(57)【要約】  本発明はサリコルニア・ブラキアタから単離された活性画分の抗結核活性の亢進に関する。また、本発明は当該画分の無毒性を開示し、そして主要な成分としてショ糖が同定できる。純粋なショ糖は抗結核活性を有さないことが示され、これにより当該画分の活性が１又は複数の微量成分に帰することが示された。微量成分は、比較的低分子量の実体であることが示され、そしてクロマトグラフィー技術は、詳細にこれらの活性及び構造を証明するために多量のショ糖からこれらを分離するために開示される。また可能であればこれらの合成も新規である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サリコルニア属の抽出物由来の生理活性画分。
【請求項２】
サリコルニア属がサリコルニア・ブラキアタを含んで成る、請求項１に記載の生理活性画分。
【請求項３】
サリコルニア・ブラキアタが十分に成熟した植物である、請求項２に記載の生理活性画分。
【請求項４】
前記抽出物が、根、根茎、穂、及び種子以外の全植物から成る群から選択されるサリコルニア植物部分由来の抽出物を含んで成る、請求項１に記載の生理活性画分。
【請求項５】
生理活性画分が、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、及びＦ５を含んで成る、請求項１に記載の生理活性画分。
【請求項６】
生理活性画分Ｆ２が更に、細画分のＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７を含んで成る、請求項６に記載の生理活性画分。
【請求項７】
ＳＦ３−ＫがＳＦ３の細画分である、請求項６に記載の生理活性画分。
【請求項８】
ＳＦ３−Ｋが５０℃以下の温度において少なくとも４時間安定である、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項９】
ＳＦ３−Ｋの主要成分が、ＲＩ検出を伴うＨＰＬＣに基づき７５〜８０％のショ糖を含んで成る、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項１０】
前記生理活性画分が抗結核活性を有する、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項１１】
生理活性画分が抗結核剤として有用である、請求項１に記載の生理活性画分。
【請求項１２】
ＯＡＤＣ（Ｂ−Ｄ、ＵＳＡ）を含有する７Ｈ１０ミドルブルック培地を使用して評価される場合、生理活性画分ＳＦ３Ｋが、結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して３．１２５μｇ／ｍＬ以下のＭＩＣ値を示す、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項１３】
ＢＡＣＴＥＣ法により試験管内において評価される場合、生理活性画分ＳＦ３−Ｋが、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの投与量において結核菌（M. Tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して完全な阻害を示し、そして更に成長指数の用量依存性を示す、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項１４】
生体内においても活性であり、そして５０ｍｇ／ｋｇ体重のＳＦ３−Ｋの用量が感染後１２日間経口的に投与される場合、感染したマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）が５日間増加する、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項１５】
ＳＦ３−Ｋが、１００μｇ／ｍＬ以下の投与量でＶＥＲＯ株化細胞において行われた試験において細胞毒性を示さない、即ち、ＳＦ３−ＫのＭＩＣ値の１０倍以上である、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項１６】
０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において経口的にＳＦ３−Ｋを投与された健康なマウスに対してＳＦ３−Ｋが毒性を示さない、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項１７】
主要成分のショ糖が、１００μｇ／ｍＬの投与量であるとしても純粋なショ糖としていずれの活性も有さない、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項１８】
最も顕著な微量成分が、分子量１１７の成分に相等する１１８［１１７＋Ｈ］+、及び１４０［１１７＋Ｎａ+］のｍ／ｚ値を示す、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項１９】
分子量１１７を有する微量成分が、５８及び５９のｍ／ｚ値に対応する娘ピークを示し、一方ナトリウム塩の形態において、娘フラグメントが９６、８１、５３、及び２３のｍ／ｚ値を伴い表れる、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項２０】
分子量１１７を有する成分が、質量分光法の条件下においてセルフクラスターを形成し、そしてまた主要成分（ショ糖）ともクラスターを形成する、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項２１】
他の微量成分が、１１３、１１５、及び１４２の分子量で観察される、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項２２】
細画分のＳＦ１、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７が、１００〜１２．５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明し、そしてＳＦ２及びＳＦ４が、１００〜２５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明した、請求項７に記載の生理活性画分。
【請求項２３】
以下の工程を含んで成るサリコルニア属の抽出物耀来の生理活性画分の調製方法：
（ｉ）２００４年４月２２日の米国特許第１０／８２９，４００号、及び２００３年８月２９日のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＩＮ０３／００２９２号において請求されたサリコルニア・ブラキアタ由来のＦ２画分を供する工程；
（ii）ＲＰ−１８カラム(Phenomenex)、及び７ｍＬ／分における３：９７：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ移動相を使用してＦ２生理活性画分を分取用（Semi-preparative)ＨＰＬＣにおいて細分画にかける工程；
（iii ）本願に供される分取用（Semi-preparative)ＨＰＬＣプロファイルにおいて０〜２２分の間の７つの細画分ＳＦ１、ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７を回収する工程；
（iv）工程（iii ）において得られた細画分を抗結核スクリーニングにかける工程；
（ｖ）細画分の活性及び得られた物質の量の面から最も適当なものとして細画分ＳＦ３を同定する工程；
（vi）工程（iv）において得られた細画分を濃縮し、そして同じ分取用カラム（流速が６〜７ｍＬ／分に変更したことを除き全て同じ条件である）において、分取用カラムにおいて６ｍＬ／分の流速で１１．８９分の保持時間、及び分析用カラムにおいて１ｍＬ／分の流速で２．９５分の保持時間を有するピークの純度を亢進するために再度クロマトグラフィーにかける工程；
（vii ）工程（vi）において得られた画分を濃縮し、そしてＳＦ３−Ｋを得るために凍結乾燥にかける工程。
【請求項２４】
乾燥した根から０．６〜０．９％の収率において、固体のＳＦ３−Ｋを得るために工程（vi）において得られた画分が凍結乾燥にかけられる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載の成分を特徴づけるために、８０：２０：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏを使用するＳＦ３−Ｋの成分をWaters・アミノカラムにおける液体クロマトグラフィーにかけること、及び微量及び主要成分の両方をＵＶ（２１０ｎｍ）及びＲＩ検出器でモニタリングすること、及びＬＳ−ＭＳを使用して当該成分を分析することにより解決される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
抗結核剤としてのサリコルニア属の抽出物から得られた生理活性画分の使用。
【請求項２７】
サリコルニア属がサリコルニア・ブラキアタを含んで成る、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
サリコルニア・ブラキアタが十分に成熟した植物である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２９】
前記抽出物が、根、根茎、穂、及び種子以外の全植物から成る群から選択されるサリコルニア植物部分由来の抽出物を含んで成る、請求項２６に記載の使用。
【請求項３０】
生理活性画分が、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、及びＦ５を含んで成る、請求項２６に記載の使用。
【請求項３１】
生理活性画分Ｆ２が、ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７に細分画される、請求項２６に記載の使用。
【請求項３２】
細画分ＳＦ３が更にＳＦ３−Ｋに分画される、請求項２６に記載の使用。
【請求項３３】
ＳＦ３−Ｋの主要成分が、ＲＩ検出を伴うＨＰＬＣに基づき７５〜８０％のショ糖を含んで成る、請求項２６に記載の使用。
【請求項３４】
前記生理活性画分が抗結核活性を有する、請求項２６に記載の使用。
【請求項３５】
ＯＡＤＣ（Ｂ−Ｄ、ＵＳＡ）を含有する７Ｈ１０ミドルブルック培地を使用して評価される場合、画分ＳＦ３Ｋが、結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して３．１２５μｇ／ｍＬ以下のＭＩＣ値を示す、請求項２６に記載の使用。
【請求項３６】
ＢＡＣＴＥＣ法により試験管内において評価される場合、画分ＳＦ３−Ｋが、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの投与量において結核菌（M. Tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して完全な阻害を示し、そして更に成長指数の用量依存性を示す、請求項２６に記載の使用。
【請求項３７】
生体内においても活性であり、そして５０ｍｇ／ｋｇ体重のＳＦ３−Ｋの用量が感染後１２日間経口的に投与される場合、感染したマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）が５日間増加する、請求項２６に記載の使用。
【請求項３８】
ＳＦ３−Ｋが、１００μｇ／ｍＬ以下の投与量でＶＥＲＯ株化細胞において行われた試験において細胞毒性を示さない、即ち、ＳＦ３−ＫのＭＩＣ値の１０倍以上である、請求項２６に記載の使用。
【請求項３９】
０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において経口的にＳＦ３−Ｋを投与された健康なマウスに対して毒性を示さない、請求項２６に記載の使用。
【請求項４０】
主要成分のショ糖が、１００μｇ／ｍＬの投与量であるとしても純粋なショ糖としていずれの活性も有さない、請求項２６に記載の使用。
【請求項４１】
最も顕著な微量成分が、分子量１１７の成分に相等する１１８［１１７＋Ｈ］+、及び１４０［１１７＋Ｎａ+］のｍ／ｚ値を示す、請求項２６に記載の使用。
【請求項４２】
分子量１１７を有する微量成分が、５８及び５９のｍ／ｚ値に対応する娘ピークを示し、一方ナトリウム塩の形態において、娘フラグメントが９６、８１、５３、及び２３のｍ／ｚ値を伴い表れる、請求項２６に記載の使用。
【請求項４３】
分子量１１７を有する成分が、質量分光法の条件下においてセルフクラスターを形成し、そしてまた主要成分（ショ糖）ともクラスターを形成する、請求項２６に記載の使用。
【請求項４４】
他の微量成分が、１１３、１１５、及び１４２の分子量で観察される、請求項２６に記載の使用。
【請求項４５】
細画分のＳＦ１、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７が、１００〜１２．５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明し、そしてＳＦ２及びＳＦ４が、１００〜２５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明した、請求項２６に記載の使用。
【請求項４６】
結核に苦しむ患者に対してサリコルニア属から得られた医薬的有効量の抗結核画分を、任意的に、合成又は天然のいずれかの他の抗結核薬、及び医薬的に許容される添加物又は担体とともに投与することを含んで成る、結核の治療方法。
【請求項４７】
前記方法が、サリコルニア属の生理活性画分又は粗抽出物のいずれかを患者に対して投与することを含んで成る、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
サリコルニア属がサリコルニア・ブラキアタを含んで成る、請求項４６に記載の方法。
【請求項４９】
サリコルニア・ブラキアタが十分に成熟した植物である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
生理活性画分が、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、及びＦ５を含んで成る、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
生理活性画分Ｆ２が、ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７に細分画される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５２】
細画分ＳＦ３が更にＳＦ３Ｋに分画される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
ＳＦ３Ｋの主要成分が、ＲＩ検出を伴うＨＰＬＣに基づき７５〜８０％のショ糖を含んで成る、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
前記生理活性画分が抗結核活性を有する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５５】
ＯＡＤＣ（Ｂ−Ｄ、ＵＳＡ）を含有する７Ｈ１０ミドルブルック培地を使用して評価される場合、画分ＳＦ３Ｋが、結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して３．１２５μｇ／ｍＬ以下のＭＩＣ値を示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項５６】
ＢＡＣＴＥＣ法により試験管内において評価される場合、画分ＳＦ３Ｋが、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの投与量において結核菌（M. Tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して完全な阻害を示し、そして更に成長指数の用量依存性を示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項５７】
前記画分が生体内においても活性であり、そして５０ｍｇ／ｋｇ体重のＳＦ３−Ｋの用量が感染後１２日間経口的に投与される場合、感染したマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）が５日間増加する、請求項４６に記載の方法。
【請求項５８】
前記画分が、０〜１００μｇ／ｍＬ以下の投与量でＶＥＲＯ株化細胞において行われた試験においてさえ細胞毒性を示さない、即ち、ＳＦ３−ＫのＭＩＣ値の１０倍以上である、請求項４６に記載の方法。
【請求項５９】
前記画分が、０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において経口的にＳＦ３−Ｋを投与された健康なマウスに対して毒性を示さない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６０】
主要成分のショ糖が、１００μｇ／ｍＬの投与量であるとしても純粋なショ糖としていずれの活性も有さない、請求項４６に記載の方法。
【請求項６１】
最も顕著な微量成分が、分子量１１７の成分に相等する１１８［１１７＋Ｈ］+、及び１４０［１１７＋Ｎａ+］のｍ／ｚ値を示す、請求項４６に記載の方法。
【請求項６２】
分子量１１７を有する微量成分が、５８及び５９のｍ／ｚ値に対応する娘ピークを示し、一方ナトリウム塩の形態において、娘フラグメントが９６、８１、５３、及び２３のｍ／ｚ値を伴い表れる、請求項４６に記載の方法。
【請求項６３】
分子量１１７を有する成分が、質量分光法の条件下においてセルフクラスターを形成し、そしてまた主要成分（ショ糖）ともクラスターを形成する、請求項４６に記載の方法。
【請求項６４】
他の微量成分が、１１３、１１５、及び１４２の分子量で観察される、請求項４６に記載の方法。
【請求項６５】
細画分のＳＦ１、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７が、１００〜１２．５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明し、そしてＳＦ２及びＳＦ４が、１００〜２５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明した、請求項４６に記載の方法。
【請求項６６】
前記画分が、錠剤、ロゼンジ、カプセル、粉末、溶液から選択される形態において、静脈内又は経口的に投与される、請求項４６に記載の方法。
【請求項６７】
サリコルニア属の抽出物から単離された生理活性画分を、任意的に、いずれかの他の合成又は天然の抗結核薬、及び医薬的に許容される添加物又は担体とともに含んで成る医薬組成物。
【請求項６８】
サリコルニア属がサリコルニア・ブラキアタを含んで成る、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
サリコルニア・ブラキアタが十分に成熟した植物である、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７０】
前記抽出物が、根、根茎、穂、及び種子以外の全植物から成る群から選択されるサリコルニア植物部分由来の抽出物を含んで成る、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７１】
生理活性画分が、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、及びＦ５を含んで成る、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７２】
画分Ｆ２が、ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７に細分画される、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７３】
細画分ＳＦ３が更にＳＦ３Ｋに細分画される、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７４】
ＳＦ３Ｋの主要成分が、ＲＩ検出を伴うＨＰＬＣに基づき７５〜８０％のショ糖を含んで成る、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７５】
前記画分が抗結核活性を有する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７６】
ＯＡＤＣ（Ｂ−Ｄ、ＵＳＡ）を含有する７Ｈ１０ミドルブルック培地を使用して評価される場合、画分ＳＦ３Ｋが、結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して３．１２５μｇ／ｍＬ以下のＭＩＣ値を示す、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７７】
ＢＡＣＴＥＣ法により試験管内において評価される場合、画分ＳＦ３Ｋが、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの投与量において結核菌（M. Tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して完全な阻害を示し、そして更に成長指数の用量依存性を示す、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７８】
生体内においても活性であり、そして５０ｍｇ／ｋｇ体重のＳＦ３−Ｋの用量が感染後１２日間経口的に投与される場合、感染したマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）が５日間増加する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項７９】
１００μｇ／ｍＬ以下の投与量でＶＥＲＯ株化細胞において行われた試験において細胞毒性を示さない、即ち、ＳＦ３−ＫのＭＩＣ値の１０倍以上である、請求項６７に記載の組成物。
【請求項８０】
０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において経口的にＳＦ３−Ｋを投与された健康なマウスに対して毒性を示さない、請求項６７に記載の組成物。
【請求項８１】
主要成分のショ糖が、５０〜１００μｇ／ｍＬの投与量であるとしても純粋なショ糖としていずれの活性も有さない、請求項４６に記載の方法。
【請求項８２】
最も顕著な微量成分が、分子量１１７の成分に相等する１１８［１１７＋Ｈ］+、及び１４０［１１７＋Ｎａ+］のｍ／ｚ値を示す、請求項６７に記載の組成物。
【請求項８３】
分子量１１７を有する微量成分が、５８及び５９のｍ／ｚ値に対応する娘ピークを示し、一方ナトリウム塩の形態において、娘フラグメントが９６、８１、５３、及び２３のｍ／ｚ値を伴い表れる、請求項６７に記載の組成物。
【請求項８４】
分子量１１７を有する成分が、質量分光法の条件下においてセルフクラスターを形成し、そしてまた主要成分（ショ糖）ともクラスターを形成する、請求項６７に記載の組成物。
【請求項８５】
他の微量成分が、１１３、１１５、及び１４２の分子量で観察される、請求項６７に記載の組成物。
【請求項８６】
細画分のＳＦ１、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７が、１００〜１２．５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明し、そしてＳＦ２及びＳＦ４が、１００〜２５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明した、請求項６７に記載の組成物。
【請求項８７】
前記組成物が、錠剤、ロゼンジ、カプセル、粉末、溶液から成る群から選択される形態における、請求項６７に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はサリコルニア(Salicornia)種の抗結核性抽出物に関する。より具体的には、本発明はインドのグジャラート沿岸に天然に育成するサリコルニア・ブラキアタ(Salicornia brachiata)の根抽出物の１：１のクロロホルム−メタノール画分の抗結核活性の亢進に関する。
【背景技術】
【０００２】
現在世界中で使用される抗結核性化学療法薬は、主に合成薬物、例えば、単独で、又はナトリウムＰＡＳ（パラアミノサリチル酸ナトリウム）との組み合わせにおいて使用されるイソニアジド（即ち、イソニコチン酸ヒドラジド）、イソネックス（Isonex)、エルバジド（イソニアジドのメタンスルホン酸カルシウム）、シクロセリン、塩酸モルファジンアミド、リファンピシン、エタンブトール／ミアンブトール、スパルフロキサシン等を含んで成り、これらは抗生物質ストレプトマイシンの合成の後に開発された。
【０００３】
上述の薬物をＢＣＧワクチン接種とともに使用することによる結核の治療が存在するが、いくつかの欠点、特にこのような薬物の副作用、治療の遷延性の接種／持続時間の必要性について認められる。他に観察される問題は、治療後にもいくらかのマイコバクテリウム（Mycobacterium)が対象中に存在し続けることである。このため、投与量又は接種期間を減少するか、あるいは当該薬物の耐性の問題が取り除かれるような、前記種類の薬物に代わるものを製造する必要がある。
【０００４】
引用文献は、AstraZeneca press (2005)によりBioSpaceにおいて出版されたRaritan, N. J.の "Novel Antibiotic shows promise in shortening treatment duration of Tuberculosis"と題される化学文献において公表され、世界保健機関により現在推奨されている３種混合療法よりも単独及び組み合わせにおいて優れ、かつ有望な薬剤として、ジアリールキノリン（ＤＡＲＱ）と称される抗ＴＢ剤の新規なファミリーに属する化合物を記載している。ＤＡＲＱを含有するする混合療法は、現在使用されている治療よりも半分の時間でマウスにおける感染を除去した。更に、新規の抗ＴＢ薬物は過去４０年間臨床に持ち込まれておらず、医師が効果のある第一選択治療薬を持っていても、これらを必要とする患者に届けたり、医薬品耐性のある患者を効果的に治療することには困難があることも述べている。しかしながら、当該薬物をマウスにおいて試験し、そして当該化合物の臨床的可能性を完全に決定するためにかなりの実験を行う必要がある。
【０００５】
同様の引用例は、TB Control- The Government & The Private Sector AllianceにおけるSubhas, Ch. Chakraborttiにより編集されたＴＢに関するJournal of Indian Medical Association, vol. 101.No.03 (March 2003)においても発行されており、その優れた有用性がRNTCPのインドの政策の政府機関における他のＭＤＲ療法における現存するＴＢ薬治療及び研究の他の治療に関連する。インドでは毎年２００万の新規な症例が登録され、５００００人が死亡している。
【０００６】
また、引用例は、Jan Koci et. alによりBioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12 (2002) 3275: 27において"Heterocyclic Benzazole Derivatives with Antimycobacterial In Vitro Activity"と題された論文において公表され、合成され且つヒト結核菌及び非結核菌に対するこれらの試験管内における抗ミコバクテリア活性が評価されたベンゾキサゾール及びベンゾチアゾールの２−ベンジルスルファニル誘導体類、並びにｍｍｏｌ／Ｌにおける最小阻止濃度（ＭＩＣ）として表現された活性が記載されている。２つのニトロ基を有する物質（４ｅ，４ｆ，５ｅ，５ｆ）、又はチオアミド基を有する物質（４ｉ，４ｊ，５ｉ，５ｊ）は非結核株に対して特に明らかな活性を示している。しかしながらほとんどの活性化合物は毒性試験にかけたところ中程度の細胞毒性を有するものと評価された。
【０００７】
また、引用例は、Sandra M. Newton et. alによりJournal of Ethnopharmacology 79, 57-67 (2002)において"The evaluation of forty-three plant species for in vitro antimycobacterial activities; isolation of active constituents from Psoralea corylifolia and Sanguinaria canadensis"と題された論文において公表され、４３種の植物由来の抽出物がＴＢ及び／又はライ病の治療に報告されている伝統的な使用として選択されたことを記載する。これらは抗ミコバクテリア活性が評価された。２種のミコバクテリアのモデル種、Ｍ．オーラム（M. aurum）及びＭ．スメグマチス（M. smegmatis）を使用して、簡単な試験管内スクリーニングアッセイが利用された。Ｃ．ムクル（C. mukul）, Ｐ．コリリホリア（P. corylifolia） 及び Ｓ．カナデンシス（S. canadensis）の３種の植物由来の粗メタノール性抽出物は、Ｍ．オーラム（M. aurum）に対してのみ有意な抗ミコバクテリア活性を有することが判明した（ＭＩＣ＝６２．５μｇ／ｍｌ）。バイオアッセイ画分は、Ｓ．カナデンシス（S. canadensis）の根から２つの既知なベンゾフェナントリジンアルカロイドのサンギナリン（１）とケレリスリン（２）、及び, Ｐ．コリリホリア（P. corylifolia）の種子から既知のフェノール性メロテルペンのバクチオール（３）の単離に導いた。Ｃ．ムクル（C. mukul）の樹脂の画分は、抗ミコバクテリア活性の低下に導き、そしてこれにより更なる研究は探求されていない。化合物（２）はＭ．オーラム（M. aurum）及びＭ．スメグマチス（M. smegmatis）に最も活性であった（それぞれ、ＩＣ５０＝７．３０ｐｇ／ｍｌ［１９．０２μＭ］及び２９．０μｇ／ｍｌ［７５．５６μＭ］）。３種の全ての化合物に対してＭ．オーラム（M. aurum）は最も感受性の高い生物であった。異なるｐＨ値の培地において２つのアルカロイドの活性を試験した場合、抗ミコバクテリア活性における有意な違いは観察されなかった。Ｍ．オーラム（M. aurum）に対する純粋化合物の活性は、最も活性な化合物（２）によるＢＣＧであるM. bo_に対するものに匹敵した（M.bo_はＢＣＧであり、ＩＣ５０＝１４．３ｐｇ／ｍＬ［３７．３μＭ］）。これらの結果は、伝統的医薬におけるこれらの植物の使用を裏付けた。当該発明の欠点は、活性の更なる確認が生体内実験により行われていないことである。
【０００８】
また、引用例は、Usha K. et alによりJournal of Medicinal and Aromatic plant Sciences,22/ 4A-23/ lA, 182-184 (英語)(2001)における"Antitubercular potential of selected plant materials"と題された論文において公表され、これは、ニーム、ツゥルシ（tulsi)、ニンニク、ショウガ、及びアドゥルサ等の植物の抗結核能を記載し、これらは痰に添加された１００ｍＬの水性ピューレ（５０％ｗ／ｖ）の植物材料を使用する試験管内培養、続いてＬＪ培地に播種することにより試験された。全ての植物抽出物は、結核菌の成長を抑制し、これは酵素性及び非酵素性の抗酸化物、例えば、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、全カロテン、アスコルビン酸、トコフェロール、及びポリフェノールに基づき、従ってＲＯＳ(活性酸素種)による組織の損傷を防ぐ。適用に必要な多量の頓服にも関わらず、阻害の程度及び頓服のＭＩＣは不明確である。
【０００９】
また、引用例は、N. Lall et alによりJournal of Ethno pharmacology, 66, 347-354 (1999)における"In vitro inhibition of drug- resistant and drug-sensitive strains of Mycobacteriu. tuberculosis by ethno-botanically selected South African plants"と題された論文において公表され、寒天板法(Middlebrook and Cohn, 1958)による結核菌の薬剤感受性株であるＨ３７Ｒｖに対する２０種の南アフリカの薬用植物の抽出物の予備的なスクリーニングを記載する。当該著者は、２０種中１４種のアセトン抽出物が５００μｇ／ｍＬの濃度において抑制活性を示し、他方で植物種、クリプトカリヤ・ラチホリア（Cryptocarya latifolia）、エウクレア・ナタレンシス（Euclea natalensis）、ヘリクリズム・メラナクメ（Helichrysum melanacme）、ニドレラ・アノマラ（Nidorella anomala）、及びチムス・ブルガリス（Thymus vulgaris）のアセトン及び水抽出物が放射測定法によりＨ３７Ｒｖ株に対して１００μｇ／ｍＬのＭＩＣを示すと推定する。
【００１０】
また、引用例は、Cantrell, Charles L. et alによりJournal of Planta Medica, 67 (8), (英語)(2001)における"Antimycobacterial plant terpenoids"と題される総論において公表され、これは、試験管内バイオアッセイにおいて結核菌（M. tuberculosis）に対して中〜高活性を示した植物由来テルペノイドにおける最近の報告を網羅している。当該総論において、モノ−、セスキ−、ジ−、及びトリテルペン及びステロール、これらの構造類似体、並びに半合成誘導体は、抗ミコバクテリア活性に必須の構造特性に特に重点をおいて議論された。
【００１１】
引用例は、Ma, Junrui により２０００年９月６日のＣＮ１２６５３１５Ａ，４頁 "Compositions containing herbal medicine for pulmonary tuberculosis" (中国語)(2001)と題された特許において公表され、これは、タラクトゲノス（Taraktogenos）、 オウレン、ステモナ（Stemona）、冬虫夏草、タツネミソウ属、スイカズラ、 レンギョウ属、ヘルバ・ビオラエ（Herba violae）、ハナスゲ属、タンジン、フルクタス・ヌメ（Fructus mume）、イチョウ属、アナカムプティス・ピオアミダリス・リチャード（Anacamptis pyoamidalis Richard）、ポリゴナツム（Polygonatum）、グリキリザ属（Glycyrrhiza）、ツルドクダミ、ブルネラ・ブルガリス（Brunella vulgaris）、ノアザミ、コノテガシワの葉、スグイソルバ・オフィシナリス（Sguisorba officinalis）、ヘラクレウム（Heracleum）、通常のアンドログラフィス属（Andrographis）、ホウツイニア属（Houttuynia）、ヘルバ・アルテミシアエ（herba artemisiae）、及びモグノリア・オフィシナリス（Magnolia officinalis）から成る肺結核を治療するための異なる形態の組成物（エアロゾル、吸入薬、錠剤、カプセル、粉末、経口濃縮物、及び液体）を包含する。しかしながら、これらの欠点は、結核菌に対する植物の積極的な利益を解明する目的のための複数の薬草の使用であって、個々の薬草又は集団的な組み合わせのいずれかのＭＩＣレベルには言及されていないことであるである。
【００１２】
引用例は、F. Salie, PFK Eagles と HMJ Leng によりJournal of Ethanopharmacology 52(1996), 27-33 pp における"Preliminary antimicrobial screening four South African asteraceae species" において公表され、ここで当該著者はウエスタン・ケープ（南アフリカのケープ・フローラル・キングダムの一部）の植物相を調査した。著者は、多様な程度のマイコバクテリウム・スメグマティスに選択的な抗菌活性を示す４種のキク科種（アルクトピス・アウリクランタ（Arctopis auriculanta）、エリオセファルス・アフリカヌス（Eriocephalus africanus L.）、フリシア・エリゲロイデス（Felicia erigeroides）DC、及びヘリクリズム・クリスプム（Helichrysum crispum）(L. ) D. Don.)に言及する。アルクトピス・アウリクランタの葉において８５００μｇ/ｍＬのＭＩＣを確認した。当該発明の欠点は非常に高いＭＩＣ値である。
【００１３】
また、引用例は、サリコルニア植物におけるインターネット・ウェブサイトのbenefits@coqui.netにおいて開示され、ここで食用油源としてのサリコルニア植物の使用、及び豆炭燃料としての所望の粉砕した茎の使用、又はパーティクルボードが報告されている。しかしながら当該植物のいずれの生理活性も言及されていない。
【００１４】
また引用例は、P. K.Ghosh et. alにより２００２年３月２６日の米国特許第１０１０６３３４号において開示され、塩生植物を使用する種子の除去後の残留乾燥物質由来の植物塩調製物が植物に由来する値を最大となるように記載されている。しかしながら、当該出願は薬剤／医薬目的の当該植物のいずれの利用も供していない。
【００１５】
引用例は、Wealth of India, vol. IX RH-SO, Raw Material Page No. 169 において開示され、これはインドの多様な生物源を記載し、その出願にはサリコルニア・リン、及び飼料としての種の使用に基づくその分類が挙げられている。当該植物はまたHooker(1889)によるインドの植物相中に挙げられる。しかしながら両文献においてサリコルニアに関するいずれの種類の生理活性も言及されていない。これは一年生又は多年生無葉の果肉質の薬草又は低木の小属であり、アジア、アフリカ、ヨーロッパ、及び北アメリカの塩湿地に原生する。一種のみインドに原生する。D.E.P.VI (2), 387:1, 399:IT, 60, Fl. Br. Ind., V.12: Kirt. and Basu, P1. 800. これはインドの多くの地域においてGujarati: - Muchul, Telugu :- Kagalu, Tamil & Malayalam : Umari Keeraiとして異なる名称で知られている。
【００１６】
これは、３０〜４５ｃｍの節跡を伴う多様性の多くの枝がある草本である。ベンガルからグジャラートの海岸に沿った塩湿地に多く見つかる。枝はやや細長く、節は６〜１２ｍｍ以下であり、花は節のくぼみに沈んでおり、各側に３つあり、膜型果実である。
【００１７】
前記植物は、炭酸ナトリウムを抽出するために使用されるアルカリ、土、又はサジ（saji）の源である。サジ又はバリラ（barilla)と呼ばれる植物の灰は、以前はセッケン及びガラス製造において使用されていた。空気乾燥させた植物は６．９８％のタンパク質（Ｎ×６．２５）、及び８．９７％の灰を含む。これは、全水溶解性塩の８６％のＣを構成する高いパーセンテージの塩化ナトリウムイオンを含む。水抽出性ミネラルは、Ｃｌ＝１０．０２ｍ、Ｎａ＝５．６、Ｓ＝０．７０、Ｐ＝１．１３、Ｃ＝０．７２、Ｃａ＝０．０１、Ｍｇ＝０．０２％である(Parekh and Rao. curr. Sci. 1965,34; 247)。当該植物は、強塩性であり、低く若い苗条は採取後食べられる。苗条はしばしばポット−ハーブとして使用される。当該植物はラクダの飼料としても使用される(Mc canr, J. Bombay nat. Hist. Soc, . 1951-52.50, 870）。灰は疥癬及びかゆみに使用され、通経薬及び堕胎薬としても考慮される(Kirt. & Basu, III 2082)。
【００１８】
引用例は、Rathod et alにより２００４年４月２２日の米国特許第１０／８２９，４００号、及び２００３年８月２９日のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＩＮ０３／００２９２号において開示され、グジャラート海岸に生育するサリコルニア・ブラキアタの結核菌に対する活性が開示されている。当該出願の主な欠点は、ＨＰＬＣ画分があまりに複雑であり、活性画分において成分の特性の手がかりをほとんど供さないことである。更に、試験管内研究における最大阻害は、投与量を６．２５μｇ／ｍＬとした場合、僅か７５％であった。
【発明の開示】
【００１９】
発明の目的
本発明の主な目的はサリコルニア属からの生理活性画分を供することである。
【００２０】
本発明の他の目的は、継続している２００４年４月２２日の米国特許出願第１０／８２９，４００号、及び２００３年８月２９日のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＩＮ０３／００２９２号における出願により以前に開示されているサリコルニア・ブラキアタの根抽出物のＦ２画分における抗ＴＢ活性源を特定することである。
【００２１】
更なる目的は、分取用（Semi-preparative)ＨＰＬＣを介する分離の先行技術に報告される活性画分における多様なピークを決定するためにクロマトグラフィーの分離条件を改善することである。
【００２２】
他の目的は、これらの活性を伴う活性画分から得られた異なる細画分を関連付けることである。
【００２３】
他の目的は、感染したマウスに対する試験管内及び生体内の両方において結核に対して最も活性な細画分の有効性を示すことである。
【００２４】
他の目的は、最も活性な細画分のＭＩＣが３．１２５μｇ／ｍＬ以下であることを示すことである。
【００２５】
他の目的は、５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において活性細画分を経口的に投与された感染マウスの亢進された生存期間を示すことである。
【００２６】
他の目的は、最も活性な細画分が、ＶＥＲＯ株化細胞を使用する細胞毒性実験において観察可能な毒性を有さないことを示すことである。
【００２７】
他の目的は、活性画分を投与された健康なマウスが健康を維持し、そして体重を増やすことを示し、これにより活性細画分の無毒性を示すことである。
【００２８】
他の目的は活性細画分の成分を特徴付けることである。
【００２９】
他の目的は、ショ糖が細画分の主要成分であり、更に当該ショ糖と共溶出する微量成分が存在することを示すことである。
【００３０】
他の目的は、ショ糖単独では抗ＴＢ活性を有さず、そして活性が単独で又は他の微量成分及び／又は主要な成分との組み合わせにおいて作用する微量成分中に存在することを示すことである。
【００３１】
他の目的は、結核の可能な治療として最も活性な細画分を利用し、あるいは更なる精製を介してより更に活性を亢進することである。
【００３２】
他の目的は、これらの抗ＴＢ活性のための微量成分を分離し、そして個別に研究することである。
【００３３】
発明の概要
従って、本発明はサリコルニア属の抽出物由来の生理活性画分を供する。
【００３４】
本発明はまた、係属している２００４年４月２２日の米国特許出願第１０／８２９，４００号、及び２００３年８月２９日のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＩＮ０３／００２９２号において開示される成熟したサリコルニア・ブラキアタの根から得られたクロロホルム−メタノール（１：１）画分の抗結核活性の亢進方法を供する。
サリコルニア属がサリコルニア・ブラキアタを含んで成る生理活性画分。
サリコルニア・ブラキアタが十分に成熟した植物である生理活性画分。
抽出物が、根、根茎、穂、穀皮、及び種子以外の全植物から成る群から選択されるサリコルニア植物の部分由来の抽出物を含んで成る生理活性画分。
生理活性画分が、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、及びＦ５を含んで成る、生理活性画分。
生理活性画分Ｆ２が、更に細画分ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７を含んで成る、生理活性画分。
ＳＦ３−ＫがＳＦ３の細画分である生理活性画分。
ＳＦ３−Ｋが５０℃以下の範囲の温度において４時間も安定である生理活性画分。
ＳＦ３−Ｋの主要成分が、ＲＩ検出を伴うＨＰＬＣに基づき７０〜８０％程度のショ糖を含んで成る、生理活性画分。
前記生理活性画分が抗結核活性を有する生理活性画分。
生理活性画分が抗結核剤として有用である生理活性画分。
【００３５】
本発明のある態様において、ＯＡＤＣを含む７Ｈ１０ミドルブルック培地中の結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して試験した場合、本発明の抗結核画分（以下ＳＦ３−Ｋという）のＭＩＣ値は３．１２５μｇ／ｍＬ以下である。
【００３６】
他の態様において、ＢＡＣＴＥＣ法により試験管内において評価される場合、ＳＦ３−Ｋは、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの投与量において結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して完全な阻害を示し、そして更に成長指数の用量依存性を示す。
【００３７】
他の態様において、ＳＦ３−Ｋは１００μｇ／ｍＬ以下の投与量としてＶＥＲＯ株化細胞で行われた試験においても細胞毒性を示さない。即ち、請求項１に記載の方法により評価されるＳＦ３−ＫのＭＩＣ値の１０倍以上である。
【００３８】
他の態様において、ＳＦ３−Ｋはまた生体内においても活性であり、そして５０ｍｇ／ｋｇ体重のＳＦ３−Ｋの用量を感染後１２日間経口的に投与した場合、感染したマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）を５日間増加させる。
【００３９】
他の態様において、健康なマウスに対して０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において経口的にＳＦ３−Ｋを投与した場合、ＳＦ３−Ｋは無毒性を示す。
【００４０】
他の態様において、ＳＦ３−Ｋは、主にショ糖から成り［ＨＰＬＣ−ＲＩ検出器に基づき７５〜８０％］、平衡は１１３、１１５、分子量１１７を有する微量な成分である。他の成分は１４３［１４２＋Ｈ+］のｍ／ｚを有する。
【００４１】
本発明の他の態様において、ＳＦ３−Ｋの抗結核活性はたった２０〜２５重量％の画分に相等する画分の微量な成分において存在することが示される。
【００４２】
従って、本発明は、以下の工程を含んで成るサリコルニア属の抽出物耀来の生理活性画分の調製方法を供する：
（ｉ）２００４年４月２２日の米国特許第１０／８２９，４００号、及び２００３年８月２９日のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＩＮ０３／００２９２号において請求されたサリコルニア・ブラキアタ由来のＦ２画分を供する工程；
（ii）ＲＰ−１８カラム(Phenomenex)、及び７ｍＬ／分における３：９７：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ移動相を使用して、Ｆ２生理活性画分を分取用（Semi-preparative)ＨＰＬＣにおいて細分画にかける工程；
（iii ）本願に供される分取用（Semi-preparative)ＨＰＬＣプロファイルにおいて０〜２２分の間の７つの細画分ＳＦ１、ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７を回収する工程；
（iv）工程（iii ）において得られた細画分を抗結核スクリーニングにかける工程；
（ｖ）細画分の活性、及び得られた物質の量の面から最も適当なものとして細画分ＳＦ３を同定する工程；
（vi）工程（ｖ）において得られた細画分を濃縮し、そして同じ分取用カラム（流速が６〜７ｍＬ／分に変更したことを除き全て同じ条件である）において、分取用カラムにおいて６ｍＬ／分の流速で１１．８９分の保持時間、及び分析用カラムにおいて１ｍＬ／分の流速で２．９５分の保持時間を有するピークの純度を亢進するために再度クロマトグラフィーにかける工程；
（vii ）工程（vi）において得られた画分を濃縮し、そしてＳＦ３−Ｋを得るために凍結乾燥にかける工程。
【００４３】
本発明の他の態様において、乾燥した根から０．６〜０．９％の範囲の収率において固体のＳＦ３−Ｋを得るために、工程（vi）において得られた画分が凍結乾燥にかけられる。
【００４４】
本発明の他の態様において、クロロホルム−メタノール画分の逆相クロマトグラフィー分離は、画分を７つの異なる部分（細画分）への細分画、及び得られた物質の抗結核活性及び量の面から最も所望される１つの細画分（ＳＦ３）の同定を可能にするために、移動相をアセトニトリル：水：：３：９７に変更することにより、係属している特許出願において報告されているものに対して改善されている。
【００４５】
他の態様において、ＳＦ３を再度クロマトグラフにかけ、そして分析用逆相カラムにおいて明らかな単一のピークとしてＳＦ３−Ｋを得るために更に精製した。
【００４６】
本発明の更に他の態様において、ＳＦ３−Ｋは４５〜５５℃の温度範囲においてロータリー・エバポレーターで濃縮した。
【００４７】
本発明の更に他の態様において、濃縮された抽出物は−５０〜−６０℃の温度範囲において８〜１６時間凍結乾燥することができる。
【００４８】
本発明の更に他の態様において、ＳＦ３−Ｋを暑い日中に４時間暴露し、そして安定であることがわかった。
【００４９】
本発明の更に他の態様において、Waters・アミノカラムにおいてＳＦ３−Ｋをクロマトグラフィーにかけ、そして８０：２０：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏで溶出し、ＳＦ３−Ｋの多様な成分が分離され、そして質量分光法に基づき、これらの分子量が１１３、３４２（ショ糖）、１１５、及び１１７であることが測定された。また、１４３のｍ／ｚを有する微量な成分が長い保持時間において観察された。
【００５０】
ＳＦ３−Ｋの成分の特徴付けのための本発明の態様において、ＳＦ３−Ｋの成分は、これを８０：２０：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏを使用してWaters・アミノカラムにおける液体クロマトグラフィーにかけることにより分離され、そして微量及び主要成分の両方をＵＶ（２１０ｎｍ）及びＲＩ検出器でモニタリングし、そしてＬＳ−ＭＳを使用して当該成分を分析した。
【００５１】
生理活性画分は抗結核剤として有用なサリコルニア属の抽出物から得られた。
【００５２】
本発明の態様において、サリコルニア属はサリコルニア・ブラキアタを含んで成る。
【００５３】
本発明の態様において、サリコルニア・ブラキアタは十分に成熟した植物である。
【００５４】
本発明の他の態様において、生理活性抽出物は、根、根茎、穂、穀皮、及び種子以外の全植物から成る群から選択されるサリコルニア植物の部分由来の抽出物を含んで成る。
【００５５】
本発明の更に他の態様において、生理活性画分はＦ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、及びＦ５を含んで成る。
【００５６】
本発明の更に他の態様において、画分Ｆ２は、更に細画分ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７を含んで成る。
【００５７】
本発明の態様において、細画分ＳＦ３は更にＳＦ３Ｋに分画される。
【００５８】
本発明の更に他の態様において、ＳＦ３Ｋの主要な成分は、ＲＩ検出を伴うＨＰＬＣに基づき７０〜８０％程度のショ糖を含んで成る。
【００５９】
本発明のある態様において、前記生理活性画分は抗結核活性を有する。
【００６０】
本発明のある態様において、ＯＡＤＣ（Ｂ−Ｄ、ＵＳＡ）を含有する７Ｈ１０ミドルブルック培地中の結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して試験した場合、ＳＦ３Ｋ画分は３．１２５μｇ／ｍＬ以下のＭＩＣ値を示す。
【００６１】
本発明の態様において、ＢＡＣＴＥＣ法により試験管内において評価される場合、ＳＦ３Ｋ画分は、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの投与量において結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して完全な阻害を示し、そして更に成長指数の用量依存性を示す。
【００６２】
本発明の態様において、生理活性画分はまた生体内においても活性であり、そして５０ｍｇ／ｋｇ体重のＳＦ３−Ｋの用量を感染後１２日間経口的に投与した場合、感染したマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）を５日間増加させる。
【００６３】
本発明の態様において、当該画分は、１００μｇ／ｍＬ以下の投与量のＶＥＲＯ株化細胞で行われた試験においても、細胞毒性を示さない。即ち、ＳＦ３−ＫのＭＩＣ値の１０倍以上である。
【００６４】
本発明の態様において、画分は、０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において経口的にＳＦ３−Ｋを投与された健康なマウスに対して無毒性を示す。
【００６５】
本発明の態様において、主要な成分であるショ糖は、１００μｇ／ｍＬの投与量であっても純粋なショ糖としていずれの活性も有さない。
【００６６】
本発明の態様において、最も顕著な微量成分は、分子量１１７の成分に相等する１１８［１１７＋Ｈ］+、及び１４０［１１７＋Ｎａ+］のｍ／ｚ値を示す。
【００６７】
本発明の態様において、分子量１１７を有する微量成分は５８及び５９のｍ／ｚ値に対応する娘ピークを示し、一方ナトリウム塩の形態において、娘フラグメントは９６、８１、５３、及び２３のｍ／ｚ値を伴うことが解る。
【００６８】
本発明の態様において、分子量１１７を有する成分は、質量分光法の条件下においてセルフクラスターを形成し、そしてまた主要成分（ショ糖）ともクラスターを形成する。
【００６９】
本発明の態様において、他の微量成分は、１１３、１１５、及び１４２の分子量で観察される。
【００７０】
本発明の態様において、細画分の、ＳＦ１、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７はまた、１００〜１２．５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明し、そしてＳＦ２及びＳＦ４は、１００〜２５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明した。
【００７１】
本発明の態様において、結核の治療方法は、これらに苦しむ対象に対して、サリコルニア属から得られた医薬的有効量の抗結核画分を、任意的に、合成又は天然のいずれかの他の抗結核薬、及び医薬的に許容される添加物又は担体とともに投与することを含んで成る。
【００７２】
本発明の態様において、前記方法は、対象に対してサリコルニアの生理活性画分又は粗抽出物のいずれかを投与することを含んで成る。
【００７３】
本発明の態様において、サリコルニア属はサリコルニア・ブラキアタを含んで成る。
【００７４】
本発明の態様の１つにおいて、サリコルニア・ブラキアタは完全な成熟した植物である。
【００７５】
本発明の態様において、前記画分は、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、及びＦ５を含んで成る。
【００７６】
本発明の態様において、画分Ｆ２は、ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７に分画される。
【００７７】
本発明の態様において、細画分ＳＦ３は更にＳＦ３Ｋに分画される。
【００７８】
本発明の態様において、ＳＦ３の主要成分はＲＩ検出を伴うＨＰＬＣに基づき７５〜８０％の範囲のショ糖を含んで成る。
【００７９】
本発明のある態様において、前記生理活性画分は抗結核活性を有する。
【００８０】
本発明のある態様において、ＯＡＤＣ（Ｂ−Ｄ、ＵＳＡ）を含有する７Ｈ１０ミドルブルック培地中の結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して試験した場合、ＳＦ３Ｋ画分は３．１２５μｇ／ｍＬ以下のＭＩＣ値を示す。
【００８１】
本発明の態様において、ＢＡＣＴＥＣ法により試験管内において評価される場合、ＳＦ３Ｋ画分は、５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの投与量において結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して完全な阻害を示し、そして更に成長指数の用量依存性を示す。
【００８２】
本発明の態様において、生理活性画分はまた、生体内においても活性であり、そして５０ｍｇ／ｋｇ体重のＳＦ３−Ｋの用量を感染後１２日間経口的に投与した場合、感染したマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）を５日間増加させる。ここで当該画分は、０〜１００μｇ／ｍＬの投与量におけるＶＥＲＯ株化細胞で行われた試験において、当該画分は細胞毒性を示さない。即ち、ＳＦ３−ＫのＭＩＣ値の１０倍以上である。
【００８３】
本発明の態様において、健康なマウスに対してＳＦ３−Ｋを０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において経口的に投与した場合、当該画分は無毒性を示す。
【００８４】
本発明の態様において、主要な成分であるショ糖は、１００μｇ／ｍＬの投与量としても純粋なショ糖としていずれの活性も有さない。
【００８５】
本発明の態様において、最も顕著な微量成分は、分子量１１７の成分に相等する１１８［１１７＋Ｈ］+、及び１４０［１１７＋Ｎａ+］のｍ／ｚ値を示す。
【００８６】
本発明の態様において、分子量１１７を有する微量成分は５８及び５９のｍ／ｚ値に対応する娘ピークを示し、一方ナトリウム塩の形態において、娘フラグメントは９６、８１、５３、及び２３のｍ／ｚ値を伴うことが解る。
【００８７】
本発明の態様において、分子量１１７を有する成分は、質量分光法の条件下においてセルフクラスターを形成し、そしてまた主要成分（ショ糖）ともクラスターを形成する。
【００８８】
本発明の態様において、他の微量成分は、１１３、１１５、及び１４２の分子量で観察される。
【００８９】
本発明の態様において、前記画分は、錠剤、ロゼンジ、カプセル、粉末、溶液から選択される形態において、静脈内及び経口的に投与される。
【００９０】
サリコルニア属の抽出物から単離された生理活性画分を、任意的に、いずれかの他の合成又は天然の抗結核薬、及び医薬的に許容される添加物又は担体とともに含んで成る医薬組成物。
【００９１】
本発明の態様において、サリコルニア属はサリコルニア・ブラキアタを含んで成る。
【００９２】
本発明の態様において、サリコルニア・ブラキアタは完全な成熟した植物である。
【００９３】
本発明の態様において、生理活性抽出物は、根、根茎、穂、穀皮、及び種子以外の全植物から成る群から選択されるサリコルニア植物の部分由来の抽出物を含んで成る。
【００９４】
本発明の態様において、前記画分は、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３、Ｆ４、及びＦ５を含んで成る。
【００９５】
本発明の態様において、画分Ｆ２は更に、細画分ＳＦ１、ＳＦ２、ＳＦ３、ＳＦ４、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７を含んで成る。
【００９６】
本発明の態様において、細画分ＳＦ３は更に、ＳＦ３Ｋに分画される。
【００９７】
本発明の態様において、ＳＦ３の主要成分は、ＲＩ検出を伴うＨＰＬＣに基づき７５〜８０％の範囲のショ糖を含んで成る。
【００９８】
本発明の態様において、前記生理活性画分は抗結核活性を有する。
【００９９】
本発明の態様において、ＯＡＤＣ（Ｂ−Ｄ、ＵＳＡ）を含有する７Ｈ１０ミドルブルック培地中の結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して試験した場合、ＳＦ３Ｋ画分は３．１２５μｇ／ｍＬ以下のＭＩＣ値を示す。
【０１００】
本発明の態様において、ＢＡＣＴＥＣ法により試験管内において評価される場合、ＳＦ３Ｋ画分は５０μｇ／ｍＬ及び１００μｇ／ｍＬの投与量において結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して完全な阻害を示し、そして更に成長指数の用量依存性を示す。
【０１０１】
本発明の態様において、生理活性画分はまた生体内においても活性であり、そして５０ｍｇ／ｋｇ体重のＳＦ３−Ｋの用量を感染後１２日間経口的に投与した場合、感染したマウスの平均生存期間（ＭＳＴ）を５日間増加させる。
【０１０２】
本発明の態様において、１００μｇ／ｍＬ以下の投与量においてＶＥＲＯ株化細胞で行われた試験において、細胞毒性を示さない。即ち、ＳＦ３−ＫのＭＩＣ値の１０倍以上である。
【０１０３】
本発明の態様において、０〜５０ｍｇ／ｋｇ体重の投与量において経口的にＳＦ３−Ｋを投与された健康なマウスに対して無毒性を示す。
【０１０４】
本発明の態様において、主要な成分であるショ糖は、５０〜１００μｇ／ｍＬの投与量であるとしても純粋なショ糖としていずれの活性も有しない。
【０１０５】
本発明の態様において、最も顕著な微量成分は、分子量１１７の成分に相等する１１８［１１７＋Ｈ］+、及び１４０［１１７＋Ｎａ+］のｍ／ｚ値を示す。
【０１０６】
本発明の態様において、分子量１１７を有する微量成分は５８及び５９のｍ／ｚ値に対応する娘ピークを示し、一方ナトリウム塩の形態において、娘フラグメントは９６、８１、５３、及び２３のｍ／ｚ値を伴うことが解る。
【０１０７】
本発明の態様において、分子量１１７を有する成分は、質量分光法の条件下においてセルフクラスターを形成し、そしてまた主要成分（ショ糖）ともクラスターを形成する。
【０１０８】
本発明の態様において、他の微量成分は、１１３、１１５、及び１４２の分子量で観察される。
【０１０９】
本発明の態様において、細画分のＳＦ１、ＳＦ５、ＳＦ６、及びＳＦ７はまた１００〜１２．５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明し、そしてＳＦ２及びＳＦ４は１００〜２５μｇ／ｍＬにおいて抗結核活性を有することが判明した。
【０１１０】
本発明の態様において、前記組成物は、錠剤、ロゼンジ、カプセル、粉末、及び溶液から成る群から選択される形態である。
【０１１１】
発明の詳細な説明
本発明は、抗結核活性を有しうる生理活性画分又はその粗抽出物を得るためのサリコルニア属の分析及び研究に関する。
【０１１２】
サリコルニア属において、サリコルニア・ブラキアタはインドに原生する種であり、インドの西海岸の沿岸の泥地に多く生育し、そしてまた西／南海岸においても報告されている。サリコルニアの他の種は、サリコルニア・ビゲロビ（Salicornia bigelovi）、サリコルニア・デプレッサ（Salicornia depressa）、及びサリコルニア・マリチマ（Salicornia maritima）（米国の北西に生育する）、サリコルニア・ヘルベセア（Salicornia herbecea）、サリコルニア・フルイチコサ（Salicornia fruiticosa）、及びサリコルニア・ヨーロパエア（Salicornia europaea）（欧州諸国に生育する）であり、同様の活性を有する。サリコルニア・ブラキアタ由来又は他のサリコルニア属由来の化合物が抗結核活性を有するということは、世界において全く報告されていない。アカザ科に属するサリコルニア・ブラキアタは完全な成熟期において確認され、そして採取された。サリコルニア属はアジア／アフリカ、ヨーロッパ、及び北アメリカの塩湿地において生育している。
【０１１３】
従って、本発明は、サリコルニア属の粗抽出物由来の新規な生理活性画分を供する。また、本発明は、また、抗結核活性を伴うサリコルニア属の植物抽出物の調製方法であって、完全な成熟期における植物を採取し、水道水、次に脱イオン水を使用して当該植物を洗浄し、全ての外来物質を除去し、分離し、そして所望の部分を得るために植物材料を処理し、乾燥させ、適当なメッシュサイズに切断及び微粉砕し、溶媒中に浸漬させ、そして全ての溶解性物質を抽出し、慣習的な技術により抽出物を濃縮し、固形残渣を得るために濃縮した抽出物を凍結乾燥させ、当該抽出物をブタノール、クロロホルム、メタノール、及び水を単独又は組み合わせにおいて使用して５つの画分に分画し、試験管内及び生態内において特に結核菌Ｈ３７Ｒｖに対する抗結核活性のために粗抽出物及び画分を試験し、そしてフィンガープリントとして利用するために当該画分のＨＰＬＣプロファイルを記録すること、を含んで成る方法に関する。
【０１１４】
前記植物材料は、好ましくは洗浄され、そして含水量が０．５〜１．５％の範囲になるまで２０〜３５℃の温度範囲において乾燥させる。浸漬する前に、植物材料は、好ましくは微粉砕され、そして１６〜２０メッシュサイズの範囲において篩にかけた物質を更なる処理のために選択することができる。当該抽出物及び画分は、抗結核活性のために試験管内と生体内の両方において試験した。
【０１１５】
当該植物分類は、一年生で直立性の分枝した薬草であり、高さは３０〜４０ｃｍである。これは多肉性で節のある茎、対生の枝、及び短い茎節間を有する。葉は、芽鱗に縮小し、未発達の薄膜及び鋭い先端を伴う短い葉鞘を形成する。
【０１１６】
花は三重であり、枝の上部とともに空洞（cavities)中に包埋される。種穂は３つの花を含む集散花序から成る。集散花序中の中央の花は外側の２つよりも明らかに高く、三角形を生じる。雄しべは１つ又は２つであり、花柱は明瞭であり、柱頭は錘状であり、両側の胚芽は下向きである。種子は垂直であり、圧縮しており、膜状であり、そして無胚乳である。
【０１１７】
本発明の方法は以下を含んで成る：
１．  十分な成熟期におけるサリコルニア・ブラキアタ植物材料を採取する工程。
２．  ２５〜３７℃の周囲温度において植物材料を洗浄及び乾燥させ、一方水分を０．１〜１．５％の範囲に維持する工程。
３．  微粉砕することにより植物材料の大きさを縮小させ、そして１６〜２０メッシュ篩のサイズ範囲において材料を選択する工程。
４．  当該植物材料を脱イオン水中に浸漬させ、そして８０〜９０℃に加熱し、そして新鮮な脱イオン水で浸漬工程を２４時間の間隔において５回繰り返す工程。
５．  慣習的／生薬濃縮技術により抽出物を濃縮する工程。
６．  １８〜２０％の収率の粗生成物を回収するために、濃縮した抽出物を−５０〜−６０℃の温度範囲において８〜１６時間凍結乾燥させる工程。
７．  当該抽出物を５つの画分、ブタノール中のＦ１（５〜１５％の収率）、５０％メタノール−クロロホルム中のＦ２（１３〜３０％の収率）、メタノール中のＦ３（３４〜５１％の収率）、５０％メタノール−水中のＦ４（９〜１５％の収率）、水中のＦ５（３〜９％の収率）に分画する工程。
８．  抗結核活性のために試験管内及び生体内において前記５つの画分を試験する工程。
９．  前記活性画分の１つのＦ２を、分取用（Semi-preparative)ＨＰＬＣシステムにおいて７つの細画分に細分画し、そして７つの再画分の全てを試験管内において抗結核活性のために試験する工程。
１０．  活性細画分の主要な成分であるＳＦ３を分取用（Semi-preparative)ＨＰＬＣシステムにおいて精製し、そして精製した細画分ＳＦ３−Ｋを試験管内及び続いて試験管内における抗結核活性のために試験する工程。
１１．  化合物を同定するための多様なスペクトル分析を使用して精製した細画分ＳＦ３−Ｋを特徴付ける工程。
【０１１８】
本発明に従い、前記植物を分類学的に同定し、そして完全な成熟期において必要な材料が採取した。泥、粉塵粒子、及び外来物質を除去するために当該物質を脱イオン水により徹底的に洗浄した。洗浄した植物材料を日陰において室温で３〜４週間乾燥させた。当該植物を微粉砕し、そして１６〜２０メッシュサイズの粉末が得られるように篩にかけ、脱イオン水に浸漬させ、そして水浴において８０〜９０℃で５〜６時間加熱した。新鮮な脱イオン水を使用して当該抽出サイクルを５回繰り返し、そしてブフナー漏斗において減圧下で濾過した。それから全ての濾液を混合し、そして既知の技術を使用して濃縮し、粗抽出物を得た。当該濃縮された抽出物を凍結乾燥して、粉末形態において水分を含まない粗抽出物を得た。当該抽出物を最初に試験管内において試験し、そして陽性試験を何回か繰り返した後、更に当該抽出物の抗結核活性を試験管内において試験した。当該抽出物を異なる極性の溶媒混合物で５つの画分に分画し、そして各画分を７つの細画分に細分画し、そして試験管内及び生体内において抗結核活性を試験した。当該活性細画分ＳＦ３を精製し、そしてＳＦ３−Ｋを得た。精製した細画分ＳＦ３−Ｋの試験管内及び生体内における抗結核活性を試験し、そして最後に多様な分光法を使用して特長付けた。
【実施例１】
【０１１９】
２００４年４月２２日の米国特許第１０／８２９，４００号、及び２００３年８月２９日のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＩＮ０３／００２９２号において開示されるとおり、インドのカンベイ湾、より正確には北緯２１°４６’及び東経７２°１１’〜北緯２０°４０’及び東経７１°０１’（北緯２１°７５’及び東経７２°１７’〜 北緯２１°０９’及び東経７２°００’）の地域から野生のサリコルニア・ブラキアタを成熟期（１１月〜３月）又はその前に採取した。それから更に、植物の異なる部分を、周囲温度における溶媒：メタノール−水（９５：５）、メタノール−水（１：１）、及び８０〜９０℃における純水で粗抽出調製物のために処理した。これらの粗抽出物を抗結核活性のバイオアッセイにかけた。判明した多くの部分の生理活性の結果を以下に示す：
【表１】
2008501041.tif 000002
【０１２０】
前記の結果から、根の水抽出物が他の植物部分から調製された抽出物よりも高い活性を有することが推測され、これにより前記特許において開示されたＦ１〜Ｆ５の画分を得るために分画実験が選択された。
【０１２１】
５つの画分の全てを試験管内において抗結核活性のために評価し、そして全ての画分が５０μｇ／ｍＬにおいて活性であることが判明した。前記各分のＦ２が、前記特許出願の実施例１において更に開示されるとおり、単離された活性部分を得るための更なる画分のために選択された。この活性及びＨＰＬＣプロファイルは同じものとして確立された（図１）。Ｆ２画分中の成分の分離を改善するために、クロマトグラフィーの条件を以下のとおり改変した：移動相は３：９７：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ（均一溶媒）とし、使用したカラムは５μＲＰ−１８分析用カラム（Phenomnex, USA)とし、流速は１ｍＬ／分とし、操作時間は２０分とし、そしてＵＶ検出の波長は２２０ｎｍとした。図２のＨＰＬＣプロファイルからも解るとおり、当該画分の成分はより分離されている。
【実施例２】
【０１２２】
１ｇの実施例２のＦ２画分を１０μＲＰ−１８分取用カラム（Phenomnex, USA)において処理し、流速を６ｍＬ／分とし、操作時間を２８分とし、そしてＵＶ検出の波長を２２０ｎｍとした。当該ＨＰＬＣ追跡を図３に示す。続いて、全量１ｇのＦ２画分で５０回の注入を行い、そして図３に示されるとおり７つの細画分（ＳＦ−１からＳＦ−７）が回収された。当該細画分をロータリー・エバポレーターにおいて濃縮し、続いて−５８℃で凍結乾燥させた。ＳＦ１からＳＦ７の個々の細画分は、それぞれ、２３８ｍｇ、３１２ｍｇ、１６０ｍｇ、５ｍｇ、９ｍｇ、１ｍｇ、及び８ｍｇであった。
【実施例３】
【０１２３】
実施例２のＳＦ−１からＳＦ−７の細画分を試験管内において結核菌（M. tuberculosis）に対して試験した。ＳＦ３細画分は、一貫して、ＯＡＤＣを含む７Ｈ１０ミドルブルック培地中の結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖの成長及びコロニー形成能の阻害において活性であることが判明し、図３中の矢印に示されるピークは、最も活性な成分に対応するピークであることを示す（活性フローチャートによる）。
【実施例４】
【０１２４】
３８ｍｇの実施例２のＳＦ−３細画分を、実施例２に記載したものと同じ条件を維持する分取用（Semi-preparative)ＨＰＬＣカラムにおいて再度クロマトグラフにかけた。当該細画分の４つの細細画分が回収された。溶媒を飛ばした後、３番目の細画分を秤量し田結果、２５．３ｍｇであった。これは分析用ＲＰ−１８カラムにおいて図４のＨＰＬＣを生じた。
【実施例５】
【０１２５】
実施例４の精製した化合物を含む蓋をしたガラスバイアルを、暑夏の日中に４時間保ち、インドの気候条件下における熱安定性を調べた。日光に暴露した後、当該ＨＰＬＣプロファイルを調査し、そして当該プロファイルは図４のものと一致した。これは、生理活性測定の目的のための保管及び輸送に耐えるくらいＳＦ３−Ｋが適当な熱安定性を有することを示す。
【実施例６】
【０１２６】
実施例３の方法（詳細はバイオアッセイ手順で別に供する）により評価される場合、実施例４のＳＦ３−Ｋは、結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対して３．１２５μｇ／ｍＬ以下のＭＩＣ値を示した。
【実施例７】
【０１２７】
ＢＡＣＴＥＣと称される他の方法（詳細はバイオアッセイ手順で別に供する）によりＳＦ３−Ｋの試験管内における活性を更に測定した。結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖの成長の阻害は、５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度において測定した。成長の完全な阻害が観察された。
【実施例８】
【０１２８】
小規模な制限された実験において、結核の実験モデルにおけるＳＦ３−Ｋの抗結核活性を評価した。結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖで感染させたマウスにおいて、１ｋｇの体重あたり５０ｍｇでＳＦ３−Ｋの活性を試験した。マウスは精製したＳＦ３−Ｋを１２日間経口的に１回受けた。２つのグループの説明及び処理は以下のとおりである：
グループＩ  感染させ、処理をしていないマウス
グループII  感染させたが、感染後１２日間、５０ｍｇ／ｋｇ体重の精製したＳＦ３で処理した。
【０１２９】
グループＩのマウスは、感染から１０日後に体重が減少し始めた。これらは波状の体毛を伴い衰弱しているように見え、そして感染から１４日目に死に始めた。１６日以内に全てのマウスが結核により死亡した。肺中に明らかな破壊を伴い脾臓が拡大した。ＳＦ３−Ｋで処理したグループIIの全てのマウスはより長く生存し、そして平均生存期間は５日亢進された（図５）。
【実施例９】
【０１３０】
ＶＥＲＯ細胞における細胞毒性（ＩＣ５０）のために、０、１２．５、２５、５０、及び１００μｇ／ｍＬの異なる濃度においてＳＦ３−Ｋを試験した。当該範囲は、結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７ＲｖのためのＳＦ−３のＭＩＣの１０倍と同じ用量を網羅する。７２時間の暴露後、ＭＴＴのホルマザン生成物への細胞変換に基づき生存率を評価し（Promega CellTitre 96 非放射性細胞増殖アッセイを使用）、これは４９２ｎｍにおける吸光度により測定した。１００μｇ／ｍｌ以下では阻害は存在せず、当該化合物は無細胞毒性であることを示唆している。結果を図６に示す。Ｘ及びＹと命名された２つの細胞毒性化合物を比較のために利用した。
【実施例１０】
【０１３１】
また、ＳＦ３−Ｄで処理した健康なマウスにおいて毒性実験を行った。７匹のマウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重を含有するＳＦ３−Ｋの用量を毎日１回ずつ１２日間与え（経口経路）、そして３５日目まで生存率及び体重を観察した。死亡したマウスは存在せず、且つこれらは体重を増やした。
【実施例１１】
【０１３２】
５００ＭＨｚのバリアンＮＭＲ装置においてＳＦ３−ＫのＴＯＣＳＹ（全相関分光法）プロトンＮＭＲスペクトルを記録した（図７）。丸で囲んだピークを除き、全ての他のピークはショ糖に起因し、そして純粋なショ糖（Sigma)を伴う分離ＮＭＲ実験はこれを確認した。ＲＩ検出を伴うＨＰＬＣに基づき、ＳＦ３−Ｋ中のショ糖の適当なパーセンテージは７５〜８０％であり、これにより微量成分は２０〜２５％以下が含まれることを示している。更に同じ重量におけるＳＦ３−Ｋと標準ショ糖（Sigma)の比較的な1Ｈ  ＮＭＲは、プロトンシグナル面積において約５％の違いを示す。同様に、微量成分において１１７と１４２の分子量を有する化合物間の割合は、ＵＶ検出を伴うＨＰＬＣに基づき約４：１である。当該実施例は、ＳＦ３−Ｋが、主に、丸で囲んだピークに関係する１又は複数の微量成分の存在を伴うショ糖であることを示す。
【実施例１２】
【０１３３】
ＢＡＣＴＥＣ法を使用して、コントロールとしてSigmaからの純粋なショ糖（１００μｇ／ｍＬ）及びＳＦ３−Ｋにより、試験管内におけるＨ３７Ｒｖに対する実験を行った。図８から解るように、ショ糖では阻害は観察されず、そしてその挙動はコントロールに見られたものに類似し、一方ＳＦ３−Ｋは有意な阻害を示した。ショ糖が希釈剤以外の役割を果たさない場合、実施例１１に示されるとおりＳＦ３−Ｋにおいて活性成分は２０〜２５％以下しか含まれないためＳＦ３−Ｋ中の活性成分のＭＩＣ値は実施例６において示された値よりも極めて低いと予想される。
【実施例１３】
【０１３４】
実施例１２の実験をＳＦ３−Ｋの２つの異なる用量レベル、即ち５０μｇ／ｍＬと１００μｇ／ｍＬにおいて繰り返した。図９から解るとおり、実施例１２の知見は、再現性を有することが判明した（図９）。更に阻害の用量依存性が示された。
【実施例１４】
【０１３５】
３：９７：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏを使用する実施例１のＨＰＬＣ条件を純粋なショ糖で繰り返し、そして２２０ｎｍでの検出下においてクロマトグラフにおいてピークは見られず、一方ＲＩ検出は２２０ｎｍのＵＶ検出下又はＲＩ検出下のＳＦ３−Ｋの保持時間と同様のピークを明らかにした。いずれかの微量成分に由来する他のピークはＳＦ３−ＫのＵＶ検出又はＲＩ検出のいずれかにより観察されなかった。当該実施例はＳＦ３−Ｋ中の微量成分を示唆し、これは実施例１１のＴＯＣＳＹ  ＮＭＲ及び実施例１２と１３の活性データから明らかであり、採用されたクロマトグラフィー条件下においてショ糖とともに共溶出する。
【実施例１５】
【０１３６】
前述のＨＰＬＣの条件下において図４のクロマトグラフを有するＳＦ３−Ｋの成分を決定するためにＨＰＬＣ条件を改変した。このために以下の変更を行った：ＲＰ−１８カラムをWaters・アミノカラムで置き換え、そして移動相を８０：２０：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏに変更した。ＬＣ−ＭＳ操作条件下において得られたクロマトグラフ（２１０ｎｍ検出）を図１０に示す。図から解るとおり、３．０９分、４．２６分、１５．９２分、及び２０．７４分においてピークが得られた。ＲＩ検出を使用する同じ条件下における純粋なショ糖（Sigma）での分離実験は、７．７０分におけるピークを明らかにした。即ち、ショ糖は７．７０分において溶出するがＵＶにおいては検出されない。従って、質量スペクトルは、４．２６分、７．７０分、１５．９２分、及び２０．７４分において溶出する成分を特徴付けた（図１１Ａ〜Ｄ）。ＳＦ３−Ｋの質量スペクトル（走査ＥＳ+）を図１２に示す。４．２６分において溶出する成分は［１１３＋Ｈ］+に対応するｍ／ｚ＝１１４を示す。即ちこれは１１３の分子量を有する。ＭＳ条件下において、当該化合物はまた、ｍ／ｚ＝２２７におけるピークを有する二量体の凝集体［（１１３）2＋Ｈ］+を形成する。７．７０分において溶出する成分（図１１Ｂ）は［ショ糖（３４２）＋ＮＨ4+（１８）］に対応するｍ／ｚ＝３６０を有する。即ち予想されたとおり、これはショ糖によるものである。１５．９２分において溶出する成分（図１１Ｃ）は、［１１７＋Ｈ］+に対応するｍ／ｚ＝１１８におけるＭＳピークを示す。即ちこれは分子量１１７を有する。ＭＳ条件下において、当該化合物はまた、それぞれ、ｍ／ｚ＝２３５及び３５２を有する二量体［（１１７）2＋Ｈ］+、及び三量体［（１１７）3＋Ｈ］+クラスターを形成する。図１２のスペクトルにおいて、ｍ／ｚ＝１１８［１１７＋Ｈ］+及び１４０［１１７＋Ｎａ+］の娘ピークを示すＭＳ−ＭＳを図１３ａ及びｂに示す。図１３ａ及びｂの分裂パターンに基づき、図７においてピークを丸で囲んだ「非ショ糖」のＮＭＲ位置、及びＳＦ３−ＫのためのアミドとカルボニルバンドのＩＲ証拠（図１４ａ）はショ糖では見られず（図１４ｂ）、後述の構造（１）はｍ／ｚ＝１８に対応する可能な構造の１つとなりうる（当該成分はＳＦ３−Ｋの「微量成分」中で支配的である）。２０．７４分において溶出する成分（図１１Ｄ）は１４３［１４２＋Ｈ］+におけるｍ／ｚを示すが、更に特徴付けられていない。これらのピークに加えて、ＬＳ−ＭＳにおけるｍ／ｚ＝１１８の共成分として、ＳＦ３−Ｋの直接噴霧下において、ｍ／ｚ＝１１６［１１５＋Ｈ］+におけるピーク、またｍ／ｚ＝１３８［１１５＋Ｎａ+］におけるピークが観察された。図１２の質量スペクトルの複合体パターンはそれ自身又は分子量１１７を有する微量成分を伴うショ糖のクラスターに関して説明することができる。
【０１３７】
方法
サリコルニア・ブラキアタの乾燥した成熟した根からのＳＦ３−Ｋの調製
十分に成熟した段階においてサリコルニア・ブラキアタを採取し、そしてその根を、係属しているRathod et alによる２００４年４月２２日の米国特許第１０／８２９，４００号、及び２００３年８月２９日のＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＩＮ０３／００２９２号において開示されたとおり、水性抽出物の調製に使用した。当該根を水道水、続いて脱イオン水で洗浄して泥、粉塵粒子、及び他の外来物質を除去し、小片に切断し、微粉砕し、そして脱イオン水中に浸漬した。浸漬した根を水浴において８０〜９０℃に加熱した。水溶性抽出物を容器に移し、そして濾過した。全ての水溶性物質を回収するために前記の処理を３〜５日間行った。ロータリー・エバポレーターにより濾液を濃縮し、続いてフリーズドライアーで乾燥させ、固形物を得た。ブタノール、１：１クロロホルム：メタノール、メタノール、１：１メタノール：水、及び水での連続抽出を介して当該固形物を５つの画分を得るために分画した。ＲＰ−１８カラム（Phenomenex)及び７ｍＬ／分における３：９７：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏ移動相を使用する分取用（Semi-preparative)ＨＰＬＣにおいて細画分のために当該クロロホルム：メタノール画分（Ｆ２と称する）を取った。０〜２２分の間に７つの細画分を回収し、９．９分〜１０．６５分に回収された細画分をＳＦ３としてラベルした。当該ＳＦ３をロータリー・エバポレーターにおいて５０℃で濃縮し、それから同じカラムにおいて、そして流速を６ｍＬ／分に変化させ、全操作時間を１９分に変更したことを除き同じ条件下において再度クロマトグラフィーにかけた。主要なピークに対応する画分は１１．８〜１２．６分の間に回収された。即ち当該回収は、ベースラインより上のピークの上昇相の間に開始し、そしてピークが下降相の間であってベースラインに達する前に中断する。当該細画分を再度ロータリー・エバポレーターにおいて濃縮し、そして凍結乾燥させ、粉末を得た。１００ｇの乾燥した根の出発材料から０．８０５ｇのＳＦ３−Ｋを得た。
【０１３８】
ＯＡＤＣ（Ｂ−Ｄ、ＵＳＡ）を含有する７Ｈ１０ミドルブルック培地中の結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖに対するＳＦ３−Ｋの試験管内スクリーニング
ＯＡＤＣ（Ｂ−Ｄ、ＵＳＡ）を含有する７Ｈ１０ミドルブルック培地中の結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖの成長及びコロニー形成能の阻害により、ＳＦ３−Ｋの抗結核活性を測定した。当該培地をオートクレーブし、そしてＯＡＤＣを補充し、そして２ｍＬを無菌管に分配した。１ｍｇ／ｍＬの濃度のＳＦ３−Ｋの懸濁液を無菌水中に調製し、一定の容量、即ち０．１ｍＬを保つ異なる濃度において、これを補充培地を含む試験管中に添加した。適当に混合した後、当該試験管を傾斜位において保ち、そして冷却して凝固させた。いずれかの混入を観察するためにこれらの管を３７℃で２４時間インキュベートした。そうでない場合、当該管を結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖの培養懸濁液（１〜５×１０4桿菌／管）でストリークした。播種した管を２種のコントロールとともに３７℃でインキュベートした；１つは同じ結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖの播種でストリークしたが阻害性が存在しない化合物であり、そして２つ目は結核菌の成長を阻害する、報告された最小の阻害性濃度における標準抗結核化合物で添加した。結核菌の成長はインキュベーション後４週間まで観察された。ＳＦ３−Ｋを含む管を上述のコントロール管と比較した。
【０１３９】
ＢＡＣＴＥＣ法の試験管内スクリーニング
ＳＦ３−Ｋの水性原液（１ｍｇ／ｍＬ）を濾過滅菌した。５０及び１００μｇ／ｍＬの最終濃度のＳＦ３−Ｋになるように、５０μＬのＳＦ３−Ｋを４ｍＬの放射測定用７Ｈ１２ブロス（ＢＡＣＴＥＣ  １２Ｂ）に添加した。５０μＬの無菌水をＳＦ３−Ｋを添加されないコントロールバイアル中に添加した。最後に、１０4〜１０5のコロニー形成単位の結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖを全てのバイアル、即ち５０及び１００μｇ／ｍＬのＳＦ３−Ｋを含む４ｍＬのＢＡＣＴＥＣ放射測定用７Ｈ１２ブロスのバイアル、並びにＳＦ３−Ｋを伴わないコントロールバイアル中に播種した。全てのバイアルを二つ組にし、そして３７℃でインキュベートした。成長指標（ＧＩ）を毎日記録した。その活性が存在する場合にはそれを確かめるために、ＳＦ３−Ｋの代わりにショ糖（Sigma；１００μｇ／ｍＬ）で同様の様式において実験を行った。
【０１４０】
生体内におけるスクリーニング法
Ｌ−Ｊ傾斜培養において成長させた結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖを回収し、そして同種の懸濁液を約１×１０8桿菌／ｍＬにおいてＴｗｅｅｎ−生理食塩水中で調製した。雌のスイスマウスをCentral Drug Research Institute, Lucknow, Indiaの飼育室において飼育し、そして１８〜２０ｇの体重にした。当該マウスを各グループ７匹ずつ２つのグループに分けた。外側の尾の血管を介して上述のとおり調製した０．１ｍＬの細菌懸濁液を注射することにより結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖ（１×１０7桿菌／マウス）をマウスに感染させた。感染から４８時間後、ＳＦ３−Ｋ（５０ｍｇ／ｋｇ体重；無菌水に溶解させた）でのマウスの処理を開始し、１２日間経口経路を介して投与した。
【０１４１】
本発明の主要な工程は以下のとおりである：
（ｉ）  Ｆ２の精製ができる用にクロマトグラフィー条件を変更する。
（ii）  Ｆ２と活性を相関させ、そして更なる実験のためにＳＦ３を選択する。
（iii ）  明確な高純度を示唆するＨＰＬＣで単一のピークを生じるＳＦ３−Ｋを得るためにＳＦ３を更に精製する。
（iv）  ＳＦ３−Ｋの主要な成分としてショ糖を同定し、そして更にこれが不活性であることを示す。
（ｖ）  その後、ＵＶ関連ピークが検出され、これらのピークが主要成分に起因する部分においてショ糖が溶出することを示す。
（vi）  ２Ｄ−ＮＭＲにより、ショ糖以外の追加的なＮＭＲピークが微量な成分に起因し、そしてショ糖の官能的な修飾には起因しないことを証明する。
（vii ）  ＳＦ３−Ｋの多様な成分を分離するための方法を改善し、そして予備的な特徴付けを試みる。
（viii）  ＜３．１２５μｇ／ｍＬのＭＩＣのＳＦ３−Ｋが極めて低いＭＩＣの活性な微量成分に変化することを間接的に示し、このため単離すること及び分離的に実験することが必要である。
（ix）  ＳＦ３−Ｋが完全に無毒であることを示す。
（ｘ）  試験管内と生体内の両方において作用の有効性を示す。
【０１４２】
本発明の主な利点は以下である：
１．  ＳＦ３−Ｋと命名される特異的な細画分における活性の濃縮を介するサリコルニア・ブラキアタ由来の抗結核抽出物のＭＩＣ値における低下、ＭＩＣ値を３．１２５μｇ／ｍＬに導く。
２．  亢進された生存期間を介して説明されるとおり、Ｈ３７Ｒｖで感染させたマウスにおける制限実験を介する生体内における抗結核作用の有効性の証明。
３．  ＭＩＣ値の１０倍以上の投与量で行われた細胞毒性実験を介する細画分の非毒性の証明。
４．  活性成分を投与された健康なマウスにおける同様の無毒的な挙動のモニタリング。
５．  インドにおける日中にＳＦ３−Ｋの固体を暴露することにより説明されたとおり、ＵＶ検出を伴うＨＰＬＣプロファイルにおいて変化を誘導しないＳＦ３−Ｋの適当な熱的及び光化学的安定性。
６．  植物の反復的な採取、並びに反復的な抽出及び分画を介する活性の再現性。
７．  ＳＦ３−Ｋの活性が微量成分中に存在すること、及びこれにより主要な不活性成分、特にショ糖を含まない活性成分を単離することにより更に３〜５倍のＭＩＣ値の減少の達成を提供することの証明。
８．  主要な活性成分、及びＳＦ３−Ｋの他の成分又は現在流行している又は直ぐに導入される他の既知の薬剤との相乗作用を同定するための観点を伴い、ＳＦ３−Ｋの異なる微量成分の抗ＴＢ活性の詳細な研究を可能にする、クロマトグラフィー手段によるＳＦ３−Ｋの微量成分を主要な不活性成分から分離することが可能であることの証明。
９．  結核菌（M. tuberculosis）に対して活性な１又は複数のＳＦ３−Ｋの微量成分が質量スペクトルデータに基づき単一の分子であり、そして抗結核活性が以前に調査された可能性がないことの証明。
１０．  ＳＦ３−Ｋが、結核菌（M. tuberculosis）に対して、新規な無毒性且つ有効な薬草薬物として使用できること、すでに全ての角度から詳細に試験が完了したことの可能性。
１１．  ＳＦ３−Ｋが合成としても受け入れられる結核菌（M. tuberculosis）に対する新規な化学的実体を産生できることの可能性。
１２．  今までに複合体構造及び複素環を有する結核の既知の化合物が発見されている。本調査において単離された化合物は、極めて単純であり、そして低い分子量を有する（１１７）。
【図面の簡単な説明】
【０１４３】
【図１】２５４ｎｍにおけるＦ２画分の分析用ＨＰＬＣプロファイルである。ＲＰ−１８カラム（Phenomenex)及び１ｍＬ／分の流速における均一溶出溶媒系として１：１：：ＣＨ3ＣＮ：ＭｅＯＨを使用する。
【０１４４】
【図２】２２０ｎｍにおけるＦ２画分の分析用ＨＰＬＣプロファイルであり、ＲＰ−１８カラム（Phenomenex)及び本発明の開始点である１ｍＬ／分の流速における均一溶出溶媒系として３：９７：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏを使用する。
【０１４５】
【図３】２２０ｎｍにおけるＦ２画分の分取用ＨＰＬＣプロファイルであり、ＲＰ−１８カラム（Phenomenex)及び６ｍＬ／分の流速における均一溶出溶媒系として３：９７：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏを使用する。
【０１４６】
【図４】２２０ｎｍにおけるＳＦ３−Ｋの分析用ＨＰＬＣプロファイルであり、ＲＰ−１８カラム（Phenomenex)及び１ｍＬ／分の流速における均一溶出溶媒系として３：９７：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏを使用する。
【０１４７】
【図５】結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖの感染に対するマウスに５０ｍｇ／ｋｇ体重の用量において１２日間経口的に与えられるＳＦ３−Ｋによる保護。
【０１４８】
【図６】ＭＴＴアッセイを使用するＶＥＲＯ株化細胞法におけるＳＦ３−Ｋの細胞毒性実験である。
【０１４９】
【図７】ＳＦ３−Ｋ中に存在する主要成分のショ糖から微量成分の解離を示すＳＦ３−ＫのＴＯＣＳＹスペクトル（２Ｄ）である。
【０１５０】
【図８】５日間のＢＡＣＴＥＣ試験管内スクリーニング法によるショ糖と比較したＳＦ−Ｋによる結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖの成長阻害データである。
【０１５１】
【図９】ＢＡＣＴＥＣにおける５０及び１００μｇ／ｍＬの濃度の２つの異なる用量レベルにおけるＳＦ３−Ｋによる結核菌（M. tuberculosis）Ｈ３７Ｒｖの成長の阻害のための反復実験データである。
【０１５２】
【図１０】ＬＳ−ＭＳ条件下におけるＳＦ３−ＫのＨＰＬＣ−ＵＶプロファイルである。ＨＰＬＣは移動相として８０：２０：：ＣＨ3ＣＮ：Ｈ2Ｏを伴うWaters・アミノカラムを使用して行った。
【０１５３】
【図１１−ａ】図１０のＬＳ−ＭＳ条件下のＨＰＬＣ−ＵＶ操作において確認されたＳＦ３−Ｋの個々のピークの質量スペクトルである。
【図１１−ｂ】ショ糖ピークの質量スペクトルであり、ＳＦ３−ＫのＬＳ−ＭＳ操作中、７．０分においてＵＶ下で検出されない。
【図１１−ｃ】図１０のＬＳ−ＭＳ条件下のＨＰＬＣ−ＵＶ操作において確認されたＳＦ３−Ｋの個々のピークの質量スペクトルである。
【図１１−ｄ】図１０のＬＳ−ＭＳ条件下のＨＰＬＣ−ＵＶ操作において確認されたＳＦ３−Ｋの個々のピークの質量スペクトルである。
【０１５４】
【図１２】ＳＦ３−Ｋの質量スペクトル−ＥＳ+走査である。
【０１５５】
【図１３−ａ】ｍ／ｚ＝１１８の娘を示すＭＳ−ＭＳである。
【図１３−ｂ】ｍ／ｚ＝１４０の娘を示すＭＳ−ＭＳである。
【０１５６】
【図１４−ａ】ＫＢｒペレットにおけるＳＦ３−ＫのＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図１４−ｂ】ＫＢｒペレットにおける標準ショ糖のＦＴ−ＩＲスペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図３Ａ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−ａ】
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【図１１−ｂ】
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【図１１−ｃ】
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【図１１−ｄ】
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【図１２】
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【図１３−ａ】
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【図１３−ｂ】
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【図１４−ａ】
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【図１４−ｂ】
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【国際調査報告】
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