(57)【要約】  本発明は一般にインドロキノン類により起きる、放射線療法に対する腫瘍の増感に関する。より具体的には、本発明は、インドロキノン類が低酸素細胞を選択的にターゲティングしてこれら低酸素細胞のDNAに傷害を与える能力による、放射線増感薬（放射線療法の佐剤）としてのインドロキノン類の知見に関する。インドロキノン類は正常な細胞および組織に対して最小の毒性でこの効果を達成する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類以上のインドロキノンを投与することにより、１種類以上の腫瘍を放射線療法に対して増感することを含む方法。
【請求項２】
１種類以上の腫瘍が低酸素細胞を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
さらに、１種類以上のインドロキノンをその必要がある患者に投与することを含み、投与が全身および／または局所投与を含み、患者が少なくとも2回の放射線療法を受ける予定である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
１種類以上のインドロキノンの投与を、経口投与、腫瘍内投与、静脈内投与、膀胱内投与および動脈内投与よりなる群のうち１以上から選択される経路により行う、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
１種類以上のインドロキノンがアパジクオン（EO9）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
１種類以上のインドロキノンの投与を、患者のすべての放射線療法の前；患者のそれら放射線療法の一部の前；患者のすべての放射線療法の後；患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のすべての放射線療法の前と後；患者のすべての放射線療法の前と患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のすべての放射線療法の後；および患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のそれら放射線療法の一部の後よりなる群から選択される様式で行う、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
１種類以上のインドロキノンを含み、この１種類以上のインドロキノンが腫瘍の処置のための放射線療法と組み合わせて投与するように指示されている、組成物。
【請求項８】
腫瘍が低酸素細胞を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
１種類以上のインドロキノンが全身および／または局所的に投与するように指示されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
１種類以上のインドロキノンが、経口投与、腫瘍内投与、静脈内投与、膀胱内投与および動脈内投与よりなる群のうち１以上から選択される経路により投与するように指示されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１１】
１種類以上のインドロキノンがアパジクオン（EO9）を含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
１種類以上のインドロキノンが少なくとも2回の放射線療法を受ける予定の患者に投与するように指示されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項１３】
１種類以上のインドロキノンを、患者のすべての放射線療法の前；患者のそれら放射線療法の一部の前；患者のすべての放射線療法の後；患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のすべての放射線療法の前と後；患者のすべての放射線療法の前と患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のすべての放射線療法の後；および患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のそれら放射線療法の一部の後よりなる群から選択される様式で投与するように指示された、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１４】
１種類以上のインドロキノン、およびこの１種類以上のインドロキノンを腫瘍の処置のための放射線療法と組み合わせて投与するように指示する指示情報を含む、投与方式。
【請求項１５】
腫瘍が低酸素細胞を含む、請求項１４に記載の投与方式。
【請求項１６】
指示情報が、１種類以上のインドロキノンを全身および／または局所的に投与するように指示する、請求項１４に記載の投与方式。
【請求項１７】
指示情報が、１種類以上のインドロキノンを経口投与、腫瘍内投与、静脈内投与、膀胱内投与および動脈内投与よりなる群のうち１以上から選択される経路により投与するように指示する、請求項１４に記載の投与方式。
【請求項１８】
１種類以上のインドロキノンがアパジクオン（EO9）を含む、請求項１４に記載の投与方式。
【請求項１９】
指示情報が、１種類以上のインドロキノンを少なくとも2回の放射線療法を受ける予定の患者に投与するように指示する、請求項１４に記載の投与方式。
【請求項２０】
１種類以上のインドロキノンを、患者のすべての放射線療法の前；患者のそれら放射線療法の一部の前；患者のすべての放射線療法の後；患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のすべての放射線療法の前と後；患者のすべての放射線療法の前と患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のすべての放射線療法の後；および患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のそれら放射線療法の一部の後よりなる群から選択される様式で投与するように指示する、請求項１９に記載の投与方式。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、１種類以上のインドロキノンの投与により腫瘍細胞を放射線療法に対して増感することに関する。より具体的には、本発明は１種類以上のインドロキノンの投与により低酸素腫瘍細胞を放射線療法に対して増感することに関する。
【背景技術】
【０００２】
放射線療法（放射線照射）は多様な腫瘍タイプの処置に有効な理学療法である。癌患者全体のうち半数は、その癌処置コース中に放射線療法を受けるであろう。放射線療法は最も広く用いられている癌処置法のひとつであるが、低酸素細胞を含む腫瘍の処置に用いる場合、その有効性が低下する。
【０００３】
低酸素細胞は、受け取る酸素が他の細胞より少ない細胞である。一般に、低酸素細胞は酸素含量が少ないため、放射線療法または化学療法に対する抵抗性がより高い。放射線療法または化学療法に対する抵抗性がより高い細胞は、生存して体内の他の部位へ拡散する能力が高いため、より大きな危険性を癌患者に及ぼす。
【０００４】
低酸素細胞を含む腫瘍を処置するために現在用いられている一般的な医薬が幾つかある。これらの医薬には、インドロキノン類が含まれる。インドロキノンのひとつであるアパジクオン（Apaziquone）（EO9）は、マイトマイシンCの新規な類似体である。EO9は、投与されると細胞内レダクターゼにより生体内還元されて活性なDNA傷害性部分となり、低酸素細胞をターゲティングすると考えられる。臨床試験により、全身投与したEO9は腫瘍への薬物送達性に乏しいが、それの局所投与は有意の抗腫瘍活性を示すことが、多様な異種移植モデルにおいて示された。現在まで、EO9は単一療法薬として用いられているにすぎない。
【０００５】
本発明は、放射線療法と組み合わせて用いた場合、EO9その他のインドロキノン類が低酸素細胞を放射線療法に対して増感し、これによって多様な癌の処置に寄与することができるという知見を利用している。この放射線療法と組み合わせたインドロキノン類の投与は、放射線療法またはEO9を含めたインドロキノン類の単独投与を上回る利点をもたらす。
【発明の開示】
【０００６】
発明の簡単な概要
本発明は、インドロキノン類の投与により腫瘍細胞を放射線療法に対して増感することを提供する。より具体的には、本発明はインドロキノン類の投与により低酸素腫瘍細胞を放射線療法に対して増感することに関する。
【０００７】
具体的には、本発明による１態様は、１種類以上のインドロキノンを投与することにより、１種類以上の腫瘍を放射線療法に対して増感する方法である。
本発明による方法の他の態様において、１種類以上の腫瘍は低酸素細胞を含む。
【０００８】
本発明による方法の他の態様において、この方法はさらに、１種類以上のインドロキノンをその必要がある患者に投与することを含み、その投与が全身および／または局所投与を含み、患者は少なくとも2回の放射線療法を受ける予定である。
【０００９】
この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を経口投与により行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を腫瘍内投与により行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を静脈内投与により行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を膀胱内投与により行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を動脈内投与により行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を、経口投与、腫瘍内投与、静脈内投与、膀胱内投与および動脈内投与のうちいずれか１以上の組合わせから選択される経路により行う。
【００１０】
この方法の他の態様において、１種類以上のインドロキノンはアパジクオン（EO9）を含む。
この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を、その患者のすべての放射線療法の前に行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を、その患者のそれら放射線療法の一部の前に行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を、その患者のすべての放射線療法の後に行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を、その患者のそれら放射線療法の一部の後に行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を、その患者のすべての放射線療法の前と後に行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を、その患者のすべての放射線療法の前とその患者のそれら放射線療法の一部の後に行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を、その患者のそれら放射線療法の一部の前とその患者のすべての放射線療法の後に行う。この方法の他の態様においては、１種類以上のインドロキノンの投与を、その患者のそれら放射線療法の一部の前とその患者のそれら放射線療法の一部の後に行う。
【００１１】
本発明は組成物をも含む。ある本発明組成物において、組成物は１種類以上のインドロキノンを含み、この１種類以上のインドロキノンは腫瘍の処置のための放射線療法と組み合わせて投与するように指示される。
【００１２】
組成物の他の態様において、腫瘍は低酸素細胞を含む。
組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは全身および／または局所的に投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは経口投与により投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは腫瘍内投与により投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは静脈内投与により投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは膀胱内投与により投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは動脈内投与により投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは、経口投与、腫瘍内投与、静脈内投与、膀胱内投与および動脈内投与のうちいずれか１以上の組合わせから選択される経路により投与するように指示される。
【００１３】
組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンはアパジクオン（EO9）を含む。
組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは、少なくとも2回の放射線療法を受ける予定の患者に投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは、その患者のすべての放射線療法の前に投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは、その患者のそれら放射線療法の一部の前に投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは、その患者のすべての放射線療法の後に投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは、その患者のそれら放射線療法の一部の後に投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは、その患者のすべての放射線療法の前と後に投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは、その患者のすべての放射線療法の前とその患者のそれら放射線療法の一部の後に投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは、その患者のそれら放射線療法の一部の前とその患者のすべての放射線療法の後に投与するように指示される。組成物の他の態様において、１種類以上のインドロキノンは、その患者のそれら放射線療法の一部の前とその患者のそれら放射線療法の一部の後に投与するように指示される。
【００１４】
本発明は投与方式をも含む。本発明による投与方式の１態様は、１種類以上のインドロキノン、およびこの１種類以上のインドロキノンを腫瘍の処置のための放射線療法と組み合わせて投与するように指示する指示情報を含む。
【００１５】
投与方式の他の態様において、腫瘍は低酸素細胞を含む。
投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンを全身および／または局所的に投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンを経口投与により投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンを腫瘍内投与により投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンを静脈内投与により投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンを膀胱内投与により投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンを動脈内投与により投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンを経口投与、腫瘍内投与、静脈内投与、膀胱内投与および動脈内投与のうちいずれか１以上の組合わせから選択される経路により投与するように指示する。
【００１６】
投与方式の他の態様において、１種類以上のインドロキノンはアパジクオン（EO9）を含む。
投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンを少なくとも2回の放射線療法を受ける予定の患者に投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンをその患者のすべての放射線療法の前に投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンをその患者のそれら放射線療法の一部の前に投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンをその患者のすべての放射線療法の後に投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンをその患者のそれら放射線療法の一部の後に投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンをその患者のすべての放射線療法の前と後；その患者のすべての放射線療法の前とその患者のそれら放射線療法の一部の後に投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンをその患者のそれら放射線療法の一部の前とその患者のすべての放射線療法の後に投与するように指示する。投与方式の他の態様において、指示情報は１種類以上のインドロキノンをその患者のそれら放射線療法の一部の前とその患者のそれら放射線療法の一部の後に投与するように指示する。
【００１７】
用語の定義
本発明について述べる前に、以下において用いる特定の用語の定義を理解することが役立つであろう。
【００１８】
用語“患者”には、少なくとも１種類の腫瘍を伴う生存生物がいずれも含まれる。生存生物は、哺乳類、魚類、爬虫類または鳥類のいずれであってもよい。哺乳類には、ヒトを含む霊長類、イヌ、ネコ、ヤギ、ヒツジ、ウサギ、ブタ、ウマおよびウシが含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
用語“処置”または”処置に寄与する”には、充実性腫瘍の予防、進行もしくは増殖の遅延、収縮または排除が含まれる。したがって、これらの用語には、医療的投与および／または予防的投与の両方が適宜含まれる。
【００２０】
用語“指示情報（instructional information）”には、医薬製剤に添付される情報であって、その製剤の投与方法の説明、その製剤の目的の説明、および／または医師、薬剤師もしくは患者が情報に基づいてその製剤の使用に関する決定を行うのに必要な安全性と有効性のデータの説明を提供する情報が含まれる。指示情報は、一般に医薬製剤の”ラベル”であると考えられ、製剤挿入物として収容することができる。指示情報は多様な形で得ることができ、これには挿入紙、CDロム、または指示情報を含むウェブサイトへのリンクが含まれるが、これらに限定されない。
【００２１】
用語“プロドラッグ”には、インビボで、たとえば加水分解によって速やかに本発明に有用な化合物に変換される化合物が含まれる。プロドラッグについての詳細な考察がHiguchi et al., Prodrugs as Novel Delivery Systems, Vol. 14, the A.C.S.D. Symposium Series、およびRoche (著), Bioreversible Carriers in Drug Design, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987に示されている。
【００２２】
用語”増感する”は、作用に対して、より感受性にすることを意味する。
“複数の放射線療法”には、ある期間を隔てて患者に施される放射線処置が含まれる。複数の放射線療法を隔てる期間は、処置を行う医師または獣医が決定でき、数分間、数時間、数日間、数週間、数カ月間または数年間が含まれるが、これらに限定されない。ある放射線療法は、その直前または直後の放射線療法と同じでも異なってもよい。
【００２３】
詳細な説明
本発明は、インドロキノン類が腫瘍を放射線療法に対して増感し、これにより種々の癌の処置に寄与することができるという知見に関連する。より具体的には、インドロキノン類は、腫瘍内の低酸素細胞をターゲティングし、それらのDNAに傷害を与えることにより、これらの細胞を放射線療法に対して増感することができる。重要なことは、インドロキノン類がこれらの効果を正常な細胞および組織に対して最小の毒性で達成できることである。
【００２４】
アパジクオン（”EO9”；3-ヒドロキシメチル-5-アジリジニル-1-メチル-2-(1H-インドール-4,7-ジオン)-プロパ-β-エン-α-オール；IUPAC：3-ヒドロキシメチル-5-アジリジニル-1-メチル-2-(1H-インドール-4,7-ジオン)-プロペノール）は、インドロキノンのひとつであり、マイトマイシンCの新規な類似体である。EO9活性化の基本的機序は他のインドロキノン類と類似すると考えられ、１または2個の電子を輸送する細胞性酵素により還元されて、それぞれセミキノンおよびヒドロキノンを形成することを伴う。好気的条件下でのセミキノンの酸化により酸化還元サイクルが生じ、これが反応性酸素種（ROS）を形成してDNA鎖を破断することにより細胞死を引き起こすことができる。セミキノン／ヒドロキノンは、特に低酸素条件下で、DNAその他の高分子をアルキル化および架橋して細胞死を引き起こす。
【００２５】
腫瘍に発現するレダクターゼは、EO9の選択性に重要な役割を果たすと思われる。2電子型レダクターゼ酵素であるNQO1（NAD(P)H：キノンオキシドレダクターゼ）は、酸素化細胞を選択的にターゲティングし、一方、１電子型還元酵素、たとえばシトクロムP450レダクターゼは低酸素細胞のターゲティングの方に有効であると思われる。Loadman et al., 137 Br. J. Pharmacol. 701-709, 2002。本発明による種々の態様を以下の実施例に記載する。
【実施例】
【００２６】
実施例１．腫瘍容積が腫瘍酸素分圧に及ぼす影響
U-87ヒトグリア芽細胞腫細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)）を、10%ウシ胎仔血清(Atlanta Biologicals)を含むアルファMEM培地(Sigma)中で維持した。U-87ヒトグリア芽細胞腫細胞（100μlのPBS中に5×105個）を、無胸腺NCR NUMヌードマウス(Taconic Farms)の右後足に皮下注射し、低酸素細胞容積が約550 mm3になるまで増殖させた。腫瘍の酸素分圧をOxford Oxylite光ファイバー探針（英国オックスフォード）により測定した。この検出システムは、光ファイバー探針末端にあるルテニウム顔料の青色光励起に基づき、これが酸素により消光する。麻酔したマウス（75 mg/kgのケタミン(Ketamine)および0.3 mg/kgのアセプロマジン(Acepromazine)）について測定を実施し、その間、加熱パッドで体温を37℃に維持した。25ゲージの針を用いて腫瘍嚢を穿刺し、光ファイバー探針の挿入を容易にした。探針を腫瘍内へ2〜4 mmの深さまで案内した。図１は、複数の小腫瘍（丸、N=5）および複数の大腫瘍（四角、N=6）についての腫瘍pO2中央値を示す。棒はグループ中央値を示す。この結果は、小腫瘍が大腫瘍より高い腫瘍酸素分圧をもつことを指摘する。
【００２７】
実施例２．低酸素腫瘍におけるNQO1およびシトクロムP450レダクターゼのレベル
前記のように、U-87ヒトグリア芽細胞腫細胞を無胸腺NCR NUMマウスの右後足に皮下注射し、約550 mm3の直径になるまで増殖させて、低酸素を誘発した。40 mMのジチオトレイトール、14 mg/Lのアプロチニン（aprotinin）、0.7 mg/Lのペプスタチン（pepstatin）および5 mMの4-(2-アミノエチル)-ベンゼンスルホニルフルオリドを含量するLDS試料用緩衝液（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）中に、腫瘍試料を調製した。試料をNuPage 10%ビス-トリス（bis-Tris）ゲル（Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド）上に分散させた。半乾式トランスファー装置（Pharmacia-LKB multiphor II）を用いて、タンパク質をポリ二フッ化ビニリデン膜（Amersham Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカッタウェイ）上へ移した。モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、すなわち抗ヒトNQO1、抗ヒト-シトクロムP450レダクターゼおよび抗GAPDHを用いて、免疫ブロット法を実施した。Tropix Western-Starタンパク質検出キット（Applied Biosystems；カリフォルニア州フォスターシティー）を用いる増強化学発光により免疫検出を実施した。
【００２８】
図２は、酸素正常U87細胞および低酸素下で漸増時間処理した細胞のウェスタンブロット分析を示す。この図２は、低酸素がU87細胞においてNQO1をダウンレギュレーションすることを示す。図３は、3つの小腫瘍からプールした腫瘍試料（列1；平均 = 143 mm3）、およびサイズが漸増する3つの低酸素腫瘍（列2、3および4；平均 = 693 mm3）を示す。
この図３は、低酸素腫瘍がより高いシトクロムP450レダクターゼ対NQO1比をもつことを示す。図４は、3つの非処理腫瘍（対照1、2、3）、および7.5 Gyで１日１回ずつ3回、分割照射した3つの腫瘍（RT 1、2、3）のウェスタンブロット分析を示す。最終照射の24時間後に試料を採取した。この図４は、分割放射線療法により腫瘍異種移植片のシトクロムP450レダクターゼ対NQO1比が増大することを示す。理論により拘束されるわけではないが、前記のようにNQO1およびシトクロムP450レダクターゼのレベルの相異が低酸素腫瘍細胞に対するEO9の選択性の基礎をもたらす可能性がある。
【００２９】
実施例３．EO9と放射線療法が平均腫瘍容積に及ぼす影響
実施例３ａ．短期試験
U-87ヒトグリア芽細胞腫細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション）を、10%ウシ胎仔血清(Atlanta Biologicals)を含むアルファMEM培地(Sigma)中で維持した。U-87細胞懸濁液（100μlのPBS中に5×105個）を、無胸腺NCR NUMマウス(Taconic Farms)の右後足に皮下注射し、処理前に低酸素細胞容積が約550 mm3になるまで増殖させた。EO9が腫瘍細胞を放射線療法に対して増感するという仮説を調べるために、腫瘍をEO9と分割放射線療法計画で処理した。1、2および3日目に、EO9またはビヒクルを各回の放射線療法の30分後に投与した。この試験には4つの処理グループを用いた：ビヒクル（DMSO）、放射線療法のみ（3日間×7.5 Gy）、EO9（3日間×2 mg/kg）、およびEO9 + 放射線療法（3日間×7.5 Gy×2 mg/kg）。最適送達を達成するために、EO9を腫瘍内注射により局所投与した。
【００３０】
麻酔したマウスに、250 kV、10 mAで作動する2-mmアルミニウムフィルター付きＸ線照射機(Pantak)を用いて照射を実施した。有効光子エネルギーは約90 keVであった。それぞれ75 mg/kgと0.30 mg/kg濃度のケタミンとアセプロマジンの組合わせにより、マウスを麻酔した。腫瘍を局所照射できるように、各マウスを鉛のケースに収容し、マウスの腫瘍を含む足を側面の開口から外へ出した。
【００３１】
図５は、これら4つの処理グループの平均実測値および標準誤差を示す。混合効果回帰（mixed-effects regression）を用いて、ベース-10 logの腫瘍容積を時間および処理の関数としてモデリングした（腫瘍増殖分析）。対数変換した結果を用いたのは、このサイズの腫瘍はほぼ指数関数的に増殖し、したがって腫瘍容積の対数が経時的にほぼ直線的だからである。この方法は、異なる動物についての異なる測定回数など不均衡なデータを適切に処理し、各動物の経時的な測定の相関関係を考慮に入れている。これらの分析をSAS 8.2 (SAS Institute Inc., ノースカロライナ州ケアリー, 1999-2001)により実施した。図６は、1、2および3日目にEO9またはビヒクルを放射線療法の30分後に投与した動物における、一次回帰および腫瘍が2000 mm3に増殖するまでの推定時間を示す。図７は、図６から合わせてプロットしたトレンドラインを示す。これらの図から分かるように、EO9と放射線療法を受けた動物は最も遅い腫瘍増殖を示した。
【００３２】
次表に示すように、ビヒクル処理グループにおける平均腫瘍増殖は3.2日の倍加時間に対応する。EO9単独または放射線療法単独を投与した場合、腫瘍倍加時間がそれぞれ約4.6日（対照に対してp<0.001）または8.4日（対照に対してp<0.001）に延長された。EO9と放射線療法の組合わせは、平均倍加時間を11.7日に延長した。これは、匹敵するEO9単独（p<0.001）または放射線療法単独（p=0.027、比較日1〜7）の方式によりみられたものより強力な効果である。したがって、EO9と放射線療法の組合わせは相加的であった。さらに、EO9処理後、いずれのグループにも体重減少の増加または局所標準毒性はみられなかった。
【００３３】
【表１】
2008534624.tif 000002
【００３４】
%△：腫瘍容積の平均増加率（１日の増加率%）
95% CI：95%信頼区間
T2×：腫瘍容積の平均倍加時間（日）。
【００３５】
実施例３ｂ．長期試験
EO9と放射線療法を長期間にわたって投与するプロトコルを調べた。この試験では、EO9または放射線療法を単独で、または組み合わせて、各週不連続2日で3週間送達した。6グループに、ビヒクルのみ（DMSO）、放射線療法の30分前にビヒクル（2日間×7.5 Gy）、放射線療法の30分後にビヒクル（2日間×7.5 Gy）、EO9のみ（2日間×3 mg/kg）、放射線療法の30分前にEO9、および放射線療法の30分後にEO9を投与した。最適送達を達成するために、EO9を腫瘍内注射により局所投与した。
【００３６】
図８は、週2日で3週間の放射線療法の前または後に投与したEO9について、平均実測値および標準誤差を示す。図８は、放射線療法の前または後にEO9を投与したグループを単一グループにまとめ、全体としてこのグループが最も遅い腫瘍増殖率を示したことを示す。EO9を放射線療法の前または後に投与した2つのグループをまとめていない次表は、最も有効な投与計画はEO9を放射線療法の前に投与した場合であったことを示す。この投与計画が最も長い倍加時間をもたらした。腫瘍が3000 mm3に増殖するまでの推定時間を含む：
【００３７】
【表２】
2008534624.tif 000003
【００３８】
%△：腫瘍容積の平均増加率（１日の増加率%）
95% CI：95%信頼区間
T2×：腫瘍容積の平均倍加時間（日）。
【００３９】
EO9を長期方式で送達した場合（週2回で3週間）、EO9は放射線療法の前に投与した場合の方が有効であった。これらの試験により、EO9は単独薬剤として抗腫瘍活性をもつという先の所見が確認され、かつ、より重要であるが、EO9は有意の放射線療法増感薬であることが立証される。図９は、3週間の放射線療法（不連続2日／週×7.5 Gy）の30分前または後にEO9（3 mg/kg）またはビヒクルを投与した動物における、一次回帰および腫瘍が2000 mm3に増殖するまでの推定時間を示す。
【００４０】
実施例に記載した結果のまとめ
平均約550 mm3の腫瘍は放射線生物学的に低酸素領域にあった（図１）。低酸素および分割放射線療法は、シトクロムP450レダクターゼ対NQO1比を高めた；これが低酸素腫瘍の増感に作用する可能性がある（図２〜４）。他方において、NQO1の存在は、放射線療法のほかに酸素化腫瘍細胞を根絶する作用をもつ可能性もある。図５、６、７および表１に示すように、EO9単独または放射線療法単独で、腫瘍倍加時間がそれぞれ1.4日（対照に対してp<0.001）または5.2日（対照に対してp<0.001）延長された。EO9と放射線療法の組合わせは、平均倍加時間を8.5日延長して11.7日にした；これは、匹敵するEO9単独（p<0.001）または放射線療法単独（p=0.027、比較日1〜7）の方式でみられたものより強力な効果である。EO9処理後、いずれのグループにも体重減少の有意の増加または標準毒性はみられなかった。さらに、長期処理実験を実施した（図８、９および表２）。対照グループ（ビヒクル）において、腫瘍は3.6日の倍加時間を示した（表２）。この増殖速度は、放射線療法単独で実質的に7.0日（対照に対してp = 0.001）に低下し、EO9単独で6.1日（対照に対してp = 0.006）に低下した。放射線療法とEO9の組合わせにより、腫瘍増殖速度はさらに低下した。EO9の前に施した放射線療法は、平均腫瘍倍加時間を9.1日（放射線療法単独に対してp = 0.25、EO9単独に対して0.11、対照に対して0.001）に遅らせた。ところが、EO9後に施した放射線療法は最強の効果をもち、平均腫瘍倍加時間を17.3日（放射線療法単独に対してp = 0.007、EO9単独に対して0.005、対照に対して0.001）に遅らせた。これらの結果は、EO9が分割方式の放射線療法にとって有益となる可能性があり、放射線療法増感薬としてさらに探求すべきであることを初めて示す。EO9は単独で、または放射線療法と組み合わせて、統計的に有意の抗腫瘍活性を備えていた。
【００４１】
本発明による有効成分を含有する医薬組成物は、ヒトまたは他の哺乳類に投与するのに適切である。一般に本発明の医薬組成物は無菌性であり、投与した際に有害反応を引き起こす有毒、発癌性または変異原性の化合物を含有しない。本発明の医薬組成物の投与は、充実性腫瘍の増殖が開始する前、途中または後に実施できる。
【００４２】
本発明方法は、前記の有効成分を用いて、またはその生理的に許容できる塩、誘導体、プロドラッグもしくは溶媒和物として用いて実施できる。有効成分をそのままの化合物として、またはいずれか一方もしくは両方のものを含有する医薬組成物として投与できる。
【００４３】
本発明の医薬組成物には、有効成分の意図する目的を達成するのに有効な量で有効成分を投与する組成物が含まれる。より具体的には、”療法有効量”は、充実性腫瘍の発症を阻止し、排除し、進行を遅延させ、またはサイズを縮小するのに有効な量を意味する。療法有効量の決定は当業者が、特に本明細書に示した詳細な開示を考慮して容易になしうるものである。
【００４４】
“療法有効量”は、目的効果を達成する有効成分の量を表わす。そのような有効成分の毒性および有効性は、細胞培養または実験動物において、医薬標準法により、たとえばLD50（その集団の50%に対して致死的な用量）およびED50（その集団の50%において療法有効な用量）の決定により判定できる。毒作用と療法作用の用量比が療法指数であり、LD50とED50の比として表わされる。高い療法指数が好ましい。得られたデータを用いて、ヒトに使用するための用量範囲を判定することができる。有効成分の用量は、好ましくは毒性をほとんどまたは全くもたないED50を含む循環濃度範囲内にある。用量は、用いる剤形および用いる投与経路に応じて、この範囲内で変更できる。
【００４５】
厳密な配合および用量は、各医師が患者の状態を考慮して決定する。投与量および投与間隔は、治療効果または予防効果を維持するのに十分な有効成分レベルを得るように、個別に調整できる。前記のように、本発明による方法、組成物および投与方式は、患者のすべての放射線療法の前；患者のそれら放射線療法の一部の前；患者のすべての放射線療法の後；患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のすべての放射線療法の前と後；患者のすべての放射線療法の前と患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のすべての放射線療法の後；および患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のそれら放射線療法の一部の後に適用または投与することができる。
【００４６】
医薬組成物の投与量は、処置される対象、対象の体重、疾病の重症度、投与様式、および処方する医師の判断に依存する。
有効成分を単独で、または意図する投与経路および医薬標準法との関連で選択される医薬用キャリヤーと混合して、投与することができる。本発明に従って使用するための医薬組成物は、たとえば有効成分を医薬として使用できる製剤に加工するのを容易にする賦形剤および助剤を含めた１種類以上の生理的に許容できるキャリヤーを用いて常法により配合できる。
【００４７】
療法有効量の有効成分を投与する際、本発明組成物は、発熱物質を含有しない、非経口用として許容できる水性液剤の形であってもよい。非経口用として許容できるそのような液剤の調製は、pH、等張性、安定性などを適切に考慮して当業者が容易になしうるものである。
【００４８】
動物に用いるためには、本発明の有効成分を普通の動物医療に従って適切に許容できる配合物として投与することができる。獣医はその動物に最も適切な投与方式を容易に決定できる。
【００４９】
本発明は本明細書に具体的に記載したもの以外に実施でき、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、これらの態様を多様に適用および改変することができる。以上の記載は説明のためのものであって、限定のためのものではない。本発明の範囲は特許請求の範囲によってのみ判定されるべきである。
【００５０】
本明細書中に用いた用語および表現は記述のために用いたものであって、限定のためのものではなく、そのような用語および表現の使用に際して図示および記載したものまたはその一部の均等物を排除するつもりはない。特許請求の範囲に示した本発明の範囲内で多様な改変が可能であることを認識すべきである。さらに、本発明の範囲から逸脱することなく、本発明のいずれかの態様の１以上の特質を本発明の他のいずれかの態様の他のいずれか１以上の特質と組み合わせることができる。
【００５１】
別途指示しない限り、本明細書および特許請求の範囲中で用いた、成分、特性、たとえば分子量、反応条件などの量を表わすすべての数値は、すべての場合、”約”という用語で修飾できると理解すべきである。したがって、そうではないと指示しない限り、本明細書および特許請求の範囲中で述べる数値パラメーターは概数であり、本発明により達成したい目的特性に応じて変更できる。少なくとも、特許請求の範囲の均等物の原則を制限するためではなく、各数値パラメーターは少なくとも報告した有意性指数の数値を考慮して、かつ通常の四捨五入法を適用して解釈すべきである。本発明の広い範囲を設定する数値範囲およびパラメーターは概数であるけれども、具体例中に述べる数値は可能な限り厳密に報告されている。しかし、数値は本来、それらの各試験測定値中にみられる標準偏差から必然的に生じる一定の誤差を含む。
【００５２】
本発明を記載するために（特に特許請求の範囲中で）用いた冠詞は、本明細書中に別途指示しない限り、または状況からそうではないことが明らかでない限り、単数と複数の両方を含むと解釈すべきである。本明細書中で数値範囲を引用したのは、その範囲に含まれる各個別の数値を個々に記載することの簡略化法として用いたにすぎない。本明細書中で別途指示しない限り、各個別の数値が個々に本明細書中に引用されたと同様に本明細書に含まれる。本明細書中に別途指示しない限り、または状況からそうではないことが明らかでない限り、本明細書に記載したすべての方法をいかなる適切な順序で実施することもできる。本明細書中に示した例または例示語（たとえば”など”）の使用はいずれもすべて、本発明をより良く説明するためのものにすぎず、特許請求の範囲に示した以外は本発明の範囲を限定するものではない。本明細書中の言語はいずれも、特許請求の範囲に示していない要素が本発明の実施に必須であることを示すものと解釈すべきではない。
【００５３】
本明細書に開示する本発明の代替要素または態様の分類を限定と解釈すべきではない。グループの各メンバーを個別に、またはそのグループの他のメンバーもしくは本明細書中にある他の要素と組み合わせて表記し、権利請求することができる。あるグループの１以上のメンバーを、便宜上、および／または特許性の理由で、あるグループに収容し、またはあるグループから削除することができるものとする。そのような収容および削除が行われる場合、本明細書はそのグループを改変されたものとして含み、したがって特許請求の範囲で用いるすべてのマーカッシュ（Markush）グループの記述を満たすものと考えられる。
【００５４】
本発明による特定の態様を本明細書に記載する。これには本発明を実施するために本発明者らが知る最良の形態が含まれる。もちろん、これらの態様の変更は、以上の記載を読めば当業者に自明であろう。本発明者らは当業者がそのような変更を適宜採用すると予想し、本発明者らは本発明が本明細書に詳述したものと異なる形態で実施されるものと考える。したがって、適用できる法律により許容されるように、本発明は特許請求の範囲に示した対象事項のすべての改変および均等物を含む。さらに、本明細書中に別途指示しない限り、または状況からそうではないことが明らかでない限り、本発明のすべての可能な変更において前記要素のいかなる組合わせも本発明に含まれる。
【００５５】
さらに、本明細書全体において特許および印刷物を多数参照した。前記に引用した参考文献および印刷物それぞれを全体として個別に本明細書中に援用する。
最後に、本明細書に開示する本発明の態様は本発明の原理の例示であると理解すべきである。採用できる他の態様も本発明の範囲に含まれる。たとえば、限定ではないが、本発明の別形態を本明細書の教示に従って採用することができる。したがって、本発明は厳密に図示および記載したものに限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】腫瘍容積が腫瘍の酸素分圧に及ぼす影響を示す。
【図２】低酸素がU87腫瘍細胞のNQO1をダウンレギュレーションすることを示す。
【図３】低酸素腫瘍がより高いシトクロムP450レダクターゼ対NQO1比をもつことを示す。
【図４】分割放射線療法が腫瘍異種移植片においてシトクロムP450レダクターゼ対NQO1比を高めることを示す。
【図５】放射線療法とその後のEO9またはビヒクル投与後の平均腫瘍容積を示す。
【図６】放射線療法とその後のEO9またはビヒクル投与の後の一次回帰および腫瘍が2000 mm3に増殖するまでの推定時間を示す。
【図７】図６からプロットしたトレンドラインを示す。
【図８】放射線療法およびその前のEO9またはビヒクル投与の後の平均腫瘍容積を示す。
【図９】放射線療法およびその前のEO9またはビヒクル投与の後の一次回帰および腫瘍が2000 mm3に増殖するまでの推定時間を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年3月21日(2008.3.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種類以上のインドロキノンを含む、１種類以上の腫瘍を放射線療法に対して増感するための組成物。
【請求項２】
１種類以上のインドロキノンを含み、この１種類以上のインドロキノンが腫瘍の処置のための放射線療法と組み合わせて投与するように指示されている、組成物。
【請求項３】
腫瘍が低酸素細胞を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
１種類以上のインドロキノンが全身および／または局所的に投与するように指示されている、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
１種類以上のインドロキノンが、経口投与、腫瘍内投与、静脈内投与、膀胱内投与および動脈内投与よりなる群のうち１以上から選択される経路により投与するように指示されている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
１種類以上のインドロキノンがアパジクオン（EO9）を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
１種類以上のインドロキノンが少なくとも2回の放射線療法を受ける予定の患者に投与するように指示されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
１種類以上のインドロキノンを、患者のすべての放射線療法の前；患者のそれら放射線療法の一部の前；患者のすべての放射線療法の後；患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のすべての放射線療法の前と後；患者のすべての放射線療法の前と患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のすべての放射線療法の後；および患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のそれら放射線療法の一部の後よりなる群から選択される様式で投与するように指示された、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
１種類以上のインドロキノン、およびこの１種類以上のインドロキノンを腫瘍の処置のための放射線療法と組み合わせて投与するように指示する指示情報を含む、投与方式。
【請求項１０】
腫瘍が低酸素細胞を含む、請求項９に記載の投与方式。
【請求項１１】
指示情報が、１種類以上のインドロキノンを全身および／または局所的に投与するように指示する、請求項９又は１０に記載の投与方式。
【請求項１２】
指示情報が、１種類以上のインドロキノンを経口投与、腫瘍内投与、静脈内投与、膀胱内投与および動脈内投与よりなる群のうち１以上から選択される経路により投与するように指示する、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の投与方式。
【請求項１３】
１種類以上のインドロキノンがアパジクオン（EO9）を含む、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の投与方式。
【請求項１４】
指示情報が、１種類以上のインドロキノンを少なくとも2回の放射線療法を受ける予定の患者に投与するように指示する、請求項９〜１３のいずれか１項に記載の投与方式。
【請求項１５】
１種類以上のインドロキノンを、患者のすべての放射線療法の前；患者のそれら放射線療法の一部の前；患者のすべての放射線療法の後；患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のすべての放射線療法の前と後；患者のすべての放射線療法の前と患者のそれら放射線療法の一部の後；患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のすべての放射線療法の後；および患者のそれら放射線療法の一部の前と患者のそれら放射線療法の一部の後よりなる群から選択される様式で投与するように指示する、請求項１４に記載の投与方式。
【国際調査報告】
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2008534624.tif 000014
2008534624.tif 000015
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