(57)【要約】  ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの活性を調節するための方法及び組成物を提供する。ＷＩＳＰ-１アンタゴニストには、少なくとも１種類の哺乳動物細胞において、天然ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドによるＩＩＡＳ２、ＩＩＡ、ＣＤ４４又はＲＩＩＡＭＭの誘発又は分泌を阻害又は中和する抗ＷＩＳＰ-１抗体、ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシン及びＷＩＳＰ-１変異体(及びその融合タンパク質)が含まれる。本発明は、また、天然ＷＩＳＰ-１ポリペプチドが関与している病理症状又は哺乳動物細胞のインビトロ、インサイツ、及び／又はインビボ診断及び／又は治療の方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種類の哺乳動物細胞において、天然ＷＩＳＰ-１ポリペプチドによるＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭの誘発又は分泌を阻害又は中和する単離されたＷＩＳＰ-１アンタゴニストであって、抗ＷＩＳＰ-１抗体、ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシン及びＷＩＳＰ-１変異体からなる群から選択される前記アンタゴニスト。
【請求項２】
抗ＷＩＳＰ-１抗体を含む、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
前記抗ＷＩＳＰ-１抗体が、図９Ａ−９Ｃ(配列番号１)のアミノ酸２３−３６７を含んでなる天然ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチド、又は配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によりコードされるアミノ酸を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチドの１以上のドメインと結合する、請求項２に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
前記抗ＷＩＳＰ-１抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項２又は３に記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシンを含む、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したヒトＷＩＳＰ-１配列を含む、請求項５に記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
請求項１ないし６のいずれか１項に記載のアンタゴニストと担体とを含んでなる組成物。
【請求項８】
前記担体が製薬的に許容可能な担体である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
哺乳動物細胞におけるＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭのＷＩＳＰ-１誘発又は分泌を阻害又は中和する方法であって、前記哺乳動物の細胞を有効量のＷＩＳＰ-１アンタゴニストに接触させることを含んでなり、前記ＷＩＳＰ-１アンタゴニストが
ｄ)ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシン；
ｅ)ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びポリオキシアルキレンからなる群から選択される非タンパク質様ポリマーにリンクしたＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
ｆ)ＷＩＳＰ-１抗体；及び
ｇ)ＷＩＳＰ-１変異体
からなる群から選択される方法。
【請求項１０】
前記ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシンが免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＷＩＳＰ-１配列を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗ＷＩＳＰ-１抗体が、図９Ａ−９Ｃ(配列番号１)のアミノ酸２３−３６７を含んでなる天然ヒトＷＩＳＰ-１、又は配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によりコードされるアミノ酸を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチドの１以上のドメインと結合する、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記抗ＷＩＳＰ-１抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項９又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記哺乳動物細胞は癌細胞を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記哺乳動物細胞は、大腸癌又は結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、又は脳腫瘍細胞を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物に対し有効量のＷＩＳＰ-１アンタゴニストを投与することを含んでなる哺乳動物における癌の治療法であって、前記アンタゴニストが抗ＷＩＳＰ-１抗体、ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシン、及びＷＩＳＰ-１変異体からなる群から選択される方法。
【請求項１６】
前記癌が大腸癌又は結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞、脳腫瘍細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アンタゴニストが癌細胞の増殖又は転移を阻害又は低減させる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗ＷＩＳＰ-１抗体が、図９Ａ−９Ｃ(配列番号１)のアミノ酸２３−３６７を含んでなるヒト天然ＷＩＳＰ-１、又は配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によりコードされるアミノ酸を含んでなるＷＩＳＰ-１ポリペプチドの１以上のドメインと結合する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗ＷＩＳＰ-１抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項１５又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
化学療法、放射線、プロドラッグ、細胞傷害剤、増殖阻害剤、又はサイトカインも前記哺乳動物に投与する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記アンタゴニストは、少なくとも１種類の哺乳動物細胞において、天然ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドによる、ＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭの誘発又は分泌を阻害するか、又は中和する、前記１５に記載の方法。
【請求項２２】
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５、又はＰＴＡ−４６２７で寄託されているハイブリドーマによりそれぞれ分泌される３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４、又は９Ｃ１１抗体を含んでなるモノクローナル抗体。
【請求項２３】
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５、又はＰＴＡ−４６２７で寄託されているハイブリドーマ細胞系によりそれぞれ生成される３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４、又は９Ｃ１１モノクローナル抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合するモノクローナル抗体。
【請求項２４】
ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５、又はＰＴＡ−４６２７で寄託されているハイブリドーマ細胞系によりそれぞれ生成されるモノクローナル抗体３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４、又は９Ｃ１１を生成するハイブリドーマ細胞系。
【請求項２５】
ＷＩＳＰ-１ポリペプチドに結合し、かつＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５、又はＰＴＡ−４６２７で寄託されているハイブリドーマ細胞系によりそれぞれ生成されるモノクローナル抗体３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４、又は９Ｃ１１の、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドに対する結合を競合的に阻害する抗体を含む、単離された抗ＷＩＳＰ-１抗体。
【請求項２６】
キメラ抗体、ヒト化抗体又はヒト抗体である、請求項２５に記載の抗体。
【請求項２７】
ＷＩＳＰ-１ポリペプチドに特異的に結合し、且つＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５、又はＰＴＡ−４６２７で寄託されているハイブリドーマ細胞系によりそれぞれ生成される３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４、又は９Ｃ１１モノクローナル抗体由来の配列を含む、キメラ抗ＷＩＳＰ-１抗体。
【請求項２８】
前記モノクローナル抗体由来の配列が、３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４、又は９Ｃ１１モノクローナル抗体の可変領域又は高頻度可変領域である、請求項２７に記載の抗体。
【請求項２９】
前記抗体が、非タンパク質様ポリマー、細胞傷害剤、酵素、放射性同位元素、蛍光化合物、及び化学発光化合物からなる群から選択される１以上の薬剤にリンクした抗ＷＩＳＰ-１抗体である、請求項１ないし２８のいずれか１項に記載のＷＩＳＰ-１アンタゴニスト又は抗体。
【請求項３０】
前記アンタゴニストが、哺乳動物の転移部位、又は哺乳動物の原発肺腫瘍部位とは異なる部位において、肺癌細胞の転移を阻害又は低減させる、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
発明の分野
(発明の分野)
本発明は、一般に、ＷＩＳＰポリペプチド、特にＷＩＳＰ-１ポリペプチドの活性の調節に使用される方法及び組成物に関する。本発明は、また、インビトロ、インサイツ、及び／又はインビボでのＷＩＳＰポリペプチドに関連する病的状態又は哺乳動物細胞の診断及び／又は治療のための方法及び組成物に関する。
【０００２】
発明の背景
結合組織成長因子(ＣＴＧＦ)は、ＴＧＦ-βを含む多くの因子によって線維芽細胞において誘導される成長因子であり、形質転換された細胞の性質である付着依存性増殖(ＡＩＧ)を誘導するＴＧＦ-βの能力に対して必須である。ＣＴＧＦはまた細胞に対して分裂促進的で化学走性であり、よってこのファミリーの成長因子は、ヒト組織の正常な発達、成長及び修復に所定の役割を担っているものと考えられている。Ｃｙｒ６１、Ｎｏｖ，ＷＩＳＰ-１、ＷＩＳＰ２、及びＷＩＳＰ-３を含む、ＣＴＧＦに関連した５つのタンパク質が単離され、クローニングされ、配列決定され、ＣＣＮ遺伝子ファミリーに属するものと特徴付けられている。Oemar及びLuescher, Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 17: 1483-1489 (1997); Brigstock, Endocrine Rev., 20:189-206 (1999)。Ｃｙｒ６１をコードしている遺伝子は血管新生、腫瘍増殖及び血管新生を促進することが見出された。Babic等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 6355-6360 (1998)。ｎｏｖ遺伝子は腎臓において本質的に胚形成期に発現され、正常な腎臓に対して、ｎｏｖ発現の変化が鳥類腎芽細胞腫とヒトウイルム腫瘍の双方で検出されている。Martinerie等, Oncogene, 9: 2729-2732 (1994)。Ｗｔ１はヒトｎｏｖ発現を下方制御し、この下方制御が正常な及び腫瘍の腎形成におけるキーとなる要素を表しているかもしれない。Martinerie等, Oncogene, 12: 1479-1492 (1996)。
ＣＣＮファミリーの異なったメンバーは様々な可溶性又はマトリクス随伴巨大分子、特に硫酸化された複合糖質と相互作用する(Bork, FEBS Letters, 327:125-130)。この相互作用はヘパリン-アガロースでのアフィニティクロマトグラフィによりＣｙｒ６１及びＣＴＧＦを精製するために使用された(Frazier等, J. Invest. Dermatol., 107:404-411 (1996); Kireeva等, Mol. Cell. Biol., 16:1326-1334 (1996))。Ｃｙｒ６１は分泌されそのヘパリン硫酸に対する親和性のために細胞外マトリックスと細胞表面の双方に伴う(Yang等, Cell. Growth Diff., 2:351-357 (1991))。最近、ＷＩＳＰ-１は、デコリン(decorin)及びバイグリカン(biglycan)という分泌された２つのデルマタン硫酸プロテオグリカンと相互作用することが示された。(Desnoyers等, J. Biol. Chem., 276:47599-47607 (2001)。
【０００３】
最近マウスタンパク質ＥＬＭ１が低転移性細胞において同定された。Hashimoto等, J. Exp. Med., 187: 289-296 (1998)。以下に開示するＷＩＳＰ-１のマウスオルソログであるｅｌｍ１遺伝子は、ＣＮＮ遺伝子ファミリーの他のメンバーである。これは、インビボでのＫ-１７３５マウスメラノーマ細胞の腫瘍増殖と転移を抑制する。以下に記載するＷＩＳＰ-２のラットのオルソログであるｒＣｏｐ-１に関する他の最近の文献は、細胞形質転換後のこの遺伝子の発現の消失を記載している。Zhang等, Mol. Cell. Biol., 18:6131-6141 (1998)。
Ｗｎｔは、そのメンバーが回虫、昆虫、軟骨魚、及び脊椎動物で見出されている大きな遺伝子ファミリーによってコードされる。Holland等, Dev. Suppl., 125-133 (1994)。Ｗｎｔは、多くの広範な種が複数の保存Ｗｎｔ遺伝子を有しているので、様々な発生及び生理学的過程において機能するものと考えられる。McMahon, Trends Genet., 8: 236-242 (1992); Nusse及びVarmus, Cell, 69: 1073-1087 (1992)。Ｗｎｔ遺伝子は幾つかの原始細胞型において活性な傍分泌又は自己分泌シグナルとして機能すると考えられる分泌糖タンパク質をコードしている。上掲のMcMahon (1992); 上掲のNusse及びVarmus (1992)。Ｗｎｔ増殖因子ファミリーは、ｃＤＮＡクローニングによって、マウスにおいて同定された１０を越える遺伝子(Ｗｎｔ-１、-２、-３Ａ、-３Ｂ、-４、-５Ａ、-５Ｂ、-６、-７Ａ、-７Ｂ、-８Ａ、-８Ｂ、-１０Ｂ、-１１、-１２、及び-１３)(例えば、Gavin等, Genes Dev., 4: 2319-2332 (1990)；Lee等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 2268-2272 (1995)；Christiansen等, Mech. Dev., 51: 341-350 (1995)を参照)及びヒトにおいて同定された少なくとも９つの遺伝子(Ｗｎｔ-１、-２、-３、-５Ａ、-７Ａ、-７Ｂ、-８Ｂ、-１０Ｂ、-１１)を含む。例えば、Vant Veer等, Mol. Cell. Biol., 4:2532-2534 (1984)を参照のこと。
【０００４】
Ｗｎｔ-１プロト癌遺伝子(ｉｎｔ-１)は、ウイルスＤＮＡ配列の挿入のためにマウス乳房腫瘍ウイルス(ＭＭＴＶ)によって誘導される乳房腫瘍から元々は同定された。Nusse及びVarmus, Cell 31: 99-109(1982)。成体マウスにおいて、Ｗｎｔ-１ｍＲＮＡの発現レベルは精子発生の後期段階において精巣にのみ検出される。Ｗｎｔ-１タンパク質は約４２ＫＤａであり、分泌のためのシグナル配列として機能しうるアミノ末端疎水性領域を含んでいる(上掲のNusse及びVarmus, 1992)。Ｗｎｔ-２の発現はマウス胎仔及び成体組織中で検出され、その分布はＷｎｔ-１の発現パターンとオーバーラップしない。Ｗｎｔ-３はマウス乳房腫瘍形成に関連している。マウス胚でのＷｎｔ-３の発現は神経管と肢芽において検出されている。Ｗｎｔ-５ａ転写物は、９．５から１４．５日齢の発達中の前肢及び後肢において検出されており、最も高いレベルは肢の遠位端の外胚葉性頂に濃縮している。上掲のNusse及びVarmus (1992)。最近、Ｗｎｔ-ｘと呼ばれるＷｎｔ成長因子が、骨組織及び骨由来細胞でのＷｎｔ-ｘの発現の検出と共に記載されている(国際公開公報95/17416)。また記載されていることは、成熟骨芽細胞の維持におけるＷｎｔ-ｘの役割と、治療薬として又は骨関連疾病を治療するための他の治療薬の開発においてＷｎｔ-ｘ成長因子を使用することである。
Ｗｎｔは局所の細胞シグナル伝達に役割を担っている可能性がある。Peifer及びPolakis, Science, 287:1606-1609 (2000)を参照。生化学的研究により、分泌されたＷｎｔタンパク質の多くが、培地に自由に拡散するよりむしろ細胞表面又は細胞外マトリックスに付随して見出されうることが示された。Papkoff及びSchryver, Mol. Cell. Biol., 10: 2723-2730 (1990)；Bradley及びBrown, EMBO J., 9: 1569-1575 (1990)。
【０００５】
Ｗｎｔ遺伝子における突然変異の研究は、成長調節及び組織パターニングにおけるＷｎｔの役割を示した。ショウジョウバエにおいて、無羽(ｗｇ)はＷｎｔ関連遺伝子をコードし(Rijsewik等, Cell, 50: 649-657 (1987))、及びｗｇ変異は胚外胚葉、神経形成、及び成虫原基成長のパターンを変えた。Morata及びLawerence, Dev. Biol., 56: 227-240 (1977); Baker, Dev. Biol., 125: 96-108 (1988); Klingensmith及びNusse, Dev. Biol., 166: 396-414 (1994)。線虫においては、ｌｉｎ-４４が非対称的細胞分裂に必要なＷｎｔ相同体をコードする。Herman及びHorvitz, Development, 120: 1035-1047 (1994)。マウスにおけるノックアウト突然変異は、Ｗｎｔが脳の発達(McMahon及びBradley, Cell, 62: 1073-1085 (1990)；Thomas及びCappechi, Nature, 346: 847-850 (1990))、及び腎臓(Stark等, Nature, 372: 679-683 (1994))、尾芽(Takada等, Genes Dev., 8: 174-189 (1994))、及び肢芽についての胚原基の成長に必須であることを示した。Parr及びMcMahon, Nature, 374: 350-353 (1995)。乳腺におけるＷｎｔ−１の過剰発現は、乳腺過形成(上掲のMcMahon (1992)；上掲のNusse及びVarmus (1992))、早熟性肺胞発達(Bradbury等, Dev. Biol., 170: 553-563 (1995))、及び乳癌(Li等, Oncogene, 19:1002-1009 (2000))をもたらす。
Ｗｎｔ-５ａ及びＷｎｔ-５ｂは７−８日齢のマウス胚の後及び側部中胚葉及び胚外中胚葉において発現される。上掲のGavin等, (1990)。これらの胚性ドメインは多能の造血前駆体及びＨＳＣが誘導されるＡＧＭ領域及び卵黄嚢組織に寄与する。Dzierzak及びMedvinsky, Trends Genet., 11: 359-366 (1995)；Zon等, Gluckman及びCoulombel編, Colloque, INSERM, 235: 17-22 (1995)、1995年4月3-6日にフランス、パリにてのJoint International Workshop on Foetal and Neonatal Hematopoiesis and Mechanism of Bone Marrow Failureで紹介；Kanatsu及びNishikawa, Development, 122: 823-830 (1996)。Ｗｎｔ-５ａ、Ｗｎｔ-１０ｂ、及び他のＷｎｔは肢芽において検出され、Ｗｎｔ-７ｂに対して示されたように初期の骨の微環境の発達と様式における可能な役割を示している。上掲のGavin等(1990)；Christiansen等, Mech Devel., 51: 341-350 (1995)；上掲のParr及びMcMahon (1995)。
【０００６】
Ｗｎｔに関するレビューには、Cadigan及びNusse, Genes & Dev., 11: 3286-3305 (1997)を参照のこと。
Pennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998)は、Ｗｎｔ-１によって形質転換されたマウス乳腺上皮細胞株Ｃ５７ＭＧにおいて上方制御される２つの遺伝子ＷＩＳＰ-１及びＷＩＳＰ-２、及び第３の関連する遺伝子ＷＩＳＰ-３のクローニングと特徴付けを記載している。(また、1999年5月6日公開の国際公開公報99/21998；1999年5月6日公開の国際公開公報99/21999を参照のこと。)Pennica等は、これらのＷＩＳＰ遺伝子がＷｎｔ-１シグナル伝達の下流にあり、大腸癌でのＷＩＳＰ発現の異常なレベルが大腸腫瘍形成においてある役割を担っている可能性があると報告している。ＷＩＳＰ-１は最近β-カテニン調節遺伝子として同定されており、その発癌性活性の特徴付けは、ＷＩＳＰ-１がβ-カテニン媒介腫瘍形成に寄与しているかもしれないことを実証した(Xu等, Gene & Develop., 14:585-595 (2000))。正常なラット腎臓細胞(ＮＲＫ-４９Ｆ)中でのＷＩＳＰ-１過剰発現は形態変換、加速された細胞成長及び亢進された飽和密度を誘導した。また、これらの細胞はヌードマウスに注入されると直ぐに腫瘍を形成し、ＷＩＳＰ-１が腫瘍形成にある種の役割を担っている可能性があることを示唆している(上掲のXu等, 2000)。ＷＩＳＰ-１はまた、特定の進行した徴候に関連する初期ヒト乳癌の４７％と、形質転換されたヒト乳癌細胞系とに過剰発現する。Xie等, Cancer Res., 61:8917-8923 (2001)；Saxena等, Mol. Cell Biochem., 228:99-104 (2001)；Michaelson等, Oncogene, 20:5093-5099 (2001)参照。また、特定のＷＩＳＰ-１変異体が、ヒトスキルス胃癌細胞の約８６％に過剰発現することが報告されている。Tanaka等, Oncogene, 20:5525-5532 (2001)参照。
【０００７】
Hurvitz等, Nature Genetics, 23:94-97 (1999)は、無関係の個人におけるＷＩＳＰ３の９つの異なった変異が常染色体性劣性骨格疾患である進行性疑性リウマチ様異形成症(ＰＰＤ)を伴うことが見出された。ヒト滑膜細胞、関節軟骨細胞、及び骨髄由来間葉前駆細胞においてＲＴ-ＰＣＲによるＷＩＳＰ３の発現がHurvitz等によって観察された。
1998年5月22日に公開されたＰＣＴ出願国際公開公報98/21236は、成長因子スーパーファミリーの２６ｋＤメンバーをコードしているヒト結合組織成長因子遺伝子-３(ＣＴＧＦ-３)を開示している。国際公開公報98/21236は、ＣＴＧＦ-３アミノ酸配列はヒト骨芽細胞ｃＤＮＡクローンから推定され、ＣＴＧＦ-３が卵巣、精巣、心臓、肺、骨格筋、副腎髄質、副腎皮質、胸腺、前立腺、小腸及び大腸のような複数の組織で発現されたことを開示している。
【０００８】
ヒアルロン酸(ＨＡ、ヒアルロネート又はヒアルロナンとも呼ばれる)は、文献において細胞外マトリックスの重要な成分として認識されている(例えば、Hardingham等, FASEB J., 6:861-870 (1992)；Laurent等, FASEB J., 6:2397-2404 (1992)参照)。ＨＡは、皮膚及び間葉組織の成分であり、そこで傷の治癒、炎症、及び胚の形態形成の間の細胞遊走を促進する。(Knudson等, FASEB J., 7:1233-1241 (1993)；Knudson等, CIBA Found. Symp., 143:150-169 (1989)。)ＨＡはまた、特定の種類の転移に関与することが報告されている(Naor等, CD44: Structure, Function and Association with the Malignate Process, Advances in Cancer Research, Academic Press (1997), 241-319頁。)ＨＡの最大濃度は皮膚と筋骨格に見られ、それが全身のＨＡのうちの50%を超える量を占める。(Banerji等, J. Cell Biol., 144:789-801 (1999)。)
様々な研究者により、ＨＡに結合するレセプターが報告されている。ＨＡについて同定されたレセプターの１つがＣＤ４４タンパク質である。(例えば、Culty等, J. Cell Biology, 111:2765-2774 (1990)；Aruffo等, Cell, 61:1303-1313 (1990)；Naor等, CD44: Structure, Function and Association with the Malignant Process, Advances in Cancer Research, Academic Press (1977), 241-319頁；Ropponen等, Cancer Res., 58:342-347 (1998)；Masaki等, Cancer, 92:2539-2546 (2001)参照。)ＣＤ４４は、選択的スプライシングと差次的グリコシル化によって、単一の遺伝子から生成される細胞表面糖タンパク質のファミリーである。ＣＤ４４は、細胞外分子、特にヒアルロン酸を、細胞及び細胞骨格に連結する細胞接着レセプターとして機能すると考えられている(Wielenga等、上掲)。ＣＤ４４は上皮細胞、間葉細胞、及びリンパ球に発現する。(Lesley等, Adv. Immunol., 54:271-335 (1994)。)Wielenga等は、ＡＰＣ又はＴｃｆ-４に遺伝的欠陥を持つマウス及びヒトの腸管粘膜におけるＣＤ４４の発現を分析する特定の実験に基づいて、ＣＤ４４の発現をＷＮＴ経路により調節できることを報告した。(Wielenga等、上掲。)
【０００９】
現在までに特徴付けられているその他のＨＡレセプターには、ＲＨＡＭＭ(ヒアルロン酸媒介運動性のためのレセプターとも呼ばれる)という、形質変換されたリンパ球の表面に一過性に発現する５８ｋＤの細胞内タンパク質が含まれる(Hardwick等, J. Cell Biol., 117:1343-1350 (1992)；Turley等, Exp. Cell Res., 207:277-282 (1993))。線維芽細胞におけるＲＨＡＭＭ発現が転移を早め、Ｈ-Ｒａｓ形質転換に重要な役割を果たすことが報告されている(Hall等、後述)。
ＨＡに結合する別のレセプターがBanerji等によって開示された(Banerji等、上掲)。Banerji等によって、「ＬＹＶＥ-１」と呼ばれるリンパ管壁上のレセプターが報告され、これは３２２残基のタイプ１の複合的膜ポリペプチドであり、ＣＤ４４レセプターと４１％の類似性を有する。ＨＡのＣＤ４４レセプターとは異なり、ＬＹＶＥ-１タンパク質は血管内には存在しない。加えて、ｌａｙｉｌｉｎ(Bono等, Mol. Biol. Cell, 12:891-900 (2001))及びＨＡＲＥ(Zhou等, J. Biol. Chem., 275:37733-37741 (2000))もまたＨＡレセプターとして開示された。
【００１０】
発明の概要
出願人は、驚いたことに、ＷＩＳＰ-１が、ＨＡＳ２(ヒアルロナン剛性２)、ＣＤ４４、及びＲＨＡＭＭ  ｍＲＮＡ発現、ＣＤ４４タンパク質合成、及びＨＡ分泌を誘発することができることを見出した。このような分子の誘発又は分泌は、癌細胞の成長、運動性及び／又は転移の可能性を促進させるか又は増大させ得る。よって、本発明により、例えばＷＩＳＰ-１アンタゴニストとそのようなアンタゴニストの使用法が提供される。ここに開示するアンタゴニストは、特に、ＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭに関連する哺乳動物の癌細胞又はその他病的状態のインビトロ、インサイツ、又はインビボでの診断又は治療にその用途を見出すことができる。
本発明の一実施態様では、単離させられたＷＩＳＰ-１アンタゴニストが提供される。   そのようなアンタゴニストは、ＷＩＳＰ-１抗体のような抗体を含んでもよい。好ましい実施形態では、アンタゴニストは、ＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭのＷＩＳＰ-１誘導あるいは分泌を遮断してもよいし中和してもよい。そのような拮抗性の抗体は、例えば、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体あるいはヒト抗体であり得る。発明での使用が考慮されるＷＩＳＰ-１アンタゴニストは、ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ-１変異体、その共有結合的な収束形態又はその融合タンパク質を含む。例えば、そのようなアンタゴニストは、ペグ化されたＷＩＳＰ-１、又は異種配列に融合したＷＩＳＰ-１、例えば、エピトープタグ又はロイシンジッパーを含む。本方法では、１種類のアンタゴニスト分子又は２種類以上のアンタゴニストの組合せの使用を考慮する。 
【００１１】
本発明の方法は、ＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭの誘導或いは分泌を含め、ＷＩＳＰ-１に関連するか、それに起因する哺乳動物の病的状態又は疾病を治療する方法を含む。本治療方法では、ＷＩＳＰ-１アンタゴニストが、そのような病的状態又は疾病を有する哺乳動物に投与される。例えば、本発明は、癌細胞等の哺乳動物の細胞を、ＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭのＷＩＳＰ-１誘導あるいは分泌を減少、中和、又は遮断するのに有効な量の中の１以上のＷＩＳＰ-１アンタゴニストに接触させることを含む方法を提供する。細胞は、細胞培養、又は哺乳動物、例えば癌に苦しむ哺乳動物内にあってよい。
本発明は、さらに、１以上のＷＩＳＰ-１アンタゴニストを含む組成物を提供する。場合によっては、本発明の組成物は製薬的に許容可能な担体又は希釈剤を含む。好ましくは、組成物は、病理的状態又は疾病を処置するために治療上有効な量の１以上のＷＩＳＰ-１アンタゴニストを含む。
【００１２】
本発明は、さらに、１以上のＷＩＳＰ-１アンタゴニストを含む製造品及びキットを提供する。
本発明は、さらに、小分子化合物、ポリペプチド又は抗体のような候補分子を同定するためのスクリーニングアッセイを行なう方法を提供し、それはＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭのＷＩＳＰ-１誘導あるいは分泌の遮断又は中和に対するアンタゴニストとして作用する。
【００１３】
本発明のさらなる特定の実施形態は単離されたＷＩＳＰ-１アンタゴニストを含み、それは少なくとも１種類の哺乳動物細胞において天然ＷＩＳＰ-１ポリペプチドによるＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４あるいはＲＨＡＭＭの誘導又は分泌を遮断するか、又は中和し、該アンタゴニストは、抗ＷＩＳＰ-１抗体、ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ-１変異体、又はその融合タンパク質から成る群から選択される。本アンタゴニストは、図９Ａ−９Ｃのアミノ酸２３−３６７を含む天然ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチド、或いはここに開示する配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１によりコードされるアミノ酸を含むＷＩＳＰ-１の1以上のドメインに結合する抗ＷＩＳＰ-１抗体を含んでもよい。この抗ＷＩＳＰ-１抗体はキメラ、ヒト化、又はヒト抗体であり得る。
本発明は、さらに、ここに開示するアンタゴニストと担体を含む組成物を提供し、随意で担体は製薬的に許容可能な担体である。
【００１４】
その発明は、さらに、有効量のＷＩＳＰ-１アンタゴニストへ前記哺乳類細胞を曝すことを含む、哺乳類細胞においてＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭのＷＩＳＰ-１誘導あるいは分泌を遮断又は中和する方法を提供し、本方法の前記ＷＩＳＰ-１アンタゴニストは以下からなる群から選択される。
a) ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシン；
b) ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びポリオキシアルキレンから成る群から選択される非タンパク質のポリマーに結合したＷＩＳＰ-１ポリペプチド；
c) ＷＩＳＰ-１抗体；及び
d) ＷＩＳＰ-１変異体
本方法で使用されるＷＩＳＰ-１ イムノアドヘシンは、免疫グロブリンのＦｃ領域に融合したＷＩＳＰ-１配列を含んでもよい。本方法で使用された抗ＷＩＳＰ-１抗体は、図９Ａ−９Ｃのアミノ酸２３−３６７、又は後述の実施形態に開示するＷＩＳＰ-１の領域の1つ以上に結合する天然ヒトＷＩＳＰ-１含んでもよい。本方法では、哺乳類細胞は癌細胞を含み、場合によっては、該細胞は大腸癌又は結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞又は脳腫瘍細胞(神経膠腫又は膠芽腫等)を含む。
他の実施形態では、哺乳動物の癌の治療法が提供され、本方法は、前記哺乳動物に有効量のＷＩＳＰ-１アンタゴニストを投与することを含む。状況に応じて、前記方法において、アンタゴニストは、少なくとも１種類の哺乳類細胞の天然ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドによる、ＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４又はＲＨＡＭＭの誘発又は分泌を遮断、或いは中和し、前記アンタゴニストは抗ＷＩＳＰ-１抗体、ＷＩＳＰ-１ イムノアドヘシン、及びＷＩＳＰ-１変異体から成る群から選択される。状況に応じて、アンタゴニストは癌細胞成長又は癌細胞転移を阻害するように作用できる。哺乳動物の癌は、大腸又は結腸直腸癌細胞、乳癌細胞、肺癌細胞又は神経膠腫又は膠芽腫等の脳腫瘍細胞を含んでよい。状況に応じて、本方法に使用されるアンタゴニストは、癌細胞の成長又は転移を阻害又は低減する。また、本方法では、化学療法、放射線、プロドラッグ、細胞傷害剤、成長阻害剤、又はサイトカインを哺乳動物に投与することもできる。
【００１５】
さらに別の特定の実施形態では、配列番号３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１の配列によってコードされたアミノ酸を含むＷＩＳＰ-１ポリペプチド(実施例で後述する)の１以上の領域へ特異的に結合する抗体が提供される。状況に応じて、抗体はモノクローナル抗体である。状況に応じて、モノクローナル抗体は、ＡＴＣＣに受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５あるいはＰＴＡ−４６２７としてそれぞれ寄託されたハイブリドーマによって分泌された３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４又は９Ｃ１１抗体を含む。
さらに、ＡＴＣＣに受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５又はＰＴＡ−４６２７として寄託されたハイブリドーマ細胞系によって生産される３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４又は９Ｃ１１モノクローナル抗体がそれぞれ結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体が提供される。
【００１６】
また別の特定の実施形態では、モノクローナル抗体３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４又は９Ｃ１１を生産し、また受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５又はＰＴＡ−４６２７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞系、並びに受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５又はＰＴＡ−４６２７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによってそれぞれ分泌されるモノクローナル抗体３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４又は９Ｃ１１が提供される。
さらに、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドに結合し、ＡＴＣＣ受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５あるいはＰＴＡ−４６２７で寄託されたハイブリドーマにより生産されるモノクローナル抗体の、前記ＷＩＳＰ-１ポリペプチドに対する結合を競争的に阻害する抗体を含む、単離された抗ＷＩＳＰ-１モノクローナル抗体がさらに提供される。
【００１７】
さらに、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドに特異的に結合し、(a) 受入番号ＰＴＡ−４６２４、ＰＴＡ−４６２８、ＰＴＡ−４６２６、ＰＴＡ−４６２５又はＰＴＡ−４６２７としてＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマによってそれぞれ分泌される、３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４又は９Ｃ１１抗体由来の配列を含むキメラ又はヒト化抗ＷＩＳＰ-１抗体が提供される。状況に応じて、このような抗体は、３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１０、５Ｄ４又は９Ｃ１１抗体由来の重鎖、軽鎖又は可変領域を含んでもよい。
抗ＷＩＳＰ-１抗体は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール及びポリオキシアルキレンから成る群から選択される、1以上の非タンパク質ポリマー、或いは細胞傷害剤又は酵素、或いは蛍光性化合物又は化学発光の化合物である放射性同位元素に結合し得る。
【００１８】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「ＷＩＳＰポリペプチド」という用語は、天然配列ヒト及びマウスＷＩＳＰタンパク質及びその遺伝子が少なくともＷｎｔ-１によって誘導されるここに記載される変異体を意味する。この用語には、ＷＩＳＰ-１及びその変異体が含まれる。このようなＷＩＳＰ-１タンパク質は更に以下に記載され、1999年5月6日に公開されたＰＣＴ出願国際公開公報99/21998、2002年5月14日発行の米国特許第6387657号及びPennica等, Proc. Natl. Acad. Sci., 95:14717-14722 (1998)に記載されている。
ここで使用される、用語「ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」「ＷＩＳＰ-１相同体」及びそれらの文法上の変化形は、天然配列ＷＩＳＰ-１タンパク質及びそれらの変異体(ここで更に詳細に定義する)を包含する。ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、ヒト組織型又は他の供給源のような様々な供給源から単離してもよく、あるいは組換え又は合成法によって、あるいはこれらの類似の技術の任意の組み合わせによって調製してもよい。
【００１９】
「天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」という用語は、天然由来のＷＩＳＰ-１ポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。このような天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチド」という用語には、特に、ここに開示されるＷＩＳＰ-１ポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌型、自然に生じる変異型(例えば、選択的スプライシングがなされた形態又はスプライス変異体)及びＷＩＳＰ-１ポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が包含される。本発明の一実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わない、それぞれ図９のアミノ酸２３から３６７又は図９のアミノ酸１から３６７を含有する成熟又は全長天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドである。
本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、図９のアミノ酸２３から３６７又は１から３６７を含有する全長又は成熟天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、１８４番の位置のバリン残基又は２０２番の位置のアラニン残基がイソロイシン又はセリン残基にそれぞれ変化したもので、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。本発明の他の実施態様では、図９のアミノ酸２３から３６７又は１から３６７を含有する全長又は成熟天然配列ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドであって、１８４番の位置のバリン残基及び２０２番の位置のアラニン残基がイソロイシン又はセリン残基にそれぞれ変化したもので、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。
【００２０】
本発明の他の実施態様では、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、国際公開公報99/21998に示された配列番号：２３、２４、２５、２６、２７、２８、又は２９を含む、ヒトＷＩＳＰ-１スプライス又は他の天然配列変異体の一つを含むヌクレオチド配列によってコードされるものであって、Ｎ末端メチオニンを伴うか伴わないものである。
「ＷＩＳＰ-１変異体」という用語は、図９に示す推定アミノ酸配列又はその可溶性断片を有するヒト成熟ＷＩＳＰ-１と、少なくとも約８０％、好ましくは少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、より好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、最も好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、又は９９％のアミノ酸配列同一性を有するものとして以下に定義するような活性なＷＩＳＰ-１ポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、図９の全長又は成熟配列のＮ末端又はＣ末端に対して一又は複数のアミノ酸残基が付加され、又は欠失されたＷＩＳＰ-１ポリペプチド、或いはポリペプチドの内部配列又はドメインから一又は複数のアミノ酸残基が挿入され、又は欠失されたＷＩＳＰ-１ポリペプチドで、他の種の変異体を含むものが含まれるが、天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは除かれる。好ましくは、このような変異体は後述するようにアンタゴニストとして作用する。
【００２１】
「細胞外ドメイン」、「ＥＣＤ」又は「分泌された」タンパク質は、膜貫通及び細胞質ドメインを基本的に有しない型を指す。タンパク質又はポリペプチドの「分泌された」型は、シグナル配列を含む場合と含まない場合がある。
ここで定義される「ストリンジェントな条件」は、(１)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、５０℃において０．０１５Ｍの塩化ナトリウム／０．００１５Ｍのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの；(２)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、４２℃において５０％(ｖ／ｖ)ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．１％フィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのｐＨ６．５のリン酸ナトリウムバッファー、及び７５０ｍＭの塩化ナトリウム、７５ｍＭクエン酸ナトリウムを用いるもの；(３)４２℃における５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(０．７５ＭのＮａＣｌ、０．０７５Ｍのクエン酸ナトリウム)、５０ｍＭのリン酸ナトリウム(ｐＨ６．８)、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５×デンハード液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ(５０μｇ／ｍｌ)、０．１％ＳＤＳ、及び１０％のデキストラン硫酸と、４２℃における０．２×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳでの洗浄；又は(４)１０％デキストラン硫酸、２×ＳＳＣ(塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム)のバッファー及び５５℃での５０％ホルムアミド、次いで５５℃におけるＥＤＴＡを含む０．１×ＳＳＣからなる高ストリンジェンシー洗浄を用いるものによるものである。
【００２２】
「中程度のストリンジェント条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (ニューヨーク: Cold Spring Harbor Press, 1989)に記載されているように同定され、上記のストリンジェントより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度及び％ＳＤＳ)の使用を含む。中程度のストリンジェント条件は、２０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ(１５０ｍＭのＮａＣｌ、１５ｍＭのクエン酸三ナトリウム)、５０ｍＭリン酸ナトリウム(ｐＨ７．６)、５×デンハード液、１０％デキストラン硫酸、及び２０ｍｇ／ｍＬの変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中の３７℃での終夜インキュベーション、次いで１×ＳＳＣ中３７−５０℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識する。
「単離された」とは、ここで開示された種々のポリペプチドを記述するために使用するときは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたポリペプチドを意味する。その自然環境の汚染成分とは、そのポリペプチドの診断又は治療への使用を典型的には妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、(1) スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５残基のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(2) クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性まで精製される。単離されたポリペプチドには、ＷＩＳＰの自然環境の少なくとも１つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツのタンパク質が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも１つの精製工程により調製される。
【００２３】
「コントロール配列」という表現は、特定の宿主生物において作用可能に結合したコード配列を発現するために必要なＤＮＡ配列を指す。例えば原核生物に好適なコントロール配列は、プロモーター、場合によってはオペレータ配列、及びリボソーム結合部位を含む。真核生物の細胞は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル及びエンハンサーを利用することが知られている。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのポリペプチドのＤＮＡに作用可能に結合している；プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している；又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
【００２４】
「リポソーム」は、種々の型の脂質、リン脂質及び／又は界面活性剤からなる小型の小胞であり、哺乳動物への薬物(インシュリン及びここで記載されるインシュリン変異体など)の輸送に有用である。リポソームの成分は、通常は生体膜の脂質配列に類似する二層形式に配列させる。
「アミノ酸」という用語は、天然に生じるＬ-α-アミノ酸すべてを意味する。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、及びホモシステインを含むことを意図する。アミノ酸はアルファベット１文字又は３文字で表す：
Ａｓｐ    Ｄ    アスパラギン酸
Ｔｈｒ    Ｔ    スレオニン
Ｓｅｒ    Ｓ    セリン
Ｇｌｕ    Ｅ    グルタミン酸
Ｐｒｏ    Ｐ    プロリン
Ｇｌｙ    Ｇ    グリシン
Ａｌａ    Ａ    アラニン
Ｃｙｓ    Ｃ    システイン
Ｖａｌ    Ｖ    バリン
Ｍｅｔ    Ｍ    メチオニン
Ｉｌｅ    Ｉ    イソロイシン
Ｌｅｕ    Ｌ    ロイシン
Ｔｙｒ    Ｙ    チロシン
Ｐｈｅ    Ｆ    フェニルアラニン
Ｈｉｓ    Ｈ    ヒスチジン
Ｌｙｓ    Ｋ    リジン
Ａｒｇ    Ｒ    アルギニン
Ｔｒｐ    Ｗ    トリプトファン
Ｇｌｎ    Ｑ    グルタミン
Ａｓｎ    Ｎ    アスパラギン
配列表及び図面において使用されている上記以外の１文字又は３文字の略表記は、配列中の任意の位置における２つ以上のアミノ酸又はヌクレオチドを表す。
【００２５】
ここに同定されるポリペプチド配列に対する「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとした、ここで同定されたポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較コンピュータプログラムALIGN-2を用いて得られる。ALIGN-2プログラムの完全なソースコードを下記表に示す。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテック社によって作成され、以下の表に示したソースコードは米国著作権庁, Washington D.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下に登録されている。ALIGN-2プログラムはジェネンテック社、South San Francisco, Californiaを通して公的に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIX(登録商標)オペレーティングシステム、好ましくはデジタルUNIX(登録商標) V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメータは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。
「エピトープタグ」なる用語は、ここで用いられるときは、「タグポリペプチド」に融合したポリペプチドを含んでなるキメラポリペプチドを指す。タグポリペプチドは、その抗体が産生され得るエピトープを提供するに十分な数の残基を有している。また、タグポリペプチドは、好ましくは、抗体が他のエピトープと実質的に交差反応をしないようにかなり独特である。適切なタグポリペプチドは、一般に、少なくとも６のアミノ酸残基、通常は約８〜約５０のアミノ酸残基(好ましくは約１０〜約２０の残基)を有する。
【００２６】
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインとを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３又はＩｇＧ-４サブタイプ、ＩｇＡ(ＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２を含む)、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
「アンタゴニスト」なる用語は最も広い意味で用いられ、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、ＷＩＳＰ-１の１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害、又は中和する任意の分子を含む。ＷＩＳＰ-１ポリペプチドのそのような生物学的活性の例には、少なくとも１種類の哺乳動物細胞におけるＨＡＳ２、ＨＡ、ＣＤ４４、又はＲＨＡＭＭの誘発又は分泌が含まれる。アンタゴニストは直接的又は間接的に機能する。例えば、アンタゴニストは、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドへの直接的結合の結果として、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害、又は中和するよう機能することが可能である。また、アンタゴニストは、インビトロ、インサイツ又はインビボにおいて、例えば、他のエフェクター分子を遮断又は阻害した結果として、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を部分的又は完全に遮断、阻害、又は中和するために間接的にも機能する。
「ＷＩＳＰ-１ポリペプチドアンタゴニスト」なる用語は、ＷＩＳＰ-１の生物学的活性を部分的又は完全にブロック、阻害、又は中和し、限定はされないが、抗体、イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ-１融合タンパク質、ＷＩＳＰ-１の共有結合的修飾形態、ＷＩＳＰ-１変異体及びその融合タンパク質、ＷＩＳＰ-１抗体、及びＷＩＳＰ-１の高次オリゴマー(二量体、凝集物)、或いはＷＩＳＰ-１のホモポリマー又はヘテロポリマー形態を含む。ＷＩＳＰ-１アンタゴニスト分子が部分的又は完全にＷＩＳＰ-１の生物学的活性を遮断、阻害又は中和するかどうかを決定するために、例えば、様々な細胞(実施例に記載)又は肺癌転移のインビボのマウスモデルへのアンタゴニスト分子の効果を評価するために、アッセイをおこなうことが可能である。そのようなアッセイは、既知のインビトロ又はインビボアッセイ形式により実施してもよい。好ましくは、ここに開示される方法で使用されるＷＩＳＰ-１アンタゴニストは、ここで記載されているようなアッセイで場合によっては測定することが可能な、少なくとも１種類のＷＩＳＰ-１活性を遮断又は中和することができる。
【００２７】
「抗体」という用語は最も広い意味において使用され、特に、例えば単一のモノクローナル抗体(アゴニスト、アンタゴニスト、及び中和又は阻害抗体を含む)、ポリペプチド特異性を持つ抗体組成物、一本鎖抗体、及び抗体断片を含む。本明細書で使用する「抗体」は、本明細書で述べる所望の拮抗的特性を示すものである限り、無傷免疫グロブリン又は抗体分子、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(つまり、少なくとも２つの無傷抗体から形成された二重特異性抗体)、及び免疫グロブリン断片(例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')２、又はＦｖ)を含む。
典型的に、抗体は、特定の抗原に対する結合特性を示すタンパク質又はポリペプチドである。天然の抗体は、通常、２つの同一の軽(L)鎖及び２つの同一の重(H)鎖からなるヘテロ四量体の糖タンパク質である。通常、軽鎖の各々は、共有ジスルフィド結合により１つの重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は免疫グロブリンのイソタイプによって異なる。また、各重鎖及び軽鎖は、等間隔に並ぶ鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖の一端には可変ドメイン(ＶＨ)があって、それに複数の定常ドメインが続いている。各軽鎖の一端(ＶＬ)には可変ドメインが、他端には定常ドメインがある；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列しており、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が軽鎖の可変ドメインと重鎖の可変ドメインの界面を形成すると考えられている(Chothia等, J. Mol. Biol., 186:651-663, 1985年；Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:4592-4596, 1985)。任意の脊椎動物の種由来の抗体の軽鎖は、その定常ドメインアミノ酸配列に基づいて、κ及びλと呼ばれる２つの明確に区別される型の一方に割り当てることができる。重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、免疫グロブリンを複数のクラスに分けることができる。免疫グロブリンには５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ  及びＩｇＭがあり、これらのうち複数をさらにサブクラス(イソタイプ)、例えば、ＩｇＧ-１、ＩｇＧ-２、ＩｇＧ-３及びＩｇＧ-４、ならびにＩｇＡ-１及びＩｇＡ-２に分けることができる。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖の定常ドメインを、それぞれ、α、δ、υ、γ及びμと呼ぶ。
「抗体断片」は、無傷の抗体の一部、通常は無傷の抗体の抗原結合又は可変領域を含む。抗体断片の例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；一本鎖抗体分子；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体を含む。
【００２８】
「可変」という用語は、抗体間で配列が異なる可変ドメインの特定の部分を表すために使用され、特定の抗原に対する特定の抗体の各々の結合及び特異性に利用される。しかしながら、抗体の可変ドメインにおいて可変性は通常一様に分布してはいない。典型的には、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメイン両方の相補性決定領域(ＣＤＲ)又は高頻度可変領域と呼ばれる３つの染色体部分に集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分をフレームワーク(ＦＲ)と呼ぶ。天然の重鎖及び軽鎖の各可変ドメインは、大部分がβ−シート構造を取り入れ、３つのCDRにより連結された４つのFR領域を有しており、それらＣＤＲはβ−シート構造を連結するループを形成するか、場合によってはβ−シート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲはＦＲ領域によって互いに近接して保持されており、別の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat, E.A.等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 米国国立衛生研究所(ＮＩＨ)，ベセズダ， メリーランド州、1987年参照)。定常ドメインは抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存性の細胞毒性への抗体の関与など、様々な作動体機能を示す。
ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を称する、すなわち、集団を構成する個々の抗体が、少量存在しうる自然に生じる可能な突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、一つの抗原部位に指向する。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対応する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に指向する。
【００２９】
ここで、モノクローナル抗体は特に、所望の生物学的活性、又は特性を有するものである限りにおいて、指定の起源の種、免疫グロブリンのクラス、又はサブクラスに関係なく、定常ドメイン(例えば「ヒト化」抗体)、又は重鎖を有する軽鎖、又は別の種由来の鎖を有するある種由来の鎖、又は異種タンパク質との融合を有する対象とする抗体の(高頻度可変を含む)可変ドメインをスプライシングすることにより生成される「キメラ」抗体、ハイブリッド抗体、及び組換え抗体、ならびに抗体断片(例えばＦａｂ、Ｆ(ａｂ')、Ｆ(ａｂ')２、及びＦｖ)を含む。例えば米国特許第4,816,567号、及びMageらによるMonoclonal Antibody Production Techniques and Applications 79-97ページ(Marcel Dekker, Inc.: ニューヨーク, 1987)を参照のこと。
このように、「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体集団から得られたという抗体の性質を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは米国特許第4,816,567号に記載されたような組換えＤＮＡ法によって作ることができる(参照)。「モノクローナル抗体」は、また、例えばMcCaffertyらによるNature, 348:552-554(1990)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離することができる。
【００３０】
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」形とは、特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、あるいはそれらの断片(例えばＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。大部分において、ヒト化抗体はレシピエントの相補性決定領域(ＣＤＲ)の残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでもよい。これらの修飾は抗体の能力を更に洗練し、最適化するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのＦＲ領域がヒト免疫グロブリン共通配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域又はドメイン(Ｆｃ)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域又はドメインの少なくとも一部を含んでなる。
「ヒト抗体」は、ヒトにより生成される抗体のアミノ酸残基に対応するアミノ酸残基を有するもの、及び／又はヒト抗体をつくる既知の技術のいずれかを使用して、又はここに開示するようにして、つくられたものである。ヒト抗体のこのような定義は、少なくとも１つのヒト重鎖ポリペプチド又は少なくとも１つのヒト軽鎖ポリペプチド、例えばマウス軽鎖及びヒト重鎖ポリペプチドを含む抗体を含む。ヒト抗体は、様々な従来技術を使用して生成することができる。一実施態様では、ライブラリがヒト抗体を発現する場合、そのようなファージライブラリからヒト抗体を選択する(Vaughan等,  Nature Biotechnology, 14:309-314, 1996年；Sheets他 PNAS, アメリカ合衆国、95:6157-6162,1998年；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381, 1991年; Marks等, J. Mol. Biol., 222:581, 1991)。ヒト抗体はまた、ヒト免疫グロブリン座を、トランスジェニック動物、例えば、内因性免疫グロブリン遺伝子が特異的に又は完全に非活性化されているマウスに導入することにより生成することができる。実験によりヒト抗体の産生が確認されており、それは遺伝子の再配列、アセンブリ、及び抗体のレパートリーを含め、すべての面でヒトに見られる抗体産生に非常に類似している。この方法は、例えば、米国特許第5,545,807号、同第5,545,806号、同第5,569,825号、同第5,625,126号、同第5,633,425号、同第5,661,016号、及び以下の科学文献に開示されている：Marks等, Bio/Technology, 10: 779-783, 1992年；Lonberg等, Nature, 368: 856-859, 1994年；Morrison, Nature, 368:812-13, 1994年；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14: 845-51, 1996年；Neuberger, Nature Biotechnology, 14: 826, 1996年；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93, 1995年。あるいは、ヒト抗体は、標的となる抗原を志向する抗体を産生するＢリンパ球(このようなＢリンパ球は個体から回収できるか、又はインビボで免疫することができる)の不死化により調製することもできる。 例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77, 1985年；Boerner等, J. Immunol., 147 (1):86-95, 1991年；及び米国特許第5,750,373号を参照のこと。
【００３１】
「Ｆｃ領域」という用語は、無傷の抗体のパパイン消化により生成される免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列のＦｃ領域又は変異体Ｆｃ領域でありうる。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界はまちまちであるが、ヒトＩｇＧ重鎖のＦｃ領域は、通常、約Ｃｙｓ２２６又は約Ｐｒｏ２３０に位置するアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで延びていると定義される(ここではKabat等, 上掲による番号付けシステムを使用した)。免疫グロブリンのＦｃ領域は、通常、２つの定常ドメイン、１つのＣＨ２ドメイン及び１つのＣＨ３ドメインを含み、状況に応じてＣＨ４ドメインを含む。
ここで使用する「Ｆｃ領域鎖」という表現は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖のうちの１つを意味する。
【００３２】
ヒトＩｇＧ Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Cγ２」ドメインとも呼ばれる)は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びている。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985)を参照のこと。ここで、ＣＨ２ドメインは天然配列のＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインとすることができる。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまでの範囲(つまり、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸から約４４７位のアミノ酸)を含む。ここでは、ＣＨ３領域は、天然配列のＣＨ３ドメインか、又は変異体ＣＨ３ドメイン(例えば、その一鎖に「protroberance」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたＣＨ３ドメイン：米国特許第5,821,333号参照)とすることができる。このような変異体ＣＨ３ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性(例えば二重特異性)抗体をつくることができる。
【００３３】
「ヒンジ領域」は、通常、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０まで延びていると定義される(Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985)。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりIgG1と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、又は変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域はは、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「作動体機能」を有する。例示的「作動体機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター； ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのような作動体機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、そのような抗体の作動体機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
【００３４】
「天然配列Ｆｃ領域」は、天然に由来するＦｃ領域と同じアミノ酸配列を有する。「変異体ポリペプチドを含む。「変異体Ｆｃ領域」には、最低１つのアミノ酸修飾だけが天然配列のＦｃ領域と異なるアミノ酸配列が含まれる。好ましくは、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域、又は親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合に、天然配列Ｆｃ領域又は親ポリペプチドのＦｃ領域において少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば約１から約１０のアミノ酸置換、好ましくは約１から約５のアミノ酸置換を有する。ここに開示する突然変異Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域に対して、少なくとも約８０％の配列同一性を有し、好ましくは少なくとも約９０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％の配列同一性を有する。
「抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用」及び「ＡＤＣＣ」は、Ｆｃレセプター(ＦｃＲ)を発現する非特異性の毒性細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球、及びマクロファージ)が標的細胞に境界抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす、細胞媒介性反応を指す。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する一次細胞はＦｃγＲIIIのみを発現し、一方単核細胞はＦｃγＲI、ＦｃγＲII、及びＦｃγＲIIIを発現する。造血細胞上のＦｃＲ発現は、Ravetch及びKinetによる、Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991)の、464ページの表3にまとめられている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するために、インビボＡＤＣＣアッセイ(例えば米国特許第5,500,362号又は同第5,821,337号に記載)を行うことができる。そのようなアッセイに有用な作動体細胞には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー(ＮＫ)細胞が含まれる。あるいは、又はそれに加えて、目的とする分子のＡＤＣＣ活性をインビボで、例えばClynesらによる PNAS(アメリカ合衆国)、 95:652-656(1998)に開示されているような動物モデルにおいて評価することができる。
【００３５】
「ヒト作動体細胞」は、１以上のＦｃＲを発現する白血球であり、作動体機能を果たす。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲIIIを発現し、ＡＤＣＣ作動体機能を果たす。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例には、末梢血単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単核細胞、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれ、中でもＰＢＭＣとＮＫ細胞が好ましい。作動体細胞はその天然供給源、例えば血液又はＰＢＭＣからここに開示するように単離することができる。
「Ｆｃレセプター」及び「ＦｃＲ」という用語は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを表すために使用される。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体に結合するもの(ガンマレセプター)であり、ＦｃγＲI、ＦｃγＲII、及びＦｃγＲIIIサブクラス のレセプターを含み、それには対立変異体及びそれらレセプターの変形スプライス形式が含まれる。ＦｃγＲIIレセプターはＦｃγＲIIA(「活性化レセプター」)及びＦｃγＲIIB(「抑制レセプター」)を含み、それらは主にその細胞質ドメインにおいて異なる類似したアミノ酸配列を有する。活性化レセプターであるＦｃγＲIIAは、その細胞質ドメインに免疫レセプターのトリオシン(tryosine)に基づく活性化モチーフ(ＩＴＡＭ)を有する。阻害するレセプターＦｃγＲIIBは、その細胞質ドメインにある免疫レセプター チロシンベース阻害モチーフ(ＩＴＩＭ)を有する(Daeron, Annu. Rev. Immunol., 15:203-234, 1997年に記載)。ＦｃＲはRavetch及びKinet, Annu. Rev. Immunol., 9:457-92(1991)；Capel等, Immunomethods, 4:25-34(1994)；及びde Haas等, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41(1995)に説明されている。本明細書で使用する「ＦｃＲ」という語は、将来同定されるものも含め、その他のＦｃＲを包括する。この用語はまた、母性ＩｇＧの胎児への移転をつかさどる新生児レセプターであるＦｃＲｎを含む(Guyer等, J. Immunol., 117:587, 1976年；及びKim等, J. Immunol., 24:249, 1994)。
【００３６】
「補体依存性細胞障害作用」及び「ＣＤＣ」は、補体存在下における標的の溶解を指す。補体の活性経路は補体系(Ｃ１ｑ)の第一成分の分子の、同種抗原と複合した分子(例えば抗体)への結合により開始される。補体の活性を評価するため、例えばGazzano-SantoroらによるJ. Immunol. Methods, 202:163(1996)に記載されているようなＣＤＣアッセイを実行することができる。
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。好ましい親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks等は、Bio/Technology, 10:779-783(1992)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas等, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier等, Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton等, J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson等, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins等, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。
「抗体の免疫特異的結合」に使用される「免疫特異的」という用語は、抗体の抗原混合部位と抗体により認識される特異的な抗原との間に発生する抗原に特異的な結合の相互作用を意味する。
【００３７】
「癌」、「癌性の」及び「転移」という用語は、典型的には調節されない細胞成長を特徴とする、哺乳動物における生理学的状態を指すか記述する。癌の例には、これらに限定されるものではないが、腺癌、リンパ腫、芽細胞腫、黒色腫、肉腫、及び白血病を含む悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより特定の例には、扁平細胞癌(squamous cell cancer)、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝癌及び肝細胞腫などの肝臓癌、膀胱癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮癌、骨髄腫(多発性骨髄腫)、唾液腺癌、腎癌及びウィルムス腫などの腎臓癌、基底細胞癌、黒色腫、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、、精巣癌、食道癌、並びに多種多様な頭部及び頸部の癌が含まれる。ここに開示する治療に好ましい癌には、乳癌、胃がん、肺癌、大腸癌又は直腸結腸癌、神経膠腫及び神経膠芽腫が含まれる。
この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親-薬剤(parent drug)に比較して癌細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, pp. 375-382, 615th Meeting, Belfast (1986),及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), pp.147-267, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、これらに限られないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸変性プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、βラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定するものではないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞傷害剤の例には、後述の化学療法剤が含まれる。
【００３８】
ここで用いられる「細胞傷害剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は抑制し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位体)、化学療法剤、及び小分子毒素又は細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素等の毒素、又はそれらの断片及び/又は変異体を含むことを意図する。
「化学療法剤」は、癌などの状態の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びシクロスホスファミド(CYTOXAN(登録商標))のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(acetogenins)(特にブラタシン(bullatacin)及びブラタシノン(bullatacinone))；カンプトセシン(合成類似体トポテカン(topotecan)を含む)；ブリオスタチン；カリスタチン(callystatin)；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン(adozelesin)、カルゼレシン(carzelesin)及びバイゼレシン(bizelesin)合成類似体を含む)；クリプトフィシン(cryptophycin)(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン(dolastatin)；デュオカルマイシン(duocarmycin )(合成類似体、KW-2189及びCBI-TMIを含む)； エレトロビン(eleutherobin)；パンクラチスタチン(pancratistatin)；サルコディクチン(sarcodictyin)；スポンジスタチン(spongistatin)；クロランブシル、クロルナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタード等のナイトロジェンマスタード；ニトロスレアス(nitrosureas)、例えばカルムスチン(carmustine)、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン(lomustine)、ニムスチン、ラニムスチン；エネジイン(enediyne) 抗生物質等の抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１I及びカリケアマイシンθＩ１、例えば、Agnew  Chem Intl. Ed. Engl., 33：183-186(1994)を参照のこと；ダイネミシンＡ(dynemicinＡ)を含むダイネミシン(dynemicin)；エスペラマイシン(esperamicin)； 同様にネオカルチノスタチン発光団及び関連色素蛋白エネジイン(enediyne) 抗生物質発光団)、アクラシノマイシン(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン(bleomycins)、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン(carminomycin)、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン (モルフォリノ−ドキソルビシン、シアノモルフォリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン(esorubicin)、イダルビシン、マセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシン(mitomycins)、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、クエラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)のような抗-代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類似体；フルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンのようなプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)、５−ＦＵのようなピリミジン類似体；カルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)のようなアンドロゲン類；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンのような抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium acetate)；エポチロン(epothilone)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシン(maytansine)及びアンサマイトシン(ansamitocin)のようなメイタンシノイド(maytansinoid)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＫＳ(登録商標)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン(rhizoxin)；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン(trichothecenes)(特に、Ｔ-２トキシン、ベラキュリンＡ(verracurin A)、ロリデンＡ(roridin A)及びアングイデン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ara-C」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル(タキソール(登録商標)、Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ)、及びドキセタキセル(タキソテア(登録商標)、Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；ゲンシタビン(gemcitabine)；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；シスプラチン及びカルボプラチンのようなプラチナ類似体；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン(Navelbine)；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；キセローダ(xeloda)；イバンドロナート(ibandronate)；ＣＰＴ-１１；トポイソメラーゼインヒビターＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸；カペシタビン(capecitabine)；並びに上述したものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。また、この定義には、腫瘍に対するホルモン���用を調節又は阻害するように働く抗ホルモン剤、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン(raloxifene)、例えば４(５)-イミダゾール類を阻害するアロマターゼ、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(Fareston)；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、ロイプロリド、及びゴセレリン；並びに上記のものの製薬的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体が含まれる。
【００３９】
ここで使用される場合の「増殖阻害剤」とは、インビトロ又はインビボにおいて、細胞の増殖を阻害する化合物又は組成物を指すものである。よって、増殖阻害剤とは、Ｓ期におけるそのような遺伝子の過剰発現細胞のパーセンテージを有意に低減させるものである。増殖阻害剤の例には、細胞分裂周期の進行を遮断する薬剤(Ｓ期以外の場所において)、例えばＧ１停止及びＭ期停止を誘発する薬剤が含まれる。伝統的なＭ期ブロッカーには、ビンカ(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール(登録商標)、及びトポIIインヒビター、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンが含まれる。Ｇ１を停止させるこれらの薬剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、例えばタモキシフェン、プレドニゾン、ダカーバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びａｒａ-ＣがＳ期停止へ波及する。更なる情報は、Murakamiらにより「細胞分裂周期の調節、オンコジーン、及び抗新生物薬(Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs)」と題された、癌の分子的基礎(The Molecular Basis of Cancer)、Mendelsohn及びIsrael編、第1章(WB Saunders；Philadelphia, 1995)、特に13頁に見出すことができる。
「サイトカイン」なる用語は、１つの細胞集団から放出され、他の細胞に細胞間メディエータとして作用するタンパク質の一般用語である。このようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインに含まれるのは、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インシュリン；プロインシュリン；レラキシン；プロレラキシン；糖タンパク質ホルモン、例えば濾胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体化ホルモン(ＬＨ)；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；Ａｐｏ-２リガンド(ＴＲＡＩＬとも呼ばれる)；ミューラー阻害因子；マウス生殖腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子；血小板増殖因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-β等のトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦｓ)；インシュリン様成長因子-Ｉ及びＩＩ；エリスロポエチン(ＥＰＯ)；骨誘発因子；インターフェロン-α、-β、及び-γ等のインターフェロン；コロニー刺激因子(ＣＳＦｓ)、例えばマクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；インターロイキン(ＩＬｓ)、例えばＩＬ-１、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子である。ここで用いられる際、用語サイトカインには、天然供給源から、又は組換え細胞培養からのタンパク質、及び天然配列サイトカインの生物学的に活性な等価物が含まれる。
【００４０】
「治療」とは、疾患の病理の進展阻止又は変化の本発明で実施される介入である。従って、「治療」は治療的処置及び予防的又は保護的手段の両方を指し、標的である病理学的状態又は疾患を予防、又は抑制(減少)することが目的である。治療が必要なものは、既に疾患に罹患しているもの並びに疾患が防止されるべきものを含む。関連疾患の治療では、治療薬は直接的に疾患の病理成分の応答の大きさを低下又は増加させうるし、或いは疾患を他の治療剤による治療、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、化学療法剤等に対してより敏感にし得る。
用語「有効量」とは、病理的状態の測定可能な改善又は縮小を引き起こす、誘発する又は結果的に生じるＷＩＳＰ-１アンタゴニストの最小濃度である。癌の治療法において、有効量とは、癌細胞の数、又は腫瘍容積の減少を引き起こす、誘発する、又は結果として生じるものである。更に、「治療的有効量」とは、少なくとも病理的症状を和らげるのに有効な、哺乳動物に対して投与されるＷＩＳＰ-１アンタゴニストの最小濃度(量)である。
【００４１】
「慢性」投与とは、急性の様式とは異なり、初期の治療効果(活性)を長時間に渡って維持するために連続的な様式で薬剤を投与することを指す。「間欠」投与とは、中断無く連続的になされるのではなく、むしろ本質的に周期的になされる処理である。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、及び動物園、スポーツ用、又はペット用動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ブタ、ハムスターなどを含む哺乳動物に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００４２】
一又は複数の更なる治療薬と「組合わせた」投与には、いずれかの順番による同時的(併用の)及び継続的な投与が含まれる。
ここで用いられる「担体」は、製薬上許容される担体、賦形剤、又は安定化剤を含み、使用用量及び濃度でそこに暴露される細胞又は哺乳動物に対して非毒性のものである。しばしば、生理学的に許容される担体の例は、水性ｐＨ緩衝溶液である。生理学的に許容される担体は、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(登録商標)、ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、及びPLURONICS(登録商標)、ヒアルロン酸(ＨＡ)などの非イオン性界面活性剤を含む。
【００４３】
ＩＩ．本発明の方法と組成物
以下の実施例で詳述するように、驚くべきことに、線維芽細胞におけるＷＩＳＰ-１の異所性発現により、ＨＡ生産、すなわち細胞表面及び培養培地におけるＨＡ生産の増大が引き起こされることがわかった。細胞表面のＨＡは、非足場依存性の成長及び腫瘍形成を亢進させ(Kosaki等, Cancer Res., 59:1141-1145(1999)、そして細胞増殖の接触阻止を低減させ、よって細胞遊走を促進させる (Ichikawa等, J.Invest. Dermatol., 113: 935-939(1999)；Itano等, Proc. Natl. Acad. Sci., 99:3609-3614(2002))。また、ヒアルロナン被膜形成は、細胞転移の可能性と関連付けられている(Zhang等, Cancer Res.,  55:428-433(1995)；Toole等, J. Biol. Chem., 277:4593-4596(2002))。ＨＡシンターゼ(ＨＡＳ１、ＨＡＳ２、及びＨＡＳ３)発現の分析により、ＷＩＳＰ-１がＨＡＳ２誘導を促進するが、ＨＡＳ１とＨＡＳ３ ｍＲＮＡのレベルは変化しないことが明らかになった。 ＨＡＳ２は成長因子とサイトカインにより上方制御されたＨＡ合成の主な標的である(Pienimaki等、J. Biol. Chem. 276:20428-20435(2001))。ＨＡＳ２の異所性発現は、ＨＡ分泌を増加させ、ヒアルロナン被膜形成を引き起こす(Kosaki等、上掲)。さらに、ＨＡＳ２は、心臓の形態形成の間における上皮の間葉へのヒアルロナン媒介性形質転換に重要であると考えられている(Camenisch等, J.Clin. Invest., 106:349-360 (2000))。上皮の間葉への移行は腫瘍湿潤及び転移においても重要であるので、 ＨＡＳ２は上皮性腫瘍の進行に重要な役割を果たすと思われる(Boyer等, Biochem.  Pharmacol., 60: 1091-1099(2000)；Hay, Acta Anat., 154: 8-20(1995)；Arias, Cell, 105:425-431(2001))。 これらの結果は、ＷＩＳＰ-１によって引き起こされたＨＡ分泌が腫瘍侵入と転移に重要であり得ることを示す。
ＷＩＳＰ-１はまた、２つのＨＡレセプター、即ちＣＤ４４とＲＨＡＭＭの発現を誘発する。ＨＡレセプターの発現を誘発し、ＨＡ生産を増大させることで、ＷＩＳＰ-１は、自己分泌及び／又はパラ分泌ループを活性化できる。ヒアルロナンがＣＤ４４及びＲＨＡＭＭと相互作用することにより、インビトロにおいて細胞運動と増殖が、インビボにおいて腫瘍成長と転移が促進される(Turley等, J. Biol. Chem., 277:4589-4592 (2002)；Sy等, Curr. Top. Microbiol. Immunol., 213:129-153 (1996)；Hall等, J. Neurooncol., 26:221-229 (1995))。
【００４４】
細胞遊走に対するＷＩＳＰ-１の影響を細胞創傷治癒アッセイにおいて時間経過顕微鏡観察により分析したところ、データによりＷＩＳＰ-１発現により細胞運動性が亢進されることが示された。さらに、単離された細胞において遊走の増大がみられ、これによりＷＩＳＰ-１が自己分泌機構により作用できることが示された。但し、表面に付着したとき、精製された組換えＷＩＳＰ-１はＨＡＳ２とＣＤ４４の発現を促進した。この誘発は、ＷＩＳＰ-１がデコリンとの相互作用により係留されたときにさらに増大した。同様に、表面結合したときＷＩＳＰ-１は細胞運動性を促進し、これにより表面に係留されたときＷＩＳＰ-１がパラ分泌機構により作用できることも示された。本明細書の実施例は、ＷＩＳＰ-１によって誘導された細胞運動性はＣＤ４４により媒介されており、抗ＣＤ４４抗体により遊走が無くなることを示す。ＷＩＳＰ-１が誘発した細胞運動性はまた、ＷＩＳＰ-１抗体により阻害された。さらに、ＷＩＳＰ-１の走触性活性は単細胞型に制限されず、ＷＩＳＰ-１は正常線維芽細胞と大腸癌細胞の遊走の両方を誘導した。
ＷＩＳＰ-１がＷｎｔ-１の下流のエフェクターであると考えられているので、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ-１細胞系をＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１細胞に見られる表現型について分析した。 Ｗｎｔ−１の下流のＷＩＳＰ-１の役割と呼応して、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ-１細胞はＨＡＳ２及びＣＤ４４を過剰発現し、親細胞系と比較してＣＤ４４タンパク質含有量が高かった。更に、Ｃ５７／Ｗｎｔ-１細胞は、培地中で自然に分散し、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞と同様の非分化反-微分されたspindloid形態を示した。
【００４５】
また、ＭＭＴＶ-Ｗｎｔ-１の乳房腫瘍のグループに対して発現分析行ったところ、ＭＭＴＶ-Ｗｎｔ-１遺伝子導入マウス由来のすべての乳房腫瘍でＣＤ４４及びＨＡＳ２の発現の増大が検出された。これらの腫瘍では、ＷＩＳＰ-１表現は間質性線維芽細胞に局在化していたが、ＣＤ４４とＨＡＳ２は腫瘍上皮細胞に発現した。ＨＡＳ２発現についてはネガティブであったが、腫瘍周囲の間質は高レベルのＨＡを含み、一方腫瘍柔組織はＨＡについては弱い染色しか示さなかった。線維芽細胞がＨＡ生産の原因であると一般に受け取られているが、間質性ＨＡの起源は明確に確認されていない。ＨＡＳ２発現は柔組織にしか見られないので、ここで開示される実験結果は、腫瘍細胞が間質におけるＨＡ合成と蓄積の原因であることを示唆するものである。腫瘍周囲の間質におけるヒアルロナン蓄積は、いくつかの腫瘍タイプで頻繁に発生し、卵巣、胸部、前立腺、及び大腸腺癌に報告されている(Ropponen等、Cancer Res., 58: 342-347(1998)；Lipponen等、Eur. J. Cancer, 37: 849-856(2001)；Auvinen等、Am.,  J. Pathol., 156: 529-536(2000)；Anttila等、Cancer Res., 60、: 150-155(2000))。更に、高レベルのＨＡは不十分な分化、転移性の反応、及び好ましくない予後に関連していた。
ＨＡとＣＤ４４は腫瘍湿潤に関連しているため、ＷＩＳＰ-１を発現する細胞の転移の可能性をインビボで評価した。尾への接種後、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１細胞は、すぐに注射されたマウスの肺にコロニー形成し、ガン性腫瘍を形成した。 ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１細胞は有意な転移の可能性を示したが、ＮＲＫ細胞ではそのような可能性は示されなかった。組織学的な観察により、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１細胞が脈管構造に存在し、肺気道を湿潤したことが明らかになった。肺のコロニー形成は注射した細胞数、注射の時間、及びＷＩＳＰ-１発現に比例していた。さらに、転移性の可能性はＣＤ４４とＨＡＳ２の発現レベルに比例しており、またＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞を接種したマウスをＣＤ４４抗体又はＷＩＳＰ-１抗体で処置することにより、肺の腫瘍の数と大きさが大きく減少した。したがって、ＷＩＳＰ-１のレベルは、ヒアルロナン−ＣＤ４４メカニズムによって肺コロニー形成を促進したと考えられる。これは、肺の脈管構造における転移性細胞の腫瘍成長、転移、及び保有に関するＣＤ４４の重要性とＨＡとの相互作用を示した既出の報告と一貫している(Sy等、上掲; Kogerman等、Proc. Natl. Acad. Sci.、94、: 13233-13238(1997))。
【００４６】
ＡＰＣ又はβカテニン突然変異によるＷｎｔ経路の活性化は典型的には結腸直腸癌に関連付けられるが、複数の証拠により、胸部腺癌を含む他の種類の癌にも寄与することが示唆されている(Polakis, Genes Dev., 14:1837-1851 (2000)；Brown, Breast Cancer Res., 3:351-355 (2001))。ヒト乳癌細胞系において、ＡＰＣのトランケーションとβカテニンレベルの上昇が認められた(Schlosshauer等, Carcinogenesis, 21:1453-1456 (2000))。ＡＰＣ遺伝子の体細胞突然変異が原発性乳癌で見られた(Furuuchi等、Am. J. Pathol., 156:1997-2005 (2000))。加えて、突然変異を活性化するβカテニンはマウスの胸部腺癌を促進する(Michaelson等, Oncogene, 20:5525-5532 (2001))。湿潤性乳腺管癌においてＷｎｔ−１とβカテニンのレベルの上昇が見られ、この場合予後も不良であった(Lin等, Proc. Natl. Acad. Sci., 97:4262-4266 (2000))。従って、特定の胸部腺癌に見られるＷＩＳＰ-１の発現は、Ｗｎｔ経路の活性に起因していると考えることができる。また、Ｔａｇｍａｎ分析により、ＷＩＳＰ-１が乳癌及び膠細胞腫瘍等の癌に過剰発現することが発見された。
少なくともこれらの理由で、ＷＩＳＰ-１アンタゴニストは癌等の様々な病理学的な異状の治療と診断に有用であると考えられる。よって、本発明は、所望の量のＷＩＳＰ-１アンタゴニストに細胞を接触させることを含む、哺乳動物の細胞におけるＷＩＳＰ-１の活性を調節、遮断、又は中和する方法を提供する。好ましくは、使用するＷＩＳＰ-１アンタゴニストの量は、癌細胞の成長、転移、又は運動性を低減、又は阻害するのに有効な量である。これは例えば、実施例で後述する方法に従い、インビボ又はエクスビボで実施できる。このようなＷＩＳＰ-１アンタゴニストによって治療されるべき例示的状態又は疾病には、臨床的に癌と呼ばれる哺乳動物の状態が含まれる。
【００４７】
ここでは診断方法も提供される。例えば、アンタゴニストを使用して湿潤性又は転移性癌を検出できる。アンタゴニスト分子は、例えば試料中の転移性癌を検出又は定量化するためのアッセイに使用できる。試料、例えば哺乳動物から採取した細胞を標識したアンタゴニストの存在下でインキュベートし、試料中に結合した標識アンタゴニストの検出を実施することができる。
本方法に使用できるアンタゴニストは、限定しないが、ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシン、ＷＩＳＰ-１を含む融合タンパク質、ＷＩＳＰ-１の供給結合的に修飾された形態、ＷＩＳＰ-１変異体、その融合タンパク質、及びＷＩＳＰ-１抗体を含む。アンタゴニストの作成に使用できる様々な技術がここに開示される。例えば、ＷＩＳＰ-１ポリペプチド調製のための方法と技術が開示される。ポリペプチドのさらなる変形、及びＷＩＳＰ-１に対する抗体も開示される。
【００４８】
ここに開示される完全長天然配列ＷＩＳＰ-１ポリペプチドに加え、ＷＩＳＰ-１ポリペプチド変異体が調製可能であることも考慮される。ＷＩＳＰ-１変異体は、コード化ＤＮＡに適切なヌクレオチド変化を導入すること、及び／又は所望のポリペプチドを合成することにより調製できる。本技術分野の当業者が周知のように、例えばグリコシル化部位の数又は位置の変化、或いは膜固着特性の変更等のアミノ酸変化により、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの翻訳後のプロセスが変化し得る。
ここに開示されるＷＩＳＰ-１ポリペプチドの変異形態を、例えば米国特許第５３６４９３４号に記載されているような保存的及び非保存的突然変異のための技術及びガイドのいずれかを用いて作成することができる。変異とは、天然配列ポリペプチドとは異なるアミノ酸配列を生じさせるような、ポリペプチドをコードする１以上のコドンを置換、削除又は挿入することであってよい。場合によっては、少なくとも１つのアミノ酸を置換し、それ以外のアミノ酸がＷＩＳＰ-１ポリペプチドの１以上のドメインにあると変異となる。所望の活性に逆効果を与えることなく、どのアミノ酸残基を挿入、置換又は削除したらよいかの判断は、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの配列を既知の相同なタンパク質の配列と比較し、相同性の高い領域においてはアミノ酸配列の変更数を最小限にすれば指標となる。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸を同様の構造及び／又はキメラ特性を有する別のアミノ酸で置き換えること、例えばロイシンをセリンに置き換える、つまり保存的なアミノ酸の置き換えとしてよい。場合によっては、挿入又は削除は約１−５のアミノ酸の範囲で行われる。可能な変異は、配列中のアミノ酸を体系的に挿入、削除又は置換し、完全長又は成熟天然配列により示される活性に関して結果的に生じる変異を試験することにより決定できる。
【００４９】
ここにＷＩＳＰ-１ポリペプチド断片が提供される。そのような断片は、完全長天然タンパク質と比較したとき、例えば、Ｎ末端又はＣ末端で切断されているか、又は内部残基を欠損している。一部の断片は所望のＷＩＳＰ-１ポリペプチドの生物学的活性に必須ではないアミノ酸残基を欠いている。
ＷＩＳＰ-１ポリペプチド断片は、多数の従来技術のいずれかにより調製できる。所望のペプチド断片を化学的に合性することができる。別の方法では、酵素消化、例えば特定のアミノ酸残基によって画定される部位においてタンパク質を切断することが知られている酵素を用いてタンパク質を処理すること、又は適切な制限酵素を用いてＤＮＡを消化し、所望の断片を単離することにより、ポリペプチド断片を生成する。また別の適切な技術では、ポリメラーゼ連鎖反応(ＰＣＲ)により所望のポリペプチド断片をコードするＤＮＡ断片の単離と増幅を行う。ＰＣＲにおいて、ＤＮＡ断片の所望の終端を画定するオリゴヌクレオチドを５'及び３'プライマーが使用される。
【００５０】
特定の実施形態における、対象となる保存的置換を以下の表の好ましい置換の欄に示す。このような置換の結果生物学的活性が変化すれば、表の例示的置換の欄に示した置換、又はアミノ酸の分類に関して後述するような置換をさらに導入し、産出物をスクリーニングする。
表
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ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの機能又は免疫学的同一性の実質的な修飾は、(a) 置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はヘリックス構造、(b) 標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は(c) 側鎖の嵩の維持に対して大きく効果を異にする置換基を選択することにより達成される。天然発生残基は共通の側鎖特性に基づいてグループに分けることができる。
(1) 疎水性：ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2) 中性の親水性：cys, ser, thr;
(3) 酸性：asp, glu;
(4) 塩基性：asn, gln, his, lys, arg;
(5) 鎖配向に影響する残基：gly, pro; 及び
(6) 芳香族：trp, tyr, phe
【００５１】
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。このようにして置換された残基も、保存的置換部位、又はさらに好ましくは残りの(非保存的)部位に挿入することができる。
変異は、オリゴヌクレオチド媒介(部位特異的)変異、アラニンスキャンニング、及びＰＣＲ変異などの、この分野で知られた方法を用いて行うことができる。部位特異的変異［Carter等, Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller等, Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)］、カセット変異［Wells等, Gene, 34:315 (1985)］、制限選択変異［Wells等, Philos. Trans.R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)］又は他の周知の技術などをクローニングされたＤＮＡに対して行ってＷＩＳＰ-１ポリペプチド変異ＤＮＡを生産することができる。
【００５２】
また、隣接する配列に沿って１つ又は複数のアミノ酸を同定するのに、スキャニングアミノ酸分析も用いることができる。好ましいスキャニングアミノ酸は、比較的小さい中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し、変異体の主鎖高次構造を変える可能性が低いので、これらの群の中の典型的に好適なスキャンニングアミノ酸である[Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085(1989)]。また、アラニンは、最も普通のアミノ酸であるので典型的に好ましい。さらに、隠れた及び露出した位置の両方で頻繁に見いだされる［Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)］。アラニン置換が適当な量の変異を生じない場合、アイソテリック(isoteric)なアミノ酸を用いることができる。
また、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの適当な構造を維持するのに関与しない任意のシステイン残基は、通常、セリンで置換することで、分子の酸化的安定性を向上させ、異常な架橋を防ぐことができる。逆に、システイン結合をＷＩＳＰ-１ポリペプチドに付加することにより、その安定性を向上させることができる。
【００５３】
以下の説明は、主として、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドコード化核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによるＷＩＳＰ-１ポリペプチドの生産に関する。勿論、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてＷＩＳＰ-１ポリペプチドを調製することができると考えられている。例えば、適切なアミノ酸配列、又はその一部分を、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生成してもよい［例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., サンフランシスコ, カリフォルニア(1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照］。手動技術を使用することによって又は自動によりインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(フォスター  シティー, カリフォルニア)を用いて、製造者の指示によって実施してもよい。ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの種々の部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて所望するＷＩＳＰ-１ポリペプチドを生成させてもよい。開示される方法及び技術は、ＷＩＳＰ-１変異体、ＷＩＳＰ-１及びＷＩＳＰ-１抗体の修飾形態にも同様に適用可能である。
【００５４】
１．ＷＩＳＰ-１ポリペプチドをコードするＤＮＡの単離
ＷＩＳＰ-１ポリペプチドをコードするＤＮＡは、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドｍＲＮＡを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから得ることができる。従って、ヒトＷＩＳＰ-１ポリペプチドＤＮＡは、ヒトの組織から調製されたｃＤＮＡライブラリーから簡便に得ることができる。またＷＩＳＰ-１ポリペプチド-コード化遺伝子は、ゲノムライブラリーから又は公知の合成方法(例えば、自動核酸合成法)により得ることもできる。
ライブラリーは、対象となる遺伝子あるいはその遺伝子によりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(少なくとも約２０〜８０塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーのスクリーニングは、例えばSambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual(ニューヨーク: コールド  スプリング  ハーバー研究所出版, 1989)に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。ＷＩＳＰ-１ポリペプチドをコードする遺伝子を単離する他の方法は、ＰＣＲ法を使用するものである［Sambrook等,上掲；Dieffenbach等, PCR Primer：A Laboratory Manual(コールド  スプリング  ハーバー研究所出版, 1995)］。
【００５５】
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするための技術は、当該分野で良く知られている。プローブとして選択されたオリゴヌクレオチド配列は、疑陽性が最小化されるよう十分な長さであり、十分に明瞭でなければならない。オリゴヌクレオチドは、スクリーニングされるライブラリー内のＤＮＡとのハイブリダイゼーション時に検出可能であるように標識されていることが好ましい。標識化の方法は当該分野において良く知られており、３２Ｐ標識ＡＴＰのような放射性標識、ビオチン化あるいは酵素標識の使用を含む。中程度のストリンジェンシー及び高度のストリンジェンシーを含むハイブリダイゼーション条件は、上掲のSambrook等に示されている。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、GenBankらの公共データベース又は他の個人の配列データベースに寄託され利用可能となっている他の周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内の又は完全長配列に渡っての(アミノ酸又はヌクレオチドレベルのいずれかでの)配列同一性は、当該分野で知られ、ここに記載した方法を用いて決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、ｃＤＮＡに逆転写されていないｍＲＮＡの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸長法を使用して、選択されたｃＤＮＡ又はゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって得られる。
【００５６】
２．宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞を、ここに記載したＷＩＳＰ-１ポリペプチド生成のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に修正された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実際の技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及び上掲のSambrook等に見出すことができる。
真核生物細胞形質移入及び原核生物細胞形質転換の方法、例えば、ＣａＣｌ２、ＣａＰＯ４、リポソーム媒介及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションが、一般的に原核生物に対して用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンスによる感染が、Shaw等, Gene, 23:315(1983)及び1989年6月29日公開の国際公開89/05859に記載されているように、或る種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4399216号に記載されている。酵母菌中への形質転換は、典型的には、Van Solingen等, J. Bact., 130:946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、ＤＮＡを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞との細菌プロトプラスト融合、又は例えばポリブレン、ポリオルニチン等のポリカチオンもまた用いることもできる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336:348-352 (1988)を参照のこと。
【００５７】
ここに記載のベクターにＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。適切な原核生物には、限定するものではないが、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性微生物、例えば大腸菌のような腸内細菌科が含まれる。種々の大腸菌株が公に利用可能であり、例えば、大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)；大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)；大腸菌株Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)及びＫ５７７２(ＡＴＣＣ５３６３５)である。他の好ましい原核動物宿主細胞は、大腸菌属、例えば大腸菌(E. coli)、エンテロバクター、エルビニア(Erwinia)、クレブシエラ(Klebsiella)、プロテウス(Proteus)、サルモネラ、例えばネズミチフス菌(Salmonella Typhimurium)、セラチア、例えばセラチア・マルセサンス(Serratia marcescans) 、及び赤痢菌、並びに桿菌、例えばバチルス・スブチルス(B. subtilis)及びバチルス・リチェニフォルミス(B. licheniformis)(例えば、1989年4月12日公開のＤＤ２６６７１０に記載されたバチルス・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス、などの腸内細菌科を含む。これらの例は限定ではなく例示である。株Ｗ３１１０は、組換えＤＮＡ生成物発酵のための共通の宿主株であるので一つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、株Ｗ３１１０を、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子変異をもたらすように修飾してもよく、そのような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３を有する大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ−ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７(ＡＴＣＣ  ５５，２４４)；完全な遺伝子型ｔｏｎＡ  ｐｔｒ３  ｐｈｏＡ  Ｅ１５  (ａｒｇＦ-ｌａｃ)１６９  ｄｅｇＰ  ｏｍｐＴ  ｒｂｓ７  ｉｌｖＧ  ｋａｎrを有する大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６；非カナマイシン耐性ｄｅｇＰ欠失変異を持つ３７Ｄ６株である大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び1990年8月7日発行の米国特許第4946783号に開示された変異周辺質プロテアーゼを有する大腸菌株を含む。あるいは、クローニングのインビトロ法、例えばＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が好ましい。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドコード化ベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシアは、通常用いられる下等真核生物宿主微生物である。他に、シゾサッカロミセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pombe)(Beach及びNurse, Nature, 290: 140 [1981]；1985年5月2日公開の欧州特許第139383号)；クリュイベロミセス宿主(Kluyveromyces hosts)(米国特許第4943529号; Fleer等, Bio/Technology, 9: 968-975 (1991))、例えばクリュイベロミセスラクチス(K. lactis)(MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt等, J. Bacteriol., 154(2): 737-742 [1983])、クリュイベロミセス・フラギリス(K. fragilis)(ＡＴＣＣ１２４２４)、クリュイベロミセス・ブルガリクス(K. bulgaricus)(ＡＴＣＣ１６０４５)、クリュイベロミセス・ウィケラミイ(K. wickeramii)(ＡＴＣＣ２４１７８)、クリュイベロミセス・ワルチイ(K. waltii)(ＡＴＣＣ５６５００)、クリュイベロミセス・ドロソフィラルム(K. drosophilarum)(ＡＴＣＣ３６９０６； Van den Berg等, Bio/Technology, 8: 135 (1990))、クリュイベロミセス・テモトレランス(K. thermotolerans)及びクリュイベロミセス・マルキシアナス(K. marxianus)；ヤロウィア(yarrowia)(欧州特許第402226号)；ピシア・パストリス(Pichia pastoris)(欧州特許第183070号； Sreekrishna等, J. Basic Microbiol, 28: 265-278 [1988])；カンジダ；トリコデルマ・レーシア(Trichoderma reesia)(欧州特許第244234号)；アカパンカビ(Case等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 5259-5263 [1979])；シュワニオマイセス(Schwanniomyces)、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス(Schwanniomyces occidentalis)(1990年10月31日公開の欧州特許第394538号)；及び糸状真菌、例えば、ニューロスポラ、ペニシリウム、トリポクラジウム(Tolypocladium)(1991年1月10日公開の国際公開91/00357)；及びアスペルギルス宿主、例えばアスペルギルス・ニダランス(Ballance等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112: 284-289 [1983]；Tilburn等, Gene, 26: 205-221 [1983]；Yelton等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984])及びアスペルギルス・ニガー(Kelly及びHynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])が含まれる。ここで好ましいメチロトロピック(Ｃ１化合物資化性、Methylotropic)酵母は、これらに限られないが、ハンセヌラ(Hansenula)、カンジダ、クロエケラ(Kloeckera)、ピシア(Pichia)、サッカロミセス、トルロプシス(Torulopsis)、及びロドトルラ(Rhodotorula)からなる属から選択されたメタノールで成長可能な酵母を含む。この酵母の分類の例示である特定の種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に記載されている。
【００５８】
グリコシル化ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの発現に適した宿主細胞は、多細胞生物由来のものである。非脊椎動物細胞の例には、植物細胞、例えば綿、トウモロコシ、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト及びタバコの細胞培養と同様に、ショウジョウバエＳ２及びヨトウ(spodoptera)Ｓｆ９等の昆虫細胞が含まれる。多くのバキュロウイルス株及び変異体、及びヨトウガ(Spodoptera frugiperda)(幼虫(caterpillar))、ネッタイシマカ(蚊)、ヒトスジシマカ(蚊)、キイロショウジョウバエ(ショウジョウバエ)、及びカイコ等の宿主に対応する許容性昆虫宿主細胞が同定されている。種々のトランスフェクション用のウィルス株、例えばオートグラファ・カルフォルニカ(Autographa californica)ＮＰＶのＬ−１変異株、カイコＮＰＶのＢｍ-５株が公に入手でき、このようなウィルスは、本発明に係るウィルスとして、特に、ヨトウガ細胞のトランスフェクションのために使用してもよい。
しかし、最大の関心は脊椎動物細胞に向けられ、培養(組織培養)した脊椎動物細胞の増殖がルーチン作業となった。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、ＳＶ４０(ＣＯＳ-７，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１６５１)で形質転換させたサル腎ＣＶ１細胞株；ヒト胚芽腎細胞株(２９３又は懸濁培養で成長するようにサブクローン化された２９３細胞，Graham等,J.Gen Virol.,36:59(1977))；ベビーハムスター腎細胞(ＢＨＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ１０)；チヤイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ，Urlaub等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216 (1980))；マウスセルトリ細胞(ＴＭ４，Mather,Biol.Reprod.,23：243-251 (1980))；サル腎細胞(ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０)；アフリカミドリザル腎細胞(ＶＥＲＯ-７６，ＡＴＣＣ ＣＲＬ-１５８７)；ヒト頚管腫瘍細胞(ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ２)；イヌ腎細胞(ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ ＣＣＬ３４)；バッファローラット肝細胞(ＢＲＬ ３Ａ，ＡＴＣＣ ＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞(Ｗ１３８，ＡＴＣＣ ＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞(Ｈｅｐ Ｇ２，ＨＢ ８０６５)；マウス乳房腫瘍細胞(ＭＭＴ ０６０５６２，ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝臓癌細胞(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、ＷＩＳＰ-１ポリペプチド生成のために上述の発現又はクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘発し、形質転換体を選出し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適切に修正した通常の栄養培地で培養される。
【００５９】
３．複製可能なベクターの選択及び使用
ＷＩＳＰ-１ポリペプチドをコードする核酸(例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ)は、クローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、ＤＮＡはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の１つ又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
ＷＩＳＰ-１は組換え手法によって直接産生されるだけではなく、シグナル配列、あるいは成熟タンパク質ないしポリペプチドのＮ-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである、異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても産生される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるＷＩＳＰ-１ポリペプチド-コード化ＤＮＡの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリフォスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクリュイベロミセス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5010182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行の欧州特許第362179号)、又は1990年11月15日に公開された国際公開90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
【００６０】
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。そのような配列は多くの細菌、酵母及びウイルスについてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a) アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b) 栄養要求性欠陥を補い、又は(c) 例えばバチルスのＤ-アラニンラセマーゼをコードする遺伝子などの、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質、をコードする。
【００６１】
哺乳動物細胞に適切な選択マーカーの例は、ＤＨＦＲあるいはチミジンキナーゼのように、ＷＩＳＰ-１ポリペプチド-コード化核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたＤＨＦＲ活性に欠陥のあるＣＨＯ株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である［Stinchcomb等, Nature, 282: 39(1979)；Kingsman等, Gene, 7: 141(1979)；Tschemper等, Gene, 10: 157(1980)］。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ番号４４０７６あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファンで成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する［Jones, Genetics, 85:12 (1977)］。
発現及びクローニングベクターは、通常、ＷＩＳＰ-１ポリペプチド-コード化核酸配列に作用可能に結合し、ｍＲＮＡ合成を方向付けるプロモーターを含む。種々の有能な宿主細胞により認識されるプロモーターが知られている。原核生物宿主との使用に適したプロモーターはβ-ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系［Chang等, Nature, 275:615 (1978)；Goeddel等, Nature, 281:544 (1979)］、アルカリフォスファターゼ、トリプトファン(trp)プロモーター系［Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)；欧州特許第36,776号］、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター［deBoer等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)］を含む。細菌系で使用するプロモーターもまたＷＩＳＰポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
【００６２】
酵母宿主との使用に適したプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ［Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)］又は他の糖分解酵素［Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17: 4900(1978)］、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸フォスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモーターは欧州特許第73657号に更に記載されている。
【００６３】
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからのＷＩＳＰ-１ポリペプチド転写は、例えば、ポリオーマウィルス、伝染性上皮腫ウィルス(1989年7月5日公開の英国特許第2211504号)、アデノウィルス(例えばアデノウィルス２)、ウシ乳頭腫ウィルス、トリ肉腫ウィルス、サイトメガロウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス及びサルウィルス４０(ＳＶ４０)のようなウィルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、及びヒートショックプロモーターから得られるプロモーターによって、このようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り制御される。
より高等の真核生物によるＷＩＳＰ-１ポリペプチドをコードするＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約１０から３００塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するＤＮＡのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドコード化配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから５'位に位置している。
【００６４】
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの通常は５'、時には３'の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのＷＩＳＰ-１ポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981)；Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979)；欧州特許第117060号；及び欧州特許第117058号に記載されている。
【００６５】
４．宿主細胞の培養
本発明のＷＩＳＰ-１ポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地の例としては、ハム(Ham)のＦ１０(シグマ)、最小必須培地((MEM),シグマ)、ＲＰＭＩ-１６４０(シグマ)及びダルベッコの改良イーグル培地((DMEM),シグマ)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58:44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102:255 (1980), 米国特許第4767704号；同4657866号；同4927762号；同4560655号；又は同5122469号；国際公開第90/03430号；国際公開第87/00195号；又は米国特許再発行第30985号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培養培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の増殖因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は上皮増殖因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオシド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン(商品名)薬)、微量元素(マイクロモル範囲の最終濃度で通常は存在する無機化合物として定義される)及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。
【００６６】
５．遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子の増幅及び／又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、ｍＲＮＡの転写を定量化するノーザンブロット法［Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)］、ドットブロット法(ＤＮＡ分析)、又はインサイツハイブリダイゼーションによって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、ＤＮＡ二本鎖、ＲＮＡ二本鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二本鎖又はＤＮＡ-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。ついで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果、表面での二本鎖の形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量化する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって、測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び／又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列ＷＩＳＰポリペプチドに対して、又はここで提供されるＤＮＡ配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はＷＩＳＰ ＤＮＡに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
【００６７】
６．ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの精製
ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの様々な形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いて又は酵素的切断により膜から引き離すことができる。ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
ＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される：すなわち、イオン交換カラムでの分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィ；クロマトフォーカシング；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばセファデックスＧ-７５を用いるゲル濾過;ＩｇＧのような汚染物を除くプロテインＡセファロースカラム；及びＷＩＳＰ-１ポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, ニューヨーク (1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生成方法及び特に生成される特定のＷＩＳＰ-１ポリペプチドの性質に依存する。
【００６８】
ＷＩＳＰ-１の可溶性型を本方法においてアンタゴニストとして使用することができる。このようなＷＩＳＰ-１の可溶性型は、以下に示すような変形を含む(イムノグロブリン、エピトープタグ又はロイシンジッパーへの融合によるものなど)。イムノアドヘシン分子は、ここに開示の方法におけるさらなる使用が考慮される。ＷＩＳＰ-１イムノアドヘシンは、完全長ポリペプチド、並びにＷＩＳＰ-１の可溶性型又はその断片のような、ＷＩＳＰ-１の様々な形体を含んでもよい。ある実施態様において、分子は、ＷＩＳＰ-１ポリペプチドと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定の領域との融合体を含んでもよい。イムノアドヘシンの二価の形体に対して、そのような融合は、ＩｇＧ分子のＦｃ領域に対して行われてもよい。Ｉｇ融合は、好適には、Ｉｇ分子の少なくとも１の可変領域に代えて、ポリペプチドの可溶性型(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化型)で置換することを含む。特に好適な実施態様において、イムノグロブリンの融合は、ＩｇＧ１分子のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３、又はヒンジ、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む。イムノグロブリン融合体の生産については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号、及びChamow等, TIBTECH, 14:52-60(1996)も参照のこと。
最も単純で最も直接的なイムノアドヘシン設計は、アドヘシン(例えばＷＩＳＰ-１)の結合ドメインと免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域を組み合わせる。通常、本発明のイムノアドヘシンを調整する場合、アドヘシンの結合ドメインをコードする核酸をＣ末端でイムノグロブリン定常ドメイン配列のＮ末端をコードする核酸に融合させるが、Ｎ末端融合は不可能である。
【００６９】
典型的には、そのような融合において、コード化されるキメラポリペプチドは免疫グロブリン重鎖の定常ドメインの機能的に活性なヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを保持する。融合はまた定常ドメインのＦｃ領域のＣ末端、又は重鎖のＣＨ１又は軽鎖の対応する領域にＮ末端に直ぐになされる。融合がなされる正確な部位は重要なものではない；特定の部位がよく知られており、イムノアドヘシンの生物活性、分泌、又は結合特性を最適化するために選択されうる。
好ましい実施態様では、アドヘシン配列が免疫グロブリンＧ１(ＩｇＧ１)のＦｃ領域のＮ末端に融合される。アドヘシン配列に重鎖定常領域全体を融合させることができる。しかし、より好ましくは、ＩｇＧのＦｃを化学的に定めるパパイン切断部位の直ぐ上流のヒンジ領域に始まる配列(すなわち、重鎖定常領域の最初の残基を１１４として残基２１６)、又は他の免疫グロブリンの類似部位が融合において使用される。特に好適な実施態様では、アドヘシンアミノ酸配列はＩｇＧ重鎖の(a)ヒンジ領域及びＣＨ２及びＣＨ３又は(b)ＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合される。
【００７０】
二重特異的イムノアドヘシンについては、イムノアドヘシンは多量体として、特にヘテロ二量体又はヘテロ四量体として組み立てられる。一般には、これらの組み立てられた免疫グロブリンは既知の単位構造を有している。基本的な四鎖構造単位はＩｇＧ、ＩｇＤ及びＩｇＥが存在する型である。四鎖単位はより高分子量の免疫グロブリンにおいて繰り返される；ＩｇＭは一般にジスルフィド結合によって一緒に保持される四つの基本単位の五量体として存在する。ＩｇＡグロブリン、そして時折ＩｇＧグロブリンが血清中に多量体型で存在しうる。多量体の場合、四つの単位の各々は同じでも異なっていてもよい。
ここに記載した範囲内の様々な組み立てられたイムノアドヘシンの例は以下に概略的に模式化される： 
(a) ＡＣＬ-ＡＣＬ； 
(b) ＡＣＨ-(ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(c) ＡＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＡＣＨ, ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, ＶＬＣＬ-ＡＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)；
(d) ＡＣＬ-ＶＨＣＨ-(ＡＣＨ, 又はＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；
(e) ＶＬＣＬ-ＡＣＨ-(ＡＣＬ-ＶＨＣＨ, 又はＶＬＣＬ-ＡＣＨ)；及び
(f) (Ａ-Ｙ)ｎ-(ＶＬＣＬ-ＶＨＣＨ)２；
ここで、各Ａは同一又は異なったアドヘシンアミノ酸配列を示し；
ＶＬは免疫グロブリン軽鎖可変ドメインであり；
ＶＨは免疫グロブリン重鎖可変ドメインであり；
ＣＬは免疫グロブリン軽鎖定常ドメインであり；
ＣＨは免疫グロブリン重鎖定常ドメインであり；
ｎは１より大きい整数であり；
Ｙは共有結合架橋剤の残基を示す。
【００７１】
簡略化のため、先の構造はキーとなる特徴を示しているのみである；これらは、免疫グロブリンの結合する(Ｊ)又は他のドメインを示していないしジスルフィド結合も示していない。しかし、そのようなドメインが結合活性に対して必要である場合は、それらを構築して、免疫グロブリン分子にそれらが占める通常の位置に存在させることができる。
あるいは、アドヘシン配列は、キメラ重鎖を含んでなる免疫グロブリンが得られるように、免疫グロブリン重鎖と軽鎖配列の間に挿入することができる。この実施態様では、アドヘシン配列は免疫グロブリンの各アームの免疫グロブリンの重鎖の３'末端に、ヒンジとＣＨ２ドメインの間、又はＣＨ２とＣＨ３ドメインの間の何れかで融合される。同様な作成物がHoogenboom等, Mol.Immunol.28:1027-1037(1991)によって報告されている。
【００７２】
免疫グロブリン軽鎖の存在は本発明のイムノアドヘシンにおいて必要ではないけれども、免疫グロブリン軽鎖はアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合ポリペプチドに共有結合的に結合するか、アドヘシンに直接的に融合されるかもしれない。前者の場合、免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは典型的にはアドヘシン-免疫グロブリン重鎖融合タンパク質をコードするＤＮＡと同時発現される。分泌時にハイブリッドの重鎖及び軽鎖が共有結合的に結合されて、２つのジスルフィド結合で結合した免疫グロブリン重鎖-軽鎖対を含んでなる免疫グロブリン様構造を提供する。そのような構造の調製に好適な方法は、例えば1989年3月28日に発行された米国特許第4,816,567号に開示されている。
イムノアドヘシンは最も簡便には免疫グロブリンｃＤＮＡ配列にインフレームでアドヘシン部分をコードするｃＤＮＡ配列を融合させることにより構築される。しかし、ゲノム免疫グロブリン断片への融合もまた使用することができる(例えば、Aruffo等,Cell61:1303-1313(1990)；及びStamenkovic等,Cell66:1133-1144(1991)を参照されたい)。融合の後者のタイプは、発現に対してＩｇ調節配列の存在を必要とする。ＩｇＧ重鎖定常領域をコードするｃＤＮＡは、脾臓又は末梢血リンパ球から取り出されたｃＤＮＡライブラリーからの公開されている配列に基づいて、ハイブリダイゼーションにより、又はポリメラーゼ鎖反応(ＰＣＲ)法により単離することができる。「アドヘシン」をコードするｃＤＮＡとイムノアドヘシンの免疫グロブリンが、選ばれた宿主細胞において効率的な発現を指示するプラスミドベクター内にタンデムに挿入される。
【００７３】
他の実施態様において、ＷＩＳＰ-１又はＷＩＳＰ-１アンタゴニストは、米国特許第4,640,835号；第4,496,689号；第4,301,144号；第4,670,417号；第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法で、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール(ＰＥＧ)、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンのうち一つに、又はポリグルタミン酸のような同様の分子に、ポリペプチドを連結させることにより共有結合的に修飾される。このようなペグ化形態は当該技術分野において既知の方法を用いて調製してもよい。
また、これらの分子のロイシンジッパー形態も本発明によって考慮される。「ロイシンジッパー」は当該技術分野において、その融合相手(例えば、ロイシンジッパーが融合するか、又は連結する配列又は分子)の二量体化又は三量体化を増強し、促進し、又は引き起こすロイシンに富む配列のことを意味するために使用される語句である。様々なロイシンジッパーポリペプチドは当該分野において記述されている。例えば、Landschulz等, Science 240:1759 (1988)；米国特許第5,716,805号；国際公開公報94/10308；Hoppe等, FEBS Letters 344:1991 (1994)；Maniateis等, Nature, 341:24 (1989)；Maniatis等, Nature 341:24 (1989)を参照されたい。当業者であれば、ロイシンジッパー配列をＷＩＳＰ-１又はＷＩＳＰ-１アンタゴニスト分子の５'末端又は３'末端に融合しうることは理解するであろう。
【００７４】
また、本発明のＷＩＳＰ-１ポリペプチドは、他の異種ポリペプチド又はアミノ酸配列に該ポリペプチドを融合することによりキメラ分子を形成する方法で修飾してもよい。好ましくは、そのような異種性ポリペプチド又はアミノ酸配列は、キメラ分子をオリゴマー化するように作用するものである。一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドと本発明のＷＩＳＰ-１ポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的には本発明のポリペプチドのアミノ又はカルボキシル末端に位置する。このようなポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってＷＩＳＰポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ−ヒスチジン(poly-his)又はポリ−ヒスチジン−グリシン(poly-his-gly)タグ；flu HAタグポリペプチド及びその抗体１２ＣＡ５［Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)］；c-mycタグ及びそれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)]；及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質Ｄ(gD)タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)]；ＫＴ３エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)]；α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)]；及びＴ７遺伝子１０タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
抗ＷＩＳＰ-１抗体は個々に開示する方法に使用できると考えられる。そのような分子の例には、癌細胞の成長、転移又は運動性を低減し得る中和又は遮断抗体を含む。抗−ＷＩＳＰ-１は、モノクローナル抗体であってもよい。
【００７５】
モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)等により記載されたハイブリドーマ法によって調製することができる。ハイブリドーマ法においては、免疫剤を用いてマウス、ハムスター又はその他の適当な宿主動物通常通りに免疫し、免疫剤と特異的に結合する抗体を産生するか、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。
免疫剤は、典型的には対象とするＷＩＳＰ-１ポリペプチド又はその融合タンパク質、例えばＷＩＳＰ-１ ＩｇＧ融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「ＰＢＬ」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する［Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103］。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は増殖を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプテリン及びチミジンを含み(「ＨＡＴ培地」)、この物質がＨＧＰＲＴ欠乏性細胞の増殖を阻止する。
【００７６】
好ましい不死化株化細胞は、効率的に融合し、選択された抗体生成細胞による安定した高レベルの抗体発現を支援し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性である。より好ましい不死化株化細胞はマウス骨髄腫株であり、これは例えばカリフォルニア州サンディエゴのSalk Institute Cell Distribution Centerやヴァージニア州マナッサスのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションより入手可能である。ヒトモノクローナル抗体を生成するためのヒト骨髄腫及びマウス-ヒト異種骨髄腫株化細胞も開示されている［Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984)、Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, (1987) pp. 51-63］。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、ＷＩＳＰ-１に対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)や酵素結合免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード解析法によって測定することができる。
【００７７】
所望のハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法で増殖させることができる［Goding, 上掲］。この目的のための適当な培地には、例えば、ダルベッコの改変イーグル培地又はRPMI-1640倍地が含まれる。あるいは、ハイブリドーマ細胞は哺乳動物においてインビボで腹水として増殖させることもできる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィ等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
【００７８】
また、モノクローナル抗体は、組換えＤＮＡ法、例えば米国特許第4,816,567号に記載された方法により作成することができる。本発明のモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常套的な方法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能なオリゴヌクレオチドプローブを使用して)、容易に単離し配列決定することができる。本発明のハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい供給源となる。ひとたび単離されたら、ＤＮＡは発現ベクター内に配することができ、これが宿主細胞、例えばサルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、あるいは免疫グロブリンタンパク質を生成等しない骨髄腫細胞内に形質移入され、組換え宿主細胞内でモノクローナル抗体の合成をすることができる。また、ＤＮＡは、例えば相同マウス配列に換えてヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインのコード配列を置換することにより［Morrison等, Proc. Nat. Acad. Sci. 81, 6851 (1984)］、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の一部又は全部を共有結合することにより修飾することができる。
このような非免疫グロブリンポリペプチドは、本発明の抗体の定常ドメインに置換でき、あるいは本発明の抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインに置換でき、ＷＩＳＰ-１の特異性を持つ１つの抗原結合部位、及び異なる抗原に対する特異性を持つ部位を有するキメラ性二価抗体を生成する。
【００７９】
キメラ又はハイブリッド抗体も、架橋剤を用いる合成タンパク質化学における既知の方法を用いてインビトロで調製できる。例えば、ジスルフィド交換反応を用いることにより、又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を構築できる。この目的のための適切な試薬の例は、イミノチオラート及びメチル-４-メルカプトブチルイミダートである。
一本鎖Ｆｖ断片を、Iliades等, FEBS Letters, 409:437-441 (1997)に記載に従って生産できる。様々なリンカーを使用したこのような一本鎖断片の結合は、Kortt等, Protein Engineering, 10:423-433 (1997)に開示されている。抗体の組換え生産及び操作の様々な技術が当技術分野において既知である。当業者によって利用されるそのような技術の例示的実施例を以下に詳述する。
【００８０】
(i) ヒト化抗体
一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は、基本的に、ウィンター(Winter)及び共同研究者(Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988))の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。
よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
更に、抗体を、抗原に対する高結合親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、好ましい方法では、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をコンセンサス及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
【００８１】
(ii) ヒト抗体
ヒトモノクローナル抗体はハイブリドーマ法により作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の生成のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種骨髄腫の細胞系は、例えば、Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984), 及びBrodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., ニューヨーク, 1987)に記載されている。
内在性の免疫グロブリン産生がない状態で、免疫化によりヒト抗体のレパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが現在では可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(ＪＨ)遺伝子の同型接合除去が内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の移入は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)を参照のこと。
【００８２】
Mendez等(Nature Genetics 15: 146-156 [1997年])はこの技術をさらに改良し、抗原を投与すると親和性の高い完全ヒト抗体を生成する「ゼノマウスII(Xenomouse II)」と称する系列のトランスジェニックマウスを生成した。これは、上述のように、内因性ＪＨセグメントに欠陥を有するマウスに、メガベースのヒト重鎖遺伝子座及び軽鎖遺伝子座を生殖系に統合組み込みすることにより達成された。ゼノマウスIIは、約６６ＶＨ遺伝子、完全なＤＨ及びＪＨ領域及び３つの異なる定常領域(μ、δ及びχ)を含む１，０２０ｋｂのヒト重鎖遺伝子座を有し、また３２Ｖκ遺伝子、Ｊκセグメント及びＣκ遺伝子を含む８００ｋｂのヒトκ遺伝子座を有する。これらのマウスに生成された抗体は、遺伝子再配列、構成、及びレパートリーを含め、ヒトに見られる抗体に全ての面で非常に類似している。ヒト抗体は、好ましくは、マウス座における遺伝子再配列を抑制する内因性ＪＨセグメントの欠損により、内因性抗体全体にわたって発現する。
別法として、ファージディスプレイ技術(McCafferty等, Nature 348：552-553, 1990)を使用して、非免疫化ドナーの免疫グロブリン可変(Ｖ)ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を生産させることができる。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの、メジャー又はマイナーコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づく選択によっても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、Marks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術にそのまま従うことで単離することができる。自然な免疫応答において、抗体遺伝子は高い率で突然変異を蓄積する(体細胞過剰変異)。導入された変化の一部は高い親和性を提供し、親和性の高い表面免疫グロブリンを示すＢ細胞は、その後の抗原曝露の間に優先的に複製され、分化される。このような自然の工程を、「チェーンシャフリング」として知られる技術(Marks等, Bio/Technol. 10, 779-783, 1992)を使用することにより模倣することができる。この方法では、重鎖Ｖ領域遺伝子と軽鎖Ｖ領域遺伝子を、順に、非免疫化ドナーから取得したＶドメイン遺伝子の自然に生じる変異体(レパートリー)のレパートリーで置換することにより、ファージディスプレイによって得られた「一次」ヒト抗体の親和性を改善することができる。この技術により、ｎＭ範囲での親和性を有する抗体及び抗体断片の生産が可能である。非常に大きなファージ抗体のレパートリー(「マザーオブオール ライブラリー(the Mother-of-all libraries)」とも呼ばれる)を作る方法が、WaterhouseらによるNucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993)に開示されている。また、遺伝子シャフリングは、ヒト抗体が元になっている齧歯類の抗体と類似した親和性及び特性を有している場合、齧歯類の抗体からヒト抗体を得るために使用することもできる。「エピトープインプリンティング」と呼ばれるこの方法により、ファージディスプレイ技術により得られた齧歯類抗体の重鎖Ｖドメイン遺伝子と軽鎖Ｖドメイン遺伝子をヒトＶドメイン遺伝子のレパートリーで置換し、齧歯類−ヒトキメラを作成する。抗原を選択することにより、機能的抗原結合部位を回復することができるヒト可変部が単離される、つまり、エピトープがパートナーの選択をつかさどる(インプリントする)。残りの齧歯類Ｖドメインを置換するためにこの工程を繰り返すと、ヒト抗体が��られる(1993年4月1日公開のPCT特許出願国際公開公報93/06213を参照)。伝統的なＣＤＲ移植による齧歯類抗体のヒト化と異なり、この技術により、齧歯類起源のフレームワーク又はＣＤＲ残基を全く持たない完全なヒト抗体が得られる。
後述するように、本発明の抗体は、状況に応じて、一量体抗体、二量体抗体、ならびに抗体の多価形態を含んでよい。当業者は、当分野で既知の技術により、そのような二量体又は多価形態を構築することができる。一価抗体を調製する方法もまた、当技術分野で周知である。例えば、一方法では、免疫グロブリン軽鎖と修飾された重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般にFc領域の任意の点で切断され、重鎖の架橋が形成されることが防止される。あるいは、関連するシステイン残基を別のアミノ酸残基で置換するか、又は削除し、よって架橋結合を防止する。
【００８３】
(iii) 二重特異性抗体
二重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本発明の場合、結合特異性の一方はＷＩＳＰ-１に対してである。例えば、ＷＩＳＰ-１又はＷＩＳＰ-１変異体及び別のＣＮＮファミリーメンバー(例えばＷＩＳＰ-２、ＷＩＳＰ-３、ＣＴＧＦ、Ｃｙｒ６１、又はＮｏｖ)に特異的に結合する二重特異性抗体は、本発明に含まれる。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖／軽鎖対の発現に基づく。Millstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は１０種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィ工程によって通常達成されるが、幾分扱いにくく、生産性が低い。同様の手順が1993年5月13日公開の国際公開公報93/08829、及びTraunecker等, EMBO,10:3655-3659 (1991)に開示されている。
【００８４】
さらに好ましい別の方法により、所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコード化するＤＮＡ、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が所最適な収率をもたらす実施態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな融通性がもたらされる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を１つの発現ベクターに挿入することが可能である。この手法の好ましい実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と、他方のアームにハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、1994年3月3日公開の国際公開公報94/04690に開示されている。
二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
【００８５】
(iv) ヘテロ抱合抗体
ヘテロ抱合抗体も本発明の範囲に含まれる。ヘテロ抱合抗体は、２つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びＨＩＶ感染の治療のために(国際公開公報91/00360；国際公開公報92/200373；欧州特許第03089号)提案されている。ヘテロ抱合抗体は、任意の簡便な架橋法を使用して、調製することができる。適切な架橋剤は当技術分野において既知であり、複数の架橋技術と共に、米国特許第4,676,980号に開示されている。
【００８６】
(v) 抗体断片
一部の実施態様においては、抗ＷＩＳＰ-１抗体(マウス抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び抗体変異体を含む)は抗体断片である。抗体断片を生産するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化を介して誘導されている(例えば、Morimoto等, J. Biochem. Biophys. Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接生産することができる。例えば、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合してF(ab')２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他の実施態様では、ロイシンジッパーGCN4を使用してＦ(ａｂ')２を形成し、Ｆ(ａｂ')２分子の構築を促進する。別の実施態様では、組換え宿主細胞の培地からＦｖ、Ｆａｂ又はＦ(ａｂ')２断片を直接分離することができる。抗体断片を生産するための他の技術は当業者には明らかである。例えば、パパインを使用して消化を行うことができる。パパイン消化の例は、1994年12月22日公開の国際公開公報94/29348及び米国特許第4,342,566号に開示されている。抗体のパパイン消化は、通常、Ｆａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片を生成する。各Ｆａｂ断片は単一の抗原結合部位、及び残存性Ｆｃ断片を持つ。ペプシン処理により、２つ抗原結合部位を持ち、抗原に架橋結合する能力のあるＦ(ａｂ')２が生成される。
抗原消化で生成されるＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメイン及び重鎖の第一定常ドメイン(ＣＨ１)も含む。Ｆａｂ’断片は、それに加えて、抗原ヒンジ領域由来の１以上のシステインを含む重鎖のＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に少数の残基を持つ点においてＦａｂ断片と異なる。本発明では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ'として、ここではＦａｂ'-ＳＨと記載する。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、もともとそれらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生成されたものである。抗体断片の他の化学的結合も知られている。
【００８７】
抗体をその定常領域の保存位置でグリコシル化する(Jefferis及びLund, Chem. Immunol. 65:111-128, 1997年; Wright及びMorrison, TibTECH 15:26-32, 1997)。免疫グロブリンのオリゴ糖側鎖は、タンパク質の機能(Boyd他., Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996年; Wittwe及びHoward, Biochem. 29:4175-4180, 1990)、及び、糖タンパク質の高次構造及び提示される三次元表面に影響しうる糖タンパク質の部分同士の分子内相互作用(Hefferis及びLund, 上掲; Wyss and Wagner, Current Opin. Biotech. 7:409-416, 1996)に作用する。オリゴ糖はまた、特異的な認識構造に基づいて任意の糖タンパク質を特定の分子に標的化するのに役立つ。例えば、アガラクトシル化ＩｇＧにおいて、オリゴ糖部分はＣＨ２内空間の外に「とび出し(flip)」、末端Ｎ−アセチルグリコサミン残基がマンノース結合タンパク質に結合できるようになることが報告されている(Malhotra等, Nature Med. 1:237-243, 1995)。チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞において、オリゴ糖のグリコペプチダーゼによるＣＡＭＰＡＴＨ-１Ｈ(ヒトリンパ球のＣＤｗ５２抗原を認識する組換えヒト化マウスモノクローナルＩｇＧ１抗体)からの除去を実行した結果、補体媒介性溶解(ＣＭＣＬ)が完全に低減したが(Boyd等, Mol. Immunol. 32:1311-1318, 1996)、ノイラミニダーゼを使用してシアル酸残基を選択的に除去した結果、ＤＭＣＬの低減は見られなかった。抗体のグリコシル化はまた、抗体依存性の細胞の細胞障害性(ＡＤＣＣ)に影響することが報告されている。特に、バイセクティングＧｌｃＮＡｃの形成を触媒するグリコシルトランスフェラーゼである、β(１,４)-N-アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(ＧｎＴIII)のテトラサイクリン制御発現を持つＣＨＯ細胞で、ＡＤＣＣ活性が向上したことが報告されている(Umana等, Mature Biotech. 17:176-180, 1999)。
抗体のグリコシル化変異体は、抗体のグリコシル化のパターンが変更された変異体である。変更するとは、抗体に見られる１以上の炭水化物部分を除去し、抗体に１以上の炭水化物部分を加え、グリコシル化の組成(グリコシル化パターン)、グリコシル化の範囲、その他を変更することを意味する。グリコシル化変異体は、例えば、抗体をコードする核酸配列について、１以上のグリコシル化部位の、除去、変更、及び/又は付加を行うことにより調製することができる。
【００８８】
抗体のグリコシル化は、通常、Ｎ−結合かＯ−結合である。Ｎ−結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物成分の付与を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−スレオニン(ここで、Ｘはプロリン以外の任意のアミノ酸)は、炭水化物成分のアスパラギン側鎖への酵素的付与の認識配列である。したがって、ポリペプチド中にこれらトリペプチド配列のいずれかが存在することにより、潜在的グリコシル化部位が創造される。Ｏ−結合のグリコシル化とは、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの、Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの糖類のうち１つの付着を指す。５−ヒロドキシプロリン、又は５−ヒドロキシリジンを使用してもよい。
抗体へのグリコシル化部位の付加は、(Ｎ−結合グリコシル化部位について)上述のトリペプチド配列の１又は複数を有するようにアミノ酸配列を変更することにより常套的に達成される。変更は、また、(Ｏ−結合グリコシル化部位について)元の抗体の配列に対して１以上のセリン又はスレオニン残基を付加又は置換することにより行ってもよい。
【００８９】
抗体のグリコシル化(グリコシル化パターンを含む)は、内在するヌクレオチド配列を変更することなく変更可能である。グリコシル化は抗体を発現するために使用される宿主細胞に大きく依存する。潜在的治療剤として、抗体などの組換え糖タンパク質の発現に使用される細胞の種類が、まれに天然の細胞であることから、抗体のグリコシル化パターンは大きく変化することが予想される(例えばHse等, J. Biol. Chem. 272:9062-9070, 1997年参照)。宿主細胞の選択に加えて、抗体の組換え産生の間のグリコシル化に影響を与える因子には、増殖形態、媒地組成、培養密度、酸素添加、ｐＨ、精製スキームなどが含まれる。オリゴ等製造に関わるある種の酵素の導入又は過剰発現を含む、特定の宿主生物においてなされたグリコシル化パターンを変えるための様々な方法が提案されている(米国特許第5,047,335号、米国特許第5,510,261号及び米国特許第5,278,299号)。グリコシル化、又は特定の種類のグリコシル化は、例えばエンドグリコシダーゼＨ(Endo H)の使用により、糖タンパク質から酵素学的に除去することができる。加えて、組換え宿主細胞を遺伝学的に設計することができ、例えば多糖類の特定種のプロセシングにおいて欠損をつくることができる。これら同様の技術は当技術分野において既知である。
抗体のグリコシル化構造は、レクチンクロマトグラフィ、ＮＭＲ、質量分析、ＨＰＬＣ、ＧＰＣ、単糖成分分析、連続酵素消化、及び高ｐＨアニオン交換クロマトグラフィを使用して電荷に基づきオリゴ糖を分離するＨＰＡＥＣ-ＰＡＤなどの、炭水化物分析を行う従来技術により容易に分析できる。分析的な目的のためにオリゴ糖を遊離させる方法も知られており、それらには、限定はしないが、酵素的処理(通常ペプチド−Ｎ−グリコシダーゼ Ｆ／エンド−β−ガラクトシダーゼを使用して行う)、主にＯ−結合構造を遊離するための強アルカリ環境を使用しての除去、及びＮ−結合とＯ−結合両方のオリゴ糖を遊離させるための無水ヒドラジンを使用する化学的方法が含まれる。
三重特異性抗体も本発明の範囲に含まれる。そのような抗体は、例えばIliades等、上掲のKortt等, 上掲に記載されている。
【００９０】
本発明の抗体は、細胞傷害剤(例えば毒素分子)又はプロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開公報81/01145号を参照)を活性な抗ガン剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることにより、修飾することができる。例えば国際公開公報88/07378及び米国特許第4,975,278号を参照されたい。この技術は「抗体依存性酵素媒介プロドラッグ療法」(ＡＤＥＰＴ)とも呼ばれる。
ＡＤＥＰＴに有用な免疫コンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。限定するものではないが、この発明の方法に有用な酵素には、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗ガン剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；カスパーゼ−３などのカスパーゼ；Ｄ-アミノ酸置換基を含有するプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びβガラクトシダーゼ；βラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なβラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた公知の、酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328:457-458(1987)を参照)。抗体-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、腫瘍細胞群にアブザイムを送達するために調製することができる。
【００９１】
酵素は当該分野においてよく知られている技術、例えばヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、抗体に共有的に結合させることができる。あるいは、本発明の抗体の少なくとも抗原結合領域を本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(Neuberger等, Nature 312:604-608(1984))。
さらなる抗体の修飾を考慮する。例えば、抗体を様々な非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、又はポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマー、或いはポリグルタミン酸等のその他の分子の１つに結合させることができる。又は抗体を、例えばコアセルベーション技術又は界面重合(例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ−(メチルメタクリル酸)マイクロカプセル)により、コロイド性薬剤送達系(例えばリポソーム、アルブミン微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)に調製したマイクロカプセルに封入することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A., Ed., (1980)に開示されている。抗体の血清半減期を増加させるため、例えば、米国特許第5,739,277号に記載のように、サルベージレセプター結合エピトープを抗体(特に抗体断片)に包含してもよい。ここで使用する「サルベージレセプター結合エピトープ」という用語は、インビボでＩｇＧ分子の血清半減期を増加させるＩｇＧ分子(例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを指す。
【００９２】
製剤
ここに開示されるＷＩＳＰ-１アンタゴニストを状況に応じて担体に使用する。適切な担体とその製剤は、Osolらにより編集されたRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed.., 1980,Mack Publishing Co.に記載されている。典型的には、適当量の製薬的に許容可能な塩が製剤を等張にするために担体中に使用される。担体の例には、生理食塩水、リンゲル液及びブドウ糖液が含まれる。担体のｐＨは好ましくは約５から約８、より好ましくは約７．４から約７．８である。例えば投与経路及び投与される薬剤の濃度に応じてある種の担体がより好ましいことは当業者には明らかであろう。担体は凍結乾燥された製剤又は水性溶液の形態をとりうる。
許容できる担体、賦形剤又は安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、リン酸、クエン酸及び他の有機酸等の緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンズアルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン類、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(残基数１０個未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、ヒスチジン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース又はデキストリン等の単糖類、二糖類又は他の炭水化物、ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖類、ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はTWEEN(登録商標)、PLURONICS(登録商標)又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００９３】
また、製剤は、治療される特定の効能に必要な一以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。
またここに開示されるアンタゴニストは、例えばコアセルベーション法又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタクリレート)マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルションに捕捉することができる。このような技術はRemington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol,A.編(1980)に開示されている。
【００９４】
インビボ投与に使用される製剤は滅菌されていなくてはならない。これは、滅菌フィルター膜を通す濾過により容易に達成される。
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適切な例には、活性剤を含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが含まれ、このマトリックスはフィルム又はマイクロカプセル等の成形品の形態である。徐放性マトリックスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えばポリ(２-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール)、ポリラクチド(米国特許第3773919号)、Ｌ-グルタミン酸とγ-エチル-Ｌ-グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性の乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばLUPRON DEPOT(登録商標)(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシ酪酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニルや乳酸-グリコール酸等のポリマーは１００日以上分子を放出できるが、特定のヒドロゲルはより短い時間タンパク質を放出する。
【００９５】
治療の形態
ここに開示される分子は様々な病理的状態の治療に有用である。これらの状態は、ここに開示されるアンタゴニストの１以上の投与により治療することができる。ここに開示される様々な病理的状態を持つ哺乳動物の診断は、専門の医師により行うことができる。診断技術は、例えば哺乳動物の癌又は免疫関連疾患の診断又は検出を可能にする従来技術を使用できる。例えば、限定されないが、触診、血液分析、レントゲン、ＮＭＲ等を含む技術により癌を識別できる。
アンタゴニストは、公知の方法、例えばボーラスとしてもしくは一定時間にわたる連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液包内、くも膜下腔内、経口、局所的、又は吸入経路により投与される。場合によっては、投与は、様々な市販の装置を使用するミニポンプ流入によって実施することもできる。また、従来技術に開示されている遺伝子治療技術を使用してアンタゴニストを使用することもできる。
【００９６】
アンタゴニストの投与の有効な用量とスケジュールは、経験的に決定することができ、そのような決定を行うことは当業者の技量の範囲にある。１回、又は複数回の投与を行うことができる。単独に使用されるアンタゴニストの効果的な用量又は量は一日当り約１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇ体重あるいはそれ以上までの範囲であると現在は考えられる。用量の種間スケーリングは、例えば、Mordenti等, Pharmaceut. Res., 8:1351(1991)に開示されているような当該分野で知られている方法で実施することができる。
アンタゴニストをインビボで投与する場合、通常の投与量は、投与経路に応じて、１日当たり哺乳動物の体重の約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇまで、好ましくは約１μｇ／ｋｇ／日から１０ｍｇ／ｋｇ／日とすることができる。特定の容量及び投与方法は、例えば米国特許第4,657,760号、同第5,206,344号、又は5,225,212号等の文献に指標が開示されている。異なる製剤は異なる治療化合物及び異なる疾患に効果を有し、１器官又は組織を標的とする投与には、例えば、別の器官又は組織への投与とは異なる投与方法が必要となると考えられる。当業者であれば、投与されなければならないアンタゴニストの用量は、例えばアゴニスト又はアンタゴニストを受ける哺乳動物、投与経路、及び哺乳動物に投与されている他の薬物又は治療法に応じて変化することを理解するであろう。
【００９７】
細胞の型及び／又は病気の重症度に応じて、例えば一又は複数の別個の投与又は連続注入の何れであれ、約１μｇ／ｋｇないし１５ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１−２０ｍｇ／ｋｇ)のアンタゴニスト抗体が患者への最初の候補用量である。上述した要因に応じて、典型的な一日の投与量は約１μｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇあるいはそれ以上の範囲である。数日間又はそれ以上の繰り返し投与の場合、状態によっては、病気の徴候の望ましい抑制が生じるまで処置を維持する。しかしながら、他の投薬計画も有効であろう。
本発明の方法では1種類のアンタゴニストを使用することができる。例えば、１のＷＩＳＰ-１イムノアドヘシン分子を投与できる。或いは、専門の医師であれば本方法にアンタゴニストの組合せ、例えばＷＩＳＰ-１イムノアドヘシンとＷＩＳＰ-１抗体の組合せの使用を選択できる。また本発明に別の療法を加えることも考慮できる。１以上の療法は、限定されないが、従来技術に既知であり、上述の説明でさらに定義した放射線治療、サイトカイン、成長阻害剤、化学療法剤、細胞毒性剤、チロシンキナーゼ阻害薬、ｒａｓファルネシルトランスフェラーゼ阻害薬、血管新生阻害薬、サイクリン依存性キナーゼ阻害薬を含む。加えて、腫瘍抗原を標的とする治療的抗体、例えばリツキサンＴＭ又はハーセプチンＴＭ、並びに抗血管新生抗体、例えば抗ＶＥＧＦに基づくものが含まれる。
【００９８】
化学療法剤の調製と用量スケジュールは、製造者の指示書に従って使用されるか、有能な実務家により経験的に決定されて使用される。このような化学療法剤の調製と用量スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams &amp; Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、アンタゴニスト等の投与の前でも後でもよく、又はそれと同時に与えてもよい。例えばアンタゴニストは、抗エストロゲン化合物、例えばそのような分子に知られている投与におけるonapristone(欧州特許第616812号参照)等の抗プロゲステロン又はタモキシフェン等の抗エストロゲン化合物と組み合わせてもよい。
他の抗原に対する抗体、例えばＣＤ２０、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＥｒｂＢ２、ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、血管内皮因子(ＶＥＧＦ)、又はその他ＴＮＦＲファミリーメンバー(例えばＤＲ４、ＤＲ５、ＯＰＧ、ＴＮＦＲ１、ＴＮＦＲ２)も投与することが望ましい。或いは、ここに開示される同じ抗原又は２以上の異なる抗原に結合する加えて２以上の抗体を患者に同時投与できる。場合によっては、加えて１以上のサイトカインを患者に投与することが効果的である。１実施形態では、ここに開示するアンタゴニストと成長阻害剤を同時投与した。例えば、成長阻害剤をはじめに投与し、続いて本発明のアンタゴニストを投与した。
アンタゴニストと１以上の他の療法は、同時に又は逐次的に投与することができる。アンタゴニストの投与に続いて、インビトロの治療細胞を分析することができる。インビボ治療があった場合、治療された哺乳動物は熟練した実務家によく知られた様々な方法でモニターすることができる。
【００９９】
製造品
本発明の他の実施態様では、前述した疾患の治療に有用な物質を含有する製造品が提供される。製造品は容器及びラベルを含んでなる。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ、及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような様々な材料で形成することができる。容器は病状の治療に有効な組成物を収容しており、滅菌した出入口を有している(例えば、容器は皮下注射針により貫通可能なストッパーを具備する静脈溶液用のバック又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤はアンタゴニストを含む。容器上の又は容器に伴うラベルには、組成物が、選択された病状の治療に使用されることが示されている。製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガル液及びブドウ糖液を収容する第２の容器を更に具備する。更に、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用指示書を含むパッケージ挿入物を含む、市販及び使用者の観点から望ましい他の材料を更に含んでいてもよい。
以下の実施例は例示のみを目的としており、如何なる意味でも本発明の範囲を制限するものではない。
本明細書において引用した全ての特許文献及び非特許文献の全体ををここでの参照により本発明に包含する。
【実施例】
【０１００】
特に断らない限り、実施例で引用する市販の試薬は、製造者の指示に従って使用した。   ＡＴＣＣ受入番号によって、以下の実施例、及び本明細書全体にわたって同定された細胞の供給源は、アメリカンタイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス(VA)である。特に明記しない限り、本発明は、上記及び以下の教科書に記載されているような組換えＤＮＡ技術の標準的方法を使用する：Sambrook等、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, コールド  スプリング  ハーバー出版 ニューヨーク, 1989；Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology, コールド  スプリング  ハーバー出版, 1988；Gait, M.J., Oligonucleotide Synthesis, IRL Press, Oxford, 1984；R.I.Freshney, Animal Cell Culture, 1987；Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
以下の実施例において言及される分析及び材料の説明は、以下の文献に提供されている：
タンパク質及び抗体：既に開示されているようにして、完全長ヒトＷＩＳＰ-１-Ｆｃ融合タンパクを発現し、精製した(Desnoyers等, J. Biol. Chem., 276:47599-47607 (2001))。精製されたマウス抗ネズミＣＤ４４抗体(クローンOX49)はBD Bioscience(ベッドフォード・マサチューセッツ州)から入手した。マウスＩｇＧ２ａアイソタイプコントロール抗体は、Pharmingenから入手した。ＦＩＴＣコンジュゲートマウス抗ラットＣＤ４４はSerotec(ローリー、ノースカロライナ州)から入手し、ＦＩＴＣコンジュゲートマウスＩｇＧ１アイソタイプコントロール抗体はDAKO(デンマーク)から入手した。ラット抗マウスＣＤ４４(クローンKM114)はPharmingenから入手した。アクチン抗体(クローンC4)はICN biomedicals(オーロラ、オハイオ州)から入手した。マウスの抗ヒトＷＩＳＰ-１モノクローナル抗体を生成し、免疫原としてＷＩＳＰ-１-Ｆｃを用いて選択した。試薬及びプロトコールは2002年5月14日発行の米国特許第6,387,657号の実施例に記載されている。下に注記されているように、この種のモノクローナル抗体５つは、出願人によってＡＴＣＣに寄託されたものである。
【０１０１】
細胞及び組織標本：ＮＲＫ-４９Ｆ細胞株及びＳＷ４８０細胞株(ATCC、Manassas、VA)は、１０％のウシ胎仔血清(ＦＢＳ)を補充した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地(ＨＧＤＭＥＭ)中で維持した。親Ｃ５７ＭＧ、Ｗｎｔ-１を発現するＣ５７ＭＧ(Ｃ５７ＭＧ/Ｗｎｔ-１)、ｈＷＩＳＰ-１を高レベルに発現するＮＲＫ-４９Ｆ(ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ)、ｈＷＩＳＰ-１を低レベルに発現するＮＲＫ-４９Ｆ(ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ)及び空のベクターを含むＮＲＫ-４９Ｆ(ＮＲＫ／コントロール)は、アーノルド・レビン(プリンストン大学、プリンストン、ニュージャージー州)から入手したもので、２．５μｇ ｍｌ−１のピューロマイシンを含む培地中で維持した(Xu等、Genes Dev.(14)：585-595(2000))。ハロルド・ヴァーマス(国立癌研究所、国立衛生研究所、ベセズダ、メリーランド州)から入手したＷｎｔ-１遺伝子組換えマウスは、ジャクソンLaboratories(バー ハーバー、マサチューセッツ州)から入手したｐ５３ヌルマウスと交配し、Ｗｎｔ-１遺伝子組換え／ｐ５３ノックアウトマウスを作製した。胸部腫瘍及び乳腺管上皮の標本を、分析のためにそれらのマウスから切除した。
粒子除外アッセイ：上述のように、若干の変更を加えて赤血球沈降アッセイを用いた。(Knudson等、J. Cell Sci., 99：227-235(1991))。ＮＲＫ/ＷＩＳＰ-１((ＷＩＳP-１を形質移入した正常ラット腎臓線維芽細胞；Xu等, Genes Dev.14：585-595(2000)を参照)、及びＮＲＫ／コントロール細胞(正常ラット腎臓線維芽細胞；アーノルド・レビン、プリンストン大学、プリンストン、ニュージャージー州から入手)(１×１０５細胞/ウェル)ファルコン６ウェルプレート(Becton Dickinson, Franklin Lanes, NJ)に播き、３７℃、５％ＣＯ２で一晩、１０％のウシ胎児血清(ＦＢＳ)(Life Technologies、Gaithersburg、MD)を補充した高グルコースのダルベッコ変法イーグル培地で維持した。その翌日、培地を除去して、７５０μｌのＰＢＳ／０．１％ＢＳＡ(Boehringer Mannheim, Indianapolis、IN)中の１０８のヒツジＲＢＣ(Inter-Cell Technologies、Hopewell、NJ)を加え、１５分間置いた。細胞はNikon Diaphot 300倒立顕微鏡を使用して観察し、デジタル画像をSONY DKC-5000デジタル写真カメラ(日本)を使用して得た。
【０１０２】
培養細胞のヒアルロナン染色：前述の方法に若干の変更を加えてヒアルロナン染色を行った(Pienimaki等、J. Biol. Chem.,276：20428-20435(2001))。ＮＲＫ/ＷＩＳＰ-１及びＮＲＫ／コントロール細胞(８−１０×１０３)を８つのウェルプラスチックチャンバスライドに播き、一晩３７℃(５％ＣＯ２)で維持した(上記)。その翌日、細胞をリン酸緩衝生理食塩水(ＰＢＳ)で洗浄し、室温で２０分間、４％パラホルムアルデヒドを含むＰＢＳで固定した。細胞をＰＢＳで洗浄し、非特異的結合部を１％ウシ血清アルブミン(ＢＳＡ)及び０．１％トリトンＸ-１００(Calbiochem、LaJolla、CA)を含む蒸留水で３０分間飽和させた。ビオチン化したＨＡ結合タンパク質(ＨＡ-ＢＰ)(Seikagaku America, Falmouth、MA)(ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中に５μｇ／ｍｌ)を加え、室温で一晩インキュベートした。翌日、細胞をＰＢＳで洗浄し、ＴＢＳ及び１％／ＢＳＡに１：１０００のＦＩＴＣコンジュゲートストレプトアビジン(DAKO、Carpinteria、CA)とともに３０分間インキュベートした。細胞をＰＢＳで洗浄し、１μｇ／ｍｌのHoechst 33342(Molecular Probe、Eugene、OR)を含むVectashield(Burlingame、CA)を用いて反応させ、Nikon Eclipse800蛍光顕微鏡の下で視覚化した。画像は、アップル社のＧ３コンピュータにより−４０℃で作動するPhotometrics 300 CCDカメラによって得た。同じ手順を使用して、Ｗｎｔ-１遺伝子組換えマウス由来の乳房腫瘍の凍結切片を着色した。
リアルタイムＲＴ-ＰＣＲ：報告されているように、リアルタイムＲＴ-ＰＣＲを用いて相対的ＲＮＡ発現レベルを決定した(Winer等, Anal. Biochem., 270:41-49 (1999))。全ＲＮＡを、製造業者のプロトコール(Molecular Research Center)を用いてTri-試薬にて細胞から抽出した。特異的なプライマー及び蛍光発生プローブを設定して使用し、遺伝子発現レベルを増幅し、定量化した。遺伝子の特異的シグナルは、グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素ハウスキーピング遺伝子のそれに標準化した。３セットのデータを各状態について平均した。全てのTaqMan RT-PCR試薬は、Applied Biosystems (Foster City, CA)から購入した。遺伝子発現に対する組換えＷＩＳＰ-１の効果を試験するために、ペトリ皿(35mm)を７５μｇ／ｍｌのｈＷＩＳＰ-１-Ｆｃを含むＰＢＳにより４℃で一晩コーティングした。翌日、細胞(３×１０５細胞/皿)をコーティングした表面に広げ、１８時間後に発現分析を行った。場合によって、細胞を蒔く前に、塗布面を洗浄し、室温でさらに２時間処理した。
【０１０３】
ＦＡＣＳ分析：細胞をトリプシン処理によって収集し、ＰＢＳで洗浄し、１μｇ  ｍｌ−１のＦＩＴＣコンジュゲート抗ＣＤ４４(Serotec, Raleigh, NC)又はアイソタイプコントロールＡｂ(DAKO,デンマーク)を含むＰＢＳ  １％ＢＳＡ／２０％グルコース中でインキュベートした。細胞を同じバッファで洗浄し、ＥＰＩＣＳ ＸＬ-ＭＣＬ(Coulter, Miami, FL)で分析した。
ウエスタンブロット：ＮＲＫ／Ｃ及びＮＲＫ／Ｗ１Ｈを、１０ｃｍ２のプレートで集密に培養した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１％トリトン-Ｘ１００を含むＴＢＳ  ３００μｌにて５分間抽出した。抽出物にアセトンの１０容量を加えることによってタンパク質を沈殿させた。試料を還元し、変性させ、４−２０％の勾配ＳＤＳポリアクリルアミドゲルに搭載した。ゲルをＰＶＤＦ膜に移し、１μｇ／ｍｌの濃度の抗ラットＣＤ４４抗体(ＯＸ４９)又は抗マウスＣＤ４４(ＫＭ１１４)によってプローブし、ＨＲＰコンジュゲート抗マウスＩｇＧ二次抗体及びアマシャムＥＣＬ検出試薬を用いて検出した。試料中のアクチン検出をローディングコントロールとして使用した。
【０１０４】
拡散(scatter)アッセイ：細胞を低濃度(〜１０００細胞/ウェル)で２４ウェルプレートに分配し、３日間に亘ってコロニーを形成させた。細胞はDiff-Quik(Dade Behring, Newark,DE)を使用して染色したところ、コロニーが顕微鏡で観察された。
細胞創傷治癒アッセイ：細胞遊走は、若干の変更を加えた前述の細胞創傷治癒アッセイを用いて評価した(Pienimaki等、J. Biol. Chem. 276：20428-20435(2001))。簡単に言うと、集密になるまで細胞を培養した。使い捨ての黄色のチップを備えたマイクロピペットを使用して細胞層に１本の線(〜１ｍｍ)を引いた。不純物を除去した領域の細胞遊走を１５時間に亘って微速度鏡検によってモニターした。この期間の後、細胞によって新しく占有された領域を、段階的にμm単位で調整されるNIH画像ソフトウェアを使用して測定した。
経時的顕微鏡検査法：細胞をＨＧＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ中に分配し、それらのランダムな遊走を経時的顕微鏡検査法を用いて１５時間観察した。細胞に覆われた距離を、段階的にμm単位で調整されるNIH画像ソフトウェアを使用して測定した。
【０１０５】
遊走アッセイ：前述のようにして、変更ボイデンチャンバシステムを用いて走触性を測定した(Bourguignon等, J. Biol. Chem., 275:1829-1838 (2000))。８μm多孔性２４ウェルフォーマットＰＥＴ膜フィルター(ファルコン)の下側をタンパク質(５０μｇ  ｍｌ−１)を含むＰＢＳ  ５０μｌにて一晩４℃でコーティングした。コーティングされた挿入部を無血清培地ですすぎ、０．５×１０５のＮＲＫ細胞を含む０．５ｍｌのＨＧＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳを上部チャンバに加えた。下部チャンバを０．７５ｍｌの同じ培地で満たし、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、上部チャンバを綿棒で拭き、挿入部の下部に遊走した細胞をDiff-Quik Stainキット(Dade Behring Inc.)で染色し、顕微鏡下で数えた。３組のデータを各状態について平均した。
場合によって、コーティングした挿入部を洗浄し、室温でさらに２時間処理した。
インサイツハイブリダイゼーション：NM_018865のｎｔ４４０−１１８０に亘るマウスＷＩＳＰの７４０ｂｐ断片(上部-5’GGCTGCCATCTGTGACCCA(配列番号１２)及び下部-5’CATAGGACCT GCCGGGAGAA A(配列番号１３))、又はNM_018865のｎｔ２０４−９１０に亘るマウスＷＩＳＰ-１の７０６ｂｐ断片(上部-5’GCCGTGGCAGTCCTGAGGG(配列番号１４)及び下部-5’CAGCACCGGG CATTGACGTT A(配列番号１５))、又はM27129のｎｔ１４４−６０８に亘るマウスＣＤ４４の４６４ｂｐ断片(上部-5’TGGAGAAAAATGGCCGCTAC A(配列番号１６)及び下部5’TGGGGTGCTC TTCTCGATGG(配列番号１７))、又はNM_008216のｎｔ９２７−１５５７に亘るマウスＨＡＳ２の６３０断片(上部-5’GGACAAATCGGCCACGTACA T(配列番号１８)及び下部5’CTTGCTCCAT CGGGTCTGC(配列番号１９))のいずれかを増幅するためにＰＣＲプライマーを設定した。プライマーは、増幅産物からセンス又はアンチセンスのプローブのインビトロでの転写を可能にする２７-ヌクレオチドＴ７又はＴ３ ＲＮＡポリメラーゼ開始部位をコードする伸長部を含んでいた。(Lu等、Cell Vision(1)：169-176(1994))。全ての組織を４％のホルマリンに固定しパラフィン包埋した。３−５ミクロン厚の切片を脱パラフィン化して、３７℃で３０分間４ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ中で除タンパクし、更に前述のようにしてインサイツハイブリダイゼーションのために処理した。(Holcomb等、EMBO J., Aug 2000 1;19(15):4046-55)。３３Ｐ-ＵＴＰ標識したセンス及びアンチセンスのプローブを一晩５５℃で切片にハイブリダイズさせた。ハイブリダイズしなかったプローブは２０ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ中で３７℃で３０分間インキュベートすることにより除去し、その後５５℃の０．１×ＳＳＣ中で２時間に亘り高ストリンジェントな洗浄を行い、段階的なエタノールで脱水した。スライドをＮＢＴ２ニュークリア トラップ エマルジョンに浸漬し、dessicantを含む密閉したプラスチック製のスライドボックス内で４℃で４時間露出させ、ヘマトキシリンとエオジンで対比染色した。
【０１０６】
実施例１
高レベル又は低レベルのＷＩＳＰ-１を安定して発現する線維芽細胞細胞系(それぞれＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ)及び空のベクターを含むコントロール細胞系(ＮＲＫ／コントロール)を使用して、ＨＡ産生に対するＷＩＳＰ-１の効果を評価した。粒子除外アッセイによって示されたように、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈの細胞は、沈殿する赤血球を除外することができる大きなヒアルロナン細胞周囲皮膜を蓄積した(図１ａ)。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌは小さな細胞周囲マトリックスを蓄積したが(図１ｂ)、一方ヒアルロニダーゼで処理したＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ又はＮＲＫ／コントロール(図１ｃ)を取り囲むマトリックスは無かった(データは示さない)。また、細胞表面に結合するＨＡの蓄積を、ビオチン化したＨＡ結合タンパク質(ｂＨＡＢＰ)を用いた蛍光染色により評価した。染色によりＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈの細胞表面におけるＨＡ蓄積が明らかになったが(図１ｄ)、一方ＮＲＫコントロール細胞での染色は検出されなかった(図１ｅ)。
ＨＡ分泌に対するＷＩＳＰ-１の効果を、時間とともに、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈの培養物におけるＨＡの蓄積とＮＲＫ／コントロール細胞とを比較することによって評価した。２４時間後、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ培養物中のＨＡ濃度はＮＲＫ／コントロール細胞培養物の３．５倍であり、１４４時間後までに漸増的に８倍となった(図１ｆ)。これらの結果を総合すると、ＮＲＫ細胞におけるＷＩＳＰ-１発現が細胞表面及び培養物においてＨＡ蓄積を促進することを示す。
【０１０７】
実施例２
ＷＩＳＰ-１誘導ＨＡ産生を担う酵素を同定するために、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ及びＮＲＫ／コントロール細胞における周知のＨＡシンターゼ(ＨＡＳ１、ＨＡＳ２及びＨＡＳ３)の発現を分析した。ＨＡＳ２の発現がＷＩＳＰ-１を生成する細胞において１０倍まで増加したのに対し、ＨＡＳ１及びＨＡＳ３ｍＲＮＡレベルはコントロール群と同じであった(図２ａ)。また、ＣＤ４４及びＲＨＡＭＭのｍＲＮＡのレベルがＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１細胞系において増加したのに対し、ヒアルロニダーゼ発現に変化は見られなかった(図２ａ)。さらに、ＨＡＳ２、ＣＤ４４及びＲＨＡＭＭのｍＲＮＡレベルはＷＩＳＰ-１の発現と比例していた。ＦＡＣＳ分析(図２ｂ)及びウエスタンブロット(図２ｃ)によって示されたように、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈの細胞におけるＣＤ４４ｍＲＮＡ発現の増加により、ＣＤ４４タンパク質レベルが４倍に増加した。
【０１０８】
実施例３
ＨＡは、２つの細胞表面レセプターであるＣＤ４４及びＲＨＡＭＭとの相互作用により細胞遊走を刺激することがわかった(Hall等、上掲; Bourguignon等、上掲)。ＷＩＳＰ-１がＨＡ生産及びＣＤ４４及びＲＨＡＭＭ発現の両方を増大させたので、ＷＩＳＰ-１を発現している細胞の運動性を評価した。低密度に広げたとき、ＮＲＫ／コントロール細胞は増殖し、明確なコロニーを形成していた(図３ａ)。増殖性のＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ細胞は、増殖コロニーから離れて存在するものもあるため、分類できるグループを形成しなかった(図３ｂ)。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈのコロニーは見られず、細胞はランダムに点在していた(図３ｃ)。コントロール群(図３ｄ)に反して、ＷＩＳＰ-１発現細胞は、運動性の高い拡張した膜状仮足の特徴を有する非常に細長い形態を示した(図３ｅ)。経時的顕微鏡検査法によると、コントロール細胞と比較してＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈの遊走距離が４倍増加していた(図３ｆ)。また、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈは細胞創傷治癒アッセイにおいても遊走域の２．５倍の増加を示した(図３ｇ)。これらの結果を総合すると、ＷＩＳＰ-１発現が細胞遊走を促進できることが証明された。
【０１０９】
実施例４
ＷＩＳＰ-１の異所性の添加を行うことによりＨＡＳ２発現及び細胞遊走を促進することができるかどうかを決定するために、精製された組換えＷＩＳＰ-１-ＩｇＧ(Desnoyers等、上掲)を用いてアッセイを行った。培養培地へのＷＩＳＰ-１添加により、ＨＡＳ２発現は促進されなかった(データは示さない)。ＮＲＫ細胞をＷＩＳＰ-１-ＩｇＧコート表面上に広げたとき、コーティングしてないプラスチック表面上、又は無関係なＩｇＧキメラタンパク質(ＴＮＦＲ-ＩｇＧ)をコートした表面上へ広げた細胞と比較してＨＡＳ２発現が増加した(図４ａ)。デコリン単独によりＨＡＳ２発現が促進されたが、この誘導はコート表面をＷＩＳＰ-１とともにインキュベートした後に３倍まで更に増加した。ＮＲＫ細胞遊走に対する異所性のＷＩＳＰ-１添加の効果も検討した。トランスウェル分析において、フィルターの下面(図４ｂ)をコーティングしたとき、ＷＩＳＰ-１-ＩｇＧはＮＲＫ細胞の走触性遊走を誘導した。無関係なＩｇＧキメラタンパク質(ＴＮＦＲ-ＩｇＧ)のコーティング又はＷＩＳＰ-１-ＩｇＧの下部チャンバへの添加により遊走は促進されなかった。ＣＤ４４又はＷＩＳＰ-１抗体は、ＷＩＳＰ-１に誘導される走触性遊走を阻害した(図４ｂ)。さらに、ＳＷ４８０細胞(大腸腺癌細胞系)の遊走を促進したので、ＷＩＳＰ-１の走触性活性は線維芽細胞に限られたものではない(図４ｃ)。これらの結果を総合すると、異所性のＷＩＳＰ-１の添加によりＨＡＳ２発現が増大し、ＣＤ４４媒介機構により細胞遊走を促進することが示された。完全に理解されたわけではないが、ＷＩＳＰ-１の存在は、この活性を引き起こすためには基質に繋がれていることが必要であるかもしれないので、遊走に重要であると考えられる。
【０１１０】
実施例５
ＷＩＳＰ-１はＷｎｔ-１の下流のエフェクターであると考えられているので、Ｗｎｔ-１(Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ-１)によって安定的に形質移入した乳房上皮細胞系におけるＷＩＳＰ-１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４発現を分析した。コントロール細胞株(Ｃ５７ＭＧ)と比較したとき、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ-１細胞はＷＩＳＰ-１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４ｍＲＮＡ発現がそれぞれ２．７、５．８及び３倍に増加した(図５ａ)。ウエスタンブロットによって示されたように、Ｃ５７／Ｗｎｔ-１細胞もＣＤ４４タンパク質含有量に６倍の増加を示した(図５ｂ)。さらに、コントロール細胞株とは異なり、低密度で培養されたとき、Ｗｎｔ-１発現細胞は個別のコロニーを形成することができず、分散した(図５ｃ)。これらの結果は、ＨＡＳ２及びＣＤ４４発現及び細胞運動性が、Ｗｎｔ-１によりＷＩＳＰ-１発現が誘発される細胞株において上昇することを示す。
【０１１１】
実施例６
乳房上皮におけるＷｎｔ-１の発現は遺伝子組換えマウスの腫瘍発達を促進する(Li等、Oncogene(19：1002-1009(2000))；Tsukamoto等, Cell 55：619-625(1988))。ＷＩＳＰ-１がＷｎｔ-１の推論上の下流エフェクターであるので、ＭＭＴＶ-Ｗｎｔ-１遺伝子組換えマウス由来の自然発生乳癌におけるＨＡＳ２及びＣＤ４４のｍＲＮＡ発現を測定した。乳腺管上皮と比較して、ＨＡＳ２  ｍＲＮＡ発現は、分析した全ての乳癌において２．５から５．５倍に増加した(ｎ＝５；図５ｄ)。同様に、ＣＤ４４ｍＲＮＡ発現誘発は、全ての腫瘍において２．２から４．２倍に増加した(ｎ＝５；図５ｅ)。これらの結果は、ＨＡＳ２及びＣＤ４４がＷＩＳＰ-１を発現しているＭＭＴＶ-Ｗｎｔ-１  遺伝子組換えマウス乳房腫瘍において過剰発現されることを示す。
【０１１２】
実施例７
インサイツハイブリダイゼーションは、ＭＭＴＶ-Ｗｎｔ-１遺伝子組換えマウス乳房腫瘍の腫瘍周囲間質に高いＷＩＳＰ-１発現を示した(図６ａ、ｂ)。対照的に、ＨＡＳ２(図６ｃ−ｄ)及びＣＤ４４(図６ｅ−ｆ)発現は、腫瘍上皮細胞だけに見られた。腫瘍実質におけるＣＤ４４の局在は、免疫組織化学によって確認された(図６ｇ)。リンクタンパク質染色により、腫瘍間質を伴うヒアルロナンの蓄積がみられた(図６ｈ)。最大の染色強度が腫瘍小葉の近傍に見られたのに対し、正常乳腺管上皮に局所化していた染色は弱かった。これらの所見は、ＷＩＳＰ-１が腫瘍とヒアルロン酸及びＣＤ４４を含む間質性細胞の間の相互作用を調整することができるという示唆と一貫している。
【０１１３】
実施例８
前述のように、形質転換株の転移及び成長の可能性を評価した(Welch等, Cancer Res., 60:1552-1556 (2000))。９週齢のスイスのｎｕ／ｎｕ雌マウスを用いた。簡潔には、細胞は、トリプシン処理によって収集し、ＰＢＳで２度洗浄した。各々のマウスの尾側面の静脈に、５×１０４又は２．５×１０５個の細胞を含む懸濁液１００μｌを注射した。注射後２、３及び４週目に、映写磁気共鳴画像(ＭＲＩ)を使用してマウスの肺病変を示す影を検査し、剖検を行った。肺をブアン固定液に入れ、切除し、Ｈ＆Ｅで染色した部分を肺腫瘍コロニー形成評価のために作成した。
左肺の縦方向切片、並びに右肺の頭側、内側、尾側、及び副葉の単一の横断切片を評価した。組織学的に、影響を受けた肺は、肺間質が浸透したspindloid新生細胞を有した。しかしながら、変化の重傷度は可変的だったので、以下の類別システムを決定した。
I：肺間質の関与が最小−肺の１０−２０％が影響を受ける。spindloid新生細胞の病巣及びクラスターは、多限局的に肺間質を崩壊する。影響を受けた病巣は共通して胸膜の表層に沿ってあり、間質に達する。血管又は大きな気道は影響を受けない。
II ：肺間質の関与が中程度−肺の２０−５０％が影響を受ける。spindloid新生細胞の病巣及びクラスターは、多限局的に肺間質を崩壊する。血管又は大きな気道の一部は、spindloid細胞で満たされる。Spindloid細胞は、しばしば、胸膜下部に幅広い帯状域又は大きな集団を形成して間質へと伸びている。上層の中皮は膨らんでいる(反応性)。
III：肺間質の関与が重大−肺の５０−１００％が影響を受ける。spindloid新生細胞の病巣及びクラスターは、多限局的に肺間質を崩壊する。血管及び大きな気道は、spindloid細胞で満たされる。Spindloid細胞は、胸膜下部に幅広い帯状域又は大きな集団を形成して間質へと伸びている。Spindloid細胞は、青白い好塩基球性から両親媒性(amphophilic)の無細胞材料に包埋されていることが多い。上層の中皮は膨らんでいる(反応性)。ガス交換のために最小限の無影響の領域が残っている。
【０１１４】
ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ及びＮＲＫ／コントロール細胞を接種したヌードマウスの肺コロニー形成の結果を、図７及び１０にまとめる。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌを接種したマウスにおいて、細胞は、時間及び用量依存性の肺塊を形成した。最も重度の病変は、２．５×１０５のＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈを注射したマウスに見られ、注射の４週後に検死が行われた。注射後２及び３週のマウスには、それ程重症でないが、進行性腫瘍形成が見られた(等級I−II；上記分類を参照)。２．５×１０５のＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌを注射したマウスでは、注射後４週目までに最小の肺腫瘍形成が見られただけだった。注射後４週目の、０．５×１０５のＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ細胞を接種されたマウスは、正常であったか、又は最小の腫瘍性の湿潤を有していた(等級I)のに対し、０．５×１０５のＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈの細胞を注射したマウスはさらなる腫瘍性の浸潤(等級I−II)を示した。組織学的観察により、ＮＲＫ／コントロール細胞を接種される動物の肺が正常であることが明らかとなった(図７ａ−ｃ)。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１を注射された動物では、青白い好塩基球性から両親媒性(amphophilic)の無細胞材料に包埋されていることが多い肺の胸膜表面内か、それから突出しているか、又はその下部に、腫瘍性のspindloid細胞が小さいクラスターを形成した(等級I；図７ｄ−ｆ)。さらに重大な影響を受けた動物において、新生細胞は、胸膜下部に幅広い帯状の集密域を形成した(等級II；図７ｇ−ｉ)。最も重大な影響を受けた動物においては、血管及び大きな気道はspindloid細胞で満たされた(等級III；図７ｊ−ｌ)。ＭＲＩ分析は、組織学的等級II及び等級IIIの浸潤を有する動物の胸膜に沿った左右の肺の周縁部における密度の上昇(hypersignal)を示した。ＭＲＩ上の病変の重症度は、組織学的スコアと整合していた(図７ａ、ｄ、ｇ、ｊ)。これらの結果は、ＷＩＳＰ-１発現が細胞転移性成長能を促進することを示す。
【０１１５】
実施例９
ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞(２．５×１０５個)を、ヌードマウスの尾静脈に注射した。細胞接種の日から、マウスには週に２回、ＣＤ４４抗体、アイソタイプコントロール抗体、又は緩衝液のみを、それぞれ１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。肺を固定し、４週後に肉眼解剖学的分析のために切除した。
４週後、ＣＤ４４抗体で処置した動物(ｎ＝５)に見られる病変の重症度が正常から等級Iまでであったのに対し、コントロール抗体又は生理食塩水で処置した全ての(ｎ＝１０)動物で等級IIIの病変が見られた(図８ａ)。ＣＤ４４抗体で処置した動物の肺の転移巣の平均面積は、コントロール抗体で処置した動物と比較して、９９％(P＜0.00003)減少した(図８ｂ)。
【０１１６】
実施例１０
特定のＷＩＳＰ-１抗体の結合特異性を検討するためにアッセイを行った。完全長マウスＷＩＳＰ-１(GenBank受入番号NM_018865)、及び完全長ヒトＷＩＳＰ-１(GenBank受入番号AF100779；図９)を、ＷＩＳＰ-１配列の下流でヒトＩｇＧ１ Ｆｃ領域をコードしている発現ベクターにクローニングした。結果として生じる組換え融合タンパク質(ＷＩＳＰ-１-Ｆｃ)を、Ｓｆ９昆虫細胞を用いたバキュロウイルス発現系において合成し、プロテインＡセファロース4 Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)のアフィニティークロマトグラフィによって、無血清調整培地から均質になるまで精製した。また、完全長ヒトＷＩＳＰ-１は大腸菌株においてアミノ末端６-ヒスチジンタグ(ＷＩＳＰ-１ Ｈｉｓ)により発現された。細胞溶解液を、Ｎｉ２＋ ＮＴＡアガロースカラム(Qiagen)のクロマトグラフィを実施した。ＷＩＳＰ-１-Ｈｉｓを０〜５００ｍＭのイミダゾール勾配によって溶出した。次いで溶出されたＷＩＳＰ-１-Ｈｉｓを含む画分をプールし、透析した。哺乳類の発現系由来のヒトＷＩＳＰ-１は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ試料緩衝液を用いてヒトＷＩＳＰ-１(アーノルド・レビン;プリンストン大学、プリンストン、ニュージャージー州)を安定に形質移入したＮＲＫ細胞を溶解させることによって得られた。コントロール細胞溶解液は、空のベクターによって安定に形質移入したＮＲＫ細胞を用いて生成した。
さまざまな発現系由来のＷＩＳＰ-１(５０ｎｇ)を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲルで電気泳動にかけて、polyvinyldifluoride(PVDF)メンブレンに電気的にトランスファーし、異なるＷＩＳＰ-１モノクローナル抗体でプローブした。
【０１１７】
ＷＩＳＰ-１抗体３Ｄ１１．Ｄ７(本明細書において「３Ｄ１１」とも称する)、１１Ｃ２．Ｃ１０(本明細書において「１１Ｃ２」とも称する)、９Ｃ１１．Ｃ７(本明細書において「９Ｃ１１」とも称する)及び５Ｄ４．Ｆ６(本明細書において、「５Ｄ４」とも称する)は、バキュロウィルス(細菌及び哺乳類の発現系)から生じるＷＩＳＰ-１に特異的に結合した(図１１ａ)。これらの抗体は、バキュロウイルス由来のマウスＷＩＳＰ-１に結合せず、コントロール溶解液のいかなるタンパク質も認識しなかった。バキュロウイルス発現系によって生成されたときのみ、ＷＩＳＰ-１抗体６Ｆ８、３Ａ７、１０Ｈ１２、３Ａ１１、６Ｅ３、３Ｈ１０、５Ｇ１及び１０Ｂ１はヒト及びマウスＷＩＳＰ-１を認識した(図１１ｂ)。細菌又は哺乳動物の発現系で生成すると、これらの抗体はヒトＷＩＳＰ-１を認識しなかった。クローン９Ｃ１０由来の抗体は、ウエスタンブロットの後、いかなる種類のタンパク質にも結合しなかった。
これらの結果は、ＷＩＳＰ-１抗体３Ｄ１１、１１Ｃ２、９Ｃ１１及び５Ｄ４がヒトＷＩＳＰ-１を特異的に認識し、ウエスタンブロットによってＷＩＳＰ-１検出のために使用できることを示唆する。
【０１１８】
実施例１１
ＷＩＳＰ-１抗体１１Ｃ２、９Ｃ１１、５Ｄ４及び３Ｄ１１によって認識されるエピトープを同定するためにアッセイを実行した。
完全長ヒトＷＩＳＰ-１(GenBank受入番号AF100779)を、ＷＩＳＰ-１配列の下流で6つのヒスチジンをコードしているpIRESpuro2発現ベクター(Clontech Laboratories、Palo Alto, CA)にクローニングした。また、ヒトのＷＩＳＰ-１の１、２、又は３つの領域を取り除くことにより、欠失突然変異体を生成した。結果として生じるコンストラクトは、また、pIRESpuro2発現ベクターにクローニングした。異なるＷＩＳＰ-１コンストラクトを同定するために使用した命名法はそれに含まれるドメインを意味する。(図１２Ｂを参照)ドメイン１はインスリン様成育因子結合タンパク質ドメイン(ＩＦＧＢＰ)、ドメイン２はフォンビルブラント因子Ｃ(ＶＷＦｃ)ドメイン、ドメイン３はトロンボスポンジン(ＴＳＰ)ドメイン、及びドメイン４はＣ末端(ＣＴ)ドメインである。可変領域は、ドメイン２と３の間に位置する。ＷＩＳＰ-１のこれらの領域及びドメインは、図１２Ａに例示される。
【０１１９】
ＷＩＳＰ-１のこれらのドメインをコードしている配列は、以下の通りである：
ＷＩＳＰ-１コンストラクトの配列
ドメイン１：
2008537958.tif 000003
ドメイン２：
2008537958.tif 000004
ドメイン３：
2008537958.tif 000005
ドメイン４：
2008537958.tif 000006
ドメイン１，２：
2008537958.tif 000007
ドメイン１，２，３：
2008537958.tif 000008
ドメイン１，２，４：
2008537958.tif 000009
ドメイン１，３，４：
2008537958.tif 000010
ドメイン２，３，４：
2008537958.tif 000011
【０１２０】
細胞(ＨＥＫ ２９３Ｔ)を異なるコンストラクトによって形質移入し、培養物を４８時間後に回収した。１ミリリットルの培養物を、１時間コバルトアガロース２０μｌとともにインキュベートし、遠心分離し洗浄した。吸収されたタンパク質は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ試料緩衝液２０μlで５分間１００℃でペレットを加熱することによって溶出した。試料を電気泳動にかけ、ＰＶＤＦ上に電気的にトランスファーし、異なるＷＩＳＰ-１抗体でプローブした。
抗体１１Ｃ２、９Ｃ１１及び５Ｄ４は、ドメイン２及び３の間に位置する可変領域の最初の１９のアミノ酸を含むＷＩＳＰ-１コンストラクトだけを認識した(図１２Ｃ；１２Ｅ；１２Ｇ)。ＷＩＳＰ-１抗体３Ｄ１１は、ドメイン１を含むＷＩＳＰ-１コンストラクトだけを認識した(アミノ酸２４−１１７；図１２Ｄ；１２Ｆ)。
これらの結果は、抗体１１Ｃ２、９Ｃ１１及び５Ｄ４がＷＩＳＰ-１の可変領域を特異的に認識するのに対して、抗体３Ｄ１１がＷＩＳＰ-１のドメイン１を特異的に認識することを示す。
【０１２１】
実施例１２
ＷＩＳＰ-１抗体９Ｃ１０．Ｆ５(本明細書において「９Ｃ１０」とも称される)によって認識されるエピトープを同定するためにアッセイを行った。
様々なＷＩＳＰ-１欠失コンストラクトを形質移入したＨＥＫ２９３Ｔ細胞の培養物を(実施例１１で先に述べたように)、１μｇのＷＩＳＰ-１抗体９Ｃ１０及び２０μｌのプロテインＡアガロースとともに室温で１時間インキュベートした。免疫複合体を、遠心分離によって沈殿させ、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ試料緩衝液２０μｌで５分間１００℃でペレットを加熱することによって溶出した。試料を電気泳動にかけ、ＰＶＤＦに電気的にトランスファーし、ＷＩＳＰ-１抗体１１Ｃ２でプローブした。
抗体９Ｃ１０は、ＷＩＳＰ-１のドメイン１を含むコンストラクトだけを免疫沈降させた(図１３)。これらの結果は、抗体９Ｃ１０がＷＩＳＰ-１のドメイン１を特異的に認識し、免疫沈降に使用できることを示す。
【０１２２】
実施例１３
ＷＩＳＰ-１抗体９Ｃ１０(炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中に２μｇ／ｍｌ、１００μｌ)は、４℃で一晩かけてMaxisorbプレートにコーティングした。プレートは、１時間に亘り２００μｌのＰＢＳ／３％ＢＳＡによって遮断した。標準曲線をＷＩＳＰ-１-Ｆｃ(ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中のものを１００μｌ)の階段希釈で作成し、１時間インキュベートした。インキュベートの後、プレートを１００μｌのＰＢＳ／０．０５％TWEENで洗浄し、ＰＢＳ／３％ＢＳＡ中でＷＩＳＰ-１抗体(ビオチン化１１Ｃ２又は５５Ｂ)(２μｇ／ｍｌを１００μｌ)を１時間インキュベートした。ビオチン化１１Ｃ２については、プレートを２μｇ／ｍｌのＨＲＰコンジュゲートストレプトアビジンとともに更にインキュベートした。５５Ｂについては、プレートを洗浄し、１時間に亘りＨＲＰコンジュゲートロバ抗ウサギＩｇＧとともにインキュベートした。インキュベーションの後、ウェルを０．０５％Tween-20を含むＰＢＳ  ２００μｌで６回洗浄し、１００μｌのワサビペルオキシダーゼ色原体基質ＴＭＢ(Kirkegaard & Perry Laboratories)を用いて視覚化した。反応を１Ｍリン酸１００μｌで止め、４５０ｎｍのＯＤを測定した。非特異的結合は、マイクロタイタウェルコーティングを除去することにより、平行インキュベーションにおいて決定された。ＷＩＳＰ-１-Ｆｃ又はＷＩＳＰ-１抗体が除去されたとき、信号は発生しなかった。
捕獲のために抗体９Ｃ１０を、検出のために抗体１１Ｃ２及び５５Ｂを用いて、最低０．４μｇ／ｍｌの濃度のＷＩＳＰ-１を検出できるＥＬＩＳＡを実施した(図１４)。このＥＬＩＳＡは、生体液(例えば血清)中のＷＩＳＰ-１タンパク質の検出に有用であり得る。
【０１２３】
実施例１４
Maxisorbプレートを、１０μｇ／ｍｌのヘパリン(Sigma)５０μｌ／ウェルを用いて４℃で一晩コーティングした。非特異的結合部位を、２００μｌのＰＢＳ／３％ＢＳＡで１時間遮断した。次にプレートを、ＷＩＳＰ-１抗体の段階的希釈液の存在下で５０μｌの６μｇ／ｍｌのｈＷＩＳＰ-１とともに１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ／０．０５％Tweenによって洗浄し、２μｇ／ｍｌのＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ-Ｆｃ含むＰＢＳ／３％ＢＳＡ  ５０μｌとともに更に１時間インキュベートした。プレートを洗浄し、１００μｌのＨＲＰ基質(ＴＭＢ)を加えた。発色現像を１Ｍリン酸１００μｌで止め、４５０ｎｍのＯＤを測定した。
ＷＩＳＰ-１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４及び９Ｃ１１は、それぞれ１．９、２．５及び３．７μｇ／ｍｌのＩＣ５０でヘパリンへのＷＩＳＰ-１結合を阻害した(図１５)。抗体３Ｄ１１は、試験した最高濃度(４０μｇ／ｍｌ)において最大６２％の抑制でヘパリンへのＷＩＳＰ-１結合を中程度に低減させた。抗体９Ｃ１０はＷＩＳＰ-１ヘパリン結合を減らさなかったことから、無関係な抗体コントロールに類似の抑制曲線が示された。
これらの結果は、可変領域を認識する抗体がヘパリンへのＷＩＳＰ-１結合を阻害することができることを示す。ドメイン１を認識している２つのＷＩＳＰ-１抗体がヘパリンへのＷＩＳＰ-１結合にほとんど又は全く影響を及ぼさないことから、現在、ドメイン１はこの相互作用に関与しないと考えられている。
【０１２４】
実施例１５
改良ボイデンチェンバーシステムを用いて走触性を測定した。８μｍの多孔性２４ウェルフォーマットＰＥＴメンブレンフィルター(Becton Dickinson, Franklin Lakes、NJ)の下側を、タンパク質(５０μｇ／ｍｌ)を含むＰＢＳ  ５０μｌにて４℃で一晩かけてコーティングした。正常なラット腎臓細胞(ＮＲＫ；５×１０４／０．５ｍｌのＨＧＤＭＥＭ／１０％ＦＢＳ)を上部チャンバに加え、下部チャンバを同じ培地で満たし、プレートを３７℃でインキュベートした。翌日、上部チャンバを綿棒で拭き、挿入部の下部に移動した細胞を染色し、顕微鏡下で数えた。各状態ごとに３組のデータを平均した。場合によって、コーティングした挿入部を洗浄し、室温でさらに２時間処理した。
トランスウェルアッセイにおいて、フィルターの下面にコーティングしたＷＩＳＰ-１-ＦｃはＮＲＫ細胞の走触性遊走を誘発した(図１６Ａ)。無関係なＩｇＧキメラタンパク質(ＴＮＦＲ-Ｆｃ)のコーティング又はＷＩＳＰ-１-Ｆｃの下部チャンバへの添加は、遊走を促進しなかった。コーティングしたＷＩＳＰ-１-Ｆｃの存在下では、５つの異なるＷＩＳＰ-１抗体(９Ｃ１０、１１Ｃ２、３Ｄ１１、９Ｃ１１、５Ｄ４)は顕著に細胞遊走を阻害した。コーティングしたＷＩＳＰ-１-Ｆｃの非存在下では、これらの抗体は、細胞遊走に対していかなる効果も示さなかった。これらの結果は、ＷＩＳＰ-１の存在下では、ＷＩＳＰ-１抗体が細胞遊走を調整することを証明する。細胞遊走の遮断によって、癌進行を予防する上で、ＷＩＳＰ-抗体が重要な治療的な役割を果たす。
上の実施例で述べられる３Ｄ１１、９Ｃ１０、１１Ｃ２、５Ｄ４及び９Ｃ１１抗体の特徴及び特性の概要は、図１６Ｂにおいて提供される。
【０１２５】
実施例１６
９週齢のスイスｎｕ／ｎｕ雌マウスに、２．５×１０５細胞を含む懸濁液１００μｌを側方尾静脈に注射した。接種の日から、マウスはＷＩＳＰ-１抗体(９Ｃ１１、１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１０、３Ｄ１１)又はアイソタイプコントロール抗体の腹腔内投与(１０ｍｇ／ｋｇ)によって週２回処理した。３週間後、肺を４％の中性緩衝ホルマリンにて灌流し、摘出し、Ｈ＆Ｅで染色した切片を作成した。左肺の縦方向切片、並びに右肺の頭側、内側、尾側、及び副葉の横断切片を評価した。各スライドについて、転移巣の数を数え、転移巣の平均面積をSPOT RTソフトウェア(Diagnostic Instruments Incorporated, Burlingame, CA)を使用して測定した。面積(μｍ２)を、肺の４つの切片の少なくとも５つの個々の転移巣について測定した。
３週間後に、ＷＩＳＰ-１抗体で処理した動物に見られる病変の重症度に、コントロールと比較して大きな減少が見られた(図１７ａ、ｂ)。ＷＩＳＰ-１抗体で処理したマウス(ｎ＝５)に見られる結節の数及び平均面積は、コントロール抗体で処理したマウスと比較して小さかった(図１７ｃ，ｄ)。さらに、ＷＩＳＰ-１抗体による処理後、病変に覆われた肺の面積は、アイソタイプコントロール抗体で処理した動物と比較して８２−９７％減少していた(図１７ｅ)。これらの結果は、転移に関する腫瘍の重荷の軽減においてＷＩＳＰ-１抗体のインビボでの有効性を示すものである。ＷＩＳＰ-１抗体の作用の機構は完全には理解されていないが、それらの有効性は、組織部位における癌細胞の運動性、浸潤及び播種を阻害する能力及び／又は成長低減能によって調整可能と考えられる。
【０１２６】
実施例１７
完全長マウスＷＩＳＰ-１(GenBank受入番号NM_018865)を、ｐＲＫ哺乳類発現ベクターにクローニングした。結果として生じるコンストラクト(ｐＲＫ-ＷＩＳＰ-１；１８ｕｇ)を、製造者の指示書に従って、Fugene6(ロシュ)を用いて４Ｔ１マウス乳房腺癌細胞株(Dr. Fred Miller, Barbara Ann Karmanos Cancer Institute, Detroit, MIから入手)に２μｇのｐＳＶｉ-ピューロマイシンプラスミドによって同時形質移入した。２日後、細胞を２μｇ／ｍｌのピューロマイシン中で選択した。２週間後、クローンを単離し、ＷＩＳＰ-１発現を免疫蛍光法によって評価した。同じ手順を使用して、空のベクターを用いてコントロール細胞株を生成した。結果として生じる４Ｔ１／コントロール及び４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１細胞株を、１０％ＦＢＳ及び３μｇ／ｍｌのピューロマイシンを含むＩｓｃｏｖｅ培地中で維持した。
４Ｔ１／コントロール、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ、ＮＲＫ／コントロール、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ及びＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈの細胞株におけるＷＩＳＰ-１発現を、ヒトとマウスのＷＩＳＰ-１遺伝子を区別しないプローブとプライマーを用いて半定量的ＲＴ-ＰＣＲ(Taqman)により測定した。
ＷＩＳＰ-１は４Ｔ１／コントロール細胞株において発現しなかった。４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞株におけるＷＩＳＰ-１発現は、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌの２倍であったが、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈの７００分の１であった(図１８)。
【０１２７】
実施例１８
４Ｔ１細胞散乱に対するＷＩＳＰ-１の効果を評価するため、１００，０００の４Ｔ１／コントロール、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１L又は４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞を１０％ウシ胎児血清を含むＩｓｃｏｖｅの培地の６ウェルプレートに播いた。低密度で播いたとき、４Ｔ１／コントロール細胞は増殖し、明確なコロニーを形成した(図１９)。一部の細胞が増殖するコロニーから分離したため、増殖している４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌの細胞が形成したグループははっきりしなかった(図１９)。４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈのコロニーは見られず、ランダムに分散していた(図１９)。これらの結果を総合すると、ＷＩＳＰ-１発現が細胞遊走を促進することを示唆する。
【０１２８】
実施例１９
４Ｔ１細胞浸潤に対するＷＩＳＰ-１の効果を、８μｍの多孔性２４ウェルフォーマットＰＥＴメンブランフィルター(Falcon)のMatrigel被膜改良ボイデンチャンバシステムを用いて評価した。４Ｔ１／コントロール、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ又は４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈの細胞(１００，０００細胞)を、０．５ｍｌのＩｓｃｏｖｅ培地中の上部チャンバに加えた。下部チャンバを５％ウシ胎児血清を含む０．７５ｍｌの同培地で満たし、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。翌日、上部チャンバを綿棒で拭き、挿入部の下部に移動した細胞をDiff-Quik Stainキット(Dade Behring Inc.)で染色し、顕微鏡下で数えた。各状態ごとに３組のデータを平均した。４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１H及び４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ細胞は、４Ｔ１／コントロールと比較してそれぞれ１２及び６倍の浸潤増加を示した(図２０)。これらの結果は、ＷＩＳＰ-１が腫瘍形成性の乳房上皮細胞浸潤を促進し、転移に寄与し得ることを示唆するものである。
【０１２９】
実施例２０
乳房上皮細胞腫瘍形成に対するＷＩＳＰ-１の効果は、６−８週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス(６匹のマウス／グループ)の第４の乳房脂肪褥に１．５×１０５細胞(４Ｔ１／コントロール１、４Ｔ１／コントロール２、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ又は4Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ)を注射することによって評価した。腫瘍体積を週３回計量した。注射後３１日目にマウスを屠殺し、腫瘍を切除して重さを測定した。
４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ細胞(図２１ａ；□)、及び４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞(図２１ａ；■)の接種により、４Ｔ１／コントロール１及び４Ｔ１／コントロール２の細胞(図２１ａ；○及び●)と比較して腫瘍の増殖が速かった。３１日後、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ及び４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌの接種により形成された腫瘍は、重量比で、４Ｔ１／コントロール細胞によって形成された腫瘍の４倍(図２１ａ)、及び３倍(図２１ｂ)であった。これらの結果は、ＷＩＳＰ-１が乳房上皮腫瘍細胞の増殖を増大させることを示唆している。
【０１３０】
実施例２１
４Ｔ１／コントロール、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ及び４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞の接種により形成された腫瘍におけるＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現を測定した。４Ｔ１／コントロール細胞腫瘍と比較したとき、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１細胞腫瘍におけるＣＤ４４発現は５から２３倍まで増加した(図２２)。一方、ＨＡＳ２発現は、分析した全ての腫瘍において同じであった。これらの結果は、ＷＩＳＰ-１が４Ｔ１細胞を接種したマウスにおけるＣＤ４４の発現を増やすことを示唆するものである。これらの腫瘍におけるＣＤ４４の過剰発現は、転移の促進に寄与し得る。
【０１３１】
実施例２２
マウス乳房脂肪褥に４Ｔ１細胞を接種し(実施例２０を参照)、マイクロコンピュータ断層撮影及び組織学によって転移の波及範囲を検討することにより、乳房上皮細胞転移に対するＷＩＳＰ-１の影響を評価した。３１日後、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ又は４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞を接種したマウスは、４Ｔ１／コントロールを注射したマウス(図２３ａ及び２３ｃ)と比較して、広範囲な肺転移を有していた(図２３ｂ及び２３ｄ)。４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌと４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞の転移可能性に有意差は見られなかった。４Ｔ１／コントロール細胞を接種したマウスは０．６８グラムの平均重量を有する平均２．１１の肺病巣を有し、一方４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１細胞を接種したマウスは１２．４６グラムの平均重量を有する平均２０．２５の肺病巣を有していた。また、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１細胞を注射されたマウスの肺の平均的組織学スコアは、ＮＲＫ／コントロール細胞を注射されたマウスの０．１１と比較して０．９２であった。
また、免疫組織化学では、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１肺転移病巣が高レベルのＣＤ４４を発現することが観察された(図２３ｅ)。これらの腫瘍において、ＣＤ４４は、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１細胞の原形質膜に局所化していた(図２３ｆ)。これらの結果を総合すると、肺転移巣の数(１０倍)及びサイズ(１８倍)が増大していることを示し、ＷＩＳＰ-１が４Ｔ１細胞の転移の可能性を促進することを証明する。また、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１が肺に転移した後、ＣＤ４４発現増加は維持された。
４Ｔ１／コントロール１又は４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１細胞を接種したマウスの臨床的観察により、ＷＩＳＰ-１発現が別の二次部位において転移を促進することが証明された。４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈを接種された２匹のマウスは腎臓上に変色した白い部分を有したのに対して、他のいかなるマウスにも腎臓腫瘍の証拠がなかった。
【０１３２】
実施例２３
上記のヒトＷＩＳＰ-１完全長と欠失変異体コンストラクトを正常なラット腎臓細胞に形質移入した(ＮＲＫ-４９Ｆ)。４８時間後に、培養物に２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加した。２週間後に、発現細胞のプールを分析して、結果として生じた細胞株を１０％ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)及び２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充した高グルコースダルベッコ修飾イーグル培地(ＨＧＤＭＥＭ)中で維持した。
ＮＲＫ／コントロール細胞株、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４細胞株、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１３４細胞株、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_２３４細胞株、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３細胞株及びＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２４細胞株におけるＷＩＳＰ-１発現を、半定量的ＲＴ-ＰＣＲ(Taqman)で測定した。結果はＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４におけるＷＩＳＰ-１発現との相対的な倍数として表す(図２４Ａ)。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１３４とＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_２３４におけるＷＩＳＰ-１発現は、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４と比較するとそれぞれ０．０３５倍と０．０９倍であった。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４と比較するとＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３は１６．１倍、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２４は７．６倍であった。
【０１３３】
６〜８週間齢の雌ヌードマウス(１０匹マウス／グループ)の皮下に５×１０６個の細胞(ＮＲＫ／コントロール細胞、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４細胞、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３細胞、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２４細胞、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１３４細胞、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_２３４細胞)を注入することによって、ＷＩＳＰ-１促進腫瘍形成に対する特定のドメインの関与を評価した。腫瘍体積は毎週測定した。３５日後、マウスを屠殺して、腫瘍を切除し、組織学的に分析した。
ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４細胞(図２４Ｂ；▲)、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１３４細胞(図２４Ｂ；●)、及びＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_２３４細胞(図２４Ｂ；■)の接種により腫瘍が生成された。しかしながら、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３(図２４Ｂ；□)、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２４(図２４Ｂ；○)及びＮＲＫ／コントロール(図２４Ｂ；△)の接種により腫瘍は生成されなかった。３５日後に、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_２３４細胞により形成される腫瘍の大きさは、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４細胞により形成される腫瘍と同等であった。しかしながら、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４細胞により形成された腫瘍より、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１３４細胞により形成された腫瘍は２．５倍大きかった。これらの結果から、ドメイン１及び２はＷＩＳＰ-１促進ＮＲＫ腫瘍形成に必要でないが、ドメイン３及び４はＷＩＳＰ-１促進ＮＲＫ腫瘍形成に必要であることが示唆される。好ましくは、本発明のＷＩＳＰ-１アンタゴニストはＷＩＳＰ-１のドメイン３及び／又は４に結合しうる、及び／又はＷＩＳＰ-１のドメイン３及び／又は４を阻止しうると思われる。
【０１３４】
加えて、結果から、ＷＩＳＰ-１のドメイン２の欠失がその腫瘍形成性能を増加しうることが示唆される。
切除した腫瘍の組織学的分析(図２５)により、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_２３４腫瘍の腫瘍性細胞はＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４腫瘍の腫瘍性細胞と表現型が類似していたことが明らかとなった。これらの腫瘍において、細胞は、線維芽細胞性の分化したspindloidであるようであった。しかしながら、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１３４腫瘍の腫瘍性細胞は表現型が異なり、あまり分化しておらず、多核であるものが多く、複数の有糸分裂像の存在(矢印)で示されるように活発な有糸分裂速度を有した。さらに、腫瘍性細胞は、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１３４腫瘍に隣接したいくつかの血管に浸潤していた(図２６)。これらの結果は、ＷＩＳＰ-１_１３４発現がそれらのインビボ増殖及び浸潤能を促進することによって、ＮＲＫ細胞に腫瘍形成能を与えうることと示す。さらに、このコンストラクトの発現により、悪性の腫瘍性細胞に特徴的な表現形質の形質転換が起こる。
【０１３５】
実施例２４
８μｍの多孔性２４ウェル形式ＰＥＴメンブレンフィルター(BD Biosciences)のマトリゲルコート修飾ボイデンチャンバシステムを用いて、促進された4Ｔ1細胞浸潤に対する特定のＷＩＳＰ-１ドメインの関与を評価した。前述のＷＩＳＰ-１コンストラクトを安定して発現するＨＥＫ２９３細胞(２０×１０６)(ＷＩＳＰ-１_１２３４、ＷＩＳＰ-１_１３４、ＷＩＳＰ-１_１２３、ＷＩＳＰ-１_１２、ＷＩＳＰ-１_２３、ＷＩＳＰ-１_３、ＷＩＳＰ-１_１及びＷＩＳＰ-１_４)を、５％ウシ胎児血清を含有する５０:５０培地(ＤＭＥ及びＨａｍＦ-１２培地の１：１混合物)０．７５ｍｌを含む下方チャンバに播き、プレートを３７℃に終夜置いた。翌日、４Ｔ１細胞(１００，０００細胞)を、０．５ｍｌの無血清５０：５０培地中の上方チャンバに添加し、プレートを３７℃で終夜インキュベートした。翌日、上方チャンバを綿棒で拭き取り、インサートの下方に遊走した細胞をＤｉｆｆ-Ｑｕｉｋ染色キット(Dade Behring Inc.)で染色し、顕微鏡下で計数した。３回のデータをそれぞれの条件ごとに平均し、その結果を、空のベクターを形質移入したＨＥＫ２９３細胞を下方チャンバに播いたコントロールと比較したときの浸潤を倍数として表した。コンストラクトＷＩＳＰ-１_１２３４、ＷＩＳＰ-１_１３４又はＷＩＳＰ-１２３を発現するＨＥＫ２９３細胞を下方チャンバに播いたとき、４Ｔ１細胞は４倍の浸潤増加を示した(図２７)。コンストラクトＷＩＳＰ-１_１２を発現するＨＥＫ２９３細胞は、４Ｔ１細胞の浸潤を２．５倍にした。ＷＩＳＰ-１_２３、ＷＩＳＰ-１_３、ＷＩＳＰ-１_１又はＷＩＳＰ-１_４を発現するＨＥＫ２９３細胞を下方チャンバに播いたとき、４Ｔ１細胞浸潤の増加はわずかであった。これらの結果から、ドメイン１はＷＩＳＰ-１促進４Ｔ１細胞浸潤に必要であることが示唆された。さらに、データは、ＷＩＳＰ-１ドメイン１単独が４Ｔ１細胞浸潤を促進するためにおそらく十分でないことを示す。
【０１３６】
実施例２５
ＷＩＳＰ-１促進４Ｔ１細胞浸潤に対するＷＩＳＰ-１のドメイン１の拮抗活性を評価するためにアッセイを行った。ＷＩＳＰ-１のドメイン１を、ヒトのＩｇＧ１ Ｆｃ領域配列のすぐ上流の発現ベクター内にクローニングした。結果として生じた組み換え融合タンパク質(ＷＩＳＰ-１−ドメイン１−Ｆｃ)をチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞を用いた哺乳類の発現システムにおいて、合成し、プロテインＡセファロース４Fast Flow(Amersham Pharmacia Biotech)の親和性クロマトグラフィによって、条件培地から均一になるまで精製した。また、ＣＨＯ発現システムにおいて、アミノ末端のヘキサヒスチジンタグによって、ＷＩＳＰ-１のドメイン１を発現させ、Ｎｉ２＋ＮＴＡアガロースカラム(Qiagen)の親和性クロマトグラフィによって、培地上清から均一になるまで精製した。次いで、溶出されたＷＩＳＰ-１−ドメイン１−Ｈｉｓを含有する分画をプールして、透析した。
８μｍの多孔性２４ウェル形式ＰＥＴメンブレンフィルター(BD Biosciences)のマトリゲルコート修飾ボイデンチャンバシステムを用いて、ＷＩＳＰ-１促進４Ｔ１細胞浸潤に対する精製した可溶性ＷＩＳＰ-１−ドメイン−１の拮抗作用を評価した。４Ｔ１／コントロール細胞又は４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１細胞(１０００００細胞)を０．５ｍｌのＩｓｃｏｖｅ培地中の上方チャンバに添加した。下方チャンバは、０．７５ｍｌの５％ウシ胎児血清を含有する同じ培地で満たした。様々な濃度のＷＩＳＰ-１−ドメイン−１−Ｆｃ又はＷＩＳＰ-１−ドメイン−１−Ｈｉｓを上方及び下方のチャンバに添加し、プレートを３７℃で終夜インキュベートした。翌日、上方チャンバを綿棒で拭き取り、インサートの下方に遊走した細胞をＤｉｆｆ-Ｑｕｉｋ染色キット(Dade Behring Inc.)で染色し、顕微鏡下で計数した。３回のデータをそれぞれの条件ごとに平均した。結果を、４Ｔ１／コントロール細胞と比較したときの浸潤を倍数として表した。ＷＩＳＰ-１−ドメイン−１−Ｈｉｓ及びＷＩＳＰ-１−ドメイン−１−Ｆｃは、ＷＩＳＰ-１促進４Ｔ１浸潤に対して用量依存性の拮抗活性を示した(図２８)。ＷＩＳＰ-１−ドメイン−１−Ｈｉｓ及びＷＩＳＰ-１−ドメイン−１−Ｆｃはともに、０．０１μｇ／ｍｌの見かけのＩＣ５０を示した。これらの結果から、精製されたＷＩＳＰ-１−ドメイン−１がＷＩＳＰ-１促進細胞浸潤を中和(アンタゴナイズ)することが示唆される。
【０１３７】
実施例２６
ヒトの膵臓腺癌のＨＰＡＣ異種移植片モデルにおけるＷＩＳＰ-１発現を評価するために動物実験を行った。５×１０６個のヒト膵臓腺癌細胞(ＨＰＡＣ細胞株、カタログ番号ＣＲＬ-２１１９、ATCC, Manassas, VA, USA)を６〜８週間齢の雌ヌードマウスの皮下に注入した。２１日後、マウスを屠殺し、腫瘍を切除し、ＷＩＳＰ-１発現をヒトＷＩＳＰ-１特異的プローブとマウスＷＩＳＰ-１特異的プローブを用いたインサイツハイブリダイゼーションによって、分析した(図２９)。結果は、腫瘍間質に相当する領域において強いマウスＷＩＳＰ-１の発現を示した。一方、切除した腫瘍にはヒトＷＩＳＰ-１の発現はみられなかった。さらに、腫瘍は、腫瘍間質について強いα-平滑筋アクチンの免疫組織化学染色と弱いビメンチン免疫組織化学染色を示した。これらの結果は、ヌードマウスへのＨＰＡＣ細胞接種によりＷＩＳＰ-１が発現されるマウス筋線維芽細胞性間質が漸増したことを示す。
【０１３８】
実施例２７
腫瘍増殖を遅延させる際のＷＩＳＰ-１−ドメイン−１のインビボ有効性を評価するために動物実験を行った。発現ベクター(pIRES puro2、 Clontech Laboratories, Palo Alto, CA)内にクローニングしたヒトのＷＩＳＰ  １_１、ＷＩＳＰ-１_１２コンストラクトをＨＰＡＣヒトの膵臓腺癌細胞株に形質移入した。４８時間後に、培養液に２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを補充した。２週間後に、発現細胞のプールを分析して、結果として生じた細胞株を１０％ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)及び２μｇ／ｍｌ ピューロマイシンを補充した５０：５０培地(ＤＭＥ及びＨａｍ Ｆ−１２培地の１：１混合物)中で維持した。
６〜８週間齢の雌ヌードマウス(１０マウス／グループ)の皮下に５×１０６個の細胞(ＨＰＡＣ／ＷＩＳＰ-１_１２細胞、ＨＰＡＣ／ＷＩＳＰ-１_１細胞)を注入することによって、腫瘍増殖を遅延させる際のＷＩＳＰ-１−ドメイン−１のインビボ有効性を評価した。腫瘍体積は２５日目まで週に２回測定した。結果は、ＨＰＡＣ細胞におけるＷＩＳＰ-１_１又はＷＩＳＰ-１_１２の発現がそれらのインビボ増殖を遅延させたことを示した。ＨＰＡＣ／ＷＩＳＰ-１_１２細胞及びＨＰＡＣ／ＷＩＳＰ-１_１細胞の腫瘍体積は、ＨＰＡＣコントロール細胞腫瘍と比較してそれぞれ１２％及び５４％小さかった(図３０)。これらの結果は、ＨＰＡＣ細胞により発現されるＷＩＳＰ-１−ドメイン−１及びＷＩＳＰ-１−ドメイン−１２が、マウスＷＩＳＰ-１の腫瘍促進活性を中和することによって、その腫瘍の増殖能を遅延することを示す。
【０１３９】
実施例２８
原発性のヒトの膵臓腺癌において、ＷＩＳＰ-１の発現を評価するためにインサイツハイブリダイゼーション実験を行った。腫瘍マイクロアレイ(ＴＭＡ)を用いると、試料集団の６８％(１２５／１８４)がＷＩＳＰ-１発現について陽性であったことが示された。さらに、これらの試料では、ＷＩＳＰ-１の発現は間質区画に限定されていた(図３１)。これらの結果は、ヒトの原発性膵臓腫瘍の間質区画におけるＷＩＳＰ-１発現の高い発生率を示す。
【０１４０】
実施例２９
原発性大腸腺癌において、ＷＩＳＰ-１の発現を評価するために免疫組織化学的染色を行った。原発性のヒトの腺癌の１５の試料のパネルを、ＷＩＳＰ-１特異的ポリクローナルヤギ抗体(R&D systems、 カタログ番号AF1627)を用いてＷＩＳＰ-１について染色した。分析した試料の１００％(１５／１５)にＷＩＳＰ-１が検出された。すべての試料において、ＷＩＳＰ-１は腫瘍を囲む間質区画に位置していた(図３２)。これらの結果は、ＷＩＳＰ-１がヒトの大腸腺癌の間質区画に主に存在することを示す。
【０１４１】
ＷＩＳＰ-１コンストラクト：
ドメイン２、３：
2008537958.tif 000012
ドメイン１−ＩｇＧ：
2008537958.tif 000013
【０１４２】
材料の寄託
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション,10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209 USA(ATCC)に寄託した：
材料                    ＡＴＣＣ寄託番号            寄託日
３Ｄ１１．Ｄ７          ＰＴＡ−４６２４        ２００２年９月４日
１１Ｃ２．Ｃ１０        ＰＴＡ−４６２８        ２００２年９月４日
９Ｃ１０．Ｆ５          ＰＴＡ−４６２６        ２００２年９月４日
５Ｄ４．Ｆ６            ＰＴＡ−４６２５        ２００２年９月４日
９Ｃ１１．Ｃ７          ＰＴＡ−４６２７        ２００２年９月４日
【０１４３】
この寄託は、特許手続き上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約及びその規則(ブダペスト条約)の規定に従って行われた。これは、寄託の日付から３０年間、寄託の生存可能な培養が維持されることを保証するものである。寄託物はブダペスト条約の条項に従い、またジェネンテック社とＡＴＣＣとの間の合意に従い、ＡＴＣＣから入手することができ、これは、どれが最初であろうとも、関連した米国特許の発行時又は任意の米国又は外国特許出願の公開時に、寄託培養物の後代を永久かつ非制限的に入手可能とすることを保証し、米国特許法第122条及びそれに従う特許庁長官規則(特に参照番号886 OG 638の37CFR第1.14条を含む)に従って権利を有すると米国特許商標庁長官が決定した者に後代を入手可能とすることを保証するものである。
本出願の譲受人は、寄託した培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものに即座に取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。
上記の文書による開示は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。ここに例示した実施例により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの物質の寄託は、文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に改変することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、請求の範囲内に入るものである。
【図面の簡単な説明】
【０１４４】
【図１】ＷＩＳＰ-１によるヒアルロナン生産の促進を示す。粒子除外アッセイは、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈの表面(Ａ)とＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ(Ｂ)にヒアルロナン被膜を示したが、ＮＲＫ／コントロール(Ｃ)には示されなかった。ｂＨＡＢＰを用いてＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ(Ｄ)とＮＲＫ／コントロール(Ｅ)をヒアルロナンについて染色した。Ｆは、時間の経過に伴うＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ及びＮＲＫ／コントロール培地におけるＨＡ蓄積を示す。
【図２】ＷＩＳＰ-１がＨＡＳ２、ＣＤ４４及びＲＨＡＭＭ  ｍＲＮＡの発現とＣＤ４４タンパク質発現を増大させることを示す。Ａは、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ及びＮＲＫ／コントロール細胞におけるＨＡＳ１、ＨＡＳ２、ＨＡＳ３、ＣＤ４４、ＲＨＡＭＭ及びヒアルロニダーゼ(Ｈｙａｌ)ｍＲＮＡ発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。ＢはＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ及びＮＲＫ／コントロール細胞におけるＣＤ４４発現のフローサイトメトリー分析を示す。影の部分は二次抗体のみの蛍光強度を示す。ＣはＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ及びＮＲＫ／コントロール細胞におけるＣＤ４４タンパク質のウェスタンブロット分析を示す。ローディングコントロールにはアクチン染色を使用した。
【図３】ＷＩＳＰ-１発現が細胞運動性を増大させ、細胞形態学を変化させることを示す。低密度で広げられたときＮＲＫ／コントロール細胞(Ａ)は明確なコロニーを作成し、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ(Ｂ)及びＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ(Ｃ)細胞は分散した。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ(Ｅ)は、ＮＲＫ／コントロール細胞(Ｄ)と比較した場合、Lamelipodiaを有する非分化spindloid形態学を示した。Ｆは、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ及びＮＲＫ／コントロール細胞のランダムな分散を時間経過顕微鏡を用いて１５時間後に測定したものである。結果は、一領域での細胞の典型的な平均移動距離を示す。Ｇは、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ及びＮＲＫ／コントロール細胞の運動性を細胞創傷治癒アッセイにより評価し、時間経過顕微鏡を用いて１５時間後に測定したものである。データは典型的実験結果を示す。
【図４】ＷＩＳＰ-１の添加によりＮＲＫ細胞のhapototactic遊走及びＨＡＳ２  ｍＲＮＡ発現が誘発されることを示す。Ａは、コーティングした表面に蒔かれたＮＲＫ細胞におけるＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。一部のケースでは、ＷＩＳＰ-１を用いてさらにコーティングした基質をインキュベートした(処置)。その結果、非コーティング、非処置表面に広げたＮＲＫ細胞におけるＮＲＫの過剰発現が倍増した。改良ボイデンチャンバフィルターの下側をコーティングし、ＮＲＫ細胞(Ｂ)又はＳＷ４８０細胞(Ｃ)を上部チャンバに加えた。一部のケースでは、下部チャンバに直接添加した。挿入物の下側へ移動した細胞の数を数えることにより細胞運動性を評価した。
【図５Ａ−Ｃ】図５Ａ−Ｃは、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞及びＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス乳房腫瘍におけるＷＩＳＰ-１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４過剰発現及び細胞運動性の上昇を示す。ＡはＣ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１及びＣ５７ＭＧ／コントロール細胞におけるＷＩＳＰ-１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４発現のリアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析を示す。結果はＣ５７ＭＧ／コントロール細胞における発現の何倍かで示す。Ｂは、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１及びＣ５７ＭＧ／コントロール細胞におけるＣＤ４４含有量のウェスタンブロット分析を示す。ローティング対照としてアクチン染色を用いた。Ｃは、低密度で広げたときにＣ５７ＭＧ／コントロール細胞が明確なコロニーを形成し、一方Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞は分散したことを示す。
【図５Ｄ−Ｅ】図５Ｄ−Ｅは、Ｃ５７ＭＧ／Ｗｎｔ−１細胞及びＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス乳房腫瘍におけるＷＩＳＰ-１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４過剰発現及び細胞運動性の上昇を示す。ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウスの乳房腫瘍におけるＨＡＳ２(Ｄ)とＣＤ４４(Ｅ)の半定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析の結果を、正常な乳腺組織における発現の何倍かで示す。
【図６Ａ−Ｄ】ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換え乳房腫瘍におけるＷＩＳＰ-１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現、並びにＨＡ蓄積を示す。Ａ及びＢは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス乳房腫瘍におけるＷＩＳＰ-１のインサイツハイブリダイゼーションを示す。Ｃ及びＤは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス乳房腫瘍におけるＨＡＳ２のインサイツハイブリダイゼーションを示す。ｔは腫瘍を、ｓは間質を示す。
【図６Ｅ−Ｈ】ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換え乳房腫瘍におけるＷＩＳＰ-１、ＨＡＳ２及びＣＤ４４の発現、並びにＨＡ蓄積を示す。Ｅ及びＦは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス乳房腫瘍におけるＣＤ４４のインサイツハイブリダイゼーションを示す。Ｇは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス乳房腫瘍におけるＣＤ４４の免疫組織化学を示す。Ｈは、ＭＭＴＶ−Ｗｎｔ−１遺伝子組換えマウス乳房腫瘍におけるヒアルロナンのｂＨＡＢＰ傾向染色を示す。ｔは腫瘍を、ｓは間質を示す。
【図７Ａ−Ｆ】ＷＩＳＰ-１により転移性肺コロニー形成及び腫瘍増殖が促進されることを示す。ＮＲＫ／コントロール、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ-１の影響を分析した。Ａ及びＤは、注射後に異なる一定時間が経過した後のＭＲＩによる肺画像を示す。Ｂ及びＥは、注射後に異なる一定時間が経過した後で切除した肺の全体像を示す。Ｃ及びＦは、注射後に異なる一定時間が経過した後で切除した肺の組織学的特性を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は正常(Ａ、Ｂ、Ｃ)及び等級１(Ｄ、Ｅ、Ｆ)である。
【図７Ｇ−Ｌ】ＷＩＳＰ-１により転移性肺コロニー形成及び腫瘍増殖が促進されることを示す。ＮＲＫ／コントロール、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ又はＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞をヌードマウスの尾静脈に注射することによりＷＩＳＰ-１の影響を分析した。Ｇ及びＪは、注射後に異なる一定時間が経過した後のＭＲＩによる肺画像を示す。Ｈ及びＫは、注射後に異なる一定時間が経過した後で切除した肺の全体像を示す。Ｉ及びＬは、注射後に異なる一定時間が経過した後で切除した肺の組織学的特性を示す。腫瘍による肺湿潤の重傷度は等級２(Ｇ、Ｈ、Ｉ)及び等級３(Ｊ、Ｋ、Ｌ)である。
【図８】ＣＤ４４抗体がＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞転移を防ぐことを示す。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞(２．５×１０５個)をヌードマウスの尾静脈に注射した。マウスを１０ｍｇ／ｋｇのＣＤ４４抗体、アイソタイプコントロール抗体又は緩衝液のみ(ＰＢＳ)で週に２回処置した。４週後肺を切除し、肉眼的解剖分析を行った。正常な肺の画像を比較のために示す。
【図９Ａ】天然ヒトＷＩＳＰ-１のヌクレオチド(配列番号２)及び推定上のアミノ酸配列(配列番号１)を示す。
【図９Ｂ】天然ヒトＷＩＳＰ-１のヌクレオチド(配列番号２)及び推定上のアミノ酸配列(配列番号１)を示す。
【図９Ｃ】天然ヒトＷＩＳＰ-１のヌクレオチド(配列番号２)及び推定上のアミノ酸配列(配列番号１)を示す。
【図１０】ＮＲＫ転移可能性に対するＷＩＳＰ-１発現の影響を示す。
【図１１】様々なＷＩＳＰ-１コンストラクト及び調製物に対するＷＩＳＰ-１抗体の結合特性を示す。
【図１２Ａ】ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ-１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｂ】ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ-１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｃ】ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ-１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。配列番号：２０のアミノ酸配列を示す。
【図１２Ｄ】ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ-１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｅ】ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ-１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｆ】ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ-１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１２Ｇ】ＷＩＳＰ-１ポリペプチドの様々なドメイン及びＷＩＳＰ-１抗体１１Ｃ２、５Ｄ４、９Ｃ１１、及び３Ｄ１１がそれぞれ認識するエピトープを同定するためのアッセイの結果を示す。
【図１３】ＷＩＳＰ-１抗体９Ｃ１０により認識されるエピトープを同定するために行ったアッセイの結果を示す。
【図１４】ＷＩＳＰ-１抗体によるＷＩＳＰ-１の検出を示すＥＬＩＳＡの結果を示す。
【図１５】ＷＩＳＰ-１の可変領域を認識するＷＩＳＰ-１抗体がヘパリンに対するＷＩＳＰ-１の結合を阻害することを示すＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示す。
【図１６】Ａは、ＷＩＳＰ抗体によるＮＲＫ細胞の走触性の阻害を検出するアッセイの結果を示す。Ｂは、ＷＩＳＰ-１抗体の特性及び特徴をまとめた表である。
【図１７Ａ−Ｂ】ＷＩＳＰ-１抗体の影響のインビボでの研究の結果を示す。３週後、ＷＩＳＰ-１抗体で処置した動物に見られる病変の重症度はコントロール群と比較して大きく低減していた。
【図１７Ｃ−Ｅ】ＷＩＳＰ-１抗体の影響のインビボでの研究の結果を示す。Ｃ及びＤは、ＷＩＳＰ-１抗体(ｎ＝５)で処置したマウスに見られる転移病巣の小結節の数及び平均面積は、コントロール抗体で処置した動物群と比較して減少した。Ｅは、病変肺面積はアイソタイプコントロール抗体で処置した動物と比較して８２−９７％減少した。
【図１８】判定量的ＲＴ−ＰＣＲ(Ｔａｑｍａｎ)で測定した、４Ｔ１／コントロール、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ、ＮＲＫ／コントロール、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１Ｌ、及びＷＩＳＰ-１Ｈ細胞系におけるＷＩＳＰ-１の発現を示す棒グラフである。
【図１９】４Ｔ１／コントロール、４Ｔ１ＷＩＳＰ-１Ｌ、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈのコロニー形成に対するインビトロアッセイの結果を示す。
【図２０】Ｍａｔｒｉｇｅｌ改良型ボイデンチャンバシステム及び４Ｔ１／コントロール、４Ｔ１ＷＩＳＰ-１Ｌ、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞系を用いた浸潤比を測定するインビトロアッセイの結果を示す。
【図２１】乳腺上皮細胞腫瘍形成におけるＷＩＳＰ-１発現の影響を示す。４Ｔ１／コントロール１、４Ｔ１／コントロール２、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ又は４Ｔ１／ＷＩＳＰＨ細胞をＢａｌｂ／Ｃマウスに注射することによりＷＩＳＰ-１の影響を分析した。図２１Ａは腫瘍容積を、２１Ｂは腫瘍重量を示す。
【図２２】４Ｔ１／コントロール、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ及び４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞の注射により形成された腫瘍におけるＨＡＳ２及びＣＤ４４の相対的発現を示す棒グラフである。
【図２３】マウス乳房脂肪褥に４Ｔ１細胞を接種し、マイクロコンピュータ断層撮影及び組織学によって転移の波及範囲を検討することにより、インビボで評価した乳房上皮細胞転移に対するＷＩＳＰ-１の影響を示す。３１日後、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｌ又は４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１Ｈ細胞を注射したマウス(図２３Ｂ及び２３Ｄ)は、４Ｔ１／コントロールを注射したマウス(図２３Ａ及び２３Ｃ)と比較して肺転移が広がっていた。免疫組織化学を用いることにより、４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１肺転移病巣が高レベルのＣＤ４４を発現していることが観察された(図２３Ｅ)。これらの腫瘍において、ＣＤ４４は４Ｔ１／ＷＩＳＰ-１細胞の原形質膜に局在していた(図２３Ｆ)。
【図２４】Ａは、半定量的ＲＴ-ＰＣＲ(Taqman)によって測定した、ＮＲＫ／コントロール細胞株、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４細胞株、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１３４細胞株、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_２３４細胞株、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３細胞株及びＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２４細胞株におけるＷＩＳＰ-１発現を示す、結果は、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４細胞株におけるＷＩＳＰ-１発現との倍数的な相対として表す。Ｂは、生体内での腫瘍形成に対するこれらのコンストラクトの効果を示す。結果は、腫瘍体積に対する効果によって示す。
【図２５】図２４に示す切除した腫瘍の組織学的分析を示し、ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_２３４腫瘍の腫瘍性細胞がＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１２３４腫瘍の腫瘍性細胞と表現型が類似していたことが明らかとなった。これらの腫瘍において、細胞は、線維芽細胞性の分化したspindloidであるようであった。ＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１３４腫瘍の腫瘍性細胞は、表現型が異なり、あまり分化しておらず、多核であるものが多く、複数の有糸分裂像の存在(矢印)で示されるように活発な有糸分裂速度を有した。
【図２６】図２４に示すＮＲＫ／ＷＩＳＰ-１_１３４異種移植片の切除した腫瘍の組織学的分析を示し、腫瘍に隣接したいくつかの血管に腫瘍性細胞が浸潤したことが明らかとなった。
【図２７】空のベクターを形質移入したＨＥＫ２９３細胞が修飾ボイデンチャンバシステムに播かれたコントロールと比較したときの浸潤を倍数で表す。コンストラクトＷＩＳＰ-１_１２３４、ＷＩＳＰ-１_１３４又はＷＩＳＰ-１２３を発現するＨＥＫ２９３細胞を下方チャンバに播いた場合、４Ｔ１細胞は４倍の浸潤の増加を示した。
【図２８】マトリゲルコート修飾ボイデンチャンバシステムを用いて評価したときの、ＷＩＳＰ-１促進４Ｔ１細胞浸潤に対する可溶性ＷＩＳＰ-１−ドメイン−１の効果を示す。結果は、４Ｔ１／コントロール細胞と比較したときの浸潤を相対的な倍数で表す。ＷＩＳＰ-１−ドメイン−１−Ｈｉｓ及びＷＩＳＰ-１−ドメイン−１−Ｆｃは、ＷＩＳＰ-１促進４Ｔ１浸潤に対して用量依存性の拮抗を示した。
【図２９】ＷＩＳＰ-１発現を評価するための、ヒトの膵臓腺癌のＨＰＡＣ異種移植片モデルからの組織のインサイツハイブリダイゼーション分析を示す。
【図３０】ヌードマウスモデルの腫瘍体積に対するＷＩＳＰ-１コンストラクトの効果をグラフに示す。
【図３１】原発性ヒトの膵臓腺癌におけるＷＩＳＰ-１発現を評価するインサイツハイブリダイゼーション分析。
【図３２】原発性大腸腺癌におけるＷＩＳＰ-１発現を評価する免疫組織化学的染色を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ−Ｃ】
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【図５Ｄ−Ｅ】
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【図６Ａ−Ｄ】
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【図６Ｅ−Ｈ】
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【図７Ａ−Ｆ】
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【図７Ｇ−Ｌ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１２Ｆ】
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【図１２Ｇ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ−Ｂ】
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【図１７Ｃ−Ｅ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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