(57)【要約】  本発明は、約２℃と約８℃との間の温度で構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を提供する。いくつかの例では、コンジュゲート分子は、抗原、例えば、アレルゲンを含む。いくつかの例では、コンジュゲート分子は、ブタクサ抗原Ａｍｂ  ａ１を含む。本発明は、このような組成物を作製及び使用する方法を提供する。個体における免疫応答を調節する方法であって、本明細書に記載した構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を投与することを含む前記方法が本明細書中に提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物であって、前記コンジュゲート分子が、コンジュゲートパートナー及び免疫賦活化配列（ＩＳＳ）を含むポリヌクレオチドを含み、そして、前記組成物が、約６．０〜約９．０の範囲で組成物のｐＨを維持することができる成分をさらに含む前記組成物。
【請求項２】
直角光散乱（ＲＡＬＳ）によって測定されるように約２℃と約８℃との間の温度で非凝集形態である約７０％を超える前記コンジュゲート分子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ｐＨを維持することができる成分が、非極性成分及び負に荷電していない成分からなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
ｐＨを維持することができる成分が、ヒスチジンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
ヒスチジンが、約１ｍＭと約５０ｍＭとの間の濃度で組成物中に存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
ヒスチジンが、約５ｍＭと約２０ｍＭとの間の濃度で組成物中に存在する、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
ｐＨを維持することができる成分が、リン酸塩である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
リン酸塩が、約５ｍＭと約５０ｍＭとの間の濃度で組成物中に存在する、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
リン酸塩が、約２０ｍＭと約５０ｍＭとの間の濃度で組成物中に存在する、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
組成物のｐＨが、約７．０〜約８．０の範囲にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
組成物のｐＨが、約７．５〜約８．０の範囲にある、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
ＩＳＳが、六量体モチーフＡＡＣＧＴＴを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
ＩＳＳが、モチーフＧＡＣＧＣＴＣＣ；ＧＡＣＧＴＣＣＣ；ＧＡＣＧＴＴＣＣ；ＧＡＣＧＣＣＣＣ；ＡＧＣＧＴＴＣＣ；ＡＧＣＧＣＴＣＣ；ＡＧＣＧＴＣＣＣ；ＡＧＣＧＣＣＣＣ；ＡＡＣＧＴＣＣＣ；ＡＡＣＧＣＣＣＣ；ＡＡＣＧＴＴＣＣ；ＡＡＣＧＣＴＣＣ；ＧＧＣＧＴＴＣＣ；ＧＧＣＧＣＴＣＣ；ＧＧＣＧＴＣＣＣ；ＧＧＣＧＣＣＣＣ；ＧＡＣＧＣＴＣＧ；ＧＡＣＧＴＣＣＧ；ＧＡＣＧＣＣＣＧ；ＧＡＣＧＴＴＣＧ；ＡＧＣＧＣＴＣＧ；ＡＧＣＧＴＴＣＧ；ＡＧＣＧＴＣＣＧ；ＡＧＣＧＣＣＣＧ；ＡＡＣＧＴＣＣＧ；ＡＡＣＧＣＣＣＧ；ＡＡＣＧＴＴＣＧ；ＡＡＣＧＣＴＣＧ；ＧＧＣＧＴＴＣＧ；ＧＧＣＧＣＴＣＧ；ＧＧＣＧＴＣＣＧ；ＧＧＣＧＣＣＣＧ；ＧＡＣＧＣＴ；ＧＡＣＧＴＣ；ＧＡＣＧＴＴ；ＧＡＣＧＣＣ；ＧＡＣＧＣＵ；ＧＡＣＧＵＣ；ＧＡＣＧＵＵ；ＧＡＣＧＵＴ；ＧＡＣＧＴＵ；ＡＧＣＧＴＴ；ＡＧＣＧＣＴ；ＡＧＣＧＴＣ；ＡＧＣＧＣＣ；ＡＧＣＧＵＵ；ＡＧＣＧＣＵ；ＡＧＣＧＵＣ；ＡＧＣＧＵＴ；ＡＧＣＧＴＵ；ＡＡＣＧＴＣ；ＡＡＣＧＣＣ；ＡＡＣＧＴＴ；ＡＡＣＧＣＴ；ＡＡＣＧＵＣ；ＡＡＣＧＵＵ；ＡＡＣＧＣＵ；ＡＡＣＧＵＴ；ＡＡＣＧＴＵ；ＧＧＣＧＴＴ；ＧＧＣＧＣＴ；ＧＧＣＧＴＣ；ＧＧＣＧＣＣ；ＧＧＣＧＵＵ；ＧＧＣＧＣＵ；ＧＧＣＧＵＣ；ＧＧＣＧＵＴ；又はＧＧＣＧＴＵを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
ＩＳＳが、配列
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号１）；
５’−ＴＧＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号２）；
５’−ＴＣＡＴＣＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＣＡＣＡＧＴＣＡ−３’（配列番号３）；
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号４）；
５’−ＴＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＴＡＡＣＧＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号５）；
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号６）；
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号７）；又は
５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＢＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号８）
を含み、ここで、Ｂが、５−ブロモシトシンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
ＩＳＳが、５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’を含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
コンジュゲートパートナーが、抗原である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
抗原が、アレルゲンである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
アレルゲンが、甲殻類アレルゲン、昆虫アレルゲン、哺乳動物アレルゲン、軟体動物アレルゲン、植物アレルゲン、及び真菌アレルゲンからなる群から選択される、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１９】
アレルゲンが、植物アレルゲンのブタクサ抗原Ａｍｂ  ａ１である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
ヒスチジン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン及びアラニンからなる群から選択されるアミノ酸をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
アミノ酸が、グリシンである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
グリシンが、約２３０ｍＭと約２８５ｍＭとの間の濃度で組成物中に存在する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
ラクトース、スクロース、マンノース、マルトース、ソルビトール、及びグルコースからなる群から選択される糖質をさらに含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項２４】
糖質が、スクロースである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
スクロースが、約１％と１０％との間の濃度で組成物中に存在する、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
糖質が、ソルビトールである、請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
ソルビトールが、約３％と約５％との間の濃度で組成物中に存在する、請求項２６に記載の組成物。
【請求項２８】
コンジュゲート分子；約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度であるヒスチジン；及び約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲の濃度であるグリシンを含み、約６．０〜約９．０の範囲のｐＨを有する組成物。
【請求項２９】
約１〜１０％の範囲でソルビトールをさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度でスクロースをさらに含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３１】
約７．０〜約８．０の範囲でｐＨを有する、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３２】
約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲で５ｍＭのヒスチジン及び２８５ｍＭのグリシンを含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３３】
約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲で２０ｍＭのヒスチジン及び２７０ｍＭのグリシンを含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３４】
約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲で２０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのグリシン、及び３．８％のソルビトールを含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３５】
約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲で２０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのグリシン、及び２１０ｍＭのスクロースを含む、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３６】
コンジュゲートパートナーが、アレルゲンである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３７】
アレルゲンが、植物アレルゲンである、請求項３６に記載の組成物。
【請求項３８】
植物アレルゲンが、ブタクサ抗原Ａｍｂ  ａ１である、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
適した条件下で請求項２３に記載の組成物を凍結乾燥することによって製造される凍結乾燥した組成物。
【請求項４０】
請求項２９又は３０に記載の組成物を含む凍結乾燥した組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２００５年３月４日出願の米国仮特許出願第６０／６５８，９４７号の優先権の利益を主張し、この開示は本明細書中に参照により全体として援用される。
【０００２】
連邦政府支援の研究又は開発に関する陳述
利用なし。
コンパクトディスク付属物への言及
利用なし。
【背景技術】
【０００３】
背景
種々の病理学、例えば、ウイルス感染、細菌感染、癌及びアレルギー反応に見られるものを消散するための免疫応答は、宿主の健康の全体に重要である。感染、癌又はアレルギー反応の成功した解決は、免疫応答のタイプ及び規模に依存するかもしれない。更なる免疫応答を引き出すために抗原を使用することによる免疫化は、感染、癌、及び／又はアレルギー反応の首尾よい解決に役立つかもしれない。免疫賦活化ポリヌクレオチド−免疫調節分子コンジュゲート組成物は、ＷＯ９８／１６２４７に開示される。抗原に連結した免疫賦活化配列を含有する免疫調節組成物は、ＷＯ０１／３５９９１に開示される。免疫賦活化配列を用いた免疫応答を調節する方法は、ＷＯ０１／１２２２３に開示される。
本明細書中に引用した全ての刊行物、参考文献、特許出願、特許刊行物及び特許は、本明細書中に参照により全体として援用される。
【発明の開示】
【０００４】
簡単な概要
構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物が本明細書中に提供され、このコンジュゲート分子は、コンジュゲートパートナー、及び免疫賦活化配列（ＩＳＳ）を含むポリヌクレオチドを含み、そして、組成物は約６．０〜約９．０の範囲で組成物のｐＨを維持することができる成分をさらに含む。いくつかの例では、コンジュゲートパートナーは、抗原、例えば、アレルゲンである。他の例において、アレルゲンは、甲殻類アレルゲン、昆虫アレルゲン、哺乳動物アレルゲン、軟体動物アレルゲン、植物アレルゲン、及び真菌アレルゲンからなる群から選択される。更なる例では、アレルゲンは、植物アレルゲンのブタクサ抗原Ａｍｂ  ａ１である。いくつかの例では、コンジュゲート分子は、本明細書中に記載されるようなＡＩＣである。いくつかの例では、組成物は、直角光散乱（ＲＡＬＳ）によって測定されるような約２℃と約８℃との間の温度で非凝集形態の約７０％を超えるコンジュゲート分子を含む。他の例では、組成物は、直角光散乱（ＲＡＬＳ）によって測定されるような約２℃と約８℃との間の温度で非凝集形態の約８０％超、約９０％超、約９５％超、又は約９７％超のコンジュゲート分子を含む。他の例では、コンジュゲートパートナーを含む組成物は、非極性成分及び負に荷電していない成分からなる群から選択されるｐＨを維持することができる成分を含む。更なる例では、ｐＨを維持することができる成分は、ヒスチジンである。いくつかの例では、ヒスチジンは、約１ｍＭと約５０ｍＭとの間の濃度で組成物中に存在する。他の例では、ヒスチジンは、約５ｍＭと約２０ｍＭとの間の濃度で組成物中に存在する。さらに他の例では、ｐＨを維持することができる成分は、リン酸塩である。いくつかの例では、リン酸塩は、約５ｍＭと約５０ｍＭとの間の濃度で組成物中に存在し、そして、他の例では、約２０ｍＭと約５０ｍＭとの間である。いくつかの例では、組成物は、約６．０〜約９．０の範囲のｐＨを有する。いくつかの例では、組成物は、約７．０〜約８．０の範囲のｐＨを有し；そして、他の例では、約７．５〜約８．０の範囲である。いくつかの例では、コンジュゲート分子は、六量体モチーフＡＡＣＧＴＴを含むＩＳＳを含む。他の例では、ＩＳＳは、モチーフＧＡＣＧＣＴＣＣ；ＧＡＣＧＴＣＣＣ；ＧＡＣＧＴＴＣＣ；ＧＡＣＧＣＣＣＣ；ＡＧＣＧＴＴＣＣ；ＡＧＣＧＣＴＣＣ；ＡＧＣＧＴＣＣＣ；ＡＧＣＧＣＣＣＣ；ＡＡＣＧＴＣＣＣ；ＡＡＣＧＣＣＣＣ；ＡＡＣＧＴＴＣＣ；ＡＡＣＧＣＴＣＣ；ＧＧＣＧＴＴＣＣ；ＧＧＣＧＣＴＣＣ；ＧＧＣＧＴＣＣＣ；ＧＧＣＧＣＣＣＣ；ＧＡＣＧＣＴＣＧ；ＧＡＣＧＴＣＣＧ；ＧＡＣＧＣＣＣＧ；ＧＡＣＧＴＴＣＧ；ＡＧＣＧＣＴＣＧ；ＡＧＣＧＴＴＣＧ；ＡＧＣＧＴＣＣＧ；ＡＧＣＧＣＣＣＧ；ＡＡＣＧＴＣＣＧ；ＡＡＣＧＣＣＣＧ；ＡＡＣＧＴＴＣＧ；ＡＡＣＧＣＴＣＧ；ＧＧＣＧＴＴＣＧ；ＧＧＣＧＣＴＣＧ；ＧＧＣＧＴＣＣＧ；ＧＧＣＧＣＣＣＧ；ＧＡＣＧＣＴ；ＧＡＣＧＴＣ；ＧＡＣＧＴＴ；ＧＡＣＧＣＣ；ＧＡＣＧＣＵ；ＧＡＣＧＵＣ；ＧＡＣＧＵＵ；ＧＡＣＧＵＴ；ＧＡＣＧＴＵ；ＡＧＣＧＴＴ；ＡＧＣＧＣＴ；ＡＧＣＧＴＣ；ＡＧＣＧＣＣ；ＡＧＣＧＵＵ；ＡＧＣＧＣＵ；ＡＧＣＧＵＣ；ＡＧＣＧＵＴ；ＡＧＣＧＴＵ���ＡＡＣＧＴＣ；ＡＡＣＧＣＣ；ＡＡＣＧＴＴ；ＡＡＣＧＣＴ；ＡＡＣＧＵＣ；ＡＡＣＧＵＵ；ＡＡＣＧＣＵ；ＡＡＣＧＵＴ；ＡＡＣＧＴＵ；ＧＧＣＧＴＴ；ＧＧＣＧＣＴ；ＧＧＣＧＴＣ；ＧＧＣＧＣＣ；ＧＧＣＧＵＵ；ＧＧＣＧＣＵ；ＧＧＣＧＵＣ；ＧＧＣＧＵＴ；又はＧＧＣＧＴＵを含む。さらに他の例では、ＩＳＳは、配列５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号１）；５’−ＴＧＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号２）；５’−ＴＣＡＴＣＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＣＡＣＡＧＴＣＡ−３’（配列番号３）；５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号４）；５’−ＴＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＴＡＡＣＧＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号５）；５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号６）；５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号７）；又は５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＢＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号８）を含み、ここで、Ｂは５−ブロモシトシンである。更なる例では、ＩＳＳは、５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’を含む。
【０００５】
いくつかの例では、コンジュゲートパートナーは、抗原であり、そして、なお他の例では、アレルゲンである。さらに他の例では、アレルゲンは、甲殻類アレルゲン、昆虫アレルゲン、哺乳動物アレルゲン、軟体動物アレルゲン、植物アレルゲン、及び真菌アレルゲンからなる群から選択される。更なる例では、アレルゲンは、植物アレルゲンのブタクサ抗原Ａｍｂ  ａ１である。
【０００６】
いくつかの例では、コンジュゲートパートナーを含む組成物は、ヒスチジン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン及びアラニンからなる群から選択されるアミノ酸を含む。いくつかの例では、アミノ酸は、グリシンであり；いくつかの例では、グリシンは、約２３０ｍＭと約２８５ｍＭとの間の濃度で組成物中に存在する。更なる例では、組成物は、ラクトース、スクロース、マンノース、マルトース、ソルビトール、及びグルコースからなる選択される糖質を含む。いくつかの例では、糖質は、スクロースである。いくつかの例では、スクロースは、約１％と１０％との間の濃度で組成物中に存在する。他の例では、糖質は、ソルビトールである。いくつかの例では、ソルビトールは、約３％と約５％との間の濃度で組成物中に存在する。さらに他の例では、コンジュゲート分子；約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲の濃度のヒスチジン；及び約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲の濃度のグリシンを含む組成物が、本明細書中に提供され、ここで、前記組成物は、約６．０〜約９．０の範囲のｐＨを有する。他の例では、約１〜１０％の範囲のソルビトール又は約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭの濃度のスクロースをさらに含むコンジュゲート分子を含む組成物が、本明細書中に提供される。いくつかの例では、組成物は、約７．０〜約８．０の範囲のｐＨを有する。更なる例では、コンジュゲート分子、５ｍＭ  ヒスチジン及び２８５ｍＭ  グリシンを約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲で含む組成物が、本明細書中に提供される。
【０００７】
他の例では、コンジュゲートパートナー、２０ｍＭ  ヒスチジン及び２７０ｍＭ  グリシンを約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲で含む組成物が、本明細書中に提供される。更なる例では、２０ｍＭ  ヒスチジン、５０ｍＭ  グリシン、及び３．８％  ソルビトールを約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲で含む組成物が、本明細書中に提供される。更なる例では、２０ｍＭ  ヒスチジン、５０ｍＭ  グリシン、及び２１０ｍＭ  スクロースを約７．０と約８．０の間のｐＨ範囲で含む組成物が、本明細書中に提供される。本発明は、液体形態、凍結乾燥形態、及び凍結乾燥形態から再構成した液体形態で組成物を提供する。
【０００８】
本発明はまた、構造的に安定なコンジュゲート分子、例えば、限定されないが、ＡＩＣを含む、本明細書中に記載される組成物を作成及び使用する方法、並びにこのような組成物を含むキット及び製造品を提供する。
【０００９】
発明の詳細な説明
コンジュゲート分子を含む組成物が本明細書中に記載され、ここで、コンジュゲート分子は、コンジュゲートパートナー及び免疫賦活化配列（ＩＳＳ）を含むポリヌクレオチドを含む。本発明は、組成物中のコンジュゲート分子の構造的安定性が温度、塩及びｐＨ条件に依存するという発見に部分的に基づく。本発明者らは、抗原を含むコンジュゲート分子が、リン酸ナトリウム及び塩化ナトリウムを含む組成物において２〜８℃の液体で保存される場合、経時的に凝集することを見出した。低いｐＨは、抗原を含むコンジュゲート分子が低イオン強度の条件下で可逆的に凝集する原因となることもまた見出した。コンジュゲート分子の凝集を最小又は減少するように開発した組成物、及びこのような組成物を製造及び使用する方法が、本明細書中に提供される。約２℃と約８℃との間の温度で構造的に安定であるコンジュゲート分子を含む組成物が、本明細書中に記載される。いくつかの例では、コンジュゲート分子は、例えば、アレルゲンのような抗原を含む。いくつかの例では、アレルゲンは、精製した短いブタクサ抗原（Ａｍｂ  ａ１）である。したがって、約２〜約８％Ｃで構造的に安定なＡｍｂ  ａ１を含むコンジュゲート分子を含む組成物が、本明細書中に提供される。
【００１０】
コンジュゲート分子、及び約６．０〜約９．０の範囲の組成物のｐＨを維持することができる成分を含む組成物が、本明細書中に記載される。いくつかの例では、組成物は、約２℃と約８℃との間の温度で非凝集形態の７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、９７％超、９８％超又は９９％超のコンジュゲート分子を含む。いくつかの例では、組成物は、最大約１週間、最大約２週間、最大約３週間、最大約４週間、最大約６週間、最大約８週間、最大約１０週間、最大約１２週間、最大約１４週間、最大約１６週間、最大約１８週間、最大約２０週間、最大約２２週間、最大約２４週間、最大約１年間、又は最大約２年間、非凝集形態で７０％超、８０％超、９０％超、９５％超又は９７％超のコンジュゲート分子を含む。いくつかの例では、凝集は、直角光散乱（ＲＡＬＳ）によって測定される。他の例では、組成物中のコンジュゲート分子の凝集は、ＲＡＬＳと併用してもよく又は併用しなくてもよい内部蛍光（ＩＦ）、外部蛍光（ＥＦ）及び／又はＳＥＣ−ＨＰＬＣによって測定される。いくつかの例では、コンジュゲート分子は、抗原を含む。抗原の例は、当該技術分野に知られ、限定されないが、ペプチド、脂質、多糖、ガングリオシド、及び糖タンパク質を含む。いくつかの例では、抗原は、アレルゲンである。アレルゲンの例は、当該技術分野に知られ、本明細書中に記載され、そして、限定されないが、甲殻類アレルゲン、昆虫アレルゲン、哺乳動物アレルゲン、軟体動物アレルゲン、植物アレルゲン、及び真菌アレルゲンを含む。いくつかの例では、アレルゲンは、植物アレルゲン、例えば、ブタクサアレルゲンである。いくつかの例では、アレルゲンは、Ａｍｂ  ａ１である。したがって、約６．０〜約９．０の範囲で組成物のｐＨを維持することができる成分をさらに含むコンジュゲート分子を含む組成物が、本明細書中に提供され、ここで、組成物は、約２℃と約８℃との間の温度で非凝集形態の約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超又は約９７％超のコンジュゲート分子を含む。他の例では、コンジュゲート分子を含む組成物は、組成物が非凝集形態でＡｍｂ  ａ１を含む７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超又は約９７％超のコンジュゲート分子を含む限り、１）アミノ酸、２）糖質、３）界面活性剤、又は４）他の適した成分の１以上をさらに含んでもよい。いくつかの例では、組成物は、液体形態である。他の例では、組成物は、凍結乾燥され、そして、さらに他の例では、組成物は、凍結乾燥形態から再構成した液体形態である。
【００１１】
組成物中に存在する約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満又は約３％未満のコンジュゲート分子が、約２℃と約８℃との間の温度で凝集形態であるコンジュゲート分子を含む組成物が本明細書中に記載される。いくつかの例では、組成物に存在する約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満又は約３％未満のコンジュゲート分子が、最大約１週間、最大約２週間、最大約３週間、最大約４週間、最大約６週間、最大約８週間、最大約１０週間、最大約１２週間、最大約１４週間、最大約１６週間、最大約１８週間、最大約２０週間、最大約２２週間、最大約２４週間、最大約１年間、又は最大約２年間、約２℃と約８℃との間の温度で凝集形態である。いくつかの例では、組成物中のコンジュゲート分子の凝集は、直角光散乱（ＲＡＬＳ）によって測定される。いくつかの例では、コンジュゲート分子は、抗原を含む。一般的に、抗原は、ペプチド、脂質（例えば、コレステロールを除くステロール、脂肪酸、及びリン脂質）、多糖、ガングリオシド及び糖タンパク質である。いくつかの例では、抗原は、限定されないが、原生動物、細菌、真菌（単細胞及び多細胞を含む）、及びウイルス感染体を含む感染体由来の抗原を含む。例えば、寄生生物由来の抗原は、住血吸虫種（例えば、Ｓ．マンソニ）由来の住血吸虫卵（例えば、Ｓｍ−ｐ４０）、及びトキソプラズマ種（例えば、Ｔ．ゴンジイ）由来の抗原を含む。例えば、Ｓｔａｄｅｃｋｅｒら（１９９８）、Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２１７−２２１；Ｓｕｂａｕｓｔｅら（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５３２−５２７を参照されたい。いくつかの例では、抗原は、アレルゲンである。アレルゲンの例は、当該技術分野において知られ、本明細書中に記載され、そして、限定されないが、甲殻類アレルゲン、昆虫アレルゲン、哺乳動物アレルゲン、軟体動物アレルゲン、植物アレルゲン、及び真菌アレルゲンを含む。いくつかの例では、アレルゲンは、植物アレルゲン、例えば、ブタクサ抗原である。いくつかの例では、アレルゲンは、Ａｍｂ  ａ１である。したがって、Ａｍｂ  ａ１を含むコンジュゲート分子を含む組成物が本明細書中に提供され、ここで、組成物に存在する約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満又は約３％未満のコンジュゲート分子は、約２℃と約８℃との間の温度で凝集形態である。
【００１２】
本明細書中に記載される構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を製造及び使用する方法が、本明細書中に提供される。哺乳動物の宿主の免疫応答を調節する方法が、本明細書中に提供され、本明細書中に記載される構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を哺乳動物の宿主に投与することを含み；医薬組成物は、構造的に安定なコンジュゲート分子を含み；キットは、構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を含み：そして、製造品は、構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を含む。いくつかの例では、製造品は、コンジュゲート分子を含む組成物を含み、ここで、組成物は、約２℃と約８℃との間の温度で非凝集形態の約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超又は約９７％超のコンジュゲート分子を含む。いくつかの例では、凝集は、ＲＡＬＳによって測定される。他の例では、製造品は、コンジュゲート分子を含む液体組成物を含み、そして、他の例では、製造品は、コンジュゲート分子を含む凍結乾燥した組成物を含む。さらに他の例では、製造品は、構造的に安定なコンジュゲート分子を含む再構成した液体組成物（凍結乾燥した組成物から再構成される）を含む。
【００１３】
一般的技術
本発明の実施は、他に指示がなければ、分子生物学（組換え技術を含む）、細胞生物学、生化学及び免疫学の慣用的な技術を使用されるであろうし、これらは当該技術分野の範囲内である。このような技術は、文献的、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ編集、１９８４）；Ａｍｉｎａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編集、１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ編集）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ編集、１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌら編集、１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓら編集、１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎら編集、１９９１）；Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（Ｒ．Ｍａｓｓｅｙｅｆｆ，Ｗ．Ｈ．Ａｌｂｅｒｔ，及びＮ．Ａ．Ｓｔａｉｎｅｓ編集、Ｗｅｉｎｈｅｉｍ：ＶＣＨ  Ｖｅｒｌａｇｓ  ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，１９９３）；及びＧｅｎｎａｒｏら、２０００、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．Ｌｉｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤに十分に説明される。
【００１４】
定義
本明細書中で使用されるとき、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その（ｔｈｅ）」は、他に指示がない限り、複数の対象を含む。例えば、「１つの」ＩＳＳは、１又はそれより多くのＩＳＳを含む。
【００１５】
用語「免疫賦活化配列」又は「ＩＳＳ」は、本明細書中で使用されるとき、インビトロ、インビボ及び／又はエクスビボで測定される測定可能な免疫応答を生じるポリヌクレオチド配列を意味する。測定可能な免疫応答の例は、限定されないが、抗原特異性抗体産生、サイトカイン分泌、ＮＫ細胞、ＣＤ４+Ｔリンパ球、ＣＤ８+Ｔリンパ球、Ｂリンパ球等のようなリンパ球集団の活性化又は拡大を含む。好ましくは、ＩＳＳ配列は、優先的にＴｈ１タイプの応答を活性化する。本発明で使用するためのポリヌクレオチドは、少なくとも１つのＩＳＳを含有する。本明細書中で使用されるとき、「ＩＳＳ」はまた、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドに関する省略形である。
【００１６】
「コンジュゲート分子」は、本明細書中で使用されるとき、ＩＳＳ（即ち、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチド）及びコンジュゲートパートナーを含む分子又は複合体を意味する。いくつかの例では、ＩＳＳ及びコンジュゲートパートナーは、直接的又は間接的に連結される。このようなコンジュゲート連結は、共有結合及び／又は非共有連結を含む。コンジュゲートパートナーは、限定されないが、抗原を含む。「コンジュゲート分子の集団」は、ＩＳＳ−コンジュゲートパートナー（即ち、コンジュゲートパートナーに直接的若しくは間接的に連結した又は結合したＩＳＳ）の群である。本発明の目的のために、このような集団は、各コンジュゲートパートナーに結合した一定数のＩＳＳを必ずしも有さず、及び有してもよく又は有しなくてもよいことが理解される。典型的には、所定の集団は、（所定の集団の様々な範囲のコンジュゲートに基づく）分子量分布、つまり、コンジュゲートパートナーにコンジュゲートした平均数のＩＳＳを有するであろう。本明細書中に記載されるコンジュゲート分子の任意の集団は、例えば、不完全なコンジュゲート及び／又は精製によって、遊離のコンジュゲートパートナー（即ち、ＩＳＳに連結していないコンジュゲートパートナー）及び／又は遊離のＩＳＳ（即ち、コンジュゲートパートナーに連結していないＩＳＳ）の分子を含有してもよいことが理解される。本発明の目的のために、本明細書中に記載される集団は、コンジュゲート分子を含有するが、排他的にコンジュゲート分子を含有する必要はない。本明細書中で使用されるとき、「ＡＩＣ」コンジュゲート分子は、ＩＳＳにコンジュゲートしたブタクサアレルゲン、Ａｍｂ  ａ１を意味する。
【００１７】
組成物中のコンジュゲート分子の構造的安定性は、コンジュゲート分子が本質的にそれを物理的安定性及び完全な状態に保持する組成物を意味する。組成物中のコンジュゲート分子の物理的安定性は、組成物中のコンジュゲート分子の凝集の量、即ち、パーセント（％）によって測定される。一般的に、組成物中のコンジュゲート分子の凝集の増加％は、組成物中のコンジュゲート分子の構造的安定性の減少と相関する。組成物中のコンジュゲート分子の構造的安定性は、組成物中にコンジュゲート分子の凝集が０％であること、又は組成物中に存在する場合、遊離の、即ち、凝集していないコンジュゲートパートナーの凝集が０％であること、又は組成物中に存在する場合、遊離の、即ち、コンジュゲートしていないＩＳＳが０％であることを必要としない。構造的に安定であるコンジュゲート分子を含む組成物は、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超又は約９７％超のコンジュゲート分子が組成物中に非凝集形態で存在する組成物を意味する。本明細書中で使用されるとき、コンジュゲート分子と比較して、句「非凝集形態」は、限定されないが、モノマー形態でコンジュゲート分子を含む。一般的に、組成物中のコンジュゲート分子のモノマーの増加％は、組成物中のコンジュゲート分子の構造的安定性の増加と相関する。したがって、構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物は、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％及び少なくとも約９７％のコンジュゲート分子が、約２℃と約８℃との間の温度でモノマー形態で組成物中に存在する組成物を意味し、即ち、それを含む。構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物は、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満又は約３％未満のコンジュゲート分子が組成物中に凝集体として存在する組成物を意味し、即ち、それを含む。構造的安定性を測定する種々の方法は、当該技術分野において利用可能であり、本明細書中に開示され、そして、限定されないが、直角光散乱（ＲＡＬＳ）を含み、単独で、又は当該技術分野において既知であり、本明細書中に記載され、限定されないが、ＩＦ、ＥＦ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣを含む他の方法と併用される。いくつかの例では、組成物中のコンジュゲート分子の％凝集はＲＡＬＳによって測定される。「不安定化」されるコンジュゲート分子を含む組成物は、凝集形態で存在する組成物中の約３０％超、約４０％超、約５０％超、約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超又は約９５％超のコンジュゲート分子を有するものである。
【００１８】
所定の集団における所定のパラメータ（例えば、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの数又は質量）の「平均」は、集団のメンバーの数で割った全集団についてのパラメータの全部を意味する。例えば、コンジュゲートパートナーに結合したＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均数は、コンジュゲートパートナー分子の集団におけるコンジュゲートパートナー当りのＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均数（即ち、コンジュゲートパートナーの総数で割ったＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの全体数）を意味する。下記に記載されるように、この数は、通常、例えば分光計で測定されるコンジュゲートパートナーに対するポリヌクレオチドの重量測定に由来する。
【００１９】
所定の集団に対する「中央値」の数又は重量は、集団の半分が上回り、集団の半分が下回る数又は重量を意味する。例えば、コンジュゲートパートナー当りのＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの中央値の数は、集団におけるコンジュゲートパートナーの半分がコンジュゲートパートナー当りのＩＳＳ含有ポリヌクレオチドのより低い数を有し、半分がより高い数を有することを意味する。
【００２０】
本明細書中で相互交換に使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及び二重鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、修飾したオリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオシド又はそれらの組合せを含む。オリゴヌクレオチドは、直線的又は環状的な形状をとることができ、あるいはオリゴヌクレオチドは、直線状又は環状セグメントを含有することができる。オリゴヌクレオチドは、一般的には、リン酸エステル連結を通じて連結されたヌクレオシドの高分子である。ヌクレオシドは、糖に結合したプリン（アデニン若しくはグアニン又はそれらの誘導体）又はピリミジン（チミン、シトシン若しくはウラシル又はそれらの誘導体）塩基からなる。ＤＮＡにおける４つのヌクレオシドユニット（又は塩基）は、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシチミジン、及びデオキシシチジンと呼ばれる。ヌクレオチドは、ヌクレオシドのリン酸エステルである。
【００２１】
用語「免疫調節」又は「免疫応答を調節すること」は、本明細書中で使用されるとき、免疫賦活化並びに免疫抑制効果を含む。免疫賦活化効果は、限定されないが、細胞性又は体液性免疫応答を直接的又は間接的に増加するものを含む。免疫賦活化効果の例には、限定されないが、抗原特異的抗体産生の増加；ＮＫ細胞、ＣＤ４+Ｔリンパ球、ＣＤ８+Ｔリンパ球、マクロファージ等のようなリンパ球集団の活性化又は増殖；限定されないが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α等を含む免疫賦活化サイトカインの合成の増加が含まれる。免疫抑制効果は、細胞性又は体液性免疫応答を直接的又は間接的に減少するものを含む。免疫抑制効果の例には、限定されないが、ＩｇＥ産生の減少のような抗原特異的抗体の産生の減少；リンパ球、又は免疫寛容に帰着するもののような免疫抑制活性を有する他の細胞集団の活性化；そして、ある種の細胞機能に対する抑制効果を有するサイトカイン合成の増加が含まれる。この一例は、ＩＦＮ−γであり、ＩＬ−４誘導のＩｇＥ及びＩｇＧ1へのクラススイッチを遮断するようであり、それによってこれらの抗体のサブクラスのレベルが減少する。
【００２２】
「コンジュゲートの範囲」は、所定の集団におけるコンジュゲーションの平均度合を意味する。本明細書中で記載されるとき、コンジュゲーションの程度は、構造及び／又は機能的パラメータの任意数によって、単独で又は任意の組合せで特徴付けられてもよい。
【００２３】
用語「抗原」は、抗体又はＴ細胞抗原受容体によって特異的に認識及び結合する物質を意味する。抗原は、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、複合糖質、糖、ガングリオシド、脂質及びリン脂質；それらの部分及びそれらの組合せを含むことができる。抗原は、天然に見られるものであり得て、又は合成のものであり得る。ＩＳＳを用いた投与に適した抗原は、Ｂ細胞又はＴ細胞の抗原特異的応答を引き出すことができる任意の分子を含む。好ましくは、抗原は、抗原に特異的な抗体応答を発揮する。ハプテンは、「抗原」の範囲に含まれる。ハプテンは、それ自身では免疫原性ではないが、抗原決定基を含有する免疫分子とコンジュゲートした場合に免疫原性にさせる低分子量の化合物である。小分子は、抗原性にさせるためにハプテン化させるのに必要でなくてもよい。好ましくは、いくつかの例では、本発明の抗原は、ペプチド、脂質（例えば、ステロール、脂肪酸、及びリン脂質）、多糖、ヘモフィラス・インフルエンザワクチンで使用されるような多糖、ガングリオシド及び糖タンパク質を含む。
【００２４】
「アジュバント」は、抗原のような免疫原に添加された場合、混合物への曝露に応じた受容者宿主における抗原に対する免疫応答を非特異的に増加又は可能にする物質を意味する。
【００２５】
用語「ペプチド」は、生物学的応答、例えば、抗体産生又はサイトカイン活性を生じるのに十分な長さ及び組成であるポリペプチドであり、いずれにせよペプチドはハプテンである。典型的には、ペプチドは、長さにして少なくとも６個のアミノ酸残基である。用語「ペプチド」は、修飾したアミノ酸（天然又は非天然に発生する）をさらに含み、このような修飾は、限定されないが、リン酸化、グリコシル化、ＰＥＧ化、脂質化及びメチル化を含む。
【００２６】
「抗原性ペプチド」は精製した天然ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗製タンパク質抽出物、弱毒化又は不活化ワクチン、細胞、微生物、又はこのようなペプチドの断片を含むことができる。したがって、「抗原性ペプチド」又は「抗原ポリペプチド」は、１以上の抗原的特性を提示するポリペプチドの全部又は一部を意味する。つまり、例えば、「Ａｍｂ  ａ１抗原性ポリペプチド」又は「Ａｍｂ  ａ１ポリペプチド抗原」は、抗原的特性を提示する（即ち、抗体又はＴ細胞受容体に特異的に結合する）Ａｍｂ  ａ１由来のアミノ酸配列であって、その配列の全体、その配列の一部、及び／又はそれの配列の修飾である。
【００２７】
「輸送分子」又は「輸送ベヒクル」は、特定の部位に及び／又は特定の時期に関してＩＳＳ及び／又は抗原の輸送を促進、容認、及び／又は増加する化学的成分である。輸送ベヒクルは、免疫応答を付加的に刺激してもよく又はしなくてもよい。
【００２８】
「抗原に対するアレルギー反応」は、好中球及び／又は抗原特異的ＩｇＥの発生によって一般的に特徴付けられる免疫応答、及びこれらに伴う効果を意味する。当該技術分野において周知であるように、ＩｇＥは、マスト細胞及び好塩基球上のＩｇＥ受容体に結合する。ＩｇＥによって認識される抗原に後者を曝露すると、抗原は、マスト細胞及び好塩基球上でＩｇＥと架橋し、これらの細胞の脱顆粒を引き起こし、限定されないが、ヒスタミン放出を含む。用途「抗原に対するアレルギー反応」、「アレルギー」、及び「アレルギー条件」は、本発明の方法のいくつかの応用に同様に適切であることが理解され、意図される。本発明の方法は、アレルギー反応の阻害に同様に適しているもの、並びに、既存のアレルギー状態を治療することを含む。
【００２９】
本明細書中で使用されるとき、用語「アレルゲン」は、抗原、又は患者への曝露に応じてアレルギー反応を引き出す分子、通常、タンパク質の抗原性部分を意味する。典型的には、患者は、例えば、膨疹及び発熱試験又は当該技術分野において既知の方法によって指示されるアレルゲンに過敏である。分子は、たとえ小集団の患者のみが、その分子の曝露に応じてアレルギー性（例えば、ＩｇＥ）免疫応答を提示するとしてもアレルゲンと呼ばれる。多くの単離したアレルゲンが当該技術分野において既知である。これらは、限定されないが、本明細書中に提供されるものを含む。
【００３０】
用語「脱感作」は、患者が感受性を示したアレルゲンの増加した投与量の投与の過程を意味する。脱感作に使用さえるアレルゲンの投与量の例は、当該技術分野に既知であり、例えば、Ｆｏｒｎａｄｌｅｙ（１９９８）Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３１：１１１−１２７を参照されたい。
【００３１】
「抗原特異的免疫療法」は、抗原を伴い、そして、免疫応答の抗原特異的調節を生じる免疫療法の任意の形態を意味する。アレルギーの状態で、抗原特異的免疫療法は、限定されないが、脱感作療法を含む。
【００３２】
「個体」は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。哺乳動物は、限定されないが、ヒト、霊長類、家畜、競技用動物、げっ歯類及びペットを含む。
物質の「有効量」又は「十分量」は、臨床結果を含む有益な結果又は所望の結果を生じるのに十分な量であり、例えば、「有効量」は、適用される状況に依存する。抗原に対する免疫応答を調節する組成物を投与する状況において、ＩＳＳ−コンジュゲートパートナー（即ち、ＩＳＳ及びコンジュゲートパートナー）を含む有効量の組成物は、抗原を単独で投与した場合に得られる免疫応答と比較してこのような調節を達成するのに十分な量である。有効量は、１回以上で投与され得る。
【００３３】
用語「同時投与」は、本明細書中で使用されるとき、免疫応答を調節するのに十分に近接した時間で少なくとも２種の異なった物質の投与を意味する。好ましくは、同時投与は、少なくとも２種の異なった物質の同時投与を意味する。
【００３４】
Ｔｈ１応答のような免疫応答の「刺激」は、応答を引き出すこと及び／又は応答の増加から生じ得る応答における増加を意味する。
「アレルギー関連障害」は、抗原特異的ＩｇＥ免疫応答の効果に起因する障害を意味する。このような効果には、限定されないが、低血圧及びショックを含むことができる。過敏症は、循環系に放出したヒスタミンが血管拡張を引き起こし、並びにその結果としての循環系からの血漿の顕著な減少を伴う毛細血管の透過性の増加のアレルギー関連障害の例である。過敏症は、全身に亘って体験される同時効果を伴った全身的に生じ得て、そして、特定の標的組織又は臓器に限定した反応を伴った局所的に生じ得る。
【００３５】
「ＩｇＥ関連障害」は、持続しても又はしなくてもよいＩｇＥ濃度の上昇によって、部分的に特徴付けられる生理的状態である。ＩｇＥ関連障害は、限定されないが、アレルギー及びアレルギー反応、アレルギー関連障害（後述）、喘息、鼻炎、結膜炎、蕁麻疹、職、膜翅目の毒針アレルギー、及び薬物アレルギー、並びに寄生虫病を含む。用語はまた、これらの障害の関連した徴候を含む。一般的には、このような障害のＩｇＥは、抗原特異的である。
【００３６】
本明細書中で使用されるように、及び当該技術分野において十分に理解されるように、「治療」は、臨床的な結果を含む有利な結果又は所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有利な結果又は所望の結果は、限定されないが、検出できる又は検出できないかに係わらず、１以上の症状の緩和又は改善、疾患の程度の縮小、疾患の安定化（即ち、悪化していない）状態、疾患の拡大の阻害、疾患の進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は軽減、及び鎮静（部分的又は全体的）を含む。「治療」はまた、治療を受けない場合に期待される生存と比較して、生存の長期化を意味し得る。
【００３７】
疾患又は障害を「軽減すること」は、障害を治療しない場合と比較して、障害又は疾患状態の程度及び／又は望まれない臨床的徴候が減少し、そして進行の時間経過が遅くなり又は延びることを意味する。特に、アレルギーの状態で、当業者に十分に理解されるように、軽減が、アレルゲン（又は複数）に対する免疫応答の調節に応じて生じてもよい。さらに、軽減は、１回投与によって必ずしも生じることはないが、しばしば、連続投与に応じて生じる。つまり、応答又は障害を軽減するのに十分な量は、１回以上で投与されてもよい。
【００３８】
ＩＳＳ−コンジュゲートパートナー又はＩＳＳ−抗原によって「誘発される」「抗体力価」又は「抗体量」は、コンジュゲート又は抗原の投与後の時間点で測定した所定の抗体量を意味する。
【００３９】
「Ｔｈ１関連抗体」は、産生及び／又はそうかがＴｈ１免疫応答と関連する抗体である。例えば、ＩｇＧ２ａは、マウスにおけるＴｈ１関連抗体である。本発明の目的のために、Ｔｈ１関連抗体の測定は、１以上のこのような抗体の測定であり得る。例えば、ヒトにおいて、Ｔｈ１関連抗体の測定は、ＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ３の測定を必要とし得た。
【００４０】
「Ｔｈ２関連抗体」は、産生及び／又は増加がＴｈ２免疫応答と関連する抗体である。例えば、ＩｇＧ１は、マウスにおけるＴｈ２関連抗体である。本発明の目的のために、Ｔｈ２関連抗体の測定は、１以上のこのような抗体の測定であり得る。例えば、ヒトにおいて、Ｔｈ２関連抗体の測定は、ＩｇＧ２及び／又はＩｇＧ４の測定を必要とし得た。
【００４１】
サイトカイン産生、抗体産生、又はヒスタミン放出のような機能又は活性を「抑制」又は「阻害」することは、関心のある条件又はパラメータを除いて別の同じ条件と比較した場合、あるいは、別の条件と比較した場合、機能又は活性を減少することである。例えば、ヒスタミン放出を抑制するコンジュゲート分子集団は、例えば、抗原単独で誘導したヒスタミン放出と比較したヒスタミン放出の減少である。別の例では、抗体産生を抑制するコンジュゲート分子集団は、例えば、抗原単独で産生される抗体の程度及び／又は濃度と比較して、抗体の程度及び／又は濃度を減少する。
【００４２】
コンジュゲート分子を含む組成物
本発明は、コンジュゲート分子を含む組成物に部分的に関連し、ここで、コンジュゲート分子は、コンジュゲートパートナー及び免疫賦活化配列（ＩＳＳ）を含むポリヌクレオチドを含み、そして、本発明は、このような組成物を製造及び使用する方法に部分的に関連する。本発明はまた、構造的に安定なコンジュゲートを含む組成物、及びこのような組成物を製造及び使用する方法に部分的に関連する。本発明に包含されるＩＳＳ及びコンジュゲートパートナーは、本明細書中に記載される。当業者に理解されるであろうが、本発明に包含されるコンジュゲート分子は、コンジュゲートパートナー、コンジュゲート分子に存在するＩＳＳのタイプ及び数、及びＩＳＳとコンジュゲートパートナーとの間のコンジュゲーションの平均的な程度に基づいて、異なった識別される生物学的特性を有してもよい。いくつかの例では、コンジュゲートパートナーは、抗原又はアレルゲンのようなタンパク質である。いくつかの例では、コンジュゲートパートナーは、アレルゲン、Ａｍｂ  ａ１を含む。他の例では、ＩＳＳは、６塩基よりも任意に長いポリヌクレオチド又は塩基対であり得て、いくつかの例では、配列５’−シトシン（Ｃ）、グアニン−３’（Ｇ）を含み、他の例では、配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン−３’（例えば、５’−ＡＡＣＧＴＴ−３’）、他の例では、１５塩基又は塩基対よりも長い、そして、他の例では、長さにして２０塩基又は塩基対より長い。いくつかの例では、ＩＳＳは、配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’；又は、配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｃ−３’；又は配列５’−Ｔ、Ｃ、Ｇ−３’を含む。いくつかの例では、ＩＳＳは、５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’を含む。
【００４３】
いくつかの例では、コンジュゲート分子は、５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’を含むＩＳＳにコンジュゲートしたＡｍｂ  ａ１を含む。このような組成物は、例えば、コンジュゲート分子の構造的安定性を維持することが重要である場合、例えば、治療法及び診断法における使用を見出す。抗原に連結した免疫賦活化配列（ＩＳＳ）を含有するコンジュゲート分子は、ＰＣＴ公開ＷＯ０１／３５９９１、ＷＯ９８／１６２４７及びＷＯ０１／１２２２３に開示され、これらの開示は、全体として参照により本明細書中に具体的に援用される。
【００４４】
本発明者らは、組成物内のコンジュゲート分子の構造的安定性が温度、塩及びｐＨ条件に依存することを発見した。アレルゲンを含むコンジュゲート分子は、組成物中のリン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、負に荷電した化合物及び／又は極性成分の存在によって、約０℃以上の温度で、液体組成物中で不安定化することを見出した。低いｐＨは、アレルゲンを含むコンジュゲート分子が低いイオン強度の条件下で可逆的に凝集する原因となることを見出した。
【００４５】
理論にとらわれずに、コンジュゲート分子の負電荷により、ＩＳＳの存在の理由で、負に荷電していない成分又は中性電荷を有する成分又は非極性成分を含む組成物は、組成物中に存在するコンジュゲート分子の構造的安定性を維持することが望まれると信じられる。負電荷を有する成分、例えば塩化ナトリウムの添加は、ＩＳＳを含むコンジュゲート分子が凝集し、それによって不安定化される原因となるだろうことを見出した。組成物中の求核試薬、例えば、アジド、又は同等に低い塩化ナトリウムの存在は、コンジュゲート分子を不安定化させるであろうことを見出した。
【００４６】
種々の組成物中にアレルゲンを含むコンジュゲート分子の構造的安定性は、本明細書中に記載されるように特徴付けられた。実験は、ｐＨ、温度、時間及び組成物条件、例えば、イオン強度、及び界面活性剤の存在の関数として、組成物中のコンジュゲート分子における可能な構造的変化を解明するように設計した。本明細書中に記載されるように、約０．１μｇ〜２００μｇの濃度範囲で、ＩＳＳ（Ａｍｂ  ａ１−ＩＳＳオリゴヌクレオチドコンジュゲート、即ち「ＡＩＣ」として本明細書中に言及される）に共有結合的に連結した、精製した短いブタクサ抗原、ＡＭＢ  ａ１を含むコンジュゲート分子の例示が、種々のイオン強度及び種々のｐＨ条件を含有する組成物中に透析され、次に、コンジュゲート分子を温度変化に供しながら、内部蛍光（ＩＦ）；外部蛍光（ＥＦ）；及び直角光散乱（ＲＡＬＳ）を用いることによって分析した。ＩＦ、ＥＦ、及びＲＡＬＳは、本明細書中の実施例に記載される。コンジュゲート分子は、せん断応力に供され、そして、ＲＡＬＳ及びサイズ排除クロマトグラフィーＨＰＬＣ（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）によって分析した。同じ方法、即ち、ＩＦ、ＥＦ、ＲＡＬＳ、及びＳＥＣ−ＨＰＬＣは、リン酸ナトリウム及び塩化ナトリウム（実施例中、ＰＢＳとして言及される）の存在下で、ＡＩＣを含む組成物の凍結−融解感受性を調べるために並行して使用した。
【００４７】
組成物中のＡＩＣにおける構造的変化を解明するために設計された実験の結果は、本明細書中に記載され、実施例及び表１０、１１及び１２に含まれる。表１０は、ｐＨ条件を維持するための種々の成分についての分析結果を示す。したがって、いくつかの例では、コンジュゲート分子を含む組成物のｐＨ条件を維持するための成分は、ｐＨ７．５のヒスチジン、ｐＨ８．０のヒスチジン、ｐＨ７．５のリン酸塩、ｐＨ８．０のリン酸塩、ｐＨ７．０のリン酸塩、ｐＨ７．０のヒスチジン又はｐＨ６．５のヒスチジンを含む。本明細書中に記載されるように、組合せ試験、即ち、コンジュゲート分子を含む組成物中の成分の組合せについて、組成物は、ヒスチジンを含むように調製した。表１１は、種々のアミノ酸の分析の結果を示す。したがって、いくつかの例では、コンジュゲート分子を含む組成物での使用のためのアミノ酸は、ヒスチジン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、又はアラニンを含む。組合せ試験、即ち、コンジュゲート分子を含む組成物中の成分の組合せに関して、組成物はグリシンを含むように調製した。表１２は、種々の糖質の分析の結果を示す。したがって、いくつかの例では、コンジュゲート分子を含む組成物は、糖質、例えば、ラクトース、スクロース、マンノース又はマルトースを含む。実施例６は、組合せ試験の結果を記載する。
【００４８】
約２℃と約８℃との間の温度で構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物が、本明細書中に提供される。いくつかの例では、組成物は、液体形態であり、そして、他の例では、凍結乾燥した形態である。構造的に安定なコンジュゲート分子及び約６．０〜約９．０の範囲で組成物のｐＨを維持することができる成分を含む組成物が、本明細書中に提供される。いくつかの例では、成分は、約７．０〜約８．０の範囲でｐＨを維持することができ、そして、他の例では、約７．５〜約７．８の範囲であり、そして、他の例では、約７．５のｐＨである。いくつかの例では、約６．０〜約９．０の範囲でｐＨを維持することができる成分は、中性電荷又は塩基性電荷を有する。いくつかの例では、約６．０〜約９．０の範囲でｐＨを維持することができる成分は、非極性である。いくつかの例では、約６．０〜約９．０の範囲で組成物のｐＨを維持することができる成分は、ヒスチジン又はリン酸塩からなる群から選択される。いくつかの例では、ｐＨを維持することができる成分は、約２℃と約８℃との間の温度で凝集しない形態で、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超又は９７％超のコンジュゲート分子を保持するのに十分な量で組成物中に存在する。コンジュゲート分子の凝集は、本明細書中に開示される方法、例えば、直角光散乱（ＲＡＬＳ）によって、そして、当該技術分野において既知の方法によって測定され得る。
【００４９】
他の例では、コンジュゲート分子を含む組成物は、組成物が非凝集形態又はモノマー形態で７０％超、８０％超、９０％超、９５％超又は９７％超のコンジュゲート分子を含む限り、１以上の１）アミノ酸、２）糖質、３）界面活性剤、及び４）他の適した医薬として許容される担体を含んでもよい。いくつかの例では、アミノ酸は、ヒスチジン、グリシン、イソロイシン、プロリン及びアラニンからなる群から選択される。いくつかの例では、アミノ酸は、ヒスチジン又はグリシンである。いくつかの例では、糖質は、ラクトース、スクロース、マンノース、マルトース、ソルビトール及びグルコースからなる群から選択される。いくつかの例では、糖質は、ソルビトール又はスクロースである。構造的に安定なコンジュゲート分子、及び約６．０〜約９．０の範囲で組成物のｐＨを維持することができる成分を含む組成物が、本明細書中に提供される。構造的に安定なコンジュゲート分子、約６．０〜約９．０の範囲で組成物のｐＨを維持することができる成分、及びアミノ酸を含む組成物が、本明細書中に提供される。構造的に安定なコンジュゲート分子、約６．０〜約９．０の範囲で組成物のｐＨを維持することができる成分、アミノ酸、及び糖質を含む組成物が、本明細書中に提供される。いくつかの例では、構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物は、界面活性剤をさらに含む。いくつかの例では、組成物は、液体形態であり、そして、他の例では、凍結乾燥した形態である。本発明は、凍結乾燥した形態から液体形態に再構成したコンジュゲート分子を含む組成物を包含する。
【００５０】
本明細書中に記載されるように、約３０μｇ／ｍｌ及び約６０μｇ／ｍｌを含む濃度で本明細書に記載されるＡＩＣを含み、そして、Ａｍｂ  １ａ（平均分子量：約６５ｋＤａ）の１モル当り平均約４．０モルのＩＳＳを含む液体形態での種々の組成物の評価によって、約２℃と約８℃との間の温度でＡＩＣの構造的安定性を維持する組成物を同定した。いくつかの例では、構造的安定性は、少なくとも６時間維持された。ＡＩＣを含むこれらの組成物は、限定されないが、約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のヒスチジンを含む組成物；約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のヒスチジン及び約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲のグリシンを含む組成物；約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のヒスチジン及び組成物の約１％〜約５％の範囲のソルビトールを含む組成物；約１ｍＭ〜約５０ｍＭの範囲のヒスチジン、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲のグリシン、及び組成物の約１％〜約５％の範囲のソルビトールを含む組成物を含み、これらはすべて約７．０〜約８．０の範囲のｐＨを有する。ＡＩＣ（本明細書中に記載されるように、低い（Ｌ）、中くらい（Ｍ）又は高い（Ｈ）状態であってもよい）を含む組成物が本明細書中に提供され、ここで、組成物中のＡＩＣは、約２℃〜約８℃の間の温度で構造的に安定であり、限定されないが、
・約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲又は約７．５のｐＨでの５ｍＭ  ヒスチジン、２８５ｍＭ  グリシン；
・約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲又は約７．５のｐＨでの２０ｍＭ  ヒスチジン、２７０ｍＭ  グリシン；
・約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲又は約７．５のｐＨでの２０ｍＭ  ヒスチジン、５０ｍＭ  グリシン、３．８％  ソルビトール；
・約７．０と約８．０との間のｐＨ範囲又は約７．５のｐＨでの２０ｍＭ  ヒスチジン、５０ｍＭ  グリシン、２１０ｍＭ  スクロース
を含む。
【００５１】
本明細書中に開示した実験結果に基づいて、構造的に安定であると予測されるＡＩＣの更なる組成物を下記に示す。
【００５２】
【表１】
2008531722.tif 000002
【００５３】
例えば、サイズ排除（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）のような分析用ＨＰＬＣ法とＳＤＳ−ＰＡＧＥとを組み合わせたＩＦ、ＥＦ及びＲＡＬＳは、組成物中のコンジュゲート分子の構造的安定性についての条件を測定するために、ｐＨ、温度及び時間、並びに溶液条件（即ち、イオン強度、界面活性剤等）の関数として、組成物中の任意のコンジュゲート分子の振る舞いを評価するように設計することができる。
【００５４】
コンジュゲートパートナー
本発明に包含されるコンジュゲートパートナーは、限定されないが、抗原、例えば、ペプチド、タンパク質、糖タンパク質、多糖、複合糖質、糖、ガングリオシド、脂質及びリン脂質；それらの部分及びそれらの組合せを含む。いくつかの例では、抗原は、原生動物、細菌、真菌（単細胞及び多細胞を含む）、及びウイルス感染体を含む感染体由来であり得る。例えば、寄生生物由来の抗原は、住血吸虫種（例えば、Ｓ．マンソニ）由来の住血吸虫卵（例えば、Ｓｍ−ｐ４０）、及びトキソプラズマ種（例えば、Ｔ．ゴンジイ）由来の抗原を含む。例えば、Ｓｔａｄｅｃｋｅｒら（１９９８）、Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０：２１７−２２１；Ｓｕｂａｕｓｔｅら（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：５３２−５２７を参照されたい。抗原は、当該技術分野において既知の精製技術を用いてそれらの供給源から単離してもよく、より好都合には、組換え法を用いて生産してもよい。抗原性ペプチドは、精製した天然ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗製タンパク質抽出物、弱毒化又は不活化ウイルス、細胞、微生物、又はこのようなペプチドの断片を含むことができる。免疫調節性ペプチドは、天然であるか又は化学的若しくは酵素的に合成され得る。当該技術分野に既知の化学合成の任意の方法が適している。溶液相ペプチド合成は、中程度サイズのペプチドを構築するために使用することができ、あるいは、ペプチドの化学的構築については、固相合成を使用することができる。Ａｔｈｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６２：８３３−８３９。タンパク質分解酵素はまた、アミノ酸をカップルさせ、ペプチドを生成するために利用することができる。その代わりに、ペプチドは、細胞の生化学的機構を用いることによって、又は生物源からの分離によって得ることができる。組換えＤＮＡ技術は、ペプチドの生成のために使用することができる。ペプチドはまた、アフィニティークロマトグラフィーのような標準的な技術を用いて分離することができる。一般的には、抗原は、ペプチド、脂質（例えば、コレステロールを除くステロール、脂肪酸、及びリン脂質）、多糖、ガングリオシド及び糖タンパク質である。これらは、化学的及び酵素的方法を用いた分離及び合成を含む当該技術分野において既知のいくつかの方法を介して得ることができる。ある場合には、多くのステロール、脂肪酸及びリン脂質の場合のように、分子の抗原性部分は、商業的に利用可能である。感染体由来の抗原は、当該技術分野において既知の方法を用いて、天然のウイルス又は細菌抽出物、感染体で感染した細胞、精製したポリペプチド、組換え的に生成したポリペプチドから及び／又は合成ペプチドとして得てもよい。
【００５５】
いくつかの例では、抗原はアレルゲンである。組換えアレルゲンの例は、表１に提供され、限定されないが、甲殻類アレルゲン、昆虫アレルゲン、哺乳動物アレルゲン、軟体動物アレルゲン、植物アレルゲン、及び真菌アレルゲンを含む。いくつかの例では、アレルゲンは、植物アレルゲンである。他の例では、アレルゲンは、ブタクサアレルゲンＡｍｂ  ａ１である。多くのアレルゲンの調製は、当該技術分野において周知であり、限定されないが、ブタクサ花粉アレルゲン抗原Ｅ（Ａｍｂ  ａ１）（Ｒａｆｎａｒら（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１２２９−１２３６）、主要な埃ダニアレルゲンＤｅｒ  ｐＩ及びＤｅｒ  ＰＩＩ（Ｃｈｕａら（１９８８）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６７：１７５−１８２；Ｃｈｕａら（１９９０）Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｐｐｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９１：１２４−１２９）、白樺花粉Ｂｅｔ  ｖｌ（Ｂｒｅｉｔｅｎｅｄｅｒら（１９８９）ＥＭＣＯ  Ｊ．８：１９３５−１９３８）、家ネコアレルゲンＦｅｌ  ｄＩ（Ｒｏｇｅｒｓら（１９９３）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３０：５５９−５６８）、及び樹木花粉由来のタンパク質抗原（Ｅｌｓａｙｅｄら（１９９１）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｓｕｐｐｌ．２０４：１７−３１）を含む。示されるように、樹木由来のアレルゲンは知られ、樺の木、ネズ、ニホンスギ由来のアレルゲンを含む。インビボ投与のための花粉からのタンパク質抗原の調製が報告されている。Ｍａｌｌｅｙ（１９８９）Ｊ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６：１７３−１８６。表１に示されるように、いくつかの例では、アレルゲンは、食物アレルゲン、例えばピーナッツアレルゲン、例えばＡｒａ  ｈＩであり、そして、いくつかの例では、アレルゲンは、草アレルゲン、例えばライムギアレルゲン、例えばＬｏｌ  ｐＩである。表１は、本発明に包含されるアレルゲンのリストを示す。
【００５６】
【表２】
2008531722.tif 000003
【００５７】
【表３】
2008531722.tif 000004
【００５８】
【表４】
2008531722.tif 000005
【００５９】
【表５】
2008531722.tif 000006
【００６０】
いくつかの例では、抗原は、原生動物、細菌、真菌（単細胞及び多細胞を含む）、及びウイルス感染体を含む感染体由来である。適切なウイルス抗原の例は、本明細書中に記載され、そして、当該技術分野において既知である。細菌は、ヘモフィラス・インフルエンザ、マイコバクテリウム・ツベルクロ（登録商標）シス及びボルデテラ・ペルツシスを含む。原生動物感染体は、マラリア原虫、リーシュマニア種、トリパノソーマ種及び住血吸虫種を含む。真菌は、カンジダ・アルビカンスを含む。
【００６１】
いくつかの例では、抗原は、ウイルス抗原である。ウイルス性ポリペプチド抗原は、限定されないが、ＨＩＶｇａｇタンパク質（限定されないが、膜固定（ＭＡ）タンパク質、コアカプシド（ＣＡ）タンパク質及びヌクレオカプシド（ＮＣ）タンパク質を含む）のようなコアタンパク質、ＨＩＶポリメラーゼ、インフルエンザウイルス・マトリックス（Ｍ）タンパク質及びインフルエンザウイルス・ヌクレオシドカプシド（ＮＰ）タンパク質を含む。インフルエンザのワクチン化を検討した参考文献は、Ｓｃｈｅｒｌｅ及びＧｅｒｈａｒｄ（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：４４４６−４４５０；Ｓｃｈｅｒｌｅ及びＧｅｒｈａｒｄ（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６４：１１１４−１１２８；Ｇｒａｎｏｆｆら（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：Ｓ４６−５１；Ｋｏｄｉｈａｌｌｉら（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：３３９１−３３９６；Ａｈｍｅｉｄａら（１９９３）Ｖａｃｃｉｎｅ  １１：１３０２−１３０９；Ｃｈｅｎら（１９９９）Ｖａｃｃｉｎｅ  １７：６５３−６５９；Ｇｏｖｏｒｋｏｖａ及びＳｍｉｒｎｏｖ（１９９７）Ａｃｔａ  Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）４１：２５１−２５７；Ｋｏｉｄｅら（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ  １３：３−５；Ｍｂａｗｕｉｋｅら（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：１３４０−１３４８；Ｔａｍｕｒａら（１９９４）Ｖａｃｃｉｎｅ  １２：３１０−３１６；Ｔａｍｕｒａら（１９９２）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：４７７−４８１；Ｈｉｒａｂａｙａｓｈｉら（１９９０）Ｖａｃｃｉｎｅ  ８：５９５−５９９を含む。抗原ポリペプチドの他の例は、グループ又はサブグループ特異的抗原であり、多くの感染体について知られ、限定されないが、アデノウイルス、単純疱疹ウイルス、パピローマウイルス、呼吸器合胞体ウイルス及びポックスウイルスを含む。
【００６２】
多くの抗原性ペプチド及びタンパク質が知られ、及び当該技術分野において利用可能であり；他は、慣用的な技術を用いて同定することができる。腫瘍形成に対する免疫化について、免疫調節性ペプチドは、腫瘍細胞（生存又は照射）、腫瘍細胞抽出物、例えば、Ｈｅｒ−２／ｎｅｕ、Ｍａｒｔ１、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ガングリオシド、ヒト乳脂肪球（ＨＭＦＧ）、ムチン（ＭＵＣ１）、ＭＡＧＥ抗原、ＢＡＧＥ抗原、ＧＡＧＥ抗原、ｇｐ１００、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、及びチロシナーゼのような腫瘍抗原のタンパク質サブユニットを含むことができる。免疫を基礎とした避妊のためのワクチンは、ＩＳＳと一緒に投与した精子タンパク質を含むことによって形成され得る。Ｌｅａら（１９９６）Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １３０７：２６３。
【００６３】
弱毒化及び不活化ウイルスは、抗原として本明細書での使用に適している。これらのウイルスの調製は、当該技術分野において周知であり、多くは、商業的に利用可能である（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（１９９８）第５２版、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．）。例えば、ポリオウイルスは、ＩＰＯＬ（登録商標）（Ｐａｓｔｅｕｒ  Ｍｅｒｉｅｕｘ  Ｃｏｎｎａｕｇｈｔ）及びＯＲＩＭＵＮＥ（登録商標）（Ｌｅｄｅｒｌｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）として、Ａ型肝炎ウイルスはＶＡＱＴＡ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）として、麻疹ウイルスはＡＴＴＥＮＵＶＡＸ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）として、流行性耳下腺炎ウイルはＭＵＭＰＳＶＡＸ（登録商標）（Ｍｅｒｃｋ）として、及び風疹ウイルスはＭＥＲＵＶＡＸ（登録商標）ＩＩ（Ｍｅｒｃｋ）として利用可能である。加えて、弱毒化及び不活化ウイルス、例えば、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、単純疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ロタウイルス、ヒト及びヒト以外のパピローマウイルス及び脳機能低下ウイルスは、ペプチド抗原を提供し得る。
【００６４】
いくつかの例では、抗原は、ワクシニア、アデノウイルス、及びカナリア痘のようなウイルスベクターを含む。
抗原は、当該技術分野において既知の精製技術を用いてそれらの供給源から分離してもよく、より慣用的には、組換え法を用いて生成してもよい。
【００６５】
抗原性ペプチドは、精製した天然のペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、粗製タンパク質抽出物、弱毒化若しくは不活化ウイルス、細胞、微生物、又はこのようなペプチドの断片を含むことができる。免疫調節性ペプチドは、天然であるか又は化学的若しくは酵素的に合成することができる。当該技術分野において既知の化学的合成の任意の方法が適している。溶液相ペプチド合成は、中程度の大きさのペプチドを構築するために使用されることができ、あるいはペプチドの化学的構築に関しては、固相合成を使用することができる。Ａｔｈｅｒｔｏｎら（１９８１）Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ  Ｚ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３６２：８３３−８３９。タンパク質分解酵素はまた、アミノ酸をカップルしてペプチドを生成するために利用することができる。Ｋｕｌｌｍａｎｎ（１９８７）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．。その代わりに、ペプチドは、細胞の生化学的機構を用いることによって、又は生物原からの分離によって得ることができる。組換えＤＮＡ技術は、ペプチド生成のために使用することができる。Ｈａｍｅｓら（１９８７）Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ。ペプチドはまた、アフィニティークロマトグラフィーのような標準的な技術を用いて分離することができる。
【００６６】
いくつかの例では、抗原は、ペプチド、脂質（例えば、ステロール、脂肪酸、及びリン脂質）、Ｈ．インフルエンザワクチンで使用されるもののような多糖、ガングリオシド及び糖タンパク質である。これらは、化学的方法及び酵素的方法を用いた分離及び合成を含む当該技術分野において既知のいくつかの方法を通じて得ることができる。ある場合には、多くのステロール、脂肪酸及びリン脂質の場合のように、分子の抗原性部分は、商業的に利用可能である。
【００６７】
対象の組成物及び組成物を用いた方法に使用されるウイルス抗原の例は、限定されないが、ＨＩＶ抗原を含む。このような抗原は、限定されないが、ＨＩＶエンベロープ糖タンパク質由来の抗原を含み、限定されないが、ｇｐ１６０、ｇｐ１２０及びｇｐ４１を含む。ＨＩＶ遺伝子及び抗原の無数の配列が知られる。例えば、Ｌｏｓ  Ａｌａｍｏｓ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ＨＩＶ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａｂａｓｅは、ＨＩＶヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を収集し、管理し、そして注釈を付ける。このデータベースは、インターネットを通じてhttp://hiv-web.lanl.gov/で、そして、年１回の刊行物（Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ＡＩＤＳ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ（例えば、１９９８年版を参照されたい）にアクセスすることができる。
【００６８】
感染体由来の抗原は、当該技術分野において既知の方法を用いて、例えば、天然ウイルス若しくは細菌抽出物から、感染体で感染させた細胞から、生成したポリペプチドから、組換え的に生成したポリペプチドから、及び／又は合成ペプチドから得てもよい。
【００６９】
ＩＳＳ
本発明に従って、コンジュゲート分子は、少なくとも１つのＩＳＳを含有し、そして複数のＩＳＳを含むことができる。ＩＳＳは、ポリヌクレオチド内に隣接することができ、あるいはポリヌクレオチド内の追加したヌクレオチド塩基によって分別することができる。
【００７０】
ＩＳＳは、当該技術分野において説明されており、そして、サイトカイン分泌、抗体産生、ＮＫ細胞活性化及びＴ細胞増殖のような免疫応答の種々の側面を含む標準的なアッセイを用いて容易に同定してもよい。例えば、ＷＯ９７／２８２５９；ＷＯ９８／１６２４７；ＷＯ９９／１１２７５；Ｋｒｉｅｇら（１９９５）Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：５４６−５４９；Ｙａｍａｍｏｔｏら（１９９２ａ）；Ｂａｌｌａｓら（１９９６）；Ｋｌｉｎｍａｎら（１９９７）；Ｓａｔｏら（１９９６）；Ｐｉｓｅｔｓｋｙ（１９９６ａ）；Ｓｈｉｍａｄａら（１９８６）Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７７：８０８−８１６；Ｃｏｗｄｅｒｙら（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５６：４５７０−４５７５；Ｒｏｍａｎｎら（１９９７）；及びＬｉｐｆｏｒｄら（１９９７ａ）を参照されたい。
【００７１】
ＩＳＳは、６個の塩基又は塩基対より多い任意の長さであり得て、一般的に、配列５’−シトシン、グアニン−３’を含み、より具体的には配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン−３’（例えば、５’−ＡＡＣＧＴＴ−３’）、好ましくは、いくつかの例では、長さにして１５個の塩基又は塩基対より多く、より好ましくは、いくつかの例では、２０個の塩基又は塩基対より多い。ＩＳＳはまた、配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｇ−３’を含んでもよい。ＩＳＳはまた、配列５’−プリン、プリン、Ｃ、Ｇ、ピリミジン、ピリミジン、Ｃ、Ｃ−３’を含んでもよい。下記のポリヌクレオチド配列に示されるように、ＩＳＳはまた、配列５’−Ｔ、Ｃ、Ｇ−３’を含んでもよい。
【００７２】
いくつかの例では、ＩＳＳは、下記の配列：
ＧＡＣＧＣＴＣＣ；ＧＡＣＧＴＣＣＣ；ＧＡＣＧＴＴＣＣ；ＧＡＣＧＣＣＣＣ；ＡＧＣＧＴＴＣＣ；ＡＧＣＧＣＴＣＣ；ＡＧＣＧＴＣＣＣ；ＡＧＣＧＣＣＣＣ；ＡＡＣＧＴＣＣＣ；ＡＡＣＧＣＣＣＣ；ＡＡＣＧＴＴＣＣ；ＡＡＣＧＣＴＣＣ；ＧＧＣＧＴＴＣＣ；ＧＧＣＧＣＴＣＣ；ＧＧＣＧＴＣＣＣ；ＧＧＣＧＣＣＣＣ；ＧＡＣＧＣＴＣＧ；ＧＡＣＧＴＣＣＧ；ＧＡＣＧＣＣＣＧ；ＧＡＣＧＴＴＣＧ；ＡＧＣＧＣＴＣＧ；ＡＧＣＧＴＴＣＧ；ＡＧＣＧＴＣＣＧ；ＡＧＣＧＣＣＣＧ；ＡＡＣＧＴＣＣＧ；ＡＡＣＧＣＣＣＧ；ＡＡＣＧＴＴＣＧ；ＡＡＣＧＣＴＣＧ；ＧＧＣＧＴＴＣＧ；ＧＧＣＧＣＴＣＧ；ＧＧＣＧＴＣＣＧ；ＧＧＣＧＣＣＣＧ
のいずれかを含む。
【００７３】
いくつかの例では、ＩＳＳは、下記の配列：
ＧＡＣＧＣＴ；ＧＡＣＧＴＣ；ＧＡＣＧＴＴ；ＧＡＣＧＣＣ；ＧＡＣＧＣＵ；ＧＡＣＧＵＣ；ＧＡＣＧＵＵ；ＧＡＣＧＵＴ；ＧＡＣＧＴＵ；ＡＧＣＧＴＴ；ＡＧＣＧＣＴ；ＡＧＣＧＴＣ；ＡＧＣＧＣＣ；ＡＧＣＧＵＵ；ＡＧＣＧＣＵ；ＡＧＣＧＵＣ；ＡＧＣＧＵＴ；ＡＧＣＧＴＵ；ＡＡＣＧＴＣ；ＡＡＣＧＣＣ；ＡＡＣＧＴＴ；ＡＡＣＧＣＴ；ＡＡＣＧＵＣ；ＡＡＣＧＵＵ；ＡＡＣＧＣＵ；ＡＡＣＧＵＴ；ＡＡＣＧＴＵ；ＧＧＣＧＴＴ；ＧＧＣＧＣＴ；ＧＧＣＧＴＣ；ＧＧＣＧＣＣ；ＧＧＣＧＵＵ；ＧＧＣＧＣＵ；ＧＧＣＧＵＣ；ＧＧＣＧＵＴ；ＧＧＣＧＴＵ
のいずれかを含む。
【００７４】
いくつかの例では、免疫調節ポリヌクレオチドは、配列５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号１）を含む。他の例では、ＩＳＳは、配列５’−ＴＧＡＣＣＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号２）；５’−ＴＣＡＴＣＴＣＧＡＡＣＧＴＴＣＣＡＣＡＧＴＣＡ−３’（配列番号３）；５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号４）；５’−ＴＣＣＡＴＡＡＣＧＴＴＣＧＣＣＴＡＡＣＧＴＴＣＧＴＣ−３’（配列番号５）；５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号６）（ここで、Ｂは、５−ブロモシトシンである）；５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号７）（ここで、Ｂは、５−ブロモシトシンである）；そして、５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＢＧＴＴＢＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号８）（ここで、Ｂは、５−ブロモシトシンである）のいずれかを含む。
【００７５】
ＩＳＳ及び／又はＩＳＳを含有するポリヌクレオチドは、修飾を含有してもよい。ＩＳＳの修飾は、当該技術分野において既知のいずれか、限定されないが、３’ＯＨ又は５’ＯＨ基の修飾、ヌクレオチド塩基の修飾、糖成分の修飾、及びリン酸基の修飾を含む。種々のこのような修飾は、下記に記載される。
【００７６】
ＩＳＳは、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ、並びに一本鎖又は二本鎖ＲＮＡ又は他の修飾したポリヌクレオチドであってもよい。ＩＳＳは、上述した六量体モチーフに存在してもよいか又はそのモチーフを超えて拡大してもよい１以上の回文領域を含んでもよく又は含まなくてもよい。ＩＳＳは、追加のフランキング配列を含んでもよく、そのいくつかは本明細書中に記載される。ＩＳＳは、天然に発生するか又は修飾された非天然に発生する塩基を含有してもよく、そして修飾した糖、リン酸塩、及び／又は末端を含有してもよい。例えば、リン酸塩修飾は、限定されないが、リン酸メチル、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート（ブリッジ又はブリッジなし）、ホスホトリエステル及びホスホロジチオエートを含み、そして、任意の組合せで使用してもよい。他のリン酸塩でない連結はまた使用されてもよい。いくつかの例では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエート骨格を含む。この領域において既知の糖修飾、例えば、２’−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２’−アミノ−ＲＮＡ類似体及び２’−アルコキシ−又はアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラ及び本明細書中に記載される他のものはまた、作製され、そして任意のリン酸塩修飾と組み合わせてもよい。塩基修飾の例は、限定されないが、ＩＳＳのシトシンのＣ−５及び／又はＣ−６（例えば、５−ブロモシトシン、５−クロロシトシン、５−フルオロシトシン、５−ヨードシトシン）に電子求引部分の添加を含む。
【００７７】
ＩＳＳは、当該技術分野において周知である技術及び核酸合成装置を用いて合成することができ、限定されないが、酵素的方法、化学的方法、及びより大きなオリゴヌクレオチド配列の分解を含む。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら（１９８７）；及びＳａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）を参照されたい。酵素的に集結させる場合、個々のユニットは、例えば、Ｔ４  ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼのようなリガーゼを用いて連結することができる。米国特許第５，１２４，２４６号。オリゴヌクレオチド分解は米国特許第４，６５０，６７５号に例示されるように、オリゴヌクレオチドをヌクレアーゼに晒すことを通じて達成され得る。
【００７８】
ＩＳＳはまた、慣用的なポリヌクレオチド単離手法を用いて単離することができる。このような手法は、限定されないが、共通したヌクレオチド配列を検出するためのプローブによるゲノム又はｃＤＮＡライブラリーへのハイブリダイゼーション、共通した構造的特徴を検出するための発現ライブラリーの抗体スクリーニング、及びポリメラーゼ連鎖反応による特定の天然配列の合成を含む。
【００７９】
環状ＩＳＳは、単離され、組換え法を介して合成され、又は化学的に合成することができる。環状ＩＳＳは、単離を介して又は組換え法を介して得られる場合、ＩＳＳは、いくつかの例では、プラスミドであろう。より小さな環状オリゴヌクレオチドの化学的合成は、文献に記載される任意の方法を用いて実行され得る。例えば、Ｇａｏら（１９９５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２０２５−２０２９；及びＷａｎｇら（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：２３２６−２３３３を参照されたい。
【００８０】
オリゴヌクレオチド及び修飾したオリゴヌクレオチドを作製する技術は、当該技術分野において既知である。天然に発生するＤＮＡ又はＲＮＡは、ホスホジエステル結合を含有し、一般的には、３’−末端で固体支持体に結合した成長しているオリゴヌクレオチドの５’−ヒドロキシ基に適切なホスホルアミダイトを連続的にカップリングさせ、その後、中間体の亜リン酸トリエステルをリン酸トリエステルに酸化することによって合成される。所望のオリゴヌクレオチド配列が合成されると、オリゴヌクレオチドは、支持体から除去され、リン酸トリエステル基は、リン酸ジエステルに脱保護され、そして、ヌクレオチド塩基は、アンモニア水又は他の塩基を用いて脱保護される。例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９９３）“Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ａｇｒａｗａｌ編集）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ；Ｗａｎｅｒら（１９８４）ＤＮＡ  ３：４０１及び米国特許第４，４５８，０６６号を参照されたい。
【００８１】
ＩＳＳはまた、リン酸塩修飾したオリゴヌクレオチドを含有することができる。修飾したリン酸塩連結又は非リン酸塩連結を含有するポリヌクレオチドの合成はまた、当該技術分野において既知である。概説として、Ｍａｔｔｅｕｃｃｉ（１９９７）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ：ａｎ  Ｏｖｅｒｖｉｅｗ”ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ，（Ｄ．Ｊ．Ｃｈａｄｗｉｃｋ及びＧ．Ｃａｒｄｅｗ編集）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ及びＳｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹを参照されたい。本発明のオリゴヌクレオチドにおける糖又は糖類似部分に結合され得るリン誘導体（又は修飾したリン酸基）は、一リン酸塩、二リン酸塩、三リン酸塩、アルキルリン酸塩、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等であり得る。上述したリン酸塩類似体の調製、及びそれらのヌクレオチド、修飾したヌクレオチド及びオリゴヌクレオチドへの導入それ自体はまた知られ、本明細書中に詳細に記載する必要はない。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：１８４１−１８４８；Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２３１８−２３２３；及び、Ｓｃｈｕｌｔｚら（１９９６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２９６６−２９７３。例えば、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの合成は、酸化工程を硫化工程（Ｚｏｎ（１９９３）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｏｔｈｉｏａｔｅｓ”ｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｌｃｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ａｇｒａｗａｌ編集）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．１６５−１９０）に置換することを除いて、天然に発生するオリゴヌクレオチドに関して上記したのと類似する。同様に、他のリン酸塩アナログ、例えば、ホスホトリエステル（Ｍｉｌｌｅｒら（１９７１）ＪＡＣＳ  ９３：６６５７−６６６５）、非架橋ホスホルアミデート（Ｊａｇｅｒら（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７：７２４７−７２４６）、Ｎ３’からＰ５’ホスホルアミデート（Ｎｅｌｓｏｎら（１９９７）ＪＯＣ  ６２：７２７８−７２８７）及びホスホロジチオエート（米国特許第５，４５３，４９６号）の合成はまた、記載されている。他のリンを基礎としていない修飾オリゴヌクレオチドはまた使用することができる（Ｓｔｉｒｃｈａｋら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：６１２９−６１４１）。ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル骨格を有するものより免疫原性であり得て、宿主への注射後の分解により耐性であるようだ。Ｂｒａｕｎら（１９８８）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４１：２０８４−２０８９；及び、Ｌａｔｉｍｅｒら（１９９５）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３２：１０５７−１０６４。
【００８２】
本発明において使用されるＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチド（唯一の又は主な糖成分としてリボースを含有する）、デオキシリボヌクレオチド（主な糖成分としてデオキシリボースを含有する）を含むことができ、あるいは、当該技術分野において知られるように、修飾した糖又は糖類似体はＩＳＳに導入され得る。つまり、リボース及びデオキシリボースに加えて、糖部分は、ペントース、デオキシペントース、ヘキソース、デオキシヘキソース、グルコース、アラビノース、キシロース、リキソース、及び糖「類似体」シクロペンチル基であり得る。糖は、ピラノシル形態又はフラノシル形態であり得る。ＩＳＳにおいて、糖部分は、いくつかの例では、リボース、デオキシリボース、アラビノース又は２’−Ｏ−アルキルリボースのフラノシドであり、そして、糖は、α又はβアノマー配置のいずれいかで、それぞれヘテロ環塩基に結合することができる。糖修飾は、限定されないが、２’−アルコキシ−ＲＮＡ類似体、２’−アミノ−ＲＮＡ類似体及び２’−アルコキシ−又はアミノ−ＲＮＡ／ＤＮＡキメラを含む。これらの糖又は糖類似体、及びこのような糖又は類似体がヘテロ環塩基（核酸塩基）に結合されるそれぞれの「ヌクレオチド」はそれ自体の調製は知られ、このような調製が任意の特定の例に適切であり得るという程度を除いて、本明細書中に記載する必要はない。糖修飾はまた、ＩＳＳの調製においてなされ、そして任意のリン酸塩修飾と組み合わせてもよい。
【００８３】
ヘテロ環塩基、又は核酸塩基は、ＩＳＳに導入され、天然に発生する主なプリン及びピリミジン塩基（即ち、ウラシル又はチミン、シトシン、アデニン及びグアニン、上述）、並びに前記の主な塩基の天然に発生し合成的な修飾であり得る。
【００８４】
当業者は、種々のヘテロ環塩基及び糖部分（及び糖類似体）を含む大多数の「合成の」非天然ヌクレオチドが当該技術分野において利用可能であり、そして、本発明の他の基準が満たされる限り、ＩＳＳは、天然に発生する核酸の主要な５つの塩基成分以外の１又は複数個のヘテロ環塩基を含み得ることを認識するであろう。しかしながら、いくつかの例では、ＩＳＳ中のヘテロ環塩基は、限定されないが、ウラシル−５−イル、シトシン−５−イル、アデニン−７−イル、アデニン−８−イル、グアニン−７−イル、グアニン−８−イル、４−アミノピロロ［２．３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−５−イル、２−アミノ−４−オキソピロロ［２．３−］ピリミジン−３−イル基を含み、それは、プリンが９位を介してピリミジンが１位を介して、ピロロピリミジンが７位を介して、そしてピラゾロピリミジンが１位を介してＩＳＳの糖部分に結合した場合である。
【００８５】
ＩＳＳは、共通して所有される米国特許第６，５６２，７９８号（ＵＳＳＮ３２４，１９１）及び国際出願ＷＯ９９／６２９２３に記載される少なくとも１つの修飾塩基を含んでもよい。本明細書中で使用されるとき、「修飾塩基」は、「塩基類似体」と同義であり、例えば、「修飾したシトシン」は、「シトシン類似体」と同義である。同様に、「修飾した」ヌクレオシド又はヌクレオチドは、本明細書中、ヌクレオシド又はヌクレオチド「類似体」であるものとして定義される。塩基修飾の例は、限定されないが、電子求引性部分によるＩＳＳのシトシンのＣ−５及び／又はＣ−６への添加を含む。いくつかの例では、電子求引部分はハロゲンである。このような修飾したシトシンは、限定されないが、アザシトシン、５−ブロモシトシン、ブロモウラシル、５−クロロシトシン、塩素化シトシン、シクロシトシン、シトシンアラビノシド、５−フルオロシトシン、フルオロピリミジン、フルオロウラシル、５，６−ジヒドロシトシン、５−ヨードシトシン、ヒドロキシウレア、ヨードウラシル、５−ニトロシトシン、ウラシル、及び任意の他のピリミジン類似体又は修飾したピリミジンを含むことができる。
【００８６】
塩基修飾したヌクレオシドの調製、及び前駆体として前記塩基修飾したヌクレオシドを用いた修飾したオリゴヌクレオチドの合成は、例えば、米国特許第４，９１０，３００号、第４，９４８，８８２号、及び第５，０９３，２３２号に記載されている。これらの塩基修飾したヌクレオシドは、それらがオリゴヌクレオチドの末端又は内部位置のいずれかに化学合成によて導入し得るように設計されている。このような塩基修飾したヌクレオシドは、オリゴヌクレオチドの末端又は内部位置のいずれかに存在し、ペプチド又は他の抗原の結合のための部位として使用され得る。それらの糖部分において修飾されたヌクレオシドはまた記載され（限定されないが、例えば、米国特許第４，８４９，５１３号、第５，０１５，７３３号、第５，１１８，８００号、第５，１１８，８０２号を含む）、そして同様に使用することができる。
【００８７】
いくつかの例では、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、下記の長さ（塩基又は塩基対で）：およそ１０，０００；５，０００；２５００；２０００；１５００；１２５０；１０００；７５０；５００；３００；２５０；２００；１７５；１５０；１２５；１００；７５；５０；２５；１０のいずれかより短い。いくつかの例では、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、下記の長さ（塩基又は塩基対で）：およそ６；７；８；１０；１５；２０；２５；３０；４０；５０；６０；７５；１００；１２５；１５０；１７５；２００；２５０；３００；３５０；４００；５００；７５０；１０００；２０００；５０００；７５００；１００００；２００００；５００００のいずれかよりも長い。いくつかの例では、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、長さにして約６塩基又は塩基対より長く、かつ、長さにして約２００塩基又は塩基対より短い。
【００８８】
種々の構造的及び免疫調節特性を有するコンジュゲート分子集団
一般的に、本発明及び本明細書中に記載したコンジュゲート分子の分類又は集団は、下記：
（ａ）抗原に付着又は連結したＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均値の数；
（ｂ）抗原に付着又は連結したＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの中央値の数；
（ｃ）ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均質量と抗原の平均質量の比；
（ｄ）ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの中央値の質量と抗原の中央値の質量の比；
（ｅ）（ｉ）抗原特異的抗体の抗原への結合阻害に要求されるＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原特異的抗体の抗原への同程度の阻害に必要とされる抗原の濃度の比（下記に記載されるように、これらの比は、通常、必要ないが、５０％阻害で計算される）；
（ｆ）アレルゲンである抗原に関して、（ｉ）抗原に感受性の個体由来の好塩基球からのヒスタミン放出に必要とされるＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原に感受性のある個体由来の好塩基球からのヒスタミン放出の同程度に必要とされる抗原の濃度の比；
（ｇ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発されるＴｈ１関連抗体及びＴｈ２関連抗体の総量と（ｉｉ）抗原によって誘発されるＴｈ１関連抗体及びＴｈ２関連抗体の総量の比；
（ｈ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発されるＴｈ１関連抗体と（ｉｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発されるＴｈ２関連抗体の比；
（ｉ）抗原単独と比較した場合の異なるサイトカイン産生プロフィール；
（ｊ）抗原特異的抗体産生の抑制の程度
を含む、多くの構造及び／又は機能的特性のいずれかによって区別及び／又は定義されてもよい。
【００８９】
これらの分類及び本明細書中に記載される実施例の全てが記載され、及び／又は上記で列挙した特性の１つ、１より多く、及び／又は任意の組み合わせによって定義されてもよい。したがって、本発明は、構造的に安定なコンジュゲート分子の集団を含む組成物を提供し、前記コンジュゲート分子は、抗原、及び免疫賦活化配列（ＩＳＳ）を含む１以上のポリヌクレオチドを含み、ここで、前記集団は、単独で又は任意に組み合わせて、本明細書中に記載された１以上の任意の特性を含む。特性（比を含む）は、当該技術分野において標準的な技術及び本明細書に記載された技術を用いて測定してもよく、そして、任意のこれらの特性は、マウス及び／又はヒトを含む脊椎動物及び哺乳動物のようなインビボ系を含む多様な系で測定されてもよいことが理解される。
【００９０】
例えば、上記に従って、そしてＡｍｂ  ａ１及びＩＳＳ含有の２２マーのポリヌクレオチド（５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’、配列番号１）のコンジュゲートに関連する観察に基づいて、「Ｈ」クラスは、下記のいずれかの特性：
（ａ）抗原分子当り少なくとも約５．５個、及びいくつかの例では、６個のＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均；
（ｂ）（ｉ）ＩＳＳ含有のポリヌクレオチドの平均の質量と（ｉｉ）抗原の平均の質量の比が、（ｉｉ）約４０に対して（ｉ）約又は代替的に少なくとも約３５、４０又は４５であり；
（ｃ）（ｉ）抗原特異的抗体の抗原への結合の５０％阻害に必要なＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原特異的抗体の抗原への結合の５０％阻害に必要な抗原抗原の濃度の比が、約３．５〜約６．０又はそれより高い（限定されないが、７．０、８．０、９．０、１０．０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０又はそれより高い）、あるいは、その代わりに、少なくとも下記の約：３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、８．０、９．０、１０、１５、２０、２５のいずれかである（範囲として表現する場合、上限は、列挙されたものを含む任意の数であってよい）；
【００９１】
（ｄ）例えば、抗原がアレルゲンである場合において、（ｉ）抗原感受性の個体由来の好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要なＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原感受性の個体由来の好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要な抗原の濃度の比は、約３００より大きく、約５００より大きく、約７５０より大きく、約１０００より大きく、約１２５０より大きく、約１４００より大きく、約１５００より大きい（上限が任意の数であり、限定されないが、７５０、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００を含む）；
（ｅ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発され総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当りで誘発された抗体の観点で）と（ｉｉ）抗体によって誘発された総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体（投与された抗原の単位質量の観点で）の比は、下記の約１０、７、５、４、３．５、３．０、２．５、２．０、１．５、１．０、０．７５、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１のいずれかであるか、あるいは、その代わりにそれより小さい；
（ｆ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発される総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当り誘発された抗体の観点で）と（ｉｉ）抗原によって誘発されるＴｈ１−及びＴｈ２−関連抗体（投与されたコンジュゲートの量と比べて投与された苦言の単位質量の１０倍という観点で）の比は、下記の約１．０、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１１、０．０７５、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１のいずれかであるか、あるいは、その代わりにそれよりも小さい；
【００９２】
（ｇ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当りの誘発された抗体の観点で）と（ｉｉ）抗原によって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの量と比べて投与された抗原の単位質量の観点で）の比は、下記：約６０、５５、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５のいずれかであるか、あるいは、その代わりにそれよりも小さい；
（ｈ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当りの誘発された抗体の観点で）と（ｉｉ）コンジュゲートによって誘発されたＴｈ２−関連抗体の力価の比は、下記：約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０のいずれかであるか、あるいは、その代わりにそれよりも大きい（範囲として表現される場合、上限は、任意の数であり、列挙されたもの、並びに１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７５、８０、９０、１００のような他のものを含んでよい）；
（ｉ）同量の連結していないＩＳＳ含有ポリヌクレオチド及び抗原の投与と比較して、あるいは同量の抗原のみの投与と比較して、抗原特異的抗体産生（Ｔｈ１−関連抗体及び／又はＴｈ２−関連抗体を含む）の抑制
の単独又は組合せによって定義される。
【００９３】
「Ｍ」クラスは、下記のいずれかの特性：
（ａ）抗原分子当り平均約３〜約５個のＩＳＳ含有ポリヌクレオチド；
（ｂ）（ｉ）ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均質量と（ｉｉ）抗原の平均質量の比は、（ｉｉ）約４０に対して（ｉ）約２０、約２５、又は約３０である；
（ｃ）（ｉ）抗原特異的抗体の抗原への結合の５０％阻害に必要とされるＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原特異的抗体の抗原に対する５０％阻害に必要とされる抗原の濃度の比は、約２．５〜約３．５であるか、あるいは約３．２５である；
【００９４】
（ｄ）（ｉ）抗原感受性の個体由来の好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要とされるＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原感受性の個体由来の好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要とされる抗原の濃度の比は、約１００〜約２００であるか、あるいは約１００であるか、あるいは約７５と約２５０との間である；
（ｅ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発された総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当り誘発された抗体に関する）と（ｉｉ）抗原によって誘発された総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体（投与されたコンジュゲートの単位質量に関する）の比は、約１３であるか、あるいは約１０又は約１２と約１００との間（又は、いくつかの例では、約１２〜約５０）である；
（ｆ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発された総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当り誘発された抗体に関する）と、抗原によって誘発された総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体（投与されたコンジュゲートの量と比較して投与されたコンジュゲートの単位質量の１０倍に関する）の比は、約１．３であるか、あるいは約１．０又は約１．２０と約１０との間（又は、いくつかの例では、約１．２〜約５．０）である；
【００９５】
（ｇ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当り誘発された抗体に関する）と（ｉｉ）抗原によって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの量と比較して投与された抗原の単位質量に関する）の比は、約７０と約５００との間である；
（ｈ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当り誘発された抗体に関する）と（ｉｉ）コンジュゲートによって誘発されたＴｈ２−関連抗体の力価の比は、約２と約４との間である
の単独又は組合せによって定義される。
【００９６】
「Ｌ」クラスは、下記のいずれかの特性：
（ａ）抗原分子当り平均約３個未満のＩＳＳ含有ポリヌクレオチド；
（ｂ）（ｉ）ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドの平均質量と（ｉｉ）抗原の平均質量の比は、（ｉｉ）約４０に対して（ｉ）約１５又はその代わりに約１５未満（いくつかの例では、約１０又はその代わりに約１０未満）である；
（ｃ）（ｉ）抗原特異的抗体の抗原への結合の５０％阻害に必要とされるＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原特異的抗体の抗原への５０％阻害に必要とされる抗原の濃度の比は、約２．０未満であるか、あるいはその代わりに約２．０である；
（ｄ）抗原がアレルゲンである例については、（ｉ）抗原感受性の個体由来の好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要とされるＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原感受性の個体由来の好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要とされる抗原の濃度の比は、約７５未満であるか、あるいはその代わりに約７５（他の例では、約６０未満又はその代わりに約６０）〜約２００又はその代わりに〜約１００である；
【００９７】
（ｅ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発された総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当り誘発された抗体に関する）と（ｉｉ）抗原によって誘発された総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体（投与されたコンジュゲートの単位質量に関する）の比は、約１５０であるか、あるいはその代わりに下記：約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００のいずれかよりも大きい（範囲として表現される場合、上限は、列挙された数を含む任意の数であってよい）；
（ｆ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発された総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当り誘発された抗体に関する）と（ｉｉ）抗原によって誘発された総Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連抗体（投与されたコンジュゲートの量と比較して投与されたコンジュゲートの単位質量の１０倍に関する）の比は、下記：約１０、１２、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０のいずれかであるか、又はその代わりにそれよりも大きい；
【００９８】
（ｇ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当り誘発された抗体に関する）と（ｉｉ）抗原によって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価の比は、約５００又はそれより多く、限定されないが、約５００以上、約６００以上、約７００以上、約８００以上、約９００以上、約１０００以上を含む（範囲として表現される場合、上限は、任意の数であってよく、限定されないが、６００、７００、８００、９００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００を含む）；
（ｈ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートによって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価（投与されたコンジュゲートの単位質量当り誘発された抗体に関する）と（ｉｉ）コンジュゲートによって誘発されたＴｈ２−関連抗体の力価の比は、下記：約２．０、１．５、１．２５未満のいずれかである
の単独又は組合せによって定義される。
【００９９】
本明細書の記載から明らかなように、多くのコンジュゲート分子の集団のいずれかが生産され得て、「Ｌ」、「Ｍ」、及び「Ｈ」の分類が、コンジュゲート分子集団のクラスのいくつかの例であることが理解される。コンジュゲーションの程度を変化及び制御する能力、即ち、免疫応答の調節のタイプを制御する能力は、本明細書中に例示したものに加えて他の集団まで拡張する。容易に測定可能な構造的及び機能的特徴が提供されれば、多くの集団のいずれかを開発することは当該技術分野において周知である。したがって、本発明はまた、下記：
（ａ）（ｉ）抗原特異的抗体の抗原への結合の５０％阻害に必要とされるＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原特異的抗体の抗原への５０％阻害に必要とされる抗原の濃度の比は、約１．５、２．０、２．２５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５０、４．７５、５．０、５．２５、５．５、５．７５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０より大きいもののいずれかである（範囲として表現される場合、上限は、列挙したものを含むいずれかの数であってよい（例えば、コンジュゲート集団は、約２．０超、約２．０超かつ約５．５未満、約２．０超かつ約２０．０未満であってよい））；
【０１００】
（ｂ）（ｉ）抗原特異的抗体の抗原への結合の５０％阻害に必要とされるＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原特異的抗体の抗原への５０％阻害に必要とされる抗原の濃度の比は、約１．５、２．０、２．２５、３．０、３．２５、３．５、３．７５、４．０、４．２５、４．５０、４．７５、５．０、５．２５、５．５、５．７５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、９．５、１０．０未満のいずれかである（範囲として表現される場合、上限は、列挙したものを含むいずれかの数並びにゼロであってよい（例えば、コンジュゲート集団は、約５．０未満、その代わりに約５．０未満かつ約２．０超であってよい））；
（ｃ）抗原がアレルゲンである場合、（ｉ）抗原感受性の個体由来の好塩基球からの４０％のヒスタミン放出に必要とされるＩＳＳ−抗原コンジュゲートの濃度と（ｉｉ）抗原感受性の個体由来の好塩基球から４０％のヒスタミン放出に必要とされる抗原の濃度の比は、少なくとも下記：約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７５、８０、９０、９５、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００のいずれかである（範囲として表現さえる場合、上限は、列挙したものを含む任意の数であってよい。その代わりに、この比は、下記：約２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７５、８０、９０、９５、１００、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００、３２５０、３５００、３７５０、４０００、４２５０、４５００、４７５０、５０００未満のいずれかであってよい。範囲として表現される場合、下限は、列挙した任意の数並びにゼロであってよい。）；
【０１０１】
（ｄ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲートの単位質量当り誘発された抗体力価（より具体的には、ＩｇＧ力価、例えば、Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連ＩｇＧ力価の全体）と、抗原の単位質量当り誘発された抗体力価（より具体的には、ＩｇＧ力価、例えば、Ｔｈ１−及びＴｈ２−関連ＩｇＧ力価の全体）の比は、下記：約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、２、５、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１２５０、１５００、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００未満のいずれかである（範囲として表現される場合、上限は、列挙したものを含む任意の数であってよい。その代わりに、この比は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．７５、１、１．５、２、２．５、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２５、５０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１２５０、１５００、２０００、２２５０、２５００、２７５０、３０００未満のいずれかであってよい。範囲として表現される場合、下限は、ゼロであるか又は列挙した数のいずれかであってよい。）；
【０１０２】
（ｅ）（単位質量当り）コンジュゲートによって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価と、コンジュゲートによって誘発されたＴｈ−２関連抗体の力価の比は、下記：約２０、１５、１２、１０、７、５、４．５、４．２５、４．０、３．７５、３．５、３．２５、３．０、２．５、１．５、１．２５、１．０、０．５未満のいずれかである（範囲として表現される場合、下限は、ゼロを含む列挙した任意の数であってよい。その代わりに、この比は、下記：０．５、０．７５、１．０、１．２５、１．５、２．０、２．５、３．０、３．２５、３．５、４．０、４．５、５．０超のいずれかであってよい。範囲として表現される場合、上限は、列挙されたものを含む任意の数であってよい。）；
（ｆ）（単位質量当り）コンジュゲートによって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価と、抗原によって誘発されたＴｈ１−関連抗体の力価の比は、下記：５０００、４５００、４０００、３５００、３０００、２５００、２０００、１５００、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５、６０、５０、４０、４５、３０、３５、２５、２０、１４、１０、５未満のいずれかである（範囲として表現される場合、下限は、ゼロを含む列挙された任意の数であってよい。その代わりに、この比は、下記：約１０、２０、５０、６０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、７５０、８００、１０００、１２５０、１５００、１７５０、２０００、２２５０、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００超のいずれかであってよい。範囲として表現される場合、上限は、列挙したものを含む任意の数であってよい。）
のいずれかによって特徴付けられるコンジュゲート集団を含む。
【０１０３】
コンジュゲーションの程度は、多くのやり方で調節することができ、その全ては当該技術分野において周知の化学的技術を使用し、本明細書にも記載される。コンジュゲーションの程度を調節する１つのやり方は、抗原上の連結部位に関連して、ＩＳＳの当量を変えることである。即ち、一定量又は数の連結部位をＩＳＳの特定量と反応させる。本明細書中に例示されるＩＳＳ−Ａｍｂ  ａ１コンジュゲート分子について、例えば、マレイミド活性化Ａｍｂ  ａ１に基づいて、１モル当量のＡｍｂ  ａ１との４モル当量の５’チオＩＳＳ、７モル当量の５’チオＩＳＳ、及び１７モル当量お５’チオＩＳＳとの反応は、それぞれ「Ｌ」、「Ｍ」、「Ｈ」集団を生じた。コンジュゲーションの程度を調節する別のやり方は、ＩＳＳとの反応を飽和させ、抗原上の利用可能な連結の量を変えることである。連結部位は、例えば、所望数の連結部位を与えたある種の連結部分を選択すること（例えば、アミノ酸とは対照的に糖質を介して連結することを選択すること）によって、あるいは、その代わりに所望の平均的な数の連結部位が達成されるように連結を活性化する反応を調節することによって調節することができた。
【０１０４】
一般的に、所定の抗原は、抗原−ＩＳＳ連結の性質に依存して、最大数の潜在的な連結部位を有する。コンジュゲーションの程度は、ＩＳＳを連結するために使用されるこれらの連結部位の数によって調節することができる。したがって、本発明はまた、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドに結合した連結部位の全体数の平均的なパーセントが少なくとも下記：約５％、１０％、２０％、３０％、３３％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％のいずれかである例を含む。その代わりに、本発明はまた、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドに結合した連結部位の全体数の平均的なパーセントが少なくとも下記：約１０％、２０％、３０％、３３％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８２％、８５％、８８％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％未満のいずれかである例を含む。連結部位の全体数が、結合様式によって測定される。例えば、抗原がＩＳＳ含有ポリヌクレオチドに遊離アミノ酸基（例えば、リジン）を介して連結される場合、連結部位の全体数はリジンの数である。抗原がスルフィドリル基（例えば、システイン）を介して連結される場合、連結部位の全体数は遊離スルフィドリル基の全体数である。抗原が糖質部分を介して連結される場合、連結部位の全体数は糖質部分の全体数である。これらの例のいずれかに関して、ＩＳＳ含有のポリヌクレオチドに結合した平均的なパーセントの連結部位は、上記で列挙した免疫調節特性のいずれかの単独又は組合せによって達成されてもよい。
【０１０５】
ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子のクラスの特徴付け
コンジュゲート分子集団は、上記に列挙したものを含む多くのやり方のいずれかによって同定及び／又は特徴付けられてもよい。例えば、構造に関して、コンジュゲーションの程度は、（ａ）抗原分子に対する平均的な又は中央値の数のＩＳＳ；（ｂ）ＩＳＳと抗原における全体の連結部位の比；（ｃ）ＩＳＳ量（平均又は中央値のいずれか）と抗原量（平均又は中央値のいずれか）の比；（ｄ）ＩＳＳと抗原におけるＴ細胞エピトープの比；（ｅ）ＩＳＳと抗原におけるＢ細胞エピトープの比によって説明されてもよい。限定されないが、免疫調節を含む機能に関して、本発明のコンジュゲート分子集団は、（ａ）ＩｇＧ応答のような抗原特異的抗体の応答の程度；（ｂ）Ｔｈ１−関連抗体とＴｈ２−関連抗体の比；（ｃ）ヒスタミン放出の抑制の程度；（ｄ）抗原への結合に関する抗原特異的抗体との競合の程度；（ｅ）Ｔｈ２関連免疫応答の抑制の程度；（ｆ）インターフェロンのようなＴｈ１−関連サイトカインの分泌；（ｇ）ＩＬ−４及び／又はＩＬ−５のようなＴｈ２−関連サイトカインの分泌に関連して特徴づけられてもよい。
【０１０６】
構造的特徴付け
ＩＳＳ−抗原コンジュゲーションの程度は、当該技術分野において既知の任意の数のタンパク質及び核酸測定法を用いて測定されてもよい。例えば、抗原及び／又はタンパク質特異的検出技術（例えば、抗原特異的抗体及び／又はクマーシーブルー染色）及び核酸特異的検出技術（例えば、検出可能に標識したＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーション）が、コンジュゲーション反応産物を分析するために使用されてもよい。適切な定量標準を使用して、抗原に対するポリヌクレオチドの量を測定してもよい。
【０１０７】
ポリペプチドに結合したオリゴヌクレオチドの量はまた、コンジュゲート分子の大きさ又は分子量の測定によって決定してもよい。コンジュゲート分子サイズは、限定されないが、ドデシル硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミド電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）分析及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を含む、当該技術分野において既知の方法を用いて測定されてもよい。
【０１０８】
ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子は、サイズ測定及び／又は分離技術及び核酸及びタンパク質測定技術を用いて分析されてもよい。例えば、ＳＥＣを用いて、コンジュゲート分子反応産物の分画後、各分画のタンパク質及び核酸含有量は、それぞれ２８０ｎｍ及び２６０ｎｍでの分画の吸光度によって測定されてもよい。このやり方では、コンジュゲート分子の大きさ及び核酸及びタンパク質検出分析の両方の結果は、コンジュゲート分子の構造を特徴づけるために組み合わせてもよい。ポリヌクレオチド量と各コンジュゲート分子の分画中のタンパク質量の比は、抗原分子当りのＩＳＳ分子の平均数を示す。
【０１０９】
機能的特徴付け
当該技術分野において既知の種々の方法は、ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子の投与に応答して生じた抗体の抗原特異性及び抗体クラス及び／又は抗体のサブクラスを決定するために使用されてもよい。例えば、標準的なＥＬＩＳＡフォーマットアッセイは、種々のＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子に応答して産生した抗体の量、特異性及び／又はタイプを検出及び測定するために使用されてもよい。このようなアッセイでは、例えば、抗原は、基質と結合し、ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子で治療した個体由来の血清とともにインキュベートされる。次に、基質に結合した抗原に結合した抗原特異的抗体の量は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＥ等に特異的な抗体のような抗体特異的試薬を用いて測定される。
【０１１０】
当該技術分野に既知の方法、例えば、本明細書中に記載した競合的ＥＬＩＳＡアッセイは、抗原特異的抗体の抗原への結合の阻害に必要とされるＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子の濃度を測定するために使用されてもよい。
【０１１１】
当該技術分野において既知の方法は、ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子に応答して抗原感受性の個体由来の好塩基球からのヒスタミンの放出量を測定するために使用されてもよい。例えば、本明細書中に記載されるように、細胞の培養上清中に放出されるヒスタミン量は、アレルギーの個体の血液由来の白血球がＩＳＳ−アレルゲンコンジュゲート分子の種々の濃度及び／又は調製物で処置した後に測定されてもよい。
【０１１２】
当該技術分野において既知の方法は、ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子の投与に応答して生じたサイトカイン産生プロフィールを測定するために使用されてもよい。例えば、インビトロでＩＳＳ−コンジュゲート分子で処置した細胞の上清はサイトカインの存在について分析される。ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子に晒されたリンパ球によって産生されるサイトカインのタイプ及び量は、標準的なＥＬＩＳＡフォーマットアッセイを用いて測定されてもよい。ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子に応答して産生したサイトカインのプロフィールはまた、限定されないが、細胞生存が特定のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２）の存在に依存するもの、及び特定のサイトカイン（例えば、インターフェロン）がウイルス複製を阻害するものを含む標準的なサイトカインバイオアッセイを用いて測定されてもよい。
【０１１３】
コンジュゲート分子のクラスはまた、投与後の抗原特異的抗体の抑制の程度によって、又は抗原単独の投与と比較して特徴付けられてもよい。例えば、血清中の抗体濃度は、ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子及び／又は抗原単独の投与の前後で測定されてもよい。次に、種々の時間点での抗体の濃度は、抗体抑制の程度を測定するために比較されてもよい。
【０１１４】
コンジュゲート分子のクラスはまた、抗体応答の程度、いくつかの例では、抗原特異的抗体応答、特にＩｇＧ応答によって特徴付けられてもよい。上述したように、クラスは、（ｉ）コンジュゲート分子に応答して産生されるＩｇＧ抗体と（ｉｉ）抗体単独に応答して産生されるＩｇＧ抗体の比によって特徴づけられてもよい。これらの特徴付け及び例については、この比は、
（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子によって誘発されたＴｈ１−関連抗体及びＴｈ２−関連抗体の総量と（ｉｉ）Ｔｈ１−関連抗体及びＴｈ２−関連抗体を誘発した抗原の量の比；
（ｉｉ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子によって誘発されたＴｈ１−関連抗体（又は複数）と（ｉｉ）抗原によって誘発されたＴｈ１−関連抗体の比；
（ｉｉｉ）（ｉ）ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子によって誘発されたＴｈ２−関連抗体（又は複数）と（ｉｉ）抗原によって誘発されたＴｈ２−関連抗体の比
であってもよい。
【０１１５】
Ｔｈ１−関連抗体は、Ｔｈ１応答と関連した抗体である。マウスでは、例えば、ＩｇＧ２ａは、Ｔｈ１応答と関連する。ヒトでは、ＩｇＧ１及び／又はＩｇＧ３抗体は、Ｔｈ１応答と関連するようである。例えば、Ｗｉｄｈｅら（１９９８）Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７：５７５−５８１及びｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｏら（１９９９）Ａｎｎ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ａｓｔｈｍａ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．８３：１６０−１６４を参照されたい。同様に、Ｔｈ２−関連抗体は、Ｔｈ２応答と関連した抗体である。マウスでは、ＩｇＧ１は、Ｔｈ２応答と関連する。ヒトでは、ＩｇＧ２及び／又はＩｇＧ４は、Ｔｈ２応答と関連するようである（Ｗｉｄｈｅら（１９９８）及びｄｅ  Ｍａｒｔｉｎｏら（１９９９））。ヒト及びマウスの両方において、ＩｇＥは、Ｔｈ２応答と関連する。これらの特徴付け及び例については、同じ抗体又は抗体産生レベルが抗原単独によって誘発されるものと比較される限り、任意の１以上のタイプの抗体が評価されてもよいことが理解される。
【０１１６】
この比を計算する１つの方法は、コンジュゲート分子の単位質量当りに産生した対象の抗体（又は複数）の量対抗原の単位質量当りに産生した同抗体（又は複数）の量に関連する。コンジュゲート分子の単位質量は、コンジュゲート分子の抗原成分の質量、コンジュゲート分子のポリヌクレオチド成分、及び／又はコンジュゲート分子の質量に関連してもよい。例えば、コンジュゲート分子が、８０を占める抗原成分及び２０を占めるＩＳＳ成分である全分子量１００を有する場合、抗体産生のレベルを計算し、及び比較する目的のための単位質量は、１００、８０、又は２０のいずれかであってもよい。実施例は、コンジュゲート分子（Ａｍｂ  ａ１）の抗原成分の質量は、抗原産生のレベルを計算し、及び抗原単独と比較するための基礎として使用する計算を提供する。
【０１１７】
さらに、コンジュゲート分子によって産生される抗体対抗原によって産生される抗体との比の計算において、抗原の質量に対するコンジュゲート分子の質量は、１：１であってもよく、又はそうでなくもよい。例えば、いくつかの例では、単位質量のコンジュゲート分子によって産生される抗体は、任意の２、３、４、５、６、７、８、１０、１５、２０、２５、３０、４０倍の抗原の質量によって産生される抗体と比較される。例えば、Ａｍｂ  ａ１の場合において、１μｇのコンジュゲート分子（抗原の量によって測定され；即ち、コンジュゲート分子中の１μｇの抗原）によって産生される抗体は、１０μｇのＡｍｂ  ａ１によって産生される抗体と匹敵される。
【０１１８】
ＩＳＳ−抗原コンジュゲート
本明細書中に記載される組成物のいくつかの例では、ＩＳＳ含有ポリヌクレオチドは、抗原とともにコンジュゲートされる。ＩＳＳ部分は、共有的及び／又は非共有的相互作用を含む種々の方法においてコンジュゲート分子の抗体部分とカップルさせることができる。
【０１１９】
これらの部分との間の連結は、ＩＳＳの３’又は５’で、あるいはＩＳＳの中間位置で安定に修飾した塩基でなすことができる。抗原がペプチドであり、適した反応基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）を含有する場合、シトシン残基のＮ4アミノ基と直接的に反応することができる。ＩＳＳのシトシン残基の数と位置に依存して、１以上の残基での特定のカップリングを達成することができる。
【０１２０】
その代わりに、修飾したオリゴヌクレオチドは、当該技術分野において知られ、末端のいずれかで、あるいは、ＩＳＳの中間位置で導入することができる。これらは、脱ブロック化した場合、対象の抗原に存在し、又はそれに結合することができる種々の官能基と反応性があるブロックされた官能基を含有することができる。
【０１２１】
抗原がペプチドである場合、コンジュゲート分子のこの部分は、固相化学を通じてＩＳＳの３’末端に達成することができる。例えば、ＩＳＳ部分は、支持体上の前合成したポリペプチド部分に添加することができる。Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら（１９９０ａ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１８：４９３−４９９；及び、Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓら（１９９０ｂ）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．５０１−５０５。その代わりに、ＩＳＳは、３’末端から伸張する開裂可能なリンカーを通じて固相に連結されるように合成することができる。固相からのＩＳＳの化学的開裂に応じて、末端のチオール基は、オリゴヌクレオチドの３’末端（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５３０５−５３２１；及びＣｏｒｅｙら（１９８７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：１４０１−１４０３）で残存し、又は末端のアミノ基は、オリゴヌクレオチドの３’末端（Ｎｅｌｓｏｎら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：１７８１−１７９４）で残存する。ペプチドのアミノ基へのアミノ修飾したＩＳＳのコンジュゲーションは、Ｂｅｎｏｉｔら（１９８７）Ｎｅｕｒｏｍｅｔｈｏｄｓ  ６：４３−７２に記載されるように実行することができる。ペプチドのカルボキシル基へのチオール修飾のＩＳＳのコンジュゲーションは、Ｓｉｎｈａら（１９９１）、ｐｐ．１８５−２１０、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓに記載されるように実行され得る。ペプチドのシステイン残基のチオール側鎖への追加したマレイミドを担持するオリゴヌクレオチドのカップリングはまた記載されている。Ｔｕｎｇら（１９９１）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２：４６４−４６５。
【０１２２】
コンジュゲート分子のペプチド部分は、合成中にオリゴヌクレオチドに導入したアミン、チオール、又はカルボキシル基を介してＩＳＳの５’末端に結合することができる。いくつかの例では、オリゴヌクレオチドが個体支持体に固定される場合、一端で保護されたアミノ、チオール、又はカルボキシル、及び他端でのホスホルアミダイトを含む連結基は、５’−ヒドロキシルに共有結合される。Ａｇｒａｗａｌら（１９８６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：６２２７−６２４５；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：４４８５−４５０２；Ｋｒｅｍｓｋｙら（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：２８９１−２９０９；Ｃｏｎｎｏｌｌｙ（１９８７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：３１３１−３１３９；Ｂｉｓｃｈｏｆｆら（１９８７）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６４：３３６−３４４；Ｂｌａｎｋｓら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０２８３−１０２９９；及び、米国特許第４，８４９，５１３号、第５，０１５，７３３号、第５，１１８，８００号、及び第５，１１８，８０２号。脱保護後、アミン、チオール、及びカルボキシル官能性は、オリゴヌクレオチドをペプチドに共有結合させるために使用することができる。Ｂｅｎｏｉｔら（１９８７）；及び、Ｓｉｎｈａら（１９９１）。
【０１２３】
ＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子はまた、非共有結合、例えば、イオン結合、疎水性相互作用、水素結合及び／又はファン・デル・ワールス吸引力を介して形成され得る。
非共有的に連結したコンジュゲート分子は、ビオチン−ストレプトアビジン複合体のような非共有的相互作用を含むことができる。ビオチニル基は、例えば、ＩＳＳの修飾した塩基に結合することができる。Ｒｏｇｅｔら（１９８９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１７：７６４３−７６５１。ストレプトアビジン部分のペプチド部分への導入は、ストレプトアビジンをコンジュゲートしたペプチドとビオチン化オリゴヌクレオチドの非共有結合的複合体の形成を可能にする。
【０１２４】
非共有結合はまた、ＩＳＳと帯電したアミノ酸のような抗原内の残基に関わるイオン相互作用を介して、あるいはオリゴヌクレオチド及び抗原の両方と相互作用することができる帯電した残基を含むリンカー部分の使用を介して、発生することができる。例えば、非共有コンジュゲーションは、一般的に負に帯電したＩＳＳと、ポリリジン、ポリアルギン及びポリヒスチジン残基のようなペプチドの正に帯電したアミノ酸残基との間に発生することができる。
【０１２５】
ＩＳＳと抗原との間の非共有コンジュゲーションは、それらの天然のリガンドとしてＤＮＡと相互作用する分子のＤＮＡ結合モチーフを介して発生することができる。例えば、このようなＤＮＡ結合モチーフは、転写因子及び抗ＤＮＡ抗体において見出すことができる。
【０１２６】
脂質へのＩＳＳの連結は、標準的な方法を用いて形成し得る。これらの方法は、限定されないが、オリゴヌクレオチド−リン脂質コンジュゲート分子（Ｙａｎａｇａｗａら（１９８８）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．１９：１８９−１９２）、オリゴヌクレオチド−脂肪酸コンジュゲート分子（Ｇｒａｂａｒｅｋら（１９９０）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１８５：１３１−１３５；及びＳｔａｒｏｓら（１９８６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５６：２２０−２２２）、及びオリゴヌクレオチド−ステロールコンジュゲート分子の合成ほ含む。Ｂｏｕｊｒａｄら（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５７２８−５７３１。
【０１２７】
オリゴ糖へのオリゴヌクレオチドの連結は、標準的な既知の方法を用いて形成し得る。これらの方法は、限定されないが、オリゴヌクレオチド−オリゴ糖コンジュゲート分子の合成を含み、ここで、オリゴ糖は、免疫グロブリンの部分である。Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら（１９８５）Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．７：３４７−３５５。
【０１２８】
ペプチド又は抗原への環状ＩＳＳの連結は、いくつかの方法で形成し得る。環状ＩＳＳは組換え又は化学的方法を用いて合成される場合、修飾したヌクレオシドが適している。Ｒｕｔｈ（１９９１），ｐｐ．２５５−２８２，ｉｎ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ。次に、標準的な連結技術は、抗原又は他のペプチドに環状ＩＳＳを接続するために使用することができる。Ｇｏｏｄｃｈｉｌｄ（１９９０）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１：１６５。環状ＩＳＳが分離され、又は組換え法若しくは化学的方法を用いて合成される場合、連結は、抗原又は他のペプチドへ導入した反応基（例えば、カルベン、ラジカル）を化学的に活性化又は光活性化することによって形成することができる。
【０１２９】
オリゴヌクレオチドにペプチド及び他の分子を連結する追加の方法は、米国特許第５，３９１，７２３号；Ｋｅｓｓｌｅｒ（１９９２）“Ｎｏｎｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ”Ｋｒｉｃｋａ編集，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；及び、Ｇｅｏｇｈｅｇａｎら（１９９２）Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．３：１３８−１４６。
【０１３０】
コンジュゲート分子を含むキット
本発明はまた、構造的に安定なコンジュゲート分子、及び限定されないが、約６．０〜約９．０の範囲の組成物のｐＨを維持することができる成分；アミノ酸、糖質、界面活性剤、及び／又は他の医薬として許容される担体を含む本明細書中に記載される１以上の追加の成分を含む組成物を含むキットを提供する。キットは、このような組成物を含有する製造品を含んでもよく、ここで、組成物は液体であるか又は凍結乾燥した形態であってもよい。いくつかの例では、製造品は、コンジュゲート分子を含む組成物を含み、ここで、組成物は、約２℃と約８℃との間の温度で非凝集形態である約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超又は約９７％超のコンジュゲート分子を含む。いくつかの例では、製造品は、アレルゲンを含む組成物を含み、キットは、前記組成物を含む少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５又は少なくとも６個の製造品を含んでもよい。いくつかの例では、アレルゲンは、Ａｍｂ  ａ１である。いくつかの例では、凝集は、ＲＡＬＳによって測定される。他の例では、製造品は、コンジュゲート分子を含む液体組成物を含み、そして、他の例では、コンジュゲート分子を含む凍結乾燥した組成物を含む。更に他の例では、製造品は、コンジュゲートパートナーを含む再構成した液体組成物（即ち、凍結乾燥した組成物から再構成される）を含む。本発明のキットは、場合により、それらの使用のための使用説明書（例えば、本明細書中に記載される方法のいずれかのための使用説明書）、及び／又は任意の他の適した成分を含んでもよい。
【０１３１】
コンジュゲート分子を含む組成物を使用及び作製するための方法
本発明はまた、構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を作製及び使用する方法を含む。本明細書に記載される構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物は、（例えば、感染症、癌、及び／又はアレルギーとの関連で）免疫調節を必要としている個体への投与に本質的に有用である。したがって、本発明は、構造的に安定なコンジュゲート分子を含む医薬組成物を提供する。方法は、一般的に、個体において免疫応答を調節するのに十分な量で個体に本明細書中に記載される構造的に安定なコンジュゲート分子又はコンジュゲート分子集団を含む組成物を投与することを含む。いくつかの例では、免疫応答を調節する方法は、免疫応答の所望の調節が達成されるように、コンジュゲート分子を含む組成物を投与することを含む。免疫応答の評価は、上述した。いくつかの例では、キットは、約０．１μｇ〜約２００μｇの範囲の構造的に安定なＡＩＣを含む組成物を含む製造品を含む。他の例では、組成物は、少なくとも約１０μｇ、２０μｇ、３０μｇ、４０μｇ、５０μｇ、６０μｇ、７０μｇ、８０μｇ、９０μｇ又は１００μｇであって、最大約１１０μｇ、１２０μｇ、１３０μｇ、１４０μｇ、１５０μｇ、１６０μｇ、１７０μｇ、１８０μｇ、１９０μｇ又は２００μｇの範囲のＡＩＣを含む。いくつかの例では、組成物は、約３０μｇと約６０μｇとの間の範囲のＡＩＣを含む。
【０１３２】
構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を個体に投与する工程を含む個体における免疫応答を調節するための方法が、本明細書中に提供される。いくつかの例では、コンジュゲート分子は、アレルゲンを含み、そして、他の例では、コンジュゲート分子はＡｍｂ  ａ１を含む。更なる他の例では、コンジュゲート分子はＡＩＣである。いくつかの例では、組成物は、ＡＩＣ、及び約６．０〜約９．０の範囲で組成物のｐＨを維持することができる成分を含み、そして、さらに、ＡＩＣが組成物中で構造的に安定である限り、いずれか１又はそれより多くの下記：１）アミノ酸；２）糖質；３）界面活性剤、又は４）他の医薬として担体を含有してもよい。
【０１３３】
いくつかの例では、本発明は、免疫応答を調節するのに十分な量でコンジュゲート分子のいずれか又は本明細書中に記載されるコンジュゲート分子集団を個体に投与することを含む、個体における免疫応答を調節するための方法を提供する。一般的に、個体は、例えば、疾患状態又は疾患状態を発症する危険性のために、このような調節をを必要とするか又は必要となるであろう。疾患状態の例は、限定されないが、アレルギー、癌、感染症（例えば、ウイルス又は細菌感染）が含まれる。いくつかの例では、疾患状態は、アレルギーである。
【０１３４】
いくつかの例では、免疫調節は、ある（即ち、１又はそれより多くの）Ｔｈ１−関連サイトカイン、例えば、インターフェロンγを刺激することを含む。いくつかの例では、免疫調節は、ある（即ち、１又はそれより多くの）Ｔｈ２−関連サイトカイン、例えば、ＩＬ−４及び／又はＩＬ−５の産生を抑制することを含む。これらのパラメータを測定することは、当該技術分野において標準的な方法及び上記で検討した方法を使用する。
【０１３５】
いくつかの例では、１（又はそれより多く）のＴｈ１−関連サイトカインは産生され、一方、抗原特異的抗体産生は抑制される。これらのパラメータを測定することは、当該技術分野において標準的な方法及び上記で検討した方法を使用する。
【０１３６】
一例では、免疫調節は、１（又はそれより多く）のＴｈ１−関連サイトカイン、例えば、インターフェロンγを刺激し、そして、抗原特異的抗体の産生を抑制することを含む。Ｔｈ１−関連抗体産生、及びＴｈ１−及びＴｈ２−関連抗体産生の組合せを含む、種々のコンジュゲート分子集団に対する抗原特異的抗体産生の抑制の程度は、上述され、そしてこれらの方法に適用される。
【０１３７】
いくつかの例では、免疫調節は、ヒスタミン放出の抑制を含む。種々のコンジュゲート分子集団に対するヒスタミン放出の抑制の程度は、上述され、そしてこれらの方法に適用される。
【０１３８】
いくつかの例では、Ｔｈ１−関連サイトカインの産生を刺激しながら、個体における抗体形成、好ましくは抗原特異的抗体形成を抑制する方法は、ＨクラスのＩＳＳ−抗原コンジュゲート分子集団を含む組成物を個体に投与することを含み、それによって、抗体形成が抑制され、一方、Ｔｈ１−関連サイトカインが刺激される。これらのパラメータを測定することは、当該技術分野において標準的な方法及び上記で検討した方法を使用する。
【０１３９】
いくつかの例では、本発明は、構造的に安定なコンジュゲート分子、又は本明細書中に記載されるコンジュゲート分子集団を含む組成物のいずれかを投与することを含む、個体におけるアレルギー状態を治療する方法を提供し、その中で抗原は、一般的に、抗原に対する免疫応答を調節することによって、アレルギー状態を改善又は緩和するのに十分な量のアレルゲンである。緩和は、例えば、アレルギーと関連した１以上の症状の軽減によって測定され得る。
【０１４０】
本発明はまた、抗原、特にアレルゲンのアレルゲン性を軽減する方法を提供し、アレルゲン性を低減させるために、本明細書中に記載される構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を必要としている患者に投与することを含む。いくつかの例では、コンジュゲート分子は、ＡＩＣである。
【０１４１】
一般的に、特定用途に有用な構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物の投与経路（又は複数）は、当業者に明確である。投与経路は、限定されないが、血管内、動脈内又は静脈内；皮下；腹腔内；臓器内（ｉｎｔｒａｏｒｇａｎａｌ）；筋内；経口；経粘膜的；表皮性；非経口；そして胃腸等を含む。インビトロ又はエクスビボ投与に関して、化合物は、細胞及び／又は臓器に、１回のボーラスとして、反復投与によって、連続注入によって等で提供されてもよい。
【０１４２】
投与に関して、組成物は、好都合には単位投与形態で提供されてもよく、そして、製剤の技術分野において周知な任意の方法によって提供されてもよい。このような方法は、コンジュゲート分子又はコンジュゲート分子集団を本明細書に記載した成分と接触させる工程を含む。いずれかの適用のためにコンジュゲート分子の最適濃度を決定するために、慣用的な技術を使用してもよい。コンジュゲート分子が組成物中で引き続き構造的に安定である限り、組成物は、対象とする受容者の血液と等張な組成物を与える静菌薬及び溶質を含有してもよい水性及び非水性の等張無菌注射液を含んでもよい。構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物は、エアロゾルとして提供される場合、当該技術分野において既知の高圧ガスは、液体組成物に添加されてもよい。
【０１４３】
上述した組成物、及び投与方法は、限定されないが、本発明の方法及び組成物を表すとを意味する。種々の組成物及び装置を提供する方法は、当業者の能力の範囲内であって、本明細書中には詳述しない。
【０１４４】
本発明はまた、本明細書に記載される技術及び／又は工程のいずれかを含む構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を作製するための方法を提供する。したがって、コンジュゲート分子を約６．０〜約９．０の範囲のｐＨを維持することができる成分と合わせることを含む、構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を製造するための方法が本明細書中に提供される。このような成分は本明細書に記載される。いくつかの例では、構造的に安定なコンジュゲート分子を含む組成物を製造する方法は、コンジュゲート分子が依然として構造的に安定である限り、いずれか１つ又はそれより多くの１）本明細書に記載されるアミノ酸；２）本明細書に記載される糖質；３）界面活性剤；及び４）医薬として許容される担体を任意の順序でコンジュゲート分子を組み合わせる工程をさらに含む。本発明はまた、構造的に安定なコンジュゲート分子を含む液体組成物を凍結乾燥させる工程を含む凍結乾燥した組成物を製造する方法を提供する。本発明はまた、凍結乾燥した組成物を再構成することを含む再構成された組成物を製造する方法を提供する。
【０１４５】
下記の実施例は、限定されないが、本発明を説明するように提供される。本明細書に記載されたものに加えて、本発明の種々の変更は、前記説明及び添付の図面から当業者に明確となるであろう。このような変更は、添付した請求の範囲内であることが意図される。
【実施例】
【０１４６】
実施例
実施例１．ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−Ｍ又はＡＩＣ−Ｈの製造
Ａｍｂ  ａ１−ＩＳＳオリゴヌクレオチド・コンジュゲート（ＡＩＣ）は、精製した短いブタクサ抗原Ａｍｂ  ａ１をホスホロチオエート免疫賦活化（ＩＳＳ）オリゴヌクレオチドに共有結合的に連結させることによって製造されるタンパク質−オリゴヌクレオチドコンジュゲートである。Ａｍｂ  ａ１は、抽出及び硫酸アンモニウム沈殿によって２〜８℃で花粉から単離される。粗抽出物は、２種のクロマトグラフィー工程を介して周囲温度で行われる。Ａｍｂ  ａ１は、ＤＥＡＤ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ陰イオン交換クロマトグラフィー、続くＢｕｔｙｌ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ疎水性相互作用クロマトグラフィーによって精製される。
【０１４７】
架橋は、ヘテロ二官能性リンカー、スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ）を介する。ｓＳＭＣＣは、ＩＳＳオリゴヌクレオチドとＡｍｂ  ａ１との間に安定なアミド及びチオエーテル結合を形成する。ＡＩＣは、１モルのＡｍｂ  ａ１当り平均約４．０モルのＩＳＳオリゴヌクレオチドを有し、約６５ｋＤａの平均分子量を有する。Ａｍｂ  ａ１抗原（約３７，８００Ｄａの分子量）は、標準的な化学的及びクロマトグラフィー技術を用いて脱脂した短いブタクサ花粉（Ａｍｂｒｏｓｉａ  ａｒｔｅｍｉｓｉｉｆｏｌｉａ）から精製した。精製後、遊離のＡｍｂ  ａ１スルフィドリルは、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）を用いてブロックされる。次に、ブロックされたタンパク質は、ｓ−ＳＭＣＣで活性化される。ｐＨ７．２で、Ａｍｂ  ａ１アミノ基は、ｓＳＭＣＣのスクシンイミジルエステルと排他的に反応し、安定なアミド結合を形成し、マレイミド活性化Ａｍｂ  ａ１を生じる。Ａｍｂ  ａ１活性化反応と一致して、５’ジスルフィドＩＳＳオリゴヌクレオチドは、トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）で還元され、５’チオＩＳＳオリゴヌクレオチドを生じる。活性化されたＡｍｂ  ａ１マレイミド基は、５’チオＩＳＳオリゴヌクレオチドのスルフィドリルと反応し、安定なチオエーテル結合を形成し、Ａｍｂ  ａ１をＩＳＳに共有的に連結させてＡＩＣを生じる。ＡＩＣは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ＨＲ２００ゲルろ過クロマトグラフィーによって精製される。５’ジスルフィドＩＳＳオリゴヌクレオチドは、免疫賦活化六量体モチーフ５’−ＡＡＣＧＴＴを含有し、配列５’−ジスルフィド−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’を有する。理論上の分子量は、約７５００Ｄａである。
【０１４８】
ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−Ｍ、及びＡＩＣ−Ｈは、アレルゲンＡｍｂ  ａ１及びＩＳＳ含有ポリヌクレオチド５’−ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＴＴＣＧＡＧＡＴＧＡ−３’（配列番号１）の共有的コンジュゲート分子である。３つのクラス全てのコンジュゲート分子は、同じＩＳＳ含有ポリヌクレオチドから製造され、同じヘテロ二官能性リンカーを使用する。Ａｍｂ  ａ１に結合したオリゴヌクレオチドの量は、コンジュゲート分子の大きさ又は分子量の測定によって決定され得る。ＡＩＣ−Ｌは、Ａｍｂ  ａ１分子当り平均２〜３個のオリゴヌクレオチドを含有し、ＡＩＣ−Ｍは、平均３．５〜４．５個を含有し、そして、ＡＩＣ−Ｈは、平均＞５．５個を含有する。これらの３つのクラスのＡＩＣは、記載されるように異なった生物学的特性を有する。
【０１４９】
５’チオＩＳＳオリゴヌクレオチドの製造及び単離
５’ジスルフィドＩＳＳオリゴヌクレオチドは、自動化シンセサイザーを用いて、調節された孔質ガラス支持体（ＣＰＧ）上でホスホロチオエートとして合成した。必要とされる配列は、脱トリチル化、カップリング、酸化、及びキャッピングの標準的なβ−シアノエチルホスホロアミダイト‘ＤＭＴオフ’アプローチを用いて作製される。ＨＳＰプロセスは、ＨＳＰによって放出されるバルクな製剤として、凍結乾燥した５’−ジスルフィドＩＳＳオリゴヌクレオチドを生成する。
【０１５０】
トリスカルボキシエチルホスフィン（ＴＣＥＰ）は、周囲温度に到達するようにし、１０ｍＭ  ＮａＰＯ4／１４１ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ７．２に溶解した。５’ジスルフィドＩＳＳオリゴヌクレオチドは、周囲温度になるようにし、同じ緩衝液に溶解させ、そして、２時間４０℃でＴＣＥＰ溶液で処理した。この材料は、単離工程に直接進めた。
【０１５１】
２種のプレパック脱塩カラムを順番に連結し、１０ｍＭ  ＮａＰＯ4／１４１ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ  ７．２緩衝液で平衡化した。５’ジスルフィドＩＳＳオリゴヌクレオチド還元混合物をカラム上に装填し、そして５’チオオリゴヌクレオチドを等張的に溶離した。
【０１５２】
マレイミド活性化Ａｍｂ  ａ１の製造及び単離
Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）は、周囲温度に達するようにし、そして、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で撹拌しながら溶解した。Ａｍｂ  ａ１は、２時間２０℃でＮＥＭ溶液で解凍し、処置した。スルホスクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ｓＳＭＣＣ）は周囲温度に達するようにし、そして、ＤＭＳＯに溶解させた。ＮＥＭをブロックしたＡｍｂ  ａ１は、２．５時間２０℃でｓＳＭＣＣ溶液で処理した。この材料は、単離工程に直接進行した。２種のプレパック脱塩カラムを順番に連結し、１０ｍＭ  ＮａＰＯ４／１４１ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ７．２緩衝液で平衡化した。Ａｍｂ  ａ１活性化混合物をカラム上に装填し、そしてマレイミド活性化Ａｍｂ  ａ１は等張的に溶離した。
【０１５３】
ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−Ｍ又はＡＩＣ−Ｈの製造及び単離
粗製ＡＩＣ−Ｌコンジュゲート分子は、４モル当量の５’チオＩＳＳオリゴヌクレオチドと１モル当量のマレイミド活性化Ａｍｂ  ａ１の混合物を３時間２０℃でインキュベートすることによって製造した。粗製ＡＩＣ−Ｍ及びＡＩＣ−Ｈは、同様の方法であるが、それぞれ７及び１７モル当量の５’チオＩＳＳのオリゴヌクレオチドの添加によって製造した。プレパックのゲルろ過カラムは、１０ｍＭ  ＮａＰＯ4／１４１ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ７．２の緩衝液を用いて平衡化し、粗製ＡＩＣ−Ｌ、ＡＩＣ−Ｍ又はＡＩＣ−Ｈをカラム上に装填した。ＡＩＣは、１０ｍＭ  ＮａＰＯ4／１４１ｍＭ  ＮａＣｌ／ｐＨ７．２の緩衝液で等張的に溶離した。
【０１５４】
実施例２：ＡＩＣを含む組成物の安定性プロフィーリング分析
実施例は、ｐＨ、温度、時間及び組成物条件、例えば、イオン強度及び界面活性剤の存在の関数として、組成物内のコンジュゲート分子ＡＩＣ（Ａｍｂ  ａ１当り３〜５個のＩＳＳの比）で可能な構造的変化を測定するように設計した。試験は、約２℃と約８℃との間の温度（リアルタイム安定性）、及び昇温（加速した安定性）で行った。実験は、＜−６０℃で凍結して保存した１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４１ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）を含有する組成物中のＡＩＣの構造的安定性を、２〜８℃で液体で保存した２０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのグリシン、２１０ｍＭのスクロース、ｐＨ７．５（ＨＧＳ）を含有する組成物中のＡＩＣの構造的安定性と比較するように設計された。ＰＢＳ及びＨＧＳ含有組成物は、全放出試験を用いて分析され、そして、インビトロでのヒスタミン放出試験を用いて追加の特徴付けがなされた。少なくとも６ヶ月のリアルタイム安定性は、ＨＧＳ調合において２〜８℃で保存されたＡＩＣに関して実証された。ＰＢＳ中のＡＩＣについては、ＡＩＣは、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４１ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）組成物にＡＩＣを希釈し、その後、ろ過滅菌して調製し、＜−６０℃で凍結して保存した。ＰＢＳ中のＡＩＣに関するリアルタイム安定性試験は、＜−６０℃で保存した場合、少なくとも２４ヶ月示された。＜−６０℃の保存温度が選択されたのは、ＡＩＣ製剤がＰＢＳ中の２〜８℃で液体で保存された場合に経時的に凝集されることを加速された安定性試験が示したためである。この凝集は、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）法によって評価される１２ヶ月でのＡＩＣモノマー含有量での約３０％減少に帰着した。最大３３％の凝集体は、マウスＩｇＧ２ａ抗体（本明細書中に記載される）の発生によって決定した有効性において減少にはならなかった。＜−６０℃及び２〜８℃の両方で保存したＰＢＳ中のＡＩＣを特徴付けるためのＳＥＣ法を用いた結果を下記の表２及び３に示される。
【０１５５】
表２
＜−６０℃及び２〜８℃での１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４１ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２中のＡＩＣ３０μｇ／ｍｌの安定性
【０１５６】
【表６】
2008531722.tif 000007
【０１５７】
表３
＜−６０℃及び２〜８℃での１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４１ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２中のＡＩＣ６０μｇ／ｍｌの安定性
【０１５８】
【表７】
2008531722.tif 000008
【０１５９】
ＡＩＣを含む液体組成物に関する安定性プロフィール分析は、負に帯電した成分が予測された立体構造変化及び凝集に帰着するＡＩＣを不安定化することを示した。ＰＢＳ調合のリン酸ナトリウム及び塩化ナトリウムの両方は、ＡＩＣの凝集に寄与した。追加の安定性プロフィーリング分析は、２〜８℃で液体として構造的に安定である２０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのグリシン、２１０ｍＭのスクロース、ｐＨ７．５（ＨＧＳ）を含有するＡＩＣ組成物の開発に帰着した。ＨＧＳ中のＡＩＣに関する加速した試験は、ＰＢＳ組成物中のＡＩＣと比較した場合、２０〜２２℃でＡＩＣモノマーの最小限の喪失を示した。＜−６０℃及び２〜８℃の両方で保存したＡＩＣについてのＳＥＣ法を用いた結果を下記の表４及び５に示す。
【０１６０】
表４
２０〜２２℃及び２〜８℃での２０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのグリシン、２１０ｍＭのスクロース、ｐＨ７．５でのＡＩＣ３０μｇ／ｍｌの安定性
【０１６１】
【表８】
2008531722.tif 000009
【０１６２】
表５
２０〜２２℃及び２〜８℃での１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４１ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２でのＡＩＣ３０μｇ／ｍｌの安定性
【０１６３】
【表９】
2008531722.tif 000010
【０１６４】
２〜８℃でのＨＧＳにおけるＡＩＣのリアルタイム安定性試験は、有意な凝集体形成なしに少なくとも２ヶ月の安定性を示した。２〜８℃で保存し、２３〜２７℃で加速したＡＩＣに関するＳＥＣ法を用いた結果を下記の表６及び７に示す。
【０１６５】
表６
２３〜２７℃及び２〜８℃での２０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのグリシン、２１０ｍＭのスクロース、ｐＨ７．５におけるＡＩＣ３０μｇ／ｍｌの安定性
【０１６６】
【表１０】
2008531722.tif 000011
【０１６７】
表７
２３〜２７℃及び２〜８℃での２０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのグリシン、２１０ｍＭのスクロース、ｐＨ７．５におけるＡＩＣ６０μｇ／ｍｌの安定性
【０１６８】
【表１１】
2008531722.tif 000012
【０１６９】
実施例３：ＰＢＳ又はＨＧＳ中のＡＩＣの安定性：マウスＩｇＧ２ａ安定性
マウスＩｇＧ２ａ活性
ＡＩＣの生物学的活性は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＡｍｂ  ａ１特異的ＩｇＧ２ａ応答を生じる能力によって測定した。Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓからの１２週齢の雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスは、２週間の間隔を置いて１μｇ投与量のＡＩＣ（１０匹のマウス／群）を用いて尾に２度、皮内に免疫した。Ａｍｂ  ａ１特異的ＩｇＧ２ａ力価は、２週間後に２回目の免疫をして回収した血清からＥＬＩＳＡによって測定した。Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルプレートは、リン酸緩衝液中の１μｇ／ｍｌ  Ａｍｂ  ａ１を用いて一晩４℃で被覆し、洗浄し、そしてブロックした。希釈した血清をプレートに装填し、４℃で一晩インキュベートした。Ａｍｂ  ａ１  ＩｇＧ２ａ抗体は、ビオチン化ヤギ抗マウスＩｇＧ２ａコンジュゲート分子を用いて検出した。ストレプトアビジン−ＨＲＰコンジュゲート分子で処置後、プレートを３，３’，５，５’テトラメチルベンジジンで発色させた。ＥＬＩＳＡプレートリーダーでＡ450を測定した。Ａ450が０．５として提供される希釈した血清の逆数として力価を計算した。１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４１ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２中のＡＩＣ３０μｇ／ｍｌに関するＩｇＧ２ａ活性（力価）は、１１２，３５６であり、そして、２０ｍＭのヒスチジン、５０ｍＭのグリシン、２１０ｍＭのスクロース（ＨＧＳ）、ｐＨ７．５中のＡＩＣ３０μｇ／ｍｌに関するＩｇＧ２ａ活性（力価）は、６９，７０５であった。１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４１ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２中のＡＩＣ６０μｇ／ｍｌに関するＩｇＧ２ａ活性（力価）は、６４，４２２であり、そして、ＨＧＳ中のＡＩＣ６０μｇ／ｍｌに関するＩｇＧ２ａ活性（力価）は、５８，０５７であった。
【０１７０】
実施例４：ＰＢＳ又はＨＧＳ中のＡＩＣのアレルゲン性：ヒスタミン放出
実施例３に記載したＡＩＣで実行した試験に加えて、ＨＧＳ及びＰＢＳ中におけるＡＩＣのインビトロでの特徴付けを行った。具体的には、これらの組成物のアレルゲン性は、インビトロでのヒスタミン放出アッセイを用いて試験した。ＰＢＳ及びＨＧＳにおけるＡＩＣのアレルゲン性は、インビトロでのヒスタミン放出アッセイを用いたＡｍｂ  ａ１に匹敵した。このアッセイでは、白血球は、ブタクサにアレルギーである患者の血液から調製した。これらの細胞は、０．０００１〜１．０μｇ／ｍｌの範囲のＡｍｂ  ａ１又はＡＩＣの濃度で４５分間インキュベートした。次に、遠心によって細胞をペレットにし、上清は自動化蛍光定量法によってヒスタミン含有量について分析した。１００％のヒスタミン放出は、２％のＨＣＩＯ4を用いて細胞を溶菌することによって測定される。結果を表８に示す。結果は、ヒト細胞から４０％のヒスタミン放出を誘導するのに必要とされる試料の濃度（Ａｍｂ  ａ１又はＡＩＣ、μｇ／ｍｌ）として定義されるＨＲ40に関して表現される。結果は、両組成物中のＡＩＣが、Ａｍｂ  ａ１より５９から４６倍高い２つの組成物に関するＨＲ40値でヒスタミン放出を誘導する能力を比較的減少した（５９〜４６倍多いＡＩＣがヒスタミン放出を誘導するのに必要とされる）ことを示す。両組成物は、コンジュゲートしていないＡｍｂ  ａ１より非常に少ないアレルゲン誘発性である。
【０１７１】
表８
Ａｍｂ  ａ１及びＡＩＣによって誘導されるヒト白血球からのヒスタミン放出（ＨＲ40）a
【０１７２】
【表１２】
2008531722.tif 000013
aＨＲ40−４０％のヒスタミン放出を誘導するのに必要とされるＡｍｂ  ａ１又はＡＩＣの濃度
【０１７３】
実施例５：ＰＢＳ及びＨＧＳ中のＡＩＣの安定性試験
本発明者らは、コンジュゲート分子の構造的安定性が温度、塩及びｐＨ条件に依存することを発見した。本発明者らは、抗原を含むコンジュゲート分子が、リン酸ナトリウム及び塩化ナトリウムを含む組成物中で２〜８℃の液体で保存される場合に凝集されることを見出した。理論にとらわれずに、コンジュゲート分子の負電荷により、ＩＳＳの存在の理由で、負に帯電していない成分又は中性電荷若しくは非極性成分を有する組成物は、組成物に存在するコンジュゲート分子の構造的安定性を維持することが所望されると信じられる。種々の組成物中にアレルゲンＡｍｂ  ａ１を含むコンジュゲート分子の構造的安定性は、本明細書中に記載されるようにＩＦ、ＥＦ  ＲＡＬＳ、ＨＰＬＣ−ＳＥＣ、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを用いて特徴付けられた。
【０１７４】
材料及び方法
ＩＦ、ＥＦ及びＲＡＬＳ法
内部蛍光（ＩＦ）は、応力誘導の立体構造変化から生じるトリプトファン環境における可能な変化を測定する。応力関連の構造的変化の効果は、非常に僅かであり得て、そして、トリプトファン（Ｔｒｐ）及び／又はチロシン（Ｔｙｒ）及びフェニルアラニン（Ｐｈｅ）の内部蛍光（ＩＦ）における可能な変化を調べることによって検出されるが、コンジュゲート分子のほとんどにおいて、極性感受性Ｔｒｐ蛍光は、全ての内部フルオロフォアを支配する。この極性に依存した蛍光感受性は、分子が応力環境変化に供される場合に立体構造における変化を監視するために使用することができる。環境的感受性残基は、溶媒接近性、ｐＨ、及び隣接する側鎖の近接性等に影響を受け易い。つまり、純粋なトリプトファンは、極性環境中で３５５ｎｍ、及び非極性環境中で３０５ｎｍの発光極大を有する。したがって、強度（高／低）の比は、外部刺激に対するアルフォールディング／構造的応答についての情報を得ることができる。さらに、比を用いることによって、ＡＩＣ濃度における相違、及び装置の変化によって引き起こされる不正確さが排除される。ＩＦにおいて、比が高くなればなるほど、分子はよりアンフォールドする（Ｔｒｐ残基はより多くの極性環境に晒される）。
【０１７５】
外部蛍光（ＥＦ）は、外部の、非共有的な、極性感受性蛍光プローブ、例えば、ＡＮＳ（８−アニリノ−ナフタレンスルホン酸）を利用して、疎水性ドメインのコンジュゲート分子の見掛けの曝露を探索し、種々の環境応力及び条件の関数としてこのパラメータにおいて可能な変化を監視する。コンジュゲート分子の疎水性ドメインに対するアフィニティーを有する蛍光プローブは、内部蛍光を補足することができる。ＡＩＣ又は種々の溶液応力によって誘導される他のコンジュゲート分子における変化は、このようなプローブが結合する疎水性ドメインにおける変化に帰着し、順番に、非共有的に結合したプローブ蛍光のスペクトル特性に影響を与えることができる。つまり、ＡＩＣ又は他のコンジュゲート分子中の疎水的な裂け目へのＡＮＳの結合は、ｐＨ、イオン強度、極性、凝集等における変化によって影響され得る。ＡＩＣが存在しない場合のＡＮＳ蛍光は、ｐＨ及び温度と無関係である。ＡＮＳは、極性環境中で５２０ｎｍ、そして非極性環境中で４９０ｎｍの発光極大を有する。したがって、５２０ｎｍと４９０ｎｍの蛍光発光の比（５２０／４９０）は、ＡＩＣ又は試験した他のコンジュゲート分子における疎水性ドメインの見掛けの曝露を示し、より低い比はプローブに対して疎水的な裂け目の利用可能性を増加することを示し、したがって、より多くの分子がフォールドしないことを示す。
【０１７６】
直角光散乱（ＲＡＬＳ）は、他の視覚的に透明な製剤における応力を与えたコンジュゲート分子の会合挙動における僅かな変化を検出及び監視するために採用することができる。コンジュゲート分子における立体構造変化は、極性水をできる限り排除するために分子間の会合に帰着し得る。この会合挙動は僅かであり得て、あるいは可溶性及び不溶性凝集体又は可視的な沈殿でさえ容易に検出することができる。ＲＡＬＳは、不溶性凝集体に転移する他の可溶性分子における巨視的変化を監視する。０〜１０のスケール（最小と最大強度の装置スケール）に関して、１０は、他の視覚的に透明な製剤における自己凝集を示唆し得る。
【０１７７】
熱応力
ＡＩＣ試料は、循環するプログラム可能な水浴を用いて、２℃／分で２０〜９０℃で加熱した。１分間隔で、試料温度及びＥＦ又はＲＡＬＳの何れか及びＩＦデータを記録し、異なった応力温度での可能な立体構造変化を測定した。
【０１７８】
せん断応力
ＡＩＣ試料は、三角形のスターラーバーを用いて円錐形のガラスバイアル中に迅速に撹拌した（３００ｒｐｍ、キャビテーションを避ける）。所定の時間間隔で、溶液の透明度に注意し、アリコートを取り出し、ＲＡＬＳによって凝集を評価し、そして、ＳＥＣによって回収及び凝集体量を評価した。
【０１７９】
ｐＨプロフィール
大部分のコンジュゲートの構造的安定性は、ｐＨによって影響される。ＡＩＣは、ＲＡＬＳ、ＩＦ、及びＥＦを用いてｐＨを変化しながら可能なｐＨ誘導の立体構造変化に関して探索された。これは、容易なｐＨ変化を可能にする基本緩衝液（後述）にＡＩＣを透析し、次に、ＲＡＬＳを観察中にＨＣｌ及びＮａＯＨを用いて滴定することによって行った。さらに、生産物の安定性は、ｐＨ条件の範囲を用いて、ＩＦ及びＲＡＬＳ又はＥＦを用いて試験した。
【０１８０】
実験手順
全ての実験について、ＲＡＬＳ及びＩＦデータの両方は、蛍光光度計において同時に記録した。外部プローブの介在により、ＥＦ測定は、別々の実験で記録した。
【０１８１】
モノクロメータセッティングの決定
３０ｐｇ／ｍＬのＡＩＣ溶液は、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４１．７ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２（ＰＢＳ）で調製した。吸高度スキャンは、ＵＶ分光光度計を用いてこの試料において行った。最大の吸高度の波長は、２５８ｎｍであることが分かった。次に、試料は、励起及び発光スキャンを用いて試験した。ＡＩＣは２５８ｒｕｎ（つまり、２５８ｎｍ）で最大吸収を提示したが、ＩＦ励起は、Ｔｒｐの励起がＰｈｅ及びＴｙｒの励起と重なるため、２９５ｎｍで選択した。したがって、ＩＦ励起波長は、１０ｎｍ上の最大を選択した。発光波長の比は、立体構造における変化を評価するために使用される。２９５ｎｍの発光波長は、発光スキャンに基づいて選択され、最大半分の発光値を得る波長が選択された。ＡＩＣについては、これらの波長は、３２３ｎｍ及び３６３ｎｍであった。
【０１８２】
ＲＡＬＳ及びＥＦは、波長決定を必要としない。しかしながら、ＲＡＬＳは、電圧決定を必要とし、使用される電圧は、ＡＩＣ濃度に従って変化する。ＲＡＬＳは、３２０ｎｍで励起及び発光波長をセットすることによって最もよく監視される。外部プローブＡＮＳは、３８０ｎｍで励起され、そして発光は、４９０ｎｍと５２０ｎｍで観察される。ＡＮＳは、極性環境では５２０ｎｍ、そして非極性環境では４９０ｎｍの発光最大を有する。したがって、５２０ｎｍと４９０ｎｍでの蛍光発光比（５２０／４９０）は、試験したＡＩＣ上の疎水性ドメインの見掛け上の曝露を示し、より低い比は、プローブに対して疎水的な裂け目の利用可能性を増加することを示す。
【０１８３】
外部蛍光測定に関して、ＡＮＳ（８−アニリノ−ナフタレンスルホン酸）は、外部プローブとして試料に添加される。ＡＩＣ立体構造の変化を追随するために必要とされるＡＮＳ量を決定するために、ＡＮＳは、現在の製剤における４００ｐＬ試料の薬物（３０μｇ／ｍＬ）に滴定された。この滴定中の蛍光強度を監視することによって、１０ｍＭストックの７ＡＬを４００ｇＬの３０ｐｇ／ｍＬ試料に添加することによって得られた０．１７５ｍＭのＡＮＳについての最終濃度は、最も試験に適するように決定した。
【０１８４】
グアニジン滴定は、立体構造変化に応じてＴｒｐ環境中での変化に起因する最大限の可能なＩＦ強度変化を測定するために使用された。０Ｍ〜６Ｍの範囲のグアニジンを含有する試料を調製し（室温で３０分間インキュベートする）、そして、蛍光発光スキャンを行った。スキャンは、２９５ｎｍの励起を用いて観察した。３つの比は、最大の発光波長（３４３）、及びそのピークから＋２０ｎｍ及び−２０ｎｍで発光波長を用いて観察した。
【０１８５】
これらのスキャンは、ＡＩＣが５Ｍを超えるグアニジン濃度で変性され、そして、存在するＴｒｐ残基が立体構造変化に応じてより高い波長で同時に蛍光を発光した。３２３／３６３比はグアニジン滴定を超えて最大の比の範囲を与えたので、この比は、全ての試験について選択された。
【０１８６】
ＡＩＣのせん断感受性を調査するために、予備試験が３０μｇ／ｍＬ  ＡＩＣの４２５μＬを用いて実行された。ＰＢＳ緩衝液中のこれらの試料は、３５０ｒｐｍで回転した三角形のスターラーバーを用いて円錐形のガラスバイアル（１時間点当り１バイアル）で迅速に（キャビテーションなし）混合した。所定の時間間隔（０、０．５、１、２、３、４、８、及び２４時間）で、各条件からの１バイアルがマグネティックスターラーから取り出された。全ての試料は、試験が完了するまで室温に放置した。次に、溶液の透明度を観察して、凝集をＲＡＬＳによって評価し、そして、回収及び分解をＨＰＬＣによって評価した。
【０１８７】
ＡＩＣは、適度なせん断応力感受性であるように見える。ＲＡＬＳは、３時間で実質的に増加し、その後、ＲＡＬＳにおいて更なる増加は観察されなかった。つまり、この試験で使用した濃度で、短い期間のせん断は、最小の効果を有するか又は効果がないはずである。より高い濃度で、この感受性は、実質的な課題になり得ることに留意されたい。
【０１８８】
回収が矛盾しているけれども、％非凝集は、せん断応力試験を介して妥当であるが一定の減退（つまり、増加した％凝集体）を示した。
【０１８９】
ＰＢＳ中の緩慢な凍結融解
ＰＢＳ中のＡＩＣを特徴付けるために、繰り返しの凍結融解サイクルに対する分子の感受性を測定した。このデータはまた、試料が追加の分析前にどのように保存されるべきかを決定するために使用した。試料は、ＰＢＳ中４６０μｇ／ｍＬで−８０℃で保存した。５個のエッペンドルフチューブは、ＰＢＳ中、３０μｇ／ｍＬで１ｍＬ試料を用いて調製し、対照として凍結していない１つの２００μＬの試料を調製した。全ての試料は、フリーザー中のボックスに試料を置くことによって、全ての試料を−８０℃でゆっくり凍結した。凍結が完了後、全ての５個の１ｍＬのアリコートは、ベンチトップ（室温）上で融解した。次に、１つのアリコートは、ＩＦ及びＲＡＬＳ（同時に試験される）及びＥＦ（全８００μＬ）によって分析し、一方、残りの４個は、−８０℃で少なくとも２時間、再凍結した。分析した２００μＬの残りの試料は、ラベルし、ＨＰＬＣによる将来の分析のために再凍結した。この手順は、５回の凍結融解サイクルが完了するまで繰り返され、試験された。ＲＡＬＳの可変性は、１回目の凍結融解した試料で観察され、連続的な全ての実験における分析の直前に脱気工程を含むようにＲＡＬＳ法を変更する原因となった。
【０１９０】
ＲＡＬＳデータは、ＰＢＳ（１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１４１．７ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２）中のＡＩＣが、温度上昇に応じて凝集せず沈殿しないことを示す。凍結融解の繰り返しサイクルは、温度勾配に対する分子応答を変化するようには見えず、それは、試料が加熱された場合、ＲＡＬＳにおいて増加がなかったためである。
【０１９１】
それ自身による凍結及び融解の過程は、ＡＩＣの凝集を変化してもよい。つまり、ＲＡＬＳ値は分析された。
融解後すぐに各試料の初期ＲＡＬＳを調べることは、凍結融解に応答してＡＩＣのいくつかの凝集が存在することを示す。１回サイクルの凍結融解は、ＲＡＬＳを増加するのに十分である。最大増加は、３回の凍結融解後に発生した。
【０１９２】
ＩＦは、Ｔｒｐ蛍光を測定する。Ｔｒｐは極性環境では３５５ｎｍ、そして、非極性環境では３０５ｎｍの蛍光最大を有するので、比がより低くなれば、Ｔｒｐ残基はより極性のある環境に晒され、そして、分子はアンフォールドする。ＡＩＣにおける凍結融解の効果は、ＩＦによって測定される。
【０１９３】
ＩＦ比は、温度が上昇した場合に初期に減少し、これは、温度の関数として関連した立体構造変化を示唆し、Ｔｒｐ残基の緩衝液への曝露を増加する原因となる。約５５℃で、分子は、実質的な立体構造変化を被り、ＩＦ比の増加によって示唆される。この立体構造変化は、視覚的には蛍光光度計のキュベットで又はＲＡＬＳ測定のいずれかで検出可能な凝集によって達成されない。
【０１９４】
ＦＴＩとＩＦによって調べた他の試料との間の最大の相違以外で、繰り返しの凍結融解応答は、ＡＩＣに影響しない。これらのデータは、ＲＡＬＳによって得たデータを支持する。
【０１９５】
外部の非共有的な極性感受性の蛍光プローブであるＡＮＳは、極性環境では５２０ｎｍ、そして、非極性環境では４９０ｎｍの発光最大を有する。したがって、５２０／４９０比は、試験したＡＩＣ溶液の見掛け上の疎水性を示す。より高い比は、分子がより疎水性であることを示し、そして、より低い比は、分子がＡＮＳ結合に関して疎水的ドメインを晒していることを示す。
【０１９６】
ＥＦ比は、最大約４０℃まで増加するので、分子は、より少ない疎水的ドメインを晒す原因となる連続的な立体構造変化を被る。−４０℃、−６０℃及び−８５℃でのシフトは、それらの温度でのＡＩＣの立体構造変化を反映する。
【０１９７】
蛍光光度計の実験後に−８０℃で保存した凍結融解試料を溶解し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣカラム上に注入した。
ＨＰＬＣの結果は、繰り返しの凍結融解に応答して幾分僅かな分解を示唆した。
【０１９８】
緩慢な凍結融解試験の結論
分子がＥＦによってより疎水的な残基を漏出し始める温度（Ｔｍ  約４０℃）は、Ｔｒｐ残基がそのＩＦプロフィールによって示されるより極性のある環境を体験し始める温度（Ｔｍ  約５０℃）よりも僅かに低い。つまり、これら２つの方法は、互いに支持し、そして、ＡＩＣが４０℃と５０℃との間でアンフォールドし始めることを示唆する。
【０１９９】
ＡＩＣが上昇した温度の結果として体験した立体構造変化は、幾分凝集の原因となる。３つ全てのアッセイは、異なった凍結融解試料の中で同様のプロフィールを提示し、ＡＩＣが繰り返しの緩慢な凍結融解に相対的に安定であることを示唆する。
【０２００】
ＡＩＣにおける遊離のスルフィドリル含有量の試験：ＰｙＭａｌアッセイ
ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解したＰｙＭａｌ［Ｎ−（１−ピレン）マレイミド］は、分子中の遊離の−ＳＨ基の可能な存在を検出するために使用した外部の−ＳＨ特異的プローブである。ＰｙＭａｌは、遊離のスルフィドリル基と反応する場合、それは蛍光的となり、３７４ｎｍ及び３９４ｎｍでの蛍光のピークを有する。２０倍の過剰なモル数のＰｙＭａｌを３０μｇ／ｍｌでＡＩＣの試料に添加し、試料を、分子をアンフォールドするために、６Ｍ  グアニジン又は１０％  ＳＤＳのいずれかの存在下で３０分間インキュベートした。データは、蛍光値から差し引かれた緩衝試料を有する。データは、ネガティブ状態で分子内で隠された遊離のスルチドリル基がないことを示唆し、これは、ＰｙＭａｌ蛍光が、ネガティブなＰＢＳ及びＳＤＳで前処理した試料を含む場合に同定されたためである。グアニジンは、ＰｙＭａｌとＡＩＣとの反応を抑制するように見える。ＰｙＭａｌ蛍光は長時間増加するので、データはまた、分子が潜在的に凝集の原因となり得るネガティブな状態でされ露出した遊離のスルフィドリル基を潜在的に有することを示唆した。データは、遊離のスルフィドリルの定量可能な測定を提供しない。
【０２０１】
長時間ＡＩＣに対するイオン強度及び温度の効果
異なったイオン強度は、時間及び温度の関数としてＡＩＣについて試験し、その後、ｐＨ試験した。一貫性を維持し、このような試験の間の比較を可能にするために、それらは、本明細書中では基本緩衝液（ＢＢ）と称する共通の緩衝系で行われる。ＢＢは、緩衝液それ自体からの安定性影響を減少するために最小の緩衝液濃度を用いている間、容易なｐＨ変化を促進するように設計された複数の緩衝系である。典型的には、１０×強度溶液は下記のように調製される：
【０２０２】
【表１３】
2008531722.tif 000014
【０２０３】
種々のイオン強度でのＢＢにおけるＡＩＣの調製
使用に関して、１０×ＢＢは、１×（各緩衝液成分について２ｍＭの最終濃度になる）に希釈し、所望の成分を添加し、そして、ｐＨが要求されるように調整される。この明細書に提示されるイオン強度試験に関して、各ＢＢ緩衝液は、ＮａＣｌ（０ｍＭ、１０ｍＭ、１００ｍＭ、５００ｍＭ）の濃度を変化して調製され、そして、ＰＢＳ組成物を適合するためにｐＨ７．２に調整した。ＡＩＣ（約３００μｇ／条件）は、ＮａＣｌ濃度を変えて、ＢＢに対してＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセット中で透析した。透析緩衝液は、３回取り替え、２度目のインキュベーションは一晩行った。回収後、試料を希釈し、次に、ＵＶ分光光度計によって測定し、濃度を決定した。その後、試料をさらに希釈し、所望の最終濃度３０μｇ／ｍｌを得た。生物安全フード内で、試料は０．２ｇのＰＥＳフィルターを用いて１５ｍＬの滅菌チューブ中に滅菌され、次に、１．５ｍＬの滅菌凍結用バイアル（ポリプロピレン、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログＮｏ．４３０６５９）中に分注した。これらの試料は、インキュベーター中の保存ボックスに設置され、翌朝まで４℃で保存された。安定性試験について、２つのセットの約１．１ｍＬの試料を３０℃に設置し、そして、１つを４０℃に設置した。残った試料セットは、試料がＥＦ、ＩＦ；ＲＡＬＳによって、そして、ｐＨ変化によって分析されるまで、４℃で保存した（下記を参照されたい）。
【０２０４】
【表１４】
2008531722.tif 000015
【０２０５】
上述したように調製したＲＡＬＳ試料によって監視された異なったイオン強度を有するろ過後のＡＩＣ製剤は、ＵＶ分光光度計によって試験し、最終濃度を確かめた。それらは、ＩＦ、ＲＡＬＳ、及びＥＦによって温度勾配中に試験した。これらの試料由来のアリコートは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる後の試験のために凍結した。
【０２０６】
５００ｍＭ条件でのＲＡＬＳにおける増加は、より高い温度で、高いイオン強度条件に設置された場合、分子が凝集体を形成することを示す。全ての他の条件は、このアッセイによって検出可能な凝集を提示しない。
【０２０７】
ＡＩＣにおける不安定性を促進するために、提示されたイオン強度試料はまた、３０℃及び４０℃で７日（ｔ7）インキュベートされ、そして、ＲＡＬＳ、ＩＦ、及びＥＦによって分析された。これらの試料由来のアリコートは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって後に試験するために凍結した。
【０２０８】
４０℃での７日間のインキュベーションは、３０℃のインキュベーションから得られた結果とほぼ同一であるように見える。唯一の相違は、４０℃でインキュベートした試料中の１００ｍＭ及び５００ｍＭのＮａＣｌ条件においてＲＡＬＳにおける小さな増加である（図１）。これは、このより高い温度が、ＲＡＬＳを用いて試験したようなＡＩＣ挙動における僅かな相違を示すかもしれない。同様の結果は、１４日間３０℃でインキュベートした同じ製剤で観察された。図１に示されるように、５００ｍＭのＮａＣｌの製剤は、ＲＡＬＳによって決定される凝集における実質的な増加を提示した。
【０２０９】
ＩＦによって監視される異なったイオン強度を有するＡＩＣ製剤
イオン強度のＲＡＬＳ試験において、試料は、ＲＡＬＳ温度プロフィール中にＩＦ変化について同時に試験した。
【０２１０】
低／高のＩＦ発光の波長比が増加するので、トリプトファン（Ｔｒｐ）はより疎水的な環境で隔離されるようなより方で、分子は立体構造を変化している。より低い比は、Ｔｒｐ残基が極性環境にあり、比におけるこの変化が分子のアンフォールドと相関することを示す。
【０２１１】
温度が上昇するにつれて、ＡＩＣは、全ての組成物について同じである約５０℃のＴｍを用いて立体構造変化を提示する。しかしながら、５００ｍＭのＮａＣｌ試料は、最大の立体構造変化を提示し、その後、１００ｍＭの試料に続く。組成物は、１４１ｍＭのＮａＣｌを含有し、ＩＦ比によって判断されるように、１００ｍＭの試料について観察されたものと同等な立体構造変化を提示する。これらのデータは、高いイオン強度がＡＩＣ分子の安定性に不利益であるかもしれないことを示唆する。
【０２１２】
ＡＩＣの安定性は、ｔ７試料を用いたＩＦによって試験した。
ｔ７試料は、より低いイオン強度条件で、ＡＩＣ分子が展開を示す立体構造変化を提示することを示す（グアニジン滴定に基づく）。全ての製剤は、温度上昇に伴って、同じ立体構造変化（ＩＦ比は同じＴｍで変化する）を提示するが、より低いイオン強度条件でのより低いＩＦ比は、ＡＩＣのＴｒｐ残基が極性環境に多く晒されることを示す。
【０２１３】
７日間４０℃でインキュベートした試料は、３０℃でインキュベートした試料で観察された上昇した温度での劇的な立体構造変化を提示しなかった。しかしながら、室温でのＩＦ比は、３０℃の試料と同様のパターンを追随した。５００ｍＭのＮａＣｌ製剤は、ＩＦによって測定したような立体構造における実質的な変化を提示した。
【０２１４】
ＥＦによって監視される異なったイオン強度を有するＡＩＣ製剤
イオン強度試料は、温度勾配の外部蛍光を用いて試験した。
７日間４０℃でのインキュベーションの結果は、３０℃のインキュベーションの結果と類似する。高いイオン強度組成物におけるＥＦ比の減少は、ＡＩＣが室温でこの条件でより多くの疎水性ドメインを露出するように構造変化することを示唆する。疎水性ドメインのこの増加した露出は、これらの疎水性ドメインが結合するにつれて凝集の増加へと導いてもよい。温度が上昇するにつれて、高いイオン強度の試料はより大きな立体構造変化を被る。これらのＥＦデータは、ＲＡＬＳ及びＩＦ実験からの結果を支持し、そして、高いイオン強度がＡＩＣに関して所望の条件ではないことを示唆する。
【０２１５】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって試験した異なったイオン強度におけるＡＩＣ製剤
イオン強度蛍光光度計試験からの試料を凍結し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分析まで−８０℃で保存した。
【０２１６】
温度を９０℃まで勾配後、試料を冷却し、次にエッペンドルフチューブに移し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分析まで−８０℃で保存した。未処理試料への追加のＮａＣｌはまた−８０℃に保った。ＮａＣｌ  ｔ0は、高い％非凝集を示した。
【０２１７】
ｔ7−３０℃及びｔ14−３０℃からの温度勾配の試料を試験した。
３０℃対４０℃で７日間インキュベートした試料において得られた結果において、５００ｍＭ  ＮａＣｌの条件を除いて、実質的な差異はなかった。全体的に、％非凝集は、温度勾配に供しない試料においてより高く、そして、パーセント全回収（クロマトグラフィー由来のピーク領域によって測定される）は、温度勾配後、より低かった。
【０２１８】
３０℃でさらに７日間（全１４日）のＡＩＣのインキュベーションによって、全試料に対するパーセント回収（クロマトグラフィー由来のピーク領域によって測定される）における控え目な減少、並びに１００ｍＭ及び５００ｍＭのＮａＣｌ条件に対する減少した％非凝集（即ち、増加した％凝集）に帰着した。０．１Ｍ  ＮａＣｌを含有するＢＢにおいて調合し、３０℃で７日間インキュベートしたＡＩＣのクロマトグラムを２１５〜、２６０〜及び２８０ｎｍについて図２Ａ〜２Ｃに示す。これは、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって示されるようにＡＩＣの分解を示す。それは、分解産物の保持時間（７、１０、１１、１３、１５、１６、１８分）を示す。全てのアッセイは、より高いイオン強度の製剤において安定性がより小さいことを示す。
【０２１９】
ＢＢにおけるＡＩＣに関するイオン強度の関数としてのｐＨの効果
ｐＨ滴定は、異なったイオン強度で実行した。ｐＨが変化している間、ＡＩＣの安定性を調べるために、異なったＮａＣｌ濃度でＢＢにおいて調製したＡＩＣを使用した。２．７ｍＬ（５００ｍＭ  ＮａＣｌについては２．４ｍＬ）の試料調製物は、蛍光光度計のキュベットに設置し、そして、ｐＨプローブを溶液中に入れる。これは、ＲＡＬＳ及びＩＦデータを得ながら、リアルタイムのｐＨ測定を容認した。次に、試料を５μＬの１Ｎ  ＨＣｌ又はＮａＯＨ溶液で滴定し、約１ユニットのｐＨ変化に帰着した。それぞれ添加後、ｐＨを平衡にするために３分置いた。その後、ｐＨ、ＲＡＬＳ、及びＩＦ値を記録した。この全過程は、２時間のタイムコースに渡って行った。各条件について、試料のｐＨは、ｐＨ７．２からｐＨ３、ｐＨ１１まで調整し、そしてｐＨ７．２に戻し（３→１１）、あるいはｐＨ７．２から１１、３まで調整し、ｐＨ７．２まで戻した（１１→３）。低いｐＨは、ＡＩＣが低いイオン強度の条件下で可逆的に凝集する原因となる。
【０２２０】
ｐＨを下げた場合、ＡＩＣは、より疎水的な環境に晒されるＴｒｐ残基に帰着する可逆的な立体構造変化を受ける。０ｍＭのＮａＣｌで、ｐＨ変化に起因するＡＩＣのＲＡＬＳ及びＩＦにおける変化は可逆的である。
【０２２１】
ｐＨを５００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で下げた場合、ＡＩＣは、より疎水的な環境に晒されるＴｒｐ残基に帰着する不可逆的な立体構造変化を受ける。ｐＨを初期に１１まで上昇すると（始めは低くない）、この効果は、なお可逆的ではないにしても言明されるほどではない。
１０ｍＭ及び１００ｍＭでのｐＨ滴定は、高いＮａＣｌ濃度がＡＩＣに不利である場合に、ＮａＣｌ濃度の効果を示す。
【０２２２】
ＡＩＣへのイオン強度及びｐＨ滴定の効果：ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析
ＮａＣｌ試料を４℃で保存した。１〜２週間後、これらの試料は、ｐＨ滴定実験で使用した。滴定後、試料を凍結し、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによる分析まで−８０℃で保存した。
【０２２３】
％非凝集は、高いＮａＣｌ濃度（５００ｍＭ）で実質的に低減した（即ち、％凝集が増加した）。１００ｍＭ  ＮａＣｌ試料は、ｐＨを始めに１１まで上昇させ、次に３まで下げた場合に、％非凝集において僅かな減少を提示した。ｐＨを３、次に１１に調整することは、１００ｍＭ  ＮａＣｌ濃度に対して％非凝集を低減しなかった。
【０２２４】
モノマー回収は、ＨＰＬＣへの注入前に解凍及び調製した対照試料と比較して計算した。モノマー回収は、５００ｍＭ  ＮａＣｌで低減した。これらの５００ｍＭ試料において、新しいピークが、この明細書で示されたいずれかの他のＨＰＬＣクロマトグラムにおいては大きくない約１０分の保持時間で出現した。このピークは、５００ｍＭ  ＮａＣｌ試料に関する見掛け上のパーセント全回収を実質的に増加した。これらのデータは、高いＮａＣｌ濃度がＡＩＣを不安定化させることを示唆する蛍光光度計データを支持する。
【０２２５】
ＢＢにおけるＡＩＣへの時間及び温度の関数としてのｐＨの効果
初期のｐＨ試験に関して、一連のＢＢ緩衝液（０ｍＭ  ＮａＣｌ）は、ｐＨ３〜ｐＨ１１の範囲のｐＨで調製した。ＡＩＣ（ＢＢ  ｐＨ７で７５μｇ／ｍＬまで希釈した製剤当り約１５０μｇ）は、新たに解凍したＡＩＣ材料を用いて４℃でｐＨを変化させてＢＢに対してＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ透析カセットにおいて透析した。透析緩衝液は、３回変化させ、一晩透析する３番目の緩衝液交換を含む。回収後、試料は、濃度を決定するためにＵＶ分光光度計によって試験し、次に、希釈して所望の最終濃度３０μｇ／ｍＬを得た。生物安全フード内で、０．２μｍのＰＥＳフィルターを用いて１５ｍＬの滅菌チューブに試料を無菌にし、次に、１．５ｍＬの滅菌した凍結バイアル（ポリプロピレン、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログＮｏ．４３０６５９）に分注した。これらの試料は、湿度制御のインキュベーター中の保存ボックスに設置した。３セットの約１．０ｍＬの試料を３０℃の条件に設置し、そして、１セットは４０℃に設置した。残った試料は、全ての試料がＥＦ、ＩＦ、ＲＡＬＳによって分析されるまで、４℃で保存した。残った材料は、ＨＰＬＣによるその後の分析のために凍結した。
【０２２６】
任意の試料を使用する前、ＡＩＣ濃度を測定した。これらの結果の概要は、表９に提示される。ＡＩＣ濃度は、２８０ｎｍでの吸光度を用いて測定した。ＢＢへの透析後のＡＩＣ回収の結果は、ｔ0試料濃度を用いて示した。ｐＨ３、ｐＨ４、及びｐＨ５試料は、変則的に高い測定値を有し（パーセント回収によって示される）、そして、そのために他の試料の結果に基づく体積を用いて希釈した。
【０２２７】
全ての回収は１００％を超えることに留意されたい。これは、ＡＩＣ測定が試料を希釈せずになされたという事実による可能性がある。つまり、ＵＶ分光光度計の読み取りは、１を優に上回っていて、正確性及び直線性が低減していた。これはまた、希釈の計算に影響され得て、多くの変化した濃度に帰着した。
【０２２８】
表９
ｐＨ試料：ｔ0からｔ14でのＡＩＣのＡ280に基づくＡＩＣ濃度
【０２２９】
【表１５】
2008531722.tif 000016
【０２３０】
＊ＰＢＳ対照＝１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２
ＡＩＣ濃度はまた、Ａ２６０を用いて決定し、結果はＡ２８０で得られた結果に類似するが同一ではなかった。安定性インキュベーションは、ｔ0値からの濃度を実質的に変化しなかった。
【０２３１】
ＲＡＬＳによって監視される異なったｐＨでのＡＩＣ製剤
ｐＨ試験に関して、ｐＨ試料は、３０分に亘る２０℃から９０℃の温度勾配中にＲＡＬＳを用いて監視した。分子における不安定性を加速し、異なる製剤間の安定性を区別するために、ＡＩＣは、３０及び４０℃で、７及び１４日間（ｔ7及びｔ14）でインキュベートした。異なったｐＨでＢＢに調製した試料は、温度プロフィールにおけるＲＡＬＳによって調べた。
【０２３２】
低いｐＨ製剤（ｐＨ３及びｐＨ４）だけが、ｔ0での残りの試料との相違点を提示した。これらの２種の製剤は、ＲＡＬＳによって測定した実質的な凝集を提示した。全ての試料は、温度勾配を適用する前に透明であった。９０℃に到達後、ｐＨ３の試料だけが濁った。残りは透明のままであった。異なったｐＨ値のＢＢ中で調製した試料は、７日間３０℃でそれらをインキュベート後、温度プロフィールにおいて再び試験した。
【０２３３】
ＲＡＬＳに基づいて、３０℃で７日間インキュベーション後、低いｐＨ（３〜５）は、ＲＡＬＳの読み取りによって判断されるようにＡＩＣが凝集するように誘導した。４０℃で７日間インキュベーション後、極端なｐＨ（３〜４、及び１０〜１１）での製剤は、凝集の形成に帰着するより小さな安定性を示した。温度上昇は、低いｐＨ（ｐＨ４）で更なる凝集体の形成を誘導し、一方、高いｐＨ（ｐＨ１０及びｐＨ１１の両方）でＡＩＣをばらばらにした。温度は、ｐＨ６とｐＨ９との間のｐＨでは凝集に影響を与えそうになかった。
【０２３４】
３０℃で１４日間のインキュベーションは、ｐＨ４での凝集の増加に帰着した。他の全ての製剤は、ｔ0及びｔ7データと類似した。
ＲＡＬＳ値はまた、異なったｐＨでのＡＩＣ安定性の見識を提供する。
酸性であるｐＨ（３〜５）は、凝集体の増加に帰着し、３０℃又は４０℃で長時間のインキュベーションと共に増加した。アルカリ性であるｐＨ（１０及び１１）では、４０℃でのンキュベーションだけが凝集を引き起こした。
【０２３５】
ＩＦによって監視される異なったｐＨでのＡＩＣ製剤
ｐＨ試料はまた、３０℃及び４０℃のインキュベーションの前後で、温度勾配中、ＩＦを用いて調べた。
【０２３６】
ｐＨ３での製剤は、非常に高いＩＦ比を提示した。全ての製剤は、温度遷移を提示し、Ｔｍはより低いｐＨ試料に対してはより低かった。これらの結果は、全体のＩＦ比がｐＨ３〜ｐＨ６で実質的により高いため、低いｐＨがＡＩＣにおける立体構造において実質的な変化を引き起こすことを示す。ｐＨ３は、さらにより高いＩＦ比を提示した。３０℃のインキュベーションでは、１．５５で開始され、温度プロフィール全体で着実に上昇し、約２．３、９０℃で終了した。ｐＨ７及びそれより上で、分子は、上昇した温度で立体構造変化を示さない。４０℃のインキュベーション後、ｐＨ３及びｐＨ４の両方は、プロフィールの完全な長さについてスケールから外れていた（高い）。初期のＩＦ比は、温度プロフィールによって得られた結果を確実にする。
これらの結果は、全体のＩＦ比がｐＨ３〜ｐＨ６で実質的に高かったので、ＡＩＣにおける立体構造の実質的な変化を引き起こすことを示す。
【０２３７】
ＥＦによって監視される異なったｐＨでのＡＩＣ製剤
ｐＨ試料はまた、温度勾配中、そして、３０℃での長期間のインキュベーションによりＥＦを用いて試験した。ｔ0及びｔ7試料の両方は、下記に提示される。
【０２３８】
ｐＨ３を除いて、酸性試料は、１４日間の安定性試験の全体でＥＦ比における実質的な減少を提示し、分子がこれらのｐＨ製剤で晒されたより疎水的なドメインを有することを指示する。これは、ｔ0及びｔ7での以前の結果を支持する。図３を参照されたい。
【０２３９】
ＥＦ比がより低くなると、より多くの疎水性領域は外部プローブＡＮＳが結合するように晒される。データは、ｐＨ３〜ｐＨ６を有する製剤が、凝集へと導き得る疎水性の増加を引き起こす実質的な立体構造変化を誘導する。これらのデータは、ＲＡＬＳデータ、並びにｐＨ滴定データによって支持される。延長したインキュベーション後のｐＨ３でのＥＦ比における増加は、分子の完全な分解の結果となるかもしれない。
【０２４０】
ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって試験される異なった緩衝液を含有するＡＩＣ製剤
ｐＨ試験のために調製した試料を凍結し、ＨＰＬＣによる分析まで−８０℃で保存した。図４Ａ〜４Ｃを参照されたい。％非凝集及びモノマー回収（ＭＲｃ）はアルカリ性ｐＨ（ｐＨ７〜ｐＨ１１）でより高い。ＭＲｅｃ  ｔ０は時間０でのモノマー回収である。
【０２４１】
３０℃で７日間のインキュベーションは、４０℃のインキュベーションよりも高い％非凝集及びパーセント回収に帰着した。４０℃でのインキュベーションは、ｐＨ３〜５での分子の完全な喪失、及び５を超えたｐＨで減少したパーセント回収が観察される程度までＡＩＣを分解した。３０℃で１４日間のインキュベーションは、ｐＨ８を除いて全ての試料について％非凝集の減少（即ち、凝集の増加）を引き起こした。
【０２４２】
１４日間、３０℃でのインキュベーションは、７日間のインキュベーションと比較して、ｐＨ５、ｐＨ１０及びｐＨ１１の試料に実質的な影響があった。３０℃での７日のインキュベーションの効果と比較して、ｐＨ６〜９での試料への緩和した効果だけがあった。安定性試験中の低いｐＨでのＡＩＣの完全な破壊に基づいて、ＡＩＣはｐＨ７〜９で最大の安定があることを示した。
【０２４３】
本明細書中に記載したアッセイは、ＡＩＣ安定性に関して良好な指標となることが示され、任意のコンジュゲート分子の構造的安定性に関して良好な指標となることが予測される：ＲＡＬＳ、ＩＦ、ＥＦ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣ。上記の実験の結果に基づいて、下記のパラメータは、構造的に安定なコンジュゲート分子に対して提供する組成物の設計について追随する。試験は、ｐＫが７と９との間の値である化合物を試験するように設計されるであろう。塩は使用されないであろう（イオン強度試験は、１０ｍＭ  ＮａＣｌが分子の安定性を実質的に影響を与えなかったので、低い濃度が最終の製剤におけるオスモル濃度を調整するために実行可能であるかもしれないことを示唆した）。
【０２４４】
表１０、１１及び１２は、ＲＡＬＳ、ＥＦ、ＩＦ及びＨＰＬＣ−ＳＥＣによって試験された成分の評価に関する決定マトリックスの作成に基づいて作成した。種々の組成物中のＡＩＣにおける時間及び温度の効果は、蛍光アッセイによって分析され、そして、結果は、２つの方法のうちの１つで質的及び比較的分析によって記録した。いくつかの試験において、組成物は、各時間点での各アッセイによって判断されるように最良から最悪（例えば、１〜１０、１は最高である）で番号を付した。各アッセイは、初期値、急激な温度勾配における変化、及び４０℃でインキュベートした場合の長期における変化（ｔ0（０時）対ｔ7（７日）、ｔ14（１４日）及びｔ28（２８日）；より小さな変化はより高いスコアで与えられる）について記録した。次に、この数は、０〜１００（１００が最良である）のスコアに変換した。他の試験は、組成物をランキングすること以外は各アッセイからの実際の値を使用した。これら全てのスコアは平均であり、表１０、１１、１２に記録した。ＨＰＬＣの結果は、各インキュベーションの時間点、即ち、０、７日、１４日及び２８日についての実際の％非凝集及び回収値を０〜１００の範囲で数学的に広げることによって記録した。これら全ての波長からの結果は記録のために平均した。ｔ7、ｔ14、及びｔ28のＨＰＬＣデータは、より大きな重みをこれらのデータに提供するために、個別に評価した。
【０２４５】
ＡＩＣにおける熱応力試験は、４０℃でＡＩＣが約５０から約６０℃の熱によるアンフォールディング遷移を１０℃下回る（ＩＦ及びＥＦ試験によって評価される）ので、この温度が加速した構造安定性試験に有用であろう。ＲＡＬＳ実験は、ＡＩＣが約７５℃から約８０℃で凝集し、沈殿することを示す。他のコンジュゲート分子における加速した構造安定性試験に適した温度は、分析されるべきコンジュゲート分子の熱によるアンフォールディング遷移温度を測定することによって、そして、アンフォールディング遷移温度よりも低い約１０℃下回る試験の温度を維持することによって決定することができる。このような測定は、当業者に既知の方法によって、及び本明細書中に開示したＩＦ及びＥＦによってなすことができる。ＡＩＣのＩＦ及びＥＦは、急激な温度勾配の有無で調べられる（３０分、２０℃から９０℃）。
【０２４６】
ｐＨ試験からの結果は、ＡＩＣがｐＨ６．０を上回る製剤中に実質的により安定であることを示した。これらの結果に基づいて、ｐＫａ値がｐＨ６．０〜ｐＨ８．０の範囲である異なった成分を含有する組成物を調査する試験が開始された。結果を表１０に示す。表１０の結果について、成分は下記の通り調製した。試料は、表１０に列挙した各組成物に対して、約１４５μｇのＡＩＣを透析することによって調製した。各組成物は、所望の値にｐＨを調製し、０．２μｍ  Ｎａｌｇｅｎフィルターを用いてろ過した。透析は、３００ｍＬのビーカー中で６０ｒｐｍで撹拌しながら、Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒカセット中で４℃で行い、透析緩衝液を３回交換した。無菌の緩衝液を分注し、ＡＩＣ測定における対照としての使用、及びＨＰＬＣへの注入のために４℃で保存した。透析後、試料を生物安全フード中で０．２μｍのＰＥＳフィルターを用いてろ過滅菌し、４つの滅菌凍結バイアルに分注した。各組成物の３セットは、３０μｇ／ｍＬに調製し、４０℃のインキュベータに設置した。１セットは、ｔ0試験のために即座に使用した。対照組成物は、二塩基リン酸ナトリウム２０ｍＭ、ｐＨ７．２（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）；安息香酸塩（Ｂｅｎ）は安息香酸ナトリウム２０ｍＭである（Ｓｉｇｍａ）；クエン酸塩（Ｃｉｔ）は２０ｍＭのクエン酸ナトリウム（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ）は２０ｍＭ（Ｓｉｇｍａ）；リン酸塩（Ｐｈｏｓ）は二塩基リン酸ナトリウム２０ｍＭ（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）；及びコハク酸塩（Ｓｕｃ）は２０ｍＭのスクシン酸であり、全ては指定されたｐＨを示す。
【０２４７】
表１０
ＡＩＣのｐＨ条件を維持するための成分を選択するためのマトリックス
【０２４８】
【表１６】
2008531722.tif 000017
【０２４９】
キー：Ｄｅｇ＝形成した分解産物；
*１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２
【０２５０】
結果を上に示す。決定マトリックス表から、ｐＨ７．５のヒスチジン；ｐＨ８．０のヒスチジン；ｐＨ７．５、ｐＨ８．０、ｐＨ７．０のリン酸塩；並びにｐＨ７．０及びｐＨ６．５のヒスチジンが組成物における使用のために選択される。
【０２５１】
いくつかの実験では、ｐＨ７．５のヒスチジンがコンジュゲート分子を含む組成物において使用される。ＡＩＣにおける種々のアミノ酸安定化剤の効果を評価した。下記に選択されるセットは、許諾薬剤産物において注射可能な非経口的薬剤としてそれらの使用に基づいて選ばれた。試験されるべきアミノ酸を含む組成物は、２０ｍＭのヒスチジン及び５０ｍＭのアミノ酸を用いて透析のために調製され、ｐＨは７．５に調整した。組成物は、０．２μｍのＮａｌｇｅｎフィルターを用いてろ過した。対照として、ヒスチジンのみを含有する組成物はまた、５ｍＭ、２０ｍＭ及び５０ｍＭで調製した。試験した全てのアミノ酸は、Ｓｉｇｍａから得た。アミノ酸の結果を表１１に示す。
【０２５２】
表１１
ＡＩＣについてのアミノ酸安定化剤を選択するためのマトリックス
【０２５３】
【表１７】
2008531722.tif 000018
【０２５４】
６個のアミノ酸が、組成物の開発に使用するために選択された。６個のアミノ酸は、同様の安定化効果を有していた。それらは、５ｍＭ  ヒスチジン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、及びアラニンである。組合せ試験に関して、グリシンは、最初に選択されたアミノ酸であった。
【０２５５】
ＡＩＣを潜在的に安定化することができる他の成分を調査するために、種々の糖質及び界面活性剤を調査した。これらの成分は、凍結乾燥開発が進められる場合、バルク剤として使用することができる。下記に提示した試験は、安定化剤としての１０個の糖質及び４個の界面活性剤を評価した。それらは、注射可能な非経口剤としてのそれらの使用に基づいて研究のために選択された。全ての組成物は、ｐＨ７．５で２０ｍＭ  ヒスチジンを用いて、表１２に列挙される成分と一緒に調整した。対照として、二塩基リン酸ナトリウム  ２０ｍＭ、ｐＨ７．２を使用し、組成物は２０ｍＭのヒスチジンを含有する。フルクトース（Ｆｒｕ）３％（Ｓｉｇｍａ）；グルコース（Ｇｌｕ）３％（Ｓｉｇｍａ）；ラクトース（Ｌａｃ）３％（Ｓｉｇｍａ）；マルトース（Ｍａｌ）３％（Ｆｒｕ、Ｇｌｕ、Ｌａｃ、及びＭａｌの全ては、凍結乾燥及び液体製剤中ではＭａｉｌｌａｒｄ反応に関与する還元糖である）；マンノース（Ｍａｎ）３％（Ｓｉｇｍａ）；マンニトール（Ｍｔｏｌ）３％（Ｓｉｇｍａ）；ソルビトール（Ｓｏｒ）３％（Ｓｉｇｍａ）；Ｓｕｃｒｏｓｅ（Ｓｕｃ）３％（Ｓｉｇｍａ）；トレハロース（Ｔｒｅ）３％（Ｓｉｇｍａ）；キシリトール（Ｘｙｌ）３％（Ｓｉｇｍａ）；ＰＥＧ３３５０（Ｐ３３５０又はＰ３）０．１％（Ｓｉｇｍａ）；ＰＥＧ４０００（Ｐ４０００又はＰ４）０．１％（Ｍａｌｌｉｎｃｋｒｏｄｔ）；Ｔｗｅｅｎ２０（Ｔ２０）０．１％（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）；及び、Ｔｗｅｅｎ８０（Ｔ８０）０．１％（ＪＴ  Ｂａｋｅｒ）。
【０２５６】
表１２
ＡＩＣについて糖質又は界面活性剤成分を選択するためのマトリックス
【０２５７】
【表１８】
2008531722.tif 000019
【０２５８】
＊モノマー％
＊＊全回収
【０２５９】
この試験からの４つの成分の選択は、ラクトース、スクロース、並びにマンノース及びマルトースである。しかしながら、スクロースは最良の全スコアを示したが、ｔ28でのＡＩＣの％非凝集によって評価した４０℃でのインキュベーションには貧弱な応答であった。安定性インキュベーションの効果は、スクロース及びソルビトールについてｔ28でＨＰＬＣ−ＳＥＣを用いて評価した。結果は、スクロールを含有する組成物がソルビトール製剤と比較して２６０ｎｍ及び２８０ｎｍでより大きな分解産物を有することを示した。ラクトース及びマルトースは還元糖であり、マンノースがｔ14及びｔ28での貧弱なＨＰＬＣ結果を有するため、組合せ試験はスクロースとソルビトールに焦点を合わせた。
【０２６０】
実施例６：組合せ組成物試験
組合せ試験のための組成物の調製
試験１
ＡＩＣについて良好な安定化剤（即ち、コンジュゲート分子の構造安定性を提供するもの）として同定される成分を組み合わせる効果を調査するために、下記に提示さえた試験は、２種の緩衝液、２種のアミノ酸、及び２種の糖質を含む組合せを含有する組成物を評価した。これらの成分は、安定性試験の２８日を通して得られたデータに基づく試験について選ばれ、試験１４日を通じたデータから選ばれた糖質を除く。組成物は、評価のために必要とされる組成物の数を減少しながら、単一の成分における変化の間の比較を単純化するように設計した。組成物は、本明細書中に示された組合せ及び手段を用いて、表１３（ｐＨ７．５）に列挙した成分を用いて調製した。１セットは、ｔ0試験のために即座に使用した。
【０２６１】
表１３
組み合わせた成分を有する組成物
【０２６２】
【表１９】
2008531722.tif 000020
【０２６３】
注記：組成物は、（組成物に対して）最終希釈し、ろ過後にオスモル濃度について分析した。
【０２６４】
各時間点でのＡＩＣ濃度及び回収は、２８０ｎｍでの吸光度を用いて測定し、表１４に提示した。
組成物は、本明細書中に記載した方法によって、ＲＡＬＳ、ＩＦ、ＥＦ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによって更に分析した。
組成物を選択するために、決定マトリックス表、表１４を構築した。
【０２６５】
表１４
組成物について成分を選択するための決定表
【０２６６】
【表２０】
2008531722.tif 000021
【０２６７】
＊モノマー％
＊＊全回収
【０２６８】
表１４の結果に基づいて、組成物３、４、６、及び８を選択した（全ては同じ結果を有した）。組成物１及び２は、対照組成物であり、最終組成物として選ばれる十分なオスモル濃度を有していない。
【０２６９】
種々の組成物を比較すると、下記の結論が導かれる：
グリシン濃度の増加及びスクロース濃度の減少（組成物４〜６）は安定性減少の原因となる。スクロース（組成物４）に代えてマンノース（組成物９）の含有は、安定性における相当な減少を引き起こす組成物に帰着する。イソロイシン（組成物１０）の添加、及びスクロース（組成物４）濃度の減少は、安定性の減少に帰着する。リン酸塩緩衝化した組成物（１１〜１４）は、全体としてヒスチジンを緩衝化した組成物と同様には機能しなかった。しかしながら、ＨＰＬＣデータ単独では、リン酸塩緩衝化した組成物は、ほとんどヒスチジン緩衝化した組成物と同程度に機能した。５ｍＭ（組成物８）と２０ｍＭ（組成物６）のヒスチジンを含有する組成物の間には差異がほとんど観察されなかったが、５０ｍＭ  ヒスチジン（組成物７）は、安定性に顕著な減少を引き起こした。
【０２７０】
試験２
組合せ試験２についての組成物の調製
良好な安定化剤として同定された成分の組合せの効果をさらに調査するために、ここに提示した試験は、１種の緩衝剤、２種のアミノ酸、及び３種の糖質を安定化剤として含有する組成物を評価した。それらは、安定性試験の２８日を通して得られたデータに基づいた試験に関して選ばれた。組成物は、ＡＩＣの２８日のインキュベーションからのデータが、ソルビトールがスクロースよりＡＩＣをより良く安定化することを示したので、ソルビトールの使用を探索するように設計した。
【０２７１】
組成物は、表１５に列挙した成分を用いて調製した。各組成物のｐＨは、７．５に調整し、次に、各組成物は、本明細書中に記載されるように調製した。
【０２７２】
表１５
組み合わせた成分を有する組成物
【０２７３】
【表２１】
2008531722.tif 000022
＊測定された実際のオスモル濃度
【０２７４】
透析及びろ過後（ｔ0）、並びに７、１４及び２９日の４０℃でのインキュベーション後のＡＩＣ濃度及び回収は２８０ｎｍの吸光度を用いて測定した。
組成物は、本明細書中に記載されるような方法によって、ＲＡＬＳ、ＩＦ、ＥＦ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによってさらに分析した。
組成物を選択するために、決定マトリックス表、表１６を構築した。
【０２７５】
【表２２】
2008531722.tif 000023
【０２７６】
組成物３、７、９及び１０を選択した。４つ全ては同様の結果を示した。
種々の組成物を比較すると、下記の結論が導かれる。組成物１０が使用のために選択された。ソルビトール濃度の増加は、組成物２対３及び組成物６対７を用いて示されるように安定性を増大した。ロイシン（組成物９）のグリシン（組成物７）への置換は、安定性において僅かな減少を引き起こした。組成物３は、グリシン及びロイシンを含まないでソルビトールを含有し、グリシン又はロイシンと組み合わせたソルビトールを用いた組成物よりも良好な安定化剤であることが提供された。リン酸塩以外のヒスチジンを含有する組成物は、それらの全体の記録（組成物５及び６）に基づいてより高い安定性を提示するが、ソルビトールと組み合わせたリン酸塩は、ＨＰＬＣデータのみ（組成物３対５）を考慮した場合、ヒスチジン及びソルビトールを含有する組成物とほとんど同様にＡＩＣを安定化した。
【０２７７】
試験３：成分の組合せ
組合せ試験３についての組成物の調製
上記の２つの組合せ試験を再度検討後、組合せ試験は、グリシン、プロリン及びロイシンの相互作用を３％ソルビトール及び２０ｍＭヒスチジンと比較して準備した。さらに、ＡＩＣは安定性のために糖質を必要としなくてもよいので、種々の塩がＡＩＣ組成物におけるイオン性調節剤として調査された。前述のイオン強度試験において、ＮａＣｌは、モデル化合物として使用した。データは、安定化剤が存在しない場合に、より高いイオン強度がＡＩＣに好ましくないことを示唆するが、この組成物の反復は、安定化剤としてヒスチジンの存在下で異なった塩又は等張性調節剤と一緒に実行された。
【０２７８】
組成物は、示された組合せを用いて表１７に列挙した成分とともに調製した。各組成物のｐＨを７．５に調整し、組成物は本明細書中に記載されるように調製した。
表１７
組合せた成分を有する組成物
【０２７９】
【表２３】
2008531722.tif 000024
【０２８０】
*ｔ0で測定した実際のオスモル濃度
**この組成物の調製に誤りがあった。この組成物は５７ｍＭ  ＮａＣｌであることが意図された。
【０２８１】
透析及びろ過後（ｔ0）、並びに７、１４及び２８日の４０℃でのインキュベーション後のＡＩＣ濃度及び回収は２８０ｎｍの吸光度を用いて測定した。組成物は、本明細書中に記載される方法によって、ＲＡＬＳ、ＩＦ、ＥＦ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによってさらに分析した。
表１８は、組成物の組合せを選択するためのマトリックスを選択する。
【０２８２】
表１８
組合せを選択するためのマトリックス
【０２８３】
【表２４】
2008531722.tif 000025
【０２８４】
組合せ試験からの５種の組成物を選択した：１、３、４、５、１２。組成物の全ては同様の結果であった。
種々の組成物を比較すると、下記の結論が導かれる。塩は、ＡＩＣが塩の存在下で不安定であるという初期の観察と一致して等張性安定化剤として使用することができない（組成物６〜１１）。組成物１は、前回のラウンドよりもこのラウンドの組成物では良好に記録されるが、十分なオスモル濃度ではない。ヒスチジン及びソルビトールを有するロイシン又はプロリンを含有する組成物（組成物３及び４）は、ロイシン又はプロリンを含まない組成物（組成物１）よりも良好な安定性を提供した。安定化について、ロイシン及びプロリンは、それらがソルビトールと組み合わされる場合、グリシンよりも良好な成分であるが（組成物３及び４対２）、グリシンは、組成物３又は４のいずれかよりもソルビトールを含まない（組成物５）良好な安定化剤である。
【０２８５】
試験４
３つの組合せ試験を再度検討後、最終的な組合せ試験は、所望のｐＨを維持することができる成分の効果を試験するために準備された。２０ｍＭ  ヒスチジン、ｐＨ７．５において２７０ｍＭ  グリシンを含有する組成物は前述の試験で十分に機能したので、表１９に概要した組成物を試験した。
【０２８６】
組成物は、示された組合せを用いて、表１９に列挙された成分を用いて調製された。各組成物のｐＨを７．５に調整し、組成物は、本明細書中に記載の方法に従って調製された。
【０２８７】
表１９
組合せた成分を有する組成物
【０２８８】
【表２５】
2008531722.tif 000026
【０２８９】
ヒスチジン対リン酸塩の使用が確かめられ得るように組成物を調製した。全ての時間点後のろ過後及び透析後（ｔ0）のＡＩＣ濃度及び回収は、２８０ｎｍの吸光度を用いて測定し、表２０に示す。
【０２９０】
表２０
組合せた成分を有する組成物：
Ａ280でのＡＩＣのＡＩＣ濃度
【０２９１】
【表２６】
2008531722.tif 000027
【０２９２】
ｔ28についてのタンパク質濃度は得られなかった。
組成物は、本明細書中に記載した方法によって、ＲＡＬＳ、ＩＦ、ＥＦ及びＳＥＣ−ＨＰＬＣによってさらに分析した。ＲＡＬ測定の結果を図５に示す。
この試験からの組成物を選択するために、決定マトリックス表（表２１）を構築した。
【０２９３】
表２１
ＡＩＣについて組合せ３種の成分を選択するためのマトリックス
【０２９４】
【表２７】
2008531722.tif 000028
【０２９５】
種々の組成物を比較すると、下記の結論が導かれる。ヒスチジンを含有する組成物（１及び３）は、リン酸塩を含有するもの（２）よりも良好な安定性を提供した。低いヒスチジン濃度及び高いグリシン濃度を有する組成物（組成物３）は、高いヒスチジン濃度及び低いグリシン濃度を有する組成物（組成物１）よりも良好な安定性を提供した。データは、ＮａＣｌが存在しない場合、ＡＩＣが最も安定であることを示唆する。ＡＩＣに対して最良のｐＨは７．５（７〜９の範囲）である。ＡＩＣは、実質的にせん断感受性ではない。４０℃を上回る温度は、ＡＩＣの分解に帰着する。熱及びｐＨ応力は、不溶性でありかつ凝集した種を産出する。ＡＩＣ組成物に関してｐＨを維持するための最良の成分は、ヒスチジン、ｐＨ７．５であり、次いでヒスチジン、ｐＨ８．０、及びリン酸塩、ｐＨ７．５及びｐＨ８．０である。安定なＡＩＣ組成物についての最良の所望のアミノ酸は、５ｍＭ  ヒスチジン単独、グリシン、イソロイシン、ロイシン、プロリン、及びアラニンである。全体として、安定なＡＩＣ組成物についての最良の糖質は、ラクトース、スクロース、並びにマンノース及びマルトースである。マルトース及びラクトースは、還元糖である。ＨＰＬＣの結果だけをみると、ソルビトール及びグルコースは、還元糖を除いて全ての糖質に亘って改善された安定性を提供した。いくつかの例では、下記の組成物は、約２℃と約８℃との間の温度で構造的に安定なＡＩＣの液体組成物に対して使用され得る：５ｍＭ  ヒスチジン、２８５ｍＭ  グリシン；２０ｍＭ  ヒスチジン、２７０ｍＭ  グリシン；及び２０ｍＭ  ヒスチジン、５０ｍＭ  グリシン、及び３．８％  ソルビトール。
【０２９６】
本発明は、直接的な説明によって、及び実施例によって詳述されている。本発明の均等物及び変更物は、当業者に明確であろうし、本発明の範囲内に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０２９７】
【図１】図１は、実施例５で検討したように、ＲＡＬＳによって測定されるイオン強度、時間及び温度の効果を示す。対照は、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２である。（バーは、対照及びＮａＣｌ濃度のそれぞれについて、左から右へ、ｔ０、ｔ７  ３０Ｃ、ｔ７  ４０Ｃ、ｔ１４  ３０Ｃである。）
【図２Ａ】図２Ａは、実施例５で検討したように、ｔ7（３０℃）での０．１Ｍ  ＮａＣｌ塩基緩衝液（ＢＢ）中のＡＩＣのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２Ａは２１５ｎｍである。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例５で検討したように、ｔ7（３０℃）での０．１Ｍ  ＮａＣｌ塩基緩衝液（ＢＢ）中のＡＩＣのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２Ｂは２６０ｎｍである。
【図２Ｃ】図２Ｃは、実施例５で検討したように、ｔ7（３０℃）での０．１Ｍ  ＮａＣｌ塩基緩衝液（ＢＢ）中のＡＩＣのＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラムを示す。図２Ｃは２８０ｍＭである。
【図３】図３は、実施例５で検討したように、外部蛍光によって測定したＡＩＣにおけるｐＨ、時間及び温度の効果を示す。対照は、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２である。（バーは、各ｐＨ値について、左から右へ、ｔ０、ｔ７−３０、ｔ７−４０、ｔ１４−３０である。）
【図４Ａ】図４Ａは、ＡＩＣにおけるｐＨの効果を示す：ｔ0ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（２１５ｎｍ）。対照は、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２である。％ＭＲｃは、％モノマー回収である；％Ｔｏｔ  Ｒｃは、％全量回収であり；そして、Ｍ  Ｒｅｃ  ｔ０は、時間０でのモノマー回収である。（図４Ａに関しては、バーは、Ｃｔｌ（対照）、ＰＢＳ対照及び各ｐＨ値のそれぞれについて、左から右へ、％非凝集、％ＭＲｃ、及び％Ｔｏｔ  Ｒｃである。）。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＡＩＣにおけるｐＨ、時間及び温度（４０℃）の効果を示す：ｔ7ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（２１５ｎｍ）。対照は、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２である。％ＭＲｃは、％モノマー回収である；％Ｔｏｔ  Ｒｃは、％全量回収であり；そして、Ｍ  Ｒｅｃ  ｔ０は、時間０でのモノマー回収である。（図４Ｂ〜４Ｃに関しては、バーは、Ｃｔｌ（対照）、ＰＢＳ対照及び各ｐＨ値のそれぞれについて、左から右へ、％非凝集、％ＭＲｃ、％Ｔｏｔ  Ｒｃ、及びＭ  Ｔｅｃ  ｔ０である。）
【図４Ｃ】図４Ｃは、ＡＩＣにおけるｐＨ、時間及び温度（３０℃）の効果を示す：ｔ14ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（２１５ｎｍ）。対照は、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２である。％ＭＲｃは、％モノマー回収である；％Ｔｏｔ  Ｒｃは、％全量回収であり；そして、Ｍ  Ｒｅｃ  ｔ０は、時間０でのモノマー回収である。（図４Ｂ〜４Ｃに関しては、バーは、Ｃｔｌ（対照）、ＰＢＳ対照及び各ｐＨ値のそれぞれについて、左から右へ、％非凝集、％ＭＲｃ、％Ｔｏｔ  Ｒｃ、及びＭ  Ｔｅｃ  ｔ０である。）
【図５】図５は、実施例に示されるように、ＲＡＬＳによって測定されるＡＩＣにおける成分、時間及び温度の組み合わせの効果を示す。ＰＢＳ対照は、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム、１４１．７ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．２である。（バーは、各組成物について、左から右へ、ｔ０、ｔ７、ｔ１４及びｔ２８である。）
【図１】
2008531722.tif 000029
【図２Ａ】
2008531722.tif 000030
【図２Ｂ】
2008531722.tif 000031
【図２Ｃ】
2008531722.tif 000032
【図３】
2008531722.tif 000033
【図４Ａ】
2008531722.tif 000034
【図４Ｂ】
2008531722.tif 000035
【図４Ｃ】
2008531722.tif 000036
【図５】
2008531722.tif 000037
【配列表】
2008531722000001.app
【国際調査報告】
2008531722.tif 000038
2008531722.tif 000039
2008531722.tif 000040