(57)【要約】  本発明は、エリスロポエチン（EPO）の新規な内因性変異体、並びに細胞死（アポトーシス、ネクローシス）及び炎症に起因する組織損傷に関連する症状の治療又は予防、特に神経保護、例えば神経系の急性疾患（例えば卒中）及び神経系の慢性疾患（例えばALS）の治療、のためのその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a) 各々配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22で示される推定アミノ酸配列を有する、hs3、h1-4、h1-5、hs4、h1-1、h2-1、mS、mG3、mG5、m301及びmK3と称されるポリペプチドの少なくとも成熟形態をコードするポリヌクレオチド；
(b) 当該ポリペプチドの少なくとも成熟形態をコードする、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、19及び21で示される、コード配列を有するポリヌクレオチド；
(c) 配列番号14、16、18、20及び22で示される推定アミノ酸配列を有する、ポリペプチドmS、mG3、mG5、m301及びmK3のヒト化変形体（humanized version）をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号32、34、36及び38で示されるアミノ酸配列の群より選ばれるアミノ酸配列のN-末端における、配列番号24、26、28及び30で示されるアミノ酸配列の群より選ばれるアミノ酸配列の融合を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(e) 配列番号31、33、35及び37で示されるポリヌクレオチド配列の群より選ばれるポリヌクレオチド配列の5'での、配列番号23、25、27及び29で示されるポリヌクレオチド配列の群より選ばれるポリヌクレオチド配列の融合を含むポリヌクレオチド；
(f) (a)〜(e)のいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの誘導体をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該誘導体において、1〜10個のアミノ酸残基は当該ポリペプチドに比べて保存的に置換され、当該誘導体は細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；
(g) (a)〜(f)のいずれか１つのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該断片において、1〜10個のアミノ酸残基はN-及び/又はC-末端が削除され、及び/又は1〜10個のアミノ酸は、当該ポリペプチドに比べて連結部のN-及び/又はC-末端的が削除され、当該断片は、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；
(h) (a)〜(g)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと少なくとも50%の同一性であり、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；並びに
(i) ポリヌクレオチドの相補鎖が、(a)〜(h)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリダイズし、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、当該ポリヌクレオチド、 
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド；又はかかるポリヌクレオチドの相補鎖、をコードするエリスロポエチン（EPO）変異体。
【請求項２】
別の高等な真核細胞種由来の、請求項１に記載のポリヌクレオチドをコードするエリスロポエチン（EPO）変異体のホモログ。
【請求項３】
エリスロポエチン（EPO）変異体であって、以下： 
(a) ヘリックスAを含む完全長EPOのN-末端部分を含み、以下：
(i) ヘリックスAとヘリックスBとの間の少なくとも10個のアミノ酸の断片；
(ii) ヘリックスBの少なくとも10個のアミノ酸の断片；
(iii) ヘリックスBとヘリックスCとの間の少なくとも2個のアミノ酸の断片；
(iv) ヘリックスCの少なくとも10個のアミノ酸の断片
(v) ヘリックスCとヘリックスDとの間の少なくとも10個のアミノ酸の断片；及び/又は
(vi) ヘリックスDの少なくとも10個のアミノ酸の断片
の少なくとも１つを欠く、EPO変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ここで当該変異体は、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；
(b) (a)のいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの誘導体をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該誘導体において、1〜10個のアミノ酸残基は、当該ポリペプチドに比べて保存的に置換され、当該誘導体は、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；並びに
(c) ポリヌクレオチドの相補鎖が、(a)〜(b)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリダイズし、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、当該ポリヌクレオチド、
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド；又はかかるポリヌクレオチドの相補鎖、をコードする、前記変異体。
【請求項４】
DNA、ゲノムDNA又はRNAである、請求項１〜３のいずれか１項記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項６】
前記ポリヌクレオチドが、原核宿主細胞及び/又は真核宿主細胞において発現することができる発現制御配列に作動可能に連結される、請求項５記載のベクター。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、又は請求項５もしくは６記載のベクター、で遺伝的に改変された宿主細胞。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、請求項５もしくは６記載のベクター、及び/又は請求項７記載の宿主細胞を含む、トランスジェニック非-ヒト動物。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチドによりコードされるEPO変異ポリペプチドの製造法であって、請求項７記載の宿主細胞を培養するステップ、及び当該ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを回収するステップを含む、前記方法。
【請求項１０】
前記EPO変異体を修飾するステップを更に含み、当該修飾が、酸化、硫酸化、リン酸化、オリゴ糖の添加又はそれらの組合せからなる群より選ばれる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
請求項５又は６記載のベクターを用いてin vitroで細胞を遺伝子工学的に組換えることを含む、EPO変異体の少なくとも１つを発現することができる細胞の製造方法であって、当該EPO変異体ポリペプチド（複数）が請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチドによりコードされる、前記方法。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有するか、又は請求項９もしくは１０に記載の方法により得られる、ポリペプチド。
【請求項１３】
請求項１２記載のポリペプチドに特異的に結合する抗体。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、請求項７記載の宿主細胞、請求項１２記載のポリペプチド及び/又は請求項１３記載の抗体、並びに１以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項１５】
細胞死に起因する組織損傷に関連する症状の治療又は予防のための医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれか１項記載のポリヌクレオチド、請求項５もしくは６記載のベクター、請求項７記載の宿主細胞、又は請求項１２記載のポリペプチドの使用。
【請求項１６】
前記細胞死が、虚血、低酸素症、細菌感染、ウイルス感染により誘導され、自己免疫学的、外傷的もしくは化学的に誘導され、又は放射線誘導される、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
前記症状が、急性もしくは慢性の神経変性及び/又は神経炎症性疾患であり、急性もしくは慢性の心臓、肺、腎臓、肝臓又は膵臓の疾患、又は前記症状が臓器又は細胞移植に関連する、請求項１５又は１６記載の使用。
【請求項１８】
前記の急性神経変性及び/又は神経炎症性疾患が、塞栓性閉塞及び血栓性閉塞を含む脳虚血又は梗塞、急性虚血に従う再潅流、出産前後期の虚血損傷、心不全、頭蓋内出血、クモ膜下出血及頭蓋内損傷、脊椎内（intravertebral）損傷、椎間損傷、乳幼児ムチウチ揺さぶり症候群、流行性脳炎、髄膜炎、頭痛からなる群より選ばれる、請求項１７記載の使用。
【請求項１９】
慢性神経変性及び/又は神経炎症性疾患が、痴呆、ピック病、びまん性レービー病、進行性核上性麻痺（スチール-リチャードソン症候群）、多発性硬化症、多発性系萎縮症、神経変性に関連する慢性癲癇性症状、運動神経疾患、変性運動失調、皮質基底変性、ALS-グアム島パーキンソニスム痴呆複合、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、パーキンソン病、サイヌクレイノパシー、原発性進行性失語症、線条体黒質変性症、マシャド・ジョセフ病/3型脊髄小脳変性症及びオリーブ橋小脳変性症、ジル・ドラ・トゥレット症候群、球麻痺及び仮性球麻痺、脊髄筋萎縮症（spinal muscular atrophy）及び脊髄筋萎縮症（ケネディ病）（spinobulbar muscular atrophy）、原発性側索硬化症、進行性強直性対麻痺、ウェルドニッヒ・ホフマン病、クーゲルベルグ・ヴェランダー病、テイ・ザックス病、サンドホフ病、進行性強直性対麻痺、痙性対麻痺、進行性多発性白質脳症、家族性自律神経失調症（リリィ-デイ症候群）、多発ニューロパシー、プリオン病、耽溺、感情障害、融合失調症、慢性疲労症、慢性疼痛からなる群より選ばれる、請求項１７記載の使用。
【請求項２０】
前記症状が加齢である、請求項１５又は１６記載の使用。
【請求項２１】
前記医薬が、前記症状の発症前後に投与される、請求項１５〜２０のいずれか１項記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、エリスロポエチン（EPO）の新規な内因性変異体、並びに細胞死（アポトーシス、ネクローシス）及び炎症に起因する組織損傷に関連する症状の治療又は予防、特に神経保護、例えば神経系の急性疾患（例えば卒中）及び慢性疾患（例えばALS）のための、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
卒中は、米国で年に400,000人超を襲う身体を衰弱させる病気であり、米国で３番目に最も一般的な死因である。加えて、神経病の入院患者の半分は、卒中関連問題を有している。最近の傾向では、この数は、2050年までに年に100万人に急増すると予測されている。卒中の直接的な費用（処置及び治療）及び間接的な費用（生産性の喪失）を共に考慮すると、卒中は、米国社会だけで年に433億ドルの負担をかける。患者の３分の１は最初の３ケ月に死亡し、残りの３分の１は、重度の身体的障害が残り、３分の１のみが正常な状態に戻り、許容される結果を有する。1990年には、脳血管障害は、世界中で死因の第二であり、世界で430人を超える人々が死亡した。従って、公衆衛生予測によれば、卒中は最も関連のある疾患である。
【０００３】
卒中は、脳領域への急激な循環喪失により特徴付けられ、神経機能の対応する喪失を生じる。また、脳血管障害又は卒中症候群とも称される卒中は、血栓症、塞栓症及び出血を含む病態生理学的原因の異種群を包含する非特異的な用語である。卒中は現在、出血性又は虚血性のいずれかに分類される。急性虚血性卒中は、血栓症又は塞栓症により起こり、全卒中の80%を占める。
【０００４】
虚血性卒中は、脳を満たす動脈の閉塞から起こり、最も一般的には、内部頸動脈の枝で起こる。閉塞は、一般的には、アテローム性動脈硬化症に起因する血液クロット（血栓）片又は脂肪蓄積（アテローム）が、裂け（塞栓になる）、血流に乗って移動し、脳を満たす動脈内に留まるときに生じる。動脈壁内の脂肪蓄積が破裂すると、血液クロットが形成されることがある。かかる脂肪蓄積の破裂は、大きな脂肪蓄積が血流を遅くし、滴りにまで血流を遅くするときにも、形成されることがある。ゆっくりと流れる血液は、血液クロットしやすい。従って、狭い動脈内で血液クロットを形成し、狭い動脈をブロックする危険性は高い。血液クロットは、他の部位、例えば心臓で、又は心臓弁で形成されることがある。かかる血液クロットに起因する卒中は、最近心臓手術を受けた人、及び心臓弁障害を又は異常な心拍リズム（不整脈）、特に心房性細動、を有する人の間で最も一般的である。また、ある疾患、例えば赤血球（多血症）過剰では、血液が濃くなるので血液クロットの危険性は増加している。
【０００５】
脳への血流が減少する場合には、人は多量の血液を失うか又は非常に低い血圧を有するときに起こることがあるので、虚血卒中も起こりうる。時には、脳への血流が正常であるが、血液が充分な酸素を含まないときに、虚血性卒中は起こる。血液の酸素量を減少される疾患は、重度の貧血症（赤血球の欠乏）、窒息及び一酸化炭素中毒を含む。通常、かかる例での脳損傷は、広がり（拡散し）、昏睡が起こる。炎症又は感染が脳を満たす血管を狭くする場合には、虚血性卒中が起こり得る。同様に、薬物、例えばコカイン及びアンフェタミンは、動脈の痙攣を引き起こすことがあり、これは、卒中が起こる程度に、脳を満たす動脈の狭小化を招き得る。
【０００６】
脳は、神経代謝及び機能を維持するためにグルコース及び酸素を必要とする。酸素の脳への不十分な送達は、不十分な脳血流からの、低酸素症及び虚血性結果を招く。脳虚血の結果は、減少した脳血流の程度及びその期間に依拠する。ニューロンは、30〜60分間、虚血に寛容であり得る。血流が虚血部位で回復しない場合には、一連の代謝プロセスが結果として起こる。ニューロンは、ATPを使い果たし、効率的な経路である、嫌気性解糖に切り替える。乳酸塩は蓄積し、細胞内pHは減少する。ATPの充分な供給がない場合には、血漿膜内のイオンポンプは機能しなくなる。生じる、ナトリウム、水及びカルシウムの細胞内への流入は、ニューロン及びグリア細胞の急激な膨潤を引き起こす。膜局在化はまた、いずれも脳内で刺激神経伝達物質として働く、アミノ酸であるグルタミン酸及びアスパラギン酸の大規模な放出を刺激する。グルタミン酸は、すなわちN-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）カルシウムチャンネルをうまく特徴付ける神経細胞膜内のナトリウム及びカルシウムイオンチャネルを更に活性化する。過剰なカルシウムの流入は、広範囲の酵素系（プロテアーゼ、リパーゼ及びヌクレアーゼ）の乱れた活性化を引き起こす。これらの酵素及びその代謝産物、例えば酸素フリーラジカル、損傷細胞膜、遺伝子材料及びニューロン内の構造タンパク質は、究極的には、ニューロンの細胞死を招く（Dirnagl, U. et al. (1999) Trends Neurosci. 22: 391-397）。
【０００７】
卒中は突然始まり、急速に広がり、数分から数日内に脳組織の死を引き起こす。虚血性脳では、我々は、通常、２つの組織体積、すなわち、−虚血性半影部として知られている、梗塞のコア及び周囲領域と、−潅流下の及び代謝的に欠陥のある、決定的に損傷されたコアを囲む余白部、とを識別する。コア及び半影部は、２つの異なった種類の細胞死により特徴付けられる：ネクローシス及びアポトーシス（プログラム細胞死又は遅れた神経細胞死とも称される）。コアでの重大な潅流欠損は、数分内に細胞にその完全な状態を失わせることになる、代謝プロセス、細胞エネルギー供給及びイオンホメオシタシスの機能停止を起こす。従って、細胞及び組織の急性ネクローシスは、コアで明らかになる。半影部では、残りの潅流の中には、側副血管により維持されるものもある。このことは、十分な機能性代謝を維持することができないが、迅速な構造的分解を抑制し得る。しかしながら、長期間（数時間から数日）、細胞性ホメオシタシスの変化は、更に多くの細胞を死に至らしめ、潅流体積が増加する。半影部は、よって、梗塞の熟成中に危険な状態にある組織として考えられる。この部位では、アポトーシス及び炎症シグナルカスケードは、重要な役割を果たす。当該カスケードは、潅流として最後に達する体積の50%を最初に構成することがある。遅れた細胞死を招くメカニズムは、虚血によりチャレンジされるが依然として生きている脳部位での特別な神経保護治療用の標的を提供する。
【０００８】
これまでの治療的選択は、非常に期待外れである：血栓溶解は、rtPAを用いるが、主な臨床試験（NINDS）において有効であると判明した唯一の治療法は、３時間ウィンドー以内で有効であるに過ぎず、虚血性卒中の患者の数パーセントのみへの適用に限定されている。言い換えれば、基本的な支持的治療法に加えて、現在では、具体的には、卒中の95%超を治療することができない。このことは、ここ10年に渡って現れているこの疾患の基礎的な病理生理学に関する我々の知識とは正反対である。特に、実質的な脳損傷及び内因性神経保護のメカニズム、並びに機能性かつ構造的な再構築のメカニズムに広範な知識が集積している。
【０００９】
近年、神経保護性を有する内因性脳タンパク質の潜在的な治療的役割に注目が集まっている。腎臓の尿細管周囲毛細血管内皮細胞により主に産生される糖タンパク質ホルモンであるEPOは、成長ホルモン/プロラクチンサイトカインファミリーのメンバーであり（Zhu Y. and D'Andrea A.D: (1994) Curr. Opin. Hematol. 1: 113-118)、有望な候補物である。EPOは最初に特徴付けられ、現在では造血性ホルモンとしての役割が広く知られているが、齧歯動物及びヒトの脳組織での、及び培養されたニューロン及び星状細胞でのEPO及びその受容体（EPOR）の検出は、EPOの他の生物的役割の研究を拡げた。
【００１０】
脳では、パラクリンEPO/(Epo-R)2系が、成人の赤血球生成の内分泌系とは関係なく存在する；ニューロンは(Epo-R)2を発現し、星状細胞はEPOを産生する（Ruscher et al. (2002) J. Neurosci. 22, 10291-301; Prass et al. (2003) Stroke 34, 1981-1986）。EPOが虚血及び低酸素症により誘導される神経アポトーシスの強力なインヒビターである、ことがin vitro及びin vivoで証明された（Ruscher et al. (2002) J. Neurosci. 22, 10291-301; Bernaudin, M., et al. (1999) J Cereb Blood Flow Metab. 19: 643-51; Morishita, E., et al. (1997) Neuroscience. 76: 105-16）。EPOの神経培養物への添加は、低酸素症及びグルタミン酸毒素に対して保護し（Henn F. A: and Braus D.F. (1999) Eur. Arch. Psychiatry Clin. Neurosci. 249: 48-56, Vogeley K. et al. (2000) Am. J. Psychiatry 157: 34-39）、卒中の齧歯動物モデルにおいて神経障害を減じる (Brines M. L. et al. (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97: 10526-10531、及びBernaudin et al. (1999) J. Cereb. Blood Flow Metab. 10: 643-651) ことがいくつかのグループにより報告された。これらの実験の有望な結果は、急性卒中のEPO治療が安全であり、有用であるかもしれないことを示す、ヒト試験で確認されている (Ehrenreich H. et al. (2002) Mol. Medicine 8: 495-505) 及びWO 00/35475 A2）。これらの細胞及びEPOのより特定の神経保護性は、この領域での更なる研究をもたらし、より大規模な試験でのこれらの発見を実証し、そしてEPOの使用は現在、例えば統合失調症を含む他の処方においても提案されている（Ehrenreich H et al. (2004) Molecular Psychiatry 9: 42-54、及びWO 02/20031 A2）。
【００１１】
組織損傷を予防するためのEPOの適用について、造血活性は通常、必要とはされず、低酸素症又は虚血を引き起こした組織損傷の効果を処置し又は改善するために大量のEPOが投与される場合には、有害であり得る。そのため、細胞保護性のみを示すが造血性を示さない、EPO変異体を創製する試みがなされてきた。米国特許出願第2003/0130197号は、天然のEPO又はその断片に配列相同性を有さない、神経変性疾患の治療のためのEPOのペプチド模倣体を記載する。米国特許第6,531,121号明細書は、組換えEPOの完全脱シアル酸化により生じるアシアロエリスロポエチンが内皮細胞壁を越える高い能力を示し、減少した造血活性を有した、ことを開示する。カルバミル化エリスロポエチン（CEPO）は、組織保護的効果を示すが、赤血球生成効果を示さないことも明らかとなった（Leist et al. (2004) Science 305: 239-242、及びWO 2005/025606 A1）。
【００１２】
最後に、EPOの17-マーのペプチドは、２つの神経細胞株、SK-N-MC及びNS20Yの細胞死を阻害し、一方、造血活性を有さない、ことが明らかとなった（Campana W. M. et al. (1998) Int. J. Mol Medicine 1: 235-241）。しかしながら、1 ng/mlのEPOペプチドは、NS20Y細胞における100 pg/ml組換えEPO（rhEPO）と同一の抗アポトーシス効果、及びSK-N-MC細胞における400 pg/ml rhEPOと同一の抗アポトーシス効果を引き出す必要があった。約66.000 g/molの（理論分子量は約33.000 g/molであるが、rhEPOに含まれるオリゴ糖残基の重量を含まない）及び約1.900 g/molのEPOペプチドのrhEPOの見掛け分子量を考慮すると、各々、rhEPOの1.52 pmol/l及び6.06 pmol/lの濃度であり、1 nmol/lのEPOペプチドは同一レベルの細胞保護効果を引き出した。結果的に、EPOペプチドは、細胞死を抑制する点でrhEPOよりも650-倍から165-倍活性が低い。17-マー内に含まれるEPO領域がEPOの細胞保護機能の点で重要な役割を果たさない、ことが本図から明らかである。従って、先行技術において知られている減少した造血活性を有する全てのEPO変異体は、rhEPOと比較した場合に、当該EPO変異体はその天然グリコシル化を失うか又は人工的に先端を切られているかのいずれか、及び/又は非常に減少した細胞保護活性を有するので、天然でないという不利点を抱えている。そのため、先行技術では、天然EPOに近く、rhEPOと同一又はより高い組織保護活性を有するが、造血活性をほとんど有さないか又は全く有さない、特に赤血球活性を有さない、EPO誘導体を提供する要求がある。
【００１３】
この問題は、ヒト及びマウス組織（脳、腎臓）で天然に見出され、rhEPOと同等の又はより高い細胞保護活性を示すが、著しい造血活性を示さない、新規なEPO変異体の提供により解決される。
【発明の開示】
【００１４】
発明の概要
【００１５】
１つの局面では、本発明は、以下：
(a) 各々配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22で示される推定アミノ酸配列を有する、hs3、h1-4、h1-5、hs4、h1-1、h2-1、mS、mG3、mG5、m301及びmK3と称されるポリペプチドの少なくとも成熟形態をコードするポリヌクレオチド；
(b) 当該ポリペプチドの少なくとも成熟形態をコードする、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、19及び21で示される、コード配列を有するポリヌクレオチド；
(c) 配列番号14、16、18、20及び22で示される推定アミノ酸配列を有する、ポリペプチドmS、mG3、mG5、m301及びmK3のヒト化変形体（humanized version）をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号32、34、36及び38で示されるアミノ酸配列の群より選ばれるアミノ酸配列のN-末端における、配列番号24、26、28及び30で示されるアミノ酸配列の群より選ばれるアミノ酸配列の融合、を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(e) 配列番号31、33、35及び37で示されるポリヌクレオチド配列の群より選ばれるポリヌクレオチド配列の5'における、配列番号23、25、27及び29で示されるポリヌクレオチド配列の群より選ばれるポリヌクレオチド配列の融合を含むポリヌクレオチド；
(f) (a)〜(e)のいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの誘導体をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該誘導体において、1〜10個のアミノ酸残基は当該ポリペプチドに比べて保存的に置換され、当該誘導体は細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；
(g) (a)〜(f)のいずれか１つのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該断片において、1〜10個のアミノ酸残基はN-及び/又はC-末端が削除され、及び/又は1〜10個のアミノ酸は、当該ポリペプチドに比べて連結部のN-及び/又はC-末端的が削除され、当該断片は、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；
(h) (a)〜(g)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと少なくとも50%の同一性であり、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；並びに
(i)ポリヌクレオチドの相補鎖が、(a)〜(h)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリダイズし、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、当該ポリヌクレオチド； 
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド；又はかかるポリヌクレオチドの相補鎖、をコードするエリスロポエチン（EPO）変異体に関する。
【００１６】
本発明の更なる局面は、別の高等な真核細胞種由来のポリヌクレオチドをコードするエリスロポエチン（EPO）変異体のホモログである。
【００１７】
本発明の更なる局面は、エリスロポエチン（EPO）変異体であって、以下： 
(a) ヘリックスAを含む完全長EPOのN-末端部分を含み、以下：
(i) ヘリックスAとヘリックスBとの間の少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個のアミノ酸の断片；
(ii) ヘリックスBの少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27又は28個のアミノ酸の断片；
(iii) ヘリックスBとヘリックスCとの間の少なくとも2個のアミノ酸、好ましくは3、4、5又は6個のアミノ酸の断片；
(iv) ヘリックスCの少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22又は23個のアミノ酸の断片
(v) ヘリックスCとヘリックスDとの間の少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26又は27個のアミノ酸の断片；及び/又は
(vi) ヘリックスDの少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21又は22個のアミノ酸の断片
の少なくとも１つを欠く、EPO変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ここで当該変異体は、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；
(b) (a)のいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの誘導体をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該誘導体において、1〜10個のアミノ酸残基は、当該ポリペプチドに比べて保存的に置換され、当該誘導体は、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；並びに
(c) ポリヌクレオチドの相補鎖が、(a)〜(b)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリダイズし、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、当該ポリヌクレオチド、
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド；又はかかるポリヌクレオチドの相補鎖、をコードするエリスロポエチン（EPO）変異体に関する。
【００１８】
好ましい局面では、本発明のポリヌクレオチドは、DNA、ゲノムDNA又はRNAである。
【００１９】
別の局面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチドを含むベクターに関連する。ベクターに含まれるポリヌクレオチドは、原核宿主細胞及び/又は真核宿主細胞中で発現することができる発現制御配列に作動可能に連結される、ことが好ましい。本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチド又は本発明のベクターを用いて遺伝子工学的に組換えられた宿主細胞である。
【００２０】
本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドを含むトランスジェニック非-ヒト動物、本発明のベクター及び/又は本発明の宿主細胞である。
【００２１】
本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるEPO変異体ポリペプチドを産生するための方法であって、以下：宿主細胞を培養し、及び本発明のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを回収することを含む、前記方法である。
【００２２】
好ましい実施態様では、本発明の方法は、当該EPO変異体を修飾するステップを更に含み、当該修飾は、酸化、硫酸化、リン酸化、オリゴ糖の付加又はそれらの組合せからなる群より選ばれる。
【００２３】
本発明の別の局面は、EPO変異体の少なくとも１つを発現することができる細胞を産生する方法であって、本発明のベクターを用いてin vitroで細胞を遺伝子工学的に組換えることを含み、当該EPO変異体ポリペプチド（複数）は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる。
【００２４】
本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるか、又は本発明の方法により得られる、アミノ酸配列を有するポリペプチドである。
【００２５】
本発明の別の局面は、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体である。
【００２６】
本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のポリペプチド及び/又は本発明の抗体、並びに１以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。
【００２７】
本発明の別の局面は、細胞死、例えばアポトーシスとネクローシス及び炎症、に起因する組織損傷に関連する症状の治療又は予防のための医薬の製造のための、本発明のポリヌクレオチド、本発明のベクター、本発明の宿主細胞、本発明のポリペプチドの使用である。
【００２８】
本発明の好ましい使用において、細胞死は、虚血、低酸素症、細菌感染、ウイルス感染により誘導され、自己免疫学的、外傷的もしくは化学的（例えば、代謝的、毒素として）に誘導され、又は放射線誘導される。
【００２９】
本発明の好ましい使用において、症状は、急性の神経変性/神経炎症性疾患、又は慢性の神経変性/神経炎症性疾患であり、急性もしくは慢性の心臓（例えば、心筋梗塞）、肺（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患）、腎臓（例えば、糸球体腎炎）、肝臓（例えば、慢性肝臓障害）又は膵臓（例えば、膵炎）の疾患、あるいは当該症状が臓器（例えば、腎臓又は肝臓）又は細胞移植（例えば、幹細胞）に関連する。
【００３０】
好ましくは、急性神経変性及び/又は神経炎症疾患は、塞栓性閉塞及び血栓性閉塞を含む脳虚血又は梗塞、急性虚血に従う再潅流、出産前後期の低酸素-虚血損傷、心不全、頭蓋内出血、クモ膜下出血及頭蓋内損傷（例えば、CNS損傷）、脊髄損傷、椎間損傷、乳幼児ムチウチ揺さぶり症候群、流行性脳炎（例えば、ヘルペス脳炎）、髄膜炎（例えば、細菌性）、頭痛（例えば、片頭痛）からなる群より選ばれる。
【００３１】
好ましくは、慢性神経変性/神経炎症疾患は、痴呆（例えば、アルツハイマー病、血管性痴呆）、ピック病、びまん性レービー病、進行性核上性麻痺（スチール-リチャードソン症候群）、多発性硬化症、（シャイ・ドレーガー症候群を含む）多発性系萎縮症、神経変性に関連する慢性癲癇性症状、運動神経疾患、変性運動失調、皮質基底変性、ALS-グアム島パーキンソニスム痴呆複合、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、パーキンソン病、サイヌクレイノパシー、原発性進行性失語症、線条体黒質変性症、マシャド・ジョセフ病/3型脊髄小脳変性症及びオリーブ橋小脳変性症、ジル・ドラ・トゥレット症候群、球麻痺及び仮性球麻痺、脊髄筋萎縮症（spinal muscular atrophy）及び脊髄筋萎縮症（ケネディ病）（spinobulbar muscular atrophy）、原発性側索硬化症、進行性強直性対麻痺、ウェルドニッヒ・ホフマン病、クーゲルベルグ・ヴェランダー病、テイ・ザックス病、サンドホフ病、進行性強直性対麻痺、痙性対麻痺、進行性多発性白質脳症、家族性自律神経（リリィ-デイ症候群）、多発ニューロパシー（例えば、糖尿病、アルコール毒素、ギラン・バレー症候群、慢性炎症脱髄性多発神経障害）、プリオン病、耽溺、感情障害（例えば、鬱病）、融合失調症、慢性疲労症、慢性疼痛（例えば、腰痛）からなる群より選ばれる。
【００３２】
本発明の好ましい使用では、症状は加齢である。
【００３３】
本発明の好ましい使用では、医薬は、前記症状の開始前後に投与される。
【００３４】
詳細な説明
他に特定しない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関連する当業者により一般的に理解されるものと同一の意味を有する。コンフリクトの場合には、定義を含む本明細書は調整することになるだろう。本明細書に記載される方法及び材料と類似又は等価な方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及び材料を以下に記載する。本明細書に記載の全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、参考として全体的に援用される。本明細書に開示される材料、方法及び例は、例示に過ぎず、本発明を限定するものではない。
【００３５】
本発明は、EPO変異体は神経組織中で発現されるという驚くべき観察、及び変異体が、酸素-グルコース除去によって引き起こされる損傷からニューロンを保護したが造血活性を示さなかったという決定、に基づいている。この挙動は、EPOの造血機能が必要とされないか又は有害である状況において、治療薬としての使用に当該変異体を適合させる。従って、本発明の第１の局面では、以下：
(a) 各々配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22で示される推定アミノ酸配列を有する、hs3、h1-4、h1-5、hs4、h1-1、h2-1、mS、mG3、mG5、m301及びmK3と称されるポリペプチドの少なくとも成熟形態をコードするポリヌクレオチド；
(b) 当該ポリペプチドの少なくとも成熟形態をコードする、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、19及び21で示される、コード配列を有するポリヌクレオチド；
(c) 配列番号14、16、18、20及び22で示される推定アミノ酸配列を有する、ポリペプチドmS、mG3、mG5、m301及びmK3のヒト化変形体（humanized version）をコードするポリヌクレオチド；
(d) 配列番号32、34、36及び38で示されるアミノ酸配列の群より選ばれるアミノ酸配列のN-末端における、配列番号24、26、28及び30で示されるアミノ酸配列の群より選ばれアミノ酸配列の融合、を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(e) 配列番号31、33、35及び37で示されるポリヌクレオチド配列の群より選ばれるポリヌクレオチド配列の5'における、配列番号23、25、27及び29で示されるポリヌクレオチド配列の群より選ばれるポリヌクレオチド配列の融合を含むポリヌクレオチド；
(f) (a)〜(e)のいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの誘導体をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該誘導体において、1〜10個のアミノ酸残基が当該ポリペプチドに比べて保存的に置換され、当該誘導体が細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；
(g) (a)〜(f)のいずれか１つのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該断片において、1〜10個のアミノ酸残基はN-及び/又はC-末端が削除され、及び/又は1〜10個のアミノ酸は、当該ポリペプチドに比べて連結部のN-及び/又はC-末端的が削除され、当該断片は、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；
(h) (a)〜(g)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと少なくとも50%の同一性であり、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；並びに
(i) ポリヌクレオチドの相補鎖が、(a)〜(h)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリダイズし、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、当該ポリヌクレオチド、 
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド；又はかかるポリヌクレオチドの相補鎖、をコードするエリスロポエチン（EPO）変異体である。
【００３６】
本発明は更に、以下：
(a) 各々、配列番号50、51、52、53及び60で示される推定アミノ酸配列を有する、ha、hAma、hAmE、hA-20及びha-輸送配列と称されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチド；
(b) 当該ポリペプチドの少なくとも成熟形態をコードする、配列番号55、56、57、58及び61で示される、コード配列を有するポリヌクレオチド；
(c) (a)又は(b)のいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの誘導体をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該誘導体において、1〜10個のアミノ酸残基は当該ポリペプチドに比べて保存的に置換され、当該誘導体は細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；
(d) (a)又は(f)のいずれか１つのポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの断片をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該断片において、1〜10個のアミノ酸残基はN-及び/又はC-末端が削除され、及び/又は1〜10個のアミノ酸は、当該ポリペプチドに比べて連結部のN-及び/又はC-末端的が削除され、当該断片は、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；並びに
(e) (a)又は(g)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと少なくとも50%の同一性であり、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド；
(i) ポリヌクレオチドの相補鎖が、(a)〜(h)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリダイズし、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、当該ポリヌクレオチド、
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド；又はかかるポリヌクレオチドの相補さをコードするEPO変異体のペプチドに関する。
【００３７】
更なる局面では、本発明のポリヌクレオチドは、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない、別のより高等な真核細胞種、特に、哺乳類、より好ましくは、非-ヒト霊長類；齧歯動物、例えば、ラット又はギニアピッグ；反芻動物、例えば、ウシ；又はヒツジ；ウマ：ブタ；ウサギ；イヌ；又はネコから得られる、本発明のEPO変異体のホモログを含む。本文脈で、ホモログの用語は、本質的に配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、55、56、57、58又は61に従うポリヌクレオチドと同一の削除を含む、別の種から得られるEPO変異体をコードするポリヌクレオチドを称する。ポリヌクレオチドの削除が、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、50、51、52、53又は60に従うEPO変異体ポリペプチドにおいて各々削除されたポリペプチドと相同である、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの削除を含む場合には、ポリヌクレオチドの削除は、本質的に同一であると考えられる。２つのペプチド配列間のホモロジーを決定する基準は、充分に確立されている。この目的のために、BLASTPとしてのプログラムが使用できる。削除が、図１及び２でも示される配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19又は21における各々の削除として、おおよそ1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、55、56、57、58又は61個のヌクレオチドを含む場合には、削除は、なお、本質的に同一と考えられる。
【００３８】
本発明の更なる局面は、エリスロポエチン（EPO）変異体であって、以下： 
(a) ヘリックスAを含む完全長EPOのN-末端部分を含み、以下：
(i) ヘリックスAとヘリックスBとの間の少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19又は20個のアミノ酸の断片；
(ii) ヘリックスBの少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27又は28個のアミノ酸の断片；
(iii) ヘリックスBとヘリックスCとの間の少なくとも2個のアミノ酸、好ましくは3、4、5又は6個のアミノ酸の断片；
(iv) ヘリックスCの少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22又は23個のアミノ酸の断片
(v) ヘリックスCとヘリックスDとの間の少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26又は27個のアミノ酸の断片；及び/又は
(vi) ヘリックスDの少なくとも10個のアミノ酸、好ましくは11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21又は22個のアミノ酸の断片
の少なくとも１つを欠く、EPO変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
ここで当該変異体は、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；
(b) (a)のいずれか１つのポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドの誘導体をコードするポリヌクレオチド、ここで、当該誘導体において、1〜10個のアミノ酸残基は、当該ポリペプチドに比べて保存的に置換され、当該誘導体は、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さない；並びに
(c) ポリヌクレオチドの相補鎖が、(a)〜(b)のいずれか１つで特定されるポリヌクレオチドと緊縮条件下でハイブリダイズし、細胞保護性、特に神経保護活性を有するが本質的に造血活性を有さないポリペプチドをコードする、当該ポリヌクレオチド、
からなる群より選ばれるポリヌクレオチド；又はかかるポリヌクレオチドの相補鎖、をコードするエリスロポエチン（EPO）変異体である。
【００３９】
本文脈において、EPOポリペプチドのヘリックスA、B、C及びDは、図４で示されるマウス及びヒト由来の完全長EPOの各ヘリックスA、B、C及びD部位と相同である部位である。２つのポリペプチド配列間の相同性を決定する方法は当該分野では良く知られており、当業者の中には、例えば別の種から得られる所与のEPOポリペプチド配列を一列に並べ、そしてこのEPOポリペプチド中のヘリックスA、B、C及びDの各位置を決定することができるだろう。EPO変異体ポリヌクレオチドがより高等な真核生物、特に哺乳類又は鳥類から得られる、ことが好ましい。好ましい哺乳類は、ヒト、非-ヒト霊長類；齧歯動物、例えば、ラット又はギニアピッグ；反芻動物、例えば、ウシ；又はヒツジ；ウマ：ブタ；ウサギ；イヌ；又はネコから得られる。様々な種由来のポリヌクレオチドをコードするこのような非常に多数の安全長EPOが知られている。ネコ (Gene Bank受入番号 L10606)、ブタ (Gene Bank受入番号 10607)、ヒツジ (Gene Bank受入番号 10610)、イヌ (Gene Bank受入番号 L13027)、日本猿 (Gene Bank受入番号 M18189)、赤毛猿 (Gene Bank受入番号 L10609)、マウス (Gene Bank受入番号 12930)、ラット (Gene Bank受入番号 L10608)、ヒト (Gene Bank受入番号 M11319)、バリウシ (Gene Bank受入番号 U44762) 及びコブウシ (Gene Bank受入番号 L41354）を含むが、これらに制限されない。
【００４０】
好ましくは、EPO変体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、以下を欠く：(i); (ii); (iii); (iv); (v); (vi); (i) 及び (ii); (i) 及び (iii); (i) 及び (iv); (i) 及び (v); (i) 及び (vi); (ii) 及び (iii); (ii) 及び (iv); (ii) 及び (v); (ii) 及び (vi); (iii) 及び (iv); (iii) 及び (v); (iii) 及び (vi); (iv) 及び (v); (iv) 及び (vi); (v) 及び (vi); (i)、(ii) 及び (iii); (i)、(ii) 及び (iv)、(i)、(ii) 及び (v)、(i)、(ii) 及び (vi)、(i)、(iii) 及び (iv); (i)、(iii) 及び (v); (i)、(iii) 及び (vi); (i)、(iv) 及び (v); (i)、(iv) 及び (vi); (i)、(v) 及び (vi); (ii)、(iii) 及び (iv); (ii)、(iii) 及び (v); (ii)、(iii) 及び (vi); (ii)、(iv) 及び (v); (ii)、(iv) 及び (vi); (ii)、(v) 及び (vi); (iii)、(iv) 及び (v); (iii)、(iv) 及び (vi); (iii)、(v) 及び (vi); 又は、(iv)、(v) 及び (vi)。
【００４１】
細胞保護活性を示すポリペプチドは、酸素又はグルコース除去により、化学的又は放射線曝露により、あるいはウイルス性又は細菌性感染により引き起こされるアポトーシスによる損傷から神経を保護する各EPO変異体の能力の、少なくとも50%（例えば、少なくとも55%; 60%; 65%; 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99.5%; 又は100%、あるいはそれ以上）を有するポリペプチドである。細胞、特に当該分野で知られている神経細胞に対する損傷を決定するためのアッセイ。好適なアッセイは、本明細書の以下に記載される酸素-グルコース除去アッセイである。当該アッセイでは、読み出しは、ラクトースデヒドロゲナーゼ活性（LDH）の量である。しかしながら、細胞において引き出される損傷、特に細胞死（例えば、アポトーシス、ネクローシス）の量を評価することができる、様々な他の方法が存在する。これらのアッセイは、当該分野で知られている、タネルアッセイ、MTT-アッセイ、染色による生存/死滅アッセイ（例えば、エチジウムブロミド及びアクリジンオレンジ染色）、カスパーゼアッセイ、電子顕微鏡検査法を含むが、これらに限定されない。
【００４２】
本質的に造血活性を示さないEPO変異体ポリペプチドは、rhEPO及びwt mEPOのモル濃度と同一のモル濃度、CFU-E (コロニー形成単位-赤血球）の10%未満、好ましくは9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%又は1%未満での当該分野で公知のコロニー形成アッセイを引き出すポリペプチドであり、その例を以下に記載する。対照反応（wt又はEPO変異体なし）で観察されたCFU-E数を各値から差し引くことにより、各CFU-E数を、所与のrhEPO、wt mEPO又はEPO変異体について計算する。
【００４３】
本発明のポリペプチドの文脈では、用語「連結部」は、rhEPO又はマウスwt EPOでは連続しておらず、おそらくEPO mRNAでのスプライス事象又は他の再配列の結果であろう、２つのアミノ酸が互いに続く部位を称する。本発明のEPO変異体の各連結部は、図４から得られる、例えば、hS3についてENIT｜RVGQ、h1-4についてVGQQ｜ALLV、h1-5についてVNFY｜ALLV、hS4についてKRME｜PWEP、h1-1についてITVP｜GPVG、h2-1についてLNEN｜NHC、mSについてKRME｜KELM、mG3についてLLAN｜FLRG、mG5についてDTFC｜RRGD、m301についてKVNF｜LRGK、又はmK3についてLSEA｜VHGR。
【００４４】
本発明のポリヌクレオチド分子は、in vitroで合成することができ（例えば、ホスホロジアミダイト-型合成）、又は哺乳類の細胞等の細胞から得られる。
【００４５】
配列番号14、16、18、20及び 22で示される推定アミノ酸配列を有するmS、mG3、mG5、m301及びmK3と称されるEPO変異体は、各々、マウスから単離された。マウス配列は、ヒト配列に高い相同性を有する。ヒト及びマウスから得られるEPOのアミノ酸配列の配列は図４に示す。マウス配列が、位置８のアラニン残基の欠如、及び以下の39個の置換（番号付けは、ヒトEPO内の各アミノ酸位置に従う。示された第１のアミノ酸はその位置がヒトアミノ酸であり、第２のアミノ酸は、対応するマウスのアミノ酸である）により、ヒト配配列と識別されることは明らかである：4H→4P、6C→6R、9W→9T；11W→11L、18S→18L；19L→19I；27G→27C；43L→43I；52I→52V；54T→54M；60H→60G；61C→61P、62S→62R；64N→64S；84G→84E；85Q→85E；95A→95S；101V→101I；103R→103Q；104G→104A；109V→109A；115W→115P；117P→117T；122V→122I；126V→126I；134T→134S；138A→138V；145A→145L；146I→146M；151A→151T；152A→152T；153S→153P；154A→154P；160I→160L；162A→162V；166R→166C；173S→173A；187A→187V、及び190T→190R。ヒト化mS、mG3、mG5、m301又はmK3は、マウスのアミノ酸配列よりもヒトの、位置８に、及び/又は１以上の好ましくは2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36又は37個の位置に追加のアラニン残基を有する。mS、mG3、mG5、m301及びmK3は、完全にヒト化されており、すなわち、上記位置の全てのアミノ酸が各変異体に存在する限りは、当該アミノ酸はマウス配列よりもむしろヒト配列についてである、ことが特に好ましい。マウス変異体のヒト化は、ヒトの治療において使用するときに遭遇することがある免疫学的問題を少なくするだろう。
【００４６】
本発明のEPO変異体核酸分子は、DNA、cDNA、ゲノムDNA、合成DNA又はRNAでよく、二重-鎖でも単一-鎖でもよく、センス鎖及び/又はアンチセンス鎖でもよい。これらの分子は、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により製造してもよく、又は１以上の制限エンドヌクレアーゼによる処理により製造してもよい。リボ核酸（RNA）分子は、in vitro転写により製造することができる。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチド分子は、天然配列、又は天然配列とは異なった配列を含むことができるが、遺伝子コードの縮重に起因して、同一のポリペプチド、すなわち配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22を有するポリヌクレオチドをコードすることができる。加えて、これらの核酸分子は、コード配列に限定されない。例えば、当該核酸分子は、コード配列の上流又は下流にある非-コード配列のいくつか又は全てを含むことができる。
【００４８】
加えて、本発明の単離核酸分子は、天然状態ではそういうものとは見られない断片を包含することができる。従って、本発明は、ベクター（例えば、プラスミド又はウイルス性ベクター）に組み込まれた、あるいは異種細胞のゲノム（又は、天然染色体の位置以外の位置で、同種細胞のゲノム）内に組み込まれた、組換え核酸分子を包含する。よって、組換え核酸分子及びその使用は、以下で更に考察する。
【００４９】
好ましい実施態様では、本発明のポリヌクレオチドはまた、(a) 配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、50、51、52、53又は60のポリペプチドをコードする核酸分子；及び (b) 各々、配列番号1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、55、56、57、58又は61の塩基配列、と少なくとも50%、好ましくは55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%又は99%の同一性であり、同時に細胞保護性、特に神経保護活性を有するが、本質的に造血活性を有さない、核酸分子を含む。
【００５０】
２つの配列間の同一性の割合の決定は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 5873-5877の数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。かかるアルゴリズムは、Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410のBLASTN及びBLASTPプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド調査は、BLASTNプログラム、スコア = 100、ワード長 = 12で行い、核酸をコードするEPO変異体ポリペプチド対して塩基配列相同性を得る。BLASTタンパク質調査は、BLASTPプログラム、スコア = 50、ワード長 = 3で行い、EPO変異体ポリペプチド対してアミノ酸配列相同性を得る。比較目的のためのギャップ付きアライメントを得るためには、Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402に記載のようにしてギャップ付きBLASTが利用される。BLAST及びギャップ付きBLASTプログラムを利用するときには、各々のプログラムのデフォルトパラメータが使用される。
【００５１】
ハイブリダイゼーションも、２つの核酸配列間の相同性の指標として使用することができる。本明細書に開示されているEPO変異体のいずれかをコードする核酸配列、又はその誘導体もしくは断片は、標準的なハイブリダイゼーション法に従うハイブリダイゼーションプローブとして使用することができる。EPO変異体プローブの、試験源（例えば、哺乳類細胞）由来のDNA又RNAへのハイブリダイゼーションは、試験源における関連EPO DNA又はRNAの存在の指標である。ハイブリダイゼーション条件は、当業者には知られており、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y., 6.3.1-6.3.6, 1991に見出される。緊縮条件は、45℃での6X塩化ナトリウム/クエン酸ナトリム（SSC）でのハイブリダイゼーション、次いで65℃での0.2 X SSC、0.1 % SDSでの洗浄と等価であると定義される。内部欠損を有する変異体に特異的なプローブを選択するときには、相同性のある核酸を検出するために使用されるプローブが欠損の境界、例えば、hs3、h1-4、H1-5、hS4、mS、mG3、mG5又はm301、を重複する、ことが好ましい。スプライシングがタンパク質の別のC-末端、例えばh1-1、h2-1又はmK3をもたらす場合には、相同性のあるDNA配列を検出するために使用されるプローブは、公知のEPO配列と別のC-末端との境界を重複する、ことが好ましい。例えば、スプライス部位の10の5'側相補的塩基、及びスプライス部位の10の3'側相補的塩基を含む、プローブを設計することができる。
【００５２】
「単離されたDNA」は、(1) 任意の天然配列の配列と同一でない配列を含むDNA、又は (2) 天然配列（例えば、cDNA又はゲノムDNA）を有するDNAの文脈で、対象のDNAを含む遺伝子が天然に生じる生物のゲノムにおいて、対象のDNAを含む遺伝子と隣り合う遺伝子の少なくとも１つがないDNA、のいずれかである。従って、当該用語は、ベクター、自発的に複製するプラスミドもしくはウイルス、又は原核細胞もしくは真核細胞のゲノムDNAに組み込まれる組換えDNAを含む。当該用語は、cDNAのような分離した分子（separate molecule）も含む。そこでは、対応するゲノムDNAは、イントロンを有し、そのため、異なった配列；フランキング遺伝子の少なくとも１つを欠くゲノム断片；ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）により産生されたcDNA断片又はゲノムDNA；フランキング遺伝子の少なくとも１つを欠くゲノム断片；融合タンパク質、突然変異タンパク質又は所与のタンパク質断片のような非-天然タンパク質をコードするDNA；及び、cDNAの縮重変異体又は天然核酸である核酸、を有する。加えて、当該用語は、ハイブリッド遺伝子、すなわち、非-天然融合タンパク質をコードする遺伝子、の一部である組換え塩基配列を含む。単離DNAは、例えば、cDNAもしくはゲノムDNAライブラリー、又は例えば、制限消化反応混合物又は電気泳動ゲルスライス中のゲノムDNA制限消化生成物内の、数百から数百万の他のDNA分子中のDNAを意味しない、ことは先の記載から明らかであろう。
【００５３】
本発明の更なる局面は、本発明のポリヌクレオチド（複数）を含むベクター、又は本発明のポリヌクレオチドによってコードされるタンパク質である。用語「ベクター」は、タンパク質及び/又は核酸を細胞に導入することができるポリヌクレオチド又はその混合物を称する。導入されたポリヌクレオチドによりコードされるタンパク質は、ベクターの導入の際に細胞内で発現される、ことが好ましい。
【００５４】
好ましい実施態様では、本発明のベクターは、プラスミド、ファージミド、ファージ、コスミド、人工哺乳類染色体、ノックアウト又はノックイン構築体、ウイルス、特にアデノウイルス、ワクシニアウイルス、弱毒化ワクシニアウイルス、カナリアポックスウイルス、レンチウイルス（Chang, L. J. and Gay, E. E. (20001) Curr. Gene Therap. 1: 237-251)、ヘルペスウイルス、特に単純ヘルペスウイルス（HSV-1, Carlezon, W. A. et al. (2000) Crit. Rev. Neurobiol.)、バキュロウイルス、レトロウイルス、アデノ-関連-ウイルス（AAV, Carter, P.J. and Samulski, R.J. (2000) J. MoI. Med. 6: 17-27)、リノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（HIV）、フィロウイルス、及びそれらの改変体（例えば、Cobinger G. P. et al (2001) Nat. Biotechnol. 19: 225-30参照)、ビロソーム、「ネイキド」DNAリポソーム、並びに核酸コート粒子、特にゴールド球を含む。アデノウイルスベクター又はレトロウイルスベクターのようなウイルスベクターは特に好ましい（Lindemann et al. (1997) Mol Med. 3: 466-76、及びSpringer et al. (1998) Mol. Cell. 2: 549-58)。リポソームは、通常、カチオン性、中性及び/又はアニオン性の脂質からできている、例えば、リポソーム懸濁液の超音波処理によりつくられる、単層又は多層状小胞である。DNAは、例えば、リポソーム表面にイオン的に結合することができ、又はリポソームの内部に包まれることができる。好適な脂質混合物は、当該分野で公知であり、例えば、いずれも様々な細胞株で使用されてきた、DOTMA (1,2-ジオレイルオキシプロピル-3-トリメチルアンモニウムブロミド）及びDPOE (ジオレイオイルホスファチジル-エタノールアミン）を含む。
【００５５】
核酸コート粒子は、細胞内に粒子を機械的に導入させる、いわゆる「遺伝子銃」を用いて、細胞内に核酸を導入するための別の手段である。好ましくは、粒子自体は、不活性であり、そのため、好ましい実施態様では、ゴールド球からつくられる。
【００５６】
更なる局面では、本発明のポリヌクレオチドは、原核宿主細胞及び/又は真核宿主細胞内での発現を可能にする発現制御配列に作動可能に連結される。上で言及した転写/翻訳調節要素は、誘導的及び非-誘導的で、構成的な、細胞周期が調節された、代謝的に調節されたプロモーター、エンハンサー、オペレーター、サイレンサー、リプレッサー、及び当業者に公知であって、遺伝子発現を推進し又は調節する他の要素、を含むが、これらに限定されない。かかる調節要素は、構成的発現を方向付ける調節要素、例えばRNAポリメラーゼIIIにより転写されるプロモーター、例えばsnRNA U6又はscRNA 7SK遺伝子用のプロモーター、サイトメガロウイルスhCMV中間体初期遺伝子、SV40アデノウイルスの初期又は後期プロモーター、ウイルス性プロモーター及び例えばNBV、HCV、HSV、HPV、EBV、HTLV、MMTV又はHIVから得られる活性化因子配列；誘導可能な発現を可能にする調節要素、例えば、CUP-1プロモーター、例えばtet-on又はtet-off系で採用されるtet-リプレッサー、lac系、trg系；組織特異的発現を方向付ける調節要素、好ましくは神経細胞特異的発現、例えばプロモーター（例えば、Thy-1.2、NSE、II型ミオシン軽鎖、チロシンヒドロキシラーゼ、CaMKIIアルファプロモーター、血小板由来成長因子ベータ-鎖（PDGF）、ドーパミンベータ-ヒドロキシラーゼ、Tau、細胞周期特異的発現を方向付ける調節要素（例えば、NRSE/RE-1; 神経-制限サイレンシング要素/リプレッサー要素1）、例えば、cdc2、cdc25C又はサイクリンA；又は、TAC系、TRC系、ファージAの主要オペレーター及びプロモーター部位、fdコートタンパク質の制御部位、3-ホスホグリセリン酸キナーゼ用のプロモーター、酸性ホスファターゼのプロモーター、並びに酵母α-又は交配因子のプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００５７】
本明細書で用いられる「作動可能に結合された」は、発現制御配列が、対象のコード配列の発現を効果的に制御するように、遺伝子的構築物内に組み込まれることを意味する。
【００５８】
同様に、本発明のポリヌクレオチドは、追加のポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部、例えば、マーカー又はレポーターとして機能するタンパク質をコードする配列、を形成することができる。ハイブリッド遺伝子は、融合タンパク質をもたらすことができ、又は、２以上の部分は、２以上の分離タンパク質の発現をもたらす内部的リボゾーム挿入位置（IRES）配列により分断することができる。マーカー及びリポーター遺伝子の例は、β-ラクタマーゼ、クロラムフェニコール アセチルトランスフェラーゼ（CAT）、アデノシンデアミナーゼ（ADA）、アミノグリコシド リン酸トランスフェラーゼ（neor、G418r）、ジヒドロ葉酸還元酵素（DHFR）、ヒグロマイシン-B-リン酸トランスフェラーゼ（HPH）、チミジンキナーゼ（TK）、(β-ガラクトシダーゼをコードする）lacZ、緑色蛍光タンパク質（GFP）及びそれらの変異体、並びにキサンチン-グアニンホスホリボシル-トランスフェラーゼ（XGPRT）を含む。本発明の実施に関連する多くの標準的手段と同様に、当業者は、追加の有用な試薬、例えばマーカー又はレポーターの機能として役立つことができる追加の配列、を知っているだろう。ハイブリッド遺伝子の発現が１つのポリペプチドをもたらす場合には、ハイブリッドポリペプチドは、通常、第１部分及び第２部分を含むだろう：第１部分は、EPO変異体ポリペプチドであり、第２部分は、例えば、上記のレポーターであるか又はIg定常領域もしくはIg定常領域の一部分、例えばIgG2a重鎖のCH2及びCH3ドメインである。他のハイブリッドは、精製及び/又は検出を助けるための異種ペプチド配列、例えば、抗原性タグ、例えば、mycタグ又は領域に優先的に結合するタグ例えばキチンタグ又はHisタグ、を含むことができる。組換え核酸分子は、異種シグナル配列に作動可能に結合されるEPO変異体ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含むこともできる。かかるシグナル配列は細胞内の異なったコンパートメントにタンパク質を方向付けることができ、当業者によく知られている。好ましいシグナル配列は、得られるタンパク質の分泌を促進する配列である。好ましくは、これらのシグナル及び/又はタグ配列は、２つの多くのアミノ酸、好ましくは最終EPOに10個以下の追加のアミノ酸、以内の本質的に純粋なタンパク質を提供するために、精製後にEPO変異体を開裂することができるように設計される。かかる開裂部位は、当該分野ではよく知られ、例えばエンドペプチターゼ開裂部位及びインテイン開裂部位を含む。
【００５９】
本発明の別の局面は、上記のポリヌクレオチド又はベクターを用いて遺伝子工学的に組換えられた宿主細胞である。本発明の目的のために使用することができる宿主細胞は、例えば、本発明のポリヌクレオチド分子を含む、組換えバクテリオファージDNA、プラスミドDNA、又はコスミドDNA発現ベクターを用いて形質転換することができる、原核細胞、例えば細菌（例えば、E. コリ（E. coli）及びB. サブチリス（B. subtilis））；単純真核細胞、例えば、本発明のポリヌクレオチド分子を含む、組換え酵母発現ベクターを用いて形質転換することができる、酵母（例えば、サッカロミセス属（Saccharomyces）及びピキア属（Pichia））；昆虫細胞系、例えば、本発明のポリヌクレオチド分子を含む、組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）を用いて形質転換することができる、Hi5細胞のSf9；例えば、プラスミドを用いて注入することができるゼノプス（Xenopus）卵母細胞；例えば、組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワー・モザイク・ウイルス（CaMV）又はタバコモザイク病ウイルス（TMV））により感染させることができる、又はEPO変異体塩基配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Tiプラスミド）により形質転換することができる、植物細胞系；あるいは、例えば、例えば哺乳類細胞（例えば、メタロチオネインプロモーター）のゲノム、哺乳類ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、CMV IE及びワクシニアウイルス7.5Kプロモーター）又は細菌性細胞（例えば、tet-リプレッサー結合は、tet-on及びtet-off系で採用される）から得られたプロモーター、を含む組換え発現構築物により形質転換することができる、哺乳類細胞系（例えば、COS、CHO、BHK、HEK293、VERO、HeLa、MDCK、Wi38、Swiss 3T3及びNIH 3T3細胞）、を含むが、これらに限定されない。哺乳類から直接得られ、プラスミドベクターで形質転換されるか又はウイルスベクターで感染される一次又は二次細胞も、宿主細胞として有用である。本発明のポリヌクレオチドを導くために使用される宿主細胞及び各ベクターによって、ポリヌクレオチドは、例えば、染色体又はミトコンドリアDNAに組み込むことができる、あるいは染色体外で、例えばエピソーム的に（episomally）維持することができる、あるいは細胞内に一時的に含むことができるに過ぎない。
【００６０】
EPOはin vivoで高度にグリコシル化されるので、タンパク質を忠実にグリコシル化する発現系を選択することが望ましい。従って、本発明のEPOスライス変異体をコードするポリヌクレオチドを、より高等の真核細胞、特に哺乳類細胞、例えば、COS、CHO、BHK、HEK293、VERO、HeLa、MDCK、Wi38、Swiss 3T3又はNIH 3T3細胞に導入することが好ましい。
【００６１】
本発明の更なる局面は、上記のポリヌクレオチド、ベクター及び/又は宿主細胞を含むトランスジェニック非-ヒト動物である。当該動物は、体を構成する細胞の一部のみが本発明のポリヌクレオチド、ベクター及び/又は細胞を含むことを意味するモザイク様（mosaic）動物か、あるいは動物の細胞の全てが本発明のポリヌクレオチド及び/又はベクターを含むか、又は本発明の細胞から得られることを意味する動物でよい。モザイク様又はトランスジェニック動物は、細胞に含まれる本発明のポリヌクレオチドについて同種接合か又は異種接合のいずれかでよい。好ましい実施態様では、トランスジェニック動物は、本発明のタンパク質をコードする遺伝子に関して同種接合かもしくは異種接合ノックアウト又はノックイン動物のいずれかである。当該動物は、原則としていずれの動物でもよいが、好ましくは、非-ヒト霊長類であるウマ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ネコ、ウサギ、マウス、ラット、ギニアピッグ、ハムスター又はアレチネズミの群より選ばれる哺乳類である。
【００６２】
本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるEPO変異体ポリペプチドの製造法であって、上記の宿主細胞を培養し、及び前記のポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドを回収すること、を含む前記方法である。宿主細胞及びベクターの好ましい組合せは、上で述べたとおりであり、更なる組合せは当業者には容易に明らかであろう。回収されたペプチドの後の意図された使用により、好適な細胞種が選択される。細胞により産生されるタンパク質が本質的にグリコシル化の自然なパターンを示し、原核細胞が選択されることが望ましい場合には、例えば、真核細胞においてのみ、タンパク質に一般的に導入されるグリコシル化又は他の修飾反応が望ましくないか又は必要でない場合には、上記のように、真菌細胞が好ましく選択される。
【００６３】
タンパク質薬物の薬物動力学がタンパク質の修飾により著しく変更され得ることは先行技術において知られている。完全長EPOについて、グリコシル化、特にオリゴ糖側鎖の末端のシアル酸残基の存在は、循環時間の原因となり、シアル酸基の除去は、肝臓によるクリアランスを増加させるガラクトース残基を曝露させる、ことが記載されている（WO 95/05465）。そのため、EPO循環時間を増加させるために採られる１つのアプローチは、シアル酸残基の増加であった。従って、いくつかのアプローチは、追加のグリコシル化部位の提供を含む（例えば、WO 91/05867、WO 94/09257及びWO 01/81405参照）。かかる修飾EPOアナログは、少なくとも１つの追加のN-結合及び/又はO-結合糖鎖を有することがある。EPOの半減期を改善する他の試みは、アミノ酸骨格の長さを変えるというポリエチレングリコール残基（PEG）の付加を含んだ（例えば、WO 00/32772、WO 01/02017、WO 03/029291参照）。別の試みは、酸化、硫酸化、リン酸化、PEG化又はそれらの組合せを用いて更に修飾された、少なくとも１つのN-結合及び/又はO-結合オリゴ糖を用いるEPO分子の修飾を使用した（WO 2005/025606参照）。全てのこれらのアプローチは、本発明のEPO変異体の半減期を延ばすために等しく採用することができ、よって、好ましい実施態様では、上記の方法は、EPO変異体を修飾するステップ、ここで、当該修飾は、酸化、硫酸化、リン酸化、オリゴ糖の付加又はそれらの組合せからなる群より選ばれる、を更に含む。更なるN-結合又はO-結合オリゴ糖の付加が望ましい場合には、各位置が本発明の変異体中に存在するときには、先行技術において記載されている追加のグリコシル化部位を、例えば位置30、51、57、69、88、89、136及び/又は138に導入することにより、当該オリゴ糖を導入することが可能である（WO 01/81405参照）。
【００６４】
本発明の更なる局面は、EPO変異体の少なくとも１つを発現することができる細胞の製造法であって、請求項３又は４記載のベクターでin vitroで細胞を遺伝工学的に組換えることを含む、ここで当該EPO変異体ポリペプチド（複数）は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされる、当該方法である。
【００６５】
本発明の別の局面は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるアミノ酸配列を有する又は上記の方法により得られるポリペプチドである。本発明のポリペプチドは、1〜10のN-及び/又はC-末端欠損を有する、本明細書に開示された全てのポリペプチド及びこれらのポリペプチドの断片を含む。好ましくは、欠損は、10未満、9未満、8未満、7未満、6未満、5未満、4未満、3未満、2未満、1未満のアミノ酸である。本発明により包含されるポリペプチドはまた、関連しないアミノ酸配列に融合される、上で特定された、配列番号2、4、6、8、10、12、14、16、18、20及び22で示されるEPOスライス変異体、又は配列番号14、16、18、20及び22で示される変異体のヒト化変形体又はそれらの断片のいずれかを含む、融合タンパク質を含む。関連しない配列は、追加の機能性ドメイン又はシグナルペプチドを含むことができる。シグナルペプチドは以下により詳細に記載され、例示される。
【００６６】
ポリペプチドは、上記のポリペプチドのいずれでのよいが、10以下（例えば、10以下、9以下、8以下、7以下、6以下、5以下、4以下、3以下、2以下又は1以下）の保存的置換を有するポリペプチドがよい。保存的置換は、当該分野で公知であり、典型的には、例えば１つの極性アミノ酸と別の極性アミノ酸との置換、及び１つの酸性アミノ酸と別の酸性アミノ酸との置換を含む。従って、保存的置換は、好ましくは、以下：グリシン、アラニン、バリン、プロリン、イソロイシン及びロイシン（非極性、脂肪族側鎖）；アスパラギン酸及びグルタミン酸（負に荷電した側鎖）；アスパラギン、グルタミン、メチオニン、システイン、セリン及びスレオニン（極性の非電荷側鎖）；リシン、ヒスチジン及びアルギニン；フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン（芳香族側鎖）；並びに、アルギニン及びヒスチジン（正に荷電した側鎖）、のアミノ酸群内での置換を含む。例えばpKI等に与える所定の置換の効果を決定する方法は当該分野ではよく知られている。１以上の保存的置換を有するポリペプチドに必要とされるものは、損傷/細胞死（例えば、アポトーシス又はネクローシス）からニューロンを保護するための、改変されていないEPO変異体の能力の少なくとも50%（例えば、少なくとも、55%; 60%; 65%, 70%; 75%; 80%; 85%; 90%; 95%; 98%; 99%; 99.5%; 又は100%以上）を有することである。ここで、当該細胞死は、酸素及び/又はグルコース除去により、毒素、化学的、物理的、機械的、炎症性もしくは放射線曝露により、又はウイルス性もしくは細菌性感染により引き起こされる。
【００６７】
ポリペプチド及びペプチドは、好適なポリペプチド又はペプチドをコードする塩基配列を用いて、標準的なin vitro組換えDNA法及びin vivo突然変異誘発法により産生することができる。当業者に周知の方法は、関連するコード配列及び好適な転写/翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築するために使用することができる。例えば、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版) [Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., 1989]、及びAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology [Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989]に記載の方法を参照。
【００６８】
本発明のポリペプチド及び断片は、上記のものであるが、関連するポリペプチドの生存を助けるためのブロッキング剤の、アミノ-及び/又はカルボキシル-末端での付加により、in vivoでの使用のために修飾されたものも含む。このことは、細胞取り込みの前に、ペプチド末端がプロテアーゼによって分解される傾向にある状況において有用であり得る。かかるブロッキング剤は、投与されるべきペプチドのアミノ及び/又はカルボキシ末端残基に結合することができる追加の関連又は関連しないポリペプチド配列を含むが、これらに限定されない。このことは、ペプチド合成中に化学的に、又は当業者に知られている方法による組換えDNA法により、行うことができる。
【００６９】
代替的には、ブロッキング剤、例えばピログルタミン酸又は当該分野で公知の他の分子は、アミノ及び/又はカルボキシル末端残基に結合することができるか、あるいは、アミノ末端のアミノ基又はカルボキシ末端のカルボキシ基は、異なった部分と置換することができる。同様に、ペプチドは、投与の前に、薬学的に許容される「担体」タンパク質と共有結合的に又は非共有結合的に結合することができる。
【００７０】
本明細書で用いられる用語「単離された」ポリペプチド又はペプチド断片は、例えば、組織、例えば舌、膵臓、肝臓、脾臓、卵巣、精巣、筋肉、関節組織、神経組織、胃腸組織又は腫瘍組織、又は体液、例えば血液、血清又は尿において、天然対応物を有さないか、又はそれに伴って天然に存在する成分から分離又は精製された、のいずれかのポリペプチド又はペプチドの断片を意味する。典型的には、ポリペプチド又はペプチド断片は、タンパク質及び天然に関連しない他の天然有機分子を含まず、乾燥重量で少なくとも70%であるときに、「単離された」と考えられる。好ましくは、本発明のポリペプチド（又はそのペプチド断片）の調製物は、本発明のポリペプチド（又はそのペプチド断片）の各々、少なくとも80重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、及び最も好ましくは少なくとも99重量%である。従って、例えば、ポリペプチドxの調製物は、ポリペプチドxの、少なくとも80重量%、より好ましくは少なくとも90重量%、及び最も好ましくは少なくとも99重量%である。化学的に合成されるポリペプチドは、その性質上、それに伴って天然に存在する成分から分離されるので、合成ポリペプチドは「単離される」。
【００７１】
本発明の単離されたポリペプチド（又はそのペプチド断片）は、例えば、天然資源（例えば、組織又は体積）からの抽出により；ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現により；又は、化学的合成により得られる。ポリペプチドに伴って天然に存在する成分が必ずしも存在しないので、天然に存在する資源と異なった細胞系において産生されるポリペプチドが「単離される」。単離又は精製の程度は、任意の好適な方法、例えばカラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又はHPLC分析により測定することができる。本発明の更なる局面は、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるか又は上記の方法により得られるEPO変異体ポリペプチドに特異的に結合する、抗体である。用語「抗体」は、モノクローナル及びポリクローナル抗体及びその断片、特に、Fc-断片、いわゆる「単一-鎖-抗体」(Bird R. E. et al (1988) Science 242: 423-6）、キメラ抗体、ヒト化抗体、特にCDR-グラフト抗体、並びにダイアボディ又はテトラボディ（Holliger P. et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90: 6444-8）を含む。本発明のポリペプチドに特異的に結合するための、例えばファージディスプレイ法を含む技術により選択されるタンパク質のような免疫グロブリンも含まれる。本文脈で、用語「特異的結合」は、スプライス連結点又は他の方法によりつくられる連結点、例えば、hS3についてENIT｜RVGQ、h1-4についてVGQQ｜ALLV、h1-5についてVNFY｜ALLV、hS4についてKRME｜PWEP、h1-1についてITVP｜GPVG、h2-1についてLNEN｜NHC、mSについてKRME｜KELM、mG3についてLLAN｜FLRG、mG5についてDTFC｜RRGD、m301についてKVNF｜LRGK、又はmK3についてLSEA｜VHGR、から得られるペプチドに対して生じる抗体を意味する。かかるペプチドは、追加のもしくはより少ないN-又はC-末端アミノ酸を含むことができる。EPO変異体に対する抗体の親和性が、完全長のヒト又はマウスEPOよりも、少なくとも50-倍高く、好ましくは100-倍高く、より好ましくは少なくとも1000-倍高い場合には、抗体は、EPO変異体に特異的であると考えられる。好ましくは、本発明の特異的抗体は、完全長のヒト又はマウスEPOに結合しないか、又は本質的に結合しない。抗体の作製方法、及び所与の特異性を有する抗体の選択方法は、当該分野でよく知られている。
【００７２】
本発明の更なる局面は、細胞死（例えば、アポトーシス及びネクローシス）に起因する組織損傷に関連する症状の治療又は予防のための医薬の製造のための、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又はポリペプチドの使用に関する。アポトーシス又はネクローシスは、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又はポリペプチドを用いる時に予防し又は改善することができる細胞破壊をもたらす。細胞死は、多くの異なった内部及び外部刺激により引き起こされ、好ましくは、虚血、低酸素症、細菌性又はウイルス性感染、放射線を含み、あるいは代謝、毒性、化学的、自己免疫的、又は外傷性刺激により引き起こされる。例えば、形態学的基準、タネルアッセイ、MTT-アッセイ、染色（例えば、エチジウムブロミド及びアクリジンオレンジ染色）による生存/死滅アッセイ、カスパーゼアッセイ、電子顕微鏡検査法、DNA-ラダー、又は以下に記載するLDH放出アッセイを用いる、細胞死を検出する方法は当該分野ではよく知られている。例えば、アポトーシスは、クロマチン断片化、細胞内容物の管外遊出及び終には細胞死により特徴付けられる。多くの急性又は慢性の病的プロセスに役割を果たすと理解されている。従って、本発明の好ましい使用は、急性及び慢性の神経変性又は神経感染性疾患、心臓の急性又は慢性疾患（例えば、心筋梗塞症）、肺の急性又は慢性疾患（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患）、腎臓の急性又は慢性疾患（例えば、糸球体腎炎）、肝臓の急性又は慢性疾患（例えば、慢性肝臓障害）、又は膵臓の急性又は慢性疾患（例えば、膵炎）、並びに細胞（例えば、幹細胞）に関連する症状又は臓器（例えば、腎臓又は肝臓）移植を予防、治療又は改善するための、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又はポリペプチドの投与を含む。この点で、本発明のEPO変異体が、輸送及び/又は外傷的損傷のために臓器又は手足を保存するために使用される保存溶液中に含まれ得る、ことが想定される。
【００７３】
急性神経変性疾患は、脳血管不全、限局性又はびまん性脳外傷、びまん性脳損傷及び脊髄損傷を含む神経細胞死に関連する様々な種類の急性神経変性疾患を含むが、これらに限定されない。急性神経変性疾患の例は以下：塞栓性閉塞及び血栓性閉塞を含む脳虚血又は梗塞、急性虚血に従う再潅流、出産前後期の虚血損傷、心不全、並びに任意の種類の頭蓋内出血（例えば、硬膜外、硬膜下、クモ膜下及び大脳内）、及び頭蓋内及び脊椎内（intravertebral）損傷（例えば、打ち身、貫通傷、せん断傷、圧迫及び裂傷)、乳幼児ムチウチ揺さぶり症候群、流行性脳炎（例えば、ヘルペス脳炎）、髄膜炎（例えば、細菌性）、頭痛（例えば、片頭痛）である。
【００７４】
本発明のEPO変異体で治療することができる慢性神経変性疾患は、痴呆（例えば、アルツハイマー病、血管性痴呆）、ピック病、びまん性レービー病、進行性核上性麻痺（スチール-リチャードソン症候群）、多発性硬化症、（シャイ・ドレーガー症候群を含む）多系統萎縮症、神経変性に関連する慢性癲癇性症状、筋萎縮性側索硬化症を含む運動神経疾患、変性運動失調、皮質基底変性、ALS-グアム島パーキンソニスム痴呆複合、亜急性硬化性全脳炎、ハンチントン病、パーキンソン病、（多系統萎縮症を含む）サイヌクレイノパシー、原発性進行性失語症、線条体黒質変性症、マシャド・ジョセフ病/3型脊髄小脳変性症及びオリーブ橋小脳変性症、ジル・ドラ・トゥレット症候群、球麻痺及び仮性球麻痺、脊髄筋萎縮症（spinal muscular atrophy）及び脊髄筋萎縮症（ケネディ病）（spinobulbar muscular atrophy）、原発性側索硬化症、家族性痙性対麻痺、ウェルドニッヒ・ホフマン病、クーゲルベルグ・ヴェランダー病、テイ・ザックス病、サンドホフ病、家族性痙性疾患、痙性対麻痺、進行性多発性白質脳症、家族性自律神経（リリィ-デイ症候群）、プリオン病（クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病、クル及び致死性家族性不眠症を含むが、これらに限定されない）、多発ニューロパシー（例えば、糖尿病、アルコール毒素、ギラン・バレー症候群、慢性炎症脱髄性多発神経障害）、プリオン病、耽溺、感情障害（例えば、鬱病）、融合失調症、慢性疲労症、慢性疼痛（例えば、腰痛）を含むが、これらに限定されない。
【００７５】
本発明の更なる局面は、抗-加齢医薬の製造のための、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞又はポリペプチドの使用に関する。本発明のEPO変異体に関する本出願の基礎は、加齢を伴うほとんどの身体的機能の進行する低下が、細胞死に関しているという事実であり、そして、そのため、有用な細胞保護効果を提供するにすぎない本発明のEPO変異体が、EPOの連続的投与に一般的に関連する副作用なしに連続して投与することができるが、EPO変異体はEPOの赤血球効果の原因となる、と想像される。
【００７６】
本発明者らは、本発明に従う核酸及びタンパク質が、驚くべき抗-炎症性を有する、ことを驚くべきことに発見した（図及び実験を参照）。従って、これらのEPO変異体は、炎症性及び変性疾患の治療に有用である。炎症性疾患は、例えば多発性硬化症、ウイルス性及び細菌性感染症又は敗血症に限定されない疾患を含む。変性疾患は、例えば卒中、心筋梗塞症に限定されない疾患である。
【００７７】
本発明はまた、本発明に従う核酸のin vivo発現の全ての種類の形態に関する。本発明は、形質転換細胞、特に治療剤として使用される幹細胞に更に関する。かかる細胞は、本発明に従う核酸で安定的に形質転換することができる。核酸は、プロモーターに作動可能に連結するカセット中に存在してもよい。プロモーターは、特に組織、例えば神経組織、脳、又は炎症もしくは変性を示す組織に限定されない、においてのみ発現を促進することができる。各教示は、WO 97/14307から得られる。
【００７８】
EPOポリペプチドの（単位での）反応性は、典型的に、霊長類モデルでの赤血球産生の刺激における（及びEPOの国際基準により得られる）その有効性に基づいて定義される。正常なEPOの１単位（U）（約34,000の分子量）は、タンパク質の約10 ng（1 mgのタンパク質は約100,000 U）である。しかしながら、上記のように、本発明は、エリスロポエチンの非-造血形態の使用を含み、そのようなわけで、造血活性に基づくこの定義は好適ではない。従って、本明細書で使用される、EPO変異体の活性単位は、神経又は他のエリスロポエチン-反応細胞系において、天然型EPOにより同一の系で引き出される活性と同一の活性を引き出すために必要とされるタンパク質量として定義される。当業者は、本明細書に記載の指針に従う非-造血性EPOの単位を容易に決定するだろう。
【００７９】
更なる局面では、本発明は、本発明のポリヌクレオチド、ベクター、宿主細胞、ポリペプチド及び/又は抗体、並びに１以上の薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００８０】
本発明の１つの局面の実施では、上記の医薬組成物は、充分なレベルのエリスロポエチン変異体を提供する任意の経路により、哺乳類に投与することができる。当該医薬組成物は全身的に又は局所的に投与することができる。かかる投与は、非経口的、経粘膜的、例えば経口的、鼻腔内、直腸的、膣内、舌下的、粘膜下又は経皮的でよい。好ましくは、投与は非経口的、例えば静脈内又は腹腔内注射を介して行われ、動脈内、筋肉内、皮内及び皮下投与を含むが、これらに限定されない。本発明の医薬組成物が局所的に投与される場合には、治療される臓器又は組織に直接的に注射することができる。神経系を治療する場合には、この投与経路は、頭蓋内及び脊椎内（intravertebral）ニードル及びポンプ装置を備えた又は備えていないカテーテルを採用することができる、投与の大脳内、心室内、脳室内、鞘内、槽内（intracistemal）、髄腔内、及び/又は脊髄周囲的（peri-spinal）経路を含むが、これらに限定されない。
【００８１】
好ましい実施態様では、医薬組成物は、EPO-反応性細胞、組織又は臓器の保護又は亢進に適合した投薬単位形態でEPO変異体ポリペプチド及び薬学的に許容される担体を含み、EPO変異体は、投薬単位当たり、約0.5 mg〜5 mgのEPO変異体; 0.6 mg〜5 mgのEPO変異体; 0.7 mg〜5 mgのEPO変異体; 0.8 mg〜5 mgのEPO変異体; 0.9 mg〜5 mgのEPO変異体; 1〜5 mgのEPO変異体; 1.5〜5 mgのEPO変異体; 2〜5 mgのEPO変異体; 2.5〜5 mgのEPO変異体; 3.5〜5 mgのEPO変異体; 4 mg〜5 mgのEPO変異体; 又は、4.5〜5 mgのEPO変異体の範囲内の有効非-毒性量である。
【００８２】
好ましい実施態様では、EPO変異体ポリペプチドは、100ナノグラム〜約50マイクログラム/kg体重、好ましくは約20マイクログラム〜約50マイクログラム/kg体重の投薬で全身的に投与することができる。かかる血清レベルは、投与後約1、2、3、4、5、6、7、8、9又は10時間で達成することができる。かかる投薬は、必要に応じて繰り返すことができる。例えば、投与は、臨床的に必要である限り、毎日又は隔日、３日目、４日目、５日目、６日目又は７日目に、又は好適な間隔の後に、例えば１〜12週毎に、好ましくは３〜８週毎に繰り返すことができる。１つ実施態様では、EPO変異体の有効量及び薬学的に許容される担体は、単一投薬バイアル又は他の容器内に包装することができる。各々の治療される疾患又は症状により、EPO変異体は、所定の期間又は継続的に単一用量で投与することができる。急性の症状又は疾患が治療される場合には、一定の期間、例えば２日間〜12ケ月、好ましくは１週間〜６ケ月、より好ましくは２週間〜３ケ月、EPO変異体の単一用量を患者に提供すれば充分であろう。慢性疾患又は症状が治療される場合、又はEPO変異体が加齢に関連する低下を予防もしくは減少させるために使用される場合には、EPO変異体は連続的に投与することができる。本発明のEPO変異体が所定の期間又は連続的に投与される場合には、上記の間隔及び上記の好ましい間隔で投与することが好ましい。必要な間隔は、各疾患を治療又は改善するために必要なEPO変異体の血清レベル、及び各EPO変異体の薬物動力学に部分的に依拠し、EPOの修飾、例えばPEGに部分的に依拠するだろう。例えば治療される患者の症状、症状の重度等を考慮すると、正確な期間、用量及びEPOの種類を決定するのは、実行者の裁量にあるだろう。
【００８３】
例えば、臓器への潅水、注射の使用による他の投与経路、又は他の局所投与について、上記のEPO変異体と同様のレベルを生じる医薬組成物が提供されるだろう。約10 pg/ml〜約1000 ng/mlのレベルが望ましい。
【００８４】
本発明の医薬組成物は、化合物、例えば、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、細胞又はベクターの治療上有効量、及び薬学的に許容される担体を含むことができる。具体的な実施態様では、用語「薬学的に許容される」は、連邦政府又は州政府の管理機関により承認されていること、又は米国薬局方、又は動物、より特にはヒトでの使用のための他の一般的に承認されている薬局方に掲載されていることを意味する。用語「担体」は、治療薬と共に投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤又はビヒクルを意味する。かかる薬学的な担体は、殺菌液体、例えば、水の、及び石油、動物、野菜又は合成起源の油、例えばピーナッツ油、大豆油、鉱油、ゴマ油等を含む、油の食塩溶液でよい。医薬組成物が静脈内投与される場合には、食塩溶液は好ましい担体である。食塩溶液及び水溶性デキストロースとグリセロールの溶液は、液状担体、特に注射可能溶液としても採用することができる。好適な薬学的賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グルコール、水、エタノール等を含む。必要であれば、当該組成物は、少量の湿潤剤、乳化剤又はpH緩衝剤を含んでもよい。これらの組成物は、液剤、懸濁剤、エマルション剤、錠剤、ピル剤、カプセル剤、粉剤、徐放製剤等の形態を採りうる。当該組成物は、典型的な結合剤及び担体、例えばトリグリセリドと共に、座薬として製剤化することができる。本発明の化合物は、中性の又は塩の形態として製剤化することができる。薬学的に許容される塩は、遊離アミノ基、例えば、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸等から得られるアミノ基で形成される塩、及びカルボキシル基、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、2-エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等から得られるカルボキシル基から形成される塩を含む。好適な薬学的担体の例は、E. W. Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」に記載されている。かかる組成物は、患者に正確な投与用の形態を提供できるように、好適な量の担体と共に、好ましくは精製形態で化合物の治療上有効量を含むだろう。製剤は投与形式に適していなければならない。
【００８５】
経口投与に適合した医薬組成物は、カプセル剤又は錠剤として；粉剤又は顆粒剤として；液剤、シロップ剤又は懸濁剤（水溶性又は非水溶性液剤）として；食用フォーム又はホイップとして；又は、エマルション剤として提供することができる。錠剤又は硬ゼラチンカプセル剤は、ラクトース、デンプン又はそれらの誘導体、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウム、ステアリン酸又はその塩を含んでもよい。軟ゼラチンカプセル剤は、植物油、ワックス、脂肪、半固体、又は液状ポリオール等を含むことができる。液剤及びシロップ剤は、水、ポリオール及び糖類を含むことができる。
【００８６】
経口投与を意図した活性剤は、胃腸管内での活性剤の崩壊及び/又は吸収を遅らせる材料でコートし又は当該材料と混合することができる（例えば、モノステアリン酸グルセリル又はジステアリン酸グリセリルが使用される）。従って、活性剤の徐放は長時間に渡って達成することができ、必要ならば、活性剤は、胃内で分解されないように保護される。経口投与用の医薬組成物は、特異的pH又は酵素的条件に起因して、特に胃腸管の場所で
活性剤の放出を促進するように製剤化することができる。
【００８７】
経皮的投与に適合した医薬組成物は、長期間、レシピエントの表皮とうまく接触した状態を維持することを意図した剥がせるパッチ剤として提供することができる。局所的投与に適合した医薬組成物は、軟膏、クリーム、懸濁剤、ローション、粉剤、液剤、ペースト、ゲル、スプレイ、アエロゾル又は油剤として提供することができる。皮膚、口、目又は他の外部組織への局所投与について、軟膏又はクリームは好ましく使用される。軟膏として製剤化されるときには、活性成分は、パラフィン系又は水-混和性軟膏基剤のいずれかと共に採用することができる。代替的には、活性成分は、水中油型基剤又は油中水型基剤と共に、クリームとして製剤化することができる。目への局所投与に適合した医薬組成物は、点眼剤を含む。これらの組成物では、活性成分は、好適な担体、例えば、水性溶媒中に溶解又は懸濁することができる。口での局所投与に適合した医薬組成物は、トローチ剤、パスティール及びマウスウオッシュを含む。
【００８８】
鼻腔内投与に適合した医薬組成物は、固体担体、例えば（好ましくは、20〜500ミクロンの範囲の粒径を有する）粉剤を含むことができる。粉剤は、鼻から吸い込むような方法、例えば、鼻に接近させた状態の粉剤の容器からの鼻への速吸入、により投与することができる。代替的に、鼻腔内投与に適合した組成物は、液状担体、例えば鼻腔内スプレイ又は鼻腔内液滴を含むことができる。これらの組成物は、活性成分の水溶液又は油液を含むことができる。吸入による投与用組成物は、加圧型アエロゾル、ネブライザー又は吸入器を含むが、これらに限定されない、活性成分の所定投薬量を提供できるように構築することができる、特別に適合された装置内で供給することができる。好ましい実施態様では、本発明の医薬組成物は、鼻腔へ投与されて肺に入る。
【００８９】
直腸的投与に適合した医薬組成物は、座薬又は浣腸剤として提供することができる。膣内投与に適合した医薬組成物は、ペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォーム又はスプレイ製剤として提供することができる。非経口投与に適合した医薬組成物は、水溶性及び非水溶性の殺菌注射液剤又は懸濁剤を含む。当該注射液剤又は懸濁剤は、組成物を、対象のレシピエントの血液と実質的に等張にする、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤及び溶質を含むことがある。かかる組成物中に存在することがある他の成分は、例えば、水、アルコール、ポリオール、グリセリン及び植物油を含む。非経口投与に適合した組成物は、単位-用量又は複数回-用量容器、例えば、密封アンプル及びバイアル中に存在することができ、殺菌液体担体、例えば注射用生理食塩水の使用直前での添加のみを必要とする、フリーズ-ドライ（凍結乾燥）条件中に保存することができる。殺菌性粉剤、顆粒剤及び錠剤から、即席の注射液剤及び懸濁剤が調製できる。１つの実施態様では、EPO変異体の注射可能溶液を含む自己注射器は、救急車、緊急治療室及び戦場の状況による緊急用途のために、及び家庭内場面、特に例えば芝刈り機の軽率な使用によって外傷性切断の可能性が起こる場合、での自己-投与用にさえ提供することができる。切断された足又は足指の細胞及び組織が再付着後に生き残る可能性は、現場において医療関係者の到着の前にさえ、又は緊急治療室で牽引されている足指が切断されている患者の到着時に、できるだけ速やかに、切断部部分の複数の部位にEPO変異体を投与することにより増加することができる。
【００９０】
好ましい実施態様では、ヒトへの静脈内投与に適合した医薬組成物として規定の方法に従って製剤化される。典型的に、静脈内投与用組成物は、殺菌性の等張性水性緩衝剤に含まれる液剤である。必要ならば、組成物は、溶解剤及び局所麻酔剤、例えば、注射部位の痛みを和らげるためのリドカインを含んでもよい。一般的に、成分は、例えば、密封容器、例えば活性剤の量を表示するアンプル又はサシェ内に凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として、単位投薬形態で分けて又は混合して供給される。組成物が輸液により投与される場合には、殺菌性の薬学的等級の水又は食塩水を含む輸液ボトルで行うことができる。組成物が注射により投与される場合には、投与前に成分が混合できるように、殺菌性の食塩水のアンプルが提供される。
【００９１】
座薬は、一般的に、0.5重量%〜10重量%の範囲の活性成分を含み；経口製剤は好ましくは、10重量%〜95重量%の範囲の活性成分を含む。潅水組成物は、移植臓器浴での使用、インサイチュの潅流のため、又は臓器採取前の臓器ドナーの脈管構造への投与のために提供することができる。
【００９２】
かかる医薬組成物は、個体への急性又は慢性の、局所的又は全身的な投与に適さない、EPO変異体又はEPO変異体の一形態のレベルを含むことができるが、解剖用の死体、臓器浴、臓器潅水において、又は治療される臓器又は組織を規定の循環に曝露し又は戻す前の、組成物に含まれるEPO変異体を除き又はそのレベルを減少させる前のインサイチュ潅水において、本明細書で意図した機能のために役立つだろう。
【００９３】
本発明はまた、本発明の医薬組成物の１以上の成分で満たされた１以上の容器を含む、薬学的なパック又はキットを提供する。場合により、医薬又は生物製品の製造、使用又は販売を管理する政府機関により規定されている形態での注意がかかる容器（複数）に付いていてもよい。当該注意書は、ヒト投与について製造、使用又は販売の機関による承認を反映している。
【００９４】
別の実施態様では、例えば、EPO変異体は、制御された放出系で送達することができる。例えば、ポリペプチドは、静脈内注入、移植可能な浸透圧ポンプ、経皮的パッチ、リポソーム、又は他の投与形式を用いて投与することができる。１つの実施態様では、ポンプは使用される（Sefton (1987) CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201; Buchwald et al. (1980) Surgery 88: 507; Saudek et al. (1989) N. Eng. J. Med. 321: 574参照）。別の実施態様では、化合物は、小胞、特にリポソームにおいて送達することができる（Langer (1990) Science 249: 1527-1533; Treat et al. (1989) in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (著), Liss, N. Y., 353-365; WO 91/04014; 米国特許第4,704,355号明細書参照）。別の実施態様では、ポリマー性材料が使用できる（Medical Applications of Controlled Release (1974) Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Fla.; Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, (1984) Smolen and Ball (eds.), Wiley: N.Y.; Ranger and Peppas (1953) J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23: 61参照；Levy et al. (1985) Science 228: 190; During et al. (1989) Ann. Neurol. 25: 351; Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105参照）。
【００９５】
更に別の実施態様では、制御された放出系は、治療的標的、すなわち標的細胞、組織又は臓器の近くに置かれ、そのため、全身的用量の一部分を必要とするに過ぎない（例えば、Goodson (1984) 115-138 in Medical Applications of Controlled Release, 第2巻）。他の制御された放出系は、Langerによる考察で議論される（1990, Science 249: 1527-1533）。
【００９６】
別の実施態様では、適正に製剤かされたEPO変異体は、鼻腔内、経口的、直腸的、膣内、又は舌下投与により投与することができる。
【００９７】
特定の実施態様では、治療の必要な部位に局所的に本発明の医薬組成物を投与することが望ましい；このことは、例えば、限定されないが、外科手術の間の局所的輸液、局所的適用、例えば、外科手術後の創傷包帯と併せて、注射によって、カテーテルの手段により、座薬の手段により、又は移植の手段、当該移植は、膜、例えばシラスティック（登録商標）膜又はファイバーを含む多孔質、非-多孔質又はゲラチン質の材料により、達成することができる。
【００９８】
好ましい有効用量の選択は、当業者に知られているであろう数個の要素を考慮すると、当業者により決定されるだろう。かかる要素は、医薬化合物の規制当局の承認を得る時に典型的に採用される通常の開発手続きの間に確立されることになる、医薬組成物の特定の形態、例えば、ポリペプチド又はベクター、及びその薬物動力学的パラメーター、例えば生物学的利用能、代謝、半減期等を含む。用量が、治療される症状又は疾患、又は健康な個体において達成される利益を含むことを考慮する時の更なる要素は、患者の体格、投与経路、投与が急性であるか又は慢性であるかどうか、付随する医薬、及び投与される医薬の効力に影響を与えることがよく知られている他の因子を含む。従って、正確な用量は、実施者の判断及び患者の環境、例えば個々の患者の症状及び免疫状態に依拠する、に従って、標準的な臨床的技術に従って決められるべきである。
【００９９】
本発明の別の局面では、潅水又は潅流溶液は、潅流及び移植用の臓器の保存のために提供される。潅流溶液は、EPO変異体-反応細胞及び関連細胞、組織又は臓器を保護するために有効な医薬組成物の量を含む。
【０１００】
移植は、臓器（細胞、組織又は他の身体部分を含む）が、１つのドナーから採取され、異なったレシピエントに移植される異種移植；臓器を取り除かれ、ex vivoで切除され、修復され又は細工される、例えば腫瘍切除の後に元の場所に戻される、卓上手術のような、臓器が体の一部から採られ、別の場所に戻される、自己移植、を含むがこれらに限定されない。１つの実施態様では、潅流溶液は、約1〜約25 U/mlエリスロポエチン；（約200,000〜約300,000の分子量を有し、及び実質的にエチレングリコール、エチレンクロロヒドリン、塩化ナトリウム及びアセトンを含まない）5% ヒドロキシエチルデンプン；25 mM KH2PO4; 3 mM グルタチオン; 5 mM アデノシン; 10 mM グルコース; 10 mM HEPES緩衝剤; 5 mM グルコン酸マグネシウム; 1.5 mM CaCl2；105 mM グルコン酸ナトリウム; 200,000 単位のペニシリン; 40 単位のインシュリン; 16 mg デキサメタソン; 12 mg フェノールレッドを含み；7.4〜7.5のpHを有し、約320 mOSm/1の浸透圧を有する、ウィスコンシン大学（UW）溶液（米国特許第4,798,824号明細書）である。当該溶液は、移植前の死体腎臓及び膵臓を維持するために使用される。当該溶液を用いることにより、死体腎臓保持のために推奨される30-時間限界を超えて保持することができる。この特定の潅水は、医薬組成物の有効量を含むことにより本使用に適合することができる、多数のこのような溶液の例示にすぎない。更なる実施態様では、潅水溶液は、約5〜約35 U/mlのエリスロポエチン又は約10〜約30 U/mlのエリスロポエチン相当を含む。
【０１０１】
本明細書の至るところに記載の目的のためのEPO変異体の好ましいレシピエントはヒトであるが、本明細書の方法は、他の哺乳類、特に家庭内動物、家畜、コンパニオン・アニマル及び動物園の動物にも等しく適用する。しかしながら、本発明は、そのような限定をするものではなく、任意の哺乳類に適用することができる。
【０１０２】
ある人が卒中を発症する危険にあることが判っている場合には、本発明の医薬組成物の予防的投与は可能である。これらの場合には、医薬組成物、特に、EPO変体ポリペプチドは、好ましくは、１日当たりを基準に上記の好ましい用量及び特に好ましい用量で投与される。好ましくは、約100ナノグラム〜約50マイクログラム/kg体重、好ましくは約20μグラム〜約50マイクログラム/kg体重である。この投与は、卒中を発症する危険性が減少するまで継続することができる。しかしながら、ほとんどの場合には、卒中と診断されると直ちに、当該医薬組成物が投与されるだろう。これらの場合には、医薬組成物の第１用量は、卒中の最初の症候が明らかになった後の最初の24時間胃内の第１時間、好ましくは、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1時間以内にに投与されることが好ましい。好ましくは、投与は、好ましくは少なくとも7日間、より好ましくは少なくとも14日間及びより好ましくは少なくとも21日間、継続される。用量は、好ましくは１日に１回、好ましくは上記の処方用量で投与される。
【実施例】
【０１０３】
マウスEPO cDNAの合成
RNAは、トリゾール抽出により、野生型C57BL/6又はSV129S6マウスの腎臓、又は２種のマウス脳（卒中後１時間）から単離した。このRNAをクロロホルム及びイソプロパノールで沈殿させ、最後に、DEPC-H2Oに溶解した。DNAは、プロメガ社のRQ1 リボヌクレアーゼ無添加デオキシリボヌクレアーゼ・プロトコールで消化した。反応を、200 μl フェノール/クロロホルム/イソプロピルアルコール（25/24/1）の添加により停止して、反応混合物を得、10000 rpm及び10℃で10分間遠心した。上清を200 μl クロロホルム/イソプロピルアルコール（24/1）と混合し、10000 rpm及び10℃で10分間遠心した。この上清に、20 μlの8 M塩化リチウム及び550 μlの無水エタノールを加えた。次いで、混合物を-70℃で１時間インキュベートし、続いて11000 rpm及び0℃での遠心により、30分間沈殿させた。得られたペレットを600 μlの75%エタノールで洗浄し、8000 rpm（40℃、10分間）で遠心し、室温で乾燥した。DNAを20 μlのDEPC-H2Oに溶解した。
【０１０４】
モロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（MuLV、リボヌクレアーゼHマイナス、プロメガ）は、3 μg DNA及び3 μlランダムヘキサマープライマーを含むDEPC-H2O（10 μM）を含む15 μlの反応体積中で第１鎖cDNA合成において使用した。逆転写反応は、6μl M-MuLV反応緩衝剤 (5x)、2 μl dNTP (各2.5 mM)、1 μl リボヌクレアーゼインヒビター (1U/μl)、1 μl M-MuLV逆転写酵素、及び5 μl DEPC-H2Oを用いて、以下の操作プログラム：21℃で5分；37℃で1時間；95℃で5分、で作動するPCRマシーン中で行った。
【０１０５】
得られたcDNAプールを、ネストPCR法により完全EPO cDNAを増幅するために使用した。第１ステップは、EPO遺伝子のコーディング領域の外側にあるプライマー（genepo_センス; (配列番号39): gaa ctt cca agg atg aag act tgc age、及びgenepo_アンチセンス; (配列番号40): gtg gca gca gca tgt cac ctg tc）を採用した。第２ステップは、次のクローニング用の付着BamH1開裂部位が付いた、開始コドンから停止コドンまでの遺伝子を増幅するために設計されたプライマー（epo_センス; (配列番号41): tat gga tec atg ggg gtg ccc gaa cgt ccc ac）、及びepo_アンチセンス; (配列番号42): tat gga tec tea cct gtc ccc tct cct gca gac）を使用した。全てのプライマーは、MWG-Biotech AGから購入した。ネストPCRは、ハイバイド社のPCRマシーンにて、２つのステップ、第１PCRステップ（95℃で3分；35サイクル: 65℃で30秒、72℃で1分、95℃で30秒；72℃で10分；40℃維持）及び第２PCRステップ（95℃で3分；5サイクル: 67℃で30秒、72℃で1分、95℃で30秒；15サイクル：70℃で30秒；72℃で1分、95℃で30秒；72℃で10分；4℃）で行った。
【０１０６】
２つのPCRでは、製造者のプロトコールに従ってPfu Turboホットスタートポリメラーゼ (ストラタジーン) を用いた。第１ステップのPCR産物を第２PCR用に1:50に希釈した。第２のcDNA合成プロトコールを、アクセスRT-PCR装置（インビトロゲン）を用いて、以下のパラメーター：48℃で5分；94℃で2分；40サイクル：94℃で30秒、65℃で1分、70℃で2分；70℃で7分；4℃で、行った。上記のようにして第２PCRを行った。
【０１０７】
1.2% TAE-アガロースゲル上で増幅した完全長EPO cDNA及びEPO異性体を分離した。様々なPCR産物の図を図１ａに示す。断片は、Wizard SV-ゲル・クリーンアップ装置 (プロメガ) 又はゲル抽出キット (チアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製した。Pfuポリメラーゼは平滑末端産物を生じるので、化学的にコンピテントなTop10 One Shot細胞（インビトロゲン）を用いて、cDNAをpCR-Blunt II-TOPO ベクター（インビトロゲン）中でサブクローニングした。
【０１０８】
プラスミド-DNAは、チアゲンQIA prepキットの利用により、単一コロニーから単離した。Thermo Sequenase （登録商標） プライマーサイクルシークエンシングキット (アマシャム バイオサイエンス)を用いて、ALFexpress （登録商標） DNAシークエンサー (ファルマシア バイオテク) で、挿入物をシークエンスした。プライマーM13FWDCY (配列番号43: gtc gtg act ggg aaa ace ctg gcg) 及びM13REVCY (配列番号44: age gga taa caa ttt cac aca gga) をCy5で標識した。シークエンシングのパラメーターは、t=900分; T=55℃; 800V; 55 mA及び30 Wであった。配列分析は、エキソン4を欠くEPOの新規変異体及び３つの内部欠損変異体の存在を明らかにした。塩基配列を、図２ａ及び図２ｂに示し、コードペプチド配列を図４に示す。EPO変異体mSの塩基配列及びペプチド配列は、各々、配列番号13及び14に対応する。EPO変異体mG3の塩基配列及びペプチド配列は、各々、配列番号15及び16に対応する。EPO変異体mG5の塩基配列及びペプチド配列は、各々、配列番号17及び18に対応する。EPO変異体m301の塩基配列及びペプチド配列は、各々、配列番号19及び20に対応する。EPO変異体mK3の塩基配列及びペプチド配列は、各々、配列番号21及び22に対応する。
【０１０９】
ヒトEPO cDNAの合成
ヒト成人腎臓（男性）及び胎児脳（男性）ポリ A+ RNAは、ストラテジーンより購入した。上記のモロニーマウス白血病ウイルス逆転写酵素（MuLV、リボヌクレアーゼHマイナス）に従って、250 ng腎臓RNA又は200 ng脳RNAからcDNAを分離した。Pfuポリメラーゼ (ストラテジーン) を用い、以下のプライマー：Hepo_センス (配列番号45): gat ggg ggt gca cga atg tec tgc及びHepo_アンチセンス (配列番号46): cac ace tgg tea tct gtc ccc tgt cを用いて完全EPO cDNAを増幅するために、得られたcDNAプールを用いた。
【０１１０】
インビトロゲン社のPCRマシーンでPCRを行った（95℃で3分；35サイクル: 67℃で30秒、72℃で1分、95℃で30秒; 72℃で10分）。胎児脳cDNAの場合には、20サイクルのPCR産物で第２増幅ステップを行う、ネストPCR法を用いた。1.2% TAE-アガロースゲル上で増幅したPCR産物を分離し（図１ｂ）、ゲル抽出キット（チアゲン、ヒルデン、ドイツ）を用いて精製した。化学的にコンピテントなTop10 One Shot細胞（インビトロゲン）を用いて、精製cDNAをpCR-Blunt II-TOPO ベクター（インビトロゲン）中でサブクローニングした。プラスミド-DNAは、チアゲンQIA prepキットの利用により、単一コロニーから単離した。Thermo Sequenase （登録商標） プライマーサイクルシークエンシングキット (アマシャム バイオサイエンス)を用いて、ALFexpress （登録商標） DNAシークエンサー (ファルマシア バイオテク) で、挿入物をシークエンスした。プライマーM13FWDCY (配列番号43) 及びM13REVCY (配列番号44) をCy5で標識した。シークエンシングのパラメーターは、t=900分; T=55℃; 800V; 55 mA及び30 Wであった。配列分析は、エキソン3及びエキソン4の最初の半分をそれぞれ欠くヒトEPOの２つの新規変異体の存在、並びにマウスで検出された反復トリマー又はヘキサマーのルールに従う多数の変異体の存在を明らかにした。塩基配列を図３ａ及び図３ｂに示し、コードペプチド配列を図４に示す。EPO変異体hS3の塩基及びペプチド配列は、各々、配列番号1及び2に対応する。EPO変異体hl-4の塩基及びペプチド配列は、各々、配列番号3及び4に対応する。EPO変異体hl-5の塩基及びペプチド配列は、各々、配列番号5及び6に対応する。EPO変異体hS4の塩基及びペプチド配列は、各々、配列番号7及び8に対応する。EPO変異体hl-1の塩基及びペプチド配列は、各々、配列番号9及び10に対応する。EPO変異体h2-1の塩基及びペプチド配列は、各々、配列番号11及び12に対応する。
【０１１１】
HEK細胞におけるHis-タグタンパク質の発現
停止コドンのないオーバーハングセンスプライマー及びオーバーハングアンチセンスプライマー(マウス変異体について: epo_センス (配列番号41) 及びepoeco_アンチセンス (配列番号47): aaa gaa ttc cct gtc ccc tct cct gca gac etc; ヒト変異体について; hepobam_se (SEQ ID NO 48): tat gga tec atg ggg gtg cac gaa tgt cc, hepoeco_(配列番号49): aga gaa ttc tct gtc ccc tgt cct gca g)を用いて、クローニング用BamHI及びEcoRI制限部位をマウス及びヒトEPO変異体に加えた。BamHI及びEcoRI制限部位を用いてpcDNA-3.1-HIS/V5 A（インビトロゲン）にPCR産物をクローニングした。XL-I Blueコンピテント細胞 (recA1 endA1 gyrA96 thi1 hsdR17 supE44 relA1 lac [F' proAB laclqZΔM15 Tn10 (TetR)]) (ストラタジーン) 中で、プラスミドを増幅した。メルカプトエタノールを使用せず及び60秒間の長い熱パルスを用いて、XL-I Blueコンペテント細胞転換プロトコールを行った。QIAprep Spin Miniprepキット (チアゲン、ヒルデン、ドイツ)を用いてプラスミドDNAを抽出した。哺乳類細胞へのトランスフェクションについて、EndoFree Plasmid Maxiキット (チアゲン、ヒルデン、ドイツ) を用いてDNAを抽出した。HEK293細胞（BDバイオサイエンス）を、ダルベッコ改変イーグル倍地 (DMEM; バイオクロム, ベルリン, 1 g/l グルコース, 3.7 g/l NaHCO3; 10%ウシ胎児血清GOLD, 1% アオカビ属菌/ストレプトアビジン及び1% L-グルタミンで補充) で18日間、組織培養フラスコ（25 cm2）中で、37℃、5% CO2で増殖させた。80〜90%コンフルエンスに近づいた後、細胞を２〜３毎に分けた。DIV18で、抗生物質無しのダルベッコ改変イーグル培地を含む12ウェルプレートの各ウェルに120,000細胞を播いた。50%コンフルエントになるまで約48時間、細胞を増殖させた。HEK細胞用の提供されたプロトコールに従って、リポフェクタミン2000（インビトロゲン）でトランスフェクションを行った。
【０１１２】
抗生物質を含まない血清無しのDMEMによるトランスフェクションの10分前に、HEK-細胞のプレート培地を交換した。DNA-リポフェクタミン複合体を用いて、細胞を37℃で5時間インキュベートした。次いで、抗生物質を含まない新鮮な血清含有DMEMに培地を交換した。DIV2で、細胞を分け、抗生物質を含むダルベッコ改変イーグル培地に播いた。
【０１１３】
His-タグEPO変異体の発現及び精製
His-タグタンパク質はHEK-細胞中で一時的に発現した。pcDNA-3.1-HIS/V5 A-構築体でトランスフェクションした２〜６日後に、HEK293細胞由来の培地を採取した。細胞の残骸を3500 rpm、4℃で15分間、ペレット化した。BD TALON (商標) 金属親和性樹脂（BDバイオサイエンス）をHis-タグタンパク質の精製に使用した。全てのステップ（平衡化、洗浄及び溶出）は、pH 7.1で行った。提供されたプロトコールを4℃での長い終夜の結合ステップに変更した。500 μl-分画で溶出物を回収した。サンタ・クルーズ社の抗-rhEPO抗体又はマウスEPO ELISA-キット (R&D) を用いて、ウェスタンブロットにより分画を分析した。製造者のプロトコールに従ってアマシャム バイオサイエンス社のHiTrap（商標）脱塩カラム（5 ml）を用いて、タンパク質-含有分画からイミダゾールを除いた。これは、緩衝剤のPBSへの交換を含んだ。
【０１１４】
ウェスタンブロット
標準的なプロトコールを用いて16% SDS-ゲルを調製し、110 Vで操作した。ブロッティングは、200 mAで45分間、ニトロセルロース-膜上で行った。0.1% Tween-20中に5%非-脂質乾燥ミルク粉末を含むブロッキング緩衝剤中で、少なくとも１時間、このブロットをブロックした。第１抗体（EPO (H-162) sc-7956 ウサギポリクローナルIgG, サンタ・クルーズ, 1:500）によるインキュベーションを4℃で終夜行った。室温で２時間、第２抗体（ヤギ抗-ウサギHRP; 1:1000）を加えた。このブロットは、ルミノールの使用により明らかとなった；写真は２分間露光した。膜をポンソーレッドで染色した。EPO特異的抗体は全てのEPO変異体を検出することができた。
【０１１５】
赤血球コロニー形成アッセイ
骨髄細胞を雄性C57BL/6マスス（8〜11週令）の脛骨及び大腿から採取し、α-培地（10%ウシ胎児血清GOLD、1%アオカビ属菌/ストレプトアビジン及び1% L-グルタミンで補充）に再懸濁した。細胞を、８量部のをMethoCult SF 3236メチルセルロース (StemCell Technologie Inc)、１量部の細胞、及び２量部のEPO誘導体（マウスEPOの場合には、150 U/l）を含むHEK-細胞予備調整培地と混合したα-培地を含む35 mm2ペトリ皿（225.000細胞/皿）に播いた。150 U/lのrhEPO (ロシュ) を陽性対照として用いた。プレートを48時間、5% CO2を含む湿気中で、37℃でインキュベートした。評価については、少なくとも６個のヘモグロビンの多い（hemoglobinised）細胞を含む赤みを帯びたコロニーのみを考慮した。
【０１１６】
EPO変異体の造血潜在能力
MethoCult SF 3236は、好適なサイトカインの添加後のみ、コロニー（CFU-M、CFU-G又はCFU-E）形成を引き起こした。エリスロポエチンの添加後、２日後に、CFU-E (コロニー形成単位-赤芽球) の形成が観察された。小さな不規則な赤みを帯びたコロニーは３日目までに消えた。
【０１１７】
このアッセイで、変異体の造血潜在能力を試験し、EPOの野生型及びrhEPOと比較した。以下の条件を比較用に準備した：陰性対象として、pZ/EGでトランスフェクトしたHEK細胞由来の培地、陽性対象として、pZ/EG細胞及び150 U/l rhEPO (ロシュ）でトランスフェクトしたHEK細胞由来の培地、並びにpZ/EG-EPO-IRES (150 U/l マウスEPO)、pZ/EG-スプライス-IRES (変異体S; mS) 又はpZ/EG-G3-IRES (変異体G3; mG3) のいずれかでトランスフェクトしたHEK細胞由来の培地。DIV2で、少なくとも６個のへモグロビンの多い（hemoglobinised）細胞を含む赤みを帯びたコロニーをカウントした。３つの各々の実験結果を図５に示す。
【０１１８】
マウスEPO及びrhEPOと比較すると、マウスEPO変異体（mS及びmG3-変異体）は、造血潜在能力を欠いた。
【０１１９】
一次神経培養物
ウィスターラット（Bundesinstitut fur gesundheitlichen Verbraucherschutz und Veterinarmedizin, ベルリン, ドイツ）のE16から初期19までの胚からラット一次神経培養物を得た。チューブリンα-1プロモーターの制御下でクレ-リコンビナーゼを発現する異種接合トランスジェニックマウスのE16胚から、クレ-発現マウスニューロンを得た（U. Schweitzer博士; Experimental Endocrinology, Chariteにより提供された）。マウス及びラットの培養物は、Brewer (1995) J Neurosci Res. 42: 674-83からの改変プロトコールに従って調製した。髄膜の除去後に大脳皮質を単離し、PBSで２回洗浄した（バイオクロム, ベルリン, ドイツ）。トリプシン/EDTA (PBS中に0.05/0.02%) 中で37℃で15分インキュベーションした後、組織を、N-Med (10%ウシ胎児血清、100 Uペニシリン及びバイオクロム社のストレプトマイシン、2 mM L-グルタミン、100 IEインスリン/l、10 mM HEPES、及び44 mM グルコースを含むギブコ社の改変イーグル培地）で２回洗浄し、パスツールピペットを用いて少量のN-Medに注意深く分離させた。210 gで２分間遠心して、細胞を室温でペレット化し、NBMスターター培地（ギブコ社の2% B27サプリメント、1% Pen/Strep、0,5 mM L-グルタミン及び25 μM グルタミン酸塩を含むギブコ社のNeurobasal培地）中に再懸濁した。
【０１２０】
培養プレートの調製
24-ウェルプレート及び6-ウェルプレートを、バイオクロム社のポリ-L-リジン (PBS中に2.5 μg/ml) を用いて、4℃での終夜のインキュベーションにより予備処理した。PBSでのウェルの洗浄後に、コーティング培地（PAA社の5% FCS Gold、1% Pen/Strep、10 mM HEPES及びバイオクロム社の0.03 w/vコラーゲンGを含む改変イーグル培地）を用いて、37℃で１時間インキュベーションし、次いで、PBSで２回注意深くウェルを洗浄した。プレート培地の容積及び種類は、実験手段によって選択した。
【０１２１】
ラット一次皮質ニューロンの酸素グルコース除去−脳虚血の細胞培養モデル
OGDについて、PBSで１回濯ぐことにより培養培地を洗浄した。OGDは、5% CO2、85% N2及び10% H2を含むガス混合物でフラッシュした、専用の湿めったガス気密性のインキュベーター (Concept 400, Ruskinn Technologies, Bridgend, UK) によって生じる低酸素大気中で、500 μlの非酸素化糖質溶液 (BSS0-O2; 143.8 mM Na+, 5.5 mM K+, 1.8 mM Ca2+, 0.8 mM Mg2+, 125.3 mM Cl-, 26.2 mM HCO3-、及び0.8 mM SO42-, pH 7.4）により引き起こした。OGD-時間は、密度及び培養物の熟成に依拠し、２時間30分〜２時間40分の間で変化した。対照実験では、500 μlの非酸素化糖質溶液 (BSS0-O2; 143.8 mM Na+, 5.5 mM K+, 1.8 mM Ca2+, 0.8 mM Mg2+, 125.3 mM Cl-, 26.2 mM HCO3-、0.8 mM SO42-, 及び20 mMグルコース，pH 7.4）でウェルを処理し、5% CO2を含む常酸素大気中で37℃でインキュベートした。OGDの直後に、処理した細胞及び対照は、PBS溶液から、40%調整NBM及び60%新鮮NBMを含む500 μlの培地に変えた。24時間後に、細胞死の指標として上清中で乳酸脱水素酵素（LDH）活性を測定した。
【０１２２】
LDH測定については、25 μlの培地を、96ウェルプレート（グライナー）中で、100 μlの新鮮なβ-NADH溶液 (0.15 mg/mlの1xLDH-緩衝剤; シグマ, 誘導形) と混合した。リーダー (Thermo Labsystems; MRXTC Revelation) にプレートを置く直前に25 μlの22.7 mMピルビン酸塩（シグマ）を加えた。パラメーターは以下のように選択した：フィルター: 340 nm、攪拌時間: 5秒、間隔: 30秒、カウント: 10。LDH-濃度をLDH-標品 (グライナー、システムキャリブレータ) に比例的に計算した。
【０１２３】
トランスフェクトされたHEK293細胞系発現EPO変異体からの調整培地による神経保護の誘導
以下の実験において、陽性対照としてrhEPO（シグマアルドリッチ社の組換えヒトEPO，ディーゼン-ホーフェン, ドイツ）を使用した。神経保護アッセイを図６に図示した。ニューロンを600 μl NBMの最終体積で、300,000細胞密度で24-ウェルプレートに播いた。４日後、200 μlの培地を250 μlの新鮮NBM（グルタミン酸塩を含まないNBMスターターと同一）と交換した。
【０１２４】
rhEPO、野生型mEPO、野生型hEPO又はEPO変異体での予備処理について、培地を除いて200μlの終体積にし、それぞれ、等量のEPO又はEPO変異体 (200 U/l rhEpoに相当) を含む200 μl新鮮NBM+B27で満たした。HEK293細胞からの調整培地中の様々なEPO変異体（並びにmEPO及びhEPO）の等濃度をウェスタンブロット及びEPO-Elisaにより評価した。その後、酸素グルコース除去（OGD）を（示したOGD間隔で）行う前に、ニューロンを、37℃で常酸素の、多湿の条件下で成長させた。細LDH放出測定によるOGDの24時間後に、細胞死を評価した。LDH放出の減少は、モック処理ニューロン（骨格プラスミドでトランスフェクトしたHEK293細胞からの培地 = ko; 100%）に比べて、神経保護の定量的指標である。全ての実験において、我々は、野生型EPOに比べて、EPO変異体によって提供されるより強い神経保護効果を観察した（マウスEPO及びその変異体についての図７のパネルＡ及びＢ参照、ヒトEPO及びその変異体についての図８のパネルＡ及びＢ参照）。
【０１２５】
マウスEPO変異体により誘導される神経保護は、EPO（rhEPO、及び野生型マウスEPO）により誘導される神経保護よりも強い。例えば、EPOにより介在される神経保護は、明確に特定されたOGDの長さのウィンドー（明確に特定された損傷レベルに相当）において観察できるにすぎない。低濃度でのhS3及びhS4による神経保護は、hEPOによる神経保護と同等か又はそれ以上であった。結局のところ、変異体によって引き起こされる神経保護は、rhEPOにより引き起こされる神経保護よりも強い。加えて、変異体は、野生型のmEPO及びhEPOよりも高い神経保護能力を有し、これらはEPO変異体と同一の方法により産生された。
【０１２６】
H9c2-虚血モデル
ラットBDIX心臓筋芽細胞細胞株（European Collection of Cell Culturesから入手）を、2mM L-グルタミン、10% 不活性化ウシ胎児血清及び1 % ペニシリン-ストレプトアビジンで補充した4.5 g/l グルコースを含むDMEM（バイオクロム）で培養した。サブコンフルエント培養物（70%）を1:4に継代培養した。24-ウェルプレートのウェル当たり15,000細胞の密度で、それぞれ120 pM hEPO又はhS3を含む400 μl培地に細胞を播き、48時間培養した。2mM L-グルタミン、10% 不活性化ウシ胎児血清及び1 % ペニシリン-ストレプトアビジンで補充した4.5 g/l グルコースを含む、400 μlの血清無しDMEM中で細胞を培養し、24時間、85% N2及び10% H2を含む混合ガスで飽和した嫌気性ワークステーション（Concept 400, Ruskinn Technologies, Bridgend, UK）中に37℃で放置することにより、低酸素を達成した。常酸素インキュベーター中で、血清無しのDMEM中に対照細胞を入れた。実験の最後に、培地400 μl新鮮血清無しDMEMと交換し、24時間後に標準的プロトコールに従ってLDHを測定した。
【０１２７】
免疫沈降
実験には、餌及び水を自由に与えた雄性129S6マウス又は雄性C57BI6マウス (8〜10週令, Bundesinstituts fur Risikobewertung, Berlin) を使用した。CoC12に60 mg/kgの用量で皮下的に注射し、動物を18時間後に殺した。商業的に入手可能な ELISA (R&D, mEPO) により、血清、腎臓及び脳のタンパク質抽出物でタンパク質発現を測定した。
【０１２８】
R&D (抗-mEPO抗体, ヤギ, ビオチン標識) 及びサンタ・クルーズ (抗-rhEPO, ウサギ) から免疫沈降用抗体を購入した。標準的プロトコールに従い免疫沈降を行い、ウェスタンブロットにより評価した。
【０１２９】
ウェスタンブロット検出抗体のブロッキングは、ブロットインキュベーションの前に、室温で10 μgダルベポエチン（darbpoietin）Aの２時間のインキュベーションにより行った。
【０１３０】
α-ヘリックス-変異体の生成（図10）
ヒトα-ヘリックス-変異体は全て、標準的なプロトコールを用いてPCR型アプローチにより産生した。
【０１３１】
突然変異体A (hAmA) 及び突然変異体E (hAmE) は、位置41（アルギニン）でのアミノ酸置換によるα-ヘリックスの変異体である。cDNA配列は、突然変異体A（アラニン）についてはAGGからGCGに、突然変異体E（グルタミン酸）についてはAGGからGAGに置換した。-20aa及び-10aaは、C-末端にそれぞれ20又は10アミノ酸を欠くα-ヘリックスの欠損変異体である。全ての突然変異体は、V5及びHis-タグ無しで産生し、HEK 293細胞で発現した。様々な変異体を発現するトランスフェクトされたHEK細胞の培地を用いて、前記のようにして、神経保護実験を行った。
【０１３２】
H9c2細胞における虚血モデルのhEPO及びhS3介在細胞保護（図11）
H9c2心臓筋芽細胞での血清除去及び低酸素からなる虚血モデルにおいて、精製hEPO及びhS3についてEPO変異体の細胞保護能力を示した（図１）。アポトーシス細胞死のマーカーとしてLDH放出を評価した。我々は、２つの変異体についての顕著な細胞保護能力を見出した（hEPO及びhS3について、それぞれ約20%及び25%）。
【０１３３】
免疫沈降は、CoC12-処置マウスの腎臓タンパク質抽出物におけるEPOスプライシングアイソフォームを明らかにする（図12）
PCR-型アプローチによりヒト及びマウス組織中のEPOスプライシングアイソフォームの我々の発見を強化するために、我々は、２つのアイソフォームを認識するために試験された抗体を用いて、CoC12処置マウスのマウス血清、脳及び腎臓のタンパク質抽出物について免疫沈降を行った。CoC12の皮下注射は、数個のマウス組織、いわゆる血液、脳、肝臓及び腎臓におけるエリスロポエチンレベルを増加させることが知られている。
【０１３４】
我々は、CoC12処置マウスの血清、脳及び腎臓のタンパク質抽出物からエリスロポエチン（約40 kDa）を沈降させることができた（図２）；非処置マウスの腎臓タンパク質からのエリスロポエチンの沈降は、低発現レベルのためうまくいかなかった。更に、我々は、CoC12処置マウスの腎臓タンパク質抽出物中の２番目の小タンパク質（約30 kDa）の存在を明らかにすることができた。このタンパク質は、ダルベポエチンAとの抗体-抗原相互作用の完全なブロッキングにより示されるように、抗-rhEPOによって特異的に認識される。これらの発見は、マウスエリスロポエチンのスプライシングアイソフォームの存在を強力に支持する。これらの結果は、第２のマウス株、すなわちC57BI6において再現された。
【０１３５】
エリスロポエチンα-ヘリックスの異なったアイソフォームによって介在される神経保護（図13）
これまで特定されたエリスロポエチン変異体の神経保護潜在能力を分析して、我々は、エリスロポエチンの神経保護特性についてα-ヘリックスが機能的に重要なドメインであることを示唆した。この仮説を試験するために、我々は、ヒトエリスロポエチンの短縮型、いわゆるα-ヘリックスドメインをHEK 293細胞中で発現させ、OGD-モデルにおいてこのペプチドを試験した。我々は、図13に示すように、このペプチドの30 pM及び15 pMの保護潜在能力が30 pMのhEPOと等価であることを見出した。
【０１３６】
ヒトエリスロポエチンのα-ヘリックスドメイン中の機能的に重要な残基を特定するために、我々は、アミノ酸置換 (hAmA及びhAmE) を含む異なったエリスロポエチン突然変異体、又は完全なドメイン欠損体 (hA-10及びhA-20) のいずれかを作製した。
【０１３７】
位置41での中性アミノ酸置換も酸性アミノ酸置換も、我々のOGDモデルにおけるα-ヘリックスの神経保護潜在能力を破壊することができなかった（図14）。
【０１３８】
数個のヒトEPO-アイソフォーム(n=6)により介在される神経保護、P*<0,05; ANOVA1対対照（図14）。
【０１３９】
α-ヘリックスのC-末端に10又は20のアミノ酸を欠く欠損変異体を、HEK293細胞で発現せ、またOGDモデルで試験した。欠損変異体hA-10は、hS3スプライスアイソフォームに匹敵する神経保護特性を依然と有した。20アミノ酸の欠損（hA-20）は、もはや保護性でないポリペプチドをもたらした（図15）。
【０１４０】
ヒトエリスロポエチン変異体による免疫調節（図16）
ヒトEPO変異体hS3及びhS4は、強力な免疫調節効果を示す。エンドトキシンリポ多糖（LPS）で刺激されたヒトマクロファージにおいて、hS3及びhS4は、抗-炎症性サイトカインIL-10を誘導し、炎症性サイトカインIL-6及びIL-8の発現を減少させる。EPO (hWT) に比べて、hS3及びhS4の抗-炎症効果は、非常に多く述べられている。EPO変異体の抗-炎症特性は、炎症性疾患（例えば、多発性硬化症、ウイルス及び細菌感染、敗血症）及び変性疾患（例えば、卒中、心筋梗塞）の治療に有用である。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１】図１は、EPO PCR産物の比較を示す図である。パネルＡは、異なったマウスEPO変異体を含む純粋なプラスミド又はマウス脳もしくは腎臓由来のcDNAのいずれかを用いて行った様々なPCR反応のDNA産物を示し、これらは、1.2% アガロースゲル上で分離した。左から右へ、レーンは以下を含む：1 kb 分子量マーカー、純粋なmK3産物、純粋なmG3産物、純粋なmG5産物、純粋なm301産物、純粋なmS産物、純粋なmWT産物、脳cDNA、腎臓cDNA。パネルＢは、ヒト脳由来のcDNAを用いて行ったPCRのDNA産物を示す。左から右へ、レーンは、1 kb 分子量標品及びヒト脳cDNAのPCR産物含む。
【図２ａ】図２ａは、マウス脳cDNAで特定されたEPO変異体の塩基配列と、「野生型」マウスEPO、すなわち、先に記載のEPOの配列とのアラインメントを示す図である。
【図２ｂ】図２ｂは、マウス脳cDNAで特定されたEPO変異体の塩基配列と、「野生型」マウスEPO、すなわち、先に記載のEPOの配列とのアラインメントを示す図である。
【図３ａ】図３ａは、ヒト脳cDNAで特定されたEPO変異体の塩基配列と、「野生型」ヒトEPOとのアラインメントを示す図である。
【図３ｂ】図３ｂは、ヒト脳cDNAで特定されたEPO変異体の塩基配列と、「野生型」ヒトEPOとのアラインメントを示す図である。
【図４】図４は、マウス及びヒトで特定されたEPO変異体のアミノ酸配列、及び各「野生型」EPOのアラインメントを示す図である。
【図５】図５は、マウス及びヒトEPO、並びに本発明のEPO変異体の造血活性を示す図である。パネルＡは、マウスEPO及びEPO変異体のコロニー形成アッセイの結果を示し、パネルＡは、ヒトEPO及びEPO変異体のコロニー形成アッセイの結果を示す。
【図６】図６は、rhEPO及びEPO-異性体を用いる神経保護アッセイのための実験手法を示す図である。
【図７】図７のパネルＡは、1時間40分及び1時間50分の酸素グルコース除去（OGD）の長さの実験を示す図である。２つの時点では、神経保護者（neuroguardian）については40〜50%の保護率であるが、mEPO及びrhEPOでは保護が観察されなかった。図７のパネルＡは、２つの異なった時点での実験を示す図である（２つの実験間のOGDの長さは、神経密度により変化する）。2時間45分では、神経保護者（neuroguardian）（60〜70%）に比べて、wtEPO（20〜30%）では僅かな保護が達成されたに過ぎなかった。rh EPOの完全な保護能力は、より高い損傷レベル（3時間15分）で観察されたに過ぎなかった。
【図８】図８のパネルＡは、100 U/l hEPO相当のタンパク質濃度での、2時間00分、2時間15分及び2時間20分のODGの長さでの実験を示す図である。全ての３つの時点で、ヒトでは、40〜50%の保護率であったが、mEPO及びrhEPOでは保護が認められなかった。図８のパネルＢは、２つの異なった時点（２つの実験間のOGDの長さは、神経密度によって変化する）での実験を示す図である。2時間45分では、神経保護者（neuroguardian）（60〜70%）に比べて、wtEPO（20〜30%）では僅かな保護が達成されたに過ぎなかった。EPOの完全な保護能力は、より高い損傷レベル（3時間15分）で観察されたに過ぎなかった。
【図９】図９のパネルＡは、各々、pcDNA3.1-V5/His-hEPO、pcDNA3.1-V5/His-hS3又はpcDNA3.1-V5/His-hS4でトランスフェクトされたHEK293-細胞の培地由来のウェスタンブロットを示す図である。これらの培地は図８に示す実験に使用した。マウス-EPO-ELISA (R&D)いより定量されたhEPO濃度は、2 U/mlであった。rhEPO (2.5 ngをゲル上に装填した)、hEPO (0.4 ngをゲル上に装填した)、hS3及びhS4: 各20 μl培地 (トランスフェクション後の２日後に回収した)。マーカー = 5 μlのHis-タグが付いたBenchMark（商標）。タンパク質標品 (インビトロゲン)。図９のパネルＢは、His-タグ付き-精製マウス型EPO (mEPO)、ヒトhS3及びhS4 EPO変異体のウェスタンブロットを示す図である。mEPOは、EPO-マウス-ELISAで精製した。130 pg mEPOをゲル上に装填した（一次抗体: ウサギ抗-rhEPO-Antikorper; サンタ・クルーズ)。
【図１０】図10は、組換えで作製されたEPO変異体（α-へリックス突然変異体）のアミノ酸配列と、in vivoで特定されたEPO変異体のアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。配列番号50は、ヒトα-ヘリックス野生型配列であり；配列番号51は、hAmA（(点突然変異アラニン）であり；配列番号52は、hAmE（点突然変異グルタミン酸）であり；配列番号 53は、hA-10（欠損突然変異体）であり、及び配列番号54は、hA-20（欠損突然変異体）である。
【図１１】図11は、H9c2心筋芽細胞における、血清除去及び低酸素からなる虚血モデルでの、hEPO及びhS3介在細胞保護を示す図である。H9c2細胞を、常酸素又は低酸素の条件下で24時間、血清-除去DMEM-培地でインキュベートした。LDHアッセイにより、24時間後にアポトーシスを評価した。常酸素及び低酸素条件下での非処置細胞のデルタLDH放出を100%に設定することにより、データを標準化した。Ａは、標準化LDH放出の平均値を示すカラム図を示し、Ｂは、データを、中程度（ボックスを横切る線）、25%（低ヒンジ）、75%（高ヒンジ）、最大値及び最小値を示すボックスプロット図として示した。実験数 n=7. P*<0,001 (ANOVA1)。
【図１２】図12は、R&D（ヤギ、ビオチン標識）社の抗-mEPO抗体を用いる、EPO変異体の免疫沈降を示す図である；Ａは、CoC12-処置マウス (129S6) の腎臓タンパク質抽出物における第２EPOアイソフォーム（30 kDa）を示し、Ｂは、ダルベポエチンAによる抗体-抗原相互作用のブロッキングを示す。
【図１３】図13は、エリスロポエチンα-ヘリックスにより介在される神経保護 (hA; n=4)を示す図である。hA 100/Ul: 30 pM; hA 50 U/l: 15 pM; hEPO: 30 pM=100 U/l; P*<0.05; ANOVA1対対照。
【図１４】図14は、数個のヒトEPO-アイソフォームによって介在される神経保護を示す図である (n=6)。P*<0,05; ANOVA1対対照。
【図１５】図15は、エリスロポエチンα-ヘリックス欠損変異対によって介在される神経保護を示す図である (n=6)。P*<0.05; ANOV1対対照。Ａは、標準化LDH放出の平均値を示すカラム図である。Ｂは、標準化LDH放出の平均百分率値（25%、75%）を示すボックスプロットである。
【図１６】図16は、ヒトマクロファージによるLPS-誘導サイトカイン産生に対するヒトEPO変異体及び完全長ヒトEPOの効果を示す図である。rhu M-CSF (50 ng/ml) の存在下において、６日間、精製ヒト単球をマクロファージと識別した。hS4、hS3又はhEPO (各300 mU/ml) でマクロファージを３時間予備-インキュベートし、次いで４時間、10 ng/mlエンドトキシン (E.coli 0127:B8由来のLPS) で刺激した。上清中のサイトカイン濃度をELISA (Cytometric Beads Array, Becton Dickinson, ハイデルベルグ, ドイツ) により測定した。データは、平均±SDで示した。**結果は、対照 (PBS) 群とは異なった (p<0.01; マン-ホイットニーU検定; n=3〜9/群)。
【図１７】図17は、EPO欠損変異体の核酸核酸配列のアラインメントを示す図である。
【図１８】図18は、突然変異体及び組換え的に作製された欠損変異体、並びに野生型ヘリックスA（hWT-EPOヘリックスA）のDNA配列を示す図である。ここで、配列番号55はhA（野生型ヘリックスA）、配列番号56はhAmA (アラニンを有する欠損突然変異体)、配列番号57はhAmE（グルタミン酸を有する欠損突然変異体）、配列番号58はhA-10 (欠損突然変異体ヘリックスA -10aa)、及び配列番号59はhA-20（欠損突然変異体ヘリックスA -20aa）である。
【図１９】図19は、リーダー配列輸送配列を示す好ましい実施態様である。Ａは、配列番号60としてリーダーを有さないhA DNA配列を示す。これは、成熟運び出し（exported）タンパク質である。Ａは、リーダー-配列（配列番号63）も示す。Ｂは、配列番号61としてリーダーを有さないhAアミノ酸を示し、配列番号62としてリーダー-配列のアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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