(57)【要約】本発明は、Ｎｏｄ１の発現および／またはＮＯＤ１の活性を増加させることを含む腫瘍を治療するための組成物および方法を提供する。本発明の１つの態様は、Ｎｏｄ１発現またはＮＯＤ１活性を増大させる因子を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物において腫瘍の退行を促進する方法である。本発明の方法で治療することができる腫瘍の例は脳、膀胱、頸部、結腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、膵臓、卵巣、前立腺、皮膚、胃または甲状腺腫瘍を含む。
2008531600.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
担体、および治療有効量のＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）、γ−Ｄ−グルタミ−メソ−ジアミノピメリン酸（ｉＥ−ＤＡＰ）、γ―Ｄ−Ｇｌｎ−ＤＡＰ（ｉＱ−ＤＡＰ）、Ｄ−Ａｌａ―Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）、またはこれらの組み合わせを含む組成物であって、ここで、該治療有効量は腫瘍の退行に効果的である、組成物。
【請求項２】
さらに、ＮＯＤ１ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む核酸を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項３】
前記ＮＯＤ１ポリペプチドが配列番号１または配列番号３を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項４】
前記ＮＯＤ１ポリペプチドをコードするセグメントが配列番号２を含む、請求項２記載の組成物。
【請求項５】
前記核酸が、さらに、調節エレメントを含む、請求項２記載の組成物。
【請求項６】
前記調節エレメントがプロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル、またはこれらの組み合わせである、請求項２記載の組成物。
【請求項７】
前記核酸が発現カセットまたは発現ベクターである、請求項２記載の組成物。
【請求項８】
前記核酸が遺伝子送達ビヒクルを含む、請求項２記載の組成物。
【請求項９】
さらに、有効量のＮＯＤ１ポリペプチドを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１０】
さらに、有効量の腫瘍壊死因子αを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１１】
さらに、有効量のシクロヘキシミドを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１２】
さらに、有効量のホルモンまたは抗ホルモンを含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１３】
さらに、有効量のＲＩＰ２キナーゼ阻害剤を含む、請求項１記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が腫瘍または癌性組織への局所投与のために処方される、請求項１記載の組成物。
【請求項１５】
Ｎｏｄ１発現またはＮＯＤ１活性を増加させる因子を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物において腫瘍退行を促進する方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が脳、膀胱、頸部、結腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、膵臓、卵巣、前立腺、皮膚、胃または甲状腺の腫瘍である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記腫瘍がエストロゲン感受性腫瘍である、請求項１５記載の方法。
【請求項１８】
前記腫瘍が乳房の腫瘍である、請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記因子がＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）、γ―Ｄ−グルタミ−メソ−ジアミノピメリン酸（ｉＥ−ＤＡＰ）、γ―Ｄ−Ｇｌｕ−ＤＡＰ（ｉＱ−ＤＡＰ）、Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）またはこれらの組み合わせである、請求項１５記載の方法。
【請求項２０】
前記因子が、ＮＯＤ１ポリペプチドをコードする核酸セグメントを含む核酸である、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記ＮＯＤ１ポリペプチドが配列番号１または配列番号３を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記ＮＯＤ１ポリペプチドをコードする該核酸セグメントが配列番号２を含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
前記核酸が、さらに、調節エレメントを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２４】
前記調節エレメントがプロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル、またはこれらの組み合わせである、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記核酸が発現カセットまたは発現ベクターである、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
前記核酸が遺伝子送達ビヒクルを含む、請求項２０記載の方法。
【請求項２７】
前記因子がＮＯＤ１ポリペプチドである、請求項１５記載の方法。
【請求項２８】
前記ＮＯＤ１ポリペプチドが配列番号１または配列番号３を含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記因子が、腫瘍または癌性組織の部位に局所投与される、請求項１５記載の方法。
【請求項３０】
前記因子が、徐放用に処方される、請求項１５記載の方法。
【請求項３１】
前記因子が、有効量の腫瘍壊死因子αと組み合わせて投与される、請求項１５記載の方法。
【請求項３２】
前記因子が、有効量のシクロヘキシミドと組み合わせて投与される、請求項１５記載の方法。
【請求項３３】
前記因子が、有効量のＲＩＰ２キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与される、請求項１５記載の方法。
【請求項３４】
前記因子が、有効量のホルモンまたは抗ホルモンと組み合わせて投与される、請求項１５記載の方法。
【請求項３５】
前記ホルモンがエストロゲンである、請求項３４記載の方法。
【請求項３６】
前記抗ホルモンが抗エストロゲンである、請求項３４記載の方法。
【請求項３７】
前記因子が有効量の化学療法化合物と組み合わせて投与される、請求項１５記載の方法。
【請求項３８】
前記化学療法化合物がアルトレタミン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルシウムフォリネート、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、ティオグアニン／チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
ＮＯＤ１活性を欠く、単離されたＮｏｄ１−／―細胞株。
【請求項４０】
プロゲステロン受容体も欠く、請求項３９記載の単離されたＮｏｄ１−／―細胞株。
【請求項４１】
前記細胞株がＭＣＦ−７Ｃ２０細胞を含む、請求項３９記載の単離されたＮｏｄ１−／―細胞株。
【請求項４２】
さらに、組み換えＮｏｄ１対立遺伝子を含む、請求項３９記載の単離されたＮｏｄ１−／―細胞株。
【請求項４３】
ＲＩＰ２酵素を試験因子と接触させること、および該試験因子がＲＩＰ２キナーゼ活性を阻害するか否かを決定することを含む、化学療法剤を同定する方法であって、ここで、該試験因子による細胞におけるＲＩＰ２活性の阻害は、該試験因子が化学療法剤であることを示す、方法。
【請求項４４】
前記方法がインビトロで行われる、請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
前記方法がインビボで行われる、請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
乳房腫瘍細胞を有効量のＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）と接触させることを含む、乳房腫瘍細胞においてアポトーシスを促進する方法。
【請求項４７】
Ｎｏｄ１−／−細胞を試験因子と接触させること、および該試験因子が該細胞のアポトーシスを増加させるか否かを判断することを含む、細胞においてアポトーシスを増加させる因子を同定する方法。
【請求項４８】
前記アポトーシスを増加させる試験因子が化学療法剤として有用である、請求項４７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、米国仮特許出願第６０／６５６，１７５号（２００５年２月２５日出願）、および米国仮特許出願第６０／７５２，７９４号（２００５年１２月２２日出願）の出願日の利益を主張する。これらの内容は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
政府の基金
本明細書中に記載された発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された基金番号ＡＩ１５１３６下で合衆国政府の支援でなされた。合衆国政府は、本発明においてある種の権利を有する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、Ｎｏｄ１、および形質転換された悪性細胞のアポトーシスにおけるその機能に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
癌は、多くの人々に悪影響を及ぼす疾患であって、ヒトおよび非ヒト動物において死亡の主な原因である。癌は、典型的には、次いで、多くの新しい細胞を作り出す少数の細胞の制御されない分裂を含む。従って、多くの抗癌薬物は、細胞の増殖を阻害し、または停止させる因子である。そのような化学療法剤は新形成病を有する患者の生存率を改善したが、多くの化学療法剤に伴う深刻な副作用は、それらの用法を制限し、癌によって既に弱められた患者の健康を害する。従って、癌細胞に対して増強された選択性を呈する、あるいは癌細胞の増殖を制御することができる新しい因子が必要とされる。
【０００５】
多くの抗癌剤に伴う１つの主な問題はそれらの特異性である。抗癌薬物は、癌性である細胞および癌性でない細胞の間を区別する必要がある。しかしながら、膨大な抗癌薬物はこの点について区別しない。典型的には、抗癌剤は負の血液学的効果（例えば、有糸分裂の停止、および骨髄およびリンパ系組織における形成されたエレメントの崩壊）、および免疫抑制作用（例えば、抑制された細胞カウント）を有し、また、上皮組織（例えば、腸粘膜）、生殖系組織（例えば、精子形成の悪化）、および神経系に対するひどいインパクトを有し得る。例えば、非特許文献１参照。
【非特許文献１】Ｐ．Ｃａｌａｂｒｅｓｉ  ａｎｄ  Ｂ．Ａ．Ｃｈａｂｎｅｒ，Ｉｎ：Ｇｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  （Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）（ｐｐ．１２０９−１２１６）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
必要とされるのは、選択された腫瘍タイプ、または好ましくは広く種々の腫瘍タイプを有利に治療することができ、かつ侵入性腫瘍に特に適した抗癌剤である。さらに、そのような抗癌剤は効果的なはずであるが、それらは毒性をほとんどまたは全く呈しないべきである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要旨
本発明は、Ｎｏｌ１発現またはＮＯＤ１活性の増加を含む腫瘍細胞においてアポトーシスを促進するための組成物および方法を提供する。
【０００８】
かくして、本発明の１つの態様は、Ｎｏｄ１発現またはＮＯＤ１活性を増大させる因子を哺乳動物に投与することを含む哺乳動物において腫瘍の退行を促進する方法である。本発明の方法で治療することができる腫瘍の例は脳、膀胱、頸部、結腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、膵臓、卵巣、前立腺、皮膚、胃または甲状腺腫瘍を含む。いくつかの実施形態において、腫瘍はエストロゲン感受性腫瘍または乳癌である。
【０００９】
ＮＯＤ１活性を増大させる因子の例は以下の配列を有するペプチドを含む：Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）、γ−Ｄ−グルタミ−メソ−ジアミノピメリン酸（ｉＥ−ＤＡＰ）、γ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＤＡＰ（ｉＱ−ＤＡＰ）、Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）、およびこれらの組み合わせ。これらのペプチドはＮＯＤ１タンパク質を活性化することができ、よって、アポトーシスに導くＮｏｄ１依存性経路を活性化することができる。ＮＯＤ１活性を増大させることができる因子のもう１つの例はＮＯＤ１ポリペプチドである。いくつかの実施形態において、ＮＯＤ１ポリペプチドはヒトＮＯＤ１ポリペプチド、例えば、配列番号１または配列番号３を持つヒトＮＯＤ１ポリペプチドであり得る。
【００１０】
Ｎｏｄ１発現を増加させることができる因子の１つの例は、ＮＯＤ１ポリペプチドをコードするセグメントを含む核酸である。ＮＯＤ１ポリペプチドについての配列の例は配列番号１または配列番号３を含む。ＮＯＤ１ポリペプチドをコードする核酸セグメントの１つの例は、配列番号２を含む。該核酸は、さらに、調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル、またはこれらの組み合わせを含むことができる。該核酸は発現カセット、または発現ベクター、または遺伝子送達ビヒクルの一部であり得る。
【００１１】
さらなる有効成分を、Ｎｏｄ１発現またはＮＯＤ１活性を増大させる因子と組み合わせて投与することができる。例えば、有効量の腫瘍壊死因子αをそのような因子と共に投与することができる。いくつかの実施形態において、腫瘍壊死因子αはＮｏｄ依存性アポトーシス経路を増強させることができる。加えて、有効量のシクロヘキシミドを、該因子と共に投与して、Ｎｏｄ１発現またはＮＯＤ１活性を増加させることができる。さらに、１以上の化学療法化合物を該因子と組み合わせて投与することができる。
【００１２】
本発明の組成物および方法で用いてもよい化学療法化合物の例はアルトレタミン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルシウムフォリネート、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール−ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、ティオグアニン／チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、およびこれらの組み合わせを含む。
【００１３】
該因子は腫瘍の部位へ局所投与することができ、および／または徐放用に処方することができる。
【００１４】
本発明のもう１つの態様は、担体、ＮＯＤ１ポリペプチドをコードするセグメントを含む核酸、および有効量のＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）、γ−Ｄ−グルタミ−メソ−ジアミノピメリン酸（ｉＥ−ＤＡＰ）、γ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＤＡＰ（ｉＱ−ＤＡＰ）、またはＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）を含む組成物であり、ここで、該組成物は腫瘍への局所投与用に処方される。ＮＯＤ１ポリペプチドは、例えば、配列番号１または配列番号３を含むことができる。ＮＯＤ１ポリペプチドをコードする核酸セグメントの例は配列番号２である。該組成物で使用される核酸は調節エレメント、例えば、プロモーター、エンハンサー、転写終結シグナル、またはこれらの組み合わせを含むことができる。該核酸は発現カセットまたは発現ベクターであり得る。該核酸は遺伝子送達ビヒクルを含む。本発明の組成物は他の有効成分、例えば、有効量の腫瘍壊死因子αまたは化学療法化合物も含むことができる。該組成物は腫瘍の部位への局所投与用に処方することができ、および／または徐放用に処方することができる。
【００１５】
本発明のもう１つの態様は、乳癌細胞を有効量のＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）と接触させることを含む乳癌細胞においてアポトーシスを促進する方法である。
【００１６】
本発明のもう１つの態様は、乳癌細胞を有効量のＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）と接触させることを含むエストロゲン感受性腫瘍細胞においてアポトーシスを促進する方法である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
発明の詳細な説明
本発明によると、増大されたＮｏｄ１発現またはＮＯＤ１活性は腫瘍退行に導く。本発明は、従って、抗腫瘍処理として、ＮＯＤ１ポリペプチド、ＮＯＤ１核酸、およびＮｏｄ１発現またはＮＯＤ１活性を増大させる因子を対象に投与することを含む。いくつかの実施形態において、Ｎｏｄ１発現または活性を増加させる因子は、γ−Ｄ−グルタミ−メソ−ジアミノピメリン酸（ｉＥ−ＤＡＰ）、γ−Ｄ−Ｇｌｎ−ＤＡＰ（ｉＱ−ＤＡＰ）、Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）、およびこれらの組み合わせのようなＮＯＤ１のペプチドアクチベーターを含む。本発明では、いずれのタイプの腫瘍を治療することも考えられるが、本発明の組成物および方法は、エストロゲン感受性腫瘍および／または乳癌腫瘍を治療するための特別な用途を有することができる。
【００１８】
ＮＯＤ１
先天性免疫系は、微生物、ウイルス、異常な／損傷した宿主細胞などの成分を認識する受容体のファミリーからなり、宿主応答を開始させて、侵入する生物を排除し、殺傷し、または非典型的宿主細胞を除去する。最近、Ｎｏｄ／毛虫ファミリーとして知られた細胞内サイトゾルタンパク質のファミリーが先天的免疫応答に関連付けられている。このファミリーの全てのメンバーは２つの保存されたドメイン、すなわち、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン（ＮＢＤ／ＮＯＤ）およびカルボキシル末端ロイシン−リッチな反復（ＬＲＲ）領域を有する。エフェクタードメインといわれるファミリーメンバーのアミノ末端領域は、カスパーゼ動員ドメイン（ＣＡＲＤ）、ピリン、ＢＩＲおよび他のドメインを含む可変構造を含有する。
【００１９】
Ｎｏｄ／毛虫ファミリーの２つのメンバーは、特に、感染に対する先天性免疫応答に関連付けられている。これらのメンバーはＮＯＤ１（ＣＡＲＤ４）およびＮＯＤ２（ＣＡＲＤ１５）として知られている。ＮＯＤ１およびＮＯＤ２のエフェクタードメインは、各々、１および２のＣＡＲＤドメインからなる。ＮＯＤ１およびＮＯＤ２は、最初、細菌リポ多糖（ＬＰＳ）に対する受容体として作用する細胞内タンパク質であると提唱された。引き続いて、ＮＯＤリガンドは細菌ペプチドグリカン（ＰＧＮ）に由来し、ＬＰＳから由来しないことが見出された。かくして、ＮＯＤ１およびＮＯＤ２は、感染の間において細菌または細菌産物の細胞内センサーとして機能するようである。しかしながら、現在までに行われた研究は、ＮＯＤ１またはＮＯＤ２が欠乏したマウスは、免疫不全に関連する明白な表現型、または感染に対する増大した感受性を発現しないことを示す。
【００２０】
ＮＯＤ１についての核酸およびアミノ酸配列、およびＮＯＤ／毛虫ファミリーの他のメンバーは、例えば、ＮＣＢＩデータベースにおいて当該分野で見出すことができる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるウェブサイト参照。例えば、ヒトＮＯＤ１についての１つのアミノ酸配列は、配列番号１として容易な参照のために以下に掲げる（ＮＣＢＩアクセション番号Ｑ９Ｙ２３９；ｇｉ：２０１３７５７９）。
【００２１】
【化１】
2008531600.tif 000003
ヒトＮｏｄ１についてのヌクレオチド配列もまたＮＣＢＩアクセション番号ＢＣ０４０３３９として入手可能であり（ｇｉ：２５９５５６６０）、容易な参照のために配列番号２として以下に再掲する。
【００２２】
【化２】
2008531600.tif 000004
【００２３】
【化３】
2008531600.tif 000005
【００２４】
【化４】
2008531600.tif 000006
【００２５】
【化５】
2008531600.tif 000007
【００２６】
【化６】
2008531600.tif 000008
ＮＯＤ１タンパク質は細菌の認識において重要な役割を有するように見え、細胞内区画において特異的宿主パターン認識受容体として機能できる。最近の研究は、ジアミノピメリン酸を含有する細菌ペプチドグリカンの宿主認識において必須であるそのＮＯＤ１を示している（Ｃｈａｍａｉｌｌａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ＤＯＩ：１０．１０３８／ｎｉ９４５，  Ｊｕｎｅ８，２００３）。ＮＯＤ１によって認識されるコア構造は、ジペプチド、γ−Ｄ−グルタミル−メソ−ジアミノピメリン酸（ｉＥ−ＤＡＰともいわれる）である。このジペプチドは、限定された数の細菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓおよびＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）のようないくつかのグラム陽性菌）においてのみ存在することが知られている。
【００２７】
本発明者らは、ＮＯＤ１が細胞をＴＮＦα誘導アポトーシスに対して感受性とすること、およびＮＯＤ１特異的リガンドがいずれかの他の公知のアポトーシストリガーの非存在下で腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導することを見出した。動物モデルを用いるインビボ研究は、ＮＯＤ１が腫瘍退行において有する役割を説明し、それを強調する。特に、本明細書中で示すように、ＳＣＩＤマウスに入れられたＭＣＦ−７乳癌細胞の異種移植片は典型的には腫瘍を形成する。しかしながら、しばらくした後に、抗腫瘍処理なくしてさえも、これらの腫瘍が典型的には退行する。しかしながら、Ｎｏｄ１−／−ＭＣＦ−７腫瘍細胞をマウスに移植すると、腫瘍は退行せず、その代わり、成長し続ける（図１０）。（適当な遺伝子構築体のトランスフェクションによって）ＮＯＤ１機能をＮｏｄ１−／−ＭＣＦ−７腫瘍細胞に戻すと、これらのＮＯＤ１発現細胞を移植することによって生じた腫瘍はいまや退行するであろう。よって、ＮＯＤ１発現は腫瘍細胞の成長を制御するのを助けることができ、腫瘍細胞のアポトーシスに導くことができる。
【００２８】
本発明は、アポトーシス活性を保有するＮＯＤ１突然変異体（Ｖ４１Ｑ）ポリペプチドも提供する。このＶ４１Ｑ突然変異体ＮＯＤ１ポリペプチドの配列を配列番号３として以下に掲げ、Ｖ４１Ｑ突然変異は太文字とし、かつ下線を施す。
【００２９】
【化７】
2008531600.tif 000009
突然変異Ｖ４１ＱはＮｏｄ１のＣＡＲＤドメインで起こり、カスパーゼ９のＮｏｄ１への結合を破壊すると以前に報告されている。しかしながら、Ｖ４１Ｑ突然変異がＮｏｄ１依存性アポトーシスを阻害することを示す以前の結果とはコントロール的に、本発明者らによって行われた実験は、Ｖ４１Ｑ突然変異体ポリペプチドがアポトーシス経路において活性であることを示す（図４）。
【００３０】
腫瘍
本発明の組成物および方法は、限定されるものではないが、エストロゲン感受性腫瘍ならびに胸、膀胱、頸部、結腸、胆嚢、腎臓、肝臓、肺、膵臓、卵巣、前立腺、皮膚、胃、甲状腺などの腫瘍を含めた、種々の癌および腫瘍の治療で有用である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物を用いて、膀胱、胸、結腸、腎臓、肝臓、小細胞肺癌を含めた肺、食道、胆嚢、卵巣、膵臓、胃、頸部、甲状腺、前立腺、および扁平細胞癌腫を含めた皮膚などの癌腫；白血病、急性リンパ系白血病、急性リンパ芽球白血病、Ｄ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、毛様細胞リンパ腫およびバーケットリンパ腫を含めたリンパ系の造血系腫瘍；急性および慢性骨髄性白血病、骨髄形成異常症候群およびプロ骨髄細胞白血病を含めた骨髄系の造血系腫瘍；線維肉腫および横紋筋肉腫を含めた間葉起源の腫瘍；神経膠星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠細胞腫および神経鞘腫を含めた中枢および末梢神経系の腫瘍；メラノーマ、セミノーマ、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトキサントーマ、甲状腺小胞子癌およびカポシ肉腫を含めた他の腫瘍を含めた種々の癌および腫瘍を治療または予防することが出来る。いくつかの実施形態において、本発明を用いて、乳癌および腫瘍を治療または予防することができる。
【００３１】
例えば、ＮＯＤ１ポリペプチド、Ｎｏｄ１核酸、ＮＯＤ１の発現または活性を増加させることができる因子、またはこれらの組み合わせを、単独で、あるいはＴＮＦのような他の因子と組み合わせて腫瘍に、または腫瘍に隣接して注射して、腫瘍細胞がアポトーシスを受けるようにすることができる。従って、本発明の組成物および方法を用いて癌を治療することができる。
【００３２】
ＮＯＤ１の発現および活性の変調
本発明によると、増大したＮＯＤ１発現および／またはＮＯＤ１活性は腫瘍の退行を促進する。よって、本発明は、ＮＯＤ１ポリペプチド、Ｎｏｄ１核酸、ＮＯＤ１発現および／または活性を増大させる因子、またはこれらの組み合わせを哺乳動物に投与することによって、哺乳動物において腫瘍の成長を治療し、予防する方法を提供する。ＮＯＤ１の発現または活性を増大させる因子は、ＮＯＤ１の転写、翻訳または活性を増大させることができるいずれの因子を含む。
【００３３】
かくして、腫瘍退行の発生率は、ＮＯＤ１ポリペプチド（例えば、配列番号１）、ＮＯＤ１ポリペプチドをコードする核酸（例えば、配列番号２を含む核酸）を投与することによって増大または促進することができる。ＮＯＤ１をコードする核酸は、容易な操作、発現および複製のために発現カセットに入れ、および／またはベクターに維持することができる。ＮＯＤ１をコードしＮＯＤ１ポリペプチドを発現することができる核酸の作成方法は後により詳細に記載する。
【００３４】
ＮＯＤ１の発現または活性を増加させる因子は、ＮＯＤ１活性を増強させる小さなペプチジルリガンドを含む。例えば、γ―Ｄ−グルタミ―メソ―ジアミノピメリン酸（ｉＥ−ＤＡＰ）、γ―Ｄ−Ｇｌｎ−ＤＡＰ（ｉＱ−ＤＡＰ）、Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメミン酸（γＴｒｉＤＡＰ）、およびこれらの組み合わせはＮＯＤ１の発現または活性を増加させることができる。いくつかの実施形態において、γ―Ｄ−グルタミ―メソ―ジアミノピメリン酸（ｉＥ−ＤＡＰ）のみ、またはγ―Ｄ−Ｇｌｎ−ＤＡＰ（ｉＱ−ＤＡＰ）のみ、またはＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）を用い、または投与する。他の実施形態において、γ―Ｄ−グルタミ―メソ―ジアミノピメリン酸（ｉＥ−ＤＡＰ）、γ―Ｄ−Ｇｌｎ−ＤＡＰ（ｉＱ−ＤＡＰ）、および／またはＤ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）の組み合わせを用い、または投与する。
【００３５】
本発明は、さらに、対象のＮＯＤ１活性を改変することができる因子を供し；次いで、対象のＮＯＤ１活性が改変されるような条件下で該因子を対象に投与することを含む、対象においてＮＯＤ１活性を変調する方法を提供する。いくつかの実施形態において、該因子の対象への投与の結果、対象内において腫瘍の退行がもたらされる。本発明は特定の化合物に制限されない。事実、限定されるものではないが、Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）を含むペプチド、グルタミン―ジアミノピメリン酸ジペプチド、およびグルタミン酸―ジアミノピメリン酸ジペプチドを含むペプチド（例えば、ｉＥ−ＤＡＰ、ｉＱ−ＤＡＰ，ｉＥ−ＤＡＰもしくはｉＱ−ＤＡＰのアナログ、またはｉＥ−ＤＡＰもしくはｉＱ−ＤＡＰの小分子ミメティック）を含めた種々の化合物が考えられる。
【００３６】
併用療法
本発明では、ＮＯＤ１促進剤と、他の入手可能な抗治療剤との組み合わせを使用する組成物および方法が考えられる。慣用的な抗腫瘍剤の用量はしばしばできるだけ低く維持される。なぜならば、副作用はより高い用量で観察され得るからである。本発明において、ＮＯＤ１および／またはＮＯＤ１の発現または活性を増加させる因子と、入手可能な抗腫瘍剤との組み合わせは、それらに対して抗腫瘍剤が効果的である癌のスペクトルを改良し、それらの抗腫瘍剤の必要な用量を低下させることができる。かくして、本発明では、本発明のＮＯＤ１関連因子と１以上の抗腫瘍または静癌剤との組み合わせが考えられる。当業者に入手可能ないずれの抗腫瘍および静癌剤も、本発明のＮＯＤ１関連因子と共に用いることができる。しかしながら、いくつかの実施形態において、選択された抗腫瘍または静癌剤は異なる作用メカニズムを有し、あるいは幾分異なるタイプの癌または腫瘍に対して働く。例えば、本発明のＮＯＤ１関連因子を静癌剤または免疫アクチベーターと組み合わせて、ＮＯＤ１のプロアポトーシス効果を、静癌剤の抗新形成効果および／または免疫アクチベーターによって誘導されたプロ免疫応答と組み合わせることができる。さらに、いくつかの場合には、これらの方法に加えて放射線療法または外科的処置を行って、治療の効果を改善する。
【００３７】
本発明のＮＯＤ１関連因子と組み合わせて用いることができる他の化学療法剤の例はアルトレタミン、ブレオマイシン、ブスルファン、カルシウムフォリネート、カペシタミン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタミン、ヒドロキシ尿素、イダルビシン、イフォスファミド、イリノテカン、リポソームドキソルビシン、ロムスチン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトリキセート、マイトマイシン、マイトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、ストレプトゾシン、テガフール―ウラシル、テモゾロミド、チオテパ、ティオグアニン／チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンおよびこれらの組み合わせを含む。
【００３８】
いくつかの実施形態において、ＮＯＤ１関連因子は１以上のホルモンと共に投与される。例えば、ＮＯＤ１関連因子は１以上のアンドロゲン、プロゲステロン、エストロゲンまたは抗エストロゲンと共に投与することができる。抗エストロゲンは、エストロゲンに対して応答性である細胞または組織に対して拮抗効果を発揮することによって、あるいは細胞表面に位置する受容体部位に対するアクセスについてエストロゲンと競合することによって作用する。例えば、薬物タモキシフェン（商品名：Ｎｏｌｖａｄｅｘ）またはＡｒｉｍｉｄｅｘ（アナストロゾール）は、用いることができる抗エストロゲンである。タモキシフェンは乳癌の治療で用いられており、高い危険性の婦人における乳癌発生率を低下させる。ここに示すように、タモキシフェンの添加はγＴｒｉＤＡＰ−Ｎｏｄ１誘導細胞死滅を部分的にブロックした。よって、いくつかの場合には、タモキシフェンは本発明のＮＯＤ１組成物において用いることができない。しかしながら、他の場合には、ＮＯＤ１因子の投与を含む治療養生法に含めた場合、タモキシフェンは有用であろう。
【００３９】
もう１つの実施形態において、本発明のＮＯＤ１関連因子は腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）と組み合わせて投与される。ＴＮＦαは、Ｐｒｏ−ｓｐｅｃ  Ｔａｎｙ  ＴｅｃｈｎｏＧｅｎｅ  Ｌｔｄ．（イスラエル）から商業的に入手可能である。腫瘍壊死因子についての配列は、ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおいてＮＣＢＩデータベースで見出すことができる。ヒトＴＮＦαについての配列の１つの例は配列番号４として以下に掲げる。
【００４０】
【化８】
2008531600.tif 000010
アポトーシス
本発明中に記載したように、ＮＯＤ１は腫瘍細胞のアポトーシスを促進することができる。腫瘍成長を治療または予防するために、当業者は抗腫瘍剤と、本発明に記載されたＮＯＤ１関連因子との組み合わせを使用するように選択することができる。本発明のＮＯＤ１関連因子と共に、種々の抗腫瘍剤を含有する組成物は、当業者に利用できる種々の方法で試験して、それらの組成物が最適に腫瘍退行および／または腫瘍細胞のアポトーシスを促進するかを確認することができる。
【００４１】
例えば、アポトーシスは、アポトーシスの間に生じたＤＮＡの断片の３’−ＯＨ遊離末端のＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ媒介ｄＵＴＰニック末端標識）標識を検出することによってアッセイすることができる（Ｇａｖｒｉｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｃｅｌ  Ｂｉｏ．１１９：４９３）。ＴＵＮＥＬアッセイは、一般には、クロモゲン系に、または蛍光タグにコンジュゲートされたヌクレオチドを、１８０−ｂｐ（塩基対）オリゴマーＤＮＡ断片の３’−ＯＨ末端に触媒により付加させて、該断片を検出することよりなる。１８０−ｂｐオリゴマーのＤＮＡラダーの存在はアポトーシスを示す。ＴＵＮＥＬ方法に基づいて細胞死滅を検出するための手法は、例えば、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ（Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｋｉｔ）およびＯｎｃｏｒ（Ａｐｏｐｔａｇ  Ｐｌｕｓ）から商業的に入手可能である。
【００４２】
現在入手可能なもう１つのアポトーシスマーカーは、商標ＡＰＯＰＴＥＳＴ下で販売されているアネキシンである。アネキシンマーカーは例えば、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから商業的にやはり入手可能である、「Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」で用いられる。アポトーシスの間に、細胞膜のリン脂質の非対称は、リン脂質が外側膜に露出されるように変化する。アネキシンはカルシウムの存在下でリン脂質に結合するタンパク質の相同群である。第２の試薬は、ＤＮＡ結合フルオロクロームであるヨウ化プロピジウム（ＰＩ）、アネキシンを検出する試薬と組み合わせて用いることができる。細胞集団を双方の試薬に暴露した場合、アポトーシス細胞はアネキシンに対して陽性およびＰＩに対して陰性に染色され、壊死細胞は双方に対して陽性に染色され、他方、生きた細胞は双方に対して陰性に染色される。アポトーシスについて試験する他の方法は当該分野で知られており、本発明の方法で用いることができる。
【００４３】
腫瘍退行は、動物モデル、例えば、当業者が入手できるいずれかの動物モデルまたは本明細書中において記載し説明された異種移植片モデルを用いることによって評価することができる。
【００４４】
異種移植片モデル
本発明はマウスにおいて腫瘍を形成することができる細胞株を含む異種移植片モデルを提供する。マウスをこれらの異種移植片細胞で接種すると、腫瘍が出現する。本発明の異種移植片細胞株はＮｏｄ１機能を欠如し、時々、本明細書中においてはＮｏｄ１−／−細胞という。驚くべきことには、ヌルＮｏｄ１対立遺伝子とは反対に野生型の存在を除いて同一の遺伝的バックグラウンドを持つ細胞は、迅速に退行する腫瘍を形成する。Ｎｏｄ１機能を欠如するＮｏｄ１−／−細胞のみが、継続して成長する腫瘍を形成する。本発明によると、これらの単離されたＮｏｄ１−／−細胞は腫瘍および腫瘍退行を研究するのに有用である。従って、本発明のＮｏｄ１−／−細胞を用いて、化学療法剤を開発し、腫瘍発生のメカニズムを調べることができる。
【００４５】
本発明の単離されたＮｏｄ１−／−細胞株の１つの例はＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞株である。本発明者らは、Ｃ２０クローンを雄マウスに移植した場合に、より頑強な腫瘍成長を観察した。ポリメラーゼ鎖反応増幅実験により、ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞、および機能的Ｎｏｌ１対立遺伝子が組み換えにより導入されたＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞（すなわち、ＭＣＦ−７  Ｃ２０ＮＯＤ１細胞）においてプロゲステロン受容体が失われていると判断される。さらなるＰＣＲ実験は、エストロゲン受容体アルファが３つのＭＣＦ−７細胞型全て（野生型ＭＣＦ−７細胞、ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞およびＭＣＦ−７  Ｃ２０ＮＯＤ１細胞）各々に存在したことを明らかにした。
【００４６】
Ｎｏｄ１発現カセットおよびベクター
本発明によると、ＮＯＤ１ポリペプチドは組み換えにより産生し、次いで、抗腫瘍剤としての対象への投与のために精製することができる。もう１つの実施形態において、ＮＯＤ１をコードする核酸を発現カセットおよび／または発現ベクターに入れることができる。これらのＮｏｄ１発現カセットおよび発現ベクターの抗腫瘍剤として対象に投与することもできる。よって、本発明は、Ｎｏｄ１発現カセットおよびＮｏｄ１発現ベクターを提供する。
【００４７】
ＮＯＤ１ポリペプチドの哺乳動物発現はＤｉｊｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯＪ．（１９８５）４：７６１，Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９８２ｂ）７９：６７７７，Ｂｏｓｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ（１９８５）４１：５２１および米国特許第４，３９９，２１６号に記載されているように達成することができる。哺乳動物発現の他の特徴はＨａｍ  および  Ｗａｌｌａｃｅ，  Ｍｅｔｈ，Ｅｎｚ．（１９７９）５８：４４，Ｂａｒｎｅｓ  および  Ｓａｔｏ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（１９８０）１０２：２５５，米国特許第４，７６７，７０４号，第４，６５７，８６６号，第４，９２７，７６２号，第４，５６０，６５５号，ＷＯ９０／１０３４３０，ＷＯ８７／００１９５，および米国再発行特許第３０，９８５号に記載されたように促進することができる。そのようなＮｏｄ１核酸の使用は内因性Ｎｏｄ１遺伝子の発現を増大させ、または置き換えることができる。
【００４８】
Ｎｏｄ１核酸は線状または環状分子内に置くことができる。それらは自立複製分子内にまたは複製配列なくして分子内に置くことができる。それらは、当該分野で知られたようにそれら自身によってまたは他の調節配列によって調節することができる。ＮＯＤ１をコードする核酸構築体は、細胞中でのＮｏｄ１配列の転写を制御するための、プロモーターエレメント、エンハンサーまたはＵＡＳエレメントおよび転写ターミネーターシグナルのような転写調節エレメントを含むことができる。
【００４９】
Ｎｏｄ１核酸は、Ｎｏｄ１  ｍＲＮＡ、全長ＮＯＤ１タンパク質、ＮＯＤ１融合タンパク質、ＮＯＤ１ポリペプチド、またはＮＯＤ１ポリペプチドの断片を細胞、好ましくは真核生物細胞に送達する目的で、発現カセットまたは遺伝子送達ビヒクルで用いることができる。本発明によると、遺伝子送達ビヒクルは例えば、裸のプラスミドＤＮＡ、ウイルス発現ベクターまたはリポソームまたは凝集剤と組み合わせた本発明のＮＯＤ１核酸であり得る。
【００５０】
ＮＯＤ１核酸は、トランスフェリン―ポリカチオン媒介ＤＮＡ導入、裸のまたはカプセル化された核酸でのトランスフェクション、リポソーム媒介ＤＮＡ導入、ＤＮＡ被覆ラテックスビーズの細胞内輸送、プロトプラスト融合、ウイルス感染、エレクトロポレーション、核酸マイクロプロジェクタイル手法の使用、およびリン酸カルシウム媒介トランスフェクションのような当該分野で利用できる種々の技術を用いて適当な宿主細胞に導入することができる。
【００５１】
本発明の１つの実施形態において、遺伝子送達ビヒクルはプロモーターおよびＮＯＤ１コーディング核酸を含む。用いることができるプロモーターの例は、組織特異的プロモーターおよびチミジンキナーゼおよびチミジレートシンターゼプロモーターのような細胞増殖によって活性化されるプロモーターを含む。他の好ましいプロモーターは、α―およびβ−インターフェロンプロモーターのようなウイルスでの感染によって活性化されるプロモーターおよびエストロゲンのようなホルモンによって活性化することができるプロモーターを含む。用いることができる他のプロモーターはモロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターを含む。
【００５２】
遺伝子送達ビヒクルはウイルス複製起点またはパッケージングシグナルのようなウイルス配列を含むことができる。これらのウイルス配列はアストロウイルス、コロナウイルス、オルトミクソウイルス、パボパウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルスのようなウイルスから選択することができる。いくつかの実施形態において、遺伝子送達ビヒクルは組み換えレトロウイルスベクターである。組み換えレトロウイルスおよびその種々の使用は、例えば、Ｍａｎｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ３３：１５３，１９８３，ＣａｎｅおよびＭｕｌｌｉｇａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ‘ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９，１９８４，Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４，１９９０，米国特許第４，４０５，７１２号，第４，８６１，７１９号，および第４，９８０，２８９号およびＰＣＴ出願Ｎｏｓ．Ｗｏ  ８９／０２，４６８，ＷＯ  ８９／０５，３４９，および  ＷＯ９０／０２，８０６を含めた多数の文献に記載されている。多数のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを本発明で利用することができ、例えば、ＥＰ０，４１５，７３１；ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８，ＷＯ９３／２５２３４；米国特許第５，２１９，７４０号；ＷＯ９３１１２３０；ＷＯ９３１０２１８；Ｖｉｌｅ  および  Ｈａｒｔ，ＣａｎｃｅｒＲｅｓ．５３：３８６０−３８６４，１９９３；ＶｉｌｅおよびＨａｒｔ，  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７，１９９３；Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８，１９９３；Ｔａｋａｍｉｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３，１９９２；Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５，１９９３（米国特許第４，７７７，１２７号，ＧＢ２，２００，６５１，ＥＰ０，３４５，２４２およびＷＯ９１１０２８０５）に記載されたものを含む。
【００５３】
利用することができるレトロウイルスの例は、鳥類白血病ウイルス（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−５３５およびＶＲ２４７）、ウシ白血病ウイルス（ＶＲ１３１５）、ネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ミンク細胞フォーカス誘導ウイルス（Ｋｏｃｈ  ｅｌ  ａｌ．，ｊ．Ｖｉｒ．４９：８２８，１９８４，およびＯｌｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．４８：５４２，１９８３）、ネズミ肉腫ウイルス（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−８４４、４５０１０および４５０１６）、網内皮症ウイルス（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−９９４、ＶＲ−７７０および４５０１１）、ラウス肉腫ウイルスメイソン−ファイザーサルウイルス、ヒヒ内因性ウイルス、内因性ネコレトロウイルス（例えば、ＲＤ１１４）、およびレトロウイルスベクターとして用いる、マウスまたはラットｇＬ３０配列を含む。それから組み換えレトロウイルスを作成することができるＭＬＶ株は４０７０Ａおよび１５０４Ａ（ＨａｒｔｌｅｙおよびＲｏｗｅ，Ｊ．Ｖｉｒ．１９：１９，１９７６），Ａｂｅｌｓｏｎ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−９９９），Ｆｒｉｅｎｄ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−２４５），Ｇｒａｆｆｉ（Ｒｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６７：４７２２，１９９３；およびＹａｎｔｃｈｅｖ  Ｎｅｏｐｋｓｍａ  ２６：３９７，１９７９），Ｇｒｏｓｓ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−５９０），Ｋｉｒｓｔｅｎ（Ａｌｂｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０，１９８６），Ｈａｒｖｅｙ肉腫ウイルス（Ｍａｎｌｙ  ｅｌ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６２：３５４０，１９８８；およびＡｌｂｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０，１９８６）およびＲａｕｓｃｈｅｒ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−９９８）およびＭｏｌｏｎｅｙ  ＭＬＶ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１９０）を含む。用いることができる非マウスレトロウイルスはラウス肉腫ウイルス、例えば、Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ（Ｍａｎｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒ．６２：３５４０，１９８８；およびＡｌｂｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１７１０，１９８６）、Ｂｒｙａｎ高力価（ｈｉｇｈ  ｔｉｔｅｒ）（ｅ．ｇ．，ＡＴＣＣ  Ｎｏｓ．ＶＲ−３３４、ＶＲ−６５７、ＶＲ−７２６、ＶＲ−６５９およびＶＲ−７２８），Ｂｒｙａｎ標準（ｓｔａｎｄａｒｄ）（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＶＲ−１４０），Ｃａｒｒ−Ｚｉｌｂｅｒ（Ａｄｇｉｇｈｉｔｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｏｐｌａｓｍａ  ２７：１５９，１９８０），Ｅｎｇｅｌｂｒｅｔｈ−Ｈｏｌｍ（Ｌａｕｒｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ９０８：２４１，１９８７），Ｈａｒｒｉｓ，Ｐｒａｇｕｅ（ｅ．ｇ．ＡＴＣＣ  Ｎｏｓ．ＶＲ−７７２および４５０３３）またはＳｃｈｍｉｄｔ−Ｒｕｐｐｉｎ（ｅ．ｇ．ＡＴＣＣ  Ｎｏｓ．ＶＲ−７２４，ＶＲ−７２５，ＶＲ−３５４）ウイルスである。
【００５４】
前記レトロウイルスのいずれも容易に利用して、本明細書中に提供される開示および標準的な組み換え技術（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）およびＫｕｎｋｌｅ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８２：４８８，１９８５）を仮定すれば、レトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを組み立て、構築することができる。レトロウイルス発現ベクターの一部は異なるレトロウイルスから誘導することができる。例えば、レトロウイルスＬＴＲはネズミ肉腫ウイルスから誘導することができ、ｔＲＮＡ結合部位はラウス肉腫ウイルスから誘導することができ、パッケージングシグナルはネズミ白血病ウイルスから誘導することができ、第二ストランド合成の起点は鳥類白血病ウイルスから誘導することができる。これらの組み換えレトロウイルスベクターを用いて、それらを適当なパッケージング細胞株に導入することによって形質導入コンピテントレトロウイルスベクター粒子を作成することができる（１９９１年１１月２９日に出願されたセリアル番号第０７１８００、９２１号参照）。
【００５５】
組み換えレトロウイルスゲノムの宿主細胞ＤＮＡの特異的領域への部位特異的組込みを指令する組み換えレトロウイルスを産生することができる。そのような部位特異的組込みが内因性ＮＯＤ１遺伝子を突然変異させ、または置き換えるのに有用である。部位特異的組込みは、レトロウイルス粒子に取り込まれたキメラインテグラーゼによって媒介され得る（１９９５年５月２２日に出願されたセリアル番号第０８／４４５、４６６５参照）。
組み換えウイルス遺伝子送達ビヒクルは複製欠陥組み換えウイルスが好ましい。
【００５６】
前記したレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルで用いるのに適したパッケージング細胞株は容易に調製することができ（ＷＯ  ９２／０５２６６参照）、それを用いて、組み換えウイルス粒子の産生のための（ベクター細胞株または「ＶＣＬ」ともいわれる）プロデューサー細胞株を作り出すことができる。本発明のいくつかの実施形態において、パッケージング細胞株はヒト（例えば、ＨＴ１０８０細胞）またはミンク親細胞株から作成され、それにより、ヒト血清による不活化に対して生存することができる組み換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの産生を可能とする。そのような組み換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルの構築は、ＷＯ  ９１／０２８０５に詳細に記載されている。これらの組み換えレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを用いて、それらを適当なパッケージング細胞株に導入することによって形質導入コンピテントレトロウイルス粒子を作り出すことができる。同様に、アデノウイルス遺伝子送達ビヒクルもまた、本明細書中に提供された開示を仮定すれば容易に調製し利用することもできる（Ｂｅｒｋｎｅｒ，  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２７，１９８８，およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１−４３４，１９９１，ＷＯ９８／０６２２３，およびＷＯ９３／０７２８２も参照）。
【００５７】
遺伝子送達ビヒクルは、組み換えアデノウイルス遺伝子送達ビヒクルでもあり得る。そのようなビヒクルは、本明細書中に提供された開示および当該分野で利用できる情報を仮定すれば、容易に調製し利用することができる（例えば、Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ６：６１６，１９８８およびＲｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ２５２：４３１、１９９１、ＷＯ９３／０７２８３，ＷＯ９３／０７２８３，ＷＯ９３／０６２２３，およびＷＯ９３／０７２８２）。また、アデノ関連ウイルス遺伝子送達ビヒクルを構築し、それを用いて、インビトロまたはインビボにて本発明のタンパク質または核酸を細胞に送達することができる。インビトロでのアデノ関連ウイルス遺伝子送達ビヒクルの使用はＣｈａｔｔｅｉｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：１４８５−１４８８（１９９２），Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８９：７２５７−７２６１（１９９２），Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９４：１４４０−１４４８（１９９４），Ｆｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ，．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：３７８１−３７９０（１９９３），Ｐｎｎａｚｈａｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：７３３−７３８（１９９４），Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：１０１８３−１０１８７（１９９４），Ｅｉｎｅｒｈａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２：３３６−３４３（１９９５），Ｌｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２３：１２６１−１２６７（１９９５）、およびＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ３：２２３−２２９（１９９６）に記載されている。これらのビヒクルのインビボの使用はＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．ｓｃｉ．９０：１０６１３−１０６１７（１９９３）およびＫａｐｌａｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅ．８：１４８−１５３（１９９４）に記載されている。
【００５８】
本発明のもう１つの実施形態において、遺伝子送達ビヒクルはトガウイルスに由来する。そのようなトガウイルスは１９９５年３月１５日に出願された米国セリアル番号第０８／４０５，６２７号、ＷＯ  ９５／０７９９４に記載されている。シンドビスおよびＥＬＶＳウイルスを含めたアルファウイルスは、本発明の核酸用の遺伝子送達ビヒクルであり得る。アルファウイルスは、ＷＯ  ９４／２１７９２、ＷＯ  ９２／１０５７８およびＷＯ  ９５／０７９９４に記載されている。いくつかの異なるアルファウイルス遺伝子送達ビヒクル系を構築し、これを用いて、本発明に従って核酸を細胞に送達することができる。そのような系の代表的な例は米国特許第５、０９１、３０９号および第５、２１７、８７９号に記載されたものを含む。いくつかの実施形態において、本発明で用いるアルファウイルス遺伝子送達ビヒクルは、ＷＯ  ９５／０７９９４に記載されたものを含む。
組み換えウイルスビヒクルは、シンドビスウイルスに基づく組み換えアルファウイルスのビヒクルでもあり得る。シンドビス構築体、ならびに多数の同様な構築体を容易に調製することができる。シンドビスウイルス遺伝子送達ビヒクルは、典型的には、シンドビスウイルス転写を開始することができる５’配列、シンドビス非構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列、断片転写を妨げるように不活化されたウイルス接合領域、およびシンドビスＲＮＡポリメラーゼ認識配列を含む。所望により、該ウイルス接合領域は、核酸の転写が低下され、増大され、または維持されるように修飾することができる。当業者によって認識されるように、他のアルファウイルスからの対応する領域を前記したものの代わりに用いることができる。
【００５９】
アルファウイルス由来遺伝子送達ビヒクルのウイルス接合領域は、核酸の転写を妨げるように不活化された第一のウイルス接合領域、および核酸の転写が低下されるように修飾された第二のウイルス接合領域を含むことができる。また、アルファウイルス由来ビヒクルは、ｃＤＮＡからのウイルスＲＮＡの合成を開始することができる５’プロモーター、および転写終結を制御する３’配列を含むことができる。
【００６０】
本発明で利用することができる他の組み換えトガウイルス遺伝子送達ビヒクルは、セムリキフォレストウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ミドルベルグ（Ｍｉｄｄｌｅｂｅｒｇ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７０）、ロスリバー（Ｒｏｓｓ  Ｒｉｖｅｒ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０：ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４９；ＡＴＣＣＶＲ−５３２）、および米国特許第５，０９１，３０９号および第５，２１７，８７９号、ならびにＷＯ  ９２／１０５７８に記載されたものに由来するものを含む。
【００６１】
本発明で用いるのに適した他のウイルス遺伝子送達ビヒクルは、例えば、ポリオウイルス（Ｅｖａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ３３９：３８５，１９８９，およびＳａｂｉｎｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ  １：１１５，１９７３）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８）；リノウイルス（Ａｒｎｏｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｌ４０１，１９９０）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１１０）；カナリアポックスウイルスまたはワクシニアウイルスのようなポックスウイルス（Ｆｉｓｈｅｒ−Ｈｏｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：３１７，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．５６９：８６，１９８９；Ｆｌｅｘｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：１７，１９９０；米国特許第４，６０３，１１２号および４，７６９，３３０号；ＷＯ８９／０１９７３）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−１１１；ＡＴＣＣ  ＶＲ−２０１０）；ＳＶ４０（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８，１９７９）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３０５），（Ｍａｄｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒ．７３：１５３３，１９２２）；インフルエンザウイルス（Ｌｕｙｔｊｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ５９：１１０７、１９８９；ＭｃＭｉｃｈｅａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３０９：１３，１９８３；およびＹａｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ２７３：２３８，１９７８）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７９７）；アデノ関連ウイルスのようなパルボウイルス（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｊｉｒ．６３：３８２２，１９８９，およびＭｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ１６６：１５４，１９８８）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４５）；単純疱疹ウイルス（Ｋｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．  Ｂｉｏｌ．２１５：２１９、１９８９）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９７７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６０）；Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：１０８，１９７９）；ヒト免疫不全ウイルス（ＥＰＯ３８６，８８２、Ｂｕｃｈｓｃｈａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．６６．２７３１，１９９２）；麻疹ウイルス（ＥＰＯ４４０，２１９）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−２４）；Ａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７），Ａｕｒａ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６８）、ベラルウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６００；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４０）、Ｃａｂａｓｓｏｕ（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２２）、チクングンヤ（Ｃｈｉｋｕｎｇｕｎｙａ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６４；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４１）、フォルトモルガン（Ｆｏｒｔ  Ｍｏｒｇａｎ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２４）、ゲタ（Ｇｅｔａｈ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３６９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４３）、クズラガヒ（Ｋｙｚｕｌａｇａｃｈ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２７）、マヤロ（Ｍａｙａｒｏ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６６）、ムカンボ（Ｍｕｃａｍｂｏ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−５８０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４４）、ヌドゥム（Ｎｄｕｍｕ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７１）、ピクスナ（Ｐｉｘｕｎａ）ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７２；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４５）、トナテ（Ｔｏｎａｔｅ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２５）、トリニチ（Ｔｒｉｎｉｔｉ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−４６９）、ウナ（Ｕｎａ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７４）、ワタロア（Ｗｈａｔａｒｏａ）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２６）、Ｙ−６２−３３（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７５）、オニオン（Ｏ’ｎｙｏｎｇ）ウイルス、東洋脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６５；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４２）、西洋脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７０；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５１；ＡＴＣＣ  ＶＲ−６２２；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５２）、およびコロナウイルス（Ｈａｍｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．１２１：１９０，１９６６）（ＡＴＣＣ  ＶＲ−７４０）に由来するものを含む。
【００６２】
本発明の核酸を縮合剤と組み合わせて、遺伝子送達ビヒクルを形成することもできる。いくつかの実施形態において、縮合剤は、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリオルニチン、プロタミン、スペルミン、スペルミジンン、およびプトレシンのようなポリカチオンである。縮合剤および核酸の間に結合を作成する多くの適当な方法は当該分野で知られている（例えば、１９９４年１２月３０日に出願されたセリアル番号０８／３３６，７８７参照）。
【００６３】
代替実施形態において、Ｎｏｄ１核酸またはＮｏｄ１ポリペプチドをリポソームと会合させて、遺伝子送達ビヒクルを形成させる。リポソームは、脂質二層によって包まれた水性区画から構成される脂質小胞、典型的には、直径が数百オングストロームの球状またはわずかに細長い構造である。適当な条件下で、リポソームを、細胞の原形質膜等、あるいはリポソームを内部化した細胞内のエンドサイトーシス小胞の膜と融合させ、それにより、その内容物を細胞質に放出することができる。しかしながら、細胞の表面との相互作用に先立って、リポソーム膜は、例えば、分解酵素からその内容物を隔離し、保護する比較的非浸透性バリアーとして作業する。加えて、リポソームは合成構造であるので、望ましい特徴を一体化させた特別に設計されたリポソームを産生することができる。例えば、Ｓｔｒｙｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ｐｐ．２３６−２４０，１９７５（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ，ＳａｎＦｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆ．）；Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ６００：１，１９８０；Ｂａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．５５０：４６４，１９７９；Ｒｉｖｎａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１４９：１１９，１９８７；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＲＯＣ．ＮＡＴＬ．ＡＣＡＤ．ＳＣＩ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８４：７８５１，１９８７，Ｐｌａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１７６：４２０，１９８９，および米国特許第４，７６２，９１５号参照。リポソームは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、本発明で記載されたもののような核酸を含む発現構築体、およびＮｏｌ１ポリペプチドを含めた種々の核酸およびポリペプチド分子をカプセル化することができる。
【００６４】
本発明で用いられるリポソーム調製物はカチオン性（正に荷電）、アニオン性（負に荷電）および中性調製物を含む。カチオン性リポソームは、機能的形態の、プラスミドＤＮＡ（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−７４１６，１９８７）、ｍＲＮＡ（Ｍａｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：６０７７−６０８１，１９８９）、および精製された転写因子（Ｄｅｂｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５：１０１８９−１０１９２，１９９０）の細胞内送達を媒介することが示されている。例えば、Ｎ［１−２，３−ジオレイルオキシ］プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリエチルアンモニウム（ＤＯＴＭＡ）リポソームはＧＩＢＣＯ  ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．商標Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ下で入手可能である。また、Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＲＳ４９１：５１４８−５１５２．８７，１９９４参照。他の商業的に入手可能なリポソームはＴｒａｎｓｆｅｃｔａｃｅ（ＤＤＡＢ／ＤＯＰＥ）およびＤＯＴＡＰ／ＤＯＰＥ（Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ）を含む。他のカチオン性リポソームは当該分野で利用可能な技術を用いて容易に入手可能な材料から調製することができる。ＤＯＴＡＰ（１，２−ビス（オレオイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン）リポソームの合成の記載については、例えば、Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：４１９４−４１９８，１９７８；およびＷＯ９０／１１０９２参照。
【００６５】
同様に、アニオン性および中性リポソームはＡｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ．）のように容易に入手可能であり、あるいは容易に利用できる材料を用いて容易に調製することができる。そのような材料はホスファチジルコリン、コレステロール、ホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）、ジオレオイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）などを含む。これらの材料はＤＯＴＭＡおよびＤＯＴＡＰ出発材料と適当な比率で混合することもできる。これらの材料を用いてリポソームを作製するための方法は当該分野でよく知られている。
【００６６】
リポソームはマルチラメラー小胞（ＭＬＶ）、小さなユニラメラ小胞（ＳＵＶ）、または大きなユニラメラ小胞（ＬＵＶ）を含むことができる。種々のリポソーム−核酸複合体が当該分野で公知の方法を用いて調製される。例えば、Ｓｔｒａｕｂｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＥＴＨＯＤＳ  ＯＦ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＦＹ（１９８３），Ｖｏｌ．１０１，ｐｐ．５１２−５２７；Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：３４１０−３４１４，１９９０；Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ３９４：４８３，１９７５；Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １７：７７，１９７９；ＤｅａｍｅｒおよびＢａｎｇｈａｍ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  ４４３：６２９，１９７６；Ｏｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．７６：８３６，１９７７；Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：３３４８，１９７９；ＥｎｏｃｈおよびＳｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：１４５，１９７９；Ｆｒａｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：１０４３１，１９８０；ＳｚｏｋａおよびＰａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４５，１９７９；およびＳｃｈａｅｆｅｒ−Ｒｉｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２１５：１６６，１９８２参照。
【００６７】
加えて、リポソームは細胞への送達用の本発明の核酸と共に含めることができる。そのようなリポタンパク質の例はキロミクロン、ＨＤＬ、ＩＤＬ、ＬＤＩ、およびＶＬＤＬを含む。これらのタンパク質の突然変異体、断片または融合も用いることができる。アセチル化ＬＤＬのような、天然に生じるリポタンパク質の修飾も用いることができる。これらのリポタンパク質はリポタンパク質受容体を発現する細胞への核酸の送達を標的化することができる。いくつかの実施形態において、もしリポタンパク質が核酸内に含まれれば、他の標的化リガンドは組成物に含めない。
【００６８】
特異的組織へのＮｏｄ１核酸の受容体媒介標的化送達を用いることができる。受容体媒介ＤＮＡ送達技術は、例えば、Ｆｉｎｄｅｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３），Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １１，２０２−０５；Ｃｈｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４），ＧＥＮＥ  ＴＨＥＲＡＰＥＵＴＩＣＳ：ＭＥＴＨＯＤＳ  およびＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ  ＯＦ  ＤＩＲＥＣＴ  ＧＥＮＥ  ＴＲＡＮＳＦＥＲ（Ｊ．Ａ．Ｗｏｌｆｆ，ｅｄ．）；Ｗｕ＆Ｗｕ（１９８８），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３，６２１−２４；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９，５４２−４６；Ｚｅｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７，３６５５−５９；Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１），Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６，３８８−４２に記載されている。
【００６９】
もう１つの実施形態において、裸の核酸分子を、例えば、ＷＯ  ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載された遺伝子送達ビヒクルとして用いる。そのような遺伝子送達ビヒクルはＤＮＡまたはＲＮＡいずれかであり得るが、ある実施形態においては、殺したアデノウイルスに連結させる。Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９２。他の適当なビヒクルはＤＮＡ−リガンド（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９）、脂質−ＤＮＡ組み合わせ（Ｆｅｉｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３  ７４１７，１９８９）、リポソーム（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．８４：７８５１−７８５５，１９８７）およびマイクロプロジェクタイル（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７２６−２７３０，１９９１）を含む。
【００７０】
核酸を生分解性ラテックス上にコーティングすることによって、細胞に摂取される裸の核酸の効率を増大させることができる。このアプローチは、培養中の細胞と共にインキュベートすると、ラテックスビーズは細胞の核周辺領域に効果的に輸送され、そこで濃縮されるという観察を利用する。次いで、筋肉に注射する場合、ビーズを細胞に輸送する。エンドサイトーシスがラテックスビーズによって開始され、かくして、遺伝子導入および発現効率を増加させた後、核酸被覆ラテックスビーズは細胞に効果的に輸送されるであろう。この方法は、ビーズを処理してその疎水性を増大させ、それにより、エンドソームの破壊、および核酸の細胞質への放出を容易とすることによってさらに改良され得る。
【００７１】
ＮＯＤ−１コーディング核酸を同様にして細胞に導入することができる。マイクロインジェクション、リポソーム媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、またはリン酸カルシウム沈殿のような機械的方法を用いて、ＮＯＤ１核酸構築体を細胞に導入することができ、アポトーシスおよび／または腫瘍細胞の死滅を促進する。別法として、もし細胞が安定してＤＮＡ構築体を保持することが望まれるならば、ＤＮＡ構築体をプラスミドに供給し、当該分野で知られているように、別々のエレメントとして維持し、または細胞のゲノムに組み込むことができる。
【００７２】
細胞中での内因性ＮＯＤ１遺伝子の発現もまた、内因性ＤＮＡ１遺伝子とイン・フレームにて、ＮＯＤ１標的化配列、調節配列、エクソン、および不対スプライスドナー部位を含むＤＮＡ構築体を相同組み換えによって、ＤＮＡ構築体を含む相同組み換え細胞が形成されるように導入することによって改変することもできる。新しい転写ユニットを用いて、望むようにＮＯＤ１遺伝子をオンまたはオフすることができる。内因性遺伝子発現に影響させるこの方法は、米国特許第５，６４１，６７０号に教示されている。
【００７３】
細胞株のゲノムまたは組織への送達されたＮＯＤ１核酸の取り込みは、当該分野で知られたいずれかの手段によってモニターすることができる。例えば、送達されたＮＯＤ１核酸のサザーンブロッティングを行うことができる。送達された核酸の断片のサイズの変化は取り込みを示す。送達された核酸の複製は、とりわけ、ＮＯＤ１プローブへのハイブリダイゼーションと組み合わせて、標識されたヌクレオチドの取り込みを検出することによってモニターすることができる。ＮＯＤ１核酸の発現は、送達された核酸にハイブリダイズするＮＯＤ１  ｍＲＮＡの産生を検出するか、あるいはＮＯＤ１タンパク質を検出することによってモニターすることができる。ＮＯＤ１タンパク質は免疫学的に検出することができる。
【００７４】
ＲＩＰ２モジュレーター
本発明によると、「キナーゼ欠乏」ＲＩＰ２が細胞で発現されると、細胞はアポトーシスに対して感受性化される。本明細書中で用いるように、「キナーゼ欠乏」ＲＩＰ２は、実質的にキナーゼ機能を有しないＲＩＰ２ポリペプチドを意味する。よって、本発明は、キナーゼ機能がないＲＩＰ２ポリペプチド、ＲＩＰ２キナーゼ阻害剤、ならびにキナーゼ欠乏ＲＩＰ２を発現させるための発現カセットおよび発現ベクターを提供する。
【００７５】
ＲＩＰ２はそのカルボキシル末端にＣＡＲＤドメインを含有するセリン／スレオニンキナーゼであり、過剰発現系においてＮＦ−κＢ活性化を誘導することが示されている。ＲＩＰ２は、先天性および養子免疫応答双方を調製するにおいて役割を演じることも示されている。Ｒｉｐ２が欠乏したマウスは、リポ多糖（ＬＰＳ）のようなトール（Ｔｏｌｌ）様受容体アゴニストに対する減弱化された免疫応答のみを備えていた。
【００７６】
ＲＩＰ２についての配列は、例えば、ＮＣＢＩデータベースで入手できる。ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるウェブサイト参照。例えば、ヒトＲＩＰ２についての１つのアミノ酸配列を、配列番号５（ＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＣ２７７２２；ｇｉ：３３４２９１０）として容易な参照のために以下に掲げる。
【００７７】
【化９】
2008531600.tif 000011
先に示し、実施例においてより詳細に記載するように、キナーゼ欠乏ＲＩＰ２を発現する細胞は、ＲＩＰ２の他のドメインおよび機能（例えば、ＣＡＲＤドメイン）は大いに機能的である場合に、アポトーシスに対して感受性化される。従って、本発明は、細胞を、ＲＩＰ２キナーゼを阻害することができる因子と接触させることによって細胞をアポトーシスに対して感受性化する方法に関する。もう１つの実施形態において、本発明は、治療有効量のＲＩＰ２キナーゼ阻害剤を哺乳動物に投与することによって動物において癌を治療する方法に関する。ＲＩＰ２キナーゼもまた、ＮＯＤ１ポリペプチドもしくはＮｏｄ１核酸、またはＮＯＤ１活性を変調する因子と共に投与することもできる。
【００７８】
いずれの利用可能なＲＩＰ２阻害剤も本発明の組成物および方法で用いることができる。いくつかの実施形態において、ＲＩＰ２キナーゼ機能はｐ３８阻害剤を用いて阻害することができる。例えば、ＲＩＰ２を阻害するのに用いることができるｐ３８阻害剤は、２−（４−クロロフェニル）−４−（４−フルオロフェニル）−５−ピリジン−４−イル−１，２−ジヒドロピラゾール−３−オン、ＳＣ６８３７６、ＳＢ２０３５８０（ヨード）、ＳＢ２０２１９０、ＳＢ２０３５８０、ＳＢ２０３５８０（スルホン）、ＰＤ１６９３１６、ＳＢ２２００２５、ＳＫＦ−８６００２、ＳＢ２３９０６３、またはＭＬ３１６３を含む。ＳＢ２２００２５、ＳＢ２０３５８０およびＰＤ１６９３１６についての構造を以下に掲げる。
【００７９】
【化１０】
2008531600.tif 000012
これらの阻害剤は、ｐ３８を阻害するのに用いられるのに匹敵する濃度で用いることができる。
【００８０】
もう１つの実施形態において、本発明は、ＲＩＰ２キナーゼ活性を試験因子が阻害することができるか否かを観察することによってＲＩＰ２阻害剤を同定する方法を提供する。この方法はインビトロまたはインビボにて行うことができる。ＲＩＰ２アッセイを試験因子の非存在下で行う場合、コントロールを含めることができる。試験因子の存在下におけるＲＩＰ２の減少した活性は、試験因子がＲＩＰ２阻害剤であることを示す。
【００８１】
組成物
それらの塩を含めたＮＯＤ１ポリペプチドおよびＮＯＤ１リガンド、ならびにＮＯＤ１核酸および／またはＲＩＰ２キナーゼ阻害剤を投与して、アポトーシスおよび腫瘍退行を促進し、ＮＯＤ１活性を変調し、あるいは癌性疾患、または不適切な細胞成長に関連する他の疾患に関連付けられる少なくとも１つの徴候の低下を達成する。抗腫瘍剤、化学療法剤、ＴＮＦ、ＲＩＰ２キナーゼ阻害剤、ＲＩＰ２キナーゼ欠乏ポリペプチド、ＲＩＰ２キナーゼ欠乏ポリペプチドをコードする核酸などのような本明細書中に記載された他の因子を含めることができる。
【００８２】
所望の効果を達成するためには、ＮＯＤ１ポリペプチド、リガンド、核酸、および他の因子との組み合わせを単一または分割用量として投与することができる。例えば、ＮＯＤ１ポリペプチド、リガンドおよび核酸は少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約５００ないし７５０ｍｇ／ｋｇの、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｋｇないし約３００ないし５００ｍｇ／ｋｇの、少なくとも約０．１ｍｇ／ｋｇないし約１００ｍないし３００ｍｇ／ｋｇまたは少なくとも約１ｍｇ／ｋｇないし約５０ないし１００ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与することができるが、他の用量は有利な結果を供することができる。投与される量は、限定されるものではないが、ポリペプチド、選択されるリガンドまたは核酸、疾患、体重、身体の状態、健康、哺乳動物の年齢、予防または治療を達成すべきか、およびポリペプチド、リガンドまたは核酸が化学的に修飾されているか、を含めた種々の因子に依存して変化するであろう。そのような因子は、当該分野で利用できる動物モデルまたは他の試験系を使用する臨床家が容易に決定することができる。
【００８３】
本発明による治療剤の投与は、例えば、受容者の生理学的状態、投与の目的が治療であるかまたは予防であるか、および技量がある実行者に知られた他の因子に応じて、単一用量にて、複数用量にて、連続的または間歇的方法であってよい。本発明のポリペプチド、リガンド、核酸および他の因子の投与は、予め選択された期間にわたって実質的に連続的とすることができるか、あるいは一連の間隔を設けた用量のものとすることができる。局所投与および全身投与の双方が考えられる。
【００８４】
組成物を調製するためには、ポリペプチド、リガンド、核酸および因子を合成し、またはそうでなければ入手し、必要であるかまたは所望であれば精製し、次いで、凍結乾燥し、安定化させる。次いで、ポリペプチド、リガンドまたは核酸を適当な濃度に調整し、所望により、他の因子と組み合わせる。単位用量に含まれる所与のポリペプチド、リガンドまたは核酸の絶対重量は広く変化させることができる。例えば、約０．０１ないし約２ｇ、または約０．１ないし約５００ｍｇの本発明の少なくとも１つのポリペプチド、核酸または抗体、あるいは複数のポリペプチド、リガンドおよび核酸を投与することができる。別法として、単位用量は約０．０１ｍｇ／ｋｇから約５０ｇでまで、約０．０１ｇから約３５ｇまで、約０．１ｇから約２５ｇまで、約０．５ｇから約１２ｇまで、約０．５ｇから約８ｇまで、約０．５ｇから約４ｇ、または約０．５ｇから約２ｇまで変化させることができる。
【００８５】
本発明のポリペプチド、リガンド、または核酸の日用量は同様に変化させることができる。そのような日用量は、例えば、約０．１ｇ／日から約５０ｇ／日まで、約０．１ｇ／日から約２５ｇ／日まで、約０．１ｇ／日から約１２ｇ／日まで、約０．５ｇ／日から約８ｇ／日まで、約０．５ｇ／日から４ｇ／日まで、および約０．５ｇ／日から約２ｇ／日までの範囲とすることができる。
【００８６】
かくして、本発明の治療ポリペプチド、リガンド、または核酸を含む１以上の適当な単位投与形態は、経口、（皮下、静脈内、筋肉内および腹腔内を含めた）非経口、直腸、皮膚、経皮、器官内、肺内および鼻腔内（呼吸器系）経路を含む種々の経路によって投与することができる。いくつかの実施形態において、ＮＯＤ１ポリペプチド、リガンドまたは核酸を腫瘍または癌部位に局所投与する。
【００８７】
治療剤は、（例えば、マイクロカプセル化を用い、ＷＯ９４／０７５２９、および米国特許第４，９６２，０９１号参照）徐放用に処方することもできる。該処方は、適切な場合、便利に区別される単位投与形態で供することができ、医薬分野でよく知られた方法のいずれかによって調製することができる。そのような方法は治療剤を液体担体、固体マトリックス、半固体担体、微粉砕固体形態またはこれらの組み合わせと混合し、次いで、必要であれば、生成物を所望の送達系に導入し、または成型する工程を含むことができる。
【００８８】
本発明の治療剤を経口投与のために調製する場合、それらは医薬上許容される担体、希釈剤または賦形剤と一般的には組み合わせて、医薬処方または単位投与形態を形成する。経口投与では、治療剤は粉末、顆粒処方、溶液、懸濁液またはエマルジョンとして、あるいはチューインガムからの有効成分の摂取用の天然もしくは合成ポリマーまたは樹脂中に存在させてもよい。治療剤はボーラス、エレクチュアリまたはペーストとして供することもできる。本発明の経口投与される治療剤は徐放用に処方することもでき、例えば、治療剤は被覆し、マイクロカプセル化し、または保持された送達デバイス内に置くことができる。そのような処方中の合計有効成分は処方の０．００１ないし９９．９重量％を含む。
【００８９】
「医薬上許容される」は、処方の他の成分と適合し、その受容者に対して有害でない担体、希釈剤、賦形剤および／または塩を意味する。
【００９０】
本発明の治療剤を含有する医薬処方は、よく知られ、かつ容易に入手できる成分を用いて当該分野で公知の手法によって調製することができる。例えば、治療剤は通常の賦形剤、希釈剤または担体とで処方することができ、錠剤、カプセル、溶液、懸濁液、粉末、アエロゾルなどに形成することができる。そのような処方に適した賦形剤、希釈剤および担体の例は緩衝液、ならびに澱粉、セルロース、糖、マンニトールおよびシリカ誘導体のような充填剤および展延剤を含む。カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよび他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチンおよびポリビニルピロリドンのような結合剤を含めることもできる。グリセロールのような保湿剤、炭酸カルシウムおよび炭酸水素カルシウムのような崩壊剤を含めることができる。溶解を遅延させるためのパラフィンのような因子も含めることができる。第四級アンモニウム化合物のような再吸収加速剤も含めることができる。セチルアルコールおよびグリセロールモノステアレートのような表面活性剤も含めることができる。カオリンおよびベントナイトのような吸着性担体を加えることができる。タルク、ステアリン酸カルシウム、およびステアリン酸マグネシウム、および固体ポリエチレングリコールのような滑沢剤を含めることもできる。保存剤も加えることができる。本発明の組成物はセルロースおよび／またはセルロース誘導体のような増粘剤を含有することもできる。それらはキサンタン、グアもくしはカルボガムまたはアラビアガムのようなガム、または別法として、ポリエチレングリコール、ベントンおよびモンモリロナイトを含有することもできる。
【００９１】
例えば、本発明の治療剤を含有する錠剤またはカプセルは炭酸カルシウム、酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムのような緩衝剤を含めることができる。カプレットおよび錠剤はセルロース、予めゼラチン化された澱粉、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マイクロクリスタリンセルロース、澱粉、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、鉱油、ポリエチレングリコール、リン酸ナトリウム、ステアリン酸亜鉛などのような不活性な成分を含むこともできる。本発明の少なくとも１つの治療剤を含有するハードまたはソフトゼラチンカプセルは、ゼラチン、マイクロクリスタリンセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、澱粉、タルク、および二酸化チタンなど、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および植物油のような液体ビヒクルのような不活性な成分を含有することができる。さらに、本発明の１以上の治療剤を含有する腸溶コーティングカプレットまたは錠剤は、胃の中での崩壊に抵抗し、十二指腸のより中性ないしアルカリ性環境で溶解するように設計される。
【００９２】
本発明の治療剤は、例えば、便利な経口投与のためのエリキシルまたは溶液として、あるいは筋肉内、皮下、腹腔内、または静脈内経路による非経口投与に適した溶液として処方することもできる。本発明の治療剤の医薬処方は水性もしくは無水溶液もしくは分散液の形態、あるいはエマルジョンまたは懸濁液または膏薬の形態を取ることもできる。
【００９３】
かくして、治療剤は（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または継続的注入による）非経口投与用に処方することができ、アンプル、プレフィルシリンジ、小容積注入容器中での単位投与形態にて、あるいは複数−容積容器中での単位容積形態で供することができる。前記したように、保存剤を加えて、投与形態のシェルフ寿命を維持するのを助けることができる。活性なポリペプチド、核酸、もしくは抗体および他の成分は油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンを形成することができ、懸濁化、安定化および／分散剤のような処方剤を含有することができる。別法として、活性なポリペプチド、核酸もしくは抗体および他の成分は、適当なビヒクル、例えば、滅菌パイロジェンフリー水での使用前の復元のために、滅菌固体の無菌単離によって、または溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態とすることができる。
【００９４】
これらの処方は、当該分野でよく知られた医薬上許容される担体、ビヒクルおよび補助剤を含有することができる。例えば、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、名称「Ｄｏｗａｎｏｌ」のもとで販売される製品のようなグリコールエーテル、ポリグリコールおよびポリエチレングリコール、短鎖酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、乳酸エチルまたは乳酸イソプロピル、名称「Ｍｉｇｌｙｏｌ」のもとで市販される製品のような脂肪酸トリグリセリド、イソプロピルミニステート、動物、鉱および植物油およびポリシロキサンのような溶媒から、水に加えて選択された、生理学的観点から許容される１以上の有機溶媒を用いて溶液を調製することが可能である。
【００９５】
所望であれば、抗酸化剤、界面活性剤、他の保存剤、フィルム形成、角質溶解性または面皰溶解剤、香料、フレーバー剤および着色剤から選択されるさらなる成分を加えることができる。ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよびα−トコフェロールおよびその誘導体のような抗酸化剤を加えることができる。
【００９６】
加えて、ポリペプチド、リガンドおよび核酸は、徐放投与形態などとしての処方によく適合する。該処方は、それらが、例えば、恐らくはある期間にわたって腸または呼吸器系管の特定の部分において治療剤を放出するように構成することができる。コーティング、エンベロープおよび保護マトリックスは、例えば、ポリラクチド−グリコレート、リポソーム、マイクロエマルジョン、ミクロ粒子、ナノ粒子またはワックスのようなポリマー物質から作成することができる。これらのコーティング、エンベロープ、および保護マトリックスは、留置デバイス、例えば、ステント、カテーテル、腹腔透析チューブ、排出デバイスなどをコーティングするのに有用である。
【００９７】
局所投与では、治療剤は、標的領域への直接的な適用のために当該分野で知られているように処方することができる。主として局所適用のための条件を付した形態は、例えば、クリーム、ミルク、ゲル、分散液またはマイクロエマルジョン、多かれ少なかれ厚くしたローション、含浸されたパッド、軟膏またはスティック、エアロゾル処方（例えば、スプレーまたはフォーム）、石鹸、洗剤、ローションまたは石鹸のケーキの形態を取る。この目的のための他の慣用的な形態は創傷包帯、被覆された包帯または他のポリマー被覆、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゼリー、スプレーおよびエアロゾルを含む。かくして、本発明の治療剤は皮膚投与のためにパッチまたは包帯を介して送達することができる。別法として、ポリペプチド、リガンドおよび／または核酸は、ポリアクリレートまたはアクリレート／酢酸ビニルコポリマーのような接着性ポリマーの一部であるように処方することができる。長期間の適用では、微多孔性および／または通気性裏打ラミネートを用い、従って、皮膚の水和または浸軟を最小化できるのが望ましいであろう。裏打層は、所望の保護的および支持体機能を供するいずれの適当な厚みとすることもできる。適当な厚みは、一般には、約１０ないし約２００ミクロンであろう。
【００９８】
軟膏およびクリームは、例えば、適当な増粘剤および／またはゲル化剤を加えて、水性または油性基剤で処方することができる。ローションは水性または油性基剤で処方することができ、一般には、１以上の乳化剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、増粘剤または着色剤も含有するであろう。また、例えば、米国特許第４，１４０，１２２号；４，３８３，５２９号；または４，０５１，８４２号に開示されたように、治療剤はイオントフォレシスを介して送達することもできる。局所処方に存在する本発明の治療剤の重量パーセントは種々の因子に依存するが、一般には、処方の全重量の０．００１％ないし９５％であり、典型的には、０．０１ないし８５重量％であろう。
【００９９】
点眼剤または点鼻剤のような点剤は、１以上の分散剤、安定化剤または懸濁化剤も含む水性または非水性基剤中の１以上の治療剤で処方することができる。液体スプレーは、便利に、圧縮されたパックから送達される。点剤は、単純な眼ドロッパー−キャップドボトルを介して、または液体内容物を滴下により特殊な形状のクロージャーを介して送達するのに適合したプラスティックボトルを介して送達することができる。
【０１００】
治療剤は、口または喉における局所投与用にさらに処方することができる。例えば、有効成分は、さらに、フレーバー処理した基剤、通常はスクロースおよびアカシアまたはトラガカントを含むロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのような不活性な基剤中に組成物を含む香錠；および適当な液体担体中に本発明の組成物を含むマウスウォッシュとして処方することができる。
【０１０１】
本発明の医薬処方は、任意の成分として、医薬上許容される担体、希釈剤、可溶化または乳化剤、および当該分野で入手可能なタイプの塩を含むことができる。そのような物質の例は、生理学的に緩衝化された食塩溶液および水のような通常の食塩溶液を含む。本発明の医薬処方で有用な担体および／または希釈剤の具体的な非限定的例は、水、およびリン酸緩衝化食塩溶液ｐＨ  ７．０〜８．０のような生理学的に許容される緩衝化食塩溶液を含む。
【０１０２】
本発明の治療剤は呼吸器系管に投与することもできる。かくして、本発明は、本発明の方法で用いられるエアロゾル医薬処方および投与形態も提供する。一般に、そのような投与形態は、特定の癌、腫瘍、症状または関連病の臨床的徴候を治療または予防するのに有効な量の本発明の少なくとも１つの因子を含む。本発明の方法に従って治療された癌の１以上の徴候のいずれの統計学的に有意な軽減も本発明の範囲内にあるそのような癌の治療であると考えられる。
【０１０３】
別法として、吸入またはガス注入による投与では、組成物は乾燥粉末、例えば、治療剤およびラクトースまたは澱粉のような適当な粉末基剤の粉末ミックスの形態を取ることができる。粉末組成物は、例えば、カプセルまたはカートリッジ、あるいは例えば、インハレーター（ｉｎｈａｌａｔｏｒ）、インサフレーター、または計量用量インハーラーの助けを借りてそれから粉末を投与することができるゼラチンまたはブリスターパックの単位投与形態にて供与することができる（例えば、Ｎｅｗｍａｎ，Ｓ．Ｐ．ｉｎ  Ａｅｒｏｓｏｌｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｌｕｎｇ，Ｃｌａｒｋｅ，Ｓ．Ｗ．およびＤａｖｉａ，Ｄ．ｅｄｓ．，ｐｐ．１９７−２２４，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ，１９８４に開示された圧縮計量用量インハーラー（ＭＤＩ）および乾燥粉末インハーラー参照）。
【０１０４】
本発明の治療剤は、エアロゾルまたは吸入形態で投与する場合には、水性溶液にて投与することもできる。かくして、他のエアロゾル医薬処方は、例えば、約０．１ｍｇ／ｍｌおよび約１００ｍｇ／ｍｌの間の、治療すべき症状または疾患に対して特異的な本発明の治療剤の１以上を含有する生理学的に許容される緩衝化食塩溶液を含むことができる。液体に溶解または懸濁されていない微粉砕固体ポリペプチド、リガンドまたは核酸粒子の形態である乾燥エアロゾルも本発明を実施するのに有用である。本発明のポリペプチド、リガンドまたは核酸は、散布粉末として処方することができ、約１および５μｍの間、別法として２および３μｍの間の平均粒子サイズを有する微粉砕粒子を含むことができる。微粉砕粒子は、当該分野で良く知られた技術を用い、粉砕およびスクリーン濾過によって調製することができる。粒子は、粉末の形態とすることができる微粉砕物質の所定量を吸入することによって投与することができる。各投与形態の個々のエアロゾル用量に含まれた有効成分または複数有効成分の単位含量は、それ自体が、特定の感染、適応症または疾患を治療するのに効果的な量を構成する必要がないことが認識される。というのは、必要な有効量は複数の投与単位の投与によって到達できるからである。さらに、有効量は、投与形態中の用量未満を、個々に、または一連の投与により用いて達成することができる。
【０１０５】
吸入による上部（鼻）または下部呼吸器系管への投与では、本発明の治療剤は、便利に、ネビュライザーもしくは圧縮パック、またはエアロゾルスプレーを送達する他の慣用的な手段から送達される。圧縮されたパックは、ジクロロジフロロメタン、トリクロロフルロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当なガスのような適当なプロペラントを含むことができる。圧縮されたエアロゾルの場合には、投与単位は、計量された量を送達するためのバルブを供することによって決定することができる。ネビュライザーは、限定されるものではないが、米国特許第４，６２４，２５１号；第３，７０３，１７３号；第３，５６１，４４４号；および第４，６３５，６２７号に記載されたものを含む。本明細書中に開示されたタイプのエアロゾル送達系は、Ｆｉｓｏｎｓ  Ｃｏｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓ．）、Ｓｃｈｅｒｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．（Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ，ＮＪ）およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｈａｒｍｏｓｅａｌ  Ｃｏ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を含めた多数の商業的源から入手可能である。鼻腔内投与では、治療剤はプラスティックボトルのアトマイザーまたは計量用量インハーラーを介するように、点鼻剤、液体スプレーを介して投与することもできる。典型的なアトマイザーはＭｉｓｔｏｍｅｔａｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）である。
【０１０６】
さらに、有効成分は、記載された疾患またはいくつかの他の疾患用であるかを問わず、他の治療剤、例えば、苦痛軽減剤、抗炎症剤、抗ヒスタミン剤、抗微生物剤、気管支拡張剤などと組み合わせて使用することもできる。
【０１０７】
本発明は、さらに、キットまたは他の容器のような、Ｎｏｄ１発現を変調するためのパッケージされた医薬組成物に関する。該キットまたは容器は、Ｎｏｄ１遺伝子発現を変調するための治療有効量の医薬組成物、およびＮｏｄ１遺伝子発現を変調するための医薬組成物を用いるための指示書を保持する。医薬組成物は、Ｎｏｄ１遺伝子発現が変調される治療有効量の、本発明の少なくとも１つのＮｏｄ１核酸を含む。該組成物は、抗腫瘍剤または化学療法剤も含有することができる。
【０１０８】
もう１つの実施形態において、本発明は、ＮＯＤ１活性を変調するためのパッケージされた医薬組成物を提供する。該キットまたは容器は、ＮＯＤ１活性を変調するための治療有効量の医薬組成物、およびＮＯＤ１活性を変調するための医薬組成物を使用するための指示書を保有する。医薬組成物は、ＮＯＤ１活性が変調されるような治療有効量の、本発明の少なくとも１つのＮＯＤ１ポリペプチドまたはＮＯＤ１リガンドを含む。
【０１０９】
以下の詳細な実施例を参照することによって本発明をさらに記載するが、実施例は本発明の説明のために掲げるものであり、それを限定する意図のものではない。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：ＮＯＤ１誘導は腫瘍退行に導く。
【０１１１】
該実施例は、Ｎｏｄ１が細胞をＴＮＦα誘導アポトーシスに対して感受性とし、およびＮＯＤ１特異的リガンドがいずれかの他の公知のアポトーシストリガーの非存在下においてＭＣＦ−７乳癌細胞でアポトーシスを誘導することを示す。インビボ動物モデルを使用して、ＳＣＩＤマウスで行った異種移植片に関連する腫瘍退行におけるＮＯＤ１の役割を示した。これらのデータは、Ｎｏｄ１が腫瘍細胞の成長を制御するにおいて鍵となる役割を演じることを示す。
【０１１２】
材料および方法
細胞培養。ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−７およびＳＫＢＲ３を、１０％胎児ウシ血清、
２ｍＭグルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを補足したダルベッコの改変イーグル培地中に維持した。
【０１１３】
哺乳動物発現構築体および部位特異的突然変異誘発。ヒトＦＬＡＧ−Ｎｏｄ１、ＦＬＡＧ−Ｎｏｄ２  ｃＤＮＡはＧａｂｒｉｅｌ  Ｎｕｅｚ博士から入手し、Ｙ．Ｏｇｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７６，４８１２（２００１）に記載されている。ヒトＭｙｃ−ＲＩＰ２  ｗｔおよびＭｙｃ−ＲＩＰ２（Ｋ４７Ａ）はＣ．Ｖｉｎｃｅｎｚ博士（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ）からの贈物であった。Ｎｏｄ１突然変異体（Ｖ４１ＱおよびＫ２０８Ｒ）は部位特異的突然変異誘発によって構築した。Ｍｙｃ−ＲＩＰ２  ΔＣＡＲＤは、カルボキシ末端ＣＡＲＤドメインの欠失、およびｐｃＤＮＡ４／Ｍｙｃ／Ｈｉｓプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）へのクローニングによって作成した。ヌクレオチド配列は、全てＤＮＡ配列決定によって確認した。
【０１１４】
レトロウイルストランスフェクション。本実験で用いた種々の遺伝子はｐＭＳＣＶ−Ｂｌａｓｔｏ、ｐＢａｂｅ−ＰｕｒｏまたはｐＢａｂｅ−Ｎｅｏレトロウイルスベクターにクローン化した。ＭＣＦ−７細胞は利用可能な手法を用いて安定にトランスフェクトされた。簡単に述べれば、両栄養性２９３細胞を、選択されたＮｏｄ１、Ｎｏｄ２および他のタンパク質をコードするレトロウイルスベクターでトランスフェクトされた。トランスフェクションから２４時間後に、細胞を３２℃で一晩インキュベートして、ウイルス粒子を生じさせた。標的細胞を組み換えレトロウイルス粒子を含有するウイルス含有２９３細胞上清で翌日に感染させた。細胞は１０μｇ／ｍｌブラスチシジンＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ，ＣＡ）、５００μｇ／ｍｌゲンタマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）または５μｇ／ｍｌピューロマイシン（Ｃａｌｄｉｏｃｈｅｍ）で選択した。全ての構築体の発現はウエスタンブロット分析によって確認した。１７β―エストラジオール（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）の効果を測定するために、細胞を、５％木炭ストリップドＦＣＳを補足したフェノールレッドフリーのＤＭＥＭ中で培養した。細胞を種々の濃度の１７β―エストラジオール（Ｅ２）を含む９６ウェルプレートに２４時間で接種し、３Ｈ−チミジン（１μＣｉ／ウェル，ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ，Ｉｖｒｉｎｅ，ＣＡ）でパルスした。細胞をガラス繊維フィルター上に採取し、放射能を液体シンチレーションによって測定した。
【０１１５】
ウエスタンブロット分析および免疫沈澱。細胞を徹底的に洗浄し、５０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ，１００ｍＭ  ＮａＣｌ，２ｍＭ  ＥＤＴＡ，１０％グリセロール，１％  Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ−４０，１４μＭペプスタチンＡ，１００ｕＭロイペプチン、３ｍＭベンズアミジン、１ｍＭＰＭＳＦ、１ｍＭピロリン酸ナトリウム、１０ｍＭオルトバナジン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌアプロチミン、および１００ｍＭフッ化ナトリウムを含有する溶解緩衝液を用いて溶解させた。氷上での３０分間のインキュベーションの後、細胞溶解物を遠心し（１４０００ｒｐｍ，１０ｍｉｎ，４℃）、上清を回収した。免疫沈澱では、細胞溶解物を一定に攪拌しつつ５μｇの抗体と４℃にて３時間混合した。免疫複合体は２０μｌのプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅビーズに一晩結合させ、ビーズを溶解緩衝液で３回洗浄した。免疫沈澱をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離し、ＰＶＤＦ膜に移した。
【０１１６】
細胞生存率アッセイ。ヨウ化プロピジウム排除アッセイ：細胞を２日間示したように刺激した。引き続いて、細胞を採取し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＦＣＳおよび０．１％ＮａＮ３を含有するＰＢＳ）中で２回洗浄し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）含有ＦＡＣＳ緩衝液（４ｕｇ／ｍｌ）に再懸濁させた。細胞死滅の程度はＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒフローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で分析した。ＤＡＰＩ染色：ＭＣＦ−７細胞をチャンバースライド中で平板培養し、２日間刺激した。細胞をＰＢＳで洗浄し、アポトーシス核を１μｇ／ｍｌ  ＤＡＰＩ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で染色した。細胞を４％パラホルムアルデヒド中で固定し、蛍光顕微鏡によって調べた。
【０１１７】
ＴＵＮＥＬ染色：細胞をγＴｒｉＤＡＰで処理し、アポトーシス核は、製造業者の指示（ＲＯＣＨＥ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）に従い、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ媒介ＵＴＰニック末端標識）アッセイによってモニターした。
【０１１８】
ＩＬ−８  ＥＬＩＳＡ。トランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の培養上清中のＩＬ−８の濃度を９６ウェルＩｍｍｕｎｌｏｎプレートを用いるＥＬＩＳＡによって測定した
（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｃｈａｎｔｉｌｌｙ，ＶＡ）。ＥＬＩＳＡは、捕獲のためのＭａｂ  ＭＡＢ２０８、およびビオチニル化ポリクローナルウサギ抗ヒトＩＬ−８  Ａｂ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）、続いて、検出用のストレプトアビジンＨＲＰを用いて行った。
【０１１９】
ヌードマウスにおけるヒト異種移植片。ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ，ＭＣＦ−７  Ｃ２０およびＭＣＦ−７  Ｃ２０／Ｎｏｄ１細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで１回洗浄し、１．５ｘ１０７／ｍｌの濃度まで再懸濁させた。２００マイクロリットルの各懸濁液を無胸腺ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤまたはＳＣＩＤ／Ｎｏｄ（非肥満糖尿病性）雌マウスの脇腹部に皮下接種した。腫瘍のサイズを一週間に１回評価した。腫瘍容積を計算した。
【０１２０】
結果
Ｎｏｄ１はＴＮＦαおよびＮｏｄ１リガンド誘導アポトーシスにおいて役割を有する。乳癌上皮細胞株ＭＣＦ−７は、ＴＮＦαのような生物学的シグナルによって、または細胞傷害性薬物によって誘導されたアポトーシスを研究するのに広く用いられてきた。ＭＣＦ−７細胞株は、エストロゲン陽性乳癌を研究するためのモデルとしても用いられてきた（Ｓｉｍｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．２２８：９９５−１００３（２００３））。
【０１２１】
ＭＣＦ−７細胞を最初に、レトロウイルス媒介突然変異誘発を使用する遺伝子的スクリーニングで用いて、ＴＮＦα誘導細胞死滅に必要な遺伝子を同定した。ＭＣＦ−７細胞のレトロウイルス構築体への曝露の後にクローンをＴＮＦα抵抗性について選択し、次いで、ＴＮＦα抵抗性クローンにおいて同定した。抵抗性クローンの１つは破壊されたＮｏｄ１遺伝子を含有し、このＴＮＦα抵抗性クローンの細胞株はＭＣＦ７−Ｃ２０と命名された。レトロウイルス構築体からのｐＤｉｓｒｕｐ挿入は、ロイシン−リッチな領域９および１０の領域において、Ｎｏｄ１遺伝子の３’部分にマッピングされた（ＬＲＲ９〜１０；図１Ａ参照）。この挿入は、ブラスチシジンのオープンリーディングフレームをＮｏｄ１コーディング領域に入れた。ブラスチシジン−Ｎｏｄ１融合ｍＲＮＡの模式的ダイアグラム図１Ａに模式的に示す。抗ヒトＮｏｄ１モノクローナル抗体を用いるウエスタンブロット分析を行って、ＮＯＤ１タンパク質がＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞で発現されたか否かを試験した。内因性ＮＯＤ１タンパク質は親ＭＣＤ−７細胞溶解物で検出された（「ｗｔ」で標識する）が、ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞溶解物のウエスタンブロットは、Ｎｏｄ１の検出可能な発現を明らかとせず、これは、ＭＣＦ−７  Ｃ２０における機能的Ｎｏｄ１対立遺伝子が破壊されたことを示す（図１Ｂ）。
【０１２２】
ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞株は、２００６年２月２３日に、またはその頃にブタペスト条約の規定の下で、ＡＴＣＣアクセション番号ＡＴＣＣ番号 としてＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された（１０８０１  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｂｌｖｄ．，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．，２０１１０−２２０９  ＵＳＡ（ＡＴＣＣ））。
【０１２３】
Ｎｏｄ１機能の喪失はアポトーシスに対して有意な効果を有した。特に、（Ｎｏｄ１発現がない）ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞は、Ｎｏｄ１を発現する親ＭＣＦ−７細胞よりもＴＮＦα誘導アポトーシスに対して有意により抵抗性であった（図１Ｃ）。これらのデータは、Ｎｏｄ１がＭＣＦ−７細胞内のＴＮＦα経路において感受性化因子であり、Ｎｏｄ１がＭＣＦ−７乳癌細胞におけるアポトーシスを促進することを示唆する。
【０１２４】
アポトーシスにおけるＮｏｄ１の役割をさらに調べるために、種々の細胞型を、Ｎｏｄ１を特異的に活性化させるＮｏｄ１リガンド、Ｄ−Ａｌａ−Ｌ−Ｇｌｕ−ジアミノピメリン酸（γＴｒｉＤＡＰ）と共にインキュベートした。試験された細胞型は、親ＭＣＦ−７細胞株、Ｎｏｄ１欠乏ＭＣＦ−７Ｃ２０クローン、およびＮｏｄ１が過剰発現するようにさらなるヒトＮｏｄ１対立遺伝子（ＭＣＦ−７Ｎｏｄ１）を含有するように設計された細胞株を含む。γＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスに対するＣ２０細胞の抵抗性がＮｏｄ１の不存在に由来するかを判断するために、ヒトＮｏｄ１をＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞において安定に発現させて、Ｎｏｄ１十分Ｃ２０細胞（Ｃ２０／Ｎｏｄ１）を生じさせた。もう１つのコントロールとして、親ＭＣＦ−７細胞株を空のレトロウイルスベクターでトランスフェクトして、ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ細胞を生じさせた。細胞をシクロヘキシミド（ＣＨＸ）の存在下または非存在下でγＴｒｉＤＡＰで処理し、次いで、細胞死滅をヨウ化プロピジウム染色およびフローサイトメトリーによって決定した。
【０１２５】
シクロへキシニドの存在下における野生型ＭＣＦ−７細胞のγＴｒｉＤＡＰへの暴露は約２５％細胞死滅を誘導した（図２Ａ、上方左側パネル、陰影を付した棒線）。シクロヘキシニド単独（塗り潰ぶしていない棒線）またはγＴｒｉＤＡＰ単独で処理した野生型細胞においては細胞死滅は観察されなかった。コントロール的に、（Ｎｏｄ１発現無しの）ＭＣＦ−７Ｃ２０細胞は、γＴｒｉＤＡＰ＋シクロヘキシニドの効果に対して全く抵抗性であって、アポトーシスにおける実質的な増加はこれらの細胞で観察されなかった（図２Ａ、上方右側パネル）。Ｎｏｄ１のＭＣＦ−７Ｃ２０細胞への再導入により、これらの細胞のγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスに対する十分な感受性が回復された（図２Ａ、下方右側パネル）。シクロヘキシニドおよびγＴｒｉＤＡＰの組み合わせは、安定にＮｏｄ１を過剰発現したＭＣＦ−７細胞における広範な細胞死滅を誘導し、これらのＭＣＦ−７Ｎｏｄ１細胞における細胞死滅は４８時間の処理の後にほぼ６０％に到達した（図２Ａ、下方右側パネル）。
【０１２６】
Ｎｏｄ１リガンド、γＴｒｉＤＡＰはアポトーシスの最適な誘導に必要であった。メソＤＡＰがγＴｒｉＤＡＰにおけるようにγ位置におけるよりもむしろα位置におけるＧｌｕに結合した、不活性なコントロールのαＴｒｉＤＡＰと命名されるトリペプチドは、シクロヘキシミドの存在下においてＭＣＦ−７細胞でインキュベートした場合に細胞死滅を誘導しなかった（図２ＡにおけるαＴｒｉ）。
【０１２７】
コントロールとして、γＴｒｉＤＡＰまたはαＴｒｉＤＡＰの代わりに培地（「Ｍｅｄ」）を用いた。培地の添加はアポトーシスに対して実質的に効果を有しなかった。ＭＣＦ−７  ＢｌａｓｔｏおよびＭＣＦ−７Ｎｏｄ１細胞における内因性Ｎｏｄ１の発現、およびＮｏｄ１の過剰発現は、免疫沈澱およびウエスタンブロット分析によって確認した（図２Ｂ）。そのような発現はＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞で観察されなかった（図２Ｂ）。これらのデータは、γＴｒｉＤＡＰの存在下におけるＮｏｄ１がＭＣＦ−７乳癌細胞をアポトーシスに対して感受性化することを示す。
【０１２８】
しかしながら、γＴｒｉＤＡＰ単独での細胞の処理は野生型細胞においてアポトーシスを誘導しなかった。その代わり、アポトーシスが観察される前に、γＴｒｉＤＡＰおよびシクロヘキシミド双方の添加が必要であった。シクロヘキシミドのようなプロアポトーシス因子は、しばしば、アポトーシスが観察される前に必要である。しかしながら、ＭＣＦ−７細胞で認められたγＴｒｉＤＡＰまたはＴｒｉαに対する感受性の変化は、ドキシルビシンおよびカンプトテシンを含めた他のアポトーシス刺激で観察されず、ここで、親およびＣ２０細胞は細胞死滅に対して同等に感受性であった（データは示さず）。
【０１２９】
γＴｒｉＤＡＰで処理されたＭＣＦ−７細胞の光学顕微鏡観察により、アポトーシスに特徴的であるが、壊死には特徴的でない形態学的変化が明らかにされた（図２Ｃ、パネルａないしｂ）。しかしながら、γＴｒｉＤＡＰによって誘導される細胞死滅が事実アポトーシスであるかを確認するために、ＤＡＰＩおよびＴＵＮＥＬ染色を行った。図２Ｃに示されるように、ＭＣＦ−７細胞核は、ＤＡＰＩ染色によって示されるように（パネルｃないしｄ）、γＴｒｉＤＡＰでの処理の後に凝縮したクロマチンを含有し、ＴＵＮＥＬ染色によって観察される核断片が伴った（パネルｅないしｆ）。核染色は無処理細胞においては検出できなかった。
【０１３０】
γＴｒｉＤＡＰがアポトーシスを誘導するというさらなる確認は２つの広スペクトルカスパーゼ阻害剤、すなわち、ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫおよびＢｏｃ−Ｄ−ＦＭＫを用いて得られた。ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫおよびＢｏｃ−Ｄ−ＦＭＫは共にγＴｒｉＤＡＰ誘導細胞死滅を無くした（図２Ｄ）。最後に、不活性なコントロールトリペプチドαＴｒｉＤＡＰではなく、γＴｒｉＤＡＰのＭＣＦ−７細胞への添加の結果、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）およびカスパーゼ６、７、８および９のタンパク質分解がもたらされた（図３、９Ｂ）。ＭＣＦ−７細胞はカスパーゼ３を欠くことが知られており、親ＭＣＦ−７細胞またはＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞におけるカスパーゼ３の発現はγＴｒｉＤＡＰに対する応答パターンを変化させなかった（データは示さず）。
【０１３１】
かくして、一連の証拠は、Ｎｏｄ１に対する同族リガンドであるγＴｒｉＤＡＰによってＭＣＦ−７細胞において誘導された特異的アポトーシス経路が存在すること、およびこの経路はＮｏｄ１タンパク質の存在を必要とすることを示す。
ＭＣＦ−７Ｃ２０細胞のγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスに対する抵抗性がＮｏｄ１の不存在に由来することをさらに確立するために、ヒトＮｏｄ１をＭＣＦ−７Ｃ２０細胞において安定に発現させて、Ｎｏｄ１発現ＭＣＦ−７Ｃ２０細胞を生じさせた（ＭＣＦ−７Ｃ２０／Ｎｏｄ１）。Ｎｏｄ１のこれらのＮｏｄ１欠乏細胞への再導入により、γＴｒｉＤＡＰに対するこれらの細胞の十分な感受性が回復され（図２Ａ）、カスパーゼおよびＰＡＲＰ切断に導いた（図３）。
【０１３２】
Ｎｏｄ１依存性アポトーシスが他のヒト細胞株において起こるかを判断するために、一連の上皮細胞株を調べ、そこでは、Ｎｏｄ１は安定に発現されて、Ｎｏｄ１経路の活性化に対する感受性を増強した。細胞をＣＨＸ（Ｃ）の存在下または非存在下においてＴＮＦα（Ｔ）およびγＴｒｉＤＡＰ（γ）で処理し、アポトーシスの尺度としてのＰＩ染色によって生存率についてモニターした（表１）。
【０１３３】
【表１】
2008531600.tif 000013
試験した細胞株の内、ＳＫ−ＢＲ３およびＡ４３１細胞は、共に、Ｎｏｄ１依存性アポトーシス経路を明らかにした。しかしながら、ＭＣＦ−７系とはコントロール的に、γＴｒｉＤＡＰをＴＮＦαおよびＣＨＸと共に加えた場合に、これらの細胞はアポトーシスを受けるに過ぎない。ＣａＣｏ２およびＨＴ２９細胞はＴＮＦαおよびＣＨＸに応答してアポトーシスを受けるが、Ｎｏｄ１経路を同時にγＴｒｉＤＡＰによって活性化した場合には相乗効果は観察されなかった。２９３細胞のような他の系は、ＴＮＦαおよびＣＨＸを加えた場合においてさえ、γＴｒｉＤＡＰ誘導細胞死滅に対して抵抗性であった。Ｎｏｄ１依存性アポトーシスの欠如は、ＮＯＤ１を活性化するγＴｒｉＤＡＰの無能力の結果ではない。なぜならば、Ｎｏｄ１を発現する２９３細胞はＮｏｄ１リガンドに応答してＩＬ−８を放出するからである。ＨＴ２９およびＣａＣｏ２細胞は、ＮＯＤ１タンパク質の存在に拘わらずアポトーシスおよびＩＬ−８放出アッセイ双方においてγＴｒｉＤＡＰに対して貧弱にしか応答性でなく、これは、１以上の正のレギュレーターが存在しないか、または強力な負の調節経路が存在することを示唆する。関連する複雑な相互作用にも拘わらず、Ｎｏｄ１依存性アポトーシスは、ＳＫ−ＢＲ３およびＡ４３１細胞株を含めたいくつかの上皮細胞株において示すことができる。
【０１３４】
ＮＯＤ１はＳＫＢＲ３ヒト乳癌細胞株において発現され、先に示したように、それらの癌細胞においてアポトーシスを変調する。ＳＫＢＲ３野生型細胞は、Ｎｏｄ１を過剰発現するＳＫＢＲ３細胞よりも、ＴＮＲαおよびγＴｒｉＤＡＰ濃度の関数としてより低いアポトーシスを呈する（図９Ａ）。さらに、アポトーシスＳＫＢＲ３細胞のパーセンテージは培養条件に依存して変化する（図９Ｂ）。図９Ｂに示されるように、ＳＫＢＲ３細胞のアポトーシスは、細胞をγＴｒｉＤＡＰ（γＴｒｉ）＋ＴＮＦα（ＴＮＦ）およびシクロヘキシミド（ＣＨＸ）に暴露した場合に最高である。不活性なγＴｒｉＤＡＰアナログ、αＴｒｉＤＡＰ（αＴｒｉ）の置換は、低下したアポトーシスに導いた。これらの因子に暴露されたＳＫＢＲ３細胞の溶解物のウエスタン分析は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）およびカスパーゼ３、７および８がタンパク質分解切断を受けることを示した。図９Ｃは、異なる因子の存在下においてＳＫＢＲ３細胞を培養した後に観察されたアポトーシス野生型ＮＯＤ１発現およびＣＬＡＲＰ発現ＳＫＢＲ３細胞のパーセンテージをグラフにより示す。示されたように、ＳＫＢＲ３細胞のアポトーシスは、シクロヘキシミド（ＣＨＸまたはＣ）、ＴＮＦα（ＴＮＦまたはＴ）およびγＴｒｉＤＡＰ（γＴｒｉ）が存在する場合に（すなわち、「ｇＴＣ」組み合わせ）、最高である。しかしながら、ＣＬＡＲＰ発現は種々の培養条件下でアポトーシスを増大させなかった。
【０１３５】
ヒトＮｏｄ１の以前の構造−機能実験は、Ｐ−ループ残基（Ｋ２０８）が、２９３細胞においてＮＦ−ｋＢを活性化するのに一過的に過剰発現されたＮｏｄ１タンパク質で必要であることを示す。他の実験は、Ｋ２０８の突然変異が、ヌクレオチド結合／オリゴマー化（ＮＢＤ／ＮＯＤ）ドメインによって媒介されるオリゴマー化で必要な立体配座変化をブロックすることを示す。Ｎｏｄ１のＣＡＲＤドメインにおける突然変異Ｖ４１Ｑもまた、カスパーゼ９のＮｏｄ１への結合を破壊することが示されており、その結果、２９３細胞における一過的トランスフェクション実験の間におけるＮｏｄ１依存性アポトーシスの阻害をもたらす。
【０１３６】
さらなる実験を行って、いずれのＮＯＤ１構造ドメインがアポトーシスで必要かを判断した。図４Ａに示すように、Ｋ２０８Ｒ突然変異はγＴｒｉＤＡＰ＋シクロヘキシミドの効果を無くし、他方、Ｖ４１Ｑ突然変異はほとんどまたは全く有意な効果を有しなかった。これらの突然変異体Ｎｏｄ１ポリペプチドは、図４Ｂに示すウェスタンブロッドによって示されるように、効果的に発現された。かくして、これらのポリペプチドの異なる効果は、発現レベルの差によるものではなかった。その代わり、データは、オリゴマー化に必要な立体配座変化を媒介するヌクレオチド結合／オリゴマー化（ＮＢＤ／ＮＯＤ）ドメインがＮｏｄ１アポトーシスで必要であることを示す。
【０１３７】
さらなる実験は、γＴｒｉＤＡＰ誘導ＩＬ−８の産生がＭＣＦ−７Ｃ２０細胞で阻害されたが（データは示さず）、そのようなＩＬ−８の産生は野生型Ｎｏｄ１がＭＣＦ−７Ｃ２０Ｎｏｄ１細胞で発現された場合（図５Ｃ）、あるいはＶ４１Ｑ  Ｎｏｄ１突然変異体がＭＣＦ−７Ｃ２０（すなわちＭＣＦ−７Ｃ２０Ｖ４０Ｑ）細胞で発現された場合（データは示さず）、回復されることを示した。しかしながら、ＭＣＦ−７Ｃ２０（すなわちＭＣＦ−７Ｃ２０Ｋ２０８Ｒ）細胞におけるＫ２０８Ｒ  Ｎｏｄ１突然変異体ポリペプチドの発現はγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを回復しなかった。
【０１３８】
Ｎｏｄ２活性化はＭＣＦ−７細胞においてアポトーシスを誘導しない
また、実験を行って、その特異的アクチベーター、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）によるＮｏｄ２の活性化が親ＭＣＦ−７細胞において、または、Ｎｏｄ２を過剰発現するＭＣＦ−７細胞（ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ２）においてアポトーシスを開始するか否かを確認した。かくして、γＴｒｉＤＡＰまたはＭＤＰをこれらの細胞株の各々に加え、アポトーシス（図５Ａ）およびＩＬ−８産生（図５Ｃ）を測定した。ＭＤＰ＋ＣＨＸで処理されたＭＣＦ−７  Ｎｏｄ２細胞は増大したアポトーシスを受けなかった。コントロール的に、γＴｒｉＤＡＰの添加は予測されるように細胞死滅を生じた。ＭＤＰ処理の結果、ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ２細胞においてＩＬ−８が分泌された（図５Ｃ）。ＭＣＦ−７安定トランスフェクタントにおけるＮｏｄ１およびＮｏｄ２の実験は、免疫ブロッティングによって確認された（図５Ｂ）。ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞のＮｏｄ２での補充の結果、ＭＤＰまたはγＴｒｉＤＡＰいずれかの添加後にアポトーシスはもたらされなかった（データは示さず）。
【０１３９】
Ｎｏｄ１依存性アポトーシスにおけるカスパーゼの関与
今日アポトーシスは特異的カスパーゼによって開始された区別される細胞内経路の活性化に続いて起こると理解される。Ｎｏｄ１依存性経路における開始カスパーゼについての情報を得るために、ファルマコロジックおよびバイオロジック阻害剤を用い、これはカスパーゼに対して変動する特異性を有した。広いスペクトルの阻害剤ｚ−ＶＡＤは、γＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスをほとんど完全にブロックした（図６Ａ）。コントロール的に、カスパーゼ１，２，６および７の特異的阻害剤は、アポトーシスに対して最小効果を有するに過ぎなかった（図６Ａ）。しかしながら、カスパーゼ９阻害剤ＬＥＨＤおよびカスパーゼ８阻害剤ＩＥＴＤは、ｚ−ＶＡＤで観察されたのと同様な阻害のレベルでもって顕著な阻害効果を有した（図６Ａ）。これらのデータは、γＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスの阻害におけるカスパーゼ８および９についての可能な役割を示唆する。
【０１４０】
二つの主なアポトーシス経路、すなわち、内因性（ミトコンドリア、ストレス誘導）および外因性（受容体媒介）経路が記載されている。アポトーシスに参画するカスパーゼはヒエラルキーカスケードに組織化されるように見え、カスパーゼ９およびカスパーゼ８は、各々、内因性および外因性経路における上流阻害剤である。これらの経路の間を識別するために、トランスフェクションによって、細胞に導入されたいくつかのタンパク質阻害剤を用いた。
【０１４１】
まず、ＣＬＡＲＰ（Ｆｌｉｐ）トランスフェクタントを試験した。ＣＬＡＲＰはカスパーゼ８の特異的阻害剤であると考えられ、２つの死滅エフェクタードメイン（ＤＥＤ）を有し、不活性なカスパーゼドメインを有する。ＣＬＡＲＰはカスパーゼ８およびＦＡＤＤと相互作用することが知られており、それにより、Ｆａｓ、ＴＮＦαおよびＴＲＡＩＬを含めた種々のリガンド受容体対によって誘導されるアポトーシスを特異的に阻害する。γＴｒｉＤＡＰ誘導細胞死滅に対するＣＬＡＲＰの効果を決定するために，単独で、またはＮｏｄ１の存在下で安定にＣＬＡＲＰ（ＭＣＦ−７  ＣＬＡＲＰ）を発現するＭＣＦ−７細胞株を樹立した。ＭＣＦ−７ＣＬＡＲＰ細胞をγＴｒｉＤＡＰ／ＣＨＸと共にインキュベートすると、細胞死滅は全く阻害され、これは、Ｎｏｄ１誘導アポトーシス経路がカスパーゼ８によって開始される経路と重複することを示唆する（図６Ｃ、頂部パネル）。
【０１４２】
もう１つの抗アポトーシスタンパク質であるＢｃｌ−２は、ミトコンドリアからのチトクロームｃの放出を妨げることが示されており、それにより、Ａｐａｆ１／カスパーゼ９複合体の活性化をブロックする。安定なＭＣＦ−７細胞株が作成され、これはＢｃｌ−２を過剰発現し、細胞の死滅は、Ｎｏｄ１活性化に際して、このＢｃｌ−２発現ＭＣＦ−７細胞で評価した。図６Ｃ（一番下のパネル）に示すように、Ｂｃｌ−２の過剰発現はγＴｒｉＤＡＰ誘導細胞死滅を部分的に妨げたのみであった。
【０１４３】
ＭＣＦ−７細胞はカスパーゼＩＩＩを欠如することが知られている。本発明者らによるさらなる実験により、親ＭＣＦ−７またはＭＣＦ−７Ｃ２０細胞におけるカスパーゼＩＩＩの発現は、これらの細胞の、Ｎｏｄ１リガンドγＴｒｉＤＡＰに対する応答パターンを変化させないと判断された（データは示さず）。これらの実験は、カスパーゼ８が、ＭＣＦ−７細胞においてγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを開始させるにおいて重要な役割を演じることを示す。さらなる支持は、間接的ではあるが、カスパーゼ９と相互作用しないＮｏｄ１のＶ４１Ｑ突然変異体が、γＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシス（図４Ａ）およびＩＬ８産生（データは示さず）を支持するのに野生型Ｎｏｄ１と同等であるという発見に由来する。
【０１４４】
ＣＡＲＤドメインはＮｏｄ１誘導アポトーシスで必要であるが、キナーゼ活性は必要でない。
【０１４５】
ＲＩＰ２はＣＡＲＤドメインを含有するプロテインキナーゼである。ＲＩＰ２は、ＮＦ−ｋＢ活性化に導くＮｏｄ１シグナリングにおいて重要であることが示されている（Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４１６：１９４−９９（２００２）：Ｃｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ４１６：１９０−９４（２００２））。ＣＡＲＤ−ＣＡＲＤ相互作用を介するＮｏｄ１に対するＲＩＰ２の結合は、ＮＦ−ｋＢ活性化に必須であると考えられる。なぜならば、ＣＡＲＤドメインを欠如するＲＩＰ２はＮｏｄ１シグナリングの支配的な負の阻害剤として作用するからである。
【０１４６】
いくつかのＲＩＰ２突然変異体をＭＣＦ−７細胞において安定に発現させてγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスにおけるＲＩＰ２キナーゼ活性の役割を評価した。そのＣＡＲＤドメインを欠如するＲＩＰ２の発現は、Ｎｏｄ１誘導細胞死滅を完全に無くした（図７Ａ）。コントロール的に、野生型ＲＩＰ２の、または触媒的に不活性な（ＲＩＰ２  ＫＤ）の発現は、Ｎｏｄ１の正常なレベルを発現した親ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ細胞で見られるアポトーシスレベルに対してアポトーシスの程度を増大させた（図７Ａ、１３Ａ）。野生型ＲＩＰ２およびＲＩＰ２  ＫＤ構築体を発現する細胞はより低濃度のγＴｒｉＤＡＰに対して感受性であり、Ｎｏｄ１のみを発現する細胞（図１３Ｃ）よりも、あるいは親ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ細胞（データは示さず）よりも速く死滅した。さらに、ＭＤＰは、ＲＩＰ２  ＫＤを発現する細胞において高レベルのアポトーシスを誘導するのに効果的であったが、野生型ＲＩＰ２またはＲＩＰ２ΔＣＡＲＤいずれかを発現する細胞においてはそうでなかった（図１３Ａ）。ＭＤＰもまたＮｏｄ１発現細胞におけるよりもＲＩＰ２  ＫＤ細胞においてより高いレベルのアポトーシスを誘導した（図１３Ｃ）。しかしながら、ＴＮＦαは、野生型ＲＩＰ２、ＲＩＰ２  ＫＤおよびＲＩＰ２ΔＣＡＲＤを発現した細胞において同様なレベルのアポトーシスを誘導した（図１３Ｂ）。γＴｒｉＤＡＰ誘導ＩＬ−８分泌は、野生型ＲＩＰ２を発現する細胞において最高であった（図１３Ｄ）。実験したトランスフェクトされた細胞株の各々が、ほとんど同一の量の野生型または突然変異体ＲＩＰ２を発現し（図７Ｂ）、発現レベルは細胞死滅の差の原因ではなかったことを示す。かくして、Ｎｏｄ１依存性アポトーシス経路はＲＩＰ２  ＣＡＲＤドメインを必要とするが、驚くべきことに、ＲＩＰ２キナーゼ活性を必要としない。
【０１４７】
γＴｒｉＤＡＰ誘導ＪＮＫリン酸化に対するＲＩＰ２発現の効果も調べた（図７Ｃ）。シクロヘキシミドの存在下における２時間のγＴｒｉＤＡＰへの野生型ＲＩＰ２またはＲＩＰ２  ＫＤを発現するＭＣＦ−７細胞の暴露がＪＮＫのリン酸化を誘導した（図７Ｃ）。しかしながら、γＴｒｉＤＡＰおよびシクロヘキシミドはＲＩＰ２ΔＣＡＲＤ細胞に対してそのような効果を有しなかった。
【０１４８】
かくして、Ｎｏｄ１はエストロゲン感受性腫瘍成長を制御するのにＲＩＰ２（足場プロテインキナーゼ）を必要とする。しかしながら、エストロゲン感受性腫瘍成長のＮｏｄ１−ＲＩＰ２調節はＲＩＰ２  ＣＡＲＤドメインを必要とするが、それは、Ｎｏｄ１依存性アポトーシス、および腫瘍成長の抑制双方についての適当な下流シグナルを供するのにＲＩＰ２キナーゼ活性を必要としない。同様な結果がｐ３８で得られた（データは示さず）。ＲＩＰ２ΔＣＡＲＤ細胞におけるＭＡＰＫ活性化の不存在は改変されたＭＡＰＫキナーゼシグナリングによるものではなかった。なぜならば、ＩＬ−１は全てのトランスフェクタントにおいてＪＮＫリン酸化を強く誘導したからである。かくして、ＭＣＦ−７細胞におけるγＴｒｉＤＡＰの活性はＲＩＰ２を必要とするが、そのキナーゼ活性は必要としない。
【０１４９】
これらのデータは、ＲＩＰ２／ＲＩＣＫ、Ｎｏｄ１の下流のプロテインキナーゼがＮｏｄ１プロアポトーシス経路の必須の成分であろうことを示す。なぜならば、ＲＩＰ２の優性負形態の発現はγＴｒｉＤＡＰ誘導細胞死滅を無くしたからである。
【０１５０】
Ｎｏｄ１は腫瘍形成を制御する。Ｎｏｄ１依存性アポトーシス経路は、腫瘍形成に導く腫瘍細胞成長調節および悪性細胞が細胞死滅を受けないことを含めた、多数の生物学的プロセスにおいて重要であろう。ＳＣＩＤマウスにおける腫瘍成長の異種移植片モデルを用いて腫瘍成長および腫瘍拒絶においてＮｏｄ１が演じる役割を調べた。ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ  ＭＣＦ−７Ｃ２０およびＭＣＦ−７Ｃ２０Ｎｏｄ１細胞の集団（各々、合計して約３ｘ１０６細胞）を、別々に雌マウスの脇腹に皮下注射して、ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤまたはＳＣＩＤ／Ｎｏｄ１マウスにおいて腫瘍成長を誘導した。動物を、８週間までの間、注射後に１週間に１回腫瘍形成についてスコアを取った。
【０１５１】
全ての３つの細胞集団は、注射後１５日までに全てのマウスにおいて１０ｍｍ３の近似的に計算された腫瘍容積があるように、注射後最初の数週間の間に等しく腫瘍を成長させた。かくして、ＭＣＦ−７Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７Ｃ２０およびＭＣＦ−７Ｃ２０Ｎｏｄ１細胞は、全て、マウスへの導入のうちに約１５日まで腫瘍を生起させた。
【０１５２】
しかしながら、ＭＤＦ−７ＢｌａｓｔｏおよびＭＣＦ−７Ｃ２０Ｎｏｄ１細胞から形成された腫瘍は、８週間の実験の残りにわたってほとんど消失した。ＭＣＦ−７ＢｌａｓｔｏおよびＭＣＦ−７Ｃ２０Ｎｏｄ１細胞によって生じた初期腫瘍はサイズが迅速に減少し、退行した（図１０）。ＭＣＦ−７Ｃ２０細胞の注射のみが、退行せず、成長し続けた注射の部位において大きな丸い腫瘍を生じた。これらの結果は、Ｎｏｄ１の不存在が腫瘍成長を可能とし、他方、Ｎｏｄ１の存在は腫瘍退行に導くことを示す。
【０１５３】
これらの実験はＳＣＩＤマウスで行ったので、異種移植片の腫瘍成長における免疫系の役割は無視できた。さらに、ＭＣＦ−７ＢｌａｓｔｏおよびＭＣＦ−７Ｃ２０Ｎｏｄ１細胞を受ける動物における腫瘍の不存在は、増殖する減少した能力によるものではなかった。なぜならば、ＭＣＦ−７Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７Ｎｏｄ１、ＭＣＦ−７Ｃ２０およびＭＣＦ−７２０Ｎｏｄ１を発現する細胞株を含めたここに実験したＭＣＦ−７系の各々は、組織培養条件において、および軟寒天コロニー形成アッセイにおいて同一の成長特徴を有したからである（データは示さず）。
【０１５４】
これらの別々の実験の結果のまとめを表２に示し、そこでは、ＳＣＩＤ／ＳＩＤマウスを実験１および２で用い、およびＳＣＩＤ／Ｎｏｄマウスを実験３で用いた。
【０１５５】
【表２】
2008531600.tif 000014
これらの結果は、（ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞を用いた場合の様な）Ｎｏｄ１機能の喪失は、腫瘍が退行しない確率を増加させることを示す。（ＭＣＦ−７  Ｃ２０  Ｎｏｄ１細胞を用いた場合の様な）Ｎｏｄ１機能の置き換えまたはＮｏｄ１発現の誘導は、腫瘍が退行する確率を増大する。
【０１５６】
また、１つの実験を行い、そこでは、ＭＣＦ−７Ｃ２０およびＭＣＦ−７Ｃ２０Ｎｏｄ１細胞で３．５週間前に注射した腫瘍担持ＳＣＩＤ／ＳＣＩＤマウスから腫瘍を採取した。次いで、腫瘍組織をミンチし、組織培養フラスコに入れた。約１週間後にいずれの残存する固体腫瘍組織も除去し、１０μｇ／ｍｌブラスチシジンを加えた。次いで、標準的な条件下で、蒔かれた細胞を、ブラスチシジンの存在下で６継代の間維持した。次いで、これらの細胞を用いてナイーブなＳＣＩＤマウスに注射し、腫瘍容積の変化のタイムコースを６０日間の間測定した。
【０１５７】
腫瘍由来ＭＣＦ−７Ｃ２０またはＭＣＦ−７Ｃ２０Ｎｏｄ１細胞のいずれかを含有するマウスは腫瘍を成長させ始めた。注射後１５日まで双方の細胞型は５０ｍｍ３の近似計算された腫瘍容積を生起させた。この実験の残りの４０日の間にＭＣＦ−７Ｃ２０Ｎｏｄ１細胞から形成された腫瘍は最小に検出可能なサイズ（＜１０ｍｍ３）まで退行し、他方、ＭＣＦ−７Ｃ２０細胞によって生じた腫瘍は２００〜２７０ｍｍ３の最大容積まで成長する（図１１ＡないしＣ）。
【０１５８】
これらの結果は、さらに、腫瘍細胞におけるＮｏｄ１発現が腫瘍細胞アポトーシスおよび腫瘍退行に導くことができることを確認する。
【０１５９】
ＭＣＦ−７細胞はＴＮＦαに応答してアポトーシスを受けるので、ネズミＴＮＦα（Ｂａｎｃｒｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：１２７−３０（１９８９））を中和するハムスターモノクローナル抗体を用いて、Ｎｏｄ１誘導アポトーシスに対するＴＮＦαの効果をさらに調べた。この抗体の存在はアポトーシスを阻害しなかった。なぜならば、ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ又はＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１細胞を接種した場合に腫瘍は形成されなかったからである。さらに、従前の実験で観察されたように、ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞をマウスに注射した場合に、腫瘍は成長した。
【０１６０】
再度、Ｎｏｄ１発現腫瘍細胞を注射した後における腫瘍の不存在は、ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞と比較してＭＣＦ−７  ＢｌａｓｔｏおよびＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１細胞の減少した増殖速度によるものではなかった。なぜならば、実験したＭＣＦ−７系の各々は培養において、および軟寒天コロニー形成アッセイにおいて同一の成長特徴を有したからである。さらに、他の因子によるアポトーシスの単純なブロックは腫瘍成長を生起させたメカニズムではないようであった。なぜならば、ＣＬＡＲＰ（ｃ−ＦＬＩＰ）はカスパーゼ８の特異的阻害剤であり、ＭＣＦ−７  ｃ−ＦＬＩＰ／ＣＬＡＲＰ細胞はヌードマウスにおいて腫瘍を形成できなかったからである（データは示さず）。
【０１６１】
エストロゲンの役割
予備的実験において、Ｃ２０クローンを雄マウスに移植した場合により頑強な腫瘍成長が観察され、これは、腫瘍退行において雌関連ホルモンについての役割を示唆する。種々の遺伝子標的のポリメラーゼ鎖反応増幅によるさらなる調査は、プロゲステロン受容体はＣ２０細胞株では存在せず、他方、それは野生型細胞において、より重要なことにはＣ２０Ｎｏｄ１細胞において存在するという観察に導いた。さらに、ＰＣＲ分析も又、エストロゲン受容体アルファが三つのＭＣＦ−７細胞型の各々に存在したことを明らかにした。
【０１６２】
ほとんどの実験において、ＭＣＦ−７細胞による腫瘍形成は細胞を高濃度で接種した場合においてさえ、ヌードマウスにおける腫瘍形成にはエストロゲンの補充を必要とする。腫瘍形成におけるエストロゲンの役割をさらに調べるために、全ての３つの細胞株をエストロゲンペレットと共にマウスに注射した（図１１Ｂ）。予測されるように、エストロゲンが存在する場合、腫瘍は、ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ細胞を注射したマウスにおいて成長した。ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞を注射したマウスは腫瘍を生じさせ、これは、エストロゲンペレットが存在する場合にさらに大きく成長した。興味深いことには、ＭＣＦ−７  Ｃ２０／Ｎｏｄ１を受けたマウスはエストロゲンペレットの存在下で腫瘍を成長させなかった。これらのデータはＮｏｄ１がエストロゲン依存性腫瘍成長を抑制することを示す。
【０１６３】
腫瘍成長におけるＮｏｄ１経路の役割をさらに裏付けるために、ＲＩＰ２（ＲＩＰ２ΔＣＡＲＤ）の優性負対立遺伝子の発現を調べて、この対立遺伝子が腫瘍を成長させるＭＣＦ−７細胞の能力とやはり干渉できるか否かを判断した。図１１Ｃは腫瘍はＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞で観察された腫瘍よりも小さかったが、これらのＲＩＰ２ΔＣＡＲＤ細胞は腫瘍を成長させたことを示す。一緒にすると、これらのデータは、Ｎｏｄ１が腫瘍成長において臨界的な役割を有すること、およびＮｏｄ１の存在はエストロゲン依存性腫瘍成長に対してブレーキとして作用することを示す。
【０１６４】
この仮説に対するさらなる裏づけを得るために、エストロゲン誘導増殖に対するＭＣＦ−７細胞株の感度は、細胞を培養基中のエストロゲンの非存在下で成長させた条件下で観察された。これらの条件下では、ＭＣＦ−Ｃ２０細胞ならびにＭＣＦ−７ ＲＩＰ２ΔＣＡＲＤ細胞は加えられたエストロゲンに対する強力な増殖応答を受け、他方、親ＭＣＦ−７  Ｃ２０／Ｎｏｄ１細胞株も刺激して増殖しなかった（図１１Ｄ）。しかしながら、ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞で観察されたエストロゲン誘導増殖は、培養基におけるタモキシフェンの添加によってブロックされた（データは示さず）。
【０１６５】
エストロゲンの存在がＮｏｄ１誘導アポトーシス経路を変調するか否かを判断するために、細胞を木炭処理血清を含有する培地中で培養した。エストロゲンは、Ｎｏｄ１を実質的に発現せず、アポトーシスを実質的に阻害しなかったＣ２０細胞におけるアポトーシスに対してほとんどまたは全く効果を有しなかった（図１２Ａ、中央パネル）。Ｃ２０／Ｎｏｄ１およびＢｌａｓｔｏ細胞は、ステロイドの非存在下で培養した場合にγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスに対してより抵抗性であった（Ｃ２０／Ｎｏｄ１は、ステロイド無くして１０％アポトーシスを呈し、それに対し、ステロイド有りでは８０％アポトーシスを呈した、図１２Ａ、下方パネル）。かくして、アポトーシスに対する抵抗性は、アポトーシスがエストロゲン濃度に対し用量依存的に増大するように、エストロゲンの添加によって逆行した（図１２Ａ）。逆に、タモキシフェンの添加は、γＴｒｉＤＡＰ誘導細胞死滅を部分的にブロックした（図１２Ｂ）。最後に、Ｎｏｄ１の過剰発現は、負荷コントロールとして用いたＥＲＫ２のそれに影響することなく、内因性エストロゲン受容体−α（ＥＲα）の発現を顕著に低下させた（図１２Ｃ）。同様に、ＥＲα発現の減少が、腫瘍から単離された再培養した細胞で観察された（図１２Ｃ、右側パネル）。これらのデータは、Ｎｏｄ１経路がＥＲα発現レベルに影響し、従って、腫瘍を発生するＭＣＦ−７の乳癌細胞の感受性に影響することを示す。
【０１６６】
本明細書中において引用しまたは言及した全ての特許および刊行物は、本発明が関する分野における当業者の技量のレベルを示し、各そのような引用された特許または刊行物は、ここに引用して、あたかもそれが引用によりその全体が個々に一体化され、あるいはここにその全体が記載されているのと同程度に一体化される。出願人は、本明細書に、いずれかのそのような引用された特許または刊行物からいずれかのおよび全ての材料および情報を物理的に取り込む権利を留保する。
【０１６７】
本明細書中に記載された具体的な方法および組成物は好ましい実施形態の代表であり、例示的なものであって、本発明の範囲に対する限定を意図するものではない。他の目的、態様、および実施形態は、本明細書を考慮すると当業者に明らかであり、特許請求の範囲の範囲によって定義される発明の精神内に含まれる。本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の置換および修飾を本明細書中に開示された発明に対してなすことができるのは当業者に容易に明らかであろう。本明細書中に適切に説明的に記載された発明は、本明細書中において必須として具体的に開示されていないいずれかのエレメントまたは複数エレメント、または限定、または複数限定の非存在下で実施することができる。本明細書中において適切に説明的に記載された方法およびプロセスは異なる工程の順番で行うことができ、それらは本明細書中において、または特許請求の範囲において示された工程の順番を必ずしも制限しない。本明細書中において、および添付の請求の範囲において用いるように、単数の形態「ある」および「該」は、明瞭に文脈が他のことを指令していなければ複数の引用を含む。かくして、例えば、「ある抗体」に対する言及は、複数のそのような抗体を示す（例えば、抗体の溶液、または一連の抗体調製物）。特許が、本明細書中に具体的に開示された特別な実施例または実施形態または方法に限定されると解釈されるべき状況はない。特許が、特許商標局のいずれかの審査官またはいずれかの他の職員によってなされたいずれかの陳述によって、そのような陳述が出願人による応答書面において具体的かつ資格または留保なくして明示的に採用されるのでなければ、限定されるように解釈されるべき状況はない。
【０１６８】
使用されてきた用語および表現は記載の用語として用い、限定のものではなく、示され、および記載された特徴のいずれかの同等物、またはその部分を排除するようにそのような用語および表現を用いることを意図せず、種々の修飾が特許請求される発明の範囲内で可能であることが認識される。かくして、本発明を好ましい実施形態および任意の特徴によって具体的に開示してきたが、本明細書中において開示された概念の修飾および変形は当業者によってなすことができ、そのような修飾および変形は添付の請求の範囲によって定義される本発明の範囲内であると考えられると理解される。
【０１６９】
本発明はここに広くかつ一般的に記載されてきた。上位概念的開示に入るより狭い種および下位概念的グループも各々もまた本発明の一部を形成する。これは、削除された材料が本明細書中において具体的に言及されているか否かに拘わらず上位概念からいずれかの主題を除去する但し書きまたは消極的な限定を伴う本発明の上位概念的記載を含む。
【０１７０】
他の実施形態は以下の請求の範囲内のものである。加えて、本発明の特徴または態様がマーカッシュ群の形式で記載されている場合、当業者であれば、本発明がそれにより、マーカッシュ群のいずれかの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの形式でやはり記載されていることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１７１】
【図１Ａ】図１ＡないしＣは、ＴＮＦ誘導アポトーシスにおけるＮｏｄ１の関与を示す。図１Ａは、ＴＮＦα−抵抗性表現型を生起させ、後にブラスチシジン（ｂｌａｓｔ）遺伝子挿入を担うＮｏｄ１突然変異体として同定された突然変異した遺伝子の模式的ダイアグラムを供する。このＮｏｄ１突然変異を担う細胞株がＭＣＦ７−Ｃ２０細胞株である。ｐＤｉｓｒｕｐレトロウイルス構築体からの挿入はＮｏｄ１遺伝子にマッピングされた。Ｎｏｄ１遺伝子と融合したブラスチシジンの接合は、ロイシン−リッチな領域８（ＬＲＲ８）およびロイシン−リッチな領域９（ＬＲＲ９）の間のＮｏｄ１遺伝子の３’末端で起こった。よって、ＬＲＲ９およびＬＲＲ１０領域はブラスチシジン挿入に対して３’側である。
【図１Ｂ】図１ＡないしＣは、ＴＮＦ誘導アポトーシスにおけるＮｏｄ１の関与を示す。図１Ｂは、ＮＯＤ１タンパク質がＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞において検出可能な量で存在しないことを示す。ＭＣＦ−７親（「ｗｔ」と呼ばれる）およびＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞からの細胞抽出物を調製し、モノクローナル抗ＮＯＤ１抗体で免疫沈澱させる（上方パネル）か、あるいは直接的にＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに負荷させ（下方パネル）、次いで、ＰＶＤＦ膜に移した。ブロットは、同一のモノクローナル抗ＮＯＤ１活性を用いる免疫ブロッティングによって分析した。
【図１Ｃ】図１ＡないしＣは、ＴＮＦ誘導アポトーシスにおけるＮｏｄ１の関与を示す。図１Ｃは、ＭＣＦ−７細胞がＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞よりもＴＮＦ誘導アポトーシスに対して抵抗性であることを示す。ＭＣＦ−７およびＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞を、増大する濃度のＴＮＦ（０ないし４０ｎｇ／ｍｌ）で２０時間処理した。細胞生存率は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除アッセイおよびフローサイトメトリーによって測定した。グラフは、ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞がアポトーシスを有意に受けるようであることを示す。
【図２Ａ】図２ＡないしＤは、ＭＣＦ−７細胞がγＴｒｉＤＡＰ処理に際してアポトーシスを受けることを示す。図２Ａは、ＮＯＤ１がγＴｒｉＤＡＰ誘導細胞死滅で必要であることを示す。正常なレベルのＮＯＤ１を発現するＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ細胞、ＮＯＤ１をほとんどまたは全く発現しないＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞、またはＮＯＤ１を過剰発現するＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１細胞を、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（３ｕｇ／ｍｌ）の存在下（陰影を施した棒線）または非存在下（塗り潰ぶしていない棒線）、γＴｒｉＤＡＰまたはαＴｒｉＤＡＰ（各々５０ｕｇ／ｍｌ）で４８時間処理した。コントロールアッセイはγＴｒｉＤＡＰまたはαＴｒｉＤＡＰの代わりに培地（Ｍｅｄ）を受けた。４８時間のインキュベーションの後、細胞を採取し、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）（４ｕｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。細胞の生存率はフローサイトメトリー分析によって測定した。示したデータは、少なくとも４つの独立した実験の代表的な実験である。
【図２Ｂ】図２ＡないしＤは、ＭＣＦ−７細胞がγＴｒｉＤＡＰ処理に際してアポトーシスを受けることを示す。図２Ｂは、ベクター単独でトランスフェクトされたＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ細胞、内因性Ｎｏｄ１遺伝子において破壊を有するＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞、またはＮＯＤ１を過剰発現するように作成されたＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１細胞におけるＮＯＤ１発現のレベルを示す。ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｃ２０およびＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１細胞におけるＮＯＤ１の発現は、モノクローナル抗ＮＯＤ１抗体を用いるウエスタンブロッティングによって分析した。
【図２Ｃ】図２ＡないしＤは、ＭＣＦ−７細胞がγＴｒｉＤＡＰ処理に際してアポトーシスを受けることを示す。図２Ｃは、γＴｒｉＤＡＰ処理ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１細胞における形態学的変化を示す。細胞を４−ウエルチャンバースライドに蒔き、γＴｒｉＤＡＰ／シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（パネルｂ、ｄ、ｆ）またはＣＨＸ単独（パネルａ、ｃ、ｅ）で処理した。細胞をＤＡＰＩ（パネルｃ、ｄ）またはＴＵＮＥＬ（パネルｅ、ｆ）で染色し、固定し、位相差（パネルａ、ｂ）または蛍光（パネルｃないしｆ）顕微鏡下で観察した。
【図２Ｄ】図２ＡないしＤは、ＭＣＦ−７細胞がγＴｒｉＤＡＰ処理に際してアポトーシスを受けることを示す。図２Ｄは、ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１細胞におけるγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスが、２つの広いスペクトルのカスパーゼ阻害剤、ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫおよびＢｏｃ−Ｄ−ＦＭＫによって減少され、または無くされたことを示す。ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１細胞を、４８時間でγＴｒｉＤＡＰ／ＣＨＸを加える前に３０分間、ｚ−ＶＡＤまたはＢｏｃ−Ｄ−ＦＭＫカスパーゼ阻害剤（各々５０ｕＭ）で予備処理した。細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共にインキュベートし、アポトーシス細胞死滅をフローサイトメトリーによって測定した。
【図３】図３は、ＭＣＦ−７細胞への不活性なコントロールトリペプチドαＴｒｉＤＡＰではなくγＴｒｉＤＡＰの添加の結果、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の、およびカスパーゼ６、７、８および９のタンパク質解切断をもたらしたウエスタン分析を示す。ＰＡＲＰおよび種々のカスパーゼの切断は、ＣＨＸ（０．５ｕｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下におけるγＴｒｉＤＡＰ、αＴｒｉＤＡＰまたは培地（コントロール）での２４時間の刺激の後に、細胞ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｃ２０およびＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１のウエスタンブロット分析によって検出した。細胞を採取し、ウエスタンブロッティングに付し、ＰＡＲＰ、カスパーゼ、ｐ２０、ｐ４１／４３およびｐ３５をその反応性抗体で検出した。
【図４Ａ】図４ＡないしＣは、ＮＯＤ１突然変異体Ｖ４１ＱがγＴｒｉＤＡＰに対して反応性であって、アポトーシス経路において機能的なままであり、他方、ＮＯＤ１突然変異体Ｋ２０８ＲがγＴｒｉＤＡＰに対して応答性ではなく、アポトーシス経路において活性ではないことを示す。図４Ａは、培地（Ｍｅｄ、コントロール）またはγＴｒｉＤＡＰでの処理の後における異なる細胞株でのアポトーシス細胞のパーセンテージをグラフにより示す。ＮＯＤ１  Ｖ４１ＱおよびＫ２０８Ｒ突然変異体は部位特異的突然変異誘発によって構築した。Ｖ４１Ｑ突然変異はＮＯＤ１のＣＡＲＤドメイン中にあり、他方、Ｋ２０８Ｒ突然変異は、Ｎｏｄ／ＮＢＤドメインによって媒介されるオリゴマー化に必要な立体配座変化をブロックすると考えられる。これらのＮＯＤ１  Ｖ４１ＱおよびＫ２０８Ｒ突然変異体ポリペプチドをコードする構築体をＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞にトランスフェクトし、アポトーシスアッセイを行った。示されるように、Ｖ４１Ｑ突然変異体はＮＯＤ１活性を保有するが、Ｋ２０８Ｒ突然変異体は保持しない。
【図４Ｂ】図４ＡないしＣは、ＮＯＤ１突然変異体Ｖ４１ＱがγＴｒｉＤＡＰに対して反応性であって、アポトーシス経路において機能的なままであり、他方、ＮＯＤ１突然変異体Ｋ２０８ＲがγＴｒｉＤＡＰに対して応答性ではなく、アポトーシス経路において活性ではないことを示す。図４Ｂは、ＮＯＤ１突然変異体および野生型ポリペプチドの発現レベルが実質的に同一であることを示す。
【図４Ｃ】図４ＡないしＣは、ＮＯＤ１突然変異体Ｖ４１ＱがγＴｒｉＤＡＰに対して反応性であって、アポトーシス経路において機能的なままであり、他方、ＮＯＤ１突然変異体Ｋ２０８ＲがγＴｒｉＤＡＰに対して応答性ではなく、アポトーシス経路において活性ではないことを示す。図４Ｃは、ウエスタン分析によって、ＭＣＦ−７細胞におけるＮＯＤ１発現がＰＡＲＰの、およびカスパーゼ６、７、８および９のタンパク質分解切断に必要であることを示す。ＰＡＲＰおよび種々のカスパーゼの切断は、ＮＯＤ１を発現しないＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞の、およびＮｏｄ１構築体が組み換えによりＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞に導入されたＭＣＦ−７  Ｃ２０  Ｎｏｄ１細胞のウエスタンブロット分析によって検出された。細胞を、シクロヘキシミド（ＣＨＸ）（０．５ｕｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下においてγＴｒｉＤＡＰまたは培地（コントロール）で２４時間刺激した。次いで、細胞を採取し、ウエスタンブロッティングに付した。ＰＡＲＰ、カスパーゼ、ｐ２０、ｐ４１／４３およびｐ３５はそれに対して反応性である抗体で検出した。
【図５Ａ】図５ＡないしＣは、Ｎｏｄ２はＭＣＦ−７細胞においてアポトーシスを誘導しないことを示す。図５Ａにおいて、ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１およびＭＣＦ−７  Ｎｏｄ２を、ＣＨＸの存在下または非存在下で、ＮＯＤ１リガンドγＴｒｉＤＡＰまたはＮｏｄ２リガンドムラミルジペプチド（ＭＤＰ）（各々２０ｕｇ／ｍｌ）で４８時間処理した。次いで、細胞をＰＩと共にインキュベートし、アポトーシス細胞死滅をフローサイトメトリーによって測定した。示すように、γＴｒｉＤＡＰはアポトーシスを刺激するが、Ｎｏｄ２リガンドは刺激しない。
【図５Ｂ】図５ＡないしＣは、Ｎｏｄ２はＭＣＦ−７細胞においてアポトーシスを誘導しないことを示す。図５Ｂにおいて、ＮＯＤ１およびＮＯＤ２の発現は、組み換えタンパク質の検出用の抗Ｍｙｃ抗体を用いてウエスタンブロット分析によって確認された。
【図５Ｃ】図５ＡないしＣは、Ｎｏｄ２はＭＣＦ−７細胞においてアポトーシスを誘導しないことを示す。図５Ｃは、ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ２細胞がインターロイキン−８（ＩＬ−８）分泌によって検出されるようにＭＤＰに対して応答することを示す。ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１およびＭＤＦ−７  Ｎｏｄ２細胞を、ＣＨＸ（０．５ｕｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でγＴｒｉＤＡＰまたはＭＤＰで２４時間刺激した。次いで、細胞上清を採取し、ＩＬ−８分泌についてアッセイした。
【図６Ａ】図６ＡないしＤは、カスパーゼ８およびカスパーゼ９がγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスに必要であることを示す。図６Ａは、γＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスに対する異なるカスパーゼ阻害剤の効果を示す。４８時間のγＴｒｉＤＡＰ／ＣＨＸでの刺激に先立って３０分間、ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１細胞を図６Ａのｘ軸に沿ってリストされたカスパーゼの阻害剤で予備処理した。次いで、細胞をヨウ化プロピジウムと共にインキュベートし、細胞生存率をフローサイトメトリーによって測定した。全ての阻害剤は１００ｕＭの濃度で用いた。
【図６Ｂ】図６ＡないしＤは、カスパーゼ８およびカスパーゼ９がγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスに必要であることを示す。図６Ｂは、Ｎｏｄ１をカスパーゼ９と共発現させた場合に、高分子量のＮＯＤ１の形態が検出されることを示し、これは、ＮＯＤ１がカスパーゼ９と相互作用することを示す。この実験において、２９３細胞を、空のベクター、Ｍｙｃ−ＮＯＤ１、またはＭｙｃ−ＮＯＤ２の存在下で、ＦＬＡＧ−カスパーゼ９をコードするベクターで共トランスフェクトした。細胞抽出物を抗ＦＬＡＧ抗体で免疫沈澱（ＩＰ）させ、ポリクローナル抗Ｍｙｃ抗体を用いる免疫ブロッティング（ＷＢ）によって、共沈殿されたタンパク質が明らかとなった。
【図６Ｃ】図６ＡないしＤは、カスパーゼ８およびカスパーゼ９がγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスに必要であることを示す。図６Ｃは、ＣＬＡＲＰがγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを完全に阻害し、他方、Ｂｃｌ２がγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを部分的にしか阻害しなかったことを示す。ＭＣＦ−７  ＣＬＡＲＰ、ＭＣＦ−７  ＣＬＡＲＰ／Ｎｏｄ１、ＭＣＦ−７  Ｂｃｌ２およびＭＣＦ−７  Ｂｃｌ２／Ｎｏｄ１細胞を、ＣＨＸ（３ｕｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でγＴｒｉＤＡＰで４８時間処理し、または処理しなかった。次いで、細胞をヨウ化プロピジウムと共にインキュベートし、アポトーシス細胞の死滅をフローサイトメトリーによって測定した。
【図６Ｄ】図６ＡないしＤは、カスパーゼ８およびカスパーゼ９がγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスに必要であることを示す。図６Ｄは、ＣＬＡＲＰ、Ｂｃｌ２およびＮＯＤ１がＭＣＦ−７細胞で発現することを示すウエスタンブロットを示し、これは、図６Ｃで観察された結果が、この２つのタンパク質の発現レベルの差よりはむしろＣＬＡＲＰおよびＢｃｌ２の間の機能的差によるものであることを示す。
【図７Ａ】図７ＡないしＣは、野生型ＲＩＰ２およびＲＩＰ２のキナーゼ欠乏（ＫＤ）突然変異体の双方がＮＯＤ１アポトーシス経路において機能的であることを示す。しかしながら、ＣＡＲＤドメインを欠くＲＩＰ２がＮＯＤ１シグナリングの優性の負の阻害剤として作用する。図７Ａは、野生型ＲＩＰ２、ＲＩＰ２  ＫＤおよびＲＩＰ２  ΔＣＡＲＤ細胞の集団においてアポトーシス性である細胞のパーセンテージをグラフにより示す。ＭＣＦ−７細胞は野生型Ｍｙｃ−ＲＩＰ２、Ｍｙｃ−ＲＩＰ２  ＫＤ、およびＭｙｃ−ＲＩＰ２  ΔＣＡＲＤで安定にトランスフェクトされ、未処理のままにするか、あるいはＣＨＸ（３ｕｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下でγＴｒｉＤＡＰで４８時間処理した。細胞をＰＩとともにインキュベートし、アポトーシス細胞死滅をフローサイトメトリーにおいて測定した。
【図７Ｂ】図７ＡないしＣは、野生型ＲＩＰ２およびＲＩＰ２のキナーゼ欠乏（ＫＤ）突然変異体の双方がＮＯＤ１アポトーシス経路において機能的であることを示す。しかしながら、ＣＡＲＤドメインを欠くＲＩＰ２がＮＯＤ１シグナリングの優性の負の阻害剤として作用する。図７Ｂは、ポリクローナル抗Ｍｙｃ抗体での細胞抽出物の免疫沈澱、およびモノクローナル抗Ｍｙｃ  ９Ｅ１０抗体を用いる免疫ブロッティングによって確認されたように、ＲＩＰ２ポリペプチドが発現されたことを示す。
【図７Ｃ】図７ＡないしＣは、野生型ＲＩＰ２およびＲＩＰ２のキナーゼ欠乏（ＫＤ）突然変異体の双方がＮＯＤ１アポトーシス経路において機能的であることを示す。しかしながら、ＣＡＲＤドメインを欠くＲＩＰ２がＮＯＤ１シグナリングの優性の負の阻害剤として作用する。図７Ｃは、ＲＩＰ２野生型、ＭＣＦ−７  ＲＩＰ２  ＫＤ、およびＲＩＰ２  ΔＣＡＲＤ細胞におけるＪＮＫのリン酸化のγＴｒｉＤＡＰ誘導を示す。示されたように、シクロヘキシミドの存在下における、野生型ＲＩＰ２またはＲＩＰ２  ＫＤを発現するＭＣＦ−７細胞の２時間のγＴｒｉＤＡＰへの暴露が、ＪＮＫのリン酸化を誘導した。しかしながら、同様にして処理されたＲＩＰ２ΔＣＡＲＤ細胞においてはそのようなＪＮＫのリン酸化は観察されなかった。
【図８Ａ】図８ＡないしＤは、相乗的関係がＮＯＤ１およびＴＮＦαの間で存在することを示す。図８Ａは、ＮＯＤ１の濃度が０．０から１００μｇ／ｍｌまで増大し、ＴＮＦαの濃度が０．５ｎｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌまで増大するにつれ、アポトーシス細胞のパーセンテージが用量依存的に増加することをグラフで示す。
【図８Ｂ】図８ＡないしＤは、相乗的関係がＮＯＤ１およびＴＮＦαの間で存在することを示す。図８Ｂは、シクロヘキシミドの濃度が０．０から３μｇ／ｍｌまで増加し、およびＴＮＦαの濃度が０．５ｎｇ／ｍｌから１ｎｇ／ｍｌまで増加するにつれ、アポトーシス細胞のパーセンテージが用量依存的に増加することをグラフで示す。
【図８Ｃ】図８ＡないしＤは、相乗的関係がＮＯＤ１およびＴＮＦαの間で存在することを示す。図８Ｃは、γＴｒｉＤＡＰがＴＮＦαの存在下でアポトーシスを増加させるが、不活性なコントロールトリペプチドαＴｒｉＤＡＰがＴＮＦαのより高い用量においてさえ、アポトーシスを現実には阻害できることをグラフで示す。
【図８Ｄ】図８ＡないしＤは、相乗的関係がＮＯＤ１およびＴＮＦαの間で存在することを示す。図８Ｄは、ＭＣＦ−７細胞のＴＮＦαへの暴露の後の種々の時点におけるＮＯＤ１発現を示す。
【図９Ａ】図９ＡないしＣは、もう１つのヒト乳癌細胞株、ＳＫＢＲ３癌細胞株におけるＮＯＤ１発現を示す。図９Ａ（頂部）は、ＴＮＦα濃度の関数としてのアポトーシスＳＫＢＲ３野生型およびＳＫＢＲ３  Ｎｏｄ１細胞のパーセンテージをグラフにより示す。図９Ａ（底部）は、γＴｒｉＤＡＰ濃度の関数としてのアポトーシスＳＫＢＲ３野生型およびＳＫＢＲ３  Ｎｏｄ１細胞のパーセンテージをグラフにより示す。
【図９Ｂ】図９ＡないしＣは、もう１つのヒト乳癌細胞株、ＳＫＢＲ３癌細胞株におけるＮＯＤ１発現を示す。図９Ｂ（頂部）は、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）またはＤｉｏｃ６によって異なる条件下で観察されたアポトーシスＳＫＢＲ３細胞のパーセンテージをグラフにより示す。使用した条件はウエスタンブロット下方に示す。用いた略語は以下の通りである：ＣＨＸ（シクロヘキシミド）、ＴＮＦ（ＴＮＦα）、γＴｒｉ（γＴｒｉＤＡＰ）、αＴｒｉ（αＴｒｉＤＡＰ）。図９Ｂ２は、ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）の、およびカスパーゼ３、７および８のタンパク質分解切断を示すウエスタン分析を供する。ＰＡＲＰおよび種々のカスパーゼの切断は、ウエスタンブロット下方で確認される条件下で刺激後の細胞ＭＣＦ−７細胞のウエスタンブロット分析によって検出された。細胞を採取し、ウエスタンブロッティングに付し、およびＰＡＲＰ、カスパーゼ、ｐ２０、ｐ４１／４３およびｐ３５をそれに対して反応性である抗体で検出した。
【図９Ｃ】図９ＡないしＣは、もう１つのヒト乳癌細胞株、ＳＫＢＲ３癌細胞株におけるＮＯＤ１発現を示す。図９Ｃは、棒グラフ下方に示す条件下で観察された、アポトーシス野生型、ＮＯＤ１発現およびＣＬＡＲＰ発現、ＳＫＢＲ３細胞のパーセンテージをグラフで示す。用いた略語：ＣＨＸ（シクロヘキシミド）、ＴＮＦ（ＴＮＦα）、ｇＴｒｉ（γＴｒｉＤＡＰ）、ｇＴＣ（γＴｒｉＤＡＰ＋ＣＨＸ）、ａＴＣ（αＴｒｉＤＡＰ＋ＣＨＸ）。
【図１０Ａ】図１０Ａ、ＢおよびＣは、各々、野生型ＭＣＦ−７乳癌細胞、ＮＯＤ１ノックアウトＭＣＦ−７細胞およびＮＯＤ１トランスフェクトＭＣＦ−７細胞を接種したマウスのイメージを供する。マウスは、３×１０６ヒト乳癌細胞で皮下接種した。矢印の頭は、図１０Ｂの右側の拡大イメージに示される皮下腫瘍を示した。
【図１０Ｂ】図１０Ａ、ＢおよびＣは、各々、野生型ＭＣＦ−７乳癌細胞、ＮＯＤ１ノックアウトＭＣＦ−７細胞およびＮＯＤ１トランスフェクトＭＣＦ−７細胞を接種したマウスのイメージを供する。マウスは、３×１０６ヒト乳癌細胞で皮下接種した。矢印の頭は、図１０Ｂの右側の拡大イメージに示される皮下腫瘍を示した。
【図１０Ｃ】図１０Ａ、ＢおよびＣは、各々、野生型ＭＣＦ−７乳癌細胞、ＮＯＤ１ノックアウトＭＣＦ−７細胞およびＮＯＤ１トランスフェクトＭＣＦ−７細胞を接種したマウスのイメージを供する。マウスは、３×１０６ヒト乳癌細胞で皮下接種した。矢印の頭は、図１０Ｂの右側の拡大イメージに示される皮下腫瘍を示した。
【図１１Ａ】図１１ＡないしＤは、Ｎｏｄ１の存在がＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍成長を妨げることを示す。図１１Ａは、時間の関数としての、ＭＣＦ−７  Ｃ２０（左側）およびＭＣＦ−７  Ｃ２０／ＭＯＤ１（右側）細胞を注射したマウスにおける腫瘍の容積をグラフで示す。細胞（３×１０６細胞／マウス）を雌ＳＣＩＤマウスの側腹部に注射した。腫瘍のサイズを１週間に１回測定し、容積は式（Ｗ２×Ｌ）／２に従って決定した。各線は１匹のマウスで観察された腫瘍成長を表す（ｎ＝４）。示されたように、腫瘍の容積は、Ｎｏｄ１発現腫瘍細胞（Ｃ２０／Ｎｏｄ１）を受けたマウスにおいて減少した。コントロール的に、腫瘍の容積は、Ｎｏｄ１を発現しなかった腫瘍細胞（Ｃ２０細胞）を受けたマウスにおいて増大した。
【図１１Ｂ】図１１ＡないしＤは、Ｎｏｄ１の存在がＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍成長を妨げることを示す。図１１Ｂは、ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｃ２０およびＭＦＣ−７  Ｃ２０／Ｎｏｄ１細胞の注射（３×１０６細胞／マウス）の注射に先立ってのマウスへのエストロゲンペレットの移植が、腫瘍細胞がＮｏｄ１を発現する場合（Ｃ２０／Ｎｏｄ１細胞）を除いて腫瘍の成長を増加させることをグラフで示す。陰影を施した棒線はエストロゲンペレットを受けたマウスで得られた結果を表し、他方、塗り潰ぶしていない棒線はエストロゲンペレットを受けていないマウスで得られた結果を表す。腫瘍容積は前記したように決定した。
【図１１Ｃ】図１１ＡないしＤは、Ｎｏｄ１の存在がＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍成長を妨げることを示す。図１１Ｃは、ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｃ２０およびＭＦＣＦ−７  ＲＩＰ２ΔＣＡＲＤ細胞を注射したマウスにおける経時的な腫瘍容積をグラフで示す。示されるように、ＭＣＦ−７  ＲＩＰ２ΔＣＡＲＤ細胞（＊）を受けるマウスにおける腫瘍容積は、いくらかＮｏｄ１を発現するマウス（Ｂｌａｓｔｏ，塗り潰ぶした菱形）におけるよりも大きかったが、Ｎｏｄ１を発現しないマウス（Ｃ２０、塗り潰ぶした四角）におけるよりも小さかった。
【図１１Ｄ】図１１ＡないしＤは、Ｎｏｄ１の存在がＳＣＩＤマウスにおいて腫瘍成長を妨げることを示す。図１１Ｄは、エストロゲン濃度の関数としての腫瘍細胞の成長をグラフで示す。示されるように、Ｎｏｄ１を発現しない腫瘍細胞（ＭＣＦ−７  Ｃ２０細胞）および突然変異体ＲＩＰ２を発現する腫瘍細胞（ＭＣＦ−７  ＲＩＰ２ΔＣＡＲＤ細胞）はエストロゲンに対してより感受性であって、増大した細胞成長を呈する。ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｃ２０、ＭＣＦ−７  Ｃ２０／Ｎｏｄ１およびＭＣＦ−７  ＲＩＰ２ΔＣＡＲＤ細胞を増大する濃度の１７β−エストラジオールに暴露し、３Ｈ−チミジンでパルスし、液体シンチレーションによって細胞の成長を測定した。データは、少なくとも３つの独立した実験の代表である。
【図１２Ａ】図１２ＡないしＣは、エストロゲンが、種々のＭＣＦ−７腫瘍細胞株において、γＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを増大させ、タモキシフェンがγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを阻害することを示す。図１２Ａは、増大する量のエストロゲンおよびシクロヘキシミド（ＣＨＸ）またはＣＨＸ＋γＴｒｉＤＡＰ（γＴｒｉ）いずれか中で培養されたＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｃ２０およびＭＣＦ−７  Ｃ２０／Ｎｏｄ１細胞におけるパーセントアポトーシスをグラフで示す。
【図１２Ｂ】図１２ＡないしＣは、エストロゲンが、種々のＭＣＦ−７腫瘍細胞株において、γＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを増大させ、タモキシフェンがγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを阻害することを示す。図１２Ｂは、増大する量のタモキシフェンおよびシクロヘキシミド（ＣＨＸ）またはＣＨＸ＋γＴｒｉＤＡＰ（γＴｒｉ）いずれか中で培養されたＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｃ２０およびＭＣＦ−７  Ｃ２０／Ｎｏｄ１細胞におけるパーセントアポトーシスをグラフで示す。エストロゲンの実験では、ＭＣＦ−７細胞を木炭処理培地中で培養し、増大する濃度のエストロゲン（Ｅ２）の存在下でγＴｒｉＤＡＰ／ＣＨＸで刺激し、細胞生存率をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）排除によって測定した。タモキシフェン実験では、γＴｒｉＤＡＰ／ＣＨＸの添加に先立って細胞をタモキシフェンで処理し、細胞生存率をＰＩ排除によって測定した。
【図１２Ｃ】図１２ＡないしＣは、エストロゲンが、種々のＭＣＦ−７腫瘍細胞株において、γＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを増大させ、タモキシフェンがγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを阻害することを示す。図１２Ｃは、インビトロ培養細胞（左側）およびインビボ腫瘍細胞（右側）からの細胞溶解物の免疫ブロットを示し、これは、エストロゲン受容体の発現が、Ｎｏｄ１を発現する細胞において低下することを示す。ＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｃ２０およびＭＣＦ−７  Ｃ２０／Ｎｏｄ１細胞からの、および腫瘍から単離された細胞からの全タンパク質抽出物を、エストロゲン受容体（ＥＲα）に対する抗体および、付加コントロールとしてのＥＲＫ２を用いる免疫ブロッティングによって分析した。
【図１３Ａ】図１３ＡないしＤは、ＲＩＰ２が、Ｎｏｄ１アポトーシス経路の重要な成分であることを示す。図１３Ａは、腫瘍細胞株におけるキナーゼ欠乏ＲＩＰ２（ＲＩＰ２  ＫＤ）の安定な発現が、それらの細胞を、Ｎｏｄ１またはＮｏｄ２アクチベーターによって誘導されたアポトーシス細胞死滅に対して感受性とすることを示す。ＭＣＦ−７細胞を、Ｍｙｃ−Ｎｏｄ１、Ｍｙｃ−ＲＩＰ２（野生型）、Ｍｙｃ−ＲＩＰ２  ＫＤ、およびＭｙｃ−ＲＩＰ２  ΔＣＡＲＤで安定にトランスフェクトした。次いで、ＣＨＸ（３μｇ／ｍｌ）の存在下また非存在下において、試験細胞をγＴｒｉＤＡＰ、αＴｒｉＤＡＰおよびＭＤＰ（各々２０μ／ｍｌ）で４８時間処理し、他方、コントロール細胞はこれらの因子で処理しなかった。次いで、細胞をヨウ化プロピジウム（ＰＩ）と共にインキュベートし、アポトーシス細胞死滅をフローサイトメトリーによって測定した。
【図１３Ｂ】図１３ＡないしＤは、ＲＩＰ２が、Ｎｏｄ１アポトーシス経路の重要な成分であることを示す。図１３Ｂは、図１３Ａに記載されたのと同一のＭＣＦ−７細胞株におけるアポトーシスに対するＴＮＦの効果を示す。これらの細胞株はＴＮＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）で１８時間処理し、図１３Ａで記載されたようにアポとーシス細胞死滅を評価した。ＴＮＦは試験した全ての細胞株においてアポトーシスを増大させた。
【図１３Ｃ】図１３ＡないしＤは、ＲＩＰ２が、Ｎｏｄ１アポトーシス経路の重要な成分であることを示す。図１３Ｃは、ＭＣＦ−７  ＲＩＰ２  ＫＤ細胞が、ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１細胞よりも増大したγＴｒｉＤＡＰ誘導アポトーシスを呈したことを示す。細胞を、ＣＨＸの存在下で増大する濃度のγＴｒｉＤＡＰまたはＭＤＰの存在下で４８時間インキュベートし、図１３Ａで記載されたようにアポトーシス細胞死滅を評価した。
【図１３Ｄ】図１３ＡないしＤは、ＲＩＰ２が、Ｎｏｄ１アポトーシス経路の重要な成分であることを示す。図１３Ｄは、ＣＨＸ（０．５ｍｇ／ｍｌ）またはＴＮＦの存在下におけるγＴｒｉＤＡＰでの刺激後のＭＣＦ−７  Ｂｌａｓｔｏ、ＭＣＦ−７  Ｎｏｄ１およびＭＣＦ−７  ＲＩＰ２野生型細胞によるＩＬ−８分泌を示す。インキュベーション後に、全ての上清を採取し、ＩＬ−８分泌についてアッセイした。
【図１Ａ】
2008531600.tif 000015
【図１Ｂ】
2008531600.tif 000016
【図１Ｃ】
2008531600.tif 000017
【図２Ａ】
2008531600.tif 000018
【図２Ｂ】
2008531600.tif 000019
【図２Ｃ】
2008531600.tif 000020
【図２Ｄ】
2008531600.tif 000021
【図３】
2008531600.tif 000022
【図４Ａ】
2008531600.tif 000023
【図４Ｂ】
2008531600.tif 000024
【図４Ｃ】
2008531600.tif 000025
【図５Ａ】
2008531600.tif 000026
【図５Ｂ】
2008531600.tif 000027
【図５Ｃ】
2008531600.tif 000028
【図６Ａ】
2008531600.tif 000029
【図６Ｂ】
2008531600.tif 000030
【図６Ｃ】
2008531600.tif 000031
【図６Ｄ】
2008531600.tif 000032
【図７Ａ】
2008531600.tif 000033
【図７Ｂ】
2008531600.tif 000034
【図７Ｃ】
2008531600.tif 000035
【図８Ａ】
2008531600.tif 000036
【図８Ｂ】
2008531600.tif 000037
【図８Ｃ】
2008531600.tif 000038
【図８Ｄ】
2008531600.tif 000039
【図９Ａ】
2008531600.tif 000040
【図９Ｂ】
2008531600.tif 000041
【図９Ｃ】
2008531600.tif 000042
【図１０Ａ】
2008531600.tif 000043
【図１０Ｂ】
2008531600.tif 000044
【図１０Ｃ】
2008531600.tif 000045
【図１１Ａ】
2008531600.tif 000046
【図１１Ｂ】
2008531600.tif 000047
【図１１Ｃ】
2008531600.tif 000048
【図１１Ｄ】
2008531600.tif 000049
【図１２Ａ】
2008531600.tif 000050
【図１２Ｂ】
2008531600.tif 000051
【図１２Ｃ】
2008531600.tif 000052
【図１３Ａ】
2008531600.tif 000053
【図１３Ｂ】
2008531600.tif 000054
【図１３Ｃ】
2008531600.tif 000055
【図１３Ｄ】
2008531600.tif 000056
【配列表】
2008531600000001.app
【国際調査報告】
2008531600.tif 000057
2008531600.tif 000058
2008531600.tif 000059