(57)【要約】  本発明は、増加した逆転写酵素活性を示す変異体ＤＮＡ  ５ポリメラーゼを含む、組成物、キットおよび方法に関するものである。また、本発明は修飾されたｃＤＮＡの生成方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つのアミノアリル修飾ヌクレオチドを含み、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素活性の増加を示す組成物。
【請求項２】
変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのアミノアリル修飾ヌクレオチド、およびそれらのための包装材を含み、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが逆転写酵素活性の増加を示すキット。
【請求項３】
修飾されたＤＮＡ相補鎖を生成する方法であって、
少なくとも１つの特殊なヌクレオチドを含む反応混合物中で、鋳型ＤＮＡ分子と逆転写酵素活性の増加を示す変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼとを、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成して、前記特殊なヌクレオチドを前記合成された相補的ＤＮＡ鎖に組み込むことを可能にするのに十分な条件下でおよび十分な時間、合わせることを含む方法。
【請求項４】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、領域ＩＩのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９と対応する位置にＬＹＰモチーフを有する野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される野生型ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号３のＬ４０９からＰ４１１と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異を含む、請求項３、４、５または６に記載の方法。
【請求項８】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下をさらに示す、請求項３、４、５または６に記載の方法。
【請求項９】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、塩基類似体検出活性の減少をさらに示す、請求項３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１０】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下および塩基類似体検出活性の減少をさらに示す、請求項３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１１】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号３のＬ４０９と対応する位置のアミノ酸変異を含む、請求項３、４、５または６に記載の方法。
【請求項１２】
配列番号３のＬ４０９と対応するアミノ酸における前記アミノ酸変異が、ロイシンからフェニルアラニンへの変異、ロイシンからチロシンへの変異、ロイシンからヒスチジンへの変異またはロイシンからトリプトファンへの変異である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記特殊なヌクレオチドが、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、アミノアリル修飾ヌクレオチドおよびコンジュゲートしたヌクレオチドからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記コンジュゲートしたヌクレオチドが、放射性標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、化学発光標識ヌクレオチドおよび量子ドット標識ヌクレオチドからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
カップリングする段階をさらに含む請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記カップリングする段階が、前記修飾されたｃＤＮＡを、ＮＨＳエステルまたはＳＴＰエステルの脱離基を含む蛍光色素と結合することを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
ＲＮＡ分子を増幅するための方法であって、
鋳型ＲＮＡ分子を、逆転写酵素活性の増加を示す変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼを含む第１の反応混合物中でプライマー複合体とインキュベートする段階であって、前記インキュベーションは相補的ＤＮＡ鋳型の合成を可能にし、前記プライマー複合体は標的配列に相補的なプライマーおよびプロモーター領域を含む段階、
前記相補的ＤＮＡ鋳型を、前記プロモーター領域を含む第２の相補的ＤＮＡの合成を可能にする第２の反応混合物中でインキュベートする段階、および
前記プライマー複合体のプロモーター領域から開始してＲＮＡのコピーを転写する段階であって、前記転写はアンチセンスＲＮＡを生成する段階
を含む方法。
【請求項１８】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、領域ＩＩのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９と対応する位置にＬＹＰモチーフを有する野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される野生型ポリメラーゼの変異体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下をさらに示す、請求項１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、塩基類似体検出活性の減少をさらに示す、請求項１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下および塩基類似体検出活性の減少をさらに示す、請求項１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号３のＬ４０９からＰ４１１と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異を含む、請求項１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが、配列番号３のＬ４０９と対応する位置のアミノ酸変異を含む、請求項１７、１８、１９または２０に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号３のＬ４０９と対応するアミノ酸における前記アミノ酸変異が、ロイシンからフェニルアラニンへの変異、ロイシンからチロシンへの変異、ロイシンからヒスチジンへの変異またはロイシンからトリプトファンへの変異である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記第１および第２の反応混合物が、同じ反応管で生じる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２８】
前記第２の反応混合物が、第２のＤＮＡポリメラーゼまたは２つ以上の他のＤＮＡポリメラーゼの組合せを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第２のＤＮＡポリメラーゼが、野生型ＤＮＡポリメラーゼである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第２のＤＮＡポリメラーゼが、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、クレノウ、Ｅｘｏ−Ｐｆｕ  Ｖ９３、Ｅｘｏ−ＰｆｕまたはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記転写する段階が、特殊なヌクレオチドを前記アンチセンスＲＮＡに組み込む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３２】
カップリングする段階をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３３】
前記カップリングする段階が、前記アンチセンスＲＮＡを、ＮＨＳエステルまたはＳＴＰエステルの脱離基を含む蛍光色素と結合することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記プライマー複合体が特殊な従来のヌクレオチドを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項３５】
ＲＮＡ分子を増幅する方法であって、
鋳型ＲＮＡ分子を、逆転写酵素活性の増加を示す変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼを含む第１の反応混合物中で第１のプライマー複合体とインキュベートする段階であって、前記第１のプライマー複合体は前記鋳型に相補的なプライマーおよびプロモーター領域を含み、前記インキュベーションは相補的ＤＮＡ鋳型の合成を可能にする段階、
前記相補的ＤＮＡ鋳型および第２のプライマー複合体を、前記プロモーター領域を含む第２の相補的ＤＮＡの合成を可能にする第２の反応混合物中でインキュベートする段階、
前記プライマー複合体のプロモーター領域から開始してＲＮＡのコピーを転写する段階であって、前記転写は合成ＲＮＡを生成する段階
を含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、逆転写酵素活性の増加を示すＤＮＡポリメラーゼ酵素を利用する組成物、キットおよび方法に関する。本発明の酵素は、核酸の検出可能な標識が求められる多くの用途で役立つ。
【背景技術】
【０００２】
逆転写（ＲＴ）およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、多くの分子生物学の用途および関連用途、特に遺伝子発現分析用途にとって重要である。逆転写は通常、マグネシウムイオンの存在下で活性なトリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ−ＲＴ）またはモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ−ＲＴ）から単離されたウイルス性逆転写酵素で実施される。逆転写は核酸の検出可能な標識で役に立つ。検出可能な標識は、研究ならびに臨床診断技術の用途を含む分子生物学の多くの用途で要求される。核酸を標識するために一般的に用いられる方法は、１つまたは複数の特殊なヌクレオチド、および新しく合成された相補鎖への前記特殊なヌクレオチドの鋳型依存性組込みを触媒するポリメラーゼ酵素を用いる。
【０００３】
逆転写は最初のＲＮＡ試料（例えばｍＲＮＡ）から鋳型ＤＮＡ（例えばｃＤＮＡ）を調製するためにも用いられ、次いで、この鋳型ＤＮＡは、関心の用途のために十分な量の増幅生成物を生成するためにＰＣＲを用いて増幅させる。
【０００４】
ＤＮＡ増幅のＲＴおよびＰＣＲの段階は、２段階または１段階プロセスとして実施することができる。
【０００５】
２段階プロセスの１つの型では、第１段階は逆転写酵素による第１の鎖ｃＤＮＡの合成を含み、第２のＰＣＲ段階がそれに続く。あるプロトコルでは、これらの段階は別々の反応管で実施される。これらの２管式プロトコルでは、第１の管での最初のＲＮＡ鋳型の逆転写の後、得られた反応生成物の一定量を次に第２のＰＣＲ管に入れ、ＰＣＲ増幅を実施する。
【０００６】
２段階プロセスの第２の型では、ＲＴおよびＰＣＲは、適合するＲＴおよびＰＣＲ緩衝液を用いて同じ管内で実施される。一般的に、逆転写が最初に実施され、次に反応管にＰＣＲ試薬を添加し、ＰＣＲに移行する。
【０００７】
様々な種類の１段階ＲＴ−ＰＣＲプロトコルが開発されており、例えば、BlainおよびGoff、J.Biol.Chem.（1993年）５：２３５８５−２３５９２；BlainおよびGoff、J.Virol.（1995年）６９：４４４０−４４５２；Sellnerら、J.Virol.Method.（1994年）４９：４７−５８；ＰＣＲ（ＰＣＲ）、必須技術（Essential Techniques）（J. F. Burke編、J. Wiley & Sons、ニューヨーク）（1996年）ｐｐ６１−６３；８０−８１を参照されたい。
【０００８】
いくつかの１段階系は市販されており、例えば、ワールドワイドウェブ（lifetech.com/world_whatsnew/archive/nz1-3.html）上のスーパースクリプト１段階ＲＴ−ＰＣＲ系（SuperScript One-Step RT-PCR System）の説明；ワールドワイドウェブ（promega.com/tbs/tb220/tb220.html）上のアクセスＲＴ−ＰＣＲ系およびアクセスＲＴ−ＰＣＲ入門系（Access RT-PCR System and Access RT-PCR Introductory System）の説明；www.clontech.comから入手できるAdvanTaq & AdvanTaq Plus ＰＣＲキットおよびユーザマニュアル（AdvanTaq & AdvanTaq Plus PCR kits and User Manual）ならびにProSTAR（商標）ＨＦ単管ＲＴ−ＰＣＲキット（ProSTAR（商標）HF single-tube RT-PCR kit）（Stratagene、カタログ番号６００１６４、ワールドワイドウェブStratagene．comから情報を入手可能）などがある。
【０００９】
ある種のＲＴ−ＰＣＲ方法は逆転写酵素活性およびＤＮＡポリメラーゼもしくはエキソヌクレアーゼ活性を有する酵素混合物または酵素を用い、例えば米国特許第６，４６８，７７５号、６，３９９，３２０号、５，３１０，６５２号、６，３００，０７３号、米国特許出願２００２／０１１９４６５Ａ１、ＥＰ１，１３２，４７０Ａ１および国際公開ＷＯ００／７１７３９Ａ１で記載されており、これらのすべては本明細書で参照により組み込まれている。
【００１０】
既存のいくつかのＲＴ−ＰＣＲ１段階法は、高温で活性のある好熱生物のＤＮＡポリメラーゼの未変性の逆転写酵素活性を利用し、例えば、本明細書の上で引用した参考文献および米国特許第５，３１０，６５２号、６，３９９，３２０号、５，３２２，７７０号および６，４３６，６７７号、ならびにMyersおよびGelfand、1991年、Biochem., ３０：７６６１−７６６６で記載されており、これらのすべては本明細書で参照により組み込まれている。逆転写酵素活性を有する耐熱性のＤＮＡポリメラーゼは、一般にサームス（Thermus）属の種から単離される。
【００１１】
当技術分野において、逆転写酵素活性の増加を示すＤＮＡポリメラーゼが必要とされている。当技術分野では、特に、核酸プローブを生成するために、逆転写酵素活性の増加を示し、特殊なヌクレオチドを組み込むことができる耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが必要とされている。
【００１２】
近年では、米国特許出願２００２／００１２９７０（本明細書で参照により組み込まれている）は、複合ＲＴ−ＰＣＲ反応のためにＲＴ活性を得るために、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼを修飾することを記載している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
（発明の概要）
本発明の目的は、逆転写酵素活性の増加を示すＤＮＡポリメラーゼ酵素を利用するキット、組成物および方法を提供することである。本発明の他の目的は、修飾された核酸を生成するためのキット、組成物および方法を提供することである。本発明の酵素は、核酸の検出可能な標識が求められる多くの用途で有用である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
第１の態様では、変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼおよび少なくとも１つのアミノアリル修飾ヌクレオチドを含む組成物が開示され、前記変異体は逆転写酵素活性の増加を示す。
【００１５】
一実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、領域ＩＩのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９と対応する位置にＬＹＰモチーフを有する野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００１６】
本組成物の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される野生型ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００１７】
本組成物の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む野生型ポリメラーゼの変異体である。
【００１８】
本組成物の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９からＰ４１１と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異を含む。
【００１９】
他の実施形態では、前記変異ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異を含む。
【００２０】
他の実施形態では、配列番号３のＬ４０９と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異は、ロイシンからフェニルアラニンへの変異、ロイシンからチロシンへの変異、ロイシンからヒスチジンへの変異またはロイシンからトリプトファンへの変異である。
【００２１】
本組成物の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下をさらに示す。
【００２２】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００２３】
他の実施形態では、前記変異体ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下および塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００２４】
他の実施形態では、本組成物は反応緩衝液、ｄＮＴＰおよび対照プライマーからなる群から選択される１つまたは複数の試薬をさらに含む。
【００２５】
他の実施形態では、本組成物のｄＮＴＰはさらなる特殊なヌクレオチドを含む。
【００２６】
他の実施形態では、前記特殊なヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、アミノアリル修飾ヌクレオチドおよびコンジュゲートしたヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２７】
他の実施形態では、前記コンジュゲートしたヌクレオチドは、放射性標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、化学発光標識ヌクレオチドおよび量子ドット標識ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００２８】
他の実施形態では、本組成物はホルムアミド、ＤＭＳＯ、ベタイン、トレハロース、低分子アミド、スルホン、ファミリーＢ補助因子、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼ、他の逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群から選択される１つまたは複数の試薬をさらに含む。
【００２９】
他の態様では、変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼ、少なくとも１つのアミノアリル修飾ヌクレオチド、およびそれらのための包装材を含むキットが開示される。前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素活性の増加を示す。
【００３０】
他の実施形態では、前記アミノアリル修飾ヌクレオチドは、アミノアリルｄＵＴＰ、アミノアリルＵＴＰまたはアミノアリルｄＣＴＰである。
【００３１】
本キットの一実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、領域ＩＩのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９と対応する位置にＬＹＰモチーフを有する野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００３２】
他の実施形態では、前記野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００３３】
本キットの他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される野生型ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００３４】
本組成物の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９からＰ４１１と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異を含む。
【００３５】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９と対応する位置のアミノ酸変異を含む。
【００３６】
他の実施形態では、配列番号３のＬ４０９と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異は、ロイシンからフェニルアラニンへの変異、ロイシンからチロシンへの変異、ロイシンからヒスチジンへの変異またはロイシンからトリプトファンへの変異である。
【００３７】
本キットの他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下をさらに示す。
【００３８】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００３９】
他の実施形態では、前記変異体ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下および塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００４０】
他の実施形態では、本キットは反応緩衝液、ｄＮＴＰおよび対照プライマーからなる群から選択される１つまたは複数の試薬をさらに含む。
【００４１】
本キットの他の実施形態では、ｄＮＴＰはさらなる特殊なヌクレオチドを含む。
【００４２】
他の実施形態では、前記特殊なヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、アミノアリル修飾ヌクレオチドおよびコンジュゲートしたヌクレオチドからなる群から選択される。
【００４３】
他の実施形態では、前記コンジュゲートしたヌクレオチドは、放射性標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、化学発光標識ヌクレオチドおよび量子ドット標識ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００４４】
他の実施形態では、本キットはホルムアミド、ＤＭＳＯ、ベタイン、トレハロース、低分子アミド、スルホン、ファミリーＢ副因子、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼ以外のＤＮＡポリメラーゼ、他の逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼおよびエキソヌクレアーゼからなる群から選択される１つまたは複数の試薬をさらに含む。
【００４５】
他の態様において、変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼおよびアミノアリル修飾ヌクレオチドを含む反応混合物中でＲＮＡ鋳型をインキュベートすることを含む、ＲＮＡ鋳型を逆転写する方法が開示される。前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素活性の増加を示す。
【００４６】
他の実施形態では、前記アミノアリル修飾ヌクレオチドは、アミノアリルｄＵＴＰ、アミノアリルＵＴＰまたはアミノアリルｄＣＴＰである。
【００４７】
一実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、領域ＩＩのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９と対応する位置にＬＹＰモチーフを有する野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００４８】
本方法の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される野生型ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００４９】
他の実施形態では、前記野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００５０】
本方法の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９からＰ４１１と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異を含む。
【００５１】
本方法の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９と対応する位置のアミノ酸変異を含む。
【００５２】
他の実施形態では、配列番号３のＬ４０９と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異は、ロイシンからフェニルアラニンへの変異、ロイシンからチロシンへの変異、ロイシンからヒスチジンへの変異またはロイシンからトリプトファンへの変異である。
【００５３】
本方法の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下をさらに示す。
【００５４】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００５５】
他の実施形態では、前記変異体ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下および塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００５６】
他の態様において、修飾されたＤＮＡ相補鎖を生成する方法が開示され、その方法では少なくとも１つの特殊なヌクレオチドを含む反応混合物中で、鋳型ＲＮＡ分子が逆転写酵素活性の増加を示す変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼと、この変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが相補的ＤＮＡ鎖を合成してこの鎖が前記特殊なヌクレオチドを前記合成された相補的ＤＮＡ鎖に組み込むことを可能にするのに十分な条件下でおよび十分な時間、合わせる。
【００５７】
一実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、領域ＩＩのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９と対応する位置にＬＹＰモチーフを有する野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００５８】
本方法の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される野生型ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００５９】
他の実施形態では、前記野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００６０】
本方法の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９からＰ４１１と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異を含む。
【００６１】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９と対応する位置のアミノ酸変異を含む。
【００６２】
他の実施形態では、配列番号３のＬ４０９と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異は、ロイシンからフェニルアラニンへの変異、ロイシンからチロシンへの変異、ロイシンからヒスチジンへの変異またはロイシンからトリプトファンへの変異である。
【００６３】
本方法の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下をさらに示す。
【００６４】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００６５】
他の実施形態では、前記変異体ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下および塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００６６】
他の実施形態では、前記特殊なヌクレオチドは、ジデオキシヌクレオチド、リボヌクレオチド、アミノアリル修飾ヌクレオチドおよびコンジュゲートしたヌクレオチドからなる群から選択される。
【００６７】
他の実施形態では、前記コンジュゲートしたヌクレオチドは、放射性標識ヌクレオチド、蛍光標識ヌクレオチド、ビオチン標識ヌクレオチド、化学発光標識ヌクレオチドおよび量子ドット標識ヌクレオチドからなる群から選択される。
【００６８】
他の実施形態では、修飾されたｃＤＮＡを生成する前記方法はカップリング段階をさらに含む。
【００６９】
他の実施形態では、前記カップリング段階は、前記修飾されたｃＤＮＡをＮＨＳエステルまたはＳＴＰエステルを含む蛍光色素と結合することを含む。
【００７０】
他の態様では、鋳型ＲＮＡ分子を、逆転写酵素活性の増加を示す変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼを含む第１の反応混合物中で第１のプライマー複合体とインキュベートすることを含むＲＮＡ分子を増幅するための方法が開示され、前記インキュベーションは相補的ＤＮＡ鋳型の合成を可能にし、前記プライマー複合体は標的配列に相補的なプライマーおよびプロモーター領域を含む。前記相補的ＤＮＡ鋳型および第２のプライマー複合体を、前記プロモーター領域を含む第２の相補的ＤＮＡの合成を可能にする第２の反応混合物中でインキュベートする。最終段階は、前記プライマー複合体のプロモーター領域から開始してＲＮＡのコピーを転写して、アンチセンスＲＮＡを生成することを含む。
【００７１】
一実施形態では、前記組換えファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、領域ＩＩのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９と対応する位置にＬＹＰモチーフを有する野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００７２】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される野生型ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００７３】
他の実施形態では、前記野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００７４】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９からＰ４１１と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異を含む。
【００７５】
他の実施形態では、前記ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９と対応する位置のアミノ酸変異を含む。
【００７６】
他の実施形態では、配列番号３のＬ４０９と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異は、ロイシンからフェニルアラニンへの変異、ロイシンからチロシンへの変異、ロイシンからヒスチジンへの変異またはロイシンからトリプトファンへの変異である。
【００７７】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下をさらに示す。
【００７８】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００７９】
他の実施形態では、前記変異体ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下および塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００８０】
本方法の他の実施形態では、前記第１および第２の反応混合物は、同じ反応管で行われる。
【００８１】
一実施形態では、前記第２の反応混合物は、第２のＤＮＡポリメラーゼまたは２つ以上の他のＤＮＡポリメラーゼの組合せを含む。
【００８２】
他の実施形態では、前記第２のＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼである。
【００８３】
他の実施形態では、前記第２のＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ Turbo ＤＮＡポリメラーゼKlenow（クレノウ）、大腸菌ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、Ｅｘｏ−Ｐｆｕ  Ｖ９３、Ｅｘｏ−Ｐｆｕまたはこれらの組合せを含む。
【００８４】
本方法の他の実施形態では、前記転写する段階は、特殊なヌクレオチドを前記アンチセンスＲＮＡに組み込む。
【００８５】
本方法の他の実施形態では、前記転写反応の後にカップリングする段階が続く。
【００８６】
他の実施形態では、前記カップリングする段階は、前記修飾されたＲＮＡをＮＨＳエステルまたはＳＴＰエステルの脱離基を含む蛍光色素と結合することを含む。
【００８７】
本発明の最後の態様では、鋳型ＲＮＡ分子を、逆転写酵素活性の増加を示す変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼを含む第１の反応混合物中で第１のプライマー複合体とインキュベートすることを含むＲＮＡ分子を増幅するための方法が開示され、前記インキュベーションは相補的ＤＮＡ鋳型の合成を可能にする。前記相補的ＤＮＡ鋳型、および前記鋳型と相補的なプライマーおよびプロモーター領域を含む第２のプライマー複合体を、前記プロモーター領域を含む第２の相補的ＤＮＡの合成を可能にする第２の反応混合物中でインキュベートする。最終段階では、前記第２のプライマー複合体のプロモーター領域から開始してＲＮＡのコピーを転写して、合成されたＲＮＡを生成する。
【００８８】
本発明の一実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、領域ＩＩのＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９と対応する位置にＬＹＰモチーフを有する野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。本発明の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼおよびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼからなる群から選択される野生型ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００８９】
本発明の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１および２３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの変異体である。
【００９０】
本発明の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９からＰ４１１と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異を含む。
【００９１】
本発明の他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９と対応する位置のアミノ酸変異を含む。
【００９２】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下をさらに示す。
【００９３】
他の実施形態では、前記変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００９４】
他の実施形態では、前記変異体ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の低下および塩基類似体検出活性の減少をさらに示す。
【００９５】
本発明の他の実施形態では、配列番号３のＬ４０９と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異は、ロイシンからフェニルアラニンへの変異、ロイシンからチロシンへの変異、ロイシンからヒスチジンへの変異またはロイシンからトリプトファンへの変異である。
【００９６】
本発明の他の実施形態では、前記第１および第２の反応混合物は、同じ反応管で行われる。
【００９７】
本発明の他の実施形態では、前記第２の反応混合物は、第２のＤＮＡポリメラーゼまたは２つ以上の他のＤＮＡポリメラーゼの組合せを含む。
【００９８】
本発明の他の実施形態では、前記第２のＤＮＡポリメラーゼは、野生型ＤＮＡポリメラーゼである。
【００９９】
本発明の他の実施形態では、前記第２のＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ Turbo ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ、大腸菌ＤＮＡ  ｐｏｌ  Ｉ、Ｅｘｏ−Ｐｆｕ  Ｖ９３、およびＥｘｏ−Ｐｆｕを含む。
【０１００】
本発明の他の実施形態では、前記第１のプライマー複合体および前記第２のプライマー複合体は同じである。
【０１０１】
本発明の他の実施形態では、前記プライマー複合体は標的配列に相補的なプライマーおよびプロモーター領域を含む。
【０１０２】
本方法の他の実施形態では、前記転写段階は、特殊なヌクレオチドを前記合成されたＲＮＡに組み込む。
【０１０３】
本方法の他の実施形態では、前記転写反応の後にカップリング段階が続く。
【０１０４】
最後の実施形態では、前記カップリング段階は、前記合成されたＲＮＡをＮＨＳエステルまたはＳＴＰエステルの脱離基を含む蛍光色素と結合することを含む。
【０１０５】
最後の実施形態では、前記第１または第２のプライマー複合体は、特殊なヌクレオチドを含む。
【０１０６】
（詳細な説明）
定義
本明細書で使用する「ポリヌクレオチドポリメラーゼ」は、例えば、リボヌクレオシド三リン酸またはデオキシヌクレオシド三リン酸からポリヌクレオチド鎖を合成するために、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を指す。通常、この酵素はポリヌクレオチド鋳型配列にアニールされたプライマーの３’末端で合成を開始して、その鋳型鎖の５’末端の方へ進む。「ＤＮＡポリメラーゼ」はデオキシヌクレオチドの重合を触媒してＤＮＡを合成し、「ＲＮＡポリメラーゼ」はリボヌクレオチドの重合を触媒してＲＮＡを合成する。
【０１０７】
用語「ＤＮＡポリメラーゼ」は、デオキシヌクレオシド三リン酸の鋳型依存的な組込みによって新しいＤＮＡ鎖を合成する、ＤＮＡポリメラーゼを指す。ＤＮＡポリメラーゼ活性の測定は、当技術分野で公知のアッセイ、例えば既報の方法（Hogrefe，Ｈ．Ｈ．ら（０１）Methods in Enzymology, ３４３：９１−１１６）で記載されているものによって実施することができる。「ＤＮＡポリメラーゼ」は、ＤＮＡ依存性（すなわち、ＤＮＡ鋳型を用いる）またはＲＮＡ依存性（すなわち、ＲＮＡ鋳型を用いる）でよい。
【０１０８】
本明細書で使用する用語「鋳型依存的方法」は、プライマー分子の鋳型依存的伸長を含む方法を指す（例えばＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成）。用語「鋳型依存的方法」はＲＮＡまたはＤＮＡのポリヌクレオチド合成を指し、新しく合成されたポリヌクレオチド鎖の配列は相補的な塩基対形成の公知の法則によって決定される（Watson,J.D.ら、遺伝子の分子生物学（Molecular Biology of the Gene）第４版、W. A. Benjamin, Inc., Menlo Park、カリフォルニア州(1987年)を参照）。
【０１０９】
本明細書で使用する「耐熱性」は高温において活性であり、約９３℃から約９７℃の範囲のＤＮＡ二重螺旋変性温度に耐性である酵素の特性を指す。「活性」は、二本鎖核酸の変性を起こすのに必要な時間、高い温度または変性温度にさらしてもプライマー伸長反応を起こす能力を酵素が保持することを意味する。高温は本明細書で使用するように約７０℃から約７５℃の範囲を指し、非高温は本明細書で使用するように約３５℃から約５０℃の範囲を指す。
【０１１０】
本明細書で使用する「古細菌の」は、Archaea（古細菌）界の生物、例えばArchaebacteriaからの生物またはＤＮＡポリメラーゼを指す。「古細菌ＤＮＡポリメラーゼ」は、例えば表ＩＶで記載されているArchaeabacteriaから単離された任意の同定されたまたは未同定の「古細菌ＤＮＡポリメラーゼ」を指し、その例は表ＩＩのサブヘッディング古細菌ＤＮＡポリメラーゼにおいて、および表ＩＩＩで記載されている。
【０１１１】
本明細書で使用する「ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼ」は、ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼのメンバーとして分類される任意のＤＮＡポリメラーゼを指し、ここで、ファミリーＢの分類は大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩとの構造類似性に基づく。古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼのメンバーである。以前はα−ファミリーポリメラーゼとして知られるファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼとしては、それらに限定されないが、表Ｉ〜ＩＩＩで掲載するものなどがある。
【０１１２】
本明細書で使用する用語「逆転写酵素（ＲＴ）」は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼとして特徴づけられるポリメラーゼのクラスを表す。ＲＴは、ＨＩＶ、ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、ＦｅＬＶ、ＦＩＶ、ＳＩＶ、ＡＭＶ、ＭＭＴＶおよびＭｏＭｕＬＶを含むすべてのレトロウイルスのための、ウイルスＲＮＡからのｃＤＮＡの合成を担う重要な酵素である。総説については、例えばLevin、1997年、Cell、８８：５−８；Brosiusら、1995年、Virus Genes １１：１６３−７９を参照のこと。ウイルス由来の公知の逆転写酵素は、ＲＮＡ鋳型からＤＮＡ転写産物を合成するためにプライマーを必要とする。逆転写酵素は主にＲＮＡをｃＤＮＡに転写し、それを次にさらなる操作のためにベクターにクローニングするか、または様々な増幅方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）もしくは自立式配列複製（３ＳＲ）で用いるために利用されてきた。
【０１１３】
本明細書で使用する用語「逆転写活性」および「逆転写酵素活性」は互換的に用いられ、ＲＮＡ鎖を鋳型として利用してＤＮＡ鎖（すなわちｃＤＮＡ）を合成する酵素（例えば逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼ）の能力を指す。ＲＴ活性の測定方法は、本明細書の下記実施例で提供されているが、当技術分野でも公知である。例えば、Quan−Ｔ−ＲＴアッセイ系はAmersham（Arlington Heights, Ill）から市販され、Bosworthら、Nature 1989年、３４１：１６７−１６８で記載されている。
【０１１４】
本明細書で使用する用語「逆転写酵素活性の増加」は、野生型の形と比較した突然変異酵素（例えばＤＮＡポリメラーゼ）の逆転写酵素活性レベルを指す。ある突然変異酵素の逆転写酵素活性レベル（本明細書で記載されているか当技術分野で公知の方法で測定される）がその野生型の形より少なくとも２０％以上、例えば少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％高い場合、または少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍もしくは１０倍以上高い場合は、それは「逆転写酵素活性の増加」を有すると言われる。
【０１１５】
本明細書で使用する「特殊なヌクレオチド」は、ａ）ＤＮＡポリメラーゼによって認識されて組み込まれる通常の４つのデオキシヌクレオチドｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの１つでないヌクレオチド構造、ｂ）ａ）の通常の４つのデオキシヌクレオチドの１つでない合成ヌクレオチド、ｃ）修飾された通常のヌクレオチド、またはｄ）リボヌクレオチド（それらは通常ＤＮＡポリメラーゼによって認識されず、また組み込まれないので）およびリボヌクレオチドの修飾形を指す。好ましくは、「特殊なヌクレオチド」はアミノアリル修飾のヌクレオチド、例えばアミノアリルｄＵＴＰ、アミノアリルＵＴＰおよびアミノアリルｄＣＴＰである。
【０１１６】
特殊なヌクレオチドとしては、それらには限定されないが表Ｖに記載のものがあり、それらは例えばNew England NuclearおよびSigma-Aldrichから市販されている。上記の特殊なヌクレオチドのいずれか１つは「コンジュゲートしたヌクレオチド」でよく、それは本明細書で使用するように、それらには限定されないが蛍光標識、同位体、化学発光標識、量子ドット標識、抗原または親和性基を含む検出可能な標識を有するヌクレオチドを指す。
【０１１７】
本明細書で使用する「アミノアリル修飾ヌクレオチド」は、修飾されてヌクレオチドの５’末端に１級アミンを含み、好ましくは核酸ポリマーの１級アミンおよび核酸部分の間に置かれた１つまたは複数のメチレン基を有するヌクレオチドを指す。メチレン基の数は６が好ましい。アミノアリル修飾ヌクレオチドは、本明細書で開示されているポリメラーゼによって、核酸に導入することができる。「アミノアリル修飾ヌクレオチド」としては、アミノアリルｄＵＴＰ、アミノアリルＵＴＰおよびアミノアリルｄＣＴＰがある。
【０１１８】
本明細書で使用する「検出可能に標識された」は、様々な手段で容易に検出することができる官能基（標識）を組み込む構造修飾を指す。検出可能に標識することができる化合物としては、それには限定されないがヌクレオチド類似体がある。検出可能なヌクレオチド類似体標識としては、それらには限定されないが、Ｃｙ５、Ｃｙ３などの蛍光化合物、同位体化合物、化学発光化合物、量子ドット標識、ビオチン、酵素、高電子密度試薬およびそのために抗血清またはモノクローナル抗体が利用できるハプテンまたはタンパク質がある。前記様々な検出手段としては、それらには限定されないが、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的または化学的手段がある。
【０１１９】
本明細書で使用する「修飾された核酸」はポリヌクレオチドポリメラーゼ、例えば本発明のＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素またはＤＮＡポリメラーゼによって生成される核酸を指し、前記「修飾された核酸」は少なくとも１つの特殊なヌクレオチドを含む。
【０１２０】
本明細書で使用する「エキソヌクレアーゼ」はＤＮＡ分子の末端から１つずつ、ヌクレオチド間の結合、好ましくはホスホジエステル結合を切断する酵素を指す。エキソヌクレアーゼはＤＮＡ分子の５’または３’末端に特異的であることができ、本明細書では５’−３’エキソヌクレアーゼまたは３’−５’エキソヌクレアーゼと称す。３’−５’エキソヌクレアーゼは、連続したヌクレオチドをポリヌクレオチドの３’末端から切断することによってＤＮＡを分解し、５’−３’エキソヌクレアーゼは、連続したヌクレオチドをポリヌクレオチドの５’末端から切断することによってＤＮＡを分解する。ポリヌクレオチド鋳型の合成または増幅の間、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性（３’−５’ｅｘｏ＋）を有するＤＮＡポリメラーゼは不正対合塩基を除去する能力（校正活性）を有するので、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性のない（３’−５’ｅｘｏ−）ＤＮＡポリメラーゼよりもエラーを起こす傾向が低い（すなわち、忠実度が高い）。エキソヌクレアーゼ活性は当業界公知の方法によって測定することができる。例えば、１単位のエキソヌクレアーゼ活性は、３７℃で１時間内に１μｇのＤＮＡ標的を切断するために必要な酵素の量と称することができる。
【０１２１】
用語「５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない」は、酵素が野生型酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の約５％未満、好ましくは野生型酵素の５’−３’エキソヌクレアーゼ活性の約３％未満を有し、最も好ましくは検出可能な５’−３’エキソヌクレアーゼ活性をまったく有しないことを示す。用語「３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を実質的に有しない」は、酵素が野生型酵素の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の約５％未満、好ましくは野生型酵素の３’−５’エキソヌクレアーゼ活性の約３％未満を有し、最も好ましくは検出可能な３’−５’エキソヌクレアーゼ活性をまったく有しないことを示す。
【０１２２】
本明細書で使用する用語「忠実度」は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ重合の正確度を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度は、誤り率（不正確なヌクレオチド、すなわち鋳型依存的方法に組み込まれていないヌクレオチドを組み込む頻度）で測定される。ＤＮＡ重合の正確度または忠実度は、ＤＮＡポリメラーゼのポリメラーゼ活性および３’−５’エキソヌクレアーゼ活性によって維持される。用語「高忠実度」は、１塩基対につき５×１０−６以下の誤り率を指す。ＤＮＡポリメラーゼの忠実度または誤り率は、当技術分野で公知のアッセイを用いて測定することができる（例えば、Lundburgら、1991年 Gene, １０８：１−６を参照）。
【０１２３】
本明細書で使用する「塩基類似体検出の減少」は、ＤＮＡ鋳型に存在する塩基類似体、例えばウラシルまたはイノシンを認識する能力の低下したＤＮＡポリメラーゼを指す。これとの関係で、塩基類似体検出活性の「低下」した突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、野生型酵素のそれよりも低い塩基類似体検出活性、すなわち野生型酵素の塩基類似体検出活性の１０％未満（例えば、８％、６％、４％、２％未満または１％未満）を有するＤＮＡポリメラーゼ変異体である。塩基類似体検出活性は、本明細書で参照により組み込まれているGreaggら、（1999年）Proc.Natl.Acad.Sci. ９６、９０４５−９０５０および係属中の米国特許出願１０／４０８６０１（Hogrefeら、2003年４月７日出願）の実施例３で記載されているように、ウラシル検出が低下したＤＮＡポリメラーゼの検出のために記載されているものと類似したアッセイに従って測定することができる。あるいは、「低下した」塩基類似体検出は、塩基類似体を認識する能力が低下した突然変異ＤＮＡポリメラーゼを指し、塩基類似体の「低下した」認識は、塩基類似体検出活性の低下していない野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して少なくとも１０％、好ましくは５０％、より好ましくは９０％、最も好ましくは９９％以上の＞１０ＫｂのＰＣＲ量の増加から明らかである。＞１０ＫｂのＰＣＲ生成物の量は、ゲル溶出した＞１０ＫｂのＰＣＲ  ＤＮＡ生成物の分光光度−吸光度アッセイによって、または例えばMolecular Dynamics（ＭＤ）FluorImager（商標）（Amersham Biosciences、カタログ番号６３−０００７−７９）を用いた臭化エチジウム染色アガロース電気泳動ゲルでの＞１０ＫｂのＰＣＲ生成物の蛍光分析によって測定される。塩基類似体検出活性の低下したＤＮＡポリメラーゼは、本明細書で参照により完全に組み込まれているＵＳＳＮ１０／４０８６０１で教示されている。
【０１２４】
本明細書で使用する「塩基類似体」はＰＣＲ反応に必要な温度上昇の結果として化学修飾を受けた塩基を指す。好ましい一実施形態では、「塩基類似体」はシトシンの脱アミノによって生成されたウラシルを指す。他の好ましい実施形態では、「塩基類似体」はアデニンの脱アミノによって生成されたイノシンを指す。
【０１２５】
本明細書で使用する「増幅生成物」は増幅反応の終わりの一本鎖または二本鎖のポリヌクレオチド集団を指す。増幅生成物は、元のポリヌクレオチド鋳型および増幅反応の間にこのポリヌクレオチド鋳型を用いてＤＮＡポリメラーゼによって合成されたポリヌクレオチドを含む。
【０１２６】
本明細書で使用する「ポリヌクレオチド鋳型」または「標的ポリヌクレオチド鋳型」は、ＤＮＡポリメラーゼが鋳型依存的方法においてＤＮＡを合成するための鋳型の役目を果たすポリヌクレオチド（ＲＮＡまたはＤＮＡ）を指す。「増幅領域」は、本明細書で使用するように、逆転写によって合成されるか、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅されるポリヌクレオチドの領域である。例えば、ポリヌクレオチド鋳型の増幅領域は、それに対して２つのＰＣＲプライマーが相補的である２つの配列の間に存在してもよい。
【０１２７】
本明細書で使用する「プライマー」は鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡと実質的に相補的（すなわち、１０中少なくとも７つ、好ましくは１０中９つ、より好ましくは１０塩基中９つは完全に相補的である）で、相補的な鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡとアニールしてプライマーおよび鋳型の間で二重鎖を形成することができる天然のまたは合成されたオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは、ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖とのアニーリングに続く、ポリメラーゼによる核酸合成の開始点の役目を果たすことができる。プライマーは、一般的に一本鎖オリゴデオキシリボ核酸である。プライマーの適当な長さはプライマーの使用目的によって決まり、一般的に約１０から約６０ヌクレオチドの範囲、好ましくは１５から４０ヌクレオチド長である。プライマーは、１つまたは複数の特殊なヌクレオチドを含むことができる。本明細書で使用する用語「プライマー複合体」は、プライマーおよびＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域を有するオリゴヌクレオチドを指す。プライマー成分は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される当技術分野で公知の条件下に置かれるとき、すなわち、適当な条件下の適当なヌクレオチドおよび複製因子（例えば本発明のＤＮＡポリメラーゼ）の存在下で、一般的にはＤＮＡ複製を指す合成の開始点の働きをすることができる。ＲＮＡポリメラーゼプロモーター領域は、核酸鎖に相補的であるプライマー伸長生成物の合成が誘導される当技術分野で公知の条件下に置かれるとき、すなわち、適当な条件下の適当なヌクレオチドおよび複製因子（例えばＲＮＡポリメラーゼ）の存在下で、ＲＮＡ合成の開始点の働きをすることができる。
【０１２８】
「相補的な」は、２つのポリヌクレオチド鎖の領域間、または２つのヌクレオチド間の塩基対合を介した配列相補性の広い概念を指す。アデニンヌクレオチドは、チミンまたはウラシルであるヌクレオチドと特異的な水素結合を形成すること（「塩基対形成」）ができることが知られている。同様に、シトシンヌクレオチドはグアニンヌクレオチドと塩基対形成ができることが知られている。
【０１２９】
本明細書で使用する用語「相同性」は、コンピュータによるアルゴリズムの実行によって行うことができる、配列（ヌクレオチドまたはアミノ酸）の最適なアラインメントを指す。「相同性」は、例えばポリヌクレオチドに関して、デフォルトのパラメータを用いてBLASTNバージョン２．０による分析で測定することができる。「相同性」は、ポリペプチド（すなわちアミノ酸）に関して、比較するポリペプチドまたは断片を整列させてそれらの間のアミノ酸同一性または類似性の程度を測定するBLASTPバージョン２．２．２などのプログラムを使用して、デフォルトのパラメータを用いて測定することができる。アミノ酸「相同性」は保存的置換、すなわちポリペプチド内の所定のアミノ酸を類似した特性を有する他のアミノ酸によって置換するものを含むことは理解されよう。以下の置換は、保存的置換と一般的にみなされる：脂肪族アミノ酸、例えばＡｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの他の脂肪族アミノ酸による置換、ＳｅｒのＴｈｒによる置換、またはその逆も同様、酸性残基、例えばＡｓｐまたはＧｌｕの他の酸性残基による置換、アミド基を有する残基、例えばＡｓｎまたはＧｌｎの他のアミド基を有する残基による置換、塩基性残基、例えばＬｙｓまたはＡｒｇの他の塩基性残基による置換、ならびに、芳香族残基、例えばＰｈｅまたはＴｙｒの他の芳香族残基による置換。
【０１３０】
アミノ酸変異の位置に関して本明細書で使用する用語「対応する」は、第１のポリペプチドおよび参照ポリペプチド配列を整列させたときに、参照ポリペプチド配列内の所定のアミノ酸と整列する第１のポリペプチド配列内のアミノ酸を指す。アラインメントは、この目的のために設計されたソフトウェア、例えばBLASTPバージョン２．２．２を用い、そのバージョンのデフォルトのパラメータを用いて当業者によって実施される。「対応」するアミノ酸の例として、配列番号１のＪＤＦ−３  ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０８は、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９と「対応」し、またその逆も同様であり、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９はMethanococcus voltaeのＤＮＡポリメラーゼのＬ４５４と「対応」し、またその逆も同様である。
【０１３１】
用語「野生型」は、天然の供与源から単離されたとき、その遺伝子または遺伝子産物の特性を有する遺伝子または遺伝子産物を指す。対照的に、用語「修飾」または「突然変異」は、野生型の遺伝子または遺伝子産物と比較して、変化したヌクレオチドまたはアミノ酸の配列（すなわち、変異）を示す遺伝子または遺伝子産物を指す。例えば、本発明の突然変異酵素は、野生型と比較して増加した逆転写酵素活性を示す突然変異ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１３２】
本明細書で使用する用語「変異」は、野生型と比較して遺伝子または遺伝子産物中のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列の変化、あるいは遺伝子外の調節配列の変化を指す。変化は、欠失、置換、点突然変異、複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の変異、転座、逆位、フレームシフト、ナンセンス変異、またはポリヌクレオチドまたはタンパク質の配列を遺伝子または遺伝子産物の野生型配列のそれと差別化する他の形態の逸脱でよい。
【０１３３】
本明細書で使用する用語「ポリヌクレオチド結合タンパク質」は、ポリヌクレオチドと結合することができるタンパク質を指す。本発明による有用なポリヌクレオチド結合タンパク質としては、それらに限定されるものではないが、Ｎｃｐ７、ｒｅｃＡ、ＳＳＢ、Ｔ４ｇｐ３２、ファミリーＢ配列非特異性二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Ｓｓｏ７ｄ、Ｓａｃ７ｄ、ＰＣＮＡ（本明細書で参照により組み込まれている国際公開ＷＯ０１／９２５０１）およびヘリックス−ヘアピン−ヘリックスドメインがある。
【０１３４】
本明細書で使用する用語「ファミリーＢ副因子」は、ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素またはポリメラーゼの活性を強化するポリペプチド因子を指す。副因子は、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度および／または進化性またはその酵素の逆転写酵素活性を強化することができる。古細菌の副因子のそれには限定されない例は、本明細書で参照により組み込まれている国際公開ＷＯ０１／０９３４７および米国特許第６，３３３，１５８号で提供されている。
【０１３５】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、外来性または内因性のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するために用いられるポリヌクレオチドを指す。ベクターは、１つまたは複数のポリペプチド分子をコードすることができるヌクレオチド配列を含む。天然状態のまたは組み換えられたプラスミド、コスミド、ウイルスおよびバクテリオファージは、少なくとも１つの所望の単離されたポリヌクレオチド分子を含む組換えベクターを提供するために一般的に用いられるベクターの、それには限定されない例である。
【０１３６】
本明細書で用いる用語「形質転換」または用語「トランスフェクション」は、外来性のポリヌクレオチド（例えばＤＮＡ）を細胞に導入するための、当技術分野で認められた様々な技術を指す。ある細胞が「形質転換」または「トランスフェクション」されるのは、外来性ＤＮＡが細胞膜内に導入されたときである。用語「形質転換」および「トランスフェクション」およびそれぞれから由来する用語は、互換的に用いられる。
【０１３７】
本明細書で使用する「発現ベクター」は、細胞によって転写および翻訳されることができるポリペプチド（すなわちタンパク質）をコードするポリヌクレオチドを有する、組換え発現カセットを指す。発現ベクターは、プラスミド、ウイルスまたはポリヌクレオチド断片でよい。
【０１３８】
本明細書で使用するように、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドに関して用いられるとき、「単離された」または「精製された」は、天然のヌクレオチドまたはアミノ酸の配列がその通常の細胞環境から取り出されたか、非天然環境で合成される（例えば、人工的に合成される）ことを意味する。このように、「単離された」または「精製された」配列は、無細胞溶液中にあってもよいし、異なる細胞環境に置くこともできる。用語「精製された」は、そのヌクレオチドまたはアミノ酸の配列が存在する唯一のポリヌクレオチドまたはポリペプチドであることを意味せず、それと自然に結合している非ポリヌクレオチドまたはポリペプチド物質をそれが基本的に含まないことを意味する（約９０〜９５％、最大で９９〜１００％の純度）。
【０１３９】
本明細書で使用する用語「コーディング」は、ポリヌクレオチド、例えば染色体内の遺伝子またはｍＲＮＡの、定義されたヌクレオチド（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、他のＲＮＡ分子）またはアミノ酸の配列を有する生物過程内の他のポリマーおよび大分子の合成のための鋳型の役目を果たす特異的なヌクレオチド配列の固有の特性、ならびにそこから生じる生物的特性を指す。このように、遺伝子が生成するｍＲＮＡの転写および翻訳が細胞内または他の生物系でタンパク質を生成するならば、その遺伝子はそのタンパク質をコードするという。転写のための鋳型として用いられ、そのヌクレオチド配列はｍＲＮＡ配列と同一で、通常配列リストで提供される遺伝子またはｃＤＮＡのコード鎖および非コード鎖の両方は、その遺伝子もしくはｃＤＮＡのタンパク質または他の生成物をコードすると称することができる。タンパク質をコードするポリヌクレオチドには、異なるヌクレオチド配列を有するが、遺伝子コードの変性のためにタンパク質の同じアミノ酸配列をコードするいかなるポリヌクレオチドも含まれる。
【０１４０】
本明細書で特定されるアミノ酸残基は、天然のＬ型の立体配置のものが好ましい。標準のポリペプチド命名法、J.Biol.Chem., ２４３：３５５７−３５５９、1969年に合わせて、アミノ酸残基の略記号は以下の表Ｉに示す通りである。
【表１】
2008501338.tif 000003
【０１４１】
本発明は、１つまたは複数の変異を有し、それらの修飾されていない野生型と比較して逆転写酵素活性が増加した耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、例えばファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの発見に関するものである。本明細書で記載した参考文献のすべては、その全体において本明細書で参照により組み込まれている。
【０１４２】
耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ
トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）逆転写酵素およびモロニーマウス白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）逆転写酵素などの一般的に用いられる逆転写酵素による多くのＲＮＡ鋳型からの逆転写は、ＲＮＡ鋳型の二次構造によってしばしば制限される。ＲＮＡの二次構造は、与えられたＲＮＡ分子内の相補的な領域の間のハイブリダイゼーションから生じる。ポリメラーゼは二次構造を通して処理することができないので、二次構造はｃＤＮＡ合成の低下およびｃＤＮＡ生成物の早過ぎる終結を引き起こす。したがって、二次構造を有するＲＮＡはｃＤＮＡライブラリーで十分に提示されず、ＲＴ−ＰＣＲによる試料中の二次構造を有するＲＮＡの存在の検出は困難となる可能性がある。さらに、ＲＮＡの二次構造は、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲのような手法において、矛盾した結果をもたらす可能性がある。したがって、二次構造を除去するか制限するように、高い温度で逆転写反応を行うことが有利である。
【０１４３】
いくつかの耐熱性真正細菌のＤＮＡポリメラーゼ（例えばT. thermophilus ＤＮＡポリメラーゼ、T. aquaticus ＤＮＡポリメラーゼ（例えば米国特許第５，３２２，７７０号）、A. thermophilum ＤＮＡポリメラーゼ（例えば国際公開ＷＯ９８／１４５８８）、T. vulgaris ＤＮＡポリメラーゼ（例えば米国特許第６，４３６，６７７号）、B. caldotenax ＤＮＡポリメラーゼ（例えば米国特許第５，４３６，１４９号）、およびＣ．ＴＨＥＲＭ（Boehringer Mannheim）として市販されているポリメラーゼ混合物が、逆転写酵素活性を有することが証明された。これらの酵素はレトロウイルス逆転写酵素よりも高い温度で用いることができ、そのためＲＮＡ分子の二次構造の多くが除去される。
【０１４４】
本発明は、逆転写酵素活性の増加した耐熱性のファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼを提供する。本発明のために有用な野生型の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、本来の逆転写酵素活性を所有してもしなくてもよい。本発明による有用な野生型耐熱性ＤＮＡポリメラーゼには、それらには限定されないが、表ＩＩ〜ＩＶにあげたポリメラーゼが含まれる。
【０１４５】
一実施形態では、野生型ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは逆転写酵素活性の増加した耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを生成するために用いられる。
【０１４６】
耐熱性古細菌のファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、一般的に古細菌（Archeobacteria）から単離される。本発明で有用な古細菌のファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼを得ることができる古細菌の生物種を表ＩＶに示すが、それらの種に限定されるものではない。古細菌は、１００℃前後で最適に成長する一群の「超好熱菌」を含む。これらの生物は９０℃よりも高い温度で成長し、それらの酵素は好熱性真正細菌ＤＮＡポリメラーゼよりも高い耐熱性を示す（Mathurら、1992年、Stratagies ５：１１）。それらは、現在３つの異なる属、Pyrodictium、PyrococcusおよびPyrobaculumによって代表される。Pyrodictium brockii（Ｔｏｐｔ  １０５℃）は、Ｈ２によるＳ０からＨ２Ｓへの還元を行いながらエネルギーを得る絶対独立栄養生物であるが、Pryobaculum islandicum（Ｔｏｐｔ  １００℃）は、Ｓ０を還元するために有機基質またはＨ２を用いる条件的従属栄養生物である。対照的に、Pyrococcus furiosus（Ｔｏｐｔ  １００℃）は、Ｓ０呼吸ではなく発酵型代謝によって成長する。この微生物は単糖類および複合多糖を利用する厳密な従属栄養生物であり、Ｈ２およびＣＯ２だけが検出可能な生成物である。Ｈ２は増殖を抑制することから、この生物は見かけ上解毒の形で硫黄元素をＨ２Ｓに還元する。
【０１４７】
本発明によるファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの生成のための出発配列は、プラスミドベクターに含ませることができる。クローニングされたファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの非限定的リストおよびそれらのGenbank受託番号を表ＩＩＩに掲載する。
【０１４８】
表ＩＩ．ＤＮＡポリメラーゼファミリー
ファミリーＡ  ＤＮＡポリメラーゼ
細菌のＤＮＡポリメラーゼ                                            参考文献
ａ）大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ                                      （１）
ｂ）肺炎連鎖球菌ＤＮＡポリメラーゼＩ                                （２）
ｃ）Thermus aquaticus ＤＮＡポリメラーゼＩ                          （３）
ｄ）Thermus flavus  ＤＮＡポリメラーゼＩ                            （４）
ｅ）Thermotoga maritima ＤＮＡポリメラーゼＩ
バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ
ａ）Ｔ５  ＤＮＡポリメラーゼ                                        （５）
ｂ）Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ                                        （６）
ｃ）Ｓｐｏ１  ＤＮＡポリメラーゼ                                    （７）
ｄ）Ｓｐｏ２  ＤＮＡポリメラーゼ                                    （８）
ミトコンドリアのＤＮＡポリメラーゼ
酵母ミトコンドリアのＤＮＡポリメラーゼＩＩ                  （９、１０、１１）
ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼ
細菌のＤＮＡポリメラーゼ
大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩＩ                                        （１５）
バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼ
ａ）ＰＲＤ１  ＤＮＡポリメラーゼ                                （１６、１７）
ｂ）φ２９  ＤＮＡポリメラーゼ                                      （１８）
ｃ）Ｍ２  ＤＮＡポリメラーゼ                                        （１９）
ｄ）Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼ                                        （２０）
古細菌のＤＮＡポリメラーゼ
ａ）Thermococcus litoralis ＤＮＡポリメラーゼ（Ｖｅｎｔ）
（２１、８７、８８、８９）
ｂ）Pyrococcus属種ＤＮＡポリメラーゼ（Pyrococcus属種ＧＢ−ＤからのＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔ）                                                            （９０）
ｃ）Pyrococcus furiosus ＤＮＡポリメラーゼ
（２２、９１、９２、９３、９４）
ｄ）Sulfolobus solfataricus ＤＮＡポリメラーゼ
（２３）
ｅ）Thermococcus gorgonarius ＤＮＡポリメラーゼ
（６４）
ｆ）Thermococcus属種ＴＹ                            （６５）
ｇ）Thermococcus属種系統ＫＯＤＩ（以前はPyrococcusとして分類された）
（６６、９５）
ｈ）ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ                                  （９６）
ｉ）Sulfolobus acidocaldarius
（６７、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３）
ｊ）Thermococcus属種９０Ｎ−７                                      （６８）
ｋ）Pyrodictium occultum                                            （６９）
ｌ）Methanococcus voltae                                            （７０）
ｍ）Desulfurococcus系統ＴＯＫ（Ｄ．Ｔｏｋ  Ｐｏｌ）                  （７１）
真核細胞ＤＮＡポリメラーゼ
（１）ＤＮＡポリメラーゼα
ａ）ヒトＤＮＡポリメラーゼ（α）                                  （２４）
ｂ）S. cerevisiae ＤＮＡポリメラーゼ（α）                          （２５）
ｃ）S. pombe ＤＮＡポリメラーゼＩ（α）                            （２６）
ｄ）Drosophila melanogaster ＤＮＡポリメラーゼ（α）              （２７）
ｅ）Trypanosoma brucei ＤＮＡポリメラーゼ（α）                  （２８）
（２）ＤＮＡポリメラーゼδ
ａ）ヒトＤＮＡポリメラーゼ（δ）                              （２９、３０）
ｂ）ウシのＤＮＡポリメラーゼ（δ）                                （３１）
ｃ）S. cerevisiae ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（δ）                  （３２）
ｄ）S. pombe ＤＮＡポリメラーゼＩＩＩ（δ）                      （３３）
ｅ）Plasmodiun falciparum ＤＮＡポリメラーゼ（δ）                （３４）
（３）ＤＮＡポリメラーゼε S. cerevisiae ＤＮＡポリメラーゼＩＩ（ε）（３５）
（４）他の真核生物ＤＮＡポリメラーゼ
S. cerevisiae ＤＮＡポリメラーゼＲｅｖ３                            （３６）
ウイルスのＤＮＡポリメラーゼ
ａ）単純疱疹ウイルス１型  ＤＮＡポリメラーゼ                        （３７）
ｂ）馬のヘルペスウイルス１型  ＤＮＡポリメラーゼ                    （３８）
ｃ）水痘−帯状疱疹ウイルスＤＮＡポリメラーゼ                        （３９）
ｄ）ＥＢウイルスＤＮＡポリメラーゼ                                  （４０）
ｅ）ヘルペスウイルスサイミリＤＮＡポリメラーゼ                      （４１）
ｆ）ヒトサイトメガロウイルスＤＮＡポリメラーゼ                      （４２）
ｇ）マウスサイトメガロウイルスＤＮＡポリメラーゼ                    （４３）
ｈ）ヒトヘルペスウイルス６型  ＤＮＡポリメラーゼ                    （４４）
ｉ）ブチナマズウイルスＤＮＡポリメラーゼ                            （４５）
ｊ）クロレラウイルスＤＮＡポリメラーゼ                              （４６）
ｋ）鶏痘ウイルスＤＮＡポリメラーゼ                                  （４７）
ｌ）ワクシニアウイルスＤＮＡポリメラーゼ                            （４８）
ｍ）Choristoneura biennis ＤＮＡポリメラーゼ                        （４９）
ｎ）オートグラファカリフォルニアニュークレアポリメラーゼウイルス（ＡｃＭＮＰＶ）ＤＮＡポリメラーゼ                                                  （５０）
ｏ）マイマイガ核多角体病ウイルスＤＮＡポリメラーゼ                  （５１）
ｐ）アデノウイルス−２  ＤＮＡポリメラーゼ                          （５２）
ｑ）アデノウイルス−７  ＤＮＡポリメラーゼ                          （５３）
ｒ）アデノウイルス−１２  ＤＮＡポリメラーゼ                        （５４）
真核生物の線状ＤＮＡプラスミドをコードしたＤＮＡポリメラーゼ
ａ）Ｓ−１トウモロコシＤＮＡポリメラーゼ                            （５５）
ｂ）kalilo neurospora intermedia ＤＮＡポリメラーゼ                  （５６）
ｃ）ｐＡ１２ ascobolus immersus ＤＮＡポリメラーゼ                  （５７）
ｄ）ｐＣＬＫ１ Claviceps purpurea ＤＮＡポリメラーゼ                （５８）
ｅ）maranhar neurospora crassa ＤＮＡポリメラーゼ                  （５９）
ｆ）ｐＥＭ Agaricus bitorquis ＤＮＡポリメラーゼ                      （６０）
ｇ）ｐＧＫＬ１ Kluyveromyces lactis ＤＮＡポリメラーゼ              （６１）
ｈ）ｐＧＫＬ２ Kluyveromyces lactis ＤＮＡポリメラーゼ              （６２）
ｉ）ｐＳＫＬ Saccharomyces kluyveri ＤＮＡポリメラーゼ              （６３）
【０１４９】
表ＩＩＩ−ある種の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの受託情報
Ｖｅｎｔ  Thermococcus litoralis−受託ＡＡＡ７２１０１：ＰＩＤ：ｇ３４８６８９；バージョンＡＡＡ７２１０１．１  ＧＩ：３４８６８９；DBSOURCE遺伝子座ＴＨＣＶＤＰＥ受託Ｍ７４１９８．１
Thest Thermococcus属種．（系統Ｔｙ）−受託Ｏ３３８４５；ＰＩＤｇ３９１３５２４；バージョンＯ３３８４５  ＧＩ：３９１３５２４；DBSOURCE swissprot：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＳＴ、受託Ｏ３３８４５
Pab Pyrococcus abyssi−受託Ｐ７７９１６；ＰＩＤ  ｇ３９１３５２９；バージョンＰ７７９１６  ＧＩ：３９１３５２９；DBSOURCE swissprot：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＡＢ、受託Ｐ７７９１６
PYRHO Pyrococcus horikoshii−受託Ｏ５９６１０；ＰＩＤ  ｇ３９１３５２６；バージョンＯ５９６１０  ＧＩ：３９１３５２６；DBSOURCE swissprot；遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＨＯ、受託Ｏ５９６１０
Pyrse Pyrococcus属種（系統Ｇｅ２３）−受託Ｐ７７９３２；ＰＩＤ  ｇ３９１３５３０；バージョンＰ７７９３２  ＧＩ：３９１３５３０；DBSOURCE swissprot：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＳＥ、受託Ｐ７７９３２
Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ  Pyrococcus属種−受託ＡＡＡ６７１３１；ＰＩＤ  ｇ４３６４９５；バージョンＡＡＡ６７１３１．１  ＧＩ：４３６４９５；DBSOURCE遺伝子座ＰＳＵ００７０７受託Ｕ００７０７．１
Ｐｆｕ  Pyrococcus furiosus−受託Ｐ８００６１；ＰＩＤ  ｇ３９９４０３；バージョンＰ８００６１  ＧＩ：３９９４０３；DBSOURCE swissprot：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＰＹＲＦＵ、受託Ｐ８００６１
ＪＤＦ−３−Thermococcus属種−受託ＡＸ１３５４５９；Baross ｇｉ｜２０９７７５６｜特許｜米国｜５６０２０１１｜１２特許ＵＳ５６０２０１１からの配列１２
９０Ｎ Thermococcus属種（系統９０Ｎ−７）．受託Ｑ５６３６６；ＰＩＤ  ｇ３９１３５４０；バージョンＱ５６３６６  ＧＩ：３９１３５４０；DBSOURCE swissprot：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＳ９、受託Ｑ５６３６６
ＫＯＤ  Pyrococcus属種−受託ＢＡＡ０６１４２；ＰＩＤ  ｇ１６２０９１１；バージョンＢＡＡ０６１４２．１  ＧＩ：１６２０９１１；DBSOURCE遺伝子座ＰＹＷＫＯＤＰＯＬ受託Ｄ２９６７１．１
Ｔｇｏ  Thermococcus gorgonarius.−受託４６９９８０６；ＰＩＤ  ｇ４６９９８０６；バージョンＧＩ：４６９９８０６；DBSOURCE pdb：鎖６５、1999年２月２３日発表
ＴＨＥＦＭ  Thermococcus fumicolans；受託Ｐ７４９１８；ＰＩＤ  ｇ３９１３５２８；バージョンＰ７４９１８  ＧＩ：３９１３５２８；DBSOURCE swissprot：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＴＨＥＦＭ、受託Ｐ７４９１８
ＭＥＴＴＨ  Methanobacterium thermoautotrophicum−受託Ｏ２７２７６；ＰＩＤ  ｇ３９１３５２２；バージョンＯ２７２７６  ＧＩ：３９１３５２２；DBSOURCE swissprot：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＭＥＴＴＨ、受託Ｏ２７２７６
Methanococcus jannaschii−受託Ｑ５８２９５；ＰＩＤ  ｇ３９１５６７９；バージョンＱ５８２９５  ＧＩ：３９１５６７９；DBSOURCE swissprot：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＭＥＴＪＡ、受託Ｑ５８２９５
ＰＯＣ  Pyrodictium occultum−受託Ｂ５６２７７；ＰＩＤ  ｇ１３６３３４４；バージョンＢ５６２７７  ＧＩ：１３６３３４４；DBSOURCE pir：遺伝子座Ｂ５６２７７
ＡｐｅＩ  Aeropyrum pernix；受託ＢＡＡ８１１０９；ＰＩＤ  ｇ５１０５７９７；バージョンＢＡＡ８１１０９．１  ＧＩ：５１０５７９７；DBSOURCE遺伝子座ＡＰ００００６３受託ＡＰ００００６３．１
ＡＲＣＦＵ  Archaeoglobus fulgidus−受託Ｏ２９７５３；ＰＩＤ  ｇ３１２２０１９；バージョンＯ２９７５３  ＧＩ：３１２２０１９；DBSOURCE swissprot：遺伝子座ＤＰＯＬ＿ＡＲＣＦＵ、受託Ｏ２９７５３
Desulfurococcus属種−受託６４３５７０８；ＰＩＤ  ｇ６４３５７０８９；バージョンＧＴ：６４３５７０８；DBSOURCE pdb．鎖６５、1999年６月２日発表
【０１５０】
表ＩＶ−CRENARCHAEOTA（極めて好熱性の古細菌）
サーモプロテウス綱（Thermoprotei）
Desulfurococcales；Desulfurococcaceae；Aeropyrum (Aeropyrum pernix) ；Desulfurococcus (Desulfurococcus amylolyticus、Desulfurococcus mobilis、Desulfurococcus mucosus、Desulfurococcus saccharovorans、Desulfurococcus属種、Desulfurococcus属種ＳＥＡ、Desulfurococcus属種ＳＹ、Desulfurococcus属種Ｔｏｋ、Ignicoccus、Ignicoccus islandicus、Ignicoccus pacificus、Staphylothermus、Staphylothermus hellenicus（Staphylothermus marinus）；Stetteria（Stetteria hydrogenophila）；Sulfophobococcus（Sulfophobococcus zilligii）；Thermodiscus（Thermodiscus maritimus）；Thermosphaera（Thermosphaera aggregans）；Pyrodictiaceae；Hyperthermus（Hyperthermus butylicus）；Pyrodictium（Pyrodictium abyssi、Pyrodictium brockii、Pyrodictium occultum）；Pyrolobus（Pyrolobus fumarii）；未分類のDesulfurococcales；Acidilobus（Acidilobus aceticus）；Caldococcus（Caldococcus noboribetus）；Sulfolobales；Sulfolobaceae；Acidianus （Acidianus ambivalens、Acidianus brierleyi、Acidianus infernus、Acidianus属種Ｓ５、Metallosphaera、Metallosphaera prunae、Metallosphaera sedula、Metallosphaera属種、Metallosphaera属種ＧＩＢ  １１／００、Metallosphaera属種Ｊ１）；Stygiolobus（Stygiolobus azoricus）；Sulfolobus（Sulfolobus acidocaldarius、Sulfolobus islandicus、Sulfolobus metallicus、Sulfolobus shibatae、Sulfolobus solfataricus、Sulfolobus thuringiensis、Sulfolobus tokodaii. Sulfolobus yangmingensis、Sulfolobus属種、Sulfolobus属種ＡＭＰ１２／９９、Sulfolobus属種ＣＨ７／９９、Sulfolobus属種ＦＦ５／００、Sulfolobus属種ＭＶ２／９９、Sulfolobus属種ＭＶＳｏｉｌ３／ＳＣ２、Sulfolobus属種ＭＶＳｏｉｌ６／ＳＣ１、Sulfolobus属種ＮＧＢ２３／００、Sulfolobus属種ＮＧＢ６／００、Sulfolobus属種ＮＬ８／００、Sulfolobus属種ＮＯＢ８Ｈ２、Sulfolobus属種ＲＣ３、Sulfolobus属種ＲＣ６／００、Sulfolobus属種ＲＣＳＣ１／０１、Sulfurisphaera、Sulfurisphaera ohwakuensis）；Thermoproteales；Thermofiliaceae；Thermofilum；Thermofilum librum (Thermofilum pendens)；未分類のThermofiliaceae（Thermofiliaceae属菌株．ＳＲＩ−３２５、Thermofiliaceae属菌株ＳＲＩ−３７０）；Thermoproteaceae；Caldivirga (Caldivirga maquilingensis)；Pyrobaculum (Pyrobaculum aerophilum. Pyrobaculum arsenaticum、Pyrobaculum islandicum、Pyrobaculum neutrophilum、Pyrobaculum oguniense、Pycobaculum organotrophum、Pyrobaculum属種ＷＩＪ３)；Thermocladium（Thermocladium modestius）；Thermoproteus (Thermoproteus neutrophilus、Thermoproteus tenax、Thermoproteus属種ＩＣ−０３３、Thermoproteus属種ＩＣ−０６１)；Vulcanisaeta（Vulcanisaeta distributa、Vulcanisaeta souniana）。
【０１５１】
ユリアーキオータ門（Euryarchaeota）
Archaeoglobi；Archaeoglobales；Archaeoglobaceae；Archaeoglobus (Archaeoglobus fulgidus、Archaeoglobus lithotrophicus、Archaeoglobus profundus、Archaeoglobus veneficus)；Ferroglobus (Ferroglobus placidus)；Halobacteria；Halobacteriales；Halobacteriaceae；Haloalcalophilium (Haloalcalophilium atacamensis)；Haloarcula (Haloarcula aidinensis、Haloarcula argentinensis、Haloarcula hispanica、Haloarcula japonica)；Haloarcula marismortui (Haloarcula marismortui亜種marismortui)、Haloarcula mukohataei、Haloarcula sinaiiensis、Haloarcula vallismortis、Haloarcula属種、Haloarcula属種ＡＲＧ−２）；Halobacterium（Halobacterium salinarum（Halobacterium salinarum（系統Ｍｅｘ）、Halobacterium salinarum（系統Ｐｏｒｔ）、Halobacterium salinarum（系統Ｓｈａｒｋ））、Halobacterium属種、Halobacterium属種９Ｒ、Halobacterium属種ａｒｇ−４、Halobacterium属種ＡＵＳ−１、Halobacterium属種ＡＵＳ−２、Halobacterium属種ＧＲＢ、Halobacterium属種ＪＰ−６、Halobacterium属種ＮＣＩＭＢ  ７１４、Halobacterium属種ＮＣＩＭＢ  ７１８、Halobacterium属種ＮＣＩＭＢ  ７２０、Halobacterium属種ＮＣＩＭＢ  ７３３、Halobacterium属種ＮＣＩＭＢ  ７３４、Halobacterium属種ＮＣＩＭＢ  ７４１、Halobacterium属種ＮＣＩＭＢ  ７６５、Halobacterium属種ＮＲＣ−１、Halobacterium属種ＮＲＣ−８１７、Halobacterium属種ＳＧ１、Halobaculum、Halobacterium gomorrense）；Halococcus (Halococcus dombrowskii、Halococcus morrhuae、Halococcus saccharolyticus、Halococcus salifodinae、Halococcus tibetense、Halococcus属種)；Haloferax (Haloferax alexandrinus、Haloferax alicantei、Haloferax denitrificans、Haloferax gibbonsii、Haloferax mediterranei、Haloferax volcanii、Haloferax属種、Haloferax属種Ｄ１２２７、Haloferax属種ＬＷｐ２．１)；Halogeometricum (Halogeometricum borinquense)；Halorhabdus (Halorhabdus utahensis)；Halorubrum (Halorubrum coriense、Halorubrum distributum、Halorubrum lacusprofundi Halorubrum saccharovorum、Halorubrum sodomense；Halorubrum tebenquichense、Halorubrum tibetense、Halorubrum trapanicum、Halorubrum vacuolatum、Halorubrum属種ＧＳＬ５．４８、Halorubrum属種ＳＣ１．２)；Halosimplex (Halosimplex carlsbadense)；aloterrigena (Haloterrigena thermotolerans、Haloterrigena turkmenicus、Natrialba、Natrialba aegyptia；Natrialba asiatica、Natrialba chahannaoensis、Natrialba hulunbeirensis、Natrialba magadii、Natrialba属種ＡＴＣＣ  ４３９８８、Natrialba属種Tunisia ＨＭｇ−２５、Natrialba属種Tunisia ＨＭｇ−２７)；Natrinema (Natrimema versiforme、Natrinema属種R-fish)；Natronobacterium (Natronobacterium gregoryi、Natronobacterium innermongoliae、Natronobacterium nitratireducens、Natronobacterium wudunaoensis)；Natronococcus (Natronococcus amylolyticus、Natronococcus occultus、Natronococcus xinjiangense、Natronococcus属種)；Natronomonas (Natronomonas pharaonis)；Natronorubrum (Natronorubrum bangense、Natronorubrum tibetense、Natronorubrum属種Tenzan-10、Natronorubrum属種Wadi Natrun-19)。
【０１５２】
メタノバクテリウム綱（Methanobacteria）
_Methanobacteriales；Methanobacteriaceae；Methanobacterium (Methanobacterium bryantii、Methanobacterium congolense、Methanobacterium curvum、Methanobacterium defluvii、Methanobacterium espanolae、Methanobacterium formicicum、Methanobacterium ivanovii、Methanobacterium oryzae、Methanobacterium palustre、Methanobacterium subterraneum、Methanobacterium thermaggregans、Methanobacterium thermoflexum、Methanobacterium thermophilum、Methanobacterium uliginosum、Methanobacterium属種)；Methanobrevibacter (Methanobrevibacter arboriphilus、Methanobrevibacter curvatus、Methanobrevibacter cuticularis、Methanobrevibacter filiformis、Methanobrevibacter oralis、Methanobrevibacter ruminantium、Methanobrevibacter smithii、Nyctotherus cordiformisのメタン生成内部共生体、Nyctotherus ovalisのメタン生成内部共生体、Nyctotherus veloxのメタン生成内部共生体、メタン生成共生体ＲＳ１０４、メタン生成共生体ＲＳ１０５、メタン生成共生体ＲＳ２０８、メタン生成共生体ＲＳ３０１、メタン生成共生体ＲＳ４０４、Methanobrevibacter属種、Methanobrevibacter属種ＡＴＭ、Methanobrevibacter属種ＦＭＢ１、Methanobrevibacter属種ＦＭＢ２、Methanobrevibacter属種ＦＭＢ３、Methanobrevibacter属種ＦＭＢＫ１、
Methanobrevibacter属種ＦＭＢＫ２、Methanobrevibacter属種ＦＭＢＫ３、Methanobrevibacter属種ＦＭＢＫ４、Methanobrevibacter属種ＦＭＢＫ５、Methanobrevibacter属種ＦＭＢＫ６、Methanobrevibacter属種ＦＭＢＫ７、Methanobrevibacter属種ＨＷ２３、Methanobrevibacter属種ＬＲｓＤ４、Methanobrevibacter属種ＭＤ１０１、Methanobrevibacter属種ＭＤ１０２、Methanobrevibacter属種ＭＤ１０３、Methanobrevibacter属種ＭＤ１０４、Methanobrevibacter属種ＭＤ１０５、Methanobrevibacter属種ＲｓＩ３、Methanobrevibacter属種ＲｓＷ３、Methanobrevibacter属種ＸＴ１０６、Methanobrevibacter属種ＸＴ１０８、Methanobrevibacter属種ＸＴ１０９)；Methanosphaera (Methanosphaera stadtmanae)；Methanothermobacter；Methanothermobacter marburgensis (Methanothermobacter marburgensis株Marburg)；Methanothermobacter thermautotrophicus (Methanothermobacter thermautotrophicus株Winter、Methanothermobacter wolfeii)；Methanothermaceae；Methanothermus (Methanothermus fervidus、Methanothermus sociabilis)；Methanococci；Methanococcales；Methanococcaceae；Methanococcus (Methanococcus aeolicus、Methanococcus fervens、Methanococcus igneus、Methanococcus infernus、Methanococcus jannaschii、
Methanococcus maripaludis、Methanococcus vannielii、Methanococcus voltae、Methanococcus vulcanius、Methanococcus属種Ｐ２Ｆ９７０１ａ)；Methanothermococcus （Methanothermococcus okinawensis、Methanothermococcus thermolithotrophicus）；Methanomicrobiales；Methanocorpusculaceae；Methanocorpusculum (Methanocorpusculum aggregans、Methanocorpusculum bavaricum、Methanocorpusculum labreanum、Methanocorpusculum parvum、Metbanocorpusculum sinense、Metopus contortus古細菌共生体、Metopus palaeformis内部共生体、Trimyema属種古細菌共生体)；Methanomicrobiaceae；Methanocalculus (Methanocalculus halotolerans、Methanocalculus taiwanense、Methanocalculus属種Ｋ１Ｆ９７０５ｂ  Methanocalculus属種Ｋ１Ｆ９７０５ｃ、Methanocalculus属種Ｏ１Ｆ９７０２ｃ)；Methanoculleus (Methanoculleus bourgensis、Methanoculleus chikugoensis、Methanoculleus marisnigri、Methanoculleus olentangyi、Methanoculleus palmolei、Methanoculleus thermophilicus、Methanoculleus属種、Methanoculleus属種ＢＡ１、Methanoculleus属種ＭＡＢ１、Methanoculleus属種ＭＡＢ２、Methanoculleus属種ＭＡＢ３)；Methanofollis（Methanofollis aquaemaris、Methanofollis liminatans、Methanofollis tationis）；
Methanogenium（Methanogenium cariaci、Methanogenium frigidum、Methanogenium organophilum、Methanogenium属種）；Methanomicrobium (Methanomicrobium mobile)；Methanoplanus (Methanoplanus endosymbiosus、Methanoplanus limicola、Methanoplanus petrolearius)；Methanospirillum (Methanospirillum hungatei、Methanospirillum属種)；Methanosarcinales；Methanosaetaceae；Methanosaeta (Methanosaeta concilii、Methanothrix thermophila、Methanosaeta属種、Methanosaeta属種ＡＭＰＢ−Ｚｇ)；Methanosarcinaceae；Methanimicrococcus (Methanimicrococcus blatticola)；Methanococcoides (Methanococcoides burtonii、Methanococcoides methylutens、Methanococcoides属種ＮａＴ１)；Methanohalobium (Methanohalobium evestigatum、Methanohalobium属種系統ＳＤ−１)；Methanohalophilus (Methanohalophilus euhalobius、Methanohalophilus halophilus、Methanohalophilus mahii、Methanohalophilus oregonensis、Methanohalophilus portucalensis、Methanohalophilus zhilinae、Methanohalophilus属種系統Ｃａｓ−１、Methanohalophilus属種系統ＨＣＭ６、Methanohalophilus属種系統Ｒｅｆ−１、Methanohalophilus属種系統ＳＦ−１)；Methanolobus (Methanolobus bombayensis、Methanolobus taylorii、Methanolobus tindarius、Methanolobus vulcani；Methanomethylovorans (Methanomethylovorans hollandica、Methanomethylovorans victoriae)；Methanosarcina (Methanosarcina acetivorans、Methanosarcina barkeri、Methanosarcina lacustris、Methanosarcina mazei、Methanosarcina semesiae、Methanosarcina siciliae、Methanosarcina thermophila、Methanosarcina vacuolata、Methanosaicina属種、Methanosarcina属種ＦＲ、Methanosarcina属種ＧＳ  １−Ａ、Methanosarcina属種ＷＨ−１)；Methanopyri；Methanopyrales；Methanopyraceae；Methanopyrus (Methanopyrus kandleri)；Thermococci；Thermococcales；Thermococcaceae；Palaeococcus (Palaeococcus ferrophilus)；Pyrococcus (Pyrococcus abyssi、Pyrococcus endeavori、Pyrococcus furiosus、Pyrococcus furiosus DSM 3638、Pyrococcus glycovorans、Pyrococcus horikoshii、Pyrococcus woesei、Pyrococcus属種、Pyrococcus属種GB-3A、Pyrococcus属種ＧＢ−Ｄ、Pyrococcus属種ＧＥ２３、Pyrococcus属種ＧＩ−Ｈ、Pyrococcus属種ＧＩ−Ｊ、Pyrococcus属種ＪＴ１、Pyrococcus属種ＭＺ１４、Pyrococcus属種ＭＺ４、Pyrococcus属種ＳＴ７００)；Thermococcus (Thermococcus acidaminovorans、
Thermococcus aegaeus、Thermococcus aggregans、Thermococcus alcaliphilus、Thermococcus atlantis、Thermococcus barophilus、Thermococcus barossii、Thermococcus celer、Thermococcus chitonophagus、Thermococcus fumicolans、Thermococcus gammatolerans、Thermococcus gorgonarius、Thermococcus guaymasensis、Thermococcus hydrothermalis、Thermococcus kodakaraensis、Thermococcus litoralis、Thermococcus marinus、Thermococcus mexicalis、Thermococcus pacificus、Thermococcus peptonophilus、Thermococcus profundus、Thermococcus radiophilus、Thermococcus sibiricus、Thermococcus siculi、Thermococcus stetteri、Thermococcus sulfurophilus、Thermococcus waimanguensis、Thermococcus waiotapuensis、Thermococcus zilligii、Thermococcus属種、Thermococcus属種9N2、Thermococcus属種９Ｎ３、Thermococcus属種９０Ｎ−７、Thermococcus属種Ｂ１００１、Thermococcus属種ＣＡＲ−８０、Thermococcus属種ＣＫＵ−１、Thermococcus属種ＣＫＵ−１９９、Thermococcus属種ＣＬ１Thermococcus属種ＣＬ２、Thermococcus属種ＣＭＩ、Thermococcus属種ＣＮＲ−５、Thermococcus属種ＣＸ１、Thermococcus属種CX2、Thermococcus属種ＣＸ３、Thermococcus属種ＣＸ４、Thermococcus属種ＣＹＡ、Thermococcus属種ＧＥ８、
Thermococcus属種Ｇｏｒｄａ２、Thermococcus属種Ｇｏｒｄａ３、Thermococcus属種Ｇｏｒｄａ４、Thermococcus属種Ｇｏｒｄａ５、Thermococcus属種Ｇｏｒｄａ６、Thermococcus属種ＪＤＦ−３、Thermococcus属種ＫＳ−１、Thermococcus属種ＫＳ−８、Thermococcus属種ＭＺ１、Thermococcus属種ＭＺ１０、Thermococcus属種ＭＺ１１、Thermococcus属種ＭＺ１２、Thermococcus属種ＭＺ１３、Thermococcus属種ＭＺ２、Thermococcus属種ＭＺ３、Thermococcus属種ＭＺ５、Thermococcus属種ＭＺ６、Thermococcus属種ＭＺ８、Thermococcus属種ＭＺ９、Thermococcus属種Ｐ６、Thermococcus属種Ｒｔ３、Thermococcus属種ＳＮ５３１、Thermococcus属種ＴＫ１、Thermococcus属種ｖｐｌ９７)；Thermoplasmata；Thermoplasmatales；Ferroplasmaceae；Ferroplasma (Ferroplasma acidarmanus、Ferroplasma acidiphilum、Picrophilaceae)；Picrophilus (Picrophilus oshimae、Picrophilus torridus；Thermoplasmataccae；Thermoplasma (Thermoplasma acidophilum、Thermoplasma volcanium、Thermoplasma属種ＸＴ１０１、Thermoplasma属種ＸＴ１０２、Thermoplasma属種ＸＴ１０３、Thermoplasma属種ＸＴ１０７)；
コルアーキオータ門(Korarchaeota)(korarchaeote ＳＲＩ−３０６)。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１５３】
逆転写酵素（ＲＴ）活性の増加した突然変異耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの調製
クローニングされた野生型または変異体のＤＮＡポリメラーゼは、ＲＴ活性の増加を示す変異体を生成するためにいくつかの方法によって修飾することができる。これらには、以下に記す方法および当技術分野で公知の他の方法が含まれる。本発明ではＲＴ活性の増加したＤＮＡポリメラーゼ変異体を調製するために、任意の耐熱性ＤＮＡポリメラーゼを用いることができる。
【０１５４】
増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを調製する好ましい方法の１つは、遺伝子組換えによるものである（例えば、野生型または変異体のＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡ配列を修飾することによる）。ＤＮＡ配列の標的突然変異だけでなくランダムな変異を起こさせるためのいくつかの方法が当技術で知られている（例えば、Ausubelら、分子生物学の簡易プロトコル(Short Protocols in Molecular Biology)(1995年)第３版John Wiley & Sons,Inc.を参照）。
【０１５５】
最初に、１つまたは複数の変異がランダムに起こる一群の変異体をもたらす、ランダムな突然変異誘発方法が当技術分野で存在する。そのような一群の変異体は、次に、野生型ポリメラーゼと比較して増加したＲＴ活性を示すものについてスクリーニングすることができる（下記の、「増加したＲＴ活性について変異体を評価する方法（Methods of Evaluating Mutants for Increased RT Activity）」を参照）。ランダムな突然変異誘発のための方法の一例は、いわゆる「誤りがちな(error-prone)ＰＣＲ法」である。その名の通り、この方法はＤＮＡポリメラーゼが高忠実度組込みを支援しない条件下で、与えられた配列を増幅する。異なるＤＮＡポリメラーゼのための誤りがちな(error-prone)組込みに有利な条件は変動するが、当業者は与えられた酵素のためのそのような条件を決定することができる。多くのＤＮＡポリメラーゼの増幅忠実度における重要な変数は、例えば、緩衝液中の二価金属イオンの種類および濃度である。マンガンイオンの使用および／またはマグネシウムもしくはマンガンのイオン濃度の変更は、したがってポリメラーゼの誤り率に影響を及ぼすために適用することができる。
【０１５６】
第２に、当技術分野で公知のいくつかの部位特異的突然変異誘発方法があり、それらは直接的な方法による特定の部位または領域の突然変異を可能にする。従来法およびＰＣＲに基づく方法を含めて、部位特異的突然変異誘発の実施で利用できるいくつかの市販キットがある。利用できる例としては、Stratageneから入手できるEXSITE（商標）ＰＣＲベース部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２００５０２；ＰＣＲベース）およびStratageneからのQUIKCHANGE（商標）部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２００５１８；非ＰＣＲベース）、およびStratageneからのCHAMELON（登録商標）二本鎖部位特異的突然変異誘発キット（カタログ番号２００５０９）がある。
【０１５７】
さらに、増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、当業者に公知の方法に従って挿入性変異または切り詰め（Ｎ末端、内部またはＣ末端）によって生成することができる。
【０１５８】
当技術分野で知られている以前の部位特異的突然変異誘発方法は、突然変異させる配列のＭ１３バクテリオファージベクターなどの一本鎖ＤＮＡ鋳型の単離を可能にするベクターへのサブクローニングに依存していた。これらの方法では、突然変異誘発性のプライマー（すなわち、突然変異させる部位にアニールすることができるが、突然変異部位に１つまたは複数のミスマッチヌクレオチドを抱えたプライマー）を一本鎖鋳型にアニールして、次に突然変異誘発性プライマーの３’末端から鋳型の相補体を重合させた。結果として生じる二重鎖は次に宿主菌に形質転換して、所望の変異を選択するためにプラークをスクリーニングした。
【０１５９】
最近では、部位特異的突然変異誘発は、一本鎖鋳型を必要としない長所があるＰＣＲ法を使用する。さらに、サブクローニングを必要としない方法が開発された。ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発を実施するときは、いくつかの問題が考慮される。最初に、これらの方法においては、ポリメラーゼによって導入される望ましくない変異の伸長を阻止するために、ＰＣＲサイクルの数を減らすことが望まれる。第２に、反応内で持続する非変異の親分子の数を減らすために、選択手段を使用することができる。第３に、単一のＰＣＲプライマーセットの使用を可能にするためには、伸長した長さのＰＣＲ方法が好ましいかもしれない。第４に、一部の耐熱性ポリメラーゼの非鋳型依存的末端伸長活性のために、ＰＣＲ生成突然変異生成物の平滑末端ライゲーションの前に、末端ポリシング段階を工程に組み込む必要があるかもしれない。
【０１６０】
一部の実施形態では、分子生物学的方法を用いてゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡを単離することによって、突然変異誘発のための鋳型の役目を果たす野生型ＤＮＡポリメラーゼがクローニングされる。あるいは、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡをＰＣＲによって増幅して、ＰＣＲ生成物を突然変異誘発のための鋳型として用いることができる。
【０１６１】
以下に記す非限定的プロトコルは、以下の段階を通してこれらの考慮事項を含む。第１に、用いた鋳型濃度は従来のＰＣＲ反応で用いたものより約１０００倍高く、生成物収量を激減させることなくサイクル数を２５〜３０から５〜１０に減少させることができる。第２に、大腸菌Ｄａｍの最も一般的な系統は配列５−ＧＡＴＣ−３（配列番号２４）でそれらのＤＮＡをメチル化するので、親ＤＮＡに対して選択するために制限エンドヌクレアーゼＤｐｎＩ（認識標的配列：５−Ｇｍ６ＡＴＣ−３、Ａ残基はメチル化されている）を用いる。第３に、長い（すなわち完全なプラスミド長）ＰＣＲ生成物の割合を増加させるために、Taq ExtenderをＰＣＲ混合物で用いる。最後に、Ｔ４ＤＮＡリガーゼを用いた分子内ライゲーションの前にＰＣＲ生成物の末端をポリシングするために、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いる。
【０１６２】
本発明の一実施形態に従うＰＣＲベースの部位特異的突然変異誘発について、以下で１つの方法を詳述する。
【０１６３】
ポリヌクレオチド（約０．５ｐｍｏｌｅ）をコードするＤＮＡポリメラーゼを含むプラスミド鋳型ＤＮＡを、以下を含むＰＣＲカクテルに加える：１×突然変異誘発緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、８ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４０μｇ／ｍｌ  ＢＳＡ）；１２〜２０ｐｍｏｌの各プライマー（当業者はオリゴヌクレオチドプライマーのアニール特性に影響を及ぼす塩基組成、プライマー長および意図された緩衝塩濃度などの要素を考慮して、必要に応じて突然変異誘発プライマーを設計することができる。１つのプライマーはＤＮＡポリメラーゼコード配列内に所望の変異を含まなければならず、１つ（同じかまたは他の）は後のライゲーションを容易にするために５’リン酸を含まなければならない）、ｄＮＴＰそれぞれを２５０μＭ、２．５ＵのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、および２．５ＵのTaq Extender（Stratageneから入手可能、Nielsonら、（1994年）Strategies ７：２７および米国特許第５，５５６，７７２号を参照）。
【０１６４】
プライマーは、本明細書で参照により組み込まれているMatteucciら、1981年、J.Am.Chem.Soc. １０３：３１８５−３１９１、のトリエステル法を用いて調製することができる。あるいは、例えば、シアノエチルホスホラミダイト化学を用いたBiosearch 8700 ＤＮＡ合成装置による自動合成が好ましい。
【０１６５】
ＰＣＲサイクリングは、以下の通りに実施される：９４℃で４分、５０℃で２分および７２℃で２分を１サイクル、続いて９４℃で１分、５４℃で２分および７２℃で１分を５〜１０サイクル。親の鋳型ＤＮＡおよび突然変異誘発プライマーを組み込む線状のＰＣＲ生成ＤＮＡを、ＤｐｎＩ（１０Ｕ）およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５Ｕ）で処理する。この結果、ｉｎ  ｖｉｖｏのメチル化された親の鋳型およびハイブリッドＤＮＡのＤｐｎＩ消化、ならびに線状ＰＣＲ生成物上の非鋳型依存性のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼで伸長した塩基の、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼによる除去がもたらされる。反応物は３７℃で３０分間インキュベートして、次に７２℃へさらなる３０分間移す。０．５ｍＭのＡＴＰを含む突然変異誘発緩衝液（１×を１１５μｌ）を、ＤｐｎＩで消化し、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼでポリシングしたＰＣＲ生成物に加える。溶液を混合して１０μｌを新しいミクロチューブに取り、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（２〜４Ｕ）を加える。ライゲーションは３７℃で６０分を超える時間、インキュベートする。最後に、処理した溶液を標準の方法によってコンピテント大腸菌へ形質転換する。
【０１６６】
多様な生物からの耐熱性ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼを含むファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの直接的比較は、これらの酵素のドメイン構造が高度に保存されていることを示す（例えば、Hopfnerら、1999年、Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.９６：３６００−３６０５、Blancoら、1991年、Gene １００：２７−３８、およびLarderら、1987年、EMBO J. ６：１６９−１７５を参照）。すべてのファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは領域Ｉ〜ＶＩと命名された６つの保存された領域を有し、ポリペプチド内でＩＶ〜ＩＩ〜ＶＩ〜ＩＩＩ〜Ｉ〜Ｖの順番で配置されている（領域間の間隔は異なるが、順番は変化しない）。領域Ｉ（別名モチーフＣ）は、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸５４１〜５４３およびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸５４０〜５４２に位置する保存配列ＤＴＤで規定される。領域ＩＩ（別名モチーフＡ）は、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸４０５〜４１３およびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸４０４〜４１２に位置する共通配列ＤＸＸ（Ａ／Ｓ）ＬＹＦＳＩ（配列番号２５）で規定される。領域ＩＩＩ（別名モチーフＢ）は、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸４８８〜４９６およびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸４８７〜４９５に位置する共通配列ＫＸＸＸＮＡ／ＳＸＹＧ（配列番号２６）で規定される。これらの配列と他のファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼのそれらとの配列アラインメントは、他のファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼ上の様々な領域の境界の帰属を可能にする。結晶Thermococcus gorgonarius（Hopfnerら、1999年、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.９６：３６００−３６０５）、９０Ｎ（Rodriguesら、2000年、J.Mol.Biol.299：４４７−４６２）、およびThermococcus属種系統ＫＯＤ１（以前はPyrococcus属種に分類、Hashimotoら、2001年、J.Mol.Biol. ３０６：４６９−７７）を含めていくつかのファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの結晶構造が解決され、それらの領域の構造機能関係の確立に貢献した。これらの保存された領域の位置は、基本的機能、例えばＤＮＡ重合およびプルーフリーディング活性を保存しつつ、増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを調製するための遺伝子組換えを指示するために有用なモデルを提供する。例えば、本明細書では、領域ＩＩを規定するより大きな保存された構造モチーフＤＸＸＳＬＹＰＳＩ（配列番号２７）の一部である「ＬＹＰ」構造モチーフが、酵素の逆転写酵素活性を強化する変異のための主な標的であることが認められる。本明細書で使用する用語「ＬＹＰモチーフ」は、BLASTまたはClustal Wを用いて実施された配列アラインメントにおいて、配列番号１のＪＤＦ−３  ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸４０８〜４１０に位置するＬＹＰ配列に対応するファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの領域ＩＩを有するアミノ酸配列を意味する（Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬＹＰモチーフは、ポリペプチドのアミノ酸４０９〜４１１に位置する）。このモチーフはＬＹＰであることが最も多いが、このモチーフが異なるファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼのメンバーが存在することが記されている。例えば、ＬＹＰはArchaeoglobus fulgidusfu（Ａｆｕ）ＤＮＡポリメラーゼではＭＹＰに対応する。
【０１６７】
本明細書で開示されるように、逆転写酵素活性の増加を導く配列番号１のＬ４０８に対応する位置のアミノ酸変化は、環状側鎖、例えばフェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジンまたはチロシンを導入する傾向がある。本明細書では環状側鎖を有するアミノ酸はファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を増加させることが示されているが、ＬＹＰモチーフの他のアミノ酸変化は逆転写酵素活性に影響を及ぼすことが企図される。このように、他のファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性を修飾するために、まず領域ＩＩのＬＹＰモチーフ、特にＬＹＰモチーフのＬまたは他の対応するアミノ酸のモチーフを修飾するために、まず環状側鎖を置換して、下記本明細書で「増加したＲＴ活性について変異体を評価する方法（Methods of Evaluating Mutants for Increased RT Activity）」で開示されるように、野生型と比較した逆転写酵素活性を評価する。必要に応じて、または所望により、その後ＬＹＰモチーフの同じ位置をさらなるアミノ酸で修飾して、活性に対する影響を同様に評価することができる。あるいは、または加えて、ＬＹＰモチーフの他の位置を修飾して、同様に逆転写酵素活性を評価することができる。
【０１６８】
本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体を生成するために、変性オリゴヌクレオチドプライマーを用いることができる。一部の実施形態では変性プライマーの化学合成は自動ＤＮＡ合成装置で実施され、変性プライマーの目的は、１つの混合物で、ＤＮＡポリメラーゼ配列の所望の特定の突然変異部位をコードするすべての配列を提供することである。変性オリゴヌクレオチドの合成は当技術分野で公知である（例えば、Narang,S.A, Tetrahedron ３９：３  ９、1983年；Itakuraら、Recombinant ＤＮＡ、Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromol, Walton編、Elsevier、アムステルダム、pp 273-289、1981年；Itakuraら、Annu.Rev.Biochem.５３：３２３、1984年；Itakuraら、Science １９８：１０５６、1984年およびIkeら、Nucleic Acid Res.１１：４７７ 1983年）。そのような手法は他のタンパク質の指向進化で使用されている（例えば本明細書でそれぞれが参照により組み込まれている、Scottら、Science ２４９：３８６−３９０、1980年；Robertsら、Proc.Nat’l.Acad.Sci., ８９：２４２９−２４３３、1992年；Devlinら、Science ２４９：４０４−４０６、1990年；Cwirlaら、Proc.Nat’l.Acad.Sci., ８７：６３７８−６３８２、1990年、ならびに米国特許第５，２２３，４０９号、５，１９８，３４６号および５，０９６，８１５号）。
【０１６９】
増加したＲＴ活性を有する突然変異ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の方法で、例えば、「増加したＲＴ活性について変異体を評価する方法（Methods of Evaluating Mutants for Increased RT Activity）」で後述されているように、スクリーニングおよび／または確認することができる。
【０１７０】
突然変異誘発で生成した所望の突然変異ＤＮＡポリメラーゼをコードするポリヌクレオチドは、変異を特定するために配列決定をすることができる。１つ以上の変異を含む変異体については、与えられた変異の影響は、部位特異的突然変異誘発による野生型遺伝子への特定された変異の導入により、特定の変異体が有する他の変異からの隔離によって評価することができる。このように生成される単一の変異体のスクリーニングアッセイは、次にその変異単独の影響の決定を可能にする。
【０１７１】
好ましい一実施形態では、増加したＲＴ活性を有する酵素は、１つまたは複数の変異を含むファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼに由来する。
【０１７２】
好ましい一実施形態では、増加したＲＴ活性を有する酵素は、ＰｆｕまたはＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼに由来する。
【０１７３】
野生型ＰｆｕまたはＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸およびＤＮＡコード配列を図７で示す（それぞれGenbank受託番号Ｐ８００６１（ＰＦＵ）およびＱ５６３６６（ＪＤＦ−３））。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼの構造および機能の詳述は、なかでも米国特許第５，９４８，６６３号、５，８６６，３９５号、５，５４５，５５２号、５，５５６，７７２号で、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼの構造および機能の詳述は、なかでも米国特許第５，９４８，６６３号、５，８６６，３９５号、５，５４５，５５２号、５，５５６，７７２号で見られ、こられのすべては本明細書で参照により組み込まれている。増加したＲＴ活性を有するＰｆｕまたはＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼを調製するための非限定的な詳細な手順は、本明細書の実施例で提供される。
【０１７４】
この開示の恩恵を受ける当業者は、ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼに由来するウラシル検出活性の低下したポリメラーゼは、例えばＶｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕポリメラーゼ、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ、ＫＯＤ、表ＩＩおよびＩＩＩにあげた他の酵素などは、本発明で十分に用いることができる。
【０１７５】
対象組成物の酵素は、まだ単離されていないＤＮＡポリメラーゼを含むことができる。
【０１７６】
本発明の好ましい実施形態では、変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９に対応するアミノ酸位置でアミノ酸置換を有する（図６を参照）。好ましい一実施形態では、本発明の突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、ＪＤＦ−３ポリメラーゼのＬ４０８またはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９に対応する位置のアミノ酸で、ロイシンからＦ、Ｙ、ＷまたはＨへの置換を含む。
【０１７７】
一実施形態では、本発明の突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸位置４０９でロイシンからＦ、Ｙ、ＷまたはＨへの置換を含むＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１７８】
一実施形態では、本発明の突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、アミノ酸位置４０８でロイシンからＦ、Ｙ、ＷまたはＨへの置換を含むＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼである。
【０１７９】
一実施形態では、突然変異ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号３のＬ４０９からＰ４１１と対応するアミノ酸におけるアミノ酸変異を含む。
【０１８０】
本発明によると、増加したＲＴ活性を有するＬＹＰモチーフ突然変異ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｆｕ  Ｌ４０９変異体またはＪＤＦ−３  Ｌ４０８変異体）は、そのＲＴ活性をさらに増加させるかＤＮＡポリメラーゼの１つまたは複数のさらなる活性、例えば３’−５’エキソヌクレアーゼ活性、塩基類似体検出活性を減少または消失させる、１つまたは複数のさらなる変異を含むことができる。
【０１８１】
一実施形態では、本発明によるＬ４０９突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に消失した形態をもたらす、１つまたは複数のさらなる変異を含む。
【０１８２】
本発明は、係属中の米国特許出願０９／６９８３４１（Sorgeら、2000年１０月２７日出願）で開示されているように、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を減少または消失させる１つまたは複数の変異をさらに含むＲＴ活性の増加したＬ４０９突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼをさらに提供する。
【０１８３】
好ましい一実施形態では、本発明は３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が減少してＲＴ活性が増加した、Ｌ４０９／Ｄ１４１／Ｅ１４３トリプル突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０１８４】
一実施形態では、トリプル突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、Ｌ４０９の位置でＦ、Ｙ、ＷまたはＨ置換を、Ｄ１４１の位置でＡ置換を、およびＥ１４３の位置でＡ置換を含む。
【０１８５】
本発明によると、増加したＲＴ活性を有するＬＹＰモチーフ突然変異ＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｆｕ  Ｌ４０９変異体またはＪＤＦ−３  Ｌ４０８変異体）は、塩基類似体検出活性を減少させる１つまたは複数のさらなる変異を含むことができる。
【０１８６】
一実施形態では、本発明によるＬ４０９突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、低下した塩基類似体検出活性を示す形態をもたらす１つまたは複数のさらなる変異を含む。
【０１８７】
本発明は、係属中の米国特許出願１０／４０８６０１（Hogrefeら、2003年４月７日出願）で開示されているように、塩基類似体検出活性を減少させる１つまたは複数の変異をさらに含む、ＲＴ活性の増加したＬ４０９突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０１８８】
一実施形態では、本発明は増加したＲＴ活性および低下した塩基類似体検出活性を有するＬ４０９／Ｖ９３突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを提供する。他の実施形態では、突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＬ４０９の位置でＦ、Ｙ、ＷまたはＨ置換を、Ｄ１４１の位置でＡ置換を、Ｖ９３の位置でＲ、Ｅ、Ｋ、ＤまたはＢ置換を含む。他の実施形態では、増加したＲＴ活性および低下した塩基類似体検出活性を有する突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１０５のアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
好ましい一実施形態では、本発明は、３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が低下し、塩基類似体検出活性が低下し、ＲＴ活性が増加した、Ｌ４０９／Ｄ１４１／Ｅ１４３／Ｖ９３の４重突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを提供する。
【０１９０】
一実施形態では、４重突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼはＬ４０９の位置でＦ、Ｙ、ＷまたはＨ置換を、Ｄ１４１の位置でＡ置換を、Ｅ１４３の位置でＡ置換を、Ｖ９３の位置でＲ、Ｅ、Ｋ、ＤまたはＢ置換を含む。他の実施形態では、４重突然変異Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼは、配列番号１０６のアミノ酸配列を含む。
【０１９１】
複数の変異を含むＤＮＡポリメラーゼは、所望の変異をすでに有するＤＮＡポリメラーゼ変異体をコードするポリヌクレオチドを用いて部位特異的突然変異誘発によって生成することができ、または、それらは当技術分野で公知であり本明細書で記載されている方法に従って、１つまたは複数を含む１つまたは複数の突然変異誘発プライマーを用いて生成することができる。
【０１９２】
Ｄ１４１ＡおよびＥ１４３の変異を含む３’−５’エキソヌクレアーゼ欠失ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼを生成する方法は、係属中の米国特許出願０９／６９８３４１（Sorgeら、2000年１０月２７日出願）で開示されている。Ｌ４０９  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼｃＤＮＡおよび係属中の米国特許出願０９／６９８３４１（Sorgeら、2000年１０月２７日出願）の教示を所有する当業者は、係属中の米国特許出願０９／６９８３４１で開示されているように、確立されている部位特異的突然変異誘発方法を使用して対応するＤ１４１ＡおよびＥ１４３Ａの変異または他の３’−５’エキソヌクレアーゼ変異をＬ４０９  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼｃＤＮＡへ導入することに問題はないであろう。
【０１９３】
Ｖ９３Ｒ、Ｖ９３Ｅ、Ｖ９３Ｋ、Ｖ９３ＤおよびＶ９３Ｂの変異を含む、塩基類似体検出活性の低下した突然変異古細菌ＤＮＡポリメラーゼを生成する方法は、係属中の米国特許出願１０／４０８６０１（Hogrefeら、2003年４月７日出願）で開示されている。Ｌ４０９  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼｃＤＮＡおよび係属中の米国特許出願１０／４０８６０１（Hogrefeら、2003年４月７日出願）の教示を所有する当業者は、係属中の米国特許出願１０／４０８６０１で開示されているように、確立されている部位特異的突然変異誘発方法を使用してＶ９３変異または塩基類似体検出活性の低下をもたらす他の変異をＬ４０９  Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼｃＤＮＡへ導入することに問題はないであろう。
【０１９４】
他の実施形態では、変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼはキメラタンパク質であり、例えば、進化性および／または塩抵抗性を増加させるドメインをさらに含む。本発明に従って有用なドメインおよびキメラの調製方法は、国際公開ＷＯ０１／９２５０１Ａ１およびPavlovら、2002年、Proc.Natl.Acad.Sci USA、９９：１３５１０−１３５１５で記載されている。両参考文献は、それらの全部が本明細書で組み込まれる。
【０１９５】
本開示を考慮すると、前記の突然変異誘発方法に加えて、一般に適用できる他の突然変異誘発方式が当業者にとって明らかとなる。例えば、ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、例えば、アラニンスキャン突然変異誘発など（Rufら、Biochem., ３３：１５６５−１５７２、1994年；Wangら、J.Biol.Chem., ２６９：３０９５−３０９９、1994年；Balintら、Gene １３７：１０９−１１８、1993年；Grodbergら、Eur.J.Biochem., ２１８：５９７−６０１、1993年；Nagashimaら、J.Biol.Chem., ２６８：２８８８−２８９２、1993年；Lowmanら、Biochem., ３０：１０８３２−１０８３８、1991年；およびCunninghamら、Science、２４４：１０８１−１０８５、1989年）、リンカースキャン突然変異誘発（Gustinら、Virol., １９３：６５３−６６０、1993年; Brownら、Mol.Cell.Biol., １２：２６４４−２６５２、1992年；McKnightら、Science、２３２：３１６）、または飽和突然変異誘発（Meyersら、Science、２３２：６１３、1986年）を用いて生成およびスクリーニングすることができ、これらの参考文献はすべて本明細書で参照により組み込まれている。
【０１９６】
増加したＲＴ活性について変異体を評価する方法
突然変異誘発のポリヌクレオチド生成物をスクリーニングするために、広範囲にわたる手法が当技術分野で公知である。多数のポリヌクレオチド生成物をスクリーニングするために最も広く用いられる手法は、突然変異誘発ポリヌクレオチドを複製可能な発現ベクターにクローニングすること、適当な細胞を得られたベクターで形質転換すること、および所望の活性（例えばＲＴ）の検出が所望の生成物をコードするポリヌクレオチドを含むベクターの単離を比較的容易にするような条件下で前記ポリヌクレオチドを発現させることを一般的に含む。
【０１９７】
ＲＮＡ依存性のＤＮＡ合成をベースにした逆転写酵素（ＲＴ）活性のアッセイ方法は、米国特許第３，７５５，０８６号、Poieszら、（1980年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、７７：１４１５；Hoffmanら、（1985年）Virology １４７：３２６で記載されているように当技術分野で公知であり、これらはすべて本明細書で参照により組み込まれている。
【０１９８】
近年では、１から１０粒子相当のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを検出することができる、高感度のＰＣＲベースのアッセイが開発された（Silverら、（1993年）Nucleic Acids Res.２１：３５９３−４；米国特許第５，８０７，６６９号）。ＰＢＲＴ（ＰＣＲベースの逆転写酵素）と命名されたそのようなアッセイの１つは、様々な試料中のＲＴ活性を検出するために用いられている（Pyraら、（1994年）Proc.Natl.Acad.Sci.USA ５１：１５４４−８；Boniら、（1996年）J.Med.Virol.４９：２３−２８）。このアッセイは、従来のＲＴアッセイよりも感度が１０６〜１０７高い。
【０１９９】
他の有用なＲＴアッセイとしては、それらには限定されないが、Hepler,R.W.およびKeller,P.M.（1998年）Biotechniques ２５（１）、９８−１０６で記載されている１段階蛍光プローブ生成物強化逆転写酵素アッセイ、Chang,A., Ostrove,J.M.およびBird,R.E.（1997年）J Virol Methods ６５（１）、４５−５４で記載されている改良生成物強化逆転写酵素アッセイ、Nakanoら、（1994年）感染症学雑誌６８（７）、９２３−３１で記載されている改良非放射性同位元素逆転写酵素アッセイ、Yamamoto,S., Folks,T.M.およびHeneine,W.（1996年）J Virol Methods ６１（１−２）、１３５−４３で記載されている逆転写酵素活性の高感度定性定量的検出があり、これらの参考文献はすべて本明細書で参照により組み込まれている。
【０２００】
ＲＴ活性は、放射性または非放射性標識を用いて測定することができる。
【０２０１】
一実施形態では、Hogrefeら、2001年、Methods in Enzymology、３４３：９１−１１６で記載されているように、適切に精製したＤＮＡポリメラーゼ変異体または希釈した細菌抽出物（すなわち、クローン化ポリメラーゼまたは変異させたクローン化ポリメラーゼを発現する細菌細胞の熱処理および清澄化した抽出物）の１μｌを、各ヌクレオチドカクテル（２００μＭ  ｄＡＴＰ、２００μＭ  ｄＧＴＰ、２００μＭ  ｄＣＴＰおよび５μＣｉ／ｍｌのα−３３Ｐ  ｄＣＴＰおよび２００μＭ  ｄＴＴＰ、ＲＮＡ鋳型、１×適当な緩衝液）の１０μｌに加え、その後適温（例えばＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼでは７２℃）で３０分間インキュベーションする。次に伸長反応を氷上でクエンチして、５μｌの一定量を直ちにＤＥ８１イオン交換フィルター（２．３ｃｍ、Whatman＃３６５８３２３）の上へスポットする。組み込まれていない標識は、２×ＳＣＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で６回洗浄し、続いて１００％エタノールで短時間洗浄して除去する。組み込まれた放射能は、次にシンチレーション計数で測定する。「総ｃｐｍ」（フィルター洗浄段階を削除する）および「最小ｃｐｍ」（上と同様にフィルターを洗浄する）を測定するために、酵素を欠いた反応液も試料インキュベーションと一緒に設定する。結合するｃｐｍは、細菌抽出物または精製ＤＮＡポリメラーゼの１容あたりのＲＴ活性量に比例する。
【０２０２】
他の実施形態では、ＲＴ活性は基本的にHoltke,H.J., Sagner,G、Kessler,C.およびSchmitz,G.（1992年）Biotechniques １２、１０４−１１３で記載されている方法に従って、合成されたＤＮＡへの非放射性ジゴキシゲニン標識ｄＵＴＰの組込み、ならびに組み込まれた標識の検出および定量によって測定される。反応は、次の成分からなる反応混合物中で実施される：１μｇのｐｏｌｙｄＡ−（ｄＴ）１５、３３μＭ  ｄＴＴＰ、０．３６μＭの標識ｄＵＴＰ、２００ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、２０ｍＭ  ＫＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＥおよび様々な量のＤＮＡポリメラーゼ。試料は５０℃で３０分間インキュベートし、２μの０．５Ｍ  ＥＤＴＡを添加して反応を止め、管を氷上に置く。８μｌの５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５０μｌのエタノール（−２０℃に予冷）を添加した後、氷上で１５分間インキュベーションしてＤＮＡを沈殿させ、４℃の１３０００×ｒｐｍで１０分間の遠心分離によりペレット化する。ペレットは１００μｌの７０％エタノール（−２０℃に予冷）および０．２Ｍ  ＮａＣｌで洗浄し、再び遠心分離し、真空乾燥した。
【０２０３】
ペレットは、５０μｌのトリス−ＥＤＴＡ（１０ｍＭ／０．１ｍＭ、ｐＨ７．５）で溶解する。試料の５μｌを、底がナイロン膜の白色マイクロ波プレート（Pall Filtrationstechnik ＧｍｂＨ、Dreieich、ＦＲＧ、製品番号：ＳＭ０４５ＢＷＰ）のウェルにスポットする。７０℃で１０分間焼くことによって、ＤＮＡを膜に固定する。ＤＮＡを注入したウェルに、０．４５μｍで濾過した１％のブロッキング溶液（１００ｍＭマレイン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％（ｗ／ｖ）カゼイン、ｐＨ７．５）の１００μｌを満たした。以下のすべてのインキュベーション段階は、室温で行われる。２分間のインキュベーションの後、−０．４バールの適当な真空マニホルドで、膜を通して溶液を吸引する。洗浄段階を繰り返した後に、ウェルに上記のブロッキング溶液で１：１０，０００に希釈した抗ジゴキシゲニン−ＡＰ、Ｆａｂフラグメント（Boehringer Mannheim、ＦＲＧ、番号：１０９３２７４）溶液１００μｌを満たす。２分のインキュベーションおよび吸引の後、この段階を一度繰り返す。ウェルは、真空下でそれぞれ２００μｌの洗浄緩衝液１（１００ｍＭマレイン酸、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．３％（ｖ／ｖ）ツイーン（商標）２０、ｐＨ７．５）で２回洗浄する。真空下でそれぞれ２００μｌの洗浄緩衝液２（１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ｐＨ９．５）でさらに２回洗浄した後、ウェルをアルカリホスファターゼの化学発光基質の役目を果たす、洗浄緩衝液２で１：１００に希釈した５０μｌのＣＳＰＤ（商標）（Boehringer Mannheim、番号：１６５５８８４）と５分間インキュベートする。膜を通して溶液を吸引し、１０分間のインキュベーションの後、ＲＬＵ／秒（１秒あたりの相対光単位）をMicroLumat ＬＢ９６Ｐ（EG&G Berthold, Wilbad, ＦＲＧ）などのルミノメータで検出する。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの連続希釈を用いて参照曲線を作成し、そこからの直線範囲は、分析するＤＮＡポリメラーゼの活性測定のための基準としての役目を果たす。
【０２０４】
米国特許第６，１００，０３９号（本明細書で参照により組み込まれている）は、蛍光偏光法を用いて逆転写酵素活性を検出するために有用な他の方法を記載する。逆転写酵素活性検出アッセイは、Beacon（商標）2000アナライザを用いて実施される。以下の試薬は、市販品を購入する。フルオレセイン標識オリゴｄＡ−Ｆ（Bio.Synthesis Corp., Lewisville、Tex.）、ＡＭＶ逆転写酵素（Promega Corp., ウィスコンシン州Madison）およびポリアデニル酸ポリＡ（Pharmacia Biotech、ウィスコンシン州Milwaukee）。このアッセイは、逆転写酵素反応段階とそれに続く蛍光偏光法に基づく検出段階を必要とする。逆転写酵素反応は、キットに附属する指示書を用いて完了する。反応では、２０ｎｇのオリゴ（ｄＴ）を１μｇのポリＡに７０℃で５分間アニールした。アニールした反応物を、ＲＴ緩衝液および種々の単位（３０、１５、７．５、３．８および１．９単位／Ｒｘｎ）の逆転写酵素を有するｄＴＴＰヌクレオチドを含むＲＴ混合物に加える。反応物は、３７℃の水浴でインキュベートする。５μｌの一定量を２０μｌの１２５ｍＭ  ＮａＯＨを含む管に加えることによって、５、１０、１５、２０、２５、３０、４５および６０分時にクエンチする。検出段階では、オリゴｄＡ−Ｆの０．５Ｍトリス溶液、ｐＨ７．５、７５μｌの一定量を、クエンチした各反応物に加える。試料は１０分間、室温でインキュベートする。各試料中の蛍光偏光は、Beacon（商標）２０００アナライザを用いて測定した。
【０２０５】
本発明による有用な特殊なヌクレオチド。
【０２０６】
当技術分野の有用な多種多様な特殊ヌクレオチドがある。それらのいずれかまたはすべては、本発明のＤＮＡポリメラーゼでの使用が企図される。そのような特殊なヌクレオチドの非限定的リストを、表Ｖで提示する。
【０２０７】
表Ｖ．特殊なヌクレオチド
ジデオキシヌクレオチド類似体
フルオレセイン標識                    蛍光団標識
フルオレセイン−１２−ｄｄＣＴＰ      エオシン−６−ｄｄＣＴＰ
フルオレセイン−１２−ｄｄＵＴＰ      クマリン−５−ｄｄＵＴＰ
フルオレセイン−１２−ｄｄＡＴＰ      テトラメチルローダミン−６−ｄｄＵＴＰ
フルオレセイン−１２−ｄｄＧＴＰ      テキサスレッド−５−ｄｄＡＴＰ
フルオレセイン−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ      LISSAMINE（商標）−ローダミン−５−ｄｄＧＴＰ
ＦＡＭ標識                            ＴＡＭＲＡ標識
ＦＡＭ−ｄｄＵＴＰ                    ＴＡＭＲＡ−ｄｄＵＴＰ
ＦＡＭ−ｄｄＣＴＰ                    ＴＡＭＲＡ−ｄｄＣＴＰ
ＦＡＭ−ｄｄＡＴＰ                    ＴＡＭＲＡ−ｄｄＡＴＰ
ＦＡＭ−ｄｄＧＴＰ                    ＴＡＭＲＡ−ｄｄＧＴＰ
ＲＯＸ標識                            ＪＯＥ標識
ＲＯＸ−ｄｄＵＴＰ                    ＪＯＥ−ｄｄＵＴＰ
ＲＯＸ−ｄｄＣＴＰ                    ＪＯＥ−ｄｄＣＴＰ
ＲＯＸ−ｄｄＡＴＰ                    ＪＯＥ−ｄｄＡＴＰ
ＲＯＸ−ｄｄＧＴＰ                    ＪＯＥ−ｄｄＧＴＰ
Ｒ６Ｇ標識                            Ｒ１１０標識
Ｒ６Ｇ−ｄｄＵＴＰ                    Ｒ１１０−ｄｄＵＴＰ
Ｒ６Ｇ−ｄｄＣＴＰ                    Ｒ１１０−ｄｄＣＴＰ
Ｒ６Ｇ−ｄｄＡＴＰ                    Ｒ１１０−ｄｄＡＴＰ
Ｒ６Ｇ−ｄｄＧＴＰ                    Ｒ１１０−ｄｄＧＴＰ
ビオチン標識                          ＤＮＰ標識
ビオチン−Ｎ６−ＡＴＰ                ＤＮＰ−Ｎ６−ｄｄＡＴＰ
デオキシヌクレオチド類似体
ＴＴＰ類似体                          ｄＡＴＰ類似体
フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ        クマリン−５−ｄＡＴＰ
クマリン−５−ｄＵＴＰ                ジエチルアミノクマリン−５−ｄＡＴＰ
テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ  フルオレセイン−１２−ｄＡＴＰ
テトラエチルローダミン−６−ｄＵＴＰ  フルオレセインクロロトリアジニル−４−ｄＡＴＰ
テキサスレッド−５−ｄＵＴＰ          LISSAMINE（商標）−ローダミン−５−ｄＡＴＰ
LISSAMINE（商標）−ローダミン−５−ｄＵＴＰ
ナフトフルオレセイン−５−ｄＡＴＰ
ナフトフルオレセイン−５−ｄＵＴＰ    ピレン−８−ｄＡＴＰ
フルオレセインクロロトリアジニル−４−ｄＵＴＰ
テトラメチルローダミン−６−ｄＡＴＰ
ピレン−８−ｄＵＴＰ                  テキサスレッド−５−ｄＡＴＰ
ジエチルアミノクマリン−５−ｄＵＴＰ  ＤＮＡ−Ｎ６−ｄＡＴＰ
アミノアリルｄＵＴＰ                  ビオチン−Ｎ６−ｄＡＴＰ
ｄＣＴＰ類似体                        ｄＧＴＰ類似体
クマリン−５−ｄＣＴＰ                クマリン−５−ｄＧＴＰ
フルオレセイン−１２−ｄＣＴＰ        フルオレセイン−１２−ｄＧＴＰ
テトラメチルローダミン−６−ｄＣＴＰ  テトラメチルローダミン−６−ｄＧＴＰ
テキサスレッド−５−ｄＣＴＰ          テキサスレッド−５−ｄＧＴＰ
LISSAMINE（商標）−ローダミン−５−ｄＣＴＰ
LISSAMINE（商標）−ローダミン−５−ｄＧＴＰ
ナフトフルオレセイン−５−ｄＣＴＰ
フルオレセインクロロトリアジニル−４−ｄＣＴＰ
ピレン−８−ｄＣＴＰ                  ジエチルアミノクマリン−５−ｄＣＴＰ
フルオレセイン−Ｎ４−ｄＣＴＰ
ビオチン−Ｎ４−ｄＣＴＰ
ＤＮＰ−Ｎ４−ｄＣＴＰ
アミノアリルｄＣＴＰ
アミノヘキシルｄＣＴＰ
リボヌクレオチド類似体
ＣＴＰ類似体                          ＵＴＰ類似体
クマリン−５−ＣＴＰ                  フルオレセイン−１２−ＵＴＰ
フルオレセイン−１２−ＣＴＰ          クマリン−５−ＵＴＰ
テトラメチルローダミン−６−ＣＴＰ    テトラメチルローダミン−６−ＵＴＰ
テキサスレッド−５−ＣＴＰ            テキサスレッド−５−ＵＴＰ
LISSAMINE（商標）−ローダミン−５−ＣＴＰ
LISSAMINE（商標）−５−ＵＴＰ
ナフトフルオレセイン−５−ＣＴＰ      ナフトフルオレセイン−５−ＵＴＰ
フルオレセインクロロトリアジニル−４−ＣＴＰ
フルオレセインクロロトリアジニル−４−ＵＴＰ
ピレン−８−ＣＴＰ                    ピレン−８−ＵＴＰ
フルオレセイン−Ｎ４−ＣＴＰ          アミノアリルＵＴＰ
ビオチン−Ｎ４−ＣＴＰ
アミノアリルＣＴＰ
ＡＴＰ類似体
クマリン−５−ＡＴＰ
フルオレセイン−１２−ＡＴＰ
テトラメチルローダミン−６−ＡＴＰ
テキサスレッド−５−ＡＴＰ
LISSAMINE（商標）−ローダミン−５−ＡＴＰ
フルオレセイン−Ｎ６−ＡＴＰ
ビオチン−Ｎ６−ＡＴＰ
ＤＮＰ−Ｎ６−ＡＴＰ
【０２０８】
本発明に従い使用できるさらなる特殊なヌクレオチドとしては、それらには限定されないが、７−デアザ−ｄＡＴＰ、７−デアザ−ｄＧＴＰ、５’−メチル−２’−デオキシシチジン−５’−三リン酸およびＤＩＧ標識ヌクレオチドがある。さらなる特殊なヌクレオチドまたは上で記載したものの変形形態は、すべて本明細書で参照により組み込まれている米国特許６，３８３，７４９Ｂ２、WrightおよびBrown, 1990年、およびPharmacol.Ther. ４７：４４７で教示される。リボヌクレオチドは一般にＤＮＡポリメラーゼによって組み込まれないので、特殊なヌクレオチドとしての資格を有することが特に指摘される。
【０２０９】
アミノアリルｄＵＴＰ、アミノアリルＵＴＰなどのアミノアリル修飾ヌクレオチド、アミノヘキシルｄＣＴＰなどのアミノヘキシル修飾ヌクレオチドは、ＮＨＳエステルまたはＳＴＰエステルの脱離基を含む任意の蛍光色素と結合させることができる。これらの蛍光色素には、ARES Alexa Fluor ＤＮＡラベリングキット（Molecular Probes, Eugene, ＯＲ；カタログ番号Ａ−２１６７５、２１６７４、２１６６５、２１６６６、２１６６７、２１６７７、２１６６８、２１６６９、２１６７６）、およびCYDYE mono-Reactive Dye ５−パック（Amersham Pharmacia Biotech；カタログ番号ＰＡ２３００１、２３５０１、２５００１、２５５０１）中のものが含まれる。
【０２１０】
野生型酵素または本発明による変異酵素の発現
本発明によるＤＮＡポリメラーゼの変異形を発現および単離するために、当技術分野で公知の方法を適用することができる。本明細書で記載される方法は、本発明で有用な野生型酵素の発現のために適用することもできる。多くの細菌発現ベクターは、外来配列によってコードされるタンパク質の誘導可能な高レベル発現を可能にする配列要素、または配列要素の組合せを含む。例えば、上記のように、組み込まれた誘導可能な形態のＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現する細菌は、Ｔ７プロモーターに結合した変異ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を有する発現ベクターで形質転換することができる。適当なインデューサー、例えばｌａｃ誘導可能なプロモーターのためのイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によるＴ７  ＲＮＡポリメラーゼの誘導は、Ｔ７プロモーターからの変異遺伝子の高発現を誘導する。
【０２１１】
当業者は、細菌の適当な宿主系統を当技術分野で利用できるものから選択することができる。それには限定されない例として、大腸菌系統ＢＬ−２１は大腸菌の他の系統と比較してプロテアーゼを欠失しているので、外来性タンパク質の発現のために通常用いられる。誘導可能なＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を抱えるＢＬ−２１系統には、ＷＪ５６およびＥＲ２５６６が含まれる（GardnerおよびJack、1999年、前掲）。特定のポリメラーゼ遺伝子のために使用されるコドンが大腸菌遺伝子で通常見られるものと異なる状況のためには、より稀なアンチコドンを有するｔＲＮＡ（例えば、ａｒｇＵ、ｉｌｅＹ、ｌｅｕＷおよびｐｒｏＬのｔＲＮＡ遺伝子）をコードするｔＲＮＡ遺伝子を運搬するように修飾され、クローン化されたタンパク質遺伝子、例えばクローン化された古細菌の酵素遺伝子の高効率発現を可能にしたＢＬ−２１の系統がある（稀なコドンのｔＲＮＡを有するいくつかのＢＬ２１−ＣＯＤＯＮ  ＰＬＵＳＴＭ細胞系統は、例えばStratageneから入手可能である）。
【０２１２】
本発明の突然変異ＤＮＡポリメラーゼの精製のために適当な、当業者に公知の多くの方法がある。例えば、Lawyerら（1993年、PCR Meth & App. ２：２７５）の方法は、当初、Ｔａｇポリメラーゼの単離のために設計されたので、大腸菌で発現するＤＮＡポリメラーゼの単離に適する。あるいは、Kongら（1993年、J.Biol.Chem.２６８：1965年、本明細書で参照により組み込まれている）の方法を用いることができ、それは宿主タンパク質を破壊するために熱変性段階を使用し、高活性で約８０％純粋なＤＮＡポリメラーゼを単離するために２つのカラム精製段階（ＤＥＡＥセファロースカラムおよびヘパリンセファロースカラム）を使用する。さらに、ＤＮＡポリメラーゼ変異体は硫安分画とそれに続くＱセファロースおよびＤＮＡセルロースカラムによって、または、HiTrap Ｑカラム上への混在物の吸着とそれに続くHiTrapヘパリンカラムからの傾斜溶離によって単離することができる。
【０２１３】
一実施形態では、Ｐｆｕ変異体は、本明細書で参照により完全に組み込まれている米国特許第５，４８９，５２３号で記載されているように発現および精製される。
【０２１４】
他の実施形態では、ＪＤＦ−３変異体は、本明細書で参照により完全に組み込まれている米国特許出願０９／８９６９２３で記載されているように発現および精製される。
【０２１５】
キット
本発明は本明細書で、本発明の組成物の１つまたは複数の容器を有し、一部の実施形態ではＲＴ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ増幅、ｃＤＮＡ標識およびＲＮＡ標識を含むポリヌクレオチド合成のために用いる様々な試薬の容器を含む、パッケージユニットを含むキット形式も企図する。
【０２１６】
本発明のキットは、それらには限定されないが、ｃＤＮＡライブラリーの構築のための逆転写鋳型ＲＮＡ、ディファレンシャルディスプレイＰＣＲのためのＲＮＡの逆転写、標的ＲＮＡを含むことが疑われる試料中の標的ＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲによる同定、ＲＮＡ増幅、センスおよびアンチセンスＲＮＡの生成、マイクロアレイおよびｉｎ  ｓｉｔｕアッセイのための核酸の標識などを含む方法、ならびにＲＮＡが使用可能な他の方法で利用されることを企図する。一部の実施形態では、ＲＴ、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ増幅およびＲＮＡ標識のためのキットは、逆転写の方法で必要な必須の試薬を含む。例えば、一部の実施形態において、キットは増加したＲＴ活性を有するポリメラーゼを含む容器を含む。一部の実施形態では、ポリメラーゼの濃度は、約０．１から１００ｕ／μｌの範囲である。他の実施形態において、その濃度は約５ｕ／μｌである。一部の実施形態では、逆転写のためのキットは、ＲＴ反応緩衝液を含む容器も含む。好ましくは、これらの試薬はＲＮアーゼ活性で汚染されていない。本発明の他の実施形態では、反応緩衝液は約５〜１５ｍＭの緩衝試薬（好ましくは２５℃でｐＨが約７．５〜９．０の約１０ｍＭトリス−ＨＣｌ）、約２０〜１００  ｍＭの濃度の一価の塩（好ましくは約５０ｍＭ  ＮａＣｌまたはＫＣｌ）、約１．０〜１０．０ｍＭの濃度の二価のカチオン（好ましくはＭｇＣｌ２）、それぞれ約０．０５〜３．０ｍＭの濃度（好ましくはそれぞれ約０．２ｍＭ）のｄＮＴＰ類、ならびに約０．００１〜１．０容量％（好ましくは約０．０１〜０．１％）の濃度の界面活性剤を含む。一部の実施形態では、キットは約０．０５〜３．０ｍＭの濃度の特殊なヌクレオチドを含む。好ましくは、特殊なヌクレオチドは、アミノアリル修飾ヌクレオチドである。一部の実施形態では、品質管理のために、また実験試料との比較のために、精製されたＲＮＡ標準セットが提供される。一部の実施形態では、キットはアッセイ方法（例えば逆転写、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＮＡ増幅、標識化）を実施するための説明書を含む、単一の容器で包装される。一部の実施形態では試薬は容器に入れて提供されており、直接使用または希釈後の使用に適当な強さを有する。
【０２１７】
本発明の組成物またはキットは、ＲＴ−ＰＣＲの生成物収量、進化性および特異性を改善するために、ＤＭＳＯ（好ましくは約２０％）、ホルムアミド、ベタイン、トレハロース、低分子量アミド、スルホンまたはＰＣＲ強化因子（ＰＥＦ）などの化合物をさらに含むことができる。ＤＭＳＯが好ましい。
【０２１８】
本発明の組成物またはキットは、バクテリオファージＴ４からの遺伝子３２タンパク質（国際公開ＷＯ００／５５３０７、本明細書で参照により組み込まれている）および大腸菌ＳＳＢタンパク質などのＤＮＡ結合タンパク質をさらに含むことができる。他のタンパク質添加剤としては、古細菌のＰＣＮＡ、ＲＮアーゼＨ、エキソヌクレアーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは他の逆転写酵素をあげることができる。キットは、ＤＮＡポリメラーゼが、例えば、Ｎｃｐ７、ｒｅｃＡ、古細菌の配列非特異性二本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、Sulfolobus solfactaricusからのＳｓｏ７ｄ、国際公開ＷＯ０１／９２５０１、本明細書で参照により組み込まれている）またはトポイソメラーゼＶからのヘリックス−ヘアピン−ヘリックスドメイン（Pavlovら、PNAS、2002年）と融合したファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼＬＹＰ変異体（例えばＪＤＦ−３ポリメラーゼのＬ４０８変異体、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０９変異体）融合を含むこともできる。
【０２１９】
組成物またはキットは、以下のアイテムの１つまたは複数を含むこともできる：ポリヌクレオチド前駆体、特殊なヌクレオチド、蛍光標識、プライマー、緩衝液、説明書および対照。キットは、本発明に従って方法を実施するために適当な割合で混合した試薬の容器を含むことができる。試薬容器は、好ましくは、本発明の方法を実施するときの測定段階を不要にする、単位量で試薬を含む。
【０２２０】
増幅反応への適用
ｃＤＮＡへのＲＮＡ鋳型の逆転写は、分子生物学で用いられる多くの手法で不可欠の部分である。したがって、本発明で提供される逆転写手法、組成物およびキットは、様々な用途がある。例えば、本発明の逆転写手法および組成物は、ｃＤＮＡライブラリーベクターへのクローニングのためにｃＤＮＡ挿入断片を生成するために利用されることを企図する（例えばλｇｔ１０［Huynhら、ＤＮＡクローニング技術：実用的アプローチ（ＤＮＡ  Cloning Techniques:A Practical Approach）、D. Glover編、IRL Press, Oxford、４９、1985年］、λｇｔ１１［YoungおよびDavis、Proc.Nat’l.Acad.Sci., ８０：１１９４、1983年］、ｐＢＲ３２２［Watson、Gene ７０：３９９−４０３、1988年］、ｐＵＣ１９［Yarnisch-Perronら、Gene ３３：１０３−１１９、1985年］およびＭ１３［Messingら、Nucl.Acids.Res. ９：３０９−３２１、1981年］）。本発明は、ＲＴ−ＰＣＲを通した試料中の標的ＲＮＡの同定の用途もある（例えば、本明細書で参照により組み込まれている米国特許第５，３２２，７７０号）。さらに、本発明はディファレンシャルディスプレイＰＣＲ（例えば、LiangおよびPardee、Science ２５７（５０７２）：９６７−７１（1992年））、ＦＩＳＨ分析（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）およびマイクロアレイおよび他のハイブリダイゼーション手法などの手法のためにｃＤＮＡ鋳型を提供する用途がある。増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、そのようなポリメラーゼを含む組成物またはキットは、任意の適当な用途、例えばそれらには限定されないが以下の例に適用することができる。
【０２２１】
１．逆転写
本発明は、逆転写反応のための耐熱性ＤＮＡポリメラーゼの使用を企図する。したがって、本発明の一部の実施形態において、増加したＲＴ活性を有する耐熱性ＤＮＡポリメラーゼが提供される。一部の実施形態では、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼは、表ＩＩ〜ＩＶにリストしたＤＮＡポリメラーゼ、例えばＰｆｕまたはＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼから選択される。
【０２２２】
ＲＮＡを逆転写するために増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼが利用される本発明の一部の実施形態では、逆転写反応は約５０℃から８０℃で、好ましくは約６０℃から７５℃で行われる。各ＤＮＡポリメラーゼのための最適反応温度は当技術分野で公知であり、それらは本発明の突然変異ＤＮＡポリメラーゼのための適温として頼ることができる。逆転写のための好ましい条件は、２０％ＤＭＳＯを含む１×のＭＭＬＶ  ＲＴ緩衝液（５０ｍＭトリスｐＨ８．３、７５ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２）である。
【０２２３】
他の実施形態では、増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の逆転写は、そのＲＮＡ分子に実質的に相補的であるｃＤＮＡ分子を生成する。他の実施形態では、増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、次にｃＤＮＡ分子に相補的な第２の鎖ＤＮＡの合成を触媒して二本鎖ＤＮＡ分子を形成する。本発明の他の実施形態では、増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、下記のようにＰＣＲで二本鎖ＤＮＡ分子の増幅を触媒する。一部の実施形態では、ＰＣＲは逆転写酵素反応と同じ反応混合液中で行われる（すなわち、単管反応が実施される）。他の実施形態では、ＰＣＲは逆転写反応から取り出した一定量について別の反応混合液中で実施される（すなわち、２管反応が実施される）。
【０２２４】
一部の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、例えば、マイクロアレイ用の標識ｃＤＮＡを生成するために用いることができる。一実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、特殊なヌクレオチド、例えばアミノアリルｄＵＴＰを合成された鎖、例えばｃＤＮＡ、センスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡに組み込んで、修飾された核酸を生成する。他の実施形態では、蛍光標識などの検出可能な標識の結合段階は、アミノアリルヌクレオチドの組込みに続く。蛍光結合段階は、特殊なヌクレオチドへの蛍光色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５その他の結合をもたらす。そのような手法は当技術分野で日常用いられ、FAIRPLAYマイクロアレイラベリングキット（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla；カタログ番号２５２００２）の製品文献、Manduchiら、Physiol Genomics：１０：１６９−１７９（2002年６月１８日）およびhttp://cmgm.stanford-edu/pbrown/protocolsで見られ、これらはすべて本明細書で参照により組み込まれている。他の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、検出可能な標識に結合した特殊なヌクレオチドを組み込む。
【０２２５】
他の実施形態では、オリゴｄＴ、配列特異的プライマーなどの少なくとも１つの特殊なヌクレオチドを含むプライマーを伸長させるために、本発明のＤＮＡポリメラーゼを用いて修飾された核酸が生成される。本明細書で記載されるＤＮＡポリメラーゼ変異体は、野生型酵素と比較してより効率的な標識化または標識ヌクレオチドのより均一な組込みという利点があると考えられる。
【０２２６】
２．ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲ
逆転写反応はＰＣＲ増幅に適合する温度で行われるので、本発明の増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼはＲＴ−ＰＣＲに有用である。他の利点は、ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅のために同じ酵素を用いることが可能なことである。さらに、耐熱性のファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼが機能する高温はＲＮＡ二次構造の完全な変性を可能にし、それによって進化性を強化する。本発明は、逆転写および増幅が単一の、連続的方法で実施される、単一反応ＲＴ−ＰＣＲを企図する。本発明のＲＴ−ＰＣＲ反応は、それらには限定されないが、ｍＲＮＡ発現を分析するための診断技法、ｃＤＮＡライブラリーの合成、ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅（すなわちＲＡＣＥ）、および当技術分野で公知の他の増幅ベースの手法を含めて、多くの手法の基礎としての役目を果たす。本発明の方法および試薬によって任意の種類のＲＮＡを、例えば、それらには限定されないが、ＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡを逆転写および増幅することができる。ＲＮＡは任意の供与源、例えばそれらには限定されないが、細菌、ウイルス、真菌類、原生動物、酵母、植物、動物、血液、組織およびインビトロ合成の核酸からのものでよい。
【０２２７】
本発明の増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ用の適当な酵素を提供する。ＰＣＲ法は米国特許第４，６８３，１９５号および４，６８３，２０２号で記載され、それらの開示は本明細書で参照により組み込まれている。一部の実施形態では、核酸または核酸混合物に含まれる少なくとも１つの特異的核酸配列を増幅して、二本鎖ＤＮＡを生成する。標的ＤＮＡの変性、プライマーのハイブリダイゼーションおよび相補鎖の合成を含むＰＣＲ法では、プライマー、鋳型、ヌクレオシド三リン酸、適当な緩衝液と反応条件、およびポリメラーゼが用いられる。各プライマーの伸長生成物は、所望の核酸配列の生成のための鋳型になる。ＰＣＲで使用されるポリメラーゼが熱安定酵素であるならば、熱はポリメラーゼ活性を破壊しないので、ポリメラーゼを各変性段階の後に加える必要はない。増加したＲＴ活性を有する耐熱性のＤＮＡポリメラーゼの使用は、各冷却段階で新しい酵素を必要とせずに、加熱／冷却サイクルの反復を可能にする。このことは、各冷却段階で新しい酵素を各反応管に加えなければならない中温菌の酵素（例えばクレノウ）の使用に比べて、大きな利点となる。
【０２２８】
本発明の一部の実施形態では、逆転写のためのプライマーは、増幅のためのプライマーの役目も果たす。他の実施形態では、逆転写のために用いられる１つまたは複数のプライマーは、増幅のために用いられるプライマーとは異なる。一部の実施形態では、プライマーはＲＮＡプロモーター要素を含む。他の実施形態において、プライマーは少なくとも１つの特殊なヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ＲＮＡ混合物中の２つ以上のＲＮＡをＲＴ−ＰＣＲによって増幅または検出することができる。他の実施形態では、ＲＮＡ混合物中の複数のＲＮＡを多重手法で増幅することができる（例えば、本明細書で参照により組み込まれている米国特許第５，８４３，６６０号）。
【０２２９】
合成／増幅反応の忠実度を増加させるために、当業者は本発明の酵素混合物に加えて他のＰＣＲパラメータを使用することもできる。ＰＣＲ忠実度は、ｄＮＴＰ濃度の変化、各反応で使用される酵素の単位、ｐＨおよび反応液中に存在するＭｇ２＋とｄＮＴＰとの比率などの要因の影響を受ける可能性があることが報告された。逆転写段階の忠実度はエキソヌクレアーゼを逆転写に加えることによって増加することができ、または、本明細書で記載されるポリメラーゼ変異体（例えばＪＤＦ−３ポリメラーゼのＬ４０８変異体、ＰｆｕポリメラーゼのＬ４０９変異体）のエキソヌクレアーゼ活性を用いてＤＮＡ／ＲＮＡ二重鎖内の不正対合ヌクレオチドを切り取ることができる。
【０２３０】
Ｍｇ２＋濃度は、プライマー−鋳型相互作用を安定させることによって鋳型ＤＮＡへのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングに影響を及ぼし、また、ポリメラーゼと鋳型−プライマーとの複製複合体を安定させる。したがって、それは非特異的アニーリングを増加させて、望ましくないＰＣＲ生成物を生成する（複数のバンドをゲル上で示す）。非特異的増幅が起こるときは、増幅の正確度および特異性を増加させるためにＭｇ２＋を低下させる必要があるか、またはＥＤＴＡを加えてＭｇ２＋をキレート化することができる。
【０２３１】
Ｍｎ２＋またはＣｏ２＋などの他の二価のカチオンも、ＤＮＡ重合に影響を及ぼす。各ＤＮＡポリメラーゼのための適当なカチオンは、当技術分野で公知である（例えば、ＤＮＡ複製（DNA Replication）第２版、上記）。二価のカチオンは、ＭｇＣｌ２、Ｍｇ（ＯＡｃ）２、ＭｇＳＯ４、ＭｎＣｌ２、Ｍｎ（ＯＡｃ）２またはＭｎＳＯ４などの塩の形態で提供される。トリス−ＨＣｌ緩衝液中の使用できるカチオン濃度は、ＭｎＣｌ２では０．５から７ｍＭ、好ましくは０．５から２ｍＭ、ＭｇＣｌ２では０．５から１０ｍＭである。Bicine／ＫＯＡｃ緩衝液中の使用できるカチオン濃度は、Ｍｎ（ＯＡｃ）２では１から２０ｍＭ、好ましくは２から５ｍＭである。
【０２３２】
ＤＮＡポリメラーゼによって要求される一価カチオンは、カリウム、ナトリウム、アンモニウムまたはリチウムの塩化物または酢酸塩によって供給される。ＫＣｌの場合、濃度は１および２００ｍＭの間、好ましくは濃度は４０および１００ｍＭの間であるが、最適濃度は反応で用いられるポリメラーゼによって異なる。
【０２３３】
デオキシリボヌクレオチド三リン酸（ｄＮＴＰ）は、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰの塩、例えば二ナトリウムまたはリチウム塩の溶液として加えられる。ｄＮＴＰは、１つまたは複数の特殊なヌクレオチドを含むこともできる。本方法では、それぞれ１μＭ〜２ｍＭの範囲の最終濃度が適当であり、１００〜６００μＭが好ましいが、ヌクレオチドの最適濃度は、ＰＣＲ反応では総ｄＮＴＰおよび二価金属イオン濃度によって、また、緩衝液、塩類、特定のプライマーおよび鋳型によって異なってもよい。より長い生成物の場合、すなわち１５００ｂｐを超える場合、トリス−ＨＣｌ緩衝液を用いるときは５００μＭの各ｄＮＴＰが好ましい。
【０２３４】
ｄＮＴＰは二価のカチオンをキレート化するので、用いられる二価のカチオンの量は反応内のｄＮＴＰ濃度に従って変える必要がある。ｄＮＴＰの過剰量（例えば、１．５ｍＭを超える量）は、誤り率を増加させ、おそらくＤＮＡポリメラーゼを抑制する可能性がある。ｄＮＴＰを（例えば、１０〜５０μＭまで）を低下させることは、したがって、誤り率を減らすことができる。より大きな鋳型を増幅するためのＰＣＲ反応は、より多くのｄＮＴＰを必要とする。
【０２３５】
１つの適当な緩衝剤はトリス−ＨＣｌであり、好ましくはｐＨ８．３であるが、ｐＨは８．０〜８．８の範囲でよい。トリス−ＨＣｌの濃度は５〜２５０ｍＭであるが、１０〜１００ｍＭが最も好ましい。他の好ましい緩衝剤は、Bicine−ＫＯＨおよびトリシンである。
【０２３６】
鋳型ＧＣ含量が高い場合は、変性時間を増加してもよい。高ＧＣ含量のプライマーまたはより長いプライマーのためには、高いアニール温度が必要とされることがある。勾配ＰＣＲは、アニール温度を決定するのに有用な方法である。より多くのＰＣＲ生成物の増幅のためには、伸長時間を延ばす必要がある。しかし、酵素への損傷を制限するために、可能な場合はいつでも伸長時間を短くする必要がある。
【０２３７】
繰り返す回数は、鋳型ＤＮＡ分子の数が非常に少ない場合は増加させ、より多くの鋳型ＤＮＡを用いる場合は減少させることができる。
【０２３８】
増幅効率を改善するために、ＰＣＲ強化因子を用いることもできる。本明細書で使用する「ＰＣＲ強化因子」または「ポリメラーゼ強化因子」（ＰＥＦ）は、ポリヌクレオチドポリメラーゼ強化活性を有する複合体またはタンパク質を指す（Hogrefeら、1997年、Strategies １０：９３−９６、および米国特許第６，１８３，９９７号、両方とも本明細書で参照により組み込まれている）。Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼについては、ＰＥＦはＰ４５を未変性の形で（Ｐ５０およびＰ４５の複合体として）、または組換えタンパク質として含む。ＰｆｕのＰ５０およびＰ４５の未変性複合体では、Ｐ４５だけがＰＣＲ強化活性を示す。Ｐ５０タンパク質は、構造が細菌のプラビンタンパク質に類似する。Ｐ４５タンパク質は構造がｄＣＴＰデアミナーゼおよびｄＵＴＰアーゼに類似するが、ｄＵＴＰをｄＵＭＰおよびピロリン酸に変換するｄＵＴＰアーゼとしてだけ機能する。本発明に従い、ＰＥＦは以下のものからなる群から選択することもできる：古細菌供与源（例えばPyrococcus furiosus）から得られる単離または精製された天然のポリメラーゼ強化タンパク質；Ｐｆｕ  Ｐ４５またはポリメラーゼ強化活性を有するその類似体と同じアミノ酸配列を有する全合成または部分合成のタンパク質；前記天然のまたは全合成もしくは部分合成のタンパク質の１つまたは複数のポリメラーゼ強化混合物；前記天然のまたは全合成もしくは部分合成のタンパク質の１つまたは複数のポリメラーゼ強化タンパク複合体；あるいは前記天然のタンパク質の１つまたは複数を含む、ポリメラーゼを強化する部分精製細胞抽出物（米国特許第６，１８３，９９７号、前掲）。ＰＥＦのＰＣＲ強化活性は、当技術分野で公知の手段によって定義される。ＰＥＦの単位の定義は、ｄＵＴＰからのピロリン酸（ＰＰｉ）の生成を観察することによって測定される、ＰＥＦ（Ｐ４５）のｄＵＴＰアーゼ活性に基づく。例えば、ＰＥＦをｄＵＴＰ（１×クローン化Ｐｆｕ  ＰＣＲ緩衝液中の１０ｍＭのｄＵＴＰ）と共にインキュベートし、その間、ＰＥＦはｄＵＴＰをｄＵＭＰおよびＰＰｉに加水分解する。形成されるＰＰｉの量を、Sigma（＃Ｐ７２７５）から市販されている結合型酵素アッセイ系を用いて定量する。活性の１単位は、機能的に１時間あたりに生成する４．０ｎｍｏｌｅのＰＰｉ（８５℃）と定義される。
【０２３９】
他のＰＣＲ添加剤も、ＰＣＲ反応の正確度および特異性に影響を及ぼすことがある。増幅反応混合物には０．５ｍＭ未満のＥＤＴＡが存在してもよい。ツイーン２０（商標）およびノニデット（商標）Ｐ−４０のような界面活性剤が、酵素希釈緩衝液に存在する。非イオン性界面活性剤の最終濃度は約０．１％以下が適当であるが、０．０１〜０．０５％が好ましく、ポリメラーゼ活性に干渉しない。同様に、グリセリンが酵素標品にしばしば存在し、通常、反応混合物で１〜２０％の濃度に希釈される。グリセリン（５〜１０％）、ホルムアミド（１〜５％）またはＤＭＳＯ（２〜２０％）を、ＧＣ含量が高いか長さが長い（例えば＞１ｋｂ）鋳型ＤＮＡのためにＰＣＲに加えることができる。好ましくは約２０％のＤＭＳＯを、本明細書で記載される変異体ファミリーＢポリメラーゼを用いてｃＤＮＡ合成段階に加えることができる。これらの添加剤は、プライマー−鋳型ハイブリダイゼーション反応のＴｍ（融点）およびポリメラーゼ酵素の耐熱性を変える。ＢＳＡ（最高０．８μｇ／μｌ）は、ＰＣＲ反応の効率を改善することができる。ベタイン（０．５〜２Ｍ）も、長い鋳型またはＧＣ含量の高い鋳型のＰＣＲに有用である。塩化テトラメチルアンモニウム（ＴＭＡＣ、＞５０ｍＭ）、塩化テトラエチルアンモニウム（ＴＥＡＣ）およびトリメチルアミンＮ−オキシド（ＴＭＡＮＯ）も用いることができる。上で指摘した各添加剤の最適濃度を決定するために、試験ＰＣＲ反応を実施することができる。
【０２４０】
本明細書で記載したＬＹＰモチーフ変異体（例えばＪＤＦ−３ポリメラーゼのＬ４０８変異体、ＰｆｕポリメラーゼのＬ４０９変異体）をｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ増幅のために用いることができるが、忠実度が強化された増幅のために、そのようなポリメラーゼ変異体はＰＣＲのために使用される１つまたは複数の他の酵素、例えば大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ、クレノウ、Ｅｘｏ−Ｐｆｕ  Ｖ９３、Ｅｘｏ−ＰｆｕまたはＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼとの混合物または混和物で用いることもできる。
【０２４１】
本発明は、それらには限定されないが抗体（ホットスタートＰＣＲのための）およびｓｓｂ（高特異性）を含む添加剤を提供する。本発明は、例えば参照により完全に本明細書に組み込まれている米国特許第６，３３３，１５８号（例えば、そこで記載されているＦ７、ＰＦＵ−ＲＦＣおよびＰＦＵ−ＲＦＣＬＳ）、および国際公開ＷＯ０１／０９３４７（例えば、そこで記載されている古細菌のＰＣＮＡ、古細菌のＲＦＣ、古細菌のＲＦＣ−ｐ５５、古細菌のＲＦＣ−ｐ３８、古細菌のＲＦＡ、古細菌のＭＣＭ、古細菌のＣＤＣ６、古細菌のＦＥＮ−１、古細菌のリガーゼ、古細菌のｄＵＴＰアーゼ、古細菌のヘリカーゼ２〜８および古細菌のヘリカーゼｄｎａ２）で記載されているようなファミリーＢ副因子と併用する変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼを企図する。他の添加剤としては、忠実度を増加させるＰｆｕ  Ｇ３８７Ｐなどのエキソヌクレアーゼがある。
【０２４２】
当技術分野で様々な特異的ＰＣＲ増幅の用途が利用できる（総説については、例えば本明細書で参照により組み込まれている、Erlich、1999年、Rev Imnnmogenet., １：１２７−３４; Prediger 2001年、Methods Mol.Biol. １６０：４９−６３；Jurecicら、2000年、Curr.Opin.Microbiol. ３：３１６−２１；Triglia、2000年、Methods Mol.Biol. １３０：７９−８３；MaClellandら、1994年、PCR Methods Appl. ４：３６６−８１；AbramsonおよびMyers、1993年、Current Opinion in Biotechnology ４：４１−４７を参照）。
【０２４３】
本発明はＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲの用途で用いることができ、このＰＣＲ用途としては、それらには限定されないが、以下のものがある。ｉ）非特異的増幅を減らすホットスタートＰＣＲ、ｉｉ）高いアニール温度から始まり、次に非特異的ＰＣＲ生成物を減らす段階でアニール温度を下げるタッチダウンＰＣＲ、ｉｉｉ）外部のプライマーセットおよび内部のプライマーセットを用いて信頼性の高い生成物を合成する入れ子ＰＣＲ、ｉｖ）既知の配列に連なる領域の増幅のための逆ＰＣＲ、この方法では、ＤＮＡを消化し、所望の断片をライゲーションにより環状化し、次に外側へ伸長する既知の配列と相補的なプライマーを用いたＰＣＲが続く。ｖ）ＡＰ−ＰＣＲ（任意に初回刺激される）／（ランダム増幅多形ＤＮＡ）。これらの方法は、任意のオリゴヌクレオチドを用いて増幅することによって、ほとんど知られていない標的配列を有する種からゲノムフィンガープリントを作成する。ｖｉ）ＰＣＲのために用いるｃＤＮＡを合成するために、ＲＮＡ誘導性ＤＮＡポリメラーゼ（例えば逆転写酵素）を用いるＲＴ−ＰＣＲ。この方法は、組織または細胞内の特定の配列の発現を検出する感度が極めて高い。ｍＲＮＡ転写産物を定量するために使用することもできるｖｉｉ）ＲＡＣ（ｃＤＮＡ末端の迅速な増幅）。これは、ＤＮＡ／タンパク質配列に関する情報が制限されるときに用いられる。この方法は、ｃＤＮＡの３’または５’末端を増幅して、それぞれ特定のプライマー１つだけ（および１つのアダプタープライマー）を有するｃＤＮＡの断片を生成する。次に重複するＲＡＣＥ生成物を組み合わせて、完全長ｃＤＮＡを生成することができる。ｖｉｉｉ）異なる組織で差別的に発現する遺伝子を特定するために用いられるＤＥ−ＰＣＲ（ディファレンシャルディスプレイＰＣＲ）。ＤＤ−ＰＣＲの第１段階はＲＴ−ＰＣＲを含み、次に短く、故意に非特異的なプライマーを用いて増幅を実施する。ｉｘ）同じ検体中のＤＮＡ配列の２つ以上の特有な標的が同時に増幅される多重ＰＣＲ。ＰＣＲの品質を検査するために、１つのＤＮＡ配列を対照として使用することができる。ｘ）同じプライマーセットをめぐって標的ＤＮＡ（競合的ＰＣＲ）と争う内部標準ＤＮＡ配列（大きさは異なる）を用いるＱ／Ｃ−ＰＣＲ（定量的、比較的）ｘｉ）遺伝子を合成するために用いられる繰り返しＰＣＲ。この方法で用いられるオリゴヌクレオチドは、遺伝子のひと繋がり（＞８０塩基）に、あるいは末端がオーバーラップ（約２０塩基）したセンスおよびアンチセンス鎖に相補的である。ｘｉｉ）不斉ＰＣＲ、ｘｉｉｉ）ｉｎ  ｓｉｔｕ  ＰＣＲ、ｘｉｖ）部位特異的ＰＣＲ突然変異誘発。
【０２４４】
一部の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、標識ＤＮＡを生成するために用いることができる。一実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、特殊なヌクレオチド、例えばアミノアリルｄＵＴＰを合成された鎖、例えばｃＤＮＡに組み込んで、修飾された核酸を生成する。他の実施形態では、蛍光標識などの検出可能な標識の結合段階は、アミノアリルヌクレオチドの組込みに続く。蛍光結合段階は、特殊なヌクレオチドへの蛍光色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５その他の結合をもたらす。そのような手法は当技術分野で日常用いられ、FAIRPLAYマイクロアレイラベリングキット（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla；カタログ番号２５２００２）の製品文献、Manduchiら、Physiol Genomics：１０：１６９−１７９（2002年６月１８日）およびhttp://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocolsで見られ、これらはすべて本明細書で参照により組み込まれている。他の実施形態では、本発明のＤＮＡポリメラーゼ変異体は、検出可能な標識に結合した特殊なヌクレオチドを組み込む。
【０２４５】
一部の実施形態では、オリゴｄＴ、配列特異的プライマーなどの少なくとも１つの特殊なヌクレオチドを含むプライマーを伸長させるために、本発明のＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＲＴなどのＤＮＡポリメラーゼを用いて修飾された核酸が生成される。
【０２４６】
３．プロモーター配列を用いるＲＮＡの増幅
本発明の増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡプロモーターを用いたＲＮＡ増幅に有用である。本発明のＲＮＡプロモーターベースの増幅反応は、それらには限定されないが、ｍＲＮＡ発現を分析するための診断技法、ｃＤＮＡライブラリーの合成および当技術分野で公知の他の増幅ベースの手法を含めて、多くの手法の基礎としての役目を果たす。それらには限定されないがＲＮＡ、ｒＲＮＡおよびｍＲＮＡを含めて任意の種類のＲＮＡを利用することができる。ＲＮＡは任意の供与源、例えばそれらには限定されないが、細菌、ウイルス、真菌類、原生動物、酵母、植物、動物、血液、組織およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成の核酸からのものでよい。
【０２４７】
本発明の増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼは、ＲＮＡプロモーターベースの増幅反応用の適当な酵素を提供する。ＲＮＡプロモーターベースの増幅反応は米国特許第５，５４５，５２２号および６，０２７，９１３号で記載され、それらの開示は本明細書で参照により組み込まれている。一部の実施形態では、核酸または核酸混合物に含まれる少なくとも１つの特異的核酸配列が増幅されて、アンチセンスＲＮＡを生成する。米国特許第５，５４５，５２２号で記載されている方法は、プライマー複合体の５’末端に組み込まれたＲＮＡポリメラーゼプロモーターを利用する。
【０２４８】
本発明の一般実施形態では、ｃＤＮＡ鎖は、オリゴヌクレオチドプライマー複合体、すなわちＲＮＡプロモーター領域に結合したプライマーを用いて、ｍＲＮＡの集合体から合成される。標的ｍＲＮＡがｍＲＮＡ集団全体であるならば、プライマーは、各ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリ（Ａ）テールと結合するポリチミジレート領域（例えば、約５〜２０、好ましくは約１０〜１５のＴ残基）でよい。プライマーは配列（５’−Ｔ（５〜２０）ＶＮ−３’）に固定されたプライマーでもよく、前式中、ＶはＧ、ＡまたはＣ、ＮはＧ、Ａ、ＣまたはＴである。あるいは、あらかじめ選択されたｍＲＮＡだけを増幅する場合は、プライマーは選択されたｍＲＮＡの一般的に３’末端の部分と実質的に相補的である。プロモーター領域は、使用するｍＲＮＡ集団との関係で転写を可能にする配向で、プライマーの上流の５’末端に位置する。このことは、常にそうであるとは限らないが、プライマーに作動可能的に結合したプロモーターＤＮＡ配列は、機能的プロモーター配列の相補体であることを意味する。第２のｃＤＮＡ鎖が合成されるとき、その第２のｃＤＮＡ鎖を鋳型として用いてＲＮＡ合成を開始するために、プロモーター配列はその鎖内で正しい配向にある。好ましくは、プロモーター領域は原核生物に由来し、より好ましくはＳＰ６、Ｔ３およびＴ７ファージからなる群に由来する（本明細書で参照により組み込まれているChamberlinおよびRyan、The Enzymes、P.Boyer編（Academic Press、ニューヨーク）ｐｐ．８７−１０８（1982年））。好ましいプロモーター領域は、そのＲＮＡポリメラーゼ結合部位（５’ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧ ３’）に対応する、Ｔ７ファージからの配列である。
【０２４９】
オリゴヌクレオチドプライマーおよび結合したプロモーター領域がｍＲＮＡとハイブリダイズすると、第１のｃＤＮＡ鎖が合成される。このｃＤＮＡの第１の鎖は、好ましくは逆転写の過程を通して生成される。逆転写は、本発明のＤＮＡポリメラーゼによって実施される。
【０２５０】
二本鎖（ｄｓ）ｃＤＮＡを形成する第２の鎖ｃＤＮＡは、様々な手段によって合成することができるが、ＲＮアーゼＨおよびＤＮＡポリメラーゼの添加によるのが好ましい。ＲＮアーゼはＲＮＡ／第１鎖ｃＤＮＡハイブリッドの破壊を補助し、ＤＮＡポリメラーゼは鋳型ＤＮＡ鎖から相補的ＤＮＡ鎖を合成する。デオキシヌクレオチドが成長する鎖の３’末端に加えられるにしたがい、第２の鎖が生成される。成長する鎖が第１の鎖ＤＮＡの５’末端に到達するにしたがい、第１の鎖の相補的なプロモーター領域は二本鎖プロモーター配列内に所望の配向性で複製される。
【０２５１】
第２の鎖ｃＤＮＡを合成するための他の手段は、ＲＮＡ／第１鎖ｃＤＮＡハイブリッドのＲＮＡをＲＮアーゼＨで除去するかニックを入れることによる。第２のプライマーを第１の鎖ｃＤＮＡと共にインキュベートする。第２のプライマーは、あらかじめ選択された標的配列と結合する１つまたは複数の変性塩基を３’末端に有することができる。同じプライマーが、５’末端にあらかじめ選択されたヌクレオチド配列、例えばＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むことができる。第２のプライマーは、標的配列と結合する１つまたは複数の固定されたヌクレオチドを３’末端に含むことができる。
【０２５２】
その後、プロモーター領域に結合することができるＲＮＡポリメラーゼを導入することによって、ｃＤＮＡはアンチセンスＲＮＡ（ａＲＮＡ）に転写される。ｃＤＮＡの第２の鎖は、最初のｍＲＮＡ集団の相補体であるａＲＮＡに転写される。ポリメラーゼは鋳型上でサイクルを繰り返す（すなわちプロモーター領域から再び転写を開始する）ので、増幅が起こる。
【０２５３】
転写のために用いられるＲＮＡポリメラーゼは、プライマー複合体で使用される特定のプロモーター領域に作動可能的に結合できなければならない。好ましいＲＮＡポリメラーゼはバクテリオファージで見られるもので、特にＴ３およびＴ７ファージである。実質的にいかなる組合せのポリメラーゼ／プロモーターを用いることができるが、ポリメラーゼは転写を始めるのに十分な特異性をそのプロモーターに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏで有するものとする。
【０２５４】
一実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは１つまたは複数の特殊なヌクレオチドを、修飾核酸を生成するａＲＮＡに組み込む。他の実施形態では、修飾された核酸分子は検出可能な標識、例えば蛍光色素と結合される。他の実施形態では、特殊なヌクレオチドは、ヌクレオチド組込みの時点で検出可能な標識と結合させる。
【０２５５】
一部の実施形態では、核酸または核酸混合物に含まれる少なくとも１つの特異的核酸配列を増幅して、センスＲＮＡを生成する。この方法は上記のものと類似するが、センスＲＮＡが生成され、２つの異なるプライマーセットが用いられる。この方法は、本明細書で参照により組み込まれている米国特許第６，０２７，９１３号で記載されている方法の修正に基づいて実施される。この方法は、米国特許第６，０２７，９１３号、カラム２１の５９行からカラム２２の１９行で詳述されている。最初に、オリゴ（ｄｔ）またはｍＲＮＡ特異的オリゴヌクレオチドプライマーを用いたオリゴヌクレオチドプライマー複合体を用いて、ｍＲＮＡ集合体からｃＤＮＡ合成を実施する。本発明の増加したＲＴ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを用いて、合成を実施する。第２に、ＰＣＲ反応を実施するが、オリゴヌクレオチドプライマーの一方または両方は増幅する領域に相補的な配列に結合されたプロモーターを含む。プロモーター領域は、原核生物に、好ましくはＳＰ６、Ｔ３およびＴ７からなる群に由来する。最後に、ファージプロモーターに特異的なＲＮＡポリメラーゼで転写反応を実施する。
【０２５６】
一実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、例えばマイクロアレイ用のために、ＲＮＡを標識するために用いることができる。他の実施形態では、ＲＮＡポリメラーゼは、特殊なヌクレオチド、例えばアミノアリルＵＴＰを合成された鎖、例えばセンスＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡに組み込む。他の実施形態では、蛍光標識などの検出可能な標識の結合段階は、アミノアリルヌクレオチドの組込みに続く。蛍光結合段階は、特殊なヌクレオチドへの蛍光色素、例えば、Ｃｙ３、Ｃｙ５その他の結合をもたらす。このような結合反応は当技術分野で日常用いられ、FAIRPLAYマイクロアレイラベリングキット（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla；カタログ番号２５２００２）の製品文献、Manduchiら、Physiol Genomics : １０：１６９−１７９（2002年６月１８日）およびhttp://cmgm.stanford.edu/pbrown/protocolsで見られ、これらはすべて本明細書で参照により組み込まれている。
【０２５７】
本発明が、いかなる特定の増幅系にも限定されるものではないことは理解されるだろう。他の系が開発されるにしたがい、それらの系は本発明の実施により利益を得ることができる。
【実施例】
【０２５８】
実施例１．逆転写酵素活性を有するｅｘｏ−およびｅｘｏ＋ＪＤＦ−３およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の構築
野生型（ｅｘｏ＋）ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼおよび３’−５’エキソヌクレアーゼ活性が実質的に欠いているＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（ｅｘｏ−）を、米国特許出願０９／８９６９２３で記載されているように調製した。点突然変異フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）およびトリプトファン（Ｗ）を、Quickchange部位特異的突然変異誘発キット（Stratagene）を用いて、ｅｘｏ−およびｅｘｏ＋Ｐｆｕのロイシン（Ｌ）４０９の位置、およびｅｘｏ−およびｅｘｏ＋ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼのＬ４０８の位置に導入した。Quickchangeキットでは、一対の突然変異誘発性のプライマーを用いて点突然変異を導入した（図１）。組み込まれた変異を特定するために、クローンを配列決定した。ＪＤＦ−３  Ｌ４０８Ｈの構築は、以前に記載されている（本明細書で参照により組み込まれている特許出願国際公開ＷＯ０１３２８８７を参照）。
【０２５９】
実施例２．変異体ＪＤＦ−３およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを含む細菌抽出物の調製
プラスミドＤＮＡをStrataPrep（登録商標）プラスミドミニプレップキット（Stratagene）で精製して、ＢＬ２６−CodonPlus−ＲＩＬ細胞を形質転換するために用いた。アンピシリン耐性のコロニーを、Turbo Amp（商標）（１００μｇ／μｌ）およびクロラムフェニコール（３０μｇ／μｌ）を含む１〜５リットルのＬＢ培地で、中程度のエアレーションを加えながら３０℃で増殖させた。細胞を遠心により収集して、使用時まで−８０℃で保存した。
【０２６０】
細胞ペレット（１２〜２４グラム）を、３容の溶解緩衝液（緩衝液Ａ：５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ８．２）、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１０ｍＭβＭＥ）で再懸濁した。リゾチーム（１ｍｇ／ｇ細胞）およびＰＭＳＦ（１ｍＭ）を加えて、細胞を４℃で１時間溶解した。細胞混合物を超音波処理して、破片を１５，０００ｒｐｍ、３０分の遠心（４℃）で除去した。ツイーン２０およびIgepal ＣＡ−６３０を０．１％の最終濃度になるように加え、上清を７２℃で１０分間加熱した。次に熱変性大腸菌タンパク質を１５，０００、３０分の遠心（４℃）で除去した。
【０２６１】
ＪＤＦ−３およびＰｆｕ変異体の発現は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（バンドは９５ｋＤで移動する）で確認した。
【０２６２】
実施例３．放射性ヌクレオチド組込みアッセイによるＲＴ活性の評価
精製および包括的なＲＴ−ＰＣＲ試験のために最も有望な候補を特定するために、部分精製されたＪＤＦ−３およびＰｆｕ変異体調製物（熱処理細菌抽出物）を分析した。変異体のＲＴ活性を評価するために、相対的なＲＮＡ／ＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合活性を、各変異体について測定した。
【０２６３】
ＤＮＡ依存性ＤＮＡ重合活性アッセイは、前に出版された方法（Hogrefe，Ｈ．Ｈ．ら、（０１）Methods in Enzymology、３４３：９１−１１６）によって実施した。相対的なｄＮＴＰ組込みは、ポリメラーゼ活性（活性化された仔ウシ胸腺ＤＮＡへの［３Ｈ］−ＴＴＰの組込み）の測定により判定した。適当なＤＮＡポリメラーゼ反応カクテルは、１×クローン化Ｐｆｕ反応緩衝液、それぞれ２００μＭのｄＮＴＰ、５μＭの［３Ｈ］ＴＴＰ（ＮＥＮ＃ＮＥＴ−２２１Ｈ、１ｍＣｉ／ｍｌ、２０．５Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）、２５０μｇ／ｍｌの活性化された仔ウシ胸腺ＤＮＡ（Pharmacia＃２７−４５７５−０１）を含む。ＷＴおよび変異体からの３つの異なる量の清澄化溶解物（図２および３）を、１０μｌの最終反応量で用いた。重合反応は、７２℃で３０分間、２反復で行った。
【０２６４】
伸長反応を氷上でクエンチして、５μｌの一定量を直ちにＤＥ８１イオン交換フィルター（２．３ｃｍ、Whatman＃３６５８３２３）の上へスポットした。組み込まれていない［３Ｈ］ＴＴＰは、２×ＳＣＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で６回洗浄し、続いて１００％エタノールで短時間洗浄して除去した。組み込まれた放射能は、シンチレーション計数で測定した。「総ｃｐｍ」（フィルター洗浄段階を削除する）および「最小ｃｐｍ」（上と同様にフィルターを洗浄する）を測定するために、酵素を欠いた反応液も試料インキュベーションと一緒に設定した。「補正ｃｐｍ」を決定するために、試料ｃｐｍから最小ｃｐｍを引いた。
【０２６５】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合アッセイは、以下の通りに実施した。相対的なｄＮＴＰ組込みは、ポリメラーゼ活性（ポリ（ｄＴ）：ポリ（ｒＡ）鋳型（apbiotech ２７−７８７８）への［３Ｈ］−ＴＴＰの組込み）の測定により判定した。適当なＤＮＡポリメラーゼ反応カクテルは、１×クローン化Ｐｆｕ反応緩衝液、８００μＭ  ＴＴＰ、５μＭ［３Ｈ］ＴＴＰ（ＮＥＮ＃ＮＥＴ−６０１Ａ、６５．８Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）、１０μｇポリ（ｄＴ）：ポリ（ｒＡ）を含む。ＷＴおよび変異体からの３つの異なる量の清澄化溶解物（図２および３）を、１０μｌの最終反応量で用いた。重合反応は、５０℃で１０分間、その後７２℃で３０分間、２反復で行った。
【０２６６】
伸長反応を氷上でクエンチして、５μｌの一定量を直ちにＤＥ８１イオン交換フィルター（２．３ｃｍ、Whatman＃３６５８３２３）の上へスポットした。組み込まれていない［３Ｈ］ＴＴＰは、２×ＳＣＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で６回洗浄し、続いて１００％エタノールで短時間洗浄して除去した。組み込まれた放射能は、シンチレーション計数で測定した。「総ｃｐｍ」（フィルター洗浄段階を削除する）および「最小ｃｐｍ」（上と同様にフィルターを洗浄する）を測定するために、酵素を欠いた反応液も試料インキュベーションと一緒に設定した。「補正ｃｐｍ」を決定するために、試料ｃｐｍから最小ｃｐｍを引いた。
【０２６７】
ｅｘｏ−およびｅｘｏ＋のＪＤＦ−３  Ｌ４０８ＦおよびＬ４０８ＹならびにＰｆｕ  Ｌ４０９ＦおよびＬ４０９Ｙの部分精製調製物は、野生型ＪＤＦ−３およびＰｆｕと比較して向上したＲＴ活性を示した（図２および３）。
【０２６８】
実施例４．ＪＤＦ−３およびＰｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の精製
ＪＤＦ−３およびＰｆｕ変異体は、米国特許第５，４８９，５２３号（ｅｘｏ−Ｐｆｕ  Ｄ１４１Ａ／Ｅ１４３Ａ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の精製）で記載されているように、または以下の通りに精製することができる。清澄化され、熱処理された細菌抽出物を、緩衝液Ｂ（緩衝液Ａおよび０．１％（ｖ／ｖ）Igepal ＣＡ−６３０、および０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０）で平衡化したQ-Sepharose（商標）Fast Flowカラム（約２０ｍｌのカラム）でクロマト分離した。フロースルー（flow-through）分画を収集して、次に緩衝液Ｃ（ｐＨ７．５である以外は緩衝液Ｂと同じ）で平衡化したＰ１１ホスホセルロースカラム（約２０ｍｌ）上へ直接ロードした。カラムを洗浄して、次に０〜０．７Ｍ  ＫＣｌ勾配／緩衝液Ｃで溶出した。ＤＮＡポリメラーゼ変異体を含む分画（ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより９５ｋＤ）を、緩衝液Ｄ（５０ｍＭトリスＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭβＭＥ、５％（ｖ／ｖ）グリセリン、０．２％（ｖ／ｖ）Igepal ＣＡ−６３０、０．２％（ｖ／ｖ）ツイーン２０および０．５Ｍ  ＮａＣｌ）に対して一晩透析し、次に緩衝液Ｄで平衡化したヒドロキシアパタイトカラム（約５ｍｌ）に適用した。カラムを洗浄して、ＤＮＡポリメラーゼ変異体は４００ｍＭ  ＫＰＯ４、（ｐＨ７．５）、５ｍＭβＭＥ、５％（ｖ／ｖ）グリセリン、０．２％（ｖ／ｖ）Igepal ＣＡ−６３０、０．２％（ｖ／ｖ）ツイーン２０および０．５Ｍ  ＮａＣｌを含む緩衝液Ｄ２で溶出した。精製したタンパク質はCentricon ＹＭ３０装置を用いてスピン濃縮し、最終透析緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．２）、０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、５０％（ｖ／ｖ）グリセリン、０．１％（ｖ／ｖ）Igepal ＣＡ−６３０および０．１％（ｖ／ｖ）ツイーン２０）に換えた。
【０２６９】
タンパク質試料は、大きさ、純度およびおよその濃度について、トリス−グリシン４〜２０％アクリルアミド勾配ゲルを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価した。ゲルは、銀染色またはSypro Orange（Molecular Probes）で染色した。タンパク質濃度は、ＢＣＡアッセイ（Pierce）を用いてＢＳＡ標準（Pierce）と比較して測定した。
【０２７０】
変異タンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる測定で約９０％の純度に精製した。
【０２７１】
実施例５．放射性ヌクレオチド組込みアッセイによる精製変異体のＲＴ活性の評価
ＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合アッセイは、以下の通りに実施した。相対的なｄＮＴＰ組込みは、ポリメラーゼ活性（［３３Ｐ］−ｄＧＴＰのポリ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣ）鋳型（apbiotech２７−７９４４）への組込み）の測定により決定した。適当なＤＮＡポリメラーゼ反応カクテルは、１×クローン化Ｐｆｕ反応緩衝液、８００μＭ  ｄＧＴＰ、１μＣｉ［３３Ｐ］ｄＧＴＰ（ＮＥＮ＃ＮＥＧ−６１４Ｈ、３０００Ｃｉ／ｍｍｏｌｅ）、１０μｇポリ（ｄＧ）：ポリ（ｒＣ）を含む。最終的な反応量は、１０μｌであった。重合反応は、５０℃で１０分間、その後７２℃で３０分間、２反復で行った。
【０２７２】
伸長反応を氷上でクエンチして、５μｌの一定量を直ちにＤＥ８１イオン交換フィルター（２．３ｃｍ、Whatman＃３６５８３２３）の上へスポットした。組み込まれていない［３３Ｐ］ｄＧＴＰは、２×ＳＣＣ（０．３Ｍ  ＮａＣｌ、３０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）で６回洗浄し、続いて１００％エタノールで短時間洗浄して除去した。組み込まれた放射能は、次にシンチレーション計数で測定した。「総ｃｐｍ」（フィルター洗浄段階を削除する）および「最小ｃｐｍ」（上と同様にフィルターを洗浄する）を測定するために、酵素を欠いた反応液も試料インキュベーションと一緒に設定した。「補正ｃｐｍ」を測定するために、試料ｃｐｍから最小ｃｐｍを引いた。
【０２７３】
ｅｘｏ−ＪＤＦ−３  Ｌ４０８ＨおよびＬ４０８Ｆの精製調製物は、野生型ＪＤＦ−３およびＰｆｕと比較して向上したＲＴ活性を示した（図４）。StrataScript（StratageneのＲＮアーゼＨからＭＭＬＶ−ＲＴを引く）２単位のＲＴ活性は、比較のための同じアッセイで測定した。
【０２７４】
実施例６．ＲＴ−ＰＣＲアッセイによる精製変異体のＲＴ活性の評価
各ＲＴアッセイは、１０μｌの総反応量で実施した。最終的な試薬濃度は以下の通りであった。１８ｐｍｏｌオリゴ（ｄＴ）１８、それぞれ１ｍＭのｄＮＴＰ、StrataScriptのためには１×StrataScript緩衝液（Stratagene）またはＰｆｕ、ＪＤＦ３  ＷＴおよび変異体のためには１×クローン化Ｐｆｕ緩衝液（Stratagene）中の５００ｎｇのヒト総ＲＮＡ。StrataScript反応液は、４２℃で４０分間インキュベートした。ＷＴ  Ｐｆｕ、ＪＤＦ３および変異体は、５０℃で５分間、続いて７２℃で３０分間インキュベートした。各ｃＤＮＡ合成反応の２μｌを、２．５単位のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、各２００μＭのｄＮＴＰ、各１００ｎｇのＧＡＰＤＨ−ＦおよびＧＡＰＤＨ−Ｒプライマー（図１）を１×Ｔａｑ ２０００緩衝液（Stratagene）内に含むＰＣＲで用いた。以下の温度サイクリングプロフィールを用いて増幅反応を実施した。９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、および７２℃で１分間のサイクルを３５回。各ＰＣＲの５μｌを１％アガロースゲルにかけ、臭化エチジウムで染色した（図５）。
【０２７５】
各反応のＤＮＡ増幅部分は同じ酵素（Ｔａｇ）で実施したので、これらの結果はｅｘｏ−ＪＤＦ３  Ｌ４０８Ｐはｅｘｏ−ＪＤＦ３  Ｌ４０８Ｈよりも高い逆転写効率を示すことを証明した（図５）。ｅｘｏ−ＪＤＦ３のＲＴ活性は、陰性対照（StrataScriptなし）と類似する。
【０２７６】
実施例７．精製したｅｘｏ＋Ｐｆｕ  Ｌ４０９ＹのＲＴ活性に及ぼすＤＭＳＯの影響の評価
変異体ファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼのＲＴ活性に及ぼすＤＭＳＯ濃度の影響を評価するために、異なる量のＤＭＳＯの存在下でｅｘｏ＋Ｐｆｕ  Ｌ４０９Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼを用いて、ｃＤＮＡ合成反応を実施した。反応は、２０μｌの総量で実施した。最終的な試薬濃度は以下の通りであった。１×StrataScript緩衝液（Stratagene）中の１０００ｎｇのｅｘｏ＋Ｐｆｕ  Ｌ４０９Ｙ、９０ｐｍｏｌのオリゴ（ｄＴ）１８、各０．８ｍＭのｄＮＴＰ、３μｇのＲＮＡサイズマーカー（Ambion、カタログ番号７１５０）。０〜２５％の範囲のＤＭＳＯを反応に加えた。反応液は、５０℃で３分間、続いて６５℃で６０分間インキュベートした。各反応の全体量を１％アルカリアガロースゲルにかけ、臭化エチジウムで染色した。
【０２７７】
図８で示す結果は、ＤＭＳＯを加えることはｅｘｏ＋Ｐｆｕ  Ｌ４０９Ｙの逆転写酵素活性をかなり向上させることを証明する。
【０２７８】
実施例８．突然変異Ｐｆｕ  Ｌ４０９Ｙのアミノ修飾ヌクレオチドの組込み
突然変異Ｐｆｕによるアミノ修飾ヌクレオチドの組込みの効率を評価するために、ｃＤＮＡ合成反応をＰｆｕ  Ｌ４０９Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼで行った。５つのｃＤＮＡ合成反応を実施した（Ｐｆｕ  Ｌ４０９Ｙで４反応およびSTRATASCRIPT逆転写酵素で１反応）。第１の反応は、修飾されていないｄＮＴＰを含んだ。反応２は、ｄＴＴＰよりも２倍過剰なアミノアリル修飾ｄＵＴＰを含んだ。反応３は、ｄＣＴＰよりも２倍過剰なアミノアリルｄＣＴＰを含んだ。反応４は、ｄＴＴＰよりも２倍過剰なアミノアリルｄＵＴＰおよびｄＣＴＰよりも２倍過剰なアミノアリルｄＣＴＰを含んだ。反応５は、アミノアリルｄＵＴＰおよびSTRATASCRIPT逆転写酵素（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla；カタログ番号２５２００２）を含む、FAIRPLAYマイクロアレイラベリングキット（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla；カタログ番号２５２００２）を利用した。
【０２７９】
２０Ｘ−ｄＮＴＰ溶液を除いて、Ｐｆｕ  Ｌ４０９Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼを用いた逆転写酵素反応で用いたすべての反応成分は、FAIRPLAYマイクロアレイラベリングキット（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla；カタログ番号２５２００２）から得られた。STRATASCRIPT逆転写酵素（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla：カタログ番号６００８５）で行われた反応は、FAIRPLAYマイクロアレイラベリングキット（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla；カタログ番号２５２００２）からのすべての反応要素をメーカーの説明に従って用いた。
【０２８０】
ｃＤＮＡへのａａ−ｄＵＴＰおよび／またはａａ−ｄＣＴＰの組込みは、以下の通りであった。３μｌの１μｇ／μｌ  ＲＮＡラダー（Millenium ＲＮＡラダー、Ambion）を、８μｌの総容積で１μｌの０．５μｇ／μｌオリゴｄＴプライマー（１８量体、TriLink）と組み合わせた。ＲＮＡおよびオリゴｄＴプライマーは、７０℃で１０分間試料を加熱した後に氷冷することによりアニールした。修飾されたｃＤＮＡを調製するために、２μｌの１０×STRATASCRIPT緩衝液、１．５μｌの０．１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１μｌの２０×ｄＮＴＰ混合物（２０×は、１６ｍＭ  ｄＧＴＰ、１６ｍＭ  ｄＣＴＰ、１６ｍＭ  ｄＡＴＰ、１６ｍＭ  ｄＴＴＰおよびａａ  ｄＵＴＰ（TriLink）または１６ｍＭ  ｄＧＴＰ、１６ｍＭ  ｄＴＴＰ、１６ｍＭ  ｄＡＴＰ、１６ｍＭ  ｄＣＴＰおよびａａ  ｄＣＴＰ（TriLink））、４μｌの１００％（ｖ／ｖ）ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、０．５μｌの（４０単位／μｌ）ＲＮアーゼブロックおよび１９μｌの総反応量までのＲＮアーゼを含まないＨ２Ｏを合わせて、アニールしたＲＮＡおよびオリゴｄＴに加えた。反応液を十分混合し、１μｌの１μｇ／μｌ  Ｐｆｕ  ＲＴ（Ｅｘｏ＋、Ｌ４０９Ｙ）を加えた。反応液は４５℃で５分、次に６５℃で１〜２時間インキュベートした。特殊なヌクレオチド、アミノアリル−ｄＵＴＰまたはアミノアリル−ｄＣＴＰを含むアミノ修飾ｃＤＮＡを含む各反応の４分の１を、次にそれぞれ相対的なｃＤＮＡ収率および長さを測定するために、変性アルカリ性アガロースゲル電気泳動で分析した。
【０２８１】
図９で示す結果は、Ｐｆｕ  Ｌ４０９Ｙは、修飾されていないｄＮＴＰおよびアミノアリル修飾ｄＮＴＰと同等のＤＮＡ収率および長さを生ずることを証明する。さらに、Ｐｆｕ  ４０９ＹはSTRATASCRIPT逆転写酵素（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla；カタログ番号２５２００２）よりも高い収率および長さを生ずる。
【０２８２】
実施例９：Ｃｙ５と結合した突然変異Ｐｆｕ  Ｌ４０９Ｙのアミノアリル修飾ＤＮＡ
アミノアリル修飾ＤＮＡの高収率および長さを生ずるＰｆｕ  Ｌ４０９Ｙの能力を確認するために、Ｃｙ５と結合したアミノアリル修飾ＤＮＡを生成するために第２の反応を実施した。１０μｌの１Ｎ  ＮａＯＨを加えて７０℃で１０分間インキュベートすることによって、実施例８からの残りの反応量を加水分解してＲＮＡを除去した。反応を中和するために、反応液を室温まで冷却し、回転により凝縮物を収集して、１０μｌのＨＣｌを加えた。精製したｃＤＮＡを沈殿させるために、４μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．２、１μｌの２０μｇ／μｌグリコーゲン（Roche）、および１００μｌの氷冷１００％エタノールを加えて、−２０℃で最低３０分間インキュベートした。試料を１４，０００×ｇで１５分間、４℃で遠心して、上清を別の容器に移した。ペレットを０．５ｍｌの７０％エタノールで洗浄して再遠心し、上清を別の容器へ移し、ｃＤＮＡペレットは空気乾燥した。
【０２８３】
アミノ修飾ｃＤＮＡは、以下の通りにアミン反応性蛍光色素に結合した。１つの反応からのｃＤＮＡペレットを４．５μｌの０．１Ｍ重炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．０、の中で再懸濁し、１０μｌのＤＭＳＯ中で１２．５〜１８．８ｎｇの単官能性ＮＨＳエステルＣｙ３またはＣｙ５色素（Amersham Pharmacia Biotech）と組み合わせて、暗所の室温で１時間インキュベートした。FAIRPLAYマイクロアレイラベリングキット（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla；カタログ番号２５２００２）からの精製カラムをメーカーの説明に従って用いて、蛍光標識ｃＤＮＡを精製して約１５μｌに濃縮した。
【０２８４】
蛍光結合型のｃＤＮＡは、アガロースゲル電気泳動分析によって分析した。２ｃｍ×３ｃｍのガラス顕微鏡スライド上に１×ＴＡＥ緩衝液中の２％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを注ぐことによって、薄いアガロースゲルを調製した。各反応からの標識ｃＤＮＡの４分の１をゲル上へロードし、１２５ボルト（Ｖ）で０．５時間電気泳動にかけた。Ｃｙ−５標識ｃＤＮＡは、２色レーザー／ＰＭＴプロトタイプマイクロアレイスキャナ（John Parker；ＵＣＬＡ）を用いて可視化した。Ｃｙ５は、７００ｎｍ放射フィルターを用いて６３５ｎｍレーザーで検出した。
【０２８５】
図１０で示す結果は、Ｐｆｕ  Ｌ４０９Ｙは、STRATASCRIPT逆転写酵素（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla；カタログ番号２５２００２）で比較したとき、修飾されていないｄＮＴＰおよびアミノアリル修飾ｄＮＴＰと同等のＤＮＡ収率および長さを生ずることを証明する。
【０２８６】
本明細書で引用したすべての特許、特許出願、および公表文献は、その全体において本明細書で参照により組み込まれる。本発明はその好ましい実施形態に関して詳細に示されて記載されたが、添付の請求項に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、それに形態および詳細の様々な変化を加えることができることは当業者によって理解される。
【０２８７】
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【図面の簡単な説明】
【０２８８】
【図１】本発明の一部の実施形態によるＰｆｕまたはＪＤＦ−３突然変異誘発のために用いられるプライマー配列（配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９）を示す図である
【図２】野生型および突然変異体のＰｆｕおよびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼの澄明溶解物中のＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合（逆転写酵素、ＲＴ）活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡポリメラーゼ）活性の比較を示す図である。各ポリメラーゼのために３つの異なる量の澄明溶解物を用いた。上部パネル、取り込まれた３Ｈ−ＴＴＰのｃｐｍとして測定したＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性。中央パネル、取り込まれた３Ｈ−ＴＴＰのｃｐｍとして測定したＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性。下部パネル、０．２μｌの澄明溶解物の試料からのＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の比。
【図３】Ｅｘｏ＋野生型および突然変異体のＰｆｕおよびＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼの澄明溶解物中のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の比較を示す図である。各ポリメラーゼのために３つの異なる量の澄明溶解物を用いた。上部パネル、取り込まれた３Ｈ−ＴＴＰのｃｐｍとして測定したＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性。中央パネル、取り込まれた３Ｈ−ＴＴＰのｃｐｍとして測定したＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性。下部パネル、０．２μｌの澄明溶解物の試料からのＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の比。
【図４】本発明のいくつかの実施形態に従う精製された変異体ポリメラーゼの逆転写酵素活性を評価する実験の結果を示す図である。反応は、ｅｘｏ−ＪＤＦ−３  Ｌ４０８ＨおよびＬ４０８Ｆ変異体の精製調製物、ならびに野生型ＪＤＦ−３およびＰｆｕおよびＲＮａｓｅＨ−ＭＭＬＶ−ＲＴ（StrataScript（商標）、Stratagene）で実施された。活性は、取り込まれた３３Ｐ−ｄＧＴＰのｃｐｍとして測定される。変異体ポリメラーゼで改善されたＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、野生型ＪＤＦ−３およびＰｆｕと比較して明白である。
【図５】精製ポリメラーゼ変異体のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性をＲＴ−ＰＣＲによって評価した実験の結果を示す図である。各ＲＴ反応のために異なる精製ポリメラーゼ（２単位）を用い、以降のＰＣＲ増幅のためにＴａｑポリメラーゼを用いた。生成物はアガロースゲル電気泳動によって分離して、臭化エチジウムで染色した。レーン１、陰性対照（ＲＴａｓｅなし）、レーン２、StrataScript（商標）ＲＴａｓｅ（ＲＮａｓｅＨ−ＭＭＬＶ−ＲＴ）を用いた陽性対照、レーン３、ｅｘｏ−ＪＤＦ−３ポリメラーゼ、レーン４、ｅｘｏ−ＪＤＦ−３  Ｌ４０８Ｈポリメラーゼ、レーン５、ｅｘｏ−ＪＤＦ−３  Ｌ４０８Ｆポリメラーゼ。
【図６】いくつかのファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの配列アラインメントの図である。Ｐｆｕ、Pyrococcus furiosus（配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５）、ＪＤＦ−３（配列番号４６、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１）、Ｔｇｏ、Thermococcus gorgonarius（配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６、配列番号５７）、Ｔｌｉ、Thermococcus litoralis（配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３）Ｔｓｐ、Thermococcus属種（配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９）、Ｍｖｏ、Methanococcus voltae（配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７５）、ＲＢ６９、バクテリオファージＲＢ６９（配列番号７６、配列番号７７、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８０、配列番号８１）Ｔ４、バクテリオファージＴ４（配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７）Ｅｃｏ、大腸菌（配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９１、配列番号９２、配列番号９３）。さらなる種からのＤＮＡポリメラーゼ配列は、本明細書で参照により組み込まれている、Hopfnerら、1999年、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96:3600-3605で列記されている。
【図７】代表的なファミリーＢ  ＤＮＡポリメラーゼの野生型アミノ酸およびポリヌクレオチド配列を示す図であり、例として以下のものがある。ＪＤＦ−３  ＤＮＡポリメラーゼ（それぞれ配列番号１および２）、処理したポリペプチドのアミノ酸配列はイタリック体の配列番号１０３で示し、本発明のいくつかの実施形態で変異の標的にされたアミノ酸は下線付きであり、野生型Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（それぞれ配列番号３および４）、野生型ＫＯＤポリメラーゼ（それぞれ配列番号５および６）、野生型Ｖｅｎｔ（商標）ポリメラーゼ（それぞれ配列番号７および８）、野生型Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔポリメラーゼ（それぞれ配列番号９および１０）、Ｔｇｏ  ＤＮＡポリメラーゼ（それぞれ配列番号１１および１２）、Thest Thermococcus系統ＴＹ  ＤＮＡポリメラーゼ（それぞれ配列番号１３および１４）、９０Ｎ  Thermococcus属の種ＤＮＡポリメラーゼ（それぞれ配列番号１５および１６）。Methanobacterium thermoautotrophicum ＤＮＡポリメラーゼ（それぞれ配列番号１７および１８）、Thermoplasma acidophilum ＤＮＡポリメラーゼ（それぞれ配列番号１９および２０）、Pyrobaculum islandicum ＤＮＡポリメラーゼ（それぞれ配列番号２１および２２）およびMethanococcus jannaschii  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（配列番号２３）。
【図８】ｅｘｏ＋Ｐｆｕｌ４０９Ｙ  ＤＮＡポリメラーゼ変異体の逆転写酵素活性に及ぼすＤＭＳＯ濃度の影響を評価する実験からのデータを示す図である。Ｍ＝ＲＮＡサイズマーカー。０〜２５と印を付けたレーンは、０〜２５％のＤＭＳＯの存在下で実施された反応と対応する。
【図９】ＰｆｕＬ４０９ＹまたはSTRATASCRIPT ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla）での非修飾およびアミノアリル修飾のｄＵＴＰおよびｄＣＴＰの組込みを評価する実験からのデータを示す図である。結果は、臭化エチジウムで染色された１％アルカリ性アガロースゲル上で分析した。レーン１、１ｋｂ  ＤＮＡラダー、レーン２、非修飾ｄＮＴＰ、レーン３、０．５３ｍＭアミノアリルｄＵＴＰ：０．２７ｍＭ  ｄＴＴＰ、レーン４、０．５３ｍＭアミノアリルｄＣＴＰ：０．２７ｍＭ  ｄＣＴＰ、レーン５、０．２６５ｍＭアミノアリルｄＵＴＰ：０．１３５ｍＭ  ｄＴＴＰおよび０．２６５ｍＭアミノアリルｄＣＴＰ：０．１３５ｍＭ  ｄＣＴＰ、レーン６、STRATASCRIPT ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla）およびアミノアリルｄＵＴＰを有するFAIRPLAYマイクロアレイ標識キット（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla）。
【図１０】ＰｆｕＬ４０９ＹまたはSTRATASCRIPT ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla）によるアミノアリル修飾のヌクレオチドの組込みとその後のＣｙ５との結合を評価する実験からのデータを示す図である。結果は、Ｃｙ５蛍光を測定する非変性ゲル上で分析した。レーン１、１ｋｂ  ＤＮＡラダー、レーン２、非修飾ｄＮＴＰ、レーン３、０．５３ｍＭアミノアリルｄＵＴＰ：０．２７ｍＭ  ｄＣＴＰ、レーン４、０．５３ｍＭアミノアリルｄＣＴＰ：０．２７ｍＭ  ｄＣＴＰ、レーン５、０．２６５ｍＭアミノアリルｄＵＴＰ：０．１３５ｍＭ  ｄＴＴＰおよび０．２６５ｍＭアミノアリルｄＣＴＰ：０．１３５ｍＭ  ｄＣＴＰ、レーン６、STRATASCRIPT ＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla）およびアミノアリルｄＮＴＰを有するFAIRPLAYマイクロアレイ標識キット（Stratagene、カリフォルニア州La Jolla）。
【図１】
2008501338.tif 000004
【図２】
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【図３】
2008501338.tif 000006
【図４】
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【図５】
2008501338.tif 000008
【図６Ａ】
2008501338.tif 000009
【図６Ｂ】
2008501338.tif 000010
【図６Ｃ】
2008501338.tif 000011
【図７Ａ】
2008501338.tif 000012
【図７Ｂ】
2008501338.tif 000013
【図７Ｃ】
2008501338.tif 000014
【図７Ｄ】
2008501338.tif 000015
【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図７Ｇ】
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【図７Ｈ】
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【図７Ｉ】
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【図７Ｊ】
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【図７Ｋ】
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【図７Ｌ】
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【図７Ｍ】
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【図７Ｎ】
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【図７Ｏ】
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【図７Ｐ】
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【図７Ｑ】
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【図７Ｒ】
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【図７Ｓ】
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【図７Ｔ】
2008501338.tif 000031
【図７Ｕ】
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【図７Ｖ】
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【図７Ｗ】
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【図７Ｘ】
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【図７Ｙ】
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【図７Ｚ】
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【図７Ｚ−１】
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【図７Ｚ−２】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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