(57)【要約】  本発明は、水平開口部を有する疎水性仕切り壁によって２つのチャンバに分割され、それらのチャンバが、電解質溶液を収容し、かつ前記開口部が、脂質二重層によって閉じられることを特徴とする、細胞または小胞の少なくとも１つの特性を測定するための測定装置に関する。本発明は、少なくとも１つの細胞または１つの小胞が、脂質二重層と接触することを特徴とする。本発明は、測定装置の使用を含む方法にも関し、かつ測定装置に適した全てのアレー、測定チャンバ、および微量滴定プレートにも関する。
2008518594.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞または小胞の少なくとも１つの特性を確定するための測定装置であって、該測定装置が、水平開口部を有する疎水性仕切り壁によって、電解質溶液を収容する２つのチャンバに仕切られることによって特徴づけられ、前記開口部が、脂質二重層によって閉じられ、少なくとも１つの細胞または１つの小胞が、脂質二重層と接触することを特徴とする測定装置。
【請求項２】
前記少なくとも１つの細胞または小胞の膜が、脂質二重層と少なくとも部分的に融合することを特徴とする、請求項１に記載の測定装置。
【請求項３】
前記開口部が、０．１μｍから１００μｍの直径を有することを特徴とする、請求項１または２に記載の測定装置。
【請求項４】
前記疎水性仕切り壁が、高分子フィルムであることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項５】
前記疎水性仕切り壁が、テフロン（登録商標）、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ、ＰＤＭＳ、またはトパーズから作られることを特徴とする、請求項１から４のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項６】
前記脂質二重層が、合成および／または精製された生物学的脂質から構成されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項７】
回路が、測定装置を介して、かつ脂質二重層を介して適用されてきていることを特徴とする、請求項１から６のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項８】
少なくとも部分的に光学的に透明な材料から構成されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一項に記載の測定装置。
【請求項９】
請求項１から８のいずれか一項に記載の測定装置を使用して、細胞または小胞の特性を確定する方法。
【請求項１０】
水平開口部を有する疎水性仕切り壁によって分離される、２つのチャンバを備える測定装置を使用して、細胞の特性を確定する方法であって、
開口部を閉じる脂質二重層が、開口部内に配置され、
生理的緩衝溶液が、両方のチャンバに加えられ、
少なくとも１つの細胞が、前記脂質二重層の片側に接触させられ、
光学的特性が、測定され、かつ／または電極が、両方のチャンバ内に配置され、かつ電気的特性が測定される、方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの特性が、細胞膜の光学的または電気生理学的特性であることを特徴とする、請求項１から８のいずれか一項に記載の測定装置、または請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記小胞が、細胞小器官、蛋白リポソーム、および／または細胞または細胞小器官膜の小胞状の断片であることを特徴とする、請求項１から１１のいずれか一項に記載の測定装置、または請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
生物学的巨大分子が、前記脂質二重層に含まれる、または前記脂質二重層に結合されることを特徴とする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の測定装置、または請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
自動化された方法として実施されることを特徴とする、請求項９から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１から８のいずれか一項に記載の少なくとも２つの測定装置から構成される、細胞または小胞の特性を自動的に確定するためのアレー。
【請求項１６】
各々、横壁（４）を備える第１の空洞（１１、１５）を有する２つの並置された測定チャンバを備える、２重測定チャンバであって、
底部（１）を有する接続する第２の空洞（１２）が、２つの第１の空洞（１１、１５）の下に配置され、
前記第１の空洞（１５）が、開口部（１４）を介して前記第２の空洞（１２）と接続され、
第１の空洞（１１）が、疎水性仕切り壁（３）によって第２の空洞（１２）から分離され、
前記疎水性仕切り壁（３）が、前記第１の空洞（１１）が前記第２の空洞（１２）と接続されるように、０．１μｍから１００μｍの直径を有する測定開口部（１３）を含み、
電極（２１、２２）が、第１の空洞（１１）および（１５）の各々内に含まれることを特徴とする、２重測定チャンバ。
【請求項１７】
請求項１６に記載の２重測定チャンバ、およびさらに第１の空洞（１６）を有する第３の測定チャンバから構成される３重測定チャンバであって、
接続する第２の空洞（１２）が、３つの第１の空洞（１１、１５、１６）の下に存在し、
第１の空洞（１６）が、開口部（１７）を介して第２の空洞（１２）と接続される、３重測定チャンバ。
【請求項１８】
前記開口部（１４）または（１７）が、１０μｍから５ｍｍの直径を有することを特徴とする、請求項１６または１７に記載の２重または３重測定チャンバ。
【請求項１９】
前記疎水性仕切り壁（３）が、高分子シートであることを特徴とする、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の２重または３重測定チャンバ。
【請求項２０】
前記疎水性仕切り壁（３）が、テフロン（登録商標）、ポリカーボネート、ＰＭＭＡ、ＰＤＭＳ、またはトパーズから作られることを特徴とする、請求項１６から１９のいずれか一項に記載の２重または３重測定チャンバ。
【請求項２１】
脂質二重層が、測定開口部（１３）を横切って跨っていることを特徴とする、請求項１６から２０のいずれか一項に記載の２重または３重測定チャンバ。
【請求項２２】
前記脂質二重層が、合成および／または精製された天然脂質から構成されることを特徴とする、請求項２１に記載の２重または３重測定チャンバ。
【請求項２３】
回路が、測定装置を介して適用されることを特徴とする、請求項１６から２２のいずれか一項に記載の２重または３重測定チャンバ。
【請求項２４】
前記底部（１）が、光学的に透明な材料から構成されることを特徴とする、請求項１６から２３のいずれか一項に記載の２重または３重測定チャンバ。
【請求項２５】
前記第２の空洞（１２）が、相互接続されることを特徴とする、請求項１６から２４のいずれか一項に記載の少なくとも２つの２重または３重測定チャンバから構成される微量滴定プレート。
【請求項２６】
請求項１６から２４のいずれか一項に記載の２重または３重測定チャンバ、または請求項２５に記載の微量滴定プレートを使用して、細胞、小胞、または脂質二重層の特性を確定する方法。
【請求項２７】
自動化された方法として実施されることを特徴とする、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、少なくとも１つの細胞または小胞が脂質二重層に接触する、細胞および小胞の特性を確定するための方法に関する。本発明は、前記方法で使用するための測定装置にも関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の電気生理学的特性を確定するために、パッチクランプ技術を使用するのが普通である。すなわち、（約１μｍの直径の）ガラスピペットが、電解質溶液で満たされ、注意深く細胞の表面上に置かれる。次いで、膜パッチに孔を開けた後、全細胞表面上の電流または電位を、パッチピペット内で測定することができる（全細胞記録）。しかしながら、パッチクランプ技術の実際の利点は、ピペット先端部直下の膜パッチ内に存在する個々のチャンネルを介して電流を測定する能力である。この技術の部分的な自動化のための方法では、細胞は、互いの頂部上にある２つのチャンバの間のより小さな開口部上に吸い上げられるが、この開口部は、細胞寸法に適合していなければならない。次いでこの細胞が安定化され、かつこの開口部がそれによってシールされたとき、細胞開口部接続が、実質的にイオン（シール）のためにシールされている限り、電気的測定を実施することができる。細胞と開口部の縁部との間のシール抵抗は、１０９Ω程度であり、これは、ギガシールと呼ばれる。高解像度（ｐＡ−ｎＡ）のために絶対的に必要な一時的に安定なギガシールは、パッチクランプ測定の自動化での主要な問題点である。細胞をより小さな開口部上に吸い上げる現行の方法については、１０７から１０８Ωの範囲内のシール抵抗が達成され、またそれらは時がたてば安定ではなくなる。再現可能な方法での高シール抵抗は、個々の実験でのみ、かつより少ない数の膜種類についてのみ達成することができ、それが、パッチクランプ技術の適応可能性を強く制限している。活性物質への近代の研究に対して、これは、自動化の様々な試みにも関わらず、依然として立ち戻らなければならない、主として蛍光に基づく、今のところは標準外の方法であることを意味する。薬理学的安全性が最大の優先事項を享有する薬剤の承認に対して、かつほとんど専ら電気生理学的測定技術によって試験されなければならない薬剤に対して、逐次的な個々の測定は相当な障害である。潜在的な活性物質の大規模な判別調査は、この方法では不可能である。光学的測定も、またそのような自動化されたパッチクランプシステムによって実施することができない。
【０００３】
電気生理学的データを確定するための別の確立された技術は、電解質で満たされた２つのチャンバの間を跨った垂直脂質二重層を含む（Ｂｏｒｉｓｅｎｋｏら、２００３年、Ｈｉｎｎａｈら、２００２年）。イオンチャンネルまたは輸送蛋白の脂質二重層内への溶解後、この蛋白によって仲介された電流は、単一分子レベルに分解されることができる。この確立された古典的な脂質二重層技術は、自動化されることができない。パッチクランプ技術と対照的に、それによって、無傷の細胞膜の特性を測定することはできない。したがって、全細胞に対して実施される測定方法のみが、この目的のために使用されるので、この技術は、薬理学的に活性な物質の試験用に適しておらずまたは承認されていない。
【０００４】
米国特許出願公開第２００３／０１４６０９１号は、１つまたは複数のサンプルを有する細胞の測定を実施するための装置を説明する。いくつかの測定チャンバを有する実施形態（図７Ａ、図７Ｂ、および図８Ａ、図８Ｂ）では、例えば窒化シリコンまたはシリカから作られる親水性の仕切り壁内に配置される開口部に細胞は接合される。この親水性の仕切り壁は、細胞の膜が疎水性被覆と連結するように、細胞が配置され得るために、部分的に疎水性被覆剤によって被覆される。そのような多層装置の準備は、比較的時間がかかる。
【０００５】
この装置上の細胞の前記配置は、測定物体自体、すなわち細胞が、「ギガシール」を実現し且つその結果測定を実施できるようにするために、最初に装置の全ての開口部をシールしなければならないので、間違いを起こしやすい。
【０００６】
Ｓａｍｓｏｎｏｖら２００２年は、細胞溶解蛋白をそれらの表面に発現させる、細胞との溶解因子を含む脂質二重層の溶解を調査している。１５０μｍ〜２００μｍの開口部を含む疎水性仕切り壁を有する測定チャンバが、使用される。この開口部内に、コレステロールおよびスフィンゴ脂質などの溶解に必要不可欠な因子を含む脂質二重層が挿入される。このシステムの確立は、特別な溶解因子が加えられかつ発現されなければならないので、時間がかかる。
【０００７】
ドイツ国特許出願公開第１００４７３９０号は、脂質二重層によってそれぞれ分離される複数の測定チャンバを有する装置を開示する。この脂質二重層を横切って電圧を印加した後、有機化合物を加えた際の膜の変化を調べることができる。この装置は、ハイスループットスクリーニング（ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）に適している。しかしながら、この装置は欠点を有する。すなわち、装置の分解および図１ｂによる二重層の塗布が、厄介である。下側サンプルチャンバは、容易にアクセス可能ではなく、やっとのことで均一に満たしかつ洗浄することができる。銀電極が、光学的な測定が可能ではないように配置されている。脂質二重層が形成された後、下側のチャンバが完全に閉じられるので、サンプルが膜の上のチャンバに加えられるとき、膜に悪影響を及ぼし、それによって測定結果をゆがめる浸透圧が、発生する可能性がある。
【０００８】
Ｈａｎｊｕら１９９８年は、単一測定チャンバ内に垂直に配置される脂質二重層の試験を開示する。細胞または小胞の試験は行われず、測定チャンバの配置の故に、そのような細胞および小胞が、特別な手段によって水平な膜に固定されていた場合のみ可能であったであろう。
【０００９】
Ｂｅｌｌｅｍａｒｅら１９９６年は、脂質二重層内のイオンチャンネルを試験している。デルリンカップ（Ｄｅｌｒｉｎ  ｃｕｐ）、すなわち、より大きな容器内に垂直な測定開口部を有する基本的により小さな容器が、測定アセンブリとして使用され、この開口部は、２００μｍから４００μｍの直径を有する。
【００１０】
Ｓａｎｆｏｒｄら１９８９年も、垂直膜上の単一測定チャンバ内の脂質二重層の試験を開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
上記で説明した方法の欠点を克服する、新規なマイクロ分析またはナノ分析技術を開発することが本発明の目的である。特に、目的は、電気生理学的および光学的特性などの細胞特性を正確に、信頼性高く、かつ再現可能な方法で、できるだけ単純なやり方で確定する方法および手段を提供することである。方法は、自動化のために、および活性物質の初期の予備判別調査にもう既に使用されているのに適切なはずである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の目的は、特許請求の範囲の請求項１から２７のいずれか一項に記載の装置および方法によって意外にも達成される。
【００１３】
本発明は、細胞または小胞の少なくとも１つの特性を確定するための測定装置に関し、測定装置は、水平の開口部（測定開口部）を有する疎水性の仕切り壁によって、電解質溶液を収容する２つのチャンバに区切られ、前記開口部が、脂質二重層によって閉じられる。少なくとも１つの細胞または小胞が、この脂質二重層と接触する。
【００１４】
脂質二重層は、この開口部を横切って跨っている。この脂質二重層は、生物学的な、精製された、天然のまたは合成の脂質が、適切な形態で疎水性の基板に塗布されるとき、自然発生的に形を成す。さらに、この脂質二重層は、開口部をシールし、その結果２つのチャンバは、互いから通常約１０１０Ωの抵抗を有する。時間にわたるこの脂質二重層の安定性は、開口部の半径に逆比例し、３０μｍの直径を有する穴に対して既に数時間から数日の範囲内にある（Ｈｉｎｎａｈら、２００２年）。
【００１５】
生物学的細胞が、脂質二重層と接触する場合、それらの電気的特性は結合される。前記接触は、例えば水平に配置されている脂質二重層によって実施され得る。次いで細胞または小胞が、脂質二重層の上にまたは上方に加えられるとき、それは主として重力によって脂質二重層と接触する。しかしながら、この接触は、例えば測定装置、電解質を移動させることによって、かつ／または脂質二重層と細胞または小胞の間の引力相互作用を使用することなど、別の方法で実施するまたは高められることもできる。例えば、この接触は、細胞溶解を促進する適切な受容体／配位子システムまたは表面蛋白を使用することによっても、実施するまたは高められることができる。しかしながら、そのような特定の相互作用は、本発明によるシステムに必要とされない。本発明の好ましい実施形態では、細胞／膜溶解は、対応する溶解成分を加えることによって、またはＥ１およびＥ２外膜蛋白質などの溶解を実施しまたは促進させる蛋白成分の先行する狙い澄ました発現によって、人工的に高められることはない。そうではなく、単に小胞を脂質二重層に加えることによって、単純な方法で小胞特性の測定が可能になる状態が意外にももたらされる。
【００１６】
結合の分子的な機構は、詳細に知られていないが、それらの結果は、細胞の脂質膜との結合であり、そこでは細胞は、基本的にその形態的な構造を維持し、脂質二重層と共に共通な電気抵抗を示す（導電結合）。好ましい実施形態では、細胞または小胞の脂質膜は、脂質二重層に接触した後、脂質二重層と共に部分的にまたは完全に溶解する。細胞または小胞膜の構成成分は、例えばイオンチャンネルであり、それによってチャンバを仕切る脂質二重層障壁の構成成分になる。細胞特性の確定は、溶解が完了し、システムが安定化してから実施するのが好ましい。
【００１７】
しかしながら、本発明による方法は、細胞または小胞が、脂質二重層と接触し、膜の溶解が起きることなく共通のキャパシタを両者が形成するとき（容量結合）でも適用できることも、指摘されるべきである。電圧が脂質二重層を横切って印加されるとき、キャパシタとして働くそのような構造も、例えば、細胞の電気的特性の測定を既に可能にしている。
【００１８】
好ましい実施形態では、水平開口部（測定開口部）は、０．１μｍから１００μｍの直径、特に０．５μｍから５０μｍの直径、または２μｍから４０μｍの直径を有する。この開口部は、形状が円形または楕円形であることが好ましい。開口部内に配置される脂質二重層は、開口部に起因して基本的に水平である。これは、脂質二重層が、上向きにまたは下向きに若干曲がっている場合があることを意味する。そのような曲がりは、例えば膜の上方または下方の溶液が異なるときに形成される可能性がある。
【００１９】
この疎水性仕切り壁は、必ずしも必要ではないが水平とすることができる。例えば、第１の空洞（１１）に加えられる細胞が、重量によって脂質二重層に向かって到達するように、測定開口部に向かってわずかな勾配を有することができる。好ましい実施形態では、この疎水性仕切り壁の水平に対する勾配は、４５％、２０％、または１０％より小さい。
【００２０】
この疎水性仕切り壁は、高分子フィルムであることが好ましい。本発明の具体的な実施形態では、この仕切り壁は、テフロン（登録商標）、ＰＭＭＡ、ＰＤＭＳ、トパーズ、またはポリカーボネートから作られる。仕切り壁は、１μｍ〜１００μｍの厚さを有するのが好ましい。適切な材料には一般に、脂質二重層が、材料の開口部に安定的に導入され得るように、十分に非極性である材料が含まれる。この仕切り壁と関連して、「疎水性」は、安定な脂質二重層が、仕切り壁内の開口部に形成され得ることを意味する。
【００２１】
電解質溶液は、生理食塩水であることが好ましい。安定な塩には、特に、イオンＫ＋、Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ−、ＳＯ４２−、およびＰＯ４３−を含有する塩が含まれる。ｐＨ値は、５と９の間にあることが好ましく、適切なｐＨ緩衝物質によって調整される。
【００２２】
脂質二重層は、特に、合成のおよび／または精製された生物学的脂質から作られる。電気生理学的測定を行うために仕切り壁の開口部に脂質二重層を生成することは、従来技術から、例えば本明細書に参照によって組み込まれるＨｉｎｎａｈら２００２年から知られている。合成または精製された生物学的脂質の脂質試料は、脂質二重層を作るために使用されることが好ましい。そのような脂質試料では、脂質は、それらの天然の環境にはない、すなわち、それらは、最早無処理の細胞小器官、細胞、または他の天然の小胞の構成成分ではない。
【００２３】
本発明の好ましい実施形態では、脂質二重層および脂質二重層と接触する細胞の電気的特性に関する測定が、行われ得るように、回路が測定装置を介して、かつ脂質二重層を介して適用された。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、この測定装置は、光学的測定を行うことができるように、少なくとも部分的に光学的に透明な材料から構成される。例えば、細胞が、潜在的な受容体配位子の添加に際して光学的信号を送るか否か調査することができる。
【００２５】
本発明は、本発明による測定装置を使用して、細胞および小胞の特性を確定するための方法に関する。
【００２６】
細胞または小胞の前記少なくとも１つの確定された特性は、細胞膜の光学的または電気生理学的特性であることが好ましい。例えば、膜の電気抵抗、膜を通り流れる電流、および／または蛍光信号を、本発明により測定することができる。このようにすると、細胞膜の特性のみならず、物質の添加などの外的な刺激および変化に対する細胞膜の応答も調査することができる。点測定によって個々の値を確定すること、またはパラメータの変化を追って、その結果細胞過程を観察することが可能である。本発明によれば、脂質二重層および結合した細胞を有する測定装置への（潜在的な）受容体配位子の添加によって、例えばどのように細胞膜内のイオンチャンネルが開かれ、かつ閉じられるかを調査することができる。
【００２７】
別の実施形態では、生物学的な巨大分子を脂質二重層内に含む、または脂質二重層と結合させることができる。特に、イオンチャンネルまたは受容体などの蛋白質が適している。
【００２８】
また、細胞が脂質二重層によって溶解された後、例えば２つのチャンバのどちらに配位子が加えられたかに応じて、細胞膜の両側の調査が可能になる。
【００２９】
小胞は、脂質二重層に基づいた１つの外側膜を有する。この膜は、蛋白質などの他の通常の生物学的膜の構成成分を含むことができるが、組み換え蛋白質などの人工的に製造された一体化された構成成分も含むことができる。好ましい実施形態では、小胞は、細胞小器官、例えばミトコンドリアなどの精製された生物学的小胞、またはリポソームまたは蛋白リポソームなどの人工的に生成された小胞である。本発明による小胞は、細胞または細胞小器官膜の小胞状の断片も含むことができる。
【００３０】
本発明による方法は、特に自動化された実施に適している。本発明は、請求項１に記載の少なくとも２つの測定装置から構成される、細胞または小胞の特性を自動的に確定するためのアレーにも関する。これらの測定装置は、互いにしっかりと結合され、電気的に個別にアドレスされることができるのが好ましい。本発明によるこのアレーによって、この方法を、ロボットまたは機械によって少なくとも部分的に実施するのが可能になる。それらは、少なくとも２個の測定装置、好ましくは５０個から２０００個の測定装置、特に９６個、３８４個、または１５３６個の測定装置を備える（ＳＢＳ規格）。
【００３１】
本発明によって、全細胞用の支持体として非常に小さい水平脂質二重層の使用が可能になる。活性物質の研究で重要なこれらの調査対象物は、ハイスルーアウトスクリーニング（ＨＴＳ）で既に確立されている蛍光ベースの方法によってのみならず、同時に電気的分析によっても分析されることができる。
【００３２】
また、個々の支持脂質二重層は、高度に小型化することができ、ナノ技術的に構造化されかつ生成されたアレー（ナノアレー）で、同時にまたは接近する時間関係で測定することができる。この結果可能になる、異なる薬理学的に関連する態様のほとんど同時の調査は、活性物質用の判別調査の全体工程を顕著に短縮することができる。また、この新規な技術は、膜輸送過程の分析を顕著に拡大させるであろう。細胞と脂質二重層のこの結合によって、例えば、ほとんど全ての細胞、小胞、または蛋白リポソームの電気的特性が、測定されることができる。
【００３３】
この方法で、適用された細胞膜の電気的かつ／または光学的特性を、再現可能なかつ機械的に安定な方法で測定しかつ特徴づけることができる。パッチクランプ技術と対照的に、安定したシール抵抗を必要とするパッチピペットは、本発明では全く使用されない。したがって、細胞または小胞を開口部に固定するための真空または減圧の適用もまた必要ではない。疎水性基板と脂質二重層との間に、シール抵抗が、自然発生的にかつ少なくとも数時間安定的に形成される。さらに、脂質二重層と疎水性シートとの間のこの結合は、ＨＴＳに必要とされる高い機械的安定性を有する。脂質二重層上の細胞または小胞の配置は、好ましくは、単にそれらを脂質二重層上に加えることによって実施される。
【００３４】
また、本明細書で説明する方法は、測定チャンバが、サンドイッチ形式で並行して製造することができ、真空ラインなどの機械的に不安定などのような構成部品を含まないので、従来技術から知られ、かつ開示されるものより実質的に安上がりである。
【００３５】
さらに、細胞への光学的通路を制限なく使用することができ、この結果、本発明は、高解像度蛍光顕微鏡および分光器と組み合わせることができる。
【００３６】
脂質二重層と細胞または蛋白リポソームなどの細胞小胞との間の結合によって、例えば、１０８〜１０１０Ωのシール抵抗で、膜の電気的特性を測定するのが可能になる。また、この方法によって、並行する光学的測定も可能になる。脂質二重層上への細胞の正確な配置は必要でなく、その結果この方法は、自動化および並列化に極めて適切である。
【００３７】
本発明は、請求項１６から２７のいずれか一項に記載の、単一、２重、および３重の測定チャンバ、ならびに微量滴定プレート、および方法にも関する。本発明による単一、２重、および３重の測定チャンバは、本発明による細胞特性の判定用の方法に使用するのに特に適している。しかしながら、それらは、一般的に細胞に接触することの無い、脂質二重層の特性の調査用にも使用されることができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３８】
図５Ａは、横壁（４）および同時に空洞の底部でもある仕切り壁（３）を有する、第１の空洞（１１）を備える、本発明による単一チャンバシステムを示す。下に、測定開口部（１３）を介して前記第１の空洞（１１）と接続される第２の空洞（１２）が設けられる。前記第２の空洞（１２）は、層（３）によっておよび下側底部（１）によって横方向に境界を付けられる。金属の電極が、両方の空洞内に配置される。下側底部は、ガラスなどの光学的に活性な材料から構成することができる。
【００３９】
図５Ｂは、２つの第１の空洞（１１）、（１５）ならびに接続する第２の空洞（１２）、第１の測定開口部（１３）および第２の開口部（１４）を備える、本発明による２重チャンバシステムを示す。
【００４０】
図５Ｃは、図５Ｂによる特徴を有する本発明による３重チャンバシステムを示す。さらに、開口部（１７）を有する別の第１の空洞（１６）が含まれている。第２の空洞（１２）は、第１の空洞（１１）、（１５）および（１６）の下を接続して延びる。
【００４１】
図６Ａおよび図６Ｂは、図５Ｂおよび図５Ｃによる特徴を有する本発明による２重および３重チャンバシステムをそれぞれ示す。さらに、電圧源Ｕ（２３）および電流測定装置Ｉ（２４）を介して接続される、２本の電極（２１）および（２２）が含まれる。脂質二重層は、開口部（１３）内に配置される。空洞は液体で満たされ、この脂質二重層は、異なる成分を有する２つの溶液を分離する。
【００４２】
図７Ａ、図７Ｂは、本発明による脂質二重層を有する２重または３重チャンバシステムの特定の区画室内で、液体の交換がどのように実施され得るかを概略的に示す。左側に、液体の交換前のシステムが、それぞれ示されている。抜き取りおよび添加の場所は、矢印付きのバーで印が付けられている。右側に、液体の部分的交換後のシステムをそれぞれ示し、新たに添加された液体は、より明るい陰で示されている。
【００４３】
図８Ａ、図８Ｂは、本発明による２重または３重チャンバシステムが、どのようにアレーおよび微量滴定プレート内に配置することができるかを示す。図８Ａで、類似して配置される別の２重測定チャンバと共通の底部を介して接続される２重測定チャンバユニットが、箱枠によって示されている。それに応じて、３重測定チャンバが、図８Ｂに箱枠によって示されている。
【００４４】
図５Ａに示すように、本発明による単一測定チャンバは、横壁（４）および上向きの開口部を有する第１の空洞（１１）を備える。第１の空洞（１１）の下に第２の空洞（１２）が配置され、第１の空洞は、第２の空洞から疎水性仕切り壁（３）によって分離される。疎水性仕切り壁（３）は、０．１μｍから１００μｍの直径を有する測定開口部（１３）を有する。「測定開口部」は、本明細書では、開口部またはその環境内で光学的および電気的特性を引き続き測定するために、その中に脂質二重層を導入することができる、開口部または穴を呼ぶ。対照的に、「測定開口部」と呼ばれない開口部（１４、１７）は、脂質二重層を受けるために役立たないが、第１の空洞と第２の空洞との間の液体交換および電流の流れを可能にする。したがって、それらは、測定開口部の直径より大きな直径を有することが好ましい。
【００４５】
第１および第２の空洞（１１、１２）内に、各々がワイヤで作られる１本の電極が含まれる。測定チャンバは、上記で説明した方法によって、第１の空洞を第２の空洞から分離する脂質二重層が、測定開口部（１３）内に配置されることができるような構成を有する。この２本の電極を介して、電圧を、脂質二重層の両端間に加えることができる。第１の空洞（１１）に、電解質溶液および生理的緩衝システムまたは調査すべき細胞などの適切な液体を加えることができる。
【００４６】
図５Ｂおよび図６Ａに示すように、本発明による２重測定チャンバは、各々が横壁（４）および上向きの開口部を備える第１の空洞（１１、１５）を有する、２つの並置された測定チャンバを備える。接続する第２の空洞（１２）は、２つの第１の空洞（１１、１５）の下に配置される。第１の空洞（１５）は、開口部（１４）を介して第２の空洞（１２）と接続される。もう１つの第１の空洞（１１）は、疎水性仕切り壁（３）によって第２の空洞（１２）から分離される。前記仕切り壁（３）は、前記第１の空洞（１１）が前記第２の空洞（１２）と接続されるように、０．１μｍから１００μｍの直径を有する測定開口部（１３）を含む。第１の空洞（１１）および（１５）のそれぞれに、電極（２１、２２）が含まれる。本発明による単一測定チャンバと対照的に、第２の空洞（１２）内に電極が設けられていない。第２の空洞（１２）は、溝のように構成されることができ、簡単に充填し濯がれることができる。２重測定チャンバのこの配置によって、空洞内の液体の量を変更することによる圧力補償が可能になる。したがって、脂質二重層が損傷されまたは破られるのが回避される。液体の添加および引抜の可能性は、図７Ａに概略的に示されている。
【００４７】
本発明による３重測定チャンバが、図５Ｃおよび図６Ｂに示されている。それは、第１の空洞（１６）を有する別の第１の測定チャンバを備える２重測定チャンバ、３つの第１の空洞（１１、１５、１６）の下にある接続する第２の空洞（１２）、および開口部（１７）を介して第２の空洞（１２）に接続される第１の空洞（１６）から構成される。脂質二重層は、第１の空洞（１１）を第２の空洞（１２）から分離する測定開口部（１３）内に配置される。
【００４８】
この配置は、脂質二重層が形成され、したがって空洞（１１）が分離された後、それを介して圧力が補償される空洞１２、１５および１６にわたり連通する液体システムが存在するという利点を有する。また、第２の空洞（１２）内の液体は、この脂質二重層の存在下で交換する（濯ぐ）ことができる。これは、例えば、連続的または段階的なイオン濃度の変化、空洞（１２）の濯ぎおよび洗浄、または脂質二重層または接触細胞へのその作用が調査される、添加剤の添加または引き抜きを可能にする。図７Ｂは、本発明による３重チャンバシステムで、脂質二重層の存在下で、中央の第１の空洞内の液体をどのように交換することができるかを概略的に示す。中央の第１の空洞（シス（ｃｉｓ））内では、添加および引き抜きは、同じ経路によって実施され、一方２つの相互接続される第１の空洞内では、この添加および引き抜きは、異なる空洞内で実施することができ、かつ圧力補償は、下側空洞を介して実施される。
【００４９】
この圧力補償は、脂質二重層が、浸透圧勾配に起因して変化しまたは損傷さえし、それによって測定結果をゆがめることも防止する。本発明による装置では、下側空洞（１２）が、脂質二重層によって閉じられていない少なくとも１つの開口部を有する故に、圧力補償が実施されることは極めて一般的に好ましい。
【００５０】
本発明によれば、測定チャンバは、微量滴定プレートを形成するように配置されることができる。本発明の微量滴定プレートは、本発明による少なくとも２つの測定チャンバを有する。好ましくは、測定チャンバは、空間の２方向に列を成して同一に配置される（図８Ａ、図８Ｂ）。好ましい実施形態では、チャンバは、シリカガラスの窓などによる、例えば下方からの光学的アクセス、および上方からのピペットアクセスを含む。チャンバの準備は、安価なサンドイッチ形式で実施できる。これによって、薬理学試験に対し要求されるような使い捨て方法が確実になる。本発明による装置については、ＳＢＳに準拠している微量滴定プレートを保持しながら、水平膜上で同時にかつ個々に、電気的および光学的測定の両方を高処理量で行うことができる。空間の２方向へ並行にされた測定チャンバは、小さな空間に多数を収容することができる。
【００５１】
図の測定チャンバは、単に概略図で示されており、特に図の構成部品の寸法関係は、実際の関係に必ずしも対応していない。図５Ａ〜図５Ｃによる配置では、底部（１）が、５μｍ〜２００μｍ、特に１０μｍ〜１００μｍの垂直方向寸法を有し、層（２）が、５μｍ〜２００μｍ、特に１０μｍ〜１００μｍの寸法を有し、仕切り壁（３）が、１μｍ〜１００μｍ、特に５μｍ〜２５μｍの寸法を有するのが好ましい。横壁（４）の高さは、０．５ｍｍ〜１０ｍｍ、特に１ｍｍ〜５ｍｍであり、第１の空洞の水平方向直径は、０．５ｍｍ〜１０ｍｍ、特に１ｍｍ〜５ｍｍであることが好ましい。第１の空洞は、液体１μｌから１ｍｌの容量を有するのが好ましい。第２の空洞（１２）は、層（２）と同じ垂直方向寸法を有するのが好ましい。第２の空洞の幅は、好ましくは０．１μｍと５００μｍの間で変化することができる。
【００５２】
「膜プローブ（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｂｅ）」、および膜蛋白質、特に膜トランスポータの電気生理学的特性の測定は、薬理学研究で益々重要性を得てきている。特に、膜蛋白質の電気的特性を、それらの光学的特性と比較することは興味深い。従来技術から、Ｂｏｒｉｓｅｎｋｏら（２００３年）の方法が、脂質二重層を調査するために知られている。疎水性シートの底部側に、光学的アクセスを自由のままに残し、かつ電気的測定の場合には電極として働く薄い導電層（例えば、銀）が、気相蒸着によって付けられる。光学的測定のみ意図される場合は、この銀の層はなしで済ますことができる。この測定チャンバは、銀の層が、光学的測定に悪影響を及ぼし、かつ既存のアガロース層の準備が、相対的に複雑であり、また数時間のうちに水損失によって変質するであろう欠点を有する。したがって、この装置は、特に自動化方法の基礎としては適切ではない。マイクロリットルの規模（微量滴定プレート）の容量を有する微量滴定プレートが、薬剤研究での活性物質の調査における、通常のハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）およびウルトラハイスループットスクリーニング（ＵＨＴＳ）実験シリーズに必要とされる。知られている電気的および連結された電気的光学的測定方法に対して、ＳＢＳ（Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）規格によるＨＴＳおよびＵＨＴＳに適した測定チャンバが欠けている。
【００５３】
本発明の単一、２重、および３重測定チャンバならびに微量滴定プレートは、本発明による方法によって細胞または小胞の特性を確定し、かつ少なくとも１つの細胞または１つの小胞が脂質二重層と接触する、本発明による測定装置を準備するのに特に適している。したがって、小胞または細胞を含む本発明による測定装置の実施形態は、本発明の単一、２重、または３重測定チャンバの特有な形態に存在する。
【００５４】
本発明による測定チャンバおよび微量滴定プレートは、脂質二重層を調査するための知られた装置より優れた多くの利点を有する。本発明による測定チャンバは、本発明による方法で、水平脂質二重層によって分離される２つの水相間の過程を光学的にかつ／または電気的にたどることを可能にする。小型化された測定チャンバの使用、ならびに低い数の構成部品を有する非常に多数の測定チャンバが準備されるサンドイッチ構造の使用が、可能になる。装置の底部を介した光学的アクセスが確保される。上方からのピペットおよび電極アクセスが確保され、したがって、この測定方法は、簡単にかつ自動化された方法としても実施することができる。
【００５５】
通常のＳＢＳ準拠微量滴定プレートを使用して、光学的方法によってチャンバの内腔内の変化しか基本的に観察することができない。対照的に、本発明による微量滴定プレートは、水平な脂質二重層膜によって分離される２つの水性の区画内で、光学的および電気的測定を同時にまたは個々に実施する可能性を提供する。したがって、電気的および光学的特性を、様々な空洞内で個々に確定することができる。さらに、膜を介した輸送過程、ならびに膜への結合と関連する過程、膜内へのエフェクターの解離または結合も、光学的にかつ電気的に測定することができる。従来型の微量滴定プレートと対照的に、本発明による微量滴定プレートは、ＵＨＴＳ測定チャンバプレートの特徴を失うことなく、膜特性または膜過程を、電気的にかつ／または光学的に測定することの可能性を提供する。
【００５６】
本発明による装置では、少なくとも２つの空洞が、脂質二重層によって分離される。したがって、輸送過程の電気的なパラメータを、この膜を横切って測定することができる。光学的アクセスを確実にするために、この脂質二重層は、ガラスプレートの上方に十分に近接して、すなわち焦点深さ内に安定化されなければならない。この構造体は、テフロン（登録商標）およびガラスなどの異なる適切な材料のサンドイッチ構造であることが好ましい。そのような層構造が、例えば図１（層１、２、３および４）に示されている。
【００５７】
２重または３重測定チャンバを形成するように並置された測定チャンバを有する構造は、測定チャンバの当初の数を少なくとも１／２だけ減少させる（すなわち、９６ウエルの微量滴定プレートは、４８ウエルの２重ウエルプレートになる、等）。しかしながら、この多数チャンバ構造は、チャンバシステムが、水平の脂質二重層によって分離された後、脂質二重層を変形させることなく、チャンバシステム間の圧力補償を実施することができる利点を有する（図７Ａ、図７Ｂ）。これは、２つのチャンバ間のイオン勾配を取り扱うために必要不可欠なものである。
【００５８】
本発明による２重および３重測定チャンバの好ましい実施形態は、図５Ｂ〜図５Ｃから見ることができる。例えば、１つ（または複数の）小型化されたシート（または複数のシート）が、測定チャンバの上側部分とガラス底部との間に導入された。そのようなシートによって、少なくとも２つの隣接するチャンバが、２重チャンバ（３重チャンバ等、微量滴定プレート）を形成するように連結される。２重チャンバ毎に、小さな直径（０．１μｍ〜１００μｍ）を有する１つの穴、ならびに好ましくはより直径を有する１つの穴、および２つの穴を水平に接続する空洞（溝）が、シートに導入される。例えば、そのような空洞は、シートにまたはシリカガラスに一体化されることができる。好ましい実施形態では、分離膜は、微量滴定プレート内でガラス層上方の焦点深さ内に水平に配置される。
【００５９】
互いの頂部にある２つの空洞を有する本発明による単一測定チャンバ構造体は、微量滴定プレートに対して配置されるとき、チャンバの数は減少させない。それは、空洞間の圧力補償が膜の変形によってしか可能ではないので、安定性の理由で、両方の空洞内のイオン濃度が対称的なまたは同様な場合に主として使用されるべきである。
【００６０】
勿論それは、共通のチャンバ／開口部システムによって相互接続される少なくとも４つの測定チャンバを有するシステムを作り出すために、本発明による３重測定チャンバを有する別の測定チャンバに接続することもできる。本発明は、追加の測定チャンバを有する３重チャンバシステムなどのようなシステムにも関する。
【００６１】
例
２つの区画を分離する厚さ２５μｍテフロン（登録商標）シートから作られたプラスチック隔膜内に、約３０μｍ〜５０μｍの直径の穴が、電気的な方法によって作られた。この穴の中に、前に説明した（Ｈｉｎｎａｈら、２００２年）ように、人工的な脂質二重層が、２つの水性区画の間に作られる。両方の区画は、Ａｇ＋／ＡｇＣｌ電極によって電気的に接触される。チャンバの測定設定は、二重層が、エピフォーカル（ｅｐｉｆｏｃａｌ）または共焦点（ｃｏｎｆｏｃａｌ）蛍光顕微鏡の焦点内に定められることができるような寸法を有する（図１）。そのような二重層は、通常＞５ＧΩのシール抵抗値を有し、電圧ゲート（Ｖｃｍｄ）の印加に際して、二重層容量が充電された後、Ｖｃｍｄ＝１００ｍＶのときの平均電流が＜２０ｐＡである、図１による図式に略図で示すような電流応答を示す。
【００６２】
図２は、電圧パルスの印加（「電圧ゲート」、上左パネル）に際して、水平二重層上の電圧クランプ（右パネル）を示す。電圧（Ｖｃｍｄ）の振幅は、Ｖｃｍｄ＝０ｍＶから始まって、Ｖｃｍｄ＝１００ｍＶまで、Ｖｃｍｄ＝±１０ｍＶの増分で増大した（図２、上左）。下左の図は、二重層の容量および抵抗値によって加重された電流応答値の時間的経過を示す。それは、２つの容量的な尖頭値（Ｉ・ｄｔ＝Ｃｂｉｌａｙｅｒ・Ｖｃｍｄ）および一定電流（Ｉ＝Ｖｃｍｄ／Ｒｂｉｌａｙｅｒ）によって特徴づけられる。図２は、二重層が、５０μｍの直径および９．５ＧΩの平均シール抵抗値を有する実際の場合を示す。
【００６３】
この二重層に対して、少なくとも１つのＳＦ−９細胞が加えられる（図３）。単一またはいくつかの細胞の付着および操作が、マイクロピペッテングおよびマイクロマニピュレータによって実施される。次いで容量または導電結合に際して、電圧ゲートが印加されるとき、著しく高い（図２と比較して＞４０倍の）平均電流を有する図３に示す電流応答値が測定される。ＳＦ−９細胞は、蛋白質の異種発現（ｈｅｔｅｒｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）のために使用される昆虫（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）から由来する細胞株である。
【００６４】
Ｈｅｋ細胞に異種発現されるＮａ＋依存グルタミン酸塩トランスポータ（ＥＡＡＣ１）を使用した、水平二重層上の細胞の結合の定量的な検定を図４Ａ〜図４Ｃに示す。図４Ａは、ＥＡＡＣ１  Ｈｅｋ２９３細胞を有する水平二重層、およびこの測定設定の電流応答を示す。Ｖｃｍｄ＝±６０ｍＶのときの電流応答の定量的な評価（図４Ｂ）、および同じ細胞準備で「全細胞」パッチクランプ構成での並行した実験（Ｇｒｅｗｅｒら、２０００年）で得られた平均電流との平均電流の比較が、表１に比較されている。
【表１】
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【００６５】
グルタミン酸塩トランスポータは、その活性において正確にＮａ＋依存である（Ｇｒｅｗｅｒら、２０００年）。両方の水性区画内の潅流によってＮａ＋イオンが取り除かれた後、平均電流は、結合された細胞なしの二重層の値まで減少した（図４Ｃ）。Ｎａ＋イオンの新たな添加に際して、開始測定設定の平均電流に到達する（図４Ｃ）。
【００６６】
これらのデータは、Ｈｅｋ２９３−ＥＡＡＣ１細胞への「全細胞」パッチクランプ設定によって得られる電流応答は、その上に細胞が結合された水平二重層から得られるものと同じであることを示す。平均電流の変動（Ｉｍｅａｎ、表１）は、Ｈｅｋ２９３細胞のＥＡＡＣ１の発現速度の生化学的に立証された変動に起因すると考えるべきである。これらの結果は、Ｈｅｋ２９３−ＥＡＡＣ１細胞は、水平二重層と容量および導電結合によって結合されることを立証している。この方法の利点は、この水平設定で、２つの水性区画が、迅速かつ再現可能な方法で高抵抗値（＞５ＧΩ）を有する脂質二重層によって分離することができることにある。この二重層に１つまたは複数の細胞を付加すること、ならびにこの二重層膜に、またはその中に巨大分子の付加または融合することによって、光学的および電気的測定方法によって、細胞膜を通るまたは細胞膜に対する、かつ対応して脂質二重層膜を通る、荷電されたまたは荷電されない分子の輸送および結合を調査することが可能になる。その特性に起因して、この方法は、並行ハイスループットスクリーニング測定に極めて適している。
【００６７】
（参考）
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【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】本発明の微量滴定プレートの層構造を示す。
【図２】電圧パルスの印加に際して水平二重層上の電圧クランプを示す。
【図３】二重層上に少なくとも１つのＳＦ−９細胞が加えられたときの、電圧パルスの印加に際して水平二重層上の電圧クランプを示す。
【図４Ａ】ＥＡＡＣ１を使用した、水平二重層上の細胞の結合の定量的な検定を示す。
【図４Ｂ】ＥＡＡＣ１を使用した、水平二重層上の細胞の結合の定量的な検定を示す。
【図４Ｃ】ＥＡＡＣ１を使用した、水平二重層上の細胞の結合の定量的な検定を示す。
【図５Ａ】本発明による単一チャンバシステムを示す。
【図５Ｂ】本発明による２重チャンバシステムを示す。
【図５Ｃ】本発明による３重チャンバシステムを示す。
【図６Ａ】本発明による２重チャンバシステムを示す。
【図６Ｂ】本発明による３重チャンバシステムを示す。
【図７Ａ】本発明による２重チャンバシステムの特定の区画室内で、液体の交換がどのように実施され得るかを概略的に示す。
【図７Ｂ】本発明による３重チャンバシステムの特定の区画室内で、液体の交換がどのように実施され得るかを概略的に示す。
【図８Ａ】本発明による２重チャンバシステムが、どのようにアレーおよび微量滴定プレート内に配置されることができるかを示す。
【図８Ｂ】本発明による３重チャンバシステムが、どのようにアレーおよび微量滴定プレート内に配置されることができるかを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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