのエッペンドルフチューブに入れた。50〜100μlの血液サンプルを、予め温めた実験マウスの側部尾静脈から収集し、関連するチューブに移した。チューブを攪拌して混合させ、凝固を防止した。フローサイトメトリーチューブのセット(Starstedt)を標識し、フィコエリトリン(Beckman Coulterカスタム合成T04005、1μg/10μl)にコンジュゲートさせた10μlのH2-Kd HIV Gag (AMQMLKETI)テトラマーを各チューブに添加した(対照チューブ以外)。クエン酸バッファーと混合した100μlの全血を、各チューブに添加した。チューブを暗室中、室温で20分間インキュベートした。チューブあたり、0.2 mg/ml抗マウスCD8-CyChrome(CD8aサイクロム抗マウス(Ly-2)、(53-6.7)(BD Pharmingen 553034)の1/20希釈液10μlを添加した(対照を含む)。チューブを、暗室中でさらに15分間インキュベートした。チューブあたり、50μlの熱不活化したウシ胎仔血清を添加した。次いで、チューブをBeckman Coulter TQ Prep上に置き、標識された細胞を、Immunoprep試薬系(Beckman Coulter 7546999)を用いて溶解／固定した。3 mlのFACSバッファー(リン酸緩衝生理食塩水中の2.5％熱不活化ウシ胎仔血清)を各チューブに添加した後、1500 rpmで5分間遠心分離し、上清を廃棄した。チューブをボルテックスして混合し、ペレットを500μlのFACSバッファー中に再懸濁した。テトラマー陽性CD8細胞の割合を、Beckman Coulter Epics XL-MCLフローサイトメーターを用いて、標準化されたプロトコルにおいてEXPO 32 ADCソフトウェアを用いる分析により決定した。
【０４５０】
C)非ヒト霊長類アデノウイルス保存液および投与
CMV極初期プロモーターの制御下でHIV抗原Gag、RTおよびNefをコードするポリヌクレオチドを含む血清型Pan 6(C6としても知られる)の、E1/E3欠失させた非ヒト霊長類(NHP)由来アデノウイルスベクター(WO02/36792に記載)を、この実施例において異種追加免疫化に用いた。このベクター構築物は、PCT/EP2006/004854に記載されており、抗原はWO03/025003に記載されている。これらのベクター構築物を作製する方法の詳細については、実施例60〜62に記載されている。
【０４５１】
ジェミニ界面活性剤およびプラスミドDNAのリポプレックスを、この実施例においてOPTで標識された(すなわち、OPTIMEMで緩衝化された)サンプルについて説明47に記載のように調製した。また、ジェミニ界面活性剤およびプラスミドDNAリポプレックスを、実施例55に記載のようにEBSSまたはPBSを用いて調製した。複合体を、実施例48(A)に記載のようにBalb/cマウスに皮内(ID)投与するか、または上記のように筋肉内(IM)投与した。この実施例のために用いられた免疫化計画は、マウスを裸のDNAもしくはGS543A:DNAリポプレックスでプライミングすること、次いで、この後、反復初回免疫の相同的追加免疫を行った後、Pan 6 NHP GRNアデノウイルス(p6grm)の、1 x 10E8粒子形成単位(p.f.u)を用いる異種追加免疫を行うことを含んでいた(図42を参照)。
【０４５２】
マウスを、リポプレックスもしくは裸のDNAまたは陰性対照としてPBSで初回免疫および追加免疫し、初回免疫および追加免疫の間隔は28日であった(図42を参照)。応答を、最初にELISPOTにより追加免疫後10日目に、異なるバッファー：OPTIMEM(OPT)またはEBSSまたはPBSから形成されたリポプレックスについて比較した。この実験から得られたデータを、図43(インターフェロンγのELISPOT)、および図44(インターロイキン-2のELISPOT)に示す。このデータは、この系における細胞性応答の生成において、i.m.経路よりもi.d.経路の有効性が増加することを示している。このデータは、特にEBSSを用いて形成されたGS543A：DNAリポプレックスが、相同的な免疫化計画において、特に皮内経路を介する、裸のDNAのみを用いたマウスの免疫化よりも大きい細胞性免疫応答を生成することを示している。
【０４５３】
初回免疫化後の細胞性免疫応答の残りのレベルを、血液中に存在するGag陽性CD8 T細胞の割合を同定することにより、初回免疫後26日目で測定した。これに関するデータを、図45に示す。また、血液中に存在するGag陽性CD8 T細胞の割合を、最初の追加免疫後26日目に再度測定し、そのデータを図42に示す(54日目)。EBSSと複合体化させ、i.d.経路を介して送達されるGS543A：DNAリポプレックスを受けた動物についての、初回免疫後と比較した1回目の追加免疫後の血液中に認められるGag陽性CD8 T細胞のレベルにおける差異は、裸のDNAのみを受けたものよりも再び増加した。
【０４５４】
また、細胞性応答を、p73iTrngにより発現されたものと非常に類似する抗原を発現するNHPアデノウイルスp6GRNを用いて異種追加免疫した後に再度分析した。異種追加免疫後7日目に得られた、そのようなデータの一例(図42を参照)を、図47(インターフェロンγのELISPOT)、および図48(インターロイキン-2のELISPOT)に示す。このデータは、EBSSと複合体化させたGS543A：DNAリポプレックスの2回の免疫化でマウスをプライミングすることは、特に内皮経路を介して、類似する抗原を発現するNHPアデノウイルスで追加免疫した後、細胞性応答が増強される点で利点を提供することを確認するものである。裸のDNAのみでプライミングすることを超える利点およびNHPアデノウイルスのみでの免疫化から生成される一次応答の利点を、EBSSと複合体化させたGS543A：DNAリポプレックスを用いて証明した。
【０４５５】
また、体液性応答をこの実施例において分析した。体液性応答を、全血清IgGとして測定し、データを相同的初回免疫および追加免疫後の両方で収集し、NHPアデノウイルスp6GRNを用いる異種追加免疫後にも再度収集した(図42を参照)。相同的追加免疫後10日目に得られた、そのようなデータの一例を図49に示し、異種追加免疫後14日目に得られたものを図50に示す。このデータは、相同的追加免疫および異種追加免疫の両方の後に、皮内経路を介して、EBSSで緩衝化されたGS543A：DNAのリポプレックスを最初に受けたマウスが、最も強い体液性応答ならびに最も強い細胞性応答を生成したことを示している。
【０４５６】
実施例60
E1/E3欠失されたPan 6および7アデノウイルスの構築
1. 組換えE1-欠失されたSV-25ベクターの作製
遺伝子操作されたE1欠失について以外は完全なSV-25ゲノムを含むプラスミドを構築した。E1欠失の部位に、トランスジーン発現カセットを2つの酵素認識部位にフランキングさせるシャトルプラスミドからのトランスジーンの挿入を可能にする、制限酵素I-CeuIおよびPI-SceIの認識部位を挿入した。
【０４５７】
制限部位SwaI-SnaBI-SpeI-AflII-EcoRV-SwaIを含む合成リンカーを、EcoRIおよびNdeIで切断したpBR322にクローニングした。これを、2つの合成オリゴマーSV25T(5'-AAT TTA AAT ACG TAG CGC ACT AGT CGC GCT AAG CGC GGA TAT CAT TTA AA-3')およびSV25B (5'-TAT TTA AAT GAT ATC CGC GCT TAA GCG CGA CTA GTG CGC TAC GTA TTT A-3')を一緒にアニーリングし、EcoRIおよびNdeIで消化したpBR322にそれを挿入することにより行った。Ad SV25の左端(bp1〜1057)を、上記のリンカーのSnaBIおよびSpeI部位の間にクローニングした。Ad SV25の右端(bp28059〜31042)を、該リンカーのAflIIおよびEcoRV部位の間にクローニングした。次いで、アデノウイルスE1を、以下のようにクローニングされた左端から、EcoRI部位(bp547)〜XhoI(bp2031)部位の間を切り出した。pShutle(Clontech)からPCR生成されたI-CeuI-PI-SceIカセットを、EcoRIとSpeI部位の間に挿入した。次いで、Ad SV-25(bp2031〜12185)の10154 bpのXhoI断片を、SpeI部位に挿入した。得られたプラスミドをHindIIIで消化し、構築物(pSV25)を、18344 bpのAd SV-25 HindIII断片(bp11984〜30328)を挿入することにより完成させて、組換えアデノウイルスの作製にとって好適なE1欠失されたアデノウイルスSV25の完全な分子クローンを作製した。必要に応じて、所望のトランスジーンを、新しく作製されたpSV25ベクタープラスミドのI-CeuIおよびPI-SceI部位に挿入する。
【０４５８】
マーカー遺伝子を担持するAdSV25を作製するために、予めプラスミドpShuttle (Clontech)中にクローニングされたGFP(緑色蛍光タンパク質)発現カセットを、制限酵素I-CeuIおよびPI-SceIを用いて切り出し、同じ酵素で消化したpSV25(または本明細書に記載の別のAd chimpプラスミド)中に連結した。得られるプラスミド(pSV25GFP)を、SwaIで消化して、細菌プラスミド骨格を分離し、E1を補完する細胞系HEK 293にトランスフェクトした。約10日後、複製ウイルスの存在を示唆する細胞変性効果が観察された。GFPを発現するアデノウイルスベクターに基づくAd SV25の作製の成功を、トランスフェクトされた培養物に由来する上清を、新鮮な細胞培養物に適用することにより確認した。二次感染した細胞の存在を、細胞の集団中で緑色蛍光を観察することにより決定した。
【０４５９】
2. E3欠失させたPan-6およびPan-7ベクターの構築
アデノウイルスベクターのクローニング能力を増強するために、E3領域は培養物におけるウイルスの増殖にとって必要ではない遺伝子をコードするため、この領域を欠失させることができる。この目的のために、Pan-5、Pan-6、Pan-7、およびC68のE3欠失させたバージョンを作製した(E31-9を含む3.5 kbのNru-AvrII断片を欠失させる)。
【０４６０】
Pan6に基づくベクターにおけるE3欠失
E1欠失させたpPan6-pkGFP分子クローンをSbfIおよびNotIで消化して、19.3 kb断片を単離し、SbfI部位に戻し連結した。得られた構築物pPan6-SbfI-E3をEco 47 IIIおよびSwa Iで処理し、pPan6-E3を作製した。最後に、pPan6-pkGFPのSbfI消化から得られた21 kbのSbfI断片を、pPan6-E3中にサブクローニングして、E3中に4 kbの欠失を含むpPan6-E3-pkGFPを作製した。
【０４６１】
E3欠失させたPan7ベクター
同じ戦略を用いて、Pan7におけるE3欠失を達成した。最初に、E3領域に及ぶ5.8 kbのAvr II断片を、pSL-1180にサブクローニングした後、Nru I消化によりE3を欠失させた。得られたプラスミドを、Spe IおよびAvr IIで処理して、4.4 kbの断片を取得し、pPan7-pkGRPのAvr II部位にクローニングして、それぞれAvr II断片を含む元のE3を置換した。最終的なpPan7-E3-pkGFP構築物は3.5 kbのE3欠失を有していた。
【０４６２】
これらの、および他のPanアデノウイルス血清型におけるE1、E3およびE4欠失の構築の完全な記載を、WO03/0046124に与える。また、さらなる情報はHuman Gene Therapy 15:519-530 (WO03/046124)においても入手可能である。
【０４６３】
実施例61
Gag、RT、Nef配列の構築
これは、WO03/025003に完全に記載されている。
【０４６４】
プラスミドp73i-Tgrn
1. プラスミド：p73i-GRN2クローン#19(p17/p24(opt)/RT(opt)trNef)-修復
目的の遺伝子：
Iowa長のHCMVプロモーター＋エクソン1の下流、およびウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナルの上流のHIV-1クレード(clade)B株HXB2に由来するコドン最適化されたGag、コドン最適化されたRTおよびトランケートされたNef遺伝子のp17/p24部分。
【０４６５】
プラスミドp17/24trNef1から誘導されたtrNef遺伝子を含むプラスミドは、Nefの末端に由来する19個のアミノ酸にRからHへのアミノ酸変化を与えるPCRエラーを含む。これをPCR突然変異誘発により補正し、補正されたNef PCRを、p7077-RT3に由来するコドン最適化されたRTに縫込み、縫い込まれた断片をApaIおよびBamHIで切断し、ApaI/BamHI切断したp73i-GRN中にクローニングした。
【０４６６】
プライマー：
プライマー：
センス：U1
GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT
AScoRT-Nef
GGTGTGACTGGAAAACCCACCATCAGCACCTTTCTAATCCCCGC
を用いるp7077-RT3からのPCR coRT(ポリメラーゼ＝PWO(Roche)スルーアウト)。
【０４６７】
サイクル：95℃(30秒)、次いで95℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(180秒)を20サイクル、次いで、72℃(120秒)および4℃で保持。
【０４６８】
1.7 kbのPCR産物をゲル精製した。
【０４６９】
プライマー：
センス：S-Nef
ATGGTGGGTTTTCCAGTCACACC 
アンチセンス: ASNef-G:
GATGAAATGCTAGGCGGCTGTCAAACCTC
を用いるp17/24trNef1からのPCR 5'Nef。
【０４７０】
サイクル：95℃(30秒)、次いで、95℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(60秒)で15サイクル、次いで、72℃(120秒)および4℃で保持。
【０４７１】
プライマー：
センス：SNEF-G
GAGGTTTGACAGCCGCCTAGCATTTCATC
アンチセンス:
AStrNef (アンチセンス)
CGCGGATCCTCAGCAGTTCTTGAAGTACTCC
を用いるp17/24trNef1からのPCR 3'Nef。
【０４７２】
サイクル：95℃(30秒)、次いで95℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(60秒)で15サイクル、次いで72℃(120秒)、および4℃で保持。
【０４７３】
PCR産物をゲル精製した。最初に、2つのNef産物を、5'(S-Nef)および3'(AstrNef)プライマーを用いて縫い込んだ。
【０４７４】
サイクル：95℃(30秒)、次いで95℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(60秒)で15サイクル、次いで72℃(180秒)および4℃で保持。
【０４７５】
PCR産物をPCRクリーニングし、U1およびAstrNefプライマーを用いてRT産物に縫い込んだ。
【０４７６】
サイクル：95℃(30秒)、次いで95℃(30秒)、55℃(30秒)、72℃(180秒)で20サイクル、次いで72℃(180秒)および4℃で保持。
【０４７７】
2.1 kbの産物をゲル精製し、ApaIおよびBamHiで切断した。また、プラスミドp73I-GRNをApaIおよびBamHIで切断し、ゲル精製し、ApaI-Bam RT3trNefを用いて連結して、p17/p24(opt)/RT(opt)trNef遺伝子を再生した。
【０４７８】
2. プラスミド：p73I-RT w229k(不活化RT)
目的の遺伝子：
Iowa長のHCMVプロモーター＋エクソン1の下流、およびウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナルの上流の不活化RT遺伝子の作製。
【０４７９】
治療用ワクチンにおける活性なHIV RT種の使用に関する心配のために、遺伝子の不活化が望ましかった。これを、RT(P731-GRN2由来)のアミノ酸位置229をTrpからLys(R7271 p1-28)にPCR突然変異誘発させることにより達成した。
【０４８０】
プライマー：
プライマー：
センス: RT3-u:1
GAATTCGCGGCCGCGATGGGCCCCATCAGTCCCATCGAGACCGTGCCGGTGAAGCTGAAACCCGGGAT
アンチセンス: AScoRT-Trp229Lys
GGAGCTCGTAGCCCATCTTCAGGAATGGCGGCTCCTTCT
を用いるPCR 5'RT+突然変異(ポリメラーゼ＝PWO(Roche)スルーアウト)。
【０４８１】
サイクル：
1 x   [94℃ (30秒)]
15 x [94℃ (30秒)/55℃ (30秒)/72℃ (60秒)]
1 x   [72℃ (180秒)]
PCRゲル精製。
【０４８２】
プライマー：
アンチセンス: RT3- l:1
GAATTCGGATCCTTACAGCACCTTTCTAATCCCCGCACTCACCAGCTTGTCGACCTGCTCGTTGCCGC 
センス: ScoRT-Trp229Lys
CCTGAAGATGGGCTACGAGCTCCATG
を用いるPCR 3'RT+突然変異。
【０４８３】
サイクル：
1 x   [94℃(30秒)]
15 x [94℃(30秒)/55℃(30秒)/72℃(60秒)]
1 x   [72℃(180秒)]
PCRゲル精製。
【０４８４】
PCR産物をゲル精製し、RTの5'および3'末端を、5'(RT3-U1)および3'(RT3-L1)プライマーを用いて縫い込んだ。
【０４８５】
サイクル：
1 x   [94℃(30秒)]
15 x [94℃(30秒)/55℃ (30秒)/72℃ (120秒)]
1 x   [72℃(180秒)]。
【０４８６】
PCR産物をゲル精製し、NotIおよびBamHI制限部位を用いて、p7313ie中にクローニングして、p73I-RT w229kを作製した。
【０４８７】
3. プラスミド：p73i-Tgrn
目的の遺伝子：
Iowa長のHCMVプロモーター＋エクソン1の下流、およびウサギβ-グロビンポリアデニル化シグナルの上流のHIV-1クレードB株HXB2に由来するコドン最適化されたgag、コドン最適化されたRTおよびトランケートされたNef遺伝子のp17/p24部分。
【０４８８】
活性な形態のRTを含む3重融合構築物は、ヒトへの使用のための規制権限にとって許容し得るものではないため、p73i-RT w229kに由来するNheIおよびApaI切断された断片を、NheI/ApaI切断されたp73i-GRN2#19中に挿入することにより、RTの不活化を達成した。これは、RT中の位置229においてWからKへの変化をもたらす。
【０４８９】
Tgrnプラスミド挿入物の完全な配列を、図51に示す。これは、p17p24(opt)Gag、p66 RT(optおよび不活化)およびトランケートされたNefを含む。プラスミドp73i-Tgrnのマップを、図52に示す。
【０４９０】
実施例62
アデノウイルスへのGag、RT、Nef配列の挿入
pShuttleプラスミドへのGRN発現カセットのサブクローニング
プロモーター、cDNAおよびポリアデニル化シグナルからなる完全な発現カセットを、SphIおよびEcoRIの2重消化によりpT-GRN構築物から単離した。SphI/EcoRI断片のSphI末端を、Klenowを用いて充填し、MluI末端が平滑化されているpShuttleプラスミドのEcoRIおよびMluI部位にクローニングした。
【０４９１】
クローニングプロセスの間に、追加のフランキング配列はHIV発現カセットと結合するようになった。この配列はCer配列として知られており、公知の機能を有さない。
【０４９２】
Pan6およびPan7ベクターのE1/E3欠失された分子クローンへのGRN発現カセットの導入
この発現カセットを、I-CeuIおよびPI-SceI消化によりpShuttleから回収し、Pan6およびPan7ベクターの分子クローンの同じ部位にクローニングした。組換えクローンを、緑/白色選択を介して同定し、広範囲の制限酵素分析により確認した。
【０４９３】
組換えウイルスの救出および増殖
C6およびC7ベクターの分子クローンを、好適な制限エンドヌクレアーゼ(それぞれPmeIおよびPacI)で処理して、無傷の線状ベクターゲノムを放出させ、リン酸カルシウム法を用いて293細胞中にトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞中で完全な細胞変性効果が観察された場合、粗ウイルス溶解物を収穫し、293細胞中で大規模感染まで徐々に増殖させた(1 x 109個の細胞)。大規模感染に由来するウイルスを、標準的なCsCl沈降法により精製した。
【０４９４】
さらに、pShuttleプラスミドを、EcoRIおよびXmnIで切断することによりさらに整備して、3'リンカー配列を除去し、プラスミドのサイズを減少させてpShuttleGRNcを作製した。
【０４９５】
略語
DOPE = 1,2-ジオレオイル-syn-グリセロ-3-ホスホ-エタノールアミン
DMRIE-C = 1,2-ジミリスチルオキシプロピル-3-ジメチル-ヒドロキシエチルアンモニウムブロミドおよびコレステロール (1;1, M/M混合物)
jet-PEI = 線状ポリエチレンイミン
jet-PEI-Man =マンノース結合線状ポリエチレンイミン
EBSS = Earle's平衡化塩溶液
PBS = リン酸緩衝生理食塩水
TBS = Tris緩衝生理食塩水
HEPES = N-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-N'-(2-エタンスルホン酸)
QELS = 準弾性光散乱
ELS = 電気泳動光散乱
NHP = 非ヒト霊長類
p.f.u. = プラーク形成単位
Ad = アデノウイルス
PMED =粒子媒介性表皮送達(遺伝子銃)
【０４９６】
図面の手がかり
図1〜3
ルシフェラーゼ活性を、RLU/mgタンパク質(相対発光量／mgタンパク質)として示す。
【０４９７】
図5〜11
初回：p7313＝p7313ie(空のベクター)、rng＝p7313ieTrng
追加：PBS＝モック追加、DNA＝2 x PBS中の裸のDNA、GS＝ジェミニ界面活性剤＋DNA、rng PMED＝PMED追加。
【０４９８】
図27
古い＝4℃で4ヶ月間保存されたジェミニ界面活性剤
新しい＝新たに調製されたジェミニ界面活性剤。
【０４９９】
図29および30
遊離＝DNAの非存在下でのジェミニ界面活性剤
DNA複合体＝プラスミドDNAと複合体化されたジェミニ界面活性剤。
【０５００】
図35
新しいOPT＝新しく開封されたOPTIMEM
古いOPT＝3ヶ月間開封されたOPTIMEM。
【０５０１】
図37
(1)OPT中の1μgプラスミド、(2)OPT中の1μgプラスミド＋GS543A*、(3)OPT中の2μgプラスミド＋GS543A、(4)EBSS中の1μgプラスミド、(5)EBSS中の1μgプラスミド＋GS543A*、(6)EBSS中の2μgプラスミド＋GS543A、(7)PBS中の1μgプラスミド、(8)PBS中の1μgプラスミド＋GS543A*、(9)PBS中の2μgプラスミド＋GS543A、(10)1 kbラダー；*＝遅延したプラスミドDNAを含むレーン。
【０５０２】
図42
38日目＝1回目の追加免疫後10日目
62日目＝2回目の追加免疫後7日目
69日目＝2回目の追加免疫後14日目
免疫化AおよびB＝p7313iTrng、i.d.またはi.m.注入による50μl中の2 x 10μgのDNA+/-GS543A
免疫化C＝p6grn、i.d.またはi.m.注入による50μl中の1 x 108 pfuのNHPアデノウイルス。
【図面の簡単な説明】
【０５０３】
【図１】DNA送達の24時間後でのマウス皮膚におけるルシフェラーゼ活性を示す。
【図２】DNA送達の24時間後でのマウス皮膚におけるルシフェラーゼ活性を示す。
【図３】DNA送達の24時間後でのマウス皮膚におけるルシフェラーゼ活性を示す。
【図４】免疫化スケジュールを示す。
【図５】追加免疫後8日目のインターフェロンγのELISPOTを示す。
【図６】追加免疫後8日目のインタロイキン-2のELISPOTを示す。
【図７】追加免疫後14日目のインターフェロンγのELISPOTを示す。
【図８】追加免疫後14日目のインターロイキン-2のELISPOTを示す。
【図９】追加免疫後21日目のインターフェロンγのELISPOTを示す。
【図１０】追加免疫後21日目のインターロイキン-2のELISPOTを示す。
【図１１】体液性応答：追加免疫後14日目の血清サンプル上での全IgG ELISAを示す。
【図１２】ペンタミンジェミニ化合物の合成において有用な進歩した中間体5の合成のための一般的スキームを示す。
【図１３】ペンタミンジェミニ化合物の合成のための一般的スキームを示す。
【図１４】ペンタミンジェミニ化合物の合成において有用な活性化アミノ酸(Aa)x基の調製のための反応スキームを示す。
【図１５】ペンタミンジェミニ化合物の合成のための一般的なスキームを示す。
【図１６】ペンタミンジェミニ化合物の合成のための一般的なスキームを示す。
【図１７】ペンタミンジェミニ化合物の塩の生成のための進歩した中間体の脱保護のための一般的な反応スキームを示す。
【図１８】ペンタミンジェミニ化合物の塩の生成のための反応スキームを示す。
【図１９】スペルミジンに基づくジェミニ化合物の合成において有用な保護された(Aa)基6の合成のための一般的なスキームを示す。試薬および条件：a) CF3CO2Et, H2O, MeCN, 還流; b) Boc2O, iPr2NEt, THF, rt; c) NaOH-H2O, MeOH, 10℃ - rt; d) RCO2NSuc, K2CO3, THF, H2O, rt; e) CF3CO2H, CH2Cl2, rt。
【図２０】スペルミジンに基づくジェミニ化合物の合成において有用な保護された(Aa)基9の合成のための一般的なスキームを示す。試薬および条件: a) CF3CO2Et, H2O, MeCN, 還流; b) Br(CH2)pCO2R, iPr2NEt, MeCN, rt; c) NaOH-H2O, MeOH, rt; d) Boc2O, H2O, MeOH, rt。
【図２１】スペルミジンに基づくジェミニ化合物の合成において有用な進歩した中間体14の合成のための一般的なスキームを示す。試薬および条件: a) MeOCOCl, NaOH-H2O, THF, rt; b) 10% Pd/C, cHCl, MeOH, H2, 5バール; c) Boc2O, iPr2NEt, DMF; d) 2N KOH-H2O, THF, rt。
【図２２】スペルミジンに基づく分子の合成のための一般的なスキームを示す。試薬および条件: a) (PG)y(Aa)x, HCTU, iPrNEt2, DMF, rt; b) 5N HCl-EtOAC, CH2Cl2, rt。
【図２３】スペルミジンに基づく分子の合成のための一般的なスキームを示す。
【図２４】スペルミジンに基づく分子の合成のための一般的なスキームを示す。試薬および条件: a) (PG)y(Aa)x, HCTUまたはHBTU, iPr2NEt, DMF, rt.; b) 5N HCl-EtOAc, CH2Cl2, rt。
【図２５ａ】エステル結合した界面活性剤の合成のための一般的なスキームを示す。
【図２５ｂ】図２５ａの続きである。
【図２６】非対称スペルミンに基づくジェミニ化合物の合成のための一般的なスキームを示す。試薬および条件: (a). CF3CO2Et, MeCN, 還流, 18時間; (b). (Boc)2O, iPr2NEt, THF; (c). K2CO3, H2O, MeOH, 還流, 2時間; (d). R1CO2C6F5, Et3N, CH2Cl2, -78℃ - rt; (e). R2CO2H, TBTU, HOBt, iPr2NEt, CH2Cl2; (f) HCl, Et2O; (g). Aa.Boc, TBTU, HOBt, iPr2NEt, CH2Cl2; (h) HCl, Et2O, rt。
【図２７】QELSによるジェミニ界面活性剤(「古い」および「新しい」保存液)の分析を示す。
【図２８】QELSによるジェミニ界面活性剤の分析：新しく調製された保存液に関する時間経過を示す。
【図２９】QELSによるジェミニ界面活性剤の分析：プラスミドDNAとの複合体形成を示す。
【図３０】ELSによるジェミニ界面活性剤の分析：プラスミドDNAとの複合体形成を示す。
【図３１】QELSによるジェミニ界面活性剤の分析：プラスミドDNAとの複合体形成後の時間経過を示す。
【図３２】QELSによるGS543Aの分析：GS543A:DNA比を変化させる効果を示す。
【図３３】QELSによるジェミニ界面活性剤の分析：ジェミニ界面活性剤-DNA複合体のpH感受性の調査を示す。
【図３４】QELSによる水中で形成されたか、またはOPTIMEM中に希釈されたジェミニ界面活性剤の分析を示す。
【図３５】QELSによるジェミニ界面活性剤の分析：新鮮な(「新しい」)または保存された(「古い」)OPTIMEM中で形成されたジェミニ界面活性剤-DNA複合体を示す。
【図３６】QELSによるジェミニ界面活性剤の分析：異なるバッファー中で形成されたジェミニ界面活性剤-DNA複合体を示す。
【図３７】アガロースゲル遅延によるOptimem(OPT)、EBSSまたはPBSバッファー中のGS543AおよびDNAのリポプレックスの分析を示す。
【図３８】PMEDによりプライミングされたBalb/cマウスにおける、ジェミニ界面活性剤(「古い」および「新しい」保存液)を用いたi.d.DNA免疫化後の細胞性応答：追加免疫後14日目のインターフェロンγのELISPOTを示す。
【図３９】PMEDによりプライミングされたBalb/cマウスにおける、ジェミニ界面活性剤(「古い」および「新しい」保存液)を用いたi.d.DNA免疫化後の細胞性応答：追加免疫後14日目のインターロイキン-2のELISPOTを示す。
【図４０】PMEDによりプライミングされたBalb/cマウスにおける、GS543A：DNA複合体(OPTIMEMまたはEBSSにより緩衝化された種々の保存液)を用いたi.d.免疫化後の細胞性応答：追加免疫後14日目のインターフェロンγのELISPOTを示す。
【図４１】PMEDによりプライミングされたBalb/cマウスにおける、GS543A：DNA複合体(OPTIMEMまたはEBSSにより緩衝化された種々の保存液)を用いたi.d.免疫化後の細胞性応答：追加免疫後14日目のインターロイキン-2のELISPOTを示す。
【図４２】相同的計画におけるDNA免疫化、次いでi.d.およびi.m.経路を介するアデノウイルスを用いる異種追加免疫化に対する応答に対するGS543Aの効果の分析のための免疫化スケジュールを示す。
【図４３】Balb/cマウスにおける、GS543A：DNA複合体(OPTIMEMまたはEBSSまたはPBSにより緩衝化)を用いたi.d.またはi.m.免疫化後の細胞性応答：追加免疫後10日目のインターフェロンγのELISPOTを示す(免疫化B)。
【図４４】Balb/cマウスにおける、GS543A：DNA複合体(OPTIMEMまたはEBSSまたはPBSにより緩衝化)を用いたi.d.またはi.m.免疫化後の細胞性応答：追加免疫後10日目のインターロイキン-2のELISPOTを示す(免疫化B)。
【図４５】Balb/cマウスにおける、GS543A：DNA複合体(OPTIMEMまたはEBSSまたはPBSにより緩衝化)を用いたi.d.またはi.m.免疫化後の細胞性応答：初回免疫後26日目のGag CD8テトラマー応答を示す(A)。
【図４６】Balb/cマウスにおける、GS543A：DNA複合体(OPTIMEMまたはEBSSまたはPBSにより緩衝化)を用いたi.d.またはi.m.免疫化後の細胞性応答：初回追加免疫後26日目のGag CD8テトラマー応答を示す(B)。
【図４７】アデノウイルスによる追加免疫後のBalb/cマウスにおける、GS543A：DNA複合体(OPTIMEMまたはEBSSまたはPBSにより緩衝化)を用いたi.d.またはi.m.免疫化後の細胞性応答：2回目の異種追加免疫後7日目のインターフェロンγのELISPOTを示す(免疫化C)。
【図４８】アデノウイルスによる追加免疫後のBalb/cマウスにおける、GS543A：DNA複合体(OPTIMEMまたはEBSSまたはPBSにより緩衝化)を用いたi.d.またはi.m.免疫化後の細胞性応答：2回目の異種追加免疫後7日目のインターロイキン-2のELISPOTを示す(免疫化C)。
【図４９】Balb/cマウスにおける、GS543A：DNA複合体(OPTIMEMまたはEBSSまたはPBSにより緩衝化)を用いたi.d.またはi.m.免疫化後の体液性応答：追加免疫後10日目の血清サンプルに対する全IgG ELISAを示す(免疫化B)。
【図５０】アデノウイルスによる追加免疫後のBalb/cマウスにおける、GS543A：DNA複合体(OPTIMEMまたはEBSSまたはPBSにより緩衝化)を用いたi.d.またはi.m.免疫化後の体液性応答：2回目の異種追加免疫後14日目の血清サンプルに対する全IgG ELISAを示す(免疫化C)。
【図５１−１】Tgrnポリヌクレオチド(配列番号1)およびTgrnアミノ酸(配列番号2)を示す。
【図５１−２】図５１−１の続きである。
【図５２】プラスミドp73i-Tgrnのマップを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５ａ】
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【図２５ｂ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１−１】
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【図５１−２】
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【図５２】
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【国際調査報告】
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