(57)【要約】  新規抗原結合ポリペプチド（ＡＢＰ）及びそれらの使用を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有する、抗原結合ポリペプチド。
【請求項２】
抗原結合ポリペプチドが一つ以上の翻訳後修飾を含有する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
【請求項３】
抗原結合ポリペプチドがリンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
【請求項４】
抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有し、該ポリヌクレオチドが少なくとも１個のセレクターコドンを含有する、単離核酸。
【請求項５】
請求項３に記載の抗原結合ポリペプチドを調製する方法（該方法は、非天然コードアミノ酸を含有する単離抗原結合ポリペプチドを、該非天然コードアミノ酸と反応する部分を含有する、リンカー、ポリマー又は生物活性分子と接触させることを含む。）。
【請求項６】
請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド及び医薬的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項７】
請求項６に記載の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む、ＡＢＰにより調節される疾患を有する患者を治療する方法。
【請求項８】
請求項４に記載の核酸を含有する細胞。
【請求項９】
非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを調製する方法（該方法は、非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドの発現が可能な条件下で、セレクターコドンを含有する抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（一つ又は複数）、直交化ＲＮＡシンテターゼ及び直交化ｔＲＮＡを含む細胞を培養すること及び抗原結合ポリペプチドを精製することを含む。）。
【請求項１０】
抗原結合ポリペプチドの、血清半減期又は循環時間を調節する方法（該方法は、抗原結合ポリペプチドにおいて、何れかの一つ以上の天然アミノ酸を一つ以上の非天然コードアミノ酸で置換することを含む。）。
【請求項１１】
ポリヌクレオチドによりコードされる抗原結合ポリペプチドであって、前記ポリヌクレオチドは、セレクターコドンを含有し、及び前記ポリペプチドは、少なくとも１個の非天然コードアミノ酸を含有する、方法。
【請求項１２】
請求項１１に記載の抗原結合ポリペプチド及び医薬的に許容される担体を含有する組成物。
【請求項１３】
互いに連結している第一のＡＢＰと第二のＡＢＰとを含有する、二重特異性ＡＢＰ（前記第一のＡＢＰと前記第二のＡＢＰは、異なるエピトープに特異的に結合し、前記第一のＡＢＰは、第一の抗原における少なくとも１個のエピトープに対して結合特異性を有し、第二のＡＢＰは、前記第一のエピトープとは異なる、第一の抗原又は第二の抗原における第二のエピトープに対して結合特異性を有しており、及び前記二重特異性ＡＢＰは、少なくとも１個の非天然コードアミノ酸を含有する。）。
【請求項１４】
請求項１３に記載の二重特異性ＡＢＰと、医薬的に許容される担体と、を含有する組成物。
【請求項１５】
疾患又は状態を治療するための方法であって、治療を必要とする患者に請求項１４に記載の組成物の治療的有効量を投与することを含む、前記方法。
【請求項１６】
生物活性分子と組み合わせた、請求項１３に記載の二重特異性ＡＢＰを含有する、ＡＢＰ。
【請求項１７】
一つ以上の抗原を発現する、細胞又は組織を検出する方法であって、検出可能な標識を結合させたＡＢＰと請求項１３に記載の細胞又は組織を接触させること及び前記標識を検出することを含み、細胞又は組織に会合する前記標識の検出は、ＡＢＰが結合する一つ以上の抗原を発現する、細胞又は組織の存在を示す、前記方法。
【請求項１８】
単一のアミノ酸における抗原結合ポリペプチドへの共有結合により連結される水溶性ポリマーを含有する抗原結合ポリペプチド。
【請求項１９】
少なくとも１個のリンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有し、前記リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、リボソームにおいてポリペプチドに取り込まれる非天然コードアミノ酸の官能基を介してポリペプチドに結合する、抗原結合ポリペプチド。
【請求項２０】
一つ以上の非天然コードアミノ酸に結合している、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有しており、前記非天然コードアミノ酸が、リボソームにおいて事前選択部位でポリペプチドに取り込まれる、抗原結合ポリペプチド。
【請求項２１】
抗原結合ポリペプチドの免疫原性を調節する方法（該方法は、抗原結合ポリペプチドにおいて、何れかの一つ以上の天然アミノ酸を一つ以上の非天然コードアミノ酸で置換することを含む。）。
【請求項２２】
ポリペプチドが配列番号１９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３１又はそれらの断片からなる群から選択される、抗原結合ポリペプチド。
【請求項２３】
抗原結合ポリペプチドが変性条件下で、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結される、請求項３に記載の抗原結合ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願に対する相互参照）
本願は、米国仮出願第６０／５８１，３３４号、２００４年６月１８日出願、米国仮出願第６０／６４８，２２２号、２００５年１月２８日及び米国仮出願第６０／６５４，０１８号、２００５年２月１７日出願（それらの全体を本明細書中に参照により組み込む。）に対する優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、少なくとも１個の非天然コードアミノ酸を含有する新規抗原結合ポリペプチドに関する。本発明は、全般的に、化学反応及び組み換えＤＮＡの両方を用いた、分子生物学の方法による、抗原結合ポリペプチドの産生及び選択の分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
天然に産生される抗体（Ａｂ）は、２個の同一の免疫グロブリン（Ｉｇ）重鎖及び２個の同一の軽鎖から構成される四量体構造である。Ａｂの重鎖及び軽鎖は、異なるドメインからなる。各軽鎖は、１個の可変ドメイン（ＶＬ）及び１個の定常ドメイン（ＣＬ）を有し、一方、各重鎖は、１個の可変ドメイン（ＶＨ）及び３又は４個の定常ドメイン（ＣＨ）を有する。約１１０アミノ酸残基からなる各ドメインは、それぞれに対してパッキングされている２個のβシートから形成される特徴的なβサンドイッチ構造にフォールディングされている（免疫グロブリンフォールド）。ＶＬドメインは、それぞれ３個の相補性決定領域（ＣＤＲ１−３）を有し、ＶＨドメインは、それぞれ４個以下の相補性決定領域（ＣＤＲ１−４）を有しており、これらは、ループ又はターンであり、ドメインの一方の末端でβ鎖に連結している。軽鎖及び重鎖両方の可変領域は、通常、抗原特異性に寄与するが、必ずしも個々の鎖が等しく特異性に寄与はするものではない。抗体分子は、ランダム化されたＣＤＲループを用いることにより、膨大な数の分子に結合するよう進化してきた。
【０００４】
タンパク質分解及び組み換え法により、Ａｂの機能性サブ構造を調製することができる。これらは、Ｆａｂ断片（１個の鎖間ジスルフィド結合により連結される、重鎖のＶＨ−ＣＨ１ドメイン及び軽鎖のＶＬ−ＣＬ１ドメインを含む。）及びＦｖ断片（ＶＨ及びＶＬドメインのみを含む。）及びＦｃ部分（分子の非抗原結合領域を含有する。）を含む。場合により、１つのＶＨドメインが抗原に対する顕著な親和性を有する（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５５４−５４６）。ある一定のモノマーκ軽鎖がその抗原に特異的に結合することも示されている（Ｌ．Ｍａｓａｔら、１９９４、ＰＮＡＳ  ９１：８９３−８９６）。分離された軽鎖又は重鎖が、ある種の抗原結合活性も保持することが観察されることがある（Ｗａｒｄら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３４１、５５４−５４６）。
【０００５】
別の機能的サブ構造は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）であり、ペプチドリンカーにより共有結合している、免疫グロブリン重鎖及び軽鎖の可変領域からなる（Ｓ−ｚ  Ｈｕら、１９９６、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６、３０５５−３０６１）。これらの小型（Ｍｒ２５，０００）タンパク質は通常、１個のポリペプチドにおいて抗原に対して特異性及び親和性を持っており、より大型の抗原特異的分子に対して都合の良い基礎的要素を提供することができる。循環でのｓｃＦｖの半減期が短いために、多くの場合、治療でそれらを利用することには限界がある。
【０００６】
鋳型としてＩｇ  ＶＨドメインの一部を用いて、「ミニボディ」と呼ばれる小型のタンパク質の骨組みが設計された（Ｐｅｓｓｉら、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ  ３６２、３６７−３６９）。ＶＨのＣＤＲ１及びＣＤＲ２に対応するループをランダム化し、ファージディスプレイ法を用いて突然変異体を選択することにより、インターロイキン−６に対して高い親和性を有するミニボディ（解離定数（Ｋｄ）約１０−７Ｍ）が同定された（Ｍａｒｔｉｎら、１９９４、ＥＭＢＯ  Ｊ．１３、５３０３−５３０９）。
【０００７】
ラクダは、血清由来のＩｇＧ様物質を分析した場合、可変軽鎖ドメインを欠く場合が多く、このことは、十分な抗体特異性及び親和性がＶＨドメイン（３又は４個のＣＤＲループ）のみから得られることを示唆している。高い親和性を有する「ラクダ化」ＶＨドメインを作製し、ＣＤＲ３のみをランダム化することにより高い特異性を得ることができる。
【０００８】
「ミニボディ」に対する代替物は、「ダイアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ）」である。ダイアボディは、小型の二価及び二重特異性抗体断片であり、２個の抗原結合部位を有する。この断片は、同じポリペプチドドメイン鎖（ＶＨ−ＶＬ）において軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有する。ダイアボディは、Ｆａｂ断片と同じ大きさである。短すぎて同じ鎖において２個のドメイン間でペアとなることができないリンカーを使用することにより、そのドメインを別の鎖の相補的ドメインと対合させ、２つの抗原結合部位を作る。これらの二量体性抗体断片又は「ダイアボディ」は、二価であり、二重特異性がある。Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒら、ＰＮＡＳ  ９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照のこと。
【０００９】
ＣＤＲペプチド及び有機ＣＤＲ模倣体が作製された（Ｄｏｕｇａｌｌら、１９９４、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２、３７２−３７９）。ＣＤＲペプチドは短く、通常環状で、抗体のＣＤＲループのアミノ酸配列に対応するペプチドである。ＣＤＲループは、抗体−抗原相互作用に関与する。ＣＤＲペプチド及び有機ＣＤＲ模倣体がある程度の結合親和性を有することが示されている（Ｓｍｙｔｈ及びｖｏｎ  Ｉｔｚｓｔｅｉｎ，１９９４、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６、２７２５−２７３３）。親和性を失うことなく、マウスＣＤＲがヒトＩｇフレームワークに移植された（Ｊｏｎｅｓら、１９８６、Ｎａｔｕｒｅ  ３２１、５２２−５２５；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８）。
【００１０】
身体において、特異的Ａｂが大きなライブラリから選択され、増幅される（親和性成熟）。コンビナトリアルライブラリ技術を用いて、このプロセスをインビトロで再現することができる。バクテリオファージの表面でＡｂ断片をうまく表示することにより、膨大な数のＣＤＲ突然変異体を生成させてスクリーニングすることができる（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら、１９９０、Ｎａｔｕｒｅ  ３４８、５５２−５５４；Ｂａｒｂａｓら、１９９１、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８８、７９７８−７９８２；Ｗｉｎｔｅｒら、１９９４、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１２、４３３−４５５）。この技術により、Ｆａｂ及びＦｖ（ならびにそれらの誘導体）の生成数が増える。コンビナトリアル技術をＡｂ模倣と組み合わせることができる。
【００１１】
ファージキャプシドタンパク質との融合体として、タンパク質骨格として機能する可能性がある多数のタンパク質ドメインが発現させられてきた。Ｃｌａｃｋｓｏｎ及びＷｅｌｌｓ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１２：１７３−１８４（１９９４）において概説されている。ウシ膵臓トリプシン阻害剤（Ｒｏｂｅｒｔｓら、ＰＮＡＳ  ８９：２４２９−２４３３（１９９２））、ヒト成長ホルモン（Ｌｏｗｍａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１０８３２−１０８３８（１９９１））、Ｖｅｎｔｕｒｉｎｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １：７０−７５（１９９４））及びＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ（ストレプトコッカス、連鎖球菌）のＩｇＧ結合ドメイン（Ｏ’Ｎｅｉｌら、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖ（Ｃｒａｂｂ，Ｌ．編）ｐｐ．５１７−５２４、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９４））をはじめ、これらのタンパク質ドメインのうちいくつかは、既にランダムペプチド配列を表示するための骨格として使用されている。これらの骨格は、１個のランダム化したループ又は領域を表示した。糸状ファージＭ１３における提示骨格として、テンダミスタットが使用された（ＭｃＣｏｎｎｅｌｌ及びＨｏｅｓｓ、１９９５、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５０：４６０−４７０）。
【００１２】
ＥｒｂＢファミリーの受容体チロシンキナーゼは、細胞増殖及び分化において重要な役割を担う。これらの受容体の異常な活性化は、ヒトの癌と関連がある。二量体化（受容体の対合）は、ＥｒｂＢ受容体のシグナリング活性全てに必須である。ＥｒｂＢ２の二量体活性を阻害することにより、他のＥｒｂＢ受容体タンパク質と二量体化するＥｒｂＢ２の能力が直接抑制されることが分かっている。受容体二量体化を阻害することにより、ＥｒｂＢシグナリング経路の活性化が妨げられる。ＥｒｂＢシグナリングを下方制御するアンタゴニスト性分子は、抗腫瘍剤として機能する可能性がある。ＥｒｂＢシグナリングネットワークは現在、抗腫瘍薬開発における主要なターゲットとなっている。ＥｒｂＢ−１はＥＧＦに特異的な受容体であり、一方、ＥｒｂＢ−２は、天然リガンドが分かっていない。ＥｒｂＢ２は、ＥＧＦの添加時に、ＥｒｂＢ−１とヘテロ二量体を形成することができる。ＥｒｂＢ２もまた、不活性型キナーゼＥｒｂＢ−３及びＥｒｂＢ−４（これらは両方とも、ニューレグリンに対する受容体である。）に対する好ましい二量体パートナーとして機能する。ＥｒｂＢシグナリングネットワークはまた、サイトカイン及びＧ−カップリングタンパク質受容体のリガンドによるシグナリングの際に間接的に活性化され得、このことから、多くの様々な細胞型の増殖制御において中心的役割を果たすことが示唆される。
【００１３】
癌原遺伝子ｃ−ＥｒｂＢ−１は、上皮増殖因子受容体をコードする。この名前は、鳥類赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）から単離されたウイルスホモローグのｖ−ｅｒｂＢに由来しており、アミノ末端リガンド結合ドメインを欠くニワトリｃ−ＥｒｂＢ−１遺伝子の断片として含有されている。ＥｒｂＢ−１遺伝子を過剰発現させると、様々な部位の扁平上皮癌ならびに腺癌を含む様々な腫瘍が生じる。ヒトｃ−ＥｒｂＢ−１遺伝子は、染色体領域７ｐ１４及び７ｐ１２に位置する。
【００１４】
ＥｒｂＢ−２癌原遺伝子（Ｎｅｕ、ＥＧＦＲ−２又はＨＥＲ−２とも呼ばれる。）は、膜貫通型受容体チロシンキナーゼファミリーの一員であり、このファミリーには、ＥＧＦ受容体及びＥＧＦＲ−３（ＨＥＲ−３又はＥｒｂＢ−３）も含まれる。ＥｒｂＢ−２は、固有のチロシンキナーゼ活性を有する１８５ｋＤａの膜貫通型受容体様糖タンパク質をコードする。ＥｒｂＢ−２の高親和性リガンドは知られていないが、過剰発現か、又は受容体のＥｒｂＢファミリーの他のメンバーとのヘテロ会合により、そのキナーゼ活性をリガンドなしで活性化することができる。原発ヒト乳癌のほぼ４０％において、ＥｒｂＢ−２遺伝子の増幅及びその産物の過剰発現が検出されている。卵巣、胃、唾液及び非小細胞肺癌においてもＥｒｂＢ−２過剰発現が観察されている。ＥｒｂＢ−２は、ニューレグリン受容体ＥｒｂＢ−３及びＥｒｂＢ−４とのヘテロ二量体において、ニューレグリンにより活性化される。ヒト化抗ＥｒｂＢ−２モノクローナル抗体、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（ハーセプチン、モノクローナル４Ｄ５由来）は、ＥｒｂＢ−２を過剰発現する癌の治療に対してＦＤＡ認可を受けている。開発中の別の抗ＥｒｂＢ２抗体は、Ｐｅｒｔｕｚｕｍａｂ（ペルツズマブ、モノクローナル２Ｃ４由来）である。ＥｒｂＢ−１（ＥＧＦ受容体）のチロシンキナーゼ活性の特異的阻害剤もまた臨床試験中である。
【００１５】
抗ＥｒｂＢ２抗体は、当技術分野で公知であり、以下に限定されないが、米国特許第４，７５３，８９４号；同５，１６９，７７４号；同５，６７７，１７１号；同５，７２０，９３７号；同５，７２０，９５４号；同５，７２５，８５６号；同５，７７０，１９５号；同５，７７２，９９７号；同５，７８３，１８６号；同６，０５４，５６１号；同６，１６５，４６４号；同６，３３３，１６９号；同６，０１５，５６７号；同６，３８７，３７１号；同６，３９９，０６３号；同６，４４１，１４３号；同６，４５８，３５６号；同６，６２７，１９６号（それぞれ、本明細書中に参照により組み込む。）が挙げられる。
【００１６】
親水性ポリマーポリ（エチレングリコール）、略してＰＥＧの共有結合は、水溶性、バイオアベイラビリティーを向上、血清半減期を延長、治療半減期を延長、免疫原性を調節、生物学的活性を調節するか、又は、タンパク質、ペプチド及び特に疎水性分子を含む多くの生物活性分子の循環時間を延長させる方法である。医薬において、人工インプラントにおいて、及び、生物適合性、毒性の欠如及び免疫原性の欠如が重要であるその他の適用において、広範囲にわたりＰＥＧが使用されてきた。ＰＥＧの所望する特性を最大限に生かすために、ＰＥＧポリマー又は生物活性分子に結合したポリマーの総分子量及び水和状態は、水溶性向上及び循環半減期の延長など、ＰＥＧポリマー結合に通常付随する有利な特性を与えるよう十分に高くなければならず、同時に、親分子の生物活性に悪影響を与えてはならない。
【００１７】
ＰＥＧ誘導体は、リジン、システイン及びヒスチジン、Ｎ−末端及び炭化水素部分などの反応性化学官能基を介して生物活性分子に連結することが多い。タンパク質及びその他の分子においてポリマー結合に利用できる反応性部位の数は限られていることが多い。ポリマー結合を介した修飾のための最適部位は、受容体結合において重要な役割を担い、分子の生物学的活性の保持に必要であることが多い。結果として、生物活性分子におけるこのような反応性部位に対するポリマー鎖の無差別結合により、ポリマー修飾分子の生物活性が顕著に低下するか、又は完全になくなることが多い。Ｒ．Ｃｌａｒｋら（１９９６）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：２１９６９−２１９７７。標的分子に対して所望する利点を与えるのに十分なポリマー分子量を有する共役物を形成するために、先行技術のアプローチでは、通常、分子へ多くのポリマーアームをランダムに結合させており、それにより親分子の生物活性を低下させるか、完全に欠失させるリスクが上昇した。
【００１８】
タンパク質に対するＥＰＧ誘導体の結合のための場所を形成する反応性部位は、タンパク質の構造により決まる。酵素を含むタンパク質は、Ｈ２Ｎ−−ＣＨＲ−−ＣＯＯＨの一般構造を有するα−アミノ酸の様々な配列から構成される。１つのアミノ酸のαアミノ部分（Ｈ２Ｎ−−）は、隣接するアミノ酸のカルボキシル部分（−−ＣＯＯＨ）と連結し、−−（ＮＨ−−ＣＨＲ−−ＣＯ）ｎ−−で表すことができるアミド結合を形成する（式中、「ｎ」という下付き文字は、何百何千と等しいものであり得る。）。Ｒにより表される断片は、タンパク質生物活性のための、及びＰＥＧ誘導体結合のための反応性部位を含有し得る。
【００１９】
例えば、アミノ酸リジンの場合、イプシロン位ならびにアルファ位に−−ＮＨ２部分が存在する。イプシロン−−ＮＨ２は、塩基性ｐＨ下で反応できる。ＰＥＧによるタンパク質誘導化の分野における技術の多くは、タンパク質に存在するリジン残基のイプシロン−ＮＨ２部分へ結合させるためのＰＥＧ誘導体を開発することを目的としている。「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ」、Ｎｅｋｔａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃａｔａｌｏｇ，２００３，ｐｐ．１−１７。しかし、これらのＰＥＧ誘導体は全て、共通する制限があり、これらは、タンパク質表面に存在する、多数であることが多いリジンの中での選択的な取り込みができない。例えば酵素活性部位において存在する、リジン残基がタンパク質活性に対して重要である場合において、又は、受容体結合部位の場合のように、タンパク質とその他の生物分子との相互作用の媒介においてリジン残基が重要な役割を果たす場合、これは重大な制限であり得る。
【００２０】
タンパク質ＰＥＧ化のための既存の方法の第二の問題であり同じように重要な問題は、ＰＥＧ誘導体が、所望する反応以外に、残基と望ましくない反応を起こし得ることである。ヒスチジンは、構造的に−−Ｎ（Ｈ）−−で表される反応性イミノ部分を含有するが、イプシロン−−ＮＨ２と反応する多くの化学的反応性種はまた、−−Ｎ（Ｈ）−−とも反応し得る。同様に、アミノ酸システインの側鎖は、−ＳＨとして構造的に表される遊離スルフヒドリル基を有する。ある例において、リジンのイプシロン−−ＮＨ２部分に向けられるイプシロンＰＥＧ誘導体もまた、システイン、ヒスチジン又は他の残基と反応する。これにより、複雑なＰＥＧ誘導化生物活性分子のヘテロ混合物が生じ、標的となる生物活性分子の活性が崩壊するリスクが生じ得る。タンパク質内の１部位に化学官能基を導入することができ、特定かつ推定可能なタンパク質表面の特定部位において生物活性分子に一つ以上のＰＥＧポリマーを選択的にカップリングさせることを可能にするＰＥＧ誘導体を開発することが望まれている。
【００２１】
リジン残基に加えて、当技術分野において、システイン、ヒスチジン及びＮ末端を含むその他のアミノ酸側鎖を標的とする活性化ＰＥＧ剤の開発に多大な努力が行われてきた。米国特許第６，６１０，２８１号（本明細書中に参照により組み込む。）及び「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ」、Ｎｅｋｔａｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃａｔａｌｏｇ、２００３，ｐｐ．１−１７を参照のこと。部位特異的突然変異誘発法及び当技術分野で公知のその他の技術を用いて、部位選択的にシステイン残基をタンパク質構造に導入することができ、得られた遊離スルフィジリル部分をチオール反応性官能基を有するＰＥＧ誘導体と反応させることができる。しかし、遊離スルフィジリル基の導入により、生じるタンパク質の、発現、フォールディング及び安定性が複雑になり得るということで、このアプローチは複雑である。したがって、同時に、タンパク質において見出されるスルフィジニル及びその他の化学官能基と適合性がありながら（即ち、望ましくない副反応をおこさない。）、一つ以上のＰＥＧポリマーをタンパク質に選択的にカップリングすることを可能にする、生物活性分子への化学官能基導入のための方法を得ることが必要となろう。
【００２２】
当技術分野の例示から分かるように、タンパク質の側鎖、特にリジンアミノ酸側鎖の−−ＮＨ２部分及びシステイン側鎖の−ＳＨ部分への結合に対して開発されたこれらの誘導体の多くが、その合成及び使用において問題を孕んでいることが明らかとなっている。あるものは、加水分解されやすいタンパク質と不安定な連結を形成し、したがって分解、崩壊し、又は血流中などの水性環境で不安定である。あるものは、より安定な連結を形成するが、連結が形成される前に加水分解されやすく、すなわち、ＰＥＧ誘導体における反応基が、タンパク質が連結できるようになる前に不活性化され得る。あるものは、幾分毒性があり、したがって、インビボでの使用にあまり適していない。あるものは、反応が遅すぎて実際に有用とはならない。あるものは、タンパク質の活性に寄与する部位への結合により、タンパク質活性を失わせる。あるものは、それらが結合する部位が特異的ではなく、またその結果、所望する活性が失われ、結果の再現性も失われ得る。ポリ（エチレングリコール）部分によるタンパク質修飾に関連する問題を解決するために、より安定なＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第６，６０２，４９８号（本明細書中に参照により組み込む。））又は分子及び表面におけるチオール部分と選択的に反応するＰＥＧ誘導体（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号（本明細書中に参照により組み込む。））が開発されてきた。安定な化学結合を形成するために選択的に反応することが必要になるまで生理的環境において化学的に不活性であるＰＥＧ誘導体が当技術分野で必要とされていることは明らかである。
【００２３】
最近、タンパク質科学において全く新しい技術が報告されており、この技術は、タンパク質の部位特異的修飾に関連する制限の多くの解決を期待できるものである。具体的には、新しい成分を原核生物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．コリ、大腸菌）（例えば、Ｌ．Ｗａｎｇら、（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００）及び真核生物Ｓａｃｃｈｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ（Ｓ．セレビシエ、酵母）（例えば、Ｊ．Ｃｌｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７（２００３））のタンパク質生合成機構に付加し、それにより、非遺伝子コードアミノ酸をインビボでタンパク質へ取り込むことができるようになった。光親和性標識及び光異性化可能なアミノ酸、ケトアミノ酸及びグリコシル化アミノ酸を含む、新規の、化学的、物理的又は生物学的特性を有する新しいアミノ酸の多くが、この方法を用いて、アンバーコドン、ＴＡＧに反応して、効率的かつ高忠実度でＥ．コリ及び酵母のタンパク質に組み込まれた。例えば、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、（２００２）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００２）、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、（２００２）、ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；及びＬ．Ｗａｎｇ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００２）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０を参照のこと。これらの研究から、選択的かつルーチンとして、タンパク質において見られず、２０種類の一般的な遺伝子コードアミノ酸で見られるの全ての官能基に対して化学的に不活性であり、安定な共有結合を形成するために効率的かつ選択的に反応させるために使用され得る、ケトン基、アルキン基及びアジド部分などの化学官能基を導入できることが分かった。
【００２４】
非遺伝子コードアミノ酸をタンパク質に取り込むことができると、リジンのイプシロン−ＮＨ２、システインのスルフィジル−ＳＨ、ヒスチジンのイミノ基などの天然の官能基に対して有用な選択肢を与え得る化学官能基を導入できるようになる。ある一定の化学官能基は、２０種類の一般的な遺伝子コードアミノ酸において見られる官能基に不活性であるが、安定な結合を形成するために、明確かつ効率的に反応することが知られている。例えば、アジド及びアセチレン基は、当技術分野において、銅の触媒量が存在する水性条件下でＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応を受けることが知られている。例えば、Ｔｏｒｎｏｅら（２００２）Ｏｒｅ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；及びＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９を参照のこと。タンパク質構造にアジド部分を導入することにより、例えば、アミン、スルフヒドリル、カルボン酸、タンパク質で見られるヒドロキシル基に対して化学的に不活性であるが、またアセチレン部分と円滑かつ効率的に反応し、付加環化産物を形成する官能基を取り込むことができる。重要なことであるが、アセチレン部分がない場合、アジドは化学的に不活性なままであり、他のタンパク質側鎖存在下及び生理的条件下で非反応性である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２５】
本発明は、とりわけ、抗原結合ポリペプチド及びその断片の活性及び産生に関連する問題に取り組み、また、治療半減期の改善など、生物学的及び薬理学的特性が向上した抗原結合ポリペプチドの産生にも取り組む。
【課題を解決するための手段】
【００２６】
（本発明の簡単な要約）
本発明は、一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチド（ＡＢＰ）を提供する。ある実施形態において、ＡＢＰは、完全な抗体重鎖を含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、完全な抗体軽鎖を含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、抗体軽鎖の可変領域を含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、抗体重鎖の可変領域を含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、抗体軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、抗体重鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲ及び重鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、Ｆａｂを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、２以上のＦａｂ’ｓを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、ｓｃＦｖを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、２以上のｓｃＦｖを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、ミニボディを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、２以上のミニボディを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、ダイアボディを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、２以上のダイアボディを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、軽鎖の可変領域及び重鎖の可変領域を含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、完全な軽鎖及び完全な重鎖を含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、一つ以上のＦｃドメイン又はその一部を含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、上記実施形態の何れかの組合せを含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、上記実施形態の何れかの、ホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、結合パートナーに結合するポリペプチド（この結合パートナーは、抗原、ポリペプチド、核酸分子、ポリマー又はその他の分子もしくは物質を含有する。）を含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、非抗体骨格分子又は物質と会合させられる。
【００２７】
ある実施形態において、ＡＢＰは、一つ以上の翻訳後修飾を含有する。ある実施形態において、ＡＢＰは、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている。ある実施形態において、ＡＢＰは、二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも１個のさらなるＡＢＰに連結されている。ある実施形態において、ＡＢＰは、ＡＢＰではないポリペプチドに連結されている。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドは、非天然コードアミノ酸も含み得る、一つ以上のさらなる抗原結合ポリペプチドに連結されている。
【００２８】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結されている。ある実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含有する。ある実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、二官能性ポリマーである。ある実施形態において、二官能性ポリマーは、第二のポリペプチドに連結されている。ある実施形態において、第二のポリペプチドは、抗原結合ポリペプチドである。
【００２９】
ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ポリ（エチレングリコール）部分を含有する水溶性ポリマーに連結している少なくとも２個のアミノ酸を含有する。ある実施形態において、少なくとも１個のアミノ酸は、非天然コードアミノ酸である。
【００３０】
ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、置換、付加又は欠失のない対応する抗原結合ポリペプチドの親和性と比較して、抗原に対する抗原結合ポリペプチドの親和性を調節する、置換、付加又は欠失を含有する。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、置換、付加又は欠失のない対応する抗原結合ポリペプチドの安定性性と比較して、抗原結合ポリペプチドの安定性を向上させる、置換、付加又は欠失を含有する。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、置換、付加又は欠失のない対応する抗原結合ポリペプチドの免疫原性と比較して、抗原結合ポリペプチドの免疫原性を調節する、置換、付加又は欠失を含有する。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、置換、付加又は欠失のない、対応する抗原結合ポリペプチドの、血清半減期又は循環時間と比較して、抗原結合ポリペプチドの、血清半減期又は循環時間を調節する、置換、付加又は欠失を含有する。
【００３１】
ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、置換、付加又は欠失のない対応する抗原結合ポリペプチドの水溶性と比較して、対応する抗原結合ポリペプチドの水溶性を向上させる、置換、付加又は欠失を含有する。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、置換、付加又は欠失のない対応する抗原結合ポリペプチドの溶解性と比較して、宿主細胞中で産生された抗原結合ポリペプチドの溶解性を向上させる、置換、付加又は欠失を含有する。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、置換、付加又は欠失のない、対応する抗原結合ポリペプチドの発現と比較して、宿主細胞中での抗原結合ポリペプチド発現量又はインビトロでの合成量を増加させる、置換、付加又は欠失を含有する。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、置換、付加又は欠失のない対応する抗原結合ポリペプチドのプロテアーゼ抵抗性と比較して、抗原結合ポリペプチドのプロテアーゼ抵抗性を向上させる、置換、付加又は欠失を含有する。
【００３２】
ある実施形態において、ＡＢＰにおけるアミノ酸置換は、天然又は非天然アミノ酸によるものであり得るが、ただし、少なくとも１つの置換が非天然コードアミノ酸によるものである。
【００３３】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、カルボニル基、アセチル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。
【００３４】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、カルボニル基を含む。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、構造：
【００３５】
【化１】
2008503217.tif 000002
を有する（式中、
ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。
【００３６】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、アミノオキシ基を含む。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、ヒドラジド基を含む。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、ヒドラジン基を含む。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸残基は、セミカルバジド基を含む。
【００３７】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸残基は、アジド基を含む。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、構造：
【００３８】
【化２】
2008503217.tif 000003
を有する（式中、
ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、又は存在せず；ｍは０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。
【００３９】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、アルキン基を含む。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、構造：
【００４０】
【化３】
2008503217.tif 000004
を有する（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか、又は存在せず；ｍは０から１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。
【００４１】
ある実施形態において、ポリペプチドは、抗原の少なくとも１つの活性の、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストである。ある実施形態において、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストは、水溶性ポリマーに連結している非天然コードアミノ酸を含有する。ある実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含有する。ある実施形態において、アゴニスト、部分アゴニスト、アンタゴニスト、部分アンタゴニスト又は逆アゴニストは、非天然コードアミノ酸及び一つ以上の、翻訳後修飾、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有する。
【００４２】
本発明はまた、抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する単離核酸を提供するが、このポリヌクレオチドは、以下に限定されないが、配列番号１８、２０、２２、２５、２７、２９を含む、少なくとも１個のセレクターコドンを含有する。ある実施形態において、セレクターコドンは、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン及び四塩基コドンからなる群から選択される。
【００４３】
本発明はまた、水溶性ポリマーに連結している抗原結合ポリペプチドを作製する方法を提供する。ある実施形態において、この方法は、非天然コードアミノ酸を含有する単離した抗原結合ポリペプチドを非天然コードアミノ酸と反応する部分を含有する水溶性ポリマーと接触させることを含む。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドに取り込まれる非天然コードアミノ酸は、２０種類の一般的アミノ酸のいずれに対しても反応性がないが、水溶性ポリマーに対して反応性がある。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドに取り込まれる非天然コードアミノ酸は、２０種類の一般的アミノ酸のいずれに対しても反応性がないが、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に対して反応性がある。
【００４４】
ある実施形態において、カルボニル含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドをアミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含有するポリ（エチレングリコール）分子と反応させることにより、水溶性ポリマーに連結している抗原結合ポリペプチドを作製する。ある実施形態において、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結している。
【００４５】
ある実施形態において、カルボニル基を含有するポリ（エチレングリコール）分子をアミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含む非天然コードアミノ酸を含有するポリペプチドと反応させることにより、水溶性ポリマーに連結している抗原結合ポリペプチドを作製する。
【００４６】
ある実施形態において、アルキン含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドを、アジド部分を含有するポリ（エチレングリコール）分子と反応させることにより、水溶性ポリマーに連結した抗原結合ポリペプチドを作製する。ある実施形態において、アジド又はアルキン基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結している。
【００４７】
ある実施形態において、アジド含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドを、アルキン部分を含有するポリ（エチレングリコール）分子と反応させることにより、水溶性ポリマーに連結した抗原結合ポリペプチドを作製する。ある実施形態において、アジド又はアルキン基は、アミド結合を介してポリ（エチレングリコール）分子に連結している。
【００４８】
ある実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子の分子量は、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの間である。ある実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子の分子量は、０．１ｋＤａから５０ｋＤａの間である。
【００４９】
ある実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分子は、分枝ポリマーである。ある実施形態において、ポリ（エチレングリコール）分枝ポリマーの各枝の分子量は、１ｋＤａから１００ｋＤａの間であるか、又は１ｋＤａから５０ｋＤａの間である。
【００５０】
ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドに連結している水溶性ポリマーは、ポリアルキレングリコール部分を含む。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドに取り込まれる非天然コードアミノ酸残基は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含む。ある実施形態において、ＡＢＰに取り込まれる非天然コードアミノ酸残基は、カルボニル部分を含有し、水溶性ポリマーは、アミノオキシ、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含有する。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドに取り込まれる非天然コードアミノ酸残基は、アルキン部分を含有し、水溶性ポリマーは、アジド部分を含有する。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドに取り込まれる非天然コードアミノ酸残基は、アジド部分を含有し、水溶性ポリマーは、アルキン部分を含有する。
【００５１】
本発明はまた、非天然のコードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドと、医薬的に許容される担体と、を含有する組成物を提供する。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結している。
【００５２】
本発明はまた、セレクターコドンを含有する抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する細胞を提供する。ある実施形態において、この細胞は、抗原結合ポリペプチドに非天然コードアミノ酸置換を導入するための、直交化ＲＮＡシンテターゼ及び／又は直交化ｔＲＮＡを含有する。
【００５３】
本発明はまた、非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを作製する方法を提供する。ある実施形態において、この方法は、抗原結合ポリペプチドの発現が可能となる条件下で、抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（一つ以上）、直交化ＲＮＡシンテターゼ及び／又は直交化ｔＲＮＡを含有する細胞を培養すること；抗原結合ポリペプチドを細胞及び／又は培地から精製することを含む。
【００５４】
本発明はまた、抗原結合ポリペプチドの、治療半減期、血清半減期又は循環時間を向上させる方法も提供する。本発明はまた、抗原結合ポリペプチドの免疫原性を調節する方法も提供する。ある実施形態において、この方法は、天然抗原結合ポリペプチド中の何れかの一つ以上のアミノ酸を非天然コードアミノ酸で置換すること及び／又は抗原結合ポリペプチドをリンカー、ポリマー、水溶性ポリマー又は生物活性分子に連結させることを含む。
【００５５】
本発明はまた、本発明の抗原結合ポリペプチドの有効量を用いて、このような治療を必要とする患者を治療する方法も提供する。ある実施形態において、この方法は、非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドと、医薬的に許容される担体と、を含有する医薬組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結している。
【００５６】
本発明はまた、少なくとも１つのアミノ酸が非天然コードアミノ酸で置換されていることを除き、配列番号１９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３１で示される配列もしくはそれらの断片又は何らかの他の抗原結合ポリペプチド配列を含有する抗原結合ポリペプチドも提供する。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、水溶性ポリマーに連結している。ある実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含有する。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含有する。
【００５７】
本発明はまた、医薬的に許容される担体と、配列番号１９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３１で示される配列もしくはそれらの断片又は何らかの他の抗原結合ポリペプチド配列（ここで、少なくとも１つのアミノ酸が非天然コードアミノ酸により置換されている。）を含有する抗原結合ポリペプチドと、を含有する医薬組成物も提供する。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、糖部分を含有する。ある実施形態において、水溶性ポリマーは、糖部分を介してポリペプチドに連結している。ある実施形態において、リンカー、ポリマー又は生物活性分子は、糖部分を介して抗原結合ポリペプチドに連結している。
【００５８】
本発明はまた、１個のアミノ酸における抗原結合ポリペプチドへの共有結合により連結している水溶性ポリマーを含有する抗原結合ポリペプチドも提供する。ある実施形態において、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）部分を含有する。ある実施形態において、水溶性ポリマーに共有結合により連結しているアミノ酸は、ポリペプチドに存在する非天然コードアミノ酸である。
【００５９】
本発明は、少なくとも１個のリンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有し、リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、リボソームにおいてポリペプチドに取り込まれる非天然コードアミノ酸の官能基を介してポリペプチドに結合している、抗原結合ポリペプチドを提供する。ある実施形態において、ポリペプチドは、モノＰＥＧ化されている。本発明はまた、一つ以上の非天然コードアミノ酸（この非天然コードアミノ酸は、前もって選択された部位でリボソームにおいてポリペプチドに取り込まれる。）に結合している、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有するＡＢＰポリペプチドも提供する。
【００６０】
別の実施形態において、一つ以上の非天然アミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを別の分子（以下に限定されないがＰＥＧなど。）に共役させることにより、非天然アミノ酸への共役に利用されるユニークな化学反応ゆえに、実質的に精製された抗原結合ポリペプチドを提供する。共役段階の前又は後に行われる他の精製技術とともに、一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドの、ＰＥＧなどの別の分子への共役を行い、実質的に純粋な抗原結合ポリペプチドを得ることができる。
【００６１】
（定義）
本発明は、本明細書中に記載の、特定の方法、プロトコール、細胞株、コンストラクト及び試薬等に限定されず、そのようなものとして、変化し得ることを理解されたい。また、本明細書中で使用する用語が、特定の実施形態をただ説明するものであり、本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の範囲は添付の請求項の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
【００６２】
本明細書中及び添付の請求項の範囲で使用する場合、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈において明らかに別に示されない限り、複数形の意味を含む。したがって、例えば、「抗原結合ポリペプチド」又は「ＡＢＰ」は、一つ以上のこのようなタンパク質を意味し、当業者にとって公知の同等物などを含む。
【００６３】
別段の定義がない限り、本明細書中で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明が属する当業者にとって通常理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は試験において、本明細書中に記載のものと同様又は同等の、あらゆる方法、装置及び材料を使用することができるが、ここでは、好ましい方法、装置及び材料を記載する。
【００６４】
本明細書中で言及する刊行物及び特許は、例えば、刊行物に記載のコンストラクト及び方法を説明し開示する目的で、本明細書中に参照により組み込み、それらは、今回述べる発明に関連して使用し得る。本明細書中で考察する刊行物は、ただ、本願の提出日前のそれらの開示に対して提供される。本明細書のいかなる開示内容も、本発明が先行技術の効力によってこのような開示に対して先行する権利を与えられていないことを認めるものではない。
【００６５】
「実質的に精製された」という用語は、通常、その天然の環境（即ち、ネイティブ細胞又は組み換え産生ＡＢＰの場合は宿主細胞）で見られる場合にタンパク質に伴う、又はタンパク質と相互作用する成分について、実質的に、又は基本的に不含であり得るＡＢＰを指す。十分に細胞性物質不含であり得るＡＢＰは、混入タンパク質が約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満又は約１％未満（乾燥重量による。）である、タンパク質の調製物を含む。ＡＢＰ又はその変異型が宿主細胞により組み換え産生される場合、存在し得る混入タンパク質は、細胞の乾燥重量の、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約４％、約３％、約２％又は約１％未満である。ＡＢＰ又はその変異型が宿主細胞により組み換え産生される場合、培地中に存在し得る混入タンパク質の量は、細胞の乾燥重量に対して、約５ｇ／Ｌ、約４ｇ／Ｌ、約３ｇ／Ｌ、約２ｇ／Ｌ、約１ｇ／Ｌ、約７５０ｍｇ／Ｌ、約５００ｍｇ／Ｌ、約２５０ｍｇ／Ｌ、約１００ｍｇ／Ｌ、約５０ｍｇ／Ｌ、約１０ｍｇ／Ｌ又は約１ｍｇ／Ｌ未満である。したがって、本発明の方法により産生される場合の「実質的に精製された」ＡＢＰの純度は、ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析、ＲＰ−ＨＰＬＣ、ＳＥＣ及びキャピラリー電気泳動などの適切な方法により測定した場合、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、具体的には、少なくとも約７５％、８０％、８５％、より具体的には、少なくとも約９０％の純度、少なくとも約９５％の純度、少なくとも約９９％以上の純度であり得る。
【００６６】
「組み換え宿主細胞」又は「宿主細胞」とは、例えば、直接取り込み、形質導入、ｆ−交配又は組み換え宿主細胞を作製するための当技術分野で公知のその他の方法など、挿入に使用する方法に関わらず、外来ポリヌクレオチドを含む細胞を指す。外来ポリヌクレオチドは、例えばプラスミドなど、非組み込みベクターとして維持されるか、あるいは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【００６７】
本明細書中で使用する場合、「培地（ｍｅｄｉｕｍ）」又は「培地（ｍｅｄｉａ）」という用語は、細菌宿主細胞、酵母宿主細胞、昆虫宿主細胞、植物宿主細胞、真核宿主細胞、哺乳類宿主細胞、ＣＨＯ細胞又はＥ．コリ及び細胞含有物を含む何らかの宿主細胞を支持し得るか、又は含有し得る、あらゆる培養用培地、溶液、固体、半固体又は固定支持体を含む。したがって、この用語は、増殖段階の前又は後の何れかの培地を含む、宿主細胞を増殖させている培地、例えば、ＡＢＰが分泌されている培地を包含し得る。この用語はまた、ＡＢＰが細胞内で産生され、宿主細胞が溶解又は分解されてＡＢＰが放出される場合など、宿主細胞の細胞溶解液を含有する、緩衝液又は試薬も包含し得る。
【００６８】
タンパク質リフォールディングに関して、本明細書中で使用する場合、「還元剤」は、還元状態においてスルフヒドリル基を維持し、分子内又は分子間ジスルフィド結合を還元する、何らかの化合物又は物質として定義する。適切な還元剤としては、以下に限定されないが、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、２−メルカプトエタノール、ジチオエリスリトール、システイン、システアミン（２−アミノエタンチオール）及び還元グルタチオンが挙げられる。当業者にとって当然のことながら、本発明の方法及び組成物における使用に対して多岐にわたる還元剤が適切である。
【００６９】
タンパク質リフォールディングに関して、本明細書中で使用する場合、「酸化剤」という用語は、酸化される化合物から電子を除去することができる、あらゆる化合物又は物質として定義する。適切な酸化剤としては、以下に限定されないが、酸化グルタチオン、シスチン、シスタミン、酸化ジチオスレイトール、酸化エリスレイトール及び酸素が上げられる。当業者にとって当然のことながら、本発明の方法及び組成物における使用に対して多岐にわたる酸化剤が適切である。
【００７０】
「変性試薬」又は「変性剤」とは、本明細書中で使用する場合、タンパク質の可逆的なアンフォールディングを引き起こす、あらゆる化合物又は物質として定義する。変性試薬又は変性剤の強さは、特定の変性試薬又は変性剤の特性及び濃度の両方により決まる。適切な変性試薬又は変性剤は、カオトロープ、界面活性剤、有機溶媒、水混和性溶媒、リン脂質又は２以上のこのような物質の混合物であり得る。適切なカオトロープとしては、以下に限定されないが、尿素、グアニジン及びチオシアン酸ナトリウムが挙げられる。有用な界面活性剤としては、以下に限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム又はポリオキシエチレンエーテル（例えば、ＴｗｅｅｎもしくはＴｒｉｔｏｎ界面活性剤）などの強力な界面活性剤、Ｓａｒｋｏｓｙｌ、穏やかな非イオン性界面活性剤（例えばジギトニン）、Ｎ→２，３−（ジオレイオキシ）−プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムなどの穏やかな陽イオン性界面活性剤、穏やかなイオン性界面活性剤（例えば、コール酸ナトリウムもしくはデオキシコール酸ナトリウム）又は両性イオン界面活性剤（以下に限定されないが、スルホベタイン（両性洗浄剤）、３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−１−プロパンサルフェート（ＣＨＡＰＳ）及び３−（３−クロラミドプロピル）ジメチルアンモニオ−２−ヒドロキシ−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳＯ）が含まれる。）を挙げることができる。アセトニトリル、低級アルカノール（特に、エタノールもしくはイソプロパノールなどの、Ｃ２−Ｃ４アルカノール）又は低級アルカンジオール（特に、エチレングリコールなどのＣ２−Ｃ４アルカンジオール）などの有機、水混和性溶媒を変性剤として使用し得る。本発明において有用なリン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルセリン及びホスファチジルイノシトールなどの天然リン脂質又はジヘキサのイルホスファチジルコリンもしくはジヘプタノイルホスファチジルコリンなどの合成リン脂質誘導体もしくは変異型であり得る。
【００７１】
「リフォールディング」とは、本明細書中で使用する場合、ジスルフィド結合に関して、正しくフォールディングされていない、又は、ネイティブにフォールディングされていない状態、又は正しくフォールディングされている立体構造からのポリペプチドを含有する、ジスルフィド結合を変形させる、あらゆるプロセス、反応又は方法を指す。
【００７２】
「コフォールディング（ｃｏｆｏｌｄｉｎｇ）」とは、本明細書中で使用する場合、具体的に、互いに相互作用し、その結果、フォールディングされていない、又は正しくフォールディングされていないポリペプチドをネイティブに、正しくフォールディングされているポリペプチドに変形させる、少なくとも２つのポリペプチドを用いる、リフォールディングプロセス、反応又は方法を指す。
【００７３】
抗体は、特異的な抗原に対して結合特異性を示すタンパク質である。ネイティブ抗体は、通常、約１５０,０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質であり、２個の同一の軽（Ｌ）鎖及び２個の同一の重（Ｈ）鎖から構成される。各軽鎖は、１個の共有ジスルフィド結合により重鎖に連結されており、また、ジスルフィド結合数は、様々な免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で変化する。各重鎖及び軽鎖はまた、通常、間隔のあいた鎖内ジスルフィド橋も有する。各重鎖は、一方の末端で、可変ドメイン（ＶＨ）を有し、続いて、多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端で、可変ドメイン（ＶＬ）及びもう一方の末端で定常ドメインを有し、軽鎖の定常ドメインは、重鎖の最初の定常ドメインと一列に並び、軽鎖可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと一列に並ぶ。特定のアミノ酸残基は、軽鎖及び重鎖の可変ドメイン間で接触面を形成すると考えられている。
【００７４】
「可変である」という用語は、可変ドメインのある一定の部分が抗体の中で非常に様々であり、それが、各特定の抗体のその特定の抗原に対する結合特異性に寄与しているということを指す。しかし、可変性は、抗体の可変ドメイン間で同じではない。可変性は、軽鎖及び重鎖両方の可変ドメインにおいて、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３個のセグメントに集中している。可変ドメインの中で保存性がより高い部分は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。ネイティブ重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、４個のＦＲ領域からなり、大部分は、３個又は４個のＣＤＲにより連結されるβシート立体配置を導入し、ある場合はβシート構造の一部を形成する、ループ連結を形成する。各鎖におけるＣＤＲは、他の鎖からのＣＤＲとともに、ＦＲ領域によって近接近して一緒に保持されており、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ.（１９９１）を参照のこと。）。
【００７５】
定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合に直接関与しないが、様々なエフェクター機能を示す。重鎖の定常領域のアミノ酸配列に依存して、抗体又は免疫グロブリンを異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには、５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）にさらに分けることができる（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４；ＩｇＡ１及びＩｇＡ２）。免疫グロブリンの様々なクラスに対応する重鎖定常領域は、それぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。様々なヒト免疫グロブリンクラスの中で、補体を活性化することが知られているのは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＭのみである。
【００７６】
インビボで、抗体の親和性成熟は、主として体細胞超変異によって作られる、より親和性が高い抗体変異型の抗原選択により行われる。「レパートリーシフト」も、第二又は第三の反応の主要な生殖系列遺伝子が、第一又は第二の反応のそれとは異なるとみなされる場合に起こることが多い。
【００７７】
免疫系の親和性成熟プロセスは、インビトロで抗体遺伝子に突然変異を導入し、親和性選択を用いて親和性が向上した突然変異体を単離することにより再現することができる。このような変異抗体を糸状バクテリオファージ又は、酵母などの微生物の表面上で表示することができ、抗原に対するその親和性により、又は抗原からのそれらの解離のカイネティクス（解離速度）により、抗体を選択することができる。Ｈａｗｋｉｎｓら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９−８９６（１９９２）。ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）のヒトエンベロープ糖タンパク質ｇｐ１２０を結合するヒト抗体の親和性成熟に対して、ＣＤＲウォーキング突然変異誘発法が用いられてきた（Ｂａｒｂａｓ  ＩＩＩら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９１：３８０９−３８１３（１９９４）；及びＹａｎｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４：３９２−４０３（１９９５））；及び抗ｃ−ｅｒｂＢ−２一本鎖Ｆｖ断片（Ｓｃｈｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１５６７（１９９６））。抗体鎖シャッフリング及びＣＤＲ突然変異誘発法を用いて、ＨＩＶの第三の超可変ループに対して高親和性ヒト抗体を親和性成熟させた（Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５６：７７−８８（１９９６））。Ｂａｌｉｎｔ及びＬａｒｒｉｃｋ  Ｇｅｎｅ  １３７：１０９−１１８（１９９３）は、コンピュータを利用したオリゴデオキシリボヌクレオチドに向けたスキャニング突然変異誘発法について述べており、これにより、可変領域遺伝子のＣＤＲ全てに対して、改善された変異体について同時かつ完全に検索を行う。６個のＣＤＲ全ての各位置に対して突然変異を導入し、次いで親和性が最大の突然変異を含むコンビナトリアルライブラリを発現させ、スクリーニングを行う、初回限定の突然変異誘発ストラテジーを用いて、αｖβ３−特異的ヒト化抗体の親和性成熟を行った（Ｗｕら、ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９５：６０３７−６−４２（１９９８））。ファージディスプレイ抗体は、Ｃｈｉｓｗｅｌｌ及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ＴＩＢＴＥＣＨ  １０：８０-８４（１９９２）；及びＲａｄｅｒ及びＢａｒｂａｓ  ＩＩＩ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．８:５０３−５０８（１９９７）で概説されている。親抗体と比較して親和性が向上した変異抗体が上述の参考文献で報告されているが、その各場合において、変異抗体には、ＣＤＲにおいてアミノ酸置換がある。
【００７８】
「親和性成熟」とは、本明細書中で、抗体のその抗原に対する親和性促進のプロセスを意味する。親和性成熟のための方法には、以下に限定されないが、コンピュータによるスクリーニング法及び実験的方法が含まれる。
【００７９】
「抗体」とは、本明細書中で、抗体遺伝子全体又はその一部により実質的にコードされている、一つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリン遺伝子には、以下に限定されないが、κ、λ、α、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４）、δ、ε及びμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が含まれる。本明細書中で、抗体は、全長抗体及び抗体断片を含み、あらゆる生物において天然に存在する、又は操作された（例えば変異型）抗体を含むものとする。
【００８０】
「抗体断片」とは、全長形態以外の、抗体のあらゆる形態を意味する。本明細書中で、抗体断片には、全長抗体中に存在するより小さい成分である抗体及び操作された抗体が含まれる。抗体断片には、以下に限定されないが、Ｆｖ、Ｆｃ、Ｆａｂ及び（Ｆａ’）２、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、二機能性ハイブリッド抗体、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＣＤＲ、可変領域、フレームワーク領域、定常領域などの組合せが含まれる（Ｍａｙｎａｒｄ及びＧｅｏｒｇｉｏｕ、２０００、Ａｍｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｅｎｇ．２：３３９−７６；Ｈｕｄｓｏｎ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：３９５−４０２）。
【００８１】
「コンピュータを利用したスクリーニング法」とは、本明細書中で、タンパク質において一つ以上の突然変異を設計するためのあらゆる方法を意味し、この方法では、コンピュータを利用して、候補となるアミノ酸側鎖置換の互いの、及び／又はタンパク質の他の部位との相互作用のエネルギーを評価する。
【００８２】
「Ｆｃ」とは、本明細書中で、免疫グロブリンドメインＣγ２及びＣγ３（Ｃγ２及びＣγ３）からなる抗体の一部を意味する。Ｆｃはまた、Ｃγ２とＣγ１（Ｃγ１）との間のＮ末端ヒンジに存在する何らかの残基も含み得る。Ｆｃは、単独で、この領域を、又は抗体もしくは抗体断片に関連してこの領域を意味し得る。Ｆｃはまた、Ｆｃの何らかの修飾形態（以下に限定されないが、ネイティブ単量体、ネイティブ二量体（ジスルフィド結合連結）、修飾二量体（ジスルフィド及び／又非共有結合）及び修飾単量体（即ち誘導体）を含む。）も含み得る。
【００８３】
「全長抗体」とは、本明細書中で、抗体Ｈ及び／又はＬ鎖の天然の生物学的形態を構成する構造を意味する。ヒト及びマウスを含む殆どの哺乳動物において、この形態は四量体であり、２本の免疫グロブリン鎖の同一の２対からなり、各ペアは、１個の軽鎖及び１個の重鎖を有し、各軽鎖は免疫グロブリンドメインＶＬ及びＣＬを含有し、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２及びＣγ３を含有する。各ペアにおいて、軽鎖及び重鎖可変領域（ＶＬ及びＶＨ）は、一緒に、抗原への結合に寄与しており、定常領域（ＣＬ、Ｃγ１、Ｃγ２及びＣγ３、特にＣγ２及びＣγ３）は、抗体エフェクター機能に寄与している。ある種の哺乳動物において、例えばラクダ及びラマにおいては、全長抗体は、２本の重鎖のみから構成され得、各重鎖は、免疫グロブリンドメインＶＨ、Ｃγ２及びＣγ３を含有する。
【００８４】
「免疫グロブリン（Ｉｇ）」とは、本明細書中で、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされている、一つ以上のポリペプチドからなるタンパク質を意味する。免疫グロブリンには、以下に限定されないが抗体が含まれる。免疫グロブリンは、多くの構造形態を有し得、これには、以下に限定されないが、全長抗体、抗体断片及び個々の免疫グロブリンドメイン（以下に限定されないが、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬ及びＣＬなど。）が含まれる。
【００８５】
「免疫グロブリン（Ｉｇ）ドメイン」とは、本明細書中で、免疫グロブリン遺伝子により実質的にコードされているポリペプチドからなるタンパク質ドメインを意味する。Ｉｇドメインには、以下に限定されないが、図１で示されるように、ＶＨ、Ｃγ１、Ｃγ２、Ｃγ３、ＶＬ及びＣＬが含まれる。
【００８６】
「変異タンパク質配列」とは、本明細書中で使用する場合、別の同様のタンパク質配列とはアミノ酸が異なっている、一つ以上の残基を有するタンパク質配列を意味する。この同様のタンパク質配列は、天然の野生型タンパク質配列又は野生型配列の別の変異型であり得る。一般に、出発配列は、「親」配列と呼ばれ、野生型又は変異型配列であり得る。例えば、本発明の好ましい実施形態は、コンピュータを利用した解析を行い変異型を作製する場合、ヒト化親配列を利用し得る。
【００８７】
抗体の「可変領域」とは、本明細書中で、図１で示されるように、ＶＨ免疫グロブリンドメイン、ＶＬ免疫グロブリンドメイン又はＶＨ及びＶＬ免疫グロブリンドメインからなる、ポリペプチド又はポリペプチド（複数）を意味する（変異型を含む。）。可変領域は、Ｆｖ断片として、ｓｃＦｖ断片として、より大きな抗体断片に対するこの領域として、又は全長抗体に対するこの領域として、あるいは、非抗体骨格分子として、単独で、これ又はこれらのポリペプチドを指し得る。
【００８８】
多岐にわたる源から得られた抗体に対して、本発明を適用し得る。抗体は、実質的に、以下に限定されないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ラクダ、ラマ、ヒトコブラクダ、サル、特に哺乳動物、とりわけヒト、とりわけマウス及びラットを含む、あらゆる生物体由来の、抗体遺伝子（単数）又は抗体遺伝子（複数）によりコードされ得る。ある実施形態において、抗体は、トランスジェニックマウス又はその他の動物を用いることにより、例えば患者又は対象者から得られた（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ及びＴａｕｓｓｉｇ、１９９７、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．８：４５５−４５８）完全ヒト抗体又は、選択法と組み合わせてヒト抗体ライブラリから得られた（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ及びＤｕｎｃａｎ、１９９８、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：１０２−１０８）完全ヒト抗体であり得る。抗体は、あらゆる源由来であり得、人工又は天然のものが含まれる。例えば、本発明は、改変抗体（以下に限定されないが、キメラ抗体及びヒト化抗体（Ｃｌａｒｋ、２０００、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  ２１：３９７−４０２）を含む。）又はコンビナトリアルライブラリ由来の抗体を利用し得る。さらに、最適化された抗体は、一つ以上の天然抗体遺伝子により実質的にコードされている抗体の組み換え変異型であり得る。例えば、ある実施形態において、最適化された抗体は、親和性成熟により同定された抗体である。
【００８９】
本発明のＡＢＰに関して、「抗原性の面で特異的」又は「特異的に結合」という用語は、関心のある抗原又は結合パートナーの一つ以上のエピトープに結合するが、抗原の混合集団を含有する試料中のその他の分子を実質的に認識せず結合しないＡＢＰを指す。
【００９０】
「二重特異性ＡＢＰ」又は「多重特異性ＡＢＰ」という用語は、本明細書中で使用する場合、２以上の抗原結合部位又は結合パートナー結合部位を含有するＡＢＰを指し、第一の結合部位は、第一の抗原又はエピトープに対して親和性を有し、第二の結合部位は、第一のものとは異なる、第二の抗原又はエピトープに対して親和性を有する。
【００９１】
「エピトープ」という用語は、本明細書中で使用する場合、ＡＢＰにより認識される、抗原又は結合パートナーにおける部位を指す。抗原がポリペプチドを含有する場合、エピトープは、直線状又は立体配座的に形成された配列又はアミノ酸の形であり得る。エピトープはまた、ＡＢＰが抗原に結合する場合のあらゆる型の抗原のあらゆる位置であり得る。
【００９２】
本明細書中で使用する場合、「抗原結合ポリペプチド」又は「ＡＢＰ」は、抗原などの特定の結合パートナーへの特異的結合の生物活性を少なくとも有する、ポリペプチド及びタンパク質、ならびにＡＢＰ類似体、ＡＢＰアイソフォーム、ＡＢＰ模倣体、ＡＢＰ断片、ハイブリッドＡＢＰタンパク質、融合タンパク質、オリゴマー及び多量体、ホモローグ、グリコシル化パターン変異型及びそれらの突然変異タンパク質（同じ生物活性に関わらない、及び、以下に限定されないが、組み換え（ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は核酸のその他の形態から産生される。）、インビトロ、インビボ、核酸分子のマイクロインジェクションによる、合成、トランスジェニック及び遺伝子活性法を含む、それらの合成又は製造法に関わらない。）を含む。ＡＢＰの具体例には、以下に限定されないが、抗体分子、重鎖、軽鎖、可変領域、ＣＤＲ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、選択的な骨格非抗体分子、リガンド、受容体、ペプチド、又は抗原に結合する何らかのアミノ酸配列が含まれる。
【００９３】
「ＡＢＰ」又は「抗原結合ポリペプチド」という用語は、上述のようなＡＢＰならびに、以下に限定されないが抗原結合以外の活性を含む、天然抗体の少なくとも１つの生物活性を有するポリペプチドを指す。抗原結合以外の活性には、以下に限定されないが、Ｆｃと会合する、何らかの一つ以上の活性が含まれる。
【００９４】
抗原結合ポリペプチドには、医薬的に許容される塩及びプロドラッグ及びプロドラッグの塩、多形体、水和物、溶媒和物、生物活性断片、生物活性のある変異型及び天然ヒトＡＢＰの立体異性体、ならびに、天然ヒトＡＢＰの、アゴニスト、模倣体、アンタゴニスト変異型及びそれらのポリペプチド融合物が含まれる。アミノ末端、カルボキシル末端又は両方にさらなるアミノ酸を含有する融合物は、「抗原結合ポリペプチド」という用語に包含される。融合物の例としては、以下に限定されないが、例えば、組み換え発現による、メチオニンがＡＢＰのＮ末端に連結しているメチオニルＡＢＰ、精製目的の融合物（以下に限定されないが、ポリヒスチジン又は親和性エピトープを含む。）、ＡＢＰを他の生物活性分子と連結させるための融合物、血清アルブミン結合ペプチドとの融合物及び血清タンパク質（血清アルブミンなど）との融合物が含まれる。
【００９５】
「抗原」又は「結合パートナー」という用語は、ＡＢＰにより示される、結合活性に対する標的である物質を指す。実質的に、あらゆる物質が、ＡＢＰに対する抗原又は結合パートナーであり得る。抗原又は結合パートナーの例には、以下に限定されないが、α−１抗トリプシン、アンジオスタチン、抗溶血性因子、抗体、アポリポタンパク質、アポタンパク質、心房性ナトリウム利尿因子、心房性ナトリウム利尿ポリペプチド、心房性ペプチド、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン（例えば、Ｔ３９７６５、ＮＡＰ−２、ＥＢＡ−７８、Ｇｒｏ−ａ、Ｇｒｏ−ｂ、Ｇｒｏ−ｃ、ＩＰ−１０、ＧＣＰ−２、ＮＡＰ−４、ＳＤＦ−１、ＰＦ４、ＭＩＧ）、カルシトニン、ＣＣケモカイン（例えば、単球化学誘引物質タンパク質−１、単球化学誘引物質タンパク質−２、単球化学誘引物質タンパク質−３、単球炎症性タンパク質−１α、単球炎症性タンパク質−１β、ＲＡＮＴＥＳ、１３０９、Ｒ８３９１５、Ｒ９１７３３、ＨＣＣｌ、Ｔ５８８４７、Ｄ３１０６５、Ｔ６４２６２）、ＣＤ４０リガンド、Ｃ−Ｋｉｔリガンド、コラーゲン、コロニー刺激因子（ＣＳＦ）、補体因子５α、補体阻害剤、補体受容体１、サイトカイン（例えば、上皮好中球活性化ペプチド−７８、ＧＲＯ□／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ、ＧＲＯ、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、エリスロポエチン（「ＥＰＯ」）、剥離毒素Ａ及びＢ、第ＩＸ因子、第ＶＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子、第Ｘ因子、繊維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、フィブリノーゲン、フィブロネクチン、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、グルコセレブロシダーゼ、ゴナドトロピン、増殖因子、ヘッジホッグタンパク質（例えば、ソニック、インディアン、デザート）、ヘモグロビン、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ヒルジン、ヒト血清アルブミン、インスリン、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２など）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ラクトフェリン、白血病抑制因子、ルシフェラーゼ、ニューチュリン、好中球阻害因子（ＮＩＦ）、オンコスタチンＭ、骨形成タンパク質、副甲状腺ホルモン、ＰＤ−ＥＣＳＦ、ＰＤＧＦ、ペプチドホルモン（例えば、ヒト成長ホルモン）、プレイオトロピン、タンパク質Ａ，タンパク質Ｇ、発熱性外毒素Ａ、Ｂ及びＣ、リラキシン、レニン、ＳＣＦ、可溶性補体受容体Ｉ、可溶性Ｉ−ＣＡＭ１、可溶性インターロイキン受容体（ＩＬ−１、２、３、４、５、６、７、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５）、可溶性ＴＮＦ受容体、ソマトメジン、ソマトスタチン、ソマトトロピン、ストレプトキナーゼ、スーパー抗原、即ちスタフィロコッカス（ブドウ球菌）エンテロトキシン（ＳＥＡ、ＳＥＢ、ＳＥＣ１、ＳＥＣ２、ＳＥＣ３、ＳＥＤ、ＳＥＥ）、超酸化物ジスムターゼ、毒素性ショック症候群毒素（ＴＳＳＴ−１）、チモシンα１、組織プラスミノーゲン活性化因子、腫瘍壊死因子β（ＴＮＦβ）、腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＥＦ）、ウロキナーゼ及びその他多くのものが含まれる。
【００９６】
これらのタンパク質の多くは市販されており（例えば、Ｓｉｇｍａ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ  ２００２カタログ及び価格表を参照。）、対応するタンパク質配列及び遺伝子ならびに、通常、それらの多くの変異型が周知である（例えば、Ｇｅｎｂａｎｋを参照。）。
【００９７】
さらなる抗原又は結合パートナーには、以下に限定されないが、転写及び発現活性化因子が含まれる。転写及び発現活性化因子の例には、細胞増殖、分化、制御などを調節する、遺伝子及びタンパク質が含まれる。発現及び転写活性化因子は、原核生物、ウイルス及び、真菌、植物及び動物（哺乳動物を含む。）を含む真核生物において見出され、多岐にわたる治療ターゲットを提供する。当然のことながら、発現及び転写活性化因子は、例えば、受容体への結合、シグナル形質導入カスケードの刺激、転写因子の発現制御、プロモーター及びエンハンサーへの結合、プロモーター及びエンハンサーに結合するタンパク質への結合、ＤＮＡの巻き戻し、プレｍＲＮＡのスプライシング、ＲＮＡのポリアデニル化及びＲＮＡの分解によるものなどの、多くの機構により転写を制御する。抗原又は結合パートナーには、以下に限定されないが、サイトカイン、炎症性分子、増殖因子、それらの受容体及び癌遺伝子産物、例えばインターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−８など）、インターフェロン、ＦＧＦ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＮＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＳＣＦ／ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０、ＶＬＡ−４／ＶＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−１、／ＬＦＡ−１及びヒアルリン／ＣＤ４４；シグナル形質導入分子及び対応する癌遺伝子産物、例えば、Ｍｏｓ、Ｒａｓ、Ｒａｆ及びＭｅｔ；及び転写活性化因子及び抑制因子、例えば、ｐ５３、Ｔａｔ、Ｆｏｓ、Ｍｙｃ、Ｊｕｎ、Ｍｙｂ、Ｒｅｌ及び、エストロゲン、プロゲステロン、テストステロン、アルドステロン、ＬＤＬ受容体リガンド及びコルチコステロンに対するものなどのステロイドホルモン受容体などの発現活性化因子が含まれる。
【００９８】
ワクチンタンパク質は、以下に限定されないが、感染性真菌、例えばＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（アスペルギルス）、カンジダ種；細菌、特にＥ．コリ（病原性細菌に対するモデルである。）ならびに、スタフィロコッカス（例えばａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌））などの医学的に重要な細菌又はストレプトコッカス（例えばｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ（肺炎球菌））；胞子虫類などの原生動物（例えばプラスモジウム）、根足虫（例えばエントアメーバ）及び鞭毛虫類（トリパノソーマ、リーシュマニア、トリコモナス、ジアルジア属など）；（＋）ＲＮＡウイルス（例としては、ポックスウイルス（例えばワクシニア）；ピコナウイルス、例えばポリオウイルス；トガウイルス、例えば風疹ウイルス；フラビウイルス、例えばＨＣＶウイルス；及びコロナウイルスが挙げられる。）、（−）ＲＮＡウイルス（例えば、ラブドウイルス、例えばＶＳＶ；パラミクソウイルス、例えばＲＳＶ；オルトミクソウイルス、例えばインフルエンザウイルス；ブンヤウイルス；及びアレナウイルス）、ｄｓＤＮＡウイルス（例えばレオウイルス）、ＲＮＡからＤＮＡへのウイルス（即ちレトロウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＴＬＶ）ならびにある種のＤＮＡからＲＮＡへのウイルス（Ｂ型肝炎ウイルスなど）などのウイルス、からのタンパク質を含む、抗原又は結合パートナーであり得る。
【００９９】
抗原又は結合パートナーは、以下に限定されないが、アミダーゼ、アミノ酸ラセマーゼ、アシラーゼ、デハロゲナーゼ、ジオキシゲナーゼ、ジアリールプロパンペルオキシダーゼ、エピメラーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、グルコースイソメラーゼ、グリコシダーゼ、グリコシルトランスフェラーゼ、ハロペルオキシダーゼ、モノオキシゲナーゼ（例えばｐ４５０ｓ）、リパーゼ、リグニンペルオキシダーゼ、ニトリルヒドラターゼ、ニトリラーゼ、プロテアーゼ、ホスファターゼ、サブチリシン、トランスアミナーゼ及びヌクレアーゼを含む酵素であり得る。
【０１００】
昆虫耐性タンパク質（例えば、Ｃｒｙタンパク質）、デンプン及び脂質産生酵素、植物及び昆虫毒素、毒素耐性タンパク質、マイコトキシン解毒タンパク質、植物生長酵素（例えば、リブロース１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼ／オキシゲナーゼ、「ＲＵＢＩＳＣＯ」）、リポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）及びホスフェノピルベート（ＰＥＰ）カルボキシラーゼなどの農業関係のタンパク質もまた抗原又は結合パートナーであり得る。
【０１０１】
例えば、抗原又は結合パートナーは、Ｂ細胞イディオタイプ、悪性Ｂ細胞上のＣＤ２０、白血病性芽球上のＣＤ３３、乳癌でのＨＥＲ２／ｎｅｕなどの腫瘍表面抗原といった疾患関連分子であり得る。あるいは、抗原又は結合パートナーは、増殖因子受容体であり得る。増殖因子の例には、以下に限定されないが、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、トランスフェリン、インスリン様増殖因子、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）、インターロイキン−１及びインターロイキン−２が含まれる。例えば、多岐にわたるヒト上皮原発腫瘍において、ＥＧＦ受容体の高発現が観察されている。癌細胞において、ＴＧＦ−αが自己分泌刺激経路を媒介することが分かっている。ある種のマウスモノクローナル抗体は、ＥＧＦ受容体に結合し、ＥＧＦ受容体へのリガンドの結合を阻止し、培養及び異種移植モデルにおいて様々なヒト癌細胞株の増殖を阻害できることが明らかとなっている。Ｍｅｎｄｅｌｓｏｈｎ及びＢａｓｅｌｇａ（１９９５）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，Ｂｉｏｌｏｇｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，第２版、ＪＢ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ｐｐ６０７−６２３。したがって、様々な癌を治療するために本発明のＡＢＰを使用し得る。
【０１０２】
抗原又は結合パートナーはまた、細胞表面タンパク質又は血小板糖タンパク質Ｉｉｂ／ＩＩＩａ受容体などの冠動脈疾患に関連する受容体、ＣＤ４、ＣＡＭＰＡＴＨ−１及びグラム陰性細菌リポ多糖類のリピッドＡ領域などの自己免疫疾患関連の受容体であり得る。菌状息肉腫、汎発性膿疱性乾癬、重症乾癬及び関節リウマチの患者の治療において、ＣＤ４に対するヒト化抗体が臨床試験で試験された。敗血症性ショックの治療において、グラム陰性細菌リポ多糖類のリピッドＡ領域に対する抗体の臨床試験が行われた。ＣＡＭＰＡＴＨ−１に対する抗体もまた、難治性関節リウマチの治療において臨床試験が行われた。したがって、様々な自己免疫疾患を治療するために、本発明のＡＢＰを使用し得る。Ｖａｓｗａｎｉら（１９９８）「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｄｒｕｇｓ」Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ，Ａｓｔｈｍａ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８１：１０５−１１５。
【０１０３】
抗原又は結合パートナーはまた、炎症性メディエータータンパク質、例えばインターロイキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ロイコトリエン受容体及び５−リポキシゲナーゼ、ならびに、Ｖ−ＣＡＭ／ＶＬＡ−４などの接着分子といったヒトアレルギー疾患に関連する、タンパク質又はペプチドでもあり得る。さらに、ＩｇＥが喘息などのＩ型即時型過敏アレルギー反応において中心的役割を果たしているので、ＩｇＧもまた抗原又は結合パートナーとして機能し得る。研究により、総血清ＩｇＥレベルが疾患、特に喘息の重症度と相関する傾向があることが示されている。Ｂｕｒｒｏｗｓら（１９８９）「Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｓｔｈｍａ  ｗｉｔｈ  ｓｅｒｕｍ  ＩｇＥ  ｌｅｖｅｌｓ  ａｎｄ  ｓｋｉｎ−ｔｅｓｔ  ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ  ｔｏ  ａｌｌｅｒｇｅｎｓ」Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ．Ｌ．Ｍｅｄ．３２０：２７１−２７７。したがって、ＩｇＥに対して選択されたＡＢＰを使用して、正常免疫機能に重大な影響を与えることなく、アレルギー疾患の治療において、ＩｇＥレベルを低下させるか、又はマスト細胞及び好塩基球へのＩｇＥの結合を阻止し得る。
【０１０４】
抗原又は結合パートナーはまた、宿主の免疫応答を誘発する抗原として機能し得る、ウイルス表面又はコアタンパク質でもあり得る。これらのウイルス性タンパク質の例には、以下に限定されないが、糖タンパク質（又は表面抗原、例えばＧＰ１２０及びＧＰ４１）及びキャプシドタンパク質（又は構造タンパク質、例えばＰ２４タンパク質）；Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ又はＥ型肝炎ウイルスの、Ｂ型肝炎ウイルスの表面抗原又はコアタンパク質（例えば、小型Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原（ＳＨＢｓＡｇ）及びＣ型肝炎ウイルスのコアタンパク質、ＮＳ３、ＮＳ４及びＮＳ５抗原）；呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の、糖タンパク質（Ｇ−タンパク質）又は融合タンパク質（Ｆ−タンパク質）；及び単純ヘルペスウイルス、ＨＳＶ−１及びＨＳＶ−２の、表面及びコアタンパク質（例えば、ＨＳＶ−２由来の糖タンパク質Ｄ）が含まれる。
【０１０５】
抗原又は結合パートナーはまた、腫瘍抑制機能を失っており、癌に対する細胞の感受性を高め得る、突然変異のある腫瘍抑制遺伝子産物であり得る。腫瘍抑制遺伝子は、細胞増殖及び分裂周期を阻害するよう機能する遺伝子であり、したがって、新生組織形成の進展を妨げる。腫瘍抑制遺伝子における突然変異により、細胞が阻害シグナルのネットワークの一つ以上の成分を無視するようになり、細胞周期チェックポイントを乗り越え、その結果、制御された細胞増殖の速度が速まる（即ち癌）。腫瘍抑制遺伝子の例には、以下に限定されないが、ＤＰＣ−４、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＲＢ、ｐ５３、ＷＴ１、ＢＲＣＡ１及びＢＲＣＡ２が含まれる。
【０１０６】
ＤＰＣ−４は、膵臓癌に関連し、細胞分裂を阻害する細胞質経路に関与する。ＮＦ−１は、Ｒａｓを阻害するタンパク質、細胞質阻害タンパク質をコードする。ＮＦ−１は、神経系の神経線維腫症及び褐色細胞腫、ならびに骨髄性白血病に関与する。ＮＦ−２は、神経系の、髄膜腫、神経鞘腫及び上衣腫に関与する核タンパク質をコードする。ＲＢは、ｐＲＢタンパク質、細胞周期の主要な阻害因子である核タンパク質をコードする。ＲＢは、網膜芽細胞腫ならびに、骨の癌、膀胱癌、小細胞肺癌及び乳癌に関与する。ｐ５３は、細胞分裂を制御し、アポトーシスを誘導するｐ５３タンパク質をコードする。多岐にわたる癌において、ｐ５３の突然変異及び／又は不活性が見られる。ＷＴ１は、腎臓のウィルムス腫瘍に関与する。ＢＲＣＡ１は、乳癌及び卵巣がんに関与し、ＢＲＣＡ２は、乳癌に関与する。したがって、腫瘍開始及び成長の経路における遺伝子産物と他のタンパク質又は生物化学物質との相互作用を阻止するために、ＡＢＰを使用し得る。
【０１０７】
抗原又は結合パートナーは、以下に限定されないが、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄ、ＣＤ２、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ６、ＣＤ７、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＣＤ９、ＣＤ１０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤｗ１２、ＣＤ１３、ＣＤ１４、ＣＤ１５、ＣＤ１５ｓ、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２６、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２９、ＣＤ３０、ＣＤ３１、ＣＤ３２、ＣＤ３３、ＣＤ３４、ＣＤ３５、ＣＤ３６、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ３９、ＣＤ４０、ＣＤ４１、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４２ｂ、ＣＤ４２ｃ、ＣＤ４２ｄ、ＣＤ４３、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４５Ｒ、ＣＤ４６、ＣＤ４７、ＣＤ４８、ＣＤ４９ａ、ＣＤ４９ｂ、ＣＤ４９ｃ、ＣＤ４９ｄ、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４９ｆ、ＣＤ５０、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ５４、ＣＤ５５、ＣＤ５６、ＣＤ５７、ＣＤ５８、ＣＤ５９、ＣＤｗ６０、ＣＤ６１、ＣＤ６２Ｅ、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６４、ＣＤ６５、ＣＤ６６ａ、ＣＤ６６ｂ、ＣＤ６６ｃ、ＣＤ６６ｄ、ＣＤ６６ｅ、ＣＤ６６ｆ、ＣＤ６７、ＣＤ６８、ＣＤ６９、ＣＤｗ７０、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤ７９α、ＣＤ７９β、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＣＤ８７、ＣＤ８８、ＣＤ８９、ＣＤ９０、ＣＤ９１、ＣＤｗ９２、ＣＤ９３、ＣＤ９４、ＣＤ９５、ＣＤ９６、ＣＤ９７、ＣＤ９８、ＣＤ９９、ＣＤ１００、ＣＤ１０１、ＣＤ１０２、ＣＤ１０３、ＣＤ１０４、ＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ１０７ａ、ＣＤ１０７ｂ、ＣＤｗ１０８、ＣＤｗ１０９、ＣＤ１１０−１１３、ＣＤ１１４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１６、ＣＤ１１７、ＣＤ１１８、ＣＤ１１９、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ１２１ａ、ＣＤ１２１ｂ、ＣＤ１２２、ＣＤ１２３、ＣＤｗ１２４、ＣＤ１２５、ＣＤ１２６、ＣＤｗ１２７、ＣＤｗ１２８ａ、ＣＤｗ１２８ｂ、ＣＤ１２９、ＣＤｗ１３０、ＣＤ１３１、ＣＤ１３２、ＣＤ１３３、ＣＤ１３４、ＣＤ１３５、ＣＤ１３６、ＣＤｗ１３７、ＣＤ１３８、ＣＤ１３９、ＣＤ１４０ａ、ＣＤ１４０ｂ、ＣＤ１４１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４３、ＣＤ１４４、ＣＤｗ１４５、ＣＤ１４６、ＣＤ１４７、ＣＤ１４８、ＣＤｗ１４９、ＣＤ１５０、ＣＤ１５１、ＣＤ１５２、ＣＤ１５３、ＣＤ１５４、ＣＤ１５５、ＣＤ１５６、ＣＤ１５７、ＣＤ１５８ａ、ＣＤ１５８ｂ、ＣＤ１６１、ＣＤ１６２、ＣＤ１６３、ＣＤ１６４、ＣＤ１６５、ＣＤ１６６及びＴＣＲζを含むＣＤ分子であり得る。抗原又は結合パートナーは、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２、ＴＮＦα、ＴＮＦＲＩ受容体、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ、ＩＬ−２Ｒα鎖、ＩＬ−２Ｒβ鎖、ＲＳＶ  Ｆタンパク質、α４インテグリン、ＩｇＥ、ＩｇＥ受容体、ジゴキシン、カーペットバイパー毒素、補体Ｃ５、ＯＰＧＬ、ＣＡ−１２５腫瘍抗原、ブドウ球菌タンパク質、表皮ブドウ球菌タンパク質、黄色ブドウ球菌タンパク質、ブドウ球菌感染に関与するタンパク質（以下に限定されないが、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（黄色ブドウ球菌）及び��ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ（表皮ブドウ球菌）を含む。）、ＩＬ−６受容体、ＣＴＬＡ−４、ＲＳＶ、ＩＬ−２受容体のＴａｃサブユニット、ＩＬ−５及びＥｐＣａｍであり得る。抗原又は結合パートナーは、分子の断片であり得る。
【０１０８】
二重特異性ＡＢＰの例には、以下に限定されないが、腫瘍細胞抗原に対して向けられるＡＢＰ及び細胞毒性誘発分子に向けられるその他のＡＢＰ、例えば、抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞（１Ｄ１０）、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎細胞癌、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ−３、抗ＣＤ３／Ｌ−Ｄ１（抗結腸癌）、抗ＣＤ３／抗メラノサイト刺激ホルモン類似体、抗ＥＧＦ受容体／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、抗神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）／抗ＣＤ３、抗葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）／抗ＣＤ３、抗汎癌関連抗原（ＡＭＯＣ−３１）／抗ＣＤ３；腫瘍抗原に特異的に結合するＡＢＰ及び毒素に結合する別のＡＢＰを伴う二重特異性ＡＢＰ、例えば、抗サポリン／抗Ｉｄ−１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイドなど；変換酵素活性化プロドラッグを変換するための二重特異性ＡＢＰ、例えば、抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ（リン酸マイトマイシンプロドラッグのマイトマイシンアルコールへの変換を触媒する。）；繊維素溶解剤として使用することができる二重特異性ＡＢＰ、例えば、抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子（ｔＰＡ）、抗フィブリン／抗ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）など；細胞表面受容体への免疫複合体のターゲティングのための二重特異性ＡＢＰ、例えば、抗低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）／抗Ｆｃ受容体（例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ又はＦｃγＲＩＩＩ）；感染性疾患の治療での使用のための二重特異性ＡＢＰ、例えば、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、抗Ｔ細胞受容体；ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨｒＶ；インビトロ又はインビボでの腫瘍検出のための二重特異性ＡＢＰ、例えば、抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン；ワクチンアジュバントとしての二重特異性ＡＢＰ（Ｆａｎｇｅｒ，ＭＷら、Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９２；１２（３−４）：１０１−２４（本明細書中に参照により組み込む。）を参照。）；及び診断ツールとしての二重特異性、例えば抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗サブスタンスＰ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β−ガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ，Ｏ及びＲ．Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９０年８月１日；１０４０（１）：１−１１（本明細書中に参照により組み込む。））が含まれる。三重特異性ＡＢＰの例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。
【０１０９】
様々な文献において、ポリマー共役又はグリコシル化によるポリペプチドの修飾が開示されている。「ＡＢＰ」又は「抗原結合ポリペプチド」という用語には、以下に限定されないが、ＰＥＧなどのポリマーに共役しているポリペプチドが含まれ、システイン、リジン、ＮもしくはＣ末端アミノ酸又はその他の残基の、一つ以上のさらなる誘導体化が含まれ得る。さらに、ＡＢＰは、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有し得、リンカー、ポリマー又は生物活性分子が共役しているアミノ酸は、本発明による非天然アミノ酸であり得るか、又は、リジンもしくはシステインへのカップリングなどの当技術分野で公知の技術を利用して、天然のコードアミノ酸に共役させ得る。米国特許第４，９０４，５８４号は、ＰＥＧ化リジン枯渇ポリペプチドを開示しており、ここでは、少なくとも１個のリジン残基が欠失しているか、又は何らかの他のアミノ酸残基で置換されている。ＷＯ９９／６７２９１は、タンパク質をＰＥＧと共役させるためのプロセスを開示しており、ここでは、タンパク質の少なくとも１個のアミノ酸残基を欠失させ、タンパク質への共役が十分に達成される条件下でタンパク質をＰＥＧと接触させる。ＷＯ９９／０３８８７は、成長ホルモンスーパーファミリーに属するポリペプチドのＰＥＧ化変異型を開示しており、ここでは、ポリペプチドの特定領域に位置する非必須アミノ酸残基でシステイン残基が置換されている。ＷＯ００／２６３５４は、アレルゲン性が低下したグリコシル化ポリペプチド変異型を作製する方法を開示しており、この変異型は、対応する親ポリペプチドと比較して、少なくとも１個のさらなるグリコシル化部位を含有する。
【０１１０】
「抗原結合ポリペプチド」という用語はまた、以下に限定されないが、何れかのアミノ酸位置でグリコシル化されたポリペプチド、ポリペプチドのＮ−結合もしくはＯ−結合グリコシル化型などのグリコシル化ＡＢＰを含む。１個のヌクレオチド変化を含有する変異型はまた、ＡＢＰの生物活性変異型とみなされる。さらに、スプライシング変異型もまた含まれる。「抗原結合ポリペプチド」という用語はまた、化学的方法により連結されている、又は融合タンパク質ならびに、例えば特定の欠失もしくはその他の修飾を含有するポリペプチド類似体として発現され、さらに生物活性を維持している、何れかの一つ以上のＡＢＰ又はその他のポリペプチド、タンパク質、炭水化物、ポリマー、小分子、リンカー、リガンド又は何らかのタイプのその他の生物活性の、ＡＢＰヘテロ二量体、ホモ二量体、ヘテロ多量体又はホモ多量体も含む。
【０１１１】
ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドはさらに、ＡＢＰの生物活性を調節する、付加、置換又は欠失を含む。例えば、付加、置換又は欠失は、以下に限定されないが、抗原に対する親和性の調節、抗原立体配座又はその他の二次、三次もしくは四次構造変化の調節（以下に限定されないが、増減を含む。）、抗原立体配座又はその他の二次、三次もしくは四次構造変化の安定化、抗原立体配座又は又はその他の二次、三次もしくは四次構造変化の誘導もしくは生成、循環半減期の調節、治療半減期の調節、ポリペプチド安定性の調節、量の調節、放出もしくはバイオアベイラビリティの調節、精製の促進又は投与の特定経路の改善もしくは変更を含む、ＡＢＰの一つ以上の特性もしくは活性を調節し得る。同様に、抗原結合ポリペプチドは、検出（以下に限定されないが、ＧＦＰを含む。）、精製又はポリペプチドのその他の特性を改善する、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ又はポリＨｉｓを含む。）又はその他の親和性ベース配列（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなどを含む。）又は連結された分子（以下に限定されないが、ビオチンを含む。）を含有し得る。
【０１１２】
「抗原結合ポリペプチド」という用語はまた、融合物として非天然コードアミノ酸側鎖を介して、同じ又は異なる非天然コードアミノ酸側鎖、天然コードアミノ酸側鎖の何れかに直接連結されるもの、又はリンカーを介して間接的に連結されるものを含む、連結された、ＡＢＰホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体及びヘテロ多量体も包含する。例となるリンカーには、以下に限定されないが、小さな有機化合物、様々な長さの水溶性ポリマー、例えばポリ（エチレングリコール）もしくはポリデキストランなど、又は様々な長さのポリペプチドが含まれる。
【０１１３】
当業者にとって当然のことながら、特定の抗原結合ポリペプチド配列における位置に対応するアミノ酸の位置を、抗原結合ポリペプチド又は関連抗原結合ポリペプチドなどの断片において容易に同定することができ、例えば、ＢＬＡＳＴなどの配列アライメントプログラムを使用して、関連配列での位置に対応するタンパク質での特定位置をアラインして同定することができる。
【０１１４】
「抗原結合ポリペプチド」という用語は、一つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含む抗原結合ポリペプチドを包含する。本発明の抗原結合ポリペプチドは、一つ以上の非天然アミノ酸修飾と組み合わせた、一つ以上の天然アミノ酸による修飾を含み得る。天然ＡＢＰポリペプチドの多岐にわたるアミノ酸位置での置換の例には、以下に限定されないが、例えば、以下に限定されないがアゴニスト活性を向上させる、ポリペプチド溶解性を向上させる、ポリペプチドをアンタゴニストに変換するなど、抗原結合ポリペプチドの生物活性の一つ以上を調節する置換が含まれ、これらは、「ＡＢＰ」という用語に包含される。
【０１１５】
「非天然コードアミノ酸」は、２０種類の一般的アミノ酸の１つもしくはピロリシンもしくはセレノシステインではないアミノ酸を指す。「非天然コードアミノ酸」と同義語として用い得るその他の用語は、「非天然のアミノ酸」、「天然ではないアミノ酸」、「天然に生じないアミノ酸」及びそれらの様々なハイフンで結んだ、及びハイフンで結ばないものである。「非天然コードアミノ酸」という用語はまた、以下に限定されないが、天然コードアミノ酸の修飾（例えば、翻訳後修飾）により生じるが、翻訳複合体により成長するポリペプチド鎖に天然にそれ自身取り込まれない、アミノ酸（以下に限定されないが、２０種類の一般的アミノ酸又はピロリシン及びセレノシステインを含む。）を含む。このような非天然アミノ酸の例には、以下に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチルグルコサミニル−Ｌ−スレオニン及びＯ−ホスホチロシンが含まれる。
【０１１６】
「アミノ末端修飾基」は、ポリペプチドのアミノ末端に結合させることができる何らかの分子を指す。同様に、「カルボキシ末端修飾基」は、ポリペプチドのカルボキシ末端に結合させることができる何らかの分子を指す。末端修飾基には、以下に限定されないが、様々な水溶性ポリマー、血清アルブミンなどの、ペプチドもしくはタンパク質又はペプチドの血清半減期を延長させるその他の部分が含まれる。
【０１１７】
「官能基」、「活性部分」、「活性化基」、「脱離基」、「反応部位」、「化学的反応基」及び「化学的反応部分」という用語は、当技術分野及び本明細書中で使用される場合、明確な、限定的部分又は分子のユニットを指す。この用語は、化学技術分野におけるものとある程度同義であり、ある機能もしくは活性を示し、他の分子と反応性のある分子の部分を示すために本明細書中で使用される。
【０１１８】
「連結」又は「リンカー」という用語は、本明細書中で使用する場合、化学反応の結果として通常形成され、通常共有結合である、基又は結合を指す。加水分解安定な結合とは、結合が、以下に限定されないが長時間にわたる（無期限でも）生理的状態下など、水中で十分に安定であり、有用なｐＨ値で水と反応しないことを意味する。加水分解に不安定である、又は分解性である結合とは、結合が水中、又は例えば血液などの水溶液中で、分解性であることを意味する。酵素に不安定である、又は分解性である結合とは、結合が、一つ以上の酵素により分解され得ることを意味する。当技術分野で理解されるように、ＰＥＧ及び関連ポリマーは、そのポリマー骨格又は、ポリマー骨格と、ポリマー分子の一つ以上の末端官能基との間のリンカー基において分解性結合を含み得る。例えば、生物活性物質においてＰＥＧカルボン酸又は活性化ＰＥＧカルボン酸とアルコール基との反応により形成されるエステル結合は、通常、生理的条件下で加水分解され、物質を放出する。その他の加水分解により分解する結合には、以下に限定されないが、カーボネート結合；アミンとアルデヒドとの反応から生じるイミン結合；アルコールをリン酸基と反応させることにより形成されるリン酸エステル結合；ヒドラジドとアルデヒドとの反応産物であるヒドラゾン結合；アルデヒドとアルコールとの反応産物であるアセタール結合；ギ酸とアルコールとの反応産物であるオルトエステル結合；以下に限定されないがＥＰＧなどのポリマーの末端及びペプチドのカルボキシル基において、など、アミン基により形成されるペプチド結合；及び、以下に限定されないがポリマーの末端及びオリゴヌクレオチドの５’ヒドロキシル基において、など、ホスホールアミダイトにより形成されるオリゴヌクレオチド結合が含まれる。本発明の抗原結合ポリペプチドにおいて、分枝リンカーを使用し得る。
【０１１９】
「生物活性分子」、「生物活性部分」又は「生物活性物質」という用語は、本明細書中で使用する場合、以下に限定されないが、ウイルス、細菌、バクテリオファージ、トランスポゾン、プリオン、昆虫、真菌、植物及びヒトを含む、生物系、生物に関連する、経路、分子もしくは相互作用の何らかの生理的又は生化学的特性に影響を与え得るあらゆる物質を意味する。特に、本明細書中で使用する場合、生物活性分子には、以下に限定されないが、ヒトもしくはその他の動物における疾患の、診断、治療、緩和、処置もしくは予防のための、又は、ヒトもしくはその他の動物において生理的もしくは精神的健康を促進するためのあらゆる物質が含まれる。生物活性分子の例には、以下に限定されないが、ペプチド、タンパク質、酵素、小分子薬物、ハードドラッグ、ソフトドラッグ、顔料、脂質、ヌクレオシド、オリゴヌクレオチド、毒素、細胞、ウイルス、リポソーム、微小粒子及びミセルが含まれる。本発明との使用に適切な生物活性物質のクラスには、以下に限定されないが、薬物、プロドラッグ、放射性核種、造影剤、ポリマー、抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤、抗炎症剤、抗腫瘍剤、心血管作動薬、抗不安薬、ホルモン、増殖因子、ステロイド剤、微生物由来毒素などが含まれる。
【０１２０】
ある実施形態において、本発明のＡＢＰ分子を使用して、生物活性分子又は検出可能標識の標的を腫瘍部位に向けることができる。これにより、腫瘍の殺滅、検出及び／又は局在又はその他の効果を促進することができる。診断プローブ又は造影プローブもまた、本発明のＡＢＰ分子に連結し得る。ある特に好ましい実施形態において、ＡＢＰの生物活性分子成分は、「放射線不透化性」標識、例えば、Ｘ線を用いて容易に視覚化できる標識である。放射線不透化性物質は、当業者にとって周知である。最も一般的な放射線不透化性物質としては、ヨウ化物、臭化物又はバリウム塩が挙げられる。その他の放射線不透化性物質もまた公知であり、これには、以下に限定されないが、有機ビスマス誘導体（例えば、米国特許第５，９３９，０４５号を参照）、放射線不透化性マルチウレタン（例えば、米国特許第５，３４６，９８１号を参照）、有機ビスマス組成物（例えば、米国特許第５，２５６，３３４号を参照）、放射線不透化性バリウム多量体複合体（例えば、米国特許第４，８６６，１３２号を参照）などが含まれる。
【０１２１】
本発明のＡＢＰ’ｓを放射線不透化性部分に直接カップリングさせるか、又は放射線不透化性物質を担うかもしくは含有する「パッケージ」（例えば、キレート、リポソーム、多量体マイクロビーズなど）に結合させることができる。
【０１２２】
放射線不透化性標識に加え、本発明での使用に対してその他の標識も適切である。本発明のＡＢＰ’ｓの生物活性分子成分としての使用に適切な検出可能標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的又は化学的手段により検出可能なあらゆる成分が挙げられる。本発明において有用な標識には、磁気ビーズ（例えばＤｙｎａｂｅａｄｓＴＭ）、蛍光色素（例えば、蛍光イソチアネート、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、又は３２Ｐ）、酵素（例えば、セイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ及びＥＬＩＳＡで一般に使用されるその他の酵素）及び、金コロイドなどの比色標識又は色ガラスもしくはプラスチック（例えば、マルチスチレン、マルチプロピレン、ラテックスなど）ビーズが含まれる。
【０１２３】
様々な好ましい放射性標識としては、以下に限定されないが、９９Ｔｃ、２０３Ｐｂ、６７Ｇａ、６８Ｇａ、７２Ａｓ、１１１Ｉｎ、１１３ｍＩｎ、９７Ｒｕ、６２Ｃｕ、６４ＩＣｕ、５２Ｆｅ、５２ｍＭｎ、５１Ｃｒ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、７７Ａｓ、９０Ｙ、６７Ｃｕ、１６９Ｅｒ、１２１Ｓｎ、１２７Ｔｅ、１４２Ｐｒ、１４３Ｐｒ、１９８Ａｕ、１９９Ａｕ、１６１Ｔｂ、１０９Ｐｄ、１６５Ｄｙ、１４９Ｐｍ、１５１Ｐｍ、１５３Ｓｍ、１５７Ｇｄ、１５９Ｇｄ、１６６Ｈｏ、１７２Ｔｍ、１６９Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７５Ｙｂ、１７７Ｌｕ、１０５Ｒｈ及び１１１Ａｇが挙げられる。
【０１２４】
このような標識を検出する手段は、当業者にとって周知である。したがって、例えば、写真用フィルム、シンチレーション検出器などを用いて放射性標識を検出し得る。放出された光を検出するために光検出器を用いて蛍光マーカーを検出し得る。酵素標識は一般に、基質とともに酵素を与え、基質における酵素の作用により生じる反応産物を検出することにより検出し、比色標識は、有色の標識を単純に視覚化することにより検出する。
【０１２５】
ある特定の実施形態において、本発明は、腫瘍及び／又はその他の癌細胞を検出するための、免疫抱合体（キメラ部分）の使用をもくろむ。したがって、例えば、本発明の二重特異性抗体を、ガンマカメラでの検出のためにγ放射の放射性同位体（例えば、Ｎａ−２２、Ｃｒ−５１、Ｃｏ−６０、Ｔｃ−９９、Ｉ−１２５、Ｉ−１３１、Ｃｓ−１３７、Ｇａ−６７、Ｍｏ−９９）と、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）機器での検出のために陽電子放出同位体（例えば、Ｃ−１１、Ｎ−１３、Ｏ−１５、Ｆ−１８など）と、及び、核磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）のために金属造影剤（例えば、Ｇｄ含有試薬、Ｇｕ含有試薬など）と、共役させることができる。さらに、従来の免疫組織化学（例えば、蛍光標識、ナノクリスタルビーズ、酵素的及び比色的標識など。）において、本発明の二重特異性抗体を使用することができる。
【０１２６】
別の実施形態において、生物活性分子は、細胞において電離放射線の細胞毒性効果（例えば、６０Ｃｏ又はＸ線源などにより生じ得る。）を促進する放射性増感剤であり得る。多くの放射性増感剤が公知であり、これには、以下に限定されないが、ベンゾポルフィリン誘導体化合物（例えば、米国特許第５，９４５，４３９号を参照。）、１，２，４−ベンゾトリアジンオキシド（例えば、米国特許第５，８４９，７３８号を参照。）、ある種のジアミンを含有する化合物（例えば、米国特許第５，７００，８２５号を参照。）、ＢＣＮＴ（例えば、米国特許第５，８７２，１０７号を参照。）、放射性増感ニトロ安息香酸アミド誘導体（例えば、米国特許第４，４７４，８１４号を参照。）、様々な複素環誘導体（例えば、米国特許第５，０６４，８４９号を参照。）、プラチナ錯体（例えば、米国特許第４，９２１，９６３号を参照。）などが含まれる。
【０１２７】
生物活性分子はまた、リガンド、エピトープタグ、ペプチド、タンパク質又は別のＡＢＰでもあり得る。リガンド及び抗体は、免疫細胞において表面マーカーに結合するものであり得る。このような抗体を生物活性分子として利用するキメラ分子は、リガンド又はＡＢＰに対する結合パートナーを担う免疫細胞とＥＧＦＲファミリーメンバーを発現する腫瘍細胞との間の会合を成立させる二官能性リンカーとして機能する。
【０１２８】
特にプレターゲティングのストラテジーを利用する場合、本明細書中に記載の、医薬品及び／又は放射性標識の多くをキレート剤として提供することができる。キレート分子は、通常、二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰと連結するエピトープタグを特異的に結合する分子（例えば、ビオチン、アビジン、ストレプトアビジンなど）にカップリングさせる。
【０１２９】
キレート基は当業者にとって周知である。ある一定の実施形態において、キレート基は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）、シクロヘキシル１，２−ジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（−２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、Ｎ，Ｎ−ビス（ヒドロキシベンジル）−エチレンジアミン−Ｎ，Ｎ’−二酢酸（ＨＢＥＤ）、トリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）、ヒドロキシエチルジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）、１，４，８，１１−テトラ−アザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＴＥＴＡ）、置換ＤＴＰＡ、置換ＥＤＴＡなど由来である。
【０１３０】
ある好ましいキレート剤の例としては、非置換又は置換２−イミノチオラン及び２−イミノチアシクロヘキサン、特に２−イミノ−４−メルカプトメチルチオラン及びＳＡＰＳ（Ｎ−（４−［２１１Ａｔ］アスタトフェネチル）スクシナート）が挙げられる。
【０１３１】
あるキレート剤、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ’’，Ｎ’’’−四酢酸（ＤＯＴＡ）は、放射性核種及び放射性標識など、診断及び治療において重要な金属の多くをキレートする能力があるため、特に興味深いものである。
【０１３２】
ＤＯＴＡと抗体などのタンパク質との共役が記載されている。例えば、米国特許第５，４２８，１５６号は、抗体及びＡＢＰ断片にＤＯＴＡを共役させる方法を教示する。これらの共役物を作製するために、ＤＯＴＡの１個のカルボン酸基を、ＡＢＰ又はＡＢＰ断片におけるアミン又はスルフヒドリル基と反応することができる活性エステルに変換する。Ｌｅｗｉｓら（１９９４）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．５：５６５−５７６は、ＤＯＴＡの１個のカルボキシル基を活性エステルに変換し、活性化されたＤＯＴＡをＡＢＰと混合し、ＡＢＰのリジン残基のε−アミノ基を介して、ＡＢＰをＤＯＴＡに連結し、それによりＤＯＴＡの１個のカルボキシル基をアミド部分に変換するという、同様の方法を記載している。
【０１３３】
あるいは、直接、又はリンカーを介して、エピトープタグ又は、エピトープタグを結合する部分にキレート剤をカップリングさせることができる。ＤＯＴＡとビオチンとの共役が記載されており（例えば、Ｓｕ（１９９５）Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，３６（５  Ｓｕｐｐｌ）：１５４Ｐ、この論文は、ＤＯＴＡ−ＬＣ−ビオチン又はＤＯＴＡ−ベンジル−４−（６−アミノ−カプロアミド）−ビオチン）など、利用可能なアミノ側鎖ビオチン誘導体を介したＤＯＴＡのビオチンへの連結を開示している。Ｙａｕら、ＷＯ９５／１５３３５は、ビオチンに共役させることができるニトロ−ベンジル−ＤＯＴＡ化合物を作製する方法を開示している。この方法は、ヒドロキシ基の一時的なプロジェクション（ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ）；アミンのトシル化；一時的に保護したヒドロキシ基の脱保護；脱保護したヒドロキシ基のトシル化；及び分子内トシレート環化を介した環化反応を含む。Ｗｕら（１９９２）Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ，１９（２）：２３９−２４４は、１１１ＩＮ及び９０Ｙによる放射性標識タンパク質のための、大環状キレート剤の合成を開示している。Ｗｕらは、アビジン、研究のためのモデルタンパク質との共役物の安定性及び生体内分布を調べるために、標識ＤＯＴＡ−ビオチン共役物を作製している。この共役物は、インシトゥで生じた活性化ＤＯＴＡ誘導体と反応するために、遊離アミノ基を含有するビオチンヒドラジドを用いて作製された。
【０１３４】
本発明のＡＢＰ’ｓを、以下に限定されないが、細胞毒性薬、毒素、ペプチド、タンパク質、酵素及びウイルスを含む、他の生物活性分子と融合させ得る（Ｃｈｅｓｔｅｒ、（２０００）Ｄｉｓ．Ｍａｒｋｅｒｓ  １６：５３−６２；Ｒｉｐｐｍａｎｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３４９（Ｐｔ．３）：８０５−８１２、Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：３１３−３２５；Ｒｙｂａｋ，Ｓ．Ｍ．（２００１）Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｌ．Ｔｈｅｒ．１：９９５−１００３；ｖａｎ  Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ，Ｖ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｖｉｏｌ．（２００２）７６：２７５３−２７６２）。
【０１３５】
標的細胞において主に見出される抗原を標的とし結合するＡＢＰ’ｓと、強力な細胞毒性薬又はペイロードとを結合させ得る（以下に限定されないが、癌細胞を含む。）。血流中で安定である、又は例えば腫瘍部位に存在する条件下で切断を受けやすい可能性があるリンクを介して、ペイロード剤をＡＢＰに連結させる。標的細胞に毒素などのペイロード剤を送達し、このように毒素に依存した機構を介して細胞殺滅を開始させることができる。
【０１３６】
このような毒素の例には、以下に限定されないが、真菌由来カリケアマイシン（Ｈｉｎｍａｎら（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３３３６−３３４２）及びマイタンシノイド（Ｌｉｕら（１９９６）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ９３：８６１８−８６２３、Ｓｍｉｔｈ，Ｓ．（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３（２）：１９８−２０３）、トリコテン及びＣＣ１０６５などの小分子又はタンパク質、例えば、リシンＡ鎖（Ｍｅｓｓｍａｎら、（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６（４）：１３０２−１３１３）、緑膿菌外毒素（Ｔｕｒら、（２００１）Ｉｎｔｌ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８（５）：５７９−５８４）、ジフテリア毒素（ＬｅＭａｉｓｔｒｅら、（１９９８）Ｂｌｏｏｄ  ９１（２）：３９９−４０５）及びリボソーム不活性化タンパク質（Ｔａｚｚａｒｉら（２００１）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６７：４２２２−４２２９）が含まれる。特定の実施形態において、一つ以上のカリケアマイシン分子を使用し得る。抗生物質のカリケアマイシンファミリーのメンバーは、ピコモル濃度以下の濃度で２本鎖ＤＮＡ切断を起こすことができる。カリケアマイシンの構造化類似体も公知である。Ｈｉｎｍａｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５３：３３３６−４２（１９９３）；Ｌｏｄｅら、（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：２９２５−２８を参照のこと。ＦＤＡ認可を得ている抗毒素の例には、Ｍｙｌｏｔａｒｇ（Ｒ）（Ｗｙｅｔｈ  Ａｙｅｒｓｔ）、急性骨髄性白血病のためのカリケアマイシン共役抗ＣＤ３３（Ｓｉｅｖｅｒｓら、（１９９９）Ｂｌｏｏｄ  ９３（１１）：３６７８−３６８４；Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ（２０００）Ｌｅｕｋｅｍｉａ  １４：４７４−４７５）がある。同様に、本発明のＡＢＰ’ｓを毒素に融合させ得る。あるいは、ボツリヌスＡ神経毒、細菌Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ（ボツリヌス菌）により産生されるタンパク質複合体と融合させるために、本発明のＡＢＰ’ｓを使用し得る。
【０１３７】
さらに別の実施形態において、本発明のＡＢＰ’ｓは、一つ以上の酵素的活性のある毒素及び／又はその断片を含有し得る。このような毒素の例には、ジフテリア毒素、ジフテリアＡ鎖、外毒素Ａ鎖（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（緑膿菌）由来）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、ジアンチンタンパク質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ（アメリカヤマゴボウ）タンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ（ニガウリ）阻害剤、クルシン、ｃｒｏｔｉｎ  ｓａｐａｎａｒｉａ（クロチン・サパナリア）、ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（オフィシナリス）阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン（ｍｉｔｏｇｅｌｌｉｎ）、レストリクトエイン（ｒｅｓｔｒｉｃｔｏｅｉｎ）、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコテシンの非結合活性断片が含まれる。例えば、ＷＯ９３／２１２３２を参照のこと。特に好ましい細胞毒素としては、緑膿菌外毒素（ＰＥ）、ジフテリア毒素、リシン及びアブリンが挙げられる。緑膿菌外毒素及びジフテリア毒素は周知である。ＰＥのように、ＡＤＰリボシル化伸長因子２（それによりタンパク質合成を阻害する。）によりジフテリア（ＤＴ）毒素は細胞を殺滅する。抗毒素に関するさらなる引用文献としては、Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ，Ｕ．（２０００）Ｉｎ  ｖｉｖｏ  １４：２１−２８、Ｎｉｖら、（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２：１９−４６、Ｒｅｉｔｅｒら、（２００１）Ａｄｖ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８１：９３−１２４、Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｒ．Ｊ．（１９９９）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１：５７０−５７８；Ｈａｌｌ（２００１）Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１６６：１３９−１５４；Ｋｒｅｉｔｍａｎ（２００１）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ２（９）：１２８２−１２９３が挙げられる。様々なリガンドに融合したＰＥ又はＤＴをコードする遺伝子をクローニングする方法は、当業者にとって周知である（例えば、Ｓｉｅｇａｌｌら、（１９８９）ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，３：２６４７−２６５２；及びＣｈａｕｄｈａｒｙら、（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４：４５３８−４５４２を参照。）。引用文献は全て、本明細書中に参照により組み込む。
【０１３８】
その他の適切な生物活性分子としては、薬理作用のある物質又は、様々な薬理作用のある物質を含有するカプセル封入系が挙げられる。したがって、腫瘍に直接送達されるべき薬物に、キメラ分子の標的分子を直接結合させ得る。このような薬物は当業者にとって周知であり、これには、以下に限定されないが、ドキシルビシン、ビンブラスチン、ゲニステイン、アンチセンス分子などが含まれる。
【０１３９】
あるいは、生物活性分子は、薬物、核酸（例えばアンチセンス核酸）などの治療成分又は循環系への直接的曝露から好ましくは保護される別の治療成分を含有する、ウイルスキャプシド、リポソーム又はミセルなどの、カプセル封入系であり得る。抗体に結合したリポソームを調製する方法は当業者にとって周知である。例えば、米国特許第４，９５７，７３５号、Ｃｏｎｎｏｒら、（１９８５）Ｐｈａｒｍ．Ｔｈｅｒ．，２８：３４１−３６５を参照のこと。それらの抗原特異性ゆえに、本発明のＡＢＰ’ｓを使用して、薬物を担うリポソームをその標的に向けることができる。Ｐａｒｋ，Ｊ．Ｗ．ら（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８、１１７２−１１８１及びＳｈｉ，Ｎ．ら（２００１）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．１８，１０９１−１０９５を参照のこと。
【０１４０】
本発明のＡＢＰ’ｓをＰＥＧなどの分子に共役させて、インビボでの送達及び薬物動態プロファイルを改善することができる。Ｌｅｏｎｇらは、非ＰＥＧ化形態よりもクリアランス速度が遅くなり、抗原結合活性喪失が殆ど又は全くない、抗ＩＬ−８抗体のＦａｂ'断片の部位特異的ＰＥＧ化について述べている（Ｌｅｏｎｇ，Ｓ．Ｒ．ら、（２００１）Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６−１０９）。
【０１４１】
本発明のＡＢＰ’ｓをプロドラッグに連結させることができる。「プロドラッグ」という用語は、本明細書中で使用する場合、薬理学的に不活性であるか、又は活性が低い、活性薬物の誘導体を意味する。物理化学的、生物薬剤学的又は薬物動態学的特性など、薬物の特性の操作により所望の作用部位に到達する、薬物又は生物活性分子の量を調節するために、プロドラッグを設計し得る。酵素的又は非酵素的反応により、体内でプロドラッグが活性薬物に変換される。プロドラッグにより、溶解性の向上など、物理化学的特性が向上し、特定の細胞、組織、器官又はリガンドを特異的に標的とすることなどの送達特性が向上し、薬物の治療的価値が向上し得る。プロドラッグ活性化のために、本発明のＡＢＰ’ｓを酵素に融合させ得る（Ｋｏｕｓｐａｒｏｕ，Ｃ．Ａ．，ら、（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９９、１３８−１４８）（２００２）。組み換え分子は、シアン化物などの細胞毒素を放出するためにプロドラッグにおいて働く、ＡＢＰ及び酵素を含有し得る。
【０１４２】
プロドラッグとして治療薬を投与し得、続いて、プロドラッグ様ペプチジル化学療法剤を活性のある抗癌剤に変換するプロドラッグ活性化酵素により活性化させる。例えば、ＷＯ８８／０７３７８；ＷＯ８１／０１１４５；米国特許第４，９７５，２７８号を参照のこと。一般に、酵素成分には、プロドラッグをそのより活性の高い細胞毒素形態に変換するような方法でプロドラッグにおいて作用可能なあらゆる酵素が含まれる。
【０１４３】
有用であり得る酵素には、以下に限定されないが、リン酸含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリホスファターゼ、硫酸含有プロドラッグの遊離薬物への変換に有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンの抗癌剤、５−フルオロウラシルへの変換に有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な、セラチアプロテアーゼなどのプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン（カテプシンＢ及びＬなど）；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの変換に有用な、Ｄ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な、β−ガラクトシダーゼ及びノイラミニダーゼなどの糖質切断酵素；β−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；及び、アミノ窒素の位置でフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基でそれぞれ誘導体化されている薬物を遊離薬物に変換するのに有用な、ペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼなどのペニシリンアミダーゼが含まれる。
【０１４４】
あるいは、当技術分野で「抗体酵素」としても知られる酵素活性のある抗体を使用して、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換し得る。例えば、Ｍａｓｓｅｙ，（１９８７）３２８：４５７−４５８を参照のこと。
【０１４５】
当業者にとって当然のことながら、本発明の、二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰ及び生物活性分子部分は、通常、あらゆる順番で連結することができる。したがって、例えば、標的分子が一本鎖タンパク質である場合、生物活性分子を標的分子のアミノ又はカルボキシ末端の何れかに連結させ得る。生物活性分子はまた、二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰの内部領域に連結させることもでき、又はその逆を行うこともできる。同様に、二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰを生物活性分子の内部の位置又は末端に連結することができる。どのような場合でも、二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰ又は生物活性分子のそれぞれの活性を妨害しない結合点を選択する。
【０１４６】
当業者にとって周知である数多くの方法の何れかにより、二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰ及び生物活性分子を連結することができる。通常は、生物活性分子を直接又はリンカー（スペーサー）を介して二重特異性ＡＢＰに共役させる。しかし、生物活性分子及び二重特異性ＡＢＰ両方がポリペプチドである場合は、１つの鎖の融合タンパク質としてキメラ分子を組み換え発現させることが望ましいであろう。
【０１４７】
ある実施形態において、二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰを生物活性分子（例えば、細胞毒素、標識、リガンド、薬物、ＡＢＰ、リポソームなど。）とキメラ的に共役させる。化学的共役分子の手段は当業者にとって周知である。
【０１４８】
ＡＢＰ又はその他のポリペプチド標的分子に薬物を連結するための手段は、その薬物の化学構造により様々である。ポリペプチドは、通常、それに生物活性分子を結合させるために、生物活性分子の適切な官能基との反応に利用可能な様々な官能基、例えばカルボン酸（ＣＯＯＨ）又は遊離アミン（−−ＮＨ２）基を含有する。
【０１４９】
あるいは、二重特異性ＡＢＰ及び／又は生物活性分子を誘導体化して、さらなる反応官能基を曝露又は連結することができる。誘導体化には、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌから入手可能なものなどの、多くのリンカー分子の何れかの連結が含まれ得る。
【０１５０】
ある状況において、キメラ部分がその標的部位に到達した際に、生物活性分子を二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰから遊離させるか、又はプロドラッグを活性化することが望ましいであろう。したがって、生物活性分子を標的部位で放出させるべき場合、標的部位の付近において切断可能である結合を含むキメラ共役物を使用することができる。ＡＢＰから薬物を放出させるための結合切断は、酵素活性又は、標的細胞内部もしくは標的部位付近の何れかで免疫抱合体が供される条件により促進し得る。標的部位が腫瘍である場合、腫瘍部位で見られる条件下（例えば、腫瘍関連酵素又は酸性ｐＨに曝露される場合）で切断可能なリンカーを使用し得る。
【０１５１】
多くの様々な切断可能リンカーが当業者にとって公知である。米国特許第４，６１８，４９２号；同第４，５４２，２２５号及び同第４，６２５，０１４号を参照のこと。これらのリンカー基からの薬物放出の機構には、例えば、光解離性結合の照射及び酸で触媒される加水分解が含まれる。米国特許第４，６７１，９５８号には、例えば、患者の補体系のタンパク質分解酵素により標的部位でインビボで切断されるリンカーを含む免疫抱合体の記載が含まれる。リンカーの長さを予め決定するか、又はＡＢＰとこれに連結する分子との間の所望の空間的関係により選択し得る。様々な放射性診断化合物、放射性治療化合物、薬物、毒素及びその他の物質を抗体に連結させるための方法が多数報告されてきたことを考慮し、当業者は、ある物質をＡＢＰ又はその他のポリペプチドに連結するための適切な方法を決定することができる。
【０１５２】
ある一定の実施形態において、生物活性分子は、ＡＢＰ又はエピトープタグに連結したキレート剤を含む。二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰは、二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰをキレート剤に単純に接触させた結果、ＡＢＰが生物活性分子に連結するように、対応するエピトープタグ又はＡＢＰを担う。その部分を使用した後に組合せ段階を行うか（プレターゲティングストラテジー）、又はキレート剤を送達させる前に標的組織を二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰに結合させることができる。様々な標的部分にカップリングさせるのに適切なキレートを作製する方法は当業者にとって周知である（例えば、米国特許第６，１９０，９２３号、６，１８７，２８５号、６，１８３，７２１号、６，１７７，５６２号、６，１５９，４４５号、６，１５３，７７５号、６，１４９，８９０号、６，１４３号２７６号、６，１４３，２７４号、６，１３９，８１９号、６，１３２，７６４号、６，１２３，９２３号、６，１２３，９２１号、６，１２０，７６８号、６，１２０，７５１号、６，１１７，４１２号、６，１０６，８６６号、６，０９６，２９０号、６，０９３，３８２号、６，０９０，８００号、６，０９０，４０８号、６，０８８，６１３号、６，０７７，４９９号、６，０７５，０１０号、６，０７１，４９４号、６，０７１，４９０号、６，０６０，０４０号、６，０５６，９３９号、６，０５１，２０７号、６，０４８，９７９号、６，０４５，８２１号、６，０４５，７７５号、６，０３０，８４０号、６，０２８，０６６号、６，０２２，９６６号、６，０２２，５２３号、６，０２２，５２２号、６，０１７，５２２号、６，０１５，８９７号、６，０１０，６８２号、６，０１０，６８１、６，００４，５３３号及び６，００１,３２９号を参照のこと。）。
【０１５３】
二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰ及び／又は生物活性分子が一本鎖タンパク質であり比較的短い場合（即ち、約５０アミノ酸未満）、標準的化学ペプチド合成技術を用いてそれらを合成することができる。両成分が比較的短い場合、１つの連続的ポリペプチドとしてキメラ部分を合成することができる。あるいは、二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰ及び生物活性分子を個別に合成して、その後一方の分子のアミノ末端を他方の分子のカルボキシル末端と縮合させて、それによりペプチド結合を形成させ得る。あるいは、二重特異性及び／又は多重特異性ＡＢＰ及び生物活性分子をそれぞれペプチドスペーサー分子の一方の末端と縮合させることができ、それにより連続的な融合タンパク質が形成される。
【０１５４】
配列のＣ末端アミノ酸を不溶性支持体に連結させ、次いで配列の残りのアミノ酸を順次付加する固相合成は、本発明のポリペプチドの化学合成に好ましい方法である。固相合成の技術は、Ｂａｒａｎｙ及びＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖｏｌ．２：Ｓｐｅｃｉａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｐａｒｔ  Ａ中のＳｏｌｉｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ；ｐｐ．３−２８４、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，８５：２１４９−２１５６（１９６３）及びＳｔｅｗａｒｔら、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ，第２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌ（１９８４）において述べられている。
【０１５５】
「二官能性ポリマー」とは、共有又は非共有結合を形成するために、他の部分（以下に限定されないが、アミノ酸側鎖基を含む。）と特異的に反応可能な２個の別個の官能基を含有するポリマーを指す。特定の生物活性成分における基との反応性のある１個の官能基及び第二の生物学的成分における基との反応性がある別の基を有する二官能性リンカーを使用して、第一の生物活性成分、二官能性リンカー及び第二の生物活性成分を含む共役物を形成し得る。ペプチドに様々な化合物を連結させるための多くの手段及びリンカー分子が公知である。例えば、欧州特許出願第１８８，２５６号；米国特許第４，６７１，９５８号、同第４，６５９，８３９号、同第４，４１４，１４８号、同第４，６９９，７８４号；同第４，６８０，３３８号；同第４，５６９，７８９号；及び同第４，５８９，０７１号（参照により本明細書中に組み込む。）を参照のこと。「多官能性ポリマー」とは、共有又は非共有結合を形成するために、他の部分（以下に限定されないが、アミノ酸側鎖基を含む。）と特異的に反応可能な２以上の個別の官能基を含有するポリマーを指す。二官能性ポリマー又は多官能性ポリマーは、何らかの所望の分子長又は分子量であり得、特定の所望のスペーシング又はＡＢＰに連結する分子の１つの間の立体構造を与えるように選択し得る。
【０１５６】
置換基が左から右へ書かれ、それらの従来からの化学式により指定される場合、それらは等しく、右から左に構造が書かれた化学的に同一である置換基を包含し、例えば、構造−ＣＨ２Ｏ−は、構造−ＯＣＨ２−と同等である。
【０１５７】
「置換基」という用語は、以下に限定されないが、「非妨害置換基」を含む。「非妨害置換基」は、安定な化合物を生じる基である。適切な非妨害置換基又は基には、以下に限定されないが、ハロ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル、Ｃ２−Ｃ１０アルケニル、Ｃ２−Ｃ１０アルキニル、Ｃ１−Ｃ１０アルコキシ、Ｃ１−Ｃ１２アラルキル、Ｃ１−Ｃ２アルカリル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルキル、Ｃ３−Ｃ１２シクロアルケニル、フェニル、置換フェニル、トルオイル、キシレニル、ビフェニル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアルキル、Ｃ２−Ｃ１２アルコキシアリール、Ｃ７−Ｃ１２アリールオキシアルキル、Ｃ７−Ｃ１２オキシアリール、Ｃ１−Ｃ６アルキルスルフィニル、Ｃ１−Ｃ１０アルキルスルホニル、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（式中、ｍは１から８である。）、アリール、置換アリール、置換アルコキシ、フルオロアルキル、複素環基、置換複素環基、ニトロアルキル、−−ＮＯ２、−−ＣＮ、−−ＮＲＣ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、Ｃ２−−Ｃ１０アルキルチオアルキル、−−Ｃ（Ｏ）Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）、−−ＯＨ、−−ＳＯ２、＝Ｓ、−−ＣＯＯＨ、−−ＮＲ２、カルボニル、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）−−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）−−ＣＦ３、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）−−Ｓ−−（Ｃ６−Ｃ１０アリール）、−−Ｃ（Ｏ）−−（Ｃ１−Ｃ１０アリール）、−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（−−（ＣＨ２）ｍ−−Ｏ−−（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）（式中、各ｍは１から８である。）、−−Ｃ（Ｏ）ＮＲ２、−−Ｃ（Ｓ）ＮＲ２、−−ＳＯ２ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ２、−−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ２、それらの塩などが含まれる。各Ｒは、本明細書中で使用する場合、Ｈ、アルキルもしくは置換アルキル、アリールもしくは置換アリール、アラルキル又はアルカリルである。
【０１５８】
「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、ヨウ素及び臭素を含む。
【０１５９】
「アルキル」という用語は、それ自身又は別の置換基の一部として、別段の断りがない限り、直鎖もしくは分枝鎖もしくは環状炭化水素基又はそれらの組合せを意味し、完全に飽和、モノ又はポリ不飽和であり得、指定の炭素原子数を有する（即ち、Ｃ１−Ｃ１０は、１から１０個の炭素を意味する。）、二価及び多価の基を含み得る。飽和炭化水素基の例としては、以下に限定されないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、ｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、シクロヘキシル、（シクロヘキシル）メチル、シクロプロピルメチル、例えば、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチル、ｎ−オクチルなどの同族体及び異性体などの基が挙げられる。不飽和アルキル基は、一つ以上の二重結合又は三重結合を有する基である。不飽和アルキル基の例としては、以下に限定されないが、ビニル、２−プロペニル、クロチル、２−イソペンテニル、２−（ブタジエニル）、２，４−ペンタジエニル、３−（１，４−ペンタジエニル）、エチニル、１−及び３−プロピニル、３−ブチニル及び高級同族体及び異性体が挙げられる。「アルキル」という用語はまた、別段の注記がない限り、「ヘテロアルキル」など、下記でさらに詳細に定義するアルキルの誘導体を含むものとする。炭化水素基に限定されるアルキル基は「ホモアルキル」と呼ぶ。
【０１６０】
「アルキレン」という用語は、それ自身又は別の置換基の一部として、アルカン由来の二価の基を意味し、例としては、以下に限定されないが、構造−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−が挙げられ、さらに、「ヘテロアルキレン」として下記で述べる基が含まれる。通常、アルキル（又はアルキレン）基は、１個から２４個の炭素原子を有し、本発明において好ましいのは炭素原子１０個以下の基である。「低級アルキル」又は「低級アルキレン」は、より短い鎖のアルキル又はアルキレン基であり、通常、炭素原子は８個以下である。
【０１６１】
「アルコキシ」、「アルキルアミノ」及び「アルキルチオ」（又はチオアルコキシ）という用語は、これらの従来の意味で使用し、分子の残りの部分にそれぞれ酸素原子、アミノ基又はイオウ原子を介して結合するアルキル基を指す。
【０１６２】
「ヘテロアルキル」という用語は、それ自身又は別の用語と組み合わせて、別段の断りがない限り、炭素原子の指定数及び、Ｏ、Ｎ、Ｓｉ及びＳからなる群から選択される少なくとも１個のヘテロ原子（窒素及びイオウ原子は、場合によって酸化され得、窒素ヘテロ原子は、場合によっては四級化され得る。）からなる、安定な直鎖もしくは分枝鎖もしくは環状炭化水素基又はそれらの組合せを意味する。ヘテロ原子Ｏ、Ｎ及びＳ及びＳｉは、ヘテロアルキル基の内部の何れかの位置に、又はアルキル基がその分子の残りと結合している位置に置かれ得る。例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３、−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２、−Ｓ（Ｏ）−ＣＨ３、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ（Ｏ）２−ＣＨ３、−ＣＨ＝ＣＨ−Ｏ−ＣＨ３、−Ｓｉ（ＣＨ３）３、−ＣＨ２−ＣＨ＝Ｎ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ＝ＣＨ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ３が挙げられる。例えば、−ＣＨ２−ＮＨ−ＯＣＨ３及び−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ＣＨ３）３など、２個以下のヘテロ原子が連続し得る。同様に、「ヘテロアルキレン」という用語は、それ自身又は別の置換基の一部として、ヘテロアルキル由来の二価の基を意味し、例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−及び−ＣＨ２−Ｓ−ＣＨ２−ＣＨ２−ＮＨ−ＣＨ２−が挙げられる。ヘテロアルキレン基の場合、同じ又は異なるヘテロ原子がまた、鎖端の一方又は両方を占め得る（以下に限定されないが、アルキレンオキシ、アルキレンジオキシ、アルキレンアミノ、アルキレンジアミノ、アミノオキシアルキレンなど）。さらに、アルキレン及びヘテロアルキレン連結基の場合、連結基の式が書かれている方向により、連結基の方向が示唆されることはない。例えば、式−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−は、−Ｃ（Ｏ）２Ｒ’−と−Ｒ’Ｃ（Ｏ）２−との両方を表す。
【０１６３】
「シクロアルキル」及び「ヘテロシクロアルキル」という用語は、それら自身又は他の用語と組み合わせて、別段の断りがない限り、それぞれ「アルキル」及び「ヘテロアルキル」の環状形態を表す。したがって、シクロアルキル又はヘテロシクロアルキルは、飽和及び不飽和環結合を含む。さらにヘテロシクロアルキルの場合、複素環が分子の残りの部分に結合する位置をヘテロ原子が占め得る。シクロアルキルの例には、以下に限定されないが、シクロペンチル、シクロヘキシル、１−シクロへキセニル、３−シクロへキセニル、シクロヘプチルなどが含まれる。ヘテロシクロアルキルの例としては、以下に限定されないが、１−（１，２，５，６−テトラヒドロピリジル）、１−ピペリジニル、２−ピペリジニル、３−ピペリジニル、４−モルホリニル、３−モルホリニル、テトラヒドロフラン−２−イル、テトラヒドロフラン−３−イル、テトラヒドロチエン−２−イル、テトラヒドロチエン−３−イル、１−ピペラジニル、２−ピペラジニルなどが挙げられる。さらに、この用語は、二環式及び三環式環構造を包含する。同様に、「ヘテロシクロアルキレン」という用語は、それ自身又は別の置換基の一部として、ヘテロシクロアルキル由来の二価の基を意味し、「シクロアルキレン」という用語は、それ自身又は別の置換基の一部として、シクロアルキル由来の二価の基を意味する。
【０１６４】
本明細書中で使用する場合、「水溶性ポリマー」という用語は、水性溶媒中で可溶性であるあらゆるポリマーを指す。ＡＢＰへの水溶性ポリマーの連結の結果、以下に限定されないが、非修飾形態と比較した場合、血清半減期が延長もしくは調節されるか、又は治療半減期が延長もしくは調節され、免疫原性が調節され、凝集及び多量体形成などの物理的結合特性が調節され、受容体結合が変化し、受容体二量体化もしくは多量体化が変化することなどを含む変化が生じ得る。水溶性ポリマーは、それ自身の生物活性を有していても有していなくてもよく、以下に限定されないが、一つ以上のＡＢＰ’ｓ又は一つ以上の生物活性分子を含む他の物質へのＡＢＰの連結のためにリンカーとして利用され得る。適切なポリマーとしては、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒド、モノＣ１−Ｃ１０アルコキシ又はそれらのアリールオキシ誘導体（米国特許第５，２５２，７１４号に記載（本明細書中に参照により組み込む。）。）、モノメトキシ−ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテル無水マレイン酸、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、硫酸デキストランを含むデキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリプロピレンオキシド／エチレンオキシドコポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖類、オリゴ糖、グリカン、セルロース及びセルロース誘導体（以下に限定されないが、メチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含む。）、デンプン及びデンプン誘導体、ポリペプチド、ポリアルキレングリコール及びそれらの誘導体、ポリアルキレングリコールとそれらの誘導体とのコポリマー、ポリビニルエチルエーテル及びα−β−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミドなど又はそれらの混合物が挙げられる。このような水溶性ポリマーの例としては、以下に限定されないが、ポリエチレングリコール及び血清アルブミンが挙げられる。
【０１６５】
本明細書中で使用する場合、「ポリアルキレングリコール」又は「ポリ（アルケングリコール）」という用語は、ポリエチレングリコール（ポリ（エチレングリコール））、ポリプロピレングリコール、ポリブチレングリコール及びそれらの誘導体を指す。「ポリアルキレングリコール」という用語は、直鎖状及び分枝状ポリマーの両方を包含し、平均分子量は、０．１ｋＤａから１００ｋＤａの間である。その他の例となる実施形態は、例えば、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのカタログ、「Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  Ｇｌｙｃｏｌ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」（２００１）などの市販業者のカタログで挙げられる。
【０１６６】
「アリール」という用語は、別段の断りがない限り、単環又は多環式（好ましくは１から３環）であり得、一緒に縮合するか又は共有結合している、ポリ不飽和、芳香族、炭化水素置換基を意味する。「ヘテロアリール」という用語は、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１個から４個のヘテロ原子（窒素及びイオウ原子は、場合によって酸化され得、窒素ヘテロ原子は、場合によっては四級化され得る。）を含有するアリール基（又は環）を指す。ヘテロアリール基は、ヘテロ原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。アリール及びヘテロアリール基の非限定例としては、フェニル、１−ナフチル、２−ナフチル、４−ビフェニル、１−ピロリル、２−ピロリル、３−ピロリル、３−ピラゾリル、２−イミダゾリル、４−イミダゾリル、ピラジニル、２−オキサゾリル、４−オキサゾリル、２−フェニル−４−オキサゾリル、５−オキサゾリル、３−イソオキサゾリル、４−イソオキサゾリル、５−イソオキサゾリル、２−チアゾリル、４−チアゾリル、５−チアゾリル、２−フリル、３−フリル、２−チエニル、３−チエニル、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−ピリミジル、４−ピリミジル、５−ベンゾチアゾリル、プリニル、２−ベンゾイミダゾリル、５−インドリル、１−イソキノリル、５−イソキノリル、２−キノキサリニル、５−キノキサリニル、３−キノリル及び６−キノリルが挙げられる。上述のアリール及びヘテロアリール環系のそれぞれに対する置換基は、下記の許容可能な置換基の群から選択する。
【０１６７】
簡潔にするため、「アリール」という用語を他の用語と組み合わせて使用する場合（以下に限定されないが、アリールオキシ、アリールチオキシ、アリールアルキルを含む。）、「アリール」という用語は、上記で定義した、アリール及びヘテロアリール環の両方を含む。したがって、「アリールアルキル」という用語は、炭素原子（これ限定されないが、メチレン基を含む。）が例えば酸素原子で置換されているアルキル基などのアルキル基（以下に限定されないが、ベンジル、フェネチル、ピリジルメチルなど。）にアリール基が連結される基を含むものとする（以下に限定されないが、フェノキシメチル、２−ピリジルオキシメチル、３−（１−ナフチルオキシ）プロピルなどを含む。）。
【０１６８】
上記の用語のそれぞれ（以下に限定されないが、「アルキル」、「ヘテロアルキル」、「アリール」及び「ヘテロアリール」を含む。）は、指定の基の、置換及び非置換形態の両方を含むものとする。各タイプの基に対する置換基の例は下記で示す。
【０１６９】
アルキル及びヘテロアルキル基（アルキレン、アルケニル、ヘテロアルキレン、ヘテロアルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、シクロアルケニル及びヘテロシクロアルケニルと呼ばれることが多い基を含む。）に対する置換基は、以下に限定されないが、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、＝ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’）＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２（０から（２ｍ’＋１）の範囲の数、ｍ’はこのような基の炭素原子総数である。）から選択される様々な基の一つ以上であり得る。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’はそれぞれ独立に、水素、置換又は非置換へテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（以下に限定されないが、１個から３個のハロゲンで置換されているアリールを含む。）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基又はアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合、例えば、各Ｒ基は、これらの基の複数が存在する場合であれば、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として独立に選択される。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合する場合、これらは、窒素原子と一緒になって５、６又は７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、以下に限定されないが１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むものとする。置換基の上記考察から、「アルキル」という用語は、ハロアルキル（以下に限定されないが、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３を含む。）及びアシル（以下に限定されないが、-Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含む。）など、水素基以外の基に結合した炭素原子などの基を含むものとすることを当業者は理解する。
【０１７０】
アルキル基に対して述べた置換基と同様に、アリール及びヘテロアリール基に対する置換基は、様々であり、以下に限定されないが、ハロゲン、−ＯＲ’、＝Ｏ、＝ＮＲ’、＝Ｎ−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−ＳｉＲ’Ｒ’’Ｒ’’’、−ＯＣ（Ｏ）Ｒ’、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯ２Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−ＯＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＮＲ’−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’’Ｒ’’’、−ＮＲ’’Ｃ（Ｏ）２Ｒ’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’Ｒ’’’＝ＮＲ’’’’、−ＮＲ−Ｃ（ＮＲ’Ｒ’’）＝ＮＲ’’’、−Ｓ（Ｏ）Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’’’、−ＮＲＳＯ２Ｒ’、−ＣＮ及び−ＮＯ２、-Ｒ’、−Ｎ３、−ＣＨ（Ｐｈ）２、フルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルコキシ及びフルオロ（Ｃ１−Ｃ４）アルキル（０から芳香環系におけるオープンバレンスの総数の範囲の数；Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’は、水素、アルキル、ヘテロアルキル、アリール及びヘテロアリールから独立に選択される。）から選択される。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合、例えば、Ｒ基それぞれは、これらの基の複数が存在する場合であれば、各Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基として独立に選択される。
【０１７１】
本明細書中で使用する場合、「血清半減期の調節」という用語は、その非修飾形態と比較して修飾ＡＢＰの循環半減期が延長又は短縮されることを意味する。血清半減期は、ＡＢＰ投与後、様々な時間点で血液試料を採取し、各試料中のその分子の濃度を調べることにより測定される。血清濃度と時間との相関関係から、血清半減期を計算することができる。血清半減期の望ましい延長は、少なくとも約２倍に延長することであるが、それより小幅な延長も有用であり、例えば、これにより、満足のいく投与計画を実現するか、又は毒性の影響を避けることができる。ある実施形態において、延長とは、少なくとも約３倍、少なくとも約５倍又は少なくとも約１０倍である。
【０１７２】
「治療半減期の調節」という用語は、本明細書中で使用する場合、その非修飾形態と比較して、ＡＢＰ又は修飾された生物活性分子を含有するＡＢＰの治療的有効量の半減期が延長又は短縮されることを意味する。治療半減期は、投与後に、様々な時間点で分子の薬物動態及び／又は薬力学特性を測定することにより調べられる。治療半減期を望ましく延長させることにより、特定の有益な投与計画、特定の有益な総投与量が実現でき、望ましくない影響を避けることができる。ある実施形態において、効力の増強、標的に対する修飾分子結合の増加又は低下、又は別のパラメーターの上昇もしくは低下又は非修飾分子の作用機構の結果、治療半減期が延びる。
【０１７３】
「単離した」という用語は、核酸又はタンパク質に対して適用する場合、核酸又はタンパク質において、天然状態では付随しているその他の細胞成分が実質的に含まれていないことを意味する。これは、均一状態であり得る。単離された物質は、乾燥もしくは半乾燥又は、以下に限定されないが水溶液を含む溶液の何れかの状態であり得る。純度及び均一性は、通常、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて調べる。調製物中に存在する主要な種であるタンパク質を実質的に精製する。特に、遺伝子に隣接し、関心のある遺伝子以外のタンパク質をコードするオープンリーディングフレームから単離遺伝子を分離する。「精製した」という用語は、電気泳動ゲルにおいて核酸又はタンパク質が実質的に単一バンドを生じることを意味する。特に、核酸又はタンパク質が少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９９％以上純粋であることを意味する。
【０１７４】
「核酸」という用語は、デオキシリボヌクレチド、デオキシリボヌクレシド、リボヌクレオシド又はリボヌクレオチド及び、１本鎖もしくは２本鎖形態の何れかのそれらのポリマーを指す。特段の制限のない限り、この用語は、関連核酸と同様の結合特性を有し、天然ヌクレオチドと同様に代謝される天然ヌクレオチドの既知の類似体を含有する核酸を包含する。特段の制限のない限り、この用語はまた、ＰＮＡ（ペプチド核酸）を含むオリゴヌクレオチド類似体、アンチセンス技術で使用されるＤＮＡの類似体（ホスホロチオアート、ホスホロアミデートなど）も指す。別段の指示がない限り、特定の核酸配列もまた、明示しないが、保存的に修飾されたそれらの変異型（以下に限定されないが、縮重コドン置換を含む。）及び相補的配列ならびに明確に指示される配列も包含する。具体的に、一つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第三番目の位置が、混合基及び／又はデオキシイノシン残基で置換された配列を生じさせることにより、縮重コドン置換を行い得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；及びＣａｓｓｏｌら、（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８:９１−９８（１９９４））。
【０１７５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すように、本明細書中で交換可能に使用される。即ち、ポリペプチドに向けられる説明は、ペプチドの説明及びタンパク質の説明に等しく適用され、その逆も成り立つ。これらの用語は、天然アミノ酸ポリマーならびに一つ以上のアミノ酸残基が非天然コードアミノ酸であるアミノ酸ポリマーに適用される。本明細書中で使用する場合、これらの用語は、全長タンパク質（即ち抗原）を含む、あらゆる長さのアミノ酸鎖を包含しており、このアミノ酸残基は、共有ペプチド結合により連結される。
【０１７６】
「アミノ酸」という用語は、天然及び非天然のアミノ酸ならびに、天然アミノ酸と同様に機能する、アミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然コードアミノ酸は、２０種類の一般的アミノ酸（アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）及びピロリシン及びセレノシステインである。アミノ酸類似体は、天然アミノ酸と同じ基本化学構造（即ち、水素に結合したα炭素）、カルボキシル基、アミノ基及びＲ基を有する化合物を指し、ホモセリン、ノルロイシン、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホキシド、メチオニンメチルスルホニウムなどである。このような類似体は、修飾されたＲ基（ノルロイシンなど）又は修飾されたペプチド骨格を有するが、天然アミノ酸と同じ基本化学構造を保持している。
【０１７７】
アミノ酸は、本明細書中で、周知の３文字表記又はＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｓｉｏｎ推奨の１文字表記により表し得る。同様に、ヌクレオチドは、一般に受容されている１文字コードで表し得る。
【０１７８】
「保存的に修飾された変異型」は、アミノ酸及び核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、「保存的に修飾された変異型」とは、同一又は基本的に同一のアミノ酸配列をコードする核酸、又は核酸がアミノ酸配列をコードしていない場合、基本的に同一の配列を指す。遺伝暗号の縮重ゆえに、機能的に同一の核酸の多数が、何らかのある一定のタンパク質をコードする。例えば、コドン、ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ及びＧＵＣは全てアミノ酸アラニンをコードする。したがって、アラニンがコドンにより指定される各位置において、そのコドンを、コードされるポリペプチドを変更することなく、上述の対応するコドンの何れかに変更することができる。このような核酸の変動性は、「サイレントな変動（ｓｉｌｅｎｔ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）」であり、保存的修飾変異型の１つである。ポリペプチドをコードする本明細書中の全ての核酸配列はまた、核酸の全ての可能なサイレントな変動（ｓｉｌｅｎｔ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ）も表す。当業者にとって当然のことながら、核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ及び通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＴＧＧを除く。）を修飾して、機能的に同一の分子を生じさせることができる。したがって、ポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変動は、述べられている各配列において潜在的である。
【０１７９】
アミノ酸配列に関しては、当業者にとって当然のことながら、コードされる配列において１個のアミノ酸又はアミノ酸の数％を変更するか、付加又は欠失を行う、核酸、ペプチド、ポリペプチド又はタンパク質配列への、個々の置換、欠失又は付加は、変更の結果、化学的に類似のアミノ酸でアミノ酸が置換される「保存的修飾変異型」となる。機能的に同様のアミノ酸を与える保存的置換の一覧は、当技術分野で周知である。このような保存的に修飾された変異型は、多型変異体、種間ホモローグ及び本発明の対立遺伝子に加えられ、多型変異体、種間ホモローグ及び本発明の対立遺伝子を除外しない。
【０１８０】
次の８群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する。
【０１８１】
１）アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）；
２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；
３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；
４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；
５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、バリン（Ｖ）；
６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）；
７）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；及び
８）システイン（Ｃ）、メチオニン（Ｍ）（例えば、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ  Ｈ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．；第２版（１９９３、１２月）を参照のこと。
【０１８２】
「同一」又はパーセント「同一」という用語は、２以上の核酸又はポリペプチド配列に関して、同じである２以上の配列又はサブ配列を指す。比較枠（ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｗｉｎｄｏｗ）にわたり、又は以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、もしくは手動のアラインメント及び目視により測定する場合の指定領域にわたり一致が最大になるように比較し並べた際に、アミノ酸残基又はヌクレオチドが同じである比率を有する場合（即ち、指定領域にわたり、約６０％同一、場合によっては約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％同一である。）、配列は「実質的に同一」である。この定義はまた、試験配列の相補体を指す。少なくとも約５０のアミノ酸長又はヌクレオチド長である領域にわたり、又は約７５から１００のアミノ酸長又はヌクレオチド長である領域にわたり、又は指定せずに全配列もしくはポリヌクレオチドもしくはポリペプチドにわたり、同一性が存在し得る。
【０１８３】
配列比較の場合、通常１つの配列を参照配列として扱い、それに対して試験配列の比較を行う。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピュータに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、配列アルゴリズムプログラムパラメータを指定する。初期設定プログラムパラメータを使用するか、又は代替パラメータを指定することができる。次いで、プログラムパラメータに基づき、配列比較アルゴリズムが参照配列に対する試験配列の配列同一性％を計算する。
【０１８４】
「比較枠」とは、本明細書中で使用する場合、２０から６００、通常約５０から約２００、より一般的には約１００から約１５０（２個の配列を最適にアラインした後、同数の連続的位置の参照配列と配列を比較し得る。）からなる群から選択される多くの連続的位置の何れか１つのセグメントに対する参照を含む。比較のための配列のアラインメント法は当技術分野で周知である。以下に限定されないが、Ｓｍｉｔｈ及びＷａｔｅｒｍａｎ（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃの部分的ホモロジーアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈ（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３のホモロジーアラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ及びＬｉｐｍａｎ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４の類似法の検索、これらのアルゴリズムのコンピュータ化（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）又は手動でのアラインメント及び目視（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９５、付録）を含む方法により、比較のための配列の最適アラインメントを行うことができる。
【０１８５】
％配列同一性及び配列類似性を調べるための適切なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、これらは、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２及びＡｌｔｓｃｈｕｌら（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０でそれぞれ述べられている。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎを通して公開されている。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、Ｔ及びＸは、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、初期設定として、１１の語長（Ｗ）、期待値（Ｅ）又は１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４及び両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、初期設定として、３の語長）、１０の期待値（Ｅ）及び５０のＢＬＯＳＵＭ６２採点マトリクス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝Ｍ及び両鎖の比較を使用する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、通常、「低複雑度」のフィルターをオフにして行う。
【０１８６】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計解析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７を参照。）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより与えられる類似性の１つの指標は、最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間のマッチが偶然起こる確率の目安を与える。例えば、参照核酸に対する試験核酸の比較における最小の合計確率が約０．２未満、より好ましくは約０．０１未満、最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸を参照配列と同じとみなす。
【０１８７】
「〜に選択的に（又は特異的に）ハイブリダイズする。」という句は、配列が複合混合物（以下に限定されないが、細胞全体又はライブラリＤＮＡ又はＲＮＡを含む。）中に存在する場合、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、特定のヌクレオチド配列とのみ分子が、結合する、二本鎖になる又はハイブリダイズすることを指す。
【０１８８】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下」という句は、当業者にとって公知のような、イオン強度が低く、高温である条件を指す。通常、ストリンジェントな条件下で、核酸の複合混合物（以下に限定されないが、細胞全体又はライブラリＤＮＡ又はＲＮＡを含む。）中でプローブはその標的物質にハイブリダイズするが、複合混合物中でその他の配列にはハイブリダイズしない。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、様々な状況により異なる。長い配列ほど、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する詳細は、Ｔｉｊｓｓｅｎ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３）で見出される。一般に、ストリンジェントな条件は、指定されたイオン強度ｐＨで、特定の配列に対する熱融解温度（Ｔｍ）より約５℃から１０℃低いように選択する。Ｔｍとは、（指定されたイオン強度、ｐＨ及び核酸濃度下で）、標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする（標的配列がＴｍで過剰に存在する場合、平衡状態においてプローブの５０％が平衡状態でハイブリダイズされる。）温度である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍナトリウムイオン未満、通常、約０．０１から１．０Ｍナトリウムイオン濃度（又は他の塩）、ｐＨ７．０から８．３である条件であり得、温度は、短いプローブ（以下に限定されないが、１０から５０ヌクレオチドを含む。）であれば少なくとも約３０℃、長いプローブ（以下に限定されないが、５０ヌクレオチドを超える物を含む。）であれば少なくとも６０℃である。ホルムアミドなど、不安定化させる物質を添加してストリンジェントな条件を達成することもできる。選択的又は特異的ハイブリダイゼーションの場合、ポジティブなシグナルは、バックグラウンドの少なくとも２倍、場合によってはバックグラウンドハイブリダイゼーションの１０倍であり得る。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の一例としては次の条件を挙げることができる：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ及び１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベーション、又は５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベーション、６５℃にて０．２ｘＳＳＣ及び０．１％ＳＳＣで洗浄。５、１５、３０、６０、１２０分又はさらに長時間、このような洗浄を行うことができる。
【０１８９】
本明細書中で使用する場合、「真核生物」という用語は、動物（以下に限定されないが、哺乳類、昆虫類、爬虫類、鳥類などを含む。）、繊毛虫類、植物（以下に限定されないが、単子葉植物、双子葉植物、藻類などを含む。）、真菌、酵母、鞭毛虫類、微胞子虫、原生生物界などの系統発生のＥｕｃａｒｙａ（ユーカリア）ドメインに属する生物を指す。
【０１９０】
本明細書中で使用する場合、「非真核生物」という用語は、非真核の生物を指す。例えば、非真核生物は、真正細菌（以下に限定されないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（サーミス・サーモフィルス）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ（バシラス・ステロサーモフィルス、好熱性細菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレセンス、蛍光菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス・エルギノーサ、緑膿菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（シュードモナス・プチダ、プチダ菌）などが含まれる。）系統発生ドメイン又は古細菌（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（好熱性メタン菌）、Ｈａｌｏｆｅｒａｘ  ｖｏｌｃａｎｉｉ（ハロフェラクス・ボルカニ）及びＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ハロバクテリウム）種ＮＲＣ−１などのＨａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（ハロバクテリウム）、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ  ｆｕｌｇｉｄｕｓ（アルケログロブス・フルギドゥス）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ（ピロコッカス・フリオサス）、Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｏｒｉｋｏｓｈｉｉ（ピロコッカス・ホリコシ）、Ａｅｕｒｏｐｙｒｕｍ  ｐｅｒｎｉｘ（ユーロピルム・ペルニクス）系統発生ドメインなどを含む。
【０１９１】
「対象」という用語は、本明細書中で使用する場合、治療、観察及び実験が行われる、動物、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトを指す。
【０１９２】
「有効量」という用語は、本明細書中で使用する場合、治療を行う、疾病、状態又は疾患の症候の一つ以上をある程度緩和する、（修飾）非天然アミノ酸ポリペプチドの投与量を指す。本明細書中に記載の（修飾）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物を予防処置、促進処置及び／又は治療処置のために投与することができる。
【０１９３】
「促進する」又は「促進すること」という用語は、所望の効果の強度又は持続時間の何れかを増加又は延長させることを意味する。したがって、治療薬の効果を促進するということに関して、「促進すること」という用語は、系において他の治療薬、の強度又は持続時間、効果を向上又は延長させる能力を意味する。「促進に有効な量」とは、本明細書中で使用する場合、所望の系において別の治療薬の効果を促進するのに適切な量を指す。患者において使用する場合、使用に有効な量は、疾病、疾患又は状態の重症度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する反応ならびに治療を行う医師の判断に依存する。
【０１９４】
「修飾された」という用語は、本明細書中で使用する場合、ポリペプチドにおける翻訳後修飾の存在を指す。「（修飾された）」という形態の用語は、考察下のポリペプチドが場合によっては修飾されている、つまり、考察下のポリペプチドが修飾されていてもよいし非修飾でもよいことを意味する。
【０１９５】
「翻訳後修飾された」及び「修飾された」という用語は、天然又は非天然アミノ酸がポリペプチド鎖に組み込まれた後、このようなアミノ酸に起こる、天然又は非天然アミノ酸のあらゆる修飾を指す。この用語は、一例に過ぎないが、インビボ翻訳時修飾、インビボ翻訳後修飾及びインビトロ翻訳後修飾を包含する。
【０１９６】
予防適用において、特定の疾病、疾患又は状態のリスクが高くなりやすい又はリスクが高い患者に、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物を投与する。このような量は、「予防的有効量」として定義される。この用途において、正確な量はまた、患者の健康状態、体重などに依存する。通常の実験によりこのような予防的有効量を決定する（例えば、用量増加臨床試験）ことは、当業者の技術の範囲内であるとみなされる。
【０１９７】
「保護化」という用語は、ある一定の反応条件下で化学反応官能基の反応を防ぐ、「保護基」又は部分の存在を指す。保護基は、保護する化学反応基のタイプにより様々である。例えば、化学反応基がアミン又はヒドラジドである場合、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から保護基を選択することができる。化学反応基がチオールである場合、保護基はオルトピリジルジスルフィドであり得る。化学反応基が、ブタン酸もしくはプロピオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基である場合、保護基はベンジル又は、メチル、エチルもしくはｔｅｒｔ−ブチルなどのアルキル基であり得る。本明細書中に記載の、方法及び組成物において、又はそれらと一緒に、当技術分野で公知のその他の保護基も使用し得る。
【０１９８】
一例に過ぎないが、封鎖基／保護基を以下のものから選択し得る。
【０１９９】
【化４】
2008503217.tif 000005
【０２００】
その他の保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ及びＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，第３版、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，１９９９（その全体を本明細書中に参照により組み込む。）に記載されている。
【０２０１】
治療適用において、既に疾病、状態又は疾患に罹患している患者に、疾病、状態又は疾患を治癒させるのに十分な量で、又は少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、（修飾された）非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物を投与する。このような量は、「治療的有効量」であると定義され、これは、疾病、疾患又は状態の重症度及び経過、以前の治療、患者の健康状態及び薬物に対する反応ならびに治療を行う医師の判断に依存する。通常の実験（例えば、用量増加臨床試験）によりこのような予防的有効量を決定することは、十分に当技術分野の技術の範囲内にあると考えられる。
【０２０２】
「治療する」という用語は、予防的及び／又は治療的処置の何れかを指すために使用する。
【０２０３】
別段の指示がない限り、当技術分野の技術の範囲内である、質量分析、ＮＭＲ、ＨＰＬＣ、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来からの方法を用いる。
【０２０４】
詳細な説明
Ｉ．導入
本発明において、少なくとも１個の非天然アミノ酸を含有するＡＢＰ分子を提供する。本発明のある一定の実施形態において、少なくとも１個の非天然アミノ酸を有するＡＢＰは、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む。ある実施形態において、少なくとも１つの翻訳後修飾は、当業者にとって特定の反応基に適切であることが知られている化学の方法を利用した、以下に限定されないが、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、細胞毒性化合物、放射性核種、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光プローブ、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は上記又は、第一の反応基を含有する少なくとも１個の非天然アミノ酸に対する第二の反応基を含有するその他の何らかの所望の化合物もしくは物質のあらゆる組合せを含む、分子の連結を含む。例えば、第一の反応基はアルキニル部分（以下に限定されないが、非天然アミノ酸、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニン（プロパルギル基はまた、アセチレン部分と呼ばれる場合がある。）において、などを含む。）であり、第二の反応基はアジド部分であり、［３＋２］付加環化の化学の方法を利用する。別の例において、第一の反応基はアジド部分であり（以下に限定されないが、非天然アミノ酸ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおいて、などを含む。）、第二の反応基はアルキニル部分である。本発明の修飾されたＡＢＰポリペプチドのある一定の実施形態において、少なくとも１つの翻訳後修飾が糖部分を含む場合、少なくとも１つの翻訳後修飾を含む、少なくとも１個の非天然アミノ酸（以下に限定されないが、ケト官能基を含有する非天然アミノ酸を含む。）を使用する。ある一定の実施形態において、真核細胞中又は非真核細胞中で、インビボで翻訳後修飾を行う。
【０２０５】
ある一定の実施形態において、タンパク質は、ある宿主細胞によりインビボで成された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、通常、別のタイプの宿主細胞により成されることはない。ある一定の実施形態において、タンパク質は、真核細胞によりインビボで成された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、通常、非真核細胞により成されることはない。翻訳後修飾の例には、以下に限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾などが含まれる。ある実施形態において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合による、アスパラギンへのオリゴ糖の結合を含む（以下に限定されないが、オリゴ糖が（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃを含む場合などを含む。）。別の実施形態において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン、ＧａｌＮＡｃ−スレオニン、ＧｌｃＮＡｃ−セリン又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、セリン又はスレオニンへのオリゴ糖（以下に限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｃＮＡｃなどを含む。）の結合を含む。ある一定の実施形態において、本発明のタンパク質又はポリペプチドは、分泌又は局在配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含み得る。分泌シグナル配列の例としては、以下に限定されないが、原核生物分泌シグナル配列、真核生物分泌シグナル配列、細菌発現のために５’−最適化された真核生物分泌シグナル配列、新規分泌シグナル配列、ペクチン酸リアーゼ分泌シグナル配列、Ｏｍｐ  Ａ分泌シグナル配列及びファージ分泌シグナル配列が挙げられる。分泌シグナル配列の例としては、以下に限定されないが、ＳＴＩＩ（原核生物）、Ｆｄ  ＧＩＩＩ及びＭ１３（ファージ）、Ｂｇｌ２（酵母）及びトランスポゾン由来のシグナル配列ｂｌａが挙げられる。
【０２０６】
非天然アミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを使用して、以下に限定されないが、小分子、ペプチド及びオリゴヌクレオチドを含む生物活性分子の、治療半減期、血清半減期又は循環時間を調節し得る。このような小分子、ペプチド及びオリゴヌクレオチドは、以下に限定されないが、標的分子又は細胞タイプとの結合及び／又は認識、抗腫瘍、抗血管形成、抗ウイルス及びアポプトーシス活性などの、生物活性を有し得る。さらに、非天然アミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドは、以下に限定されないが、ＡＤＣＣなどのエフェクター機能、食作用又は補体依存性の細胞毒性、プロドラッグの活性化、酵素活性、触媒活性、タンパク質−タンパク質相互作用の阻止、所望の抗原への結合及び所望の部位への小分子のターゲティングをはじめとする、所望の活性を与え得る。ＡＢＰのタンパク質−タンパク質相互作用の阻止により、連結された生物活性分子の一つ以上の活性が調節され得る。アンタゴニストとして小分子を使用して、他のタンパク質又は分子の結合活性を妨害し得る。
【０２０７】
リンカー、ポリマー又は共有結合により抗原結合ポリペプチド及び小分子を連結し得る。このリンカー、ポリマー又は小分子それ自身は、２０種類の一般的アミノ酸に対して反応性がない官能基を含み得る。このリンカー又はポリマーは二官能性であり得る。リンカー、ポリマー又は共有結合を介した生物活性分子への抗原結合ポリペプチドの連結に関与する一つ以上の結合は、所望の条件下で、不可逆的、可逆的又は不安定であり得る。リンカー、ポリマー又は共有結合を介した、分子への抗原結合ポリペプチドの連結に関与する一つ以上の結合により、抗原結合ポリペプチド又はその他の分子の放出を調節し得る。化学的手段、天然産物としての単離又はその他の手段により、当業者は小分子の多様性を生じさせ得る。
【０２０８】
Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３年４月２９日；１００（９）：５３９６−４００（本明細書中に参照により組み込む。）において、Ｒａｄｅｒらは、小分子を一般的な抗体分子と反応させることによって、小型の合成分子に対してエフェクター機能を与え、血清半減期を延長する方法を述べている。述べられている複合体は、抗体における反応性リジン残基を介した、天然アルドラーゼ酵素を模倣した触媒抗体ｍＡｂ  ３８Ｃ２及び、インテグリン標的Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐペプチド模倣薬のジケトン誘導体の間の可逆的共有結合により作製された。ペプチド模倣薬の半減期延長に加え、この複合体は、インテグリンαｖβ３及びαｖβ５発現細胞の表面に対する、抗体の選択的再標的化を示した。
【０２０９】
関心のあるタンパク質又はポリペプチドは、少なくとも１個の、少なくとも２個の、少なくとも３個の、少なくとも４個の、少なくとも５個の、少なくとも６個の、少なくとも７個の、少なくとも８個の、少なくとも９又は１０個以上の非天然アミノ酸を含有し得る。非天然アミノ酸は、同じ又は異なるものであり得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる非天然アミノ酸を含有するタンパク質において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる部位があり得る。ある一定の実施形態において、タンパク質の天然型に存在する、少なくとも１個の、しかし、総数より少ない、特定のアミノ酸を非天然アミノ酸で置換する。
【０２１０】
本発明は、抗原結合ポリペプチド又はＡＢＰ（少なくとも１個の非天然コードアミノ酸を含有する。）を基にした、方法及び組成物を提供する。少なくとも１個の非天然コードアミノ酸をＡＢＰに導入することにより、以下に限定されないが、一つ以上の非天然コードアミノ酸を用いてなど、特定の化学反応を含む共役化学を適用することが可能となる（一方、普通に存在する２０種類のアミノ酸とは反応しない。）。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸を含有するＡＢＰは、非天然コードアミノ酸の側鎖を介して、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーに連結している。本発明は、ＰＥＧ誘導体を用いてタンパク質を選択的に修飾するための効率の高い方法を提供するが、この方法は、セレクターコドンに応答してタンパク質に非遺伝子コードアミノ酸（以下に限定されないが、２０種類の天然で取り込まれるアミノ酸では見られない、官能基又置換基（以下に限定されないが、ケトン、アジド又はアセチレン部分を含む。）を含有するアミノ酸）を選択的に組み込むこと、及び、次いで適切な反応性ＰＧＥ誘導体でそれらのアミノ酸を修飾することを含む。取り込み後、当業者にとって公知の化学的方法を利用することによりアミノ酸側鎖を修飾して、天然コードアミノ酸に存在する特定の官能基又は置換基に適切なものとすることができる。水溶性ポリマーをタンパク質に取り込むための本発明での使用に対して、多岐にわたる公知の化学的方法が適切である。このような方法には、以下に限定されないが、（以下に限定されないが）それぞれ、アセチレン又はアジド誘導体とのＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（１９９１）Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．編、Ｐｅｒｇａｍｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９−１１０９；及びＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．，１，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．（１９８４）Ｐａｄｗａ，Ａ編、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．１−１７６を参照。）が含まれる。
【０２１１】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化法は、求電子置換反応ではなく付加環化を含むため、非常に高い選択性でタンパク質を修飾することができる。Ｃｕ（Ｉ）塩の触媒量を反応混合物に添加することにより、優れた位置選択性（１，４＞１，５）で、水性条件下で、室温にて反応を行うことができる。例えば、Ｔｏｒｎｏｅら、（２００２）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；及びＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９；及びＷＯ０３／１０１９７２を参照のこと。［３＋２］付加環化により本発明のタンパク質に付加することができる分子には、適切な官能基又は置換基（以下に限定されないが、アジド又はアセチレン誘導体を含む。）を有する実質的にあらゆる分子が含まれる。以下に限定されないがｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなどのアセチレン基又は以下に限定されないがｐ−アジド−フェニルアラニンなどのアジド基をそれぞれ用いて、これらの分子を非天然アミノ酸に付加することができる。
【０２１２】
Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化により生じた５員環は、通常、還元環境において可逆的ではなく、水性環境中で長時間にわたり加水分解に対して安定である。結果として、本発明の活性ＰＥＧ誘導体を用いて、厳しい水性条件下で、多岐にわたる物質の物理的及び化学的特性を改変することができる。さらに重要なこととして、アジド及びアセチレン部分は互いに特異的である（及び、例えば、２０種類の一般的な遺伝子コードアミノ酸のいずれとも反応性がない。）ので、非常に高い選択性で、一つ以上の特定部位において、タンパク質を修飾することができる。
【０２１３】
本発明はまた、水溶性であり加水分解に対して安定である、ＰＥＧ誘導体の誘導体及び一つ以上のアセチレン又はアジド部分を有する関連親水性ポリマーも提供する。アセチレン部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに反応してタンパク質に選択的に導入されたアジド部分とのカップリングに対する選択性が高い。同様に、アジド部分を含有するＰＥＧポリマー誘導体は、セレクターコドンに反応してタンパク質に選択的に導入されたアセチレン部分とのカップリングに対する選択性が高い。
【０２１４】
とりわけ、アジド部分は、以下に限定されないが、アルキルアジド、アリールアジド及びこれらのアジドの誘導体を含む。アルキル及びアリールアジドの誘導体は、アセチレン特異的反応性が維持される限り、その他の置換基を含み得る。アセチレン部分は、アルキル及びアリールアセチレンならびにそれぞれの誘導体を含む。アルキル及びアリールアセチレンの誘導体は、アジド特異的反応性が維持される限り、その他の置換基を含み得る。
【０２１５】
抗体の特異性を利用するアッセイにおいて、非天然コードアミノ酸を含有するＡＢＰを使用し得る。例えば、候補となる抗原の集団をスクリーニングするために、本発明のＡＢＰ分子を使用し得る。
【０２１６】
本発明は、多岐にわたる官能基、置換基又は部分を有する物質と、以下に限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋リンカー、細胞毒性化合物、放射性核種、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光プローブ、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は上記もしくはその他の何らかの所望の化合物もしくは物質のあらゆる組合せを含むその他の物質との共役物を提供する。本発明はまた、アジド又はアセチレン部分を有する物質と、対応するアセチレン又はアジド部分を有するＰＥＧポリマー誘導体との共役物も含む。例えば、アセチレン官能基を有する非遺伝子コードアミノ酸を含有するタンパク質中の位置において、アジド部分を含有するＰＥＧポリマーを生物活性分子とカップリングさせることができる。ＰＥＧ及び生物活性分子をカップリングさせる結合には、以下に限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物が含まれる。
【０２１７】
ＰＥＧを使用して生体材料の表面を修飾できることは、当技術分野で定着している（例えば、米国特許第６，６１０，２８１号；Ｍｅｈｖａｒ，Ｒ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔ．Ｓｃｉ．，３（１）：１２５−１３６（２０００）（本明細書中に参照により組み込む。）を参照。）。本発明はまた、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化結合を介して表面にカップリングさせられた、一つ以上の反応性アジド又はアセチレン部位及び、本発明の、アジド又はアセチレン含有ポリマー一つ以上を有する面を含有する生体材料を含む。カルボン酸、アミン、アルコール又はチオール部分を含有する結合によるものなど、アジド又はアセチレン結合以外の結合により、生体材料及びその他の物質をアジド又はアセチレン活性化ポリマー誘導体にカップリングさせて、アジド又はアセチレン部分をその後の反応で利用可能な状態のままにしておくこともできる。
【０２１８】
本発明は、本発明のアジド及びアセチレン含有ポリマーを合成する方法を含む。アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合、ポリマーの炭素原子にアジドを直接結合させることができる。あるいは、生じるポリマーがその末端にアジド部分を有するように、一方の末端にアジド部分を有する連結剤を従来の活性化ポリマーに結合させることにより、アジド含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合、ポリマーの炭素原子にアセチレンを直接結合させることができる。あるいは、生じるポリマーがその末端にアセチレン部分を有するように、一方の末端にアセチレン部分を有する連結剤を従来の活性化ポリマーに結合させることにより、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。
【０２１９】
より具体的には、アジド含有ＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１個の活性ヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーを反応させて、メシレート、トレシレート、トシレート又はハロゲン脱離基など、より活性の高い部分をその上に有する置換ポリマーを生じさせる。ハロゲン化スルホン酸、ハロゲン原子及びその他の脱離基を含有するＰＥＧ誘導体の調製及び使用は、当業者にとって周知である。次に、生じた置換ポリマーを反応させて、そのポリマーの末端でアジド部分をより反応性の高い部分に置換する。あるいは、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合を形成させ、アジド部分をポリマーの末端に置くように、少なくとも１つの活性求核もしくは求電子部分を有する水溶性ポリマーを、一方の末端にアジドを有する連結剤と反応させる。アミン、チオール、ヒドラジド、ヒドラジン、アルコール、カルボキシレート、アルデヒド、ケトン、チオエステルなどを含む、求核及び求電子部分は、当業者にとって周知である。
【０２２０】
とりわけ、アセチレン含有ＰＥＧ誘導体の場合、少なくとも１個の活性ヒドロキシル部分を有する水溶性ポリマーを反応させて、アセチレン部分を含有する前駆体からハロゲン又はその他の活性化脱離基に置換する。あるいは、ＰＥＧポリマーと連結剤との間に共有結合を形成させ、アセチレン部分をポリマーの末端に置くように、少なくとも１個の活性求核もしくは求電子部分を有する水溶性ポリマーを、一方の末端にアセチレンを有する連結剤と反応させる。有機合成及び調製ならびにＰＥＧ誘導体の使用に関する場合の、ハロゲン部分、活性化脱離基、求核及び求電子部分の使用は、当業者にとって定着している。
【０２２１】
本発明はまた、以下に限定されないが、ＰＥＧ及び、アジド又はアセチレン部分を含有するＰＥＧ誘導体のような水溶性ポリマーなどを含む修飾タンパク質にその他の物質を付加するための、タンパク質の選択的修飾の方法を提供する。アジド及びアセチレン含有ＰＥＧ誘導体を使用して、表面及び分子の特性（生体適合性、安定性、溶解性及び免疫原性の欠落が重要である。）を改変し、同時に、当技術分野で以前知られていたものよりも選択性が高い、タンパク質へのＰＥＧ誘導体の連結方法を提供することができる。
【０２２２】
ＩＩ．抗原結合ポリペプチド
多岐にわたるＡＢＰ’ｓがある。ＡＢＰは、それ自身、多岐にわたる抗原に特異的である。抗原特異的な、多岐にわたる多数のＡＢＰ断片もある。したがって、ＡＢＰは、標的分子又は抗原に特異的に結合する能力を示すあらゆるポリペプチドを含むものとする。いずれの公知の抗体又は抗体断片もＡＢＰである。
【０２２３】
本発明のＡＢＰ’ｓは、Ｆｃ領域又はＦｃ様領域を含み得る。Ｆｃドメインは、補体又は食細胞などのエフェクター機能に対する連結を可能にする。免疫グロブリンのＦｃ部分は、血漿半減期が長く、Ｆａｂの寿命は短い（Ｃａｐｏｎら、（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１）。治療用のタンパク質とともに構築される場合、Ｆｃドメインは、半減期を長くするか、又はＦｃ受容体結合、プロテインＡ結合、補体結合及びおそらく胎盤通過などの機能を取り込むことができる。例えば、ＣＤ３０−Ｌ、ホジキン病腫瘍細胞、未分化リンパ腫細胞、Ｔ細胞白血病細胞及びその他の悪性細胞タイプで発現されるＣＤ−３０受容体を結合させる分子のＮ末端にＩｇＧ１抗体のＦｃ領域を融合させた（米国特許第５，４８０，９８１号）。サイトカインの短い循環半減期を延長させるために、ＩＬ−１０、抗炎症及び拒絶反応抑制剤をマウスＦｃγ２ａに融合させた。Ｚｈｅｎｇ，Ｘ．ら、（１９９５）、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１５４：５５９０−５６００。研究により、敗血症ショック患者（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｃ．ら、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３４：１６９７−１７０２（１９９６）；Ｖａｎ  Ｚｅｅ，Ｋ．ら、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１５６：２２２１−２２３０（１９９６））及び関節リウマチ（Ｍｏｒｅｌａｎｄら、（１９９７），Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３３７（３）：１４１−１４７）の患者の治療のためのヒトＩｇＧＩのＦｃタンパク質と連結された腫瘍壊死因子受容体の使用も評価された。また、ＦｃをＣＤ４受容体と融合させ、ＡＩＤＳの治療のための治療用タンパク質が調製された（Ｃａｐｏｎら、（１９８９）、Ｎａｔｕｒｅ，３３７：５２５−５３１）。さらにまた、インターロイキン２の半減期が短いという問題及びその全身的な毒性の問題を解決するために、インターロイキン２のＮ末端をＩｇＧ１又はＩｇＧ３のＦｃ部分に融合させた（Ｈａｒｖｉｌｌら、（１９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１：９５−１０５）。
【０２２４】
抗体のＦｃ領域が、ジスルフィド結合又は非共有会合により、二量体又は多量体形態に連結され得る単量体ポリペプチドセグメントから構成されることは周知である。ネイティブＦｃ分子の単量体サブユニットの間の分子間ジスルフィド結合数は、関与する抗体のクラス（例えばＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）又はサブクラス（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、ＩｇＧＡ２）により、１から４の範囲である。「Ｆｃ」という用語は、本明細書中で使用する場合、Ｆｃ分子の、単量体、二量体及び多量体形態に対する総称である。ジスルフィド結合形成を介した二量体化を妨害する特定の条件が存在しない限り、適切なＣｙｓ残基が存在する場合、Ｆｃ単量体が自然に二量体化することに留意されたい。Ｆｃ二量体において通常ジスルフィド結合を形成するＣｙｓ残基を除去又は他の残基で置換した場合でも、単量体鎖は通常、非共有相互作用を介して二量体化する。「Ｆｃ」という用語は、本明細書中で、これらの形態：ネイティブ単量体、ネイティブ二量体（ジスルフィド結合による連結）、修飾二量体（ジスルフィド及び／又は非共有結合による連結）及び修飾単量体（即ち誘導体）の何れかを意味するために使用する。
【０２２５】
例えば、非天然コードアミノ酸を含む、残基又は配列の様々な置換を行うことにより、Ｆｃ部分の、変異型、類似体又は誘導体を構築し得る。変異型（又は類似体）ポリペプチドには、挿入変異型が含まれ、この場合、一つ以上のアミノ酸残基がＦｃアミノ酸配列を補完する。タンパク質の何れかの末端もしくは両端に挿入を置くか、又はＦｃアミノ酸配列の内部領域内に挿入を置き得る。何れかの末端もしくは両端におけるさらなる残基を用いた挿入変異型は、例えば、融合タンパク質及び、アミノ酸タグ又は標識を含むタンパク質を含む。例えば、Ｆｃ分子は、Ｎ末端Ｍｅｔを場合によっては（特に、Ｅ．コリなどの細菌細胞において分子が組み換え発現される場合）含有し得る。Ｆｃ欠失変異型において、Ｆｃポリペプチド中の一つ以上のアミノ酸残基を除去する。Ｆｃポリペプチドの一方もしくは両方の末端で欠失を起こすか、又は、Ｆｃアミノ酸配列内の一つ以上の残基を除去することにより、欠失を為すことができる。したがって、欠失変異型は、Ｆｃポリペプチド配列の全ての断片を含む。Ｆｃ置換変異型において、Ｆｃポリペプチドの一つ以上のアミノ酸残基が除去され、代替残基で置換される。ある態様においては、その置換は実際に保存的であるが、本発明は非保存的でもある置換を包含する。例えば、システイン残基を欠失させるか、又は他のアミノ酸で置換して、Ｆｃ配列の一部又は全ジスルフィド架橋の形成を妨げることができる。タンパク質は、一つ以上のシステイン残基を有し得、これらのシステイン残基のそれぞれを除去するか、又は一つ以上のそのようなシステイン残基をＡｌａもしくはＳｅｒもしくは非天然コードアミノ酸などの他のアミノ酸で置換し得る。別の例として、修飾を行い、（１）Ｆｃ受容体結合部位を除去するために；（２）補体（Ｃｌｑ）結合部位を除去するために；及び／又は（３）抗体依存性細胞介在細胞毒性（ＡＤＣＣ）部位を除去するために、アミノ酸置換基を導入し得る。このような部位は、当技術分野で公知であり、本明細書中で使用する場合、いずれの公知の置換もＦｃの範囲内である。例えば、ＩｇＧＩのＡＤＣＣ部位に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，Ｎｏ．５，６３３−６３９（１９９２）を参照のこと。同様に、一つ以上のチロシン残基をフェニルアラニン残基で置換することができる。さらにその他の変異型アミノ酸挿入、欠失（例えば、１から２５アミノ酸）及び／又は置換ももくろんでおり、これらは本発明の範囲内にある。保存的アミノ酸置換が一般に好ましい。さらに、変更は、ペプチド模倣薬又はＤ−アミノ酸などの変更が施されたアミノ酸の形態であり得る。
【０２２６】
また、Ｆｃ配列を誘導体化し得る（即ち、アミノ酸残基の、挿入、欠失又は置換以外の修飾が施される。）。好ましくは、修飾は実際に共有結合であり、例えば、ポリマー、脂質、その他の有機部分及び無機部分との化学結合を含む。循環半減期を延長させるために本発明の誘導体を調製するか、又は所望する細胞、組織又は器官へのポリペプチドの標的化能力を向上させるように設計することができる。ＷＯ９６／３２４７８（題名「Ａｌｔｅｒｅｄ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｈａｌｆ−Ｌｉｆｅ」）に記載のように、本発明化合物のＦｃ部分として、そのままのＦｃ分子のサルベージ受容体結合ドメインを使用することも可能である。本明細書中でＦｃと呼ばれる分子のクラスのさらなるメンバーは、ＷＯ９７／３４６３１（題名「Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｌｉｎ−Ｌｉｋｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｈａｌｆ−Ｌｉｖｅｓ」）に記載のものである。この段落で引用した公開ＰＣＴ出願の両方を本明細書中に参照により組み込む。
【０２２７】
さらなるＡＢＰが将来的に発見されるであろう。予想されるタンパク質配列の、コンピュータを利用した二次構造及び三次構造解析により、及び特定の標的に結合する分子を同定するように設計された選択技術により、新しいＡＢＰを同定することができる。このような後に発見されるＡＢＰもまた、本発明内に含まれる。
【０２２８】
したがって、説明目的で、及び、単なる一例として、本明細書中に記載の、方法、組成物、ストラテジー及び技術の範囲を制限するものとしてではなく、ＡＢＰの説明を与える。さらに、本願でのＡＢＰ’ｓへの言及は、あらゆるＡＢＰの例として総称を使用するものとする。したがって、具体的な抗原結合ポリペプチド又はタンパク質に関する本明細書中に記載の修飾及び化学反応は、本明細書中で具体的に挙げたものを含め、あらゆる抗原結合ポリペプチドに同等に適用することができることを理解されたい。
【０２２９】
ＩＩＩ．本発明とともに使用するための一般的な組み換え核酸方法
本発明の多くの実施形態において、関心のあるＡＢＰをコードする核酸を単離し、クローニングし、多くの場合は、組み換え法を用いて変更を施す。以下に限定されないが、タンパク質発現に対して、又は変異型、誘導体、発現カセットもしくは抗原結合ポリペプチド由来のその他の配列の生成中に、このような実施形態を使用する。ある実施形態において、本発明のポリペプチドをコードする配列を異種プロモーターに操作可能に連結させる。
【０２３０】
親ポリペプチドのアミノ酸配列に基づき、次いで、適切なアミノ酸残基の導入（即ち取り込み又は置換）又は除去（即ち欠失又は置換）が為されるようにヌクレオチド配列を変化させて、非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を合成し得る。従来の方法に従い、部位特異的突然変異誘発法により、ヌクレオチド配列を都合よく修飾し得る。あるいは、以下に限定されないが、オリゴヌクレオチド合成装置を用いることによるもの（所望するポリペプチドのアミノ酸配列に基づきオリゴヌクレオチドを設計し、好ましくは、組み換えポリペプチドを産生させる宿主細胞において好適であるコドンを選択する。）を含む化学合成により、ヌクレオチド配列を調製し得る。例えば、所望するポリペプチドの部分をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、ＰＣＲ、ライゲーション又はライゲーション連鎖反応により組み立て得る。例えば、Ｂａｒａｎｙら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．  ８８：１８９−１９３（１９９１）；米国特許第６，５２１，４２７号（これらを本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０２３１】
本発明は、遺伝子組み換えの分野での通常の技術を利用する。本発明で役立つ一般的方法を開示する基礎的な教科書としては、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第３版、２００１）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９０）；及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９９４）が挙げられる。
【０２３２】
分子生物学技術を記載する一般的教科書としては、Ｂｅｒｇｅｒ及びＫｉｍｍｅｌ、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ｖｏｌｕｍｅ  １５２  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（Ｂｅｒｇｅｒ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（第２版）、Ｖｏｌ．１−３、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９（「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」）及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら、編、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ．ＩｎｃとＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．との合同出版（１９９９まで補充あり。）（「Ａｕｓｂｅｌ」）が挙げられる。これらの教科書は、突然変異誘発法、ベクターの使用、プロモーター及び、以下に限定されないが、非天然アミノ酸、直交化ｔＲＮＡ、直交化シンテターゼ及びそれらの組合せなどのタンパク質産生のためのセレクターコドンを含む遺伝子生成など、多くのその他の関連のある話題を記載している。
【０２３３】
様々な目的のために（以下に限定されないが、ｔＲＮＡライブラリの作製、シンテターゼのライブラリの作製、セレクターコドンの作製、関心のあるタンパク質又はポリペプチドにおける非天然アミノ酸をコードするセレクターコドンの挿入のために、など。）、様々なタイプの突然変異誘発法を本発明において使用する。これらには、以下に限定されないが、部位特異的、ランダムポイント突然変異誘発法、相同的組み換え、ＤＮＡシャッフル又はその他の繰り返し用いられる突然変異誘発法、キメラ構築、ウラシル含有テンプレートを用いた突然変異誘発法、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発法、ホスホロチオエート修飾ＤＮＡ突然変異誘発法、ギャップのある二本鎖ＤＮＡなどを用いた突然変異誘発法又はそれらの何らかの組合せが含まれる。さらなる適切な方法としては、ポイントミスマッチ修復（ｐｏｉｎｔ  ｍｉｓｍａｔｃｈ  ｒｅｐａｉｒ）、修復欠損宿主株を用いた突然変異誘発法、制限選択及び制限精製、欠失突然変異誘発法、トータル遺伝子合成による突然変異誘発法、二本鎖切断修復などが挙げられる。以下に限定されないがキメラ構築を含むものなどの、突然変異誘発法もまた本発明に含まれる。ある実施形態において、天然分子又は変更もしくは突然変異を施された天然分子の既知の情報（以下に限定されないが配列、配列比較、物理特性、二次構造、三次構造又は四次構造、結晶構造などを含む。）により、突然変異誘発を導くことができる。
【０２３４】
本明細書中で見出される教科書及び例は、これらの手段を記載する。さらなる情報は、以下の文献中で引用される次の刊行物及び参考文献において見出すことができる：Ｌｉｎｇら、Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ＤＮＡ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｏｖｅｒｖｉｅｗ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２５４（２）：１５７−１７８（１９９７）；Ｄａｌｅら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｒａｎｄｏｍ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｍｅｔｈｏｄ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５７：３６９−３７４（１９９６）；Ｓｍｉｔｈ，ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１９：４２３−４６２（１９８５）；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ及びＳｈｏｒｔｌｅ，Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９：１１９３−１２０１（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２３７：１−７（１９８６）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ＆  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．及びＬｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｊ．編、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ）（１９８７）；Ｋｕｎｋｅｌ，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｕｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：４８８−４９２（１９８５）；Ｋｕｎｋｅｌら、Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４、３６７−３８２（１９８７）；Ｂａｓｓら、Ｍｕｔａｎｔ  Ｔｒｐ  ｒｅｐｒｅｓｓｏｒ  ｗｉｔｈ  ｎｅｗ  ＤＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｉｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：２４０−２４５（１９８８）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａｎｙ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１０：６４８７−６５００（１９８２）；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｌｏｎｅｄ  ｉｎｔｏ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１００：４６８−５００（１９８３）；Ｚｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈ��Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａ  ｓｉｍｐｌｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｕｓｉｎｇ  ｔｗｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ａｎｄ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＤＮＡ  ｔｅｍｐｌａｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３２９−３５０（１９８７）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ  ｉｎ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｎｉｃｋｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７４９−８７６４（１９８５）；Ｔａｙｌｏｒら、Ｔｈｅ  ｒａｐｉｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｈｉｇｈ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＤＮＡ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：８７６５−８７８７（１９８５）；Ｎａｋａｍａｙｅ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｎｃｉ  Ｉ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｂｙ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ  ｇｒｏｕｐｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：９６７９−９６９８（１９８６）；Ｓａｙｅｒｓら、５’−３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）；Ｓａｙｅｒｓら、Ｓｔｒａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＤＮＡ  ｂｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ，（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：８０３−８１４；Ｋｒａｍｅｒら、Ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：９４４１−９４５６（１９８４）；Ｋｒａｍｅｒ及びＦｒｉｔｚ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｖｉａ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３５０−３６７（１９８７）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７２０７（１９８８）；Ｆｒｉｔｚら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ：ｇａｐｐｅｄ  ｄｕｐｌｅｘ  ＤＮＡ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｒｅａｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：６９８７−６９９９（１９８８）；Ｋｒａｍｅｒら、Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｂａｓｅ／ｂａｓｅ  ｍｉｓｍａｔｃｈｅｓ  ａｒｅ  ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｍｅｔｈｙｌ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  ｍｉｓｍａｔｃｈ−ｒｅｐａｉｒ  ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｃｅｌｌ  ３８：８７９−８８７（１９８４）；Ｃａｒｔｅｒら、Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４３１−４４４３（１９８５）；Ｃａｒｔｅｒ，Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍ１３  ｖｅｃｔｏｒｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４：３８２−４０３（１９８７）；Ｅｇｈｔｅｄａｒｚａｄｅｈ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｔｏ  ｇｅｎｅｒａｔｅ  ｌａｒｇｅ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：５１１５（１９８６）；Ｗｅｌｌｓら、Ｉｍｐｏｒｔａｎｃｅ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ−ｂｏｎｄ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｔａｂｉｌｉｚｉｎｇ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ  ｓｔａｔｅ  ｏｆ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｐｈｉｌ．Ｔｒａｎｓ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｌｏｎｄ．Ａ３１７：４１５−４２３（１９８６）；Ｎａｍｂｉａｒら、Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２３：１２９９−１３０１（１９８４）；Ｓａｋｍａｒ及びＫｈｏｒａｎａ，Ｔｏｔａｌ  ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ  ａｎｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｇｅｎｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｒｏｄ  ｏｕｔｅｒ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｇｕａｎｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６３６１−６３７２（１９８８）；Ｗｅｌｌｓら、Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：ａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｔ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｉｔｅｓ，Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３（１９８５）；Ｇｒｕｎｄｓｔｏｅｍら、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｍｉｃｒｏｓｃａｌｅ  「ｓｈｏｔ−ｇｕｎ」ｇｅｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３３０５−３３１６（１９８５）；Ｍａｎｄｅｃｋｉ，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋ  ｒｅｐａｉｒ  ｉｎ  ｐｌａｓｍｉｄｓ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ：ａ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．８３：７１７７−７１８１（１９８６）；Ａｒｎｏｌｄ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｆｏｒ  ｕｎｕｓｕａｌ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：４５０−４５５（１９９３）；Ｓｉｅｂｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９：４５６−４６０（２００１）；Ｗ．Ｐ．Ｃ．Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０，３８９−９１（１９９４）；及びＩ．Ａ．Ｌｏｒｉｍｅｒ，Ｉ．Ｐａｓｔａｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３，３０６７−８（１９９５）。上記の方法の多くにおけるさらなる詳細は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  第１５４巻（これも、様々な突然変異誘発法に伴うトラブルシューティング問題に対する有用なコントロールについて述べている。）。で見出すことができる。
【０２３５】
本発明はまた、真核宿主細胞、非真核宿主細胞及び直交化ｔＲＮＡ／ＲＳペアを介した非天然アミノ酸のインビボ取り込みのための生物に関する。宿主細胞は、本発明のポリヌクレオチド又は、以下に限定されないが本発明のベクター（例えば、クローニングベクター又は発現ベクターであり得る。）などの、本発明のポリヌクレオチドを含むコンストラクトを用いて遺伝子操作（以下に限定されないが、形質転換、形質導入又はトランスフェクションなど。）されている。ベクターは、例えば、プラスミド、細菌、ウイルス、裸のポリヌクレオチド又は共役ポリヌクレオチドの形態であり得る。エレクトロポレーション（Ｆｒｏｍら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２、５８２４（１９８５））、ウイルスベクターによる感染、小さなビーズもしくは粒子のマトリクス内又は表面上の何れかに核酸を有する小粒子による高速弾丸貫入（Ｋｌｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３２７、７０−７３（１９８７））を含む標準的方法により、細胞及び／又は微生物にベクターを導入する。
【０２３６】
例えばスクリーニング段階、プロモーター活性化又は形質転換細胞の選択などの作業に対して適切なように改変した従来の栄養培地中で、操作した宿主細胞を培養することができる。トランスジェニック生物中においてこれらの細胞を場合によっては培養することができる。その他の有用な参考文献としては（以下に限定されないが細胞単離及び培養に関する（例えば続く核酸単離に関する）ものなどを含む。）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ（１９９４）Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ，Ａ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｂａｓｉｃ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，第３版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ及びそこで引用されている文献；Ｐａｙｎｅら、（１９９２）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ；Ｇａｍｂｏｒｇ及びＰｈｉｌｌｉｐｓ（編）（１９９５）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，Ｔｉｓｓｕｅ  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（Ｂｅｒｌｉｎ  Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）ならびに、Ａｔｌａｓ及びＰａｒｋｓ（編）Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉａ（１９９３）ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ．が挙げられる。
【０２３７】
標的核酸を細胞に導入するいくつかの周知の方法を利用可能であり、そのいずれも本発明で使用することができる。これらには、ＤＮＡを含有する細菌プロトプラストとの受容細胞の融合、エレクトロポレーション、衝撃法（ｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ  ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）及びウイルスベクターによる感染（下記でさらに述べる。）などが含まれる。本発明のＤＮＡコンストラクトを含有するプラスミド数を増幅するために、細菌細胞を使用することができる。対数増殖期まで細菌を増殖させ、細菌内のプラスミドを当技術分野で公知の様々な方法により単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋを参照のこと。）。さらに、細菌からのプラスミド精製のために、多くのキットが市販されている（例えば、ＥａｓｙＰｒｅｐＴＭ、ＦｌｅｘｉＰｒｅｐＴＭ、両方とも、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈより；ＳｔｒａｔａｇｅｎｅからのＳｔｒａｔａＣｌｅａｎＴＭ；及びＱｉａｇｅｎからのＱＩＡｐｒｅｐＴＭ）。次に、単離され精製されたプラスミドをさらに操作して、他のプラスミドを生成させ、細胞に対してトランスフェクションを行うか、又は生物に感染させるために関連ベクターに組み込むために使用する。一般的なベクターは、転写及び翻訳ターミネーター、転写及び翻訳開始配列、ならびに、特定の標的核酸の発現制御に有用なプロモーターを含有する。ベクターは、場合によっては、少なくとも１個の独立したターミネーター配列、真核もしくは原核細胞又は両方においてカセットの複製を可能にする配列（以下に限定されないが、シャトルベクターを含む。）及び原核生物及び真核細胞系両方に対する選択マーカーを含有する一般的発現カセットを含む。ベクターは、原核細胞、真核細胞又は好ましくはこの両方での複製及び組み込みに適切である。Ｇｉｌｉｍａｎ及びＳｍｉｔｈ，Ｇｅｎｅ  ８：８１（１９７９）；Ｒｏｂｅｒｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ，３２８：７３１（１９８７）；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，Ｂ，ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．６４３５：１０（１９９５）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｂｅｒｇｅｒ（全て先述）を参照のこと。クローニングに有用な、細菌及びバクテリオファージのカタログは、例えば、ＡＴＣＣにより与えられている（例えば、Ｔｈｅ  ＡＴＣＣ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ（１９９２）Ｇｈｅｒｎａら（編）、ＡＴＣＣにより出版。）。配列決定、クローニング及び分子生物学のその他の態様に対するさらなる基本的手段ならびに基礎となる理論的考察はまた、Ｗａｔｓｏｎら（１９９２）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ  第２版、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ，ＮＹで見出すことができる。さらに、基本的にあらゆる核酸（及び標準的又は非標準的であれ、実際にはあらゆる標識された核酸）を、Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ、ｍｃｒｃ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能。）、Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ、ｇｅｎｃｏ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能。）、ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉ��ｃ．（Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ、ｅｘｐｒｅｓｓｇｅｎ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能。）、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡ）及びその他の多くの業者などの、あらゆる様々な市販ソースからカスタム注文又は通常注文することができる。
【０２３８】
セレクターコドン
本発明のセレクターコドンは、タンパク質生合成機構の遺伝子コドンフレームワークを広げる。例えば、セレクターコドンには、以下に限定されないが、ユニークな３個の塩基コドン、非センスコドン、例えば、停止コドン（以下に限定されないが、アンバーコドン（ＵＡＧ）又はオパールコドン（ＵＧＡ）などを含む。）、非天然コドン、４以上の塩基コドン、レアコドンなどが含まれる。当業者にとって当然のことながら、少なくともＡＢＰの一部をコードする１つのポリヌクレオチド中に、以下に限定されないが、一つ以上、２以上、３を超える、４、５、６、７、８、９、１０以上、所望する遺伝子に導入することができる、様々な数のセレクターコドンが存在する。
【０２３９】
ある実施形態において、本発明は、真核細胞でのインビボの非天然アミノ酸の組み込みのための停止コドンであるセレクターコドンの使用を含む。例えば、以下に限定されないが、ＵＡＧを含む停止コドンを認識するＯ−ｔＲＮＡを作製し、所望する非天然アミノ酸を用いてＯ−ＲＳによりアミノアシル化する。このＯ−ｔＲＮＡは、天然の宿主アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼにより認識されない。以下に限定されないがＴＡＧを含む停止コドンを関心のあるポリペプチドの関心のある部位に導入するために、従来の部位特異的突然変異誘発法を使用することができる。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ら、（１９８８）、５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ、Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，７９１−８０２。Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び関心のあるポリヌクレオチドをコードする核酸をインビボで組み合せる場合、非天然アミノ酸をＵＡＧコドンに反応して取り込み、特定の位置に非天然アミノ酸を含有するポリペプチドを与える。
【０２４０】
真核宿主細胞を顕著に撹乱することなく、インビボでの非天然アミノ酸の取り込みを行うことができる。例えば、ＵＡＧコドンに対する抑制効率は、Ｏ−ｔＲＮＡ（以下に限定されないが、アンバーサプレッサーｔＲＮＡを含む。）と真核放出因子（以下に限定されないが、ｅＲＦ）（これは、停止コドンに結合し、リボソームからの伸長ペプチドの放出を開始させる。）との間の競合に依存するので、以下に限定されないが、Ｏ−ｔＲＮＡ及び／又はサプレッサーｔＲＮＡの発現レベルを向上させることなどにより、抑制効率を調節することができる。
【０２４１】
セレクターコドンはまた、延長したコドン（以下に限定されないが、４以上の塩基コドン、例えば、４、５、６以上の塩基コドンを含む。）も含有する。４塩基コドンの例としては、以下に限定されないが、ＡＧＧＡ、ＣＵＡＧ、ＵＡＧＡ、ＣＣＣＵなどが挙げられる。５個の塩基コドンの例としては、以下に限定されないが、ＡＧＧＡＣ、ＣＣＣＣＵ、ＣＣＣＵＣ、ＣＵＡＧＡ、ＣＵＡＣＵ、ＵＡＧＧＣなどが挙げられる。本発明の特性には、フレームシフト抑制に基づく、延長されたコドンを用いることが含まれる。４以上の塩基コドンは、以下に限定されないが一つ以上の非天然アミノ酸などを同じタンパク質に挿入する。例えば、以下に限定されないがアンチコドンループ（例えば少なくとも８−１０ｎｔのアンチコドンループ）を有する特別なフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを含む、突然変異が入っているＯ−ｔＲＮＡの存在下で、４以上の塩基コドンを１個のアミノ酸として読む。他の実施形態において、以下に限定されないが、少なくとも４塩基のコドン、少なくとも５塩基のコドン又は少なくとも６塩基以上のコドンなどの、アンチコドンループを解読できる。２５６個の可能な四塩基コドンがあるので、４以上の塩基コドンを用いて、同じ細胞において複数の非天然アミノ酸をコードすることができる。Ａｎｄｅｒｓｏｎら、（２００２）Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｌｉｍｉｔｓ  ｏｆ  Ｃｏｄｏｎ  ａｎｄ  Ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  Ｓｉｚｅ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，９：２３７−２４４；Ｍａｇｌｉｅｒｙ，（２００１）Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｓ  ｏｆ  Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ａｎｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  「Ｓｈｉｆｔｙ」Ｆｏｕｒ−ｂａｓｅ  Ｃｏｄｏｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３０７：７５５−７６９を参照のこと。
【０２４２】
例えば、インビトロ生合成法を用いて非天然アミノ酸をタンパク質に取り込むために、四塩基コドンが使用されてきた。例えば、Ｍａら、（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２：７９３９；及びＨｏｈｓａｋａら、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：３４を参照のこと。ＣＧＧＧ及びＡＧＧＵを使用して、２個の化学的にアシル化したフレームシフトサプレッサーｔＲＮＡを用いて、インビトロでストレプトアビジンに２−ナフチルアラニン及びリジンのＮＢＤ誘導体を同時に取り込ませた。例えば、Ｈｏｈｓａｋａら、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１２１９４を参照のこと。インビボ実験において、Ｍｏｏｒｅらは、ＮＵＣＡアンチコドンを伴うｔＲＮＡ  Ｌｅｕ誘導体がＵＡＧＮコドンを抑制する能力を調べ（Ｎは、Ｕ、Ａ、Ｇ又はＣであり得る。）、０又は−１フレームでの解読がほとんどなく、１３％から２６％の効率で、クアドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）ＵＡＧＡが、ＵＣＵＡアンチコドンを伴うｔＲＮＡ  Ｌｅｕにより解読され得ることが分かった。Ｍｏｏｒｅら、（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９８：１９５を参照のこと。ある実施形態において、本発明にて、レアコドン又はナンセンスコドンに基づく延長コドンを使用することができ、他の不必要な部位で、ミスセンス、リードスルー及びフレームシフト抑制を減少させることができる。
【０２４３】
ある一定の系に対して、セレクターコドンはまた、天然の３塩基コドンのうち１個を含み得、内在性の系は、天然塩基コドンを使用しない（又は稀にしか使用しない。）。例えば、これには、天然の３塩基コドンを認識するｔＲＮＡを欠いている系及び／又は３塩基コドンがレアコドンである系が含まれる。
【０２４４】
セレクターコドンは、場合によっては、非天然塩基対を含む。これらの非天然塩基対はさらに、既存の遺伝子アルファベットを拡張する。１つの余分な塩基対により、６４から１２５にトリプレットコドン数が増加する。第三の塩基対の特性には、安定かつ選択的な塩基対形成、ポリメラーゼによる、ＤＮＡへの高性能の効率的な酵素的取り込み及び新生非天然塩基対の合成後の効率的な連続したプライマー伸長が含まれる。方法及び組成物に対して適応させることができる非天然塩基対の記述としては、例えば、Ｈｉｒａｏら（２００２）  Ａｎ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ｂａｓｅ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０：１７７−１８２が挙げられる。その他の適切な刊行物は下記で挙げる。
【０２４５】
インビボ利用の場合、非天然ヌクレオシドは膜透過性であり、リン酸化されて対応する三リン酸を形成する。さらに、さらに多くの遺伝情報は安定であり、細胞性酵素により破壊されない。Ｂｅｎｎｅｒら及びその他による以前の研究は、標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋペアにおけるものとは異なる水素結合パターンを利用しており、最も価値ある例は、Ｃ：ｉｓｏ−Ｇペアである。例えば、Ｓｗｉｔｚｅｒら、（１９８９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８３２２；及びＰｉｃｃｉｒｉｌｌｉら、（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ、３４３：３３；Ｋｏｏｌ、（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２を参照のこと。これらの塩基は通常、ある程度天然塩基と誤対合し、酵素的に複製することはできない。Ｋｏｏｌ及び共同研究者らは、塩基間の疎水性パッキング相互作用が水素結合を置換して、塩基対の形成を推進できることを明らかにした。Ｋｏｏｌ（２０００）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６０２；及びＧｕｃｋｉａｎ及びＫｏｏｌ、（１９９８）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３６，２８２５を参照のこと。上記の要求全てを満足させる非天然塩基対を開発する目的で、Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｒｏｍｅｓｂｅｒｇ及び共同研究者らは、一連の非天然疎水性塩基を体系的に合成し、研究を行った。ＰＩＣＳ：ＰＩＣＳ自己対合が、天然塩基対よりも安定で、Ｅ．コリ  ＤＮＡポリメラーゼＩ（ＫＦ）のＫｌｅｎｏｗ断片により、ＤＮＡに効率的に取り込まれ得ることが分かっている。例えば、ＭｃＭｉｎｎら、（１９９９）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２１：１１５８６；及びＯｇａｗａら、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：３２７４を参照のこと。ＫＦにより、生物機能に十分効率的かつ選択的に、３ＭＮ：３ＭＮ自己対合を合成することができる。例えば、Ｏｇａｗａら、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：８８０３を参照のこと。しかし、両塩基とも、さらなる複製に対して連鎖停止剤として作用する。突然変異ＤＮＡポリメラーゼは最近、ＰＩＣＳ自己対合を複製するために使用できることが分かった。さらに、７ＡＩ対合を複製することができる。例えば、Ｔａｅら、（２００１）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２３：７４３９を参照。Ｃｕ（ＩＩ）を結合した際に安定なペアを形成する、新規メタロ塩基対、Ｄｉｐｉｃ：Ｐｙもまた開発された。Ｍｅｇｇｅｒｓら、（２０００）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，１２２：１０７１４を参照のこと。延長コドン及び非天然コドンは、天然コドンに対して本質的に直交化なので、本発明の方法は、それらに対する直交化ｔＲＮＡを生成させるためにこの特性の長所を利用することができる。
【０２４６】
所望するポリペプチドにおいて非天然アミノ酸を取り込むために、翻訳回避系を使用することもできる。翻訳回避系において、長い配列を遺伝子に取り込むが、タンパク質に翻訳されない。この配列は、リボソームがその配列を跳び越すよう誘発し、挿入の下流で翻訳を開始するきっかけとして働く構造を含有する。
【０２４７】
ある一定の実施形態において、本発明の方法及び／又は組成物における、関心のあるタンパク質又はポリペプチド（又はその一部）が核酸によりコードされる。通常、核酸は、少なくとも１個のセレクターコドン、少なくとも２個のセレクターコドン、少なくとも３個のセレクターコドン、少なくとも４個のセレクターコドン、少なくとも５個のセレクターコドン、少なくとも６個のセレクターコドン、少なくとも７個のセレクターコドン、少なくとも８個のセレクターコドン、少なくとも９個のセレクターコドン、１０個以上のセレクターコドンを含有する。
【０２４８】
当業者にとって周知であり、本明細書中に記載の方法を用いて、関心のあるタンパク質又はポリペプチドをコードする遺伝子に対して突然変異誘発を行い、例えば、非天然アミノ酸の取り込みのための一つ以上のセレクターコドンを含むようにすることができる。例えば、関心のあるタンパク質に対する核酸に対して突然変異誘発を行い、一つ以上のセレクターコドンを含むようにし、それにより一つ以上の非天然アミノ酸が取り込まれるようにする。本発明は、あらゆるこのような変異型（以下に限定されないが、突然変異体、例えば少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むあらゆるタンパク質の型など。）を含む。同様に、本発明はまた、対応する核酸、即ち、一つ以上の非天然アミノ酸をコードする一つ以上のセレクターコドンを有する何らかの核酸も含む。
【０２４９】
ＡＢＰなどの関心のあるタンパク質をコードする核酸分子に対して容易に突然変異誘発を行い、ポリペプチドの何れかの所望の位置にシステインを導入し得る。反応性分子、水溶性ポリマー、タンパク質又は多岐にわたるその他の分子を関心のあるタンパク質に導入するために、システインが広く使用されている。抗原結合ポリペプチドの所望の位置にシステインを取り込むのに適切な方法は、米国特許第６，６０８，１８３号（本明細書中に参照により組み込む。）に記載のもの及び標準的突然変異誘発技術など、当技術分野で周知である。
【０２５０】
ＩＶ．非天然コードアミノ酸
非常に多岐にわたる非天然コードアミノ酸が本発明における使用に適切である。あらゆる数の非天然コードアミノ酸をＡＢＰに導入することができる。一般に、導入された非天然コードアミノ酸は、２０種類の一般的な遺伝子コードアミノ酸（即ち、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン及びバリン）に対して実質的に化学的に不活性である。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、効率的かつ選択的に２０種類の一般的なアミノ酸では見られない官能基（以下に限定されないが、アジド、ケトン、アルデヒド及びアミノオキシ基）と反応し、安定な共役物を形成する側鎖官能基を含む。例えば、アジド官能基を含有する非天然コードアミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドは、ポリマー（以下に限定されないが、ポリ（エチレングリコール）又はアルキン部分を含有する第二のポリペプチドを含む。）と反応し、アジド及びアルキン官能基の選択的反応を引き起こす安定な共役物を形成し、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化生成物を形成することができる。
【０２５１】
α−アミノ酸の一般構造を以下に示す（式Ｉ）：
【０２５２】
【化５】
2008503217.tif 000006
【０２５３】
非天然コードアミノ酸は、通常、上記で挙げた式（式中、Ｒ基は、２０種類の天然アミノ酸で使用されるもの以外の何らかの置換基であり、本発明での使用に適切であり得る。）を有するあらゆる構造である。本発明の非天然コードアミノ酸は通常、側鎖の構造のみが天然アミノ酸と異なるので、非天然コードアミノ酸は、天然ポリペプチドにおいてアミド結合が形成されるのと同様にして、以下に限定されないが天然又は非天然コードのものを含む他のアミノ酸とアミド結合を形成する。しかし、非天然コードアミノ酸は、天然アミノ酸と非天然アミノ酸とを区別する側鎖基を有する。例えば、Ｒは、場合によっては、アルキル−、アリール−、アシル−、ケト−、アジド−、ヒドロキシル−、ヒドラジン、シアノ−、ハロ−、ヒドラジド、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、セレノ−、スルホニル−、ホウ酸塩、ボロン酸塩、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環、エノン、イミン、アルデヒド、エステル、チオ酸、ヒドロキシルアミン、アミノ基など又はこれらの組合せを含む。本発明での使用に適切であり得る関心のあるその他の非天然アミノ酸には、以下に限定されないが、光活性化架橋を含有するアミノ酸、スピン標識アミノ酸、蛍光アミノ酸、金属結合アミノ酸、金属含有アミノ酸、放射性アミノ酸、新規官能基を有するアミノ酸、他の分子と共有又は非共有相互作用するアミノ酸、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）及び／又は光異性化アミノ酸、ビオチン又はビオチン類似体を含有するアミノ酸、糖置換セリンなどグリコシル化アミノ酸、その他の炭水化物修飾アミノ酸、ケト含有アミノ酸、ポリエチレングリコール又はポリエーテルを含有するアミノ酸、重原子置換アミノ酸、化学切断可能及び／又は光切断可能なアミノ酸、天然アミノ酸と比較して長い側鎖を有するアミノ酸（以下に限定されないが、ポリエーテル又は、約５を超える、又は約１０炭素を超える（これらに限定されない。）長鎖炭化水素など。）、炭素結合糖含有アミノ酸、酸化還元活性アミノ酸、アミノチオ酸含有アミノ酸及び一つ以上の毒性部分を含有するアミノ酸が含まれる。
【０２５４】
本発明における使用に適切であり得、水溶性ポリマーとの反応に有用である非天然コードアミノ酸の例としては、以下に限定されないが、カルボニル、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド、セミカルバジド、アジド及びアルキン反応基を有するものが挙げられる。ある実施形態において、非天然コードアミノ酸は、糖部分を含む。このようなアミノ酸の例としては、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−ガラクトサミニル−Ｌ−セリン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−スレオニン、Ｎ−アセチル−Ｌ−グルコサミニル−Ｌ−アスパラギン及びＯ−マンノサミニル−Ｌ−セリンが挙げられる。このようなアミノ酸の例としては、また、アミノ酸と糖との間の天然Ｎ−又はＯ−結合が、一般に天然では見られない共有結合（以下に限定されないが、アルケン、オキシム、チオエーテル、アミドなどを含む。）により置換されている例が挙げられる。このようなアミノ酸の例としてはまた、天然タンパク質では一般に見られない糖、例えば、２−デオキシ−グルコース、２−デオキシガラクトースなどが挙げられる。
【０２５５】
本明細書中で与えられる非天然コードアミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ部門、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＰｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から市販されている。場合によっては、本明細書中で与えるように、又は当業者にとって公知の標準的方法を用いて、市販されていないものを合成する。有機合成技術に関しては、例えば、Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｎｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第二版、Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙ及びＳｕｎｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、パートＡ及びＢ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。また、米国特許出願公開２００３／００８２５７５及び２００３／０１０８８８５（本明細書中に参照により組み込む。）も参照のこと。新規側鎖を含有する非天然アミノ酸に加えて、本発明での使用に適切であり得る非天然アミノ酸もまた、場合によっては、以下に限定されないが、式ＩＩ及びＩＩＩの構造で示されるような修飾骨格構造を含む：
【０２５６】
【化６】
2008503217.tif 000007
2008503217.tif 000008
（式中、Ｚは、通常、ＯＨ、ＮＨ２、ＳＨ、ＮＨ−Ｒ’又はＳ−Ｒ’を含み；Ｘ及びＹは、同じ又は異なり得、通常、Ｓ又はＯを含み、Ｒ及びＲ’は、場合によっては同じ又は異なり得、通常、式Ｉを有する非天然アミノ酸に対して上記で述べたＲ基に対する構成成分の同じ一覧ならびに水素から選択される。）。例えば、本発明の非天然アミノ酸は場合によっては、式ＩＩ及びＩＩＩにより示されるように、アミノ又はカルボキシル基において置換を含む。このタイプの非天然アミノ酸には、以下に限定されないが、α−ヒドロキシ酸、α−チオ酸、α−アミノチオカルボキシレートが含まれ、以下に限定されないが、一般的な２０種類の天然アミノ酸に対応する側鎖又は非天然側鎖などを有する。さらに、α炭素における置換には、場合によっては、以下に限定されないが、Ｄ−グルタメート、Ｄ−アラニン、Ｄ−メチル−Ｏ−チロシン、アミノ酪酸などの、Ｌ、Ｄ又はα−α−２置換アミノ酸が含まれる。他の構造的代替物には、プロリン類似体ならびに、３、４、６、７、８及び９員環のプロリン類似体などの環状アミノ酸、置換β−アラニン及びγ−アミノ酪酸などのβ及びγアミノ酸が含まれる。
【０２５７】
多くの非天然アミノ酸は、チロシン、グルタミン、フェニルアラニンなどの天然アミノ酸に基づいており、本発明での使用に適切である。チロシン類似体としては、以下に限定されないが、パラ−置換チロシン、オルト−置換チロシン及びメタ置換チロシンが挙げられ、置換チロシンとしては、以下に限定されないが、ケト基（以下に限定されないが、アセチル基など）、ベンゾイル基、アミノ基、ヒドラジン、ヒドロキシアミン、チオール基、カルボキシ基、イソプロピル基、メチル基、Ｃ６−Ｃ２０直鎖もしくは分枝炭化水素、飽和もしくは不飽和炭化水素、Ｏ−メチル基、ポリエーテル基、ニトロ基、アルキニル基などが挙げられる。さらに、多置換アリール環ももくろまれる。本発明での使用に適切であり得るグルタミン類似体としては、以下に限定されないが、α−ヒドロキシ誘導体、γ−置換誘導体、環状誘導体及びアミド置換グルタミン誘導体が挙げられる。本発明での使用に適切であり得るフェニルアラニン類似体の例としては、以下に限定されないが、パラ−置換フェニルアラニン、オルト−置換フェニルアラニン及びメタ−置換フェニルアラニンが挙げられ、置換基としては、以下に限定されないが、ヒドロキシ基、メトキシ基、メチル基、アリル基、アルデヒド、アジド、ヨード、ブロモ、ケト基（以下に限定されないがアセチル基を含む。）、ベンゾイル、アルキニル基などが挙げられる。本発明での使用に適切であり得る非天然アミノ酸の具体例としては、以下に限定されないが、α−アセチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｏ−メチル−Ｌ−チロシン、Ｌ−３−（２−ナフチル）アラニン、３−メチル−フェニルアラニン、Ｏ−４−アリル−Ｌ−チロシン、４−プロピル−Ｌ−チロシン、トリ−Ｏ−アセチル−ＧｌｃＮＡｃβ−セリン、Ｌ−ドーパ、フッ素化フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニ、ｐ−アシル−Ｌ−フェニルアラニン、ｐ−ベンゾイル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ−ヨード−フェニルアラニン、ｐ−ブロモフェニルアラニン、ｐ−アミノ−Ｌ−フェニルアラニン、イソプロピル−Ｌ−フェニルアラニン及びｐ−プロパルギルオキシ−フェニルアラニンなどが挙げられる。本発明での使用に適切であり得る様々な非天然アミノ酸の構造の例は、例えば、ＷＯ２００２／０８５９２３（題名「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」を参照のこと。また、さらなるメチオニン類似体について、Ｋｉｉｃｋら、（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ９９：１９−２４も参照のこと。
【０２５８】
ある実施形態において、非天然アミノ酸（ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニンなど。）を含むＡＢＰの組成物を提供する。ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン及び、以下に限定されないが、タンパク質及び／又は細胞などを含有する様々な組成物も提供する。ある態様において、ｐ−（プロパルギルオキシ）−フェニルアラニン非天然アミノ酸を含む組成物は、さらに直交化ｔＲＮＡを含む。以下に限定されないが、直交化ｔＲＮＡに対してアミノアシル結合を介して共有結合で、直交化ｔＲＮＡの末端リボース糖の３’ＯＨ又は２’ＯＨに対して共有結合で、など、直交化ｔＲＮＡに非天然アミノ酸を（以下に限定されないが、共有結合により）結合させることができる。
【０２５９】
タンパク質に取り込むことができる非天然アミノ酸を介した化学部分は、様々な長所があり、これによりタンパク質の様々な操作が可能となる。例えば、ケト官能基はユニークな反応性を有するので、これによりヒドラジン−又はヒドロキシルアミン含有物質のあらゆる数を用いて、タンパク質をインビトロ及びインビボで選択的に修飾することができるようになる。重原子非天然アミノ酸は、例えば、Ｘ線構造データを位相整合するのに有用であり得る。非天然アミノ酸を用いた重原子の部位特異的導入によっても、重原子の位置を選択的かつ柔軟に選択できる。光反応性非天然アミノ酸（以下に限定されないが、ベンゾフェノン及びアリールアジド（以下に限定されないがフェニルアジドなど。）側鎖を有するアミノ酸など。）により、例えば、タンパク質の効率的なインビボ及びインビトロ光架橋連結が可能になる。光反応性非天然アミノ酸の例としては、以下に限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニン及びｐ−ベンゾイル−フェニルアラニンが挙げられる。次に、光反応基を与える時間的制御の励起により、光反応性非天然アミノ酸を有するタンパク質を任意に架橋することができる。ある実施形態において、以下に限定されないが、核磁気共鳴及び振動分光法などを使用した、局所構造及びダイナミクスのプローブとして、同位体標識したもの（以下に限定されないがメチル基など）で、非天然アミノのメチル基を置換することができる。アルキニル又はアジド官能基により、例えば、［３＋２］付加環化反応を介して、分子を用いてタンパク質を選択的に修飾できるようになる。
【０２６０】
アミノ末端でポリペプチドに組み込まれる非天然アミノ酸は、２０種類の天然アミノ酸において使用されるもの以外の何れかの置換基であるＲ基及び、α−アミノ酸に通常存在するＮＨ２基とは異なる第二の反応基から構成され得る（式Ｉ参照。）。同様の非天然アミノ酸を、α−アミノ酸に通常存在するＣＯＯＨ基とは異なる第二の反応基とともに、カルボキシル末端で取り込むことができる（式Ｉ参照。）。
【０２６１】
非天然アミノ酸の化学合成
本発明での使用に適切な非天然アミノ酸の多くは、例えば、Ｓｉｇｍａ（ＵＳＡ）又はＡｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ，ＵＳＡ）から市販されている。市販されていないものは、本明細書中で与えるようにして、又は様々な刊行物で与えるようにして、当業者にとって公知の標準的方法を用いて、場合によっては合成する。有機合成技術に関しては、例えば、Ｆｅｓｓｅｎｄｏｎ及びＦｅｓｓｅｎｄｏｎによるＯｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８２、第二版、Ｗｉｌｌａｒｄ  Ｇｒａｎｔ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｓｔｏｎ  Ｍａｓｓ．）；ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）；及びＣａｒｅｙ及びＳｕｎｂｅｒｇによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、パートＡ及びＢ、１９９０、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。非天然アミノ酸の合成について述べているさらなる刊行物としては、例えばＷＯ２００２／０８５９２３（題名「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」；Ｍａｔｓｕｏｋａら、（１９９５）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．，３８，４６６０−４６６９；Ｋｉｎｇ，Ｆ．Ｅ．及びＫｉｄｄ，Ｄ．Ａ．Ａ．（１９４９）Ａ  Ｎｅｗ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎｄ  ｏｆ  γ−Ｄｉｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｃ  Ａｃｉｄ  ｆｒｏｍ  Ｐｈｔｈｙｌａｔｅｄ  Ｉｎｔｅｒｍｅｄｉａｔｅｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３３１５−３３１９；Ｆｒｉｅｄｍａｎ，Ｏ．Ｍ．及びＣｈａｔｔｅｒｒｊｉ，Ｒ．（１９５９）Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ  ｏｆ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｓ  Ｍｏｄｅｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉ−Ｔｕｍｏｒ  Ａｇｅｎｔｓ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，３７５０−３７５２；Ｃｒａｉｇ，Ｊ．Ｃ．ら、（１９８８）Ａｂｓｏｌｕｔｅ  Ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ  ｏｆ  ７−Ｃｈｌｏｒｏ−４［［４−（ｄｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）−１−ｍｅｔｈｙｌｂｕｔｙｌ］ａｍｉｎｏ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｅ（Ｃｈｌｏｒｏｑｕｉｎｅ）．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５３、１１６７−１１７０；Ａｚｏｕｌａｙ，Ｍ．，Ｖｉｌｍｏｎｔ，Ｍ．及びＦｒａｐｐｉｅｒ，Ｆ．（１９９１）Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ  ａｓ  Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  Ａｎｔｉｍａｌａｒｉａｌｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２６，２０１−５；Ｋｏｓｋｉｎｅｎ，Ａ．Ｍ．Ｐ．及びＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８９）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ４−Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｄ  Ｐｒｏｌｉｎｅｓ  ａｓ  Ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ  Ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ  Ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５４、１８５９−１８６６；Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，Ｂ．Ｄ．及びＲａｐｏｐｏｒｔ，Ｈ．（１９８５）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｏｐｔｉｃａｌｌｙ  Ｐｕｒｅ  Ｐｉｐｅｃｏｌａｔｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  （＋）−��ｐｏｖｉｎｃａｍｉｎｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  Ｄｅｃａｒｂｏｎｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｉｎｉｕｍ  Ｉｏｎ  Ｃｙｃｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９８９：１８５９−１８６６；Ｂａｒｔｏｎら、（１９８７）Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｎｏｖｅｌ  ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｃｉｄｓ  ａｎｄ  Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｌ−ａｎｄ  Ｄ−ａ−Ａｍｉｎｏ−Ａｄｉｐｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｌ−ａ−ａｍｉｎｏｐｉｍｅｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅ  Ｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ．Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．４３：４２９７−４３０８；及びＳｕｂａｓｉｎｇｈｅら、（１９９２）Ｑｕｉｓｑｕａｌｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ：ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ  ｏｆ  ｂｅｔａ−ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ  ２−ａｍｉｎｏｐｒｏｐａｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｔ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｑｕｉｓｑｕａｌａｔｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｚｅｄ  ｓｉｔｅ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５：４６０２−７が挙げられる。また、特許出願、題名「Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｒｒａｙｓ」２００３年１２月２２日提出、第１０／７４４，８９９号及び２００２年１２月２２日出願の第６０／４３５，８２１号も参照のこと。
【０２６２】
Ａ．カルボニル反応基
カルボニル反応基を有するアミノ酸により、特に求核付加又はアルドール縮合を介して分子（以下に限定されないが、ＰＥＧ又はその他の水溶性分子など。）を連結する様々な反応が可能となる。
【０２６３】
典型的なカルボニル含有アミノ酸は、次のように表すことができる：
【０２６４】
【化７】
2008503217.tif 000009
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純アルキル（即ち、メチル、エチル又はプロピル）であり、ケトン部分がアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、Ｒ２は単純アルキル（即ち、メチル、エチル又はプロピル）であり、ケトン部分がアルキル側鎖に対してメタ位に位置する。
【０２６５】
ｐ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニン及びｍ−アセチル−（＋／−）−フェニルアラニンの合成は、Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている（本明細書中に参照により組み込む。）。当業者は、その他のカルボニル含有アミノ酸を同様に調製することができる。
【０２６６】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸を含有するポリペプチドを化学的に修飾して、反応性カルボニル官能基を生じさせる。例えば、隣接アミノ及びヒドロキシル基を有する官能基から、共役反応に有用なアルデヒド官能基を生じさせることができる。生物活性分子がポリペプチドである場合、例えば、Ｎ末端セリン又はスレオニン（通常存在するか、化学的もしくは酵素的消化により曝露され得る。）を使用し、過ヨウ素酸を用いて穏やかな酸化的開裂条件下で、アルデヒド官能基を生じさせることができる。例えば、Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：２６２−２６８（１９９２）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．及びＳｔｒｏｈ，Ｊ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｇａｅｒｔｎｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：７２２４−７２３０（１９９４）を参照のこと。しかし、当技術分野で公知の方法は、ペプチド又はタンパク質のＮ末端のアミノ酸に限定されている。
【０２６７】
本発明において、隣接ヒドロキシル及びアミノ基を有する非天然コードアミノ酸を「マスクされた」アルデヒド官能基として、ポリペプチドに取り込むことができる。例えば、５−ヒドロキシリジンは、εアミンに隣接したヒドロキシル基を有する。アルデヒドを生成させるための反応条件は、通常、ポリペプチド内の他の部位で酸化を避けるために穏やかな条件下でメタ過ヨウ素酸ナトリウムの過剰モルを添加することを含む。酸化反応のｐＨは、通常、約７．０である。典型的な反応は、ポリペプチドの緩衝化溶液にメタ過ヨウ素酸ナトリウム約１．５モル濃度過剰量を添加し、続いて、暗所で約１０分間インキュベートすることを含む。例えば、米国特許第６，４２３，６８５号（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０２６８】
水溶液中で、穏やかな条件下にて、カルボニル官能基を選択的にヒドラジン−、ヒドラジド−、ヒドロキシルアミン−又はセミカルバジド含有物質と反応させて、生理的条件下で安定な、対応するヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾン結合をそれぞれ形成させることができる。例えば、Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．８１，４７５−４８１（１９５９）；Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｍ，Ｊ．Ｐ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照のこと。さらに、カルボニル基のユニークな反応性により、他のアミノ酸側鎖の存在下での選択的な修飾が可能となる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１８：８１５０−８１５１（１９９６）；Ｇｅｏｇｈｅｇａｎ，Ｋ．Ｆ．及びＳｔｒｏｈ，Ｊ．Ｇ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６（１９９２）；Ｍａｈａｌ，Ｌ．Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１１２５−１１２８（１９９７）を参照のこと。
【０２６９】
Ｂ．ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド反応基
ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジドなどの求核基を含有する非天然コードアミノ酸により、（以下に限定されないが、ＰＥＧ又はその他の水溶性ポリマーを用いたものなど）共役物を形成させるための様々な求電子基による反応が可能となる。
【０２７０】
ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド含有アミノ酸の例は、以下のように表すことができる：
【０２７１】
【化８】
2008503217.tif 000010
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルもしくは置換アリールであるか、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、ＮもしくはＳであるか、又は存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。
【０２７２】
ある実施形態において、ｎは４であり、Ｒ１存在せず、ＸはＮである。ある実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１は存在せず、Ｘは存在しない。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、この酸素原子は、アリール環のアルファティック（ａｌｐｈａｔｉｃ）基に対してパラ位にある。
【０２７３】
ヒドラジド−、ヒドラジン−及びセミカルバジド含有アミノ酸が市販されている。例えば、Ｌ−グルタメート−γ−ヒドラジドは、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から入手可能である。当業者は、市販のものを購入できないその他のアミノ酸を調製することができる。例えば、米国特許第６，２８１，２１１号（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０２７４】
アルデヒド又は同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド官能基を有する非天然コードアミノ酸を含有するポリペプチドと、を効率的かつ選択的に反応させることができる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｍ，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８９３−３８９９（１９９５）を参照のこと。ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジド官能基のユニークな反応性により、２０種類の一般的アミノ酸に存在する求核基（以下に限定されないが、セリンもしくはスレオニンのヒドロキシル基又はリジンのアミノ基及びＮ末端を含む。）と比較して、アルデヒド、ケトン及びその他の求電子基に対するそれらの反応性が顕著に高くなる。
【０２７５】
Ｃ．アミノオキシ含有アミノ酸
アミノオキシ（ヒドロキシルアミンとも呼ばれる。）基を含有する非天然コードアミノ酸により、（以下に限定されないが、ＰＥＧはその他の水溶性ポリマーなどとの）共役物を形成するための、様々な求電子基との反応が可能となる。ヒドラジン、ヒドラジド及びセミカルバジドのように、アミノオキシ基の求核性が高まることにより、アルデヒド又は同様の化学反応性を有する他の官能基を含有する様々な分子と効率的かつ選択的に反応できるようになる。例えば、Ｓｈａｏ，Ｊ．及びＴａｍ，，Ｊ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１７：３８３９−３８９９（１９９５）；Ｈ．Ｈａｎｇ及びＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ．Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．３４：７２７−７３６（２００１）を参照のこと。しかし、ヒドラジン基との反応により生じるものが対応するヒドラゾンである一方、オキシムは、通常、ケトンなどのカルボニル含有基とアミノオキシ基との反応に由来するものである。
【０２７６】
典型的なアミノ酸含有アミノオキシ基は、次のように表すことができる：
【０２７７】
【化９】
2008503217.tif 000011
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであるか又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在せず；ｍは０から１０であり；Ｙ＝Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、Ｙは存在する。ある実施形態において、ｎは２であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍは０であり、Ｙは存在しない。
【０２７８】
容易に入手できるアミノ酸前駆体（ホモセリン、セリン及びスレオニン）からアミノオキシ含有アミノ酸を調製することができる。例えば、Ｍ．Ｃａｒｒａｓｃｏ及びＲ．Ｂｒｏｗｎ、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６８：８８５３−８８５８（２００３）。Ｌ−２−アミノ−４−（アミノオキシ）酪酸などのある一定のアミノオキシ含有アミノ酸が天然源から単離された（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ，Ｇ．ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．６０：１６３５−１６４１（１９９７）。当業者は、その他のアミノオキシ含有アミノ酸を調製することができる。
【０２７９】
Ｄ．アジド及びアルキン反応基
アジド及びアルキン官能基のユニークな反応性により、ポリペプチド及び他の生物分子の選択的修飾にこれらの官能基が非常に有用となる。有機アジド、特にアルファティック（ａｌｐｈａｔｉｃ）アジド及びアルキンは、通常、通常の反応化学状態に対して安定である。特に、アジド及びアルキン官能基の両者とも、天然に生じるポリペプチドで見られる２０種類の一般的アミノ酸の側鎖（即ちＲ基）に対して不活性である。しかし、近接近させた場合、アジド及びアルキン基の「バネ仕掛け」のような性質が現れ、それらは、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応を介して選択的かつ効率的に反応し、対応するトリアゾールを生成させる。例えば、Ｃｈｉｎ，Ｊ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−７（２００３）；Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、３１９２−３１９３（２００３）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）を参照のこと。
【０２８０】
Ｈｕｉｓｇｅｎの付加環化反応は、求核置換ではなく、選択的付加環化反応を含むので（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，ら編、１９９１）、ｐ．１０６９−１１０９；Ｈｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．，１，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｐａｄｗａ，Ａ．編、１９８４）、ｐ．１−１７６）、アジド及びアルキン含有側鎖を有する非天然コードアミノ酸の取り込みによって、生じるポリペプチドが非天然コードアミノ酸の位置で選択的に修飾を受けることができるようになる。アジド又はアルキン含有ＡＢＰを含む付加環化反応は、Ｃｕ（ＩＩ）をＣｕ（Ｉ）に還元するための還元剤存在下で、インシトゥ、触媒量で、Ｃｕ（ＩＩ）（以下に限定されないが、ＣｕＳＯ４の触媒量の形態など）を添加することにより、室温にて、水性条件下で行うことができる。例えば、Ｗａｎｇ，Ｑ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５、３１９２−３１９３（２００３）；Ｔｏｒｎｏｅ，Ｃ．Ｗ．ら、Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４（２００２）；Ｒｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９（２００２）を参照のこと。典型的な還元剤としては、以下に限定されないが、アスコルビン酸塩、金属銅、キニン、ヒドロキノン、ビタミンＫ、グルタチオン、システイン、Ｆｅ２＋、Ｃｏ２＋及び加電圧が挙げられる。
【０２８１】
ある場合においては、アジドとアルキンとの間のＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応が必要とされる場合、抗原結合ポリペプチドは、アルキン部分を含有する非天然コードアミノ酸を含有し、アミノ酸に連結させる水溶性ポリマーは、アジド部分を含有する。あるいは、逆の反応を行うこともできる（即ち、アミノ酸上のアジド部分及び水溶性ポリマー上に存在するアルキン部分を用いる。）。
【０２８２】
アリールエステルを含有し、アリールホスフィン部分で適切に官能化された水溶性ポリマーとアジド官能基とを選択的に反応させて、アミド結合を生成させることもできる。アリールホスフィン基は、インシトゥでアジドを還元し、次に、生じたアミンが隣接するエステル結合と効率的に反応し、対応するアミドを生成させる。例えば、Ｅ．Ｓａｘｏｎ及びＣ．Ｂｅｒｔｏｚｚｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７、２００７−２０１０（２０００）を参照のこと。アジド含有アミノ酸は、アルキルアジド（以下に限定されないが、２−アミノ−６−アジド−Ｌ−ヘキサン酸を含む。）又はアリールアジド（ｐ−アジド−フェニルアラニン）の何れかであり得る。
【０２８３】
アリールエステル及びホスフィン部分を含有する典型的な水溶性ポリマーの例は、次のように表すことができる：
【０２８４】
【化１０】
2008503217.tif 000012
（式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーであり、ＲはＨ、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリール基であり得る。）。Ｒ基の例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ及び−ＮＯ２が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’はそれぞれ独立に、水素、置換もしくは非置換へテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（以下に限定されないが、１−３個のハロゲンで置換されたアリールを含む。）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基又はアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が、複数のＲ基を含む場合、例えば、各Ｒ基は、これらの基の複数が存在する場合、それぞれ、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基であるとして独立に選択される。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合する場合、これらは、窒素原子と一緒になって５、６又は７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、以下に限定されないが１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むものとする。置換基の上記考察から、「アルキル」という用語が、ハロアルキル（以下に限定されないが、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３を含む。）及びアシル（以下に限定されないが、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含む。）など、水素基以外の基に結合した炭素原子を含む基を含むものであることを当業者は理解するであろう。
【０２８５】
チオエステルを含有し、アリールホスフィン部分で適切に官能化されている水溶性ポリマーとアジド官能基を選択的に反応させて、アミド結合を生成させることもできる。アリールホスフィン基は、インシトゥでアジドを還元し、次に、生じたアミンがチオエステル結合と効率的に反応し、対応するアミドを生成させる。チオエステル及びホスフィン部分を含有する典型的な水溶性ポリマーは、次のように表すことができる：
【０２８６】
【化１１】
2008503217.tif 000013
（式中、ｎは１から１０であり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在しない場合もあり、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは、水溶性ポリマーである。）。
【０２８７】
典型的なアルキン含有アミノ酸は、次のように表すことができる：
【０２８８】
【化１２】
2008503217.tif 000014
（式中、ｎは０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキルもしくは置換アリールであるか又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在せず；ｍは０から１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり；Ｘは存在せず、ｍは０であり、アセチレン部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは１であり、プロパルギルオキシ基は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する（即ち、Ｏ−プロパルギル−チロシン）。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍは０である（即ち、プロパリルグリシン）。
【０２８９】
アルキン含有アミノ酸は市販されている。例えば、プロパルギルグリシンは、Ｐｅｐｔｅｃｈ（Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡ）から市販されている。あるいは、アルキン含有アミノ酸を標準的方法に従い調製することができる。例えば、Ｄｅｉｔｅｒｓ，Ａ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１１７８２−１１７８３（２００３）に記載のようにして、例えば、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンを合成することができ、Ｋａｙｓｅｒ，Ｂ．ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５３（７）：２４７５−２４８４（１９９７）に記載のようにして、４−アルキニル−Ｌ−フェニルアラニンを合成することができる。当業者は、その他のアルキン含有アミノ酸を調製することができる。
【０２９０】
典型的なアジド含有アミノ酸は、次のように表すことができる：
【０２９１】
【化１３】
2008503217.tif 000015
（式中、ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル、置換アリールであるか、又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在せず；ｍは０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１は、フェニルであり、Ｘは存在せず、ｍは０であり、アジド部分はアルキル側鎖に対してパラ位に位置する。ある実施形態において、ｎは０から４であり、Ｒ１及びＸは存在せず、ｍ＝０である。ある実施形態において、ｎは１であり、Ｒ１はフェニルであり、ＸはＯであり、ｍは２であり、β−アジドエトキシ部分は、アルキル側鎖に対してパラ位に位置する。
【０２９２】
アジド含有アミノ酸は市販されている。例えば、Ｃｈｅｍ−Ｉｍｐｅｘ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．（Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ，ＩＬ）から４−アジドフェニルアラニンを入手することができる。市販されていないアジド含有アミノの場合、以下に限定されないが、適切な脱離基（以下に限定されないが、ハロゲン化物、メシレート、トシレートなど。）の置換を介するか、又は適切に保護化ラクトンの開環を介するなど、当業者にとって公知の標準的方法を用いて、比較的容易にアジド基を調製することができる。例えば、ＭａｒｃｈによるＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（第三版、１９８５、Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。
【０２９３】
Ｅ．アミノチオール反応基
β−置換アミノチオール官能基のユニークな反応性により、チアゾリジンの形成を介した、ポリペプチド及びアルデヒド基を含有する他の生物分子の選択的修飾に、これらの官能基が非常に有用となる。例えば、Ｊ．Ｓｈａｏ及びＪ．Ｔａｍ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７（１４）３８３９−３８９９を参照のこと。ある実施形態において、β−置換アミノチオールアミノ酸をＡＢＰポリペプチドに取り込み、次いで、アルデヒド官能基を含有する水溶性ポリマーと反応させることができる。ある実施形態において、チアゾリジンの形成を介して、水溶性ポリマー、薬物共役物又はその他のペイロードをβ−置換アミノチオールアミノ酸を含有するＡＢＰポリペプチドにカップリングさせることができる。
【０２９４】
非天然アミノ酸の細胞取り込み
真核細胞による非天然アミノ酸取り込みは、以下に限定されないが、タンパク質への取り込みなど、非天然アミノ酸を設計し選択する際に通常考慮される１つの問題である。例えば、α−アミノ酸の電荷密度が高いことから、これらの化合物が細胞透過性であろうことが示唆される。天然アミノ酸は、タンパク質を利用した輸送系の回収を介して真核細胞に取り込まれる。もしあれば、どの非天然アミノ酸が細胞により取り込まれるかを評価するスクリーニングを迅速に行うことができる。例えば、題名「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｒｒａｙｓ」（２００３年１２月２２日提出）、第１０／７４４，８９９号及び第６０／４３５，８２１号（２００２年１２月２２日提出）における毒性アッセイ；及びＬｉｕ，Ｄ．Ｒ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．（１９９９）Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｔｏｗａｒｄ  ｔｈｅ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｏｒｇａｎｉｓｍ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｃｏｄｅ．ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ９６：４７８０−４７８５を参照のこと。様々なアッセイで取り込みを容易に分析できるが、細胞への取り込み経路に反応しやすい非天然アミノ酸の設計に対する代替手段は、インビボでアミノ酸を生成させるために生合成経路を与えることである。
【０２９５】
非天然アミノ酸の生合成
アミノ酸及び他の化合物の産生に対して、多くの生合成経路が細胞において既に存在する。特定の非天然アミノ酸に対する生合成法が天然には（以下に限定されないが、真核細胞においてなど。）存在し得ないが、本発明はこのような方法を提供する。例えば、新しい酵素を添加するか、又は既存の宿主経路を改変することにより、場合によっては非天然アミノ酸に対する生合成経路を宿主細胞において生じさせる。さらなる新しい酵素は、場合によっては天然酵素又は人工的に生じさせた酵素である。例えば、ｐ−アミノフェニルアラニンの生合成（ＷＯ２００２／０８５９２３、題名「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ」における実施例で与えられるように。）は、他の生物からの既知の酵素の組合せの添加に依存する。これらの酵素の遺伝子を含有するプラスミドを用いて細胞の形質転換を行い、これらの酵素の遺伝子を真核細胞に導入することができる。細胞中で発現させる場合、遺伝子は、所望する化合物を合成するための酵素的経路を与える。場合によっては添加されるこのタイプの酵素の例は、下記の実施例で与える。例えばＧｅｎｂａｎｋにおいて、さらなる酵素の配列が記載されている。人工的に生じさせた酵素もまた、場合によっては同様に細胞へ添加する。このようにして、細胞の機構及び細胞のリソースを操作して非天然アミノ酸を産生させる。
【０２９６】
生合成経路での使用のための、又は既存経路を進化させるための新規酵素を産生させるために、様々な方法を利用できる。例えば、以下に限定されないが、Ｍａｘｙｇｅｎ，Ｉｎｃ．（ｍａｘｙｇｅｎ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能）により開発されたものなど、繰り返して用いられる組み換えを場合によっては使用して、新規酵素及び経路を開発する。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、Ｒａｐｉｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｙ  ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ，Ｎａｔｕｒｅ  ３７０（４）：３８９−３９１；及びＳｔｅｍｍｅｒ（１９９４）、ＤＮＡ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｂｙ  ｒａｎｄｏｍ  ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅａｓｓｅｍｂｌｙ：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，９１：１０７４７−１０７５１を参照のこと。同様に、Ｇｅｎｅｎｃｏｒ（ｇｅｎｅｎｃｏｒ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能）により開発されたＤｅｓｉｇｎＰａｔｈＴＭを、場合によっては、以下に限定されないが、細胞でＯ−メチル−Ｌ−チロシンを生成させるために経路を操作することなど、代謝経路操作のために使用する。この技術により、以下に限定されないが機能的ゲノム科学により同定されたものなどの新しい遺伝子及び分子進化ならびに設計などの組合せを用いて、宿主生物において既存の経路を再構築する。Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（ｄｉｖｅｒｓａ．ｃｏｍのＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能）もまた、以下に限定されないが新しい経路を作るためなど、遺伝子ライブラリ及び遺伝子経路の迅速なスクリーニングのための技術を提供する。
【０２９７】
通常、操作を行った本発明の生合成経路を用いて産生される非天然アミノ酸は、効率的なタンパク質生合成に十分な濃度（以下に限定されないが、天然の細胞量など。）であるが、他のアミノ酸の濃度に影響を与えない、又は細胞リソースを枯渇させない程度に産生される。このようにしてインビボで産生される通常の濃度は、約１０ｍＭから約０．０５ｍＭである。特定の経路に必要な酵素を産生させるのに使用される遺伝子を含有するプラスミドを用いて細胞を形質転換し、非天然アミノ酸が生成されたら、リボソームタンパク質合成及び細胞増殖の両方に対して非天然アミノ酸の産生をさらに最適化するために、インビボ選択を場合によっては使用する。
【０２９８】
非天然アミノ酸を有するポリペプチド
以下に限定されないが、タンパク質構造及び／又は機能におけるテーラリング変更、サイズ、酸性度、求核性、水素結合、疎水性、プロテアーゼ標的部位の接近可能性の変更、部分（以下に限定されないが、タンパク質アレイに対してなど。）への標的化、生物活性分子の付加、ポリマーの結合、放射性核種の結合、血清半減期の調節、組織浸透性の調節（例えば腫瘍）、能動輸送の調節、組織、細胞又は器官特異性の調節、免疫原性の調節、プロテアーゼ抵抗性の調節など、様々な目的で非天然アミノ酸の取り込みを行うことができる。非天然アミノ酸を含むタンパク質は、触媒又は生物物理学的特性が向上しているか、又は完全に新しい触媒又は生物物理学的特性を有し得る。例えば、タンパク質に非天然アミノ酸を取り込ませることにより、次の特性を場合によっては変更する：毒性、生体内分布、構造特性、分光学的特性、化学及び／又は光化学的特性、触媒能、半減期（以下に限定されないが、血清半減期など。）、他の分子との反応能（以下に限定されないが、共有又は非共有的な反応など。）など。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含むタンパク質を含む組成物は、以下に限定されないが、新規治療、診断、触媒酵素、工業用酵素、結合タンパク質（以下に限定されないが、抗体など。）及び、以下に限定されないが、タンパク質構造及び機能の研究などに有用である。例えば、Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，（２０００）Ｕｎｎａｔｕｒａｌ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ  ａｓ  Ｐｒｏｂｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４：６４５−６５２を参照のこと。
【０２９９】
本発明のある態様において、組成物は、少なくとも１個の、以下に限定されないが、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個又は少なくとも１０以上などの、非天然アミノ酸を有する少なくとも１個のタンパク質を含む。非天然アミノ酸は、同じ又は異なるものであり得、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる非天然アミノ酸を含有するタンパク質において、以下に限定されないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の異なる部位があり得る。別の態様において、組成物は、少なくとも１個の、しかし、総数より少ない、タンパク質に存在する特定のアミノ酸が非天然アミノ酸で置換されているタンパク質を含む。複数の非天然アミノ酸を有するある一定のタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同じ又は異なるものであり得る（以下に限定されないが、タンパク質は、２以上の異なる型の非天然アミノ酸を含むか、又は同じ非天然アミノ酸２個を含み得る。）。２以上の非天然アミノ酸を有するある一定のタンパク質の場合、非天然アミノ酸は、同じもの、異なるもの、又は、同じ種の複数の非天然アミノ酸と少なくとも１個の異なる非天然アミノ酸との組合せであり得る。
【０３００】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する関心のあるＡＢＰ’ｓは、本発明の特徴である。本発明はまた、本発明の組成物及び方法を用いて産生された少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する、ポリペプチド又はタンパク質も含む。賦形剤（以下に限定されないが、医薬的に許容される賦形剤を含む。）もまた、タンパク質とともに存在し得る。
【０３０１】
少なくとも１個の非天然アミノ酸を有する関心のあるタンパク質又はポリペプチドを真核細胞において産生させることにより、タンパク質又はポリペプチドは通常、真核翻訳後修飾を含む。ある一定の実施形態において、タンパク質は、少なくとも１個の非天然アミノ酸及び真核細胞によりインビボで為された少なくとも１つの翻訳後修飾を含み、この翻訳後修飾は、原核生物細胞では行われない。例えば、翻訳後修飾には、以下に限定されないが、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミテート付加、リン酸化、糖脂質結合修飾、グリコシル化などが含まれる。ある態様において、翻訳後修飾は、ＧｌｃＮＡｃ−アスパラギン結合によるオリゴ糖（以下に限定されないが、（ＧｌｃＮＡｃ−Ｍａｎ）２−Ｍａｎ−ＧｌｃＮＡｃ−ＧｌｃＮＡｃ）など。）のアスパラギンへの結合を含む。真核タンパク質のＮ−結合オリゴ糖のいくつかの例を挙げた表１を参照のこと（さらなる残基も存在し得るが、示さない。）。別の態様において、翻訳後修飾は、ＧａｌＮＡｃ−セリン又はＧａｌＮＡｃ−スレオニン結合による、又はＧｌｃＮＡｃ−セリン又はＧｌｃＮＡｃ−スレオニン結合による、オリゴ糖（以下に限定されないが、Ｇａｌ−ＧａｌＮＡｃ、Ｇａｌ−ＧｌｕＮＡｃなどを含む。）のセリン又はスレオニンへの結合を含む。
【０３０２】
【表１】
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【０３０３】
さらに別の態様において、翻訳後修飾は、前駆体（以下に限定されないが、カルシトニン前駆体、カルシトニン遺伝子関連ペプチド前駆体、プレプロ副甲状腺ホルモン、プレプロインスリン、プロインスリン、プレプロ−オピオメラノコルチン、プロオピオメラノコルチンなど。）のタンパク質分解プロセシング、マルチサブユニットタンパク質へのアセンブリーもしくは巨大分子アセンブリー、細胞の別の部位（以下に限定されないが、小胞体、ゴルジ装置、核、リソソーム、ペルオキシソーム、ミトコンドリア、葉緑体、液胞などの細胞小器官へ、又は分泌経路を通じて、などを含む。）への変換を含む。ある一定の実施形態において、タンパク質は、分泌又は局在化配列、エピトープタグ、ＦＬＡＧタグ、ポリヒスチジンタグ、ＧＳＴ融合などを含む。
【０３０４】
非天然アミノ酸のある長所は、これが、さらなる分子を付加するために使用できるさらなる化学部分を与えることである。真核又は非真核細胞においてインビボで、又はインビトロで、これらの修飾を行い得る。したがって、ある一定の実施形態において、翻訳後修飾は、非天然アミノ酸によるものである。例えば、翻訳後修飾は、求核−求電子反応によるものであり得る。タンパク質の選択的修飾のために現在使用されている殆どの反応は、以下に限定されないが、ヒスチジン又はシステイン側鎖とのα−ハロケトンの反応など、求核反応パートナーと求電子反応パートナーとの間での共有結合形成を含む。これらの場合の選択性は、タンパク質中の求核残基の数及び接近可能性により決定される。本発明のタンパク質において、非天然ケト−アミノ酸とヒドラジド又はアミノオキシ化合物とのインビトロ及びインビボでの反応など、選択性のより高い他の反応を使用することができる。例えば、Ｃｏｒｎｉｓｈら、（１９９６）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１１８：８１５０−８１５１；Ｍａｈａｌら、（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２７６：１１２５−１１２８；Ｗａｎｇら、（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００；Ｃｈｉｎら、（２００２）Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：９０２６−９０２７；Ｃｈｉｎら、（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９９：１１０２０−１１０２４；Ｗａｎｇら、（２００３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００：５６−６１；Ｚｈａｎｇら、（２００３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４２：６７３５−６７４６；及びＣｈｉｎら、（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ（印刷中）を参照のこと。これにより、蛍光プローブ、架橋剤、糖誘導体及び細胞毒性分子を含む物質のホストによる、事実上あらゆるタンパク質の選択的標識が可能となる。米国特許仮出願第６０／４１９，２６５号（２００２年１０月１６日提出）、米国特許仮出願第６０／４２０，９９０号（２００２年１０月２３日提出）及び米国特許仮出願第６０／４４１，４５０号（２００３年１月１６日提出）に基づく、米国特許出願第１０／６８６，９４４号（題名「Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、２００３年１０月１５日提出も参照のこと（これらは、本明細書中に参照により組み込む。）。Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒライゲーションにより（以下に限定されないが、トリアリールホスフィン試薬を用いて。）、以下に限定されないが、アジドアミノ酸によるものなどの翻訳後修飾を為すことができる。例えば、Ｋｉｉｃｋら、（２００２）Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｚｉｄｅｓ  ｉｎｔｏ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ｃｈｅｍｏｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｓｔａｕｄｉｎｇｅｒ  ｌｉｇａｔｉｏｎ，ＰＮＡＳ９９：１９−２４を参照のこと。
【０３０５】
本発明は、タンパク質の選択的修飾のための別の高効率の方法を提供するが、この方法は、以下に限定されないが、セレクターコドンに反応してアジド又はアルキニル部分をタンパク質に含有させるなど、非天然アミノ酸の遺伝子による取り込みを含む。次に、以下に限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（例えば、Ｐａｄｗａ，Ａ．，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｖｏｌ．４，（１９９１）Ｔｒｏｓｔ，Ｂ．Ｍ．，Ｐｅｒｇａｍｏｎ編、Ｏｘｆｏｒｄ，ｐ．１０６９−１１０９；及びＨｕｉｓｇｅｎ，Ｒ．，１，３−Ｄｉｐｏｌａｒ  Ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８４）Ｐａｄｗａ，Ａ．編、Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐ．１−１７６を参照。）などにより、以下に限定されないが、アルキニル又はアジド誘導体などをそれぞれ用いて、これらのアミノ酸側鎖を修飾することができる。この方法は、求核置換ではなく付加環化を含むので、非常に高い選択性でタンパク質を修飾することができる。Ｃｕ（Ｉ）塩の触媒量を反応混合物に添加することにより、優れた位置選択性（１，４＞１，５）で、水性条件下、室温にてこの反応を行うことができる。例えば、Ｔｏｒｎｏｅら、（２００２）Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６７：３０５７−３０６４；及びＲｏｓｔｏｖｔｓｅｖら、（２００２）Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４１：２５９６−２５９９を参照のこと。使用できる別の方法は、テトラシステインモチーフを用いた、ビスヒ素化合物における配位子交換である（例えば、Ｇｒｉｆｆｉｎら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８１：２６９−２７２を参照のこと。）。
【０３０６】
［３＋２］付加環化により本発明のタンパク質に付加できる分子には、事実上、アジド又はアルキニル誘導体を有するあらゆる分子が含まれる。分子には、以下に限定されないが、色素、蛍光、架橋剤、糖誘導体、ポリマー（以下に限定されないが、ポリエチレングリコールの誘導体など。）、光架橋リンカー、細胞毒性化合物、親和性標識、ビオチンの誘導体、レジン、ビーズ、第二のタンパク質又はポリペプチド（又はさらなるもの。）、ポリヌクレオチド（以下に限定されないが、ＤＮＡ、ＲＮＡなど。）、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物などが含まれる。アルキニル基を有する非天然アミノ酸（以下に限定されないが、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンなど。）及びアジド基を有する非天然アミノ酸（以下に限定されないが、ｐ−アジド−フェニルアラニンなど。）に、これらの分子をそれぞれ付加することができる。
【０３０７】
Ｖ．非遺伝子コードアミノ酸を含有するＡＢＰのインビボ生成
修飾ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを用いて本発明の抗原結合ポリペプチドをインビボで生成させ、天然の系でコードされていないアミノ酸を付加又はこのようなアミノ酸で置換することができる。
【０３０８】
天然の系でコードされていないアミノ酸を使用する、ｔＲＮＡ及びｔＲＮＡシンテターゼを生成させるための方法は、例えば、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５号（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５号（第１０／１２６，９３１号）（これらを本明細書中に参照により組み込む。）で述べられている。これらの方法は、翻訳系に対して内在性である、シンテターゼ及びｔＲＮＡを独立に機能させる（したがって、「直交化」と呼ばれることがある。）翻訳機構を生成させることを含む。通常、この翻訳系は、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を含む。通常、Ｏ−ＲＳは、この翻訳系において少なくとも１個の非天然アミノ酸を有するＯｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化し、ＯｔＲＮＡは、この系において他のｔＲＮＡにより認識されない少なくとも１個のセレクターコドンを認識する。したがって、この翻訳系は、コードされたセレクターコドンに反応して、この系で産生されたタンパク質に非天然コードアミノ酸を挿入し、それにより、コードされたポリペプチドの位置においてアミノ酸の「置換」が起こる。
【０３０９】
特定の合成アミノ酸をポリペプチドに挿入するために、多岐にわたる直交化ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼが当技術分野で述べられており、これらは一般に本発明での使用に適切である。例えば、ケト特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが、Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １００：５６−６１（２００３）及びＺｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．４２（２２）：６７３５−６７４６（２００３）で述べられている。代表的なＯ−ＲＳ又はその一部はポリヌクレオチド配列によりコードされ、米国特許第出願公開第２００３／００８２５７５号及び２００３／０１０８８８５号（それぞれ、本明細書中に参照により組み込む。）に記載のアミノ酸配列を含む。Ｏ−ＲＳとの使用のための対応するＯ−ｔＲＮＡ分子もまた、米国特許願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５号（第１０／１２６，９３１号）（本明細書中に参照により組み込む。）に記載されている。
【０３１０】
アジド特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ系の例は、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）に記載されている。ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅに対するＯ−ＲＳ配列の代表例としては、米国特許第出願公開第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（本明細書中に参照により組み込む。）で記載されているように、以下に限定されないが、ヌクレオチド配列、配列番号：１４から１６及び２９から３２、及びアミノ酸配列、配列番号：４６から４８及び６１から６４が挙げられる。本発明での使用に適切なＯ−ｔＲＮＡ配列の代表例としては、米国特許第出願公開第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（本明細書中に参照により組み込む。）で記載されているように、以下に限定されないが、ヌクレオチド配列、配列番号：１から３が挙げられる。特定の非天然コードアミノ酸に特異的なＯ−ｔＲＮＡ／アミノアシルＬ−ｔＲＮＡシンテターゼペアのその他の例は、米国特許願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）（本明細書中に参照により組み込む。）で記載されている。Ｓ．セレビシエにおいてケト及びアジド両方を含有するアミノ酸を取り込む、Ｏ−ＲＳ及びＯ−ｔＲＮＡは、Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０１：９６４−９６７（２００３）に記載されている。
【０３１１】
Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの使用は、非天然コードアミノ酸をコードする特定のコドンの選択を含む。あらゆるコドンを使用できるが、通常、Ｏ−ｔＲＮＡ／アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼが発現される細胞において殆ど使用されないか、又は全く使用されないコドンを選択することが望ましい。例えば、代表的なコドンには、停止コドン（アンバー、オーカー及びオパール）などのナンセンスコドン、４以上の塩基のコドン及び、殆ど使用されないか又は全く使用されないその他の天然の３塩基コドンが含まれる。
【０３１２】
当技術分野で公知の突然変異誘発法（以下に限定されないが、部位特異的突然変異誘発法、カセット突然変異誘発法、制限選択突然変異誘発法などを含む。）を用いて、配列をコードするＡＢＰポリヌクレオチドにおいて、適切な位置に特異的セレクターコドンを導入することができる。
【０３１３】
非天然コードアミノ酸を取り込むために使用できる、Ｏ−ＲＳ、Ｏ−ｔＲＮＡ及び直交化Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアなどのタンパク質生合成機構の成分を生成させるための方法は、Ｗａｎｇ，Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９２：４９８−５００（２００１）；Ｃｈｉｎ，Ｊ．Ｗ．ら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４：９０２６−９０２７（２００２）；Ｚｈａｎｇ，Ｚ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：６７３５−６７４６（２００３）に記載されている。非天然コードアミノ酸のインビボ取り込みのための方法及び組成物は、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）（本明細書中に参照により組み込む。）に記載されている。生物のインビボ翻訳系での使用のための直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを選択する方法もまた、米国特許出願公開第２００３／００８２５７５（第１０／１２６，９２７号）及び同第２００３／０１０８８８５（第１０／１２６，９３１号）（本明細書中に参照により組み込む。）に記載されている。
【０３１４】
少なくとも１つの組み換え直交化アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を作製する方法は、（ａ）以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｏｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム）、ハロバクテリウム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ）、Ａ．フルギドゥス、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、Ｔ．サーモフィリスなどの原核生物又は真核生物などを含む、第一の生物から、少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）由来の（場合によっては突然変異体）ＲＳのライブラリを作製することと、（ｂ）非天然コードアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で、直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するメンバーに対してＲＳ（場合によっては突然変異体ＲＳ）のライブラリを選択（及び／又はスクリーニング）し、それにより活性のある（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールを提供することと；及び／又は（ｃ）（場合によってはネガティブ選択によって）非天然コードアミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する活性ＲＳ（以下に限定されないが、突然変異体ＲＳを含む。）に対するプールを選択して、それにより少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを提供することと、を含み；少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳが非天然コードアミノ酸を伴うＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する。
【０３１５】
ある実施形態において、ＲＳは、不活性ＲＳである。活性ＲＳに対して突然変異誘発を行うことにより、不活性ＲＳを生成させることができる。例えば、少なくとも約１、少なくとも約２、少なくとも約３、少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６又は少なくとも約１０以上のアミノ酸に対して、以下に限定されないがアラニンなどの、異なるアミノ酸へと突然変異誘発を行うことにより不活性ＲＳを生成させることができる。
【０３１６】
以下に限定されないが、タンパク質三次元ＲＳ構造に基づいた合理的設計又は、無作為もしくは合理的設計技術でのＲＳヌクレオチドの突然変異誘発などの当技術分野で公知の様々な技術を用いて、突然変異体ＲＳのライブラリを作製することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、多様性を生成する組み換え突然変異誘発、キメラ構築、合理的設計により、及び本明細書中に記載の、又は当技術分野で公知のその他の方法により、突然変異体ＲＳを生成させることができる。
【０３１７】
ある実施形態において、以下に限定されないが、非天然コードアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）をアミノアシル化するものなど、活性のあるメンバーに対してＲＳ（場合によっては突然変異体ＲＳ）のライブラリを選択（及び／又はスクリーニング）することには、ポジティブ選択及びスクリーニングマーカー（以下に限定されないが抗生物質耐性遺伝子など。）、ＲＳ（場合によっては突然変異体）のライブラリを複数の細胞に導入することと（ポジティブ選択及びスクリーニングマーカーは、少なくとも１個の、以下に限定されないがアンバー、オーカー又はオパールコドンなどの、セレクターコドンを含有する。）；選択物質の存在下で複数の細胞を増殖させることと；ポジティブ選択もしくはスクリーニングマーカーにおいて少なくとも１個のセレクターコドンを抑制することにより、セレクション及び／又はスクリーニング物質存在下で生存している（又は特異的反応を示す）細胞を同定することと（これにより、活性（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールを含有するポジティブ選択細胞のサブセットを提供する。）を含む。場合によっては、選択及び／又はスクリーニング物質濃度を変化させることができる。
【０３１８】
ある態様において、ポジティブ選択マーカーは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子であり、セレクターコドンは、ＣＡＴ遺伝子におけるアンバー停止コドンである。場合によっては、ポジティブ選択マーカーは、β−ラクタマーゼ遺伝子であり、セレクターコドンは、β−ラクタマーゼ遺伝子におけるアンバー停止コドンである。別の態様において、正のスクリーニングマーカーは、蛍光又は発光性のスクリーニングマーカー又は親和性を利用したスクリーニングマーカー（以下に限定されないが、細胞表面マーカーなど。）を含む。
【０３１９】
ある実施形態において、非天然コードアミノ酸の非存在下でＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する活性ＲＳ（場合によっては突然変異体）に対するプールのネガティブ選択又はスクリーニングは、ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーを、ポジティブ選択又はスクリーニングからの活性（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールとともに、第二の生物の複数の細胞に導入することと（このネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、少なくとも１個のセレクターコドンを含有する（以下に限定されないが抗生物質耐性遺伝子（以下に限定されないが、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子など。）を含む。）。）；非天然コードアミノ酸及びスクリーニング又は選択物質を添加した第一の培地において生存しているか又は特異的スクリーニング反応を示すが、非天然コードアミノ酸及びスクリーニング又は選択物質を添加しない第二の培地中で生存できないか又は特異的反応を示さない細胞を同定することと、を含み、それにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを伴う、生存細胞又はスクリーニング済み細胞を与える。例えば、適切なＯ−ＲＳ組み換え体の決定において、ＣＡＴ同定プロトコールは、場合によっては、ポジティブ選択及び／又はネガティブスクリーニングとして機能する。例えば、一つ以上の非天然コードアミノ酸の存在下、又は非存在下の何れかで、場合によっては、ＣＡＴを含有する（少なくとも１個のセレクターコドンを含有する。）クローンのプールを増殖プレート上に複製する。したがって、非天然コードアミノ酸を含有するプレート上で独占的に増殖するコロニーは、組み換えＯ−ＲＳを含有するとみなす。ある態様において、選択（及び／又はスクリーニング）物質の濃度が変化する。ある態様において、第一及び第二の生物は異なる。したがって、第一及び／又は第二の生物には、場合によっては、原核、真核、哺乳動物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などが含まれる。他の実施形態において、スクリーニングマーカーは、蛍光もしくは発光性スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む。
【０３２０】
別の実施形態において、活性（場合によっては突然変異体）ＲＳに対するプールをスクリーニング又は選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択など。）することは、活性のある突然変異体ＲＳのプールをポジティブ選択段階（ｂ）から単離することと；ネガティブ選択又はスクリーニングマーカー（ネガティブ選択又はスクリーニングマーカーは、少なくとも１個のセレクターコドンを含有する（以下に限定されないが、毒性マーカー遺伝子（以下に限定されないが、少なくとも１個のセレクターコドンを含む、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子など。）を含む。）。）及び活性のある（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールを第二の生物の複数の細胞に導入することと；非天然コードアミノ酸を添加していない第一の培地中で生存しているか又は特異的スクリーニング反応を示すが、非天然コードアミノ酸添加している第二の培地中で生存できないか又は特異的スクリーニング反応を示さない細胞を同定することと、を含み、それにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ（この少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳは、非天然コードアミノ酸に特異的である。）を伴う、生存細胞又はスクリーニング済み細胞を提供する。ある態様において、少なくとも１個のセレクターコドンとは、約２以上のセレクターコドンを含む。このような実施形態には、場合によっては、少なくとも１個のセレクターコドンが２以上のセレクターコドンを含む場合及び第一及び第二の生物が異なる（以下に限定されないが、各生物には、場合によっては、原核、真核、哺乳動物、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などが含まれる。）場合が含まれ得る。また、いくつかの態様には、ネガティブ選択マーカーがリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子を含む（少なくとも１個のセレクターコドンを含有する。）場合も含まれる。他の態様には、スクリーニングマーカーが、場合によっては、蛍光もしくは発光性スクリーニングマーカー又は親和性に基づくスクリーニングマーカーを含む場合が含まれる。本明細書中の実施形態において、スクリーニング及び／又は選択には、場合によっては、スクリーニング及び／又は選択ストリンジェンシーの変更が含まれる。
【０３２１】
ある実施形態において、少なくとも１つの組み換え直交化アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（Ｏ−ＲＳ）を生成させるための方法はさらに、（ｄ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳを単離することと；（ｅ）少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ由来の第二のＯ−ＲＳのセット（場合によっては突然変異）を生成させることと；（ｆ）Ｏ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する能力を含む突然変異Ｏ−ＲＳが得られるまで段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すことと、を含み得る。場合によっては、以下に限定されないが少なくとも約２回など、段階（ｄ）−（ｆ）を繰り返す。ある態様において、以下に限定されないがランダム突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、組み換え又はそれらの組合せなどの、突然変異誘発により、少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ由来の第二の突然変異Ｏ−ＲＳのセットを生成させることができる。
【０３２２】
上述の方法における、以下に限定されないが、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又は正及びネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）及び（ｃ）の両方などの、選択／スクリーニング段階のストリンジェンシーは、場合によっては、選択／スクリーニングストリンジェンシーを変更することを含む。別の実施形態において、ポジティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）、ネガティブ選択／スクリーニング段階（ｃ）又は正及びネガティブ選択／スクリーニング段階（ｂ）及び（ｃ）の両方は、受容体を使用することを含み、この場合、蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）により受容体を検出するか、又は発光により受容体を検出する。場合によっては、ファージディスプレイなどで、受容体を細胞表面に表示し、非天然コードアミノ酸又は類似体に関する親和性又は触媒活性に基づき、選択する。ある実施形態において、ファージディスプレイなどで、突然変異シンテターゼを細胞表面に表示する。
【０３２３】
組み換え直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）を生成させるための方法は、（ａ）第一の生物から、以下に限定されないがサプレッサーｔＲＮＡなどの少なくとも１つのｔＲＮＡ由来の突然変異体ｔＲＮＡのライブラリを作製することと；（ｂ）第一の生物からのＲＳの非存在下で、第二の生物由来のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡに対してライブラリの、選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択）又はスクリーニングを行うことと（これにより、ｔＲＮＡ（場合によっては突然変異体）のプールが与えられる。）；（ｃ）導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーに対してｔＲＮＡ（場合によっては突然変異体）のプールを選択又はスクリーニングすることと（これにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡが与えられる。）を含み；この少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第二の生物由来のＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより選択的にアミノアシル化される。ある実施形態において、少なくとも１つのｔＲＮＡは、サプレッサーｔＲＮＡであり、及び／又は、天然及び／又は非天然塩基のユニークな３塩基コドンを含有しするか、又はナンセンスコドン、レアコドン、非天然コドン、少なくとも４塩基を含有するコドン、アンバーコドン、オーカーコドンもしくはオパール停止コドンである。ある実施形態において、組み換えＯ−ｔＲＮＡは、直行性が向上している。当然のことながら、ある実施形態において、Ｏ−ｔＲＮＡは、改変の必要なく、場合によっては、第二の生物から第一の生物に持ち込まれる。様々な実施形態において、第一及び第二の生物は、同じであるか又は異なり、場合によっては、以下に限定されないが、原核生物（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、ハロバクテリウムなど。）、真核生物、哺乳動物、真菌、酵母、古細菌、真正細菌、植物、昆虫、原生生物などを含む。さらに、組み換えｔＲＮＡは、場合によっては、非天然コードアミノ酸によりアミノアシル化され、この場合、この非天然コードアミノ酸は、天然に又は遺伝子操作によりインビボで生合成される。非天然コードアミノ酸は、場合によっては、少なくとも第一又は第二の生物用の増殖培地に添加される。
【０３２４】
ある態様において、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによりアミノアシル化される（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡに対してライブラリの選択（以下に限定されないが、ネガティブ選択を含む）又はスクリーニングを行うこと（段階（ｂ））は、第二の生物由来の複数の細胞に毒性マーカー遺伝子（この場合、この毒性マーカー遺伝子は、少なくとも１つのセレクターコドン（又は毒性もしくはスタティック（ｓｔａｔｉｃ）物質の産生を導く遺伝子又は生物にとって必須の遺伝子（このようなマーカー遺伝子が少なくとも１個のセレクターコドンを含有する。））を含有する。）及び（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのライブラリを導入することと；生存細胞を選択することと（この場合、生存細胞は、少なくとも１つの直交化ｔＲＮＡ又は非機能的ｔＲＮＡを含む（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのプールを含有する。）を含む。例えば、細胞密度比較アッセイを用いて、生存細胞を選択することができる。
【０３２５】
別の態様において、毒性マーカー遺伝子は、２以上のセレクターコドンを含み得る。この方法の別の実施形態において、毒性マーカー遺伝子は、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子であり、このリボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、少なくとも１つのアンバーコドンを含有する。場合によっては、リボヌクレアーゼバルナーゼ遺伝子は、２以上のアンバーコドンを含み得る。
【０３２６】
ある実施形態において、導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーに対して（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのプールを選択又はスクリーニングすることは、ポジティブ選択又はスクリーニングマーカー遺伝子（この正のマーカー遺伝子は、薬物耐性遺伝子（以下に限定されないが、Ｏ−ＲＳとともに、少なくとも１つのアンバー停止コドンなどのセレクターコドンの少なくとも１つを含有するβ−ラクタマーゼ遺伝子など。）又はその生物に必須の遺伝子又は毒性物質の解毒を導く遺伝子を含有する。）及び（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのプールを第二の生物由来の複数の細胞に導入することと；以下に限定されないが抗生物質を含む、選択又はスクリーニング物質存在下で増殖させた、生存している又はスクリーニング済み細胞を同定することと（これにより少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡを有する細胞のプールを与える。）を含み得、この少なくとも１つの組み換えｔＲＮＡは、Ｏ−ＲＳによりアミノアシル化され、少なくとも１個のセレクターコドンに応答して、正のマーカー遺伝子によりコードされる翻訳産物にアミノ酸を挿入する。別の実施形態において、選択及び／又はスクリーニング物質の濃度が変更される。
【０３２７】
特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳのペアを生成させるための方法が与えられる。方法は、（ａ）第一の生物からの少なくとも１つのｔＲＮＡ由来の突然変異体ｔＲＮＡのライブラリを作製することと；（ｂ）第一の生物由来のＲＳ非存在下で、第二の生物由来のアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）によりアミノアシル化される（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡに対してライブラリをネガティブ選択又はスクリーニングすることと（これにより、（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのプールが与えられる。）；（ｃ）導入された直交化ＲＳ（Ｏ−ＲＳ）によりアミノアシル化されるメンバーに対して（場合によっては突然変異体）ｔＲＮＡのプールを選択又はスクリーニングすることと（これにより、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡが与えられる。）を含む。少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡは、セレクターコドンを認識し、第二の生物由来のＲＳにより効率的に認識されず、Ｏ−ＲＳにより選択的にアミノアシル化される。この方法はまた、（ｄ）第三の生物からの少なくとも１つのアミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）由来の（場合によっては突然変異体）ＲＳのライブラリを作製することと；（ｅ）非天然コードアミノ酸及び天然アミノ酸の存在下で、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化するメンバーに対して突然変異体ＲＳのライブラリを選択又はスクリーニングすることと（これにより、活性（場合によっては突然変異体）ＲＳのプールが与えられる。）；（ｆ）非天然コードアミノ酸非存在下で、少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する活性（場合によっては突然変異体）ＲＳに対して前記プールをネガティブ選択又はスクリーニングすることと（これにより、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアが与えられる。）を含み、少なくとも１つの特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアは、非天然コードアミノ酸に対して特異的な少なくとも１つの組み換えＯ−ＲＳ及び少なくとも１つの組み換えＯ−ｔＲＮＡを含有する。この方法により生成された特異的なＯ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳ対が含まれる。例えば、特異的Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアには、以下に限定されないが、ｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ｍｕｔＴｙｒＲＳペア、例えばｍｕｔＲＮＡＴｙｒ−ＳＳ１２ＴｙｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＬｅｕ−ｍｕｔＬｅｕＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＴｈｒ−ｍｕｔＴｈｒＲＳペア、ｍｕｔＲＮＡＧｌｕ−ｍｕｔＧｌｕＲＳペアなどが含まれ得る。さらに、このような方法は、第一及び第三の生物が同じである（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）など。）場合を含む。
【０３２８】
第二の生物のインビボでの翻訳系において使用するための直交化ｔＲＮＡ−ｔＲＮＡシンテターゼペアを選択するための方法もまた本発明に含まれる。この方法は、マーカー遺伝子、ｔＲＮＡ及び、第一の生物から単離された、又はこれに由来する、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＲＳ）を第二の生物由来の細胞の第一のセットに導入することと；マーカー遺伝子及びｔＲＮＡを第二の生物由来のデュプリケートの細胞セットに導入することと；デュプリケートの細胞セットにおいて生存できない第一のセットにおける生存細胞に対する選択を行うか、又はデュプリケートの細胞セットにおいてこのような反応を与えられない、特異的なスクリーニング応答を示す細胞に対するスクリーニングを行うこと、を含み、この場合、第一のセット及びデュプリケートの細胞セットを選択又はスクリーニング物質存在下で増殖させ、生存細胞又はスクリーニング済み細胞は、第二の生物のインビボでの翻訳系での使用のための直交化ｔＲＮＡ-ｔＲＮＡシンテターゼペアを含む。ある実施形態において、比較及び選択又はスクリーニングを行うことは、インビボ相補性試験を含む。選択又はスクリーニング物質の濃度は変更することができる。
【０３２９】
本発明の生物は、様々な生物及び様々な組合せを含む。例えば、本発明の方法の第一及び第二の生物は、同じであるか又は異なる。ある実施形態において、この生物には、場合によっては原核生物（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム）、ハロバクテリウム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、Ａ．フルギドゥス、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、Ｔ．サーモフィリスなど。）が含まれる。あるいは、この生物には、場合によっては、真核生物（以下に限定されないが、植物（以下に限定されないが、単子葉植物又は双子葉植物などの複雑植物など。）、藻類、原生生物、真菌（以下に限定されないが、酵母など。）、動物（以下に限定されないが、哺乳動物、昆虫、節足毒物など。）などが含まれる。別の実施形態において、第二の生物には、原核生物（以下に限定されないが、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）、Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃｕｍ（メタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム）、ハロバクテリウム、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（エスケリチア・コリ、大腸菌）、Ａ．フルギドゥス、Ｐ．フリオサス、Ｐ．ホリコシ、Ａ．ペルニクス、Ｔ．サーモフィリスなど。）が含まれる。あるいは、第二の生物は、真核生物（以下に限定されないが、酵母、動物細胞、植物細胞、真菌、哺乳類細胞など。）であり得る。様々な実施形態において、第一及び第二の生物の生物は様々である。
【０３３０】
ＶＩ．ＡＢＰにおける非天然アミノ酸の位置
本発明は、一つ以上の非天然アミノ酸のＡＢＰへの取り込みをもくろむ。ポリペプチドの活性を妨害しない特定の位置において一つ以上の非天然アミノ酸を取り込み得る。「保存的」置換（以下に限定されないが、疎水性アミノ酸の疎水性アミノ酸による置換、大きなアミノ酸の大きなアミノ酸による置換、親水性アミノ酸の親水性アミノ酸による置換など。）を行うことにより、及び／又は活性に必要のない位置に非天然アミノ酸を位置に挿入することにより、これを遂行することができる。
【０３３１】
様々な生化学的及び構造的アプローチを利用して、抗原結合ポリペプチド内で非天然コードアミノ酸を用いた置換を行うための所望の位置を選択することができる。当業者にとって当然のことながら、ポリペプチド鎖のあらゆる位置が、非天然コードアミノ酸を取り込むための選択に適切であり、選択は、合理的設計に基づくか、又は、何らかの所望の目的のための、又は所望の目的なしの、ランダム選択によるものであり得る。所望の部位の選択は、以下に限定されないが、アゴニスト、スーパーアゴニスト、逆アゴニスト、アンタゴニスト、受容体結合モジュレーター、受容体活性モジュレーター、二量体又は多量体形成などの、何らかの所望の特性又は活性を有するが、ネイティブ分子と比較して活性又は特性に変化がないＡＢＰ分子を産生するためのもの、又は、溶解性、凝集又は安定性などのポリペプチドの何らかの物理的又は化学的特性を操作するためのものであり得る。例えば、当技術分野で公知のアラニンスキャニング又はホモローグスキャニング法を用いてＡＢＰの生物活性に必要なポリペプチドにおける位置を同定することができる。アラニン又はホモローグスキャニング突然変異誘発により生物活性に重要と同定されるもの以外の残基は、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に依存した非天然コードアミノ酸による置換に適切な候補であり得る。あるいは、生物活性に重要と同定される部位もまた、ポリペプチドに対して求められる所望の活性に依存した非天然コードアミノ酸による置換に適切な候補であり得る。別の代替法は、ポリペプチド鎖の各位置において非天然コードアミノ酸で単純に連続した置換を行い、ポリペプチドの活性に対する影響を観察することであろう。当業者にとって当然のことながら、何らかのポリペプチドへの非天然アミノ酸による置換を行う位置を選択するための、あらゆる手段、技術又は方法が本発明での使用に適切である。
【０３３２】
非天然コードアミノ酸での置換に非寛容であると思われる残基を削除した後、残りの位置のそれぞれにおいてもくろまれている置換の影響を、その二次、三次もしくは四次構造又は抗原結合ポリペプチド及びその結合パートナーの三次元結晶構造から調べることができる。したがって、当業者は、非天然コードアミノ酸で置換できるアミノ酸位置を容易に同定することができる。
【０３３３】
非天然コードアミノ酸の取り込みの残基の代表例には、以下に限定されないが、可能性のある抗原結合領域から排除されるものが含まれ、これは、完全もしくは部分的に溶媒に曝露され、近隣の残基との水素結合相互作用がわずかであるか全くなく、近隣の反応残基への曝露が最小限であり得、ＡＢＰの曝露面の一つ以上上にあり得、第二のＡＢＰもしくはその他の分子又はそれらの断片と並列したＡＢＰの部位又は複数の部位であり得、ＡＢＰの三次元構造、二次、三次もしくは四次構造により推定したところ、非常に柔軟であるか又は構造的に硬く、その抗原に結合するかもしくは結合しないか、又は別のＡＢＰもしくはその他の生物活性分子にカップリングするかもしくはカップリングしない領域にあり得るか、又は所望のように完全構造の柔軟性及び剛性を変化させることによりＡＢＰそのものもしくは一つ以上のＡＢＰを含有する二量体もしくは多量体の立体構造を調節し得る。非天然アミノ酸の取り込みのための残基は、開裂配列、抗体断片もしくはＡＢＰを連結するリンカー配列、抗体結合ドメイン（以下に限定されないが、ｍｙｃタグ、ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓなど。）又はその他の親和性に基づく配列（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなど。）の一部であり得る。非天然アミノ酸の取り込みのための残基は、ＡＢＰのＮ末端もしくはＣ末端残基又はＡＢＰの非抗原結合残基であり得る。
【０３３４】
ＡＢＰのある一定の位置に対して、多岐にわたる非天然コードアミノ酸を置換するか、又は取り込むことができる。一般に、その抗原を伴うＡＢＰの三次元結晶構造又は、何らかの他の手段、保存的置換に対する優先性（即ち、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ又はＴｒｐに対して置換する、例えば、ｐ−アセチルフェニルアラニン又はＯ−プロパルギルチロシンなどの、アリールを基にした非天然コードアミノ酸。）及び抗原結合ポリペプチドに導入することを望む特異的共役化学（例えば、アルキン部分を有する水溶性ポリマーを用いてＨｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化を行いたい場合、又はアリールエステルを有する水溶性ポリマーを用いてアミド結合形成を行いたい場合（次に、ホスフィン部分を取り込む。）、４−アジドフェニルアラニンの導入。）により決定したＡＢＰの二次、三次又は四次構造を調べることにより、特定の非天然コードアミノ酸を取り込みのために選択する。
【０３３５】
ある実施形態において、本発明はさらに、タンパク質に非天然アミノ酸を取り込むことと（この非天然アミノ酸は、第一の反応基を含む。）；第二の反応基を含有する分子（以下に限定されないが、標識、色素、ポリマー、水溶性ポリマー、ポリエチレングリコールの誘導体、光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質又はポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光プローブ、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は、上記もしくは何らかのその他の所望の化合物もしくは物質の組み合わせを含む。）とそのタンパク質を接触させることと、を含む。第一の反応基が第二の反応基と反応し、［３＋２］付加環化を介して非天然アミノ酸に分子を連結させる。ある実施形態において、第一の反応基は、アルキニル又はアジド部分であり、第二の反応基はアジド又はアルキニル部分である。例えば、第一の反応基は、アルキニル部分（以下に限定されないが、非天然アミノ酸、ｐ−プロパルギルオキシフェニルアラニンにおいて、など。）であり、第二の反応基はアジド部分である。別の例において、第一の反応基はアジド部分であり（以下に限定されないが、非天然アミノ酸、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンにおいて、など。）、第二の反応基はアルキニル部分である。
【０３３６】
ある場合において、非天然コードアミノ酸置換を抗原結合ポリペプチド内の他の置換もしくは欠失と組み合わせて、ＡＢＰの他の生物学的特性に影響を与える。ある場合において、他の、付加、置換又は欠失により、ＡＢＰの安定性（以下に限定されないが、タンパク質分解性の分解に対する抵抗性など。）が向上するか、又はＡＢＰ受容体又は抗原に対するＡＢＰの親和性が向上し得る。ある場合において、他の、付加、置換又は欠失により、抗原結合ポリペプチドの溶解性（以下に限定されないが、Ｅ．コリ又はその他の宿主細胞で発現させた場合など。）が向上し得る。ある実施形態において、付加、置換又は欠失により、Ｅ．コリ又はその他の組み換え宿主細胞での発現後、ポリペプチド溶解性が向上し得る。ある実施形態において、Ｅ．コリ又はその他の組み換え宿主細胞での発現後、ポリペプチド溶解性が向上する非天然アミノ酸取り込みのための別の部位に加えて、天然コードアミノ酸又は非天然アミノ酸での置換のために部位を選択する。ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドは、ＡＢＰ受容体に対する親和性を調節する、受容体二量体化を調節する（以下に限定されないが、向上又は低下など。）、受容体二量体を安定化する、循環半減期を調節する、放出もしくはバイオアベイラビリティを調節する、精製を促進するか、又は特定の投与経路を改善するかもしくは変更する、別の付加、置換又は欠失を含む。同様に、抗原結合ポリペプチドは、化学的又は酵素切断配列、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗原結合ドメイン（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ又はポリ−Ｈｉｓなど）又はその他の親和性ベースの配列（以下に限定されないが、ＦＬＡＧ、ポリ−Ｈｉｓ、ＧＳＴなど。）又は、検出（以下に限定されないが、ＧＦＰなど。）、精製、組織もしくは細胞膜を介した輸送、プロドラッグ放出もしくは活性化、ＡＢＰサイズの縮小又はポリペプチドのその他の特性を促進する連結分子（以下に限定されないが、ビオチンなど。）を含有し得る。
【０３３７】
ある場合において、一つ以上の非天然コードアミノ酸で、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のアミノ酸を置換する。ある場合において、ＡＢＰはさらに、天然アミノ酸に対する、一つ以上の非天然コードアミノ酸の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の置換を含む。ある実施形態において、ＡＢＰの次の領域における少なくとも２つの残基を一つ以上の非天然コードアミノ酸で置換する。ある場合において、２以上の非天然コード残基を一つ以上のより低分子量の、直鎖状又は分枝状ＰＥＧ（質量でおよそ５から２０ｋＤａ以下）に連結させる（それにより、１個のより高分子量のＰＥＧと連結する種と比較して、結合親和性が高まり、血清半減期は同程度となる。）。
【０３３８】
ある実施形態において、抗原結合ポリペプチドの２個以下の残基を一つ以上の非天然コードアミノ酸で置換する。
【０３３９】
ＶＩＩ．非真核生物及び真核生物における発現
クローニングしたＡＢＰポリヌクレオチドを高レベルで発現させるために、通常、転写、転写／翻訳ターミネーターを支配するための強力なプロモーターを含有し、タンパク質をコードする核酸に対する場合は、翻訳開始のためのリボソーム結合部位を含有する発現ベクターに本発明の抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをサブクローニングする。適切な細菌プロモーターは、当技術分野で周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、及びＡｕｓｂｅｌｌらにより記載されている。
【０３４０】
本発明のＡＢＰポリペプチドを発現させるための細菌発現系は、以下に限定されないが、Ｅ．コリ、バチルス種、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレセンス、蛍光菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス・エアルギノサ、緑膿菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（シュードモナス・プチダ、プチダ菌）及びサルモネラなどにおいて利用可能である（Ｐａｌｖａら、Ｇｅｎｅ  ２２：２２９−２３５（１９８３）；Ｍｏｓｂａｃｈら、Ｎａｔｕｒｅ３０２：５４３−５４５（１９８３））。このような発現系のためのキットが市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核発現系は当技術分野で周知であり、これも市販されている。直交化ｔＲＮＡ及びアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（上述）を使用して本発明の抗原結合ポリペプチドを発現させる場合、直交化成分を宿主細胞が使用する能力に基づいて発現用の宿主細胞を選択する。代表的な宿主細胞としては、グラム陽性細菌（以下に限定されないが、Ｂ．ブレビス、Ｂ．サブチリス又はストレプトマイセスなど）及びグラム陰性細菌（Ｅ．コリ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレセンス、蛍光菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス・エアルギノサ、緑膿菌）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（シュードモナス・プチダ、プチダ菌）など。）、ならびに酵母及び他の真核細胞が挙げられる。本明細書中で記載のようにして、Ｏ−ｔＲＮＡ／Ｏ−ＲＳペアを含有する細胞を使用することができる。
【０３４１】
本発明の真核宿主細胞又は非真核宿主細胞により、大量の有用な量で非天然アミノ酸を含有するタンパク質を合成することができるようになる。ある態様において、この組成物は、場合によっては、以下に限定されないが、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を少なくとも１０マイクログラム、少なくとも５０マイクログラム、少なくとも７５マイクログラム、少なくとも１００マイクログラム、少なくとも２００マイクログラム、少なくとも２５０マイクログラム、少なくとも５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム、少なくとも１０ミリグラム、少なくとも１００ミリグラム、少なくとも１グラム以上含むか、又はインビボタンパク質産生方法により達成され得る量を含む（組み換えタンパク質産生及び精製に対する詳細は本明細書中で与える。）。別の態様において、このタンパク質は、場合によっては、以下に限定されないが、細胞溶解液、緩衝液、医薬緩衝液又はその他の懸濁液などの中で（以下に限定されないが、約１ｎＬから約１００Ｌなどの何れかの体積で）、以下に限定されないが、少なくとも１Ｌあたりタンパク質１０マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク質５０マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク質７５マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク１００マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク質２００マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク質２５０マイクログラム、少なくとも１Ｌあたりタンパク質５００マイクログラム、少なくとも１ミリグラム又は少なくとも１Ｌあたりタンパク質１０ミリグラム以上の濃度で、組成物中に存在する。少なくとも１個の非天然アミノ酸を含む真核細胞でのタンパク質の大量産生（以下に限定されないが、他の方法（以下に限定されないが、インビトロ翻訳など。）で通常可能なものを超える量など。）は、本発明の特徴である。
【０３４２】
本発明の真核宿主細胞又は非真核宿主細胞により、大量の有用な量で非天然アミノ酸を含有するタンパク質の生合成が可能となる。例えば、細胞抽出液、細胞溶解液、培養液、緩衝液などの中で、以下に限定されないが、少なくとも、タンパク質、１０μｇ／リットル、少なくとも５０μｇ／リットル、少なくとも７５μｇ／リットル、少なくとも１００μｇ／リットル、少なくとも２００μｇ／リットル、少なくとも２５０μｇ／リットル又は少なくとも５００μｇ／リットル、少なくとも１ｍｇ／リットル、少なくとも２ｍｇ／リットル、少なくとも３ｍｇ／リットル、少なくとも４ｍｇ／リットル、少なくとも５ｍｇ／リットル、少なくとも６ｍｇ／リットル、少なくとも７ｍｇ／リットル、少なくとも８ｍｇ／リットル、少なくとも９ｍｇ／リットル、少なくとも１０ｍｇ／リットル、少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００ｍｇ／リットル、１ｇ／リットル、５ｇ／リットル、１０ｇ／リットル以上のなどの濃度で、非天然アミノ酸を含有するタンパク質を産生させることができる。
【０３４３】
Ｉ．発現系、培養及び単離
例えば、酵母、昆虫細胞、哺乳動物細胞及び細菌を含む多くの適切な発現系においてＡＢＰを発現させ得る。代表的な発現系の説明を下記で行う。
【０３４４】
酵母
本明細書中で使用する場合、「酵母」という用語は、ＡＢＰをコードする遺伝子を発現することができるあらゆる様々な酵母を含む。このような酵母としては、以下に限定されないが、有子嚢酵母（Ｅｎｄｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ、エンドミケス）、担子胞子酵母及び、不完全菌類（分芽菌）に属する酵母が挙げられる。有子嚢酵母は、Ｓｐｅｒｍｏｐｈｔｈｏｒａｃｅａｅ（スペルモフトラセア）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ（サッカロミケス）の２種類の科に分けられる。後者は、４種類の亜科、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄａｅ（シゾサッカロミコイデ）（例えばシゾサッカロミセス属）、Ｎａｄｓｏｎｉｏｉｄｅａｅ（ナドソニオイデ）、Ｌｉｐｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ（リポミコイデ）及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｏｉｄｅａｅ（サッカロミコイデ）（例えば、ピチア属、クリベロミセス属及びサッカロミセス属）からなる。担子胞子酵母は、Ｌｅｕｃｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（ロイコスポリジウム）、Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ（ロドスポリジウム）、Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ（スポリジオボルス）、Ｆｉｌｏｂａｓｉｄｉｕｍ（フィロバシディウム）及びＦｉｌｏｂａｓｉｄｉｅｌｌａ（フィロバシディエラ）属を含む。不完全菌類（分芽菌）に属する酵母は、Ｓｐｏｒｏｂｏｌｏｍｙｃｅｔａｃｅａｅ（スポロボロミセタセア）（例えば、スポロボロミセス属及びブレラ属）及びＣｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｃｅａｅ（クリプトコッカセア）（例えばカンジダ属）の２種類の科に分けられる。
【０３４５】
本発明との使用に特に興味深いのは、ピチア属、クリベロミセス属、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ハンセヌラ属、トルロプシス属及びカンジダ属（以下に限定されないが、Ｐ．パストリス、Ｐ．グイレリモンディ、Ｓ．セレビシエ、Ｓ．カルルスベルゲンシス、Ｓ．ディアスタチクス、Ｓ．ダグラシ、Ｓ．クリベリ、Ｓ．ノルベンシス、Ｓ．オビフォルミス、Ｋ．ラクチス、Ｋ．フラギリス、Ｃ．アルビカンス、Ｃ．マルトーサ、及びＨ．ポリモルファなど。）内の種である。
【０３４６】
ＡＢＰの発現に適切な酵母の選択は、当業者の技術の範囲内である。発現のための酵母宿主の選択において、適切な宿主は、例えば、優れた分泌能、低タンパク質分解活性、優れた分泌能、優れた可溶タンパク質産生及び全体的なロバスト性を有することを示すものを含み得る。酵母は通常、以下に限定されないが、Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。
【０３４７】
「酵母宿主」「酵母宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた酵母を含む。この用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡを受容したオリジナルの酵母宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な突然変異のために、１個の親細胞の子孫は、オリジナルの親に対して形態もしくはゲノムＤＮＡもしくはトータルＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はない事を理解されたい。ＡＢＰをコードするヌクレオチド配列の存在など適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０３４８】
多くの酵母宿主への形質転換のために、染色体外レプリコン又は組み込みベクターを含む発現及び形質転換ベクターが開発されてきた。例えば、Ｓ．セレビシエ（Ｓｉｋｏｒｓｋｉら、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）１１２：１９；Ｉｔｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５３：１６３；Ｈｉｎｎｅｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９７８）７５：１９２９）；Ｃ．アルビカンス（Ｋｕｒｔｚら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）６：１４２）；Ｃ．マルトーサ（Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１）；Ｈ．ポリモルファ（Ｇｌｅｅｓｏｎら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８６）１３２：３４５９；Ｒｏｇｇｅｎｋａｍｐら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８６）２０２：３０２）；Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ（Ｄａｓら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８４）１５８：１１６５）；Ｋ．ラクチス（Ｄｅ  Ｌｏｕｖｅｎｃｏｕｒｔら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９８３）１５４：７３７；Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｅｒｇら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９０）８：１３５）；Ｐ．ギレリモンディ（Ｋｕｎｚｅら、Ｊ．Ｂａｓｉｃ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８５）２５：１４１）；Ｐ．パストリス（米国特許第５，３２４，６３９号；同第４，９２９，５５５号；及び同第４，８３７，１４８号；Ｃｒｅｇｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ（１９８５）５：３３７６）；Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ（Ｂｅａｃｈ及びＮｕｒｓｅ，Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）３００：７０６）；及びＹ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ（Ｄａｖｉｄｏｗら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：３８０（１９８５）；Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．（１９８５）１０：４９）；Ａ．ニドゥランス（Ｂａｌｌａｎｃｅら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．（１９８３）１１２：２８４−８９；Ｔｉｌｂｕｒｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２６：２０５−２１１；及びＹｅｌｔｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８４）８１：１４７０−７４）；Ａ．ニガー（Ｋｅｌｌｙ及びＨｙｎｅｓ，ＥＭＢＯ  Ｊ．（１９８５）４：４７５４７９）；Ｔ．レーシア（ＥＰ０２４４２３４）；及び糸状菌、例えば、アカパンカビ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウム属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、トリポクラディウム（Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ）（ＷＯ９１／００３５７）など（それぞれ本明細書中に参照により組み込む。）に対して発現ベクターが開発された。
【０３４９】
酵母ベクターに対する制御配列は当業者にとって周知であり、以下に限定されないが、アルコールデヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ）（ＥＰ０２８４０４４）；エノラーゼ；グルコキナーゼ；グルコース−６−リン酸イソメラーゼ；グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰ又はＧＡＰＤＨ）；ヘキソキナーゼ；ホスホフルクトキナーゼ；３−ホスホグリセレートムターゼ；及びピルベートキナーゼ（ＰｙＫ）（ＥＰ０３２９２０３）などの遺伝子からのプロモーター領域が挙げられる。酸性ホスファターゼをコードする酵母ＰＨＯ５遺伝子もまた、有用なプロモーター配列を提供し得る（Ｍｙａｎｏｈａｒａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８３）８０：１）。酵母宿主との使用に適切なその他のプロモーター配列は、３−ホスホグリセレートキナーゼに対するプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８０）２５５：２０７３）；及びその他の糖分解酵素、例えばピルベートデカルボキシラーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ及びホスホグルコースイソメラーゼ（Ｈｏｌｌａｎｄら、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９７８）１７：４９００；Ｈｅｓｓら、Ｊ．Ａｄｖ．Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｇ．（１９６８）７：１４９）が挙げられる。増殖条件により調節される転写のさらなる長所を有する誘導型酵母プロモーターには、アルコールデヒドロゲナーゼ２；イソチトクロムＣ；酸性ホスファターゼ；メタロチオネイン；グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ；窒素代謝に関与する分解酵素；及びマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素に対するプロモーター領域が含まれる。酵母発現での使用に適切なベクター及びプロモーターはさらにＥＰ００７３６５７に記載されている。
【０３５０】
酵母エンハンサーを酵母プロモーターと一緒に使用することもできる。さらに、合成プロモーターも酵母プロモーターとして機能し得る。例えば、酵母プロモーターの上流活性化配列（ＵＡＳ）を別の酵母プロモーターの転写活性領域と連結させることができ、これにより合成ハイブリッドプロモーターを作製できる。このようなハイブリッドプロモーターの例としては、ＧＡＰ転写活性化領域に連結させられたＡＤＨ制御配列が挙げられる。米国特許第４，８８０，７３４号及び同第４，８７６，１９７号（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。ハイブリッドプロモーターのその他の例としては、ＧＡＰ又はＰｙＫなどの糖分解酵素遺伝子の転写活性化領域と組み合わせた、ＡＤＨ２、ＧＡＬ４、ＧＡＬ１０又はＰＨＯ５遺伝子の制御配列からなるプロモーターが挙げられる。ＥＰ０１６４５５６号を参照のこと。さらに、酵母プロモーターは、酵母ＲＮＡポリメラーゼと結合し、転写を開始させる能力を有する非酵母由来の天然プロモーターを含む。
【０３５１】
酵母発現ベクターの一部を含み得る他の制御エレメントには、ターミネーター、例えば、ＧＡＰＤＨ又はエノラーゼ遺伝子由来のものが含まれる（Ｈｏｌｌａｎｄら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９８１）２５６：１３８５）。さらに、２μプラスミドオリジンからの複製起点は、酵母に適切である。酵母での使用に適切な選択遺伝子は、酵母プラスミドに存在するｔｒｐ１遺伝子である。Ｔｓｃｈｅｍｐｅｒら、（Ｇｅｎｅ（１９８０）１０：１５７；Ｋｉｎｇｓｍａｎら、Ｇｅｎｅ（１９７９）７：１４１を参照のこと。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中での増殖能を欠く酵母の突然変異株に対する選択マーカーを与える。同様に、Ｌｅｕ−２欠失酵母株（ＡＴＣＣ２０，６２２又は３８，６２６）は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドにより補完される。
【０３５２】
外来性ＤＮＡを酵母宿主に導入する方法は当業者にとって周知であり、一般に、以下に限定されないが、アルカリ陽イオンで処理された、スフェロプラスト又はインタクトな酵母宿主細胞の何れかの形質転換が含まれる。例えば、Ｈｓｉａｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．（１９７９）７６：３８２９及びＶａｎ  Ｓｏｌｉｎｇｅｎら、Ｊ．Ｂａｃｔ．（１９７７）１３０：９４６に記載の方法に従い、酵母の形質転換を行うことができる。しかし、核注入、エレクトロポレーション又はプロトプラスト融合など、細胞にＤＮＡを導入するためのその他の方法も、一般にＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂ．Ｍａｎｕａｌ（２００１）に記載のように使用し得る。次いで、当業者にとって公知の標準的技術を用いて、酵母宿主細胞を培養し得る。
【０３５３】
酵母宿主細胞において異種タンパク質を発現させるためのその他の方法は、当業者にとって周知である、一般に、米国特許公開第２００２００５５１６９号、米国特許第６，３６１，９６９号、同第６，３１２，９２３号；同第６，１８３，９８５号；同第６，０８３，７２３号；同第６，０１７，７３１号；同第５，６７４，７０６号；同第５，６２９，２０３号；同第５，６０２，０３４号及び同第５，０８９，３９８号；米国再審査特許第ＲＥ３７，３４３号及び同第ＲＥ３５，７４９号；ＰＣＴ公開特許出願ＷＯ９９／０７８６２１；ＷＯ９８／３７２０８；及びＷＯ９８／２６０８０；欧州特許出願ＥＰ０９４６７３６；ＥＰ０７３２４０３；ＥＰ０４８０４８０；ＥＰ０４６００７１；ＥＰ０３４０９８６；ＥＰ０３２９２０３；ＥＰ０３２４２７４；及びＥＰ０１６４５５６を参照のこと。また、Ｇｅｌｌｉｓｓｅｎら、Ａｎｔｏｎｉｅ  Ｖａｎ  Ｌｅｅｕｗｅｎｈｏｅｋ（１９９２）６２（１−２）：７９−９３；Ｒｏｍａｎｏｓら、Ｙｅａｓｔ（１９９２）８（６）：４２３−４８８；Ｇｏｅｄｄｅｌ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（１９９０）１８５：３−７（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）も参照のこと。
【０３５４】
当業者にとって周知である標準的なフィードバッチ発酵法を用いて、増幅段階の際、発酵装置中で酵母宿主株を増殖させ得る。この発酵法を採用して、特定の酵母宿主の炭素利用経路又は発現制御方式の違いを明らかにすることができる。例えば、サッカロミセス酵母宿主の発酵には、１つのグルコース供給、複合窒素源（例えばカゼイン加水分解物）及び複数ビタミンの供給が必要であり得る。対して、メチロトローフ酵母、Ｐ．パストリスは、グリセロール、メタノール及び微量元素の供給を必要とするが、最適な増殖及び発現のために、単純なアンモニウム（窒素）塩のみが必要である。例えば、米国特許第５，３２４，６３９号；Ｅｌｌｉｏｔｔら、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍ（１９９０）９：９５及びＦｉｅｓｃｈｋｏら、Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ．（１９８７）２９：１１１３（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０３５５】
しかし、このような発酵法は、使用する酵母宿主と無関係なある一定の一般的な特徴を有し得る。例えば、最大限に増殖させるために、増幅期の際に、増殖制限栄養、通常は炭素、を発酵装置に添加し得る。さらに、発酵法は通常、炭素、窒素、基本的塩、リン及びその他の微量栄養素（ビタミン、微量元素及び塩など。）の適正な量を含有するように設定された発酵培地を用いる。ピチアとともに使用するのに適切な発酵の例は、米国特許第５，３２４，６３９号及び同第５，２３１，１７８号（本明細書中に参照により組み込む。）に記載されている。
【０３５６】
バキュロウイルス感染昆虫細胞
「昆虫宿主」又は「昆虫宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた昆虫を指す。この用語は、トランスフェクトされたオリジナルの昆虫宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な突然変異のために、１個の親細胞の子孫は、オリジナルの親に対して形態又はゲノムＤＮＡもしくはトータルＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はないことを理解されたい。ＡＢＰをコードするヌクレオチド配列の存在など、適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０３５７】
ＡＢＰの発現に適切な昆虫細胞の選択は、当業者にとって周知である。ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）など、いくつかの昆虫種が当技術分野で詳しく記載されており、市販されている。発現のための昆虫宿主の選択において、適切な宿主は、例えば、優れた分泌能、低タンパク質分解活性及び全体的なロバスト性を有することを示すものを含み得る。昆虫は通常、以下に限定されないが、Ｉｎｓｅｃｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。
【０３５８】
一般に、バキュロウイルス感染昆虫発現系の成分には、トランスファーベクター、通常は、バキュロウイルスゲノムの断片及び発現させる異種遺伝子の挿入のための従来の制限部位の両方を含有する細菌プラスミド；トランスファーベクター中のバキュロウイルス特異的断片と相同な配列を有する野生型バキュロウイルス（これにより、バキュロウイルスゲノムへの異種遺伝子の相同組み換えが可能となる。）；及び適切な昆虫宿主細胞ならびに増殖培地が含まれる。ベクターの構築、細胞のトランスフェクション、プラークの回収、培養での細胞増殖などで使用される、材料、方法及び技術は、当技術分野で公知であり、これらの技術を記載するマニュアルが利用可能である。
【０３５９】
トランスファーベクターに異種遺伝子を挿入した後、ベクター及び野生型ウイルスゲノムを、ベクター及びウイルスゲノムの組み換えを行う昆虫宿主細胞にトランスフェクトする。パッケージングされた組み換えウイルスを発現させ、組み換えプラークを同定し、精製する。バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に対する材料及び方法は、キット形態で、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）から市販されている。これらの技術は通常、当業者にとって公知であり、Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）に詳しく記載されている（参照により本明細書中に組み込む。）。また、Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，３９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（１９９５）；Ａｕｓｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６．９−１６．１１（１９９４）；Ｋｉｎｇ及びＰｏｓｓｅｅ，Ｔｈｅ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｇｕｉｄｅ（１９９２）；及びＯ’Ｒｅ；ｌｌｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）も参照のこと。
【０３６０】
実際に、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いた様々な異種タンパク質産生が当技術分野で周知である。例えば、米国特許第６，３６８，８２５号；同第６，３４２，２１６号；同第６，３３８，８４６号；同第６，２６１，８０５号；同第６，２４５，５２８号、同第６，２２５，０６０号；同第６，１８３，９８７号；同第６，１６８，９３２号；同第６，１２６，９４４号；同第６，０９６，３０４号；同第６，０１３，４３３号；同第５，９６５，３９３号；同第５，９３９，２８５号；同第５，８９１，６７６号；同第５，８７１，９８６号；同第５，８６１，２７９号；同第５，８５８，３６８号；同第５，８４３，７３３号；同第５，７６２，９３９号；同第５，７５３，２２０号；同第５，６０５，８２７号；同第５，５８３，０２３号；同第５，５７１，７０９号；同第５，５１６，６５７号；同第５，２９０，６８６号；ＷＯ０２／０６３０５；ＷＯ０１／９０３９０；ＷＯ０１／２７３０１；ＷＯ０１／０５９５６；ＷＯ００／５５３４５；ＷＯ００／２００３２；ＷＯ９９／５１７２１；ＷＯ９９／４５１３０；ＷＯ９９／３１２５７；ＷＯ９９／１０５１５；ＷＯ９９／０９１９３；ＷＯ９７／２６３３２；ＷＯ９６／２９４００；ＷＯ９６／２５４９６；ＷＯ９６／０６１６１；ＷＯ９５／２０６７２；ＷＯ９３／０３１７３；ＷＯ９２／１６６１９；ＷＯ９２／０３６２８；ＷＯ９２／０１８０１；ＷＯ９０／１４４２８；ＷＯ９０／１００７８；ＷＯ９０／０２５６６；ＷＯ９０／０２１８６；ＷＯ９０／０１５５６；ＷＯ８９／０１０３８；ＷＯ８９／０１０３７；ＷＯ８８／０７０８２（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０３６１】
バキュロウイルス／昆虫細胞発現系に有用なベクターは、当技術分野で公知であり、例えば、ヘルパー非依存性のウイルス発現ベクターである、バキュロウイルス、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ（オートグラファカリフォルニカ）多角体病ウイルス核（ＡｃＮＰＶ）由来の、昆虫発現及びトランスファーベクターを含む。この系由来のウイルス発現ベクターは通常、強力なウイルスポリへドリン遺伝子プロモーターを使用して異種遺伝子の発現を駆動する。一般的に、Ｒｅｉｌｌｙら、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９９２）を参照のこと。
【０３６２】
バキュロウイルスゲノムに外来遺伝子を挿入する前に、プロモーター、リーダー（必要に応じて）、関心のあるコード配列及び転写終結配列を含む上述の成分を、通常、中間移行（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）コンストラクト（トランスファーベクター）に集める。中間移行（ｔｒａｎｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）コンストラクトは、細菌などの宿主において安定した維持が可能な染色体外エレメント（例えばプラスミド）など、レプリコンにおいて維持されることが多い。レプリコンは複製系を有し、したがって、これにより、クローニング及び増幅に適切な宿主において維持されるようになる。とりわけ、プラスミドは、ポリへドリンポリアデニル化シグナル（Ｍｉｌｌｅｒら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．（１９８８）４２：１７７）及び原核生物アンピシリン耐性（ａｍｐ）遺伝子及びＥ．コリでの選択及び増殖のための複製起点を含有し得る。
【０３６３】
外来遺伝子をＡｃＮＰＶに導入するための、よく使用されるあるトランスファーベクターは、ｐＡｃ３７３である。例えば、ｐＶＬ９８５（ポリへドリン開始コドンをＡＴＧからＡＴＴに変更し、ＡＴＴから３２塩基対下流にＢａｍＨＩクローニング部位を導入する。）をはじめ、当業者にとって公知である、多くのその他のベクターもまた設計されてきた。Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ、１７  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１（１９８９）を参照のこと。その他の市販ベクターとしては、例えば、ＰＢｌｕｅＢａｃ４．５／Ｖ５−Ｈｉｓ；ｐＢｌｕｅＢａｃＨｉｓ２；ｐＭｅｌＢａｃ；ｐＢｌｕｅＢａｃ４．５（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。
【０３６４】
異種遺伝子の挿入後、トランスファーベクター及び野生型バキュロウイルスゲノムを昆虫細胞宿主に共トランスフェクションする。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望の部位に導入するための方法は、当技術分野で公知である。Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６；Ｌｕｃｋｏｗ及びＳｕｍｍｅｒｓ、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ（１９８９）１７：３１を参照のこと。例えば、相同二重交叉組み換えにより、ポリへドリン遺伝子などの遺伝子に挿入し得、所望のバキュロウイルス遺伝子に組み込んだ制限酵素部位にも挿入し得る。Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ（１９８９）４：９１も参照のこと。
【０３６５】
エレクトロポレーションによりトランスフェクションを遂行し得る。Ｔｒｏｔｔｅｒ及びＷｏｏｄ，３９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：（１９９５）；Ｍａｎｎ及びＫｉｎｇ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）７０：３５０１を参照のこと。あるいは、リポソームを使用して、昆虫細胞に組み換え発現ベクター及びバキュロウイルスをトランスフェクションし得る。例えば、Ｌｉｅｂｍａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９９）２６（１）：３６；Ｇｒａｖｅｓら、ＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ（１９９８）３７：６０５０；Ｎｏｍｕｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３（２２）：１３５７０；Ｓｃｈｍｉｄｔら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９８）１２：３２３；Ｓｉｆｆｅｒｔら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９８）１８：４５；Ｔｉｌｋｉｎｓら、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  １４５−１５４（１９９８）；Ｃａｉら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ（１９９７）１０：２６３；Ｄｏｌｐｈｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ（１９９７）１７：４９１；Ｋｏｓｔら、Ｇｅｎｅ（１９９７）１９０：１３９；Ｊａｋｏｂｓｓｏｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１：２２２０３；Ｒｏｗｌｅｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１（３７）：２２３７６；Ｒｅｖｅｒｓｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９６）２７１（３９）：２３６０７−１０；Ｓｔａｎｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９５）２７０：４１２１；Ｓｉｓｋら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９４）６８（２）：７６６；及びＰｅｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ（１９９３）１４．２：２７４を参照のこと。市販のリポソームとしては、例えば、Ｃｅｌｌｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）及びＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（Ｒ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）が挙げられる。さらに、リン酸カルシウムトランスフェクションを使用し得る。Ｔｒｏｔｔｅｒ及びＷｏｏｄ、３９  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：（１９９５）；Ｋｉｔｔｓ，ＮＡＲ（１９９０）１８（１９）：５６６７；及びＭａｎｎ及びＫｉｎｇ、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８９）７０：３５０１を参照のこと。
【０３６６】
バキュロウイルス発現ベクターは通常、バキュロウイルスプロモーターを含有する。バキュロウイルスプロモーターは、バキュロウイルスＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる何らかのＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して置かれる転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。バキュロウイルスプロモーターはまた、エンハンサーと呼ばれる第二のドメインを有し得、これは、存在する場合、通常、構造遺伝子の遠位にある。さらに、発現が制御されるか又は構造的である。
【０３６７】
感染サイクルの後期に非常によく転写される構造遺伝子は、特に有用なプロモーター配列を与える。例としては、ウイルス性ポリへドロンタンパク質をコードする遺伝子（Ｆｒｉｅｓｅｎら、Ｔｈｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓｅｓ（１９８６）；ＥＰ０１２７８３９及び０１５５４７６）及びｐ１０タンパク質をコ―ドする遺伝子（Ｖｌａｋら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）６９；７６５）由来の配列が挙げられる。
【０３６８】
新たに形成されたバキュロウイルス発現ベクターを感染性組み換えバキュロウイルスにパッケージングし、続いて、増殖させたプラークを当業者にとって公知の技術で精製し得る。Ｍｉｌｌｅｒら、Ｂｉｏａｓｓｅｙｓ（１９８９）４：９１；Ｓｕｍｍｅｒｓ及びＳｍｉｔｈ，Ｔｅｘａｓ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｓｔａｔｉｏｎ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  Ｎｏ．１５５５（１９８７）を参照のこと。
【０３６９】
いくつかの昆虫細胞への感染のために、組み換えバキュロウイルス発現ベクターが開発されてきた。例えば、とりわけ、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ−１２５）、カイコ（Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−８９１０）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）（ＡＴＣＣ番号１９６３）、スポドプテラ・フルギペルタ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）及びイラクサギンウワバ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）に対して組み換えバキュロウイルスが開発されている。ＷＯ８９／０４６，６９９；Ｗｒｉｇｈｔ、Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：７１８；Ｃａｒｂｏｎｅｌｌら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．（１９８５）５６：１５３；Ｓｍｉｔｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８３）３：２１５６を参照のこと。一般的に、Ｆｒａｓｅｒら、Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  Ｃｅｌｌ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．（１９８９）２５：２２５を参照のこと。とりわけ、バキュロウイルス発現ベクター系に対して使用する細胞株としては、一般に、以下に限定されないが、Ｓｆ９（スポドプテラ・フルギペルタ）（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−１７１１）、Ｓｆ２１（スポドプテラ・フルギペルタ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、カタログ番号１１４９７−０１３（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））、Ｔｒｉ−３６８（イラクサギンウワバ）及びＨｉｇｈ−ＦｉｖｅＴＭＢＴＩ−ＴＮ−５Ｂ１−４（イラクサギンウワバ）が挙げられる。
【０３７０】
バキュロウイルス／発現における異種ポリペプチドの直接及び融合発現両方に対して、細胞及び培養用培地が市販されており、細胞培養技術は一般に当業者にとって公知である。
【０３７１】
Ｅ．コリ、緑膿菌種ならびにその他の原核生物
細菌発現技術は、当技術分野で周知である。細菌宿主での使用に対して多岐にわたるベクターが利用可能である。ベクターは、シングルコピー又は低もしくは高多コピーベクターであり得る。ベクターは、クローニング及び／又は発現に役立ち得る。ベクターに関する豊富な文献、多くのベクターが市販されていること、及びベクターならびにそれらの制限地図及び特性を記載するマニュアルを考慮すると、本明細書中で幅広い考察を行う必要はない。周知のとおり、ベクターは通常、選択を可能にするマーカーを含み、このマーカーは、細胞毒性物質耐性、原栄養性又は免疫性を規定し得る。しばしば、複数のマーカーが存在し、これらが様々な特性を規定する。
【０３７２】
細菌性プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、コード配列（例えば構造遺伝子）のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することができる何らかのＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端に近接して置かれる転写開始領域を有する。この転写開始領域は、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合部位及び転写開始部位を含む。細菌プロモーターはまた、オペレーターと呼ばれる第二のドメインも有し得、これは、ＲＮＡ合成が開始される隣接するＲＮＡポリメラーゼ結合部位と重複し得る。遺伝子リプレッサータンパク質がオペレーターに結合し得、それにより特異的遺伝子の転写が抑制されるので、オペレーターにより、負に制御された（誘導型）転写が可能となる。オペレーターなどの負の制御エレメントの非存在下で構造性発現が起こり得る。さらに、遺伝子活性化タンパク質結合配列により、正の制御を行い得、これは、存在する場合、通常、ＲＮＡポリメラーゼ結合配列に対して近位（５’）にある。遺伝子活性化タンパク質の一例は、カタボライト活性化タンパク質（ＣＡＰ）であり、これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．コリ、大腸菌）におけるｌａｃオペロンの転写開始を促進する（Ｒａｉｂａｕｄら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ／Ｇｅｎｅｔ．（１９８４）１８：１７３）。したがって、制御発現は、正又は負の何れかのものであり得、それにより、転写が促進されるか又は抑制させる。
【０３７３】
代謝経路酵素をコードする配列は、特に、有用なプロモーター配列を与える。一例として、ガラクトース、ラクトース（ｌａｃ）（Ｃｈａｎｇら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７７）１９８：１０５６）及びマルトースなどの糖代謝酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。さらなる例としては、トリプトファン（ｔｒｐ）（Ｇｏｅｄｄｅｌら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８０）８：４０５７；Ｙｅｌｖｅｒｔｏｎら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（１９８１）９：７３１；米国特許第４，７３８，９２１号；ＥＰ公開第０３６７７６号及び同第１２１７７５号（本明細書中に参照により組み込む。））などの生合成酵素由来のプロモーター配列が挙げられる。β−ガラクトシダーゼ（ｂｌａ）プロモーター系（Ｗｅｉｓｓｍａｎｎ（１９８１）「Ｔｈｅ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  ａｎｄ  ｏｔｈｅｒ  ｍｉｓｔａｋｅｓ．」Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ３（Ｉ．Ｇｒｅｓｓｅｒ編））、バクテリオファージλＰＬ（Ｓｈｉｍａｔａｋｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９８１）２９２：１２８）及びＴ５（米国特許第４，６８９，４０６号（本明細書中に参照により組み込む。））プロモーター系もまた有用なプロモーター配列を与える。本発明の好ましい方法は、Ｔ７プロモーターなどの強力なプロモーターを利用して、高レベルでＡＢＰを誘導する。このようなベクターの例は当技術分野で周知であり、これには、ＮｏｖａｇｅｎからのｐＥＴ２９シリーズ及びＷＯ９９／０５２９７（本明細書中に参照により組み込む。）に記載のｐＰＯＰベクターが含まれる。このような発現系は、宿主細胞生存能又は増殖パラメーターに影響を与えることなく宿主において高レベルのＡＢＰを産生する。ｐＥＴ１９（Ｎｏｖａｇｅｎ）は、当技術分野で公知の別のベクターである。
【０３７４】
さらに、天然にはない合成プロモーターもまた、細菌プロモーターとして機能する。例えば、ある細菌又はバクテリオファージプロモーターの転写活性化配列を別の細菌又はバクテリオファージプロモーターのオペロン配列と連結させて、合成ハイブリッドプロモーターを作製し得る（米国特許第４，５５１，４３３号（本明細書中に参照により組み込む。））。例えば、ｔａｃプロモーターは、ｔｒｐプロモーターと、ｌａｃリプレッサーにより制御されるｌａｃオペロン配列の両方からなる、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃプロモーターである（Ａｍａｎｎら、Ｇｅｎｅ（１９８３）２５：１６７；ｄｅ  Ｂｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８３）８０：２１）。さらに、細菌プロモーターは、細菌ＲＮＡポリメラーゼに結合し、転写を開始させることができる非細菌由来の天然プロモーターを含み得る。原核生物におけるいくつかの遺伝子を高レベルで発現させるために、非細菌由来の天然プロモーターを適合するＲＮＡポリメラーゼと組み合わせることもできる。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ／プロモーター系は、組合せプロモーター系の一例である（Ｓｔｕｄｉｅｒら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９８６）１８９：１１３；Ｔａｂｏｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（１９８５）８２：１０７４）。さらに、ハイブリッドプロモーターはまた、バクテリオファージプロモーター及びＥ．コリオペレーター領域から構成され得る（ＥＰ公開第２６７８５１）。
【０３７５】
機能するプロモーター配列に加え、原核細胞での外来遺伝子の発現に対しては効率的なリボソーム結合部位も有用である。Ｅ．コリにおいて、リボソーム結合部位は、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（ＳＤ）配列と呼ばれ、開始コドン（ＡＴＧ）及び開始コドンの３から１１ヌクレオチド上流に位置する３−９ヌクレオチド長の配列を含む（Ｓｈｉｈｅら、Ｎａｔｕｒｅ（１９７５）２５４：３４）。ＳＤ配列は、ＳＤ配列とＥ．コリ１６Ｓ  ｒＲＮＡの３’末端との間の塩基の対合によりｍＲＮＡのリボソームへの結合を促進すると考えられる（Ｓｔｅｉｔｚら、「Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｎｄ  ｎｕｃｅｌｔｉｄｅ  ｓｅｑｕｅｎｓｅｓ  ｉｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡ」、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ：Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（Ｒ．Ｆ．Ｇｏｌｄｂｅｒｇｅｒ編、１７９７））。弱いリボソーム結合部位により真核遺伝子及び原核遺伝子を発現させるために（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ」、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．１９８９）。
【０３７６】
「細菌宿主」又は「細菌宿主細胞」という用語は、組み換えベクター又はその他のトランスファーＤＮＡに対するレシピエントとして使用することができる、又は使用されてきた細菌を指す。この用語は、トランスフェクトされたオリジナルの細菌宿主細胞の子孫を含む。偶然又は意図的な突然変異のために、１個の親細胞の子孫は、オリジナルの親に対して形態又はゲノムＤＮＡもしくはトータルＤＮＡ相補体が必ずしも完全に同一である必要はないことを理解されたい。ＡＢＰをコードするヌクレオチド配列の存在など適切な特性を特徴とする親と十分に類似している親細胞の子孫は、この定義により意図される子孫に含まれる。
【０３７７】
ＡＢＰの発現に適切な宿主細菌の選択は、当業者にとって周知である。発現のための細菌宿主の選択において、適切な宿主は、とりわけ、優れた封入体形成能、低タンパク質分解活性及び全体的なロバスト性を有することを示すものを含み得る。細菌宿主は通常、以下に限定されないが、Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｈｙｓｉｃｓ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ，ＣＡ）及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（「ＡＴＣＣ」）（Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）などの様々なソースから入手可能である。工業的／製薬的発酵は通常、Ｋ株（例えばＷ３１１０）由来の細菌又はＢ株（例えばＢＬ２１）由来の細菌を使用する。これらの株は、その増殖パラメーターが非常によく知られておりロバストなので、特に有用である。さらに、これらの株は、非病原性であり、安全性及び環境面の理由で商業上重要である。本発明の方法のある実施形態において、Ｅ．コリ宿主は、ＢＬ２１の株である。本発明の方法の別の実施形態において、Ｅ．コリ宿主は、以下に限定されないがＯＭＰ−及びＬＯＮ−などの、プロテアーゼマイナス株である。本発明の方法の別の実施形態において、宿主細胞株は、以下に限定されないが、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレセンス）、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ（シュードモナス・エアルギノサ）及びＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ（シュードモナス・プチダ）などの緑膿菌種である。Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（シュードモナス・フルオレセンス）次亜種１（ＭＢ１０１株と呼ばれる。）は、組み換え産生に有用であることが知られており、治療用タンパク質産生過程で利用可能である。緑膿菌発現系の例としては、宿主株として、Ｔｈｅ  Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｉｄｌａｎｄ，ＭＩ、ｄｏｗ．ｃｏｍにおいてＷｏｒｌｄ  Ｗｉｄｅ  Ｗｅｂで利用可能。）から入手可能な系が挙げられる。米国特許第４，７５５，４６５号及び同第４，８５９，６００号（本明細書中に参照により組み込む。）は、ヒト成長ホルモン産生のための宿主細胞としての緑膿菌株の使用について述べている。
【０３７８】
組み換え宿主細胞株を確立（即ち、発現コンストラクトを宿主細胞に導入し、正しい発現コンストラクトを有する宿主細胞を単離する。）した後、ＡＢＰ産生に適切な条件下でその組み換え宿主細胞株を培養する。当業者にとって当然のことながら、組み換え宿主細胞株の培養方法は、利用する発現コンストラクトの性質及び宿主細胞が何であるかに依存する。当業者にとって周知である方法を用いて組み換え宿主株を普通に培養する。組み換え宿主細胞は通常、炭素、窒素及び無機塩の同化可能なソースを含有し、場合によっては、当業者にとって周知である、ビタミン、アミノ酸、増殖因子及びその他のタンパク性の培地補助物質を含有する液体培地中で培養する。宿主細胞培養用の液体培地は、望ましくない微生物の増殖を防ぐために抗生物質又は抗真菌剤を場合によっては含有し得、及び／又は、発現ベクターを含有する宿主細胞を選択するために、以下に限定されないが抗生物質などの化合物を含有し得る。
【０３７９】
組み換え宿主細胞をバッチ又は連続様式の何れかで培養し、細胞を回収するか（ＡＢＰが細胞内に蓄積する場合。）、又はバッチ又は連続様式で培養上清を回収し得る。原核生物宿主細胞で産生を行う場合、バッチ培養及び細胞回収が好ましい。
【０３８０】
組み換え系での発現後、本発明の抗原結合ポリペプチドを通常精製する。当業者にとって公知の様々な方法により、宿主細胞からＡＢＰを精製し得る。通常、細菌宿主細胞中で産生されたＡＢＰは、溶解性が低いか、又は不溶性である（封入体形態において）。本発明のある実施形態において、本明細書中で開示する、ならびに当業者にとって公知の方法を利用して、組み換え産生されたタンパク質の溶解性を高める目的で選択したアミノ酸置換を抗原結合ポリペプチドにおいて容易に行い得る。不溶性タンパク質の場合、遠心分離により宿主細胞細胞溶解液からタンパク質を回収し得、さらに続いて、細胞のホモジェナイズを行い得る。溶解性の乏しいタンパク質の場合、化合物（以下に限定されないが、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含む。）を添加して、ある程度可溶性のタンパク質の沈殿を誘導し得る。次に、沈殿したタンパク質を従来どおり遠心分離により回収し得る。当業者にとって周知である様々な方法を用いて、組み換え宿主細胞を破壊又はホモジェナイズして細胞内から封入体を放出させ得る。以下に限定されないが、酵素的細胞破壊、超音波破砕、ダウンス型ホモジェナイズ又は高圧放出破壊法などの周知の技術を用いて、宿主細胞破壊又はホモジェナイズを行い得る。本発明の方法のある実施形態において、高圧放出破壊法を使用して、Ｅ．コリ宿主細胞を破壊し、ＡＢＰの封入体を放出させる。ＡＢＰの封入体を扱う場合、可溶化、機械的せん断又はタンパク質分解などの要素による喪失なく封入体の回収率を最大にするために、繰り返しでのホモジェナイズ時間を最短にすることが有利である。
【０３８１】
次に、当技術分野で公知の多くの適切な可溶化剤の何れかを用いて、不溶性又は沈殿ＡＢＰを可溶化し得る。好ましくは、尿素又は塩酸グアニジンを用いてＡＢＰを可溶化する。都合よく操作できるバッチサイズを用いて大量に産生できるように、可溶化ＡＢＰの体積は最少に抑えるべきである。数千リットルもの体積であるバッチにおいて組み換え宿主を増殖させ得る大規模な工業的設定において、この要素は重要であり得る。さらに、大規模な工業的設定でＡＢＰを製造する場合、特にヒトの医薬品の用途の場合、機械類もしくは容器類又はタンパク質産物そのものに損傷を与え得る強い化学物質の回避は、可能であれば避けるべきである。本発明の方法においては、強い変性剤である塩酸グアニジンの代わりにより穏やかな変性剤である尿素を使用してＡＢＰ封入体を可溶化できることが分かっている。尿素を使用することにより、ＡＢＰ封入体を効率的に可溶化しながら、ＡＢＰの製造及び精製過程で利用するステンレス鋼の設備に損傷を与えるリスクが顕著に低下する。
【０３８２】
可溶性ＡＢＰの場合、ペリプラスム間隙又は培地にＡＢＰを分泌させ得る。さらに、宿主細胞の細胞質に可溶性ＡＢＰが存在し得る。精製段階を行う前に、可溶性ＡＢＰを濃縮することが望ましいものであり得る。当技術分野で公知の標準的技術を用いて、例えば、細胞溶解液又は培地から、可溶性ＡＢを濃縮し得る。さらに、当業者にとって公知の標準的技術を用いて、宿主細胞を破壊し、宿主細胞の細胞質又はペリプラスム間隙から可溶性ＡＢＰを放出させ得る。
【０３８３】
融合タンパク質としてＡＢＰを産生させる場合、融合配列を好ましくは除去する。酵素的又は化学的切断、好ましくは酵素的切断により、融合配列の除去を行い得る。当業者にとって周知の方法を用いて、融合配列の酵素的除去を行い得る。融合配列を除去するための酵素は、融合物が何であるかによって決まり、当業者にとって当然のことながら、反応条件は選択した酵素によって決まる。切断したＡＢＰを好ましくは切断融合配列から周知の方法により精製する。当業者にとって当然のことながら、融合配列及びＡＢＰが何であるか及びそれらの特性により、このような方法が決定される。精製方法には、以下に限定されないが、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーもしくは透析又はそれらの何らかの組合せが含まれ得る。
【０３８４】
タンパク質溶液からＤＮＡを除去するために、ＡＢＰも好ましくは精製する。沈殿又はイオン交換クロマトグラフィーなど、何らかの適切な当技術分野で公知の方法により、ＤＮＡを除去し得るが、好ましくは、以下に限定されないが硫酸プロタミンなどの、核酸沈殿剤を用いた沈殿により除去する。以下に限定されないが遠心分離又はろ過などの、標準的な周知の方法を用いて、沈殿したＤＮＡからＡＢＰを分離し得る。ヒトを治療するためにＡＢＰを使用すべき場合、宿主核酸分子の除去は重要な要素であり、本発明の方法により、宿主細胞ＤＮＡが医薬的に許容されるレベルに低下する。
【０３８５】
小規模又は大規模発酵の方法はまた、以下に限定されないが、発酵槽、振盪フラスコ、流動層バイオリアクター、中空糸バイオリアクター、ローラーボトル培養系及び撹拌タンクバイオリアクター系など、タンパク質発現において使用することもできる。バッチ、半回分又は連続様式過程において、これらの方法それぞれを行うことができる。
【０３８６】
本発明のヒトＡＢＰは通常、当技術分野で標準的な方法を用いて回収し得る。例えば、培地又は細胞溶解液を遠心分離又はろ過して、細胞残屑を除去することができる。上清を所望の体積に濃縮もしくは希釈するか、又はさらなる精製に適切な状態にするための適切な緩衝液に調製物をダイアフィルトレーションすることができる。本発明のＡＢＰのさらなる精製には、インタクト形態からのＡＢＰ変異型の脱アミド化及び短縮型を分離することが含まれる。
【０３８７】
次の代表的な手段の何れかを本発明の抗原結合ポリペプチドの生成に用いることができる：アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー以下に限定されないが、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどを用いる。）；シリカにおけるクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（以下に限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５などを用いる。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿；硫酸アンモニウム沈殿；等電点電気泳動；置換クロマトグラフィー；電気泳動法（以下に限定されないが、分取等電点電気泳動を含む。）、異なる溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（以下に限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む。）、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ又は抽出。
【０３８８】
当業者にとって公知であり当業者により使用されている標準的手段に従い、以下に限定されないが非天然アミノ酸を含有するタンパク質、非天然アミノ酸を含有するタンパク質に対する抗体、非天然アミノ酸を含有するタンパク質に対する結合パートナーなどを含む、本発明のタンパク質を、部分的に又は実質的に均一になるように精製することができる。したがって、以下に限定されないが硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸もしくは塩基抽出、カラムクロマトグラフィー、アフィニティーカラムクロマトグラフィー、陰イオンもしくは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、レクチンクロマトグラフィー、ゲル電気泳動法などを含む、当技術分野で周知の多くの方法の何れかにより、本発明のポリペプチドを回収し、精製することができる。正しくフォールディングされた成熟タンパク質の生成にいおて、要望どおり、タンパク質リフォールディング段階を使用することができる。高純度が望まれる最終精製段階において、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、アフィニティークロマトグラフィー又はその他の適切な方法を利用することができる。ある実施形態において、以下に限定されないが、一つ以上の非天然アミノ酸を含有するタンパク質の親和性を利用した精製のためなど、非天然アミノ酸（又は非天然アミノ酸を含有するタンパク質）に対して作製された抗体を精製剤として使用する。望みどおり、ある程度又は均一になるまで精製した後、以下に限定されないがアッセイ成分、治療剤、予防剤、診断薬、実験用試薬及び／又は抗体産生のための免疫原などとして、ポリペプチドを多岐にわたる用途に場合によっては使用する。
【０３８９】
本明細書で示した他の参考文献に加えて、様々な精製／タンパク質フォールディング法が当技術分野で周知であり、これには、以下に限定されないが、Ｒ．Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．（１９８２）；Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）；Ｓａｎｄａｎａ、（１９９７）Ｂｉｏｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．；Ｂｏｌｌａｇら、（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．第２版  Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，ＮＹ；Ｗａｌｋｅｒ、（１９９６）Ｔｈｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ，Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ、（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  ａｔ  Ｏｘｆｏｒｄ、Ｏｘｆｏｒｄ，Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｃｏｐｅｓ、（１９９３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  第３版  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎ．Ｙ．；Ｊａｎｓｏｎ及びＲｙｄｅｎ、（１９８８）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ，Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、第２版、Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ、ＮＹ；及びＷａｌｋｅｒ（１９８８）、ＣＤ−ＲＯＭの、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＪ；及び上記文献で引用されている参考文献が含まれる。
【０３９０】
真核宿主細胞又は非真核宿主細胞での、非天然アミノ酸を有する関心のあるタンパク質又はポリペプチドの産生の長所の１つは、通常、ネイティブの立体構造においてタンパク質又はポリペプチドがフォールディングされているであろうことである。しかし、本発明のある一定の実施形態において、合成、発現及び／又は精製後、タンパク質が、適切なポリペプチドの所望の立体構造とは異なる立体構造を有し得ることを当業者は認識するであろう。本発明のある態様において、発現されたタンパク質を場合によっては変性させ、次いで再生する。以下に限定されないが、関心のあるタンパク質又はポリペプチドへのシャペロニンの添加によるもの、グアニジンＨＣｌなどのカオトロピック剤中でタンパク質を可溶化することによるもの、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼを利用することなど、当技術分野で公知の方法を利用してこれを行う。
【０３９１】
一般に、発現されたポリペプチドを変性させ還元し、次いで好ましい立体構造にポリペプチドをリフォールディングすることが望ましい場合がある。例えば、グアニジン、尿素、ＤＴＴ、ＤＴＥ及び／又はシャペロニンを関心のある翻訳産物に添加することができる。タンパク質を還元、変性及び再生する方法は、当業者にとって周知である（上記の参考文献及び、Ｄｅｂｉｎｓｋｉら、（１９９３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：１４０６５−１４０７０；Ｋｒｅｉｔｍａｎ及びＰａｓｔａｎ（１９９３）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，４：５８１−５８５；及びＢｕｃｈｎｅｒら、（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０５：２６３−２７０を参照のこと。）。例えば、Ｄｅｂｉｎｓｋｉらは、グアニジンＤＴＥ中での封入体タンパク質の変性及び還元を記載している。以下に限定されないが、酸化されたグルタチオン及びＬ−アルギニンなどを含有するレドックス緩衝液中でタンパク質をリフォールディングすることができる。リフォールディング剤を循環させるか、あるいは一つ以上のポリペプチド又はその他の発現産物と接触させるように移動させるか、又はその逆を行うことができる。
【０３９２】
ＡＢＰの原核生物産物の場合、このように産生されたＡＢＰをミスフォールディングさせて、生物活性を失わせるか又は低下させることができる。「リフォールディング」することにより、タンパク質の生物活性を復元し得る。一般に、例えば一つ以上のカオトロピック剤（例えば尿素及び／又はグアニジン）及びジスルフィド結合を還元することができる還元剤（例えば、ジチオスレイトール、ＤＴＴ又は２−メルカプトエタノール、２−ＭＥ）を用いて、ポリペプチド鎖を可溶化し（ＡＢＰがまた不溶性である場合）、フォールディングを解き、還元することにより、ミスフォールドされたＡＢＰをリフォールディングする。カオトロープの中程度の濃度において、次いで酸化剤（例えば、酸素、シスチン又はシスタミン）を添加し、これにより、ジスルフィド結合を再形成させる。米国特許第４，５１１，５０２号、同第４，５１１，５０３号及び同第４，５１２，９２２号（本明細書中に参照により組み込む。）に記載の方法などの、当技術分野で公知の標準的方法を用いて、ＡＢＰをリフォールディングし得る。ＡＢＰを他のタンパク質と共フォールディングさせて、ヘテロ二量体又はヘテロ多量体を形成させることもできる。リフォールディング又は共フォールディング後、好ましくはＡＢＰをさらに精製する。
【０３９３】
一般的な精製方法
ＡＢＰを含有する細胞溶解液に対して、又は何らかの単離段階（以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）、逆相ＨＰＬＣ（「ＲＰ−ＨＰＬＣ」）、膨張層吸着又はそれらの何らかの組合せ及び／又は繰り返し（あらゆる適切な順番で）など。）の結果生じるあらゆるＡＢＰ混合物に対して、様々な単離段階のうち何れかを行い得る。
【０３９４】
本明細書中に記載の技術を行う際に使用する装置及びその他の必要な材料は市販されている。ポンプ、フラクションコレクター、モニター、レコーダー及びシステム全体は、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）及びＡｍｅｒｓｈａｍ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）から入手できる。以下に限定されないが、交換マトリックス材料、溶液及び緩衝液を含むクロマトグラフィーの材料もまた、このような会社から入手可能である。
【０３９５】
ポンプなどの特別に設計された装置を用いて、平衡化及び、洗浄及び溶出などの本明細書中に記載のカラムクロマトグラフィー過程におけるその他の段階をより迅速に行うことができる。市販のポンプとしては、以下に限定されないが、ＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）ポンプＰ−５０、Ｐｅｒｉｓｔａｌｔｉｃ  Ｐｕｍｐ  Ｐ−１、Ｐｕｍｐ  Ｐ−９０１及びＰｕｍｐ  Ｐ−９０３（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【０３９６】
フラクションコレクターの例としては、ＲｅｄｉＦｒａｃフラクションコレクター、ＦＲＡＣ−１００及びＦＲＡＣ−２００フラクションコレクター及びＳＵＰＥＲＦＲＡＣ（Ｒ）フラクションコレクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。ミキサーはまた、ｐＨ及び直線的な濃度勾配を形成するために利用できる。市販されているミキサーとしては、Ｇｒａｄｉｅｎｔ  Ｍｉｘｅｒ  ＧＭ−１及びＩｎ−Ｌｉｎｅ  Ｍｉｘｅｒｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【０３９７】
何らかの市販のモニターを使用してクロマトグラフィー過程をモニタリングし得る。このようなモニターを使用して、ＵＶ、ｐＨ及び伝導度などの情報を収集し得る。検出器の例としては、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−１、ＵＶＩＣＯＲＤ（Ｒ）Ｓ  ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−Ｍ  ＩＩ、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＶ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ＵＰＣ−９００、Ｍｏｎｉｔｏｒ  ｐＨ／Ｃ９００及びＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  Ｍｏｎｉｔｏｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。実際に、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）からの様々なＡＫＴＡ（Ｒ）システムをはじめ、全体的なシステムが市販されている。
【０３９８】
本発明のある実施形態において、例えば、得られた精製ＡＢＰを尿素中で最初に変性させ、次いで、適切なｐＨにて還元剤（ＤＴＴなど）を含有するＴＲＩＳ緩衝液で希釈することにより、ＡＢＰを還元し、変性させ得る。別の実施形態において、約２Ｍから約９Ｍの間の濃度範囲の尿素中でＡＢＰを変性させ、次いで、約５．０から約８．０の範囲のｐＨにてＴＲＩＳ緩衝液中で希釈する。次に、この実施形態のリフォールディング混合液をインキュベートする。ある実施形態において、室温にて４時間から２４時間、リフォールディング混合液をインキュベートする。次いで、還元され変性したＡＢＰ混合液をさらに単離するか又は精製することができる。
【０３９９】
本明細書中で述べるように、何らかの以降の単離段階を行う前に、第一のＡＢＰ混合液のｐＨを調整し得る。さらに、当技術分野で公知の技術を用いて、第一のＡＢＰ混合液又は何らかのその後のそれらの混合物を濃縮し得る。さらに、当業者にとって周知である技術を用いて、第一のＡＢＰ混合物又は何らかのその後のそれらの混合物を含有する溶出緩衝液を、次の単離段階に適切な緩衝液に交換し得る。
【０４００】
イオン交換クロマトグラフィー
ある実施形態において、及び任意のさらなる段階として、第一のＡＢＰ混合液に対してイオン交換クロマトグラフィーを行い得る。全般的に、Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１１１４−２１、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を参照のこと。市販されているイオン交換カラムとしては、ＨＩＴＲＡＰ（Ｒ）、ＨＩＰＲＥＰ（Ｒ）及びＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。このようなカラムは、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ及びＱ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＸＬなどの強力な陰イオン交換体；ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ及びＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）ＸＬなどの強力な陽イオン交換体；ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの弱い陰イオン交換体；及びＣＭ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（Ｒ）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗなどの弱い陽イオン交換体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）を利用する。精製段階の何れかの段階でＡＢＰに対して陰イオン又は陽イオン交換カラムクロマトグラフィーを行い、実質的に純粋なＡＢＰを単離し得る。何らかの適切な陽イオン交換マトリクスを用いて、陽イオン交換クロマトグラフィー段階を行い得る。有用な陽イオン交換マトリクスとしては、以下に限定されないが、繊維状、多孔性、非多孔性、微小顆粒、ビーズ状又は架橋陽イオン交換マトリクス材料が挙げられる。このような陽イオン交換マトリクス材料としては、以下に限定されないが、セルロース、アガロース、デキストラン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリスチレン、シリカ、ポリエーテル又は前出のものの何れかの混合物が挙げられる。
【０４０１】
陽イオン交換マトリクスは、強及び弱陽イオン交換体を含む、何らかの適切な陽イオン交換体であり得る。強い陽イオン交換体は、広範囲のｐＨにわたりイオン化したままであり、したがって、広範囲のｐＨにわたり、ＡＢＰを結合することが可能であり得る。しかし、弱い陽イオン交換体は、ｐＨに応じて、イオン化性を失い得る。例えば、弱い陽イオン交換体は、ｐＨが約４又は５以下に低下した場合、電荷を失い得る。適切な強い陽イオン交換体としては、以下に限定されないが、スルホプロピル（ＳＰ）、メチルスルホネート（Ｓ）又はスルホエチル（ＳＥ）などの荷電した官能基が挙げられる。陽イオン交換マトリクスは、強い陽イオン交換体であり得、好ましくは、約２．５から約６．０のＡＢＰ結合ｐＨ範囲を有するものであり得る。あるいは、この強い陽イオン交換体は、約２．５から約５．５のＡＢＰ結合ｐＨ範囲を有し得る。この陽イオン交換マトリクスは、約３．０でＡＢＰ結合ｐＨ範囲をする強い陽イオン交換体であり得る。あるいは、この陽イオン交換マトリクスは、強い陽イオン交換体であり得、好ましくは、約６．０から約８．０のＡＢＰ結合ｐＨ範囲を有するものであり得る。この陽イオン交換マトリクスは、強い陽イオン交換体であり得、好ましくは、約８．０から約１２．５のＡＢＰ結合ｐＨ範囲を有するものであり得る。あるいは、強い陽イオン交換体は、約８．０から約１２．０のＡＢＰ結合ｐＨ範囲を有し得る。
【０４０２】
ＡＢＰを載せる前に、例えば、希釈弱酸の数カラム体積、例えば２０ｍＭ酢酸、ｐＨ３の４カラム体積を用いて、陽イオン交換マトリクスを平衡化し得る。平衡化した後、ＡＢＰを添加し得、実質的に精製されたＡＢＰを溶出する前に、また弱い酢酸などの弱酸溶液又はリン酸溶液を用いて、カラムを１回から数回洗浄し得る。例えば、２０ｍＭ酢酸、ｐＨ３のおよそ２から４カラム体積を使用して、カラムを洗浄し得る。例えば０．０５Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．５又は、０．１Ｍ塩化ナトリウムと混合した０．０５Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．５の２から４カラム体積を使用して、さらなる洗浄を行うことができる。あるいは、当技術分野で公知の方法により、希釈した弱塩基数カラム体積を用いて、陽イオン交換マトリクスを平衡化し得る。
【０４０３】
あるいは、十分に低いｐＨ又はイオン強度の緩衝液と陽イオン交換マトリクスを接触させてマトリクスからＡＢＰを排除することにより、実質的に精製されたＡＢＰを溶出し得る。溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ６．０であり得る。とりわけ、溶出緩衝液のｐＨは、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．５、約ｐＨ２．５から約ｐＨ５．０の範囲であり得る。溶出緩衝液のｐＨは、約３．０であり得る。さらに、溶出緩衝液の量は様々であり得、一般に、約２から約１０カラム体積の範囲である。さらに、以下に限定されないが、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲の、クエン酸、リン酸、ギ酸、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳ緩衝液など、当業者にとって公知の適切な緩衝液を本明細書中で使用できる。
【０４０４】
ＡＢＰポリペプチドを陽イオン交換マトリクスに吸着させた後、十分に高いｐＨ又はイオン強度の緩衝液とそのマトリクスを接触させてマトリクスからＡＢＰを排除することにより、実質的に精製されたＡＢＰポリペプチドを溶出し得る。十分に精製されたＡＢＰの高ｐＨ溶出での使用に適切な緩衝液としては、以下に限定されないが、少なくとも約５ｍＭから少なくとも約１００ｍＭの濃度範囲の、クエン酸、リン酸、ギ酸、酢酸、ＨＥＰＥＳ及びＭＥＳ緩衝液が挙げられる。
【０４０５】
逆相クロマトグラフィー
当業者にとって公知の適切なプロトコールに従い、ＲＰ−ＨＰＬＣを行って、タンパク質を精製し得る。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎら、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８２）１２４：２１７−２３０（１９８２）；Ｒｉｖｉｅｒら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．（１９８３）２６８：１１２−１１９；Ｋｕｎｉｔａｎｉら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．（１９８６）３５９：３９１−４０２を参照のこと。ＡＢＰに対してＲＰ−ＨＰＬＣを行って、実質的に精製されたＡＢＰを単離し得る。この場合、以下に限定されないが、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ３０、少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ２０又は少なくとも約Ｃ３から少なくとも約Ｃ１８など、様々な長さのアルキル官能基によるシリカ誘導体化樹脂を使用し得る。あるいは、ポリマー性樹脂を使用し得る。例えば、ＴｏｓｏＨａａｓ  Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍｅ  ＣＧ１０００ｓｄ樹脂を使用し得る（これは、スチレンポリマー樹脂である。）。様々なアルキル鎖長を有するシアノ又はポリマー性樹脂も使用し得る。さらに、エタノールなどの溶媒を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムを洗浄し得る。ＳｏｕｒｃｅＲＰカラムは、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムの別の例である。
【０４０６】
イオン対合剤及びメタノール、イソプロパノール、テトラヒドロフラン、アセトニトリル又はエタノールなどの有機変性剤を含有する適切な溶出緩衝液を使用して、ＲＰ−ＨＰＬＣカラムからＡＢＰを溶出し得る。最も一般的に使用されるイオン対合剤としては、以下に限定されないが、酢酸、ギ酸、過塩素酸、リン酸、トリフルオロ酢酸、ヘプタフルオロ酪酸、トリエチルアミン、テトラメチルアンモニウム、テトラブチルアンモニウム及び酢酸トリエチルアンモニウムが挙げられる。分離時間を短くし、ピーク幅を狭めるのに好ましい勾配条件を用い、一つ以上の勾配もしくは定組成条件を用いて、溶出を行い得る。別の方法は、異なる溶媒濃度範囲の２種類の勾配を使用することを含む。本明細書中での使用に適切な溶出緩衝液の例としては、以下に限定されないが、酢酸アンモニウム及びアセトニトリル溶液が挙げられる。
【０４０７】
疎水性相互作用クロマトグラフィー精製技術
ＡＢＰに対して疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）を行い得る。全般的に、Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２０−９０、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））を参照のこと（本明細書中に参照により組み込む。）。適切なＨＩＣマトリクスとしては、以下に限定されないが、アガロース、架橋アガロース、セファロース、セルロース、シリカ、デキストラン、ポリスチレン、ポリ（メタクリレート）マトリクス及び混合形態の樹脂（以下に限定されないが、ポリエチレンアミン樹脂又はブチルもしくはフェニル置換ポリ（メタクリレート）マトリクスなど。）を含む、アルキル又はアリール置換マトリクス、例えばブチル、ヘキシル、オクチル又はフェニル置換マトリクスなどがある。疎水性相互作用カラムクロマトグラフィーのための市販ソースとしては、以下に限定されないが、ＨＩＴＲＡＰ（Ｒ）、ＨＩＰＲＥＰ（Ｒ）及びＨＩＬＯＡＤ（Ｒ）カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が挙げられる。
【０４０８】
簡単に述べると、酢酸／塩化ナトリウム溶液又は硫酸アンモニウム含有ＨＥＰＥＳなどの、当業者にとって公知の標準的緩衝液を用いて、試料添加前にＨＩＣカラムを平衡化し得る。ＨＩＣカラムへの試料添加のための緩衝液として、硫酸アンモニウムを使用し得る。ＡＢＰを添加した後、次に、標準的緩衝液及び条件を用いてカラムを洗浄し、不必要な物質を除去（しかし、ＡＢＰはＨＩＣカラムに保持し続ける。）する。特に、ＥＤＴＡ及び硫酸アンモニウム（平衡化緩衝液より低濃度）を含有するＨＥＰＥＳ緩衝液又は酢酸／塩化ナトリウム緩衝液などの標準的緩衝液約３から約１０カラム体積でＡＢＰを溶出し得る。例えばリン酸カリウム勾配を用いて、塩濃度を直線的に低下させる勾配を使用して、ＡＢＰ分子を溶出することもできる。次に、例えばダイアフィルトレーション又は限外ろ過などのろ過により、溶出物を濃縮する。ダイアフィルトレーションを利用して、ＡＢＰを溶出するために用いた塩を除去し得る。
【０４０９】
他の精製技術
例えば、ゲルろ過（Ｇｅｌ  Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｃａｔ．Ｎｏ．１８−１０２２−１８、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）（本明細書中に参照により組み込む。）、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー（以下に限定されないが、ＨＡ−Ｕｌｔｒｏｇｅｌ、Ｈｉｇｈ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、ＣＨＴ  Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ（ＢｉｏＲａｄ）、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  ＨＴＰヒドロキシアパタイト（ＢｉｏＲａｄ）などの、適切なマトリクス）、ＨＰＬＣ、膨張層吸着、限外ろ過、ダイアフィルトレーション、凍結乾燥などを用いて、第一のＡＢＰ混合物又は何らかのその後のそれらの混合物に対してさらに別の単離段階を行い、あらゆる過剰な塩を除去し、緩衝液を次の単離段階もしくは最終製剤の処方にも適した緩衝液で置換することができる。
【０４１０】
非天然コードアミノ酸を含有しない他の細胞性タンパク質からの分離を行うために、ＡＢＰ中に存在する非天然コードアミノ酸を利用することもできる。非天然コードアミノ酸はユニークな化学官能基を含み得るので、このユニークな官能基を別の分子にカップリングさせることにより、実質的な精製段階を行い得る。例えば、他のタンパク質からの分離を促進する別の分子に非天然コードアミノ酸をカップリングさせ得る。非天然アミノ酸にカップリングさせるためのこのような分子としては、以下に限定されないが、ＰＥＧ及びその他のポリマー、ビーズならびにその他の固形物質が挙げられる。
【０４１１】
当業者にとって公知の技術を用いて、本明細書中で記載の各段階で、実質的に精製されたＡＢＰを含むＡＢＰの収率をモニタリングし得る。最後の単離段階後に、このような技術を用いて、実質的に精製されたＡＢＰの収率を評価することもできる。例えば、シアノＲＰ−ＨＰＬＣ、Ｃ１８ＲＰ−ＨＰＬＣ；ならびに陽イオン交換ＨＰＬＣ及びゲルろ過ＨＰＬＣなどの、様々なアルキル鎖長を有する種々の逆相高圧液体クロマトグラフィーカラムの何れかを用いて、ＡＢＰの収率をモニタリングし得る。
【０４１２】
本発明の具体的な実施形態において、各精製段階後のＡＢＰの収率は、各精製段階の出発物質中のＡＢＰの、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．９％又は少なくとも約９９．９９％であり得る。
【０４１３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの標準的技術を用いて、又はウェスタンブロット及びＥＬＩＳＡアッセイを用いてＡＢＰを測定することにより、純度を決定し得る。例えば、ネガティブ対照の酵母発酵及び陽イオン交換回収から単離したタンパク質に対してポリクローナル抗体を生成させ得る。この抗体を使用して、混入宿主細胞タンパク質の存在を調べることもできる。
【０４１４】
ＲＰ−ＨＰＬＣ材料、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４（Ｖｙｄａｃ）は、Ｃ４−アルキル鎖を担持する表面を持つシリカゲル粒子からなる。疎水性相互作用の強度の相違に基づき、ＡＢＰがタンパク質性不純物から分離される。希釈トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いて溶出を行う。ステンレス鋼カラムを用いて分取ＨＰＬＣを行う（Ｖｙｄａｃ  Ｃ４シリカゲル２．８から３．２Ｌで満たす。）。トリフルオロ酢酸を添加することにより、Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ溶出液を酸性化し、Ｖｙｄａｃ  Ｃ４カラムに添加する。洗浄及び溶出のために、希釈トリフルオロ酢酸中のアセトニトリル勾配を用いる。分画を回収し、すぐにリン酸緩衝液で中和する。ＩＰＣ限界内のＡＢＰ分画をプールする。
【０４１５】
ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）は、セファロースビーズの表面に共有結合するジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）基から構成される。ＤＥＡＥ基へのＡＢＰの結合は、イオン性相互作用を介する。保持されることなく、アセトニトリル及びトリフルオロ酢酸がカラムを通過する。これらの物質を洗い流した後、低ｐＨの酢酸緩衝液でカラムを洗浄することにより、微量の不純物を除去する。次に、このカラムを中性リン酸緩衝液で洗浄し、イオン強度が上昇していく緩衝液を用いてＡＢＰを溶出する。カラムにＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  ｆｌｏｗを充填する。３から１０ｍｇＡＢＰポリペプチド／ｍｌゲルの範囲でＡＢＰを添加することができるようにするために、カラム体積を調整する。水及び平衡化緩衝液（リン酸ナトリウム／カリウム）でカラムを洗浄する。ＨＰＬＣ溶出の分画を集めたものを添加し、カラムを平衡化緩衝液で洗浄する。次に、カラムを洗浄緩衝液（酢酸ナトリウム緩衝液）で洗浄し、続いて平衡化緩衝液で洗浄する。続いて、溶出緩衝液（塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム／カリウム）を用いてカラムからＡＢＰを溶出し、主たる溶出プロファイルに従い、１個の分画において回収を行う。ＤＥＡＥ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラムの溶出液を指定の伝導度に調整する。得られた製剤原料をろ過滅菌してＴｅｆｌｏｎボトルに入れ、−７０℃で保管する。
【０４１６】
利用し得るさらなる方法としては、以下に限定されないが、エンドトキシンを除去する段階が挙げられる。エンドトキシンは、例えばＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．コリ、大腸菌）などのグラム陰性宿主細胞の外膜に位置するリポ多糖類（ＬＰＳ）である。エンドトキシンレベルを低下させる方法は当業者にとって公知であり、これには、以下に限定されないが、シリカ支持体、ガラス粉末又はヒドロキシアパタイトを用いた精製技術、逆相、アフィニティー、サイズ排除クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、これらの方法の組合せなどが含まれる。一緒に移動したタンパク質などの不純物を関心のあるポリペプチドから除去するために、変法又はさらなる方法が必要である可能性がある。
【０４１７】
以下に限定されないが、ブラッドフォードアッセイ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、銀染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、クーマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、マススペクトロメトリー（以下に限定されないが、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦを含む。）及び当業者にとって公知の、タンパク質の特徴を調べるためのその他の方法など、多岐にわたる方法及び手段を使用して、一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有するＡＢＰタンパク質の収率及び純度を評価することができる。
【０４１８】
ＶＩＩＩ．代替系での発現
非組み換え宿主細胞、突然変異誘発宿主細胞又は細胞を使用しない系においてタンパク質に非天然アミノ酸を導入するために、いくつかのストラテジーが利用されてきた。これらの系はまた、本発明の抗原結合ポリペプチドの作製での使用にも適切である。Ｌｙｓ、Ｃｙｓ及びＴｙｒなどの反応性側鎖によるアミノ酸の誘導体化により、リジンがＮ２−アセチル−リジンに変換される。化学合成によっても、非天然アミノ酸を取り込む直接的な方法が得られる。ペプチド断片の、酵素的ライゲーション及びネイティブ化学ライゲーションの最近の開発により、より大きなタンパク質を調製することが可能である。例えば、Ｐ．Ｅ．Ｄａｗｓｏｎ及びＳ．Ｂ．Ｈ．Ｋｅｎｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６９：９２３（２０００）。１００を超える非天然アミノ酸を実際にあらゆるサイズの様々なタンパク質へ部位特異的に取り込むために、所望の非天然アミノ酸により化学的にアシル化されたサプレッサーｔＲＮＡを、タンパク質生合成に対応可能なインビトロ抽出物に添加するという一般的なインビトロ生合成法が使用されてきた。例えば、Ｖ．Ｗ．Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｄ．Ｍｅｎｄｅｌ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，１９９５、３４：６２１（１９９５）；Ｃ．Ｊ．Ｎｏｒｅｎ，ＳＪ．Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｍ．Ｃ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１８２−１８８（１９８９）；及びＪ．Ｄ．Ｂａｉｎ、ＣＧ．Ｇｌａｂｅ，Ｔ．Ａ．Ｄｉｘ，Ａ．Ｒ．Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ｅ．Ｓ．Ｄｉａｌａ、Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１１：８０１３−８０１４（１９８９）を参照のこと。タンパク質安定性、タンパク質フォールディング、酵素機構及びシグナル伝達の研究のために、様々な官能基がタンパク質に導入されてきた。
【０４１９】
野生型シンテターゼの乱雑性（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を利用するために、選択圧取り込みと呼ばれるインビボ法が開発された。例えば、Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｓ．Ａｌｅｆｅｌｄｅｒ、Ｗ．Ｗｅｎｇｅｒ、Ｆ．Ｍ．Ｄｏｎｇ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．，１３：４１（１９９９）を参照のこと。天然アミノ酸の限定濃度を含有する最小培地で、特定の天然アミノ酸を細胞に供給する関連代謝経路のスイッチがオフになっている栄養要求性株を増殖させ、同時に標的遺伝子の転写を抑制する。定常増殖期の開始時に、天然アミノ酸をなくし、非天然アミノ酸類似体で置き換える。組み換えタンパク質発現の誘発により、非天然類似体を含有するタンパク質の蓄積が起こる。例えば、このストラテジーを用いて、ｏ、ｍ及びｐ−フルオロフェニルアラニンをタンパク質に取り込み、容易に同定できる、ＵＶスペクトルの２つの特徴的な肩が示され（例えば、Ｃ．Ｍｉｎｋｓ、Ｒ．Ｈｕｂｅｒ，Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２８４：２９（２０００）を参照。）；トリフルオロメチオニンを使用して、バクテリオファージＴ４ライソザイムにおいてメチオニンを置換し、１９Ｆ  ＮＭＲによりチトオリゴ糖リガンドとのその相互作用が調べられ（例えば、Ｈ．Ｄｕｅｗｅｌ，Ｅ．Ｄａｕｂ，Ｖ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＪ．Ｆ．Ｈｏｎｅｋ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３６：３４０４（１９９７）；及びトリフルオロロイシンをロイシンの代わりに取り込み、その結果、ロイシンジッパ―タンパク質の温度及び化学安定性が高まった。例えば、Ｙ．Ｔａｎｇ、Ｇ．Ｇｈｉｒｌａｎｄａ、Ｗ．Ａ．Ｐｅｔｋａ、Ｔ．Ｎａｋａｊｉｍａ、Ｗ．Ｆ．ＤｅＧｒａｄｏ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，４０：１４９４（２００１）を参照のこと。さらに、セレノメチオニン及びテルロメチオニンを様々な組み換えタンパク質に取り込み、Ｘ線結晶解析での相の溶解を促進させる。例えば、Ｗ．Ａ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｊ．Ｒ．Ｈｏｒｔｏｎ及びＤ．Ｍ．Ｌｅｍａｓｔｅｒ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，９：１６６５（１９９０）；Ｊ．Ｏ．Ｂｏｌｅｓ，Ｋ．Ｌｅｗｉｎｓｋｉ、Ｍ．Ｋｕｎｋｅｌ、Ｊ．Ｄ．Ｏｄｏｍ、Ｂ．Ｄｕｎｌａｐ、Ｌ．Ｌｅｂｉｏｄａ及びＭ．Ｈａｔａｄａ、Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，１：２８３（１９９４）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｂ．Ｓｔｅｉｐｅ、Ｐ．Ｄｅｍａｎｇｅ、Ｃ．Ｅｃｋｅｒｓｋｏｒｎ、Ｊ．Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３０：７８８（１９９５）；及びＮ．Ｂｕｄｉｓａ、Ｗ．Ｋａｒｎｂｒｏｃｋ、Ｓ．Ｓｔｅｉｎｂａｃｈｅｒ、Ａ．Ｈｕｍｍ、Ｌ．Ｐｒａｄｅ、Ｔ．Ｎｅｕｅｆｅｉｎｄ、Ｌ．Ｍｏｒｏｄｅｒ及びＲ．Ｈｕｂｅｒ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：６１６（１９９７）を参照のこと。アルケン又はアルキン官能基を有するメチオニン類似体もまた効率的に取り込まれ、これにより、化学的手段によるタンパク質のさらなる修飾が可能となった。例えば、。Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎＨｅｓｔ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４２８：６８（１９９８）；Ｊ．Ｃ．Ｍ．ｖａｎ���ｅｓｔ、Ｋ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２２：１２８２（２０００）；及びＫ．Ｌ．Ｋｉｉｃｋ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、５６：９４８７（２０００）；米国特許第６，５８６，２０７号；米国特許公開２００２／００４２０９７（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。
【０４２０】
この方法の成功は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼによる非天然アミノ酸類似体の認識に依存し、一般に、これにはタンパク質翻訳の忠実度を確実にする高い選択性が必要である。本方法の範囲を広げるある方法は、アミノアシル−ｔＲＮＡシンテターゼの基質特異性を緩めることであり、これが遂行されたのは限られたケースである。例えば、Ｅ．コリのフェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＰｈｅＲＳ）においてＡｌａ２９４をＧｌｙで置換することにより、基質結合ポケットが大きくなり、その結果、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン（ｐ−Ｃｌ−Ｐｈｅ）によるｔＲＮＡＰｈｅのアシル化が起こる。Ｍ．Ｉｂｂａ、Ｐ．Ｋａｓｔ及びＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３３：７１０７（１９９４）を参照のこと。この突然変異ＰｈｅＲＳを有するＥ．コリ株により、フェニルアラニンの代わりに、ｐ−Ｃｌ−フェニルアラニン又はｐ−Ｂｒ−フェニルアラニンの取り込みが可能となる。例えば、Ｍ．Ｉｂｂａ及びＨ．Ｈｅｎｎｅｃｋｅ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６４：２７２（１９９５）；及びＮ．Ｓｈａｒｍａ、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ、Ｐ．Ｋａｓｔ及びＤ．Ａ．Ｔｉｒｒｅｌｌ、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，４６７：３７（２０００）を参照のこと。同様に、Ｅ．コリのチロシル−ｔＲＮＡシンテターゼのアミノ酸結合部位付近の点突然変異Ｐｈｅ１３０Ｓｅｒにより、アザチロシンがチロシンよりも効率的に取り込まれることが分かった。Ｆ．Ｈａｍａｎｏ−Ｔａｋａｋｕ、Ｔ．Ｉｗａｍａ、Ｓ．Ｓａｉｔｏ−Ｙａｎｏ、Ｋ．Ｔａｋａｋｕ、Ｙ．Ｍｏｎｄｅｎ、Ｍ．Ｋｉｔａｂａｔａｋｅ、Ｄ．Ｓｏｉｌ及びＳ．Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５：４０３２４（２０００）を参照のこと。
【０４２１】
非天然アミノ酸をタンパク質にインビボで取り込むための別のストラテジーは、校正機構を有するシンテターゼを改変することである。これらのシンテターゼは選別することができず、したがって、同種の天然アミノ酸と構造的に類似のアミノ酸を活性化する。このエラーは別の部位で補正され、タンパク質翻訳の忠実度を維持するために、ｔＲＮＡからのミスチャージアミノ酸が脱アシル化される。シンテターゼの校正活性が機能しない場合、間違って活性化された構造類似体が校正機能を逃れ、取り込まれる。バリル−ｔＲＮＡシンテターゼ（ＶａｌＲＳ）により、このアプローチが近年明らかにされた。Ｖ．Ｄｏｒｉｎｇ、Ｈ．Ｄ．Ｍｏｏｔｚ、Ｌ．Ａ．Ｎａｎｇｌｅ、Ｔ．Ｌ．Ｈｅｎｄｒｉｃｋｓｏｎ、Ｖ．ｄｅ  Ｃｒｅｃｙ−Ｌａｇａｒｄ、Ｐ．Ｓｃｈｉｍｍｅｌ及びＰ．Ｍａｒｌｉｅｒｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９２：５０１（２００１）を参照のこと。ＶａｌＲＳは、ｔＲＮＡＶａｌをＣｙｓ、Ｔｈｒ又はアミノブチレート（Ａｂｕ）で間違ってアミノアシル化し得；続いて、校正ドメインによりこれらの非同種アミノ酸を加水分解する。Ｅ．コリ染色体のランダム突然変異誘発後、ＶａｌＲＳの校正部位に突然変異のある突然変異Ｅ．コリ株を選択する。この校正機能欠失ＶａｌＲＳは、ＣｙｓによりｔＲＮＡＶａｌを不正確に処理する。Ａｂｕは立体的にＣｙｓに類似しているので（Ｃｙｓの−ＳＨ基はＡｂｕにおいて−ＣＨ３に置き換えられる。）、この突然変異Ｅ．コリ株をＡｂｕ存在下で増殖させた場合、突然変異ＶａｌＲＳもまたタンパク質にＡｂｕを取り込む。マススペクトロメトリー分析から、ネイティブタンパク質中の各バリン位置においてバリンの約２４％がＡｂｕにより置換されることが示される。
【０４２２】
固相合成及び半合成法によってもまた、新規アミノ酸を含有する多くのタンパク質の合成が可能となる。例えば、次のようなものである、次の刊行物及びそこで引用されている参考文献を参照のこと：Ｃｒｉｃｋ，Ｆ．Ｊ．Ｃ．，Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｌ．，Ｂｒｅｎｎｅｒ，Ｓ．，Ｗａｔｔｓ−Ｔｏｂｉｎ，Ｒ．，Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ、１９２：１２２７−１２３２（１９６１）；Ｈｏｆｍａｎｎ，Ｋ．，Ｂｏｈｎ，Ｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ．ＸＸＸＶＩ．Ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐｙｒａｚｏｌｅ−ｉｍｉｄａｚｏｌｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｓ−ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｐｏｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ａｎ  Ｓ−ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．８８（２４）：５９１４−５９１９（１９６６）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ  ａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅｓ，Ａｃｃ  Ｃｈｅｍ  Ｒｅｓ，４７−５４（１９８９）；Ｎａｋａｔｓｕｋａ，Ｔ．，Ｓａｓａｋｉ，Ｔ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ  ｔｈｉｏｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，３８０８−３８１０（１９８７）；Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ，Ｍ．，Ｋｅｎｔ，Ｓ．Ｂ．Ｈ．Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｂｙ  ｄｏｖｅｔａｉｌｉｎｇ  ｕｎｐｒｏｔｅｃｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ：ｂａｃｋｂｏｎｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＨＩＶ  ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５６（５０５４）：２２１−２２５（１９９２）；Ｃｈａｉｋｅｎ，Ｉ．Ｍ．Ｓｅｍｉｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１（３）：２５５−３０１（１９８１）；Ｏｆｆｏｒｄ，Ｒ．Ｅ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｙ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｅａｎｓ？  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１（３）：１５１−１５７（１９８７）；及びＪａｃｋｓｏｎ，Ｄ．Ｙ．，Ｂｕｒｎｉｅｒ，Ｊ．Ｑｕａｎ，Ｃ．，Ｓｔａｎｌｅｙ，Ｍ．，Ｔｏｍ，Ｊ．，Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．Ａ  Ｄｅｓｉｇｎｅｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｇａｓｅｆｏｒ  Ｔｏｔａｌ  Ｓｙｎｔｅｈｓｉｓ  ｏｆ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ａ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｎａｔｕｒａｌ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｒｅｓｉｄｕｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６６（５１８３）：２４３（１９９４）。
【０４２３】
インビトロでタンパク質に共同因子、スピン標識及びオリゴヌクレオチドなどの様々な非天然側鎖を導入するために、化学修飾が使用されてきた。例えば、Ｃｏｒｅｙ，Ｄ．Ｒ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｙｂｒｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅａｓｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３８（４８３２）：１４０１−１４０３（１９８７）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｄ．Ｓ．，Ｒｏｋｉｔａ，Ｓ．Ｅ．Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，５４：５６５−５９５（１９８５）；Ｋａｉｓｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｌａｗｒｅｎｃｅ  Ｄ．Ｓ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｎｚｙｍｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２６（４６７４）：５０５−５１１（１９８４）；Ｎｅｅｔ，Ｋ．Ｅ．，Ｎａｎｃｉ  Ａ，Ｋｏｓｈｌａｎｄ，Ｄ．Ｅ．Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｓｔｉｌｉｓｉｎ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４３（２４）：６３９２−６４０１（１９６８）；Ｐｏｌｇａｒ，Ｌ．Ｂ．，Ｍ．Ｌ．Ａ  ｎｅｗ  ｅｎｚｙｍｅ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃａｌｌｙ  ｆｏｒｍｅｄ  ａｃｔｉｖｅ  ｓｉｔｅ．Ｔｈｉｏｌ−ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ．Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，３１５３−３１５４（１９６６）；及びＰｏｌｌａｃｋ，Ｓ．Ｊ．，Ｎａｋａｙａｍａ，Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｏｐｈｉｌｅｓ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｉｃ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎｔｏ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｍｂｉｎｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４２（４８８１）：１０３８−１０４０（１９８８）を参照のこと。
【０４２４】
あるいは、いくつかの生物物理学的プローブをインビトロで合成されたタンパク質に取り込むために、化学的修飾アミノアシル−ｔＲＮＡを用いる生合成法が使用されてきた。例えば、次のようなものである、次の刊行物及びそこで引用されている参考文献を参照のこと：Ｂｒｕｎｎｅｒ，Ｊ．Ｎｅｗ  Ｐｈｏｔｏｌａｂｅｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｉｏｃｈｅｍ，６２：４８３−５１４（１９９３）；及びＫｒｉｅｇ，Ｕ．Ｃ．，Ｗａｌｔｅｒ，Ｐ．，Ｈｏｈｎｓｏｎ，Ａ．Ｅ．Ｐｈｏｔｏｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎａｓｃｅｎｔ  ｐｒｅｐｒｏｌａｃｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ５４−ｋｉｌｏｄａｌｔｏｎ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｇｎａｌ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｐａｒｔｉｃｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８３（２２）：８６０４−８６０８（１９８６）。
【０４２５】
以前、所望のアンバーナンセンス突然変異を含有する遺伝子を用いてプログラムされたタンパク質合成反応に化学的アミノアシル化サプレッサーｔＲＭＡを加えることにより、非天然アミノ酸がインビトロでタンパク質に部位特異的に取り込まれ得ることが示された。これらのアプローチを用いて、特定のアミノ酸に対して栄養要求性である株を使用し、多くの一般的な２０種類のアミノ酸を構造が近いホモローグで、例えばフェニルアラニンに対してフルオロフェニルアラニンで、置換することができる。例えば、Ｎｏｒｅｎ，Ｃ．Ｊ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ，Ｍ．Ｃ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１８２−１８８（１９８９）；Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋら、Ｓｃｉｅｎｃｅ２６８：４３９−４２（１９９５）；Ｂａｉｎ，Ｊ．Ｄ．，Ｇｌａｂｅ，Ｃ．Ｇ．，Ｄｉｘ，Ｔ．Ａ．，Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ，Ａ．Ｒ．，Ｄｉａｌａ、Ｅ．Ｓ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｏｎ−ｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｉｎｔｏ  ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ，Ｊ．Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ，１１１：８０１３−８０１４（１９８９）；Ｎ．Ｂｕｄｉｓａら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１３：４１−５１（１９９９）；Ｅｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ，Ｓ．，Ｎｏｒｅｎ，ＣＪ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｎａｔｕｒａｌ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄｓ  ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚ．，３０１−３３６（１９９２）；及びＭｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｃｏｒｎｉｓｈ，Ｖ．Ｗ．及びＳｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｄｅ，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ．２４、４３５−６２（１９９５）を参照のこと。
【０４２６】
例えば、停止コドンＵＡＧを認識するサプレッサーｔＲＮＡを調製し、非天然アミノ酸を用いて化学的にアミノアシル化した。従来の部位特異的突然変異誘発を使用して、タンパク質遺伝子の関心のある部位に停止コドンＴＡＧを導入した。例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｈｍｉｄｔ，Ｗ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．５’，３’Ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，１６（３）：７９１−８０２（１９８８）を参照のこと。アシル化サプレッサーｔＲＮＡ及び突然変異遺伝子をインビトロ転写／翻訳系において組合せた場合、指定の位置にそのアミノ酸を含有するタンパク質を与えるＵＡＧコドンに反応して非天然アミノ酸が取り込まれた。［３Ｈ］−Ｐｈｅを用いた実験及びα−ヒドロキシ酸を用いた実験から、所望するアミノ酸のみがＵＡＧコドンにより指定された位置に取り込まれ、このアミノ酸がタンパク質の他の何れの位置にも取り込まれないことが分かった。例えば、Ｎｏｒｅｎら、前出；Ｋｏｂａｙａｓｈｉら、（２００３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０（６）：４２５−４３２；及びＥｌｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｍｅｎｄｅｌ，Ｄ．，Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ｐ．Ｇ．Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｖｅｌ  ｂａｃｋｂｏｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｉｎｔｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５５（５０４１）：１９７−２００（１９９２）を参照のこと。
【０４２７】
非天然アミノ酸をタンパク質に取り込むために、マイクロインジェクション技術も使用されてきた。例えば、Ｍ．Ｗ．Ｎｏｗａｋ、Ｐ．Ｃ．Ｋｅａｒｎｅｙ、Ｊ．Ｒ．Ｓａｍｐｓｏｎ、Ｍ．Ｅ．Ｓａｋｓ、Ｃ．Ｇ．Ｌａｂａｒｃａ、Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｗ．Ｇ．Ｚｈｏｎｇ、Ｊ．Ｔｈｏｒｓｏｎ、Ｊ．Ｎ．Ａｂｅｌｓｏｎ、Ｎ．Ｄａｖｉｄｓｏｎ、Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６８：４３９（１９９５）；及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：６４５（２０００）を参照のこと。インビトロで調製した２種類のＲＮＡ種（関心のあるアミノ酸位置にＵＡＧ停止コドンを有する標的タンパク質をコードするｍＲＮＡ及び所望の非天然アミノ酸でアミノアシル化したアンバーサプレッサーｔＲＮＡ）をアフリカツメガエル卵母細胞に同時に注入した。次に、卵母細胞の翻訳機構は、ＵＡＧにより指定される位置に非天然アミノ酸を挿入する。この方法により、膜内在性タンパク質のインビボ構造−機能研究が可能となった（これは、通常、インビトロ発現系に反応しない。）。一例としては、蛍光共鳴エネルギー移動により距離を測定するための蛍光アミノ酸のタキキニンニューロキニン−２受容体への取り込み（例えば、Ｇ．Ｔｕｒｃａｔｔｉ、Ｋ．Ｎｅｍｅｔｈ、Ｍ．Ｄ．Ｅｄｇｅｒｔｏｎ、Ｕ．Ｍｅｓｅｔｈ、Ｆ．Ｔａｌａｂｏｔ、Ｍ．Ｐｅｉｔｓｃｈ、Ｊ．Ｋｎｏｗｌｅｓ、Ｈ．Ｖｏｇｅｌ及びＡ．Ｃｈｏｌｌｅｔ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１９９９１（１９９６）を参照。）；イオンチャネルにおいて表面で曝露された残基を同定するためのビオチン化アミノ酸の取り込み（例えば、Ｊ．Ｐ．Ｇａｌｌｉｖａｎ、Ｈ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ及びＤ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，４：７３９（１９９７）を参照。）；イオンチャネルにおける立体構造変化をリアルタイムでモニタリングするためのケージドチロシン類似体の使用（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｍｉｌｌｅｒ、Ｓ．Ｋ．Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ、Ｎｅｕｒｏｎ、２０：６１９（１９９８）；及びそれらのゲーティング機構を調べるためにイオンチャネル骨格を変化させるためのαヒドロキシアミノ酸の使用が挙げられる。例えば、Ｐ．Ｍ．Ｅｎｇｌａｎｄ，Ｙ．Ｚｈａｎｇ，Ｄ．Ａ．Ｄｏｕｇｈｅｒｔｙ及びＨ．Ａ．Ｌｅｓｔｅｒ，Ｃｅｌｌ、９６：８９（１９９９）；及びＴ．Ｌｕ、Ａ．Ｙ．Ｔｉｎｇ、Ｊ．Ｍａｉｎｌａｎｄ、Ｌ．Ｙ．Ｊａｎ、Ｐ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ及びＪ．Ｙａｎｇ、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，４：２３９（２００１）を参照のこと。
【０４２８】
インビボでタンパク質に非天然アミノ酸を直接取り込むことができることから、突然変異タンパク質の収率が高くなること、技術が容易であること、及び細胞もしくは可能であれば生きている生物での突然変異タンパク質の研究の可能性、ならびに、治療処置でのこれらの突然変異タンパク質の使用といった長所が得られる。様々な大きさ、酸性度、求核性、疎水性及びその他の特性を有する非天然アミノ酸をタンパク質に含有させることができれば、タンパク質機能を調べ、かつ新規の特性を有する新しいタンパク質又は生物を作製するための、タンパク質構造に対する合理的かつ体系的な操作能が飛躍的に拡大し得る。しかし、タンパク質翻訳における忠実度を高くするために必要とされるｔＲＮＡ−シンテターゼ相互作用の複雑な特性のために、このプロセスは困難である。
【０４２９】
部位特異的にパラ−Ｆ−Ｐｈｅを取り込むある試みにおいて、ｐ−Ｆ−Ｐｈｅ耐性の、Ｐｈｅ栄養要求性Ｅ．コリ株で、酵母アンバーサプレッサーｔＲＮＡ  ＰｈｅＣＵＡ／フェニルアラニル−ｔＲＮＡシンテターゼペアが使用された。例えば、Ｒ．Ｆｕｒｔｅｒ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．，７：４１９（１９９８）を参照のこと。
【０４３０】
細胞を使用しない（インビトロ）翻訳系を用いて本発明のＡＢＰポリヌクレオチドの発現を達成することも可能であり得る。テンプレートとしてのｍＲＭＡ（インビトロ翻訳）又はテンプレートとしてのＤＮＡ（インビトロ転写及び翻訳の組合せ）の何れかを含み得るこれらの系において、インビトロ合成はリボソームにより導かれる。細胞を使用しないタンパク質発現系の開発に対して多大な努力が行われてきた。例えば、Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７４：３０９−３１６（２００１）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２２，１５３７−１５４２（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ，１６，３８５−３９０（２０００）；Ｋｉｍ，Ｄ．−Ｍ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、６６，１８０−１８８（１９９９）；及びＰａｔｎａｉｋ，Ｒ．及びＪ．Ｒ．Ｓｗａｒｔｚ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４、８６２−８６８（１９９８）；米国特許第６，３３７，１９１号；米国特許公開２００２／００８１６６０；ＷＯ００／５５３５３；ＷＯ９０／０５７８５（本明細書中に参照により組み込む。）を参照のこと。非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドの発現に対して適用し得る別のアプローチとしては、ｍＲＮＡ−ペプチド融合技術が挙げられる。例えば、Ｒ．Ｒｏｂｅｒｔｓ及びＪ．Ｓｚｏｓｔａｋ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９４：１２２９７−１２３０２（１９９７）；Ａ．Ｆｒａｎｋｅｌら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：１０４３−１０５０（２００３）を参照のこと。このアプローチにおいて、ピューロマイシンに連結しているｍＲＮＡテンプレートがリボソーム上でペプチドに翻訳される。一つ以上のｔＲＮＡ分子が改変されている場合、その上非天然アミノ酸をそのペプチドに取り込ませることができる。最後のｍＲＮＡコドンが読まれた後、ピューロマイシンがペプチドのＣ末端を捕獲する。生じたｍＲＮＡ−ペプチド共役物が関心のある特性を有することがインビトロアッセイにおいて分かった場合、ｍＲＮＡ配列からそれが何であるかを容易に明らかにすることができる。このようにして、一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドのライブラリをスクリーニングして、所望の特性を有するポリペプチドを同定し得る。さらに最近、精製された成分を用いたインビトロリボソーム翻訳により、非天然コードアミノ酸で置換されたペプチドの合成が可能となることが報告された。例えば、Ａ．Ｆｏｓｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）１００：６３５３（２００３）を参照のこと。
【０４３１】
ＩＸ．ＡＢＰにカップリングした巨大分子ポリマー
本明細書に記載の組成物、方法、技術及びストラテジーを用いて、本明細書に記載の非天然アミノ酸ポリペプチドに対する様々な修飾を為すことができる。これらの修飾には、ポリペプチドの非天然アミノ酸成分へのさらなる官能基の取り込み（以下に限定されないが、標識；色素；ポリマー；水溶性ポリマー；ポリエチレングリコールの誘導体；光架橋リンカー、放射性核種、細胞毒性化合物、薬物、親和性標識、光親和性標識、反応性化合物、レジン、第二のタンパク質もしくはポリペプチドもしくはポリペプチド類似体、抗体もしくは抗体断片、金属キレート剤、共同因子、脂肪酸、炭水化物、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡ及びアンチセンスポリヌクレオチド、水溶性デンドリマー、シクロデキストリン、阻害リボ核酸、生体材料、ナノ粒子、スピンラベル、蛍光プローブ、金属含有部分、放射性部分、新規官能基、他の分子と共有結合又は非共有結合により相互作用する基、フォトケージ（ｐｈｏｔｏｃａｇｅｄ）部分、光異性化可能部分、ビオチン、ビオチン誘導体、ビオチン類似体、重原子を組み込む部分、化学的切断可能な基、光切断可能な基、伸長側鎖、炭素結合型糖、酸化還元活性剤、アミノチオ酸、毒性部分、同位体標識部分、生物物理学的プローブ、リン光性の基、化学発光基、高電子密度基、磁性の基、挿入基、発色団、エネルギー移動剤、生物活性剤、検出可能標識、小分子又は上記もしくはその他の何らかの所望の化合物の組合せなど。）が含まれる。本明細書に記載の、組成物、方法、技術及びストラテジーの説明目的の非限定例として、本明細書に記載の組成物、方法、技術及びストラテジーがまた、他の官能基（以下に限定されないが上記で挙げたものなど。）を添加するのに適用可能（必要に応じて適切な改変を行い、当業者が本明細書中での開示を思いつき得る。）であるという了解のもと、以下の記述は、非天然アミノ酸ポリペプチドに巨大分子ポリマーを添加することに焦点を当てる。
【０４３２】
本発明の抗原結合ポリペプチドに多岐にわたる巨大分子ポリマー及びその他の分子を連結してＡＢＰの生物学的特性を調節する、及び／又はＡＢＰ分子に新しい生物学的特性を与えることができる。天然コードアミノ酸を介して、非天然コードアミノ酸を介して、又は天然もしくは非天然アミノ酸の何らかの官能置換基又は、天然もしくは非天然アミノ酸に付加されている何らかの置換基もしくは官能基を介して、これらの巨大分子ポリマーをＡＢＰに連結することができる。このポリマーの分子量は、広範囲にわたり、それは、以下に限定されないが、約１００Ｄａから約１００，０００Ｄａの間、又はそれ以上である。
【０４３３】
本発明は、ポリマー：タンパク質共役物の実質的に均一な調製物を与える。「実質的に均一な」とは、本明細書中で使用する場合、ポリマー：タンパク質共役物分子がタンパク質全体の半分よりも多いことが観察されることを意味する。ポリマー：タンパク質共役物は、生物活性を有し、本明細書中で提供される本発明の「実質的に均一な」ＰＥＧ化ＡＢＰ調製物は、均一な調製物の長所（例えば、ロットの異なるものの薬物動態の予測可能性において臨床適用が容易であるなど。）を示すよう十分均一であるものである。
【０４３４】
ポリマー：タンパク質共役分子の混合物を調製するという選択肢を選択することもでき、それにより与えられる長所とは、混合物に含めるためのモノポリマー：タンパク質共役物の比を選択し得るということである。したがって、必要に応じて、様々な数の結合ポリマー部分を有する（即ち、ジ−、トリ−、テラ−など。）様々なタンパク質の混合物を調製し、本発明の方法を用いて調製したモノ−ポリマー：タンパク質共役物と前記共役物を組み合わせ、モノ−ポリマー：タンパク質共役物の前もって決定された比率を有する混合物を得ることができる。
【０４３５】
選択したポリマーは、それを結合させるタンパク質が水性環境（生理的環境など）で沈殿しない程度に水溶性であり得る。このポリマーは、分枝又は非分枝であり得る。好ましくは、最終産物調製物の治療用途に対しては、このポリマーは医薬適合性である。
【０４３６】
反応混合物中の濃度により、タンパク質分子に対するポリエチレングリコール分子の比率は変化する。一般に、最適な比率（過剰な非反応タンパク質又はポリマーが最小限となる反応効率の観点で。）は、選択したポリエチレングリコールの分子量により、及び利用可能な反応基の数において決定され得る。分子量に関連して、通常、ポリマーの分子量が高いほど、タンパク質に結合させ得るポリマー分子の数は少なくなる。同様に、これらのパラメーターを最適化する場合、ポリマーの分枝を考慮すべきである。一般に、分子量が高いほど（又は分枝が多いほど）、ポリマータンパク質の比率が高くなる。
【０４３７】
本明細書中で使用する場合、及びＰＥＧ化ＡＢＰ共役物をもくろむ場合、「治療的有効量という用語は、患者に対して所望の有効性を与える量を指す。この量は、個々の患者により変化し、患者の全体的な健康状態及び治療を行うべき状態の根本的な原因を含む、多くの要因に依存する。治療に使用するＡＢＰポリペプチドの量は、許容可能な速度で変化を促し、有用なレベルで所望の応答を維持する。本発明組成物の治療的有効量は、公に入手可能な物質及び手段を用いて当業者により容易に確定され得る。
【０４３８】
水溶性ポリマーは、以下に限定されないが、直鎖状、フォーク状又は分枝状を含む、あらゆる構造形態であり得る。通常、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレングリコール）、例えば、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）などであるが、その他の水溶性ポリマーも利用できる。一例として、ＰＥＧを使用して、本発明のある一定の実施形態を説明する。
【０４３９】
ＰＥＧは、市販されている周知の水溶性ポリマーであるか、又は、当技術分野で周知の方法に従い、エチレングリコールの開環ポリマー化により調製することができる（Ｓａｎｄｌｅｒ及びＫａｒｏ、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｖｏｌ．３、１３８−１６１頁）。「ＰＥＧ」という用語は、大きさ又はＰＥＧの末端の修飾に関わらずあらゆるポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用され、ＡＢＰに連結する場合、式：
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｙ
により表すことができる（式中、ｎは、２から１０，０００であり、ＸはＨ又は、以下に限定されないがＣ１−４アルキルなどの末端修飾である。）。
【０４４０】
ある場合において、本発明で使用するＰＥＧは、一方の末端がヒドロキシ又はメトキシで終わっている（即ち、Ｘは、Ｈ又はＣＨ３（「メトキシＰＥＧ」）である。）。あるいは、ＰＥＧは反応基で終わり得、これにより、二官能性ポリマーが形成される。通常の反応基には、２０種類の一般的アミノ酸で見られる官能基（以下に限定されないが、マレイミド基、活性化カーボネート（以下に限定されないが、ｐ−ニトロフェニルエステルなど。）、活性化エステル（以下に限定されないが、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェニルエステルなど。）及びアルデヒドなど。）ならびに、２０種類の一般的アミノ酸に対して不活性であるが非天然コードアミノ酸中に存在する相補的官能基と特異的に反応する官能基（以下に限定されないが、アジド基、アルキン基など。）と反応させるために一般に使用される反応基が含まれ得る。ＰＥＧの他方の末端（上記式中でＹで示される。）は、天然又は非天然コードアミノ酸を介して、抗原結合ポリペプチドに直接又は間接的に結合することに留意されたい。例えば、Ｙは、アミド、カルバメート又は、ポリペプチドのアミノ基（以下に限定されないが、リジンのεアミン又はＮ末端など。）への尿素結合であり得る。あるいは、Ｙは、チオール基（以下に限定されないが、システインのチオール基など。）へのマレイミド結合であり得る。あるいは、Ｙは、２０種類の一般的アミノ酸を介して通常は接近可能ではない残基への結合であり得る。例えば、ＰＥＧ上のアジド基をＡＢＰ上のアルキン基と反応させて、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化産物を形成させることができる。あるいは、ＰＥＧ上のアルキン基を非天然コードアミノ酸中に存在するアジド基と反応させて、同様の産物を形成させることができる。ある実施形態において、強い求核試薬（以下に限定されないが、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン、セミカルバジドなど。）を非天然コードアミノ酸中に存在するアルデヒド又はケトン基と反応させて、ヒドラゾン、オキシム又はセミカルバゾンを形成させることができ、規定どおりに、ある場合においては、適切な還元剤を用いた処理によりそれをさらに還元することができる。あるいは、非天然コードアミノ酸を介して強い求核試薬をＡＢＰに取り込み、これを使用して水溶性ポリマーに存在するケトン又はアルデヒド基と選択的に反応させることができる。
【０４４１】
実際に所望する場合は、以下に限定されないが、要望どおり、約１００ダルトン（Ｄａ）から１００，０００Ｄａ以上（以下に限定されないが、しばしば、０．１から５０ｋＤａ又は１０から４０ｋＤａなど。）など、ＰＥＧに対するあらゆる分子量を使用することができる。以下に限定されないが、各鎖が１から１００ｋＤａの範囲のＭＷを有する（以下に限定されないが、１から５０ｋＤａ又は５から２０ｋＤａなど。）ＰＥＧ分子を含む分枝鎖ＰＥＧもまた使用することができる。以下に限定されないが、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．カタログ、ＮｅｋｔａｒＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓカタログ（本明細書中に参照により組み込む。）などに、多岐にわたるＰＥＧ分子が記載されている。
【０４４２】
一般に、非天然コードアミノ酸との反応に、少なくとも１つのＰＥＧ分子の末端を利用できる。例えば、アミノ酸側鎖との反応のためのアルキン及びアジド部分を有するＰＥＧ誘導体を使用して、本明細書に記載のとおり、非天然コードアミノ酸にＰＥＧを連結させることができる。非天然コードアミノ酸がアジドを含有する場合、ＰＥＧは通常、［３＋２］付加環化産物の形成を実現するためのアルキン部分又は、アミド結合の形成を実現するためのホスフィン基を含有する活性化ＰＥＧ種（即ち、エステル、カーボネート）の何れかを含有する。あるいは、非天然コードアミノ酸がアルキンを含有する場合、ＰＥＧは通常、［３＋２］Ｈｕｉｓｇｅｎ付加環化環化産物の形成を実現するためのアジド部分を含有する。非天然コードアミノ酸がカルボニル基を含有する場合、ＰＥＧは通常、対応するヒドラゾン、オキシム及びオキシム及びセミカルバゾン結合の形成をそれぞれ実現するために、強力な求核試薬（以下に限定されないが、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド官能基など。）を含有する。あるいは、上述の反応基の方向が逆であるものを使用することができ、即ち、アルキンを含有するＰＥＧ誘導体と非天然コードアミノ酸中のアジド部分を反応させることができる。
【０４４３】
ある実施形態において、ＰＥＧ誘導体を有するＡＢＰ変異型は、非天然コードアミノ酸の側鎖上に存在する化学官能基と反応性がある化学官能基を含有する。
【０４４４】
本発明は、ある実施形態において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格を含有する、アジド−及びアセチレン−含有ポリマー誘導体を提供する。水溶性ポリマーのポリマー骨格は、ポリ（エチレングリコール）であり得る。しかし、以下に限定されないが、ポリ（エチレン）グリコール及びその他の関連ポリマーを含む（ポリ（デキストラン）及びポリ（プロピレングリコール）など）多岐にわたる水溶性ポリマーもまた、本発明の実施における使用に適切であり、ＰＥＧ又はポリ（エチレングリコール）という用語の使用は、このような分子全てを包含し含むものとすることを理解されたい。ＰＥＧという用語は、以下に限定されないが、そのあらゆる形態でのポリ（エチレングリコール）（二官能性ＰＥＧ、分岐ＰＥＧ、誘導体化ＰＥＧ、フォーク状ＰＥＧ、分枝ＰＥＧ、懸垂ＰＥＧ（即ち、ポリマー骨格に垂れ下がった、一つ以上の官能基を有する、ＰＥＧ又は関連ポリマー）又はその中に分解性の結合を有するＰＥＧなど。）を含む。
【０４４５】
ＰＥＧは通常、透明で無色、無臭、水溶性、熱安定性、多くの化学物質に対して不活性であり、加水分解又は分解せず、通常は無毒性である。ポリ（エチレングリコール）は、生体適合性であるとみなされ、つまり、ＰＥＧは、害を与えることなく生体組織又は器官と共存可能である。より具体的には、ＰＥＧは、実質的に非免疫原性であり、つまり、ＰＥＧは、身体において免疫反応を生じさせる傾向がない。生物活性物質など、身体においてあるいくつかの必要な機能を有する分子に連結させる場合、ＰＥＧは、その物質をマスクする傾向があり、生物がその物質の存在に対して寛容性を示すことができるように、あらゆる免疫反応を低下させるか、又は取り除くことができる。ＰＥＧ共役物は実質的な免疫反応を引き起こさないか、又は凝固もしくはその他の不必要な影響を生じさせない傾向がある。式：−−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−を有するＰＥＧ（式中、ｎは約３から約４０００、通常は約２０から２０００である。）は、本発明での使用に適切である。分子量が約８００Ｄａから約１００，０００ＤａであるＰＥＧは、本発明のある実施形態において、ポリマー骨格として特に有用である。
【０４４６】
ポリマー骨格は、直鎖状又は分枝ポリマーであり得る。分枝ポリマー骨格は通常当技術分野で公知である。通常、分枝ポリマーは、中央分枝コア部分を有し、直鎖状ポリマー鎖の複数が中央分枝コアに連結している。ＰＥＧは一般に、グリセロール、グリセロールオリゴマー、ペンタエリスリトール及びソルビトールなどの様々なポリオールへのエチレンオキシドの添加により調製することができる分枝形態で使用される。中央分枝部分はまた、リジンなどのいくつかのアミノ酸由来であり得る。Ｒ（−ＰＥＧ−ＯＨ）ｍ（式中、Ｒはグリセロール、グリセロールオリゴマー又はペンタエリスリトールなどのコア部分由来であり、ｍは腕部分の数を表す。）のような一般式で分枝ポリ（エチレングリコール）を表すことができる。米国特許第５，９３２，４６２号、同第５，６４３，５７５号；同第５，２２９，４９０号；同第４，２８９，８７２号；米国特許公開２００３／０１４３５９６；ＷＯ９６／２１４６９；及びＷＯ９３／２１２５９（本明細書中にその全体を参照により組み込む。）に記載のものなどの、分岐したＰＥＧ分子もまたポリマー骨格として使用できる。
【０４４７】
分枝ＰＥＧは、ＰＥＧ（−−ＹＣＨＺ２）ｎ（式中、Ｙは、連結基であり、Ｚは指定された長さの原子鎖によりＣＨに連結された活性化末端基である。）で表されるフォーク状ＰＥＧの形態であり得る。
【０４４８】
さらに別の分枝形態である懸垂ＰＥＧは、ＰＥＧ鎖の末端ではなく、ＰＥＧ骨格とともにカルボキシルなどの反応基を有する。
【０４４９】
ＰＥＧのこれらの形態に加えて、骨格中の弱い又は分解性結合を用いて、ポリマーを調製することもできる。例えば、加水分解に供されるポリマー骨格中のエステル結合を用いてＰＥＧを調製できる。下記で示すように、この加水分解の結果、ポリマーがより低分子量の断片に切断される：
−ＰＥＧ−ＣＯ２−ＰＥＧ−＋Ｈ２Ｏ→ＰＥＧ−ＣＯ２Ｈ＋ＨＯ−ＰＥＧ−
ポリ（エチレングリコール）又はＰＥＧという用語が、以下に限定されないが、本明細書中で開示するものなど、当技術分野で公知の形態全てを表すか又は含むことは、当業者により理解される。
【０４５０】
多くの他のポリマーもまた本発明での使用に適切であり得る。ある実施形態において、水溶性であり、２から約３００末端であるポリマー骨格は本発明において特に有用である。適切なポリマーの例としては、以下に限定されないが、その他のポリ（アルキレングリコール）、例えばポリ（プロピレングリコール）（「ＰＰＧ」）など、そのコポリマー（以下に限定されないが、エチレングリコールとプロピレングリコールとのコポリマーなど。）、そのターポリマー、それらの混合物などが挙げられる。ポリマー骨格の各鎖の分子量は様々であり得るが、通常は、約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａ、多くの場合、約６，０００Ｄａから約８０，０００Ｄａの範囲である。
【０４５１】
実質的に水溶性の骨格に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的としたものであり、上述の質を有する全てのポリマー性物質が本発明での使用に適切なものとしてもくろまれることを、当業者は認識するであろう。
【０４５２】
本発明のある実施形態において、ポリマー誘導体は、「多官能性」であり、これは、つまり、ポリマー骨格が少なくとも２つの末端を有し、官能基により官能化又は活性化された、約３００末端にのぼる末端を有する可能性があることを意味する。多機能性ポリマー誘導体としては、以下に限定されないが、２つの末端（各末端に同じもしくは異なり得る官能基が結合している。）を有する直鎖状ポリマーが挙げられる。
【０４５３】
ある実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ポリ−Ｂ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（式中、Ｎ＝Ｎ＝Ｎはアジド部分であり、Ｂは連結部分（存在してもよく存在しなくてもよい。）であり、ポリは、水溶性の非抗原性ポリマーであり、Ａは、連結部分（存在してもよく存在しなくてもよく、Ｂと同じか異なっていてもよい。）であり、Ｘは第二の官能基である。）を有する。Ａ及びＢに対する連結部分の例としては、以下に限定されないが、１８個以下、より好ましくは１個から１０個の炭素原子を含有する多官能性アルキル基が挙げられる。窒素、酸素又はイオウなどのヘテロ原子がこのアルキル鎖に含まれ得る。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子において分枝され得る。Ａ及びＢに対する連結部分のその他の例としては、以下に限定されないが、１０個以下、より好ましくは５個から６個の炭素原子を含有する多官能性のアリール基が挙げられる。このアリール基は、もう１つの炭素原子、窒素、酸素又はイオウ原子により置換され得る。適切な連結基のその他の例としては、米国特許第５，９３２，４６２号；同第５，６４３，５７５号；及び米国特許公開２００３／０１４３５９６（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）に記載の連結基が挙げられる。連結部分に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的としたものであり、上述の質を有する全ての連結部分が本発明での使用に適切なものとしてもくろまれることを、当業者は認識するであろう。
【０４５４】
Ｘとしての使用に適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイニジルエステル及び１−ベンゾトリアゾリルエステルなど、活性カーボネート、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイニジルカーボネート及び１−ベンゾトリアゾリルカーボネートなど、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、ヒドラジド、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレート、アルケン、ケトン及びアジドが挙げられる。当業者により理解されるように、選択されたＸ部分は、アジド基との反応が起こらないよう、アジド基と適合可能であるべきである。アジド含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは、第二の官能基（即ちＸ）もアジド部分であることを意味するか、又はヘテロ二官能性であり、つまり、第二の官能基が異なる官能基であることを意味する。
【０４５５】
「保護化」という用語は、ある一定の反応条件下で、化学的に反応性のある官能基の反応を妨げる、保護基又は部分の存在を指す。保護基は、保護する化学的に反応性のある反応基のタイプにより異なる。例えば、化学的に反応性のある基がアミン又はヒドラジドである場合、ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）及び９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）の群から保護基を選択することができる。化学的に反応性のある基がチオールである場合、保護基は、オルトピリジルジスルフィドであり得る。化学的に反応性のある基が酪酸もしくはプロピイオン酸などのカルボン酸又はヒドロキシル基である場合、保護基は、ベンジル又はアルキル基（例えば、メチル、エチル又はｔｅｒｔ−ブチルなど。）であり得る。当技術分野で公知のその他の保護基もまた、本発明において使用し得る。
【０４５６】
文献中の末端官能基の具体例としては、以下に限定されないが、Ｎ−スクシンイニジルカーボネート（例えば、米国特許第５，２８１，６９８号、同第５，４６８，４７８号を参照。）、アミン（例えば、Ｂｕｃｋｍａｎｎら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８２：１３７９（１９８１）、Ｚａｐｌｉｐｓｋｉら、Ｅｕｒ．Ｐｏｌｙｍ．Ｊ．１９：１１７７（１９８３）を参照。）、ヒドラジド（例えば、Ａｎｄｒｅｚら、Ｍａｋｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．１７９：３０１（１９７８）を参照。）、スクシンイニジルプロピオネート及びスクシンイニジルブタノアート（例えば、Ｏｌｓｏｎら、Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、ｐｐ．１７０−１８１、Ｈａｒｒｉｓ及びＺａｐｌｉｐｓｋｙ編、ＡＣＳ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９７を参照。；米国特許第５，６７２，６６２号も参照のこと。）、スクシンイニジルスクシネート（例えば、Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ，７：１７５（１９８４）及びＪｏｐｐｉｃｈら、Ｍａｃｒｏｌｏｌ．Ｃｈｅｍ．１８０：１３８１（１９７９）を参照。）、スクシンイニジルエステル（例えば、米国特許第４，６７０，４１７号参照。）、ベンゾトリアゾールカーボネート（例えば、米国特許第５，６５０，２３４号参照。）、グリシジルエーテル（例えば、Ｐｉｔｈａら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．９４：１１（１９７９）、Ｅｌｌｉｎｇら、Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３：３５４（１９９１）を参照。）、オキシカルボニルイミダゾール（例えば、Ｂｅａｕｃｈａｍｐら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３１：２５（１９８３）、Ｔｏｎｄｅｌｌｉら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １：２５１（１９８５）を参照。）、ｐ−ニトロフェニルカーボネート（例えば、Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１１：１４１（１９８５）；及びＳａｒｔｏｒｅら、Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，２７：４５（１９９１）を参照。）、アルデヒド（例えば、Ｈａｒｒｉｓら、Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ｃｈｅｍ．Ｅｄ．２２：３４１（１９８４）、米国特許第５，８２４，７８４号、米国特許第５，２５２，７１４号を参照。）、マレイミド（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ８：３４３（１９９０）、Ｒｏｍａｎｉら、Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ２：２９（１９８４）及びＫｏｇａｎ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｃｏｍｍ．２２：２４１７（１９９２）を参照。）、オルトピリジル−ジスルフィド（例えば、Ｗｏｇｈｉｒｅｍら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．４：３１４（１９９３）を参照。）、アクリロール（例えば、Ｓａｗｈｎｅｙら、Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２６：５８１（１９９３）を参照。）、ビニルスルホン（例えば、米国特許第５，９００，４６１号を参照。）（上記の参考文献及び特許の全てを本明細書中に参照により組み込む。）が挙げられる。
【０４５７】
本発明のある一定の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
（式中、Ｘは、上述のような官能基であり、ｎは約２０から約４０００である。）を有するポリマー骨格を含有する。別の実施形態において、本発明のポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｗ−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ（式中、Ｗは、１個から１０個の炭素原子を含有する、脂肪族又は芳香族リンカー部分であり；ｎは約２０から約４０００であり；Ｘは上述のような官能基であり、ｍはｍは１から１０である。）を有するポリマー骨格を含有する。
【０４５８】
当技術分野で公知及び／又は本明細書中で開示されている様々な方法により、本発明のアジド含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。下記で示すある方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（第一の官能基に第一の末端が結合し、適切な脱離基に第二の末端が結合するポリマー骨格）をアジド陰イオン（ナトリウム、カリウム、ｔｅｒｔ−ブチルアンモニウムなどの適切な対イオンの何れかの数と対合し得る。）と反応させる。脱離基は求核置換され、アジド部分により置換され、これにより、所望のアジド含有ＰＥＧポリマーが生じる。
【０４５９】
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋Ｎ３−→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎ３
示されるように、本発明での使用に適切なポリマー骨格は、式：Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは適切な脱離基である。）を有する。適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アセタール、アルケニル、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、マレイミド、ジチオピリジン及びビニルピリジンならびにケトンが挙げられる。適切な脱離基の例としては、以下に限定されないが、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート及びトシレートが挙げられる。
【０４６０】
本発明のアジド含有ポリマー誘導体の調製のための別の方法において、アジド官能基を含有する連結剤を平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（ここで、この連結剤は、連結基によりアジドがポリマー骨格から離されているアジド含有ポリマー誘導体産物を形成するために、ＰＥＧポリマー上の化学官能基と選択的に反応する化学官能基を有する。）に接触させる。
【０４６１】
例となる反応スキームを以下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｍ＋Ｎ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ→ＰＧ−Ｘ−ＰＥＧ−リンカー−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシなどのキャッピング基又は上述のような官能基であり；Ｍは、アジド官能基と反応性がないが、Ｎ官能基と効率的かつ選択的に反応する官能基である。）。
【０４６２】
適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、Ｎがアミンである場合、Ｍが、カルボン酸、カーボネート又は活性エステルである；Ｎがヒドラジド又はアミノオキシ部分である場合、Ｍがケトンである；Ｎが求核試薬である場合、Ｍが脱離基であるものが挙げられる。
【０４６３】
以下に限定されないが、生成物の沈殿とその後のクロマトグラフィー（必要に応じて）など、公知の方法により、粗製生成物の精製を行い得る。
【０４６４】
ＰＥＧジアミンの場合のより具体的な例を下記に示すが、この場合、アミンのうち１個がｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃなどの保護基部分により保護され、アジド官能基を有する連結部分と、生じたモノ保護化ＰＥＧジアミンとを反応させる：
ＢｏｃＨＮ−ＰＥＧ−ＮＨ２＋ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）３−Ｎ＝Ｎ＝Ｎ
【０４６５】
この例において、塩化チオニル又はカルボジイミド剤及びＮ−ヒドロキシスクンイミド又はＮ−ヒドロキシベンゾトリアゾールなどの様々な活性化剤を用いて、アミン基をカルボン酸基とカップリングさせ、モノアミンＰＥＧ誘導体とアジド含有リンカー部分との間にアミド結合を形成させることができる。アミド結合をうまく形成させた後、生じたＮ−ｔｅｒｔ−ブチル−Ｂｏｃ−保護化アジド含有誘導体を直接用いて、生物活性分子を修飾するか、又はこれをさらに変化させて、その他の有用な官能基を取り込むことができる。例えば、強酸での処理によりＮ−ｔ−Ｂｏｃ基を加水分解して、オメガ−アミノ−ＰＥＧ−アジドを生成させることができる。生じたアミンを合成ハンドルとして使用して、有用なヘテロ二官能性物質を生成させるための、マレイミド基、活性化ジスルフィド、活性化エステルなどのその他の有用な官能基を取り込むことができる。
【０４６６】
ヘテロ二官能性誘導体は、ポリマーの各末端に異なる分子を結合させたい場合、特に有用である。例えば、オメガ−Ｎ−アミノ−Ｎ−アジドＰＥＧにより、ＰＥＧの一方の末端への、アルデヒド、ケトン、活性化エステル、活性化カーボネートなどの活性化された求電子基を有する分子の結合及びＰＥＧの他方の末端へのアセチレン基を有する分子の結合が可能となる。
【０４６７】
本発明の別の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−Ａ−ポリ−Ｂ−Ｃ≡Ｃ−Ｒ（式中、Ｒは、Ｈ又はアルキル、アルケン、アルキオキシ又はアリールもしくは置換アリール基の何れかであり得；Ｂは連結部分（存在してもよく存在しなくてもよい。）であり；ポリは、水溶性非抗原性ポリマーであり；Ａは連結部分（存在してもよく存在しなくてもよく、Ｂと同じか異なっていてもよい。）であり、Ｘは第二の官能基である。）を有する。
【０４６８】
Ａ及びＢに対する連結部分の例としては、以下に限定されないが、１８個以下、より好ましくは１個から１０個の炭素原子を含有する多官能性アルキル基が挙げられる。窒素、酸素又はイオウなどのヘテロ原子がこのアルキル鎖に含まれ得る。アルキル鎖はまた、ヘテロ原子において分枝し得る。Ａ及びＢに対する連結部分のその他の例としては、以下に限定されないが、１０個以下、より好ましくは５個から６個の炭素原子を含有する多官能性のアリール基が挙げられる。このアリール基は、もう１つの炭素原子、窒素、酸素又はイオウ原子により置換され得る。適切な連結基のその他の例としては、米国特許第５，９３２，４６２号；同第５，６４３，５７５号；及び米国特許公開２００３／０１４３５９６（それぞれを本明細書中に参照により組み込む。）に記載の連結基が挙げられる。連結部分に対する前述の一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的とするものであり、上述の質を有する多岐にわたる連結部分が本発明において有用に適切であることがもくろまれることを、当業者は認識するであろう。
【０４６９】
Ｘとしての使用に適切な官能基の例としては、以下に限定されないが、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アルコキシル、活性エステル、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイニジルエステル及び１−ベンゾトリアゾリルエステルなど、活性カーボネート、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイニジルカーボネート及び１−ベンゾトリアゾリルカーボネートなど、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、ヒドラジド、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート、トレシレート、アルケン、ケトン及びアセチレンが挙げられる。当業者により理解されるように、選択されるＸ部分は、アセチレン基との反応が起こらないよう、アセチレン基と適合可能であるべきである。アセチレン含有ポリマー誘導体は、ホモ二官能性であり得、これは、第二の官能基（即ちＸ）もアセチレン部分であることを意味するか、又はヘテロ二官能性であり、つまり、第二の官能基が異なる官能基であることを意味する。
【０４７０】
本発明の別の実施形態において、ポリマー誘導体は、構造：
Ｘ−ＣＨ２ＣＨ２Ｏ−−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（式中、Ｘは、上述のような官能基であり、ｎは約２０から約４０００であり、ｍは１から１０である。）を有するポリマー骨格を含有する。ヘテロ二官能性ＰＥＧポリマーのそれぞれの具体例を下記に示す。
【０４７１】
当業者にとって公知の方法及び／又は本明細書中で開示する方法を用いて、本発明のアセチレン−含有ＰＥＧ誘導体を調製することができる。ある方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａである水溶性ポリマー骨格（第一の官能基に第一の末端が結合し、適切な求核基に第二の末端が結合するポリマー骨格）を、アセチレン官能基と、ＰＥＧ上の求核基との反応に適切な脱離基と、の両方を有する化合物と反応させる。求核部分を有するＰＥＧポリマー及び脱離基を有する分子を組み合わせた場合、脱離基において求核置換が起こり、求核部分により置換され、これにより、所望のアセチレン含有ＰＥＧポリマーが生じる。
【０４７２】
Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ＋Ｌ−Ａ−Ｃ→Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ−Ａ−Ｃ≡ＣＲ’
示されるように、本反応での使用に適切なポリマー骨格は、式：Ｘ−ＰＥＧ−Ｎｕ（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｎｕは求核部分であり、Ｘは、Ｎｕ、Ｌ又はアセチレン官能基と反応しない官能基である。）を有する。
【０４７３】
Ｎｕの例としては、以下に限定されないが、アミン、アルコキシ、アリールオキシ、スルフヒドリル、イミノ、カルボキシレート、ヒドラジド、アアミンオキシ基（主にＳＮ２型の機構を介して反応する。）が挙げられる。Ｎｕ基のさらなる例としては、求核付加反応を介して主に反応する官能基が挙げられる。Ｌ基の例としては、塩化物、臭化物、ヨウ化物、メシレート、トレシレート及びトシレート及び、求核置換が行われると予想されるその他の基ならびに、ケトン、アルデヒド、チオエステル、オレフィン、α−β−不飽和カルボニル基、カーボネート及び、求核試薬により付加が起こると予想されるその他の求電子基が挙げられる。
【０４７４】
本発明の別の実施形態において、Ａは、１個から１０個の間の炭素原子の脂肪族リンカー又は６個から１４個の間の炭素原子の置換アリール環である。Ｘは、アジド基と反応しない官能基であり、Ｌは、脱離基である。
【０４７５】
本発明のアセチレン含有ポリマー誘導体の調製のための別の方法において、平均分子量が約８００Ｄａから約１００，０００Ｄａであり、一方の末端に保護化官能基又はキャッピング剤の何れかを有しており、他方の末端に適切な脱離基を有するＰＥＧポリマーをアセチレ陰イオンと接触させる。
【０４７６】
典型的な反応スキームを以下に示す：
Ｘ−ＰＥＧ−Ｌ＋−Ｃ≡ＣＲ’→Ｘ−ＰＥＧ−Ｃ≡ＣＲ’（式中、ＰＥＧはポリ（エチレングリコール）であり、Ｘは、アルコキシなどのキャッピング基又は上述のような官能基であり；Ｒ’は、Ｈ又は、アルキル、アルコキシ、アリール又はアリールオキシ基もしくは置換アルキル、アルコキシ、アリールもしくはアリールオキシ基の何れかである。）。
【０４７７】
上記の例において、脱離基Ｌは、十分な濃度のアセチレン陰イオンと接触させた場合に、ＳＮ２型の置換を起こすよう十分に反応性があるべきである。アセチレン陰イオンによる脱離基のＳＮ２型の置換を遂行するのに必要な反応条件は、当技術分野で周知である。
【０４７８】
以下に限定されないが、生成物の沈殿とその後のクロマトグラフィー（必要に応じて）など、公知の方法により、粗製生成物の精製を行い得る。
【０４７９】
水溶性ポリマーを本発明の抗原結合ポリペプチドに連結させることができる。抗原結合ポリペプチドに取り込まれた非天然コードアミノ酸、又は非天然コードもしくは天然コードアミノ酸の何れかの官能基もしくは置換基、又は非天然コードもしくは天然コードアミノ酸に付加された何れかの官能基もしくは置換基を介して水溶性ポリマーを連結し得る。あるいは、天然アミノ酸（以下に限定されないが、システイン、リジン又はＮ末端残基のアミン基など。）を介して非天然コードアミノ酸を取り込んでいる抗原結合ポリペプチドに水溶性ポリマーを連結させる。ある場合において、本発明のＡＢＰは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の非天然アミノ酸を含有し、一つ以上の非天然コードアミノ酸が水溶性ポリマー（以下に限定されないが、ＰＥＧ及び／又はオリゴ糖など。）に連結している。ある場合において、本発明のＡＢＰはさらに、水溶性ポリマーに連結している、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上の天然コードアミノ酸を含有する。ある場合において、本発明のＡＢＰは、水溶性ポリマーに連結している一つ以上の非天然コードアミノ酸及び、水溶性ポリマーに連結している一つ以上の天然のアミノ酸を含有する。ある実施形態において、本発明で使用される水溶性ポリマーは、非共役形態と比較してＡＢＰの血清半減期を延長させる。
【０４８０】
本発明の、抗原結合ポリペプチドに連結している水溶性ポリマーの数（即ち、ＰＥＧ化又はグリコシル化の程度）を調節して、インビボ半減期などの、薬理学的、薬物動態学的又は薬力学的特徴を変更（以下に限定されないが、増加又は減少など。）することができる。ある実施形態において、非修飾ポリペプチドよりも、少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、２倍、５倍、１０倍、５０倍又は少なくとも約１００倍、ＡＢＰの半減期を延長させる。
【０４８１】
強い求核基（即ち、ヒドラジド、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン又はセミカルバジド）を含有するＰＥＧ誘導体
本発明のある実施形態において、カルボニル含有非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドをＰＥＧ骨格と直接連結される、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体で修飾する。
【０４８２】
ある実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０４８３】
ある実施形態において、ヒドラジン含有又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）を有する。
【０４８４】
ある実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）を有する。
【０４８５】
本発明の別の実施形態において、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結している、末端ヒドロキシルアミン、ヒドラジド、ヒドラジン又はセミカルバジド部分を含有するＰＥＧ誘導体により、カルボニル含有アミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを修飾する。
【０４８６】
ある実施形態において、ヒドロキシルアミン末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０４８７】
ある実施形態において、ヒドラジン又はヒドラジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）を有する。
【０４８８】
ある実施形態において、セミカルバジド含有ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）を有する。
【０４８９】
本発明の別の実施形態において、末端ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有し、分枝ＰＥＧの各鎖が１０から４０ｋＤａ、より好ましくは５から２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する分枝ＰＥＧ誘導体により、カルボニル含有アミノ酸を含有するＡＢＰを修飾する。
【０４９０】
本発明の別の実施形態において、分枝構造を有するＰＥＧ誘導体により非天然のコードアミノ酸を含有するＡＢＰを修飾する。例えば、ある実施形態において、ヒドラジン−又はヒドラジド−末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは、場合によっては、存在しても存在しなくてもよい、カルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である。）を有する。
【０４９１】
ある実施形態において、セミカルバジド基を含有するＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、Ｘは場合によってはＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）を有する。
【０４９２】
ある実施形態において、ヒドロキシルアミン基を含有するＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−ＣＨ２−ＣＨ２］２ＣＨ−Ｘ−（ＣＨ２）ｍ−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、Ｘは場合によってはＮＨ、Ｏ、Ｓ、Ｃ（Ｏ）であるか又は存在せず、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）を有する。
【０４９３】
水溶性ポリマーがＡＢＰに連結している程度及び部位により、抗原又は受容体に対するＡＢＰの結合を調節することができる。
【０４９４】
ポリマーの活性化のための、ならびに、ペプチドの共役のための、方法及び化学反応は、文献中に記載されており、当技術分野で公知である。ポリマーの活性化のために一般に使用される方法としては、以下に限定されないが、臭化シアン、過ヨウ素酸塩、グルタールアルデヒド、ビエポキシド、エピクロロヒドリン、ジビニルスルホン、カルボジイミド、ハロゲン化スルホニル、トリクロロトリアジンなどによる官能基の活性化が挙げられる。（Ｒ．Ｆ．Ｔａｙｌｏｒ、（１９９１）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｍｍｏｂｉｌｉｓａｔｉｏｎ．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｓ．Ｓ．Ｗｏｎｇ，（１９９２）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ；Ｇ．Ｔ．Ｈｅｒｍａｎｓｏｎら、（１９９３）、Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｇａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．；Ｄｕｎｎ，Ｒ．Ｌ．ら、編、Ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ，ＡＣＳ  Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ  Ｓｅｒｉｅｓ  Ｖｏｌ．４６９，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．１９９１を参照。）。
【０４９５】
ＰＥＧの官能化及び共役のいくつかの概説及び論文が利用可能である。例えば、Ｈａｒｒｉｓ，Ｍａｃｒｏｎｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．Ｃ２５：３２５−３７３（１９８５）；Ｓｃｏｕｔｅｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １３５：３０−６５（１９８７）；Ｗｏｎｇら、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８６６−８７４（１９９２）；Ｄｅｌｇａｄｏら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ９：２４９−３０４（１９９２）；Ｚａｌｉｐｓｋｙ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．６：１５０−１６５（１９９５）を参照のこと。
【０４９６】
ポリマーの活性化のための方法はまた、ＷＯ９４／１７０３９、米国特許第５，３２４，８４４号、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／０４１９３、米国特許第５，２１９，５６４号、米国特許第５，１２２，６１４号、ＷＯ９０／１３５４０、米国特許第５，２８１，６９８号及びＷＯ９３／１５１８９においても、及び、活性化ポリマーと、以下に限定されないが、凝固因子ＶＩＩＩ（ＷＯ９４／１５６２５）、ヘモグロビン（ＷＯ９４／０９０２７）、酸素運搬分子（米国特許第４，４１２，９８９）、リボヌクレアーゼ及び超酸化物ジムスターゼ（Ｖｅｒｏｎｅｓｅら、Ａｐｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１１：１４１−４５（１９８５））を含む酵素との間の共役に対するものも見出すことができる。引用する参考文献及び特許を全て、本明細書中に参照により組み込む。
【０４９７】
何らかの従来法により、ｐ−アジド−Ｌ−フェニルアラニンなどの非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドのＰＥＧ化（即ち、何らかの水溶性ポリマーの付加）を行う。例えば、アルキン末端ｍＰＥＧ誘導体によりＡＢＰをＰＥＧ化する。簡潔に述べると、室温にて、撹拌しながら、ｐ−アジド−Ｌ−Ｐｈｅ−含有ＡＢＰの水溶液に固体ｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨの過剰量を添加する。通常、反応を行うｐＨ付近（通常約ｐＨ４から１０）のｐＫａを有する緩衝液で水溶液を緩衝化する。ｐＨ７．５でのＰＥＧ化のための適切な緩衝液の例としては、例えば、以下に限定されないが、ＨＥＰＥＳ、リン酸塩、ホウ酸塩、ＴＲＩＳ−ＨＣｌ、ＥＰＰＳ及びＴＥＳが挙げられる。ｐＨを連続してモニタリングし、必要に応じて調整する。反応は通常、約１時間から４８時間連続して行う。
【０４９８】
続いて反応産物を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供して、フリーのｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ及び、ブロックされていないＰＥＧが分子の両末端で活性化されている場合に形成され得、それによりＡＢＰ変異型分子を架橋する、ＰＥＧ化ＡＢＰの全ての高分子量複合体から、ＰＥＧ化ＡＢＰ変異型を分離する。疎水性相互作用クロマトグラフィーの際の条件は、フリーのｍＰＥＧ（５０００）−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨがカラムから流出し、一方であらゆる架橋ＰＥＧ化ＡＢＰ変異型複合体が、一つ以上のＰＥＧ基と共役させられている１個のＡＢＰ変異型分子を含有する所望の形態の後に、溶出するようなものである。適切な条件は、架橋複合体対所望の共役物の相対サイズにより異なり、当業者は容易にこれを決定する。所望の共役物を含有する溶出物を限外ろ過により濃縮し、ダイアフィルトレーションにより脱塩する。
【０４９９】
必要に応じて、以下に限定されないが、アフィニティークロマトグラフィー；陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー（以下に限定されないが、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥなどを使用する。）；シリカでのクロマトグラフィー；逆相ＨＰＬＣ；ゲルろ過（以下に限定されないが、ＳＥＰＨＡＤＥＸ  Ｇ−７５などを使用する。）；疎水性相互作用クロマトグラフィー；サイズ排除クロマトグラフィー、金属キレートクロマトグラフィー；限外ろ過／ダイアフィルトレーション；エタノール沈殿； 硫酸アンモニウム沈殿；クロマト分画；置換クロマトグラフィー；電気泳動法（以下に限定されないが、分取等電点電気泳動など。）、異なる溶解性（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｓｏｌｕｂｉｌｉｔｙ）（以下に限定されないが、硫酸アンモニウム沈殿を含む。）又は抽出などの、当業者にとって公知の一つ以上の手段により、疎水性クロマトグラフィーから得たＰＥＧ化ＡＢＰをさらに精製する。球状タンパク質標準（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｈａｒｒｉｓ及びＡｎｇａｌ編）ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ  １９８９，２９３−３０６）と比較することによるＧＰＣによって、見かけの分子量を推定し得る。タンパク質分解（以下に限定されないが、トリプシン切断など。）を行い、次いでマススペクトロメトリー分析を行うことにより、ＡＢＰ−ＰＥＧ共役物の純度を評価することができる。Ｐｅｐｉｎｓｋｙ  Ｂ．，ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ＆  Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９７（３）：１０５９−６６（２００１）。
【０５００】
制限なしで、本発明のＡＢＰのアミノ酸に連結している水溶性ポリマーをさらに誘導体化するか置換することができる。
【０５０１】
アジド含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、非天然コードアミノ酸の側鎖に存在するアルキン部分と反応するアジド部分を含有するＰＥＧ誘導体により、抗原結合ポリペプチドを修飾する。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１から１００ｋＤａの平均分子量を有し、ある実施形態においては、１０から４０ｋＤａの平均分子量を有する。
【０５０２】
ある実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｎ３（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０５０３】
別の実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０５０４】
本発明の別の実施形態において、末端アジド部分を含有し、分枝ＰＥＧの各鎖が１０から４０ｋＤａ、より好ましくは５から２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する分枝ＰＥＧ誘導体により、アルキン含有アミノ酸を含有するＡＢＰを修飾する。例えば、ある実施形態において、アジド末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−Ｎ３（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは、場合によっては、各場合において、Ｏ、Ｎ、Ｓ又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）である（存在してもよいし、存在しなくてもよい。）。）を有する。
【０５０５】
アルキン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、非天然コードアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体により、抗原結合ポリペプチドを修飾する。
【０５０６】
ある実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ≡ＣＨ（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である（即ち、平均分子量は５から４０ｋＤａの間である。）。）を有する。
【０５０７】
本発明の別の実施形態において、アミド結合によりＰＥＧ骨格に連結している末端アジド又は末端アルキン部分を含有するＰＥＧ誘導体により、アルキン含有非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを修飾する。
【０５０８】
ある実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、ｎは１００から１，０００である。）を有する。
【０５０９】
本発明の別の実施形態において、末端アルキン部分を含有し、分枝ＰＥＧの各鎖が１０から４０ｋＤａ、より好ましくは５から２０ｋＤａの範囲のＭＷを有する分枝ＰＥＧ誘導体により、アジド含有アミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを修飾する。例えば、ある実施形態において、アルキン末端ＰＥＧ誘導体は、次の構造：
［ＲＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）］２ＣＨ（ＣＨ２）ｍ−Ｘ−（ＣＨ２）ｐ−Ｃ≡ＣＨ（式中、Ｒは単純アルキル（メチル、エチル、プロピルなど。）であり、ｍは２から１０であり、ｐは２から１０であり、ｎは１００から１，０００であり、Ｘは、場合によっては、Ｏ、Ｎ、Ｓ又はカルボニル基（Ｃ＝Ｏ）であるか、又は存在しない。）を有する。
【０５１０】
ホスフィン含有ＰＥＧ誘導体
本発明の別の実施形態において、非天然コードアミノ酸の側鎖に存在するアジド部分と反応するアリールホスフィン基をさらに含む活性化官能基（以下に限定されないが、エステル、カーボネートなど。）を含有するＰＥＧ誘導体により、抗原結合ポリペプチドを修飾する。一般に、ＰＥＧ誘導体は、１から１００ｋＤａの平均分子量、ある実施形態においては、１０から４０ｋＤａの平均分子量を有する。
【０５１１】
ある実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
【０５１２】
【化１４】
2008503217.tif 000017
（式中、ｎは１から１０であり、ＸはＯ、Ｎ、Ｓであり得るか、又は存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーである。）を有する。
【０５１３】
ある実施形態において、ＰＥＧ誘導体は、構造：
【０５１４】
【化１５】
2008503217.tif 000018
（式中、Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであり得るか、又は存在しなくてもよく、Ｐｈはフェニルであり、Ｗは水溶性ポリマーであり、Ｒは、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリール基であり得る。）を有する。Ｒ基の例としては、以下に限定されないが、−ＣＨ２、−Ｃ（ＣＨ３）３、−ＯＲ’、−ＮＲ’Ｒ’’、−ＳＲ’、−ハロゲン、−Ｃ（Ｏ）Ｒ’、−ＣＯＮＲ’Ｒ’’、−Ｓ（Ｏ）２Ｒ’、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲ’Ｒ’’、−ＣＮ及び−ＮＯ２が挙げられる。Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’はそれぞれ独立に、水素、置換もしくは非置換へテロアルキル、置換もしくは非置換アリール（以下に限定されないが、１個から３個のハロゲンで置換されているアリールを含む。）、置換もしくは非置換アルキル、アルコキシもしくはチオアルコキシ基又はアリールアルキル基を指す。本発明の化合物が複数のＲ基を含む場合、例えば、各Ｒ基は、これらの基の複数が存在する場合であれば、Ｒ’、Ｒ’’、Ｒ’’’及びＲ’’’’基それぞれとして独立に選択される。Ｒ’及びＲ’’が同じ窒素原子に結合する場合、これらは、窒素原子と一緒になって５、６又は７員環を形成し得る。例えば、−ＮＲ’Ｒ’’は、以下に限定されないが、１−ピロリジニル及び４−モルホリニルを含むものとする。置換基の上記考察から、「アルキル」という用語が、ハロアルキル（以下に限定されないが、−ＣＦ３及び−ＣＨ２ＣＦ３を含む。）及びアシル（以下に限定されないが、-Ｃ（Ｏ）ＣＨ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＦ３、−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＯＣＨ３などを含む。）など、水素基以外の基に結合した炭素原子などの基を含むものであることを当業者は理解するであろう。
【０５１５】
その他のＰＥＧ誘導体及び一般的なＰＥＧ化技術
抗原結合ポリペプチドに連結させ得るその他の代表的なＰＥＧ分子ならびに、ＰＥＧ化の方法には、次の文献に記載のものが含まれる。例えば、米国特許公開２００４／０００１８３８；２００２／００５２００９；２００３／０１６２９４９；２００４／００１３６３７；２００３／０２２８２７４；２００３／０２２０４４７；２００３／０１５８３３３；２００３／０１４３５９６；２００３／０１１４６４７；２００３／０１０５２７５；２００３／０１０５２２４；２００３／００２３０２３；２００２／０１５６０４７；２００２／００９９１３３；２００２／００８６９３９；２００２／００８２３４５；２００２／００７２５７３；２００２／００５２４３０；２００２／００４００７６；２００２／００３７９４９；２００２／０００２２５０；２００１／００５６１７１；２００１／００４４５２６；２００１／００２７２１７；２００１／００２１７６３；米国特許第６，６４６，１１０号；同第５，８２４，７７８号；同第５，４７６，６５３号；同第５，２１９，５６４号；同第５，６２９，３８４号；同第５，７３６，６２５号；同第４，９０２，５０２号；同第５，２８１，６９８号；同第５，１２２，６１４号；同第５，４７３，０３４号；同第５，５１６，６７３号；同第５，３８２，６５７号；同第６，５５２，１６７号；同第６，６１０，２８１号；同第６，５１５，１００号；同第６，４６１，６０３号；同第６，４３６，３８６号；同第６，２１４，９６６号；同第５，９９０，２３７号；同第５，９００，４６１号；同第５，７３９，２０８号；同第５，６７２，６６２号；同第５，４４６，０９０号；同第５，８０８，０９６号；同第５，６１２，４６０号；同第５，３２４，８４４号；同第５，２５２，７１４号；同第６，４２０，３３９号；同第６，２０１，０７２号；同第６，４５１，３４６号；同第６，３０６，８２１号；同第５，５５９，２１３号；同第５，６１２，４６０号；同第５，７４７，６４６号；同第５，８３４，５９４号；同第５，８４９，８６０号；同第５，９８０，９４８号；同第６，００４，５７３号；同第６，１２９，９１２号；ＷＯ９７／３２６０７、ＥＰ２２９，１０８、ＥＰ４０２，３７８、ＷＯ９２／１６５５５、ＷＯ９４／０４１９３、ＷＯ９４／１４７５８、ＷＯ９４／１７０３９、ＷＯ９４／１８２４７、ＷＯ９４／２８０２４、ＷＯ９５／００１６２、ＷＯ９５／１１９２４、ＷＯ９５／１３０９０、ＷＯ９５／３３４９０、ＷＯ９６／０００８０、ＷＯ９７／１８８３２、ＷＯ９８／４１５６２、ＷＯ９８／４８８３７、ＷＯ９９／３２１３４、ＷＯ９９／３２１３９、ＷＯ９９／３２１４０、ＷＯ９６／４０７９１、ＷＯ９８／３２４６６、ＷＯ９５／０６０５８、ＥＰ４３９５０８、ＷＯ９７／０３１０６、ＷＯ９６／２１４６９、ＷＯ９５／１３３１２、ＥＰ９２１１３１、ＷＯ９８／０５３６３、ＥＰ８０９９９６、ＷＯ９６／４１８１３、ＷＯ９６／０７６７０、ＥＰ６０５９６３、ＥＰ５１０３５６、ＥＰ４００４７２、ＥＰ１８３５０３及びＥＰ１５４３１６（これらを本明細書中に参照により組み込む。）。本明細書に記載のＰＥＧ分子の何れも、以下に限定されないが、１本鎖、分枝鎖、分岐鎖、一官能性、二官能性、多官能性又はそれらのあらゆる組合せを含む、あらゆる形態で使用することができる。
【０５１６】
血清アルブミンに対する親和性の促進
様々な分子を本発明の抗原結合ポリペプチドに融合させて、血清中のＡＢＰの半減期を調節することもできる。ある実施形態において、分子を本発明の抗原結合ポリペプチドと連結又は融合させて、動物における内在性血清アルブミンに対する親和性を促進する。
【０５１７】
例えば、ある場合において、抗原結合ポリペプチドの組み換え融合物及びアルブミン結合配列を作製する。代表的なアルブミン結合配列には、以下に限定されないが、連鎖球菌タンパク質Ｇからのアルブミン結合ドメイン（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２７７：５３４−５４２（１９９６）及びＳｊｏｌａｎｄｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１：１１５−１２３（１９９７）参照。）又は例えばＤｅｎｎｉｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：３５０３５−３５０４３（２００２）に記載のものなどのアルブミン結合ペプチドが含まれる。
【０５１８】
他の実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドを脂肪酸でアシル化する。ある場合において、脂肪酸は血清アルブミンへの結合を促進する。例えば、Ｋｕｒｔｚｈａｌｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３１２：７２５−７３１（１９９５）を参照のこと。
【０５１９】
他の実施形態において、本発明の抗原結合ポリペプチドを血清アルブミンに直接融合させる（以下に限定されないが、ヒト血清アルブミンなど。）。多岐にわたるその他の分子を本発明におけるＡＢＰに連結させて、血清アルブミン又はその他の血清成分への結合を調節することもできることを、当業者は認識するであろう。
【０５２０】
Ｘ．ＡＢＰのグリコシル化
本発明は、糖残基を有する一つ以上の非天然コードアミノ酸を取り込んでいる抗原結合ポリペプチドを含む。糖残基は、天然（以下に限定されないが、Ｎ−アセチルグルコサミンなど。）又は非天然（以下に限定されないが、３−フルオロガラクトースなど。）の何れかであり得る。糖はＮ−又はＯ−結合型グリコシド結合（以下に限定されないが、Ｎ−アセチルガラクトース−Ｌ−セリンなど。）又は非天然結合（以下に限定されないが、オキシム又は対応するＣ−もしくはＳ−結合型グリコシドなど。）の何れかにより、非天然コードアミノ酸に連結し得る。
【０５２１】
糖（以下に限定されないが、グリコシルなど。）部分をインビボ又はインビトロの何れかで抗原結合ポリペプチドに付加し得る。本発明のある実施形態において、アミノオキシ基により誘導体化された糖を用いてカルボニル含有非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを修飾し、オキシム結合を介して連結された対応するグリコシル化ポリペプチドを生成させる。非天然コードアミノ酸に連結させた後、グリコシルトランスフェラーゼ及びその他の酵素を用いて処理を行って、抗原結合ポリペプチドに結合したオリゴ糖を生成させることにより、糖をさらに変化させ得る。例えば、Ｈ．Ｌｉｕら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２５：１７０２−１７０３（２００３）を参照のこと。
【０５２２】
本発明のある実施形態において、アミノオキシ誘導体として調製された規定される構造を有するグリカンを用いて、カルボニル含有非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを直接修飾する。アジド、アルキン、ヒドラジド、ヒドラジン及びセミカルバジドなどの他の官能基を使用して、非天然コードアミノ酸に糖を連結させることができることを、当業者は認識するであろう。
【０５２３】
本発明のある実施形態において、以下に限定されないが、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化反応（以下に限定されないが、アルキニル又はアジド誘導体それぞれなどを用いて。）などにより、アジド又はアルキニル含有非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを修飾することができる。この方法により、タンパク質を非常に高い選択性で修飾することができるようになる。
【０５２４】
ＸＩ．ＡＢＰ二量体及び多量体
本発明はまた、以下に限定されないが、ＡＢＰホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体（即ち、三量体、四量体など。）などの、ＡＢＰの組み合わせを提供するが、この場合、一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有するＡＢＰポリペプチドは、ポリペプチド骨格に直接、又はリンカーを介しての何れかで、別のＡＢＰもしくはそれらの変異型又は非ＡＢＰポリペプチドもしくはそれらの変異型である何らかの他のポリペプチドと結合している。単量体と比較してその分子量が大きいことから、ＡＢＰ二量体又は多量体共役物は、以下に限定されないが、異なる薬理学的、薬物動態的特性、単量体ＡＢＰと比べて、調節された治療半減期又は調節された血漿半減期など、新しい、又は所望する特性を示し得る。ある実施形態において、本発明のＡＢＰ二量体は、ＡＢＰ受容体の二量体化を調節する。他の実施形態において、本発明のＡＢＰ二量体又は多量体は、ＡＢＰ受容体アンタゴニスト、アゴニスト又はモジュレーターとして作用する。
【０５２５】
ある実施形態において、ＡＢＰ含有二量体又は多量体に存在するＡＢＰの一つ以上は、水溶性ポリマーに連結している非天然コードアミノ酸を含有する。ある実施形態において、以下に限定されないが、Ａｓｎ−Ｌｙｓアミド結合又はＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合などを介して、ＡＢＰは直接連結している。ある実施形態において、連結ＡＢＰ及び／又は連結非ＡＢＰポリペプチドは、二量体化を促進するために、異なる非天然コードアミノ酸を含有し、以下に限定されないが、第一のＡＢＰの１つの非天然コードアミノ酸中のアルキン及び第二のＡＢＰの第二の非天然コードアミノ酸中のアジドなどは、Ｈｕｉｓｇｅｎ［３＋２］付加環化により共役される。あるいは、ヒドロキシルアミン含有非天然コードアミノ酸を含有する第二のＡＢＰポリペプチドに、第一のＡＢＰ及び／又は、ケトン含有非天然コードアミノ酸を含有する連結非ＡＢＰポリペプチドを共役させ、対応するオキシムの形成を介してそのポリペプチドを反応させる。
【０５２６】
あるいは、２個のＡＢＰ及び／又は連結非ＡＢＰポリペプチドをリンカーを介して連結させる。何らかのヘテロ又はホモ二官能性リンカーを使用して、２個のＡＢＰ及び／又は連結非ＡＢＰポリペプチド（同じ又は異なる一次配列を有し得る。）を連結させることができる。ある場合において、ＡＢＰ及び／又は連結非ＡＢＰポリペプチドを一緒に連結するために使用するリンカーは、二官能性ＰＥＧ物質であり得る。リンカーは、幅広い分子量又は分子長を有し得る。より大きい又はより小さい分子量のリンカーを使用して、ＡＢＰと連結物体との間に、所望の空間的関係又は立体構造を与え得る。より長い又はより短い分子長のリンカーを使用して、ＡＢＰと連結物体との間に、所望の空間又は柔軟性を与えることもできる。同様に、特定の形又は立体構造を有するリンカーを利用して、ＡＢＰがその標的に到達する前又は後の何れかに、ＡＢＰ又は連結物体に特定の形又は立体構造を与え得る。所望の条件下でＡＢＰ又は非ＡＢＰポリペプチドの放出を調節するために、リンカーの各末端に存在する官能基を選択し得る。ＡＢＰと連結物体との間の空間的関係をこのように最適化することにより、新しい、調節された、又は所望の特性を分子に対して与え得る。
【０５２７】
ある実施形態において、本発明は、ダンベル構造を有する水溶性二官能性リンカーを提供するが、この構造は以下のものを含む：ａ）ポリマー骨格の少なくとも第一の末端における、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシルアミン又はカルボニル含有部分；及びｂ）ポリマー骨格の第二の末端における少なくとも第二の官能基。第二の官能基は、第一の官能基と同じ又は異なり得る。第二の官能基は、ある実施形態において、第一の官能基と反応性がない。本発明は、ある実施形態において、分枝状分子構造の少なくとも１つのアームを含有する水溶性化合物を提供する。例えば、分枝状分子構造は、樹状であり得る。
【０５２８】
ある実施形態において、本発明は、構造：
Ｒ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｘ（式中、ｎは約５から３，０００であり、ｍは２から１０であり、Ｘは、アジド、アルキン、ヒドラジン、ヒドラジド、アミノオキシ基、ヒドロキシルアミン、アセチル又はカルボニル含有部分であり得、Ｒは、Ｘと同じもしくは異なリ得る、キャッピング基、官能基又は脱離基である。）を有する水溶性活性化ポリマーとの反応により形成された、一つ以上のＡＢＰを含有する多量体を提供する。Ｒは、例えば、ヒドロキシル、保護化ヒドロキシル、アルコキシ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイニジルエステル、１−ベンゾトリアゾリルエステル、Ｎ−ヒドロキシスクシンイニジルカーボネート、１−ベンゾトリアゾリルカーボネート、アセタール、アルデヒド、アルデヒド水和物、アルケニル、アクリレート、メタクリレート、アクリルアミド、活性スルホン、アミン、アミノオキシ、保護化アミン、ヒドラジド、保護化ヒドラジド、保護化チオール、カルボン酸、保護化カルボン酸、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ビニルスルホン、ジチオピリジン、ビニルピリジン、ヨウ化アセトアミド、エポキシド、グリオキサール、ジオン、メシレート、トシレート及びトレシレート、アルケン及びにケトンからなる群から選択される官能基であり得る。
【０５２９】
ＸＩＩ．ＡＢＰ活性及びＡＢＰ抗原もしくは結合パートナーに対するＡＢＰの親和性の測定
標準的なインビトロ又はインビボアッセイを用いて、ＡＢＰ活性を測定することができる。例えば、ＡＢＰを結合する、細胞又は細胞株（以下に限定されないが、ネイティブのＡＢＰ抗原もしくは結合パートナーを含有する細胞又は組み換えＡＢＰ抗原もしくは結合パートナー産生細胞）を使用して、ＡＢＰ結合をモニタリングすることができる。非天然アミノ酸を含有する非ＰＥＧ化又はＰＥＧ化抗原結合ポリペプチドの場合、ＢＩＡｃｏｒｅＴＭバイオセンサー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）などの当技術分野で公知の技術を用いて、その抗原又は結合パートナーに対するＡＢＰの親和性を測定することができる。
【０５３０】
ＡＢＰ’ｓを調製するためにどの方法を用いるかに関わらず、生物活性に対するアッセイにＡＢＰ’ｓを供する。適切な場合は、トリチウム化チミジンアッセイを行って、細胞分裂の程度を確認することができる。しかし、その他の生物学的アッセイを用いて所望の活性を確認することができる。抗原の生物活性を阻害する能力（酵素的、増殖的又は代謝活性など。）の測定などの生物学的アッセイによってもＡＢＰ活性の指標が与えられる。その他のインビトロアッセイを使用して生物活性を確認することができる。一般に、生物活性に対する試験により、抗原の生物活性に応じて、生物活性の増加もしくは低下（非変更ＡＢＰと比較した場合）、異なる生物活性（非変更ＡＢＰと比較した場合）、受容体親和性の分析、立体構造的もしくは構造的変化又は血清半減期分析などの、所望の結果に対する分析が可能となる。
【０５３１】
アッセイ法に対する上記の参考例をまとめたものは網羅的ではなく、他のアッセイも所望の最終結果に対する試験に有用であることを当業者は認識するであろう。
【０５３２】
ＸＩＩＬ．効力、機能的インビボ半減期及び薬物動態学的パラメーターの測定
本発明の重要な態様は、水溶性ポリマー部分へのＡＢＰの共役あり又は無しで、ＡＢＰの構築により得られる生物学的半減期の延長である。ＡＢＰ血清濃度が急激に低下することにより、共役及び非共役ＡＢＰ及びそれらの変異型を用いた治療に対する生物学的反応を評価することが重要となる。好ましくは、本発明の、共役及び非共役ＡＢＰならびにそれらの変異型の血清半減期は、ｉ．ｖ．投与後も長く、これにより、例えばＥＬＩＳＡ法により、又は一次スクリーニングアッセイにより測定することが可能となる。本明細書に記載のとおりにインビボ生物学的半減期の測定を行う。
【０５３３】
正常Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙオスラット（各治療群あたりＮ＝５匹動物）において、非天然のコードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドに対する薬物動態学的パラメーターを評価することができる。動物に対して、２５μｇ／ラットのｉｖ又は５０μｇ／ラットのｓｃの単回投与の何れかを行い、前もって定めたタイムコースに従い、およそ５回から７回の血液試料採取を行うが、通常、水溶性ポリマーに共役していない非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドの場合は約６時間、水溶性ポリマーに共役させた非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドの場合は約４日間にわたり実施する。ＡＢＰに対する薬物動態学的データはいくつかの種で詳しく研究されており、非天然コードアミノ酸を含有するＡＢＰに対して得たデータと直接比較することができる。
【０５３４】
当技術分野で公知の様々なアッセイにより、本発明によるＡＢＰの比活性を調べることができる。本明細書中に記載の、又は本明細書中で参照した、又は当業者にとって公知の方法により、本発明に従い調製し精製した、ＡＢＰ突然変異体又はそれらの断片の生物活性を試験することができる。
【０５３５】
ＸＩＶ．投与及び医薬組成物
以下に限定されないが、適切な製薬担体と組み合わせるなどして、治療用途のために、本発明の、ポリペプチド又はタンパク質（以下に限定されないが、ＡＢＰ、シンテターゼ、一つ以上の非天然アミノ酸を含有するタンパク質など。）を場合によっては使用することができる。このような組成物は、例えば、化合物の治療的有効量と医薬的に許容される担体又は賦形剤とを含有する。このような担体又は賦形剤としては、以下に限定されないが、生理食塩水、緩衝食塩水、デキストロース、水、グリセロール、エタノール及び／又はそれらの組合せが挙げられる。投与様式に適切となるように処方物を調製する。一般に、タンパク質の投与方法は、当技術分野で周知であり、本発明のポリペプチドの投与に適用することができる。
【０５３６】
当技術分野で周知の方法に従い、本発明の一つ以上のポリペプチドを含有する治療用組成物を、場合によっては一つ以上の適切なインビトロ及び／又はインビボ疾患動物モデルにおいて試験し、有効性、組織代謝を確認し、投与量を推定する。特に、投与量は最初、天然アミノ酸ホモローグに対する本明細書中の非天然物（以下に限定されないが、天然アミノ酸ＡＢＰに対する、一つ以上の非天然アミノ酸を含むように修飾されたＡＢＰの比較など。）の、活性、安定性又はその他の適切な指標により、即ち、適切なアッセイにおいて、決定することができる。
【０５３７】
投与は、血液又は組織細胞と最終的に接触するように分子を導入するために通常使用されるあらゆる経路による。何らかの適切な様式で、場合によっては一つ以上の医薬的に許容される担体とともに、本発明の非天然アミノ酸ポリペプチドを投与する。本発明の関連におけるこのようなポリペプチドを患者に投与する適切な方法が利用可能であるが、複数の経路を用いて特定組成物を投与することができ、特定経路によって、別の経路よりも迅速かつ効果的な作用又は応答を得られることが多い。
【０５３８】
一部、投与する特定の組成物によって、ならびに、組成物を投与するのに使用する特定の方法によって、医薬的に許容される担体を決定する。したがって、本発明の医薬組成物の多岐にわたる適切な処方がある。
【０５３９】
以下に限定されないが、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、皮下、局所、舌下又は直腸手段などの多くの経路により、ポリペプチド組成物を投与することができる。リポソームを介して修飾又は非修飾の非天然アミノ酸ポリペプチドを含有する組成物を投与することもできる。このような投与経路及び適切な処方は通常、当業者にとって公知である。
【０５４０】
単独又はその他の適切な成分と組み合わせて非天然アミノ酸を含有するＡＢＰをエアロゾル製剤に調製して（即ち、これらは「霧状」にすることができる。）、吸入により投与することもできる。加圧された許容可能なプロペラント（ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素など。）にエアロゾル製剤を入れることができる。
【０５４１】
例えば、関節内投与（関節中に）、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内及び皮下経路などの非経口投与に適切な処方としては、水性及び非水性の等張滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び、処方物を投与する受容者の血液と等張にする溶質を含有し得る。）及び、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存料を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。アンプル及びバイアルなど、単位用量又は複数回用量の密封容器において、パッケージ化ＡＢＰの処方を提供することができる。
【０５４２】
非経口投与及び静脈内投与は好ましい投与方法である。特に、現在使用されている処方物とともに、天然アミノ酸ホモローグ治療薬に対して既に使用されている投与経路（以下に限定されないが、ＥＰＯ、ＧＨ、ＡＢＰ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ、インターロイキン、抗体及び／又は何らかの他の医薬として送達されるタンパク質に対して通常使用されるものなど。）は、本発明のポリペプチドに対する好ましい投与経路及び処方を与える。
【０５４３】
本発明に関連して、患者へ投与する用量は、時間とともに患者において有効な治療応答を有するのに十分なものであるか、又は、適用に依存して、以下に限定されないが病原体による感染又はその他の適切な活性を阻害するためなどに十分なものである。特定のベクターもしくは処方の効率及び使用する非天然アミノ酸ポリペプチドの活性、安定性もしくは血清半減期及び患者の状態、ならびに処置する患者の、体重もしくは表面積により、用量を決定する。特定の患者における、特定のベクター、処方などの投与に付随する何らかの不都合な副作用の、存在、性質及び程度によっても、用量サイズが決定される。
【０５４４】
疾患（以下に限定されないが、癌、遺伝性疾患、糖尿病、ＡＩＤＳなど。）の治療又は予防において投与するベクター又は処方の有効量を決定する場合、医師は、循環血漿レベル、処方の毒性、疾患の進行及び／又は適切な場合は、抗非天然アミノ酸ポリペプチド抗体の産生を評価する。
【０５４５】
例えば、７０ｋｇの患者に投与する用量は、通常、現在使用されている治療用タンパク質の投与量と等しい範囲であり、関連組成物の活性又は血清半減期の変化に対して調節される。本発明のベクターは、抗体投与、ワクチン投与、細胞毒性物質、天然アミノ酸ポリペプチド、核酸、ヌクレオチド類似体、生物反応調節物質などの投与をはじめ、何らかの公知の従来の治療による治療状態を補完することができる。
【０５４６】
投与に対して、以下に限定されないが大部分及び全体的な患者の健康に対して適用する場合を含め、関連処方のＬＤ−５０又はＥＤ−５０及び／又は様々な濃度での非天然アミノ酸の何らかの副作用の観察により決定した速度で本発明の処方物を投与する。単回投与又は分割投与で投与を行うことができる。
【０５４７】
処方物の注入を行っている患者が発熱、悪寒又は筋肉痛を発症した場合、その患者にアスピリン、イブプロフェン、アセトアミドフェン又はその他の疼痛／発熱制御薬の適量を与える。発熱、筋肉痛及び悪寒など、注入に対する反応が出たことがある患者には、それ以降の注入の３０分前に、アスピリン、アセトアミドフェン又は以下に限定されないがジフェンヒドラミンなどの何れかを前もって与える。解熱剤及び抗ヒスタミン剤に対して迅速に応答しないより重度の悪寒及び筋肉痛には、メペリジンを使用する。反応の重症度によって、細胞注入の速度を遅くするか、又は中断する。
【０５４８】
動物対象に、本発明のヒト抗原結合ポリペプチドを直接投与することができる。投与は、ＡＢＰを対象に導入するために通常使用される何れかの経路による。本発明の実施形態によるＡＢＰ組成物には、経口、直腸、局所、吸入（以下に限定されないが、エアロゾルを介したものなど。）、口腔内（以下に限定されないが、舌下など。）、膣内、非経口（以下に限定されないが、皮下、筋肉内、皮内、関節内、胸膜内、腹腔内、脳内、動脈内又は静脈内など。）、局所（即ち、皮膚及び粘膜表面の両方、気道表面を含む。）及び経皮投与に適切なものが含まれるが、いかなる場合も、最適な経路は、治療する状態の性質及び重症度に依存する。投与は局所又は全身投与の何れかであり得る。アンプル及びバイアルなどの、単位用量又は複数回用量の密封容器において化合物の処方物を与え得る。単位用量の注射用形態（以下に限定されないが、溶液、懸濁液又はエマルジョンなど。）での医薬的に許容される担体との混合物において本発明のＡＢＰを調製することができる。持続注入（以下に限定されないが、浸透圧ポンプなどのミニポンプなどを用いる。）、単一ボーラス又は徐放デポー製剤により、本発明のＡＢＰを投与することもできる。
【０５４９】
投与に適切な処方としては、水性及び非水性の溶液、等張滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌薬及び、等張にする溶質を含有し得る。）及び、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤及び保存料を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。既に述べられた種類の、滅菌粉末、顆粒及び錠剤から、溶液及び懸濁液を調製し得る。
【０５５０】
本発明の医薬組成物は、医薬的に許容される担体を含有し得る。一部、投与する特定の組成物によって、ならびに、組成物を投与するのに使用する特定の方法によって、医薬的に許容される担体を決定する。したがって、様々な、本発明の医薬組成物の適切な処方がある（任意の医薬的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を含む。）（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１７版、１９８５を参照。）。
【０５５１】
適切な担体には、リン酸塩、ホウ酸塩、ＨＥＰＥＳ、クエン酸塩及びその他の有機酸を含有する緩衝液；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリンを含む、単糖類、二糖類及びその他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；亜鉛、コバルト又は銅などの二価金属イオン；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎＴＭ、ＰｌｕｒｏｎｉｃｓＴＭなどの非イオン性界面活性剤又はＰＥＧが含まれる。
【０５５２】
徐放システムにより、又は徐放システムの一部として、ＰＥＧなどの水溶性ポリマーに連結しているものを含む、本発明のＡＢＰ’ｓを投与することもできる。徐放組成物としては、以下に限定されないがフィルム又はマイクロカプセルなどの、造形品の形態の半透性ポリマーマトリクスが挙げられる。徐放マトリクスには、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）（Ｌａｎｇｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．，１５：１６７−２７７（１９８１）；Ｌａｎｇｅｒ、Ｃｈｅｍ．Ｔｅｃｈ．，１２：９８−１０５（１９８２）、エチレンビニルアセテート（Ｌａｎｇｅｒら、前出）又はポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸（ＥＰ１３３，９８８）、ポリラクチド（ポリ乳酸）（米国特許第３，７７３，９１９号；ＥＰ５８，４８１）、ポリグリコリド（グリコール酸のポリマー）、ポリラクチド共グリコリド（乳酸とグリコール酸とのコポリマー）ポリ無水物、Ｌ−グルタミン酸とγ−エチル−Ｌ−グルタメートとのコポリマー（Ｕ．Ｓｉｄｍａｎら、Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ、２２、５４７−５５６（１９８３）、ポリ（オルト）エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、カルボン酸、脂肪酸、リン脂質、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシンなどのアミノ酸、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン及びシリコーンなどの生体適合性の物質由来のものが含まれる。徐放組成物にはまた、リポソームに封入された化合物が含まれる。それ自身公知の方法により、化合物を含有するリポソームを調製する：ＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本特許公開８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；及びＥＰ１０２，３２４。引用した参考文献及び特許は全て本明細書中に参照により組み込む。
【０５５３】
例えばＤＥ３，２１８，１２１；Ｅｐｓｔｅｉｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８２：３６８８−３６９２（１９８５）；Ｈｗａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，７７：４０３０−４０３４（１９８０）；ＥＰ５２，３２２；ＥＰ３６，６７６；ＥＰ８８，０４６；ＥＰ１４３，９４９；ＥＰ１４２，６４１；日本国特許出願８３−１１８００８；米国特許第４，４８５，０４５号及び同第４，５４４，５４５号；及びＥＰ１０２，３２４に記載の方法により、リポソーム中に封入されたＡＢＰを調製することができる。組成物及びリポソームサイズは周知であるか、又は当業者により実験的に容易に決定可能である。リポソームのいくつかの例が、例えばＰａｒｋ  ＪＷら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９２：１３２７−１３３１（１９９５）；Ｌａｓｉｃ  Ｄ及びＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  Ｄ（編）：Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｌｙｐｏｓｏｍｅｓ（１９９８）；Ｄｒｕｍｍｏｎｄ  ＤＣら、Ｌｉｐｏｓｏｍａｌ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，Ｔｅｉｃｈｅｒ  Ｂ（編）：Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２００２）；Ｐａｒｋ  ＪＷら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ．Ｒｅｓ．８：１１７２−１１８１（２００２）；Ｎｉｅｌｓｅｎ  ＵＢら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １５９１（１−３）：１０９−１１８（２００２）；Ｍａｍｏｔ  Ｃら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３：３１５４−３１６１（２００３）に記載されている。引用した参考文献及び特許は全て本明細書中に参照により組み込む。
【０５５４】
本発明に関連して、患者へ投与する用量は、時間とともに患者において有効な応答を生じさせるのに十分なものである。一般に、非経口投与する本発明のＡＢＰの、投与あたりの総医薬的有効量は、約０．０１μｇ／ｋｇ／日から約１００μｇ／ｋｇ、又は約０．０５ｍｇ／ｋｇから約１ｍｇ／ｋｇ（患者体重）の範囲であるが、これは治療での判断に委ねられる。投与頻度もまた、治療での判断に委ねられ、ヒトでの使用が認可されている市販のＡＢＰ製品よりも多い又は少ない頻度であり得る。一般に、上述の何れかの投与経路により、本発明のＰＥＧ化抗原結合ポリペプチドを投与することができる。
【０５５５】
ＸＶ．本発明の抗原結合ポリペプチドの治療的使用
本発明のＡＢＰポリペプチドは、多岐にわたる疾患を治療するのに有用である。以下に限定されないが、抗増殖剤、抗炎症剤又は抗ウイルス剤が使用されるような、ＡＢＰアゴニスト又はアンタゴニストに影響を受け得る疾患（単独で、又は状態もしくは疾患の一部としての何れか。）に罹患しているヒト患者への様々な手段による投与に効果的な強度で、ＡＢＰを含有する医薬組成物を処方し得る。ＡＢＰの平均量は変化し得、特に、有資格の医師の推奨及び指示に基づくものであるべきである。ＡＢＰの正確な量は、治療する正確な状態のタイプ、治療する患者の状態ならびに組成物中の他の成分などの因子に対する選択性の問題である。本発明はまた、抗癌化学療法剤などの別の活性剤の治療的有効量を投与することを提供する。与える量は、ＡＢＰを用いた治療に基づき、当業者により容易に決定し得る。
【実施例】
【０５５６】
次の実施例は、説明のために与えるものであり、主張する発明を制限するものではない。
【０５５７】
（実施例１）
この実施例は、非天然コードアミノ酸をＡＢＰに取り込むのに好ましい部位の選択に対する、可能性のある多くの一連の基準を説明する。
【０５５８】
この実施例は、非天然コードアミノ酸の導入にために、どのように抗原結合ポリペプチド内の好ましい部位を選択するかを示す。ＡＢＰの２個の分子からなる三次元構造又はＡＢＰの二次、三次もしくは四次構造を使用して、一つ以上の非天然コードアミノ酸を導入し得る好ましい位置を決定する。
【０５５９】
次の基準を使用して、非天然コードアミノ酸の導入のためのＡＢＰの各位置を評価する：残基は、（ａ）三次元構造又はＡＢＰの二次、三次もしくは四次構造の構造解析に基づいて何れのＡＢＰの結合も妨害せず、ｂ）アラニン又はホモローグスキャニング突然変異誘発により影響を受けず、（ｃ）表面に曝露されており、周囲の残基と、最小のファンデルワールス力もしくは水素結合相互作用を示し、（ｄ）ＡＢＰの曝露面の一つ以上上にあり得、（ｅ）第二のＡＢＰ又はその他分子もしくはそれらの断片に並列される、ＡＢＰの部位又は複数の部位であり得、（ｆ）ＡＢＰ変異型において欠失があるか又は可変であるかの何れかであり、（ｇ）その結果、非天然コードアミノ酸での置換において保存的変化が得られ、（ｈ）所望のように、完全構造の柔軟性又は剛直性を変化させることにより、ＡＢＰそのもの又は一つ以上のＡＢＰを含有する二量体もしくは多量体の立体構造を調整し得、（ｉ）非常に柔軟性の高い領域又は構造的に剛直な領域の何れかで見られ得、（ｊ）相補性決定領域（ＣＤＲ）で見られるか又は見られない。さらに、Ｃｘプログラム（Ｐｉｎｔａｒら、Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ，１８、ｐｐ。９８０）を利用してＡＢＰ分子においてさらなる計算を行い、各タンパク質原子に対する突出の程度を調べた。結果として、ある実施形態において、以下に限定されないがＡＢＰの一つ以上の位置で、非天然コードアミノ酸が置換される。
【０５６０】
（実施例２）
この実施例は、Ｅ．コリにおける非天然コードアミノ酸を含むＡＢＰのクローニング及び発現について詳述する。
【０５６１】
直交化ｔＲＮＡ（Ｏ−ｔＲＮＡ）及び直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ（ＯＲＳ）を含有する、導入した翻訳系を使用して、非天然コードアミノ酸を含有するＡＢＰを発現させる。Ｏ−ＲＳは、非天然コードアミノ酸を有するＯ−ｔＲＮＡを選択的にアミノアシル化する。次に、この翻訳系は、コードされたセレクターコドンに反応して、ＡＢＰに非天然コードアミノ酸を挿入する。
【０５６２】
【表２】
2008503217.tif 000019
【０５６３】
改変されたＡＢＰ遺伝子を含有するプラスミド及び直交化アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼ／ｔＲＮＡペア（所望の非天然コードアミノ酸に特異的。）を用いたＥ．コリの形質転換により、非天然コードアミノ酸のＡＢＰへの部位特異的取り込みが可能となる。特定の非天然コードアミノ酸０．０１から１００ｍＭを含有する培地中、３７℃にて増殖させた形質転換したＥ．コリは、高い忠実度かつ効率で修飾ＡＢＰを発現する。Ｅ．コリ宿主細胞により、封入体又は凝集体として、非天然コードアミノ酸を含有するＨｉｓタグ付加ＡＢＰが産生される。凝集体を可溶化し、６ＭグアニジンＨＣｌの変性条件下でアフィニティー精製を行う。５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、４０μＭ  ＣｕＳＯ４及び２％（ｗ／ｗ）サルコシル中で４℃にて一晩透析することにより、リフォールディングを行う。次に、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２に対して物質を透析し、次いでＨｉｓタグを除去する。Ｂｏｉｓｓｅｌら、（１９９３）２６８：１５９８３−９３を参照のこと。ＡＢＰの精製方法は当技術分野で周知であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット分析又はエレクトロスプレーイオン化法イオントラップマススペクトロメトリーなどにより確認する。
【０５６４】
発現コンストラクト
ペリプラスムｓｃＦｖ−１０８：ＥＧＦＲ−特異的モノクローナル抗体ｍＡｂ１０８（米国特許第６，２１７，８６６号、本明細書中に参照により組み込む。）の可変領域（ＶＬ及びＶＨ）をｓｃＦｖ断片として、（ＧＧＧＧＳ）４リンカー配列とともに酵母ＢＧＬ２（Ｃ７）ペリプラスムリーダー配列の下流にクローニングした（Ｈｕｍｐｈｒｅｙｓ，ＤＰ．ら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．２０００年１１月２０日；２０（２）：２５２−６４）。ｃ−ｍｙｃ抗体ならびに６ｘＨｉｓタグにより認識されるエピトープ配列をＶＬドメインの下流にクローニングした。野生型ｓｃＦｖ−１０８コンストラクトならびに、ＶＬドメインにアンバー停止コドン（ＴＡＧ）を含有する変異型（図２、パネルＡ）をＥ．コリ発現ベクターへと誘導プロモーターの制御下にクローニングした。このプラスミドはまた、構成的にアンバーサプレッサーチロシルｔＲＭＡＴｙｒ／ＣＵＡをＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）（Ｍｊ  ｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡ）から発現した。アンバー停止コドンの位置を示す。作製したコンストラクトを配列番号１８（ヌクレオチド配列）及び配列番号１９（翻訳されたタンパク質配列）で示す。コンストラクトを表３及び４に記載する。
【０５６５】
【表３】
2008503217.tif 000020
【０５６６】
【表４】
2008503217.tif 000021
【０５６７】
細胞性ｓｃＦｖ−１０８：Ｎ末端ＭｅｔＧｌｙ配列及び６ｘＨｉｓ配列を含有するＶＨ−リンカー−ＶＬ（ＶＨ−ＧｌｙＳｅｒ−ＶＬ）配列をＴ７プロモーター制御下で発現ベクターにクローニングした（図２、パネルＢ参照。）。アンバー停止コドン及びＰＥＧ化残基の位置を示す。作製したコンストラクトを配列番号２０（ヌクレオチド配列）及び配列番号２１（翻訳されたタンパク質配列）で示す。コンストラクトを表５に記載する。
【０５６８】
【表５】
2008503217.tif 000022
【０５６９】
Ｆａｂ−１０８：ｍＡｂ１０８のＶＬ及びＶＨ配列をｐＦＴ３、ｇ３（ＶＬ）及びＳＴＩＩ（ＶＨ）ペリプラスムリーダー配列ならびに、ヒトκ定常及びＣＨ１ドメインをコードするプラスミドにクローニングした。ＣＨ１ドメインのＣ末端に６−Ｈｉｓタグを付けて精製しやすくした。ＣＨ１ドメインにアンバー突然変異を導入し、Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）（ＭｊｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡ）由来のアンバーサプレッサーチロシルｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡを構成的に発現する発現プラスミドに２−シストロン性のカセット全体をクローニングした（図２、パネルＣを参照のこと。）。Ｆａｂ断片のＶＬ及びＶＨドメインの翻訳を促進する２個のＳｈｉｎｅ  Ｄｅｌｇａｒｎｏ配列（ＳＤ）を示す。作製したコンストラクトを配列番号２２（ヌクレオチド配列）及び配列番号２３及び２４（Ｆａｂ１０８のＶＬκ鎖；Ｆａｂ１０８のＶＨ−ＣＨ１鎖の翻訳したタンパク質配列）で示す。コンストラクトを表６に記載する。
【０５７０】
【表６】
2008503217.tif 000023
【０５７１】
ペリプラスムｓｃＦｖ−４Ｄ５：ＨＥＲ２−特異的モノクローナル抗体ｍＡｂ−４Ｄ５（Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．ら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）１９９２  Ｆｅｂ；１０（２）：１６３−７）の可変領域（ＶＬ及びＶＨ）をｓｃＦｖ断片として酵母ＢＧＬ２（Ｃ７）ペリプラスムリーダー配列の下流にクローニングした。ＶＬ配列のＣ末端（ｓｃＦｖ−４Ｄ５−Ｈｉｓ；図２、パネルＤ）又はＶＨドメインのＮ末端（Ｈｉｓ−ｓｃＦｖ−４Ｄ５；図２、パネルＥ）の何れかに６ｘＨｉｓタグをクローニングした。Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）（Ｍｊ  ｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡ）からのアンバーサプレッサーチロシルｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡを構成的に発現するＥ．コリ発現ベクターに、野生型ｓｃＦｖ−４Ｄ５コンストラクトならびにＧｌｙＳｅｒリンカードメイン中のアンバー停止コドン（ＴＡＧ）を含有する変異型をクローニングした。作製した６ｘＨｉｓ  Ｃ末端コンストラクトを配列番号２５（ヌクレオチド配列）及び配列番号２６（翻訳されたタンパク質配列）として示す。作製した６ｘＨｉｓ  Ｎ末端コンストラクトを配列番号２７（ヌクレオチド配列）及び配列番号２８（翻訳されたタンパク質配列）として示す。６ｘＨｉｓＣ末端コンストラクトを表７に記載し、６ｘＨｉｓＮ末端コンストラクトを表８に記載する。
【０５７２】
【表７】
2008503217.tif 000024
【０５７３】
【表８】
2008503217.tif 000025
【０５７４】
Ｆａｂ−４Ｄ５：ｍＡｂ４Ｄ５のＶＬ及びＶＨ配列をｐＦＴ３、ｇ３及びＳＴＩＩペリプラスムリーダー配列ならびに、ヒトκ定常及びＣＨ１ドメインをコードするプラスミドにサブクローニングし、次いでＭｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｊａｎｎａｓｃｈｉｉ（メタノコッカス・ジャナシ）からのアンバーサプレッサーチロシルｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡ（Ｍｊ  ｔＲＮＡＴｙｒ／ＣＵＡ）を構成的に発現する発現プラスミドにクローニングした。図２、パネルＦは、Ｆａｂ−４Ｄ５の発現に使用されるシストロンを示す。Ｆａｂ−４Ｄ５のＣＨ１ドメイン、リジン１３９にアンバー突然変異を導入した。このリジンは、Ｆａｂ１０８のＫ１４２に対応する。ＣＨ１ドメインのＣ末端に余分のシステイン残基を含有する（ＴＨＴＣＡＡ）Ｆａｂ−４Ｄ５コンストラクトを重複ＰＣＲにより作製した（Ｆａｂ−４Ｄ５−ｃｙｓ）。作製したコンストラクトを配列番号２９（ヌクレオチド配列）及び配列番号３０及び３１（Ｆａｂ４Ｄ５のＶＬκ鎖の翻訳したタンパク質配列；Ｆａｂ４Ｄ５のＶＨ−ＣＨ１鎖）で示す。コンストラクトを表９に記載する。
【０５７５】
【表９】
2008503217.tif 000026
【０５７６】
発現／抑制
パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）による抑制：当技術分野で公知の標準的プロトコールを用いて、Ｅ．コリにおけるアンバー突然変異の抑制を行った。簡潔に述べると、Ｅ．コリにおける抗体断片（ｓｃＦｖ及びＦａｂ）のペリプラスム抑制のために、Ｍ．ジャナシからの直交化チロシルｔＲＮＡ−シンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）をコードするプラスミドを用いて、発現ベクターコンストラクトをＥ．コリに形質転換した。一晩細菌を培養したものをＬＢ培地（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）又はＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈの何れかを含有する振盪フラスコ中で１：１００希釈し、３７℃にておよそ０．８のＯＤになるまで増殖させた。Ｆａｂ及びｓｃＦｖ発現を誘導し、一方、パラ−アセチル−フェニルアラニン（ｐＡｃＦ）を４ｍＭの最終濃度になるように添加することにより、アンバーコドンの抑制を行った。２５℃で一晩培養物をインキュベートした。同一の条件下で、野生型（アンバーコドンを欠く。）ｓｃＦｖ及びＦａｂ断片（Ｆａｂ−４Ｄ５−ｃｙｓを含む。）の発現を行った。細胞性ｓｃＦｖ断片の発現／抑制（図２、パネルＢ）を同様にして行った。
【０５７７】
ａａ９．２による抑制：使用したＭ．ジャナシからの直交化チロシルｔＲＮＡ−シンテターゼ（ＭｊＴｙｒＲＳ）がこのアミノ酸に特異的であったことを除き、ｐＡｃＦと同様にして、ｐＡｃＦの誘導体（ａａ９．２）によるアンバー突然変異の抑制を行った。誘導時にａａ９．２（４ｍＭ）を添加することにより抑制を行った。
【０５７８】
タンパク質抽出及び精製
遠心分離により細胞を回収し、ライソザイム１００μｇ／ｍＬを添加したペリプラスム放出緩衝液（５０ｍＭ  ＮａＰＯ４、２０％スクロース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ８．０）中で懸濁し、氷上で３０分間インキュベートした。遠心分離後、上清中の抗体断片をそれらのＨｉｓタグによりＰｒｏＢｉｎｄビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）上に固定し、結合緩衝液でビーズをよく洗浄し、次いで０．５Ｍイミダゾールを用いて、結合した断片をビーズから溶出した。精製した断片を保存緩衝液（５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０％グリセロール、５％スクロース、ｐＨ７．８）中で透析した。細胞質で発現されたｓｃＦｖ断片の小規模分析の場合、培養液１５ｍＬからのＥ．コリを遠心分離により回収し、ＤＮａｓｅ１０μｇ／ｍＬを添加した細胞溶解緩衝液１ｍＬ（Ｂ−ＰＥＲ、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；Ｒｏｃｋｆｏｌｄ，ＩＬ）中で再懸濁した。混合物を３７℃で３０分間インキュベートし、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｏａｄｉｎｇ緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中で１ｘになるように希釈し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０５７９】
図３、パネルＡは、ＧｌｙＳｅｒリンカーの第二のセリンでのアンバー突然変異の抑制を示し（Ｓ１３１Ａｍ）、対応するｐＡｃＦ−含有ｓｃＦｖの精製を示す（図３、パネルＢ）。図３、パネルＡとして示されるウェスタンブロット分析から、細胞をＬＢ又はＳｕｐｅｒｂｒｏｔｈ培地の何れかで増殖させる場合、アンバー停止突然変異を抑制するためにｐＡｃＦが必要であることが分かる。ｐＡｃＦの存在は、ＴＡＧ停止コドンを欠くｓｃＦｖ（ＷＴｓｃＦｖ−１０８）の発現に影響を及ぼさない。図３、パネルＢは、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）によるｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ１０８−（Ｓ１３１）の精製を示す。ｐＡｃＦ−含有ｓｃＦｖの推定収率は、１．５ｍｇ／Ｌであった。ｓｃＦｖ断片の位置を矢印で示す。クーマシーゲルの試料添加を次のように行った：レーン１−ｓｃＦｖ対照（１．７μｇ）；レーン２−ＩＭＡＣ結合前（２０μＬ／７０ｍＬ）；レーン３−ＩＭＡＣボイド（２０μＬ／７０ｍＬ）；レーン４−ＩＭＡＣ溶出（５μＬ／１．３ｍＬ）；レーン５−ＮＡＰ１０緩衝液交換（１０μＬ／１．５ｍＬ）；レーン６−ＥＶＩＡＣビーズ溶出後；レーン７−ｓｃＦｖ対照（３．４μｇ）。
【０５８０】
ｓｃＦｖの細胞質発現中のＶＬ鎖（Ｌ１５６）におけるアンバー突然変異の抑制を図４で示す。収率は、＞１００ｍｇ／Ｌ（Ｅ．コリ培養物）であり、停止コドンの抑制は、ｐＡｃＦの存在に完全に依存していた。全長ｓｃＦｖを矢印により示す。アンバーコドンにおいて短縮されている産物を黒丸で示す。
【０５８１】
抗体断片のＰＥＧ化／二量体化（１）
ＰＥＧ化：ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８タンパク質およそ１ｍｇを反応緩衝液（１００ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）中で５０μＬの最終体積まで濃縮した。一官能性（ヒドロキシルアミン）５Ｋ  ＰＥＧ（反応緩衝液中で平衡化）の１００倍モル過剰量とともに、１００μＬ最終体積で反応混合物を２８℃にて３２時間インキュベートした。ＰＥＧ化物質を続くゲル電気泳動により評価し、細胞結合アッセイに直接使用した。
【０５８２】
二量体化：同様の手段を使用して、ｐＡｃＦ−含有ｓｃＦｖ−１０８断片を二量体化した。簡潔に述べると、出発物質のｐＡｃＦ含有ｓｃＦｖ断片を反応緩衝液中で＞５μｇ／μＬの濃度に濃縮し、次いで二官能性ヒドロキシルアミン共役ＰＥＧリンカー（３６４Ｄａ）とともにインキュベートした。透析により未反応ＰＥＧを除去し、新鮮なｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ断片（１モーラータンパク質：タンパク質等量）の分割量を混合物に添加した。次に混合物を２８℃でさらに３２時間インキュベートした。２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（ＳＰ−５ＰＷ）上に二量体を添加し、ＮａＣｌ勾配（０から０．４Ｍ）で溶出した。
【０５８３】
ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８断片の、ＰＥＧ化及び二量体化を図５に示す。図５、パネルＡは、ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８−（Ｌ１５６）及びｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８−（Ｓ１３６）ＰＥＧ化（５Ｋ）及びｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８−（Ｓ１３６）の二量体化を示す。次のようにゲルへの試料添加を行った：レーン１−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８−（Ｌ１５６）（５Ｋ  ＰＥＧ）；レーン２−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８−（Ｓ１３６）（５Ｋ  ＰＥＧ）；レーン３−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８−（Ｓ１３６）（３６４ＤａＰＥＧ）リンカーの二量体化；レーン４−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８−（Ｓ１３６）の二量体化；最初のＰＥＧ化反応後にリンカーを除去しなかった。一重矢印及び二重矢印によりそれぞれ、モノＰＥＧ化ｓｃＦｖ断片及びｓｃＦｖ−１０８−（Ｓ１３６）二量体の位置を示す。レーン４において二量体化が見られないのは、ｓｃＦｖが分子間ジスルフィド結合形成を介してカップリングされなかったことを示す。図５、パネルＣは、ｓｃＦｖ断片へのＰＥＧの共役が完全にｐＡｃＦの存在に依存していることを示す。ＷＴｓｃＦｖ断片のＰＥＧ化は観察されなかった。次のようにゲルへの試料添加を行った：レーン１−ＷＴｓｃＦｖ１０８対照；レーン２−ｓｃＦｖ  ＷＴ、反応緩衝液中で１６時間；レーン３−ｓｃＦｖＷＴ＋５Ｋ  ＰＥＧ、反応液中で１６時間。
【０５８４】
図６は、ｓｃＦｖホモ二量体の陽イオン交換クロマトグラフィー中に得た分画のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。二官能性ヒドロキシルアミン３６４ダルトンのＰＥＧリンカーを用いてｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ１０８−（Ｓ１３１）断片をホモ二量体化した。陽イオン交換クロマトグラフィー中に、ＮａＣｌ勾配（０から０．４Ｍ）中の様々な点で分画を採取した。次のようにゲルへの試料添加を行った：レーン１−マーカー、レーン２−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ１０８（Ｓ１３１）−Ｘ−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ１０８（Ｓ１３１）分画＃１、レーン３−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ１０８（Ｓ１３１）−Ｘ−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ１０８（Ｓ１３１）分画＃２、レーン４−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ１０８（Ｓ１３１）−Ｘ−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ１０８（Ｓ１３１）分画＃３。
【０５８５】
図８、パネルＡは、ｐＡｃＦ及びｐＡｃＦ−ＰＥＧ化Ｆａｂ断片のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。Ｋ１４２、Ｔ２０４及びＫ２１９で修飾されたＦａｂ−１０８断片を示し、ＰＥＧ化の効率は部位特異的である。５Ｋ  ＰＥＧと共役させたヒドロキシルアミンを用いて、ｐＡｃＦ−含有Ｆａｂ断片のＰＥＧ化を行った。
【０５８６】
図１０、パネルＡ及びＢは、Ｃ末端（ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−４Ｄ５−Ｈｉｓ（Ｓ１３３）；図１０、パネルＡ）又はＮ末端（ｐＡｃＦ−Ｈｉｓ−ｓｃＦｖ−４Ｄ５（Ｓ１３９）；図１０、パネルＢ）ｓｃＦｖ−４Ｄ５断片のＧｌｙＳｅｒリンカーの第二のセリンにおけるアンバー突然変異の抑制を示す。５時間又は一晩（１６時間）の何れかの時間、０．０２％アラビノースを添加することにより、ｓｃＦｖタンパク質の発現を誘導した。ａａ９．２（４ｍＭ）を同時添加することにより、アンバー突然変異の抑制を行った。抑制産物を矢印により示し、短縮タンパク質を黒丸で示す。５０％を超える抑制率が達成された（１．５ｍｇ／Ｌ）。ｓｃＦｖ−４Ｄ５よりわずかに高く移動するｓｃＦｖ１０８を添加した対照レーンを（Ｃ）で示す。
【０５８７】
Ｆａｂ断片ｐＡｃＦ−Ｆａｂ−４Ｄ５−（Ｋ１３９）及びＦａｂ−４Ｄ５−ｃｙｓを発現させ、同様にして精製した。図１１、パネルＡは、還元及び非還元条件の両方においてＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した試料を示す。Ｆａｂ断片収率は次のとおりであった：ｐＡｃＦ−Ｆａｂ−４Ｄ５-（Ｋ１３９）、０．３７ｍｇ／Ｌ／ＯＤ（最終ＯＤ６００＝３．１４）及びＦａｂ−４Ｄ５−ｃｙｓ０．２３ｍｇ／Ｌ／ＯＤ（最終ＯＤ６００＝３．２６）。図１１、パネルＢは、抗Ｈｉｓ抗体を用いた、図１１、パネルＡで示す試料（５μＬ）のウェスタンブロットを示す。この試料は、非還元条件下で移動させた。Ｆａｂ−４Ｄ５−ｃｙｓコンストラクトからの多量体ＶＨ−ＣＨ１複合体を矢印で示す。ｐＡｃＦ−Ｆａｂ−４Ｄ５−（Ｋ１３９）と一緒に、多量体は見られなかった。
【０５８８】
抗体断片のＰＥＧ化／二量体化（２）
ＰＥＧ化：ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８タンパク質およそ１ｍｇをネイティブ反応緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ４．０）及び変性反応緩衝液（２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、８Ｍ尿素、ｐＨ４．０）中で５０μＬの最終体積になるまで濃縮した。一官能性（ヒドロキシルアミン）５ＫＰＥＧ（対応する反応緩衝液中で平衡化）の１００倍モル過剰量とともに、１００μＬ最終体積で反応混合物を２８℃で３２時間インキュベートした。１６時間後、反応混合物をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより調べ、細胞結合アッセイに直接使用した。
【０５８９】
変性条件下での、リンカー、ポリマー、生物活性分子又はその他の分子とのポリペプチドの共役には、一つ以上の長所があり得る。このような長所には、以下に限定されないが、反応基のアクセシビリティが向上したことにより共役がより容易であること、非共役ポリペプチドと比較して共役ポリペプチドのリフォールディングがより容易であること、及び非変性条件下で使用できるポリペプチド濃度よりも共役に対して高い濃度でポリペプチドを使用できることが含まれる。例えば、ポリペプチドが不安定であり、共役反応のためにあまり濃縮できない場合、変性条件が所望され得る。しかし、変性条件下でポリペプチドの共役を行う結果、マレイミド化学反応など、標準的なシステインを利用した共役化学反応又は、マレイミド化学反応など、リジンを利用した化学反応による反応において、一つ以上のシステイン、リジン又はその他のアミノ酸を有するポリペプチド中の好ましくない及び／又は意図しない部位で共役が起こり得る。このような好ましくない及び／又は意図しない部位での共役は、共役化ポリペプチドの活性に影響を与え得る。一方、共役反応に関与する反応基が非天然コードアミノ酸の一部であるため、一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有するＡＢＰなどのポリペプチドを部位特異的な様式で変性条件下にて共役させ得る。したがって、一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有するポリペプチドの使用とともに、変性条件下での共役から得られるあらゆる長所を生かし得る。
【０５９０】
図５Ｂは、ＰＥＧ化ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−（Ｓ１３６）及び対照試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。次のようにゲルへの試料添加を行った：レーン１−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−（Ｓ１３６）；レーン２−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−（Ｓ１３６）、２８℃で１６時間インキュベート；レーン３−ＰＡｃＦ−ｓｃＦｖ−（Ｓ１３６）、５Ｋ  ＰＥＧ、２８℃で１６時間インキュベート、非変性条件；レーン４−ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−（Ｓ１３６）、５Ｋ  ＰＥＧ、２８℃で１６時間インキュベート、変性条件。矢印は、ｓｃＦｖ及びＰＥＧ化ｓｃＦｖを示す。図５Ｃは、ｓｃＦｖ断片に対するＰＥＧの共役が、ｐＡｃＦの存在に完全に依存することを示す。ＷＴｓｃＦｖ断片のＰＥＧ化は見られなかった。次のようにゲルへの試料添加を行った：レーン１−ＷＴｓｃＦｖ１０８対照；レーン２−ｓｃＦｖ  ＷＴ、反応緩衝液中、ＰＥＧなし、１６時間；レーン３−ｓｃＦｖ  ＷＴ＋５Ｋ  ＰＥＧ３、反応緩衝液中、１６時間。
【０５９１】
連続的二量体化：簡潔に述べると、出発物質のｐＡｃＦ含有ｓｃＦｖ断片を反応緩衝液中で１０ｍｇ／μＬの濃度に濃縮し、次いで二官能性ヒドロキシルアミン共役ＰＥＧリンカー（３６４Ｄａ）の１００倍過剰量とともにインキュベートした。反応混合物を２８℃にて１６時間インキュベートした。透析により未反応ＰＥＧを除去し、新鮮なｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ断片（１モーラータンパク質：タンパク質等量）の分割量を混合物に添加した。次に混合物を２８℃でさらに３２時間インキュベートした。図１３を参照のこと。２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４．０）で平衡化した陽イオン交換カラム（ＳＰ−５ＰＷ、２０ミクロン）上に二量体を載せ、ＮａＣｌ勾配（０から０．４Ｍ）で溶出した。
【０５９２】
図１４、パネルＡ及びＢは、二量体化試料の、非還元及び還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析を示す。次のようにゲルへの試料添加を行った：レーン１−３６４Ｄａ  ＰＥＧ二官能性リンカーとの最終ｓｃＦｖ二量体化反応混合物；レーン２−３６４Ｄａ  ＰＥＧ二官能性リンカーなしの、最終ｓｃＦｖ二量体化反応対照；レーン３−ｓｃＦｖ。矢印は、ｓｃＦｖ二量体及びｓｃＦｖ単量体を示す。二官能性リンカーのみ存在下でｓｃＦｖ二量体を合成した。レーン２において二量体化が見られないことから、ｓｃＦｖが分子間ジスルフィド結合形成によりカップリングされなかったことが示される。還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで分析した試料と非還元ＳＤＳ  ＰＡＧＥでゲル分析した試料との間で差が見られなかったので、二官能性リンカーの存在により分子間ジスルフィド結合形成は促進されなかった。
【０５９３】
二量体精製：
強力な陽イオン交換カラム（ＳＰ−５ＰＷ、２０ミクロン）を用いて、二量体化反応混合物を精製した。緩衝液Ａ：２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、ｐＨ４．０；緩衝液Ｂ：２０ｍＭ  ＮａＯＡｃ、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．０。ｓｃＦｖ二量体を４０％のＢで溶出した。精製二量体のＳＤＳ  ＰＡＧＥ分析（図１５）から、１回のカラム精製後、二量体の純度がおよそ９０％となったことが分かった。
【０５９４】
本発明のヘテロ二官能性ＡＢＰの例を図９で示す。同じ抗原（例えばＥｒｂＢ２）の異なるエピトープに結合する２種類の異なる抗体分子（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ及びＯｍｎｉｔａｒｇ）に対して決定された既知の結晶構造に基づき、ある一定の所望の選択基準内にそれらが合致するように、特異的なアミノ酸の位置を同定する。この実施例におけるアミノ酸位置に対する所望の選択基準には、各分子における、一つ以上の特異的アミノ酸位置の相対的近接性が含まれる。このようなアミノ酸位置は、リンカー分子を用いて、図９で示されるヘテロ二官能性分子を形成するために望ましいものであり得る。ヘテロ二官能性ＡＢＰを形成するのに使用され得るリンカー分子であるように、基準に合致する各分子における特異的アミノ酸位置を下記図１０で示す。この一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的とするものであり、ある一定の所望の選択基準に合致する全てのアミノ酸位置が本発明での使用に適切なものとしてもくろまれることを、当業者は認識するであろう。各分子におけるこれらの位置の一つ以上において、本発明の非天然アミノ酸が置換され、リンカー連結に利用される化学官能基を与え得る。所望の基準に合致するためのアミノ酸位置を同定するために、以下に限定されないが、同じ又は異なる分子間の近接性、立体構造変化調節、ＡＢＰ’ｓ又はＡＢＰに連結している分子間の距離の調節、リンカーの長さ又は形状、表面曝露、リガンド結合特性の調節、受容体二量体化の調節など、多岐にわたる他の選択基準も利用可能である。
【０５９５】
【表１０】
2008503217.tif 000027
【０５９６】
ＨＩＶｇｐ４１  ｅｎｖタンパク質とのＨＩＶ−Ｉ中和ヒトＦａｂ  ４Ｅ１０の相互作用に基づき、ある一定の所望の選択基準内にそれらが合致するように、特異的アミノ酸位置を同定する。この実施例におけるアミノ酸位置に対する所望の選択基準には、ｇｐ４１に対する４Ｅ１０の相補性決定領域（ＣＤＲ）の結合及び認識に悪影響を及ぼさずにｇｐ４１へのＴ−２０の結合が起こるような、Ｆａｂに対するＴ−２０ペプチドの共役に使用される残基が含まれる。ＤＰ−１７８としても知られているＴ−２０は、ウイルス融合阻害剤として作用することにより細胞へのＨＩＶの侵入を阻害する。図１２は、模倣ｇ４１ペプチドを伴うＨＩＶ中和ヒトＦａｂ  ４Ｅ１０を示す。Ｔ−２０連結の可能性がある残基を示す。非天然コードアミノ酸の取り込みの可能性のある残基には、以下に限定されないが、Ｇｌｎ６４−−Ｆａｂの重鎖；ＧｌｕＩ−−Ｆａｂの軽鎖及びＧｌｎ２７−−Ｆａｂの軽鎖が含まれる。この一覧は、他のものを除外するものではなく、ただ説明を目的とするものであり、ある一定の所望の選択基準に合致する全てのアミノ酸位置が本発明での使用に適切なものとしてもくろまれることを、当業者は認識するであろう。所望の基準に合致するためのアミノ酸位置を同定するために、以下に限定されないが、同じ又は異なる分子間の近接性、立体構造変化調節、ＡＢＰ’ｓ又はＡＢＰに連結している分子間の距離の調節、リンカーの含有、リンカーの長さ又は形状、表面曝露、リガンド結合特性の調節、受容体二量体化の調節など、多岐にわたる他の選択基準も利用可能である。
【０５９７】
（実施例３）
この実施例は、カルボニル含有アミノ酸の導入及び、それに続く、アミノオキシ含有ＰＥＧとの反応について詳述する。
【０５９８】
この実施例は、ケトン含有非天然コードアミノ酸（続いて、およそ５，０００ＭＷのアミノオキシ含有ＰＥＧと反応する。）を取り込む抗原結合ポリペプチドの生成のための方法を示す。次の構造を有する非天然コードアミノ酸を用いて、実施例１の基準に従い同定された残基それぞれを個別に置換する：
【０５９９】
【化１６】
2008503217.tif 000028
【０６００】
ＡＢＰへのｐ−アセチル−フェニルアラニンの部位特異的取り込みに利用される配列は、上記実施例２に記載の、配列番号１（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナシ  ｍｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）及び１３、１４又は１５（ＴｙｒＲＳ  ＬＷ１、５又は６）である。
【０６０１】
修飾後、形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒはメチルであり、ｎは３であり、Ｎはおよそ５，０００ＭＷである。）のアミノオキシ含有ＰＥＧ誘導体と、カルボニル含有アミノ酸を含有するＡＢＰ変異型とを反応させる。２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ７．０又は１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ４．５中で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解させた、ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含有する精製ＡＢＰを、アミノオキシ含有ＰＥＧの１０倍から１００倍過剰量と反応させ、次いで室温にて１０時間から１６時間撹拌する（Ｊｅｎｃｋｓ，Ｗ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９５９、８１、ｐｐ４７５）。次いで、すぐに精製及び分析を行うために、ＰＥＧ-ＡＢＰを適切な緩衝液に希釈する。
【０６０２】
（実施例４）
アミド結合を介してＰＥＧに連結しているヒドロキシルアミン基からなるＰＥＧとの共役
実施例３に記載の手段を用いて、次の構造を有するＰＥＧ物質をケトン含有非天然コードアミノ酸とカップリングさせる：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝４、Ｎはおよそ２０，０００ＭＷである。）。反応、精製及び分析条件は実施例３に記載のとおりである。
【０６０３】
（実施例５）
この実施例は、２個の個別の非天然コードアミノ酸のＡＢＰへの導入について詳述する。
【０６０４】
この実施例は、実施例１に従い同定した２箇所でケトン官能基を含有する非天然コードアミノ酸を取り込む抗原結合ポリペプチドを生成させるための方法を示す（Ｘ＊は、非天然コードアミノ酸を表す。）。サプレッサーコドンを核酸中の異なる２箇所に導入することを除き、実施例１及び２に記載のようにして抗原結合ポリペプチドを調製する。
【０６０５】
（実施例６）
この実施例は、ヒドラジド含有ＰＥＧへの抗原結合ポリペプチドの共役及び続くインシトゥ還元について詳述する。
【０６０６】
実施例２及び３に記載の手段に従い、カルボニル含有アミノ酸を取り込む抗原結合ポリペプチドを調製する。修飾後、次の構造を有するヒドラジド含有ＰＥＧをＡＢＰに共役させる：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｘ−ＮＨ−ＮＨ２（式中、Ｒ＝メチル、ｎ＝２、Ｎ＝１０，０００ＭＷであり、Ｘはカルボニル（Ｃ＝Ｏ）基である。）。ｐ−アセチルフェニルアラニンを含有する精製ＡＢＰを２５ｍＭ  ＭＥＳ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ６．０、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ７．０又は１０ｍＭ  酢酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）ｐＨ４．５中で０．１から１０ｍｇ／ｍＬに溶解させ、ヒドラジド含有ＰＥＧの１倍から１００倍過剰量と反応させ、１０から５０ｍＭの最終濃度になるようにＨ２Ｏ中に溶解している保存１Ｍ  ＮａＣＮＢＨ３（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加することにより、対応するヒドラゾンをインシトゥで還元する。４℃からＲＴにて１８時間から２４時間、暗所で反応を行う。約ｐＨ７．６の１Ｍ  Ｔｒｉｓ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を５０ｍＭの最終Ｔｒｉｓ濃度になるように添加することにより、又はすぐに精製するために適切な緩衝液中に希釈することによって、反応を停止させる。
【０６０７】
（実施例７）
この実施例は、アルキン含有アミノ酸のＡＢＰへの導入及びｍＰＥＧ−アジドによる誘導体化について詳述する。
【０６０８】
実施例１に従い同定した残基の何れかを次の非天然コードアミノ酸で置換する：
【０６０９】
【化１７】
2008503217.tif 000029
【０６１０】
ｐ−プロパルギル-チロシンの部位特異的取り込みのために利用する配列は、上記実施例２に記載の、配列番号１（ｍｕｔｔＲＮＡ、Ｍ．ジャナシｍｔＲＮＡＴｙｒＣＵＡ）及び６、７又は８である。プロパルギルチロシンを含有する抗原結合ポリペプチドをＥ．コリで発現させ、実施例３に記載の条件を用いて精製する。
【０６１１】
プロパルギル−チロシンを含有する精製ＡＢＰを０．１から１０ｍｇ／ｍＬになるように、ＰＢ緩衝液（１００ｍＭ  リン酸ナトリウム、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ＝８）中で溶解させ、アジド含有ＰＥＧの１０倍から１００倍過剰量を反応混合物に添加する。次に、ＣｕＳＯ４及び銅細線の触媒量を反応混合物に添加する。混合物をインキュベートした後（以下に限定されないが、室温もしくは３７℃にて約４時間又は４℃にて一晩など。）、Ｈ２Ｏを添加し、透析膜に通して混合物をろ過する。以下に限定されないが、実施例３に記載の同様の手段によるなど、その添加に対して試料を分析することができる。
【０６１２】
この実施例において、ＰＥＧは、次の構造を有する：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３（式中、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、Ｎは１０，０００ＭＷである。）。
【０６１３】
（実施例８）
この実施例は、ＡＢＰにおける、大きな疎水性アミノ酸の、プロパルギルチロシンでの置換について詳述する。
【０６１４】
実施例７に記載のようにして、ＡＢＰの配列内に存在するＰｈｅ、Ｔｒｐ又はＴｙｒ残基を次の非天然コードアミノ酸で置換する。
【０６１５】
【化１８】
2008503217.tif 000030
【０６１６】
修飾後、アルキン含有アミノ酸を含有するＡＢＰ変異型にＰＥＧを結合させる。ＰＥＧは、次の構造を有し：
Ｍｅ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｎ３
カップリング手段は実施例７の手段に従う。これにより、天然の大きな疎水性アミノ酸の１つとほぼ等比体積であり、ポリペプチド内の別の部位でＰＥＧ誘導体により修飾される非天然のコードアミノ酸を含有するＡＢＰ変異型が生成する。
【０６１７】
（実施例９）
この実施例は、一つ以上のＰＥＧリンカーにより分けられる、ＡＢＰホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体の生成について詳述する。
【０６１８】
実施例７で作製したアルキン含有ＡＢＰ変異型を、
Ｎ３−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｎ３（式中、ｎは４であり、ＰＥＧは、およそ５，０００の平均ＭＷを有する。）の形態の二官能性ＰＥＧ誘導体と反応させ、２個のＡＢＰ分子がＰＥＧにより物理的に離されている対応するＡＢＰホモ二量体を生成させる。同様の方法において、抗原結合ポリペプチドを一つ以上の他のポリペプチドとカップリングさせて、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を形成することができる。実施例７及び３に従い、カップリング、精製及び分析を行う。
【０６１９】
（実施例１０）
この実施例は、ＡＢＰへの糖部分のカップリングについて詳述する。
【０６２０】
実施例３に記載のようにして、下記の非天然コードアミノ酸でＡＢＰの一つ以上のアミノ酸残基を置換する。
【０６２１】
【化１９】
2008503217.tif 000031
【０６２２】
修飾後、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）のβ結合アミノオキシ類似体と、カルボニル含有アミノ酸を含有するＡＢＰ変異型とを反応させる。ＡＢＰ変異型（１０ｍｇ／ｍＬ）及びアミノオキシ糖（２１ｍＭ）を１００ｍＭ酢酸ナトリウム水性緩衝液（ｐＨ５．５）中で混合し、３７℃で７時間から２６時間インキュベートする。１５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）中で、ＵＤＰ−ガラクトース（１６ｍＭ）及びβ−１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ（０．４ユニット／ｍＬ）とともに糖共役ＡＢＰ（５ｍｇ／ｍＬ）を周囲温度にて４８時間インキュベートすることにより、酵素を用いて第一の糖に第二の糖をカップリングさせる（Ｓｃｈａｎｂａｃｈｅｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７０、２４５、５０５７−５０６１）。
【０６２３】
（実施例１１）
この実施例は、ＰＥＧ化ＡＢＰアンタゴニストの生成について詳述する。
【０６２４】
実施例３に記載のようにして、ＡＢＰアミノ酸残基の一つ以上を次の非天然コードアミノ酸により置換する。
【０６２５】
【化２０】
2008503217.tif 000032
【０６２６】
修飾後、形態：
Ｒ−ＰＥＧ（Ｎ）−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＮＨ２（式中、Ｒはメチルであり、ｎは４であり、Ｎは２０，０００ＭＷである。）のアミノオキシ-含有ＰＥＧ誘導体と、カルボニル含有アミノ酸を含有するＡＢＰ変異型とを反応させ、ポリペプチド中の１箇所でＰＥＧ誘導体により修飾されている非天然のコードアミノ酸を含有するＡＢＰアンタゴニストを生成させる。実施例３に従い、カップリング、精製及び分析を行う。
【０６２７】
（実施例１２）
ＡＢＰ分子が直接連結している、ＡＢＰホモ二量体、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体の生成
アジド含有アミノ酸を含有する別のＡＢＰ変異型にアルキン含有アミノ酸を含有するＡＢＰ変異型を直接カップリングさせることができる（それらのそれぞれが、以下に限定されないが実施例１０に記載の部位で非天然コードアミノ酸により置換されている。）。これにより、２個のＡＢＰ変異型が物理的に連結している対応するＡＢＰホモ二量体が生成する。同様の方法において、一つ以上の他のポリペプチドに抗原結合ポリペプチドをカップリングさせて、ヘテロ二量体、ホモ多量体又はヘテロ多量体を形成させ得る。実施例３、６及び７に従い、カップリング、精製及び分析を行う。
【０６２８】
（実施例１３）
【０６２９】
【化２１】
2008503217.tif 000033
【０６３０】
ポリアルキレングリコール（Ｐ−ＯＨ）をハロゲン化アルキルと反応させ（Ａ）、エーテルを形成させる（Ｂ）。これらの化合物において、ｎは、１から９の整数であり、Ｒ’は、直鎖もしくは分枝鎖、飽和もしくは不飽和のＣ１からＣ２０アルキル又はヘテロアルキル基であり得る。Ｒ’はまた、Ｃ３からＣ７の飽和もしくは不飽和の環状アルキル又は環状へテロアルキル、置換もしくは非置換アリールもしくはヘテロアリール基又は置換もしくは非置換アルクアリール（アルキルは、Ｃ１からＣ２０の飽和もしくは不飽和アルキルである。）又はヘテロアルクアリール基でもあり得る。通常、ＰＥＧ−ＯＨは、８００から４０，０００ダルトン（Ｄａ）の分子量の、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又はモノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）である。
【０６３１】
（実施例１４）
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
２０，０００Ｄａの分子量のｍＰＥＧ−ＯＨ（ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。次に、キシレン中８０重量％溶液として溶解している臭化プロパルギルの溶液（０．５６ｍＬ、５ｍｍｏｌ、５０当量、Ａｌｄｒｉｃｈ）及びＫＩの触媒量を溶液に添加し、生じた混合物を２時間加熱還流した。次いで水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、体積をおよそ２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に滴下添加した。生じた沈殿物を回収し、冷ジエチルエーテル数部で洗浄し、乾燥させ、プロパルギル−Ｏ−ＰＥＧを得た。
【０６３２】
（実施例１５）
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−（ＣＨ２）３−Ｃ≡ＣＨ
２０，０００Ｄａの分子量のｍＰＥＧ−ＯＨ（２０ｋＤａ；２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理した。次に、５−ブロモ−Ｌ−ペンチン（０．５３ｍＬ、５ｍｍｏｌ、Ａｌｄｒｉｃｈ）の５０当量及びＫＩの触媒量を混合物に添加した。生じた混合物を１６時間加熱還流した。次いで水（１ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、体積をおよそ２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をジエチルエーテル（１５０ｍＬ）に滴下添加した。生じた沈殿を回収し、冷ジエチルエーテル数部で洗浄し、乾燥させ、対応するアルキンを得た。同様の反応において５−クロロ−１−ペンチンを使用できる。
【０６３３】
（実施例１６）
（１）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４ＯＨ＋ＮａＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍ−ＨＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＭｓＣｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（３）ｍ−ＭｓＯＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ＋ＬｉＢｒ→ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
（４）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ｍ−Ｂｒ−ＣＨ２Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４Ｏ−ＣＨ２−Ｃ≡ＣＨ
ＴＨＦ（５０ｍＬ）及び水（２．５ｍＬ）中の３−ヒドロキシベンジルアルコール（２．４ｇ、２０ｍｍｏｌ）の溶液に、粉状の水酸化ナトリウム（１．５ｇ、３７．５ｍｍｏｌ）を最初に添加し、次いでキシレン中８０重量％溶液として溶解している臭化プロパルギルの溶液（３．３６ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を還流温度で６時間加熱した。この混合物に１０％クエン酸（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣を酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａＣｌ飽和溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、３−プロパルギルオキシベンジルアルコールを得た。
【０６３４】
０℃にて、塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２中の化合物３（２．０ｇ、１１．０ｍｍｏｌ）の溶液に添加し、反応物を１６時間冷蔵庫に置いた。通常の処理により、淡黄色の油状物質としてメシレートを得た。この油状物質（２．４ｇ、９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中で溶解させ、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間加熱還流し、次いで室温に冷却した。この混合物に水（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で残渣を抽出し、合わせた有機層をＮａＣｌ飽和溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、所望の臭化物を得た。
【０６３５】
ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ（１．０ｇ、０．０５ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中で溶解させ、溶液を氷浴中で冷却した。数分間にわたり激しく撹拌しながらＮａＨ（６ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を添加し、次に、上記で得た臭化物（２．５５ｇ、１１．４ｍｍｏｌ）及びＫＩの触媒量を添加した。冷却槽を取り外し、生じた混合物を１２時間加熱還流した。この混合物に水（１．０ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、体積をおよそ２ｍＬまで減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に滴下添加し、それにより、白色の沈殿が生じ、これを回収し、ＰＥＧ誘導体を得た。
【０６３６】
（実施例１７）
ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋Ｘ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）Ｎ−Ｃ≡ＣＲ’→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）ｎ−Ｃ≡ＣＲ’
上記で示すとおり、末端官能基を含有するポリ（エチレングリコール）ポリマーをアルキン官能基含有反応性分子とカップリングさせることにより、末端アルキン含有ポリ（エチレングリコール）ポリマーを得ることもできる。ｎは、１から１０である。Ｒ’はＨ又はＣ１からＣ４の小さいアルキル基であり得る。
【０６３７】
（実施例１８）
（１）ＨＯ２Ｃ−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ＋ＮＨＳ＋ＤＣＣ→ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
（２）ｍＰＥＧ−ＮＨ２＋ＮＨＳＯ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ→ｍＰＥＧ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）２−Ｃ≡ＣＨ
４−ペンチン酸（２．９４３ｇ、３．０ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）中で溶解させた。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（３．８０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）及びＤＣＣ（４．６６ｇ、３．０ｍｍｏｌ）を添加し、溶液を室温にて一晩撹拌した。生じた粗製ＮＨＳエステル７をさらに精製せずに次の反応において使用した。
【０６３８】
５，０００Ｄａの分子量のｍＰＥＧ−ＮＨ２（ｍＰＥＧ−ＮＨ２、１ｇ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（５０ｍＬ）中で溶解させ、混合物を４℃に冷却した。激しく撹拌しながら、ＮＨＳエステル７（４００ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ）を分割して添加した。室温に温めながら、混合物を３時間撹拌した。次に、水（２ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、体積をおよそ２ｍＬまで減少させた。このＣＨ２Ｃｌ２溶液をエーテル（１５０ｍＬ）に滴下添加した。生じた沈殿物を回収し、真空下で乾燥させた。
【０６３９】
（実施例１９）
この実施例は、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホニルエステル（これはまた、ポリ（エチレングリコール）のメタンスルホネート又はメシレートとも呼ばれ得る。）の調製を示す。同様の手段により、対応するトシレート及びハロゲン化物を調製することができる。
【０６４０】
ｍＰＥＧ−ＯＨ＋ＣＨ３ＳＯ２Ｃｌ＋Ｎ（Ｅｔ）３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＳＯ２ＣＨ３→ｍＰＥＧ−Ｎ３
トルエン１５０ｍＬ中のｍＰＥＧ−ＯＨ（ＭＷ＝３，４００、２５ｍｇ、１０ｍｍｏｌ）を窒素下で２時間共沸蒸留し、溶液を室温に冷却した。この溶液に、無水ＣＨ２Ｃｌ２４０ｍＬ及び無水トリエチルアミン（１５ｍｍｏｌ）２．１ｍＬを添加した。溶液を氷浴中で冷却し、蒸留した塩化メタンスルホニル（１５ｍｍｏｌ）１．２ｍＬを滴下添加した。溶液を窒素下で室温にて一晩撹拌し、無水エタノール２ｍＬを添加することにより、反応を停止させた。混合物を真空蒸発させて、主にトルエン以外の溶媒を除去し、ろ過し、再び真空下で濃縮し、次いでジエチルエーテル１００ｍＬ中で沈殿させた。ろ過液を冷ジエチルエーテル数部で洗浄し、真空乾燥させ、メシレートを得た。
【０６４１】
メシレート（２０ｇ、８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ７５ｍＬ中で溶解させ、溶液を４℃に冷却した。冷却溶液にアジ化ナトリウム（１．５６ｇ、２４ｍｍｏｌ）を添加した。窒素下で２時間、反応物を加熱還流した。次に、溶媒を蒸発させ、残渣をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）で希釈した。有機画分をＮａＣｌ溶液で洗浄し、無水ＭｇＳＯ４上で乾燥させた。体積を２０ｍＬまで減少させ、冷無水エーテル１５０ｍＬを添加することにより生成物を沈殿させた。
【０６４２】
（実施例２０）
（１）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４−ＣＯ２Ｈ→Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ
（２）Ｎ３−Ｃ６Ｈ４ＣＨ２ＯＨ→Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
（３）ｍＰＥＧ−ＯＨ＋Ｂｒ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３
米国特許第５，９９８，５９５号（本明細書中に参照により組み込む。）に記載の方法を用いて、４−アジドベンジルアルコールを生成させることができる。０℃にて、ＣＨ２Ｃｌ２中の４−アジドベンジルアルコール（１．７５ｇ、１１ｍｍｏｌ）の溶液に、塩化メタンスルホニル（２．５ｇ、１５．７ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（２．８ｍＬ、２０ｍｍｏｌ）を添加し、反応物を１６時間冷蔵庫に置いた。通常の処理により、淡黄色の油状物質としてメシレートを得た。この油状物質（９．２ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２０ｍＬ）中で溶解させ、ＬｉＢｒ（２．０ｇ、２３．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を１時間加熱還流し、次いで室温に冷却した。この混合物に水（２．５ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。酢酸エチル（３ｘ１５ｍＬ）で残渣を抽出し、合わせた有機層をＮａＣｌ飽和溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮し、所望の臭化物を得た。
【０６４３】
ｍＰＥＧ−ＯＨ  ２０ｋＤａ（２．０ｇ、０．１ｍｍｏｌ、Ｓｕｎｂｉｏ）をＴＨＦ（３５ｍＬ）中のＮａＨ（１２ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ）で処理し、臭化物（３．３２ｇ、１５ｍｍｏｌ）をＫＩの触媒量とともに混合物に添加した。生じた混合物を１２時間加熱還流した。この混合物に水（１．０ｍＬ）を添加し、溶媒を真空除去した。残渣にＣＨ２Ｃｌ２（２５ｍＬ）を添加し、有機層を分離し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、体積をおよそ２ｍＬまで減少させた。エーテル溶液（１５０ｍＬ）に滴下添加したところ沈殿物が生じ、これを回収し、ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ６Ｈ４−Ｎ３を得た。
【０６４４】
（実施例２１）
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ＋Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２−ＮＨＳ→Ｎ３−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ
ＮＨ２−ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＯ２Ｈ（ＭＷ３，４００Ｄａ、２．０ｇ）をＮａＨＣＯ３（１０ｍＬ）の飽和水溶液中で溶解させ、溶液を０℃に冷却した。激しく撹拌しながら３−アジド−１−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドプロピオネート（５当量）を添加した。３時間後、Ｈ２Ｏ  ２０ｍＬを添加し、さらに４５分間室温で混合物を撹拌した。０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨを３に調整し、およそ１５重量％の濃度までＮａＣｌを添加した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬｘ３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルにより沈殿させた後、生成物をろ過により回収し、真空下で乾燥させ、オメガ−カルボキシ−アジドＰＥＧ誘導体を得た。
【０６４５】
（実施例２２）
ｍＰＥＧ−ＯＭｓ＋ＨＣ≡ＣＬｉ→ｍＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｃ≡Ｃ−Ｈ
当技術分野で公知のように調製し、−７８℃に冷却した、ＴＨＦ中のリチウムアセチリド（４当量）の溶液に、ＴＨＦ中で溶解させたｍＰＥＧ−ＯＭｓの溶液を激しく撹拌しながら滴下添加した。３時間後、反応物を室温に温め、ブタノール１ｍＬを添加することで反応停止させた。次に、Ｈ２Ｏ  ２０ｍＬを添加し、さらに４５分間室温にて混合物を撹拌した。０．５Ｎ  Ｈ２ＳＯ４を用いてｐＨを３に調整し、およそ１５重量％の濃度までＮａＣｌを添加した。反応混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬｘ３）で抽出し、Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮した。冷ジエチルエーテルにより沈殿させた後、生成物をろ過により回収し、真空下で乾燥させ、１−（ブタ−３−イニルオキシ）−メトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）を得た。
【０６４６】
（実施例２３）
Ｌ．Ｗａｎｇら、（２００１）、Ｓｃｉｅｎｃｅ２９２：４９８−５００、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：９６４−７（２００３））、Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、（２００２）、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １２４：９０２６−９０２７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ、（２００２）、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏ  Ｃｈｅｍ  １１：１１３５−１１３７；Ｊ．Ｗ．Ｃｈｉｎら、（２００２）、ＰＮＡＳ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９９：１１０２０−１１０２４；及びＬ．Ｗａｎｇ及びＰ．Ｇ．Ｓｃｈｕｌｔｚ（２００２）、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．，１−１０に記載の方法を用いて、タンパク質へ部位選択的にアジド−及びアセチレン−含有アミノ酸を取り込ませた。アミノ酸を取り込ませた後、２ｍＭ  ＰＥＧ誘導体、１ｍＭ  ＣｕＳＯ４及び〜１ｍｇ銅細線存在下で、３７℃にて４時間、リン酸緩衝液（ＰＢ）、ｐＨ８中の０．０１ｍＭタンパク質を用いて付加環化反応を行った。
【０６４７】
（実施例２４）
この実施例は、非天然コードアミノ酸を含有するＡＢＰ及びＰＥＧ化ＡＢＰのインビトロ及びインビボ活性を測定する方法を述べる。
【０６４８】
細胞結合アッセイ
０℃にて９０分間、様々な濃度の（体積１０μＬ）、非標識ＡＢＰ、ＡＢＰもしくはネガティブ対照非存在下又は存在下で、及び、１２５Ｉ−ＡＢＰ（およそ１００，０００ｃｐｍ又は１ｎｇ）存在下で、ＰＢＳ／１％ＢＳＡ（１００μＬ）中で、各２測定試料ずつ、細胞（３ｘ１０６）をインキュベートする（総体積：１２０μＬ）。次に細胞を再懸濁し、３５０μＬプラスチック遠沈管中の２００μＬ氷冷ＦＣＳ上に重ねるように添加し、遠心分離する（１０００ｇ、１分間）。管の端を切ってペレットを回収し、ペレット及び上清を個別にガンマカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ）でカウントする。
【０６４９】
競合物の非存在下での総結合（２測定の平均）から非標識ＡＢＰ（非特異的結合）の１００倍過剰量存在下での結合（ｃｐｍ）を差し引いたものとして特異的結合（ｃｐｍ）を決定する。使用した細胞タイプのそれぞれに対して非特異的結合を測定する。１２５Ｉ−ＡＢＰの同じ調製物を用いて別の日に実験を行い、内部均一性を示すべきである。非標識の天然ＡＢＰ又はＡＢＰにより容量依存的に結合が阻害されるが、ネガティブ対照により阻害されない。天然１２５Ｉ−ＡＢＰの結合に対するＡＢＰの競合能から、受容体が両方の形態を同じようによく認識することが示唆される。
【０６５０】
ｓｃＦｖ−１０８を用いた結合アッセイの場合、トリプシン処理後にＡ４３１細胞を回収し、ＦＡＣＳ緩衝液（ＰＢＳ、２％ＦＢＳ、０．０１％ＮａＮ３）中で再懸濁し、次に、９６ウェル丸底マイクロタイタープレートに播種した（３ｘ１０５細胞／ウェル）。野生型又はｐＡｃＦ含有ｓｃＦｖ−１０８断片の様々な濃度とともに細胞を３０分間氷上でインキュベートした。遠心分離後に洗浄することにより（２−３回繰り返す。）、結合しなかったｓｃＦｖタンパク質を除去した。次に、７．５ｎＭの濃度（ＥＣ８０）のｍＡｂ−１０８（ＡＴＣＣ＃ＨＢ９７６４）とともに細胞を３０分間インキュベートした。２回洗浄した後、ＡＰＣ標識（アロフィコシアニン）抗マウス抗体（１０μｇ／ｍＬ）とともに氷上で細胞を３０分間インキュベートした。細胞を２回洗浄して二次抗体を除去した後、ヨウ化プロピジウム（０．５μｇ／ｍＬ）を添加したＦＡＣＳ緩衝液中で細胞を再懸濁し、フローサイトメトリーで分析した。Ｆａｂ−１０８を用いた結合アッセイの場合、ｓｃＦｖ−１０８アッセイに対して使用したものと同じ条件下で漸増量のＦａｂ−１０８とともに、細胞をインキュベートした。抗Ｈｉｓ抗体を用い、その後ＡＰＣ標識抗マウス二次抗体を用いて、Ｆａｂ結合を検出した。
【０６５１】
図７、パネルＡ−Ｃは、ＥＧＦ受容体を発現するＡ４３１細胞に対する、ｐ−アセチル−フェニルアラニンを含有するｓｃＦｖタンパク質（ｐＡｃＦ）又はＰＥＧを有するｐＡｃＦ及びＷＴｓｃＦｖの競合結合曲線を示す。洗浄して非結合ｓｃＦｖ’ｓを除去した後、様々な濃度のｓｃＦｖタンパク質とともに細胞をインキュベートし、上述のように、ｍＡｂ１０８を用いて細胞を処理した。ペリプラズムで全タンパク質を発現させた。表１１において、野生型ｓｃＦｖと比較した、修飾ｓｃＦｖ’ｓ（ｐＡｃＦ及びＰＥＧの付いたｐＡｃＦ）の結合をまとめる。
【０６５２】
【表１１】
2008503217.tif 000034
【０６５３】
図８、パネルＢ−Ｄは、ＥＧＦ受容体を発現するＡ４３１細胞に対する、ｐＡｃＦ又はｐＡｃＦ−ＰＥＧ−含有Ｆａｂ−１０８断片及びＷＴ  Ｆａｂの結合を示す。Ｆａｂ断片がＰＥＧ化された結果、ＥＧＦ受容体に対するその断片の親和性の低下は僅かである。野生型Ｆａｂと比較した、修飾Ｆａｂ断片の結合を表１２で示す。
【０６５４】
結合条件は既に述べたとおりであった。
【０６５５】
【表１２】
2008503217.tif 000035
【０６５６】
ＰＥＧ化ＡＢＰのインビボ実験
ＰＥＧ−ＡＢＰ、非修飾ＡＢＰ及び緩衝溶液をマウス又はラットに投与する。この結果から、非修飾ＡＢＰと比較して、本発明のＰＥＧ化ＡＢＰの活性が活性が高く、半減期が長くなっていることが示される。
【０６５７】
共役及び非共役ＡＢＰならびにそれらの変異型のインビボ半減期の測定
雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（約７週齢）を使用する。投与日に、各動物の体重を測定する。非共役及び共役ＡＢＰ試料を１００μｇ／ｋｇ体重、それぞれこれらのラットの尾静脈に静脈内投与する。投与から１分、３０分、１、２、４、６及び２４時間後に、ＣＯ２麻酔下で各ラットから血液５００μＬを採取する。血液試料を室温で１．５時間保存し、次いで、遠心分離（４℃、１８０００ｘｇで５分間）により血清を分離する。分析する日まで血清試料を−８０℃で保存する。氷上で試料を凍結融解した後、ＡＢＰインビトロ活性分析により血清試料中の活性ＡＢＰの量を定量する。
【０６５８】
（実施例３１）
非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＡＢＰの安全性及び／又は有効性のヒト臨床試験
目的  皮下投与した、非天然のコードアミノ酸を含有するＰＥＧ化組み換えヒトＡＢＰの安全性及び薬物動態学的を、同じ標的抗原に特異的な市販の製品（例えば、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（Ｒ）、Ｂｅｘｘａｒ（Ｒ）、Ｃａｍｐａｔｈ（Ｒ）、ＣＥＡ−Ｓｃａｎ（Ｒ）、Ｅｎｂｒｅｌ（Ｒ）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（Ｒ）、Ｈｕｍｉｒａ（Ｒ）、Ｍｙｏｓｃｉｎｔ（Ｒ）、Ｐｒｏｓｔａｓｃｉｎｔ（Ｒ）、Ｒａｐｔｉｖａ（Ｒ）、Ｒｅｍｉｃａｄｅ（Ｒ）、ＲｅｏＰｒｏ（Ｒ）、Ｒｉｔｕｘａｎ（Ｒ）、Ｓｉｍｕｌｅｃｔ（Ｒ）、Ｓｙｎａｇｉｓ（Ｒ）、Ｖｅｒｌｕｍａ（Ｒ）、Ｘｏｌａｉｒ（Ｒ）、Ｚｅｎａｐａｘ（Ｒ）、Ｚｅｖａｌｉｎ（Ｒ）又はＡｖａｓｔｉｎ（Ｒ）。）と比較すること。
【０６５９】
患者  ２０歳から４０歳で、体重６０ｋｇから９０ｋｇの１８名の健康なボランティアを本試験に登録する。対象者は、血液学又は血清化学における重大な異常臨床検査値がなく、尿毒性スクリーニング、ＨＩＶスクリーニング及びＢ型肝炎表面抗原検査の結果が陰性である。これら対象者は、次の徴候の何れも有してはならない：高血圧；何らかの原発性血液疾患の病歴；重度の、肝臓、腎臓、心血管、胃腸管、尿生殖器、代謝性、神経性の疾患の病歴；貧血又は発作性疾患の病歴；細菌もしくは哺乳動物由来産物、ＰＥＧ又はヒト血清アルブミンに対する既知の感受性；カフェイン含有飲料の習慣的消費及び大量消費；何らかの他の臨床試験への参加又は試験エントリー３０日以内の輸血もしくは献血；試験エントリー３ヶ月以内のＡＢＰへの曝露；試験エントリー７日以内の病気；及び試験前健康診断又は試験エントリー１４日以内の臨床検査評価での顕著な異常。全対象者が安全性に関して評価可能であり、スケジュールどおりに、薬物動態学的分析のために全ての採血試料を回収する。試験は全て、研究所の倫理委員会の承認及び患者の同意を得て行う。
【０６６０】
試験計画
これは、健康な男性ボランティアにおける、フェーズＩの、１ヶ所の施設での非盲検の無作為化２期クロスオーバー試験である。１８名の対象者を無作為に２つの処置順序群の１つに割り当てる（各群９名）。２回の別個の投与期間にわたり、非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＡＢＰ及び選択した市販製品の同等の投与量を用いて、大腿上方にボーラスｓ．ｃ．注射としてＡＢＰを投与する。市販製品の投与の用量及び頻度は、包装のラベルに指示されている通りである。さらなる対象者の群を加えることにより、必要に応じて、市販製品を用いた、さらなる投与、投与頻度又はその他のパラメーターをこの試験に付け加え得る。各投与期間は、１４日間のウォッシュアウト期間を置くことにより分けられる。２回の投与期間それぞれに対して、少なくとも１２時間前から投与後７２時間まで、被験者を試験施設に収容するが、投与期間と投与期間の間は収容しない。ＰＥＧ化ＡＢＰに対して同じように試験する、さらなる投与、頻度又はその他のパラメーターを加える場合は、さらなる被験者群を付け加え得る。ＡＢＰの実験処方物は、非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＡＢＰである。
【０６６１】
採血
ＡＢＰ投与前後に静脈に針を直接刺し、連続血液を採取する。血清ＡＢＰ濃度を調べるための静脈血液試料（５ｍＬ）を投与前約３０、２０及び１０分（３種類のベースライン試料）及び投与からおよそ３０分ならびに、１、２、５、８、１２、１５、１８、２４、３０、３６、４８、６０及び７２時間後に採取する。各血清試料を２つに分注する。血清試料を全て−２０℃で保存する。血清試料をドライアイス上で発送する。第１日の最初の投与直前、第４日の午前及び第１６日の投与直前、第１９日の午前に、絶食臨床検査（血液学、血清化学及び尿検査）を行う。
【０６６２】
生物分析化学法
血清ＡＢＰ濃度を測定するために、ラジオイムノアッセイ（ＲＡ）又はＥＬＩＳＡキット法を用いる。
【０６６３】
安全性試験  各投与直前（第１日及び第１６日）、各投与後６、２４、４８及び７２時間に、バイタルサインを記録する。安全性試験は、有害事象の発生及びタイプ、及びベースラインからの臨床検査値の変化に基づく。さらに、血圧を含む、試験前からのバイタルサイン測定値の変化及び健康診断の結果を評価する。
【０６６４】
データ解析  投与後値のそれぞれから、投与前３０分、２０分及び１０分に回収した３種類の血清のＡＢＰレベルの平均値を出すことから決定した平均ベースラインＡＢＰを差し引くことにより、投与後の血清濃度値を投与前ベースラインＡＢＰ濃度に対して補正する。投与前血清ＡＢＰ濃度は、それらがアッセイの定量レベル以下である場合は、平均値の計算に含めない。ベースラインＡＢＰ濃度に対して補正した血清濃度データから薬物動態学的パラメーターを調べる。ＢＩＯＡＶＬソフトウェアの最新版を用いて、Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ＶＡＸ  ８６００コンピュータシステムにおいて、モデル非依存的方法により薬物動態学的パラメーターを計算する。次の薬物動態学的パラメーターを調べる：ピーク血清濃度（Ｃｍａｘ）；ピーク血清濃度までの時間（ｔｍａｘ）；線形台形法を用いて計算する、時間ゼロから最終採血時までの（ＡＵＣ０−７２）の濃度−時間曲線下の面積（ＡＵＣ）；及び、消失速度定数から計算した、最終消失半減期（ｔ１／２）。対数線形濃度−時間プロットの最終線形領域における連続したデータ点の直線回帰により、消失速度定数を推定する。薬物動態学的パラメーターの、平均、標準偏差（ＳＤ）及び変動係数（ＣＶ）を各処置に対して計算する。パラメーター平均の比率（保存処方物／非保存処方物）を計算する。
【０６６５】
安全性の結果  有害事象の発生は、治療群にまたがり等しく分布する。ベースライン又は試験前の臨床検査もしくは血圧からの臨床的に顕著な変化及び、健康診断結果及びバイタルサイン測定値における試験前からの顕著な変化はない。２つの治療群に対する安全性プロファイルは同じであると思われる。
【０６６６】
薬物動態学的結果  測定した各時間点において、同じ標的抗原に対して特異的な市販製品の一つ以上を単回投与した後の、１８名の全対象者における平均血清ＡＢＰ濃度−時間プロファイル（ベースラインＡＢＰレベルに対する補正なし。）を、非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＡＢＰと比較する。全対象者が正常な生理的範囲内の投与前ベースラインＡＢＰ濃度を有するべきである。投与前平均ベースラインＡＢＰ濃度に対して補正した血清データから薬物動態学的パラメーターを決定し、Ｃｍａｘ及びｔｍａｘを決定する。選択した臨床比較物に対する平均ｔｍａｘは、非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＡＢＰに対するｔｍａｘよりも有意に短い。試験した市販のＡＢＰ製品に対する最終半減期値は、非天然のコードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＡＢＰに対する最終半減期と比較して、有意に短い。
【０６６７】
この試験を健康な男性被験者において行うが、同様の吸収特性及び安全性プロファイルが他の患者集団、例えば男性もしくは女性の癌もしくは慢性腎不全患者、小児腎不全患者、前貯蔵式自己血液プログラムの患者又は待機手術の予定がある患者などにおいて予想される。
【０６６８】
結論として、非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＡＢＰの皮下単回投与は安全であり、健康な男性被験者においては良好な耐容性を示す。有害事象の相対的な発生率、臨床検査値、バイタルサイン及び健康診断の結果に基づき、ＡＢＰの市販の形態及び非天然コードアミノ酸含有ＰＥＧ化ＡＢＰの安全性プロファイルは同等である。非天然コードアミノ酸を含有するＰＥＧ化ＡＢＰは、患者及びヘルスケア関係者に対して大きな臨床的有用性を提供する可能性がある。
【０６６９】
本明細書に記載の実施例及び実施形態は、ただ説明を目的とするものであり、それらに照らして、様々な変形及び変更が当業者に対して示唆され、これらが、本願の精神及び範囲ならびに添付の特許請求の範囲内に含まれるものとすることを理解されたい。本明細書中で引用した、全ての刊行物、特許及び特許明細書は、あらゆる目的のために、その全体を本明細書中に参照により組み込む。
【０６７０】
本発明の追加及び代替的実施形態
１．一つ以上の非天然コードアミノ酸を含有する、抗原結合ポリペプチド。
２．一つ以上の翻訳後修飾を含有する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
３．リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
４．水溶性ポリマーに連結されている、請求項３に記載の抗原結合ポリペプチド。
５．二官能性ポリマー、二官能性リンカー又は少なくとも１つのさらなる抗原結合ポリペプチドに連結されている、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
６．二官能性リンカー又はポリマーが、第二のポリペプチドに連結している、請求項５に記載の抗原結合ポリペプチド。
７．第二のポリペプチドが、抗原結合ポリペプチドである、請求項６に記載の抗原結合ポリペプチド。
８．第二のポリペプチドが、非抗原結合ポリペプチドである、請求項６に記載の抗原結合ポリペプチド。
９．水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）部分を含有する、請求項４に記載の抗原結合ポリペプチド。
１０．二官能性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）部分である、請求項５に記載の抗原結合ポリペプチド。
１１．前記水溶性ポリマーが、抗原結合ポリペプチドに存在する非天然コードアミノ酸と連結している、請求項４に記載の抗原結合ポリペプチド。
１２．ポリ（エチレングリコール）部分を含有する水溶性ポリマーに連結している少なくとも２個のアミノ酸を含有する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
１３．前記水溶性ポリマーに連結している少なくとも１個のアミノ酸が、非天然コードアミノ酸である、請求項１２に記載の抗原結合ポリペプチド。
１４．抗原結合ポリペプチドが、ＡＢＰ受容体又は抗原に対する抗原結合ポリペプチドの親和性を調節する一つ以上の、アミノ酸置換、付加又は欠失を含む、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
１５．安定性、組み換え宿主細胞における発現レベル又はインビトロでの合成、免疫原性、プロテアーゼ抵抗性、組織もしくは器官特異性又は抗原結合ポリペプチドの溶解性を調節する一つ以上の、アミノ酸置換、付加又は欠失を含有する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
１６．非天然コードアミノ酸が、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に対して反応性があり、ポリペプチドにおける２０種類の一般的アミノ酸のいずれに対しても非反応性である、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
１７．非天然コードアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジン基、ヒドラジド基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含有する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
１８．非天然コードアミノ酸が、カルボニル基を含有する、請求項１７に記載の抗原結合ポリペプチド。
１９．非天然コードアミノ酸が、構造
【０６７１】
【化２２】
2008503217.tif 000036
（式中、
ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであり；Ｒ２は、Ｈ、アルキル、アリール、置換アルキル及び置換アリールであり；Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ４は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）を有する、請求項１８に記載の抗原結合ポリペプチド。
２０．非天然コードアミノ酸が、アミノオキシ基を含有する、請求項１７に記載の抗原結合ポリペプチド。
２１．非天然コードアミノ酸が、ヒドラジド基を含有する、請求項１７に記載の抗原結合ポリペプチド。
２２．非天然コードアミノ酸が、ヒドラジン基を含有する、請求項１７に記載の抗原結合ポリペプチド。
２３．非天然コードアミノ酸が、セミカルバジド基を含有する、請求項１７に記載の抗原結合ポリペプチド。
２４．非天然コードアミノ酸が、アジド基を含有する、請求項１７に記載の抗原結合ポリペプチド。
２５．非天然コードアミノ酸が、構造
【０６７２】
【化２３】
2008503217.tif 000037
（式中、
ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであるか又は存在せず；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在せず；ｍは０から１０であり；Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）を有する、請求項２４に記載の抗原結合ポリペプチド。
２６．非天然コードアミノ酸が、アルキン基を含有する、請求項１７に記載の抗原結合ポリペプチド。
２７．非天然コードアミノ酸が、構造：
【０６７３】
【化２４】
2008503217.tif 000038
（式中、
ｎは、０から１０であり；Ｒ１は、アルキル、アリール、置換アルキル又は置換アリールであり；Ｘは、Ｏ、Ｎ、Ｓであるか又は存在せず；ｍは０から１０であり、Ｒ２は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はアミノ末端修飾基であり、Ｒ３は、Ｈ、アミノ酸、ポリペプチド又はカルボキシ末端修飾基である。）を有する、請求項２６に記載の抗原結合ポリペプチド。
２８．水溶性ポリマーが、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項４に記載の抗原結合ポリペプチド。
２９．水溶性ポリマーが、約０．１ｋＤａから約５０ｋＤａの間の分子量を有する、請求項２８に記載の抗原結合ポリペプチド。
３０．カルボニル含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含有する水溶性ポリマーと反応させることにより調製される、請求項４に記載の抗原結合ポリペプチド。
３１．アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基が、アミド結合を介して水溶性ポリマーと連結されている、請求項３０に記載の抗原結合ポリペプチド。
３２．カルボニル基を含む水溶性ポリマーを、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド基を含有する非天然コードアミノ酸を含有するポリペプチドと反応させることにより調製される、請求項４に記載の抗原結合ポリペプチド。
３３．アルキン含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドを、アジド部分を含有する水溶性ポリマーと反応させることにより調製される、請求項４に記載の抗原結合ポリペプチド。
３４．アジド含有アミノ酸を含む抗原結合ポリペプチドを、アルキン部分を含有する水溶性ポリマーと反応させることにより調製される、請求項４に記載の抗原結合ポリペプチド。
３５．アジド又はアルキン基が、アミド結合を介して水溶性ポリマーに連結されている、請求項１７に記載の抗原結合ポリペプチド。
３６．水溶性ポリマーが、分枝又は分岐ポリマーである、請求項４に記載の抗原結合ポリペプチド。
３７．水溶性ポリマーの各分枝が、約１ｋＤａから１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項３６に記載の抗原結合ポリペプチド。
３８．ポリペプチドが、抗原結合ポリペプチドアンタゴニストである、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
３９．ポリペプチドが、一つ以上の翻訳後修飾、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有する、請求項３８に記載の抗原結合ポリペプチド。
４０．ポリマーが、水溶性ポリマー及びポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含有する、請求項３９に記載の抗原結合ポリペプチド。
４１．非天然コードアミノ酸が、糖部分を含有する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
４２．リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、糖部分を介してポリペプチドに連結している、請求項３に記載の抗原結合ポリペプチド。
４３．抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含有しており、このポリヌクレオチドが少なくとも１個のセレクターコドンを含有する、単離核酸。
４４．セレクターコドンが、アンバーコドン、オーカーコドン、オパールコドン、ユニークコドン、レアコドン及び四塩基コドンからなる群から選択される、請求項４３に記載の単離核酸。
４５．請求項３に記載の抗原結合ポリペプチドを調製する方法（この方法は、非天然コードアミノ酸を含有する単離抗原結合ポリペプチドを、この非天然コードアミノ酸と反応する部分を含有する、リンカー、ポリマー又は生物活性分子と接触させることを含む。）。
４６．ポリマーが、水溶性ポリマー及びポリ（エチレングリコール）からなる群から選択される部分を含有する、請求項４５に記載の方法。
４７．非天然コードアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含有する、請求項４５に記載の方法。
４８．非天然コードアミノ酸がカルボニル部分を含有し、リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分を含有する、請求項４５に記載の方法。
４９．アミノオキシ、ヒドラジン、ヒドラジド又はセミカルバジド部分が、アミド結合を介して、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項４８に記載の方法。
５０．非天然コードアミノ酸が、アルキン部分を含有し、リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、アジド部分を含有する、請求項４５に記載の方法。
５１．非天然コードアミノ酸が、アジド部分を含有し、リンカー、ポリマー又は生物活性分子がアルキン部分を含有する、請求項４５に記載の方法。
５２．アジド又はアルキン部分が、アミド結合を介して、リンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結されている、請求項４７に記載の方法。
５３．ポリ（エチレングリコール）部分が、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの間の平均分子量を有する、請求項４６に記載の方法。
５４．ポリ（エチレングリコール）部分が、分枝又は分岐ポリマーである、請求項４６に記載の方法。
５５．請求項１に記載の抗原結合ポリペプチドと、医薬的に許容される担体と、を含有する組成物。
５６．非天然コードアミノ酸が、水溶性ポリマーに連結されている、請求項５５に記載の組成物。
５７．ＡＢＰにより調節される疾患を有する患者を治療する方法（この方法は、請求項５５に記載の組成物の治療的有効量を患者に投与することを含む。）。
５８．請求項４３に記載の核酸を含有する細胞。
５９．直交化ｔＲＮＡシンテターゼ又は直交化ｔＲＮＡを含有する、請求項５８に記載の細胞。
６０．非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドを調製する方法（この方法は、非天然コードアミノ酸を含有する抗原結合ポリペプチドの発現が可能な条件下で、セレクターコドンを含有する抗原結合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（一つ以上）、直交化ＲＮＡシンテターゼ及び直交化ｔＲＮＡを含む細胞を培養することと、抗原結合ポリペプチドを精製することと、を含む。）。
６１．抗原結合ポリペプチドの、血清半減期又は循環時間を調節する方法（この方法は、抗原結合ポリペプチドにおいて、何れかの一つ以上の天然アミノ酸を一つ以上の非天然コードアミノ酸で置換することを含む。）。
６２．ポリヌクレオチドによりコードされる抗原結合ポリペプチド（前記ポリヌクレオチドは、セレクターコドンを含有しており、前記ポリペプチドは、少なくとも１個の非天然コードアミノ酸を含有する。）。
６３．非天然コードアミノ酸が、リンカー、ポリマー、水溶性ポリマー又は生物活性分子と連結されている、請求項６２に記載の抗原結合ポリペプチド。
６４．水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）部分を含有する、請求項６３に記載の抗原結合ポリペプチド。
６５．非天然コードアミノ酸が、カルボニル基、アミノオキシ基、ヒドラジド基、ヒドラジン基、セミカルバジド基、アジド基又はアルキン基を含有する、請求項６２に記載の抗原結合ポリペプチド。
６６．ポリ（エチレングリコール）部分が、約０．１ｋＤａから約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項６４に記載の抗原結合ポリペプチド。
６７．ポリ（エチレングリコール）部分が、分枝又は分岐ポリマーである、請求項６４に記載の抗原結合ポリペプチド。
６８．ポリ（エチレングリコール）部分が、約１ｋＤａから約１００ｋＤａの間の分子量を有する、請求項６７に記載の抗原結合ポリペプチド。
６９．請求項６２に記載の抗原結合ポリペプチドと、医薬的に許容される担体と、を含有する組成物。
７０．二重特異性ＡＢＰ（互いに連結している、第一のＡＢＰと第二のＡＢＰとを含有しており、前記第一のＡＢＰ及び前記第二のＡＢＰは異なるエピトープに特異的に結合し、前記第一のＡＢＰは、第一の抗原において少なくとも１個のエピトープに対する結合特異性を有し、第二のＡＢＰは、第一のエピトープとは異なる、第一の抗原又は第二の抗原の第二のエピトープに対して結合特異性を有しており、前記二重特異性ＡＢＰは、少なくとも１個の非天然コードアミノ酸を含有する。）。
７１．前記第一のＡＢＰ及び前記第二のＡＢＰが、リンカーにより連結されている、請求項７０に記載の二重特異性ＡＢＰ。
７２．前記リンカーが、ペプチドリンカーである、請求項７１に記載の二重特異性ＡＢＰ。
７３．前記リンカーが、タンパク質分解的切断部位を欠くペプチドリンカーである、請求項７２に記載の二重特異性ＡＢＰ。
７４．前記第一のＡＢＰが、一本鎖ＡＢＰであり、前記第二のＡＢＰが、一本鎖ＡＢＰであり、前記第一のＡＢＰが、ペプチドリンカーにより前記第二のＡＢＰにカップリングしている、請求項７０に記載の二重特異性ＡＢＰ。
７５．請求項７０に記載の二重特異性ＡＢＰと、医薬的に許容される担体と、を含有する組成物。
７６．疾患又は状態を治療するための方法（この方法は、これを必要とする患者に請求項７５に記載の組成物の治療的有効量を投与することを含む。）。
７７．生物活性分子とカップリングしている請求項７０に記載の二重特異性ＡＢＰを含む、ＡＢＰ。
７８．前記生物活性分子が、細胞毒素、標識、放射性核種、薬物、リポソーム、リガンド及びＡＢＰからなる群から選択される、請求項７７に記載のＡＢＰ。
７９．融合タンパク質である、請求項７７に記載のＡＢＰ。
８０．一つ以上の抗原を発現する、細胞又は組織を検出する方法（この方法は、検出可能な標識に連結させた請求項７０に記載のＡＢＰと細胞又は組織とを接触させることと；前記標識を検出することと、を含み、細胞又は組織と会合している前記標識の検出が、ＡＢＰが結合する一つ以上の抗原を発現する、細胞又は組織の存在を示す。）。
８１．前記検出可能標識が、ガンマ放出体、陽電子放射体、ＭＲＩ標識及び蛍光標識からなる群から選択される、請求項８０に記載の方法。
８２．前記検出可能標識が、ガンマ放出体であり、前記検出が、ガンマカメラによるイメージングを含む、請求項８０に記載の方法。
８３．前記検出可能標識が、陽電子放射体であり、前記検出が、陽電子放出断層撮影（ＰＥＴ）によるイメージングを含む、請求項８０に記載の方法。
８４．前記検出可能標識が、ＭＲＩ標識であり、前記検出が、核磁気共鳴影像法による検出を含む、請求項８０に記載の方法。
８５．１個のアミノ酸における抗原結合ポリペプチドへの共有結合により連結される水溶性ポリマーを含有する、抗原結合ポリペプチド。
８６．水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）部分を含有する、請求項８５に記載の抗原結合ポリペプチド。
８７．水溶性ポリマーに共有結合するアミノ酸が、非天然コードアミノ酸である、請求項８５に記載の抗原結合ポリペプチド。
８８．少なくとも１つのリンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有しており、前記リンカー、ポリマー又は生物活性分子が、リボソームにおいてポリペプチドに組み込まれる非天然コードアミノ酸の官能基を介してポリペプチドに連結されている、抗原結合ポリペプチド。
８９．前記抗原結合ポリペプチドが、モノＰＥＧ化されている、請求項８８に記載の抗原結合ポリペプチド。
９０．一つ以上の非天然コードアミノ酸に連結されており、前記非天然コードアミノ酸が、リボソームにおいて事前選択部位でポリペプチドに取り込まれる、リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有する、抗原結合ポリペプチド。
９１．１個の、前記リンカー、ポリマー又は生物活性分子を含有する、請求項９０に記載の抗原結合ポリペプチド。
９２．抗原結合ポリペプチドの、血清半減期又は循環時間を調節する、一つ以上のアミノ酸置換、付加又は欠失を含有する、請求項１に記載の抗原結合ポリペプチド。
９３．抗原結合ポリペプチドの免疫原性を調節する方法（この方法は、抗原結合ポリペプチドにおいて、何れかの一つ以上の天然アミノ酸を一つ以上の非天然コードアミノ酸で置換することを含む。）。
９４．単離核酸の配列が、配列番号１８、２０、２２、２５、２７及び２９又はそれらの断片からなる群から選択される、請求項４３に記載の単離核酸。
９５．配列番号：１９、２１、２３、２４、２６、２８、３０、３１又はそれらの断片からなる群から選択される、抗原結合ポリペプチド。
９６．抗原結合ポリペプチドが、変性条件下でリンカー、ポリマー又は生物活性分子に連結される、請求項３に記載の抗原結合ポリペプチド。
【図面の簡単な説明】
【０６７４】
【図１】抗体分子（ＩｇＧ）及びその抗原結合部分の一般構造の図式を示す。ＣＤＲは、抗原認識部位内に含有される。
【図２】ｓｃＦｖ−１０８の、ペリプラスム（図２、パネルＡ）及び細胞質（図２、パネルＢ）発現／抑制に対して用いたコンストラクトを示す。アンバー停止コドンの位置を示す。Ｆａｂ−１０８断片の発現／抑制のために用いた２−シストロン性のカセット（図２、パネルＣ）を示す。ｓｃＦｖ−４Ｄ５断片のペリプラスム発現／抑制のために用いたコンストラクトを示す（図２、パネルＤ及びパネルＥ）。Ｆａｂ−４Ｄ５断片の発現／抑制のためのシストロンを示す（図２、パネルＦ）。
【図２−１】ｓｃＦｖ−１０８の、ペリプラスム（図２、パネルＡ）及び細胞質（図２、パネルＢ）発現／抑制に対して用いたコンストラクトを示す。アンバー停止コドンの位置を示す。Ｆａｂ−１０８断片の発現／抑制のために用いた２−シストロン性のカセット（図２、パネルＣ）を示す。ｓｃＦｖ−４Ｄ５断片のペリプラスム発現／抑制のために用いたコンストラクトを示す（図２、パネルＤ及びパネルＥ）。Ｆａｂ−４Ｄ５断片の発現／抑制のためのシストロンを示す（図２、パネルＦ）。
【図３】ＧｌｙＳｅｒリンカー（Ｓ１３１Ａｍ）の第二のセリンにおけるアンバー突然変異の抑制（図３、パネルＡ）及び対応するｐＡｃＦ−含有ｓｃＦｖのＩＭＡＣ精製の分析（図３、パネルＢ）を示す。
【図４】ｓｃＦｖの細胞質発現中のＶＬ鎖（Ｌ１５６）におけるアンバー突然変異（Ｌ１５６）の抑制を示す。
【図５】ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８断片の、ＰＥＧ化及び二量体化を図５、パネルＡで示す。モノＰＥＧ化ｓｃＦｖ及び二量体の位置をそれぞれ一重矢印及び二重矢印により示す。図５、パネルＢは、ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８断片−（Ｓ１３６）のＰＥＧ化を示す。図５、パネルＣは、ＷＴ  ｓｃＦｖ断片のＰＥＧ化が見られなかったことを示す。
【図５−１】ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８断片の、ＰＥＧ化及び二量体化を図５、パネルＡで示す。モノＰＥＧ化ｓｃＦｖ及び二量体の位置をそれぞれ一重矢印及び二重矢印により示す。図５、パネルＢは、ｐＡｃＦ−ｓｃＦｖ−１０８断片−（Ｓ１３６）のＰＥＧ化を示す。図５、パネルＣは、ＷＴ  ｓｃＦｖ断片のＰＥＧ化が見られなかったことを示す。
【図６】ｓｃＦｖ−１０８ホモ二量体の精製の際に採取した分画を示すゲルを示す。
【図７】ＥＧＦ受容体を発現するＡ４３１細胞への、ｐＡｃＦ又はｐＡｃＦ−ＰＥＧ−含有ｓｃＦｖタンパク質の結合を図７、パネルＡ−Ｃで示す。
【図８】ｍＡｂ１０８の、ｐＡｃＦ及びｐＡｃＦ−ＰＥＧ−含有Ｆａｂ断片を示すゲルは、図８、パネルＡのように示される。ＥＧＦ受容体を発現するＡ４３１細胞への、ｍＡｂ１０８のＦａｂ断片の結合を図８、パネルＢ−Ｄで示す。
【図８−１】ｍＡｂ１０８の、ｐＡｃＦ及びｐＡｃＦ−ＰＥＧ−含有Ｆａｂ断片を示すゲルは、図８、パネルＡのように示される。ＥＧＦ受容体を発現するＡ４３１細胞への、ｍＡｂ１０８のＦａｂ断片の結合を図８、パネルＢ−Ｄで示す。
【図８−２】ｍＡｂ１０８の、ｐＡｃＦ及びｐＡｃＦ−ＰＥＧ−含有Ｆａｂ断片を示すゲルは、図８、パネルＡのように示される。ＥＧＦ受容体を発現するＡ４３１細胞への、ｍＡｂ１０８のＦａｂ断片の結合を図８、パネルＢ−Ｄで示す。
【図８−３】ｍＡｂ１０８の、ｐＡｃＦ及びｐＡｃＦ−ＰＥＧ−含有Ｆａｂ断片を示すゲルは、図８、パネルＡのように示される。ＥＧＦ受容体を発現するＡ４３１細胞への、ｍＡｂ１０８のＦａｂ断片の結合を図８、パネルＢ−Ｄで示す。
【図９】本発明のヘテロ二官能性ＡＢＰの例を示す。
【図１０】Ｃ末端（図１０、パネルＡ）又はＮ末端（図１０、パネルＢ）ｓｃＦｖ−４Ｄ５断片のＧｌｙＳｅｒリンカーの第二のセリンにおけるアンバー突然変異の抑制を示すゲルを示す。
【図１０−１】Ｃ末端（図１０、パネルＡ）又はＮ末端（図１０、パネルＢ）ｓｃＦｖ−４Ｄ５断片のＧｌｙＳｅｒリンカーの第二のセリンにおけるアンバー突然変異の抑制を示すゲルを示す。
【図１１】還元及び非還元条件下両方での、ｐＡｃＦ−Ｆａｂ−４Ｄ５−（Ｋ１３９）及びＦａｂ−４Ｄ５−ｃｙｓのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す（図１１、パネルＡ）。図１１、パネルＢは、図１１、抗Ｈｉｓ抗体を用いた、パネルＡで示す試料のウェスタンブロットを示す。
【図１２】ペプチドＴ２０に連結しているＨＩＶ−Ｉ中和ヒトＦａｂ４Ｅ１０を示す。
【図１３】二量体化手段の図式を示す。
【図１４】ｓｃＦｖ二量体形成の非還元（図１４、パネルＡ）及び還元（図１４、パネルＢ）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す。
【図１５】精製ｓｃＦｖ二量体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を示す。
【図１】
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【図２】
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【図２−１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図５−１】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図８−１】
2008503217.tif 000049
【図８−２】
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【図８−３】
2008503217.tif 000051
【図９】
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【図１０】
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【図１０−１】
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【図１１】
2008503217.tif 000055
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2008503217.tif 000098