(57)【要約】本発明はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの表在ポリペプチドおよびカンピロバクターに対するワクチン接種におけるその使用に関する。本発明はさらにポリヌクレオチド、これらの表在ポリペプチドを発現する発現ベクター、組換えウィルスまたは組換え細胞のワクチン接種における使用に関する。さらにまた本発明は抗カンピロバクター療法のための表在ポリペプチドに対する抗体の使用に関する。最後に、表在ポリペプチドを介した、カンピロバクターを検出するため、および、抗カンピロバクター剤を同定するための方法を開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、以下：
−  配列番号１〜５１の表在カンピロバクターポリペプチドからなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、または、
−  該ポリペプチドに結合し得る抗体、
を含有する、組成物。
【請求項２】
前記組成物が、以下：
−  配列番号１〜５１からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記改変体が、前記配列に対する少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１または２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原性フラグメントが、前記配列の全長の９９％未満、例えば７５％未満、例えば５０％未満、例えば２５％未満、例えば２０％未満、例えば１５％未満または例えば１０％未満を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原性フラグメントが、前記配列の７０未満の連続アミノ酸残基、例えば５０未満、例えば４０未満、例えば３０未満、例えば２０未満の連続残基を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原性フラグメントが、前記配列の６以上、例えば７以上、例えば８以上、例えば９以上、例えば１０以上の連続アミノ酸を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記抗原性フラグメントが、配列番号５２〜１１９からなる群より選択されるフラグメントの１つ以上の残基、例えば配列番号５２〜１１９からなる群より選択されるフラグメントの２つ以上の連続する残基、例えば３つ以上の連続する残基、例えば４つ以上の連続する残基、例えば５つ以上の連続する残基、例えば６つ以上の連続する残基を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドがタグ、例えばヒスチジンタグを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記組換え細胞が弱毒化されたか、もしくは毒性の減少したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞または弱毒化されたか、もしくは毒性の減少したサルモネラ属細胞である、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記組換え細胞が生存している、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記組換え細胞が死滅している、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記医薬がワクチンである、請求項２〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が免疫原性キャリア、例えばキャリアタンパク質を含有し、該免疫原性キャリアは好ましくは前記ポリペプチドに結合している、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物がアジュバントを含有する、請求項１２または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得る抗体を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗体が、さらにインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得、かつ、インタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る抗体を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗体がポリクローナルである、請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗体がモノクローナルである、請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１５〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗体が抗体の結合フラグメントである、請求項１５〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗体が５×１０−６Ｍ未満、例えば１０−６Ｍ未満、例えば５×１０−７Ｍ未満、例えば１０−７Ｍ未満、例えば５×１０−８Ｍ未満、例えば１０−８Ｍ未満、例えば５×１０−９Ｍ未満、例えば１０−９Ｍ未満、例えば５×１０−１０Ｍ未満、例えば１０−１０Ｍ未満、例えば５×１０−１１Ｍ未満、例えば１０−１１Ｍ未満、例えば５×１０−１２Ｍ未満、例えば１０−１２Ｍ未満、例えば５×１０−１３Ｍ未満、例えば１０−１３Ｍ未満、例えば５×１０−１４Ｍ未満、例えば１０−１４Ｍ未満、例えば５×１０−１５Ｍ未満、例えば１０−１５Ｍ未満の解離定数、即ちＫｄを有する請求項１５〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が薬学的に受容可能なキャリアを含有する、請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が全身投与に適している、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与に適している、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が経口投与に適している、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が鼻腔内投与に適している、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得る抗体。
【請求項２９】
前記抗体がさらにインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得、かつ、インタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る、抗体。
【請求項３１】
請求項１８〜２２のいずれかの特徴を含む、請求項２８〜３０のいずれかに記載の抗体。
【請求項３２】
ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた組換え細胞であって、該ポリペプチドが配列番号１〜３６からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含む、組換え細胞。
【請求項３３】
前記組換え宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはサルモネラ属細胞である、請求項３２に記載の組換え細胞。
【請求項３４】
前記組換え細胞が弱毒化されたか、または毒性の減少した細胞である、請求項３２または３３に記載の組換え細胞。
【請求項３５】
ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた組換え弱毒化もしくは毒性の減少したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたは組換え弱毒化もしくは毒性の減少したサルモネラ属細胞であって、該ポリペプチドは配列番号３７〜５１からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントもしくは改変体を含む、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはサルモネラ属細胞。
【請求項３６】
カンピロバクター属、好ましくはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの感染に対抗する動物またはヒトの免疫化のための医薬の調製のための、以下：
−  配列番号１〜５１からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含む、ポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
の使用。
【請求項３７】
前記免疫化が防御免疫応答を誘導する、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記医薬が、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与または鼻腔内投与に適した医薬である、請求項３６または３７に記載の使用。
【請求項３９】
動物またはヒトにおけるカンピロバクター属、好ましくはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの感染の治療または予防のための医薬の製造のための、配列番号１〜５１からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得る抗体、好ましくは請求項２８〜３１のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項４０】
非ヒト動物における配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドに対して抗体を惹起するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．以下：
−  配列番号１〜３６からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントもしくは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を提供する工程、
ｂ．該動物に該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組換えウィルスまたは組換え細胞を含有する組成物を導入する工程、
ｃ．該動物において抗体を惹起させる工程、および、
ｄ．該抗体を単離し、必要に応じて精製する工程、
を包含する、方法。
【請求項４１】
非ヒト動物における配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチドに対する抗体を惹起するための方法であって、該抗体はインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得、該方法は、以下：
ａ．以下：
−  配列番号３７〜５１からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントもしくは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を提供する工程、
ｂ．該動物に該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組換えウィルスまたは組換え細胞を含有する組成物を導入する工程、
ｃ．該動物において抗体を惹起させる工程、
ｄ．該抗体を単離し、必要に応じて精製する工程、および、
ｅ．インタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る抗体を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
前記動物がヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物である請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
サンプル中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはその部分を検出するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドに特異的に結合し得るインジケーター部分に該サンプルを接触させる工程、および、
ｂ．該インジケーター部分によりシグナルが発生されたか否かを決定し、それにより、該サンプルがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはその部分を含有するか否かを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４４】
前記インジケーター部分がさらにインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
サンプル中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉを検出するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチドに特異的に結合し得るインジケーター部分に該サンプルを接触させる工程であって、該インジケーター部分はさらにインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に特異的に結合し得る、工程、および、
ｂ．該インジケーター部分によりシグナルが発生されたか否かを決定する工程により、該サンプルがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉを含有するか否かを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４６】
前記インジケーター部分がＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜を通過しない、請求項４３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記インジケーター部分が抗体、例えば請求項２８〜３１のいずれかに定義した抗体からなるか、または該抗体を含む、請求項４３〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントの結合相手を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントを提供する工程、
ｂ．該ポリペプチドまたはフラグメントを推定結合相手に接触させる工程、および、
ｃ．該推定結合相手が該ポリペプチドまたはフラグメントに結合し得るか否か決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項４９】
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに対する抗細菌活性を有する化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドの低減されたレベルを有する感作された細胞を提供する工程、および、
ｂ．推定抗細菌化合物に対する該細胞の感受性を、例えば増殖アッセイにより決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに対する抗細菌活性を有する化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチドの低減されたレベルを有する感作された細胞を提供する工程、および、
ｂ．推定抗細菌化合物に対する該細胞の感受性を例えば増殖アッセイにより決定する工程であって、該推定抗細菌化合物は、野生型のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜を通過し得ない、工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドのインヒビターを同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドのレベルの異なる二つの細胞を提供する工程、
ｂ．該細胞の推定インヒビターに対する感受性を例えば増殖アッセイにより決定する工程、および、
ｃ．該二つの細胞が該推定インヒビターの存在により異なって影響されるか否か決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
前記推定インヒビターがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜を通過しない、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
配列番号３７〜５１のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのインヒビターを同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチドのレベルの異なる二つの細胞を提供する工程、
ｂ．該細胞の推定インヒビターに対する感受性を、例えば増殖アッセイにより決定する工程であって、該推定インヒビターはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜を通過し得ない、工程、および、
ｃ．該二つの細胞が該推定インヒビターの存在により異なって影響されるか否かを決定する工程、
を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００３年１１月２５日に出願された米国仮特許出願番号第６０／５２４，６１７号の特許本出願であり、これは、本明細書中にその全体が参考として援用される。本出願に引用された全ての特許および非特許参考文献は、本明細書中にその全体が参考として援用される。
【０００２】
（発明の分野）
本発明はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの細胞表在ポリペプチドおよびカンピロバクター感染に対抗した免疫化における、カンピロバクターの診断における、および、抗カンピロバクター活性を有する化合物の同定における、その使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
（発明の背景）
（カンピロバクター感染の発生）
グラム陰性の微好気性細菌であるカンピロバクターは１９７３年にヒト病原体として最初に同定された。以降、先進国における下痢性疾患の最も一般的な起因菌となり、より伝統的に認知されていた食品介在の病原体であるシゲラ種およびサルモネラ種を合わせたものよりも多くの疾患を誘発している。種々の疾患誘発性カンピロバクター菌株のうち、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉは最も重要であり、カンピロバクター症の原因の９９％に相当する。地球的レベルにおいては、この微生物は病原体として最初に認識されて以来、カンピロバクター症の報告例数が一貫して増大していることが調査により示されている。実際、世界保健機構は現時点でカンピロバクター症を誘発する細菌を世界で最も重要な腸炎の原因菌と認識している。国際的な公衆衛生の当局の推定によれば、毎年世界規模で下痢の４００〜５００百万症例をＣ．ｊｅｊｕｎｉが単独で誘発しており、そして米国における食品介在の病原体の第１となっている。２０００年に関する最近のデータによれば食品介在疾病の他のより報告されている原因と比較した場合のカンピロバクターの重大性を指摘している。カンピロバクターはサルモネラまたは大腸菌媒介による食品介在疾病よりも多くの症例、入院および死亡の原因となっている。データセットのうち、カンピロバクターは症例の５５％および入院の３３％を超えている。
【０００４】
（カンピロバクター感染の症状）
下痢はカンピロバクター症のより一貫した顕著な発現状態である。出血を伴う場合が多い。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ感染の典型的な症状は熱、吐き気、嘔吐、腹痛、頭痛および筋肉痛を包含する。症例の大部分は軽症であり入院を必要とせず、自己に限定される。しかしながらＣ．ｊｅｊｕｎｉ感染は重症で致命的となる場合がある。死亡は他の疾患（例えば癌、肝臓病および免疫不全関連の疾患）が存在する場合により一般的となる。５歳未満の小児および１５〜２９歳の若年者が最も罹患率の高い年齢群である。インキュベーション期間（曝露と最初の症状の発症の間の時間）は典型的には２〜５日であるが、発症は摂取後２日もの短期〜１０日もの長期にわたる場合がある。病状は通常は１週間を超えて継続することは無いが、重症例は３週間まで持続する場合がある（食品介在疾患流行の確認に関するＣＤＣカイドライン、ＭＭＷＲ、１９９６；４５：５９）。
【０００５】
（カンピロバクターの長期の転帰）
カンピロバクター感染は場合により長期の転帰を示す場合がある。一部の患者ではカンピロバクター症後の身体の神経に影響するギヤン−バレー症候群と呼ばれる疾患を発症する。稀ではあるが、これは西洋における急性全身性麻痺の最も一般的な原因である。これはカンピロバクター患者の少数において下痢性の病状の数週間後に開始する。これは個体の免疫系がカンピロバクターの成分に対する抗体を形成する場合に生じ、それらの抗体は化学的に細菌成分と類似しているため、身体の神経細胞の成分を攻撃する（非特許文献１）。ギヤン−バレー症候群は脚部において始まり、全身に広がる。チクチク感から脆弱化に至り麻痺をもたらす。これは数週間〜数ヶ月持続し、集中治療を要する場合が多い。完全回復が一般的であるが、患者は重度の神経学的損傷を伴ったままとなる。ギヤン−バレー患者の約１５％は１年後は寝たきりまたは車椅子使用となる。報告されているカンピロバクター症例の１０００例当たり約１例（０．１％）がギヤン−バレー症候群を続発すると推定される。英国におけるギヤン−バレー症候群の４０％もの症例がカンピロバクター症の後に起こっている（非特許文献２）。
【０００６】
ミラーフィッシャー症候群はカンピロバクター症に後続する場合があるもう１つの関連する神経学的症候群であり、やはり免疫学的な模倣性により生じる１。ミラーフィッシャー症候群においては、頭部の神経が身体の神経よりも高度に影響される。
【０００７】
カンピロバクター感染に関連する別の慢性症状はライター症候群と称される関節炎である。これはひざおよび下背部のような大重量負荷の関節に影響する場合が多い反応性関節炎である。これは特定の遺伝子的特性と強力に関係している合併症であり；ヒトリンパ球抗原Ｂ２７（ＨＬＡ−Ｂ２７）を有する個体が最も罹患し易い。
【０００８】
さらにまたカンピロバクターは盲腸を誘発したり、または腹腔（腹腔炎）、心臓（心炎）、中枢神経系（髄膜炎）、胆嚢（胆のう炎）、尿道および血流に感染する場合がある。
【０００９】
（カンピロバクター症の治療）
カンピロバクター症を有する患者は水分保持を維持するために下痢が持続している限り大量の液体を飲用する必要がある。ロペラミドのような抗下痢剤は一部の症状を緩和する場合がある。カンピロバクターは通常は自己限定性の疾病であるが、それが同定されれば治療が疾病の過程を短期化するため抗生物質を使用した特定の治療が指示される。胃腸炎のより重度の症例においては、抗生物質は培養結果が判明するよりも前に通常は開始される。マクロリド抗生物質（エリスロマイシン、クラリスロマイシンまたはアジトロマイシン）はＣ．ｊｅｊｕｎｉに対する最も効果的な薬剤である。フルオロキノロン抗生物質（シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシンまたはモキシフロキサシン）もまた使用できる。
【００１０】
しかしながら、カンピロバクターの抗微生物剤に対する耐性は多くの国において報告されており、そして増大している（非特許文献３）。キノロン耐性は欧州、アジアおよび米国で増大している。耐性の増加は少なくとも部分的には家畜飼料中の抗生物質の使用に関係している（非特許文献４）。
【非特許文献１】Ａｎｇ  ＣＷら、Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．、２００１年、第６９巻、第４号、ｐ．２４６２−２４６９
【非特許文献２】Ｒｅｅｓら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９５年、第３３３巻、ｐ．１３７４−１３７９
【非特許文献３】ＰｅｄｕｎｇｔｏｎおよびＫａｎｅｅｎｅ、Ｊ．Ｖｅｔ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．２００３年、第６５巻、第２号、ｐ．１６１−１７０
【非特許文献４】Ｓｍｉｔｈら、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９９９年、第３４０巻、ｐ．１５２５−１５３２
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
（カンピロバクターの治療、防止および診断のための新しい方策）
発生率の上昇および耐性の広範な発生のため、カンピロバクター感染の治療および防止のための新しい効果的な製品の開発の必要性は大きい。一方において、耐性の発生により、新しい抗カンピロバクター化合物の必要性が存在する。他方において、観察実験研究によりヒトにおける後天性免疫の発生の証拠が得られており、特にリスク群においてワクチン開発の概念を後押ししている（ＳｃｏｔｔおよびＴｒｉｂｂｌｅ、「Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ」、第２版、ＮａｃｈａｍｋｉｎおよびＢｌａｓｅｒ編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｃｉｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０００年、ｐ．３０３−３１９）。さらにまた、カンピロバクター感染の診断のための新しい迅速で信頼性の高い方法が必要とされている。
【００１２】
これらの目的は標的、即ち免疫系および／または抗体に対する標的、細胞毒性インヒビターに対する標的、または診断におけるインジケーター部分に対する標的として機能することができる適当なＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉポリペプチドの同定および使用を介して達成することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
（発明の概要）
本出願はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの表在ポリペプチドに関する。本出願の内容において、「表在」ポリペプチドとはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜の外側に少なくとも部分的に（即ちポリペプチド鎖の部分またはまたポリペプチド分子の集合の部分）局在化するポリペプチドとして定義される。即ち表在ポリペプチドは外膜の外側の空間に向けて完全または部分的に露出しているポリペプチドである。表在ポリペプチドはさらに本明細書に記載する低ｐＨの表面タンパク質抽出により得られる画分中に同定することができる全てのポリペプチドまたはポリペプチドフラグメントを包含する。
【００１４】
表在ポリペプチドは、このようなポリペプチドの細胞外空間への露出がこれらのポリペプチドと相互作用する化合物（例えば細菌感染の防止、治療または診断のために使用される化合物）が有効であるために外膜へ進入または通過する必要がない場合が多いため、細菌感染の抗生物質療法および／または診断のための魅力的な標的である。
【００１５】
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉポリペプチドの細胞表面局在化の測定は現時点では実験的にのみ行うことができ、この局在化に関する共通した分類シグナルまたはモチーフが知られていないため、バイオインフォマティクス的には不可能である。ポリペプチドがペリプラズムに進入できるか否かをある程度の確実性をもって予測することは可能であるが、ポリペプチドの表面局在化に関する一般的モチーフは同定されておらず、そしてこのために、あるペリプラズム（または非ペリプラズム）のポリペプチドが表面に輸送されるかどうかを配列のみから予測することは不可能である。確認された表面ポリペプチドの数はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに関しては比較的少数であり、そして大部分は鞭毛構造のタンパク質および少数の非鞭毛関連の表面タンパク質、例えばＰＥＢ１−４を包含する。
【００１６】
本発明者等はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの細胞表面画分中の５１種の異なるポリペプチドを同定している。使用した方法は比較的高レベルに発現されるポリペプチドを同定する。表面に露出されていること、および、比較的大量に存在することの組合せは、これらのポリペプチドを抗体の標的として、即ち受動または能動免疫／ワクチン接種において使用するために適するものとしている。
【００１７】
従って、第１の態様において、本発明は、医薬として使用するための、下記成分：
−  配列番号１〜５１の表在カンピロバクターポリペプチドからなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
または、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
または、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、
または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
または、
−  該ポリペプチドに結合し得る抗体、
を含む組成物に関する。
【００１８】
別の主要な態様において、本発明は、カンピロバクター、好ましくはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの感染に対抗して動物または人間を免疫化するための医薬の製造のための下記物質：
−  配列番号１〜５１からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
の使用に関する。
【００１９】
さらにまた、本発明は主要な態様において、動物または人間におけるカンピロバクター、好ましくはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの感染の治療または予防のための医薬の製造のための配列番号１〜５１からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得る抗体の使用に関する。
【００２０】
同定されている５１の表在ポリペプチドのうちの１５（配列番号３７〜５１）はＷＯ０２／０７７１８３に記載の通り他の細菌の必須遺伝子を用いた相同性検索におけるヒットとして３６０００を超える他の遺伝子座の中から特に以前に報告されているものである。ＷＯ０２／０７７１８３は同定されたポリペプチドの細胞下の局在化の同定もその発現レベルの測定も記載していない。
【００２１】
別の主要な態様において、本発明は配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得る抗体に関する。
【００２２】
さらに別の主要な態様において、本発明は配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得、そして、インタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合できる抗体に関する。
【００２３】
さらに別の主要な態様においては、本発明は上記した本発明の抗体を形成する方法に関する。
【００２４】
表面露出であることと比較的大量に存在することの組合せはさらに、本発明により同定された５１ポリペプチドをカンピロバクター症の診断のための標的として高度に適するものとしており、これにより高い感度でインタクトな細胞を検出できるようになる。即ち、別の主要な態様において、本発明は本明細書に記載する細胞表面に位置するポリペプチドを認識することができるインジケーターを用いてＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはその部分を検出するための方法に関する。
【００２５】
さらにまた、５１ポリペプチドの表面局在化はこれらをインヒビターの標的として適するものとしている。このようなインヒビターは殺菌性または制菌性であるか、または、宿主生物とのＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの相互作用（毒力）を防止する。すなわち、別の主要な態様において本発明は本明細書に記載した細胞表面局在ポリペプチドのインヒビターを同定するための方法に関する。
【００２６】
（定義）
ワクチン：人間および動物における微生物に対抗した保護的な免疫応答を誘導することができる組成物を指すために使用する。
【００２７】
防御免疫応答：感染体、本明細書においてはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉが一次応答ではなく二次応答にむしろ適合するものであり、これにより宿主生物に対するその衝撃を低減することができるような、生物における記憶を誘導する免疫応答（体液性／抗体および／または細胞性）を指すために使用する。
【００２８】
ポリペプチド：特段の記載が無い限り、「ポリペプチド」という用語は本明細書において使用する場合は、ポリペプチドの改変体またはフラグメントも指すものとする。好ましいポリペプチドは抗原性ポリペプチドである。
【００２９】
フラグメント：ポリペプチドの非完全長の部分を指すために使用する。即ち、フラグメントそのものもポリペプチドである。
【００３０】
改変体：所定の参照ポリペプチドの「改変体」とは、該参照ポリペプチドと配列同一性の特定のレベルを示すが、該参照ポリペプチドと同一ではないポリペプチドを指す。
【００３１】
抗原／抗原性の／抗原性／免疫原／免疫原性の／免疫原性：すべて免疫応答を誘導する能力を指す。
【００３２】
免疫原性キャリア：免疫応答を直接または間接的に支援または強化する化合物を指す。
【００３３】
発現ベクター：ポリヌクレオチド配列由来のポリペプチドの生産において使用される好ましくは組換えのプラスミドまたはファージまたはウィルスを指す。発現ベクターは発現コンストラクトを含み、これは（１）遺伝子発現において調節的な役割を有する遺伝子エレメント、例えばプロモーターまたはエンハンサー、（２）ｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳され、そして、（１）のエレメントに作動可能に連結している構造またはコーディング配列；および（３）適切な転写開始および終止配列の組立物を含む。
【００３４】
結合相手：ポリペプチドの結合相手とは、該ポリペプチドに結合し得る分子を指す。このような結合は別の分子を介した間接的なものであることができるが、好ましくは直接的なものである。結合相手はいずれかの型の分子、例えば小型疎水性分子、または、例えば細胞内または細胞外の巨大分子、例えばタンパク質、炭水化物または核酸であることができる。好ましい型の結合相手は抗体、リガンドまたはインヒビターを包含する。
【００３５】
複数：「複数」という用語は１つより多い、好ましくは１０より多いことを指す。
【００３６】
インジケーター部分：「インジケーター部分」という用語はあるポリペプチドおよび／または細胞に特異的に結合し得、そして、検出可能なシグナルを発生することができる分子または分子複合体を包含する。好ましくは、インジケーター部分は抗体であるか、抗体分子を含む。即ち、好ましいインジケーター部分は検出可能な物質とカップリングまたは複合体化する抗体である。
【００３７】
宿主尤度分子または宿主分子：Ｃ．ｊｅｊｕｎｉを感染させることができる宿主生物中に通常存在する分子を指す。宿主誘導分子は好ましくは宿主ポリペプチド、好ましくはヒトポリペプチドである。
【００３８】
抗体：「抗体」という用語は、本明細書において使用する場合は、抗体並びにその機能的等価物を包含するものとする。即ち、これにはポリクローナル抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ヒト化、ヒトまたはキメラ抗体、１本鎖抗体、および、さらには抗体の結合フラグメント、例えばＦａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ発現ライブラリにより作成されたフラグメント、抗イディオタイプ抗体、抗体フラグメント含むハイブリッドおよびこれらのいずれかのエピトープ結合フラグメントを含むハイブリッドが包含されるが、これらに限定されない。用語はさらに多価、多重特異性、例えば二重特異性の抗体およびモノクローナル抗体の混合物も包含する。
【００３９】
解離定数Ｋｄはマクロ分子間、例えば抗体とその抗原の間の結合の強度（または親和性またはアビディティー）を記載するための尺度である。Ｋｄが小さいほど結合は強力である。
【００４０】
単離された：本明細書に開示したポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体に関して使用する場合は、「単離された」とは同定され、そしてその天然の、典型的には細胞の環境の成分から分離および／または回収されているものを指す。天然の環境の夾雑成分とは、ポリペプチドに関する診断または治療用途を典型的に妨害する物質であり、そして酵素、ホルモンおよび他のタンパク質性または非タンパク質性の溶質を包含する。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は好ましくは単離されており、そして本発明のワクチンおよび他の成分は好ましくは単離されたポリペプチドまたは単離されたポリヌクレオチドまたは単離された抗体を含む。
【００４１】
２００３年１１月２１日出願のデンマーク優先権出願ＰＡ２００３０１７２６および２００３年１１月２５日出願の米国暫定出願６０／５２４，６１７から転記したリスト１は参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
（医薬として使用するための組成物）
第１の主要な態様において、本発明は医薬として使用するための、下記成分：
−  配列番号１〜５１の表在カンピロバクターポリペプチドからなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、または、
−  該ポリペプチドに結合し得る抗体、
を含む組成物に関する。
【００４３】
重要な実施形態において、組成物は下記成分：
−  配列番号１〜５１からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を含む。
【００４４】
該組成物は能動免疫化のためのワクチンとしてそれを必要とする固体において使用できる。これは「本発明のワクチン組成物およびワクチン接種の方法」のセクションにおいて説明する。
【００４５】
１つの好ましい実施形態においては、組成物は配列番号１〜３６からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチドを含む。別の好ましい実施形態においては、組成物は配列番号３７〜５１からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチドを含む。
【００４６】
別の重要な実施形態においては、組成物は配列番号１〜５１の表在カンピロバクターポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドに結合し得る抗体を含む。該組成物は例えば受動免疫において、それを必要とする個体に対し使用できる。これは「本発明の抗体および抗体を惹起するための方法」のセクションにおいて説明する。
【００４７】
（本発明のワクチン組成物およびワクチン接種の方法）
ワクチン接種または能動免疫化の目的は抗原性または免疫原性の組成物を使用して感染性微生物に対する記憶応答を誘導することにより保護免疫を与えることである。即ちワクチンは人間または動物における微生物に対抗する保護免疫応答を誘導することができる組成物である。このような免疫応答は細胞性の応答および／または体液性の応答、例えば特異的Ｔ細部応答または抗体応答であることができる。
【００４８】
従って、重要な実施形態において、組成物はワクチン組成物である。即ち、本発明はワクチンとしての下記成分：
−  配列番号１〜５１の表在カンピロバクターポリペプチドからなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、
または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、を含む組成物の使用に関する。本明細書においては、改変体とは、該配列に対して少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００４９】
上記した組成物の１つの実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００５０】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００５１】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００５２】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００５３】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号５またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００５４】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号６またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００５５】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号７またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００５６】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号８またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００５７】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号９またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００５８】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１０またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００５９】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１１またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００６０】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１２またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００６１】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１３またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００６２】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１４またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００６３】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１５またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００６４】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１６またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００６５】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１７またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００６６】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１８またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００６７】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１９またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００６８】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２０またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００６９】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２１またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００７０】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２２またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００７１】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２３またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００７２】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２４またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００７３】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２５またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００７４】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２６またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００７５】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２７またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００７６】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２８またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００７７】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号２９またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００７８】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３０またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００７９】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３１またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００８０】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３２またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００８１】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３３またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００８２】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３４またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００８３】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３５またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００８４】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３６またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００８５】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３７またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００８６】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３８またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００８７】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号３９またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００８８】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４０またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００８９】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４１またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００９０】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４２またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００９１】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４３またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。１つの好ましい実施形態においては配列番号４３のＸ１はＶであり、そしてＸ２はＡであり、そしてＸ３はＴである。別の好ましい実施形態においては配列番号４３のＸ１はＡであり、そしてＸ２はＴであり、そしてＸ３はＡである。
【００９２】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４４またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００９３】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４５またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００９４】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４６またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００９５】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４７またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００９６】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４８またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００９７】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号４９またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００９８】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号５０またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【００９９】
上記した組成物の別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号５１またはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【０１００】
組成物の一部の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１〜５１の群から選択される配列よりなる。別の実施形態においては、ポリペプチドは配列番号１〜５１の群から選択される配列または該配列の抗原性フラグメントまたは改変体、ならびにタグ、例えばｈｉｓタグ、即ちポリヒスチジンタグを含む。
【０１０１】
組成物は配列番号１〜５１の群から選択される１つのポリペプチドまたはそのフラグメントまたは改変体をふくむのみであってよい。しかしながら、別の実施形態においては、組成物は配列番号１〜５１の群の１つより多いポリペプチドおよび／または配列番号１〜５１から選択されるポリペプチドの１つより多いフラグメントを含む。即ち、本発明の組成物は１つより多い、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９、例えば１０、例えば５〜１０の範囲のポリペプチドおよび／またはフラグメントの数、または１０より多い、例えば１０〜２０の範囲の、配列番号１〜５１の群から選択される異なるポリペプチドまたはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【０１０２】
同様に、組成物は本発明の１つのポリヌクレオチド、１つの発現ベクター、または、１つの組換えウィルスまたは組換え細胞を含むのみであってよい。しかしながら、別の実施形態においては、組成物は本発明の１つのポリヌクレオチド、１つの発現ベクター、または、１つの組換えウィルスまたは組換え細胞より多くを含む。即ち本発明の組成物は、１つより多い、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９、例えば１０、または１０より多い、例えば１０〜２０の範囲の、本明細書に記載した本発明の異なるポリヌクレオチド、発現ベクターまたは組換えウィルスまたは組換え細胞を含んでよい。
【０１０３】
さらにまた、一部の実施形態においては、本発明の組換え細部は配列番号１〜５１のポリペプチド１つより多く、および／または、配列番号１〜５１の群から選択されるポリペプチドの抗原性フラグメントまたは改変体１つより多くを発現してよい。即ち、本発明の組成物は１つより多い、例えば２、例えば３、例えば４、例えば５、例えば６、例えば７、例えば８、例えば９、例えば１０、例えば５〜１０の範囲のポリペプチドおよび／またはフラグメントの数、または１０より多い、例えば１０〜２０の範囲の、配列番号１〜５１の群から選択される異なるポリペプチドまたはその抗原性フラグメントまたは改変体を含む組換え細胞を含む。別の実施形態においては、本発明において使用する組成物は本発明に記載する複数の組換えウィルスまたは組換え細胞を含む。
【０１０４】
（ポリペプチドを含むワクチン）
好ましい実施形態においては、本発明は、ワクチンとして使用するための、配列番号１〜５１からなる群より選択される配列、例えば配列番号１〜３６のいずれか、または配列番号３７〜５１のいずれか、または該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチドを含む組成物に関する。好ましいフラグメントまたは改変体はフラグメントおよび改変体に関する本明細書のセクションにおいて記載するものである。
【０１０５】
従って、本実施形態においては、抗原性または免疫原性はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の表面に通常位置するポリペプチドの直接の投与により提供される。１つの特定の実施形態においては、ポリペプチドは、ワクチン組成物が異なるＭＨＣ分子、例えば異なるＭＨＣクラスＩ分子に会合することができる複数のポリペプチドを含むように、選択される。好ましくは、ワクチンとして使用するための組成物は最も頻繁に存在するＭＨＣクラスＩ分子と会合することができるポリペプチドおよび／またはフラグメントを含む。本発明の１つの特定の実施形態においては、組成物はＭＨＣクラスＩ分子と会合することができるポリペプチドおよび／またはフラグメント１つ以上、および、ＭＨＣクラスＩＩ分子と会合することができるポリペプチドおよび／またはフラグメント１つ以上を含む。従って、ワクチン組成物は一部の実施形態においては、特定の細胞毒性Ｔ細胞応答および／または特定のヘルパーＴ細胞応答を形成することができる。ＭＨＣ分子への会合は例えばＡｎｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ  ５４：１８５；またはＴａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０９：２５に記載の通り測定できる。
【０１０６】
（アジュバントおよび免疫原性キャリア）
好ましくは、本発明のワクチンとして使用するための組成物、即ちワクチン組成物は「本発明において使用するための組成物」のセクションにおいて本明細書に記載する通り薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【０１０７】
組成物はさらにアジュバントを含むことができる。アジュバントは、それをワクチン組成物に添加することで、ポリペプチドまたは他の抗原に対する免疫応答を増大またはその他の変化をもたら物質である。アジュバントは例えばＡｌＫ（ＳＯ４）２、ＡｌＮａ（ＳＯ４）２、ＡｌＮＨ４（ＳＯ４）、シリカ、ミョウバン、Ａｌ（ＯＨ）３、Ｃａ３（ＰＯ４）２、カオリン、炭素、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ムラミルジペプチド、Ｎ−アセチル−ムラミル−Ｌ−スレオニル−Ｄ−イソグルタミン（ｔｈｒ−ＤＭＰ）、Ｎ−アセチル−ノルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソ−グルタミン（ＣＧＰ１１６８７、ｎｏｒ−ＭＤＰとも称する）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−イソグルタミニル−Ｌ−アラニン−２−（１’２’−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ヒドロキシホスホリルオキシ）−エチルアミン（ＣＧＰ１９８３５Ａ、ＭＴＰ−ＰＥとも称する）、２％スクアレン／Ｔｗｅｅｎ−８０．ＲＴＭ．エマルジョン中のＲＩＢＩ（ＭＰＬ＋ＴＤＭ＋ＣＷＳ）、リポ多糖類および誘導体、例えば脂質Ａ、フロイントの完全アジュバント（ＦＣＡ）、フロイントの非完全アジュバント、メルクアジュバント６５、ポリヌクレオチド（例えばポリＩＣおよびポリＡＵ酸）、マイコバクテリウム・ツベルクロシス由来ワックスＤ、コリネバクテリウム・パルバム、百日咳菌およびブルセラ属のメンバー中に存在する物質、リポソームまたは他の脂質エマルジョン、Ｔｉｔｅｒｍａｘ、ＩＳＣＯＭＳ、ＱｕｉｌＡ、ＡＬＵＮ（米国特許５８７６７および５，５５４，３７２参照）、脂質Ａ誘導体、コレラ毒誘導体、ＨＳＰ誘導体、ＬＰＳ誘導体、合成ペプチドマトリックスまたはＧＭＤＰ、インターロイキン１、インターロイキン２、モンタニドＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１のいずれかであることができる。本発明において使用するのに好ましいアジュバントはモンタニドＩＳＡ−５１およびＱＳ−２１を包含する。モンタニドＩＳＡ−５１（Ｓｅｐｐｉｃ，Ｉｎｃ．）は通常はエマルジョンとして投与される不完全フロインドアジュバントに類似した鉱物油系のアジュバントである。ＱＳ−２１（Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｓ；Ａｑｕｉｌｌａ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）は水溶液と同様に取り扱われる高度に精製された水溶性のサポニンである。
【０１０８】
本発明に従って使用できるアジュバントの望ましい機能を以下の表に列挙する。
【０１０９】
【表１】
2008501625.tif 000002
入手元：Ｊｏｈｎ  Ｃ．Ｃｏｘ  ａｎｄ  Ａｌａｎ  Ｒ．Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅ  １９９７  Ｆｅｂ；１５（３）：２４８−５６。
【０１１０】
本発明のワクチン組成物は異なるアジュバントを１つより多く含んでよい。本発明のカンピロバクターポリペプチド、またはそのフラグメント１つ以上およびアジュバントはいずれかの適切な順序において個別に投与できることも意図している。
【０１１１】
頻繁には、選択されるアジュバントは例えばミョウバン沈殿抗原と組み合わせて使用されるフロインドの完全または不完全アジュバント、または殺傷された百日咳菌である。アジュバントに関する一般的な考察はＧｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ（２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８６）ｐ６１−６３に記載されている。しかしながらＧｏｄｉｎｇによれば、目的の抗原が低分子量のものである場合、または免疫原性が乏しい場合は、免疫原性キャリアへのカップリングが推奨される（後述参照）。種々のサポニン抽出物およびサイトカインもまた免疫原性組成物中のアジュバントとして有用であることが示唆されている。近年、アジュバントとしてよく知られたサイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の使用が提案された（ＷＯ９７／２８８１６）。
【０１１２】
さらにまた、本発明のワクチン組成物は、カンピロバクターのポリペプチドまたはそのフラグメントが会合することができる相手となるスカホールド構造、例えばタンパク質または多糖類のような免疫原性キャリアを含むことができる。ワクチン組成物中に存在するカンピロバクターポリペプチドまたはその抗原性フラグメントまたは改変体は例えばタンパク質のような免疫原性キャリアと会合することができる。キャリアタンパク質へのポリペプチドの結合または会合は共有結合製または非共有結合性であってよい。免疫原性キャリアタンパク質はアジュバントとは独立して存在してよい。キャリアタンパク質の機能は、例えば、特定のフラグメントの分子量を増大させることによりその活性または免疫原性を増大させるか、安定性を付与するか、生物活性を増大させるか、または、血清中半減期を延長することである。さらにまた、免疫原性キャリアタンパク質はＴ細胞に対してカンピロバクターポリペプチドまたはそのフラグメントを提示する場合に寄与する。キャリアタンパク質としては例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清タンパク質、例えばトランスフェリン、ウシ血清アルブミン、ヒト血清アルブミン、タイログロブリンまたはオブアルブミン、免疫グロブリンまたはホルモン、例えばインスリンであるが、これらに限定されない。破傷風トキソイド、および／またはジフテリアトキソイドもまた本発明の１つの実施形態における適当なキャリアである。代替またはさらに加えて、デキストラン、例えばセファロースを添加してよい。さらに別の実施形態においては、抗原提示細胞、例えばＴ細胞に対してポリペプチドまたはそのフラグメントを提示することができる樹状細胞を添加することによりキャリアタンパク質と同様の作用を得てよい。
【０１１３】
ワクチン組成物の製造方法は例えば米国特許５，４７０，９５８およびその参考文献に記載されている。本発明のワクチン組成物のポリペプチド成分の有効量は、注射される場合は、典型的にはヒト対象に対し、約０．１〜約１０００μｇ、例えば約１〜約９００μｇ、例えば約５〜約５００μｇ、そして一般的に約０．０１〜１０．０μｇ／ｋｇ対象動物体重の範囲である。上記した範囲は例示であり、本発明を限定するものではない。
【０１１４】
本発明の抗原性ポリペプチドの有効量は免疫調節剤の非存在下において検出可能な体液性免疫応答を誘発することができる量である。多くの免疫原について、これは、ヒト対象に対しては約５〜１００μｇの範囲である。使用すべき免疫原の適切な量はそれが誘発すべき免疫学的応答により異なる。さらにまた、必要とされる厳密な有効用は対象の種、齢および全身状態、治療すべき状態の重症度、投与様式等に応じて対象ごとに変動する。従って厳密な有効量を特定することは常時可能ではない。しかしながら、適切な有効量は当該分野の日常的実験または従来の知見を用いて当業者が決定してよい。
【０１１５】
（ＤＮＡワクチン組成物および組換えウィルスまたは組換え細胞を含むワクチン組成物）
ＤＮＡまたはＲＮＡワクチンは、患者内への例えば抗原性ポリペプチド決定基の導入を、目的のポリペプチド、本明細書においては配列番号１〜５１のポリペプチドまたはその抗原性フラグメントまたは改変体をコードする配列に作動可能に連結した発現制御配列を包含するポリヌクレオチドコンストラクトを患者の細胞内で過剰発現することにより行うことに関する。このようなフラグメントはメチオニン開始コドンを含有していない場合があるため、このようなコドンは場合により発現制御配列の部分として含まれる。ポリヌクレオチドコンストラクトは非複製の直鎖ポリヌクレオチド、環状発現ベクターまたは自律複製プラスミドまたはウィルス発現ベクターであってよい。コンストラクトは宿主ゲノム内に組み込まれてよい。哺乳類細胞をトランスフェクトで切るいずれかの発現ベクターを本発明による個体を免疫化する方法において使用してよい。発現ベクターを構築する方法は当該分野で良く知られている（例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９参照）。好ましいものは本発明の配列番号１〜５１から選択される複数のポリペプチドおよび／または複数の抗原フラグメントを発現することにより、予め選択された種々の標的に対して同時にワクチン接種を可能とするような、複数の遺伝子を含む組成物である。
【０１１６】
ワクチンはまた、生存しているが無害であるベクター、例えばウィルスまたは細胞、例えば弱毒化または毒性の減少した大腸菌またはサルモネラの細胞内に目的の特定の抗原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを取りこませることにより製造することもできる。無害な組換えウィルスまたは組換え細胞を意図されるレシピエントに注射する。このような組換え細胞は死滅または生存していてよい。生存している場合は、組換え生物は宿主内で複製する一方で抗原性ポリペプチドを生産し、宿主の免疫系に対して提示する。この型のワクチンは非複製型ワクチンよりも有効である。このようなワクチンが良好であるためには、ベクター生物は生存していなければならず、そして本来非毒性であるか、または、弱毒化または毒性の減少した表現型を有さなければならない。
【０１１７】
弱毒化細菌を使用するワクチン接種の方策およびそこで使用するための適当な細菌株は例えばＭａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．３１：１−８；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９１：５７７−５８２；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４９６９−４９７９；ＷＯ９９／４９０２６；およびＷＯ０３／０２２３０７に記載されている。
【０１１８】
適用することができるベクターの別の例は、例えばＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９１／０２８０５、ＷＯ９３／２５２３４、ＷＯ９３／２５６９８およびＷＯ９４／０３６２２に開示されているレトロウィルス、Ｂｅｒｋｎｅｒ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ６：６１６−６２７，１９８８；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．４：４０３−４０９，１９９３；Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．５：１３０−１３４，１９９３；およびＫｏｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１；２１５−２１９，１９９４に開示されているアデノウィルス、米国特許４，７６９，３３０；米国特許５，０１７，４８７；およびＷＯ８９／０１９７３に開示されているポックスウィルス。ＷＯ９１／１１０９２に開示されているネイキッドＤＮＡ、ＷＯ９３／０３７０９に開示されている多価カチオン分子と複合体化しているポリヌクレオチド分子、およびＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７８５１，１９８７に開示されているリポソームに会合しているポリヌクレオチドを含むベクターである。特定の実施形態においては、ＤＮＡはＣｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４，１９９２；Ｃｏｔｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６０９４に開示されている殺傷または不活性化アデノウィルスに連結してよい。他の適当な組成物はＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７，１９８９に開示されているＤＮＡリガンド、および、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４：７４１３−７４１７，１９８９に開示されている脂質−ＤＮＡ組合せを包含する。さらにまた、細胞へのネイキッドＤＮＡの取り込みの効率は生体分解性のラテックスビーズ上にＤＮＡをコーティングすることにより向上させてよい。
【０１１９】
ワクチンベクターは好ましくは免疫原性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に作動可能に連結した適当なプロモーターを含む。標的細胞内の高レベルの転写開始を指向することができるいずれかのプロモーターを本発明において使用してよい。即ち非組織特異的プロモーター、例えばサイトメガロウィルス（ＤｅＢｅｒｎａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９２５７−９２６１［１９９１］およびその参考文献）、マウスメタロチオイネンＩ（Ｈａｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ａｐｐｌ  Ｇｅｎ  １：２７３−２８８［１９８２］）、ＨＳＶチミジンキナーゼ（ＭｃＫｎｉｇｈｔ，Ｃｅｌｌ  ３１：３５５−３６５［１９８２］）およびＳＶ４０早期（Ｂｅｎｏｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９０：３０４−３１０［１９８１］）プロモーターを使用してよい。
【０１２０】
（ワクチン接種方法）
別の主要な態様において、本発明はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの感染に対抗する動物またはヒトの免疫化のための医薬の製造のための下記物質：
−  配列番号１〜５１からなる群より選択される配列、例えば配列番号１〜３６のいずれかまたは配列番号３７〜５１のいずれかを含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
のいずれかの１つ以上の使用に関する。免疫化が防御免疫応答を誘導するのが望ましい。
【０１２１】
同様に、本発明は下記物質：
−  配列番号１〜５１の配列のいずれか、例えば配列番号１〜３６のいずれかまたは配列番号３７〜５１のいずれかを含むか；または、該配列のいずれかのフラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
のいずれか１つ以上を投与することによりＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染に対抗して動物または人間を免疫化する工程を含む、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染に対抗した該動物または人間の免疫化のための方法に関する。
【０１２２】
動物はいずれかの鳥類または哺乳類、例えばニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウシまたはブタであってよい。人間の特定の標的集団は危険集団、例えば４歳以下の小児集団、先進国民集団、または、開発途上国への無免疫または半免疫の旅行者集団に属する個体である。
【０１２３】
本発明の組成物の投与様式は、例えば全身投与、例えば静脈内または皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、経口投与、および一般的には粘膜投与のいずれかの形態を包含する。
【０１２４】
本発明の免疫原性作用は例えばＲＩＡにより血清サンプル中の抗体の試験により測定することができる。さらにまた、作用は例えばＴ細胞依存性抗原ポリペプチドに対するＴ細胞の増大した応答性を測定することによりインビボで測定でき、その場合、該増大した応答性はそのような抗原性ポリペプチドに対する正常な免疫応答の増強に態様的なものである。免疫刺激作用もまた特にＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−ガンマおよび／またはＧＭ−ＣＳＦの増強されたＴ細胞の生産として測定してよい。即ち、増強された免疫応答を誘発する能力を有するポリペプチドまたはそのフラグメントは例えば参照により本明細書に組み込まれるＵＳ０７／７７９，４９９に記載の通り、Ｔ細胞による増強されたＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＦＮ−ガンマまたはＧＭ−ＣＳＦ生産をスクリーニングすることにより容易に同定することができる。Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００），Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｅｄ．Ｎａｃｈａｍｋｉｎ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｅｒ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２８７−３０１もまた治療および予防の方策の薬効のおよび組成物の評価において使用できる一連の適当な動物モデルを記載している。カンピロバクターに対抗したワクチン接種に関連する多くの態様、例えば潜在的標的集団、動物モデルおよびワクチン接種の方策は、Ｓｃｏｔｔ  ａｎｄ  Ｔｒｉｂｂｌｅ（２０００），Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｅｄ．Ｎａｃｈａｍｋｉｎ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｅｒ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．３０３−３１９に記載されている。
【０１２５】
本明細書に記載したポリヌクレオチドおよび発現ベクターはいずれかの標準的な方法、例えばＩＳ−ＣＯＭＳ、リポソームまたは赤血球ゴースト内に取り込まれたネイキッドＤＮＡ（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５：６１７−６４８［１９９７］）として、または、バイオリスティックトランスファー、カルシウム沈降またはエレクトロポレーションにより、インビボまたはインビトロで標的細胞に導入できる。或いは、動物または人間の細胞内に目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入するための手段としてウィルス系ベクターを使用することもできる。好ましいウィルスベクターは複製欠損肝炎ウィルス（例えばＨＢＶおよびＨＣＶ）、レトロウィルス（例えばＷＯ８９／０７１３６；およびＲｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３２３（９）：５７０−５７８［１９９０］参照）、アデノウィルス（例えばＭｏｒｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｓｕｐｐ．１７Ｅ［１９９３］参照）アデノ関連ウィルス（Ｋｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８７：２２１１−２２１５［１９９０］）、複製欠損単純疱疹ウィルス（ＨＳＶ；Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ，ｐ．６６，Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，  Ｓｅｐ．２２−２６，１９９２，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  ＮＹ）、カナリア痘ウィルスから誘導したもの、および、これらのベクターのいずれかの修飾された型を包含する。インビトロでトランスフェクトされた細胞を培養し、所望によりクローニングした後に患者内に導入することができる。
【０１２６】
直接のインビボの操作法に加えて、細胞を動物から取り出し、修飾し、そして同じか別の動物に入れるというエクスビボの操作法を使用してよい。エクスビボの概念において組織の細胞内に本発明の抗原性ポリペプチドまたはこれをコードするポリヌクレオチドを導入するために、上記した組成物のいずれかを利用することができることは明白である。ウィルス的、物理的および化学的な取り込み方法に関するプロトコルは当該分野で知られている。即ち、患者への直接の本発明のポリペプチドまたはそのようなポリペプチドを発現できるベクターの投与の変わりに、患者からヘルパーＴ細胞を取り出し；これらのＴ細胞をエクスビボで同じ抗原性ポリペプチドまたはベクターを用いながら刺激し；そして刺激されたヘルパーＴ細胞を同じ患者に導入することができる。
【０１２７】
（本発明の抗体および本発明の抗体を惹起するための方法）
別の主要な実施形態において、医薬として使用するための組成物は配列番号１〜５１の表在カンピロバクターポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドに結合し得る抗体を含む。このような医薬は抗体療法、例えば治療を要する個体の受動免疫のために使用できる。
【０１２８】
従って、別の主要な態様において、本発明は配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／またはその改変体、例えば配列番号１のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号３のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号５のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号６のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号７のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号８のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号９のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号１０のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号１１のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号１２のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号１３のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号１４のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号１５のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号１６のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号１７のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号１８のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号１９のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２０のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２１のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２２のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２３のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２４のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２５のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２６のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２７のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２８のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号２９のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号３０のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号３１のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号３２のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号３３のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号３４のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号３５のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号３６のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、に結合、好ましくは特異的に結合し得る抗体に関する。「特異的に結合する」とは、この内容においては、絶対的な特異性を意味することを意図していない。抗体は一部の実施形態においては例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ由来のポリペプチドと高度な配列同一性を有する他のカンピロバクター種に由来するポリペプチド、例えばＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ由来のポリペプチドとの配列同一性９０％超、例えば９５％超または９８％超を有するポリペプチドにも特異的に結合してよい。
【０１２９】
好ましい実施形態においては、抗体は配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチド、例えば配列番号１のポリペプチド、例えば配列番号２のポリペプチド、例えば配列番号３のポリペプチド、例えば配列番号４のポリペプチド、例えば配列番号５のポリペプチド、例えば配列番号６のポリペプチド、例えば配列番号７のポリペプチド、例えば配列番号８のポリペプチド、例えば配列番号９のポリペプチド、例えば配列番号１０のポリペプチド、例えば配列番号１１のポリペプチド、例えば配列番号１２のポリペプチド、例えば配列番号１３のポリペプチド、例えば配列番号１４のポリペプチド、例えば配列番号１５のポリペプチド、例えば配列番号１６のポリペプチド、例えば配列番号１７のポリペプチド、例えば配列番号１８のポリペプチド、例えば配列番号１９のポリペプチド、例えば配列番号２０のポリペプチド、例えば配列番号２１のポリペプチド、例えば配列番号２２のポリペプチド、例えば配列番号２３のポリペプチド、例えば配列番号２４のポリペプチド、例えば配列番号２５のポリペプチド、例えば配列番号２６のポリペプチド、例えば配列番号２７のポリペプチド、例えば配列番号２８のポリペプチド、例えば配列番号２９のポリペプチド、例えば配列番号３０のポリペプチド、例えば配列番号３１のポリペプチド、例えば配列番号３２のポリペプチド、例えば配列番号３３のポリペプチド、例えば配列番号３４のポリペプチド、例えば配列番号３５のポリペプチド、例えば配列番号３６のポリペプチドに結合、好ましくは特異的に結合し得る。
【０１３０】
好ましい実施形態においては本発明の抗体はさらに、インタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに結合し得、即ち、自身の構造的一体性を保持している生存または死滅カンピロバクター細胞、好ましくは外膜の一体性を保持している細胞（即ち外膜が透過性となっていないもの）に結合し得る。インタクトな細胞への抗体の結合は例えばＲｉｏｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：５１６２−５１６５またはＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：３９３７−３９４６に記載されているフローサイトメトリーにより測定できる。
【０１３１】
別の主要な態様において、本発明はインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに結合、好ましくは特異的に結合し得、そして、配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、配列番号３７のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号３８のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号３９のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４０のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４１のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４２のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４３のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４４のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４５のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４６のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４７のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４８のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号４９のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号５０のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体、例えば配列番号５１のポリペプチドおよび／またはそのフラグメントおよび／または改変体に結合、好ましくは特異的に結合し得る抗体に関する。
【０１３２】
好ましい実施形態において、抗体はインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに結合、好ましくは特異的に結合し得、そして、配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチド、配列番号３７のポリペプチド、例えば配列番号３８のポリペプチド、例えば配列番号３９のポリペプチド、例えば配列番号４０のポリペプチド、例えば配列番号４１のポリペプチド、例えば配列番号４２のポリペプチド、例えば配列番号４３のポリペプチド、例えば配列番号４４のポリペプチド、例えば配列番号４５のポリペプチド、例えば配列番号４６のポリペプチド、例えば配列番号４７のポリペプチド、例えば配列番号４８のポリペプチド、例えば配列番号４９のポリペプチド、例えば配列番号５０のポリペプチド、例えば配列番号５１のポリペプチドに結合、好ましくは特異的に結合し得る。
【０１３３】
好ましい抗体は５×１０−６Ｍ未満、例えば１０−６Ｍ未満、例えば５×１０−７Ｍ未満、例えば１０−７Ｍ未満、例えば５×１０−８Ｍ未満、例えば１０−８Ｍ未満、例えば５×１０−９Ｍ未満、例えば１０−９Ｍ未満、例えば５×１０−１０Ｍ未満、例えば１０−１０Ｍ未満、例えば５×１０−１１Ｍ未満、例えば１０−１１Ｍ未満、例えば５×１０−１２Ｍ未満、例えば１０−１２Ｍ未満、例えば５×１０−１３Ｍ未満、例えば１０−１３Ｍ未満、例えば５×１０−１４Ｍ未満、例えば１０−１４Ｍ未満、例えば５×１０−１５Ｍ未満、例えば１０−１５Ｍ未満の解離定数、即ちＫｄにおいて結合するものである。結合定数は当該分野で知られている方法、例えばＥＬＩＳＡ（例えばＯｒｏｓｚ  ａｎｄ  Ｏｖａｄｉ（２００２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２７０：１５５−１６２）または表面プラズモン共鳴分析を用いて測定することができる。
【０１３４】
抗体は哺乳類、好ましくは人間、より好ましくは免疫無防備状態の患者の受動免疫化のために使用できる。抗体の投与はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染を治癒または防止するために行うことができる。本発明の抗体は以下の好ましい機械的な群を包含する。
１．抗微生物剤（細菌の生活能力に影響する）として働く機能抑制抗体。このような抗体は患者の免疫状態とは無関係に有効となるはずである。好ましくはこのような抗体はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの生育をインビボで抗体無添加の対照の５０％未満、例えば２５％未満、例えば１０％未満、例えば５％未満まで低減することができる。
２．食作用性の殺傷を増強するように設計されたオプソニン作用性抗体。このような抗体の有効性は患者の免疫状態に依存しているが、それらが免疫無防備状態の患者においてさえも食作用性の殺傷を増強することは十分に可能である。
３．毒素または殺菌剤、例えばリシンまたは放射性同位体のような治療部分にコンジュゲートされた抗体。治療部分を抗体にコンジュゲートする手法は当該分野で知られており、例えばＴｈｏｒｐｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８２）  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．６２，１１９−１５８を参照できる。これらの抗体は患者の免疫状態とは無関係に有効となるはずである。
【０１３５】
自身にコンジュゲートされた治療部分を有するか有さない抗体は、単独で投与される治療薬として、または、化学療法剤または他の治療薬と組み合わせて使用できる。
【０１３６】
１つの実施形態において本発明の抗体はオプソニン作用性並びに機能抑制性である。別の実施形態においては、本発明の抗体はオプソニン作用性であるが機能抑制性ではない。後者のグループの抗体は例えばカンピロバクターの生活能力のために必須ではない標的ポリペプチドに対して指向された抗体であることができる。
【０１３７】
別の主要な態様において、本発明は非ヒト動物における配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドに対する抗体を惹起するための方法であって、下記工程：
ａ．下記成分：
−  配列番号１〜３６からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を提供すること、
ｂ．該動物に該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組換えウィルスまたは組換え細胞を含む組成物を導入すること、
ｃ．該動物において抗体を惹起させること、および、
ｄ．抗体を単離し、場合により精製すること、
を含む上記方法に関する。
【０１３８】
別の主要な態様において、本発明は非ヒト動物における配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチドに対する抗体を惹起するための方法であって、抗体はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得、方法は下記工程：
ａ．下記成分：
−  配列番号３７〜５１からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を提供すること、
ｂ．該動物に該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組換えウィルスまたは組換え細胞を含む組成物を導入すること、
ｃ．該動物において抗体を惹起させること、
ｄ．抗体を単離し、場合により精製すること、および、
ｅ．インタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る抗体を選択すること、
を含む上記方法に関する。
【０１３９】
上記した方法は好ましくはヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物において行う。さらに好ましい実施形態においては、上記方法は非治療性である。
【０１４０】
（モノクローナル／ポリクローナル抗体）
本発明の抗体はポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体またはモノクローナル抗体の混合物であることができる。好ましい実施形態においては、抗体はモノクローナル抗体またはそのフラグメントである。モノクローナル抗体（Ｍａｂ）は各抗体分子が同様であり、従って同じエピトープを認識する抗体である。抗体はいずれかの種類の抗体であってよいが、好ましくはＩｇＧまたはＩｇＡ抗体である。
【０１４１】
モノクローナル抗体は一般的にハイブリドーマ細胞系統により生産される。多金属酸化物および抗体合成ハイブリドーマ細胞を作成する方法は当該分野でよく知られている。抗体生産ハイブリドーマは例えば不朽化細胞系統に抗体生産Ｂリンパ球を融合させることにより作成してよい。モノクローナル抗体は以下の工程により作成することができる。動物を完全長ポリペプチドまたはそのフラグメントのような抗原で免疫化する。免疫化は典型的には、抗原を、免疫学的に有効な量、即ち免疫応答をもたらすのに十分な量で免疫学的にコンピテントな哺乳類に投与することにより達成される。好ましくは、哺乳類はウサギ、ラットまたはマウスのようなげっ歯類である。次に哺乳類が高親和性の抗体分子を生成するのに十分な時間、哺乳類をブースタースケジュールに維持する。抗体生産細胞の懸濁液を所望の抗体を分泌している各免疫化哺乳類から採取する。高親和性抗体を生成するのに十分な時間の後、動物（例えばマウス）を屠殺し、そして抗体生産リンパ球をリンパ節、脾臓および末梢血１つ以上から採取する。脾細胞が好ましく、そして当該分野でよく知られた方法を用いて生理学的媒体中で機械的に分離して個々の細胞とすることができる。抗体生産細胞はマウスミエローマ系統の細胞との融合により不朽化される。マウスリンパ球はマウス相同ミエローマとの安定な融合を高比率で可能とするが、ラット、ウサギおよびカエルの体細胞も使用できる。所望の抗体生産動物の脾細胞は一般的にはポリエチレングリコールのような融合剤の存在下にミエローマ細胞と融合することにより不朽化される。融合相手として適しているミエローマ細胞系統の多くのうちのいずれかとしては、例えばＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  （ＡＴＣＣ），Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄから入手できるＰ３−ＮＳ１／１−Ａｇ４−１、Ｐ３−ｘ６３−Ａｇ８．６５３またはＳｐ２／Ｏ−Ａｇ１４ミエローマ系統であることができる。
【０１４２】
モノクローナル抗体はまた組換えＤＮＡ技術の分野の当業者のよく知る他の方法により作成することもできる。「コンビナトリアル抗体ディスプレイ」法と称される代替法が特定の特異性を有する抗体フラグメントの同定および単離のために開発されており、そしてモノクローナル抗体の生産のために利用されている。
【０１４３】
ポリクローナル抗体は特定のある抗原を認識する抗体分子の混合物であり、従って、ポリクローナル抗体は例えばポリペプチド内の異なるエピトープを認識してよい。一般的にポリクローナル抗体は抗原で予め免疫化されている哺乳類の血清から精製される。ポリクローナル抗体は例えばＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８に記載の方法のいずれかにより作成してよい。ポリクローナル抗体はいずれかの適当な哺乳類種、例えばマウス、ラット、ウサギ、ロバ、ヤギおよびヒツジから誘導してよい。
【０１４４】
（特異性）
本発明の抗体は配列番号１〜５１のポリペプチドのいずれかに対して単一特異性であってよい。別の実施形態においては、抗体は配列番号１〜５１のポリペプチドのいずれかに対して特異的な部分少なくとも１つを有する二重特異性または多重特異性である。
【０１４５】
単一特異性抗体は１価、即ち結合ドメイン１個のみを有する。１価の抗体については、免疫グロブリン定常ドメインのアミノ酸配列は好ましくはＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＨ４のような当該分野で知られた抗体分子の構造的部分を含む。好ましいものはＣＬとして当該分野で知られているものである。さらにまた定常ドメインが重鎖または軽鎖の定常ドメイン（それぞれＣＨまたはＣＬ）である限り、種々の１価の抗体組成物が本発明により意図される。例えば軽鎖定常ドメインは別の軽鎖定常ドメインまたは重鎖定常ドメインのいずれかとジスルフィド結合し得る。一方、重鎖定常ドメインは２つの独立したジスルフィド架橋を形成することができ、これにより別の重鎖と軽鎖の両方と架橋可能であるか、または、重鎖の重合体を形成できる。即ち、別の実施形態においては、本発明は定常鎖ドメインＣがジスルフィド架橋少なくとも１つを形成できるシステイン残基を有し、そして、組成物が該ジスルフィド架橋に共有結合した１価のポリペプチド少なくとも２つを含む１価のポリペプチドを含む組成物を意図している。
【０１４６】
本発明の別の実施形態においては、抗体は結合ドメイン少なくとも２つを有する多価の抗体である。結合ドメインは同じリガンドまたは異なるリガンドに対する特異性を有していてよい。
【０１４７】
（二重特異性を包含する多重特異性）
好ましい実施形態においては、本発明は少なくとも２つの異なる実体に対して親和性を有し、そして特異的に結合し得る多重特異性抗体に関する。
【０１４８】
１つの実施形態において多重特異性抗体は、少なくとも１つが抗体起源である少なくとも２つの異なる結合ドメインを担持した二重特異性の抗体である。本発明の二重特異性分子はまた１本鎖二重特異性分子であることもできる。多重特異性分子もまた１本鎖分子であるか、または、少なくとも２つの１本鎖分子を含んでよい。二重特異性を含む多重特異性の抗体は当業者の知るいずれかの態様により製造してよい。例えばＷＯ９４／０９１３１；ＷＯ９４／１３８０４；ＷＯ９４／１３８０６または米国特許５，４６０，２０３；５，４５５，０３０；４，８８１，１７５；５，１３２，４０５；５，０９１，５１３；５，４７６，７８６；５，０１３，６５３；５，２５８，４９８；および５，４８２，８５８に記載のもののような多くの方法が開発されている。
【０１４９】
本発明の二重特異性または多重特異性の抗体を使用することは、単一特異性／１価の抗体と比較して幾つかの好都合な点をもたらす。二重特異性／多重特異性抗体は配列番号１〜５１のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉポリペプチドのいずれかを特異的に認識して結合し得る第１の結合ドメインを有し、ここで別の結合ドメインは他の目的のために使用してよい。１つの実施形態において、少なくとも１つの別の結合ドメインをＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉポリペプチドへの結合、例えば第１の結合ドメインとしての同じＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉポリペプチド上の別のエピトープへの結合のために使用する。これによりＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに対する特異性が増大すると同時に抗体のアビディティーが増大する。別の実施形態においては、少なくとも１つの別の結合ドメインを哺乳類細胞、例えばヒト細胞に特異的に結合するために使用してよい。治療方法における抗体の作用を増大させるためには、少なくとも別の結合ドメインが免疫活性細胞、例えば白血球、マクロファージ、リンパ球、好塩基球および／または好酸球に結合できることが好ましい。このことは、少なくとも１つの別の結合ドメインが哺乳類タンパク質、例えばヒトタンパク質、例えばクラスター分化タンパク質（ＣＤ）、特にＣＤ６４および／またはＣＤ８９のいずれかから選択されるタンパク質に特異的に結合できることが確実であれば達成される。
【０１５０】
（ヒト化抗体）
ヒト治療のために非ヒト抗体を使用することは非ヒト「外来性」エピトープが治療すべき個体に免疫応答を誘発する可能性があるため常時望ましいわけではない。非ヒト抗体に関わる問題を排除するためには、キメラ抗体誘導体、即ちヒト定常領域（Ｆｃ）に非ヒトＦａｂ可変領域結合決定基を組合せる「ヒト化」抗体分子を作成することが望ましい。このような抗体は上記したモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体の等しい抗原特異性および親和性を態様とし、ヒトに投与した場合に低免疫原性であり、そのため、治療すべき個体がより高い耐容性を示す。
【０１５１】
従って、１つの実施形態において本発明の抗体はヒト化抗体である。ヒト化抗体は一般的にヒト抗体から誘導した領域および非ヒト抗体、例えばげっ歯類抗体から誘導した領域を含むキメラ抗体である。ヒト化（リシェイピングまたはＣＤＲグラフティングとも称する）は異種原料（一般的にはげっ歯類）由来のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の免疫原性を低下させ、ヒト免疫グロブリンに対する相同性を増大させ、そしてヒト免疫系のその活性化を向上させるための十分確立された手法である。即ち、ヒト化抗体は典型的には一部のＣＤＲ残基および恐らくは一部のフレームワーク残基がげっ歯類抗体の類似の部位に由来する残基により置換されているヒト抗体である。
【０１５２】
ヒト化抗体は抗原に対する高度な親和性および他の好都合な生物学的特性を温存していることが重要である。この目的を達成するためには、好ましい方法によれば、ヒト化抗体は親配列および種々の概念的なヒト化産物を、親およびヒト化配列の三次元モデルを用いながら分析する過程により作成する。三次元免疫グロブリンモデルは市販されており、当該分野でよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推定される三次元コンホーメーションを図示してディスプレイするコンピュータプログラムが使用できる。これらのディスプレイの精査により、候補免疫グロブリン配列の機能における特定の残基の推定される役割の分析、即ち、候補免疫グロブリンがその抗原に結合する能力に影響する残基の分析が可能となる。抗原結合に直接そして最も大きく影響するのはＣＤＲ残基であるが、このようにしてＦＲ残基をレシピエントから選択して組合せ、そして所望の抗体特性、例えば標的抗原への増大した親和性が最大限となるように、配列を移入する。
【０１５３】
ｍＡｂをヒト化する１つの方法は、１つの抗体の完全な可変ドメインを含む抗原結合部位が第２の抗体、好ましくはヒト抗体に由来する定常ドメインに融合しているキメラ抗体の製造に関する。このようなキメラ化の操作法を実施するための方法は例えばＥＰ−Ａ−０１２０６９４（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ），ＥＰ−Ａ−０１２５０２３（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．），ＥＰ−Ａ−０１７１４９６（Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．Ｃｏｒｐ．Ｊａｐａｎ），ＥＰ−Ａ−０１７３４９４（Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）およびＥＰ−Ａ−０１９４２７６（Ｃｅｌｌｔｅｃｈ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）に記載されている。
【０１５４】
本発明のヒト化抗体は非ヒト抗体から誘導されたＣＤＲでヒト抗体のＣＤＲの少なくとも部分を置き換えることができるいずれかの方法により作成してよい。Ｗｉｎｔｅｒは本発明のヒト化抗体を製造するために使用してよい方法を記載しており（英国特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ）、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５５】
一例として、本発明のヒト化抗体は以下の操作法：
（ａ）ＣＤＲおよび抗体結合特異性を温存するために必要とされる可変ドメインフレームワーク領域の最小限部分が非ヒト免疫グロブリンから誘導され、そして抗体鎖の残余部分はヒト免疫グロブリンから誘導されている抗体重鎖をコードするＤＮＡ配列でオペロンを含有する発現ベクターを従来の手法により構築すること；
（ｂ）ＣＤＲおよびドナーの抗体結合特異性を温存するために必要とされる可変ドメインフレームワーク領域の最小限部分が非ヒト免疫グロブリンから誘導され、そして抗体鎖の残余部分はヒト免疫グロブリンから誘導されている相補抗体軽鎖をコードするＤＮＡ配列でオペロンを含有する発現ベクターを従来の手法により構築すること；
（ｃ）従来の手法で宿主細胞内に発現ベクターをトランスフェクトすること；および、
（ｄ）従来の手法でトランスフェクトされた細胞を培養してヒト化抗体を製造すること、
により製造してよい。
【０１５６】
宿主細胞は、本発明の２ベクター、即ち第１のベクターは軽鎖誘導ポリペプチドをコードするオペロンを含有し、そして第２のベクターは重鎖誘導ポリペプチドをコードするオペロンを含有するもので同時トランスフェクトしてよい。２ベクターは異なる選択マーカーを含有するが、それ以外は、抗体重鎖および軽鎖コーディング配列を除き、好ましくは同一であることにより、可能な限り重鎖および軽鎖のポリペプチドの等しい発現を確保する。或いは、単一のベクターを使用し、そのベクターは軽鎖および重鎖のポリペプチドの両方をコードする配列を含むものとする。軽鎖および重鎖に関するコーディング配列はｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡまたは両方を含んでよい。
【０１５７】
本発明の壊変抗体を発現するために使用する宿主細胞は大腸菌のような細菌細胞または真核細胞のいずれであってもよい。特に、この目的のために十分解明された型の哺乳類細胞、例えばミエローマ細胞またはチャイニーズハムスター卵巣細胞を使用してよい。
【０１５８】
本発明のベクターを構築するための一般的方法、本発明の宿主細胞を作成するために必要なトランスフェクション方法、および、このような宿主細胞から本発明の抗体を製造するために必要な培養方法は全て従来技術である。同様に、製造後は、本発明のヒト化抗体を標準的な操作法に従って精製してよい。
【０１５９】
（ヒト抗体）
より好ましい実施形態においては、本発明はヒト抗体により結合ドメインが担持されている、即ち、抗体がヒト化抗体よりも高いレベルのヒトペプチド配列を有している抗体に関する。
【０１６０】
ヒトタンパク質に対して指向されているヒトｍＡｂ抗体はマウスの系ではなくヒト免疫系を担持するトランスジェニックマウスを用いて作成することができる。目的の抗原で免疫化されたこれらのトランスジェニックマウスの脾細胞を用いてヒトタンパク質由来のエピトープに対して特異的親和性を有するヒトｍＡｂを分泌するハイブリドーマを作成する（例えばＷｏｏｄ等の国際特許出願ＷＯ９１／００９０６、Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ等のＰＣＴ出願ＷＯ９１／１０７４１；Ｌｏｎｂｅｒｇ等の国際出願ＷＯ９２／０３９１８；Ｋａｙ等の国際出願９２／０３９１７；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．７：１３−２１；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９４  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：６８５１−６８５５；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３  Ｙｅａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７：３３−４０；Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９３ＰＮＡＳ９０：３７２０−３７２４；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２１：１３２３−１３２６参照）。このようなトランスジェニックマウスはＡｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，Ｃａｌｉｆ．およびＭｅｄａｒｅｘ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎａｎｄａｌｅ，ＮＪより入手可能である。キメラおよび生殖細胞系統の突然変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（ＩＨ）の遺伝子のホモ接合欠失は内因性抗体生産の完全な抑制をもたらすことが記載されている。ヒト生殖細胞系統の免疫グロブリン遺伝子アクロレインをそのような生殖細胞系突然変異マウスに移行させると、抗原攻撃によりヒト抗体の生産が起こる。例えばＪａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．７：３３（１９９３）；およびＤｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  ３５５：２５８（１９９２）を参照できる。ヒト抗体はまたファージディスプレイライブラリから誘導することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９２）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：３０９（１９９６））。
【０１６１】
ヒトモノクローナル抗体を製造するための適当な方法はさらにＷＯ０３／０１７９３５、ＷＯ０２／１００３４８、ＵＳ２００３０９１５６１およびＵＳ２００３１９４４０３に記載されている。
【０１６２】
（抗体の結合フラグメント）
本発明の１つの実施形態においては、抗体は抗体のフラグメント、好ましくは抗原結合フラグメントまたは可変領域である。本発明において有用な抗体フラグメントの例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメントである。抗体のパパイン消化により各々が単一の抗原結合部位を有するＦａｂフラグメントと称される２つの同一の抗原結合フラグメントおよび容易に結晶化するその能力のために「Ｆｃ」フラグメントと称されている残余が生じる。ペプシン処理では抗原に交差結合できる２つの抗原結合フラグメントを有するＦ（ａｂ’）２フラグメントおよび残余の他のフラグメント（ｐＦｃ’と称される）が生じる。別のフラグメントとしては抗体フラグメントから形成されるダイアボディー、線状抗体、１本鎖抗体分子および多重特異性抗体が包含される。
【０１６３】
抗体フラグメントＦａｂ、ＦｖおよびｓｃＦｖは抗体フラグメントが抗原結合部位を１つのみしか担持していない点において全抗体とは異なる。２結合部位を有する組換えフラグメントが数種の方法、例えばＦｖのＶＨのＣ末端（Ｃｕｍｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）またはｓｃＦｖのＶＬのＣ末端（Ｐａｃｋ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，１９９２）において導入されたシステイン残基の化学的交差結合によるか、または、Ｆａｂ’のヒンジシステイン残基を介して（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２）作成されている。
【０１６４】
好ましい抗体フラグメントはその抗原と選択的に結合することに関する抗体の能力の一部または本質的に全てを温存している。一部の好ましいフラグメントは以下に定義するとおりである。
（１）Ｆａｂは抗体分子の１価の抗原結合フラグメントを含有するフラグメントである。Ｆａｂフラグメントは酵素パパインで全抗体を消化してインタクトな軽鎖および１つの重鎖の部分を形成することにより作成できる。
（２）Ｆａｂ’は抗体分子のフラグメントであり、そして、全抗体をペプシンで処理し、その後還元してインタクトな軽鎖および一部の重鎖を形成することにより得ることができる。２つのＦａｂ’フラグメントが抗体分子当たりえられる。Ｆａｂ’フラグメントは抗体ヒンジ領域由来のシステイン１つ以上を含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端において数個の残基が吹かされることによりＦａｂフラグメントとは異なる。
（３）（Ｆａｂ’）２は酵素ペプシンにより全抗体を処理し、後に還元を行うことなく得られる抗体のフラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２はジスルフィド結合２つにより共に保持された２つのＦａｂ’フラグメントの２量体である。
（４）Ｆｖは完全な抗原認識結合部位を含有する最小の抗体フラグメントである。この領域は堅固で非共有結合の会合における１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインの２量体よりなる（ＶＨ−ＶＬ２量体）。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ２量体の表面上の抗原結合部位を決定するのはこの配置においてである。全体として６つのＣＤＲが抗体への抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的な僅か３つのＣＤＲを含むＦｖの半分）であっても、全結合部位よりも低親和性では有るが、抗原を認識して結合する能力を有する。
【０１６５】
本発明の１つの実施形態において、抗体は遺伝子的に融合された１本鎖分子としての適当なポリペプチドリンカーにより連結された軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含有する遺伝子工学による分子として定義される１本鎖抗体である。このような１本鎖抗体は「１本鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体フラグメントとも称する。一般的に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが抗原結合のための望ましい構造を形成できるようなＶＨおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを含む。
【０１６６】
本発明の抗体フラグメントは当業者の知るいずれかの適当な態様で製造してよい。幾つかの微生物発現系が既に活性抗体フラグメント製造用に開発されており、例えば大腸菌またはコウボのような種々の宿主におけるＦａｂの製造が記載されている。フラグメントはＦａｂ’として、またはＦｖ’として製造できるが、さらにＶＨおよびＶＬは可撓性ポリペプチドリンカーによりいずれかの順序で遺伝子的に連結できることも示されており、その組合せはｓｃＦｖとして知られている。
【０１６７】
（本発明において使用するための組成物）
医薬として使用するための組成物の好ましい実施形態においては、該組成物は活性成分のほかに、薬学的に受容可能なキャリアを含む。
【０１６８】
本明細書においては、組成物またはキャリアに関して使用する場合の「薬学的に受容可能な」という用語は、吐き気、眩暈、胃の不快感等の望ましくない生理学的作用をもたらすことなく物質をヒトまたは動物に投与することができることを示す。
【０１６９】
活性成分を自身に溶解または分散させて含有する組成物の製造は当該分野でよく知られている。このような組成物は液体の溶液または懸濁液、水性または非水性のいずれかにおいて滅菌注射液として製造される場合が多いが、使用前に液体中の溶液または懸濁液とするのに適する固体形態も製造できる。製剤は乳化することもできる。活性成分は製薬上許容され、そして活性成分と適合し、本明細書に記載した方法において使用するのに適する量のキャリアと混合することができる。適当なキャリアは例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびコレラの組合せである。さらにまた、所望により組成物は活性成分の有効性を増強する少量の副次的物質、例えば水和剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤等を含有することができる。
【０１７０】
本発明の組成物は成分の薬学的に受容可能な塩を含むことができる。薬学的に受容可能な塩は無機酸、例えば塩酸または燐酸、または有機酸、例えば酢酸、酒石酸、マンデル酸等と共に形成される酸付加塩（ポリペプチドの遊離のアミノ基で形成）を包含する。遊離のカルボキシル基で形成される塩もまた無機の塩基、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウムまたは水酸化鉄、および有機の塩基、例えばイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルチオ、エタノール、ヒスチジン、プロカイン等から誘導することができる。
【０１７１】
薬学的に受容可能なキャリアは当該分野でよく知られている。液体キャリアの例は活性成分および水のほかに物質を含有しないか、または、生理学的なｐＨのリン酸ナトリウムのような緩衝剤、生理食塩水または両方を含有する滅菌水溶液、例えばリン酸塩緩衝食塩水である。さらにまた、水性キャリアは１種より多い緩衝塩、ならびに塩化ナトリウムまたはカリウムのような塩類、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよび他の溶質も含有できる。液体組成物はまた水に加えて、および、水を除外して液相を含有できる。このような別の液相の例は、グリセリン、植物油、例えば綿実油、有機エステル、例えばオレイン酸エチルおよび水−油エマルジョンである。
【０１７２】
本発明のポリペプチドまたは抗体を含有する組成物は好ましくは総医薬組成物の重量当たりポリペプチドまたは抗体少なくとも０．１重量％の量を含有する。重量％は総組成物に対するポリペプチドまたは抗体の重量比である。即ち、例えば、０．１重量％は総組成物の１００ｇ当たりポリペプチドまたは抗体０．１ｇである。
【０１７３】
組成物はまたさらに抗生物質、例えばβラクタム、セファロスポリン、ペニシリン、アミノグリコシド、マクロリド抗生物質（エリスロマイシン、クラリスロマイシンまたはアジスロマイシン）およびフルオロキノロン抗生物質（シプロフロキサシン、レボフロキサシン、ガチフロキサシンまたはモキシフロキサシン）からなる群より選択される抗生物質を含む、および／または免疫刺激剤、例えばサイトカイン、インターフェロン、成長因子、例えばＧＣＳＦまたはＧＭ−ＣＳＦを含むキットインパートであってよい。キットインパートは同時、逐次または個別の投与のために使用してよい。
【０１７４】
本発明はさらに、本明細書に記載した方法を実施するために有用な医薬組成物に関する。即ち、本発明は薬学的に受容可能なキャリアおよび下記成分：
−  配列番号１〜３６の配列のいずれかを含むか、または、該配列のフラグメントまたは改変体を含む単離されたポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む単離されたポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を含む医薬組成物に関する。
【０１７５】
さらにまた、本発明は本明細書に記載した本発明の抗体および薬学的に受容可能なキャリアを含む医薬組成物に関する。
【０１７６】
（本発明のポリペプチド）
（本発明のフラグメント）
別の態様において、本発明は配列番号１〜５１のいずれかに示したポリペプチドのフラグメント、例えば配列番号１〜３６のいずれかのフラグメントまたは配列番号３７〜５１のいずれかのフラグメント、好ましくは抗原性フラグメントに関する。このようなフラグメントの長さはポリペプチドの２連続アミノ酸残基から完全長ポリペプチドマイナス１アミノ酸残基まで変動してよい。好ましくは、フラグメントは１００未満の連続アミノ酸残基、例えば７０〜５０未満連続アミノ酸、例えば４０未満の連続アミノ酸残基、例えば３０未満の連続アミノ酸、例えば２５未満の連続アミノ酸、例えば２０未満の連続アミノ酸の長さである。即ち、例えばフラグメントは２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０連続アミノ酸の長さであることができる。さらに好ましい実施形態においては、フラグメントは相当する完全長配列の６以上、例えば７以上、例えば８以上、例えば９以上、例えば１０以上の連続アミノ酸を含む。好ましい範囲は、５〜５０連続アミノ酸長、例えば５〜２５アミノ酸長、例えば５〜２０アミノ酸長のフラグメントを包含する。他の方法で表現すれば、フラグメントは完全長ポリペプチドと比較して１００％未満の長さであるアミノ酸配列の部分よりなる。好ましくは、フラグメントの長さは完全長ポリペプチドの長さの９９％未満、例えば７５％未満、例えば５０％未満、例えば２５％未満、例えば２０％未満、例えば１５％未満、例えば１０％未満である。さらに好ましい実施形態においては、フラグメントは完全長ポリペプチドと比較して１００％未満であるが１％より大きい長さ、例えば完全長ポリペプチドと比較して１００％未満であるが５％より大きい、例えば１００％未満であるが１０％より大きい、例えば１００％未満であるが２０％より大きい、例えば１００％未満であるが２５％より大きい、例えば１００％未満であるが５０％より大きい長さのアミノ酸配列の部分よりなる。
【０１７７】
好ましい特定のフラグメントは配列番号５２〜１１９からなる群より選択されるフラグメントの残基１つ以上、例えば配列番号５２〜１１９からなる群より選択されるフラグメントの２以上、例えば３以上、例えば４以上、例えば５以上、例えば６以上の連続残基を含むフラグメントを包含する。さらにより好ましい特定のフラグメントは配列番号５２〜１１９からなる群より選択される配列よりなる、または本質的になるフラグメントを包含する。
【０１７８】
他の好ましいフラグメントは参照により本明細書に組み込まれる２００３年１１月２１日出願のデンマーク優先権出願ＰＡ２００３０１７２６および２００３年１１月２５日出願の米国暫定出願６０／５２４，６１７のリスト１のフラグメントを包含する。
【０１７９】
好ましくは本発明のフラグメントはインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞または他の細胞において、そこで組換え発現されれば表面露出する。表面露出は例えばＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：３９７３−３９４６に記載の通り該フラグメントに特異的なモノクローナル抗体を用いて測定することができる。さらに好ましいものはインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に特異的に結合できる抗体を誘導することができるフラグメントである。これはＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：３９７３−３９４６に記載の通り、該フラグメントを用いてモノクローナル抗体を形成し、その後、インタクトな細胞への個々の抗体の結合を特性化することにより測定できる。
【０１８０】
本発明の配列番号１〜５１の完全長ポリペプチド並びにフラグメントは当該分野で知られた従来の手法により組換え生産することができる。適当な宿主細胞は哺乳類細部、例えばＣＨＯ、ＣＯＳまたはＨＥＫ２９３細胞であることができる。或いは、昆虫細胞、細菌細胞またはカビ細胞を使用できる。上記した細胞型におけるポリヌクレオチド配列の非相同発現およびその後の例えば精製後に除去してよいヒスチジンタグのようなタグ配列を用いたポリペプチド産物の精製のための方法は当該分野でよく知られている。或いは本発明のフラグメントは合成により製造することもできる。
【０１８１】
（本発明の改変体）
別の主要な態様において、本発明は、医薬として使用するための組成物中の配列番号１〜５１に記載のポリペプチドのいずれか、例えば配列番号１〜３６のいずれかまたは配列番号３７〜５１のいずれかの改変体、または、配列番号１〜５１に記載のポリペプチドのいずれかのフラグメントの改変体の使用に関する。
【０１８２】
本明細書において使用する場合は、「配列番号Ｘに少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチド」という表現は、「配列番号Ｘのポリペプチドおよびその改変体、ただしここで改変体は該配列に少なくとも９５％の配列同一性を有するもの」という表現と同じ対象を指向することを意図している。
【０１８３】
改変体は好ましくは所定のポリペプチドまたはフラグメントと少なくとも７５％の配列同一性、例えば少なくとも８０％の配列同一性、例えば少なくとも８５％の配列同一性、例えば少なくとも９０％の配列同一性、例えば少なくとも９１％の配列同一性、例えば少なくとも９２％の配列同一性、例えば少なくとも９３％の配列同一性、例えば少なくとも９４％の配列同一性、例えば少なくとも９５％の配列同一性、例えば少なくとも９６％の配列同一性、例えば少なくとも９７％の配列同一性、例えば少なくとも９８％の配列同一性、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する。配列同一性は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０においてアルゴリズムＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴまたはＦＡＳＴＡのいずれかにより、デフォルトギャップウエイトを用いて測定される。
【０１８４】
所定のポリペプチドまたはフラグメントの好ましい改変体は改変体と所定の比較対照ポリペプチドまたはフラグメントの間の全てのアミノ酸置換が保存的置換である改変体である。保存的アミノ酸置換とは、同様の側鎖を有する残基の互換性を指す。例えば、脂肪族の側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり；脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり；アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり；芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり；塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり；そしてイオウ含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好ましい連続アミノ酸置換のグループは、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリンおよびアスパラギン−グルタミンである。
【０１８５】
ポリペプチドまたはそのフラグメントの改変体はまたアミノ酸１つ以上が欠失または挿入されているポリペプチドまたはフラグメントの形態も包含する。好ましくは、５未満、例えば４未満、例えば３未満、例えば２未満、例えば僅か１つのアミノ酸が挿入または欠失している。ポリペプチドまたはそのフラグメントの「改変体」とは、さらに、アミノ酸配列の翻訳後修飾により修飾されたこれらのポリペプチドまたはフラグメントの形態も包含する。
【０１８６】
（本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクター）
別の態様において、本発明は配列番号１〜５１からなる群より選択される配列の抗原性フラグメントまたは改変体をコードする配列、例えば配列番号１〜３６からなる群より選択される配列の抗原性フラグメントまたは改変体をコードする配列、または、配列３７〜５１からなる群より選択される配列の抗原性フラグメントまたは改変体をコードする配列を含むポリヌクレオチド、好ましくは単離および／または組換えポリヌクレオチドに関する。
【０１８７】
さらにまた本発明は配列番号１〜５１からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列のいずれかのフラグメントまたは改変体を含むポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターに関する。好ましい発現ベクターはＤＮＡワクチン接種に適する。他の好ましい発現ベクターは、大腸菌やサルモネラの配列の発現を指示するプロモーターの制御下における本発明のポリヌクレチオドである。後者の発現ベクターは本明細書に記載する通り本発明の組換えウィルスまたは組換え細胞の製造において有用である。
【０１８８】
本発明のポリヌクレオチドおよび発現ベクターは当該分野でよく知られている標準的な組換えＤＮＡ手法により製造できる。
【０１８９】
（本発明の組換え細胞）
別の主要な態様において、本発明はポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトした組換え細胞に関し、ここで該ポリペプチドは配列番号１〜３６からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含む。好ましくは、該組換え細胞は大腸菌またはサルモネラ属細胞、より好ましくは弱毒化または毒性の減少した大腸菌またはサルモネラ属細胞である。
【０１９０】
別の態様において、本発明はポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた、組換えの弱毒化または毒性の減少した微生物細胞、好ましくは大腸菌またはサルモネラ属細胞に関し、ここで該ポリペプチドは配列番号３７〜５１からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含む。
【０１９１】
本明細書において使用する適当な細菌株はＭａｋｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｍｉｃｒｏｂ．Ｐａｔｈｏｇ．３１：１−８；Ｇｅｎｔｓｃｈｅｖ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２９１：５７７−５８２；Ｔｕｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６９：４９６９−４９７９；ＷＯ９９／４９０２６；およびＷＯ０３／０２２３０７およびその参考文献に記載されている。適当なサルモネラ菌株の例はＣｖＤ９０８−Ｔ７ｐｏｌ（Ｓａｎｔｉａｇｏ−Ｍａｃｈｕｃａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｐｌａｓｍｉｄ  ４７：１０８−１１９）、ＡＴＣＣ３９１８３、ＡＴＣＣ５３６４７およびＡＴＣＣ５３６４８である。適当な大腸菌株はＹＴ１０６およびＥ１３９２／７５−２Ａである。
【０１９２】
（本発明の方法および使用）
上記定義した組成物および他の産物はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染および／またはそのような感染から生じた疾患を治療または予防するために、それを要する動物または人間において使用できる。好ましくは動物はニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、ウシまたはブタである。好ましいヒト集団は危険集団、例えば４歳以下の小児集団、先進国民集団、または、開発途上国への無免疫または半免疫の旅行者集団である。
【０１９３】
本発明における治療および防止は、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに対抗するための全ての型の施療的治療および防止的治療および他の治療を包含し、例えばワクチン接種、予防、免疫活性化、受動免疫化、抗体投与、治療処置、緩解のための治療が挙げられる。特に、本発明の抗体を使用した受動免疫が免疫無防備状態の個体のための適当な治療である。
【０１９４】
即ち、別の態様において、本発明は下記物質：
−  配列番号１〜５１の配列のいずれか、例えば配列番号１〜３６の配列のいずれかまたは配列番号３７〜５１のいずれかを含むか；または、該配列のいずれかのフラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、または、
−  該ポリペプチドに特異的に結合し得る抗体、
のいずれか１つを投与することにより、該動物または人間におけるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染を治療または予防する工程を含む、動物または人間におけるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染の治療または予防のための方法に関する。
【０１９５】
好ましくは、該投与は非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経口または鼻腔内で行う。
【０１９６】
好ましくは、該医薬は非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経口または鼻腔内投与に適している医薬である。
【０１９７】
別の態様において、本発明は下記物質：
−  配列番号１〜５１からなる群より選択される配列、例えば配列番号１〜３６のいずれかまたは配列番号３７〜５１のいずれかを含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を投与する工程を含むＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染に対抗する動物または人間の免疫化のための方法に関する。
【０１９８】
好ましくは該投与は非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経口または鼻腔内で行う。
【０１９９】
別の態様において本発明は動物または人間におけるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染の治療または予防のための医薬の製造のための本明細書に記載した本発明の抗体の使用に関する。即ち、本発明はまた本明細書に記載した本発明の抗体を投与することによりＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染を治療または予防する工程を含むＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染の治療または予防のための方法に関する。好ましくは該投与は非経口、静脈内、筋肉内、皮下、経口または鼻腔内で行う。
【０２００】
（本発明の診断方法）
細胞において、表面露出であること、および、比較的高コピー数で存在することの組合せはまた、本発明で同定された５１ポリペプチドをＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの検出のために極めて適するものとしており、これにより高い感度でこの微生物を検出することができる。
【０２０１】
従って、別の主要な態様において、本発明はサンプル中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはその部分を検出するための方法であって、下記工程：
ａ．配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドに特異的に結合し得るインジケーター部分に該サンプルを接触させること、および、
ｂ．インジケーター部分がシグナルを発生したかどうかを測定することにより、該サンプルがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはその部分を含有するかどうかを検出すること、
を含む上記方法に関する。
【０２０２】
好ましくは、該インジケーター部分はインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合、好ましくは特異的に結合し得る。
【０２０３】
別の態様において、本発明はサンプル中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉを検出するための方法であって、下記工程：
ａ．配列番号３７〜５１からなる群より選択されるポリペプチドに特異的に結合し得るインジケーター部分に該サンプルを接触させること、ここでインジケーター部分はさらにインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に特異的に結合し得るものであること、および、
ｂ．インジケーター部分がシグナルを発生したかどうかを測定することにより、該サンプルがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはその部分を含有するかどうかを検出すること、
を含む上記方法に関する。
【０２０４】
上記した診断方法の好ましい実施形態においては、接触工程と測定工程との間に洗浄工程を実施することにより検出の特異性を向上させる。
【０２０５】
サンプルは例えば糞便、尿、組織、組織抽出液、液体サンプルまたは体液サンプル、例えば血液、血漿または血清であることができる。サンプルの別の例は食品サンプル、例えば畜肉サンプルである。
【０２０６】
上記した方法は個体におけるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染またはカンピロバクター症の診断に使用できる。上記方法の好ましい実施形態においては、該インジケーター部分はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜を通過しない。該インジケーター部分の好ましい型は抗体、例えば本明細書に記載した本発明の抗体よりなる。
【０２０７】
当業者の知る通り、サンプル中において、自身の量がリガンドの量に関連する結合反応産物、本発明においてはＣ．ｊｅｊｕｎｉまたはその部分を形成するためにインジケーター部分を使用できるような多くのよく知られた臨床診断化学操作法が存在する。即ち、例示される試験方法を本明細書に記載したが、本発明はそれらに限定されない。
【０２０８】
本発明はまた生物学的サンプル中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの存在、および、好ましくは量も試験するための好ましくはキット形態の診断系に関する。診断用キットの製造方法は例えば米国特許５，４７０，９５８およびその参考文献に記載されている。
【０２０９】
診断系には、少なくとも１回の診断を実施するために十分な量において、本発明のインジケーター部分を好ましくは別にパッケージされた試薬として、そしてより好ましくはさらに取扱説明書を包含する。パッケージされたとは固定された限界内に本発明のインジケーター部分を保持することができる固体マトリックスまたは物質、例えばガラス、プラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロピレンまたはポリカーボネート）、紙、ホイル等の使用を指す。即ち、例えば、パッケージは意図された標識されたインジケーター部分の長生物のミリグラム量を含有するために使用されるガラスバイアルであることができ、或いはそれは意図されるインジケーター部分のマイクログラム量を作用可能に固定化、即ちリガンドに結合できるように連結させてあるマイクロプレートのウェルであることができる。
【０２１０】
「取扱説明書」とは、典型的には試薬の濃度または少なくとも１つの試験方法のパラメーター、例えば混合すべき試薬およびサンプルの相対的な量、試薬／サンプル混合物の保守期間、温度、緩衝液の条件等を説明した有形の表記物を包含する。
【０２１１】
大部分の実施形態において、本発明の診断方法および系は、予め選択されたリガンド（即ち配列番号１〜５１の配列のいずれかおよび／またはそのフラグメントを含むポリペプチド）と複合体化されたインジケーター部分を含有する結合反応複合体の形成をシグナリングすることができる標識または指示手段をインジケーター部分の一部として包含する。このような標識はそれら自体臨床診断化学においてよく知られている。
【０２１２】
標識手段は抗体または抗原にそれらを変性させること無く化学的に結合して有用な免疫蛍光トレーサーである蛍光色素（染料）を形成する蛍光標識剤であることができる。適当な蛍光標識剤は蛍光色素、例えばフルオレセインイソシアネート（ＦＩＣ）、フルオレセインイソチオシアネーオト（ＦＩＴＣ）、５−ジメチルアミン−１−ナフタレンスルホニルクオリド（ＤＡＮＳＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、リッサミン、ローダミン８２００スルホニルクロリド（ＲＢ２００ＳＣ）である。適当な蛍光物質の他の例はウンビリフェロン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリスリン等を包含する。免疫蛍光分析の手法の説明は、ＤｅＬｕｃａ，”Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ”，  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ａｓ  ａ  Ｔｏｏｌ，  Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｌｔｄ．，ｐｐ．１８９−２３１（１９８２）に記載されている。
【０２１３】
放射性元素もまた標識剤として有用である。例示される放射標識剤はガンマ線発光をもたらす放射性元素である。自体がガンマ線を発射する元素、例えば、１２４Ｉ、１２５Ｉ、１２８Ｉ、１３２Ｉおよび５１Ｃｒはガンマ線発射性放射性元素標識群の１クラスを示す。特に好ましいものは１２５Ｉである。有用な標識手段の別の群は自体が陽電子を発射する１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎのような元素、またはベータエミッター、例えば３Ｈの１１１インジウムである。他の適当な放射性物質は１３１Ｉおよび３５Ｓを包含する。
【０２１４】
抗体を使用する検出は、他の実施形態においては、抗体を別の検出可能な物質、例えば酵素、補欠分子族、ルミネセント物質またはバイオルミネセント物質にカップリングすることにより促進される。適当な酵素の例はセイヨウワサビペルオキシダーゼ、アルカルホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼまたはアセチルコリンエステラーゼを包含し；適当な補欠分子族複合体の例はストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを包含し；ルミネセント物質の例はルミノールを包含し；バイオルミネセント物質の例はルシフェラーゼ、ルシフェリンおよびエクオリンを包含する。
【０２１５】
好ましい実施形態においては、指示群は酵素、例えばセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）またはグルコースオキシダーゼである。第１の指示群がＨＲＰまたはグルコースオキシダーゼのような酵素である場合は、インジケーター部分／リガンド複合体（免疫反応体）が形成されたという事実を可視化するために別の試薬が必要になる。ＨＲＰのためのこのような別の試薬は過酸化水素およびジアミノベンジジンのような酸化染料前駆体を包含する。グルコースオキシダーゼのために有用である別の試薬は２，２’−アミノ−ジ−（３−エチル−ベンズチアゾリン−Ｇ−スルホン酸）である。
【０２１６】
標識を連結すること、即ち抗体のようなポリペプチドを標識することは当該分野でよく知られている。例えば培地中の成分として提供された放射性同位体含有アミノ酸の代謝的取り込みによりタンパク質を標識することができる。例えばＧａｌｆｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，７３：３−４６（１９８１）を参照できる。活性化された官能基を介したタンパク質のコンジュゲート形成またはカップリングの手法が特に適用される。例えばＡｕｒａｍｅａｓ，  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃａｎｄ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，Ｖｏｌ．８  Ｓｕｐｐｌ．７：７−２３（１９７８），Ｒｏｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｂｉｏｔｅｃｈ．３：８８９−８９４および米国特許４，４９３，７９５を参照できる。
【０２１７】
上記インジケーター部分を使用した種々の診断試験をＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに関してサンプルを試験するために設定できる。例示される試験はＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ（ｅｄｓ．），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８８に記載されいている。このような試験の代表例は向流免疫電気泳動（ＣＩＥＰ）、ラジオイムノアッセイ、ラジオ免疫沈降法、酵素連結免疫吸着試験（ＥＬＩＳＡ），ドットブロット試験、阻害または競合試験、およびサンドイッチ試験、免疫スティック（ディップスティック）試験、同時イムノアッセイ、免疫クロマトグラフィー試験、免疫濾過試験、ラテックスビーズ凝集試験、免疫蛍光試験、バイオセンサー試験および低光検出試験を包含する（さらに米国特許４，３７６，１１０および４，４８５，５３０参照）。
【０２１８】
１つの実施形態においては、本発明の診断用キットは液体サンプル中の予備選択されたリガンドの量を検出するための「ＥＬＩＳＡ」フォーマットにおいて使用できる。「ＥＬＩＳＡ」とは固相に結合した抗体または抗原および酵素−抗原または酵素−抗体コンジュゲートを使用することによりサンプル中に存在する抗原を検出して定量する酵素連結免疫吸着試験を指し、そして、本発明の方法に容易に適用される。即ち、一部の実施形態においては、本発明のインジケーター部分を固体マトリックスに固定することにより対照となる診断系におけるパッケージを含む固体支持体を形成することができる。試薬は典型的には水性媒体からの吸着により固体マトリックスに固定するが、抗体のようなポリペプチドに適用される当該分野でよく知られた他の様式の固定化も使用できる。有用な固体マトリックスも当該分野でよく知られている。このような物質は水不溶性であり、そしてＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｆｉｎｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  （Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）から商標ＳＥＰＨＡＤＥＸの下に入手可能な交差結合デキストラン；アガロース；Ｎｏｒｔｈ  Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＩＩのＡｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓより入手可能な直径約１ミクロン〜約５ミリメートルのポリスチレンビーズのビーズ；ポリ塩化ビニル、ポリスチレン、交差結合ポリアクリルアミド、ニトロセルロース系またはナイロン系の織物、例えばシート材、ストリップ材またはパドル材；またはポリスチレンまたはポリ塩化ビニルのような材料で作成された試験管、プレートまたはマイクロプレートのウェルを包含する。
【０２１９】
別の診断方法はリガンドに交差結合することにより複数のリガンドおよびポリペプチドの凝集物を形成し、沈殿性の凝集体を生じさせるために、本発明の１つの実施形態の抗体組成物の多価性を利用してよい。この実施形態は免疫沈降のよく知られた方法に匹敵するものである。この実施形態は、本発明の抗体を含む組成物にサンプルを添加混合して結合条件下に結合混合物を形成する工程、その後、形成した結合複合体を単離するための分離工程を含む。典型的には、単離は混合物から凝集物を除去するための遠心分離または濾過により達成される。結合複合体の存在は検出されるべき予備選択されたリガンドの存在を示す。
【０２２０】
（本発明のポリペプチドの結合相手およびインヒビター）
本発明が関連する５１ポリペプチドの表在化はそれらをインヒビターのような結合相手のための標的として高度に適するものとする。病原性微生物の表在ポリペプチドは宿主生物と相互作用する場合が多い。即ち、表在ポリペプチドの結合相手のいずれかの型は宿主−病原体の相互作用を妨害する場合がある。即ち結合相手は微生物の病原性（毒力）を拮抗する場合が多い。結合相手はまたそれが結合するポリペプチドのインヒビターでもあってよい。
【０２２１】
即ち、別の主要な態様において、本発明は配列番号１〜５１に示す表在ポリペプチドの結合相手の同定のための方法に関する。このような方法は生化学的または細胞系であってよい。
【０２２２】
（生化学的方法）
主要な態様において、本発明は配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントの結合相手を同定するための方法であって、下記工程：
ａ．配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントを提供すること、
ｂ．該ポリペプチドまたはフラグメントを推定結合相手に接触させること、および、
ｃ．該推定結合相手が該ポリペプチドまたはフラグメントに結合し得るかどうか測定すること、
を含む上記方法に関する。
【０２２３】
好ましい実施形態においては、該推定結合相手は宿主誘導分子である。
【０２２４】
方法の別の好ましい実施形態においては、ポリペプチドまたはそのフラグメントは固体支持体、例えばカラムまたはマイクロプレートの上に固定化されて提供され、そして、接触工程の後、推定結合相手が固体支持体に結合しているかどうかを測定する。ポリペプチドまたはそのフラグメントの固定化は、固体支持体への直接の結合を介して、または、例えば特異的抗体を用いた間接的な結合を介しターゲティング部分のであってよい。好ましい実施形態においては、洗浄工程を接触工程と測定工程の間に実施することにより検出の特異性を向上させる。別の好ましい実施形態においては推定結合相手は検出可能な標識と複合体化させる。推定相手は接触が起こる前に標識してよい。或いは、標識は接触工程後に行ってもよい。さらにまた、方法の一部の実施形態においては、固定化はポリペプチドまたはそのフラグメントが結合相手に結合した後に実施してよい。好ましい実施形態においては、方法は複数の推定結合相手に対して方法を反復するスクリーニング方法である。結合を測定する適当な方法は当該分野でよく知られており、その数種は本明細書において言及している。
【０２２５】
別の態様において、配列番号１〜５１の群から選択されるポリペプチド、例えば配列番号１〜３６のいずれか、または、配列番号３７〜５１のいずれかの宿主誘導結合相手は以下の通り、即ち、精製された宿主膜を電気泳動により分離し、メンブレン上にブロットし、目的のポリペプチドまたはそのフラグメントと共にインキュベートすることにより同定してよい。次に目的のポリペプチドまたはそのフラグメントに特異的な抗体を用いて結合を検出できる。ポリペプチドまたはそのフラグメントが結合している宿主結合相手はその後ブロットから溶出させ、そして後の質量スペクトルによる分析により、または、当該分野で知られている別の手法により、同定することができる。
【０２２６】
病原性生物の表在ポリペプチドの結合相手が宿主誘導分子である場合、表在ポリペプチドと宿主との間の相互作用が細菌の毒力のために重要となる場合がある。即ち表在ポリペプチドと宿主誘導結合相手の相互作用を部外する化合物はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ感染の防止または治療に適している。従って、本発明の別の方法は、下記工程：
ａ．配列番号１〜５１のポリペプチドのいずれか、例えば配列番号１〜３６のいずれか、または、配列番号３７〜５１のいずれか、またはそのフラグメントを提供すること、
ｂ．該ポリペプチドの宿主誘導結合相手を提供すること（上記の通り、またはいずれかの他の方法で同定）、
ｃ．該相互作用の推定インヒビターの非存在下で該宿主誘導結合相手に該ポリペプチドを接触させること、
ｄ．該推定インヒビターの存在下で該宿主誘導結合相手に該ポリペプチドを接触させること、
および、
ｅ．工程ｄで得られた該宿主誘導結合相手への該ポリペプチドの結合の強度が工程ｃで得られたものと比較して低減されているかどうか測定すること、
を含む配列番号１〜５１の表在Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉポリペプチドのいずれか、例えば配列番号１〜３６のいずれか、または、配列番号３７〜５１のいずれかの宿主誘導結合相手との相互作用のインヒビターを同定する方法に関する。
【０２２７】
一部の実施形態においては、工程ｃおよびｄは２つの異なるサンプルコンパートメントにおいて実施してよい。別の実施形態においては、工程ｄは工程ｃの混合物に推定インヒビターを添加することにより実施してよい。好ましい実施形態においては、方法は複数の推定インヒビターに対して反復する。
【０２２８】
特に有利なものは表在ポリペプチドの活性を阻害する結合相手である。このような活性は酵素活性、輸送活性またはいずれかの型の他の生化学的または細胞的な活性、好ましくは酵素活性である。
【０２２９】
好ましい宿主誘導結合相手は宿主のポリペプチドおよび宿主の脂質である。結合は例えばＳｚｙｍａｎｓｋｉ  ａｎｄ  Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ（１９９６）  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６４：３４６７−３４７４に記載の通り測定してよい。
【０２３０】
上記した生化学的方法の好ましい実施形態においては、結合相手と表在ポリペプチドまたはそのフラグメントの間の結合は５×１０−６Ｍ未満、例えば１０−６Ｍ未満、例えば５×１０−７Ｍ未満、例えば１０−７Ｍ未満、例えば５×１０−８Ｍ未満、例えば１０−８Ｍ未満、例えば５×１０−９Ｍ未満、例えば１０−９Ｍ未満、例えば５×１０−１０Ｍ未満、例えば１０−１０Ｍ未満、例えば５×１０−１１Ｍ未満、例えば１０−１１Ｍ未満、例えば５×１０−１２Ｍ未満、例えば１０−１２Ｍ未満、の解離定数、即ちＫｄを有する。解離定数は例えば表面プラズモン共鳴分析により測定できる。
【０２３１】
（細胞系の方法）
表在ポリペプチドのレベルを、それに対する構造遺伝子の欠失または破壊によるか、または、遺伝子発現をダウンレギュレート（後述参照）することにより低減することは、細菌細胞に影響する。細胞は細胞毒性化合物に対してより感受性となる場合がある。特に表在ポリペプチドの場合、そのレベルの低下は、細胞に化合物が進入することを防止する際の細胞の外部の部分、例えば外膜または細胞壁の機能に影響する。即ち、表在ポリペプチドのレベルの低下は種々の化合物に対して細胞をより「透過性」とすることができる。
【０２３２】
即ち、本発明の態様はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに対する抗細菌活性を有する化合物を同定するための方法であって、下記工程：
ａ．配列番号１〜３６のポリペプチドのいずれかの低減されたレベルを有する感作された細胞を提供すること、および、
ｂ．推定抗細菌化合物に対する該細胞の感受性を、例えば増殖アッセイにより測定すること、
を含む上記方法に関する。
【０２３３】
好ましくは、方法は推定抗細菌化合物複数に対して操作法を反復するスクリーニング方法である。好ましい推定抗細菌化合物は、野生型Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜を通過しないものである。
【０２３４】
さらにまた、本発明はＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに対する抗細菌活性を有する化合物を同定するための方法であって、下記工程：
ａ．配列番号３７〜５１のポリペプチドのいずれかの低減されたレベルを有する感作された細胞を提供すること、および、
ｂ．推定抗細菌化合物に対する該細胞の感受性を例えば増殖アッセイにより測定すること、ここで推定抗細菌化合物は野生型のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜を通過することができないものであること、
を含む上記方法に関する。
【０２３５】
好ましくは、方法は推定抗細菌化合物複数に対して操作法を反復するスクリーニング方法である。
【０２３６】
この施策の背後にある論理的根拠は表在ポリペプチドのレベルがより低値である細胞は細胞毒性化合物に対して上昇した感受性を示すことになり、これにより試験に野生型細胞を使用する場合に見逃してしまう低力価を有する抗細菌化合物の同定を可能にするという点である。この方法により同定された化合物は力価を向上させるために修飾を要する場合が多い。これは化学的修飾により行える。
【０２３７】
表在ポリペプチドの活性の阻害は、細菌の生活能力（即ち生存、生育および／または増殖）に影響する場合がある。特に好都合なものはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの生活能力にとって必須である表在ポリペプチドの阻害である。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ遺伝子の必須性は例えばＷＯ０２／０７７１８３に記載されている通り調べてよい。必須の表在ポリペプチドのインヒビターは細菌の生活能力に影響することが可能となるために必ずしも菌体内に進入する必要はない。即ち、抗微生物剤として有効であるためには、細胞内の標的のインヒビターに対するよりも、必須表在標的ポリペプチドのインヒビターの構造に対しては、要求される条件が一般的に少ない。
【０２３８】
従って本発明は、配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドのインヒビターを同定するための方法であって、下記工程：
ａ．配列番号１〜３６からなる群より選択されるポリペプチドのレベルの異なる二つの細胞を提供すること、
ｂ．該細胞の推定インヒビターに対する感受性を例えば増殖アッセイにより測定すること、および、
ｃ．該二つの細胞が該推定インヒビターの存在により異なって影響されるかどうか測定すること、
を含む上記方法に関する。
【０２３９】
好ましくは推定インヒビターの複数に対して方法を反復する。好ましいインヒビターはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの外膜を通過しない。
【０２４０】
さらにまた本発明は配列番号３７〜５１のポリペプチドからなる群より選択されるポリペプチドのインヒビターを同定するための方法であって、下記工程：
ａ．配列番号３７〜５１びポリペプチドのいずれかレベルの異なる二つの細胞を提供すること、
ｂ．該細胞の推定インヒビターに対する感受性を、例えば増殖アッセイにより測定すること、ここで推定インヒビターはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜を通過することができないものであること、および、
ｃ．該二つの細胞が該推定インヒビターの存在により異なって影響されるかどうか測定すること、
を含む上記方法に関する。
【０２４１】
好ましくは推定インヒビターの複数に対して方法を反復する。
【０２４２】
この施策の背後にある論理的根拠は必須ポリペプチドのレベルがより低値である細胞はより高いレベルの細胞の生活の力よりもポリペプチドのインヒビターにより高度に影響されるという点である。２つの細胞が異なって影響されれば、これは、インヒビターが標的に対して、または少なくとも同じ生化学的経路において、作用することを示している。
【０２４３】
方法の一部の実施形態においては、目的のポリペプチドの異なる活性を有する２つの細胞は野性型細胞（または目的の遺伝子の野生型活性を有する他の細胞）および目的のポリペプチドの低減された活性を有する感作された細胞である。一部の実施形態においては、感作された細胞における異なる、または低減されたレベルは目的の遺伝子の異なる、または低減された発現レベルであることができる（異なる、または低減されたコピー数のポリペプチドを与える）。このことは、調節プロモーターの制御下に遺伝子を置くか、または、必須ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの翻訳を阻害するアンチセンスＲＮＡの調節可能な発現により、達成することができる。他の実施形態においては、異なる、または低減された活性は例えば温度感受性突然変異のような突然変異による、目的のポリペプチドの異なる、または低減された活性であることができる。
【０２４４】
感作された細胞を作成し、そしてそれをインヒビターのスクリーニングに使用する適当な方法はＷＯ０２／０７７１８３に記載されている。感作された細胞は、インデューサーまたはリプレッサーのある濃度の存在下、または、細菌の生活能力のために必要なあるレベルのその機能の有無が生活能力のための速度決定工程となる遺伝子産物を細菌の生活能力のために必要なレベルで与える条件において、コンディショナル発現のＣ．ｊｅｊｕｎｉ突然変異菌株を生育させることにより得てよい。Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉのための調節可能なプロモーターは例えばＫｅｌａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｆｏｏｄ  Ｐｒｏｔ  ６６：１１９０−１１９７およびＤｅｄｉｅｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）  Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６８：４２０９−４２１５に記載されている。標的遺伝子の致死量未満の発現は、阻害が少なくとも約１０％、例えば少なくとも約２５％、例えば少なくとも約５０％、例えば少なくとも約７５％、例えば少なくとも約９０％、例えば少なくとも約９５％であってよい。
【０２４５】
本発明の細胞系試験の別の実施形態においては、感作された細胞は、ポリペプチドにおける温度感受性突然変異のような突然変異を用いて細菌の生活能力のために必要なポリペプチドのレベル活性の低減により得られる。許容温度および制限温度の間の中間的温度でこのような細胞を成育させることにより遺伝子産物の活性が低下した細胞が生成される。上記した方法は細菌の生活能力に必要な遺伝子産物の活性またはレベルを低減するが、これを消失させないいずれかの突然変異により実施してよい。この施策はまたコンディショナル発現の方法と組み合わせてもよい。この組合せの施策においては、目的の遺伝子内に温度感受性の突然変異を有し、やはりコンディショナル発現される細胞を作成する。
【０２４６】
必須ポリペプチドのインヒビターについてスクリーニングする場合は、生育阻害は対数増殖期のサンプル中の未接種の生育培地と相対比較した場合の培養物の工学密度により測定された生育の量を対照サンプルの値と直接比較することにより測定できる。細胞の増殖を試験するための代替法は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）レポーターコンストラクト発光の測定、種々の酵素活性試験、および当該分野でよく知られている他の方法を包含する。生活能力を測定するために使用する他のパラメーターは例えばコロニー形成単位を包含する。上記した方法は固相、液相、前記２培地の組合せ、またはインビボで実施してよい。複数の化合物を寒天プレートに写し、そして自動化および半自動化の装置を用いて同時に試験してもよい。
【０２４７】
本発明の細胞系の試験は、目的の標的分子に対して低い、または中等度の力価を示す化合物は、非感作細胞よりも感作細胞に対してその化合物が実質的により強力に作用するため、その検出が可能となる。作用は被験化合物が、非感作細胞と比較して感作細胞で試験した場合に、２〜数倍強力、例えば少なくとも１０倍強力、例えば少なくとも２０倍強力、例えば少なくとも５０倍強力、例えば少なくとも１００倍強力、例えば少なくとも１０００倍強力、さらには１０００倍を超えて強力となるようなものであってよい。
【０２４８】
表在ポリペプチドを過剰発現する変異体のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ菌株もまたポリペプチドを阻害する化合物を同定するために使用できる。化合物が細胞毒性である場合は、標的ポリペプチドの過剰発現は細胞をより耐性とする。即ち、本発明はまた配列番号１〜５１の表在Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉポリペプチドのいずれか、例えば配列番号１〜３６のいずれか、または配列番号３７〜５１のいずれかのインヒビターを同定するための方法に関し、方法は下記工程：
ａ．列番号１〜５１の表在Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉポリペプチドのいずれか、例えば配列番号１〜３６のいずれか、または配列番号３７〜５１のいずれかの活性において異なる二つの細胞を提供すること、ここで一方の細胞は実質的に該ポリペプチドの野生型のコピー数を含有し、そして他方の細胞は該ポリペプチドの野生型コピー数より高値を含有すること、
ｂ．該細胞の推定インヒビターに対する感受性を例えば増殖アッセイにより測定すること、および、
ｃ．該二つの細胞が該推定インヒビターの存在により異なって影響されるかどうか測定すること、
を含む。
【０２４９】
過剰発現は、強力なプロモーターを使用するか、または表在ポリペプチドに関する構造遺伝子の複数のコピーを導入することにより達成してよい。強力なＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉプロモーターはＷｏｓｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８０：５９４−５９９に記載されている。インヒビターの細胞標的ではないポリペプチドの過剰発現もまたインヒビターに対して細胞を耐性とすることができるため、推定インヒビターによる目的標的ポリペプチドの阻害は他の手段、例えば生化学的試験により確認しなければならない。
【０２５０】
表在ポリペプチドの生化学的または他の細胞活性のインヒビターに加えて、上記した細胞系の方法は例えば遺伝子調節を妨害することにより標的の発現レベル、即ちコピー数を低減する化合物を同定するために使用できる。
【０２５１】
結合相手またはインヒビターを同定するための細胞形または生化学的な方法のいずれかの好ましい実施形態においては、方法は複数の候補化合物に対して反復される。
【０２５２】
別の態様において、本発明は本明細書に記載した細胞系の方法において使用される変異体のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ菌株、例えば非相同調節プロモーターの制御下に表在ポリペプチドをコードする遺伝子が置かれた菌株、表在ポリペプチドの温度感受性対立遺伝子を担持した菌株、および、表在ポリペプチドを過剰発現する菌株に関する。
【０２５３】
表在ポリペプチド、例えば配列番号１〜３６のポリペプチドのいずれかをターゲティングすることにより細菌の生育を妨害する他の方法は、特定のアンチセンス、例えばアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを使用する、そして、必須表在ポリペプチドをコードするｍＲＮＡに特異的なリボザイム分子を使用する遺伝子発現の抑制を包含する。
【実施例】
【０２５４】
（方法）
プロジェクトの実験工程は以下の通りである。低ｐＨ溶出により表面タンパク質を単離する。２Ｄゲルおよび質量スペクトルにより分析する。大腸菌発現ベクターにクローニングする。組換えタンパク質を作成し、マウスを免疫化し、免疫化されたマウスをＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉで攻撃し、疾患および腸のコロニー形成に対抗した保護を観察する。大腸菌およびサルモネラの表面局在化も評価する（陽性であれば、弱毒化ベクター株使用の可能性）。
【０２５５】
（細菌培養）
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ（Ｃ．ｊ．）菌株ＭＬ５３（血清型０：１９）、ヒト糞便臨床単離株はＫａｒｅｎ  Ｋｒｏｇｆｅｌｄ（ＳＳＩ）より寄贈された。血液寒天プレート上で通常通り３７℃１０％ＣＯ２５％Ｏ２雰囲気下にて生育させた。
【０２５６】
（表面タンパク質抽出）
細菌を血液寒天プレート上に一夜生育させ、５０ｍＭＴｒｉｓｐＨ７．８中に採取し、６０００ｇで５分間遠心分離することによりペレット化した。ペレットを０．２ＭグリシンｐＨ２．２中に際懸濁し、細菌懸濁液を室温で１０分間穏やかに混合した。細菌を５分間６０００ｇで遠心分離することにより再度ペレット化し、表面タンパク質を含有する上澄みを採取し、ＮａＯＨで中和し、−８０℃で凍結した。サンプルはＡｍｅｒｓｈａｍ  ＨｉＴｒａｐ脱塩カラムで脱塩した後に２Ｄゲル電気泳動に付した。
【０２５７】
（２Ｄゲル電気泳動）
二次元ゲル電気泳動はＥｔｔａｎ  Ｄａｌｔ  ２システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）またはＮｏｖｅｘ  ＮｕＰａｇｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）のいずれかにおいてゲル系と共に提供された取扱説明書に従って実施した。
【０２５８】
慨すれば、第１の次元の泳動は７ｃｍまたは２４ｃｍのプレキャストＩＰＧストリップ（ｐＨ範囲３〜１０または６〜１１）において、Ｅｔｔａｎ  ＩＰＧｐｈｏｒ等電点電気泳動システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いながら製造元の指示書に従って実施した。等電点電気泳動は以下の条件、即ち７ｃｍｐＨ３〜１０ストリップ：８０００Ｖｈ、７ｃｍｐＨ６〜１１ストリップ：１６０００Ｖｈ、２４ｃｍｐＨ３〜１０ストリップ：５２０００Ｖｈにおいて実施した。第２の次元はプレキャスト１２．５％ゲル（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いながら、１５分間ゲル当たり５Ｗ、次に４〜６時間合計１７０Ｗで２４ｃｍストリップについて実施した。７ｃｍストリップは４０分間２００ボルトでプレキャスト４〜１２％ゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いながらＮｏｖｅｘ  ＮｕＰａｇｅシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上を泳動させた。Ｍｏｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １（１１），  １３５９−１３６３に元法が記載された変法に従ってゲルを銀染色し、ＡｍｅｒｓｈａｍのＥｔｔａｎ  Ｓｐｏｔ  Ｐｉｃｋｅｒを用いながら製造元の指示書に従って質量スペクトル分析用のスポットを切り出した。
【０２５９】
（質量スペクトル）
特異的タンパク質のスポットを切り出し、Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水中に入れた。これらのゲルプラグを５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３／５０％エタノールで洗浄し、９６％エタノール中でインキュベートすることにより脱水した。還元およびアルキル化は還元溶液（１０ｍＭ  ＤＴＴ、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）中で５６℃においてインキュベートし、その後暗所アルキル化溶液（５５ｍＭヨードアセトアミド、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３）中の室温インキュベーションにより実施した。次に２サイクルの洗浄および脱水を実施した後に５μＬのトリプシン溶液（１２．５ｎｇ／μＬ  Ｐｒｏｍｅｇａトリプシン、５０ｍＭ  ＮＨ４ＨＣＯ３、１０％アセトニトリル中）を添加した。次にさらに重炭酸ナトリウム溶液を添加し、消化物を３７℃で一夜インキュベートした。トリフルオロ酢酸を添加して一夜消化した後に振とうインキュベートした。
【０２６０】
抽出物の一部をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチド質量フィンガープリント分析（Ｒｅｆｌｅｘ  ＩＶ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において使用し、ピークリストを特定のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉデータベースに対するデータベース検索において使用した。Ｍａｓｃｏｔ検索プログラムおよびスコアリングアルゴリズム（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，ＵＫ）をデータベース検索に使用した。ペプチド質量耐容性は６０ｐｐｍおよび０．５Ｄａにそれぞれ設定した。検索パラメーターはＭｅｔの酸化、カルバミドメチル基のＣｙｓへの付加が包含されるように調節し、そしてトリプシンはペプチド当たり１切断部位の取り落としは許容されるものとした。
【０２６１】
同定されたフラグメントは２００３年１１月２１日出願のデンマーク優先権出願ＰＡ２００３０１７２６のリスト１に記載され、そして、２００３年１１月２５日出願の米国暫定出願６０／５２４，６１７のリスト１（参照により本明細書に組み込まれる）が同定された。合計５１の異なるＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉタンパク質がこの操作法により同定された。これらのタンパク質の完全長の配列は配列番号１〜５１に示す（図４参照）。配列表のタンパク質はＳａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅの分類に従って機能的に分類される。ゲノム配列から予測されたがこれまで特性化されておらず、以前に特性化されたタンパク質と何れの相同性も有していなかった全タンパク質はＳａｎｇｅｒ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより仮説的と分類された。既知のタンパク質に相同性を有していたものは相同性の程度に応じて、接頭辞「可能性有り（ｐｒｏｂａｂｌｅ）」または「推定される（ｐｕｔａｔｉｖｅ）」を付した相当する既知タンパク質として命名した。一部のタンパク質は厳密な生化学的／代謝的な機能を割り付けることのできなかった小型モチーフを有していたが、それらが特定の態様、例えばヌクレオチド結合モチーフ、膜結合部位等を保有しているという事実は明言できた。推定ペリプラズムタンパク質は同じ基準によりそのまま分類し、それらは短い（４〜６アミノ酸）Ｎ末端モチーフを有しており、これはペリプラズムへの輸送を媒介していると考えられる。
【０２６２】
（バイオインフォマティクス試験）
抗原指数試験はＤＮＡＳｔａｒ社（Ｂｕｒｌａｎｄ，ＴＧ（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：７１−９１）のＬａｓｅｒｇｅｎｅ配列分析ソフトウエアを用いて求めたデフォルトパラメーターを用いて実施した。配列番号５２〜１１９に示す配列がその相当する完全長ポリペプチドの特に抗原性のフラグメントであると予測されている（図４参照）。
【０２６３】
（大腸菌におけるクローニングおよび発現）
目的のタンパク質に相当する遺伝子をＰＣＲ増幅し、ｈｉｓタグを有する大腸菌発現ベクター（ｐＥＴ１０１，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）内にクローニングした。得られたプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）菌株に形質転換し、４時間０．５ｍＭ  ＩＰＴＧでタンパク質発現を誘導した。グリシン溶出液を上記した通り調製し、３種類の独立した方法、即ち、クーマシー染色、抗ｈｉｓタグ抗体によるウエスタンブロットおよび質量スペクトル分析により組換えＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉタンパク質の存在について分析した。表面局在化の検出は８プラスミド（Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７１５、Ｃｊ０７７２ｃ、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０およびＣｊ１６４３を発現するもの）について実施した。８プラスミド全てが大腸菌の細胞表面上に存在した。
【０２６４】
組換えタンパク質を培養物から精製し、製造元の指示書に従ってＮＴＡ−Ｎｉアガロース（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて上記した通り誘導した。精製タンパク質はＰＢＳに対して透析し、−８０℃で凍結保存した。
【０２６５】
（マウス免疫化）
（抗原用量決定）
各タンパク質について旨適免疫化用量およびワクチン接種のタイムスケジュールを決定するために、マウスを各タンパク質１、５、１０および２５ミリグラムを用いて免疫化した。ＰＢＳ中に溶解したタンパク質の適切な量を１００μｇミョウバン（Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ，Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ）／マウスと混合し、３０分間室温で回転させた。ＰＢＳで容量を０．５ｍＬとした。マウスを３回（第０、１４、２８日）皮下免疫化した。各免疫化後第０日および７日（第７、２１、３５日）に採血した。２００μＬ血液ｍＬの血液サンプルを第７日に眼窩叢から採取し、１時間放置して凝固させ、３５００ｇで１０分間遠心分離し、血清を採取した。
【０２６６】
（血液分析）
抗体応答は血液中の抗体力価を測定することによりモニタリングした。これはウエスタンブロットにより行った。結成をＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ中１：１００〜１：２５６００に連続希釈した。組換えタンパク質を分取用（２Ｄ）ウェルゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）上で膜上のタンパク質バンド１．５ｍｍがタンパク質１００ｎｇに相当するように泳動させた。１．５ｍｍ幅のスロットを有するＳｕｒｆ−Ｂｌｏｔ装置（Ｉｄｅａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を用いてウエスタンブロットを実施した。血清の希釈液は一次抗体として使用し、アルカリホスファターゼコンジュゲート抗マウス抗体（Ｓｉｇｍａ）を二次抗体として使用した。ブロットはＦａｓｔＴａｂ錠剤（Ｓｉｇｍａ）で発色させた。全抗原とも５、１０および２５マイクログラム／匹で適用した場合に１２８００〜２５６００の抗血清希釈度で検出可能であった。
【０２６７】
（攻撃のための免疫化）
第０、１４および２８日に上記の通り調製した組換えタンパク質ワクチン２５マイクログラムでマウスを免疫化した。第７、２１、３５日に採血し、上記の通り試験した。最後のブースト後２週間以内に攻撃実験に用いなかったマウスは、攻撃の１週間前に組換えタンパク質１０マイクログラムで再度ブーストした。
【０２６８】
（マウス経口チャレンジ）
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ菌株ＭＬ１およびＭＬ５３（Ｋａｒｅｎ  Ｋｒｏｇｆｅｌｄ、ＳＳＩより寄贈された臨床単離株）を４２℃で血液寒天プレート上に生育させた。攻撃の前日、細菌を１％コウボエキス含有Ｂｒａｉｎ  ｈｅａｒｄ注入ブロス中に採取し、ＯＤ６０００．０５となるまで希釈し、スターター培養物を得た。ＢＨＩ寒天２０ｍＬの入った７５ｃｍ２のフラスコにスターター培養物２５ｍＬを接種し、４２℃で一夜インキュベートした。攻撃当日、細菌を５分間６０００ｇで遠心分離することにより採取し、新しいＢＨＩ／ＹＥブロス中にＯＤ６００１となるまで再懸濁した（５×１０８〜１０９コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬ；実際のｃｆｕはＢＨＩ寒天プレート上に連続希釈物をプレーティングすることにより各バッチに付き測定した）。懸濁液をマウスに与えるまで氷上に保存した（通常は調製３時間以内）。
【０２６９】
抗原当たり６〜８匹のワクチン接種マウスをＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ２．５〜５×１０８ｃｆｕで経口攻撃した（上記調製した懸濁液０．５ｍＬ）。５検体の糞便ペレット（またはＡＣＥ０１７実験では全糞便ペレット）を毎日採取し、１０％グリセロール添加ＢＨＩ／ＹＥブロス０．５ｍＬ（または５ｍＬ）中に入れ、−８０℃で凍結した。
【０２７０】
コロニー形成はカンピロバクター用の選択培地上にプレーティングすることによりモニタリングした。糞便ペレットをホモゲナイズし、容量を２（または１２）ｍＬに調節し、そしてホモジネート２５０μＬを血液寒天プレート上面のＢＨＩ／ＹＥ１．５ｍＬ中に入れた。プレートを２〜３時間４２℃でインキュベートし、そして液体１５０〜２５０μＬをＫａｒｍａｌｉ寒天プレート上に展開し、次にこれを４８時間４２℃でインキュベートした。プレートは以下の通り評点した。即ち、コンフルエントな菌叢が観察された場合には１０００点、分離したコロニーが菌叢中に識別できれば５００点、そして、コロニー数が１００末端であれば１００点（その場合コロニー計数した）とした。点数は毎日各抗原に付き全マウスに渡って平均した。
【０２７１】
（菌株スクリーニング）
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ１３菌株およびカンピロバクター・コリの１菌株をマウス攻撃実験において使用した８抗原の存在についてスクリーニングした。溶解した全細胞をＳＤＳゲル上で泳動し、免疫化マウス由来の抗結成でウエスタンブロットした。
【０２７２】
（結果）
種々の組合せの抗原および対照を含む５実験を以下の通り実施した。
【０２７３】
【化１】
2008501625.tif 000003
実験ＡＣＥ００３ｂおよびＡＣＥ００３ｃのマウス由来の血液に対して実施した血液分析の例を図１および２に示す。
【０２７４】
攻撃の結果を図３に示す。  
【０２７５】
種々のカンピロバクター菌株における抗原の存在に関するスクリーニングの結果を表１に示す。
【０２７６】
（ＭＬ５３（血清型０：１９）菌株由来のＡＣＥ３９３のＤＮＡ配列決定）
菌株ＭＬ５３由来のＡＣＥ３９３（配列番号１２０）のＤＮＡ配列決定によればタンパク質配列への翻訳後のアミノ酸レベルにおいてＮＣＢＩで公開されている配列と比較して３相違点が判明した。相違点は以下の通りである。
アミノ酸配列の７０位：Ｖ（公開配列）からＡ（ＭＬ５３菌株）
アミノ酸配列の１３６位：Ａ（公開配列）からＴ（ＭＬ５３菌株）
アミノ酸配列の１６８位：Ｔ（公開配列）からＡ（ＭＬ５３菌株）。
【０２７７】
初回の動物薬効試験において使用した菌株ＭＬ５３（０：１９）由来の組換えＡＣＥ３９３のタンパク質配列の実験確認を実施した。分析には、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによるインタクトな質量の測定；１Ｄゲル分析；２Ｄゲル分析および２Ｄゲルウエスタンブロットを用いた。データ（示さず）は初期コンストラクト、即ちＣ末端６ＨｉｓタグおよびＶ５リンカー領域を含む配列に基づくものとした。全試験および分析は標準的プロトコルに従ってＮｉ−Ｈｉｓ精製後に得られたＡＣＥ３９３を用いて実施した。
【０２７８】
ＡＣＥ３９３のインタクト分析より、２タンパク質が観察された。これらの２つの質量はＮ末端トランケーション型の予測質量と完全に一致していた（〜２１アミノ酸および同様のＮ末端トランケーション型、および１９アミノ酸の別のＣ末端トランケーション）。１Ｄ  ＳＤＳ  ＰＡＧＥによれば２つのスポットは１つが大型、１つが小型であった。これはインタクトＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ分析のデータと極めてよく合致した。これらの２つのスポットのペプチドマッピングデータは恐らくオーバーロードによる如何なる相違も示していなかった。２Ｄゲル分析におけるスポットの数は混合物が２つより多い成分を含有している可能性があることを示していた。データは変化がＳＤＳ分子の数による電荷の相違に起因する可能性があることを示していた。マウス抗体を用いたウエスタンブロットのデータは同じパターンを示し、銀染色データと十分な合致を示した。
【０２７９】
（天然および組換えＡＣＥ３９３のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチドフィンガープリント分析）
（天然型）
ＡＣＥ３９３の天然型は全カンピロバクター細胞溶解物を含有する４種の異なる２Ｄゲル中で検出された。同定は４０〜５５％の配列カバー度を有するＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチドフィンガープリント分析に基づいた。
【０２８０】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチドフィンガープリントデータを公開された配列およびＡＣＥ３９３インハウス観察配列（ＭＬ５３，０：１９）の両方に対して検索した。インハウス配列は２つの別のペプチドを与えた。
【０２８１】
【化２】
2008501625.tif 000004
（太字のアミノ酸は２配列の相違点である）。
【０２８２】
公開配列と比較して最後の修飾を含むペプチド
【０２８３】
【化３】
2008501625.tif 000005
は小型過ぎるためＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチドフィンガープリント分析で検出できない。
【０２８４】
（組換え型）
組換えタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦペプチドフィンガープリント分析は天然タンパク質の分析で検出されたものと同様の２修飾を示した。別のペプチドがリンカーＨｉｓ配列から同定された。
【０２８５】
（過剰可変領域）
標的配列を”Ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｆｏｏｄ−ｂｏｒｎｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎ  Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ．Ｎａｔｕｒｅ，  ２０００  Ｆｅｂ  １０；４０３（６７７０）：６６５−８”に記載の潜在的に過剰可変のホモポリマー領域について確認した。本明細書に記載した標的はこれらの可変領域には存在せず、即ちこれらをワクチン候補として特に適するものとしている。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】実験ＡＣＥ００３ｂおよびＡＣＥ００３ｃから得た抗原当たり任意に選択した４マウス由来の血清を１：２０００に希釈し、そして全細胞のカンピロバクター溶解物（Ｂ、Ｄ）または組換えタンパク質１００ｎｇ（Ａ、Ｃ）に対するウエスタンブロットに対して試験した。分子量マーカータンパク質ＭＷのｋＤ：９７、６４、５１、３９、２８、１９、１４。
【図２】抗体力価測定の例。第２１日（予め第１および第１４日に免疫化）に採取した実験ＡＣＥ００３ｂおよびＡＣＥ００３ｃからの無作為に選択したマウス（抗原当たり１匹）の血清を連続希釈し、相当する組換えタンパク質に対してウエスタンブロットを実施した（１００ｎｇ／スポット）。
【図３−１】マウス経口攻撃の結果。異なる組合せの抗原および対照を含む５実験を以下の通り実施した。ミョウバン陰性対照は四角、抗原は三角、ただしＡＣＥ０１７は例外的に抗原は三角であるが、陽性対照をグリシン溶出物（Ｒｏｍｂｕｓ）とし、陰性対照をＣＢＰ（下記）とし、四角に類似させた。実験名            使用抗原ＡＣＥ００３ｂ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ００３ｃ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｌ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１１ａ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ０１１ｂ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１７      Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、クロストリジウム・セルロボランスのセルロース結合ドメインイン（ＣＢＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ８５８１）、グリシン溶出物は本文中のＣ．ｊ．菌株由来）。
【図３−２】マウス経口攻撃の結果。異なる組合せの抗原および対照を含む５実験を以下の通り実施した。ミョウバン陰性対照は四角、抗原は三角、ただしＡＣＥ０１７は例外的に抗原は三角であるが、陽性対照をグリシン溶出物（Ｒｏｍｂｕｓ）とし、陰性対照をＣＢＰ（下記）とし、四角に類似させた。実験名            使用抗原ＡＣＥ００３ｂ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ００３ｃ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｌ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１１ａ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ０１１ｂ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１７      Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、クロストリジウム・セルロボランスのセルロース結合ドメインイン（ＣＢＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ８５８１）、グリシン溶出物は本文中のＣ．ｊ．菌株由来）。
【図３−３】マウス経口攻撃の結果。異なる組合せの抗原および対照を含む５実験を以下の通り実施した。ミョウバン陰性対照は四角、抗原は三角、ただしＡＣＥ０１７は例外的に抗原は三角であるが、陽性対照をグリシン溶出物（Ｒｏｍｂｕｓ）とし、陰性対照をＣＢＰ（下記）とし、四角に類似させた。実験名            使用抗原ＡＣＥ００３ｂ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ００３ｃ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｌ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１１ａ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ０１１ｂ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１７      Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、クロストリジウム・セルロボランスのセルロース結合ドメインイン（ＣＢＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ８５８１）、グリシン溶出物は本文中のＣ．ｊ．菌株由来）。
【図３−４】マウス経口攻撃の結果。異なる組合せの抗原および対照を含む５実験を以下の通り実施した。ミョウバン陰性対照は四角、抗原は三角、ただしＡＣＥ０１７は例外的に抗原は三角であるが、陽性対照をグリシン溶出物（Ｒｏｍｂｕｓ）とし、陰性対照をＣＢＰ（下記）とし、四角に類似させた。実験名            使用抗原ＡＣＥ００３ｂ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ００３ｃ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｌ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１１ａ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ０１１ｂ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１７      Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、クロストリジウム・セルロボランスのセルロース結合ドメインイン（ＣＢＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ８５８１）、グリシン溶出物は本文中のＣ．ｊ．菌株由来）。
【図３−５】マウス経口攻撃の結果。異なる組合せの抗原および対照を含む５実験を以下の通り実施した。ミョウバン陰性対照は四角、抗原は三角、ただしＡＣＥ０１７は例外的に抗原は三角であるが、陽性対照をグリシン溶出物（Ｒｏｍｂｕｓ）とし、陰性対照をＣＢＰ（下記）とし、四角に類似させた。実験名            使用抗原ＡＣＥ００３ｂ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ００３ｃ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｌ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１１ａ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ０１１ｂ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１７      Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、クロストリジウム・セルロボランスのセルロース結合ドメインイン（ＣＢＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ８５８１）、グリシン溶出物は本文中のＣ．ｊ．菌株由来）。
【図３−６】マウス経口攻撃の結果。異なる組合せの抗原および対照を含む５実験を以下の通り実施した。ミョウバン陰性対照は四角、抗原は三角、ただしＡＣＥ０１７は例外的に抗原は三角であるが、陽性対照をグリシン溶出物（Ｒｏｍｂｕｓ）とし、陰性対照をＣＢＰ（下記）とし、四角に類似させた。実験名            使用抗原ＡＣＥ００３ｂ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ００３ｃ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｌ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１１ａ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ０１１ｂ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１７      Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、クロストリジウム・セルロボランスのセルロース結合ドメインイン（ＣＢＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ８５８１）、グリシン溶出物は本文中のＣ．ｊ．菌株由来）。
【図３−７】マウス経口攻撃の結果。異なる組合せの抗原および対照を含む５実験を以下の通り実施した。ミョウバン陰性対照は四角、抗原は三角、ただしＡＣＥ０１７は例外的に抗原は三角であるが、陽性対照をグリシン溶出物（Ｒｏｍｂｕｓ）とし、陰性対照をＣＢＰ（下記）とし、四角に類似させた。実験名            使用抗原ＡＣＥ００３ｂ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ００３ｃ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｌ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１１ａ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ０１１ｂ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１７      Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、クロストリジウム・セルロボランスのセルロース結合ドメインイン（ＣＢＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ８５８１）、グリシン溶出物は本文中のＣ．ｊ．菌株由来）。
【図３−８】マウス経口攻撃の結果。異なる組合せの抗原および対照を含む５実験を以下の通り実施した。ミョウバン陰性対照は四角、抗原は三角、ただしＡＣＥ０１７は例外的に抗原は三角であるが、陽性対照をグリシン溶出物（Ｒｏｍｂｕｓ）とし、陰性対照をＣＢＰ（下記）とし、四角に類似させた。実験名            使用抗原ＡＣＥ００３ｂ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ００３ｃ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｌ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１１ａ    Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、ミョウバンＡＣＥ０１１ｂ    Ｃｊ０７１５、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、ミョウバンＡＣＥ０１７      Ｃｊ００９２、Ｃｊ０１４３ｃ、Ｃｊ０４２０、Ｃｊ０７７２ｃ、Ｃｊ１０１８ｃ、Ｃｊ１３８０、Ｃｊ１６４３、クロストリジウム・セルロボランスのセルロース結合ドメインイン（ＣＢＰ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃ８５８１）、グリシン溶出物は本文中のＣ．ｊ．菌株由来）。
【図４−１】本発明の配列表を示す。
【図４−２】本発明の配列表を示す。
【図４−３】本発明の配列表を示す。
【図４−４】本発明の配列表を示す。
【図４−５】本発明の配列表を示す。
【図４−６】本発明の配列表を示す。
【図４−７】本発明の配列表を示す。
【図４−８】本発明の配列表を示す。
【図４−９】本発明の配列表を示す。
【図５】１３の無作為に選択したＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉおよびカンピロバクター・コリ菌株における８抗原の存在。記載した１４菌株の全細胞菌体溶解物をウエスタンブロットに付し、全８抗原に対する血清でプローブした。
【図１】
2008501625.tif 000006
【図２】
2008501625.tif 000007
【図３−１】
2008501625.tif 000008
【図３−２】
2008501625.tif 000009
【図３−３】
2008501625.tif 000010
【図３−４】
2008501625.tif 000011
【図３−５】
2008501625.tif 000012
【図３−６】
2008501625.tif 000013
【図３−７】
2008501625.tif 000014
【図３−８】
2008501625.tif 000015
【図４−１】
2008501625.tif 000016
【図４−２】
2008501625.tif 000017
【図４−３】
2008501625.tif 000018
【図４−４】
2008501625.tif 000019
【図４−５】
2008501625.tif 000020
【図４−６】
2008501625.tif 000021
【図４−７】
2008501625.tif 000022
【図４−８】
2008501625.tif 000023
【図４−９】
2008501625.tif 000024
【図５】
2008501625.tif 000025
【手続補正書】
【提出日】平成17年12月5日(2005.12.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、以下：
−  配列番号１、２５、３６および４３の表在カンピロバクターポリペプチドからなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、または、
−  該ポリペプチドに結合し得る抗体、
を含有する、組成物。
【請求項２】
前記組成物が、以下：
−  配列番号１、２５、３６および４３からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記改変体が、前記配列に対する少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、例えば少なくとも９９％の配列同一性を有する、請求項１または２のいずれかに記載の組成物。
【請求項４】
前記抗原性フラグメントが、前記配列の全長の９９％未満、例えば７５％未満、例えば５０％未満、例えば２５％未満、例えば２０％未満、例えば１５％未満または例えば１０％未満を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の組成物。
【請求項５】
前記抗原性フラグメントが、前記配列の７０未満の連続アミノ酸残基、例えば５０未満、例えば４０未満、例えば３０未満、例えば２０未満の連続残基を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の組成物。
【請求項６】
前記抗原性フラグメントが、前記配列の６以上、例えば７以上、例えば８以上、例えば９以上、例えば１０以上の連続アミノ酸を含む、請求項１〜５のいずれかに記載の組成物。
【請求項７】
前記抗原性フラグメントが、配列番号５２〜６２、７４〜８１、９６〜１０２および１０９〜１１９からなる群より選択されるフラグメントの１つ以上の残基、例えば配列番号５２〜６２、７４〜８１、９６〜１０２および１０９〜１１９からなる群より選択されるフラグメントの２つ以上の連続する残基、例えば３つ以上の連続する残基、例えば４つ以上の連続する残基、例えば５つ以上の連続する残基、例えば６つ以上の連続する残基を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の組成物。
【請求項８】
前記ポリペプチドがタグ、例えばヒスチジンタグを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の組成物。
【請求項９】
前記組換え細胞が弱毒化されたか、もしくは毒性の減少したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞または弱毒化されたか、もしくは毒性の減少したサルモネラ属細胞である、請求項１〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
前記組換え細胞が生存している、請求項１〜９のいずれかに記載の組成物。
【請求項１１】
前記組換え細胞が死滅している、請求項１〜１０のいずれかに記載の組成物。
【請求項１２】
前記医薬がワクチンである、請求項２〜１１のいずれかに記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が免疫原性キャリア、例えばキャリアタンパク質を含有し、該免疫原性キャリアは好ましくは前記ポリペプチドに結合している、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物がアジュバントを含有する、請求項１２または１３のいずれかに記載の組成物。
【請求項１５】
前記組成物が配列番号１、１５、３６および４３からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得る抗体を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記抗体が、さらにインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
前記組成物が、配列番号４３からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得、かつ、インタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る抗体を含有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記抗体がポリクローナルである、請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗体がモノクローナルである、請求項１５〜１７のいずれかに記載の組成物。
【請求項２０】
前記抗体がヒト抗体またはヒト化抗体である、請求項１５〜１９のいずれかに記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗体が抗体の結合フラグメントである、請求項１５〜２０のいずれかに記載の組成物。
【請求項２２】
前記抗体が５×１０−６Ｍ未満、例えば１０−６Ｍ未満、例えば５×１０−７Ｍ未満、例えば１０−７Ｍ未満、例えば５×１０−８Ｍ未満、例えば１０−８Ｍ未満、例えば５×１０−９Ｍ未満、例えば１０−９Ｍ未満、例えば５×１０−１０Ｍ未満、例えば１０−１０Ｍ未満、例えば５×１０−１１Ｍ未満、例えば１０−１１Ｍ未満、例えば５×１０−１２Ｍ未満、例えば１０−１２Ｍ未満、例えば５×１０−１３Ｍ未満、例えば１０−１３Ｍ未満、例えば５×１０−１４Ｍ未満、例えば１０−１４Ｍ未満、例えば５×１０−１５Ｍ未満、例えば１０−１５Ｍ未満の解離定数、即ちＫｄを有する請求項１５〜２１のいずれかに記載の組成物。
【請求項２３】
前記組成物が薬学的に受容可能なキャリアを含有する、請求項１〜２２のいずれかに記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が全身投与に適している、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２５】
前記組成物が静脈内投与、筋肉内投与または皮下投与に適している、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２６】
前記組成物が経口投与に適している、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が鼻腔内投与に適している、請求項１〜２３のいずれかに記載の組成物。
【請求項２８】
配列番号１、２５および３６からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得る抗体。
【請求項２９】
前記抗体がさらにインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る、請求項２８に記載の抗体。
【請求項３０】
配列番号４３のポリペプチドに結合し得、かつ、インタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る、抗体。
【請求項３１】
請求項１８〜２２のいずれかの特徴を含む、請求項２８〜３０のいずれかに記載の抗体。
【請求項３２】
ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチドで形質転換またはトランスフェクトされた組換え細胞であって、該ポリペプチドが配列番号１、２５および３６からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含む、組換え細胞。
【請求項３３】
前記組換え宿主細胞がＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはサルモネラ属細胞である、請求項３２に記載の組換え細胞。
【請求項３４】
前記組換え細胞が弱毒化されたか、または毒性の減少した細胞である、請求項３２または３３に記載の組換え細胞。
【請求項３５】
配列番号４３のポリペプチドをコードする配列を含むか、または該配列の抗原性フラグメントもしくは改変体を含むポリヌクレオチドで、形質転換またはトランスフェクトされた、組換え弱毒化もしくは毒性の減少したＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたは組換え弱毒化もしくは毒性の減少したサルモネラ属細胞。
【請求項３６】
カンピロバクター属、好ましくはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの感染に対抗する動物またはヒトの免疫化のための医薬の調製のための、以下：
−  配列番号１、２５、３６および４３からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントまたは改変体を含む、ポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
の使用。
【請求項３７】
前記免疫化が防御免疫応答を誘導する、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記医薬が、非経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経口投与または鼻腔内投与に適した医薬である、請求項３６または３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記医薬がアジュバントをさらに含有する、請求項３６〜３８のいずれかに記載の使用。
【請求項４０】
動物またはヒトにおけるカンピロバクター属、好ましくはＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉの感染の治療または予防のための医薬の製造のための、配列番号１、２５、３６および４３からなる群より選択されるポリペプチドに結合し得る抗体、好ましくは請求項２８〜３１のいずれかに記載の抗体の使用。
【請求項４１】
非ヒト動物における配列番号１、２５および３６からなる群より選択されるポリペプチドに対して抗体を惹起するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．以下：
−  配列番号１、２５および３６からなる群より選択される配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントもしくは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を提供する工程、
ｂ．該動物に該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組換えウィルスまたは組換え細胞を含有する組成物を導入する工程、
ｃ．該動物において抗体を惹起させる工程、および、
ｄ．該抗体を単離し、必要に応じて精製する工程、
を包含する、方法。
【請求項４２】
非ヒト動物における配列番号４３のポリペプチドに対する抗体を惹起するための方法であって、該抗体はインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得、該方法は、以下：
ａ．以下：
−  配列番号４３の配列を含むか、または、該配列の抗原性フラグメントもしくは改変体を含むポリペプチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、
−  該ポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクター、または、
−  該ポリヌクレオチドまたは該発現ベクターを含む組換えウィルスまたは組換え細胞、
を提供する工程、
ｂ．該動物に該ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、組換えウィルスまたは組換え細胞を含有する組成物を導入する工程、
ｃ．該動物において抗体を惹起させる工程、
ｄ．該抗体を単離し、必要に応じて精製する工程、および、
ｅ．インタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る抗体を選択する工程、
を包含する、方法。
【請求項４３】
前記動物がヒト抗体を産生し得るトランスジェニック動物である請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
サンプル中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはその部分を検出するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号１、２５および３６からなる群より選択されるポリペプチドに特異的に結合し得るインジケーター部分に該サンプルを接触させる工程、および、
ｂ．該インジケーター部分によりシグナルが発生されたか否かを決定し、それにより、該サンプルがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉまたはその部分を含有するか否かを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４５】
前記インジケーター部分がさらにインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に結合し得る、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
サンプル中のＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉを検出するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号４３のポリペプチドに特異的に結合し得るインジケーター部分に該サンプルを接触させる工程であって、該インジケーター部分はさらにインタクトなＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞に特異的に結合し得る、工程、および、
ｂ．該インジケーター部分によりシグナルが発生されたか否かを決定する工程により、該サンプルがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉを含有するか否かを検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項４７】
前記インジケーター部分がＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜を通過しない、請求項４４〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記インジケーター部分が抗体、例えば請求項２８〜３１のいずれかに定義した抗体からなるか、または該抗体を含む、請求項４４〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
配列番号１、２５および３６からなる群より選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントの結合相手を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号１、２５および３６からなる群より選択されるポリペプチドまたはそのフラグメントを提供する工程、
ｂ．該ポリペプチドまたはフラグメントを推定結合相手に接触させる工程、および、
ｃ．該推定結合相手が該ポリペプチドまたはフラグメントに結合し得るか否か決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５０】
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉに対する抗細菌活性を有する化合物を同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号１、２５および３６からなる群より選択されるポリペプチドの低減されたレベルを有する感作された細胞を提供する工程、および、
ｂ．推定抗細菌化合物に対する該細胞の感受性を、例えば増殖アッセイにより決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５１】
配列番号１、２５および３６からなる群より選択されるポリペプチドのインヒビターを同定するための方法であって、該方法は、以下：
ａ．配列番号１、２５および３６からなる群より選択されるポリペプチドのレベルの異なる二つの細胞を提供する工程、
ｂ．該細胞の推定インヒビターに対する感受性を例えば増殖アッセイにより決定する工程、および、
ｃ．該二つの細胞が該推定インヒビターの存在により異なって影響されるか否か決定する工程、
を包含する、方法。
【請求項５２】
前記推定インヒビターがＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ細胞の外膜を通過しない、請求項５１に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成18年7月28日(2006.7.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008501625000001.app
【国際調査報告】
2008501625.tif 000026
2008501625.tif 000027
2008501625.tif 000028
2008501625.tif 000029
2008501625.tif 000030
2008501625.tif 000031