(57)【要約】本発明は、新規のトロンビン切断部位を含むペプチドリンカーを利用する、融合タンパク質を分離するための組成物および方法に関する。本発明は、配列Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５を含む、ペプチドリンカーを提供し、ここで、Ｘ１は互いに同一または異なった２個以上のアミノ酸残基であり；Ｘ２は疎水性アミノ酸であり；Ｘ３はアルギニンまたはリジンであり；Ｘ４はアラニンまたはグリシンであり；そして、Ｘ５は非酸性アミノ酸である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５
ただし、
Ｘ１が互いに同一または異なった２個以上のアミノ酸残基であり；
Ｘ２が疎水性アミノ酸であり；
Ｘ３がアルギニンまたはリジンであり；
Ｘ４がアラニンまたはグリシンであり；そして、
Ｘ５が非酸性アミノ酸である；
を含む、ペプチドリンカー。
【請求項２】
Ｘ１が４個以上のアミノ酸残基である、請求項１記載のペプチドリンカー。
【請求項３】
Ｘ１が１０個以下のアミノ酸残基である、請求項１記載のペプチドリンカー。
【請求項４】
Ｘ１がプロリンまたはアルギニンを含む、請求項１記載のペプチドリンカー。
【請求項５】
Ｘ２が、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１記載のペプチドリンカー。
【請求項６】
Ｘ２がグリシンである、請求項５記載のペプチドリンカー。
【請求項７】
Ｘ５が、セリン、アラニン、アスパラギン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１記載のペプチドリンカー。
【請求項８】
Ｘ５がセリンである、請求項７記載のペプチドリンカー。
【請求項９】
配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）を含む、請求項１記載のペプチドリンカー。
【請求項１０】
配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）を含む、請求項１記載のペプチドリンカー。
【請求項１１】
目的とするタンパク質、融合パートナー、およびそれらの間に置かれたペプチドリンカーを含む融合タンパク質であって、
該ペプチドリンカーが、配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５
ただし、
Ｘ１が互いに同一または異なった２個以上のアミノ酸残基であり；
Ｘ２が疎水性アミノ酸であり；
Ｘ３がアルギニンまたはリジンであり；
Ｘ４がアラニンまたはグリシンであり；および、
Ｘ５が非酸性アミノ酸である；
を含む融合タンパク質。
【請求項１２】
目的とするタンパク質が、インターロイキン（ＩＬ）−１１、チモシンβ４、チモシンα１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、プロテアーゼ活性化型受容体１（ＰＡＲ１）、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、ＲＡＮＴＥＳ、ストロマ細胞由来因子−１α、単球走化性タンパク質、幹細胞因子、ＦＬＴ−３Ｌ、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−β１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、および免疫グロブリン重鎖からなる群から選択される、請求項１１記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記目的とするタンパク質が、ヒトＩＬ１１、チモシンβ４、ＩＬ−６、およびＰＡＲ４からなる群から選択される、請求項１２記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記目的とするタンパク質がヒトＩＬ１１である、請求項１２記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記融合パートナーが親和性ペプチドである、請求項１１記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記融合パートナーが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヘキサヒスチジン、Ｔ７ペプチド、ユビキチン、Ｆｌａｇペプチド、ｃ−ｍｙｃペプチド、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ＢＴａｇ、ガラクトース結合ドメイン、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、カルモジュリン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、Ｓ−ペプチド、ストレプトアビジン、Ｈｉｓ−タグ、およびＳｔｒｅｐ−タグからなる群から選択される、請求項１５記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記融合パートナーがＧＳＴである、請求項１６記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
請求項１１記載の融合タンパク質から目的とするタンパク質を分離する方法であって、該融合タンパク質を十分な量のトロンビンに接触させて、該ペプチドリンカーの切断が起きるようする工程を含む、方法。
【請求項１９】
前記融合タンパク質を、ペプチドリンカーのＸ３とＸ４との間で切断する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記トロンビンがヒトトロンビンである、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記融合タンパク質を、約０．１ユニット〜約１．０ユニットのトロンビンに接触させる、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
前記融合タンパク質を、約０．２ユニット〜約０．７ユニットのトロンビンに接触させる、請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記融合タンパク質を、約０．２ユニット〜約０．５ユニットのトロンビンに接触させる、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記融合タンパク質を、約０．２ユニット〜約０．３ユニットのトロンビンに接触させる、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記融合タンパク質を、約５分間〜約１．５時間トロンビンに接触させる、請求項２０記載の方法。
【請求項２６】
前記融合タンパク質を、約８分間〜約１．２時間トロンビンに接触させる、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記融合タンパク質を、約１０分間〜約１．０時間トロンビンに接触させる、請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記融合タンパク質を、約０．２５ユニットのトロンビンに約３０分間接触させる、請求項２０記載の方法。
【請求項２９】
前記トロンビンがウシトロンビンである、請求項１８記載の方法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質を、約０．１ユニット〜約１．０ユニットのトロンビンに接触させる、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質を、約０．２ユニット〜約０．７ユニットのトロンビンに接触させる、請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質を、約５分間〜約１．５時間トロンビンに接触させる、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
前記融合タンパク質を、約８分間〜約１．２時間トロンビンに接触させる、請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記融合タンパク質を、約１０分間〜約１．０時間トロンビンに接触させる、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記融合タンパク質を、約０．５ユニットのトロンビンに約１時間接触させる、請求項２９記載の方法。
【請求項３６】
請求項１記載のペプチドリンカーをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項３７】
前記ペプチドリンカー中のＸ２が、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項３６記載のポリヌクレオチド。
【請求項３８】
前記ペプチドリンカー中のＸ２がグリシンである、請求項３７記載のポリヌクレオチド。
【請求項３９】
前記ペプチドリンカー中のＸ５が、セリン、アラニン、アスパラギン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項３６記載のポリヌクレオチド。
【請求項４０】
前記ペプチドリンカー中のＸ５がセリンである、請求項３９記載のポリヌクレオチド。
【請求項４１】
前記ペプチドリンカーが、配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）を含む、請求項３６記載のポリヌクレオチド。
【請求項４２】
ペプチドリンカーが、配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）を含む、請求項３６記載のポリヌクレオチド。
【請求項４３】
請求項１１記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４４】
前記目的とするタンパク質が、インターロイキン（ＩＬ）−１１、チモシンβ４、チモシンα１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、プロテアーゼ活性化型受容体１（ＰＡＲ１）、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、ＲＡＮＴＥＳ、ストロマ細胞由来因子−１α、単球走化性タンパク質、幹細胞因子、ＦＬＴ−３Ｌ、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−β１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、および免疫グロブリン重鎖からなる群から選択される、請求項４３記載のポリヌクレオチド。
【請求項４５】
前記目的とするタンパク質がヒトＩＬ１１である、請求項４４記載のポリヌクレオチド。
【請求項４６】
前記融合パートナーが親和性ペプチドである、請求項４３記載のポリヌクレオチド。
【請求項４７】
前記融合パートナーが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヘキサヒスチジン、Ｔ７ペプチド、ユビキチン、Ｆｌａｇペプチド、ｃ−ｍｙｃペプチド、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ＢＴａｇ、ガラクトース結合ドメイン、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、カルモジュリン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、Ｓ−ペプチド、ストレプトアビジン、Ｈｉｓ−タグ、およびＳｔｒｅｐ−タグからなる群から選択される、請求項４６記載のポリヌクレオチド。
【請求項４８】
前記融合パートナーがＧＳＴである、請求項４７記載のポリヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項４３記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５０】
前記ポリヌクレオチドに機能的に結合した１つ以上の調節配列をさらに含む、請求項４９記載のベクター。
【請求項５１】
請求項５０記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５２】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項５１記載の宿主細胞。
【請求項５３】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項５１記載の宿主細胞。
【請求項５４】
請求項３６記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項５５】
前記ポリヌクレオチドの上流および／または下流に１つ以上のクローニング部位をさらに含む、請求項５４記載のベクター。
【請求項５６】
前記ポリヌクレオチドの上流および／または下流にインフレームで融合パートナーをコードするポリヌクレオチドを含む、請求項５４記載のベクター。
【請求項５７】
前記ポリヌクレオチドに機能的に結合した１つ以上の調節配列をさらに含む、請求項５４記載のベクター。
【請求項５８】
請求項５４記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５９】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項５８記載の宿主細胞。
【請求項６０】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項５８記載の宿主細胞。
【請求項６１】
前記目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、請求項５５記載のベクターの前記クローニング部位に挿入する工程を含む、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製する方法
【請求項６２】
融合タンパク質を産生する方法であって、
ａ）目的とするタンパク質、融合パートナー、およびそれらの間に置かれた請求項１記載のペプチドリンカーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを調製する工程；
ｂ）該ベクターを宿主細胞中に送達する工程；
ｃ）該融合タンパク質が発現される条件下で、該宿主細胞を培養する工程；および
ｄ）該融合タンパク質を分離する工程；
を含む、方法。
【請求項６３】
目的とするタンパク質を産生する方法であって、
ａ）該目的とするタンパク質、融合パートナー、およびそれらの間に置かれた請求項１記載のペプチドリンカーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを調製する工程；
ｂ）該ベクターを宿主細胞中に送達する工程；
ｃ）該融合タンパク質が発現される条件下で、該宿主細胞を培養する工程；
ｄ）該融合タンパク質を分離する工程；
ｅ）該融合タンパク質をトロンビンと接触させて、該融合タンパク質を切断する工程；および
ｄ）該目的とするタンパク質を分離する工程；
を含む、方法。
【請求項６４】
前記宿主細胞が真核生物細胞である、請求項６３記載の方法。
【請求項６５】
前記宿主細胞が原核生物細胞である、請求項６３記載の方法。
【請求項６６】
前記宿主細胞が細菌細胞である、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
工程（ｄ）において高圧を加えることによって前記細菌細胞を溶解する、請求項６６記載の方法。
【請求項６８】
前記細菌細胞を高圧ホモジナイザーによって溶解する、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
アフィニティーカラムにより前記融合タンパク質の分離を行う、請求項６３記載の方法。
【請求項７０】
前記融合タンパク質が前記アフィニティーカラムに結合している間に、該融合タンパク質とトロンビンとの接触を行う、請求項６９記載の方法。
【請求項７１】
前記融合タンパク質を分離する工程が、前記目的とするタンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィーに供する工程をさらに含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７２】
前記融合タンパク質を分離する工程が、前記目的とするタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程をさらに含む、請求項６９記載の方法。
【請求項７３】
前記トロンビンがヒトトロンビンである、請求項６３記載の方法。
【請求項７４】
前記融合タンパク質を、約０．１ユニット〜約１．０ユニットのトロンビンに接触させる、請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記融合タンパク質を、約０．２ユニット〜約０．７ユニットのトロンビンに接触させる、請求項７４記載の方法。
【請求項７６】
前記融合タンパク質を、約０．２ユニット〜約０．５ユニットのトロンビンに接触させる、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記融合タンパク質を、約０．２ユニット〜約０．３ユニットのトロンビンに接触させる、請求項７６記載の方法。
【請求項７８】
前記融合タンパク質を、約５分間〜約１．５時間トロンビンに接触させる、請求項７３記載の方法。
【請求項７９】
前記融合タンパク質を、約８分間〜約１．２時間トロンビンに接触させる、請求項７８記載の方法。
【請求項８０】
前記融合タンパク質を、約１０分間〜約１．０時間トロンビンに接触させる、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記融合タンパク質を、約０．２５ユニットのトロンビンに約３０分間接触させる、請求項７３記載の方法。
【請求項８２】
前記トロンビンがウシトロンビンである、請求項８１記載の方法。
【請求項８３】
前記融合タンパク質を、約０．１ユニット〜約１．０ユニットのトロンビンに接触させる、請求項８２記載の方法。
【請求項８４】
前記融合タンパク質を、約０．２ユニット〜約０．７ユニットのトロンビンに接触させる、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
前記融合タンパク質を、約５分間〜約１．５時間トロンビンに接触させる、請求項８２記載の方法。
【請求項８６】
前記融合タンパク質を、約８分間〜約１．２時間トロンビンに接触させる、請求項８５記載の方法。
【請求項８７】
前記融合タンパク質を、約１０分間〜約１．０時間トロンビンに接触させる、請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
前記融合タンパク質を、約０．５ユニットのトロンビンに約１．０間接触させる、請求項８２記載の方法。
【請求項８９】
請求項５４記載のベクターを含む、キット。
【請求項９０】
前記ベクターが、前記ポリヌクレオチドの上流および／または下流に１つ以上のクローニング部位をさらに含む、請求項８９記載のキット。
【請求項９１】
前記ベクターが、前記ポリヌクレオチドの上流および／または下流にインフレームで融合パートナーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項８９記載のキット。
【請求項９２】
前記ベクターが、前記ポリヌクレオチドに機能的に結合した１つ以上の調節配列をさらに含む、請求項８９記載のキット。
【請求項９３】
前記ベクターを使用するための説明書をさらに含む、請求項８９記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、融合タンパク質を分離するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
関連技術
融合タンパク質を利用した発現系は、十分に受容されている、組換えタンパク質を作製するための技術である。これらの系では、融合パートナーは、所望のタンパク質の発現および精製を促進する。融合パートナーは、しばしば、融合タンパク質のその後の精製を促進することができる「タグ」を提供するために利用される。しかし、所望のタンパク質を天然型または薬学的に許容される形で回収するためには、融合タンパク質を単離したところで、融合パートナーを取り除かなければならない。融合パートナーを除去するために最も広く利用されている方法は、トロンビン、第Ｘａ因子、またはエンテロキナーゼなどの特異的切断酵素を使用することを含む（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３）。これは、所望のタンパク質と融合パートナーとの間を切断酵素によって切断させるのに特異的でユニークなアミノ酸配列を挿入することを含む。切断酵素（例えばトロンビン）で融合タンパク質を切断することによって、所望のタンパク質を回収することができる。
【０００３】
トロンビンは、セリンアミノ酸を用いてペプチド結合を切断するトリプシン様セリンプロテアーゼである。多くの研究者によってトロンビンの特異性が研究されてきた。既知のトロンビン切断部位は以下の通りである（非特許文献４；非特許文献５）。
１）Ｐ４−Ｐ３−Ｐｒｏ−Ａｒｇ／Ｌｙｓ↓Ｐ１’−Ｐ２’、Ｐ３およびＰ４は疎水性アミノ酸であり、Ｐ１’およびＰ２’は非酸性アミノ酸である。Ａｒｇ／Ｌｙｓ↓Ｐ１’の結合が切断される。
例：
【０００４】
【表１】
2008539696.tif 000002
２）Ｐ２−Ａｒｇ／Ｌｙｓ↓Ｐ１’、Ｐ２またはＰ１’がＧｌｙである。Ａｒｇ／Ｌｙｓ↓Ｐ１’の結合が切断される。
例：
【０００５】
【表２】
2008539696.tif 000003
最も頻繁に利用されるトロンビン切断配列は、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ（配列番号：４）またはＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１）であり、これらは、ウシの第ＸＩＩＩ因子中の配列に由来する（Ｔａｋａｇｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ１３：７５０（１９７４））。切断はアルギニン残基で起き、目的とするタンパク質が、そのアミノ酸末端にＧｌｙまたはＧｌｙ−Ｓｅｒが付加された形で得られる。このトロンビン切断配列は、ｐＧＥＸシリーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）やｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ）など、いくつかの市販されている発現プラスミドでも使用されている。
【０００６】
最近になって、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１）配列をさらに改変して、配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ（配列番号：５）を含むグリシンリッチなリンカーが、トロンビン切断部位であるＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１）のすぐ前か後に位置して含まれるようにした（非特許文献６；非特許文献７）。
【０００７】
現在既知のリンカー配列領域内におけるトロンビンによる切断は十分に特異的であるものの完全ではない。トロンビンは適度に特異的な酵素であるが、さまざまに異なったアミノ酸配列をその切断部位として利用することができる。標的タンパク質がトロンビン切断部位を含む場合には、それらの部位で切断が起きる可能性があり、所望の全長タンパク質ではなく、内部的に切断されたタンパク質が産生される結果となる。
【０００８】
例えば、内部にトロンビン切断配列を含むハロバクテリウム・ハロビウム（Ｈａｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｈａｌｏｂｉｕｍ）Ｌ１１タンパク質を、ＧＳＴタグとＬ１１との間にＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１）トロンビン切断部位を含んだＧＳＴ融合タンパク質として発現させたときに、トロンビンで処理したところ、標的タンパク質Ｌ１１とＧＳＴタグとの間ではなく、Ｌ１１内で切断される結果となった（非特許文献８）。また、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＣｄｃ１４ｐタンパク質も、内部にトロンビン切断配列を持っている。Ｃｄｃ１４ｐタンパク質を、Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：６）トロンビン切断部位を含むＧＳＴ融合タンパク質として発現させると、融合タンパク質は、トロンビン切断リンカーの内部にある部位だけでなく、Ｃｄｃ１４ｐの内部にある部位でも切断された（非特許文献９）。
【０００９】
本発明は、当業者に知られている優れた特異性をもたらす、トロンビン切断用の新規リンカー配列を提供する。
【非特許文献１】Ｗａｓｓｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．６：１７１８（１９９７）
【非特許文献２】Ｓｃｈｌｕｍｐｂｅｒｇｅｒら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．９：４４０（２０００）
【非特許文献３】Ｚａｉｔｓｅｖａら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．５：１１００（１９９６）
【非特許文献４】Ｃｈａｎｇ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：２１１（１９８５）
【非特許文献５】ＧＳＴ  ｇｅｎｅ  ｆｕｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｈａｎｄｂｏｏｋ，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｅｄｉｔｉｏｎ  ＡＡ，ｐ．８８−８９
【非特許文献６】Ｇｕａｎら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９２：２６２（１９９１）
【非特許文献７】Ｈａｋｅｓら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０２：２９３（１９９２）
【非特許文献８】Ｐｏｒｓｅら、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２７６：３９１（１９９８）
【非特許文献９】Ｔａｙｌｏｒら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２４０５４（１９９７）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
本発明は、新規のトロンビン切断部位を含むペプチドリンカーであって、目的とするタンパク質を含む融合タンパク質を組換えにより産生させ、かつ、目的とするタンパク質を融合タンパク質から分離するのに役立つペプチドリンカーを提供する。一つの実施形態において、このペプチドリンカーは、以下の配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５
ただし、
Ｘ１は、互いに同一または異なった２つ以上のアミノ酸残基であり；
Ｘ２は、疎水性アミノ酸であり；
Ｘ３は、アルギニンまたはリジンであり；
Ｘ４は、アラニンまたはグリシンであり；そして、
Ｘ５は、非酸性アミノ酸である；
を含む。
【００１１】
本発明は、目的とするタンパク質、融合パートナー、およびそれらの間に置かれた本発明のペプチドリンカーを提供する。また、本発明は、目的とするタンパク質を融合タンパク質から分離する方法であって、この融合タンパク質を十分な量のトロンビンに接触させて、ペプチドリンカーの切断を生じさせることを含む方法も提供する。切断反応が起きた後、目的とするタンパク質が融合タンパク質から生じる。目的とするタンパク質は、当業者に周知の簡単な技術を用いて回収することができる。
【００１２】
本発明を用いて、宿主細胞中で組換えＤＮＡ技術の産物として発現させることができる、原核生物または真核生物のタンパク質を精製することができる。これらの組換えタンパク質産物には、サイトカイン、ケモカイン、ホルモン、レセプター、酵素、貯蔵タンパク質、血液タンパク質、タンパク質工学技術によって生み出された変異タンパク質、または合成タンパク質などがある。
【００１３】
さらに、本発明は、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、それを含むベクター、およびそのベクターを含む宿主細胞に関する。
【００１４】
本発明は、また、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製する方法、融合タンパク質を産生させる方法、および目的とするタンパク質を産生する方法も提供する。
【００１５】
本発明は、また、本発明のポリヌクレオチドおよびベクターを含むキットも提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、トロンビンなどにより切断可能なトロンビン切断部位を含むリンカーペプチドを提供する。一つの実施態様において、このペプチドリンカーは以下の配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５
ただし、
Ｘ１は、互いに同一または異なった２つ以上のアミノ酸残基であり；
Ｘ２は、疎水性アミノ酸であり；
Ｘ３は、アルギニンまたはリジンであり；
Ｘ４は、アラニンまたはグリシンであり；そして、
Ｘ５は、非酸性アミノ酸である；
を含む。
【００１７】
一つの実施形態において、Ｘ１は、互いに同一または異なった４つ以上のアミノ酸残基である。別の実施形態において、Ｘ１は１０個以下のアミノ酸残基、例えば、８個以下のアミノ酸残基、例えば、６個以下のアミノ酸残基である。例えば、さまざまな実施形態において、Ｘ１は２〜６個、２〜８個、２〜１０個、４〜６個、４〜８個、または４〜１０個のアミノ酸残基であってよい。
【００１８】
ペプチドリンカーをトロンビンで処理すると、Ｘ３とＸ４との間の結合で切断が起きる。切断部位に対して、Ｘ１が２個のアミノ酸残基である場合には、Ｘ１は、第５位および第６位（Ｐ５〜Ｐ６）を占め、Ｘ１が４個のアミノ酸残基である場合には、第５位から第８位（Ｐ５〜Ｐ８）を占める。Ｘ２、Ｓｅｒ、Ｐｒｏ、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ５は、それぞれ第４位、３位、２位、１位、１’位、および２’位（Ｐ４、Ｐ３、Ｐ２、Ｐ１、Ｐ１’、Ｐ２’）を占める。一つの実施形態において、Ｘ１はＰｒｏおよびＡｒｇを含む。一つの実施形態において、Ｘ３はＡｒｇまたはＬｙｓであり得る。ＡｒｇまたはＬｙｓがカルボキシル基の前にあると、トロンビンはペプチド結合を切断する。別の実施形態において、Ｘ４はＡｌａまたはＧｌｙであり得る。ＡｌａおよびＧｌｙの特性は非常に似ており、どちらも小さく非極性のアミノ酸である。一つの実施形態において、Ｘ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、およびＴｒｐからなる群から選択された疎水性アミノ酸であり得る。特定の実施形態において、Ｘ２はＧｌｙである。さらなる実施形態において、Ｘ５は、Ｓｅｒ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｌｙｓ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐからなる群から選択された非酸性アミノ酸であり得る。特定の実施形態において、Ｘ５はＳｅｒである。一つの実施形態において、Ｘ１は、２つ以上の任意のアミノ酸であり得る。別の実施形態において、Ｘ１は、４つ以上の任意のアミノ酸であり得る。Ｘ１の正確なアミノ酸配列が、トロンビン切断に顕著な影響を及ぼすことはない。
【００１９】
一つの実施形態において、ペプチドリンカーは、配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）を含む。さらなる実施形態において、ペプチドリンカーは、配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）を含む。この切断部位を含む融合タンパク質をトロンビンで処理すると、切断部位内のＡｒｇ↓Ａｌａ結合が切断される。一つの実施形態において、ペプチドリンカーは、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）以外の配列を含む。別の実施形態において、ペプチドリンカーは、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）以外の配列を含む。
【００２０】
ペプチドリンカー配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）およびＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）は、Ｐ３アミノ酸のＳｅｒが疎水性でないために、既知のトロンビン切断部位とは異なっている。従来の研究によれば、最適なトロンビン切断部位は、Ｐ３位に疎水性アミノ酸を含む（Ｃｈａｎｇ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１５１：２１１（１９８５））。非疎水性アミノ酸がＰ３位置に存在すると、トロンビン切断にかかる時間が延びることが知られている。Ｒａｆｔｅｒｙらは、マウスのＭＲＰ１４タンパク質に存在するアミノ酸配列Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ（配列番号：９）がトロンビンの基質であるかもしれないが、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１）と比べると、不良な基質である旨を報告していた（Ｒａｆｔｅｒｙら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ．Ｐｕｒｉｆ．１５：２２８（１９９９））。トロンビンの天然基質であるフィブリノーゲンの場合、フィブリノペプチドＡ（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｒｇ↓Ｇｌｙ−Ｐｒｏ）（配列番号：１０）のＰ３位にはＧｌｙが存在するが、フィブリノペプチドＢ（Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ↓Ｇｌｙ−Ｈｉｓ）（配列番号：１１）のＰ３位にはＳｅｒが見出される。フィブリノペプチドＡは、フィブリノペプチドＢよりも急速にトロンビンによって切断される（Ｂｉｎｎｉｅら、Ｂｌｏｏｄ．８１：３１８６（１９９３））。
【００２１】
本発明は、目的とするタンパク質、融合パートナー、およびそれらの間に置かれたペプチドリンカーを含む融合タンパク質を提供する。
【００２２】
本明細書において、用語「融合タンパク質」および「キメラタンパク質」は互換的であり、目的とするタンパク質、融合パートナー、およびそれらの間に置かれた、トロンビン切断部位を持つペプチドリンカーを含むポリペプチドおよびタンパク質を意味する。一つの実施形態において、目的とするタンパク質はペプチドリンカーのＮ−末端に結合し、融合パートナーはペプチドリンカーのＣ−末端に結合している。別の実施形態において、目的とするタンパク質は、ペプチドリンカーのＣ−末端に結合し、融合パートナーがペプチドリンカーのＮ−末端に結合している。さらなる実施形態において、融合タンパク質は、それぞれがペプチドリンカーによって隔てられた１つ以上の目的とするタンパク質および／または１つ以上の融合パートナーを含むことも可能である。これらの実施形態において、複数の目的とするタンパク質は同一でも異なっていてもよく、複数の融合パートナーは同一でも異なっていてもよく、複数の目的とするペプチドリンカーは同一でも異なっていてもよい。
【００２３】
本明細書において、用語「目的とするタンパク質」、「所望のポリペプチド」、「所望のタンパク質」、または「標的タンパク質」は互換的であり、その産生が望ましいタンパク質またはペプチドを意味する。一つの実施形態において、このタンパク質またはペプチドは生物学的に活性である。目的とするタンパク質の例には、インターロイキン（ＩＬ）−１１、チモシンβ４、チモシンα１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、プロテアーゼ活性型レセプター１（ＰＡＲ１）、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、ＲＡＮＴＥＳ、ストロマ細胞由来因子−１α、単球走化性タンパク質、幹細胞因子、ＦＬＴ−３Ｌ、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−β１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、および免疫グロブリン重鎖などがあるが、これらに限定されない。一つの実施形態において、目的のタンパク質は、ヒトＩＬ１１、チモシンβ４、ＩＬ−６およびＰＡＲ４からなる群から選択される。別の実施形態において、目的とするタンパク質はヒトＩＬ１１である。
【００２４】
本明細書において、用語「融合パートナー」は、融合タンパク質に含まれることが望ましいタンパク質またはペプチドを意味する。一つの実施形態において、融合パートナーは、融合タンパク質に改善された特性、例えば、精製の容易さ、安定性、可溶性などを付与する。一つの実施形態において、融合パートナーは親和性ペプチドである。親和性ペプチドの例には、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヘキサヒスチジン、Ｔ７ペプチド、ユビキチン、Ｆｌａｇペプチド、ｃ−ｍｙｃペプチド、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ＢＴａｇ、ガラクトース結合ドメイン、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、カルモジュリン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、Ｓ−ペプチド、ストレプトアビジン、Ｈｉｓ−タグ、およびＳｔｒｅｐ−タグなどがあるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書において、用語「ペプチドリンカー」は、トロンビンによって認識および切断されるトロンビン切断部位を含む特異的アミノ酸配列を意味する。
【００２６】
本明細書において、用語「トロンビン」は、本発明のペプチドリンカーを切断する能力のある、任意の形態のトロンビンを意味する。トロンビンは、ある程度の切断活性をタンパク質が保持しているのであれば、天然のトロンビン、組換えトロンビン、トロンビン断片、およびトロンビンアナログを含むことが可能である。一つの実施形態において、トロンビンは、ヒトトロンビンであっても、ウシトロンビンであってもよく、ヒトまたはウシの配列に由来する天然トロンビン、組換えトロンビン、またはトロンビン断片およびアナログを含む。
【００２７】
本発明は、目的とするタンパク質を、この目的とするタンパク質、融合パートナー、およびこれらの間に置かれたペプチドリンカーを含む融合タンパク質から分離する方法であって、該融合タンパク質を十分な量のトロンビンに接触させて、ペプチドリンカーの切断を生じさせることを含む方法を提供する。一つの実施形態において、融合タンパク質は、ペプチドリンカーのＸ３とＸ４との間で切断される。この方法は、目的とするタンパク質を、例えば、アフィニティー精製またはサイズ分離によって、融合タンパク質の他の部分から分離することをさらに含む。
【００２８】
一つの実施形態において、トロンビンはヒトトロンビンであって、融合タンパク質を、約０．１ＵＳＰユニット〜約１．０ＵＳＰユニットのトロンビン、例えば、約０．２ＵＳＰユニット〜約０．７ＵＳＰユニットのトロンビン、例えば、約０．２ＵＳＰユニット〜約０．５ユニットのトロンビン、例えば、約０．２ユニット〜約０．３ユニットのトロンビンと接触させる。別の実施形態において、トロンビンはヒトトロンビンであって、融合タンパク質を、約５分間〜約１．５時間、例えば、約８分間〜約１．２時間、例えば、約１０分間〜約１．０時間、トロンビンと接触させる。さらなる実施形態において、トロンビンはヒトトロンビンであって、融合タンパク質を、約３０分間、約０．２５ユニットのトロンビンと接触させる。
【００２９】
一つの実施形態において、トロンビンはウシトロンビンであって、融合タンパク質を、約０．１ユニット〜約１．０ユニットのトロンビン、例えば、約０．２ユニット〜約０．７ユニットのトロンビンと接触させる。別の実施形態において、トロンビンはウシトロンビンであって、融合タンパク質を、約５分間〜約１．５時間、例えば、８分間〜約１．２時間、例えば、約１０分間〜約１．０時間、トロンビンと接触させる。さらなる実施形態において、トロンビンはウシトロンビンであって、融合タンパク質を、約１．０時間、約０．５ユニットのトロンビンと接触させる。
【００３０】
本発明は、本発明のペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドを提供する。このポリヌクレオチドは化学合成またはクローニングによって調製することができる。
【００３１】
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを提供する。本発明によって、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを単離するか、合成するか、または別の方法で得て、リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に結合させる。リンカーペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に結合した所望のタンパク質遺伝子を含むハイブリッドポリヌクレオチドをキメラポリヌクレオチドと呼ぶ。一つの実施形態において、キメラポリヌクレオチドを、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド配列を取り込むプライマーを使用して、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応法などの増幅法によって調製して、増幅産物が、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に結合した、ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドを含むようにする。別の実施形態において、ポリヌクレオチドを、リガーゼを用いて連結させる。そして、キメラポリヌクレオチドを、融合パートナーをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合させて、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを産生する。別の実施形態において、融合パートナーをコードするポリヌクレオチドを、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合させて、キメラポリヌクレオチドを形成させてから、このキメラポリヌクレオチドを、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドに機能的に結合させて、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを産生する。
【００３２】
本明細書において、タンパク質またはペプチドをコードする２つのポリヌクレオチドについて言う場合には、用語「機能的に結合」は、２つのポリヌクレオチドが、両方のポリヌクレオチドを跨いで連続したオープンリーディングフレームが存在するように結合することを意味する。調節エレメントに関する場合には、用語「機能的に結合」は、調節エレメントが、ポリヌクレオチドの転写および／または翻訳に作用を及ぼすように、調節エレメントが、タンパク質またはペプチドをコードするポリヌクレオチドに結合することを意味する。
【００３３】
本発明は、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドを含むベクター（例えばプラスミドベクター、ウイルスベクター、またはバクテリオファージベクター）を提供する。一つの実施形態において、ベクターは発現ベクターである。ベクターは、好ましくは、宿主細胞中で自己複製可能であり、好ましくは、薬剤耐性遺伝子（例えばアンピシリンもしくはテトラサイクリン）または栄養要求性相補遺伝子などの選択可能なマーカーを含む。一つの実施形態において、ベクターは、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドに、（例えば、同一のリーディングフレーム内の上流または下流に）機能的に結合した、融合パートナーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドに、（例えば、同一のリーディングフレーム内の上流または下流に）機能的に結合した、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、目的とするタンパク質、融合パートナー、およびそれらの間に置かれたペプチドリンカーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。一つの実施形態において、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、目的とするタンパク質または融合パートナーをコードするポリヌクレオチドが、ペプチドリンカーとインフレームでベクターにクローニングされ易くなるよう、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドの上流および／または下流に、１つ以上のクローニング部位、例えば、制限酵素認識部位をさらに含む。
【００３４】
ベクターは、適当な宿主細胞内における融合タンパク質の発現を調節するために必要な調節配列（例えば転写因子および翻訳因子）を提供する。これらの調節配列は、一つ以上のプロモーター領域、エンハンサー領域、転写終結点、リボソーム結合部位、開始コドン、スプライスシグナル、イントロン、ポリアデニル化シグナル、シャイン／ダルガノ翻訳配列、およびコザック共通配列を含むことができる。調節配列は、融合タンパク質を産生させる宿主細胞に関して選択される。適当な細菌プロモーターには、バクテリオファージλｐＬもしくはｐＲ、Ｔ６、Ｔ７、Ｔ７／ｌａｃＯ、ｌａｃ、ｒｅｃＡ、ｇａｌ、ｔｒｐ、ａｒａ、ｈｕｔ、およびｔｒｐ−ｌａｃなどがあるが、これらに限定されない。適当な真核生物プロモーターには、ＰＲＢＩ、ＧＡＰＤＨ、メタロチオネイン、チミジンキナーゼ、ウイルスＬＴＲ、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、または、α−フェトタンパク質、アミラーゼ、カテプシンＥ、Ｍ１ムスカリンレセプター、もしくはγ−グルタミルトランスフェラーゼなどの組織特異的もしくは腫瘍特異的なプロモーターなどがあるが、これらに限定されない。
【００３５】
また、宿主細胞から培養基の中、または宿主細胞のペリプラズムの中に分泌される融合タンパク質は、シグナル配列を含むこともできる。シグナル配列は、融合パートナーであってよく、または融合パートナー以外のものであってよい。シグナル配列をコードするポリヌクレオチドは、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’末端に機能的に結合することができる。さらに、別のペプチドリンカーをシグナル配列と融合タンパク質の残余との間に挿入して、トロンビンによる切断によりシグナル配列が融合タンパク質から除去されるようにすることができる。適当なシグナル配列は当技術分野においてよく知られており、例えば、大腸菌に由来するＭＢＰ、ＧＳＴ、ＴＲＸ、ＤｓｂＡ、およびＬａｍＢ、ならびに酵母菌に由来するα−因子などがある。
【００３６】
適当な発現ベクターのさらなる例は、米国特許第５，８１４，５０３号に見出されるが、この文献は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３７】
本発明は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを調製する方法であって、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターのクローニング部位に挿入して、ポリヌクレオチドが、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドの上流または下流でインフレームになるようにする工程を含む方法を提供する。さらなる実施形態では、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、融合パートナーをコードするポリヌクレオチド配列に機能的に結合した、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターのクローニング部位に挿入して、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドの上流または下流でインフレームになるようにする。
【００３８】
本発明は、本発明のベクターを含む宿主細胞を提供する。宿主細胞は、原核生物細胞（例えば細菌）、および真核生物細胞（例えば真菌、酵母菌、動物、昆虫、植物）など、融合タンパク質を発現させるのに適した任意の細胞であってよい。適当な原核宿主細胞には、大腸菌（例えばＤＨ５株、ＨＢ１０１株、ＪＭ１０９株、またはＷ３１１０株）、バシラス属、ストレプトミセス属、サルモネラ属、セラチア属、およびシュードモナス属の種が含まれるが、これらに限定されない。適当な真核宿主細胞には、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅｐＧ−２、ＣＶ−１、ＬＬＣ−ＭＫ２、３Ｔ３、ＨｅＬａ、ＲＰＭＩ８２２６、２９３、ＢＨＫ−２１、Ｓｆ９、およびサッカロミセス属、ピキア属、ハンゼヌラ属、クルイベロミセス属、アスペルギルス属、またはトリコデルマ属の種が含まれるが、これらに限定されない。
【００３９】
組換えベクター、およびそれを用いて形質転換用宿主細胞を調製し、宿主細胞中でベクターを複製させ、生物活性の外来ポリペプチドおよびタンパク質を発現させるための方法および材料は、Ｏｌｄら、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９８１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２００１、およびＡｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  ３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００）に記載されており、それぞれが参照されて本明細書に組み込まれる。ベクターは、当技術分野において周知の手段により宿主細胞に導入することができ、そのような手段には、形質移入、リン酸カルシウム沈殿、電気穿孔法、リポフェクション、マイクロインジェクション、およびウイルス感染などがあるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを調製すること、ベクターを宿主細胞中に送達すること、融合タンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養すること、および融合タンパク質を分離することを含む、融合タンパク質を産生させる方法を提供する。該方法は、分離した融合タンパク質をトロンビンに接触させて融合タンパク質を切断すること、および目的とするタンパク質を分離することをさらに含むことが可能である。
【００４１】
さらに、本発明は、本発明の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを調製すること、ベクターを宿主細胞中に送達すること、融合タンパク質が発現される条件下で宿主細胞を培養すること、融合タンパク質を分離すること、分離した融合タンパク質をトロンビンと接触させて融合タンパク質を切断すること、および目的とするタンパク質を分離することを含む、目的とするタンパク質を産生させる方法を提供する。
【００４２】
融合タンパク質は、当技術分野周知の手段によって宿主細胞から分離することができる。融合タンパク質が宿主細胞から分泌されれば、融合タンパク質を含む培養基を回収することができる。融合タンパク質が宿主細胞から分泌されなければ、細胞を溶解して融合タンパク質を放出させることができる。例えば細菌細胞は、（例えば、高圧破砕機を用いて）高圧をかけるか、または超音波処理によって溶解させることができる。
【００４３】
好ましくは、融合タンパク質は、融合パートナーに基づいたアフィニティー精製によって分離される。例えば、ＧＳＴを含む融合タンパク質は、グルタチオン含有カラムで分離することができ、ヘキサヒスチジンタグを含む融合タンパク質は、金属含有カラムで分離することができる。
【００４４】
融合タンパク質を分離するにはアフィニティー精製法が好ましいが、アフィニティー精製の代わり、またはアフィニティー精製に加えて、溶媒抽出法、限外濾過法、硫安分画法、ＨＰＬＣ、ゲル濾過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、電気泳動法、および等電点電気泳動法など、タンパク質を分離するための任意の周知技術を用いることができる。
【００４５】
一つの実施形態において、融合パートナーをカラムに結合させ、目的とするタンパク質を通過させて回収するために、分離した融合タンパク質をトロンビンに接触させ、切断されたタンパク質をアフィニティークロマトグラフィーによって分離することができる。別の実施形態において、融合タンパク質を、アフィニティークロマトグラフィーによって分離し、その後アフィニティーメディアから溶出ししてから、トロンビンに接触させることができる。さらなる実施形態において、融合タンパク質を、アフィニティーメディアに依然として付着している間にトロンビンと接触させて、目的とするタンパク質を放出させることができる。トロンビンの濃度は、約０．１〜約１００ＵＳＰユニット／ｍｌ、例えば約１〜約５０ユニット／ｍｌ、例えば約１０ユニット／ｍｌの範囲であってよい。流速は、ポンプを止めて０ｍｌ／分に調節して、約５分間〜約６０分間、例えば約１０分間〜約１５分間これを維持することができる。
【００４６】
トロンビンによって融合タンパク質を切断するための条件は、当技術分野においてよく知られており、典型的には以下の通りである。ｐＨは約７〜約９、約４℃〜約３７℃、基質：酵素の比は約５：１〜約１２５：１（モル比）、約１時間〜２４時間。
【００４７】
また、上記のタンパク質精製技術は、トロンビンによって融合タンパク質を切断した後、目的とするタンパク質を分離するために使用することもできる。一つの実施形態において、目的とするタンパク質を、陽イオン交換クロマトグラフィー（例えばＣＭ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）および／または陰イオン交換クロマトグラフィー（例えばＱ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ）に供する。一つの実施形態において、目的とするタンパク質をまず陽イオン交換クロマトグラフィーに供し、続いて陰イオン交換クロマトグラフィーに供する。
【００４８】
例えば、アフィニティークロマトグラフィーから単離された組換えＩＬ−１１タンパク質を、まず、陽イオン交換カラム、例えばＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗメディアを用いて精製することができる。このメディアを充填したカラムを、２５ｍＭトリス塩酸を含むバッファーＢで平衡化することができる。ＩＬ−１１タンパク質を含むサンプルを、バッファーＢで約４倍に希釈してから、カラム上にロードすることができる。カラムを洗浄するために、バッファーＢをロードしてから、ｐＨ９．５の０．１５Ｍ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨを含むバッファーＥ添加することができる。標的タンパク質を、ｐＨ９．５の０．１５Ｍ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨ、および０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含むバッファーＦで溶出することができる。この工程の手順はすべて、約４℃で行うことができる。バッファーＢのｐＨ値は、約７．５〜約８．５の範囲であってよい。バッファーＥおよびバッファーＦの場合には、ｐＨは約９．２〜約９．７の範囲であってよい。
【００４９】
陽イオン交換カラムから溶出した組換えＩＬ−１１タンパク質は、陰イオン交換カラム、例えばＱ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗメディアを用いて、さらに精製することができる。このメディアを充填したカラムは、ｐＨ９．５の１Ｍ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨを含むバッファーＧで平衡化することができる。このカラムは、ｐＨ９．５の４０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨを含むバッファーＨで再平衡化することができる。前工程から得られたサンプルを水で約４倍に希釈してから、カラム上にロードすることができる。そして、標的タンパク質を含む流下液を回収することができる。また、ｐＨ９．５の４０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨを含むバッファーＨをカラムに添加し、その流下液も回収する。この工程におけるｐＨ値は約９．２〜約９．７または約９．５の範囲であってよい。この陰イオン交換クロマトグラフィーのすべての手順は、ほぼ室温で行うことができる。これらの手順によって、内毒素を効率的に除去することができる。
【００５０】
本発明は、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドを含むキットを提供する。一つの実施形態において、キットは、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドを含むベクターを含む。別の実施形態において、ベクターは発現ベクターである。一つの実施形態において、ベクターは、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドに、例えば、同一リーディングフレーム内で上流または下流に機能的に結合した、融合パートナーをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドに、例えば、同一リーディングフレーム内で上流または下流に機能的に結合した、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む。別の実施形態において、ベクターは、目的とするタンパク質、融合パートナー、およびこれらの間に置かれたペプチドリンカーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む。一つの実施形態において、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドの上流および／または下流に、１つ以上のクローニング部位、例えば、制限酵素認識部位をさらに含み、目的とするタンパク質または融合パートナーをコードするポリヌクレオチドが、ペプチドリンカーとインフレームでベクター中にクローニングされやすくする。さらなる実施形態において、ベクターは、融合パートナーをコードするポリヌクレオチドに機能的に結合した、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドを含み、さらに、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチドの上流または下流に一つ以上のクローニング部位を含む。一つの実施形態において、ポリヌクレオチドの順序は、融合パートナー、ペプチドリンカー、クローニング部位である。代替的な実施形態において、ポリヌクレオチドの順序はクローニング部位、ペプチドリンカー、融合パートナーである。一つの実施形態において、キットは、各ベクターが、ペプチドリンカーをコードするポリヌクレオチド、およびペプチドリンカーに対して異なったリーディングフレームで複数のクローニング部位を含む複数のベクターを含み、よって、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、これらのベクターの一つにペプチドリンカーとインフレームになるよう挿入され得る。
【００５１】
キットは、ベクターを使用することに関連する他の薬剤、例えば、バッファー、制限酵素、リガーゼ、ホスホリラーゼ、宿主細胞などをさらに含む。また、キットは、ベクターを使用するための指示、例えば、目的とするタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入したり、融合タンパク質を産生させたりするための説明書を含んでよい。
【００５２】
以下の実施例は、本発明を具体的に説明するものであって、これを制限するものではない。その他、医療および薬学において通常見かけられ、かつ当業者に明白な、さまざまな条件およびパラメーターを適当に改変および適合させることも、本発明の趣旨および範囲内に含まれる。
【実施例】
【００５３】
実施例１
ＧＳＴ−ＩＬ１１（Ａ）
本実施例では、融合タンパク質ＧＳＴ−ＩＬ１１（Ａ）を調製した。融合タンパク質ＧＳＴ−ＩＬ１１（Ａ）は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）およびヒトＩＬ−１１からなり、これらの間に挿入されたトロンビン切断部位をもつ。ＧＳＴ−ＩＬ１１（Ａ）のトロンビン切断部位はＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）である。
【００５４】
ＧＳＴ−ＩＬ１１（Ａ）を産生させるために、大腸菌発現プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−ｈＩＬ１１（Ａ）を構築した（図１）。ヒトＩＬ−１１をコードするＤＮＡ配列を、ヒトＩＬ−１１からのＰＣＲおよび部位特異的突然変異誘発法によって得た。以下のプライマー対をＰＣＲに使用した。
【００５５】
【数１】
2008539696.tif 000004
以下のプライマー対を、部位特異的突然変異誘発法に使用した。
【００５６】
５’ＤＮ：ＣＣＡ  ＧＣＣ  ＡＣＣ  ＣＣＣ  ＧＡＡ  ＣＣＣ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＧＣＣ（配列番号：１４）
３’ＤＮ：ＧＧＣ  ＧＣＣ  ＧＧＣ  ＧＧＧ  ＴＴＣ  ＧＧＧ  ＧＧＴ  ＧＧＣ  ＴＧＧ（配列番号：１５）
ＰＣＲ用の５’プライマーは、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：１６）残基をコードするように設計した。ＢａｍＨＩ／ＳａｉｌＩで処理したＤＮＡ断片を、ｐＧＥＸ４Ｔ−１プラスミドのＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングして、ｐＧＥＸ４Ｔ−ｈＩＬ１１（Ａ）を作製した。プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−１は、元来、ＧＳＴタグの後方に、トロンビン切断部位Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１）を持つ。したがって、ｐＧＥＸ４Ｔ−ｈＩＬ１１（Ａ）は、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ配列とヒトＩＬ−１１配列との間に、新たなトロンビン切断部位Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）を有する。
【００５７】
部位特異的突然変異誘発法を実施して、野生型ＩＬ−１１（ＮＣＢＩアクセッション番号：ＡＡＡ５９１３２）のＡｓｐ１５５をＡｓｎに変えた。
【００５８】
トロンビン切断部位を含むｈＩＬ１１（Ａ）のアミノ酸配列は以下の通りである。
【００５９】
【数２】
2008539696.tif 000005
発現プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−ｈＩＬ１１（Ａ）を大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で培養した。次に、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０．４ｍＭになるよう添加してタンパク質発現を誘導し、細胞を３７℃でさらに３時間増殖させた。ＧＳＴ−ＩＬ１１が発現したことをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって確認した。細胞を遠心分離によって回収し、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス塩酸バッファー中に再懸濁してから、超音波処理によって溶解させた。トリス粉末でｐＨ８．０を維持しながら、硫化アンモニウムを添加して最終濃度５．６％にした。硫化アンモニウムの添加は４℃で行った。標的タンパク質を含む上清を、予めｐＨ８．０の２５ｍＭトリス塩酸バッファーで平衡化したグルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）アフィニティーカラムに適用した。数回か洗浄した後、結合した融合タンパク質を、１５０ｍＭのＮａＣｌおよびｐＨ８．０の１０ｍＭ還元グルタチオンを含む２５ｍＭトリス塩酸バッファーで溶出させた。
【００６０】
精製された融合タンパク質をトロンビンで分解した。１００マイクログラムのタンパク質サンプルを、ｐＨ８の１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２５ｍＭトリス塩酸バッファー中、２０℃で、０．１ユニット、０．２５ユニットまたは０．５ユニットのウシトロンビンまたはヒトトロンビンによって切断した。さまざまな時点（反応後１０分、３０分、１時間、２時間、および５時間）で、各反応液から等量液を取り出し、反応を停止させるために５分間沸騰して熱失活させた。結果をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で解析し、クマシーブリリアントブルーで染色して視覚化した。融合タンパク質ＧＳＴ−ｈＩＬ１１（Ａ）は、反応が進むにつれて、徐々に２つの主要生成物、ＧＳＴ融合パートナー（２６ｋＤａ）とＩＬ−１１（１８．２ｋＤａ）とに分かれてゆき（図２Ａおよび図２Ｂ）、ＩＬ−１１内に内部切断は見られなかった。ＧＳＴ融合パートナーは、試験を行った濃度範囲および時点では、ウシトロンビンおよびヒトトロンビンの両方によって効率よく切断された（図２Ａおよび図２Ｂ）。
【００６１】
トロンビンによる切断の後、ＩＬ−１１を、グルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて再びクロマトグラフにかけ、融合タンパク質のＧＳＴ部分を除去した。ＩＬ−１１のＮ−末端アミノ酸配列を、Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９１Ａ  ＨＴタンパク質シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて解析した。単離したＩＬ１１（Ａ）が、配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号：１８）を、そのＮ−末端に持つことを確認した。
【００６２】
あるいは、結合能が約１０ｍｇ／ｍｌのグルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗメディアを含むカラムに融合タンパク質を結合させたままで、融合タンパク質のＧＳＴ部分を除去した。カラムにグルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗメディアを充填して、ｐＨ８．０の２５ｍＭトリス塩酸を含む、約５倍カラム容量（ＣＶ）のバッファーＢで平衡化した。細菌溶解物から得られた上清をロードした後、カラムを２０ＣＶのバッファーＢで洗浄してから、ｐＨ８．０の２５ｍＭトリス塩酸、および０．１５ＭのＮａＣｌを含む約５ＣＶのバッファーＣで平衡化した。次に、バッファーＣ中に溶解させたトロンビンを、メディア１ｍｌ当り約１０ユニット（またはメディア１ｍｌ当り約１ユニットの結合能）になるよう添加した。続いて、約３ＣＶのバッファーＣをカラムに添加し、融合パートナーから脱離したＩＬ−１１（Ａ）を回収した。全部の手順を、室温、すなわち約２０〜２５℃で行った。
【００６３】
ＩＬ−１１内で内部切断が起きたか否かを調べるために、ＩＬ−１１を、陽イオン交換クロマトグラフィーで、続いて陰イオンクロマトグラフィーによってさらに精製し、マトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析装置（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ）（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ），Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。ＩＬ−１１の予想分子量は、Ｃｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／ＭＷツール（ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌで利用可能）によれば、１８．２６ｋＤａであり、１８２６４Ｄａのピークが見られた（図３）。この結果から、完全なＩＬ−１１タンパク質が、ＧＳＴ−ＩＬ１１（Ａ）のトロンビン切断後に生成されたことが確認された。
【００６４】
より具体的には、アフィニティークロマトグラフィーから単離された組換えＩＬ−１１タンパク質を、まず、ＣＭ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗメディアを用いて精製した。このメディアを充填したカラムを、バッファーＢで平衡化した。ＩＬ−１１タンパク質を含むサンプルを、バッファーＢで約４倍に希釈してから、カラム上にロードした。このカラムを洗浄するために、バッファーＢをロードしてから、ｐＨ９．５の０．１５Ｍ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨを含むバッファーＥを添加した。ｐＨ９．５の０．１５Ｍ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨ、および０．１５ＭのＮａＣｌを含むバッファーＦで標的タンパク質を溶出した。この工程の手順はすべて約４℃で行った。
【００６５】
次に、陽イオン交換カラムから溶出した組換えＩＬ−１１タンパク質を、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗメディアを使用してさらに精製した。このメディアで充填したカラムを、ｐＨ９．５の１Ｍ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨを含むバッファーＧで平衡化した。このカラムを、ｐＨ９．５の４０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨを含むバッファーＨで再平衡化した。前工程から得られたサンプルを、水で約４倍に希釈してから、カラム上にロードした。次に、標的タンパク質を含む流下液を回収した。また、ｐＨ９．５の４０ｍＭ  Ｇｌｙ−ＮａＯＨをカラムに添加し、この流下液も回収した。この工程におけるｐＨ値は約９．５であった。この陰イオン交換クロマトグラフィーの全手順は、ほぼ室温で行った。これらの手順によって、内毒素は効率よく除去された。
【００６６】
ＧＳＴ−ＩＬ１１（Ａ）融合タンパク質は、新たなトロンビン切断配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）を含んでいる。Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）配列は、既知のＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１）配列を含むが、トロンビン切断は、Ａｒｇ↓Ｇｌｙではなく、Ａｒｇ↓Ａｌａで起きる。このことは、トロンビンがＬｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（配列番号：１）よりも、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）を選好することを証明している。
【００６７】
実施例２
ＧＳＴ−チモシンβ４
ＧＳＴ−チモシンβ４発現プラスミドであるｐＧＥＸ−チモシンβ４を、チモシンβ４のｃＤＮＡをｐＧＥＸ４Ｔ−１−Ｋａｎに挿入して構築した（図４）。ヒトチモシンβ４をコードするｃＤＮＡを、逆転写（ＲＴ）−ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によりＫ５６２細胞から調製された全ＲＮＡからクローニングした。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチドは以下の通りであった。
【００６８】
【数３】
2008539696.tif 000006
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：２０）のコード配列を含むように５’プライマーを設計して、ＰＣＲ産物がｐＧＥＸ４Ｔ−１発現プラスミドにクローニングされると、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）が生成されるようにした。
【００６９】
１３５ｂｐのｃＤＮＡ産物をＰＣＲによって生成した。増幅産物をｐＧＥＸＭ−Ｔ  Ｅａｓｙプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）にクローニングして、ｐＧＥＸＭ−チモシンβ４を得た。配列を確認した後、ｐＧＥＭ−チモシンβ４のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片を、ｐＧＥＸ４Ｔ−１から、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性遺伝子に置換して調製されたｐＧＥＸ４Ｔ−１−Ｋａｎベクターの対応部位にクローニングした。
【００７０】
トロンビン切断部位を含むチモシンβ４のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【００７１】
【数４】
2008539696.tif 000007
発現プラスミドを大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。形質転換体をＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃でインキュベートしてから、ＩＰＴＧを最終濃度が０．４ｍＭになるよう添加した。培養を３時間続けてから、細胞を遠心分離により回収した。ＧＳＴ−チモシンβ４の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。細菌のペレットを、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス塩酸バッファー中に再懸濁してから、超音波処理によって細胞溶解した。ＧＳＴ−チモシンβ４を、グルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによって可溶性画分から精製した。
【００７２】
精製した融合タンパク質をトロンビンで分解してから、１５％トリシン分離ゲルを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。１００マイクログラムのタンパク質サンプルを、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭの還元型グルタチオンを含む、ｐＨ８．０の２５ｍＭトリス塩酸バッファーの中、２０℃で、０．５ユニットのトロンビンによって切断した。さまざまな時点（反応後１０分、３０分、１時間、２時間、および３時間）で、各反応液から等量液を取り出し、反応を停止させるために５分間沸騰して熱失活させた。反応時間が経過するにつれて、融合タンパク質であるＧＳＴ−チモシンβ４（３１ｋＤａ）が徐々に消失し、チモシンβ４（５ｋＤａ）の量が増加した（図５）。
【００７３】
トロンビンによる切断の後、チモシンβ４を、グルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて再びクロマトグラフィーにかけ、融合タンパク質のＧＳＴ部分を取り除いた。チモシンβ４のＮ−末端アミノ酸配列を、Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９１Ａ  ＨＴタンパク質シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて解析した。単離されたチモシンβ４が、そのＮ−末端に配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｉｌｅ（配列番号：２２）を持つことを確認した。
【００７４】
トロンビンβ４内で内部切断が起きたか否かを調べるために、チモシンβ４を、さらに陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオンクロマトグラフィーによって精製し、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＭＳ（Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥ  ＳＴＲ），Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で解析した。チモシンβ４の予想分子量は、Ｃｏｍｐｕｔｅ  ｐＩ／ＭＷツール（ａｕ．ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ／ｔｏｏｌｓ／ｐｉ＿ｔｏｏｌ．ｈｔｍｌで利用可能）によれば５．０２ｋＤａであり、４９９２Ｄａのピークが観察された（図６）。この結果から、完全なチモシンβ４タンパク質が、ＧＳＴ−チモシンβ４のトロンビン切断後に生成することが確認された。
【００７５】
実施例３
ＧＳＴ−ＩＬ６
ＧＳＴ−ＩＬ６発現プラスミドであるｐＧＥＸ−ＩＬ６を、マウスＩＬ−６のｃＤＮＡをｐＧＥＸ４Ｔ−１に挿入して構築した（図７）。マウスＩＬ−６をコードするｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲによってマウスの樹状細胞から調製した全ＲＮＡからクローニングした。ＰＣＲ用オリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【００７６】
【数５】
2008539696.tif 000008
【００７７】
【数６】
2008539696.tif 000009
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：２０）のコード配列を含むように５’プライマーを設計して、ＰＣＲ産物をｐＧＥＸ４Ｔ−１発現プラスミドにクローニングするとき、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）が生成するようにした。
【００７８】
５８８ｂｐのｃＤＮＡ産物をＰＣＲによって生成した。この増幅産物をｐＧＥＸＭ−Ｔ  Ｅａｓｙプラスミド（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ，ＵＳＡ）にクローニングして、ｐＧＥＭ−ＩＬ６を得た。配列を確認した後、ｐＧＥＭ−ＩＬ６のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片を、ｐＧＥＸ４Ｔ−１ベクターの対応部位にクローニングした。
【００７９】
トロンビン切断部位を含むＩＬ−６のアミノ酸配列は、以下の通りである。
【００８０】
【数７】
2008539696.tif 000010
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃でインキュベートしてから、ＩＰＴＧを最終濃度０．４ｍＭになるよう添加した。培養を３時間続けてから、細胞を遠心分離により回収した。ＧＳＴ−ＩＬ６の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。細菌のペレットを、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス塩酸バッファーに再懸濁してから、超音波処理によって溶解した。ＧＳＴ−ＩＬ６を、可溶性画分からグルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによって精製した。
【００８１】
精製した融合タンパク質を、トロンビンで分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。１００マイクログラムのタンパク質サンプルを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭの還元型グルタチオンを含むｐＨ８．０の２５ｍＭトリス塩酸バッファー中、２０℃で、０．５ユニットのトロンビンによって切断した。さまざまな時点（反応後１０分、３０分、１時間、２時間、および３時間）で、各反応液から等量液を取り出し、反応を停止させるために５分間沸騰して熱失活させた。反応時間が経過するにつれて、融合タンパク質ＧＳＴ−ＩＬ６（４６ｋＤａ）が徐々に消失してゆき、ＩＬ−６（２２ｋＤａ）の量が増加した（図８）。
【００８２】
トロンビン処理によって切断がどこで起きたかを調べるために、ＩＬ−６タンパク質を含むタンパク質バンドを得て、アミノ酸配列を決定した。まず、精製されたＧＳＴ−ＩＬ６タンパク質を３時間トロンビンで処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。次に、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。ＩＬ−６タンパク質を含むバンドを同定した後、これをＰＶＤＦ膜から切り取り、アミノ酸配列を決定した。ＩＬ−６が、そのＮ−末端に配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号：２６）を持つことが確認された。
【００８３】
実施例４
ＧＳＴ−ＰＡＲ４
プロテアーゼ活性化型受容体（ＰＡＲ）は、Ｎ−末端細胞外ドメインのタンパク質分解によって活性化されることが知られている（Ｋａｈｎら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：８７９（１９９９））。このタンパク質ファミリーを構成する４つのＰＡＲ（ＰＡＲ１〜４）が存在するが、ＰＡＲ１、３および４はトロンビンによって活性化される（Ｃｏｕｇｈｌｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６：１１０２３（１９９９））。ＰＡＲ４上のトロンビン切断部位のアミノ酸配列はＬｅｕ４３−Ｐｒｏ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ｇｌｙ−Ｔｙｒ（配列番号：２７）である。本発明者らは、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）配列を、別のトロンビン切断部位として含むＧＳＴ−ＰＡＲ４タンパク質を作成して、どの部位がトロンビンによって選好されるかを調べた。
【００８４】
ＧＳＴ−ＰＡＲ４発現プラスミドであるｐＧＥＸ−ＰＡＲ４を、ヒトＰＡＲ４のｃＤＮＡをｐＧＥＸ４Ｔ−１−Ｋａｎに挿入して構築した（図９）。ヒトＰＡＲ４をコードするｃＤＮＡを、Ｋ５６２細胞からＲＴ−ＰＣＲによって調製された全ＲＮＡからクローニングした。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りであった。
【００８５】
【数８】
2008539696.tif 000011
５’プライマーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：２０）のコード配列を含むように設計して、ＰＣＲ産物をｐＧＥＸ４Ｔ−１−Ｋａｎプラスミドにクローニングするとき、Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）が生成させるようにした。
【００８６】
５４０ｂｐのｃＤＮＡ産物をＰＣＲによって作成した。増幅産物をｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙプラスミドにクローニングして、ｐＧＥＭ−ＰＡＲ４を得た。配列確認した後、ｐＧＥＭ−ＰＡＲ４のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片をｐＧＥＸ４Ｔ−１−Ｋａｎベクターの対応部位にクローニングした。
【００８７】
トロンビン切断部位を含むＰＡＲ４のアミノ酸配列は以下の通りである。
【００８８】
【数９】
2008539696.tif 000012
【数１０】
2008539696.tif 000013
内部トロンビン切断部位に下線を施した。
【００８９】
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１に形質転換させる。形質転換体を、カナマイシン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で培養し、ＩＰＴＧを最終濃度が０．４ｍＭになるまで添加する。培養を３時間続けてから、細胞を遠心分離により回収する。ＧＳＴ−ＰＡＲ４が発現したことをＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認する。細菌ペレットを、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス塩酸バッファーで再懸濁してから、超音波処理によって溶解する。ＧＳＴ−ＰＡＲ４を、可溶性画分からグルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによって精製する。
【００９０】
精製した融合タンパク質を、トロンビンで分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析する。１００マイクログラムのタンパク質サンプルを、１５０ｍＭのＮａＣｌおよび１０ｍＭの還元型グルタチオンを含むｐＨ８．０の２５ｍＭトリス塩酸バッファー中、２０℃で、０．５ユニットのトロンビンによって切断する。さまざまな時点（反応後１０分、３０分、１時間、２時間、および３時間）で、各反応液から等量液を取り出して、反応を停止させるために５分間沸騰して熱失活させる。
【００９１】
実施例５
ＧＳＴ−ＩＬ１１（ＬＶ−）
全配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）が効率的なトロンビン切断に必要であるか否かを試験するために、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）をトロンビン切断部位としてコードする発現プラスミドを構築した。まず、ＩＬ−１１（Ａ）を含むＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片を、実施例１に記載されているｐＧＥＸ４Ｔ−ＩＬ１１（Ａ）から得た。次に、これをｐＧＥＸ６Ｐ−２のＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ部位に挿入して、ｐＧＥＸ６Ｐ−ＩＬ１１を得た。ｐＧＥＸ６Ｐ−２プラスミドは、ＢａｍＨＩ部位の上流に「Ｐｒｏ−Ｌｅｕ」配列を含んでいる。したがって、ＩＬ−１１（Ａ）を含むＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ断片は、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：２０）配列として開始するため、ｐＧＥＸ６Ｐ−ＩＬ１１はＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：３１）を持つことができる。二番目のアミノ酸Ｌｅｕを部位特異的突然変異誘発によってＡｒｇに変えて、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）配列を産生した。以下のオリゴヌクレオチドを、部位特異的突然変異誘発に使用した。
【００９２】
【数１１】
2008539696.tif 000014
得られたプラスミドをｐＧＥＸ−ＩＬ１１（ＬＶ−）と名づけ（図１０）、ＧＳＴ−ＩＬ１１１（ＬＶ−）を産生させるために使用した。
【００９３】
トロンビン切断部位を含むＩＬ−１１（ＬＶ−）のアミノ酸配列は以下の通りである。
【００９４】
【数１２】
2008539696.tif 000015
【００９５】
【数１３】
2008539696.tif 000016
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地に植菌して、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で培養し、ＩＰＴＧを最終濃度が０．４ｍＭになるよう添加した。培養をさらに３時間続け、細胞を遠心分離によって回収した。ＧＳＴ−ＩＬ１１（ＬＶ−）の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。細菌のペレットを、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス塩酸バッファーに再懸濁してから、超音波処理によって溶解した。ＧＳＴ−ＩＬ１１（ＬＶ−）を、可溶性画分からグルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによって精製した。
【００９６】
精製した融合タンパク質をトロンビンで分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。１００マイクログラムのタンパク質サンプルを、１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ８の２５ｍＭトリス塩酸バッファーの中、２０℃で、０．５ユニットのトロンビンによって切断した。さまざまな時点（反応後１０分、３０分、１時間、２時間、および３時間）で、等量液を各反応液から取り出して、反応を停止させるために、５分間沸騰して熱失活させた。反応時間が経過するにつれて、融合タンパク質であるＧＳＴ−ＩＬ１１（ＬＶ−）（４４ｋＤａ）が徐々に消失し、ＩＬ−１１（ＬＶ−）（１８ｋＤａ）の量が増加した（図１１）。
【００９７】
トロンビン処理による切断がどこで起きたかを調べるために、ＩＬ−１１（ＬＶ−）タンパク質を含むタンパク質バンドを得て、アミノ酸配列を決定した。まず、精製したＧＳＴ−ＩＬ１１（ＬＶ−）タンパク質をトロンビンで３時間処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分離した。次に、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。ＩＬ−１１（ＬＶ−）タンパク質を含むバンドを同定した後、それをＰＶＤＦ膜から切り取り、アミノ酸配列を決定した。ＩＬ−１１（ＬＶ−）が、そのＮ−末端に配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ａｓｐ（配列番号：３５）を持つことが確認されたが、これは、配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）が、効率的なトロンビン切断にとって十分であることを示唆している。
【００９８】
実施例６
ＭＢＰ−ＩＬ１１
ＭＢＰ−ＩＬ１１発現プラスミドであるｐＭＡＬ−ｃ２−ＩＬ１１を、ヒトＩＬ−１１のｃＤＮＡをｐＭＡＬ−ｃ２に挿入して構築した（図１２）。ヒトＩＬ−１１をコードするｃＤＮＡは、ｐＧＥＸ４Ｔ−ＩＬ１１（Ａ）からＰＣＲによって得た。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【００９９】
【数１４】
2008539696.tif 000017
５’プライマーは、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）に対するコード配列を含むように設計した。ＩＬ−１１配列を含むＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ断片を、ｐＭＡＬ−ｃ２ベクターのＥｃｏＲＩ／ＳａｌＩ部位にクローニングして、ｐＭＡＬ−ｃ２−ＩＬ１１を産生した。したがって、ｐＭＡＬ−ｃ２−ＩＬ−１１は、マルトース結合ドメイン配列とヒトＩＬ−１１配列との間に、ｐＧＥＸ−ＩＬ１１（ＬＶ−）と同じトロンビン切断部位を有する。
【０１００】
トロンビン切断部位を含む、マルトース結合ドメインの下流にあるＩＬ−１１のアミノ酸配列は以下の通りである。
【０１０１】
【数１５】
2008539696.tif 000018
【０１０２】
【数１６】
2008539696.tif 000019
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地中に植菌して、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で培養し、ＩＰＴＧを最終濃度が０．４ｍＭになるまで添加した。培養を３時間継続してから、細胞を遠心分離によって回収した。ＭＢＰ−ＩＬ１１の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。細菌のペレットを、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１ｍＭアジ化ナトリウムを含む、ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩酸バッファー中に再懸濁してから、超音波処理によって溶解した。標的タンパク質を含む上清を、２００ｍＭのＮａＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡを含む、ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩酸バッファーで予め平衡化したアミロース（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）アフィニティーカラムに適用した。数回洗浄を行ってから、結合した融合タンパク質を、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１０ｍＭマルトースを含む、ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩酸バッファーで溶出した。
【０１０３】
精製した融合タンパク質をトロンビンで分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。１００マイクログラムのタンパク質サンプルを、２００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＤＴＡ、および１０ｍＭマルトースを含む、ｐＨ７．４の２０ｍＭトリス塩酸バッファーの中、２０℃で、０．５ユニットのトロンビンによって切断した。さまざまな時点（反応後１０分、３０分、１時間、２時間、および３時間）で、等量液を各反応液から取り出して、反応を停止させるために５分間沸騰して熱失活させた。反応時間が経過するにつれて、融合タンパク質ＭＢＰ−ＩＬ１１（６０ｋＤａ）が徐々に消失し、ＩＬ−１１の量（１８ｋＤａ）が増加した（図１３）。
【０１０４】
トロンビン処理による切断がどこで起きたかを調べるために、ＩＬ−１１タンパク質を含むタンパク質バンドを得て、アミノ酸配列を決定した。まず、精製したＭＢＰ−ＩＬ１１タンパク質をトロンビンで３時間処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。次に、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。ＩＬ−１１タンパク質を含むバンドを同定した後、それをＰＶＤＦ膜から切り取り、アミノ酸配列を決定した。ＩＬ−１１が、そのＮ−末端に配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号：３８）を持つことが確認されたが、これは、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）配列が、効率的なトロンビン切断にとって十分であることを示唆している。
【０１０５】
実施例７
ＨＩＳ−ＩＬ１１
Ｈｉｓ−ＩＬ１１発現プラスミドであるｐＥＴ１９ｂ−ＩＬ１１を、ヒトＩＬ−１１のｃＤＮＡをｐＥＴ−１９ｂに挿入して構築した（図１４）。ヒトＩＬ−１１をコードするｃＤＮＡは、ｐＧＥＸ４Ｔ−ＩＬ１１（Ａ）からＰＣＲによって得た。ＰＣＲ用のオリゴヌクレオチド配列は、以下の通りである。
【０１０６】
【数１７】
2008539696.tif 000020
５’プライマーは、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ↓Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）に対するコード配列を含むように設計した。ＩＬ−１１配列を含むＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ断片を、ｐＥＴ−１９ｂベクターのＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、ｐＥＴ１９ｂ−ＩＬ１１を生成した。したがって、ｐＥＴ１９ｂ−ＩＬ１１は、Ｈｉｓタグ配列とヒトＩＬ−１１配列との間に、ｐＧＥＸ−ＩＬ１１（ＬＶ−）と同じトロンビン切断部位を有する。
【０１０７】
トロンビン切断部位を含む、Ｈｉｓタグの下流にあるＩＬ−１１のアミノ酸配列は以下の通りである。
【０１０８】
【数１８】
2008539696.tif 000021
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地中に植菌して、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で培養し、ＩＰＴＧを最終濃度が１ｍＭになるまで添加した。培養を３時間継続してから、細胞を遠心分離によって回収した。Ｈｉｓ−ＩＬ１１の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。細菌のペレットを、０．５ＭのＮａＣｌを含む、ｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中に再懸濁してから、超音波処理によって溶解した。標的タンパク質を含む上清を、０．５ＭのＮａＣｌおよび２０ｍＭイミダゾールを含む、ｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで予め平衡化したＮｉ−セファロース高速（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）アフィニティーカラムに適用した。数回洗浄を行ってから、結合した融合タンパク質を、０．５ＭのＮａＣｌおよび５００ｍＭイミダゾールを含む、ｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファーで溶出した。
【０１０９】
精製した融合タンパク質をトロンビンで分解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって解析した。１００マイクログラムのタンパク質サンプルを、０．５ＭのＮａＣｌおよび５００ｍＭイミダゾールを含む、ｐＨ７．４の２０ｍＭリン酸ナトリウムバッファー中、２０℃で、０．５ユニットのトロンビンによって切断した。さまざまな時点（反応後１０分、３０分、１時間、２時間、および３時間）で、等量液を各反応液から取り出して、反応を停止させるために５分間沸騰して熱失活させた。反応時間が経過するにつれて、融合タンパク質Ｈｉｓ−ＩＬ１１（２２ｋＤａ）が徐々に消失し、ＩＬ−１１の量（１８ｋＤａ）が増加した（図１５）。
【０１１０】
トロンビン処理による切断がどこで起きたかを調べるために、ＩＬ−１１タンパク質を含むタンパク質バンドを得て、アミノ酸配列を決定した。まず、精製したＨｉｓ−ＩＬ１１タンパク質をトロンビンで３時間処理し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。次に、ポリアクリルアミドゲル中のタンパク質をＰＶＤＦ膜に移した。ＩＬ−１１タンパク質を含むバンドを同定した後、それをＰＶＤＦ膜から切り取り、アミノ酸配列を決定した。ＩＬ−１１が、そのＮ−末端に配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（配列番号：４１）を持つことが確認されたが、これは、Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）配列が、効率的なトロンビン切断にとって十分であることを示唆している。
【０１１１】
ここまで本発明を詳しく説明して来たが、当業者は、本発明またはその実施形態の範囲に影響を及ぼすことなく、広範かつ同等の条件、処方、およびその他のパラメーターの範囲内で本発明を実施することができることを理解できるはずである。本明細書で引用したすべての特許、特許出願、および刊行物は、その全体が参照により完全に本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】本発明のペプチドリンカー（配列番号：８）を含む融合タンパク質をコードするｐＧＥＸ４Ｔ−ｈＩＬ１１（Ａ）の概略図を示す。
【図２Ａ】ＧＳＴ−ＩＬ１１（Ａ）のトロンビン切断を示す。
【図２Ｂ】ＧＳＴ−ＩＬ１１（Ａ）のトロンビン切断を示す。
【図３】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるＩＬ１１（Ａ）の解析結果を示す。
【図４】本発明のペプチドリンカー（配列番号：８）を含む融合タンパク質をコードするｐＧＥＸ−チモシンβ４の概略図を示す。
【図５】ＧＳＴ−チモシンβ４のトロンビン切断を示す。
【図６】ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるチモシンβ４の解析結果を示す。
【図７】本発明のペプチドリンカー（配列番号：８）を含む融合タンパク質をコードするｐＧＥＸ−ＩＬ６の概略図を示す。
【図８】ＧＳＴ−ＩＬ６のトロンビン切断を示す。
【図９】本発明のペプチドリンカー（配列番号：８）を含む融合タンパク質をコードするｐＧＥＸ−ＰＡＲ４の概略図を示す。
【図１０】本発明のペプチドリンカー（配列番号：７）を含む融合タンパク質をコードするｐＧＥＸ−ＩＬ１１（ＬＶ−）の概略図を示す。
【図１１】ＩＬ１１（ＬＶ−）のトロンビン切断を示す。
【図１２】本発明のペプチドリンカー（配列番号：７）を含む融合タンパク質をコードするｐＭＡＬ−ｃ２−ＩＬ１１の概略図を示す。
【図１３】ＭＢＰ−ＩＬ１１のトロンビン切断を示す。
【図１４】本発明のペプチドリンカー（配列番号：７）を含む融合タンパク質をコードするｐＥＴ１９ｂ−ＩＬ１１の概略図を示す。
【図１５】Ｈｉｓ−ＩＬ１１のトロンビン切断を示す。
【図１】
2008539696.tif 000022
【図２Ａ】
2008539696.tif 000023
【図２Ｂ】
2008539696.tif 000024
【図３】
2008539696.tif 000025
【図４】
2008539696.tif 000026
【図５】
2008539696.tif 000027
【図６】
2008539696.tif 000028
【図７】
2008539696.tif 000029
【図８】
2008539696.tif 000030
【図９】
2008539696.tif 000031
【図１０】
2008539696.tif 000032
【図１１】
2008539696.tif 000033
【図１２】
2008539696.tif 000034
【図１３】
2008539696.tif 000035
【図１４】
2008539696.tif 000036
【図１５】
2008539696.tif 000037
【手続補正書】
【提出日】平成20年3月3日(2008.3.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５
からなる単離されたペプチドリンカーであって、
Ｘ１が互いに同一または異なった２個〜１０個のアミノ酸残基であり；
Ｘ２が疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘ３がアルギニンまたはリジンであり；
Ｘ４がアラニンまたはグリシンであり；そして、
Ｘ５が非酸性アミノ酸である；
ペプチドリンカー。
【請求項２】
Ｘ１が４個〜１０個のアミノ酸残基である、請求項１記載の単離されたペプチドリンカー。
【請求項３】
Ｘ１がプロリンおよびアルギニンを含む、請求項１記載の単離されたペプチドリンカー。
【請求項４】
Ｘ２が、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１記載の単離されたペプチドリンカー。
【請求項５】
Ｘ２がグリシンである、請求項４記載の単離されたペプチドリンカー。
【請求項６】
Ｘ５が、セリン、アラニン、アスパラギン、バリン、ロイシン、イソロイシン、リジン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１記載の単離されたペプチドリンカー。
【請求項７】
Ｘ５がセリンである、請求項６記載の単離されたペプチドリンカー。
【請求項８】
配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）からなる、請求項１記載の単離されたペプチドリンカー。
【請求項９】
配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）からなる、請求項１記載の単離されたペプチドリンカー。
【請求項１０】
目的とするタンパク質、融合パートナー、およびそれらの間に置かれたペプチドリンカーを含む融合タンパク質であって、
該ペプチドリンカーが、配列：
Ｘ１−Ｘ２−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５
からなり、ここで、
Ｘ１が互いに同一または異なった２個〜１０個のアミノ酸残基であり；
Ｘ２が疎水性アミノ酸残基であり；
Ｘ３がアルギニンまたはリジンであり；
Ｘ４がアラニンまたはグリシンであり；および、
Ｘ５が非酸性アミノ酸である；
融合タンパク質。
【請求項１１】
前記目的とするタンパク質が、インターロイキン（ＩＬ）−１１、チモシンβ４、チモシンα１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、プロテアーゼ活性化型受容体１（ＰＡＲ１）、ＰＡＲ３、ＰＡＲ４、ＲＡＮＴＥＳ、ストロマ細胞由来因子−１α、単球走化性タンパク質、幹細胞因子、ＦＬＴ−３Ｌ、副甲状腺ホルモン、トロンボポエチン、上皮細胞増殖因子、塩基性線維芽細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、顆粒球コロニー刺激因子、マクロファージコロニー刺激因子、血小板由来増殖因子、形質転換増殖因子（ＴＧＦ）−β１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）−α、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、肝細胞増殖因子、血管内皮増殖因子、および免疫グロブリン重鎖からなる群から選択される、請求項１０記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記目的とするタンパク質が、ヒトＩＬ１１、チモシンβ４、ＩＬ−６、およびＰＡＲ４からなる群から選択される、請求項１１記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記目的とするタンパク質がヒトＩＬ１１である、請求項１１記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記融合パートナーが親和性ペプチドである、請求項１０記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記融合パートナーが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、ヘキサヒスチジン、Ｔ７ペプチド、ユビキチン、Ｆｌａｇペプチド、ｃ−ｍｙｃペプチド、ポリアルギニン、ポリシステイン、ポリフェニルアラニン、ＢＴａｇ、ガラクトース結合ドメイン、セルロース結合ドメイン（ＣＢＤ）、チオレドキシン、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ、カルモジュリン、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、Ｓ−ペプチド、ストレプトアビジン、Ｈｉｓ−タグ、およびＳｔｒｅｐ−タグからなる群から選択される、請求項１４記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記融合パートナーがＧＳＴである、請求項１５記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１０記載の融合タンパク質から目的とするタンパク質を分離する方法であって、該融合タンパク質を十分な量のトロンビンに接触させて、該ペプチドリンカーの切断が起きるようする工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記融合タンパク質を、ペプチドリンカーのＸ３とＸ４との間で切断する、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
請求項１記載のペプチドリンカーをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２０】
前記ペプチドリンカー中のＸ２が、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンからなる群から選択される、請求項１９記載のポリヌクレオチド。
【請求項２１】
前記ペプチドリンカーが、配列Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：７）からなる、請求項１９記載のポリヌクレオチド。
【請求項２２】
前記ペプチドリンカーが、配列Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（配列番号：８）からなる、請求項１９記載のポリヌクレオチド。
【請求項２３】
請求項１０記載の融合タンパク質をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項２４】
前記融合パートナーがＧＳＴである、請求項２３記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２３記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２６】
請求項２５記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２７】
融合タンパク質を産生する方法であって、
ａ）目的とするタンパク質、融合パートナー、およびそれらの間に置かれた請求項１記載のペプチドリンカーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを調製する工程；
ｂ）該ベクターを宿主細胞中に送達する工程；
ｃ）該融合タンパク質が発現される条件下で、該宿主細胞を培養する工程；および
ｄ）該融合タンパク質を分離する工程；
を含む、方法。
【請求項２８】
目的とするタンパク質を産生する方法であって、
ａ）該目的とするタンパク質、融合パートナー、およびそれらの間に置かれた請求項１記載のペプチドリンカーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを調製する工程；
ｂ）該ベクターを宿主細胞中に送達する工程；
ｃ）該融合タンパク質が発現される条件下で、該宿主細胞を培養する工程；
ｄ）該融合タンパク質を分離する工程；
ｅ）該融合タンパク質をトロンビンと接触させて、該融合タンパク質を切断する工程；および
ｄ）該目的とするタンパク質を分離する工程；
を含む、方法。
【請求項２９】
アフィニティーカラムにより前記融合タンパク質の分離を行う、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
前記融合タンパク質が前記アフィニティーカラムに結合している間に、該融合タンパク質とトロンビンとの接触を行う、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質を分離する工程が、前記目的とするタンパク質を陽イオン交換クロマトグラフィーに供する工程をさらに含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記融合タンパク質を分離する工程が、前記目的とするタンパク質を陰イオン交換クロマトグラフィーに供する工程をさらに含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３３】
請求項２５記載のベクターを含む、キット。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
【数２】
2008539696.tif 000038
発現プラスミドｐＧＥＸ４Ｔ−ｈＩＬ１１（Ａ）を大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で培養した。次に、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を最終濃度が０．４ｍＭになるよう添加してタンパク質発現を誘導し、細胞を３７℃でさらに３時間増殖させた。ＧＳＴ−ＩＬ１１が発現したことをＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によって確認した。細胞を遠心分離によって回収し、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス塩酸バッファー中に再懸濁してから、超音波処理によって溶解させた。トリス粉末でｐＨ８．０を維持しながら、硫化アンモニウムを添加して最終濃度５．６％にした。硫化アンモニウムの添加は４℃で行った。標的タンパク質を含む上清を、予めｐＨ８．０の２５ｍＭトリス塩酸バッファーで平衡化したグルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）アフィニティーカラムに適用した。数回か洗浄した後、結合した融合タンパク質を、１５０ｍＭのＮａＣｌおよびｐＨ８．０の１０ｍＭ還元グルタチオンを含む２５ｍＭトリス塩酸バッファーで溶出させた。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
トロンビンによる切断の後、ＩＬ−１１を、グルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを用いて再びクロマトグラフにかけ、融合タンパク質のＧＳＴ部分を除去した。ＩＬ−１１のＮ−末端アミノ酸配列を、Ｐｒｏｃｉｓｅ  ４９１Ａ  ＨＴタンパク質シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，ＵＳＡ）を用いて解析した。単離したＩＬ１１（Ａ）が、配列Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ（配列番号：４２）を、そのＮ−末端に持つことを確認した。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００８０】
【数７】
2008539696.tif 000039
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地に植菌し、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃でインキュベートしてから、ＩＰＴＧを最終濃度０．４ｍＭになるよう添加した。培養を３時間続けてから、細胞を遠心分離により回収した。ＧＳＴ−ＩＬ６の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。細菌のペレットを、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス塩酸バッファーに再懸濁してから、超音波処理によって溶解した。ＧＳＴ−ＩＬ６を、可溶性画分からグルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによって精製した。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９５】
【数１３】
2008539696.tif 000040
発現プラスミドを大腸菌ＢＬ２１に形質転換した。形質転換体を、アンピシリン（最終濃度５０μｇ／ｍｌ）を添加したＬＢ培地に植菌して、ＯＤ６００が０．５に達するまで３７℃で培養し、ＩＰＴＧを最終濃度が０．４ｍＭになるよう添加した。培養をさらに３時間続け、細胞を遠心分離によって回収した。ＧＳＴ−ＩＬ１１（ＬＶ−）の発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した。細菌のペレットを、ｐＨ８．０の５０ｍＭトリス塩酸バッファーに再懸濁してから、超音波処理によって溶解した。ＧＳＴ−ＩＬ１１（ＬＶ−）を、可溶性画分からグルタチオン・セファロース４Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗによって精製した。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008539696000001.app