(57)【要約】  本発明は、遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスおよびそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。上記遺伝的に改変されたウイルスおよびポリヌクレオチドを含むワクチンも提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＮＬＳ−２領域、ＮｏＬＳ領域、およびＮＥＳ領域からなる群より選択された少なくとも１つの保存領域内で改変され、それによって前記保存領域が失われているＮタンパク質を含む、弱毒化されている遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルス、
ｂ）ａ）の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子、ならびに
ｃ）ｂ）の感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子
からなる群より選択されたＰＲＲＳ感染性因子を含む組成物。
【請求項２】
さらに改変されており、その結果、ａ）保存ＮＬＳ−１領域が失われているか、または、非保存的アミノ酸置換の導入によって前記保存領域が失われているか、または前記保存領域が少なくとも部分的に欠失している、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記保存領域が以下のもの、すなわち、ａ）ＮｏＬＳ領域、ＮＬＳ−２領域、および／もしくはＮＥＳ領域のいずれか、またはこれらの組合せから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＰＲＲＳウイルスが以下のもの、すなわち、北米型ＰＲＲＳウイルスもしくはヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスのいずれか、またはこれらの組合せから選択される、請求項１から３に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＰＲＲＳウイルスが北米型ＰＲＲＳウイルスであり、前記保存領域がＮＬＳ−２領域である、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
Ｎタンパク質の残基４３および４４がグリシンである組成物、
Ｎタンパク質の残基４３および４４がグリシンであり、かつ残基４５がアスパラギンである組成物、
ＮＬＳ−２領域が少なくとも部分的に欠失している組成物、
Ｎタンパク質の残基４３から４８までのうち少なくとも１残基が欠失している組成物、
Ｎタンパク質の残基４３および４４の両方が欠失している組成物、
Ｎタンパク質の残基４３、４４、および４６が欠失している組成物、
Ｎタンパク質の残基４４、４６、および４７が欠失している組成物、ならびに／または
Ｎタンパク質の残基４６、４７、および４８が欠失している組成物
からなる群より選択された、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
復帰の可能性を最小にするように設計された、追加のヌクレオチド変異、置換、および／または欠失を含有している、請求項１から６に記載の組成物。
【請求項８】
ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタ動物を防御するワクチンであって、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項１から７のいずれかに記載の組成物と、獣医学的使用に許容できる担体とを含むワクチン。
【請求項９】
ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタ動物を防御する方法であって、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項８に記載のワクチンで動物にワクチン接種するステップを含む方法。
【請求項１０】
請求項１から９のいずれかに記載の組成物を含む、形質移入された宿主細胞。
【請求項１１】
遺伝的に改変された弱毒化ＰＲＲＳウイルスを作製する方法であって、
ａ）ＮＬＳ−２領域、ＮｏＬＳ領域、およびＮＥＳ領域からなる群より選択された少なくとも１つの保存領域内で改変され、それによって前記保存領域が失われているＮタンパク質を含む遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを産生するように、ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異導入するステップと、
ｂ）ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞に、前記遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを導入するステップと
を含む方法。
【請求項１２】
前記遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスが、復帰の可能性を最小にする１つまたは複数の追加のヌクレオチド変異、置換および／または欠失でさらに改変されている、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスが北米型ＰＲＲＳウイルスまたはヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞がＭＡＲＣ−１４５細胞である、請求項１１から１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞が、生きているブタ動物の体内に含まれている、請求項１１から１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスおよびそれをコードするポリヌクレオチドを提供する。上記遺伝的に改変されたウイルスおよびポリヌクレオチドを含むワクチンも提供する。
【背景技術】
【０００２】
ブタ生殖器呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）は、成熟したメスブタおよび未成熟のメスブタでは流産、死産、および他の生殖上の問題を、ならびに若いブタでは呼吸器疾患を特徴とする。原因物質は、アルテリウイルス科およびニドウイルス目の一員であるＰＲＲＳウイルスである。このウイルスの２つの異なった遺伝子型が北米およびヨーロッパで１９８０年代後半にほぼ同時に現れた。ＰＲＲＳウイルスは、現在、ほとんどすべてのブタ産出国で風土病となっており、全世界のブタ肉産業に影響を与えている経済的に最も重要な疾患の１つであると考えられている。
【０００３】
現在、ＰＲＲＳに対する市販のワクチンには、改変生ワクチンおよび死菌（不活性化）ワクチンが含まれる。死菌ワクチンは、異種系統のＰＲＲＳウイルスに対して活発な免疫を誘導しないことが批判されている。改変生ワクチンは、病原性が無くなるまで細胞培養で連続継代することによって弱毒化されている。改変生ワクチンは、死菌ワクチンより広範な防御を誘発するが、残留病原性、非接種ブタへの伝搬、および病原性への遺伝的復帰を含めた、いくつかの安全性に関する懸念を与えることがある。そのようなワクチンは、弱毒化過程で起こる抗原性の変化のため、病原性の強い野生株ＰＲＲＳウイルスに対する防御能力も、その一部を失うことがある。そのため、ＰＲＲＳから防御するための新規かつ改善された改変生ワクチンに対する緊急な必要性が存在する。
【０００４】
配列の簡単な説明
配列番号１  北米型ＰＲＲＳＶ単離株ＶＲ２３３２のＮタンパク質残基４１〜４７
配列番号２  ＶＲ２３３２  ＮｏＬＳ領域の配列
配列番号３  レリスタットＮｏＬＳ領域の配列
配列番号４  ＶＲ２３３２単離株のＮＥＳ領域
配列番号５  レリスタット単離株のＮＥＳ領域
配列番号６  Ｐ１２９単離株からのＮタンパク質のアミノ酸配列
配列番号７  Ｐ１２９単離株からのＯＲＦ７（Ｎタンパク質をコードする）のヌクレオチド配列
配列番号８  プライマーＰ−ＳＨＵＴＴＬＥ−ＦＷＤ
配列番号９  プライマーＰ−ＳＨＵＴＴＬＥ−ＲＥＶ
配列番号１０  変異原性プライマーＫＫ４３／４４ＧＧ−Ｆｗｄ
配列番号１１  変異原性プライマーＫＫ４３／４４ＧＧ−ＲＥＶ
配列番号１２  表８の欠失変異体。野生型Ｐ１２９のＮＬＳ２領域のアミノ酸配列：
配列番号１３  表８の欠失変異体。野生型Ｐ１２９のＮＬＳ２領域のヌクレオチド配列：
配列番号１４  表８の欠失変異体。Ｐ１２９−ＧＧのＮＬＳ２領域のアミノ酸配列：
配列番号１５  表８の欠失変異体。Ｐ１２９−ＧＧのＮＬＳ２領域のヌクレオチド配列：
配列番号１６  表８の欠失変異体。Ｐ１２９−ｄ４３／４４のＮＬＳ２領域のアミノ酸配列：
配列番号１７  表８の欠失変異体。Ｐ１２９−ｄ４３／４４のＮＬＳ２領域のヌクレオチド配列：
配列番号１８  表８の欠失変異体。Ｐ１２９−ｄ４３／４４／４６のＮＬＳ２領域のアミノ酸配列：
配列番号１９  表８の欠失変異体。Ｐ１２９−ｄ４３／４４／４６のＮＬＳ２領域のヌクレオチド配列：
配列番号２０  表８の欠失変異体。Ｐ１２９−ｄ４４／４６／４７のＮＬＳ２領域のアミノ酸配列：
配列番号２１  表８の欠失変異体。Ｐ１２９−ｄ４４／４６／４７のＮＬＳ２領域のヌクレオチド配列：
配列番号２２  表８の欠失変異体。Ｐ１２９−ｄ４６／４７／４８のＮＬＳ２領域のアミノ酸配列：
配列番号２３  表８の欠失変異体。Ｐ１２９−ｄ４６／４７／４８のＮＬＳ２領域のヌクレオチド配列：
配列番号２４  Ｐ１２９−ｄ４３／４４Ｆ
配列番号２５  Ｐ１２９−ｄ４３／４４／４６Ｆ
配列番号２６  Ｐ１２９−ｄ４４／４６／４７Ｆ
配列番号２７  Ｐ１２９−ｄ４６／４７／４８Ｆ
配列番号２８  Ｐ１２９−ｄ４３／４４Ｒ
配列番号２９  Ｐ１２９−ｄ４３／４４／４６Ｒ
配列番号３０  Ｐ１２９−ｄ４４／４６／４７Ｒ
配列番号３１  Ｐ１２９−ｄ４６／４７／４８Ｒ
【０００５】
引用文献
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【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質のＮＬＳ−２領域、ＮｏＬＳ領域、および／またはＮＥＳ領域内で改変され、その結果生じるＰＲＲＳウイルスが弱毒化されている遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを提供する。本発明はさらに、上記遺伝的に改変されたウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子、および上述の感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子も提供する。
【０００８】
本発明は、上述のウイルスの生物学的に純粋な培養物（すなわち他のウイルスを実質的に含まない）も提供し、上述の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含むウイルスベクターを示す。
【０００９】
本発明はさらに、前述のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、単離されたポリヌクレオチド、または上述のウイルスベクターのいずれかを含む形質移入された宿主細胞も提供する。
【００１０】
本発明はさらに、ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタ動物を防御するワクチンも提供し、上記ワクチンは、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の、上述の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルス、上記遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする上述の感染性ＲＮＡ分子、遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする上述の単離されたポリヌクレオチド分子（プラスミドの形態でもよい）、または遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする上述のウイルスベクターと、獣医学的使用に許容できる担体とを含む。
【００１１】
本発明はさらに、ＮＬＳ−２の復帰抵抗性変異も提供する。本発明の好ましい実施形態、特にワクチンを目的としたものは、復帰の可能性が最小となるように、そして他の隣接残基がリジンおよびアルギニンなどの塩基性残基に変異して、それによってこの領域内で機能的なＮＬＳモチーフが回復する可能性が最小となるように設計された、追加のヌクレオチド置換および／または欠失を含有しているであろう。
【００１２】
本発明は、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の、上述のワクチンを動物に接種するステップを含む、ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタ動物を防御する方法をさらに提供する。
【００１３】
本発明は、上述のＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異導入するステップと、適当な発現系を用いて遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを発現するステップとを含む、遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを作製する方法を提供する。
【００１４】
ＰＲＲＳウイルスは、野生型のものも、遺伝的に改変されたものも、当技術分野で一般的に知られている適当な発現系を用いて、単離されたポリヌクレオチド分子から発現させることができ、そのような発現系の例は、本出願に記載されている。例えば、単離されたポリヌクレオチド分子は、下記にさらに詳述する通り、コードされているウイルスを適当な宿主細胞で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現することができるプラスミドの形態のものでよい。
【００１５】
本発明の他の特徴は、概観することで明らかになろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明者らは、本明細書において、病原性ＰＲＲＳウイルスのヌクレオカプシドタンパク質、すなわちＮタンパク質（ＯＲＦ７によってコードされている）のＮＬＳ−２領域、ＮｏＬＳ領域またはＮＥＳ領域を変異または欠失させることによって病原性ＰＲＲＳウイルスを弱毒化する方法と、前記弱毒化ウイルスを含む免疫原性組成物と、前記免疫原性組成物を用いたワクチン接種によってブタをＰＲＲＳから防御する方法とを開示する。この方法によって弱毒化されたＰＲＲＳウイルスは、病原性野生株の抗原性の特徴を保持し、それゆえ、細胞培養によって弱毒化されたウイルスに基づくワクチンより効果的な防御を提供するに違いない。
【００１７】
ＯＲＦ７によってコードされるＰＲＲＳＶのヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）は、リン酸化されている小さな塩基性タンパク質であり（Ｗｏｏｔｔｏｎ、Ｒｏｗｌａｎｄ、およびＹｏｏ、２００２年）、ホモ二量体を形成する（ＷｏｏｔｔｏｎおよびＹｏｏ、２００３年）。結晶構造が最近決定された（ＤｏａｎおよびＤｏｋｌａｎｄ、２００３年）。Ｎタンパク質は感染細胞内で複数の機能を有すると考えられている。ゲノムＲＮＡがその中にパッケージングされる球状カプシド構造の形成は、細胞質中で起こる過程であるが、この過程に加えて、Ｎタンパク質の一部は、感染細胞の核内に、より詳細には核小体に輸送される。Ｎタンパク質のアミノ酸配列は、２つの核移行シグナル（ＮＬＳ）、すなわち、核小体移行シグナル（ＮｏＬＳ）および核外輸送シグナル（ＮＥＳ）を含有しており、これらはそれぞれ、核および核小体内への輸送と、核からの搬出とを促進する（Ｒｏｗｌａｎｄら、１９９９年；Ｒｏｗｌａｎｄら、２００３年；ＲｏｗｌａｎｄおよびＹｏｏ、２００３年）。核小体内にある間に、Ｎタンパク質は、核小体低分子ＲＮＡ関連タンパク質であるフィブリラリンと相互作用し、ウイルス複製のために感染細胞内でのｒＲＮＡプロセシングおよびリボソーム生合成を調節している可能性がある（Ｙｏｏら、２００３年）。本発明において、本発明者らは、Ｎタンパク質のＮＬＳ、ＮｏＬＳ、およびＮＥＳモチーフ内における変異および欠失によって、核移行が異常な生存ウイルスが生じうること、およびそのような変異を含むウイルスがＰＲＲＳに対するワクチンとして有用であることを示す。
【００１８】
このタイプのウイルス変異は、単独でも、他の弱毒化変異と併用しても、新規なＰＲＲＳワクチンを設計するのに有用である。
【００１９】
定義
「効果的免疫防御反応」および「免疫防御」などの用語は、本発明の目的では、ワクチン接種された動物で病原体による感染に対して防御する、病原体の１つまたは複数の抗原エピトープに対する免疫応答を意味する。本発明の目的では、病原体による感染に対する防御には、感染の絶対的予防のみでなく、ワクチン接種されなかった感染動物と比較した際の、ワクチン接種された動物での病原体による感染の程度または率におけるいかなる検出可能な低減も、あるいは病原体による感染から生じた疾患またはなんらかの症状もしくは状態の重症度におけるいかなる検出可能な低減も含まれる。効果的免疫防御反応は、以前に病原体に感染していない、かつ／またはワクチン接種時に病原体に感染していない動物で誘導できる。効果的免疫防御反応は、ワクチン接種時に既に病原体に感染していた動物でも誘導できる。
【００２０】
遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスが「弱毒化されている」のは、それが未改変の親株より有毒でない場合である。ある株が「より有毒でない」のは、疾患の重症度を決定する１つまたは複数のパラメータが統計的に有意な減少を示す場合である。そのようなパラメータには、ウイルス血症のレベル、熱、呼吸困難の重症度、生殖性の症状の重症度、または肺病変の数もしくは重症度などが含まれることがある。
【００２１】
「ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルス」は、１９９１年頃にヨーロッパで最初に単離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｗｅｎｓｖｏｏｒｔ，Ｇ．ら、１９９１年、Ｖｅｔ．Ｑ．１３：１２１−１３０）に関連した遺伝的特性を有する、いかなる株のＰＲＲＳウイルスも意味する。当技術分野では、「ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルス」を「レリスタットウイルス」と呼ぶこともある。
【００２２】
「遺伝的に改変された」は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、人的な介入によって遺伝的に変異導入されていることを意味する。「変異導入されている」は、好ましくはコードされているアミノ酸が変化するような様式における、あるアミノ酸から別のアミノ酸への交換、またはあるコーディングヌクレオチドから別のヌクレオチドへの交換（例えばＴからＣへ）、すなわち、いわゆる「置換」、または「欠失」もしくは「挿入」などの他の任意の変異を意味する。上記の変異は常に、コーディングヌクレオチド配列中で行われたものである。
【００２３】
「ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞」は、本発明のウイルスで感染させた際に、感染性ＰＲＲＳを産生できる細胞系を意味する。そのような細胞には、ブタ肺胞マクロファージ細胞およびブタ肺胞マクロファージ細胞に由来した細胞、ＭＡ−１０４細胞およびＭＡ−１０４細胞に由来した細胞、ならびにＭＡＲＣ−１４５細胞およびＭＡＲＣ−１４５細胞に由来した細胞、ならびにＰＲＲＳウイルスの受容体で形質移入された細胞が含まれる。本発明の小型プラーク表現型を実証するには、ＭＡＲＣ−１４５細胞が特に好ましい。「ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞」という用語には、生きているブタの体内にある細胞も含まれうる。
【００２４】
本発明の目的では、「免疫応答」は、１つもしくは複数の特定の抗原エピトープに対する、または上記エピトープの分解または阻害を補助する、抗体および／または細胞（Ｔリンパ球など）の産生を意味する。
【００２５】
「北米型ＰＲＲＳウイルス」は、限定されるものではないが、１９９０年代初期に米国で最初に単離されたＰＲＲＳウイルス（例えば、Ｃｏｌｌｉｎｓ、Ｊ．Ｅ．ら、１９９２年、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．４：１１７−１２６を参照）；北米型ＰＲＲＳウイルス単離株ＭＮ−１ｂ（Ｋｗａｎｇ、Ｊ．ら、１９９４年、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｄｉａｇｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．６：２９３−２９６）；ＰＲＲＳのＱｕｅｂｅｃ  ＩＡＦ−ｅｘｐ９１株（Ｍａｒｄａｓｓｉ、Ｈ．ら、１９９５年、Ａｒｃｈ．Ｖｉｒｏｌ．１４０：１４０５−１４１８）；および北米型ＰＲＲＳウイルス単離株ＶＲ２３８５（Ｍｅｎｇ、Ｘ．−Ｊら、１９９４年、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７５：１７９５−１８０１）などの北米型ＰＲＲＳウイルス単離株に関連した遺伝的特性を有するいかなるＰＲＲＳウイルスも意味する。遺伝的特性とは、北米型ＰＲＲＳウイルス株が共有するゲノムヌクレオチド配列類似性およびアミノ酸配列類似性を意味する。
【００２６】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、本明細書で使用される場合、特定のＰＲＲＳウイルスタンパク質を、終止コドンの介在なしにコードするのに必要な最小限のヌクレオチド配列を指す。
【００２７】
「ブタの（ｐｏｒｃｉｎｅ）」および「ブタ（ｓｗｉｎｅ）」は、本明細書では同義的に使用され、例えば豚（ｐｉｇ）など、イノシシ（Ｓｕｉｄａｅ）科の一員であるいかなる動物も指す。「ＰＲＲＳウイルス」という用語は、本明細書で使用される場合、別段の指示がない限り、北米型またはヨーロッパ型いずれかのいかなるＰＲＲＳウイルス株も意味する。
【００２８】
「ＰＲＲＳ」は、ＰＲＲＳウイルス感染によって引き起こされる、ブタの疾患症状を包含する。そのような症状の例には、発熱、妊娠したメスの流産、呼吸困難、肺病変、食欲不振、および若年のブタの死亡が含まれるが、これらに限定されない。本明細書で使用される場合、「ＰＲＲＳを生じさせることができない」ＰＲＲＳウイルスは、ブタを感染させることができるウイルスであって、通常、ブタでのＰＲＲＳ感染に関連しているいかなる病徴も生じさせないウイルスを指す。
【００２９】
ＰＲＲＳＶ「Ｎタンパク質」または「ＯＲＦ７」は、本明細書で使用される場合、ＰＲＲＳウイルスのヨーロッパゲノム型および北米ゲノム型両方におけるＯＲＦ７によってコードされているポリペプチドと定義される。現在知られているＮタンパク質の特定のアイソタイプの例は、アクセッション番号ＰＲＵ８７３９２によってＧｅｎｂａｎｋに報告されている、北米型ＰＲＲＳの原型単離株ＶＲ２３２２における１２３アミノ酸ポリペプチド、およびＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ａ２６８４３で報告されている、ヨーロッパ型ＰＲＲＳの原型単離株レリスタットの１２８残基Ｎタンパク質である。
【００３０】
「ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質ＮＬＳ−１領域」または「ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７  ＮＬＳ−１領域」は、成熟Ｎタンパク質におけるＮ末端最初の約１５残基内に位置している４残基の連続した塩基性アミノ酸（リジンまたはアルギニン）、または３残基の塩基性残基とヒスチジンもしくはプロリンとを含有しており、「ｐａｔ４」または「ｎｕｃ１」核移行シグナルを指す（ＮａｋａｉおよびＫａｎｅｈｉｓａ、１９９２年；ＲｏｗｌａｎｄおよびＹｏｏ、２００３年）。一例として、ＶＲ２３３２  ＮＬＳ−１領域配列はＫＲＫＫであり、残基９〜１２に位置し、一方、レリスタット単離株配列は、ＫＫＫＫであり、Ｎタンパク質の残基１０〜１３で位置している。
【００３１】
「ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質ＮＬＳ−２領域」または「ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７  ＮＬＳ−２領域」は、２つの形態のうちの１つを取ることができるＮタンパク質中の第２の核移行シグナルを指す。北米型ＰＲＲＳウイルスでは、ＮＬＳ−２は、本発明者らが「ｐａｔ８」モチーフと命名したパターンを有し、このモチーフは、プロリンで始まり、その後３残基以内に、５残基のうち少なくとも３残基の塩基性残基（ＫまたはＲ）を含有する５残基配列が続く（ＮａｋａｉおよびＫａｎｅｈｉｓａ、１９９２年；ＲｏｗｌａｎｄおよびＹｏｏ、２００３年に記載の「ｐａｔ７」または「ｎｕｃ２」モチーフのわずかな改変形態）。一例として、そのような配列は、北米型ＰＲＲＳＶ単離株ＶＲ２３３２のＮタンパク質残基４１〜４７に位置しており、配列ＰＧＫＫＮＫＫＫ（配列番号１）によって表される。ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスでは、ＮＬＳ−２は、「ｐａｔ４」または「ｎｕｃ１」モチーフを有し、このモチーフは、ヒスチジンまたはプロリンを伴った連続した４残基の塩基性アミノ酸または３残基の塩基性残基の領域である（ＮａｋａｉおよびＫａｎｅｈｉｓａ、１９９２年；ＲｏｗｌａｎｄおよびＹｏｏ、２００３年）。ヨーロッパ型ＰＲＲＳＶ単離株レリスタットのＮＬＳ−２は、残基４７〜５０に位置し、配列ＫＫＫＫによって表される。
【００３２】
「ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質ＮｏＬＳ領域」または「ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７  ＮｏＬＳ領域」は、全長約３２アミノ酸を有する核小体移行シグナルを指し、アミノ末端近傍のＮＬＳ−２領域を組み込んでいる。一例として、ＶＲ２３３２  ＮｏＬＳ領域配列は、残基４１〜７２に位置し、配列ＰＧＫＫＮＫＫＫＮＰＥＫＰＨＦＰＬＡＴＥＤＤＶＲＨＨＦＴＰＳＥＲ（配列番号２）によって表され（ＲｏｗｌａｎｄおよびＹｏｏ、２００３年）、対応するレリスタット単離株配列は、残基４２〜７３に位置し、配列ＰＲＧＧＱＡＫＫＫＫＰＥＫＰＨＦＰＬＡＡＥＤＤＩＲＨＨＬＴＱＴＥＲ（配列番号３）によって表される。
【００３３】
「ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質ＮＥＳ領域」または「ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ７  ＮＥＳ領域」は、Ｎタンパク質のカルボキシ末端近傍に位置するＬＸＬモチーフを含有する核外輸送シグナルを指す。ＮＥＳモチーフは、Ｘ−Ｒ（２〜５）−Ｘ−Ｒ２−Ｘ−Ｒ−Ｙであり、配列中、Ｘはロイシン、イソロイシンまたはバリンのいずれか、Ｙはロイシン、イソロイシン、バリンまたはアラニンのいずれか、そして、Ｒは任意のアミノ酸である。以下に示す通り、北米型およびヨーロッパ型の原型単離株は、このスキームに従い、両方とも５残基のスペーサーを有する。
【００３４】
「形質移入された宿主細胞」は、米国特許第５６００６６２号に記載のものなど、ＰＲＲＳウイルスＲＮＡで形質移入された際に第１ラウンドのＰＲＲＳビリオンを産生できる実際的にいかなる宿主細胞も意味する。さらに増殖性の感染が望ましい場合には、以下に定義する「ＰＲＲＳウイルスの複製を支持できる宿主細胞」が使用されるであろう。
【００３５】
ポリヌクレオチド分子への遺伝学的な変異導入は、当技術分野で知られている部位特異的変異導入による技法、または化学変異原もしくは放射線照射への曝露による技法などの、無作為変異導入による技法を含めた、当業者に知られている組換え技法を用いて行える。前記変異導入は、当技術分野で知られている標準法によって、例えば、記載の通り（例えば、Ｍｅｕｌｅｎｂｅｒｇら、Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．、１９９８年、４４０：１９９−２０６）の感染性コピーの部位特異的変異導入（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ社、米国ニューヨーク州Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ所在）によって実施できる。
【００３６】
したがって、本発明は、上述のＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異導入するステップと、適した発現系を用いて遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを発現するステップとを含む、遺伝的に改変された北米型ＰＲＲＳウイルスを作製する方法をさらに提供する。遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスは、当技術分野で一般的に知られている適した発現系を用いて、単離されたポリヌクレオチド分子から発現させることができる。そのような発現系の例は、この出願に記載されている。例えば、単離されたポリヌクレオチド分子は、下記にさらに詳述する通り、コードされているウイルスを適当な宿主細胞で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現することができるプラスミドの形態のものでよい。
【００３７】
これらの北米型ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質配列は、高度に保存されており、報告されている配列は、相互に約９３〜１００％の同一性を有する。北米型およびヨーロッパ型ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質は、約５７〜５９％同一であり、共通の構造モチーフを共有する。
【００３８】
一例として、ＶＲ２３３２  ＮＥＳ領域配列は、残基１０６〜１１７に位置し、配列ＬＰＴＨＨＴＶＲＬＩＲＶ（配列番号４）によって表され（ＲｏｗｌａｎｄおよびＹｏｏ、２００３年）、レリスタット単離株配列は、残基１０７〜１１８に位置し、配列ＬＰＶＡＨＴＶＲＬＩＲＶ（配列番号５）によって表される。
【００３９】
以下のコンセンサスには、Ｇｅｎｂａｎｋにおける北米型ＰＲＲＳＶ配列中にあるすべての配列が含まれ、このコンセンサスでは、（＊）のある位置が完全に保存されている。代替のアミノ酸を各位置の下に示す。
ＬＰＴＨＨＴＶＲＬＩＲＶ（配列番号４）
＊＊ＶＡＱ＊＊＊＊＊＊Ａ
Ｑ
Ｖ
Ｇ
【００４０】
上記で参照したアミノ酸付番は、言及したデータベースの記載に従ったものである。付番が異なっているかもしれない他のすべてのＰＲＲＳ単離株において、対象とするＰＲＲＳ株にある保存されている特徴的なアミノ酸を同定し、それを標準株とアラインメントすることによって、適切な領域が容易に同定される。本発明の目的の１つは、置換、欠失、または挿入によって１つまたは複数の保存領域が失われ、その結果、弱毒化表現型が生じるようにＰＲＲＳウイルスまたはそのコーディング核酸を改変することである。
【００４１】
本発明のコーディングウイルス中のポリヌクレオチドを改変することによって、保存されたＮＬＳ−２モチーフ、ＮｏＬＳ領域、またはＮＥＳモチーフを除去する欠失、挿入、または置換を導入する。好ましい実施形態では、１、２、３、４または５アミノ酸を含んだ欠失または挿入の結果、保存モチーフの除去が起こり、弱毒化ウイルスが生じる。
【００４２】
アミノ酸は、物理学的特性、ならびにタンパク質の二次構造および三次構造への寄与に応じて分類することができる。保存的置換は、当技術分野において、あるアミノ酸から類似の特性を有する別のアミノ酸への置換であると認識されている。保存的置換の例を、すぐ下の表１に示す（国際公開第９７／０９４３３号パンフレット、１０頁、１９９７年３月１３日公開（１９９６年９月６日出願のＰＣＴ出願第ＧＢ９６／０２１９７号）より）。
【００４３】
【表１】
2008531006.tif 000002
【００４４】
別法では、すぐ下の表２に示す通り、保存的アミノ酸をＬｅｈｎｉｎｇｅｒ（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第２版、Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ社、米国ニューヨーク州ニューヨーク所在（１９７５年）、７１〜７７頁）に従って分類することができる。
【００４５】
【表２】
2008531006.tif 000003
【００４６】
さらに別の別法として、保存的置換の例をすぐ下の表３に示す。
【００４７】
【表３】
2008531006.tif 000004
【００４８】
遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスの調製
組換えＤＮＡ技術は、核酸をＤＮＡレベルで改変することを目的とした極めて多様かつ強力な分子生物学技法を含み、分子レベルでのゲノムの分析および改変を可能にする。この点に関して、ＰＲＲＳウイルスなどのウイルスは、そのゲノムのサイズが小さいため、そのような操作がとりわけ容易である。しかし、レトロウイルスではないＲＮＡウイルスは、それらの複製においてＤＮＡ中間体の段階を包含しないため、組換えＤＮＡ技術をそれらに直ちに適用することができない。そのようなウイルスに関しては、改変ウイルスを生成させるために、それらのゲノムに組換えＤＮＡ技術を適用できるようになる前に、感染性のｃＤＮＡクローンを発生させなければならない。感染性クローンは、研究しているウイルスの完全長（ゲノム長）ｃＤＮＡ（ここでは、ＲＮＡのＤＮＡコピーに関する広い意味で用いられおり、厳密な意味でのｍＲＮＡのＤＮＡコピーのみではない）を構築し、その後、その完全長ｃＤＮＡで形質移入された細胞において、ｉｎ  ｖｉｖｏで感染性転写産物を合成させることを介して得ることができるが、感染性転写産物は、完全なウイルスゲノムを含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ連結された部分長ｃＤＮＡ断片からのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によっても得ることができる。すべての場合において、転写されたＲＮＡは、上記ｃＤＮＡに導入されたすべての改変を保有し、そのように改変されたウイルスのさらなる継代に使用することができる。
【００４９】
ヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルス単離株であるレリスタットウイルスの感染性クローンの調製は、参照により本明細書に完全に組み込まれている米国特許第６２６８１９９号明細書に記載されている。Ｐ１２９と命名された北米型ＰＲＲＳウイルス単離株の感染性ｃＤＮＡクローンの調製は、参照により本明細書に完全に組み込まれている米国特許第６５００６６２号明細書に記載されている。Ｐ１２９ｃＤＮＡの配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＦ４９４０４２および米国特許第６５００６６２号明細書に開示されている。本発明者らの下記の研究は、プラスミドの状態でＣＭＶ前初期プロモーターによって発現されるそのような感染性クローンを利用している。この感染性クローンは、ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９と呼ばれ、米国特許第６５００６６２号明細書の中でも開示されている。米国特許第６５００６６２号に記載の通り、ここでの使用に適した他のプラスミドおよびプロモーターも存在する。
【００５０】
対象とするいかなるオープンリーディングフレームも、その完全な配列および対象とするアミノ酸残基の位置が得られれば、コドン表を参照するのみで、当業者が所望の特定の位置における変化を設計するのに十分である。アミノ酸、ならびにそれらを表す略号、シンボル、およびコドンの表を、下記表４に示す。
【００５１】
【表４】
2008531006.tif 000005
【００５２】
コドンは、ｍＲＮＡ分子およびそれらに対応するｃＤＮＡ分子において、ヌクレオチドのトリプレット配列を構成する。コドンは、ｍＲＮＡ分子中に存在する場合には、ウラシル（Ｕ）塩基を特徴とするが、ＤＮＡ中に存在する場合には、チミジン（Ｔ）塩基を特徴とする。ポリヌクレオチド中におけるあるコドンから同じアミノ酸残基のコドンへの単純な変化は、コードされているポリペプチドの配列も、構造も変化させないであろう。ある特定の３ヌクレオチド配列が、いずれのアミノ酸であれ特定のアミノ酸を「コードしている」と述べる句が存在する場合、当業者ならば、問題としている特定のヌクレオチドを同定する手段が、上記の表から得られると認識するであろうことは明らかである。一例として、特定の３ヌクレオチド配列がリジンをコードする場合、上記の表は、２つの可能なトリプレット配列がＡＡＡおよびＡＡＧであることを開示する。グリシンは、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＴ（ＲＮＡ中ではＧＧＵ）、およびＧＧＧによってコードされている。コードされているタンパク質中のリジン残基をグリシン残基に変えるには、コーディング核酸中のＡＡＡまたはＡＡＧトリプレットを、ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＴ、またはＧＧＧのいずれかで置換することができるだろう。Ｐ１２９単離株のＮタンパク質すなわちＯＲＦ７タンパク質のコード配列を下記に例示する。
【００５３】
【表５】
2008531006.tif 000006
【００５４】
ＮＬＳ−２領域内で改変されている変異体タンパク質Ｎポリヌクレオチド配列の構築を、実施例２に例示によって示す。
【００５５】
ＮＬＳ−１、ＮｏＬＳまたはＮＥＳ領域内での変異は、同様の技法および同様の結果で実現できることが理解されよう。
【００５６】
遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスが弱毒化されていることの実証
特定の遺伝的に改変された株が弱毒化されていることを実証するために、以下に記載する実験を用いることができよう。
【００５７】
各試験には、ＰＲＲＳＶが存在しない農場から得られた妊娠経験のないメスブタを、１群あたり少なくとも１０匹含んでいる。ＰＲＲＳウイルス特異的な血清抗体が非存在であるかかどうか、すなわちＰＲＲＳＶに関して陰性であるかどうか動物を試験した。試験に含まれているすべての動物は、供給源および品種が同一のものである。群への動物の割付けは無作為化して行った。
【００５８】
抗原への曝露は、妊娠９０日目に、鼻孔あたり１０５ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳＶ  １ｍｌを鼻腔内投与することによって行う。各試験設定ごとに、少なくとも３群が存在する。すなわち、１群はＰ１２９に曝露させるため；１試験群は弱毒化されている可能性のあるウイルスに曝露させるため；そして１群は厳密な対照群である。
【００５９】
この試験が有効であるとされるのは、試験期間全体を通して厳密な対照がＰＲＲＳＶ陰性のまま残り、かつＰ１２９曝露された群における生きた健康な子ブタの誕生が、厳密な対照と比較して少なくとも２５％少ない場合である。
【００６０】
弱毒化は、換言すれば病原性の低減であり、自己増殖能力または他の総体的徴候を決定する１つまたは複数のパラメータの統計的に有意な変化と定義される。無改変親株に感染した群との比較で、試験群（弱毒化ウイルスである可能性がある）に関する以下のパラメータ、すなわち、
ａ）死産の頻度、
ｂ）妊娠１１２日目の以前における妊娠中絶、
ｃ）ミイラ変性した子ブタの数、
ｄ）不活発で弱い子ブタの数、
ｅ）離乳前の死亡率
のうちの１つにおける有意な低減が弱毒化の指標となろう。さらに、無改変親株に感染した群との比較で、試験群に関する以下のパラメータ、すなわち、
ｆ）メスブタ１匹あたりの離乳した子ブタの数、
ｇ）メスブタ１匹あたりに産まれた生きていて健康な子ブタの数
のうちの１つにおける有意な増大が好ましい。別法では、下記実施例３に記載の通り、弱毒化を確定するために、ＰＲＲＳＶ感染の呼吸器症状および他の症状を検査することができよう。
【００６１】
ワクチン
弱毒化株はワクチンの製剤に有用である。
【００６２】
ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを防御する場合、本ワクチンが有効である。あるワクチンがＰＲＲＳウイルスによる感染からブタを防御するのは、１匹または複数の非罹患ブタにワクチンを投与した後、それに続いて、生物学的に純粋なウイルス単離株（例えば、ＶＲ２３８５、ＶＲ２３８６、Ｐ１２９など）に曝露させた結果、疾患のなんらかな全体的または組織病理学的な変化（例えば肺における病変）および／または症状の重症度が、防御されていない同様なブタで上記単離株によって通常引き起こされるそれらの変化または症状と比較して（すなわち適切な対照と比較して）低下している場合である。より詳細には、本ワクチンは、それを必要とする１匹または複数の適当なブタに本ワクチン投与し、その後、適当な長さの期間（例えば３週間）の後に、生物学的に純粋なＰＲＲＳＶ単離株の大量の試料（１０（３〜７）ＴＣＩＤ（５０））に攻撃させることによって、有効であることを示すことができる。その後、約１週間後に、抗原に攻撃されたブタから血液試料を採取し、次に、血液試料からウイルスを単離する試み（例えば、下記実験ＶＩＩＩに例示するウイルス単離過程を参照）を行う。多量のウイルスが単離されることは、ワクチンが効果的でない可能性があることの指標であり、ウイルス単離量の減少（またはウイルスの不在）は、ワクチンが効果的でありうることの指標である。
【００６３】
したがって、本ワクチンの有効性は、定量的（すなわち、適切な対照群と比較しての圧縮された肺組織の割合の低下）にも、定性的（例えば、血液からのＰＲＲＳＶの単離、免疫アッセイによる肺、扁桃腺、またはリンパ節組織標本中のＰＲＲＳＶ抗原の検出）にも評価できる。ブタ生殖器呼吸器疾患の症状は、定量的（例えば体温／熱）にも、準定量的（例えば、呼吸困難（下記に詳細に説明する）の重症度）にも、または定性的（例えば、１つもしくは複数の症状が存在するかしないか、またはチアノーゼ、肺炎、肺障害などの１つもしくは複数の症状の重症度低下）にも評価できる。
【００６４】
非罹患ブタとは、ブタ生殖器呼吸器疾患感染因子に曝露されていないブタ、またはブタ生殖器呼吸器疾患感染性因子に曝露されているが上記疾患の症状を示していないブタである。罹患ブタとは、ＰＲＲＳの症状を示しているか、あるいはＰＲＲＳＶを単離することができるブタである。
【００６５】
本発明のワクチンは、標準的な緩衝剤、安定化剤、希釈剤、保存剤、および／または可溶化剤など、ヒト（適切な場合）を含めた動物にとって許容できる担体を含むように、許容できる通例に従って製剤でき、また、持続放出を容易にするように製剤することもできる。希釈剤には、水、食塩水、ブドウ糖、エタノール、およびグリセロールなどが含まれる。等張化添加物には、とりわけ、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースが含まれる。安定化剤には、とりわけ、アルブミンが含まれる。改変生ワクチンを製剤するのに特に有用なものを含めた他の適当なワクチン媒体および添加物は、当業者に知られているか、明らかであろう。例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１８版、１９９０年、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ社を参照のこと。
【００６６】
本発明のワクチンは、例えば、とりわけアジュバントまたはサイトカインなど、１つまたは複数の追加免疫調節性成分もさらに含むことができる。本発明のワクチンで使用できるアジュバントの非限定例には、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ｒｉｂｉ社、米国モンタナ州Ｈａｍｉｌｔｏｎ所在）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲルなどの鉱物ゲル、水中油型乳剤、油中水型乳剤、例えばフロインド（Ｆｒｅｕｎｄｓ‘）の完全および不完全アジュバント、ブロックコポリマー（Ｂｌｏｃｋ  ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ）（ＣｙｔＲｘ社、米国ジョージア州Ａｔｌａｎｔａ所在）、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社、米国マサチューセッツ州Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ所在）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ社、米国カリフォルニア州Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ所在）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、Ｑｕｉｌ  Ａもしくは他のサポニン画分、モノホスホリル脂質Ａ、ならびにアブリジン脂質アミンアジュバントが含まれる。本発明のワクチンで有用な水中油型乳剤の非限定例には、改変ＳＥＡＭ６２およびＳＥＡＭ１／２製剤が含まれる。改変ＳＥＡＭ６２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン（Ｓｉｇｍａ社）、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ社）、０．７％（ｖ／ｖ）ＴＷＥＥＮ（登録商標）８０界面活性剤（ＩＣＩ  Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ社）、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、２００ｐｇ／ｍｌ  Ｑｕｉｌ  Ａ、１００［ｍｇｒ］ｇ／ｍｌコレステロール、および０．５％（ｖ／ｖ）レシチンを含有する水中油型乳剤である。改変ＳＥＡＭ１／２は、５％（ｖ／ｖ）スクアレン、１％（ｖ／ｖ）ＳＰＡＮ（登録商標）８５界面活性剤、０．７％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０界面活性剤、２．５％（ｖ／ｖ）エタノール、１００μｇ／ｍｌ  Ｑｕｉｌ  Ａ、および５０μｇ／ｍｌコレステロールを含む水中油型乳剤である。上記ワクチンに含有させることのできる他の免疫調節剤には、例えば、１つまたは複数のインターロイキン、インターフェロン、または他の既知なサイトカインが含まれる。
【００６７】
本発明のワクチンは、任意選択で、本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの持続放出用に製剤することもできる。そのような持続放出製剤の例には、例えば、ポリ（乳酸）、乳酸−グリコール酸コポリマー、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどの生体適合ポリマーの複合物と混合された、ウイルス、感染性ＲＮＡ、プラスミド、またはウイルスベクターが含まれる。薬物送達媒体における分解性ポリマーの構造、選択、および使用は、参照により本明細書に組み込まれている、Ａ．Ｄｏｍｂら、１９９２年、Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ３：２７９−２９２を含めたいくつかの出版物に概説されている。製剤におけるポリマーの選択および使用に関する追加の手引きは、当技術分野で知られている教科書、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第４５巻（Ｍ．Ｄｅｋｋｅｒ社、米国ニューヨーク州所在）中のＭ．ＣｈａｓｉｎおよびＲ．Ｌａｎｇｅｒ（編集）、１９９０年、「Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ」で見出すことができる。別法または追加として、投与および効果を改善するために、ウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターをマイクロカプセルに入れることもできる。抗原をマイクロカプセルに入れる方法は、当技術分野で周知であり、例えば、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第３１３７６３１号、第３９５９４５７号、第４２０５０６０号、第４６０６９４０号、第４７４４９３３号、第５１３２１１７号明細書、および国際特許公開第９５／２８２２７号パンフレットに記載の技法が含まれる。
【００６８】
ウイルス、プラスミド、またはウイルスベクターの持続放出を提供するのに、リポソームを用いることもできる。リポソーム製剤をどのように作製および使用するかに関する詳細は、とりわけ、参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第４０１６１００号、第４４５２７４７号、第４９２１７０６号、第４９２７６３７号、第４９４４９４８号、第５００８０５０号、および第５００９９５６号明細書に見出すことができる。
【００６９】
上述したどのワクチンも、効果をモニターしながら、低用量のウイルス、プラスミドまたはウイルスベクターから開始して、その後、用量を増強する従来の方法によって、その有効量を決定することができる。有効量は、ワクチンの単独投与後に得られても、ワクチンの多回投与後に得られてもよい。動物あたりの最適用量を決定する際には、既知な因子を考慮に入れることができる。これらには、種、サイズ、動物の年齢、一般的な健康状態、および動物体内における他剤の存在などが含まれる。実際の用量は、他の動物試験から得られた結果を考慮した後に選択することが好ましい。
【００７０】
適切な免疫応答が実現されたかどうかを検出する方法の１つは、ワクチン接種後における動物体内の血清転換および抗体価を測定することである。ワクチン接種のタイミング、および追加免疫が必要な場合におけるその数は、好ましくは、すべての関連因子の分析に基づいて、医師または獣医によって決定されるであろう。そのような関連因子の一部は上述されている。
【００７１】
本発明のウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターの有効用量は、既知な技法を使用し、ワクチン接種される動物の体重などの、当業者によって測定できる因子を考慮に入れて決定することができる。本発明のワクチン中の本発明のウイルスの用量は、好ましくは約１０１から約１０９ｐｆｕ（プラーク形成単位）まで、より好ましくは約１０２から約１０８ｐｆｕまで、そして最も好ましくは約１０３から約１０７ｐｆｕまでの範囲にある。本発明のワクチン中の本発明のプラスミドの用量は、好ましくは約０．１μｇから約１００ｍｇまで、より好ましくは約１μｇから約１０ｍｇまで、さらにより好ましくは約１０μｇから約１ｍｇまでの範囲にある。本発明のワクチン中の本発明の感染性ＲＮＡ分子の用量は、好ましくは約０．１から約１００ｍｇまで、より好ましくは約１μｇから約１０ｍｇまで、さらにより好ましくは約１０μｇから約１ｍｇまでの範囲にある。本発明のワクチン中の本発明のウイルスベクターの用量は、好ましくは約１０１ｐｆｕから約１０９ｐｆｕまで、より好ましくは約１０２ｐｆｕから約１０８ｐｆｕまで、そしてさらにより好ましくは約１０３から約１０７ｐｆｕまでの範囲にある。適当な用量サイズは、約０．５ｍｌから約１０ｍｌまで、より好ましくは約１ｍｌから約５ｍｌまでの範囲にある。
【００７２】
ワクチンは一例として、経口送達、非経口送達、皮内送達、皮下送達、筋肉内送達、鼻腔内送達、または静脈内送達できる。経口送達には、例えば動物の飼料または飲料への上記組成物の添加が包含されうる。ワクチン用量に影響を与える因子には、例えばブタの体重および年齢が含まれる。
【００７３】
本発明はさらに、本明細書に記載のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターを含むワクチンを調製する方法を提供し、この方法は、本発明のＰＲＲＳウイルス、感染性ＲＮＡ分子、プラスミド、またはウイルスベクターのうちの１つの有効量を、薬学的または獣医学的使用に許容できる担体と混合するステップを含む。
【００７４】
加えて、本発明の弱毒化生ワクチンは、米国特許第６５００６６２号明細書に記載の通り、既知な組換え技法を用いて、ＰＲＲＳウイルスゲノムに挿入された異種抗原エピトープをコードするように改変することもできる。本発明の異種抗原エピトープとして有用な抗原エピトープには、ＰＲＲＳウイルス以外のブタ病原体由来の抗原エピトープが含まれ、これらには、ブタパルボウイルス、ブタシルコウイルス、ブタロタウイルス、ブタインフルエンザ、仮性狂犬病ウイルス、伝染性胃腸炎ウイルス、ブタ呼吸器コロナウイルス、古典的ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、脳心筋炎ウイルス、ブタパラミクソウイルス、アクチノバシラスプルロニューモニエ、アクチノバシラススイス、炭疽菌、気管支敗血症菌、溶血クロストリジウム、クロストリジウムパーフリンジェンス、破傷風菌、大腸菌、ブタ丹毒菌、ブタパラインフルエンザ菌、レプトスピラ属全種、マイコプラズマヒオニューモニエ、マイコプラズマヒオリニス、マイコプラズマヒオシノビア（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｈｙｏｓｙｎｏｖｉａ）、パスツレラムルトシダ、ブタコレラ菌、ネズミチフス菌、ストレプトコッカスエクイシミリス、およびブタ連鎖球菌からなる群から選択されたブタ病原体由来の抗原エピトープが含まれるが、これらに限定されない。前述したブタ病原体由来の抗原エピトープをコードするヌクレオチド配列は、当技術分野で知られており、ＮＣＢＩによって提供されているＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｗｅｂ／Ｇｅｎｂａｎｋ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ）などの公共の遺伝子データベースから得ることができる。
【００７５】
本発明の追加の機能および変異は、詳細な説明を含めたこの出願全体から、当業者には明らかであろう。そのような特徴のすべてが本発明の態様として意図されている。同様に、本明細書に記載の本発明の特徴は、それらの特徴の組合せが、本発明の一態様または実施形態として、上記に特別に言及されているかどうかに関係なく、それらを再結合して、追加の実施形態にすることができ、それらも本発明の態様として意図されている。本発明に重要であると本明細書に記述されているような限定のみを限定として考えるべきであり、本明細書に重要であると記述されていない限定がない本発明の変形は、本発明の態様と意図されている。以上の説明および実施例で特に記載されている方法とは別の方法で、本発明を実施できることは明らかであろう。
【００７６】
上記の教示に照らして、多数の本発明の改変および変形が可能であり、それゆえ、それらも本発明の範囲内である。
【００７７】
本発明を以下の実施例で例示するが、本発明はこれらに限定されない。
【実施例】
【００７８】
（実施例１）
シャトルプラスミドｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７の構築
完全長ＰＲＲＳウイルスゲノムｃＤＮＡクローンへの特定の改変の導入を容易にするために、シャトルプラスミドを構築した。ウイルスゲノムの最も３’末端側に相当する３９９７ｂｐ断片（２１残基のポリアデノシンテールを含むヌクレオチド位置１１５０４から１５４１６まで）および下流のベクター配列８４ｂｐをＰＣＲ増幅させた。このＰＣＲ反応は、５ｎｇのｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９プラスミドＤＮＡ（ＵＳ６５００６６２Ｂ１）、３００ｎｇの順方向プライマーＰ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｆｗｄ（５’−ＡＣＴＣＡＧＴＣＴＡＡＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＧＴＴＡＴＧ−３’）（配列番号８）：位置１１５０４から１１５３０）、３００ｎｇの逆方向プライマーＰ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｒｅｖプライマー（５’−ＡＴＣＴＴＡＴＣＡＴＧＴＣＴＧＧＡＴＣＣＣＣＧＣＧＧＣ−３’）（配列番号９）：位置１５５００から１５４７５）、各１ｍＭのｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＴＴＰ、１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）、および２．５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を含有し、ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて行った。反応物を９５℃で５分間加熱し、下記の条件、すなわち、９５℃で３０秒の変性、５５℃で１分間のプライマーアニーリング、および７２℃で３分間の伸長で、３５サイクルの増幅を行った。このＰＣＲ産物を、ＴｒｕｅＢｌｕｅ  ＭｉｃｒｏＣａｒｔｒｉｄｇｅ（商標）ＰＣＲクローニングキットＸＬ（Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｏｎｅ社；米国ニューヨーク州Ｂｕｆｆａｌｏ所在）を用いて、ｐＴｒｕｅＢｌｕｅベクター中にクローニングして、ｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７を作製した。
【００７９】
（実施例２）
Ｐ１２９−ＧＧウイルスを生成するためのＮＬＳ−２配列の改変
ＰＣＲベースの部位特異的変異導入を用いて、ヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質のアミノ酸位置４１〜４７に位置する核移行シグナル２（ＮＬＳ−２）モチーフを改変した。北米遺伝子型ＰＲＲＳウイルスの間では、このＮＬＳモチーフは通常、ＰＧＫＫＮＫＫ（原型単離株ＶＲ−２３３２またはカナダ単離株ＰＡ−８と同じく）、またはその誘導体、すなわちＰＧＫＫＳＫＫ（単離株Ｐ１２９および９３−４７３２４で見出されている）などである。完全に機能的なＮＬＳシグナルには、正電荷を有するリジン（Ｋ）またはアルギニン（Ｒ）残基が複数存在することが重要であると考えられている。上記のシャトルプラスミドと、変異原性プライマー対であるＫＫ４３／４４ＧＧ  Ｆｗｄ（５’−ＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＡＡＣ−３’）（配列番号１０）：ゲノム位置１４９８４から１５０１９）およびＫＫ４３／４４ＧＧ  Ｒｅｖ（５’−ＧＴＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＣ−３’）（配列番号１１）：ゲノム位置１４９８４から１５０１９）とを用いて、Ｎの位置４３および４４（Ｐ１２９ゲノムのヌクレオチド位置１４９９９〜１５００４）のリジン残基をグリシン残基で置換した。配列中、下線部は、ＫＫＳからＧＧＮにアミノ酸置換させるコドン改変を示す。ＰＣＲ増幅は、５ｎｇのｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−ＰＲＲＳＶ−３９９７プラスミドＤＮＡ、順方向プライマーおよび逆方向プライマーそれぞれ３００ｎｇ；それぞれ１ｍＭ濃度のｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、およびｄＴＴＰ；１×ＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ（ＮＨ４）２ＳＯ４、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）、２ｍＭ  ＭｇＳＯ４、０．１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）ならびに２．５ＵのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）を用いて行った。下記の条件、すなわち、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で１分間のプライマーアニーリング、および６８℃で１２分３０秒間のプライマー伸長で、試料の増幅を１６サイクル行った。ＰＣＲサイクルの後に、メチル化されているプラスミドＤＮＡ鋳型を除去するために、１０ＵのＤｐｎ  ＩでＰＣＲ産物を消化させた。変異導入されたプラスミドを含有するＰＣＲ−Ｄｐｎ  Ｉ消化反応物４μｌを用い、熱ショックによって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＸＬ１−Ｂｌｕｅ細胞を形質転換させ、アンピシリンを含有するＬＢアガープレート上に広げた。コロニーをランダムに選択し、終夜培養した。プラスミドＤＮＡは、ＱＩＡｐｒｅｐ  ｓｐｉｎミニプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて調製した。所望の変異（ＰＧＧＧＮＫＫ）の存在を、ヌクレオチド配列の決定によって確認し、結果として得られたプラスミドをｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｎ−ＧＧと命名した。
【００８０】
ＧＧ変異を有するシャトルプラスミド（ｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｎ−ＧＧ）および野生型完全長ゲノムクローン（ｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９）は、それぞれユニークなＢｓｒＧ  Ｉ部位およびＳｐｅ  Ｉ部位を含有している（それぞれ、位置１１９２および３９６３、ならびに位置１２６９２および１５４６３）。これら２種類の酵素で消化した後に、２７７２ｂｐのＢｓｒＧ  Ｉ−Ｓｐｅ  Ｉ断片をｐＴＢ−ｓｈｕｔｔｌｅ−Ｎ−ＧＧからゲル精製し、１６１２０ｂｐのＢｓｒＧ  Ｉ−Ｓｐｅ  Ｉ断片をｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９からゲル精製した。これら２つの断片をＴ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を用いて連結し、ＧＧＮ改変完全長ゲノムｃＤＮＡクローンを構築した。１０μｌの連結反応物で大腸菌株ＤＨ５−αを形質転換させた。アンピシリンを含有するＬＢプレートから細菌コロニーを選択し、プラスミドＤＮＡを調製した。Ｘｍａ  Ｉ消化パターンに基づいて、完全長クローンを選択した。完全長ゲノムｃＤＮＡクローンにおけるＧＧＮ改変の存在を確認するために、選択されたクローンの配列決定を行った。この結果得られたプラスミドの１つをｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＧＧと命名した。
【００８１】
ＭＡＲＣ−１４５細胞を、８％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、およびストレプトマイシン（５０μｇ／ｍｌ）で補足されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中、５％ＣＯ２存在下、３７℃で培養した。直径３５ｍｍの培養皿中に細胞を播種し、７０％集密状態まで培養した。リポフェクチン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用し、２４時間にわたって、２μｇのｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＧＧプラスミドＤＮＡでこれらの細胞に形質移入した。形質移入細胞を、８％ＦＢＳで補足されたＤＭＥＭ中、３７℃で５日間インキュベートした。ＰＲＲＳＶ特異的な細胞変性効果（ＣＰＥ）は、形質移入の３日後から観測され、近傍の細胞へのさらなる伝搬は、形質移入の５日後までに見られた。ＣＰＥの特異性は、非構造タンパク質ｎｓｐ２およびｎｓｐ３に対するウサギ抗血清、ならびにＮ特異的ＭＡｂ  ＳＤＯＷ１７を用いた免疫蛍光細胞染色によって確認した（図１参照）。形質移入の５日後に、形質移入細胞の培養上清を採取し、「Ｐ１２９−ＧＧ継代１」（Ｐ１）と命名した。継代１ウイルスを用いて、新たなＭａｒｃ−１４５細胞に播種し、５日後に採取したものを「継代２」（Ｐ２）と命名した。「継代３」（Ｐ３）ウイルスも、Ｐ２と同様に調製した。各ウイルス継代は、使用するまで、１ｍｌアリコート、−８０℃で保存した。Ｐ１２９−ＧＧウイルスの各継代をプラークアッセイによって力価決定した。継代１、２、および３の力価は、それぞれ、１×１０２、５×１０２、および５×１０３ｐｆｕ／ｍｌと測定された。平行して、野生型Ｐ１２９ウイルスをｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９から産生させ、力価決定した。その結果得られた、継代１、２、および３の力価はそれぞれ１×１０３、１×１０４、および５×１０５ｐｆｕ／ｍｌであった。
【００８２】
（実施例３）
Ｐ１２９−ＧＧウイルスおよび親Ｐ１２９ウイルスへのブタの感染（Ｐ１２９−ＧＧウイルスが弱毒化されていることの実証）
ＰＲＲＳＶおよびマイコプラズマハイオニューモニエに起因する疾患またはそれらに対するワクチン接種の履歴がない２１頭の健康な雑種ブタを、各７頭のブタからなる３つの治療群に無作為に割り当てた。週齢約６週間のときに、Ｔ０１ブタにプラセボを与え、一方、Ｔ０２およびＴ０３のブタには、それぞれ、遺伝的に改変されたＰ１２９−ＧＧウイルス（プラスミドｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９−ＧＧから生成された）または親Ｐ１２９  ＰＲＲＳウイルス（プラスミドｐＣＭＶ−Ｓ−Ｐ１２９から生成された）の２．５×１０４ｐｆｕ／ｍｌ（５．０×１０４ｐｆｕ／用量）に希釈したウイルスストック２．０ｍｌを鼻腔内投与した。すべてのブタに関して、毎日、全般的健康状態、抑うつ、食欲不振、くしゃみ、せき、および呼吸困難を含めた臨床徴候を観察した。直腸温および体重を記録した。ＰＲＲＳＶの単離および血清検査用に、０、４、７、１０、１４、２１、および２８日目に血液試料を採取した。１４日目（ブタ２頭／群）および２８日目（ブタ５頭／群）に、死体解剖を行い、組織試料（肺および扁桃腺）を採取した。肺病変重度および各肺葉の硬化のパーセントの推算を行った。群Ｔ０２およびＴ０３のブタは、軽度のＰＲＲＳウイルス感染の症状、すなわち血清中における排出ウイルスおよび血清転換を示した。未感染対照ブタ（Ｔ０１）は、血清ウイルス血症陰性のままであり、そしてＰＲＲＳウイルスに対する抗体も陰性のままであった。
【００８３】
Ｐ１２９親ウイルスに感染しているブタ（Ｔ０３）と比較して、Ｐ１２９−ＧＧウイルスに感染しているブタ（Ｔ０２）では、血清中の排出ウイルスが少なく（図２ａおよび２ｂ）、かつ産生された抗ＰＲＲＳ  ＥＬＩＳＡ抗体（図２Ｃおよび２Ｄ）および中和抗体（図２ｅ）のレベルが高かった。
【００８４】
【表６】
2008531006.tif 000007
【００８５】
感染後の７、１４、２１、および２８日に、Ｔ０２およびＴ０３の両群で血清中和力価を測定した。中和力価は、９６ウェルプレート中、２回で、ＴＣＩＤ５０によって測定した。各ウェルで、容積１００μｌ中にある２００ｐｆｕの野生型Ｐ１２９ウイルスを、血清の連続２倍希釈液（予め５６℃で３０分間熱不活性化した）１００μｌと混合した。この混合物を３７℃で１時間インキュベートし、それに続いて、細胞の感染を行った。感染細胞を５日間インキュベートし、ＣＰＥを測定した。データは下記に示されており、これは変異体ウイルスに感染したブタが、野生型親ウイルスに感染したブタよりも高い平均中和力価に達したことを示している。
【００８６】
【表７】
2008531006.tif 000008
【００８７】
ＰＲＲＳＶ感染の特徴の１つは、扁桃腺におけるウイルスの持続的な存在である。したがって、検査終了時（感染後４週間目）に、すべての感染ブタおよび２頭の偽感染対照ブタから扁桃腺を採取し、ＲＴ−ＰＣＲによって、ウイルスが持続的に存在しているかどうか検査した。ＧＧウイルスまたはＰ１２９ウイルスのいずれかに感染したすべてのブタで、ＲＴ−ＰＣＲによってＮ遺伝子が検出可能であったが、偽感染ブタからの扁桃腺は陰性なままであった。これは、すべての感染ブタが感染後４週間目にウイルスを排出していたことを示す。Ｎ遺伝子のＮＬＳ中における潜在的な変異を検査するために、扁桃腺からのＰＣＲ産物の配列決定を行った。
【００８８】
５頭のブタすべてにおいて、扁桃腺中に持続的に存在していたＧＧウイルスは、位置４３または４４のいずれかにおけるアルギニンの導入によって、ＮＬＳ−２配列中に変異導入されていることが判明した。扁桃腺からの野生型Ｐ１２９ウイルスは変異しておらず、野生型のＮＬＳ−２配列を保持していた。
【００８９】
（実施例４）
ＮＬＳ−２の復帰抵抗性変異
実施例２に記載したＰ１２９−ＧＧ変異は、６ヌクレオチドを改変することによって生成された。実施例３で分かるように、このウイルスは部分的または完全に復帰変異でき、ランダム変異および自然淘汰のため、比較的に高い頻度で親株のＮＬＳ陰性表現型を回復しうる。本発明の好ましい実施形態、特にワクチンを目的としたものは、復帰の可能性が最小となり、かつ他の隣接残基がリジンおよびアルギニンなどの塩基性残基に変異して、それによってこの領域内で機能的なＮＬＳモチーフが回復する可能性が最小となるように設計された、さらに別のヌクレオチド置換および／または欠失を含有しているであろう。塩基性残基をコードするコドンに変異するために、２もしくは３回の別々なヌクレオチド改変を必要とするコドンが、１回のみの改変を必要とするものよりも好ましい。欠失変異は、その領域の一部分が除かれているので、復帰する可能性が非常に低い。変異によってｐａｔ７、ｐａｔ４、または他のＮＬＳモチーフが再生する確率を小さくするために、隣接アミノ酸に代替のコドンを選択することもできる。そのような「復帰抵抗性」の変異の例を表６に示す。これらは、限定的なものではなく、代表的なものとして意図されている。この情報に基づいて、当業者ならば、復帰抵抗性変異の他の例を想起することができよう。
【００９０】
表８において、変異体ウイルスＰ１２９−ｄ４３／４４は、アミノ酸４３および４４の欠失株である。加えて、位置４５のセリンコドンがリジンまたはアルギニンコドンに変異する確率を低下させるために、上記コドンがＡＧＴからＴＣＴに改変されている。また、位置４９のアスパラギンコドン（ＡＡＣ）も、同じ理由からセリンコドン（ＴＣＣ）に改変されている。位置４９では、一部の天然存在の野外単離株でセリンが見出されているので、十分に許容されるはずである。この変異体には、最小のｐａｔ７  ＮＬＳモチーフ（ＰＧＳＫＫＫＳ）が残っているので、部分的なＮＬＳ活性を有している可能性がある。部分的なＮＬＳ活性を有するウイルスは、野生型（親）ウイルスと、完全なＮＬＳノックアウト変異体との間の中間的な表現型を有すると予測されている。そのようなウイルスはワクチンとして特に有用でありうる。
【００９１】
【表８】
2008531006.tif 000009
【００９２】
表８に示した他の３株の変異体（Ｐ１２９−ｄ４３／４４／４６、Ｐ１２９−ｄ４４／４６／４７、およびＰ１２９−ｄ４６／４７／４８）は、３アミノ酸欠失株であり、上記に論じた位置４５および４９のコドン変化も有する。これらの変異は、ＮＬＳモチーフを欠失しており、ＮＬＳ活性の完全なノックアウトを有すると予測されている。これらのウイルスは、ブタで弱毒化されていること、特にワクチンとして使用されることが予期されている。
【００９３】
表８に記載の変異のための順方向プライマーおよび逆方向プライマーは以下の通りである。
順方向プライマー（５’−３’）
Ｐ１２９−ｄ４３／４４Ｆ（配列番号２４）
ＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＧＡＧ
Ｐ１２９−ｄ４３／４４／４６Ｆ（配列番号２５）
ＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＴＣＴＡＡＧＡＡＡＴＣＣＣＣＧＧＡＧ
Ｐ１２９−ｄ４４／４６／４７Ｆ（配列番号２６）
ＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＡＡＧＴＣＴＡＡＡＴＣＣＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣ
Ｐ１２９−ｄ４６／４７／４８Ｆ（配列番号２７）
ＧＣＡＡＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＣＣＣＣＧＧＡＧＡＡＧＣＣＣＣ
逆方向プライマー（５’−３’）
Ｐ１２９−ｄ４３／４４Ｒ（配列番号２８）
ＣＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＣ
Ｐ１２９−ｄ４３／４４／４６Ｒ（配列番号２９）
ＣＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＣＴＴＡＧＡＴＣＣＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣＣＴＣＴＧＧＡＣ
Ｐ１２９−ｄ４４／４６／４７Ｒ（配列番号３０）
ＧＧＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＴＴＴＡＧＡＣＴＴＴＣＣＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣ
Ｐ１２９−ｄ４６／４７／４８Ｒ（配列番号３１）
ＧＧＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＡＴＴＴＣＴＴＴＣＣＣＧＧＴＣＣＣＴＴＧＣ
【００９４】
上記の説明および実施例は、扁桃腺に持続的に存在する唯一のウイルスが変異しているという事実によって実証されている通り、ＮＬＳ−２領域は、ウイルス増殖に必要ではないが、ＰＲＲＳＶの重要な病原性因子であることを実証するものである。本発明者らは、ＰＲＲＳＶ  Ｎタンパク質のＮＬＳが、より高レベルの中和抗体、およびより高レベルのＥＬＩＳＡ力価と正の相関関係を有することも実証している。したがって、本発明者らは、ＮＬＳ−２配列モチーフを失わせる変異によって、ＰＲＲＳＶの弱毒化株が得られることを確立した。
【００９５】
本発明の付番された記述
１．ａ）ＮＬＳ−２領域、ＮｏＬＳ領域、およびＮＥＳ領域からなる群より選択された少なくとも１つの保存領域内で改変され、それによって上記保存領域が失われているＮタンパク質を含む、弱毒化されている遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルス、ｂ）ａ）の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子、ならびにｃ）ｂ）の感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子からなる群より選択されたＰＲＲＳ感染性因子を含む組成物。２．さらに改変されており、その結果、保存ＮＬＳ−１領域が失われている請求項１に記載の組成物。３．上記保存領域が非保存的アミノ酸置換の導入によって失われている、請求項１に記載の組成物。４．上記保存領域が少なくとも部分的に欠失している、請求項１または２に記載の組成物。５．上記保存領域がＮｏＬＳ領域である、請求項１に記載の組成物。６．上記保存領域がＮＬＳ−２領域である、請求項１に記載の組成物。７．上記保存領域がＮＥＳ領域である、請求項１に記載の組成物。８．上記ＰＲＲＳウイルスが北米型ＰＲＲＳウイルスである、請求項１に記載の組成物。９．上記ＰＲＲＳウイルスがヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスである、請求項１に記載の組成物。１０．上記保存領域がＮＬＳ−２領域である、請求項８に記載の組成物。１１．Ｎタンパク質の残基４２および４３がグリシンである、請求項１０に記載の組成物。１２．Ｎタンパク質の残基４２および４３がグリシンであり、残基４４がアスパラギンである、請求項１０に記載の組成物。１３．上記ＮＬＳ−２領域が少なくとも部分的に欠失している、請求項１０に記載の組成物。１４．Ｎタンパク質の残基４３から４８までのうち少なくとも１残基が欠失している、請求項１３に記載の組成物。１５．Ｎタンパク質の残基４３および４４の両方が欠失している、請求項１４に記載の組成物。１７．Ｎタンパク質の残基４３、４４、および４６が欠失している、請求項１４に記載の組成物。Ｎタンパク質の残基４４、４６、および４７が欠失している、請求項１４に記載の組成物。１９．Ｎタンパク質の残基４６、４７、および４８が欠失している、請求項１４に記載の組成物。２０．復帰の可能性を最小にするように設計された、追加のヌクレオチド変異、置換、および／または欠失を含有している、請求項１から１９に記載の組成物。
【００９６】
２１．ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタ動物を防御するワクチンであって、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項１から２０のいずれかに記載の組成物と、獣医学的使用に許容できる担体とを含むワクチン。２２．ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタ動物を防御する方法であって、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の、請求項２０のワクチンを動物に接種するステップを含む方法。２３．請求項１から２０のいずれかに記載の組成物を含む、形質移入された宿主細胞。
【００９７】
２４．遺伝的に改変された弱毒化ＰＲＲＳウイルスを作製する方法であって、ａ）ＮＬＳ−２領域、ＮｏＬＳ領域、およびＮＥＳ領域からなる群より選択された少なくとも１つの保存領域内で改変され、それによって上記保存領域が失われているＮタンパク質を含む遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを産生するように、ＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列に変異導入するステップと、ｂ）ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞に、上記遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを導入するステップとを含む方法。２５．上記遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスが北米型ＰＲＲＳウイルスである、請求項２４に記載の方法。２６．上記遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスがヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスである、請求項２４に記載の方法。２７．上記ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞がＭＡＲＣ−１４５細胞である、請求項２４に記載の方法。２８．上記ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞が、生きているブタ動物の体内に含まれる、請求項２４に記載の方法。２９．本明細書に記載した発明のうちの任意のもの、または上述した請求項の組合せのうちの任意のもの。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】（Ａ）Ｐ１２９ヌクレオカプシドタンパク質中における、ＮＬＳ変異の位置および配列を示す図である。（Ｂ）偽感染、Ｐ１２９感染、およびＰ１２９−ＧＧ感染のＭＡＲＫ−１４５細胞の顕微鏡写真である。上側の列は、典型的なプラークを位相差顕微鏡観察を用いて示し、下側の列は、ＦＩＴＣ結合モノクローナル抗体ＳＤＯＷ１７を用いた、感染増殖巣の蛍光抗体染色像を示す。Ｐ１２９−ＧＧに感染している細胞の核および核小体におけるヌクレオカプシド染色の不在に留意されたし。
【図２】（Ａ）感染後０から２８日目までの、ウイルス感染したブタの数を治療群（１群あたり７頭のブタ）ごとに示すグラフである。（Ｂ）感染後０から２８日目までの、ブタ血清中の平均ウイルス力価を治療群ごとに示すグラフである。（Ｃ）感染後０から２８日目までの、ブタ血清中の平均ＥＬＩＳＡ抗体レベル（Ｓ／Ｐ比）を治療群ごとに示すグラフである。（Ｄ）図２Ｃに示した血清の再力価測定を示すグラフである。高力価を有する試料相互における相違の識別を向上させるために、アッセイ前にすべての試料を１：５希釈した。（Ｅ）４週間の検査期間における感染ブタの平均血清中和力価を示すグラフである。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【配列表】
2008531006000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年6月10日(2008.6.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）１もしくは複数のアミノ酸の欠失によって、または非保存的アミノ酸置換の導入によって、ＮＬＳ−２領域内で改変され、それによって保存領域が失われているＮタンパク質を含む、弱毒化されている遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルス、
ｂ）ａ）の遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスをコードする感染性ＲＮＡ分子、ならびに
ｃ）ｂ）の感染性ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列を含む単離されたポリヌクレオチド分子
からなる群より選択されたＰＲＲＳ感染性因子を含む医薬組成物。
【請求項２】
さらに改変されており、その結果、１もしくは複数のアミノ酸の欠失によって、または非保存的アミノ酸置換の導入によって、保存ＮＬＳ−１領域が失われている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＰＲＲＳウイルスが北米型ＰＲＲＳウイルスまたはヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスである、請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４３および４４に対応する位置の残基がグリシンであるか、
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４３および４４に対応する位置の残基がグリシンであり、かつ配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４５に対応する位置の残基がアスパラギンであるか、
配列番号６に記載されるＮタンパク質の残基４１〜４７に対応する残基を含むＮＬＳ−２領域が少なくとも部分的に欠失しているか、
配列番号１２に記載されるＮタンパク質の位置４３から４８に対応する位置における少なくとも１残基が欠失しているか、
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４３および４４に対応する位置の両方の残基が欠失しているか、
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４３、４４、および４６に対応する位置の残基が欠失しているか、
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４４、４６、および４７に対応する位置の残基が欠失しているか、または
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４６〜４８が欠失している
ようにＮタンパク質のＮＬＳ−２領域が改変されている、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項５】
ＰＲＲＳウイルスが北米型ＰＲＲＳウイルスであり、前記ウイルスのＮタンパク質が：
位置４３および４４の残基がグリシンであるか、
位置４３および４４の残基が欠失しているか、
位置４３、４４、および４６の残基が欠失しているか、
位置４４、４６、および４７の残基が欠失しているか、または
位置４６〜４８の残基が欠失している
ことを除いて配列番号６と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４に記載の医薬組成物。
【請求項６】
ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタ動物を防御するワクチンであって、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項１から５のいずれか一項に記載の医薬組成物と、獣医学的使用に許容できる担体とを含むワクチン。
【請求項７】
ＰＲＲＳウイルスによる感染からブタ動物を防御する方法であって、ＰＲＲＳウイルスによる感染に対する免疫防御を生み出すのに有効な量の請求項６に記載のワクチンで動物にワクチン接種するステップを含む方法。
【請求項８】
請求項１に記載のＰＲＲＳ感染性因子を含む、形質移入された宿主細胞。
【請求項９】
遺伝的に改変された弱毒化ＰＲＲＳウイルスを作製する方法であって、
ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞に、遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスを導入するステップを含み、
前記ウイルスは、１もしくは複数のアミノ酸の欠失によって、または非保存的アミノ酸置換の導入によって、ＮＬＳ−２領域内で改変され、それによって保存領域が失われているＮタンパク質を含む、弱毒化されている遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスである方法。
【請求項１０】
前記遺伝的に改変されたＰＲＲＳウイルスが北米型ＰＲＲＳウイルスまたはヨーロッパ型ＰＲＲＳウイルスである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４３および４４に対応する位置の残基がグリシンであるか、
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４３および４４に対応する位置の残基がグリシンであり、かつ配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４５に対応する位置の残基がアスパラギンであるか、
配列番号６に記載されるＮタンパク質の残基４１〜４７に対応する残基を含むＮＬＳ−２領域が少なくとも部分的に欠失しているか、
配列番号１２に記載されるＮタンパク質の位置４３から４８に対応する位置における少なくとも１残基が欠失しているか、
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４３および４４に対応する位置の両方の残基が欠失しているか、
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４３、４４、および４６に対応する位置の残基が欠失しているか、
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４４、４６、および４７に対応する位置の残基が欠失しているか、または
配列番号６に記載されるＮタンパク質の位置４６〜４８が欠失している
ようにＮタンパク質のＮＬＳ−２領域が改変されている、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＲＲＳウイルスが北米型ＰＲＲＳウイルスであり、前記ウイルスのＮタンパク質が：
位置４３および４４の残基がグリシンであるか、
位置４３および４４の残基が欠失しているか、
位置４３、４４、および４６の残基が欠失しているか、
位置４４、４６、および４７の残基が欠失しているか、または
位置４６〜４８の残基が欠失している
ことを除いて配列番号６と同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞がＭＡＲＣ−１４５細胞である、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＰＲＲＳの複製を支持できる宿主細胞が、生きているブタ動物の体内の細胞である、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【国際調査報告】
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