(57)【要約】  環境的に安定なバイオセンサが開示され、それはリガンド結合時の蛍光共鳴エネルギー移動の検出および測定を可能にするドナーおよび蛍光部分に結合する好熱性生物由来のリガンド結合ドメインを含む。かかるバイオセンサは、中温生物由来のタンパク質ドメインを用いて構築されたセンサと比較して酸、熱および化学安定性が高いことを示している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環境的に安定な蛍光指示薬をコード化する単離された核酸であって、前記指示薬が、
好熱性生物由来のリガンド結合タンパク質部分と、
前記リガンド結合タンパク質部分に共有結合されたドナー蛍光団部分と、
前記リガンド結合タンパク質部分に共有結合されたアクセプター蛍光団部分と、
を含み、ここで前記ドナー部分が励起されかつリガンドが前記リガンド結合タンパク質部分に結合すると、前記ドナー部分と前記アクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が変化する、核酸。
【請求項２】
前記指示薬が好酸性生物由来のリガンド結合タンパク質部分をさらに含む請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３】
前記ドナーおよびアクセプター部分が前記リガンド結合タンパク質部分に遺伝的に融合している請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４】
前記ドナーおよびアクセプター部分が前記リガンド結合タンパク質部分の末端に遺伝的に融合している請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項５】
前記ドナーおよびアクセプター部分の一方または両方が前記リガンド結合タンパク質部分の内部位置に遺伝的に融合している請求項３に記載の単離された核酸。
【請求項６】
前記好熱性生物が高度好熱菌または中等度好熱菌である請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項７】
前記高度好熱菌が、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、サーモクリニス（Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ）、サーマトガ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ）、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アキフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アエロパイレム（Ａｅｒｏｐｙｒｅｍ）、アーケオグロブス（Ａｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ）、パイロロバス（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、アシディアヌス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ）、スルホロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アルビネラ（Ａｌｖｉｎｅｌｌａ）、およびシアニジウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ）の種よりなる群から選択される請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項８】
前記中等度好熱菌が、例えば、アシディチオバチルス・カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ）（旧チオバチルス・カルダス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ））、アシジミクロビウム・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、スルホバチルス・アシドフィルス（Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、スルホバチルス・ジスルフィドオキシダンス（Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｏｏｘｉｄａｎｓ）、スルホバチルス・サーモスルフィドオキシダンス（Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｉｄｏｏｘｉｄａｎｓ）、フェロプラズマ・アシダルマヌス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）を含む、アシディチオバチルス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシジミクロビウム（Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、スルホバチルス（Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、フェロプラズマ（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ）、サーモプラズマおよびアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種よりなる群から選択される請求項６に記載の単離された核酸。
【請求項９】
前記生物がパイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）である請求項７に記載の単離された核酸。
【請求項１０】
前記生物がアリシクロバチルス・アシドカルダリウスである請求項８に記載の単離された核酸。
【請求項１１】
前記リガンド結合タンパク質部分がマルトース結合タンパク質である請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１２】
前記マルトース結合タンパク質がパイロコッカス・フリオサス由来のｍａｌＥである請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１３】
前記マルトース結合タンパク質部分が配列番号２の配列を含む請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１４】
前記マルトース結合タンパク質がアリシクロバチルス・アシドカルダリウス由来のｍａｌＥである請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１５】
前記マルトース結合タンパク質部分が配列番号４の配列を含む請求項１１に記載の単離された核酸。
【請求項１６】
前記ドナー蛍光団部分がＧＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ｄｓＲＥＤ、ＣｏｒａｌＨｕｅ  Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ（ＭｉＣｙ）および単量体ＣｏｒａｌＨｕｅ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（ｍＫＯ）よりなる群から選択される請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１７】
前記アクセプター蛍光団部分がＧＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰ、ＹＦＰ、ｄｓＲＥＤ、ＣｏｒａｌＨｕｅ  Ｍｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ（ＭｉＣｙ）および単量体ＣｏｒａｌＨｕｅ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ（ｍＫＯ）よりなる群から選択される請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１８】
前記ドナー蛍光団部分がＣＦＰであり、かつ前記アクセプター蛍光団部分がＹＦＰ  Ｖｅｎｕｓである請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項１９】
少なくとも１つのリンカー部分をさらに含む請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項２０】
前記蛍光指示薬が化学変性に耐性を示す請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項２１】
変性剤が塩酸グアニジンである請求項２０に記載の単離された核酸。
【請求項２２】
前記化学変性剤が尿素、トリトンＸ−１００、およびドデシル硫酸ナトリウムよりなる群から選択される請求項２０に記載の単離された核酸。
【請求項２３】
前記蛍光指示薬が熱変性に耐性を示す請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項２４】
前記蛍光指示薬が５０℃を超える温度に耐性を示す請求項２３に記載の単離された核酸。
【請求項２５】
前記蛍光指示薬が６０℃を超える温度に耐性を示す請求項２３に記載の単離された核酸。
【請求項２６】
前記蛍光指示薬が７０℃を超える温度に耐性を示す請求項２３に記載の単離された核酸。
【請求項２７】
前記蛍光指示薬が８０℃を超える温度に耐性を示す請求項２３に記載の単離された核酸。
【請求項２８】
前記蛍光指示薬が９０℃を超える温度に耐性を示す請求項２３に記載の単離された核酸。
【請求項２９】
前記蛍光指示薬が１００℃を超える温度に耐性を示す請求項２３に記載の単離された核酸。
【請求項３０】
前記蛍光指示薬が１１０℃を超える温度に耐性を示す請求項２３に記載の単離された核酸。
【請求項３１】
前記蛍光指示薬が酸変性に耐性を示す請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３２】
前記酸変性がリン酸塩緩衝液のｐＨをＨ３ＰＯ４およびＮａＯＨで滴定することによって行われる請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項３３】
請求項１に記載の核酸を発現する細胞。
【請求項３４】
請求項１に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項３５】
請求項３４に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３６】
原核細胞内の機能に適合している請求項３４に記載の発現ベクター。
【請求項３７】
真核細胞内の機能に適合している請求項３４に記載の発現ベクター。
【請求項３８】
原核生物である請求項３５に記載の細胞。
【請求項３９】
真核細胞である請求項３５に記載の細胞。
【請求項４０】
酵母細胞である請求項３９に記載の細胞。
【請求項４１】
動物細胞である請求項３９に記載の細胞。
【請求項４２】
請求項１に記載の核酸を発現するトランスジェニック動物。
【請求項４３】
線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）である請求項４２に記載のトランスジェニック動物。
【請求項４４】
前記リガンド結合タンパク質部分のそのリガンドに対する親和性を低下させる１つもしくは複数の核酸置換をさらに含む請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４５】
前記リガンド結合の特異性またはセンサの他の特性を改変するための１つもしくは複数の核酸置換をさらに含む請求項１に記載の単離された核酸。
【請求項４６】
請求項１に記載の核酸によってコード化されるリガンドと結合する蛍光指示薬。
【請求項４７】
細胞の試料中のリガンドのレベルにおける変化を検出する方法であって、
（ａ）請求項１に記載の核酸を発現する細胞を提供するステップと、
（ｂ）前記ドナー蛍光団部分と前記アクセプター蛍光団部分の間のＦＲＥＴにおける変化を検出するステップと、
を含み、前記ドナー部分とアクセプター部分との間のＦＲＥＴにおける変化が、細胞の試料中のリガンドのレベルにおける変化を示す、方法。
【請求項４８】
ＦＲＥＴを測定するステップが前記アクセプター蛍光団部分から放射される光を測定するステップを含む請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
ＦＲＥＴを測定するステップが、前記ドナー蛍光団部分から放射される光を測定するステップと、前記アクセプター蛍光団部分から放射される光を測定するステップと、前記ドナー蛍光団部分から放射される光と前記アクセプター蛍光団部分から放射される光の比を計算するステップと、を含む請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
ＦＲＥＴを測定するステップが前記ドナー部分の励起状態寿命を測定するステップを含む請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記細胞の試料がインビボで含められる請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記細胞の試料がインビトロで含められる請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
リガンドのその受容体への結合を調節する化合物を同定する方法であって、
（ａ）リガンドの存在下で請求項１に記載の核酸を発現する細胞を１つもしくは複数の試験化合物と接触させるステップと、
（ｂ）接触させるステップ後、ドナー蛍光ドメインとアクセプター蛍光ドメインの間のＦＲＥＴを測定するステップと、
を含み、ここで前記接触させるステップ後におけるＦＲＥＴの増減は、前記試験化合物がリガンド結合を調節する化合物であることを示す方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２００５年３月４日出願の米国仮特許出願第６０／６５８，１４２号の優先権を主張するものであり、その全体が本明細書中に含まれる。
【０００２】
本出願は、米国仮特許出願第６０／６４３，５７６号、米国仮特許出願第６０／６５８，１４１号、米国仮特許出願第６０／６５７，７０２号、ＰＣＴ出願［代理人整理番号第０５６１００−５０５３号、「Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」］、ＰＣＴ出願［代理人整理番号第０５６１００−５０５４号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅｐｅａｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ」］およびＰＣＴ出願［代理人整理番号第０５６１００−５０５５号、「Ｓｕｃｒｏｓｅ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｓａｍｅ」］にも関連しており、それらの全体が引用により本明細書中に含まれる。
【０００３】
［連邦政府によって後援された研究または開発に関する声明］
本発明は、デューク大学（Ｄｕｋｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）からのＮＩＨの外注契約（外注契約番号ＳＰＳＩＤ  １２６６３２）およびヒューマン・フロンティア・サイエンス・プログラム（Ｈｕｍａｎ  Ｆｒｏｎｔｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｇｒａｍ）助成金（契約番号ＲＧＰ００４１／２００４Ｃ）を含む２つの助成金を通じて資金提供を受けた。したがって、米国政府は本発明に対して特定の権利を有する。
【０００４】
［発明の分野］
本発明は、一般に、環境的に安定なバイオセンサの構築ならびに蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いて代謝産物レベルにおける変化を測定および検出するための方法についての分野に関する。
【背景技術】
【０００５】
本明細書中のすべての出版物および特許は、あたかも各々の出版物および特許出願が引用により含まれることを意図して具体的かつ個別に示されるのと同程度に、引用により含まれる。
【０００６】
本出願の出願日に先立ち、本明細書中で考察される出版物は、あくまでそれらの開示を目的として提供される。本明細書においては、先行発明に照らして本発明にかかる出版物に先行する権利が与えられないことの承認として解釈されるべき点は全くない。
【０００７】
高度好熱性生物、すなわち水の沸点付近の温度（高圧で有意に１００℃を超える場合がある）で成長する生物は、主に地熱泉近傍の深海に見出されるが、多数の他の自然および人工環境下でも発生する。これらの細菌は高温環境下で生存することから、消化および呼吸などの生命過程の維持に不可欠なそれらの酵素は、かかる極限温度条件下で機能できなければならない。一般的な中温性細菌（すなわち、全生物において高温および低温の極限に対する中間の温度で成長可能な生物）内の酵素は、典型的にはこれらの高温で機能しなくなる。
【０００８】
多数の生物が極限環境から単離されている。これらの生物は研究対象とされ、特定の有用な化合物が同定されている。例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼがサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）から得られている。プロテアーゼが、サーマス・アクアティカス（Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、デスルフロコッカス（Ｄｅｓｕｌｆｕｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、パイロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）、スルホロバス・アシドカルダリウス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）、サーモコッカス・ステッテリ（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｔｅｔｔｅｒｉ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、およびパイロバクラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ  ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）を含む好熱菌から単離されている。しかし、極限微生物の培養が困難であることから、特徴づけられているこれらの微生物の数ならびにそれらから単離される有用な化合物の数が限定されている（ブレナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）、Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ、１９９６年１０月１４日）。メタゲノムクローニングの新たな実施により、将来におけるこれらの培養上の問題が回避されうる（リー  Ｊ．Ｋ．（Ｒｈｅｅ  Ｊ．Ｋ．）ら、「Ｎｅｗ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ｅｓｔｅｒａｓｅ  ｗｉｔｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｌｉｐａｓｅ  ｆａｍｉｌｙ，ｃｌｏｎｅｄ  ｆｒｏｍ  ａ  ｍｅｔａｇｅｎｏｍｉｃ  ｌｉｂｒａｒｙ」、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１（２）：８１７−８２５頁）。
【０００９】
ステッター（Ｓｔｅｔｔｅｒ）らは、１００℃を超える温度で成長する、イタリアのブルカノ島（Ｖｕｌｃａｎｏ  Ｉｓｌａｎｄ）の、温泉に由来する微生物を同定した（ステッター  Ｋ．Ｏ．（Ｓｔｅｔｔｅｒ  Ｋ．Ｏ．）  「Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｌｉｆｅ  ｉｎ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍａｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ」、ＡＳＭ  Ｎｅｗｓ  ６１：２８５−２９０頁、１９９５年、ステッター  Ｋ．Ｏ．（Ｓｔｅｔｔｅｒ  Ｋ．Ｏ．）、フィアラ  Ｇ．（Ｆｉａｌａ  Ｇ．）、ヒューバー  Ｒ．（Ｈｕｂｅｒ  Ｒ．）およびセグレ  Ａ．（Ｓｅｇｅｒｅｒ  Ａ．）  「Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ」、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．７５：１１７−１２４頁、１９９０年）。長年にわたり６０℃で最適に成長する好熱性生物が知られている一方、高度好熱性（または極めて好熱性）の微生物は、古細菌（Ａｒｃｈａｅａ）と称される新たな進化したクラスに属する（ウース  Ｃ．Ｒ．（Ｗｏｅｓｅ  Ｃ．Ｒ．）、カンドラー  Ｏ．（Ｋａｎｄｌｅｒ  Ｏ．）およびホイーリス  Ｍ．Ｌ．（Ｗｈｅｅｌｉｓ  Ｍ．Ｌ．）  「Ｔｏｗａｒｄｓ  ａ  Ｎａｔｕｒａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｏｆ  Ｏｒｇａｎｉｓｍｓ：Ｐｒｏｐｏｓａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ  Ａｒｃｈａｅａ，Ｂａｃｔｅｒｉａ，ａｎｄ  Ｅｕｃａｒｙａ」、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：４５７６−４５７９頁、１９９０年）。古細菌は、地球が冷却された期間にあたる１０億年より前に発生していたと考えられている。その結果、温泉および深海熱水孔の環境内でそれらの進化的発生が生じた。この新しい集団の１つのメンバーがパイロコッカス・フリオサスである。
【００１０】
パイロコッカス・フリオサスなどの高度好熱性生物は、進化して顕著に高い温度で生存してきた。これを実現するには、細菌タンパク質、特にペリプラスム空間（環境との接触が最も感じられる場所）内で発現されるものがこれらの条件に十分に適合しなければならない。パイロコッカス・フリオサスは、最高約１０３℃の温度で、タンパク質および澱粉を含む高分子基質上で成長可能な偏性従属栄養生物（ｏｂｌｉｇａｔｅ  ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈ）である。パイロコッカス・フリオサスから調製されるタンパク質分解酵素を含有する製剤については、過去に米国特許第５，２４２，８１７号および米国特許第５，３９１，４８９号に記載されている。例えば、ブルメンタルズ、イルセ  Ｉ．（Ｂｌｕｍｅｎｔａｌｓ，Ｉｌｓｅ  Ｉ．）、ロビンソン、アン  Ｓ．（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ａｎｎｅ  Ｓ．）、ケリー、ロバート  Ｍ．（Ｋｅｌｌｙ，Ｒｏｂｅｒｔ  Ｍ．）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｄｏｄｅｃｙｌ  Ｓｕｌｆａｔｅ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  Ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ．」  Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、５６、７：１９９２−１９９８頁、（１９９０年）、エゲン、リック（Ｅｇｇｅｎ，Ｒｉｋ）、ギアリング、アンス（Ｇｅｅｒｌｉｎｇ，Ａｎｓ）、ワッツ、ジェニファー（Ｗａｔｔｓ，Ｊｅｎｎｉｆｅｒ）およびデヴォス、ウィレム  Ｍ．（ｄｅ  Ｖｏｓ，Ｗｉｌｌｅｍ  Ｍ．）、「Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｙｒｏｌｙｓｉｎ，ａ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｖｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ａｒｃｈａｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ．」  ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、７１：１７−２０頁（１９９０年）、フォールホルスト（Ｖｏｏｒｈｏｒｓｔ）、ウィルフリード  Ｇ．Ｂ．（Ｗｉｌｆｒｉｅｄ  Ｇ．Ｂ．）、エゲン、リック  Ｉ．Ｌ．（Ｅｇｇｅｎ，Ｒｉｋ  Ｉ．Ｌ．）、ギアリング、アンス  Ｃ．Ｍ．（Ｇｅｅｒｌｉｎｇ，Ａｎｓ  Ｃ．Ｍ．）、プラチュー、クライスト（Ｐｌａｔｔｅｅｕｗ，Ｃｈｒｉｓｔ）、ジーゼン、ローランド  Ｊ．（Ｓｉｅｚｅｎ，Ｒｏｌａｎｄ  Ｊ．）、デヴォス、ウィレム  Ｍ．（ｄｅ  Ｖｏｓ，Ｗｉｌｌｅｍ  Ｍ．）、「Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  Ｓｅｒｉｎｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ，Ｐｙｒｏｌｙｓｉｎ，ａｎｄ  Ｉｔｓ  Ｇｅｎｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  Ａｒｃｈａｅｏｎ  Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ．」  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７１、３４：２０４２６−２０４３１頁（１９９６年）も参照のこと。
【００１１】
過去数年にわたり、同様に、極めて低いｐＨおよび重金属が多い環境下、２０〜８０℃の温度勾配において成長するポンペイワーム（Ｐｏｍｐｅｉｉ  ｗｏｒｍ）のアルビネラ・ポンペヤーナ（Ａｌｖｉｎｅｌｌａ  ｐｏｍｐｅｊａｎａ）を例とする数種類の好熱真核生物が発見されている。別の好熱好酸性種であるアリシクロバチルス・アシドカルダリウス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｃａｌｄａｒｉｕｓ）は、進化して高温および極めて低いｐＨにて生存している。このため、この生物由来のタンパク質（特に、極限環境条件のあらゆる負荷に暴露されたペリプラスムタンパク質）がかかる環境下でセンサとして機能する能力があり、細胞のかかる部分において局所的に液胞として認められうると考えられる。
【００１２】
近年における数が増加し続ける高度好熱性種の発見と同時に、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）の使用によるイオンおよび代謝産物のインビボ測定が十分に利用されている。例えば、ＦＲＥＴ技術を利用し、ＣＦＰ、ＹＦＰ、およびカルモデュリンおよびＭ１３ペプチドよりなる認識ドメインを融合させることにより、カルシウム濃度変化が測定されている（チャン  Ｊ．（Ｚｈａｎｇ  Ｊ．）、キャンベル  Ｒ．Ｅ．（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｒ．Ｅ．）、ティン  Ａ．Ｙ．（Ｔｉｎｇ  Ａ．Ｙ．）、およびツィエン  Ｒ．Ｙ．（Ｔｓｉｅｎ  Ｒ．Ｙ．）（２００２ａ）「Ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｎｅｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．」  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３、９０６−９１８頁、チャン  Ｊ．（Ｚｈａｎｇ  Ｊ．）、キャンベル  Ｒ．Ｅ．（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｒ．Ｅ．）、ティン  Ａ．Ｙ．（Ｔｉｎｇ  Ａ．Ｙ．）、およびツィエン  Ｒ．Ｙ．（Ｔｓｉｅｎ  Ｒ．Ｙ．）（２００２ｂ）「Ｃｒｅａｔｉｎｇ  ｎｅｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ．」  Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３、９０６−９１８頁）。カルシウムのカルモデュリンへの結合はキメラの広範囲にわたる構造的再編成を引き起こし、それによりドナーおよびアクセプター蛍光部分に媒介されてＦＲＥＴ強度に変化が生じる。基質結合時に２つのローブのハエトリソウ様（Ｖｅｎｕｓ  ｆｌｙｔｒａｐ−ｌｉｋｅ）の閉鎖を受ける多数の細菌のペリプラスム結合タンパク質が、最近、代謝産物ナノセンサ用の足場としての使用が成功している（フェー  Ｍ．（Ｆｅｈｒ  Ｍ．）、フロマー  Ｗ．Ｂ．（Ｆｒｏｍｍｅｒ  Ｗ．Ｂ．）およびラロンド  Ｓ．（Ｌａｌｏｎｄｅ  Ｓ．）（２００２年）  「Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｔｏｓｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒｓ．」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９、９８４６−９８５１頁、フェー  Ｍ．（Ｆｅｈｒ  Ｍ．）、ラロンド  Ｓ．（Ｌａｌｏｎｄｅ  Ｓ．）、ラガー  Ｉ．（Ｌａｇｅｒ  Ｉ．）、ウォルフ  Ｍ．Ｗ．（Ｗｏｌｆｆ  Ｍ．Ｗ．）、およびフロマー  Ｗ．Ｂ．（Ｆｒｏｍｍｅｒ  Ｗ．Ｂ．）（２００３年）  「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｙｔｏｓｏｌ  ｏｆ  ＣＯＳ−７  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒｓ．」  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８、１９１２７−１９１３３頁、ラガー  Ｉ．（Ｌａｇｅｒ  Ｉ．）、フェー  Ｍ．（Ｆｅｈｒ  Ｍ．）、フロマー  Ｗ．Ｂ．（Ｆｒｏｍｍｅｒ  Ｗ．Ｂ．）、およびラロンド  Ｓ．（Ｌａｌｏｎｄｅ  Ｓ．）（２００３年）  「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｒｉｂｏｓｅ．」  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ５５３、８５−８９頁）。
【００１３】
ＦＲＥＴバイオセンサが生物内の代謝産物レベルの研究において必須のツールであることが判明しているが、中温性リガンド結合タンパク質を用いるバイオセンサの構築はそれ自体の限界を有している。限界の１つは、タンパク質工学を介し、変異がタンパク質に一旦導入されると、リガンド結合タンパク質が不安定化状態になり、例えばリガンド結合の特異性が変化するかまたはセンサシグナルが増強される可能性がある。例えば、推定上の乳酸塩結合タンパク質Ｌａｃ．Ｇ２（ルーガー（Ｌｏｏｇｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、４２３（６９３６）：１８５−１９０頁）がＦＬＩＰ−ｍｇｌＢ．Ｅｃの変異により作製され、それは乳酸塩結合の証拠を示したが、ＦＲＥＴシグナルの温度依存的低下から明らかなように顕著に不安定化された。したがって、タンパク質工学のためのより強固な足場を提供しうる、改善された熱安定性、化学安定性、および酸安定性を有する環境的に安定なバイオセンサを開発することが必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、容易に作製可能な改善された環境的に安定なバイオセンサに対する需要が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
［発明の概要］
本発明は、好熱性タンパク質がΔＧｆｏｌｄに対して好ましいエンタルピーおよびエントロピーの寄与を有すると見られるという概念に基づいており、ナノセンサの構築および設計におけるより堅牢なプラットフォームを提供しうる。これらの高度に進化したタンパク質は、より耐久性のあるセンサの認識因子をほぼ確実にもたらすことになり、さらにより高度な変異誘発に適合する一方、依然としてフォールディングされた安定なタンパク質を提供しうる。この後者の特性は、これらのタンパク質を他のリガンドに結合させるという再設計において有用なものとなる。それはループが挿入されたＦＬＩＰコンストラクトの構築においても役立つことになり、それは典型的には線状の末端融合物に対してより高いシグナル対ノイズ比を有するが、相対的に不安定化されるのも典型的である。
【００１６】
本出願に記載のＦＲＥＴバイオセンサは、実施を目的とするこの概念を最初に還元したものである。例えば、本明細書に記載のパイロコッカス・フリオサスｍａｌＥまたはアリシクロバチルス・アシドカルダリウスｍａｌＥを使用して構築されたＦＲＥＴバイオセンサは、想定されるマルトース結合、良好なシグナル変化、塩酸グアニジン変性に対する強固な耐性、および大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）ｍａｌＥを用いて調製された中温性タンパク質ＦＬＩＰ−ｍａｌＥ．ＥｃコンストラクトよりもｐＨに対して安定なシグナルを示す。例えばパイロコッカス・フリオサス、アリシクロバチルス・アシドカルダリウスまたは他の好熱性生物由来の他の好熱性タンパク質の結合ドメインを含むバイオセンサはまた、本明細書に記載の方法を用いて作製可能である。
【００１７】
したがって、本発明は、代謝産物濃度における変化を検出および測定することを目的とする、高度好熱性および好熱性タンパク質を利用した、酸変性、熱変性および化学変性に耐性を示す環境的に安定なバイオセンサを提供する。特に、本発明は、好熱性生物由来のリガンド結合タンパク質部分、リガンド結合タンパク質部分と共有結合されたドナー蛍光団部分、およびリガンド結合タンパク質部分に共有結合されたアクセプター蛍光団部分を含む環境的に安定な蛍光指示薬をコード化する単離された核酸配列を提供し、ここで、ドナー部分が励起されかつリガンドがリガンド結合タンパク質部分に結合すると、ドナー部分とアクセプター部分の間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）が変化する。本発明の核酸を含む、発現ベクターを含むベクター、および宿主細胞、ならびに該核酸によってコード化されるバイオセンサのタンパク質もまた提供される。かかる核酸、ベクター、宿主細胞およびタンパク質は、リガンド結合および分析物のレベルにおける変化を検出する方法、ならびにリガンド結合を調節する化合物を同定する方法において使用されうる。
【００１８】
［図面の簡単な説明］
図１は、図１ａおよび１ｂを含み、１０ｍＭマルトースの存在下または非存在下でのｍａｌＥ＿ＰｆおよびｍａｌＥ＿Ａａのナノセンサのシグナル変化を示す。
図２は、図２ａおよび２ｂを含み、ｍａｌＥ＿ＰｆおよびｍａｌＥ＿Ａａナノセンサについての滴定曲線を描いたものである。
図３は、熱変性に対するｍａｌＥ＿Ｐｆ、ＭａｌＥ＿ＡａおよびＭａｌＥ＿Ｅｃナノセンサの耐性を比較したものである。
図４は、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣＬ）変性に対するｍａｌＥ＿Ｐｆ、ＭａｌＥ＿ＡａおよびＭａｌＥ＿Ｅｃナノセンサの耐性を比較したものである。
図５は、高度好熱性ＦＬＩＰ−ｍａｌＥ＿Ｐｆおよび中温性ＦＬＩＰ−ｍａｌＥ＿ＥｃナノセンサのｐＨ安定性を示す。
図６は、様々なｐＨでのｍａｌＥ＿Ｐｆ、ｍａｌＥ＿ＡａおよびｍａｌＥ＿Ｅｃナノセンサの蛍光シグナルの安定性を示す。
【００１９】
［発明の詳細な説明］
以下の説明は、本発明の理解において有用でありうる情報を含む。本明細書中に提供される情報のいずれかが先行技術であるかまたは今回特許請求される発明に関連していること、あるいは具体的もしくは暗黙的に参照される任意の出版物が先行技術であることは承認されたことではない。
【００２０】
本発明の他の目的、利点および特徴は、当業者にとっては本明細書中に提供される明細書および図面をレビューする際に明白なものになる。したがって、本発明のさらなる目的および利点は、以下の記載から明白なものになる。
【００２１】
バイオセンサ
本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）を用いて標的の生体代謝産物濃度中の変化を検出および測定することを目的とした、高度好熱性および中等度好熱性タンパク質を利用する環境的に安定なバイオセンサを提供する。本明細書中で用いられる「好熱性」は、さらに下記のようにタンパク質および生物における高度好熱性（または超好熱性）と中等度好熱性の双方を示す。本発明の文脈において「環境的に安定な」とは、バイオセンサが酸変性、熱変性および／または化学変性に耐性であることを示すのに用いられる。例えば、かかる酸はＨＣｌを含むがこれに限定されない場合がある。耐性温度は、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１１０℃を超える場合がある。かかる化学変性剤は、塩酸グアニジン、尿素、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、およびドデシル硫酸ナトリウムを含むがこれらに限定されない場合がある。
【００２２】
一実施形態では、特に本発明は、高度好熱性生物由来のリガンド結合タンパク質を含む蛍光指示薬、特にパイロコッカス・フリオサスまたはアリシクロバチルス・アシドカルダリウスのマルトース／マルトデキストリン結合タンパク質由来のマルトース／マルトデキストリン結合タンパク質部分を含む指示薬を提供する。しかし、本発明は、特定のリガンド結合タンパク質、あるいはいずれかの特定の高度好熱性生物または好熱性生物によるものに限定されない。むしろ、本発明は、高度好熱性生物または中等度好熱性生物を含む好熱性生物内で同定可能な任意のリガンド結合タンパク質を含むＦＲＥＴバイオセンサを含む。
【００２３】
本明細書中で用いられる「高度好熱性」または「超好熱性」は、約６５〜約１１５℃の範囲内に含まれる成長の温度範囲を有する生物に対する一般用語を示す。高度好熱性は、高度好熱性生物によって生成される酵素を示すためにも本明細書中で用いられる場合がある。例えばＳ．ソルファタリクス（Ｓ．ｓｏｌｆａｔａｒｉｃｕｓ）は、約６５℃〜約９１℃の成長の温度範囲を有する。好適な高度好熱性生物は、例えばサーマス・アクアティカス、サーマス・サーモフィラス、サーマス・ブロキアナス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｂｒｏｃｋｉａｎｕｓ）、サーマス・フラバス（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｆｌａｖｕｓ）、サーモクリニス・ルーバー（Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ  ｒｕｂｅｒ）、サーマトガ・マリチマ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーマトガ・サーマラム（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｔｈｅｒｍａｒｕｍ）、サーマトガ・ネアポリターナ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ  ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａ）、サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）、パイロコッカス・フリオサス、パイロコッカス・ウーゼイ（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｗｏｅｓｉｉ）、パイロロバス・フマリイ（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ  ｆｕｍａｒｉｉ）を含む、サーマス（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、サーモクリニス（Ｔｈｅｒｍｏｃｒｉｎｉｓ）、サーマトガ（Ｔｈｅｒｍａｔｏｇａ）、サーモプラズマ（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、サーモコッカス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ）、サーモアクチノマイセス（Ｔｈｅｒｍｏａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ）、アキフェックス（Ａｑｕｉｆｅｘ）、アエロパイレム（Ａｅｒｏｐｙｒｅｍ）、アーケオグロブス（Ａｒｃｈｅｏｇｌｏｂｕｓ）、パイロコッカス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、パイロロバス（Ｐｙｒｏｌｏｂｕｓ）、アシディアヌス（Ａｃｉｄｉａｎｕｓ）およびスルホロバス（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）の細菌種を含むがこれらに限定されない。また、アルビネラ・ポンペヤーナ（Ａｌｖｉｎｅｌｌａ  ｐｏｍｐｅｊａｎａ）およびシアニジウム・カルダリウム（Ｃｙａｎｉｄｉｕｍ  ｃａｌｄａｒｉｕｍ）を含むがこれらに限定されない好熱性の真核生物も含まれる。
【００２４】
本明細書中で用いられる「中等度好熱菌」は、約４５〜６５℃の範囲内に含まれる成長の温度範囲を有する微生物に対する一般用語を示す。好適な中等度好熱性生物は、例えば、アシディチオバチルス・カルダス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ）（旧チオバチルス・カルダス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓ））、アシジミクロビウム・フェロオキシダンス（Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ  ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ）、スルホバチルス・アシドフィルス（Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、スルホバチルス・ジスルフィドオキシダンス（Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｏｏｘｉｄａｎｓ）、スルホバチルス・サーモスルフィドオキシダンス（Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｓｕｌｆｉｄｏｏｘｉｄａｎｓ）、フェロプラズマ・アシダルマヌス（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄａｒｍａｎｕｓ）、サーモプラズマ・アシドフィラム（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウスを含む、例えば、アシディチオバチルス（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシジミクロビウム（Ａｃｉｄｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、スルホバチルス（Ｓｕｌｆｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、フェロプラズマ（Ｆｅｒｒｏｐｌａｓｍａ）、サーモプラズマおよびアリシクロバチルス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ）の種よりなる群から選択されうる。アリシクロバチルス・アシドカルダリウスは、熱安定性および酸安定性の両方を有する。その熱および酸に安定性を有する（ｔｈｅｒｍｏａｃｉｄｏｓｔａｂｌｅ）マルトース結合タンパク質の構造はＸ線により解明されており、かつタンパク質は低いｐＨに耐性であることが示されている（ハルスマン（Ｈｕｌｓｍａｎｎ）ら、（２０００年）。好熱好酸性グラム陽性細菌アリシクロバチルス・アシドカルダリウスにおけるマルトースおよびマルトデキストリンの輸送は、低いｐＨに耐性を示すマルトース結合タンパク質を含む高親和性輸送糸により仲介される。Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２、６２９２−６３０１頁、シャファー（Ｓｃｈａｆｅｒ）ら、（２００４年）。好熱好酸性の細菌アリシクロバチルス・アシドカルダリウスのマルトース−マルトデキストリン結合タンパク質のＸ線構造は、タンパク質の酸安定性への洞察をもたらす。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５、２６１−２７４頁。
【００２５】
したがって、本発明は、高度好熱性および好熱性生物に由来するタンパク質リガンド結合部分を含む好熱性のリガンド結合部分を用いて構成される蛍光指示薬をコード化する単離された核酸を提供する。一実施形態は、特に、マルトース／マルトデキストリンと結合する蛍光指示薬をコード化する単離された核酸であり、該指示薬は高度好熱性または好熱性生物に由来するマルトース／マルトデキストリン結合タンパク質部分、マルトース／マルトデキストリン結合タンパク質部分に共有結合されたドナー蛍光団部分、およびマルトース／マルトデキストリン結合タンパク質部分に共有結合されたアクセプター蛍光団部分を含み、ここで、ドナー部分が励起されかつマルトースまたはマルトデキストリンがマルトース／マルトデキストリン結合タンパク質部分に結合すると、ドナー部分とアクセプター部分の間のＦＲＥＴが変化する。好ましいマルトース／マルトデキストリン結合タンパク質部分は、高度好熱菌パイロコッカス・フリオサスおよび好熱好酸菌アリシクロバチルス・アシドカルダリウス由来のマルトース／マルトデキストリン結合タンパク質部分である。
【００２６】
本明細書中で用いられる「共有結合される」は、ドナーおよびアクセプター蛍光部分が、リガンド結合タンパク質部分、例えば該リガンド結合タンパク質部分内の選択されたアミノ酸に化学結合を介して結合されうることを意味する。共有結合されるとは、ドナーおよびアクセプター部分がリガンド結合タンパク質部分に、リガンド結合タンパク質部分がドナーおよびアクセプター部分を含む融合タンパク質として発現されるように遺伝的に融合されうることも意味する。
【００２７】
ドナー蛍光団部分またはアクセプター蛍光団部分あるいはこれら双方は、前記リガンド結合タンパク質部分の内部部位に融合されうる。ドナーおよびアクセプター部分は同じタンパク質ドメイン上またはローブ上に含まれうるが、好ましくは、ドナーおよびアクセプター部分はタンデムに融合されない。ドメインは、特定の機能を果たし、かつ典型的には少なくとも約４０〜約５０アミノ酸長であるタンパク質の一部である。単一のタンパク質にはいくつかのタンパク質ドメインが含まれうる。本発明に記載の「リガンド結合タンパク質部分」は、完全な天然タンパク質配列、またはその少なくとも１つもしくは複数のリガンド結合部分でありうる。好ましい実施形態では、特に、本発明のリガンド結合部分は、少なくとも約４０〜約５０アミノ酸長であるか、少なくとも約５０〜約１００アミノ酸長であるか、または約１００アミノ酸長よりも長い。
【００２８】
好ましいリガンド結合タンパク質部分は、特に、パイロコッカス・フリオサス（ＡＴＣＣ４３５８７）ｍａｌＥタンパク質由来のマルトース／マルトデキストリン結合タンパク質部分である。パイロコッカスｍａｌＥのＤＮＡ配列（配列番号１）およびそのタンパク質配列（配列番号２）は、当該技術分野で既知である。別の好ましいリガンド結合タンパク質部分は、アリシクロバチルス・アシドカルダリウスｍａｌＥタンパク質由来のマルトース／マルトデキストリン結合タンパク質部分である。アリシクロバチルスｍａｌＥのＤＮＡ配列（配列番号３）およびそのタンパク質配列（配列番号４）も当該技術分野で既知である。マルトース／マルトデキストリン結合領域をコード化するｍａｌＥ  ＤＮＡ配列のいずれの部分も、本発明の核酸において用いられうる。他の好熱性および高度好熱性生物由来のｍａｌＥまたはそのホモログのいずれかのマルトース／マルトデキストリン結合部分は、本明細書に記載のベクターにクローニングされ、活性について開示されたアッセイに従いスクリーニングされうる。
【００２９】
測定可能なマルトース／マルトデキストリンの結合機能を維持する部位特異的変異、欠失または挿入を含む人工的に設計された変異体、ならびに大きさがマルトースまたはマルトデキストリンに類似した別の低分子、および例えばショ糖またはオーキシンもしくはセロトニンを例とする異なるものといった化学物質に結合するように意図的に設計される誘導体に加え、ｍａｌＥの天然種変異体も使用可能である。本発明の核酸コンストラクトにおける使用に適する変異核酸配列は、好ましくはｍａｌＥの遺伝子配列に対して少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９％の類似性または同一性を有することになる。適切な変異核酸配列はまた、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でｍａｌＥの遺伝子にハイブリダイズしうる。高度にストリンジェントな条件は当該技術分野で既知であり、例えばマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、１９８９年、およびＳｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、アウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら編（双方とも本明細書において引用により含まれる）を参照のこと。ストリンジェントな条件は、配列に依存し、かつ異なる環境下で異なることになる。より長い配列は、より高温で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションに対する広範な手引きは、ティッセン（Ｔｉｊｓｓｅｎ）、Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ，「Ｏｖｅｒｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｓｓａｙｓ」（１９９３年）（引用により本明細書中に含まれる）において見出される。一般にストリンジェントな条件は、所定のイオン強度、ｐＨで特定の配列の熱融点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低いように選択される。Ｔｍは、（標的配列がＴｍで過剰に存在し、プローブの５０％が平衡時に占有される際に）標的に対して相補的なプローブの５０％が平衡時に標的配列にハイブリダイズする（所定のイオン強度、ｐＨおよび核酸濃度の下での）温度である。ストリンジェントな条件は、塩濃度が約１．０Ｍ未満のナトリウムイオン、典型的にはｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度（または他の塩）、ならびに温度が短いプローブ（例えば１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃および長いプローブ（例えば５０ヌクレオチドより長い）について少なくとも約６０℃という条件となる。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加によって得られる場合がある。
【００３０】
開示されたナノセンサにより測定可能なリガンド濃度の範囲を拡大するために、本発明の好ましい人工変異体が、リガンドに対する低い親和性を示すように設計される場合がある。リガンドに対する結合親和性の低下または増大を示すさらなる人工変異体は、ランダムまたは部位特異的変異誘発および他の既知の変異誘発技術によって構築され、本明細書に記載のベクターにクローニングされ、活性について開示されたアッセイに従いスクリーニングされうる。開示されたバイオセンサの結合特異性はまた、バイオセンサによって認識されるリガンドを改変するように変異誘発によって改変されうる。例えば、ルーガー（Ｌｏｏｇｅｒ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、４２３（６９３６）：１８５−１９０頁を参照のこと。
【００３１】
本発明のセンサはまた、ＦＲＥＴに適合する蛍光タンパク質のドナー／アクセプター対とは異なるレポーター要素を用いて設計されうる。例えば、センサのリガンド結合部分は、活性が特異的リガンドにより調節される、アロステリック制御される酵素を生成するような方法で酵素と融合されうる（グンタス（Ｇｕｎｔａｓ）およびオスターマイヤー（Ｏｓｔｅｒｍｅｉｅｒ）、２００４年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６（１）：２６３−７３頁）。さらに、かかるアロステリック制御されるレポータードメインは、２つもしくはそれより多くの分離した補完的部分、例えばβ−ラクタマーゼ（ガラヌー（Ｇａｌａｒｎｅａｕ）ら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０：６１９−６２２頁）またはＧＦＰ（カバントゥー（Ｃａｂａｎｔｏｕｓ）ら、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２３：１０２−１０７頁）の補完的断片に分かれる可能性がある。いかなるレポーター要素断片も、末端間方式でリガンド結合部分と融合されるか（例えば典型的な融合タンパク質）またはリガンド結合部分の配列に内部挿入される可能性がある（例えば、本明細書に記載のようなループが挿入された蛍光タンパク質）。
【００３２】
本発明の単離された核酸は、ＦＲＥＴにおけるドナーおよびアクセプター部分として協働可能なあらゆる適切なドナーおよびアクセプター蛍光団部分を組み込んでいてもよい。好ましいドナーおよびアクセプター部分は、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、ＣＦＰ（シアン蛍光タンパク質）、ＢＦＰ（青色蛍光タンパク質）、ＹＦＰ（黄色蛍光タンパク質）、およびこれらの強化された変異体よりなる群から選択され、ここでは特に好ましい実施形態が、ＣＦＰドナー／改善されたｐＨ耐性および成熟期間を有するＹＦＰの変異体であるＹＦＰ−Ｖｅｎｕｓ（ナガイ  Ｔ（Ｎａｇａｉ  Ｔ）、イバタ  Ｋ．（Ｉｂａｔａ  Ｋ．）、パーク  Ｅ．Ｓ．（Ｐａｒｋ  Ｅ．Ｓ．）、クボタ  Ｍ．（Ｋｕｂｏｔａ  Ｍ．）、ミコシバ  Ｋ．（Ｍｉｋｏｓｈｉｂａ  Ｋ．）、およびミヤワキ  Ａ．（Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ．）（２００２年）  「Ａ  ｖａｒｉａｎｔ  ｏｆ  ｙｅｌｌｏｗ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｗｉｔｈ  ｆａｓｔ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ−ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．」  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０、８７−９０頁）アクセプターの対によって提供される。それ以外として、より高いｐＨ安定性およびより大きいスペクトル分離を有するＭｉＣｙ／ｍＫＯ対が挙げられる（カラサワ  Ｓ．（Ｋａｒａｓａｗａ  Ｓ．）、アラキ  Ｔ．（Ａｒａｋｉ  Ｔ．）、ナガイ  Ｔ．（Ｎａｇａｉ  Ｔ．）、ミズノ  Ｈ．（Ｍｉｚｕｎｏ  Ｈ．）、ミヤワキ  Ａ．（Ｍｉｙａｗａｋｉ  Ａ．）  「Ｃｙａｎ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｒａｎｇｅ−ｅｍｉｔｔｉｎｇ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｓ  ａ  ｄｏｎｏｒ／ａｃｃｅｐｔｏｒ  ｐａｉｒ  ｆｏｒ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ  ｅｎｅｒｇｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．」  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２００４年、３８１：３０７−１２頁）。さらに、ドナーまたはアクセプターとして適するものに、ディスコソマ（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ）種に由来する天然ＤｓＲｅｄ、別属に由来するＤｓＲｅｄのオルソログ、または最適化された特性を有する天然ＤｓＲｅｄの変異体（例えば、Ｋ８３Ｍ変異体またはＤｓＲｅｄ２（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）から入手可能））が挙げられる。ドナーおよびアクセプター蛍光部分を選択する場合に考慮すべき基準は、例えば米国特許第６，１９７，９２８号（その全体が引用により本明細書中に含まれる）に開示のように当該技術分野で既知である。
【００３３】
本発明者らは、最近、バイオセンサの蛍光団が類似または関連配列のストレッチを含む場合、遺伝子サイレンシングが特定の細胞内および特に生物全体内でのバイオセンサの発現に不利に作用しうることを発見している。かかる場合には、蛍光団の核酸配列が修飾されてもコード化されたアミノ酸配列は変化しないように、蛍光団のコーディング配列を各蛍光団のコドンの１つもしくは複数の縮重またはゆらぎ位置で修飾することが可能である。あるいは蛍光団の機能に不利に作用しない、１つもしくは複数の保存的置換もまた取り込まれる場合がある。ＰＣＴ出願［代理人整理番号第０５６１００−５０５４号、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｒｅｄｕｃｉｎｇ  Ｒｅｐｅａｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ」］（その全体が引用により本明細書中に含まれる）を参照のこと。
【００３４】
本明細書中で用いられる「変異体」という用語は、天然蛍光分子に対し、少なくとも８０％、９０％、９５％またはより高い同一性を含む、少なくとも約７０％、より好ましくは少なくとも７５％の同一性を有するポリペプチドを示すことが意図されている。多数のかかる変異体は、当該技術分野で既知であるか、または天然蛍光分子のランダムまたは特異的変異誘発により容易に調製可能である（例えば、フラドコフ（Ｆｒａｄｋｏｖ）ら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４７９：１２７−１３０頁（２０００年）を参照）。いくつか挙げると、ＴＯＴＯ色素（ライブ（Ｌａｉｂ）およびシーガー（Ｓｅｅｇｅｒ）、２００４年、Ｊ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃ．１４（２）：１８７−９１頁）、Ｃｙ３およびＣｙ５（チャーチマン（Ｃｈｕｒｃｈｍａｎ）ら、２００５年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０２（５）：１４１９−２３頁）、テキサスレッド（Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ）、フルオレセイン、およびテトラメチルローダミン（ＴＡＭＲＡ）（アンルー（Ｕｎｒｕｈ）ら、Ｐｈｏｔｏｃｈｅｍ  Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌ．２００４年１０月１日）、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ  ４８８を含むがこれらに限定されない色素、ならびに蛍光タグ（例えば、ホフマン（Ｈｏｆｆｍａｎ）ら、２００５年、Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２（３）：１７１−７６頁を参照）を、単独で使用するかまたは上掲の蛍光団と併用することも可能である。
【００３５】
ＦＲＥＴにおいては、センサがナノ粒子の表面に結合され、ラマン分光により検出がなされる、表面増強ラマン散乱を含む（ハエス（Ｈａｅｓ）およびヴァン・ダイン（Ｖａｎ  Ｄｕｙｎｅ）、２００４年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｄｉａｇｎ．４（４）：５２７−３７頁）、発光量子ドット（ＱＤ）またはペブル共役（ｐｅｂｂｌｅ−ｃｏｕｐｌｅｄ）アプローチ（クラップ（Ｃｌａｐｐ）ら、２００５年、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２７（４）：１２４２−５０頁、メディンツ（Ｍｅｄｉｎｔｚ）ら、２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０１（２６）：９６１２−１７頁、バック（Ｂｕｃｋ）ら、２００４年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．８（５）：５４０−６頁）を用いることも可能である。
【００３６】
生物発光共鳴エネルギー移動（ＢＲＥＴ）をインビトロおよびインビボ測定の双方で用いることも可能であり、それは蛍光励起の結果を伴わずにＦＲＥＴの利点を提供する。ＢＲＥＴは自然現象である。例えば、光タンパク質イクオリンがクラゲのアエクオレア（Ａｅｑｕｏｒｅａ）から精製される場合、それはＧＦＰの非存在下で青色光を放射するが、ＧＦＰとイクオリンがインビボにおけるように結合される場合、ＧＦＰはイクオリンからエネルギーを受け取り、緑色光を放射する。ＢＲＥＴでは、ＦＲＥＴ技術におけるドナー蛍光団の代わりにルシフェラーゼが用いられる。基質の存在下で、ルシフェラーゼからの生物発光により、上記と同じフェルスター（Ｆｏｅｒｓｔｅｒ）の共鳴エネルギー移動機構を通じてアクセプター蛍光団が励起される。したがって、ルシフェラーゼ／ＧＦＰ変異体または他の蛍光団の組合せの使用によりＢＲＥＴを、タンパク質相互作用をインビボとインビトロの双方で測定するのに利用できる（クス（Ｘｕ）ら、１９９９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９６：１５１−５６頁を参照、引用により本明細書中に含まれる）。
【００３７】
本発明は、本明細書に記載のバイオセンサのポリペプチドをコード化する単離された核酸分子を含むベクターをさらに提供する。例示的なベクターは、バクテリオファージ、バキュロウイルスまたはレトロウイルスなどのウイルス由来のベクター、ならびにコスミドまたはプラスミドなど、細菌あるいは細菌の配列と他の生物由来の配列の組み合わせに由来するベクターを含む。かかるベクターは、バイオセンサをコードする核酸配列に作動可能に連結される発現制御配列を含む発現ベクターを含む。ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）もしくは他の細菌などの原核細胞内、または酵母および動物細胞を含む真核細胞内での機能に適合されうる。例えば、本発明のベクターは、一般に、対象とする宿主細胞に適合する複製起点、対象とする宿主細胞に適合する１つもしくは複数の選択可能なマーカーおよび１つもしくは複数のマルチクローニングサイトなどの要素を含むことになる。ベクター内に含めることを意図した特定の要素の選択は、例えば誘導または調節可能なプロモーター、ベクターの所望のコピー数、所望の選択系などの使用を通じ、対象とする宿主細胞、インサートのサイズ、挿入配列の調節された発現が望ましいか否かなどの因子に依存することになる。異なる用途における宿主細胞とベクターの間の適合性を保証することに関連する因子は、当該技術分野で周知である。
【００３８】
本発明での使用を目的とする好ましいベクターは、ドナーおよびアクセプター蛍光分子をコード化する核酸間のリガンド結合ドメインまたは受容体のクローニングを可能にし、ドナーおよびアクセプター蛍光分子に共有結合されたリガンド結合ドメインを含むキメラまたは融合タンパク質の発現をもたらすことになる。例示的なベクターは、フェー（Ｆｅｈｒ）ら、（２００２年）（「Ｖｉｓｕａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍａｌｔｏｓｅ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ｌｉｖｉｎｇ  ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｎａｎｏｓｅｎｓｏｒｓ．」  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９、９８４６−９８５１頁、その全体が引用により本明細書中に含まれる）に開示された細菌のｐＲＳＥＴ−ＦＬＩＰ誘導体を含む。融合タンパク質を発現するような正しいフレームで核酸をベクターにクローニングする方法は、当該技術分野で周知である。
【００３９】
本発明のキメラ核酸は、好ましくは、ドナーとアクセプターの間のＦＲＥＴにおける変化がリガンド結合時に検出されうるような方法で、ドナーおよびアクセプター蛍光部分のコーディング配列がリガンド結合ドメインの別の末端に融合されるように構築される。蛍光ドメインは、所望により、１つもしくは複数の柔軟なリンカー配列によりリガンド結合ドメインから分離されうる。かかるリンカー部分は、好ましくは約１〜５０アミノ酸残基長、およびより好ましくは約１〜３０アミノ酸残基長である。リンカー部分およびそれらの用途は当該技術分野で周知であり、例えば、米国特許第５，９９８，２０４号および米国特許第５，９８１，２００号ならびにニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：５４５−５５３頁（１９９６年）において記載されている。あるいは、本明細書に記載の蛍光団のいずれかの短縮バージョンが使用されうる。
【００４０】
蛍光部分が末端ではなくバイオセンサ内部の位置から発現および提示されるように、蛍光分子のコーディング配列の一方もしくは双方をリガンド結合タンパク質のオープンリーディングフレーム内に挿入することも、リガンド結合ドメインの性質および大きさに応じて可能となる。かかるセンサは、米国特許出願番号［代理人整理番号第５０４６号］（その全体が引用により本明細書中に含まれる）に概ね記載されている。ｍａｌＥまたは他のマルトース／マルトデキストリン結合ドメインをコード化する配列などのリガンド結合配列を、タンデム分子間ではなく、単一の蛍光団のコーディング配列、すなわちＧＦＰ、ＹＦＰ、ＣＦＰ、ＢＦＰなどをコード化する配列内に挿入することも可能となる。米国特許第６，４６９，１５４号および米国特許第６，７８３，９５８号（これら各々はその全体が引用により本明細書中に含まれる）の開示によると、かかるセンサは、蛍光団の活性に影響するタンパク質内部での検出可能な変化をもたらすことにより応答する。
【００４１】
本発明はまた、大腸菌もしくは他の細菌などの原核細胞、または酵母細胞もしくは動物細胞などの真核細胞を含む、本発明のベクターまたは発現ベクターが形質移入された宿主細胞を含む。別の態様では、本発明は、環境的に安定なバイオセンサの発現をコードする核酸配列の発現に特徴づけられる表現型を有するトランスジェニック非ヒト動物を特徴とする。表現型は、動物の体細胞内および胚細胞内に含有される導入遺伝子によって授けられ、（ａ）環境的に安定なバイオセンサをコード化するＤＮＡコンストラクトを含む導入遺伝子を動物の接合体に導入するステップと、（ｂ）接合体を偽妊娠した動物に移植するステップと、（ｃ）接合体の出産までの発達を可能にするステップと、（ｄ）導入遺伝子を含む少なくとも１つのトランスジェニック子孫を同定するステップと、により生成されうる。導入遺伝子を胚に導入するステップは、導入遺伝子を含む胚性幹細胞を胚に導入するか、または胚を導入遺伝子を含むレトロウイルスに感染させることにより実施可能である。本発明のトランスジェニック動物は、トランスジェニック線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、トランスジェニックマウスおよび他の動物を含む。
【００４２】
本発明は、本明細書に記載の特性を有する単離された環境的に安定なバイオセンサ分子、特に高度好熱性および中等度好熱性タンパク質を用いて構築された結合蛍光指示薬も包含する。かかるポリペプチドは、本明細書に記載の核酸コンストラクトを用いて組み換え発現されうるか、または成分ドメインの一部もしくは全部の化学的結合により生成されうる。発現されたポリペプチドを、所望により、当該技術分野で既知の生化学的および／または免疫学的精製方法により、転写−翻訳系において生成しかつ／またはそれから単離するか、あるいは組み換え細胞から産生してもよい。本発明のポリペプチドを、細胞膜抽出物などの脂質二重層、あるいは人工脂質二重層（例えばリポソーム小胞）またはナノ粒子に導入してもよい。
【００４３】
分析物を検出する方法
本発明の核酸およびタンパク質は、リガンド結合を検出し、かつインビトロと動物の双方での分析物のレベルにおける変化を測定するのに有用である。一実施形態では、本発明は、細胞の試料内での分析物のレベルにおける変化を検出する方法であって、（ａ）本明細書に記載の環境的なバイオセンサをコード化する核酸を発現する細胞および細胞の試料を提供するステップと、（ｂ）ドナー蛍光団部分とアクセプター蛍光団部分の間のＦＲＥＴにおける変化を検出するステップと、を含む方法を含み、ここで、ドナー蛍光団部分とアクセプター蛍光団部分の各々がリガンドまたは分析物の結合ドメインに共有結合されており、ドナー部分とアクセプター部分との間のＦＲＥＴの変化が、細胞の試料中の分析物のレベルの変化を示す。
【００４４】
ＦＲＥＴは、当該技術分野で既知の種々の技術を用いて測定されうる。例えば、ＦＲＥＴを測定するステップは、アクセプター蛍光団部分から放射される光を測定するステップを含みうる。あるいは、ＦＲＥＴを測定するステップは、ドナー蛍光団部分から放射される光を測定するステップと、アクセプター蛍光団部分から放射される光を測定するステップと、ドナー蛍光団部分から放射される光とアクセプター蛍光団部分から放射される光の比を計算するステップと、を含みうる。ＦＲＥＴを測定するステップは、ドナー部分の励起状態寿命または異方性変化を測定するステップも含みうる（スクワイア  Ａ．（Ｓｑｕｉｒｅ  Ａ．）、バーバー  ＰＪ．（Ｖｅｒｖｅｅｒ  ＰＪ．）、ロックス  Ｏ．（Ｒｏｃｋｓ  Ｏ．）、バスティアンズ  ＰＩ．（Ｂａｓｔｉａｅｎｓ  ＰＩ．）、Ｊ．Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ．２００４年  １４７（１）：６２−９頁、「Ｒｅｄ−ｅｄｇｅ  ａｎｉｓｏｔｒｏｐｙ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｄｙｎａｍｉｃ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｈｏｍｏ−ＦＲＥＴ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌｓ．）。かかる方法は、当該技術分野で既知であり、米国特許第６，１９７，９２８号に概ね記載されており、これはその全体が引用により本明細書中に含まれる。
【００４５】
細胞の試料中のリガンドまたは分析物の量については、ＦＲＥＴの度合いを測定することにより判定可能である。まずセンサを試料中に導入しなければならない。分析物濃度における変化については、試料と蛍光指示薬の間の接触後における第１の時間および第２の時間にＦＲＥＴをモニターし、かつＦＲＥＴの度合いにおける差異を測定することによって判定可能である。試料中の分析物の量を、例えば滴定により確定された較正曲線を用いて定量可能である。
【００４６】
本発明の方法によって分析されるべき細胞試料は、例えば細胞表面上でのリガンド輸送の測定においてはインビボに、またはリガンドの流出は細胞培養において測定されうるインビトロに含有される場合がある。あるいは、細胞または組織由来の流体抽出物は試料として使用される場合があり、それからリガンドが検出または測定される。
【００４７】
本明細書に開示されるように分析物レベルを検出するための方法を用い、分析物の濃度およびリガンド結合の調節に使用可能な化合物をスクリーニングおよび同定することが可能である。一実施形態では、特に、本発明は、リガンド結合を調節する化合物を同定する方法であって、（ａ）本明細書に開示されるように環境的に安定なバイオセンサを発現する細胞および細胞の試料を含む混合物を、１つもしくは複数の試験化合物に接触させるステップと、（ｂ）該接触させるステップ後に、ドナー蛍光ドメインとアクセプター蛍光ドメインの間のＦＲＥＴを測定するステップと、を含む、方法を含み、ここで該接触させるステップ後のＦＲＥＴの増大または低下は、該試験化合物がリガンド結合活性を調節する化合物であることを示す。
【００４８】
この実施形態における「調節する」という用語は、かかる化合物がリガンド結合活性を増大または低下させうることを意味する。リガンド結合活性を増大させる化合物は、上記のように、異常なリガンド活性に関連した疾患の治療的介入および治療のための標的でありうる。リガンド結合活性を低下させる化合物は、リガンド結合活性に関連した疾患の治療のための治療用生成物へと開発されうる。
【００４９】
本発明の方法は、ハイスループットおよびハイコンテント薬剤スクリーニングのためのツールとしても使用されうる。例えば、本発明のバイオセンサを含む固体支持体またはマルチウェルディッシュを用い、複数の有望な候補薬剤を同時にスクリーニングすることが可能である。したがって、本発明は、受容体へのリガンドの結合を調節する化合物を同定するハイスループットな方法であって、（ａ）本発明の少なくとも１つのバイオセンサまたは本発明のバイオセンサの核酸を発現する少なくとも１つの細胞を含む固体支持体を、リガンドおよび複数の試験化合物と接触させるステップと、（ｂ）該接触させるステップ後に、ドナー蛍光ドメインとアクセプター蛍光ドメインの間のＦＲＥＴを測定するステップと、を含む、方法を含み、ここで該接触させるステップ後のＦＲＥＴの増大または低下は、特定の試験化合物がリガンド結合を調節する化合物であることを示す。
【００５０】
センサの原形質膜の外葉への標的化は、有望な用途の一つの実施形態にすぎない。それはナノセンサが特定の区画に標的化されうることを示す。あるいは、他の標的化配列を用いることで、センサは小胞、ＥＲ、液胞などの他の区画にて発現されうる。
【００５１】
以下の実施例は、本発明を説明および例示するために提供される。そのようなものとして、それらが本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者であれば、多数の他の実施形態も上文や特許請求の範囲に記載のような本発明の範囲内に含まれることを十分に理解するであろう。
【実施例】
【００５２】
実施例１  センサの構築
最初に、好熱性生物に由来するナノセンサのコンストラクトをパイロコッカス・フリオサスから得た。それは例えばマルトース結合タンパク質（ｍａｌＥ）センサ（ｍａｌＥ＿Ｐｆ）である。いくつかのさらなる好熱性生物に由来するセンサも構築した（サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）由来のｍａｌＥ、サーマス・サーモフィラス由来のｍａｌＥ（ｍａｌＥ＿Ｔｔ）、サーマス・サーモフィラス由来のｍｇｌＢ、サーマス・サーモフィラス由来のｑ７２ｈｃ２（分岐アミノ酸結合タンパク質）、サーマス・サーモフィラス由来の２６０９（アミノ酸結合タンパク質）、サーマス・サーモフィラス由来の１０３３（グルタミン酸塩結合タンパク質）、およびアリシクロバチルス・アシドカルダリウス由来のｍａｌＥ（ｍａｌＥ＿Ａａ））。
【００５３】
アリシクロバチルス・アシドカルダリウス由来のマルトース結合タンパク質（ｍａｌＥ）を、その既知の熱安定性および酸耐性故に、ナノセンサの構築における優先度の高い標的として選択した。ｍａｌＥ遺伝子をＰＣＲによりゲノムＤＮＡから単離し、最近開発されたＧＡＴＥＷＡＹ＿ＦＬＩＰクローニング方法を用いてＦＬＩＰ形式にした。同方法をｍａｌＥ＿Ｐｆナノセンサの構築にも適用した。
【００５４】
図１ａは、ｍａｌＥ−Ｐｆセンサにおける基質誘導されたＦＲＥＴ変化を示す。図１ｂは、ｍａｌＥ＿Ａａセンサにおける基質誘導されたＦＲＥＴ変化を示す。図面は、ｍａｌＥ＿ＰｆとｍａｌＥ＿Ａａのセンサ双方について１０ｍＭマルトースの存在下および非存在下におけるスペクトルが約５１０ｎｍで等吸収点（ｉｓｏｂｅｓｔｉｃ  ｐｏｉｎｔ）を有することを示す。約１００ｎＭのタンパク質濃度を有するｐＨ７．９の１０ｍＭトリス緩衝液中でスペクトルを得た。励起フィルタは４３３／−１２ｎｍ、ＣＦＰおよびＹＦＰ放射についての放射フィルタはそれぞれ４８１／−１２および５２６／−１２ｎｍであった。
【００５５】
図２ａおよび２ｂでは、ｍａｌＥ＿ＰｆおよびｍａｌＥ＿Ａａナノセンサについてのインビトロでの基質の滴定曲線を、マルトース依存性の比の変化を計算することにより得た。マルトースを添加した結果、ＣＦＰ放射が低下しかつＹＦＰ放射が増大した（ＹＦＰ／ＣＦＰ比における増加の正味効果）。非線形回帰により、ｍａｌＥ＿ＰｆのＫｄが４μＭであると判定した。単色光分光器のマイクロプレートリーダー、サファイア（Ｓａｆｉｒｅ）（テカン（Ｔｅｃａｎ）、オーストリア）を使用し、放射スペクトルおよび基質の滴定曲線を得た。励起フィルタは４３３／−１２ｎｍ、ＣＦＰおよびＹＦＰ放射についての放射フィルタはそれぞれ４８１／−１２および５２６／−１２ｎｍであった。すべての分析を、約１００ｎＭのタンパク質濃度を有するｐＨ７．９の１０ｍＭトリス緩衝液中で行った。
【００５６】
遺伝的にコード化されたＦＬＩＰセンサ形式は、種々の環境条件下でのセンサの安定性および応答についてのアッセイおよびスクリーニングに対して容易に利用可能である。ＦＬＩＰにおける蛍光タンパク質（ＦＰ）群の超安定性は、安定な結合タンパク質（ＢＰ）の存在下でＦＬＩＰセンサが堅牢になることを保証する。本発明者らは、熱、化学（塩酸グアニジン）および酸という３つの形態の変性に対する、ｍａｌＥ＿ＰｆおよびｍａｌＥ＿Ａａ（および対照比較については大腸菌由来のｍａｌＥ＿Ｅｃセンサ）の安定性についてアッセイした。
【００５７】
実施例２  温度耐性
３つのナノセンサを高温（６０℃〜９５℃）に５分間暴露し、次いで室温に再び低下させ、蛍光計にて速やかに分析した。すべてのセンサが、６０℃への暴露からの悪影響を全く示さなかった。ｍａｌＥ＿Ａａタンパク質は７０℃への暴露に対していくらかの感受性を示し、８５℃により不安定化した。ｍａｌＥ＿Ｅｃナノセンサは、７０℃に対してわずかに低い感受性を示したが、その後まもなく不安定化した。ｍａｌＥ＿Ｐｆセンサは最大８０℃の温度まで感受性を示さず、ＦＰが約８５℃でほどけることにより、この領域内で３つの全センサのシグナルの崩壊が生じる可能性が高い（図３）。蛍光シグナルが部分的に不安定化する時に増大することが、先に観察されており、それは溶融球状態の形成に起因する可能性がある。
【００５８】
実施例３  化学変性剤耐性
３つのセンサを様々な濃度の化学変性剤ＧｕＨＣｌ（塩酸グアニジン）にも暴露し、蛍光スペクトルを記録した。再び極限条件がナノセンサのＢＰ部分とＦＰ部分の双方に作用し、その上ＧｕＨＣｌ溶液中の高塩化物濃度がＦＰ、特にＹＦＰにいくらかのクエンチングをもたらす。これにもかかわらず、異なるセンサ間の傾向を観察することは可能である。ｍａｌＥ＿Ｐｆセンサは、中性ｐＨでのＧｕＨＣｌ変性に対して抜群の耐性を示す。この後、ｍａｌＥ＿Ｅｃ、次いで最後にｍａｌＥ＿Ａａセンサが続く。低いｐＨ（４．１）への暴露時でも、ｍａｌＥ＿Ｐｆセンサはやはり最も安定であるが、不安定化した。これに続くのはｍａｌＥ＿Ａａセンサであり、中性ｐＨに対していくらか不安定化した。ｍａｌＥ＿Ｅｃは、強酸ｐＨへの暴露により顕著に不安定化した（図４）。
【００５９】
実施例４  ＦＬＩＰ−ｍａｌＥナノセンサのｐＨ耐性
図５は、異なるｐＨ値での高度好熱性ＦＬＩＰ−ｍａｌＥ＿Ｐｆナノセンサおよび中温性ＦＬＩＰ−ｍａｌＥ＿Ｅｃナノセンサの安定性を比較したものである。ｐＨ５．５〜８．５の２０ｍＭリン酸塩緩衝液中で実験を行った。ＦＬＩＰ−ｍａｌＥ＿Ｐｆセンサは、ｐＨの変化に対する耐性がより高く、ここでのシグナル変動がＦＬＩＰ−ｍａｌＥ＿Ｅｃセンサよりもはるかに小さいことが判明した。
【００６０】
実施例５  ｐＨ変化時での蛍光シグナルの安定性
ナノセンサは、極限条件下で安定である上、特にもしこの新しい環境（例えば細胞内部）下での較正が困難である場合、正常な機能性を保持する必要がある。３つのナノセンサをｐＨ２．３〜７．０の範囲に暴露し、蛍光シグナルを２０ｍＭ  ＭＯＰＳ緩衝液中、飽和リガンド（１００μＭマルトース）の非存在下および存在下で測定した。ｍａｌＥ＿Ｐｆセンサは、ｐＨ２．７まで低下させたｐＨ作用に対して完全に耐性を示し、ｐＨ２．３での作用は極めてわずかであった。ｍａｌＥ＿Ｅｃセンサは、ｐＨ３．５未満において感受性であった。ｍａｌＥ＿Ａａセンサは、酸不安定化に対して最も耐性を示すにもかかわらず、ｐＨ変化により最も作用を受け、それ故、極めて低いｐＨで信頼性の高いマルトースセンサとして機能するまでにさらなる設計を加える必要があることになる（図６）。
【００６１】
本明細書中て考察されるすべての出版物、特許および特許出願は、引用により本明細書中に含まれる。本発明がその特定の実施形態に関連して記載されている一方、そのさらなる改良を可能とし、さらに本出願が、一般に本発明の原理に従い、本発明が関係する当該技術分野内での既知のまたは習慣的な実施の枠内に収まり、上記の本質的な特徴に適用可能で、かつ添付の特許請求の範囲の範囲内に従うように、本開示からのかかる逸脱を含む、本発明の任意の変数、使用、または適応を網羅するように意図されることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
【図１】図１は、図１ａおよび１ｂを含み、１０ｍＭマルトースの存在下または非存在下でのｍａｌＥ＿ＰｆおよびｍａｌＥ＿Ａａのナノセンサのシグナル変化を示す。
【図２】図２は、図２ａおよび２ｂを含み、ｍａｌＥ＿ＰｆおよびｍａｌＥ＿Ａａナノセンサについての滴定曲線を描いたものである。
【図３】図３は、熱変性に対するｍａｌＥ＿Ｐｆ、ＭａｌＥ＿ＡａおよびＭａｌＥ＿Ｅｃナノセンサの耐性を比較したものである。
【図４】図４は、塩酸グアニジン（ＧｕＨＣＬ）変性に対するｍａｌＥ＿Ｐｆ、ＭａｌＥ＿ＡａおよびＭａｌＥ＿Ｅｃナノセンサの耐性を比較したものである。
【図５】図５は、高度好熱性ＦＬＩＰ−ｍａｌＥ＿Ｐｆおよび中温性ＦＬＩＰ−ｍａｌＥ＿ＥｃナノセンサのｐＨ安定性を示す。
【図６】図６は、様々なｐＨでのｍａｌＥ＿Ｐｆ、ｍａｌＥ＿ＡａおよびｍａｌＥ＿Ｅｃナノセンサの蛍光シグナルの安定性を示す。
【図１−ａ】
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【図１−ｂ】
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【図２−ａ】
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【図２−ｂ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月1日(2007.11.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2008531048.tif 000033
2008531048.tif 000034