(57)【要約】  少なくとも１つの星状細胞表現型と、星状細胞表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型とを含む単離されたヒト細胞およびその集団が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの星状細胞表現型と、星状細胞表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型とを含む単離されたヒト細胞。
【請求項２】
星状細胞型構造的表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型と、少なくとも１つの星状細胞型構造的表現型とを含む単離されたヒト細胞。
【請求項３】
星状細胞型機能的表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型と、少なくとも１つの星状細胞型機能的表現型とを含む単離されたヒト細胞。
【請求項４】
少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含み、少なくとも１つの神経栄養因子を発現する単離されたヒト細胞であって、前記発現は、間葉性幹細胞における前記神経栄養因子の基礎的発現よりも少なくとも２倍大きい単離されたヒト細胞。
【請求項５】
（ｉ）ヒト細胞の少なくともＮ％が少なくとも１つの星状細胞表現型を含む；
（ｉｉ）前記ヒト細胞の少なくともＭ％が、星状細胞表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含む；および
（ｉｉｉ）前記ヒト細胞の少なくとも１つが、前記少なくとも１つの星状細胞表現型と、前記少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型との両方を含む；
ただし、ＭおよびＮはそれぞれが独立して、１〜９９の間で選択される、
ヒト細胞を含む単離された細胞集団。
【請求項６】
（ｉ）ヒト細胞の少なくともＮ％が少なくとも１つの神経栄養因子を発現し、前記発現は間葉性幹細胞における前記神経栄養因子の基礎的発現よりも少なくとも２倍大きい；
（ｉｉ）前記ヒト細胞の少なくともＭ％が少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含む；および
（ｉｉｉ）前記ヒト細胞の少なくとも１つが前記少なくとも１つの神経栄養因子および前記少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を発現する；
ただし、ＭおよびＮはそれぞれが独立して、１〜９９の間で選択される、
ヒト細胞を含む単離された細胞集団。
【請求項７】
（ｉ）ヒト細胞の少なくともＮ％が少なくとも１つの星状細胞型構造的表現型を含む；
（ｉｉ）前記ヒト細胞の少なくともＭ％が、星状細胞型構造的表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含む；および
（ｉｉｉ）前記ヒト細胞の少なくとも１つが、前記少なくとも１つの星状細胞型構造的表現型と、前記少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型との両方を含む；
ただし、ＭおよびＮはそれぞれが独立して、１〜９９の間で選択される、
ヒト細胞を含む単離された細胞集団。
【請求項８】
（ｉ）ヒト細胞の少なくともＮ％が少なくとも１つの星状細胞型機能的表現型を含む；
（ｉｉ）前記ヒト細胞の少なくともＭ％が、星状細胞型機能的表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含む；および
（ｉｉｉ）前記ヒト細胞の少なくとも１つが、前記少なくとも１つの星状細胞型機能的表現型と、前記少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型との両方を含む；
ただし、ＭおよびＮはそれぞれが独立して、１〜９９の間で選択される、
ヒト細胞を含む単離された細胞集団。
【請求項９】
細胞は遺伝子操作されない、請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれかに記載の単離されたヒト細胞または単離された細胞集団。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの星状細胞表現型は構造的表現型である、請求項１または５に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの星状細胞表現型は機能的表現型である、請求項１または５に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項１２】
前記細胞はさらに星状細胞型機能的表現型を含む、請求項２または７に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項１３】
前記星状細胞型機能的表現型は前記間葉性幹細胞表現型ではない、請求項１２に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項１４】
前記細胞はさらに星状細胞型構造的表現型を含む、請求項３または８に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項１５】
前記細胞はさらに星状細胞型構造的表現型を含む、請求項４または６に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項１６】
前記星状細胞型構造的表現型は前記間葉性幹細胞表現型ではない、請求項１４または１５に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項１７】
前記星状細胞型構造的表現型は、細胞サイズ、細胞形状、オルガネラサイズおよびオルガネラ数である、請求項２、７、１０、１４または１５のいずれかに記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項１８】
前記星状細胞型構造的表現型は少なくとも１つの星状細胞マーカーの発現である、請求項２、７、１０、１４または１５のいずれかに記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項１９】
前記星状細胞マーカーは表面マーカーである、請求項１８に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項２０】
前記星状細胞マーカーは内部マーカーである、請求項１８に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項２１】
前記星状細胞型機能的表現型は、少なくとも１つの神経栄養因子を間葉性幹細胞における前記神経栄養因子の基礎的産生よりも少なくとも２倍大きいレベルで発現することである、請求項３、８、１１または１２のいずれかに記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項２２】
前記少なくとも１つの神経栄養因子は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５、ニュールツリン（ＮＴＮ）、ペルセフィン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アルテミン（ＡＲＴ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）およびニューブラスチンからなる群から選択される、請求項４、６または２１のいずれかに記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの神経栄養因子はＧＤＮＦである、請求項２２に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項２４】
前記星状細胞マーカーは、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＴ−１およびＧＬＡＳＴからなる群から選択される、請求項１８に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項２５】
前記ＧＤＮＦの分泌がＩＬ−１βおよび／またはカベルゴリンによって調節される、請求項２３に記載の単離されたヒト細胞または細胞集団。
【請求項２６】
間葉性幹細胞を、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびヒトニューレグリン１−β１を含む分化培地でインキュベーションし、それにより、星状細胞様細胞を作製することを含む、星状細胞様細胞を作製する方法。
【請求項２７】
前記インキュベーションの継続期間が約４８時間である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＰＤＧＦの濃度が約５ｎｇ／ｍｌである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記ヒトニューレグリン１−β１の濃度が約５０ｎｇ／ｍｌである、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
前記分化培地はさらに、Ｌ−グルタミン、ジブチリル環状ＡＭＰおよびイソブチルメチルキサンチンＩＢＭＸを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
前記インキュベーションの前に細胞をさらなる培地で培養し、それにより、前記細胞を星状細胞様細胞に分化しやくすることをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３２】
前記さらなる培地はヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）およびヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ｈＥＧＦの濃度が約２０ｎｇ／ｍｌである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ｈｂＦＧＦの濃度が約２０ｎｇ／ｍｌである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記さらなる培地はさらに、Ｌ−グルタミン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、セレンおよびトランスフェリンを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３６】
前記培養の継続期間は約４８時間である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３７】
前記間葉性幹細胞が、
（ａ）前記間葉性幹細胞を含む細胞の集団を、前記間葉性幹細胞を維持および／または拡大培養することができる増殖培地で培養する工程；および
（ｂ）前記間葉性幹細胞を工程（ａ）から得られる細胞から選択する工程
によって得られる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３８】
工程（ｂ）が、表面に接着している細胞を集めることによって行われる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
間葉性幹細胞を、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヒトニューレグリン１−β１、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、Ｎ２、ＩＢＭＸおよびｃＡＭＰからなる群から選択される少なくとも１つの分化因子を含む培地でインキュベーションし、それにより、星状細胞様細胞を作製することを含む、星状細胞様細胞を作製する方法。
【請求項４０】
治療効果的な量の星状細胞様細胞をその必要性のある個体に投与し、それにより、ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害を治療することを含む、ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害を治療する方法。
【請求項４１】
ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害を治療するための星状細胞様細胞の使用。
【請求項４２】
少なくとも１つの神経伝達物質を内因的に合成することができる幹細胞を個体に投与することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害は神経変性疾患または神経変性障害である、請求項４０または４１に記載の方法または使用。
【請求項４４】
ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害は、運動障害、解離性障害、気分障害、情動障害、常習性障害および痙攣性障害からなる群から選択される、請求項４０または４１に記載の方法または使用。
【請求項４５】
神経変性障害は、パーキンソン病、多発性硬化症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病およびハンチングトン病からなる群から選択される、請求項４３に記載の方法または使用。
【請求項４６】
前記細胞は自己の細胞である、請求項４０または４１に記載の方法または使用。
【請求項４７】
前記細胞は非自己の細胞である、請求項４０または４１に記載の方法または使用。
【請求項４８】
請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれかに記載される細胞または細胞集団のいずれかを活性な作用因として含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＣＮＳ疾患を治療するために使用することができる細胞およびその集団に関連する。
【背景技術】
【０００２】
パーキンソン病は、振せん、硬直および運動失調などの症状によって現れる運動機能の進行性の喪失をやがてはもたらす、中脳の黒質におけるドーパミン産生ニューロンの進行性の喪失によって特徴づけられる加齢性障害である。
【０００３】
ＰＤのための現在の治療法は、一般にはドーパミン前駆体のＬ−ＤＯＰＡ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）の投与によって、ドーパミンの枯渇を回復することに集中する。Ｌ−ＤＯＰＡ（血液脳関門（ＢＢＢ）を透過するドーパミン前駆体）はドーパミンの合成および放出を首尾よく増大させる。しかしながら、疾患が進行するに従い、ドーパミンを前駆体から合成するために利用することができるドーパミン作動性ニューロンが少なくなり、治療の有効性が低下し、その一方で、Ｌ−ＤＯＰＡにより誘導されるジスキネジーが現れる。ドーパミンアゴニスト、モノアミンオキシダーゼ阻害剤またはＣＯＭＴ阻害剤による他の治療でもまた、部分的な改善が明らかにされるが、それらは疾患の進行を防止することができない。
【０００４】
細胞移植が、失われつつあるドーパミン作動性ニューロンを修復および代用するための代替治療選択肢として提案されている。そのような細胞置換治療が機能するためには、移植された細胞が、損傷を受けた組織の内部において、生存し、かつ、機能的および構造的の両方で一体化しなければならない。
【０００５】
幹細胞をパーキンソン病のための細胞置換治療での細胞源として使用することが近年、提案されている。幹細胞には、未分化の状態でインビボで存在し、かつ、自己再生する能力がある。幹細胞は、起源となった組織に対して特異的な細胞タイプに限定されず、従って、他の組織からの局所的な環境的合図に応答して分化することができる。自己再生および分化のこの能力は、様々な疾患を治療する際において最大の治療可能性を有する。
【０００６】
パーキンソン病において、幹細胞置換法は、ドーパミン（ＤＡ）神経伝達の回復が、残存する組織に時間とともに一体化し、長く持続する機能的な組織を生じさせる細胞移植片によって達成されるという考えに基づく。ＰＤにおける移植のために幹細胞を処理する方法が２つある。第１の方法では、移植前に、細胞がドーパミン作動性ニューロンにインビトロで分化させられる。これは、関連する細胞の標準化および品質管理を可能にする。第２の方法は、線条体または黒質に埋め込まれた後でドーパミン作動性ニューロンにインビボで分化すると考えられる未分化幹細胞を移植することを含む。
【０００７】
理論的には、ＰＤにおける細胞治療のためのＤＡニューロンは、下記の４つの異なる源に由来する幹細胞から作製することができる：胎児のドーパミン作動性ニューロン、神経幹細胞、胚性幹細胞および骨髄幹細胞。
【０００８】
骨髄は幹細胞の２つの大きな集団を含有する：造血幹細胞（ＨＳＣ）、および、骨髄間質細胞と呼ばれることがある間葉性幹細胞（ＭＳＣ）。
【０００９】
ラットのＢＭＳＣは、分化後、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、コリンアセチルトランスエステラーゼおよびβ−ＩＩＩチューブリンを発現することが示された［Ｗｏｏｄｂｕｒｙ，Ｄ．他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ、６９（６）：９０８〜１７、２００２］。ＰＤにおけるマウスＢＭＳＣの臨床での治療可能性が、マウスＢＭＳＣをＰＤの１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）マウスモデルに線条体内注入することによって明らかにされた。移植された細胞は生存し、ＴＨを発現した。そのうえ、移植後３５日でのロータロッド試験に対する改善が示された［Ｌｉ，Ｙ．他、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ、３１６（２）：６７〜７０、２００１］。
【００１０】
本発明者らの米国特許出願公開２００５０２６５９８３は、中脳のＤＡニューロンを特徴づけるニューロンマーカーおよび転写因子をニューロン分化の誘導の後で発現したヒトのドーパミン合成ＭＳＣを教示する。
【００１１】
細胞置換法の代替法として、移植された細胞が生存し、形態学的、電気生理学的および機能的なドーパミン作動特性を有しなければならない場合、細胞治療は、線条体の正常な解剖学的構造（結合性）および生理学（適切なシナプス接触および機能発現）を回復または再確立することに向けられ得る。
【００１２】
神経栄養因子（ＮＴＦ）は、ニューロン細胞の生存、機能維持および表現型発達を調節する分泌型タンパク質である。ＮＴＦレベルでの変化が、ニューロンにおけるプログラム化された細胞死の引き金となることに関与し、従って、パーキンソン病および他の神経変性疾患の病理発生の一因である。
【００１３】
ドーパミン作動性ニューロンに対する最も強力なＮＴＦの１つがグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と呼ばれる。これは、黒質におけるドーパミン作動性ニューロの生存を促進すること、神経突起の成長を促進すること、細胞体サイズを増大させること、同様にまた、ＴＨのレベルを上昇させることが知られている。ＧＤＮＦは、現時点では下記の４つの神経栄養因子からなる、ＴＧＦ−βスーパーファミリーに関連するタンパク質ファミリーに属する：ＧＤＮＦ、ニュールチュリン（ＮＴＮ）、ペルセフィンおよびアルテミン／ニューブラスチン。これらの因子は、細胞増殖および細胞分化の調節因子として働くことが知られている。
【００１４】
神経前駆体細胞（ＳＴ１４Ａ）の分析により、ＧＤＮＦの過剰産生が、軸索の出芽、神経突起の成長、棘形成、小胞輸送およびシナプス可塑性に関与する遺伝子のアップレギュレーションに関連し得ることが解明された［Ｐａｈｎｋｅ  Ｊ他、Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ、２９７（２）：４８４〜９４、２００４］。ＧＤＮＦの神経保護活性が、抗酸化性の酵素系（例えば、グルタチオンペルオキシダーゼ活性、スーパーオキシドディスムターゼ活性およびカタラーゼ活性など）のその活性化を介することもまた示唆された［Ｃｈａｏ  ＣＣ、Ｌｅｅ  ＥＨ、Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ、３８（６）：９１３〜６、１９９９］。
【００１５】
様々な細胞のタイプがＧＤＮＦを産生しており、これらには、グリア細胞（乏突起神経膠細胞および星状細胞）、神経芽細胞腫細胞株および神経膠芽細胞腫細胞株が含まれる。２０％ウシ胎児血清が補充されたＤＭＥＭで培養されたラットＢＭＳＣが、６回目の継代培養を行ったとき、ＧＤＮＦおよびＮＧＦを発現することが近年、示されている［Ｇａｒｃｉａ  Ｒ他、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、３１６（３）：７５３〜４、２００４］。
【００１６】
ＧＤＮＦの合成は、様々な増殖因子、ホルモン、サイトカインおよび神経伝達物質によって調節され得る。例えば、腫瘍壊死因子−αまたはインターロイキン−１は神経膠芽細胞腫細胞からのＧＤＮＦの放出を誘導する。フォルスコリンまたはｃＡＭＰは、神経芽細胞腫および神経膠芽細胞腫の両方の細胞株によるＧＤＮＦ放出における増大を引き起こす。これらの細胞は、神経伝達物質がストレス条件下での増殖因子の産生を調節することを可能にする神経伝達物質受容体を含む。
【００１７】
ＧＤＮＦを直接に脳内に投与することが、ＰＤの様々な動物モデルにおいて効果的であることが示されている。加えて、細胞を移植前にＧＤＮＦにさらすことが有益であると判明している。例えば、４０００００個の胎児ドーパミン作動性ニューロンを移植前にグラフト化することにより、障害ラットの回旋行動が著しく改善された［Ｍｅｈｔａ  Ｖ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ、１９９９（Ａｐｒ）、９０（４）：８０４〜６］。
【００１８】
様々な方法が、ＧＤＮＦを脳内に投与することを助けるために使用されており、それらには、浸透圧ポンプ、カプセルおよびミクロスフェアが含まれる。ＧＤＮＦ送達のための別の方法がインビボ遺伝子治療である。ＧＤＮＦを発現するように遺伝子操作され、ＭＰＴＰ障害マウスに移植された骨髄間葉性細胞は黒質ニューロンならびに線条体繊維を保護することができた［Ｐａｒｋ，Ｋ．、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．、４０：３１５〜３２３、２００１］。
【００１９】
いくつかの研究では、種々の因子にインビトロでさらされた後のＭＳＣはその表現型を変化させ、ニューロンマーカーおよび神経膠マーカーを明らかにすることが示されている［Ｋｏｐｅｎ，Ｇ．Ｃ．他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９６（１９）：１０７１１〜６、１９９９；Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他、Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ、１６４（２）：２４７〜５６、２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ、Ｄ．他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ、６１（４）：３６４〜７０、２０００；Ｗｏｏｄｂｕｒｙ、Ｄ．、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｒｅｓ、６９（６）：９０８〜１７、２００２；Ｂｌａｃｋ，Ｉ．Ｂ．、Ｗｏｏｄｂｕｒｙ、Ｄ．、Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ  Ｄｉｓ、２７（３）：６３２〜６、２００１；Ｋｏｈｙａｍａ，Ｊ．他、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ、６８（４−５）：２３５〜４４、２００１；Ｌｅｖｙ，Ｙ．Ｓ．、Ｊ  Ｍｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２１（２）：１２１〜３２、２００３］。
【００２０】
しかしながら、これらの研究はどれも、著しいレベルの神経栄養因子を分泌することができるヒトＭＳＣを示していない。
【００２１】
従って、神経変性障害を治療するために神経栄養因子（例えば、ＧＤＮＦなど）を合成することができる移植可能な細胞が必要であることが広く認識されており、そのような移植可能な細胞を有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００２２】
本発明によれば、少なくとも１つの星状細胞表現型と、星状細胞表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型とを含む単離されたヒト細胞が提供される。
【００２３】
本発明の別の態様によれば、星状細胞型構造的表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型と、少なくとも１つの星状細胞型構造的表現型とを含む単離されたヒト細胞が提供される。
【００２４】
本発明のさらに別の態様によれば、星状細胞型機能的表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型と、少なくとも１つの星状細胞型機能的表現型とを含む単離されたヒト細胞が提供される。
【００２５】
本発明のなおさらに別の態様によれば、少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含み、少なくとも１つの神経栄養因子を発現する単離されたヒト細胞が提供され、この場合、その発現は、間葉性幹細胞におけるその神経栄養因子の基礎的発現よりも少なくとも２倍大きい。
【００２６】
本発明のさらなる態様によれば、
（ｉ）ヒト細胞の少なくともＮ％が少なくとも１つの星状細胞表現型を含む；
（ｉｉ）ヒト細胞の少なくともＭ％が、星状細胞表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含む；および
（ｉｉｉ）ヒト細胞の少なくとも１つが、少なくとも１つの星状細胞表現型と、少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型との両方を含む；
ただし、ＭおよびＮはそれぞれが独立して、１〜９９の間で選択される、
ヒト細胞を含む単離された細胞集団が提供される。
【００２７】
本発明のさらなる態様によれば、
（ｉ）ヒト細胞の少なくともＮ％が少なくとも１つの神経栄養因子を発現し、この場合、その発現は間葉性幹細胞におけるその神経栄養因子の基礎的発現よりも少なくとも２倍大きい；
（ｉｉ）ヒト細胞の少なくともＭ％が少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含む；および
（ｉｉｉ）ヒト細胞の少なくとも１つが少なくとも１つの神経栄養因子および少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を発現する；
ただし、ＭおよびＮはそれぞれが独立して、１〜９９の間で選択される、
ヒト細胞を含む単離された細胞集団が提供される。
【００２８】
本発明のなおさらなる態様によれば、
（ｉ）ヒト細胞の少なくともＮ％が少なくとも１つの星状細胞型構造的表現型を含む；
（ｉｉ）ヒト細胞の少なくともＭ％が、星状細胞型構造的表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含む；および
（ｉｉｉ）ヒト細胞の少なくとも１つが、少なくとも１つの星状細胞型構造的表現型と、少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型との両方を含む；
ただし、ＭおよびＮはそれぞれが独立して、１〜９９の間で選択される、
ヒト細胞を含む単離された細胞集団が提供される。
【００２９】
本発明のさらなる態様によれば、
（ｉ）ヒト細胞の少なくともＮ％が少なくとも１つの星状細胞型機能的表現型を含む；
（ｉｉ）ヒト細胞の少なくともＭ％が、星状細胞型機能的表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含む；および
（ｉｉｉ）ヒト細胞の少なくとも１つが、少なくとも１つの星状細胞型機能的表現型と、少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型との両方を含む；
ただし、ＭおよびＮはそれぞれが独立して、１〜９９の間で選択される、
ヒト細胞を含む単離された細胞集団が提供される。
【００３０】
本発明のさらなる態様によれば、間葉性幹細胞を、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびヒトニューレグリン１−β１を含む分化培地でインキュベーションし、それにより、星状細胞様細胞を作製することを含む、星状細胞様細胞を作製する方法が提供される。
【００３１】
本発明のなおさらなる態様によれば、間葉性幹細胞を、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヒトニューレグリン１−β１、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、Ｎ２、ＩＢＭＸおよびｃＡＭＰからなる群から選択される少なくとも１つの分化因子を含む培地でインキュベーションし、それにより、星状細胞様細胞を作製することを含む、星状細胞様細胞を作製する方法が提供される。
【００３２】
本発明のなおさらなる態様によれば、治療効果的な量の星状細胞様細胞をその必要性のある個体に投与し、それにより、ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害を治療することを含む、ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害を治療する方法が提供される。
【００３３】
本発明のなおさらなる態様によれば、ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害を治療するための星状細胞様細胞の使用が提供される。
【００３４】
本発明のなおさらなる態様によれば、請求項１、２、３、４、５、６、７または８のいずれかに記載される細胞または細胞集団のいずれかを活性な作用因として含み、かつ、医薬的に許容され得るキャリアを含む医薬組成物が提供される。
【００３５】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、細胞は遺伝子操作されない。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの星状細胞表現型は構造的表現型である。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの星状細胞表現型は機能的表現型である。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞はさらに星状細胞型機能的表現型を含む。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、星状細胞型機能的表現型は間葉性幹細胞表現型ではない。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞はさらに星状細胞型構造的表現型を含む。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞はさらに星状細胞型構造的表現型を含む。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、星状細胞型構造的表現型は間葉性幹細胞表現型ではない。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、星状細胞型構造的表現型は、細胞サイズ、細胞形状、オルガネラサイズおよびオルガネラ数である。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、星状細胞型構造的表現型は少なくとも１つの星状細胞マーカーの発現である。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、星状細胞マーカーは表面マーカーである。
【００４６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、星状細胞マーカーは内部マーカーである。
【００４７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、星状細胞型機能的表現型は、少なくとも１つの神経栄養因子を間葉性幹細胞におけるその神経栄養因子の基礎的産生よりも少なくとも２倍大きいレベルで発現することである。
【００４８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの神経栄養因子は、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５、ニュールツリン（ＮＴＮ）、ペルセフィン、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、アルテミン（ＡＲＴ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）およびニューブラスチンからなる群から選択される。
【００４９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、少なくとも１つの神経栄養因子はＧＤＮＦである。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、星状細胞マーカーは、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＴ−１およびＧＬＡＳＴからなる群から選択される。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＧＤＮＦの分泌がＩＬ−１βおよび／またはカベルゴリンによって調節される。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、インキュベーションの継続期間が約４８時間である。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＰＤＧＦの濃度が約５ｎｇ／ｍｌである。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ヒトニューレグリン１−β１の濃度が約５０ｎｇ／ｍｌである。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、分化培地はさらに、Ｌ−グルタミン、ジブチリル環状ＡＭＰおよびイソブチルメチルキサンチンＩＢＭＸを含む。
【００５６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の方法はさらに、細胞を、インキュベーションする前にさらなる培地で培養し、それにより、細胞を星状細胞様細胞に分化しやくすることを含む。
【００５７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、さらなる培地はヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）およびヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）を含む。
【００５８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ｈＥＧＦの濃度が約２０ｎｇ／ｍｌである。
【００５９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ｈｂＦＧＦの濃度が約２０ｎｇ／ｍｌである。
【００６０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、さらなる培地はさらに、Ｌ−グルタミン、インスリン、プロゲステロン、プトレシン、セレンおよびトランスフェリンを含む。
【００６１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、培養の継続期間は約４８時間である。
【００６２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、間葉性幹細胞が、（ａ）間葉性幹細胞を含む細胞の集団を、間葉性幹細胞を維持および／または拡大培養することができる増殖培地で培養する工程；および（ｂ）間葉性幹細胞を工程（ａ）から得られる細胞から選択する工程によって得られる。
【００６３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、工程（ｂ）が、表面に接着している細胞を集めることによって行われる。
【００６４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、本発明の方法はさらに、少なくとも１つの神経伝達物質を内因的に合成することができる幹細胞を個体に投与することを含む。
【００６５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害は神経変性疾患または神経変性障害である。
【００６６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害は、運動障害、解離性障害、気分障害、情動障害、常習性障害および痙攣性障害からなる群から選択される。
【００６７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、神経変性障害は、パーキンソン病、多発性硬化症、てんかん、筋萎縮性側索硬化症、卒中、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、アルツハイマー病およびハンチングトン病からなる群から選択される。
【００６８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は自己の細胞である。
【００６９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞は非自己の細胞である。
【００７０】
本発明は、神経栄養因子を分泌することができる細胞およびその集団を提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００７１】
別途定義されない場合、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と同様または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。本明細書中で言及された全ての刊行物、特許出願、特許および他の参考文献は、全体を参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。また、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００７２】
図面の簡単な記述
本発明は、例示のみを目的とし、添付されている図面を参照して、本明細書中に記載される。次に図面を詳しく具体的に参照して、示されている項目は、例としてであり、また、本発明の好ましい実施形態の例示的な議論のためのものであり、従って、本発明の原理および概念的態様の最も有用かつ容易に理解された記述であると考えられるものを提供するために示されていることが強調される。これに関して、記述を図面と一緒に理解することにより、本発明のいくつかの形態が実際にどのように具体化され得るかが当業者には明らかになるので、発明の構造的詳細を、発明の基本的な理解のために必要であるよりも詳細に示すことは試みられていない。
図１Ａ〜図１Ｂは、５日目の分化したヒトＭＳＣおよび分化していないヒトＭＳＣの光学顕微鏡観察画像である。分化したヒトＭＳＣは星状細胞様の形態学（例えば、典型的な星状体様構造など）を明らかにする（光学顕微鏡観察）。
図２Ａ〜図２Ｄは、５日目の分化したヒトＭＳＣ（図２Ｂ〜図２Ｄ）および分化していないヒトＭＳＣ（図２Ａ）の走査電子顕微鏡観察画像である。分化したヒトＭＳＣは星状細胞様の形態を明らかにする。
図３Ａ〜図３Ｂは、分化したヒトＭＳＣにおける星状細胞マーカーの発現を例示する顕微鏡写真である。免疫染色を、抗Ｓ１００β（図３Ａ）および抗グルタミンシンセターゼ（図３Ｂ）を用いて、分化したヒトｈＢＭＳｃに対して行った。細胞の核を、ＤＡＰＩを使用して染色した（青色）。
図４Ａ〜図４Ｂは、分化したヒトＭＳＣにおける星状細胞マーカーのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現を例示する顕微鏡写真および棒グラフである。免疫染色を、抗ＧＦＡＰを用いて、分化したヒトｈＢＭＳｃに対して行い、また、細胞の核を、ＤＡＰＩを使用して染色した（青色）（図４Ａ）。図４Ｂは、プライマー（配列番号１１および配列番号１２）を使用してリアルタイムＰＣＲによって分析されたときの、分化したヒトＭＳＣの細胞抽出物におけるＧＦＡＰのレベルを例示する棒グラフである。
図５は、分化していないヒトＭＳＣと比較して、分化したヒトＭＳＣにおける神経栄養因子転写物の量を例示する棒グラフである。細胞抽出物を、ＧＤＮＦ転写物（配列番号３および配列番号４）、ＮＧＦ転写物（配列番号９および配列番号１０）およびＢＤＮＦ転写物（配列番号５および配列番号６）についてのリアルタイムＰＣＲアッセイに供した。
図６Ａ〜図６Ｂは、分化したヒトＭＳＣにおけるＧＤＮＦの発現を例示する顕微鏡写真および棒グラフである。免疫染色を、抗ＧＤＮＦを用いて、分化したヒトｈＢＭＳｃに対して行った。細胞の核を、ＤＡＰＩを使用して染色した（青色）（図６Ａ）。図６Ｂは、抗ＧＤＮＦにより陽性に染色された細胞の数が約３０％であったことを例示する（＊Ｐ＜０．０５、ｎ＝３、ｎあたりの計数された平均細胞＝４１５．５±３７．５）。ＧＤＮＦ細胞の数を、３つの独立した培養物からの１５の視野を調べることによって評価した。これらのサンプルにおける細胞総数を、ＤＡＰＩ染色された細胞の核を計数することによって求めた。結果が陽性細胞の（平均±ＳＥＭ）パーセントとして表される。
図７は、分化したヒトＭＳＣにおいて細胞に存在するＧＤＮＦの量を例示する棒グラフである。ＧＤＮＦの産生を、ＥＬＩＳＡによって、分化したｈＢＭＳｃの細胞抽出物においてアッセイした。結果は３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。ｐ＜０．０５である差（＊）は、コントロールと比較したときに有意であった。分化した細胞を、分化を４８時間にわたって開始させた後２４時間、カベルゴリン（１３０ｐｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１β（１００ｐｇ／ｍｌ）とインキュベーションした。
図８Ａ〜図８Ｄは、分化したヒトＭＳＣによって分泌されたＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦの量を例示する棒グラフである。図８Ａは、ＧＤＮＦの分泌に対する、カベルゴリン（１３０ｐｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１β（１００ｐｇ／ｍｌ）の４８時間のインキュベーションの影響を例示する。培養培地を７２時間の分化の後で集め、ＥＬＩＳＡを使用して分析した。結果は３つの独立した実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。ｐ＜０．０５である差（＊）は、コントロールと比較したときに有意であった。分化した細胞の培地はまた、ＧＤＮＦ（図８Ｂ）およびＮＧＦ（図８Ｃ）についてもアッセイした（ドナー＃１４−２、ドナー＃８−１０またはドナー＃Ｈ１−２−７）。青色の棒は分化後の分泌を示し、赤色の棒は分化前の分泌を示す。図８Ｄは、３名の異なるドナーに由来するＭＳＣにおけるＢＤＮＦ分泌に対する４８時間の分化の影響を例示する。
図９は、ＭＳＣの分化の後におけるグルタミン酸輸送体（ＧＬＡＳＴおよびＧＬＴ−１）の発現を例示する棒グラフである。これらのグルタミン酸輸送体の発現を、血清非含有培地で成長させたｈＢＭＳｃ、および、星状細胞に分化したｈＢＭＳｃから抽出された総ＲＮＡに対して行われたリアルタイムＰＣＲによって評価した。ＧＬＡＳＴのためのプライマーが配列番号７および配列番号８であり、ＧＬＴ−１のためのプライマーが配列番号１３および配列番号１４であった。サンプルはまた、任意の単位（独立した培養物に対して行われた三連の測定からの平均±ＳＥＭ）で表されるＰＣＲ生成物の定量的分析を可能にするＧＡＰＤＨのＰＣＲ増幅において使用された。統計学的分析を、一元配置ａｎｏｖａ、それに続く、多重比較のためのニューマン・クールズ検定によって行った。＊（ｐ＜０．０５）は、血清非含有培地で維持された細胞からの有意な差を示す。
図１０は、ｈＢＭＳＣの星状細胞分化の前後におけるグルタミン酸輸送体の機能的活性を例示する棒グラフである。［３Ｈ］ｄ−アスパラギン酸の取り込み（２０ｎｍ）を、血清非含有培地で成長させた細胞と比較して、分化培地で成長させたｈＢＭＳＣにおいて測定した。示されたデータは、３つの独立した培養物に対して行われた三連の測定からの平均±ＳＥＭである。統計学的分析を、一元配置ａｎｏｖａ、それに続く、多重比較（ｐ＜０．０５）のためのニューマン・クールズ検定によって行った。
図１１は、星状細胞に分化したｈＢＭＳｃが移植された６−ＯＨＤＡ障害ラットの行動における改善を例示する線グラフである。ラットには、５Ｘ１０５個の細胞が障害後６週間で同側の線条体に注入されて移植された。アポモルヒネ（０．１５ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．）により誘導された旋回行動を６０分あたりの平均旋回数について記録した。移植ラットは、移植後７５日で、回転における顕著な減少（ｐ＜０．０５）を示した。
図１２は、星状細胞に分化したｈＢＭＳｃが移植された６−ＯＨＤＡ障害ラットのロータロッドアッセイにおける改善を例示する棒グラフである。ロータロッド成績（ロッド上での秒数）を同じラットにおいて移植後９５日で観察した。移植ラットは顕著な改善（ｐ＜０．０５）を示した（フリードマンａｎｏｖａの後での多重比較検定、Ｐ＜０．０５）。
図１３は、星状細胞に分化したｈＢＭＳｃが移植された６−ＯＨＤＡ障害ラットの微妙な運動機能における改善を例示する線グラフである。ヒマワリ種子摂食試験を移植後１００日で行った。星状細胞が移植されたラットは、生理的食塩水により治療されたラットと比較して、はるかに速く、５分の期間中に種子を開け、食べた。結果は、２日続けて行われた２回試験の平均±ＳＥＭである。
図１４Ａ〜図１４Ｅは、星状細胞に分化したｈＢＭＳｃが移植された６−ＯＨＤＡ障害ラットの細胞に対する共焦点顕微鏡観察画像である。移植後１１０日で、動物を屠殺し、組織化学研究を行った。図１４ＡはＤＡＰＩ染色を例示する。図１４Ｂはヒト核抗原染色を例示する。図１４ＣはＧＦＡＰ染色を例示する。図１４Ｄは、３つの染色のすべてを重ねたものである。免疫染色および共焦点顕微鏡観察による研究により、ヒト抗原について陽性であった細胞の２５％までがＧＦＡＰについてもまた陽性であったことが明らかにされた。
図１５は、ＡＬＳマウスの腓腹筋に移植された星状細胞分化ＢＭＳＣが疾患の発症を遅らせ、ロータロッドにおけるその運動成績を改善することを例示する線グラフである（ｎ＝８、ｐ＜０．０５）。
図１６は、ＡＬＳマウスの腓腹筋に移植された星状細胞分化ＢＭＳＣが体重減少を遅らせることを例示する線グラフである。
図１７Ａ〜図１７Ｃは、星状細胞に分化したｈＢＭＳｃが移植されたＡＬＳマウスの細胞に対する共焦点顕微鏡観察画像であり、ＡＬＳマウスの腓腹筋に移植された星状細胞分化ＢＭＳＣが移植後１１０日を生存することを例示する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００７３】
本発明は、数多くの神経変性疾患を治療するために患者に移植することができる細胞およびその集団に関連する。
【００７４】
本発明の原理および操作は、図面および付随する記述を参照してより良好に理解され得る。
【００７５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または様々な方法で実施または実行されることが可能である。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであり、限定であるとして見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００７６】
神経栄養因子（ＮＴＦ）は、ニューロン細胞の生存、機能維持および表現型発達を調節する分泌型タンパク質である。ＮＴＦレベルでの変化が、ニューロンにおけるプログラム化された細胞死の引き金となることに関与し、従って、パーキンソン病および他の神経変性疾患の病理発生の一因である。
【００７７】
ドーパミン作動性ニューロンに対する最も強力なＮＴＦの１つがグリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）と呼ばれる。これは、黒質におけるドーパミン作動性ニューロンの生存を促進すること、神経突起の成長を促進すること、細胞体サイズを増大させること、同様にまた、ＴＨのレベルを上昇させることが知られている。
【００７８】
しかしながら、一般には神経栄養因子の直接的な使用、具体的にはＧＤＮＦの直接的な使用は、それらが全身的注射の後で血液脳関門を通過せず、また、適切に分布しないので阻まれている。従って、他の方策を、それらの治療的特性を活用するために開発しなければならない。
【００７９】
本発明を実施に移しているとき、本発明者らは、特定の培養条件のもとで、間葉性幹細胞（ＭＳＣ）が、神経栄養因子を分泌することができる星状細胞表現型を有する細胞に分化し得ることを見出している。この結果は、ドナーおよび継代培養の両方に依存しないことが示された。それに従って、本発明者らは、そのような分化したＭＳＣが、移植後、神経変性疾患の患者を治療するために使用できることを示している。
【００８０】
本発明者らは、新規な２段階プロトコルに従って分化させたＭＳＣが、星状細胞マーカーの存在（図３Ａ〜図３Ｂおよび図４Ａ〜図４Ｂ）を伴う星状細胞様の形状（図１Ａ〜図１Ｂおよび図２Ａ〜図２Ｄ）を表すことを示している。このような星状細胞様細胞は、著しいレベルのＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦの発現（図５）および分泌（図８Ａ〜図８Ｄ）をもたらすことが示された。そのうえ、ＮＴＦの産生がカベルゴリン（Ｄ２受容体アゴニスト）およびＩＬ−１によってさらにアップレギュレーションされた（図７および図８Ａ）。加えて、この星状細胞様細胞はグルタミン酸クリアランス機構を有していた（図１０）。
【００８１】
６−ＯＨＤＡ障害ラット（パーキンソン病についてのラットモデル）の線条体およびＡＬＳトランスジェニックマウスの足筋肉に移植した後、そのような細胞は生存し、ロータロッド試験によって調べられた行動欠損、および、アポモルヒネにより誘導された回旋行動を改善した（図１１〜図１７Ａ〜図１７Ｃ）。
【００８２】
従って、本発明の１つの態様によれば、間葉性幹細胞を、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）およびヒトニューレグリン１−β１を含む分化培地でインキュベーションし、それにより、星状細胞様細胞を作製することを含む、星状細胞様細胞を作製する方法が提供される。
【００８３】
本明細書中で使用される表現「星状細胞様細胞」は、星状細胞様細胞が星状細胞の活性（すなわち、ニューロンの支援）をインビボで媒介することを可能にする少なくとも１つの星状細胞表現型を含む細胞を示す。
【００８４】
そのような表現型が本明細書中下記においてさらに記載される。
【００８５】
用語「間葉性幹細胞」または用語「ＭＳＣ」は、最終分化していない成熟細胞、すなわち、幹細胞である細胞を生じさせるために分裂することができる成熟細胞、または、間葉性細胞系譜の細胞を生じさせるために不可逆的に分化する成熟細胞について交換可能に使用される。本発明の間葉性幹細胞は供給源が同系または同種であってもよいが、同系の供給源が好ましい。
【００８６】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、間葉性幹細胞は、本明細書中に記載される細胞および細胞集団を作製するために遺伝子操作されない（すなわち、発現構築物により形質転換されない）。
【００８７】
本発明の細胞は、好ましくはＥＳ細胞に由来しないが、任意の幹細胞に由来し得ることが理解される。
【００８８】
間葉性幹細胞を、骨髄、末梢血、血液、胎盤および脂肪組織（これらに限定されない）をはじめとする様々な組織から単離することができる。間葉性幹細胞を末梢血から単離する方法がＫａｓｓｉｓ他によって記載される［Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２００６（Ｍａｙ）；３７（１０）：９６７〜７６］。間葉性幹細胞を胎盤組織から単離する方法がＺｈａｎｇ他によって記載される［Ｃｈｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ、２００４、１１７（６）：８８２〜８８７］。脂肪組織、胎盤および臍帯血の間葉性幹細胞を単離および培養する方法がＫｅｒｎ他によって記載される［Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ、２００６、２４：１２９４〜１３０１］。
【００８９】
本発明のこの態様の好ましい実施形態によれば、間葉性幹細胞はヒト由来である。
【００９０】
骨髄を吸引によって個体の腸骨稜から単離することができる。低密度ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）をＦＩＣＯＬ−ＰＡＧＵＥ密度勾配によって分離することができる。間葉性幹細胞を得るために、間葉性幹細胞（例えば、ＢＭＭＮＣ）を含む細胞集団を、細胞を維持および／または拡大培養することができる増殖培地で培養することができる。１つの実施形態によれば、そのような集団は（例えば、フラスコにおける）ポリスチレンプラスチック表面に置かれ、間葉性幹細胞が、非接着性細胞を除くことによって単離される。あるいは、間葉性幹細胞を、間葉性幹細胞マーカーを使用してＦＡＣＳによって単離することができる（本明細書中下記における表１を参照のこと）。
【００９１】
好ましくは、ＭＳＣは少なくとも５０％精製され、より好ましくは、少なくとも７５％精製され、一層より好ましくは、少なくとも９０％精製される。
【００９２】
単離後、細胞は、典型的には、単離された細胞を、本明細書中下記において実施例１に記載されるように、エクスビボで維持および／または拡大培養することができる増殖培地で培養することによって拡大培養される。増殖培地は、ＤＭＥＭ、α−ＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２であり得る。好ましくは、増殖培地はＤＭＥＭである。好ましくは、増殖培地はさらに、例えば、下記の実施例の節の実施例１に記載されるように、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミンおよび血清（例えば、ウシ胎児血清またはウマ血清など）を含む。
【００９３】
星状細胞様細胞への分化を、ＭＳＣを分化培地（例えば、米国特許第６５２８２４５号に記載される分化培地、および、Ｓａｎｃｈｅｚ−Ｒａｍｏｓ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｕｒｒｙ他（２０００）；Ｗｏｏｄｂｕｒｒｙ他（Ｊ．Ｎｅｕｒｉｓｃｉ．Ｒｅｓ．、９６：９０８〜９１７、２００１）；ＢｌａｃｋおよびＷｏｏｄｂｕｒｙ（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌ．Ｄｉｓ．、２７：６３２〜６３５、２００１）；Ｄｅｎｇ他（２００１）；Ｋｏｈｙａｍａ他（２００１）；ＲｅｙｅｓおよびＶｅｒｆａｔｉｌｅ（Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．、９３８：２３１〜２３５、２００１）；Ｊｉａｎｇ他（Ｎａｔｕｒｅ、４１８：４７〜４９、２００２）によって記載される分化培地など）でインキュベーションすることによって行うことができる。
【００９４】
ＢＭＳｃは、好ましくは、「分化培地」におけるそのインキュベーションに先立って、少なくとも２４時間、好ましくは４８時間、「さらなる培地」でインキュベーションされる。「分化培地」におけるインキュベーションは少なくとも２４時間続き、好ましくは、少なくとも４８時間続く。
【００９５】
分化培地（さらなる分化培地を含む）はＤＭＥＭまたはＤＭＥＭ／Ｆ１２であってもよく、好ましくはＤＭＥＭである。好適な「さらなる培地」は、細胞に星状細胞様の分化を受けやすくすることができる任意の成長培地（例えば、上皮増殖因子ｈＥＧＦ（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）および／または塩基性線維芽細胞増殖因子（例えば、２０ｎｇ／ｍｌ）が補充された成長培地など）であり得る。好ましくは、さらなる培地はまた、Ｎ２補充物（インスリン、プロゲステロン、プトレシン、セリンおよびトランスフェリン）を含む。
【００９６】
本発明の分化培地は、好ましくは、血小板由来増殖因子（例えば、５ｎｇ／ｍｌ）およびヒトニューレグリン１−β１（例えば、５０ｎｇ／ｍｌ）を含む。「分化培地」は、好ましくは、分化因子（例えば、ＩＬ−１βおよび／またはｄｂｃＡＭＰなど）を含む。
【００９７】
好ましくは、分化培地はさらに、ＳＰＮ、Ｌ−グルタミン、補充物（例えば、Ｎ２またはＢ２７など）、抗生物質（例えば、ＩＢＭＸ）および血清（ウシ胎児血清（ＦＣＳ、ＦＢＳ）またはウマ血清など）を含む。
【００９８】
本発明の別の態様によれば、間葉性幹細胞は、本発明の星状細胞様細胞を作製するために、少なくとも１つの分化因子を含む培地でインキュベーションされる。分化因子の例には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ヒトニューレグリン１−β１、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、Ｎ２補充物、ＩＢＭＸおよびｃＡＭＰが含まれるが、これらに限定されない。
【００９９】
分化培地（さらなる分化培地を含む）はまた、他の因子、例えば、神経栄養因子（例えば、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＧＤＮＦ、ＮＴＮ、ＮＴ３またはＬＩＦ）、ホルモン、増殖因子（例えば、ＧＧＦ２、ＴＧＦ−β３、ＴＧＦ−α、ＦＧＦ−８およびｂＦＧＦ）、ビタミン、ホルモン（例えば、インスリン、プロゲステロン）および他の因子（例えば、ソニックヘッジホッグなど）、骨形態形成タンパク質、フォルスコリン、レチノイン酸、アスコルビン酸、プトレシン、セレンおよびトランスフェリン）を含むことができる。
【０１００】
例示的な分化培地が本明細書中下記において実施例１に記載される。
【０１０１】
本明細書中に記載される方法に従って得られた細胞集団は典型的には均一でない。
【０１０２】
従って、本発明の別の態様によれば、
（ｉ）細胞の少なくともＮ％が少なくとも１つの星状細胞表現型を含む；
（ｉｉ）細胞の少なくともＭ％が、星状細胞表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含む；および
（ｉｉｉ）ヒト細胞の少なくとも１つが、少なくとも１つの星状細胞表現型と、少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型との両方を含む；
ただし、ＭおよびＮはそれぞれが独立して、１〜９９の間で選択される、
ヒト細胞の単離された集団が提供される。
【０１０３】
本明細書中で使用される用語「単離された」は、そのインビボでの存在位置（例えば、骨髄、神経組織）から取り出されている細胞の集団を示す。好ましくは、単離された細胞集団は、そのインビボでの存在位置に存在する他の物質（例えば、他の細胞）を実質的に含まない。
【０１０４】
本明細書中で使用される表現「星状細胞表現型」は、本発明の分化したＭＳＣと、分化していないＭＳＣとを識別するために使用することができる、星状細胞に典型的である（例えば、特有である）構造的パラメーターおよび／または機能的パラメーターを示す。星状細胞表現型は、本発明の分化したＭＳＣと、分化していないＭＳＣとを識別するために使用することができる１つだけの特徴または多数の特徴を含むことができる。
【０１０５】
機能的パラメーターは構造的パラメーター（例えば、分泌小胞の存在）と重なり得ることが理解される。
【０１０６】
好ましくは、機能的な星状細胞表現型は、神経栄養因子を、分化していないヒト間葉性幹細胞におけるその神経栄養因子の基礎的発現よりも少なくとも２倍大きいレベルで発現する能力を含む。
【０１０７】
本明細書中で使用される用語「発現する」は、上記で述べられた神経栄養因子の合成および／または分泌を示す。神経栄養因子はその影響を細胞外で誘発するので、好ましくは、神経栄養因子の分泌が本発明の集団の細胞では増大する。好ましい実施形態によれば、分泌は、分化していないヒト間葉性幹細胞において分泌される神経栄養因子の量と比較して少なくとも２倍増大し、一層より好ましくは５倍増大する。
【０１０８】
本明細書中で使用される表現「神経栄養因子」は、ニューロンに対する、成長、分化、機能的維持および／または生存の様々な影響を含む、脳神経系に対して作用する細胞因子を示す。神経栄養因子の例には、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｌ１９０６３、同Ｌ１５３０６；神経成長因子（ＮＧＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＣＡＡ３７７０３；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＣＡＡ６２６３２；ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ３７７６３；ニューロトロフィン−４／５；ニュールツリン（ＮＴＮ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿００４５４９；ニューロトロフィン−４、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号Ｍ８６５２８；ペルセフィン、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＣ３９６４０；脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＣＡＡ４２７６１；アルテミン（ＡＲＴ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＤ１３１１０；毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６０５；インスリン様成長因子−Ｉ（ＩＧＦ−１）、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＮＰ＿０００６０９；およびニューブラスチン、ＧｅｎＢａｎｋアクセション番号ＡＡＤ２１０７５が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０９】
機能的な星状細胞表現型のさらなる一例が、ＩＬ−１βおよびカベルゴリンの添加の後での神経栄養因子の発現および／または分泌の増強である。
【０１１０】
星状細胞は、高親和性のグルタミン酸輸送体によるグルタミン酸のクリアランスによって、低い細胞外グルタミン酸濃度の維持において重要な役割を果たす。従って、本発明の集団の細胞の別の機能的な星状細胞表現型はグルタミン酸輸送体の増大した活性であり得る。そのようなグルタミン酸輸送体の活性は、標識されたアスパラギン酸（例えば、細胞の培養培地からの［３Ｈ］−ｄ−アスパラギン酸取り込み）を測定することによって分析することができる。
【０１１１】
本明細書中上記で述べられたように、本発明の細胞集団の細胞のある割合は、さらに、または、代わりに、構造的な星状細胞表現型を含むことができる。
【０１１２】
構造的な星状細胞表現型の例には、細胞サイズ、細胞形状、オルガネラサイズおよびオルガネラ数が含まれる。従って、星状細胞の構造的表現型には、丸い核、「星型形状」体、および、脈管足板としてＣＮＳの小血管において終わる多くの長いプロセスが含まれる（図１Ａ〜図１Ｂおよび図２Ａ〜図２Ｄを参照のこと）。構造的な星状細胞表現型のさらなる例を下記において見出すことができる：ＲｅｙｎｏｌｄｓおよびＷｅｉｓｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）、２５５：１７０７〜１７１０；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、ＴｅｔｚｌａｆｆおよびＷｅｉｓｓ、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ（１９９２）、１２：４５６５〜４５７４；Ｋａｎｄｅｌ他、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、第３版（１９９１）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ＆Ｌａｎｇｅ、Ｎｏｒｗａｌｋ、Ｃｏｎｎ．。これらの構造的表現型は、顕微鏡技術（例えば、走査電子顕微鏡観察）を使用して分析することができる。抗体または色素を使用して、分析を助けるために、特徴的な特徴を強調することができる。
【０１１３】
構造的な星状細胞表現型はまた、星状細胞マーカーの発現を含むことができる。
【０１１４】
本明細書中で使用される表現「星状細胞マーカー」は、星状細胞において選択的または非選択的のいずれでも発現されるポリペプチドを示す。星状細胞マーカーは細胞表面または内部で発現されてもよい。星状細胞マーカーの例には、Ｓ１００β、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、グルタミンシンセターゼ、ＧＬＡＳＴおよびＧＬＴ−１が含まれる。
【０１１５】
本明細書中上記で述べられたように、細胞集団の細胞のある割合は、典型的な星状細胞には存在しない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型を含む。そのような幹細胞表現型は典型的には構造的である。例えば、本発明の細胞は、間葉性幹細胞の形態と類似する形態（例えば、紡錘体様の形態）を示すことができる。代わりに、または、さらに、本発明の細胞は、間葉性幹細胞に対しては典型的であるが、生来的な星状細胞に対しては典型的でないマーカー（例えば、表面マーカー）を発現することができる。間葉性幹細胞表面マーカーの例には、ＣＤ１０５＋、ＣＤ２９＋、ＣＤ４４＋、ＣＤ９０＋、ＣＤ３４−、ＣＤ４５−、ＣＤ１９−、ＣＤ５−、ＣＤ２０−、ＣＤ１１Ｂ−およびＦＭＣ７−が含まれるが、これらに限定されない。他の間葉性幹細胞マーカーには、チロシンヒドロキシラーゼ、ネスチンおよびＨ−ＮＦが含まれるが、これらに限定されない。
【０１１６】
本発明の細胞集団にはまた、星状細胞表現型および間葉性幹細胞表現型の両方を呈示する細胞が含まれる。間葉性幹細胞表現型は、好ましくは、星状細胞表現型ではない。従って、表３に例示されるように、本発明の細胞集団の細胞は、間葉性幹細胞マーカーのチロシンヒドロキシラーゼ、ＣＤ９０およびＨ−ＮＦ、すなわち、星状細胞では発現しないことが知られている３つのマーカーを発現することが示された。
【０１１７】
好ましくは、細胞が、本明細書中上記で記載された星状細胞表現型および間葉性幹細胞表現型の両方を含むとき、それらの星状細胞表現型は星状細胞に特有である。細胞は、星状細胞に特有な１つの星状細胞表現型（例えば、星型形状の形態）、または、星状細胞に特有な表現型を組合せで表す非特有な星状細胞表現型の組合せを含むことができる。
【０１１８】
本発明の１つの実施形態によれば、本発明の集団の細胞のいずれかの星状細胞表現型は生来的な星状細胞に可能な限り近い。従って、下記の実施例の節で例示されるように、本発明の方法に従って分化した細胞は星状細胞様の形状を示し（図１Ａ〜１Ｂおよび図２Ａ〜図２Ｄ）、星状細胞マーカーの存在が付随し（図３Ａ〜図３Ｂおよび図４Ａ〜図４Ｂ）、著しいレベルのＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦの発現（図５）および分泌（図８Ａ〜図８Ｄ）を有し、カベルゴリン（Ｄ２受容体アゴニスト）およびＩＬ−１によってさらにアップレギュレーションされるＮＴＦ産生を含み（図７および図８Ａ）、かつ、グルタミン酸クリアランス機構を有する（図１０）。
【０１１９】
星状細胞表現型を含む細胞の割合は、意図された必要性に従って増減させることができる。従って、例えば、細胞集団を、特定の星状細胞表現型（例えば、ＧＤＮＦの発現）を有する細胞について濃縮することができる。これは、星状細胞の細胞マーカーに対して特異的な抗体を使用してＦＡＣＳによって行うことができる。そのような星状細胞マーカーの例が本明細書中上記に記載される。細胞マーカーが内部マーカーであるならば、好ましくは、ＦＡＣＳ分析は、細胞の中に容易に浸透することができ、および、検出後に細胞から容易に洗い出すことができる抗体またはそのフラグメントを含む。ＦＡＣＳプロセスは、最終産物として要求される濃縮度および細胞表現型に依存して、同じマーカーまたは異なるマーカーを使用して何回も繰り返すことができる。
【０１２０】
本発明のこの態様の別の実施形態によれば、細胞集団は、細胞の均一な集団が作製されるように、星状細胞表現型および間葉性幹細胞表現型の両方を含む細胞について濃縮することができる。
【０１２１】
従って、本発明のさらなる態様によれば、少なくとも１つの星状細胞表現型と、星状細胞表現型でない少なくとも１つの間葉性幹細胞表現型とを含む単離されたヒト細胞が提供される。
【０１２２】
分化され、また、場合により単離されると、細胞はそれらの星状細胞表現型（例えば、機能的な神経栄養因子を分泌する能力）について（培養状態で）調べることができる。培養物を、下記の実施例の節の実施例１において記載されるような生化学な分析方法（例えば、免疫アッセイ、ウエスタンブロットおよびリアルタイムＰＣＲなど）を使用して、または、酵素活性バイオアッセイによって星状細胞表現型について比較分析することができる。
【０１２３】
星状細胞表現型に従って、本発明の細胞および細胞集団は、特定の疾患または障害を治療するために使用することができる。細胞集団は分化後そのまま使用することができ、または、本明細書中上記で記載されたように、特定の星状細胞表現型について濃縮することができる。本明細書中下記の表１に要約されるように、ある種の神経栄養因子またはある１組の神経栄養因子は、特定の疾患を治療するために特に有益であることが示されている。例えば、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＦＧＦおよびＧＤＮＦを分泌する本発明の細胞は、パーキンソン病を治療するために特に好適であると考えられる。
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【０１２４】
星状細胞は、モノアミンオキシダーゼ−Ｂおよびカテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼを発現するので、ドーパミンを代謝することによってニューロンにおける酸化性ストレスを軽減させ得ることが提案されている。加えて、星状細胞は、ＮＯにより生じる神経毒性をグルタチオン依存的な機構によって防止し得ることが提案されている（Ｃｈｅｎ他、２００４、Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ、２００５（Ｎｏｖ）、６（７）：８２１〜３３）。従って、除去機能を含み、および／または、ドーパミン代謝酵素を発現する本発明の細胞もまた、パーキンソン病を治療するために好適であり得る。
【０１２５】
グルタミン酸輸送体の不十分なクリアランスまたは低下のために、グルタミン酸の興奮毒性がＡＬＳについての原因因子の１つとして示唆されている［Ｂｅｎｄｏｔｔｉ他、２００１、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ、７９（４）：７３７〜７４６、２００１］。従って、上昇したグルタミン酸輸送体活性を示す本発明の細胞はまた、ＡＬＳを治療するために好適であり得る。
【０１２６】
従って、本発明の別の態様によれば、ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害を治療する方法が提供される。
【０１２７】
本明細書中で使用される表現「ＣＮＳ疾患」は、本発明の細胞により治療することができる中枢神経系の任意の障害、疾患または状態を示す。
【０１２８】
従って、本発明の細胞は、医薬品（これは交換可能に医薬組成物と呼ばれる）を調製するために使用することができ、それにより、そのような医薬品は、ＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害を治療するために配合される。
【０１２９】
本明細書中に記載される細胞により有益に治療することができるＣＮＳ疾患またはＣＮＳ障害の代表的な例には、痛み障害、運動障害、解離性障害、気分障害、情動障害、神経変性疾患または神経変性障害、および、痙攣性障害が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３０】
そのような状態のより具体的な例には、パーキンソン病、ＡＬＳ、多発性硬化症、ハンチングトン病、自己免疫性脳脊髄炎、糖尿病性神経障害、緑内障性神経障害、黄斑変性、動作時振せんおよび遅発性ジスキネジア、パニック、不安、うつ病、アルコール中毒、不眠症、躁病的行動、アルツハイマー病およびてんかんが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３１】
本明細書中に記載される方法のいずれにおいても、細胞は、任意の自己または非自己（すなわち、同種または異種）のヒトドナーから得ることができる。例えば、細胞をヒト死体またはドナー対象者から単離することができる。
【０１３２】
本発明の細胞は、様々な移植法（その性質は埋め込み部位に依存する）を使用して個体を治療するために投与することができる。
【０１３３】
「移植」、「細胞置換」または「グラフト化する」の用語または表現は、本明細書中では交換可能に使用され、本発明の細胞を標的組織に導入することを示す。細胞は被移植者に由来し得るか、あるいは、同種ドナーまたは異種ドナーに由来し得る。
【０１３４】
細胞を、中枢神経系内に、または、脳室腔内に、または、宿主の脳の表面での硬膜下に移植することができる。成功した移植のための条件には、（ｉ）移植体の生存性；（ｉｉ）移植部位における移植体の保持；および（ｉｉｉ）移植部位における最小量の病理学的反応が含まれる。様々な神経組織（例えば、胚の脳組織）を宿主の脳に移植するための様々な方法が、“Ｎｅｕｒａｌ  ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍａｍｍａｍａｌｉａｎ  ＣＮＳ”、ＢｊｏｒｋｌｕｎｄおよびＳｔｅｎｅｖｉ編（１９８５）；Ｆｒｅｅｄ他、２００１；Ｏｌａｎｏｗ他、２００３に記載されている。これらの手法には、移植時に脳実質に向かい合わせにされるように組織を宿主の脳の内部に注入または設置することによって達成される実質内移植、すなわち、（脳の外側または実質外移植と比較されるような）宿主の脳の内部での移植が含まれる。
【０１３５】
実質内移植を、２つの方法を使用して行うことができる：（ｉ）宿主の脳実質の中への細胞の注入、または（ｉｉ）宿主の脳実質を露出するための外科的手段によって腔を調製し、その後、移植体を腔内に置くこと。両方の方法は、移植体と、宿主の脳組織との間での実質への設置を移植時にもたらし、また、両方の方法は、移植体と、宿主の脳組織との間での解剖学的一体化を容易にする。このことは、移植体が宿主の脳の不可分の一部となり、宿主の生涯にわたって生存することが要求されるならば、重要である。
【０１３６】
代替として、移植体を脳室（例えば、大脳脳室）に置くことができ、あるいは、移植体が、介在する軟膜またはクモ膜および軟膜によって宿主の脳実質から隔てられる場合には硬膜下に、すなわち、宿主の脳の表面に置くことができる。脳室への移植は、ドナー細胞を注入することによって、または、移植体の転位を防止するために、細胞を基体（例えば、３％コラーゲンなど）において成長させて、脳室内にその後で埋め込むことができる充実組織の栓子を形成することによって達成することができる。硬膜下移植するために、細胞を、硬膜に細長い切り口を作製した後、脳の表面の周りに注入することができる。宿主の脳の選択された領域への注入を、ドリルで穴を開け、硬膜を貫いて、マイクロシリンジのニードルを挿入することを可能にすることによって行うことができる。マイクロシリンジは、好ましくは、定位固定フレームに取り付けられ、三次元での定位固定座標が、ニードルを脳または脊髄の所望される場所に設置するために選択される。細胞はまた、脳の被殻、基底核、海馬皮質、線条体、黒質または尾状核の領域、ならびに、脊髄に導入することができる。
【０１３７】
細胞はまた、組織の健康な領域に移植されることがある。一部の場合には、損傷を受けた組織区域の正確な場所が不明であることがあり、細胞が健康な領域に気づかずに移植されることがある。他の場合には、細胞を健康な領域に投与し、それにより、その領域に対する何らかのさらなる損傷を避けることが好ましい場合がある。いずれにせよ、移植後、細胞は、好ましくは、損傷を受けた区域に移動する。
【０１３８】
移植するために、細胞懸濁物がシリンジの中に引き込まれ、麻酔された被移植者に投与される。多数回の注入を、この手順を使用して行うことができる。
【０１３９】
従って、細胞懸濁物による手法は、細胞を脳または脊髄における任意の所定の部位に移植することを可能にし、および、比較的に非外傷性であり、および、同じ細胞懸濁物を使用していくつかの異なる部位または同じ部位における多数回の移植を同時に可能にし、および、異なる解剖学的領域からの細胞の混合物を可能にする。多数の移植体は、いくつかの細胞タイプの混合物、および／または、細胞に挿入された導入遺伝子の混合物からなり得る。好ましくは、約１０４個〜約１０８個の細胞が１つの移植体について導入される。
【０１４０】
腔内への移植（これは、脊髄に移植するために好ましい場合がある）のために、組織が、例えば、Ｓｔｅｎｅｖｉ他（Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ、１１４：１〜２０、１９７６）によって記載されるように、脳を覆う骨を除き、出血をゲルフォームのような材料で止めることによって、移植腔を形成するために中枢神経系（ＣＮＳ）の外側表面に近い領域から除かれる。吸引を、腔を作製するために使用することができる。その後、移植体が腔に置かれる。２つ以上の移植体を、細胞または固体の組織インプラントを使用して同じ腔に置くことができる。好ましくは、埋め込み部位は、治療されているＣＮＳ障害、および、細胞に含まれる星状細胞表現型（例えば、特定の神経栄養因子が本発明の細胞により分泌されること）によって決定される。例えば、ＧＤＮＦを分泌する細胞は、好ましくは、パーキンソン病患者の黒質に埋め込まれる。
【０１４１】
非自己の細胞は、身体に投与されたとき、免疫反応を誘導する可能性があるので、いくつかの方法が、非自己細胞の拒絶の可能性を低下させるために開発されている。これらには、被移植者の免疫系を抑制すること、または、非自己細胞を移植前に免疫隔離性の半透過性膜でカプセル化することのいずれかが含まれる。
【０１４２】
カプセル化技術は、一般には、マイクロカプセル化（これは小さい球状のビヒクルを伴う）およびマクロカプセル化（これはより大きい平坦シート膜および中空膜を伴う）として分類される（Ｕｌｕｄａｇ、Ｈ．他、哺乳動物細胞カプセル化の技術、Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ、２０００、４２：２９〜６４）。
【０１４３】
マイクロカプセルを調製する様々な方法がこの分野で知られており、これらには、例えば、Ｌｕ  ＭＺ他（アルギン酸塩およびα−フェノキシシンナミリデン−アセチル化ポリ（アリルアミン）による細胞カプセル化、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ、２０００、７０：４７９〜８３）によって開示される方法、Ｃｈａｎｇ  ＴＭおよびＰｒａｋａｓｈ  Ｓ（酵素、細胞および遺伝子操作微生物のマイクロカプセル化のための手順、Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、２００１、１７：２４９〜６０）によって開示される方法、Ｌｕ  ＭＺ他（光感受性ポリ（アリルアミンα−シアノシンナミリデンアセタート）を使用する新規な細胞カプセル化方法、Ｊ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌ、２０００、１７：２４５〜５１）によって開示される方法が含まれる。
【０１４４】
例えば、マイクロカプセルが、修飾されたコラーゲンを、メチルアクリル酸２−ヒドロキシルエチル（ＨＥＭＡ）、メタクリル酸（ＭＡＡ）およびメタクリル酸メチル（ＭＭＡ）のターポリマー外皮により複合体化し、それにより、２μｍ〜５μｍのカプセル厚さを生じさせることによって調製される。そのようなマイクロカプセルはさらに、負荷電のなめらかな表面を与えるために、また、血漿タンパク質の吸収を最小限に抑えるために、さらなる２μｍ〜５μｍのターポリマー外皮によりカプセル化することができる（Ｃｈｉａ，Ｓ．Ｍ．他、細胞カプセル化のための多層マイクロカプセル、Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ、２００２、２３：８４９〜５６）。
【０１４５】
他のマイクロカプセルがアルギン酸塩（海洋多糖）（Ｓａｍｂａｎｉｓ，Ａ．、糖尿病の治療におけるカプセル化された小島、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．、２００３、５：６６５〜８）またはその誘導体に基づいている。例えば、マイクロカプセルを、塩化カルシウムの存在下でのポリカチオンのポリ（メチレン−ｃｏ−グアニジン）塩酸塩を用いたポリアニオンのアルギン酸ナトリウムおよび硫酸セルロースナトリウムの間での高分子電解質複合体化によって調製することができる。
【０１４６】
細胞カプセル化は、より小さいカプセルが使用されるときには改善されることが理解される。従って、カプセル化された細胞の品質管理、機械的安定性、拡散特性およびインビトロ活性が、カプセルサイズが１ｍｍから４００μｍに低下したときに改善された（Ｃａｎａｐｌｅ  Ｌ．他、サイズ制御による細胞カプセル化の改善、Ｊ  Ｂｉｏｍａｔｅｒ  Ｓｃｉ  Ｐｏｌｙｍ  Ｅｄ、２００２、１３：７８３〜９６）。そのうえ、７ｎｍもの小さい十分に制御された細孔サイズ、細かく調節された表面化学および精密な微細構造を有するナノ多孔性バイオカプセルは、細胞のための微小環境を首尾よく免疫隔離することが見出された（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｄ．、小さいことは美しい：医療用デバイスにおけるマイクロ粒子技術およびナノ粒子技術、Ｍｅｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌ、１９９９、１０：６〜９；Ｄｅｓａｉ，Ｔ．Ａ．、膵臓細胞カプセル化のための微細製造技術、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｌ  Ｔｈｅｒ、２００２、２：６３３〜４６）。
【０１４７】
免疫抑制剤の例には、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、シクロスポリンＡ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、スルファサラジン（スルファサラゾピリン）、金塩、Ｄ−ペニシラミン、レフルノミド、アザチオプリン、アナキンラ、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥ（登録商標））、エタネルセプト、ＴＮＦα遮断剤、炎症性サイトカインを標的とする生物学的薬剤、および、非ステロイド系抗炎症性薬物（ＮＳＡＩＤ）が含まれるが、これらに限定されない。ＮＳＡＩＤの例には、アセチルサリチル酸、サリチル酸コリンマグネシウム、ジフルニサル、サリチル酸マグネシウム、サルサラート、サリチル酸ナトリウム、ジクロフェナク、エトドラク、フェノプロフェン、フルルビプロフェン、インドメタシン、ケトプロフェン、ケトロラク、メクロフェナマート、ナプロキセン、ナブメトン、フェニルブタゾン、ピロキシカム、スリンダク、トルメチン、アセトアミノフェン、イブプロフェン、Ｃｏｘ−２阻害剤およびトラマドールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
本明細書中に記載される方法のいずれにおいても、細胞は、それ自体で、または、好ましくは、医薬的に許容され得るキャリアをさらに含む医薬組成物の一部として、そのいずれでも投与することができる。
【０１４９】
本明細書中で使用される「医薬組成物」は、本明細書中に記載される化学的コンジュゲートの１つまたは複数と、他の化学的成分（例えば、医薬的に好適なキャリアおよび賦形剤）との調製物を示す。医薬組成物の目的は、対象に対する化合物の投与を容易にすることである。
【０１５０】
以降、用語「医薬的に許容され得るキャリア」は、対象に対する著しい刺激を生じさせず、かつ、投与された調合物の生物学的活性および生物学的性質を阻害しないキャリアまたは希釈剤を示す。キャリアの非限定的な例には、プロピレングリコール、生理食塩水、有機溶媒と水の混合物およびエマルジョンがある。
【０１５１】
本明細書中において、用語「賦形剤」は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性な物質を示す。賦形剤の非限定的な例には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、様々な糖およびタイプのデンプン、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油およびポリエチレングリコールが含まれる。
【０１５２】
本発明の好ましい実施形態によれば、医薬用キャリアは塩類の水溶液である。
【０１５３】
薬物の配合および投与のための様々な技術が“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、最新版）（これは参考として本明細書中に組み込まれる）に見出され得る。
【０１５４】
好適な投与経路には、目的の組織または器官への直接投与が含まれる。したがって、例えば細胞は上記のように脳に直接投与されてもよいし、下記の実施例３において記述されるように筋肉に直接投与されてもよい。
【０１５５】
本発明の方法において使用される任意の調製物について、治療効果的な量または用量をインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイから最初に推定することができる。好ましくは、用量が、所望される濃度または力価を達成するために動物モデルにおいて定められる。そのような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。
【０１５６】
本明細書中に記載される有効成分の毒性および治療的効力を、標準的な薬学的手法によって、インビトロで、あるいは、細胞培養または実験動物において求めることができる。例えば、６−ＯＨＤＡ障害マウスをパーキンソン病の動物モデルとして使用することができる。加えて、ヒマワリ試験を、ヒマワリの種子を特定の期間の間に開けるように動物をし向けることによって微妙な運動機能における改善を試験するために使用することができる。
【０１５７】
ハンチングトン病についてのモデルとして、増大した数のＣＡＧ反復を含み、脳幹、視床または脊髄においてではなく、線条体および大脳皮質（これらはこの疾患におけるニューロン細胞喪失部位によく一致する）のニューロンにおけるハンチンチンおよびユビキチンの核内封入体を有するトランスジェニックマウスを使用することができる。
【０１５８】
ＳＯＤ−１の変異を含むトランスジェニックマウスを、ＡＬＳ疾患についてのモデルとして使用することができる。
【０１５９】
中隔海馬経路は、海馬采を切断することによって片側性に横方向に切断された場合、アルツハイマー病における中隔海馬経路喪失のコリン作動性欠如を模倣する。従って、この障害を含む動物モデルは、アルツハイマー病を治療するための本発明の細胞を試験するために使用することができる。
【０１６０】
動物の生存および回旋行動（例えば、ロータロッド上での回旋行動）を、本発明の細胞を投与した後で（実施例２および実施例３でのように）分析することができる。
【０１６１】
これらのインビトロアッセイおよび細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のための投薬量の範囲を定める際に使用することができる。投薬量は、用いられた投薬形態物および利用された投与経路に依存して変化し得る。正確な処方、投与経路および投薬量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選ぶことができる（例えば、Ｆｉｎｇｌ他、１９７５、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、第１章、１頁を参照のこと）。例えば、パーキンソン病患者は、治療に対する陽性の応答を示す改善された運動機能について症状的にモニターすることができる。
【０１６２】
注射のために、医薬組成物の有効成分は、水溶液において、好ましくは、生理学的に適合し得る緩衝液（例えば、ハンクス溶液、リンゲル溶液または生理学的塩緩衝液など）において配合することができる。
【０１６３】
投薬量および投薬間隔は、移植された細胞による神経伝達物質の合成を効果的に調節するために十分である有効成分のレベルに合わせて個々に調製され得る。所望される効果を達成するために必要な投薬量は、個体の特性および投与経路に依存する。検出アッセイを、血漿濃度を測定するために使用することができる。
【０１６４】
治療される状態の重篤度および応答性に依存して、服薬は単回または複数回の投与が可能であり、治療の経過は、数日から数週間まで、または、疾患状態の縮小が達成されるまで続く。
【０１６５】
投与される組成物の量は、当然のことではあるが、治療されている個体、病気の重篤度、投与様式、処方医師の判断などに依存する。投薬量および投与時期は、個体の変化する状態の注意深い継続したモニターリングに応答する。例えば、治療されているパーキンソン病患者には、モニターリング中の表示値に基づいて、所望されるレベルにドーパミン合成を促進または抑制するために十分である量の作用物が投与される。
【０１６６】
本発明の細胞は、神経変性障害を治療することにおいて有用な治療剤（例えば、ガングリオシド、抗生物質、神経伝達物質、神経ホルモン、トキシン、神経突起促進分子、ならびに、神経伝達物質分子の代謝拮抗剤および前駆体（例えば、Ｌ−ＤＯＰＡなど）など）と同時に投与することができる。加えて、本発明の細胞は、神経伝達物質を合成することができる他の細胞と同時に投与することができる。そのような細胞が本発明者らの米国特許出願公開第２００５０２６５９８３号に開示される。
【０１６７】
移植後、本発明の細胞は、好ましくは、一定の期間（例えば、少なくとも６ヶ月）にわたって疾患領域において生存し、その結果、治療的効果が観測されるようになる。実施例２に記載されるように、本発明の細胞は、６−ＯＨＤＡ障害マウスの脳半球において移植後１６週で生存可能であること、また、ＡＬＳについてのトランスジェニックマウスモデルにおいて移植後１１０日で生存可能であることが示された。
【０１６８】
本明細書中で使用される用語「約」は、±１０％を意味する。
【０１６９】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。また、本明細書中上記に描かれ、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、下記の実施例において実験的裏付けが見出される。
【実施例】
【０１７０】
上記説明とともに、以下の実施例を参照して本発明を例示する。なお、これら実施例によって本発明は限定されない。
【０１７１】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている［例えば以下の諸文献を参照されたい。「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋら１９８９年；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編１９９４年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻；Ａｕｓｕｂｅｌら著１９８９年「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク１９８８年；Ｗａｔｓｏｎら、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎら編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク１９９８年；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｃｏｌｉｇａｎ，  Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻１９９４年；Ｓｔｉｔｅｓら編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク１９９４年；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク１９８０年；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている。米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」１９８４年；Ｈａｍｅｓ，  Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」１９８５年；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」１９８４年；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，  Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」１９８６年；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８６年；Ｐｅｒｂａｌ，  Ｂ．著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」１９８４年および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ１９９０年；Ｍａｒｓｈａｋら、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、１９９６年；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである］。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１７２】
（実施例１）
星状細胞に分化したＢＭＳＣの特徴化
材料および方法
ヒトＢＭＳＣの単離および培養：骨髄吸引物（１０ｍｌ〜３０ｍｌ）を、インフォームドコンセントを得た健康な成人ドナーの後部腸骨稜から集めた。低密度ＢＭ単核細胞（ＢＭＭＮＣ）をＦＩＣＯＬ−ＰＡＧＵＥ密度勾配（１．０７７ｇ／ｍｌ）によって分離し、ＨＢＳＳにより洗浄した。次いで、細胞をポリスチレン製プラスチックフラスコにおいて成長培地に入れた。成長培地は、１５％のウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１２．５ユニット／ｍｌのナイスタチン（ＳＰＮ）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）からなった。非接着性細胞を培地置換とともに除いた。コンフルエンス後、接着性の層をトリプシン処理し、再接種し、コンフルエンスに成長させて、２回〜６回の継代培養を行い、その後、実験に使用した。成長培地を１週間に２回交換し、細胞を加湿５％ＣＯ２インキュベーターにおいて３７℃で維持した。
【０１７３】
星状細胞分化：星状細胞分化を誘導するために、１Ｘ１０６個の細胞を１０ｍｍのディッシュで培養した。細胞を４８時間、予備分化培地とともに再置床した（ＳＰＮ、２ｍＭのＬ−グルタミン、２０ｎｇ／ｍｌのヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、２０ｎｇ／ｍｌのヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｈｂＦＧＦ）およびＮ２補充物（インスリン：５μｇ／ｍｌ、プロゲステロン：２０ｎＭ、プトレシン：１００μＭ、セレン：３０ｎＭ、トランスフェリン：１００μｇ／ｍｌ）が補充されたＤＭＥＭ）。４８時間後、予備分化培地を分化培地に交換した（ＳＰＮ、２ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのジブチリル環状ＡＭＰ（ｄｂｃＡＭＰ）、０．５ｍＭのイソブチルメチルキサンチン（ＩＢＭＸ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、米国）、５ｎｇ／ｍｌのヒト血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および５０ｎｇ／ｍｌのヒトニューレグリン１−β１（ＮＲＧ１−β１−ＧＧＦ−２）が補充されたＤＭＥＭ）。いくつかの実験では、ＩＬ−１β（１００ｐｇ／ｍｌ）またはカベルゴリン（１３０ｐｇ／ｍｌ）を分化開始後２４時間で培地に加えた。
【０１７４】
免疫細胞化学：免疫細胞化学分析のために、細胞を１２ｍｍの円形のポリ−Ｌ−リシン被覆されたガラス製カバースリップで成長させた。実験が終了した時、培地を除き、細胞を室温で２０分間、４％（ｖ／ｖ）のパラホルムアルデヒドにより固定処理し、その後、２０分間、０．１Ｍ  ＰＢＳにおける０．２５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により透過処理した。非特異的な結合を、５％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）および１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ）を含有する０．１Ｍ  ＰＢＳ溶液において細胞を３７℃で１時間インキュベーションすることによって阻止した。続いて、細胞を、一次抗体、すなわち、ウサギ抗グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）（１：１００、ＤＡＫＯ）、ウサギ抗ＧＤＮＦ（１：１００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、米国）、マウス抗ヒト核ｈ−Ｎｕｃ（１：３０）、ウサギ抗グルタミンシンセターゼ（１：２００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、米国）、マウス抗Ｓ１００β（１：２００、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｉｓｓｏｕｒｉ、米国）とともに、０．２５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％のＮＧＳおよび１％のＢＳＡを含有する０．１Ｍ  ＰＢＳ溶液においてインキュベーションした。二次抗体、例えば、ＧＤＮＦ染色については、ヤギ抗ウサギビオチン化体（１：２００）を１時間加え、続いて、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ−４８８コンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）を加えた。他の染色については、Ａｌｅｘａ−４８８コンジュゲート化ヤギ抗ウサギＩｇＧ抗体（１：２００）およびローダミン−Ｒｘコンジュゲート化体（１：２００、Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、米国）を、０．２５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、５％のＮＧＳおよび１％のＢＳＡを含有する０．１Ｍ  ＰＢＳ溶液で希釈し、室温で１時間加えた。核を、核色素ＤＡＰＩ（１：２００、Ｓｉｇｍａ，Ａｌｄｒｉｃｈ）により５分間染色した。ＰＢＳにおける３回の洗浄の後、調製物をＡｎｔｉｆａｉｄｉｎｇ（Ｓｉｇｍａ、イスラエル）で固定し、ＣＣＤカメラ（Ｔ．Ｉ．Ｌ．Ｌ．ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ドイツ）に接続された蛍光顕微鏡を使用して調べた。励起波長（Ａｌｅｘａ４８８、ＤＡＰＩおよびＡｌｅｘａ５６８についてそれぞれ、４８８ｎｍ、４０５ｎｍおよび５６８ｎｍ）を、モノクロメーター（Ｔ．Ｉ．Ｌ．Ｌ．ｐｈｏｔｏｎｉｃｓ、Ｍａｒｔｉｎｓｒｉｅｄ、ドイツ）に接続されたキセノンランプを使用して発生させた。デジタル画像を、適切なフィルターを使用して取得し、ＴＩＬＬｖｉｓＩＯＮソフトウエアを使用して組み合わせた。
【０１７５】
ＧＤＮＦおよびＢＤＮＦの分析：上記の分化手順が終了したとき、上清をプレートから回収し、また、細胞を集め、計数した。細胞溶解物および細胞培養上清におけるＧＤＮＦまたはＢＤＮＦの量を、ＧＤＮＦ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  ＳｙｓｔｅｍまたはＢＤＮＦ  ＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を製造者のプロトコルに従って使用することによって定量した。４５０ｎｍでの吸光度をＭｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（ＢｉｏＲａｄ  Ｍｏｄｅｌ５５０）で記録し、その値を使用して、ＧＤＮＦ標準物またはＢＤＮＦ標準物の曲線を作製した。ＧＤＮＦ標準曲線は１５．６ｐｇ／ｍｌ〜１０００ｐｇ／ｍｌの間で直線であった。ＥＬＩＳＡの結果を、プレートあたり１０６個の細胞に従って計算した。
【０１７６】
細胞カウント評価：特定の抗原を発現する陽性細胞の数を求めるために、データを、サンプルあたり３つの独立した培養物からの１５の視野を注意深く調べることから集めた。これらのサンプルにおけるＭＳＣの総数を、ＤＡＰＩ染色された細胞の核を計数することによって求めた。結果が、ＧＤＮＦ、グルタミンシンセターゼまたはＳ１００βのいずれかについての陽性細胞の百分率として表される。
【０１７７】
ｍＲＮＡの調製：総ＲＮＡを、ＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉおよびＳａｃｃｈｉ（Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ、１６２：１５６〜１５９、１９８７）によって記載されるように単離した。細胞を２００μｌの溶液Ｄ（４Ｍのチオシアン酸グアニジニウム、２５ｍＭのクエン酸ナトリウム、０．５％のサルコシル、０．１Ｍの２−メルカプトエタノール）により破壊した。続いて、０．１体積の２Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）、１体積のフェノール（飽和）および０．２体積のクロロホルム：イソアミルアルコール（４９：１）を加えた。サンプルを４℃で３０分間静置し、その後、４℃で２０分間、１００００Ｘｇで遠心分離した。上部の水相を２体積のエタノールと混合し、ＲＮＡを−２０℃で一晩沈殿させた。最終的なＲＮＡペレットを７５％エタノールで洗浄し、空気乾燥した。ペレットをＤＥＰＣ処理水に溶解した。ＲＮＡの量を、ＮＤ−１０００分光光度計（Ｎａｎｏ−ｄｒｏｐ）を使用して分光光学的に求めた。ＲＮＡの品質を、ＯＤ２６０／ＯＤ２８０の比率を測定することによって確認した。ＲＮＡを使用まで−８０℃で保存した。
【０１７８】
リアルタイム定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応：所望される遺伝子のリアルタイム定量的ＰＣＲを、ＳｙｂｒグリーンＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）および下記のプライマーを使用してＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００配列検出システム（Ａｐｐｌｉｅｄ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で行った。
2008546385.tif 000003
ＧＡＰＤＨ遺伝子は、転写プロファイリングのための有効な基準の「ハウスキーピング」遺伝子として役立った。
【０１７９】
定量化のために、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を二連で行った。ｑＰＣＲ増幅を、増幅されたそれぞれの遺伝子についての標準曲線およびテンプレート非含有コントロール（ＮＴＣ）もまた含有した同じＰＣＲ反応プレートの別個のウエルにおいてそれぞれのサンプルについて行った。最適な実験パラメーター（ハイブリダイゼーション温度、伸長時間およびプライマー濃度）をそれぞれのプライマー対について決定した。それぞれの遺伝子について、１つだけのピークを融解曲線分析で確認することにより、ＰＣＲ生成物の特異性が評価された。
【０１８０】
ＰＣＲを、１μｌの上記ｃＤＮＡ、それぞれ１μｌの３’プライマーおよび５’プライマー（５００ｎｍｍｏｌ／Ｌの最終濃度）、１０μｌのＡｂｓｏｌｕｔｅ（商標）ＱＰＣＲ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＲＯＸ  Ｍｉｘおよび８μｌのＤＥＰＣ水を含有する２０μｌの総体積で行った。
【０１８１】
増幅プロトコルは、それぞれ９５℃を１５秒間、その後、６０℃を１分間の４０サイクルであった。ＧＡＰＤＨに対する目的とする遺伝子の定量的計算を、ユーザーブレティン＃２  ＡＢＩｐｒｉｓｍ７７００配列決定システム（２００１年１０月更新）に指示されるように、ｄｄＣＴ法を使用して行った。
【０１８２】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）：ＲＴ−ＰＣＲを、１．３μＭのオリゴ−ｄＴ１２〜１８（Ｓｉｇｍａ、米国）、製造者によって供給される１ｘ緩衝液、１０ｍＭのＤＴＴ、２０μＭの各ｄＮＴＰ、および、ＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮＡｇｕａｒｄ、ａｍｅｒｓｈａｍ  ｐｈａｒｍａｃｉａ  ｂｉｏｔｅｃｈ、英国）を含有する混合物において１０Ｕの酵素ＲＴ−ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ、ＭＤ、米国）を使用して、０．５マイクログラムのＲＮＡサンプルに対して行った。逆転写を４２℃で２時間行った。所望される遺伝子のＰＣＲを、Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒでの２５サイクル〜３０サイクル（９４℃を３０秒間、５５℃での３０秒間のアニーリング、７２℃での４５秒間のＤＮＡ伸長）により、２μｌのＲＴ、１Ｘ緩衝液（Ｔａｋａｒａ、日本）、２００μＭの各ｄＮＴＰ、１μＭの各プライマーおよび５ＵユニットのＴａｑポリメラーゼ（Ｔａｋａｒａ、日本）を含有する混合物において特異的なプライマーを用いて行った。これらの実験条件のもとで、増幅の直線性が観測された。
【０１８３】
ＲＴ−ＰＣＲを、分化していないｈＢＭＳＣ、および、本発明の方法による分化したＢＭＳＣに対して行った。遺伝子の発現をこれら２つの細胞タイプの間で比較し、また、（文献から得られる情報からの）星状細胞における発現と比較した。プライマー配列が本明細書中下記の表２に詳しく記載される。
2008546385.tif 000004
【０１８４】
走査電子顕微鏡観察：細胞をリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）における２．５％グルタルアルデヒドにより固定し、同じ緩衝液で洗浄し、２％ＯｓＯ４により後固定した。固定処理の第３工程を、タンニン酸およびグアニジン塩酸塩の溶液を使用して行った。三重に固定処理された細胞を段階的なアルコール溶液において脱水した。その後、アルコールを、段階的なＦｒｅｏｎ溶液を使用してＦｒｅｏｎ−１１２に交換した。細胞を空気乾燥し、金被覆し、Ｊｅｏｌ８４０走査電子顕微鏡を使用して調べた。
【０１８５】
グルタミン酸取り込み：グルタミン酸輸送体の機能的特徴化を、トリプシン処理された分化後の細胞に対して行った。輸送速度を、Ｎａ＋を含有する緩衝液における３７℃での６分間のインキュベーションの後での［３Ｈ］−ｄ−アスパラギン酸（２０ｎＭ）の取り込みを測定することによって推定した。グルタミン酸輸送体の比活性をｍｇ単位でのタンパク質の量に対する取り込み速度として表した。
【０１８６】
結果
本発明の方法に従って分化したｈＢＭＳｃは、星状細胞に類似する衛星様の形態を獲得し、これに対して、血清非含有培地だけで成長させたコントロール細胞は、ｈＢＭＳｃに特徴的な平坦な線維芽細胞様の形態を示した（図１Ａ〜図１Ｂ）。分化した細胞はまた、走査電子顕微鏡を使用して分析され、これにより、その特有な星状細胞型の衛星形態が確認された（図２Ａ〜図２Ｄ）。
【０１８７】
細胞の星状細胞表現型がさらに、典型的な星状細胞マーカーによる免疫蛍光分析を使用して確認された。図３Ａ〜図３Ｂに例示されるように、形態学的な変化には、Ｓ１００β（星状細胞のＣａ＋チャネルのサブユニット）およびグルタミンシンセターゼ（ＧＳ）（グルタミン酸を代謝する特有の星状細胞酵素）についての陽性の免疫染色が伴った。加えて、細胞はグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）について陽性に染色された（図４Ａ）。
【０１８８】
免疫細胞化学染色データの定量化により、Ｓ１００β、ＧＦＡＰおよびＧＳについての陽性細胞の割合が２０％〜３０％の範囲にあることが明らかにされた。
【０１８９】
星状細胞マーカーの発現をさらに確認するために、リアルタイムＰＣＲ分析を行った。図４Ｂに明らかにされるように、ＧＦＡＰ転写物が１０倍〜２０倍アップレギュレーションされた。類似した値がＳ１００β転写物およびＧＳ転写物において示された。
【０１９０】
星状細胞は様々な神経栄養因子（ＮＴＦ）のその分泌について知られているので、ＮＴＦ（例えば、ＧＤＮＦ、ＮＧＦおよびＢＤＮＦなど）のｍＲＮＡレベルを分析した。リアルタイムＰＣＲ分析により、星状細胞に分化したｈＢＭＳｃは、血清非含有培地で成長させたＭＳＣではこれらの転写物が低いか、または存在しないことと比較されるように、多量のＮＴＦ転写物を発現することが明らかにされた（図５）。抗ＧＤＮＦによる免疫染色により、培養された細胞の３０％がこの抗体により陽性に染色されたが明らかにされた（図６Ａ〜図６Ｂ）。
【０１９１】
特異的な抗体によるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、ＮＴＦの産生および分泌を定量した。ＧＤＮＦ産生の測定を細胞抽出物（図７）および成長培地（図８Ａ）において調べた。ＧＤＮＦ産生の基礎的レベルが、培養されたＭＳＣおよび神経芽細胞腫細胞株（ラサゲレインにより処理されたＳＨ−ＳＹ５Ｙ）において検出されたが、培養培地では、ＧＤＮＦが、分化したＭＳＣにおいて検出されただけであった。
【０１９２】
そのうえ、ＧＤＮＦの顕著な高まった産生および分泌が、ＩＬ−１βおよびカベルゴリン（ＧＤＮＦをアップレギュレーションすることが知られている因子）を加えた後で検出された。この現象は、分化した細胞が星状細胞として応答するという考えを支持する。分泌されたＧＤＮＦおよびＮＧＦのレベルをいくつかのドナーで比較した。分泌レベルが、ＧＤＮＦ（図８Ｂ）については１０６個の細胞あたり６９ｐｇ〜１４０ｐｇの間で変化し、ＮＧＦ（図８Ｃ）については１０６個の細胞あたり３５６ｐｇ〜８７５ｐｇの間で変化することを認めることができる。
【０１９３】
星状細胞は、高親和性のグルタミン酸輸送体を介するグルタミン酸のクリアランスによって、また、グルタミン酸をグルタミンシンセターゼにより代謝することによって、低い細胞外グルタミン酸濃度の維持において重要な役割を果たす。従って、分化した細胞を、グルタミン酸輸送体およびグルタミンシンセターゼの発現についてＲＴ−ＰＣＲ分析を使用して分析した。ＧＬＴ−１／ＥＡＡＴ−２転写物の高い発現が、星状細胞に分化したｈＢＭＳｃにおいて見出された（図９）。グルタミン酸輸送体の活性が、ＭＳＣからではなく、分化した細胞の培養培地からの３Ｈ−グルタミン酸取り込みによって明らかであった（ｐ＜０．００５）（図１０）。
【０１９４】
より詳しいＲＴ−ＰＣＲ分析を、どの間葉性細胞マーカーが、また、どの星状細胞マーカーが本発明の細胞によって発現されたかを明らかにするために行った。これら２つの細胞タイプにおける遺伝子の発現もまた、星状細胞における遺伝子の発現（文献から得られる情報）と比較した。結果が本明細書中下記の表３にまとめられる。
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【０１９５】
従って、本発明の分化した細胞は、間葉性幹細胞および星状細胞の両方に対して異なる特定の表現型を示すことを認めることができる。例えば、本発明の細胞は、本発明の細胞を星状細胞から区別するＣＤ９０、チロシンヒドロキシラーゼおよびＨ−ＮＦを発現する。加えて、本発明の細胞は高レベルの神経栄養因子および星状細胞マーカーを発現し、このことにより、本発明の細胞は間葉性幹細胞とは区別される。
【０１９６】
（実施例２）
星状細胞様の分化したｈＢＭＳｃの線条体内移植による障害ラットの運動機能の改善
【０１９７】
本発明の細胞の可能な治療可能性を探るために、本発明の方法に従って分化させたＨＢＭＳＣをパーキンソン病の確立されたラットモデルにおいて移植した。
【０１９８】
材料および方法
動物：体重が２２０ｇ〜２８０ｇであるオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｈａｒｌａｎ、イスラエル）を６−ＯＨＤＡ障害実験のために使用した。すべての動物を標準的な条件で飼育した：一定の温度（２２±１℃）、湿度（相対、３０％）、１２時間の照明：１２時間の消灯のサイクル、ならびに、餌および水の自由な摂取。手術手順を、Ｒａｂｉｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＣｅｎｔｅｒおよびＴｅｌ  Ａｖｉｖ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｔｅｌ  Ａｖｉｖ、イスラエル）の動物管理委員会の管理のもとで行った。
【０１９９】
６−ＯＨＤＡ障害：ラットをクロラール水和物（３５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、定位固定フレーム（Ｓｔｏｅｌｉｎｇ、米国）に固定した。動物に、片側において、６−ＯＨＤＡ臭化水素酸塩（１２μｇ／６μｌ、アスコルビン酸塩−生理的食塩水に溶解したもの）を、２６ゲージのニードルを付けたＨａｍｉｌｔｏｎ  １０μｌシリンジを使用して、左側の線条体に２カ所で注射した（２つの深さでそれぞれの部位について６μｌ）。注射の座標は下記の通りであった：（１）ＡＰ：ブレグマから＋０．５ｍｍ、Ｌ：側方から中央に−２．５ｍｍ、Ｖ：腹側から硬膜表面に−６．５ｍｍ、および（２）ＡＰ：−０．５ｍｍ、Ｌ：−３．７ｍｍ、Ｖ：−６．０ｍｍ（これらは定位固定アトラス（Ｐａｘｉｎｏｓ＆Ｗａｔｓｏｎ、１９８６）に基づいた）。注射が完了したとき、減圧を防止するために、カニューレを、１ｍｍ／分で引き抜く前に、さらに３分間、その位置に置いたままにした。
【０２００】
回旋行動の測定：障害ラットを６−ＯＨＤＡの脳内注射の後の１４日で回旋行動について試験した。運動の非対称性を、ＤＡアゴニストのアポモルヒネ（Ｓｉｇｍａ、０．１５ｍｇ／ｋｇ、規定生理的食塩水に溶解）を皮下注射した後１時間にわたって、自動化された回転測定装置でモニターした。線条体のＤＡ受容体が６−ＯＨＤＡ障害の結果として過敏性になるので、アポモルヒネは最初の障害側に対して対側性の回旋行動を誘導する。１分あたり５回の回転速度のラットを、確立されたＰＤモデルであると見なし、移植実験のために使用した。この試験は、線条体におけるドーパミン欠乏の信頼できる指標として広く使用される。
【０２０１】
移植：６−ＯＨＤＡ障害後６週間で、ＰＤモデルラットをコントロール群および実験群の２つの群に分けた。コントロール群におけるラット（ｎ＝７）には、０．９％生理的食塩水が注射された。実験群におけるラット（ｎ＝６）には、ＧＤＮＦ産生細胞が移植された。ｈＢＭＳＣ星状細胞様細胞を移植前に集め、生理的食塩水において５μｌあたり５ｘ１０５個の生細胞で再懸濁した。細胞を、１０μｌのＨａｍｉｌｔｏｎシリンジの２６ゲージニードルによって左側の線条体に一方の部位において２つの深さで定位固定により注入した（それぞれについて２．５μｌ）。注入のために使用された座標は下記の通りであった：（１）ＡＰ：＋１．０ｍｍ、Ｌ：＋３．０ｍｍ、Ｖ：−５．０ｍｍ；および（２）ＡＰ：＋１．０ｍｍ、Ｌ：＋３．０ｍｍ、Ｖ：−４．１ｍｍ（トゥースバー（ｔｏｏｔｈ−ｂａｒ）が両耳間線のレベルで設定された）。手術後、動物は、上記で記載されたように、２週間毎に回転試験を受けた。ヒトＭＳＣが移植された場合、動物はＳａｎｄｉｍｕｎｅ（１０ｍｇ／ｋｇ／日；Ｎｏｖａｒｔｉｓ）の毎日の皮下注射によって免疫抑制された。
【０２０２】
ロータロッド：ロータロッド課題に対する成績を移植後３ヶ月で試験した。課題は、ラットがロッドに載せられ、加速するロッドから落ちないように（１６ＲＰＭまで）挑戦する３回の連続する実験からなった。それぞれの実験が、最大で２分まで続けられた。実験間の間隔は３０秒であった。結果が２回の毎週の試験から得られた。
【０２０３】
ヒマワリ試験：この試験の目的は、ヒマワリの種子を最大で５分の期間中に開けることを動物に挑戦させることであった。この試験を行うために、動物には、過度な餌が与えられず、４５ｍｇ／ｇｋ／日のみが、モニターリングを開始する前の３日間与えられた。動物を３日間訓練し、４日目および５日目に測定を行った。動物を空のゲージに入れ、種子を５分間与えた。開けて、食べた種子の数を測定した。［Ｇｏｎｚａｌｅｚ  Ｃ．、Ｋｏｌｂ  Ｂ．、行動および脳形態学に対する卒中の異なるモデルの比較、Ｅ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ、１８（１９５０−１９６２）、２００３］。
【０２０４】
免疫組織化学：移植後１６週で、コントロール群および治療群の両方を免疫染色に供した。ラットをクロラール水和物（３５０ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．）で深く麻酔し、６５ｍｌの冷生理的食塩水により、その後、０．１ｍｏｌ／ｌのＰＢＳ（ｐＨ７．４）における冷４％パラホルムアルデヒドの２５０ｍｌにより心臓を介して灌流した。脳を取り出し、４％ＰＦＡ／ＰＢＳに４８時間入れ、その後、４８時間、２０％スクロース／ＰＢＳにおいて凍結保護し、その後、ドライアイス上のイソペンタンで凍結した。脳の連続する冠状切片をミクロトームクライオスタットで２０μｍの厚さで切断した。切片をＰＢＳで３回洗浄し、続いて、ＰＢＳにおける５％正常ウマ血清（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ）において１時間ブロッキング処理した。続いて、切片を、ヒトの核に対する一次抗体（１：３０、マウスモノクローナル；Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、ＣＡ、米国）、ＧＤＮＦに対する一次抗体（１：２００、ウサギポリクローナル、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、および、ＧＦＡＰに対する一次抗体（１：１００、ウサギ、ＤＡＫＯ）を含有する同じ溶液において２４時間インキュベーションした。その後、切片をＰＢＳで３回洗浄し、下記の二次抗体に室温で１時間さらした：ローダミンにカップリングされたヤギ抗マウスＩｇＧ（１：５００；Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ、ＰＡ、米国）、および、Ａｌｅｘａ−４８８にコンジュゲート化されたヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：５００；Ｍｏｌｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）。核を核色素のＤＡＰＩ（１：２００）（Ｓｉｇｍａ）により５分間染色した。最後に、切片を０．１Ｍ  ＰＢＳで洗浄し、９５％グリセロールとともにカバーグラスを載せた。コントロールの免疫染色実験を、（ｉ）一次抗体、（ｉｉ）二次抗体、および、（ｉｉｉ）一次抗体および二次抗体の両方のいずれかを省くことによって行った。
【０２０５】
結果
６−ヒドロキシドーパミンを、線条体におけるドーパミン作動性ニューロンの中程度の障害を誘導するためにラットの脳に線条体内注入した。障害の程度を、同側性の回転をもたらすアポモルヒネの注入によって３週間後に測定した。星状細胞様細胞（５Ｘ１０５個）を、その回旋成績に基づいて事前に選択されたラットの同側の線条体に移植した。薬理学的に誘導された回旋行動を、植え付け後６０日、７５日および１０５日で、移植を受けたラット、ならびに、生理的食塩水が注入されたラットにおいて測定した。実験期間中、両方の群には、シクロスポリンが、移植体の拒絶を防止するために毎日注射された。図１１に例示されるように、アポモルヒネにより誘導される回転が、移植を受けたラット（ｎ＝８）において、７５日では、ベースライン状態での１時間あたり１６０回の回転の平均値から、１時間あたり６０回の回転に、また、移植後１０５日では、１時間あたり５０回の回転に低下した（６８％および７５％の低下、ｐ＜０．０５）。コントロール群（ｎ＝８）は、ベースライン状態で１時間あたり１５５回、回転し、１０５日後では１４０回、回転した（有意な減少ではなかった）。
【０２０６】
移植後９５日で、非薬理学的ロータロッド試験を、運動欠如の直接的な測定を得るために行った。星状細胞様細胞が移植された動物は、コントロールよりも長い期間、加速するロッドの上を歩くことができた（図１２）。
【０２０７】
ヒマワリ摂食試験もまた、動物に適用された。移植後１００日で、動物を、ヒマワリの種子を制限時間において開けるその能力について評価した（方法を参照のこと）。移植を受けた動物は、同じ時間で４４個を開けたコントロールと比較して、５分間で４４個の種子を開けた（ｐ＜０．０５）（図１３）。
【０２０８】
移植後１１０日で、動物を屠殺し、組織学研究を、移植された細胞を特定および特徴づけるために行った。抗ヒト核抗原抗体および抗ＧＤＮＦ抗体を、移植されている分化した細胞を特定するために使用した（図１４Ａ〜図１４Ｅ）。免疫染色および共焦点顕微鏡観察による研究により、ヒト抗原について陽性であった細胞の２５％までがＧＦＡＰについてもまた陽性であったことが明らかにされた。これらの結果は、星状細胞様細胞が線条体におけるドーパミン欠乏を回復することができ、また、おそらくは、他の神経変性疾患において有益であることを示している。
【０２０９】
（実施例３）
星状細胞様の分化したｈＢＭＳｃの筋肉内移植によるＡＬＳのトランスジェニックマウスモデルの運動機能の改善
【０２１０】
材料および方法
動物モデル：ＴｇＮ（ＳＯＤ１−Ｇ９３Ａ）１Ｇｕｒトランスジェニックマウス（Ｇｕｒｎｅｙ、１９９４）のコロニーをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（米国）から得た。マウスをＣＳＪＬＦ１において交配し、１月齢で、子孫を、下記のＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲ分析によって遺伝子型決定した。
2008546385.tif 000006
アニーリング温度は５３℃であり、ＰＣＲ生成物は、２３６ｂｐ（ｈＳＯＤ１）、３２４ｂｐ（ＩＬ２）であった。この研究で使用されることになったマウスは３月齢までは健康であり、４月齢〜５月齢の間で完全に麻痺した。動物実験はＴｅｌ−Ａｖｉｖ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙによって承認および管理された。
【０２１１】
細胞移植および行動：４０日目に、０．５ｘ１０６個の、ヒト星状細胞に分化した細胞（これは実施例１に記載されるように調製された）を２本の足において腓腹筋内に移植した。運動成績を、加速された回転によるロータロッド装置によって２週間毎に評価した。
【０２１２】
組織病理学的評価：マウスを１１０日目に屠殺し、足を４℃で４％パラホルムアルデヒド／０．１Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．４）に入れた。パラフィンブロックを調製し、抗ヒト抗原抗体により免疫染色した。
【０２１３】
統計学的分析：比較を、３つ以上の群が関わったとき、事後ダネット検定によるＡＮＯＶＡによって行った。データが正規分布でなかったならば、ノンパラメトリック検定（マン・ホィットニーのＵ検定）を結果の比較のために使用した。データを平均±ｓ．ｅ．ｍ．として表した。
【０２１４】
結果
星状細胞に分化した細胞（０．５ｘ１０６個）を、４０日目に、ｈｍＳＯＤマウス（ｎ＝８）に筋肉内移植した（足）。並行群には生理的食塩水を注射した。加えて、野生型マウス（ｎ＝８）およびｍｈＳＯＤ  Ｔｇマウス（ｎ＝８）を陽性コントロールおよび陰性コントロールとして使用した。
【０２１５】
行動評価を、４０日目から死亡まで（１２０日目〜１４０日目まで）、２週間毎にロータロッドで行った（Ｍ＆Ｍを参照のこと）。図１５に示されるように、運動成績における低下（すなわち、ＡＬＳの症状）が細胞移植マウスでは著しく遅れた。
【０２１６】
動物の体重を測定し、移植群と、コントロールとの間で比較し、統計学的に分析した。コントロール群は、移植群よりも著しく大きい（ｐ＜０．０５）体重減少を示した（図１６）。
【０２１７】
組織学的研究を抗ヒト核抗原抗体により１１０日目に行い、植え付けられた細胞が生存していたことが示された（図１７Ａ〜図１７Ｃ）。
【０２１８】
分かりやすくするため別個の実施態様で説明されている本発明のいくつもの特徴は、組み合わせて単一の実施態様にして提供することもできることは分かるであろう。逆に簡略化するため単一の実施態様で説明されている本発明の各種特徴は、別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２１９】
本発明を、その具体的実施態様とともに説明してきたが、多くの代替、変形および変更が当業技術者には明らかであることは明白である。したがって、本発明は、本願の特許請求の範囲の精神と広い範囲内に入っているこのような代替、変形および変更をすべて含むものであることを意図する。本明細書に記載のすべての刊行物、特許および特許出願は、あたかも、個々の刊行物、特許または特許出願各々が、本願に具体的にかつ個々に参照して示されているように、本願に援用するものである。さらに、本願における任意の文献の引用もしくは確認は、このような文献が本発明に対する従来技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０２２０】
【図１】５日目の分化したヒトＭＳＣおよび分化していないヒトＭＳＣの光学顕微鏡観察画像である。
【図２】５日目の分化したヒトＭＳＣ（図２Ｂ〜図２Ｄ）および分化していないヒトＭＳＣ（図２Ａ）の走査電子顕微鏡観察画像である。
【図３】分化したヒトＭＳＣにおける星状細胞マーカーの発現を例示する顕微鏡写真である。
【図４】分化したヒトＭＳＣにおける星状細胞マーカーのグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）の発現を例示する顕微鏡写真および棒グラフである。
【図５】分化していないヒトＭＳＣと比較して、分化したヒトＭＳＣにおける神経栄養因子転写物の量を例示する棒グラフである。
【図６】分化したヒトＭＳＣにおけるＧＤＮＦの発現を例示する顕微鏡写真および棒グラフである。
【図７】分化したヒトＭＳＣにおいて細胞に存在するＧＤＮＦの量を例示する棒グラフである。
【図８Ａ−Ｃ】分化したヒトＭＳＣによって分泌されたＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦの量を例示する棒グラフである。
【図８Ｄ】分化したヒトＭＳＣによって分泌されたＧＤＮＦ、ＢＤＮＦおよびＮＧＦの量を例示する棒グラフである。
【図９】ＭＳＣの分化の後におけるグルタミン酸輸送体（ＧＬＡＳＴおよびＧＬＴ−１）の発現を例示する棒グラフである。
【図１０】ｈＢＭＳＣの星状細胞分化の前後におけるグルタミン酸輸送体の機能的活性を例示する棒グラフである。
【図１１】星状細胞に分化したｈＢＭＳｃが移植された６−ＯＨＤＡ障害ラットの行動における改善を例示する線グラフである。
【図１２】星状細胞に分化したｈＢＭＳｃが移植された６−ＯＨＤＡ障害ラットのロータロッドアッセイにおける改善を例示する棒グラフである。
【図１３】星状細胞に分化したｈＢＭＳｃが移植された６−ＯＨＤＡ障害ラットの微妙な運動機能における改善を例示する線グラフである。
【図１４】星状細胞に分化したｈＢＭＳｃが移植された６−ＯＨＤＡ障害ラットの細胞に対する共焦点顕微鏡観察画像である。
【図１５】ＡＬＳマウスの腓腹筋に移植された星状細胞分化ＢＭＳＣが疾患の発症を遅らせ、ロータロッドにおけるその運動成績を改善することを例示する線グラフである（ｎ＝８、ｐ＜０．０５）。
【図１６】ＡＬＳマウスの腓腹筋に移植された星状細胞分化ＢＭＳＣが体重減少を遅らせることを例示する線グラフである。
【図１７】星状細胞に分化したｈＢＭＳｃが移植されたＡＬＳマウスの細胞に対する共焦点顕微鏡観察画像であり、ＡＬＳマウスの腓腹筋に移植された星状細胞分化ＢＭＳＣが移植後１１０日を生存することを例示する。
【配列表フリーテキスト】
【０２２１】
配列番号１〜５６は一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドの配列である。
【図５】
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【図７】
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【図８Ａ−Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図６】
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【図１４】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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