(57)【要約】本発明は、特にグラム陰性細菌のリポ多糖（ＬＰＳ）と高い親和性で非共有結合する能力およびポリミキシンＢと同様にＬＰＳを解毒する能力においてポリミキシンＢを摸倣するＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマーに関する。１７アミノ酸を超えず、陽イオン性疎水性アミノ酸残基を本質的に含むペプチド配列中に存在する２つのシステイン残基が関与する一組のジスルフィド結合によってダイマー構造が維持される。本発明のダイマーにおいて、ペプチドは、平行または逆平行配向を有することができる。一例として、本発明のダイマーは、平行または逆平行ダイマー形態の、式：ＮＨ2−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ１−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ２−ＣＯＯＨで示されるペプチドによって構成される。ＳＡＥＰ ＩＩダイマーは、グラム陰性細菌感染によって生じる敗血症性ショックおよび関連障害の治療または予防に有用である。本発明また、ＬＰＳおよびＳＡＥＰ ＩＩダイマーが一緒に非共有結合しているＬＰＳ−ペプチド複合体に関する。これらの複合体は、グラム陰性細菌感染に対するワクチン剤として有用である。
2008537749.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2008537749.tif 000017
［式中、２個のＣｙｓ１残基はジスルフィド結合を介して結合し合っており、２個のＣｙｓ２残基はジスルフィド結合を介して結合し合っている］
または式（ＩＩ）：
【化２】
2008537749.tif 000018
［式中、Ｃｙｓ１残基はジスルフィド結合を介してＣｙｓ２残基と結合している］
（ここで、ＡおよびＡ'は、独立して、少なくとも２個のアミノ酸残基が独立してＬｙｓ、Ｈｙｌ（ヒドロキシ−リジン）、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基２〜５個、好ましくは、３または４個のペプチド部分である；
ここで、ＢおよびＢ'は、独立して、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから独立して選択されるアミノ酸残基を少なくとも２個、好ましくは３個含むアミノ酸残基３〜７個、好ましくは４または５個のペプチド部分である；
ここで、ＣおよびＣ'は、任意であり、独立して、アミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基２〜３個のペプチド部分である；
ただし、陽イオン性アミノ酸残基／疎水性アミノ酸残基比（陽イオン性／疎水性比）は、０.４〜２である）
で示されるＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマー。
【請求項２】
陽イオン性／疎水性比が０.５から１.２または１.５までである、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される、請求項１記載のＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマー。
【請求項３】
陽イオン性／疎水性比が０.６〜１である、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される、請求項２記載のＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマー。
【請求項４】
陽イオン性／疎水性比が０.６〜０.８である、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される、請求項３記載のＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマー。
【請求項５】
ＢおよびＢ'ペプチド部分が配列−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−を含む（ここで、Ｘ１およびＸ２；Ｘ２およびＸ３；またはＸ１、Ｘ２およびＸ３は、独立して、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから選択され；好ましくは、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｈｅから選択される）、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される、請求項１〜４いずれか１項記載のＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマー。
【請求項６】
ＢおよびＢ'ペプチド部分が
（ｉ）配列−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−（ここで、
Ｘ１は、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、ＨｉｓまたはＡｒｇであり、好ましくは、ＬｙｓまたはＡｒｇであり；より好ましくは、Ｌｙｓであり；
Ｘ２は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＶａｌであり；好ましくは、ＰｈｅまたはＬｅｕであり；より好ましくは、Ｐｈｅであり；
Ｘ３は、Ｐｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＶａｌであり；好ましくは、ＰｈｅまたはＬｅｕであり；より好ましくは、Ｌｅｕである）；および
（ｉｉ）存在するとすれば、各々、独立して、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる群；好ましくは、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる群；より好ましくは、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残基
を含む、式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される、請求項５記載のＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマー。
【請求項７】
式（ＩＩＩ）：
【化３】
2008537749.tif 000019
［ここで、２個のＣｙｓ１残基はジスルフィド結合を介して結合し合っており、２個のＣｙｓ２残基はジスルフィド結合を介して結合し合っている］
または式（ＩＶ）：
【化４】
2008537749.tif 000020
［式中、Ｃｙｓ１残基は、ジスルフィド結合を介してＣｙｓ２と結合している］
（ここで、Ａ、Ａ'、ＢおよびＢ'は、上記請求項における定義と同じである）
で示される、請求項１〜６いずれか１項記載のＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマー。
【請求項８】
同種ペプチドダイマーである、請求項１〜７いずれか１項記載のＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマー。
【請求項９】
式（ＶＩ）：
【化５】
2008537749.tif 000021
［式中、Ｃｙｓ１残基は、ジスルフィド結合を介してＣｙｓ２残基と結合している］
で示される逆平行ダイマーである、請求項１〜８いずれか１項記載のＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマー。
【請求項１０】
式（ＶＩＩ）：
【化６】
2008537749.tif 000022
［式中、２個のＣｙｓ１残基はジスルフィド結合を介して結合し合っており、２個のＣｙｓ２残基はジスルフィド結合を介して結合し合っている］
で示される平行ダイマーである、請求項１〜８いずれか１項記載のＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマー。
【請求項１１】
ペプチドが本質的に平行ダイマー形態である請求項１〜１０いずれか１項記載のペプチドダイマーを含む組成物。
【請求項１２】
ペプチドが本質的に逆平行ダイマー形態である請求項１〜１０いずれか１項記載のペプチドダイマーを含む組成物。
【請求項１３】
グラム陰性細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）の解毒剤としての請求項１〜１０いずれか１項記載のペプチドダイマーの使用。
【請求項１４】
（ｉ）請求項１〜１０いずれか１項記載のペプチドダイマーまたは請求項１１もしくは１２記載の組成物および（ｉｉ）医薬上許容される希釈剤または担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
敗血症性ショックの治療または予防のための薬物の製造における請求項１〜１０いずれか１項記載のペプチドダイマーまたは請求項１１もしくは１２記載の組成物の使用。
【請求項１６】
敗血症性ショックの治療または予防方法であって、必要とする個体に請求項１〜１０いずれか１項記載のペプチドダイマーまたは請求項１１もしくは１２記載の組成物の治療上有効量を投与することを含む方法。
【請求項１７】
（ｉ）グラム陰性細菌のＬＰＳ実体（部分）および（ｉｉ）請求項１〜１０いずれか１項記載のＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマーを含むＬＰＳ−ペプチド複合体（ここで、ＬＰＳ部分およびＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマーはお互いに非共有結合し合っている）。
【請求項１８】
ＬＰＳが、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）；イー・コリ（E. coli）；サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）；サルモネラ・パラティフィ（Salmonella paratyphi）；シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）；ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）；クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）；ボルデテラ・ペルツッシス（Bordetella pertussis）；ブルセラ（Brucella）；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophia）；ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）；モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catharralis）；シュードモナス・エルジノーザ（Pseudomonas aeruginosa）；およびクレブシエラ・ニューモニア（Kiebsiella pneumonia）のＬＰＳである、請求項１７記載のＬＰＳ−ペプチド複合体。
【請求項１９】
ＬＰＳが、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）のＬＰＳである、請求項１８記載のＬＰＳ−ペプチド複合体。
【請求項２０】
ＬＰＳがＬＰＳ Ｌ８である、請求項１９記載のＬＰＳ−ペプチド複合体。
【請求項２１】
１：１.５〜１：０.５、好ましくは１：１.２〜１：０.８のＬＰＳ：ペプチドモル比を特徴とする、請求項１７〜２０いずれか１項記載のＬＰＳ−ペプチド複合体。
【請求項２２】
１：１のＬＰＳ：ペプチドモル比を特徴とする、請求項２１記載のＬＰＳ−ペプチド複合体。
【請求項２３】
グラム陰性細菌感染症の治療または予防のための請求項１７〜２２いずれか１項記載のＬＰＳ−ペプチド複合体の使用。
【請求項２４】
請求項１７〜２２いずれか１項記載のＬＰＳ−ペプチド複合体および医薬上許容される希釈剤または担体を含む医薬組成物。
【請求項２５】
グラム陰性細菌感染症の治療または予防のための医薬の製造における請求項１７〜２２いずれか１項記載のＬＰＳ−ペプチド複合体の使用。
【請求項２６】
グラム陰性細菌感染症の治療または予防方法であって、必要とする個体に請求項１７〜２２いずれか１項記載のＬＰＳ−ペプチド複合体の治療上有効量を投与することを含む方法。
【請求項２７】
（ｉ）グラム陰性細菌のＬＰＳおよび（ｉｉ）請求項１〜１０いずれか１項記載のペプチドダイマーを混合することを含む、ＬＰＳ／ペプチド複合体の製造方法
【請求項２８】
ＬＰＳおよびペプチドまたはその塩が１：１.２〜１：０.８のＬＰＳ：ペプチドモル比で混合される、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
ＬＰＳおよびペプチドまたはその塩が１：１のＬＰＳ：ペプチドモル比で混合される、請求項２９記載の方法。
【請求項３０】
（ｉ）ＬＰＳおよび（ｉｉ）請求項１〜１０いずれか１項記載のペプチドダイマーを混合することを含む、グラム陰性細菌のＬＰＳを解毒する方法。
【請求項３１】
ＬＰＳおよびペプチドまたはその塩が１：１.２〜１：０.８のＬＰＳ：ペプチドモル比で混合される、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
ＬＰＳおよびペプチドまたはその塩が１：１のＬＰＳ：ペプチドモル比で混合される、請求項３１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＬＰＳ解毒に有用なポリミキシンＢのペプチドアナログに関する。医薬の技術分野では、それらは、（ｉ）とりわけグラム陰性細菌感染症によって引き起こされる敗血症性ショックのような致死性障害を治療するために、そのままで使用できるか；または（ｉｉ）ＬＰＳと非共有結合させて使用してＬＰＳを解毒することができる；その複合体は、グラム陰性細菌感染症に対するワクチン剤として有用である。
【背景技術】
【０００２】
リポ多糖（ＬＰＳ）は、グラム陰性細菌の細胞壁の外膜の主要構成成分である。ＬＰＳは、哺乳動物、特に、ヒトに非常に有毒であり、その生物活性に関しては、内毒素と呼ばれている。それは、グラム陰性細菌による急性感染症（敗血症）により生じる生命にかかわる事象である敗血症性ショックにおける内毒素中毒症に由来する作用に関与している。
【０００３】
ＬＰＳ構造は、多糖部分と共有結合したリピドＡと呼ばれる脂質部分によって構成される。
【０００４】
リピドＡは、特にＢ細胞およびマクロファージとの相互作用を介して、ＬＰＳの毒性作用に関与している。この相互作用は炎症誘発性サイトカインの分泌を誘発する。該炎症症状は致死性の内毒素ショック状態に達することがある。
【０００５】
リピドＡは、非常に疎水性であり、細菌細胞壁の外層においてＬＰＳをしっかりと固定する。リピドＡは、（ｉ）保存二リン酸化二糖領域（最も頻繁には、Ｎ,Ｏ−アシルβ−１,６−Ｄ−グルコサミン１,４'−二リン酸）および（ｉｉ）二糖ヒドロキシルにある様々な水素原子を置換する脂肪酸からなる。脂肪酸の数およびそれらの組成は、種間変数である。一例として、ナイセリア・メニンジティディス（Neisseria meningitidis）リピドＡの２つの対称的なグルコサミン（ＧｌｃＮ１およびＧｌｃＮ２）はそれぞれ以下の脂肪酸を有している：２Ｎ−Ｃ１４,３ＯＨ；Ｃ１２；および３Ｏ−Ｃ１２,３ＯＨ。
【０００６】
ＬＰＳ多糖部分は、抗原性に関与している糖鎖によって構成されている。該糖鎖構造は、自体、（ｉ）リピドＡと結合したＫＤＯ（２−ケト,３−デオキシオクツロソン酸）領域と呼ばれる保存内部コアおよび（ｉｉ）ＫＤＯ領域と結合した、一般的に様々な糖類を含むと定義されている可変外部コア、ならびに（ｉｉｉ）外部Ｏ特異的鎖の第１反復単位（糖類１０個までを含むことができる）からなっている。
【０００７】
ナイセリア類（Neisserias）、ボルデテラ類（Bordetellas）、ヘモフィルス類（Haemophilus）およびモラクセラ類（Moraxellas）のようなグラム陰性非腸内細菌には、Ｏ特異的鎖は存在しない（第１反復単位であると定義されているものは実際には反復していない）。したがって、これらの細菌のＬＰＳは、しばしば、リポオリゴ糖（ＬＯＳ）と称される。
【０００８】
ＬＰＳは、有毒であるだけではなく、免疫原性が高い。哺乳動物では、感染および保菌の間に抗−ＬＰＳ抗体が誘発され、保護することができる。この点から、ＬＰＳを解毒し、グラム陰性細菌感染症および関連疾患の予防においてその解毒された形態を使用することが既に提案されている。
【０００９】
すでにいくつかの解毒方法が知られている。特に、ポリミキシンＢまたはより適切にはそのペプチドアナログを使用してＬＰＳを解毒することができる。
【００１０】
ポリミキシンＢは、ＬＰＳが有意に解毒されるように高親和性でリピドＡと結合する分子である。ポリミキシンＢは、動物モデルにおいて治療的に投与された場合に敗血症性ショックを予防することができる。しかしながら、ポリミキシンＢは、その生分解性および結果として生じる腎臓へ蓄積する傾向のためにヒトにとって多少有毒である可能性のあるポリカチオン性抗体である。したがって、予防薬または治療薬における使用には推奨されていない。
【００１１】
この制限を克服するために、ポリミキシンＢのペプチドアナログが開発された。それらは、ポリミキシンＢ毒性を保持しないが、単にポリミキシンＢの一次および二次構造を摸倣しており、ＬＰＳ−ペプチド複合体が形成されるようにポリミキシンＢと同一の部位でリピドＡと結合する。結果として、ＬＰＳは解毒される。ペプチドアナログは、特に、特許文献１、特許文献２、特許文献３、特許文献４、特許文献５および特許文献６に記載されている。それらのうちの１つである、式ＫＴＫＣＫＦＬＫＫＣで示される環状モノマーＳＡＥＰ２（合成抗内毒素ペプチド２）は、より詳しく研究されている（非特許文献１および非特許文献２）。
【特許文献１】米国特許第5,358,933号
【特許文献２】WO 93/14115
【特許文献３】WO 95/03327
【特許文献４】WO 96/38163
【特許文献５】EP 842 666
【特許文献６】EP 976 402
【非特許文献１】Rustici et al, 1993, Science 259:361
【非特許文献２】Velucchi et al, 1997, J. Endotox. Res. 4(4): 261
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ＳＡＥＰ２ペプチド、および２つの隣接するシステイン残基によって囲まれており、陽イオン性アミノ酸から作られた短い外部尾部によって平衡している多数の非荷電性極性アミノ酸をそれらの配列に含む類似ペプチド（以下、総称的にＳＡＥＰ ＩＩペプチドと称する）が、それらがダイマー形態である場合に特に興味深いものであることが見出された；該ダイマーは、システイン残基間の一組のジスルフィド結合によって立体構造的に形成され維持されている。実際に、ＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマーは、対応するモノマーよりも強い解毒特性を示す。
【００１３】
したがって、本発明は、式（Ｉ）：
【化１】
2008537749.tif 000003
［式中、２個のＣｙｓ１残基は、ジスルフィド結合を介して結合し合っており、２個のＣｙｓ２残基は、ジスルフィド結合を介して結合し合っている］
または式（ＩＩ）：
【化２】
2008537749.tif 000004
［式中、Ｃｙｓ１残基は、ジスルフィド結合を介してＣｙｓ２残基と結合している］
（ここで、ＡおよびＡ'は、独立して、少なくとも２個のアミノ酸残基が独立してＬｙｓ、Ｈｙｌ（ヒドロキシ−リジン)、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基２〜５個、好ましくは、３または４個のペプチド部分である；
ここで、ＢおよびＢ'は、独立して、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから独立して選択されるアミノ酸残基を少なくとも２個、好ましくは３個含むアミノ酸残基３〜７個、好ましくは４または５個のペプチド部分である；
ここで、ＣおよびＣ'は、任意であり（これらの位置は、空であってもそうでなくてもよい）、独立して、アミノ酸残基であるかまたはアミノ酸残基２〜３個のペプチド部分である；
ただし、陽イオン性アミノ酸残基／疎水性アミノ酸残基比（陽イオン性／疎水性比）は、０.４〜２、有利には０.５から１.２または１.５まで、好ましくは０.６〜１；最も好ましくは０.６〜０.８；例えば、０.７５である）
で示されるＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマーに関する。
【００１４】
有利には、ＡおよびＡ'は、独立して、少なくとも１個、好ましくは２個のアミノ酸残基が独立してＬｙｓ、Ｈｙｌ、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択されるアミノ酸残基２〜５個、好ましくは３または４個のペプチド部分である；Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、ＡｒｇおよびＨｉｓから選択されないもの（「残りのアミノ酸残基」）は、存在する場合には、非荷電性極性または非極性アミノ酸残基（好ましくは、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＧｌｙ；最も好ましくはＴｈｒ）からなる群から選択される。
【００１５】
ＡおよびＡ'ペプチド部分がアミノ酸残基３個を含む場合、それらは各々陽イオン性残基であり得るか；または別法として、残基３個のうち２個は陽イオン性アミノ酸であり、残りの残基は、非荷電性極性または非極性アミノ酸残基（好ましくは、Ｔｈｒ、ＳｅｒおよびＧｌｙ；最も好ましくは、Ｔｈｒ）からなる群から選択される。
【００１６】
ＡおよびＡ'ペプチド部分がアミノ酸残基４個を含む場合、残基４個のうち２個または３個は上記定義の陽イオン性アミノ酸残基からなる群から選択され、残りの残基は上記定義の非荷電性極性または非極性アミノ酸残基からなる群から選択されるのが好ましい。
【００１７】
ＡおよびＡ'ペプチド部分がアミノ酸残基５個を含む場合、残基５個のうち３個または４個は上記定義の陽イオン性アミノ酸残基から選択され、残り残基は上記定義の非荷電性極性または非極性アミノ酸残基からなる群から選択されるのが好ましい。
【００１８】
有利には、ＢおよびＢ'は、独立して、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐ（好ましくは、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｈｅ）から独立して選択されるアミノ酸残基を少なくとも２個、好ましくは３個含むアミノ酸残基３〜７個、好ましくは４個または５個のペプチド部分である；Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから選択されないもの（「残りのアミノ酸残基」）は、存在する場合には、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる群から独立して選択される。容易に理解されるように、ＢおよびＢ'ペプチド部分は、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから独立して選択されるアミノ酸残基を７個まで含むことができる。
【００１９】
有利には、ＢおよびＢ'ペプチド部分は、配列−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−を含む（ここで、Ｘ１およびＸ２；Ｘ２およびＸ３；またはＸ１、Ｘ２およびＸ３は、独立して、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐから選択され；好ましくは、Ｌｅｕ、ＩｌｅおよびＰｈｅから選択される。好ましい実施態様では、配列−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−は、Ｐｈｅ−Ｌｅｕモチーフを含む。
【００２０】
ペプチド部分ＢおよびＢ'の特定の実施態様としては、
（ｉ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−配列（ここで、
Ｘ１はＬｙｓ、Ｈｙｌ、ＨｉｓまたはＡｒｇであり、好ましくはＬｙｓまたはＡｒｇであり；より好ましくはＬｙｓであり；
Ｘ２はＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＶａｌであり；好ましくはＰｈｅまたはＬｅｕであり；より好ましくはＰｈｅであり；
Ｘ３はＰｈｅ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＶａｌであり；好ましくはＰｈｅまたはＬｅｕであり；より好ましくはＬｅｕである）；および
（ｉｉ）存在するとすれば、各々、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ｈｙｌ、ＡｒｇおよびＨｉｓからなる群；好ましくはＶａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる群；より好ましくはＬｅｕ、ＩｌｅおよびＰｈｅからなる群から選択されるアミノ酸残基
が挙げられる。
【００２１】
ＢおよびＢ'が４個を超える非極性アミノ酸残基を含む場合、ＡおよびＡ'は、好ましくは、正に荷電されたアミノ酸残基を少なくとも３個含む。
【００２２】
ＣおよびＣ'ペプチド部分では、アミノ酸残基は、いずれものアミノ酸残基であり得るが、ただし、陽イオン性アミノ酸残基／疎水性アミノ酸残基比は所定の範囲内である。有利には、それらは、独立して、極性または非極性の非荷電性アミノ酸残基から選択され、これらの後者が好ましい。しかしながら、好ましくは、ＣおよびＣ'は空の位置である。
【００２３】
したがって、好ましいクラスのダイマーは、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2008537749.tif 000005
または式（ＩＶ）：
【化４】
2008537749.tif 000006
［式中、Ａ、Ａ'、ＢおよびＢ'は上記のとおりである；ただし、陽イオン性アミノ酸残基／疎水性アミノ酸残基比は、０.４〜２、有利には、０.５から１.２または１.５まで、好ましくは０.６〜１；最も好ましくは０.６〜０.８；例えば０.７５である］
で示されるものである。
【００２４】
平行配向のペプチドを有する式（Ｉ）または（ＩＩＩ）で示されるダイマーは、平行ダイマーと称される。逆平行配向のペプチドを有する式（ＩＩ）または（ＩＶ）で示されるダイマーは、逆平行ダイマーと称される。
【００２５】
式（Ｉ）〜（ＩＶ）では、ＡとＡ'は好ましくは同一である。ＢとＢ'；およびＣとＣ'についても同じことが言える。ＡとＡ'；ＢとＢ'；およびＣとＣ'が２つずつ同一である式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）で示されるペプチドダイマーは、同種ダイマーと称される。実際に、この場合、該ダイマーに含まれるペプチドサブユニットは同一である。
【００２６】
一例として、本発明のダイマーにおいて用いるのに適しているものとして以下のペプチドが挙げられる：
【化５】
2008537749.tif 000007
【００２７】
対応する同種ダイマーの個々の陽イオン性／疎水性比は、２.００、０.５０、０.７５および０.６７である。
【００２８】
上記ダイマーの特定の例は、式（Ｖ）ＮＨ2−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ１−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｃｙｓ２−ＣＯＯＨで示されるペプチドによって構成される。このペプチドは、以下、ＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドと称される。上記のとおり、それはまた、平行または逆平行ダイマー形態であり得る。
【００２９】
本発明に含まれるペプチドまたは本発明のダイマーに含まれるペプチドは、例えばコンピューターによる自動合成装置を用いるような古典的方法によって合成され得る。特定のペプチドが得られるような手順を設計する方法を知ることはペプチド合成の技術分野における当業者の技能の範囲内である。合成期の間、システインのチオール基を保護することができるのは当然である。合成が完了すると、それらは脱保護され、環状モノマー、平行または逆平行ダイマーを生成させるために該チオール基の酸化が行われる。
【００３０】
ペプチド中に存在する両方のシステイン残基が同時に脱保護された場合、酸化により理論的には３つの形態の各々を生成することができる。次いで、３つの形態の各々は、慣用的な生化学的精製方法によってお互いに分離され得る。適当な例として、分取逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）が挙げられる。実際に、３つの形態の各々は、異なる保持時間で溶出すると考えられる。したがって、精製した環状モノマー、または精製した平行および逆平行ダイマーを含有する調製物は、個々のピークフラクションを一緒にプールすることによって簡単に得ることができる。
【００３１】
酸化により生じた３つの形態の各々の個々の割合は、とりわけ特定のアミノ酸配列、および、重要なことには、該ペプチドの濃度に依存する。偶然に３つの形態のうち１つまたは２つが優位に生じることがあり得る；そして、実際に、１つまたは２つの形態の優位さは、他のものが全く形成されないようなものであり得る。
【００３２】
一例として、ＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドは自然発生的に酸化して、溶液中の該ペプチドの濃度に依存する割合で環状モノマーおよび逆平行ダイマーとなる。逆平行ダイマーの「側鎖」（ＮＨ２−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−部分）の内部立体障害は、平行ダイマーのものよりも明らかに低く、平行ダイマーと比べて低い最小エネルギーが水性溶媒中での逆平行ダイマーの優先的形成の原因であると考えられ得る。この濃度主導型方法の直接的な結果として、逆平行ダイマーおよびそれほどではないにせよ環状モノマーの形成は、平衡状態から平行ダイマーの排除に至るまで好ましい。
【００３３】
酸化により平行ダイマーが自然発生的に生じることができない場合、平行配向でペプチドを会合させるために特定の処置を取ることが必要である。これらの処置は、ペプチド合成の技術分野における当業者の技能の範囲内である。それにもかかわらず、単なる一例として、Ｃｙｓ１およびＣｙｓ２アミノ酸の差動保護に次ぐ選択的脱保護が平行配向をもってダイマー化を行うための好都合な方法であることが示される。次いで、ダイマーは、ＲＰ−ＨＰＬＣを含む慣用方法によって精製することができる。
【００３４】
化学合成し、精製したペプチドは、化学合成工程および精製工程の間に酸および塩が用いられるために、一般に塩形態で得られる。一般に用いられる塩は酢酸塩である。したがって、本明細書で用いる「ペプチド」なる用語は塩形態も包含すると理解すべきである。
【００３５】
本発明のダイマーで用いるためのペプチドは、とりわけ、イオン・サイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）、マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）質量分析法および核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光測定法を包含する様々な技術によって特徴付けることができる。特に、ＮＭＲ分析法により３つの形態（環状モノマー、平行および逆平行ダイマー）の各々を識別することができる。ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析法は、単にモノマーとダイマーとを識別することができる。
【００３６】
本発明の化合物の純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣによって評価することができる。すなわち、化合物の調製物をＲＰ−ＨＰＬＣにかける。ピーク面を積分することによって相対的な純度を算出する。それは、化合物のピーク面／全ピーク面として表される。通常、それぞれ少なくとも９５％、しばしば少なくとも９７％の純度を示す本発明の化合物が製造される。
【００３７】
本発明はまた、
−  ペプチドが本質的に平行ダイマー形態である、ＳＡＥＰ ＩＩペプチド；
−  ペプチドが本質的に逆平行ダイマー形態である、ＳＡＥＰ ＩＩペプチド；または
−  その混合物
を含む組成物に関する。
【００３８】
「本質的に」とは、組成物において特定の形態が少なくとも９５％、好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは９８％の純度であることを意味する。
【００３９】
ＳＡＥＰ ＩＩペプチドがいくつかの形態（平行ダイマー形態、逆平行ダイマー形態および／またはモノマー形態）で存在する混合組成物は、一定の期間にわたって適当な温度で維持された単一の実体（例えば、平行ダイマー形態）を含む組成物の進展により自然発生的に生じる。これは、例えばＲＰ−ＨＰＬＣ分析により、明らかにすることができる。同様に、種々のペプチド形態の個々の量を定量化することができる。
【００４０】
ＳＡＥＰ ＩＩダイマーは、インビトロおよびインビボで、そのままでグラム陰性細菌性ＬＰＳの解毒剤として有用である。したがって、それらは、グラム陰性細菌感染症の結果としてのＬＰＳの全身循環中（例えば、血液中）への放出に起因する病的状態を予防または治療するために使用することができる。これらの状態としては、とりわけ、内毒素中毒症、細菌性敗血症および敗血症性ショックが挙げられる。
【００４１】
したがって、本発明は、以下のことを包含する：
−  本発明の化合物または組成物の医薬用途；
−  本発明の化合物または組成物を医薬上許容される希釈剤または担体と一緒に含む医薬組成物；
−  敗血症性ショックの治療または予防のための薬物の製造における本発明の化合物または組成物の使用；および
−  敗血症性ショックの治療または予防方法であって、必要とする個体に本発明の化合物または組成物の治療上または予防上有効量を投与することを含む方法。
【００４２】
本発明の化合物または組成物は、内毒素中毒症、細菌性敗血症および／または敗血症性ショックを引き起こす可能性があるグラム陰性細菌感染症が診断された場合、哺乳動物、すなわちヒトに投与することができる。これらの致死性障害の原因となり得るグラム陰性細菌としては、とりわけ、ナイセリア・メニンジティディス（N. meningitidis）、イー・コリ（E. coli）、サルモネラ・ティフィ（Salmonella typhi）、ボルデテラ・ペルツッシス（Bordetella pertussis）およびシュードモナス・エルジノーザ（Pseudomonas aeruginosa）が挙げられる。本発明の化合物または組成物は、必要とする個体に全身経路、好ましくは静脈内経路によって投与することができる。投与量は、とりわけ、患者の年齢、体重および生理学的状態ならびに感染状態を包含する種々の因子に依存する。致命的事象のリスクが回避されるまで１回または数回投与することができる。
【００４３】
ＳＡＥＰ ＩＩダイマーおよびＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドはまたインビトロでＬＰＳを解毒することができるので、本発明はまた、（ｉ）グラム陰性細菌のＬＰＳ部分、および（ｉｉ）ＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマーまたはＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドを含むＬＰＳ−ペプチド複合体に関する；ここで、ＬＰＳ部分とＳＡＥＰ ＩＩペプチドダイマーまたはＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドとはお互いに非共有結合し合っている。
【００４４】
ＬＰＳ解毒は、欧州薬局方において言及されている多数のアッセイで評価することができる。それらは、Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバー様細胞ライセート（ＬＡＬ）アッセイ、ウサギにおける発熱物質試験およびＤ−ガラクトサミン感作マウスにおける急性毒性アッセイを包含する。これらのアッセイは、以下の実施例で例示する。各アッセイでは、ＬＰＳの作用およびＬＰＳ−ペプチド複合体の作用を平行して測定して、解毒比を確立する。
【００４５】
ＬＡＬアッセイでは、解毒比は、ＬＰＳ／ＬＰＳ−ペプチド複合体比によって表される。発熱物質試験および急性毒性アッセイでは、解毒比は、ＬＰＳ−ペプチド複合体／ＬＰＳ比によって表される。
【００４６】
以下の場合に有意な解毒が得られる：
（ｉ）  ＬＡＬアッセイで測定された解毒比が少なくとも１００、好ましくは５００、より好ましくは１０００である場合；
（ｉｉ）  発熱物質試験で測定された解毒比が少なくとも５０、好ましくは１００、より好ましくは５００である場合；または
（ｉｉｉ）  Ｄ−ガラクトサミンマウスで測定された解毒比が少なくとも５０、好ましくは１００、より好ましくは２００である場合。
【００４７】
解毒はまた、インビトロまたはインビボアッセイで、ＩＬ６、ＩＬ８およびＴＮＦαのような炎症誘発性サイトカインの放出に対するＬＰＳおよびＬＰＳ−ペプチド複合体の効果を比較して評価することもできる。これらのアッセイは、以下の実施例に例示する。ＬＰＳ−ペプチド複合体が実施例のセクション５.４.１に記載するインビボアッセイでＩＬ６分泌を少なくとも２５倍、好ましくは少なくとも５０倍、より好ましくは少なくとも７５倍、最も好ましくは少なくとも１００倍減少させる場合に有意な解毒が達成される。
【００４８】
本発明のＬＰＳ−ペプチド複合体は、有利には、１：１.５〜１：０.５、好ましくは１：１.２〜１：０.８、より好ましくは１：１.１〜１：０.９、最も好ましくは１：１のＬＰＳ：ペプチドモル比によって特徴付けられる。
【００４９】
本発明の複合体における使用については、ＬＰＳは、有利には、ナイセリア・メニンジティディス；イー・コリ；サルモネラ・ティフィ；サルモネラ・パラティフィ（Salmonella paratyphi）；シゲラ・フレクスネリ（Shigella flexneri）；ヘモフィルス・インフルエンゼ（Haemophilus influenzae）；ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）；クラミジア・トラコマチス（Chlamydia trachomatis）；ボルデテラ・ペルツッシス；ブルセラ（Brucella）；レジオネラ・ニューモフィラ（Legionella pneumophia）；ビブリオ・コレラ（Vibrio cholera）；モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catharralis）；シュードモナス・エルジノーザ；エルシニア（Yersinia）；およびクレブシエラ・ニューモニア（Kiebsiella pneumonia）のＬＰＳである。
【００５０】
序論に記載したように、解毒されたＬＰＳは、グラム陰性細菌感染症に対するワクチン剤として有用であり得る。
【００５１】
髄膜炎は、ウイルス起源または細菌起源の生命にかかわる疾患である。ヘモフィルス・インフルエンゼ（H. influenzae）およびナイセリア・メニンジティディスは、それぞれ、細菌性髄膜炎の約４０および５０％に関与している。ヘモフィルス・インフルエンゼに対するワクチン剤は１０年以上もの間市販されているが、ナイセリア・メニンジティディスに対するワクチンは依然として必要とされている。
【００５２】
髄膜炎菌性侵襲性疾患は、脳および脊髄の髄膜の炎症（髄膜炎）または血液の全身感染（髄膜炎菌性敗血症または髄膜炎菌血症）のいずれかとして発現することがある。
【００５３】
髄膜炎菌は多糖類莢膜の構造に基づいて血清学的方法を用いて分類される。抗原的におよび化学的に異なる１３種類の多糖類莢膜が記載されている。ほとんど全ての侵襲性髄膜炎菌性疾患は、５つの血清型：Ａ、Ｂ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５によって引き起こされる。各血清型の相対的な重要さは、地理的位置に依存する。血清型Ｂは、温暖な国における髄膜炎菌性疾患の大部分に関与している。
【００５４】
血清型Ａ、Ｃ、ＹおよびＷ−１３５に対する複合多糖類ワクチンは既に存在しているが、現在のところ、アメリカ合衆国およびヨーロッパにおいて蔓延している血清型に対するワクチンはない。実際には、ｍｅｎＢ疾患を予防するためのワクチン剤としての莢膜多糖の使用は問題を含んでいる。
【００５５】
したがって、完全に抗原性の特別に解毒された形態でのワクチン剤としてのナイセリア・メニンジティディスＬＰＳの使用は、特に血清型Ｂに対する、望ましいワクチン接種率を提供することができる有望な代替物である。
【００５６】
上記序論に記載したように、ナイセリア類、ボルデテラ類、ヘモフィルス類およびモラクセラ類のようなグラム陰性非腸内細菌の細胞壁の主な構成成分は、真のＬＰＳではなくてリポオリゴ糖（ＬＯＳ）である。それにもかかわらず、この用途の目的で、ＬＰＳなる用語は、ＬＯＳを包含すると理解されるべきである。ＬＯＳは、ＬＰＳの特定のサブクラスを構成する。「髄膜炎菌性ＬＰＳ」なる用語および「髄膜炎菌性ＬＯＳ」なる用語は、同じ意味で用いられる。
【００５７】
図１は、ナイセリア・メニンジティディスＬＯＳの構造の図式を示す。ＬＯＳは、ＫＤＯによってリピドＡと結合している５〜１０個の単糖類からなる分枝オリゴ糖によって構成されている。リピドＡ、ならびに２つのＫＤＯ、２つのヘプトース（ＨｅｐＩおよびＩＩ）およびＮ−アセチル化グルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）によって構成されている内部コアは、種内で保存されている。外部コアを構成するオリゴ糖鎖の残部（ＨｅｐＩに結合しているα−鎖；ＨｅｐＩＩの３位に結合しているβ−鎖；およびＨｅｐＩＩの２位に結合しているγ−鎖）は、免疫型（ＩＴ）に従って可変である。
【００５８】
ナイセリア・メニンジティディスＬＰＳは、一連のモノクローナル抗体との反応性に基づいて１３種類の免疫型に分類することができる（Achtman et al, 1992, J Infect. Dis. 165: 53-68）。免疫型間の差異は、オリゴ糖鎖の組成および立体構造の違いによるものである。これは、下記表に見ることができる。
【００５９】
【表１】
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【００６０】
上記表に示したように、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）は、ＬＯＳ Ｌ１、Ｌ３、Ｌ７およびＬ８においてＨｅｐＩＩの３位でβ−鎖のＧｌｃを置換する。ＰＥＡは、ＬＯＳ Ｌ２、Ｌ４およびＬ６において６位または７位にて結合されている。ＬＯＳ Ｌ２、Ｌ３、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ５、Ｌ７はまた、α−鎖の末端ガラクトース（Ｇａｌ）にてＮ−アセチルノイラミン酸でシアリル化することもできる。
【００６１】
免疫型Ｌ１〜Ｌ８は、血清型ＢおよびＣと本質的に結合するが、免疫型Ｌ９〜Ｌ１２は、主に血清型Ａ内で見つけられる。
【００６２】
いずれのＬＯＳも同等に解毒することができるが、これら後者はさらにワクチン用とすることを目的とするので本発明の複合体においてＬＯＳ Ｌ８を用いるのが有利である。実際には、ＬＯＳ Ｌ８ α−鎖の完全な構造は、該構造がこれまでのところ同定された免疫型全てに共通している（Kahler & Stephens, 1988, Crit. Rev. Microbiol. 24:281）。
【００６３】
髄膜炎菌株は、しばしばいくつかの免疫型を発現するが、その存在は培養条件によって影響を受ける可能性がある。ＬＯＳ Ｌ８に特別に関心があれば、主にＬ８免疫型を発現するか、またはより好ましくは排他的にそれを発現することが知られている株からこのＬＯＳを抽出するのが望ましい。この目的を達成するために、血清型Ａの株Ａ１（２Ｅとも称される）、血清型Ｂの株Ｍ９７８（Mandrell & Zollinger, 1977, Infect. Immun. 16:471；Gu et al, 1992, J. Clin. Microbiol. 30:2047-2053；Zhu et al, 2001, FEMS Microbiol. Lett. 203:173）、血清型Ｂの株８６８０（Dominique Caugeant collection）および株８５３２（米国特許第6,476,201号）が適している。これらの株は、科学コミュニティーから入手できる（米国特許第6,531,131）。
【００６４】
ＬＯＳ Ｌ８に対して特異的なモノクローナル抗体としては、Ｍａｂ ２−１−１８（Moran et al, 1994 Infect Immun. 62: 5290-5295；Mandrell et al, 1986, Infect Immun. 54: 63-69）、Ｍａｂ ６Ｅ７−１０（Braun et al, 2004, Vaccine 22: 898-908）、Ｍａｂ ４３８７Ａ５および４３８５Ｇ７（Andersen et al, 1995, Microb. Pathog. 19: 159-168；Gu et al（上記を参照））が挙げられる。
【００６５】
本発明の複合体における使用のために、ＬＰＳは慣用的な手段によって得ることができる；特に、グラム陰性細菌培養物から抽出することができ、次いで、古典的な方法に従って精製することができる。このような方法の多くの記載を文献中に見ることができる。この文献としては、とりわけ、Gu & Tsai, 1993, Infect. Immun. 61(5): 1873、Wu et al, 1987, Anal. Biochem.160:281および米国特許第6,531,131号が挙げられる（全て単に例示として挙げられる）。ＬＰＳ調製物はまた、当該技術分野で周知の方法に従って定量化され得る。好都合な方法は、高速陽イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥＣ）ＰＡＤを用いるＫＤＯ投与である。
【００６６】
ＬＰＳは、そのまままたは抱合した形態で本発明の化合物と複合体を形成することができる。ＬＰＳ抱合体は、ＬＰＳを担体分子、例えば、ポリペプチドまたはペプチドに、直接共有結合を介してまたは化学的スペーサー／リンカー分子を使用して共有結合させることによって慣用的に製造することができる。担体分子の例としては、百日咳、ジフテリアまたは破傷風のトキソイド、およびナイセリア・メニンジティディスのＯＭＰ１またはＯＭＰ２／３のような外膜タンパク質（ＯＭＰ）が挙げられる。このような抱合方法の記載は文献中に多く見ることができる。単に例示として米国特許第6,531,131が挙げられる。
【００６７】
抱合した形態で使用される場合、ＬＰＳは、有利には、本発明の化合物と複合体を形成する前に抱合される。いわゆる非抱合ＬＰＳも同様に適している。
【００６８】
本発明はまた、
−  （ｉ）グラム陰性細菌のＬＰＳおよび（ｉｉ）本発明の化合物を混合することを含む、グラム陰性細菌ＬＰＳを解毒する方法；および
−  （ｉ）グラム陰性細菌のＬＰＳおよび（ｉｉ）本発明の化合物を混合することを含む、ＬＰＳ−ペプチド複合体の製造方法
に関する。
【００６９】
本発明の方法において使用するために、両方の成分は、有利には、液体媒体（適当には、水）中に存在する。ＬＰＳ溶液および化合物溶液は、有利には、混合前に滅菌される。製造方法は、有利には、滅菌条件下で行われる。混合すると、該複合体を含有する沈殿物が形成される。それは、とりわけ、遠心分離によって回収することができ、必要に応じて１回または数回の洗浄工程を施すことができる。
【００７０】
上記のとおり、本発明のＬＰＳ−ペプチド複合体は、それらが哺乳動物に安全に投与され得る点で有用である。実際に、ＬＰＳは、投与後に副作用が生じなくなるほどまでに解毒される。一例として、ウサギの発熱物質アッセイにおいて１ｎｇ／ｍＬ／ｋｇ ＩＶ投与量を超える、好ましくは、１０ｎｇ／ｍＬ／ｋｇ ＩＶ投与量の発熱閾値を示すＬＰＳ−ペプチド複合体が適している。別法として、または、加えて、ＬＡＬアッセイに言及することができる。すでに、３,０００〜５,０００のＬＡＬ内毒素単位となるＬＰＳを含有するワクチンがヒト投与について認可されているので（Frederiksen et al, 1991, NIPH Annals 14(2): 67）、本発明のワクチンの投与量は、安全には、５,０００ ＬＡＬ内毒素単位またはそれ以下、例えば、３,０００未満、２,０００未満、１,０００未満または５００未満のＬＡＬ内毒素単位未満を示すことができることを予想することができる。
【００７１】
一例として、ＬＡＬアッセイにおいて例えば１００内毒素単位（ＥＵ)／μｇを示す複合体は、したがって、２０μｇの投与量での投与に対して受け入れられる。本発明の複合体は、５０ＥＵ／μｇよりも低い、しばしば、２０ＥＵ／μｇよりも低いＬＡＬ活性を示すことができるので、このことは本発明の複合体を用いて達成できる。
【００７２】
また、本発明のＬＰＳ−ペプチド複合体は、生理学的条件下であっても、安定である。「安定した」とは、複合体におけるＬＰＳの解毒状態が、長期間、少なくとも３、６、１２または１８ヶ月間、一定のままであることを意味する。これは、すなわち上記アッセイのうちの少なくとも１つにおいて、間隔を置いて解毒比を評価することによってモニターすることができる。長期間、解毒比の有意な差異は観察されない。
【００７３】
本発明のＬＰＳ−ペプチド複合体はまた、それらがグラム陰性細菌に対する免疫応答を誘発することができる点で有用である。これは、哺乳動物、例えば、ウサギ、マウスまたはヒトへの複合体の投与、次いで、ＬＰＳに対して特異的な抗体（とりわけ、免疫グロブリンＧまたはＭ）の存在を明らかにするための血清のＥＬＩＳＡ分析により示すことができる。有利には、該免疫応答（誘発された抗体）は、殺菌活性および／またはオプソニン活性を有することができる。
【００７４】
グラム陰性細菌感染症から保護することができる本発明の複合体によって誘発される免疫応答の能力は、現在のところ細菌種または疾患に対して特異的である適当な動物モデルにおいて評価することができる。特定の細菌または疾患に関する公知の動物モデルを選択することはワクチンの技術分野における当業者の技能の範囲内である。
【００７５】
一例として、ナイセリア・メニンジティディスから保護することができる本発明の複合体によって誘発される免疫応答の能力は、マウスの腹腔内感染モデルにおいて評価することができる（Schryvers et al, 1989, Infect. Immun. 57(8): 2425およびDanve et al, 1993, Vaccine 11(12): 1214）。複合体を投与した後のヒト血清の殺菌活性を測定することによってヒトにおいて評価することもできる。実際に、この試験は、少なくともナイセリア・メニンジティディス血清型Ｂからの保護の代用試験としての役割を果たすために提案された（Holst et al, 2003, Vaccine, 21:734）。４よりも高いかまたはそれと同等のヒト血清殺菌活性（ＳＢＡ）力価は、保護と相関関係にあることを示した。
【００７６】
これに関連して、本発明はまた、
（ｉ）  グラム陰性細菌感染症の治療または予防のための、本発明のＬＰＳ−ペプチド複合体の使用；
（ｉｉ）  本発明のＬＰＳ−ペプチド複合体および医薬上許容される希釈剤または担体を含む医薬（ワクチン）組成物；
（ｉｉｉ）  グラム陰性細菌感染症の治療または予防のための薬物の製造における本発明のＬＰＳ−ペプチド複合体の使用；
（ｉｖ）  哺乳動物に本発明のＬＰＳ−ペプチド複合体の有効量を投与することを含む、グラム陰性細菌ＬＰＳまたはグラム陰性細菌に対して哺乳動物における免疫応答を誘発させる方法；および
（ｖ）  必要とする個体に本発明のＬＰＳ−ペプチド複合体の治療上有効量を投与することを含む、グラム陰性細菌感染症の治療または予防方法
に関する。
【００７７】
本発明のワクチン組成物は、慣用的な経路により、特に全身または筋肉内経路により、単回投与として、または１回または数回の反復投与として、例えば間隔を置いて２または３回、例えば１、２、３、６、１０、１２ヶ月間隔で投与することができる。本発明のワクチン組成物は、有利には液体形態で、慣用的に製剤化され得る。必要に応じて、本発明のワクチン組成物にアジュバントを加えることができる；しかしながら、本発明の複合体は、ワクチン組成物中のアジュバントの存在を必要としないように十分に免疫原性を示し得ることが示される。
【００７８】
適当な投与量は、当業者によって決定され得るように、種々のパラメーター、例えば、処置される個体（大人または子供）、投与の様式および頻度、ならびにＬＰＳ解毒状態に依存する。一般に、ヒトの大人への投与量は、１０,０００ ＬＡＬ内毒素単位を超えるべきではない；有利には、８,０００ ＬＡＬ内毒素単位を超えるべきではない；好ましくは、５,０００ ＬＡＬ内毒素単位を超えるべきではない；より好ましくは、１,０００ ＬＡＬ内毒素単位を超えるべきではない；最も好ましくは、５００ ＬＡＬ内毒素単位を超えるべきではないことが示される。ＬＡＬアッセイでは、本発明の複合体についての測定値は、一般に、１０〜２０ＥＵ／μｇという低い値であり得る。したがって、投与量は、１〜５００、有利には２.５〜１００、好ましくは１０〜５０、より好ましくは１５〜３０μｇを含有することができる。
【００７９】
慣例により、複合体の量は常にＬＰＳ含量として表される。したがって、例示として、「複合体５０μｇ」とは、実際には、複合体調製物中のＬＰＳ ５０μｇを意味する。
【００８０】
以下に記載する実施例は、添付の図面を参照して本発明をさらに例示するものである。
【００８１】
図１Ａは、ナイセリア・メニンジティディスのＬＰＳ Ｌ８の構造を示す。Ｋｄｏは、２−ケト,３−デオキシオクツロソン酸の略である；Ｈｅｐは、ヘプトースの略である；Ｇｌｃは、グルコースの略である；Ｇａｌはガラクトースの略である；ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチル化グルコサミンの略である。
【００８２】
図１Ｂは、酢酸でのＬＰＳ処理後に生じる反応を示す。
【００８３】
図２Ａ〜２Ｃは、本質的に、モノマー形態（２Ａ）、平行ダイマー形態（２Ｂ）および逆平行ダイマー形態（２Ｃ）のＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドを含む組成物を用いて２１４ｎｍで得たＨＰＬＣクロマトグラムを示す。軸は、時間（分）および吸光度単位（ＡＵ）である。
【００８４】
図３は、モノマー形態、平行ダイマー形態および逆平行ダイマー形態のＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドを含む組成物を用いて２１４ｎｍで得たＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【００８５】
図４Ａ〜４Ｃは、本質的に、モノマー形態（４Ａ）、平行ダイマー形態（４Ｂ）および逆平行ダイマー形態（３Ｃ）のＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドを含む組成物を用いて得た1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。それらの全てにおいて、１.９ｐｐｍでのピークは、該ペプチドが酢酸塩形態であることを示している。
【００８６】
図５Ａ〜５Ｃは、図４Ａ〜４Ｃの1Ｈ ＮＭＲスペクトルの６.５〜７.５ｐｐｍで構成される範囲の拡大図である。
【００８７】
図６は、モノマー形態、平行ダイマー形態および逆平行ダイマー形態のＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドを含む組成物を用いて得た1Ｈ ＮＭＲスペクトルの６.５〜７.５ｐｐｍ領域を示す。
【００８８】
図７Ａ〜７Ｃは、較正基準（７Ａ）、平行ダイマー（７Ｂ）および逆平行ダイマー（７Ｃ）のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦスペクトルを示す。
【００８９】
図８は、酢酸処理により加水分解されたＬＰＳのＨＰＥＡＣ−ＰＡＤクロマトグラムを示す。
【実施例】
【００９０】
実施例１：  ＳＡＥＰ２−Ｌ２平行ダイマーの製造
１．１．  合成
対応する線状モノマーの合成は、Atheron & Shepard: in Solid phase peptide synthesis, 1989, IRL press, Oxford U.によって報告された選択されたペプチド配列の最初のアミノ酸の選択に従って適当に活性化されている樹脂支持体（例えば、ポリオキシエチレングリコール活性化ポリスチレン、または活性化ポリアクリルアミド）を含有するカラムを用いて操作するコンピューターによる自動合成装置Ｍｉｌｌｉｇｅｎ ９０５０（Millipore Inc.）を使用して固相上にて行われる。
合成サイクルは、報告された線状配列に従って段階的に進む。それは、純粋な溶媒ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中にて行われる。端が保護されている活性化アミノ酸を使用する。
１０位のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ−１０）のチオール基を酸不安定性基トリチル（トリフェニル−メチル誘導体、Ｔｒｔ）で保護する。４位のＣｙｓ残基（Ｃｙｓ−１０）のチオール基を酸耐性基Ｓ−アセトアミド−メチル（Ａｃｍ）で保護する。
アミノ酸は全てＯ−ペンタ−フルオロフェニル−リン酸エステル（Ｏ−Ｐｆｐ−誘導体）によって−ＣＯＯＨ側にて活性化される。それらは、９−フルオレニル−メチルオキシ−カルボニルエステル（Ｆｍｏｃ−誘導体）によって−ＮＨ2側にて一時的に保護される。
合成した後、２〜５％（ｖ／ｖ）のスカベンジャーエタンジチオールの存在下にてＴＦＡ ９５％を使用して保護ペプチドを樹脂支持体から開裂する。これらの条件下で、Ｃｙｓ−１０のチオール基は脱保護されるが、一方、Ｃｙｓ−４のチオール基はＡｃｍ保護されたままである。遊離Ａｃｍ保護ペプチドを真空蒸発により濃縮し、次いで、最終濃度８０％（ｖ／ｖ）でエーテルを用いて沈殿させることにより回収する。
Ｃｙｓ−４保護、Ｃｙｓ−１０脱保護ペプチドを真空乾燥させ、次いで、１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水に溶解し、０.１Ｍアンモニア水を用いてｐＨ７.５０に調整する。Ｃｙｓ １０残基を介するダイマー化を行うために、次に、１気圧下にて４℃で１８〜２４時間、該水溶液を強く撹拌することによって酸化が行われる。チオール基の完全な酸化は、エルマン比色分析によって測定される。
次いで、１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度の溶液中の部分酸化ペプチドを、残存するＣｙｓ−４ Ｓ−Ａｃｍ官能基の脱保護のために処理する。この目的を達成するために、スカベンジャーとして２〜５％（ｖ／ｖ）のフェノールを使用して該ペプチド溶液を０.１Ｍの最終濃度で酢酸第二水銀と一緒に加える。該溶液を再度１気圧下にて２０℃で１８〜２４時間強く撹拌する。チオール基の完全な酸化は、エルマン比色分析によって測定する。
【００９１】
１．２．  精製
ペプチド調製物に含まれる低分子量分子（スカベンジャー、酢酸第二水銀など）を除去するために、該ペプチド調製物を１気圧下にて操作される逆相カラムＳｅｐ−Ｐａｃｋ（Millipore）に適用する。水性溶媒中、該ペプチドは疎水力によりカラム上に保持されるが、一方、水溶性の低分子量分子は全て流水と共に流れる。次いで、５０〜７０％（ｖ／ｖ）のメタノール−水混合液によって該ペプチドを溶離する。アルコール性溶媒中の溶離したペプチドを真空濃縮により回収し、再度、所望の濃度で水に溶解する。
ＨＰＬＣ操作型逆相Ｃ１８カラム（寸法＝２５０×４ｍｍ）にて溶媒Ａ（水中０.１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸））および溶媒Ｂ（水中８０％酢酸ニトリル）の０〜１００％直線勾配液を使用して最終精製を行う。これらの条件下で、平行ダイマーは単一の鋭いピークとして溶出する。ピークフラクションを回収する。
該調製物を凍結乾燥形態で、中性ガス、アルゴンまたは窒素下で、＋２〜＋６℃にて保持する。
【００９２】
１．３．  精製ペプチドの特徴付け
１．３．１．  アミノ酸組成物
Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ法（Millipore）によりアミノ酸組成物を分析する。結果を下記表に示す。
【００９３】
【表２】
2008537749.tif 000009
【００９４】
１．３．２．  分子量
イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）により分子量を測定する。測定値は２,３８７.３３±０.３ＡＭＵであり、該ペプチドの元素構造Ｃ110Ｈ190Ｏ24Ｎ26Ｓ4と一致する値である。
【００９５】
実施例２：  ＳＡＥＰ２−Ｌ２モノマーおよび逆平行ダイマーの調製
２．１．  合成
システイン残基のチオール基を保護するために別の方法を使用する以外は実施例１と同様に線状モノマーの合成を行う：Ｃｙｓ−４および−１０の両方をそれらの−ＳＨ基のところで酸不安定性基トリチル（トリフェニル−メチル、Ｔｒｔ）により保護する。
２〜５％（ｖ／ｖ）のスカベンジャーエタンジチオールの存在下にてＴＦＡ ９５％により保護ペプチドを樹脂支持体から開裂する。これらの条件で、Ｃｙｓ−４および−１０の両方の残基のチオール基を脱保護する。次いで、開裂され脱保護されたペプチドを真空蒸発により濃縮し、８０％（ｖ／ｖ）エーテルを用いて沈殿させることにより回収する。
脱保護ペプチドを１〜１０ｍｇ／ｍＬの濃度で水に溶解し、０.１Ｍアンモニア水を用いてｐＨを７.５０に調整する。
次いで、１気圧下にて４℃で１８〜２４時間、該水溶液を強く撹拌することにより酸化を行う。チオール基の完全な酸化はエルマン比色分析によって測定される。
【００９６】
２．２．  ペプチドの精製
溶液中の該ペプチドは、実際に、環状モノマー（約４０％）および逆平行ダイマー（約６０％）の混合物を構成する。各形態を分取逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーによって精製する。実際に、これらの形態はそれぞれ単一の鋭いピークとして異なる保持時間で溶出するので環状モノマーと逆平行ダイマーを分離することができる。逆平行ダイマーは短い保持時間で溶出する。これは、２つのダイマーの異なる分子対称と一致する。逆平行ペプチドは、いずれもの他の異性体の「トランス」対「シス」立体構造と同様に、側鎖の低い内部立体障害によって水性溶媒中で低い最小エネルギーを呈することができる。
全ての調製物を凍結乾燥形態で、中性ガス、アルゴンまたは窒素下で、＋２〜＋６℃にて保持する。
【００９７】
２．３．  逆平行ダイマーの特徴付け
２．３．１．  アミノ酸組成物
Ｐｉｃｏ−Ｔａｇ法（Millipore）によりアミノ酸組成物を分析する。結果を下記表に示す。
【００９８】
【表３】
2008537749.tif 000010
【００９９】
２．３．２．  分子量
イオンサイクロトロン共鳴（ＩＣＲ）により分子量を測定する。測定値は２,３８７.３０±０.３ＡＭＵであり、該ペプチドの元素構造Ｃ110Ｈ190Ｏ24Ｎ26Ｓ4と一致する値である。
【０１００】
実施例３：  ＨＰＬＣ−逆相、ＮＭＲおよびＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析によるモノマー、平行および逆平行ダイマーのさらなる特徴付け
ＨＰＬＣ−逆相（図２Ａ〜２Ｃ）およびＮＭＲ（図４Ａ〜４Ｃおよび５Ａ〜５Ｃ）によって、実施例１で調製した平行ダイマーペプチドならびに実施例２で調製したモノマーペプチドおよび逆平行ダイマーペプチドを特徴付ける。
【０１０１】
３．１．  ＨＰＬＣ−逆相による特徴付け
実験条件
この技術は、データ収集のためにＭｉｌｌｅｎｉｕｍソフトウェア３２ Ｖ３０５０１（ＷａｔｅｒｓTM）を使用してＨＰＬＣチェーン（ＷａｔｅｒｓTM）にて行う。分析カラムＭａｃｈｅｒｅｙ ＮａｇｅｌTM ｒｅｆ ７２００１４.６（Ｎｕｃｌｅｏｓｉｌ ５μｍ Ｃ１８ １００Å ２５０×４.６ｍｍ）を２５℃で操作する。
各凍結乾燥ペプチド３０〜４０μｇをまず水３０μｌで希釈し；それに水中０.１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）３０μｌを添加する。
各ペプチドの粉末調製物４０μｇを水６０μｌ中にて混合し、それに水中０.１％ＴＦＡ６０μｌを添加することによってモノマー、平行ダイマーおよび逆平行ダイマーペプチドの混合物もまた調製する。
２０％移動相Ｂ（水中０.１％のＴＦＡ、８０％のＣＨ3ＣＮ）を使用してカラムを平衡させる。試料を平衡カラムに加えた後、該相Ｂを１ｍＬ／分の流速で４０分間以内に２０％から６０％へ（１％Ｂ／分）勾配させる。
２１４ｎｍで検出を行う。結果を図２Ａ〜２Ｃに示す。
【０１０２】
結果
各ペプチドは異なる保持時間で溶出する。上記実験条件下で、溶出は以下の保持時間（ＲＴ）で生じる：
−  モノマー：ＲＴ＝２８.２８３分
−  平行ダイマー：ＲＴ＝２９.７０８分
−  逆平行ダイマー：ＲＴ＝２２.０５９分
各ペプチド調製物の純度を確認するためにＨＰＬＣ−ＲＰ技術を使用する。ピーク面を積分することにより各ペプチドの相対的な純度を算出する。それは、ペプチドピーク面／全ピーク面として表される。
図２Ａ〜２Ｃには、モノマーならびに平行および逆平行ダイマー調製物がそれぞれ９８、９６.９および９７％の純度を示すことが示される。
図３は、混合物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【０１０３】
３．２．  ＮＭＲによる特徴付け
実験条件
Ｈ2Ｏ／Ｄ2Ｏ混合物（９０／１０ ｖ／ｖ）で希釈したペプチドの試料を使用して、1Ｈ ＮＭＲ分析（５００ＭＨｚ、２５℃、ＨＯＤ予備飽和）を行う。ＢｒｕｋｅｒTM ＤＲＸ５００分光計および付随のデータ収集用ソフトウェアを使用する。
さらに詳しくは、−７０℃に保持されたペプチド調製物を分析に用いる。１.３３ｇをＨ2Ｏ １ｍＬで希釈して０.５ｍＭのダイマーペプチド溶液を調製する。３ｍｍ ＮＭＲ管中にて、該溶液１４４μｌをＤ2Ｏ ９９.９％ Ｄ １６μｌと混合する。較正のために、Ｈ2Ｏ／Ｄ2Ｏ混合液（９０／１０ ｖ／ｖ）中０.０７５％（ｗ／ｗ）ＴＳＰ−ｄ４（３−(トリメチルシリル)プロピオン酸ナトリウム塩−２,２,３,３−ｄ４；Ａｌｄｒｉｃｈ ｒｅｆ ２９３０４−０）の外部溶液を使用する。ＴＳＰ−ｄ４の固有の共鳴シグナルが０ｐｐｍとなるように分光計を較正する。
【０１０４】
結果
使用した実験条件下で、モノマーおよびダイマーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、０〜９.５ｐｐｍの範囲を網羅しており、３つの主要な領域：
−  ６.５〜７.５ｐｐｍ；
−  ５.５〜２.５ｐｐｍ；および
−  ２〜０.３ｐｐｍ
からなる。これは図４Ａ〜４Ｃに示される。
モノマーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、上記実験条件下で、７.２５〜７.４５ｐｐｍの間に予想される５つの芳香族プロトンのＮＭＲパターンを特徴とする。図５Ａに示される実験では、このＮＭＲパターンは、それ自体、３Ｈに対応する積分曲線をもつ７.２５から７.３５ｐｐｍまでの最初の多重線および２Ｈの積分曲線をもつ７.３９ｐｐｍに中心がある２番目の多重線（偽三重線）からなる。この後者のシグナルは、モノマーだけの特徴である。
【０１０５】
平行ダイマーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、４つの芳香族プロトンに対応する７.１０〜７.２５ｐｐｍの間の二重線シグナルおよび６Ｈの積分曲線をもつ７.２５〜７.４０ｐｐｍの間の多重線を特徴とする。図５Ｂに示される実験では、４Ｈ二重線は、７.１８５ｐｐｍに中心があることが判明する（図は７.１８および７.１９ｐｐｍ）。
逆平行ダイマーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、６.９５〜７.１０ｐｐｍの間の４つの芳香族プロトンの二重線シグナルおよび６Ｈの積分曲線をもつ７.１０〜７.３０ｐｐｍの間の多重線を特徴とする。図５Ｃに示される実験では、４Ｈ二重線は、７.０２５ｐｐｍに中心があることが判明する（図は７.０２および７.０３ｐｐｍ）。
図４Ｃに示されるように、逆平行ダイマーの1Ｈ ＮＭＲスペクトルは、また、（ｉ）０.４０〜０.６５の間（二重線）および（ｉｉ）０.７０〜０.８５ｐｐｍの間（二重線）で予想される２つの高磁場メチル性共鳴を特徴とする。一の実験では、これらの二重線は、０.４２および０.６８ｐｐｍに中心があることが判明する。それらは、モノマーでも平行ダイマーでも観察されない。
【０１０６】
３．３．  ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析による同定
ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ（マトリックス支援レーザー脱離イオン化−飛行時間型）質量分析による分析により、ペプチドのモノアイソトピック質量を測定することができる。この技術は、逆平行ダイマーと平行ダイマーとを識別しない。
【０１０７】
実験条件
ポジティブレフレクターモードでＢｉｆｌｅｘ ＩＩＩ質量分析計（ＢｒｕｋｅｒTM）および付随のソフトウェアを使用してＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分析を行う。ペプチドを、レーザーエネルギーを吸収するマトリックス（αシアノ−４−ヒドロキシ桂皮酸）と混合する。
分光計は、合成ペプチド（ＡＣＴＨ １８−３９（副腎皮質刺激ホルモンフラグメント１８−３９）、ボンベシンおよびソマトスタチン２８）の混合物を用いて外部から較正する。
ＨＣＣＡ ５０ｍｇを水中７０％ＡＣＮ（アセトニトリル）０.１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）３００μｌで希釈して飽和ＨＣＣＡマトリックス溶液を調製する。
また、水中３０％ＡＣＮ、０.１％ＴＦＡでｖｏｌ：ｖｏｌ希釈してＨＣＣＡ半飽和溶液を調製する。
較正のために、まず、一次標準溶液を０.１％ＴＦＡ中にて調製する。それらは以下のとおりである：
−  副腎皮質刺激ホルモンフラグメント１８−３９（ＡＣＴＨ １８−３９）：  １００ピコモル／μｌ（０.２４７ｍｇ／ｍＬ）；
−  ボンベシン：  １００ピコモル／μｌ（０.１６０ｍｇ／ｍＬ）；および
−  ソマトスタチン２８：  １００ピコモル／μｌ（０.３１ｍｇ／ｍＬ）。
二次標準溶液を以下のとおり調製する：
−  ＡＣＴＨ（１００ピコモル／μｌ）            ２μｌ
−  ボンベシン（１００ピコモル／μｌ）          ４μｌ
−  ソマトスタチン（１００ピコモル／μｌ）      ４μｌ
−  ＡＣＮ３０％、ＴＦＡ０.１％               ５０μｌ
水中１ｍｇ／ｍＬのペプチド溶液を水中３０％ＡＣＮ、０.１％ＴＦＡで０.０２ｍｇ／ｍＬに希釈する。
較正およびペプチド試料をＨＣＣＡ半飽和溶液でｖｏｌ：ｖｏｌ希釈する。約１μｌの液滴をスチール製ターゲット（ＢｒｕｋｅｒTM）上に置き、蒸発により乾燥させる。
【０１０８】
結果
結果は図７Ａ〜７Ｃに示される。
アミノ酸配列に基づいてソフトウェアにより算出された理論的モノアイソトロピック質量は以下のとおりである：
ＡＣＴＨ ２８  Ｍ＋Ｈ+＝２４６５.１９９Ｄａ
ボンベシン  Ｍ＋Ｈ+＝１６１９.８２３Ｄａ
ソマトスタチン２８  Ｍ＋Ｈ+＝３１４７.４７１Ｄａ
ＳＡＥＰ２−Ｌ２  Ｍ＋Ｈ+＝２３８８.３５Ｄａ。
対照に対して保持される標準は、理論的質量の±２Ｄａで確立した。
図７Ａに示されるように、較正ペプチドに対して得られた実験値は、それぞれ、２４６５.２２５、１６１９.８１４および３１４７.４５４Ｄａである。したがって、内部測定偏差は、(０.０２６＋０.００９＋０.０１７)／７２３２.４９３＝７.２ｐｐｍである（認可＜５０ｐｐｍ）。
図７Ｂおよび７Ｃに示されるように、平行および逆平行ダイマー調製物について得られた実験値は、２３８８.４４９および２３８８.５３２ Ｄａである。これらの値は、理論値の範囲の中央にある同一性域（＋２Ｄａ）内である。これは、試料が予想されるものを含んでいることを意味する。
【０１０９】
実施例４：  ＬＰＳ Ｌ８／ペプチドＩ”複合体／凝集体の調製
４．１．  ＬＰＳ Ｌ８の調製
４．１．１．  髄膜培養物
前培養：  Ｌ８フォーム下で排他的にＬＰＳを発現することが知られているナイセリア・メニンジティディスＡ株からの実験用種子の凍結試料２ｍＬを使用して、グルコース水溶液（５００ｇ／ｌ）４ｍＬを加えたＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（Merck）２００ｍＬを含有する２リットルのエルレンマイヤーフラスコに播種する。この操作を４回繰り返す。エルレンマイヤーフラスコを撹拌しながら（１００ｒｐｍ）３６±１℃で１０±１時間インキュベートする。
【０１１０】
培養：  エルレンマイヤーフラスコ内容物を一緒に集め、前培養物にグルコース水溶液（５００ｇ／ｌ）４００ｍＬおよびアミノ酸溶液８００ｍＬを加える。この調製物を使用して、約０.０５の初期ＯＤ600nmで３０リットルの発酵槽（Ｂ．ＢｒａｕｎTM）中にてＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロスを播種する。発酵は、３６℃、ｐＨ６.８±０.２、１００ｒｐｍ、ｐＯ2 ３０％、および培養物１Ｌあたり０.７５リットル／分の空気の初期流速で一夜行われる。７±１時間後（ＯＤ600nm約３へ）、該培養物にＭＨブロスを４４０ｇ／時の流速で供給する。グルコース濃度が５ｇ／ｌよりも低くなると、発酵は止まる。通常、最終ＯＤ600nmは、２０から４０の間である。４℃で７０００ｇにて１時間３０分の遠心分離により細胞を回収する。ペレットを−３５℃で冷凍し続ける。
【０１１１】
４．１．２．  ＬＰＳの精製
一次フェノール抽出
ペレットを解凍し、３倍容量の４.５％（ｖ／ｖ）フェノールで懸濁し、約５℃で最低４時間、強く撹拌する。
細菌懸濁液を６５℃で加熱し、次いで、６５℃で９０％フェノールとｖ／ｖ混合する。懸濁液を６５℃で５０〜７０分間、強く撹拌し、次いで、約２０℃に冷却する。
懸濁液を約２０℃で１１０００ｇにて２０分間遠心分離する。水性相を回収し、保持する。フェノール相および中間相を回収し、二次抽出にかける。
【０１１２】
二次フェノール抽出
フェノール相および中間相を６５℃で加熱し、先に回収した水性相の容量と同量の水と混合する。該混合物を６５℃で５０〜７０分間、強く撹拌し、次いで、約２０℃に冷却する。該混合物を約２０℃で１１０００ｇにて２０分間遠心分離する。水性相を回収し、保持する。フェノール相および中間相を回収し、三次抽出にかける。
【０１１３】
三次フェノール抽出：  二次抽出の方法を繰り返す。
【０１１４】
透析
３つの水性相を別々に水４０リットルに対して一夜透析する。該透析液を一緒にプールする。透析液プールをＴｒｉｓ ２０ｍＭ、ＭｇＣｌ2 ２ｍＭ（透析液プール９容量あたり１容量）で調整する。４Ｎ ＮａＯＨでｐＨを８.０±０.２に調整する。
【０１１５】
ＤＮＡｓｅ処理
処理した細菌ペレット１ｇ（湿重量）あたり２５０ＵＩのＤＮＡｓｅを加える。該調製物を３７±２℃で５５〜６５分間撹拌する。ｐＨを６.８±０.２に調整する。該調製物を０.２２μｍ膜で濾過する。
【０１１６】
ゲル濾過：  調製物をＳｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラム（５.０×９０ｃｍ；ＰｈａｒｍａｃｉａTM）で精製する。
【０１１７】
一次アルコール沈殿
一緒にプールしたＬＰＳ含有フラクションにＭｇＣｌ2・６Ｈ2Ｏ粉末を加えて、ＭｇＣｌ2を０.５Ｍの濃度にし、撹拌しながら溶解する。
５±３℃で撹拌しながら、無水アルコールを加えて最終濃度５５％（ｖ／ｖ）にする。５±３℃で一夜撹拌を行い、次いで、５±３℃で５,０００ｇにて３０分間遠心分離する。上清を廃棄し、ペレットを二次抽出にかける。
【０１１８】
二次アルコール沈殿
ペレットを撹拌しながら少なくとも１００ｍＬの０.５Ｍ ＭｇＣｌ2で再懸濁する。
先の手順を繰り返す。ペレットを少なくとも１５０ｍＬの水で再懸濁させる。
【０１１９】
最終工程：  ゲル濾過を繰り返し、一緒にプールしたＬＰＳ含有フラクションを最後に濾過（０.８〜０.２２μｍ）により滅菌し、５＋３℃で保持する。
予備対照として、ＬＰＳ調製物をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動により分析する。硝酸銀染色により、単一の大きいバンドが示される。これは、少なくとも、該調製物がＬＰＳ Ｌ８以外のものを含有していないことを示している。
記載した精製工程により、培養物１リットルにつき約１５０ｍｇのＬＰＳ Ｌ８が得られる（収率：約５０％）。
【０１２０】
４．１．３．  ＬＰＳ Ｌ８定量化：  ＨＰＡＥＣ−ＰＡＤを用いるＫＤＯ量
この技術の参考文献は、Kiang et al, (1997) Determination of 2-keto-3-deoxyoctulosonic acid (KDO) with high performance anion exchange chromatography (HPAEC): Survey of stability of KDO and optimal hydrolytic conditions, Anal. Biochem. 245:7である。
図１Ａ〜１Ｂに示すように、ＬＰＳは、その構造中に２つのＫＤＯ単位を含んでおり、１つは、側部にある。
ＬＰＳ定量化は、軟らかい酸加水分解で遊離した側部ＫＤＯ単位の量を介して行われる（図１Ｂを参照）。
【０１２１】
酸加水分解
セクション４．１．２．の最後のダイアフィルトレーション後に得られたＬＰＳ調製物の試料を回収し、ＤｉｏｎｅｘTM １.５ｍＬフラスコ中にて最終容量４００μｌとなるように水で希釈して、該試料のＬＰＳ濃度を較正範囲（１.４〜７２.１μｇ／ｍＬ）下とする。
定量しようとしている試料およびＫＤＯ較正範囲は、以下のとおり処理される：加水分解溶液（酢酸５％；グルクロン酸（ＧｌｃＡ）２０μｇ／ｍＬ）１００μｌを加える。加水分解を１００℃で１時間行う。次いで、フラスコを窒素下にて４０℃で乾燥させ、水４００μｌで満たす。
【０１２２】
量
この技術は、データ収集のためにＣｈｒｏｍｅｌｅｏｎ ＤｉｏｎｅｘTMソフトウェアを用いてＨＰＡＥＣチェーン（ＤｉｏｎｅｘTM）にて行われる。分析用カラムＣａｒｂｏｐａｃ ＰＡ１ ４×２５０ｍｍ（ＤｉｏｎｅｘTM）を３０℃で操作する。
該カラムを溶離溶液（７５ｍＭ ＮａＯＨ、９０ｍＭ ＡｃＯＮａ）で平衡させる。試料１００μｌをカラムに注入する。次いで、該カラムを１ｍＬ／分の溶離流速で２２分間処理する。
ＬＰＳ試料のクロマトグラムは図８に示される。試料中に存在するＫＤＯの量は、ＫＤＯピークの積分により測定される。加水分解により遊離した１つのＫＤＯ分子が１つのＬＰＳ分子に対応するので、初期調製物のＬＰＳ濃度を測定することができる。
【０１２３】
４．２．  ペプチドの調製：  上記実施例１および２に記載の方法に従ってペプチドを調製する。
【０１２４】
４．３．  ＬＰＳ Ｌ８／ペプチドＩ”複合体／凝集体の調製
精製したＬＰＳを、滅菌発熱物質不含水（Ｍｉｌｌｉ Ｑ品質、ｐＨ７.２に調整、Ｌｉｍｕｌｕｓ陰性）中１ｍｇ／ｍＬで偽溶液として使用する。半透明の偽溶液を０.２２μｍ膜を用いる濾過により滅菌する。
滅菌発熱物質不含水（Ｍｉｌｌｉ Ｑ品質、ｐＨ７.２に調整、Ｌｉｍｕｌｕｓ陰性）中１ｍｇ／ｍＬのペプチドＳＡＥＰ２−Ｌ２の溶液もまた０.２２μｍ膜による濾過により滅菌する。
次工程は全て、滅菌条件下にて行われる。
ＬＰＳ偽溶液１容量をペプチドＳＡＥＰ２−Ｌ２の溶液１容量に加える。沈殿物（エンドトキソイド複合体）がすぐに出現する。室温で５分間、撹拌を行う。沈殿物を＋４℃で一夜放置する。
次いで、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することにより沈殿物（エンドトキソイド）を回収する。上清を廃棄する。
該ペレットを滅菌発熱物質不含水（Ｍｉｌｌｉ Ｑ品質、ｐＨ７.２に調整、Ｌｉｍｕｌｕｓ陰性）１容量で洗浄する。遠心分離／洗浄工程を５回繰り返す。
最後に、該ペレットを、沈殿物の湿重量に基づいて約１ｍｇ／ｍＬの濃度でｐＨ＝７.２の滅菌発熱物質不含水（Ｍｉｌｌｉ Ｑ品質）に再懸濁させる。懸濁液を＋４℃で貯蔵する。ＫＤＯ量からＬＰＳ含量を測定し、懸濁液を、例えば、複合体０.５０ｍｇ／ｍＬ（ＬＰＳ含量として表した）に調整する。
【０１２５】
以下の実施例で試験したＬＰＳ−ペプチド複合体は、別の指示がない限りセクション４．３で得られたＬＰＳ−逆平行ダイマー複合体である。したがって、この特定の複合体を単にＬＰＳ−ペプチド複合体と称する。
同様に、セクション４．２で得られたＬＰＳを単にＬＰＳと称する。
ＬＰＳおよびＬＰＳ−ペプチド複合体の比較は、該複合体の調製にも使用されるＬＰＳロットを使用して行われる。
【０１２６】
実施例５：  ＬＰＳ−ペプチド複合体の解毒の評価
解毒を評価するためにいくつかのアッセイを用いる。
【０１２７】
５．１．  Ｌｉｍｕｌｕｓアメーバー様細胞ライセート（ＬＡＬ）アッセイ
このアッセイでは、ＳＡＥＰ２−Ｌ２逆平行および平行ダイマーならびにＳＡＥＰ２−Ｌ２環状モノマーのＬＰＳを解毒する能力を比較する。そのために、ＬＰＳ−逆平行ペプチド複合体について実施例４で報告されているように、平行ダイマーまたはモノマーを含むＬＰＳ−ペプチド複合体を正確に調製する。
ＬＡＬは、グラム陰性細菌の内毒素を検出し定量化するために用いられる非常に感度が高い試験である。該試験は、内毒素の存在下で凝集を誘発するカブトガニ（Limulus polyphemus）由来のアメーバー様細胞ライセートタンパク質の性質に基づいている。
ＬＰＳ内毒素活性の評価は、欧州薬局方に従って、エンドポイント発色技術［欧州薬局方技術（５.０版、パラグラフ２.６.１４）に記載されている］を用いることによって行われる。そのために、キットＱＣＬ−１０００ ｒｅｆ ５０−６４７Ｕ（Ｃａｍｂｒｅｘ−ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒTM）（キットの直線ゾーン：  ０.１〜１ＵＩ／ｍＬ）および正の対照（イー・コリ（E. coli）内毒素、４ １０3 ＥＵ／ｍＬ、Sigma）を使用する。
希釈バッファー（Ｃａｍｂｒｅｘ−ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒTM）を用いて（ｉ）被験試料、（ｉｉ）標準および（ｉｉｉ）正の対照の希釈を行って、個々の範囲：１／１０〜１／１０5；０.５〜０.０３１ＥＵ／ｍＬおよび１／１０4〜１.８ １０4を網羅する。
９６平底ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル１個あたり５０μｌの試料、標準および正の対照希釈液を配る。３７℃で１０分間、インキュベーションを行う。次いで、ｐ−ニトロアニリン発色基質１００μｌを加える。３７℃で６分間インキュベーションを行う。水中２５％の氷酢酸１００μｌを加えて発色反応を停止させる。４０５ｎｍでの分光測定によりプレートを測定する。
結果を複合体１μｇあたりの内毒素単位（ＥＵ)で表す。それらを下記表に示す。ＬＰＳ／ＬＰＳ−ペプチド複合体比によって解毒比を確立し、対数単位で表すことができる。
【０１２８】
【表４】
2008537749.tif 000011
【０１２９】
ＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドのダイマー形態は、ＬＰＳの解毒において環状モノマー形態よりも有効であることが判明する。
【０１３０】
５．２．  ウサギにおける発熱物質試験
ウサギは、ヒトと等価なＬＰＳの発熱作用に対する感受性をもつ動物種であることが知られている。発熱物質試験は、被験物質の滅菌溶液の静脈（ＩＶ）注射によってウサギ３羽に生じた体温の上昇を測定することからなる。欧州薬局方（５.０版、パラグラフ２.６.８）に従って試験、測定および算出を行う。温度上昇は、温度の総応答に応じて解明される：総応答が１.１５℃を超えない場合には適合であり；総応答が２.６５℃を超える場合には不適合である。このケースでは、以下、発熱閾値を１.１５℃〜２.６５℃に設定する。
判明するように、ウサギにおける限界発熱物質投与量（ＩＶ）は、０.０２５ｎｇ／ｋｇ（ＬＰＳ）および１０〜２５ｎｇ／ｋｇ（ＬＰＳ−ペプチド複合体）に相当する。これらの結果は、静脈内経路によって投与された場合には、ＬＰＳ−ペプチド複合体はＬＰＳよりも弱い発熱物質であることを示している。この試験で測定されたように、解毒比（ＬＰＳ−ペプチド複合体／ＬＰＳ）は、４００〜１,０００である。
【０１３１】
５．３．  急性毒性アッセイ：  Ｄ−ガラクトサミン感作マウスにおけるＬＤ５０
このアッセイの参考文献としては、とりわけ、Galanos et al, 1979, PNAS 76: 5939；Baumgartner et al, 1990, J. Exp. Med. 171(3): 889および米国特許第6,531,131号が挙げられる。
８週齢の雌性近交系マウスのグループに、腹腔内（ＩＰ）経路によってＤ−ガラクトサミン（１５ｍｇ／０.２ｍＬ）で処置した直後に（ＬＰＳの毒性は、モデルの感受性を非常に高くするＤ−ガラクトサミン処置で約１,０００倍高くなる）、ＬＰＳまたはＬＰＳ−ペプチド複合体の投与量を漸増させながらＩＰ経路（０.５ｍＬ）によって注射する。次いで、４日間の間、死亡率を追跡する。
ＬＰＳを用いて観察されたＬＤ５０はマウス１匹あたり３.６ｎｇ（マウス１匹あたり１.９１〜６.７０ｎｇ）である；一方、ＬＰＳ−ペプチド複合体を用いて観察されたＬＤ５０はマウス１匹あたり１μｇ（マウス１匹あたり０.２〜５μｇ）であり、これは、解毒比（ＬＰＳ−ペプチド複合体／ＬＰＳ）が約２５０（１００〜１０００）であることを示している。
【０１３２】
５．４．  ペプチドと複合体形成した場合のＬＰＳの炎症誘発作用の減弱化
ＬＰＳ−ペプチド複合体がＬＰＳ誘発毒性作用を減弱することができる程度を評価するために、ＬＰＳ−ペプチド複合体の炎症誘発性サイトカインの放出に対する効果をインビトロアッセイおよびインビボアッセイにてモニター（評価）する。
【０１３３】
インビボ：  ＬＰＳまたはＬＰＳ−ペプチド複合体で免疫化したマウスの血清中でのサイトカイン（ＩＬ６およびＴＮＦα）放出をＥＬＩＳＡで比較する。これらのサイトカインの放出の最適時期であるＳＣ免疫化の９０分後に血液試料を採取する。Ｃ３Ｈ／ＨｅＯｕＪ、ＴＬＲ４−−／−−、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮおよびＣＤ１マウス系統を試験する。最初の２つは、ＬＰＳにもＬＰＳ−ペプチド複合体にも感受性を示さない。３つ目と４つ目は、共にＬＰＳ感受性があることが判明している。ＣＤ１マウスは、他のものよりもＬＰＳ−ペプチド複合体感受性が高いことが判明しており、したがって、最も過酷な条件を維持するさらなる実験のために選択される。
【０１３４】
インビトロ：  様々な濃度のＬＰＳまたはＬＰＳ−ペプチド複合体を用いて３７℃で２４時間刺激したヒト全血球細胞培養物からのサイトカイン（ＩＬ６、ＩＬ８およびＴＮＦα）放出を比較する。
【０１３５】
５．４．１．  インビボアッセイ
ＣＤ１マウスに、（ｉ）ＬＰＳ １０μｇまたは（ｉｉ）ＬＰＳ−ペプチド複合体１０μｇを、皮下（ＳＣ）投与する。注射の９０分後に採血する。ＥＬＩＳＡにより血清中にてＩＬ６およびＴＮＦα放出を測定する。
【０１３６】
サイトカイン分泌のＥＬＩＳＡ検出
それぞれ捕捉抗体（抗マウスサイトカイン）、検出抗体（ビオチン化抗マウスサイトカイン）、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体および標準（組換えサイトカイン）（いずれもPharmingenから）を含んでいるＯｐｔＥＩＡマウスＩＬ６およびＴＮＦαセット（Pharmingen）を用いてＥＬＩＳＡを行う。
抗マウスＩＬ６およびＴＮＦα抗体を０.１Ｍ炭酸塩バッファーｐＨ９.５（Sigma）で１／２５０に希釈する。各アッセイについて、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＮＵＮＣ ９６平底ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル１個につき抗体希釈液１００μｌを分配する。プレートを＋４℃で一夜インキュベートする。
プレートをＰＢＳ ０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０中で洗浄する。次いで、ウェル１個につき２００μｌのＰＢＳ、０.５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）飽和バッファーを加える。室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ ０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄する。
（ｉ）４,０００ｐｇ／ｍＬ〜６２.５ｐｇ／ｍＬの範囲内でＲＰＭＩ培地１％ ＦＣＳ １０％で組換えＩＬ６またはＴＮＦαサイトカイン希釈液を調製する（標準）。ウェル１個につき各希釈液１００μｌを分配して、標準曲線を作成する。
ＲＰＭＩ培地Ｐ.Ｓ. ｇｌｕ １％ ＦＣＳ １０％で血清希釈液を調製する。ＬＰＳを注射したマウスの血清を１／２５および１／１２５に希釈する。ＬＰＳ−ペプチド複合体を注射したマウスの血清を１／５および１／２５に希釈する。ウェル１個につき各希釈液１００μｌを分配する。
室温で２時間インキュベートする。
プレートをＰＢＳ ０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄する。ビオチン化抗マウスサイトカイン抗体および酵素をそれぞれＰＢＳ １０％ウシ胎仔血清で１／２５０に希釈する。ウェル１個につき各希釈液１００μｌを加える。室温で１時間インキュベートする。
プレートをＰＢＳ ０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄する。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ｖｏｌ／ｖｏｌ混合したＴＭＢ溶液ＡおよびＢ（ＫＰＬ））１００μｌをウェルに分配する。室温で１０〜３０分間インキュベートする。
ウェル１個につき１Ｍ Ｈ3ＰＯ4 １００μｌを加えることによって反応を停止させる。プレートを４５０ｎｍで測定する。結果は下記表に示される。
【０１３７】
【表５】
2008537749.tif 000012
【０１３８】
ペプチド単独は、ＩＬ６もＴＮＦαも誘発しない。ＬＰＳ−ペプチド複合体は、約１００倍の解毒が可能である（ＩＬ６分泌を１００倍減少させる）。
【０１３９】
５．４．２．  インビトロアッセイ
試験物質の調製
ＬＰＳ調製物（１ｍｇ／ｍＬ）およびＬＰＳ−ペプチド複合体（５００μｇ／ｍＬ）をそれぞれ１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ＮａＣｌ １５０ｍＭ、０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０、５％シュークロースで５０μｇ／ｍＬの濃度に希釈する。それらをさらに生理食塩水で５μｇ／ｍＬの濃度に希釈する。
各試験物質についてＡＩＭ−Ｖ培地（Gibco（Invitrogen））で２.５６ １０-3ｐｇ／ｍＬの濃度まで段階１／５希釈を行う。
【０１４０】
刺激
ヘパリンナトリウム（２５,０００Ｕ／５ｍＬ；sanofi-synthelabo）上に回収したヒト血液をＡＩＭ−Ｖ培地で１：４（ｖｏｌ：ｖｏｌ）に希釈し、ＭｉｃｒｏｎｉｃｓTM管中に分配する（４００μｌ／管）。試験物質の希釈液１００μｌを加える。ペプチドおよびバッファー対照を１／２０希釈液で試験する。管を５％ＣＯ2の湿雰囲気中にて３７℃で２４時間インキュベートする。
【０１４１】
血清回収
次いで、管を５００ｇで１０分間遠心分離する。各管から少なくとも２００μｌの上清を回収し、滴定するまで−８０℃で冷凍し続ける。
【０１４２】
サイトカイン分泌のＥＬＩＳＡ検出
それぞれ捕捉抗体（マウス抗ヒトサイトカイン）、検出抗体（ビオチン化マウス抗ヒトサイトカトイン）、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ複合体および標準（組換えサイトカイン）を含んでいるPharmingenからのＯｐｔＥＩＡヒトＩＬ６、ＩＬ８およびＴＮＦαセットを使用してＥＬＩＳＡを行う、
抗ヒトＩＬ６、ＩＬ８およびＴＮＦα抗体を０.１Ｍ炭酸塩バッファーｐＨ９.５（Sigma）で１／２５０に希釈する。各アッセイについて、Ｍａｘｉｓｏｒｐ ＮＵＮＣ ９６平底ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェル１個につき抗体希釈液１００μｌを分配する。プレートを＋４℃で一夜インキュベートする。
プレートをＰＢＳ ０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄する。次いで、ウェル１個につき２００μｌのＰＢＳ、０.５％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）飽和バッファーを加える。室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ ０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄する。
（ｉ）１,２００ｐｇ／ｍＬ〜１８.７５ｐｇ／ｍＬ；（ｉｉ）８００ｐｇ／ｍＬ〜１２.５ｐｇ／ｍＬ；および（ｉｉｉ）１,０００ｐｇ／ｍＬ〜１５.８７ｐｇ／ｍＬの各範囲内でＡＩＭ−Ｖ培地で組換えＩＬ６、ＩＬ８またはＴＮＦαサイトカイン希釈液を調製する（標準）。ウェル１個につき各希釈液１００μｌを分配して、標準曲線を作成する。
ＡＩＭ−Ｖで血清希釈液を調製する。ＬＰＳで刺激した血液から回収した血清を１／２５および１／１２５に希釈する。ＬＰＳ−ペプチド複合体と接触させた血液から回収したものを１／５および１／２５に希釈する。ウェル１個につき各希釈液１００μｌを分配する。
室温で２時間インキュベートする。
プレートをＰＢＳ ０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄する。ビオチン化抗ヒトサイトカイン抗体および酵素をそれぞれＰＢＳ １０％ウシ胎仔血清で１／２５０に希釈する。ウェル１個につき各希釈液１００μｌを加える。室温で１時間インキュベートする。
プレートをＰＢＳ ０.０５％ Ｔｗｅｅｎ ２０で洗浄する。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ｖｏｌ／ｖｏｌ混合したＴＭＢ溶液ＡおよびＢ（ＫＰＬ））１００μｌをウェルに分配する。室温で１０〜３０分間インキュベートする。
ウェル１個につき１Ｍ Ｈ3ＰＯ4 １００μｌを添加することにより反応を停止させる。４５０ｎｍでプレートを測定する。
【０１４３】
結果
生の結果およびサイトカイン放出曲線＝ｆ（ＬＰＳまたは複合体の濃度）では、異なる試料の比較はできない。解毒比の算出は、血液ドナー間および試験間の変動を排除することができる。解毒比の算出には該曲線の直線部分だけを考慮する。超えた場合に直線的な進行がもはや観察されなくなるＩＬ６最大放出を測定し、次いで、この最大値の５０％を誘発するのに必要な物質の量が直線回帰によって算出される。
解毒比は、ＩＬ６最大放出の５０％を誘発するＬＰＳ−ペプチド複合体の濃度（ｐｇ／ｍＬで表すＥＤ５０）のＬＰＳを用いて観察されたものに対する比率として表される。比率が高いほど、解毒は強い。解毒比は、いくつかの独立したドナーの全血を使用して統計学的に測定されるので、結果の平均を出す。
ＬＰＳ−ペプチド複合体を用いて観察された解毒比を数回測定する。ＩＬ６放出アッセイにおいて得られた６つの値からの平均データ：６４±２０。
ＩＬ６放出は、ＴＮＦαおよびＩＬ８分泌と相関関係にある。したがって、ＬＰＳ−ペプチド複合体を用いて観察される炎症減少を慣用手段で評価するためにＩＬ６放出アッセイを選択する。
【０１４４】
５．５．  結論
解毒比は、試験に応じて１０2から１０3の間で測定される。解毒値を下記表に要約して示す。
【０１４５】
【表６】
2008537749.tif 000013
【０１４６】
実施例６：  ＬＰＳペプチド複合体安定性試験
ＬＰＳ−ペプチド複合体の安定性を６ヶ月間試験し、２つのアッセイ（ＬＡＬおよびｈｕＰＢＭＣによるインビトロＩＬ−６放出）で解毒比を測定することによって評価する。ウサギにおける発熱物質試験を行うこともできる。
【０１４７】
６．１．  処方ＬＰＳペプチド複合体のインビトロ安定性
処方ＬＰＳ−ペプチド複合体の安定性を５℃で６ヶ月間追跡する。測定は、０日目、９０日目および１８０日目（６ヶ月目）に行う。結果は以下のとおりである。
【０１４８】
【表７】
2008537749.tif 000014
【０１４９】
ＩＬ６放出試験における解毒比は、３ヶ月後および６ヶ月後は有意に異ならず、これは、ＬＰＳ−ペプチド複合体（ペプチドと複合体形成したＬＰＳ）の安定性が５℃で６ヶ月後に解毒され続けていることを示している。
【０１５０】
６．２．  生理学的液体中のＬＰＳペプチド複合体のインビトロ安定性
実験の目的は、複合体を投与した場合にＬＰＳが放出されないこと、および解毒比が生理学的液体との接触後に減少しないことを立証することである。
ヒト血清１ｍＬと混合したＬＰＳ−ペプチド複合体１ｍＬを３７℃でインキュベートする。１時間後および２４時間後に解毒比を評価する。ヒト血清およびセクション４．３．で製造したＬＰＳ−ペプチド複合体を平行して試験する。
３７℃でＬＰＳ−ペプチド複合体とヒト血清との接触の１時間後および２４時間後の両アッセイによって評価された解毒の有意な差異は観察されず、結果は、ＬＰＳ−ペプチド複合体対照と同様である。
【０１５１】
実施例７：  ＬＰＳ−ペプチド複合体の免疫原性
７．１．  ＬＰＳ−ペプチド複合体によりウサギにおいて誘発される抗ＬＰＳ抗体の殺菌活性
アジュバントの存在下で筋肉内（ＩＭ）および皮下（ＳＣ）経路（それぞれ、２×０.５ｍＬおよび５×０.２ｍＬ）によりＬＰＳ−ペプチド複合体１００μｇを用いて、ニュージーランドウサギ成体３羽の免疫化を行う。それらは３週間間隔で３回の注射を受ける；１回目は、フロイント完全アジュバント（ＦＡ）を注射し、２回目および３回目は、フロイント不完全アジュバントを注射する。最後の注射から２週間後にそれらから採血する。対照グループは、同一のプロトコールを使用してアジュバントと一緒にペプチド（７１μｇ、ＬＰＳ−ペプチド複合体１００μｇ中のペプチドの量と等しい）で免疫化する。
血清（ＳＢＡ）試料の殺菌活性を、外因性補体源として仔ウサギ血清の存在下で実施例５に記載したＬＰＳ生成のために使用したナイセリア・メニンジティディス株に対して評価する。
【０１５２】
ＳＢＡアッセイ
５６℃で３０分間の間、血清を加熱不活化する。次いで、９６ウェルマイクロプレートのウェル中で、加熱不活化血清を、Ｃａ++およびＭｇ++を含有するダルベッコのリン酸塩緩衝生理食塩水（ウェル１個あたりの容量：５０μｌ）で２倍段階希釈する（１０回）。
Ｍｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎブロス（４.１０3ＣＦＵ／ｍＬ）中で増殖したナイセリア・メニンジティディスの対数期培養物２５μｌおよび仔ウサギ血清２５μｌを各ウェルに加える。プレートを振盪させながら３７℃で１時間インキュベートする。
各ウェルからの混合物５０μｌをＭｕｅｌｌｅｒ−Ｈｉｎｔｏｎ寒天上にプレーティングする。ペトリ皿を１０％ＣＯ2雰囲気下にて＋３７℃で一夜インキュベートする。
各実験で、対照としては、（ｉ）細菌および抗体不含補体源（補体対照）、（ｉｉ）細菌および加熱不活化補体、および（ｉｉｉ）抗体の存在下での細菌および加熱不活化補体が挙げられる。
殺菌力価は、補体対照と比較して細菌の≧５０％死滅が観察される最高の血清希釈逆数として報告される。
【０１５３】
ＳＢＡ結果
結果は下記表に示される。複合体に関して高いＳＢＡ力価が得られる。ＳＢＡ応答の特異性は、血清（３回投与後）がＬＰＳに吸着された場合の応答の消失について確認する。
【０１５４】
【表８】
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【０１５５】
７．２．  ＬＰＳ−ペプチド複合体を用いてマウスにおいて誘発された免疫応答
６週齢の雌性非近交系ＣＤ１マウス１０匹を、皮下経路（０.２ｍＬ）により投与量１０μｇのＬＰＳ−ペプチド複合体で免疫化する。それらは、３週間間隔で２回の注射を受ける。各注射の前にそれらから採血し、最後の注射から１４日後に失血させる。対照グループにはバッファーを注射する。
第１の実験では、ＥＬＩＳＡにより抗体応答を評価し、実施例４に記載されているＬＰＳ生成に使用したナイセリア・メニンジティディス株（同種株）および異種ナイセリア・メニンジティディス株［ナイセリア・メニンジティディス・グループＢ株ＲＨ８７３（Ｌ４、７、８免疫型）］に対する２回投与後血清試料の殺菌活性を評価する。
第２の実験では、ＥＬＩＳＡにより抗体応答を評価し、ＦＡＣＳにより２回投与後血清試料のオプソニン活性を評価する。
【０１５６】
７．２．１．  マウスにおけるＬＰＳ−ペプチド複合体の免疫原性
抗ＬＰＳ抗体のＥＬＩＳＡ滴定
バッファー１（ＰＢＳ＋１０ｍＭ ＭｇＣｌ2）中１０μｇ／ｍＬのＬＰＳ溶液１００μｌを９６ウェルマイクロプレートのウェルに塗布する。該プレートを＋３７℃で２時間、次いで、＋５℃で一夜インキュベートする。
プレートからＬＰＳ溶液を取り出し、バッファー２（ＰＢＳ＋１％乳＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）１５０μｌでウェルを飽和する。該プレートを３７℃で１時間インキュベートし；次いで、バッファー３（ＰＢＳ＋０.０５％Ｔｗｅｅｎ ２０）で洗浄する。
ウェル中で直接、バッファー２（容量：ウェル１個につき１００μｌ）を使用して血清を１２倍段階希釈する。該プレートを＋３７℃で９０分間インキュベートし；次いで、バッファー３で洗浄する。
希釈したヤギ抗マウスＩｇＧ（γ鎖特異的）またはＩｇＭ（μ鎖特異的）ペルオキシダーゼ複合体１００μｌを各ウェルに加える。該プレートを３７℃で９０分間インキュベートし、次いで、バッファー３で洗浄する。
各ウェルにテトラメチルベンジジン基質溶液１００μｌを加えることによって反応を展開させる。該プレートを３７℃で２０分間インキュベートする。１Ｍ ＨＣｌを加えることによって反応を停止させ、４５０ｎｍで吸光度を測定する。
【０１５７】
ＥＬＩＳＡ結果
結果は、参照血清との比較によって任意のＥＬＩＳＡ単位／ｍＬ（ＥＵ／ｍＬ）で表される。
予備免疫化実験で、ＥＬＩＳＡアッセイは、血清１０個のプールを使用して行われる。下記表に示されるように、ＬＰＳ−ペプチド複合体は、１回の注射後、マウスにおける高い抗ＬＰＳ ＩｇＧ力価および抗ＬＰＳ ＩｇＭを誘発することができる（ＥＬＩＳＡ）。２回目の注射後に有意なＩｇＧブースターが観察されるが、一方、有意なＩｇＭ増加は観察されない。
【０１５８】
【表９】
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【０１５９】
さらなる免疫化実験では、ＥＬＩＳＡアッセイを個別に行う。２回目の注射の後、マウス１０匹のうち７匹が高いＩｇＧおよびＩｇＭ力価を示す。対数で表した全体的な平均力価はそれぞれ約３.７および２.８である。
【０１６０】
７．２．２．  マウス血清の殺菌活性
殺菌活性は、セクション７．１．に記載したように測定される。
２回投与後血清の４０％は、同種ナイセリア・メニンジティディス株に対して殺菌活性（ＳＢＡ力価≧１６）を示す。４つが異種株に対して殺菌性を示す。
【０１６１】
７．２．３．  マウス血清のオプソニン活性
オプソニン化アッセイ
エフェクターとしてヒト前骨髄球分化ＨＬ６０細胞を使用し、標的としてＬＰＳ被覆ラテックス蛍光ビーズを使用して、フローサイトメトリー技術（ＦＡＣＳ）によってオプソニン活性を測定する。
エフェクター細胞は、１００ｍＭジメチルホルムアミドで処理した後、顆粒球に分化される。得られた細胞を洗浄し、ハンクス平衡塩類溶液に再懸濁し、それらの濃度を２.５×１０7細胞／ｍＬに調整する。
５６℃で３０分間の間、血清を加熱不活化する。９６ディープウェルマイクロプレート中にて、加熱不活化血清をＣａ++およびＭｇ++含有ハンクス平衡塩類バッファー（ウェルあたりの容量：３００μｌ）で５倍段階希釈（３回）を行う。
ＬＰＳ被覆ラテックス蛍光ビーズ２０μｌおよび外因性補体源としての仔ウサギ血清１０μｌを各ウェルに加える。該プレートを振盪させながら＋３７℃で３０分間インキュベートする。
各ウェルにエフェタクター細胞懸濁液５０μｌを加える。該プレートを振盪させながら＋３７℃で３０分間インキュベートする。
各ウェルからの１５０μｌを別のディープウェルに移し、４００μｌのＰＢＳ＋０.０２％ＥＤＴＡを加えることによって反応を停止させる。該プレートを遠心分離し、ＰＢＳ＋ＢＳＡバッファーで２回洗浄する。
抗血清および異種補体源の存在下でのＬＰＳ被覆ビーズのエフェクター細胞による食作用をＦＡＣＳにより測定する。
オプソニン活性は、食作用生成物（ＰＰ）＝２００である場合の血清希釈の逆数として表される。ＰＰは、ビーズ／食作用細胞の数の比×蛍光細胞の数として測定される。
抗血清を欠く対照ウェルおよび正のモノクローナル抗血清が各実験に含まれる。
【０１６２】
オプソニン化結果
マウス１０匹のうち８匹が高いオプソニン活性（≧３５０）を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】図１Ａは、ナイセリア・メニンジティディスのＬＰＳ Ｌ８の構造を示す。Ｋｄｏは、２−ケト,３−デオキシオクツロソン酸の略である；Ｈｅｐは、ヘプトースの略である；Ｇｌｃは、グルコースの略である；Ｇａｌはガラクトースの略である；ＧｌｃＮＡｃは、Ｎ−アセチル化グルコサミンの略である。  図１Ｂは、酢酸でのＬＰＳ処理後に生じる反応を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、本質的に、モノマー形態（２Ａ）、平行ダイマー形態（２Ｂ）および逆平行ダイマー形態（２Ｃ）のＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドを含む組成物を用いて２１４ｎｍで得たＨＰＬＣクロマトグラムを示す。軸は、時間（分）および吸光度単位（ＡＵ）である。
【図３】図３は、モノマー形態、平行ダイマー形態および逆平行ダイマー形態のＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドを含む組成物を用いて２１４ｎｍで得たＨＰＬＣクロマトグラムを示す。
【図４】図４Ａ〜４Ｃは、本質的に、モノマー形態（４Ａ）、平行ダイマー形態（４Ｂ）および逆平行ダイマー形態（３Ｃ）のＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドを含む組成物を用いて得た1Ｈ ＮＭＲスペクトルを示す。それらの全てにおいて、１.９ｐｐｍでのピークは、該ペプチドが酢酸塩形態であることを示している。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、図４Ａ〜４Ｃの1Ｈ ＮＭＲスペクトルの６.５〜７.５ｐｐｍで構成される範囲の拡大図を示す。
【図６】図６は、モノマー形態、平行ダイマー形態および逆平行ダイマー形態のＳＡＥＰ２−Ｌ２ペプチドを含む組成物を用いて得た1Ｈ ＮＭＲスペクトルの６.５〜７.５ｐｐｍ領域を示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、較正基準（７Ａ）、平行ダイマー（７Ｂ）および逆平行ダイマー（７Ｃ）のＭＡＬＤＩ−ＴｏＦスペクトルを示す。
【図８】図８は、酢酸処理により加水分解されたＬＰＳのＨＰＥＡＣ−ＰＡＤクロマトグラムを示す。
【図１】
2008537749.tif 000023
【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
2008537749.tif 000029
【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
2008537749.tif 000033
【図８】
2008537749.tif 000034
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月18日(2007.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008537749000001.app
【国際調査報告】
2008537749.tif 000035
2008537749.tif 000036
2008537749.tif 000037