(57)【要約】  本発明は免疫活性化組成物を提供する。一般的に、免疫活性化組成物は１つの抗原ペプチドと共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を包含する少なくとも部分的に精製された複合体を包含する。ある実施形態において、免疫活性化組成物はモノマー複合体を含有してよい。他の実施形態において、免疫活性化組成物は複合体及び少なくとも１つの他の抗原ペプチドの凝集体（例えば、他の複合体及び／または非複合体ペプチド）を包含する。本発明はまた、かかる免疫活性化組成物の使用方法を提供する。ある実施形態において、この方法は免疫活性化組成物を免疫細胞に接触させることによる免疫反応の誘導を包含する。他の実施形態において、本方法は、病状における少なくとも１つの症状又は臨床的徴候を改善するのに有効な量で被験者に免疫活性化組成物を投与することによる病状の治療を包含する。
2008539252.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む免疫活性化組成物：
少なくとも１つのＩＲＭ部分及び少なくとも２つの抗原ペプチドを含み、そのうちの少なくとも１つの抗原ペプチドが前記ＩＲＭ部分と共有結合する、少なくとも部分的に精製された抗原凝集体を含む、前記免疫活性化組成物。
【請求項２】
前記凝集体が実質的に均質なペプチド集団を含む、請求項１に記載の免疫活性化組成物。
【請求項３】
前記凝集体が少なくとも２つの異なるペプチドを含む、請求項１に記載の免疫活性化組成物。
【請求項４】
少なくとも２つの異なるＩＲＭ／抗原複合体を含み、ここで、第１のＩＲＭ／抗原複合体はＩＲＭ部分に共有結合する第１の抗原ペプチドを含み、第２のＩＲＭ／抗原複合体はＩＲＭ部分に共有結合する第２の抗原ペプチドを含む、請求項３に記載の免疫活性化組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの抗原ペプチドがウイルス抗原の抗原部分の少なくとも一部である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫活性化組成物。
【請求項６】
前記ウイルス抗原がＨＩＶ抗原である、請求項５に記載の免疫活性化組成物。
【請求項７】
前記ＨＩＶ抗原がＧａｇ４１の抗原部分の少なくとも一部である、請求項６に記載の免疫活性化組成物。
【請求項８】
抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む部分的に精製されたモノマーＩＲＭ／抗原複合体をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫活性化組成物。
【請求項９】
重量で少なくとも１０％の抗原凝集体を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫活性化組成物。
【請求項１０】
重量で少なくとも５０％の抗原凝集体を含む、請求項９に記載の免疫活性化組成物。
【請求項１１】
重量で少なくとも７０％の抗原凝集体を含む、請求項１０に記載の免疫活性化組成物。
【請求項１２】
重量で少なくとも９０％の抗原凝集体を含む、請求項１１に記載の免疫活性化組成物。
【請求項１３】
重量で少なくとも９９％の抗原凝集体を含む、請求項１２に記載の免疫活性化組成物。
【請求項１４】
製薬上許容できるビヒクルをさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の免疫活性化組成物。
【請求項１５】
免疫活性化組成物の作製方法であって、以下のステップ：
ＩＲＭ化合物及び抗原ペプチドの混合物を提供し；
少なくとも１つのＩＲＭ部分及び少なくとも２つの抗原ペプチドを含み、そのうちの少なくとも１つの抗原ペプチドがＩＲＭ部分と共有結合する抗原凝集体を前記混合物から生成し、それによって前記混合物の非凝集部分も定め；及び
前記混合物の前記非凝集部分の少なくとも一部から前記抗原凝集体の少なくとも一部を分離する、を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記混合物の前記抗原凝集体及び前記非凝集部分が高速液体クロマトグラフィーによって分離される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含み、少なくとも部分的に精製されたモノマーＩＲＭ／抗原複合体を加えることをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記分離された免疫活性化組成物が分離後に重量で少なくとも１０％の抗原凝集体を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記分離された免疫活性化組成物が分離後に重量で少なくとも５０％の抗原凝集体を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記分離された免疫活性化組成物が分離後に重量で少なくとも７０％の抗原凝集体を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記分離された免疫活性化組成物が分離後に重量で少なくとも９０％の抗原凝集体を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記分離された免疫活性化組成物が分離後に重量で少なくとも９９％の抗原凝集体を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＲＭ化合物及び抗原ペプチドの混合物が少なくとも２つの異なる抗原ペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗原凝集体が少なくとも２つの異なる抗原ペプチドを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原凝集体が少なくとも２つの異なるＩＲＭ／抗原複合体を含み、ここで、第１のＩＲＭ／抗原複合体がＩＲＭ部分に共有結合する第１の抗原ペプチドを含み、第２のＩＲＭ／抗原複合体がＩＲＭ部分に共有結合する第２の抗原ペプチドを含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＩＲＭ化合物及び抗原ペプチドの混合物が実質的に均質なペプチド集団を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原凝集体が均質なペプチド集団を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２８】
抗原特異的免疫反応を誘導する方法であって、以下の：
免疫細胞と、前記免疫細胞が抗原凝集体の抗原に対して免疫反応を起こすのに有効な量の少なくとも部分的に精製された前記抗原凝集体とを接触させること、を含む前記方法。
【請求項２９】
前記免疫細胞がインビトロで抗原凝集体と接触する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫細胞がインビボで抗原凝集体と接触する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
被験者における病状の治療方法であって、以下の：
ＩＲＭ部分及び少なくとも２つの抗原ペプチドを含む少なくとも部分的に精製された免疫活性化凝集体を含み、そのうちの少なくとも１つの抗原ペプチドがＩＲＭ部分に共有結合する免疫活性化組成物を被験者に投与すること、ここで、前記免疫活性化組成物は病状における少なくとも１つの症状又は少なくとも１つの臨床的徴候を改善するのに有効な量で投与される、を含む、前記方法。
【請求項３２】
前記免疫活性化凝集体が少なくとも２つの異なる抗原ペプチドを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫活性化凝集体が少なくとも２つの異なるＩＲＭ／抗原複合体を含み、ここで、第１のＩＲＭ／抗原複合体はＩＲＭ部分に共有結合する第１の抗原ペプチドを含み、第２のＩＲＭ／抗原複合体はＩＲＭに共有結合する第２の抗原ペプチドを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記免疫活性化組成物が抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む少なくとも部分的に精製されたモノマーＩＲＭ／抗原複合体をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
前記病状がウイルス性の病状である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記病状が細菌性の病状である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記病状が腫瘍性の病状である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３８】
以下の：
少なくとも部分的に精製された抗原凝集体成分；及び
製薬上許容できるビヒクルを含む、ワクチン。
【請求項３９】
前記抗原凝集体が少なくとも２つの異なる抗原ペプチドを含む、請求項３８に記載のワクチン。
【請求項４０】
前記抗原凝集体が少なくとも２つの異なるＩＲＭ／抗原複合体を含み、ここで、第１のＩＲＭ／抗原複合体はＩＲＭ部分に共有結合する第１の抗原ペプチドを含み、第２のＩＲＭ／抗原複合体はＩＲＭに共有結合する第２の抗原ペプチドを含む、請求項３９に記載のワクチン。
【請求項４１】
抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む、少なくとも部分的に精製されたモノマーＩＲＭ／抗原複合体をさらに含む、請求項３８に記載のワクチン。
【請求項４２】
少なくとも１つの抗原ペプチドがウイルス抗原の少なくとも一部分を含む、請求項３８に記載のワクチン。
【請求項４３】
少なくとも１つの抗原ペプチドが細菌性抗原の少なくとも一部分を含む、請求項３８に記載のワクチン。
【請求項４４】
少なくとも１つの抗原ペプチドが腫瘍性抗原の少なくとも一部分を含む、請求項３８に記載のワクチン。
【請求項４５】
以下の：
抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む少なくとも部分的に精製されたモノマーＩＲＭ／抗原複合体を含む、免疫活性化組成物。
【請求項４６】
実質的に均質な抗原ペプチド集団を含む、請求項４５に記載の免疫活性化組成物。
【請求項４７】
以下の：
第１の抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む第１のＩＲＭ／抗原複合体；及び
第２の抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む第２のＩＲＭ／抗原複合体、を含む請求項４５に記載の免疫活性化組成物。
【請求項４８】
少なくとも１つの抗原ペプチドがウイルス抗原の抗原部分の少なくとも一部である、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の免疫活性化組成物。
【請求項４９】
少なくとも１つの抗原ペプチドが細菌性抗原の抗原部分の少なくとも一部である、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の免疫活性化組成物。
【請求項５０】
少なくとも１つの抗原ペプチドが腫瘍性抗原の抗原部分の少なくとも一部である、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の免疫活性化組成物。
【請求項５１】
重量で少なくとも４０％のモノマー複合体を含む、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の免疫活性化組成物。
【請求項５２】
重量で少なくとも５０％のモノマー複合体を含む、請求項５１に記載の免疫活性化組成物。
【請求項５３】
重量で少なくとも７０％のモノマー複合体を含む、請求項５２に記載の免疫活性化組成物。
【請求項５４】
重量で少なくとも９０％の抗原凝集体を含む、請求項５３に記載の免疫活性化組成物。
【請求項５５】
重量で少なくとも９９％の抗原凝集体を含む、請求項５４に記載の免疫活性化組成物。
【請求項５６】
製薬上許容できるビヒクルをさらに含む、請求項４５〜４７のいずれか１項に記載の免疫活性化組成物。
【請求項５７】
免疫活性化組成物の作製方法であって、以下の：
ＩＲＭ化合物及び抗原ペプチドの混合物を提供し；
抗原ペプチドと共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む抗原モノマー複合体を前記混合物から生成し、それによって前記混合物の非モノマー複合体部分も定め；及び
前記混合物の非モノマー複合体部分の少なくとも一部からモノマー複合体の少なくとも一部を分離することを含む、前記方法。
【請求項５８】
前記混合物の前記モノマー複合体及び前記非モノマー複合体部分が高速液体クロマトグラフィーによって分離される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記分離後の免疫活性化組成物が重量で少なくとも４０％のモノマー複合体を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記分離後の免疫活性化組成物が重量で少なくとも５０％のモノマー複合体を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記分離後の免疫活性化組成物が重量で少なくとも７５％のモノマー複合体を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記分離後の免疫活性化組成物が重量で少なくとも９０％のモノマー複合体を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記分離後の免疫活性化組成物が重量で少なくとも９９％のモノマー複合体を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＩＲＭ化合物及び抗原ペプチドの混合物が少なくとも２つの異なる抗原ペプチドを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
前記免疫活性化組成物が以下の：
第１の抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む第１のＩＲＭ／抗原複合体；及び
第２の抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む第２のＩＲＭ／抗原複合体を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＩＲＭ化合物及び抗原ペプチドの混合物が実質的に均質なペプチド集団を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
前記モノマー複合体が均質なペプチド集団を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６８】
少なくとも１つのＩＲＭ部分及び少なくとも２つの抗原ペプチドを含み、そのうちの少なくとも１つの抗原ペプチドが前記ＩＲＭ部分と共有結合している、少なくとも部分的に精製された抗原凝集体を加えることをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６９】
以下の：
免疫細胞と、前記免疫細胞がモノマーＩＲＭ／抗原複合体の抗原に対して免疫反応を起こすのに有効な量の少なくとも部分的に精製された前記モノマーＩＲＭ／抗原複合体とを接触させること、を含む抗原特異的免疫反応を誘導する方法。
【請求項７０】
前記免疫細胞がモノマーＩＲＭ／抗原複合体とインビトロで接触する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記免疫細胞がモノマーＩＲＭ／抗原複合体とインビボで接触する、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
被験者における病状の治療方法であって、以下の：
抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む少なくとも部分的に精製されたモノマーＩＲＭ／抗原複合体を含む免疫活性化組成物を被験者に投与すること、ここで、前記免疫活性化組成物が病状における少なくとも１つの症状又は少なくとも１つの臨床的徴候を改善するのに有効な量で投与される、を含む、前記方法。
【請求項７３】
前記免疫活性化組成物が以下の：
第１の抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む第１のＩＲＭ／抗原複合体；及び
第２の抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む第２のＩＲＭ／抗原複合体を含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記病状がウイルス性の病状である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
前記病状が細菌性の病状である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７６】
前記病状が腫瘍性の病状である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７７】
以下の：
少なくとも部分的に精製されたモノマーＩＲＭ／抗原複合体成分；及び
製薬上許容できるビヒクルを含む、ワクチン。
【請求項７８】
前記モノマーＩＲＭ／抗原複合体が少なくとも２つの異なる抗原ペプチドを含む、請求項７７に記載のワクチン。
【請求項７９】
以下の：
第１の抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む第１のＩＲＭ／抗原複合体；及び
第２の抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を含む第２のＩＲＭ／抗原複合体、を含む請求項７８に記載のワクチン。
【請求項８０】
少なくとも１つの抗原ペプチドがウイルス抗原の少なくとも一部分を含む、請求項７７に記載のワクチン。
【請求項８１】
少なくとも１つの抗原ペプチドが細菌性抗原の少なくとも一部分を含む、請求項７７に記載のワクチン。
【請求項８２】
少なくとも１つの抗原ペプチドが腫瘍性抗原の少なくとも一部分を含む、請求項７７に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
免疫系における特定の重要な態様を刺激し、並びに特定の他の態様を抑制することで作用する新規の薬剤化合物の開発に対して、近年、著しい成果と共に大きな努力がなされて来た（例えば米国特許第６，０３９，９６９号及び第６，２００，５９２号を参照）。これらの化合物は、本明細書において免疫反応修飾物質（ＩＲＭ）と表されるが、トール様受容体（ＴＬＲ）として既知の基本的な免疫系メカニズムにおいて特定のサイトカインの生合成、共刺激分子の誘導、及び抗原提示能力の向上を誘導するように働くと思われる。それらは多岐にわたる疾患及び病状の治療に有用であり得る。例えば、特定のＩＲＭがウイルス性疾患（例えば、ヒトパピローマ・ウイルス、肝炎、ヘルペス）、腫瘍形成（例えば、基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、光線角化症、黒色腫）、及びＴH２−媒介疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、アトピー性皮膚炎）、自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症）の治療に有用であり得、ワクチン補助剤としても有用である。
ＩＲＭ化合物の多くが有機小分子イミダゾキノリンアミン誘導体（例えば米国特許第４，６８９，３３８号を参照）であるが、他の多くの化合物の分類が知られており（例えば、米国特許第５，４４６，１５３号、同第６，１９４，４２５号、及び同第６，１１０，９２９号を参照）、さらに発見されている。ＣｐＧを包含するオリゴヌクレオチドのような他のＩＲＭは高分子量を有する（例えば、米国特許第６，１９４，３８８号を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００２】
ＩＲＭにおける優れた治療的可能性を考慮すると、既に重要な功績が果たされているにもかかわらず、その使用と治療的利益を拡大する必要性は実質的に継続している。
【課題を解決するための手段】
【０００３】
抗原ペプチドへのＩＲＭの複合は１つ以上の免疫反応性画分を生成し、その各々は、単なるＩＲＭと抗原ペプチドの混合物よりも免疫反応を生成する能力の高い物質を含有することが分かっている。さらに、免疫反応性画分は分離可能であり、免疫活性化組成物を製造するために、その画分を少なくとも部分的に精製し、１つ以上の精製された画分を使用する可能性を提供する。
【０００４】
したがって、本発明は免疫活性化組成物を提供する。一般的に、免疫活性化組成物はＩＲＭ／抗原複合体を形成するのにＩＲＭ部分に共有結合する少なくとも１つの抗原ペプチドを包含する少なくとも部分的に精製された抗原複合体を包含する。
【０００５】
ある実施形態において、免疫活性化組成物はＩＲＭ部分及び少なくとも２つの抗原ペプチドを包含し、そのうちの少なくとも１つの抗原ペプチドは前記ＩＲＭ部分と共有結合する、少なくとも部分的に精製された抗原凝集体を包含してよい。他の実施形態において、免疫活性化組成物は抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を包含する少なくとも部分的に精製されたモノマー複合体を包含してよい。ある実施形態において、免疫活性化組成物は少なくとも部分的に精製された抗原凝集体及び少なくとも部分的に精製されたモノマー複合体の混合物を包含してよい。ある実施形態において、免疫活性化組成物はワクチンであってよい。
【０００６】
他の態様において、本発明はＩＲＭ化合物及び抗原ペプチドの混合物を提供し；少なくとも１つのＩＲＭ部分を抗原ペプチドに共有結合させて少なくとも２つの免疫活性化画分を混合物から形成し；第２の免疫活性化画分の少なくとも一部から１つの免疫活性化画分の少なくとも一部を分離することを包含する免疫活性化組成物の作製方法も提供する。
【０００７】
ある実施形態において、１つの免疫活性化画分は抗原凝集体を含有してよい。他の実施形態において、１つの免疫活性化画分はモノマー複合体を含有してよい。さらに他の実施形態において、免疫活性化画分はある抗原凝集体及びあるモノマー複合体を含有してよい。
【０００８】
他の態様において、本発明は抗原特異的な免疫反応を誘導する方法であって、一般的に免疫細胞と、ＩＲＭ部分に共有結合する少なくとも１つの抗原ペプチドを包含する少なくとも部分的に精製されたＩＲＭ／抗原複合体を包含する免疫活性化組成物との接触を包含する方法を提供する。ある実施形態において、ＩＲＭ／抗原複合体はモノマー複合体であってよい。他の実施形態において、免疫活性化組成物は、遊離抗原ペプチド又は第２のＩＲＭ／抗原複合体の抗原ペプチド部分であってよい少なくとも１つの他の抗原ペプチドと非共有結合関係にあるＩＲＭ／抗原複合体を包含する抗原凝集体を包含してもよい。
【０００９】
さらに他の態様において、本発明は病状を治療する方法であって、一般的に被験者に病状の予防的又は治療的な処置を提供するのに有効な量で少なくとも部分的に精製されたＩＲＭ／抗原複合体を包含する免疫活性化組成物の投与を包含する方法を提供する。ある実施形態において、ＩＲＭ／抗原複合体はモノマー複合体であってよい。他の実施形態において、免疫活性化組成物は、遊離抗原ペプチド又は第２のＩＲＭ／抗原複合体の抗原ペプチド部分であってよい少なくとも１つの他の抗原ペプチドと非共有結合関係にあるＩＲＭ／抗原複合体を包含する抗原凝集体を包含してもよい。
【００１０】
本発明の様々な他の特徴及び利点が、以下の詳細な説明、実施例、請求の範囲及び添付の図面とともに容易に明らかになるであろう。明細書を通して数箇所において、実施例を列挙することで指針が提供される。それぞれの事例において、列挙される一覧は代表的な群としてのみ与えられるのであって、限定的な一覧として解釈されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
本発明は一般的に、免疫反応を効果的に生成する製剤、及び場合によっては特定の病状を治療する方法を包含する免疫反応を生成する方法を提供する。一般的に、この製剤は抗原ペプチド及び免疫反応修飾物質（ＩＲＭ）の複合体を包含する。いくつかの場合において、この製剤はモノマー性、つまり単一の抗原ペプチドを包含してよい。他の場合において、この製剤は抗原ペプチドの凝集体を包含することができる。
【００１２】
いずれの場合においても、ＩＲＭ／抗原複合体製剤は抗原単体、ＩＲＭ単体、又はＩＲＭ及び抗原の混合物よりもより効果的に免疫反応を増加することができる。したがって、本発明の免疫活性化組成物はその一部である抗原ペプチドに対する免疫反応の増加をもたらし得る。免疫活性化組成物において抗原ペプチドの免疫原性を増加するのは、例えば、所望の結果を達成するための免疫活性化組成物の投与量の減少、免疫活性化組成物の有効性の向上又は達成、治療の迅速化又は完全化、免疫活性化組成物に関する副作用の軽減、又は低コスト化のような１つ以上の利点を提供することができる。
【００１３】
例えば、特定のワクチンは複数の抗原ペプチドを包含し、その中のいくつか（例えばトキソイド）は、例えば、痛み、腫脹、圧痛等の望まない副作用を起こし得る。本発明を実施することで、所望のレベルの免疫反応を提供するのに特定の抗原ペプチドをさほど必要としないように、免疫活性化組成物の特定の抗原ペプチド（例えばワクチントキソイド）に対する免疫反応を十分に増加するので、それによって抗原ペプチドの望まない副作用が削減又は消滅される。
【００１４】
所望の免疫反応を達成する免疫活性化組成物の各抗原ペプチドをさほど必要としないということは、（ａ）例えば特定の抗原ペプチドを得る又は配合するのに費用がかかるような際に免疫活性化組成物の製造を低コスト化する、又は（ｂ）例えば免疫活性化組成物の特定の抗原ペプチドが希少であるか又は極端に高価であるような際により広い免疫活性化組成物の分配を可能とする。
【００１５】
また、抗原ペプチドを本発明の免疫活性化組成物に混合することで、病状の効果的な治療を提供する抗原ペプチドの有効性を向上するか又は達成を助けることができる。したがって、特定の病状を治療するのに有効であると見なされる十分な免疫反応を誘導できない他の免疫活性化組成物に混合した抗原ペプチドであっても本発明の免疫活性化組成物に混合することで、病状の治療における有効性を提供する十分な免疫反応が引き起こされる。
【００１６】
部分的に精製されたモノマー複合体及び部分的に精製された凝集体の双方は、抗原及びＩＲＭの非複合混合物より抗原特異性免疫反応においてより強力な誘導物質であるが、凝集体は一般的にモノマー複合体よりも強力である。したがって、自身に対する抗原特異的免疫反応の程度を調節できるものは、免疫活性化組成物中の凝集体及びモノマー複合体の相対量を調節することで増加する。
【００１７】
したがって、１つの態様において、本発明は免疫活性化組成物を提供する。一般的に、免疫活性化組成物はＩＲＭ／抗原複合体を形成するのにＩＲＭ部分に共有結合する少なくとも１つの抗原ペプチドを包含する少なくとも部分的に精製された抗原複合体を包含する。ある実施形態において、免疫活性化組成物は１つの複合体分子につき単一の抗原ペプチドを有する実質的にはモノマー性である複合体を包含する。他の実施形態において、免疫活性化組成物は少なくとも１つの追加の抗原ペプチドと非共有結合関係にあるＩＲＭ／抗原複合体分子を含む凝集体を包含する。追加の抗原ペプチドは、他のＩＲＭ／複合体分子であるか、又は非複合体であって遊離抗原ペプチドである。ある実施形態において、免疫活性化組成物は、実質的に均質な抗原ペプチドの集合を包含し得るが、他の実施形態において免疫活性化組成物は少なくとも２つの異なる抗原ペプチドを包含し得る。ある実施形態において、免疫活性化組成物は少なくとも１つの部分的に精製されたモノマー複合体及び少なくとも１つの部分的に精製された抗原凝集体の混合物を包含してよい。
【００１８】
他の態様において、本発明は免疫活性化組成物の作製方法を提供する。一般的に、この方法は、ＩＲＭ分子と抗原ペプチド分子の混合物を提供し、抗原凝集体を形成させ、それによって混合物の非凝集部分も定め、混合物の非凝集部分の少なくとも一部から抗原凝集体の少なくとも一部を分離することを包含する。
【００１９】
さらに他の態様において、本発明は免疫活性化組成物の使用方法を提供する。一般的に、この方法は、抗原特異的免疫反応、つまり免疫活性化組成物中に包含される抗原ペプチドに対する直接的な免疫反応を引き起こすための、少なくとも部分的に精製された凝集体又は少なくとも部分的に精製されたモノマーＩＲＭ／抗原複合体を包含する免疫活性化組成物の使用を包含する。ある実施形態において、特定の病状の型によって影響される細胞（例えば、腫瘍細胞又はウイルスに感染した細胞）に対する免疫反応の発生を可能とする。かかる免疫反応は、例えば、ガン、ウイルス感染、細菌感染等のような病状に対する免疫学的治療を提供できる。
【００２０】
本明細書で使用する時、以下の用語は指示された意味を有する：
「改善する」は、特定の病状における症状又は臨床的徴候の特性において、程度、重症度、頻度及び／又は可能性における任意の削減を表す。
【００２１】
「抗原」及びその変形は、免疫反応の標的となるのが可能な任意の物質を表す。例えば、抗原は被験者の有機体によって起こる細胞媒介及び／又は体液性免疫反応の標的であってよい。或いは、免疫細胞と接触する際、抗原は細胞免疫反応（例えば、免疫細胞成熟、サイトカイン製造、抗体製造等）の標的であってよい。
【００２２】
「部分」及びその変形は、例えば特定の生物学的（例えば免疫修飾）又は化学的機能（例えば光反応性）のような特定の特性を示す化合物の一部分を表す。本発明による組成物に関して、用語「部分」は、その他の化合物又はそれらの一部分に結合する際に、結果として生じる結合された免疫活性化組成物の一部分となり得る非結合化合物又はそれらの一部分を表すのに使用され得る。
【００２３】
「ペプチド」は配列の長さや自然発生であるか又は合成であるかに関わらず、アミノ酸残基配列を表す。したがって、用語「ペプチド」は少なくとも２つのアミノ酸を有する任意のアミノ酸配列を表し、全長タンパク質、場合によってはポリタンパク質を包含する。
【００２４】
「治療」又はその変形は、病状に関連する症状又は徴候の任意の程度における削減、進行の制限、改善、又は解消を表す。
【００２５】
本明細書で使用する時、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」、「少なくとも１つの」及び「１つ以上の」は、同じ意味で使用される。したがって、例えば、「１つの（ａｎ）」抗原ペプチドを含むＩＲＭ／抗原ペプチドは、少なくとも１つの抗原ペプチドを包含するＩＲＭ／抗原ペプチド凝集体を意味すると解釈される。
【００２６】
指示がない限り、化合物に関する参照には、任意の異性体（例えば、ジアステレオマー又はエナンチオマー）、塩、溶媒和物、多形体などを包含する任意の製薬上許容できる形態中の化合物を包含し得る。特に、化合物が光学活性である場合、化合物に関する参照は各化合物のエナンチオマー並びにエナンチオマーのラセミ混合物を包含する。
【００２７】
また本明細書において、端点による数の範囲の列挙には、その範囲内に包含されるすべての数（例えば１から５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、など）が包含される。
【００２８】
上述のように、ＩＲＭ化合物は特定のサイトカインの生合成を誘導し、共刺激分子を誘導し、抗原提示能を向上することが知られている。結果として、ＩＲＭ化合物は多岐にわたる疾患及び病状を治療するのに有用であり得る。さらに、米国特許公報第ＵＳ２００４／００９１４９１号に記載されるように、免疫反応を調節するＩＲＭ化合物の能力は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）への抗原及びＩＲＭ化合物の共提示によって増加する。
【００２９】
ＩＲＭ及び抗原を共提示する１つの方法は、ＩＲＭ抗原複合体を形成するために、まずＩＲＭと抗原を共有結合する。実行可能である１つの方法は、紫外線に曝露された際に反応性を持つ光学活性部分を有するＩＲＭ化合物を使用する。溶液中で光学活性ＩＲＭとタンパク質を混合し、紫外線に曝露した際、結果として少なくとも１つのＩＲＭと抗原タンパク質の共有結合が生じる。この技術は多くの異なるタンパク質を使用してＩＲＭ／抗原複合体を生成するのに使用されている。複合体がインビボで投与される際、ＩＲＭ及び抗原が非複合混合物として一緒に投与される際よりも劇的に高いＴ細胞反応を産生することができる。
【００３０】
先に記載されたような技術では２つ以上の免疫反応性画分を製造し、これらの各々は、単なるＩＲＭと抗原の混合物よりも免疫反応を生成する能力の高い物質を含有することが分かっている。１画分には１つ以上のＩＲＭ部分と共有結合する単一タンパク質分子を包含し、本明細書中では「モノマー複合体」として表される。第２の画分には高分子量のタンパク種は、本明細書中で「抗原凝集体」又は単に「凝集体」と表される。
【００３１】
抗原凝集体は追加のペプチド又はペプチド部分と非共有結合関係にある少なくとも１つのＩＲＭ／抗原複合体分子を包含する。したがって、凝集体は複数のＩＲＭ／抗原複合体及び／又は非複合抗原ペプチド（又は遊離)を包含する。しかしながら、全ての場合において凝集体は少なくとも１つのＩＲＭ／抗原複合体を包含し、必然的に抗原ペプチドと共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を包含する。単一ＩＲＭ／抗原複合体が複数のＩＲＭ部分を包含し、凝集体は複数のＩＲＭ／抗原複合体を包含するので、凝集体は多くのＩＲＭ部分を包含し得る。
【００３２】
画分における複合反応生成物の化学的又は物理的特性における少なくとも１つの違いに基づいて、モノマー複合体を含有する画分を、凝集体を含有する画分から分離することができる。かかる分離の結果、少なくとも部分的に精製された一連の画分となる。本明細書で使用する時、「少なくとも部分的に精製された」は、非精製出発物質と比較して任意の程度で特定の構成成分（例えばモノマー複合体又はＩＲＭ／抗原ペプチド凝集体）の存在が富化されている免疫活性化製剤を表す。ある実施形態において、「少なくとも部分的に精製された」は、非精製出発物質の全タンパク質含有量（つまり光反応タンパク質＋遊離タンパク質）に対して特徴付けられ得る。特定の実施形態において、「少なくとも部分的に精製された」は、非精製出発物質の光反応タンパク質含有量に対して特徴付けられ得る。
【００３３】
１つの実施例において、ＩＲＭの抗原ペプチドへの複合化によって、抗原凝集体、モノマー複合体、及び遊離タンパク質の混合物を産生することができ、例えば、約１０％のタンパク質が凝集体形態であり、８５％のタンパク質がモノマー複合体形態であり、５％のタンパク質が遊離している。分離を実行することで、例えば凝集体の半分を含有する第１画分及び、例えば残りのタンパク質を含有する第２画分を作製することができる。本実施例において、画分における凝集体の相対量が出発物質の量よりも増加、つまり、約１０％からほぼ均質にまでなっているので、第１の画分は凝集体の少なくとも部分的に精製された試料であると見なすことができる。除去された凝集体のいくらかが第１画分に入ることによってモノマー複合体が富化されるので、本実施例における第２画分はモノマー複合体の少なくとも部分的に精製された試料であると見なすことができる。
【００３４】
複合体反応生成物は、例えば、分子量、電荷、寸法等の任意の好適な化学的又は物理的特性に基づいて分離され得る。かかる分離における技術としては、例えば、クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣを包含する）、電気泳動及び透析が周知であり、挙げられる。本明細書で使用する時「非精製出発物質」は、物質が、例えば複合体反応混合物から未反応ＩＲＭ、溶媒、又は他の非タンパク性構成成分を除くための透析のような分離技術を事前に行ったかどうかにかかわらず、記載されるような分離技術が適用される物質を表す。
【００３５】
精製の程度は、例えば、製剤における精製成分の濃度の増加、第２成分と比較して精製成分の分子量比又は重量／重量比の増加等のような任意の好適な条件において記載され得る。
【００３６】
画分が一旦分離（つまり、少なくとも部分的に精製される）されると、各画分は免疫反応を誘導する能力を向上することができる。図１は複合体反応生成物における様々な画分が免疫反応を誘導する能力を比較している。モノマーＩＲＭ／抗原複合体は、（ａ）ＩＲＭ及び抗原の非複合混合物、又は（ｂ）紫外線に曝露された抗原のどちらよりも優れた免疫反応を誘導する。凝集体はモノマー複合体以上の免疫反応を誘導する。
【００３７】
特に記載がない限り、本明細書中で用語「免疫活性化組成物」は、少なくとも部分的に精製されたモノマーＩＲＭ／抗原複合体、少なくとも部分的に精製された抗原凝集体、又はその双方を包含する組成物を表す。特に記載がない限り、ＩＲＭ化合物及び抗原はモノマー複合体又は抗原凝集体のどちらかを調製するのに有用であり得る本発明の免疫活性化組成物の調製に使用するのに好適であると特徴付けられる。
【００３８】
ある実施形態において、免疫活性化組成物は少なくとも１つのＩＲＭ部分及び少なくとも２つの抗原ペプチドを包含し、そのうちの少なくとも１つの抗原ペプチドは前記ＩＲＭ部分と共有結合する少なくとも部分的に精製された抗原凝集体を包含する。他の実施形態において、免疫活性化組成物は抗原ペプチドに共有結合する少なくとも１つのＩＲＭ部分を包含する少なくとも部分的に精製されたモノマーＩＲＭ／抗原複合体を包含する。さらに他の実施形態において、免疫活性化組成物は２つ以上の部分的に精製された抗原凝集体製剤、２つ以上の部分的に精製されたモノマー複合体製剤、又は少なくとも１つの部分的に精製された凝集体製剤及び少なくとも１つの部分的に精製されたモノマー複合体製剤の混合物を包含してよい。
【００３９】
抗原ペプチドは、例えば微生物抗原又は腫瘍抗原のような任意の好適な抗原であるか、又はその抗原から得られてよい。抗原部分の形態はタンパク質、タンパク質の抗原フラグメント、リポタンパク質、グリコタンパク質、又は特定の場合においてはポリタンパク質であってよい。
【００４０】
本明細書で使用される微生物抗原は、例えば、ウイルス、細菌、寄生生物、又は菌類の抗原である。したがって、微生物抗原は天然、全長微生物タンパク質、ポリタンパク質、又は天然微生物タンパク質のフラグメントであってよい。或いは、微生物抗原は、微生物抗原に対する免疫反応（体液及び／又は細胞）を誘導する天然の微生物抗原と全く同一か実質的に同じである合成化合物であってよい。かかる抗原は当該技術分野において日常的に使用され、当業者にも周知である。
【００４１】
抗原ペプチドはウイルス抗原であるか、ウイルス抗原から得られてよい。ヒト病原体に対する免疫反応を誘発することのできるウイルス抗原は、例えば、ＨＩＶ−１（例えば、ｔａｔ、ｎｅｆ、ｇｐ１２０、ｇｐ１６０、ｇｐ４０、ｐ２４、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ、ｒｅｖ等）；ヒトヘルペスウイルス（例えば、ｇＨ、ｇＬ、ｇＭ、ｇＢ、ｇＣ、ｇＫ、ｇＥ、ｇＤ、若しくはＨＳＶ１又はＨＳＶ２からのＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７、ＩＣＰ４、又はＩＣＰ３６等の前初期タンパク質等）；サイトメガロウイルス、特にヒト（例えば、ｇＢ等）；エプスタインバーウイルス（例えばｇｐ３５０等）；水痘帯状疱疹ウイルス（例えば、ｇｐＩ、ｇｐＩＩ、ｇｐＩＩＩ又はＩＥ６３等）；肝炎Ｂウイルスのような肝炎ウイルス（例えば、ＰｒｅＳ１、ＰｒｅＳ２、肝炎Ｂ表面抗原、肝炎Ｂコア抗原、又はｐｏｌ）、肝炎Ｃウイルス、又は肝炎Ｅウイルス；パラミクソウイルス（例えば、呼吸器合胞体ウイルス（Ｆ及びＧタンパク質等）、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス）；ヒトパピローマ・ウイルス（例えば、ＨＰＶ６、１１、１６、１８、ｅｇＬ１、Ｌ２、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ８等）；フラビウイルス（例えば、黄熱病ウイルス、デング熱ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス）；ライノウイルス、コロナウイルス（例えばＳＡＲＳ）；又はインフルエンザウイルス細胞（ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、又はＭタンパク質等）；抗原フラグメント又は適切である場合には前述の任意のポリタンパク質の抗原であるか、もしくはその抗原から誘導され得る。
【００４２】
抗原ペプチドとして使用するのに好適であるか、又は抗原ペプチドが得られる細菌性抗原としては、例えば、鉄制御外膜タンパク質、（ＩＲＯＭＰ）、外膜タンパク質（ＯＭＰ）、若しくはせつ腫症を引き起こすアエロモナス・サルモニシダのＡタンパク質；細菌性腎臓病（ＢＫＤ）を引き起こすレニバクテリウムサーモニナラムのｐ５７タンパク質；エルシニア症の主要膜関連抗原（ｍｓａ）、膜発現サイトカイン（ｍｐｒ）、膜発現ヘモリシン（ｉｓｈ）、若しくは鞭毛抗原；パスツレラ病の細胞外タンパク質（ＥＣＰ）、鉄制御外膜タンパク質（ＩＲＯＭＰ）、若しくは構造タンパク質；ビブリオ・アングイラルム若しくはビブリオ・オルダリイのＯＭＰ若しくは鞭毛タンパク質；エドワジエラ・イクタルリ若しくはエドワジエラ・タルダの鞭毛タンパク質、ＯＭＰタンパク質、ａｒｏＡ、又はｐｕｒＡ；白点病の表面抗原；サイトファーガカラムナリの構造若しくは調節タンパク質；若しくはリケッチアの構造又は調節タンパク質；又は前述の任意の抗原フラグメントが挙げられる。
【００４３】
抗原ペプチドとして使用するのに好適であるか、又は抗原ペプチドが得られる寄生性ペプチドとしては、例えば、白点病の表面抗原；熱帯熱マラリア原虫からの抗原（例えば、ＲＴＳ又は例えばＲＴＳ、Ｓ、ＴＲＡＰ、ＭＳＰ１、ＡＭＡ１、ＭＳＰ３、ＥＢＡ、ＧＬＵＲＰ、ＲＡＰ１、ＲＡＰ２、セクエストリン、ＰｆＥＭＰ１、Ｐｆ３３２、ＬＳＡ１、ＬＳＡ３、ＳＴＡＲＰ、ＳＡＬＳＡ、ＰｆＥＸＰ１、Ｐｆｓ２５、Ｐｆｓ２８，Ｐｆｓ２７／２５、Ｐｆｓ１６、Ｐｆｓ４８／４５、又はＰｆｓ２３０等の混合物）からの抗原；又はそれらの抗原フラグメントが挙げられる。
【００４４】
腫瘍抗原はペプチド又はタンパク質のような、ＭＨＣ分子において抗原提示細胞表面上に発現される際、免疫反応を誘発することのできる腫瘍又はガン細胞表面に関連する化合物であってよい。例えば、コーエン（Cohen）他による１９９４年の「ガン研究（Cancer Research）」５４：１０５５に記載されるように、ガン細胞の粗抽出物を調製し抗原を部分的に精製することで、例えばガン細胞から腫瘍抗原を調製することができる。或いは、腫瘍抗原は、好適な宿主内の好適なベクターからの抗原を組み換え発現するか、既知の抗原をデノボ合成するかによって得られる。腫瘍抗原の例としては全長タンパク質又は全長腫瘍抗原タンパク質の免疫原性部分のみが挙げられるが、これらに限定されるものではない。かかる抗原は、組み換え又は当該技術分野において既知の任意の他の手段によって分離又は調製することができる。
【００４５】
用語「腫瘍抗原」及び「ガン抗原」は同じ意味で使用することができ、ガン細胞によって異なった形で発現する抗原を表し、したがって、腫瘍特異的免疫反応を生成するのに活用され得る。腫瘍抗原の例としては、例えば、ＭＡＧＥ、ＭＡＲＴ−１／Ｍｅｌａｎ−Ａ、ｇｐ１００、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）、アデノシンデアミナーゼ結合タンパク質（ＡＤＡｂｐ）、シクロフィリンｂ、結腸直腸関連抗原Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）及びその免疫原性エピトープＣＡＰ−１及びＣＡＰ−２、ｅｔｖ６、ａｍｌ１、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）及びその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、及びＰＳＡ−３、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３−ゼータ鎖、腫瘍抗原のＭＡＧＥ−ファミリー（例えば、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＭＡＧＥ−Ａ２、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ５、ＭＡＧＥ−Ａ６、ＭＡＧＥ−Ａ７、ＭＡＧＥ−Ａ８、ＭＡＧＥ−Ａ９、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＧＥ−Ａ１１、ＭＡＧＥ−Ａ１２、ＭＡＧＥ−Ｘｐ２（ＭＡＧＥ−Ｂ２）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ３（ＭＡＧＥ−Ｂ３）、ＭＡＧＥ−Ｘｐ４（ＭＡＧＥ−Ｂ４）、ＭＡＧＥ−Ｃ１、ＭＡＧＥ−Ｃ２、ＭＡＧＥ−Ｃ３、ＭＡＧＥ−Ｃ４、ＭＡＧＥ−Ｃ５）、腫瘍抗原のＧＡＧＥファミリー（例えば、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ＧＡＧＥ−３、ＧＡＧＥ−４、ＧＡＧＥ−５、ＧＡＧＥ−６、ＧＡＧＥ−７、ＧＡＧＥ−８、ＧＡＧＥ−９）、ＢＡＧＥ、ＲＡＧＥ、ＬＡＧＥ−１、ＮＡＧ、ＧｎＴ−Ｖ、ＭＵＭ−１、ＣＤＫ４、チロシナーゼ、ｐ５３、ＭＵＣファミリー、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ｐ２１ｒａｓ、ＲＣＡＳ１、α−フェトプロテイン、Ｅ−カドヘリン、α−カテニン、β−カテニン及びγ−カテニン、ｐ１２０ｃｔｎ、ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７、ＰＲＡＭＥ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｃｄｃ２７、大腸腺腫様性ポリポーシスタンパク質（ＡＰＣ）、フォドリン、コネキシン３７、Ｉｇ−イディオタイプ、ｐ１５、ｇｐ７５、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド、ヒトパピローマ・ウイルスタンパク質のようなウイルス性生成物、腫瘍抗原のスマッドファミリー、ｌｍｐ−１、ｐ１Ａ、ＥＢウイルスコード化核抗原（ＥＢＮＡ）−１、脳グリコーゲンフォスフォリラーゼ、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−２（ＨＯＭ−ＭＥＬ−４０）、ＳＳＸ−１、ＳＳＸ−４、ＳＳＸ−５、ＳＣＰ−１及びＣＴ−７、及びｃ−ｅｒｂＢ−２；又は前述の任意の抗原フラグメントが挙げられる。
【００４６】
特定の腫瘍抗原に関連するガン又は腫瘍には、例えば、急性リンパ性白血病（ｅｔｖ６；ａｍｌ１；シクロフィリンｂ）、Ｂ細胞リンパ腫（Ｉｇ−イディオタイプ）、グリオーマ（Ｅ−カドヘリン；α−カテニン；β−カテニン；γ−カテニン；ｐ１２０ｃｔｎ）、膀胱ガン（ｐ２１ｒａｓ）、胆道癌（ｐ２１ｒａｓ）、乳ガン（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、子宮頸ガン（ｐ５３；ｐ２１ｒａｓ）、結腸ガン（ｐ２１ｒａｓ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ＭＵＣファミリー）、結腸直腸癌（Ｃ０１７−１Ａ／ＧＡ７３３；ＡＰＣ）、絨毛腫（ＣＥＡ）、上皮細胞ガン（シクロフィリンｂ）、胃ガン（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質）、肝細胞ガン（α−フェトプロテイン）、ホジキンリンパ腫（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、肺ガン（ＣＥＡ；ＭＡＧＥ−３；ＮＹ−ＥＳＯ−１）、リンパ細胞由来白血病（シクロフィリンｂ）、黒色腫（ｐ１５タンパク質、ｇｐ７５、腫瘍胎児抗原、ＧＭ２及びＧＤ２ガングリオシド）、骨髄腫（ＭＵＣファミリー；ｐ２１ｒａｓ）、非小細胞肺ガン（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、鼻咽腔ガン（ｌｍｐ−１；ＥＢＮＡ−１）、卵巣ガン（ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、前立腺ガン（前立腺特異抗原（ＰＳＡ）及びその免疫原性エピトープＰＳＡ−１、ＰＳＡ−２、及びＰＳＡ−３；ＰＳＭＡ；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、膵臓ガン（ｐ２１ｒａｓ；ＭＵＣファミリー；ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２；ｇａ７３３糖タンパク質）、腎臓（ＨＥＲ２／ｎｅｕ；ｃ−ｅｒｂＢ−２）、頸部及び食道の扁平上皮細胞癌（ヒトパピローマ・ウイルスタンパク質のようなウイルス産物）、睾丸ガン（ＮＹ−ＥＳＯ−１）、Ｔ細胞白血病（ＨＴＬＶ−１エピトープ）、及び黒色腫（Ｍｅｌａｎ−Ａ／ＭＡＲＴ−１；ｃｄｃ２７；ＭＡＧＥ−３；ｐ２１ｒａｓ；ｇｐ１００Ｐｍｅｌ１１７）が挙げられる。
【００４７】
ＩＲＭ化合物と共に使用することができる他のガン抗原は、米国特許公報第ＵＳ２００２／０１５６０３３号に提供される。
【００４８】
特定のガンにおける予防的及び／又は治療的処置の提供方法は、例えば、米国特許公報第ＵＳ２００３／０１６１７９７号、同第ＵＳ２００４／００９１４９１号、同第ＵＳ２００４／０１７５３３６号、同第ＵＳ２００４／０１９２５８５号、及び同第ＵＳ２００５／００５４６６５号に記載されている。
【００４９】
免疫活性化組成物は、抗原ペプチドの実質的に均質な集団を包含するか、或いは、２つ以上の異なる抗原ペプチドを包含する。免疫活性化組成物が抗原凝集体を包含する場合、この凝集体は２つ以上の異なる抗原ペプチドを包含してよい。免疫活性化組成物は実質的にモノマーＩＲＭ／抗原複合体のみを包含する場合、この組成物はそれぞれが異なる抗原ペプチドを有する２つ以上のモノマー複合体の集団の混合物を包含してよい。
【００５０】
ある場合において、単一の抗原ペプチドは抗原ペプチドのいくつかの異なる抗原部分に対して、いくつかの明確な抗原特異的免疫反応を誘導し得る。例えば、全長タンパク質はいくつかのエピトープ、つまり、それぞれが明確な抗原特異的免疫反応を誘導できる多くの異なったアミノ酸セグメントを含有し得る。結果として、単一抗原ペプチドによる実質的に均質な集団を包含している免疫活性化組成物であっても、１つ以上の抗原特異的免疫反応、つまり、１つ以上のエピトープに対する免疫反応を産生することができる。
【００５１】
モノマー複合体の混合物は、２つ以上のモノマー複合体の集団を調製し、次に、そのモノマー複合体製剤を混合することで得ることができる。或いは、モノマー複合体の混合物はＩＲＭ化合物と反応するための反応溶液中に２つ以上の抗原ペプチドを提供することで得ることができる。かかる反応は、多抗原凝集体並びにそれぞれに異なる抗原ペプチドを有するモノマー複合体集団の混合物を産生することができる。
【００５２】
例えば、２つ以上の既知の抗原が特定の病状に関連している際、２つ以上の異なる抗原ペプチドを包含する免疫活性化組成物が望ましい。かかる組成物は、例えば、組成物中の各抗原に対して抗原特異的免疫反応を産生することで、組成物の投与を包含する治療の有効性を増加し得る。このようにして罹患細胞は「二重標的化」され、結果として免疫系によってより認識されやすくなる及び／又はより迅速に除去され得る。
【００５３】
例えば、免疫反応が免疫原性の特性を変化させることのできる標的に対して望まれる際、２つ以上の抗原ペプチドを包含する免疫活性化組成物も望ましい。例えば、特定のウイルス性病状に対して有効なワクチンを開発する１つの試みでは、ワクチンによって誘導される免疫反応がその標的を認識せず、したがって、ウイルスを認識しないようにワクチン標的であるウイルスの抗原部分を変化することができる。１つ以上の抗原ペプチドを包含する免疫活性化組成物は、ウイルス上に多抗原標的に対する免疫反応を産生できる。したがって、ワクチンの構成成分によって誘導される免疫反応がその標的を認識できないように１つの標的抗原が変化しても、他の抗原ペプチドによって産生される免疫反応はその標的を認識し、したがって、ウイルスを認識し得る。
【００５４】
ＩＲＭ部分は任意の好適なＩＲＭ化合物であるか、ＩＲＭ化合物から得られてよい。ＩＲＭ化合物は、限定はしないが、抗ウイルス及び抗腫瘍活性を包含する強力な免疫修飾活性を有し得る。特定のＩＲＭは、サイトカインの生成及び分泌を調節する。例えば、特定のＩＲＭ化合物は、例えば、Ｉ型インターフェロン、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＭＩＰ−１、及び／又はＭＣＰ−１のようなサイトカインの生成及び分泌を誘導する。他の例としては、特定のＩＲＭ化合物が、ＩＬ−４及びＩＬ−５のような特定のＴH２サイトカインの生成及び分泌を阻害し得る。加えて、あるＩＲＭ化合物はＩＬ−１及びＴＮＦ（米国特許第６，５１８，２６５号）を抑制すると言われている。
【００５５】
特定のＩＲＭは有機小分子であって（例えば、タンパク質、ペプチド、核酸のような生体巨大分子とは対照的に、約１．６７Ｅ−２１ｇ（１０００ダルトン）未満、好ましくは８．３０Ｅ−２２ｇ（５００ダルトン）未満の分子量）、これらは例えば、米国特許第４，６８９，３３８号、同４，９２９，６２４号、同５，２６５，５７５号、同５，２６８，３７６号、同５，３４６，９０５号、同５，３５２，７８４号、同５，３８９，６４０号、同５，４４６，１５３号、同５，４８２，９３６号、同５，７５６，７４７号、同６，１１０，９２９号、同６，１９４，４２５号、同６，３３１，５３９号、同６，３７６，６６９号、同６，４５１，８１０号、同６，５２５，０６４号、同６，５４１，４８５号、同６，５４５，０１６号、同６，５４５，０１７号、同６，５７３，２７３号、同６，６５６，９３８号、同６，６６０，７３５号、同６，６６０，７４７号、同６，６６４，２６０号、同６，６６４，２６４号、同６，６６４，２６５号、同６，６６７，３１２号、同６，６７０，３７２号、同６，６７７，３４７号、同６，６７７，３４８号、同６，６７７，３４９号、同６，６８３，０８８号、同６，７５６，３８２号、同６，７９７，７１８号、及び同第６，８１８，６５０号、米国特許公報第２００４／００９１４９１号、同２００４／０１４７５４３号、及び同２００４／０１７６３６７号、及び国際公報ＷＯ２００５／１８５５１号、同ＷＯ２００５／１８５５６号、同ＷＯ２００５／２０９９９号、同ＷＯ２００５／０３２４８４号、同ＷＯ２００５／０４８９３３号、同ＷＯ２００５／０４８９４５号、同ＷＯ２００５／０５１３１７号、同ＷＯ２００５／０５１３２４号、同ＷＯ２００５／０６６１６９号、同ＷＯ２００５／０６６１７０号、同ＷＯ２００５／０６６１７２号、同ＷＯ２００５／０７６７８３号、同ＷＯ２００５／０７９１９５号、同ＷＯ２００５／１２３０７９号、同ＷＯ２００５／１２３０８０号、同ＷＯ２００６／００９８２６号、同ＷＯ２００６／０２６７６０号、同ＷＯ２００６／０２８４５１号、同ＷＯ２００６／０２８５４５号、同ＷＯ２００６／０２８９６２号、同ＷＯ２００６／０２９１１５号、及び同ＷＯ２００６／０３８９２３号に記載されている。
小分子ＩＲＭのさらなる実施例としては、特定のプリン誘導体（米国特許第６，３７６，５０１号及び同６，０２８，０７６号に記載のもの等）、特定のイミダゾキノリンアミド誘導体（米国特許第６，０６９，１４９号に記載のもの等）、特定のイミダゾピリジン誘導体（米国特許第６，５１８，２６５号に記載のもの等）、特定のベンゾイミダゾール誘導体（米国特許第６，３８７，９３８号に記載のもの等）、５員窒素含有複素環に融合する４−アミノピリミジンの特定の誘導体（米国特許第６，３７６，５０１号、同６，０２８，０７６号、及び同６，３２９，３８１号、及びＷＯ０２／０８９０５号に記載されるアデニン誘導体等）、特定の３−β−Ｄ−リボフラノシルチアゾロ［４，５−ｄ］ピリミジン誘導体（米国特許公報第２００３／０１９９４６１号に記載のもの等）、及び例えば米国特許公報第２００５／０１３６０６５号に記載のもののような特定の小分子免疫相乗化合物が挙げられる。
【００５６】
他のＩＲＭは、オリゴヌクレオチド配列のような生体巨大分子を包含する。あるＩＲＭオリゴヌクレオチド配列は、シトシン−グアニンジヌクレオチド（ＣｐＧ）を含有し、例えば、米国特許第６，１９４，３８８号、同６，２０７，６４６号、同６，２３９，１１６号、同６，３３９，０６８号、及び同６，４０６，７０５号に記載される。あるＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドは、例えば、米国特許第６，４２６，３３４号及び同６，４７６，０００号に記載のもののような合成免疫調節構造モチーフを包含し得る。他のＩＲＭヌクレオチド配列はＣｐＧ配列を欠き、例えば、国際特許公報ＷＯ００／７５３０４号に記載される。さらに他のＩＲＭヌクレオチド配列は、例えば、ヘイル（Heil）他による「科学（Science）」３０３巻、１５２６〜１５２９頁（２００４年３月５日発行）に記載されるもののようなグアノシン及びウリジン富化一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を包含する。
他のＩＲＭは、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）のような生体分子を包含し、例えば、米国特許第６，１１３，９１８号、同６，３０３，３４７号、同６，５２５，０２８号、及び同６，６４９，１７２号に記載される。
本発明のある実施形態において、ＩＲＭ化合物は少なくとも１つのＴＬＲの作用物質であって、好ましくはＴＬＲ６、ＴＬＲ７、又はＴＬＲ８の作用物質であり得る。ある場合において、ＩＲＭはＴＬＲ９の作用物質であってもよい。本発明のある実施形態において、ＩＲＭ化合物は小分子免疫反応調製物質（例えば、約１．６７Ｅ−２１ｇ（１０００ダルトン）未満の分子量）であってよい。
【００５７】
ある実施形態において、ＩＲＭ化合物は窒素含有５員複素環に融合する２−アミノピリジン、又は窒素含有５員複素環に融合する４−アミノピリミジンを包含してよい。
本発明に使用するのに好適な特定のＩＲＭ化合物は、窒素含有５員複素環に融合する２−アミノピリジンを有する化合物を包含する。かかる化合物には、限定はしないが、例えば、アミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アルコキシ置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、複素環式エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換イミダゾキノリンアミン、オキシム置換イミダゾキノリンアミン、６−、７−、８−、又は９−アリール、ヘテロアリール、窒素含有ヘテロシクリル、アリールオキシ又はアリールアルキレンオキシ置換イミダゾキノリンアミン、及びイミダゾキノリンジアミンのような置換イミダゾキノリンアミン類を含むイミダゾキノリンアミン類；限定はしないが、アミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アルコキシ置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、複素環式エーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、尿素置換テトラヒドロイミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、オキシム置換テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、及びテトラヒドロイミダゾキノリンジアミンを包含するテトラヒドロイミダゾキノリンアミン類；限定はしないが、アミド置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミド置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンアミン、アルコキシ置換イミダゾピリジンアミン、アリールエーテル置換イミダゾピリジンアミン、複素環式エーテル置換イミダゾピリジンアミン、アミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾピリジンアミン、尿素置換イミダゾピリジンエーテル、及びチオエーテル置換イミダゾピリジンアミンを包含するイミダゾピリジンアミン類；１，２−架橋イミダゾキノリンアミン；６，７融合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン；イミダゾナフチリジンアミン；テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン；オキサゾロキノリンアミン；チアゾロキノリンアミン；オキサゾロピリジンアミン；チアゾロピリジンアミン；オキサゾロナフチリジンアミン；チアゾロナフチリジンアミン；ピラゾロピリジンアミン；ピラゾロキノリンアミン；テトラヒドロピラゾロキノリンアミン；ピラゾロナフチリジンアミン；テトラヒドロピラゾロナフチリジンアミン；及び１Ｈ−イミダゾ二量体融合ピリジンアミン；キノリンアミン；テトラヒドロキノリンンアミン、ナフチリジンアミン、又はテトラヒドロナフチリジンアミン、が挙げられる。
【００５８】
特定の実施形態において、ＩＲＭ化合物はイミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、チアゾロナフチリジンアミン、ピラゾロピリジンアミン、ピラゾロキノリンアミン、テトラヒドロピラゾロキノリンアミン、ピラゾロナフチリジンアミン、又はテトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンであってよい。
【００５９】
特定の実施形態において、ＩＲＭ化合物は、置換イミダゾキノリンアミン、テトラヒドロイミダゾキノリンアミン、イミダゾピリジンアミン、１，２架橋イミダゾキノリンアミン、６，７融合シクロアルキルイミダゾピリジンアミン、イミダゾナフチリジンアミン、テトラヒドロイミダゾナフチリジンアミン、オキサゾロキノリンアミン、チアゾロキノリンアミン、オキサゾロピリジンアミン、チアゾロピリジンアミン、オキサゾロナフチリジンアミン、チアゾロナフチリジンアミン、ピラゾロピリジンアミン、ピラゾロキノリンアミン、テトラヒドロピラゾロキノリンアミン、ピラゾロナフチリジンアミン、又はテトラヒドロピラゾロナフチリジンアミンであってよい。
【００６０】
本明細書で使用する時、置換イミダゾキノリンアミンは、アミド置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミド置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンアミン、アリールエーテル置換イミダゾキノリンアミン、複素環式エーテル置換イミダゾキノリンアミン、アミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、スルホンアミドエーテル置換イミダゾキノリンアミン、尿素置換イミダゾキノリンエーテル、チオエーテル置換イミダゾキノリンアミン、ヒドロキシルアミン置換イミダゾキノリンアミン、オキシム置換イミダゾキノリンアミン、６−、７−、８−、又は９−アリール、ヘテロアリール、アリールオキシ又はアリールアルキレンオキシ置換イミダゾキノリンアミン、又はイミダゾキノリンジアミンを表す。本明細書で使用する時、置換イミダゾキノリンアミンは、具体的且つ明示的に、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン及び４−アミノ−α，α−ジメチル−２−エトキシメチル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−エタノールを除外する。
【００６１】
好適なＩＲＭ化合物には、上述のようなプリン誘導体、イミダゾキノリンアミド誘導体、ベンゾイミダゾール誘導体、アデニン誘導体、アミノアルキルグルコサミニドホスフェート、及びオリゴヌクレオチド配列が挙げられる。ある実施形態において、ＩＲＭ化合物が１つ以上のＴＬＲの作用物質として特定される化合物であってよい。
【００６２】
１つの特定な実施形態において、化合物の免疫反応修飾部分は、Ｎ−［６−（｛２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝アミノ）−６−オキソヘキシル］−４−アジド−２−ヒドロキシベンザミドから得られる。
【００６３】
他の実施形態において、化合物の免疫反応修飾部分は、Ｎ−｛２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝−６［（３−メルカプトプロパノイル）アミノ］ヘキサンアミドから得られる。
【００６４】
他の実施形態において、化合物の免疫反応修飾部分は、Ｎ−｛２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝−６［（３−メルカプトプロパノイル）アミノ］ヘキサンアミドから得られる。
【００６５】
他の態様において、本発明は被験者において抗原特異的免疫反応を誘導する方法を提供する。一般的にこの方法は、免疫細胞と免疫細胞が免疫活性化組成物の抗原に対する免疫反応を産生するのに効果的な量で部分的に精製された抗原凝集体もしくは部分的に精製されたモノマー複合体を包含する免疫活性化組成物とを接触させることを包含する。
【００６６】
他の態様において、本発明は被験者における病状の治療方法を提供する。一般的にこの方法は、病状において少なくとも１つの症状又は少なくとも１つの臨床的徴候を改善するのに効果的な量で部分的に精製された抗原凝集体又は部分的に精製されたモノマー複合体を包含する免疫活性化組成物を被験者に投与することを包含する。この方法は、予防的処置、治療的処置、又は双方を提供するのに使用され得る。本明細書で使用する時、予防的処置は病状における症状又は臨床的徴候の進行及び／又は出現の任意の程度における制限を表す。本明細書で使用する時、治療的処置は、病状に関連する１つ以上の既存の症状又は臨床的徴候を改善する治療を表す。
【００６７】
免疫活性化組成物は、被験者に対する投与において好適な任意の処方で提供され得る。処方における好適な型は、例えば、米国特許第５，２３８，９４４号、米国特許第５，９３９，０９０号、米国特許第６，２４５，７７６号、欧州特許ＥＰ０  ３９４  ０２６号、及び米国特許公報第２００３／０１９９５３８号に記載されている。本化合物は、限定はしないが、溶液、懸濁液、エマルション、又は混合物の任意の形態を包含する任意の好適な形態で提供され得る。化合物は任意の製薬上許容できる賦形剤、担体、又はビヒクルと処方中で供給され得る。例えば、この処方はクリーム、軟膏、エアゾール製剤、非エアゾールスプレー、ジェル、ローション等のような従来の局所用剤形として供給されてよい。処方はさらに、限定はしないが、補助剤、脂質、油分、粘膜接着剤、皮膚浸透助剤、着色剤、香料、香味料、保湿剤、増粘剤等を包含する１つ以上の添加物を包含してもよい。最終的に、免疫活性化組成物は、徐放又は持続効果を提供するように処方つまり、支持物質に付着し、脂質膜、脂質小胞、又はリポソームに組み込まれ、又は生分解性ポリマーマトリックス内に構成される免疫活性化組成物の分子を包含することができる。
【００６８】
処方は、例えば非経口でないか又は非経口のような任意の好適な方法で投与され得る。本明細書で使用する時、非経口でないというのは経口摂取を包含する消化管を通しての投与を表す。非経口は、例えば、静脈内、筋肉内、経皮的、皮下的、経粘膜的（例えば、吸入による）、又は局所的のような、消化管以外を通しての処方を表す。
【００６９】
本発明を実行するのに好適な処方の化合物は、限定はしないが、免疫活性化組成物の物理的及び化学的特性、担体の特性、意図する処方計画、被験者の免疫系の状態（例えば、抑制化、低下、刺激化）、免疫活性化組成物の投与方法、処方が投与されている種を包含する当該技術分野において既知の要因によって変化する。したがって、実行可能な用途の全てにおいて有効な処方の組成物を示すのは一般的に実用的ではない。しかしながら、当業者は、かかる要因を検討することで適切な処方を容易に決定できる。
【００７０】
ある実施形態において、本発明の方法は、例えば、約０．０００１％〜約１０％（指示がない限り、本明細書で提供される全てのパーセントは、重量／全処方に対する重量である）の処方の被験者への免疫活性化組成物の投与を包含するが、ある実施形態における免疫活性化組成物は、この範囲外の濃度において処方され得る。特定の実施形態において、この方法は、約０．０１％〜約１％の免疫活性化組成物を包含する処方、例えば、約０．１％〜約０．５％の免疫活性化組成物を包含する処方の被験者への投与を包含する。
【００７１】
本発明を実行するのに効果的な免疫活性化組成物の量は、抗原特異的免疫反応誘導するのに十分な量である。抗原特異的免疫反応を誘導するのに十分である免疫活性化組成物の正確な量は、限定はしないが、免疫活性化組成物の物理的及び化学的特性、担体の特性、意図する処方計画、被験者の免疫系の状態（例えば、抑制化、低下、刺激化）、抗原の固有免疫原性、ＩＲＭ部分の有効性、免疫活性化組成物の投与方法、及び処方が投与されている種を包含する当該技術分野における既知の要因によって変化する。したがって、実行可能な用途の全てにおける抗原特異的免疫反応を誘導するのに有効な免疫活性化組成物の構成量を示すのは一般的に実用的ではない。しかしながら、当業者は、かかる要因を検討することで適切な量を容易に決定できる。
【００７２】
ある実施形態において、本発明の方法は例えば、被験者に対して約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するのに十分な免疫活性化組成物の投与を包含するが、ある実施形態における方法は、この範囲外の濃度の免疫活性化組成物の投与によって実行され得る。これらの実施形態のいくつかにおいて、本方法は、被験者に対して約１００ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの投与量、例えば約１００μｇ／ｋｇ〜約５ｍｇ／ｋｇの投与量を提供するのに十分な免疫活性化組成物の投与を包含する。１つの特定の実施形態において、本方法は、被験者に対する約１ｍｇ／ｋｇ〜約２．５ｍｇ／ｋｇの免疫活性化組成物の投与を包含する。
【００７３】
或いは、投与量は治療過程の開始直前に得られた実際の体重を使用して計算することができる。このように計算された投与量において、体積表面（ｍ2）は治療工程の開始直前にデュボイス式：ｍ2＝（体重ｋｇ0.425×身長ｃｍ0.725）×０．００７１８４を使用して計算される。
【００７４】
ある実施形態において、本発明の方法は、例えば、約０．０１ｍｇ／ｍ2〜約１０ｍｇ／ｍ2の投与量を提供するのに十分な免疫活性化組成物の投与を包含する。
投与計画は、限定はしないが、免疫活性化組成物の物理的及び化学的特性、担体の特性、投与される免疫活性化組成物の量、被験者の免疫系の状態（例えば、抑制化、低下、刺激化）、抗原の固有免疫原性、ＩＲＭ部分の有効性、免疫活性化組成物の投与方法、及び処方が投与されている種を包含する当該技術分野において既知の多くの要因の少なくとも一部分によって決定する。したがって、実行可能な用途の全てにおいて使用するのに有効な投与計画を示すのは一般的に実用的ではない。しかしながら、当業者は、かかる要因を検討することで適切な投与計画を容易に決定できる。
【００７５】
本発明のある実施形態において、免疫活性化組成物は、例えば１週間につき単回投与から複数回投与で投与され得る。特定の実施形態において、免疫活性化組成物は、１回（つまり単回投与）〜１日につき約１回投与され得る。１つの特定な実施形態において、免疫活性化組成物は１回投与される。他の特定の実施形態においては、免疫活性化組成物は２回投与（プライム・ブースト）される。さらに、他の特定の実施形態において、免疫活性化組成物は初期に一回投与（プライム）され、次に必要であれば規則的又は不規則な間隔で再び投与（ブースト）される。
【００７６】
病状は、限定はしないが以下に挙げる免疫活性化組成物の投与によって治療され得る：
（ａ）例えば、アデノウイルス、ヘルペスウイルス（例えば、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＳＶ−ＩＩ、ＣＭＶ、若しくはＶＺＶ）、ポックスウイルス（例えば、天然痘又は牛痘、若しくは伝染性軟属腫のようなオルトポックスウイルス）、ピコルナウイルス（例えば、ライノウイルス又はエンテロウイルス）、オルトミクソウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）、パラミクソウイルス（例えば、パラインフルエンザウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ））、コロナウイルス（例えば、ＳＡＲＳ）、パポバウイルス（例えば、陰部疣贅、尋常性疣贅、又は足底疣贅の原因となるようなパピローマウイルス）、肝炎ウイルス（例えば、肝炎Ｂウイルス）、フラビウイルス（例えば、肝炎Ｃウイルス若しくはデング熱ウイルス）、又はレトロウイルス（例えば、ＨＩＶのようなレンチウイルス）による感染が原因となる病状のようなウイルス性疾患；
（ｂ）例えば、エシェリキア属、エンテロバクター属、サルモネラ属、スタフィロコッカス属、シゲラ属、リステリア属、アエロバクター属、へリコバクター属、クレブシェラ属、プロテウス属、シュードモナス属、ストレプトコッカス続属、クラミジア属、マイコプラズマ属、肺炎球菌属、ナイセリア属、クロストリジウム属、バシラス属、コリネバクテリウム属、マイコバクテリウム属、カンピロバクター属、ビブリオ属、セラチア属、プロビデンシア属、クロモバクテリウム属、ブルセラ属、エルシニア属、ヘモフィルス属、又はボルデテラ属の細菌による感染が原因となる病状のような細菌性疾患；
（ｃ）クラミジア、限定しないがカンジタ症、アスペルギルス症、ヒストプラスマ症、クリプトコックス髄膜炎を包含する真菌病、又は限定しないがマラリア、ニューモシスティス・カリニ肺炎、リーシュマニア症、クリプトスポリジウム症、トキソプラズマ症、及びトリパノソーマ感染を包含する寄生虫症のような他の感染性疾患；
（ｄ）上皮内腫瘍、子宮頸部形成異常、光線性角化症、基底細胞ガン、扁平上皮細胞ガン、腎細胞ガン、カポジ肉腫、黒色腫、例えば乳ガン、肺ガン、及び結腸ガンのような充実性腫瘍、限定はしないが急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、及びヘアリー細胞白血病、及び他のガンのような腫瘍性疾患；
（ｅ）アトピー性皮膚炎又は湿疹、好酸球増加症、喘息、アレルギー、アレルギー性鼻炎、及びオーメン症状群のようなＴH２媒介のアトピー性疾患；
（ｆ）全身性エリテマトーデス、本態性血小板血症、多発性硬化症、円板状エリテマトーデス、円形脱毛症のような特定の自己免疫疾患；及び
（ｇ）例えば、ケロイド形成及び他の型の瘢痕の抑制（例えば、慢性創傷を包含する創傷治癒の促進）のような創傷修復に関する疾患。
【００７７】
特定の免疫活性化組成物は、免疫機能の低下した固体において特に有益となり得る。例えば、特定の免疫活性化組成物は、例えば、臓器移植患者、ガン患者及びＨＩＶ患者において細胞性免疫の抑制後に起こる日和見感染症及び腫瘍の治療に使用し得る。
【００７８】
本発明の方法は、任意の好適な被験者において実施されてよい。好適な被験者としては、限定はされないが、ヒト類、非ヒト霊長類、飼鳥類、家禽、げっ歯類、犬類、猫類、馬類、豚類、羊、ヤギ類、又は牛類のような動物を包含する。
【実施例】
【００７９】
以下の実施例は、単に本発明のさらなる例示的な特徴、利点、及び他の詳細を選択したものである。しかしながら、実施例が本目的を提供する際に、使用される特定の物質及び量並びに他の条件及び詳細は、本発明の範囲を過度に制限する方法で解釈されるべきではないことが明らかに理解される。
ＩＲＭ化合物
実施例で使用されるＩＲＭ化合物を表１に示す。
【００８０】
【表１】
2008539252.tif 000003
【００８１】
ＩＲＭ２の調製：Ｎ−｛２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝−６−［（３−メルカプトプロパノイル）アミノ］ヘキサンアミド
【００８２】
【化１】
2008539252.tif 000004
【００８３】
パートＡ
０℃においてＤＭＦ（５０ｍＬ）中の６−（カルボベンジルオキシルアミノ）カプロン酸（８．４９グラム（ｇ）、３２．０ミリモル（ｍｍｏｌ））溶液にＮ−ヒドロキシスクシンイミド及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）を加えた。短時間後、その溶液をＤＭＦ（１００ｍＬ）中の１−（２−アミノ−２−メチルプロピル）−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミン（米国特許公報第２００４／００９１４９１号に記載するように調製し、１０ｇ、３２ｍｍｏｌである）の０℃溶液に加えた。この混合物を室温まで温め、３日間攪拌した。この溶液を水（４００ｍＬ）で希釈し、酢酸エチルで抽出（３回）した。有機層を混合し、水（２倍）及びブラインで洗った。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥、ろ過及び濃縮した。組生成物をシリカゲルで３回、ＨＰＬＣによって精製し（クロロホルム中でＣＭＡによる勾配溶離）、４．９０ｇのベンジル６−（｛２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝アミノ）−６−オキソヘキシルカルバメートを白色の発泡体として提供した。
【００８４】
パートＢ
エタノール（１００ｍＬ）中のベンジル６−（｛２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝アミノ）−６−オキソヘキシルカルバメート（４．９０ｍｇ、８．７５ｍｍｏｌ）及び１０％パラジウム炭素の混合物に新鮮な水素を数回取り込みながらパール装置で１．４×１０5Ｐａ（２０ｐｓｉ）〜２．８×１０5Ｐａ（４０ｐｓｉ）において１日間水素添加した。混合物をセライトフィルター剤を通してろ過した。ろ液を減圧下で濃縮し、次の工程に直接使用する白色発泡体を産出した。
【００８５】
パートＣ
０℃においてジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）（５０ｍＬ）中の３，３’−ジチオジプロピオン酸（９２０ｍｇ、４．３８ｍｍｏｌ）及び１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢＴ）（１．４２ｇ、１０．５ｍｍｏｌ）の混合物に、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（１．８５ｇ、９．６３ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を０℃で４時間攪拌した。パートＢからの物質（８．７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解し、０℃まで冷却し、ＤＭＦで２回濯ぎながら（各１０ｍＬ）活性化した二塩基酸の冷溶液を一度に加えた。反応物をゆっくりとオーバーナイトで室温まで温めた。０℃において、続く２日間にわたって反応物にＥＤＣを数度にわたって加えた。反応物を数日間にわたって室温において攪拌し、次に水及び飽和含水重炭酸ナトリウムで希釈し、数回にわたって酢酸エチルで抽出した。混合した有機層を水及びブラインで洗浄し、減圧下で濃縮した。粗生成物をＨＰＦＣによって精製し、３．８ｇのＮ−｛２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝−６［（３−メルカプトプロパノイル）アミノ］ヘキサンアミドのジスルフィド二量体を得た。
【００８６】
パートＤ
パートＣからの物質（３．８ｇ、３．７ｍｍｏｌ）を室温でメタノール（３０ｍＬ）中に溶解した。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（１．３８ｇ、４．８１ｍｍｏｌ）を加え、次に水（３ｍＬ）及び１２．５Ｍの水酸化ナトリウム水溶液（１．１２ｍＬ、１４．１ｍｍｏｌ）を加えた。この溶液を室温で２時間攪拌し、次に０℃まで冷却した。この溶液を１Ｍの塩酸水溶液（約１４ｍＬ）でｐＨ６まで調整した。減圧下でメタノールを除去し、重炭酸ナトリウム水溶液を加えた。ジクロロメタンで混合物を抽出した（３回）。有機層を混合し、水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。シリカゲル上でＨＰＬＣ（クロロホルム中の０〜５０％ＣＭＡによる勾配溶離）によって粗生成物を精製した。適切な画分を濃縮し、２．３６ｇのＮ−｛２−［４−アミノ−２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝−６［（３−メルカプトプロパノイル）アミノ］ヘキサンアミドを提供した。
【００８７】
白色発泡体、ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ５１５（Ｍ＋Ｈ）+。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ８．２２（ｄｄ，１Ｈ），７．８０（ｄｄ，１Ｈ），７．５１（ｄｄｄ，１Ｈ），７．３２（ｄｄｄ，１Ｈ），５．９６（ｍ，１Ｈ），５．５９（ｓ，１Ｈ），５．５１（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），５．０６（ｓ，２Ｈ），４．８４（ｂｒ  ｓ，２Ｈ），３．６２（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），３．２５（ｑ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），２．８１（ｍ，２Ｈ），２．５０（ｔ，Ｊ＝６．９Ｈｚ，２Ｈ），１．９８（ｍ，２Ｈ），１．６１−１．１８（ｍ，１３Ｈ），１．２４（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ，３Ｈ）。Ｃ26Ｈ38Ｎ6Ｏ3Ｓ・０．５Ｈ2Ｏの計算値：Ｃ，５９．６３；Ｈ，７．５１；Ｎ，１６．０５；Ｓ，６．１２。実測値：Ｃ，５９．８９；Ｈ，７．６６；Ｎ，１６．２２；Ｓ，６．２５。
【００８８】
ＩＲＭ３の調製：Ｎ−｛２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝−６−［（３−メルカプトプロパノイル）アミノ］ヘキサンアミド
【００８９】
【化２】
2008539252.tif 000005
【００９０】
パートＡ
６−［タートブトキシカルボニル）アミノ］ヘキサン酸（６．８１ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（３．９８ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）（５．６６ｇ、２９．５ｍｍｏｌ）を２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチルアミン（米国特許公報第２００４/００９１４９号に記載される、８．００ｇ、２６．８ｍｍｏｌのｔｅｒｔ−ブチル２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１イル］−１，１−ジメチルエチルカルバメートの酸介在脱保護によって調製される）の０℃の水溶液に加えた。この溶液を室温においてオーバーナイトで攪拌した。さらに、６−［ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）アミノ］ヘキサン酸及びＥＤＣを加え、溶液をさらに１時間をかけて攪拌した。重炭酸ナトリウム溶液及び酢酸エチル間で溶液を分離した。水層を酢酸エチルで抽出した（２回）。有機層を混合し、水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。粗生成物をシリカゲル上のクロマトグラフィーにおいて精製し、３．９９ｇのタートブチル６−（｛２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝アミノ）−６−オキソヘキシルカルバメートを発泡体として提供した。
【００９１】
パートＢ
トリフルオロ酢酸（３０ｍＬ）をジクロロメタン（８０ｍＬ）中のｔａｒｔ−ブチル６−（｛２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝アミノ）−６−オキソへキシルカルバメート（３．９９ｇ、７．８２ｍｍｏｌ）に室温でゆっくりと加えた。１．５時間後、加圧下で溶液を濃縮し、油が提供された。油を少量の水及び濃縮水酸化アンモニウム中に溶解した。生じた塩基性混合物をジクロロメタンで複数回にわたって抽出した。混合した有機層を硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮し、さらに精製をせずに次の工程で使用される、３．４ｇの６−アミノ−Ｎ−｛２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４、５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝ヘキサンアミドが提供された。
【００９２】
パートＣ
ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の６−アミノ−Ｎ−｛２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４、５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝ヘキサンアミド（１．３５ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）、３，３’−ジチオジプロピオン酸（０．３４５ｇ、１．６４ｍｍｏｌ）、１−ヒドロキシベンゾチアゾール（０．４４３ｇ、３．２８ｍｍｏｌ）、及び１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミドヒドロクロライド（０．６９２ｇ、３．６１ｍｍｏｌ）の溶液を室温においてオーバーナイトで攪拌した。溶液を減圧下で濃縮し、飽和重炭酸ナトリウム水溶液及び酢酸エチル／メタノールの間に分離した。有機層を混合し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮した。組生成物をシリカゲルでＨＰＬＣによって精製し（ＣＭＡクロロホルムによる勾配溶離）、Ｎ−｛２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル｝−６−［（３−メルカプトプロパノール）アミノ］ヘキサンアミドのジスルフィド二量体が提供された。
【００９３】
パートＤ
Ｎ−｛２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１，１−ジメチルエチル｝−６［（３−メルカプトプロパノイル）アミノ］ヘキサンアミド（２．１４ｇ、２．１５ｍｍｏｌ）をメタノール（２０ｍＬ）に溶解した。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（０．８００ｇ、２．７９ｍｍｏｌ）、水（２ｍＬ）、及び１２．５ＭのＮａＯＨ（０．６５ｍＬ、８．１７ｍｍｏｌ）を加えた。溶液を室温で１．５時間攪拌し。次に氷浴において冷却した。溶液を１ＭのＨＣｌでｐＨ６まで調整し、生じた混合物を減圧下で濃縮しメタノールを除去した。重炭酸ナトリウム水溶液及びジクロロメタンの間で混合物を分離した。水層をジクロロメタンで数回にわたって抽出した。有機層を混合し、水及びブラインで洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、減圧下で濃縮し、１．６９ｇのＮ−｛２−［２−（エトキシメチル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−１−イル］−１，１−ジメチルエチル−６−［（３−メルカプトプロパノール）アミノ］ヘキサンアミドとして提供された白色発泡体を真空下で熱してガラス状固体が提供された。
【００９４】
無色ガラス状の固体。ＭＳ（ＥＳＩ）ｍ／ｚ５００（Ｍ＋Ｈ）+。1Ｈ  ＮＭＲ（３００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ3）δ９．３０（ｓ，１Ｈ），８．５２（ｍ，１Ｈ），８．２６（ｍ，１Ｈ），７．７２−７．６２（ｍ，２Ｈ），５．８４（ｍ，１Ｈ），５．５９（ｂｒ ｓ，１Ｈ），５．１８（ｂｒ ｓ，２Ｈ），４．９１（ｂｒ ｓ，２Ｈ），３．６３（ｍ，２Ｈ），３．２７（ｍ，２Ｈ），２．８１（ｍ，２Ｈ），２．４９（ｔ、Ｊ＝６．９Ｈｚ、２Ｈ），２．０５（ｔ，Ｊ＝７．５Ｈｚ，２Ｈ），１．６３−１．２２（ｍ，１６Ｈ）。計算値Ｃ26Ｈ37Ｎ5Ｏ3Ｓ：Ｃ，６２．５０；Ｈ，７．４６；Ｎ，１４．０２；Ｓ，６．４２。実測値：Ｃ，６２．２３；Ｈ，７．５４；Ｎ，１３．９０；Ｓ，６．６５。
【００９５】
（実施例１）
１ミリリットル当たり１０ミリグラム（ｍｇ／ｍＬ）となるようにＩＲＭ１をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に懸濁した。１０ｍｇ／ｍＬとなるようにオボアルブミン（ＯＶＡ、ミズーリ州セントルイスのシグマケミカル社（Sigma Chemical Co.））をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中に懸濁し、ＮａＯＨを添加してｐＨを１０．０未満に調整した。２つのＩＲＭ１／ＯＶＡ反応混合物を調製した。第一に、２ウェル組織培養皿の１つのウェル中で約４：１モルでＩＲＭ１が超過するように９００マイクロリットル（μＬ）のオボアルブミン溶液を１００μＬのＩＲＭ１溶液と混合した。第二に、１２ウェル組織培養プレートの１つのウェル中で約８：１モルでＩＲＭ１が超過するように８００マイクロリットル（μＬ）のＯＶＡ溶液を１００μＬのＩＲＭ１溶液と混合した。プレートを氷上に載置し、ＩＲＭ１／ＯＶＡ混合物を含有したウェルにできるだけプレートを近づけるように長波長紫外線源をプレート上に直接載置した。混合物を１５分間照射した。生じた複合体反応混合物をウェルから取り出し、ＰＢＳ中に再懸濁し、最終濃度を４．５ｍｇ／ｍＬのオボアルブミンができた。
【００９６】
別に、ＩＲＭを含まないオボアルブミン溶液（９００μＬ＋１００μＬ ＤＭＳＯ）に上述のように照射した。
【００９７】
（実施例２）
４：１のＩＲＭ１＋ＯＶＡ複合混合物、８：１のＩＲＭ１＋ＯＶＡ複合混合物、及び実施例１のＩＲＭ１を含まないで照射したＯＶＡをシステムゴールド（System Gold）ＨＰＬＣ（カリフォルニア州フルートンのベックマン・コールター社（Beckman Coulter, Inc.））で個別に稼動した。各混合物をＰＢＳ（１倍）、ｐＨ７．４のランニングバッファーを使用して１分間当たり０．５ｍＬ（ｍＬ／ｍｉｎ）の流速でスーパーデックス２００  １０／３００ＧＬサイズ除去カラム（ニュージャージー州ピスカタウェイのアマシャムバイオサイエンス社（Amersham Biosciences））にかけた。１倍のＰＢＳ、ｐＨ７．４は、１０倍のＰＢＳ溶液（カリフォルニア州カマリロのバイオソース社（Biosource International, Inc.）のカタログ番号＃Ｐ３１３−３００）をＭｉｌｌ−Ｑ精製水中に１：１０で希釈して作製した。クロマトグラムにおいて記録される、１秒当たり８個のデータポイントを有する２８０ナノメートルの検出波長を使用してデータを収集した。画分をＨＰＬＣ稼動の持続時間において１分単位で集めた。
【００９８】
４：１のＩＲＭ１＋ＯＶＡ複合体反応の生成物のクロマトグラムを表３に示す。４：１のＩＲＭ１＋ＯＶＡ複合体反応の生成物のクロマトグラムを表４に示した。ＩＲＭを含まずに紫外線を照射したＯＶＡの生成物のクロマトグラムを表２に示した。
【００９９】
（実施例３）
ＩＲＭ１を含むか又は含まない（±ＩＲＭ）オボアルブミンの照射（＋ＵＶ）又は非照射（−ＵＶ）試料を実施例１に記載のように調製した。各試料半分を実施例２に記載のようにＨＰＬＣにかけた。ＨＰＬＣにかけた画分１６〜２０又は２５〜３４を一緒に集めた。全試料のＯＶＡタンパク質の量を定量化するのにマイクロＢＣＡ蛋白測定キット（イリノイ州ロックフォードのピアスバイオテクノロジー社（Pierce Biotechnology, Inc.）のカタログ番号＃２３２２５）を使用した。マウス一匹当たり２×１０6ニワトリＯＶＡ特異的ＯＴ−Ｉ+／ＧＦＰ+リンパ球を同種Ｃ５７ＢＬ／６マウス（マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールズリバー研究所（Charles River Laboratories））に適合移植した。
【０１００】
２日後のマウスに１００マイクログラム（μｇ）のＨＰＬＣ前ＯＶＡ＋ＩＲＭ＋ＵＶ（紫外線照射されたＯＶＡ／ＩＲＭ１混合物）、ＯＶＡ＋ＩＲＭ］１−ＵＶ（ＵＶを照射しないＯＶＡ／ＩＲＭ１混合物）、又はＯＶＡ＋ＵＶ（ＵＶ照射したオボアルブミン）；９３μｇのＯＶＡ＋ＩＲＭ１＋ＵＶ、ＯＶＡ＋ＩＲＭ１−ＵＶ、又はＯＶＡ＋ＵＶの２５〜３４の収集画分；４４μｇ１６〜２０の収集画分で腹腔内免疫するか；又は処理しなかった。
【０１０１】
免疫付与３日後、マウスを屠殺し、脾臓を摘出した。グアバＰＣＡ９６（カリフォルニア州ヘイワードのグアバテクノロジー社（Guava Technologies, Inc.））を使用して、脾細胞の全数を測定した。脾細胞を、プロピジウムヨウ素（ＰＩ）標識マウス抗ＣＤ８+抗体（カリフォルニア州サンディエゴのＢＤバイオサイエンスファーミンゲン社（BD Biosciences Pharmingen））で染色し、ＰＩ−ＣＤ８+／ＧＦＰ+リンパ球上を通過するフローサイトメトリーによってＯＴ−Ｉ+／ＧＦＰ+リンパ球の割合を測定した。ＯＴ−Ｉ+／ＧＦＰ+リンパ球の全数は、全脾細胞数をＯＴ−Ｉ+／ＧＦＰ+リンパ球の割合でかけることで決定した。
【０１０２】
結果を図１に示す。
【０１０３】
（実施例４）
ボーダー、Ｗ（Border, W.）他による「臨床試験ジャーナル（Journal of Clinical Investigation）」６９巻、４５１〜４６１頁（１９８２年）に記載の方法を使用して、カルビオケム社（Calbiochem）のＢＳＡ（カリフォルニア州サンディエゴ、カタログ番号＃１２６５７）を使用して陽イオン性ウシ血清アルブミン（ｃＢＳＡ）を作製した。実施例１に記載の方法を用いて１０ｍｇ／ｍＬのｃＢＳＡタンパク質溶液及び１０ｍｇ／ｍＬのＩＲＭ１溶液を混合することでＩＲＭ１＋ｃＢＳＡ複合体を作製した。
【０１０４】
次に、実施例２に記載するものと同じ条件を用いて、ｃＢＳＡ／ＩＲＭ１複合体をＨＰＬＣにかけた。ＩＲＭ１＋ｃＢＳＡ複合体反応の生成物におけるクロマトグラムを表６に示す。ＩＲＭ１を含まずに紫外線を照射したｃＢＳＡの生成物のクロマトグラムを表５に示す。
【０１０５】
（実施例５）
４：１でＩＲＭ１の過剰モル状態で実施例１に記載の方法を用いて、ＩＲＭ１及びＨＩＶ  Ｇａｇ４１タンパク質を複合した。実施例２に記載の方法を用いて、ＩＲＭ１＋ＨＩＶ  Ｇａｇ４１複合混合物及びＩＲＭ１＋ＨＩＶ  Ｇａｇ４１非複合混合物を生成した。非複合ＩＲＭ１＋ＨＩＶ  Ｇａｇ４１の生成物におけるクロマトグラムを表７に示す。ＩＲＭ１＋ＨＩＶ  Ｇａｇ４１複合体反応の生成物におけるクロマトグラムを表８に示す。
【０１０６】
（実施例６）
ニワトリ卵リゾチーム抗原の修飾：
ニワトリ卵リゾチーム（ＨＥＬ；シグマ社（Sigma））をＰＢＳ中で１４．８ｍｇ／ｍＬの濃度及びｐＨ７．４になるように調製した。ＮＨＳ−ＰＥＯ8−マレイミド（ピアス社（Pierce））架橋剤を５ｍｇ／ｍＬの濃度になるようにＤＭＳＯ中に溶解した。攪拌しながら所望の過剰モル超過で架橋溶液をＨＥＬ溶液にゆっくりと加え、室温で１時間インキュベートした。修飾されたＨＥＬを５ｍＭ  ＥＤＴＡを含有し、ＰＢＳでｐＨ７．２に平衡化されたＰＤ１０脱塩カラムに混合物をかけることで精製した。１ミリリットルの画分を収集し、２８０ｎｍの波長における吸光度を測定することで決定される修飾ＩｇＧを含有する画分を一緒に集めた。
【０１０７】
ＨＥＬのＩＲＭへの複合化
１０ｍＭの濃度でＤＭＳＯ中にＩＲＭ２及びＩＲＭ３を溶解した。上述のように、ＩＲＭが４倍過剰モルとなるようにＩＲＭ２又はＩＲＭ３を修飾ＨＥＬに加えた。上述のように、Ｌ−システインがＨＥＬの修飾に使用される架橋剤の量に対して５倍の過剰モルとなるように、Ｌ−システインを修飾ＨＥＬに加えた。混合物を室温においてオーバーナイトでインキュベートした。ＩＲＭ反応物をクエンチするために、５００ｍＭのＬ−システイン溶液（１ＭのＴｒｉｓに溶解、ｐＨ８．０）を反応混合物に対して０．０１倍（容量／容量）で加えた。実施例２に記載のように、試料をＨＰＬＣにかけた。ＩＲＭ２−ＨＥＬ、ＩＲＭ３−ＨＥＬ、及びＬ−ｃｙｓ−ＨＥＬのクロマトグラムを図９〜１１にそれぞれ示した。
【０１０８】
１ｍＬ／分の流速でカラムランニングバッファーとしてｐＨ７．４のＰＢＳを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーによってＩＲＭ−ＨＥＬ複合体を精製した。混合物の１ミリリットル画分を収集し、２８０ｎｍで測定した。モノマー又は凝集体ＩＲＭ−ＨＥＬ複合体を含有する画分を集め、０．２ミクロンフィルターを通して無菌状態でろ過した。標準液として非修飾ＨＥＬを用いてＢＣＡアッセイによってＩＲＭ−ＨＥＬ複合体の濃度を測定した。ろ過した複合体を、その後の生物学的検定法による試験のために４℃で保管した。
【０１０９】
（実施例７）
４〜６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスの各足蹠にＨＥＬ単独（５又は５０μｇ）又は実施例６で生成した５μｇのＩＲＭ−ＨＥＬ複合体からの凝集体もしくはモノマー画分を皮下注射した。注射１０日後、マウスを屠殺し、心臓穿刺によって血液を採取した。血液を室温（ＲＴ）で３０分間凝固させ、４℃で２６１．８ｒａｄ／ｓ（２，５００ＲＰＭ）で遠心分離し、その後のＨＥＬ抗体検定のために−３０℃で収集及び保管した。
【０１１０】
マウス抗ＨＥＬ  ＩｇＧ２ａ抗体ＥＬＩＳＡを血清上で実行した。９６ウェルプレート（ニューヨーク州ロチェスターのヌンク（Nunc）社のヌンク（Nunc）ＭＡＸＩＳＯＲＰ）をコーティングバッファー（０．０５Ｍの重炭酸ナトリウム、０．０２％のアジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）中０．０２０ｍｇ／ｍＬのＨＥＬを１００μＬ／ウェルとなるように、４℃においてオーバーナイトで被覆した。次に、プレートを洗浄バッファー（０．０５Ｍの重炭酸ナトリウム、０．０２％のアジ化ナトリウム、ｐＨ９．６）で洗浄し、１ウェル当たり２００μＬのブロッキングバッファー（０．０２５％の粉末ミルク、０．００３ＭのＨＥＰＥＳ、０．４Ｍの塩化ナトリウム、３．８ｍＭのＥＤＴＡ二ナトリウム）で飽和した。３回の洗浄後、ブロッキングバッファー中の１００μＬの血清試料１０倍希釈液（１：１０〜１：１０，０００）をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。次に、プレートを３回洗浄し、ブロッキングバッファーにおいて１：４０００となる１００μＬ／ウェルのホースラディシュ・ペルオキシダーゼ標識化ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａ（ノースキャロライナ州ローリーのセロテック（Serotec））をプレートに加え、室温で１時間インキュベートした。プレートを２回洗浄し、１００μＬ／ウェルのＴＭＢ基質溶液（ＢＤバイオサイエンスファーミゲン）を加えた。室温で暗い中、約８分間プレートをインキュベートし、次に１００μＬ／ウェルの終了溶液を加えた。５７０ｎｍを参照波長として、４５０ｎｍの波長下でただちにプレートを読んだ。結果を図１２に示す。
【０１１１】
（実施例８）
パートＡ
２５ｍｇ／ｍＬのＯＶＡ溶液を反応バッファー中に調製した。反応バッファーは、シグマキット（Sigma Kit）ＰＢＳ−１の製造説明書を用いて調製した０．１５ＭのＮａＣｌ及び２ｍＭのＥＤＴＡを含有する０．５ＭのＰＢＳ溶液であった。２つのＯＶＡ参照混合物を、ＯＶＡ溶液の０．５ｍＬアリコートを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、１０μＬのＤＭＳＯ（対照１、Ｃ１）又は１０μＬの３７ｍｇ／ｍＬＮ−エチルマレイミド（ＮＭＩ；ピアス（Pierce））ＤＭＳＯ溶液（対照２、Ｃ２）で処理した。更なる試料混合物をＯＶＡ溶液の１．０ｍＬアリコートを１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、２０μＬのＮＭＩ溶液で処理することで調製した。混合物を室温でゆるく攪拌しながら２〜２．５時間インキュベートした。各混合物を２８０ｎＭの吸光度を使用して反応バッファーで平衡化されたＰＤ−１０脱塩カラムにかけて精製した。画分を収集し、タンパク質を含有する画分を一緒に集め、最終修飾ＯＶＡタンパク質を決定するのに集めた画分の吸光度（２８０ｎＭ）を記録した。対照溶液及びＯＶＡ溶液中のタンパク質の濃度は、それぞれ７．５ｍｇ／ｍＬ及び１２ｍｇ／ｍＬであった。
【０１１２】
パートＢ
０．１２３７Ｍのスルホスクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドエチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−ＳＭＣＣ；ピアス（Pierce））をＤＭＳＯ中に調製した。パートＡで精製したＯＶＡ溶液をアリコートし、５倍（５×）、１０倍（１０×）。２０倍（２０×）、又は６０倍（６０×）でスルホ−ＳＭＣＣがＯＶＡに対してモル過剰になるように混合した。混合物を室温でゆるく攪拌しながら１．５〜２時間インキュベートした。各混合物をＰＤ−脱塩カラムにかけて精製し、タンパク質を含有する画分を集め、上述のように分析した。
【０１１３】
パートＣ
０．１２４ＭのＩＲＭ１及び０．１２４ＭのＬ−システイン（ピアス（Pierce））の溶液をＤＭＳＯ中に調製した。パートＢの精製した５倍、１０倍、２０倍、及び６０倍溶液を、タンパク質に対してそれぞれ１２倍、１７倍、２７倍、及び４０倍のモル過剰であるＩＲＭ１と混合した。上述の精製した１０倍（１０倍Ｃｙｓ）、２０倍（２０倍Ｃｙｓ）、及び対照２を、タンパク質に対してそれぞれ１７倍、２７倍、及び１０倍のモル過剰であるシステインと混合した。対照１の１．５ｍＬ容量を４０μＬのＤＭＳＯと混合した。４℃の冷凍庫に直接入れるシステインを含有する混合物を除いた全混合物を室温で４５分間インキュベートした。次の日に精製するまで、全試料を４℃で維持した。各混合物をＰＤ−脱塩カラムにかけて精製し、タンパク質を含有する画分を集め、上述のように分析した。生物学的試験を実行するまで試料を４℃で維持した。
【０１１４】
インビボ試験
マウス一匹当たり３×１０6個のニワトリオボアルブミン特異的ＯＴ−Ｉ+／ＧＦＰ+リンパ球を同種Ｃ５７ＢＬ／６マウス（マサチューセッツ州ウィルミントンのチャールズリバー研究所（Charles River Laboratories））に適合移植した。
２４時間後、マウスの後脇腹に１００μＬ（１００μｇのＯＶＡを含有する：ＯＶＡ含有試料においてＢＣＡタンパク質検定法によって測定）の各５倍、１０倍、２０倍、６０倍、１０倍Ｃｙｓ、２０倍Ｃｙｓ、対照１（Ｃ１）、対照２（Ｃ２）、ＯＶＡ単体、又はＰＢＳ単体を皮下注射した。注射４日後、マウスを屠殺し、鼠径リンパ節を摘出し単個細胞浮遊液中に均質化した。グアバＰＣＡ９６（カリフォルニア州ヘイワードのグアバテクノロジー社（Guava Technologies, Inc.））を使用して、リンパ節の全数を測定した。リンパ節を、プロピジウムヨウ素（ＰＩ）標識マウス抗ＣＤ８+抗体（カリフォルニア州サンディエゴのＢＤバイオサイエンスファーミンゲン社（BD Biosciences Pharmingen））で染色し、ＰＩ−ＣＤ８+／ＧＦＰ+リンパ球上を通過するフローサイトメトリーによってＯＴ−Ｉ+／ＧＦＰ+リンパ球の割合を測定した。ＯＴ−Ｉ+／ＧＦＰ+リンパ球の全数は、全リンパ節数をＯＴ−Ｉ+／ＧＦＰ+リンパ球の割合でかけることで決定した。結果を図１０に示す。
【０１１５】
（実施例９）
牛血清アルブミン（ＢＳＡ；カルビオケム（Calbiochem））をｐＨ７．４、１５ｍｇ／ｍＬの濃度となるようにＰＢＳ中に溶解した。複合化の前にＢＳＡ二量体残留物及び凝集体を取り除くために、１ｍＬ／分の流速でカラムランニングバッファーとしてｐＨ７．４のＰＢＳを使用するサイズ排除クロマトグラフィーによってＢＳＡを精製した。モノマーＢＳＡを含有する画分を集め、複合体における出発物質（ＰＢＳ中で６．３８ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ７．４）として使用した。スルホ−ＳＭＣＣに対して２０倍又は４０倍モル過剰であって、ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍＬで調製されたモノマーＢＳＡの１ｍＬアリコート（９．６×１０−５ミリモル）を混合しながらＢＳＡにゆっくり加えた。混合物を室温で１時間インキュベートした。
【０１１６】
反応の第２工程において、マレイミド活性化ＢＳＡを２つの等しいアリコートに分割し、ＤＭＳＯ中に１０ｍｇ／ｍＬで調製された６０倍又は１２０倍過剰のＩＲＭ２もしくはＩＲＭ３（第１工程に使用されるスルホ−ＳＭＣＣに対して３倍過剰）を活性化ＢＳＡに加えた。室温におけるオーバーナイトでのインキュベーションに続いて、ＮａＯＨ中で調製された５μＬの５００ｍＭのＬ−システイン  ＨＣｌを各複合体に加え、３０分間未反応のマレイミドをクエンチし、次に上述のようにサイズ排除クロマトグラフィーによって精製した。モノマー複合体もしくは凝集化複合体を含有する画分を集めて無菌ろ過し、ＢＣＡ検定キットを使用してタンパク質濃度を測定した。非複合ＢＳＡのクロマトグラムを図１４に示す。２０倍及び４０倍スルホ−ＳＭＣＣ  ＩＲＭ２＋ＢＳＡ複合体反応の生成物のクロマトグラムをそれぞれ図１５及び１６に示す。２０倍及び４０倍スルホ−ＳＭＣＣ  ＩＲＭ３＋ＢＳＡ複合反応の生成物のクロマトグラムをそれぞれ図１７及び１８に示す。
【０１１７】
本明細書中に引用される特許、特許文献、及び刊行物の完全な開示は、それぞれが個々に組み込まれたかのように、その全体が参考として組み込まれる。不一致である場合、定義を含む本明細書は調整されるべきである。
本発明の範囲および趣旨を逸脱しない本発明の様々な変更や改変は、当分野の技術者には明らかとなるであろう。例示的な実施形態及び実施例は例示のみを提供し、本発明の範囲の制限を意図しない。本発明の範囲は以下に記載する請求項にのみ制限される。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】紫外線照射又は非照射の光反応性ＩＲＭ及び／又は抗原の混合物から収集される様々なＨＰＬＣ前及びＨＰＬＣ後の試料の免疫原性データを示す棒グラフ。
【図２】紫外線照射後の抗原単独におけるＨＰＬＣクロマトグラム。
【図３】紫外線照射後の光反応性ＩＲＭ及び抗原の４：１モル比の混合物による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図４】紫外線照射後の光反応性ＩＲＭ及び抗原の８：１モル比混合物による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図５】紫外線照射後の第２抗原単独におけるＨＰＬＣクロマトグラム。
【図６】紫外線照射後の光反応性ＩＲＭ及び第２抗原の４：１モル比混合物による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図７】第３抗原単独のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図８】紫外線照射後の光反応性ＩＲＭ及び第３抗原の４：１モル比混合物による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図９】抗原及びＩＲＭ２の複合による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１０】抗原及びＩＲＭ３の複合による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１１】抗原及びＬ−システインの複合による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１２】ＩＲＭ−ＨＥＬ複合体生成物に誘導される抗体価を示す棒グラフ。
【図１３】ＩＲＭ／抗原複合体による免疫化後の抗原特異的リンパ球の増加を示す棒グラフ。
【図１４】抗原単独のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１６】スルホ−ＳＭＣＣ及びＩＲＭ２との混合前の抗原との２０：１モル比混合物による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１５】スルホ−ＳＭＣＣ及びＩＲＭ２との混合前の抗原との４０：１モル比混合物による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１７】スルホ−ＳＭＣＣ及びＩＲＭ３との混合前の抗原との２０：１モル比混合物による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１８】スルホ−ＳＭＣＣ及びＩＲＭ３との混合前の抗原との４０：１モル比混合物による反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラム。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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