(57)【要約】  本発明は、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）の基質として適切である、式（Ｉ）［式中、Ｒ1は、水素、低級アルキル、ハロゲン、シアノ、トリフルオロメチルまたはアジドであり；Ｒ2は、リンカーであり；Ｌは、標識、または同じであるか、もしくは異なる複数の標識である］で示されるピリミジンに関する。本発明は、更に、標識を、式（Ｉ）のピリミジンからＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）およびＡＧＴ融合タンパク質に移転する方法にも関する。
2008539198.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）：
【化１】
2008539198.tif 000017
［式中、Ｒ1は、水素、低級アルキル、ハロゲン、シアノ、トリフルオロメチルまたはアジドであり；Ｒ2は、リンカーであり；Ｌは、標識、または同じであるか、もしくは異なる複数の標識である］
で示される化合物。
【請求項２】
Ｒ2が、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキレン基であって、場合により、
（ａ）１つ以上の炭素原子が酸素で置き換えられていて、特に３番目ごとの炭素原子が酸素で置き換えられた、たとえば１〜１００個のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基であり；
（ｂ）１つ以上の炭素原子が、水素原子を担持する窒素で置き換えられ、隣接する炭素原子がオキソで置換されて、アミド基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；
（ｃ）１つ以上の炭素原子が酸素で置き換えられ、隣接する炭素原子がオキソで置換されて、エステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
（ｄ）隣接する２つの炭素原子間の結合が二重結合または三重結合であって、基−ＣＨ＝ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−を表し；
（ｅ）１つ以上の炭素原子がフェニレン、飽和もしくは不飽和シクロアルキレン、飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、架橋複素芳香族、または架橋飽和もしくは不飽和ヘテロシクリル基で置き換えられ；
（ｆ）隣接する２つの炭素原子が、ジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−で置き換えられているか；
あるいは場合により置換基を有する、２つ以上、特に２つまたは３つの、（ａ）ないし（ｆ）でこれまでに定義されたアルキレンおよび／もしくは修飾アルキレン基の組合せであり；
Ｌが、分光学的プローブ、磁性プローブ、造影剤、結合相手と特異的に結合できる、特異的結合対の一方である分子、他の生体分子と相互作用すると疑われる分子、他の生体分子と相互作用すると疑われる分子のライブラリー、他の分子と架橋結合できる分子、Ｈ2Ｏ2およびアスコルビン酸塩と接触するとヒドロキシルラジカルを生成できる分子、光を照射すると、反応性ラジカルを生成できる分子、固体の支持体に共有結合した分子、膜挿入特性を有する脂質その他の疎水性分子、ならびに望ましい酵素的、化学的もしくは物理的特性を有する生体分子から選ばれる、１つのか、または同じであるか、もしくは異なる複数の標識である、請求項１記載の化合物。
【請求項３】
Ｒ2が、１つまたは２つの炭素原子が窒素で置き換えられ、０〜１２個の炭素原子が酸素で置き換えられた、場合によりオキソで置換された、２〜４０個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である、請求項１または２記載の化合物。
【請求項４】
Ｌが、分光学的プローブ、特異的結合対の一方を表す分子、固体の支持体に共有結合した分子、および細胞膜輸送エンハンサー基である、式（Ｉ）で示される請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項５】
Ｒ2が、１つまたは２つの炭素原子が窒素で置き換えられ、１つまたは２つの隣接する炭素原子がオキソで置き換えられた、２〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である、式（Ｉ）で示される請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項６】
Ｌが、発蛍光団、または特異的結合対の一方を表す分子である、式（Ｉ）で示される請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ1が水素、メチルまたはクロロである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項８】
Ｒ1がメチルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項９】
Ｒ1がトリフルオロメチルである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ2がリンカー−ＣＨ2−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−ＣＨ2−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ2）5−ＮＨ−であり、Ｌが発蛍光団またはビオチンである、式（Ｉ）で示される請求項７〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１１】
Ｒ2がリンカー−ＣＨ2−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−であり、Ｌがテトラメチルローダミンまたはローダミングリーンである、式（Ｉ）で示される請求項７〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１２】
Ｒ2がリンカー−ＣＨ2−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ2）5−ＮＨ−であり、Ｌがビオチンである、式（Ｉ）で示される請求項７〜９のいずれか一項に記載の化合物。
【請求項１３】
問題のタンパク質を検出かつ／または操作する方法であって、問題のタンパク質をＡＧＴ融合タンパク質に組み込み、ＡＧＴ融合タンパク質を、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の式（Ｉ）の化合物に接触させ、標識Ｌを、該標識を認識し、かつ／または取り扱うために設定されたシステム内で用いて、ＡＧＴ融合タンパク質を検出し、かつ場合により更に操作する工程を含む方法。
【請求項１４】
ＡＧＴ融合タンパク質を、in vitroで式（Ｉ）の化合物に接触させる、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
ＡＧＴ融合タンパク質を、細胞培養のin vivoで式（Ｉ）の化合物に接触させる、請求項１３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、標識を基質からＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ融合タンパク質へと移転させる方法、およびそのような方法における基質として適切であるピリミジンに関するものである。
【０００２】
背景技術
Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ尿素のような求電子物質の突然変異誘発および発癌効果は、主として、ＤＮＡ中のグアニンのＯ6−アルキル化に起因する。それらをＤＮＡアルキル化から防護するために、哺乳動物および細菌は、これらの病変を修復するタンパク質、すなわちＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を保有している。ＡＧＴは、アルキル基を、アルキル化されたグアニンおよびグアニン誘導体のＯ6位から自分自身のシステインの一つのメルカプト基へと移転して、不可逆的にアルキル化されたＡＧＴをもたらす。これを裏付ける機序は、ＳN２型の求核性反応であって、これにより、メチル基ばかりでなく、ベンジル基も容易に転移される理由が説明される。腫瘍細胞におけるＡＧＴの過剰発現が、プロカルバジン、ダカルバジン、テモゾロミド（temozolomide）およびビス−２−クロロエチル−Ｎ−ニトロソ尿素のようなアルキル化剤に対する耐性の主な理由であることから、ＡＧＴのインヒビターを、化学療法における増感剤として用いるよう提唱されている［Pegg et al., Progr. Nucleic Acid Res. Mol. Biol., 51: 167-223, 1995］。国際公開第９７／２０８４３号公報（WO 97/20843）は、ＡＧＴ枯渇化合物として作用する４−ヘテロアリールメトキシピリミジン、および腫瘍細胞内のＡＧＴレベルを枯渇させ、それによってアルキル化抗腫瘍剤に対する応答性を増大させるためのその使用を記載している。
【０００３】
国際公開第０２／０８３９３７号公報（WO 02/083937）は、問題のタンパク質を検出かつ／または操作する方法を開示しているが、ここでは、タンパク質をＡＧＴと融合させ、ＡＧＴ融合タンパク質を、標識を有するＡＧＴの基質と接触させ、この標識を用いてＡＧＴ融合タンパク質を検出し、場合により更に操作する。用いるべきいくつかのＡＧＴ融合タンパク質、ＡＧＴの基質の一般的な構造原理、ならびにこの方法に役立つ非常に多様な標識、および標識を検出する方法が記載されている。
【０００４】
国際公開第２００４／０３１４０４号公報（WO 2004/031404）は、問題のタンパク質を検出かつ／または操作するための記述された方法に用いるべき特定のＡＧＴ融合タンパク質、この方法によって得られる標識化融合タンパク質、および特定のＡＧＴ融合タンパク質を用いる方法を記載しており、関連する国際公開第２００４／０３１４０５号公報（WO 2004/031405）は、問題のタンパク質を検出かつ／または操作するための記述された方法に適切な特定の標識を有する、更なるＡＧＴ基質、およびそのような特定の標識化された基質の適用を開示している。
【０００５】
未公開のＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５０８９９は、この方法に適切であるＡＧＴ突然変異種を記載している。関連する未公開のＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５０９００は、問題のタンパク質を検出かつ／または操作するための記述された方法に特に適切である標識を有する、グアニン（プリン）、アザプリンまたはピリミジン核を有する更なるＡＧＴ基質、およびそのような特定の標識化された基質の適用を開示している。
【０００６】
発明の要約
本発明は、式（Ｉ）：
【０００７】
【化２】
2008539198.tif 000003
【０００８】
［式中、Ｒ1は、水素、低級アルキル、ハロゲン、シアノ、トリフルオロメチルまたはアジドであり；Ｒ2は、リンカーであり；Ｌは、標識、または同じであるか、もしくは異なる複数の標識である］
で示されるピリミジンに関するものである。
【０００９】
式（Ｉ）のこれらの化合物は、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）の基質として適切である。本発明は、更に、標識を式（Ｉ）のピリミジンからＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）およびＡＧＴ融合タンパク質に移転する方法に関するものである。
【００１０】
発明の詳細な説明
ＡＧＴ基質として適切な特定のピリミジンは、式（Ｉ）：
【００１１】
【化３】
2008539198.tif 000004
【００１２】
［式中、Ｒ1は、水素、低級アルキル、ハロゲン、シアノ、トリフルオロメチルまたはアジドであり；Ｒ2は、リンカーであり；Ｌは、標識、または同じであるか、もしくは異なる複数の標識である］
で示される化合物である。
【００１３】
低級アルキルは、好ましくは、１〜７個、好ましくは１〜４個のＣ原子を有するアルキルで、直鎖または分枝鎖状であり；好ましくは、低級アルキルは、ブチル、たとえばｎ−ブチル、sec−ブチル、イソブチル、tert−ブチル、プロピル、たとえばｎ−プロピルまたはイソプロピル、エチルまたはメチルである。最も好ましくは、低級アルキルはメチルである。
【００１４】
ハロゲンは、フルオロ、クロロ、ブロモまたはヨード、特にクロロまたはブロモ、好ましくはクロロである。
【００１５】
好適なのは、Ｒ1が水素、メチルまたはクロロ、特にメチルである化合物である。同様に、好適なのは、Ｒ1がトリフルオロメチルである化合物である。
【００１６】
リンカー基Ｒ2は、好ましくは、標識Ｌ、または同じであるか、もしくは異なる複数の標識を本発明のピリミジンのベンジル基に結合する、柔軟性に富むリンカーである。リンカー単位は、予想される適用との関係で、すなわち、ＡＧＴを含む融合タンパク質への基質の転移について選ばれる。それはまた、適切な溶媒への基質の溶解度を上昇させる。用いられるリンカーは、実際に適用される条件下で化学的に安定である。リンカーは、ＡＧＴとの反応にも、標識Ｌの検出にも干渉しないが、式（Ｉ）の化合物とＡＧＴを含む融合タンパク質との反応後の何らかの時点で切断されるように構築してもよい。
【００１７】
リンカーＲ2は、１〜３００個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキレン基であって、場合により、
（ａ）１つ以上の炭素原子が酸素で置き換えられていて、特に３番目ごとの炭素原子が酸素で置き換えられた、たとえば１〜１００個のエチレンオキシ単位を有するポリエチレンオキシ基であり；
（ｂ）１つ以上の炭素原子が、水素原子を担持する窒素で置き換えられ、隣接する炭素原子がオキソで置換されて、アミド基−ＮＨ−ＣＯ−を表し；
（ｃ）１つ以上の炭素原子が酸素で置き換えられ、隣接する炭素原子がオキソで置換されて、エステル基−Ｏ−ＣＯ−を表し；
（ｄ）隣接する２つの炭素原子間の結合が二重結合または三重結合であって、基−ＣＨ＝ＣＨ−または−Ｃ≡Ｃ−を表し；
（ｅ）１つ以上の炭素原子がフェニレン、飽和もしくは不飽和シクロアルキレン、飽和もしくは不飽和ビシクロアルキレン、架橋複素芳香族、または架橋飽和もしくは不飽和ヘテロシクリル基で置き換えられ；
（ｆ）隣接する２つの炭素原子が、ジスルフィド結合−Ｓ−Ｓ−で置き換えられているか；
あるいは場合により置換基を有する、２つ以上、特に２つまたは３つの、（ａ）ないし（ｆ）でこれまでに定義されたアルキレンおよび／もしくは修飾アルキレン基の組合せである。
【００１８】
考慮される置換基は、たとえば、低級アルキル、たとえばメチル、低級アルコキシ、たとえばメトキシ、低級アシルオキシ、たとえばアセトキシ、またはハロゲニル、たとえばクロロである。
【００１９】
考慮される更なる置換基は、たとえば、α−アミノ酸、特に天然由来のα−アミノ酸をリンカーＲ2に組み込んだときに得られるものである（ここで、炭素原子は、（ｂ）に定義されたアミド基−ＮＨ−ＣＯ−で置き換えられている）。そのようなリンカーでは、アルキレン基Ｒ2の炭素鎖の一部は、基−（ＮＨ−ＣＨＲ−ＣＯ）n−（ここで、ｎは、１〜１００であり、Ｒは、α−アミノ酸の様々な残基を表す）で置き換えられている。
【００２０】
更なる置換基は、光切断性リンカーＲ2をもたらすもの、たとえばｏ−ニトロフェニル基である。特に、この置換基ｏ−ニトロフェニル基は、アミド結合に隣接する炭素原子に位置し、たとえば基−ＮＨ−ＣＯ−ＣＨ2−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−ＮＨ−ＣＯ−中に位置するか、ポリエチレングリコール鎖中の置換基として、たとえば基−Ｏ−ＣＨ2−ＣＨ（ｏ−ニトロフェニル）−Ｏ−中に位置する。考慮されるその他の光切断性リンカーは、たとえばフェナシル、アルコキシベンゾイン、ベンジルチオエーテルおよびピバロイルグリコール誘導体である。
【００２１】
（ｅ）でこれまでに定義されたような、炭素原子と置き換わるフェニレン基は、たとえば１，２−、１，３−、または好ましくは１，４−フェニレンである。特定の実施態様では、フェニレン基は、ニトロ基で更に置換され、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）および（ｆ）に上記されたようなその他の置換と組み合わされ、光切断性の基を表し、たとえば、４−ニトロ−１，３−フェニレン（たとえば−ＣＯ−ＮＨ−ＣＨ2−（４−ニトロ−）１，３−フェニレン−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−ＣＯ−の）、または２−メトキシ−５−ニトロ−１，４−フェニレン（たとえば−ＣＨ2−Ｏ−（２−メトキシ−５−ニトロ−）１，４−フェニレン−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−の）、または２−ニトロ−１，４−フェニレン（たとえば−ＣＯ−Ｏ−ＣＨ2−（２−ニトロ−）１，４−フェニレン−ＣＯ−ＮＨ−の）である。光切断性リンカーを表すその他の特定の実施態様は、たとえば、−１，４−フェニレン−ＣＯ−ＣＨ2−Ｏ−ＣＯ−ＣＨ2−（フェナシル基）、−１，４−フェニレン−ＣＨ（ＯＲ）−ＣＯ−１，４−フェニレン−（アルコキシベンゾイン）、または−３，５−ジメトキシ−１，４−フェニレン−ＣＨ2−Ｏ−（ジメトキシベンジル部分）である。（ｅ）にこれまで定義されたような、炭素原子と置き換わる飽和または不飽和シクロアルキレン基は、３〜７個の炭素原子を有するシクロアルキル、好ましくはシクロペンチルまたはシクロヘキシルから誘導され、たとえば１，２−もしくは１，３−シクロペンチレン、１，２−、１，３−または好ましくは１，４−シクロヘキシレン、あるいはたとえば１もしくは２位が不飽和である１，４−シクロヘキシレンである。（ｅ）にこれまで定義されたような、炭素原子と置き換わる飽和または不飽和ビシクロアルキレン基は、７〜８個の炭素原子を有するビシクロアルキルから誘導され、たとえば、ビシクロ［２．２．１］ヘプチレンまたはビシクロ［２．２．２］オクチレン、好ましくは場合により２位が不飽和であるか、または２および５位が二重に不飽和である、１，４−ビシクロ［２．２．２］オクチレンである。（ｅ）にこれまで定義されたような、炭素原子と置き換わる架橋複素芳香族基は、たとえば、トリアゾリデン、好ましくは１，４−トリアゾリデン、またはイソオキサゾリデン、好ましくは３，５−イソオキサゾリデンである。（ｅ）にこれまで定義されたような、炭素原子と置き換わる架橋飽和または不飽和ヘテロシクリル基は、たとえば、上のＲ3に定義されたような不飽和ヘテロシクリル基、たとえばイソオキサゾリジネン、好ましくは３，５−イソオキサゾリジネンから誘導されるか、または３〜１２個の炭素原子を有する（うち１〜３個は、窒素、酸素および硫黄から選ばれるヘテロ原子である）完全に飽和されたヘテロシクリル基、たとえばピロリジンジイル、ピペリジンジイル、テトラヒドロフランジイル、ジオキサンジイル、モルホリンジイルまたはテトラヒドロチオフェンジイル、好ましくは２，５−テトラヒドロフランジイルまたは２，５−ジオキサンジイルから誘導される。考慮される特定のヘテロシクリル基は、糖部分、たとえばα−もしくはβ−フラノシル、またはα−もしくはβ−ピラノシル部分である。
【００２２】
リンカーＲ2内の環状の部分構造は、Ｒ2内の回転できる結合の数で測定される限りでの分子の柔軟性を低下させて、それが、in vivo細胞培養での標識化の用途のすべてに重要な、より充分な膜透過率へと導く。
【００２３】
リンカーＲ2は、好ましくは、１〜２５個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基、または基ＡもしくはＲ3に、それぞれ、−ＣＨ＝ＣＨ−もしくは−Ｃ≡Ｃ−基によって場合により結合された、４〜１００個のエチレンオキシ単位を有する直鎖ポリエチレングリコール基である。好適なのは、更に、炭素原子がアミド基−ＮＨ−ＣＯ−で場合により置き換えられ、光切断性サブユニット、たとえばｏ−ニトロフェニルを場合により有する、１〜２５個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である。好適なのは、更に、３〜６個のエチレングリコール単位を有するポリエチレングリコール基、および炭素原子がアミド結合で置き換えられ、更に置換アミノおよびヒドロキシル基を担持するアルキレン基を含む、分枝鎖リンカーである。その他の好適な分枝鎖リンカーは、アルキレン基の炭素原子をアミン、カルボキサミドおよび／またはエーテル基に置き換えた、樹枝状（樹木のような）構造を有する。
【００２４】
特に好適なリンカーＲ2は、１つまたは２つの炭素原子が窒素で置き換えられ、０〜１２個の炭素原子が酸素で置き換えられた、場合によりオキソで置換された、２〜４０個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基である。
【００２５】
最も好適なリンカーＲ2は、１つまたは２つの炭素原子が窒素で置き換えられ、１つまたは２つの隣接する炭素原子がオキソで置換された、２〜１０個の炭素原子を有する直鎖アルキレン基、たとえばリンカー−ＣＨ2−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−または−ＣＨ2−ＮＨ（Ｃ＝Ｏ）−（ＣＨ2）5−ＮＨ−である。
【００２６】
リンカーＲ2は、１つ以上の同じであるか、もしくは異なる標識、たとえば１〜１００個の同じであるか、または異なる標識、特に１〜５個、好ましくは１、２または３個、特に１つまたは２つの同じであるか、または異なる標識を担持し得る。
【００２７】
標識Ｌは、融合タンパク質が意図される用途に応じて、当業者が選ぶことができる。標識は、たとえば、標識Ｌを担持する標識化された融合タンパク質が、その環境から容易に検出または分離されるようなものであり得る。考慮されるその他の標識は、標識化融合タンパク質および／もしくは基質の環境における変化を感知かつ誘導することができるもの、または基質の物理的および／もしくは化学的特性による融合タンパク質の操作を助け、特異的に融合タンパク質に導入された標識である。
【００２８】
標識Ｌの例は、発蛍光団もしくは発色団のような分光学的プローブ、磁性プローブ、または造影剤；放射能で標識化された分子；結合相手と特異的に結合できる、特異的結合対の一方である分子；他の生体分子と相互作用すると疑われる分子；他の生体分子と相互作用すると疑われる分子のライブラリー；他の分子と架橋結合できる分子；Ｈ2Ｏ2およびアスコルビン酸と接触すると、ヒドロキシルラジカルを生成できる分子、たとえば束縛された金属キレート；光を照射すると、反応性ラジカルを生成できる分子、たとえばマラカイトグリーン；固体の支持体に共有結合する分子（支持体は、スライドグラス、微量滴定プレート、または当業者に公知のいかなる重合体でもあり得る）；その相補鎖と塩基対を形成できる核酸またはその誘導体；膜挿入特性を有する脂質その他の疎水性分子；望ましい酵素的、化学的または物理的特性を有する生体分子；あるいは上に列挙された特性のいずれかの組合せを有する分子を包含する。
【００２９】
更なる標識Ｌは、結合した分子を生細胞の原形質膜を越えての移転を促進することが知られている、正に荷電した直鎖または分枝鎖重合体である。これは、さもなければ低い細胞膜透過性を有するか、または生細胞の細胞膜に対して実質的に不透性である物質については特に重要である。細胞透過性でないＡＧＴ基質は、そのような基Ｌと結合すると、細胞膜透過性になるであろう。そのような細胞膜輸送エンハンサーである基Ｌは、たとえば、６〜１５個のアルギニン残基を有するＤ−および／もしくはＬ−アルギニンからなる直鎖ポリアルギニン、グアニジニウム基をそれぞれ有する６〜１５サブユニットからなる直鎖重合体、その一部がグアニジニウム基に結合した、６ないし５０サブユニット以下からなるオリゴマーもしくは短鎖重合体、ならびに／またはＨＩＶ−ｔａｔタンパク質の配列の一部、特にサブユニットＴａｔ４９〜Ｔａｔ５７（一文字アミノ酸コードではＲＫＫＲＲＱＲＲＲ）を含む。式（Ｉ）のピリミジンは、この基Ｌに、上記に定義されたとおりのリンカーＲ2を介して共有結合しているが、好ましくは、生細胞の内部では不安定であり、たとえば細胞内エステラーゼによるエステル基Ｒ2の切断によって分解して、直接にか、またはエステル基の切断によって誘発された更なる反応で、ＡＧＴ基質の分離、および細胞膜透過性を高める単位Ｌへと導き得る。
【００３０】
標識Ｌとして最も好適なのは、分光学的プローブ、および結合相手と特異的に結合できる、特異的結合対の一方である分子、いわゆる親和性標識である。
【００３１】
標識Ｌが、発蛍光団、発色団、磁性標識、放射性標識などであるとき、検出は、その標識に適合させた標準的手段により、またその方法が、細胞培養もしくは組織サンプル内でのin vitroもしくはin vivoで用いられるかによる。Ｌが発蛍光団であるならば、方法は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の適用であって、それを、問題のタンパク質に遺伝学的に融合させ、生細胞内でのタンパク質検査を可能にする。また、標識Ｌの特別な例は、非線形の光学的特性を示すホウ素化合物である。
【００３２】
標識Ｌの特性によっては、問題のタンパク質およびＡＧＴを含む融合タンパク質を、基質との反応の際に固体の支持体に結合してもよい。ＡＧＴを含む融合タンパク質と反応する基質の標識Ｌは、ＡＧＴとの反応に至ったときに、既に固体支持体に結合させておいてもよいか、またはその後、すなわちＡＧＴへの移転後に、標識化されたＡＧＴ融合タンパク質を固体支持体に結合させるのに用いてもよい。標識が特異的な結合対の一方の成員であって、その他方の成員は、共有結合でか、もしくは他の何らかの手段によって固体支持体に結合させるか、または結合性であってもよい。考慮される特異的結合対は、たとえばビオチンおよびアビジンまたはストレプトアビジンである。結合対のいずれの成員が基質の標識Ｌであってもよく、他方を固体支持体に結合させる。固体支持体への好都合な結合を可能にする標識の更なる例は、たとえば、マルトース結合タンパク質、糖タンパク質、ＦＬＡＧタグ、または固体支持体表面での相補的な官能基とそのような置換基との化学選択的反応を可能にする、反応性置換基である。反応性置換基および相補的官能基のそのような対の例は、たとえば、アミドを形成するアミンと活性化されたカルボキシル基、１，３−双極性付加環化反応を受けるアジ化物とプロピオル酸誘導体、二つのアミド結合を生じるアミンと活性化ビスジカルボン酸誘導体形式の付加二官能性リンカー試薬と反応する別のアミン官能基、または当技術に公知のその他の組合せである。
【００３３】
好都合な固体支持体の例は、たとえば、スライドガラスのようなガラス表面、マイクロタイタープレート、および適切なセンサー要素、特に官能化された重合体（たとえばビーズ形態のもの）、化学的に修飾された酸化物の表面、たとえば二酸化ケイ素、五酸化タンタルもしくは二酸化チタン、または化学的に修飾された金属表面、たとえば金または銀表面のような貴金属表面である。そうして、ＡＧＴ基質への不可逆的な結合および／または染着を用いて、ＡＧＴ融合タンパク質を、空間的に分割されるようにして、特に染着を通じて、タンパク質のマイクロアレー、ＤＮＡのマイクロアレーまたは小分子のアレーを示す固体支持体に結合させ得る。
【００３４】
標識Ｌが、外部刺激に接触すると、反応性ラジカル、たとえばヒドロキシルラジカルを生成できるときは、生成されたラジカルは、ＡＧＴ融合タンパク質はもとより、ＡＧＴ融合タンパク質にごく近いタンパク質も不活性化することができ、これらのタンパク質の役割を研究することを可能にする。そのような標識の例は、Ｈ2Ｏ2およびアスコルビン酸塩と接触するとヒドロキシルラジカルを生成する、テザー型金属キレート錯体（tethered metal-chelate complex）、ならびにレーザー照射されるとヒドロキシルラジカルを生成する、マラカイトグリーンのような発色団である。発色団およびレーザーを用いてヒドロキシルラジカルを生成することは、発色団支援レーザー励起不活性化（ＣＡＬＩ）として当技術にも公知である。本発明では、標識Ｌ1としての発色団、たとえばマラカイトグリーンを担持する基質でＡＧＴ融合タンパク質を標識化すること、および続くレーザー照射が、標識化されたＡＧＴ融合タンパク質はもとより、ＡＧＴ融合タンパク質と、時間的に制御され、空間的に分割された方式で相互作用するタンパク質も不活性化する。この方法は、細胞培養のin vivoでか、またはin vitroの双方に適用することができる。更に、ＡＧＴ融合タンパク質にごく近いタンパク質は、特異的な抗体によるそのタンパク質のフラグメントの検出、高解像度二次元電気泳動ゲル上でのこれらのタンパク質の消失、または切断されたタンパク質フラグメントの分離、および質量分析もしくはＮ末端分解によるタンパク質配列決定のような配列決定手法による同定のいずれによっても、そのようなものとして同定することができる。
【００３５】
標識Ｌが、他のタンパク質と架橋結合することができる分子、たとえばマレイミド、活性エステルまたはアジ化物、およびその他当技術に公知のもののような官能基を有する分子であるときは、そのような標識化ＡＧＴ基質と、他のタンパク質と（in vivoまたはin vitroで）相互作用するＡＧＴ融合タンパク質との接触は、その相互作用するタンパク質とのＡＧＴ融合タンパク質の標識を介しての共有結合による架橋結合へと導く。これはＡＧＴ融合タンパク質と相互作用するタンパク質の同定を可能にする。光架橋結合のための標識Ｌは、たとえばベンゾフェノンである。架橋結合という特別な態様では、標識Ｌは、それ自身がＡＧＴ基質であって、ＡＧＴ融合タンパク質の二量体化をもたらす分子である。そのような二量体の化学構造は、対称的（単独二量体）または非対称的（ヘテロ二量体）のいずれであってもよい。
【００３６】
考慮されるその他の標識Ｌは、たとえば、フラーレン、中性子捕獲処理のためのボラン、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド（たとえば自己対処型チップ向けの）、ペプチド核酸、金属キレート、たとえばＤＮＡに特異的に結合する白金キレートである。
【００３７】
望ましい酵素的、化学的もしくは物理的特性を有する特定の生体分子は、メトトレキサートである。メトトレキサートは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）なる酵素の強結合型インヒビターである。Ｌがメトトレキサートである式（Ｉ）の化合物は、いわゆる「二量体化の化学的誘導物質（ＣＩＤ）」という周知の群に属する。ＤＮＡ結合ドメインＬｅｘＡとのｈＡＧＴの融合タンパク質を用い、転写活性化ドメインＢ４２を有するＤＨＦＲを、Ｌがメトトレキサートである式（Ｉ）の化合物とのｈＡＧＴ融合タンパク質のin vivo細胞培養標識化に加えることは、ｈＡＧＴ−ＬｅｘＡ融合タンパク質およびＤＨＦＲ−Ｂ４２融合タンパク質のカップリング（二量体化）を誘導して、ＬｅｘＡおよびＢ４２の空間的近接性、ならびにその後の転写の刺激へと導く。
【００３８】
基質が二つまたはそれ以上の標識を有するならば、これらの標識は、同一であるか、または異なっていてもよい。特定の好適な組合せは、異なる二つの親和性標識、または一親和性標識および一発色団標識、特に一親和性標識および一発蛍光団標識、または分光学的に相互に作用する一対の標識Ｌ1／Ｌ2、たとえばＦＲＥＴ対である。
【００３９】
好適なのは、Ｌが、分光学的プローブ、特異的結合対の一方を表す分子、固体支持体に共有結合した分子、およびＬが細胞膜輸送エンハンサーの基である化合物である。
【００４０】
特に好適なのは、Ｌが、発蛍光団、たとえばフルオレセイン、テトラメチルローダミンまたはローダミングリーンである化合物である。同様に好適なのは、Ｌがビオチンである化合物である。
【００４１】
最も好適なのは、実施例の化合物である。
【００４２】
本発明は、更に、問題のタンパク質を検出かつ／または操作する方法であって、問題のタンパク質をＡＧＴ融合タンパク質に組み込み、ＡＧＴ融合タンパク質を、上記の標識を有する特定のＡＧＴ基質に接触させ、標識を、該標識を認識し、かつ／または取り扱うために設定されたシステム内で用いて、ＡＧＴ融合タンパク質を検出し、かつ場合により更に操作する工程を含む方法に関するものである。
【００４３】
本発明の方法では、問題のタンパク質またはペプチドを、Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）に融合させる。問題のタンパク質またはペプチドは、いかなる長さのものでも、また二次、三次または四次構造があるもの、およびないものの双方であってもよく、好ましくは、１２以上のアミノ酸および２，０００以下のアミノ酸からなる。そのような問題のタンパク質またはペプチドの例は、たとえば、酵素、ＤＮＡ結合タンパク質、転写調節タンパク質、膜タンパク質、核レセプタータンパク質、核局在化シグナルタンパク質、タンパク質補因子、小単量体のＧＴＰアーゼ、ＡＴＰ結合カセットタンパク質、細胞内構造タンパク質、特定の細胞区画をタンパク質の標的とする原因になる配列を有するタンパク質、標識または親和性タグとして一般的に用いられるタンパク質、および上記タンパク質のドメインまたはサブドメインである。問題のタンパク質またはペプチドは、好ましくは、酵素によって切断され得るリンカーを用いることによって、たとえばＤＮＡ段階で適切な制限酵素によって、かつ／またはタンパク質の段階で適切な酵素によって切断できるリンカーによって、ＡＧＴに融合させる。
【００４４】
Ｏ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）は、基質に存在する標識を、融合タンパク質の一部を形成するＡＧＴのシステイン残基の一つに移転する特性を有する。好適実施態様では、ＡＧＴは、野生型のヒトＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ、すなわちｈＡＧＴ、またはその突然変異種、たとえばJuillerat et al., Chem. Biol., 10: 313-317, 2003、またはＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５０８９９に記載されたような突然変異種である。本発明に用いようとする突然変異種ＡＧＴは、１以上、たとえば１０以下のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加のために野生型ｈＡＧＴとは異なり得るが、基質に存在する標識を融合タンパク質のＡＧＴ部分に移転する特性をなおも保持している。突然変異種ＡＧＴは、好ましくは、当業者に公知のタンパク質加工手法、たとえば、飽和突然変異誘発、配列中のいかなる個所にも変異を導入するための変異性ＰＣＲ、または飽和突然変異誘発および／もしくは変異性ＰＣＲの後に用いられるＤＮＡシャッフリングを用いて生成し得る。
【００４５】
問題のタンパク質およびＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡアルキルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）を含む融合タンパク質を、標識を有する特定の基質と接触させる。反応条件は、ＡＧＴが、基質と反応し、基質の標識を移転するように選ぶ。通常の条件は、室温、たとえば２５℃前後のｐＨ７前後の緩衝液である。しかし、ＡＧＴは、その他様々な条件下でも反応することが理解され、ここに列挙したような条件は、本発明の対象範囲を限定するものではない。
【００４６】
ＡＧＴは、アルキル基を、その天然の基質、すなわちＯ6−アルキルグアニン−ＤＮＡから、そのシステイン残基の一つに不可逆的に移転する。同様に、ＡＧＴは、式（Ｉ）のピリミジン核のＯ4（またはＯ6のそれぞれ）に結合した置換ベンジル基を、そのシステイン残基の一つに移転する。ＡＧＴのこの特性を本発明の方法に用いて、式（Ｉ）の化合物の残基−ＣＨ2−Ｃ6Ｈ4−Ｒ2−Ｌとしての標識Ｌを、ＡＧＴに移転するのである。
【００４７】
基質のこの標識Ｌは、融合タンパク質が意図される用途に応じて、当業者が選ぶことができる。ＡＧＴを含む融合タンパク質を基質に接触させた後、標識Ｌを融合タンパク質に共有結合させる。次いで、標識化されたＡＧＴ融合タンパク質を、移転された標識に基づいて更に操作かつ／または検出する。標識Ｌは、複数の同じであるか、または異なる標識からなってもよい。基質が二つ以上の標識を有するならば、対応する標識化ＡＧＴ融合タンパク質も、二つ以上の標識を含んでいて、それらが、標識化融合タンパク質を更に操作かつ／または検出するための選択肢を与えることになる。
【００４８】
in vitroでは、本発明の基質とのＡＧＴ融合タンパク質の反応は、一般に、細胞抽出物中でか、またはＡＧＴ融合タンパク質の精製もしくは富化された形態でかのいずれで実施することもできる。
【００４９】
本発明の基質による実験を、細胞培養においてin vivoでか、または細胞抽出物中で実施するならば、宿主の内在ＡＧＴの反応を斟酌するのが好都合である。宿主の内在ＡＧＴが式（Ｉ）のピリミジンを基質として受け入れないならば、（外来）ＡＧＴ融合タンパク質の反応は、特異的である。哺乳動物細胞、たとえばヒト、マウスまたはラット細胞では、内在ＡＧＴとの非特異的反応が生じる可能性がある。内在ＡＧＴと並ぶ（外来）ＡＧＴ融合タンパク質の同時反応が問題を投じるような実験では、公知のＡＧＴ欠乏細胞系を用いることができる。
【００５０】
実験は、好ましくは、ヒトまたは動物の体外で達成する。特に、in vitroでか、または細胞培養におけるin vivoで実施する。
【００５１】
製造方法
本発明のピリミジンは、一般的には、当技術に公知の標準的な方法によって製造する。本発明は、上記のとおりの新規な方法、および用いられ、かつ得られた新規中間体にも関するものである。
【００５２】
とりわけ、式（Ｉ）の化合物は、
（Ａ）式（II）：
【００５３】
【化４】
2008539198.tif 000005
【００５４】
［式中、Ｒ1は、式（Ｉ）で定義されたとおりの意味を有し、Ｒ3は、式（Ｉ）で反応性官能基を更に有するＲ2について定義されたとおりのリンカー基である］
で示される化合物と、式（Ｉ）で定義されたとおりの標識、もしくはその反応性誘導体との反応、または
（Ｂ）式（III）：
【００５５】
【化５】
2008539198.tif 000006
【００５６】
［式中、Ｒ1は、式（Ｉ）で定義されたとおりの意味を有し、Ｒ4は、反応性官能基である］
で示される化合物と、式（IV）：
【００５７】
【化６】
2008539198.tif 000007
【００５８】
で示されるアルコラートとの反応によって製造され、所望ならば、得られる式（Ｉ）の化合物を、式（Ｉ）の別の化合物に転換し、遊離形態の式（Ｉ）の化合物を、塩に転換し、得られる式（Ｉ）の化合物の塩を、遊離形態の化合物または別の塩に転換し、かつ／または式（Ｉ）の異性体化合物の混合物を、個々の異性体へと分離する。
【００５９】
工程（Ａ）では、置換基Ｒ3中の更なる反応性官能基は、たとえば、Ｌのカルボキシル基と反応し得るアミノ、ヒドロキシルもしくはチオ基、または標識Ｌのアミノ、ヒドロキシルもしくはチオ基と反応し得るカルボキシル基である。反応条件は、対応する反応性基に従って選んでよく、たとえば、アミノ基を（活性化された）カルボキシル基と結合するためのタンパク質化学に公知のそれである。活性化されたカルボキシル基は、たとえばＮ−スクシンイミジルエステルである。この反応は、通常、適切な溶媒の存在下、冷却または加熱しつつ、たとえば約−３０〜約＋１５０℃の温度範囲、特に約０℃前後ないし室温で実施する。
【００６０】
工程（Ｂ）では、反応性基Ｒ4は、ハロゲン、たとえばクロロまたはブロモ、またはアンモニウム基、たとえばトリメチルアンモニウムまたはメチルピロリジニウムであって、ＳN２型の反応で容易に置換可能である。反応性基として好適なのは、クロロである。反応条件は、対応する反応性基に従って選んでよく、たとえば、ＳN２型置換反応に適切なことが公知のそれである。この反応は、それ自体は公知である方式で、通常は塩基の存在下、通常は適切な溶媒の存在下、冷却または加熱しつつ、たとえば約−３０〜約＋１５０℃の温度範囲、特に約０℃前後ないし室温で実施する。化合物（IV）のアルコラートは、好ましくは、適切な塩基、たとえばトリエチルアミン、ジメチルアニリン、ピリジンもしくはジエチルイソプロピルアミンのような三置換アミンによってか、または好ましくは水素化ナトリウムとの反応によって、対応するベンジル性アルコールから、そのままの位置で形成される。
【００６１】
適切な溶媒は、極性不活性溶媒、たとえばテトラヒドロフランのようなエーテル、またはジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、また好ましくはジメチルアセトアミドのような、双極性非プロトン性溶媒である。
【００６２】
１つ以上のその他の官能基、たとえばカルボキシル、ヒドロキシルまたはアミノは、反応に関与してはならないため、式（II）、（III）、（IV）の化合物または標識Ｌ中で保護するか、もしくは保護しなければならないならば、これらは、アミド、特にペプチド化合物、セファロスポリン、ペニシリン、核酸誘導体および糖類の合成に通常適用されるような保護基である。保護基は、前駆体中に既に存在してもよく、望ましくない二次反応、たとえばアシル化、エーテル化、エステル化、酸化、加溶媒分解および類似の反応から問題の官能基を保護しなければならない。代表的には、たとえば生理学的条件に類似する条件下での、加溶媒分解、還元、光分解または酵素活性によって、自身が容易に、すなわち望ましくない二次反応なしに、除去するのに役立つこと、および最終生成物中に存在しないことが保護基の特徴である。専門家は、上記および以下に述べる反応では、いかなる保護基が適切であるかを、知っているか、または容易に確立することができる。
【００６３】
そのような保護基、保護基自体、およびその除去反応による、そのような官能基の保護は、たとえば、ペプチド合成のための標準的参考書籍、およびT.W. Greene & P.G.M. Wuts, "Protective Groups in Organic Synthesis", Wiley, 3rd ed., 1999のような、保護基に関する特別の書籍に記載されている。
【００６４】
塩形成基を有する式（Ｉ）の化合物の塩は、それ自体は公知である方式で製造し得る。したがって、式（Ｉ）の化合物の酸付加塩は、酸によるか、または適切な陰イオン交換試薬による処理によって入手し得る。
【００６５】
塩は、通常、たとえば、適切な塩基性薬剤、たとえばアルカリ金属炭酸塩、アルカリ金属炭酸水素塩またはアルカリ金属水酸化物、代表的には炭酸カリウムまたは水酸化ナトリウムによる処理によって、遊離化合物に転換することができる。
【００６６】
ここに記載された方法の工程は、すべて、公知の反応条件下で、好ましくは具体的に列挙された条件下で、反応および／または反応物質の種類に応じて、溶媒または希釈剤、好ましくは用いられる試薬に対して不活性であり、これらを溶解しうるようなものの不在下、もしくは通常は存在下で、触媒、縮合剤または中和剤、たとえばイオン交換剤、代表的には陽イオン交換剤、たとえばＨ+形態のものの不在もしくは存在下で、低温、常温または高温、たとえば−１００〜約１９０℃、好ましくは約−８０〜約１５０℃の温度範囲内、たとえば−８０〜＋６０℃、−２０〜＋４０℃、室温、または用いられる溶媒の沸点で、大気圧下でか、または適切な場合は圧力下の密閉容器内で、かつ／または不活性雰囲気、たとえばアルゴンまたは窒素下で実施することができる。
【００６７】
塩は、すべての出発化合物および過渡的物質中に、これらが塩形成基を有するならば存在し得る。塩は、反応がそれによって妨害されない限りは、そのような化合物の反応の際にも存在し得る。
【００６８】
すべての反応段階で、生じる異性体混合物は、その個々の異性体、たとえばジアステレオ異性体、位置異性体もしくは鏡像異性体にか、または異性体のいかなる混合物、たとえばラセミ化合物もしくはジアステレオ異性体混合物にも分離することができる。
【００６９】
好適実施態様では、式（Ｉ）の化合物は、実施例中に定義された方法および方法の工程に従ってか、またはそれと同様にして製造される。
【００７０】
新規な出発材料および／または中間体はもとより、その製造方法も、同様に、本発明の主題である。好適実施態様では、そのような出発材料が用いられ、反応条件は、好適な化合物を得るのを可能にするよう選ばれる。
【００７１】
式（II）の出発材料は、公知であるか、商業的に入手可能であるであるか、または当技術に公知である方法と同様にしてか、もしくはそれに従って、たとえば（Ｂ）と同様にして合成することができる。対応する式（III）および（IV）の化合物も、同様に、公知であるか、商業的に入手可能であるであるか、または当技術に公知である方法と同様にしてか、もしくはそれに従って製造することができる。
【００７２】
実施例
実施例１：２−アミノ−４−クロロピリミジン（２）および４−アミノ−２−クロロピリミジン（３）
水酸化アンモニウム（２５％、１２５ml）中の２，４−ジクロロピリミジン（７．４５g、５０．０mmol）の懸濁液を、室温で５時間撹拌した。不溶性材料の外見は、「塩状」から「雪状」へと変化した。沈澱を、濾過によって回収し、減圧下で乾燥した。この未精製材料を、ＭｅＯＨ：ＣＨ2Ｃｌ2（１：１）に再溶解し、ＳｉＯ2に吸収させ、カラムクロマトグラフィー（シクロヘキサン：酢酸エチル＝５：１〜１：１の勾配）によって精製して、１．４８g（２３％）の２、および１．７３g（２６％）の３を得た（ＴＬＣ、シクロヘキサン：酢酸エチル＝３：１、Ｒf（２）＝０．４５、Ｒf（３）＝０．３２）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１２９．８［Ｍ＋Ｈ］+。
【００７３】
実施例２：Ｎ−［４−（２−アミノピリミジン−４−イルオキシメチル）ベンジル］−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（５）
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−ヒドロキシメチルベンジル）アセトアミド２５２mg（１．１５mmol）を、乾ジメチルアセトアミド２mlにアルゴン雰囲気下で溶解し、ＮａＨ５６mg（２．３１mmol）を加えた。２−アミノ−４−クロロピリミジン（２）１００mg（０．７７mmol）を加え、溶液を室温で一晩撹拌した。水１mlを注意深く加えて、すべての過剰なＮａＨをクエンチさせ、混合物を０．５NＨＣｌ ５０ml中に注いだ。粗生成物を、酢酸エチルで抽出し、併せた有機相を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：シクロヘキサン＝１：１）によって精製した。収率：１６０mg（６３％）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３２７．４［Ｍ＋Ｈ］+。
【００７４】
実施例３：４−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノピリミジン（６）
Ｎ−［４−（２−アミノピリミジン−４−イルオキシメチル）ベンジル］−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（５）５０mg（１．５３mmol）を、メタノール１mlに溶解し、メチルアミン（エタノール中３３％）２mlで処理した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。生成物は、更に精製せずに次の工程で用いた。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２３１．４［Ｍ＋Ｈ］+。
【００７５】
実施例４：Ｎ−［４−（２−アミノピリミジン−４−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−６−カルボキサミド（７）およびＮ−［４−（２−アミノピリミジン−４−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド（８）
【００７６】
【化７】
2008539198.tif 000008
【００７７】
４−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノピリミジン（６）８mg（０．０３mmol）および５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン スクシンイミジルエステル（Molecular Probes、７．４７mg、０．０１４mmol）を、ＴＥＡ２０μlを含むＤＭＦ８５０μlに溶解し、室温で２４時間放置した。生成物を精製し、水：アセトニトリルの線形勾配（２０分間に９５：５〜２０：８０、ＴＦＡ０．０８％）を用いたＣ１８カラムでの逆相ＭＰＬＣ（中圧液体クロマトグラフィー）によって、５−および６−異性体を分離した。（ＭＳ）ＥＳＩ：ｍ／ｚ＝６５８．８［Ｍ−Ｃｌ］+。
【００７８】
実施例５：Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（１０）
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−ヒドロキシメチルベンジル）アセトアミド８１２mg（３．４８mmol）を、乾ジメチルアセトアミド３mlにアルゴン雰囲気下で溶解し、ＮａＨ１６７mg（６．９６mmol）を５分間にわたって加えた。次いで、２−アミノ−４−クロロ−６−メチルピリミジン５００mg（３．４８mmol）を加え、溶液を、９０℃で一晩撹拌した。水１mlを注意深く加えて、すべての過剰なＮａＨをクエンチさせ、混合物を０．５NＨＣｌ ５０ml中に注いだ。粗生成物を、酢酸エチルで抽出し、併せた有機相を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：シクロヘキサン＝１：１〜３：１の勾配）によって精製した。収率：３５０mg（２９％）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３４１．７［Ｍ＋Ｈ］+。
【００７９】
実施例６：６−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノ−４−メチルピリミジン（１１）
Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（１５mg、０．０６１mmol）を、メタノール１mlに溶解し、メチルアミン（エタノール中３３％）２mlで処理した。反応混合物を、室温で一晩撹拌し、すべての揮発性物質を、減圧下で除去した。生成物は、更に精製せずに、次の工程で用いた。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２４５．１［Ｍ＋Ｈ］+。
【００８０】
実施例７：Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−６−カルボキサミド（１２）およびＮ−［４−（２−アミノ−４−メチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド（１３）
【００８１】
【化８】
2008539198.tif 000009
【００８２】
６−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノ−４−メチルピリミジン（１１）８mg（０．０３mmol）および５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン スクシンイミジルエステル（Molecular Probes、７．４７mg、０．０１４mmol）を、ＴＥＡ２０μlを含むＤＭＦ８５０μlに溶解し、室温で２４時間放置した。生成物を精製し、水：アセトニトリルの線形勾配（２０分間に９５：５〜２０：８０、ＴＦＡ０．０８％）を用いたＣ１８カラムでの逆相ＭＰＬＣによって、５−および６−異性体を分離した。（ＭＳ）ＥＳＩ：ｍ／ｚ＝６５８．８［Ｍ−Ｃｌ］+。
【００８３】
実施例８：Ｎ−［４−（２−アミノ−４−クロロピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（１５）
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−ヒドロキシメチルベンジル）アセトアミド３５６mg（１．５２mmol）を、乾ジメチルアセトアミド３mlにアルゴン雰囲気下で溶解し、ＮａＨ７３．１mg（３．１mmol）を加えた。次いで、２−アミノ−４，６−ジクロロピリミジン２５０mg（１．５４mmol）を加え、溶液を、９０℃で一晩撹拌した。水１mlを注意深く加えて、すべての過剰なＮａＨをクエンチさせ、混合物を０．５NＨＣｌ ５０ml中に注いだ。粗生成物を、酢酸エチルで抽出し、併せた有機相を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：シクロヘキサン＝１：１〜３：１の勾配）によって精製した。収率：２５４mg（４６％）、ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝３６１．１［Ｍ＋Ｈ］+。
【００８４】
実施例９：６−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノ−４−クロロピリミジン（１６）
Ｎ−［４−（２−アミノ−４−クロロピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（１５）６５mg（０．１８mmol）を、メタノール１mlに溶解し、メチルアミン（エタノール中３３％）２mlで処理した。反応混合物を、室温で一晩撹拌し、すべての揮発性物質を、減圧下で除去した。生成物は、更に精製せずに、次の工程で用いた。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝２６５．３［Ｍ＋Ｈ］+。
【００８５】
実施例１０：Ｎ−［４−（２−アミノ−４−クロロピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−６−カルボキサミド（１７）およびＮ−［４−（２−アミノ−４−クロロピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド（１８）
【００８６】
【化９】
2008539198.tif 000010
【００８７】
６−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノ−４−クロロピリミジン（１６）８mg、（０．０３mmol）および５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン スクシンイミジルエステル（７．４７mg、０．０１４mmol）を、ＴＥＡ２０μlを含有するＤＭＦ８５０μlに溶解し、室温で２４時間放置した。生成物を精製し、水：アセトニトリルの線形勾配（２０分間に９５：５〜２０：８０、ＴＦＡ０．０８％）を用いたＣ１８カラムでの逆相ＭＰＬＣによって、５−および６−異性体を分離した。（ＭＳ）ＥＳＩ：ｍ／ｚ＝７１４．７［Ｍ−Ｃｌ］+。
【００８８】
実施例１１：Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］ローダミングリーン−６−カルボキサミド（１９）
【００８９】
【化１０】
2008539198.tif 000011
【００９０】
６−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノ−４−メチルピリミジン（１１）８mg（０．０３mmol）および５（６）−カルボキシローダミングリーン スクシンイミジルエステル（Molecular Probes、７．１０mg、０．０１４mmol）を、ＴＥＡ２０μlを含むＤＭＦ８５０μlに溶解し、室温で２４時間放置した。生成物を、水：アセトニトリルの線形勾配（２０分間に９５：５〜２０：８０、ＴＦＡ０．０８％）を用いたＣ１８カラムでの逆相ＭＰＬＣによって精製した。（ＭＳ）ＥＳＩ：ｍ／ｚ＝６０２．５［Ｍ−Ｃｌ］+。
【００９１】
実施例１２：Ｎ−［４−（２−アミノピリミジン−４−イルオキシメチル）ベンジル］−６−ビチニルアミノヘキサノイルカルボキサミド（２１）
【００９２】
【化１１】
2008539198.tif 000012
【００９３】
４−（４−アミノメチルベンジル）−２−アミノピリミジン（６）３．５mg（０．０１５mmol）およびＮ−（＋）−ビオチニルアミノカプロン酸スクシンイミジルエステル（３．５mg、０．００７mmol）を、ＴＥＡ４μlを含むＤＭＦ３００μlに溶解し、室温で２４時間放置した。生成物を、水：アセトニトリルの線形勾配（２０分間に９５：５〜２０：８０、ＴＦＡ０．０８％）を用いたＣ１８カラムでの逆相ＭＰＬＣによって精製した。（ＭＳ）ＥＳＩ：ｍ／ｚ＝５７０．８［Ｍ＋Ｈ］+。
【００９４】
実施例１３：Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］−６−ビチニルアミノヘキサノイルカルボキサミド（２２）
【００９５】
【化１２】
2008539198.tif 000013
【００９６】
６−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノ−４−メチルピリミジン（１１）３．５mg（０．０１５mmol）およびＮ−（＋）−ビオチニルアミノカプロン酸スクシンイミジルエステル（３．５mg、０．００７mmol）を、ＴＥＡ４μlを含むＤＭＦ３００μlにＴＥＡ４μlとともに溶解し、室温で２４時間放置した。生成物を、水：アセトニトリルの線形勾配（２０分間に９５：５〜２０：８０、ＴＦＡ０．０８％）を用いたＣ１８カラムでの逆相ＭＰＬＣによって精製した。（ＭＳ）ＥＳＩ：ｍ／ｚ＝５８４．８［Ｍ＋Ｈ］+。
【００９７】
実施例１４：Ｎ−［４−（２−アミノ−４−クロロピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］−６−ビチニルアミノヘキサノイルカルボキサミド（２３）
【００９８】
【化１３】
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【００９９】
６−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノ−４−クロロピリミジン（１６）３．５mg（０．０１５mmol）およびＮ−（＋）−ビオチニルアミノカプロン酸スクシンイミジルエステル（３．５mg、０．００７mmol）を、ＴＥＡ４μlを含むＤＭＦ３００μlに溶解し、室温で２４時間放置した。生成物を、水：アセトニトリルの線形勾配（２０分間に９５：５〜２０：８０、ＴＦＡ０．０８％）を用いたＣ１８カラムでの逆相ＭＰＬＣによって精製した。（ＭＳ）ＥＳＩ：ｍ／ｚ＝６０４．２［Ｍ＋Ｈ］+。
【０１００】
実施例１５：４−クロロ−６−（トリフルオロメチル）ピリミジン−２−アミン（２４）
２−アミノ−６−（トリフルオロメチル）ピリミジン−４−オール（２００mg、１．１mmol）をＰＯＣｌ3（３当量、０．３ml、３．３mmol）に溶解し、ジメチルアニリン（０．２８ml、２当量）を加えた。反応混合物を７０℃に４時間加熱した。得られた混合物を氷水混合物中に注ぎ、得られた沈澱を回収して、所望の化合物２４を５９％の収率で得た。ＥＳＩ−ＭＳ：ｍ／ｚ＝１９８［Ｍ＋Ｈ］+。
【０１０１】
実施例１６：Ｎ−［４−（２−アミノ−４−トリフルオロメチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（２５）
２，２，２−トリフルオロ−Ｎ−（４−ヒドロキシメチルベンジル）アセトアミド３２２mg（１．３８mmol）を、乾ジメチルアセトアミド２mlにアルゴン雰囲気下で溶解し、ＮａＨ５０mg（２．１mmol）を加えた。次いで、４−クロロ−６−（トリフルオロメチル）ピリミジン−２−アミン（２４）１３６mg（０．６９mmol）を加え、溶液を９０℃で一晩撹拌した。水１mlを注意深く加えて、すべての過剰なＮａＨをクエンチさせ、混合物を０．５NＨＣｌ ５０ml中に注いだ。粗生成物を、酢酸エチルで抽出し、併せた有機相を、ブラインで洗浄し、ＭｇＳＯ4で乾燥した。溶媒を蒸発させた後、生成物を、フラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：シクロヘキサン＝１：１〜３：１の勾配）によって精製した。
【０１０２】
実施例１７：６−（４−アミノメチル−ベンジルオキシ）−２−アミノ−４−トリフルオロピリミジン（２６）
Ｎ−［４−（２−アミノ−４−トリフルオロメチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］−２，２，２−トリフルオロアセトアミド（２５）５０mg（０．１５mmol）を、メタノール１mlに溶解し、メチルアミン（エタノール中３３％）２mlで処理した。反応混合物を室温で一晩撹拌し、すべての揮発性物質を減圧下で除去した。生成物は、更に精製せずに次の工程で用いた。
【０１０３】
実施例１８：Ｎ−［４−（２−アミノ−４−トリフルオロピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−６−カルボキサミド（２７）およびＮ−［４−（２−アミノ−４−トリフルオロピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド（２８）
【０１０４】
【化１４】
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【０１０５】
６−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノ−４−トリフルオロピリミジン（２６）４．５mg（０．０１５mmol）および５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン スクシンイミジルエステル（２mg、０．００３８mmol）を、ＴＥＡ１μlを含むＤＭＦ４２０μlに溶解し、室温で２４時間放置した。生成物を精製し、５−および６−異性体を、水：アセトニトリルの線形勾配（２０分間に９５：５〜２０：８０、ＴＦＡ０．０８％）を用いたＣ１８カラムでの逆相ＭＰＬＣによって分離した。（ＭＳ）ＥＳＩ：ｍ／ｚ＝７１１．１［Ｍ−Ｃｌ］+。
【０１０６】
実施例１９：Ｎ−［４−（２−アミノ−４−トリフルオロメチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］ローダミングリーン−６−カルボキサミド（２９）
【０１０７】
【化１５】
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【０１０８】
６−（４−アミノメチルベンジルオキシ）−２−アミノ−４−メチルピリミジン（２６）５．４mg（０．０１８mmol）および５（６）−カルボキシローダミングリーン スクシンイミジルエステル（Molecular Probes、２．２mg、０．００４３３mmol）を、ＴＥＡ１μlを含むＤＭＦ５００μlに溶解し、室温で２４時間放置した。生成物を、水：アセトニトリルの線形勾配（２０分間に９５：５〜２０：８０、ＴＦＡ０．０８％）を用いたＣ１８カラムでの逆相ＭＰＬＣによって精製した。（ＭＳ）ＥＳＩ：ｍ／ｚ＝６５５．６［Ｍ−Ｃｌ］+。
【０１０９】
実施例２０：ＡＧＴ融合タンパク質のための標識化プロトコル
ｈＡＧＴを欠くＣＨＯ細胞内に安定的なトランスフェクションを生じさせるために、ｈＡＧＴの以下の修飾の融合を用いた：Ｃｙｓ６２Ａｌａ、Ｌｙｓ１２５Ａｌａ、Ｌｙｓ１２７Ｔｈｒ、Ａｒｇ１２８Ａｌａ、Ｇｌｙ１３１Ｌｙｓ、Ｇｌｙ１３２Ｔｈｒ、Ｍｅｔ１３４Ｌｅｕ、Ａｒｇ１３５Ｓｅｒ、Ｃｙｓ１５０Ｓｅｒ、Ａｓｎ１５７Ｇｌｙ、Ｓｅｒ１５９Ｇｌｕ、１８２におけるトランケーション［ＳＮＡＰ２６、この突然変異種ｈＡＧＴをＡＧＴと命名する、ＰＣＴ／ＥＰ２００５／０５０９００を参照されたい］。
【０１１０】
ＳＮＡＰ２６を、ＳＶ４０ウイルス核局在配列の３繰返し単位と融合させて、ＳＮＡＰ２６−ＮＬＳ３を得るか、さもなければＳＮＡＰ２６を、ファルネシル化配列と融合させて、ＳＮＡＰ２６−Ｆを得た。生細胞内では、ＳＮＡＰ２６−Ｆは、ファルネシル化され、その後細胞膜へと動員されることになる。両遺伝子の安定的なトランスフェクションを用いて、Ｌが発蛍光団である式（Ｉ）のピリミジン化合物の標識化性能を試験した。細胞を、２４穴組織培養プレートに播種し、一晩放置して、再付着させた。組織培養液を、１０％ウシ胎児血清で強化したＦ１２培養液中に５μMの式（Ｉ）の化合物を含有する標識化溶液と交換した。細胞を、ＣＯ2インキュベーター内で３７℃で３０分間温置した。１０％ウシ胎児血清を含有するＦ１２培養液５００μlによる２回の洗浄の後、細胞を３０分間温置して、結合しなかった式（Ｉ）の化合物が細胞から漏出するにまかせた。細胞をもう一度洗浄してから、Ｌがテトラメチルローダミンである式（Ｉ）の化合物に対して取り付けた標準的なローダミンフィルター、またはＬがローダミングリーンである場合に取り付けた標準的な蛍光フィルターを用いた、Zeiss社のAxiovert 40 CFLなる表面蛍光顕微鏡下で画像化した。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】ＢＧ−ＴＭＲならびに化合物１７および１８で標識化したＣＨＯ−ＳＮＡＰ２６−ＮＬＳ３細胞を示す画像である（実施例２０を参照されたい、露出時間：３秒、倍率：４０ｘ）。（Ａ）Ｏ6−［（５（６）−カルボキシテトラメチルローダミン）−アミドメチル］ベンジルグアニジン、ＢＧ−ＴＭＲ、（Ｂ）Ｎ−［４−（２−アミノ−４−クロロピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−６−カルボキサミド（１７）、（Ｃ）Ｎ−［４−（２−アミノ−４−クロロピリミジン−５−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−６−カルボキサミド（１８）。
【図２】ＢＧ−ＴＭＲならびに化合物１７および１８で標識化したＣＨＯ−ＳＮＡＰ２６−Ｆ細胞を示す画像である（実施例２０を参照されたい、露出時間：３秒、倍率：４０ｘ）。（Ａ）ＢＧ−ＴＭＲ、（Ｂ）１７、（Ｃ）１８。
【図３】ＢＧ−ＴＭＲならびに化合物７および８で標識化したＣＨＯ−ＳＮＡＰ２６−ＮＬＳ３細胞を示す画像である（実施例２０を参照されたい、露出時間：３秒、倍率：４０ｘ）。（Ａ）ＢＧ−ＴＭＲ、（Ｂ）Ｎ−［４−（２−アミノピリミジン−４−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−６−カルボキサミド（７）、（Ｃ）Ｎ−［４−（２−アミノピリミジン−４−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド（８）。
【図４】ＢＧ−ＴＭＲならびに化合物７および８で標識化したＣＨＯ−ＳＮＡＰ２６−Ｆ細胞を示す画像である（実施例２０を参照されたい、露出時間：３秒、倍率：４０ｘ）。（Ａ）ＢＧ−ＴＭＲ、（Ｂ）７、（Ｃ）８。
【図５】ＢＧ−ＴＭＲならびに化合物１２および１３で標識化したＣＨＯ−ＳＮＡＰ２６−ＮＬＳ３細胞を示す画像である（実施例２０を参照されたい、露出時間：３秒、倍率：４０ｘ）。（Ａ）ＢＧ−ＴＭＲ、（Ｂ）Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−６−カルボキサミド（１２）、（Ｃ）Ｎ−［４−（２−アミノ−４−メチルピリミジン−６−イルオキシメチル）ベンジル］テトラメチルローダミン−５−カルボキサミド（１３）。
【図６】ＢＧ−ＴＭＲならびに化合物１２および１３で標識化したＣＨＯ−ＳＮＡＰ２６−Ｆ細胞を示す画像である（実施例２０を参照されたい、露出時間：３秒、倍率：４０ｘ）。（Ａ）ＢＧ−ＴＭＲ、（Ｂ）１２、（Ｃ）１３。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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