(57)【要約】細胞のアポトーシス及び細胞の寿命を調節する方法及び組成物をここに提供する。これらは、加齢に関係する異常や癌を治療又は防止するために用いられよう。
2008503479.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアミノ酸残基を含む単離されたKu70たんぱく質又はその部分と、単離された脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分とを含む、組成物。
【請求項２】
前記脱アセチル化酵素がクラスI/II ヒストンデアセチラーゼである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記脱アセチル化酵素がサーチュインである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記サーチュインがSIRT1である、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記Ku70たんぱく質又はその部分がアミノ酸残基K539 又は K542を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記アミノ酸残基がアセチル化している、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記アミノ酸残基K539 又はK542 がアセチル化しており、前記脱アセチル化酵素がSIRT1である、請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
前記Ku70たんぱく質又はその部分と、前記脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分とが複合体を形成する、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記Ku70たんぱく質又はその部分がアミノ酸残基K539 又は K542 を含み、そして前記脱アセチル化酵素がSIRT1である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
Ku70たんぱく質と脱アセチル化酵素との間の相互作用を調節する作用物質を特定する方法であって、
（ｉ）請求項６に記載の組成物を、検査化合物に、Ku70たんぱく質又はその部分と脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分との間の相互作用が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
（ｉｉ）Ku70たんぱく質又はその部分と脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分との間の相互作用のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分と脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分との間の相互作用のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質と脱アセチル化酵素との間の相互作用を調節することの指標である、ステップとを含む、方法。
【請求項１１】
前記脱アセチル化酵素がクラス I/II ヒストンデアセチラーゼである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記脱アセチル化酵素がサーチュインである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記サーチュインがSIRT1である、請求項３に記載の組成物。
【請求項１４】
Ku70たんぱく質の脱アセチル化を調節する作用物質を特定する方法であって、
（ｉ）請求項６に記載の組成物を、検査化合物に、前記Ku70たんぱく質又はその部分の脱アセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
（ｉｉ）Ku70たんぱく質又はその部分の脱アセチル化のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分の脱アセチル化のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質の脱アセチル化を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。
【請求項１５】
Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542の脱アセチル化を調節する作用物質を特定する方法であって、
（ｉ）請求項７に記載の組成物を、検査化合物に、K539又はK542の脱アセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
（ｉｉ）K539又はK542の脱アセチル化のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのK539又はK542の脱アセチル化のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542の脱アセチル化を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。
【請求項１６】
アポトーシスを調節する作用物質を特定するための、請求項１０乃至１５のいずれかに記載の方法であって、細胞のアポトーシスに対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの、前記作用物質の存在下でのアポトーシスの増加又は減少は、前記作用物質がアポトーシスを調節することの指標である、方法。
【請求項１７】
腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害する又は減少させる作用物質を特定するための、請求項１０乃至１５のいずれかに記載の方法であって、腫瘍に対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの、前記作用物質の存在下での腫瘍の成長又はサイズの減少は、前記作用物質が腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害する又は減少させることの指標である、方法。
【請求項１８】
寿命伸長を調節する作用物質を特定するための、請求項１０乃至１５のいずれかに記載の方法であって、細胞の寿命に対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの、前記作用物質の存在下での寿命の増加又は減少は、前記作用物質が細胞の寿命を調節することの指標である、方法。
【請求項１９】
アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアミノ酸残基を含む単離されたKu70たんぱく質又はその部分と、単離されたアセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分とを含む、組成物。
【請求項２０】
前記アセチルトランスフェラーゼがCREB結合たんぱく質(CBP)又はp300/CBP-関連因子 (PCAF)である、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記Ku70たんぱく質又はその部分がアミノ酸残基K539 又はK542を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２２】
前記Ku70たんぱく質又はその部分と、前記アセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分とが複合体を形成する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２３】
Ku70たんぱく質とアセチルトランスフェラーゼとの間の相互作用を調節する作用物質を特定する方法であって、
（ｉ）請求項１９に記載の組成物を、検査化合物に、Ku70たんぱく質又はその部分とアセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分との間の相互作用が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
（ｉｉ）Ku70たんぱく質又はその部分とアセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分との間の相互作用のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分とアセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分との間の相互作用のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質とアセチルトランスフェラーゼとの間の相互作用を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。
【請求項２４】
前記アセチルトランスフェラーゼがCBP 又はPCAFである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ku70たんぱく質のアセチル化を調節する作用物質を特定する方法であって、
（ｉ）請求項１９に記載の組成物を、検査化合物に、Ku70たんぱく質のアセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
（ｉｉ）Ku70たんぱく質又はその部分のアセチル化のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分のアセチル化のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアセチル化を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。
【請求項２６】
前記アセチルトランスフェラーゼがCBP 又はPCAFである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
Ku70のアミノ酸残基K539又はK542のアセチル化を調節する作用物質を特定する方法であって、
（ｉ）請求項２１に記載の組成物を、検査化合物に、K539又はK542のアセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、
（ｉｉ）アミノ酸残基K539又はK542のアセチル化のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのアミノ酸残基K539又はK542のアセチル化のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542のアセチル化を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。
【請求項２８】
Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542のアセチル化を調節する作用物質を特定する方法であって、
（ｉ）請求項１９に記載の組成物を含む細胞を、検査化合物及びアポトーシス性刺激に、前記アポトーシス性刺激が、Ku70たんぱく質又はその部分のK539又はK542のアセチル化を前記検査化合物の非存在下でも誘導する条件下で、接触させるステップと、
（ｉｉ）Ku70たんぱく質又はその部分のK539又はK542のアセチル化のレベルを判定するステップであって、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのK539又はK542のアセチル化のレベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542のアセチル化を調節することの指標である、ステップと
を含む、方法。
【請求項２９】
前記アポトーシス性刺激が紫外線暴露、電離性放射線、又はスタウロスポリンである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
アポトーシスを調節する作用物質を特定するための、請求項２３乃至２９のいずれかに記載の方法であって、細胞のアポトーシスに対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下でのアポトーシスの増加又は減少は、前記作用物質がアポトーシスを調節することの指標である、方法。
【請求項３１】
腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害する又は減少させるための作用物質を特定するための、請求項２３乃至２９のいずれかに記載の方法であって、腫瘍に対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下での腫瘍の成長又はサイズの減少は、前記作用物質が腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害する又は減少させることの指標である、方法。
【請求項３２】
寿命の伸長を調節する作用物質を特定するための、請求項２３乃至２９のいずれかに記載の方法であって、細胞の寿命に対する前記作用物質の効果を判定するステップを更に含み、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下での寿命の増加又は減少は、前記作用物質が細胞の寿命を調節することの指標である、方法。
【請求項３３】
アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアセチル化アミノ酸残基を含む、単離されたアセチル化Ku70たんぱく質又はその部分。
【請求項３４】
SEQ ID NO: 2に少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３３に記載の単離されたKu70たんぱく質であって、アセチル化していないときにはBax又はアセチルトランスフェラーゼと、あるいはアセチル化しているときには脱アセチル化酵素と、相互作用する、単離されたKu70たんぱく質。
【請求項３５】
SEQ ID NO: 2を含む、請求項３４に記載の単離されたKu70たんぱく質。
【請求項３６】
アセチル化残基K539 又は K542を含む、請求項３４に記載の単離されたKu70たんぱく質又はその部分。
【請求項３７】
アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアセチル化したアミノ酸を含むKu70たんぱく質又はその部分に特異的に結合する抗体。
【請求項３８】
Ku70たんぱく質又はその部分がアセチル化した残基K539 又は K542を含む、請求項３７に記載の抗体。
【請求項３９】
モノクローナル抗体である、請求項３８に記載の抗体。
【請求項４０】
K539、K542、K544、K553、及びK556 から成る群より選択されるリジン残基のアルギニンとの置換を含む変異型Ku70たんぱく質又はその部分をコードする核酸。
【請求項４１】
リジン残基K539 及び／又は K542 のアルギニンとの置換を含む変異型Ku70たんぱく質又はその部分をコードする核酸。
【請求項４２】
請求項４０に記載の核酸にコードされた変異型Ku70たんぱく質又はその部分。
【請求項４３】
請求項４０に記載の核酸を含む細胞。
【請求項４４】
請求項４３に記載の細胞を、変異型Ku70たんぱく質又はその部分が前記細胞で発現するような条件下で培養するステップと、前記変異型Ku70たんぱく質又はその部分を培養物から単離するステップとを含む、変異型Ku70たんぱく質又はその部分を調製する方法。
【請求項４５】
アセチル化Ku70たんぱく質、その変異型、又はその部分、あるいはそれに特異的に結合する抗体、を含む、キット。
【請求項４６】
細胞内でKu70たんぱく質のK539 又は K542 のアセチル化を誘導する、又は、脱アセチル化を阻害する、ステップを含む、細胞内でアポトーシスを誘導する方法。
【請求項４７】
Ku70たんぱく質のK539 又はK542 の脱アセチル化を阻害するステップを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
クラスI/IIデアセチラーゼのたんぱく質又は活性レベルを減少させるステップを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
サーチュインのたんぱく質又は活性レベルを減少させるステップを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
細胞を、サーチュインの活性を阻害する作用物質に接触させるステップを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記作用物質が、式１５−２４から成る群より選択される式を有する、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
クラスI/IIデアセチラーゼのたんぱく質又は活性レベルを減少させる作用物質に細胞を接触させるステップを更に含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
細胞内のCBP 又は PCAF のたんぱく質又は活性レベルを増加させるステップを含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５４】
Ku70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を誘導する、又は、脱アセチル化を阻害する、作用物質を、必要のある対象に投与するステップを含む、対象の腫瘍の成長又はサイズを減らす方法。
【請求項５５】
サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を減らす作用物質を対象に投与するステップを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
クラスI/II デアセチラーゼのたんぱく質レベル又は活性を減らす作用物質を対象に投与するステップを更に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
対象の細胞内のKu70たんぱく質のK539 又は K542 のアセチル化のレベルを判定するステップを更に含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
細胞内のKu70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を阻害する、又は、脱アセチル化を誘導する、ステップを含む、細胞のアポトーシスを阻害する方法。
【請求項５９】
細胞内のKu70たんぱく質のK539又はK542の脱アセチル化を誘導するステップを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を増加させる作用物質に細胞を接触させるステップを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
作用物質が、式２６乃至２７及び３０乃至３７から成る群より選択される式を有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
細胞内のCBP 又はPCAF のたんぱく質又は活性レベルを減らすステップを含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
クラスI/IIデアセチラーゼのたんぱく質レベル又は活性を増す作用物質に細胞を接触させるステップを更に含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
Ku70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を阻害する、又は、脱アセチル化を誘導する、作用物質に細胞を接触させるステップを含む、哺乳動物細胞の寿命を伸長する方法。
【請求項６５】
サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を増す作用物質、及び、クラスI/IIデアセチラーゼのたんぱく質レベル又は活性を増す作用物質、に細胞を接触させるステップを含む、細胞の寿命を伸長する方法。
【請求項６６】
Ku70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を誘導する、又は、脱アセチル化を阻害する、作用物質に細胞を接触させるステップを含む、哺乳動物細胞の寿命を減らす方法。
【請求項６７】
サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を減らす作用物質、及び、クラスI/IIデアセチラーゼのたんぱく質レベル又は活性を減らす作用物質、に細胞を接触させるステップを含む、細胞の寿命を減らす方法。
【請求項６８】
サーチュイン阻害剤及びクラスI/IIデアセチラーゼ阻害剤を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
政府による支援
本発明は、米国国立保健研究所からの助成金番号GM068072；AG19719 及び AG19972 を受けてなされた。政府は本発明の特定の権利を有するものである。 
【０００２】
関連出願の交互参照
本出願は、引用をもってその内容をここに特に援用することとする、２００４年６月１６日出願の米国仮出願 No. 60/580,169号に基づく権利を主張するものである。
【０００３】
背景
腫瘍抑制の鍵となる機序はアポトーシスによる細胞死である。このプロセスでかぎとなる調節ステップは、アポトーシス促進因子Baxの活性化である。Baxが細胞損傷により活性化される機序は依然、不明であるが、いくつかの下流の事象が解明されている。Baxは、その活性化後に外側のミトコンドリア膜に移動してオリゴマー化し、膜を透過性にして、チトクロームcを含むいくつかの細胞死促進因子を放出させる
(Scorrano and Korsmeyer, Biochem.
Biophys. Res. Commun. 304, 437-444 (2003))。
【０００４】
最近の研究では、Baxが不活性になる機序に光が当てられている。正常な無損傷の細胞では、BaxはKu70たんぱく質のC末端と相互作用してそれをミトコンドリアから切り離す (Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003)) 。Ku70が過剰発現すると、Bax媒介性アポトーシスが遮断されるが、他方、Ku70が枯渇すると、細胞は多様なアポトーシス性刺激に対してより感受性になる (Kim et al., Cancer Res. 59, 4012-4017 (1999); Sawada
et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003)) 。更に、Ku70とBaxとの間の相互作用は紫外線損傷後に失われる。まとめると、これらの結果は、Ku70が、Bax媒介性アポトーシスの生理学的に重要な阻害剤であることを実証しているのである(Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003)) 。
【０００５】
Ku70は最初、DNAの二本鎖損傷の非相同末端ジョイニング（NHEJ）による修復や、V(D)J組換えを通じた抗体遺伝子及びＴ細胞受容体遺伝子の再編成に必須である Ku70/ Ku80ヘテロ二量体の一部として特徴付けられた(Featherstone and Jackson, Mutat. Res. 434, 3-15 (1999)) 。Ku70/80 ヘテロ二量体は、テロメアの維持及び転写調節においても重要な役割を有する (Tuteja and Tuteja, Nature
412:607-614 (2000))。 Ku70 ノックアウトマウスは、電離性放射線に対して過敏であり (Ouyang et al., J. Exp. Med. 186, 921-929 (1997)) 、免疫無防備状態であり (Manis et al., J. Exp. Med. 187, 2081-2089 (1998)) 、そして胚発生中の高いアポトーシス性神経細胞死率を有する (Gu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
97: 2668-2673 (2000))。興味深いことに、Ku70ノックアウトマウス由来の細胞は、DNA損傷なしでもアポトーシスを促進するスタウロスポリン（STS）などの薬剤に対しても過敏である (Chechlacz et al., J. Neurochem. 78, 141-154 (2001))。このことは、DNA修復におけるその役割とは独立の、アポトーシスを抑制する上でのKu70の生理学的役割と一致する。Ku70
は主に核内たんぱく質であるが、それの細胞質側プールが少ないことが、Baxによる切り離しを担っているのではないかと考えられる (Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003)) 。DNA末端ジョイニングとアポトーシス抑制というKu70の二重の役割を考えると、それはおそらく、細胞生存とプログラムされた細胞死との間の決定によりDNA修復を調和させる中心的な因子であろう。
【０００６】
In vitroでDNA-PKによりKu70をリン酸化することができることを示したあるひとつの以前の研究 (Chan et al., Biochemistry 38:1819-1828 (1999))を別にすると、Ku70の翻訳後修飾が報告されたことはなく、このたんぱく質が調節される手段の理解も乏しい。更に、Bax媒介性アポトーシスにおけるKu70の機序上の役割も、まだ解明されていない。
【０００７】
Bax媒介性アポトーシスにおけるKu70の役割を理解できれば、たとえばアポトーシス、寿命、老化及びこれらに関係する疾患などを調節するための薬物デザインが可能になるであろう。
【０００８】
概要
アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアセチル化アミノ酸残基を含む、単離されたアセチル化Ku70たんぱく質及びその部分がここで提供される。単離された本Ku70 たんぱく質は、SEQ ID NO: 2に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を含むと思われ、この場合、本Ku70 たんぱく質は、それがアセチル化していないときはBax又はアセチルトランスフェラーゼと、あるいは、アセチル化しているときには脱アセチル化酵素と、相互作用する。単離された本Ku70 たんぱく質は、SEQ ID
NO:2 又はその一部分を含むであろう。単離された本Ku70
たんぱく質又はその部分は、アセチル化残基K539
又はK542を含むであろう。
【０００９】
更に、アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアミノ酸残基を含んでいてもよい単離されたKu70たんぱく質又はその部分と、CBP、PCAF 又は p300などの単離されたアセチルトランスフェラーゼとを含むなどの組成物も提供する。本Ku70 たんぱく質又はその部分は、アミノ酸残基K539 又は K542を含むであろう。他の組成物は、アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアミノ酸残基を含む単離されたKu70たんぱく質又はその部分と、クラスI/II
ヒストン脱アセチル化酵素及び／又はサーチュインなどの単離された脱アセチル化酵素とを含む。Ku70たんぱく質又はその部分はアミノ酸残基K539 又は K542を含むであろう。
【００１０】
単離されたたんぱく質複合体も提供される。複合体は、アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアミノ酸残基を含むKu70たんぱく質又はその部分を含んでいてもよく、そして脱アセチル化酵素も提供される。また複合体は、アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556 から成る群より選択されるアセチル化アミノ酸残基を含むKu70たんぱく質又はその部分と、脱アセチル化酵素とを含むであろう。
【００１１】
Ku70 たんぱく質又は その部分に特異的に結合すると共に、アミノ酸残基K317、K338、K539、K542、K544、K553 又は K556から成る群より選択されるアセチル化アミノ酸残基も選択的に含む抗体もここで解説される。抗体の標的をアセチル化残基K539又はK542に決定してもよい。本抗体はモノクローナル抗体でもよい。
【００１２】
例えばK539、K542、K544、K553、及びK556 から成る群より選択されるリジン残基のアルギニンとの置換を含むなど、変異型Ku70たんぱく質又はその部分をコードする核酸もここで包含される。核酸は、リジン残基K539 及び／又はK542 のグルタミンとの置換を含む変異型Ku70たんぱく質又はその部分をコードしていてもよい。これらの核酸にコードされた変異型Ku70たんぱく質又はその部分や、これらの核酸を含む細胞も、ここで解説される。変異型Ku70 たんぱく質又はその部分は、例えば、当該の変異型Ku70たんぱく質又はその部分が細胞内で発現するような条件下で、変異型Ku70たんぱく質又はその部分をコードする核酸を含む細胞を培養し、この培養物から、変異型Ku70たんぱく質又はその部分を単離するなどにより、調製することができる。
【００１３】
アセチル化Ku70たんぱく質、その変異型又はその部分、あるいはこれらに特異的に結合する抗体、を含むキットも、解説される。
【００１４】
更に、例えば（ｉ）アミノ酸残基 K539、K542、K544、K553 又は K556 を含むKu70たんぱく質又はその部分を、アセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分に、検査化合物の存在下で、かつ、Ku70と前記アセチルトランスフェラーゼとの間の相互作用が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、（ｉｉ） Ku70たんぱく質又はその部分と、前記アセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分との間の相互作用レベルを判定するステップなどを含む、Ku70たんぱく質とアセチルトランスフェラーゼとの間の相互作用を調節する作用物質を特定する方法も提供され、この場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分と、前記アセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分との間の相互作用レベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質と前記アセチルトランスフェラーゼとの間の相互作用を調節する作用物質であることの指標である。Ku70たんぱく質のアセチル化を調節する作用物質を特定するためのスクリーニング法は、（ｉ）アミノ酸残基 K539、K542、K544、K553 又は K556 を含むKu70たんぱく質又はその部分を、アセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分に、検査化合物の存在下で、かつ、Ku70と前記アセチルトランスフェラーゼとの間の相互作用が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、（ｉｉ） Ku70たんぱく質又はその部分のアセチル化レベルを判定するステップを含み、この場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分のアセチル化レベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアセチル化を調節する作用物質であることの指標である。前記アセチルトランスフェラーゼはCBPでも、又はPCAFでも、あるいはこれらの生物学的活性部分でもよい。前記の方法は、例えばアミノ酸残基K539 又は K542 を含むKu70たんぱく質又はその部分を、CBP
又は PCAF あるいはこれらの生物学的活性部分に接触させるなどにより、Ku70のアミノ酸残基K539 又は K542 のアセチル化を調節する作用物質を特定するために用いてもよい。
【００１５】
Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539、K542、K544、K553 又は K556のアセチル化を調節する作用物質を特定する他の方法は、（ｉ）Ku70たんぱく質又はその部分を含む細胞を、検査化合物及びアポトーシス性刺激に、前記アポトーシス性刺激がKu70たんぱく質又はその部分のK539、K542、K544、K553 又は K556のアセチル化を検査化合物の非存在下でも誘導するような条件下で、接触させるステップと、（ｉｉ）Ku70たんぱく質又はその部分のK539、K542、K544、K553 又は K556のアセチル化レベルを判定するステップとを含み、この場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの、前記検査化合物の存在下でのK539、K542、K544、K553 又はK556のアセチル化レベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539、K542、K544、K553 又はK556のアセチル化を調節する作用物質であることの指標である。アポトーシス性の刺激は紫外線暴露でも、電離性放射線でも、又はスタウロスポリンでもよい。
【００１６】
本方法を、アポトーシスを調節する作用物質を特定するために用いてもよく、また更に、細胞のアポトーシスに対する前記作用物質の効果を判定するステップを含めてもよく、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下でのアポトーシスの増加又は減少は、前記作用物質がアポトーシスを調節することの指標である。更に本方法を、腫瘍の大きさ又は腫瘍のサイズを阻害する又は減少させるための作用物質を特定するために用いてもよく、そして本方法に、更に、腫瘍に対する前記作用物質の効果を判定するステップを含めてもよく、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下での腫瘍の成長又はサイズの減少は、前記作用物質が腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害又は減少させることの指標である。更に本方法を、寿命の伸長を調節する作用物質を特定するために用いてもよく、また更に、細胞の寿命に対する前記作用物質の効果を判定するステップを含めてもよく、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下での寿命の増加又は減少は、前記作用物質が細胞の寿命を調節することの指標である。
【００１７】
Ku70たんぱく質と脱アセチル化酵素との間の相互作用を調節する作用物質を特定する他の方法は、（ｉ）アミノ酸残基 K539、K542、K544、K553 又はK556 を含むKu70たんぱく質又はその部分を、脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分に、検査化合物の存在下、かつ、Ku70たんぱく質又はその部分と前記脱アセチル化酵素との間の相互作用が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、（ｉｉ）Ku70たんぱく質又はその部分と前記脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分との間の相互作用レベルを判定するステップとを含むであろうが、この場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分と前記脱アセチル化酵素との間の相互作用レベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質と前記脱アセチル化酵素との間の相互作用を調節する作用物質であることの指標である。前記脱アセチル化酵素は、クラスI/II ヒストン脱アセチル化酵素でも、又はサーチュインでもよい。
【００１８】
他の方法は、Ku70たんぱく質の脱アセチル化を調節する作用物質の特定を可能にするものであり、（ｉ）アセチル化アミノ酸残基K539、K542、K544、K553 又はK556 を含むKu70たんぱく質又はその部分を、脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分に、検査化合物の存在下、かつ、Ku70たんぱく質又はその部分の脱アセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、（ｉｉ）Ku70たんぱく質又はその部分の脱アセチル化レベルを判定するステップとを含むであろうが、この場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの前記検査化合物の存在下でのKu70たんぱく質又はその部分の脱アセチル化レベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質の脱アセチル化を調節する作用物質であることの指標である。Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539
又はK542 の脱アセチル化を調節する作用物質を特定する方法の一例は、（ｉ）アセチル化アミノ酸残基K539
又は K542を含むKu70たんぱく質又はその部分を、ヒストン脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分に、検査化合物の存在下、かつ、K539又はK542の脱アセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップと、（ｉｉ）K539又はK542のアセチル化レベルを判定するステップとを含み、この場合、前記検査化合物の非存在下に比較したときの前記検査化合物の存在下でのK539又はK542のアセチル化レベルの違いは、前記検査化合物が、Ku70たんぱく質のアミノ酸残基K539又はK542の脱アセチル化を調節する作用物質であることの指標である。
【００１９】
本方法を、アポトーシスを調節する作用物質を特定するために用いてもよく、更に、細胞のアポトーシスに対する前記作用物質の効果を判定するステップを含めてもよく、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下でのアポトーシスの増加又は減少は、前記作用物質がアポトーシスを調節することの指標である。更に本方法を、腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害又は減少させる作用物質を特定するために用いてもよく、更に腫瘍に対する前記作用物質の効果を判定するステップを含めてもよく、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下での腫瘍の成長又はサイズの減少は、前記作用物質が腫瘍の成長又は腫瘍のサイズを阻害又は減少させることの指標である。更に本方法を、寿命の伸長を調節する作用物質を特定するために用いてもよく、また更に、細胞の寿命に対する前記作用物質の効果を判定するステップを含めてもよく、この場合、前記作用物質の非存在下に比較したときの前記作用物質の存在下での寿命の増加又は減少は、前記作用物質が細胞の寿命を調節することの指標である。
【００２０】
ここで解説される他の方法には、例えば細胞内のKu70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を誘導する又は脱アセチル化を阻害するステップを含むなど、細胞のアポトーシスを誘導する方法がある。ある方法は、クラスI/II脱アセチル化酵素又はサーチュインのたんぱく質又は活性レベルを減少させるステップを含むであろう。ある方法は、式１５−２４から成る群より選択される式を有する作用物質など、サーチュインの活性を阻害する作用物質に細胞を接触させるステップを含むであろう。前記方法は、更に、クラスI/II脱アセチル化酵素のたんぱく質又は活性レベルを減少させる作用物質に細胞を接触させるステップを含んでもよい。ある方法はまた、細胞内のCBP又はPCAFのたんぱく質又は活性レベルを増加させるステップを含むであろう。数々の方法を、対象の腫瘍の成長又はサイズを減少させるために用いられると思われるが、そのような方法には、必要とする対象に、Ku70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を誘導する又は脱アセチル化を阻害する作用物質を投与するステップが含まれよう。ある方法は、サーチュイン及び／又はクラスI/II脱アセチル化酵素のたんぱく質レベル又は活性を減少させる作用物質を対象に投与するステップを含むであろう。数々の方法には、更に、対象の細胞内のK539又はK542のアセチル化レベルを判定するステップが含まれよう。
【００２１】
他の方法は細胞のアポトーシスを阻害するものであり、細胞内のKu70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を阻害する又は脱アセチル化を誘導するステップを含むであろう。ある方法は、例えば式１−１０から成る群より選択される式を有する作用物質に細胞を接触させるなど、サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を増加させる作用物質に細胞を接触させるステップを含むであろう。更にある方法は、細胞内のCBP又はPCAFのたんぱく質又は活性レベルを減少させるステップを含むであろう。更にある方法は、クラスI/II脱アセチル化酵素のたんぱく質レベル又は活性を増加させる作用物質に細胞を接触させるステップを含むであろう。
【００２２】
哺乳動物細胞の寿命を伸張する方法は、Ku70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を阻害する又は脱アセチル化を誘導する作用物質に細胞を接触させるステップを含むものかも知れない。細胞の寿命を伸張するためのある方法はまた、サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を増加させる作用物質、及び、クラスI/II脱アセチル化酵素のたんぱく質レベル又は活性を増加させる作用物質に、細胞を接触させるステップを含むかも知れない。
【００２３】
代替的には、哺乳動物細胞の寿命を減少させるためのある方法は、Ku70たんぱく質のK539又はK542のアセチル化を阻害する又は脱アセチル化を誘導する作用物質に細胞を接触させるステップを含むであろう。また、細胞の寿命を減少させるためのある方法は、サーチュインのたんぱく質レベル又は活性を減少させる作用物質、及び、クラスI/II脱アセチル化酵素のたんぱく質レベル又は活性を減少させる作用物質に、細胞を接触させるステップを含むであろう。
【００２４】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び請求項に基づき、明白であろう。
【００２５】
詳細な説明
本発明は、アセチル化Ku70はBax媒介性アポトーシスを促進し、他方、脱アセチル化Ku70はアポトーシスを阻害することにより長寿を促進するという発見に少なくとも部分的に基づくものである。
【００２６】
定義
便宜上、本明細書、実施例及び付属の請求項で用いられたいくつかの用語をここに集める。他に定義しない限り、ここで用いられた全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業の当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。
【００２７】
冠詞「一つの（原語：”a”）及び「一つの（原語：”an”）は、ここでは、一つ又は二つ以上の（即ち少なくとも一つの）、この冠詞の文法上の主語を言うために用いられている。例を挙げると、「一つの要素」は一つの要素又は二つ以上の要素を意味する。
【００２８】
用語「脱アセチル化酵素」は、ここでは「アセチルトランスフェラーゼ」と交換可能に用いられており、一個のアミノ酸に一個のアセチル基（CH3CO−）の添加を触媒する酵素を言う。ヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）などのアセチルトランスフェラーゼの例には、限定はしないが、CREB結合たんぱく質 (CBP)、p300/CBP関連因子 (PCAF)； 一般的制御非抑制 5 (GCN5)；TBP関連因子 (TAF250)；ステロイド受容体コアクチベータ
(SCR1) 及び単球性白血病亜鉛フィンガーたんぱく質(MOZ)がある。
【００２９】
用語「作用物質」は、ここでは、一種の化合物、化合物の混合物、生物学的巨大分子（例えば核酸、抗体、たんぱく質又はその部分、例えばペプチド）、又は、細菌、植物、真菌、又は動物（特に哺乳動物）細胞又は組織などの生体材料から作製された抽出物、を言うために用いられている。作用物質は、以下に解説するスクリーニング検定により、特定の活性を有することが判明するであろう。このような作用物質の活性により、それは、対象内で局所的又は全身的に作用する生物学的、生理学的又は薬理学的に活性な一つの（又は複数の）物質である「治療薬」として適したものであろう。
【００３０】
ここで用いられる場合の用語「アポトーシス」とは、正常に機能しているヒト及び動物細胞内の核が、細胞の年齢又は健康状態や条件により決定されて信号を出したときのプログラムされた細胞死を言う。アポトーシスは、死んでいく細胞による代謝活性を必要とする能動的プロセスであり、例えば、DNAが断片に開裂して、ゲル上でいわゆるハシゴ状のパターンを生ずる断片になることも特徴であろう。アポトーシスを評価する更なる方法は、ここで解説されている。
【００３１】
用語「Bax」とは、Bcl-2 関連Xたんぱく質を言う。Baxはミトコンドリアに作用することで細胞死を誘導するアポトーシス促進性たんぱく質である。異なるアイソフォームを有する、６つの選択的スプライシング転写産物バリアントがこの遺伝子について報告されている。ヒトBaxアイソフォームαのヌクレオチド及びアミノ酸配列の例には、それぞれNM_138761 及びNP_620116がある。ヒトBaxアイソフォームβのヌクレオチド及びアミノ酸配列の例には、それぞれNM_004324 及び NP_004315がある。ヒトBaxたんぱく質アイソフォームγのヌクレオチド及びアミノ酸配列の例には、それぞれNM_138762 及びNP_620117がある。ヒトBaxアイソフォームδのヌクレオチド及びアミノ酸配列の例には、それぞれNM_138763
及びNP_620118がある。ヒトBaxアイソフォームεのヌクレオチド及びアミノ酸配列の例には、それぞれNM_138764及びNP_620119がある。ヒトBaxアイソフォームσのヌクレオチド及びアミノ酸配列の例には、それぞれNM_138765 及びNP_620120がある。
【００３２】
ある抗体が、ある抗原に、大半の他の抗原よりも優先的に結合する場合に、その抗体は前記抗原又は前記抗原のエピトープに「特異的に結合する」ことになる。例えば、この抗体は、一つ以上の他のエピトープに対しては、約50%、20%、10%、5%、1% 又は0.1% 未満の交差反応性を有するであろう。
【００３３】
化合物を言う場合の用語「生物学的利用能のある」は当業で公知であり、その化合物又は投与された化合物量の一部分が、それが投与された対象又は患者に吸収される、取り込まれる、又は生理学的に利用可能になるような、化合物の形態を言う。
【００３４】
用語「含む（原語：comprise）」及び「含む（原語：comprising）」は、付加的な要素も含まれ得ることを意味する包含的な広い意味で用いられている。
【００３５】
用語「脱アセチル化酵素」とは、一個のアミノ酸から一個のアセチル基（CH3CO−）の除去を触媒する酵素を言う。本発明の脱アセチル化酵素の例には、限定はしないが、クラスI、II又はIIIのヒストンデアセチラーゼ(HDAC)がある。各クラスのHDACのメンバーの例には、限定はしないが、HDAC1、HDAC2、HDAC3 及びHDAC8 (クラスI)；HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7 (クラスII)、及びサーチュイン-2 (クラスIII)がある。
【００３６】
ある化合物に言及する場合の「天然で生じる形」は、それが天然で見られる、組成物などの形の状態の化合物を意味する。例えばレスベラトロールは赤ワインに見られるため、それは赤ワインでは天然で生じる形で存在することになる。例えば、ある化合物が精製されたおり、天然では当該化合物と一緒に見られる他の分子の少なくとも幾らかから分離されていれば、その化合物は天然で生じる形にはない。
【００３７】
ここで用いられる場合の用語「相互作用する」又は「相互作用」は、分子同士の間の検出可能な関係又は結び付き（例えば生化学的相互作用）、例えば天然のたんぱく質対たんぱく質、たんぱく質対核酸、核酸対核酸、及びたんぱく質対低分子、又は、核酸対低分子間の相互作用など、を包含することが意図されている。
【００３８】
あるたんぱく質、ポリペプチド又はペプチドの関係で用いられる場合の用語「単離された」とは、他の細胞内たんぱく質から単離されたポリペプチド、ペプチド又はたんぱく質を言い、精製済み及び組換えの両方のポリペプチドを包含することが意図されている。
【００３９】
ここで用いられる場合の用語「Ku70」とは、まずKu70/Ku80 ヘテロ二量体の一部として特徴付けられたDNA末端ジョイニングたんぱく質を言う。ヒトKu70のヌクレオチド及びアミノ酸配列の例は、SEQ ID NO： 1 及び2に記載した通りであり、それぞれGenBankTM受託番号： NM_001469 及びNP_001460に相当する。ゲノム配列はGenBank
受託番号 NT_011520 及びAC144560.3に見ることができる。マウスKu70のヌクレオチド及びアミノ酸配列の例は、GenBankTM受託番号：NM_010247、NP_034377、AH006747、及びNT_081922である。ラットKu70のヌクレオチド及びアミノ酸配列の例は、GenBankTM受託番号：NM_139080、NP_620780、AB066102、及びNW_047781である。Ku70/Ku80ヘテロ二量体は非相同末端ジョイニングによるDNA二本鎖破損の修復や、V(D)J組換えを通じた抗体及びＴ細胞受容体遺伝子の再編成に必須である (Featherstone et al., Mutat. Res. 434:3-15 (1999))。
【００４０】
ここで遺伝子に関して用いられる場合の用語「変異体」とは、変異型たんぱく質をコードする遺伝子を言う。ここでたんぱく質に関して用いられる場合の用語「変異体」は、その通常の又は正常な生理学的役割を行わず、そして病的な条件又は状態と関連するであろう、あるいは原因であろう、たんぱく質を意味する。従って、ここで用いられる場合の用語「変異体」は、用語「機能不全の」、「病原性の」、「疾患を引き起こす」、及び「有害な」と基本的に同義である。本発明のKu70遺伝子及びたんぱく質に関すると、用語「変異体」とは、一つ以上のヌクレオチド／アミノ酸の置換、挿入及び／又は欠失を持つKu70遺伝子／たんぱく質を言う。Ku70の変異体の例には、一個のリジン（K）残基の一個のアルギニン（R）又はグルタミン（Q）残基との置換を含むKu70たんぱく質がある。この定義は、限定はしないが、ここに開示したものや、ヒトの介入により生じた合成又は組換え変異を含む、天然で存在するであろう多様な変異を包含するものと、理解されている。
【００４１】
「天然で生じる化合物」とは、自然界で見られる化合物、即ち、ヒトによりデザインされていない化合物、を言う。天然で生じる化合物は、ヒトにより作製されたものでも、天然で生じるものでもよい。
【００４２】
用語「パーセント同一の」とは、二つのアミノ酸配列間又は二つのヌクレオチド配列間の配列同一性を言う。同一性は、比較を目的にアライメントしてもよい各配列中のある一つの位置を比較することにより、それぞれ決定することができる。比較された配列中である同等の位置が同じ塩基又はアミノ酸で占められていれば、それらの分子はその位置において同一であることになる。同等の部位が同じ又は類似のアミノ酸残基（例えば立体及び／又は電子的性質上）で占められていれば、それらの部位をその位置において相同（類似）であると言うことができる。相同性、類似性、又は同一性のパーセントとしての表現とは、比較された配列に共通の位置にある同一又は類似のアミノ酸の数の関数を言う。相同性、類似性、又は同一性のパーセントとしての表現とは、比較された配列に共通の位置にある同一又は類似のアミノ酸の数の関数を言う。FASTA、BLAST、又はENTREZを含め、多様なアライメント・アルゴリズム及び／又はプログラムを用いられよう。FASTA及び BLASTは、GCG 配列解析パッケージ（ウィスコンシン州マジソン、ウィスコンシン大学）の一部として入手することができ、例えばデフォルトを設定するなどして用いることができる。ENTREZ は、メリーランド州ベセズダの米国国立保健研究所、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーションを通じて入手することができる。ある実施態様では、各アミノ酸のギャップをそれがあたかも二つの配列間の一個のアミノ酸又はヌクレオチドミス対合であるかのように重みを付けるなどして、ギャップ・ウェイトを1に設定したGCGプログラムにより、二つの配列の同一性パーセントを決定することができる。
【００４３】
アライメントの他の技術は米国カリフォルニア州、Harcourt
Brace & Co., San Diego社の一部門であるDoolittle,
Academic Press 社編集のMethods in
Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis
(1996)に解説されている。好ましくは、配列中のギャップを許容するアライメント・プログラムを用いて配列をアライメントするとよい。Smith-Watermanは、配列アライメントにおいてギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997) を参照されたい。更に、 Needleman 及びWunsch アライメント法を用いたGAPプログラムも、配列をアライメントするために用いることができる。ある代替的な検索戦略は、MASPARコンピュータで作動するMPSRCHソフトウェアを用いるものである。MPSRCHはSmith-Waterman アルゴリズムを用いて、超並列処理コンピュータで配列を採点する。このアプローチは関係の遠い対合を取り出す能力を向上させるものであり、小さなギャップやヌクレオチド配列エラーに特に寛容である。核酸にコードされたアミノ酸配列を用いて、たんぱく質及びDNAの両方のデータベースを検索することができる。
【００４４】
用語「ポリヌクレオチド」及び「核酸」は交換可能に用いられている。これらは、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドのいずれか、あるいはこれらの類似体である、いずれかの長さの重合体型のヌクレオチドを言う。ポリヌクレオチドは、いずれの三次元構造を有していてもよく、またいずれの公知又は未知の機能を果たすものでもよい。以下はポリヌクレオチドの非限定的な例である：ある遺伝子又は遺伝子断片のコーディング又は非コーディング領域、連鎖解析で規定される一つ（又は複数の）遺伝子座、エキソン、イントロン、メッセンジャRNA（mRNA）、トランスファーRNA、リボゾームRNA、リボザイム、cDNA、組換えポリヌクレオチド、分枝状ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクタ、いずれかの配列の単離されたDNA、いずれかの配列の単離されたRNA、核酸プローブ、及びプライマ。ポリヌクレオチドには、メチル化ヌクレオチドなどの修飾されたポリヌクレオチドやヌクレオチド類似体を含めてもよい。存在する場合のヌクレオチド構造に対する修飾は、当該重合体のアセンブリの前に起きるものでも、又は後で起きるものでもよい。ヌクレオチドの配列の途中には、非ヌクレオチド成分があってもよい。また、例えば標識成分の結合などにより、ポリヌクレオチドが更に修飾されていてもよい。用語「組換え」ポリヌクレオチドとは、天然で生じないか、あるいは、非天然の編成で別のポリヌクレオチドに連結された、ゲノム、cDNA、半合成、又は合成起源のポリヌクレオチドを意味する。
【００４５】
「患者」、「対象」又は「ホスト」とは、ヒト又は非ヒト動物のいずれかを言う。
【００４６】
用語「薬学的に許容可能な担体」は当業で公知であり、いずれか対象の組成物又はその成分を一つの器官又は身体部分から、別の器官又は身体部分に運ぶ又は輸送することに関与する、例えば液体又は固体の充填剤、希釈剤、医薬品添加物、溶媒又は封入剤など、薬学的に許容可能な物質、組成物又は賦形剤を言う。各担体は、当該の組成物及びその成分に対して適合性があり、かつ、患者にとって有害でないという意味において「許容可能」でなくてはならない。薬学的に許容可能な担体として役立つであろう物質のいくつかの例には：（１）乳糖、ブドウ糖及びショ糖などの糖類；（２）コーンスターチ及びいもでんぷんなどのでんぷん；（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース及びセルロースアセテートなどのセルロース及びその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）タルク；（８）ココアバター及び座薬用ろうなどの医薬品添加物；（９）ピーナッツ油、綿実油、紅花油、ごま油、オリーブ油、コーン油及び大豆油などの油類；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなどのポリオール；（１２）オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）無発熱原水；（１７）等張の生理食塩水；（１８）リンガー液；（１９）エチルアルコール；（２０）リン酸緩衝溶液；及び（２１）薬剤調合に用いられる他の非毒性適合性物質、がある。
【００４７】
用語「予防的」又は「治療的」な処置は当業で公知であり、ある薬物のホストへの投与を言う。望ましくない状態（例えばホスト動物の疾患又は他の望ましくない状態）の臨床上の発現前にそれがホストに投与されるのであれば、その処置は予防的であり、即ち、それはホストを、望ましくない状態の発症から防御するものであり、他方、望ましくない状態の発現後に投与されるのであれば、その処置は治療的である（即ち、既存の望ましくない状態又はそこから来る副作用を弱める、改善する又は維持することが意図されている）。
【００４８】
ある細胞の「複製寿命」とは、個々の「母細胞」により生ずる娘細胞の数を言う。他方、「暦年齢」とは、栄養分が枯渇したときに非分裂細胞集団が生きたままでいられる時間の長さを言う。細胞又は生物に用いられる場合の「細胞の寿命を増す」又は「細胞の寿命を延ばす」とは、一個の細胞が生じる娘細胞の数を増すこと；細胞又は生物がストレスと協応してDNAやたんぱく質などの損傷を戦う能力を増すこと；及び／又は、細胞又は生物が、ストレスなどの特定の条件下で生き延び、生きた状態でより長く存続する能力を増すこと、を言う。ここで解説した方法を用いると、寿命を少なくとも約20%、30%、40%、50%、60% 、あるいは20% と70%の間、30%と60%の間、40%と60%の間又はそれ以上、増すことができる。
【００４９】
ここで言及されるヒト遺伝子のSEQ ID NOを以下の表で同定する：
【００５０】
【表１】
2008503479.tif 000003
2008503479.tif 000004
【００５１】
「サーチュイン脱アセチル化酵素たんぱく質ファミリー・メンバー」「Sir2ファミリー・メンバー」、「Sir2たんぱく質ファミリー・メンバー」又は「サーチュインたんぱく質」には、酵母Sir2、Sir-2.1、並びにヒトSIRT1 及びSIRT2 たんぱく質がある。ヒトサーチュインSIRT1のヌクレオチド及びアミノ酸配列（サイレント接合型情報調節2相同体）は、それぞれSEQ ID NO：9 及び10（それぞれGenBank 受託番号 NM_012238 及びNP_036370に相当する）に記載された通りである。SIRT1のマウス相同体は、Sirt2αである。ヒトSirt2はGenbank 受託番号 NM_012237 及びNP_036369 （バリアント1の場合；それぞれSEQ ID NO： 11 及び12）並びにNM_030593 及びNP_085096（バリアント2の場合；それぞれSEQ
ID NO：13 及び14）に相当する。他のファミリー・メンバーには、「HST 遺伝子」（homologues
of Sir two）と呼ばれる四つの更なる酵母
Sir2-様遺伝子HST1、HST2、HST3及びHST4、及び５つの他のヒト相同体hSIRT3バリアント（Genbank 受託番号 NM_012239 及びNP_036371に相当する；それぞれSEQ ID NO：15 及び16)、hSIRT3 バリアント b （GenBank 受託番号 NM_001017524 及びNP_001017524に相当する；それぞれSEQ ID NO：17 及び 18） hSIRT4 （Genbank 受託番号 NM_012240 及びNP_036372に相当する；それぞれSEQ ID NO：19 及び20）、hSIRT5 （バリアント1の場合Genbank 受託番号 NM_012241 及び NP_036373 （それぞれSEQ ID NO：21 及び22） に、そしてバリアント2の場合 NM_031244 及びNP_112534（それぞれSEQ ID NO：23 及び24）に相当する）、hSIRT6 （Genbank 受託番号 NM_016539 及びNP_057623に相当する; それぞれSEQ ID NO：25 及び26）及びhSIRT7 （Genbank 受託番号 NM_016538 及びNP_057622に相当する; それぞれSEQ ID NO：27 及び28） (Brachmann
et al. (1995) Genes Dev. 9:2888 and Frye et al. (1999) BBRC 260:273)、がある。好適なサーチュインは、例えばSIRT3が有するように、SIRT1に在ってSIR2には無いN末端配列の少なくとも一部分を有するメンバーなど、SIRT2に対してよりも、SIRT1、即ちhSIRT1、及び／又はSir2に対する方がより類似性の高いものである。
【００５２】
用語「低分子」は当業で公知であり、約2000
amu未満、又は約1000 amu未満、そして更には約500 amu未満の分子量を有する組成物を言う。低分子は、例えば核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド核酸、ペプチドミメティック、糖、脂質又は他の有機（含炭素）又は無機分子である。多くの製薬企業が、ここで解説された検定のいずれかでスクリーニングすることのできる、しばしば真菌、細菌、又は海草抽出物である化学的及び／又は生物学的混合物の広範なライブラリを有する。用語「低分子」とは、しばしば有機又は医療用化合物であるとして同定される低分子を言い、核酸のみ、ペプチドのみ又はポリペプチドのみである分子を含まない。
【００５３】
用語「実質的に相同な」は、アミノ酸配列との関係で用いられる場合、相互に配列で実質上同一又は類似であるためにコンホメーションの相同性が生じていることで、一種以上の生物学的（免疫学的を含む）活性が有用な程度、保持されているような配列を言う。この用語は、通常の配列進化を暗に意味するものとは意図されていない。
【００５４】
「実質的に精製された」とは、あるたんぱく質が、天然でそれに伴う成分から分離されたものを言う。好ましくは、当該たんぱく質が、試料中で全物質（容積で、湿潤もしくは乾燥重量で、あるいはモル・パーセント又はモル画分で）の少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約90%、そして最も好ましくは少なくとも約99% であるとよい。純度はいずれの適した方法でも測定することができ、例えばポリペプチドの場合はカラム・クロマトグラフィ、ゲル電気泳動法又はHPLC分析などである。
【００５５】
「転写調節配列」は、例えば開始シグナル、エンハンサ、及びプロモータなど、それらが作動上連鎖しているたんぱく質コーディング配列の転写を誘導又は制御するDNA配列を言うために、本明細書全体を通じて用いられた一般的用語である。好適な実施態様では、組換え遺伝子の転写は、発現を意図する細胞種でこの組換え遺伝子野発現を制御するプロモータ配列（又は他の転写調節配列）の制御下にある。更に、ここで解説するように、天然で生じる型の遺伝子の転写を制御する配列と同じであるか、又は異なるような転写調節配列の制御下に、組換え遺伝子を置くこともできることは理解されよう。
【００５６】
ある状態又は疾患を「処置する」という用語は当業で公知であり、ある状態又は疾患の少なくとも一つの症状を治癒や軽減すること、あるいは、この状態又は疾患の悪化を妨げること、を言う。
【００５７】
「ベクタ」は、挿入された核酸分子をホスト細胞の内部に及び／又はホスト細胞間で移動させる自己複製性の核酸分子である。この用語は、細胞内への核酸分子の挿入のために機能するベクタ、主に核酸の複製のために機能するベクタの複製のために機能するベクタ、及び、当該DNA又はRNAの転写及び／又は翻訳のために機能する発現ベクタ、を包含する。更に、上記の機能のうちの二つ以上を提供するベクタも包含される。ここで用いられる場合の「発現ベクタ」は、適したホスト細胞に導入されたときに、転写されてポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチドであると定義しておく。「発現系」は通常、所望の発現産物を生じるように働くことのできる発現ベクタから成る、適したホスト細胞を意味するものである。
【００５８】
用語「cis」は当業で公知であり、原子又は基が二重結合の同じ側に来るような、二重結合に対する二つの原子又は基の配置を言う。Cis 配置はしばしば(Z)配置と記される。
【００５９】
用語「trans」は当業で公知であり、原子又は基が二重結合の反対側に来るような、二重結合に対する二つの原子又は基の配置を言う。Trans 配置はしばしば(E)配置と記される。
【００６０】
用語「共有結合」は当業で公知であり、電子が二つの原子の両方の核に静電的に引き付けられており、核間の電子密度増加の正味の効果が核同士の反発に拮抗しているような、二つの原子間の結合を言う。共有結合という用語には、結合が金属イオンを持つときの配位結合も含まれる。
【００６１】
用語「治療薬」は当業で公知であり、対象において局所的又は全身的に作用する生物学的、生理学的、又は薬理学的に活性な物質であるいずれかの化学的成分を言う。「薬物」とも言及される治療薬の例は、Merck Index, the Physicians Desk Reference、 及びThe Pharmacological
Basis of Therapeuticsなどの公知の文献に解説されており、それらには、限定はしないが、医薬；ビタミン；ミネラル補助剤；疾患又は疾病の処置、防止、診断、治癒又は軽減に用いられる物質；身体の構造又は機能に影響する物質；又は、生理学的環境に置かれた後に生物学的に活性になる、又はより活性になる、プロドラッグ、がある。
【００６２】
用語「治療効果」は当業で公知であり、動物、具体的には哺乳動物、そしてより具体的にはヒトにおいて、薬理学的に活性な物質により引き起こされる局所又は全身の効果を言う。従ってこの用語は、動物又はヒトにおける疾患の診断、治癒、軽減、処置又は防止に、あるいは、望ましい肉体的又は精神的発達及び／又は状態の促進に、使用されることが意図されたいずれかの物質を意味する。文言「治療上有効量」は、いずれかの処置に当てはまる妥当な利益／リスク比でいくらかの所望の局所又は全身の効果を生ずるような、このような物質の量を意味する。このような物質の治療上有効量は、治療しようとする対象及び疾患状態、対象の体重及び年齢、疾患状態の重篤度、投与の形態等、当業者であれば容易に判断することのできるものに依るであろう。例えば、ここで解説された特定の組成物を、このような処置に当てはまる妥当な利益／リスク比で生ずるような十分な量、投与してもよい。
【００６３】
用語「合成の」は当業で公知であり、in
vitroでの化学合成又は酵素合成による作製を言う。
【００６４】
用語「メソ化合物」は当業で公知であり、少なくとも二つのキラル中心を有するが、対称平面又は対称点のためにアキラルであるような化合物を言う。
【００６５】
用語「キラル」は当業で公知あり、当該の鏡像相手が重ね合わせられないという特性を有する分子同士を言い、他方、用語「アキラル」は、それらの鏡像に重ね合わせられる分子同士を言う。「プロキラル分子」は、特定のプロセスでキラル分子に転化させられる可能性を有する分子である。
【００６６】
用語「立体異性体」は当業で公知であり、同一の化学的構成を有するが、空間中の原子又は基の配置の点で異なる化合物を言う。特に、「エナンチオマ」とは、互いが互いの重ね合わせられない鏡像である、ある一つの化合物の二つの立体異性体を言う。他方、「ジアステレオマ」は、二つ以上の非対称中心を持ち、その分子が互いの鏡像ではない立体異性体を言う。
【００６７】
更に、「立体選択的プロセス」とは、ある特定の立体異性体の反応生成物が、他の可能な立体異性体の生成物よりも優先的に生ずるものである。「エナンチオ選択的プロセス」とは、二つの可能なエナンチオマの反応生成物のうちの一方の生成に有利なものである。
【００６８】
用語「位置異性体」は当業で公知であり、同じ分子式を有するが、原子の連結性の点で異なる化合物を言う。従って、「位置選択的プロセス」とは、例えば当該反応により、特定の位置異性体の収量が統計上有意に増すなど、他のものに比べ、ある特定の位置異性体の生成に有利なものである。
【００６９】
用語「エピマー」は当業で公知であり、同一の化学的構成を持ち、二つ以上の立体中心を含有するが、これらの立体中心の一方でのみ、配置が異なるような分子を言う。
【００７０】
用語「ED50」は当業で公知である。いくつかの実施態様では、ED50は、その最大応答又は効果の50%を生じる薬物の用量、あるいは選択的には、検査対象又は標品の50%において所定の応答を生じる用量、を意味する。用語「LD50」は当業で公知である。いくつかの実施態様では、LD50は、検査対象の50%で致命的な薬物の用量を意味する。用語「治療指数」は当業で公知であり、LD50/ED50として定義される、ある薬物の治療指数を言う。
【００７１】
用語「構造−活性の相関関係」又は「（SAR）」は当業で公知であり、ある薬物又は他の化合物の分子構造を変更すると、例えば受容体、酵素、核酸又は他の標的等との相互作用など、その生物学的活性が変化する態様をいう。
【００７２】
用語「脂肪族の」は当業で公知であり、直線状、分枝状、環状のアルカン、アルケン又はアルキンを言う。いくつかの実施態様では、本化合物中の脂肪族の基は、直線状又は分枝状であり、１ないし約２０個の炭素原子を有する。
【００７３】
用語「アルキル」は当業で公知であり、直鎖アルキル基、分枝鎖アルキル基、シクロアルキル（脂環式）基、アルキル置換シクロアルキル基、及びシクロアルキル置換アルキル基を含む飽和脂肪族基を包含する。いくつかの実施態様では、直鎖又は分枝鎖アルキルは約３０個以下の炭素原子をその骨格（例えば直鎖の場合はC1-C30に、分枝鎖の場合はC3-C30に）に有し、代替的には約２０個以下の炭素原子を有する。同様に、シクロアルキルは約３乃至約１０個の炭素原子をそれらの環構造に有し、そして代替的には約５個、６個又は７個の炭素を環構造内に有する。用語「アルキル」はまた、ハロ置換アルキルも包含するものと定義しておく。
【００７４】
更に、用語「アルキル（又は「低級アルキル」）には、炭化水素骨格の一つ以上の炭素に付いた水素を置換した置換基を有するアルキル部分を言う「置換アルキル」も含まれる。このような置換基には、例えばヒドロキシル、カルボニル（例えばカルボキシル、アルコキシカルボニル、ホルミル、又はアシル）、チオカルボニル、（例えばチオエステル、チオアセテート、又はチオホルメート）、アルコキシル、ホスホリル、ホスホネート、ホスフィネート、アミノ、アミド、アミジン、イミン、シアノ、ニトロ、アジド、スルフヒドリル、アルキルチオ、スルフェート、スルホネート、スルファモイル、スルホンアミド、スルホニル、ヘテロシクリル、アラルキル、又は芳香族もしくはヘテロ芳香族の部分が含まれよう。炭化水素の鎖上で置換される部分自体も、適当な場合には置換される場合があることは当業者であれば理解されよう。例えば、置換アルキルの置換基には、置換型又は非置換型のアミノ、アジド、イミノ、アミド、ホスホリル（ホスホネート及びホスフィネートを含む）、スルホニル（スルフェート、スルホンアミド、スルファモイル及びスルホネートを含む）、及びシリル基や、エーテル、アルキルチオ、カルボニル（ケトン、アルデヒド、カルボキシレート、及びエステルを含む）-CN 等も含まれよう。置換アルキルの例は以下に解説されている。シクロアルキルは更に、アルキル、アルケニル、アルコキシ、アルキルチオ、アミノアルキル、カルボニル置換アルキル-CN等で置換され得る。
【００７５】
用語「アラルキル」は当業で公知であり、一個のアリール基（例えば芳香族又はヘテロ芳香族の基）で置換されたアルキル基を言う。
【００７６】
用語「アルケニル」及び「アルキニル」は当業で公知であり、長さ及び可能な置換の点で上述したアルキルに同様であるが、それぞれ少なくとも一個の二重又は三重結合を含有する不飽和脂肪族の基を言う。
【００７７】
炭素数を他に明示しない限り、「低級アルキル」とは、上に定義した通りの、しかし一個乃至約１０個の炭素、代替的には１個乃至約６個の炭素原子を、その骨格構造に有するアルキル基を言う。同様に、「低級アルケニル」及び「低級アルキニル」は同様の鎖長を有するものである。
【００７８】
用語「ヘテロ原子」は当業で公知であり、炭素又は水素以外のあらゆる元素の原子を言う。ヘテロ原子の例には硼素、窒素、酸素、リン、硫黄及びセレンがある。
【００７９】
用語「アリール」は当業で公知であり、５−、６−及び７−員環の単一環芳香族の基を言い、この基にはゼロから４個のヘテロ原子が含まれていてもよく、例えばベンゼン、ピロール、フラン、チオフェン、イミダゾール、オキサゾール、チアゾール、トリアゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリダジン及びピリミジン等である。環構造内にヘテロ原子を有するようなアリール基はさらに「アリールヘテロ環」又は「ヘテロ芳香族」と言及される場合もある。芳香族の環は、一つ又はそれ以上の環位で、例えばハロゲン、アジド、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アルコキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、スルホンアミド、ケトン、アルデヒド、エステル、ヘテロシクリル、芳香族又はヘテロ芳香族の部分、−ＣＦ３、−ＣＮ等、上述したような置換基で置換されていてもよい。「アリール」という用語には、さらに、二つ又はそれ以上の炭素が二つの隣り合った環に共通である（これらの環が「縮合環」である）二つ又はそれ以上の環を有すると共に、環のうちの少なくとも一つが芳香族であり、例えばその他の環がシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、及び／又は、ヘテロシクリルであるような、多環式の系が含まれる。
【００８０】
オルト、メタ及びパラという用語は当業で公知であり、それぞれ1,2-、1,3-、及び1,4-二置換ベンゼンを言う。例えば1,2-ジメチルベンゼン及びオルト-ジメチルベンゼンという名称は同義である。
【００８１】
「ヘテロシクリル」又は「ヘテロ環式の基」という用語は当業で公知であり、環構造が１個から４個のヘテロ原子を含むような、３員環から約１０員環構造、代替的には３員環から約７員環を言う。ヘテロ環はまた多環であってもよい。ヘテロシクリル基には、例えば、チオフェン、チアントレン、フラン、ピラン、イソベンゾフラン、クロメン、キサンテン、フェノキサンテン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチリジン、キノキサリン、キナゾリン、チノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、ピリミジン、フェナントロリン、フェナジン、フェナルサジン、フェノチアジン、フラザン、フェノキサジン、ピロリジン、オキソラン、チオラン、オキサゾール、ピペリジン、ピペラジン、モルホリン、ラクトン、アゼチジノン及びピロリジノンなどのラクタム、スルタム、スルトン等がある。ヘテロ環式の環は、一つ又はそれ以上の位置で、上述したような置換基、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、一個のヘテロシクリル、一個の芳香族又はヘテロ芳香族の部分、−ＣＦ３、−ＣＮ等で置換されていてもよい。
【００８２】
「ポリシクリル」又は「多環式の基」という用語は、当業で公知であり、複数の環が「縮合環である」など、二つ又はそれ以上の炭素が二つの隣り合った環に共通であるような二つ又はそれ以上の環（例えばシクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、及び／又はヘテロシクリル、など）を言う。隣り合っていない原子を通じて接合された環は「架橋」環と呼ばれる。多環の環のそれぞれは、例えばハロゲン、アルキル、アラルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヒドロキシル、アミノ、ニトロ、スルフヒドリル、イミノ、アミド、ホスホネート、ホスフィネート、カルボニル、カルボキシル、シリル、エーテル、アルキルチオ、スルホニル、ケトン、アルデヒド、エステル、一個のヘテロシクリル、一個の芳香族又はヘテロ芳香族の部分、−ＣＦ３、−ＣＮ等といった上述したような置換基で置換されてもよい。
【００８３】
「炭素環」という用語は当業で公知であり、環の各原子が炭素であるような芳香族又は非芳香族の環を言う。
【００８４】
「ニトロ」という用語は当業で公知であり、−ＮＯ２を言い、用語「ハロゲン」は当業で公知であり、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ又は−Ｉを言い；用語「スルフヒドリル」は当業で公知であり、−ＳＨを言い；「ヒドロキシル」という用語は−ＯＨを意味し、そして「スルホニル」という用語は当業で公知であり、−ＳＯ２−を言う。「ハリド」は、ハロゲンの対応する陰イオンを指し、「プソイドハリド」は、Cotton and Wilkinson による“Advanced Inorganic Chemistry” の５６０に記載された定義を有する。
【００８５】
「アミン」及び「アミノ」という用語は、当業で公知であり、置換されていない及び置換されたアミンの両方を言い、例えば、一般式：
【００８６】
【化１】
2008503479.tif 000005
【００８７】
（但し式中、Ｒ５０、Ｒ５１及びＲ５２はそれぞれ個別に一個の水素、一個のアルキル、一個のアルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１を表すか、又はＲ５０及びＲ５１は、これらが結合したＮ原子と一緒になって、環構造内に４個から８個の原子を有するヘテロ環を完成するものであり、Ｒ６１は一個のアリール、一個のシクロアルキル、一個のシクロアルケニル、一個のヘテロ環、又は一個の多環を表し、そしてｍはゼロか、又は１から８までの間の一整数である）で表すことができる部分など、非置換及び置換アミンの両方を言う。いくつかの実施態様では、Ｒ５０又はＲ５１の一方のみが、一個のカルボニルであってもよく、例えばＲ５０、Ｒ５１及びこの窒素が一緒になって一個のイミドを形成していないなどである。他の実施態様では、Ｒ５０及びＲ５１（及び選択に応じてＲ５２）はそれぞれ個別に一個の水素、一個のアルキル、一個のアルケニル、又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１を表す。このように、「アルキルアミン」という用語は、置換又は非置換の一個のアルキルをそれに結合させて有する、即ちＲ５０及びＲ５１の少なくとも一方がアルキル基であるような、上に定義した通りのアミン基を包含する。
【００８８】
用語「アシルアミノ」は当業で公知であり、一般式：
【００８９】
【化２】
2008503479.tif 000006
【００９０】
（但し式中、Ｒ５０は上に定義した通りであり、そしてＲ５４は一個の水素、一個のアルキル、一個のアルケニル、又は、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１（但し式中、ｍ及びＲ６１は上に定義した通りである）を表す）で表すことのできる部分を言う。
【００９１】
「アミド」という用語はアミノ置換カルボニルとして当業で公知であり、一般式：
【００９２】
【化３】
2008503479.tif 000007
【００９３】
（但し式中、Ｒ５０及びＲ５１は上に定義した通りである）によって表すことのできる部分を含む。アミドのいくつかの実施態様には不安定な可能性のあるイミドは含まれないであろう。
【００９４】
「アルキルチオ」という用語は、それに硫黄ラジカルを付着させて有した、上に定義した通りのアルキル基を言う。いくつかの実施態様では、「アルキルチオ」部分は、−Ｓ−アルキル、−Ｓ−アルケニル、−Ｓ−アルキニル、及び−Ｓ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１（但し式中、ｍ及びＲ６１は上に定義した通りである）のうちの一つで表される。代表的なアルキルチオ基には、メチルチオ、エチルチオ等がある。
【００９５】
「カルボニル」という用語は当業で公知であり、一般式：
【００９６】
【化４】
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【００９７】
（但し式中、Ｘ５０は一個の結合であるか、又は一個の酸素もしくは一個の硫黄を表し、そしてＲ５５及びＲ５６は一個の水素、一個のアルキル、一個のアルケニル、−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１、又は薬学的に許容可能な塩を表し、Ｒ５６は一個の水素、一個のアルキル、一個のアルケニル又は−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１（但しこの式中、ｍ及びＲ６１は上に定義した通りである）を表す）で表すことのできるような部分を含む。Ｘ５０が一個の酸素であり、そしてＲ５５又はＲ５６が水素でない場合、この式は一個の「エステル」を表すことになる。Ｘ５０が一個の酸素であり、Ｒ５５が上に定義した通りである場合、この部分はここではカルボキシル基と言及されており、特にＲ５５が一個の水素である場合、この式は「カルボン酸」を表すものである。Ｘ５０が一個の酸素であり、そしてＲ５６が水素である場合、この式は「ギ酸塩」を表すことになる。一般的には、上の式の酸素原子が硫黄に置換された場合、この式は「チオールカルボニル」基を表すことになる。Ｘ５０が一個の硫黄であり、Ｒ５５又はＲ５６が水素でない場合、この式は「チオールエステル」を表すものである。Ｘ５０が一個の硫黄であり、Ｒ５５が水素であれば、この式は「チオールカルボン酸」を表すことになる。Ｘ５０が一個の硫黄であり、Ｒ５６が水素であれば、この式は「チオールホルメート」を表すことになる。他方、Ｘ５０が一個の結合であり、そしてＲ５５が水素でない場合、上の式は一個の「ケトン」基を表すものである。Ｘ５０が一個の結合であり、そしてＲ５５が水素である場合、上の式は「アルデヒド」基を表す。
【００９８】
用語「アルコキシル」又は「アルコキシ」は当業で公知であり、一個の酸素ラジカルを付着させて有する、上に定義した通りのアルキル基を言う。代表的なアルコキシル基には、メトキシ、エトキシ、プロピルオキシ、ｔ−ブトキシ等がある。「エーテル」は一個の酸素によって共有結合により連結された二つの炭化水素である。従って、アルキルをエーテルにするようなアルキルの置換基は、例えば、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルケニル、−Ｏ−アルキニル、−Ｏ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１（但し式中、ｍ及びＲ６１は上に説明した通りである）のうちの一つで表すことができるものなど、アルコキシルであるか、又はアルコキシルに似ている。
【００９９】
「スルホネート」という用語は当業で公知であり、一般式：
【０１００】
【化５】
2008503479.tif 000009
【０１０１】
（但し式中、Ｒ５７は一個の電子対、水素、アルキル、シクロアルキル、又はアリールである）で表すことができる部分を言う。
【０１０２】
「スルフェート」という用語は当業で公知であり、一般式：
【化６】
2008503479.tif 000010
【０１０３】
（但し式中、Ｒ５７は上に定義したとおりである）によって表すことができる部分を含む。
【０１０４】
「スルホンアミド」という用語は当業で公知であり、一般式：
【０１０５】
【化７】
2008503479.tif 000011
【０１０６】
（但し式中、Ｒ５０及びＲ５６は上に定義した通りである）で表すことのできる部分を含む。
【０１０７】
「スルファモイル」という用語は当業で公知であり、一般式：
【０１０８】
【化８】
2008503479.tif 000012
【０１０９】
（但し式中、Ｒ５０及びＲ５１は上に定義した通りである）で表すことのできる部分を言う。
【０１１０】
「スルホニル」という用語は当業で公知であり、一般式：
【０１１１】
【化９】
2008503479.tif 000013
【０１１２】
（但し式中、Ｒ５８は以下：水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、ヘテロシクリル、アリール又はヘテロアリールのうちの一つである）で表すことのできる部分を言う。
【０１１３】
用語「スルホキシド」は当業で公知であり、一般式：
【０１１４】
【化１０】
2008503479.tif 000014
【０１１５】
（但し式中、Ｒ５８は上に定義した通りである）で表すことのできる部分を言う。
【０１１６】
用語「ホスホリル」は当業で公知であり、一般的には式：
【０１１７】
【化１１】
2008503479.tif 000015
【０１１８】
（但し式中、Ｑ５０はＳ又はＯを表し、そしてＲ５９は水素、一個の低級アルキル、又は一個のアリールを表す）で表すことができよう。例えばアルキルなどを置換するのに用いる場合、ホスホリルアルキルのホスホリル基は一般式：
【０１１９】
【化１２】
2008503479.tif 000016
【０１２０】
（但し式中、Ｑ５０及びＲ５９は、それぞれ個別に、上に定義した通りであり、そしてＱ５１はＯ、Ｓ又はＮを表す）で表すことができよう。Ｑ５０がＳである場合、そのホスホリル部分は「ホスホロチオエート」である。
【０１２１】
「ホスホールアミジト」は当業で公知であり、一般式：
【０１２２】
【化１３】
2008503479.tif 000017
【０１２３】
（但し式中、Ｑ５１、Ｒ５０、Ｒ５１及びＲ５９は上に定義した通りである）で表せよう。
【０１２４】
用語「ホスホンアミジト」は当業で公知であり、一般式：
【０１２５】
【化１４】
2008503479.tif 000018
【０１２６】
（但し式中、Ｑ５１、Ｒ５０、Ｒ５１及びＲ５９は上に定義した通りであり、そしてＲ６０は一個の低級アルキル、又は一個のアリールを表す）で表せよう。
【０１２７】
アルケニル基及びアルキニル基には、同じような置換を行って、例えばアミノアルケニル、アミノアルキニル、アミドアルケニル、アミドアルキニル、イミノアルケニル、イミノアルキニル、チオアルケニル、チオアルキニル、カルボニル置換アルケニル又はアルキニルなどを生成させることができる。
【０１２８】
いずれかの構造において２箇所以上あるような、例えばアルキル、m、n等の各表現の定義は、同じ構造の他の箇所でのその定義とは独立であると意図されている。
【０１２９】
用語「セレノアルキル」は当業で公知であり、置換されたセレノ基をそれに付着させて有するアルキル基を言う。アルキル上で置換してもよい「セレノエーテル」の例は、−Ｓｅ−アルキル、−Ｓｅ−アルケニル、−Ｓｅ−アルキニル、及び、−Ｓｅ−（ＣＨ２）ｍ−Ｒ６１（但し式中、ｍ及びＲ６１は上に定義されている）のうちの一つから選択される。
【０１３０】
トリフリル、トシル、メシル、及びノナフリルという用語は当業で公知であり、それぞれトリフルオロメタンスルホニル、p-トルエンスルホニル、メタンスルホニル、及びノナフルオロブタンスルホニル基を言う。トリフレート、トシレート、メシレート、及びノナフレートという用語は当業で公知であり、それぞれトリフルオロメタンスルホネートエステル、p-トルエンスルホネートエステル、メタンスルホネートエステル、及びノナフルオロブタンスルホネートエステル官能基、及びこれらの官能基を含有する分子を言う。
【０１３１】
Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｈ、Ｔｆ、Ｎｆ、Ｔｓ、及びＭｓという略語は、それぞれメチル、エチル、フェニル、トリフルオロメタンスルホニル、ノナフルオロブタンスルホニル、ｐ−トルエンスルホニル、及びメタンスルホニルを表す。当業の有機化学者が用いる省略のより包括的なリストは、ジャーナル・オブ・オーガニック・ケミストリの各巻の第一号に見られるが、このリストは典型的には、スタンダード・リスト・オブ・アブリビエーションズという標題の表で提供されている。
【０１３２】
ここで解説された組成物中に含まれるいくつかの化合物は、特定の幾何学的もしくは立体異性体形状で存在していてもよい。加えて、化合物は光学的に活性であってもよい。ここで考察されるのは、cis-及びtrans-異性体、R-及びS-エナンチオマー、ジアステレオマー、(D)-異性体、（L)-異性体、これらのラセミ混合体、及びこれらの他の混合体を含め、あらゆるこのような化合物である。更なる非対称の炭素原子がアルキル基などの置換基に存在していてもよい。このような異性体や、それらの混合物はすべて、ここに包含される。
【０１３３】
例えば、ある化合物の特定のエナンチオマーを欲しい場合、これは非対称合成又はキラル補助による誘導法で作製することができ、この場合、その結果得られたジアステレオマー混合物を分離し、補助基を開裂させて所望の純粋なエナンチオマーを得る。あるいは、分子がアミノなどの塩基性の官能基を含有する場合、又はカルボキシルなどの酸性の官能基を含有する場合、適した光学的に活性な酸又は塩基でジアステレオマーの塩を形成した後、このように形成されたジアステレオマーを、当業で公知の分別晶出又はクロマトグラフィ手段で分離した後、純粋なエナンチオマーを回収する。
【０１３４】
「置換」又は「で置換された」には、このような置換が、置換される原子及び置換基にとって可能な原子価に従ったものであり、その置換の結果、例えば、転位、環化、除去又は他の反応といった変換を自発的には行わないなど、安定した化合物ができるという、暗黙の前提が含まれるものと理解されよう。
【０１３５】
更に「置換された」という用語は、有機化合物のあらゆる許容できる置換基を含むものとして考察されている。広い意味では、この許容可能な置換基には、有機化合物の非環式及び環式、分枝状及び非分枝状、炭素環式及びヘテロ環式、芳香族及び非芳香族の置換基が含まれる。置換基の例には、例えば、上に説明したものがある。許容可能な置換基は、適した有機化合物にとっては、一つ又はそれ以上であってもよく、同じ又は異なるものであってもよい。窒素などのヘテロ原子は水素置換基、及び／又は、そのヘテロ原子の原子価を満たす、ここに説明した有機化合物のいずれかの許容可能な置換基を有していてもよい。化合物は、いかなる態様でも、有機化合物の許容可能な置換基によって限定されるものではない。
【０１３６】
化学元素は、ハンドブック・オブ・ケミストリー・アンド・フィジックス、第６７版、１９８６−８７、表紙内側のＣＡＳバージョンの元素周期表に基づいて同定されている。更に、用語「炭化水素」は、少なくとも一個の水素及び一個の炭素原子を有する、あらゆる許容可能な化合物を包含するものと、意図されている。広い局面では、前記の許容可能な炭化水素には、置換されていても、又は置換されていなくともよいが、非環式及び環式、分枝状及び非分枝状、炭素環指式及びヘテロ環式、芳香族及び非芳香族の、有機化合物が含まれる。
【０１３７】
「保護基」という用語は当業で公知であり、望ましくない化学的変換から一個の潜在的反応性官能基を保護する一時的な置換基を言う。このような保護基の例には、カルボン酸のエステル、アルコールのシリルエーテル、並びに、それぞれアルデヒド及びケトンのアセタル及びケタルがある。この保護基化学の分野はProtective
Groups in Organic Synthesis, 2nd ed.; Wiley: New York, 1991）でGreene氏及びWuts氏ｃによりレビューがなされている。
【０１３８】
用語「水酸基保護基」は当業で公知であり、合成法中に望ましくない反応から水酸基を保護することを意図した基を言い、その中には、例えばベンジル、又は、当業で公知の他の適したエステルもしくはエーテル群がある。
【０１３９】
用語「カルボキシル保護基」は当業で公知であり、アミノ酸又はペプチドのＣ末端や、あるいは酸性もしくはヒドロキシルアゼピン環置換基など、合成法中に望ましくない反応からカルボン酸基を保護することを意図した基を言う。カルボキシル基の保護基の例には、例えば、ベンジルエステル、シクロヘキシルエステル、4-ニトロベンジルエステル、t-ブチルエステル、4-ピリジルメチルエステル等がある。
【０１４０】
用語「アミノ保護基」は当業で公知であり、何らかの他の官能基に対して起こさせる反応にアミノ基が参与することを防ぐが、必要に応じて当該アミンから取り除くことのできる基を言う。このような基は、上に引用したGreene and Wutsの第７章、及びBarton, Protective
Groups in Organic Chemistry 、第２章 (McOmie, ed., Plenum Press, New York, 1973)に論じられている。適した基の例には、アシル保護基、例えば、例示するなら、ホルミル、ダンジル、アセチル、ベンゾイル、トリフルオロアセチル、スクシニル、メトキシスクシニル、ベンジル及び置換ベンジル、例えば3,4-ジメトキシベンジル、o-ニトロベンジル、及びトリフェニルメチル；式-COORのもの（但し式中、Rにはメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、2,2,2-トリクロロエチル、1-メチル-1-フェニルエチル、イソブチル、t-ブチル、t-アミル、ビニル、アリル、フェニル、ベンジル、p-ニトロベンジル、o-ニトロベンジル、及び2,4-ジクロロベンジルなどの基が含まれる）；アシル基及び置換アシル、例えばホルミル、アセチル、クロロアセチル、ジクロロアセチル、トリクロロアセチル、トリフルオロアセチル、ベンゾイル、及びp-メトキシベンゾイル；並びに他の基、例えばメタンスルホニル、p-トルエンスルホニル、p-ブロモベンゼンスルホニル、p-ニトロフェニルエチル、及びp-トルエンスルホニル-アミノカルボニル、がある。好適なアミノ遮断基はベンジル(-CH２C６H５)、アシル [C(O)R1] 又はSiR1３ （但し式中、R1はC１-C４ アルキル、ハロメチル、又は2-ハロ-置換-(C２-C４ アルコキシ)である）、芳香族のウレタン保護基、例えばカルボニルベンジルオキシ（Cbz）；並びに脂肪族のウレタン保護基、例えばt-ブチルオキシカルボニル(Boc)又は9-フルオレニルメトキシカルボニル(FMOC)、である。
【０１４１】
いずれかの構造において２箇所以上あるような、例えば低級アルキル、m、n、p等の各表現の定義は、同じ構造の他の箇所でのその定義とは独立であることが意図されている。
【０１４２】
「電子求引基」という用語は当業で公知であり、ある一個の置換基が、隣り合った原子から価電子を引き付ける性質を言い、即ち、この置換基は隣り合った原子に対して電気的に陰性である。電子求引力のレベルの定量はハメットのシグマ（σ）定数によって表される。このよく知られた定数は、数多くの文献、例えば March, Advanced Organic Chemistry （McGraw Hill Book Company, New York, (1977版））の２５１から５９に説明されている。このハメットの定数の値は、σ［Ｐ］がパラ置換を示すものとしたとき、一般的には電子供与基の場合はマイナスであり（ＮＨ２の場合σ［Ｐ］＝−０．６６）、そして電子求引基の場合にはプラスである（ニトロ基の場合σ［Ｐ］＝０．７８）。代表的な電子求引基には、ニトロ、アシル、ホルミル、スルホニル、トリフルオロメチル、シアノ、クロリド等がある。代表的な電子供与基にはアミノ、メトキシ等がある。
【０１４３】
用語「薬学的に許容可能な塩」は当業で公知であり、例えばここで解説される組成物に含まれるものなど、化合物の比較的に非毒性の無機及び有機の添加塩を言う。
【０１４４】
組成物の例
Ku70たんぱく質又はその部分、例えばアセチル化アミノ酸残基を好ましくは含むペプチド、がここで提供される。Ku70たんぱく質は、例えばヒト又は非ヒト哺乳動物など、哺乳動物などのいずれかの生物由来であってもよい。Ku70たんぱく質は、例えばChan et al. (1989) J. Biol.
Chem. 264:3651; Reeves et al. J.
Biol. Chem. (1989) 264:5047; Griffith et al. (1992) Mol. Biol. Rep. 16:91; 及び Tuteja et al. (1994) EMBO J.
13:4991に解説されている。
【０１４５】
ある実施態様では、Ku70たんぱく質は、SEQ ID NO: 2に記載された通りのアミノ酸配列を有し、そして例えばSEQ ID NO:
1に記載されたヌクレオチドなどにコードされた（それぞれGenBank 受託番号 NM_001469 及びNP_001460に相当する）ヒトKu70たんぱく質である。SEQ ID NO: 2 から成るアミノ酸配列を有するたんぱく質をここでは「野生型ヒトKu70」と言及する。SEQ ID NO: 1 の開放読み取り枠はヌクレオチド 656 から2485に相当する。Ku70のDNA結合ドメインは、SEQ ID NO: 1のヌクレオチド1484から1678にコードされており、SEQ ID NO: 2のアミノ酸277 から341 に相当する。SEQ ID NO: 1 のヌクレオチド758 から2242 は、SEQ ID NO: 2のアミノ酸 35 から 529をコードしており、中央のDNA結合ベータ・バレル、ポリペプチド環、及びＣ末端のアームを含む。SEQ ID NO: 1のヌクレオチド 2066 から2332 は、Ku70/Ku80 Ｃ末端アームに相当する、SEQ ID NO: 2のアミノ酸 471 から 559 をコードしている。SEQ ID NO: 1のヌクレオチド 1772 から 2101は、Ku80結合ドメインを含む、SEQ ID NO: 2のアミノ酸373 から 482 をコードしている。SEQ ID NO: 1のヌクレオチド 2270 から2335は、リンカ／核内移行シグナルを含む、SEQ ID NO: 2のアミノ酸 539 から 560 をコードしている。SEQ ID NO: 1のヌクレオチド 2387 から 2416 は、Bax結合ドメインを含む、SEQ ID NO: 2のアミノ酸 578 から 587 をコードしている。SEQ ID NO: 1のヌクレオチド 2372 から 2476 は、SAPドメインに相当する、SEQ ID NO: 2のアミノ酸 573 から 607をコードしている（例えば GenBank 受託番号 NM_001469の解説を参照されたい）。
【０１４６】
野生型マウス Ku70 ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank 受託番号 NM_010247 及び NP_034377に記載されている。野生型ラットKu70 ヌクレオチド及びアミノ酸配列は、それぞれGenBank 受託番号 NM_139080 及びNP_620780に記載されている。
【０１４７】
Ku70 たんぱく質又はその部分は、SEQ ID NO: 2の K46、K160、K164、K317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556から成る群より選択される一つ以上のアセチル化残基を有していてもよい。従って、Ku70 たんぱく質は、アセチル化した1個、2個、3個、4個、5個、6個、7 個又は 8 個の残基を有していてもよい。ある実施態様では、K539 及び／又は K542 がアセチル化している。残基のアセチル化は、例えば実施例など、ここで更に解説された通りなどで判定することができる。
【０１４８】
SEQ ID NO: 2に少なくとも約80%、90%、95%、97%、98%、又は 99% 同一なKu70たんぱく質も、ここで提供される。たんぱく質のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO: 2 などと、1個、2個、3個、5個、10個、15個又は 20 個のアミノ酸の追加、欠失、又は置換の点で異なっていてもよい。アミノ酸置換では、保存されたアミノ酸があってもよい。保存的置換は、ここでは、以下の５つのグループのうちの一つの中での交換であると、ここで定義できよう：
Ｉ．    小さな脂肪族の、非極性又は僅かに極性の残基：  Ala、Ser、Thr、Pro、Gly 
ＩＩ．  極性の、負に帯電した残基及びそれらのアミド：  Asp、Asn、Glu、Gln
ＩＩＩ．  極性の、正に帯電した残基：  His、Arg.、Lys 
ＩＶ．  大きな脂肪族の非極性の残基：  Met、Leu、Ile、Val、Cys 
Ｖ．  大きな芳香族の残基：  Phe、Try、Trp
【０１４９】
前述のグループ内では以下の５種の置換が「保存度が高い」と考えられる： Asp/Glu；His/Arg/Lys；Phe/Tyr/Trp；Met/Leu/Ile/Val。
【０１５０】
準保存的置換とは、上記の（Ｉ）、（ＩＩ）、及び（ＩＩＩ）を含む上位グループ（Ａ）、又は上記の（ＩＶ）及び（Ｖ）を含む上位グループ（Ｂ）、に制限される上記のグループ（Ｉ）−（Ｖ）のうちの二つの間での交換であると定義しておく。アミノ酸の欠失、追加又は置換は、好ましくは、Ku70たんぱく質のうちで、例えばここで更に解説されたものなど、生物学的活性に必要でない領域に位置するとよい。
【０１５１】
SEQ ID NO: 1に少なくとも約80%、90%、95%、97%、98%、又は99% 同一な核酸にコードされたKu70たんぱく質もここで提供される。
【０１５２】
更にKu70たんぱく質は、例えばSEQ ID NO: 2を有するなど、野生型Ku70たんぱく質をコードしている核酸にハイブリダイズする核酸にコードされていてもよい。ハイブリダイゼーションは、ストリンジェンシーの高い条件でも、又は低い条件でも行うことができる。例えば４５℃の6.0 x 塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム (SSC) 、その後５０℃の2.0 x SSCの洗浄など、DNAのハイブリダイゼーションを促進するストリンジェンシーの適した条件は当業者に公知であるか、あるいは、Current Protocols in Molecular Biology、John Wiley & Sons, N.Y. (1989)、6.3.1-6.3.6に見ることができる。例えば、洗浄ステップでの塩濃度を、
約2.0 x SSC の低ストリンジェンシーから約 0.2 x SSCの高ストリンジェンシーまでから選択することができる。加えて、洗浄ステップの温度を、低ストリンジェンシー条件の室温である約２２℃から高ストリンジェンシー条件の約６５℃まで増加させることができる。温度及び塩の両者ともを変更してもよく、あるいは塩濃度の温度を一定に維持して他方の変項を変更してもよい。好適な核酸は、SEQ ID NO: 1又はその一部分を含む核酸に、例えば６５℃の0.2 x SSCでのハイブリダイゼーション及び洗浄条件など、ストリンジェンシーの高い条件下でハイブリダイズするものである。
【０１５３】
Ku70 ペプチドは少なくとも約10、15、20、25、30 35 又は 50 アミノ酸長であってよい。好ましくは、Ku70 ペプチドが SEQ ID NO: 2のK46、K160、K164、K317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556から成る群より選択されるリジン残基を含むとよい。アセチル化残基を含んでもよいKu70 ペプチドの例には、以下のアミノ酸配列：ASKAM （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 44-48）；VDASKAMFE （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 42-50）；QFKMS （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 158-162）；DVQFKMSHK （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 156-164）；SHKRI （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 162-166 ）；KMSHKRIML （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 160-168）；VQFKMSHKRIMLFTNED （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 157-173）；DTKRS （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 315-319）；PSDTKRSQI （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 313-321 ）；LLLPSDTKRSQIY （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 310-322 ）；LEKEE （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 329-333 ）；IILEKEETE （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 327-335）；ELKRF （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 336-340）；TEELKRFDD （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 334-342 ）；DTKRSQ IYGSRQIILEKEETEELKRFD （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 325-341）；EGKVT （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 537-541）；NPEGKVTKR （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 535-543）；VTKRK （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 540-544）；GKVTKRKHD （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 538-546）；KRKHD （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 542-546）；VTKRKHD （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 540-548 ）；GSKRP （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 551-555）；GSGSKRPKV （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 549-557）；RPKVE （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 553-558）；SKRPKVEYS （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 551-560 ）；DYNPEGKVTKRK （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 533-544 ）；PEGKVTKRKHDN （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 536-546）； TKRKHDNEGSGSKRPKVEYSEE （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 541-562 ）；及び EGKVTKRKHDNEGS GSKRPKV （SEQ ID NO: 2のアミノ酸残基 537-557）のうちの一つを含む、一つから成る、又は基本的に一つから成るもの、がある。
【０１５４】
Ku70たんぱく質又はその部分を、当業で公知の方法に従って細胞から得てもよい。アセチル化Ku70たんぱく質又はその部分を以下の通りに調製するか、又は得てもよい。これらを、細胞、具体的には、アポトーシスが誘導された細胞；アセチル化が刺激された細胞、及び／又は、脱アセチル化が阻害された細胞、から単離してもよい。単離は、アセチル化した又はアセチル化していないKu70に結合する抗体を用いて行われてもよい。更にアセチル化Ku70たんぱく質又はその部分をin vitroで調製してもよい。例えば、Ku70 たんぱく質又はその部分をin vitro で合成し、例えばアセチルトランスフェラーゼの存在下でのインキュベーションなどによりin vitroでアセチル化することができる。アセチルトランスフェラーゼはCREB結合たんぱく質 (CBP)でも、p300/CBP-関連因子 (PCAF)でも、p300 (あるいは EP300 もしくは E1A-結合たんぱく質、300kD) でも、あるいは、これらのコアドメインなどのこれらの生物学的活性断片でもよい。アセチル化反応は、実施例で解説する通りに行わせることができる。また、Ku70たんぱく質又はその部分を、細胞から単離し、in vitroでアセチル化してもよい。
【０１５５】
ヒトCBPはSEQ ID NO: 4に記載されたアミノ酸配列を有し、SEQ ID NO: 3に記載されたヌクレオチド配列にコードされている（それぞれGenBank 受託番号 NP_004371 及び NM_004380に相当する）。SEQ ID NO: 3 のコーディング領域はヌクレオチド199 から 7527に相当する。SEQ ID NO: 3のヌクレオチド 1096 から 1494 は、CBP、p300、及び関連するTAZ Zn-フィンガーたんぱく質で保存された、転写に関与するドメインに相当する、SEQ ID NO: 4のアミノ酸 300 から 432 をコードしている。SEQ ID NO: 3のヌクレオチド1960 から2199 は、KIXドメインに相当する、SEQ ID NO: 4のアミノ酸588 から667 をコードしている。SEQ ID NO: 3のヌクレオチド2365 から 2811は、細胞内輸送、分泌、及びベシクル輸送に関与するベシクル膜複合体COPIIサブユニットSEC31に相当する、SEQ ID NO: 3のアミノ酸723 から 871 をコードしている。SEQ ID NO: 3のヌクレオチド 3448 から 3780は、ブロモ・ドメインに相当する、SEQ ID NO: 4のアミノ酸1084 から 1194 をコードしている。SEQ ID NO: 3のヌクレオチド 4990 から 5733 は、CBP、p300 及び関連するTAZ Zn-フィンガーたんぱく質間で保存された領域に相当すると共に転写に関与する、SEQ ID NO: 4のアミノ酸1598 から 1845をコードしている。
【０１５６】
ヒトPCAF は、SEQ ID NO: 6 に記載されたアミノ酸配列を有し、SEQ ID NO: 5に記載されたヌクレオチド配列にコードされている（それぞれGenBank 受託番号 NP_003875 及びNM_003884に相当する）。SEQ ID NO: 5 のコーディング領域はヌクレオチド 447 から 2945に相当する。SEQ ID NO: 5のヌクレオチド 768 から 2924は、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ SAGA/ADA、触媒サブユニット PCAF/GCN5 及び関連たんぱく質に相当する、SEQ ID NO: 6のアミノ酸108 から 826 をコードしている。SEQ ID NO: 5のヌクレオチド 2082 から 2315は、アセチルトランスフェラーゼ（GNAT）ファミリーの保存ドメインに相当する、SEQ ID NO: 6のアミノ酸 546 から 623をコードしている。SEQ ID NO: 5のヌクレオチド 2082 から 2315は、ブロモ・ドメインに相当する、SEQ ID NO: 6のアミノ酸721 から 827 をコードしている。ヌクレオチド 2740は、選択的対立遺伝子ではT 又はGである。
【０１５７】
ヒトp300は、 SEQ ID NO: 8に記載されたアミノ酸配列を有し、SEQ ID NO: 7に記載されたヌクレオチド配列にコードされている（それぞれGenBank 受託番号 NP_001420 及び NM_001429に相当する）。SEQ ID NO: 7 のコーディング領域はヌクレオチド1200 から 8444に相当する。SEQ ID NO: 7のヌクレオチド 1230 から1250は、核内局在化ドメインに相当する、SEQ ID NO: 8のアミノ酸11 から17 をコードしている。SEQ ID NO: 7のヌクレオチド 1464 から 2024は、細胞内輸送、分泌、及びベシクル輸送に関与する、ベシクル膜複合体COPII、サブユニットSFB3に相当する、SEQ ID NO: 8 のアミノ酸89 から 275 をコードしている。SEQ ID NO: 7のヌクレオチド 2184 から 2447 は、CBP、p300、及び関連するTAZ Zn-フィンガーたんぱく質間で保存されたドメインであると共に転写に関与する、SEQ ID NO: 8のアミノ酸 329 から 416 をコードしている。SEQ ID NO: 7のヌクレオチド 2238 から 2432は、cyc/his リッチな領域1 に相当する、SEQ ID NO: 8のアミノ酸347 から 411 をコードしている。SEQ ID NO: 7のヌクレオチド 2901から 3137 は、KIXドメインに相当する、SEQ ID NO: 8のアミノ酸685 から 827 をコードしている。このたんぱく質の他の機能的ドメインはGenBank 受託番号 NM_001429に更に解説されている。
【０１５８】
ある好適な実施態様では、アミノ酸配列SEQ ID NO: 2又はその一部分を有する野生型Ku70たんぱく質とは異なるたんぱく質が、野生型のアセチル化又は非アセチル化Ku70たんぱく質のアゴニスト又はアンタゴニスト活性を有する。Ku70の活性には、Bax、アセチルトランスフェラーゼ、及び脱アセチル化酵素への結合；DNAへの結合；及びKu80への結合、がある。アセチルトランスフェラーゼはCBPでも、PCAFでも、又はp300でもよい。脱アセチル化酵素は、クラスI、II、又はIIIのヒストンデアセチラーゼであってよい。あるたんぱく質が野生型Ku70たんぱく質の活性を有するかどうかは、例えば以下の通りにして判定することができる。あるたんぱく質又はその部分がBax、アセチルトランスフェラーゼ、脱アセチル化酵素、DNA 又はKu80 に結合するかどうかの判定は、スクリーニング検定に関する項や、実施例で更に解説する通りに行うことができる。例えば、二つのたんぱく質、又は、ある一種のたんぱく質とDNA、を一緒にインキュベートし、それらの結び付きを、電気泳動法、及び／又は、それらの二つのたんぱく質の一方に対する抗体を用いた免疫沈降法で、可視化してもよい。代替的には、細胞抽出物を調製し、これらに対して免疫沈降法を行うこともできる。Ku70、Bax 及びCBPたんぱく質に対する抗体は、例えばSanta Cruz社から得られよう。PCAF 又はp300 たんぱく質に対する抗体は、例えばUpstate Biotechnology社から得られよう。代替的には、このような抗体を当業で公知の方法に従って調製することもできる。
【０１５９】
アセチル化野生型Ku70たんぱく質のアゴニスト（又は、非アセチル化野生型Ku70たんぱく質のアンタゴニスト）であるたんぱく質又はその部分は、例えばBaxと相互作用せず、従ってBaxにアポトーシスを媒介させるなど、アセチル化野生型Ku70たんぱく質のように作用するたんぱく質又はその部分である。このようなたんぱく質の例には、例えばK539又はK542などのアセチル化リジンを有するか、あるいは、リジンが、グルタミンなどの構成的にアセチル化されるアミノ酸を模倣するアミノ酸に置換されているようなアセチル化野生型Ku70たんぱく質又はその部分など、アセチル化野生型Ku70たんぱく質や、Baxと相互作用しないそのバリアント又は変異体がある。このようなたんぱく質はここで更に解説されている。野生型アセチル化Ku70たんぱく質のアゴニストであるペプチドの例には、上述したペプチドのアセチル化型がある。このようなアセチル化たんぱく質を細胞内へ導入する、又は細胞内で発現させると、例えば脱アセチル化酵素を滴定し、従ってこの脱アセチル化酵素が内因性Ku70たんぱく質を脱アセチル化できなくなることで、アポトーシスが誘導されるであろう。
【０１６０】
反対に、アセチル化野生型Ku70たんぱく質のアンタゴニスト（又は非アセチル化野生型Ku70たんぱく質のアゴニスト）は、例えばBaxと相互作用してBaxにアポトーシスを媒介させないようにするなど、非アセチル化野生型Ku70たんぱく質のように作用するたんぱく質又はその部分である。このようなたんぱく質の例には、例えばK539又はK542がアセチル化していないKu70たんぱく質又はその部分など、非アセチル化野生型Ku70たんぱく質や、Baxと相互作用するそのバリアント又は変異体がある。好ましくは、K539 又はK542のいずれもアセチル化していないとよい。野生型非アセチル化Ku70たんぱく質のアゴニストとして用いてもよいペプチドの例には、SEQ ID NO: 2のアミノ酸530-567を含む非アセチル化ペプチドがある。他のペプチドには、Bax結合ドメイン（アミノ酸578-587）があり、アミノ酸 530 から578 又は 530-609などを含むであろう。このような非アセチル化たんぱく質又はその部分を細胞内に導入する、又は、細胞内で発現させると、例えばBaxに相互作用してそれがアポトーシスを媒介しないようにするなどにより、アポトーシスが妨げられよう。
【０１６１】
たんぱく質又はその部分は、ここで更に解説するように、単離又は精製されたたんぱく質及びその部分であってもよい。例えば、アセチル化Ku70たんぱく質を、他の細胞成分を実質的に含まないなど、単離された形で提供してもよい。
【０１６２】
アセチル化Ku70及び非アセチル化Ku70たんぱく質又はその部分は、当業で公知の多様な方法により実質的に精製できよう。実質的に純粋なたんぱく質は、たんぱく質精製のための公知の手法に従って得られると思われるが、この場合、例えば免疫学的検定、クロマトグラフィ検定、酵素検定等を用いて、当該手法の各段階で精製を観察する。Ku70たんぱく質又はペプチドなどの他の部分は、それらのたんぱく質配列で明らかになった特性を基に選択される多種の方法のいずれかによって、単離及び精製し得る。例えば、限定はしないが、ゲル濾過クロマトグラフィ、イオン交換クロマトグラフィ、高速液体クロマトグラフィ（RP-HPLC、イオン交換HPLC、サイズ排除HPLC、高速クロマトフォーカシング・クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、免疫沈降法、又はイムノアフィニティ精製法を含む標準的なたんぱく質精製法を用いて、精製を行うことができる。ゲル電気泳動法（例えば PAGE、SDS-PAGE）を用いても、たんぱく質又はその部分を、その分子量、電荷特性及び疎水性に基づいて単離することができる。たんぱく質精製法は当業で公知であり、例えばDeutscher et al., Guide to Protein Purification, Harcourt
Brace Jovanovich, San Diego (1990)などに解説されている。
【０１６３】
更に、単離型又は非単離型のアセチル化又は非アセチル化Ku70たんぱく質又はその部分と、単離型又は非単離型のアセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素あるいはこれらの生物学的活性部分とを含む組成物もここで提供される。Ku70 たんぱく質又はその部分は、SEQ ID NO: 2のK317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556から成る群より選択されるリジンを含むと思われ、また、ここで解説されたKu70たんぱく質又はその部分のいずれであってもよい。組成物の一例は、単離された非アセチル化Ku70たんぱく質又はその部分と、CBP、PCAF 又はp300などの単離されたアセチルトランスフェラーゼ又はその生物学的活性部分とを含むものである。もう一つの組成物の例は、SEQ ID NO: 2のリジンK317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556 のうちの一つ以上でアセチル化した単離されたKU70たんぱく質と、例えばクラスI/II ヒストンデアセチラーゼ又はクラス III ヒストンデアセチラーゼ、例えばサーチュイン、などの単離された脱アセチル化酵素又はその生物学的活性部分とを含むものである。
【０１６４】
クラスI ヒストンデアセチラーゼ (HDAC) には、酵母Rpd3-様たんぱく質 (HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8、及び HDAC11がある。クラスII HDACには、酵母Hda1-様たんぱく質
HDAC4、HDAC5、HDAC6、HDAC7、HDAC9、及び
HDAC10 がある(Fischle, W., et al., J.
Biol. Chem, 274, 11713-11720
(1999))。
【０１６５】
これらのヒトHDACのそれぞれのヌクレオチド及びアミノ酸配列や、それらのアミノ酸配列中の保存ドメインの位置を以下に記載する（「i」は「アイソフォーム」を言う）：
HDAC                   ヌクレオチド配列               アミノ酸配列                      保存ドメイン
（アミノ酸中）
HDAC1                   NM_004964                      NP_004955                          28-321
HDAC2                   NM_001527                      NP_001518                          29-322
HDAC3                   NM_003883                      NP_003874                          3-315
HDAC4                   NM_006037                      NP_006028                          91-142;
653-994
HDAC5i1               NM_001015053                NP_001015053                     683-1026
i2              NM_005474                      NP_005465                          682-1025
HDAC6                  NM_006044                      NP_006035                          1132-1180;
883-1068;480-796;
84-404
HDAC7Ai1              NM_015401                      NP_056216                          519-829
i2              NM_016596                      NP_057680                          479-789
HDAC8                   NM_018486                      NP_060956                          16-324
HDAC9i1                NM_014707                      NP_055522                          
i2                   NM_058176                      NP_478056                          633-974
i3            
NM_058177                      NP_478057                          633-860
i4                   NM_178423                      NP_848510                          633-974
i5                   NM_178425                      NP_848512                          636-977
HDAC10                 NM_032019                      NP_114408                          1-315
HDAC11                 NM_024827                      NP_079103                          17-321
【０１６６】
ヒトサーチュインSIRT
1（サイレント接合型情報調節2
相同体）1 は、SEQ ID NO: 10 に記載されたアミノ酸配列を有し、SEQ ID NO: 9 に記載されたヌクレオチド配列にコードされている（それぞれGenBank 受託番号 NP_036370 及び NM_012238にコードされている）。SEQ ID NO: 10 のコーディング領域はヌクレオチド54 から 2297に相当する。SEQ ID NO: 9のヌクレオチド 534 から 48は、サーチュイン5及び関連するクラスIIIサーチュイン（SIR2ファミリー）の保存ドメインに相当する、SEQ ID NO: 10のアミノ酸161 から 565 をコードしている。SEQ ID NO: 9のヌクレオチド 237 から 932は、NAD結合ドメインや基質結合ドメインを包含する、SEQ ID NO: 10のアミノ酸 62-293をコードしている。従って、この領域は時にはコアドメインと呼ばれることがある。しかしながら、SIRT1のコアドメインは、SEQ ID NO: 9のヌクレオチド834 から1394 にコードされた、SEQ ID NO: 10の約アミノ酸 261 から 447と言及されたり；SEQ ID NO: 9のヌクレオチド 777 から 1532 にコードされた、SEQ ID NO: 10の約アミノ酸 242 から 493と言及されたり；あるいは、SEQ ID NO: 9のヌクレオチド813 から 1538にコードされた、 SEQ ID NO: 10の約アミノ酸254から 495 と言及されることもある。SEQ ID NO: 9のヌクレオチド750 から 767 は、推定上の核内局在化シグナルをコードしている。サーチュインの構造は、更に例えばZhao et al. PNAS 101:8563
(2004) 及びそこで引用された参考文献や、 Bitterman et al. (2003) Microbiol.
Mol. Biol. Rev. 67:376に解説されている。
【０１６７】
ヒトサーチュインのヌクレオチド及びアミノ酸配列と、保存ドメイン例を以下に記載する：
Sirt                       ヌクレオチド配列               アミノ酸配列                      保存ドメイン
（アミノ酸）
SIRT1                   NM_012238
NP_036370
431-536;
254-489
SIRT2 i1               NM_012237                         NP_036369
77-331
i2               NM_030593                         NP_085096                          40-294
SIRT3  ia             NM_012239
NP_036371
138-373
ib            NM_001017524
NP_001017524
1-231
SIRT4                   NM_012240
NP_036372                          47-308
SIRT5 i1               NM_012241
NP_036373
51-301
i2               NM_031244                         NP_112534                          51-287
SIRT6                   NM_016539
NP_057623
45-257
SIRT7                   NM_016538
NP_057622
100-314
【０１６８】
アセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素の生物学的活性部分とは、それぞれアセチル化又は脱アセチル化に充分な一部分である。例えば、CBPの生物学的活性部分は、SEQ ID NO: 4から成るヒトCBPのアミノ酸1098-1758を含むHATドメインを含む。PCAFの生物学的活性部分は、SEQ ID NO: 6から成るヒトPCAFのアミノ酸352から832を含むHATドメインを含むであろう。p300の生物学的活性部分は、SEQ ID NO: 8の約アミノ酸1066から1701、又はアミノ酸1195から1673を含むHATドメインであろう。クラスI又はIIヒストンデアセチラーゼの生物学的活性部分は当業で公知である。サーチュインの生物学的活性部分はサーチュインコアドメインを含むであろう。
【０１６９】
組成物は、ここで更に解説するものなど、薬学的に許容可能な緩衝剤又は賦形剤などを含む医薬組成物であってよい。組成物には、実施例で引用した成分など、アセチル化又は脱アセチル化に必要な付加的な分子が含まれていてもよい。更に組成物には、付加的なたんぱく質又はその部分も含まれていてもよい。
【０１７０】
たんぱく質複合体などの分子複合体も、更にここで提供される。たんぱく質複合体は、アセチル化又は非アセチル化Ku70たんぱく質又はその部分と、例えばここで解説するようにアセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素あるいはこれらの生物学的活性部分などの結合たんぱく質とを含むであろう。例えばKu70たんぱく質又はその部分と結合たんぱく質を提供するなどにより、たんぱく質複合体をin vitroで調製してもよい。例えば当該複合体を免疫沈降させるための抗体を用いるなどして、たんぱく質複合体を、細胞又は細胞抽出物から単離してもよい。
【０１７１】
たんぱく質複合体は単離された又は精製されたたんぱく質複合体であってもよい。例えば、Ku70たんぱく質及びその結合相手がin vivoでは一緒に複合体形成した状態で見られる場合、好ましくは、たんぱく質複合体は、ここで更に解説するように、単離された又は精製されたたんぱく質複合体であるとよい。
【０１７２】
別の実施態様では、変異型Ku70たんぱく質又はその部分が提供される。ある実施態様では、変異型Ku70たんぱく質又はその部分は、SEQ ID NO: 2のリジン K317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及びK556から成る群より選択されるリジン残基の別のアミノ酸との置換を含む。その他のアミノ酸、例えばアルギニンなど、アセチル化できないアミノ酸でもよい。更にその他のアミノ酸は、グルタミンなど、構成的アセチル化状態を模倣するアミノ酸であってもよい。たんぱく質の例には、K317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556 のうちの一つ以上がアルギニン又はグルタミンに置換された、SEQ ID NO: 2などの野生型Ku70たんぱく質のアミノ酸配列を含むか、又は該アミノ酸配列から成るたんぱく質がある。変異型Ku70 たんぱく質は、K539及び／又はK542がアルギニン又はグルタミンに置換された、SEQ ID NO: 2などを含むであろう。ペプチドの例には、K317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556 のうちの一つ以上がアルギニン又はグルタミンに置換された、ここで解説されたものがある。変異型Ku70ペプチドは、K539及び／又はK542がアルギニン又はグルタミンに置換された、SEQ ID NO: 2の一部分、例えばアミノ酸530-546などを含むペプチドを含むであろう。
【０１７３】
Ku70たんぱく質又はその部分と、異種のアミノ酸配列とを含む融合たんぱく質も考えられる。異種のアミノ酸配列は、安定性を提供するものでも、可溶性を提供するものでも、又は、検出及び／又は単離用のマーカーたんぱく質を提供するものでもよい。例えば、Ku70たんぱく質又はその部分をヒスチジン・タグに、又は、ヒンジ、CH2及び／又はCH3ドメインなどの免疫グロブリン分子の一部分に、融合又は連結してもよい。
【０１７４】
野生型又は変異型に関係なく、例えばここで解説されたものなど、Ku70たんぱく質又はその部分をコードする核酸も、提供される。ある実施態様では、核酸は、K317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556のうちの一つ以上がアルギニン又はグルタミンに置換されている、SEQ ID NO: 2又はその一部分を含むKu70たんぱく質又はその部分をコードするものである。核酸は、cDNA又はゲノムDNAなどのDNAでも、あるいはRNAでもよい。核酸には、例えばプロモータ、エンハンサ、サイレンサ、及びイントロンなど、たんぱく質発現に必要な調節因子が含まれていてもよい。核酸は、プラスミドの形でも、又は発現ベクタなどのベクタの形でもよい。核酸は、単離された細胞などの細胞内にあってもよい。細胞は真核細胞でも、又は原核細胞でもよい。真核細胞は、ヒト細胞、非ヒト霊長類細胞、又はげっ歯類細胞などの哺乳動物細胞であってよい。更に細胞は植物細胞でもよい。細胞は、Ku70たんぱく質又はその部分を発現させるために用いられてもよい。例えば、Ku70たんぱく質又はその部分をコードする核酸を含む細胞を、この核酸が発現してKu70たんぱく質又はその部分になるような条件下で培養し、その発現したたんぱく質又はその部分を選択に応じて培養物から単離してもよい。
【０１７５】
更に、アセチル化又は非アセチル化Ku70たんぱく質又はその部分に対する抗体もここで解説される。抗体は、例えばSEQ ID NO: 2の K317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556から成る群より選択されるアセチル化残基など、Ku70たんぱく質のアセチル化残基を特異的又は優先的に認識するものであろう。例えば、抗体は、アセチル化K539 又は K542を認識するが、それぞれ非アセチル化K539 又はK542は認識しないものかも知れない。抗体は、少なくとも約10-6、10-7、10-8、10-9、10-10、10-11、又は 10-12 nMの結合特異性を有するものでもよい。抗体はポリクローナルでも、又はモノクローナルでもよく、またIgG、IgD、IgM、IgA、又は IgE であってよい。「モノクローナル抗体」とは、全ての抗体が同じ特異性を有し、同じ核酸から産生されるような抗体標品中の抗体分子を言う。更に抗体はキメラ抗体でも、又はヒト化抗体でもよい。
【０１７６】
抗体のフラグメントも提供される。例えば、抗体フラグメントは、例えばFabフラグメント、F(ab)2フラグメント、Fvフラグメント又は一本鎖Fv（scFv）など、抗体のうちの抗原結合部分であってもよい。抗体は、従来技術を用いてフラグメントにすることができ、このフラグメントは、全抗体に関して解説されたのと同じ態様で実用性についてスクリーニングすることができる。ある一つの免疫グロブリン分子のFabフラグメントは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリンの軽鎖が共有結合により一緒に連結された免疫学的活性部分を含むと共に、抗原に特異的に結合することのできる、一個の免疫グロブリン分子の部分から成る多量体たんぱく質である。Fab フラグメントは、実質的にインタクトな免疫グロブリン分子を当業で公知の方法を用いてパパインでたんぱく質分解による消化を行うことにより、調製することができる。しかしながら、Fabフラグメントは、免疫グロブリン重鎖及び免疫グロブリン軽鎖の所望の部分を、当業で公知のいずれかの方法を用いて適したホスト細胞内で発現させることでも、調製できよう。
【０１７７】
特定のたんぱく質又はそのエピトープを狙ったモノクローナル抗体を調製する場合、連続的な細胞株培養による抗体分子作製に役立ついずれかの技術を利用してもよい。このような技術には、限定はしないが、ハイブリドーマ技術（Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495−497を参照されたい）；トリオーマ技術；ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kozbor, et al. (1983) Immunol. Today 4:72を参照されたい）、ヒト抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole,
et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss,
Inc., pp. 77−96を参照されたい）及びファージ・ディスプレイ、がある。ヒトモノクローナル抗体は、ここで解説された方法の実施で用いられてもよく、また、ヒトハイブリドーマを用いる（Cote et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026を参照されたい）、 あるいはヒトＢ細胞をエプスタイン−バー−・ウィルスでin vitroで形質転換することでも、作製できよう（Cole et al. In: Monoclonal
Antibodies and Cancer Therapy,
Alan R. Liss, Inc., pp. 77−96 (1985) を参照されたい）。
【０１７８】
アセチル化Ku70ポリペプチドの豊富度又は発現パターンを評価するために、例えばアセチル化Ku70たんぱく質を特異的に認識するものなど、抗Ku70抗体を組織試料の免疫組織化学的染色で用いてもよい。抗アセチル化Ku70 抗体を、例えば免疫沈降法、イムノブロッティング、又は免疫組織化学法などで診断的に用いて、組織中のアセチル化Ku70たんぱく質レベルを、臨床検査法の一部として検出及び評価することができる。例えば、このような測定は、癌治療の開始又は進行の予測的評価や、あるいは、寿命の予測的評価、又は、長寿を促進する操作で、有用であろう。同様に、ある個体中のアセチル化又は脱アセチル化Ku70たんぱく質レベルを観察できれば、
癌に罹患しているなどの個体にとっての治療計画の効験を判断することができる。アセチル化又は脱アセチル化Ku70ポリペプチドのレベルは、例えば脳脊髄益試料又は羊水試料など、体液中の細胞から測定してもよく、あるいは、生検で生じるものなど、組織中で測定することもできる。
【０１７９】
ここで解説されたたんぱく質、たんぱく質複合体、ペプチド、核酸、ホスト細胞、交代、及び組成物のうちの一つ以上などを含むキットも提供される。キットは、Ku70たんぱく質の複合体形成、アセチル化又は脱アセチル化を調節する化合物をスクリーニングするのに必要な試薬を含むであろう。更にキットは診断目的又は治療目的のものであってもよい。キットの選択的な追加要素には、緩衝剤、正及び負のコントロール、容器、及び他の器具がある。
【０１８０】
スクリーニング法の例
Ku70たんぱく質の活性を調節することで、アポトーシスを調節するなどする化合物を特定するためのスクリーニング法は、Ku70たんぱく質と結合たんぱく質（又は相互作用性分子）、例えばアセチルトランスフェラーゼ、脱アセチル化酵素、Bax又はKu80あるいはこれらの部分など、との間の相互作用を調節する化合物をスクリーニングするステップを含むであろう。例としてのスクリーニング法は、Ku70たんぱく質と、アセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素との間の相互作用を調節する化合物を特定するステップを含むものである。アセチルトランスフェラーゼはCBPでも、PCAFでも、又はp300でもよい。脱アセチル化酵素は、クラスI/IIヒストンデアセチラーゼでも、又は、サーチュインなどのクラスIIIデアセチラーゼでもよい。
【０１８１】
スクリーニング法は、Ku70たんぱく質又はその部分を、アセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素あるいはこれらの生物学的活性部分などの結合たんぱく質に、検査化合物の存在下、かつ、Ku70と前記結合たんぱく質との間の相互作用が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップを含むであろう。Ku70たんぱく質又はその部分は、SEQ ID NO: 2のK317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556から成る群より選択される一つ以上のアミノ酸、又は、別のKu70配列の相当するリジン、を含むであろう。結合たんぱく質の生物学的活性部分とは、検査化合物の非存在下でもKu70に結合するために充分な部分である。反応がアセチルトランスフェラーゼを含む場合、Ku70たんぱく質又はその部分は、このKu70たんぱく質又はその部分がアセチルトランスフェラーゼと相互小夜することができるように、
少なくとも部分的に脱アセチル化しているとよい。例えば、Ku70たんぱく質又はその部分がリジンK539 及び／又は K542で脱アセチル化していることであり、好ましくは両者のアミノ酸で脱アセチル化しているとよい。反応が脱アセチル化酵素を含む場合、Ku70 たんぱく質又はその部分は、このKu70たんぱく質又はその部分が脱アセチル化酵素を相互作用することができるように、少なくとも部分的にアセチル化しているとよい。
【０１８２】
Ku70 たんぱく質は野生型Ku70たんぱく質であってもよく、例えばSEQ ID NO: 2から成っていてもよい。代替的には、Ku70 たんぱく質は、ここで解説されたものなど、変異型Ku70たんぱく質であってもよい。Ku70たんぱく質の部分とは、アセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素などの結合たんぱく質に結合するために充分な部分である。例えば、ヒトKu70たんぱく質の一部分は、好ましくは、SEQ ID NO: 2 の少なくともアミノ酸530からアミノ酸546まで、あるいは別のKu70たんぱく質の均等な部分を含むとよい。Ku70の他の部分はここで解説されており、その中には例えばSEQ ID NO: 2のアミノ酸520から567までなどがある。ここで解説された他のKu70たんぱく質及びその部分も用いてよい。
【０１８３】
アセチルトランスフェラーゼはCBPでも、PCAFでも、p300でも、又は、Ku70に結合するために充分なこれらの生物学的活性部分でもよい。脱アセチル化酵素は、クラスI/II ヒストンデアセチラーゼでも、又はサーチュインなどのクラス III ヒストンデアセチラーゼでも、あるいはKu70に結合するために充分なこれらの生物学的活性部分でもよい。これらのたんぱく質の生物学的活性部分の例はここで解説されている。アセチルトランスフェラーゼに関すると、生物学的活性部分にはそれらのHATドメインが含まれよう。
【０１８４】
スクリーニング法には、更に、Ku70たんぱく質又はその部分と、結合たんぱく質又はその生物学的活性部分との間の相互作用のレベルを判定するステップを含めてもよい。検査化合物の非存在下に比較したときに検査化合物の存在下での相互作用のレベルが低いことは、この検査化合物が、Ku70たんぱく質と結合たんぱく質との間の相互作用を阻害する又は減らす化合物又は作用物質であることの指標である。検査化合物の非存在下に比較したときに検査化合物の存在下での相互作用のレベルが高いことは、この検査化合物が、Ku70たんぱく質と結合たんぱく質との間の相互作用を刺激する又は増す化合物又は作用物質であることの指標である。
【０１８５】
Ku70たんぱく質又はその部分と結合たんぱく質との間の相互作用は、多種の技術で検出できよう。複合体の形成の調節は、イムノアッセイ、クロマトグラフィ検出法により、放射性標識された、蛍光標識された、又は酵素標識されたポリペプチドなどの検出可能に標識されたたんぱく質などを用いることにより、あるいは、アセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素の固有活性を検出することにより、定量することができる。
【０１８６】
典型的には、Ku70たんぱく質又はその部分あるいは結合たんぱく質のいずれかを固定すると、一方又は両者のたんぱく質の非複合体形成形から複合体を分離したり、検定を自動化したりするために、好ましいであろう。候補作用物質の存在下及び非存在下における、結合たんぱく質へのKu70たんぱく質又はその部分の結合は、試薬を容れるために適していればいずれの容器内でも行わせることができる。例には微量定量プレート、試験管、及びマイクロ遠心管がある。
【０１８７】
ある実施態様では、Ku70たんぱく質又はその部分あるいは結合たんぱく質を、当該たんぱく質をマトリックスに結合させられるようにするドメインを含む融合たんぱく質として、提供する。例えば、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ/Ku70（GST/Ku70）融合たんぱく質を、グルタチオン・セファロース・ビーズ（ミズーリ州セントルイス、Sigma Chemical社）又はグルタチオン誘導体化微量定量プレートに吸着させた後、標識しておいてもよい他のたんぱく質と配合し、この検査化合物と混合物とを、僅かによりストリンジェントな条件が好ましい場合もあるが、例えば塩及びｐＨなどの生理条件など、複合体形成を誘導する条件下でインキュベートすることができる。インキュベート後、ビーズを洗浄して未結合の標識を取り除き、マトリックスを固定し、放射性標識の存在を直接（例えばビーズをシンチラント中に配置する）、判定しても、あるいは、次に複合体を解離させた後の上清中で判定してもよい。代替的には、複合体をマトリックスから解離させ、SDS-PAGEで分離し、ビーズ画分中に見られる結合たんぱく質のレベルを、標準的な電気泳動技術を用いてゲルから定量することもできる。
【０１８８】
たんぱく質又はペプチドをマトリックス上に固定する他の技術も、本検定での使用に向けることができる。例えばKu70たんぱく質又はその部分あるいは結合たんぱく質のいずれかを、ビオチン及びストレプトアビジンの結合を利用して固定することができる。例えば、ビオチン化Ku70 分子を、ビオチン-NHS (N-ヒドロキシ-スクシンイミド) から、当業で公知の技術（例えば、イリノイ州ロックフォード、Pierce
Chemicals社、ビオチニレーション・キット）を用いて調製し、ストレプトアビジンで被膜した９６ウェル・プレート（Pierce Chemical社）のウェル中に固定することができる。アセチル化又は脱アセチル化Ku70たんぱく質又はその部分のいずれかとは反応性であるが、Ku70たんぱく質又はその部分と結合たんぱく質との間の相互作用には好ましくは干渉しないような抗体を、プレートのウェルに誘導体化し、Ku70をこのウェルに抗体結合により捕獲することができる。上述したように、結合たんぱく質及び検査化合物の標品を、Ku70を容れたプレートのウェル内でインキュベートし、ウェルに捕獲された複合体の量を、定量することができる。このような複合体を検出する方法の例には、GST-固定化複合体に関して上述したものに加え、結合たんぱく質と反応性の、あるいは、Ku70たんぱく質に対して反応性で結合たんぱく質と競合する、抗体を用いた複合体の免疫検出；結合たんぱく質に伴う、固有又は外因性の活性である酵素活性を検出することに依拠する酵素結合検定法、がある。後者の場合、酵素を化学結合させるか、あるいは、結合たんぱく質との融合たんぱく質として提供することができる。実例を挙げると、結合たんぱく質を、西洋わさびペルオキシダーゼに、化学的に架橋させるか、又は遺伝子融合（それがポリペプチドである場合）させ、複合体に捕獲されたポリペプチドの量を、例えば3,3'-ジアミノ-ベンズアジンテトラヒドロクロリド又は4-クロロ-1-ナフトールなど、この酵素の色素産生性基質で評価することができる。同様に、当該ポリペプチド及びグルタチオン-S-トランスフェラーゼを含む融合たんぱく質を提供し、複合体形成を、1-クロロ-2,4-ジニトロベンゼンを用いてGST活性を検出することにより、定量することができる(Habig et al (1974) J Biol Chem 249:7130)。
【０１８９】
複合体に捕獲されたたんぱく質を定量するために免疫検出に依拠するプロセスの場合、このたんぱく質に対する抗体、例えば抗Ku70、抗アセチルトランスフェラーゼ又は抗脱アセチル化酵素など、を用いることができる。このような抗体は、例えばここの他所で解説したものなど、多様な市販の業者から得ることができる。代替的には、複合体中の、検出しようとするたんぱく質に、Ku70配列に加え、対する抗体が（例えば市販のものなど）容易に入手できる第二のポリペプチドを含む融合たんぱく質の形で「エピトープ・タグを付け」ることができる。例えば、上述したGST融合たんぱく質は、GST部分に対する抗体を用いた結合の定量にも、用いることができる。他の有用なエピトープ・タグには、c-myc由来の１０残基配列を含むmyc-エピトープ（例えばEllison et al. J Biol Chem. 266:21150-21157 (1991) を参照されたい）や、pFLAG系（International Biotechnologies社）又はpEZZ-プロテインＡ系（ニュージャージー州ファルマシア）がある。 
【０１９０】
検査化合物の効験は、多様な濃度のこの検査化合物を用いて得られるデータから用量応答曲線を作成することによって、評価することができる。更に、比較のための基線を提供するためにコントロール検定を行うこともできる。コントロール検定の一例では、Ku70たんぱく質又はその部分と、結合たんぱく質との間の相互作用を、検査化合物の非存在下で定量する。
【０１９１】
他のスクリーニング法は、Ku70たんぱく質のアセチル化又は脱アセチル化を調節する化合物を特定するステップを含む。ある方法は、Ku70たんぱく質又はその部分を、アセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素あるいはこれらの生物学的活性部分に、検査化合物の存在下、かつ、アセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素によるKu70の少なくとも一つのアミノ酸のそれぞれアセチル化又は脱アセチル化が前記検査化合物の非存在下でも可能な条件下で、接触させるステップを含むであろう。Ku70たんぱく質又はその部分は、SEQ ID NO: 2のK317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556から成る群より選択される一つ以上のアミノ酸、又は、別のKu70配列の相当するリジン、を含むであろう。アセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素の生物学的活性部分とは、検査化合物の非存在下でも、Ku70の少なくとも一つのアミノ酸をアセチル化又は脱アセチル化するために充分な部分である。反応がアセチルトランスフェラーゼを含む場合、Ku70たんぱく質又はその部分は、好ましくは、このKu70たんぱく質又はその部分がアセチル化できるように、少なくとも部分的に脱アセチル化しているとよい。例えば、Ku70たんぱく質又はその部分が、リジンK539及び／又はK542で脱アセチル化していることであり、好ましくは両者のアミノ酸で脱アセチル化しているとよい。
反応が脱アセチル化酵素を含む場合、Ku70たんぱく質又はその部分は、好ましくは、このKu70たんぱく質又はその部分が脱アセチル化できるように、少なくとも部分的にアセチル化しているとよい。
【０１９２】
Ku70たんぱく質は、SEQ ID NO: 2から成るなど、野生型Ku70たんぱく質であってもよい。代替的には、Ku70たんぱく質は、ここで解説したものなどの変異型Ku70たんぱく質であってもよい。Ku70たんぱく質の部分とは、アセチル化又は脱アセチル化が可能な少なくとも一つのアミノ酸を含むと共にアセチル化又は脱アセチル化するために充分な長さの部分である。例えば、ヒトKu70たんぱく質のある一部分には、SEQ ID NO: 2の少なくともアミノ酸540からアミノ酸544、又は、別のKu70たんぱく質に均等な部分が含まれよう。他の部分には、SEQ ID NO: 2のアミノ酸530から546、又は、ここで更に解説する他のフラグメントが含まれる。
【０１９３】
アセチルトランスフェラーゼはCBPでも、PCAFでも、p300でも、Ku70又はその一部分をアセチル化するために充分なこれらの生物学的活性部分でもよい。脱アセチル化酵素は、クラスI/II ヒストンデアセチラーゼでも、又は、サーチュインなどのクラスIIIヒストンデアセチラーゼでも、あるいはKu70又はその一部分を脱アセチル化するために充分なこれらの生物学的活性部分でもよい。部分の例には、これらのたんぱく質のコアドメインが含まれる。
【０１９４】
スクリーニング法には、更に、Ku70の一つ以上のアミノ酸のアセチル化又は脱アセチル化のレベルを判定するステップを含めてもよい。検査化合物の非存在下に比較したときに検査化合物の存在下でのアセチル化又は脱アセチル化のレベルが低いことは、この検査化合物が、それぞれKu70たんぱく質の少なくとも一つのアミノ酸のアセチル化又は脱アセチル化を阻害する又は減らす化合物又は作用物質であることの指標である。検査化合物の非存在下に比較したときに検査化合物の存在下でのアセチル化又は脱アセチル化のレベルが高いことは、この検査化合物が、それぞれKu70たんぱく質の少なくとも一つのアミノ酸のアセチル化又は脱アセチル化を阻害又は減らす化合物又は作用物質であることの指標である。
【０１９５】
検査化合物の存在下及び非存在下におけるKu70たんぱく質の一つ以上のアミノ酸のアセチル化のレベルを測定するには、いくつかの方法を用いることができる。方法の例を実施例で取り上げる。加えて、リジンのアセチル化を、多様な業者（Cell Signalling社、Abcam社、Sigma社等）から入手可能な抗アセチル化リジン抗体を組み合わせたウェスタン・ブロット法、免疫沈降法又は免疫組織化学技術により検出できよう。HDAC 蛍光活性検定／薬物発見キット（AK-500、BIOMOL Research Laboratories社）
を用いても、アセチル化のレベルを判定できよう。
【０１９６】
更に他のスクリーニング法は、検査化合物の存在下及び非存在下におけるKu70たんぱく質の少なくとも一つのアミノ酸のアセチル化のレベルを測定するために、全細胞又は細胞抽出物を用いるステップを含む。スクリーニング法の一例は、Ku70たんぱく質又はその部分を含む細胞を、検査化合物と、Ku70たんぱく質のアセチル化を誘導するアポトーシス性刺激などの刺激とに、前記刺激が前記検査化合物の非存在下でもKu70たんぱく質の少なくとも一つのアミノ酸のアセチル化を誘導するような条件下で、接触させるステップを含むものである。アポトーシス性の刺激は、紫外線暴露でも、電離放射線でも、スタウロスポリンでも、ＤＮＡの損傷を引き起こすようデザインされた癌化学療法薬でも、低酸素でも、毒素でも、又はプロテアーゼ阻害剤でもよい。刺激を、検査化合物に細胞を接触させる前、接触中、又は接触後、あるいはこれらのいずれかの組み合わせで、細胞に印加してよい。検査化合物を細胞の少なくとも約１０分間、３０分間、１時間、３時間又はそれ以上、接触させてもよい。
【０１９７】
あるスクリーニング法には、検査化合物の存在下ではある、アセチル化を誘導する刺激の非存在下で、Ku70たんぱく質又はその部分を含む細胞をインキュベートするステップを更に含めてもよい。このようなスクリーニング検定では、Ku70のアセチル化を刺激する化合物が特定されるであろう。
【０１９８】
細胞は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞など、真核細胞でも、酵母細胞でも、非ヒト霊長類細胞でも、ウシ細胞でも、ヒツジ細胞でも、ウマ細胞でも、ブタ細胞でも、ヒツジ細胞でも、鳥類（例えばニワトリ又は家禽）細胞でも、イヌ細胞でも、ネコ細胞でも、又はげっ歯類（マウス又はラット）細胞でもよい。更にそれは魚類の細胞などの非哺乳動物細胞であってもよい。酵母細胞にはＳ．セレビジエ（原語：S. cerevesiae ）及びＣ．アルビカンス（原語：C. albicans）がある。細胞はまた、細菌細胞などの原核細胞であってもよい。更に細胞は、原虫などの単細胞微生物であってもよい。また細胞は、後生生物細胞、植物細胞又は昆虫細胞であってもよい。
【０１９９】
スクリーニング法には、更に、検査化合物の存在下でインキュベートされた細胞中のKu70たんぱく質の少なくとも一つのアミノ酸のアセチル化のレベルを判定するステップを含めてもよい。アセチル化のレベルは、例えば実施例で更に解説したように判定することができる。検査化合物の非存在下に比較したときに検査化合物の存在下でのアセチル化のレベルが低いことは、この検査化合物が、Ku70のアセチル化を阻害する又は減らす作用物質であることの指標である。検査化合物の非存在下に比較したときに検査化合物の存在下でのアセチル化のレベルが高いことは、この検査化合物が、Ku70のアセチル化を刺激する又は増す作用物質であることの指標である。
【０２００】
Ku70の脱アセチル化が、おそらくはKu70にBaxに結合させることにより、Bax媒介性アポトーシスを阻害するという事実に少なくとも部分的に基づくと、Ku70とBaxとの間の相互作用を刺激する又は促進する、あるいは、Ku70のアセチル化を阻害する又は脱アセチル化を促進する、作用物質の特定を可能にするスクリーニング法とは、アポトーシスを阻害する作用物質を特定するスクリーニング法ということになる。反対に、Ku70とBaxとの間の相互作用を阻害する、あるいは、Ku70のアセチル化を刺激する又は脱アセチル化を阻害する、作用物質の特定を可能にするスクリーニング法とは、アポトーシスを刺激する作用物質を特定するスクリーニング法ということになる。
【０２０１】
ここで解説されたスクリーニング検定のいずれにも、細胞のアポトーシスに対する検査化合物の効果を判定するステップを含めてもよい。作用物質の非存在下に比較したときの、作用物質の存在下におけるアポトーシスの増加又は減少は、この作用物質がアポトーシスを調節することの指標である。アポトーシスの存在及びレベルは、例えばラダリング、TUNEL 検定（ニューヨーク州パーチェス、Intergen Company社、Intergen ApopTag キット）及びCaspase 検定（ウィスコンシン州マジソン、Promega社）、DNA 断片化検定、ミトコンドリア透過性のMitoPT（登録商標） 検出 （B-Bridge International社）、ssDNA アポトーシスELISA （Chemicon社）、アネキシン-V アポトーシス検出、ヒトチトクロームC ELISA 又は、スクリーニングに応用可能な、当業で公知のいずれかのアポトーシス検定などのアポトーシス検定で判定することができる。
【０２０２】
Ku70のアセチル化はBax媒介性アポトーシスを刺激し、従って、腫瘍の成長又はサイズを阻害する又は減らすという事実に少なくとも基づくと、Ku70とBaxとの間の相互作用を阻害する、あるいは、Ku70のアセチル化を刺激する、又は、脱アセチル化を阻害する、作用物質の特定を可能にするスクリーニング法は、腫瘍の成長又はサイズを阻害する又は減らす作用物質を特定するスクリーニング法ということになる。
【０２０３】
ここで解説されたスクリーニング法のいずれにも、例えばヌード・マウスなどの動物モデルを用いるなどにより、腫瘍のサイズ又は成長に対する化合物の効果を判定するステップを更に含めてもよい。
【０２０４】
Ku70の脱アセチル化が、おそらくはKu70をBaxに結合させることにより、Bax媒介性アポトーシスを阻害するという事実に少なくとも基づくと、Ku70とBaxとの間の相互作用を刺激する又は促進する、あるいは、Ku70のアセチル化を阻害する又は脱アセチル化を促進する、作用物質の特定を可能にするスクリーニング法とは、寿命の伸長を刺激する作用物質を特定するスクリーニング法ということになる。反対に、Ku70とBaxとの間の相互作用を阻害する、あるいは、Ku70のアセチル化を刺激する又は脱アセチル化を阻害する、作用物質の特定を可能にするスクリーニング法とは、寿命を減らす作用物質を特定するスクリーニング法ということになる。
【０２０５】
ここで解説されたスクリーニング法のいずれにも、細胞の寿命に対する検査化合物の効果を判定するステップを更に含めてもよい。寿命は複製寿命でも、又は、更にここで解説することとする暦年齢でもよい。作用物質の非存在下に比較したときの、作用物質の存在下での寿命の増加又は減少は、この作用物質が細胞の寿命を調節することの指標である。このような方法で用いられる細胞は、真核細胞でも、又は原核細胞でもよい。真核細胞は酵母細胞でも、Ｃ．エレガンスなどの後生生物細胞でも、又は、ヒトもしくは非ヒト細胞などの哺乳動物細胞であってもよい。細胞の寿命を測定する方法は当業で公知であり、例えばAnderson et al. (2002) J.
Biol. Chem. 277:18881; Bitterman et al. (2002) J. Biol. Chem. 277:45099; Anderson et al. (2003) Nature 423:181 及び Howitz et al. (2003) Nature 425:191; Bitterman et al. (2003) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 67:376に解説されている。Ｃ．エレガンスでの寿命の測定は、例えばGarigan
et al. Genetics (2002)161:1101;
Tissenbaum and Guarente (2001) Nature
410:227 及び Apfeld and
Kenyon et al. (1999) Nature 402:804で解説された通りに行うことができる。ドゥロソフィラでの寿命の測定は、例えば Marden et al. (2003) PNAS
100:3369で解説された通りに行うことができる。
【０２０６】
スクリーニング検定には、作用物質の効果を、例えばここで解説された疾患などの疾患の動物モデルなど、疾患のモデルで判定するステップを更に含めてもよい。
【０２０７】
検査化合物は、例えば低有機又は無機分子、たんぱく質、核酸、抗体、脂質又は糖、あるいはこれらのいずれかの組み合わせなど、いずれの分子であってもよい。
【０２０８】
他の方法例
更にここでは、例えば細胞のアポトーシスを調節するためなどの方法；細胞の寿命を調節する方法；及び腫瘍のサイズ又は成長を減らす方法も提供される。方法には、例えばKu70たんぱく質とアセチルトランスフェラーゼ又は脱アセチル化酵素との間の相互作用を調節する、あるいは、Ku70たんぱく質のアセチル化のレベルを調節する、などにより、Ku70たんぱく質とBaxとの間の相互作用を調節するステップを含めてもよい。
【０２０９】
例えば、細胞のアポトーシスを刺激する、細胞の寿命を減らす、及び、腫瘍のサイズ及び成長を減らす、方法は、細胞内でのKu70とBaxとの間の結び付きを妨げるステップを含むであろう。結び付きは、アセチル化Ku70たんぱく質又はその部分を細胞内に導入するか、又は細胞内で発現させることにより、妨げられよう。特定の作用機序に制約されることを望む訳ではないが、このようなアセチル化Ku70たんぱく質又はその部分は、細胞内の脱アセチル化酵素を滴定するだろうと考えられる。
【０２１０】
結び付きは、細胞内のKu70の少なくとも一つのアミノ酸のアセチル化を誘導する、又は、脱アセチル化を阻害することによっても、妨げられる、又は、減らされるであろう。
【０２１１】
細胞内のKu70たんぱく質のアミノ酸のアセチル化は、例えば、細胞内のCBP、PCAF又はp300などのアセチルトランスフェラーゼのたんぱく質又は活性レベルを増すなどによっても、達成されよう。アセチルトランスフェラーゼのたんぱく質レベルの増加は、例えば細胞を、当該遺伝子のプロモータを活性化させる作用物質に接触させるなどにより、その遺伝子の発現を刺激することによって、達成されよう。このような作用物質は、当業で公知の方法に従って、スクリーニング法で特定することができる。代替的には、適した転写制御因子の下にある当該遺伝子の外因性のコピーを細胞内に導入してもよい。アセチルトランスフェラーゼのたんぱく質レベルは、アセチルトランスフェラーゼたんぱく質又はその生物学的活性部分を細胞内に導入することによっても、細胞内で増加させられよう。アセチルトランスフェラーゼの活性は、アセチルトランスフェラーゼを含有する細胞を、その活性を増す作用物質の存在下でインキュベートすることにより、増すことができる。このような作用物質は、当業で公知の方法に従って、スクリーニング法で特定することができる。
【０２１２】
Ku70たんぱく質のアミノ酸のアセチル化は、クラス I/II 又はクラスIII ヒストンデアセチラーゼなどの脱アセチル化酵素のレベル又は活性を減らすことでも、達成されよう。脱アセチル化酵素のたんぱく質レベルの減少は、例えば当該細胞を、siRNAなど、遺伝子の転写、翻訳や翻訳後修飾などを促進する又は干渉するそれらのプロモータ又は作用物質に接触させるなど、当該遺伝子の発現を阻害することで達成されよう。
このような作用物質は、当業で公知の方法に従って、スクリーニング法で特定することができる。脱アセチル化酵素の活性の減少は、Luo et al. (2001) Cell
107:137などに解説されたSIRT1の変異型H363Yなど、脱アセチル化酵素のドミナント・ネガティブ変異体を細胞内に導入するか、又は細胞内で発現させることにより、達成されよう。
【０２１３】
クラス I/II ヒストンデアセチラーゼの活性を阻害する化合物には、トリコスタチンA（TSA）などのトリコスタチンなどのヒドロキサム酸；スベロイルアニリドヒドロキサム酸 (SAHA) 及びその誘導体、m-カルボキシけい皮酸ビス-ヒドロキサミドオキサムフラチン (CBHA)、ABHA、Scriptaid、ピロキサミド、及びプロペンアミド；ブチレート及びフェニルブチレートなどの短鎖脂肪酸、；トラポキシン、HC-トキシン、クラミドシン、ジヘテロペプチン、WF-3161、Cyl-1 及びCyl-2などのエポキシケトン含有環状テトラペプチド；FR901228などの非エポキシケトン含有環状テトラペプチド；アピシジン、環状ヒドロキサム酸含有ペプチド (CHAPs)、ベンズアミド、MS-275 (MS-27-275)、CI-994、及び他のベンズアミド類似体；デプデシン；PXD101；バルプロエート及び有機硫黄化合物、がある。更なる阻害剤には、TSA、TPXA 及び B、オキサムフラチン、FR901228 (FK228)、トラポキシンB、CHAP1、アロイル-ピロリルヒドロキシ-アミド (APHAs)、アピシジン、及びデプデシン (Yoshida et al.
(2001) Cancer Chemother. Pharmacol. 48: S20, Johnstone et al. (2003) Cancer
Cell 4:13 and Mai et al.
(2005) Medicinal Res. Rev. 25:261) がある。
【０２１４】
サーチュインなど、クラスIII
ヒストンデアセチラーゼの活性を阻害する化合物には、ニコチンアミド（NAM）、スラニム；スフィンゴシン；NF023 （Gたんぱく質アンタゴニスト）；NF279
（プリン作動性受容体アンタゴニスト）；Trolox（6-ヒドロキシ-2,5,7,8,テトラメチルクロマン-2-カルボン酸）; (-)-エピガロカテキン （部位3,5,7,3’,4’, 5’に水酸基）；(-)-エピガロカテキンガレート（水酸基部位 5,7,3’,4’,5’ 及びガレーとエステルは3）；シアニジンクロリド (3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラビリウムクロリド)；デルフィニジンクロリド (3,5,7,3’,4’,5’-ヘキサヒドロキシフラビリウムクロリド)；ミリセチン（カンナビセチン；3,5,7,3’,4’,5’-ヘキサヒドロキシフラボン)；3,7,3’,4’,5’-ペンタヒドロキシブラボン；及びゴシペチン (3,5,7,8,3’,4’-ヘキサヒドロキシフラボン) がある（これらはすべて、Howitz et al. (2003) Nature 425:191に解説されている）。他の阻害剤は、WO 05/002672で解説された4-ヒドロキシ-trans-スチルベン；N-フェニル-(3,5-ジヒドロキシ)ベンズアミド；3,5-ジヒドロキシ-4’-ニトロ-trans-スチルベン； 4-メトキシ-trans-スチルベン；クロロテトラサイクリン、4-ブロモフェニル-3-クロロ-プロペノン及びメトトレキセートである。阻害剤はまたWO 05/026112にも解説されている。シルチノール及びスプリトミシンなどの他の阻害剤は Grozinger et al. (2001) J.
Biol. Chem. 276:38837, Dedalov et al. (2001) PNAS 98:15113 及び Hirao et al. (2003) J. Biol.
Chem 278:52773に解説されている。これらの化合物の類似対及び誘導体も用いることができる。
【０２１５】
更に他のサーチュイン阻害剤は、以下の式：
【０２１６】
【化１５】
2008503479.tif 000019
【０２１７】
のいずれか一つを有するものであり、但し式中、それぞれの箇所で個別に、
L は O、NR、又はSを表し；
R は H、アルキル、アリール、アラルキル、又はヘテロアリールを表し；
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、SO3、OR、NR2、アルキル、 アリール、又は カルボキシを表し；
a は１以上７以下の整数を表し；そして
b は１以上４以下の整数を表す；
【０２１８】
【化１６】
2008503479.tif 000020
【０２１９】
但し式中、それぞれの箇所で個別に、
L はO、NR、又は Sを表し；
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを表し；
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、SO3、OR、NR2、アルキル、アリール、又はカルボキシを表し；
a は１以上７以下の整数を表し；そして
b は１以上４以下の整数を表す；
【０２２０】
【化１７】
2008503479.tif 000021
【０２２１】
但し式中、それぞれの箇所で個別に
L はO、NR、又は Sを表し；
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを表し；
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、SO3、OR、NR2、アルキル、アリール、又はカルボキシを表し；
a は１以上７以下の整数を表し；そして
bは１以上４以下の整数を表す；
【０２２２】
【化１８】
2008503479.tif 000022
【０２２３】
但し式中、それぞれの箇所で個別に
R’ はH、ハロゲン、NO2、SR、OR、NR2、アルキル、アリール、アラルキル、又はカルボキシを表し；
R はH、アルキル、アリール、アラルキル、又はヘテロアラルキルを表し；そして
R” はアルキル、アルケニル、又はアルキニルを表す；
【０２２４】
【化１９】
2008503479.tif 000023
【０２２５】
但し式中、それぞれの箇所で個別に、
R2、R3、及び R4 はH、OH、又は O-アルキルであり；
R’3 はH 又は NO2であり；そして 
A-B は一個のエテニレン又はアミド基である。
【０２２６】
更なる実施態様では、当該の阻害性化合物は、式１９及び付属の定義（但し式中、R3 は OHであり、A-B はエテニレンであり、そしてR’3 は Hである）で表される。
【０２２７】
更なる実施態様では、前記阻害性化合物は、式１９及び付属の定義（但し式中、R2  及びR4 はOHであり、A-B は一個のアミド基であり、そしてR’3 は Hである）で表される。
【０２２８】
更なる実施態様では、前記阻害性化合物は、式１９及び付属の定義（但し式中、R2 及び R4 は OMeであり、A-B は エテニレンであり、そしてR’3 はNO2である）で表される。
【０２２９】
更なる実施態様では、前記阻害性化合物は、式１９及び付属の定義（但し式中、R3 は OMeであり、A-B はエテニレンであり、そしてR’3 はHである）で表される。
【０２３０】
別の実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は式２０：
【０２３１】
【化２０】
2008503479.tif 000024
【０２３２】
の化合物であり、但し式中、それぞれの箇所で個別に：
R、R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、及びR8 は H、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハライド、アルコキシ、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルである。
【０２３３】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、 R は OHである）の化合物である。
【０２３４】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R1 は OHである）の化合物である。
【０２３５】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R2 は OHである）の化合物である。
【０２３６】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R3 は C(O)NH2である）の化合物である。
【０２３７】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R4 はOHである）の化合物である。
【０２３８】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R5 は NMe2である）の化合物である。
【０２３９】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R6 はメチルである）の化合物である。
【０２４０】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R7 はOHである）の化合物である。
【０２４１】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R8 はClである）の化合物である。
【０２４２】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R はOH であり、そしてR1 は OHである）の化合物である。
【０２４３】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R はOHであり、R1 は OHであり、そしてR2 は OHである）の化合物である。
【０２４４】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R は OHであり、R1 はOHであり、R2 は OHであり、そしてR3 はC(O)NH2である）の化合物である。
【０２４５】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R は OHであり、R1 はOHであり、R2 はOHであり、R3 はC(O)NH2であり、そしてR4 は OHである）の化合物である。
【０２４６】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R はOHであり、R1 は OHであり、R2 は OHであり、R3 は C(O)NH2であり、R4 は OHであり、そしてR5 はNMe2である。
【０２４７】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R は OHであり、R1 は OHであり、R2 は OHであり、R3 は C(O)NH2であり、R4 は OHであり、R5 は NMe2であり、そしてR6 はメチルである）の化合物である。
【０２４８】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R はOHであり、R1 はOHであり、R2 は OHであり、R3 はC(O)NH2であり、R4 はOHであり、R5 は NMe2であり、R6 はメチルであり、そしてR7 は OHである）の化合物である。
【０２４９】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２０及び付属の定義（但し式中、R はOHであり、R1 はOHであり、R2 は OHであり、R3 は C(O)NH2であり、R4 はOHであり、R5 は NMe2であり、R6 はメチルであり、R7 は OHであり、そしてR8 はClである）の化合物である。
【０２５０】
別の実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２１：
【０２５１】
【化２１】
2008503479.tif 000025
【０２５２】
の化合物であり、但し式中、それぞれの箇所で個別に：
R、R1、R2、及びR3 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハライド、アルコキシ、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は一個の置換もしくは非置換
アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルである。
【０２５３】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２１及び付属の定義（但し式中、R はClである）の化合物である。
【０２５４】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２１及び付属の定義（但し式中、R1 は Hである）の化合物である。
【０２５５】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２１及び付属の定義（但し式中、R2 はHである）の化合物である。
【０２５６】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２１及び付属の定義（但し式中、R3 は Brである）の化合物である。
【０２５７】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２１及び付属の定義（但し式中、R は Cl であり、そしてR1 は Hである）の化合物である。
【０２５８】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２１及び付属の定義（但し式中、R は Clであり、R1 は Hであり、そしてR2 は Hである）の化合物である。
【０２５９】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２１及び付属の定義（但し式中、R は Clであり、R1 は Hであり、R2 は Hであり、そしてR3 は Brである）の化合物である。
【０２６０】
別の実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２：
【０２６１】
【化２２】
2008503479.tif 000026
【０２６２】
の化合物であり、但し式中、それぞれの箇所で個別に：
R、R1、R2、R6、及びR7 は H 又は 一個の置換もしくは非置換アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり；
R3、R4、及びR5 はH、ヒドロキシ、アミノ、シアノ、ハライド、アルコキシ、エーテル、エステル、アミド、ケトン、カルボン酸、ニトロ、又は
一個の置換もしくは非置換 アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロシクリル、ヘテロシクリルアルキル、ヘテロアリール、又はヘテロアラルキルであり；
L はO、NR、又はSであり；
m は０以上４以下の整数であり；そして
n 及び o は０以上６以下の整数である。
【０２６３】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R は Hである）の化合物である。
【０２６４】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R1 は Hである）の化合物である。
【０２６５】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R2 はメチルである）の化合物である。
【０２６６】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、m は 0である）の化合物である。
【０２６７】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R4 はOHである）の化合物である。
【０２６８】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R5 はOHである）の化合物である。
【０２６９】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R6 は Hである）の化合物である。
【０２７０】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R7 は Hである）の化合物である。
【０２７１】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、L はNHである）の化合物である。
【０２７２】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、n は 1である）の化合物である。
【０２７３】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、o は 1である）の化合物である。
【０２７４】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R は Hであり、そしてR1 は Hである）の化合物である。
【０２７５】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R は Hであり、R1 は Hであり、そしてR2 はメチルである）の化合物である。
【０２７６】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R は Hであり、R1 は Hであり、R2 はメチルであり、そしてm は 0である）の化合物である。
【０２７７】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R はHであり、R1
は Hであり、R2 はメチルであり、m は 0であり、そしてR4 はOHである）の化合物である。
【０２７８】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R はHであり、R1
はHであり、R2 はメチルであり、m は0であり、R4 はOHであり、そして R5 はOHである）の化合物である。
【０２７９】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R は Hであり、R1 はHであり、R2
はメチルであり、m は 0であり、R4 は OHであり、R5 は OHであり、そしてR6 はHである）の化合物である。
【０２８０】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R はHであり、R1
は Hであり、R2 はメチルであり、m は 0であり、R4 は OHであり、R5 はOHであり、R6 は Hであり、そしてR7 はHである）の化合物である。
【０２８１】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R は Hであり、R1 はHであり、R2
はメチルであり、m は0であり、R4 はOHであり、R5 は OHであり、R6 はHであり、R7
は Hであり、そして L はNHである）の化合物である。
【０２８２】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R は Hであり、R1 は Hであり、R2 はメチルであり、m は 0であり、R4 は OHであり、R5 は OHであり、R6 は Hであり、R7 は Hであり、L は NHであり、そしてn は 1である）の化合物である。
【０２８３】
更なる実施態様では、サーチュイン阻害性化合物は、式２２及び付属の定義（但し式中、R は Hであり、R1 はHであり、R2
はメチルであり、m は 0であり、R4 はOHであり、R5 はOHであり、R6 はHであり、R7
は Hであり、L は NHであり、n は 1であり、そして o は1である）の化合物である。
【０２８４】
他のサーチュイン阻害剤には、例えば式２３：
【０２８５】
【化２３】
2008503479.tif 000027
【０２８６】
の化合物などのニコチンアミド及びその類似体又は誘導体があり、但し式中、
L はO、NR、又は Sであり；
R はアルキル、又はフェニルであり；
R1 は-NH2、-O-アルキル、-N(R)2、又は-NH(R)であり；そして
Het はヘテロアリール又はヘテロシクロアルキルである。
【０２８７】
用いてもよい具体的な類似体には、式２３及び付属の定義（但し式中、L はOである）の化合物；式２３及び付属の定義（但し式中、R1 は-NH2 である）の化合物；式２３及び付属の定義（但し式中、Het は、sisting of ピリジン、フラン、オキサゾール、イミダゾール、チアゾール、イソキサゾール、ピラゾール、イソチアゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、ピロール、テトラヒドロフラン、1:4 ジオキサン、1,3,5-トリオキサン、ピロリジン、ピペリジン、及びピペラジンから成る群より選択される）の化合物；式２３及び付属の定義（但し式中、Het はピリジンである）の化合物；式２３及び付属の定義（但し式中、LはOであり、そしてR1 は-NH2である）の化合物；式２３及び付属の定義（但し式中、L は Oであり、そしてHet はピリジンである）の化合物；式２３及び付属の定義（但し式中、R1は -NH2 であり、そしてHet はピリジンである）の化合物；式Ｉ及び付属の定義（但し式中、L はOであり、R1
は-NH2であり、そしてHet はピリジンである）の化合物、がある。
【０２８８】
用いることのできるニコチンアミドの他の類似体及び誘導体の例には、式２０：
【０２８９】
【化２４】
2008503479.tif 000028
【０２９０】
の化合物があり、但し式中、
L は O、NR、又はSであり；
R はアルキル、又はフェニルであり；
R1 は -NH2、-O-アルキル、-N(R)2、又は-NH(R)であり；
X はH、アルキル、-O-アルキル、OH、ハライド、又はNH2 であり；そして
n は１以上４以下の整数である。
【０２９１】
用いてもよい具体的な類似体には、式２４及び付属の定義（但し式中、L is Oである）の化合物；式２４及び付属の定義（但し式中、R1 は -NH2である）の化合物；式２４及び付属の定義（但し式中、X は H であり、そしてn は 4である）の化合物；式２４及び付属の定義（但し式中、L はOであり、そしてR1
は-NH2である）の化合物；式２４及び付属の定義（但し式中、L は Oであり、X は Hであり、そしてn は 4である）の化合物；式２４及び付属の定義（但し式中、R1 は -NH2であり、X は Hであり、そしてn は 4である）の化合物；式２４及び付属の定義（但し式中、L は Oであり、R1 は -NH2であり、X は Hであり、そしてn は 4である）の化合物、がある。
【０２９２】
更に、式１５−２４の化合物の薬学的に許容可能な添加塩及び複合体も含まれる。当該化合物が一つ以上のキラル中心を有し得る場合、明示しない限り、ここで考察される化合物は、単一の立体異性体である場合も、又は立体異性体のラセミ混合物である場合もある。
【０２９３】
当該化合物が不飽和の炭素対炭素二重結合を有する場合、ここではcis (Z) 及び trans (E)異性体の両者が考えられる。当該化合物が、
【０２９４】
【化２５】
2008503479.tif 000029
そして
2008503479.tif 000030
【０２９５】
などのケト−エノール互変異性体型で存在するかも知れない場合、各互変異性体方は、平衡状態にあるか、あるいはR'との適した置換により一方の型で固定されているかに関係なく、ここで紹介された方法に包含されるものと、考えられる。いずれか一箇所でのいずれかの置換基の意味は、その意味から、又は、いずれか他の箇所でのいずれか他の置換基の意味から、独立である。
【０２９６】
ここで紹介される方法には、式１５−２４の化合物のプロドラッグも含まれる。プロドラッグは、in vivoで活性な親薬物を放出する、共有結合した担体であると考えられている。
【０２９７】
方法には、細胞を、クラスI/II
ヒストンデアセチラーゼ及びクラス III ヒストンデアセチラーゼ阻害剤の組み合わせに接触させるステップを含めてもよい。
【０２９８】
細胞のアポトーシスを阻害したり、細胞の寿命を伸張したりする方法は、細胞内のKu70とBaxとの結び付きを刺激するステップを含むであろう。この結び付きは、SEQ ID NO: 2のK317、K331、K338、K539、K542、K544、K553 及び K556から成る群より選択される少なくとも一つのリジンを含む非アセチル化Ku70たんぱく質又はその部分を細胞内に導入するか、
又は細胞内で発現させることにより、細胞内で刺激又は維持できよう。特定の作用機序に制約されることを望む訳ではないが、これがアセチルトランスフェラーゼを滴定し、従って内因性Ku70たんぱく質のアセチル化を妨げるであろうと考えられる。
【０２９９】
前記の結び付きは、細胞内のKu70の少なくとも一つのアミノ酸のアセチル化を阻害するか、又は脱アセチル化を刺激することによっても、刺激又は亢進できよう。
【０３００】
Ku70たんぱく質の少なくとも一つのアミノ酸のアセチル化の阻害は、例えば細胞内にCBP、PCAF又はp300などのアセチルトランスフェラーゼのたんぱく質又は活性レベルを下げるなどでも、達成できよう。アセチルトランスフェラーゼのたんぱく質レベルの減少は、例えば、それらのプロモータを阻害する作用物質か、あるいは、siRNAなど、当該遺伝子の転写、翻訳又は翻訳後修飾に干渉する作用物質に細胞を接触させるなど、アセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発現を阻害することにより、達成できよう。このような作用物質は、当業で公知の方法に従って、スクリーニング法で特定することができる。アセチルトランスフェラーゼの活性の減少は、アセチルトランスフェラーゼのドミナント・ネガティブ変異体を細胞内に導入するか、又は細胞内で発現させることにより、達成できよう。Ku70たんぱく質の少なくとも一つのアミノ酸の脱アセチル化は、クラス I/II又はクラス IIIヒストンデアセチラーゼなどの脱アセチル化酵素のレベル又は活性を増すことによっても達成できよう。脱アセチル化酵素のたんぱく質レベルの増加は、例えば細胞を、脱アセチル化酵素をコードする遺伝子のプロモータを活性化する作用物質に接触させるなどにより、該遺伝子の発現を刺激することによって、達成できよう。このような作用物質は、当業で公知の方法に従って、スクリーニング法で特定することができる。代替的には、適した転写制御因子下にある当該遺伝子の外因性コピーを細胞内に導入してもよい。アセチルトランスフェラーゼのたんぱく質レベルは、細胞内に脱アセチル化たんぱく質又はその生物学的活性部分を導入することによっても、細胞内で増加させられよう。脱アセチル化酵素の活性は、脱アセチル化酵素を含有する細胞を、その活性を増す作用物質の存在下でインキュベートすることによって、増加させることができる。このような作用物質は、当業で公知の方法に従って、スクリーニング法で特定することができる。
【０３０１】
サーチュインを活性化する化合物の例は、Howitz et al. (2003) Nature
425:191に解説されており、その中には：。サーチュインを活性化する化合物の例は Howitz et al. (2003) Nature
425:191に解説されている。これらには、レスベラトロール (3,5,4’-トリヒドロキシ-trans-スチルベン)、ブテイン (3,4,2’,4’-テトラヒドロキシカルコン)、ピセアタンノール (3,5,3’,4’-テトラヒドロキシ-trans-スチルベン)、イソリキリチゲニン (4,2’,4’-トリヒドロキシカルコン)、フィセチン
(3,7,3’,4’-テトラヒドロキシフラボン)、ケルセチン (3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラボン)、デオキシラポンチン (3,5-ジヒドロキシ4’-メトキシスチルベン 3-O-β-D-グルコシド)； trans-スチルベン; ラポンチン (3,3’,5-トリヒドロキシ4’-メトキシスチルベン 3-O-β-D-グルコシド)；cis-スチルベン; ブテイン (3,4,2’,4’-テトラヒドロキシカルコン); 3,4,2’4’6’-ペンタヒドロキシカルコン; カルコン; 7,8,3’,4’-テトラヒドロキシフラボン; 3,6,2’,3’-テトラヒドロキシフラボン; 4’-ヒドロキシフラボン; 5,4’-ジヒドロキシフラボン; 5,7-ジヒドロキシフラボン; モリン (3,5,7,2’,4’- ペンタヒドロキシフラボン); フラボン; 5-ヒドロキシフラボン; (-)-エピカテキン (水酸基部位: 3,5,7,3’,4’); (-)-カテキン (水酸基部位: 3,5,7,3’,4’); (-)-ガロカテキン (水酸基部位: 3,5,7,3’,4’,5’) (+)-カテキン (水酸基部位: 3,5,7,3’,4’); 5,7,3’,4’,5’-ペンタヒドロキシフラボン; ルテオリン (5,7,3’,4’-テトラヒドロキシフラボン); 3,6,3’,4’-テトラヒドロキシフラボン; 7,3’,4’,5’-テトラヒドロキシフラボン; カンフェロール (3,5,7,4’-テトラヒドロキシフラボン); 6-ヒドロキシアピゲニン (5,6,7,4’-テトラヒドロキシフラボン); スクテラレイン); アピゲニン (5,7,4’-トリヒドロキシフラボン); 3,6,2’,4’-テトラヒドロキシフラボン; 7,4’-ジヒドロキシフラボン; ダイゼイン (7,4’-ジヒドロキシイソフラボン); ゲニステイン (5,7,4’-トリヒドロキシフラバノン); ナリンゲニン (5,7,4’-トリヒドロキシフラバノン); 3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラバノン; フラバノン; ペラルゴニジンクロリド (3,5,7,4’-テトラヒドロキシフラビリウムクロリド); ヒノキチオール (b-スジャプリシン; 2-ヒドロキシ-4-イソプロピル-2,4,6-シクロヘプタトリエン-1-オン); L-(+)-エルゴチオネイン ((S)-a-カルボキシ-2,3-ジヒドロ-N,N,N-トリメチル-2-チオキソ-1H-イミダゾール-4-エタナミニウム分子内塩); コーヒー酸フェニルエステル；MCI-186 (3-メチル-1-フェニル-2-ピラゾリン-5-オン); HBED (N,N’-Di-(2-ヒドロキシベンジル) エチレンジアミン-N,N’-二酢酸・H2O); アンブロキソール (trans-4-(2-アミノ-3,5-ジブロモベンジルアミノ) シクロヘキサン・HCl; 及び U-83836E ((-)-2-((4-(2,6-ジ-1-ピロリジニル-4-ピリミジニル)-1-ピペラザイニル（原語：piperzainyl）)メチル)-3,4-ジヒドロ-2,5,7,8-テトラメチル-2H-1-ベンゾピラン-6-オール・2HCl)、がある。これらの類似体及び誘導体も用いることができる。
【０３０２】
他のサーチュイン活性化性化合物は、以下の式２６−３５のいずれかを有するであろう。ある実施態様では、サーチュイン活性化性化合物は式２６：
【０３０３】
【化２６】
2008503479.tif 000031
【０３０４】
のスチルベン又はカルコン化合物であり、但し式中、それぞれの箇所で個別に、
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルクアリール、ヘテロアラルキル、ハライド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し；
R はH、アルキル、又はアリールを表し；
M は O、NR、又は Sを表し；
A-B は一個の二価のアルキル、アルケニル、アルキニル、アミド、スルホンアミド、ジアゾ、エーテル、アルキル、アミノ、アルキル、スルフィド、又はヒドラジン基を表し；そして
n は 0 又は 1であり；
但し条件としてもしnが 0であり；
もし R2
及び R4
が ORであり、そしてR1、R3、R5、R’1、R’2、R’4、及び R’5 が Hであり、そしてA-B がアルケニルである場合、R’3 が Cl、F、-CH3、-CH2CH3、-SMe、NO2、i-プロピル、-OMe、又は カルボキシルではなく；
もしA-B がアルキル、又はアミドである場合、R2 及びR4 は両者がOHであることはなく；
もしR3
が ORである場合、R’1、R’2、R’3、R’4、又はR’5 のうちの少なくとも一つは Hではなく；そして
R4 はカルボキシルではない。
【０３０５】
更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、n は0である）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は式２６及び付属の定義（但し式中、n は 1である）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、A-B はエテニルである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、A-B は-CH2CH(Me)CH(Me)CH2-である）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、M は Oである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、R2、R4、及び R’3 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、R2、R4、R’2 及びR’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、R3、R5、R’2 及び R’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、R1、R3、R5、R’2 及びR’3 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、R2 及びR’2 はOHであり；R4 は O-β-D-グルコシドであり；そしてR’3 は OCH3 である）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、R2 は OHであり；R4 はO-β-D-グルコシドであり；そして R’3 は OCH3である）で示される通りの化合物である。
【０３０６】
更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、n は 0であり；A-B はエテニルであり；そしてR1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は Hである） (trans スチルベン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、n は 1であり；A-B はエテニルであり；M は Oであり；そしてR1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は Hである） (カルコン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、n は 0であり；A-B はエテニルであり；R2、R4、及びR’3 は OHであり；そしてR1、R3、R5、R’1、R’2、R’4、及びR’5 はH である）（レスベラトロール）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、n は 0であり；A-B はエテニルであり；R2、R4、R’2 及び R’3 は OHであり；そして R1、R3、R5、R’1、R’4 及び R’5 は H である）(ピセアタンノール) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、n は 1であり；A-B はエテニルであり；M は Oであり；R3、R5、R’2 及び R’3 はOHであり；そして R1、R2、R4、R’1、R’4、及び R’5 はHである） (ブテイン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、n は 1であり；A-B はエテニルであり；M は Oであり；R1、R3、R5、R’2 及び R’3 は OHであり；そしてR2、R4、R’1、R’4、及び R’5 は Hである (3,4,2’,4’,6’-ペンタヒドロキシカルコン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、n は0であり；A-B はエテニルであり； R2 及び R’2 は OHであり、R4 は O-β-D-グルコシドであり、R’3 は OCH3であり；そしてR1、R3、R5、R’1、R’4、及び R’5 は Hである (ラポンチン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、 n は 0であり；A-B はエテニルであり；R2 は OHであり、R4 は O-β-D-グルコシドであり、R’3 はOCH3であり；そしてR1、R3、R5、R’1、R’2、R’4、及び R’5 は Hである (デオキシラポンチン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２６及び付属の定義（但し式中、n は 0であり；A-B は-CH2CH(Me)CH(Me)CH2-であり；R2、R3、R’2、及び R’3 は OHであり；そして R1、R4、R5、R’1、R’4、及びR’5 は H (NDGA) で示される通りの化合物である。
【０３０７】
別の実施態様では、サーチュイン活性化性化合物は、式２７：
【０３０８】
【化２７】
2008503479.tif 000032
【０３０９】
のフラバノン化合物であり、但し式中、それぞれの箇所で個別に、
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、及びR” は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し；
R は H、アルキル、又はアリールを表し；
M は H2、O、NR、又は Sを表し；
Z は CR、O、NR、又は Sを表し；そして
X は CR 又は Nを表し；そして
Y はCR 又は Nを表す。
【０３１０】
更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、X 及びY は両者ともCHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、M はOである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、M は H2 である）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、Z はOである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、R” は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、R” は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、R” は一個のエステルである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、R1 は
【０３１１】
【化２８】
2008503479.tif 000033
【０３１２】
である）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、R1、R2、R3、R4、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5 及びR” は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、R2、R4、及び R’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、R4、R’2、R’3、及びR” は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、R2、R4、R’2、R’3、及び R” は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、R2、R4、R’2、R’3、R’4、及びR” はOHである）で示される通りの化合物である。
【０３１３】
更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、X 及び Y は CHであり；M はOであり；Z 及び O；R” は Hであり；そしてR1、R2、R3、R4、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5 及び R” は Hである） (フラバノン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、X 及び Y はCHであり；M は Oであり；Z 及び O；R” は Hであり；R2、R4、及び R’3 は OHであり；そしてR1、R3、R’1、R’2、R’4、及び R’5 は Hである ）(ナリンゲニン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、X 及び Y はCHであり； M は Oであり； Z 及び O；R” は OHであり；R2、R4、R’2、及び R’3 は OHであり；そして R1、R3、R’1、R’4、及び R’5 は Hである） (3,5,7,3’,4’-ペンタヒドロキシフラバノン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、X 及び Y はCHであり；M は H2であり；Z 及び O；R” は OHであり；R2、R4、R’2、及び R’3、は OHであり；そしてR1、R3、R’1、R’4 及び R’5 は Hである） (エピカテキン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、X 及び Y は CHであり；M は H2 であり；Z 及び O；R” はOHであり；R2、R4、R’2、R’3、及びR’4 はOHであり；そしてR1、R3、R’1、及び R’5 はH である）(ガロカテキン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式２７及び付属の定義（但し式中、X 及び Y は CHであり；M はH2であり；Z 及びO； R” は
【０３１４】
【化２９】
2008503479.tif 000034
【０３１５】
であり；R2、R4、R’2、R’3、R’4、及び R” は OHであり；そしてR1、R3、R’1、及びR’5 は Hである） (エピガロカテキンガレート)で示される通りの化合物である。
【０３１６】
別の実施態様では、サーチュイン活性化性化合物は、式３：
【０３１７】
【化３０】
2008503479.tif 000035
【０３１８】
のフラバノン化合物であり、但し式中、それぞれの箇所で個別に、
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、R’5、及び R”1 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し；
R は H、アルキル、又はアリールを表し；
M は H2、O、NR、又はSを表し；
Z は CR、O、NR、又は Sを表し；そして
X は CR 又は Nを表し；そして
Y は CR 又は Nを表す。
【０３１９】
別の実施態様では、サーチュイン活性化性化合物は、式３１：
【０３２０】
【化３１】
2008503479.tif 000036
【０３２１】
のフラバノン化合物であり、但し式中、それぞれの箇所で個別に、
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及びR’5、は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し；
R” は存在しないか、あるいは、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハリド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し；
R はH、アルキル、又はアリールを表し；
M は H2、O、NR、又は Sを表し；
Z は CR、O、NR、又は Sを表し；そして
X は、R” が存在しない場合にCR 又は Nを表し、あるいは、R” が存在する場合にCを表す。
【０３２２】
更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は Cである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X はCRである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、Z は Oである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、M は Oである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R” は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R” は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、and R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R’2、及びR’3 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R4、R’2、R’3、及び R’4 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R4、R’2、及びR’3 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R3、R’2、及び R’3 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R4、R’2、及び R’3 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R’2、R’3、及びR’4 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R4、及びR’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R3、R4、及びR’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R4、及びR’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R3、R’1、及びR’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2 及びR’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R1、R2、R’2、及びR’3 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R3、R’1、及びR’2 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R’3 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R4 及びR’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2 及び R4 はOHである）で示される通りの化��物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R4、R’1、及びR’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R4 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R4、R’2、R’3、及びR’4 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R2、R’2、R’3、及び R’4 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、R1、R2、R4、R’2、及び R’3 は OHである）で示される通りの化合物である。
【０３２３】
更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X はCHであり；R” は存在せず；Z は Oであり；M はOであり；そしてR1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及びR’5 は H である）(フラボン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は Cであり；R” は OHであり；Z は Oであり；M は Oであり；R2、R’2、及び R’3 は OHであり；そして R1、R3、R4、R’1、R’4、及び R’5 は H である）(フィセチン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は CHであり；R” は存在せず；Z は Oであり；M は Oであり；R2、R4、R’2、R’3、及び R’4 は OHであり；そしてR1、R3、R’1、及びR’5 は H である）(5,7,3’,4’,5’-ペンタヒドロキシフラボン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は CHであり；R” は存在せず；Z は Oであり；M は Oであり；R2、R4、R’2、及び R’3 はOHであり；そしてR1、R3、R’1、R’4、及び R’5 は Hである (ルテオリン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X はCであり、R” は OHであり；Z は Oであり；M は Oであり； R3、R’2、及び R’3 は OHであり；そしてR1、R2、R4、R’1 R’4、及びR’5 は H である）(3,6,3’,4’-テトラヒドロキシフラボン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は Cであり、R” は OHであり；Z は Oであり；M はOであり； R2、R4、R’2、及び R’3 は OHであり；そしてR1、R3、R’1、R’4、及び R’5 は Hである） (ケルセチン) で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は CHであり；R” は存在せず；Z は Oであり；M はOであり；R2、R’2、R’3、及び R’4 は OHであり；そしてR1、R3、R4、R’1、及び R’5 はHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、 X は Cであり；R” は OHであり；Z は Oであり；M は Oであり；R2、R4、及び R’3 は OHであり；そしてR1、R3、R’1、R’2、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は CHであり；R” は存在せず；Z は Oであり；M は Oであり；R2、R3、R4、及び R’3 はOHであり；そしてR1、R’1、R’2、R’4、及びR’5 はHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は CHであり；R” は存在せず； Z は Oであり；M は Oであり；R2、R4、及び R’3 は OHであり；そしてR1、R3、R’1、R’2、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は Cであり、R”は OHであり；Z は Oであり；M は Oであり；R3、R’1、及び R’3 は OHであり；そしてR1、R2、R4、R’2、R’4、及び R’5 はHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は CHであり；R” は存在せず；Z はOであり；M は Oであり；R2 及び R’3 は OHであり；そしてR1、R3、R4、R’1、R’2、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は Cであり、R” は OHであり；Zは Oであり；M は Oであり；R1、R2、R’2、及び R’3 は OHであり；そして R1、R2、R4、R’3、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は Cであり；R” は OHであり；Z は Oであり； M は Oであり；R3、R’1、及び R’2 は OHであり；そして R1、R2、R4; R’3、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は CHであり；R” は存在せず；Z は Oであり；M は Oであり； R’3 は OHであり；そして R1、R2、R3、R4、R’1、R’2、R’4、及び R’5 はHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X はCHであり；R” は存在せず；Z は Oであり；M は Oであり；R4
及び R’3
はOHであり；そして R1、R2、R3、R’1、R’2、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は CHであり；R” は存在せず；Z は Oであり；M は Oであり；R2 及び R4 は OHであり；そして R1、R3、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は Cであり；R” は OHであり；Z は Oであり；M は Oであり；R2、R4、R’1、及び R’3 は OHであり；そして R1、R3、R’2、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は CHであり；R” は存在せず； Z は Oであり；M は Oであり；R4 は OHであり；そして R1、R2、R3、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X はCでり；R” は OHであり；Z はOであり；M は Oであり；R2、R4、R’2、R’3、及び R’4 は OHであり；そして R1、R3、R’1、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は Cであり；R” は OHであり；Z は Oであり；M は Oであり；R2、R’2、R’3、及び R’4 は OHであり；そして R1、R3、R4、R’1、及び R’5 はHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３１及び付属の定義（但し式中、X は Cであり；R” は OHであり；Z は Oであり；M は Oであり；R1、R2、R4、R’2、及び R’3 は OHであり；そして R3、R’1、R’4、及びR’5 は Hである）で示される通りの化合物である。
【０３２４】
別の実施態様では、サーチュイン活性化性化合物は、式５：
【０３２５】
【化３２】
2008503479.tif 000037
【０３２６】
のイソフラボン化合物であり、但し式中、それぞれの箇所で個別に、
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5、は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハライド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し；
R” は存在しないか、又は、H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルカリール、ヘテロアラルキル、ハライド、NO2、SR、OR、N(R)2、又はカルボキシルを表し；
R は H、アルキル、又は アリールを表し；
M は H2、O、NR、又は Sを表し；
Z は CR、O、NR、又は Sを表し；そして
Y は、R''が存在しない場合は CR 又は N、あるいはR''が存在する場合はCを表す。
【０３２７】
更なる実施態様では、本化合物は、式３２及び付属の定義（但し式中、Y は CRである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３２及び付属の定義（但し式中、Y は CHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３２及び付属の定義（但し式中、Z は Oである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３２及び付属の定義（但し式中、M は Oである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３２及び付属の定義（但し式中、R2 及び R’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３２及び付属の定義（但し式中、R2、R4、及び R’3 はOHである）で示される通りの化合物である。
【０３２８】
更なる実施態様では、本化合物は、式３２及び付属の定義（但し式中、Y は CHであり；R” は存在せず；Z は Oであり；M は Oであり；R2 及び R’3 はOHであり；そしてR1、R3、R4、R’1、R’2、R’4、及び R’5 はHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３２及び付属の定義（但し式中、Y は CHであり；R” は存在せず；Z は Oであり；M は Oであり；R2、R4、及び R’3 はOHであり；そしてR1、R3、R’1、R’2、R’4、及び R’5 はHである）で示される通りの化合物である。
【０３２９】
別の実施態様では、サーチュイン活性化性化合物は、式３３：
【０３３０】
【化３３】
2008503479.tif 000038
【０３３１】
のアントシアニジン化合物であり、但し式中、それぞれの箇所で個別に、
R3、R4、R5、R6、R7、R8、R’2、R’3、R’4、R’5、及び R’6 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルクアリール、ヘテロアラルキル、ハライド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し；
R は H、アルキル、又は アリールを表し；そして
A- は以下： Cl-、Br-、又は I-から選択される一個の陰イオンを表す。
【０３３２】
更なる実施態様では、本化合物は、式３３及び付属の定義（但し式中、A- は Cl-である）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３３及び付属の定義（但し式中、R3、R5、R7、及び R’4 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３３及び付属の定義（但し式中、R3、R5、R7、R’3、及び R’4 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３３及び付属の定義（但し式中、R3、R5、R7、R’3、R’4、及び R’5 は OHである）で示される通りの化合物である。
【０３３３】
更なる実施態様では、本化合物は、式３３及び付属の定義（但し式中、A- は Cl-であり；R3、R5、R7、及びR’4 はOHであり；そしてR4、R6、R8、R’2、R’3、R’5、及び R’6 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３３及び付属の定義（但し式中、A- は Cl- であり；R3、R5、R7、R’3、及び R’4 は OHであり；そしてR4、R6、R8、R’2、R’5、及び R’6 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３３及び付属の定義（但し式中、 A- は Cl- であり；R3、R5、R7、R’3、R’4、及び R’5 はOHであり；そしてR4、R6、R8、R’2、及び R’6 は Hである）で示される通りの化合物である。
【０３３４】
サーチュインたんぱく質ファミリー・メンバーを活性化する方法は、更に、式７：
【０３３５】
【化３４】
2008503479.tif 000039
【０３３６】
で表されるスチルベン、カルコン、又はフラボン化合物に細胞を接触させるステップを含むと思われ、但し式中、それぞれの箇所で個別に、
M は存在しないか、又はOであり；
R1、R2、R3、R4、R5、R’1、R’2、R’3、R’4、及び R’5 は H、アルキル、アリール、ヘテロアリール、アルクアリール、ヘテロアラルキル、ハライド、NO2、SR、OR、N(R)2、又は カルボキシルを表し；
Ra は H を表すか、あるいは、二つのRa が一個の結合を形成し；
R は H、アルキル、又は アリールを表し；そして
n は 0 又は 1であり；
但し条件としてn が0であり；
R2 及びR4 がORであり、そしてR1、R3、R5、R’1、R’2、R’4、及びR’5 が Hである場合、R’3 はCl、F、-CH3、-CH2CH3、-SMe、NO2、i-プロピル、-OMe、又は カルボキシルではなく；
R3 が ORである場合、R’1、R’2、R’3、R’4、又は R’5 のうちの少なくとも一つは Hではなく；そして
R4 はカルボキシルではない。
【０３３７】
更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、n は 0である）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、 n は 1である）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、M は存在しない）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、M は Oである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、Ra は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、M はOであり、二つのRa
が一個の結合を形成する）で示される通りの化合物である。
【０３３８】
更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、R5 はHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、R5 は OHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、R1、R3、及び R’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、R2、R4、R’2、及びR’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、R2、R’2、及び R’3 はOHである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、R2 及び R4 はOHである）で示される通りの化合物である。
【０３３９】
更なる実施態様では、本化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、n は 0であり；Mは存在せず； Ra
は Hであり；R5 は Hであり；R1、R3、及び R’3 は OHであり；そしてR2、R4、R’1、R’2、R’4、及び R’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本活性化性化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、n は 1であり；M は存在せず； Ra は Hであり；R5 は Hであり；R2、R4、R’2、及び R’3 はOHであり；そしてR1、R3、R’1、R’4、及びR’5 は Hである）で示される通りの化合物である。更なる実施態様では、本活性化性化合物は、式３４及び付属の定義（但し式中、n は 1であり；M は Oであり；二つのRa が一個の結合を形成し；R5 は OHであり；R2、R’2、及び R’3 は OHであり；そしてR1、R3、R4、R’1、R’4、及び R’5 は H.である）で示される通りの化合物である。
【０３４０】
他のサーチュイン活性化性化合物には、以下の式３５−３７
【０３４１】
【化３５】
2008503479.tif 000040
【０３４２】
但し式中、
R = H、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール
R’ = H、ハロゲン、NO2、SR、OR、NR2、アルキル、アリール、又はカルボキシ
【０３４３】
【化３６】
2008503479.tif 000041
【０３４４】
但し式中、
R = H、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール
【０３４５】
【化３７】
2008503479.tif 000042
【０３４６】
但し式中、それぞれの箇所で個別に、
R’ = H、ハロゲン、NO2、SR、OR、NR2、アルキル、アリール、又は
カルボキシ
R = H、アルキル、アリール、ヘテロシクリル、又はヘテロアリール
から成る群より選択される式を有する化合物がある。
【０３４７】
更に、式２６、２７、３０−３７の化合物の薬学的に許容可能な添加塩及び複合体も含まれる。当該化合物が一つ以上のキラル中心を有し得る場合、明示しない限り、ここで考察される化合物は、単一の立体異性体である場合も、又は立体異性体のラセミ混合物である場合もある。
【０３４８】
当該化合物が不飽和の炭素対炭素二重結合を有する場合、ここではcis (Z) 及び trans (E)異性体の両者が考えられる。当該化合物が、
【０３４９】
【化３８】
2008503479.tif 000043
そして
2008503479.tif 000044
【０３５０】
などのケト−エノール互変異性体型で存在するかも知れない場合、各互変異性体方は、平衡状態にあるか、あるいはR'との適した置換により一方の型で固定されているかに関係なく、ここで紹介された方法に包含されるものと、考えられる。いずれか一箇所でのいずれかの置換基の意味は、その意味から、又は、いずれか他の箇所でのいずれか他の置換基の意味から、独立である。
【０３５１】
他のサーチュイン活性化性化合物は、例えばWO 05/002672に解説されている。
【０３５２】
更にここで提供された方法には、式２６、２７、３０−３７の化合物のプロドラッグも含まれる。プロドラッグは、in vivoで活性な親薬物を放出する、共有結合した担体であると考えられている。
【０３５３】
上記の化合物の類似体及び誘導体も、サーチュインたんぱく質ファミリーのメンバーを活性化するために用いることができる。例えば、誘導体又は類似体は、当該化合物をより安定にしたり、それらの細胞膜透過能を、又は、被貪食もしくは飲作用能を高めたりするものでもよい。誘導体の例には、レスベラトロールに関して米国特許第6,361,815号に解説されたものなどの糖付加誘導体がある。レスベラトロールの他の誘導体には、cis- 及び trans-レスベラトロールや、グルコシド
（例えば米国特許第6,414,037号を参照されたい）を形成するためなど、糖とのこれらの結合体がある。ピセイド又はレスベラトロール3-O-ベータ-D-グルコピラノシドとも言及されるグルコシドポリダチンも用いることができる。化合物を結合させてもよい糖には、グルコース、ガラクトース、マルトース及びスクロースがある。糖付加されたスチルベンは、更に、Regev-Shoshani et al. Biochemical J. (4/16/03 にBJ20030141として公開) に解説されている。ここで解説された化合物の他の誘導体は、エステル、アミド及びプロドラッグである。レスベラトロールのエステルは、例えば米国特許第6,572,882号に解説されている。レスベラトロール及びその誘導体は、例えば米国特許第6,414,037号；第6,361,815号；第6,270,780号；第6,572,882号；及びBrandolini et al. (2002) J. Agric. Food. Chem.50:7407など、当業で解説された通りに調製することができる。ヒドロキシフラボンの誘導体は、例えば米国特許第4,591,600号に解説されている。レスベラトロール及び他の化合物は、例えばSigma社からなど、市販のものを得ることもできる。
【０３５４】
いくつかの実施態様では、あるサーチュイン活性化性化合物が天然で生じる場合、使用前にそれをその天然環境から少なくとも部分的に単離してもよい。例えば、植物ポリフェノールを、ここで解説された方法で用いる前に、植物から単離し、部分的又は実質的に精製してもよい。活性化性化合物を合成により調製してもよいが、この場合、それが天然で結び付いている他の化合物から切り離された状態であろう。ある例示的な実施態様では、活性化性組成物は、又は、活性化性化合物は、それが天然で結び付いている化合物の約50%、10%、1%、0.1%、10-2% 又は 10-3%未満に、結び付いている。
【０３５５】
例えばKu70のアセチル化のレベルを調節するなど、Ku70とBaxとの間の結び付きの調節は、ここで開設されたスクリーニング検定で特定された化合物のいずれかを用いて、達成することもできる。
【０３５６】
ここで解説された方法には、更に、ステップを観察するステップを含めてもよい。例えば、これらは、例えばKu70のK539 及び／又はK542のアセチル化のレベルなど、Ku70のアセチル化のレベルを観察するステップを含んでいてもよい。
【０３５７】
ある実施態様では、ここで解説された、又は、ここで解説されたスクリーニング法で得られた、作用物質で細胞を処理して、例えばそれらをより長時間、増殖状態で維持する、及び／又は、アポトーシスを妨げる、ためなど、それらの寿命を伸長する。これは、培養では限られた寿命しか有さないことが公知の初代細胞培養株（即ち、ヒトなどの生物から得られた細胞）に特に有用である。このような細胞を、ここで解説された方法に従って、例えばそれらを活性化性又は寿命伸長性の化合物に接触させるなどにより処理すると、細胞が培養で生存状態を維持する時間が長くなるであろう。胚性幹（ＥＳ）細胞及び多分化能細胞や、それらから分化した細胞も、例えば細胞又はその後代をより長時間、培養できるように、ここで解説された方法に従って処理することができる。初代培養細胞、ＥＳ細胞、多分化能細胞及びこれらの後代は、例えば当該細胞に対して特定の生物学的効果を有する化合物を特定したり、あるいは、細胞に対する化合物の毒性を検査（即ち、細胞毒性検定）したりするために、用いることができる。このような細胞は、例えばex vivoでの改変後など、対象への移植用にも用いることができる。
【０３５８】
他の実施態様では、長時間保存しようとする細胞を、例えばKu70のアセチル化を阻害する、又は、脱アセチル化を誘導する、作用物質など、Ku70-Bax相互作用を誘導又は維持する作用物質で処理する。細胞は、例えば血球、血清、生物学的成長培地などの懸濁液中の細胞であっても、組織又は器官内にある細胞であってもよい。例えば、ある個体に投与するためにある個体から採集された血液を、例えば法医学的目的のために血球をより長時間、保存するためなど、ここで解説された通りに処理することができる。寿命を伸長したり、あるいはアポトーシスから保護するために処理してもよい他の細胞には、非ヒト哺乳動物由来の細胞（例えば食肉）、又は植物細胞（例えば野菜）など、消費向けの細胞がある。
【０３５９】
更に作用物質を、哺乳動物、植物、昆虫又は微生物の発生及び成長段階で、例えば発生及び／又は成長プロセスを変える、遅らせる又は加速するなどのために、適用してもよい。
【０３６０】
別の実施態様では、ヒト又は他の哺乳動物などの対象から得られた細胞を、ここで解説された方法に従って処理した後、同じ又は異なる対象に投与する。従って、移植片としてあるドナーから得られた細胞又は組織を、この移植片のレシピエントへの投与前に、ここで解説された通りに処理することができる。例えば、ある対象から骨髄細胞を得、ex ivoでそれらの寿命を伸長するなどのために処理した後、レシピエントに投与することができる。移植片は一個の器官でも、一つの組織でも、又は、疎性（原語：loose）細胞であってもよい。
【０３６１】
更に他の実施態様では、細胞を、例えばそれらの寿命を延ばす又はアポトーシスを妨げるためなど、in vivoで処理する。例えば、上皮細胞などの皮膚をここで解説された通りに処理するなどにより、皮膚を皺の発生などの老化から保護することができる。ある実施態様の例では、Ku70-Bax相互作用を刺激する作用物質を含む医薬又は美容用組成物に皮膚を接触させる。皮膚の炎症又は皮膚の状態の例には、炎症、太陽光による損傷又は自然な老化に伴う、又は引き起こされる異常又は疾患がある。例えば、本組成物は、接触性皮膚炎（刺激性接触性皮膚炎及びアレルギー性接触性皮膚炎を含む）、アトピー性皮膚炎（アレルギー性湿疹としても知られる）、日光性角化症、角化異常（湿疹を含む）、表皮水疱症（天疱瘡を含む）、剥脱性皮膚炎、脂漏性皮膚炎、紅斑（多形性紅斑及び結節性紅斑を含む）、日光又は他の光源により引き起こされる損傷、円板状エリテマトーデス、皮膚筋炎、皮膚癌及び自然な老化の効果、の防止又は治療において用途があるであろう。本調合物を、局所的に、皮膚又は粘膜組織に、軟膏、ローション、クリーム、マイクロ乳液、ゲル、溶液等として、所望の結果を起こすのに有効な投薬計画の文脈の範囲内で投与してよい。活性な作用物質の用量は、１日あたり１ｋｇ当たり約 0.005 乃至約t 1 マイクロモルの範囲内であろうが、好ましくは、１日あたり１ｋｇ当たり約 0.05 乃至約 0.75マイクロモルの範囲内であり、より典型的には、１日あたり１ｋｇ当たり約 0.075 乃至約 0.5 マイクロモルの範囲内であろう。当業者であれば、個々の投薬量の最適な量及び間隔は、治療しようとする状態の性質及び程度、投与の部位、及び治療を行う相手の特定の個体によって決定されること、そしてこのような最適量は、従来技術により決定することができることは認識されよう。つまり、ある特定の患者にとっての最適な投薬計画、即ち、用量の回数及び頻度、従来の治療決定検査の経過を用いれば確認することができるのである。投薬計画には、一日当たり少なくとも一回、好ましくは一日当たり１乃至４回を、症状が治まるまで局所用調合物を投与するステップを含めてもよい。
【０３６２】
局所用調合物を化学防御用組成物として用いてもよい。化学防御法で用いる場合、易罹患性の皮膚を、ある特定の個体のいずれかの可視の状態の前に治療してもよい。
【０３６３】
例えば細胞の寿命を伸長する、アポトーシスに対して防御する、又はアポトーシスを誘導するなどのために、注射などで対象内の組織又は器官などに局所的に作用物質を送達することもできる。
【０３６４】
更に別の実施態様では、細胞の寿命を概ね伸ばす、及び／又は、アポトーシスを妨げるなどのために、Ku70-Bax相互作用を刺激又は維持する作用物質を対象に投与する。ここで解説されたこのような作用物質で対象を処置することは、対象に閾下増進効果、即ち、生物に対して有益で、それらの寿命を伸長するであろう緩和なストレス、を与えることと同様であると考えられる。例えば、作用物質を食用サプリメントとして対象に摂取させることができる。ある実施態様では、このような作用物質は、マルチビタミン複合剤の一成分である。更に、作用物質を、スタチン及びアスピリンなど、基本的に毎日摂取される既存の調合物に加えることもできる。また作用物質を食品添加剤として用いてもよい。
【０３６５】
例えばここで解説された方法で得られるものなど、Ku70-Bax相互作用を刺激する作用物質を、例えば脳卒中、心疾患、関節炎、高血圧、及びアルツハイマー病などの老化及び老化に関連する結果を防ぐために対象に投与してもよい。このような作用物質は、細胞死から細胞を防御するためなど、細胞死に関連する、慢性疾患などの疾患の治療に向けて、対象に投与することもできる。疾患の例には、パーキンソン病、アルツハイマー病、多発性硬化症、アムニオトロピック（原語：amniotropic）側索硬化症、及び筋ジストロフィーなどの神経細胞死又は筋細胞死に関連するもの；AIDS；劇症肝炎；クロイツフェルト−ヤコブ病、色素性網膜炎及び小脳変性などの脳の変性に関係する疾患；再生不良性貧血などの異形成性脊髄；心筋梗塞及び脳卒中などの虚血性疾患；アルコール性肝炎、Ｂ型肝炎及びＣ型肝炎などの肝疾患；骨粗鬆症などの関節の疾患；アテローム性硬化症；脱毛症；紫外線による皮膚の損傷；扁平苔癬；皮膚の萎縮；白内障；及び移植片拒絶、がある。
【０３６６】
例えば脳卒中又は心筋梗塞に罹患している対象や、又は、脊髄損傷に苦しむ対象など、期間又は組織の損傷などの急性の損傷に苦しむ対象に、Ku70-Bax相互作用を刺激する作用物質を投与することもできる。またアルコール肝を修復するために作用物質を用いることもできる。
【０３６７】
このように、Ku70-Bax相互作用を刺激又は維持する作用物質は、概して、神経変性疾患（例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、脊髄−脳失調症及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症を含むポリグルタミン路に関連する疾患；筋萎縮性側索硬化症；色素性網膜炎及び多発性硬化症、てんかん）、虚血（脳卒中、心筋梗塞及び再潅流損傷）、不妊（早発閉経、卵巣不全又は卵胞閉鎖症）、心臓血管異常（動脈硬化症、心不全、及び心臓移植）、腎低酸素、肝炎及びAIDSを含め、Bax又はアポトーシスに関連するあらゆる疾患の治療のために用いられよう。
【０３６８】
この発見に基づく薬物及び医薬製剤には、脳卒中、心臓発作、虚血、変性性疾患（神経細胞及び筋肉、例えばアルツハイマー病、パーキンソン病、心筋の変性等）で損傷した細胞及び組織の死、寄生生物（ウィルス、細菌、酵母、又は原虫等）の感染、他の薬物（例えば抗がん剤）の副作用、紫外線／Ｘ線照射、及び、細胞死シグナルを惹起するいくつかの他の病的状態、で損傷する細胞及び組織を防御するための薬物がある。他の潜在的用途には、神経細胞及び筋細胞を含む、損傷した細胞の再生；遺伝子及びたんぱく質の細胞内へのトランスフェクション効率の向上；及び、注入又は移植用の細胞及び器官の保存、がある。
【０３６９】
以下の文献は、Baxたんぱく質が多様な疾患で重要な役割を果たすことを記載するものである：Injury-induced
neuron death--Deckwerth, et al. Neuron. 17:401-411, 1996; Martin, et al., J.
Comp. Neurol. 433:299-311, 2001; Kirkland, et al., J. Neurosci. 22:6480-90,
2002; Alzheimer disease--MacGibbon, et al., Brain Res. 750:223-234, 1997;
Selznick, et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 59:271-279, 2000; Cao, et al.,
J. Cereb. Blood Flow Metab. 21 :321-333, 2001; Zhang, et al., J. Cell Biol.
156:519-529, 2002; Ischemia-induced cell damage--Kaneda, et al., Brain Res.
815:11-20, 1999; Gibson, et al., Mol. Med. 7:644-655, 2001; HIV (AIDS) and Bax:
Castedo, et al., J. Exp. Med. 194:1097-1110, 2001; Drug-induced neuron
death--Dargusch, et al., J. Neurochem. 76:295-301, 2001; Parkinson's disease--Ploix
and Spier, Trends Neurosci. 24:255, 2001; Huntington's disease--Antonawich, et al., Brain Res.
Bull. 57:647-649, 2002。
【０３７０】
一般的には、Ku70-Bax相互作用を刺激又は維持する作用物質は、対象において細胞老化により誘導される又は悪化する疾患又は状態を治療又は防止する方法；老化開始後など、対象の老化速度を低下させる方法；対象の寿命を伸長する方法；寿命に関係する疾患又は状態を治療又は防止する方法；細胞の増殖能に関連する疾患又は状態を治療又は防止する方法；及び、細胞損傷又は死を原因とする疾患又は状態を治療又は防止する方法、で用いられよう。いくつかの実施態様では、当該の疾患又は状態は、酸化ストレスを原因としない。いくつかの実施態様では、ある方法は、対象の酸化ストレスに対する耐性を有意に増すものではない。いくつかの実施態様では、本方法は、対象の寿命を短縮する疾患の発生率を減らすことによって作用するものではない。いくつかの実施態様では、ある方法は、癌などの疾患により引き起こされる致死率を減らすことにより、作用するものではない。
【０３７１】
ここで解説された化合物を、多剤複合剤の一成分として、あるいは多剤計画に対して付加的な補助剤として、摂取することもできよう。ある実施態様では、この多剤複合剤又は計画には、脳卒中、心疾患、関節炎、高血圧、アルツハイマー病などの老化に関連する疾患の治療又は防止のための薬物又は化合物が含まれよう。ある具体的な実施態様では、ある化合物を用いて、化学療法の効果から非癌細胞を防御することができよう。
【０３７２】
治療又は防止することができる心臓血管の疾患には、心筋症又は心筋炎；例えば特発性心筋症、代謝性心筋症、アルコール性心筋症、薬物誘発性心筋症、虚血性心筋症、及び高血圧性心筋症、がある。ここで解説された方法を用いて治療可能又は防止可能なものは、更に、大動脈、冠状動脈、頚動脈、脳血管動脈、腎動脈、腸骨動脈、大腿動脈、及び膝窩動脈などの主要な血管のアテローム性異常（大血管疾患）である。治療可能又は防止可能な他の血管疾患には、網膜細小動脈、糸球体細小動脈、脈管の脈管、心臓細小動脈、並びに、眼、腎臓、心臓、及び中枢及び末梢神経系の関連する毛細管床、に関連するもの、がある。また本化合物を、ある個体の血漿中のHDLレベルを増すために用いてもよい。
【０３７３】
Ku70-Bax相互作用を刺激又は維持する作用物質で治療できそうな更に他の異常には、冠状動脈介入後などの再狭窄、及び、異常なレベルの高密度及び低密度コレステロールに関係する異常、がある。Ku70-Bax相互作用を刺激又は維持する作用物質は、また、インフルエンザ、疱疹又はパピローマウィルス感染などのウィルス感染を治療又は防止するためにも用いられよう。またこれらを、抗真菌剤、抗炎症剤及び神経保護剤として用いてもよい。
【０３７４】
サーチュインが、PPAR-γを抑制するなどにより脂肪細胞内の脂質蓄積の阻害に関与しているという事実
(Picard et al. (2004) Nature 430:921)に少なくとも基づくと、Ku70-Bax相互作用を刺激又は維持する作用物質を、肥満や、それが原因で起きるいずれかの状態を治療したり、あるいは代謝性疾患などの体重増加を減らしたりするためなど、脂肪動員を刺激するためにも用いてもよいだろう。Ku70-Bax相互作用を刺激又は維持する作用物質を、インシュリン耐性、あるいは、ＩＩ型糖尿病、ＩＩＩ型糖尿病又はこれらの合併症などの他の前駆症状など、代謝性疾患を治療するために投与してもよい。方法は、対象のインシュリン感受性を増す、あるいはインシュリン・レベルを減らすものかも知れない。このような治療を必要とする対象は、インシュリン耐性又はＩＩ型糖尿病の他の前駆症状を有する対象、ＩＩ型糖尿病を有する対象、あるいは、これらの状態のいずれかを発症しそうな対象、であろう。例えば、対象は、高脂血症、脂質生成不全、高コレステロール血症、糖寛容不全、高血糖レベル、Ｘ症候群、アテローム性硬化症及び脂肪異栄養症の他の症状など、高循環中レベルのインシュリン及び／又は関連する状態を有するなどのインシュリン耐性を有する対象であってもよい。
【０３７５】
Ku70-Bax相互作用を刺激又は維持する作用物質は、ある線量の放射線を最近受けたか、又は受けそうな対象に投与することもできる。ある実施態様では、前記線量の放射線は、例えば原子力発電所、航空機の操縦、Ｘ線、ＣＡＴスキャン、又は、医療画像用の放射性染料の投与に従事するなど、職業関連又は医療の手法の一部として受けるものであり、このような実施態様では、当該化合物は、予防的対策として投与される。別の実施態様では、放射鮮暴露は、産業事故、テロリスト活動、又は放射性物質を含む戦争活動の結果など、不慮に受けるものである。このような場合、本化合物は、アポトーシスや、その後の急性放射線症候群の発症を防ぐために、暴露後すぐに投与されることが好ましい。
【０３７６】
他の実施態様では、ここで解説された方法を酵母細胞に適用する。酵母細胞の寿命を伸長することが好ましいであろう状況には、例えばビール、ヨーグルト、及びパンなどのベーカリー製品の製造など、酵母を用いるいずれかのプロセスがある。寿命が伸長された酵母を用いると、酵母の使用量を減らしたり、酵母をより長時間、活性にしたりすることができる。組換えにより作製されるたんぱく質に用いられる酵母又は他の哺乳動物も、ここで解説された通りに処理してよい。反対に、アポトーシスを刺激する作用物質を投与すれば、酵母感染を治癒させる、あるいは減らすことができよう。
【０３７７】
植物でも寿命、ストレス耐性、及び対アポトーシス抵抗性を増すために、作用物質を用いてよい。ある実施態様では、植物に対し、周期的に、又は真菌に入れて、作用物質を適用する。別の実施態様では、植物を遺伝子改変して作用物質を産生させる。別の実施態様では、収穫及び船積み前に植物及び果実を作用物質で処理して、輸送中の損傷に対する耐性を高める。
【０３７８】
更に、昆虫で寿命や対アポトーシス耐性を増すために作用物質を用いてもよい。この実施態様では、植物の受粉に関与する蜂又は他の昆虫など、有用な昆虫に作用物質を適用してもよいだろう。ある具体的な実施態様では、蜂蜜の生産に関与する蜂に作用物質を適用してもよいだろう。一般的には、ここで解説された方法を、商業上の重要性を有するであろう真核生物などのいずれの生物に適用してもよい。例えば、これらを魚類（水生環境）及び鳥類（ニワトリ及び家禽類）に適用することができる。
【０３７９】
Ku70とBaxとの間の結び付きを妨げる、あるいは、BaxからのKu70の分離を刺激する、作用物質を、特定の細胞のアポトーシスが好ましいような状態にある対象に投与してもよい。例えば腫瘍の成長が低下するであろう。具体的には、癌を治療又は防止できよう。癌の例は、脳及び腎臓のもの；乳房、前立腺、清掃、及び卵巣癌を含む、ホルモン依存的癌；リンパ腫及び白血病である。充実腫瘍に関連する癌では、作用物質を腫瘍に直接投与してもよい。白血病などの血液細胞の癌は、作用物質を血流中又は骨髄中に投与することにより、治療することができる。疣などの良性の細胞腫瘍も治療することができる。治療可能な他の疾患には、例えば全身性エリテマトーデス、強皮症、及び関節炎など、自己免疫細胞を除去すべき自己免疫疾患がある。
疱疹、HIV、アデノウィルス、及びHTLV-1随伴性の悪性及び両性の異常などのウィルス感染も、ここで解説された作用物質の投与により、治療することができる。代替的には、細胞を対象から得、ex vivoで処理して癌細胞などの特定の望ましくない細胞を取り除き、同じ又は異なる対象に投与して戻すことができる。
【０３８０】
一般的には、Ku70とBaxとの間の結び付きを妨げる、又は、BaxからのKu70の分離を刺激する、作用物質は、以下の種類の癌の治療に用いられよう：
急性リンパ芽球性白血病；急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；急性骨髄性白血病；副腎皮質癌；副腎皮質癌；AIDS-関連癌；AIDS-関連リンパ腫；肛門癌；星状細胞腫、小児小脳；星状細胞腫、小児、大脳；基底細胞癌、皮膚癌（非黒色腫）を参照されたい；胆管癌、肝臓外；膀胱癌；膀胱癌；骨の癌；骨肉腫／悪性線維性組織球腫；脳幹グリオーマ；脳腫瘍；脳腫瘍；脳幹グリオーマ；脳腫瘍、小脳星状細胞腫；脳腫瘍、大脳星状細胞腫／悪性グリオーマ；脳腫瘍、脳室上衣細胞腫；脳腫瘍、髄芽細胞腫；脳腫瘍、テント上原始神経外胚葉腫瘍；脳腫瘍、視覚路及び視床下部グリオーマ；脳腫瘍；乳癌；乳癌及び妊娠；乳癌；乳癌、男性；気管支腺腫／カルチノイド；バーキットリンパ腫；カルチノイド腫瘍；カルチノイド腫瘍、胃腸管；未知の原発の癌腫；中枢神経系リンパ腫、原発性；小脳星状細胞腫；大脳星状細胞腫/悪性グリオーマ；子宮頸癌；小児癌；慢性リンパ球性白血病；慢性骨髄性白血病；慢性骨髄増殖性異常；結腸癌；結腸直腸癌；皮膚Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉腫及びセザリー症候群を参照されたい；子宮内膜癌；脳室上衣細胞腫；食道癌；食道癌；ユーイング類の腫瘍；頭蓋外胚細胞腫瘍；性腺外胚細胞腫瘍；肝臓外胆管癌；眼の癌、眼球内黒色腫；眼の癌、網膜芽細胞腫；胆嚢癌；胃（胃）癌；胃（胃）癌；胃腸管のカルチノイド腫瘍；胚細胞腫瘍、頭蓋外; 胚細胞腫瘍、性腺外；胚細胞腫瘍、卵巣；妊娠性絨毛性腫瘍；グリオーマ；グリオーマ、小児脳幹；グリオーマ、小児大脳星状細胞腫；グリオーマ、小児視覚路及び視床下部；ヘアリー細胞白血病；頭部及び頚部の癌；肝細胞（肝臓）癌；成人（原発）；肝細胞（肝臓）癌、小児（原発）；ホジキンリンパ腫；ホジキンリンパ腫；妊娠中のホジキンリンパ腫；下咽頭癌；視床下部及び視覚路のグリオーマ；眼球内黒色腫；島細胞癌腫（膵臓内分泌腺）；カポジ肉腫；腎臓（腎細胞）癌；腎癌；
喉頭癌；喉頭癌；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性リンパ芽球性；白血病、急性骨髄性；白血病、急性骨髄性；白血病、慢性リンパ球性；白血病；慢性骨髄性；白血病、ヘアリー細胞；口唇及び口腔癌；肝臓癌、成人（原発）；肝臓癌、小児（原発）；肺癌、非小細胞；肺癌、小細胞；リンパ腫、AIDS-関連；リンパ腫、バーキット；リンパ腫、皮膚Ｔ細胞、菌状息肉腫及びセザリー症候群を参照されたい；リンパ腫、ホジキン；リンパ腫、ホジキン；リンパ腫、妊娠中のホジキン型；リンパ腫、非ホジキン型；リンパ腫、非ホジキン型；リンパ腫、妊娠中の非ホジキン型；リンパ腫、原発性中枢神経系；マクログロブリン血症、ワルデンストローム；骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫；髄芽細胞腫；黒色腫；黒色腫、眼球内（眼）；メルケル細胞癌腫；中皮腫、成人悪性；中皮腫；潜在性原発のある転移性扁平頸部癌；多発性内分泌腺新生症候群；多発性骨髄腫／プラズマ細胞新生、菌状息肉腫；脊髄形成異常性症候群；脊髄形成異常性／骨髄増殖性疾患；骨髄性白血病、慢性；骨髄性白血病、成人急性；骨髄性白血病、小児急性；骨髄腫、多発性；骨髄増殖性異常、慢性；鼻腔及び副鼻腔癌；鼻咽頭癌；鼻咽頭癌；神経芽細胞腫；非ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；妊娠中の非ホジキンリンパ腫；非小細胞肺癌；口腔癌；口腔癌、口唇及び；口咽頭癌；骨肉腫／骨の性線維性組織球腫；卵巣癌；卵巣上皮癌；卵巣胚細胞腫瘍；卵巣低悪性潜在性腫瘍；膵臓癌；膵臓癌；膵臓癌、島細胞；副鼻腔及び鼻腔癌；副甲状腺癌；陰茎癌；クロム親和性細胞腫；松果体芽細胞腫及びテント上原始神経外胚葉
腫瘍；脳下垂体腫瘍；プラズマ細胞新生／多発性骨髄腫；胸膜肺芽腫；妊娠及び乳癌；妊娠及びホジキンリンパ腫；妊娠及び非ホジキンリンパ腫；原発性中枢神経系リンパ腫；前立腺癌；直腸癌；腎細胞（腎臓）癌；腎細胞（腎臓）癌；腎盂及び尿管、移行細胞癌；網膜芽細胞腫；横紋筋肉腫；唾液腺癌；唾液腺癌；肉腫、ユーイング類の腫瘍；肉腫、カポジ；肉腫、軟組織：肉腫、軟組織；肉腫、子宮；セザリー症候群；皮膚癌（非黒色腫）；皮膚癌；皮膚癌（黒色腫）；皮膚癌腫、メルケル細胞；小細胞肺癌；小腸癌；軟組織肉腫；軟組織肉腫；扁平細胞癌腫、皮膚癌
（非黒色腫）を参照されたい；原発潜在性のある扁平頸部癌、転移性；胃（胃）癌；胃（胃）癌; テント上原始神経外胚葉腫瘍：Ｔ細胞リンパ腫、皮膚、菌状息肉腫及びセザリー症候群を参照されたい；精巣癌；胸腺腫；胸腺腫及び胸腺癌；甲状腺癌；甲状腺癌；腎盂及び尿管の移行細胞癌；絨毛性腫瘍、妊娠性；未知の原発部位の、癌腫；道の原発部位の、癌；小児のまれな癌；尿管及び腎盂、移行細胞癌；尿道癌；子宮癌、新旧内膜；子宮肉腫；膣癌；視覚路及び視床下部のグリオーマ；陰門癌；ワルデンストロームマクログロブリン血症；ウィルムス腫瘍；及び女性の癌（国立癌機関のリスト）。
【０３８１】
抗癌活性を有するとしてここで解説された化合物（例えば、アポトーシスを誘導する化合物、寿命を減らす化合物、又は、細胞をストレスに対して感受性にする化合物など）と同時投与してもよい化学療法薬には：
アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、bcg、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カンプトテシン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、コルヒチン、シクロホスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエンストロール、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラジオール、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゲニステイン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン、イリノテカン、イロノテカン、レトロゾール、ロイコボリン、ロイプロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、MESNA、メトトレキセート、ミトマイシン、ミトタン、ミトキサントロン、ニルタミド、ノコダゾール、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロン酸、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィメル、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、スラミン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、チタノセンジクロリド、トポテカン、トラスツズマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及び
ビノレルビン、がある。. 
【０３８２】
これらの化学療法薬は、それらの作用機序によって、例えば以下のグループに分類されよう：抗代謝産物／抗癌剤、例えばピリミジン類似体（5-フルオロウラシル、フロクスウリジン、カペシタビン、ゲムシタビン及びシタラビン）並びにプリン類似体、葉酸アンタゴニスト及び関連する阻害剤（メルカプトプリン、チオグアニン、ペントスタチン及び2-クロロデオキシアデノシン （クラドリビン））；ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、及びビノレルビン）などの天然生成物を含む抗増殖／抗有糸分裂剤、タキサン（パクリタキセル、ドセタキセル)、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ノコダゾール、エポチオロン及びナベルビンなどの微小管破壊剤、エピジポドフィロトキシン（テニポシド）、DNA 損傷剤（アクチノマイシン、アムサクリン、アントラサイクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、
カンプトテシン、カルボプラチン、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、シトキサン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、ヘキサメチルメラミンオキサリプラチン、イフォスファミド、メルファラン、メクロレタミン、ミトマイシン、ミトキサントロン、ニトロソウレア、パクリタキセル、プリカマイシン、プロカルバジン、テニポシド、トリエチレンチオホスホールアミド及びエトポシド
（VP16））；ダクチノマイシン (アクチノマイシン D)、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、アントラサイクリン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、プリカマイシン（ミトラマイシン）及びミトマイシンなどの抗生物質；酵素（L-アスパラギンを合成的に代謝して、それら自体のアスパラギン合成能を有さない細胞を枯渇させるL-アスパラギナーゼ）；ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド
及び類似体、メルファラン、クロラムブシル）、エチレンイミン及びメチルメラミン（ヘキサメチルメラミン及びチオテパ）、アルキルスルホネート-ブスルファン、ニトロソウレア（カルムスチン (BCNU) 及び類似体、ストレプトゾシン）、トラゼン-ダカルバジニン（DTIC）などの抗血小板剤；抗増殖性／抗有糸分裂性アルキル化剤； 葉酸類似体（メトトレキセート）などの抗増殖性／抗有糸分裂性抗代謝産物；プラチナ配位錯体（シスプラチン、カルボプラチン）、プロカルバジン、ヒドロキシウレア、ミトタン、アミノグルテチミド；ホルモン、ホルモン類似体（エストロゲン、タモキシフェン、ゴセレリン、ビカルタミド、ニルタミド）及びアロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール）；抗凝固剤（ヘパリン、合成ヘパリン塩及び他のトロンビン阻害剤）；線維素溶解剤（例えば組織プラスミノーゲンアクチベータ、ストレプトキナーゼ及びウロキナーゼ）アスピリン、COX-2阻害剤、ジピリダモール、チクロピジン、クロピドグレル、アブシキシマブ；抗遊走剤；抗分泌剤（ブレベルジン）；免疫抑制剤（シクロスポリン、タクロリムス（FK-506）、シロリムス（ラパマイシン）、アザチオプリン、ミコフェノレートモフェチル）；抗血管新生性化合物（TNP-470、ゲニステイン）及び成長因子阻害剤（血管内皮細胞成長因子（VEGF）阻害剤、線維芽細胞成長因子（FGF）阻害剤、上皮成長因子（EGF）阻害剤）；アンジオテンシン受容体遮断剤；酸化窒素供与体；アンチセンスオリゴヌクレオチド；抗体（トラスツズマブ）；細胞周期阻害剤及び分化誘導剤（トレチノイン）；mTOR 阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤（ドキソルビシン（アドリアマイシン）、アムサクリン、カンプトテシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、エニポシド、エピルビシン、エトポシド、イダルビシン、イリノテカン（CPT-11）及びミトキサントロン、トポテカン、イリノテカン）、コルチコステロイド（コルチゾン、デキサメタゾン、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾン、及びプレドニゾロン）；成長因子シグナル伝達キナーゼ阻害剤；ミトコンドリア機能不全誘導剤及びカスパーゼ活性家財；クロマチン破壊剤。
【０３８３】
これらの化学療法薬を、細胞死を誘導するとしてここで解説された化合物と一緒に用いてもよい。表１に挙げられたものを含め、しかしこれらに限らず、数多くの併用療法が開発されてきた。
【０３８４】
【表２】
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【０３８５】
従来の化学療法薬に加え、細胞死を誘導することができるとしてここで解説された化合物も、従来の化学療法のターゲットである望ましくない細胞増殖に寄与する細胞内成分の発現を阻害するために、アンチセンスRNA、RNAi 又は他のポリヌクレオチドと一緒に用いることができる。このようなターゲットは、単に実例を挙げるだけであるが、成長因子、成長因子受容体、細胞周期調節たんぱく質、転写因子、又はシグナル伝達キナーゼである。
【０３８６】
脱アセチル化酵素調節作用物質を、対象に同時でも又は逐次でも、投与してもよい。例えば、サーチュイン阻害性化合物を、脱アセチル化酵素タイプＩ又はＩＩ阻害剤の投与と同時、投与前又は投与後に投与してよい。それらの投与形態は同じでも、又は異なっていてもよい。例えば、ある阻害剤を局所的に投与し、もう一つのものを全身投与してもよい。
【０３８７】
本方法は、従来の化学療法薬に、低投薬量でより大きな効果を働かせるため、当業で公知の併用療法よりも有利であろう。ある好適な実施態様では、ある化学療法薬、あるいはここで解説された化合物と組み合わせて用いられた場合の従来の化学療法薬の組み合わせ、の有効用量（ED50）は、当該化学療法薬単独の場合のED50の少なくとも２分の１であり、そして更に好ましくは少なくとも５分の１、１０分の１又は更には２５分の１である。反対に、このような化学療法薬、又は、ここで解説された化合物と組み合わせて用いられた場合のこのような化学療法薬の組み合わせ、の治療指数（ＴＩ）は、従来の化学療法計画単独の場合の少なくとも２倍、そして更に好ましくは５倍、１０倍、又は更には２５倍にも昇り得る。
【０３８８】
他の併用療法には、ニコチンアミド、NAD+又はその塩、あるいは他のビタミンＢ３類似体との同時投与がある。L-カルニチンなどのカルニチンも、特に脳卒中、記憶喪失、初老期痴呆、アルツハイマー病を治療したり、又は、神経毒の使用により惹起される異常を防止又は治療したりするために、同時投与してもよい。COX-2阻害剤などのシクロオキシゲナーゼ阻害剤も、例えば炎症状態又は神経学的疾患など、ここで解説された特定の状態を治療するために同時投与してよい。
【０３８９】
脱アセチル化酵素阻害剤及び別の作用物質、例えば化学療法薬、抗ウィルス剤、ニコチンアミド、NAD+又はその塩、ビタミンB３類似体、レチノイド、アルファ-ヒドロキシ酸、アスコルビン酸、など、を含む組成物又は共調合物もここに包含される。
【０３９０】
いくつかの実施態様では、SIRT1活性化剤などのサーチュイン活性化剤は、SIRT1などのサーチュインの脱アセチル化酵素酵素を活性化するために有効な濃度（例えばin vivoで）では、実質的なPI3キナーゼ阻害能、アルドレダクターゼ阻害能、及び／又は、チロシンキナーゼ阻害能を有さない。例えば、好適な実施態様では、サーチュイン活性化剤は、アルドレダクターゼ及び／又はチロシンたんぱく質キナーゼのうちの一つ以上の阻害に関するEC50の少なくとも５分の１であり、そして更により好ましくは１０分の１、１００分の１又は更には１０００分の１である、サーチュイン脱アセチル化酵素活性活性化のEC50を有するように選択される。
【０３９１】
いくつかの実施態様では、サーチュイン活性化剤は、サーチュインの脱アセチル化酵素活性を活性化するために有効な濃度（例えばin vivoで）では、EGFRチロシンキナーゼ活性の実質的なトランス活性化能を有さない。例えば、好適な実施態様では、サーチュイン活性化剤は、EGFRチロシンキナーゼ活性のトランス活性化に関するEC50の少なくとも５分の１であり、そして更により好ましくは１０分の１、１００分の１又は更には１０００分の１である、サーチュイン脱アセチル化酵素活性活性化のEC50を有するように選択される。
【０３９２】
いくつかの実施態様では、サーチュイン活性化剤は、サーチュインの脱アセチル化酵素活性を活性化するために有効な濃度（例えばin vivoで）では、実質的な冠状動脈拡張能を有さない。例えば、好適な実施態様では、サーチュイン活性化剤は、冠状動脈拡張に関するEC50の少なくとも５分の１であり、そして更により好ましくは１０分の１、１００分の１又は更には１０００分の１である、サーチュイン脱アセチル化酵素活性活性化のEC50を有するように選択される。
【０３９３】
いくつかの実施態様では、サーチュイン活性化剤は、サーチュインの脱アセチル化酵素活性を活性化するために有効な濃度（例えばin vivoで）では、実質的な鎮痙活性を有さない。例えば、好適な実施態様では、サーチュイン活性化剤は、鎮痙効果に関するEC50の少なくとも５分の１であり、そして更により好ましくは１０分の１、１００分の１又は更には１０００分の１である、サーチュイン脱アセチル化酵素活性活性化のEC50を有するように選択される。
【０３９４】
いくつかの実施態様では、サーチュイン活性化剤は、サーチュインの脱アセチル化酵素活性を活性化するために有効な濃度（例えばin vivoで）では、実質的な肝チトクロームP450 1B1 (CYP) 阻害能を有さない。例えば、好適な実施態様では、サーチュイン活性化剤は、P450 1B1 阻害に関するEC50の少なくとも５分の１であり、そして更により好ましくは１０分の１、１００分の１又は更には１０００分の１である、サーチュイン脱アセチル化酵素活性活性化のEC50を有するように選択される。
【０３９５】
いくつかの実施態様では、サーチュイン活性化剤は、サーチュインの脱アセチル化酵素活性を活性化するために有効な濃度（例えばin vivoで）では、実質的な核内因子-カッパB（NF-κB）阻害能を有さない。例えば、好適な実施態様では、サーチュイン活性化剤は、NF-κB阻害に関するEC50の少なくとも５分の１であり、そして更により好ましくは１０分の１、１００分の１又は更には１０００分の１である、サーチュイン脱アセチル化酵素活性活性化のEC50を有するように選択される。
【０３９６】
いくつかの実施態様では、SIRT1活性化剤は、ヒトSIRT1の脱アセチル化酵素活性を活性化するために有効な濃度（例えばin vivoで）では、実質的な下等真核生物、特に酵母又はヒト病原体、のSIRT1オーソログ活性化能を有さない。例えば、好適な実施態様では、SIRT1活性化剤は、酵母Sir2（例えばカンジダ、Ｓ．セレビジエ等）活性化に関するEC50の少なくとも５分の１であり、そして更により好ましくは１０分の１、１００分の１又は更には１０００分の１である、ヒトSIRT1脱アセチル化酵素活性活性化のEC50を有するように選択される。
【０３９７】
他の実施態様では、サーチュイン活性化剤は、サーチュインの脱アセチル化酵素活性を活性化するために有効な濃度（例えばin vivoで）では、実質的なプロテインキナーゼ阻害能；実質的なマイトジェン活性化たんぱく質（MAP）キナーゼリン酸化能；COX-2などのシクロオキシゲナーゼの実質的な触媒又は転写活性阻害能；実質的な酸化窒素シンターゼ阻害能（iNOS）；又は、タイプＩコラーゲンへの血小板接着阻害能を有さない。例えば、好適な実施態様では、サーチュイン活性化剤は、これらの活性のいずれかを行うためのEC50の少なくとも５分の１であり、そして更により好ましくは１０分の１、１００分の１又は更には１０００分の１である、サーチュイン脱アセチル化酵素活性活性化のEC50を有するように選択される。
【０３９８】
他の実施態様では、サーチュイン活性化剤又は阻害剤などのここで解説された化合物は、当業で公知の標準的検定のいずれで判断しても、有意な又は検出可能な抗酸化剤活性を有さない。例えばある化合物は、Ｏ２ラジカルなどのフリーラジカルを有意には除去しない。ある化合物は、レスベラトロールなどの別の化合物に比較して、約２、３、５、１０、３０又は１００分の１未満の抗酸化剤活性を有するであろう。
【０３９９】
ある化合物は、約10-9M、10-10M、10-11M、10-12M 以下の対サーチュイン結合活性を有するであろう。ある化合物は、サーチュインのその基質又はNAD+に対するKmを少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、３０、５０、又は１００の因数で減少させるものかも知れない。ある化合物は、約1 nM未満、約 10 nM未満、約100 nM未満、約1μM未満、約10μM未満、約100μM未満、又は約 1乃至10 nM、約10乃至100 nM、約0.1乃至1μM、約1乃至10μM 又は約10乃至100μMである、サーチュインの脱アセチル化酵素活性を活性化させるEC50を有するかも知れない。ある化合物は、サーチュインの脱アセチル化酵素活性を、無細胞検定又は細胞ベースの検定により実施例で解説する通りに測定してときに、少なくとも約５、１０、２０、３０、５０、又は１００の因数で活性化するかも知れない。ある化合物は、同じ濃度のレスベラトロール又はここで解説された他の化合物に比較して、少なくとも１０％、３０％、５０％、８０％大きな、又は２倍、５倍、１０倍、５０倍、又は１００倍の、SIRT1の脱アセチル化酵素活性の誘導を起こすものかも知れない。またある化合物は、SIRT1を活性化する場合のEC50よりも、少なくとも約１０倍、２０倍、３０倍、５０倍である、SIRT5を活性化するそれを有するものかも知れない。
【０４００】
ある化合物は細胞の細胞質膜を横切るものであろう。例えば、ある化合物は、少なくとも約２０％、５０％、７５％、８０％、９０％又は９５％の細胞透過性を有するであろう。
【０４０１】
ここで解説された化合物は、更に、以下の特徴のうちの一つ以上を有していてもよい：本化合物は、細胞又は対象に対して基本的に無毒性であってもよい；本化合物は有機分子でも、又は、2000 amu以下、1000 amu以下の低分子であってもよい；ある化合物は、少なくとも約３０日間、６０日間、１２０日間、６ヶ月間又は１年間の、通常の大気条件下での半減期を有していてもよい；本化合物は、少なくとも約３０日間、６０日間、１２０日間、６ヶ月間又は１年間の、溶液中での半減期を有していてもよい；ある化合物は、レスベラトロールよりも、少なくとも約５０％、２倍、５倍、１０倍、３０倍、５０倍又は１００倍の因数で、溶液中で安定であってもよい；ある化合物は、DNA修復因子Ku70の脱アセチル化を促進するものかも知れない；ある化合物は、RelA/P65の脱アセチル化を促進するものかも知れない；ある化合物は、全体的なターンオーバー速度を増し、細胞の対TNF誘導性アポトーシスに対する感受性を亢進するものでもよい。
【０４０２】
ここで解説された通りに治療できると思われる対象には、哺乳動物などの真核生物、例えば、ヒト、ヒツジ、ウシ、ウマ、ブタ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、マウス、及びラットなど、がある。治療できると思われる細胞には、例えば上述した対象などを由来とする真核細胞や、又は植物細胞、酵母細胞、並びに細菌細胞などの原核細胞、がある。例えば、飼育条件により長時間耐えられる能力を高めるように、作用物質を家畜に投与してもよい。
【０４０３】
医薬組成物及び方法の例
本方法に従って用いられる医薬組成物は、一つ以上の生理学的に許容可能な担体又は医薬品添加物を用いて、従来の態様で調合できよう。このように、化合物及びそれらの生理学的に許容可能な塩及び溶媒和化合物などの作用物質を、例えば注射、吸入又は通気（口腔又は鼻腔を通して）、又は経口、バッカル、非経口又は直腸投与などによる調合に向けて調合してもよい。ある実施態様では、罹患細胞などの標的細胞が存在する部位、即ち血中又は関節内に、作用物質を局所投与する。
【０４０４】
Ku70たんぱく質又はその部分、その変異体、このような物質をコードする核酸、抗体や、スクリーニング法で特定された化合物などの作用物質は、全身及び局部又は局所投与を含め、多様な投与付加に向けて調合できよう。技術及び調合は、概略的には、Remmington’s Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton,
PAに見られよう。全身投与の場合、筋肉内、静脈内、腹腔内、及び皮下を含め、注射が好ましい。注射の場合、作用物質を液体の溶液、好ましくはハンクス溶液又はリンガー液などの生理学的に適合性ある緩衝液、に入れて、調合することができる。加えて、作用物質を固形で調合し、使用直前に再溶解又は懸濁させてもよい。凍結乾燥型も含まれる。
【０４０５】
経口投与の場合、本医薬組成物は、例えば錠剤、ロゼンジ、又はカプセルなど、例えば結合剤（例えばアルファ化させたとうもろこしでんぷん、ポリビニルピロリドン又はヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えばラクトース、微結晶セルロース又はリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム、タルク又はシリカ）；崩壊剤（例えばいもでんぷん又はでんぷんグリコール酸ナトリウム）；又は湿潤剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）などの薬学的に許容可能な医薬品添加物と一緒に、従来の手段により調製される形を採っていてもよい。錠剤は、当業で公知の方法により被覆できよう。経口投与用の液体製剤は、例えば溶液、シロップ又は懸濁液などの形を採っていてもよく、あるいはこれらは、使用前に水又は他の適した賦形剤で構築される乾燥製品として提供されてもよい。このような液体製剤は、例えば懸濁剤（例えばソルビトール・シロップ、セルロース誘導体又は水和化食用油脂）；乳濁剤（例えばレシチン又はアラビアゴム）；非水性の賦形剤（例えばアチオンド（原語：ationd ）油、油性エステル、エチルアルコール又は精留植物油）；及び保存剤（例えばメチル又はプロピル-p-ヒドロキシベンゾエート又はソルビン酸）などの薬学的に許容可能な添加剤と一緒に、従来の手段により調製できよう。更に本製剤は、適宜、緩衝塩、着香料、着色料及び甘味料を含んでいてもよい。経口投与用の製剤は、適宜、活性化合物の放出を制御できるように調合してもよい。
【０４０６】
吸入による投与の場合、本作用物質を、便利なように、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素又は他の適したガスなど、適した推進剤を用いて、加圧されたパック又はネブライザからエーロゾル噴霧される形で送達してもよい。加圧されたエーロゾルの場合、投薬単位は、定量を送達するバルブを設けることにより、決定できよう。吸入器又は通気装置で用いられる、ゼラチンなどのカプセル及びカートリッジを、本作用物質と、ラクトース又はでんぷんなどの適した粉末基剤との混合粉末を含有するように、調合してもよい。
【０４０７】
例えば大量注射又は継続輸注など、注射による非経口投与用に作用物質を調合してもよい。注射用の調合物は、保存剤を加えて、アンプル又は複数回分用の容器などに入れて、単位剤形で提供されてもよい。本組成物は、油性又は水性の賦形剤に入れた懸濁液、溶液又は乳液などの形を採っていてもよく、また、懸濁剤、安定化剤及び／又は分散剤などの調合用薬剤を含有していてもよい。選択的には、活性成分は、使用前に無菌の無発熱源水などの適した賦形剤で構築できる粉末形であってもよい。
【０４０８】
更に作用物質を、ココアバター又は他のグリセリドなどの従来の座薬用基剤を含有するなど、座薬又は直腸浣腸剤などの直腸用組成物中に調合してもよい。
【０４０９】
前述した調合物に加え、本作用物質をデポー製剤として調合してもよい。このような長時間作用性の調合物は、（例えば皮下又は筋肉内など）移植や、又は筋肉内注射などによって投与できよう。従って、例えば本化合物は、適したポリマー製又は疎水性の材料（例えば許容可能な油に入れた乳濁液として）又はイオン交換樹脂で、あるいは、節約型可溶性塩などの節約型可溶性誘導体として、調合できよう。
【０４１０】
（美容用製剤を含む）医薬組成物は、重量で約0.00001 乃至 100%、例えば0.001 乃至 10% 又は0.1% 乃至 5% の、ここで解説された一種以上の作用物質を含んでいてもよい。
【０４１１】
ある実施態様では、局所的薬物投与に概ね向き、当業で公知のいずれかのこのような物質を含む局所用担体を含有する局所用調合物に作用物質を取り入れる。局所用担体は、例えば軟膏、ローション、クリーム、マイクロ乳液、ゲル、油、溶液等の所望の形で本組成物が提供されるように選択され、また天然で生じるか合成由来のいずれかの物質か成っていてもよい。選択される担体が、当該局所用調合物の活性な作用物質又は他の成分に悪影響を与えないことが好ましい。ここで用いられる適した局所用担体の例には、水、アルコール、及び他の無毒性有機溶媒、グリセリン、鉱物油、シリコーン、ワセリン、ラノリン、脂肪酸、植物油、パラベン、ろう等がある。
【０４１２】
調合物は無色、無臭の軟膏、ローション、クリーム、マイクロ乳液及びゲルであってよい。
【０４１３】
作用物質を軟膏に取り入れてもよく、この軟膏は一般的には半固体の製剤であり、典型的には石油又は他の石油誘導体をベースとする。用いるべき具体的な軟膏基剤は、当業者であれば明らかであろうが、最適な薬物送達に役立ち、そして好ましくは、例えば軟化性などの他の所望の特徴も提供するようなものである。他の担体又は賦形剤と同様に、軟膏基剤は、不活性で安定、非刺激性かつ非感作性でなくてはならない。前記の項で引用されたRemington 'sで説明されているように、軟膏基剤は四つのクラスに分類できよう：油性の基剤；乳化性の基剤；乳液基剤；及び水溶性の基剤。油性の軟膏基剤には、例えば植物油、動物由来油、動物由来の脂肪；及び石油由来の半固体炭化水素、がある。吸収性の軟膏基剤としても知られ、水をほとんど含まないか、又は全く含まない乳化性の軟膏基剤には、例えばヒドロキシステアリンスルフェート、無水ラノリン及び親水性ワセリンがある。乳液の軟膏基剤は油中水 (W/O) 乳液又は水中油 (O/W) 乳液のいずれかであり、例えばセチルアルコール、グリセリルモノステアレート、ラノリン及びステアリン酸がある。水溶性の軟膏基剤の例は、多様な分子量のポリエチレングリコール（PEG）から調製されるものである。更なる情報をについてはやはり上記のRemington'sを参照されたい。
【０４１４】
作用物質をローションに取り入れてもよいが、このローションは一般的には摩擦なしで皮膚表面に塗られる製剤であり、典型的には、活性な作用物質を含む固体粒子が水中又はアルコール基剤中に存在する液体又は半液体の製剤である。ローションは通常、固体を懸濁させた懸濁液であり、水中油型の液体油性乳液を含んでいてもよい。ローションは、流動性の高い組成物の適用が容易になるため、大きな体表面積を治療するためには好適な調合物である。一般的には、ローション中の不溶性の物質は微細に分割されている必要がある。ローションは典型的には、分散をより良好に行わせ、例えばメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム等、活性な作用物質を皮膚と接触した状態に位置決めして保持するために有用な化合物を提供するために、懸濁剤を含有するであろう。本方法との関連で用いられるローション調合物の一例は、Beiersdorf社（コネチカット州ノーウォーク）から商標AquaphorRTMで得られるものなど、親水性ワセリンと混合されたプロピレングリコールを含有するものである。
【０４１５】
一般的には水中油又は油中水のいずれかである粘性の液体又は半固体の乳液であるクリームに作用物質を取り入れてもよい。クリームの基剤は水で洗い流すことができ、油相、乳化剤及び水相を含有する。この油相は一般的にはワセリンと、セチルもしくはステアリルアルコールなどの脂肪アルコールとから成り、水相は通常、必ずしもではないが、体積の点で油相を超え、一般的には保湿剤を含有する。クリーム調合物中の乳化剤は、上記のRemington 'sで説明されている通りに、一般的には非イオン性、陰イオン性、陽イオン性又は両向性の界面活性剤である。
【０４１６】
一般的には熱力学的に安定であり、界面活性剤分子の界面膜により安定化させた二つの不混和性の液体の等方的に透明な分散液であるマイクロ乳濁液に作用物質を取り入れてもよい(Encyclopedia of Pharmaceutical Technology (New York: Marcel Dekker,
1992), volume 9)。マイクロ乳濁液の調製に際しては、界面活性剤（乳化剤）、共界面活性剤（共乳化剤）、油相及び水相が必要である。適した界面活性剤には、例えばクリームの調製時に典型的に用いられる乳化剤など、乳液の調製に有用ないずれかの界面活性剤がある。共界面活性剤（又は「共乳化剤」）は、一般的には、ポリグリセロール誘導体、グリセロール誘導体及び脂肪アルコールから成る群より選択される。好適な乳化剤／共乳化剤の組み合わせは、必ずしもではないが一般的に、グリセリルモノステアレート及びポリオキシエチレンステアレート；ポリエチレングリコール及びエチレングリコールパルミトステアレート；並びにカプリル酸及びカプリン酸トリグリセリド及びオレオイルマクロゴルグリセリドから成る群より選択される。水相は、水だけでなく、典型的には緩衝剤、グルコース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、好ましくは低分子量ポリエチレングリコール（例えばPEG 300又はPEG 400）、及び／又はグリセロール等を含むが、油相は一般的には、例えば脂肪酸エステル、加工植物油、シリコーン油、モノ-、ジ-及びトリグリセリドの混合物、PEGのモノ-及びジ-エステル（例えばオレオイルマクロゴルグリセリド）等を含むであろう。
【０４１７】
一般的には低無機分子の粒子（二相系）又は高有機分子のいずれかが担体液体（単一相のゲル）全体に概ね均一に分散したものから成る懸濁液から成る半固体系であるゲル調合物に作用物質を取り入れてもよい。単一相ゲルは、例えば活性な作用物質、担体液体、及び、適したゲル化剤、例えばトラガカント（２乃至５％）、アルギン酸ナトリウム（２乃至１０％）、ゼラチン（２乃至１５％）メチルセルロース（３乃至５％）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（２乃至５％）、カルボマー（０．３乃至５％）又はポリビニルアルコール（１０乃至２０％）を一緒にして配合し、特徴的な半固体の生成物が生ずるまで混合することにより、作製することができる。
他の適したゲル化剤には、メチルヒドロキシセルロース、ポリオキシエチレン-ポリオキシプロピレン、ヒドロキシエチルセルロース及びゼラチンがある。ゲルは通常、水性の担体液体を用いるが、アルコール及び油類も、担体液体として用いることができる。
【０４１８】
当業者に公知の多様な添加剤を、局所用調合物などの調合物に含めてもよい。添加剤の例には、限定はしないが、可溶化剤、皮膚浸透促進剤、乳白剤、保存剤（例えば抗酸化剤）、ゲル化剤、緩衝剤、界面活性剤（特に非イオン性及び両向性界面活性剤）、乳化剤、軟化剤、増粘剤、安定化剤、保湿剤、着色剤、香料等がある。乳化剤、軟化剤及び保存剤と共に、可溶化剤及び／又は皮膚浸透促進剤の含有が特に好ましい。最適な局所用調合物は、ほぼ：２重量％乃至６０重量％、好ましくは２重量％乃至５０重量％の可溶化剤及び／又は皮膚浸透促進剤；２重量％乃至５０重量％、好ましくは２重量％乃至２０重量％の乳化剤；２重量％乃至２０重量％の軟化剤；及び０．０１乃至０．２重量％の保存剤を、この調合物の残りを構成する活性な作用物質及び担体（例えば水）と一緒に含む。
【０４１９】
皮膚浸透促進剤は、治療的レベルの活性な作用物質が、損傷のない皮膚の妥当な大きさの部分を通る通過を促すのに役立つ。適した促進剤は当業で公知であるが、その中には、例えば：メタノール、エタノール及び2-プロパノールなどの低級アルカノール：ジメチルスルホキシド（DMSO）、デシルメチルスルホキシド（C10MSO）及びテトラデシルメチルスルホキシドなどのアルキルメチルスルホキシド；2-ピロリドン、N-メチル-2-ピロリドン及びN-(-ヒドロキシエチル)ピロリドンなどのピロリドン；ウレア；N,N-ジエチル-m-トルアミド；C2−C6アルカンジオール；ジメチルホルムアミド (DMF)、N,N-ジメチルアセトアミド (DMA)及びテトラヒドロフルフリルアルコールなどのその他の溶媒；及び1-置換アザシクロヘプタン-2-オン、特に1-n-ドデシルシクロアザシクロヘプタン-2-オン（ラウロカプラム；商標名 AzoneRTM でヴァーモント州リッチモンドのWhitby Research社から入手可能）、がある。
【０４２０】
可溶化剤の例には、限定はしないが、以下のものがある：ジエチレングリコールモノエチルエーテル（エトキシジグリコール、TranscutolRTM）として市販のものを入手可能）及びジエチレングリコールモノエチルエーテルオレエート（SoftcutolRTMとして市販のものを入手可能）などの親水性のエーテル；ポリオキシ35ひまし油、ポリオキシ40硬化ひまし油等のポリエチレンひまし油誘導体；ポリエチレングリコール、特に、PEG 300 及び PEG 400などの低分子量ポリエチレングリコール、並びに、PEG-8 カプリル酸／カプリン酸グリセリド（LabrasolRTMとして市販のものを入手可能）などのポリエチレングリコール誘導体；DMSOなどのアルキルメチルスルホキシド；2-ピロリドン及びN-メチル-2-ピロリドンなどのピロリドン；並びにDMA。数多くの可溶化剤を、吸収促進剤としても作用させることができる。単一の可溶化剤を本調合物に取り入れてもよく、あるいは、可溶化剤の混合物をそこに取り入れてもよい。
【０４２１】
適した乳化剤及び共乳化剤には、限定はしないが、マイクロ乳液調合物に関して解説された乳化剤及び共乳化剤がある。乳化剤には、例えば、プロピレングリコール、グリセロール、イソプロピルミリステート、ポリプロピレングリコール-2 (PPG-2)ミリスチルエーテルプロピオネート等がある。
【０４２２】
限定はしないが、アントラニレート、ベンゾフェノン（特にベンゾフェノン-3）、カンフル誘導体、桂皮酸（例えばオクチルメトキシ桂皮酸）、ジベンゾイルメタン（例えばブチルメトキシジベンゾイルメタン）、p-アミノ安息香酸（PABA）及びこれらの誘導体、及びサリチル酸塩（例えばオクチルサリチレート）を含め、例えば他の抗炎症剤、鎮痛薬、抗微生物剤、抗カビ剤、抗生物質、ビタミン、抗酸化剤、及び、サンスクリーン調合物に通常見られる日光遮断剤など、他の活性な作用物質を処方に含めてもよい。
【０４２３】
いくつかの局所用調合物においては、活性な作用物質は、当該調合物のほぼ０．２５重量％乃至７５重量％の範囲、好ましくは当該調合物のほぼ０．２５重量％乃至３０重量％の範囲、より好ましくは当該調合物のほぼ０．５重量％乃至１５重量％の範囲、そして最も好ましくは当該調合物のほぼ
１．０重量％乃至１０重量％の範囲の量、存在する。
【０４２４】
局所用皮膚治療用組成物は、その粘性や、消費者が意図する用途に合うような適した容器に梱包することができる。例えばローション又はクリームは、ビン又はロール・ボール・アプリケータや、あるいは、推進剤で駆動されるエーロゾル装置又は指で操作するのに適したポンプを備えた容器に、梱包することができる。組成物がクリームである場合は、それを単に変形不能のビン、又は、チューブ又はフタ付きのビンなどの絞り出しビンに保存することができる。更に本組成物を、米国特許第5,063,507号に解説されたものなどのカプセルに容れてもよい。従って、ここで定義する通りに美容上許容可能な組成物を含有する密閉された容器も提供される。
【０４２５】
ある代替的な実施態様では、経口又は非経口投与用の医薬調合物が提供されるが、この場合、当該調合物に、上述したような活性化性化合物を含有するマイクロ乳液を含めてもよいが、経口又は非経口による薬物投与に特に適した代替的な薬学的に許容可能な担体、賦形剤、添加剤等を含めてもよい。選択的には、作用物質を含有するマイクロ乳液を、改変を行うことなく概ね上に記載した通りに経口又は非経口投与してもよい。
【０４２６】
例えばここで解説された作用物質でex vivoで処理されなどをされた細胞を、移植片を対象に投与する方法に従って投与することができるが、これには、シクロスポリンなど、免疫抑制剤の投与などを伴わせてもよい。医薬調合の一般的な原則に関しては、読者はCell Therapy: Stem Cell Transplantation, Gene Therapy, and Cellular
Immunotherapy, by G. Morstyn & W. Sheridan eds, Cambridge University Press,
(1996); 及び
Hematopoietic Stem Cell Therapy, E. D. Ball, J. Lister & P. Law, Churchill
Livingstone, (2000)を参照されたい。
【０４２７】
以上、本発明を概略的に解説してきたが、以下の実施例を参照すればより容易に理解されよう。但し以下の実施例は本発明の特定の局面及び実施態様の実例を挙げることを目的として含まれたのであり、本発明を限定するものとしては意図されていない。
【０４２８】
実施例
実施例１：  Ku70/80 はin vivoでCBP 及びPCAF によりアセチル化する
アセチル化は、多くの非ヒストンたんぱく質が調節される重要な機序として浮かび上がってきている (Chan et al., Nat. Cell Biol. 3, 667-674 (2001); Gu
and Roeder. Cell 90, 595-606 (1997);
Liu et al., Mol. Cell. Biol. 19,1202-1209 (1999); Sakaguchi et al., Genes Dev. 12,2831-2841 (1998))。例えば、p53のC末端の三つのリジン（即ち、K373、K382、及びK320）の CBP、PCAF、又はp300 によるアセチル化で、このたんぱく質の安定性が増し、p53-依存的転写が増加することで、成長の停止及びアポトーシスが促進される（Grossman, Eur. J. Biochem.
268, 2773-2778 (2001)にレビュー）。DNA損傷シグナル後にアセチル化すると思われる更なる因子を特定するために、p53のＣ末端のアセチル化部位の二つのクラスタ（aa 302-326 及び 367-392）に対して相同性を持つたんぱく質を探した。最も近い対合の一つは、その見かけの柔軟性のために構造的に定義することが困難なKu70のＣ末端リンカ領域に対してであった (Zhang et al., J. Biol. Chem. 276, 38231-38236 (2001)) （図１Ａ）。Ku70/p53 をアライメントすると潜在的なコンセンサス配列 [(T)KRKX3-5-
SGSX2KK] が示唆され、この潜在的なコンセンサス配列は、フラップ・エンドヌクレアーゼFEN1、転写因子 GATA1、及び転写開始因子 EFIIEβ（図１B）の公知のアセチル化ドメインともアライメントした。このアライメントに基づき、我々は、Ku70のＣ末端リンカドメインリンカのリジンが、in vivoでのアセチル化のターゲットであろうと予測した。
【０４２９】
この予測を調べるために、我々は、pan-アセチル-リジン (panAc-K)に対するウサギポリクローナル抗体を作製した。ウェスタン・ブロット分析によると、この抗体はアセチル化したたんぱく質を特異的に認識し、アセチル化していない組換えKu70は認識しなかった。HeLa細胞からの細胞抽出物を抗Ku70モノクローナル抗体 (mAb) か、又は陰性コントロールとしての抗ヘマグルチニン (HA) mAb で免疫沈降させ、panAc-K 抗体でプローブした。図１Ｃに示すように、二つのバンドが抗Ku70 免疫沈降 (IP) レーンのpan-Ac-Kで認識されたが、コントロールでは認識されなかった（左側のパネル）。ブロットを抗Ku70 又は抗Ku80 モノクローナル抗体で再プローブしたところ、アセチル化したバンドはKu70及びKU80の位置に相当することが確認された（図１Ｃ、中央及び右側パネル）。逆実験では、panAc-K抗血清による免疫沈降では、Ku70 及びKu80 が沈降したが、免疫前血清では沈降しなかった（図１Ｄ）。これらの結果は、Ku70およびKu80がin vivoではアセチル化していることの強力な証拠である。
【０４３０】
三つのヒストンアセチルトランスフェラーゼCBP、p300、及びPCAF が、非ヒストンたんぱく質をアセチル化のターゲットとすることが公知である (Brown et al., Trends Biochem. Sci. 25,15-19 (2000))。Ku70 がin vivoでこれらのアセチルトランスフェラーゼと相互作用するかどうかを調べるために、我々は、HeLa又は293細胞由来のKu70を免疫沈降させ、その免疫複合体をCBP、p300、又はPCAFについてプローブした。両方の細胞株で、我々は、
天然CBP及び Ku70間の相互作用を検出できたが、Ku80ではできなかった（図１Ｅ）。このCBP-Ku70相互作用は、DNAインターカレート剤エチジウムブロミド(50μg/ml)では損なわれなかったことから、このたんぱく質相互作用は、DNAにより架橋されるのではないことが示唆された。PCAF 及びKu70 間では弱い相互作用がIPで観察されたが、p300 及び Ku70間では何の相互作用も検出できなかった。
【０４３１】
実施例２：  Ku70はCBP、PCAF及びp300アセチルトランスフェラーゼの基質である
次に、我々は、Ku70/80
複合体がCBP、PCAF、又はp300の基質として働くのかどうかをin vitro アセチル化検定を用いて調べた。組換えKu70/80 複合体を昆虫細胞から精製し、[3H]-acetyl-CoA及びCBP、PCAF、又はp300のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（HAT）ドメインと一緒にインキュベートした。次にその反応性生物をSDS-PAGEで分離し、オートラジオグラフィで分析した。図２Ａに示すように、Ku70の大きさに相当する強力に標識された一本のバンドが、完全なアセチルトランスフェラーゼ反応（レーン４−６）のそれぞれで観察されたが、組換えKu70/80を欠く反応（レーン１−３）又はアセチルトランスフェラーゼを欠く反応（レーン７）では観察されなかった。Ku80に相当する弱いバンドも観察された（レーン４−６）。これらの条件下では、これらの酵素の基質として作用することが公知のp53コントロールペプチドは、同様な程度、CBP、PCAF、及びp300により標識された (Liu et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19:1202)。これらの結果は、Ku70がこれら三つのアセチルトランスフェラーゼすべての効率的な基質として働くことができることを実証している。バンドの輝度に基づくと、CBP はKu70に対して最も優れた結合性を有し、in vivoでのKu70とCBPとの間の強力な相互作用と一致した。
【０４３２】
Ku70とCBPとの間の強力な相互作用や、in vivoでのKu70の効率的なアセチル化のために、我々は、Ku70のうちでアセチル化のターゲットとなる領域を定義しようとした。Ku70配列全体を網羅するように３１個のペプチドのライブラリを合成した（図２Ｂ）。これらのペプチドのそれぞれを、上述したアセチル化反応で、PCAF又はCBPのいずれかのHATドメインと一緒にインキュベートした。ここでもp53ペプチドを陽性コントロールとして役立てた。表３に示すように、該ペプチドのうちの５つ（3, 8, 15,16, and 29）がPCAFによりアセチル化したが、僅かに２つ（16 及び 29）が、PCAF 及びCBP の両方で強くアセチル化した（図２Ｃ）。興味深いことに、二つのリジン（K331及びK338）を含有するペプチド16（RQIILEKEETEELKRFD325-341）が、破壊されたDNAにもぐり込むリング構造を形成するKu70領域内に位置しているDNA (Walker et al., Nature 412:607-614 (2001)) （図３Ｃを参照されたい）。４つのリジン（K542、K544、K553、及びK556）を含有するペプチド29 (TKRKHDNEGSGSKRPKVEYSEE541-562)は、我々が以前、アセチル化の潜在的ターゲットとして特定したＣ末端の柔軟性リンカ領域内に位置している（図１Ｂを参照されたい）。
【０４３３】
【表３】
2008503479.tif 000053
【０４３４】
ペプチド29のどのリジンがこの反応でアセチル化するのかを判定するために、４つのリジンのうちの３つを、アセチル化できない残基であるアルギニンに置換する一連の置換を行った。次に、各ペプチドをPCAF 又はCBPのいずれかと一緒にインキュベートし、オートラジオフラフィにより上述したように分析した。図２Ｄに示すように、K542 (KRRR) を残したペプチドは、PCAF 及びCBPの両方の好適なターゲットでり、もとのペプチド29 (KKKK)とほど同程度までアセチル化した。K553 (RRKR) もPCAF 及びCBPにより弱くアセチル化した。これらの結果は、K542 及びK553 がin vivoでCBP 及びPCAFのターゲットであろうことを示唆している。
【０４３５】
実施例３：  Ku70のうちの、in vivoでアセチル化する領域を特定する
Ku70のＣ末端リンカがin vivoでアセチル化するのかどうかを調べるために、Ku70のアミノ酸537-557を、GFPへの融合体 (pEGFP-Ku70537-557)としてして発現させた (Bertinato et al., J. Cell Sci. 114, 89-99 (2001))。この融合ペプチドをHeLa細胞から抗GFP抗体を用いて免疫沈降させ、アセチル化をウェスタン分析によりpanAc-Kポリクローナル抗体を用いて評価した。図２Ｅに示すように、panAc-K 抗体はGFPKu70537-557 融合体を強く認識したが、タグを付けていないGFPコントロールは認識せず、このKu70リンカ領域が、in vivoではアセチル化のターゲットであることが示唆された。
【０４３６】
次に、我々は、Ku70のうちのこの領域及び他の領域がin vivoでアセチル化するというより決定的な証拠を提供しようとした。我々は、6xHIS-Ku80を安定に発現している293細胞から、Ni-NTAアガロース・カラムでのワン・ステップ精製を用いて、あるいは、HeLa細胞から、抗Ku70ポリクローナル抗体を用いた免疫沈降と、続くSDS-PAGE分離により、Ku70を精製した。次に、単離後のたんぱく質をトリプシン、キモトリプシン、V8、又はAspNのいずれかで消化し、タンデム型質量分析を行った（LC-MS/MS、実施例１を参照されたい）。配列の網羅率を最大にするために複数のプロテアーゼを用いた。
【０４３７】
Ku70の配列の８０％を網羅するKu70由来ペプチドを合成し、８箇所のアセチル化部位をMASCOT検索アルゴリズムを用いて特定した(Perkins et al., Electrophoresis 20:3551-3567 (1999))・６箇所の部位は、ペプチド 16 及び29（それぞれK331、K338、及びK542、K544、K553、K556）という、in vitroではPCAF及びCBPにより強くアセチル化したのと同じ二つのペプチド（図２Ｃを参照されたい）に網羅される領域内に位置していた（図３Ａ）。in vivo アセチル化の証拠もK317 及び K539について得られた。後者の残基は、ペプチド29の領域の近くに位置しており、この見かけのＣ末端アセチル化ドメインの一部とも思われる。大半のペプチドは２箇所以上のリジンでアセチル化するようであり、いくつかは完全にアセチル化したことから、in vivoでは複数種のアセチル化Ku70があることが示唆された（図３Ａ）。アセチル化リジン残基の大半は、少なくとも２つの個別のたんぱく質標品を由来とする絨複数ペプチド中で検出された。該ペプチド（aa 527-553）で実証されたように、143 Daのイモニウム（原語：immonium ）イオンが各ペプチドで現れたことは、アセチル化の更なる証拠となった（図３Ｂ）。ペプチド16及び29中のアセチル化残基の位置は、予測されたKu70結晶構造で示されている (Walker et al., Nature 412, 607-614 (2001))（図３Ｃ）。
【０４３８】
リジンのアセチル化は、非ヒストンたんぱく質の重要な調節機序であると認識されてきたが、アセチル化により調節されると判明したたんぱく質の数はかなり少ないままである。これは、部分的には、アセチル化を研究するために利用できるツールの数が限られていることが原因である。ここで我々は、アセチル化部位を特定する補完的な技術の強力な組み合わせを示す。我々は、配列アライメント及びペプチド・ライブラリのスキャンニングを用いて、アセチル化の潜在的in vivoターゲットやそれらの対応するアセチルトランスフェラーゼを成功裡に特定できることを示す。このアプローチの妥当性は、p53のK305がin vivoでアセチル化するという我々の予測を裏付けた最近の確認により例証されている (Wang et al., J. Biol. Chem. 278, 25568-25576 (2003)) （図１を参照されたい）。我々は、アセチルトランスフェラーゼ反応における特異性がin vitroでも高いこと、そしてin vitro で特定された部位が、in vivo ターゲットの良好な予測材料であることを観察した。
【０４３９】
実施例４：  Ku70はHDAC 及びサーチュイン脱アセチル化酵素のターゲットである
In vivoでのたんぱく質アセチル化レベルは、アセチルトランスフェラーゼと対抗する脱アセチル化酵素の活性間の動的平衡の結果である。ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）は、それらの相同性、基質要件、及び特定の阻害剤に対するそれらの感受性に基づき、三つのクラスに分類することができる。クラスI/IIデアセチラーゼは阻害剤トリコスタチンA（TSA）に感受性であるが、NAD+依存的サーチュイン・ファミリーのクラスIIIデアセチラーゼは、ニコチンアミド（NAM）により特異的に阻害される (NAM) (Bitterman et al., J. Biol. Chem. 277:45099-45107 (2002); Landry et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.
278:685-690 (2000); Luo et al., Cell 107, 137-148 (2001); Yoshida and
Horinouchi, Ann. N Y Acad. Sci. 886,
23-36 (1999))。
【０４４０】
In vivoでどのクラスのデアセチラーゼがKu70をターゲットとするかを判定するために、細胞をTSA又は NAMのいずれかで処理し、Ku70アセチル化レベルをpanAc-K 抗体を用いて検出した。 NAM (5 mM) 又はTSA (1μM) のいずれかによる処理により、Ku70の総アセチル化レベルがそれぞれ１．８倍及び２．４倍に増加した（図４Ａ）。併用治療による効果は相加的であり、総アセチル化が４倍に増加した（図４Ａ）これらの結果は、Ku70は、in vivoではI/IIクラスの両方のHDAC及びクラスIII/サーチュインデアセチラーゼによる脱アセチル化のターゲットであることを示唆している。
【０４４１】
実施例５：  Ku70アセチル化はBax媒介性アポトーシスを調節する
Ku70のＣ末端リンカ・ドメインがin vitroでCBP及びPCAFのターゲットであり、それはBax相互作用ドメインの隣にあるということに基づき、我々は、この領域のアセチル化が、Ku70のアポトーシス抑制能を調節する上で役割を果たしているという仮説をたてた。ヒト胚腎細胞(293T) にBax-YFP 発現コンストラクトをトランスフェクトし、YFP陽性細胞を２４時間後に、よく特徴付けられたアポトーシス表現型である核の断片形成について評価した(Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003))。以前の報告と一致して、完全長Ku70の過剰発現は、Baxによるアポトーシス誘導を抑制した（図４Ｂ）。
【０４４２】
Ku70アセチル化の増加がBax媒介性アポトーシスに影響を与えたかどうかを調べるために、同じ実験をHDAC
阻害剤 NAM及び／又はTSAの存在下で行った。図４Ｂに示すように、細胞をNAM 又は TSAで処理すると、Ku70のアポトーシス抑制能が損なわれた。TSAの場合、アポトーシス抑制は完全に遮断された。両方の阻害剤で同時に処理したところ、アポトーシスに対して相加的な効果があり（図４Ｂ）、細胞死は未処理細胞よりも僅かに高く、アセチル化したKu70は、アポトーシスを促進する上で付加的な役割を果たすという可能性が浮かび上がった。細胞を、HDAC阻害剤で、Baxトランスフェクトなしで処理したところ
アポトーシスに対して何ら認められる効果はなかった。
【０４４３】
我々は、異所性のKu70発現の存在下で観察された前記の結果が、内因性たんぱく質の役割を表すものであることを確認したかった。第一に、内因性Ku70の発現は、Ku70アンチセンス（AS-Ku70）コンストラクトを293T細胞に導入すると７分の１に減少した。以前の報告(Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003)) と一致して、これは空のベクタ・コントロールに比較してBax媒介性アポトーシスの著しい増加につながった（図４Ｃ）。第二に、Ku70を欠くマウス胚性線維芽細胞（MEF）Ku70 (Ku70-/-)にYFP Baxをトランスフェクトし、,アポトーシスのレベルを、上述した通りに判定した（図４Ｄ）。アンチセンス実験と一致して、Ku70-/- 細胞は、Ku70+/+ MEFに比較して高いレベルのBax媒介性アポトーシスを示した。更に、Ku70を Ku70-/- 細胞に再導入すると、アポトーシスのレベルが、野生型Ku70+/+ 細胞のそれまで回復した。まとめると、これらの結果は、内因性Ku70はBax媒介性アポトーシスを抑制することを実証している。
【０４４４】
次に、我々は、Ku70ばBax媒介性アポトーシスを、Ku70/80複合体の一部として抑制するのか、あるいはKu70が単一のポリペプチドとして作用するのかどうかに着目した。図４Ｅに示すように、Ku70は、Ku80を欠くCHO細胞でBax媒介性アポトーシスを抑制した (Bertinato et al., J. Cell Sci. 114, 89-99 (2001)) ことから、Ku70のアポトーシス抑制能は、Ku80との結び付きに依存しないことが実証された。更に、Ku70及びKu80の細胞レベル下分布を比較すると、核内プールに比べ、細胞質ゾル中ではKu80よりもKu70の方が著しく高い比率になっていることが示される（図４Ｆ）。まとめると、これらの発見から、Ku70はKu80とは独立にBaxを隔絶すること、そしてこの結び付きは細胞質ゾル中で起きると思われることが分かる。
【０４４５】
実施例６：   K539 and K542 のアセチル化はBax媒介性アポトーシスを促進する
Ku70のアセチル化が、そのBax抑制能を調節している可能性を更に検査するために、我々は、CBP 及びPCAFを過剰発現している細胞内でのBax誘導性アポトーシスを調べた。TSA/NAM結果と一致して、CBP 又はPCAFのいずれかが過剰発現するとKu70のアポトーシス抑制能が失われるが、Ku70の非存在下でCBP又はPCAFが過剰発現しても、認められる効果は何もなかった（図５Ａ及び図５Ｂ）。CBP又はPCAF が単独で過剰発現しても、やはり何の効果もなかった。
【０４４６】
次に、我々は、この表現型が、Ku70の柔軟なリンカ領域内のリジンのアセチル化を特異的な原因とするものかどうかを調べた。我々はこれらの残基のそれぞれをグルタミン (K を Qに) 又はアルギニン (K をRに)のいずれかに置換して、それぞれアセチル化又は非アセチル化状態を構成的に模倣した（Li et al., J. Biol. Chem. 277:50607-50611 (2002)）。次に、293T細胞に、YFP-Bax発現コンストラクトを、野生型か、又は、我々がウェスタン分析で野生型コンストラクトと同様なレベル発現することを確認してある変異型Ku70発現ベクタのそれぞれと一緒に同時トランスフェクトした（データは図示せず）。２４時間後にアポトーシスを起こすYFP陽性細胞のパーセンテージを採点した。５つのリジン残基のいずれかをアルギニンに（K539R、K542R、K544R、K553R、又はK556R）置換した単一置換では、Ku70のBax媒介性アポトーシス抑制能に何の有意な効果もなかった（図５Ｃ）。対照的に、リジン539 又は 542のいずれかをグルタミンに (K539Q 及び K542Q) 置換すると、Ku70のBax阻害能が完全に遮断され、他方、K553Q 置換では中間の効果があった（図５Ｃ）。
【０４４７】
Ku70 はDNA修復たんぱく質であるため、我々は、DNA損傷の無い状態で誘導される、Ku70のアポトーシスに対する効果を調べたかった。スタウロスポリン（STS）ホスホリピド/Ca2+-依存的及びサイクリックヌクレオチド依存的キナーゼを阻害するアルカロイドであり、Bax及びBakなどのアポトーシス促進性Bc12ファミリー・メンバーを活性化することにより、DNA損傷とは独立にアポトーシスを誘導することができる (Rampino et al., Science 275:967-969(1997); Wei et al., Science 292:727-730 (2001))。STS-処理細胞で、Ku70 はBax媒介性アポトーシスを選択的に阻害することが知られている (Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003))。図５Ｄに示すように、Ku70を過剰発現させるとSTS-処理細胞のアポトーシスが遮断されるが、他方、変異型K539Q 及びK542Q ではされなかった。In vitroアセチル化研究及びLC-MS/MSデータと合わせると、これらの結果は、Ku70中の残基K539 及び K542のアセチル化がBax媒介性アポトーシスの調節にとって重要であることの強力な証拠である。
【０４４８】
上記の結果に基づき、我々は、Ku70アセチル化のレベルは細胞損傷後に増加するのではないかと予測した。これを調べるために、我々は、Ku70がアポトーシスを抑制することが知られている条件である紫外線処理後のKu70アセチル化の時間経過分析を行った (Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003))。293T細胞を200 J/cm2 の紫外線に暴露し、Ku70のアセチル化レベルを、それから３６、１２、及び２４時間後に調べた。この時間経過では、Bax活性化と相関する、紫外線への暴露から３時間から６時間までの間にKu70のアセチル化が増加したことが示され（図６Ａ）た (Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5, 320-329 (2003))。ＤＮＡ損傷後のKu70の安定性については矛盾する報告があり(Nothwehr and
Martinou, Nat. Cell Biol. 5, 281-283
(2003)) 、我々の実験では、全体的なKu70レベルの減少は検出されなかった（図６Ａ）。興味深いことに、Ku70アセチル化の増加は、CBPの細胞質ゾルへの移動と相関した（図６Ｂ）。この観察は、細胞損傷後にCBPが核から細胞質ゾルに移行することが、Bax媒介性アポトーシスにおける鍵となる調節ステップと思われることを示唆している。
【０４４９】
実施例７：  HDAC阻害剤は内因性Ku70-Bax相互作用を失わせる
これらの結果の最も簡単な説明は、アセチル化はKu70の抗アポトーシス機能を、それがミトコンドリアからBaxを隔絶する能力に干渉することで調節するというものである。このモデルを調べるために、我々は、Ku70アセチル化を増加するものであることを以前に我々が示した条件であるTSA/ NAMで処理した293T細胞で、内因性Ku70-Bax相互作用を調べた（図４Ａを参照されたい）。細胞をこの阻害剤で１２時間、処理し、そのKu70-Bax 相互作用を、Ku70を免疫沈降させてからBaxの免疫複合体をプローブすることで評価した。図６Ｃに示すように、TSA 及びNAMによる処理で、Ku70に結び付くBax量が著しく減少した。逆IP実験では、TSA及びNAM で抗Bax抗体のKu70免疫沈降能を完全に失われた。これらの結果に基づき、我々は、アセチル化したKu70は、Baxに結合してBax隔絶することができないためにアポトーシスを阻害しないのであると結論した。
【０４５０】
数多くの最近の観察で、アセチルトランスフェラーゼが腫瘍の抑制に結び付けられているが、このプロセスにおけるそれらの役割はあまり理解されていない(Giordano and Avantaggiati, J.
Cell. Physiol. 181: 218-230 (1999)) 。この研究で我々は、
（１）Ku70リンカ領域は、他のたんぱく質公知のアセチル化部位のクラスタとアライメントすること；（２）Ku70 は、DNA結合ドメイン及び柔軟性のリンカ領域の残基を含め、in vitro 及びin vivoで複数の部位でアセチル化すること；（３）in vitro 及びin vivoで、CBP及びPCAFはKu70と結び付いてKu70をアセチル化の標的とすること；（４）内因性Ku70のBax媒介性アポトーシス抑制能はKu80からは独立であること；（５）この機能は、細胞をHDAC阻害剤で処理するか、あるいはCBP又はPCAFを過剰発現させることにより、Ku70アセチル化を増す処理により、阻害することができること；（６）Ku70のうちのＣ末端リンカ領域中の２つの重要案リジン（K539およびK542）のアセチル化を模倣する変異があれば、Ku70の抗アポトーシス機能を遮断するには充分であること；（７）細胞をHDAC阻害剤で処理することでKu70アセチル化のレベルを増すと、Ku70とBaxとの間の相互作用が失われること；そして（８）Ku70のアセチル化レベルは紫外線処理後に増加し、これは、核から細胞質ゾルへのCBPの移行と一致すること、を示す。まとめると、これらの結果は、CBP及び／又はPCAF によるKu70のアセチル化は、アポトーシス・シグナル後の細胞の運命を決定する上で枢軸的な役割を果たすことを示している。
【０４５１】
p300、CBP、及びPCAFなどのアセチルトランスフェラーゼが、細胞成長、分化、又はアポトーシスへの運命を決定付ける環境シグナルの媒介物質として作用することが次第に明確になりつつある。これらの経路におけるそれらの重要性は、これらのアセチルトランスフェラーゼ遺伝子中での欠失、転座及び点変異が数多くの腫瘍で見つかっており、癌素因疾患であるルベンスタイン-タイビ症候群と関係するという発見により、裏付けられている(Rebel et al., 2002, PNAS 99:14789)。我々の結果は、アセチルトランスフェラーゼが腫瘍発生を抑制する主な機序はBax媒介性アポトーシスを調節することによるものだということを示している。この研究では、我々が用いたのは293T細胞という、機能的p53を欠く細胞である。従って、我々が観察した効果は、おそらくはp53活性からは独立であろう。興味深いことに、紫外線処理後のp53のアセチル化は、Ku70アセチル化及びBax活性化と同じタイプフレームで起きる(Liu et al., 1999, Mol. Cell. Biol. 19:1202) 。このことから、CBP及びPCAF は２つの並行する経路を解してアポトーシスを促進する可能性が浮かび上がり、このときの経路の一方はBax活性化につながるKu70アセチル化に関するものであり、他方はp53のアセチル化及び活性化に関するものである。
【０４５２】
ヒストンデアセチラーゼクラスI/II 阻害剤は今や、白血病及び充実腫瘍の治療に関して検査されている (Johnstone and Licht, Cancer
Cell 4, 13-18 (2003))。なぜ、癌細胞はクラス I/II HDAC阻害剤に対して感受性であるのに正常細胞は感受性でないのかは不明である。これを説明するために、癌治療におけるクラスI/II HDAC阻害剤の主なターゲットは転写ではないと思われることが示唆されている(Johnstone and Licht, 2003)。我々の発見は、このような化合物の効験がKu70の活性阻害を原因とするものと考えられることを示唆しており、このたんぱく質を、抗癌療法の魅力的なターゲットとして特定している。TSA、TPX、及び酪酸ナトリウムなどの阻害剤を抗癌剤として用いた多くの研究が文献で報告されてきた (Rahman et al., Blood 101, 3451-3459 (2003); Yoshida et al., Cancer Chemother. Pharmacol. 48:S20-S26 (2001))。ニコチンアミド及びTSAの組み合わせにより、BaxのKu70依存的阻害が完全に遮断されるという我々の結果に基づき、我々は、クラスI/II HDAC阻害剤をニコチンアミドなどのクラスIII 阻害剤と組み合わせると、化学療法薬としてのHDAC阻害剤の効験が増強されるはずであると提案する。
【０４５３】
実施例８：  実施例１−７の材料及び方法
細胞及び培地
細胞を３７℃の20% 02
及び5% CO2 の存在下で加湿したチャンバ内で成長させた。ヒト上皮癌 (HeLa)、ヒト胚性腎 (HEK 293)、293T、マウス Ku70+/+ 線維芽細胞（Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5:320-329 (2003) ）、マウスKu70 -/- 線維芽細胞 (Sawada et al., Nat Cell Biol.
5:320-329 (2003)) 、及びハムスター Ku80-/- 線維芽細胞t (V15B) (Bertinato et al.,
J. Cell Sci. 114:89-99 (2001)) を、FBS (10%) 、グルタミン (1 %) 、及びペニシリン／ストレプトマイシン (1 %) を加えたDME中で成長させた。ヒト胚性腎 293 (HEK 293) 細胞を３７℃の20% O2 及び 5% CO2 の存在下で加湿したチャンバ内で、グルタミン (1% )、ペニシリン／ストレプトマイシン(1%)、及びALラット又はCRラット由来の10%血清を加えたDME中で４８時間、成長させた。293T 細胞を、上述したようにALラット又はCRラット由来の10%血清を含有するDME培地中で成長させた。２４時間後に細胞に1μgのYFP、1μgのYFP-Bax 又は1μgのYFP-Bax 及び2μgのKu70をトランスフェクトした (Sawada et al. (2003) Nat. Cell Biol. 5:352) 。レスベラトロール実験では、 293T 細胞に1μgのYFP 又は1μgのYFP-Bax 及び2μgのKu70をトランスフェクトした。このトランスフェクションから１２時間後に、培地に様々な量のレスベラトロール (0、50 又は 100 nM) を添加し、アポトーシス性の核を持つYFP陽性細胞のパーセンテージをトランスフェクトから２４時間後に採点した。siRNA 実験には、293 細胞に1μgの siRNA ベクタ又はsiRNA-SIRT1 ベクタのいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクトから２４時間後に、この細胞に1μgのsiRNA ベクタ又はsiRNA-SIRT1を、1μgのYFP、1μgのYFP-Bax 又は1μgのYFP-Bax 及び2μgのKu70と一緒にトランスフェクトした。
【０４５４】
in vitro アセチル化検定
たんぱく質アセチルトランスフェラーゼ検定を、50 mM HEPES (pH 8.0)、10% グリセロール、1 mM DTT、1 mM PMSF、10 mM Na-ブチレート、1μlの (3H]-アセチル-CoA、1μgの組換えKu70/80 複合体又はKu70 ペプチド、及び 100 ng の、p300、PCAF、もしくはCBPの組換え HAT ドメインを含有する30μlの反応緩衝液中で行った。反応液を３０℃で１時間、インキュベートした後、SDS-PAGE (10%)で分離し、クーマシー・ブルーで染色し、EN3HANCE オートラジオグラフィ増強剤 (NEN)で処理し、乾燥させ、フィルムに３乃至７日間、露光させた。陽性コントロールとして用いられたp53ペプチドはp53315-3235 及び p53377-389だった。
【０４５５】
免疫沈降及びウェスタン・ブロット法
Ku70の免疫沈降（IP）には、1mgのたんぱく質を、プロテインA/G セファロース・ビーズ (Santa Cruz社)とのインキュベートにより予め清澄させた。その上清を、アガロースに結合させたヒツジポリクローナル抗Ku70抗体 (Santa Cruz社)と一緒にインキュベートした後、1 % トリトンのPBS溶液で３回、洗浄した。 免疫複合体をSDS-PAGEで分離し、たんぱく質を、アセチル化したウサギ血清に対して生じたウサギポリクローナル抗pan-アセチル-リジン (panAc-K) 抗体で検出した。HeLa細胞由来の内因性Ku70及びCBPのCo-IPを、50μg/ml EtBr の存在下で行った(Lai and Her, 1992, PNAS 89:6958)。293T細胞由来の内因性Ku70及びBaxの Co-IPはChaps緩衝液中で行われた (Sawada et al., Nat. Cell Biol. 5:320-329 (2003))。
【０４５６】
アポトーシス検定
アポトーシスを以前に解説された通りに誘導した ((Sawada et al., Nat Cell Biol. 5:320-329 (2003))。すべてのアポトーシス実験において、完全長Ku70を発現させた。数値は少なくとも２００個の細胞が計数された３つの実験の平均を表す。誤差棒は、平均値の中間偏差を表す。
【０４５７】
天然Ku70の大規模精製
293細胞に6xHIS-Ku80ベクタを安定にトランスフェクトした。１０りっとの細胞からの細胞抽出物（180mgのたんぱく質）をNi-NTA セファロース・カラムに入れ、Ku70/Ku80 をイミダゾール (600 mM イミダゾール)で溶出させた。代替的には、大規模IPを、懸濁液で成長させた２０リットルのHeLa MC118細胞に対して、500μgのアガロース結合ヤギポリクローナル抗Ku70 抗体 (Santa Cruz社)を用いて行った。両方の方法からの精製済みたんぱく質をSDS-PAGEで分離し、Ku70に相当するバンドを切り出し、MS/MSで分析した。
【０４５８】
タンデム型質量分析
In-gel たんぱく質分解消化を基本的には解説された通りに行った(Kinter
and Sherman, Protein Sequencing
Identification Using Tandem Mass Spectrometry (New York : Wiley and Sons)
2000)。翻訳後修飾の分析には、トリプシン、キモトリプシン、AspN、及びGIuC (V8) を用いた (Roche社)。試料を、ピコフリット・カラム(75μm ID、10 cm、NewObjective社)を備えたナノフロー液体(LC)
クロマトグラフィ系
(Waters CapLC社) に、ナノティー (Waters社) 16/1 スプリット (初流速5.5μl/分)を用いて流速をほぼ150
nl/分にしてかけた。このLC 系はQTOF マイクロタンデム型質量分析計 (MS) (Micromass社、英国)に直接、接続した。調査スキャン・モードで解析を行い、輝度が７を超える親イオンを、MS/MS モードでMassLynx 4.0 ソフトウェア (Micromass社、英国)を用いて配列決定した。MS/MS
データを処理し、Swissprot,
TREMBL/ New (www.expasy.ch)にはProteinLynx Global Server 1.1 ソフトウェア (Micromass社、英国) を用いて、あるいはNCBI 非重複データベース (NCBInr) 又は Ku70 配列のみにはMascot (Matrixscience社) (Perkins et al., Electrophoresis 20:3551-3567 (1999)) を用いて、データベース検索をかけた。リジン残基に42の質量が加わり、126 及び143 MW のイモニウム・イオンが存在することで、アセチル化を判別した。
【０４５９】
動物
１２月齢のオスのFisher
344 ラットに、NIH-31 標準飼料を適宜（AL）、与えるか、あるいはAL動物の食べるものの60%を毎日の飼料として割り当てる（離乳直後に開始して）生涯制限食を与えた
(CR)。水は両群ともに適宜、与えられた。動物をと殺後、肝臓、腎臓、脂肪組織の腹部パッド、及び脳からのたんぱく質抽出物を、補助資料に解説した通りに調製した。３匹のAL動物及び３匹のCR動物から採った各組織種の1mgの抽出物をSDS-PAGE で分離し、SIRT1に対するウサギポリクローナル抗体、又はβ-アクチンに対するモノクローナル抗体をプローブした。
【０４６０】
実施例９：  K539 又は K542のいずれかの脱アセチル化があれば、Bax媒介性アポトーシスを抑制するには充分である
多様な種で長寿を促進するSir2酵素の役割や、Ｓ．セレビジエでの酵母Sir2/3/4 複合体とKu70との 間の結び付きを念頭にして、我々は、SIRT1 は Ku70 を脱アセチル化のターゲットとすることで、細胞の対アポトーシス感受性を調節するのではないかと考えた。この仮説と一致して、我々が293T 細胞を、SIRT1の低分子活性化物質 (Howitz
et al. Nature 425, 191-6 (2003))であるレスベラトロールで処理した場合、又はこれらの細胞でSIRT1を過剰発現させた場合、我々はBas媒介性アポトーシスの用量依存的抑制を観察した（それぞれ図７Ａ及び７Ｂ、Ｃ）。反対に、ドミナント・ネガティブSIRT1対立遺伝子 (H363Y) を過剰発現させると、当該細胞のBax媒介性アポトーシスに対する感受性が増し（図７Ｄ）、アポトーシスの下流マーカである、切断型ポリ-ADP-リボースポリメラーゼ (PARP)の量が著しく増加した（図７Ｅ）。SIRT1に対する低分子干渉性RNA (siRNA) は同様な効果を有していた（図７Ｆ及び図９）。
【０４６１】
次に、我々は、SIRT1のアポトーシス減衰能にKu70が関与しているかどうかを調べた。同時免疫沈降実験では、SIRT1がKu70に in vivo で物理的に結び付くことが示された（図８Ａ）。
我々は最近、Ku70のうちで、アセチル化時にBax放出を促進する２つのリジン（K539 及び K542) を特定した（図８Ｂ）。野生型SIRT1を過剰発現させると、in vivoでのKu70の全体的アセチル化レベルが減少するが、
他方、SIRT1-H363Y
対立遺伝子を過剰発現させると反対の効果があった（図８Ｃ）。Ku70上のどのリジンがSIRT1による脱アセチル化のターゲットであるのかを特定するために、２つの異なる検定を行った。組換えSIRT1 を、アセチル化したKu70ペプチドと一緒にインキュベートし、残ったアセチル化レベルをpan-アセチル-リジン抗体を用いて確認した（図８Ｄ）。より定量的な検定は、SIRT1を、アセチル化したKu70蛍光発生性ペプチドと一緒にインキュベートし、前に解説された通りに検定した(Howitz
et al. Nature 425, 191-6 (2003)) （図８Ｅ）。リジン32でアセチル化したp53 ペプチドを陽性コントロールとして役立てた (Cheng
et al. Proc Natl Acad Sci U S A 100,
10794-9 (2003).)。両方での検定で同じ結果が出た：SIRT1は、Baxを調節する上で重要なKu70のＣ末端にある二つのリジンを効率的に脱アセチル化した（図８Ｄ、Ｅ）。
【０４６２】
SIRT1によるBax調節に、これらの２つのKu70がin vivoで関与しているかどうかを調べるために、我々は、これらのそれぞれをアルギニンと置換して、構成的に脱アセチル化した状態（上記参照）を模倣して、これらの変異型対立遺伝子がそれでもなお、SIRT1機能の非存在下でもアポトーシスを抑制できるかどうかを調べた。Ku70の残基K331を陰性コントロールとして役立てたが、それはこの残基が in vivoではアセチル化はしているがSIRT1 （図１Ｄ）の基質としては余り働かず、またin vivoでBax媒介性アポトーシスにおいて明白な役割を果たさないからである（上記参照）。SIRT1-H239Y 対立遺伝子を安定に発現する293細胞に、Ku70の変異型対立遺伝子のそれぞれをトランスフェクトし、Bax媒介性アポトーシスを上述した通りに検定した。SIRT1のH363Y対立遺伝子はBax媒介性アポトーシスをK331Rトランスフェクト細胞では促進したが、K539RもしくはK542Rトランスフェクト細胞では促進しなかったことからSIRT1 はK539 及びK542を in vivo でターゲットとすること、そしてK539 又は K542 のいずれかが脱アセチル化すれば、Bax媒介性アポトーシスを抑制するには充分であることが示された（図８Ｆ）。
【０４６３】
Cohen et al. (2004) Mol. Cell. 13:627、特許及びここで言及されたGenBank 受託番号を含む全ての公開文献の全文を、各個々の公開文献又は特許を具体的かつ個別に引用をもって援用することを示唆したのと同様に、引用をもってここに援用することとする。矛盾があれば、ここでのいずれかの定義を含む本出願を上位とする。
【０４６４】
本発明の実施にあたっては、そうでないと明示しない限り、当業者に公知のウィルス学、たんぱく質化学、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、及び組換えDNAの従来技術を用いることになるであろう。このような技術は文献に完全に説明されている。例えばClinical Virology, 2nd Ed., by Richman, Whitley, Hayden (American Society
for Microbiology Press: 2002), Molecular
Cloning A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis
(Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait
ed., 1984); Mullis et al. U.S. Patent No: 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds.
1984); Transcription And Translation
(B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987);
Immobilized Cells And Enzymes (IRL
Press, 1986); B. Perbal, A Practical
Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells
(J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory);  and Methods
In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.)を参照されたい。細胞ソーティング及び細胞分析法は当業で公知であり、例えばThe
Handbook of Experimental Immunology, Volumes 1 to 4, (D. N. Weir, editor) 及びFlow Cytometry and Cell Sorting
(A. Radbruch, editor, Springer Verlag, 1992)に解説されている。
【０４６５】
均等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに解説された本発明の具体的な実施例の均等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求項の包含するところと意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０４６６】
【図１】図１Ａは、公知の機能ドメインに比較してＣ末端リンカを示したKu70の概略図である。図１Ｂは、他のたんぱく質の公知のアセチル化部位に対する、Ku70リンカ領域の多重配列アライメントの概略図である。推定上のコンセンサス配列をアライメントの下に示してある。図１Ｃは、HeLa細胞抽出物から抗Ku70抗体を用いて免疫沈降させたKu70/Ku80複合体を示す免疫ブロットの一連の写真である。該複合体は、pan-アセチル化リジンに対するポリクローナル抗体（抗panAc-K）を用いて免疫ブロットされた。細胞抽出物投入レーン (I) は、プレIP抽出物の1/15 希釈液として充填され、抗HAmAb が陰性コントロールとして役立てられた。メンブレンを抗Ku70及び抗Ku80 mAb で再プローブすると、２つのアセチル化したバンドがKu70及びKu80の位置に相当することが示された。図１Ｄは、HeLa抽出物から抗panAc-K抗体を用いて沈降させ、抗Ku70又は抗Ku80抗体で免疫ブロットされた免疫複合体を示す免疫ブロットの一連の写真である。投入レーンは、プレIP抽出物の1/15 希釈液として充填され、免疫前血清が陰性コントロールとして役立てられた。図１Ｅは、HeLa細胞抽出物から抗CBPモノクローナル抗体を用いて免疫沈降させたCBPを示す免疫ブロットの一連の写真である。その免疫複合体を、抗Ku70抗体を用いてプローブした（左側パネル）。Ku70 を抗Ku70 mAbで免疫沈降させ、その免疫複合体を抗CBPポリクローナル抗体を用いてプローブした（右側パネル）。抗HA mAb を両方の実験で陰性コントロールとして役立てた。
【図２】図２Ａは、組換えKu70/Ku80のアセチル化検定の結果を示す一連の写真である。アセチル化検定は、CBP、PCAF、又は p300の組換えヒストンデアセチラーゼ（HAT）ドメインを、組換えKu70/80と一緒に3H-アセチル-CoAの存在下でインキュベートすることで、行われた。この反応の生成物をSDS-PAGE で分離し、オートラジオグラフィで分析した。Ku70/80 を欠く反応は左側パネルに示されている。55 kDa 及び90 kDa のところに星印で印を付けたバンドは、以前に解説された自己アセチル化生成物に相当する(Liu et al., Mol. Cell. Biol. 20, 5540-5553 (2000)) 。図２Ｂは、Ku70の完全長にわたる合成ペプチド・ライブラリの概略図である。各ペプチドをPCAF 及び3H-アセチル-CoAと一緒にインキュベートし、図２Ａで示すように分析した。PCAF によりin vitro でアセチル化したペプチドは星印で示されている。図２Ｃは、アセチル化ペプチド16及び29 をSDS-PAGE (PCAF 反応、左側パネル；CBP 反応；右側パネル)で分離して示した一連の写真である。p53のアセチル化ドメイン(aa315-325) を、アセチル化の陽性コントロールとして役立てた。アセチル化のターゲットではないペプチド11が陰性コントロールとして役立てられた。図２Ｄは、一連のペプチド29のスキャンニング合成ペプチドのアセチル化結果を示す写真である。これらのスキャンニング合成ペプチドは、４つのリジン（K）のうちの３つを、アセチル化できない残基であるアルギニン（R）に置換した状態で合成された。ペプチドはアセチル化反応においてPCAF 又はCBPと一緒にインキュベートされ、上述したようにSDS-PAGE で分離された。図２Ｅは、アセチル化したGFP-Ku70537-557を示す写真である。HeLa細胞にGFP-Ku70537-557 又はGFP 単独を発現するベクタをトランスフェクトした。GFPを含有する免疫複合体を抗GFPmAbで沈降させ、抗panAc-Lys Abで免疫ブロットした。
【図３】図３Ａは、Ku70内のアセチルリジン残基の概略図である。内因性Ku70複合体を大規模精製し、タンデム型質量分析 (LC-MS/MS) にかけた。以下のアセチル-リジン残基を特定した：317、331、338、539、542、544、553、及び 566。これらの部位は、典型的に、モノ-、ジ-、又はトリ-アセチル化ペプチドで何回も特定された。図３Ｂは、MASCOTソフトウェアで特定したKu70由来トリプシンペプチド(aa 527-553) の代表的MS/MSスペクトルである （実施例１を参照されたい）。ペプチド527-553 の(M + H)4+ 種 (MW, 3215.45) は、G1u527 (ナトリウム)、Glu537 (ナトリウム)、Lys539 (アセチル)、Lys542 (アセチル)、及びナトリウム化したＣ末端の修飾を含む。b 及び y イオンも示されている。図３Ｃは、結晶構造に基づくKu70/Ku80の概略的リボン図である(Walkeret al., Nature 412, 607-614 (2001))。Ku70のうちで、in vivoでアセチル化のターゲットとなるＣ末端リンカ及びDNA接触ループ中のリジン残基が、Ku70//80のリボン図に重ねられている。MS/MSで確認されたアセチル化部位が示されている。
【図４】図４Ａは、アセチル化したKu70を示す一連の写真である。簡単に説明すると、HeLa細胞を以下の条件の一つの下で成長させた： 0.10/6 DMS0、1μM TSA、5 mM ニコチンアミド (NAM)、又はTSA及びNAM。Ku70を全細胞抽出物から免疫沈降させ、リジンアセチル化についてpanAc-Lys Abを用いてプローブした。DMSO処理に対して正規化したアセチル化Ku70 (AcKu70) のレベルをブロットの下に示す。図４Ｂは、アポトーシス性の核を持つ293T細胞のパーセンテージを示す棒グラフである。293T細胞に、YFP (Yellow Fluorescent Protein)-Bax及び pcDNA-Ku70 をTSA/NAMの存在下又は非存在下で同時トランスフェクトした。トランスフェクトから２４時間後に、アポトーシス性の核を持つ細胞のパーセンテージを採点した。図４Ｃは、Ku70の発現及びアポトーシスを比較した写真及び棒グラフである。左の写真では、AS-Ku70トランスフェクト細胞中のKu70たんぱく質レベルを、β-チューブリンを充填コントロールとして役立てたウェスタン・ブロット法で判定した。右側の棒グラフでは、アンチセンスKu70コンストラクト(AS-Ku70) 及びGFPをトランスフェクトした細胞、Bax-GFPをトランスフェクトした細胞、並びにBax 及びAS-Ku70をトランスフェクトした細胞で、アポトーシスを起こす細胞のパーセンテージを比較する。図４Ｄは、Bax-GFP 又はGFP コンストラクトをトランスフェクトされた、Ku70+/+ 又は Ku70-/- 同腹仔由来のマウス胚性線維芽細胞（MEF）中で、アポトーシス性核を持つ細胞のパーセンテージを比較した棒グラフである。Ku70-/-細胞のアポトーシス性表現型が、Ku70の非存在が特異的な原因であるかどうかを判定するために、Bax発現の効果も、Ku70を再導入してあるKu70-/- 細胞で調べた。図４Ｅは、GFP、Bax、Bax 及びKu70のいずれかか、又はBax 及びKu70 及びKu80をトランスフェクトしたxrs6(Ku80-/-) MEF中でのアポトーシス性核を持つ細胞のパーセンテージを比較した棒グラフである。Ku70 及び／又はKu80 のBax媒介性アポトーシス抑制能を、図４Ｂで解説した通りに評価した。図４Ｆは、示差的遠心分離で単離し、免疫ブロット法で検出したときの、核（N）及び細胞質ゾル（C）画分中のKu70及びKu80の相対的レベルを示す一連の写真である。各画分の純度は、核マーカ及び細胞質マーカ（それぞれYY1 及びLDH)に関するブロットを再プローブすることにより、確認された。
【図５】図５Ａは、細胞にBax 及び／又はCBP を、Ku70又は空のベクタ・コントロールと一緒に同時トランスフェクトしたときに、Bax誘導性アポトーシスを起こす293T細胞のパーセンテージを示した棒グラフである。アポトーシスは、上述の通り２４時間後に評価された。図５Ｂは、細胞にBax 及び／又はPCAF を、Ku70又は空のベクタ・コントロールと一緒に同時トランスフェクトしたときに、Bax誘導性アポトーシスを起こす293T細胞のパーセンテージを示した棒グラフである。図５Ｃは、YFP-Bax融合コンストラクトと、提示したようにKu70リンカ領域の各アセチル化部位にK→Q又はK→R置換を持つpcDNA、Ku70、又はKu70 変異体とを同時トランスフェクトされたときのBax誘導性アポトーシスを起こす細胞のパーセンテージを示した棒グラフである。図５Ｄは、スタウロスポリン（STS）誘導性アポトーシスを起こす細胞のパーセンテージを示した棒グラフである。Ku70 野生型と、位置K539及びK542にK→Q置換を持つKu70 変異型を、それらのスタウロスポリン（STS）誘導性アポトーシス抑制能について調べた。
【図６】図６Ａは、200 J/cm2 の紫外線で処理された293T細胞中のKu70アセチル化のレベルを示した一連の写真である。処理から３、６、１２、及び２４時間後にKu70アセチル化のレベルが判定された。数は、NIH ImageJソフトウェアを用いたバンド数を表す。図６Ｂは、図６Ａの通りに処理され、CBP（赤）及びDAPI（青）について免疫染色された293T細胞の免疫組織化学的染色を示した一連のマイクロ写真である。示された染色パターンは細胞の９０％を超えるものを表す。図６Ｃは、DMSO又は脱アセチル化酵素阻害剤TSA 及びNAMの存在下で成長させた293T細胞中のBaxとKu70との間の結び付きを示した一連の写真である。Ku70 を免疫沈降させ、生成物を抗BaxポリクローナルAb (左側パネル)で免疫ブロットした。逆免疫沈降(IP) も示されている（右側パネル）。図６Ｄは、Bax媒介性アポトーシスのKu70による調節のモデルの概略図である。細胞質ゾル内Ku70 は、Ku80とは個別に機能して、アポトーシス促進性たんぱく質Baxをミトコンドリアから隔絶する。通常の成長条件下では、Ku70のＣ末端α-へリックスドメインは、ヒストンデアセチラーゼ（HDAC）及び／又はサーチュインデアセチラーゼにより非アセチル化状態に維持されているため、Bax-相互作用ドメインが露出している。細胞ストレスによりCBP 及び／又はPCAFが細胞質に移行して、そこでこれらは、Ku70の柔軟性Ｃ末端リンカ・ドメイン中の特異的リジンをアセチル化のターゲットとする。この結果、Ku70のコンホメーション変化が起きてBaxが遊離する。Bax が解放されたことで、それはBH3-のみのたんぱく質と結び付き、チトクロームcをミトコンドリアから放出させることで、アポトーシスを開始させられるようになる。
【図７】図７では、SIRT1が、Ku70のBax媒介性アポトーシス抑制能を促進することを示す。 (A) 293T 細胞に YFP (1μg) 又はYFP-Bax (1μg) 及びKu70 (2μg)をトランスフェクトした。このトランスフェクトから１２時間後に培地にレスベラトロール (0、50 又は100 nM) を補い、トランスフェクトから２４時間後に、アポトーシス性核を持つYFP陽性細胞のパーセンテージを採点した。数値は、少なくとも２００個の細胞が計数された３つの実験の平均を表し、誤差棒は、平均の標準偏差を表す。（B）SIRT1か、又は、H363Y変異を持つドミナント・ネガティブ型のSIRT1のいずれかを安定に発現している293細胞からのたんぱく質抽出物（50μg）をSDS-PAGEで分離した。SIRT1 レベルを測定するために、ブロットを、ヒトSIRT1について、次にβ-アクチンについてプローブした。 (C,D) 提示した細胞株に、YFP (1μg)、YFP-Bax (1μg) 又はYFP-Bax (1μg) 及び Ku70 (2μg)をトランスフェクトし、アポトーシス率を判定した。(E) アポトーシス速度を追跡するために、293 細胞と、SIRT1-H363Y を発現している293細胞とに、YFP (1μg) 又は YFP-Bax (1μg)をトランスフェクトした。トランスフェクトから１２時間後に、たんぱく質抽出物をSDS-PAGEで分離し、PARPについて、次にβ-アクチンについてプローブ下。(F) 293 細胞に、siRNA 空ベクタか、又はsiRNA-SIRT1ベクタ(1μg)のいずれかをトランスフェクトした。トランスフェクトから２４時間後に、細胞にsiRNAベクタか、又はsiRNA-SIRT1を、上述したようにYFP、YFP-Bax 又は YFP-Bax 及びKu70のいずれかと一緒にトランスフェクトした。２回目のトランスフェクトから２４時間後にアポトーシス率を採点した。
【図８】図８では、SIRT1が、Ku70のＣ末端にある二つの重要なリジンを脱アセチル化することにより、Bax媒介性アポトーシスを減衰することを示す。(A) SIRT1-Ku70相互作用を検出するための同時免疫沈降実験を、ここの実施例１−８とCohenet al. Mol Cell 13, 627-38 (2004)で解説された条件を用いて行った。 (B) Bax結合ドメイン及び３つのアセチル化リジンK331、K539 及び K542を示すKu70の概略図。 (C) pCDNA、pCDNA-SIRT1-H363Y 及び pCDNA-SIRT1を安定にトランスフェクトした293細胞由来のたんぱく質抽出物（1mg）をプロテイン A/G セファロース・ビーズとのインキュベーションにより清澄させた。その上清を、アガロース結合ヤギポリクローナル抗Ku70 抗体と一緒にインキュベートした後、３回、洗浄した。アセチル化レベルは以前に解説された通りに判定され(Cohenet al. Mol Cell 13, 627-38 (2004)) 、当該の膜をKu70について再プローブした。(D) Ku70のアセチル化したK539及びK542 に対応する二種類のペプチドDYNPEGK-AcVTKRKC 及びPEGKVTK-AcRKHDNCを、0.5μgの組換えSIRT1 を加えた50μlの脱アセチル化酵素緩衝液中で、３７℃で６０分間、インキュベートした。この反応液を10 kDa サイズ排除カラムに通し、その流動分にスロット・ブロットを行い、pan-アセチル化についてプローブした。(E)アセチル化Ku70-K331、K539 及びK542 の３種類のアセチル化ペプチドとp53-K320を以前に解説された通りに用いた SIRT1 脱アセチル化検定 (Howitzet al. Nature 425, 191-6 (2003))。(F) 293 細胞、又は、ドミナント・ネガティブSIRT1-H363Yを発現している293細胞に、YFP-Bax (1μg) 及び pCDNA-Ku70 (2μg) か、又は、K331, K539 and K542のK→R置換を持つKu70 変異体（2μg）をトランスフェクトした。アポトーシス率を上述した通りに判定した。
【図９】(A) 106個の293T 細胞を、ヒトフィブロネクチンで覆われたガラス・スライド上で成長させ、pU6-siRNA-SIRT1 ベクタ（400ng）をトランスフェクトした。細胞にpU6-siRNA-SIRT1ベクタ (400 ng)及びpEGFPC1 ベクタ (25 ng)を同時トランスフェクトしてから２４時間後。一回目のトランスフェクションから７２時間後に、細胞をパラホルムアルデヒドのPBS溶液（4%）で固定し、SIRT1 (赤) 及び DAPI (青)について免疫染色した。GFP陽性細胞は緑色に見える。４つの非トランスフェクト細胞の隣に代表的な細胞を比較のために示す。SIRT1染色の変化は、siRNA 陰性コントロールでは何ら観察されなかった（図示せず）。(B) 最高106個の293T 細胞に、pU6-siRNA-SIRT1(1μg) ベクタ又はpU6-siRNA ベクタ (2μg) を、連続する２日間にわたって２回、トランスフェクトした。一回目のトランスフェクトから７２時間後に、各処理から採った総たんぱく質（50μg）をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動法で分離し、抗SIRT1ウサギポリクローナル抗体または抗β-アクチンモノクローナル抗体でプローブした。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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