(57)【要約】  本発明は、組換えミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびこの断片の精製に有用な組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ＭＡＧおよびＭＡＧ断片のためのワンステップの精製方法を提供する。安定した組換えＭＡＧタンパク質を確実に生成し保存する方法に加えて、ヒト組換えＭＡＧタンパク質の新規な形態も開示される。
2008506390.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換え細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）構築物を精製する方法であって、
アフィニティー標識されたＭＡＧ構築物をコードする核酸配列を有し、少なくとも１つのＩｇドメインを含むアフィニティー標識ＭＡＧ構築物の発現能を有する、ベクターで細胞をトランスフェクトする工程と、
細胞が、アフィニティー標識ＭＡＧ構築物を発現するように、培地で前記トランスフェクト細胞を培養する工程と、
ＭＡＧ構築物を含有する馴化培地を、二価金属イオンを添加した、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
精製されたアフィニティー標識ＭＡＧ構築物を溶出する工程と
を含む方法。
【請求項２】
細胞をトランスフェクトする前記工程が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞をトランスフェクトすることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
細胞を安定にトランスフェクトすることをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ニッケル、コバルト、銅、カドミウム、カルシウム、鉄、亜鉛、およびストロンチウムからなる群から選択される少なくとも１つの二価金属イオンを有する樹脂を選択することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
二価金属イオンがニッケルである、請求項４記載の方法。
【請求項６】
二価金属イオンがコバルトである、請求項４記載の方法。
【請求項７】
ニッケル−ニトリロ三酢酸樹脂およびＴＡＬＯＮ（商標）樹脂からなる群より樹脂を選択することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項８】
ポリヒスチジンテイルでアフィニティー標識されたＭＡＧを発現することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫを有するＦＬＡＧタグでアフィニティー標識されたＭＡＧを発現することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
トランスフェクト細胞を培養する工程が、少なくとも２つのＩｇドメインを含むアフィニティー標識ＭＡＧを発現することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
トランスフェクト細胞を培養する工程が、少なくとも３つのＩｇドメインを含むアフィニティー標識ＭＡＧを発現することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
トランスフェクト細胞を培養する工程が、少なくとも４つのＩｇドメインを含むアフィニティー標識ＭＡＧを発現することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
トランスフェクト細胞を培養する工程が、グリコシル化ＭＡＧを発現することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
トランスフェクト細胞を培養する工程が、ＦＢＳを含む培地で細胞を集密になるまで培養し、次いで無血清培地に変更することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
トランスフェクト細胞を培養する工程が、メトトレキサートを含む培地で細胞を培養することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
精製されたアフィニティー標識ＭＡＧを溶出する工程が、変化するｐＨ、キレート剤および競合リガンドの少なくとも１つをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
前記キレート剤が、約７を超えるｐＨを有する溶出液中のエチレンジアミン四酢酸である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記競合リガンドがイミダゾールである、請求項１６記載の方法。
【請求項１９】
Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＣｌ、および約７．０を超えるｐＨを含む緩衝液中で、精製されたアフィニティー標識ＭＡＧを保存することをさらに含む、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
イミダゾールを含む緩衝液中で精製されたアフィニティー標識ＭＡＧを保存することをさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
界面活性剤を含む緩衝液中で精製されたアフィニティー標識ＭＡＧを保存することをさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
約０．１％のＴｗｅｅｎ２０を含む緩衝液中で精製されたアフィニティー標識ＭＡＧを保存することをさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２３】
精製されたグリコシル化ヒト組換え細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）構築物であって、
細胞が、アフィニティー標識ＭＡＧ構築物を発現するようにトランスフェクト細胞を培養する工程と、
ＭＡＧ構築物含有馴化培地を、二価金属イオンを添加した、金属イオンアフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、
精製されたアフィニティー標識ＭＡＧ構築物を溶出し、ここで溶出され、精製されたアフィニティー標識ＭＡＧ構築物が９０％超純粋である、工程と
を含む処理により調製された構築物。
【請求項２４】
トランスフェクト細胞が、トランスフェクトされたチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項２３記載の、精製されたグリコシル化ヒト組換え細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）構築物。
【請求項２５】
精製されたアフィニティー標識ＭＡＧ構築物を溶出する工程が、９５％超純粋である、精製されたアフィニティー標識ＭＡＧ構築物を溶出することをさらに含む、請求項２３記載の、精製されたグリコシル化ヒト組換え細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）構築物。
【請求項２６】
ＭＡＧ構築物が、配列番号２に示されたアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含む、請求項２３記載の、精製されたグリコシル化ヒト組換え細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）構築物。
【請求項２７】
ＭＡＧ構築物が、配列番号３に示されたアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を含む、請求項２３記載の、精製されたグリコシル化ヒト組換え細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）構築物。
【請求項２８】
ＭＡＧ構築物が、少なくとも２つのＮ−結合グリコシル化部位を含む、請求項２３記載の、精製されたグリコシル化ヒト組換え細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）構築物。
【請求項２９】
ＭＡＧ構築物が、少なくとも５重量％の炭水化物を含む、請求項２３記載の、精製されたグリコシル化ヒト組換え細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）構築物。
【請求項３０】
ＭＡＧ含有培地を、二価金属イオンを添加した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂と接触させることと、
ＩＭＡＣ樹脂を少なくとも１種のＩＭＡＣ洗浄液で洗浄することと、
ＩＭＡＣ樹脂を溶出液で溶出して精製ＭＡＧ溶液を得ることと
を含む、細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）を生成する方法。
【請求項３１】
ニッケル、コバルト、銅、鉄、カルシウムおよび亜鉛からなる群から二価金属イオンを選択することをさらに含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記二価金属イオンがニッケルである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記二価金属イオンがコバルトである、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
トランスフェクト細胞が、少なくとも１つのＩｇドメインを含むＭＡＧ構築物を発現するように、約１０％ＦＢＳおよび約１００ｎＭメトトレキサートを含む培地で前記細胞を集密になるまで培養する工程をさらに含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３５】
精製されたＭＡＧ溶液が、アフィニティー標識ＭＡＧを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３６】
精製されたＭＡＧ溶液が、ポリヒスチジンテイルを有するＭＡＧを含む、請求項３０記載の方法。
【請求項３７】
精製されたＭＡＧ溶液が、ＦＬＡＧタグを有するＭＡＧを含む、請求項３０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩｇＧ−遺伝子のスーパーファミリーに属する膜結合性細胞接着分子に関する。特に、本発明は、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびＭＡＧタンパク質の回収および精製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
中枢神経系（ＣＮＳ）神経線維への病理学的または外傷的損傷は、成体哺乳類では機能の永久的喪失をきたす結果となる。神経再生のこうした欠如は、一部にはミエリンに見られる阻止因子に起因している。ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）は、神経突起伸張を阻害する多量のミエリンタンパク質であり、ヒトＣＮＳ損傷後の回復を促進する治療法を開発するうえで、再生に果たすその役割が有力な標的となっている。
【０００３】
ＭＡＧは、５つの細胞外Ｉｇ様ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および１つの細胞質ドメインを伴う１００ｋＤａの糖タンパク質である。細胞質ドメインは、選択的ｍＲＮＡスプライシングのため細胞質ドメインでのみ異なる、発生学的に調節された２つの形態で発生する。成体ＣＮＳにおける軸策再生は、ＭＡＧおよびＮＯＧＯを含む、ミエリン中のタンパク質により阻害されることが示されている。ＮＯＧＯ受容体（ＮｇＲ）が、軸策のＧＰＩアンカー型タンパク質として同定されているのに対し、ＭＡＧ受容体は依然として解明されていない。
【０００４】
最近、ＭＡＧは、高親和性で、ＮｇＲに直接結合し、ＮｇＲとの相互作用を介して軸策再生を阻害することが示された（Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ，Ｍ．ら、ミエリン関連糖タンパク質は、Ｎｏｇｏ６６受容体と相互作用し神経突起伸張を阻害する。Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：２８３〜２９０頁、２００２年；Ｌｉｕ，Ｂ．Ｐ．ら、Ｎｏｇｏ−６６受容体の機能的リガンドとしてのミエリン関連糖タンパク質。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１９０〜１１９３頁、２００２年）。ＮｇＲがＭＡＧと相互作用することをブロックする実験は、ＭＡＧによる神経突起伸張の阻害を防止した（Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ，Ｍ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：２８３〜２９０頁、２００２年）。この相互作用は、ＭＡＧおよびＮｏｇｏ−６６が、ＮｇＲを独立に活性化し、ＣＮＳ損傷後の軸策再生を制限する可能性のある余分なＮｇＲリガンドとして働くことを示唆している。
【０００５】
しかし、現在使用されている精製法は、ヒト治療生成物または確実な研究ツールのいずれかに所望される純度レベルおよび一貫性を備えたＭＡＧタンパク質の精製については十分ではない。組換えＭＡＧを生成する多くの方法は、融合タンパク質の使用を伴う。ＭＡＧ−ＧＳＴ融合タンパク質などのＭＡＧ融合タンパク質は、きわめて弱くしか発現されず、きわめて不安定である（Ｋｕｒｓｕｌａ  Ｐ．（２０００年、Ｐｈ．Ｄ．テーマ）。ミエリン関連糖タンパク質の細胞質ドメイン。Ａｃｔａ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｏｕｌｕｅｎｓｉｓ：  Ｄ  Ｍｅｄｉｃａ  ５９４．Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｕｌｕ、Ｆｉｎｌａｎｄ）。さまざまな神経芽腫細胞、単離ニューロンおよび脳または脊髄全体由来の、ヒト免疫グロブリンのＦｃ断片に融合されたＭＡＧの組換え細胞外ドメインであるＭＡＧ−Ｆｃを精製する方法も、当技術分野で知られている（例えば、Ｋｅｌｍら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｂｉｏｌ．、４、９６５〜７２頁（１９９４年）参照）。しかし、Ｆｃ融合は、アッセイを実施または抗ＭＡＧ抗体を生成する前に、酵素的に開裂されなければならず、その結果、不純で、不安定な開裂ＭＡＧタンパク質が生じることになる。したがって、科学者は、従来のクロマトグラフィー法の組合せを用いて、所望の開裂ＭＡＧを精製しなければならない。往々にして、高分解能アフィニティークロマトグラフィー工程でさえ、相互作用の共通部位のため、他の要素に対する所望のＦｃ−開裂ＭＡＧの十分な分解能が得られない場合がある。
【０００６】
したがって、当技術分野では、Ｆｃ融合を使用しないＭＡＧの十分な精製法が必要である。また、神経再生のための改善された組成物および方法も必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、組換えミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）およびこの断片の精製に有用な組成物および方法を提供する。特に、本発明は、ＭＡＧおよびＭＡＧ断片のワンステップの精製方法を提供する。安定な組換えＭＡＧタンパク質を確実に生成し保存する方法に加えて、ヒト組換えＭＡＧタンパク質の新規な形態も開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、一部には、シングルステップの精製方法は、高純度ＭＡＧまたはこの断片を確実に提供することができるという発見に基づいている。実施例で示されている通り、ＭＡＧおよびこの断片は、サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で確認されたように９６％超純度まで精製されることができる。精製されたタンパク質の機能性は、神経突起伸張アッセイの阻害度により確認された。神経突起伸張アッセイは、本発明の方法により精製されたＭＡＧが、市販のＭＡＧ−Ｆｃタンパク質と同等レベルで神経突起成長を阻害することを示した。
【０００９】
１つの態様では、本発明は、アフィニティー標識ＭＡＧ構築物をコードする核酸配列を有するベクターで、少なくとも１つのＩｇドメインを含むアフィニティー標識ＭＡＧ構築物を発現可能なベクターで細胞をトランスフェクトする工程と、細胞がアフィニティー標識ＭＡＧ構築物を発現するように培地でトランスフェクト細胞を培養する工程と、ＭＡＧ構築物含有培地を、二価金属イオンを添加した金属イオンアフィニティークロマトグラフィー樹脂と接触させる工程と、精製されたアフィニティークロマトグラフィーＭＡＧ構築物を溶出する工程とを含む、組換え細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）構築物の精製方法を開示する。金属親和性樹脂に使用される二価金属イオンは、ニッケル、コバルト、銅、カドミウム、カルシウム、鉄、亜鉛、またはストロンチウムであることができる。特定の実施形態では、二価金属イオンはニッケルまたはコバルトであることができる。好ましくは、樹脂は、ニッケル−ニトリロ三酢酸（Ｎｉ−ＮＴＡ）樹脂またはＴＡＬＯＮ（商標）であることができる。細胞は、ＦＢＳを含む培地で集密になるまで培養され、次いで無血清培地に変えられる。メトトレキサートは、培養培地に使用される。
【００１０】
別の態様では、本発明は、アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＫを伴うポリヒスチジンテイルおよび／またはＦＬＡＧタグでアフィニティー標識されたＭＡＧの発現を開示する。方法は、さらに、少なくとも２つのＩｇドメイン、少なくとも３つのＩｇドメイン、少なくとも４つのＩｇドメイン、少なくとも５つのＩｇドメインを含むアフィニティー標識ＭＡＧの発現を開示する。トランスフェクト細胞を培養することは、グリコシル化が、ヒト内因性ＭＡＧのそれと実質的に同一な、グリコシル化ＭＡＧの発現をもたらす。特定の実施形態では、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、ＭＡＧまたはＭＡＧ断片をコードしたベクターにより安定にトランスフェクトすることができる。
【００１１】
別の態様では、本発明は、ｐＨの変更、またはキレート剤（例えば、ＥＤＴＡおよびＥＧＴＡなど）および／または競合リガンド（例えば、イミダゾール、ヒスチジン、グリシン、および塩化アンモニウムなど）の添加による、精製されたアフィニティー標識ＭＡＧの溶出を開示する。キレート剤は、約７を超えるｐＨを有する溶出液中のエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）であることができる。競合リガンドは、イミダゾールであることができる。
【００１２】
別の態様では、方法は、精製ＭＡＧの安定性を保持する保存条件を提供する。精製アフィニティー標識ＭＡＧは、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮａＣｌ、および約７．０を超えるｐＨを含む緩衝液、イミダゾールを含む緩衝液、または界面活性剤を含む緩衝液中で、精製されたアフィニティー標識ＭＡＧを保存することができる。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、非イオン性界面活性剤であることができる。本発明に有用な非イオン性海面活性剤の例としては、オクトキシノール−９（ＴＲＩＴＯＮ  Ｘ−１００、Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ）、ポリソルベート８０（ＴＷＥＥＮ８０、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．、Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ  Ｄｅｌ．）、ポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ２０、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．）およびラウレス−４（ＢＲＩＪ３０、ＩＣＩ  Ａｍｅｒｉｃａｓ，Ｉｎｃ．）があるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ２０である。
【００１３】
本発明の別の態様は、本明細書に開示された方法により調製された、精製されたグリコシル化ヒト組換え細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）構築物を開示する。ここで、溶出され精製されたアフィニティー標識ＭＡＧ構築物は、約９０％超純粋であり、好ましくは、約９５％超純粋である。ＭＡＧ構築物は、配列番号１に示されたアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を有することができる。ＭＡＧ構築物は、配列番号２に示されたアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を有することができる。ＭＡＧ構築物は、配列番号３に示されたアミノ酸配列と実質的に相同なアミノ酸配列を有することができる。
【００１４】
さらに別の態様では、本発明は、ＭＡＧ含有培地に、二価金属イオンを添加した固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）樹脂を接触させること、ＩＭＡＣ樹脂を少なくとも１種のＩＭＡＣ洗浄液で洗浄すること、ＩＭＡＣ樹脂を溶出液で溶出して精製ＭＡＧ溶液を得ることを含む、細胞外ドメインミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）の生成方法を開示する。方法には、さらに、ニッケル、コバルト、銅、鉄、カルシウムおよび亜鉛からなる群から二価金属イオンを選択することが含まれる。特定の実施形態では、二価金属イオンは、ニッケルまたはコバルトである。方法は、さらに、トランスフェクト細胞が、少なくとも１つのＩｇドメインを含むＭＡＧ構築物を発現するように、約１０％ＦＢＳおよび約１００ｎＭメトトレキサートを含む培地でトランスフェクト細胞を集密になるまで培養することを含む。
【００１５】
本発明の別の態様では、タンパク質不安定化および沈降を防止するＭＡＧの保存方法が開示される。例えば、配列番号３を含み、３つのＩｇドメインを有するＭＡＧ（１−３）であるＭＡＧ断片は、高塩条件（５００ｍＭ）および低塩条件（１５０ｍＭ）のいずれでも、リン酸ナトリウム緩衝液（Ｎａ２ＨＰＯ４）、ｐＨ７．２中で、室温および４℃のいずれにおいても１２週間安定である。金属親和性樹脂または塩分濃度はいずれも、ＭＡＧ（１−３）の純度または安定性に何ら影響を与えない。しかし、イミダゾール含有緩衝液は、界面活性剤の有無にかかわらず、リン酸ナトリウム緩衝液に比べてＭＡＧ（１−５）の安定性保持においてわずかに優れている。温度も、ＭＡＧ（１−５）（配列番号２）の安定性に影響を与える。室温では、精製ＭＡＧ（１−５）の凝集は、１２週間で３から１０％増加した。
【００１６】
本発明の組換えＭＡＧタンパク質およびこの断片は、ＭＡＧ特異的抗体の生成において、免疫原または選択標的として使用することができる。さらに、組換えＭＡＧタンパク質およびこの断片は、ＮＯＧＯ受容体とそのリガンドの相互作用を試験するアッセイのほか、脊髄損傷、および脳虚血性損傷の治療のため、相互作用をブロックする治療薬の開発に使用することができる。
【００１７】
本発明の別の態様は、精製ＭＡＧまたはこの断片に特異的に結合する分子を提供する。この結合分子は、抗体、抗体断片、または他の分子であってよい。本発明はまた、ＭＡＧまたはこの断片を特異的に認識する結合分子の生成方法も提供する。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明、図、および特許請求の範囲から、当業者には明らかとなろう。
【００１９】
（図面の簡単な記載）
図１は、本発明のさまざまなＭＡＧ断片の略図である。
【００２０】
図２Ａは、ＴＡＬＯＮ（商標）アフィニティーカラムを用いて精製されたＭＡＧ（１−５）の精製クロマトグラフィーである。
【００２１】
図２Ｂは、ニッケルアフィニティーカラムを用いて精製されたＭＡＧ（１−５）の精製クロマトグラフィーである。
【００２２】
図３は、ＴＡＬＯＮ（商標）またはＮｉ−ＮＴＡカラム精製後の精製ＭＡＧ（１−５）およびＭＡＧ（１−３）を示すＳＤＳ  ＰＡＧＥである。
【００２３】
図４は、本発明の方法を用いて精製されたＭＡＧ（１−５）で処置された、ラットの小脳顆粒ニューロンの神経突起伸張阻害を示す棒グラフである。
【００２４】
図５Ａは、３サイクルの冷凍／解凍実施後のＭＡＧ（１−３）の安定性を示すＵＶ吸収の棒グラフである。
【００２５】
図５Ｂは、３サイクルの冷凍／解凍実施後、タンパク質不安定化または凝集が生じないことを示す、ＭＡＧ（１−３）のサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の精製クロマトグラムである。
【００２６】
図６Ａは、３サイクルの冷凍／解凍実施後のＭＡＧ１−５の安定性を示すＵＶ吸収の棒グラフである。
【００２７】
図６Ｂは、３サイクルの冷凍／解凍実施後、タンパク質不安定化または凝集が生じないことを示す、ＭＡＧ１−５のサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製クロマトグラムである。
【００２８】
図７は、室温（ＲＴ）または４℃で保管した後のさまざまな時点における、ＳＥＣによるＭＡＧ１−３のパーセント純度のグラフである。
【００２９】
図８Ａは、室温（ＲＴ）または４℃で保管した後のさまざまな時点における、ＳＥＣによるＭＡＧ１−５のパーセント純度のグラフである。
【００３０】
図８Ｂは、室温（ＲＴ）で１２週間保管した後に凝集が増加したことを示す、ＭＡＧ１−５のサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製クロマトグラムである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３１】
本発明の実施は、特に指摘がない限り、当技術分野内の分析生化学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を使用する。このような技術は、文献において十分に説明されている。
【００３２】
本明細書で使用されている用語は、特定の実施形態を説明するためのものであり、限定するものではない。特に規定のない限り、化学的および技術的用語はすべて、これらが関連する技術分野で一般に使用されているのと同じ意味を有すると理解されるべきである。本発明の目的のため、次の用語を以下に定義する。
【００３３】
本明細書では、「ＭＡＧ」という用語は、５つの細胞外Ｉｇ様ドメインを含有する免疫グロブリン（ＩＧ）スーパーファミリーの１メンバーを指す。これは、以下に述べるような、保存アミノ酸置換基もしくは非アミノ酸置換基、または機能的切断片もしくはこれらの追加断片を伴う、配列番号１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２０９１６）を含むタンパク質、または配列番号１を含むペプチドと実質的に相同および機能的に同等である。哺乳類のＭＡＧ配列の非限定的な例としては、ヒトイソ型（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＨ５３３４７）、ラット（ドブネズミ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０５８８８６、ＢＮＲＴ３およびＢＮＲＴ３Ｓ）、およびマウス（ハツカネズミ）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０３４８８８、ＡＡＡ３９４８７）があるが、これに限定されるものではない。ＭＡＧは、本発明で実証されたように、機能的および非機能的ＭＡＧを結果として生じる保存アミノ酸置換基を伴うＭＡＧを網羅することを意図されている。ＭＡＧは、５つの細胞外Ｉｇ様ドメイン、単一の膜貫通ドメイン、および１つの細胞質ドメインを伴う１００ｋＤａの糖タンパク質である。細胞質ドメインは、選択的ｍＲＮＡスプライシングのため細胞質ドメインでのみ異なる、発生学的に調節された２つの形態で発生する。ＭＡＧの細胞外ドメインは、８つのＮ結合グリコシル化部位を有し、約３０重量％の炭水化物を含有している。オリゴ糖はきわめて不均一である。さらに、ＭＡＧは、シアル酸結合タンパク質であり、この最初の４つのＩｇ様ドメインは、他のシアル酸結合である、Ｉｇ様レクチン（シグレック）のそれと相同である。本明細書で使用されている「ＭＡＧ」という用語は、ＭＡＧの活性化したグリコシル化および非グリコシル化形態、分子の活性および非活性切断片型形態または断片、および配列番号１を含む活性化したより大きなペプチドを包含する。用語ＭＡＧは、翻訳後修飾された配列番号１を含むペプチドを含むことを意図されている。翻訳後修飾されたＭＡＧには、リン酸化、グリコシル化、アシル化、タンパク質分解がある。いくつかの実施形態では、本発明により包含されるグリコシル化ＭＡＧは、少なくとも２つのＮ結合グリコシル化部位におけるグリコシル化を含み、または特定の実施形態では、少なくとも３つのＮ結合グリコシル化部位におけるグリコシル化を含有し、または他の実施形態では、少なくとも４つのＮ結合グリコシル化部位におけるグリコシル化を含有し、または他の実施形態では、少なくとも５つのＮ結合グリコシル化部位におけるグリコシル化を含有し、または他の実施形態では、少なくとも６つのＮ結合グリコシル化部位におけるグリコシル化を含有し、または他の実施形態では、少なくとも７つのＮ結合グリコシル化部位におけるグリコシル化を含有し、または他の実施形態では、少なくとも８つのＮ結合グリコシル化部位におけるグリコシル化を含有する。いくつかの実施形態では、本発明により包含されるグリコシル化ＭＡＧは、少なくとも約３重量％の炭水化物を含み、または他の実施形態では、少なくとも約６重量％の炭水化物を含み、または他の実施形態では、少なくとも約９重量％の炭水化物を含有し、または他の実施形態では、少なくとも約１５重量％の炭水化物を含有し、または他の実施形態では、少なくとも約２０重量％の炭水化物を含有し、または他の実施形態では、少なくとも約２５重量％の炭水化物を含有し、または他の実施形態では、少なくとも約２９重量％の炭水化物を含有する。
【００３４】
本発明では、「断片（ｆｒａｇｍｅｎｔｓ）」または「切断片（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎｓ）」という用語は、構造的および機能的にもう１つの物質と関係している１つの化学物質と同じ意味で使用されている。断片または切断片は、親物質由来の修飾された構造、この例では、ＭＡＧの少なくとも１つのＩｇドメインおよび／または細胞モデルおよび動物モデルにおける、ＭＡＧの生物学的機能もしくは活性を含有する。ＭＡＧ欠損マウスにおけるＭＡＧの細胞内部位、生化学的特性および表現型特性に基づく、ＭＡＧが担っている可能性のある機能としては、髄鞘形成の開始および進行、他の細胞のシアル酸エピトープに対する結合およびインテグリン結合を介するような細胞接着事象、膜運動、エンドサイトーシス、グリア細胞内のシグナル伝達ならびにグリア細胞ならびにニューロン間のシグナル伝達、および神経突起伸張ならびに軸策再生の阻害が挙げられる。神経突起伸張の阻害アッセイおよび結合アッセイなど、ＭＡＧに関するインビトロでの生物学的アッセイの非限定的な例は、実施例４に説明されている。ＭＡＧ断片は、約６２６アミノ酸長未満であってよく、配列番号１と実質的に相同である。別の実施形態では、ＭＡＧ断片は、約５１７アミノ酸長未満、約３２６アミノ酸長未満、約２４１アミノ酸長未満、または約１３９アミノ酸長未満であることができる。いくつかの実施形態では、ＭＡＧ断片は、Ｃ−末端またはＮ−末端のポリヒスチジンテイルまたはＬＡＧタグ（例えば、アミノ酸配列ＤＹＫＤＤＤＤＫなど）を含む、しかしこれらに限定されない、アフィニティータグを含む。
【００３５】
本明細書では、２つのポリペプチドは、これらのアミノ酸配列間で少なくとも７０％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、もしくは少なくとも９９％の相同性である場合、またはこれらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが、互いに安定した二本鎖を形成することが可能である場合、「実質的に相同」である。同様に、２つのポリヌクレオチドは、これらのアミノ酸配列間で少なくとも７０％の相同性、少なくとも８０％の相同性、少なくとも９０％の相同性、少なくとも９５％の相同性、もしくは少なくとも９９％の相同性である場合、またはこれらのポリヌクレオチドが、互いに安定した二本鎖を形成することが可能である場合、「実質的に相同」である。一般に、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸が、それぞれ正確に一致していることを指す。パーセント同一性は、２つの分子の配列を並べ、２つの並んだ配列間の正確なマッチ数をカウントし、短いほうの配列の長さで除し、この結果に１００を乗じて、２つの分子間の配列情報を直接比較して決定することができる。容易に入手可能なコンピュータープログラム、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖａｎｃｅｓの局所ホモロジーアルゴリズム（Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２〜４８９頁、１９８１年）をペプチド分析に応用した、Ｄａｙｈｏｆｆ，Ｍ．Ｏ．のＡＬＩＧＮ（Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ、Ｍ．Ｏ．Ｄａｙｈｏｆｆ編、５  Ｓｕｐｐｌ．３：３５３〜３５８頁、Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）などは、類似性および同一性分析を支援するために使用することができる。ヌクレオチド配列の類似性および同一性を決定するためのプログラムは、例えば、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＧＡＰプログラム（これらもＳｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを利用している）など、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ、バージョン８（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．より入手可能）で利用可能である。これらのプログラムは、メーカーにより推奨された、および上述のＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅに記載されたデフォルトパラメーターにより、容易に利用される。例えば、特定のヌクレオチド配列の参照配列に対するパーセント類似性は、デフォルトスコアリングテーブルおよび６つのヌクレオチド位置のギャップペナルティーにより、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎホモロジーアルゴリズムを用いて決定することができる。あるいは、相同性は、相同領域間で安定した二本鎖を形成する条件下でポリヌクレオチドをハイブリダイゼーションした後、一本鎖特異的ヌクレアーゼにより分解し、分解された断片をサイズ判定することで決定することができる。実質的に相同なＤＮＡ配列は、サザンハイブリダイゼーション実験において、例えば、この特定のシステム用に規定されたストリンジェントな条件下で同定することができる。適切なハイブリダイゼーション条件の定義は、当業者に公知である。
【００３６】
本明細書では、「金属親和性樹脂」という用語は、キレートセファロース、フラクトゲル−ＥＭＤ−キレート、ＰＯＲＯＳ  ２０  ＭＣ、およびマトレックスセルファインキレート（Ｍａｔｒｅｘ  Ｃｅｌｌｆｉｎｅ  Ｃｈｅｌａｔｅ）などの多価陽イオンを結合および調整可能な固定化官能基（例えば、イミノジ酢酸など）を含有する樹脂を含むが、これに限定されるものではない。結合金属イオンは、銅、ニッケル、カドミウム、カルシウム、コバルト、亜鉛、またはストロンチウムなど、いくつかの選択候補から選択することができるが、これに限定されるものではない。
【００３７】
（Ｉ．ＭＡＧおよびこの切断片）
神経再生は、中枢神経系（ＣＮＳ）の軸策損傷に由来したヒト疾患のための新規治療開発における重要な工程である。ミエリン関連等タンパク質（ＭＡＧ）は、軸策再生の阻止因子であり、軸策およびミエリン間の安定した相互作用の維持に重要な役割を果たす膜貫通細胞接着分子である。ＭＡＧは、いくつかの神経変性疾患においても役割を果たしている。例えば、多発性硬化症のプラーク形成におけるＭＡＧの早期消失は、この疾患の病因に果たす役割を示唆している。ＭＡＧは、末梢神経系（ＰＮＳ）および中枢神経系（ＣＮＳ）のいずれにおいても、グリア−軸策相互作用で機能し、ミエリン化グリア細胞により発現する（Ｑｕａｒｌｅｓ  ＲＨら、（１９７２年）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ４７：４９１〜４９７頁）。ＭＡＧは、免疫グロブリンスーパーファミリーのシアル酸結合サブグループの１メンバーであり、神経細胞接着分子（Ｎ−ＣＡＭ）と顕著な相同性を共有している。
【００３８】
本発明の１つの態様では、ＤＮＡ配列が提供されるが、これには、任意の哺乳類宿主による発現を好むコドンの挿入、制限エンドヌクレアーゼ酵素による開裂部位の提供、および容易に発現するベクターの構築を促す、付加的な開始、末端または中間配列の提供が含まれる。本発明はまた、１個または複数個のアミノ酸残基の同一性または位置の点で、自然発生型とは異なるポリペプチド類似体またはＭＡＧ誘導体（すなわち、ＭＡＧ特異的残基の全部より少ない残基を含有する欠失類似体；１個または複数個の特異的残基が、他の残基に置換されている置換類似体；および１個または複数個のアミノ酸残基が、ポリペプチドの末端または中間部分に付加されている付加類似体）、および自然発生型のポリペプチドの一部または全部を共有するポリペプチド類似体またはＭＡＧ誘導体をコードするＤＮＡ配列も提供される。
【００３９】
本発明の新規ＤＮＡ配列は、原核生物または真核生物の宿主細胞において、一次構造コンフォメーションの少なくとも一部、および自然発生型ＭＡＧの生物学的特性の１つまたは複数を有するポリペプチド産物を確実に発現させるのに有用な配列を含む。本発明の非限定的なＤＮＡ配列は、具体的には、（ａ）配列番号４〜６に記載のＤＮＡ配列またはこれらの相補鎖、（ｂ）配列番号４〜６のＤＮＡ配列に対し、またはこれらの断片に対しハイブリダイズするＤＮＡ配列、および（ｃ）遺伝コードの縮重を別にすれば、配列番号４〜６のＤＮＡ配列に対しハイブリダイズすると考えられるＤＮＡ配列を含む。具体的には、（ｂ）および（ｃ）の一部には、ＭＡＧの対立遺伝子多型をコードする、ならびに／または他の哺乳類種由来のＭＡＧをコードするゲノムＤＮＡ配列、およびＭＡＧ、ＭＡＧ断片、ならびにＭＡＧ類似体をコードする作製されたＤＮＡ配列が包まれる。該ＤＮＡ配列は、微生物宿主におけるメッセンジャーＲＮＡの転写および翻訳を促進するコドンを組み込むことができる。このような作製された配列は、Ａｌｔｏｎら、ＰＣＴ出願公開ＷＯ８３／０４０５３の方法により容易に構築することができる。
【００４０】
本発明の別の態様によれば、ＭＡＧ活性を有するポリペプチドをコードする、本明細書に記載されたＤＮＡ配列は、これらが提供する、これまで入手できなかった哺乳類タンパク質のアミノ酸配列に関する情報にとって有益である。該ＤＮＡ配列は、さまざまな組換え技術によるＭＡＧの大規模合成を実現するのに有用な産物としても有益である。本発明により提供されるＤＮＡ配列は、新規の有用なウイルスプラスミドおよび環状プラスミドＤＮＡベクター、新規の有用な、形質転換ならびにトランスフェクトされた原核生物および真核生物の宿主細胞（細菌ならびに酵母細胞および培養液中で増殖した哺乳類細胞など）、およびＭＡＧならびにこの関連産物を発現可能なこうした宿主細胞の培養増殖に新規の有用な方法を作成するのに有用である。
【００４１】
本発明は、１次、２次ならびに３次コンフォメーション、およびグリコシル化パターンが、自然発生物質と実質的に同一となるように精製され、単離された自然発生型ＭＡＧを提供するほか、自然発生型ＭＡＧのそれと実質的に類似した神経突起伸張阻害活性を保有させるため、自然発生型ＭＡＧのそれと実質的に重複する１次構造コンフォメーション（すなわち、アミノ酸残基の連続配列）およびグリコシル化を有する、非自然発生型ＭＡＧを提供する（実施例４参照）。
【００４２】
ある特定の実施形態では、組換えＭＡＧは、ゲノムならびにｃＤＮＡクローニングまたは遺伝子合成により得られた外因性ＤＮＡ配列の、（例えば、培養液中の細菌、酵母、高等植物、昆虫および哺乳類の細胞による）原核生物または真核生物宿主発現の産物として作製される。典型的な酵母（例えば、サッカロマイセスセレヴィシエなど）または原核生物（例えば、大腸菌など）の宿主細胞における発現産物は、いずれの哺乳類タンパク質とも無関係である。脊椎動物［例えば、ヒト以外の哺乳類（例えば、ＣＯＳまたはＣＨＯ）および鳥類］細胞における発現産物は、いずれのヒトタンパク質とも無関係である。使用される宿主に応じて、本発明のポリペプチドは、哺乳類もしくは他の真核生物の炭水化物によりグリコシル化することができ、または非グリコシル化することができる。宿主細胞は、本明細書に参照により組み込まれている、Ｌｅｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４、１３８４８頁（１９８９年）に記載されたもののような技術を用いて改変することができる。本発明のポリペプチドは、最初のメチオニンアミノ酸残基（位置−１）も含むことができる。
【００４３】
ＭＡＧの自然発生型対立形質に加えて、本発明は、ＭＡＧポリペプチド類似体などの他のＭＡＧ断片も包含する。このような類似体は、ＭＡＧ断片を含む。当業者は、１個もしくは複数個の残基（例えば、置換残基、末端ならびに中間付加残基および欠失残基など）の同一性または位置の点で、本明細書に規定されたそれとは異なる１次コンフォメーションを有するポリペプチドを発現するためにコードされた遺伝子を、容易に設計および作製することができる（例えば、Ａｌｔｏｎら（ＷＯ８３／０４０５３）の手順参照）。あるいは、ｃＤＮＡおよびゲノム遺伝子の修飾は、既知の部位特異的変異誘発法により容易に実現でき、ＭＡＧの類似体および誘導体を生成するために使用することができる。このような産物は、ＭＡＧの生物学的特性の少なくとも１つを共有するが、他の特性が異なってもよい。非限定的な例として、本発明の産物には、例えば、欠失により短縮されたもの；または加水分解に対してより安定である（および、したがって、自然発生型よりも顕著または長期持続的な効果を有する）もの；またはＯ−グリコシル化および／もしくはＮ−グリコシル化のための、１つもしくは複数の潜在的部位を欠失もしくは付加するために改変されたもの、または、例えば、アラニンもしくはセリン残基などにより欠失もしくは置換された、１個もしくは複数個のシステイン残基を有するもの、および微生物系から活性型としてより容易に単離される可能性のあるもの；フェニルアラニンで置換された１個または複数個のチロシン残基を有し、標的タンパク質まはた標的細胞上の受容体に多かれ少なかれ容易に結合するもの、が含まれる。また、ＭＡＧ内の連続アミノ酸配列もしくは２次コンフォメーションの一部のみを複製するポリペプチド断片も含まれる。該断片は、ＭＡＧの１つの特性（例えば、受容体結合など）を保有し、他の特性（例えば、神経突起伸張阻害など）は保有しなくてもよい。本発明のいずれか１つまたは複数の産物にとって、治療的有用性または他のコンテクスト、例えば、ＭＡＧ拮抗作用アッセイなどにおける有用性を有する活性が必要ないことは注目に値する。競合的アンタゴニストは、例えば、ＭＡＧの阻害影響をブロックするのに有用となりうる。
【００４４】
本発明はまた、ヒトｃＤＮＡまたはＭＡＧのゲノムＤＮＡ配列の、タンパク質をコードするストランドに相補的なＤＮＡ部分によりコードされたポリペプチドのクラス、すなわち、「相補的な反転したタンパク質（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ）」も含む。
【００４５】
本発明の１つの態様では、ＭＡＧ断片が、図１に示された各Ｉｇドメインに割り当てられたアミノ酸配列に基づく、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＩｇドメインを含むことを意図することができる。プライマーは、当技術分野ではよく知られている通り、各ドメインの適切な発現を可能にするように設計される。適切な２次構造を可能にするため、プライマーは、断片が隣接するＩｇドメインへ伸張するように設計することができる。例えば、ＭＡＧの最初の３つのＩＧドメインを含むＭＡＧ断片は、少なくともアミノ酸１〜３２５、少なくともアミノ酸１〜３２７、または少なくともアミノ酸１〜３５０、少なくともアミノ酸１〜３７５のアミノ酸残基を含むように設計することができる。本発明の別の態様では、ＭＡＧ断片は、非隣接のＭＡＧＩｇドメインを融合するように構築することができる。例えば、Ｉｇドメイン１〜３を含むアミノ酸１〜３２５は、Ｉｇドメイン５を含むアミノ酸４１３〜５０８に融合することができる。
【００４６】
本発明の代表的なＭＡＧポリペプチドには、ＭＡＧ１〜１２０、ＭＡＧ１〜２３７、ＭＡＧ１〜３２５、ＭＡＧ１〜４１２、ＭＡＧ１〜５０８、ＭＡＧ１〜５１７、ＭＡＧ１〜５３６、ＭＡＧ１〜６２６、ＭＡＧ１〜１３９、ＭＡＧ１〜２４１、ＭＡＧ１〜３２７、ＭＡＧ１〜４１３、ＭＡＧ１〜１６０、ＭＡＧ１〜１８０、ＭＡＧ１〜２００、ＭＡＧ１〜２６０、ＭＡＧ１〜２８０、ＭＡＧ１〜３００、ＭＡＧ１〜３５０、ＭＡＧ１〜３７０、ＭＡＧ１〜３９０、ＭＡＧ１〜４３０、ＭＡＧ１〜４５０、ＭＡＧ１〜４７０、ＭＡＧ２０〜１２０、ＭＡＧ２３７〜３２７、ＭＡＧ３２５〜４１３、ＭＡＧ４１２〜５０８、ＭＡＧ４１２〜５１６、ＭＡＧ３２５〜５１６、ＭＡＧ９０〜２６０、ＭＡＧ２１０〜３４０、ＭＡＧ３１０〜４３０、ＭＡＧ３９０〜５１６、ＭＡＧ３９０〜６２６、ＭＡＧ１〜２４１、ＭＡＧ１２０〜３２７、ＭＡＧ１２０〜４１３、ＭＡＧ１２０〜５１６、ＭＡＧ１２０〜６２６、ＭＡＧ２３７〜４１３、ＭＡＧ２３７〜５１６、ＭＡＧ２３７〜５３６、ＭＡＧ２３７〜６２６、ＭＡＧ３２５〜５０８、ＭＡＧ３２５〜５３６、ＭＡＧ３２５〜６２６、ＭＡＧ１〜３２５／５０８〜６２６が含まれるが、これらに限定されるものではない。本発明のＭＡＧ断片は、Ｃ−末端またはＮ−末端のいずれかでポリヒスチジンタグ（すなわち、Ｈｉｓ６）および／またはＦＬＡＧタグを含むことができる。
【００４７】
（ＩＩ．ＭＡＧ精製）
１つの態様では、本発明は、馴化培地などの物質を含有するＭＡＧから、ＭＡＧおよびＭＡＧ断片を精製するワンステップの方法を含む。
【００４８】
所望のポリペプチドを発現させるため、該ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、または機能的等価物は、適切な発現ベクター、すなわち、挿入コード配列の転写および翻訳に必要な要素を含有するベクターに挿入することができる。当業者によく知られた方法は、発現させたいポリペプチドをコードする配列、および適切な転写ならびに翻訳調節因子を含有する発現ベクターを構築するために使用することができる。
【００４９】
さまざまな発現ベクター／宿主系は、ポリペプチド配列を含有および発現するために利用することができる。これらは、組換えバクテリオファージ、プラスミド、またはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌、酵母発現ベクターで形質転換された酵母、ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルスなど）に感染させた昆虫細胞系、ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）など）もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉまたはｐＢＲ３２２プラスミドなど）で形質転換された植物細胞系、または動物細胞系などの微生物が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
細菌系では、いくつかの発現ベクターはいずれも、発現ポリペプチドを意図とした使用に応じて選択することができる。例えば、抗体誘導のためなど大量に必要な場合は、容易に精製される融合タンパク質の高レベル発現を導くベクターを使用することができる。しかし、細菌系の使用が、内因性ＭＡＧタンパク質と実質的に同一の翻訳後修飾を可能にすることはない。さらに、融合タンパク質の使用は、多段階の精製処理を必要とする。
【００５１】
哺乳類宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系が、一般に利用可能である。例えば、アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、発現させたいポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーターおよび３つのリーダー配列からなる、アデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲーションすることができる。ウイルスゲノムの非必須Ｅ１またはＥ３領域への挿入は、感染した宿主細胞でポリペプチドを発現することが可能な生存ウイルスを得るために使用することができる。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーは、哺乳類宿主細胞における発現を増加させるために使用することができる。
【００５２】
特定の開始シグナルも、発現させたいポリペプチドをコードする配列の翻訳効率を高めるために使用することができる。このようなシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列がある。ポリペプチド、この開始コドン、および上流配列をコードする配列が、適切な発現ベクターに挿入される場合、追加の転写または翻訳調節シグナルは不要となりうる。しかし、コード配列、またはこのタンパク質のみが挿入される場合は、ＡＴＧ開始コドンなどの外因性翻訳調節シグナルを提供すべきである。さらに、開始コドンは、挿入部分全体を確実に翻訳するため、適正なリーディングフレームにあるべきである。外因性翻訳因子および開始コドンは、天然および合成のいずれも、多様な由来となりうる。発現効率は、文献に記載されているものなど、使用する特定の細胞系に適したエンハンサーを組み込むことでエンハンスすることができる。
【００５３】
一般に、ＭＡＧポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、発現ベクター内でこれが発現するのに必要な、一般的には転写プロモーターおよび転写ターミネーターなどの他の遺伝因子と操作可能に結合される。ベクターは、通常、１種または複数種の選択可能なマーカーおよび１種または複数種の複製起点も含有するであろうが、当業者であれば、特定の系では、選択可能なマーカーは、別のベクターで提供することができ、外因性ＤＮＡの複製は、宿主細胞のゲノムへの組み込みにより実現されることを認識されるであろう。プロモーター、ターミネーター、選択可能なマーカー、ベクターおよび他の因子の選択は、当業者には公知の通常の設計問題である。多くのこうした因子は、文献に記載されており、商業的供給者を通じて入手可能である。
【００５４】
ＭＡＧポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導入するため、分泌シグナル配列（リーダー配列、プレプロ配列またはとしても知られる）が、発現ベクターで提供される。分泌シグナル配列は、別の分泌タンパク質またはデノボ合成により得ることができる。分泌シグナル配列は、ＭＡＧ  ＤＮＡ配列と操作可能に結合される。すなわち、２つの配列は、適正なリーディングフレームに加えられ、新しく合成されたポリペプチドを宿主細胞の分泌経路に導入するような位置に置かれる。分泌シグナル配列は、一般に、発現させたいポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の５’末端に位置するが、特定のシグナル配列は、発現させたいＤＮＡ配列の他の場所に位置してもよい。
【００５５】
さらに、宿主細胞株は、挿入した配列の発現を調節する能力、または所望の様式で発現タンパク質をプロセシングする能力について選択することができる。ポリペプチドのこうした修飾には、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、およびアシル化があるが、これらに限定されるものではない。「プレプロ」型タンパク質を開裂する翻訳後プロセシングも、適正な挿入、折り畳みおよび／または機能の促進に使用することができる。特定の細胞機構および特性メカニズムを有するＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９４、およびＷ１３８などのさまざまな宿主細胞は、異種タンパク質の適正な修飾およびプロセシングを確実にするために選択することができる。
【００５６】
培養哺乳類細胞は、好ましくは、本発明では宿主細胞として使用される。外因性ＤＮＡの哺乳類宿主細胞への導入方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション、およびリポソームトランスフェクションが挙げられる。培養哺乳類細胞における組換えポリペプチドの生成は、当技術分野ではよく知られている。適切な培養哺乳類細胞には、ＣＯＳ−１（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６５１）、ＢＨＫ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １６３２）、ＢＨＫ５７０（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １０３１４）、２９３（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ  １５７３；Ｇｒａｈａｍら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９〜７２頁、１９７７年）およびチャイニーズハムスター卵巣（例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ  ６１；またはＣＨＯ  ＤＧ４４、Ｃｈａｓｉｎら、Ｓｏｍ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌｅｃ．Ｇｅｎｅｔ．１２：５５５頁、１９８６年）細胞系が含まれる。追加の適切な細胞系は、当技術分野では既知であり、アメリカンタイプカルチャーコレクション、マナサス、Ｖａ．などの民間寄託機関から入手可能である。適切なプロモーターには、メタロイチオネイン遺伝子、アデノウイルス主要後期プロモーター、およびＳＶ−４０またはサイトメガロウイルス由来のプロモーターが挙げられる。
【００５７】
組換えタンパク質を長期間、高収率生産するには、安定した発現が、通常は好まれる。例えば、発現させたいポリヌクレオチドを安定に発現する細胞系は、ウイルス起源の複製および／または内因性発現因子、および同一ベクター上または別のベクター上の選択可能なマーカー遺伝子を含有する発現ベクターを用いて形質転換することができる。ベクター導入後、細胞は、選択培地へ移す前に、強化培地で１〜２日間増殖させることができる。選択可能なマーカーの目的は、選択耐性を付与するためであり、選択可能なマーカーの存在は、導入配列を首尾よく発現する細胞の増殖および回収を可能にする。安定に形成転換された細胞の耐性クローンは、細胞の種類に適した組織培養技法を用いて増殖させることができる。
【００５８】
いくつもの選択系を、形質転換細胞系の回収に使用することができる。代謝拮抗物質耐性、抗生剤または除草剤耐性は、選択基準に用いることができる。例えば、メトトレキサート耐性を付与するｄｈｆｒ；アミノグリコシド抗生物質、ネオマイシンおよびＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｐｔ；クロルスルフロンおよびホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼに対する耐性をそれぞれ付与するａｌｓまたはｐａｔなどがある。追加の選択可能な遺伝子は、例えば、トリプトファンの代わりにインドールを細胞が利用することを可能にするｔｒｐＢ、またはヒスチジンの代わりにヒスチノールを細胞が利用することを可能にするｈｉｓＤなどが記述されている。可視マーカーの使用は、アントシアニン、β−グルクロニダーゼならびにこの基質のＧＵＳ、およびルシフェラーゼならびにこの基質のルシフェリンなどのマーカーに人気があり、形質転換体の同定のみならず、特定のベクター系に起因する一過性の、または安定したタンパク質発現の量の定量化にも幅広く使用されている。
【００５９】
マーカー遺伝子発現の有無は、発現させたい遺伝子も存在していることを示唆するが、この存在および発現は、確認する必要がある場合がある。例えば、ポリペプチドをコードする配列が、マーカー遺伝子配列に挿入される場合、配列を含有する組換え細胞は、マーカー遺伝子機能の欠失により同定することができる。あるいは、遺伝子配列は、単一プロモーターの調節下で、ポリペプチドをコードする配列とタンデムに配置することができる。誘導または選択に応じたマーカー遺伝子の発現は、通常、タンデム遺伝子の発現も示唆している。
【００６０】
あるいは、所望のポリヌクレオチド配列を含有し発現する宿主細胞は、当業者には周知のさまざまな方法により同定することができる。これらの方法には、ＤＮＡ−ＤＮＡまたはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション、および、例えば、核酸またはタンパク質の検出および／または定量化のための、膜、溶液、またはチップをベースにした技術を含む、タンパク質の生物学的測定または免疫学的測定法があるが、これらに限定されるものではない。
【００６１】
多種多様な標識および接合法が、当業者に知られており、さまざまな核酸およびアミノ酸アッセイで使用することができる。ポリヌクレオチドに関連した配列を検出するための、標識ハイブリダイゼーションプローブの作製方法には、オリゴラベリング法、ニックトランスレーション法、末端標識法または１個の標識ヌクレオチドを用いるＰＣＲ増幅法が挙げられる。あるいは、配列、またはこの任意のタンパク質は、ｍＲＮＡプローブ作製のため、ベクターにクローン化することができる。このようなベクターは、当業者に公知であり、市販されており、Ｔ７、Ｔ３、またはＳＰ６などの適切なＲＮＡポリメラーゼおよび標識ヌクレオチドを付加して、インビトロでＲＮＡプローブを合成するのに使用することができる。これらの方法は、さまざまな市販キットを使用して実施することができる。使用することができる適切なレポーター分子または標識としては、放射性核種、酵素、蛍光剤、化学発光剤、または発色剤のほか、基質、補因子、阻害剤、磁性粒子などがある。
【００６２】
発現させたいポリヌクレオチド配列で形質転換した宿主細胞は、細胞培養からのタンパク質の発現および回収に適した条件下で培養することができる。組換え細胞により生成されたタンパク質は、使用する配列および／またはベクターに応じて細胞内に分泌または含有されうる。当業者であれば理解されるように、本発明のポリヌクレを含有する発現ベクターは、原核生物または真核生物の細胞膜を介する、コードされたポリペプチドの分泌を導くシグナル配列を含有するように設計することができる。他の組換え構築物は、可溶性タンパク質精製を促進するであろうポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列に、発現させたいポリペプチドをコードする配列を加えるために使用することができる。このような精製促進ドメインには、金属親和性樹脂での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュールなどの金属キレートペプチド、およびＦＬＡＧＳエクステンション／アフィニティー精製システム（Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐ．、ワシントン州シアトル）で使用されているドメインがあるが、これらに限定されるものではない。
【００６３】
組換え生成方法に加えて、本発明のＭＡＧ、およびこの断片は、固相法を用いた直接ペプチド合成により生成することができる。タンパク質合成は、手作業または自動で行うことができる。自動合成は、例えば、アプライドシステムズ４３１Ａペプチド合成器（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３１Ａ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて、実現することができる。あるいは、さまざまな断片は、別々に化学的に合成し、化学的手法により結合して完全長の分子を生成することができる。
【００６４】
組換えＭＡＧおよびＭＡＧ断片は、遠心分離、限外濾過およびクロマトグラフィーの併用により、使用済み培養培地から抽出することができる。特定の実施形態では、ＣＨＯ細胞由来の培養培地は、帯電した金属親和性樹脂を通過させる。金属親和性樹脂は、非帯電キレートマトリックスで充填したカラムに金属塩溶液を通過させて帯電することができる。尿素、塩、または界面活性剤などの追加試薬は、結合緩衝液に付加することができる。結合ＭＡＧ断片は、十分に洗浄すべきであり、次いで、ｐＨ勾配の利用、イミダゾール、ヒスチジン、グリシン、または塩化アンモニウムなどの競合リガンドの利用、ＥＤＴＡまたはＥＧＴＡなどのキレート剤の利用などいくつかの方法により、金属親和性樹脂から溶出することができる。
【００６５】
精製ＭＡＧまたはＭＡＧ断片の相対量の測定は、当技術分野で既知の任意の方法によって行うことができる。タンパク質検出の一般的な方法には、細胞または組織試料からのタンパク質の抽出、次いで標的タンパク質に特異的な標識プローブ（例えば、抗体など）のタンパク質試料に対するハイブリダイゼーション、およびプローブの検出が含まれる。標識基は、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であることができる。特定のタンパク質およびポリヌクレオチドの検出も、当業者に十分に知られた多くの他の方法のうち、ゲル電気泳動、カラムクロマトグラフィー、直接シーケンス、または定量的ＰＣＲ（ポリヌクレオチドの場合）により評価することができる。
【００６６】
本発明のＭＡＧタンパク質は、感度および再現性が高い直接測定を可能にする質量分析法により測定することができる。いくつかの質量分析法が利用可能である。例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）は、１つの試料中のさまざまな種の、別の試薬に対する相対濃度の違いを定量化することができ、絶対的定量は、正規化法（例えば、内部標準の利用など）により可能である。飛行時間（ＴＯＦ）測定を可能にする質量分析法は、高い精度および解像度を有し、少量の種類を測定することができる。
【００６７】
本発明の組成物および方法は、実施例で実証される。本発明の精製工程は、ミエリン関連糖たんぱく質（ＭＡＧ）の２つのバージョン、ＭＡＧ（１−３）（配列番号３）およびＭＡＧ（１−５）（配列番号２）を用いて実証される。一連の方法を用いて、精製ＭＡＧ（１−３）およびＭＡＧ（１−５）の純度および生物活性が確認された。本発明の保存条件および操作方法が、さまざまな条件下で産物の安定性に与える影響が実証される。
【００６８】
（ＩＩＩ．精製ＭＡＧおよびこの断片の使用）
１つの態様では、本発明の方法および構築物は、神経障害の診断的および／または治療的使用を有することができる。「神経障害」または「ＣＮＳ障害」という用語は、被験者における正常な神経機能の障害もしくは欠如、または異常な神経機能の存在を指す。例えば、神経障害は、疾患、損傷、および／または加齢の結果でありうる。本明細書では、神経障害は、１個の神経細胞または神経細胞個体群の形態学的および／または機能的異常の原因となる神経変性も含む。形態学的および機能的異常の非限定的な例には、神経細胞の物理的劣化および／または死、神経細胞の異常成長パターン、神経細胞間の物理接続の異常、神経細胞による、例えば、神経伝達物質などの１つの基質もしくは複数の基質の過少または過剰産生、神経細胞が正常に産生する１つの基質または複数の基質の産生不全、異常パターンまたは異常時間での、例えば神経伝達物質などの基質の産生、および／または電気的刺激の伝達が含まれる。神経障害には、記憶障害、認知症、記憶喪失、癲癇、および虚血があるが、これらに限定されるものではない。神経障害には、神経変性疾患も含まれる。神経変性は、被験者の脳のいずれの領域でも起こりうり、アルツハイマー病、筋萎縮側索硬化症（ＡＬＳ）、多発性硬化症、ハンチントン舞踏病、およびパーキンソン病など多くの障害で見られるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
ＭＡＧに特異的に結合することができ、ＭＡＧの阻害機能をブロックする分子は、本発明に含まれる。いくつかの実施形態では、結合分子は、抗体または抗体断片である。他の実施形態では、結合分子は、非抗体種である。したがって、例えば、結合分子は、ＭＡＧが１つの基質となる酵素であってよい。結合分子は、ＭＡＧの任意のエピトープを認識することができる。結合分子は、当技術分野で受け入れられている任意の方法により、同定および生成することができる。分析物に特異的な抗体および抗体断片の同定および生成方法は、よく知られている。結合分子の同定に用いられる他の方法の例には、ランダムペプチドライブラリー（例えば、ファージ提示法など）による結合アッセイ、およびＭＡＧ構造分析に基づく設計法がある。
【００７０】
別の態様では、本発明のＭＡＧおよびＭＡＧ断片は、ＮＯＧＯ受容体（ＮｇＲ）およびｐ７５（ＮＴＲ）、およびＬＩＮＧＯ−１を含むが、これらに限定されない、ＭＡＧ受容体の構造−機能解析を調べるために使用することができる。本発明の新規断片を用いて、特定のドメイン−ドメイン相互作用を調べることができ、新規治療薬の開発につなげることができる。
【００７１】
本発明の別の態様では、ＭＡＧタンパク質および／またはＭＡＧ受容体の阻害機能は、抗体またはペプチドによりブロックされうる。本発明の組換えＭＡＧタンパク質およびこの断片は、ＭＡＧ特異的抗体の生成における免疫原または選択標的として使用することができる。さらに、本発明の組換えＭＡＧタンパク質およびこの断片は、ＮｏＧｏ受容体と、このリガンドとの相互作用を試験するためのアッセイのほか、脊髄損傷、脳虚血性損傷、および神経障害治療のため、相互作用をブロックする治療薬の開発に使用することができる。
【００７２】
成体ＣＮＳにおける軸策再生は、ミエリン、ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）、ＮｏＧｏ、およびオリゴデンドロサイトミエリン糖タンパク質（Ｏｍｇｐ）における少なくとも３つのタンパク質により制限される。ＮＯＧＯ受容体（ＮｇＲ）は、軸策のＧＰＩアンカー型タンパク質として同定されているのに対し、ＭＡＧ受容体は、未だ解明されずにいる。ＭＡＧは、高い親和性で、ＮｇＲに直接結合することが示されている（Ｌｉｕ，Ｂ．Ｐ．ら、ＮｏＧｏ−６６受容体の機能リガンドとしてのミエリン関連糖タンパク質。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９７：１１９０〜１１９３頁、２００２年）。ＧＰＩ結合タンパク質の軸策からの開裂は、ＭＡＧ誘発性崩壊から成長円錐を保護し、ドミナントネガティブＮｇＲは、神経突起伸張のＭＡＧ阻害を排除する。ＭＡＧ耐性胚性ニューロンは、ＮｇＲ発現によりＭＡＧ感受性を付与された。ＭＡＧおよびＮｏＧｏ−６６は、それぞれ、ＮｇＲを活性化し、ＣＮＳ損傷後の軸策再生を制限する可能性のある過剰なＮｇＲリガンドとして作用する。
【００７３】
最近、ＭＡＧは、ＮｇＲとの相互作用を介し、軸策再生を阻害することが示された（Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ，Ｍ．ら、ミエリン関連糖タンパク質は、Ｎｏｇｏ６６受容体と相互作用し神経突起伸張を阻害する。Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：２８３〜２９０頁、２００２年）。ＭＡＧは、ＧＰＩ依存性およびシアル酸非依存性の様態で、ＮｇＲ発現細胞系と特異的に結合する。ＭＡＧは、ＮｇＲ発現細胞、後根神経節、および小脳ニューロン由来のＮｇＲを誘発するが、これはＭＡＧおよびＮｇＲの直接相互作用に一致する。ＮｇＲのＭＡＧとの相互作用をブロックする実験は、ＭＡＧによる神経突起伸張阻害を阻止した。ＭＡＧおよびＮＯＧＯ−６６は、ＮｇＲとの結合に対し直接競合している（Ｄｏｍｅｎｉｃｏｎｉ，Ｍ．ら、Ｎｅｕｒｏｎ  ３５：２８３〜２９０頁、２００２年）。
【００７４】
神経突起伸張阻害では、ＮＯＧＯＡ、ＯＭＧＰ、およびＭＡＧの細胞外ドメインなど、いくつかのミエリン構成要素は、同じＮＯＧＯ受容体を介してその作用を発揮する。ＮＯＧＮＯ受容体のグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型の性質は、阻害シグナルを応答ニューロンの内側に伝達するには、追加の膜貫通型タンパク質が必要となることを示唆している。成長因子のニューロトロフィンファミリーの受容体として知られる膜貫通タンパク質であるｐ７５は、ＮＯＧＯ受容体と特異的に相互作用する。ｐ７５ノックアウトマウス由来のニューロンは、ミエリンまたは既知のＮＯＧＯ受容体リガンドの何れとももはや応答しなかったため、ｐ７５は、ＮＯＧＯ受容体シグナリングに必要とされている。ｐ７５−ＮＯＧＯ受容体の相互作用のブロッキングは、これらの阻害因子の活性も低減した。さらに、細胞内ドメインを欠く、トランケートされたｐ７５タンパク質は、初代ニューロンで過剰発現させた場合、同じ一連の阻害活性を減衰させた。これは、ｐ７５が、Ｎｏｇｏ受容体−ｐ７５受容体複合体のシグナル伝達物質であることを示唆している。ｐ７５およびこの下流シグナル伝達経路で干渉すると、病変軸策が、中枢神経系ミエリンに関連した阻害活性のほとんどを克服することを可能にすることができる。
【００７５】
別の態様では、ＭＡＧの阻害機能は、ｐ７５に結合する抗体またはペプチドでブロックすることができる。ｐ７５（ＮＴＲ）は、ＭＡＧシグナル伝達のためのＮＯＧＯ受容体コレセプターである（Ｗｏｎｇ，Ｓ．Ｔ．ら、ｐ７５（ＮＴＲ）およびＮｏｇｏ受容体複合体はミエリン関連糖タンパク質による反発的シグナル伝達（ｒｅｐｕｌｓｉｖｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を媒介する。Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．５：１３０２〜１３０８頁、２００２年）。ＮＯＧＯ受容体を発現している培養したヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞では、ｐ７５（ＮＴＲ）は、ＭＡＧ誘発性細胞内カルシウムの上昇に必要であった。免疫共沈降は、ｐ７５（ＮＴＲ）に対する抗体により崩壊した可能性のある、ＮＯＧＯ受容体とｐ７５（ＮＴＲ）との関連を示し、広範な共発現が、発達中のラット神経系において観察された。さらに、ｐ７５（ＮＴＲ）抗体は、ニューロンおよびＮＯＧＯ受容体／ｐ７５（ＮＴＲ）−発現ＨＥＫ細胞のいずれにおいても、ゼノパス軸策成長円錐のＭＡＧ誘発性反発的方向転換およびカルシウム上昇を止めた。
【００７６】
本発明の別の態様では、ＭＡＧベクターは、遺伝子ワクチンとして使用することができる。アデノウイルスベクター中の、完全長のヒトＭＡＧ  ＯＲＦをコードするＤＮＡは、遺伝子銃で直接使用して対象物を免疫することができる。ＭＡＧタンパク質は、遺伝子銃からＤＮＡを受け取る細胞の表面で発現される。インビトロの一時的発現アッセイでは、タンパク質は、細胞表面で検出することができた。さらに、アデノウイルスベクター中のＴＭ−ＩＣＤと融合したヒトＭＡＧ  Ｉｇ様ドメイン  Ｉ−ＩＩＩは、遺伝子銃で直接使用して対象物を免疫することができる。本発明で開示されているＭＡＧ断片はすべて、アデノウイルスベクターで発現され、遺伝子ワクチンとして使用することができる。
【実施例】
【００７７】
以下の実施例は、本発明の実践を説明している。これらの実施例は、説明目的のためにすぎず、請求された本発明の範囲を制限するものでは決してない。
【００７８】
ミエリン関連糖タンパク質（ＭＡＧ）は、膜結合性細胞接着分子であり、ＩｇＧ遺伝子スーパーファミリーに属する。ＭＡＧは、ミエリン形成および維持における複数の機能を備える、５つの細胞外ＩｇＧ様ドメインからなる。ＭＡＧは、神経突起崩壊および軸策再生阻害を引き起こしているニューロンの受容体と相互作用する。本発明の方法を実証するため、さまざまなバージョンの組換えヒトＭＡＧの発現および精製が検討された。実施例１〜３は、Ｃ−末端でＨｉｓ６およびＦＬＡＧタグと融合した、安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞系で発現された、ＭＡＧ（１−３）（アミノ酸１〜３２５、配列番号３および配列番号６）およびＭＡＧ（１−５）（アミノ酸１〜５１６、配列番号２および配列番号５）のベクター構築、発現および精製を詳述している。細胞は、１０％ＦＢＳおよび１００ｎＭメトトレキサートを含有する合成培地で、前集密になるまで培養し、回収４８時間前に血清添加しない合成培地に切り替えた。さまざまな金属アフィニティーカラムを用いた精製法が開示される。精製産物は、さまざまな方法で特性が明らかにされた。精製タンパク質の安定性および機能を保持する有効な保存および操作条件は、実施例５で説明される。
【００７９】
（実施例１：  ＭＡＧタンパク質および断片の生成）
ＭＡＧタンパク質および断片を生成するため、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２０９１６（配列番号１）のアミノ酸に対応するアミノ酸をコードする完全長オープンリーディングを含むＩＭＡＧＥコンソーシアムクローン（５１９４２０７）を、以下のプライマーによるＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。
【００８０】
１）ｐＡＤＯＲＩ−ＭＡＧ  ＦＬクローン  ａａ  １−６２６
（配列番号７）５’オリゴ：５’gatcgatcagatctgccgccatgatattcctcacggcact    ＢｇＩＩＩ部位
（配列番号８）３’オリゴ：５’tagtactagaattctcatcacttgacccggatttcagcatactca    ＥｃｏＲＩ部位
【００８１】
２）ｐＥＤ６およびｐＴＤＭＥＤＬ−ＭＡＧ−ＥＣＤ  ６Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ（ＭＡＧ  ａａ  １−５１６)：
（配列番号９）５’オリゴ：５’gatcgatctctagagccgccatgatattcctcacggcact    ＸｂａＩ部位
（配列番号１０）３’オリゴ：５’tagtactagaattctcatcagatcttatcgtcgtcatccttgtaatcatggtgatgatggtgatgag gcccgatcttggcccacat  ＥｃｏＲＩ部位
【００８２】
３）ｐＥＤ６およびｐＴＤＭＥＤＬ−ＭＡＧ−Ｉ−ＩＩＩ  ６Ｈｉｓ−ＦＬＡＧ（ＭＡＧ  ａａ  １−３２５)：
（配列番号１１）５’オリゴ：５’gatcgatctctagagccgccatgatattcctcacggcact    ＸｂａＩ部位
（配列番号１２）３’オリゴ：５’tagtactagaattctcatcagatcttatcgtcgtcatccttgtaatcatggtgatgatgg tgatgtgcatacatgacactgagccc  ＥｃｏＲＩ部位
【００８３】
４）ｐＡＤＯＲＩ−ＭＡＧ  ａａ  １−３２５／５０８−６２６)：
プライマーセット１：
（配列番号１３）オリゴＡ（５’−３’）：tcagcgatcactcactcgctgtacaga
（配列番号１４）オリゴＢ：aggcccgatcttggcccacatcagtcgtgcatacatgacactgagccccac
プライマーセット２：
（配列番号１５）オリゴＣ：ggggctcagtgtcatgtatgcacgactgatgtgggccaagatcggg
（配列番号１６）オリゴＤ：gggtcagccacgcaggctgcccccagctcct
プライマーセット３：
（配列番号１７）オリゴＡ’：5'gatcgatcagatctgccgccatgatattcctcacggcact
（配列番号１８）オリゴＤ’：gatcgatcgaattctcatcacttgacccggatttcagcatactc
【００８４】
図１は、５つのＩｇドメインを各々含むアミノ酸を同定している。当業者であれば、結果として得られるＭＡＦ断片が、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのＩｇドメインを含むようなプライマーを、配列番号４〜６に開示されたＤＮＡ配列を用いて設計することができるであろう。いくつかの例では、配列が隣接するＩｇドメインへ伸張して適正な２次構造を可能にするようなプライマーを設計することが、有益となりうる。
【００８５】
いくつかのＭＡＧ断片の生成および精製は、上記の本発明の代表的な実施例として以下に詳述されている。ＤＮＡは、ＩＭＡＧＥコンソーシアムクローン（５１９４２０７）から増幅した。このクローンの一部の配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＩ７５５０６５で見出される。このクローンはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２０９１６（配列番号１）のアミノ酸に対応するアミノ酸数を備えた完全長オープンリーディングを含有していた。ＭＡＧ（１−５）ベクターを構築するには、残基１〜５１６をコードするＤＮＡを増幅し、６Ｈｉｓ−ＦＬＡＧタグ配列に融合させ、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ部位を用いて、ｐＥＤ６およびｐＴＭＥＤＬ（ＣＨＯ細胞およびＣＯＳ細胞発現ベクター）を備えたフレームでライゲーションした。ＭＡＧ（１−３）発現ベクターを構築するには、アミノ酸（ａａ）残基１〜３２５をコードするＤＮＡを増幅し、６Ｈｉｓ−ＦＬＡＧタグ配列に融合させ、ＸｂａＩ／ＥｃｏＲＩ部位を用いて、ｐＥＤ６およびｐＴＭＥＤＬ（ＣＨＯ細胞およびＣＯＳ細胞発現ベクター）を備えたフレームでライゲーションした。ＭＡＧ−ＦＬ発現ベクターを構築するには、ａａ残基１〜６２６をコードするＤＮＡを増幅し、ＢｇＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位を用いて、ｐＡＤＯＲＩ（アデノウイルス性ベクター）を備えたフレームでライゲーションした。ＭＡＧ−（１−３／ＴＭ−ＩＣＤ）発現ベクターを構築するには、ａａ残基１〜３２５をコードするＤＮＡを、ヒトＭＡＧの膜貫通（ＴＭ）および細胞内ドメイン（ＩＣＤ）を含むアミノ酸残基５０８〜６２６に融合させ、ｐＡＤＯＲＩ（アデノウイルス性ベクター）のＢｇＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローニングした。ＭＡＧ−（１−３／ＴＭ−ＩＣＤ）は、ＩＭＡＧＥコンソーシアムクローン（５１９４２０７）をテンプレートに用いて、２つのＰＣＲ増幅により構築した。プライマーセット１およびプライマーセット２（上記に記載）を用いて、ＰＣＲ反応産物１および２を生成した。次に、ＰＣＲを用いて、プライマーセット３により、プールした反応産物１および２を増幅し、反応産物３を生成した。反応産物３を、ＢｇＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで分解し、ＢｇＩＩＩ／ＥｃｏＲＩで切断したｐＡｄｏｒｉ１−３にクローニングした。ＭＡＧタンパク質はすべて、ＣＨＯ細胞の安定したトランスフェクションにより産生し、以下に記載するさまざまな金属アフィニティーカラムで精製した。
【００８６】
（実施例２：  チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞の組換えＭＡＧ実験）
この実施例は、ＣＨＯ細胞由来のＭＡＧ分泌のための、安定した哺乳類発現系に関する。
【００８７】
ＣＨＯ細胞における安定した発現のため、上記実施例１で詳述した、６Ｈｉｓ−ＦＬＡＧタグ配列に融合させたヒトＭＡＧ断片のＭＡＧ（１−３）（アミノ酸１〜３２５、配列番号２）およびＭＡＧ（１−５）（アミノ酸１〜５１６、配列番号３）を含むＣＨＯ細胞ベクターを、ＴｒａｎｓＩＴ−ＣＨＯトランスフェクションキット、（カタログ番号：ＭＩＲ  ２１７０、Ｍｉｒｕｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マジソン、ＷＩ  ５３７１９−１２６７  ＵＳＡ）およびこのキットが提供するプロトコルにより、２枚の１００ｍｍプレートにトランスフェクトした。ＣＨＯ細胞を、選択可能なマーカー、ＤＨＦＲ遺伝子を含有するＭＡＧ−ＴＭＥＤプラスミドでトランスフェクトした。メトトレキサートを培地に添加してトランスフェクトＣＨＯ細胞を選択した。対照として、挿入されていないベクターもトランスフェクトした。
【００８８】
２４時間のトランスフェクション後、ＭＡＧトランスフェクト細胞およびベクタートランスフェクト細胞を、２枚の１００ｍｍプレートから６枚の１００ｍｍプレートに分割した。アルファ培地（Ｗｙｅｔｈ）＋１０％透析加熱不活化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ、ＵＳＡ  カタログ番号：２６４００〜０４４）およびペニシリン−ストレプトマイシン（ＰｅｎＳｔｒｅｐ  Ｇｉｂｃｏ  ＵＳ  カタログ番号：１５０７０〜０６３）／Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  ＵＳＡ、カタログ番号：２５０３０〜１４０）で培養した。２枚の各プレートに、さまざまな濃度の選択剤メトトレキサート（ＭＴＸ、シグマ、ＧＡ，ＵＳＡ；カタログ番号：Ｍ  ００２９）：２０ｎＭ（ＭＴＸ）、または５０ｎＭ  ＭＴＸ、または１００ｎＭ  ＭＴＸを添加した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。コロニーが形成され、その外観が十分に大きく正常であるなら（約２週間）、１個のコロニーを取り出し、１５０μｌの５０ｎＭ  ＭＴＸ選択培地を含有する９６ウェルプレートに入れ、このうち２５μｌを、生細胞バンクとして２４ウェルプレートに移した。さまざまな濃度の選択培地中のベクタートランスフェクト細胞、または１００ｎＭ  ＭＴＸ培地中のＭＡＧトランスフェクト細胞由来のコロニーは形成されなかった。
【００８９】
９６ウェルプレートに入った細胞を、ほぼ集密になるまで培養し、次いで、回収４８時間前に血清添加しないＲ５  ＣＤ１倍地（Ｗｙｅｔｈ）に切り替えた。馴化培地（ＣＭ）を、４〜２０％ＳＤＳゲル上に流し、抗ＭＡＧ抗体（カタログ番号：ｓｃ−１５３２４  抗ＭＡＧ（Ｈ−３００）ウサギポリクロナール、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＵＳＡ）によるウェスタンブロットで分析し、高発現クローンを選択した。２４ウェルプレート細胞バンクから選択されたクローンを、１００ｎＭ  ＭＴＸ選択培地に分割し、ほぼ集密になるまで培養し、次いで、回収４８時間前に血清添加しないＲ５  ＣＤ１倍地に切り替えた。ＣＭを４〜２０％ＳＤＳゲル上に流し、抗ＭＡＧ抗体によるウェスタンブロットで再び分析した。多量のタンパク質を分泌し、正常で成長の早いクローンを、安定した細胞系として選択した。選択した安定な細胞系を、１００ｎＭ  ＭＴＸおよびＰｅｎＳｔｒｅｐ／グルタミンを伴う１０％透析ＦＢＳアルファ培地で維持した。
【００９０】
（実施例３：  ＭＡＧタンパク質および断片の精製）
ＣＨＯ細胞から馴化培地を回収する際、培地は、０．２ｕＭフィルターを介して濾過することができ、ＮａＡｚｉｄを、０．０１％まで添加することができる。馴化培地のｐＨを、２Ｍのトリス、ｐＨ８．５で約８．０に調整し、ニッケルカラム（Ｎｉ−ＮＴＡ、キアゲン、ＣＡ）またはコバルトカラム（ＴＡＬＯＮ（商標）、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カナダ）のいずれかを備えたＨＰＬＣに、流速２〜４ｍｌ／分で添加した。カラムを洗浄し、結合タンパク質を、流速８ｍｌ／分で以下の勾配にて溶出した：１．５カラム容量（ｃｖ）の０〜１０％緩衝液Ｂ、０．１ｃｖの５０％緩衝液Ｂ、５ｃｖの１００％緩衝液Ｂ。ここで、緩衝液Ａは、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８および緩衝液Ｂは、５００ｍＭ  イミダゾールＡ、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ８．０である。ＭＡＧ１−５のＴＡＬＯＮ（商標）およびＮｉ−ＮＴＡカラム精製の代表的な精製クロマトグラムは、図２Ａおよび２Ｂに、それぞれ示されている。ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて溶出タンパク質の純度を評価した。図３は、ＴＡＬＯＮ（商標）およびＮｉ−ＮＴＡカラム精製の双方から精製したＭＡＧ１−３の、１つの優性バンドを示している。ＳＤＳ  ＰＡＧＥは、精製ＭＡＧ１−５は、単一の大バンドのみを有することを確認した。
【００９１】
ＭＡＧ（１−５）およびＭＡＧ（１−３）の精製は、Ｎ−末端シーケンシング、ウェスタンブロット分析、ＬＣ／ＭＳ、サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、およびＵＶ分析を含む追加の特性づけを介して確認された。ＳＥＣは、精製ＭＡＧ（１−５）は、純度＞９６％を有することを確認した。ＬＣ／ＭＳは、ＣＨＯタンパク質は、精製ＭＡＧ（１−５）およびＭＡＧ（１−３）の主要な不純タンパク質であることを確認した。ＩＥＦは、ＭＡＧ（１−５）のＰＩは、報告された値と実質的に同様の４．４であることを見出した。ウェスタンブロットは、大バンドおよび下部の小バンドはいずれも、ＭＡＧ（１−３）であることを確認した。ＳＥＣは、ＭＡＧ（１−３）が、純度＞９９％を有することを確認した。
【００９２】
（実施例４：  ＭＡＧタンパク質および断片の生物学的分析）
ｉ）インビトロ結合アッセイ  Ｎｉ２＋＋樹脂に固定化したＭＡＧを、１％ＢＳＡ存在下で１時間、緩衝液単独またはＮｇＲ−ｅｃｔ（残基２７〜３１０）でインキュベートし、結合タンパク質を、５００ｍＭイミダゾールで溶出した。ＮｇＲ−ｅｃｔも、Ｎｉ２＋＋樹脂単独でインキュベートし、アフィニティー樹脂との非特異的結合を除外した。（Ｌｉｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２９７：１１９０〜１１９３頁（２００２年）に記載されたプロトコル参照）。
【００９３】
ｉｉ）神経突起伸張アッセイ  精製ＭＡＧの阻害作用およびＭＡＧ断片をテストするには、解離ニューロンは、阻害基質（精製ＭＡＧ断片または対照物としてのＦｃ）の濃度を上昇させながらプレートすることができる。次いで、ニューロンは、４〜８時間増殖し、固定化し、ローダミンファロイジンで染色することができ、神経突起伸張を、ＮＩＨ  ｉｍａｇｅで評価することができる。
【００９４】
他の実験では、ラット小脳顆粒ニューロンを、２５ｕｇ／ｍｌ精製組換えＭＡＧまたは対照物（Ｆｃドメイン）で２４時間処理した。ニューロンを、３Ｔ３細胞の単分子層で増殖し、神経突起の長さを、手分析により採点した。図５は、ＭＡＧ１−５が、神経突起伸張の約４５〜５０％阻害を有することを示している。この結果は、ニッケルまたはコバルト樹脂により精製したＭＡＧ１−５は、神経突起伸張阻害において、市販のＦｃ−ＭＡＧ（カタログ番号５３８−ＭＧ−１００，Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ミネアポリス、ＭＮ）と比べ、優っているわけではないが、同程度に有効であることを実証するものである。
【００９５】
（実施例５：  ＭＡＧおよびＭＡＧ断片の安定性）
この実施例は、Ｍａｇ１−３およびＭＡｇ１−５はいずれも、比較的安定していることを実証している。図５Ａおよび６Ａは、−８０℃から室温で冷凍／解凍を３サイクル実施した後、ＭＡＧ１−３またはＭＡＧ１−５では、それぞれ、タンパク質不安定化、沈殿、または３２０ｎｍでの吸光度変化の徴候は見られないことを示している。ＳＥＣ分析はさらに、凝集は見られないことを確認した（図５Ｂおよび６Ｂ参照）。したがって、冷凍および解凍を複数サイクル行っても、ＭＡＧ（１−３）およびＭＡＧ（１−５）の安定性に何ら影響はない。
【００９６】
図７は、ＭＡＧ１−３が、きわめて強固なタンパク質であることを示している。ＭＡＧ１−３の純度は、保存温度、金属親和性樹脂または塩濃度により影響されることはない。図７は、さまざまな塩条件［（１）：５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２。低ＮａＣｌ（１５０ｍＭ）；（２）５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、ｐＨ７．２。高ＮａＣｌ（５００ｍＭ）］下、室温または４℃で保存した、Ｎｉ−ＮＴＡまたはＴＡＬＯＮ（商標）樹脂のいずれか一方で精製したＭＡＧ１−３のＳＥＣによる％純度を示している。
【００９７】
図８Ａは、ＭＡＧ１−５は、緩衝液組成物および保存温度にわずかに影響されることを示している。イミダゾール緩衝液を含む緩衝液は、ＭＡＧ１−５安定化に関してわずかに優れている。Ｔｗｅｅｎ  ２０は、ＭＡＧ１−５安定性を維持する効果が、ある程度限られる。図８Ｂは、ＭＡＧ１−５を、１２週間室温で保存した場合、４℃で保存した場合と比較して、凝集が増加したことを示している。図８は、さまざまな緩衝液条件［（１）：Ｎａ−ＰＢＳ：５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２；（２）Ｎｉ緩衝液：５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、〜２５０イミダゾール、ｐＨ８．０；Ｎａ−ＰＢＳ：５０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１＆Ｔｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ７．２］下、室温または４℃のいずれか一方で保存した、Ｎｉ−ＮＴＡまたはＴＡＬＯＮ（商標）樹脂のいずれか一方により精製したＭＡＧ１−５の、ＳＥＣによる％純度を示している。
【００９８】
結論として、サイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）後の金属アフィニティークロマトグラフィーは、良好なＭＡＧ１−３およびＭＡＧ１−５の精製方法である。Ｎｉ−ＮＴＡおよびＴＡＬＯＮ（商標）に、有意差はない。さまざまな特性研究は、ＭＡＧの精製タイプは双方とも高純度であり、ＭＡＧ１−５は、高い生物活性を有することを示した。複数サイクルの冷凍および解凍は、ＭＡＧ１−３およびＭＡＧ１−５の安定性に影響しない。ＭＡＧ１−３は、４℃または周囲条件のどちらかで、１２週間にわたり、Ｎａ−ＰＢＳ中で保存した場合、安定である。ＭＡＧ１−５の安定性は、保存条件に依存する。イミダゾール緩衝液では、ＭＡＧ１−５は、４℃で保存した場合、少なくとも１２週間安定である。Ｎａ−ＰＢＳでは、ＭＡＧ１−５は、４℃で保存した場合、９週間安定であるが、周囲条件下で保存した場合、ＭＡＧ１−５は、約１週間安定であるにすぎない。Ｎａ−ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０では、ＭＡＧ１−５は、周囲条件下で６週間安定である。
【００９９】
本発明の本方法は、形質転換宿主細胞由来の、組換え生成されたＭＡＧを精製することにより、例示されているが、本法は、細胞内で自然発生するＭＡＧの精製にも適しており、溶液、細胞ホモジネート、細胞培養上清、または単離した細胞サブフラクションからタンパク質を精製するのに使用することができる。本発明は、特定の方法および組成物について説明されているが、本発明を検討する際は、当業者には、さまざまなバリエーションおよび変更が可能となることを理解されたい。
【０１００】
当業者は、当然のことながら、上記に記載した実施形態に基づく本発明のさらなる特徴および利点を、通常の実験程度で解明できるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲により示されていることを除けば、これまで詳細に示され説明されてきたことによって制限されるものではない。出版物および参考文献はすべて、本明細書に参照により明示的にそっくり組み込まれている。
【図面の簡単な説明】
【０１０１】
【図１】本発明のさまざまなＭＡＧ断片の略図である。
【図２Ａ】ＴＡＬＯＮ（商標）アフィニティーカラムを用いて精製されたＭＡＧ（１−５）の精製クロマトグラフィーを示す図である。
【図２Ｂ】ニッケルアフィニティーカラムを用いて精製されたＭＡＧ（１−５）の精製クロマトグラフィーを示す図である。
【図３】ＴＡＬＯＮ（商標）またはＮｉ−ＮＴＡカラム精製後の精製ＭＡＧ（１−５）およびＭＡＧ（１−３）を示すＳＤＳ  ＰＡＧＥの図である。
【図４】本発明の方法を用いて精製されたＭＡＧ（１−５）で処置された、ラットの小脳顆粒ニューロンの神経突起伸張阻害を示す棒グラフである。
【図５Ａ】３サイクルの冷凍／解凍実施後のＭＡＧ（１−３）の安定性を示すＵＶ吸収の棒グラフである。
【図５Ｂ】３サイクルの冷凍／解凍実施後のＭＡＧ（１−３）のサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）の精製クロマトグラムである。
【図６Ａ】３サイクルの冷凍／解凍実施後のＭＡＧ１−５の安定性を示すＵＶ吸収の棒グラフである。
【図６Ｂ】３サイクルの冷凍／解凍実施後のＭＡＧ１−５のサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製クロマトグラムである。
【図７】室温（ＲＴ）または４℃で保管した後のさまざまな時点における、ＳＥＣによるＭＡＧ１−３のパーセント純度のグラフである。
【図８Ａ】室温（ＲＴ）または４℃で保管した後のさまざまな時点における、ＳＥＣによるＭＡＧ１−５のパーセント純度のグラフである。
【図８Ｂ】室温（ＲＴ）で１２週間保管した後の、ＭＡＧ１−５のサイズ除外クロマトグラフィー（ＳＥＣ）による精製クロマトグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年3月15日(2007.3.15)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2008506390.tif 000025
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