(57)【要約】組織選択的プロモーターの配列に作動するように結合している核酸配列であって、組み換え七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列を開示する。さらに、組織選択的プロモーターまたは増幅された組織特異的プロモーターに作動するように結合している核酸であって、非侵襲的方法を用いて検出可能なレポーターをコードする核酸を、被験体に導入する工程、およびその被験体を、レポーターまたは目的の遺伝子と選択的に相互作用する非侵襲的画像化技術または治療剤に供する工程を含む、細胞を被験体内で画像化または治療する方法も開示する。たとえば、被験体はガンを有する被験体であってよく、治療剤は抗ガン剤であってよい。とりわけ、ｈＴＥＲＴプロモーターまたは増幅されたｈＴＥＲＴプロモーターは、ｈＳＳＴＲ２および／またはｈＳＳＴＲ２派生物などのレポーターの発現を作動させる。
2008532519.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換え七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）のアミノ酸配列をコードするコーディング領域を含む核酸分子であって、該コーディング領域が組織選択的プロモーターの配列に作動するように結合している核酸分子。
【請求項２】
組み換えＧＰＣＲが、Ｃ末端の欠失を伴うか、内部移行の変化を有するか、細胞内シグナル伝達に欠陥を有するか、またはそれらの組み合わせを有する、請求項１の核酸。
【請求項３】
前記ＧＰＣＲが、アセチルコリンレセプター：Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、もしくはＭ５；アデノシンレセプター：Ａ１；Ａ２Ａ；Ａ２Ｂ；もしくはＡ３；アドレナリン作用性レセプター：アルファ１Ａ、アルファ１Ｂ、アルファ１Ｄ、アルファ２Ａ、アルファ２Ｂ、アルファ２Ｃ  ベータ１、ベータ２、もしくはベータ３；アンギオテンシンレセプター：ＡＴ１、もしくはＡＴ２；ボンベシンレセプター：ＢＢ１、ＢＢ２、もしくはＢＢ３；ブラジキニンレセプター：Ｂ１、Ｂ２、カルシトニン、アイニリン、ＣＧＲＰ、もしくはアドレノメデュリンレセプター；カンナビノイドレセプター：ＣＢ１、もしくはＣＢ２；ケモカインレセプター：ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸ３ＣＲ１、もしくはＸＣＲ１；走化性レセプター：Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、もしくはｆＭＬＰ；コレシストキニンおよびガストリンのレセプター：ＣＣＫ１、もしくはＣＣＫ２；副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター：ＣＲＦ１、もしくはＣＲＦ２；ドーパミンレセプター：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、もしくはＤ５；エンドセリンレセプター：ＥＴ（Ａ）もしくはＥＴ（Ｂ）；ガラニンレセプター：ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、もしくはＧＡＬ３；グルタミン酸レセプター：ｍｇｌ１、ｍｇｌ２、ｍｇｌ３、ｍｇｌ４、ｍｇｌ５、ｍｇｌ６、ｍｇｌ７、もしくはｍｇｌ８；糖タンパク質ホルモンレセプター：ＦＳＨ、ＬＳＨ、もしくはＴＳＨ；ヒスタミンレセプター：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、もしくはＨ４；５−ＨＴレセプター：５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｆ、５ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｆ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５Ａ、５−ＨＴ５Ｂ、５−ＨＴ６、もしくは５−ＨＴ７；ロイコトリエンレセプター：ＢＬＴ、ＣｙｓＬＴ１、もしくはＣｙｓＬＴ２；リゾリン脂質レセプター：ｅｄｇ１、ｅｄｇ２、ｅｄｇ３、もしくはｅｄｇ４；メラノコリンレセプター：ＭＣ１；ＭＣ２；ＭＣ３；ＭＣ４、もしくはＭＣ５；メラトニンレセプター：ＭＴ１、ＭＴ２、もしくはＭＴ３；ニューロペプチドＹレセプター：Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、もしくはＹ６；ニューロテンションレセプター：ＮＴＳ１、もしくはＮＴＳ２；オピオイド：ＤＯＰ、ＫＯＰ、ＭＯＰ、もしくはＮＯＰ；Ｐ２Ｙレセプター：Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、もしくはＰ２Ｙ１２）；ペルオキシソーム増殖剤：ＰＰＡＲ−アルファ、ＰＰＡＲ−ベータ、もしくはＰＰＡＲ−ガンマ；プロスタノイドレセプター：ＤＰ、ＦＰ、ＩＰ、ＴＰ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、もしくはＥＰ４；プロテアーゼ活性化レセプター：ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、もしくはＰＡＲ４；ソマトスタチンレセプター：ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ２Ａ、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、もしくはＳＳＴＲ５；タキキニンレセプター：ＮＫ１、ＮＫ２、もしくはＮＫ３；チロトロピン放出ホルモンレセプター：ＴＲＨ１、もしくはＴＲＨ２；ウロテンシン−ＩＩレセプター；血管作動性腸管ペプチドもしくは下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチドのレセプター：ＶＰＡＣ１、Ｖ���ＡＣ２、もしくはＰＡＣ１；またはバソプレシンもしくはオキシトシンのレセプター：Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２、もしくはＯＴである、請求項１または２の核酸。
【請求項４】
前記ＧＰＣＲがソマトスタチンレセプターである、請求項３の核酸。
【請求項５】
前記ソマトスタチンレセプターがソマトスタチンレセプター  タイプ２Ａ（ＳＳＴＲ２Ａ）である、請求項４の核酸。
【請求項６】
前記ＳＳＴＲ２Ａが、シグナル伝達に欠陥を有するか、内部移行の変化を有するか、またはそれらの組み合わせを有する、請求項５の核酸。
【請求項７】
前記ＳＳＴＲ２Ａが切断されている、請求項６の核酸。
【請求項８】
前記ＳＳＴＲ２Ａのアミノ酸３１４までのカルボキシ末端が切断されている、請求項７の核酸。
【請求項９】
前記プロモーター配列が、テロメラーゼプロモーター、ヒトテロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ）プロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、増幅メカニズムに作動するように結合しているｈＴＲ、または増幅メカニズムに作動するように結合しているｈＴＥＲＴである、請求項１〜８の核酸。
【請求項１０】
前記組織選択的プロモーターまたは増幅された組織特異的プロモーターが、正常なおよび／または罹患した心臓、肺、食道、筋肉、腸、胸部、前立腺、胃、膀胱、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、神経細胞、筋細胞、白血球、不死化細胞、新形成性細胞、腫瘍細胞、ガン細胞、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、唾液腺、胆嚢、膀胱、気管、喉頭、咽頭、大動脈、動脈、毛細血管、静脈、胸腺、リンパ節、骨髄、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、脳、大脳、小脳、延髄、橋、脊髄、神経、骨格筋、平滑筋、骨、精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、陰茎、卵巣、子宮、乳腺、膣、皮膚、眼、視神経、同一の胚起源に由来する組織において活性であるプロモーターまたは同一のもしくは類似の疾患によって影響を受ける一以上の組織において活性である、請求項１〜８の核酸。
【請求項１１】
前記組織選択的プロモーターが、新形成性細胞、腫瘍細胞またはガン細胞において活性である、請求項１０の核酸。
【請求項１２】
前記ガン細胞が、乳ガン細胞、肺ガン細胞、前立腺ガン細胞、卵巣ガン細胞、脳のガン細胞、肝臓ガン細胞、子宮頸ガン細胞、結腸ガン細胞、腎臓ガン細胞、皮膚ガン細胞、頭頸部ガン細胞、骨のガン細胞、食道ガン細胞、膀胱ガン細胞、子宮ガン細胞、リンパのガン細胞、胃ガン細胞、膵臓ガン細胞、精巣ガン細胞、リンパ腫細胞、または白血病細胞である、請求項１１の核酸。
【請求項１３】
前記プロモーター配列が、ｈＴＲプロモーター配列、ｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、ＡＦＰプロモーター配列、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−４、ムチン様糖タンパク質、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕオンコジーン、シクロオキシゲナーゼ、Ｅ２Ｆ転写因子１、チロシナーゼ関連タンパク質、チロシナーゼ、もしくはサバイビン、Ｔｃｆ１−アルファ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、サイクリンＥ、Ｃｄｃ２５Ａ、ＨＫ  ＩＩ、ＫＲＴ１９、ＴＦＦ１、ＳＥＬ１Ｌ、またはＣＥＬである、請求項１１の核酸。
【請求項１４】
前記プロモーター配列が、ガン細胞において機能するｈＴＥＲＴプロモーター配列である、請求項１３の核酸。
【請求項１５】
前記プロモーター配列が、免疫グロブリン重鎖プロモーター配列、免疫グロブリン軽鎖プロモーター配列、Ｔ細胞レセプタープロモーター配列、ＨＬＡ  ＤＱ  ａプロモーター配列、ＨＬＡ  ＤＱ  ベータプロモーター配列、ベータ−インターフェロンプロモーター配列、インターロイキン−２プロモーター配列、インターロイキン−２レセプタープロモーター配列、ＭＨＣクラスＩＩ  ５プロモーター配列、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−Ｄｒａプロモーター配列、ベータ−アクチンプロモーター配列、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター配列、プレアルブミン（トランスサイレチン）プロモーター配列、エラスターゼＩプロモーター配列、メタロチオネイン（ＭＴＩＩ）プロモーター配列、コラゲナーゼプロモーター配列、アルブミンプロモーター配列、アルファ−フェトプロテインプロモーター配列、ガンマ−グロビンプロモーター配列、ベータ−グロビンプロモーター配列、ｃ−ｆｏｓプロモーター配列、ｃ−ＨＡ−ｒａｓプロモーター配列、インスリンプロモーター配列、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）プロモーター配列、アルファ−１−アンチトリプシンプロモーター配列、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストンプロモーター配列、Ｉ型コラーゲンプロモーター配列、ＧＲＰ９４プロモーター配列、ＧＲＰ７８プロモーター配列、その他のグルコース調節タンパク質プロモーター配列、成長ホルモンプロモーター配列、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）プロモーター配列、トロポニンＩ（ＴＮ  Ｉ）プロモーター配列、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター配列、デュシェンヌ型筋ジストロフィープロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ポリオーマプロモーター配列、レトロウイルスプロモーター配列、パピローマウイルスプロモーター配列、Ｂ型肝炎ウイルスプロモーター配列、ヒト免疫不全ウイルスプロモーター配列、サイトメガロウイルスプロモーター配列、テナガザル白血病ウイルスプロモーター配列、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子プロモーター配列、ソマトスタチンレセプタープロモーター配列、マウス精巣上体のレチノイン酸結合遺伝子プロモーター配列、ヒトＣＤ４プロモーター配列、マウスアルファ２（ＸＩ）コラーゲンプロモーター配列、Ｄ１Ａドーパミンレセプタープロモーター配列、インスリン様成長因子ＩＩプロモーター配列、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１プロモーター配列、ヒトアルファ−ラクトアルブミンプロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、５Ｓリボソームプロモーター配列、アルファ  フェトプロテイン、細菌のＬＰＳに対する単球レセプター、ロイコシアリン、シアロフォリン、白血球共通抗原、マクロシアリンもしくはマクロシアリンのヒトアナログ、デスミン、エラスターゼ、エラスターゼＩ、エンドグリン、フィブロネクチン、ＶＥＧＦレセプター、グリア線維酸性タンパク質、細胞間接着分子２、インターフェロンベータ、ミオグロビン、オステオカルシン２、前立腺特異抗原、前立腺特異的膜抗原、サーファクタントタンパク質Ｂ、シナプシン、チロシナーゼ関連タンパク質、チロシナーゼ、または任意の組織／疾患／系統特異的プロモーター配列の機能性ハイブリッド、機能性部分、��しくはその組み合わせである、請求項１０の核酸。
【請求項１６】
前記組織選択的プロモーター配列がコアプロモーター配列に作動するように結合している、請求項１〜８の核酸。
【請求項１７】
前記コアプロモーター配列が、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、伸長因子１アルファ、初期成長因子応答１、真核生物開始因子４Ａ１、フェリチン重鎖、フェリチン軽鎖、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース調節タンパク質７８、グルコース調節タンパク質９４、熱ショックタンパク質７０、熱ショックタンパク質９０、ベータ−キネシン、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ユビキチンＢ、ベータ−アクチンまたはウイルスの最小プロモーターの配列などの構成的プロモーターに由来する、請求項１６の核酸。
【請求項１８】
前記ウイルスの最小プロモーター配列が、ＲＮＡウイルスプロモーター、ＤＮＡウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター配列、バキュロウイルスプロモーター配列、ＣＭＶプロモーター配列、パルボウイルスプロモーター配列、ヘルペスウイルスプロモーター配列、ポックスウイルスプロモーター配列、アデノ関連ウイルスプロモーター配列、セムリキ森林ウイルスプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ワクシニアウイルスプロモーター配列、レンチウイルスプロモーター、またはレトロウイルスプロモーター配列である、請求項１７の核酸。
【請求項１９】
前記ウイルスの最小プロモーター配列がミニＣＭＶプロモーター配列である、請求項１８の核酸。
【請求項２０】
前記組織選択的プロモーターがｈＴＥＲＴプロモーターである、請求項１９の核酸。
【請求項２１】
前記ｈＴＥＲＴプロモーターが第一のレポーターに作動するように結合している、請求項２０の核酸。
【請求項２２】
第二のコード配列をさらに含む核酸であって、該第二のコード配列が、治療剤、選択マーカー、組み換えトランス活性化因子、または第二の画像化遺伝子（レポーター）をコードする、請求項２１の核酸。
【請求項２３】
ＳＳＴＲ２である第一のレポーターと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である第二のレポーターとを含む、請求項２２の核酸。
【請求項２４】
第二の組織選択的プロモーターの配列、または増幅された組織特異的プロモーターもしくはＣＭＶプロモーターなどの非選択的プロモーターに作動するように結合している第二のコード配列をさらに含む、請求項１〜８の核酸。
【請求項２５】
前記第二のコード配列が、治療剤、選択マーカー、組み換えトランス活性化因子、または第二の画像化遺伝子（レポーター）をコードする、請求項２２の核酸。
【請求項２６】
前記治療剤が、腫瘍抑制因子、アポトーシス誘導物質、酵素、構造タンパク質、レセプター、抗体、抗体断片、ｓｉＲＮＡ、ホルモン、パラクリン因子、または免疫賦活剤である、請求項２５の核酸。
【請求項２７】
前記腫瘍抑制因子がＦＵＳ１である、請求項２６の核酸。
【請求項２８】
前記選択マーカーが、薬剤選択マーカー、酵素、構造タンパク質、レセプター、パラクリン因子、免疫学的マーカー、または蛍光タンパク質である、請求項２５の核酸。
【請求項２９】
第二のコード配列をさらに含む核酸であって、該第二のコード配列と前記レポーターをコードする核酸とが作動するように結合している、請求項１の核酸。
【請求項３０】
第二のコード配列をさらに含む核酸であって、該第二のコード配列と前記組み換えＧＰＣＲのアミノ酸配列をコードする核酸とが二方向性のプロモーターに作動するように結合している、請求項１の核酸。
【請求項３１】
第二のコード配列をさらに含む核酸であって、該第二のコード配列と前記組み換え七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプターのアミノ酸配列をコードする核酸とがＩＲＥＳによって分離されている、請求項１の核酸。
【請求項３２】
前記第二のコード配列が、治療剤、選択マーカー、またはレポーターをコードする、請求項２９〜３１の核酸。
【請求項３３】
前記治療剤が、腫瘍抑制因子、アポトーシス誘導物質、酵素、抗体、ホルモン、または免疫賦活剤である、請求項３２の核酸。
【請求項３４】
前記腫瘍抑制因子がＦＵＳ１である、請求項３３の核酸。
【請求項３５】
前記選択マーカーが、薬剤選択マーカー、酵素、免疫学的マーカー、または蛍光タンパク質である、請求項３２の核酸。
【請求項３６】
前記ＧＰＣＲアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に融合したタンパク質タグをさらに含む、請求項１〜８の核酸。
【請求項３７】
前記タンパク質タグが酵素活性を有する、請求項３６の核酸。
【請求項３８】
前記タンパク質タグが、ヘマグルチニンＡ、ベータ−ガラクトシダーゼ、チミジンキナーゼ、トランスフェリン、ｍｙｃタグ、ＶＰ１６、（Ｈｉｓ）６タグ、ＦＬＡＧ、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである、請求項３７の核酸。
【請求項３９】
組み換えトランス活性化因子と結合するプロモーター配列に作動するように結合している核酸配列であって、被験体内で非侵襲的方法によって検出可能なレポーターをコードする核酸配列を含む核酸。
【請求項４０】
前記組み換えトランス活性化因子がＧａｌ４ＶＰ１６である、請求項３９の核酸。
【請求項４１】
第二のコード配列をさらに含む、請求項３９の核酸。
【請求項４２】
前記レポーターをコードする配列と前記第二のコード配列とがＩＲＥＳによって分離されている、請求項３９の核酸。
【請求項４３】
前記第二のコード配列が、治療剤、選択マーカー、またはレポーターをコードする、請求項４１の核酸。
【請求項４４】
組織選択的プロモーターに作動するように結合している第三のコード配列をさらに含む核酸配列であって、該第三のコード配列が組み換えトランス活性化因子をコードする、請求項４１の核酸配列。
【請求項４５】
前記第二のコード配列が組織選択的プロモーターに作動するように結合している核酸であって、該第二のコード配列が組み換えトランス活性化因子をコードする、請求項４１の核酸。
【請求項４６】
送達ビヒクル内に含まれる、請求項３９の核酸。
【請求項４７】
前記送達ビヒクルが、脂質、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、ポリリシンなどのポリアミノ酸、原核細胞、または真核細胞である、請求項４６の核酸。
【請求項４８】
被験体内で細胞を画像化または治療する方法であって：
ａ）組織選択的プロモーターまたは増幅された組織特異的プロモーターに作動するように結合している核酸であって、インビボで非侵襲的方法を用いて検出可能なレポーターをコードする核酸を、該被験体に導入する工程；および
ｂ）該被験体を、該レポーターと選択的に相互作用する非侵襲的画像化技術または治療剤に供する工程、を含む方法。
【請求項４９】
前記治療剤が、放射線治療薬、ｓｉＲＮＡ、プロドラッグ、または化学療法薬である、請求項４８の方法。
【請求項５０】
前記組織選択的プロモーターが、正常または罹患した心臓、肺、食道、筋肉、腸、胸部、前立腺、胃、膀胱、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、神経細胞、筋細胞、白血球、不死化細胞、新形成性細胞、腫瘍細胞、ガン細胞、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、唾液腺、胆嚢、膀胱、気管、喉頭、咽頭、大動脈、動脈、毛細血管、静脈、胸腺、リンパ節、骨髄、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、脳、大脳、小脳、延髄、橋、脊髄、神経、骨格筋、平滑筋、骨、精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、陰茎、卵巣、子宮、乳腺、膣、皮膚、眼、視神経、同一の胚起源に由来する組織または同一のもしくは類似の疾患によって影響を受ける組織において活性である、請求項４８の方法。
【請求項５１】
前記組織選択的プロモーターが、新形成性細胞、腫瘍細胞、またはガン細胞おいて活性である、請求項５０の方法。
【請求項５２】
前記ガン細胞が、乳ガン細胞、肺ガン細胞、前立腺ガン細胞、卵巣ガン細胞、脳のガン細胞、肝臓ガン細胞、子宮頸ガン細胞、結腸ガン細胞、腎臓ガン細胞、皮膚ガン細胞、頭頸部ガン細胞、骨のガン細胞、食道ガン細胞、膀胱ガン細胞、子宮ガン細胞、リンパのガン細胞、胃ガン細胞、膵臓ガン細胞、精巣ガン細胞、リンパ腫細胞、または白血病細胞である、請求項５１の方法。
【請求項５３】
前記プロモーター配列が、ｈＴＲ、ｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、ＡＦＰプロモーター配列、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−４、ムチン様糖タンパク質、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕオンコジーン、シクロオキシゲナーゼ、Ｅ２Ｆ転写因子１、チロシナーゼ関連タンパク質、チロシナーゼ、もしくはサバイビン、Ｔｃｆ１−アルファ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、サイクリンＥ、Ｃｄｃ２５Ａ、ＨＫ  ＩＩ、ＫＲＴ１９、ＴＦＦ１、ＳＥＬ１Ｌ、またはＣＥＬである、請求項５１の方法。
【請求項５４】
前記プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列である、請求項５３の方法。
【請求項５５】
前記プロモーター配列が、免疫グロブリン重鎖プロモーター配列、免疫グロブリン軽鎖プロモーター配列、Ｔ細胞レセプタープロモーター配列、ＨＬＡ  ＤＱ  ａプロモーター配列、ＨＬＡ  ＤＱ  ベータプロモーター配列、ベータ−インターフェロンプロモーター配列、インターロイキン−２プロモーター配列、インターロイキン−２レセプタープロモーター配列、ＭＨＣクラスＩＩ  ５プロモーター配列、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−Ｄｒａプロモーター配列、ベータ−アクチンプロモーター配列、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター配列、プレアルブミン（トランスサイレチン）プロモーター配列、エラスターゼＩプロモーター配列、メタロチオネイン（ＭＴＩＩ）プロモーター配列、コラゲナーゼプロモーター配列、アルブミンプロモーター配列、アルファ−フェトプロテインプロモーター配列、ガンマ−グロビンプロモーター配列、ベータ−グロビンプロモーター配列、ｃ−ｆｏｓプロモーター配列、ｃ−ＨＡ−ｒａｓプロモーター配列、インスリンプロモーター配列、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）プロモーター配列、アルファ−１−アンチトリプシンプロモーター配列、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストンプロモーター配列、Ｉ型コラーゲンプロモーター配列、ＧＲＰ９４プロモーター配列、ＧＲＰ７８プロモーター配列、その他のグルコース調節タンパク質プロモーター配列、成長ホルモンプロモーター配列、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）プロモーター配列、トロポニンＩ（ＴＮ  Ｉ）プロモーター配列、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター配列、デュシェンヌ型筋ジストロフィープロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ポリオーマプロモーター配列、レトロウイルスプロモーター配列、パピローマウイルスプロモーター配列、Ｂ型肝炎ウイルスプロモーター配列、ヒト免疫不全ウイルスプロモーター配列、サイトメガロウイルスプロモーター配列、テナガザル白血病ウイルスプロモーター配列、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子プロモーター配列、ソマトスタチンレセプタープロモーター配列、マウス精巣上体のレチノイン酸結合遺伝子プロモーター配列、ヒトＣＤ４プロモーター配列、マウスアルファ２（ＸＩ）コラーゲンプロモーター配列、Ｄ１Ａドーパミンレセプタープロモーター配列、インスリン様成長因子ＩＩプロモーター配列、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１プロモーター配列、ヒトアルファ−ラクトアルブミンプロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、５Ｓリボソームプロモーター配列、アルファ  フェトプロテイン、細菌のＬＰＳに対する単球レセプター、ロイコシアリン、シアロフォリン、白血球共通抗原、マクロシアリンもしくはマクロシアリンのヒトアナログ、デスミン、エラスターゼ、エラスターゼＩ、エンドグリン、フィブロネクチン、ＶＥＧＦレセプター、グリア線維酸性タンパク質、細胞間接着分子２、インターフェロンベータ、ミオグロビン、オステオカルシン２、前立腺特異抗原、前立腺特異的膜抗原、サーファクタントタンパク質Ｂ、シナプシン、チロシナーゼ関連タンパク質、チロシナーゼ、または任意の組織、疾患、もしくは系統特異的プロモーター配列の機能性ハイブリッド、機能��部分、もしくはその組み合わせである、請求項５０の方法。
【請求項５６】
非侵襲的画像化が、前記細胞と検出可能部位との間の会合を分析することによって、前記レポーターの発現を検出する工程を含む、請求項４８の方法。
【請求項５７】
前記レポーターを発現する細胞と検出可能部位との間の会合が、該細胞による検出可能部位の結合、該検出可能部位に作動するように結合するリガンドの該細胞による結合、該検出可能部位の細胞への取り込み、または該検出可能部位に作動するように結合するリガンドの細胞への取り込みを含む、請求項５６の方法。
【請求項５８】
前記検出可能部位が、タンパク質、放射性同位体、フルオロフォア、可視光放出フルオロフォア、近赤外光放出フルオロフォア、赤外光発光性フルオロフォア、金属、強磁性体、特有のＭＲ分光学的特性を有する物質、Ｘ線吸収性もしくは反射性の物質、音響を変化させる物質、または電磁波を放射する物質である、請求項５６の方法。
【請求項５９】
前記検出可能部位が、前記レポーターに特異的に結合するリガンドに作動するように結合している、請求項５６の方法。
【請求項６０】
前記リガンドが、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子などの核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、または小分子である、請求項５９の方法。
【請求項６１】
非侵襲的方法が、ＭＲＩ、ＭＲ分光法、エックス線造影法、ＣＴ、超音波診断法、平面状のガンマ線カメラによる画像化、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、その他の核医学に基づく画像化、可視光を用いる光学的画像化、ルシフェラーゼを用いる光学的画像化、フルオロフォアを用いる光学的画像化、その他の光学的画像化、近赤外光を用いる画像化、または赤外光を用いる画像化を含む、請求項４８の方法。
【請求項６２】
前記被験体の外科的処置の間に組織を画像化する工程を含む、請求項４８の方法。
【請求項６３】
前記被験体がガン患者である、請求項４８の方法。
【請求項６４】
前記核酸がガン患者を治療するための治療剤をコードする、請求項６３の方法。
【請求項６５】
前記ガン患者が第二の抗ガン治療を受ける、請求項６２の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年３月９日に出願された米国仮特許出願第６０／６５９，８４４号（この全体が、参考として本明細書に援用される）に関する。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、一般的な画像化、生体医学上の画像化、分子生物学、遺伝子治療、およびガン治療の分野に関する。本発明の態様は、被験体の非侵襲的な画像化および／または治療のための組成物および方法を包含する。本発明のさらなる態様は、増幅された組織特異的プロモーターに作動するように結合している（目的の遺伝子に結合してもよい）レポーターを包含する。本発明のさらなる態様は、組織選択的プロモーターまたは増幅された組織特異的プロモーター、すなわちｈＴＥＲＴおよびその派生物（が含まれるがこれらに限定されるわけではない）の配列に作動するように結合している核酸配列であって、組み換えの七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）のアミノ酸配列をコードする新規核酸配列を包含する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（関連技術の記載）
遺伝子治療および細胞治療は極めて有望ではあるが、遺伝子治療の発現する位置を具体的に設定することおよび／または組み換え核酸を発現する細胞を生命体内で追跡することについての方法論を欠いていることが悩みである。種々のレポーター遺伝子は、特定の核酸の発現位置の設定および発現の定量に役立ち得る。臨床前の腫瘍モデルにおいては、レポーター遺伝子、組み換えソマトスタチンレセプター  タイプ２ａ（ＳＳＴＲ２ａ）キメラの導入をインビボで定量することができる。レポーター遺伝子は、ガンを標的とする場合の弱い成長抑制剤としても役立つだろう。しかしながら、糖尿病などのその他の障害にとって、細胞に基づく治療にとって、または目的の遺伝子の発現の評価および／またはその位置設定を行う場合においては、このことは望ましくないかもしれない。
【０００４】
生体医学上の画像化としては、被験体における疾患の診断を支援するだけではなく、正常な体の構造と機能をより深く理解するための、医師および研究者によって広く用いられている種々のモダリティが挙げられる。これらの方法の多くに伴う一つの課題は、ヒトにおける使用が安全かどうか分からない放射性医薬品か、または予想できない不都合な結果をもたらすかもしれない方法で用いる放射性同位体のいずれかを利用する点である。別の課題は、これらの方法には限界があるということである。なぜなら、次善のプロモーターの機能のせいでレポーターの転写が制限されているかもしれないからである。さらに、画像化が腫瘍などの目的の組織を標的化していないかもしれない。
【０００５】
二以上の画像モダリティ、たとえば解剖学的画像化技術および機能的画像化技術を組み合わせることによって、分解能の改善および／または目的物すなわち腫瘍などの目的の領域のキャラクタライゼーションが可能となるだろう。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、被験体に送達され、目的の組織を標的化することが可能なレポーターが望まれている。レポーターの画像化技術を促進する、たとえば発現を向上させるための方法も望まれている。レポーターの画像化技術を遺伝子治療と結びつけることによって、第二の画像化レポーター遺伝子または抗ガン遺伝子などの治療用遺伝子の有効性および生体内分布をモニターするための新しい方法が可能になるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の要旨）
核酸の発現を非侵襲的に画像化する能力は、ベクターの生体内分布、遺伝子発現の組織に関連するレベル、腫瘍における発現、非標的化組織における発現に関する情報およびこれらの知見を治療活性と関連付ける能力を提供することによって、ガン治療などの遺伝子送達の開発に寄与するだろう。このデータは、これらのパラメーターを応答の前兆として認証することや、改良されたベクターおよび遺伝子発現構築物の開発につながるかもしれない情報を提供することに役立つだろう。分子の非侵襲的な画像化には、二つの構成要素、敏感で／特異的なレポーター分子および敏感な検出装置類が必要である。新たな画像化ベクターおよびプローブを、多機能画像分析を実施するためのマルチモーダルな画像化装置に組み込むことによって、この技術と共に、分子の新たな画像化手段を開発することができる。
【０００８】
この技術は、治療効果はもとより、発現ならびに時間的および空間的な分布の観点からの遺伝子の導入を評価するために特に設計されたアプローチであって、分子を画像化するための新たなアプローチの開発を促進するだろう。さらに、この技術は、分子を二重に画像化するレポーターと治療用遺伝子の発現ベクター系の開発を促進するだろう。特定の態様においては、腫瘍特異的プロモーターで作動する治療用核酸を、たとえば二機能性レポーターを介してまたはＩＲＥＳを介してレポーターに結合してもよい。これらのレポーター構築物を、種々の画像モダリティ、たとえばこれらに限定されるわけではないがガンマ線カメラによる画像化と組み合わせて、生体内分布、発現、および／または遺伝子治療の有効性を評価することができる。具体的な態様においては、ガンに関して、画像モダリティ、たとえばこれらに限定されるわけではないがＭＲＩおよびＭＲ分光法を用いて、腫瘍の成長および投与治療および／または遺伝子治療に対する応答を非侵襲的にモニターすることができる。特定の実施形態においては、遺伝子治療を全身的に実施する。これらのアプローチとしては、画像化プローブを用いてプロモーターで作動するレポーターの発現（およびそれによる治療用遺伝子の同時発現）を特定すること、ならびにその他の画像モダリティを用いて核酸発現をモニターすることが挙げられる。超音波診断法、ＣＴ、ＭＲＩ、ＭＲ分光法などの解剖学的な画像化を利用することにより、治療用遺伝子の発現を腫瘍の緩解と関連付けることが可能になる。
【０００９】
本発明者らは、被験体内の細胞を画像化および／または治療する方法を記載する。本発明の態様は、目的の細胞内でのレポーターおよび／または治療剤の発現を向上させるための発現の増幅計画を包含する。このような増幅計画の具体例としては、米国特許出願第２００３００９９６１６号のレポーターおよび／または治療剤の発現を増幅させるためのＧａｌ４ＶＰ１６増幅系の使用が挙げられ、引用されることによってその全体が本明細書に組み込まれる。その他の増幅計画では、ｈＴＥＲＴプロモーターエレメントなどの組織選択的プロモーターを利用して、特定の細胞、組織、および臓器内でレポーターの発現を増幅させる。レポーターは、一以上の目的の遺伝子、たとえば治療用遺伝子または組み換えトランス活性化因子に作動するように結合してもよく、その結果、レポーターを、治療用遺伝子の生体内分布および治療効果の評価に応用することができる。さらに、レポーターは第二のレポーターに作動するように結合してもよい。
【００１０】
特定の実施形態においては、組織選択的プロモーターはｈＴＥＲＴプロモーターであり、ｈＴＥＲＴプロモーターは第一のレポーターに作動するように結合している。たとえば、ｈＴＥＲＴプロモーター配列は配列番号：１であってよい。さらに特定の実施形態においては、ｈＴＥＲＴプロモーターおよび第一のレポーターを含む核酸配列は第二のコード配列をさらに含んでもよく、ここで第二のコード配列は、治療剤、選択マーカー、組み換えトランス活性化因子、または第二の画像化遺伝子（レポーター）をコードしている。第二のコード配列はｈＴＥＲＴプロモーターの制御下にあってもよく、または第二のプロモーターの制御下にあってもよい。たとえば、第二のプロモーターは、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）をコードする遺伝子に作動するように結合しているＣＭＶプロモーターであってもよく、従って、核医学に基づくおよび光に基づく画像モダリティを組み合わせることによって、核酸を画像化することができる。
【００１１】
ただ一つのまたは複数の画像モダリティ、たとえば核に基づく医学技術（たとえばＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ）、ＣＴ、ＭＲＩ、ＭＲ分光法、超音波診断法、および光学的画像モダリティによって、レポーターを画像化してもよい。さらなる態様においては、レポーターとしては、融合タンパク質、たとえば、（これに限定されるわけではないがヘマグルチニンＡなどの）タグに融合したレセプタータンパク質であってもよい。たとえばこれらに限定されるわけではないが、６４Ｃｕ、６８Ｇａ、１８Ｆ、１１１Ｉｎまたは９９ｍＴｃで標識されたものなどのヒトへの使用が承認されるかもしれないまたは承認されている薬剤を含めた種々の技術を用いて、レポーターを画像化してもよい。これらに限定されるわけではないが、ペプチドおよびそのアナログ（たとえばソマトスタチンアナログ）を含めたこれらの薬剤で、種々のリガンドを標識してもよい。
【００１２】
本発明の特定の実施形態は、組織選択的プロモーターの配列に作動するように結合している核酸であって、被験体内で非侵襲的方法によって検出可能な組み換え七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）レポーターのアミノ酸配列をコードする核酸を包含する。いくつかの実施形態においては、組み換え七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプターは、Ｃ末端の欠失を伴うかおよび／または内部移行の変化を有するかおよび／または細胞内シグナル伝達に欠陥を有する。本発明に包含する目的で、ＧＰＣＲに由来するあらゆるアミノ酸配列が検討される。当業者であれば、既に特定された多数のＧＰＣＲに精通しているだろう。たとえば、ＧＰＣＲは、アセチルコリンレセプター：Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、もしくはＭ５；アデノシンレセプター：Ａ１；Ａ２Ａ；Ａ２Ｂ；もしくはＡ３；アドレナリン作用性レセプター：アルファ１Ａ、アルファ１Ｂ、アルファ１Ｄ、アルファ２Ａ、アルファ２Ｂ、アルファ２Ｃ  ベータ１、ベータ２、もしくはベータ３；アンギオテンシンレセプター：ＡＴ１、もしくはＡＴ２；ボンベシンレセプター：ＢＢ１、ＢＢ２、もしくはＢＢ３；ブラジキニンレセプター：Ｂ１、Ｂ２、カルシトニン、アイニリン、ＣＧＲＰ、もしくはアドレノメデュリンレセプター；カンナビノイドレセプター：ＣＢ１、もしくはＣＢ２；ケモカインレセプター：ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸ３ＣＲ１、もしくはＸＣＲ１；走化性レセプター：Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、もしくはｆＭＬＰ；コレシストキニンおよびガストリンのレセプター：ＣＣＫ１、もしくはＣＣＫ２；副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター：ＣＲＦ１、もしくはＣＲＦ２；ドーパミンレセプター：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、もしくはＤ５；エンドセリンレセプター：ＥＴ（Ａ）もしくはＥＴ（Ｂ）；ガラニンレセプター：ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、もしくはＧＡＬ３；グルタミン酸レセプター：ｍｇｌ１、ｍｇｌ２、ｍｇｌ３、ｍｇｌ４、ｍｇｌ５、ｍｇｌ６、ｍｇｌ７、もしくはｍｇｌ８；糖タンパク質ホルモンレセプター：ＦＳＨ、ＬＳＨ、もしくはＴＳＨ；ヒスタミンレセプター：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、もしくはＨ４；５−ＨＴレセプター：５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｆ、５ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｆ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５Ａ、５−ＨＴ５Ｂ、５−ＨＴ６、もしくは５−ＨＴ７；ロイコトリエンレセプター：ＢＬＴ、ＣｙｓＬＴ１、もしくはＣｙｓＬＴ２；リゾリン脂質レセプター：ｅｄｇ１、ｅｄｇ２、ｅｄｇ３、もしくはｅｄｇ４；メラノコリンレセプター：ＭＣ１；ＭＣ２；ＭＣ３；ＭＣ４、もしくはＭＣ５；メラトニンレセプター：ＭＴ１、ＭＴ２、もしくはＭＴ３；ニューロペプチドＹレセプター：Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、もしくはＹ６；ニューロテンションレセプター：ＮＴＳ１、もしくはＮＴＳ２；オピオイド：ＤＯＰ、ＫＯＰ、ＭＯＰ、もしくはＮＯＰ；Ｐ２Ｙレセプター：Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、もしくはＰ２Ｙ１２）；ペルオキシソーム増殖剤：ＰＰＡ���−アルファ、ＰＰＡＲ−ベータ、もしくはＰＰＡＲ−ガンマ；プロスタノイドレセプター：ＤＰ、ＦＰ、ＩＰ、ＴＰ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、もしくはＥＰ４；プロテアーゼ活性化レセプター：ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、もしくはＰＡＲ４；ソマトスタチンレセプター：ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ２Ａ、ＳＳＴＲ３、ＳＳＴＲ４、もしくはＳＳＴＲ５；タキキニンレセプター：ＮＫ１、ＮＫ２、もしくはＮＫ３；チロトロピン放出ホルモンレセプター：ＴＲＨ１、もしくはＴＲＨ２；ウロテンシン−ＩＩレセプター；血管作動性腸管ペプチドもしくは下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチドのレセプター：ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２、もしくはＰＡＣ１；またはバソプレシンもしくはオキシトシンのレセプター：Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２、もしくはＯＴであってよい。本発明の実施に際して用いることができる、ＧＰＣＲスーパーファミリーのその他のメンバーが検討される。
【００１３】
特定の具体的な実施形態においては、ＧＰＣＲはソマトスタチンレセプターであり、好ましくはソマトスタチンレセプター  タイプ２Ａ（ＳＳＴＲ２Ａ）である。いくつかの実施形態においては、ＳＳＴＲ２ＡはＣ末端の欠失を伴うかおよび／または内部移行の変化を有するかおよび／または細胞内シグナル伝達に欠陥を有する。特定の具体的な実施形態においては、末端の切断はアミノ酸３１４に向けてのカルボキシ末端である。
【００１４】
本明細書で用いられるような組織選択的プロモーターの配列とは、その他のタイプの組織または細胞内で大部分がサイレントのままであるか、比較的低レベルで発現する核酸であって、一以上のタイプの組織または細胞内で転写される核酸を作動させることができるプロモーターと定義される。当業者にとって公知のあらゆる組織選択的プロモーター配列が本明細書で検討される。組織選択的プロモーターの配列としては、これらに限定されるわけではないが、テロメラーゼプロモーター（ヒトテロメラーゼＲＮＡ）（ｈＴＲ）プロモーターまたはヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴ）プロモーターが挙げられ得る。本発明の特定の態様においては、組織選択的プロモーターを、本明細書に記載の発現増幅系と組み合わせて用いてもよい。とりわけ、増幅系では、レポーターまたはレポーターおよび目的の遺伝子の発現を直接的または間接的に作動させるためのｈＴＥＲＴプロモーターを用いてもよい。ここで、目的の遺伝子は、レポーターに作動するように結合している。
【００１５】
組織選択的プロモーターの配列は、心臓、肺、食道、筋肉、腸、胸部、前立腺、胃、膀胱、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、神経細胞、筋細胞、白血球、不死化細胞、新形成性細胞、腫瘍細胞、ガン細胞、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、唾液腺、胆嚢、膀胱、気管、喉頭、咽頭、大動脈、動脈、毛細血管、静脈、胸腺、下顎リンパ節、腸間膜リンパ節、骨髄、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、脳、大脳、小脳、延髄、橋、脊髄、坐骨神経、骨格筋、平滑筋、骨、精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、陰茎、卵巣、子宮、乳腺、膣、皮膚、眼、または視神経を含むがこれらに限定されるわけではない一以上の組織または細胞のタイプおいて活性であるものでよい。具体的な態様においては、組織選択的プロモーターは、同一の胚起源に由来する組織において活性であるものか、または類似のもしくは同一の健康状態もしくは疾患の状態によって生じるものであろう。
【００１６】
特定の実施形態においては、組織選択的プロモーターは、新形成性細胞、腫瘍またはガン細胞内で活性である。本発明の核酸に包含する目的で、新形成性細胞、腫瘍、またはガン細胞内で活性であるプロモーターが検討される。たとえば、プロモーター配列としては、ｈＴＲプロモーター配列、ｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、ＡＦＰプロモーター配列、ＭＵＣ−１プロモーター配列、ムチン様糖タンパク質プロモーター配列、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕオンコジーンプロモーター配列、シクロオキシゲナーゼプロモーター配列、Ｅ２Ｆ転写因子１プロモーター配列、チロシナーゼ関連タンパク質プロモーター配列、チロシナーゼプロモーター配列、またはサバイビンプロモーター配列であってよい。
【００１７】
特定の態様においては、プロモーター配列は、ガン細胞おいて活性であるｈＴＥＲＴプロモーター配列である。ガン細胞としては、中胚葉、内胚葉、または外胚葉に由来するもの、たとえば血液、心臓、肺、食道、筋肉、腸、胸部、前立腺、胃、膀胱、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、神経細胞、筋細胞、白血球、不死化細胞、新形成性細胞、腫瘍細胞、ガン細胞、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、唾液腺、胆嚢、膀胱、気管、喉頭、咽頭、大動脈、動脈、毛細血管、静脈、胸腺、リンパ節、骨髄、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、脳、大脳、小脳、延髄、橋、脊髄、神経、骨格筋、平滑筋、骨、精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、陰茎、卵巣、子宮、乳腺、膣、皮膚、眼、または視神経を含むあらゆるタイプのガン細胞であってよい。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態においては、プロモーター配列は、免疫グロブリン重鎖プロモーター配列、免疫グロブリン軽鎖プロモーター配列、Ｔ細胞レセプタープロモーター配列、ＨＬＡ  ＤＱ  αプロモーター配列、ＨＬＡ  ＤＱ  βプロモーター配列、ベータ−インターフェロンプロモーター配列、インターロイキン−２プロモーター配列、インターロイキン−２レセプタープロモーター配列、ＭＨＣクラスＩＩ  ５プロモーター配列、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−Ｄｒａプロモーター配列、ベータ−アクチンプロモーター配列、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター配列、プレアルブミン（トランスサイレチン）プロモーター配列、エラスターゼＩプロモーター配列、メタロチオネイン（ＭＴＩＩ）プロモーター配列、コラゲナーゼプロモーター配列、アルブミンプロモーター配列、アルファ−フェトプロテインプロモーター配列、ガンマ−グロビンプロモーター配列、ベータ−グロビンプロモーター配列、ｃ−ｆｏｓプロモーター配列、ｃ−ＨＡ−ｒａｓプロモーター配列、インスリンプロモーター配列、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）プロモーター配列、アルファ−１−アンチトリプシンプロモーター配列、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストンプロモーター配列、Ｉ型コラーゲンプロモーター配列、ＧＲＰ９４プロモーター配列、ＧＲＰ７８プロモーター配列、その他のグルコース調節タンパク質プロモーター配列、成長ホルモンプロモーター配列、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）プロモーター配列、トロポニンＩ（ＴＮ  Ｉ）プロモーター配列、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター配列、デュシェンヌ型筋ジストロフィープロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ポリオーマプロモーター配列、レトロウイルスプロモーター配列、パピローマウイルスプロモーター配列、Ｂ型肝炎ウイルスプロモーター配列、ヒト免疫不全ウイルスプロモーター配列、サイトメガロウイルスプロモーター配列、テナガザル白血病ウイルスプロモーター配列、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子プロモーター配列、ソマトスタチンレセプタープロモーター配列、マウス精巣上体のレチノイン酸結合遺伝子プロモーター配列、ヒトＣＤ４プロモーター配列、マウスアルファ２（ＸＩ）コラーゲンプロモーター配列、Ｄ１Ａドーパミンレセプタープロモーター配列、インスリン様成長因子ＩＩプロモーター配列、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１プロモーター配列、ヒトアルファ−ラクトアルブミンプロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、もしくは５Ｓリボソームプロモーター配列もしくは機能性ハイブリッド、機能性部分、または組織特異的プロモーターの配列のあらゆる組み合わせである。
【００１９】
本発明のプロモーターおよび核酸は、増幅ベクター内に含まれてもよい。増幅ベクターは、組織特異的プロモーターの制御下にあるトランス活性化因子をコードする核酸配列を含む。コードされたトランス活性化因子は、目的の単数（もしくは複数）の核酸、たとえばレポーターもしくは治療剤を含む第二の核酸と細胞内で結合しているかまたは共存しており、ここでこの核酸はトランス活性化因子により活性化されるプロモーターの制御下にある。特定の実施形態においては、トランス活性化因子はＧａｌＶＰ１６トランス活性化因子である。ＧａｌＶＰ１６は、構築物内に種々の数のＧＡＬおよび／またはＶＰ１６を含んでもよい。ＧａｌＶＰ１６は、ＧａｌＶＰ１６に結合した一以上の遺伝子を含んでもよい。
【００２０】
本発明の核酸は、コアプロモーター配列に作動するように結合していてもよく、していなくてもよい。本明細書において、コアプロモーター配列とは、トランス活性化因子または転写複合体の構成要素と結合し、それを核酸内の特定の位置に設置する能力を維持するヌクレオチド配列と定義される。特定の実施形態においては、組織選択的プロモーター配列は、コアプロモーター配列に作動するように結合している。コアプロモーター配列は、当業者にとって公知のあらゆるコアプロモーター配列であり得る。たとえば、コアプロモーター配列は、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、伸長因子１アルファプロモーター、初期成長因子応答１プロモーター、真核生物開始因子４Ａ１プロモーター、フェリチン重鎖プロモーター、フェリチン軽鎖プロモーター、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼプロモーター、グルコース調節タンパク質７８プロモーター、グルコース調節タンパク質９４プロモーター、熱ショックタンパク質７０プロモーター、熱ショックタンパク質９０プロモーター、ベータ−キネシンプロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター、ユビキチンＢプロモーター、ベータ−アクチンプロモーターまたはウイルスの最小プロモーターの配列に由来するものでよい。
【００２１】
ウイルスの最小プロモーター配列は、当業者にとって公知のあらゆるウイルスの最小プロモーター配列であり得る。たとえば、ウイルスの最小プロモーター配列は、ＲＮＡウイルスプロモーター、ＤＮＡウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター配列、バキュロウイルスプロモーター配列、ＣＭＶプロモーター配列、パルボウイルスプロモーター配列、ヘルペスウイルスプロモーター配列、ポックスウイルスプロモーター配列、アデノ関連ウイルスプロモーター配列、セムリキ森林ウイルスプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ワクシニアウイルスプロモーター配列、レンチウイルスプロモーター、レオウイルスプロモーター、またはレトロウイルスプロモーター配列でよい。具体的な実施形態においては、ウイルスの最小プロモーター配列はミニＣＭＶプロモーター配列である。たとえば、ミニＣＭＶプロモーター配列は配列番号：２であり得る。本発明の特定の態様においては、組織選択的プロモーターはｈＴＥＲＴプロモーターである。たとえば、プロモーター配列は配列番号：３を含んでもよく、これは、ミニＣＭＶ配列に作動するように結合しているｈＴＥＲＴプロモーター配列を含む。
【００２２】
種々のコード配列は、これらに限定されるわけではないが、治療剤、選択マーカー、または第二の画像化遺伝子（レポーター）を含む第二のコード配列として検討される。本明細書において、治療剤とは、被験体における疾患を治療および／または予防することに有用であると知られているかまたは推測されている薬剤と定義される。本発明のさらなる態様においては、被験体は動物であり得、好ましくはヒトである。疾患としては、これに限定されるわけではないがガンを含む、被験体に影響を与え得るあらゆる疾患であり得る。具体的な実施形態においては、治療剤は、腫瘍抑制因子、アポトーシス誘導物質、酵素、抗体、抗体断片、ｓｉＲＮＡ、ホルモン、プロドラッグ、または免疫賦活剤である。特定の実施形態においては、治療剤は放射線治療薬である。当業者にとって公知のあらゆる腫瘍抑制因子が本発明によって検討され、これらに限定されるわけではないが、ＦＵＳ１、ｐ５３、ＣＤＫ４またはその他のサイクリン依存性キナーゼ；ｐ１６ＩＮＫ４、ｐ１６Ｂ、ｐ２１ＷＡＦ１、ＣＩＰＩ、ＳＤＩ１、ｐ２７ＫＩＰ１またはその他のＣＤＫ阻害タンパク質；Ｃ−ＣＡＭ、ＲＢ、ＡＰＣ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ｚａｃ１、ｐ７３、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＦＣＣ、ＭＭＡＣ１、ＭＣＣ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ５７、ｐ２７、およびＢＲＣＡ２が挙げられる。具体的な実施形態においては、腫瘍抑制因子はＦＵＳ１である。
【００２３】
本明細書において、選択マーカーとは、発現した時に、選択マーカーを持たない細胞から、選択マーカーを含む細胞を容易に特定し、単離しおよび／または選択することを可能にする特定可能な特性を細胞に付与する核酸配列と定義される。本発明に包含する目的で、当業者にとって公知のあらゆる選択マーカーが検討される。たとえば、選択マーカーは、薬剤選択マーカー、酵素、免疫学的マーカー、または蛍光タンパク質であってよい。
【００２４】
さらなる実施形態においては、本発明の核酸は第二のコード配列を含んでもよい。ここで、第二のコード配列および組み換えの七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプターのアミノ酸配列をコードする核酸は、二方向性のプロモーターに作動するように結合している。あるいは、第二のコード配列は第二のプロモーターの制御下にあってもよい。本明細書において、二方向性のプロモーターとは、プロモーターエレメントから両方向での転写を開始する能力を有するプロモーターであると定義される。いくつかの実施形態においては、第二のコード配列および組み換え七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプターのアミノ酸配列をコードする核酸は、ＩＲＥＳによって分離されている。本明細書において、ＩＲＥＳとは内部リボソーム侵入部位であると定義される。いくつかの実施形態においては、第二のコード配列は、治療剤、選択マーカー、またはレポーターをコードしている。上記で検討したように、治療剤は、当業者にとって公知のあらゆる治療剤であり得る。たとえば、治療剤は、腫瘍抑制因子、アポトーシス誘導物質、酵素、抗体、抗体断片、ｓｉＲＮＡ、ホルモン、または免疫賦活剤であってもよい。本発明に包含する目的で、あらゆる腫瘍抑制因子が検討される。腫瘍抑制因子の典型例は、上に記載した。本発明に包含する目的で、あらゆるアポトーシス誘導物質が検討される。アポトーシス誘導物質の典型例としては、ＴＲＡＩＬ、Ｂａｘ、Ｂａｋ、Ｂｃｌ−Ｘｓ、Ｂｉｋ、Ｂｉｄ、Ｈａｒａｋｉｒｉ、Ａｄ  Ｅ１Ｂ、Ｂａｄ、およびＩＣＥ−ＣＥＤ２プロテアーゼが挙げられる。特定の具体的な実施形態においては、腫瘍抑制因子はＦＵＳ１である。
【００２５】
上記で議論したように、本発明の核酸配列に包含する目的で、当業者にとって公知のあらゆる選択マーカーが検討される。たとえば、選択マーカーとしては、薬剤選択マーカー、酵素、免疫学的マーカー、または蛍光タンパク質でよい。本明細書において、薬剤選択マーカーは、そのマーカー遺伝子が発現されたコピーを保持するかまたは保持しない細胞を選択するためまたは選択しないために用いることができるマーカーと定義される。薬剤選択マーカーの典型例としては、哺乳動物の細胞内で薬物のＧ４１８に対する抵抗性を与える細菌のアミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｎｅｏ遺伝子とも称される）、抗生物質のハイグロマイシンに対する抵抗性を与える細菌のハイグロマイシンＧホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇ）遺伝子およびミコフェノール酸の存在下で成長する能力を与える細菌のキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子（ｇｐｔ遺伝子とも称される）が挙げられる。その他の選択マーカーは、それらを関連する酵素活性を欠く細胞系と同時に使用しなければならないという点で支配的ではない。非支配的な選択マーカーの具体例としては、ｔｋ細胞系と同時に使用されるチミジンキナーゼ（ｔｋ）遺伝子、ＣＡＤ欠損細胞と同時に使用されるＣＡＤ遺伝子、およびｈｐｒｔ細胞系と同時に使用される哺乳動物のヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｈｐｒｔ）遺伝子が挙げられる。哺乳動物の細胞系における選択マーカーの使用についての総説はＳａｍｂｒｏｏｋら（２００１）に提供されている。本明細書において、免疫学的マーカーとは、ポリペプチドの発現を認識するために用いられ得る、対応する抗体または抗体断片を伴うポリペプチドであると定義される。蛍光タンパク質は、当業者にとって周知である。具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓの緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰｍｕｔ２、ＧＦＰｕｖ４、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、高感度青緑色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、ｄｉｓｃｏｓｏｍａ由来の淡黄色および赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）が挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００２６】
いくつかの実施形態においては、本発明の核酸配列は、レポーター、特にＧＰＣＲアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に融合したタンパク質タグを含む。「タグ」、「タグ配列」または「タンパク質タグ」という用語は、化学的部分、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドもしくはアミノ酸、ペプチドもしくはタンパク質またはその他の化学物質のいずれかであって、別の配列に添加した時に、さらなる効用を提供するか、または有用な特性、特にその配列の検出または単離する際に付与するものを意味する。従って、たとえば、ホモポリマー核酸配列または捕捉用オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列をプライマーまたはプローブの配列に添加して、その後の伸長産物またはハイブリッド産物の単離を促進してもよい。タンパク質タグの場合において、ヒスチジン残基（たとえば４〜８の連続したヒスチジン残基）をタンパク質のアミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかに添加して、検出、選択または単離を促進してもよい。あるいは、特異的抗体分子またはその他の分子（たとえばｆｌａｇエピトープ、ｃ−ｍｙｃエピトープ、インフルエンザＡウイルスヘマグルチニンタンパク質の膜貫通型エピトープ、プロテインＡ、セルロース結合ドメイン、カルモジュリン結合タンパク質、マルトース結合タンパク質、キチン結合ドメイン、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼなど）と反応するエピトープまたは結合決定基を代表するアミノ酸配列、ペプチド、タンパク質または融合のパートナーを、タンパク質に添加して、アフィニティーもしくはイムノアフィニティークロマトグラフィー、免疫組織化学的方法、または本明細書に記載の非侵襲的な検出方法などの手段によるタンパク質の単離、位置決定および／または特定を促進してもよい。化学的タグ部分としてはビオチンなどの分子が挙げられ、これを核酸またはタンパク質のいずれかに添加して、アビジン試薬などとの相互作用によって単離または検出を促進してもよい。その他の多数のタグ部分は公知であり、熟達した研究者によって想像することができるものであり、この定義の範囲内であることが検討される。いくつかの実施形態においては、タンパク質タグは酵素活性を有してもよい。
【００２７】
本発明のさらなる実施形態は、一般的に、被験体内で非侵襲的方法によって検出可能な核酸配列であって、組み換えトランス活性化因子に結合するプロモーター配列に作動するように結合しているレポーターをコードする核酸配列に関する。組み換えトランス活性化因子とは、適切なプロモーター配列に関連して適切な位置に付いた時に転写を誘導するドメイン（トランス活性化ドメイン）を含む、単離されたまたは改変されたポリペプチドであると定義される。改変されたトランス活性化因子は、トランス活性化ドメインに作動するように結合しているドメインであって、目的のプロモーターを認識するＤＮＡ結合ドメインを含んでもよい。特定の具体的な実施形態においては、組み換えトランス活性化因子はＧａｌ４ＶＰ１６である。核酸は第二のコード配列を含んでいてもまたは含んでいなくてもよい。特定の実施形態においては、レポーターをコードする配列および第二のコード配列は、ＩＲＥＳによって分離されている。第二のコード配列は、治療剤、選択マーカー、および／またはレポーターをコードしていてもよい。本明細書で用いられるような「レポーター」、「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」とは、あらゆる遺伝子配列またはコードされたポリペプチド配列であって、検出可能かつ細胞内に存在するその他の遺伝子配列またはコードされたポリペプチドと区別可能な配列を意味する。この明細書の他の箇所で、レポーターの長さが検討される。
【００２８】
いくつかの実施形態においては、核酸配列は、組織選択的プロモーターに作動するように結合している第二のまたは第三のコード配列をさらに含む。ここで、第二のまたは第三のコード配列は組み換えトランス活性化因子をコードしている。
【００２９】
本明細書に示される核酸配列の特定の実施形態においては、核酸は送達ビヒクル内に含まれる。本明細書において、送達ビヒクルとは、核酸と結び付き、核酸の細胞内への導入を仲介する実体であると定義される。あらゆる送達ビヒクルが本発明によって検討される。たとえば、送達ビヒクルとしては、ポリペプチド、脂質、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、ポリリシンなどのポリアミノ酸、原核細胞、または真核細胞が挙げられるがこれらに限定されるわけではない。
【００３０】
本発明のさらなる実施形態は、一般的に、組織選択的プロモーターに作動するように結合している核酸であって、インビボで非侵襲的方法を用いて検出可能なレポーターをコードする核酸を、被験体に導入する工程；およびその被験体を、そのレポーターと選択的に相互作用する非侵襲的画像化技術または治療剤に供する工程を含む、細胞を被験体内で画像化または治療する方法に関する。治療方法は、遺伝子治療、放射線治療、化学療法、および／または免疫療法であってよい。
【００３１】
特定の態様においては、組織選択的プロモーターは、新形成性細胞、腫瘍細胞、またはガン細胞において活性である。特定の実施形態においては、組織選択的プロモーターは、たとえば乳ガン細胞、肺ガン細胞、前立腺ガン細胞、卵巣ガン細胞、脳のガン細胞、肝臓ガン細胞、子宮頸ガン細胞、結腸ガン細胞、腎臓ガン細胞、皮膚ガン細胞、頭頸部ガン細胞、骨のガン細胞、食道ガン細胞、膀胱ガン細胞、子宮ガン細胞、リンパのガン細胞、胃ガン細胞、膵臓ガン細胞、精巣ガン細胞、リンパ腫細胞、または白血病細胞おいて活性である。
【００３２】
本明細書で定義されるように、「非侵襲的画像化」とは、組織を画像化するために、生検または被験体から組織を除去するその他の方法を必要としない、被験体内で組織を画像化するあらゆる方法を意味する。本発明の方法によって、非侵襲的画像化を行うためのあらゆる方法が検討される。非侵襲的画像化について、以下の明細書でより詳細に検討する。特定の実施形態においては、非侵襲的画像化は、細胞内のレポーターと検出可能部位との間の会合を評価するための、レポーターの発現を検出する工程を含む。いくつかの実施形態においては、レポーターを発現する細胞と検出可能部位との間の会合には、検出可能部位の細胞による結合、検出可能部位に作動するように結合するリガンドの細胞による結合、検出可能部位の細胞への取り込み、または検出可能部位に作動するように結合するリガンドの細胞への取り込みを必要とする。特定の態様においては、優れた組織透過率を与え、ｎＭ量というわずかな量の検出可能部位しか必要としない核医学技術による非侵襲的画像化によってなされる（一般論は、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、２００４；ＥｌｌおよびＧａｍｂｈｉｒ、２００４を参照すること）。
【００３３】
本明細書で定義されるように、検出可能部位は、非侵襲的画像化により検出可能なシグナルを放出することができる任意の分子または薬剤である。たとえば、検出可能部位は、タンパク質、放射性同位体、フルオロフォア、可視光放出フルオロフォア、赤外光発光性フルオロフォア、金属、強磁性体、電磁波を放射する物質、特有のＭＲ分光学的特性を有する物質、Ｘ線吸収性もしくは反射性の物質、または音響を変化させる物質であってよい。特定の実施形態においては、検出可能部位は、レポーターに特異的に結合するリガンドに作動するように結合している。本明細書において、「リガンド」とは、別の化学物質またはポリペプチドと結合し、より大きな複合体を形成するイオン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、分子、または分子群であると定義される。リガンドについて、以下の明細書でより詳細に検討する。たとえばいくつかの実施形態においては、リガンドは核酸であり、たとえば、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、または小分子である。ＲＮＡ分子としては、たとえばｓｉＲＮＡであってよい。
【００３４】
当業者にとって公知のあらゆる非侵襲的な画像化方法が本発明の方法によって検討される。非侵襲的な画像化方法について、以下の明細書で詳細に検討する。非侵襲的方法の具体例としては、ＭＲＩ、ＭＲ分光法、エックス線造影法、ＣＴ、超音波診断法、平面状のガンマ線カメラによる画像化、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、その他の核医学に基づく画像化、可視光を用いる光学的画像化、ルシフェラーゼを用いる光学的画像化、フルオロフォアを用いる光学的画像化、その他の光学的画像化、近赤外光を用いる画像化、または赤外光を用いる画像化が挙げられる。
【００３５】
本発明の方法の特定の実施形態は、被験体の外科的処置の間に組織を画像化する工程をさらに含む。被験体はあらゆる被験体であってよく、たとえば哺乳動物であり、好ましい被験体はヒトである。さらに具体的な実施形態においては、被験体はガン患者である。これらの実施形態においては、核酸はガン患者を治療するための治療剤をコードしていてもよく、していなくてもよい。いくつかの実施形態においては、ガン患者は抗ガン療法を受けている。抗ガン療法の典型例としては、化学療法、放射線療法、外科的療法、免疫療法、および遺伝子治療が挙げられる。
【００３６】
本明細書で用いられるような「ａ」または「ａｎ」は、一以上を意味してもよい。「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」という単語と同時に使用される時、本明細書の請求の範囲で用いられるような「ａ」または「ａｎ」という単語は、一以上を意味してもよい。本明細書で用いられるような「ａｎｏｔｈｅｒ」は、少なくとも二番目またはそれ以降のものを意味してもよい。
【００３７】
本発明のその他の目的、特徴および優位性は、次の詳細な説明から自明となるだろう。しかしながら、本発明の好ましい実施形態を示す詳細な説明および特定の実施例は、例証のみを目的として記載されたことを理解すべきである。というのは、本発明の精神および範囲に含まれる種々の変更および修飾は、当業者にとってはこの詳細な説明から自明となるだろうからである。
【００３８】
以下の図面は本明細書の一部を構成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含められる。一以上のこれらの図面を、本明細書に示された具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、本発明をさらに理解できるだろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
（例示的な実施形態の説明）
核酸の発現を非侵襲的に画像化する能力は、ベクターの生体内分布、遺伝子発現の組織に関連するレベル、腫瘍における発現に関する情報およびこれらの知見を治療活性と関連付ける能力を提供することによって、全身への遺伝子送達の開発に、疾患の診断および病期分類に、およびガンの治療として寄与するだろう。このデータは、これらのパラメーターを応答の前兆として認証することや、改良されたベクターおよび遺伝子発現構築物の開発につながるかもしれない情報を提供することに役立つだろう。分子の非侵襲的な画像化には、二つの構成要素、敏感で／特異的なレポーター分子および敏感な検出装置類が必要である。新たな画像化用ベクターおよびプローブを、多機能画像分析を実施するためのマルチモーダルな画像化装置に組み込むことによって、この技術と共に、分子の新たな画像化手段を開発することができる。
【００４０】
この技術は、治療効果はもとより、発現ならびに時間的および空間的な分布の観点からの遺伝子の導入を評価するために特に設計されたアプローチであって、分子を画像化するための新たなアプローチの開発を促進するだろう。さらに、この技術は、分子を二重に画像化するレポーターと治療用遺伝子の発現ベクター系の開発を促進するだろう。特定の態様においては、腫瘍特異的プロモーターで作動する治療用核酸は、ＩＲＥＳを介してレポーターに結合してもよい。これらのレポーター構築物を、これに限定されるわけではないが、ガンマ線カメラによる画像化などの画像モダリティと組み合わせて、生体内分布、発現、および／または遺伝子治療の活動性を判断することができる。ガンに関する特定の態様において、これらに限定されるわけではないが、ＭＲＩおよびＭＲ分光法などの画像モダリティを用いて、腫瘍の成長および遺伝子治療などの抗ガン療法の実施に対する応答を非侵襲的にモニターすることができる。特定の実施形態においては、遺伝子治療を全身的に実施してもよい。これらのアプローチには、画像化プローブを用いてプロモーターで作動するレポーターの発現を特定すること（そしてそれによる治療用遺伝子の同時発現）、およびその他の核酸の発現をモニターするための画像モダリティが含まれる。ＭＲＩなどの解剖学的な画像化を利用して、治療用遺伝子の発現と腫瘍の緩解とを関連付けることが可能になる。組織特異的プロモーターまたは増幅されたテロメラーゼ特異的プロモーターとレポーターを用いることは、たとえば遺伝性、炎症性、感染性、または腫瘍性の疾患などの疾患の診断および病期分類のための薬剤としての機能を果たすかもしれない。特にｈＴＥＲＴプロモーター（増幅されたｈＴＥＲＴプロモーター）およびレポーター（たとえばＳＳＴＲ２または派生物）が、ガンの診断および病期分類に役立つかもしれない。
【００４１】
Ｉ．  遺伝子発現の画像化
この１０年間に亘って発展してきた画像化または分子の画像化の新たな方法には、インサイチュまたはインビボでのレポーター遺伝子の画像化が含まれる。レポーター遺伝子の技術が、組織切片のインサイチュ画像化に最初に適用された（Ｂｌａｓｂｅｒｇらの総説、２００３）。たとえば、Ｈｏｏｐｅｒら（１９９０）は、単一の哺乳動物の細胞におけるルシフェラーゼ遺伝子の発現の画像化を記載した。本発明の特定の実施形態は、非侵襲的画像化技術を用いての被験体内で細胞を画像化する方法に関する。当業者にとって公知のあらゆる画像モダリティが、本発明におけるレポーター配列の発現を検出する方法として検討される。
【００４２】
レポーターの画像化は、磁気共鳴、放射性映像（ＰＥＴ、ガンマ線カメラ）および／またはインビボでの光学的画像化システムに基づくものとして記載されている（Ｂｌａｓｂｅｒｇらの総説、２００３）。たとえば、単純ヘルペスウイルス−１チミジンキナーゼまたはドーパミンレセプター  タイプ２の導入を、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）によって検出した（Ａｌａｕｄｄｉｎら、１９９６；ＡｌａｕｄｄｉｎおよびＣｏｎｔｉ、１９９８；Ｇａｍｂｈｉｒら、１９９８；ＭａｃＬａｒｅｎら、１９９９；Ｔｊｕｖａｊｅｖら、１９９８）。対照的に、ナトリウム−ヨウ化物シンポーター（Ｍａｎｄｅｌｌ、１９９９）、ドーパミントランスポーター（Ａｕｒｉｃｃｈｉｏら、２００３）、またはソマトスタチンレセプター  タイプ２（Ｋｕｎｄｒａ、２００２；Ｓｕｎら、２００１）の導入は、ガンマ線カメラによる画像化によって検出された。
【００４３】
特定の実施形態においては、画像化は、レポーター、特に組み換えＧＰＣＲの存在を、細胞表面上で、細胞膜に統合された状態でまたは細胞の細胞質内で検出する工程を含む。（以下により詳細に検討する）一以上の画像モダリティを用いることによって、シグナルを検出してもよい。たとえば、画像化手段としては、これらに限定されるわけではないが、エックス線造影法、超音波診断法、ＣＴ、ＭＲＩ、ＭＲ分光法、またはＰＥＴであってよい。しかしながら特定の態様においては、被験体の外科的処置の間に、手術中の組織の画像化が実施される。特定の実施形態においては、たとえばレポーターを用いて、外科医が摘出しようとする特定のタイプの組織を選択的に標識することができる。いくつかの実施形態においては、摘出される組織は腫瘍組織であり、手術中に行う画像化は腫瘍組織の画像化である。治療用遺伝子の投与を、手術中に行う画像化と併用して実施してもよく、またはしなくてもよい。
【００４４】
特定の実施形態においては、治療用遺伝子の被験体への投与を、画像化と併用して実施する。たとえば、プロモーターは、レポーターのアミノ酸配列および治療用遺伝子に作動するように結合していてもよい。治療用遺伝子は、当業者にとって公知のあらゆるタイプの治療用遺伝子であり得る。たとえば、治療用遺伝子としては、腫瘍抑制遺伝子、アポトーシスを誘導する遺伝子、酵素をコードする遺伝子、構造タンパク質をコードする遺伝子、レセプターをコードする遺伝子、パラクリン因子をコードする遺伝子、抗体をコードする遺伝子、またはホルモンをコードする遺伝子であってよい。本発明の方法によって、当業者にとって公知のあらゆる治療用遺伝子が検討される。
【００４５】
治療用遺伝子に作動するように結合しているレポーターのアミノ酸配列を併用投与することは、被験体内での遺伝子の生体内分布の測定に応用することもできる。従って、本明細書に記載された細胞を画像化する方法を、組織内または腫瘍内での治療用遺伝子の生体内分布を測定することに適用することができる。
【００４６】
当業者にとって公知のあらゆる方法によって、レポーターアミノ酸配列の画像化を実施することができる。たとえば、標識されたリガンドを被験体に投与することによってレポーターを画像化してもよく、ここで、標識されたリガンドは、レポーターアミノ酸配列に向けられたものである。その他の実施形態においては、リガンドは１１１Ｉｎ−オクトレオチドなどの放射標識されたプローブである。さらなる実施形態においては、リガンドは直接的にまたは間接的にレポーターアミノ酸配列と結び付く蛍光プローブか、またはレポーターアミノ酸配列に対する抗体である。本発明に包含する目的で、レポーターまたは関連するリガンドに由来するシグナルを測定するための、当業者にとって公知のあらゆる方法が検討される。検出方法の典型例は次のとおりである。
【００４７】
Ａ．  ガンマ線カメラによる画像化
画像化のための種々の核医学技術が当業者にとって公知である。これらのあらゆる技術を、レポーターからのシグナルを測定するための本発明の画像化方法の文脈に適用することができる。たとえば、レポーターから生じるシグナルの測定に利用することができる画像化方法として、ガンマ線カメラによる画像化が検討される。当業者であれば、ガンマ線カメラによる画像化の応用に適した技術に精通しているだろう。一つの実施形態においては、シグナルの測定には、１１１Ｉｎまたは９９ｍＴｃ複合体、特に１１１Ｉｎ−オクトレオチドまたは９９ｍＴｃ−ソマトスタチンアナログのガンマ線カメラによる画像化を利用することを含むことが可能である。
【００４８】
Ｂ．  コンピュータ断層撮影（ＣＴ）
本発明の文脈における画像モダリティとして、コンピュータ断層撮影（ＣＴ）が検討される。種々の角度からの一連のＸ線、時には千を超える、を受け取り、次いでそれらをコンピュータで組み合わせることによって、ＣＴは体のあらゆる部分の三次元画像を築くことができた。あらゆる角度およびあらゆる深度からの二次元の薄片を表示するように、コンピュータをプログラムする。この薄片を組み合わせて、三次元の表現を構築してもよい。
【００４９】
ＣＴにおいては、初期のＣＴスキャンが診断目的でない時は、放射線不透過性の造影剤の静脈注射によって、軟組織の塊の特定と描写を支援することができる。同様に、造影剤は、軟組織または骨粗鬆症の血管分布像の測定を支援する。たとえば、造影剤の使用が、腫瘍とそれに隣接する血管構造との関係の描写を支援してもよい。
【００５０】
ＣＴ造影剤としては、たとえばヨード造影剤が挙げられる。これらの薬剤の具体例としては、イオタラム酸、イオヘキソール、ジアトリゾ酸、イオパミドール、エチオドール、およびイオパノ酸が挙げられる。ＣＴ造影剤としてガドリニウム剤を用いることも報告されている（たとえばＨｅｎｓｏｎら、２００４を参照すること）。たとえば、ＣＴ造影剤としてガドペンタ酸剤が用いられている（ＳｔｒｕｎｋおよびＳｃｈｉｌｄにおける検討、２００４）。
【００５１】
Ｃ．  磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、画像を作成するために高強力磁石と高周波シグナルを用いる画像モダリティである。生物組織における最も豊富な分子種は水である。画像化実験においてシグナルを生じさせるのは結局のところ水のプロトン核の量子力学上の「スピン」であり、その他の核も画像化することができる。ＭＲＩにおいては、画像化されるサンプルを強い静磁場（１〜１２テスラ）内に置き、高周波（ＲＦ）パルスを照射してスピンを励起させて、サンプルに正味の磁化を生じさせる。次いで、種々の傾斜磁場およびその他のＲＦパルスがスピンに影響を与えて空間情報を、記録されたシグナルに変換する。これらのシグナルを収集し分析することによって、ＣＴ画像のような三次元画像をコンピュータで計算して、自然な二次元の薄片を表示することが可能になる。この薄片を組み合わせて三次元の表現を構築してもよい。
【００５２】
ＭＲまたはＭＲ分光法による画像化に用いる造影剤は、その他の画像化技術に用いる物とは異なる。それらの目的は、類似のシグナル特性を有する組織成分を区別して、緩和時間を短くすること（これにより、Ｔ１強調スピンエコーＭＲ画像上でより強いシグナルを生じさせ、そしてＴ２強調画像上でより弱い強度のシグナルを生じさせるであろう）を支援することである。ＭＲＩ造影剤の具体例としては、ガドリニウムキレート、マンガンキレート、クロムキレート、および鉄粒子が挙げられる。
【００５３】
ＣＴおよびＭＲＩの両者は、組織の境界線および血管構造の識別を支援する解剖学上の情報を提供する。ＣＴと比較して、ＭＲＩの短所としては、患者の許容範囲の小ささ、ペースメーカーおよびその他の特定の埋め込み式金属製装置における禁忌、ならびに少しも動いてはならない複数の原因に関する人工物が挙げられる（Ａｌｂｅｒｉｃｏら、２００４）。他方ＣＴは、素早く、許容範囲が十分大きく、そして容易に利用することができるが、コントラスト分解能がＭＲＩよりも小さく、ヨウ化物による造影や電離放射線が必要である（Ａｌｂｅｒｉｃｏら、２００４）。
【００５４】
Ｄ．  ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ
細胞生存性などの細胞レベルにおける情報に関する情報を提供する画像モダリティとしては、ポジトロン放出断層撮影法（ＰＥＴ）および単光子放射型コンピュータ断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）が挙げられる。ＰＥＴにおいて、患者はポジトロンを放射する放射性物質を摂取するかまたは注射される。この物質を、体内を移動する物質としてモニターすることができる。
【００５５】
ＰＥＴと密接な関係にあるものは、単光子放射型コンピュータ断層撮影法、すなわちＳＰＥＣＴである。この二つの物の間の主な違いは、ポジトロン放射体の代わりに、ＳＰＥＣＴでは高エネルギーの光子を放射する放射性トレーサーを用いることである。ＳＰＥＣＴは、冠動脈疾患を含む複合的な疾患の診断にとって有用であり、既に毎年約２５０万のＳＰＥＣＴによる心臓の研究が米国でなされている。
【００５６】
画像化のためのＰＥＴ用放射性医薬品は通常、１１Ｃ、１３Ｎ、１５Ｏ、１８Ｆ、８２Ｒｂ、６２Ｃｕ、および６８Ｇａなどのポジトロン放射体で標識されている。ＳＰＥＣＴ用放射性医薬品は通常、９９ｍＴｃ、２０１Ｔｌ、および６７Ｇａ、１１１Ｉｎなどのポジトロン放射体で標識されている。脳の画像化に関して、ＰＥＴおよびＳＰＥＣＴ用の放射性医薬品は、血液脳関門透過性、脳潅流および代謝、レセプター結合性、ならびに抗原抗体結合性に従って分類される（Ｓａｈａら、１９９４）。血液脳関門（ＢＢＢ）用のＳＰＥＣＴ剤、たとえば９９ｍＴｃＯ４−ＤＴＰＡ、２０１Ｔｌ、およびクエン酸［６７Ｇａ］は、正常な脳細胞によって排出されるが、腫瘍細胞内にはＢＢＢが変化により取り込まれる。［１２３Ｉ］ＩＭＰ、［９９ｍＴｃ］ＨＭＰＡＯ、［９９ｍＴｃ］ＥＣＤなどのＳＰＥＣＴ用血流製剤は親油性の薬剤であり、従って正常な脳内に拡散する。レセプター結合性の重要なＳＰＥＣＴ用放射性医薬品としては、［１２３Ｉ］ＱＮＥ、［１２３Ｉ］ＩＢＺＭ、および［１２３Ｉ］イオマゼニルが挙げられる。これらのトレーサーは特異的レセプターに結合するものであり、そしてレセプター関連疾患の評価に重要なものである。
【００５７】
Ｅ．  光学的画像化
光学的画像化は別の画像モダリティであり、特定の医療分野において広範囲に受け入れられている。具体例としては、細胞成分の光学的な標識、ならびに蛍光血管造影法およびインドシアニングリーン血管造影法などの血管造影法が挙げられる。光学的造影剤の具体例としては、たとえば、フルオレセイン、フルオレセイン誘導体、インドシアニングリーン、オレゴングリーン、オレゴングリーン誘導体の誘導体、ローダミングリーン、ローダミングリーンの誘導体、エオシン、エリトロシン、テキサスレッド、テキサスレッドの誘導体、マラカイトグリーン、ナノゴールド  スルホスクシンイミジル  エステル、カスケードブルー、クマリン誘導体、ナフタレン、ピリジルオキサゾール誘導体、カスケードイエロー色素、ダポキシル色素が挙げられる。
【００５８】
Ｆ．  超音波診断法
広範囲に受け入れられている生体医学上の別の画像モダリティは、超音波診断法である。超音波診断による画像化は非侵襲的に用いられて、リアルタイムの軟組織構造の横断面やさらには三次元画像、および体内の血流の情報を提供してきた。高周波数の音波およびコンピュータが、血管、組織、および臓器の画像を作成する。
【００５９】
超音波診断による血流の画像化は、血管のサイズおよび深度などの多数の因子によって制限を受ける可能性がある。超音波造影剤は比較的最近に開発されたものであるが、この例としてはペルフルオリンおよびペルフルオリンアナログが挙げられ、これらのものは、グレイスケール画像とドップラーシグナルの強調を促すことによってこれらの制限を克服するように設計されている。
【００６０】
Ｇ．  二重画像化
たとえば、上記のように、画像モダリティとしてはこれらに限定されるわけではないが、ＣＴ、ＭＲＩ、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、超音波診断法、または光学的画像化が挙げられる。当業者にとって公知の画像モダリティのその他の例が本発明によって検討される。
【００６１】
二つの画像化部分を有する診断上有効量の化合物を含む組成物を投与中または投与後の任意の時点で画像モダリティが実施される。たとえば、本発明の二重画像化用化合物の投与中に、またはそれ以降の任意の時点で画像化の研究を行ってもよい。いくつかの実施形態においては、二重造影剤の投与と同時に、もしくはその二重造影剤の投与から約１秒後、１時間後、１日後、もしくはより長い任意の期間後、またはこれらの規定された任意の時間間の任意の時点から、第一の画像モダリティの実施を開始する。本発明のいくつかの実施形態においては、第二の画像モダリティを第一の画像モダリティと同時に実施してもよく、または第一の画像モダリティの後の任意の時点で実施してもよい。たとえば、第一の画像モダリティの終了から約１秒後、約１時間後、約１日後、もしくはより長い任意の期間後、またはこれらの規定された任意の時間間の任意の時点から、第二の画像モダリティを実施してもよい。当業者であれば、本発明によって検討される種々の画像モダリティの能力に精通しているだろう。
【００６２】
ＩＩ．  レポーター配列
基礎科学と患者の看護の両方が、次のインビボでの遺伝子発現のための非侵襲的方法から恩恵を受けるだろう。このような道具は、目的の遺伝子を評価するための、および治療法を計画しモニターするためのベクターの開発および標的化に必要である。たとえば、ソマトスタチンレセプター  タイプ２をレポーターとして用いるインビボでの画像化では、野生型ウイルスと比較してＨＩループが変化したアデノウイルスを用いて、卵巣細胞の伝染性が高まったことを実証している。ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーターと、レポーターとしての単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を用いて、腫瘍特異的な標的化も可視化されている。別の応用は、テトラサイクリンプロモーター系を用いて、二つの別個の遺伝子の誘導をインビボで可視化することである。従って、レポーター遺伝子を単独で用いるかまたは目的の遺伝子と同時に用いるかのいずれかによって、遺伝子の導入をインビボでモニターすることに接近することができる。後者に関して、治療用遺伝子はレポーターに融合していてもよく、または別個のタンパク質として生産されてもよい。たとえば、同時形質移入（重感染）による別個の送達ビヒクル内の別個のプロモーターによって、または同一の送達ビヒクル内の別個のプロモーターによって、目的の遺伝子およびレポーターを誘導してもよい。加えて、たとえば内部リボソーム侵入部位によって、または二方向性のプロモーターによって、二つの遺伝子が同一のプロモーターと連結していてもよい。このような技術を用いて、目的の遺伝子の発現とレポーターの発現との間に相互関係をもたせる。従って、発現の位置、量、および継続時間を測定することができる。
【００６３】
レポーター遺伝子を細胞に形質移入することが可能なため、レポーターを用いて細胞輸送を追跡してもよい。たとえば、レポーターを特定の細胞にインビトロで形質移入してもよく、次いで動物に戻してホーミングを評価する。多発性硬化症についての自己免疫性脳脊髄炎の実験モデルにおいて、Ｃｏｓｔａら（２００１）は、ＩＬ−１２  ｐ４０およびルシフェラーゼを発現するように形質導入されたミエリン塩基性タンパク質特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を導入した。インビボにおいて、ルシフェラーゼを用いて中枢神経系への輸送を実証した。加えて、ＩＬ−１２  ｐ４０は炎症を抑制した。別の系では、ポジトロン放出断層撮影（ＰＥＴ）を用いて、Ｋｏｅｈｎｅら（２００３）は、単純ヘルペスウイルス−１チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）を発現するエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）特異的Ｔ細胞が、選択的にＴ細胞の制限性ＨＬＡのアレルを発現するＥＢＶ＋腫瘍に輸送されることをインビボで実証した。さらに、これらのＴ細胞は、標的とされた腫瘍を消去するそれらの能力を保持したままである。連続的な画像化を十分に利用することによって、Ｄｕｂｅｙら（２００３）は、マウス肉腫ウイルス／モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭＳＶ／Ｍ−ＭｕＬＶ）によって誘導された腫瘍に対してＨＳＶ−ＴＫを発現するＴ細胞が、抗原特異的に局在化していることを実証した。組織特異的プロモーターを用いて、分化、たとえば幹細胞の分化または肝細胞との融合およびＩＩ型肺細胞におけるサーファクタント  プロモーターの活性化などの分化した細胞の特性の獲得を評価してもよい。
【００６４】
これらの例示で説明したように、レポーターに基づく画像化の応用は刺激的であり、ヒトにおける実用性を見つけることができる。診療所に向けて迅速に転換するためには、ＦＤＡが認可した薬剤を用いて画像化することができるヒトＳＳＴＲ２などのレポーターは都合が良い。このようなリガンドは、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）またはドーパミン−２レセプター（Ｄ２Ｒ）については現在は利用できないが、これらは期待できるレポーターである。ＨＳＶ−ＴＫの別のあり得る制限は、このウイルスタンパク質に対する免疫反応があり得ることであり、このことは画像化に用いる予定の場合、望ましくない。ＨＳＶ−ＴＫおよびＤ２Ｒの画像化のための放射性医薬品は、ほとんどすべてがＰＥＴ用薬剤である。ＰＥＴに基づくシステムのためには、経済的な生産および流通システムを開発しなければならないだろうし、またはそれぞれの設備がサイクロトロンを確保して屋内で試薬を作製する際の専門技術を開発しなければならないだろう。ＳＳＴＲ２を画像化するための薬剤は、既に入手可能である。これらには、ガンマ線カメラおよびＰＥＴ用薬剤が含まれる。臨床上、ＰＥＴはガンマ線カメラに基づく画像化よりも明らかに費用がかかり、ガンマ線カメラは、より最近になって生産されたＰＥＴカメラよりも世界中で利用することができる。
【００６５】
画像化用レポーターも、目的の遺伝子を保持するかまたは保持しないベクター内に組み込まれる必要がある。たとえば、アデノ関連ウイルス送達システムでは、約３ｋｂの挿入物を担持する。１１１０塩基対であるところの小サイズのＳＳＴＲ２Ａ遺伝子を、制限された挿入スペースを有するベクター内に組み込むことができる。ＳＳＴＲ２に基づくレポーターの別の優位性は、細胞膜を横断するというそれらの位置である。細胞膜を横断するための放射性医薬品を必要とする細胞内のレポーターとは異なり、ＳＳＴＲ２用の試薬は、細胞内に浸透する必要がない。このことは、ＳＳＴＲ２を標的とする画像化用薬剤の将来の開発にとって有利である。細胞膜を貫通する位置にあることのさらなる優位性は、生きている細胞を選別するための抗体などの試薬を入手しやすいことである。このことは、レポーターを細胞輸送の研究に用いる予定の場合、形質移入／感染された細胞を素早く選別するために重要である。その他の膜貫通レポーターは、本明細書に記載のナトリウム／ヨウ素シンポーターなどのポンプに基づく。将来性はあるが、これらの作用は細胞のホメオスタシスを変化させ得るのでこれらは理想的なものではないかもしれない。
【００６６】
ＳＳＴＲ２は、ガンの遺伝子治療にとって都合の良いシグナル伝達プロファイルを有する。というのは、これは成長抑制剤だからである。そのリガンドであるソマトスタチンは、脳、下垂体、膵臓、消化管、副腎、甲状腺、腎臓および免疫系において種々の生理的機能を制御する役割を演じる。これは、内分泌腺および外分泌腺の分泌および腸の運動を阻害し、ならびに、神経伝達、栄養分およびイオンの吸収、および血管の収縮性を調節する。重要なことは、これは最初に作用して正常な細胞および腫瘍細胞の増殖を阻害する。ソマトスタチンの作用は、原形質膜のレセプターによって制御される。レセプターのタイプおよび細胞の環境によって、ソマトスタチンの生物学的作用が決定される。ソマトスタチンレセプターの過剰発現をインビボで画像化することができ、外因的に導入された遺伝子発現を画像化するために、ソマトスタチンレセプターに基づくレポーターが提案されてきた。ガンの状態において、ソマトスタチンレセプターをレポーターとして用いることは、これが弱い成長抑制剤であって、分泌を阻害するので都合が良い。後者は、カルチノイドなどの神経内分泌腫瘍を有する患者の症状の軽減にとって重要である。しかしながら、外因性のソマトスタチンレセプターの発現の非標的化発現は、上記のその他の生理的システムに影響を与えるかもしれない。さらに、結合した目的の遺伝子のシグナル伝達経路にも影響を与えるかもしれない。加えて、細胞成長の阻害は、細胞の移植と成長が望ましいという細胞に基づく治療には望ましくないだろう。さらに、細胞成長および分泌の阻害は、インスリンを分泌する細胞が目標となり得る糖尿病などのいくつかの遺伝子治療の状態には望ましくないだろう。その代わり、シグナル伝達を欠くがインビボでの画像化がなお可能なデルタ３１４などのソマトスタチンレセプターに基づくレポーターが必要である。
【００６７】
本明細書で用いられるような「レポーター」、「レポーター遺伝子」または「レポーター配列」という用語は、検出可能であって、細胞内に存在するその他の遺伝子配列またはコードされたポリペプチドと区別することができる任意の遺伝子配列またはコードされたポリペプチド配列を意味する。好ましくは、レポーター配列は、その存在、検出可能部位との会合、または検出可能なシグナルを結果的に生じさせるその活性のいずれかによって容易に検出可能なタンパク質をコードする。特定の態様においては、検出可能部位は、放射性核種、フルオロフォア、発光団、微粒子、ミクロスフィア、酵素、酵素の基質、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ナノ粒子、および／またはナノスフィアを含んでもよく、これらのすべてはレポーターを認識するおよび／または相互作用する抗体またはリガンドと結合してもよい。種々の実施形態においては、本発明の核酸配列は、レポーター核酸配列を含むか、または検出可能なポリペプチドを生じさせる産物をコードする。レポーターは、直接的にまたは間接的に検出可能なシグナルを生じさせる能力を有するレポーター分子であるかまたはそれをコードするものである。一般的に、必ずではないが、レポーター遺伝子は、核酸配列を含むおよび／または、細胞によって別の方法で生産されることはない検出可能なポリペプチドをコードする。多数のレポーター遺伝子が記載されており、いくつかは遺伝子調節の研究のために市販されている（たとえばＡｌａｍおよびＣｏｏｋ、１９９０、引用されることによってこの開示が本明細書に組み込まれる）。検出され得るシグナルとしては、これらに限定されるわけではないが、色彩、蛍光、ルミネセンス、同位体によるもしくは放射性同位体によるシグナル、細胞表面のタグ、細胞生存性、細胞の栄養必要量の軽減、細胞の成長および薬剤抵抗性が挙げられる。レポーター配列としては、これらに限定されるわけではないが、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、Ｇ−タンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）などの膜結合タンパク質、ソマトスタチンレセプター、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質、シンポーター（ＮＩＳなど）および本技術分野において周知のその他のものであって、それに向けられた高い親和性の抗体またはリガンドが存在するか従来の手段によって作製できるもの、ならびにたとえばヘマグルチニンまたはＭｙｃ由来の抗原タグドメインに適切に融合した膜結合タンパク質を含む融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列が挙げられる。
【００６８】
本発明の態様は、レセプターの突然変異体を作製し比較することによって、シグナル伝達を欠くレポーターを作製することを含む。しかしながら、レセプターの突然変異体のみを発現することは、それらの中で比較することにとっては理想的ではない。というのは、それぞれがオクトレオチドなどのリガンドについて異なる親和性を持つため、結果的に、発現レベルと親和性との間に混乱を生じさせるかもしれないからである。従って、最初の第一の要求は、レポーターの結合性または免疫原性から独立して発現を正規化することである。インビボで画像化遺伝子を導入するための、放射性医薬品に基づく少数のシステムは作られているが、これらのシステムのほとんどは、可視化された発現産物から独立して、発現を直接比較するようには設計されていなかった。
【００６９】
リガンドの結合性から独立した方法が、タンパク質発現と細胞内の局在化を比較するために必要である。突然変異体のすべてに共通したアミノ末端タグによって、レセプター間のこのような比較が可能となる。見込みのある修飾が一旦特定されれば、必要に応じてエピトープタグを除去してもよい。本発明者らは、アミノ末端にタグを付けたヒトＳＳＴＲ２Ａを発現させた。ヘマグルチニンＡ（ＨＡ）アミノ末端タグに対する抗体を用いてインビトロで検出される融合タンパク質は、レセプター結合の研究や１１１Ｉｎで標識したオクトレオチドを用いる生体内分布と関連性を有する。すなわち、融合タンパク質のインビトロでの発現レベルは、放射性医薬品の取り込みと関連性を有する。タグのさらなる優位性は、細胞を発現させるかまたは選別するための複数のクローンを迅速にスクリーニングするためのＥＬＩＳＡフォーマットに活用できるということである。さらに、タグによって、抗体を用いた発現のインビトロ分析およびエクスビボ分析が可能となり、これは画像化用放射性医薬品を用いるよりも約１００倍以上安い。実験的腫瘍または生検材料の免疫組織化学的方法などのエクスビボ研究にこれを用いることができ、内因性対外因性のヒトＳＳＴＲ２を分離することが可能となる。共通のエピトープタグによって、レセプターの突然変異体において掻き乱れてもよいリガンドまたは抗体であってレセプタードメインに結合するリガンドまたは抗体に単純に依存することなく、突然変異体間の発現レベルの比較が可能となるため、突然変異体を作製し比較して、レポーターを最適化することができる。インビトロ、インビボおよびエクスビボでの知見を分析し関連付けるというこの能力も、ｈＴＥＲＴプロモーター構築物および増幅されたｈＴＥＲＴプロモーター構築物の評価に役立つだろう。本発明者らは、インビボでの画像化を利用して、ＨＡ−ＳＳＴＲ２の遺伝子キメラの発現を定量できること、およびこれはエクスビボ発現に一致することを実証した。機能上の技術および解剖学的技術では、定量化の方法論を患者に容易に転換するために、臨床用の装置の小型動物版を採用した。
【００７０】
特定の実施形態においては、レポーターのアミノ酸配列はＧＰＣＲである。ＧＰＣＲは、本明細書の他の箇所で詳細に検討されている。さらなる実施形態においては、レポーター核酸の発現またはポリペプチドは、成長上の利点を与え、成長上の利点の程度は、宿主細胞の成長条件を変化させることによって制御される。
【００７１】
その他の実施形態においては、レポーター配列は蛍光タンパク質をコードする。本発明に基づいて用いてもよい蛍光タンパク質の具体例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓの緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰｍｕｔ２、ＧＦＰｕｖ４、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、高感度青緑色蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、ｄｉｓｃｏｓｏｍａ由来の淡黄色および赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）が挙げられる。
【００７２】
さらなる実施形態においては、レポーターの核酸は、タグを有するポリペプチドをコードしていてもよい。この実施形態に関連して、この方法は、宿主細胞をタグに特異的な蛍光標識された抗体と接触させる工程をさらに含んでもよく、それによって宿主細胞を標識する。この細胞は、ＦＡＣＳもしくはその他の検出方法、選別方法または単離方法によって検出および／または単離してもよい。
【００７３】
種々の実施形態においては、少なくとも一つのレポーター配列の所望の発現レベルは、レポーター配列の基礎的な転写レベルと比較した時のレポーター配列の発現レベルよりも向上するか、低下するかまたは変化しない。具体的な実施形態においては、レポーター配列のうちの一つの所望の発現レベルは、レポーター配列の基礎的な転写レベルと比較した時のレポーター配列の発現レベルよりも向上する。
【００７４】
種々の実施形態においては、レポーター配列は、独立して、同時に、または独立的かつ同時に分析することができる、検出可能な唯一のタンパク質をコードする。特定の実施形態においては、少なくとも一つのレポーター配列は、蛍光タンパク質をコードする。
【００７５】
その他の実施形態においては、宿主細胞は真核細胞または原核細胞であってよい。真核細胞の典型例としては、酵母および哺乳動物の細胞が挙げられる。哺乳動物の細胞としては、ヒトの細胞およびガン細胞などの病気の表現型を示す種々の細胞が挙げられる。
【００７６】
Ａ．  組み換えＧ−タンパク質が結合したレセプター（ＧＰＣＲ）
レポーターのうちの一つのクラスは、七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプター（ＧＰＣＲ）の膜タンパク質スーパーファミリーおよびそのサブファミリーを含む。ＧＰＣＲは、シグナル伝達に関与するタンパク質の一つのクラスであり、公知の最も大きなレセプタースーパーファミリーの一つである。これらのレセプターは生物学的に重要であり、これらのレセプターの機能不全は結果的に、アルツハイマー病、パーキンソン病、糖尿病、小人症、色盲、網膜色素変性症および喘息などの疾患に至ることが示されている。ＧＰＣＲはさらに、うつ病、統合失調症、不眠症、高血圧、不安症、ストレス、腎不全およびその他のいくつかの心臓血管、代謝、神経系、腫瘍的および免疫障害にも関与する。（ＨｏｒｎおよびＶｒｉｅｎｄ、１９９８）。これらもＨＩＶ感染において役割を演じることが示されている（Ｆｅｎｇら、１９９６）。
【００７７】
ＧＰＣＲは、ループによって接続された七つの推定される膜貫通ドメインを有するものとしてキャラクタライズされた。Ｎ末端はいつも細胞外にあり、Ｃ末端は細胞内にある。内因性リガンドまたは化学的部分などのシグナルは、細胞外のＮ末端側で受け取られる。次いで、このシグナルが膜を介して細胞質側に伝達される。そこでは、ヘテロ三量体タンパク質のＧ−タンパク質が活性化され、次々に応答を惹起する（ＨｏｒｎおよびＶｒｉｅｎｄ、１９９８を参照すること）。ＧＰＣＲとしては、広範囲の生物学的に活性なレセプターが挙げられ、たとえばホルモンレセプターおよびニューロンレセプターがある。具体例としては、ソマトスタチンレセプター、アドレナリン作用薬およびドーパミンについてのレセプターが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【００７８】
結合したレセプターのＧ−タンパク質ファミリーにはドーパミンレセプターが含まれ、これは、精神障害および神経障害の治療に用いられる神経弛緩薬に結合する。レセプターの本ファミリーのメンバーのその他の具体例としては、カルシトニン、エンドセリン、ｃＡＭＰ、アデノシン、アセチルコリン、セロトニン、ヒスタミン、トロンビン、キニン、卵胞刺激ホルモン、オプシン、内皮分化遺伝子−１のレセプター、ロドプシン、臭気物質についてのレセプターおよびサイトメガロウイルスレセプターが挙げられる。
【００７９】
本発明の態様には、組み換えＧＰＣＲを目的の細胞内に導入することに付随する非侵襲的な画像化および／または治療が含まれる。本発明の特定の実施形態は、一般的に、組織選択的プロモーターの配列に作動するように結合している組み換えＧＰＣＲアミノ酸配列をコードする核酸に関する。ＧＰＣＲの典型例としては、アセチルコリンレセプター：Ｍ１、Ｍ２、Ｍ３、Ｍ４、もしくはＭ５；アデノシンレセプター：Ａ１；Ａ２Ａ；Ａ２Ｂ；もしくはＡ３；アドレナリン作用性レセプター：アルファ１Ａ、アルファ１Ｂ、アルファ１Ｄ、アルファ２Ａ、アルファ２Ｂ、アルファ２Ｃ  ベータ１、ベータ２、もしくはベータ３；アンギオテンシンレセプター：ＡＴ１、もしくはＡＴ２；ボンベシンレセプター：ＢＢ１、ＢＢ２、もしくはＢＢ３；ブラジキニンレセプター：Ｂ１、Ｂ２、カルシトニン、アイニリン、ＣＧＲＰ、もしくはアドレノメデュリンレセプター；カンナビノイドレセプター：ＣＢ１、もしくはＣＢ２；ケモカインレセプター：ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ３、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＣＲ９、ＣＣＲ１０、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５、ＣＸ３ＣＲ１、もしくはＸＣＲ１；走化性レセプター：Ｃ３ａ、Ｃ５ａ、もしくはｆＭＬＰ；コレシストキニンおよびガストリンのレセプター：ＣＣＫ１、もしくはＣＣＫ２；副腎皮質刺激ホルモン放出因子レセプター：ＣＲＦ１、もしくはＣＲＦ２；ドーパミンレセプター：Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４、もしくはＤ５；エンドセリンレセプター：ＥＴ（Ａ）もしくはＥＴ（Ｂ）；ガラニンレセプター：ＧＡＬ１、ＧＡＬ２、もしくはＧＡＬ３；グルタミン酸レセプター：ｍｇｌ１、ｍｇｌ２、ｍｇｌ３、ｍｇｌ４、ｍｇｌ５、ｍｇｌ６、ｍｇｌ７、もしくはｍｇｌ８；糖タンパク質ホルモンレセプター：ＦＳＨ、ＬＳＨ、もしくはＴＳＨ；ヒスタミンレセプター：Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、もしくはＨ４；５−ＨＴレセプター：５−ＨＴ１Ａ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｄ、５−ＨＴ１Ｂ、５−ＨＴ１Ｆ、５ＨＴ２Ａ、５−ＨＴ２Ｆ、５−ＨＴ２Ｃ、５−ＨＴ３、５−ＨＴ４、５−ＨＴ５Ａ、５−ＨＴ５Ｂ、５−ＨＴ６、もしくは５−ＨＴ７；ロイコトリエンレセプター：ＢＬＴ、ＣｙｓＬＴ１、もしくはＣｙｓＬＴ２；リゾリン脂質レセプター：ｅｄｇ１、ｅｄｇ２、ｅｄｇ３、もしくはｅｄｇ４；メラノコリンレセプター：ＭＣ１；ＭＣ２；ＭＣ３；ＭＣ４、もしくはＭＣ５；メラトニンレセプター：ＭＴ１、ＭＴ２、もしくはＭＴ３；ニューロペプチドＹレセプター：Ｙ１、Ｙ２、Ｙ４、Ｙ５、もしくはＹ６；ニューロテンションレセプター：ＮＴＳ１、もしくはＮＴＳ２；オピオイド：ＤＯＰ、ＫＯＰ、ＭＯＰ、もしくはＮＯＰ；Ｐ２Ｙレセプター：Ｐ２Ｙ１、Ｐ２Ｙ２、Ｐ２Ｙ４、Ｐ２Ｙ６、Ｐ２Ｙ１１、もしくはＰ２Ｙ１２）；ペルオキシソーム増殖剤：ＰＰＡＲ−アルファ、ＰＰＡＲ−ベータ、もしくはＰＰＡＲ−ガンマ；プロスタノイドレセプター：ＤＰ、ＦＰ、ＩＰ、ＴＰ、ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３、もしくはＥＰ４；プロテアーゼ活性化レセプター：ＰＡＲ１、ＰＡＲ２、ＰＡＲ３、もしくはＰＡＲ４；ソマトスタチンレセプター：ＳＳＴＲ１、ＳＳＴＲ２、ＳＳＴＲ２Ａ、ＳＳＴＲ３、ＳＳ���Ｒ４、もしくはＳＳＴＲ５；タキキニンレセプター：ＮＫ１、ＮＫ２、もしくはＮＫ３；チロトロピン放出ホルモンレセプター：ＴＲＨ１、もしくはＴＲＨ２；ウロテンシン−ＩＩレセプター；血管作動性腸管ペプチドもしくは下垂体アデニル酸シクラーゼ活性化ペプチドのレセプター：ＶＰＡＣ１、ＶＰＡＣ２、もしくはＰＡＣ１；またはバソプレシンもしくはオキシトシンのレセプター：Ｖ１ａ、Ｖ１ｂ、Ｖ２、もしくはＯＴが挙げられる。
【００８０】
特定の実施形態においては、ＧＰＣＲはソマトスタチンレセプターであり、たとえばソマトスタチン  タイプ２レセプターである。ソマトスタチンレセプターに関する情報は、米国特許出願第２００２／０１７３６２６−Ａ１号に見出すことができ、これは引用されることによってその全体が本明細書に具体的に組み込まれる。
【００８１】
ＧＰＣＲのアミノ酸配列をコードする核酸は、ＧＰＣＲ配列の全体、ＧＰＣＲタンパク質の機能的ドメイン機能的ドメイン、安定的に発現する非機能的ＧＰＣＲ、ＧＰＣＲポリペプチド、またはＧＰＣＲポリペプチドの均等物をコードしていてもよく、そのそれぞれが一以上の膜貫通、細胞外、細胞内、単数（または複数）の細胞外ループおよび／または単数（または複数）の細胞内ループを含んでもよい。核酸はゲノムＤＮＡに由来するもの、すなわち、特定の生命体のゲノムから直接クローニングされたもの、特定の生命体に由来するｍＲＮＡ、および／またはこれに限定されるわけではないが、ＰＣＲＴＭを含む種々の方法を利用して合成されたものでもよい。
【００８２】
いくつかの実施形態においては、核酸は相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）であってよい。ｃＤＮＡは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を鋳型として用いて調製されるＤＮＡである。従って、ｃＤＮＡは、断続したあらゆるコード配列を含まなく、通常は、対応するタンパク質についての単数（または複数）のコーディング領域のほとんどそれのみを含む。その他の実施形態においては、核酸は合成的に生産されてもよい。
【００８３】
ゲノムＤＮＡの一部とｃＤＮＡまたは合成配列とを結合して、特定の構築物を形成させることは好都合かもしれない。たとえば、最終的な構築物にイントロンが望まれる場合、ゲノムのクローンを用いる必要があるかもしれない。イントロンは、ＧＰＣＲ以外のその他の遺伝子に由来するものでもよい。ｃＤＮＡまたは合成されたポリヌクレオチドが、構築物の残りの部分により便利な制限酵素認識部位を提供してもよく、従って、配列のその他の点について用いられ得る。
【００８４】
本発明は、あらゆるレポーターまたはＧＰＣＲのポリペプチド均等物をコードする核酸を含む。レポーターまたはＧＰＣＲのポリペプチド均等物をコードするこれらの核酸は、その他の生命体からの天然由来の同種核酸配列であってもよい。当業者であれば、広く利用されている実験技術を用いてレポーターまたはＧＰＣＲのポリペプチド均等物をコードする核酸を特定または合成できることを理解するだろう。本発明は、化学合成されたこれらの配列の突然変異体をも包含する。
【００８５】
別の種類の配列の変異体は、コドンの変動に起因する。２０の正常なアミノ酸のほとんどについて、いくらかのコドンが存在するため、多数の異なるＤＮＡがＧＰＣＲをコードすることができる。コドンとしては次のものが挙げられる：アラニン（Ａｌａ）：ＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、およびＧＣＵ；システイン（Ｃｙｓ）：ＵＧＣおよびＵＧＵ；アスパラギン酸（Ａｓｐ）：ＧＡＣおよびＧＡＵ；グルタミン酸（Ｇｌｕ）：ＧＡＡおよびＧＡＧ；フェニルアラニン（Ｐｈｅ）：ＵＵＣおよびＵＵＵ；グリシン（Ｇｌｙ）：ＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧおよびＧＧＵ；ヒスチジン（Ｈｉｓ）：ＣＡＣおよびＣＡＵ；イソロイシン（Ｉｌｅ）：ＡＵＡ、ＡＵＣおよびＡＵＵ；リジン（Ｌｙｓ）：ＡＡＡおよびＡＡＧ；ロイシン（Ｌｅｕ）：ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧおよびＣＵＵ；メチオニン（Ｍｅｔ）：ＡＵＧ；アスパラギン（Ａｓｎ）：ＡＡＣおよびＡＡＵ；プロリン（Ｐｒｏ）：ＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧおよびＣＣＵ；グルタミン（Ｇｌｎ）：ＣＡＡおよびＣＡＧ；アルギニン（Ａｒｇ）：ＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧおよびＣＧＵ；セリン（Ｓｅｒ）：ＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧおよびＵＣＵ；トレオニン（Ｔｈｒ）：ＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧおよびＡＣＵ；バリン（Ｖａｌ）：ＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧおよびＧＵＵ；トリプトファン（Ｔｒｐ）ＵＧＧ；チロシン（Ｔｙｒ）：ＵＡＣおよびＵＡＵ。
【００８６】
遺伝コードの縮重を考慮すれば、本明細書に開示された核酸と、約５０％〜約７５％の間、または約７６％〜約９９％の間のヌクレオチドが同一である配列が好ましい。「レポーターまたはＧＰＣＲのアミノ酸配列をコードする核酸」の範囲内にある配列は、細胞内の条件下において、上記のポリヌクレオチドセグメントと塩基対形成する能力があるものである。
【００８７】
上記のように、レポーターまたはＧＰＣＲをコードする配列は、全長ゲノムもしくはｃＤＮＡの複製、またはその断片であってよい。本発明はさらに、より短いレポーターまたはＧＰＣＲのオリゴヌクレオチドを採用してもよい。わずかに一つのヒトのゲノムにおいて、１２塩基長の配列が生じるべきであり、それゆえに、唯一の標的配列またはＰＣＲオリゴの指定を満足させる。その相補的な標的に対するオリゴヌクレオチドの結合親和性と配列特異性の両者は、長さの増加に伴って向上する。たとえばＧＰＣＲの突然変異体の調製やＰＣＲ反応においては、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９もしくは２０またはより長い塩基対のオリゴヌクレオチドを用いることが検討される。
【００８８】
１  ソマトスタチンレセプター
六種類のソマトスタチンレセプター（ＳＳＴＲ）、タイプ１、２Ａおよび２Ｂ、３、４、および５が存在する。タイプ２Ａの細胞質内のＣ末端がより長いこと以外、タイプ２Ａおよび２Ｂは互いに交換可能な同一のスプライスバリアントである。ＦＤＡが認可したソマトスタチンアナログの１１１Ｉｎ標識化オクトレオチドに対する親和性は、ヒトのタイプ２が最も高い。全身の画像化用に認可されたこの放射性医薬品、および肺の画像化用に認可された９９ｍＴｃ標識化アナログは、神経内分泌腫瘍などのソマトスタチンレセプターを過剰発現する腫瘍を検出するために実際の臨床で用いられる。臨床的に画像化するために用いられる放射標識されたソマトスタチンアナログの正常な生体内分布および線量測定は、十分に研究されている。静脈注射後の放射性医薬品は通常、腎臓、膀胱、肝臓、脾臓および腸管で見出される。画像化に用いられる投与量のトレーサーでは、プラシーボよりも強い副作用は見られず、患者は規定どおり連続的に撮影される。臨床上、ＳＳＴＲ２の発現が増加すると、小さな腫瘍でさえ検出可能となる。ＰＥＴに基づく薬剤も開発されている。
【００８９】
このレセプターについてのインビトロの研究から、第六および第七の膜貫通ドメインがオクトレオチドとの結合に必須であることが示される。第三〜第五の膜貫通ドメインも重要かもしれない。というのは、システイン−システインのジスルフィド結合が、第三の膜貫通ドメインと第二の細胞外ドメインとの間で予測されているからである。第三〜第七の膜貫通ドメインは、オクトレオチドと結合するためのポケットを共同して形成することが予測されている。
【００９０】
ＳＳＴＲ２は、ｃＡＭＰの生産を制御する。Ｇａｍｂｈｉｒら（１９９９）は、ｃＡＭＰを制御できないＤ２レセプターの突然変異体でさえ画像化できることを見出した。ＣＯＳ−７細胞において、ヒトＳＳＴＲ２の活性化は、結果的にｃＡＭＰの生産およびホスホリパーゼＣの活性化を低下させ、そして百日咳毒素に鋭敏なＧ−タンパク質を介してカルシウム動員をそれぞれ完全にまたは部分的に抑制する。ｃＡＭＰを経由して、ソマトスタチンは分泌を制御することができる。３２Ｄ造血細胞において、ｃＡＭＰはＳＳＴＲ２が介在する走化性を必要とするようである。ソマトスタチンレセプターの細胞質のＣ末端は、ｃＡＭＰの制御に関与する。ラットのＳＳＴＲ２のアミノ酸３４９以降の欠失により、ヒト胚腎臓（ＨＥＫ２９３）細胞における基礎的なｃＡＭＰの阻害が上昇する。ヒトＳＳＴＲ５のアミノ酸３１８以降の欠失により、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ  Ｋ１）細胞におけるｃＡＭＰの阻害が消失する。
【００９１】
ＳＳＴＲ２による増殖阻害は、ホスファターゼを含む複数の下流のメディエーターを必要とする。チロシンホスファターゼＳＨＰ−１はＳＳＴＲ２によって制御されるが、ＳＨＰ−１は乳ガン系のＭＣＦ−７におけるｃＡＭＰを制御しないようである。ＳＨＰ−１の上流は、抑制性Ｇタンパク質、チロシンホスファターゼＳＨＰ−２およびチロシンキナーゼＳｒｃであることが報告されている。ＳＨＰ−２は、第三の細胞内ドメインにおけるＬＣＹＬＦＩと関連するＳＳＴＲ２のチロシン２２８と相互作用し、ほとんどＣ末端である膜貫通ドメイン７におけるＩＬＹＡＦＬと関連するチロシン３１２と相互作用する。どのようにしてＳｒｃがＳＳＴＲ２と結び付くかについては、現在でも明らかではない。ホスファターゼは、ソマトスタチンレセプターそのもの、促進性成長因子またはその他の下流のエフェクターのリン酸化に直接影響を与えてもよい。ホスファチジルイノシトール、Ｒａｓ、Ｒａｐ１、Ｂ−ｒａｆ、ＭＥＫ１および２、Ｍａｐキナーゼ／Ｅｒｋ１および２は、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞におけるＳＳＴＲ２介在性のシグナル伝達に関与してきた；しかし神経芽細胞腫の細胞では、Ｒａｓは関与していなかったようであり、ＣＨＯ  ＤＧ４４細胞では上昇していた代わりにＭａｐキナーゼ／Ｅｒｋ１および２の活性は低下していた。従って、ＳＳＴＲ２が介在する増殖阻害におけるＭＡＰキナーゼ経路の役割は、現在でも明らかではない。さらに、ＳＨＰ−１の下流は神経細胞の一酸化窒素シンターゼ（ｎＮＯＳ）とグアニル酸シクラーゼであり、この両者はＣＨＯ細胞およびマウス膵腺房細胞における、ＳＳＴＲ２介在性の増殖阻害に必要なようである。この阻害には、ｒ−ＰＴＰηなどのその他のホスホチロシンホスファターゼ、およびサイクリン依存性キナーゼインヒビターｐ２７Ｋｉｐ１などのさらに下流のエフェクターも必要なのかもしれない。ソマトスタチンはさらに、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｆｏｓおよびＡＰ−１などの転写調節因子も制御する。
【００９２】
シグナル伝達について、ＳＳＴＲ２のＣ末端および細胞質内のドメインは関与しているようである。上記のような、ラットのＳＳＴＲ２とヒトのＳＳＴＲ５の両者についての欠失分析から、細胞質のＣ末端がｃＡＭＰ生産の阻害を制御することが実証された。とりわけ、アミノ酸３１４以降のＳＳＴＲ２の欠失はシグナル伝達を欠き、インビボで画像化することができる。
【００９３】
Ｂ．  本発明の検出レポーター
本発明の特定の実施形態においては、そのリガンドとの会合を検出することによって、レポーターを画像化してもよい。本明細書において、リガンドとは、別の化学物質またはポリペプチドと結合し、より大きな複合体を形成するイオン、ペプチド、オリゴヌクレオチド、アプタマー、分子、または分子群であると定義される。本発明の文脈において、リガンドは、レポーターに、またはレポーター配列（たとえば、レポーターアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端と融合するタンパク質タグ）に結合したアミノ酸配列に結合して、より大きな複合体を形成するものでよい。本発明の文脈におけるリガンドとして用いるための、当業者にとって公知のあらゆるリガンドが検討される。本発明のいくつかの実施形態においては、リガンドは画像化するための細胞と接触していてもよい。リガンドは細胞によって吸収されてもよく、またはされなくてもよい。レポーターが細胞表面に局在した場合、これらの実施形態におけるリガンドはレポーターと結合または接触しているのかもしれない。リガンドをレポーターに接触させるあらゆる方法が本発明によって検討される。その他の特定の実施形態においては、リガンドが細胞に吸収されてもよい。リガンドが一旦吸収されると、その細胞内のレポーターまたは第二のレポーターと結合するかまたは接触してもよいが、その必要はない。
【００９４】
リガンドは、検出可能なシグナルを生じさせる能力を持つ特徴を持つか、またはそのような部分と結合している分子または分子の一部であってよい。当業者にとって公知のあらゆる画像モダリティを適用して、リガンドを画像化することができる。いくつかの実施形態においては、リガンドは、画像化できる分子または分子の一部と結合することができるか、または連結することができる。たとえば、リガンドは放射性核種と結合または連結することができてもよく、当業者にとって公知の核医学技術を用いてその放射性核種を画像化することができる。たとえば、リガンドは１１１Ｉｎ−オクトレオチドであってよい。その他の実施形態においては、たとえば、リガンドは当業者にとって周知の画像化技術を用いて検出することができる造影剤と結合または連結することができる。たとえば、リガンドはＣＴ造影剤またはＭＲＩ造影剤と結合または連結することができてもよい。
【００９５】
本発明の特定の実施形態においては、リガンドはレポーターと結合することができ、そのリガンドが次々に、当業者にとって公知の画像モダリティを用いて測定することができるシグナルを発生させる。その他の実施形態においては、リガンドは、レポーターに融合したタンパク質タグに結合することができる。従って、たとえば画像化にはリガンドからのシグナルを測定する工程が含まれ、次にはこれによって、細胞内または被験体内のレポーター配列の位置が提供される。
【００９６】
種々の原子価の金属イオン、または放射性核種が放射性画像化に有用であることが知られている。具体例としては、６７Ｇａ、６８Ｇａ、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１６９Ｙｂ、６０Ｃｕ、６１Ｃｕ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ、２０１Ｔｌ、７２Ａ、および１５７Ｇｄが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。画像化の特性をより向上させ、価格をより低下させることに起因して、可能であれば、１２３Ｉ、１３１Ｉ、６７Ｇａおよび１１１Ｉｎで標識された化合物を、対応する９９ｍＴｃで標識された化合物に交換することが試みられてきた。都合の良い物理的特性ならびに価格の低さが原因で、９９ｍＴｃは放射性医薬品を標識することにとって好ましいものであった。
【００９７】
ヒトにおいて放射性画像化を最適化するためには、多数の因子を考慮する必要がある。検出効率を最大化するために、１００〜２００ｋｅＶの範囲のガンマ線エネルギーを放出する一価の金属イオンが好ましい。本明細書において、「ガンマ線放出体」は、あらゆる範囲のガンマ線エネルギーを放出する物質と定義される。当業者であれば、ガンマ線放出体である種々の原子価の金属イオンに精通しているだろう。患者に吸収される放射線量を最小化するために、放射性核種の物理的半減期を画像化手段が許容できるのと同程度の短さまでとすべきである。任意の日におよびその日の任意の時間に試験を実施することが可能となるためには、放射性核種の源が常に医療施設で使用可能であることが好都合である。９９ｍＴｃが好ましい放射性核種である。というのは、１４０ｋｅＶのガンマ線を放出し、物理的半減期が６時間であり、そしてモリブデン−９９／テクネチウム−９９ｍ生成器を用いて現場で容易に利用できるからである。当業者であれば、ヒトにおいて最適な放射性画像化を割り出す方法に精通しているだろう。
【００９８】
本発明の組成物のいくつかの実施形態においては、ベータ線放出体またはガンマ線放出体ではない治療用金属イオンであるところの一価の金属イオンが、リガンドまたはレポーターアミノ酸配列に結合することができる。たとえば、治療用金属イオンはプラチナ、コバルト、銅、ヒ素、セレンおよびタリウムであってよい。これらの治療用金属イオンを含む化合物を、ガンの治療などの過剰増殖疾患の治療に向けられた本発明の方法に適用してもよい。本明細書に記載された造影剤を用いて、放射線治療を本発明の核酸を発現する細胞に限定してもよい。
【００９９】
本発明の特定の実施形態においては、本発明の画像化方法において用いられる核酸は、インビボで放射標識することができるアミノ酸配列をコードする。コードされたレポーター配列の放射標識を直接的に行うことができ、またはたとえばタンパク質タグまたはレポーター配列と結合することができるリガンドを放射標識することによって間接的に行うことができる。本発明によって提供される放射標識された薬剤、化合物、および組成物は、適切な量の放射能を有するように準備される。たとえば９９ｍＴｃ放射性複合体を形成する際には、一般的には、１ｍＬあたり約０．０１ミリキュリー（ｍＣｉ）〜約３００ｍＣｉの濃度の放射能を含む溶液状態の放射性複合体を形成することが好ましい。
【０１００】
コードされた配列が一旦放射標識されれば、哺乳動物の体内の腫瘍などの可視化部位について画像化することができる。本発明に従って、当業者にとって公知のあらゆる方法によって放射標識を投与する。たとえば、放射標識されたリガンドとして投与される投与量であって一単位で注射可能な投与量で、投与してもよい。当業者にとって公知のあらゆる一般的な担体、たとえば滅菌された塩溶液または血漿を利用してもよい。一般的に、投与される最小投薬単位は約０．０１ｍＣｉ〜約３００ｍＣｉの放射能を有し、好ましくは５ｍＣｉ〜約３０ｍＣｉの放射能を有する。最小投薬単位で注射される溶液は通常、約０．０１ｍＬ〜約１０ｍＬの範囲である。
【０１０１】
放射標識された試薬を静脈内投与した後、臓器または腫瘍をインビボで画像化することができ、必要に応じて、放射標識された試薬を患者に導入した後、数分以内、数時間以内またはより長時間の間に画像化することができる。いくつかの例において、約０．１時間以内に画像化される領域に、投与された量のうちの十分な量が蓄積するだろう。
【０１０２】
上記のように、当業者にとって公知のあらゆる方法を用いて画像化を実施してもよい。具体例としては、ＰＥＴ、ＳＰＥＣＴ、およびガンマ線シンチグラフィーが挙げられる。ガンマ線シンチグラフィーにおいては、放射標識はガンマ線を放出する放射性核種であり、ラジオトレーサーはガンマ線検出カメラを用いて設定される（多くの場合、このプロセスはガンマ線シンチグラフィーと称される）。罹患した状態の部位に集中する（陽性造影と呼ばれる）ラジオトレーサーが選択されるか、またはラジオそのような罹患した状態の部位に特異的に集中しない（陰性造影と呼ばれる）トレーサーが選択されるかのいずれかであるため、画像化された部位は検出可能である。
【０１０３】
Ｃ．  治療、診断、病期分類、および標的の画像化
心疾患、遺伝病、糖尿病、神経変性疾患、およびガンなどの種々の疾患を治療するための遺伝子治療および細胞治療にとって、大きな可能性がある。発現した遺伝子および細胞輸送をモニターし特異的に画像化するための方法は、まだ初期の段階にある。新たな遺伝子治療および細胞治療のほとんどは、特定の組織を標的とすることになる。しかしながら、生検を行わずに、体内での遺伝子発現の位置を知ることには、困難さが残っている。細胞または遺伝子に、非侵襲的な画像化が可能なレポーターのタグを付けることは、有効性および毒性をモニターすることにとって明らかに有益である。レポーターの発現を、目的の遺伝子の発現とリンクさせることができる。次いで、標的組織内で発現がなされたかどうかを判断することができ、そして適切なレポーターを用いて、必要な発現レベルまたは機能を有する細胞の移植が、治療効果的に達成されたかどうかを判断することができる。さらに、レポーターを繰り返し可視化できるのであれば、特定の位置における発現の継続期間とレベルを繰り返しモニターすることができ、投与計画を支援することができる。長期間の発現を維持することは、現在のところ遺伝子治療の分野で挑戦されている。毒性に影響を与えるその能力のせいで、非標的化組織における発現の後で、有益かどうかを証明すべきでもある。ガン治療にとっては、成長抑制剤でもあるレポーターは望ましいが、糖尿病などのその他の疾患にとっては、細胞に与える混乱を可能な限り小さくするレポーターがより望ましい。非標的化組織への影響を制限し、そしてリンクされた目的の遺伝子によるクロストークを制限するためには、ガンについてでさえ、シグナル伝達を欠くレポーターの方がより望ましいかもしれない。
【０１０４】
現在のところ、疾患の診断および病期分類を行うためのほとんどの画像化技術は解剖学的な変化を利用する。生物学的なプロセスに左右される機能的画像化法は、解剖学的な変化が生じる前に疾患を発見することができ、またはその方法を用いて、特定の診断をもたらす解剖学的な変化の原因を理解することができる。たとえば、骨のスキャン剤９９ｍ−Ｔｃ−ＭＤＰは、エックス線造影またはコンピュータ断層撮影の前に（Ｒｉｅｄｅｎ、１９９５）、骨への転移を発見することができ、または骨粗鬆症が解剖学的な画像化で見つかった時、９９ｍ−Ｔｃ−ＭＤＰもしくは１８−フルオロデオキシグルコース（１８−ＦＤＧ）  ＰＥＴの取り込みが増加することで、良性病変から悪性腫瘍を分離するのに役立つことができる。１８−ＦＤＧ  ＰＥＴによる画像化は、すべてではないがいくらかの悪性腫瘍の診断および病期分類に有用であることが分かった。たとえば、腎細胞ガン（Ｋａｎｇら、２００４）および前立腺ガン（Ｓａｌｍｉｎｅｎら、２００２；Ｈｏｆｅｒら、１９９９）は、１８−ＦＤＧ−ＰＥＴによって十分に区別されておらず、炎症性の病変がガンに似た症状を呈する可能性もある（Ａｌｂｅｓら、２００２）。１８−ＦＤＧ−ＰＥＴはグルコースを模倣し、代謝を反映する。疾患を発見するための別のアプローチは、疾患特異的または組織特異的プロモーターを用いることである。テロメラーゼ活性は、正常な組織内では見いだされないかまたは低レベルで存在するが、ほとんどすべてのガンにおいて存在し（Ｋｉｍら、１９９４；Ｂｒｏｃｃｏｌｉら、１９９５）、たとえば生殖器（Ｋｙｏら、１９９６）、胸部（Ｈｉｙａｍａら、１９９６）、結腸（Ｃｈａｄｅｎｅａｕら、１９９５）、肝臓（Ｔａｈａｒａら、１９９５）、脳（Ｌａｎｇｆｏｒｄら、１９９５）、前立腺（Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｄら、１９９６）、および肺（Ｈｉｙａｍａら、１９９５）でそれが上昇している。ヒトテロメラーゼ（ｈＴＥＲＴ）プロモーター活性はテロメラーゼ活性とともに局在している（Ｔａｋａｋｕｒａら、１９９９；Ｃｏｎｇら、１９９９）。従って、ｈＴＥＲＴプロモーターを用いて、腫瘍における遺伝子発現の位置を特定してもよい。通常、組織特異的プロモーターは治療用としては非常に弱いため、増幅方法が必要かもしれない。増幅されたｈＴＥＲＴプロモーターを用いて、診断および病期分類のためにガン内でのレポーターの発現を作動させることができ、ならびに治療用の目的の遺伝子にリンクしたレポーターの発現を作動させることができるだろう。
【０１０５】
従って、遺伝子送達システムをさらに発展させるために、疾患を診断するために、ならびに臨床上の有効性および毒性をモニターするためには、遺伝子発現をインビボで検出するように設計された画像化方法が必要かもしれない。さらに、患者において単独の遺伝子治療または複数の遺伝子治療のいずれかをモニターするためには、多数の画像化システムが必要だろう。たとえば、糖尿病およびガンを有する患者は、二つの別個のレポーターによって独立してモニターすることができる二つの異なる遺伝子治療から恩恵を受けるかもしれない。誘導可能なプロモーターをレポーターと共に用いる場合、活性な構成的プロモーターが作動させる異なるレポーターであって、誘導が失敗した場合に生じる遺伝子の導入を評価するための異なるレポーターを導入することも好都合かもしれない。少数の遺伝子発現を画像化するシステムは設計されているが、（ＧＦＰまたはルシフェラーゼなどの光に基づく）多くのものは、皮膚を通して画像化するには十分にヒトの組織を貫通することができず、そしてほとんどは、ヒトにおいて安全であることが証明されＦＤＡが認可している放射性医薬品を利用していない。
【０１０６】
本発明では、組織選択的プロモーターに作動するように結合している核酸であって、インビボで非侵襲的方法を用いて検出可能なレポーターをコードする核酸を投与する工程、およびその被験体に、そのレポーターと選択的に相互作用する治療剤または造影剤を与える工程によって、被験体のそのような疾患または健康状態を予防し、抑制し、または治療する方法を検討している。本発明の態様はさらに、その他の抗ガン療法と組み合わせた発明の方法および組成物の使用を含む。
【０１０７】
予防され、治療されまたは診断される疾患は、本明細書に記載されたような治療剤の投与を介した治療または予防に従う被験体に影響を与えるあらゆる疾患であり得る。疾患は過剰増殖疾患でもよい。過剰増殖疾患は、異常な成長または細胞の増殖に伴う疾患である。過剰増殖疾患は、被験体における病変として現れる疾患であってもよい。過剰増殖性の病変の典型例としては、前ガン状態の病変、ガン、および腫瘍が挙げられる。ガンとしては、中胚葉、内胚葉、または外胚葉に由来するもの、たとえば血液、心臓、肺、食道、筋肉、腸、胸部、前立腺、胃、膀胱、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、神経細胞、筋細胞、白血球、不死化細胞、新形成性細胞、腫瘍細胞、ガン細胞、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、唾液腺、胆嚢、膀胱、気管、喉頭、咽頭、大動脈、動脈、毛細血管、静脈、胸腺、リンパ節、骨髄、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、脳、大脳、小脳、延髄、橋、脊髄、神経、骨格筋、平滑筋、骨、精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、陰茎、卵巣、子宮、乳腺、膣、皮膚、眼、または視神経を含むあらゆるタイプのガンが可能である。
【０１０８】
治療される疾患のその他の具体例としては、インスリンの生産が不十分である糖尿病、感染症、遺伝病、および自己免疫疾患などの炎症性疾患といった機能の喪失または不足からの回復が挙げられる。本発明の方法および組成物を適用して、疾患の免疫療法または免疫予防に適用できる抗原を送達することができる。当業者であれば、本明細書に記載された医薬組成物および方法を用いる予防または治療の影響を受けるであろう多数の疾患単位に精通しているだろう。
【０１０９】
被験体内で細胞を治療することには、被験体内でガンなどの過剰増殖性の病変の「成長を抑制すること」が含まれてもよい。「成長を抑制すること」は広義に定義され、たとえば病変の成長の鈍化または停止を含む。病変の成長を抑制することは、病変のサイズの縮小または細胞の病変のアポトーシスの誘導を含むこともできる。アポトーシスの誘導とは、薬物、毒素、化合物、組成物または生物学的存在が細胞上でのアポトーシス、すなわちプログラムされた細胞死を利用する状態を意味する。具体的な実施形態においては、細胞は腫瘍細胞である。病変の細胞に対する免疫反応を誘導することによって、病変の成長を抑制することもできる。
【０１１０】
治療剤は、被験体における任意の疾患の予防または治療に適用することができるあらゆる薬剤であり得る。たとえば、治療剤は抗ガン剤であり得る。いくつかの実施形態においては、治療剤は放射性核種である。放射性核種の詳細は以下で検討される。その他の実施形態においては、治療剤は免疫調整物質である。造影剤を用いて、本発明のレポーターを発現するサンプルの周囲の細胞または領域に治療剤を局在させてもよい。
【０１１１】
ＩＩＩ．  核酸
本発明の態様には、直接的にまたは間接的に検出することによって非侵襲的に画像化されるポリペプチドをコードする核酸を送達することが含まれる。本発明の核酸には、これらに限定されるわけではないが、検出可能なシグナルを産生する薬剤を生産するか、それに結合するか、またはそれに酵素的に作用する組み換えＧＰＣＲが含まれる。その他の態様においては、核酸は一以上のさらなる核酸配列を含んでもよく、ここでこの核酸配列としては、これらに限定されるわけではないが、トランス活性化因子をコードする核酸配列、治療剤をコードする核酸配列または第二の造影剤をコードする核酸配列が挙げられる。
【０１１２】
「核酸」という用語は、本技術分野において周知である。本明細書で用いられるような「核酸」は一般的に、（鎖状の）ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子もしくは派生物または核酸塩基を含むそのアナログを意味することになる。核酸塩基としては、たとえば天然由来のまたは誘導体化されたプリン塩基またはピリミジン塩基が挙げられ、ＤＮＡ（たとえばアデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」もしくはシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（たとえばＡ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」もしくはＣ）で見出される。「核酸」という用語は、それぞれが「核酸」という用語の亜族としての「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」という用語を包含する。「オリゴヌクレオチド」という用語は、約３〜約１００の間の長さの核酸塩基の分子を意味する。「ポリヌクレオチド」という用語は、約１００を超える長さの核酸塩基からなる少なくとも一つの分子を意味する。
【０１１３】
これらの定義は一般的に一本鎖分子を意味するが、特定の実施形態では、一本鎖分子に対して部分的に、実質的にまたは完全に相補的なさらなる鎖をも包含することになる。従って、核酸は、分子を含む特定の配列の一以上の相補鎖すなわち「単数（もしくは複数）の相補体」を含む、二本鎖分子または三本鎖分子を包含してもよい。
【０１１４】
「ベクター」という用語は、細胞内に導入するための担体であって、その中に核酸配列を挿入することができる担体を意味するように用いられ、ここでその細胞内で発現および／または複製することができる。「発現ベクター」または「核酸ベクター」という用語は、核酸配列すなわち「カセット」を含む核酸を意味し、ここでカセットとは、本明細書では遺伝子とも称される核酸配列の核酸配列の少なくとも一部、転写され得る能力を有する産物および「調節」配列または「コントロール」配列をコードするものである。ここで、調節配列またはコントロール配列は、特定の宿主細胞内で作動するように結合したコード配列の転写に必須であっておそらくは翻訳に必須な核酸配列を意味する。転写および翻訳を支配するコントロール配列に加えて、発現ベクターは、機能を同様に果たすその他の核酸配列を含んでもよい。
【０１１５】
Ａ．  発現ベクター
１  プロモーター
「プロモーター」という用語は、「プロモーターエレメント」および「プロモーター配列」と同じ意味で用いられる。同様に、「エンハンサー」という用語は、「エンハンサーエレメント」および「エンハンサー配列」と同じ意味で用いられる。プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサーは、単数（または複数）のエレメントが、核酸またはトランスジーンの転写速度または転写効率を制御するかまたは影響を与える場合、組み換え七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプターをコードする核酸などの核酸またはトランスジーンに「作動するように結合」していると言われる。たとえば、トランスジーンのコード配列の５’末端の近傍に位置するプロモーター配列は通常、トランスジーンに作動するように結合している。本明細書で用いられるような「調節エレメント」という用語は、「調節配列」と同じ意味で用いられ、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化部位およびその他の発現コントロールエレメント、またはそのようなエレメントの任意の組み合わせを意味する。
【０１１６】
プロモーターは、それがコントロールする遺伝子の５’（上流）に位置する。多数の真核生物のプロモーターは二つのタイプの認識配列から構成される：ＴＡＴＡボックスおよび上流プロモーターエレメント。転写開始部位の２５−３０ｂｐ上流に位置するＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩをＲＮＡ合成の正確な開始部位に導くことに関与すると考えられている。対照的に、上流のプロモーターエレメントは、転写が開始される割合を決定する。これらのエレメントは、それらの配向に関わらず機能することができるが、これらはＴＡＴＡボックスの１００〜２００ｂｐ上流の範囲内に位置する必要がある。
【０１１７】
エンハンサーエレメントは、結合している同種または異種のプロモーターの転写を最高で１０００倍まで刺激することができる。多くの場合、エンハンサーエレメントはそれらの配向が逆であってさえ、依然として活性を有する（Ｌｉら、１９９０）。さらに、プロモーターエレメントとは異なり、転写開始部位から下流に位置する場合、たとえばイントロン内にあるか、またはプロモーターからかなり離れた位置にある場合でさえ、エンハンサーは活性を有する可能性がある（Ｙｕｔｚｅｙら、１９８９）。
【０１１８】
本技術分野において知られているように、この間隔に関してのいくらかの変動は、プロモーター機能が失われることなく順応され得る。同様に、トランスジーンに関する調節エレメントの位置は著しく変化してもよく、機能は失われない。調節エレメントの複数のコピーは一致して機能することができる。通常、発現ベクターは、一以上のエンハンサー配列と、それに続いて５’から３’の方向でプロモーター配列を含み、すべてがトランスジーンとそれに続くポリアデニル化配列に作動するように結合している。
【０１１９】
「プロモーター」配列は、その位置で転写の開始および速度が調節される核酸配列の領域であるところのコントロール配列である。調節タンパク質および分子が結合してもよい遺伝的要素、たとえばＲＮＡポリメラーゼおよびその他の転写調節因子を含んでもよい。「作動する位置にある」、「作動するように結合している」、「の制御下にある」、および「転写制御下にある」という表現は、プロモーターが、その配列の転写開始と発現を制御する核酸配列に関して正確に機能する位置および配向にあることを意味する。プロモーターは「エンハンサー」と同時に使用してもまたはしなくてもよく、これは、核酸配列の転写活性化に関与するシス作用性の調節配列を意味する。適切なプロモーターまたはプロモーター／エンハンサーの組み合わせと、目的の遺伝子とが一緒になって、発現カセットを構成する。一以上の発現カセットが、与えられた核酸ベクターまたは発現ベクター内に存在してもよい。特定の態様においては、一つの発現カセットが、第二の発現カセットのプロモーターと相互作用するトランス活性化因子をコードしていてもよい。一以上の発現カセットが、同一のおよび／または異なる発現ベクター上に存在してもよい。
【０１２０】
プロモーターは、コーディング領域すなわちエクソンの上流に位置する５’非コーディング配列の一部を単離することによって得られるかもしれないような遺伝子または配列と自然に結び付くものであってもよい。このようなプロモーターを「内因性」と言うことができる。同様に、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する核酸配列と自然に結び付くものであってもよい。あるいは、組み換えまたは異種のプロモーター、これはその自然環境では核酸配列と自然には結び付かないプロモーターを意味する、の制御下に核酸セグメントを位置させることによって、特定の優位性が得られるだろう。本発明の特定の態様においては、異種プロモーターはキメラプロモーターであってもよく、ここで、二以上の内因性か、異種性かまたは合成のプロモーター配列のエレメントは作動するように結合しており、組み換えプロモーターを生産する。
【０１２１】
組み換えまたは異種のエンハンサーは、その自然環境では核酸配列と自然には結び付かないエンハンサーをも意味する。このようなプロモーターまたはエンハンサーとしては、その他の遺伝子のプロモーターもしくはエンハンサー、およびその他の任意の原核細胞、ウイルス、もしくは真核細胞から単離されるプロモーターもしくはエンハンサー、および「天然由来」ではない、すなわち異なる転写調節領域の異なるエレメントおよび／または発現を変化させる突然変異を含むプロモーターもしくはエンハンサーが挙げられ得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に生産することに加えて、本明細書に開示された組成物と共に、組み換えクローニング技術および／またはＰＣＲ（商標）などの核酸増幅技術を利用して、配列を生産してもよい（米国特許第４，６８３，２０２号および第５，９２８，９０６号、それぞれは引用されることによって本明細書に組み込まれる、を参照すること）。このようなプロモーターを用いてレポーターの発現を作動させてもよく、これには、これらに限定されるわけではないが、少し例示すれば、ＧＰＣＲ、＾−ガラクトシダーゼまたはルシフェラーゼが挙げられる。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などの非核性の細胞小器官内にある配列の転写および／または発現を導くコントロール配列を同様に採用できる可能性が検討される。
【０１２２】
通常、発現で選択される細胞、細胞小器官、および生命体のタイプにおいて、ＤＮＡセグメントの発現が効果的に導かれるように、プロモーターおよび／またはエンハンサーを用いることになる。分子生物学の分野の当業者は一般的に、タンパク質の発現のために、プロモーター、エンハンサー、および細胞のタイプを組み合わせて用いることを承知しており、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋら、（２００１）、引用されることによって本明細書に組み込まれる、を参照すること。採用されるプロモーターは、構成的なもの、組織特異的なもの、誘導可能なもの、および／または誘導されるＤＮＡセグメントの発現を導くことにとって適切な条件下で有用なものであればよく、たとえば組み換えタンパク質および／またはペプチドの生産に好都合なものである。プロモーターは、異種でも内因性でもよく、またはそれらの組み合わせでもよい。
【０１２３】
２  組織選択的プロモーター配列
ほとんどの遺伝子の導入方法では、種々の組織において高い発現レベルを達成するために、サイトメガロウイルスプロモーターなどのプロモーターを用いる。たとえばガンを治療するために毒性遺伝子を導入する場合、腫瘍を特異的に標的化し、正常な組織を標的化しないことが望ましい。レポーター技術を用いて、インビボでの組織特異的プロモーターの標的化の特異性を実証することができる。
【０１２４】
ｈＴＥＲＴなどの組織特異的プロモーターの短所は、転写を作動させるそれらの能力が比較的弱いということである。増幅のスキームが必要である。種々のガンにおいて活性を示し、レポーターを作動させる増幅されたプロモーターは、リンクされた治療用遺伝子の発現位置の確認と発現の定量に役立つことができる。増幅されたプロモーターおよびレポーターだけの組み合わせを用いて、治療により誘導されるｈＴＥＲＴプロモーターの機能の変化を評価してもよい。この組み合わせはさらに、ガンの発見と病期分類のための診断用のツールとして機能する能力を有する。プロモーターの漏れが正常な細胞に与える影響を制限するために、このような構築物においてはシグナル伝達を欠くレポーターが望ましい。
【０１２５】
好ましい実施形態においては、組織特異的プロモーターはテロメラーゼプロモーターである。ガン細胞とは異なり、正常な体細胞は寿命が限られている。細胞分裂ごとに、テロメアと呼ばれる染色体の末端は短くなる。これは、ＤＮＡの複製を開始するのに必要なＲＮＡプライマーの５’末端が分解されるからである。従って、テロメアの位置では複製は生じず、複製サイクルごとに染色体が短くなる。最終的に、重要な遺伝子が影響を受け、細胞の成長が停止するかまたは死ぬことになる。腫瘍細胞は無制限に分裂するため、これらは末端複製問題を解決する必要がある。リボザイムのテロメラーゼ、これは六塩基対反復を単位としてＤＮＡの末端にヌクレオチドを付加してテロメアを伸長する、を活性化させることによって、このことはほとんど解決され、その結果、細胞の寿命が延長される。
【０１２６】
正常な組織では、テロメラーゼ活性は見られないかまたは低いレベルで存在するが、すべてのガン、たとえば生殖器、胸部、結腸、肝臓、脳、前立腺、および肺で生じるもの、のうちの約８５〜９０％でその活性が存在する。インビトロおよび動物モデルにおいて、テロメラーゼリボザイムを阻害するように設計された多数の治療法が、いくらかの望みを示している。これらのアプローチの限界は、テロメアの長さが細胞の老化または死を引き起こすのに十分なほど短くなるには、倍加時間の複数倍の時間がかかることであることかもしれない。その他のものは、テロメラーゼリボザイムの一部を、腫瘍特異的Ｔ細胞を生じさせる抗原として用いてきた。いくつかの限界はあるが、特に脳腫瘍については、これも望みがあるアプローチである。
【０１２７】
テロメラーゼ活性に関与する成分は、主に二つある。第一のものは、６塩基対反復配列についての鋳型のヒトテロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ）であり、これはほとんどすべての細胞で発現する。第二のものは、テロメラーゼ活性についての律速工程のヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）であり、このプロモーター活性はテロメラーゼ活性と共に局在している。
【０１２８】
従って、ｈＴＥＲＴプロモーターを、治療用遺伝子をガンに特異的に送達するための手段、および腫瘍溶解性ウイルスの複製を悪性腫瘍に限定するための手段として活用してきた。治療効果にとって適切な遺伝子発現のレベルを維持することは遺伝子／ウイルス療法の課題であり、そしてほとんどの組織またはガン特異的プロモーターに関してこの維持は難しいことが証明された。アデノウイルスを腫瘍内に注射した後のｈＴＥＲＴプロモーターによって作動する低い発現レベルのナトリウム  ヨウ化物シンポーターを、ＰＥＴによって画像化することも可能であった。Ａ２７８０細胞（卵巣ガン）に由来する腫瘍においては発現はわずかであり、至る所で発現するｈＴＲプロモーターまたは至る所で発現するＣＭＶプロモーターに由来するものよりも低かった。ＰａｎｃＯ２細胞（膵臓ガン）に由来する腫瘍においてはｈＴＥＲＴからの明瞭な発現は見られなかったが、ｈＴＲおよびＣＭＶプロモーターにより作動される発現はあった。従って、この画像化実験においては、ｈＴＥＲＴプロモーター活性は弱かったかまたはほとんど存在していなかった。
【０１２９】
増幅計画が必要である。組織／ガン特異的プロモーターからの発現を促進させることができる。ＧＡＬ４／ＶＰ１６系を用いて、ガン胎児性抗原（ＣＥＡ）プロモーターからの、そしてつい最近ではｈＴＥＲＴプロモーターからの治療用遺伝子の発現を作動させた。アポトーシス誘導遺伝子ＴＲＡＩＬまたはＢａｘと結合した後者のものが組み込まれたアデノウイルスは結果的に腫瘍を殺すことになったが、ＣＭＶプロモーターによって作動するＴＲＡＩＬまたはＢａｘが組み込まれたアデノウイルスに伴う肝臓または全身への毒性は避けられた。従って、ｈＴＥＲＴプロモーターによる発現が促進される可能性や、ガン特異的発現を未だなお保持している可能性はある。
【０１３０】
スタッファーＤＮＡの切り出しが必要であって、細胞に依存してもよいウイルスプロモーターの転写活性に依存するＣｒｅ／ｌｏｘＰ系などのその他の手段によって、弱いプロモーターからの発現を促進させることを試みることもできる。別の方法は、組織特異的プロモーターを用いて目的の遺伝子および人為的な転写アクチベーターを作動させ、次いでプロモーターを刺激することである。これは結果的に、目的の遺伝子および転写調節因子を発現させる。さらなる計画は、ｈＴＥＲＴプロモーターを、本出願で例示されたＣＭＶなどのユビキタス  プロモーターの上流に設置することである。増幅されたｈＴＥＲＴプロモーターは治療用遺伝子の発現を作動させるのに有用なだけではなく、ｈＴＥＲＴに基づくプロモーターによって腫瘍内での複製が制限された次の腫瘍溶解性ウイルスにとっても有用であろう。これに限定されるわけではないが、ソマトスタチンレセプター  タイプ２に基づくものなどの画像化可能なレポーターをリンクすることによって、治療効果を得るために必要な発現の位置決定と定量が、および不適切な発現により毒性が生じるかどうかを分析するために必要なそれが可能となるだろう。ｈＴＥＲＴは腫瘍ではほとんど全域で発現するため、レポーターを増幅してそれにリンクした場合、ベクター系も検出、鑑別診断の補助、および腫瘍の病期分類を行う能力を有する。従って、レポーター単独を作動させるか、または目的の遺伝子にリンクしたレポーターを作動させる、増幅されたｈＴＥＲＴプロモーターを組み込んだ画像化システムは、診断、病期分類、および治療にとって有用であることが分かるはずである。増幅のスキームを、糖尿病を治療するためにベータ細胞を標的とするもの、または悪性腫瘍を治療するためにＣＥＡプロモーターなどの腫瘍を標的とするその他のものなどのその他の組織特異的プロモーターの発現の促進に適用することもできる。上記のように、ソマトスタチンレセプターは弱い成長抑制剤であり、それ故に、ガン治療を補強できるかもしれない。重要なことは、腫瘍内のそれぞれの細胞は、画像化のための遺伝子を発現する必要が無いということである；いくらかの細胞がレポーターを発現するのであれば、診断および病期分類にとって十分であり、またはレポーターを用いてリンクされた遺伝子の発現に続くのに十分である。
【０１３１】
プロモーター／遺伝子、プロモーター／レポーター、および／またはプロモーター／トランス活性化因子の位置は変化してもよい。１、２、３、４、またはそれを超える発現カセットが、発現ベクター内のカセットの順序についての一般的な優先傾向に関わらず、特定のベクターまたは特定の細胞内に存在してもよいことが検討される。発現カセットの第一の、第二の、第三のまたは第四のプロモーターは組織特異的であっても、増幅された組織特異的であってもよく、および／または目的の遺伝子、レポーター、および／またはトランス活性化因子の発現を作動させる構成的プロモーターであってもよい。プロモーター複合体およびレポーターの前後におけるプロモーターおよび目的の遺伝子の配置の順序は、本発明にとっては重要ではない。
【０１３２】
テロメラーゼ活性が低いレベルであることも、幹細胞を含めた正常な細胞内で検出されている。造血幹細胞は、種々のベクターによる感染に対して抵抗する傾向がある。たいていの幹細胞は静止状態であり、そのようなものはほとんどのベクターによる感染／形質移入に対して抵抗する。従って、どの時点においても、わずかな幹細胞だけが感染する能力を持つことになる。リンパ球は、クローン性増殖を経験した時にテロメラーゼ活性を一時的に向上させることができるが、この小集団のみが再び感染し、外因的に導入されるｈＴＥＲＴプロモーターを介する高レベルの発現を行う可能性があるだろう。静止状態にある原始幹細胞のテロメラーゼ活性は低く、ＣＤ３４＋造血前駆細胞におけるｈＴＥＲＴプロモーターの活性ははるかに低い。ｈＴＥＲＴプロモーターから漏れやすい発現がある場合、毒性を制限するための別の方法は、シグナル伝達を欠くレポーターを用いることである。従って、増幅されたｈＴＥＲＴプロモーターと共にシグナル伝達を欠くレポーターを採用するならば、細胞内で都合の悪い出来事が制限され、目的の遺伝子とのクロストークの可能性が小さくなるだろう。
【０１３３】
本発明の特定の態様は、内因性または外因性のトランス活性化因子と相互作用するプロモーター配列を含む。特定の態様においては、トランス活性化因子は組み換えトランス活性化因子である。組み換えトランス活性化因子は、その中に本発明の核酸が導入される細胞内で発現してもよい。あるいは、組み換えトランス活性化因子または組み換えトランス活性化因子をコードする核酸を、本発明の核酸の前に、共に、または後で導入してもよい。特定の態様においては、組み換えトランス活性化因子が、造影剤または治療剤をコードする核酸にコードされていてもよい。
【０１３４】
プロモーターは、種々のタイプの組織において、およびいくらかの異なる種の生命体において機能するものであってよく、または、その機能は、特定の種および／または特定の正常なもしくは罹患した組織または細胞のタイプによって制限されてもよい。さらに、プロモーターは構成的に活性を有してもよく、または、特定の物質（たとえば組織特異的因子）によって、特定の条件（たとえば低酸素症、もしくはプロモーターを含む発現カセット内にエンハンサーエレメントが存在する条件）下によって、または生命体の特定の発達段階の間（たとえば胎児では活性であって、成人では静止状態にある）において、選択的に活性を有してもよい。
【０１３５】
本発明の実施に際して有用なプロモーターは、組織特異的なものが好ましい−−すなわち、これらは、一つまたは少数の正常なまたは罹患した組織内で遺伝子の転写を動作させる能力を有するが、残りの大部分のプロモーターがその他のタイプの組織において「静止状態」であるか、または比較的低レベルで発現する。しかしながら、組織特異的または組織選択的プロモーターは、その中では静止状態にあるこれらの組織において、検出可能な量の「バックグラウンド」活性または「ベース」活性を有してもよいことが理解されるだろう。標的組織内でプロモーターが選択的に活性化されている程度を、選択率（標的組織内の活性／コントロール組織内の活性）として表現することができる。これに関して、本発明の実施に際して有用な組織特異的プロモーターは通常、約１：１．０１、１：１．１、１：１．５、１：２、１：３、１：４、１：５またはそれ以上よりも大きな選択率を有する。好ましくは、選択率は、約１：１．５よりも大きい。プロモーターは、単数（または複数）の正常なまたは目的の罹患した組織において活性が低下している状態で、逆の方法で機能してもよい。
【０１３６】
特定のプロモーター、活性については単独のタイプの組織だけに制限されていないものだが、はそれにも関わらず、これは選択性を示してもよいことがさらに理解されるであろう。というのは、これらは一つの組織のグループにおいて活性を示し、別のグループではほとんど活性を示さないか静止してもよいからである。このようなプロモーターは「組織特異的」または「組織選択的」とも呼ばれ、本発明と共に用いることが検討される。たとえば、種々の腫瘍細胞において活性であるプロモーターは、体の多数の異なるあらゆる領域に影響するかもしれないガンの治療において、治療上有用であってもよい。
【０１３７】
組織特異的プロモーターは、たとえば、異なる正常なもしくは罹患した組織において、異なる成長段階で区別を付けて発現する遺伝子か、または過形成性の細胞において発現する遺伝子のプロモーター領域に由来するものであってもよい。
【０１３８】
プロモーター領域を操作することによって、特定のプロモーターの制御下にある遺伝子の発現レベルを調節することができる。たとえば、プロモーター領域内にある異なるドメインが、異なる遺伝子調節活性を保持していてもよい。通常、これらの異なる領域の役割は、特定の領域の欠失（すなわち欠失分析）を伴うか、または単数（もしくは複数）の塩基対の変異を伴った、プロモーターの異なる変異体を有するベクター構築物を用いて判断される。通常、このような実験に用いられるベクターはレポーター配列を含み、このレポーター配列を用いて、異なる条件下での、それぞれのプロモーターの変異体の活性を決定する。このような欠失分析を応用することによって、望ましい活性を有するプロモーター配列を発見することが可能になり、従って、コアプロモーターエレメント、これらのエレメントが欠失すると不都合なプロモーターの不都合な特質、たとえばこれらに限定されるわけではないが選択性または転写調節因子の結合などがもたらされる、を含む特定のプロモータードメインを発見することが可能になる。このアプローチを利用して、たとえば組織に特異性を付与する能力を有する最も小さな領域、または、その他のプロモーターエレメント、たとえばこれらに限定されるわけではないがＣＭＶのコアプロモーターもしくはミニＣＭＶ、と組み合わせた時に、力強い転写応答を付与する最も小さな領域を特定してもよい。
【０１３９】
本明細書で記載された多数の組織特異的プロモーターは、本発明を実施する際に特に有効であればよい。ほとんどの例において、これらのプロモーターを、選択されたベクター内にクローニングすることに適した従来の制限消化断片として単離してもよい。本発明の特定の態様には、これに限定されるわけではないが、ｈＴＥＲＴプロモーターが含まれる。あるいは、ポリメラーゼ連鎖反応を利用するか、またはオリゴヌクレオチド合成によってプロモーター断片を単離してもよい。プライマーの５’末端の位置に制限酵素認識部位を組み込むことによって、これらのプロモーター断片のクローニングを促進してもよい。
【０１４０】
当業者であれば、本発明の文脈に含めることができる種々のタイプの組織選択的プロモーター配列に精通しているだろう。これらのプロモーター／エンハンサーの模範的なリストとしては、これらに限定されるわけではないが、免疫グロブリン重鎖（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８３；Ｇｉｌｌｅｓら、１９８３；Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら、１９８５；Ａｔｃｈｉｓｏｎら、１９８６、１９８７；Ｉｍｌｅｒら、１９８７；Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、１９８４；Ｋｉｌｅｄｊｉａｎら、１９８８；Ｐｏｒｔｏｎら；１９９０）；免疫グロブリン軽鎖（Ｑｕｅｅｎら、１９８３；Ｐｉｃａｒｄら、１９８４）；Ｔ細胞レセプター（Ｌｕｒｉａら、１９８７；Ｗｉｎｏｔｏら、１９８９；Ｒｅｄｏｎｄｏら；１９９０）；ＨＬＡ  ＤＱ  αおよび／またはＤＱ  β（Ｓｕｌｌｉｖａｎら、１９８７）；β−インターフェロン（Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎら、１９８６；Ｆｕｊｉｔａら、１９８７；Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎら、１９８８）；インターロイキン−２（Ｇｒｅｅｎｅら、１９８９）；インターロイキン−２レセプター（Ｇｒｅｅｎｅら、１９８９；Ｌｉｎら、１９９０）；ＭＨＣクラスＩＩ  ５（Ｋｏｃｈら、１９８９）；ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−Ｄｒａ（Ｓｈｅｒｍａｎら、１９８９）；β−アクチン（Ｋａｗａｍｏｔｏら、１９８８；Ｎｇら；１９８９）；筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）（Ｊａｙｎｅｓら、１９８８；Ｈｏｒｌｉｃｋら、１９８９；Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９８９）；プレアルブミン（トランスサイレチン）（Ｃｏｓｔａら、１９８８；エラスターゼＩ、Ｏｒｎｉｔｚら、１９８７）；メタロチオネイン（ＭＴＩＩ）（Ｋａｒｉｎら、１９８７；Ｃｕｌｏｔｔａら、１９８９）；コラゲナーゼ（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７；Ａｎｇｅｌら、１９８７）；アルブミン（Ｐｉｎｋｅｒｔら、１９８７；Ｔｒｏｎｃｈｅら、１９８９、１９９０）；α−フェトプロテイン（Ｇｏｄｂｏｕｔら、１９８８；Ｃａｍｐｅｒｅら、１９８９；γ−グロブリン、Ｂｏｄｉｎｅら、１９８７；Ｐｅｒｅｚ−Ｓｔａｂｌｅら、１９９０）；β−グロブリン（Ｔｒｕｄｅｌら、１９８７）；ｃ−ｆｏｓ（Ｃｏｈｅｎら、１９８７）；ｃ−ＨＡ−ｒａｓ（Ｔｒｅｉｓｍａｎ、１９８６；Ｄｅｓｃｈａｍｐｓら、１９８５）；インスリン（Ｅｄｌｕｎｄら、１９８５）；神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）（Ｈｉｒｓｃｈら、１９９０）；α１−アンチトリプシン（Ｌａｔｉｍｅｒら、１９９０）；Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストン（Ｈｗａｎｇら、１９９０）；マウスおよび／またはＩ型のコラーゲン（Ｒｉｐｅら、１９８９）；グルコース調節タンパク質（ＧＲＰ９４およびＧＲＰ７８）（Ｃｈａｎｇら、１９８９）；ラット成長ホルモン（Ｌａｒｓｅｎら、１９８６）；ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）（Ｅｄｂｒｏｏｋｅら、１９８９）；トロポニンＩ（ＴＮ  Ｉ）（Ｙｕｔｚｅｙら、１９８９）；血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）（Ｐｅｃｈら、１９８９）；デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｋｌａｍｕｔら、１９９０）；ＳＶ４０（Ｂａｎｅｒｊｉら、１９８１；Ｍｏｒｅａｕら、１９８１；Ｓｌｅｉｇｈら、１９８５；Ｆｉｒａｋら、１９８６；Ｈｅｒｒら、１９８６；Ｉｍｂｒａら、１９８６；Ｋａｄｅｓｃｈら、１９８６；Ｗａｎｇら、��９８６；Ｏｎｄｅｋら、１９８７；Ｋｕｈｌら、１９８７；Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら、１９８８）；ポリオーマ（Ｓｗａｒｔｚｅｎｄｒｕｂｅｒら、１９７５；Ｖａｓｓｅｕｒら、１９８０；Ｋａｔｉｎｋａら、１９８０、１９８１；Ｔｙｎｄａｌｌら、１９８１；Ｄａｎｄｏｌｏら、１９８３；ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓら、１９８４；Ｈｅｎら、１９８６；Ｓａｔａｋｅら、１９８８；ＣａｍｐｂｅｌｌおよびＶｉｌｌａｒｒｅａｌ、１９８８）；レトロウイルス（Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、１９８２、１９８３；Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、１９８２；Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、１９８３、１９８４ａ、ｂ、１９８８；Ｂｏｓｚｅら、１９８６；Ｍｉｋｓｉｃｅｋら、１９８６；Ｃｅｌａｎｄｅｒら、１９８７、１９８８；Ｔｈｉｅｓｅｎら、１９８８；Ｃｈｏｉら、１９８８；Ｒｅｉｓｍａｎら、１９８９）；パピローマウイルス（Ｃａｍｐｏら、１９８３；Ｌｕｓｋｙら、１９８３；ＳｐａｎｄｉｄｏｓおよびＷｉｌｋｉｅ、１９８３；Ｓｐａｌｈｏｌｚら、１９８５；Ｌｕｓｋｙら、１９８６；Ｃｒｉｐｅら、１９８７；Ｇｌｏｓｓら、１９８７；Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、１９８７；Ｓｔｅｐｈｅｎｓら、１９８７）；Ｂ型肝炎ウイルス（Ｂｕｌｌａら、１９８６；Ｊａｍｅｅｌら、１９８６；Ｓｈａｕｌら、１９８７；Ｓｐａｎｄａｕら、１９８８；Ｖａｎｎｉｃｅら、１９８８）；ヒト免疫不全ウイルス（Ｍｕｅｓｉｎｇら、１９８７；Ｈａｕｂｅｒら、１９８８；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、１９８８；Ｆｅｎｇら、１９８８；Ｔａｋｅｂｅら、１９８８；Ｒｏｓｅｎら、１９８８；Ｂｅｒｋｈｏｕｔら、１９８９；Ｌａｓｐｉａら、１９８９；Ｓｈａｒｐら、１９８９；Ｂｒａｄｄｏｃｋら、１９８９）；サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（Ｗｅｂｅｒら、１９８４；Ｂｏｓｈａｒｔら、１９８５；Ｆｏｅｃｋｉｎｇら、１９８６）；および／またはテナガザル白血病ウイルス（Ｈｏｌｂｒｏｏｋら、１９８７；Ｑｕｉｎｎら、１９８９）が挙げられる。
【０１４１】
３  内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）
本発明の特定の実施形態においては、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）エレメントの使用は、多重遺伝子、またはポリシストロン性のメッセージを作成するために用いられる。ＩＲＥＳエレメントは、５’メチル化Ｃａｐ依存性翻訳のリボソーム  スキャニング  モデルを迂回して、内部部位で翻訳を開始する能力を有する（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ、１９８８）。哺乳動物のメッセージに由来するＩＲＥＳ（ＭａｃｅｊａｋおよびＳａｒｎｏｗ，１９９１）だけではなく、ピコルナウイルスファミリーの二つのメンバー（ポリオおよび脳心筋炎）に由来するＩＲＥＳエレメント（ＰｅｌｌｅｔｉｅｒおよびＳｏｎｅｎｂｅｒｇ，１９８８）が記載されており、さらなる配列ならびに修飾された種類も本発明のこの出願内に想定される。ＩＲＥＳエレメントを異種のオープン  リーディング  フレームに結合することができる。複数のオープン  リーディング  フレームを一緒に転写することができ、それぞれがＩＲＥＳで分離されて、ポリシストロン性メッセージが作成される。ＩＲＥＳエレメントによって、それぞれのオープン  リーディング  フレームが、効率的に翻訳するためのリボソームにとって利用しやすくなる。単一のメッセージを転写するための単一のプロモーター／エンハンサーを用いて、複数の遺伝子を効率良く発現させることができ（米国特許第５，９２５，５６５号および第５，９３５，８１９号；およびＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５７８１号）、これらの複数の遺伝子は本発明のこの出願内に想定される。レポーターおよび単数（または複数）の目的の遺伝子の順序（ＩＲＥＳの上流または下流）は、本発明にとっては重要ではない。二以上の目的の遺伝子が結合してもよい。
【０１４２】
４  選択マーカー
本発明の特定の実施形態においては、選択マーカーを発現ベクター内に封入することによって、本発明の核酸構築物をインビトロまたはインビボで単離または選択してもよい。このような選択マーカーは、発現ベクターを含む細胞を特定し、単離しおよび／または選択することを可能にする特定可能な特性を細胞に付与するものであろう。ポジティブ選択マーカーは、このマーカーがその中に存在することでその選択を可能にするというものであるのに対して、ネガティブ選択マーカーは、その存在がその選択を妨げるというものである。ポジティブ選択マーカーの一例は薬剤抵抗性マーカーである。選択可能で選別可能なマーカーの具体例は、当業者にとって周知である。
【０１４３】
５  発現カセットのその他のエレメント
転写された真核細胞のＲＮＡ分子のほとんどは、一次転写物からイントロンを除去するためのＲＮＡスプライシングを経験することになる。真核細胞のゲノム配列を含むベクターは、タンパク質発現のための転写物の適切なプロセシングを保証するために、スプライシングのドナー部位および／またはアクセプター部位を必要とするかもしれない（Ｃｈａｎｄｌｅｒら、１９９７）。
【０１４４】
転写物の適切なポリアデニル化を達成するために、発現構築物にポリアデニル化シグナルが含まれてもよい。ポリアデニル化シグナルの性質は、本発明の実施を成功させることに対して決定的なことであるとは考えられておらず、および／またはこのような配列が採用されてもよい。具体的な実施形態としては、種々の標的細胞において従来のものおよび／または機能が十分に知られたものであるところのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよび／またはウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルが挙げられる。さらに、発現カセットのエレメントとして検討されたものが、転写終結部位である。これらのエレメントは、メッセージレベルの上昇および／またはカセットからその他の配列への読み取りの最小化に役立つことができる。
【０１４５】
本発明のベクターまたは構築物は、少なくとも一つの終結シグナルを含んでもよい。「終結シグナル」または「ターミネーター」は、ＲＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ転写の特異的な終結に関与するＤＮＡ配列から成る。従って、特定の実施形態においては、ＲＮＡ転写物の生産を終了させる終結シグナルが検討される。ターミネーターは、インビボで望ましいメッセージレベルを実現するために必要とされるかもしれない。
【０１４６】
真核細胞系においては、ポリアデニル化部位を暴露するために、ターミネーター領域が新たな転写物の部位特異的切断を許容する特定のＤＮＡ配列を含んでもよい。このことは、約２００の長さのＡ残基（ポリＡ）を転写物の３’末端に付加することに専門化した内因性ポリメラーゼを示唆する。このポリＡの尾で修飾されたＲＮＡ分子は、より安定的であるように見え、そしてより効率よく翻訳される。従って、真核生物に関するその他の実施形態においては、ターミネーターがＲＮＡ切断のためのシグナルを含むことが好ましく、ターミネーターシグナルがメッセージのポリアデニル化を促進することがより好ましい。ターミネーターエレメントおよび／またはポリアデニル化部位エレメントは、メッセージレベルの上昇とカセットからその他の配列への読み取りの最小化に役立つことができる。
【０１４７】
本発明での使用が検討されるターミネーターとしては、本明細書に記載された公知のまたは当業者により知られたあらゆる転写のターミネーターが含まれ、これらに限定されるわけではないが、たとえば、ウシ成長ホルモンのターミネーターなどの遺伝子の終結配列、またはＳＶ４０ターミネーターなどのウイルスの終結配列が挙げられる。特定の実施形態においては、終結シグナルは、たとえば配列末端が切断されたことにより転写可能なまたは翻訳可能な配列を欠いたものでもよい。
【０１４８】
宿主細胞内でベクターを増加させるために、ベクターは一以上の複製起点（「ｏｒｉ」と称されることが多い）を含んでいてもよく、これは、そこで複製が開始される特定の核酸配列である。あるいは、宿主細胞が酵母の場合は、自己複製配列（ＡＲＳ）を採用することができる。
【０１４９】
Ｂ．  核酸および遺伝子
本発明の特定の実施形態は、目的の遺伝子とも呼ばれる一以上の目的の核酸配列を含む核酸配列に関する。たとえば、組み換えＧＰＣＲをコードする核酸は、一以上の目的の核酸に作動するように結合していてもよい。本発明のその他の特定の実施形態は、細胞を画像化する方法に関し、ここでは、この方法はさらに、画像化成分をコードする核酸を細胞に送達する方法と定義される。核酸を細胞に送達する方法に包含する目的で、当業者にとって公知のあらゆる核酸または遺伝子が検討される。「遺伝子」という用語は、単に機能を持つタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする単位を意味するものとして用いられ、ゲノム的にコードされた遺伝子のエクソンおよびイントロンを含むゲノム断片を必ずしも意味するものではない。従って、遺伝子を用いて、特定の遺伝子座に関連する核酸配列のすべてまたは一部を含んだヌクレオチド配列を含む核酸を表示する。
【０１５０】
本発明の態様は、検出可能なおよび／または治療用のポリペプチドをコードする核酸または遺伝子を含む。本発明の特定の実施形態においては、遺伝子は治療用のもの、すなわち治療用遺伝子である。「治療用遺伝子」とは、疾患の治療または予防を目的として、被験体に投与することが可能な遺伝子である。たとえば、治療用遺伝子は、糖尿病またはガンの治療または予防のために被験体に投与される遺伝子であり得る。治療用遺伝子の具体例としては、これらに限定されるわけではないが、Ｒｂ、ＣＦＴＲ、ｐ１６、ｐ２１、ｐ２７、ｐ５７、ｐ７３、Ｃ−ＣＡＭ、ＡＰＣ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶｒａｓ、ＤＣＣ、ＮＦ−１、ＮＦ−２、ＷＴ−１、ＭＥＮ−Ｉ、ＭＥＮ−ＩＩ、ＢＲＣＡ１、ＶＨＬ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＢＲＣＡ２、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、チミジンキナーゼ、ｍｄａ７、ｆｕｓ１、インターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγ、ＡＤＰ、ｐ５３、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＬＣ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ２、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３、ＹＥＳ、ＭＡＤＨ４、ＲＢ１、ＴＰ５３、ＷＴ１、ＴＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＮＴＦ、ＮＧＦ、ＩＧＦ、ＧＭＦ、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、ＮＴ３、ＮＴ５、ＡｐｏＡＩ、ＡｐｏＡＩＶ、ＡｐｏＥ、Ｒａｐ１Ａ、シトシンデアミナーゼ、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ＢＲＣＡ２、ｚａｃ１、ＡＴＭ、ＨＩＣ−１、ＤＰＣ−４、ＦＨＩＴ、ＰＴＥＮ、ＩＮＧ１、ＮＯＥＹ１、ＮＯＥＹ２、ＯＶＣＡ１、ＭＡＤＲ２、５３ＢＰ２、ＩＲＦ−１、Ｒｂ、ｚａｃ１、ＤＢＣＣＲ−１、ｒｋｓ−３、ＣＯＸ−１、ＴＦＰＩ、ＰＧＳ、Ｄｐ、Ｅ２Ｆ、ｒａｓ、ｍｙｃ、ｎｅｕ、ｒａｆ、ｅｒｂ、ｆｍｓ、ｔｒｋ、ｒｅｔ、ｇｓｐ、ｈｓｔ、ａｂｌ、Ｅ１Ａ、ｐ３００、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ、トロンボスポンジン、ＢＡＩ−１、ＧＤＡＩＦ、またはＭＣＣが挙げられる。
【０１５１】
本発明の特定の実施形態においては、治療用遺伝子は腫瘍抑制遺伝子である。腫瘍抑制遺伝子は、それが細胞内に存在する時に、腫瘍形成、悪性腫瘍、または細胞の過剰増殖性の表現型を抑制する遺伝子である。この定義には、腫瘍抑制遺伝子の全長核酸配列、ならびに全長配列から導かれる任意の長さの非全長配列の両方が含まれる。配列は、単数または複数の天然の配列の縮重コドンを含むことがさらに理解され、この天然の配列は導入されて、特定の宿主細胞におけるコドンの優先権を提供する。
【０１５２】
この定義に含まれる腫瘍抑制性の核酸の具体例としては、これらに限定されるわけではないが、ＡＰＣ、ＣＹＬＤ、ＨＩＮ−１、ＫＲＡＳ２ｂ、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐ２７ｍｔ、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ＰＴＥＮ、Ｒｂ、ウテログロビン、Ｓｋｐ２、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＣＨＫ２、ＣＤＫＮ２Ａ、ＤＣＣ、ＤＰＣ４、ＭＡＤＲ２／ＪＶ１８、ＭＥＮ１、ＭＥＮ２、ＭＴＳ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＶＨＬ、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＣＦＴＲ、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｓｃＦＶ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、Ｇｅｎｅ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊（ＢＬＵ）、Ｌｕｃａ−１（ＨＹＡＬ１）、Ｌｕｃａ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ２１（ＮＰＲＬ２）、またはＳＥＭ  Ａ３ポリペプチドをコードする遺伝子およびＦＵＳ１が挙げられる。腫瘍抑制遺伝子のその他の典型例としては、ｗｗｗ．ｃｉｓｅ．ｕｆｌ．ｅｄｕ／〜ｙｙ１／ＨＴＭＬ−ＴＳＧＤＢ／Ｈｏｍｅｐａｇｅ．ｈｔｍｌにおける腫瘍抑制遺伝子のデータベースに記載のものである。このデータベースは本明細書に引用されることによって、本出願の本欄およびその他の欄に組み込まれる。上記のような腫瘍抑制遺伝子をコードする核酸としては、腫瘍抑制遺伝子、またはそれに由来する核酸（たとえばｃＤＮＡ、ｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびそれぞれの腫瘍抑制性のアミノ酸配列の活性断片をコードする部分配列）、ならびにこれらの配列を含むベクターが挙げられる。当業者であれば、本発明に適用することができる腫瘍抑制遺伝子に精通しているだろう。
【０１５３】
本発明の特定の実施形態においては、治療用遺伝子はアポトーシスを誘導する遺伝子（すなわちプロアポトーシス遺伝子）である。「プロアポトーシス遺伝子のアミノ酸配列」とは、細胞内に存在する時に、アポトーシスを誘導または促進するポリペプチドを意味する。本発明は、当業者にとって公知のあらゆるプロアポトーシス遺伝子を包含することを考慮する。プロアポトーシス遺伝子の典型例としては、ＣＤ９５、ｃａｓｐａｓｅ−３、Ｂａｘ、Ｂａｇ−１、ＣＲＡＤＤ、ＴＳＳＣ３、ｂａｘ、ｈｉｄ、Ｂａｋ、ＭＫＰ−７、ＰＥＲＰ、ｂａｄ、ｂｃｌ−２、ＭＳＴ１、ｂｂｃ３、Ｓａｘ、ＢＩＫ、ＢＩＤ、およびｍｄａ７が挙げられる。当業者であれば、プロアポトーシス遺伝子、および本発明の方法および本明細書に具体的には記載されてはいないが組成物に適用することができるその他のそのような遺伝子に精通しているだろう。
【０１５４】
治療用遺伝子は、サイトカインをコードする遺伝子でもよい。「サイトカイン」という用語は、別の細胞で細胞間メディエーターとして作用するタンパク質であって、一つの細胞集団から放出されるタンパク質についての総称である。「サイトカイン」とは、細胞内に存在する時に、サイトカインのいくらかの機能またはすべての機能を維持しているポリペプチドを意味する。この定義には、全長ならびに全長配列から導かれる任意の長さの非全長配列が含まれる。上記のように、配列が単数または複数の天然の配列の縮重コドンを含むことがさらに理解され、この天然の配列は導入されて、特定の宿主細胞におけるコドンの優先権を提供する。
【０１５５】
このようなサイトカインの具体例は、リンホカイン、モノカイン、成長因子および伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインの中に含まれるものは、ヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンなどの成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体形成ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン；肝細胞成長因子；プロスタグランジン、線維肉腫成長因子；プロラクチン；胎盤性ラクトゲン、ＯＢタンパク質；腫瘍壊死因子−αおよび−β；ミュラー管抑制物質；マウスゴナドトロピン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮細胞成長因子；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−βなどの神経成長因子；血小板成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどのトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン−α、−β、および−γなどのインターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）；顆粒球マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）などのコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２；ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２４、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ｋｉｔ−リガンドまたはＦＬＴ−３などのインターロイキン（ＩＬ）である。
【０１５６】
治療用遺伝子のその他の具体例としては、酵素をコードする遺伝子が挙げられる。具体例としては、ＡＣＰデサチュラーゼ、ＡＣＰヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロフォリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーセ、エステラーセ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、ヒアルロンシンターゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーセ、グルコースオキシダーセ、ＧＴＰアーゼ、ヘリカーゼ、ヘミセルラーゼ、ヒアルロニダーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リアーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ、ペプチダーゼ、プルラナーゼ、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ、レポーター遺伝子、インターロイキン、またはサイトカインが挙げられるが、これらに限定されるわけではない。
【０１５７】
治療用遺伝子のさらなる具体例としては、カルバモイルシンテターゼＩ、オルニチントランスカルバモイラーゼ、アルギノスクシナートシンテターゼ、アルギノスクシナートリアーゼ、アルギナーゼ、フマリルアセト酢酸ヒドロラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、アルファ−１−アンチトリプシン、グルコース−６−ホスファターゼ、低密度リポタンパク質レセプター、ポルホビリノゲンデアミナーゼ、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、シスタチオンベータ−シンターゼ、分岐ケト酸デカルボキシラーゼ、アルブミン、イソバレリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、プロピニルＣｏＡカルボキシラーゼ、メチルマロニルＣｏＡムターゼ、グルタリルＣｏＡデヒドロゲナーゼ、インスリン、ベータ−グルコシダーゼ、ピルビン酸カルボキシラーゼ、肝臓ホスホリラーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グリシンデカルボキシラーゼ、Ｈ−タンパク質、Ｔ−タンパク質、メンケス病銅輸送ＡＴＰアーゼ、ウィルソン病銅輸送ＡＴＰアーゼ、シトシンデアミナーゼ、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ、ガラクトース−１−リン酸ウリジルトランスフェラーゼ、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、スフィンゴミエリナーゼ、α−Ｌ−イズロニダーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、またはヒトチミジンキナーゼをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１５８】
治療用遺伝子は、ホルモンをコードする遺伝子も含む。具体例としては、これらに限定されるわけではないが、成長ホルモン、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、黄体形成ホルモン、卵胞刺激ホルモン、絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、レプチン、アドレノコルチコトロピン、アンギオテンシンＩ、アンギオテンシンＩＩ、β−エンドルフィン、β−メラニン細胞刺激ホルモン、コレシストキニン、エンドセリンＩ、ガラニン、胃抑制性ペプチド、グルカゴン、インスリン、リポトロピン、ニューロフィジン、ソマトスタチン、カルシトニン、カルシトニン遺伝子関連ペプチド、β−カルシトニン遺伝子関連ペプチド、悪性腫瘍因子の高カルシウム血症、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、グルカゴン様ペプチド、パンクレアスタチン、膵臓ペプチド、ペプチドＹＹ、ＰＨＭ、セクレチン、血管作動性腸管ペプチド、オキシトシン、バソプレシン、バソトシン、エンケファリンアミド、メトロフィンアミド、アルファメラニン細胞刺激ホルモン、心房性ナトリウム利尿因子、アミリン、アミロイドＰ成分、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン放出因子、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ニューロペプチドＹ、サブスタンスＫ、Ｐ、またはチロトロピン放出ホルモンをコードする遺伝子が挙げられる。
【０１５９】
本技術分野において理解されるように、「治療用遺伝子」という用語は、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列、ならびに、タンパク質、ポリペプチド、ドメイン、ペプチド、融合タンパク質、および突然変異体を発現するかまたは発現するように適合できるようなより小さな改変された遺伝子セグメントを含む。治療用遺伝子をコードする核酸分子は、約５〜約１２０００かまたはそれを超えるヌクレオチド、ヌクレオシドまたは塩基対の隣接核酸配列を含んでもよい。
【０１６０】
「その他のコード配列から実質的に単離」されたとは、目的の遺伝子が核酸セグメントのコーディング領域の一部を形成すること、およびそのセグメントは天然由来のコーディング核酸の大部分、たとえば、染色体の大きな断片またはその他の機能遺伝子もしくはｃＤＮＡコーディング領域、を含まないことを意味する。当然ながら、これは、最初に単離されたような核酸セグメントを意味し、後になって人為的操作によってセグメントに付加された遺伝子またはコーディング領域を排除しない。
【０１６１】
「治療用遺伝子」の定義の範囲内に包含されるものは、「生物学的機能が均等」な治療用遺伝子である。従って、タンパク質の生物活性が維持されている場合、治療用遺伝子のアミノ酸と同一かまたは機能が均等なアミノ酸の約７０％〜約９９％の相同性を有する配列は、生物学的機能が均等な配列であろう。
【０１６２】
Ｃ．  核酸の送達
本発明の態様は、単独で、または第二の造影剤および／または治療剤と組み合わせて送達される核酸を検出することを含む。特定の態様においては、送達される核酸には、本発明の組み換えＧＰＣＲが、そして特定の実施形態ではＳＳＴＲが含まれる。
【０１６３】
１  ウイルスベクター
本発明の特定の実施形態は、核酸を細胞内に送達するための送達ビヒクルを含む組成物に関する。当業者であれば、核酸を細胞に送達するための送達ビヒクルを用いることを理解するだろう。というのは、これらの実験的方法は本技術分野において周知だからである。とりわけ、「ウイルスベクター」を用いる技術は、本技術分野において周知である。ウイルスベクターは、（ａ）発現カセットのパッケージングを支援する、および（ｂ）その中にクローニングされた組み換え遺伝子構築物を最終的に発現させるのに十分なウイルスの配列を含むこれらの構築物を含むように作られている。
【０１６４】
核酸を送達するための一つの方法は、アデノウイルスベクターの使用を含む。アデノウイルスベクターは、ゲノムＤＮＡ内に組み込む能力が低いことが知られている。アデノウイルスベクターは結果的に、より効率の高い遺伝子導入をもたらす。
【０１６５】
現在のところ、アデノウイルスは臨床環境で遺伝子を導入するために最も広く用いられているベクターである。これらのウイルスの優位性の中で、アデノウイルスは非分裂細胞および分裂細胞の両者に遺伝子を送達する能力が高く、多量に生産することができる。ベクターは、アデノウイルスの遺伝子改変型を含む（Ｇｒｕｎｈａｕｓら、１９９２）。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルスの感染は結果的に、染色体への組み込みを生じさせない。というのは、アデノウイルスＤＮＡは、遺伝毒性の可能性を伴うことが無いエピソーム方式で複製することができるからである。さらに、アデノウイルスは構造的に安定しており、大量に増幅した後であってもゲノムの再配列は検出されなかった。
【０１６６】
ゲノムの大きさが中程度、操作の容易さ、高い力価、標的細胞の範囲の広さおよび高い伝染力のために、アデノウイルスは、遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。当業者であれば、アデノウイルスベクターを用いる実験的方法に精通しているだろう。
【０１６７】
アデノウイルスベクターは複製能力が欠けていてもよく、または少なくとも条件付で欠けていればよい。そしてアデノウイルスベクターの性質は、本発明の実施を成功させることに対して決定的なことであるとは考えられていない。アデノウイルスは、４２の公知の異なる抗原型またはサブグループＡ〜Ｆのいずれかであればよく、その他の抗原型またはサブグループが想定されている。アデノウイルスタイプ５のサブグループＣは、本発明で用いるための複製能力を条件付で欠くアデノウイルスベクターを得るための出発材料として好ましい。これは、アデノウイルスタイプ５は、大量の生化学的情報および遺伝情報が知られているヒトアデノウイルスであり、そして、アデノウイルスをベクターとして採用したほとんどの構築物について、歴史的に用いられてきたことが理由である。アデノウイルスの成長および操作は当業者にとって公知であり、インビトロおよびインビボにて、広範囲の宿主で提示される。ＣＡＲドメインが改変されたアデノウイルスなどの修飾されたウイルスを用いてもよい。ウイルスのリポソームカプセル化などの送達を促進するためのまたは免疫反応を回避するための方法も想定される。
【０１６８】
レトロウイルスは、感染した細胞内で、逆転写のプロセスによってＲＮＡを二本鎖ＤＮＡに変換する能力に特徴がある一本鎖ＲＮＡウイルスのグループの一つである（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。次いで、生じるＤＮＡはプロウイルスとして細胞の染色体内に安定的に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を命令する。組み込みは結果的に、受容細胞およびその子孫内でのウイルスの遺伝子配列の保存を生じさせる。レトロウイルスのゲノムは、ウイルスのゲノムの５’末端および３’末端に存在する、二つの長い末端反復（ＬＴＲ）配列を有する。これらは強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を有し、宿主細胞のゲノム内の組み込みにも必要である（Ｃｏｆｆｉｎ、１９９０）。
【０１６９】
レトロウイルスベクターを構築するために、目的の核酸または遺伝子をコードする核酸を、特定のウイルスの配列に代えてウイルスのゲノム内に挿入し、複製能力を欠くウイルスを生産する。当業者であれば、レトロウイルスベクターの構築に利用可能な周知の技術に精通しているだろう。
【０１７０】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、組み込み頻度が高く非分裂細胞に感染できることから本発明での使用にとって魅力的なベクター系であり、従って、組織培養中の哺乳動物の細胞内に遺伝子を送達するのに適したものが作成される（Ｍｕｚｙｃｚｋａ、１９９２）。ＡＡＶは広範囲の宿主についての伝染力を有し（Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、１９８４；Ｌａｕｇｈｌｉｎら、１９８６；Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、１９８８；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８）、これは、本発明と共に使用することに適していることを意味する。ｒＡＡＶベクターの作成および使用に関する詳細は米国特許第５，１３９，９４１号および第４，７９７，３６８号に記載されており、それぞれは本明細書に引用されることによって組み込まれる。
【０１７１】
通常、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ウイルスは、ＡＡＶの二つの末端反復に挟まれた目的の遺伝子を含むプラスミドと、末端反復を伴わない野生型ＡＡＶのコード配列を含む発現プラスミド、たとえばｐＩＭ４５（ＭｃＣａｒｔｙら、１９９１；本明細書に引用されることによって組み込まれる）とを同時形質移入することによって作成され（ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、１９８８；Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９；それぞれは本明細書に引用されることによって組み込まれる）。当業者であれば、ＡＡＶウイルスを用いるベクターを作製することに利用可能な技術に精通しているだろう。
【０１７２】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）は、神経細胞についてのその親和性のせいで、神経系疾患を治療することについての相当の関心を持たせてきたが、宿主範囲の広さを考えれば、このベクターをその他の組織のために利用することもできる。ＨＳＶを魅力的なベクターとする別の因子は、ゲノムのサイズと構成である。ＨＳＶは大きいため、その他のより小さなウイルス系よりも、複数の遺伝子または発現カセットを組み込む際の問題は小さい。加えて、異なるウイルスの、種々の能力（時間面、強さなど）を伴う制御配列が利用可能なため、その他の系よりもより広範囲に発現を制御することができる。ウイルスがごく少数のスプライスされたメッセージしか持たないため、遺伝操作がより簡単であるということも優位性である。
【０１７３】
さらにＨＳＶは比較的操作がし易く、高い力価で培養することができる。従って、十分な量のＭＯＩを確保するのに必要な体積、および繰り返し投与する必要も小さくなったことの両者に関して、送達の問題はそれほどでもない。遺伝子治療用ベクターとしてのＨＳＶの総説、Ｇｌｏｒｉｏｓｏら（１９９５）を参照すること。当業者であれば、ＨＳＶをベクターとして用いるための周知の技術に精通しているだろう。
【０１７４】
ワクシニアウイルスベクターは、構築の容易さ、得られる発現レベルの相対的な高さ、宿主範囲の広さおよびＤＮＡを保持する能力の大きさのために、広く用いられてきた。ワクシニアは、約１８６ｋｂの線状の二本鎖ＤＮＡゲノムを有し、著しい「Ａ−Ｔ」優先度を表す。約１０．５ｋｂの反転した末端反復がゲノムを挟んでいる。
【０１７５】
その他のウイルスベクターを、本発明における構築物として採用してもよい。たとえば、ポックスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを採用してもよい。異種のウイルスタンパク質の発現のために、ベネズエラウマ脳炎（ＶＥＥ）ウイルスの分子クローニングされた株を、複製能力を有するワクチンベクターとして遺伝子的に精製した（Ｄａｖｉｓら、１９９６）。ＶＥＥ感染が強力なＣＴＬ応答を刺激する研究が実証され、この研究は、ＶＥＥが免疫化にとって極めて有用なベクターであるかもしれないことを示唆した（Ｃａｌｅｙら、１９９７）。本発明において、ＶＥＥウイルスが樹状細胞の標的化に有効かもしれないことが検討される。
【０１７６】
ポリヌクレオチドは、特異的に結合するリガンドが発現するように改変されたウイルスベクター内に収容されてもよい。このようにして、ウイルス粒子は同起源の標的細胞のレセプターに特異的に結合し、内容物を細胞に送達することになる。レトロウイルスベクターを特異的に標的化することが可能となるように設計された新たなアプローチが、ラクトース残基をウイルスのエンベロープに化学的に付加することによるレトロウイルスの化学修飾に基づいて開発された。この修飾によって、シアロ糖タンパク質レセプターを介して肝細胞に特異的に感染することが可能になる。
【０１７７】
組み換えレトロウイルスを標的化するための別のアプローチを設計した。そこでは、レトロウイルスのエンベロープタンパク質に対するビオチン化抗体および特定の細胞レセプターに対するビオチン化抗体を用いた。この抗体を、ストレプトアビジンを用いることによってビオチン成分を介して結合させた（Ｒｏｕｘら、１９８９）。主要組織適合性複合体のクラスＩ抗原およびクラスＩＩ抗原に対する抗体を用いて、これらの表面抗原を有する種々のヒトの細胞の、エコトロピックウイルスによる感染についてインビトロで実証した（Ｒｏｕｘら、１９８９）。
【０１７８】
２  非ウイルスベクター
核酸を細胞内に導入するためのいくらかの非ウイルス的方法も、本発明によって検討される。これらのものとしては、リン酸カルシウム沈殿法（ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ、１９７３；ＣｈｅｎおよびＯｋａｙａｍａ、１９８７；Ｒｉｐｐｅら、１９９０）ＤＥＡＥ−デキストラン法（Ｇｏｐａｌ、１９８５）、電気穿孔法（Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、１９８６；Ｐｏｔｔｅｒら、１９８４）、ダイレクトマイクロインジェクション法（ＨａｒｌａｎｄおよびＷｅｉｎｔｒａｕｂ、１９８５）、ＤＮＡ封入リポソーム法（ＮｉｃｏｌａｕおよびＳｅｎｅ、１９８２；Ｆｒａｌｅｙら、１９７９）およびリポフェクトアミン−ＤＮＡ複合体法、ポリアミノ酸法、セルソニケーション法（Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒら、１９８７）、高速微粒子を用いる遺伝子のボンバードメント法（Ｙａｎｇら、１９９０）、ポリカチオン法（Ｂｏｕｓｓｓｉｆら、１９９５）ならびにレセプター介在性の形質移入法（ＷｕおよびＷｕ、１９８７；ＷｕおよびＷｕ、１９８８）が挙げられる。これらの技術のうちのいくつかを、インビボまたはエクスビボでの使用に首尾よく適合させることができる。当業者であれば、非ウイルスベクターの使用に関する技術に精通しているであろうし、本発明によって検討された本明細書に開示されたもの以外のタイプの非ウイルスベクターを理解するであろう。
【０１７９】
本発明のさらなる実施形態においては、リポソームまたは脂質製剤内で発現カセットをおとりに使ってもよい。リポソームは、リン脂質の二重膜と内部の水性媒体を特徴とする小胞構造である。多重膜リポソームは、水性媒体で分割される複数の脂質層を有する。さらに検討されるものは、リポフェクトアミン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）と複合化した遺伝子構築物である。当業者であれば、リポソームおよび脂質製剤を利用する技術に精通しているだろう。
【０１８０】
脂質に基づく非ウイルス的製剤は、アデノウイルスによる遺伝子治療の代替案を提供する。多数の細胞培養の研究が、脂質に基づく非ウイルス遺伝子の導入を記述してきたが、脂質に基づく製剤を介しての遺伝子の全身への送達には限界があった。非ウイルス性の脂質に基づく遺伝子送達の主な限界は、非ウイルス性の送達ビヒクルを構成するカチオン性脂質の毒性である。リポソームのインビボでの毒性は、インビトロとインビボとの間の遺伝子導入の結果の矛盾をある程度明らかにする。この矛盾したデータをもたらす別の因子は、血清タンパク質が存在する場合およびしない場合での、リポソームの安定性の差である。リポソームと血清タンパク質との間の相互作用は、リポソームの安定性に劇的な影響力を有する（ＹａｎｇおよびＨｕａｎｇ、１９９７）。カチオン性リポソームは、負の電荷を帯びた血清タンパク質を引き寄せて結合する。血清タンパク質によって覆われたリポソームは、溶解するか、またはマクロファージによって取り込まれ、結果的に血液の循環から取り除かれる。現在のインビボでのリポソームの送達方法では、皮下注射、皮内注射、腫瘍内注射、または頭蓋内注射を利用して、血液循環におけるカチオン性脂質に関連する毒性と安定性の問題を回避する。リポソームと血漿タンパク質との相互作用は、インビトロ（Ｆｅｌｇｎｅｒら、１９８７）とインビボ（Ｚｈｕら、１９９３；Ｓｏｌｏｄｉｎら、１９９５；Ｔｈｉｅｒｒｙら、１９９５；Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、１９９５；Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈら、１９９６）との間の遺伝子導入の効率性の不一致の原因である。
【０１８１】
多くの場合、（Ｉ）逆相蒸発（ＩＩ）脱水−再水和（ＩＩＩ）界面活性剤透析および（ＩＶ）薄膜水和の後に、リポソーム混合物のソニケーションまたは連続的な押し出しによって、脂質製剤の生産を成し遂げる。一旦製造されれば、脂質構造を利用して、血液循環においては毒性を示す化合物（化学療法薬）または不安定な化合物（核酸）をカプセル化することができる。リポソームのカプセル化は結果的に、このような化合物についての毒性の低下および血清中の半減期の長時間化をもたらした（Ｇａｂｉｚｏｎら、１９９０）。多数の疾患の治療に脂質に基づく遺伝子導入計画を利用して、従来の治療法を向上させたり、または新たな治療法、特に過剰増殖疾患の治療法を確立する。
【０１８２】
ＩＶ．  併用療法
請求の範囲に記載されている、被験体の細胞を治療するための方法を、別の薬剤または治療方法と組み合わせて用いることができることは、本発明の態様である。特定の実施形態においては、疾患はガンであり、その他の薬剤または治療法は別の抗ガン剤または抗ガン治療法である。請求の範囲に記載されている二元的治療剤による治療は、分〜週の範囲に亘る間隔を設けて、その他の治療法の前で行っても、またはその後で行ってもよい。別の剤を投与するという実施形態において、一般的に、それぞれの送達の間の時間である意味のある期間は満了しない、すなわち薬剤はなお有利な複合効果を細胞に及ぼしていることが保証されるだろう。たとえば、一つの薬剤の投与量の二回、三回、四回またはそれ以上を、本発明の二元的治療剤と共に実質的に同時に（すなわち約１分未満の間に）投与してもよいことが検討される。その他の態様においては、治療剤または方法を、本発明の単数または複数の二元的治療剤を投与する前のおよび／または投与後の約１分〜約４８時間またはそれ以上の範囲内で投与してもよく、あるいは、本明細書に記載していない時間の前および／または後の範囲内で投与してもよい。その他の特定の実施形態においては、本発明の二元的治療剤を、別の治療用モダリティ、たとえば外科治療または遺伝子治療の実施前および／または実施後の約１日〜約２１日の範囲内に投与すればよい。いくつかの状況においては、治療のための期間を有意に延長することが望ましいかもしれないが、それぞれの投与の間に数週間（たとえば約１〜８週間またはそれ以上）が経過する。
【０１８３】
種々の組み合わせを採用してもよく、二元的な化学療法および放射線療法のための、請求の範囲に記載されている薬剤を派生物「Ａ」とし、第二の薬剤、その他の任意の治療剤または方法であってよい、を「Ｂ」とする：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ。
【０１８４】
本発明の二元的治療剤の患者への投与は、これらの薬剤にいくらかでも毒性があるのなら、毒性に気を配りながら、化学療法薬を投与するための一般的な手順に従うことになる。治療サイクルは必要に応じて繰り返されるかもしれないことが予想される。種々の標準的な治療法ならびに外科的介入を、この治療法と組み合わせて適用してもよいことも検討される。これらの治療法としては、これらに限定されるわけではないが、さらなる薬物療法、化学療法、さらなる放射線治療、免疫療法、遺伝子治療および外科治療が挙げられる。
【０１８５】
Ａ．  化学療法
ガン治療には、化学的に基づく治療および放射線に基づく治療の両方を伴った種々の併用療法も含まれる。化学療法薬としては、これらに限定されるわけではないが、たとえばシスプラチン（ＣＤＤＰ）、カルボプラチン、プロカルバジン、メクロレタミン、シクロホスファミド、カンプトセシン、イホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、ブスルファン、ニトロソウレア、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリコマイシン、マイトマイシン、エトポシド（ＶＰ１６）、タモキシフェン、ラロキシフェン、エストロゲンレセプター結合剤、タキソール、ゲンシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼインヒビター、トランスプラチナム、５−フルオロウラシル、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびメトトレキサート、または前述の任意のアナログもしくは誘導体の変異体が挙げられる。
【０１８６】
Ｂ．  放射線治療
ＤＮＡの損傷を引き起こし、広く用いられてきたその他の因子としては、広く知られたものとしての、γ線、Ｘ線、および／または放射性同位体の腫瘍細胞への指向性の送達が挙げられる。ＤＮＡに損傷を与える因子のその他の形式としては、たとえばマイクロ波およびＵＶ照射も検討される。これらの因子のすべてが、広い範囲のＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製および修復、ならびに染色体の集合および維持に損傷を与える可能性が高い。Ｘ線の適用範囲は、長期間（３〜４週間）の場合で一日あたり５０〜２００レントゲンから、単回投与の２０００〜６０００レントゲンまでの範囲である。放射性同位体についての投与範囲は広範囲に亘って変化し、アイソトープの半減期、放出される放射線の強さおよびタイプ、および新形成性細胞による取り込みに依存する。本明細書において、細胞に適用した時に、「接触された」および「暴露された」という用語は、治療用構築物および化学療法薬または放射線治療薬が標的細胞に送達されたか、または標的細胞の横に直接並置されるプロセスを記述するために用いられる。細胞の死または静止を実現するために、細胞を殺すかまたは細胞分裂できないようにするのに有効な量を合わせて、両方の薬剤を細胞に送達する。
【０１８７】
Ｃ．  免疫療法
一般的に、免疫療法は、病気を治すかまたは軽減するために、免疫モジュレーター、免疫エフェクター細胞および分子の使用に依存している。特定の実施形態においては、免疫モジュレーター、免疫エフェクター細胞および分子は、ガン細胞を標的化して破壊する。免疫エフェクターとしては、たとえば、腫瘍細胞の表面上にあるいくつかのマーカーに対して特異的な抗体であってよい。抗体単独では、治療用のエフェクターとして役立ってもよく、または実際に細胞に死をもたらすその他の細胞を補充してもよい。さらに抗体は薬物または毒素（化学療法薬、放射性ヌクレオチド、リシンのＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）と結合して、ただ単に標的用の薬剤としての機能を果たせばよい。あるいは、エフェクターは、腫瘍細胞の標的と直接的にまたは間接的に相互作用する表面分子を保持するリンパ球であってもよい。種々のエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞およびＮＫ細胞が含まれる。
【０１８８】
従って、免疫療法を、遺伝子治療と同時に用いる併用療法の一部として用いることができるだろう。併用療法についての一般的なアプローチを下記で検討する。一般的に、腫瘍細胞は、標的化に従ういくつかのマーカー、すなわちそれはその他の細胞の大部分には存在しない、を有しているはずである。多数の腫瘍マーカーが実在し、これらのうちのいずれもが、本発明の文脈における標的化に適するだろう。共通の腫瘍マーカーとしては、ガン胎児性抗原、前立腺特異抗原、泌尿器の腫瘍に関連する抗原、胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、エストロゲンレセプター、ラミニンレセプター、ｅｒｂ  Ｂおよびｐ１５５が挙げられる。
【０１８９】
Ｄ．  遺伝子
さらに別の実施形態においては、第二の治療は、本発明の核酸組成物の前に、後にまたは同時に治療用ポリヌクレオチドを投与する第二の遺伝子治療である。二元的治療剤の送達を遺伝子産物をコードするベクターと同時に使用することによって、標的組織に影響を与える抗過剰増殖性などの複合した治療効果が得られるだろう。
【０１９０】
Ｅ．  外科治療
ガンを患う約６０％の人々が、いくつかのタイプの外科治療を経験することになり、これには予防用、診断用または病期分類用、治癒用および苦痛緩和用の外科治療が含まれる。治癒用の外科治療は、その他の治療法と同時に使用してもよいガン治療であり、たとえば、本発明の治療、化学療法、放射線治療、ホルモン治療、遺伝子治療、免疫療法および／または代替療法である。治癒用の外科治療としては、ガン性組織のすべてまたは一部を物理的に除去する切除、摘出、および／または破壊が挙げられる。腫瘍の切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的な除去を意味する。腫瘍の切除に加えて、外科治療による治療としては、レーザー外科治療、冷凍手術、電気外科、および顕微鏡制御下での外科治療（モース氏の外科治療）が挙げられる。本発明では、表在性ガン、前ガン、または二次的な量の正常な組織の除去を同時に行ってもよいことがさらに検討される。
【０１９１】
Ｖ．  製剤
本発明の特定の実施形態は、組織選択的プロモーターに作動するように結合している核酸であって、インビボで非侵襲的方法を用いて検出可能なレポーターをコードする薬学的に許容され得る投与量の核酸を、被験体に導入する工程を含む。本発明の医薬組成物は、治療上または診断上有効量の本発明の核酸を含む。「薬学的にまたは薬理学的に許容され得る」または「治療上効果のある」または「診断上効果のある」という表現は、必要に応じてヒトなどの動物に投与した時に、受け入れられない不都合な、アレルギー性のまたはその他の都合の悪い反応を生じさせない分子的実体および組成物を意味する。治療上効果のあるまたは診断上効果のある組成物の調製は、本開示を考慮すれば当業者にとっては公知であり、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版．Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９０に例示されている。ここで、本明細書にこれが引用されることによって組み込まれる。さらに、動物（たとえばヒト）への投与については、ＦＤＡの生物学的基準部門で規定される滅菌性、発熱源性、一般的な安全性および純度基準を調製物が満足すべきであることが理解されるだろう。
【０１９２】
本明細書で用いられるような、「治療上有効量を含む組成物」または「診断上有効量を含む組成物」としては、当業者であれば知っているであろうありとあらゆる溶媒、分散媒、被覆剤、界面活性剤、酸化防止剤、防腐剤（たとえば抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、保存料、薬物、薬物安定化剤、ゲル、バインダー、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味料、香料、色素、このようなものと同様の物質およびそれらの組み合わせが挙げられる。任意の従来の担体が有効成分と適合しない場合を除いて、本組成物においてその使用が検討される。
【０１９３】
本発明の組成物は、固体、液体またはエアロゾルの形態で投与されるかどうか、および注射のような滅菌を必要とする投与経路かどうかに応じて、異なるタイプの担体を含んでもよい。静脈内に、皮内に、動脈内に、腹膜内に、病変部内に、頭蓋内に、関節内に、前立腺内に、胸膜内に、気管内に、鼻腔内に、硝子体内に、膣内に、直腸内に、局所に、腫瘍内に、筋肉内に、腹腔内に、皮下に、結膜下に、小胞内に、粘膜に、心膜内に、臍帯内に、眼球内に、経口で、局所に、局部的に、注射で、輸液で、持続注入で、局部的な灌流浴で、標的細胞を直接、カテーテルを介して、洗浄を介して、脂質組成物（たとえばリポソーム）で、または当業者であれば知っているであろうその他の方法もしくは前述のものの任意の組み合わせによって、本発明の二重画像化剤および二元的治療剤を投与することができる。
【０１９４】
患者に投与される本発明の組成物の実際に必要な量を、体重、状態の重症度、治療される疾患のタイプ、これまでのまたは同時に生じる治療介入、患者の突発性疾患および投与経路などの物理的因子および生理的因子によって測定することができる。投与に責任を持つ医師は、あらゆる出来事においても、組成物における単数（または複数）の有効成分の濃度と、個々の被験体についての単数（または複数）の適切な投与量とを決定するだろう。
【０１９５】
特定の実施形態においては、医薬組成物は、たとえば少なくとも約０．１％の二重画像化剤または二元的治療剤を含んでもよい。その他の実施形態においては、活性化合物は、単位重量の約２％〜約７５％の間を、または約２５％〜約６０％の間、そしてたとえばそこから導きだせる任意の範囲を構成すればよい。その他の非限定的な例においては、投与量は、投与あたり約０．１ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１０００ｍｇ／ｋｇ／体重の量、またはこの範囲内の任意の量、または１０００ｍｇ／ｋｇ／体重を超える任意の量を構成すればよい。
【０１９６】
あらゆる場合において、組成物は、一以上の成分の酸化を遅延させるような種々の酸化防止剤を含むことができる。さらに、これらに限定されるわけではないが、パラベン（たとえばメチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールまたはそれらの組み合わせを含めた種々の抗菌剤および抗真菌剤などの保存料によって、微生物の作用の予防を行うことができる。
【０１９７】
本発明の二重画像化剤および二元的治療剤を、遊離塩基、遊離酸、中性または塩の形態の組成物内に製剤化してもよい。薬学的に許容され得る塩としては、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化第二鉄などの無機塩基に由来する遊離カルボキシル基と形成された塩；またはイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジンまたはプロカインのような有機塩基と形成された塩が挙げられる。
【０１９８】
組成物が液体の状態である実施形態においては、担体は、これらに限定されるわけではないが、水、エタノール、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（たとえばトリグリセリド、植物油、リポソーム）およびそれらの組み合わせを含む溶媒または分散媒であり得る。たとえば、レシチンなどの被覆剤を用いることによって；液体ポリオールまたは脂質などの担体に分散させて必要な粒子サイズを維持することによって；ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤を用いることによって；またはそのような方法の組み合わせによって、適切な流動性を維持することができる。多くの場合において、糖質、塩化ナトリウムまたはそれらの組み合わせなどの等張剤を含むことが好ましいだろう。
【０１９９】
必要な量の適切な溶媒の中に、必要に応じて上記に列挙された種々の量のその他の成分と共に診断用または治療用の薬剤を組み込むことによって、滅菌された注射溶液を調製し、次いでろ過滅菌を行う。一般的に、種々の滅菌された有効成分を、基本の分散媒および／またはその他の成分を含む滅菌された媒体に組み込むことによって、分散液を調製する。滅菌された注射用の溶液、懸濁液または乳液を調製するための滅菌された粉末の場合において、調製のための好ましい方法は真空乾燥技術または凍結乾燥技術であり、有効成分に加えて、既にろ過滅菌されたその液体培地に由来する任意の所望の添加成分を含んだ粉末が得られる。必要に応じて、液体培地を適切に緩衝化すべきであり、十分な生理食塩水またはグルコースで注射する前に、最初に液体希釈剤で等張にする。ＤＭＳＯを溶媒として用いることが想定される場合、直接注射用の高度に濃縮された組成物の調製も検討され、その結果、極めて迅速に浸透し、高濃度の活性成分が狭い領域に送達される。
【０２００】
組成物は、製造条件および保存条件の下では安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の作用による汚染から守られなければならない。エンドトキシンによる汚染を安全なレベルまで、たとえば０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に最小限に維持すべきであることが認識される。
【０２０１】
具体的な実施形態においては、モノステアリン酸アルミニウム、ゼラチンまたはそれらの組み合わせなどの、吸着を遅延させる薬剤組成物利用することによって、注射用組成物の吸着を引き伸ばすことができる。
【実施例】
【０２０２】
次の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために盛り込まれる。当業者であれは、以下の実施例に開示された技術が、本発明の実務において十分に機能するために本発明者によって発見された技術を代表すること、そしてそれによって、その実務にとって好ましい様式を構築するように考慮できることを認識すべきである。しかしながら、当業者であれば、本開示を考慮することにより、開示された具体的な実施形態において多くの変更をなし得ること、およびそれでもなお、本発明の精神および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを認識すべきである。
【０２０３】
（実施例１）
機能的および解剖学的な画像化による腫瘍内での外因性遺伝子発現の非侵襲的定量
本研究の目的は、機能的（二次元画像化およびＳＰＥＣＴ画像化）技術および解剖学的（ＭＲ）技術の組み合わせを用いて、ソマトスタチンレセプター  タイプ２（ＳＳＴＲ２）、遺伝子キメラの腫瘍のインビボでの発現を非侵襲的に定量できるかどうかを判断することであった。
【０２０４】
材料と方法
プラスミド
Ｋｕｎｄｒａら、２００２、この内容の全体は本明細書に引用されることによって、本欄ならびに本特許出願全体に具体的に組み込まれる、に記載されているように、全長ヒトＳＳＴＲ２Ａを、ｐＤｉｓｐｌａｙベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）の膜局在化配列およびヘマグルチニンＡ（ＨＡ）エピトープタグ配列の下流に挿入した。
【０２０５】
細胞系の生産およびキャラクタライゼーション
ＨＴ１０８０細胞（ヒト線維肉腫、ＡＴＣＣ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を、１×グルタミン、ペニシリン、およびストレプトマイシン（ＧＰＳ）と、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含むダルベッコの修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。形質移入のために、製造業者の説明書に従って、リポフェクチン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）と共に、１μｇのＤＮＡを１×１０５細胞に添加した。５時間後、リポフェクチン−ＤＮＡ溶液を除去し、細胞を成長培地でインキュベートした。Ｇ４１８の選択後、単一のコロニーを単離した。見込みのあるコロニーを、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）によって発現について評価し、次いで個々のクローンを、発現の定量性について評価した。ＥＬＩＳＡおよびレセプターの結合の研究を、既に記載（Ｋｕｎｄｒａら、２００２）されたようにして実施した。
【０２０６】
ウエスタンブロット分析
細胞について、コンフルエントな、６ウェルの皿にて、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００−ＳＤＳ溶解溶液（０．１％のドデシル硫酸ナトリウム［ＳＤＳ］、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、０．１ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ［ｐＨ  ８］、０．１４ｍｏｌ／Ｌの塩化ナトリウム、０．０２５％のアジ化ナトリウムおよび０．１８％の完全タンパク質インヒビター［Ｒｏｃｈｅ］）に対して、４℃で１時間かけて暴露した。１４，０００×ｇにて３０分間の遠心分離の後、上清を集めた。腫瘍について、サンプルを、ＰＢＳで洗浄し、ＴｒｉｔｏｎＸ−１００−ＳＤＳ溶解溶液で１０ストロークのホモジナイズを行った。１４，０００×ｇでの遠心分離の１５分後、上清を集めた。Ｂｒａｄｆｏｒｄ法（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）を用いてタンパク質濃度を測定した。レーンあたり、２０マイクログラムの細胞タンパク質または５０マイクログラムの、組織タンパク質を、７％のＳＤＳゲルに負荷した。次いで、半乾燥式の装置（Ｆｉｓｈｅｒ、Ａｔｌａｎｔａ、ＧＡ）を用いてサンプルをニトロセルロースに移した。Ｐｏｎｃｅａｕ−Ｓ染色によって同等の導入を確認した。次に、膜をブロックし、４℃で一晩かけてまたは室温で１時間かけて５０ｍＵ／ｍＬのＨＲＰ−ラット−抗ＨＡ抗体に暴露した。ＰＢＳによる１０分間の洗浄を４回行った後、フィルム形成のために、膜を化学発光性のＨＲＰ基質（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ）でカバーした。
【０２０７】
免疫組織化学的方法
パラフィン包埋した腫瘍、組織を、１：１０００希釈のマウス抗ＨＡ抗体（Ｂａｂｃｏ、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＣＡ）で調べ、洗浄し次いでＨＲＰ結合抗マウス二次抗体で染色した。ギムザで組織を対比染色した。細胞の周囲の茶色の反応産物の存在が、融合についての陽性反応であることが確認された。
【０２０８】
生体内分布と画像化
すべての実験動物は研究機関の動物管理使用委員会の認可を受けた。９匹のヌードマウス（約８週齢で２５ｇ）に、５×１０６細胞を皮下注射すると、１週間後に明瞭な腫瘍ができた。それぞれのマウスは、三種の予防接種、それぞれ腫瘍：右太腿、ベクターが形質移入された細胞；右肩および左肩、クローン３０９および３０１、これは同一の遺伝子キメラを異なるレベルで発現する、を受けた。次いで、９匹のマウスのうちの６匹をランダムに選択して、１３ＭＢｑ（３５０μＣｉ）の１１１Ｉｎ−ｏｃｔ（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ、Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ）を尾静脈に注射した。
【０２０９】
２４時間、後、麻酔された、動物の画像を４．７Ｔの小型動物用ＭＲ（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）にて、Ｔ２  ＦＳＥ配列（ＴＥ  ４１２０ｍｓｅｃ、ＴＲ  ７２ｍｓｅｃ、４  Ｎｅｘ、視野  ３．５、ｃｍ、切片の厚さ  ０．３ｍｍの間隔を空けての１ｍｍ、マトリクス  ２５６×２５６、分解能  １３６ミクロン）を用いて得た。Ｉｍａｇｅ  Ｊソフトウェア（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、ＵＳＡ）を用いて腫瘍を測定した。腫瘍を含んだそれぞれの画像において、塊の周辺をトレースし、描かれた領域の面積を計算した。次いで、この領域に切片の厚さ＋間隔で乗じて、目的を含むそれぞれの薄片の体積を得た。次いでそれぞれの薄片の体積を加えた。しかしながら、体積の平均をコントロールするために、目的を含む画像の内の最も優れたものの体積の半分と、最も劣る体積のものの半分のみを加えた。重量を導くために組織密度を１ｇ／ｍＬと想定して、ｍｍ３で表した目的の体積に、組織／ｍｍ３につき０．００１ｇを乗じた。向上したおよび減少したシグナルの面積を、腫瘍およびフルーイド−フルーイド／デブリスレベルを含むものと比較したため、同一のプロセスを用いて、ＭＲ上で特定された壊死／出血部分をトレースして重量を計算した。次いで、壊死／出血部分の重量を塊の重量から差し引いて、修正された重量を計算した。
【０２１０】
次いで、γカメラ（ｍＣＡＭ、Ｓｉｅｍｅｎｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ、Ｈｏｆｆｍａｎ  Ｅｓｔａｔｅｓ、ＩＬ）を用いて１０分間の二次元画像化を経験したマウスを中程度のエネルギーの平行孔コリメータに固定した。減衰の修正は行わなかった。ＳＰＥＣＴについて、１５分間かけて収集し、獲得した。画像化は、固定された１／１５ｒｐｍの、回転装置の３６０を超える回転角からの１２０ビューからなるものであり（７．５秒／ビュー、１２８×１２８、２．４ｍｍ／ピクセル）、この装置はコリメータの前部に設けられた。それぞれの動物は、回転装置の中で回転した。ＳＰＥＣＴの改造について、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  ０．６  Ｎｙｑｕｉｓｔ、１０ｔｈｏｒｄｅｒのフィルタ処理された逆投影法を実施した。二次元画像およびＳＰＥＣＴ画像において、目的の領域の測定値の総カウントを、目的の領域（ＲＯＩ）のピクセル数に対して正規化し、平均カウント／ピクセルを得た。二次元画像について、これらの値を左太腿から得られた値から差し引いた。左太腿には腫瘍は無かった。両方の技術に関して、関連する量の活性を含む偽像から導かれる方程式を用いて、値を分あたりのカウントに変換した。偽像は、５００μＬの異なる量の１１１Ｉｎ−塩化物（９３〜０．３μＣｉ）を含む１．５ｍＬのエッペンドルフチューブからなるものであった。それぞれのチューブの中のこの液体は、マウスにおける腫瘍のサイズと同様であった。それぞれの腫瘍は、わずかに１〜３枚のＳＰＥＣＴ像でしか見られないため、カウントが最も多い画像を選択した。これと同一の方法論を偽像について用いた。次いで、導かれた分あたりのカウント値を、分あたりのカウントの注射投与量に対して正規化し、％注射投与量（％ＩＤ）を得た。
【０２１１】
その後、マウスを殺処分し、それぞれの臓器および腫瘍を分析し、重量測定し、ガンマカウンターで関連する放射能を測定した。同時に、９匹のマウスのうちの残りの３匹を殺処分し、腫瘍を取り出してウエスタンブロッティングおよび免疫組織化学的方法を行って遺伝子キメラの発現、を評価した。
【０２１２】
放射能の影響
放射能の量が画像の説明に与える影響を評価するために、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに、９３〜０．０３μＣｉの連続的な１：１希釈の１１１Ｉｎ−塩化物を含む０．５ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水を満たした。上記のようにして二次元画像化を行った。種々のバックグラウンドおよび飽和ディスプレイレベルを利用して、画像上の偽像のサイズを実際の偽像のサイズと視覚的に比較した。
【０２１３】
統計分析
Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍテスト（一方の側）を利用して、インビボでの発現が異なる腫瘍の中でのインビトロでの発現または、取り込みを比較した。直線回帰を利用して、相関性を分析した。エクセル（２０００、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｂｅｌｌｅｖｕｅ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ）を用いてこの分析を実施した。ＳＡＳ（２００１、ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．０２、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｃａｒｙ、Ｎ．Ｃ．）を利用して、Ｋｒｕｓｋａｌ  Ｗａｌｌｉｓテストを行い、発現が異なる腫瘍間の傾向を比較した。すべてのテストについて、ｐ＜０．０５であることを有意とみなした。
【０２１４】
結果
発現
融合タンパク質のＨＡドメインに対する抗体を用いて、細胞全体における発現をＥＬＩＳＡ（細胞数について正規化）によって、および細胞溶解物における発現をウエスタンブロット分析（タンパク質について正規化）によって確認した。同一のＳＳＴＲ２Ａ遺伝子キメラ（図１Ａ）が形質移入されたクローン系の定量的ＥＬＩＳＡにおいて、クローン３０９はクローン３０１よりも強く反応した。対照的に、ベクターのみが形質移入された細胞では反応は見られなかった。ウエスタンブロット（図１Ｂ）で見られたように、ＳＳＴＲ２Ａキメラ遺伝子が形質移入された細胞を示すすべてのレーンにおいて明確なバンドが観察されるが、ベクターのみが形質移入された細胞を示すレーンでは見られない。このバンドは、クローン３０９の印のついたレーンの方が、３０１の印のついたものよりも強く、このことはクローン３０９においてより多く発現したことを示唆する。ベクターのみが形質移入された細胞では発現は見られない。
【０２１５】
融合タンパク質のＳＳＴＲ２Ａ部分の機能が適切であることを確認するために、レセプター結合アッセイを実施した。アッセイのために、１０−７Ｍの、オクトレオチドの飽和投与量を用いた（Ｒｅｉｓｉｎｅら、１９９３；、Ｒａｙｎｏｒら、１９９３）。ＨＴ１０８０細胞のクローンは両方とも同一の融合タンパク質を発現するため、結合における何らかの差は発現量に起因する。図１Ｃで見られるように、１１１Ｉｎ−ｏｃｔへの結合はクローン３０９についての方が、クローン３０１についてよりも強い。標識されていないソマトスタチンは、標識されたアナログと競合し特異性が確認される。ベクターのみが形質移入された細胞では特異的結合は見られない。レセプター結合データは、ＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロット分析と一致する。従って、抗ＨＡ、抗体に基づく発現レベルにより、１１１Ｉｎ−ｏｃｔに基づくレセプター結合データが確証される。これらのデータは、クローン３０９は、クローン３０１と比べて細胞あたりに存在する融合タンパク質がより多いこと、および融合タンパク質のＨＡドメインおよびＳＳＴＲ２Ａドメインは機能していることを実証する。
【０２１６】
生体内分布
図２は、６匹のヌードマウスの尾静脈への注射から２４時間後の、１１１Ｉｎ−ｏｃｔのエクスビボでの生体内分布の分析を実証する。それぞれのマウスは、クローン３０９、３０１、またはベクター形質移入細胞に由来する三箇所の皮下腫瘍を有する。結合しない１１１Ｉｎ−ｏｃｔは腎臓および肝臓を通して排除され、マウスの間で用いたそれぞれの経路の範囲には変化が存在した。摘出された腫瘍における知見を比較すると、ベクターまたは、遺伝子キメラ形質移入細胞（ベクター対３０１、ｐ＜０．０５、ｎ＝６；ベクター対３０９、ｐ＜０．０５、ｎ＝６）に由来する腫瘍の間で、ならびにクローン３０１および３０９（ｐ＜０．０５、ｎ＝６）の間で、生体内分布、パラメーターの％ＩＤ／ｇに、統計的に有意な差がある。従って、異なるレベルの融合タンパク質を発現する腫瘍は、侵襲的な生体内分布方法によって区別される。
【０２１７】
機能的画像化
１１１Ｉｎ−ｏｃｔの尾静脈への注射から２４時間後に、腫瘍を有するヌードマウスを画像化したが、図２は動物を殺処分する前の生体内分布の分析である。代表的なマウスの二次元画像（図３Ａ）は、より多く融合タンパク質を発現するクローン３０９に由来する腫瘍は、クローン３０１に由来する腫瘍よりも強く可視化されることを実証する。ベクターが形質移入された細胞に由来する腫瘍は、バックグラウンドと同じ程度のようである。局在化を改善するために、断層撮影法を適用した。代表的なマウスにおける遺伝子発現のＳＰＥＣＴ画像化（図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ）は、腫瘍は融合タンパク質を発現するが、ベクターが形質移入された細胞に由来する腫瘍はバックグラウンドと同程度であることを実証する。二次元画像化（ｒ＝０．９４、ｐ＜０．０５、ｎ＝１８）（図３Ｅ）およびＳＰＥＣＴ画像化（ｒ＝０．９０、ｐ＜０．０５、ｎ＝１８）（図３Ｆ）の両方について、ＲＯＩ分析から導かれる取り込みの画像は、摘出された腫瘍に関連する放射能と関連性がある（それぞれ係数＝１．８、Ｓ．Ｅ．＝０．２；係数＝１．３、Ｓ．Ｅ．＝０．２）。画像化方法の中で、二次元化およびＳＰＥＣＴ技術の間の相関係数は０．９６であった（ｐ＜０．０５、ｎ＝１８、係数＝１．３、Ｓ．Ｅ．＝０．１）。しかしながら、機能的ガンマ線カメラの画像上の目的物のサイズは、目的物の本当のサイズを反映しないようである。
【０２１８】
図３Ｇにおける二次元画像は、すべての偽像は同一のサイズではあるが、画像におけるそれぞれの偽像の見かけのサイズは、放射能の量の増加に伴って大きくなることを実証する。加えて、それぞれの個々の物体の色の表現には見かけの不均一性があるが、偽像の放射性医薬品は均一に分布している。
【０２１９】
解剖学的な画像化
動物を殺処分する前の生体内分布の分析の図２では、マウスをＭＲでも画像化した。代表的なマウス（図４Ａ）の骨盤の画像は、腫瘍が中程度のシグナルを有することを示し、隣接した構造と比べて優れたコントラストであることを実証する。断層撮影ＭＲ画像上の塊の全体の体積評価から導かれた重量（図４Ｂ）は、摘出された腫瘍の重量と関連性がある（ｒ＝０．９８、ｐ＜０．０５、ｎ＝１８、係数＝１．０３、Ｓ．Ｅ．＝０．０６）。摘出された腫瘍の重量と、ＳＰＥＣＴ画像上の塊の体積評価から導かれた重量との間（ｒ＝０、ｐ＜０．０５、ｎ＝１８）、または二次元画像から導かれた面積との間（ｒ＝０、ｐ＜０．０５、ｎ＝１８）には有意な相関性は見られなかった。
【０２２０】
いくつかの腫瘍において、高いＴ２シグナルは、軟組織の塊の中のものよりも強いことが分かった（図４Ｃ）。加えて、低いＴ２シグナルの層形成が高いシグナルのこれらの領域内で記録され、これは、出血／壊死によるフルーイド−フルーイドまたはフルーイド−デブリスレベルと一致する。これらの領域では融合タンパク質を発現する有意な数の生細胞を含むことが予想されていないため、修正された腫瘍の重量を計算するために差し引かれた。
【０２２１】
取り込みの非侵襲的評価対侵襲的評価
インビトロおよびインビボでの知見の関連性について、回帰分析によってさらに調査した。生体内分布パラメーター（図５）の％注射投与量／グラム（％Ｉ．Ｄ．／ｇ）、摘出された腫瘍を用いて計算される、は、取り込みを測定するための二次元（ｒ＝０．９０、ｐ＜０．０５、ｎ＝１８、係数＝１．８、Ｓ．Ｅ．＝０．２）技術またはＳＰＥＣＴ（ｒ＝０．８７、ｐ＜０．０５、ｎ＝１８、係数＝１．５、Ｓ．Ｅ．＝０．２）技術を用いての、および腫瘍全体の重量についてのＭＲを用いての非侵襲的な画像により導かれた値と関連性がある。
【０２２２】
摘出された腫瘍の中の１１１Ｉｎ−ｏｃｔの生体内分布を、パラメーターの％Ｉ．Ｄ．／ｇ（図６Ａ）を利用して区別することができた。ＭＲに導かれた重量を修正する代わりに正規化することで、さらに腫瘍間の生体内分布の分離が可能になる（図６Ｂ）。取り込みを評価するための二次元化技術（図６Ｃ）またはＳＰＥＣＴ（図６Ｄ）技術と、修正された重量についてのＭＲとを用いて、パラメーターに基づく画像を完全に導いた場合にも、このことが見出された。摘出された腫瘍またはパラメーターが導いたインビボでの画像のいずれかを用いて、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、または図６Ｄにおいて採用されたそれぞれの方法によって、クローン３０９に由来する腫瘍は、クローン３０１に由来するものよりも、統計的に有意に多くの量を発現し（ｐ＜０．０５、ｎ＝６）、そしてこれらの両者から、ベクターが形質移入された細胞に由来する腫瘍よりも１１１Ｉｎ−ｏｃｔの生体内分布の量が多いことが実証された（ベクター対３０１、ｐ＜０．０５、ｎ＝６；ベクター対３０９、ｐ＜０．０５、ｎ＝６）。Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓテストも、図６Ａ、図６Ｂ、図６Ｃ、または図６Ｄで採用されたいずれかの方法を用いての発現に差があることを示唆した（ｐ＜０．０５）。
【０２２３】
エクスビボ発現の分析
エクスビボでの発現をさらに有効なものとするために、画像化と同じ日に、三箇所のさらなる腫瘍を有するマウスを殺処分した。摘出された腫瘍の部分を、融合タンパク質のＨＡタグ部分に対する抗体を用いるウエスタンブロッティングで分析した。クローン３０９に由来する腫瘍における発現の方が、クローン３０１に由来するものよりも多い（図７Ａ）。ベクターのみが形質移入された細胞に由来する腫瘍では、バンドは見られない。免疫組織化学的分析（図７Ｂ）によって、クローン３０９に由来する腫瘍における発現は、クローン３０１に由来する腫瘍のそれよりも多いことが確認される。予想どおり、細胞の周辺では染色が見られ、このことは、融合タンパク質が細胞膜で局在化することと一致する。ベクターが形質移入された細胞に由来する腫瘍においては、バックグラウンド染色が見られる。クローン間での発現の程度の変動や、その後の細胞が導く腫瘍についてのこれらのデータは、インビトロおよびインビボでの知見と一致する。
【０２２４】
これらの結果は、非侵襲的な機能的画像化と解剖学的な画像化とを組み合わせて用いることによって、インビボで腫瘍内の遺伝子導入を定量できることを実証する。さらに、これらのデータは、非侵襲的画像化の特徴は、腫瘍内で次に続く遺伝子発現についての侵襲的方法の代わりになることができることを実証する。加えて、形態学上のデータを用いて、遺伝子発現に寄与することができない腫瘍の領域を特定し除外することができる。これらのデータは、これらの測定値をマウスなどの小動物で得ることができることを実証する。生体内分布の非侵襲的測定のために、機能的画像化技術と解剖学的画像化技術とを組み合わせることを、ＰＥＴおよび光学的画像化などのその他の機能的方法論ならびにＣＴなどの解剖学的モダリティにも適用すべきである。これらの装置のほとんどは患者の評価に利用できるため、これらの技術は臨床での有用性を発見するはずである。
【０２２５】
（実施例２）
治療用遺伝子の発現と分子の画像化のための腫瘍選択的ｈＴＭＣプラスミドベクターの開発
ガンの遺伝子治療を成功させることに対する主な障害の一つは、腫瘍を特異的に標的化することができる効果的な全身への送達システムが無いことである。腫瘍を標的としたトランスジーンを発現させるための一つの手段は、腫瘍特異的プロモーターを介して遺伝子の発現を制御することである。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）はテロメラーゼの触媒サブユニットであり、このテロメラーゼは不死化細胞および８５％を超えるヒトのガンにおいて強い活性であるが、正常な体細胞のほとんどでは静止している（ＳｈａｙおよびＢａｃｃｈｅｔｔｉ、１９９７；Ｓｈａｙら、２００１）。ｈＴＥＲＴプロモーターをクローニングして、このプロモーターが、腫瘍内では発現するが正常な細胞では発現しないトランスジーンの発現を選択的に促進させる能力を有することが示された（Ｎａｋａｙａｍａら、１９９８）。しかしながら、その他の哺乳動物に内在するほとんどのプロモーターと同じく、ｈＴＥＲＴプロモーターが転写を促進させる強さが、ＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０初期プロモーターなどの広く用いられるウイルスのプロモーターよりもはるかに弱い。このように、トランスジーンの発現が弱いという問題によって、ガンの遺伝子治療にそれを用いることが阻まれている（Ｎａｋａｙａｍａら、１９９８；Ｇｕら、２０００）。
【０２２６】
これらの問題を回避するために、新規キメラプロモーター、ｈＴＥＲＴ−ミニＣＭＶ（ｈＴＭＣ）を、極めて重要なｈＴＥＲＴプロモーター配列を最小のＣＭＶプロモーターエレメントと最適になるように融合することによって改変した。この新規プロモーターを用いて、本明細書で実証されたようにインビボでのｈＴＭＣ−ＥＧＦＰレポーター系を用いて、腫瘍特異性が高いトランスジーンの高発現を、インビトロおよびインビボの両方で実現した（図８）。ヒトＮ４１７肺ガン腫瘍を有するマウスに種々のＥＧＦＰ−ナノ粒子を静脈注射した。この中では、オリジナルのＣＭＶプロモーター、またはｈＴＭＣプロモーターに対するｈＴＥＲＴプロモーターのいずれかによってＥＧＦＰ発現を作動させる。注射から４８時間後にマウスを殺処分し、臓器を回収して直ちに凍結した。ＥＧＦＰの発現について、新鮮な凍結組織切片を蛍光顕微鏡下で調査した。高レベルのＥＧＦＰの発現を、ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰで処理された動物の腫瘍細胞でのみ検出したが、その他の正常なあらゆる組織においては検出されなかった（図８、パネルｈＴＭＣ）。対照的に、ＴＥＲＴ−ＥＧＦＰで処理された動物では、腫瘍特異的ＥＧＦＰの極めて弱い発現が検出され、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ構築物で処理された動物の腫瘍組織および正常な組織では、非選択的発現が検出された。
【０２２７】
（実施例３）
インビボでの遺伝子導入のガンマ線カメラによる画像化
インビボでの遺伝子導入をモニターするための多数の分子を画像化する方法は、導入された遺伝子産物に局在化する、静脈注射した放射標識された化合物を検出するためのガンマ線カメラ、ＳＰＥＣＴ、またはＰＥＴ画像化の感度に依存するが、多くは目的の遺伝子を直接検出するのでも、全身に使用することがＦＤＡにより認可された放射性医薬品を利用するのでもない（Ｙａｍａｄａら、１９９２；Ｋｕｎｄｒａら、２００２）。放射性医薬品である１１１Ｉｎ−オクトレオチドは、ＨＴ１０８０細胞におけるＳＳＴＲ２Ａの産物が細胞表面の膜に局在化することを検出することに成功した。ＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａが発現するプラスミド（ｐＨＡ−ＳＳＴＡ２Ａ）が形質移入されたＨＴ１０８０細胞における産物が細胞膜に局在化することは、抗ＨＡ抗体を用いる免疫蛍光分析によって確認された（図９Ａ）。ｐＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ−形質移入体によって生じるＨＴ１０８０腫瘍を有するマウスに、ガンマ線カメラ（図９Ｂ）によって研究される生体内分布および画像化のための１１１Ｉｎ−オクトレオチドを注射した。ＳＳＴＲ２Ａの発現から、レセプターの結合、および腫瘍による１１１Ｉｎ−オクトレオチドラジオトレーサーの取り込みの両方に有意に関連することも示された（図９Ｄ）（Ｋｕｎｄｒａら、２００２）。このアプローチは、臨床での使用のための実現可能性をさらに実証した。というのは、既にヒトにおいて用いられている投与量と同程度の量の１１１Ｉｎ−オクトレオチドを用いることによって、腫瘍を有する動物内で遺伝子導入を検出できたからである。分子の画像化のための新規な腫瘍特異的二重レポーターおよび治療用遺伝子の発現プラスミドベクターが開発された（図１０）。このベクター（ｐＬＪ２９０）においては、プラスミドベクターｐＬＪ１４３／ＦＵＳ１のバックボーンを用い（図１０Ａ）、これはＦＤＡによって第一相臨床試験が認可されている。オリジナルのベクターを、レポーター遺伝子ＳＳＴＲ２Ａと治療用の腫瘍抑制遺伝子ＦＵＳ１との間が改良された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に挿入することによって修飾した（図１０Ｃ）。これによって、同一のプロモーターの制御下にあり、かつ同一のＢＧＨポリ（Ａ）シグナル配列を伴うが離れた位置にある両方の遺伝子の同時発現が可能になる。ＳＳＴＲ２Ａ遺伝子（図９Ｄ、緑、細胞表面の膜）とＦＵＳ１遺伝子（図９Ｄ、赤、ミトコンドリア、ＥＲ、および核周辺膜の位置）の両者の同時発現および識別可能な細胞内分布は、免疫蛍光の画像化分析によって実証される。ＣＭＶプロモーターをｈＴＭＣプロモーターで置換することによって、ｐＬＪ２９０ベクターをさらに改変した（図１０Ｄ、ｐＬＪ２９４）。これによって、ＳＳＴＲ２Ａ遺伝子およびＦＵＳ１遺伝子の両方の腫瘍特異的発現が可能となるだろう。これらの新たな治療用ベクターを、放射性医薬品１１１Ｉｎ−オクトレオチドを用いた非侵襲的であって敏感なガンマ線カメラの画像化と組み合わせることによって、マウスおよび患者における、ＳＳＴＲ２Ａ−ＦＵＳ１−ナノ粒子介在性の遺伝子導入の分布、クリアランス、発現および有効性の効果的なモニターが可能となるだろう。
【０２２８】
（実施例４）
ガンの全身的な遺伝子治療のための、新規合成ｈＴＥＲＴ−ミニＣＭＶキメラプロモーターで作動するトランスジーンの腫瘍選択的高効率発現
ガンの遺伝子治療を成功させることに対する主な障害の一つは、原発腫瘍および転移性腫瘍を特異的に標的化することができる効果的な全身への送達システムが無いことである。ｈＴＥＲＴプロモーターをクローニングして、このプロモーターが、腫瘍内では発現するが正常な細胞では発現しないトランスジーンの発現を標的化する能力を有することが示された。しかしながら、その他の哺乳動物に内在するほとんどのプロモーターと同じく、ｈＴＥＲＴプロモーターが転写を促進させる強さが弱いことが、ガンの遺伝子治療に直接用いることへの障害となっていた。これらの問題を回避するために、新規キメラのｈＴＥＲＴ−ミニＣＭＶ（ｈＴＭＣ）プロモーターを開発した。これは、極めて重要なｈＴＥＲＴ調節配列を最小のＣＭＶプロモーターエレメントと最適になるように融合することによって改変されたものであった。種々のヒトのガンおよび正常な細胞に、種々のＥＧＦＰ−構築物を形質移入した。この構築物の中で、オリジナルのＣＭＶプロモーターおよびｈＴＥＲＴプロモーターのいずれかによって、またはｈＴＭＣプロモーターによってインビトロで、ＥＧＦＰの発現が作動した。形質移入体におけるＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡下での蛍光画像化（ＦＩ）によって可視化し、ＥＧＦＰ陽性細胞の集団と蛍光強度をＦＡＣＳ分析で定量した。ｈＴＭＣプロモーターによって作動した高レベルのＥＧＦＰ発現はすべての腫瘍細胞で検出されたが、正常な細胞では検出されなかった。ｈＴＥＲＴプロモーターによって作動するＥＧＦＰ発現の類似の腫瘍−選択性を見ることはできたが、発現レベルは、同一の形質移入効率下でのｈＴＭＣプロモーターによって作動したものよりも数百倍低かった。ＤＯＴＡＰ：コレステロール複合化ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰ−ナノ粒子を、胸郭内にヒトＮ４１７肺腫瘍異種移植片を有するヌードマウスに全身注射することによって、ｈＴＭＣプロモーターの効果をインビボでも判断した。ｈＴＭＣ−ＥＧＦＰで処理された動物における腫瘍細胞でのみ、常に高レベルのＥＧＦＰの発現を検出することができたが、その他のあらゆる正常な組織ではそうではなかった。さらに、上記のＮ４１７腫瘍マウスモデルを用いて、新規ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ナノ粒子を用いた全身的な治療の治療効果を、非侵襲的であって定量的なＭＲ画像化分析によって判断した。ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ナノ粒子で処理された動物において、処理されなかったものまたはｈＴＭＣ−ＥＧＦＰ−ナノ粒子で処理されたものと比較すると、治療から２週間もたたないうちに、ＭＲ画像化および体積の分析によって実証されるような腫瘍成長の有意な阻害（Ｐ＜０．００１）が見出された。凍結組織サンプルのＴＵＮＥＬ染色によるインサイチュ細胞死分析によって示されるように、腫瘍細胞においてはアポトーシスの誘導についても見出されたが、ｈＴＭＣ−ＦＵＳ１−ナノ粒子で処理されたマウスの正常な肺の周囲またはその他の正常な組織では見られなかった。これらの結果は、インビトロおよびインビボの両方において高腫瘍特異的治療用遺伝子の高発現を実現するためにｈＴＭＣプロモーターを使用することの将来性を明確に実証し、そしてこれらの結果は、腫瘍を標的とした分子によるガン治療のために治療用ｈＴＭＣ−ナノ粒子を全身投与に用いることの翻訳上の応用に関係がある。
【０２２９】
（実施例５）
新規ｈＴＥＲＴプロモーターキメラの開発ならびにインビトロおよびインビボでの画像化におけるそれらの使用
増幅されたｈＴＥＲＴが媒介するＨＡ−ＳＳＴＲ２の発現のための新規構築物を開発した。図１１に図示されたこの構築物は、ｈＴＥＲＴプロモーター、ｇａｌ４／ＶＰ１６、ｇａｌ４結合部位、ならびにヘマグルチニンＡタグおよび増幅されたｈＴＥＲＴが媒介するＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａの発現のためのソマトスタチンレセプター  タイプ２Ａ（ＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ）からなる遺伝子キメラを含む。さらに、ＳＳＴＲ２ＡがＣ末端の欠失を伴う類似の新規構築物も開発した。
【０２３０】
次いで、インビトロでの画像化について、これらの構築物の実用性を判断するための研究を行った。アメリカン  タイプ  カルチャー  コレクションから、ＨＴ１０８０細胞およびＩＭＲ９０細胞を入手した。次いで（Ｋｉｍら１９９４）の方法に従って、ＨＴ１０８０細胞およびＩＭＲ９０細胞の抽出物のテロメラーゼアッセイを実施した。ＨＴ１０８０細胞に関して、６塩基対のリピートラダーがテロメラーゼ活性を示した。結果を図１２に示す。ネガティブコントロールとして、ＨＴ１０８０細胞の抽出物をＲＮアーゼで処理し（図１２）、このものはテロメラーゼ活性を示さないことが実証された。さらに、ＩＭＲ９０細胞の抽出物は、予想どおりテロメラーゼ活性を示さないことが実証された。
【０２３１】
次いで、ＨＴ１０８０細胞およびＩＭＲ９０細胞を、ｈＴＥＲＴプロモーターおよびｇａｌ４ＶＰ１６増幅系を含むアデノウイルスに感染させた。ＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ融合タンパク質のＨＡドメインを標的とする抗体を利用する免疫蛍光およびＥＬＩＳＡのために細胞を広げた。
【０２３２】
発現したＨＡ−ＳＳＴＲ２融合タンパク質の細胞膜の細胞内分布を、免疫蛍光を用いて記録した。代表的な結果を図１３に示す。テロメラーゼを発現しないヒト線維肉腫、ＩＭＲ−９０（図１３Ｂ）と比べて、テロメラーゼを発現する個々の線維肉腫細胞、ＨＴ１０８０（図１３Ａ）において、発現したＨＡ−ＳＳＴＲ２融合タンパク質の発現が相対的に向上していることが見られた。ヒトテロメラーゼプロモーターおよびｇａｌ４ＶＰ１６増幅系を含むアデノウイルスによる感染は結果的に、テロメラーゼを発現する細胞（ＨＴ１０８０、ヒト線維肉腫）におけるＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ／感染細胞の発現を、テロメラーゼを発現しない細胞（ＩＭＲ−９０、ヒト線維肉腫）におけるそれよりも増大させた（図１４）。図１５は、増幅されたｈＴＭＣプロモーターによる作動によって、ＳＳＴＲ２ＡおよびＦＵＳ１の両者の発現がリンクしたことを図解的に示すプラスミドマップを示したものである。従って、ＨＡ−ＳＳＴＲ２または関連遺伝子は、治療用遺伝子などの目的の遺伝子と共に発現してもよい。たとえば、治療用遺伝子はＦＵＳ１などの抗ガン遺伝子であってよい。図１５に記載された構築物は、ｈＴＥＲＴプロモーター、ミニサイトメガロウイルス（ミニＣＭＶ）プロモーター、ＦＵＳ１遺伝子、内部リボソーム侵入部位、ならびにヘマグルチニンＡタグおよび増幅されたｈＴＥＲＴが媒介するＨＡ−ＳＳＴＲ２の発現のためのソマトスタチンレセプター  タイプ２Ａ（ＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ）からなる遺伝子キメラ、レポーター、およびＦＵＳ１、目的の遺伝子を含む。その他の構築物も作成されており、ｈＴＥＲＴプロモーター、ミニＣＭＶプロモーター、ヘマグルチニンＡタグおよび増幅されたｈＴＥＲＴが媒介するＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａのみの発現のためのソマトスタチンレセプター  タイプ２Ａ（ＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ）からなる遺伝子キメラを含むもの；ならびにたとえば、ミニサイトメガロウイルス（ミニＣＭＶ）プロモーター、ヘマグルチニンＡタグおよび増幅されたｈＴＥＲＴが媒介するＣ末端の欠失を伴うＨＡ−ＳＳＴＲ２のみの発現のためのＣ末端の欠失を伴うソマトスタチンレセプター  タイプ２Ａからなる遺伝子キメラを含むものがある。
【０２３３】
ヒトミニＣＭＶ−ｈＴＥＲＴプロモーターが、胸郭内腫瘍を有するマウスにおいてｈＴＥＲＴプロモーターによる組織特異的発現を向上させるかどうかを判断するための研究も行った。Ｎ４１７細胞に由来する胸郭内腫瘍を有するマウスに、プラスミド−リポプレックス（２０マイクログラムのＤＮＡ：４０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ：コレステロール／マウス）を静脈注射した。ＣＭＶプロモーター−高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を含むプラスミドは結果的に、腫瘍および正常な組織において発現した（図１６）。ｈＴＥＲＴに基づくプロモーターを含むプラスミドは結果的に、腫瘍において発現したが、正常な組織では全くまたは最低限しか発現しなかった（図１６）。ｈＴＭＣプロモーターは結果的に、増幅されなかったｈＴＥＲＴプロモーターよりも多量に、組織特異的な発現を行わせた（図１６）。種々の組織の凍結切片を４％のホルムアルデヒドで固定し、蛍光顕微鏡を用いてＥＧＦＰの発現を調査した。代表的な画像を図１６に示す。
【０２３４】
上記のように、ｈＴＭＣプロモーターまたはＣＭＶプロモーターによって作動することで、ＳＳＴＲ２ＡおよびＦＵＳ１の両者の発現が連鎖してもよい。従って、治療用遺伝子ＦＵＳ１などの目的の遺伝子と共に、ＨＡ−ＳＳＴＲ２または関連遺伝子が発現してもよい。ＣＭＶプロモーター−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物を含むプラスミドが形質移入された肺ガン細胞Ｈ１２９９は結果的に、ＨＡ−ＳＳＴＲ２融合タンパク質が発現する（図１７）。ｈＴＭＣプロモーターＦＵＳ１−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物を含むプラスミドが形質移入されたＨ１２９９細胞は結果的に、ＨＡ−ＳＳＴＲ２融合タンパク質およびＦＵＳ１の両方が発現する（図１７）。Ｈ１２９９細胞は一時的に形質移入され、７２時間後の蛍光について評価された。ＨＡ−ドメインを標的とする抗体を介してＨＡ−ＳＳＴＲ２融合タンパク質が可視化され、予想どおりに、細胞膜で発現が見られた。ＦＵＳ１は、ＦＵＳ１に対する抗体を介して可視化された。重ね合わせは、核染色とＨＡ−ＳＳＴＲ２との共存（ＣＭＶ−ＨＡ−ＳＳＴＲ２）、または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を介して発現するためにＦＵＳ１とＨＡ−ＳＳＴＲ２が結合した場合での核染色、ＨＡ−ＳＳＴＲ２、およびＦＵＳ１の共存を明示した（図１７）。
【０２３５】
（実施例６）
ＧＡＬ４−ＶＰ１６系によって増幅したｈＴＥＲＴプロモーターは結果的に、腫瘍に特異的な発現をインビボで行わせる
ＣＭＶプロモーター−緑色蛍光タンパク質挿入物（ネガティブコントロール、図１８Ａ、左）を含むアデノウイルスをヌードマウスの尾静脈に注射すると、結果的に肝臓でＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａを発現しないことが分かった。腎臓を介して、１１１−Ｉｎ−オクトレオチドの正常なウォッシュアウトが見られた。ＣＭＶプロモーター−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物（ポジティブコントロール、図１８Ａ、中央）を含むアデノウイルスを注射されたヌードマウスは結果的に、肝臓でＨＡ−ＳＳＴＲ２を発現させた。ｈＴＥＲＴ−Ｇａｌ４−ＶＰ１６プロモーター−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物（図１８Ａ、右）を含むアデノウイルスを注射されたヌードマウスは結果的に、肝臓で発現しなかった。従って、正常な組織では発現は見られない。
【０２３６】
（ＨＴ１０８０細胞に由来する）ヒト線維肉腫を有するヌードマウスの左側の腫瘍に、ｈＴＥＲＴ−Ｇａｌ４−ＶＰ１６プロモーター−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物を含むアデノウイルスをその腫瘍に注射するか、またはその右側の腫瘍に、ＣＭＶプロモーター−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物を含むアデノウイルスをその腫瘍に注射した。両方の腫瘍において、発現を可視化した。マウスにウイルスを注射し、二日後に１１１−Ｉｎ−オクトレオチドを注射した。その翌日に二次元画像化を実施した。代表的な画像を図１８Ｂに示した。これらの研究から、Ｇａｌ４−ＶＰ１６系で増幅されたｈＴＥＲＴプロモーターは結果的に、腫瘍特異的な発現をインビボで行わせることが実証される。
【０２３７】
本開示を考慮して、本明細書に開示され請求されたすべての組成物および方法を、過度の実験を伴うこと無く作製し実施することができる。好ましい実施形態という形で本発明の組成物および方法を記載したが、当業者であれば、本発明の概念、精神および範囲から逸脱すること無く、組成物および方法、ならびに本明細書に記載の工程または工程の順序に変化を加えてもよいことは自明であろう。より具体的には、同一または類似の結果が達成されるとはいえ、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤を、本明細書に記載の薬剤に換えてもよいことは自明であろう。当業者にとって自明であるところのこのようなすべての類似の置換物および修飾は、添付の請求の範囲に規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【０２３８】
（参考文献）
次の参考文献は、模範的な手続を、または本明細書に記載のものを補充するその他の詳細を提供する程度まで、本明細書に引用することによって具体的に組み込まれる：
米国特許第４，６８３，２０２号明細書
米国特許第４，７９７，３６８号明細書
米国特許第５，１３９，９４１号明細書
米国特許第５，９２５，５６５号明細書
米国特許第５，９２８，９０６号明細書
米国特許第５，９３５，８１９号明細書
米国特許出願公開第２００３／００９９６１６号明細書
Ａｋｓｅｎｔｉｊｅｖｉｃｈら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ７（９）：１１１１−１１２２，  １９９６．
Ａｌａｍ  ａｎｄ  Ｃｏｏｋ，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  １８８：２４５−２５４，  １９９０．
Ａｌａｕｄｄｉｎ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｉ，  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，  ２５：１７５−１８０，  １９９８．    
Ａｌａｕｄｄｉｎら、Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，  ２３：７８７−７９２，  １９９６．
Ａｌｂｅｒｉｃｏら、Ｓｕｒｇ．  Ｏｎｃｏｌ．  Ｃｌｉｎ．  Ｎ．  Ａｍ．，  １３（１）：１３−３５，  ２００４．
Ａｌｂｅｓら、Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｓｕｒｇ．  Ｏｎｃｏｌ．，  ２８（１）：５５−６２，  ２００２．
Ａｎｇｅｌら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：２２５６，  １９８７．  
Ａｔｃｈｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ，  Ｃｅｌｌ，  ４６：２５３，  １９８６．
Ａｔｃｈｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｒｙ，  Ｃｅｌｌ，  ４８：１２１，  １９８７．
Ａｕｒｉｃｃｈｉｏら、Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  １４（３）：２５５−２６１，  ２００３．
Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ，  ２７（２  Ｐｔ  １）：２９９−３０８，  １９８１．
Ｂａｎｅｒｊｉら、Ｃｅｌｌ，  ３３（３）：７２９−７４０，  １９８３．
Ｂｅｒｋｈｏｕｔら、Ｃｅｌｌ，  ５９：２７３−２８２，  １９８９．
Ｂｌａｓｂｅｒｇ，  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，  ３０（８）：８７９−８８８，  ２００３．
Ｂｏｄｉｎｅ  ａｎｄ  Ｌｅｙ，  ＥＭＢＯ Ｊ．，  ６：２９９７，  １９８７．
Ｂｏｓｈａｒｔら、Ｃｅｌｌ，  ４１：５２１，  １９８５．
Ｂｏｓｚｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ５（７）：１６１５−１６２３，  １９８６．
Ｂｏｕｓｓｉｆら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２（１６）：７２９７−７３０１，  １９９５．
Ｂｒａｄｄｏｃｋら、Ｃｅｌｌ，  ５８：２６９，  １９８９．  
Ｂｒｏｃｃｏｌｉら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２（２０）：９０８２−９０８６，  １９９５．
Ｂｕｌｌａ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：１４３７，  １９８６．  
Ｃａｌｅｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ７１（４）：３０３１−３０３８，  １９９７．
Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｖｉｌｌａｒｒｅａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：１９９３，  １９８８．  
Ｃａｍｐｅｒｅ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，  ３：５３７，  １９８９．
Ｃａｍｐｏら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３０３：７７，  １９８３．  
Ｃｅｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｈａｓｅｌｔｉｎｅ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６１：２６９，  １９８７．
Ｃｅｌａｎｄｅｒら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：１３１４，  １９８８．
Ｃｈａｄｅｎｅａｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５５：２５３３−２５２２，  １９９５．    
Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９４（８）：３５９６−６０１，  １９９７．
Ｃｈａｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：２１５３，  １９８９．  
Ｃｈｅｎ  ａｎｄ  Ｏｋａｙａｍａ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ７（８）：２７４５−２７５２，  １９８７．
Ｃｈｏｉら、Ｃｅｌｌ，  ５３：５１９，  １９８８．
Ｃｈｒｉｓｔｉａｎら、Ｉｎ：  Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  ＰＥＴ：  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，−  ５ｔｈ  Ｅｄ．，  Ｍｏｓｂｙ−Ｙｅａｒ  Ｂｏｏｋ  Ｉｎｃ．，  ２００４．
Ｃｏｆｆｉｎ，  Ｉｎ：  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  Ｆｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｅｄｓ．），  Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，  ＮＹ，  １４３７−１５００，  １９９０．
Ｃｏｈｅｎら、Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，  ５：７５，  １９８７．  
Ｃｏｎｇら、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ８（１）：１３７−１４２，  １９９９．
Ｃｏｓｔａら、Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １６７（４）：２３７９−２３８７，  ２００１．
Ｃｏｓｔａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：８１−９０，  １９８８．  
Ｃｒｉｐｅら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：３７４５，  １９８７．
Ｃｕｌｏｔｔａ  ａｎｄ  Ｈａｍｅｒ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：１３７６−１３８０，  １９８９．  
Ｄａｎｄｏｌｏら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ４７：５５−６４，  １９８３．  
Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ，  Ｃｕｒｒ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：１４６−１４８，  １９９６．
ｄｅ  Ｖｉｌｌｉｅｒｓら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３１２（５９９１）：２４２−２４６，  １９８４．  
Ｄｅｓｃｈａｍｐｓら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０：１１７４−１１７７，  １９８５．  
Ｄｕｂｅｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  １００（３）：１２３２−１２３７，  ２００３．
Ｅｄｂｒｏｏｋｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：１９０８−１９１６，  １９８９．  
Ｅｄｌｕｎｄら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２３０：９１２−９１６，  １９８５．  
Ｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇａｍｂｈｉｒ，  Ｉｎ：    Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ｉｎ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  -  ３ｒｄ  Ｅｄ．，  Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ，  ２００４．
Ｆｅｃｈｈｅｉｍｅｒ，ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４：８４６３−８４６７，  １９８７．
Ｆｅｌｇｎｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８４（２１）：７４１３−７４１７，  １９８７．
Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｈｏｌｌａｎｄ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４：６１７８，  １９８８．  
Ｆｅｎｇら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９３（１５）：７５７７−７５８１，  １９９６．
Ｆｉｒａｋ  ａｎｄ  Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：３６６７，  １９８６．
Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ａｎｄ  Ｈｏｆｓｔｅｔｔｅｒ，  Ｇｅｎｅ，  ４５（１）：１０１−１０５，  １９８６．  
Ｆｒａｌｅｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ７６：３３４８−３３５２，  １９７９．
Ｆｕｊｉｔａら、Ｃｅｌｌ，  ４９：３５７，  １９８７．  
Ｇａｂｉｚｏｎら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５０（１９）：６３７１−６３７８，  １９９０．
Ｇａｍｂｈｉｒら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．，  ３９：２００３−２０１１，  １９９８．
Ｇａｍｂｈｉｒら、Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．，  ２６：４８１−４９０，  １９９９．
Ｇｉｌｌｅｓら、Ｃｅｌｌ，  ３３：７１７，  １９８３．
Ｇｌｏｒｉｏｓｏら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ４（１）：８７−９９，  １９９５．
Ｇｌｏｓｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：３７３５，  １９８７．
Ｇｏｄｂｏｕｔら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：１１６９，  １９８８．
Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８５：１４４７，  １９８８．
Ｇｏｏｄｂｏｕｒｎら、Ｃｅｌｌ，  ４５：６０１，  １９８６．
Ｇｏｐａｌ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ５：１１８８−１１９０，  １９８５．
Ｇｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｄｅｒ  Ｅｂ，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ５２：４５６−４６７，  １９７３．
Ｇｒｅｅｎｅら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，  １０：２７２，  １９８９．
Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｃｅｌｌ，  ４１：８８５，  １９８５．
Ｇｕら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ６０：５３５９−５３６４，  ２０００．
Ｈａｒｌａｎｄ  ａｎｄ  Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １０１（３）：１０９４−１０９９，  １９８５．
Ｈａｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｃｕｌｌｅｎ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：６７３，  １９８８．
Ｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ，  ３２１：２４９，  １９８６．
Ｈｅｎｓｏｎら、ＡＪＮＲ  Ａｍ．  Ｊ．  Ｎｅｕｒｏｒａｄｉｏｌ．，  ２５（６）：９６９−９７２，  ２００４．
Ｈｅｒｒ  ａｎｄ  Ｃｌａｒｋｅ，  Ｃｅｌｌ，  ４５：４６１，  １９８６．
Ｈｉｒｏｃｈｉｋａら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６１：２５９９，  １９８７．
Ｈｉｒｓｃｈら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：１９５９，  １９９０．
Ｈｉｙａｍａら、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  ８７：８９５，  １９９５．    
Ｈｉｙａｍａら、Ｊ．  Ｎａｔｌ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．，  ８８：１１６−１２２，  １９９６．
Ｈｏｆｅｒら、Ｅｕｒ．  Ｕｒｏｌ．，  ３６（１）：３１−５，  １９９９．
Ｈｏｌｂｒｏｏｋら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １５７：２１１，  １９８７．  
Ｈｏｏｐｅｒら、Ｊ．  Ｂｉｏｌｕｍｉｎ．  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎ．，  ５（２）：１２３−１３０，  １９９０．
Ｈｏｒｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｂｅｎｆｉｅｌｄ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：２３９６，  １９８９．
Ｈｏｒｎ  ａｎｄ  Ｖｒｉｅｎｄ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ７６（７）：４６４−４６８  ，  １９９８．
Ｈｗａｎｇら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：５８５，  １９９０．  
Ｉｍｂｒａ  ａｎｄ  Ｋａｒｉｎ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３２３：５５５，  １９８６．
Ｉｍｌｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：２５５８，  １９８７．
Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：２５５５，  １９８８．
Ｊａｍｅｅｌ  ａｎｄ  Ｓｉｄｄｉｑｕｉ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：７１０，  １９８６．
Ｊａｙｎｅｓら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：６２，  １９８８．
Ｊｏｈｎｓｏｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９（８）：３３９３−３３９９，  １９８９．
Ｋａｄｅｓｃｈ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ６：２５９３，  １９８６．
Ｋａｎｇら、Ｊ．  Ｕｒｏｌ．，  １７１（５）：１８０６−１８０９，  ２００４．
Ｋａｒｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：６０６，  １９８７．
Ｋａｔｉｎｋａら、Ｃｅｌｌ，  ２０：３９３，  １９８０．  
Ｋａｔｉｎｋａら、Ｎａｔｕｒｅ，  ２９０：７２０，  １９８１．
Ｋａｗａｍｏｔｏら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：２６７，  １９８８．
Ｋｉｌｅｄｊｉａｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：１４５，  １９８８．  
Ｋｉｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６６：２０１１−２０１５，  １９９４．    
Ｋｌａｍｕｔら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：１９３，  １９９０．  
Ｋｏｃｈら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：３０３，  １９８９．
Ｋｏｅｈｎｅら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  ２１（４）：４０５−４１３，  ２００３．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｔｃｈａｎ，  Ｉｎ：    Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，  Ｇｌｕｚｍａｎ  （ｅｄ．），  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  ＮＹ，  １９８２．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｔｃｈａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：３２５，  １９８３．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ，  ３８：４８３，  １９８４．  
Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｃｅｌｌ，  ５３：４５，  １９８８．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｉｎ：  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌｓ  ２／Ｏｎｃｏｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅｓ，  Ｖａｎ  ｄｅ  Ｗｏｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．  ｅｄｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  １９８４．
Ｋｒｉｅｇｌｅｒら、Ｉｎ：  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，    Ａｌａｎ  Ｌｉｓｓ  （Ｅｄ．），  Ｈａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８３．
Ｋｕｈｌら、Ｃｅｌｌ，  ５０：１０５７，  １９８７．  
Ｋｕｎｄｒａら、Ｊ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．，  ４３（３）：４０６−４１２，  ２００２．
Ｋｙｏら、Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ２：２０２３−２０３８，  １９９６．
Ｌａｎｇｆｏｒｄら、Ｌａｎｃｅｔ，  ３４６：１２６７−８，  １９９５．
Ｌａｒｓｅｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ８３：８２８３，  １９８６．
Ｌａｓｐｉａら、Ｃｅｌｌ，  ５９：２８３，  １９８９．
Ｌａｔｉｍｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：７６０，  １９９０．
Ｌａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６０（２）：５１５−５２４，  １９８６．
Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８（１０）：３９８８−３９９６，  １９８８．
Ｌｅｖｉｎｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，  ２９５：７９，  １９８２．
Ｌｉら、Ｊ．  Ｂｉｏ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６６：６５６２−６５７０，  １９９０．
Ｌｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：８５０，  １９９０．
Ｌｕｒｉａら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：３３０７，  １９８７．  
Ｌｕｓｋｙ  ａｎｄ  Ｂｏｔｃｈａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ８３：３６０９，  １９８６．
Ｌｕｓｋｙら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：１１０８，  １９８３．
Ｍａｃｅｊａｋ  ａｎｄ  Ｓａｒｎｏｗ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３５３：９０−９４，  １９９１．
ＭａｃＬａｒｅｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ６：７８５−７９１，  １９９９．
Ｍａｎｄｅｌｌら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５９：６６１−６６８，  １９９９．
ＭｃＣａｒｔｙら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６５（６）：２９３６−２９４５，  １９９１．
ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６２（６）：１９６３−１９７３，  １９８８．
Ｍｉｋｓｉｃｅｋら、Ｃｅｌｌ，  ４６：２０３，  １９８６．
Ｍｏｒｅａｕら、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ９：６０４７，  １９８１．
Ｍｕｅｓｉｎｇら、Ｃｅｌｌ，  ４８：６９１，  １９８７．
Ｍｕｚｙｃｚｋａ，  Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，  １５８：９７−１２９，  １９９２．
Ｎａｋａｙａｍａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．，  １８：６５−６８，  １９９８．
Ｎｇら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １７：６０１，  １９８９．
Ｎｉｃｏｌａｕ  ａｎｄ  Ｓｅｎｅ，  Ｂｉｏｃｈｉｍ．  Ｂｉｏｐｈｙｓ．  Ａｃｔａ，  ７２１：１８５−１９０，  １９８２．
Ｏｎｄｅｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：１０１７，  １９８７．
Ｏｒｎｉｔｚら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：３４６６，  １９８７．
ＰＣＴ  Ａｐｐｌｎ．  ＰＣＴ／ＵＳ９９／０５７８１
Ｐｅｃｈら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：３９６，  １９８９．
Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒ  ａｎｄ  Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３３４（６１８０）：３２０−３２５，  １９８８．
Ｐｅｒｅｚ−Ｓｔａｂｌｅ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：１１１６，  １９９０．
Ｐｉｃａｒｄ  ａｎｄ  Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３０７：８３，  １９８４．
Ｐｉｎｋｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，  １：２６８，  １９８７．  
Ｐｏｒｔｏｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １０：１０７６，  １９９０．
Ｐｏｔｔｅｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８１：７１６１−７１６５，  １９８４．
Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｃｅｌｌ，  ３５：７４１，  １９８３．
Ｑｕｉｎｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：４７１３，  １９８９．  
Ｒａｙｎｏｒら、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ４４（２）：３８５−３９２，  １９９３．
Ｒｅｄｏｎｄｏら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２４７：１２２５，  １９９０．
Ｒｅｉｓｉｎｅら、Ｍｏｌ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，  ４４：１００８−１０１５，  １９９３．
Ｒｅｉｓｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｔｔｅｒ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：３５７１，  １９８９．
Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １８ｔｈ  Ｅｄ．  Ｍａｃｋ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，  １２８９−１３２９，  １９９０．
Ｒｉｐｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：２２２４，  １９８９．
Ｒｉｐｐｅ，ら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  １０：６８９−６９５，  １９９０．
Ｒｏｓｅｎら、Ｃｅｌｌ  ４１：８１３，  １９８８．
Ｒｏｕｘら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８６：９０７９−９０８３，  １９８９．
Ｓａｈａら、Ｓｅｍｉｎ．  Ｎｕｃｌ．  Ｍｅｄ．，  ２４（４）：３２４−３４９  ，１９９４．
Ｓａｌｍｉｎｅｎら、Ａｃｔａ  Ｏｎｃｏｌ．，  ４１（５）：４２５−９，  ２００２．
Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｉｎ：    Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ，  ２００１．
Ｓａｍｕｌｓｋｉら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．，  ６３：３８２２−３８２８，  １９８９．  
Ｓａｔａｋｅら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：９７０，  １９８８．
Ｓｃｈａｆｆｎｅｒら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２０１：８１，  １９８８．
Ｓｈａｒｐ  ａｎｄ  Ｍａｒｃｉｎｉａｋ，  Ｃｅｌｌ，  ５９：２２９，  １９８９．
Ｓｈａｕｌ  ａｎｄ  Ｂｅｎ−Ｌｅｖｙ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ６：１９１３，  １９８７．
Ｓｈａｙ  ａｎｄ  Ｂａｃｃｈｅｔｔｉ，  Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ，  ３３（５）：７８７−７９１，  １９９７．
Ｓｈａｙら、Ｈｕｍ．  Ｍｏｌ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １０（７）：６７７−６８５，  ２００１．
Ｓｈｅｒｍａｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，９：５０，  １９８９．  
Ｓｌｅｉｇｈ  ａｎｄ  Ｌｏｃｋｅｔｔ，  Ｊ．  ＥＭＢＯ，  ４：３８３１，  １９８５．  
Ｓｏｌｏｄｉｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ３４（４１）：１３５３７−１３５４４，  １９９５．
Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５６：２１８−２２，  １９９６．      
Ｓｐａｌｈｏｌｚら、Ｃｅｌｌ，  ４２：１８３，  １９８５．
Ｓｐａｎｄａｕ  ａｎｄ  Ｌｅｅ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：４２７，  １９８８．
Ｓｐａｎｄｉｄｏｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｅ，  ＥＭＢＯ  Ｊ．，  ２：１１９３，  １９８３．
Ｓｔｅｐｈｅｎｓ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ２４８：１，  １９８７．
Ｓｔｒｕｎｋ  ａｎｄ  Ｓｃｈｉｌｄ，  Ｅｕｒ．  Ｒａｄｉｏｌ．，  １４（６）：１０５５−１０６２，  ２００４．
Ｓｕｌｌｉｖａｎ  ａｎｄ  Ｐｅｔｅｒｌｉｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ７：３３１５，  １９８７．  
Ｓｕｎら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，  ８：１５７２−９，  ２００１．
Ｓｗａｒｔｚｅｎｄｒｕｂｅｒ  ａｎｄ  Ｌｅｈｍａｎ，  Ｊ．  Ｃｅｌｌ．  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，  ８５：１７９，  １９７５．
Ｔａｈａｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５５：２７３４−２７３６，  １９９５．    
Ｔａｋａｋｕｒａら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，  ５９（３）：５５１−７，  １９９９．
Ｔａｋｅｂｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：４６６，  １９８８．
Ｔｈｉｅｒｒｙら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９２（２１）：９７４２−９７４６，  １９９５．
Ｔｈｉｅｓｅｎら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：６１４，  １９８８．
Ｔｊｕｖａｊｅｖら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，    ５８：４３３３−４３４１，  １９９８．    
Ｔｒａｔｓｃｈｉｎら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４：２０７２−２０８１，  １９８４．  
Ｔｒｅｉｓｍａｎ，  Ｃｅｌｌ，  ４６（４）：５６７−１７４，  １９８６
Ｔｒｏｎｃｈｅら、Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．，  ７：１７３，  １９９０．  
Ｔｒｏｎｃｈｅら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ９：４７５９，  １９８９．  
Ｔｒｕｄｅｌ  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉ，  Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．，  ６：９５４，  １９８７．
Ｔｓｕｋａｍｏｔｏら、Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．，  ９（３）：２４３−２４８，  １９９５．
Ｔｕｒ−Ｋａｓｐａら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，  ６：７１６−７１８，  １９８６．
Ｔｙｎｄａｌｌら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ．  Ｒｅｓ．，  ９：６２３１，  １９８１．  
Ｖａｎｎｉｃｅ  ａｎｄ  Ｌｅｖｉｎｓｏｎ，  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  ６２：１３０５，  １９８８．  
Ｖａｓｓｅｕｒら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ．，  ７７：１０６８，  １９８０．
Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  ８８８（２）：２２５−３６，  １９８６．
Ｗｅｂｅｒら、Ｃｅｌｌ，  ３６：９８３，  １９８４．
Ｗｅｉｎｂｅｒｇｅｒら、Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ８：９８８，  １９８４．  
Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，  Ｃｅｌｌ，  ５９：６４９，  １９８９．
Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，  ２７：  ８８７−８９２，  １９８８．
Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．，  ２６２：４４２９−４４３２，  １９８７．
Ｙａｍａｄａら、Ｍｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，  ６：２１３６−２１４２，  １９９２．
Ｙａｍａｄａら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｓｓｏｃ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８９：２５１−２５５，  １９９２．
Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  ４  （９）：９５０−９６０，  １９９７．  
Ｙａｎｇ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ８７：４１４４−４１４８，  １９９０．
Ｙｕｔｚｅｙら、Ｍｏｌ．  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏ．，  ９：１３９７−１４０５，  １９８９．
Ｚｈｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２６１（５１１８）：２０９−２１１，  １９９３。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１】図１Ａ〜１Ｃ。インビトロで評価されるＳＳＴＲ２Ａ遺伝子キメラの発現。ＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットおよびレセプター結合アッセイのすべてが、３０９細胞が３０１細胞よりもレポーター融合タンパク質をより多く発現させることを実証している。ベクターのみが形質移入されたコントロール細胞では、融合タンパク質の発現は見られない。図１Ａ。ベクターが形質移入された細胞（ベクター）または遺伝子キメラが形質移入された細胞（クローン３０１および３０９）のＥＬＩＳＡ。エラーバーは三連のサンプルのＳＤを表す。ウェルあたり３０，０００の細胞を広げた。＊ベクター対３０１  ｐ＜０．０５、＊＊３０１対３０９  ｐ＜０．０５。図１Ｂ。ウエスタンブロット。レーンあたり２０マイクログラムのタンパク質を負荷した。図１Ｃ。レセプター結合アッセイ。（ウェルあたり３×１０４の）細胞を、０．１μＭの１１１Ｉｎ−ｏｃｔまたは０．１μＭの１１１Ｉｎ−ｏｃｔ＋１μＭのソマトスタチンに暴露した。エラーバーは三連のサンプルの標準偏差を表す。ベクター、ベクターが形質移入された細胞；３０１および３０９、遺伝子キメラが形質移入された細胞。＊ベクター対３０１  ｐ＜０．０５、＊＊３０１対３０９  ｐ＜０．０５。
【図２】１１１Ｉｎ−ｏｃｔの静脈内投与後の生体内分布。３０９細胞に由来する腫瘍は、３０１細胞およびベクターが形質移入された細胞に由来する腫瘍よりも、放射性医薬品の生体内分布が広いことが分かる。エラーバーは標準偏差（ｎ＝６匹のマウス）を表す。＊ベクター対３０１  ｐ＜０．０５、＊＊３０１対３０９  ｐ＜０．０５。
【図３】図３Ａ〜３Ｇ。ガンマ線カメラによる画像化。二次元画像化およびＳＰＥＣＴ画像化の両方によって、遺伝子キメラを発現する腫瘍が可視化できるのに対して、ベクターが形質移入された細胞に由来する腫瘍は可視化できない。（両肩と右太腿に）皮下腫瘍を有するマウスに１１１Ｉｎ−ｏｃｔ（１３ＭＢｑ）を静脈注射し、２４時間後に、二次元画像化（図３Ａ）およびＳＰＥＣＴ画像化（図３Ｂ、冠状；図３Ｃ、軸方向；図３Ｄ、矢状面）によって画像化した。クローン３０９（矢印）、３０１（白矢印）、またはベクター（黄矢印）が形質移入された細胞に由来する皮下腫瘍は、それぞれ右肩、左肩、または右太腿である。腫瘍３０９を中心として、三つのすべての断層面を揃える。この図における二次元画像およびＳＰＥＣＴ画像は、代表的な同一のマウスのものである。図３Ｅおよび図３Ｆ、摘出された腫瘍における総数と、二次元画像化（図３Ｅ、ｎ＝１８）またはＳＰＥＣＴ（図３Ｆ、ｎ＝１８）画像化のＲＯＩ分析から導かれる測定値とは関連性がある。Ｇ、二次元画像上の目的物のサイズは、目的物の実際の解剖学的なサイズと無関係であってもよい。１１１Ｉｎ−塩化物の連続的な１：１希釈液（９３〜０．３μＣｉ）の５００マイクロリットルを含む同一のサイズの偽像（下）とその二次元画像（上）。
【図４】図４Ａ〜Ｃ。ヌードマウスのＭＲ画像化。ＭＲは、目的物の解剖学的なサイズを明確にし、内部でのその形態を明示することができる。図４Ａ、右太腿における皮下腫瘍（矢印）の代表的なＴ２  ＦＳＥ画像。矢印は膀胱を特定している。図４Ｂ、ＭＲ画像化から導かれる重量は、摘出された腫瘍（ｎ＝１８）の重量と関連する。図４Ｃ、左肩における皮下腫瘍の代表的なＴ２  ＦＳＥ画像。矢印は、腫瘍内のフルーイド−デブリスレベルの一つを示している。ＭＲについては、マウスの腹部上をスキャンした。フルーイド−デブリスレベル（図４Ｃ）を明示するために、それらの画像（図４Ａおよび図４Ｃ）をこの位置設定に反映させる。４．７Ｔの磁石でのＴ２  ＦＳＥ画像化では、次のパラメーターを含んでいた：ＴＥ  ４１２０ｍｓｅｃ、ＴＲ  ７２ｍｓｅｃ、４  Ｎｅｘ、視野  ３．５ｃｍ、切片の厚さ  ０．３ｍｍの間隔を空けての１ｍｍ、マトリクス  ２５６×２５６、分解能  １３６ミクロン。
【図５】図５Ａ〜５Ｂ。侵襲的方法および非侵襲的方法による取り込みの相関性。摘出された腫瘍の％Ｉ．Ｄ．／ｇは、ＭＲ画像化と組み合わせた二次元（図５Ａ、ｎ＝１８）画像化またはＳＰＥＣＴ（図５Ｂ、ｎ＝１８）画像化から導かれる％Ｉ．Ｄ．／ｇと関連性がある。
【図６】図６Ａ〜６Ｄ。侵襲的方法によって評価される生体内分布は、非侵襲的方法によって評価される生体内分布と一致する。腫瘍の重量に正規化された摘出された腫瘍における１１１Ｉｎ−ｏｃｔの生体内分布（図６Ａ）またはＭＲに導かれて修正された重量（図６Ｂ）。ＭＲに導かれて修正された重量と組み合わせた二次元（図６Ｃ）画像化またはＳＰＥＣＴ（図６Ｄ）画像化によって評価された時の、腫瘍内の１１１Ｉｎ−ｏｃｔの生体内分布。エラーバーは標準偏差（ｎ＝６）を表す。ベクター、ベクターが形質移入された細胞に由来する腫瘍；３０９および３０１、遺伝子キメラを発現する細胞に由来する腫瘍。＊ベクター対３０１  ｐ＜０．０５、＊＊３０１対３０９  ｐ＜０．０５。
【図７】図７Ａ〜７Ｄ。エクスビボで評価されるＳＳＴＲ２Ａ遺伝子キメラの発現。代表的な腫瘍のエクスビボ分析から、３０９細胞に由来する腫瘍が、３０１細胞に由来する腫瘍よりも多くのレポーター融合タンパク質を発現すること、およびベクターのみが形質移入されたコントロール細胞に由来する腫瘍では、発現が見られないことが立証される。図７Ａ。融合タンパク質のＨＡタグ部分に対する抗体を用いる腫瘍組織のウエスタンブロット。腫瘍から抽出されたタンパク質をレーンあたり５０マイクログラム負荷した。図７Ｂ、図７Ｃ、図７Ｄ。融合タンパク質のＨＡタグ部分に対する抗体を用いる腫瘍の免疫染色。（図７Ｂ）ベクター、ベクターが形質移入された細胞に由来する腫瘍；（図７Ｃ）３０１および（図７Ｄ）３０９、遺伝子キメラを発現する細胞に由来する腫瘍。
【図８】図８Ａ〜８Ｂ。ＥＧＦＰ−ナノ粒子の全身注射によるマウスの種々の組織におけるＥＧＦＰの発現。図８Ａ。１０６  Ｎ４１７細胞のヌードマウス内の胸郭内注射により、肺Ｎ４１７腫瘍を確立した。静脈内注射による種々のＥＧＦＰ−ナノ粒子（２０μｇのＤＮＡ：４０ｎｍｍｏｌのＤＯＴＡＰ：Ｃｈｏｌ／マウス）で、マウスを処理した。注射から４８時間後に動物を殺処分し、直ちに腫瘍、腎臓、脾臓、肺、および肝臓の新鮮な凍結サンプルを調製した。凍結切片を４％のパラホルムアルデヒドで固定し、ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡下で直ちに調査した。ｈＴＭＣ、ヒトＴＥＲＴ−ミニＣＭＶプロモーター。図８Ｂ。ＦＡＣＳ分析による、腫瘍および正常なマウスの組織におけるＥＧＦＰ発現の定量。
【図９】図９Ａ〜９Ｄ。図９Ａ。ＨＴ１０８０形質移入体におけるＳＳＲＴ２Ａ融合タンパク質発現の免疫蛍光画像分析。図９Ｂ。Ａに示される、対応するＳＳＲＴ２Ａ発現（Ａ、Ｂ、Ｃ）細胞および非発現（Ｄ）細胞から接種された皮下腫瘍を有するヌードマウスのガンマ線カメラによる画像化。１１１−Ｉｎ−オクトレオチド（１３ＭＢｑ）を動物に静脈内注射し、２４時間後に画像化した。図９Ｃ。ｐＬＪ２９０／ＦＵＳ１−ＩＲＥＳ−ＳＳＲＴ２Ａプラスミドが形質移入されたＨ１２９９細胞における、ＳＳＲＴ２ＡとＦＵＳ１との同時発現。図９Ｄ。図９Ｂで例示された腫瘍によるラジオトレーサーの取り込みの相関性。％ＩＤ／ｇ＝グラムあたりの注射された量％。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄ。ガンの遺伝子治療および分子の画像化のための、ＦＵＳ１およびＳＳＲＴ２Ａを発現するプラスミドベクターの構築物。ｈＴＭＣ、ヒトＴＥＲＴ−ミニＣＭＶプロモーター。ＩＲＥＳ、内部リボソーム侵入部位。ＨＡ、ヘマグルチニンドメイン。アミノ酸３１４以降（デルタ３１４）が欠失したＨＡ−ＳＳＴＲ２ＡをＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａと交換してもよい。
【図１１】増幅されたｈＴＥＲＴが媒介するＨＡ−ＳＳＴＲ２の発現のためのアデノウイルス構築物のマップ。この構築物は、ｈＴＥＲＴプロモーター、ＧＡＬ／ＶＰ１６、ＧＡＬ結合部位、ならびにヘマグルチニンＡタグおよび増幅されたｈＴＥＲＴが媒介するＨＡ−ＳＳＴＲ２の発現のためのソマトスタチンレセプター  タイプ２Ａ（ＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ）からなる遺伝子キメラを含む。アミノ酸３１４（デルタ３１４）以降が欠失したＨＡ−ＳＳＴＲ２ＡをＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａと交換してもよい。
【図１２】テロメラーゼアッセイから、ＩＭＲ９０細胞ではなく、ＨＴ１０８０細胞における活性が実証される。ＨＴ１０８０細胞またはＩＭＲ９０細胞に由来する抽出物を用いて、テロメラーゼアッセイを実施した。ＨＴ１０８０細胞に関しては、６塩基対のリピートラダーがテロメラーゼ活性である。ネガティブコントロールとして、ＨＴ１０８０細胞の抽出物をＲＮアーゼで処理した。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｂ。ヒトテロメラーゼプロモーターおよびＧＡＬ４ＶＰ１６増幅系を含むアデノウイルスを感染させた後の、細胞膜で発現したＨＡ−ＳＳＴＲ２融合タンパク質の細胞内分布が記録されている。個々のヒト線維肉腫細胞、ＨＴ１０８０（図１３Ａ）、これらはテロメラーゼを発現する、において、ヒト線維肉腫線維芽細胞、ＩＭＲ−９０、これらはテロメラーゼを発現しない、よりも相対的に発現が向上していることが分かる（図１３Ｂ）。
【図１４】ヒトテロメラーゼプロモーターおよびＧＡＬＶＰ１６増幅系を含むアデノウイルスを感染させた結果、テロメラーゼを発現する細胞（ＨＴ１０８０、ヒト線維肉腫）が、テロメラーゼを発現しない細胞（ＩＭＲ−９０、ヒト線維肉腫）よりも多くのＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ／感染細胞を発現させる。
【図１５】プラスミドマップ。増幅されたｈＴＭＣプロモーターにより作動することで、ＳＳＴＲ２ＡおよびＦＵＳ１の両者の発現が連鎖する。この構築物は、ヒトテロメラーゼプロモーター（ｈＴＥＲＴ）、ミニサイトメガロウイルス（ミニＣＭＶ）プロモーター、ＦＵＳ１遺伝子、内部リボソーム侵入部位、ならびにヘマグルチニンＡタグおよび増幅されたｈＴＥＲＴが媒介するＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａに結合したＦＵＳ１（目的の遺伝子）の発現のためのソマトスタチンレセプター  タイプ２Ａ（ＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ）からなる遺伝子キメラを含む。
【図１６】ヒトミニＣＭＶ−ｈＴＥＲＴ（ｈＴＭＣ）プロモーターは、ｈＴＥＲＴプロモーターによる組織特異的発現を向上させる。Ｎ４１７細胞に由来する胸郭内腫瘍を有するマウスに、プラスミド−リポプレックス（２０マイクログラムのＤＮＡ：４０ｎｍｏｌのＤＯＴＡＰ：コレステロール／マウス）を静脈注射した。ＣＭＶプロモーター−高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）を含むプラスミドは、結果的に腫瘍および正常な組織において発現した。ｈＴＥＲＴに基づくプロモーターを含むプラスミドは、結果的に腫瘍において発現したが、正常な組織では全くまたは最低限しか発現しなかった。ｈＴＭＣプロモーターは結果的に、増幅されなかったｈＴＥＲＴプロモーターよりも多量に、腫瘍に特異的な発現を行わせた。
【図１７】ｈＴＭＣプロモーターまたはＣＭＶプロモーターによって作動することで、ＳＳＴＲ２ＡおよびＦＵＳ１の両者の発言が連鎖してもよい。従って、治療用遺伝子のＦＵＳ１などの目的の遺伝子と共に、ＨＡ−ＳＳＴＲ２または関連遺伝子が発現してもよい。ＣＭＶプロモーター−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物を含むプラスミドが形質移入された肺ガン細胞Ｈ１２９９は結果的に、ＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ融合タンパク質が発現する。ｈＴＭＣプロモーターＦＵＳ１−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物を含むプラスミドが形質移入されたＨ１２９９細胞は結果的に、ＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａ融合タンパク質およびＦＵＳ１の両方が発現する。ＣＭＶプロモーターＦＵＳ１−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物を含むプラスミドが形質移入されたＨ１２９９細胞は結果的に、ＨＡ−ＳＳＴＲ２融合タンパク質およびＦＵＳ１の両方が発現する。Ｈ１２９９細胞は一時的に形質移入され、７２時間後の蛍光について評価された。ＨＡ−ドメインを標的とする抗体を介してＨＡ−ＳＳＴＲ２融合タンパク質を可視化すると、予想どおりに、細胞膜で発現することが分かる。ＦＵＳ１に対する抗体を介してＦＵＳ１を可視化した。重ね合わせは、核染色とＨＡ−ＳＳＴＲ２との共存（ＣＭＶ−ＨＡ−ＳＳＴＲ２）、または内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を介して発現するためにＦＵＳ１とＨＡ−ＳＳＴＲ２が結合している場合での核染色、ＨＡ−ＳＳＴＲ２、およびＦＵＳ１の共存を明示する。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂ。Ｇａｌ４−ＶＰ１６系によって増幅したｈＴＥＲＴプロモーターは結果的に、腫瘍に特異的な発現をインビボで行わせる。図１８Ａ：ＣＭＶプロモーター−緑色蛍光タンパク質挿入物（ネガティブコントロール、左）を含むアデノウイルスをヌードマウスの尾静脈に注射すると、結果的に肝臓でＨＡ−ＳＳＴＲ２Ａは発現しない。１１１−Ｉｎ−オクトレオチドの正常なウォッシュアウトは、腎臓を介して見られる。ＣＭＶプロモーター−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物（ポジティブコントロール、中央）を含むアデノウイルスを注射したヌードマウスは結果的に、肝臓で発現する。ｈＴＥＲＴプロモーター−ＧＡＬ４／ＶＰ１６プロモーター−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物（右）を含むアデノウイルスを注射したヌードマウスは結果的に、肝臓では発現せず、従って、正常な組織での発現は見られない。図１８Ｂ：（ＨＴ１０８０細胞に由来する）ヒト線維肉腫を有するヌードマウスの左側の腫瘍に、ｈＴＥＲＴプロモーター−ＧＡＬ４／ＶＰ１６プロモーター−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物を含むアデノウイルスをその腫瘍に注射するか、またはその右側の腫瘍に、ＣＭＶプロモーター−ＨＡ−ＳＳＴＲ２挿入物を含むアデノウイルスをその腫瘍に注射した。両方の腫瘍において、発現を可視化する。マウスにウイルスを注射し、二日後に１１１−Ｉｎ−オクトレオチドを注射した。その翌日に二次元画像化を実施した。代表的な画像を示す。
【図１】
2008532519.tif 000003
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ−Ｄ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2008532519.tif 000013
【図１２】
2008532519.tif 000014
【図１３Ａ−Ｂ】
2008532519.tif 000015
【図１４】
2008532519.tif 000016
【図１５】
2008532519.tif 000017
【図１６】
2008532519.tif 000018
【図１７】
2008532519.tif 000019
【図１８】
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【配列表】
2008532519000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月20日(2007.12.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組み換えソマトスタチンレセプター（ＳＳＴＲ）のアミノ酸配列をコードするコーディング領域を含む核酸分子であって、該コーディング領域が組織選択的プロモーターの配列に作動するように結合し、組み換えＧＰＣＲが、Ｃ末端の欠失を有するか、内部移行の変化を有するか、細胞内シグナル伝達に欠陥を有するか、またはそれらの組み合わせを有する、核酸分子。
【請求項２】
前記ソマトスタチンレセプターがソマトスタチンレセプター  タイプ２Ａ（ＳＳＴＲ２Ａ）である、請求項１の核酸。
【請求項３】
前記ＳＳＴＲ２Ａが、シグナル伝達に欠陥を有するか、内部移行の変化を有するか、またはそれらの組み合わせを有する、請求項２の核酸。
【請求項４】
前記ＳＳＴＲ２Ａが切断されている、請求項３の核酸。
【請求項５】
前記ＳＳＴＲ２Ａのアミノ酸３１４までのカルボキシ末端が切断されている、請求項４の核酸。
【請求項６】
前記プロモーター配列が、テロメラーゼプロモーター、ヒトテロメラーゼＲＮＡ（ｈＴＲ）プロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター（ｈＴＥＲＴ）プロモーター、増幅メカニズムに作動するように結合しているｈＴＲ、または増幅メカニズムに作動するように結合しているｈＴＥＲＴである、請求項１〜５の核酸。
【請求項７】
前記組織選択的プロモーターまたは増幅された組織特異的プロモーターが、正常なおよび／または罹患した心臓、肺、食道、筋肉、腸、胸部、前立腺、胃、膀胱、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、神経細胞、筋細胞、白血球、不死化細胞、新形成性細胞、腫瘍細胞、ガン細胞、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、唾液腺、胆嚢、膀胱、気管、喉頭、咽頭、大動脈、動脈、毛細血管、静脈、胸腺、リンパ節、骨髄、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、脳、大脳、小脳、延髄、橋、脊髄、神経、骨格筋、平滑筋、骨、精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、陰茎、卵巣、子宮、乳腺、膣、皮膚、眼、視神経、同一の胚起源に由来する組織において活性であるプロモーターまたは同一のもしくは類似の疾患によって影響を受ける一以上の組織において活性である、請求項１〜６の核酸。
【請求項８】
前記組織選択的プロモーターが、新形成性細胞、腫瘍細胞またはガン細胞において活性である、請求項７の核酸。
【請求項９】
前記ガン細胞が、乳ガン細胞、肺ガン細胞、前立腺ガン細胞、卵巣ガン細胞、脳のガン細胞、肝臓ガン細胞、子宮頸ガン細胞、結腸ガン細胞、腎臓ガン細胞、皮膚ガン細胞、頭頸部ガン細胞、骨のガン細胞、食道ガン細胞、膀胱ガン細胞、子宮ガン細胞、リンパのガン細胞、胃ガン細胞、膵臓ガン細胞、精巣ガン細胞、リンパ腫細胞、または白血病細胞である、請求項８の核酸。
【請求項１０】
前記プロモーター配列が、ｈＴＲプロモーター配列、ｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、ＡＦＰプロモーター配列、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−４、ムチン様糖タンパク質、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕオンコジーン、シクロオキシゲナーゼ、Ｅ２Ｆ転写因子１、チロシナーゼ関連タンパク質、チロシナーゼ、もしくはサバイビン、Ｔｃｆ１−アルファ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、サイクリンＥ、Ｃｄｃ２５Ａ、ＨＫ  ＩＩ、ＫＲＴ１９、ＴＦＦ１、ＳＥＬ１Ｌ、またはＣＥＬである、請求項８の核酸。
【請求項１１】
前記プロモーター配列が、ガン細胞において機能するｈＴＥＲＴプロモーター配列である、請求項１０の核酸。
【請求項１２】
前記プロモーター配列が、免疫グロブリン重鎖プロモーター配列、免疫グロブリン軽鎖プロモーター配列、Ｔ細胞レセプタープロモーター配列、ＨＬＡ  ＤＱ  ａプロモーター配列、ＨＬＡ  ＤＱ  ベータプロモーター配列、ベータ−インターフェロンプロモーター配列、インターロイキン−２プロモーター配列、インターロイキン−２レセプタープロモーター配列、ＭＨＣクラスＩＩ  ５プロモーター配列、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−Ｄｒａプロモーター配列、ベータ−アクチンプロモーター配列、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター配列、プレアルブミン（トランスサイレチン）プロモーター配列、エラスターゼＩプロモーター配列、メタロチオネイン（ＭＴＩＩ）プロモーター配列、コラゲナーゼプロモーター配列、アルブミンプロモーター配列、アルファ−フェトプロテインプロモーター配列、ガンマ−グロビンプロモーター配列、ベータ−グロビンプロモーター配列、ｃ−ｆｏｓプロモーター配列、ｃ−ＨＡ−ｒａｓプロモーター配列、インスリンプロモーター配列、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）プロモーター配列、アルファ−１−アンチトリプシンプロモーター配列、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストンプロモーター配列、Ｉ型コラーゲンプロモーター配列、ＧＲＰ９４プロモーター配列、ＧＲＰ７８プロモーター配列、その他のグルコース調節タンパク質プロモーター配列、成長ホルモンプロモーター配列、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）プロモーター配列、トロポニンＩ（ＴＮ  Ｉ）プロモーター配列、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター配列、デュシェンヌ型筋ジストロフィープロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ポリオーマプロモーター配列、レトロウイルスプロモーター配列、パピローマウイルスプロモーター配列、Ｂ型肝炎ウイルスプロモーター配列、ヒト免疫不全ウイルスプロモーター配列、テナガザル白血病ウイルスプロモーター配列、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子プロモーター配列、ソマトスタチンレセプタープロモーター配列、マウス精巣上体のレチノイン酸結合遺伝子プロモーター配列、ヒトＣＤ４プロモーター配列、マウスアルファ２（ＸＩ）コラーゲンプロモーター配列、Ｄ１Ａドーパミンレセプタープロモーター配列、インスリン様成長因子ＩＩプロモーター配列、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１プロモーター配列、ヒトアルファ−ラクトアルブミンプロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、５Ｓリボソームプロモーター配列、アルファ  フェトプロテイン、細菌のＬＰＳに対する単球レセプター、ロイコシアリン、シアロフォリン、白血球共通抗原、マクロシアリンもしくはマクロシアリンのヒトアナログ、デスミン、エラスターゼ、エラスターゼＩ、エンドグリン、フィブロネクチン、ＶＥＧＦレセプター、グリア線維酸性タンパク質、細胞間接着分子２、インターフェロンベータ、ミオグロビン、オステオカルシン２、前立腺特異抗原、前立腺特異的膜抗原、サーファクタントタンパク質Ｂ、シナプシン、チロシナーゼ関連タンパク質、チロシナーゼ、または任意の組織／疾患／系統特異的プロモーター配列の機能性ハイブリッド、機能性部分、もしくはその組み合わせである、請求項７��核酸。
【請求項１３】
前記組織選択的プロモーター配列がコアプロモーター配列に作動するように結合している、請求項１〜６の核酸。
【請求項１４】
前記コアプロモーター配列が、ユビキチンプロモーター、アクチンプロモーター、伸長因子１アルファ、初期成長因子応答１、真核生物開始因子４Ａ１、フェリチン重鎖、フェリチン軽鎖、グリセルアルデヒド３リン酸デヒドロゲナーゼ、グルコース調節タンパク質７８、グルコース調節タンパク質９４、熱ショックタンパク質７０、熱ショックタンパク質９０、ベータ−キネシン、ホスホグリセリン酸キナーゼ、ユビキチンＢ、ベータ−アクチンまたはウイルスの最小プロモーターの配列などの構成的プロモーターに由来する、請求項１３の核酸。
【請求項１５】
前記ウイルスの最小プロモーター配列が、ＲＮＡウイルスプロモーター、ＤＮＡウイルスプロモーター、アデノウイルスプロモーター配列、バキュロウイルスプロモーター配列、ＣＭＶプロモーター配列、パルボウイルスプロモーター配列、ヘルペスウイルスプロモーター配列、ポックスウイルスプロモーター配列、アデノ関連ウイルスプロモーター配列、セムリキ森林ウイルスプロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ワクシニアウイルスプロモーター配列、レンチウイルスプロモーター、またはレトロウイルスプロモーター配列である、請求項１４の核酸。
【請求項１６】
前記ウイルスの最小プロモーター配列がミニＣＭＶプロモーター配列である、請求項１５の核酸。
【請求項１７】
前記組織選択的プロモーターがｈＴＥＲＴプロモーターである、請求項１６の核酸。
【請求項１８】
前記ｈＴＥＲＴプロモーターが第一のレポーターに作動するように結合している、請求項１７の核酸。
【請求項１９】
第二のコード配列をさらに含む核酸であって、該第二のコード配列が、治療剤、選択マーカー、組み換えトランス活性化因子、または第二の画像化遺伝子（レポーター）をコードする、請求項１８の核酸。
【請求項２０】
ＳＳＴＲ２である第一のレポーターと、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である第二のレポーターとを含む、請求項１９の核酸。
【請求項２１】
第二の組織選択的プロモーターの配列、または増幅された組織特異的プロモーターもしくはＣＭＶプロモーターなどの非選択的プロモーターに作動するように結合している第二のコード配列をさらに含む、請求項１〜６の核酸。
【請求項２２】
前記第二のコード配列が、治療剤、選択マーカー、組み換えトランス活性化因子、または第二の画像化遺伝子（レポーター）をコードする、請求項１９の核酸。
【請求項２３】
前記治療剤が、腫瘍抑制因子、アポトーシス誘導物質、酵素、構造タンパク質、レセプター、抗体、抗体断片、ｓｉＲＮＡ、ホルモン、パラクリン因子、または免疫賦活剤である、請求項２２の核酸。
【請求項２４】
前記腫瘍抑制因子がＦＵＳ１である、請求項２３の核酸。
【請求項２５】
前記選択マーカーが、薬剤選択マーカー、酵素、構造タンパク質、レセプター、パラクリン因子、免疫学的マーカー、または蛍光タンパク質である、請求項２２の核酸。
【請求項２６】
第二のコード配列をさらに含む核酸であって、該第二のコード配列と前記レポーターをコードする核酸とが作動するように結合している、請求項１の核酸。
【請求項２７】
第二のコード配列をさらに含む核酸であって、該第二のコード配列と前記組み換えＧＰＣＲのアミノ酸配列をコードする核酸とが二方向性のプロモーターに作動するように結合している、請求項１の核酸。
【請求項２８】
第二のコード配列をさらに含む核酸であって、該第二のコード配列と前記組み換え七回膜貫通型Ｇタンパク質結合レセプターのアミノ酸配列をコードする核酸とがＩＲＥＳによって分離されている、請求項１の核酸。
【請求項２９】
前記第二のコード配列が、治療剤、選択マーカー、またはレポーターをコードする、請求項２６〜２８の核酸。
【請求項３０】
前記治療剤が、腫瘍抑制因子、アポトーシス誘導物質、酵素、抗体、ホルモン、または免疫賦活剤である、請求項２９の核酸。
【請求項３１】
前記腫瘍抑制因子がＦＵＳ１である、請求項３０の核酸。
【請求項３２】
前記選択マーカーが、薬剤選択マーカー、酵素、免疫学的マーカー、または蛍光タンパク質である、請求項２９の核酸。
【請求項３３】
前記ＧＰＣＲアミノ酸配列のＮ末端またはＣ末端に融合したタンパク質タグをさらに含む、請求項１〜６の核酸。
【請求項３４】
前記タンパク質タグが酵素活性を有する、請求項３３の核酸。
【請求項３５】
前記タンパク質タグが、ヘマグルチニンＡ、ベータ−ガラクトシダーゼ、チミジンキナーゼ、トランスフェリン、ｍｙｃタグ、ＶＰ１６、（Ｈｉｓ）６タグ、ＦＬＡＧ、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼである、請求項３４の核酸。
【請求項３６】
組み換えトランス活性化因子と結合するプロモーター配列に作動するように結合している核酸配列であって、被験体内で非侵襲的方法によって検出可能なレポーターをコードする核酸配列を含む核酸。
【請求項３７】
前記組み換えトランス活性化因子がＧａｌ４ＶＰ１６である、請求項３６の核酸。
【請求項３８】
第二のコード配列をさらに含む、請求項３６の核酸。
【請求項３９】
前記レポーターをコードする配列と前記第二のコード配列とがＩＲＥＳによって分離されている、請求項３６の核酸。
【請求項４０】
前記第二のコード配列が、治療剤、選択マーカー、またはレポーターをコードする、請求項３８の核酸。
【請求項４１】
組織選択的プロモーターに作動するように結合している第三のコード配列をさらに含む核酸配列であって、該第三のコード配列が組み換えトランス活性化因子をコードする、請求項３８の核酸配列。
【請求項４２】
前記第二のコード配列が組織選択的プロモーターに作動するように結合している核酸であって、該第二のコード配列が組み換えトランス活性化因子をコードする、請求項３８の核酸。
【請求項４３】
送達ビヒクル内に含まれる、請求項３６の核酸。
【請求項４４】
前記送達ビヒクルが、脂質、リポソーム、プラスミド、ウイルスベクター、ファージ、ポリリシンなどのポリアミノ酸、原核細胞、または真核細胞である、請求項４３の核酸。
【請求項４５】
被験体内で細胞を画像化または治療するための組成物であって：
該組成物は、組織選択的プロモーターまたは増幅された組織特異的プロモーターに作動するように結合した、インビボで非侵襲的方法を用いて検出可能なレポーターをコードする核酸を含み、該組成物は、該被験体への導入に適し、ここで該被験体を、該レポーターと選択的に相互作用する非侵襲的画像化技術または治療剤に供することが意図される、組成物。
【請求項４６】
前記治療剤が、放射線治療薬、ｓｉＲＮＡ、プロドラッグ、または化学療法薬である、請求項４５の組成物。
【請求項４７】
前記組織選択的プロモーターが、正常または罹患した心臓、肺、食道、筋肉、腸、胸部、前立腺、胃、膀胱、肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、神経細胞、筋細胞、白血球、不死化細胞、新形成性細胞、腫瘍細胞、ガン細胞、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結腸、直腸、唾液腺、胆嚢、膀胱、気管、喉頭、咽頭、大動脈、動脈、毛細血管、静脈、胸腺、リンパ節、骨髄、下垂体、甲状腺、副甲状腺、副腎、脳、大脳、小脳、延髄、橋、脊髄、神経、骨格筋、平滑筋、骨、精巣、精巣上体、前立腺、精嚢、陰茎、卵巣、子宮、乳腺、膣、皮膚、眼、視神経、同一の胚起源に由来する組織または同一のもしくは類似の疾患によって影響を受ける組織において活性である、請求項４５の組成物。
【請求項４８】
前記組織選択的プロモーターが、新形成性細胞、腫瘍細胞、またはガン細胞おいて活性である、請求項４７の組成物。
【請求項４９】
前記ガン細胞が、乳ガン細胞、肺ガン細胞、前立腺ガン細胞、卵巣ガン細胞、脳のガン細胞、肝臓ガン細胞、子宮頸ガン細胞、結腸ガン細胞、腎臓ガン細胞、皮膚ガン細胞、頭頸部ガン細胞、骨のガン細胞、食道ガン細胞、膀胱ガン細胞、子宮ガン細胞、リンパのガン細胞、胃ガン細胞、膵臓ガン細胞、精巣ガン細胞、リンパ腫細胞、または白血病細胞である、請求項４８の組成物。
【請求項５０】
前記プロモーター配列が、ｈＴＲ、ｈＴＥＲＴプロモーター配列、ＣＥＡプロモーター配列、ＰＳＡプロモーター配列、プロバシンプロモーター配列、ＡＲＲ２ＰＢプロモーター配列、ＡＦＰプロモーター配列、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−４、ムチン様糖タンパク質、Ｃ−ｅｒｂＢ２／ｎｅｕオンコジーン、シクロオキシゲナーゼ、Ｅ２Ｆ転写因子１、チロシナーゼ関連タンパク質、チロシナーゼ、もしくはサバイビン、Ｔｃｆ１−アルファ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、サイクリンＥ、Ｃｄｃ２５Ａ、ＨＫ  ＩＩ、ＫＲＴ１９、ＴＦＦ１、ＳＥＬ１Ｌ、またはＣＥＬである、請求項４８の組成物。
【請求項５１】
前記プロモーター配列がｈＴＥＲＴプロモーター配列である、請求項５０の組成物。
【請求項５２】
前記プロモーター配列が、免疫グロブリン重鎖プロモーター配列、免疫グロブリン軽鎖プロモーター配列、Ｔ細胞レセプタープロモーター配列、ＨＬＡ  ＤＱ  ａプロモーター配列、ＨＬＡ  ＤＱ  ベータプロモーター配列、ベータ−インターフェロンプロモーター配列、インターロイキン−２プロモーター配列、インターロイキン−２レセプタープロモーター配列、ＭＨＣクラスＩＩ  ５プロモーター配列、ＭＨＣクラスＩＩ  ＨＬＡ−Ｄｒａプロモーター配列、ベータ−アクチンプロモーター配列、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモーター配列、プレアルブミン（トランスサイレチン）プロモーター配列、エラスターゼＩプロモーター配列、メタロチオネイン（ＭＴＩＩ）プロモーター配列、コラゲナーゼプロモーター配列、アルブミンプロモーター配列、アルファ−フェトプロテインプロモーター配列、ガンマ−グロビンプロモーター配列、ベータ−グロビンプロモーター配列、ｃ−ｆｏｓプロモーター配列、ｃ−ＨＡ−ｒａｓプロモーター配列、インスリンプロモーター配列、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）プロモーター配列、アルファ−１−アンチトリプシンプロモーター配列、Ｈ２Ｂ（ＴＨ２Ｂ）ヒストンプロモーター配列、Ｉ型コラーゲンプロモーター配列、ＧＲＰ９４プロモーター配列、ＧＲＰ７８プロモーター配列、その他のグルコース調節タンパク質プロモーター配列、成長ホルモンプロモーター配列、ヒト血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）プロモーター配列、トロポニンＩ（ＴＮ  Ｉ）プロモーター配列、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）プロモーター配列、デュシェンヌ型筋ジストロフィープロモーター配列、ＳＶ４０プロモーター配列、ポリオーマプロモーター配列、レトロウイルスプロモーター配列、パピローマウイルスプロモーター配列、Ｂ型肝炎ウイルスプロモーター配列、ヒト免疫不全ウイルスプロモーター配列、サイトメガロウイルスプロモーター配列、テナガザル白血病ウイルスプロモーター配列、ヒトＬＩＭＫ２遺伝子プロモーター配列、ソマトスタチンレセプタープロモーター配列、マウス精巣上体のレチノイン酸結合遺伝子プロモーター配列、ヒトＣＤ４プロモーター配列、マウスアルファ２（ＸＩ）コラーゲンプロモーター配列、Ｄ１Ａドーパミンレセプタープロモーター配列、インスリン様成長因子ＩＩプロモーター配列、ヒト血小板内皮細胞接着分子−１プロモーター配列、ヒトアルファ−ラクトアルブミンプロモーター配列、７ＳＬプロモーター配列、ヒトＹプロモーター配列、ヒトＭＲＰ−７−２プロモーター配列、５Ｓリボソームプロモーター配列、アルファ  フェトプロテイン、細菌のＬＰＳに対する単球レセプター、ロイコシアリン、シアロフォリン、白血球共通抗原、マクロシアリンもしくはマクロシアリンのヒトアナログ、デスミン、エラスターゼ、エラスターゼＩ、エンドグリン、フィブロネクチン、ＶＥＧＦレセプター、グリア線維酸性タンパク質、細胞間接着分子２、インターフェロンベータ、ミオグロビン、オステオカルシン２、前立腺特異抗原、前立腺特異的膜抗原、サーファクタントタンパク質Ｂ、シナプシン、チロシナーゼ関連タンパク質、チロシナーゼ、または任意の組織、疾患、もしくは系統特異的プロモーター配列の機能性ハイブリッド、機能��部分、もしくはその組み合わせである、請求項４８の組成物。
【請求項５３】
非侵襲的画像化が、前記細胞と検出可能部位との間の会合を分析することによって、前記レポーターの発現を検出する工程を含む、請求項４５の組成物。
【請求項５４】
前記レポーターを発現する細胞と検出可能部位との間の会合が、該細胞による検出可能部位の結合、該検出可能部位に作動するように結合するリガンドの該細胞による結合、該検出可能部位の細胞への取り込み、または該検出可能部位に作動するように結合するリガンドの細胞への取り込みを含む、請求項５３の組成物。
【請求項５５】
前記検出可能部位が、タンパク質、放射性同位体、フルオロフォア、可視光放出フルオロフォア、近赤外光放出フルオロフォア、赤外光発光性フルオロフォア、金属、強磁性体、特有のＭＲ分光学的特性を有する物質、Ｘ線吸収性もしくは反射性の物質、音響を変化させる物質、または電磁波を放射する物質である、請求項５３の組成物。
【請求項５６】
前記検出可能部位が、前記レポーターに特異的に結合するリガンドに作動するように結合している、請求項５３の組成物。
【請求項５７】
前記リガンドが、ＤＮＡ分子もしくはＲＮＡ分子などの核酸、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、抗体、抗体断片、または小分子である、請求項５６の組成物。
【請求項５８】
非侵襲的方法が、ＭＲＩ、ＭＲ分光法、エックス線造影法、ＣＴ、超音波診断法、平面状のガンマ線カメラによる画像化、ＳＰＥＣＴ、ＰＥＴ、その他の核医学に基づく画像化、可視光を用いる光学的画像化、ルシフェラーゼを用いる光学的画像化、フルオロフォアを用いる光学的画像化、その他の光学的画像化、近赤外光を用いる画像化、または赤外光を用いる画像化を含む、請求項４５の組成物。
【請求項５９】
前記被験体がガン患者である、請求項４５の組成物。
【請求項６０】
前記核酸がガン患者を治療するための治療剤をコードする、請求項５９の組成物。
【請求項６１】
前記ガン患者が第二の抗ガン治療を受ける、請求項６０の組成物。
【国際調査報告】
2008532519.tif 000021
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