(57)【要約】本発明は、リドカイン自体よりも少ない麻酔活性を示すが、前記リドカインよりも多くの抗炎症性および鎮痙性の活性を有するリドカイン由来化合物、加えてこれらの化合物のうちの少なくとも1つまたはこれらの塩を有効成分として持つ薬学的組成物、ならびに喘息、鼻炎、アレルギー性じんま疹を含むアトピー性疾患、アトピー性喘息の症例の後に続く好酸球増加症に関連する慢性肺炎症、および例えば大腸炎のような慢性腸炎症を治療、予防または抑制するためのそのような組成物の使用に関する。薬学的組成物は、噴霧により適用されることが予定されている噴霧形態、溶液、懸濁液、エマルションで使用可能である場合があるか、または経口用もしくは注射用の用途で薬学的に使用可能ないずれかの形態で使用可能である場合がある。2008501726.tif 000016
2008501726.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
その塩または塩のうちの1つが、式（II）、（III）および（IV)のうちの1つで表わされることを特徴とする、リドカイン由来化合物：
2008501726.tif 000012
式中、基R1、R2、R3、R4およびR5が、H、CH3、CF3またはORにより表わされ；
ここで基Rが、芳香環または側鎖の任意の位置において、水素、直鎖もしくは分岐鎖において1個または複数の炭素原子を持つアルキル基、アルケンもしくはアルキン、複素環を形成する環式もしくは非環式系におけるヒドロキシル、ヒドロキシアルキルもしくは酸素官能基、遊離もしくは置換アミン、チオアルキル、供与基および電子誘引物質（electron attractor）、ハロゲン、またはN供与基により表わされてもよく；
「n」が、分離するために1個から4個までの炭素原子により構成されてもよく；かつ
基Xが、
NH(CH2CH3)2、NH(CH2CH2CH3)2、NH(CH2CH2CH2CH3)2、
2008501726.tif 000013
により表わされていてもよい。
【請求項２】
以下の化合物：
2-ジエチルアミン-2',3'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',4'-アセトキリジド；
2-ジエチルアミン-2',5'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2-トリフルオロメチルアセトアニリド、またはこれらの塩のうちの1つ：
のうちの1つから選択されることを特徴とする、請求項1記載のリドカイン由来化合物。
【請求項３】
以下の化合物： 
2-ジエチルアミン-2',3'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',4'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',5'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2-トリフルオロメチルアセトアニリド；
2-ジエチルアミン-3',5'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-3',4'-アセトキシリジド；
2-モルホリン-2',6'-アセトキシリジド；
2-ピペリジン-2',6'-アセトキシリジド；
2-N-ブチル-ピペリジン-2',6'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',3'-メチレノジオキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-3',4'-メチレノジオキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',6'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',3'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',4'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',5'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-3',4'-ジメトキシ-アセトアニリド；および
2-ジエチルアミン-3',5'-ジメトキシ-アセトアニリドまたはこれらの塩のうちの1つ： 
のうちの1つから選択されることを特徴とする、請求項1記載のリドカイン由来化合物。
【請求項４】
以下の式のうちの1つで表わされる少なくとも1つの誘導されたリドカイン化合物またはその塩のうちの1つ、並びに薬学的に許容される賦形剤を含有することを特徴とする、薬学的組成物：
2008501726.tif 000014
式中、基R1、R2、R3、R4およびR5が、H、CH3、CF3またはORにより表わされ；
ここで基Rが、芳香環または側鎖の任意の位置において、水素、直鎖もしくは分岐鎖において1個または複数の炭素原子を持つアルキル基、アルケンもしくはアルキン、複素環を形成する環式もしくは非環式系におけるヒドロキシル、ヒドロキシアルキルもしくは酸素官能基、遊離もしくは置換アミン、チオアルキル、供与基および電子誘引物質、ハロゲン、またはN供与基により表わされてもよく；
「n」が、分離するために1個または4個までの炭素原子により構成されてもよく；かつ
基Xが、
NH(CH2CH3)2、NH(CH2CH2CH3)2、NH(CH2CH2CH2CH3)2、
2008501726.tif 000015
により表わされていてもよい。
【請求項５】
0.5〜40％p/vの濃度の誘導されたリドカイン化合物および薬学的に許容される賦形剤による、薬学的組成物。
【請求項６】
誘導されたリドカイン化合物が、以下の化合物：
2-ジエチルアミン-2',3'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',4'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',5'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2-トリフルオロメチルアセトアニリド：
のうちの1つから選択されることを特徴とする、請求項4または5記載の薬学的組成物。
【請求項７】
誘導されたリドカイン化合物が、以下の化合物：
2-ジエチルアミン-2',3'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',4'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',5'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2-トリフルオロメチルアセトアニリド；
2-ジエチルアミン-3',5'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-3',4'-アセトキシリジド；
2-モルホリン-2',6'-アセトキシリジド；
2-ピペリジン-2',6'-アセトキシリジド；
2-N-ブチル-ピペリジン-2',6'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',3'-メチレノジオキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-3',4'-メチレノジオキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',6'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',3'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',4'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',5'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-3',4'-ジメトキシ-アセトアニリド；および
2-ジエチルアミン-3',5'-ジメトキシ-アセトアニリド：
のうちの1つから選択されることを特徴とする、請求項4または5記載の薬学的組成物。
【請求項８】
噴霧療法により適用されることが予定されている噴霧形態、溶液、懸濁液、エマルションで薬学的に使用可能であることを特徴とする、請求項4〜7のいずれか1項記載の薬学的組成物。
【請求項９】
経口用または注射用の用途で薬学的に使用可能であることを特徴とする、請求項4〜7のいずれか1項記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
喘息、鼻炎、アレルギー性じんま疹を含むアトピー性疾患、非アトピー性喘息の症例の後に続く好酸球増加症に関連する慢性肺炎症、および例えば大腸炎のような慢性腸炎症の治療、抑制の予防において適用されることを特徴とする、請求項4〜9のいずれか1項記載の薬学的組成物の使用法。
【請求項１１】
喘息、鼻炎、アレルギー性じんま疹を含むアトピー性疾患、非アトピー性喘息の症例の後に続く好酸球増加症に関連する慢性肺炎症、および例えば大腸炎のような慢性腸炎症の治療、予防または抑制に用いられる、請求項4〜9のいずれか1項記載の薬学的組成物の治療有効量を、言及される治療、予防または抑制を必要とするヒトに投与することを特徴とする、疾患の治療、予防または抑制の方法。
【請求項１２】
請求項4〜9のいずれか1項記載の薬学的組成物が、噴霧療法により適用されることが予定されている薬学的噴霧形態、溶液、エマルションで用いられることを特徴とする、請求項11記載の疾患の治療、予防または抑制の方法。
【請求項１３】
請求項4〜9のいずれか1項記載の薬学的組成物が、経口用または注射用の用途の薬学的形態で用いられることを特徴とする、請求項11記載の疾患の治療、予防または抑制の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リドカイン自体よりも少ない麻酔活性を示すが、前記リドカインよりも多くの抗炎症性および鎮痙性の活性を示すリドカイン由来化合物、加えてこれらの化合物のうちの少なくとも1つまたはこれらの塩を有効成分として持つ薬学的組成物、ならびに喘息、鼻炎、アレルギー性じんま疹を含むアトピー性疾患、アトピー性喘息の症例の後に続く好酸球増加症に関連する慢性肺炎症、および例えば大腸炎のような慢性腸炎症を治療、予防または抑制するためのそのような組成物の使用法に関する。
【０００２】
更に本発明は、喘息、鼻炎、アレルギー性じんま疹を含むアトピー性疾患、アトピー性喘息の症例の後に続く好酸球増加症に関連する慢性肺炎症、および例えば大腸炎のような慢性腸炎症の治療、予防または抑制の方法であって、これらの化合物のうちの少なくとも1つ、またはそれらの塩の薬学的有効量を、前記治療、予防または抑制を必要とするヒトに投与することを含む方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
1884年にオーストラリア人の眼科医、Karl Kollerは、医療の分野に麻酔活性を持つ物質の使用を導入した。その初期の研究から、神経刺激伝達の阻止を促進する特性を持つ天然または合成化合物の探索が、複数の研究グループによって研究されてきた。1935年に、SouthworthおよびDabbsが、Xylocaine: a superior agent for conduction anesthesia. Curr Res Anesth Analg、32、159-170（非特許文献１）において、麻酔特性を持つアルカロイド異性体を合成した。続いて、LoefgrenおよびTakmanが、1952年に論文Studies on Local Anaesthetics VII. Acta Chemica Scadinavica、6、1010-1015（非特許文献２）において、それ以降リドカインと呼ばれる化合物を合成し、そのような化合物は著しい局所麻酔活性を有し、その式は、式Iにより表わされる。
2008501726.tif 000003
【０００４】
Xylocaine（登録商標）の名称で商業的に登録されており、その周知の局所麻酔活性の他に、ナトリウムチャンネルの阻害に関連する機構において、興奮性膜の脱分極過程を阻止するために適用される、リドカイン、1-(2-ジエチルアミン)N-ジメチルフェニル)-アセトアミドは、EP0643964における記載によると、心収縮性および低血圧の低減、腫瘍増殖の低減および／または阻害、殺菌能力、ならびに形質細胞の改変を促進し、ウイルス吸収への干渉を可能にし、したがって抗ウイルス作用を提供する、心不整脈の制御のために有用な臨床特性を有する。
【０００５】
HollmannおよびDurieuxによって実施された、Local anesthetics and the inflammatory response: a new therapeutic indication? Anesthesiology. 2000、93、858-875（非特許文献３）における最近の研究は、リドカインを含む局所麻酔薬が炎症過程を妨げる特性も保持する証拠を示している。しかし、これらの場合では、これらの特性の作用機序、とりわけ潜在的な臨床的応用が、ほとんど検討されないままである。
【０００６】
Effect of Nebulized Lidocaine on Severe Glucocorticoid-Dependent Asthma. Mayo Clin. Proc.、1996、71、361-368（非特許文献４）においてHuntらにより教示されたように、喘息に罹患している患者の気管支肺胞洗浄は、多くの場合、IL-5を含む異なるシトシンにより刺激される好酸球の生存を阻害することが立証された。したがって、事実、気管支肺胞流出液を収集する手法においてリドカインが使用される場合、それ自体が、インビトロで観察される好酸球への有意な生存阻止の原因であることが確認された。
【０００７】
喘息は、気管支炎に対する過剰反応性、好酸球浸潤、ならびに息切れ（getting short of air）の挿間期の繰り返し、胸でひゅーひゅー鳴る雑音がすることおよび咳をすることに強く関連すると思われる、複雑で異種の炎症性肺疾患である。そのような兆候および症候は、自発的に可逆になる場合があるか、または治療後になる場合がある、気道の閉塞に関連する。呼吸通路の炎症が、この疾患の病原に重要な役割を果たすことが知られている。この過程は、βケモカインの他に、IL-4、IL-5およびIL-13を含むシトシン2型のレベルの増加を伴う、IgEの産生および応答Th2の極性化によって注目される。喘息の病原の重要な局面は、疾患の重篤度と厳密に相関して起こる現象である、呼吸通路における複数の好酸球の蓄積である。ずっと以前から、好酸球は、アレルギー性疾患と関連しており、炎症促進の役割（pro-inflammatory role）を果たすという証拠が増えている。
【０００８】
塩基性でカチオン性のタンパク質、シトシン、および炎症性脂質媒介物質を含む、好酸球から誘導される媒介物質は、喘息群（asthmatic set）で観察される症候および病理学的兆候に直接的にかつ因果関係を示す互いに関連すると考えられることについて、かなりの証拠が文献に存在する。
【０００９】
喘息の治療に治療上利用可能な治療的蓄積（therapeutical arsenal）は、比較的豊富にあるが、一般に、医療行為は、基本的に二種類の薬剤の使用に限定されており、それは、ステロイド系抗炎症剤とアドレナリン作動性β2型気管支拡張剤であり、これらの両方は利益をもたらすことが認識されており、複数の副作用によって制限されている。
【００１０】
気管支拡張剤は、気管支の内側を覆っている平滑筋細胞の表面に位置するアドレナリン作動性β2型レセプターと結合する。この結合は、複雑なシグナル伝達カスケードを活性化し、それによってカルシウムの細胞内レベルの低減をもたらし、続いて平滑筋の弛緩、上部呼吸経路の障害物除去、および筋肉痙攣に対する保護をもたらす。しかし、最近の研究は、グルココルチコイドを伴わない気管支拡張剤の長期間の使用が患者において生命の危険性を増大することを示している。気管支拡張剤の単独の使用は危険性が高く、それは、患者に症状の軽減の感覚を伝えるが、進行性の炎症像の悪化を覆い隠すからである。
【００１１】
疫学的研究は、気管支拡張剤による喘息の治療が罹患率および死亡率の増加を妨げないことを示した。成人するまで持続的な喘息症状を持つ小児は、低下した肺機能を示す。喘息性気管支炎を罹患している成人患者は、肺気量の加速的な低下を示す。したがって、喘息療法は炎症過程に集中する傾向がある。
【００１２】
この意味において、グルココルチコイド剤を用いる療法は、現在、重篤な喘息を制御するために最も有効であり、それは、好酸球により開始され、遺伝子転写の修飾の結果もたらされるその抗炎症効果により開始されるアレルギー反応を低減するからである。標的細胞中の細胞質に存在する特定のレセプターへのこれらの薬剤の結合には、核へのステロイド-レセプター複合体の転座、二量体化、および核DNA中のいわゆる「グルココルチコイドの応答配列」への二量体の結合が続き、この方法で転写機構を活性化または抑制する。シトシン（IL-4、IL-5、IL-3、GM-CSFなど）およびケモカイン（エオタキシン、MCP-1など）を含む炎症媒介物質の過剰数の遺伝子の転写に対するグルココルチコイド剤の抑制効果は、十分に確立されている。グルココルチコイド剤療法は、一般に喘息の症状を制御することに成功しているが、これらの医薬の重篤な全身作用および喘息個体のサブグループにより示される治療に対する治療抵抗性は、新規の代替療法の明確な必要性を示している。
【００１３】
文献において、噴霧リドカインによる長期治療は喘息症状の軽減をもたらし、調査した24人の患者のうち20人において、ステロイド系抗炎症剤による治療への依存性を低減することが明確に示されている（Hunt, L. W.、Swedlund, H. A.、Gleich, G. J. Effect of Nebulized Lidocaine on Severe Glucocorticoid-dependent Asthma. Mayo Clin. Proc. 、1996、71、361-368（非特許文献５））。
【００１４】
文献によると、リドカインの抗喘息効果は、アポトーシスにより好酸球に死をもたらすその能力と関連し、この方法によって、喘息の病理発生に重要な効果細胞を排除する。
【００１５】
認識されている抗炎症活性の他に、リドカインは、少なくとも論文において、抗喘息作用に寄与する可能性がある他の作用を示す。例としては、平滑筋線維中のカルシウムの細胞内レベルを調節して、呼吸経路の筋肉に直接作用することにより呼吸機能に影響を与える。リドカインの抗炎症活性が好酸球に対する作用に限定されないことは、周知である。ホスファチジルコリンの合成、チロシンのリン酸化、超過酸化物の放出、リソソーム酵素の放出、食菌作用、凝集、内皮細胞膜への付着、および細胞接着の分子の発現／放出を含む幾つかの研究は、好中球および単球の作用に対するその阻害作用を報告する。しかし、呼吸経路に対するリドカインおよび他の局所麻酔薬の作用は、異種であり、かつ複雑である。呼吸経路での器械使用、高浸透圧性生理食塩水、運動およびヒスタミンにより誘発される喘息を含む、異なる刺激により誘導される気管支収縮に応答する危険な気管支痙攣をリドカインが防ぐという、有力な証拠がある。リドカインにより治療を受けている患者で観察されるヒスチジンによる気管支痙攣の減衰は、局所麻酔薬ジクロニンでは効果がないので、麻酔作用と関係なく起こることに留意することが重要である。
【００１６】
健康な個体において、リドカインエアゾールは、肺機構にほとんど効果をもたらさない。しかし、喘息個体を含む、呼吸経路における高められた反応性を持つ個体では、エアゾールで投与されたリドカインは、著しい初期気管支収縮効果を誘導する場合がある。逆説的と思われるこの効果を説明するために、少なくとも二つの仮説が提示された。まず第一に、呼吸経路の局所麻酔は、吸気および呼気機能調節機構の適切な感覚認知を妨げる可能性がある。実際に、吸気協調不能の状態が、後の上部呼吸経路の閉塞を伴う喉頭鏡検査の過程の際に、リドカインによる麻酔の後で報告されている。第二に、リドカインは、交感神経の神経支配および他により仲介される気管支拡張剤の神経原性反射を阻害する、気管支収縮性反応を選択する可能性がある。
【００１７】
他方では、喘息の治療におけるリドカインの使用は、この分子に特徴的な麻酔活性の欠点を示す。
【００１８】
したがって、患者を不快にするので、リドカインを喘息の治療に使用する場合に不都合な効果があることは、明白である。
【００１９】
結果として、前記で示された不都合を克服するために、代替案を提供する必要性がある。
【００２０】
このように、これは本発明の主要な特性のうちの一つを構成し、それは、リドカインにより明らかとなったものと同等またはそれよりも優れた抗炎症性および痙攣性の効果があるが、局所麻酔が最小限である化合物の開発である。
【００２１】
【非特許文献１】SouthworthおよびDabbs、Xylocaine: a superior agent for conduction anesthesia. Curr Res Anesth Analg、32、159-170
【非特許文献２】LoefgrenおよびTakman、1952年、Studies on Local Anaesthetics VII. Acta Chemica Scadinavica、6、1010-1015
【非特許文献３】HollmannおよびDurieux、Local anesthetics and the inflammatory response: a new therapeutic indication? Anesthesiology. 2000、93、858-875
【非特許文献４】Huntら、Effect of Nebulized Lidocaine on Severe Glucocorticoid-Dependent Asthma. Mayo Clin. Proc.、1996、71、361-368
【非特許文献５】Hunt, L. W.、Swedlund, H. A.、Gleich, G. J. Effect of Nebulized Lidocaine on Severe Glucocorticoid-dependent Asthma. Mayo Clin. Proc. 、1996、71、361-368
【発明の開示】
【００２２】
発明の概要
前記の説明による医薬の副作用と関連する、肺における神経の伝達の阻止を考慮すると、リドカインで観察されたものよりも優れているか、またはそれと同等である抗炎症性および痙攣性の効果および能力があるが、局所麻酔作用および副作用が最小限である、構造が類似しているリドカイン由来化合物、または前記構造の塩形態を提供することが、本発明の目的である。複数の誘導体を合成し、それらの薬理学的活性をリドカインと比較して評価した。
【００２３】
これらの化合物は、リドカインで証明されたものの19％〜60％の範囲の局所麻酔活性を示す。しかし、これらはリドカインにより示されるものよりも7〜100倍高い痙攣能力、ならびにマスト細胞を安定化する効能を示し、これは、抗原の曝露により引き起こされる血管透過および好酸球浸潤の増加を阻止する観点から、更に類似の作用である。加えて、本発明で評価された全ての化合物は、リドカインで観察されたものよりも著しく低い痙攣（convulsivant）活性を示した。全体として、そのような薬理学的特性は、抗喘息および抗アレルギー療法において局所麻酔薬よりも明確に有益である新規の代替案を構成するために、本明細書により示されるリドカイン誘導体を支援する。
【００２４】
本発明の目的は、式（II）、（III）および（IV)のうちの1つで表わされる、リドカイン由来化合物、またそれらの薬学的に許容される塩に関する。
2008501726.tif 000004
式中、基R1、R2、R3、R4およびR5は、H、CH3、CF3またはORにより表わされ；
ここで基Rは、芳香環または側鎖の任意の位置において、水素、直鎖もしくは分岐鎖において1個または複数の炭素原子を持つアルキル基、アルケンもしくはアルキン、複素環を形成する環式もしくは非環式系におけるヒドロキシル、ヒドロキシアルキルもしくは酸素官能基、遊離もしくは置換アミン、チオアルキル、供与基および電子誘引物質、ハロゲン、またはN供与基により表わされてもよく；
「n」は、分離するために1個または4個までの炭素原子により構成されてもよく；かつ
基Xは、
NH(CH2CH3)2、NH(CH2CH2CH3)2、NH(CH2CH2CH2CH3)2、
2008501726.tif 000005
により表わされていてもよい。
【００２５】
本発明の別の目的は、式（II)、（III)および（IV)により表わされる少なくとも1つのリドカイン由来化合物を有効成分として含む、薬学的組成物に関する。
【００２６】
本発明の更なる目的は、喘息、鼻炎、アレルギー性じんま疹を含むアトピー性疾患、非アトピー性喘息の症例の後に続く好酸球増加症に関連する慢性肺炎症、および例えば大腸炎のような慢性腸炎症の治療、予防または抑制におけるそのような組成物の使用に関する。
【００２７】
本発明の別の目的は、喘息、鼻炎、アレルギー性じんま疹を含むアトピー性疾患、非アトピー性喘息の症例の後に続く好酸球増加症に関連する慢性肺炎症、および例えば大腸炎のような慢性腸炎症の治療、予防または抑制の方法であって、本発明の記載に従った、言及される治療、予防または抑制を必要とするヒトにおける、治療有効量の薬学的組成物の使用を含む方法に関する。
【００２８】
発明の説明
本発明は、以下の式（II)、（III)および（IV)のうちの1つで本明細書により表わされるリドカイン由来化合物に関する。
2008501726.tif 000006
式中、基R1、R2、R3、R4およびR5は、H、CH3、CF3またはORにより表わされ；
ここで基Rは、芳香環または側鎖の任意の位置において、水素、直鎖もしくは分岐鎖において1個または複数の炭素原子を持つアルキル基、アルケンもしくはアルキン、複素環を形成する環式もしくは非環式系におけるヒドロキシル、ヒドロキシアルキルもしくは酸素官能基、遊離もしくは置換アミン、チオアルキル、供与基および電子誘引物質、ハロゲン、またはN供与基により表わされてもよく；
「n」は、分離するために1個または4個までの炭素原子により構成されてもよく；かつ
基Xは、
NH(CH2CH3)2、NH(CH2CH2CH3)2、NH(CH2CH2CH2CH3)2、
2008501726.tif 000007
により表わされていてもよい。
【００２９】
本発明において、全ての化合物は、その遊離塩基形態または薬学的に許容される塩、好ましくは塩化物類のいずれかで表わされている。
【００３０】
より具体的には、リドカイン由来化合物は、
2-ジエチルアミン-2',3'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',4'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',5'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2-トリフルオロメチルアセトアニリド；
2-ジエチルアミン-3',5'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-3',4'-アセトキシリジド；
2-モルホリン-2',6'-アセトキシリジド；
2-ピペリジン-2',6'-アセトキシリジド；
2-N-ブチル-ピペリジン-2',6'-アセトキシリジド；
2-ジエチルアミン-2',3'-メチレノジオキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-3',4'-メチレノジオキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',6'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',3'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',4'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-2',5'-ジメトキシ-アセトアニリド；
2-ジエチルアミン-3',4'-ジメトキシ-アセトアニリド；および
2-ジエチルアミン-3',5'-ジメトキシ-アセトアニリド
のうちから選択されることができ、
これらは、薬学的に許容される賦形剤と組み合わされる、リドカイン誘導体またはそれらの薬学的に許容される塩、好ましくは塩化物である。
【００３１】
上記の化合物は、生物学的活性、例としては薬理学的活性を表わし、これには、リドカインと比較すると最小限の麻酔活性が挙げられるが、これには限定されない。前記化合物の薬理学的活性の他の例は、抗炎症および痙攣活性である。
【００３２】
本発明で表わされる化合物は、米国特許第2,441,498号、英国特許第706,409号、英国特許第758,224号で記載されているように、その分野の専門家により周知の過程に従って合成されてもよいが、それら自体の固有の親油性と親水性の特性のバランスを常に観察することが、同じことを考慮すると、麻酔活性に影響を与える。
【００３３】
少なくとも1つの本発明の化合物またはこれらの化合物の塩を持つ薬学的組成物は、適切な用量を生成するために、0.5〜40％p/vの濃度で少なくとも1つの本発明の化合物および薬学的に許容される賦形剤の溶液または懸濁液により調製される、噴霧もしくは薬学的形態の経口投与、または注射によって適用されることが予定されている、噴霧、溶液、懸濁液、エマルションのような薬学的形態を介して投与されてもよい。これらの組成物は、喘息、鼻炎、アレルギー性じんま疹を含むアトピー性疾患、非アトピー性喘息の症例の後に続く好酸球増加症に関連する慢性肺炎症、および例えば大腸炎のような慢性腸炎症を治療、予防または抑制する。
【００３４】
本発明をより良く理解するために、添付の図面および後記の図面の簡単な説明を提示する。
【００３５】
実施例および図面の理解を助けるために、以下の化合物を参照コードに従って命名する。
2008501726.tif 000008
【００３６】
実施例
本発明は、下記で示されている実施例を通して詳細に記載される。本発明は、これらの実施例に限定されるのではなく、本発明の実施の範囲内で変形および改変も含むということを、強調する必要がある。
【００３７】
実施例1
リドカインおよびその誘導体の麻酔活性の比較分析
方法および評価
A.動物
Oswaldo Cruz Foundation's Center of Laboratory Animal Raisingから来た、体重200〜250gの雌および雄のウィスターラットを使用した。動物を伴う手順が調査され、Oswaldo Cruz Foundation's Comittee of Animal Ethicsにより認可された（CEUA-FIOCRUZ、認可番号00085-02）。
【００３８】
B.局所麻酔活性
ジエチルエーテルが充満している雰囲気への曝露により短時間麻酔をかけた後、動物の背側領域を三分割し、そこに試験用物質で皮内注射を行い、用量は、0.5〜4μMol/部位および賦形剤（NaCl 0.9％）（負の対照）に変え、最終容量は50μlであった。各動物が6回の注射を受け、4匹の動物を各試験物質に使用した。感受性の統合性を評価するために、適用点をピンセットで機械的に刺激した。以前に報告されたものに従って、機械的な刺激の後で皮膚の局所退縮が観察されるたびに、部位には麻酔がかかっていないと考えられた。皮内注射を行った10分後に評価を開始し、これを、皮膚退縮反応が得られるまで5分毎に続けた。値（平均±標準誤差、SEM）を分の「麻酔時間」によって表わした。
【００３９】
結果
0.5〜4μMol/部位の用量で投与すると、JM23-1、JM24-1、JM25-1およびJMF2-1として同定されたリドカイン誘導体は、リドカインにより証明されているものよりも有意に少ない麻酔時間を表わした（図1）。これらの分子は、低い麻酔活性規準、ならびに悪寒戦慄、痙攣および虚脱（データは示さず）を含む挙動の変調の兆候の不在に基づいて選択される複数のリドカイン誘導体のうちから選択した。誘導体JMF2-1の麻酔効果の最小化が強調され、その高用量（4μMol/部位）は、最大28±1分間（n＝4）活性のままであったが、リドカインはその部位に168±3分間（n＝4）麻酔をかけた。試験分子の麻酔効能の順位は、
リドカイン＞＞JM24-1＞JM25-1＞JM23-1＞JMF2-1
であった。
【００４０】
以前に確立された実験によって、図1から、成体ウィスターラットの背側領域の皮膚部位において評価されたリドカインおよびその誘導体の局所麻酔効果が観察される。分の「麻酔時間」によって表わされる値は、最小限4匹の動物の平均±SEMとして表わされる。幾つかのSEMバーがグラフに示されていないが、それは、群を代表する記号よりもそれらが低いからである。0.5〜4μMol/部位の間で変動する各用量において、誘導体の適用後に得られる値を、それぞれの用量でのリドカイン注射後に証明されているものと統計的に比較した。リドカイン誘導体は、全ての試験用量において、リドカインよりも有意に少ない麻酔時間を示した。
【００４１】
実施例2
リドカイン、JM24-1およびJMF2-1によるGH3中のNa+電流の強直性阻止
方法および評価
ラットクローン下垂体GH3細胞を、10％ウシ胎児血清、ペニシリン（100U/ml）およびストレプトマイシン（100μg/ml）を含有するRPMI 1640培地で培養し、1〜2日以内に使用するために、5％CO2加湿雰囲気下、37℃でガラスシート上にプレーティングした。イオンチャンネル電流をパッチクランプ技術によって記録した。カバーグラス上で培養した細胞を、顕微鏡の載物台に固定されたチャンバーの中に置き、細胞外生理食塩水（A）（mM）；150 NaCl、5 KCl、1 MgCl2、0.01 CaCl2、1 EGTA、10 HEPES、2 BaCl2、0.1 CdCl2、NaOHにより室温（22〜25℃）でpH7.4に調整、を用いて連続的に灌流した。細胞は、倒立顕微鏡（Axiovert 100, Carl Zeiss, Oberkochem, Germany）により位相差モードを使用して観察した。密閉式（＞10GΩ）全細胞電位固定記録を、Axopatch-1Dアンプ（Axon Instruments, San Mateo, CA）により実施した。Na+電流をアンタゴニスト（リドカイン、JM24-1、またはJMF2-1）の存在下または不在下で記録した。直列抵抗は、ピペットが、細胞内生理食塩水（B)（mM）；150 KCl、5 NaCl、1 MgCl2、10 HEPES、および0.1 EGTA、NaOHによりpH7.4に調整、で充填された場合、全ての実験において6〜10MΩであった。パッチ膜の破裂の15分後、本発明者らはイオンチャンネル電流を記録し始めた。パルスプロトコールおよび取得データは、Digidata 1320インターフェース（Axon Instruments, Palo Alto, CA）により制御し、Clampex 9ソフトウエアを使用して、パーソナルコンピューターにより得た。Na+電流の記録は、1KHzでフィルターをかけ、8KHzでサンプリングした。約26％の直列抵抗が電気的に補正された。薬剤を重力によって記録チャンバーに適用した。灌流速度を0.8〜1.1ml/分に維持し、浴容量は50μlであった。
【００４２】
結果
ここで、本発明者らは、GH3細胞のパッチクランプ記録により、Na+電流阻止に対するリドカイン、JM24-1およびJMF2-1の効果を比較的に査定する必要があった。電位作動性Na+電流を、処置の存在下または不在下でこれらの細胞から記録した。対照実験（n＝6）では、GH3細胞を保持電位-80mV〜+60mVのステップパルス（2秒間）で脱分極して、内向きNa+電流をもたらした（データは示さず）。予想されたように、Na+電流の際だった阻止が濃度の増加を伴ったリドカイン（IC50値＝0.18mM）による処置の後で注目された（図2、記号○）。注目すべきことに、JM24-1(図2、記号●）またはJMF2-1（図2、記号▲）のいずれかによる処置がCH3中でNa+電流を阻害したが、所望の濃度が有意に高かった。事実、JM24-1およびJMF2-1の50％阻害濃度は、リドカインの場合で注目されたものよりも29および169倍高いことが見出され（それぞれ5.2mMおよび25.4mM）、それらの低下した麻酔活性と一致した（図1）。
【００４３】
実施例3
リドカインおよびその誘導体は、実験動物においてアレルゲン刺激により引き起こされる肺好酸球浸潤を阻害する。
【００４４】
方法および評価
A.動物、感作および曝露
Oswaldo Cruz Foundation's Center of Laboratory Animal Raisingから来た、体重300〜400gの雌および雄の実験動物を使用した。動物を伴う手順が調査され、Oswaldo Cruz Foundation's Comittee of Animal Ethicsにより認可された（CEUA-FIOCRUZ、認可番号00085-02）。動物を、以前に記載されたことに従って、50μgのオボアルブミンと5mgのAl(OH)3の混合物の皮膚注射によって感作し、その後、オボアルブミン（1％）エアゾールで30分間、14日間曝露した。アナフィラキシー窒息による動物の死亡を避けるため、曝露の30分前に全ての動物を抗ヒスタミンディフェニドラミン（difenidramine）（30mg/kg）により腹腔内で処置した。
【００４５】
B.実験群および処置
それぞれ7匹の動物を用いる以下を含む5つの実験群を研究した。
i）感作された動物が14日目に滅菌生理用食塩水（NaCl、0.9％）エアゾールを30分間受けた負の対照群。
ii）感作された動物が14日目に生理用食塩水で希釈されたオボアルブミン（1％）のエアゾールを30分間受けた正の対照群。
iii）感作された動物が14日目にリドカイン（5％）を伴うオボアルブミン（1％）のエアゾールを30分間受けたリドカイン群。これらの動物は、3時間毎にリドカイン（5％、30分間）のみによる3回の新たなエアゾール投与を受けた。
iv）感作された動物が14日目にリドカイン（5％）を伴うオボアルブミン（1％）のエアゾールを30分間受けたJM24-1群。これらの動物は、3時間毎にJM24-1（5％、30分間）のみによる3回の新たなエアゾール投与を受けた。
v）感作された動物が14日目にリドカイン（5％）を伴うオボアルブミン（1％）のエアゾールを30分間受けたJMF2-1群。これらの動物は、3時間毎にJMF2-1（5％、30分間）のみによる3回の新たなエアゾール投与を受けた。
【００４６】
C.気管支肺胞洗浄および好酸球の計数
以前に記載された技術に従って気管支肺胞空間を洗浄するために、抗原の曝露の24時間後、ペントバルビタール（200mg/kg）の腹腔内注射によって、全ての動物に終末的な麻酔をかけた。全白血球の計数を、Tuerk液での気管支肺胞洗浄試料の希釈の後で行い、直接照明顕微鏡検査法の助けを借りてNeubauerチャンバー中で数えた。好酸球の差次的な計数も、洗浄液試料の遠心分離、ならびに特定の染料（May-Grunwald-Giemsa dye）への曝露の後で、直接照明顕微鏡検査法によって行った。
【００４７】
D.統計的分析
調査した群の平均±標準誤差を、分散分析（ANOVA）試験、続くNewman-Keuls-Student検定による統計に基づいて分析した。0.05またはそれ以下のP値は有意であると考えられた。
【００４８】
結果
図3で示されるように、アレルゲン曝露後の感作実験動物の気管支肺胞領域における好酸球の蓄積は、リドカイン処置に対して明らかに感受性があった。これらのデータは、リドカインがアポトーシスを誘発することによってヒト好酸球の死を誘発することができることを示した、インビトロでの試験で得られる以前の結果を、インビボにおいて確認する。図2は誘導体JM24-1およびJMF2-1の抑制効果も説明し、麻酔薬リドカインの抗炎症性活性がこれらの分子中でそのままの状態を維持しているという命題を支持している。誘導体JM24-1およびJMF2-1は、アレルゲン曝露後の感作実験動物の気管支肺胞領域における好酸球の蓄積を阻止することに関して、リドカインと等しい効力がある。
【００４９】
図3において、実感動物におけるアレルゲン刺激により引き起こされる肺好酸球増多症に対するリドカインおよびその誘導体の阻害効果が観察される。「好酸球の数×106/洗浄液」で表わされる値は、少なくとも7匹の動物の平均±SEMで表わされる。負の対照群では、予め感作された動物を、滅菌生理食塩水（NaCl、0.9％）エアゾールへの曝露によって人為的に曝露した。正の対照群では、感作動物をオボアルブミン1％エアゾールで曝露したが、処置を施さなかった。リドカイン、JM24-1、またはJMF2-1で処置された群では、動物は、3時間毎の他の3回のエアゾール投与に加えて、5％濃度のリドカインまたは試験類似物を伴うオボアルブミン1％を受けた。「＋」は、正と負の対照が比較された場合、統計的に有意な差異（P＜0.05）を表わす。「＊」は、処置群と正の対照群が比較された場合、統計的に有意な差異（P＜0.05）を表わす。リドカイン、JM24-1、およびJMF2-1は、抗原により誘発される好酸球の流入を阻止するのに、等しい効力があった。
【００５０】
実施例4
リドカインおよびその誘導体は、ラットにおいてアレルゲン刺激により引き起こされる血管透過の増加を阻害する。
【００５１】
方法および評価
A.動物および感作プロトコール
Oswaldo Cruz Foundation's Center of Laboratory Animal Raisingから来た、体重200〜250gの雄のウィスターラットを使用した。動物を、水および食餌が自由に入手できるようにして、室温で保持した。動物を伴う手順が調査され、Oswaldo Cruz Foundation's Comittee of Animal Ethicsにより認可された（CEUA-FIOCRUZ、認可番号00085-02）。動物を、50μgのオボアルブミンおよび5mgのAl(OH)3の混合物の皮下注射によって感作し、その後、14日間皮内曝露した。
【００５２】
B.実験群、処置および抗原曝露
動物をジエチルエーテルが充満した雰囲気で麻酔をかけ、生理食塩水および濃度の増加を伴うリドカインまたはその誘導体の合計容量50μl/部位を用いて異なる部位に皮内注射する前に、背側領域を三分割した。4つの実験群をそれぞれ4匹の動物で試験した。
I.生理食塩水およびリドカイン(0.38〜1.5μMol/部位）の皮内注射を受ける、リドカイン群；
II.生理食塩水およびJM24-1（0.3〜3μMol/部位）の皮内注射を受ける、JM24-1群；
III.生理食塩水およびJM25-1（0.3〜3μMol/部位）の皮内注射を受ける、JM25-1群；
IV.生理食塩水およびJMF2-1（0.3〜3μMol/部位）の皮内注射を受ける、JMF2-1群。
【００５３】
試験物質の最初の適用から10分後、静脈洞陰茎における血漿溢流を標識するため、エバンスブルー生体染色色素（25mg/kg）の静脈内投与のために、ジエチルエーテルチャンバー内で動物に再び麻酔をかけた。エバンスブルーの適用から15分経過して、生理食塩水または試験物質で予め刺激された部位を、今度はオボアルブミン（3μg/部位）または賦形剤（NaCl、0.9％）により最終容量20μlで刺激した。
【００５４】
C.反応の定量化
抗原曝露の30分後、動物をCO2が充満した雰囲気で殺処理し、溢流染料の領域および強度に基づいて血漿溢流の強度を評価するために、背側の皮膚を取り除いた。皮膚の内面の溢流点のデジタル化の後で、スキャナー（HP製、ScanJet 4c型）および画像分析（Image Pro Plus, version 4.5.1, Media Cybernetics, USA）を使用して、各部位における反応の強度を測定した。定量化パラメーターは、積分光学濃度（IOD)であった。これは、正確には分析部位の平均ブルーにより割られたの領域の積である。
【００５５】
D.統計的分析
異なる実験群で得られた結果を、平均±標準誤差で表わし、分散分析（ANOVA）試験、続くNewman-Keuls-Student検定によって、統計的に分析した。0.05またはそれ以下の「P」値は有意であると考えられた。
【００５６】
結果
オボアルブミン（3μg/部位）の皮内注射は、血漿溢流の強い反応を引き起こし、これは、リドカイン（0.19〜3μMol/部位）によって、適用用量に比例して阻害された（図4）。誘導体JM24-1（図5）、JM25-1(図6）およびJMF2-1（図7）も、リドカインによる主題の治療後に観察されるものに匹敵する用量および効果で、抗原刺激により引き起こされる血漿溢流を阻害することができた。これらの結果は、試験された誘導体が、アレルゲン刺激により誘発される血管透過の増加および血漿溢流を阻止するリドカインの能力を保持することを示す。
【００５７】
図4および7では、ラットにおいてアレルゲン刺激により引き起こされる血管透過の増加の阻害における、リドカインおよびその誘導体の効果が示されている。積分光学濃度（IOD)で表わされる値は、少なくとも4匹の動物の平均±SEMとして示される。動物は、滅菌生理食塩水（NaCl、0.9％）、リドカイン（0.38〜1.5μMol/部位）または類似物（0.3〜3.0μMol/部位）の、異なる部位における皮内注射を受けた。記号（＋）および（＊）は、負と正の対照群がそれぞれ比較された場合、統計的に有意な差異（P＜0.05）を表わす。血管透過の増加の阻害において、類似物JM24-1、JM25-1およびJMF2-1は、リドカインと等しい効力があった。
【００５８】
実施例5
リドカインおよびその誘導体は、感作実験動物の腸平滑筋（回腸）のアナフィラキシー収縮を阻害する。
【００５９】
方法および評価
A.動物、感作および標的組織の調製
Oswaldo Cruz Foundation's Center of Laboratory Animal Raisingから来た、体重300〜400gの雌および雄の実験動物を使用した。動物を伴う手順が調査され、Oswaldo Cruz Foundation's Comittee of Animal Ethicsにより認可された（CEUA-FIOCRUZ、認可番号00085-02）。動物を、50μgのオボアルブミンおよび5mgのAl(OH)3の混合物の皮下注射によって感作した。感作の14〜30日後、腹を開き、回盲弁を位置づけするために、実験動物を炭酸ガスのチャンバーで殺処理した。この時点で、腸を切断し、約20cmの小腸の切片（回腸に相当する）を注意深く取り除き、内部をタイロード（組成、mM）（NaCl 137; KCl 2.7; NaH2PO4 0.42; NaHCO3 11.9; MgCl2 0.5; CaCl2 1.8; グルコース5.6）の温溶液（37℃）で洗浄して、糞便内容物を除去した。非アナフィラキシー収縮（ヒスタミンによる収縮）に対するリドカインおよび類似物の効果の研究における実験では、非感作実験動物を使用した。
【００６０】
B.収縮測定法および処置
標準的な手順に従って、約3cmの回腸断片を10mlのガラスキュベット中に縦に入れ、37℃のタイロード溶液で浸し、カルボジェン（O2、95％およびCO2、5％）で通気し、アトロピンで補充した。組織の一方の端をロッドに結んだが、ロッドからキュベットに移した後、他方の端を変換器と結合した。データを取得するためにコンピューターシステムに接続した変位力変換器に助けによって、収縮を等張力的に記録した（基底張力は1g）。30分間の平衡の後、各切片を反応が安定するまでヒスタミン（1μM)により繰り返し刺激した。アナフィラキシー収縮を誘発するため、感作実験動物の回腸切片をオボアルブミン（10μg/ml）で刺激した。阻害収縮活性を試験するために実施された実験において、オボアルブミン（10μg/ml）またはヒスタミン（5μM)による組織の刺激は、10分前に栄養溶液に添加されたリドカインまたはその誘導体の同時インキュベーションのレジメン（regime）で生じた。結果を、刺激および未処置の標本で得られた収縮効果に関して計算された阻害の百分率として、表わした。
【００６１】
C-統計的分析
濃度反応データを、グラフィックソフトウエア（GraphPad Prism, USA）の助けにより非線形回帰曲線によって調整した。ヒスタミンまたは抗原による刺激後に収縮反応を50％阻害する、収縮反応を阻害するために必要なアンタゴニストの濃度（IC50）を、抗痙攣効能と比較するために使用した。値を、平均±標準誤差で表わし、分散分析（ANOVA）試験、続くNewman-Keuls-Student検定によって、統計的に分析した。0.05またはそれ以下の「P」値は有意であると考えられた。
【００６２】
結果
結果は、リドカインによる処置が、抗原（図8）およびヒスタミン（図9）により誘発された実験動物の単離された回腸の収縮を、濃度反応依存的に阻害したことを示し、それぞれ1.43±0.09mMおよび1.41±0.12mMのIC50値であった。結果は、また、ヒスタミンにより刺激された収縮（図9）のように、アナフィラキシー収縮（図8）の場合において、リドカイン誘導体を用いる処置に主要な感受性を示した。これらの結果は、麻酔活性がリドカインの抗痙攣効果に関連しているだけではないことを明確に示す。これらは、また、試験した誘導体がこの系においてリドカインよりも有意に効能があることを明らかにしたことを示す。表1で表わされているIC50値に基づいて、アナフィラキシー収縮を阻止する試験物質の効能の順位は、JM25-1＞JM24-1＞JM23-1＞リドカイン、であった。
【００６３】
（表１）抗原（10μg/ml）またはヒスタミン（5μM)により誘発された実験動物の単離された回腸の収縮反応を50％阻害するのに必要なリドカインおよびその誘導体の濃度（IC50)。
2008501726.tif 000009
【００６４】
値は、少なくとも3匹の動物から得られる平均±SEMを表わす。星印は、リドカイン群と比較される場合、統計的に有意な差異（P＜0.05）を表わす。
【００６５】
図8は、アナフィラキシー刺激（オボアルブミン10μg/ml）により誘発された実験動物の単離された回腸の収縮を濃度依存的によって阻害する、リドカインまたはその誘導体の同時インキュベーションである。値は、少なくとも3匹の動物の阻害率の平均±SEMを表わす。
【００６６】
一方、図9は、ヒスタミン刺激（5μM)により誘発された実験動物の単離された回腸の収縮を濃度依存的によって阻害する、リドカインまたはその誘導体の同時インキュベーションである。値は、少なくとも3匹の動物の阻害率の平均±SEMを表わす。
【００６７】
実施例6
リドカインおよびその誘導体は、アナフィラキシー刺激により前収縮された実験動物の気管の弛緩を誘発する。
【００６８】
方法および評価
A.動物、感作および組織標本
Oswaldo Cruz Foundation's Center of Laboratory Animal Raisingから来た、体重300〜400gの雌および雄の実験動物を使用した。動物を伴う手順が調査され、Oswaldo Cruz Foundation's Comittee of Animal Ethicsにより認可された（CEUA-FIOCRUZ、認可番号00085-02）。動物を、50μgのオボアルブミンおよび5mgのAl(OH)3の混合物の皮下注射によって感作した。感作の14〜30日後、気管を取り除くために、実験動物を炭酸ガスのチャンバーで殺処理した。気管を、クレブス液（組成、mM）（NaCl-119; KCl-4.7; NaH2PO4-1.2; NaHCO3-25; MgC12-1.2; CaC12-2.5 およびグルコース-11.5）を含有するペトリ皿に移した。全ての切片を、気管の筋肉部分である末端で切断した約3〜4個のリングの断片に分けた。
【００６９】
B.標本のマウント（mouting）、収縮測定法および処置
各断片は、一方の端をロッドに結んだが、ロッドから10mlガラスキュベットに移した後、他方の端を等尺性変換器（U Basile, Italy）と結合した。組織を、カルボジェン（O2、95％およびCO2、5％）により通気したクレブス液に37℃で浸けたままにした。収縮を、データ取得のコンピューターシステム（Letica, Spain）の助けにより記録した。30分間の平衡の後、各切片を、リドカインおよびその誘導体を用いる弛緩の濃度反応曲線を生成するために、オボアルブミン（20μg/ml）で前収縮した。結果を、アナフィラキシー前収縮の平坦域に対する弛緩の百分率として示した。
【００７０】
C-統計的分析
濃度反応データを、グラフィックソフトウエア（GraphPad Prism, USA）の助けにより非線形回帰曲線によって調整した。鎮痙効能を比較するために、前収縮平坦域の50％の割合で弛緩を得るために必要なアンタゴニストの濃度（IC50)を使用した。値を、平均±標準誤差で表わし、分散分析（ANOVA）試験、続くNewman-Keuls-Student検定によって、統計的に分析した。0.05またはそれ以下の「P」値は有意であると考えられた。
【００７１】
結果
以前の研究を裏付けるように、結果は、リドカインがアナフィラキシー刺激により前収縮した気管に依存して濃度反応弛緩を誘発できることを示し（図10）、1.35±0.02（平均±SEM)（N＝3）（表2）と等しいIC50値であった。図9は、リドカイン誘導体JM23-1、JM24-1およびJM25-1が、抗原刺激により引き起こされる痙攣を回復することにおいて、リドカインそれ自体よりも効能があることを、再び示している。表2で示されるように、リドカインのIC50と比較すると、誘導体のIC50値は、6〜45倍の比率で有意に低い削減到達を示し、これらの誘導体のアナフィラキシー痙攣に対する主要な感受性を証明している。示されたIC50値に基づいて、この系における試験物質の効能の順位は、JM24-1＞JM25-1＞JM23-1＞リドカイン、であった。
【００７２】
（表２）実験動物の気管のアナフィラキシー痙攣の50％の弛緩に必要なリドカインおよびその誘導体の濃度値（IC50)
2008501726.tif 000010
【００７３】
値は、少なくとも3匹の動物から得られる平均±SEMを表わす。星印は、リドカイン群と比較される場合、統計的に有意な差異（P＜0.05）を表わす。
【００７４】
実施例7
リドカインおよびその誘導体は、ラットの背側皮下組織の断片によるヒスタミンのアナフィラキシー放出を阻害する。
【００７５】
方法および評価
A.動物、感作および組織標本
Oswaldo Cruz Foundation's Center of Laboratory Animal Raisingから来た、体重180〜200gの雌および雄のウィスターラットを使用した。動物を伴う手順が調査され、Oswaldo Cruz Foundation's Comittee of Animal Ethicsにより認可された（CEUA-FIOCRUZ、Port. 00085-02）。ラットを、50μgのオボアルブミンと5mgのAl(OH)3の混合物を含有する皮下注射によって感作した。感作の14日後、動物を、背側皮下組織を除去するために、CO2チャンバーで殺処理し、それを、PBSを含有するペトリ皿中で約3mmのより小さい切片に断片化した。断片を、Ca++およびMg++を有する500μlのハンクス液を含有する48個のプールを持つ皿に一つ一つ移した。
【００７６】
5つの実験群を四回通り試験した。
I.生理食塩水群、負の対照、組織が処置または刺激のどちらも受けていないプール；
II.オボアルブミン群、正の対照、組織は、処置を受けていないが、オボアルブミン（300μg/ml）により刺激を受けたプール；
III.JM24-1群、組織がオボアルブミン（300μg/ml）により刺激を受ける前にJM24-1で予め処置を受けたプール；
IV.JM25-1群、組織がオボアルブミン（300μg/ml）により刺激を受ける前にJM25-1で予め処置を受けたプール；
V.JMF2-1群、組織がオボアルブミン（300μg/ml）により刺激を受ける前にJMF2-1で予め処置を受けたプール。
【００７７】
処置および未処置プールを、抗原曝露の前に、代謝インキュベーター（95％のO2および5％のCO2を含有する雰囲気）中、37℃で60分間保持した。オボアルブミン（300μg/ml）の添加の後、全てのプールを再び代謝オーブンで60分間を超えてインキュベートした。以前の研究に従って、乾燥および計量のために組織を取り除いた後、培地を収集し、過塩素酸のO.4Nの存在で酸性化し、150×gで10分間の遠心分離の後、ヒスタミンの蛍光定量化時まで、-20℃で保存した。値は、mgの組織によるヒスタミンの放出をナノグラムのように示した（乾燥重量）。
【００７８】
結果
結果は、ヒスタミンのアナフィラキシー放出に対するリドカインの阻害効果が、IgEマスト細胞の系の活性化の後で発生したという以前のデータを裏付けた。誘導体JM24-1およびJM25-1もリドカインに匹敵する濃度でヒスタミンを放出できることを示し、一方、JMF2-1は、この系において約29倍より効能があることを明らかにした（図11）。また試験された誘導体JM23-1は不活性であった（データは示さず）。表3で示されるIC50のデータに基づいて、試験した活性分子のヒスタミン放出の阻害活性の効能の順位は、JMF2-1＞リドカイン＞JM24-1＞JM25-1、であった。
【００７９】
図11は、積極的に感作されたラットの背側皮下組織由来のヒスタミンのアナフィラキシー放出に対するリドカイン、JM24-1、JM25-1およびJMF2-1による処置の効果を示す。
【００８０】
（表３）ラットの皮下組織のアナフィラキシー刺激により引き起こされるヒスタミン放出を50％阻害するのに必要なリドカイン濃度およびその誘導体（IC50）の値
2008501726.tif 000011
【００８１】
実施例8
ラットの好酸球中のカルシウム流入に対するリドカインおよびその誘導体の効果
方法および評価
A.動物
Oswaldo Cruz Foundation's Center of Laboratory Animal Raisingから来た、体重200〜250gの雌および雄のウィスターラットを使用した。動物を伴う手順が調査され、Oswaldo Cruz Foundation's Comittee of Animal Ethicsにより認可された（CEUA-FIOCRUZ、認可番号00085-02）。
【００８２】
B.好酸球の単離
以前に記載されたように、動物をCO2チャンバーで殺処理し、10〜15％の好酸球を含有する細胞集団を、同様の20mlのハンクス液で洗浄した後の腹膜腔から回収した。遠心分離の後、細胞沈殿物を再懸濁し、白血球のサブタイプ（単核細胞、好酸球、およびマスト細胞）を、400×gで25分間遠心分離して、パーコールの非連続勾配（二層）に分離した。好酸球（純度85％〜95％）を56％〜72％の界面から回収し、PPMi媒質で洗浄して、パーコールおよび関連物の残留物を除去した。Turk液中の試料を希釈した後、単離された全細胞を得て、直接照明顕微鏡検査法の助けを借りてNeubauerチャンバー中で数えた。集団純度分析を、May-Grunwald-Giemsaで染色された細胞遠心分離物の直接照明顕微鏡検査法によって行った。
【００８３】
C.精製された好酸球中の細胞質基質カルシウムの測定
記載されたように、好酸球（1×107/ml）を3μMのFura 2-AMで投入し、0.1％BSAで満たされているPBSで洗浄し、0.25％BSA、HEPESおよびグルコース（10mM）を含有する最終濃度0.5×106/mlのPBSに再懸濁した。細胞のアリコート（1.5ml）を石英キュベットに分配し、使用する前に、1mMのカルシウムにより37℃で10分間平衡させた。以前に記載されているように、蛍光変化を蛍光光度計Shimatzu（RF 1501型）で測定した。確立さた方法に従って、遊離カルシウムの微積分を蛍光スペクトル（励起波長340nmおよび380nm；発光510nm）から導き出した。値を対照群に対する阻害率として表わした。
【００８４】
3つの実験群を試験した。
I.Fura 2-AMにより予め投入されている好酸球を、一過性カルシウムの測定のために血小板活性化因子（PAF）（1μM)で刺激した、対照群。
II.Fura 2-AMにより予め投入されている好酸球を、一過性カルシウムの測定のためにPAF（1μM)で刺激する前に、用量の増加を伴うJM23-1で5分間インキュベートした、JM23-1群。
III.Fura 2-AMにより予め投入されている好酸球を、一過性カルシウムの測定のためにPAF（1μM)で刺激する前に、用量の増加を伴うJM23-1で5分間インキュベートした、JM24-1群。
【００８５】
D.統計的分析
値を、平均±標準誤差で表わし、分散分析（ANOVA）試験、続くNewman-Keuls-Student検定によって、統計的に分析した。0.05またはそれ以下の「P」値は有意であると考えられた。
【００８６】
結果
図12で示されるように、リドカイン（1mMで0.1）は、PAF(1M）で刺激した好酸球中の細胞質基質カルシウムの濃度依存性の増加を阻害し、最高濃度で47±2％（平均±SEM）（n＝8）の阻止に達した。図12は、また、誘導体JM23-1は、この系においてリドカインと等しい効力があり、類似物JM24-1は、低濃度では有効性が低いが、高濃度ではリドカインおよびJM23-1と同程度に有効であることを示す。
【００８７】
したがって、PAFによる好酸球活性系において、細胞質基質カルシウムの濃度の増加によって評価すると、試験分子の阻害効能順位は、リドカイン＝JM23-1＞JM24-1、であった。
【００８８】
図12は、ラットの好酸球をPAFで刺激した後の細胞質基質カルシウムの濃度の増加に対する、リドカインおよびその誘導体の効果を示す。値を、少なくとも4回の異なる実験の平均±SEMとして表わした。星印は、未処置群と比較した場合、統計的に有意な差異（P＜0.05）を表わす。
【００８９】
実施例9
リドカインおよびその誘導体の痙攣活性の比較分析
方法および評価
A.動物
Oswaldo Cruz Foundation's Center of Laboratory Animal Raisingから来た、体重25〜30gの雌および雄のスイス44マウスを使用した。動物を伴う手順が調査され、Oswaldo Cruz Foundation's Comittee of Animal Ethicsにより認可された（CEUA-FIOCRUZ、Act 00085-02）。
【００９０】
B.痙攣性発作
10匹の動物の群を、JM23-1、JM24-1、またはJMF2-1（40〜500mg/Kg）により腹腔内注射し、痙攣反応の出現を観察するためにプラスチックボックス内に放置した。各群において強直間代性痙攣の特徴的な兆候を示した動物の割合を、前記の薬剤注射から15分後に決定した。各分子では、動物の50％に痙攣臨床像を誘発するのに必要な用量（DE50)を、補極した（interpoled）、線形回帰曲線（GraphPad Prim, version 3.03）によって決定した。
【００９１】
結果
局所麻酔薬の主要な毒作用の確認されている可能性を考慮して、これらの分子により紹介された痙攣性発作の危険性への最初の取り組みとして、リドカインおよび3つの誘導体の用量反応曲線をマウスにおいて決定した。40〜500mg/Kg用量で腹腔内投与されると、分子JM23-1、JM24-1、およびJMF2-1は、リドカインで証明されているものよりも顕著に少ない痙攣活性を表わした（図10）。リドカインが注射動物の100％に痙攣をもたらした条件である、80mg/Kgの用量でマウスに痙攣を誘発できる同様の物質がないことを強調することは重要である。DE50値は、リドカイン、JM23-1、JM24-1、およびJMF2-1でそれぞれ62 mg/kg、154 mg/kg、230 mg/kg、および305 mg/kgであった。
【００９２】
したがって、試験した分子の痙攣活性の順位は、リドカイン＞JM23-1＞JM24-1＞JMF2-1であった。全体として、結果はリドカインの誘導体にはより高い安全域があることを示唆している。
【００９３】
図13では、スイス44マウスの腹腔内に注射されたリドカインおよびその誘導体の、痙攣促進（pro-convulsivant）活性の比較評価を示す。各投与用量で10匹の動物を使用した。
【図面の簡単な説明】
【００９４】
【図１】以前に確立された実験に従って成体ウィスターラットの背側領域の皮膚部位において評価されたリドカインおよびその誘導体の局所麻酔効果。
【図２】リドカイン（○）、JM24-1（●）およびJMF2-1（▲）の外部灌流による、GH3細胞中のNa+電流の強直性阻止。
【図３】実験用動物においてアレルゲン刺激によって引き起こされる肺好酸球増多症に対するリドカインおよびその誘導体の阻害効果。
【図４】ラットにおいてアレルゲン刺激により引き起こされる血管透過の増加の阻害におけるリドカインおよびその誘導体の阻害効果。
【図５】ラットにおいてアレルゲン刺激により引き起こされる血管透過の増加の阻害におけるJM24-1誘導体の効果。
【図６】ラットにおいてアレルゲン刺激により引き起こされる血管透過の増加の阻害におけるJM25-1誘導体の効果。
【図７】ラットにおいてアレルゲン刺激により引き起こされる血管透過の増加の阻害におけるJMF2-1誘導体の効果。
【図８】アナフィラキシー刺激（オボアルブミン）により実験動物において誘発される腸平滑筋（回腸）のアナフィラキシー収縮の阻害におけるリドカインおよびその誘導体の阻害効果。
【図９】ヒスタミンを用いる刺激により誘発される腸平滑筋（回腸）の収縮の阻害におけるリドカインおよびその誘導体の阻害効果。
【図１０】アナフィラキシー刺激により前収縮された実験動物の気管の濃度依存的な弛緩の誘発におけるリドカインおよびその誘導体の阻害効果。
【図１１】ラットの背側皮下組織の断片によるヒスタミンのアナフィラキシー放出の阻害におけるリドカインおよびその誘導体の効果。
【図１２】PAF（血小板活性化因子）によるラットの好酸球の刺激後の細胞質基質カルシウム濃度の増加におけるリドカインおよびその誘導体の効果。
【図１３】スイス44マウスの腹腔内に注射されたリドカインおよびその誘導体の痙攣促進活性の比較評価。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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