(57)【要約】  本発明は、アンドロゲン受容体を調節し、骨粗しょう症、歯周病、骨折／骨脆弱性、勃起不全、性欲減退、アンドロゲン依存性がん、および筋肉減少症などのアンドロゲン欠乏症またはアンドロゲン受容体感受性亢進により引き起こされる病気における治療に適用される、式Ｉのフッ素化４−アザステロイド誘導体の調製において有用な合成法に関する。本発明はまた、開示された合成方法において有用な中間体、およびその中間体の調製方法を包含する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
【化１】
2008540416.tif 000045
のイミダゾピリジンメタンアミンまたはその塩酸塩を調製する方法であり、
（１）式ＩＩのＮ−保護グリシン誘導体と式ＩＩＩの２，３−ジアミノピリジンとを、酸塩化物活性化剤を用いてカップリングして式ＩＶの付加体を生成すること、および
【化２】
2008540416.tif 000046
（２）酸処理および脱保護により付加体ＩＶを環化して式Ｉのイミダゾピリジンメタンアミンを得ること（式中、
ｎは、０、１、２、または３であり、
Ｒ１は、独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロ、Ｃ１−Ｃ３ペルフルオロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）またはＣ１−Ｃ６アルキルオキシであり、
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ３ペルフルオロアルキルまたはハロであり、ならびに
Ｒｐは、窒素保護基である。）
を含む、前記方法。
【請求項２】
式Ｖ：
【化３】
2008540416.tif 000047
の２−フルオロラクタムを調製する方法であり、式ＶＩ：
【化４】
2008540416.tif 000048
の２−ヨードラクタムをフッ化銀（Ｉ）で処理すること［式中、Ｒ４は、
【化５】
2008540416.tif 000049
（Ｒ１、Ｒ２は、独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ３ペルフルオロアルキルである。）であり、Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）である。］
を含む、前記方法。
【請求項３】
Ｒ４が、
【化６】
2008540416.tif 000050
であり、Ｒ１が、メチルであり、およびＲ５が、メチルである、請求項２の方法。
【請求項４】
式Ｖの２−フルオロラクタムが、２β：２αが少なくとも９０：１０の立体選択性で調製される、請求項２の方法。
【請求項５】
溶媒として、メチレンクロリド、テトラヒドロフラン、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、またはメチレンクロリド／アセトニトリル６：１の使用を更に含む、請求項２の方法。
【請求項６】
テトラヒドロフラン、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、またはメチレンクロリド／アセトニトリル６：１が溶媒であり、１．１当量から１．５当量のフッ化銀（Ｉ）の使用を更に含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが、溶媒であり、および１．１当量のフッ化銀（Ｉ）が使用される、請求項２の方法。
【請求項８】
方法が、室温で行われ、ならびに２−フルオロラクタムが、２β：２αが少なくとも９４：６の立体選択性で、および９５％を超える収率で生成される、請求項７の方法。
【請求項９】
式Ｖ’：
【化７】
2008540416.tif 000051
の２−フルオロラクタムを調製する方法であり、
式ＶＩの２−ヨードラクタムを水／Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド混合物で、続いてＮａＨＣＯ３で処理して式ＸＶＩＩＩのヒドロキシラクタムを生成すること
【化８】
2008540416.tif 000052
［式中、Ｒ４は、
【化９】
2008540416.tif 000053
（Ｒ１、Ｒ２はそれぞれ独立に、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから選択される。）であり、Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）である。］
【化１０】
2008540416.tif 000054
および
ヒドロキシラクタム（ＸＶＩＩＩ）を式Ｚ：
【化１１】
2008540416.tif 000055
の化合物で処理して式Ｖ’の２−フルオロラクタムを生成すること
【化１２】
2008540416.tif 000056
を含む、前記方法。
【請求項１０】
Ｒ４が、
【化１３】
2008540416.tif 000057
であり、Ｒ１が、メチルであり、およびＲ５が、水素である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
式ＶＩＩ：
【化１４】
2008540416.tif 000058
の化合物を調製する方法であり、
（１）式Ｖまたは式Ｖ’：
【化１５】
2008540416.tif 000059
の１つの化合物をリチウムヘキサメチルジシラジドで処理してエノラートをもたらす段階、
（２）エノラートをメチルベンゼンスルフィナートと反応させる段階、および
（３）加温して、式ＶＩＩの化合物を生成する段階［式中、Ｒ４は、
【化１６】
2008540416.tif 000060
（Ｒ１およびＲ２は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルから、それぞれ独立に選択される。）であり、およびＲ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）である。］
を含む、前記方法。
【請求項１２】
式ＶＩＩＩのアザステロイドアミドを、式ＩＸのアザステロイド酸から調製する方法であり、
【化１７】
2008540416.tif 000061
１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩またはＣＤＩをカップリング剤として用いて、酸ＩＸを式Ｉ：
【化１８】
2008540416.tif 000062
のイミダゾピリジンメタンアミンとカップリングさせること（式中、
ｎは０、１、２、または３であり、
Ｒ１は、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロ、Ｃ１−Ｃ３ペルフルオロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）またはＣ１−Ｃ６アルキルオキシであり、
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ３ペルフルオロアルキルまたはハロであり、ならびに
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）である。）
を含む、前記方法。
【請求項１３】
式Ｘ：
【化１９】
2008540416.tif 000063
のアザステロイドアミドを調製する方法であり、
（１）化合物ＸＩをヨウ素化して２−ヨウ素化合物ＸＩＩを得ること、
【化２０】
2008540416.tif 000064
（２）化合物ＸＩＩ中のヨウ素をフッ素で置換して２−フルオロ化合物ＸＩＩＩ：
【化２１】
2008540416.tif 000065
を得ること、
（３）化合物ＸＩＩＩのラクタム窒素をメチル化して化合物ＸＩＶ：
【化２２】
2008540416.tif 000066
を得ること、
（４）化合物ＸＩＶを酸化して化合物ＸＶ：
【化２３】
2008540416.tif 000067
を得ること、
（５）エステルＸＶを加水分解して酸ＸＶＩを得ること、および
【化２４】
2008540416.tif 000068
（６）酸ＸＶＩとアミンＸＶＩＩとをカップリングしてアザステロイドアミドＸを得ること
を含む、前記方法。
【請求項１４】
（１）におけるヨウ素化が、トリメチルシリルクロリドおよびＩ２の反応を含み、（２）における置換反応が、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド中、ジクロロメタン中、ジクロロメタン／アセトニトリル中、またはアセトニトリル中におけるフッ化銀（Ｉ）の反応を含み、（３）のメチル化が、ｔ−ＢｕＯＫおよびＭｅＩの反応を含み、（４）の酸化が、リチウムヘキサメチルジシラジドおよびベンゼンスルフィン酸メチルの反応を含み、（５）における加水分解が、ＮａＯＨまたはＫＯＨの反応を含み、および（６）におけるカップリングが、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩または１，１’−カルボニルジイミダゾールの反応を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（１）におけるヨウ素化が、２−ヨードラクタム生成物を生成するトリメチルシリルクロリドおよびＩ２の反応を含み、（２）における置換反応が、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）および水で処理し続いてＤｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）で処理することによる、段階（１）において生成した２−ヨードラクタム生成物の転化を含み、（３）のメチル化が、ｔ−ＢｕＯＫおよびＭｅＩの反応を含み、（４）の酸化が、リチウムヘキサメチルジシラジドおよびベンゼンスルフィン酸メチルの反応を含み、（５）における加水分解が、ＮａＯＨまたはＫＯＨの反応を含み、ならびに（６）におけるカップリングが、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩または１，１’−カルボニルジイミダゾールの反応を含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンドロゲン受容体を調節し、骨粗しょう症、歯周病、骨折、薄弱、勃起不全、性欲減退、アンドロゲン依存性がん、および筋肉減少症などのアンドロゲン欠乏症またはアンドロゲン受容体運動亢進により引き起こされる症状の治療において適用される、フッ素化４−アザステロイド誘導体の調製において有用な合成方法に関する。本発明はまた、開示される合成方法において有用な中間体、およびその中間体の調製方法を包含する。
【背景技術】
【０００２】
アンドロゲン受容体（ＡＲ）は、ステロイド／甲状腺ホルモン核内受容体のスーパーファミリーに属し、このスーパーファミリーの他のメンバーは、エストロゲン受容体（ＥＲ）、プロゲステロン受容体（ＰＲ）、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）、およびミネラルコルチコイド受容体（ＭＲ）を含む。該ＡＲは、多数の体組織において発現し、テストステロン（Ｔ）およびジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）などの外因性アンドロゲンリガンドの生理学的効果、ならびに病態生理学的効果の発現を介する受容体である。ＡＲに結合し、外因性ＡＲリガンドの作用を擬態する化合物は、ＡＲアゴニストと称される一方、外因性ＡＲリガンドの作用を阻害する化合物は、ＡＲアンタゴニストと呼ばれる。
【０００３】
ＡＲを調節する化合物の治療上の有用性は、アンタゴニストまたはアゴニストのいずれかで、男性および女性の両方において様々な疾患を含んでいる臨床的研究により証明されてきた。男性において、ＡＲを標的とした薬物は、生殖疾患、および原発性または続発性男性性腺機能低下症に関係する症状における適用が見出されてきた。天然のおよび合成の両方の多数のＡＲアゴニストが、骨疾患、造血疾患、神経筋疾患、リウマチ疾患および消耗性疾患などの筋骨格障害の治療、ならびに女性アンドロゲン欠乏症の場合におけるホルモン補充療法（ＨＲＴ）の一部のために、臨床的に研究されてきた。加えて、フルタミドおよびビカルタミドなどのＡＲアンタゴニストは、前立腺がんの治療のために使用されてきた。
【０００４】
閉経後骨粗しょう症における骨に対するアンドロゲンの有利な作用は、テストステロンとエストロゲンとの併用投与を用いる研究において実証されてきた［Ｈｏｆｂａｕｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｂｏｎｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｒｅｃｅｎｔ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｖｅｒｓｉｅｓ，”  Ｅｕｒ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．１４０：２７１−２８６（１９９９）］。アンドロゲンが男性における骨代謝において、女性におけるエストロゲンの役割に匹敵する重要な役割を演じていることも十分に証明されている［Ａｎｄｅｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｅｕｇｏｎａｄａｌ  ｍｅｎ  ｗｉｔｈ  ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ−ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｉｘ  ｍｏｎｔｈｓ  ｏｆ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｎ  ｂｏｎｅ  ｍｉｎｅｒａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ，”Ｂｏｎｅ，１８：１７１−１７７（１９９６）］。アンドロゲン欠乏の有害（ｄｅｌｉｔｉｒｏｕｓ）作用は、Ｄ期の前立腺がんを有する男性の研究において例証される。この研究において、アンドロゲン抑制療法（ＡＤＴ）を、１年を超えて受けている男性において、ＡＤＴを受けていない患者に比べて、骨減少症（５０％対３８％）および骨粗しょう症（３８％対２５％）が、より一般的に見られた［Ｗｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｄｅｎｓｉｔｙ，”Ｕｒｏｌｏｇｙ，５４：６０７−６１１（１９９９）］。
【０００５】
ＡＲアンタゴニストはまた、閉経後女性における多嚢胞卵巣症候群の治療において有用であることも見出されている［Ｃ．Ａ．Ｅａｇｌｅｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  ｏｖａｒｉａｎ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｔｈａｔ  ｆｌｕｔａｍｉｄｅ  ｒｅｓｔｏｒｅｓ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｏｎａｄｏｔｒｏｐｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｐｕｌｓｅ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ  ｔｏ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｂｙ  ｅｓｔｒａｄｉｏｌ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｅｓｔｅｒｏｎｅ，”  Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８５：４０４７−４０５２（２０００）、および、Ｅ．Ｄｉａｍａｎｔｉ−Ｋａｎｄａｒａｋｉｓ，“Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ａ  Ｐｕｒｅ  Ａｎｔｉａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｂｌｏｃｋｅｒ，Ｆｌｕｔａｍｉｄｅ，ｏｎ  ｔｈｅ  Ｌｉｐｉｄ  Ｐｒｏｆｉｌｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ  Ｏｖａｒｙ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ，”Ｉｎｔ．Ｊ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．，８３：２６９９−２７０５（１９９８）を参照］。アンドロゲン受容体修飾薬の開発のための追加的使用および理論的根拠は、Ｌ．ＺｈｉおよびＥ．Ｍａｒｔｉｎｂｏｒｏｕｇｈ  ｉｎ  Ａｎｎ．Ｒｅｐ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３６：１６９−１８０（２００１）に見出すことができる。非ステロイド系ＡＲ化合物の分子構造とアンタゴニスト活性またはアゴニスト活性との間の関係はまた、Ｊ．Ｐ．Ｅｄｗａｒｄｓ，“Ｎｅｗ  Ｎｏｎｓｔｅｒｏｉｄａｌ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  Ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ４−（Ｔｒｉｆｌｕｏｒｏｍｅｔｈｙｌ）−２（１Ｈ）−Ｐｙｒｒｏｌｉｄｉｎｏ［３，２−ｇ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｏｎｅ，”Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，８：７４５−７５０（１９９８）、およびｉｎ  Ｌ．Ｚｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ  Ａｎｄｒｏｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ  ｔｏ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｂｙ  Ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ  Ｃ−ｒｉｎｇ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔｓ  ｏｎ  Ｐｉｐｅｒｉｄｉｎｏ［３，４−ｇ］ｑｕｉｎｏｌｉｎｏｎｅ，”Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，９：１００９−１０１２（１９９９）などの、多数の文献の主題ともなってきた。
【０００６】
立証された臨床的有用性により、ＡＲ化合物は、非常に望ましい標的となっている。したがって、天然由来および合成のＡＲ化合物を製造するために使用できる化学的方法が必要である。本発明は、この必要性に対処する。
【０００７】
これらの化合物は、アンドロゲン受容体アゴニストとして効果的であり、選択性アンドロゲン受容体アゴニスト（ＳＡＲＭｓ）として特に効果的である。したがって、これらの化合物は、アンドロゲン欠乏症により引き起こされる症状、またはアンドロゲン投与により回復されうる症状の治療に有用である。
【０００８】
国際出願ＷＯ０３／０７７９１９（２００３年９月２５日公開）は、その全体を参照により本明細書中に組み込むが、低下した筋緊張の強化、および骨粗しょう症、骨減少症、グルココルチコイド誘導性骨粗しょう症、歯周病、骨折、骨の損傷とそれに続く骨再建外科、筋肉減少症、薄弱、老化した肌、男性性腺機能低下症、女性における閉経後症候群、粥状動脈硬化症、高コレステロール血症、高脂血症、肥満、再生不良性貧血およびその他造血疾患、炎症性関節炎および関節修復、ＨＩＶ消耗性症、前立腺がん、良性前立腺肥大症（ＢＰＨ）、腹部脂肪蓄積、代謝症候群、ＩＩ型糖尿病、がん悪液質、アルツハイマー症、筋ジストロフィー、認知機能低下、性機能不全、睡眠時無呼吸症、うつ病、早発閉経、および自己免疫疾患を含む、アンドロゲン欠乏症により引き起こされる症状、またはアンドロゲン投与により回復されうる症状の治療において、単独でまたは他の有効薬剤と併用して有用である、フッ素化４−アザステロイド誘導体を記述している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
（発明の概要）
本発明は、アンドロゲン受容体修飾薬である化合物の合成において有用な化学的方法に関する。本発明はまた、アンドロゲン受容体修飾薬の製造において有用な中間体をもたらす化学的方法を包含する。本発明の化学的方法は、これまで周知の方法を上回る利点を提供し、アンドロゲン受容体修飾薬への、集中型でより効果的な経路を含む。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の詳細な説明）
本発明の１つの実施形態は、式Ｉ：
【００１１】
【化２５】
2008540416.tif 000002
のイミダゾピリジンメタンアミンまたはその塩酸塩を調製する方法に関し、この方法は、
（１）式ＩＶの付加体を生成するために、式ＩＩのＮ−保護グリシン誘導体と式ＩＩＩの２，３−ジアミノピリジンとを、酸塩化物活性化剤を用いてカップリングすること、および
【００１２】
【化２６】
2008540416.tif 000003
（２）式Ｉのイミダゾピリジンメタンアミンを与えるために、酸処理および脱保護により付加体ＩＶを環化すること（式中、
ｎは０、１、２、または３であり、
Ｒ１は、独立に、Ｃ１−Ｃ６アルキル、ハロ、Ｃ１−Ｃ３ペルフルオロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）、またはＣ１−Ｃ６アルキルオキシであり、
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ３ペルフルオロアルキル、またはハロであり、ならびに
Ｒｐは、窒素保護基である。）
を含む。
【００１３】
本発明のもう１つの実施形態は、式Ｖ：
【００１４】
【化２７】
2008540416.tif 000004
の２−フルオロラクタムを調製する方法により説明され、この方法は、式ＶＩ：
【００１５】
【化２８】
2008540416.tif 000005
の２−ヨードラクタムをフッ化銀（Ｉ）で処理すること［式中、Ｒ４は、
【００１６】
【化２９】
2008540416.tif 000006
（式中、Ｒ１、Ｒ２は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルからそれぞれ独立に選択される。）であり、Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、またはＣ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）である。］
を含む。
【００１７】
本発明の１つの実施形態において、Ｒ４は、
【００１８】
【化３０】
2008540416.tif 000007
であり、Ｒ１は、メチルであり、およびＲ５は、メチルまたは水素である。
【００１９】
本発明の１つの更なる実施形態は、式Ｖの２−フルオロラクタムが、２β：２αが少なくとも９０：１０の立体選択性で調製される、上記の方法である。本方法のために好ましい溶媒は、メチレンクロリド、テトラヒドロフラン、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、または例えばメチレンクロリド／アセトニトリルが６：１などであるそれら溶媒の混合物である。特許請求された方法の１つの実施形態において、テトラヒドロフラン、アセトン、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、またはメチレンクロリド／アセトニトリル６：１が溶媒であり、およびフッ化銀（Ｉ）の１．１当量から１．５当量が使用される。１つの更なる実施形態は、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが溶媒であり、およびフッ化銀（Ｉ）の１．１当量が使用される方法である。もう１つの実施形態は、方法が室温で行われ、２−フルオロラクタムが、２β：２αが少なくとも９４：６の立体選択性で生成される方法である。
【００２０】
別法として、本発明のもう１つの実施形態において、式Ｖ’：
【００２１】
【化３１】
2008540416.tif 000008
の２−フルオロラクタムの調製は、Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）の使用を介して実施され得、この調製は、
１）式ＶＩ：
【００２２】
【化３２】
2008540416.tif 000009
［式中、Ｒ４は、
【００２３】
【化３３】
2008540416.tif 000010
（式中、Ｒ１およびＲ２は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルからそれぞれ独立に選択される。）であり、Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）である。］
の２−ヨードラクタムを、水／ＤＭＦに続きＮａＨＣＯ３で処理して、式ＸＶＩＩＩ：
【００２４】
【化３４】
2008540416.tif 000011
のヒドロキシラクタムを生成すること、および
２）ヒドロキシラクタム（ＸＶＩＩＩ）を式Ｚ：
【００２５】
【化３５】
2008540416.tif 000012
の化合物で処理して、式Ｖ’  の２−フルオロラクタムを生成すること
を含む。
【００２６】
この実施形態の１つの変法において、Ｒ４は、
【００２７】
【化３６】
2008540416.tif 000013
であり、Ｒ１およびＲ２は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルからそれぞれ独立して選択され、Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）である。
【００２８】
本発明は更に、式ＶＩＩの化合物を調製する方法を包含し、
【００２９】
【化３７】
2008540416.tif 000014
この方法は、（１）式Ｖ（またはＶ’  ）の１つの化合物をリチウムヘキサメチルジサリジドで処理してエノラートをもたらす段階、（２）該エノラートをメチルベンゼンスルフィナートと反応させる段階、および（３）加温して、式ＶＩＩの化合物を生成する段階［式中、Ｒ４は、
【００３０】
【化３８】
2008540416.tif 000015
（式中、Ｒ１およびＲ２は、ＨおよびＣ１−Ｃ６アルキルからそれぞれ独立して選択される。）であり、Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、またはＣ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）である。］
を含む。
【００３１】
また、本発明に包含されるのは、式ＶＩＩＩのアザステロイドアミドを、式ＩＸのアザステロイド酸から調製する方法であり、
【００３２】
【化３９】
2008540416.tif 000016
この方法は、カップリング剤として１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩またはＣＤＩを用いる、酸ＩＸと式Ｉ：
【００３３】
【化４０】
2008540416.tif 000017
のイミダゾピリジンメタンアミンとのカップリングを含む（式中、
ｎは、０、１、２、または３であり、
Ｒ１は、独立にＣ１−Ｃ６アルキル、ハロ、Ｃ１−Ｃ３ペルフルオロアルキル、Ｃ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）またはＣ１−Ｃ６アルキルオキシであり、
Ｒ２ａおよびＲ２ｂは、独立に、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキル、Ｃ１−Ｃ３ペルフルオロアルキルまたはハロであり、ならびに
Ｒ５は、Ｈ、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ３アルキル（ＣＯ）である。）。
【００３４】
また更にもう１つの実施形態は、式Ｘ：
【００３５】
【化４１】
2008540416.tif 000018
のアザステロイドアミドを調製する方法であり、この方法は、
（１）２−ヨウ素化合物ＸＩＩをもたらす、化合物ＸＩのヨウ素化、
【００３６】
【化４２】
2008540416.tif 000019
（２）２−フルオロ化合物ＸＩＩＩ：
【００３７】
【化４３】
2008540416.tif 000020
をもたらす、化合物ＸＩＩ中のヨウ素のフッ素での置換、
（３）化合物ＸＩＶ：
【００３８】
【化４４】
2008540416.tif 000021
をもたらす、化合物ＸＩＩＩのラクタム窒素のメチル化、
（４）化合物ＸＶ：
【００３９】
【化４５】
2008540416.tif 000022
をもたらす、化合物ＸＩＶの酸化、
（５）酸ＸＶＩをもたらす、エステルＸＶの加水分解、および
【００４０】
【化４６】
2008540416.tif 000023
（６）アザステロイドアミド：
【００４１】
【化４７】
2008540416.tif 000024
をもたらす、酸ＸＶＩとアミンＸＶＩＩとのカップリングを含む。
【００４２】
本発明は上記方法を包含する方法を更に含み、（１）におけるヨウ素化は、トリメチルシリルクロリドおよびＩ２の反応を含み、（２）における置換は、ジメチルアセトアミド中、ジクロロメタン中、ジクロロメタン／アセトニトリル中、またはアセトニトリル中におけるフッ化銀（Ｉ）の反応を含み、（３）のメチル化は、ｔ−ＢｕＯＫおよびＭｅＩの反応を含み、（４）の酸化は、リチウムヘキサメチルジシラジドおよびメチルベンゼンスルフィナートの反応を含み、（５）における加水分解は、ＮａＯＨまたはＫＯＨの反応を含み、および（６）におけるカップリングは、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩または１，１’−カルボニルジイミダゾールの反応を含む。
上記した実施方法の１つの変法において、（１）におけるヨウ素化は、トリメチルシリルクロリドおよびＩ２の反応を含み、（２）における置換は、（１）のヨウ素化合物を含水ＤＭＦ（Ｈ２Ｏ／ＤＭＦ）と共に加熱し、続いてＤｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（式Ｚを参照）で処理することを含み、（３）のメチル化は、ｔ−ＢｕＯＫおよびＭｅＩの反応を含み、（４）の酸化は、リチウムヘキサメチルジシラジドおよびメチルベンゼンスルフィナートの反応を含み、（５）における加水分解は、ＮａＯＨまたはＫＯＨの反応を含み、および（６）におけるカップリングは、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−３−エチルカルボジイミド塩酸塩または１，１’−カルボニルジイミダゾールの反応を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４３】
Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）の化学構造は、
【００４４】
【化４８】
2008540416.tif 000025
である。
【００４５】
本発明により調製される化合物は、Ｅ．Ｌ．ＥｌｉｅｌおよびＳ．Ｈ．Ｗｉｌｅｎ「Ｓｔｅｒｅｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｃａｒｂｏｎ  Ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９９４年、１１１９−１１９０ページ）に記載されているとおりに、不斉中心、キラル軸、またはキラル面に起因したキラルであってよく、単一光学異性体として、またはラセミ体、ラセミ体混合物、ジアステレオマー、ジアステレオマー混合物、鏡像異性体および鏡像異性体混合物を含む可能な光学異性体のいずれかの数の混合物として生じてよい。一定の事例において、開示される化合物は、互変異性体として存在してよく、１つの互変異性構造のみが図示されているけれども、両互変異性形が、本発明の範囲に包含されるように、意図される。例えば、以下の化合物Ａに関するいずれかの特許請求の範囲は、互変異性構造Ｂを含み（逆も同様であり）、並びにそれらの混合物を含むと理解される。ここでＸは、本発明のフッ素化４−アザステロイド誘導体の残分を表す。
【００４６】
【化４９】
2008540416.tif 000026
【００４７】
用語「アルキル」は、炭素原子数が具体的に別途示されていない限り、１から１０炭素原子の直鎖または分岐鎖炭化水素基を意味するものとする。「アルキル」の例としては、メチル、エチル、１−プロピル、２−プロピル、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチルなどが挙げられるが、これらに限定されない。５つの炭素原子を有するアルキル基は、例えば「Ｃ５−アルキル」として示され、直鎖または分岐鎖でよい。
【００４８】
用語「アルコキシ」は、本明細書中では、特定の炭素数の（例えば、Ｃ１−５アルコキシ）、またはこの範囲内のいずれかの炭素数の（即ち、メトキシ、エトキシなど）直鎖または分岐鎖アルコキシドを指す。
【００４９】
用語「ハロゲン」および「ハロ」は、ヨウ素、臭素、塩素、およびフッ素を含むものとする。
【００５０】
いずれかの可変基（例えば、Ｒ２、Ｒ３など）が、いずれかの置換基または特定の式のいずれかの化合物において、１を超える回数で出現する場合、各出現時のその定義は、すべての他の出現時のその定義とは無関係である。また、置換基および変数の組み合わせは、そのような組み合わせが安定な化合物を生じる場合にのみ許容される。
【００５１】
用語「ペルフルオラルキル」は、対応するアルキル中のすべての水素原子がフッ素原子で置換されていることを示す。
【００５２】
本発明により提供される化合物は、アンドロゲン受容体修飾化合物の製造において有用な中間体であり、またはそれ自身が、骨粗しょう症、骨減少症、グルココルチコイド誘導性骨粗しょう症、歯周病、骨折、骨の損傷に続く骨再建外科、筋肉減少症、薄弱、老化した肌、男性性腺機能低下症、女性における閉経後症候群、粥状動脈硬化症、高コレステロール血症、高脂血症、肥満、再生不良性貧血およびその他造血疾患、例えば炎症性関節炎および関節修復などの関節炎状態、ＨＩＶ消耗性症、前立腺がん、がん悪液質、筋ジストロフィー、早発閉経、および自己免疫症を含むがこれに限定されない、アンドロゲン欠乏症により引き起こされる症状、またはアンドロゲン投与により回復されうる症状の治療において、単独でまたは他の有効薬剤と併用して有用なアンドロゲン受容体修飾化合物である。治療は、開示される方法から得られる最終生成物を、その治療を必要とする哺乳動物に投与することにより実施される。加えて、これらの化合物は、単独でまたは他の有効薬剤と併用して、医薬品組成物における成分として有用である。
【００５３】
本発明の化合物を、その鏡像異性的に純粋な形態において投与することが、一般に好ましい。ラセミ混合物は、多数の従来の方法のいずれかにより、それらの個々の鏡像異性体に分割することができる。これらの方法は、キラルクロマトグラフィー、不斉補助基を用いる誘導体化とそれに続くクロマトグラフィーまたは結晶化による分離、およびジアステレオマー塩の分別結晶化を含む。
【００５４】
用語「薬学的に許容できる塩」は、無機または有機塩基および無機または有機酸を含む薬学的に許容できる無毒の塩基または酸から調製される塩を指す。無機塩基から誘導される塩は、アルミニウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、銅塩、鉄（ＩＩＩ）塩、鉄（ＩＩ）塩、リチウム塩、マグネシウム塩、マンガン（ＩＩＩ）塩、マンガン（ＩＩ）塩、カリウム塩、ナトリウム塩、亜鉛塩などを含む。特に好ましいのは、アンモニウム塩、カルシウム塩、リチウム塩、マグネシウム塩、カリウム塩、およびナトリウム塩である。薬学的に許容できる無毒の有機塩基から誘導される塩は、アルギニン、ベタイン、カフェイン、コリン、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、ジエチルアミン、２−ジエチルアミノエタノール、２−ジメチルアミノエタノール、エタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−エチル−モルホリン、Ｎ−エチルピペリジン、グルカミン、グルコサミン、ヒスチジン、ヒドラバミン、イソプロピルアミン、リシン、メチルグルカミン、モルホリン、ピペラジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂、プロカイン、プリン、テオブロミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、トリプロピルアミン、トロメタミンなどの、一級、二級、および三級アミン、天然由来の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン類、および塩基性イオン交換樹脂の塩を含む。
【００５５】
本発明の化合物が塩基性の場合、塩は、無機酸および有機酸を含む薬学的に許容できる無毒の酸から調製され得る。このような酸は、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、カンファースルホン酸、クエン酸、エタンスルホン酸、蟻酸、フマル酸、グルコン酸、グルタミン酸、臭化水素酸、塩酸、イセチオン酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、マロン酸、粘液酸、硝酸、パモン酸、パントテン酸、リン酸、プロピオン酸、コハク酸、硫酸、酒石酸、ｐ−トルエンスルホン酸、トリフルオロ酢酸などを含む。特に好ましいのは、クエン酸、フマル酸、臭化水素酸、塩酸、マレイン酸、リン酸、硫酸、および酒石酸である。
【００５６】
以下のスキームおよび実施例は、本発明により包含される方法を例証するものである。当業者には容易に理解されるように、本明細書中に例示される基質上の置換基および置換様式は、容易に入手できる出発物質、試薬、および従来の手順または変形例を選択することによる必要以上の実験（ｅｘｐｅｒｆｉｍｅｎｔａｔｉｏｎ）をすることなしに修飾できる。以下でおよびこの開示を通して、「室温」または「ＲＴ」は、反応が冷却または加熱のためのいずれかの手段も用いずに周囲温度で実施されたことを示す。「室温」は、約２５℃である。
【００５７】
従って以下の例証スキームは、列挙された化合物によって、または例証の目的のために採用されるいずれかの特定の置換基によっても限定されない。スキームにおいて示されるとおりの置換基の番号付けは、特許請求の範囲において用いられる番号付けと必ずしも関連付けられておらず、しばしば明確にするために、先に定義された式Ｉの定義の下で認められた多数の置換基の代わりに、単一置換基が化合物に結合して示される。
【００５８】
本発明の方法は、アンドロゲン受容体修飾薬として有用なイミダゾピリジル・アザステロイドの調製において有用である。イミダゾピリジニルメタンアミン側鎖の、特に有利な調製についても、開示されている。スキームＡにおいて例証されるとおりに、イミダゾピリジン中間体（Ａ−５）は、Ｎ−アシル化グリシンなどの市販品のＮ−保護グリシン誘導体（Ａ−１）、またはＣＢＺ−グリシンなどのグリシンのもう１つの適切に保護された形態、市販品でも、または当業者によりほとんど努力せずにできる合成によっても容易に入手できる、適切な２，３−ジアミノピリジン（Ａ−２）から調製される。Ｎ−アシル化グリシンが、好ましい基質である。
【００５９】
【化５０】
2008540416.tif 000027
【００６０】
スキームＡにおいて示されるとおりに、Ｎ−保護グリシン誘導体Ａ−１をジアミノピリジンＡ−２とカップリングさせて、Ａ−３を生成する。このカップリングは、１，３−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）または１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）を含むがこれに限定されないカルボキシ基活性化剤の使用によって達成される。例えば酸塩化物は、この点で活性化剤として特に有用である。保護グリシン基質と、ピバロイルクロリドなどの酸塩化物との反応は、反応性中間体として混合酸無水物を生成する。該反応における、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）などの塩基の使用は、いずれかの酸性副生成物を吸収するために有用である。ＮＭＭを使用する有益な効果とは、該反応の固体塩副生成物をろ過により除去できることである。続くＡ−３の環化は、保護されたイミダゾピリジンＡ−４を生成し、このＡ−４は、例えば酸に不安定な保護基の場合には酸の添加により脱保護でき、所望のイミダゾピリジンＡ−５をもたらす。スキームＡが開示するように、Ｒａは化学的に適合するいずれかのＮ−保護基であってよい。他の適した保護基および対応する脱保護法のスキームの例は、Ｔｈｅｏｄｏｒａ  Ｗ．Ｇｒｅｅｎ著「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、１９８１年）で例証されている。同様にＲｂは、標的アンドロゲン受容体修飾薬において望ましいであろう適合するいずれかの置換基であってよい。
【００６１】
ステロイド部分の合成は、スキームＢに示すとおりに、フッ素化反応で開始する。アザステロイドＢ−４の合成の出発物質は、２，３−不飽和類似体から容易に入手できるアザステロイドＢ−１である（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  （１９８６），２９（１１），２２９８−３１５））。フッ素化戦略は、周知のヨウ素化方法論に基づくものであり（Ｋｉｎｇ，Ａ．Ｏ．；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．；Ｓｈｕｍａｎ，Ｒ．Ｆ．；Ｋａｒａｄｙ，Ｓ．；Ａｂｒａｍｓｏｎ，Ｎ．Ｌ．；Ｄｏｕｇｌａｓ，Ａ．Ｗ．Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９３，５８，３３８４−３３８６．）、その後ヨウ化物のフッ化物置換が行われる。
【００６２】
【化５１】
2008540416.tif 000028
【００６３】
２ａ−ヨードラクタムＢ−２は、単一立体異性体として得ることができる。ヨードラクタムＢ−２は、ＫＦ、ＬｉＦ、ＣｓＦ、Ｋ２ＨＦ、ＢａＦ２、ＣａＦ２、ＭｇＦ２、ＮｉＫ２およびＥｔ３Ｎ・３ＨＦ／Ｅｔ３Ｎを含むがこれに限定されない有機および無機両方の様々なフッ化物源を用いた処理により、対応する２−フルオロラクタムに転化できる。これらの試薬は、試験され、低い転化率および望ましくない脱離生成物の生成の不利益を被ることが見出された。
【００６４】
フッ化銀（Ｉ）は、臭化アルキルおよびヨウ化アルキルを置換して、対応するフッ素化合物を与えることが周知である（Ｐｏｇａｎｙ，Ｓ．Ａ．；Ｚｅｎｔｎｅｒ，Ｇ．Ｍ．；Ｒｉｎｇｅｉｓｅｎ，Ｃ．Ｄ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  １９８７，０８，７１８−７１９）。しかし該文献の手順は、フッ化銀（Ｉ）の２．５当量から４．５当量を必要とする。加えて、ステロイド基質に対する該試薬の実用性は、未知であった。室温で、含水アセトニトリル中のＡｇＦの４．５当量を使用することにより、該２−ヨードラクタムＢ−２（Ｒ５＝Ｈ、およびＲ４＝ＣＯ２Ｍｅ）は、ＳＮ２形式において高い立体選択性（２β−フルオロ／２α−フルオロ＝９４／６）で、対応する２−フルオロラクタムに完全に転化された。必要なＡｇＦ量および反応速度は、反応溶媒に非常に敏感であった。しかしながら、ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）の使用により、反応は、室温で１２時間以内に完結した。驚くべきことに、ＡｇＦのわずか１．１当量が、必要であった。２−ヨードラクタムＢ−２（式中、Ｒ５＝Ｈ、およびＲ４＝ＣＯ２Ｍｅ）を用いる、様々な条件下でのフッ素化方法を以下にまとめる。
【００６５】
【表１】
2008540416.tif 000029
【００６６】
ステロイド部分の１つの代替の合成は、スキームＣに示したとおりにフッ素化反応で開始する。アザステロイドＣ−５の合成の出発物質はアザステロイドＣ−１であり、これは２，３−不飽和類似体から容易に入手できる（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９８６），２９（１１），２２９８−３１５）。フルオロ化戦略は、ヨウ素化方法論に基づき、その後ヨウ化物のフッ化物置換が行われる（Ｌａｌ，Ｇ．Ｓ．；Ｐｅｚ，Ｇ．Ｐ．；Ｐｅｓａｒｅｓｉ，Ｒ．Ｊ．；Ｐｒｏｚｏｎｉｃ，Ｆ．Ｍ．；Ｃｈｅｎｇ，Ｈ．；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９，６４，７０４８−７０５４．）。
【００６７】
【化５２】
2008540416.tif 000030
【実施例１】
【００６８】
イミダゾピリジンメタンアミン（１−５）の調製
【００６９】
【化５３】
2008540416.tif 000031
【００７０】
ａ）１−３の合成
【００７１】
【化５４】
2008540416.tif 000032
【００７２】
３００ｍＬのＴＨＦを、Ｎ−アセチルグリシン１−１を４８．８８ｇ（０．４１７ｍｏｌｅ）を入れた５００ｍＬ三頚フラスコに加えた。生じたスラリーを、氷浴を用いて０℃に冷却し、温度を５℃未満に保ちながら該スラリーに、Ｎ−メチルモルホリン（ＮＭＭ）５０ｍＬ（０．４５５ｍｏｌｅ）を加えた。次に、温度を５℃未満に保ちながら３０分を超えてゆっくりと、塩化ピバロイル（５０ｍＬ）をスラリーに加えた。スラリーを１５℃に３０分間加温し、次に１時間、０℃に冷却してＮＭＭ−ＨＣｌ塩結晶の生成を確実にした。反応の進行を、ＮＭＭについて上澄みをＧＣで確認することによりモニターした。上澄み中の塩の許容濃度は、１５ｍｇ／ｍＬである。結晶生成が完結すると同時に、スラリーを窒素下でろ過し、固体をＴＨＦ（９０ｍＬ）で洗浄した。黄色ろ液および洗液を、滴下ロートに入れ、次の工程で用いた。混合酸無水物  １Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）８．５２（ｔ）、３．９８（ｄ）、１．８７（ｓ）。
【００７３】
窒素導入管、メカニカルスターラー、および熱電対温度計を備えた１Ｌ三頚フラスコに、２，３−ジアミノピリジン１−２（３０．３４ｇ、０．２７８ｍｏｌｅ）およびＤＭＡＰ（３．４０ｇ、０．０２８ｍｏｌｅ）を入れた。ＴＨＦ（３００ｍＬ）を加え、続いてＮＭＭ（５０ｍＬ、０．４５５）を加えた。上記で得られた黄色混合酸無水物溶液を、水浴で温度を２５℃未満に保ちながら滴下して加えた。滴下は、４５分間かかった。室温で３時間撹拌した後にスラリーをろ過し、ＴＨＦ（７５ｍＬ）で洗浄して、窒素下および真空下で乾燥した。生成物１−３が、茶色粉末として得られた（５１．２３ｇ）。
【００７４】
粗生成物は、過剰のＮＭＭ−ＨＣｌが存在する場合に、再結晶により更に精製され得る。例えば、粗生成物の１９．８１ｇ（８３．４ｗｔ％）をエタノール（８０ｍＬ）中でスラリー化させ、９５℃に加熱した。固体のほとんどが、溶解した。ＭＴＢＥ（８０ｍＬ）を滴下で加えながら、溶液を放冷した。スラリーをろ過し、ＭＴＢＥ（４０ｍＬ）で洗浄し、窒素下および真空下で乾燥した。この方法で、５．２ｗｔ％のＮＭＭ−ＨＣｌ塩を含む生成物１−３が１５．９７ｇ得られた。１−３＝１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝９．１５（ｓ，１Ｈ，ＮＨ）、８．１９（ｔ，１Ｈ，ＮＨ）、７．７８（ｄ，１Ｈ，ｐｙｒ）、７．４９（ｄ，１Ｈ，ｐｙｒ）、６．５４（ｄｄ，１Ｈ，ｐｙｒ）、５．７４（ｓ，２Ｈ，ＮＨ２）、３．８６（ｄ，２Ｈ，ＣＨ２）、１．８８（ｓ，３Ｈ，ＣＨ３）。
【００７５】
ｂ）１−３の環化
【００７６】
【化５５】
2008540416.tif 000033
【００７７】
熱電対温度計、冷却器、および窒素ラインを備えた５００ｍＬ三頚フラスコに酢酸（２００ｍＬ）を入れた。４６．１９ｇ（０．１９４ｍｏｌｅ）の１−３を、溶媒中に、溶媒を撹拌しながらゆっくりと加えた。該黒色溶液を、１２０℃で１０時間加熱した。生じた１−４の溶液をそのまま次の工程に使用した。酢酸を粉体アミドに加えると該粉体の固化を生じるので、手動で砕く必要がある。従って、逆に添加することが、推奨される。ＨＰＬＣを用いて、出発物質が残存しなくなるまで反応をモニターした。（検定収率：９５％）。
典型的な保持時間：
アミド：６．４４分；アセチルイミダゾール：８．７１分。
【００７８】
ｃ）アセチル化イミダゾピリジン１−４の脱保護
【００７９】
【化５６】
2008540416.tif 000034
【００８０】
濃ＨＣｌを、上記環化反応で得られた反応溶液に約１２０℃のままで加えた。次に、反応混合物を１００℃で５時間加熱した。反応を、ＨＰＬＣでモニターした。約２Ａ％の出発物質が反応の完結時に残存したが、この反応を、更にＨＣｌを追加して促進することができた。しかしながら、過剰の水を、反応の完結後に蒸留によって除去しなければならない。
【００８１】
その後、溶液を蒸留して５０ｍＬの溶媒を除去し、放冷した。ｉＰＡｃ（２００ｍＬ）の滴下添加は、温度が１００℃のままで開始した。次いで、温度が８℃まで低下するようにしたが、ｉＰＡｃの添加が完結するまで、先の温度を維持した。スラリーをゆっくりと放冷し、その後０℃に冷却し、ろ過してｉＰＡｃ（１２０ｍＬ）で洗浄した。生成物１−５が、暗黒色粒状粉体（４２．８７ｇ）として得られた。
【００８２】
着色を除くために、活性炭処理を行った。１−５（９４．７ｗｔ％、４．３３ｍｍｏｌｅ）１．０１ｇをメタノール／水４：１（１０ｍＬ）に溶解した。Ｄａｒｃｏ  ＫＢ（１．０ｇ）を加え、混合物を５０℃で１時間加熱した。その後、混合物を室温まで冷却し、セイラトでろ過し、メタノール（１０ｍＬ）で洗浄した。生成物溶液を、１０ｍＬの溶媒を除去しながら濃縮した。ＴＨＦ（２０ｍＬ）を滴下して加えた。スラリーをろ過し、ＴＨＦ（２．５ｍＬ）で洗浄し、窒素下および真空下で乾燥した。生成物を明灰色粉体として得た（８３０ｍｇ、８７％回収）。１−５＝１Ｈ  ＮＭＲ（４００ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）：δ＝９．０９（ｂｓ，３Ｈ，ＮＨ）、８．５８（ｍ，２Ｈ，ｐｙｒ）、７．６４（ｄｄ，１Ｈ，ｐｙｒ）、４．４９（ｓ，２Ｈ，ＣＨ２）。
【実施例２】
【００８３】
ＡｇＦを利用したアザステロイド２−７の調製
【００８４】
【化５７】
2008540416.tif 000035
【００８５】
ａ）２−１Ａのヨウ素化
【００８６】
【化５８】
2008540416.tif 000036
【００８７】
出発物質のラクタム２−１を、対応する不飽和ステロイド２−１Ａのパラジウム触媒水素化により、文献の方法に従って調製した。Ｒａｓｍｕｓｓｏｎ，Ｇａｒｙ  Ｈ．；Ｒｅｙｎｏｌｄｓ，Ｇｌｅｎｎ  Ｆ．；Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，Ｎａｔｈａｎ  Ｇ．；Ｗａｌｔｏｎ，Ｅｄｗａｒｄ；Ｐａｔｅｌ，Ｇｏｏｌ  Ｆ．；Ｌｉａｎｇ，Ｔｅｈｍｉｎｇ；Ｃａｓｃｉｅｒｉ，Ｍａｒｇａｒｅｔ  Ａ．；Ｃｈｅｕｎｇ，Ａｎｎｅ  Ｈ．；Ｂｒｏｏｋｓ，Ｊｅｒｒｙ  Ｒ．；Ｂｅｒｍａｎ，Ｃｈａｒｌｅｓ，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．（１９８６），２９（１１），２２９８−３１５。
【００８８】
窒素導入管、メカニカルスターラー、および熱電対温度計を備えた３Ｌフラスコに、７５ｇ（０．２２５ｍｏｌ）のラクタム２−１を入れた。１．１２Ｌのジクロロメタンを加え、続いてテトラメチルエチレンジアミン１０２ｍＬ（０．６７７ｍｏｌ）を加えた。溶液を、ドライアイス／アセトン浴を用いて−１４℃に冷却した。トリメチルシリルクロリド（５８ｍＬ、０．４５６ｍｏｌｅ）を、滴下ロートで５分間かけて加えた。次いで、ヨウ素（８４ｇ、０．３１１ｍｏｌｅ）を加えた。ドライアイス／アセトン浴を外し、反応混合物を周囲温度で２時間撹拌した。出発物質ラクタムが検出され得なくなるまで、反応をＨＰＬＣでモニターした。
【００８９】
反応を１１３０ｇの１０％亜硫酸ナトリウム水溶液で急冷した。混合物を２０分間撹拌すると、二相に分離した。有機層を真空下で濃縮し、アセトニトリル（５００ｍＬ）で洗い流した。最終的なスラリー（＜３５０ｍＬ）を室温で３０分間撹拌し、ろ過した。固体をアセトニトリル（８０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥機内で約２日間乾燥し、２−２の９５．２ｇ（８７％収率）を得た。
【００９０】
ｂ）２−２のフッ素化
【００９１】
【化５９】
2008540416.tif 000037
【００９２】
窒素導入管、メカニカルスターラー、および熱電対温度計を備えた１Ｌフラスコに、ヨードラクタム２−２（６１ｇ、０．１２６ｍｏｌｅ）を入れた。ジクロロメタン（５００ｍＬ）およびアセトニトリル（９７ｍＬ）を加えた。溶液にフッ化銀（Ｉ）（２３．７ｇ、０．１８７ｍｏｌｅ）を加えた。黄色スラリーを、出発物質がＨＰＬＣにより検出されなくなるまで（２４から３６時間）周囲温度で撹拌した。スラリーをセライトでろ過し、セライトをジクロロメタン（１００ｍＬ）で洗浄した。ろ液をＨＰＬＣで分析し、固体になるまで真空下で濃縮した。固体を真空乾燥機内で乾燥し、次の段階において使用した。
【００９３】
Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）を、ジクロロメタンの代わりに溶媒として使用してよい。窒素導入管、マグネチックスターラーバー、および熱電対温度計を備えた５０ｍＬフラスコに、ヨードラクタム（１．７３ｇ、９５ｗ％、３．５８ｍｍｏｌｅ）を入れた。Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（１７ｍＬ）を加えた。溶液にフッ化銀（Ｉ）（５０２ｍｇ、３．９５ｍｍｏｌｅ、１．１当量）を加えた。黄色スラリーを周囲温度で一晩撹拌した。ＬＣ分析は、完全な転化を示唆した。スラリーを、ジクロロメタン（１００ｍＬ）および食塩水（１０％、３０ｍＬ）を入れたフラスコに注ぎ入れた。混合物を周囲温度で３０分間撹拌し、セライトでろ過した。セライトをジクロロメタン（２０ｍＬ）で洗浄した。ろ液を相分離し、有機層をＨＰＬＣで分析した。有機層をオイルとなるまで濃縮した。水（１５ｍＬ）を滴下して加えた。スラリーを周囲温度で撹拌し、ろ過した。固体１．２５ｇを回収した（８３．５ｗｔ％、８３％のβ−フルオロラクタムおよび４．７％のα−フルオロラクタム）。
【００９４】
ｃ）２−３のメチル化
【００９５】
【化６０】
2008540416.tif 000038
【００９６】
窒素導入管、メカニカルスターラー、滴下ロート、および熱電対温度計を備えた１Ｌフラスコに、フルオロＮ−Ｈラクタム２−３（６２．１ｇ、０．１５７ｍｏｌｅ）、ＴＨＦ（３３６ｍＬ）、およびＤＭＦ（６７ｍＬ）を入れた。スラリー（Ｋｆ＝１９０ｐｐｍ）を、ドライアイス／アセトン浴を用いて−３０℃に冷却した。ｔ−ＢｕＯＫ（１．０Ｍ  ＴＨＦ溶液、１８９ｍＬ、０．１８９ｍｏｌｅ）を滴下ロートで１５分間かけて加え、バッチを−１５℃で２０分間熟成した。
【００９７】
バッチ温度は、滴下終点で−１５℃にまで上昇した。反応混合物は、ｔ−ＢｕＯＫの添加および熟成後に透明な溶液に変化した。ヨードメタン（ＭｅＩ）（１３．７ｍＬ、０．２２０ｍｏｌｅ）を滴下して加えた。冷却浴を滴下後に外し、バッチを周囲温度で１時間撹拌した。バッチを脱イオン水（ＤＩ水）（３７０ｍＬ）に注ぎ入れ、生じた溶液を真空下で濃縮してＴＨＦを除去した。濃縮終点で、バッチは、スラリーに変化した。このスラリーをＤＩ水（３７０ｍＬ）で希釈し、氷浴で冷却した。スラリーを５℃で３０分間撹拌し、ろ過した。固体をＤＩ水（１５０ｍＬ）で洗浄し、真空乾燥機内で４０℃で約２日間乾燥し、６３．９ｇ（１００％収率）の２−４を得、これを更に精製することなく次の段階に使用した。
【００９８】
ｄ）脱離反応
【００９９】
【化６１】
2008540416.tif 000039
【０１００】
窒素導入管、メカニカルスターラー、滴下ロート、および熱電対温度計を備えた１Ｌフラスコに、フルオロＮ−Ｍｅラクタム２−４（３６．０ｇ、０．０９３６ｍｏｌｅ）、ＴＨＦ（３６０ｍＬ）、およびメチルベンゼンスルフィナート（１５ｍＬ、０．１１５ｍｏｌｅ）を入れた。溶液（ＫＦ＝１１０ｐｐｍ）を、ドライアイス／アセトン浴を用いて４０℃に冷却した。反応混合物を、適切に脱気して、２−ケトＮ−Ｍｅラクタムの望まない生成につながる可能性がある外因性酸素を除かなければならない。リチウムビス（トリメチルシリル）アミド（ＬｉＨＭＤＳ）（１．０ＭＴＨＦ溶液、１２０ｍＬ、０．１２ｍｏｌｅ）を滴下ロートで１０分間を超えて加えた。反応混合物を−３０から１０℃で１時間撹拌した。
【０１０１】
バッチ温度は、ＬｉＨＭＤＳの添加後に−３０℃まで上昇した。反応は、通常この時点で完結する。完結しなければ、追加の試薬（ＬｉＨＭＤＳおよびメチルベンゼンスルフィナートを１０％追加）を加えて、反応を完結させることができる。
【０１０２】
バッチを室温まで加温し、１０％クエン酸水溶液（２７０ｍＬ）で急冷した。ＭＴＢＥ（ｔ−ブチルメチルエーテル）（５４０ｍＬ）およびジクロロメタン（５４０ｍＬ）を加えた。混合物を激しく撹拌して静置した。水層を捨てた。有機層を加熱して２時間還流し、その後、大気圧下で約半分の体積になるまで蒸留した。
【０１０３】
バッチを真空下で濃縮した。残渣にＭＴＢＥ（１００ｍＬ）を加えた。スラリーを加熱して３０分間還流した。ヘプタン（５０ｍＬ）を滴下ロートで滴下して加えながら、スラリーをゆっくりと室温まで冷却した。スラリーを室温で１時間撹拌した。更にヘプタン（１２０ｍＬ）を滴下して加えた。スラリーを室温で１時間撹拌して、ろ過した。固体をＭＴＢＥ／ヘプタン（１：１、６０ｍＬ）で洗浄し、真空下で乾燥し、生成物２−５の３０．５ｇが白色固体として得られた。
【０１０４】
２−ケトラクタムから生じる不純物は、再結晶により除去することができる。固体のメチルエステル（７．８ｇ）をイソプロピルアルコール（ＩＰＡ）１５ｍＬ中でスラリー化した。スラリーを８０℃に加熱した。ヘプタン（１５ｍＬ）を加えた。スラリーを８０℃で１時間撹拌して、室温まで冷却した。ヘプタン（４５ｍＬ）を滴下して加えた。スラリーを氷浴で冷却し、１時間撹拌し、ろ過し、精製した２−５の７．２ｇを固体として得た。（５α，１７β）−２−フルオロ−３−オキソ−４−メチル−４−アザアンドロスト−１−エン−１７−カルボン酸メチルエステル（２−５）。１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．１７（ｄ，１Ｈ）、３．６８（ｓ，３Ｈ）、３．４４（ｄｄ，１Ｈ）、２．９８（ｓ，１Ｈ）、２．３８（ｔ，１Ｈ）、２．１８−２．１１（ｍ，１Ｈ）、２．１０−２．０６（ｍ，１Ｈ）、２．０４−１．９７（ｍ，１Ｈ）、１．８９−１．８０（ｍ，２Ｈ）、１．７６−１．５５（ｍ，４Ｈ）、１．４５−１．２４（ｍ，４Ｈ）、１．１８−１．００（ｍ，３Ｈ）、０．９６（ｓ，３Ｈ）、０．６８（ｓ，３Ｈ）；１９Ｆ  ＮＭＲ：（３７６．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：−１３０．３。
【０１０５】
ｅ）エステル（２−５）の加水分解
【０１０６】
【化６２】
2008540416.tif 000040
【０１０７】
メチルエステルステロイド（１５．１５ｇ、９５．５ｗｔ％、０．０４１７ｍｏｌｅ）を、イソプロピルアルコール（７５ｍＬ）入りのフラスコに入れた。水酸化ナトリウム溶液を撹拌しながら加えた。スラリーを８０℃で３時間還流し、生じた溶液を、室温まで冷却した。
【０１０８】
該２相溶液のｐＨを、１Ｎ  ＨＣｌ（２２５ｍＬ）を撹拌しながら滴下して加えて、１に調節した。混合物の温度を、水浴を用いて２５℃未満に保持した。スラリーをろ過し、水（４０ｍＬ）で洗浄した。生成物を窒素下および真空下で一晩乾燥させて、２−６の１３．７９ｇが９５％の単離収率で得られた。（５α，１７β）−２−フルオロ−３−オキソ−４−メチル−４−アザアンドロスト−１−エン−１７−カルボン酸（２−６）。１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．２０（ｄ，１Ｈ）、３．４４（ｄｄ，１Ｈ）、２．９９（ｓ，１Ｈ）、２．４３（ｔ，１Ｈ）、２．１６−２．０９（ｍ，２Ｈ）、２．０５−１．９９（ｍ，１Ｈ）、１．９３−１．８２（ｍ，２Ｈ）、１．７８−１．５５（ｍ，４Ｈ）、１．４６−１．２５（ｍ，４Ｈ）、１．２２−１．０５（ｍ，４Ｈ）、１．００（ｓ，３Ｈ）、０．７２（ｓ，３Ｈ）；１９Ｆ  ＮＭＲ：（３７６．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：−１３０．３。
【０１０９】
ｆ）（１−５）と（２−６）とのカップリング
【０１１０】
【化６３】
2008540416.tif 000041
【０１１１】
窒素導入管およびマグネチックスターラーバーを備えた１００ｍＬフラスコに、ステロイド酸２−６（１２．１ｇ、０．０１５６ｍｏｌｅ）を入れた。アセトニトリル（６０ｍＬ）を加えた。スラリーに、３．８ｇ（０．０１７２ｍｏｌｅ）のアミン１−５、ＮＭＭ（６．９ｍＬ、０．０６２６ｍｏｌｅ）、ＤＭＡＰ（０．１９１ｇ、０．００１６ｍｏｌｅ）、およびＥＤＣ（３．５９ｇ、０．０１８７ｍｏｌｅ）を加えた。スラリーを周囲温度で一晩撹拌した。次いで、反応混合物を水（３００ｍＬ）に注ぎ入れた。混合物のｐＨを６Ｎ  ＨＣｌ溶液で２に調節した。透明な黄色溶液が、この時点で得られた。溶液を真空下で濃縮してスラリーを得た。スラリーを室温で１時間撹拌し、ろ過した。固体を水洗し、固体６．９ｇを得た（８２．５％収率）。該固体をＩＰＡ（１０ｍＬ）およびアセトン（６０ｍＬ）中でスラリー化した。混合物を加熱して、５時間還流し、室温まで冷却して、２時間撹拌し、ろ過した。該固体をアセトンで洗浄して、２−７を５．９２ｇ得た。（２−７、マススペクトル、測定値［Ｍ＋Ｈ］：４８０．２７６３）
【０１１２】
別法として、ＣＤＩを、カップリング反応の活性化剤として使用できる。ステロイド酸２−６（５００ｍｇ、１．４３ｍｍｏｌｅ）をアセトニトリル（５ｍＬ）中でスラリー化した。ＣＤＩを周囲温度で加えた。反応混合物を周囲温度で３時間撹拌した。１−５（３５０ｍｇ、１．５８ｍｍｏｌｅ）を加え、続いてＮ−メチルモルホリン（０．３５ｍＬ、３．１７ｍｍｏｌｅ）を加えた。スラリーを加熱して、３時間還流し、その後周囲温度まで冷却して、一晩撹拌した。反応混合物をＭｅＯＨ（２８ｍＬ）に溶解し、６１８ｍｇの生成物を分析した（９０％収率）。
【実施例３】
【０１１３】
Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）を利用したフッ素化アザステロイド（２−４）の調製
【０１１４】
【化６４】
2008540416.tif 000042
【０１１５】
ａ）２−１Ａのヨウ素化
【０１１６】
【化６５】
2008540416.tif 000043
【０１１７】
ヨウ素化段階は、実施例２において記載されたヨウ素化と同様に実施される。
【０１１８】
ｂ）３−を生成する２−２のフッ素化
【０１１９】
【化６６】
2008540416.tif 000044
【０１２０】
２５ｍＬフラスコに２−２（１．４５ｇ、９３重量％、２．９ｍｍｏｌｅ）を入れた。ＤＭＦ（１５ｍＬ）および水（１．５ｍＬ）を加えた。反応混合物を１１０℃に加熱し、４時間撹拌した。混合物に飽和ＮａＨＣＯ３溶液（５ｍＬ）およびＭｅＯＨ（８ｍＬ）を加えた。反応混合物を６０℃で３時間撹拌し、室温まで冷却し、水（８０ｍＬ）に注ぎ入れた。混合物を真空下で濃縮して、ＭｅＯＨを除去した。スラリーを、室温で３０分間撹拌し、ろ過した。固体（３−１）を水洗し、真空下で乾燥し、生成物８６０ｍｇを白色固体として得た。ｍｐ：２８４．７−２８６．０℃；１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：６．４７（ｂｒ，１Ｈ）、４．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝４．７，１０．１Ｈｚ）、３．７６（ｓ，１Ｈ）、３．６６（ｓ，３Ｈ）、３．０５（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝２．６，３．８，１２．３Ｈｚ）、２．３４（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．３Ｈｚ）、２．１８−１．９４（ｍ，３Ｈ）、１．８６−１．６４（ｍ，５Ｈ）、１．５８−１．２０（ｍ，６Ｈ）、１．１１−０．９３（ｍ，２Ｈ）、０．８７−０．８１（ｍ，１Ｈ）、０．８５（ｓ，３Ｈ）、０．６４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ：（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１７４．９、１７４．３、６５．４、５８．４、５５．３、５５．１、５１．８、５１．３、４４．２、４３．２、３８．１、３７．５、３５．０、２９．６、２６．３、２４．３、２３．５、２１．４、１３．８、１３．５。ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ２０Ｈ３２ＮＯ４（［Ｍ＋Ｈ］＋）の計算値  ３５０．２３３１、測定値  ３５０．２３２８。
【０１２１】
１０ｍＬフラスコに３−１（２２０ｍｇ、０．６３ｍｍｏｌｅ）を入れた。ジクロロメタン（２ｍＬ）を加えた。Ｄｅｏｘｏ−Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（５０重量％トルエン溶液、３１０ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌｅ、１．１当量）を加えた。反応混合物を室温で２時間撹拌し、飽和ＮａＨＣＯ３溶液で急冷した。混合物をＥｔＯＡｃで抽出した。有機層を真空下で濃縮し、残渣をシリカゲル上でのカラムクロマトグラフィー（移動相として２０％アセトンＣＨ２Ｃｌ２溶液）により精製し、生成物１５５ｍｇを白色固体として得た（２−４）。ｍｐ：２６９．３−２７０．１℃；１Ｈ  ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：７．１５（ｂｒ，１Ｈ）、４．８７（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝７．４，１０．８，４６．８Ｈｚ）、３．６４（ｓ，３Ｈ）、３．１７（ｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝３．６，１２．５Ｈｚ）、２．４６（ｄｄｄ，１Ｈ，Ｊ＝１．５，７．５，１２．５Ｈｚ）、２．３３（ｔ，１Ｈ，Ｊ＝９．４Ｈｚ）、２．１５−１．９７（ｍ，２Ｈ）、１．８３−１．５１（ｍ，６Ｈ）、１．４７−１．２０（ｍ，５Ｈ）、１．１５−１．０８（ｍ，１Ｈ）、１．０３−０．８７（ｍ，２Ｈ）、０．９６（ｓ，３Ｈ）、０．６４（ｓ，３Ｈ）；１３Ｃ  ＮＭＲ：（１００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：１７４．２、１６８．９、１６８．７、８６．７、８４．９、６１．１、５５．１、５５．０、５１．２、５０．９、４４．１、４０．７、４０．５、３８．０、３７．９、３７．９、３４．３、２９．３、２６．３、２４．２、２３．５、２１．０、１３．５、１２．３；１９Ｆ  ＮＭＲ：（３７６．５ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ：−１９２．４。ＨＲ−ＭＳ  ｍ／ｚ  Ｃ２０Ｈ３１ＮＯ４Ｆ（［Ｍ＋Ｈ］＋）の計算値  ３５２．２２８８、測定値  ３５２．２２９０。
【０１２２】
２−４から出発し、実施例２の段階ｄ−ｆで概説したのと類似の化学反応を用いて、最終アザステロイド生成物２−７を合成する。
【０１２３】
以下の分析を用いて、本発明で調製できる組織選択的アンドロゲン受容体修飾薬の活性を特徴づける。
【０１２４】
ＳＡＲＭ活性を有する化合物の同定のためのインビトロおよびインビボアッセイ
１．内因性に発現したＡＲ物質に関する化合物親和性の、ヒドロキシアパタイト系放射性リガンド置換アッセイ：
結合バッファー：ＴＥＧＭ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ベータ−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  モリブデン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）
５０％  ＨＡＰスラリー：Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社製ヒドロキシアパタイト、高速流量、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ中、ｐＨ  ８．０、および１ｍＭ  ＥＤＴＡ。
洗浄バッファー：４０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ  ７．５、１００ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、および１ｍＭ  ＥＧＴＡ。
９５％ＥｔＯＨ
メチルトリエノロン、［１７α−メチル−３Ｈ］、（Ｒ１８８１＊）；ＮＥＮ  ＮＥＴ５９０
メチルトリエノロン（Ｒ１８８１）、ＮＥＮ  ＮＬＰ００５（９５％ＥｔＯＨ中に溶解）
ジヒドロテストステロン（ＤＨＴ）［１，２，４，５，６，７−３Ｈ（Ｎ）］  ＮＥＮ  ＮＥＴ４５３
ヒドロキシアパタイト高速流量；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃａｔ♯３９１９４７
モリブデン酸塩＝モリブデン酸（Ｓｉｇｍａ社、Ｍ１６５１）
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞培養培地：
ＲＰＭＩ  １６４０（Ｇｉｂｃｏ  １１８３５−０５５）ｗ／２３．８ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン
完全培地５００ｍＬ中                          最終濃度
１０ｍＬ（１Ｍ  Ｈｅｐｅｓ）                  ２０ｍＭ
５ｍＬ（２００ｍＭ  Ｌ−ｇｌｕ）              ４ｍＭ
０．５ｍＬ（１０ｍｇ／ｍＬ  ヒトインスリン）  １０μｇ／ｍＬ
０．０１Ｎ  ＨＣｌ中、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ♯４０７６９４−Ｓ）
５０ｍＬ  ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社  Ｆ２４４２）  １０％
１ｍＬ（１０ｍｇ／ｍＬ  ゲンタマイシン        ２０μｇ／ｍＬ
Ｇｉｂｃｏ♯１５７１０−０７２）
細胞継代：
細胞（Ｈａｌｌ  Ｒ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，３０Ａ：４８４−４９０（１９９４））をＰＢＳ中で２回すすぎ、フェノールレッドを含まないトリプシン−ＥＤＴＡを同じＰＢＳ中で１：１０に希釈する。細胞層を１Ｘトリプシンですすぎ、過剰のトリプシンを注ぎ出し、細胞層を、３７℃で約２分間温置する。フラスコを軽くたたき、細胞分離の兆候を確認する。細胞がフラスコから滑り落ちるようになった時点で、完全培地を加えてトリプシンを破壊する。この時点で細胞を計数し、次いで、適切な濃度まで希釈し、その後の培養のためにフラスコまたはシャーレに分割する（通常、１：３から１：６の希釈）。
【０１２５】
ＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞可溶化液の調製
ＭＤＡ細胞が７０％から８５％集密している場合、それら細胞を上述のように剥離させ、４℃で１０分間、１０００ｇでの遠心分離により集める。細胞ペレットを、ＴＥＧＭ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０％グリセロール、１ｍＭ  ベータ−メルカプトエタノール、１０ｍＭ  モリブデン酸ナトリウム、ｐＨ  ７．２）で２回洗浄する。最後の洗浄後、細胞を１０７細胞数／ｍＬの濃度でＴＥＧＭ中に再懸濁する。細胞懸濁液を、液体窒素中またはエタノール／ドライアイス浴中で急速冷凍し、ドライアイス上の−８０℃フリーザーに移す。結合アッセイの開始前に、冷凍試料を氷水上に放置して、そのまま解凍する（〜１時間）。次いで、試料を４℃で３０分間、１２５００ｇから２００００ｇで遠心分離する。上澄みを用いて、すぐにアッセイを開始する。上澄み５０μＬを使用する場合、試験化合物をＴＥＧＭ緩衝液５０μＬ中で調製できる。
【０１２６】
多項目化合物スクリーニング手順：
１ｘＴＥＧＭ緩衝液を調製し、同位体含有アッセイ混合物を以下の順序で調製する。ＥｔＯＨ（２％反応最終濃度）、３Ｈ−Ｒ１８８１または３Ｈ−ＤＨＴ（０．５ｎＭ反応最終濃度）および１ｘＴＥＧＭ。［例えば１００試料に対して、ＥｔＯＨ２００μＬ（１００ｘ２）＋１：１０  ３Ｈ−Ｒ１８８１原液４．２５μＬ＋１ｘＴＥＧＭ２３００μＬ（１００ｘ２３）］。化合物を逐次希釈する。例えば、開始最終濃度が１μＭおよび化合物が溶液２５μＬ中にある場合、繰り返し試料について、４ｘ１μＭ溶液７５μＬを作成し、１００μＭの３μＬを緩衝液７２μＬに加え、１：５逐次希釈を行う。
【０１２７】
３Ｈ−Ｒ１８８１トレース２５μＬおよび化合物溶液２５μＬを第１に一緒に混合し、続いて受容体溶液５０μＬを加える。反応系を穏やかに混合し、約２００ｒｐｍで短時間撹拌し、４℃で一晩温置する。５０％ＨＡＰスラリー１００μＬを調製して温置反応系に加え、次いで、渦巻攪拌し、氷上で５分から１０分間温置する。反応混合物を更に２回渦巻攪拌して、反応系を温置しながらＨＡＰを再懸濁させる。次いで、９６ウェルフォーマット中の試料を、Ｔｈｅ  ＦｉｌｔｅｒＭａｔｅ（登録商標）Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｈａｒｖｅｓｔｅｒプレート洗浄器（Ｐａｃｋａｒｄ社）を用いて洗浄緩衝液中で洗浄する。洗浄工程は、リガンド結合発現された受容体を含むＨＡＰペレットをＵｎｉｆｉｌｔｅｒ−９６ＧＦ／Ｂフィルタープレート（Ｐａｃｋａｒｄ社）に移送する。ＴｏｐＣｏｕｎｔマイクロシンチレーションカウンター（Ｐａｃｋａｒｄ社）で計数する前に、フィルタープレート上のＨＡＰペレットを、ＭＩＣＲＯＳＣＩＮＴシンチレーター（Ｐａｃｋａｒｄ社）５０μＬを用いて３０分間温置する。ＩＣ５０を、Ｒ１８８１を基準として計算する。本発明の組織選択性アンドロゲン受容体修飾薬は、１マイクロモル濃度以下のＩＣ５０値を示した。
【０１２８】
２．ＭＭＰ１プロモーター抑制、一過性形質移入アッセイ（ＴＲＡＭＰＳ）
ＨｅｐＧ２細胞を、１０％活性炭処理ＦＣＳを含有する、フェノールレッドを含まないＭＥＭ中、５％ＣＯ２を用いて３７Ｃで培養する。形質移入用に、細胞を９６ウェルの白色透明底プレート内に１００００細胞数／ウェルで平板接種する。２４時間後、製造者により推奨されたプロトコルに従って、細胞をＦｕＧＥＮＥ６形質移入試薬を用いて、ＭＭＰ１プロモーター・ルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトおよびアカゲザル発現コンストラクト（５０：１比）と共に同時導入する。ＭＭＰ１プロモーター・ルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクトを、ヒトＭＭＰ１プロモーター・フラグメント（−１７９／＋６３）をｐＧＬ２ルシフェラーゼ・レポーター・コンストラクト（Ｐｒｏｍｅｇａ社）中に挿入することにより生成し、アカゲザルＡＲ発現コンストラクトを、ＣＭＶ−Ｔａｇ２Ｂ発現ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）内で生成する。細胞を更に２４時間培養し、その後細胞を、試験化合物を用いて、ＭＭＰ１プロモーターの基礎活性を増加させるために用いる１００ｎＭのホルボール−１２−ミリステート−１３−アセテート（ＰＭＡ）の存在下で処理する。化合物をこの時点で、１０００ｎＭから０．０３ｎＭの範囲、１０希釈で、１０Ｘの濃度、１／１０の体積で加える（例：１０マイクロリットルのリガンドを１０倍で、既にウェル内にある１００マイクロリットルの培地に加える）。細胞を、追加の４８時間さらに培養する。細胞を、その後ＰＢＳで２回洗浄し、溶解緩衝液（１ｘ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）７０μＬをウェルに加えることで溶解する。ルシフェラーゼ活性を、１４５０  Ｍｉｃｒｏｂｅｔａ  Ｊｅｔ照度計（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ社）を用いて、９６ウェルフォーマット内で測定する。試験化合物の活性は、ＰＭＡ促進の対照レベルからのルシフェラーゼシグナルの抑制として現れる。ＥＣ５０値およびＥｍａｘ値が、記録される。本発明の組織選択性アンドロゲン受容体修飾薬は、一般にμＭ以下のＥＣ５０値および約５０％を超えるＥｍａｘ値で抑制作用を活性化する。
【０１２９】
参考文献：
ａ．Ｎｅｗｂｅｒｒｙ  ＥＰ，Ｗｉｌｌｉｓ  Ｄ，Ｌａｔｉｆｉ  Ｔ，Ｂｏｕｄｒｅａｕｘ  ＪＭ，Ｔｏｗｌｅｒ  ＤＡ，“Ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｃｏｌｌａｇｅｎａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ｂｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｅｔｓ−ＡＰ１  ｅｌｅｍｅｎｔ，”  Ｍｏｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．  １１：１１２９−４４（１９９７）。
ｂ．Ｓｃｈｎｅｉｋｅｒｔ  Ｊ，Ｐｅｔｅｒｚｉｅｌ  Ｈ，Ｄｅｆｏｓｓｅｚ  ＰＡ，Ｋｌｏｃｋｅｒ  Ｈ，Ｌａｕｎｏｉｔ  Ｙ，Ｃａｔｏ  ＡＣ，“Ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−Ｅｔｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｉｓ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｆｏｒ  ｓｔｅｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｏｗｎ−ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．  ２７１：２３９０７−２３９１３（１９９６）。
【０１３０】
３．アンドロゲン受容体のＮ−末端領域とＣ−末端領域とのリガンド誘導相互作用に関する哺乳動物二重ハイブリッドアッセイ（アゴニストモード）
本アッセイは、活性化アンドロゲン受容体により介在されるインビボ男性化ポテンシャルを反映するｒｈＡＲのＮ−末端領域（ＮＴＤ）とＣ−末端領域（ＣＴＤ）との相互作用を誘導するＡＲアゴニストの活性を評価する。ｒｈＡＲのＮＴＤとＣＴＤとの相互作用は、ＣＶ−１サル腎臓細胞における哺乳動物二重ハイブリッドアッセイと同様に、Ｇａｌ４ＤＢＤ−ｒｈＡＲＣＴＤ融合タンパク質とＶＰ１６−ｒｈＡＲＮＴＤ融合タンパク質との間のリガンド誘導の会合として定量化される。
【０１３１】
形質移入の前日に、ＣＶ−１細胞をトリプシン処理して計数し、次いで、細胞を、９６ウェルプレート内またはより大きなプレート内（従って、スケールアップとなる）のＤＭＥＭ＋１０％ＦＣＳ中に２００００細胞数／ウェルで平板接種する。翌朝、ＣＶ−１細胞を、製造元が推奨する手順に従って、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ＰＬＵＳ試薬（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を用いて、ｐＣＢＢ１（ＳＶ４０早期プロモーター下で発現するＧａｌ４ＤＢＤ−ｒｈＡＲＬＢＤ融合コンストラクト）、ｐＣＢＢ２（ＳＶ４０早期プロモーター下で発現するＶＰ１６−ｒｈＡＲ  ＮＴＤ融合コンストラクト）およびｐＦＲ（Ｇａｌ４応答性ルシフェラーゼ・レポーター、Ｐｒｏｍｅｇａ社）と共に同時導入する。短時間で、０．０５μｇのｐＣＢＢ１、０．０５μｇのｐＣＢＢ２および０．１μｇのｐＦＲのＤＮＡ混合物を、“ＰＬＵＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ”（１．６μＬ、ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）と混合した３．４μＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）中に混合し、室温（ＲＴ）で１５分間温置して、前複合型ＤＮＡを形成する。
【０１３２】
各ウェルについて、０．４μＬ  ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社）を二次チューブ内の４．６μＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ中に希釈し、混合して希釈ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬を形成する。前複合型ＤＮＡ（上記）および希釈ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ試薬（上記）を合わせて混合し、室温で１５分間温置する。細胞上の培地を、４０μＬ／ウェルのＯＰＴＩ−ＭＥＭで置換し、１０μＬ  ＤＮＡ−脂質複合物を各ウェルに加える。複合物を培地中に穏やかに混ぜ込み、３７℃、５％ＣＯ２で５時間温置する。温置に続いて、２００μＬ／ウェルのＤ−ＭＥＭおよび１３％活性炭処理ＦＣＳを加え、続いて３７℃、５％ＣＯ２で温置する。２４時間後、試験化合物を、所望の濃度（１ｎＭ−１０μＭ）で加える。４８時間後、製造者のプロトコルに従って、ルシフェラーゼ活性をＬＵＣスクリーンシステム（ＴＲＯＰＩＸ社）を用いて測定する。本アッセイは、アッセイ溶液１と、それに続くアッセイ溶液２各５０μＬの連続添加により、ウェル内で直接実施される。室温で４０分間のインキュベーション後、発光を２から５秒積算で直接測定する。
【０１３３】
試験化合物の活性は、３ｎＭのＲ１８８１を用いて得られた活性に対するＥｍａｘ値として計算される。本発明の典型的な組織選択性アンドロゲン受容体修飾薬は、弱いアゴニスト活性を示すかまたは全く示さず、本アッセイにおいて１０マイクロモル濃度で５０％未満のアゴニスト活性を示す。
【０１３４】
参考文献：
Ｈｅ  Ｂ，Ｋｅｍｐｐａｉｎｅｎ  ＪＡ，Ｖｏｅｇｅｌ  ＪＪ，Ｇｒｏｎｅｍｅｙｅｒ  Ｈ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＥＭ，“Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎｔｅｒ−ｄｏｍａｉｎ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＮＨ（２）−ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３７２１９−３７２２５（１９９９）。
【０１３５】
４．アンドロゲン受容体のＮ−末端領域とＣ−末端領域との相互作用阻害に関する哺乳動物二重ハイブリッドアッセイ（アンタゴニストモード）
本アッセイは、上述と同様にＣＶ−１細胞における哺乳動物二重ハイブリッドアッセイにおけるｒｈＡＲのＮＴＤとＣＴＤとの相互作用に対するＲ１８８１の促進作用と拮抗する試験化合物の活性を評価する。
【０１３６】
形質移入の４８時間後、ＣＶ−１細胞を試験化合物で、典型的には１０μＭ、３．３μＭ、１μＭ、０．３３μＭ、１００ｎＭ、３３ｎＭ、１０ｎＭ、３．３ｎＭおよび１ｎＭの最終濃度で処理する。３７℃、５％ＣＯ２で１０から３０分間温置後、ＡＲアゴニストのメチルトリエノロン（Ｒ１８８１）を０．３ｎＭ最終濃度に加え、３７℃で温置する。４８時間後、製造者により推奨されるプロトコルに従って、ルシフェラーゼ活性をＬＵＣスクリーンシステム（ＴＲＯＰＩＸ社）を用いて測定する。Ｒ１８８１の作用と拮抗する、試験化合物の活性を、０．３ｎＭのＲ１８８１単独での値と比較した相対的発光として計算する。
【０１３７】
５．アンドロゲン受容体のトランス活性化調節（ＴＡＭＡＲ）
本アッセイは、ヒトＡＲを自然に発現するヒト乳がん株細胞であるＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞内で、ＭＭＴＶ−ＬＵＣレポーター遺伝子からの転写を制御するという試験化合物の活性を評価する。該アッセイは、ＬＵＣレポーター遺伝子に結合する、修飾ＭＭＴＶ  ＬＴＲ／プロモーターの誘導を測定する。
【０１３８】
２００００から３００００細胞数／ウェルを、９６ウェルの白色透明底プレート内で、１０％ＦＢＳ、４ｍＭ  Ｌ−グルタミン、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１０ｕｇ／ｍＬヒトインスリンおよび２０ｕｇ／ｍＬゲンタマイシンを含有する、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ  １６４０からなる「指数関数的増殖培地」中に平板接種する。インキュベーターの条件は、３７℃および５％ＣＯ２である。形質移入を、バッチモードで行う。細胞をトリプシン処理し、新鮮な培地の適量中の正確な細胞数まで計数し、次いで、Ｆｕｇｅｎｅ／ＤＮＡカクテル混合物と穏やかに混合し、９６ウェルプレート上に平板接種する。ウェルはすべて、培地＋脂質／ＤＮＡ複合物の２００Ｔｌを入れてあり、次いで、３７℃で一晩温置する。形質移入カクテルは、血清を含まないＯｐｔｉｍｅｍ、Ｆｕｇｅｎｅ６試薬およびＤＮＡからなる。製造者（Ｒｏｃｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ社）のカクテル準備プロトコルは次のようである。脂質（Ｔｌ）のＤＮＡ（Ｔｇ）に対する比率は、ほぼ３：２であり、温置時間は、室温で２０分である。形質移入後１６時間から２４時間で、細胞を最終ＤＭＳＯ（媒体）濃度が３％未満になるように、試験化合物で処理する。該細胞を、試験化合物に４８時間曝露する。４８時間後、細胞をＰｒｏｍｅｇａ細胞培養溶解緩衝液で３０から６０分間溶解し、その後抽出物中のルシフェラーゼ活性を、９６ウェルフォーマット照度計内でアッセイする。
【０１３９】
試験化合物の活性は、１００ｎＭのＲ１８８１に関して得られる活性に対するＥｍａｘ値として計算される。
【０１４０】
参考文献：
ａ．Ｒ．Ｅ．Ｈａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，“ＭＤＡ−ＭＢ−４５３，ａｎ  ａｎｄｒｏｇｅｎ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，３０Ａ：４８４−４９０（１９９４）。
ｂ．Ｒ．Ｅ．Ｈａｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｄｒｏｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｓｔｅｒｏｉｄｓ  ａｎｄ  ｒｅｔｉｎｏｉｃ  ａｃｉｄ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｂｒｅａｓｔ−ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ，”  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５２：７７８−７８４（１９９２）。
【０１４１】
６．インビボ前立腺アッセイ
性成熟の最初期齢である９から１０週齢のオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを、予防モードで使用する。目的は、アンドロゲン様化合物が、精巣の除去（精巣摘出術［ＯＲＸ］）後７日間内に起こる腹側前立腺および精嚢の急速劣化（〜−８５％）を遅延させる度合いを測定することである。
【０１４２】
ラットは、精巣摘出（ＯＲＸ）される。各ラットを計量し、次いで作用が持続されるイソフルランガスにより麻酔する。陰嚢において１．５ｃｍの体軸方向の切開を行う。右睾丸を露出させる。精巣動脈および輸精管を、４．０絹糸を用いて睾丸から０．５ｃｍ近接して結紮する。睾丸を結紮部位に対して遠位側で、小型手術鋏の一回切断により除去する。組織断端を陰嚢内に戻す。同様の処置を左睾丸について繰り返す。両断端を陰嚢内に戻したならば、陰嚢および被覆している皮膚を４．０絹糸で縫合閉鎖する。偽ＯＲＸについては、結紮および鋏切除を除いたすべての手順を完了する。ラットは、意識および十分な運動性を１０から１５分以内に完全に回復する。
【０１４３】
試験化合物の用量は、外科的切開が縫合された直後に、ラットに対して皮下または経口で投与される。処置は、更に６連続日継続する。
【０１４４】
解剖および評価項目：
ラットを初めに計量し、次いでＣＯ２チャンバー内で瀕死となるまで麻酔する。約５ｍｌの全血を心穿刺により採取する。次いで、このラットを、死亡およびＯＲＸの完全性の確実な兆候について検査する。次に、前立腺の腹側部分を特定し、高度に定型化した方式において末端をそろえて解剖切除する。腹側前立腺を３から５秒間拭き取って乾かし、次いで計量する（ＶＰＷ）。最後に、精嚢を置き、解剖切除する。腹側精嚢を３から５秒間拭き取って乾かし、次いで計量する（ＳＶＷＴ）。
【０１４５】
本アッセイの一次データは、腹側前立腺および精嚢の重量である。二次データは、血清ＬＨ（黄体形成ホルモン）およびＦＳＨ（卵胞刺激ホルモン）、ならびに骨形成および男性化の可能性のある血清マーカーを含む。データを、ＡＮＯＶＡ  ＋  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＬＳＤ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験により分析して、集団間相違を特定する。試験化合物がＯＲＸ誘導されたＶＰＷおよびＳＶＷＴの減少をどの程度まで抑制するかを、評価する。
【０１４６】
７．インビボ骨形成アッセイ
７から１０月齢のメスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを処置モードで用いて、成人ヒト女性をシミュレートする。ラットを、７５から１８０日前に卵巣摘出（ＯＶＸ）して骨量減少を起こし、エストロゲン欠乏症で、骨減少症の成人ヒト女性をシミュレートした。強力な再吸収抑制剤、アレンドロネートの低量投与による前処置（０．００２８ｍｐｋ  ＳＣ、２Ｘ／ｗｋ）を、０日目に開始する。１５日目に試験化合物による処置を開始する。試験化合物処置を１５から３１日目に実施し、３２日目に解剖する。目的は、蛍光色素標識の増加により示される、アンドロゲン様化合物による骨膜表面での骨形成量の増加がどの程度であるかを測定することである。
【０１４７】
典型的なアッセイにおいて、各々７匹のラットの９群で試験をする。
【０１４８】
１９日目および２９日目（処置の５日目および１５日目）に、カルセインの単独皮下注射（８ｍｇ／ｋｇ）をそれぞれのラットに行う。
【０１４９】
解剖および評価項目：
ラットを初めに計量し、次いでＣＯ２チャンバー内で瀕死となるまで麻酔する。約５ｍｌの全血を心穿刺により採取する。次いでラットを、死亡およびＯＶＸの完全性の確実な兆候について検査する。初めに、子宮を特定し、高度に定型化した方式において末端をそろえて解剖切除し、３から５秒間拭き取って乾かし、次いで、計量する（ＵＷ）。子宮を１０％中性緩衝ホルマリン中に置く。次に、右脚を臀部で解体する。大腿骨および頸骨を、踵部で分離し、十分に筋肉除去し、次いで、７０％エタノール中に置く。
【０１５０】
大腿骨の中央部近位−遠位中間点を含む中央右大腿骨の１ｃｍ切片をシンチレーションバイアル内に置き、等級付きアルコールおよびアセトン中で脱水ならびに脱脂し、次いで、メチルメタクリレートの濃度を増加させた溶液に導入する。該切片を９０％メチルメタクリレートと１０％ジブチルフタレートとの混合物中に埋め込み、４８から７２時間の時間にわたって重合させる。ビンを割り、プラスチック塊を、断面検査用に調製された骨の長軸を中心に、Ｌｅｉｃａ  １６００  ソー・ミクロトームの万力様試料ホルダーに都合よく適合する形状に削って整える。８５μｍ厚の断面試料３片を調製し、ガラススライド上に載せる。各ラットから、骨の中間点に近接する一切片を選択し、遮光する。各切片の骨膜表面を、全骨膜表面、単一蛍光色素標識、二重蛍光色素標識、および標識間距離に関して評価する。
【０１５１】
本アッセイの一次データは、二重標識を持つ骨膜表面の百分率、および骨形成の半独立マーカーである石灰化速度（標識間距離（μｍ）／１０ｄ）である。二次データは、子宮重量および組織学的特徴を含む。三次的評価項目は、骨形成および男性化の血清マーカーを含んでよい。データを、ＡＮＯＶＡ  ＋  Ｆｉｓｈｅｒ  ＰＬＳＤ  ｐｏｓｔ−ｈｏｃ試験により分析して、群間相違を特定する。試験化合物がどの程度まで骨形成の評価項目を増加させるのかが、評価される。
【０１５２】
前述の明細書は、本発明の原理を、例証の目的で提供された実施例を用いて教示するものである一方、本発明の実施は、別書類の特許請求の範囲およびその均等物の範囲内に入るとおりの、通常の改変、適用、または変更のすべてを包含するものと理解されたい。
【国際調査報告】
2008540416.tif 000069
2008540416.tif 000070
2008540416.tif 000071