(57)【要約】本発明は、ヒト及び動物のＩ型及びＩＩ型糖尿病の治療のための長時間作用型注射用インスリン製剤に関する。本発明の目的は、安定で、糖尿病の慢性的治療に適合する良好な局所耐容性及び低い毒性を示し、例えば皮下経路による単回投与後、少なくとも２４時間に亘って有意な血糖降下作用を維持する、コロイド状懸濁液形態の長時間作用型注射用インスリン製剤を提供することにある。前記目的は、インスリンが結合した少なくとも１種のポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）からなるナノ粒子の安定な水性コロイド状製剤により達成され、該製剤のｐＨは、５．８〜７．０の間にあり、オスモル濃度Ｏ（ｍＯｓｍｏｌで表記）は、２７０≦Ｏ≦８００であり、粘度ｖ（ｍＰａ．ｓで表記）が低く、すなわちｖ≦４０であり、またポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のナノ粒子は、平均水力学的径Ｄｈ１５≦Ｄｈ≦４０を有する。本発明はさらに、２９Ｇ、３０Ｇ、又は３１Ｇの注射針で注射し得る長時間作用型インスリン製剤を基礎とする抗糖尿病医薬品に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリンが結合した少なくとも１種のポリ（Ｌ−ロイシン−ｂ−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム）（以下、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）と称する）からなるナノ粒子の安定な水性コロイド状懸濁液を含有する長時間作用型注射用インスリン製剤であって、
Ｉ  該製剤のｐＨが、
５．８≦ｐＨ≦７．０
好ましくは６．０≦ｐＨ≦７．０
ＩＩ  該製剤のオスモル濃度Ｏ（ｍＯｓｍｏｌで表記）が、
２７０≦Ｏ≦８００
好ましくは    ２７０≦Ｏ≦６００
特に好ましくは２７０≦Ｏ≦４００
ＩＩＩ  Ｍｖ法で測定した該製剤の粘度ｖ（ｍＰａ．ｓで表記）が低く、すなわち
ｖ≦４０
好ましくは    ｖ≦２５
特に好ましくはｖ≦２０
であることを特徴とする製剤。
【請求項２】
前記製剤のオスモル濃度Ｏが、少なくとも１種の一価又は多価塩を用いて調整されることを特徴とする、請求項１に記載の製剤。
【請求項３】
ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の濃度が、６０ｍｇ／ｍｌ未満、好ましくは１０〜５５ｍｇ／ｍｌ、特に好ましくは３０〜５５ｍｇ／ｍｌであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の製剤。
【請求項４】
保持されたポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の粒子の平均水力学的径Ｄｈが、Ｍｄ法により測定し、かつナノメートル（ｎｍ）で表記したとき、
１０≦Ｄｈ≦１５０
好ましくは２０≦Ｄｈ≦１００
であることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項５】
インスリン／ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の質量比が、％で表記したとき、
３≦インスリン／ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）
好ましくは５≦インスリン／ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）≦１１
であることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項６】
前記ナノ粒子に対するインスリンの最大結合率Ｔａが、Ｍａ法により測定し、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の質量に対する結合したインスリンの質量％で表記したとき、
１０≦Ｔａ
好ましくは    １０≦Ｔａ≦４０
特に好ましくは１２≦Ｔａ≦２５
であることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項７】
前記インスリンが非改変ヒトインスリンであることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項８】
好ましくはフェノール類、クレゾール類（例えばメタクレゾール）、メチル、プロピル、又はブチルパラヒドロキシベンゾエート、及びそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の保存剤を含有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の製剤。
【請求項９】
インスリンが結合したポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）からなるナノ粒子を含み、かつ請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤から得られることを特徴とする粉末状固体。
【請求項１０】
少なくとも１種のポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）と水性溶媒中のインスリンとを、好ましくは撹拌することにより混合し、必要であれば賦形剤を添加してｐＨ値を５．８〜７．０に調整し、場合により得られた懸濁液を濾過することを本質的に含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤の調製方法。
【請求項１１】
粉末状のポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）を、インスリンを含有する水相と共に混合することを本質的に含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤の調製方法。
【請求項１２】
請求項８に記載の粉末状固体を、好ましくは撹拌しながら水性溶媒中に懸濁させ、必要であれば賦形剤を添加してｐＨ値を５．８〜７．０に調整し、場合により得られた懸濁液を濾過することを本質的に含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤の調製方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の長時間作用型注射用インスリン製剤、及び／又は請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法により得られた製剤、及び／又は請求項９に記載の粉末状固体を含むことを特徴とする薬剤。
【請求項１４】
糖尿病の治療に用いられることを特徴とする、請求項１３に記載の薬剤。
【請求項１５】
糖尿病患者に、皮下注射後少なくとも２４時間、基礎インスリン値を与えることが可能であることを特徴とする、請求項１３又は１４に記載の薬剤。
【請求項１６】
一方では請求項９に記載の粉末状固体と、他方では別個にて、投与前にそれによって請求項１〜８のいずれか１項に記載の製剤、及び／又は請求項１０〜１２のいずれか１項に記載の方法により得られる製剤が再構成される水性溶媒とを含む製剤形態からなることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒト及び動物のＩ型及びＩＩ型糖尿病の治療のための、インスリンを基礎とする薬剤、特に注射用インスリン製剤の分野に関する。より正確には、本発明は、日々の非経口投与のために用いられ、糖尿病の患者又は動物の血清インスリン濃度を、昼夜を通じて、健常者における基礎濃度に近い値に保持することが可能な、コロイド状懸濁液からなる注射可能なインスリン製剤に関する。
【０００２】
本発明はさらに、該コロイド状インスリン懸濁液を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病患者は、インスリンを１日に数回自己注射しなければならないという、非常に制限的で不完全な治療を受けることを強制されている。食事中又は食後の血糖値上昇を適正化するために吸収の速いインスリンを注射することとは別に、非常に重篤な副作用を防ぐために、日中及び夜間とも血清インスリンを基礎値に保持する必要がある。夜間は、患者自身が自己処置により所望のインスリン値に回復させる機会がないため、後者（夜間）における基礎値の適正化は特に困難である。
【０００４】
注射用インスリン製剤は、安定でなくてはならない。すなわち、その製剤に含まれるインスリンが保管中に分解してはならない。例えば、製剤は５℃で２年間保管した後も十分に有効でなくてはならない。注射用インスリン製剤は、インスリンに通常使用される注射システムに適した流体学的特性を有している必要がある。したがって、非常に細い注射針を通じて注射することができる、安定な、長時間作用型のインスリン製剤が緊急に必要とされている。このような製剤の開発が困難であることはかなり以前から知られており、多くの研究の課題となっている。
【０００５】
本開示において、「インスリン」とは、ヒトインスリン、動物インスリン、又はインスリン類似物を意味する。
【０００６】
本開示において、「長時間作用型インスリン製剤」とは、一方では投与後に患者に対して有害ないかなる低血糖のピークも避け、また他方では少なくも２４時間に亘り血糖降下作用を維持する製剤を意味する。
【０００７】
本開示に関しては、「長時間作用型インスリン製剤」とは、一方では投与後に患者に対して有害ないかなる低血糖のピークも避け、また他方では少なくも２４時間に亘り血糖降下作用を維持する製剤を意味する。
【０００８】
長時間作用型インスリン製剤に関するこれまでの技術的な提案のいくつかを下記に引用する。
【０００９】
例えば、長時間作用型ヒトインスリンであるＮＰＨが知られている。これは、部分的に微結晶化したヒトインスリン／亜鉛／プロタミン複合体の懸濁液（例えば米国特許第ＵＳ−Ｂ−５，８３４，４２２号に記載されているような）からなり、ｉｎ  ｖｉｖｏでタンパク質の放出を緩やかにすることが可能である。これらの懸濁液において、インスリンは、プロタミン及び亜鉛と複合体を形成して部分的に結晶化した沈殿物となっている。皮下注射後、インスリンの放出速度は、該沈殿物の生体内での溶解動態と、インスリンの分解動態とによりコントロールされる。この種のインスリンの作用時間は、速効型のインスリンの作用時間と比較すると長いが、１６時間を超えることはなく、昼夜とも真にカバーする訳ではない。さらに、この長時間作用型インスリンＮＰＨを投与した後には低血糖のピークが観察される。したがって、この製剤は、上記で定義したような真の長時間作用型のインスリンではない。
【００１０】
最近、米国特許第ＵＳ−Ｂ−５，６５６，７２２号において、インスリンに類似した新規なタンパク質構造が開示された。これはＧＬＡＲＧＩＮＥ（登録商標）と称され、製剤に取り入れられている。
【００１１】
また、タンパク質の持続放出形態を獲得する全く異なる方法が、米国特許第ＵＳ−Ｂ−５，９０４，９３６号（欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０７３４７２０号）に開示されている。
【００１２】
ここで開示されている手法は、インスリンを化学的に改変するのでも、インスリンをプロタミン及び亜鉛と複合させるのでもなく、両親和性のポリアミノ酸、例えばポリ（Ｌ−ロイシン−ｂ−グルタミン酸ナトリウム）（以下、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）と称する）が水中で自己集合することによって形成される生体適合性のあるナノ粒子上に、ヒトインスリンを吸着させることからなる。この自己集合により、ナノ粒子のコロイド状懸濁液が生成される。このようなコロイド状懸濁液にヒトインスリンを接触させると、ヒトインスリンはナノ粒子上に自発的に吸着し、非共有結合性のインスリン／粒子複合体が形成される。皮下注射の後、このヒトインスリンは複合体から徐々に分離し、それにより血漿中インスリン濃度を長時間に亘って基礎値に近い値に維持することが可能となる。この方法の利点は、タンパク質変性を生ずる可能性のある界面活性剤に頼らず、非改変ヒトインスリン及び生態適合性のある重合体を、タンパク質変性を起こさない方法で使用していることである。
【００１３】
ヒトインスリンは、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のナノ粒子と、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）１０ｍｇに対してヒトインスリン最大量０．６５ｍｇ、すなわち６．５重量％の割合で自発的に結合することが、米国特許第ＵＳ−Ｂ−５，９０４，９３６号の実施例１４に開示されている。米国特許第ＵＳ−Ｂ−５，９０４，９３６号の実施例１４における長時間作用型注射用インスリン製剤は、以下の点で改善し得る。
【００１４】
・該製剤は、特に２９Ｇ、３０Ｇ、又は３１Ｇといった細い針を装着した注射器を使用できれば、注入の容易性が高まり有効である。数十年に亘って連日注射する必要性があるため、患者が結果として受ける不快感は大変なものである。
・該製剤は、インスリンの分解をさらに遅延させるように安定性がより高ければ有効である。
・該製剤を豚に皮下注射すると、顕著な浮腫及び紅斑を生じることがあり、これは、この製剤に対する局所耐容性に改善の余地があることを示している。したがって、この製剤は、長期間に亘って毎日投与するには適合し難い。
・該製剤は、濾過による滅菌が困難である。
【００１５】
国際公開第ＷＯ−Ａ−０１／３７８０９号パンフレットの実施例９には、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）重合体からなるナノ粒子の懸濁液を含む、ｐＨ７．４の長時間作用型インスリン注射剤が記載されている。この懸濁液は、（調製品１ｍＬあたり）：インスリン８０ＩＵ及び重合体５６ｍｇ（すなわちインスリン／ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）重量比は５％である）を含む。この懸濁液をビーグル犬に２ＩＵ／ｋｇの割合で投与すると、約２４時間に亘って放出が持続する。しかしながら、この製剤の安定性は、以下に示す本特許出願の実施例５に示すように、改善の余地がある。
【００１６】
この実験に基づき、本件出願人は長時間作用型インスリン注射剤の仕様を再定義する。
１．製剤は、小径の注射針（例えば２９Ｇ、３０Ｇ、又は３１Ｇ）を用いた注射をより容易にして患者の心地よさを改善し、それにより患者の治療に対するコンプライアンスを改善することができれば有効である。
２．インスリン製剤は、製剤の性質が改変されず、ヒトインスリンが分解しなくなるように、特に４℃及び室温における安定性に改善の余地がある。
３．製剤は、数十年に亘る連日注射に適合するように、優れた局所耐容性を有するようになれば、大きく改善される。
４．このような製剤により提供されるインスリンの生体利用能は、可能な限り高いことが好ましい。
５．例えばその血糖降下作用により測定された製剤の有効性は、注射後少なくとも２４時間に亘って可能な限り高いことが好ましい。
６．製剤は、患者が注射器を容易に満たすことができる流動性を有することが好ましい。
７．濾過によって滅菌できることは、製剤にとって決定的な利点となる。
【特許文献１】米国特許第ＵＳ−Ｂ−５，８３４，４２２号
【特許文献２】米国特許第ＵＳ−Ｂ−５，６５６，７２２号
【特許文献３】米国特許第ＵＳ−Ｂ−５，９０４，９３６号（欧州特許第ＥＰ−Ｂ−０７３４７２０号）
【特許文献４】国際公開第ＷＯ−Ａ−０１／３７８０９号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
このような状況を前提として、本発明の本質的な目的の１つは、上記に説明した仕様を完全に満たすことにある。
【００１８】
本発明の本質的な別の目的は、例えば皮下注射などの経路による単回投与後、血糖降下の実質的な効力が少なくとも２４時間に亘って持続する、コロイド状懸濁液の形態の長時間作用型インスリン製剤を提供することにある。
【００１９】
本質的な別の目的は、安定で、インスリンの構造及び生理活性を改変しない、コロイド状懸濁液の形態の長時間作用型インスリン製剤を提供することにある。
【００２０】
本発明の本質的な別の目的は、小径（例えばゲージ２９Ｇ、３０Ｇ、又は３１Ｇ等）の注射針を通して容易に注入できる長時間作用型インスリン製剤を提供することにある。
【００２１】
本発明の本質的な別の目的は、小径（例えばゲージ２９Ｇ、３０Ｇ、又は３１Ｇ等）の注射針を通して、患者が容易に注射器を満たすことができる、長時間作用型インスリン製剤を提供することにある。
【００２２】
本発明の本質的な別の目的は、治療効果の減弱、又は特に血糖降下作用の持続時間の減弱なしで、少ない注射量かつ高濃度（典型的には１００ＩＵ／ｍＬ）のヒトインスリンを含有する、注射可能なコロイド状懸濁液の形態の長時間作用型インスリン製剤を提供することにある。
【００２３】
本発明の本質的な別の目的は、局所耐容性が良好であり毒性が低いことにより糖尿病患者の慢性的治療に適した、コロイド状懸濁液の形態の長時間作用型インスリン製剤を提供することにある。
【００２４】
本発明の本質的な別の目的は、インスリンが非改変のヒトインスリンからなる、コロイド状懸濁液の形態の長時間作用型インスリン製剤を提供することにある。
【００２５】
本発明の本質的な別の目的は、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）からなるナノ粒子を含有し、０．２μｍのフィルターで濾過滅菌可能な、コロイド状懸濁液の形態の長時間作用型インスリン製剤を提供することにある。
【００２６】
本発明の本質的な別の目的は、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のナノ粒子を含有し、その粒子上にタンパク質が可逆的かつ非共有結合的に、変性することなく吸着された、コロイド状懸濁液の形態の長時間作用型インスリン製剤を提供することにある。
【００２７】
本発明の本質的な別の目的は、上述の仕様を満たす製剤を生成し、また皮下注射に適した簡易な製剤形態を構成する、液体又は乾燥形態のコロイド状インスリン懸濁液を提供することにある。
【００２８】
本発明の本質的な別の目的は、これら長時間作用型コロイド状インスリン懸濁液を調製する方法を提案することにある。該方法は、実施が簡単で、タンパク質が変性せず、加えて製剤の性質の再現性が確実に保証される。
【課題を解決するための手段】
【００２９】
とりわけ上記の目的は、インスリンが結合した少なくとも１種のポリ（Ｌ−ロイシン−ｂ−ナトリウムＬ−グルタミン酸）（以下、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）と称する）からなるナノ粒子の安定な水性コロイド状懸濁液を含有する長時間作用型注射用インスリン製剤に関する本発明により達成される。該製剤は、
Ｉ  該製剤のｐＨが
５．８≦ｐＨ≦７．０
好ましくは６．０≦ｐＨ≦７．０
ＩＩ  該製剤のオスモル濃度Ｏ（ｍＯｓｍｏｌで表記）が、
２５０≦Ｏ≦８００
好ましくは    ２５０≦Ｏ≦６００
特に好ましくは２７０≦Ｏ≦４００
ＩＩＩ  Ｍｖ法で測定した該製剤の粘度ｖ（ｍＰａ．ｓで表記）が低く、すなわち
ｖ≦４０
好ましくは    ｖ≦２５
特に好ましくはｖ≦２０
であることを特徴とする。
【００３０】
長時間作用型注射用インスリン製剤を構成することが可能なこの新規なコロイド状懸濁液の発明的基礎は、特に、以下のウインドウ内にて選択されたパラメータＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの組み合わせにある。
【００３１】
・本発明の長時間作用型注射用インスリン製剤を構成する懸濁液の良好な安定性に寄与するｐＨのウインドウ
・製剤が良好な局所耐容性及び濾過滅菌に対する良好な適合性を有することを特に保障する浸透圧のウインドウ
・小径（例えばゲージ２９Ｇ、３０Ｇ、又は３１Ｇ）の注射針を通して製剤を吸引して注射器を容易に満たすことができるような流体学的特性を製剤に付与することに関与する粘度のウインドウ
【００３２】
この新規な製剤の別の利点の１つは、コストが低いことである。
【００３３】
最後に、そして何よりも、この選択されたパラメータＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの明白でない組み合わせにより、小径（例えばゲージ２９Ｇ、３０Ｇ、又は３１Ｇ）の注射針を通して容易に注射し得るような流体学的特性が得られる。
【００３４】
さらに、本発明による製剤は、以下の特徴のうちの少なくとも１つ（理想的には全て）を有することが好ましい。
【００３５】
ａ．該製剤のオスモル濃度Ｏが、少なくとも１種の一価又は多価（例えば二価若しくは三価）の塩によって調整される。
ｂ．ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の濃度が、６０ｍｇ／ｍＬ未満であり、好ましくは１０〜５５ｍｇ／ｍＬ、特に好ましくは３０〜５５ｍｇ／ｍＬである。
ｃ．保持されたポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の粒子の平均水力学的径Ｄｈが、Ｍｄ法により計測し、かつナノメートル（ｎｍ）で表記したとき、
１０≦Ｄｈ≦１５０
好ましくは２０≦Ｄｈ≦１００
である。
ｄ．インスリン／ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の質量比が、％で表記したとき、
３≦インスリン／ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）
好ましくは５≦インスリン／ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）≦１１
である。
ｅ．ナノ粒子に対するインスリンの最大結合Ｔａが、Ｍａ法により計測し、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の質量に対する結合したインスリンの重量％で表記したとき、
１０≦Ｔａ
好ましくは    １０≦Ｔａ≦４０
特に好ましくは１２≦Ｔａ≦２５
である。
ｆ．インスリンは、非改変ヒトインスリンである。
【００３６】
最後に、本発明による長時間作用型注射用インスリン製剤は、以下の本質的特性を有する。
【００３７】
・小径の注射針を通した吸引による注射器の充填における良好な適合性
・患者の心地よさを大きく改善して患者の治療に対するコンプライアンスを改善する、小径の注射針を通した「注入の容易性」
・卓越した安定性
・良好な局所耐容性
・標準投与量である０．６ＩＵ／ｋｇをヒトに投与した後の、２４時間に亘って持続する血糖降下活性
・粒径が小さいことによる、０．２ミクロンのフィルター上での濾過滅菌における適合性
【００３８】
この懸濁液は、以下の特性も有する。
【００３９】
・重合体の余分なコストを抑制する、重合体／インスリンの小さい重量比
・良好な局所耐容性、及び濾過滅菌における良好な適合性を保証する粒径範囲
・少なくとも２４時間に亘って血糖降下作用を持続させると共に、容易な注入を可能にするｂＬＥ重合体の濃度範囲
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
長時間作用型注射用インスリン製剤に適したコロイド状インスリン懸濁液を得るためのこれらパラメータの選択は、種々の動物モデルを用いたインスリン製剤の薬物動態学的及び薬力学的活性の測定及び比較に関する多大かつ長期に亘る研究、並びにこの特定の懸濁液の「注入の容易性」、安定性、耐容性、及び生体適合性、注入可能な性質、及び注射針を通して吸引し得る能力に関する多数の研究の成果である。
【００４１】
製剤を構成する安定なコロイド状懸濁液は、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）共重合体の自己集合によって形成されたサブミクロン構造を有するナノ粒子を含有する。該ナノ粒子は、
（Ｉ）コロイド状懸濁液中において、変性することなく非共有結合的にインスリンと非溶解状態で自発的に結合（吸着）してナノ粒子／インスリン複合体を形成し、
（Ｉ）特に生体内において、持続的及び／又は遅延的にインスリンを放出することができる。
【００４２】
最後に、該ナノ粒子は、界面活性剤がなくても水相中で安定である。
【００４３】
本発明におけるナノ粒子からなるコロイド状懸濁液は、国際公開第ＷＯ−Ａ−０１／３７８０９号パンフレットにて一般的な用語で記載された中から特定の１つを選択した結果である。この特定の選択は、上述した仕様の相矛盾する要求を最善の状態にすることを目的として多数の試験を行った後に見出された。
【００４４】
上述した仕様を満たす製剤、すなわち懸濁液の開発を可能にする特定のパラメータを選択するために、本発明者等は、長期に亘って多数の試験を行う必要があった。
【００４５】
懸濁液の安定性は、該懸濁液のｐＨを５．８〜７．０、好ましくは６．０〜７．０、特に好ましくは７．４未満に調整することによって最適化される。この安定性とは、一方においては、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のナノ粒子のコロイド状懸濁液の物理化学的安定性を示し、他方においては、治療的効果（高血糖のコントロール）の観点からのインスリン活性の本質的な安定性を示す。都合のよいことに、製剤は、例えば５℃で２年間保管した後も、安定な状態が維持される。
【００４６】
小径（例えばゲージ２９Ｇ、３０Ｇ、及び３１Ｇ、又は直径０．１５〜０．４ｍｍ及び長さ８〜２０ｍｍ）の注射針を通して容易に注入されるという本発明の製剤の特記すべき特性は、注射器のピストンにかかる力を測定することにより評価される。例えば、この力は、理想的な値、例えば約４０ニュートン、好ましくは約３０ニュートンのオーダーを超えないことが望ましく、流速については１ｍＬ／分又はそれ未満でないことが望ましい。驚くべきことに、低い剪断勾配にて測定した（下記のＭｖ法によって測定した）粘度は、小径の注射針を通してコロイド状懸濁液を注入するのに要する力を完全に支配する訳ではない。注入の際に加える必要のある力は、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の濃度と共に減少することを証明したことは、本件出願人の功績である。理想的には、本発明によれば、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の濃度は、作用の持続時間と、注入の容易性とが最適な妥協点を提供するように調整され得る。この最適な条件は、重合体濃度１０〜６０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２０〜５５ｍｇ／ｍＬにおいて得られる。
【００４７】
小径（例えばゲージ２９Ｇ、３０Ｇ、及び３１Ｇ、又は直径０．１５〜０．４ｍｍかつ長さ８〜２０ｍｍ）の注射針を通して製剤を吸引することにより注射器を容易に充填することができることも、本発明が意図する特徴である。典型的には、この操作は、容積５００μＬにつき例えば１２０秒以内、好ましくは６０秒以内、特に好ましくは３０秒以内に遂行されなければならない。
【００４８】
ナノ粒子のコロイド状懸濁液から構成される製剤の「注入の容易性」に関して示したこととは対照的に、注射器の迅速な充填を可能にする本製剤の能力は、実質的に懸濁液の粘度（下記のＭｖ法によって測定）に依存することを証明したことは、本発明者等の功績である。上記の条件を満たす迅速充填は、粘度ｖ（下記に説明するＭｖ法により測定）が、例えば４０ｍＰａ．ｓ以下、好ましくは２５ｍＰａ．ｓ以下、特に好ましくは２０ｍＰａ．ｓ以下、又は実際的には１５ｍＰａ．ｓ以下であるときに得られる。
【００４９】
（Ｍｖ法）
本発明によれば、粘度ｖ（２０℃におけるｍＰａ．ｓで表記）で表される重要なパラメータは、例えば２０℃において、コーンアンドプレート構造（４ｃｍ、２℃）を装着したＡＲ１０００粘度計（ＴＡＩｎｓｔｒｕｍｅｔｓ）を用いて測定され得る。粘度ｖは、剪断勾配１０ｓ−１にて測定される。
【００５０】
懸濁液のオスモル濃度Ｏ（ｍＯｓｍで表記）を２７０〜８００、好ましくは２７〜６００、特に好ましくは２７０〜４００に調整することによって粘度を低下させる手段を発見したことも本発明者の功績である。
【００５１】
好ましくは、このオスモル濃度の調整は、例えばグリセロール、スクロース、又はその他のポリヒドロキシル化分子のような中性分子を加えるのではなく、少なくとも１種の塩、特に１種又は２種以上の一価及び／又は多価（例えば二価若しくは三価）の塩、を加えることによって達成される。これらの塩は、例えば以下のファミリー、すなわち塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化亜鉛、リン酸一水素若しくはリン酸二水素ナトリウム若しくはカリウム、塩化マグネシウム若しくはカルシウム、クエン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、又は皮下注射に適していることが当業者に周知の任意の他の塩から選択され得る。
【００５２】
本発明の特記すべき特徴によれば、多価塩は、それらが一価塩よりも強い流動化作用を有するならば、オスモル濃度を調整するための好ましい候補である。
【００５３】
有利には、この多価塩は、例えば塩化亜鉛、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸二ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸カリウム、硫酸ナトリウム又は硫酸カリウム、及びそれらの混合物からなる群から選択される。
【００５４】
本発明によれば、ナノ粒子は小さく、より正確には、Ｍｄ法により測定した水力学的径Ｄｈ（ｎｍで表記）が、例えば以下の順でより好ましい：１０≦Ｄｈ≦１５０、１０≦Ｄｈ≦１００、２０≦Ｄｈ≦１００、１０≦Ｄｈ≦５０、１５≦Ｄｈ≦４０。
【００５５】
このようにポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の粒径を選択することによる効果の１つは、中でも、本発明による製剤が、孔径０．２μｍの滅菌フィルターで容易に濾過可能であり、それにより滅菌された注射剤が容易かつ低コストで得られることである。また、驚くべきことに、以下の実施例に示すように、これら粒子の局所耐容性が、より大きい粒子よりも良好であることは明らかである。
【００５６】
（Ｍｄ法）
ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の粉末を、約５０ｇ／Ｌの濃度で水中に懸濁し、該懸濁液を２５℃で一晩撹拌する。その後、この懸濁液を０．１５Ｍの塩化ナトリウム水溶液で希釈して、最終的なポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の濃度を０．０１〜０．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．２ｇ／Ｌとする。この懸濁液を１時間撹拌した後、波長４８８ｎｍの垂直偏光したレーザー光で作動する、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ社の散乱光装置の散乱セル内に導入する。水力学的径は、「Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｓｅｒｉｅｓ」ｖｏｌｕｍｅ  ２２  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．Ｒ．Ｚａｎａ，ｃｈａｐ．３，Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ，１９８４に記載された、加算法を用いた電場自己相関関数によって算出する。
【００５７】
本発明の他の好ましい特徴によれば、本発明に従って選択されたポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）重合体は、以下の特徴を有する。
【００５８】
ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）に対するインスリンの最大結合率Ｔａが、Ｍａ法により測定し、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の質量に対する結合したインスリンの質量％として表記したとき、
１０≦Ｔａ
好ましくは    １０≦Ｔａ≦４０
特に好ましくは１２≦Ｔａ≦２５
である。
【００５９】
（Ｍａ法）
（ａ）インスリンの水性溶液の調製：凍結乾燥した組み換えヒトインスリンを、最大１５分間かけて、容積Ｖの０．０１Ｎ塩酸溶液に注入する。次いで、この溶液を同じ容積Ｖの０．０１Ｎ  ＮａＯＨ溶液に注入する。１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を用いて、ｐＨを７．２〜７．４に調整する。該溶液を３０分間緩やかに撹拌する。インスリンの質量及び容積Ｖは、最終溶液の所望の容積Ｖ’の関数として、インスリン濃度が１００ＩＵ／ｍＬ、１２０ＩＵ／ｍＬ、及び１４０ＩＵ／ｍＬとなるように算出する。
【００６０】
（ｂ）インスリン製剤の調製：凍結乾燥したポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）を、１１ｍｇ／ｍＬの速度でインスリン溶液に加える。これらの混合液を脱気した後、２５℃にて傾斜攪拌機（ｔｉｌｔｉｎｇ  ｓｔｉｒｒｅｒ）で２時間撹拌し、再び脱気する。ｐＨを１Ｎ  ＨＣｌ溶液にて７．２〜７．４に調整し、該混合物を室温で一晩撹拌（傾斜攪拌機）する。
【００６１】
（ｃ）遊離インスリンの評価：該製剤をサイズ排除液体クロマトグラフィーのカラムに、非解離条件下で注入し、遊離インスリンを蛍光定量法にて評価する。
【００６２】
１つの有利な変形として、懸濁液中のナノ粒子と結合したインスリンは、非改変インスリンである。
本発明に関して、非改変インスリンは、インスリンの基本構造が全く変換されていないか、又はそのアミノ酸の側基（ｓｉｄｅ  ｇｒｏｕｐ）が全く変更されていない、組み換え又は非組み換えインスリンである。
【００６３】
有利には、本発明の製剤を構成する懸濁液は、好ましくはフェノール類、クレゾール類（例えばメタクレゾール）、メチル、プロピル、若しくはブチルパラヒドロキシベンゾエート、又は当業者に周知の任意の他の保存剤（例えばＬ．Ａ．Ｇａｔｌｉｎ等によるＩｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｐ．Ｋ．Ｇｕｐｔａ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，１９９９の記事を参照し得る）、並びにそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の保存剤を含有する。
【００６４】
ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の合成方法、及び水性懸濁液中におけるポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のナノ粒子の製造方法は、国際公開第ＷＯ−Ａ−０１／３７８０９号パンフレットに記載されている方式及び提案に従って実施することが好ましい。
【００６５】
インスリンが結合したポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のナノ粒子は、水性溶媒中で安定な懸濁物として存在するのみならず、安定な固体の状態、好ましくは粉末状態でも存在し得る。したがって、本発明はさらに、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のインスリン結合ナノ粒子を含むこと、及び本発明の製剤を構成する上記に定義した懸濁液から得られることを特徴とする固体、好ましくは粉末状固体に関する。このことは、任意の周知の適切な手段、例えば凍結乾燥、微粒化、又は乾燥により行われる。
【００６６】
長時間作用型注射用インスリン液体製剤の調製方法は、インスリンが負荷されていないポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）に関与し、少なくとも１種のポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）及びインスリンを、好ましくは撹拌しながら水性溶媒中に懸濁させ、必要であれば賦形剤を添加してｐＨ値を５．８〜７．０に調整し、場合により得られた懸濁液を孔径０．２μｍのフィルターで濾過することを本質的に含む。
【００６７】
インスリンとナノ粒子とは、幾つかの方法により結合させ得る。その非限定的な例を以下に示す。
【００６８】
第一の方法では、インスリンを含有する水相を、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のナノ粒子のコロイド状懸濁液と接触させることによって、インスリンと粒子とを結合させる。より正確には、中性ｐＨのナノ粒子の等張懸濁液を、６０ｍｇ／ｍＬ又はそれ以上の濃度（最終的な懸濁液の所望の濃度に従う）に再構成する。次いで、濃縮したインスリン溶液（通常、５００〜６００ＩＵ／ｍＬ−ｐＨ７〜８−等張）を、迅速に用いるためにインスリン粉末から調製する（酸媒体中に溶解、次いで中性化）。２つの溶液を２〜３分間撹拌して混合し、この段階の後、場合により２〜３時間の「成熟」段階が続く。次いで、ｐＨを５．８〜７．０の値に調整する。
【００６９】
第二の方法は、粉末状態のポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）を、例えば濃度１００〜２００ＩＵ／ｍＬのインスリンを含有する水相と（混合により）接触させることを本質的に含む。
【００７０】
本発明の本質的な特徴の１つ、すなわちｐＨを５．８〜７．０、好ましくは６．０〜７．０とすることに注意を払うことが重要である。この要素は、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のナノ粒子の懸濁液の安定性及び局所耐容性に重要な役割を果たす。ｐＨは、任意の公知かつ適切な手段、特に例えば以下の方法による酸性化により調整し得る。
【００７１】
１  ０．１Ｎ塩酸をインスリン結合懸濁液に添加する（中間体が沈殿し、これは約１時間撹拌した後消失する。）。
２  ０．１Ｎ酢酸をインスリン結合懸濁液に添加する（中間体は沈殿しない）。
酢酸の添加（−２−）がより好ましい。
【００７２】
本発明に従って製剤を調製する際、必要であれば賦形剤を添加してｐＨ値を５．８〜７．０に再調整し、場合により、得られた懸濁液を孔径０．２μｍのフィルターで濾過することによって滅菌することが可能である。
【００７３】
これらの賦形剤は、特に、フェノール類、クレゾール類（例えばメタクレゾール）、メチル、プロピル、若しくはブチルパラヒドロキシベンゾエート、又は当該技術分野にて周知の任意の他の保存剤（Ｌ．Ａ．Ｇａｔｌｉｎ等によるＩｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｐ．Ｋ．Ｇｕｐｔａ，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，１９９９の記事を参照し得る）、並びにそれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１種の保存剤であり得る。
【００７４】
ｐＨの調整、及び賦形剤の添加の両方に関する混合条件は、従来通りであり、特に温度、圧力、及び撹拌に関しては、当業者の能力の範囲内にある。
【００７５】
最後に、懸濁液は、例えば凍結乾燥、微粒化、又は乾燥など、当該技術分野にて周知の任意の従来の方法により、粉末状固体に変換され得る。
【００７６】
本発明の別の特徴の１つによれば、本発明は、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）／インスリン懸濁液の薬学的及び獣医学的用途に関する。主な用途は糖尿病、より正確にはＩ型及びＩＩ型糖尿病の治療である。
【００７７】
したがって、本発明はさらに、上記に定義した通りのポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）／インスリンのコロイド状懸濁液を含有する製剤、及び／又は、同様に上述した方法により得られる製剤、及び／又は上記に定義した粉末状固体、を含むことを特徴とする薬剤に関する。
【００７８】
薬剤は、好ましくは、糖尿病の治療、より正確にはＩ型及びＩＩ型糖尿病の治療を意図するものである。
【００７９】
本発明の１つの有利な条件によれば、本発明における薬剤は、反復注射による投与計画において、皮下注射後、糖尿病患者に基礎インスリン濃度を少なくとも２４時間与えることができる長時間作用型注射用ヒトインスリン製剤と同等である。
【００８０】
本開示において、基礎インスリン濃度とは、健康な個人における一般的な血中濃度、すなわち３０ｐｉｃｏｍｏｌ／Ｌとして理解すべきである。
【００８１】
本発明はさらに、インスリン、好ましくは非改変インスリンが結合したポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のナノ粒子の安定な水性コロイド状懸濁液を含有する製剤に基づく、上述した薬剤を、患者に投与することを本質的に含むことを特徴とする、糖尿病、特にＩ型及びＩＩ型糖尿病の治療方法に関する。
【００８２】
本方法は、注射、好ましくは皮下注射による連日投与を含むことが好ましい。
【００８３】
本発明による薬物は、上述した粉末状個体と、任意にて、懸濁液を調製するための水性溶媒とを含む形態もとり得る。
【００８４】
結果として、本発明は、一方では上記に定義した粉末状個体と、他方では別個にて、投与前にそれによって本発明に従った製剤を構成する懸濁液が再構成される水性溶媒とを含む製剤形態も包含する。
【００８５】
以下の実施例は、その異なる製品／方法／用途の特徴における本発明の理解を深める。これら実施例は、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）のインスリン結合ナノ粒子の懸濁液を基礎とした、本発明による製剤の調製について説明するものである。また、これら実施例では、先行技術によるポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）／インスリン製剤と比較することにより、本製剤の構造的特徴及び性質を表す。
【実施例】
【００８６】
＜実施例１＞２５／３５ジブロックポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の合成
３８．９ｇのＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅ（０．２０８ｍｏｌ）及び１５６ｇのＮ−メチルピロリジン−２−オン（ＮＭＰ）を、撹拌しながら、サーモスタットで３０℃に制御された０．５リットルの反応器内に導入した。溶解後、０．４５２Ｍアンモニアのメタノール溶液５．７８ｇ（１．２５ｍｏｌ％／ＮＣＡ）を加えた。重合は、ガスベル瓶（ｇａｓ  ｂｅｌｌ  ｊａｒ）内に放出された二酸化酸素を測定することにより監視し、１８６０ｃｍ−１及び１７９０ｃｍ−１におけるＮＣＡの振動バンド特性の消失によって確認した。３０分後、５２１９ｇのＮＭＰ中に２３．３ｇのＮＣＡ−ロイシン（０．１４９ｍｏｌ）を溶解した溶液を導入した。１０分間の反応後、温度を６０℃に上昇させた。重合を上記のように監視した。重合は１〜２時間後に完了した。上記で得られた反応混合物の温度を８０℃に上昇させた。反応媒体に、４２．０ｇの塩酸水溶液（３５質量％）を、機械的に撹拌しながら３０分間に亘って加えた。次いで、反応器を６０Ｐａ（６００ｍｂａｒ）の減圧下にて６時間置いた。次いで、４２．０ｇの３５％塩酸と１６７．９ｇの水との混合物を６０分間に亘って加え、引き続き、２５Ｐａ（２５０ｍｂａｒ）で１８時間という第二の真空段階に置いた。次いで、反応混合物を５０℃に冷却し、水酸化ナトリウム水溶液（３５質量％）で中和した。ＮＭＰ及び中和反応中に形成された塩化ナトリウムは、１０００ダルトンのＭＷＣＯ膜を用いて、２０倍量のＭｉｌｌｉ  Ｑ水（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＩＩ  ｓｙｓｔｅｍ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に対して、膜分離法（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）により除去した。これにより、担体ナノ粒子の安定な水性コロイド状懸濁液が得られた。最後に、ナノ粒子の懸濁液を凍結乾燥した。プロトン核磁気共鳴によりロイシン単位の含有量を測定した（Ｇｌｕの４Ｈに対する２．１０、２．２２、及び２．５８ｐｐｍのシグナル、並びにＬｅｕの６Ｈに対する０．８５ｐｐｍのシグナル）。
【００８７】
＜実施例２＞２５／７０ジブロックポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）の合成
１４６．４ｇのＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅを５８６ｇのＮＭＰ中に溶解し、ここに０．４８Ｍアンモニアのメタノール溶液１８．４３ｇを加えた。ＮＣＡ−ＧｌｕＯＭｅの重合が完了した際、４３．９ｇのＮＣＡ−Ｌｅｕを７０８ｇのＮＭＰに溶解した溶液を導入し、単量体が消失するまで、ＮＣＡ−Ｌｅｕの重合を監視した。次いで、媒体を８０℃に加熱して、１２９．４ｇの３５％ＨＣｌを３０分間〜１時間に亘って滴下した。６０Ｐａ（６００ｍｂａｒ）の真空下に６時間置いた後、５１７．５ｇの水と混合した１２９．４ｇの３５％ＨＣｌをさらに加えた。次いで、２５Ｐａ（２５０ｍｂａｒ）の真空下に１８時間置いた。このステップの後、温度を５０℃に低下させ、水１リットルを導入した後、２８０ｍＬの３５％ＮａＯＨを加えて、ｐＨを７．４とした。次いで、溶液を濾過し（５μｍ）、水中で透析して（カットオフ閾値１００Ｄａ）溶媒及び塩を除去し、最後に濾過した（０．２２μｍ）。この懸濁液は、直接使用しても、又は例えば水の蒸留、若しくは凍結乾燥など、さらなる処理を受けてもよい。
【００８８】
＜実施例３＞本発明における長時間作用型インスリン懸濁液の調製
（３．１  濃度６０ｍｇ／ｇのポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ  Ｌ−グルタミン酸ナトリウム）（Ｐ）のナノ粒子の中間体コロイド状懸濁液の調製）
懸濁液は、層流フード（ｌａｍｉｎａｒ  ｆｌｏｗ  ｈｏｏｄ）下で、又は無菌室内で調製した。
【００８９】
５０ｇの凍結乾燥状態の実施例２のポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）重合体（水を約１％含有する）、及び７５７ｇの注射用水を、３Ｌのガラス製フラスコ内に連続して導入した。懸濁液を、マグネットスターラーバーを用いて、少なくとも１２時間激しく撹拌した。フラスコ内はやや真空（５０〜１００ｍｂａｒ）となった。溶液に１０．６ｇの３０％ＮａＣｌ及び６．７ｇの１Ｎ  ＮａＯＨを加えて、ｐＨを７．２に、オスモル濃度を３００ｍＯｓｍに、重合体濃度を６０ｍｇ／ｍＬに調整した。
【００９０】
（３．２  濃度５９０ＩＵ／ｍＬの中間体インスリン溶液の調製）
活性が２８．４ＩＵ／ｇであり、含水率が７．７％である４．５ｇの組み換えヒトインスリン（粉末）をガラス製フラスコ内に導入し、１８１ｇの水を加え、マグネットスターラーにてゆっくり撹拌して、インスリンを分散させた。４．０ｇの１Ｎ  ＨＣｌを加えて、透明な酸性インスリン溶液を得た。次いで、５．６ｇの１Ｎ水酸化ナトリウム溶液を加えて、ｐＨ７〜８の最終的な溶液を得た。６．１ｇの３０％ＮａＣｌを加えて、オスモル濃度を調整した。
ＮＰの懸濁液と混合する前に、溶液を０．２μｍのポリエーテルスルホン膜で濾過した。
【００９１】
（３．３  賦形剤溶液（１４０ｍＭフェノール、１４０ｍＭ  ｍ−クレゾール、０．１Ｎ酢酸）の調製）
以下を１Ｌフラスコ内に連続して導入した。
・１３．２ｇのフェノール（Ｍ＝９４ｇ／ｍｏｌ）
・１００ｇの水
・１５．１ｇのｍ−クレゾール（Ｍ＝１０８ｇ／ｍｏｌ）
・１００ｇの１Ｎ酢酸
・７７１．７ｇの水
【００９２】
溶液を少なくとも３０分間撹拌して、透明な溶液を得て、次いで０．２μｍのＰＶＤＦ膜又はＰＴＦＥ膜で濾過した。
【００９３】
（３．４  長時間作用型コロイド状インスリン懸濁液Ａの調製）
（オスモル濃度Ｏ＝３００ｍＯｓｍ、ｐＨ＝６．５、ポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）Ｃｐｏｌの濃度＝４２ｍｇ／ｍＬ、インスリンであるＣｉｎｓｕｌｉｎの濃度＝３．５ｍｇ／ｍＬ）
【００９４】
８００ｇの懸濁液Ｐを１リットルのフラスコ内に導入した。１９６ｇの濃度５９０ＩＵ／ｍＬのインスリン溶液を、マグネットスターラーにてゆっくり撹拌しながら加えた。撹拌を１／４時間維持した後、混合物を２５℃で一晩放置した。次いで、混合物に１７１ｇの賦形剤溶液を加え、溶液を４時間撹拌した。得られた製剤を０．２μｍのポリエーテルスルホン膜で濾過した。
【００９５】
＜実施例４＞本発明による長時間作用型インスリン懸濁液Ａの粘度及び水力学的径
粘度の測定は、２０℃にて、コーンアンドプレート構造（４ｃｍ、２°）を装着したＡＲ１０００粘度計（ＴＡＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて行った。粘度を剪断勾配１０ｓ−１に関して測定した。
【００９６】
粘度は、２５ｍＰａ．ｓであった。
Ｍｄ法により測定した、懸濁液Ｈ、Ｍ、及びＬの粒子の水力学的径は、３５ｎｍであった。
【００９７】
＜実施例５＞異なるｐＨ値における長時間作用型インスリン懸濁液の比較安定性
・１００ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインスリン
・４２ｍｇ／ｍＬの実施例１のポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）重合体
・２１ｍＭフェノール及びメタクレゾール
を含有する第一の薬剤的インスリン懸濁液Ｍを、上記の実施例３に従って調製した。そのｐＨを６．５±０．１に、オスモル濃度を３００±２０ｍＯｓｍｏｌに調整した。
【００９８】
組成物Ｍと同一の、第二の比較用長時間作用型薬剤的インスリン懸濁液、Ｃｏｍｐ１を、本発明の懸濁液とは対照的に、そのｐＨを７．２±０．１に調整した以外は、同一の方法で調製した。オスモル濃度Ｏは、再び３００±２０ｍＯｓｍｏｌであった。
【００９９】
薬剤的懸濁液Ｍ及びＣｏｍｐ１について、３７℃にて加速安定性試験を行った。各調製品Ａ及びＢについて、ｐＨ、オスモル濃度、インスリン結合ナノ粒子の水力学的径、及び非改変インスリンの量を時間の関数として測定し、安定性を監視した。
【０１００】
調製品Ｍ及びＣｏｍｐ１中のインスリンを測定するため、２ｍＬのトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）に０．１ｍＬの調製品０．１ｍを溶解した。次いで、溶液をＢｉｏｂａｓｉｃ（登録商標）Ｃ８カラム内に注入してタンパク質のＨＰＬＣ分析を行った。これにより、調製品中の非改変インスリンが測定される。非改変インスリンの割合が９５％を下回ると、タンパク質調製品の時間制限に到達する。
【０１０１】
以下の表に示すように、２つの調製品Ｍ及びＣｏｍｐ１に関するｐＨ、オスモル濃度、及びナノ粒子の直径は安定していた。
【０１０２】
表１に、製剤Ｍ（ｐＨ６．５）及びＣｏｍｐ１（ｐＨ７．４）のｐＨ、オスモル濃度、及び粒子の水力学的径の変化、並びに非改変ヒトインスリンのパーセントを示す。
【０１０３】
【表１】
2008506757.tif 000002
【０１０４】
ｐＨ６．５に維持された本発明の懸濁液Ｍは、２１日後においてもインスリンの９５％が非改変であることから、加速試験条件下で卓越した安定性を有することが分かる。一方、ｐＨ７．２の製剤Ｃｏｍｐ１では、非改変インスリンの量はｔ＝７日から９５％以下に低下する。したがって、驚くべきことに、本発明の長時間作用型インスリン製剤中のインスリンの安定性は、僅かに酸性のｐＨにおいて非常に良好であった。
【０１０５】
＜実施例６＞本発明の長時間作用型インスリン懸濁液、及び国際公開第ＷＯ−Ａ−０１／３７８０９号パンフレットにおけるポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）を基礎とし、本発明に従った選択に属さない長時間作用型インスリン懸濁液の局所耐容性の比較
【０１０６】
実施例３に対応する本発明における懸濁液Ｈの局所耐容性と、本発明に従った選択に属さない中性ｐＨのポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）懸濁液とを比較する試験を実施した。
本発明における懸濁液Ｍは、
・１００ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインスリン
・４２ｍｇ／ｍＬの実施例３のポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）重合体
・２１ｍＭのフェノール及びメタクレゾール
を含有し、上記の実施例３に従って調製した。そのｐＨを６．５±０．１に調整した。
【０１０７】
本発明に属さない比較用懸濁液Ｃｏｍｐ２を、特許文献４に従ってポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｇｌｕ）コポリアミノ酸から調製した。該懸濁液は、
・１００ＩＵ／ｍＬの組み換えヒトインスリン
・ロイシン４０単位及びグルタミン酸ナトリウム６０単位から形成された１００ｍｇ／ｍＬのポリ（Ｌｅｕ−ブロック−Ｌ−グルタミン酸ナトリウム）（粒子の水力学的径は、８０ｎｍである）
を含有する。
【０１０８】
この製剤Ｃｏｍｐ２を上記の実施例３に記載した手順により調製した。そのｐＨを７．４±０．１に調整した。
【０１０９】
上記の懸濁液Ｍ及びＣｏｍｐ２、並びに０．５０ｍＬの０．９％ＮａＣｌ溶液（陰性対照）を、９匹の飼育豚の腹部に皮下注射した。注射後、臨床的徴候（紅斑及び浮腫）を３日間評価した。
【０１１０】
陰性対照（ＮａＣｌ）は、臨床的反応を生じなかった。
調製品Ｃｏｍｐ２は局所反応を生じ、これは２４時間まで増大した。この段階で、中程度〜顕著（ｐｒｏｎｏｕｎｃｅｄ）と等級分けされた紅斑及び浮腫により特徴付けられる。この反応は、約３日で消失した。
【０１１１】
調製品Ｍは、非常に軽微な、一過性の局所反応を誘導した。２〜３匹の動物は、１２〜２４時間後、非常に軽微な紅斑を示し、一般的には２４時間までに非常に軽微な浮腫が観察された。
【０１１２】
このように、本発明における懸濁液Ｍの局所耐容性は、懸濁液Ｃｏｍｐ２と比較して著しく優れている。
したがって、Ｃｏｍｐ２とは対照的に、本発明の懸濁液Ｍは、薬剤の連日投与を可能にする。
【０１１３】
＜実施例７＞本発明による製剤Ａの充填時間
ゲージ２９かつ長さ８ｍｍの注射針を通した注射器の充填時間を、オスモル濃度を増加させながら測定した。
【０１１４】
実施例３に従って、本発明の懸濁液を調製した。該懸濁液は、ｐＨ６．５であり、濃度４３ｍｇ／ｍＬであった。
充填容積は、０．５ｍＬであった。
懸濁液のオスモル濃度Ｏを、定量のＮａＣｌを加えて調整した。
得られた結果を、下の表２に示す。
【０１１５】
【表２】
2008506757.tif 000003
【０１１６】
このように、本発明に従ってオスモル濃度Ｏを調整することにより、注射器の充填時間を十分に短縮でき、患者の連日使用を容易にすることができる。
【国際調査報告】
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