(57)【要約】本発明は、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリー、またはその免疫原性断片を、製薬的に許容される媒体中のアジュバントと共に含むワクチンを提供する。本発明は、血行性播種または粘膜皮膚カンジダ症を処置または予防する方法も提供する。方法は、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリー、またはその免疫原性断片を、製薬的に許容される媒体中のアジュバントと共に含むワクチンの免疫原性量を投与するステップを含む。カンジダの宿主細胞または組織への結合または侵入を抑制するために、単離Ａｌｓタンパク質ファミリー、またはその免疫原性断片の有効量を投与するステップを含む、播種性カンジダ症を処置または予防する方法も提供される。
2008540453.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
製薬的に許容される媒体中に、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその免疫原性断片を、アジュバントと一緒に含む、ワクチン。
【請求項２】
前記Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーが、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・クルセイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｋｒｕｓｅｉ）、カンジダ・トロピカリス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｇｌａｂｒａｔａ）およびカンジダ・パラプシローシス（Ｃａｎｄｉｄａ  ｐａｒａｐｓｉｌｏｓｉｓ）から成る群より選択されるカンジダ菌株に由来するＡｌｓタンパク質を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーが、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐから成る群より選択される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項４】
前記免疫原断片が、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーのＮ末端領域断片または他のいずれかの断片を含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
播種性カンジダ症またはスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）感染を処置または予防する方法であって、製薬的に許容される媒体中に、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその免疫原性断片を含むワクチンの免疫原性量を投与するステップを含む、方法。
【請求項６】
前記Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーが、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータおよびカンジダ・パラプシローシスから成る群より選択されるカンジダ菌株に由来するＡｌｓタンパク質を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーが、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐから成る群より選択される、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記免疫原断片がＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーのＮ末端領域断片を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記投与が能動免疫化、受動免疫化またはその組合せを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
播種性カンジダ症またはスタフィロコッカス・アウレウス感染を処置または予防する方法であって、宿主細胞または組織へのカンジダまたはスタフィロコッカス・アウレウスの結合または侵入を抑制するために、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその機能性断片の有効量を投与するステップを含む、方法。
【請求項１１】
前記Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーが、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータおよびカンジダ・パラプシローシスから成る群より選択されるカンジダ菌株に由来するＡｌｓタンパク質を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーが、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐから成る群より選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞接着活性が、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、上皮細胞または内皮細胞への結合を含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記機能性断片がＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーのＮ末端領域断片を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記宿主細胞が内皮または上皮細胞起源の細胞を含む、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本方法は、カンジダ・アルビカンス表面アドヘシンタンパク質に、Ｃ．アルビカンス表面アドヘシンタンパク質によるワクチン接種への免疫応答から生じる抗体に、そしてカンジダ症およびＣ．アルビカンス表面接着タンパク質による他の細菌感染の予防および／または処置のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
近年、カンジダ種によって引き起こされた院内感染の発生率に劇的な上昇がある。血行性播種性カンジダ感染の発生率は、１９８０年から１９８９年までに１１倍に上昇した。この増加しつつある発生率は１９９０年代まで続いた。カンジダ種による感染は今や、院内敗血症の４番目に多い原因であり、大腸菌のそれと等しく、クレブシエラ種によって引き起こされた発生率を超えている。さらにカンジダ種は、広範囲の火傷を有する患者での深在性真菌感染の最も多い原因である。骨髄移植を受けた個体の最大１１％および同所性肝移植を受けた個体の１３％が侵襲性カンジダ感染症を発症するであろう。
【０００３】
この属の主な病原菌であるカンジダ・アルビカンスは、２つの形態：分芽胞子期（出芽酵母）および糸状期（菌糸および仮性菌糸）の間で切り換えが可能である。線維化を制御する遺伝子が欠損しているカンジダミュータントは、動物モデルで低下した毒性を有することが報告されている。この低下した毒性は、分芽胞子から微細線維へ変化する能力がＣ．アルビカンスの主な毒性因子であることを示唆している。現在までに、Ｃ．アルビカンスにおいてこれらの線維化経路の不可欠なエフェクタは同定されていない。非特許文献１を参照。
【０００４】
スタフィロコッカス・アウレウス感染も一般的であり、抗体に対する薬物耐性をますます引き起こす。たとえばＳ．アウレウスは、米国および世界中で皮膚および皮膚構造感染、心内膜炎および菌血症の一般的な原因である。以前は、市中感染（ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  ａｃｑｕｉｒｅｄ）Ｓ．アウレウス（ＣＡ−Ｓ．アウレウス）感染は、ペニシリナーゼ耐性ベータラクタム、たとえばセファゾリン、オキサシリン、メチシリン、ペニシリンおよびアモキシリンに対してほぼ一律に感受性であった。しかしながら過去１０年間以上、ベータラクタム耐性Ｓ．アウレウス（ＭＲＳＡ）感染、特に市中感染ＭＲＳＡ（ＣＡ−ＭＲＳＡ）の流行が、世界中の多くの場所で見られている。多くの場所で、ＭＲＳＡはＣＡ感染を引き起こす有力なＳ．アウレウスとなっている。米国の３つの州における最新の予想される人口に基づく調査は、ＣＡ−ＭＲＳＡ感染の発生率が人口１００，０００人当たり５００症例であることを推定し、これは米国のみで毎年約１５０万症例に換算される。薬物耐性Ｓ．アウレウス感染の増加する頻度は、これらの感染を防止および処置する新たな方法への要求を強調している。
【０００５】
毒性に寄与する生物の制御経路におけるエフェクタの同定は、既存の抗真菌剤より優れている方法およびまたは組成物を用いた治療的介入の機会を提供する。毒性に関与する制御経路に影響する細胞表面タンパク質の同定は、タンパク質のキャラクタリゼーションがカンジダ感染と戦うときに既存の抗菌剤よりも優れた免疫治療技法を可能にするため、特に有望である。
【０００６】
カンジダ・アルビカンスの毒性は、複数の推定上の毒性因子によって制御され、そのうち宿主構成要素への付着および酵母から菌糸へ変換する能力が病原性を判定するのに特に重要である。カンジダにとって殺菌性である強力な抗菌剤があるが、アンホテリシンＢなどの強力な抗真菌剤による処置を用いても、カンジダ血症に起因する死亡率は約３８％である。またアンホテリシンＢなどの既存の薬剤は、望ましくない毒性を示しがちである。アンホテリシンＢより毒性が低い追加の抗菌剤が開発されうるが、より強力である薬剤は開発されそうにない。したがって播種性カンジダ症を処置または予防する受動または能動免疫療法のどちらかが、標準抗真菌治療の有望な代替策である。
【非特許文献１】Ｃａｅｓａｒ−ＴｏｎＴｈａｔ，  Ｔ．Ｃ．ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｃｕｔｌｅｒ，“Ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｏ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｍｏｕｓｅ  ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｃａｎｄｉｄａｃｉｄａｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：５３５４−５３５７，１９９７
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
それゆえカンジダ、Ｓ．アウレウスおよび他の免疫原性関連病原体に対する宿主免疫防御および受動免疫防御を提供する有効な免疫原への要求が存在する。本発明はこの要求を満足して、関連する利点も提供する。
【０００８】
本発明は、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリー、またはその免疫原性断片を、製薬的に許容される媒体中にアジュバントと共に含むワクチンを提供する。本発明は、播種性カンジダ症を処置または予防する方法も提供する。方法は、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリー、またはその免疫原性断片を、製薬的に許容される媒体中にアジュバントと共に含むワクチンの免疫原性量を投与するステップを含む。カンジダの宿主細胞または組織への結合または侵入を抑制するために、単離Ａｌｓタンパク質ファミリー、またはその免疫原性断片の有効量を投与するステップを含む、播種性カンジダ症を処置または予防する方法も提供される。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータおよびカンジダ・パラプシローシスから成る群より選択されるカンジダ菌株に由来することが可能であり、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーはＡｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐまたはＡｌｓ９ｐを含む。スタフィロコッカス・アウレウスを処置または予防する方法も提供される。方法は、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリー、またはその免疫原性断片を、製薬的に許容される媒体中に含むワクチンの免疫原性量を投与するステップを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
発明の詳細な説明
カンジダ・アルビカンスおよびスタフィロコッカス・アウレウスはヒトにおける一般的な病原体である。たとえばＣ．アルビカンスは、通常は無害な共生動物であるが、この生物は膣および／または口腔咽頭カンジダ症などの表層粘膜皮膚感染から播種性カンジダ症への深部器官関与までの範囲にわたる各種の状態を引き起こしうる。疾患を引き起こす前に、該真菌は胃腸管、そしてある場合には皮膚および粘膜にコロニー形成する。宿主粘膜表面への付着は、この初期ステップの主要な前提条件である。コロニー形成の後、Ｃ．アルビカンスは感染した血管内手段を介して、あるいはは化学療法またはストレス潰瘍形成により損なわれた胃腸粘膜を通じた遊出によって血流に入る。生物は次に血流を介して播種して、血管内皮に結合および浸透して血管樹から放出されて、肝臓、脾臓、および腎臓などの深部器官に侵入する。
【００１０】
本明細書に記載された各種の例示的なＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーの同定および機能的特徴は、タンパク質のこのファミリーがカンジダ症の処置で効果的に利用されることを可能にする。多様な基質への特異的結合活性および他の選択的細胞接着機能は、宿主細胞の結合、接着または侵入を抑制することによって初期感染を低減または予防するために、能動または受動免疫のためのワクチンの産生において、ペプチド、細胞接着の模倣インヒビタの類似物質の産生において活用されうる。その上、差次的結合および侵入プロフィールは、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー活性の広範囲または標的化抑制の設計および使用を可能にする。加えて結合および／または侵入活性を与える機能性断片は、望ましくない外来タンパク質配列の排除を可能にし、それゆえＡｌｓファミリータンパク質メンバーワクチンまたは治療用インヒビタの有効性を向上させる。
【００１１】
内皮細胞への付着によるＣ．アルビカンスの病原体の性質は、参照によりその全体が本明細書に特に組み入れられているＵＳＰ  ５，５７８，３０９で議論される。アドヘシンなどの遺伝子産物のキャラクタリゼーションを含む、ＡＬＳ１遺伝子およびその特徴の記述については、Ｆｕ，Ｙ．，Ｇ．Ｒｉｅｇ，Ｗ．Ａ．Ｆｏｒｉｚｉ，Ｐ．Ｈ．Ｂｅｌａｎｇｅｒ，Ｊ．Ｅ．Ｊ．Ｅｄｗａｒｄｓ，ａｎｄ  Ｓ．Ｇ．Ｆｉｌｌｅｒ．１９９８を参照。
サッカロミセス・セレビシエにおけるカンジダ・アルビカンス遺伝子ＡＬＳ１の発現は、内皮および上皮細胞への付着を誘起する。Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：１７８３−１７８６；Ｈｏｙｅｒ，Ｌ．Ｌ．１９９７．Ｆｕ  Ｙ，Ｉｂｒａｈｉｍ  ＡＳ，Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ＤＣ，Ｃｈｅｎ  Ｙ−Ｃ，Ｆｒｅｎｃｈ  ＳＷ，Ｃｕｔｌｅｒ  ＪＥ，Ｆｉｌｌｅｒ  ＳＧ，Ｅｄｗａｒｄｓ，ＪＥ，Ｊｒ．２００２．Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  Ａｌｓ  Ｉｐ：ａｎ  ａｄｈｅｓｉｎ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ａ  ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＥＦＧｌ  ｆｉｌａｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｐａｔｈｗａｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ４４：６１−７２．Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ＤＣ，Ｙｅａｍａｎ  ＭＲ，Ｗｅｌｃｈ  ＷＨ，Ｐｈａｎ  ＱＴ，Ｆｕ  Ｙ，Ｉｂｒａｈｉｍ  ＡＳ，Ｆｉｌｌｅｒ  ＳＧ，Ｚｈａｎｇ  Ｍ，Ｗａｒｉｎｇ  ＡＪ，Ｅｄｗａｒｄｓ，Ｊｒ．，ＪＥ  ２００４．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ａｌｓ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．２７９：３０４８０−３０４８９．Ｔｈｅ  ＡＬＳ  ｇｅｎｅ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ．Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｍｙｃｏｌｏｇｙ  Ｓａｌｓｉｍｏｒｇｅ，Ｉｔａｌｙ：（Ａｂｓｔｒａｃｔ）；Ｈｏｙｅｒ，Ｌ．Ｌ．，Ｓ．Ｓｃｈｅｒｅｒ，Ａ．Ｒ．Ｓｈａｔｚｍａｎ，ａｎｄ  Ｇ．Ｐ．Ｌｉｖｉ．１９９５．Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＬＳＩ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｔｏ  ａ  Ｓａｃｃｈａｒｏｎｚｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ｓｅｘｕａｌ  ａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｓｅｐａｒａｔｅｄ  ｂｙ  ａ  ｒｅｐｅａｔｉｎｇ  ｍｏｔｉｆ．Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：３９−５４。
【００１２】
この点で、ヒト真菌病原体カンジダ・アルビカンスはコロニー形成して、広範囲の宿主組織に侵入する。宿主構成要素への付着は、このプロセスにおいて重要な役割を果たす。Ｃ．アルビカンスＡｌｓタンパク質ファミリーの２つのメンバー（Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ５ｐ）は、付着を媒介して、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーの結合、接着および細胞侵入活性を例示することが見出されている。本明細書に記載するように、ＡＬＳ遺伝子ファミリーのメンバーはその個々の特徴をキャラクタリゼーションするために、クローニングされて、Ｓ．セレビシエ内で発現された。別個のＡｌｓタンパク質は、多様な宿主基質に対して別個の付着プロフィールを与えた。キメラＡｌｓ５ｐ−Ａｌｓ６ｐ構築物を使用すると、基質特異性付着を媒介する領域は、Ａｌｓタンパク質内のＮ末端ドメインに局在化された。特にＡｌｓタンパク質のサブセットも、このファミリーの以前には未知の機能であった内皮細胞侵入を媒介した。これらの結果と一致して、相同性モデリングは、Ａｌｓメンバーが、免疫グロブリンスーパーファミリーの接着およびインベイシンに相同性である、拡張領域によって挿入された逆平行βシートモチーフを含有することを明らかにした。この発見は、Ａｌｓ１ｐのＮ末端ドメインの円偏光二色性およびフーリエ変換赤外分光分析を使用して確認された。アミノ酸超可変の特異性領域は、Ａｌｓタンパク質のＮ末端ドメイン間に見出され、エネルギーベースモデルは、Ａｌｓファミリーメンバーの多様な機能をおそらく支配するＮ末端ドメインの類似性および相違を予測した。ひとまとめにして、これらの結果は、Ａｌｓファミリー内の構造的および機能的多様性がＣ．アルビカンスに、感染中に広範囲の宿主構成要素を認識して、それと相互作用できる数々の細胞壁タンパク質を供給することを示している。
【００１３】
本発明は、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその免疫原性断片、およびアジュバントを製薬的に許容される媒体中に有するワクチンを提供する。ワクチンは、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシスなどのカンジダ種に由来するＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーでありうる。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーはたとえば、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐ、またはその免疫原性断片でありうる。カンジダ種内の他の全てのＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーは同様に、本発明のワクチンとして利用されうる。
【００１４】
本発明は、Ｃ．アルビカンス凝集素様配列タンパク質ファミリーメンバーの遺伝子産物を、播種性カンジダ症を処置、予防、または軽減するためのワクチンとして利用する。ワクチンは、Ｃ．アルビカンスの各種の菌株に対してはもちろんのこと、各種のカンジダ種に対しても有効である。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーはたとえば、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐでありうる。本発明は、生物の発病を遅延させるためのワクチンとして使用するために、Ｃ．アルビカンスの内皮および／または上皮細胞への付着および侵入  Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー発現表面タンパク質の感受性におけるＡＬＳ遺伝子産物の役割を利用する。
【００１５】
本発明に従って、ＡＬＳファミリーメンバー遺伝子は、Ｃ．アルビカンスに対する免疫療法方法の標的として選択される表面アドヘシンをコードする。ＡＬＳ１遺伝子の発現産物Ａｌｓ１ｐタンパク質が表面タンパク質に特有である構造的特徴を有し、実際にＣ．アルビカンスの細胞表面で発現されることの証明は、宿主組織へのアドヘシンとして作用するタンパク質にとっての１つの基準である。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、Ｎ末端におけるシグナルペプチド、Ｃ末端におけるグリコシルホスファチジルイノシン（ＧＰＩ）アンカー配列、およびトレオニンおよびセリンが豊富な反復を含む中央領域を有するとして構造的に特徴付けられうる。またＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、細胞表面で発現されるタンパク質に特有のＮ−、およびＯ−グリコシル化部位を有する。たとえばＡＬｓ１ｐのＮ末端に向けられたモノクローナル抗体を使用する間接免疫蛍光法は、ＡＬｓ１ｐが分芽胞子の対数期の間に発現されることを明らかにした。ＡＬｓ１ｐのこの発現は菌糸形成中に上昇され、拡散した表面染色によって示されるように、菌糸要素が分芽胞子から拡張する接合部に局在化される。さらにこのモノクローナル抗体は、内皮細胞に対するＣ．アルビカンス過剰発現ミュータントの付着向上を遮断し、それによってＡＬｓ１ｐを使用する免疫療法利用の原理を確立する。他のＡｌｓファミリーメンバーの細胞接着および侵入に関連するような機能的特徴は、実施例ＶＩでさらに後述する。
【００１６】
それゆえ一態様により、本発明は、製薬組成物中に調合されてアジュバントと共に、またはアジュバントなしでワクチンとして投与されるときに有用な特性を有する、たとえばＡｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐと呼ばれるＡｌｓファミリーメンバー表面接着タンパク質、あるいはその機能性断片、コンジュゲートまたは類似物質を提供する。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーの２つ以上あるいはその機能性断片、類似体、コンジュゲートまたは誘導体の組合せは、たとえばカンジダ・アルビカンスから入手されうる。同様のアドヘシンまたはインベイシン分子あるいはその類似物質または誘導体はカンジダ起源でありえて、たとえばカンジダ属に属する種、たとえばカンジダ・パラプシローシス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・グラブラータおよびカンジダ・トロピカリスから入手されうる。本発明による表面アドヘシンまたはインベイシンは単離または精製形で得られ、それゆえ本発明の一実施形態により、実質的に純粋なＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーカンジダ表面アドヘシンタンパク質、あるいはその機能性断片、免疫原性断片、類似物質、コンジュゲートまたは誘導体は、患者にて免疫応答を引き起こしてカンジダに対する免疫応答を誘発するために、および／または内皮細胞に対する生物の接着を遮断するためにワクチンとして調合される。無傷のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーと同様の結合、接着または侵入活性を示すＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーの断片は、本明細書では機能性断片と呼ばれる。カンジダ種に対する抗体または細胞免疫応答を誘発できるＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーの断片は、本明細書では免疫原性断片と呼ばれる。例示的な機能性断片としては、実施例ＶＩでさらに後述するＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーのＮ末端ポリペプチド領域が挙げられる。例示的な免疫原性断片としては、Ｎ末端Ａｌｓポリペプチド断片、Ｃ末端Ａｌｓポリペプチド領域はもちろんのこと、抗体免疫応答、細胞免疫応答、抗体および細胞免疫応答の両方を産生するのに十分である他のいずれかのＡｌｓ断片も挙げられる。そのような免疫原性断片は、約４アミノ酸ほどの小ささで、無傷のポリペプチドほどの大きさであるのはもちろんのこと、その間のすべてのポリペプチド長を含みうる。
【００１７】
本発明による表面接着タンパク質の類似物質または誘導体は同定でき、ＡＬＳファミリーメンバー遺伝子および／または遺伝子産物について本明細書に記載した基準によってさらに特徴付けられうる。たとえば類似物質または誘導体のヌルミュータントは、対照と比較して内皮細胞への顕著に低下した接着を共有する。同様に適切なモデルでの類似物質または誘導体の過剰発現は、対照と比較して内皮細胞への付着上昇を示し、上述した基準に従って細胞表面アドヘシンとして確認される。また類似物質または誘導体への抗血清は、抗Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーと交差反応でき、本明細書で開示するような播種性カンジダ症のマウスモデルで投与したときに生存時間の延長を示しうる。
【００１８】
本発明は、播種性カンジダ症を処置または予防する方法も提供する。本発明は、製薬的に許容される媒体中の、細胞接着または侵入活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー、あるいはその免疫原性断片の有効量を投与するステップを含む。ワクチンはアジュバントと共に、またはアジュバントなしで投与されうる。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、異なるカンジダ菌株からはもちろんのこと、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータおよびカンジダ・パラプシローシスなどの異なるカンジダ種からも由来しうる。播種性カンジダ症を処置または予防する方法で使用されるＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーとしては、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐが挙げられる。
【００１９】
異なるカンジダ菌株、異なるカンジダ種、他の細菌および感染性因子に対する本発明のワクチンの有効性ならびにその広範囲の免疫活性は、さらに後述され、実施例で例示される。たとえば実施例Ｖは、抗ＡＬＳ抗体が粘膜および血行性播種性カンジダ感染に対して有効であることを示す。実施例ＶＩＩは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎを用いたワクチン接種が細胞媒介免疫を強化することによってマウス播種性カンジダ症の間の生存を改善することを示す。実施例ＶＩＩＩは、本発明のワクチンが真菌負荷を低下させ、免疫適格および免疫不全マウスの両方で生存を改善することを示す。実施例ＩＸは、Ｓ．アウレウス感染に対する本発明のＡＬＳワクチンの有効性を示す。実施例Ｘは、本発明のワクチンが、異なる動物モデルにおける有効性と同様に、Ｃ．アルビカンスの異なる菌株に対して、そしてＣ．グラブラータ、Ｃ．クルセイ、Ｃ．パラプシローシスおよびＣ．トロピカリスなどの異なる種に対して有効であることを示す。実施例ＸＩは、異なる動物モデルにおける本発明の異なるワクチンの有効性を例示するのはもちろんのこと、２つの代表的なＡＬＳワクチンの誘発された、異なる応答および効力の比較も提供する。
【００２０】
さらに供給された本発明は、宿主細胞または組織へのカンジダの結合または侵入を抑制するために、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその機能性断片の有効量を投与するステップを含む、播種性カンジダ症を処置または予防する方法である。Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、カンジダ・アルビカンス、カンジダ・クルセイ、カンジダ・トロピカリス、カンジダ・グラブラータ、カンジダ・パラプシローシスに由来しうる。播種性カンジダ症を処置または予防する方法で使用されるＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーとしては、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、Ａｌｓ５ｐ、Ａｌｓ６ｐ、Ａｌｓ７ｐおよびＡｌｓ９ｐが挙げられる。細胞接着活性としては、ゼラチン、フィブロネクチン、ラミニン、上皮細胞または内皮細胞への結合および／または細胞侵入の促進を含む。
【００２１】
加えて本発明は、本明細書に記載するＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーを使用してスタフィロコッカス・アウレウス感染を処置または予防する方法も提供する。特に、スタフィロコッカス・アウレウス感染を処置または予防する方法は、製薬的に許容される媒体中の、細胞接着活性を有する単離Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー、またはその免疫原性断片を含むワクチンの免疫原性量を投与するステップを含む。
【００２２】
Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ３ｐは、Ｓ．アウレウス細胞表面タンパク質への著しい相同性のために特に有効である。たとえばＡｌｓ１ｐおよびＡｌｓ３ｐの配列および構造相同性は実施例ＩＸでさらに後述される。本明細書で提供される教示および指針から、当業者は本発明のワクチンおよび方法が、カンジダおよびスタフィロコッカス感染の処置に等しく利用されうることを理解するであろう。同様に本明細書に記載される教示および指針から、当業者は、本発明のワクチンおよび方法が、真菌、細菌などを含む、本明細書に記載されるＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーと同様の免疫原性、配列および／または構造相同性を備えた細胞表面ポリペプチドを有する他の病原体にも利用されうることも理解するであろう。
【００２３】
カンジダまたはスタフィロコッカス感染に対する細胞接着または侵入方法の免疫療法的および／またはＡｌｓポリペプチド抑制は、血管内皮細胞への結合のレベルにおいてはもちろんのこと、線維化制御経路の下流エフェクタを通じて作用しうる。溶解性Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーまたは機能性断片を使用する結合の免疫療法的方法または抑制は、この状況で有用である、なぜなら：（ｉ）現在利用できる抗真菌治療を用いても、血行性播種性カンジダ症および他の感染性病原体に関連する罹患率および死亡率が許容されないほど高い；（ｉｉ）抗真菌および抗生物質耐性の上昇する発生率が、抗真菌剤および抗菌剤の使用増加に関連している；ｉｉｉ）深刻なカンジダおよびスタフィロコッカス感染の危機に瀕した患者の集合が十分に定義され、かなり大きく、術後患者、移植患者、癌患者および低出生体重児を含む；およびｉｖ）深刻なカンジダ感染を発祥する患者の高いパーセンテージが好中球減少性でなく、それゆえワクチンまたは競合的ポリペプチドまたは化合物インヒビタに応答しうるからである。これらの理由でカンジダおよびスタフィロコッカスは、受動免疫療法、能動免疫療法、あるいは受動または能動免疫療法の組合せにとって魅力的な真菌および細菌標的である。加えてカンジダは、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーポリペプチド、その機能性断片および／または１つ以上のＡｌｓファミリーメンバーに結合して、カンジダの宿主細胞レセプタへの結合を予防する化合物またはその模倣剤を使用する、競合的抑制のためにも魅力的である。
【００２４】
本明細書で提供される教示および指針から、当業者は、当分野で公知の免疫療法方法が本発明のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、その免疫原性断片、類似物質、コンジュゲート、および／または誘導体によって、アジュバントと共に、またはアジュバントなしでワクチンとして投与される製薬的に許容される組成物中で該分子の１つ以上を免疫原として使用するために、利用されうることを理解するであろう。本発明の目的では、「製薬的な」または「製薬的に許容される」という用語は、非毒性であることが既知の技法によって調合され、所望ならばヒトへ安全に投与されうる担体または添加剤と共に使用される組成物を指す。投与は、たとえば静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下注射を含む公知の経路を使用して実施されうる。本発明のそのようなワクチンは、溶液中でワクチンの活性を維持するために当業者に既知である緩衝液、塩または他の溶媒を含みうる。同様に当分野で公知の広範囲のアジュバントのいずれも、感受性の宿主細胞に対するカンジダまたはスタフィロコッカスの結合、侵入および／または感染を減少または遮断することができる治療的に有効な免疫応答を誘発、促進または強化するために本発明のワクチンと共に利用されうる。
【００２５】
同様に本明細書で提供する教示および指針により、当業者は、細胞表面分子を投与して、細胞表面分子のその同源レセプタへの結合を遮断するための治療方法が、製薬的に許容される組成物中でＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーの１つ以上をインヒビタとして使用するために、本発明のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー、その機能性断片、類似物質、コンジュゲートおよび／または誘導体によって利用されうることを理解するであろう。ワクチン調合物と同様に、抑制調合物も、たとえば静脈内、筋肉内、血管内または皮下注射を含む当分野で公知の方法を使用して同じく投与されうる。Ａｌｓファミリーメンバーレセプタを結合して、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー結合も遮断するそのような抑制組成物は、緩衝液、塩または溶液中でワクチンの活性を維持するために当業者に既知である他の溶媒を含みうる。さらに当分野で公知の広範囲の調合物のいずれも、送達または摂取を標的化および／または強化して感受性宿主細胞に対するカンジダまたはスタフィロコッカスの結合、侵入および／または感染を低減または抑制するために、本発明の抑制組成物によって利用されうる。
【００２６】
本発明による治療用免疫原またはレセプタ結合インヒビタとして使用される分子に関して、当業者は、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー分子が免疫原ワクチンあるいは細胞接着または侵入インヒビタとして本質的な品質を失うことなく切断または断片化されうることを認識するであろう。たとえばＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、上述され、実施例でさらに後述される機能的特性を維持しながら、Ｃ末端部からの切断によりＮ末端断片を産生するために切断されうる。同様にＣ末端断片は、その機能的特性を維持しながら、Ｎ末端部からの切断によって産生されうる。本明細書で提供される教示および指針による他の修飾は、他のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバー機能性断片、免疫原性断片、その類似物質および誘導体を作製して、未変性タンパク質を用いて本明細書に記載する治療的に有用な特性を達成するために本発明に従って実施できる。
【００２７】
本発明のＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーおよび方法の治療的有効性の一態様は、生物の宿主構成要素への付着を遮断するために、そして免疫エフェクタ細胞および他の生理学的機構による生物のクリアランスを向上させるために、線維化の制御の妨害を達成する。内皮細胞が脈管構造の大半を被覆するため、抗体、Ａｌｓファミリーメンバータンパク質、ポリペプチドまたはペプチドあるいはそのいずれかの組合せを使用して生物の内皮細胞に対する付着、侵入および／または両方を遮断する方法は、本発明の有用な実施形態を含む。上述したように、そのような付着および／または侵入遮断療法としては、能動または受動免疫療法あるいは本明細書で開示するカンジダアドヘシン、インベイシン、または同源レセプタに向けられた抑制結合が挙げられる。それゆえたとえば、いずれの適切な宿主も、所望の抗アドヘシン抗体を産生するために収集されたタンパク質および血清を、適切な精製および／または濃縮の後に注射されうる。注射の前にアドヘシンまたはインベイシンタンパク質あるいはその組合せは、適切なビヒクル、好ましくはポリサッカライドなどの既知の免疫賦活剤あるいはリポソームまたは徐放性組成物などの送達調合物中に調合されうる。それゆえさらなる態様により、本発明は、ワクチンまたはＡｌｓレセプタインヒビタとして使用するための調合物中にカンジダアドヘシンまたはインベイシンタンパク質を製薬的に許容される賦形剤と共に含む製薬組成物を提供する。
【００２８】
本発明の方法は、Ｃ．アルビカンスの宿主構成要素の内皮または上皮細胞への付着を遮断することによって、あるいはたとえばスタフィロコッカスへの抗体結合によって免疫機構に病原体を除去させることによって、カンジダまたはスタフィロコッカス感染を改善および／または予防する。それゆえ本発明の一態様により、Ａｌタンパク質ファミリーメンバーのアドヘシンまたはインベイシンタンパク質、その機能性または免疫原性断片、誘導体、類似物質、またはコンジュゲートを含む製薬組成物は、注射または輸液用生体適合性担体を含有する製薬組成物中でワクチンまたはＡｌｓレセプタインヒビタとして調合され、患者に投与される。またＡｌｓファミリーメンバータンパク質あるいは単離または組換えＡｌｓファミリーメンバータンパク質に対して産生された抗血清の直接投与も、Ｃ．アルビカンスの哺乳類宿主構成要素への付着を遮断するために、またはスタフィロコッカス病原体の除去を実施するために使用されうる。アドヘシンタンパク質に対する抗血清は、既知の技法、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９９（１９７５）によって得られ、抗原性を低下させるためにヒト化されうるか、ＵＳＰ  ５，６９３，７６２を参照、または未再配列のヒト免疫グロブリン遺伝子を残してトランスジェニックマウス内で産生されうる、ＵＳＰ  ５，８７７，３９７を参照。同様に単離または組換えＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーは、たとえば下の実施例に記載する組換え産生を含む当業者に公知の方法を使用しても産生されうる。
【００２９】
本発明のなおさらなる使用はたとえば、カンジダまたはスタフィロコッカス感染の予防および／または改善のためのワクチン方法を開発するためにＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーのアドヘシンまたはインベイシンタンパク質を使用することである。それゆえ本発明の一態様に従って、標準免疫技法を利用して、Ｃ．アルビカンスの付着を遮断するために、またはスタフィロコッカス病原体の除去を実施するために、宿主構成要素からの免疫応答を強化および／または誘発する多成分ワクチン方法が構築されうる。
【００３０】
本発明のなおさらなる使用はたとえば、ＤＮＡワクチン方法を開発することである。それゆえ本発明の一態様に従って、たとえばＡｌｓタンパク質ファミリーメンバーのアドヘシンまたはインベイシンあるいはその機能性断片をコードするＡＬＳファミリーメンバーポリヌクレオチドは、遺伝子産物に対する免疫応答を生じるように設計されたプロトコルに従って投与される。たとえばＦｅｉｇｎｅｒ  ＵＳＰ  ５，７０３，０５５を参照。
【００３１】
本発明のなおさらなる使用はたとえば、併用ワクチン方法を開発することである。それゆえ本発明の一態様に従って、たとえば抗ＡＬＳタンパク質ファミリーメンバー抗体は、カンジダまたはスタフィロコッカス感染を処置および／または治療する抗体と共に使用されうる。ＵＳＰ  ５，５７８，３０９を参照。
【００３２】
次の実施例は、播種性カンジダ症の予防措置または処置の基礎としてのＡＬＳ１アドヘシンの免疫療法的利用を説明する。実施例１は、内皮細胞への付着の媒介を確認するために、ＡＬＳ１ヌルミュータントおよびＡＬＳ１の過剰発現を特徴とするＣ．アルビカンスの菌株の調製について記載する。実施例２は、Ａｌｓ１ｐの局在化およびｅｆｇ線維化制御経路について記載する。実施例３は、ＡＬＳ１アドヘシンタンパク質の精製について記載する。実施例４は、表面アドヘシンタンパク質の遮断を証明するために使用されるＡＬＳ１表面アドヘシンに対して産生されたウサギポリクローナル抗体の調製について記載する。実施例５は、マウスモデルでの播種性カンジダ症を防御するために本発明による本明細書に記載されるようなＡＬＳ１表面接着タンパク質に対して産生されたポリクローナル抗体を使用する、生体内での付着の遮断について記載する。実施例ＶＩは、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーの構造的および機能的特徴について記載する。
本発明の各種の実施形態の活性に実質的に影響しない修飾も本明細書で提供する本発明の定義内に含まれることが理解される。したがって次の実施例は、本発明を制限するのではなく、例示するためのものである。
【実施例】
【００３３】
実施例Ｉ
Ａｌｓ１はＣ．アルビカンスの内皮細胞への付着を媒介する
ＵＲＡブラスター技法を使用して、Ａｌｓ１ｐの発現を欠損するＣ．アルビカンスのヌルミュータントが構築された。ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータントはＣ．アルビカンス菌株ＣＡＩ４にて、Ｕｒａブラスター方法（Ｆｏｎｚｉ  ａｎｄ  Ｉｒｗｉｎ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １３４，７１７（１９９３））の改良を使用して次のように構築された：２つの独立したａｌｓｌ−ｈｉｓＧ−ＩＲＡ３−ｈｉｓＧ−ａｌｓｌ構築物を利用して、遺伝子の２つの異なる対立遺伝子を破壊した。ハイフィディリティＰＣＲ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）により、プライマーを使用して、４．９ｋｂ  ＡｓＬＳ１コード配列を産生させた。
【００３４】
【数１】
2008540453.tif 000003
次にＰＣＲ断片をｐＧＥＭ−Ｔベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）内へクローニングして、それゆえｐＧＥＭ−Ｔ−ＡＬＳ１を得た。ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ構築物は、ＫｐｎｌおよびＨｉｎｄ３を用いた消化によってｐＭＧ−７から放出され、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＡＬＳ１のＫｐｎｌおよびＨｉｎｄ３消化によって放出されたＡＬＳ１の部分と交換するのに使用された。最終的なａｌｓ１−ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ−ａｌｓ１構築物は、Ｘｈｏｌを用いた消化によりプラスミドから放出され、菌株ＣＡＩ−４の形質転換によるＡＬＳ１の第１の対立遺伝子を破壊するために使用された。
【００３５】
第２のａｌｓ１−ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ−ａｌｓ１構築物は、２つのステップで産生された。第１に、ｐＭＢ７のＢｇ１２−Ｈｉｎｄ３  ｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ断片をｐＵＣ１９のＢａｍＨ１−Ｈｉｎｄ３部位内にクローニングして、それによりｐＹＣ２を産生させた。ＰＹＣ２を次に、Ｔ４  ＤＮＡポリメラーゼを使用して部分的にｄＡＴＰおよびｄＧＴＰによって充填されたＨｉｎｄ３によって消化して、次にＳｍａ１によって消化して、新しいｈｉｓＧＵＲＡ３−ｈｉｓＧ断片を産生した。第２に、ＡＬＳ１相補性フランキング領域を産生するために、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＡＬＳ１をＸｂａｌによって消化して、次にｄＣＴＰおよびｄＴＴＰによって部分的に充填した。この断片をＨｐａ１によって消化してＡＬＳ１の中央部を除去し、次にｐＹＣ３を産生するｈｉｓＧ−ＵＲＡ３−ｈｉｓＧ断片に結合させた。このプラスミドを次にＸｈｏｌによって消化して、ＡＬＳ１の第２の対立遺伝子を破壊するために使用される構築物を放出させた。産生された変異が増殖速度に影響を持たないことを確認するために、実験の間に増殖曲線を作った。すべての組込みは、ＸｂａｌおよびＨｉｎｄＩＩＩによるｐＹＦ５の消化によって産生された０．９ｋｂ  ＡＬＳ１特異性プローブを使用してサザンブロット分析によって確認した。
【００３６】
ヌルミュータントは、試験管内でのヒト臍帯静脈内皮細胞へのその付着能力について、Ｃ．アルビカンスＣＡＩ−１２（ＵＲＡ＋関連菌株）と比較した。付着調査のために、ＹＰＤ（２％グルコース、２％ペプトン、および１％酵母抽出物）一晩培養物からの酵母細胞を、グルタミンを含むＲＰＭＩ中で２５℃にて１時間培養して、Ａｌｓ１ｐ発現を誘発した。ハンクス液（Ｈａｎｋｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ）（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ））中の３ｘ１０２個の生物を内皮細胞の各ウェルに添加して、その後プレートを３７℃にて３０分間インキュベートした。接種材料サイズは、ＹＰＤ寒天での定量的培養によって確認した。インキュベーション期間の終わりに、非付着性生物を吸引して、内皮細胞単層を標準化された方式でＨＢＳＳによって２回すすいだ。ウェルをＹＰＤ寒天と重ねて、コロニーカウントによって付着生物の数を決定した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によって統計的処理を得て、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正によって複数の比較について補正した。Ｐ＜０．００１。
【００３７】
図１を参照すると、ＡＬＳ１／ＡＬＳ１およびａｌｓ１／ａｌｓ１菌株の比較は、ＡＬＳ１ヌルミュータントが内皮細胞に対してＣ．アルビカンスＣＡＩ−１２よりも３５％低い付着性であることを示した。バックグラウンド付着を低減するために、非ＡＬＳ１発現条件下で培養した野生型菌株を、Ａｌｓ１ｐを自発的に発現するミュータントと比較した。このミュータントは、構成的ＡＤＨ１プロモータの制御下で野生型Ｃ．アルビカンスへＡＬＳ１の第３のコピーを組込むことによって構築された。Ｃ．アルビカンスにおけるＡＬＳ１の構成的発現を実現するために、平滑末端ＰＣＲ産生ＵＲＡ３遺伝子をｐＯＣＵＳ−２ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）の平滑エッジＢｇ１２部位内へ結合させて、ｐＯＵ−２を得る。Ｃ．アルビカンスアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１）プロモータおよびターミネータ（Ａ．Ｂｒｏｗｎ，Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫより寄贈されたｐＬＨ−ＡＤＨｐｔから単離）を含有する２．４ｋｂ  Ｎｏｔｌ−Ｓｔｕｌ断片を、Ｎｏｔ１およびＳｔｕｌによる消化の後にｐＯＵ−２内へクローニングした。ｐＯＡＵ−３という名称の新しいプラスミドは、ＡＤＨ１プロモータとターミネータとの間にＢｇ１２部位を１個のみ有していた。ＢａｍＨ１制限酵素部位に隣接されたＡＬＳ１コード配列は、テンプレートとしてのｐＹＦ−５および次のプライマーを使用して、ハイフィディリティＰＣＲによって産生された：
【００３８】
【数２】
2008540453.tif 000004
このＰＣＲ断片はＢａｍＨ１によって消化され、ｐＡＵ−１を産生するために次にｐＯＡＵ−３の適合性Ｂｇ１２部位内へクローニングされた。最後に、Ｃ．アルビカンスＣＡＩ−４を形質転換する前に、ｐＡＵ−１はＸｂａ１によって線形化された。部位特異的組込みは、サザンブロット分析によって確認された。図１Ｂを参照すると、このＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１菌株でのＡＬＳ１の過剰発現は、野生型Ｃ．アルビカンスと比較して内皮細胞への付着の７６％の上昇が生じた。野生型の内皮細胞付着を過剰発現ミュータントのそれと比較して、酵母細胞をＹＰＤ中で２５℃（Ａｌｓ１ｐの非誘発条件）にて一晩培養した。野生型のバックグラウンド付着を低下させるためにＡｌｓ１ｐ発現は誘発されず、それゆえＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１ハイブリッド遺伝子を通じた付着におけるＡｌｓ１ｐの役割を拡大させる。付着アッセイは上述のように実施された。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によって統計的処理を得て、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正によって複数の比較について補正した。Ｐ＜０．００１。
【００３９】
モノクローナル抗Ａｌｓ１ｐマウスＩｇＧ抗体は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  ＹＥＸｐｒｅｓｓ（商標）Ｙｅａｓｔ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して発現させたＡｌｓ１ｐ（アミノ酸１７番〜４３２番）の精製および切断Ｎ末端に対して産生された。これらのモノクローナル抗Ａｌｓ１ｐ抗体の付着遮断能力は、希釈度１：５０でＣ．アルビカンス細胞を抗Ａｌｓ１抗体またはマウスＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）のどちらかでインキュベートすることによって評価した。その後、酵母細胞を付着アッセイで上述のように使用した。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によって統計的処理を得て、Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正によって複数の比較について補正した。Ｐ＜０．００１。結果は、ＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１菌株の付着が２６．８％±３．５％から１４．７％±５．３％へ低下したことを明らかにした。それゆえＡＬＳ１欠損および過剰発現の効果は、Ａｌｓ１ｐがＣ．アルビカンスの内皮細胞への付着を媒介することを証明する。
【００４０】
実施例ＩＩ
Ａｌｓ１ｐの局在化
アドヘシンがＡｌｓ１ｐとして機能するためには、それが細胞表面に位置しなければならない。Ａｌｓ１ｐの細胞表面局在化は、抗Ａｌｓ１ｐモノクローナル抗体を用いた間接免疫蛍光法を使用して検証された。指数増殖の間に分芽胞子の表面に拡散染色が検出された。この染色は定常期に分芽胞子上で検出された。図２Ａを参照すると、分芽胞子に線維化を誘発させたときに、新生微細線維の基礎に独占的に局在化した強い染色が観察された。ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータントでは免疫蛍光が観察されず、Ａｌｓ１ｐのこの抗体の特異性が確認された。図２Ｂを参照。これらの結果は、Ａｌｓ１ｐが細胞タンパク質であることを証明する。
【００４１】
Ａｌｓ１ｐへの分芽胞子−微細線維接合部への特異性局在化は、線維化プロセスにＡｌｓ１ｐを関係させている。機構を決定するために、Ｃ．アルビカンスＡＬＳ１ミュータントの線維化表現型が分析された。図３Ａを参照すると、ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータントはＬｅｅの固体培地での４日間のインキュベーション後に微細線維を形成できず、これに対してＡＬＳ１／ＡＬＳ１およびＡＬＳ１／ａｌｓ１菌株はもちろんのこと、ＡＬＳ１補足ミュータントはこの時点で豊富な微細線維を産生した。ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータントは、より長いインキュベーション期間の後に微細線維を形成できた。さらにＡＬＳ１の過剰発現は線維化を増強した：ＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１菌株は３日間のインキュベーションの後に豊富な微細線維を形成したが、これに対して野生型菌株はこの時点で不十分な微細線維を産生した。図３Ｂを参照。線維化におけるＡｌｓ１ｐの役割をさらに確認するために、ＡＬＳ１のコード配列が反対方向に挿入されることを除いて、ＡＬＳ１過剰発現ミュータントと類似したミュータントを使用して負の対照が供給された。得られた菌株の線維化表現型は、野生型菌株のそれと類似していることが示された。上述の菌株すべてが液体培地で同程度に線維化したため、Ａｌｓ１ｐの微細線維誘発特性は固体培地で増殖された細胞に特異的である。データは、Ａｌｓ１ｐが線維化を促進して、線維化制御経路の調節にＡＬＳ１発現を関係させることを証明している。ｅｆｇｌ／ｅｆｇｌ、ｃｐｈｌ／ｃｐｈｌ、ｅｆｇｌ／ｅｆｇ、ｃｐｈｌ／ｃｐｈｌ、ｔｕｐｌ／ｔｕｐｌ、およびｃｌａ４／ｃｌａ４ミュータントを含む、これらの経路のそれぞれにおける欠陥のあるミュータントでのＡＬＳ１発現のノザンブロット分析を実施した。図４Ａを参照すると、ＥＦＧ１の両方の対立遺伝子が破壊されたミュータントはＡＬＳ１を発現できなかった。野生型ＥＦＧ１のコピーのｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントへの導入は、低下したレベルであるがＡＬＳ１発現を回復させた。図４Ｂを参照。また図４Ａに見られるように、他の線維化制御変異以外のいずれも、ＡＬＳ１発現を著しく改変しなかった（図４Ａ）。それゆえＥｆｇ１ｐはＡＬＳ１発現に必要である。
【００４２】
Ｅｆｇ１ｐがＡＬＳ１の発現を刺激して、これが次に線維化を誘発する場合、ｅｆｇ１／ｅｆｇ１菌株の発現は線維化を回復すべきである。ＡＤＨ１プロモータの制御下でのＡＬＳ１機能性対立遺伝子は、ｅｆｇ１／ｅｆｇ１菌株内に組込まれた。ＡＬＳ１遺伝子産物がｅｆｇ１ヌルミュータントの線維化欠陥を補完しうる可能性を調査するために、Ｕｒａｅｆｇ１ヌルミュータントは線形化ｐＡＵ−１によって形質転換された。Ｕｒａ＋クローンが選択され、ＡＬＳ１の第３のコピーの組込みはプライマーを使用してＰＣＲによって確認された：
【００４３】
【数３】
2008540453.tif 000005
得られた菌株はＡＬＳ１を自発的に発現し、Ｌｅｅの寒天上で線維化する能力を回復した。図４ＢおよびＣを参照。したがってＥｆｇ１ｐはＡＬＳ１発現の活性化を通じて線維化を誘発する。
【００４４】
線維化はＣ．アルビカンスにおいて決定的な毒性因子であるため、線維化を制御する経路の描写は病原性に関して重要な示唆を有する。ＡＬＳ１の前に、これらの制御経路の下流エフェクタをコードする遺伝子は同定されていなかった。細胞表面タンパク質をコードする２つの他の遺伝子ＨＷＰ１およびＩＮＴＩの破壊は、線維化欠陥のあるミュータントを生じる。ＨＷＰ１発現もＥｆｇ１ｐによって制御されるが、ｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントにおける自律発現は線維化を回復させることができない。したがってＨｗｐ１ｐ単独では、ＥＦＧ１下流の線維化のエフェクタとして機能しない。またＩＮＴ１発現を制御する制御要素も未知である。それゆえＡｌｓ１ｐは線維化の下流エフェクタとして機能する、同定された最初の細胞表面タンパク質であり、それによりＣ．アルビカンスの毒性におけるこのタンパク質の中心的な役割が示唆される。
【００４５】
Ａｌｓ１ｐのＣ．アルビカンス毒性への寄与は、血行性播種性カンジダ症のモデルで試験された、Ａ．Ｓ．Ｉｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３，１９９３（１９９５）。図５Ａを参照すると、ａｌｓ１／ａｌｓ１ヌルミュータントに感染したマウスは、ＡＬＳ１／ＡＬＳ１菌株、ＡＬＳ１／ａｌｓ１ミュータント、またはＡＬＳ１補足ミュータントによって感染したマウスよりも著しく長く生存した。感染２８時間後、ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータントに感染したマウスの腎臓は、著しく少ない生物を含有していた（５．７０±０．４６  ｌｏｇ１０  ＣＦＵ／ｇ）（両方の比較についてＰ＜０．０００６）。菌株のどちらかに感染したマウスの脾臓、肺または肝臓から回収した生物のコロニーカウントにおいて、試験した時点のいずれにおいても相違は検出されなかった。これらの結果は、Ａｌｓ１ｐが感染の最初の２８時間の間に腎臓におけるＣ．アルビカンスの増殖および存続にとって重要であることを示す。図５Ｂを参照すると、感染２８時間後のマウスの腎臓の検査は、ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータントが野生型またはＡＬＳ１補足菌株のいずれよりも、著しく短い微細線維を産生し、弱い炎症応答を誘発することを明らかにした。しかしながら感染４０時間までに、微細線維の長さおよびそれらを包囲する白血球の数は３つすべての菌株で同様であった。
【００４６】
組織病理で見られるａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータントの線維化欠陥は、固体培地上での試験管内線維化アッセイを比較した。このミュータントは生体内および試験管内の両方で早期の時点での欠陥線維化を示した。この欠陥は最終的に、長期の感染／インキュベーションによって解決した。これらの結果は、ＡＬＳ１に無関係である線維化制御経路が後の時点で作用するようになることを示唆している。感染４０時間までのこの代わりの線維化経路の活性化は、ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータントに感染したマウスが続いて次の２〜３日間に死亡する理由であるように思われる。
【００４７】
ひとまとめにして、これらのデータは、Ｃ．アルビカンスＡＬＳ１が内皮細胞への付着および線維化の両方を媒介する細胞表面タンパク質をコード化することを証明する。Ａｌｓ１ｐはＣ．アルビカンスにおけるいずれの既知の線維化制御経路の唯一同定された下流エフェクタである。加えてＡｌｓ１ｐは、血行性カンジダ感染の毒性に寄与する。Ａｌｓ１ｐの細胞表面局在化および二重機能性は、それを薬物および免疫ベース治療の魅力的な標的としている。
【００４８】
実施例ＩＩＩ
ＡＬＳ１アドヘシンタンパク質の精製
Ｅ．ｃｏｌｉによって合成されたＡＬＳ１タンパク質は免疫原として十分である。しかしながらＥ．ｃｏｌｉによって合成された真核タンパク質は、不正な折畳みまたはグリコシル化の不足のために機能的でない。したがってＡＬＳ１タンパク質がＣ．アルビカンスの内皮細胞への付着を遮断できるかどうかを判定するために、タンパク質は好ましくは遺伝子組換えＣ．アルビカンスから精製される。
【００４９】
ＰＣＲを使用してヌクレオチド５２〜１２９６からＡＬＳ１の断片を増幅した。この１２４６ｂｐ断片は、シグナルペプチドの終わりからタンデム反復の始まりまでの予測されたＡＬＳ１タンパク質のＮ末端を含む。ＡＬＳ１のこの領域は、それがＳ．セレビシエＡｇａ１遺伝子産物の結合領域へのその相同性に基づいて、アドヘシンの結合部位をコードしやすいので増幅された。加えて、予測されたＡＬＳ１タンパク質のこの部分はグリコシル化をほとんど有さず、そのサイズはＥ．ｃｏｌｉでの十分な発現にとって適切である。
【００５０】
ＡＬＳ１の断片はｐＩＮＳ５を産生するためにｐＱＥ３２内へ結合された。このプラスミドでは、タンパク質はｌａｃプロモータの制御下で発現され、それは親和性精製できるようにそのＮ末端に融合された６ヒット・タグを有する。我々はＥ．ｃｏｌｉをｐＩＮＳ５によって形質転換して、それを誘発条件（ＩＰＴＧの存在下）で増殖させて、次に細胞を溶解させた。細胞溶解液をＮｉ２＋アガロースカラムに通過させてＡＬＳ１−６Ｈｉｓ融合タンパク質を親和性精製した。この手順は、ＡＬＳ１−６Ｈｉｓの実質的な量を生じた。融合タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらに精製された。タンパク質を含有するバンドを、それに対してポリクローナルウサギ抗血清を産生できるように、ゲルから切除した。当業者によって、本発明の精神から逸脱することなく、各種の既知のプロセスによって本発明による表面アドヘシンタンパク質が調製および精製されうることが認識されるであろう。Ａｌｓ１ｐの配列を図７に挙げる。
【００５１】
実施例ＩＶ
ＡＬＳ１タンパク質に対するポリクローナル抗血清の産生
ＡＬＳ１タンパク質に対する抗体がカンジダ・アルビカンスの内皮および上皮細胞、ならびに選択した宿主構成要素への試験管内での付着を遮断するかどうかを判定するために、ＡＬＳ１タンパク質によって形質転換されたＳ．セレビシエをウサギに接種した。使用した免疫化プロトコルは、カンジダの多様な種の間の抗原関係を同定した抗血清の産生のためにＨａｓｅｎｃｌｅｖｅｒおよびＭｉｔｃｈｅｌｌによって使用された用量およびスケジュールであった。Ｈａｓｅｎｃｌｅｖｅｒ，Ｈ．Ｆ．ａｎｄ  Ｗ．Ｏ．Ｍｉｔｃｈｅｌｌ．１９６０．Ａｎｔｉｇｅｎｉｃ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｏｆ  Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉｓ  ｇｌａｂｒａｔａ  ａｎｄ  ｓｅｖｅｎ  ｓｐｅｃｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｕｓ  Ｃａｎｄｉｄａ．Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．７９：６７７−６８１。対照抗血清も、空のプラスミドによって形質転換されたＳ．セレビシエに対して産生された。すべての酵母細胞をガラクトース中で増殖させて、ＡＬＳ遺伝子の発現を誘発した。付着実験で試験する前に、血清を５６℃にて不活性化して、すべての相補性活性を除去した。
【００５２】
免疫化ウサギからの血清は、空のプラスミドによって形質転換されたＳ．セレビシエの全細胞によって吸収させて、ＡＬＳ１タンパク質以外の酵母の成分と反応性である抗体を除去した。抗血清の力価は、ＡＬＳ１遺伝子を発現するＳ．セレビシエを使用した免疫蛍光法によって決定した。ＦＩＴＣ標識抗ウサギ抗体は、市販供給源（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ）より購入した。親和性精製２次抗体は、多くの市販の血清が酵母グルカンおよびマンナンと反応性の抗体を含有するために不可欠であった。２次抗体は、カンジダ・アルビカンスはもちろんのこと、プラスミドによって形質転換されたＳ．セレビシエによっても予備試験され、いずれの抗Ｓ．セレビシエおよび抗カンジダ抗体を除去するために必要に応じて吸収させた。負の対照は１）免疫前血清、２）空のプラスミドによって形質転換されたＳ．セレビシエ、および３）ＡＬＳ遺伝子によって形質転換されたが、ＡＬＳ遺伝子の発現を抑制する条件（グルコース）下で増殖させたＳ．セレビシエであった。
【００５３】
上の実験に加えて、ウェスタンブロッティングを使用して、抗血清がそれに対して産生されたＡＬＳタンパク質に特異的に結合するというさらなる確認を与えた。ＡＬＳ１によって形質転換されたＳ．セレビシエは、誘発条件下で増殖させて、その原形質膜を標準方法によって単離した。Ｐａｎａｒｅｔｏｕ  Ｒ  ａｎｄ  Ｐ．  Ｐｉｐｅｒ．１９９６．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｙｅａｓｔ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．ｐ．１１７−１２１．Ｉｎ  Ｉ．Ｈ．Ｅｖａｎｓ，（ｅｄ．），Ｙｅａｓｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ。原形質膜は、空のプラスミドによって形質転換され、同一条件下で培養したＳ．セレビシエからも調製した。膜タンパク質はＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離して、電気ブロッティングによってＰＶＤＦ膜に移した。Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ．１９８８．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ。脱脂乳によって遮断した後に、ブロットをＡＬＳ抗血清によってインキュベートした。予備吸収させた抗血清は、空のプラスミドを含有するＳ．セレビシエから抽出したタンパク質と反応しなかった。この抗血清は、Ｓ．セレビシエｐＹＦ５（カンジダ・アルビカンスＡＬＳ１）の内皮細胞への付着を遮断した。
【００５４】
実施例Ｖ
特定のＡＬＳタンパク質に対するポリクローナル抗体は、マウスを粘膜および血行性播種性カンジダ感染から予防的に防御する
上の条件下でＡＬＳ遺伝子によって形質転換されたＳ．セレビシエのクローンの付着を遮断する抗血清を同定して、これらの抗血清はマウスをカンジダ・アルビカンスによる静脈内攻撃から防御することが証明された。
【００５５】
ＡＬＳタンパク質に対する抗血清は最初に、血行性播種性カンジダ症のマウスモデルで試験された。親和性精製抗ＡＬＳ抗体は、酵母細胞の各種基質への接着を防止するのに有効である（実施例３を参照）。親和性精製は、抗体用量が正確に決定できるのでこの系において有用である。その上、未分画の抗血清は疑う余地なく、Ｓ．セレビシエキャリア細胞上の抗原に対する抗体を大量に含有するであろう。これらの抗サッカロミセス抗体の多くは、Ｃ．アルビカンスに結合して、結果の解釈を不可能にしがちである。加えて、ＡＬＳタンパク質を発現するＳ．セレビシエから抗体を溶離させるのに使用した手順が、アジュバント様活性を有しうる少量の酵母マンナンまたはグルカンも溶離させうることは、完全に可能である。免疫親和性精製抗体は、使用前にさらに精製される。それらはマウス脾細胞によっても予備吸収されうる。
【００５６】
抗体用量は、大半の能動免疫化プロトコルで予測されうる血清抗体のレベルを一括する範囲を扱うために、そしてカンジダ症のマウスモデルでの受動免疫化に通例使用される抗体用量の範囲を扱うために投与されうる。Ｄｒｏｍｅｒ，Ｆ．，Ｊ．Ｃｈａｒｒｅｉｒｅ，Ａ．Ｃｏｎｔｒｅｐｏｉｓ，Ｃ．Ｃａｒｂｏｎ，ａｎｄ  Ｐ．Ｙｅｎｉ．１９８７，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ，ｏｆ  ｍｉｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｏｓｉｓ  ｂｙ  ａｎｔｉ−Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｎｗｎｓ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５５：７４９−７５２；Ｈａｎ，Ｙ．ａｎｄ  Ｊ．Ｅ．Ｃｕｔｌｅｒ．１９９５，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｄｉｓｓｅｍｉｎａｔｅｄ  ｃａｎｄｉｄｉａｓｉｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：２７１４−２７１９；Ｍｕｋｈｅｒｊｅｅ，Ｊ．，Ｍ．Ｄ．Ｓｃｈａｒｆｆ，ａｎｄ  Ａ．Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ．１９９２，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｏ  Ｃｉｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｎｗｎｓ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６０：４５３４−４５４１；Ｓａｎｆｏｒｄ，Ｊ．Ｅ．，Ｄ．Ｍ．Ｌｕｐａｎ，Ａ．Ｍ．Ｓｃｈｌａｇｅｔｅｒ，ａｎｄ  Ｔ．Ｒ．Ｋｏｚｅｌ．１９９０，Ｐａｓｓｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ  ｗｉｔｈ  ａｎ  ｉｓｏｔｙｐｅ−ｓｗｉｔｃｈ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆｒｎｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｗｉｔｈ  ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃａｌ  ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．５８：１９１９−１９２３を参照。ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、７週齢、ＮＣＩ）に腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって、マウス脾細胞に吸収された抗ＡＬＳを投与した。対照マウスには、マウス脾細胞によって吸収された出血前血清、無傷の抗ＡＬＳ血清、またはＤＰＢＳをそれぞれ与えた。事前吸収のために、抗ＡＬＳまたは出血前血清２ｍｌをマウス（ＢＡＬＢ／ｃ、７週齢メス、ＮＣＩ）脾細胞１００μｌ（約９ｘ１０６個細胞／ｍｌ）と室温にて２０分間混合した。混合物を温滅菌ＤＰＢＳを用いて遠心分離（＠３００ｘｇ）によって３分間洗浄した。この手順を３回反復した。ｉ．ｐ．注射の体積はマウス当たり０．４ｍｌであった。４時間後、マウスをＣ．アルビカンス（菌株ＣＡ−Ｉ；マウス当たり５ｘ１０５個の親水性酵母細胞を用いてｉ．ｖ．注射によってチャレンジした。次にその生存時間を測定した。図６を参照。
【００５７】
以前の研究は、腹腔内経路を介して投与された抗体が迅速（数分以内に）およびほぼ完全に血清に移動されることを示している（Ｋｏｚｅｌ  ａｎｄ  Ｃａｓａｄｅｖａｌｌ、未発表の観察）。抗体調製物を投与する効果に対する対照として、マウスの平行群を、ＡＬＳ遺伝子によって形質転換されたＳ．セルビシエによって吸収されている免疫前血清から単離した抗体によって処置した。腎臓１グラム当たりの酵母の生存時間および数を測定した。再び図６を参照すると、ＡＬＳ１の１０６個の分芽胞子によって静脈内感染させたマウスは、カンジダ・アルビカンスＣＡＩ−１２またはＡＬＳ１の１つの対立遺伝子が欠損されたカンジダ・アルビカンスによって感染させたマウスと比較したときに、より長い中央生存時間を有していた（Ｐ＝０．００３）。
【００５８】
これらの結果は、ＡＬＳ１タンパク質をワクチンとして使用する免疫療法方法が播種性カンジダ症に対して防御的予防効果を有することを示している。
【００５９】
実施例ＶＩ
カンジダ・アルビカンスのＡｌｓタンパク質ファミリーにおける機能および構造多様性
非付着性Ｓ．セレビシエの異種相補によるＣ．アルビカンスＡＬＳ１遺伝子の単離およびｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄは以前に記載されている（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：１７８３−１７８６（１９９８））。ＡＬＳ１は、内皮および上皮細胞への付着を媒介する細胞表面タンパク質をコードする。Ｃ．アルビカンスにおけるこの遺伝子の両方のコピーの破壊は、内皮細胞への付着の３５％の低下に関連しており、ＡＬＳ１の過剰発現は付着を１２５％に上昇させる（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２））。
【００６０】
ＡＬＳ１は、Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によって最初に記載された少なくとも８つのメンバーより成る大規模なＣ．アルビカンス遺伝子ファミリーのメンバーである（Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：１７６−１８０（２００１），Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９：２９４７−２９６０（２００３））。これらの遺伝子は、３つのドメインによって特徴付けられる細胞表面タンパク質をコードする。Ｎ末端領域は、推定上のシグナルペプチドを含有し、Ａｌｓタンパク質間で相対的に保存されている。この領域は、不十分にグリコシル化されることが予測される（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９：２９４７−２９６０（２００３），Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５７：１５５５−１５６７（２００１））。これらのタンパク質の中央部は、可変数のタンデム反復（長さが〜３６アミノ酸）より成り、グリコシルホスファチジルイノシトールアンカー配列を含有するセリン−トレオニンリッチＣ末端領域が続いている（同上）。この遺伝子ファミリーによってコードされるタンパク質は感染中に発現されることが既知であるが（Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：４２５１−４２５５（１９９９），Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２００５−２０１７（２００３））、異なるＡｌｓタンパク質の機能は詳細には調査されていない。
【００６１】
非付着性Ｓ．セレビシエにおけるＡｌｓタンパク質の異種発現は、Ａｌｓタンパク質の機能を評価するために、そしてＣ．アルビカンスによって発現された複数の他のアドヘシンによって媒介された高いバックグラウンド付着を回避するために実施された。この異種発現系は、アドヘシンＡＬＳｌ、ＡＬＳ５、およびＥＡＰｌの単離およびキャラクタリゼーションを含むＣ．アルビカンス遺伝子の研究のために広範囲に使用されている（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｋａｒｙｏｔ  Ｃｅｌｌ  ２：１２６６−１２７３（２００３），Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：１７８３−１７８６（１９９８），Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：５２８９−５２９４（１９９７））。下でさらに記載するように、このモデル系を使用して、Ａｌｓタンパク質は多様な接着および侵入機能を有することが証明されている。これらの結果と一致して、相同性モデリングはＡｌｓタンパク質が構造において、タンパク質の免疫グロブリンスーパーファミリーのアドヘシンおよびインベイシンに密接に関連していることを示した。ＣＤおよびフーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）Ｉ分光法を使用する構造解析は、Ａｌｓ１ｐのＮ末端ドメインが逆平行βシート、ターン、α−らせん、および免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーの構造と一致する非構造化ドメインより成ることを確認した。最後に匹敵するエネルギーベースのモデルが、別個の付着および侵入生物学的機能を支配しうる、異なるＡｌｓタンパク質の間でのＮ末端ドメインの主要な物理化学特性の相違を示唆している。
【００６２】
ＡＬＳファミリーメンバーをクローニングして、それらをＳ．セレビシエ内で発現させるために、ＡＬＳ１、−３、−５、−６、−７、および−９は下に記載するようにうまく増幅および発現された。簡潔にはクローニングおよび他の培養ステップでは、Ｓ．セレビシエ菌株Ｓ１５０−２Ｂ（ｌｅｕ２  ｈｉｓ３  ｔｒｐｌ  ｕｒａ３）を以前に記載されているように異種発現に使用した（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６６：２０７８−２０８４（１９９８））。Ｃ．アルビカンス菌株ＳＣ５３１４はゲノムクローニングに使用した。すべての菌株は、必要に応じて１．５％  ｂａｃｔｏ−ａｇａｒ（Ｄｉｆｃｏ）によって固化させた最小限定培地（１００μｇ／ｍｌ  Ｌ−ロイシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジン、およびアデニンサルフェートを添加した、１ｘ酵母窒素ベースブロス（Ｄｉｆｃｏ）、２％グルコース、および０．５％アンモニウムサルフェート）で培養した。ｕｒａ菌株の培養は、８０μｇ／ｍｌウリジン（Ｓｉｇｍａ）の添加によって補助した。ＡＬＳ５、ｐＹＦ５を含有する、ＡＬＳｌ、およびｐＡＬＳｎを含有する、ＡＬＳ９を含有するプラスミドｐＧＫ１０３は、以前に記載されている（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６６：１７８３−１７８６（１９９８），Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６５：５２８９−５２９７（１９９７），Ｌｕｃｉｎｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １０２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２０４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，Ｕｔ．（２００２））。Ａ．Ｂｒｏｗｎ（Ａｂｅｒｄｅｅｎ，ＵＫ）より入手したプラスミドｐＡＤＨ１は、Ｓ．セレビシエにおいて機能性である、Ｃ．アルビカンスアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（ＡＤＨ１）プロモータおよびターミネータを含有する（Ｂａｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７８：５３５３−５３６０（１９９６））。このプラスミドは、Ｓ．セレビシエにおけるＡＬＳ遺伝子の構成的発現に使用された。
【００６３】
ヒト口腔上皮および血管内皮細胞を入手して、次のように培養した。咽頭癌から単離したＦａＤｕ口腔上皮細胞系をＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から購入して、その推奨プロトコルに従って維持した。内皮細胞を臍帯静脈から単離して、Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．の方法の我々の以前に記載した改良によって維持した（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２），Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．５２：２７４５−２７５６（１９７３））。すべての細胞培養物は、５％  ＣＯ２を含有する加湿環境にて３７℃で維持した。
【００６４】
ＡＬＳ遺伝子のクローニングでは、ＡＬＳファミリーのメンバーのゲノム配列を、Ｓｔａｎｆｏｒｄデータベース（ワールドワイドウェブでＵＲＬ：ｓｅｑｕｅｎｃｅ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｇｒｏｕｐ／ｃａｎｄｉｄａ／ｓｅａｒｃｌｉ．ｈｔｍｌにて入手可能）のＢＬＡＳＴ検索によって同定した。ＰＣＲプライマーは、５’ＢｇｌＩＩおよび３’ＸｈｏＩ制限酵素部位を包含する読み取り枠それぞれを特異的に増幅するために産生され、下で表Ｉに示される（配列番号：１４−１９（それぞれＡＬＳ  １、３、５、６、７および９センスプライマー）；配列番号：２０−２５（（それぞれＡＬＳ  １、３、５、６、７および９アンチセンスプライマー））。各遺伝子は、Ｅｘｐａｎｄ（登録商標）Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ  ＰＣＲ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してＰＣＲによってクローニングされた。ＡＬＳ３、ＡＬＳ６、およびＡＬＳ７はＣ．アルビカンスＳＣ５３１４ゲノムＤＮＡから増幅されたのに対して、ＡＬＳ１、ＡＬＳ５、およびＡＬＳ９は、Ｃ．アルビカンスゲノムライブラリから以前に検索されたプラスミドから増幅された（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６６：１７８３−１７８６（１９９８），Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６５：５２８９−５２９７（１９９７），Ｌｕｃｉｎｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  １０２ｎｄ  Ａｎｎｕａｌ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｐｐ．２０４，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓａｌｔ  Ｌａｋｅ  Ｃｉｔｙ，Ｕｔ．（２００２））。ＰＣＲ産物は配列決定のためにｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）内へ結合された。次に、興味のあるＡＬＳ遺伝子がＡＤＨ１プロモータの制御下にあるように、配列検証ＡＬＳ読み取り枠をＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ同時消化によってｐＧＥＭ−Ｔ−Ｅａｓｙから流離させる。Ｓ．セレビシエ菌株Ｓ１５０−２Ｂはリチウムアセテート法を使用して、ＡＬＳ過剰発現構築物それぞれによってはもちろんのこと、空のｐＡＤＨ１構築物によっても形質転換する。Ｓ．セレビシエでの各ＡＬＳ遺伝子の発現は、表現型分析を実施する前にノザンブロット分析によって検証した。
【００６５】
表Ｉ
Ｓ．セレビシエでの異種発現のためのＡＬＳ遺伝子のコード領域を増幅するために使用されたＰＣＲプライマー
【００６６】
【表１】
2008540453.tif 000006
ＡＬＳ  ｍＲＮＡ発現は、各構築物についてのノザンブロット分析によって検出された。３セットのプライマーの使用にもかかわらず、Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４のゲノムＤＮＡからのＡＬＳ２およびＡＬＳ４の増幅は成功しなかった。ＡＬＳ遺伝子のタンデム反復での配列決定およびアセンブリングの困難を考慮すると、この結果が公開ゲノムデータベースで現在入手できる配列アセンブリのエラーを反映することが可能である。
【００６７】
フローサイトメトリーは、Ａｌｓタンパク質それぞれがそのそれぞれのＳ．セレビシエ宿主の表面で発現されることを確認した。簡潔には、Ａｌｓ構築物それぞれの細胞表面発現の確認は、２つの異なるポリクローナル抗Ａｌｓ抗血清を利用する間接免疫蛍光法を使用して決定した。抗血清Ａは、Ａｌｓ１ｐの４１７アミノ酸Ｎ末端断片を用いたウサギの免疫化によって産生された、抗Ａｌｓ１ｐ抗体より構成されていた。抗血清Ｂは、Ｃ．アルビカンス細胞壁成分を認識するが、Ｓ．セレビシエと交差反応しないウサギ抗Ｃ．アルビカンスマンナン因子５であった（Ｉａｔｒｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【００６８】
各菌株で、１０７個の分芽胞子が一晩の培養から単離され、ヤギ血清１００μｌで遮断され、次に１：２５希釈物のポリクローナル抗血清ＡまたはＢのどちらかで、続いて１：１００のフルオレセインイソチオシアナート標識ヤギ抗ウサギＩｇＧによって染色した。
４８８ｎｍで放出されるアルゴンレーザを装備したＦＡＣＳＣａｌｉｂｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）装置をフローサイトメトリー分析に使用した。蛍光発光は５１５／４０−ｎｍバンドパスフィルタによって検出された。１０，０００回のイベントで蛍光データを収集して、ベースライン（すなわち空のプラスミドによって形質変換されたＳ．セレビシエ）より上の蛍光を持つ細胞の分布は、ＣＥＬＬＱＵＥＳＴソフトウェア（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して各菌株について分析した。
【００６９】
表ＩＩに示すように、２つの別個の抗血清は、Ａｌｓｐ発現菌株のすべてが、空のプラスミドによって形質変換されたＳ．セレビシエと比較したときに、蛍光の少なくとも４倍の上昇を示すことを証明した。Ａｌｓファミリーのメンバー間での予測された構造的多様性と一致して、抗血清は個々のＡｌｓ発現菌株の認識で相違を示した。
【００７０】
表ＩＩ
フローサイトメトリー分析によるＳ．セレビシエの表面でのＡｌｓタンパク質の検出
各菌株の分芽胞子は、ポリクローナル抗Ａｌｓ１ｐ抗血清（Ａ）またはポリクローナル抗Ｃ．アルビカンス細胞壁抗血清（Ｂ）のどちらかによって間接免疫蛍光法を使用して染色され、次にフローサイトメトリーを使用して分析された。結果は、カッコ内の−倍の上昇と共に、バックグラウンド（空のプラスミドによって形質変換されたＳ．セレビシエ）より上の陽性細胞のパーセンテージとして表現されている。
【００７１】
【表２】
2008540453.tif 000007
各種のＡｌｓタンパク質を発現したＳ．セレビシエクローンは、各種の宿主基質に付着するその能力について調査された。下に記載するように、結果はＡｌｓタンパク質が基質特異性付着の異なるプロフィールを提示することを示す。
【００７２】
真菌付着アッセイは、形質転換されたＳ．セレビシエ菌株の付着特性を決定するために実施された。簡潔には、前に記載した付着アッセイ（８）の改良を次のように利用した。付着プレートは、ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）、ラミニン（Ｓｉｇｍａ）、またはフィブロネクチン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の０．０１ｍｇ／ｍｌ溶液１ｍｌを６ウェル組織培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルに添加して、３７℃にて一晩インキュベートすることによってコーティングした。内皮細胞では第２継代細胞が０．２％ゼラチンマトリクスによってコーティングされた６ウェル組織培養プレートでコンフルエントまで培養され、上皮細胞ではＦａＤＵ細胞が０．１％フィブロネクチンマトリクスによってコーティングされた６ウェル組織培養プレートでコンフルエントまで培養された（３日）。付着試験の前に、ウェルを温ハンクス液（ＨＢＳＳ）１ｍｌによって２回洗浄した。試験されるＳ．セレビシエ菌株は、３０℃にて最小限定培地中で一晩培養され、次に遠心分離によって収集されて、ＨＢＳＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で洗浄され、血球計を使用して数えられた。３００個の生物を興味のある基質によってコーティングされた６ウェル組織培養プレートの各ウェルに添加して、ＣＯ２中で３７℃にて３０分間インキュベートした。非付着性生物をＨＢＳＳ  １０ｍｌによって標準化方式で２回洗浄することによって除去した。ウェルをＹＰＤ寒天（１％酵母抽出物（Ｄｉｆｃｏ）、２％バクトペプトン（Ｄｉｆｃｏ）、２％  Ｄ−グルコース、１．５％寒天）と重ねて、定量培養によって接種材料を確認した。プレートを３０℃で４８時間インキュベートして、コロニーをカウントした。付着は初期接種材料のパーセンテージとして表された。付着の相違は分散検定の一因子分析を使用して比較され、ｐ＜０．０１が有意とみなされた。
【００７３】
Ｓ．セレビシエ形質転換体の異なる基質に対する付着プロフィールに顕著な相違があった（図８）。Ａｌｓ１ｐ−、Ａｌｓ３ｐ−、およびＡｌｓ５ｐ−発現菌株は試験したすべての基質を結合したのに対して、Ａｌｓ６ｐ−発現Ｓ．セレビシエはゼラチンのみに付着して、Ａｌｓ９ｐ−発現Ｓ．セレビシエはバックグラウンドレベルを超えてラミニンのみに付着した。さらに各種の基質への付着には定量的な相違があった。たとえばＡｌｓ３ｐと比較したときに、Ａｌｓ１ｐはゼラチンに対してより高い付着性を与えるが、上皮細胞にはより低い付着性を与える（ｐ＜０．０１、一因子分散分析）。Ａｌｓ７ｐを発現するＳ．セレビシエのみが試験したいずれの基質にも付着しなかった。Ａｌｓタンパク質発現のレベルでの小規模な相違は表ＩＩに示す免疫蛍光研究によって除外できないのに対して、そのような相違は本研究で見出された基質特異性結合パターンの原因であるとは思えない。細胞表面に発現されたＡｌｓタンパク質量のそのような全体的増加または減少は、すべての基質に亘る付着での相応の増加または減少を生じることが予測され、観察された基質特異性の相違を引き起こさないだろう。
【００７４】
後述するように、Ａｌｓタンパク質の基質結合特異性は、Ａｌｓタンパク質のＮ末端配列に存する。簡潔にはＳ．セレビシエにおけるＡｌｓ５ｐ発現は、ゼラチンおよび内皮細胞を含む複数の基質への付着を与えたが、Ａｌｓ６ｐ発現はゼラチンのみへの付着を生じた。機能のこの顕著な相違にもかかわらず、Ａｌｓ５ｐおよびＡｌｓ６ｐはアミノ酸レベルで８０％を超えて同一である。これらのタンパク質のタンデム反復およびＣ末端は本質的に同一であり、配列相違の大部分はこれらの２つのＮ末端に濃縮される。これらのデータは、Ｎ末端配列可変性が基質特異性を与えることを示す。
【００７５】
上の結果は、キメラＡＬＳ５／ＡＬＳ６構築物の付着表現型を決定する研究の結果によって裏付けられた。簡潔には、キメラＡｌｓ５／Ａｌｓ６タンパク質は、各タンパク質のＮ末端を交換することによって構築された。キメラＡＬＳ５／６遺伝子を次のように構築した。遺伝子の５’２１１７ｂｐを含むＡＬＳ５のＢｇｌＩＩ−ＨｐａＩ断片を単離した。次にｐＧＥＭ−Ｔ−ＡＬＳ６をＢｇｌＩＩおよびＨｐａＩによって消化して対応するＡＬＳ６の５’２１２６ｂｐを放出させて、ｐＧＥＭ−Ｔ−ＥａｓｙおよびＡＬＳ６の３’配列より成る断片を単離し、５’ＡＬＳ５断片に結合させて、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−５Ｎ６Ｃを産生させた。対応するＡＬＳ６の５’断片およびＡＬＳ５の３’断片を使用する同じ手法を使用して、プラスミドｐＧＥＭ−Ｔ−６Ｎ５Ｃを産生させた。配列確認の後、各キメラＡＬＳ遺伝子はＢｇｌＩＩ−ＸｈｏＩ消化によって放出され、上のようにｐＡＤＨ１内にサブクローニングされた。次にＳ．セレビシエＳ１５０−２Ｂをこれらの構築物によって形質転換させて、その付着特性のキャラクタリゼーション前にノザンブロット分析によって発現を検証した。
【００７６】
Ａｌｓ５ｐのＮ末端のＡｌｓ６ｐのＣ末端へのキメラ融合を発現するＳ．セレビシエは、ゼラチンおよび内皮細胞の両方にＡｌｓ５ｐに似た方式で付着した（図９）。同様に、Ａｌｓ６Ｎ末端のＡｌｓ５ｐのＣ末端へのキメラ融合を発現する菌株は、Ａｌｓ６ｐを発現するＳ．セレビシエと同様にゼラチンのみに付着した（図９）。さらにＡｌｓ５ｐおよびキメラＡｌｓ５Ｎ６Ｃタンパク質を発現する菌株はフィブロネクチンコーティングビーズを凝集させるが、Ａｌｓ６ｐおよびキメラＡｌｓ６Ｎ５Ｃタンパク質を発現する菌株はこれらのビーズに対する親和性をほとんど〜全く持たない。ひとまとめにして、これらのデータは、これらの形質転換Ｓ．セレビシエ菌株の付着プロフィールがＡｌｓタンパク質のＮ末端部分によって支配されていることを示す。
【００７７】
Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバー間で示された基質特異性の相違に加えて、他の生物機能の相違も観察された。たとえばＡｌｓタンパク質のサブセットは、Ｓ．セレビシエによる内皮細胞侵入を媒介することが示された。Ｃ．アルビカンスは、その独自のエンドサイトーシスを誘発することによって内皮細胞に侵入する（Ｆｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３９７６−９８３（１９９５），Ｂｅｌａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００２））。このエンドサイトーシスは、生物が内皮細胞に付着した後に起こる；しかしながらこのプロセスに必要なＣ．アルビカンスリガンドは未知である。さらに付着とエンドサイトーシスの両方に別個のカンジダリガンドが必要かどうかは明らかでない。非接着性であることに加えて、Ｓ．セレビシエは内皮細胞による著しいエンドサイトーシスを受けない。したがってＡｌｓタンパク質がインベイシンとしてはもちろんのことアドヘシンとしても作用するかどうかを試験するために、Ａｌｓタンパク質を発現するＳ．セレビシエ菌株が内皮細胞へ侵入する能力が判定された。
【００７８】
Ａｌｓタンパク質が内皮細胞侵入を媒介する能力は、前に記載された差次的蛍光アッセイの改良を使用して決定された（Ｐｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６８：３４８５−３４９０（２０００））。簡潔には、内皮細胞はフィブロネクチンでコーティングされた１２ｍｍ直径ガラスカバースリップ上でコンフルエントまで培養され、２４ウェル組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）に配置した。次に細胞をＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で各Ｓ．セレビシエ菌株の１０５個の分芽胞子によって感染させた。正の対照として、細胞を同数のＣ．アルビカンス分芽胞子で感染させた。９０分間のインキュベーションの後、細胞を標準化方式でＨＢＳＳ  ０．５ｍｌによって２回すすぎ、３％パラホルムアルデヒドで固定した。内皮細胞表面に付着したままの生物を、赤色の蛍光を発するＡｌｅｘａ  ５６８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）に結合されていたウサギ抗Ｃ．アルビカンス抗血清（Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ）によって１時間染色した。この抗血清はＳ．セレビシエと２倍の高さの希釈度で交差反応する。内皮細胞は次にリン酸緩衝生理食塩水中の０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００中で１０分間透過処理して、その後に細胞結合生物（内部移行および付着生物）を再度、緑色蛍光を発するＡｌｅｘａ  ４８８に結合された抗Ｃ．アルビカンス抗血清で染色した。次にカバースリップを落射蛍光下で観察した。内皮細胞によって内部移行された生物の数は、細胞結合生物（緑色蛍光を発する）の数から付着生物（赤色蛍光を発する）の数を引くことによって決定した。少なくとも各カバースリップ上で１００個の生物がカウントされ、すべての実験は少なくとも３回の別々の機会に３通り実施された。
【００７９】
あるＡｌｓタンパク質の結合特徴を特徴付けるために、フィブロネクチンビーズ付着アッセイも実施された。この点で、Ｓ．セレビシエの表面で発現されたときにフィブロネクチンコーティングビーズの凝集を誘発するタンパク質の能力のために、Ａｌｓ５ｐが最初に同定された（Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６５：５２８９−５２９７（１９９７））。したがってフィブロネクチンに対するＡＬＳ５、ＡＬＳ６、５Ｎ６Ｃ、および６Ｎ５Ｃによって形質転換されたＳ．セレビシエ菌株は、この方法を使用してビーズ付着について試験された（Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６５：５２８９−５２９７（１９９７），Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：６０４０−６０４７（１９９９））。簡潔には、トシル化磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）は、製造者の説明書に従ってフィブロネクチンでコーティングされた。次にコーティングビーズ１０μｌ（１０６個のビーズ）を１ｘ１０８個の形質転換Ｓ．セレビシエと１ｘＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ（ＴＥ）緩衝液、ｐＨ７．０  １ｍｌ中で混合して、４５分間静かに混合しながらインキュベートした。チューブをマグネットに置いて、ビーズおよび付着性Ｓ．セレビシエを非付着性生物と分離した。非付着性生物を含有する上清は吸引によって除去され、残りのビーズはＴＥ緩衝液１ｍｌ中に再懸濁させることによって３回洗浄され、磁気分離および上清の吸引が続けられた。最後に洗浄されたビーズおよび付着性生物はＴＥ緩衝液１００μｌに再懸濁され、同時凝集について顕微鏡で検査された。
【００８０】
結果は、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、およびＡｌｓ５ｐを発現するＳ．セレビシエが細胞結合生物のパーセンテージの著しい上昇を提示し、内皮細胞に付着するその能力を反映していることを示している。加えてＡｌｓ３ｐ、そしてより低い程度でＡｌｓ１ｐおよびＡｌｓ５ｐを発現する生物は、著しい内皮細胞侵入を示した（図１０）。
【００８１】
上述の機能的研究に加えて、Ａｌｓタンパク質は免疫グロブリンスーパーファミリーのアドヘシンおよびインベイシンに相同性であることも見出された。Ａｌｓタンパク質の分子モデリングの最初のステップとして、知識ベースの検索アルゴリズムを使用して、Ａｌｓファミリーメンバーと著しい構造的類似性を共有する分子が同定された。簡潔には、Ａｌｓタンパク質の全体の物理化学的特徴を比較するために、相同性およびエネルギーベースモデリングが実施された。最初に、知識ベース法（ＳＷＩＳＳ−ＭＯＤＥＬ）（Ｇｕｅｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ  １８：２７１４−２７２３（１９９７），Ｓｃｈｗｅｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３１：３３８１−３３８５（２００３））が使用されて、相同性高次構造を持つタンパク質についてＳｗｉｓｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎタンパク質データベースで構造の組合せ拡張構造アラインメントを解析および比較された（Ｓｈｉｎｄｙａｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１１：７３９−７４７（１９９８））。この手法は、ＥｘＮＲＬ−３Ｄデータベースで一次配列類似性を検索するために、ＢＬＡＳＴＰ２アルゴリズム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））を含んでいた。同時に最大の配列同一性を持つ候補テンプレートを選択するために、動的配列アラインメントアルゴリズムＳＩＭ（Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１２：３３７−３６７（１９９１））が使用された。次に一次および精密適合分析を実施するためにＰｒｏＭｏｄＩＩが使用された。得られたタンパク質はＡｌｓタンパク質主鎖軌道の相同性モデリングのテンプレートとして使用された。
【００８２】
Ａｌｓタンパク質のＮ末端ドメインの頑強なモデル（たとえばアミノ酸１−４８０；先行する最初のタンデム反復）は、相補性手法によって産生された。Ａｌｓタンパク質のＮ末端ドメインは、Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｇｒａｐｈｉｃｓ  ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎｓ（ＳＧＩ，Ｉｎｃ．）上で動作するＳＹＢＹＬ  ６．９．１ソフトウェア（Ｔｒｉｐｏｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用して、配列相同性（Ｃｏｍｐｏｓｅｒ（Ｔｏｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｓｙｍｐ．５７：１−９（１９９０））およびスレッディング法（Ｍａｔｃｈｍａｋｅｒ（Ｇｏｄｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：２２７−２３８（１９９２））およびＧｅｎｅ−Ｆｏｌｄ（Ｊａｒｏｓｚｅｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．７：１４３１−１４４０（１９９８），Ｇｏｄｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８：４０９−４１６（１９９５），Ｇｏｄｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：１２０９８−１２１０２（１９９２），Ｇｏｄｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．７：３９７−４３８（１９９３））によって、推定上の溶液高次構造に変換された。標的Ａｌｓドメインの得られた配座異性体およびアミノ酸側鎖は分子動力学によって精密化され、歪エネルギーはＡＭＢＥＲ９５力場法（Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．２４：１９９９−２０１２（２００３））およびＰｏｗｅｌｌミニマイザ（Ｐｏｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｔｈ．Ｐｒｏｇｒａｍ  １２：２４１−２５４（１９７７））を使用して最小化された。
【００８３】
これらの手法は、ペプチド主鎖原子の位置が固定されている側鎖相互作用を最適化する。好ましい高次構造は、水性溶媒中での拡張分子動力学から決定された。次にすべてのペプチド結合のれじれ角は、最小の束縛で１８０±１５°に調整された。ある場合では、束縛なしで、または標準Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎφおよびψ角に０．４−ｋＪペナルティを印加することによりα−らせん領域が束縛されてのどちらかで、分子動力学が実行された。最終的な全体のエネルギー最小化は、すべての束縛および凝集の除去後に各モデルについて実施された。得られたＡｌｓ  Ｎ末端ドメインモデルは、３つの基準に基づいて優先順位を付けられた：（ｉ）最も好ましい歪エネルギー（分子力学）；（ｉｉ）経験的位置エネルギー関数；および（ｉｉｉ）潜在的なジスルフィド架橋の空間的配置の保存（Ｇｏｄｚｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：２２７−２３８（１９９２），Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５３：１６４−１７０（１９９１），Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２７７：３９６−４０４（１９９７），Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＳＥＢ  Ｊ．１０：１２６−１３６（１９９６），Ｌｕｔｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５６：８３−８５（１９９２））。Ａｌｓモデルは、標準手段（ｅ−ｖａｌｕｅｓ（Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：７１６５−７１７３（１９９６），Ｗｅｌｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３３：６０７４−６０８５（１９９４））を使用して、相同性テンプレートと関連付けながら有効性を評価された。最後にＡｌｓモデルの物理化学的特性は、物理的特性がＡｌｓＮ末端ドメインの水接触可能表面へ投影されるように、ＳＹＢＹＬ  ａｎｄ  ＨＩＮＴ  ｐｌａｔｆｏｒｍｓ（Ｋｅｌｌｏｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｉｄｅｄ  Ｍｏｌ．Ｄｅｓ．５：５４５−５５２（１９９１））で実施されたようにＭＯＬＣＡＤ（Ｈｅｉｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１４：２４６−２５０（１９９３））によって描出された。
【００８４】
これらのモデルは、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーと一致して、すべてのＡｌｓタンパク質のＮ末端ドメインが複数の逆平行βシートドメインを含有することを示す。これらの結果を表ＩＩＩにまとめる。これらのタンパク質は通例、それからループ／コイル構造を突出させる、複雑な７本鎖逆平行βシートドメインより成る。βシートドメインは領域を挿入することによって相互に隔離されている。この構造はビーズ・オン・ア・ストリング（ｂｅａｄｓ−ｏｎ−ａ−ｓｔｒｉｎｇ）モチーフと呼ばれることが多い。Ａｌｓタンパク質の実質的にすべてが既知のアドヘシンまたはインベイシンホモログにモデル化されることが特に注目される（表ＩＩＩ）。類似性の異なるパターンが分析したＡｌｓタンパク質間で観察された。たとえばＡｌｓ７ｐを除いて、調査したすべてのＡｌｓタンパク質がスタフィロコッカス・アウレウスのコラーゲン結合タンパク質と著しい相同性を共有していた。しかしながら特異的な一次、二次、および三次ホモログは、大半のファミリーメンバーで変化した（表ＩＩＩ）。たとえばＡｌｓ２ｐおよびＡｌｓ９ｐは、同一の一次、二次、および三次ホモログを共有していた。
【００８５】
表ＩＩＩ  Ａｌｓタンパク質間のホモログの比較
各Ａｌｓタンパク質のホモログは、記載された知識ベースのアルゴリズムによって同定され、１〜３の構造的相関の降順に並べられた。ＮＳ、相同性モデリングで同定された有意モデルなし（相関係数（（ｒ２）≦７０％。ＰＢＤ、国立バイオテクノロジー情報センターフォーマットによるタンパク質データバンクコード。
【表３】
2008540453.tif 000008
【００８６】
Ａｌｓタンパク質は、予測されたループ／コイル構造にマップするＮ末端超可変領域を含有することも判定された。この点で、個々のＡｌｓタンパク質によって媒介された基質特異性付着の観察された相違にもかかわらず、Ｎ末端ドメインの配列の大きな領域がこのファミリーで保存されている。しかしながら超可変領域（ＨＶＲ）１〜７と呼ばれるＡｌｓタンパク質間の著しく異なる７つの領域が見出された。これらの領域（８以上のアミノ酸より成る）は、Ａｌｓタンパク質での見かけのコンセンサス同一性を含有せず、５０％未満のコンセンサスを含有する。対照的に、介在する保存領域（ＣＲ）１〜７は、Ａｌｓタンパク質での３０％を超えるコンセンサス同一性および５０％を超えるコンセンサス保存を示した。既知の機能のＡｌｓタンパク質のＮ末端ドメイン（残基１−４２０）を含むこれらのアミノ酸配列の同一性プロットおよび概略アラインメントを表１１ＡおよびＢに示す。特に同一性モデリングは、異なるＡｌｓタンパク質のＨＶＲは、配列が識別可能であると同時に、ＣＲのβシート成分から突出する同様のループ／コイル構造に従うことが予測されることが明らかにされた。それゆえこれらの保存ＨＶＲの存在は、それらが宿主構成要素と相互作用するために利用できることを示している。
【００８７】
上述の相同性モデリングおよび関連する決定に加えて、経験的決定はＡｌｓ１ｐのＮ末端ドメインの予測された構造をさらに確認する。我々の相同性モデリングによって作られた仮説を試験するために、ＣＤの相補性手法およびＦＴＩＲ分光法を使用して、Ａｌｓ１ｐのＮ末端ドメインの構造的特徴が決定された。Ａｌｓ１ｐのアミノ酸１７−４３２を含むこのタンパク質はＳ．セレビシエ中で産生され、Ｆｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，４４：６１−７２（２００２）によって以前に記載されている。
【００８８】
簡潔には、熱電温度コントローラを装着したＡＶＩＶ  ６２ＤＳ分光偏光計（Ａｖｉｖ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｃ．）を使用して、円偏光二色性スペクトルを記録した。Ａｌｓ１ｐの水溶液（リン酸緩衝生理食塩水中１０μＭ）は、０．１ｍｍ光路取り外し式石英セルを使用して、２６０〜１８５ｎｍにて１０ｎｍ／分の速度および０．２ｎｍのサンプル間隔でスキャンされた。ペプチドを含まない緩衝液からのスペクトルは、光散乱アーティファクトを最小化するためにサンプル溶液から引かれ、最終スペクトルは２５℃で記録された８回のスキャンの平均であった。装置は（＋）−１０カンファースルホン酸（１ｍｍ路長セルにて１ｍｇ／ｍｌ）を用いて定期的に校正され（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：２０５−２１４（１９９０））、楕円率は平均残基楕円率（１）ＭＲＥ（度−ｃｍ２  ｄｍｏｌ−１）として表された。タンパク質濃度は、発現されたＡｌｓ１ｐドメインの芳香族アミノ酸組成に基づいて２８０ｎｍの吸収によって決定された（Ｐａｃｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ４：２４１１−２４２３（１９９５））。ＣＤスペクトルは、インターネットベースのＤｉｃｈｒｏｗｅｂ（Ｌｏｂｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８：２１１−２１２（２００２））インタフェース（ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／ｃｄｗｅｂ／ｈｔｍｌ／ｈｏｍｅ．ｈｔｍｌ）によってＳｅｌｃｏｎ（Ｓｒｅｅｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．８：３７０−３８０（１９９９））を使用して、らせん、βシート、ターン、および無秩序構造に逆重畳された。
【００８９】
Ａｌｓ１ｐセルフフィルムの赤外スペクトルは、重水素化トリグリシンサルフェート検出器を装着したＢｒｕｋｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒ  ２２  ＦＴＩＲ分光計（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｏｐｔｉｃｓ）で２５℃にて、ゲイン４、２５６回のスキャンの平均で、２ｃｍ−１の分解能にて記録した。リン酸緩衝生理食塩水５０μｌ中のタンパク質５０マイクログラムを５０ｘ２０ｘ２ｍｍゲルマニウム減衰全反射サンプル結晶（Ｐｉｋｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の表面に塗布して、乾燥させた。赤外スペクトルを記録する前に、乾燥タンパク質セルフフィルムを次にＤ２Ｏで１時間水和させた。赤外スペクトルのアミドＩバンドは、曲線当てはめソフトウェア（ＧＲＡＭＳ／３２，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ５；Ｇａｌａｃｔｉｃ）による成分ピークの面積計算により、二次高次構造について解析された。各種の高次構造の周波数制限は次の通りである：αらせん（１６６２〜１６４５ｃｍ−１）、βシート（１６３７〜１６１３および１７１０−１６８２ｃｍ−１）、βターンループ（１６８２〜１６６２ｃｍ−１）、および無秩序構造（１６４５〜１６３７ｃｍ−１）（５０−５２）。
【００９０】
Ａｌｓ１ｐのＮ末端ドメインの円偏光二色性結果は図１２Ａに示され、２１７ｎｍの二色性極小および２００ｎｍ付近の強い正の二色性極大を明らかにする。これらの特徴は、支配的な逆平行βシート成分を有するタンパク質に特有である。ＣＤスペクトルの逆重畳は、タンパク質が５０．１％  βシートの高次構造を取ったのに対し、他の構造クラス分布が無秩序構造（２６．９％）、ターン構造（１９．３％）、およびαらせん（３．７％）を含むことを示した。
【００９１】
図１２Ｂに示すように、水和Ａｌｓ１ｐのセルフフィルムのＦＴＩＲ測定は、サンプルが支配的な逆平行βシート高次構造を有することを強力に裏付けた。これらのスペクトルは、１６３４および１６２８ｃｍ−１を中心とするピークを持つ強い低周波数アミドＩバンドおよび１６８５ｃｍ−１を中心とする弱い高周波数バンドを明らかにした。
【００９２】
タンパク質アミドＩ赤外スペクトルの高および低周波数成分へのこの周波数分割は、分子内逆平行βシート間の遷移双極子カップリングの効果に特有であることが示されている（Ｈａｌｖｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１３：６７０１−６７０３（１９９１））。スペクトルの曲線当てはめは、タンパク質構築物が〜５７．２％逆平行βシートであることを示した。ＩＲスペクトルの曲線当てはめからの他の二次構造高次構造は、無秩序構造（２０．５％）、ターン成分（１３．３％）、およびαらせん（９．０％）を含む。
【００９３】
まとめると、ＦＴＩＲおよびＣＤデータはさらに、Ａｌｓ１ｐのＮ末端が、より構造化されていない領域が挿入された、マイナーαらせんおよびターン成分を含有する逆平行βシート構造の支配的なドメインを含有することをさらに裏付けている。
【００９４】
三次元モデルは、Ａｌｓ  Ｎ末端ドメイン間の物理化学的差異をさらに示す。この点で、分子モデルは、宿主細胞と複数の基質との間のその相互作用に影響を及ぼしやすいＡｌｓタンパク質のＮ末端ドメインの予測された物理化学的属性の相違を示した。図１３に示すように、Ａｌｓタンパク質は、疎水性、電荷、および水素結合電位の表面分布に基づいて、３つの別個の群に分けられる。Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、およびＡｌｓ５ｐはそれぞれ、これらの特性の同様のパターンを共有し、それゆえＡｌｓ群Ａと見なされる。これに対して、Ａｌｓ６ｐおよびＡｌｓ７ｐ  Ｎ末端ドメイン（Ａｌｓ群Ｂ）の予測された物理化学的特性は、Ａｌｓ群Ａの特性との顕著な相違を有する（図１３）。Ａｌｓ群Ａメンバーのカチオン電位が通例その中性またはアニオン面から分離されるのに対して、正電荷はＡｌｓ群ＢメンバーＡｌｓ６ｐおよびＡｌｓ７ｐの表面全体に幅広く分布する。最後にＡｌｓ２ｐ、Ａｌｓ４ｐ、およびＡｌｓ９ｐのＮ末端は、Ａｌｓ群ＡまたはＢタンパク質とは構造的に異なるＡｌｓタンパク質の第３群（Ａｌｓ群Ｃ）を構成するように思われる。Ａｌｓ群Ｃタンパク質は、疎水性または静電分布の点でＡｌｓ群Ｂよりも、Ａｌｓ群Ａに似ているように思われる。
【００９５】
接着特性を備えた複数のタンパク質がＣ．アルビカンスにおいて同定されている。Ｈｗｐ１ｐは、哺乳類トランスグルタミナーゼへの基質として作用することによって、頬側上皮細胞への付着を媒介することが示されている（５）。ＥＡＰ１は、Ｓ．セレビシエでの異種発現によって最近同定され、試験管内でのポリスチレンおよび腎臓上皮細胞への付着を媒介する（７）。Ａｌｓタンパク質ファミリーの８つのメンバーのうち、Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ５ｐのみが機能的見込みから研究されている。Ａｌｓ１ｐの異種発現は、遺伝子破壊研究によってＣ．アルビカンスにて確認された発見である、ヒト血管内皮細胞および上皮細胞への結合を媒介することが示されている（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２），Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６６：１７８３−１７８６（１９９８））。Ｓ．セレビシエでのＡＬＳ５異種発現は、コラーゲン、フィブロネクチン、ウシ血清アルブミン、およびラミニンへの付着を与える（Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｅ．６５：５２８９−５２９７（１９９７），Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：６０４０−６０４７（１９９９），Ｇａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ａｄｈｅｓ．９：４５−５７（２００２））。Ｃ．アルビカンスアドヘシンの基質特異性の大規模な比較は実施されていない。この研究で我々は、Ａｌｓタンパク質ファミリーメンバーの構造的に多様な群の接着特性を比較した。我々のデータは、Ａｌｓタンパク質が、各種のヒト基質への付着に関する重複する一連の特異性を備えた表面タンパク質の多様なファミリーを含むことを示している（図８）。さらに本ドメイン交換実験による結果は、Ａｌｓタンパク質のＮ末端ドメインがその基質付着プロフィールの特異性を与えることを示す。
【００９６】
付着を媒介することに加えて、我々のデータはＡｌｓタンパク質がインベイシンとしても機能しうることを示唆する。興味深いことに、Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ３ｐ発現Ｓ．セレビシエの両方が同様の内皮細胞付着を示すのに対して、Ａｌｓ３ｐ発現Ｓ．セレビシエはより高い率で内部移行を受けた。これらの結果は、エンドサイトーシスが単に付着の拡大ではなく、むしろリガンド−レセプタ相互作用に影響されうる別個のプロセスであることを示す。付着の場合と同様に、Ａｌｓタンパク質におけるＮ末端配列の相違がこれらの別個の機能を媒介すると思われる。
【００９７】
三次元空間に分布されるようなタンパク質ドメインの物理化学特性は、レセプタ−リガンド相互作用を支配する決定的な構造上の特徴である（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１７９：１２５−１４２（１９８４），Ｗａｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅｗ  Ｌｅｔｔ．３：１７７−１８４（１９９６），Ｈａｎｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３４９：４１８−４２２（１９９７））。Ａｌｓタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーの他のアドヘシンおよびインベイシンに特有の高次構造上の特徴を共有している。しかしながら、個々のＡｌｓタンパク質はその一次ホモログで異なり、これはＡｌｓファミリーのメンバーが異なる基質結合プロフィールを呈することを示す実験データと一致する発見であった。ひとまとめにして、Ａｌｓ相同性のこれらのパターンは、Ａｌｓタンパク質メンバーが構造および予測された折畳みにおいて全体的な類似性を共有するのに対して、別個のＡｌｓタンパク質間にはその機能の相違の原因である構造上の相違が存在することを示す。
【００９８】
Ａｌｓファミリーメンバーの構造決定に関して上述した結果は、Ａｌｓ１ｐのＮ末端領域が主にループ／コイル構造を含有する逆平行βシートドメインと、より少ない量の比較的構造化されていない領域と共に構成されることを示す、相同性モデリングを裏付けている。これらの特徴は、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーの標示モチーフである。これらの結果は、Ａｌｓ５ｐの円偏光二色性研究との著しい予測的相関を示し（Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １８：４９−６０（２００１））、Ａｌｓ５ｐのＮ末端ドメインが逆平行βシートおよびループ／コイル領域の相対的な優勢を特徴とすることを示している。それゆえＡｌｓタンパク質ファミリーのすべてのメンバーがこの全体的な構造を示すことが大いに考えられる。特に上の構造上の結果は、ＨＶＲの多くが別個のＡｌｓタンパク質のＮ末端におけるβシート領域から突出する柔軟性ループ／コイル構造に対応することを示す相同性モデルとも一致する。ひとまとめにして、これらの結果は、これらの構造がＡｌｓタンパク質による基質特異性結合に不可欠であることを示す（図１４）。上の結果と一致して、マンノース結合レクチン、α−凝集素、および免疫グロブリンスーパーファミリーの他のメンバーの類似領域は、基質結合特異性を与えるように思われる（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍｉｃｓ  ２１：２５−３６（２００２），Ｗｏｊｃｉｅｃｈｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．ｌ３：２５５４−２５６３（１９９３））。その上、これらの可変ループ領域の変異は、これらの相同性タンパク質の基質結合を著しく改変する（Ｒｅｎｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２５−１３９５−１４０６（１９９４），Ｖｉｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：２４８８−２４９７（１９９６））。
【００９９】
三次元モデリングの結果はさらに、個々のＡｌｓタンパク質のＮ末端ドメインがその接着プロフィールに関連する独特の分子署名を所有することを示している。これらの署名は、表面積、疎水性、および静電荷などのパラメータを含み、Ａｌｓタンパク質間の構造的関係を区別する配置を生じる。たとえば複数の基質に結合するＡｌｓタンパク質、たとえばＡｌｓ群Ａメンバー（Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、およびＡｌｓ５ｐ）は、立体的かさ高さ、疎水性分布、および静電電位の点で同様の予測されたＮ末端プロフィールを含む。なおこの群内でも、群内での機能的相違を支配しうる特異的な物理化学的差異が存在する（図１３）。これに対して、低下した接着能力を持つＡｌｓタンパク質は、疎水性および静電電位を含む複数の物理化学特性でＡｌｓ群Ａタンパク質とは異なることが予測される表面特徴を有する。これらの構造的特徴の相違の凝集効果が別個のＡｌｓタンパク質の特異的機能特性を与えることが大いに考えられる。
【０１００】
広範囲の遺伝子的可変性がＡＬＳ遺伝子ファミリー内で示されている。Ｃ．アルビカンスの異なる分離菌の特異性ＡＬＳ遺伝子の配列変化が観察されており（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２００５−２０１７（２００３），Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｙｅａｓｔ  １８：４９−６０（２００１））、ＡＬＳファミリーのすべてのメンバーがすべての分離菌中に存在するわけではない。１つの分離菌中の２つの異なる対立遺伝子間では、著しい配列の相違すら見出されている（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４９：２９４７−２９６０（２００３），Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２００５−２０１７（２００３））。この程度の遺伝子可変性は、これらのタンパク質が比較的高い頻度で再配置または変異を受けうることを示唆する。そのような機構は、生物に本研究で証明された高度の構造および機能多様性を生成する能力を与える。この仮説の間接的な裏付けは、ＡＬＳ７の対立遺伝子変化の近年の研究によって与えられ、この遺伝子がどちらも超変異性であることと、これらの変異が選択圧を受けることとの両方が示唆される（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１３：２００５−２０１７（２００３））。
【０１０１】
ひとまとめにして、上の結果は、構造レベルおよび機能レベルの両方での抗体とＡｌｓタンパク質との類似性を示している。たとえば相同性モデリングは、これらのファミリーの構造的配置の類似性を、そうでなければ安定な枠組み内に局在化されたドメイン（たとえばＡｌｓタンパク質のＨＶＲおよび免疫グロブリンのＦａｂ領域）へ標的化された超過変性と共に強調している。さらに抗体と同様に、ＡＬＳ遺伝子ファミリーの遺伝子可変性は、カンジダに付着および侵入における一連の特異性と共に多様な一連のタンパク質を提示する機会を与えうる。そのような関連タンパク質の群の可用性は、生物が感染の間に異なる解剖学的および生理学的ニッチにコロニー形成および侵入する能力を改善すると考えられる。
【０１０２】
この出願を通じて、各種の刊行物はカッコ内に参照されている。これらの刊行物の開示はその全体が、本発明が関係する技術水準をより十分に記載するために参照により本出願に組み入れられている。
【０１０３】
本発明は開示された実施形態を参照して記載されているが、当業者は上で詳説された特定の実施例および研究が本発明の単なる例示であることをただちに認識するであろう。本発明の精神から逸脱することなく各種の修正形態が実施されうることが理解されるべきである。したがって本発明は以下の請求項によってのみ限定される。
【０１０４】
実施例ＶＩＩ
ｒＡｌｓｌｐ−Ｎによるワクチン接種は、体液性でなく細胞媒介免疫を向上させることによって、マウス播種性カンジダ症の間の生存を改善する
この実施例は、ＢＡＬＢ／ｃマウスのＡｌｓ１ｐの組換えＮ末端（ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ）による免疫化が、Ｃ．アルビカンスの致死的接種材料を用いた次のチャレンジの間の生存を改善したことを示す。ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの防御的２０μｇ用量は、Ｔｈ１脾細胞のカンジダ刺激を著しく向上させ、生体内遅延型感受性を向上させた。これに対して、抗体力価は防御と相関しなかった。最後に、ワクチンはＴ細胞欠損マウスにおいては防御的でなかったが、Ｂ細胞欠損マウスにおいては防御的であった。これらのデータは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの作用機構が、Ｃ．アルビカンスに対する体液性ではなく、細胞媒介性の免疫の刺激であることを示す。
【０１０５】
研究で使用したＣ．アルビカンスは、動物モデルにおいて高度に毒性である十分に特徴付けされた臨床単離菌であるＳＣ５３１４で（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｒｎｍｕｎ．７１：５７５６−５７６４（２００３））、Ｗ．Ｆｏｎｚｉ（Ｇｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｕｎｉｖｅｒｉｓｔｙ）によって提供された。生物は感染前に、酵母ペプトンデキストロースブロス（Ｄｉｆｃｏ）中で３回連続継代された。
【０１０６】
研究で使用したマウス系統は、国立癌研究所（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）より入手したメスＢＡＬＢ／ｃマウスであった。ワクチン有効性に対する年齢の影響を調査するために、若年マウス（８〜１０週）および退役繁殖（≧６ヶ月）を利用した。ｉｇｈ座位のホモ接合体欠損があるメスＢ細胞欠損マウス（Ｃ．１２９Ｂ６−ＩｇＨ−Ｊｈｄｔｍ１Ｄｈｕ）、Ｔ細胞欠損ヌードマウス（Ｃ．Ｃｇ／ＡｎＢｏｍＴａｃ−ＦｏｘｎｌｎｕＮ２０）、および類似遺伝子性野生型ＢＡＬＢ／ｃ同腹子をＴａｃｏｎｉｃ  Ｆａｒｍｓ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）より入手した。マウスはフィルタ付きケージ内に、制約なしの照射食品およびオートクレーブ処理水と共に収容した。生存実験では、マウスは各種の用量の抗原（下を参照）によって免疫化され、次に尾静脈からＣ．アルビカンスＳＣ５３１４分芽胞子の適切な接種材料、またはＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ）対照によって感染させた。複製生存研究の結果は、個々のデータセットが統計的異質性を示さない場合に組合された（下を参照）。マウスを含むすべての手順は、動物の飼育および保管のための国立衛生研究所ガイドラインに従って、研究機関の動物管理使用委員会によって承認された。
【０１０７】
後述のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ免疫化手順は次のように実施された。簡潔には、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（Ａｌｓ１ｐのアミノ酸１７〜４３２）はＳ．セレビシエ内で産生され、ゲル濾過およびＮｉ−ＮＴＡマトリクス親和性精製によって精製した（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２））。タンパク質の量は改良Ｌｏｗｒｙアッセイによって定量された。高度の純度（≒９０％）はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってはもちろんのこと、上述のように円偏光二色性およびＦＴＩＲによっても確認された。マウスは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）と混合されたｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの腹腔内（ｉｐ）注射によって第０日に免疫化され、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む抗原の別の用量によって第２１日にブーストされ、ブーストの２週間後に感染した。
【０１０８】
得られた抗原力価は、９６ウェルプレート内でＥＬＩＳＡによって決定された。簡潔には、ウェルは、ウェルごとにＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ  １００μｌによってコーティングされた。マウス血清は室温にて１時間インキュベートされ、３％ウシ血清アルブミンを含有するｔｒｉｓ緩衝生理的食塩水（ＴＢＳ）（０．０１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いた遮断ステップが続いた。ウェルは、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴＢＳによって３回洗浄され、ＴＢＳによるさらに３回の洗浄が続いた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ）によってコンジュゲートされたヤギ抗マウス二次抗体は最終希釈度１：５０００で添加され、プレートはさらに室温にて１時間インキュベートされた。ウェルはＴＢＳによって洗浄され、０．１Ｍクエン酸緩衝剤（ｐＨ５．０）、５０ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）、および３０％  Ｈ２Ｏ２  １０μｌを含有する基質によってインキュベートされた。色を３０分間展開させて、その後、１０％  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応が停止され、光学密度（ＯＤ）がマイクロタイタープレートリーダーで４９０ｎｍにて決定された。負の対照ウェルは希釈剤のみ与えられ、最終ＯＤ読取値を得るためにバックグラウンド吸収が試験ウェルから引かれた。ＥＬＩＳＡ力価は、正のＯＤ読取値（すなわち＞負の対照サンプルの平均ＯＤ＋２標準偏差）を与えた最後の血清希釈度の逆数として解釈された。
【０１０９】
後述する他の方法は、次のように実施された。簡潔には、Ｃ．アルビカンス誘発サイトカインプロフィールは、細胞媒介免疫および生体内サイトカインプロフィールに対するｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの効果を判定するために実施された。マウスは上述のように免疫化された。最終ブーストの２週間後、脾細胞は収集され、上述のように４ｘ１０６細胞／ｍｌの密度にて完全培地中で培養された（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｒｎｍｕｎ．７１：５７５６−５７６４（２００３））。サイトカイン産生を刺激するために、脾細胞は加熱死Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４芽管と共に同時培養された。我々は、脾細胞を刺激して感染中の生体内状況を模倣するために、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの代わりに加熱死Ｃ．アルビカンスを使用した。Ｃ．アルビカンス細胞は、Ａｌｓ１ｐの発現を誘発するために、グルタミンを含むＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）中で９０分間予備出芽させた（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２））。得られたＣ．アルビカンス芽管を６０℃での９０分間のインキュベーションによって加熱死させた（Ｉｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６３：４３６８−７４（１９９５））。加熱死した真菌は、脾細胞培養物に２ｘ１０７仮性菌糸／ｍｌの密度（白血球１個につき真菌５個の比）で添加された。４８時間後、脾細胞は、Ｔｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮ−□＋ＩＬ−４−）、Ｔｈ２（ＣＤ４＋ＩＦＮ−□−ＩＬ−４＋）、またはＣＤ４＋ＩＬ−１０＋頻度について、以前に記載されているように細胞内サイトカイン検出およびフローサイトメトリーによってプロファイリングされた（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：５７５６−５７６４（２００３））。ＣａｌｉＢＲＩＴＥビーズ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって校正されたＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎ装置で、ＦＡＣＳＣｏｍｐソフトウェアを製造者の推奨に従って使用して、３色フローサイトメトリーが実施された。データ収集の間に、ＣＤ４＋リンパ球は前方および側方散乱の連結、ならびにＦＩＴＣ抗ＣＤ４抗体蛍光特性によってゲートされた。各サンプルのデータは、１０，０００  ＣＤ４＋リンパ球が分析されるまで収集された。結果は、Ｔｈ１またはＴｈ２細胞であったゲートされたすべてのリンパ球のパーセンテージの中央値＋第１四分位値および第３四分位値として表される。
【０１１０】
足蹠浮腫は、Ｏｏｍｕｒａらの方法によって決定された（４１）。簡潔には、マウスは適切な用量のｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはＣＦＡ単独によって上述のように免疫化された。ブーストの２週間後、免疫化マウスのベースライン足蹠サイズは電子デジタルカリパスを使用して測定された。ＰＢＳ  ２５μｌ中のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ  ５０μｇが右足蹠に注射され、ＰＢＳは単独で免疫化マウスの左足蹠に注射された。２４時間後、足蹠は再度測定された。抗原特異性足蹠浮腫は、（２４時間後の右足蹠厚さ−ベースラインの右足蹠厚さ）−（２４時間後の左足蹠厚さ−ベースラインの左足蹠厚さ）として計算された。
【０１１１】
マウスの生存時間の相違を決定するために、非パラメトリックＬｏｇ  Ｒａｎｋ検定が利用された。抗体の力価、Ｔｈ１またはＴｈ２リンパ球の頻度、および足蹠浮腫は必要に応じて、非パラメトリック複数比較ではＳｔｅｅｌ検定（Ｒｈｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ２３：５３９−４９（１９６７）によって、対応のない比較ではＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって比較された。相関はＳｐｅａｒｍａｎ  Ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によって計算された。反復生存研究に異質性が存在するかどうかを判定するために、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定が利用された。Ｐ値＜０．０５は有意と見なされた。
【０１１２】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ免疫原の最も有効な用量を決定するために、１０７倍の用量範囲が評価された（マウス当たり２０ｐｇ〜２００μｇ）。メス退役繁殖ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ＋アジュバント（ＣＦＡ／ＩＦＡ）またはアジュバント単独によって免疫化された。抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ抗体力価を決定するために、免疫化されたマウスはブーストの２週間後に採血された（下を参照）。マウスは次にＣ．アルビカンスの致死的接種材料（２ｘ１０５出芽胞子）によって感染された。個々の実験が統計的異質性を示さなかったので、反復実験からの生存データは組合された（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定によってｐ＞０．０５）。ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの２０μｇ用量は感染マウスの２５％の長期生存と、アジュバント単独と比較して全体的な生存の有意な延長をもたらした（Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ検定によってｐ＝０．０４４、図１）。１０倍高い（図１５）または低い（データを示さず）用量のどちらも、アジュバント単独と比較して生存を有意に延長しなかった。これらの結果は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの中間用量がマウス播種性カンジダ症に対する防御を誘発したことを示す。
【０１１３】
上の発見は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの防御的用量を確立した。次にワクチンの有効性が、１０６個の分芽胞子によって感染したマウスのより迅速な致死モデルで評価された（未ワクチン接種マウスにおいて１０６個対２ｘ１０５個の接種材料でそれぞれ生存中央値３対１１日）。個々の実験の結果が統計的異質性を示さなかったので、再度、反復研究からのデータは組合された（Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定によってｐ＞０．０５）。２０μｇ用量＋ＣＦＡとして１０６個のＣ．アルビカンス分芽胞子によって感染したＢａｌｂ／ｃマウスに投与されたとき、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは生存中央値を倍以上に延長して、未ワクチン接種対照に対する全体的な生存の有意な延長をもたらした（Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ検定によってｐ＝０．００１、図１６Ａ）マウスの年齢がｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンに対するその応答に影響したかどうかを判定するために、我々はそれは若年マウスで試験した。若年マウスが同じ高さの接種材料によってワクチン接種および感染されたときに、同様の生存上の利益が見出された（Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ検定によってｐ＝０．０２、図１６Ｂ）。
【０１１４】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの２００μｇ用量は２０μｇ用量と比較して劣った防御をもたらしたが、抗原２００μｇ用量のみが血清抗Ａｌｓ１ｐ抗体力価の有意な上昇を誘発した（２００μｇ用量対他のすべての群でｐ＜０．００５、図１７）。抗Ａｌｓ１ｐ抗体力価の有意な上昇は中間の防御抗原用量では検出されなかった（２０μｇ対アジュバントでｐ＝０．１）。個々のマウスの血清抗Ａｌｓ１ｐ抗体力価が各マウスの生存時間に対してプロットされたときに、抗体力価と生存との間の相関は見出されなかった（Ｒ２＝０．０３、Ｓｐｅａｒｍａｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によってｐ＞０．０５）。実際に、抗原の最高用量（２００μｇ）によって免疫化されたマウスは１：１００，０００を超える抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ抗体力価を有するが、生存期間は、力価が検出限界より低かった（〜１：１００）、より低い用量の抗原で免疫化されたマウスと変わらなかった。これらの結果は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンによって誘発された防御が抗体力価と相関するように思えないことを示す。
【０１１５】
体液性免疫はｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ誘発防御と相関しなかったので、我々はｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの防御または非防御用量によって誘発された細胞媒介免疫応答について調査した。マウスは上記のように、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ  ０．２、２０、または２００μｇ、あるいはアジュバント単独によって免疫化された。ブーストの２週間後、脾細胞は収集され、Ａｌｓ１ｐを発現することが既知である加熱死させた予備出芽Ｃ．アルビカンスの存在下で培養された（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２））。培養４８時間後、フローサイトメトリーによる細胞内サイトカイン検出のために脾細胞が収集された。抗原の防御２０μｇ用量によって免疫化されたマウスからのリンパ球のみが、アジュバント単独を与えられたマウスと比較してＴｈ１細胞の有意に増加した頻度を発生させた（ｐ＝０．０３、図１８）。Ｔｈ２頻度（図１８）または頻度ＩＬ−１０＋Ｔリンパ球（データを示さず）の有意な相違は、アジュバントまたは抗原の用量のいずれかで免疫化されたマウス間で検出されなかった。
【０１１６】
１型免疫が生体内でｒＡｌｓ１ｐ−Ｎによって刺激されたことを確認するために、遅延型過敏症が足蹠浮腫によって試験された。ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの防御２０μｇ用量によってワクチン接種されたマウスのみが対照と比較して有意に上昇した遅延型過敏症反応を発生したが、この応答も非防御０．２および２００μｇ用量によって誘発された応答よりも有意に高度であった（図１９、非パラメトリックＳｔｅｅｌ検定によって、すべての比較対２０μｇでｐ＜０．０５）ひとまとめにして、これらの結果は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ抗原の防御用量が有意なＴｈ１分極および遅延型過敏症反応を誘発したことを示す。
【０１１７】
ワクチン媒介防御における抗体およびＴ細胞の役割を定義するために、Ｂ細胞欠損、Ｔ細胞欠損ヌード、または類似遺伝子性ＢＡＬＢ／ｃ野生型対照マウスは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ２０μｇ＋アジュバントまたはアジュバント単独によって免疫化され、Ｃ．アルビカンスの致死的接種材料（８ｘ１０５個の分芽胞子）に感染させた。アジュバント単独を与えた野生型対照マウスよりも、Ｂ細胞欠損マウスは感染に対して耐性である傾向があり、これに対してＴ細胞欠損マウスはより感受性であった（Ｂ細胞欠損およびＴ細胞欠損マウス対野生型アジュバント処置ではそれぞれｐ＝０．０６５および０．０１、図２０）。最後に、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮワクチンはＢ細胞欠損マウスでその有効性を維持したが（ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン化対アジュバント単独ではｐ＝０．０４、図６）、Ｔ細胞欠損マウスでは無効であった（ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン化対アジュバント単独ではｐ＝０．４、図２０）。これらの結果は、Ａｌｓ１ｐワクチンがＢ細胞欠損マウスで有効であるが、Ｔ細胞欠損ヌードマウスでは有効でないことを示す。
【０１１８】
このタンパク質のＮ末端による免疫化が、次の血行性播種性カンジダ症の間に若年および成熟ＢＡＬＢ／ｃマウスの両方の生存を改善したことを示す結果は、上述の通りである。特にｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの中間量（２０μｇ）は、より低い用量およびより高い容量（２００μｇ）の両方と比較して優れた防御を与えた。それにもかかわらずｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの非防御２００μｇ用量は、防御２０μｇ用量と同様に抗体の１００倍高い力価を誘発するため、免疫原性であった。
【０１１９】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの最高用量にてより低い防御の逆Ｕ字形用量−応答有効性曲線は、体液性免疫と抗原の所与の用量による細胞媒介免疫との間の反比例関係を最初に記載したＰａｒｉｓｈらの古典的研究を連想させる。Ｐａｒｉｓｈの根本的なデータに照らして、逆Ｕ字形用量−応答有効性曲線は：１）ワクチン有効性が細胞媒介免疫に依存する場合に、２）ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの中間用量が高い抗体刺激用量と比較して優れた細胞媒介免疫を刺激した場合に説明されうる。我々はしたがって、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンによって見られる逆Ｕ字形用量−応答有効性曲線が、抗原の防御的中間用量による細胞媒介免疫の優れた誘発によるものであると仮定した。
【０１２０】
この仮定を試験するために、抗原の高、中、および低用量がＴｈ１細胞を刺激する能力および遅延型過敏症が判定された。脾細胞からのサイトカイン産生を刺激するために、我々は特に、感染中の生体内状況を模倣するためにｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの代わりに加熱死Ｃ．アルビカンスへの暴露によって細胞を活性化した。防御２０μｇ用量のみが、Ｃ．アルビカンス刺激脾臓Ｔｈ１リンパ球の頻度を有意に向上させた。生体外Ｃ．アルビカンス刺激脾細胞で見られたＴｈ１細胞の頻度は、マウスの播種性カンジダ症の間に生体内で検出された頻度と同様であり（５９）、この手法の妥当性を強調した。
【０１２１】
検出された生体外Ｔｈ１細胞が生体内で機能的に有意であるかどうかを判定するために、我々は異なる用量のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ免疫化によって誘発された遅延型過敏症を比較した。Ｔｈ１細胞の頻度と一致して、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの防御２０μｇ用量のみが、有意な生体内遅延型過敏症反応を刺激した。これらの結果は、ワクチン誘発防御が１型細胞媒介免疫の誘発によるものであったという仮説と一致している。驚くべきことに、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの２００μｇ用量によって顕著に上昇された抗体力価の誘発にもかかわらず、我々はこの用量でワクチン接種されたマウスで脾臓Ｔｈ２リンパ球の増加を見出さなかった。１つの考えられる説明は、Ｔｈ２細胞が脾臓ではなく末梢リンパ節で活性化されたことである。あるいは他のＴ細胞集合（たとえばＮＫＴ細胞）が、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの２００μｇ用量に応答して見られる高い抗体力価の誘発の原因かもしれなかった。
【０１２２】
抗体力価と防御との間の相関の欠如は、ワクチン誘発防御の媒介における抗体の役割を完全に除外しなかった。たとえばＥＬＩＳＡ力価は、各種の特異性および親和性を持つ抗体の計数の結果である。したがって、ワクチン媒介防御に関与した抗体の小規模なサブセットが産生される可能性は抗体力価を測定することによって排除できなかった。細胞媒介免疫および非体液性免疫のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン媒介防御における役割を確認するために、我々はＢ細胞およびＴ細胞欠損マウスでのワクチンの有効性を試験した。Ｂ細胞欠損マウスは野生型対照よりも播種性カンジダ症に対して耐性である傾向があり、ワクチンの有効性はＢ細胞欠損マウスでは抑制されなかった。これに対してＴ細胞欠損マウスは、野生型対照よりも播種性カンジダ症に感受性であり、ワクチンの有効性はＴ細胞欠損マウスで消失していた。したがって我々の発見は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの有効性が、主に体液性免疫でなく、Ｔ細胞媒介免疫の誘発に依存することを確認する。同様にＢ細胞欠損マウスは類似遺伝子性野生型同腹子よりも播種性カンジダ症に感受性でないため、このモデルにおいて抗体は播種性カンジダ症に対して支配的なエフェクタではない。
【０１２３】
要するに、我々は、新規なｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが、体液性免疫よりむしろ細胞媒介免疫を誘発することによって実験的な播種性カンジダ症に対する防御を媒介することを報告する。したがってｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの中程度の防御効果の向上は、最適化されたアジュバントおよび／またはサイトカインを使用する細胞媒介免疫の追加の初回刺激、あるいは代わりの免疫経路によって達成されうる。実際に、我々の進行中の研究において、我々はすでに、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎを腹腔内と比較して皮下的に投与することによる有効性の顕著な向上を見出している。
【０１２４】
実施例ＶＩＩＩ
抗カンジダ・アルビカンスｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、真菌負荷を低下させ、免疫適格および免疫不全マウスの両方で生存を改善する
本実施例は、免疫適格および免疫不全マウスの両方で皮下（ＳＱ）経路によって投与したときに、実施例ＶＩＩに記載したｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの有効性の向上について記載する。最初に免疫適格マウスにおけるｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの有効性。
全長タンパク質のアミノ酸１９〜４３３を含むｒＡｌｓ１ｐ−ＮがＳ．セレビシエにおいて産生され、上述のように精製された。対照調製物は、空のプラスミドによって形質転換されたＳ．セレビシエから同様に精製された。ＢＡＬＢ／ｃ退役繁殖マウス（２５〜３０ｇ）は第０日にｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（２０μｇ）またはフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）と混合した対照調製物のＳＱ注射によって免疫化され、第２１日に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）中のブースター用量が続けられた。ブーストの２週間後、ワクチンの免疫原性は、足蹠浮腫反応の強度を遅延型過敏症（ＤＴＨ）のマーカーとして前に記載したように評価することによって確認された。ワクチン化マウスは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ特異性ＤＴＨの顕著な上昇を有していた（図２１）。
【０１２５】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの有効性は、感染ＢＡＬＢ／ｃマウスでの生存に対するｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチン接種の影響を判定することによって評価された（図２２Ａ）。ワクチン接種または対照マウスは、尾静脈を介してＣ．アルビカンスの迅速な致死的接種材料（２．５〜５ｘ１０５個の分芽胞子）によって感染した。我々は以前に、そのような接種材料に感染したマウスが圧倒的な敗血症性ショックで死亡することを示した（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００５））。ワクチン接種は死までの時間を顕著に延長し（Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ検定によって両方の接種材料でｐ＜０．０５）、３０日生存を改善した（５０〜５７％対０％、ＦｉｓｈｅｒのＥｘａｃｔ検定によって両方の接種材料でｐ＜０．０５）。
【０１２６】
血行性播種性カンジダ症の間のワクチン接種の組織真菌負荷に対する影響が次に決定された。ブーストの１４日後、ワクチン接種および対照ＢＡＬＢ／ｃマウスは尾静脈を介してＣ．アルビカンスＳＣ５３１４の５ｘ１０５個の分芽細胞によって感染した。感染の６日後、対照群での最初の死の開始前に、腎臓が収集、ホモジナイズ、およびＳａｂｏｕｒａｕｄデキストロース寒天（Ｄｉｆｃｏ）中で定量的に培養された（１８）。ｒＡｌｓｌｐ−ＮによるＳＱワクチン化は、対照と比較して中央値１．５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇの腎臓真菌負荷低下をもたらした（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定によってｐ＝０．０１、図２２Ｂ）。
【０１２７】
ｒＡｌｓｌｐ−Ｎの有効性も免疫不全マウスで評価された。免疫適格性マウスでの有効性が証明され、好中球減少マウスで免疫を誘発させて、好中球減少マウスを播種性カンジダ症から防御するｒＡｌｓｌｐ−Ｎワクチンの可能性も評価された。ワクチン接種ＢＡＬＢ／ｃマウスは、シクロホスファミドの投与によって好中球減少性とされた（第−２日に２００ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ、および感染に対して第＋９日に１００ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ、記載したように約１２日間の好中球減少症を生じた（Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ．Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：１９０８−１１（２００４））。足蹠浮腫反応はシクロホスファミドの最初の用量の２日後に実施された。ワクチン処理された好中球減少マウスは、免疫適格マウスと同じ大きさのＤＴＨ反応を発生した（図２３Ａ対１、並行して実施された実験）。Ｃ．アルビカンスの２．５ｘ１０４個の分芽胞子によって尾静脈を介して感染した好中球減少マウスでは、ワクチン接種は死までの時間（Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ検定によってｐ＝０．００７対対照）、中央値生存時間（２１＞対１２日、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定によってｐ＝０．００８）、および全体の生存（８８％対３８％、ＦｉｓｈｅｒのＥｘａｃｔ検定によってｐ＝０．００５）での有意な改善も生じた（図２３Ｂ）。
【０１２８】
粘膜感染でのｒＡｌｓｌｐ−Ｎワクチン接種の有効性を判定するために、ワクチンはマウス口腔咽頭カンジダ症（ＯＰＣ）モデルで試験された（Ｋａｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：５２５６−８（２００２）およびＫａｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４５：３１９５−９７（２００１））。ワクチン接種マウスは、コルチゾンアセテートによって処置して（感染に対して第−１、１、および３日に２２５ｍｇ／ｋｇ  ＳＱ）、記載したように舌下感染させた。舌は感染後第５日に切除された。ホモジナイズされた舌のコロニー形成単位が侵入感染と表面付着コロニー形成とで区別できないので、我々は組織病理学によって侵入の程度を評価した。盲検観察者（ｂｌｉｎｄｅｄ  ｏｂｓｅｒｖｅｒ、ＢＪＳ）は、舌の長さ全体に沿ってスキャンして、４０ｘ高倍率視野（０＝病巣なし、１＋＝軽度の粘膜炎症、２＋＝上皮に限定された有意な炎症、３＋＝上皮層全体を通じて広がる炎症、４＋＝上皮下組織内へ広がる炎症）により真菌病巣の重症度を定量することによって各切片を評価した。サンプリングの偏りを回避するために、少なくとも５個の介入組織切片によって隔てられた各舌の２個の切片が評価された。すべての対照マウスは、多くの位置でその舌の顕著な真菌侵入を発生したが、２匹のワクチン接種マウスのみが何らかの舌病巣を発生した。全体で対照マウスの舌当たりの病巣の中央値数（第３、第１四分位値）は、ワクチン接種マウスの１（２．５、０）と比較して、６．５（８、５．７５）であった（Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定によってｐ＝０．０３）。感染の重症度の半定量的評価は、対照と比較したワクチン接種マウスでの有意な低下を示した（図２４、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定によってｐ＝０．０３）。
【０１２９】
粘膜感染でのｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチン接種の有効性を判定するために、膣コロニー形成のマウスのモデルにおけるこれらの２つのワクチン（Ｃｌｅｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７２：４８７８−８０（２００４）；Ｆｉｄｅｌ．Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：５１５−４８（２００２）およびＷｏｚｎｉａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ．７０：５７９０−９（２００２））ワクチン接種マウスは感染に対して第−３日にエストロゲン（３０μｇ、ＳＱで投与）によって処置され、次に膣へＣ．アルビカンスの分芽胞子１０６個を含有するリン酸緩衝生理食塩水１０μｌによってチャレンジされた。膣は接種後第３日に切除され、ホモジナイズされて、連続希釈液をＹＰＤプレート上にプレーティングした。コロニー形成単位（ＣＦＵ）は３０〜３５℃でのプレートのインキュベーションの２４〜４８時間後に数えられた。ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでワクチン接種されたマウスから収集した膣ではなく、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでワクチン接種されたマウスから収集した膣は、対照マウス（すなわちＣＦＡ単独でワクチン接種されたマウス）から収集した膣よりも低いＣＦＵを有していた（図２５、Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定によってｐ＝０．０１）。
【０１３０】
カンジダ血症の上昇する発生率およびその継続している高い死亡率に照らして、カンジダ種に対するワクチンの開発は非常に重要である。上に記載した結果は、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮによるＳＱワクチン接種が生存での顕著な改善および真菌負荷での有意な低下を、免疫適格および免疫不全マウスの両方において、そうでなければ迅速な致死性の血行性播種性カンジダ症の間に生じたことを示している。興味深いのは個々のワクチン接種マウスからの腎臓真菌負荷であり、マウスの約半分が５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇで腎臓真菌負荷を有したことを示している。我々は以前に、致死性感染を示す腎臓真菌負荷の閾値が５ｌｏｇ  ＣＦＵ／ｇであることを見出している；このレベルより上の腎臓真菌負荷を持つマウスは通例感染から死亡するのに対して、この負荷よりも低い腎臓真菌負荷を持つマウスは感染を生き延びる（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２００５）および（Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７１：５７５６−５７６４（２００３））。したがってワクチン接種群での破綻的死は、ワクチン接種にもかかわらず高い真菌負荷を反映すると思われる。組織真菌負荷のマウス間での変動は、宿主病原体相互作用および／または可変性のワクチン応答性の複雑さを反映しうる。
【０１３１】
要約すれば、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、ますます一般的であり、高致死性播種性カンジダ症の処置、重症度の低下および／または予防に使用されうる。ワクチンは免疫適格マウスで有効であり、有効性は好中球減少およびコルチコステロイド処置宿主においてさえ維持される。最後にワクチンは、膣および口腔咽頭カンジダ症を含む粘膜性カンジダ症を防御しうる。
【０１３２】
実施例ＩＸ
Ｓ．アウレウス感染に対するＡＬＳワクチンの有効性
本実施例は、Ｃ．アルビカンスからのＡｌｓタンパク質がＳ．アウレウスに感染した動物モデルの生存を改善することを示す。
【０１３３】
Ｃ．アルビカンスのＡｌｓアドヘシンは、Ｓ．アウレウスのアドヘシンに対して著しく相同性であることが同定された。この特徴はＡｌｓアドヘシンを使用してＳ．アウレウスに対する有効なワクチンを設計および施用するために使用された。簡潔には、Ｃ．アルビカンスＡＬＳファミリーは、少なくとも９つの遺伝子より成る（Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５７：１５５５−６７（２００１）；Ｈｏｙｅｒ  ＬＬ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９：１７６−８０（２００１））。前に記載されているように、Ａｌｓタンパク質は、生物学的に関連する基質に対してアドヘシンとして機能する（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４４：６１−７２（２００２）；Ｇａｕｒ  ａｎｄ  Ｋｌｏｔｚ，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６５：５２８９−９４（１９９７）；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５０：２４１５−２８（２００４）；Ｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙｌ５ｌ：６７３−８１（２００５）；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５１：１６１９−３０（２００５））；Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５：３９−５４（１９９５））。特にＡｌｓ１ｐおよびＡｌｓ３ｐのＮ末端は、コラーゲン結合タンパク質およびクランピング因子を含む、病原性Ｓ．アウレウスによって発現された表面タンパク質に著しく相同性である（表ＩＶ；Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３０４８０−８９（２００４））。
【０１３４】
【表４】
2008540453.tif 000009
上の表ＩＶに与えた相同性の計算は、配列アラインメントおよび三次元表面構造の両方の特徴を考慮する。Ａｌｓ１ｐの相同性は、Ｓ．アウレウスのコラーゲン結合タンパク質またはクランピング因子と比較して９５％または９０％を超えると計算された（ｒ２≧９０％；Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，同上）。同様に、Ａｌｓ３ｐの相同性は、Ｓ．アウレウスのコラーゲン結合タンパク質またはクランピング因子と比較して９５％または８０％を超えると計算された（ｒ２≧９０％）。
【０１３５】
上の発見を裏付けるために、相同性およびスレッディング方法を利用して、Ａｌｓ１ｐおよびＳ．アウレウスクランピング因子Ａ（ＣｌｆＡ−ＰＤＢコード：ｃｌｎ６７Ａ）の間に構造−機能一致をモデル化した。これらの方法は、一次構造、３Ｄ高次構造での特異的相同性を評価し、類似機能モチーフを探すためにパターン解析が実施された。たとえばＢＬＡＳＴＰ、ＰＲＯＳＩＴＥおよびＪＡＬＶＩＥＷ法は、ＡＬＳ対ＣｌｆＡ一次構造の類似性および相違を解析するために利用された（Ｙｏｕｎｔ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．４８：４３９５−４４０４（２００４）およびＹｏｕｎｔ  ａｎｄ  Ｙｅａｍａｎ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：７３６３−７３６８（２００４））。次に３Ｄ  ＰＳＳＭを含むインターネットベースのアプリケーションを使用して、さらなる解析のために潜在的なＡＬＳホモログが優先順位付けされた（Ｓｈｅｐｐａｒｄ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：３０４８０−３０４８９（２００４））。得られたデータと共に、ＰＨＹＲＥアプリケーション（Ｋｅｌｌｅｙ，Ｌ．，Ｒ．Ｂｅｎｎｅｔｔ−Ｌｏｖｓｅｙ，Ａ．Ｈｅｒｂｅｒｔ，ａｎｄ  Ｋ．Ｆｌｅｍｉｎｇ；ウェブサイトは次の通りである：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／〜ｐｈｙｒｅ／）を使用して、トポロジーマッピングが実施され、推定上の共有機能モチーフを同定する目的で、選択されたＡＬＳタンパク質に対して最大の構造的および機能的相同性を備えたタンパク質によって共有される三次元モチーフが同定された。上の方法はパブリックドメインで幅広く利用可能であり、多種多様のプロテオミクスおよび構造生物学用途で使用されている。上の相同性およびスレッディング法の結果に基づいて、Ａｌｓ１ｐとＣｌｆＡとの間の機能性部位相同性のコンセンサスが生成され、ＣｌｆＡに構築されたＡｌｓ１ｐモデルの特異的残基にマップされた。これらのモデル化解析から生じた複数の特定の発見が下で述べられる。
【０１３６】
第一に、Ａｌｓ１ｐとＣｌｆＡのＮ末端領域間で、特にアミノ酸３０〜３００（すなわち両方のタンパク質のＮ末端）によって含まれる領域において、二次構造およびアミノ酸保存の著しい相同性が同定された。
【０１３７】
第二に、確立されたＣｌｆＡアドヘシン決定基に基づく相同性機能性部位のコンセンサスマッピングは、Ａｌｓ１ｐの特異的トポロジーモチーフに集中した。このトポリジーモチーフは図２６に、２つのβシートドメインの隣接面の屈曲によって形成された間隙として示されている。
【０１３８】
第三に、一次構造相同性と一致して、Ａｌｓ１ｐ内の予測された機能性間隙モチーフは、アミノ酸残基３０〜３００を含むＮ末端領域内の超可変領域から生じる特異的残基にマップする。
【０１３９】
これらの結果は、一致した生物機能の構造的基礎はもちろんのこと、Ａｌｓ１ｐおよびＣｌｆａに対する免疫応答を与えた。これらの結果もさらに、我々のＡｌｓ１ｐ構造活性の全体モデルを裏付け、突然変異解析およびエピトープマッピングへの標的化手法をさらに促進する。最後にこれらの結果は、Ａｌｓ１ｐおよびＣｌｆＡが、多様な微生物病原体に存在する類似構造および機能のアドヘシンであることを示す。
【０１４０】
Ｃ．アルビカンスによって引き起こされた感染を低減しうる、Ｓ．アウレウスに対するモノクローナル抗体も同定された。上の構造的発見と同様に、この特徴もＡｌｓアドヘシンを使用してＳ．アウレウスに対する有効なワクチンを設計および施用するために使用された。
【０１４１】
簡潔には、Ｓ．アウレウスの表面アドヘシンを認識することが既知であるヒト化抗スタフィロコッカスモノクローナル抗体（Ａｕｒｅｘｉｓ（登録商標））は現在、臨床試験中である。このモノクローナル抗体もＡｌｓファミリーメンバーと交差反応する。スタフィロコッカス血流感染の処置のためのＡｕｒｅｘｉｓ（登録商標）の第二相臨床試験の好ましい結果が報告されている（Ｉｎｈｉｂｉｔｅｘ  Ｉｎｃ．，２００５；２００５年９月１９日にｈｔｔｐ：／／ｐｈｘ．ｃｏｒｐｏｒａｔｅ−ｉｒ．ｎｅｔ／ｐｈｏｅｎｉｘ．ｚｈｔｍｌ？ｃ＝ｌ７６９４４＆ｐ＝ｉｒｏｌ−ｎｅｗｓＡｒｔｉｃｌｅ＆ＩＤ＝７０７３２２＆ｈｉｇｈｌｉｇｈｔ＝にてアクセスされた）。簡潔には本報告において、血中に既知のＳ．アウレウスを持つ患者にＡｕｒｅｘｉｓ（登録商標）抗体が活動性感染のための処置として投与された（すなわちこれは活性ワクチン方法または予防研究ではない）。プラセボを与えられた患者９名は、カンジダによって引き起こされた破綻的な血流感染を経験したのに対して、Ａｕｒｅｘｉｓ（登録商標）群では患者３名のみがカンジダ血流感染を経験した。Ｓ．アウレウスに対する抗体によって処置された患者でのカンジダ血液感染の低下を認識することは、上の相同性および構造上の発見と組合されて、免疫原性エピトープがカンジダとＳ．アウレウスとの間で共有されることと、これらの免疫原性エピトープが、他の種の処置のために１つの種に対して産生された免疫応答、抗体またはエフェクタ機構を使用して治療的利益へ標的化されうることとを示している。したがって上のデータは共に、カンジダ種と交差反応するＳ．アウレウスの表面アドヘシンに対する免疫応答を与える。
【０１４２】
上の方法に従って、Ｓ．アウレウスに感染したマウスの生存を改善するための例示的なＡｌｓアドヘシンワクチンが設計され、示されている。ワクチン化するために使用された例示的なＡｌｓアドヘシンは、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎであり、上述のように産生および使用された。簡潔には、カンジダに対するこれらのＡｌｓワクチン、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−ＮがＳ．アウレウスに対する種間防御を媒介しうるかどうかを判定するために、メスＢａｌｂ／ｃマウスが前に記載された投与計画によってワクチン接種された（第０日に完全フロイントアジュバント＋ｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ  ２０μｇ、続いて３週間後に不完全フロイントアジュバントのブースター用量、どちらも皮下的に投与された）。ワクチン接種の２週間後、マウスは尾静脈を介して、メチシリン耐性であり、動物モデルで毒性であることが既知であるＳ．アウレウス菌株６７−０の致死用量で感染させた。マウス生存を示す結果を表２６に示す。示したように、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンの両方がこれらの感染マウスでの長期生存を改善した（図２７）。加えて、Ａｂ力価とｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎのどちらかによってワクチン接種されたマウスの生存との間に相関がないため、防御の機構は、Ｔｈ２よりもむしろＴｈ１の向上であると思われる（図２８）。
【０１４３】
実施例Ｘ
抗カンジダｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが、播種性カンジダに対する広範囲に亘る防御を媒介する
本実施例は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが非近交系マウスを播種性カンジダ症から防御し、Ｂａｌｂ／ｃマウスをＣ．アルビカンスおよび非アルビカンスカンジダの他の毒性菌株から防御することを示す。
【０１４４】
現在の研究は、Ｃ．アルビカンスの他の菌株に対する、そしてカンジダの非アルビカンス種に対する、フロイントアジュバント以外の第二のアジュバントと組合された、非近交系マウスでのその有効性を特に評価することによる、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎによって誘発された防御の幅を例示するために実施された。
【０１４５】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎによるワクチン接種は、非近交系マウスを播種性カンジダ症から防御した。簡潔には、非近交系ＣＤ１マウスはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）から入手した。マウスを含むすべての手順は、動物の飼育および保管のための国立衛生研究所ガイドラインに従って、研究機関の動物管理使用委員会によって承認された。マウスは以前に上で、そしてたとえばＩｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：９９９−１００５（２００５）；Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７３：６１９１−９３（２００５）に記載されたようにｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ＋フロイントアジュバントによってワクチン接種された。ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（Ａｌｓ１ｐのアミノ酸１７〜４３２）はＳ．セレビシエにおいて産生され、ゲル濾過およびＮｉ−ＮＴＡマトリクス親和性精製によって精製された。高度の純度（≒９０％）はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってはもちろんのこと、上述のように円偏光二色性およびＦＴＩＲによっても、上で、そしてたとえばＳｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：３０４８０−８９（２００４）に記載されたように確認された。マウスは、第０日にフロイント完全アジュバント（ＣＦＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，  Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と混合されたｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（２０μｇ）のＳＱ注射によって免疫化され、第２１日に不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中のブースター用量が続けられた。対照マウスはＣＦＡ／ＩＦＡ単独で免疫化された。ブーストの１４日後、免疫化マウスは、我々が以前にＩｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ，（２００５）同上；およびＳｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５），同上に記載したように、Ｃ．アルビカンスＳＣ５３１４によって尾静脈を介して感染させた。Ｂａｌｂ／ｃマウスでの我々の以前の結果と同様に、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは感染ＣＤ１マウスの生存を顕著に改善した（図２９Ａ）。
【０１４６】
フロイントアジュバントはヒトでの使用にはあまりに毒性が強いと見なされているので、我々は、ヒトでの使用に現在、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって唯一承認されているワクチンアジュバントであるミョウバン（２％  Ａｌハイドロゲル、Ｂｒｅｎｎｔａｇ  Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ，Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ，Ｄｅｎｍａｒｋ）中のｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの用量応答を実施した。ミョウバンによるワクチン接種は、フロイントアジュバントと同一のスケジュールで実施し、第１日に免疫化、第２１日にブースト、２週間後に感染であった。我々は、ミョウバンと組合せたｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの高用量が播種性カンジダ症のマウスの生存に有意な改善を生じることを見出した（図２９Ｂ）。ミョウバンと組合わせたときにｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの高用量での改善された生存との傾向との、用量応答関係があるようにも思われる。
【０１４７】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、Ｃ．アルビカンスの複数の菌株に感染したＢａｌｂ／ｃマウスの生存も改善することが示された。特に有用なワクチンは、標的病原体の複数の菌株を認識する免疫系を初回刺激できる免疫原を利用する。ＤＮＡ配列解析によって、我々は、血流（５菌株）、尿（５菌株）および口腔咽頭（１０菌株）感染からの臨床Ｃ．アルビカンス単離菌の多様な群の中で、Ａｌｓ１ｐのＮ末端領域の予測されたアミノ酸配列が９９．９％保存されたことを見出した（データを示さず）。これらの結果は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが多岐に亘るＣ．アルビカンス菌株に対して有効でありうることを示した。Ｃ．アルビカンスの他の菌株に対するｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンの防御の幅を確認するために、マウスはｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ＋フロイントアジュバントによって上のようにワクチン接種され、Ｃ．アルビカンスの複数の臨床単離菌の１つによって感染させた（Ｉｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ６３：１９９３−９８（１９９５））。図３０に示すように、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンはこれらの菌株のそれぞれによって感染させたマウスの生存を有意に改善した。
【０１４８】
ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、カンジダの複数の非アルビカンス種によって感染させたマウスで組織真菌負荷を低下させることも示された。簡潔には、ＡＬＳ遺伝子ファミリーは、Ｃ．ドゥブリニエンシスおよびＣ．トロピカリスを含む他のカンジダ種に存在する。（Ｈｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５７：１５５５−６７（２００１））。同様に、Ａｌｓファミリーメンバーに類似したアドヘシンはＣ．グラブラータに記載されている（Ｃｏｒｍａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：５７８−８２（１９９９）；  Ｆｒｉｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４６：４７９−９２（２００２））。非アルビカンス種に対するｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの有効性を確認するために、Ｂａｌｂ／ｃマウスはｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ＋フロイントアジュバントによって上のようにワクチン接種され、尾静脈を介してＣ．グラブラータ３１０２８（Ｈａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒの微生物研究所からの臨床血流単離菌）、Ｃ．クルセイ９１−１１５９（Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｎａｌｄｉ，Ｓａｎ  Ａｎｔｏｎｉｏ，Ｔｅｘａｓにより寄贈）、Ｃ．パラプシローシス（Ｈａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒからの臨床血流単離菌）、またはＣ．トロピカリス（Ｈａｒｂｏｒ−ＵＣＬＡ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒからの臨床血流単離菌）によって感染させた。図３１に示すように、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンはこれらの菌株のそれぞれによって感染されたマウスの腎臓真菌負荷を低下させた。
【０１４９】
要約すれば、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンは、ますます一般的であり、高致死性播種性カンジダ症を予防する、および／またはその重症度を低下させることができる。ワクチンは、アジュバントとしてのミョウバンと混合したときに、同系および非近交系マウスの両方で、Ｃ．アルビカンスの複数の菌株に対して、そしてカンジダの複数の非アルビカンス種に対して有効である。これらの結果はさらに、本発明のＡＬＳワクチンが多岐に亘るカンジダおよび他の感染に対して有効であることを裏付けている。
【０１５０】
実施例ＸＩ
抗カンジダｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、播種性カンジダ症に対してｒＡｌｓ１ｐ−Ｎと同等に有効であり、そして粘膜カンジダ症に対してより有効である。
【０１５１】
本実施例は、血行性播種性、口腔咽頭、および膣カンジダ症のマウスモデルにおけるｒＡｌｓ１ｐ−Ｎに対するｒＡｌｓ３ｐ−Ｎの有効性を比較する。
ＡＬＳファミリーメンバーの中で、ＡＬＳ１およびＡＬＳ３遺伝子は、最も多岐に亘る基質親和性を備えたアドヘシンをコードする。相互に比較したとき、Ａｌｓ１ｐは内皮細胞およびゼラチンに対してより大きい付着力を媒介したが、内皮細胞に対しては劣った付着力を媒介した（Ｓｈｅｐｐａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９：３０４８０−８９（２００４））。付着品質におけるこれらの相違は、ｒＡｌｓ３ｐ−ＮがｒＡｌｓ１ｐ−Ｎと比較してワクチン免疫原として異なる有効性を有しうることを示唆した。
【０１５２】
ワクチンおよびワクチン接種は、上述のように実施された。簡潔には、上で、そしてＩｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），同上；Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），同上）に記載されているように、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ（Ａｌｓ１ｐまたはＡｌｓ３ｐのアミノ酸１７〜４３２）は、Ｓ．セレビシエ内で産生され、ゲル濾過およびＮｉ−ＮＴＡマトリクス親和性精製によって精製された。タンパク質の量は改良Ｌｏｗｒｙアッセイによって定量された。高度の純度（≒９０％）はＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によってはもちろんのこと、上述のように円偏光二色性およびＦＴＩＲによっても、上でＩｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），同上；Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），同上）に記載されているように確認された。マウスは、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）と混合されたｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ２０μｇの皮下（ＳＱ）注射によって第０日に免疫化され、不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含む抗原の別の用量によって第２１日にブーストされ、ブーストの２週間後に感染した。
【０１５３】
統計的分析は下のように実施された。マウスの生存時間の相違を決定するために、非パラメトリックＬｏｇ  Ｒａｎｋ検定が利用された。抗体の力価および足蹠浮腫は必要に応じて、非パラメトリック複数比較ではＳｔｅｅｌ検定（Ｒｈｙｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ  ２３：５３９−４９（１９６７）によって、対応のない比較ではＭａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定によって比較された。相関はＳｐｅａｒｍａｎ  Ｒａｎｋ検定によって計算された。反復生存研究に異質性が存在するかどうかを判定するために、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定が利用された。Ｐ値＜０．０５は有意と見なされた。
【０１５４】
ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎによるワクチン接種は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎとの比較でより多岐に亘る抗体応答を刺激することが示された。この点で、図３２に示した結果は、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎによってワクチン接種されたマウスが、ＣＦＡ単独を与えられたマウスよりも有意に高い抗体力価を発生したことを示す。注目すべきことに、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでワクチン接種されたマウスは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでワクチン接種されたマウスと同等の力価で抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ抗体を産生した（図３２、上）。これに対して、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでワクチン接種されたマウスは、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでワクチン接種されたマウスよりも、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎに対して低い力価を産生した（図３２、下）。しかしながらｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎの両方が、図３３に示したように生体内で同様の遅延型過敏症応答を生じた。
【０１５５】
ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、播種性カンジダ症に対して同様の有効性を媒介することも示されている。簡潔には、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンが血行性播種性カンジダ症に対してｒＡｌｓ１ｐ−Ｎほど有効であったことを裏付けるために、マウスはＣＦＡ、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓｌｐ−Ｎ、またＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎによってワクチン接種され、次に尾静脈を介してＣ．アルビカンスに感染された。図３４に示す結果は、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンの両方が生存にて有意な改善を生じたことを示している。
【０１５６】
抗Ａｌｓｐ抗体力価および遅延型過敏症反応と、次にＣ．アルビカンスに感染されたワクチン接種マウスの生存との相関も決定された。簡潔には、抗体力価は、我々が以前に、そしてＩｂｒａｈｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），同上；Ｓｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），同上に記載したように、９６ウェルプレートでのＥＬＩＳＡによって決定された。ウェルは、ウェルごとにＰＢＳ中の５μｇ／ｍｌｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ  １００μｌによってコーティングされた。マウス血清は室温にて１時間インキュベートされ、３％ウシ血清アルブミンを含有するｔｒｉｓ緩衝生理的食塩水（ＴＢＳ）（０．０１Ｍ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ）を用いた遮断ステップが続いた。ウェルは、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＴＢＳによって３回洗浄され、Ｔｗｅｅｎを含まないＴＢＳによるさらに３回の洗浄が続いた。ホースラディッシュペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）によってコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ二次抗体は最終希釈度１：５０００で添加され、プレートはさらに室温にて１時間インキュベートされた。ウェルはＴＢＳによって洗浄され、０．１Ｍクエン酸緩衝剤（ｐＨ５．０）、５０ｍｇ／ｍｌ  ｏ−フェニレンジアミン（Ｓｉｇｍａ）、および３０％  Ｈ２Ｏ２  １０μｌを含有する基質によってインキュベートされた。色を３０分間展開させて、その後、１０％  Ｈ２ＳＯ４を添加することによって反応が停止され、光学密度（ＯＤ）がマイクロタイタープレートリーダーで４９０ｎｍにて決定された。負の対照ウェルは無関係の抗体を与えられ、最終ＯＤ読取値を得るためにバックグラウンド吸収が試験ウェルから引かれた。ＥＬＩＳＡ力価は、正のＯＤ読取値（すなわち＞負の対照サンプルの平均ＯＤ＋（標準偏差＊２））を与えた最後の血清希釈度の逆数として解釈された。
【０１５７】
遅延型過敏症反応は、足蹠浮腫を測定することによって評価された。簡潔には、マウスはｒＡｌｓｌｐ−Ｎ、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ、またはＣＦＡ単独によって免疫化された。ブーストの２週間後、免疫化マウスのベースライン足蹠サイズは電子デジタルカリパスを使用して測定された。ＰＢＳ  ２５μｌ中のｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ  ５０μｇが右足蹠に注射され、ＰＢＳは単独で免疫化マウスの左足蹠に注射された。２４時間後、足蹠は再度測定された。抗原特異性足蹠浮腫は、（２４時間後の右足蹠厚さ−ベースラインの右足蹠厚さ）−（２４時間後の左足蹠厚さ−ベースラインの左足蹠厚さ）として計算された。
【０１５８】
ワクチン接種マウスは、力価決定のために採血され、感染の２日前に足蹠浮腫試験を受けさせられた。それにもかかわらず感染を生き延びなかったワクチン接種マウスは、図３５に示すように多岐に亘る抗体力価を有した。多くのそのようなマウスは、≧１：５０，０００（≧４．５ｌｏｇ１０）の抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎおよび抗ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ抗体力価を有する。結果として、抗体力価は生存と有意に関連しなかった。これに対して、足蹠浮腫反応の強度は生存と関連しなかった（図３５、Ｓｐｅａｒｍａｎ  Ｒａｎｋ相関検定によりｐ＝０．６＆ｐ＝０．００９）。
【０１５９】
ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、粘膜カンジダ症の２つのモデルにおいてｒＡｌｓ１ｐ−Ｎより高い有効性も示した。Ａｌｓ３ｐはＡｌｓ１ｐと比較して上皮細胞への優れた接着を媒介するので、この観察はｒＡｌｓ３ｐ−Ｎが感染の粘膜モデルで独自の有効性を呈しうることを示す。ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎと比較されたｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの有効性は、感染のステロイド処置口腔咽頭モデルおよびカンジダ膣縁のモデルで評価された。
【０１６０】
簡潔には、上のマウス口腔咽頭カンジダ症（ＯＰＣ）モデルでのワクチン研究は、前に記載したように、そしてＳｐｅｌｌｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５），同上；Ｋａｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  ４５：３１９５−５７（２００１）、およびＫａｍａｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎ  ７０：５２５６−５８（２００２）に記載されているように実施された。ワクチン接種マウスは、コルチゾンアセテートによる処置（感染に対して第−１、１、および３日に２２５ｍｇ／ｋｇ  ＳＱ）によって免疫不全化された。感染の日に、マウスは１ｋｇ当たりキシラジン８ｍｇおよびケタミン１１０ｍｇによる腹腔内注射によって麻酔された。カルシウムアルギナート尿道スワブは、それらを３０℃のＨＢＳＳ中１ｍｌ当たり１０６個の生物の懸濁物にそれらを入れることによって、Ｃ．アルビカンスで飽和された。飽和されたスワブをマウスの口腔内で舌下に７５分間置いた。感染の５日後、舌および舌下組織は切除、秤量、ホモジナイズされ、次に定量的に培養されて口腔真菌負荷が決定された。
【０１６１】
マウス膣カンジダ症に対するワクチンの有効性は、偽発情を誘発するために、ラッカセイ油に溶解させた皮下エラストラジオールバレレート３０μｇ（どちらもＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈより）で処置されたメスＢａｌｂ／ｃマウスに感染に対して第−３日にワクチン接種することによって実施された感染の日に、マウスはケタミン１００ｍｇ／ｋｇのｉｐ投与によって鎮静させた。鎮静マウスは、ＨＢＳＳ  １０μｌ中のＣ．アルビカンスの１０６個の分芽胞子によって膣内感染された。感染後第３日に、膣および各子宮角の約１センチメートルはアン・ブロック（ｅｎ  ｂｌｏｃｋ）切除、ホモジナイズ、および定量的に培養された。
【０１６２】
図３６に示すように、口腔咽頭カンジダ症のコルチゾン処置マウスにおいて、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎは、舌真菌負荷低下への強い傾向を媒介した（ｐ＝０．０５４）。利益の全体の規模は＜０．３ｌｏｇＣＦＵ／グラムであった（図３６）。比較して、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、統計的に有意である舌真菌負荷の＞０．６ｌｏｇＣＦＵ／グラムを媒介した（ｐ＝０．００５、図３６）。同様にカンジダ膣炎の非免疫不全モデルにおいて、図３７に示すように、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、ＣＦＡ単独に比較して膣真菌負荷の０．７ｌｏｇＣＦＵ／グラムを媒介した（ｐ＝０．０２）。比較して、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎは、膣炎モデルにおいて利益を全く媒介せず、ｒＡｌｓ３ｐ−ＮはｒＡｌｓ１ｐ−Ｎよりも有意に有効であった（ｐ＝０．０１）。
【０１６３】
上の結果は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎにアミノ酸レベルで８５％相同性であるｒＡｌｓ３ｐ−Ｎに基づくワクチンは、播種性カンジダ症に対して同等に有効であるが、粘膜感染に対してｒＡｌｓ１ｐ−Ｎよりも有効であったことを示す。ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎの有効性の上昇は、口腔咽頭カンジダ症のステロイド処置モデルおよびカンジダ膣炎の免疫適格モデルの両方で見られる。上の結果は、非補助的抗真菌療法によるカンジダ敗血症性ショックのマウスモデルにおける≧５０％長期生存の達成が有望であり、本発明の全ＡＬＳワクチンの治療的利益を裏付けることを示している。
【０１６４】
抗体力価は、播種性カンジダ症の間のどちらのワクチンの防御効果と相関しないが、生体内での遅延型過敏症の誘発は防御と関連していた。これらのデータは、ワクチン誘起防御の機構は、真菌に対する１型細胞媒介免疫の誘起であったこともさらに裏付ける。ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−ＮはどちらもｒＡｌｓ１ｐ−Ｎに対する抗体の等価の力価を誘発したが、そのｒＡｌｓ３ｐ−ＮはｒＡｌｓ１ｐ−Ｎよりも、抗ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ抗体の有意に高い力価を誘起した。これらのデータは、アミノ酸配列相同性のその高い程度（８５％）にもかかわらず、体液免疫系はｒＡｌｓ１ｐ−ＮとｒＡｌｓ３ｐ−Ｎとを区別できる。上の結果はさらに、Ａｌｓ１ｐおよびＡｌｓ３ｐ上皮細胞付着特徴の相違にもかかわらず、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、血行性播種性（すなわち血管内）カンジダ症からの防御に同等に有効であった。
【０１６５】
要するに抗カンジダｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンは、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが誘発したのと同等の細胞媒介応答であるが、より広範な抗体ベース応答を誘発した。免疫原は、血行性播種性カンジダ症に対する同等の程度の防御を生じたが、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎは口腔咽頭および膣カンジダ症の療法に対してより高い防御を媒介した。
【０１６６】
この出願を通じて、各種の刊行物はカッコ内に参照されている。これらの刊行物の開示はその全体が、本発明が関係する技術水準をより十分に記載するために参照により本出願に組み入れられている。
【０１６７】
本発明は開示された実施形態を参照して記載されているが、当業者は上で詳説された特定の実施例および研究が本発明の単なる例示であることをただちに認識するであろう。本発明の精神から逸脱することなく各種の修正形態が実施されうることが理解されるべきである。したがって本発明は以下の請求項によってのみ限定される。
【図面の簡単な説明】
【０１６８】
【図１Ａ】ヒト臍帯静脈内皮細胞へのＣ．アルビカンスのＡｌｓ１ｐ付着の媒介を示す。値は、それぞれ３通り実施された少なくとも３回の独立した結果の平均±ＳＤを表す。（Ａ）ＡＬＳ１ｌ／ａｌｓ２  ａｌｓｌ／ａｌｓｌおよびＡＬＳ１補足ミュータントおよび野生型ＣＡＩｌ２（３０）の内皮細胞付着、（Ｂ）野生型Ｃ．アルビカンスと比較してＡＬＳ１を過剰発現する、ＰＡＤＨｌ−ＡＬＳ１ミュータントの内皮細胞付着。統計処理はＷｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によって得られ、Ｂｅｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いて複数の比較に対して補正した。すべての比較で＊Ｐ＜０．００１。
【図１Ｂ】ヒト臍帯静脈内皮細胞へのＣ．アルビカンスのＡｌｓ１ｐ付着の媒介を示す。値は、それぞれ３通り実施された少なくとも３回の独立した結果の平均±ＳＤを表す。（Ａ）ＡＬＳ１ｌ／ａｌｓ２  ａｌｓｌ／ａｌｓｌおよびＡＬＳ１補足ミュータントおよび野生型ＣＡＩｌ２（３０）の内皮細胞付着、（Ｂ）野生型Ｃ．アルビカンスと比較してＡＬＳ１を過剰発現する、ＰＡＤＨｌ−ＡＬＳ１ミュータントの内皮細胞付着。統計処理はＷｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によって得られ、Ｂｅｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いて複数の比較に対して補正した。すべての比較で＊Ｐ＜０．００１。
【図２】Ｃ．アルビカンス間接免疫蛍光の微細線維へのＡｌｓ１ｐの細胞表面局在化を示す。Ｃ．アルビカンスの線維化は、グルタミンを含むＲＰＭＩ  １６４０中で酵母細胞を３７℃にて１．５時間インキュベートすることによって誘発された。Ａｌｓ１ｐは、生物を最初に抗Ａｌｓ１ｐマウスｍＡｂで、続いてＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウスＩｇＧによってインキュベートすることにより検出された。Ｃ．アルビカンス細胞表面は、Ａｌｅｘａ  ５９４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）でコンジュゲートされた抗Ｃ．アルビカンスポリクローナルＡｂによっても染色された。黄色染色の範囲がＡｌｓ１ｐ局在化を表す。（Ａ）Ｃ．アルビカンス野生型。（Ｂ）ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータント菌株。（Ｃ）野生型ＡＬＳ１で補足された１ａｌｓ１／ａｌｓ１。（Ｄ）ＰＡＤＨ１過剰発現ミュータント。
【図３Ａ】固体培地上でのＣ．アルビカンス線維化に対するＡｌｓ１ｐの媒介を示す。Ｃ．アルビカンス分芽胞子はＬｅｅの寒天プレートにスポットされて、３７℃にて４日間（Ａ）または３日間（Ｂ）インキュベートされた。
【図３Ｂ】固体培地上でのＣ．アルビカンス線維化に対するＡｌｓ１ｐの媒介を示す。Ｃ．アルビカンス分芽胞子はＬｅｅの寒天プレートにスポットされて、３７℃にて４日間（Ａ）または３日間（Ｂ）インキュベートされた。
【図４Ａ】ＡＬＳ１発現の対照およびＥＦＧ１線維化制御経路によるＣ．アルビカンス線維化の媒介を示す。（Ａ）（ｉ）異なる線維化制御経路が欠乏したミュータント、（ｉｉ）ＥＦＧ１またはＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１が補足されたｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントにおける、ＡＬＳ１の発現を示すノザンブロット分析。全ＲＮＡは、線維化を誘発するためにＲＰＭ１  １６４０＋グルタミン培地で３７℃にて９０分間培養した細胞から抽出した。ブロットはＡＬＳ１およびＴＥＦ１でプローブした。（Ｂ）Ｌｅｅの寒天プレートで３７℃にて４日間培養した、ｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントおよびＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１が補足されたｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントの顕微鏡写真。
【図４Ｂ】ＡＬＳ１発現の対照およびＥＦＧ１線維化制御経路によるＣ．アルビカンス線維化の媒介を示す。（Ａ）（ｉ）異なる線維化制御経路が欠乏したミュータント、（ｉｉ）ＥＦＧ１またはＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１が補足されたｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントにおける、ＡＬＳ１の発現を示すノザンブロット分析。全ＲＮＡは、線維化を誘発するためにＲＰＭ１  １６４０＋グルタミン培地で３７℃にて９０分間培養した細胞から抽出した。ブロットはＡＬＳ１およびＴＥＦ１でプローブした。（Ｂ）Ｌｅｅの寒天プレートで３７℃にて４日間培養した、ｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントおよびＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１が補足されたｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントの顕微鏡写真。
【図４Ｃ】ＡＬＳ１発現の対照およびＥＦＧ１線維化制御経路によるＣ．アルビカンス線維化の媒介を示す。（Ａ）（ｉ）異なる線維化制御経路が欠乏したミュータント、（ｉｉ）ＥＦＧ１またはＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１が補足されたｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントにおける、ＡＬＳ１の発現を示すノザンブロット分析。全ＲＮＡは、線維化を誘発するためにＲＰＭ１  １６４０＋グルタミン培地で３７℃にて９０分間培養した細胞から抽出した。ブロットはＡＬＳ１およびＴＥＦ１でプローブした。（Ｂ）Ｌｅｅの寒天プレートで３７℃にて４日間培養した、ｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントおよびＰＡＤＨ１−ＡＬＳ１が補足されたｅｆｇ１／ｅｆｇ１ミュータントの顕微鏡写真。
【図５Ａ】（Ａ）定常期分芽胞子を注射した（マウス当たりＰＢＳ  ０．５ｍｌ中１０６個）オスＢａｌｂ／Ｃマウス（各酵母菌株についてｎ＝３０）による、血行性播種性カンジダ症のマウスモデルにおける毒性の低下を示す。曲線は、３回の反復実験の集積結果である（各菌株についてｎ＝３０マウス）。３０℃にてＹＰＤで培養したすべての菌株の倍加時間は、１．２９〜１．５２時間の範囲であり、相互に統計的に差異がなかった。全染色体ＤＮＡのサザンブロット分析を使用して、感染生物から回収したＣ．アルビカンス菌株の遺伝子型の同一性を、マウスの感染に使用したＣ．アルビカンス菌株のそれと比較した。統計分析はＷｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によって得られ、Ｂｅｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いて複数の比較に対して補正した。ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータント対他の菌株それぞれについて＊Ｐ＜０．００２。（Ｂ）Ｃ．アルビカンス野生型、ホモ接合ａｌｓ１ヌルミュータント、またはヘテロ接合ＡＬＳ１補足ミュータントによって感染された腎臓の組織学的顕微鏡写真。腎臓サンプルは、感染の２８時間後（ａ）または４０時間後（ｂ）に回収して、パラホルムアルデヒド中で固定し、銀で染色した（倍率Ｘ４００）。矢印はＣ．アルビカンス細胞を示す。
【図５Ｂ】（Ａ）定常期分芽胞子を注射した（マウス当たりＰＢＳ  ０．５ｍｌ中１０６個）オスＢａｌｂ／Ｃマウス（各酵母菌株についてｎ＝３０）による、血行性播種性カンジダ症のマウスモデルにおける毒性の低下を示す。曲線は、３回の反復実験の集積結果である（各菌株についてｎ＝３０マウス）。３０℃にてＹＰＤで培養したすべての菌株の倍加時間は、１．２９〜１．５２時間の範囲であり、相互に統計的に差異がなかった。全染色体ＤＮＡのサザンブロット分析を使用して、感染生物から回収したＣ．アルビカンス菌株の遺伝子型の同一性を、マウスの感染に使用したＣ．アルビカンス菌株のそれと比較した。統計分析はＷｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によって得られ、Ｂｅｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いて複数の比較に対して補正した。ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータント対他の菌株それぞれについて＊Ｐ＜０．００２。（Ｂ）Ｃ．アルビカンス野生型、ホモ接合ａｌｓ１ヌルミュータント、またはヘテロ接合ＡＬＳ１補足ミュータントによって感染された腎臓の組織学的顕微鏡写真。腎臓サンプルは、感染の２８時間後（ａ）または４０時間後（ｂ）に回収して、パラホルムアルデヒド中で固定し、銀で染色した（倍率Ｘ４００）。矢印はＣ．アルビカンス細胞を示す。
【図５Ｃ】（Ａ）定常期分芽胞子を注射した（マウス当たりＰＢＳ  ０．５ｍｌ中１０６個）オスＢａｌｂ／Ｃマウス（各酵母菌株についてｎ＝３０）による、血行性播種性カンジダ症のマウスモデルにおける毒性の低下を示す。曲線は、３回の反復実験の集積結果である（各菌株についてｎ＝３０マウス）。３０℃にてＹＰＤで培養したすべての菌株の倍加時間は、１．２９〜１．５２時間の範囲であり、相互に統計的に差異がなかった。全染色体ＤＮＡのサザンブロット分析を使用して、感染生物から回収したＣ．アルビカンス菌株の遺伝子型の同一性を、マウスの感染に使用したＣ．アルビカンス菌株のそれと比較した。統計分析はＷｉｌｃｏｘｏｎ  ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によって得られ、Ｂｅｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いて複数の比較に対して補正した。ａｌｓ１／ａｌｓ１ミュータント対他の菌株それぞれについて＊Ｐ＜０．００２。（Ｂ）Ｃ．アルビカンス野生型、ホモ接合ａｌｓ１ヌルミュータント、またはヘテロ接合ＡＬＳ１補足ミュータントによって感染された腎臓の組織学的顕微鏡写真。腎臓サンプルは、感染の２８時間後（ａ）または４０時間後（ｂ）に回収して、パラホルムアルデヒド中で固定し、銀で染色した（倍率Ｘ４００）。矢印はＣ．アルビカンス細胞を示す。
【図６】抗Ａｌｓ１ｐポリ血清を輸液した動物について３０日の期間に亘る生存動物の関数としての、播種性カンジダ症に対する抗ＡＬＳ抗体の予防効果を示す。
【図７】付着表現型によって配列された選択ＡＬＳポリペプチドのＮ末端部のポリペプチド配列アラインメントである。上の３つの列は、内皮細胞を結合するＡＬＳ１  ３および５ポリペプチドからの配列（それぞれ配列番号：１〜３）である。下の３つは、内皮細胞を結合しないＡＬＳ６、７および９ポリペプチドからの配列（それぞれ配列番号：４〜６）である。最後の列は、ＡＬＳポリペプチドファミリーのコンセンサス配列（配列番号：７）を表す。
【図８】Ａｌｓタンパク質が、サッカロミセス・セレビシエにて異種発現されるときに、基質特異性付着特性を与えることを示す。各パネルは、Ｃ．アルビカンスが付着することが既知である各種の基質への、１つのＡｌｓｐ発現菌株の付着パーセントを示す（黒色棒）。空のベクターによって形質転換されたＳ．セレビシエの付着（白色棒）は、負の対照として各パネルに含まれている。Ｇｅｌ、ゼラチン；ＦＮ、フィブロネクチン；ＬＮ、ラミニン；ＦａＤＵ、ＦａＤＵ上皮細胞；ＥＣ、内皮細胞。一因子分散分析による空のプラスミド対象と比較したときに、＊、ｐ＜０．０１。結果は、３通り実施した少なくとも３回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図９】基質特異性付着がＡｌｓタンパク質のＮ末端ドメインの組成によって決定されることをドメイン交換が証明することを示す。試験されるＡＬＳ遺伝子または構築物の表示は、ＡＬＳ５（黒色）またはＡＬＳ６（白色）からの配列より成る棒として描かれている。各ミュータントの付着特性は、形質転換されたＳ．セレビシエのフィブロネクチンコートビーズへの付着を示す顕微鏡写真および６ウェルプレートアッセイで測定したようなゼラチン（黒色棒）および内皮細胞（灰色棒）を示すグラフとして表示される。結果は、それぞれ３通り実施した少なくとも３つの実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図１０】Ａｌｓタンパク質のサブセットがＳ．セレビシエ内で発現されるときに内皮細胞侵入を媒介することを示す。Ａ，Ａｌｓタンパク質を発現する、または空のプラスミドによって形質転換されたＳ．セレビシエ菌株の内皮細胞付着（対照）。データは、内皮発現結合生物の総数を表し、高倍率視野当たりの細胞として表される。Ｂ，高倍率視野当たりの細胞内生物の数として示される、Ｓ．セレビシエ菌株を発現するＡｌｓｐの内皮細胞侵入の程度。一因子分散分析による空のプラスミド対象と比較したときに、＊、ｐ＜０．０１。結果は、３通り実施した少なくとも３回の実験の平均±Ｓ．Ｄ．である。
【図１１】既知の機能のＡｌｓタンパク質のＮ末端アミノ酸配列のアラインメントがＣＲおよびＨＶＲの交互パターンを表すことを示す。Ａ，既知の機能のＡｌｓタンパク質のＮ末端領域中でのコンセンサス同一性のパーセンテージ。シグナルペプチド領域（アミノ酸１〜２０）が示されていないことに注意する。開いたボックスはＨＶＲ  １〜７と呼ばれる領域を示す。Ｂ，個々のＨＶＲの組成を示す、Ａｌｓタンパク質の概略アラインメント（それぞれ配列番号：１〜６）。配列は、複数の基質への親和性を備えたタンパク質を、同定された基質をほとんどまたは全く結合しないタンパク質と比較するために配置されている。各保存領域におけるアミノ酸の数はカッコ内に示す。
【図１２】Ａｌｓタンパク質Ｎ末端ドメインのＣＤおよびＦＴＩＲスペクトルを示す。Ａ，リン酸緩衝生理食塩水中１０μＭ  Ａｌｓ１ｐの円偏光二色性スペクトル。Ｂ，Ｄ２Ｏ蒸気によって水和されたＡｌｓ１ｐセルフフィルムのＦＴＩＲスペクトル。
【図１３】Ａｌｓタンパク質ファミリー間のＮ末端ドメインの予測された物理化学特性の比較を示す。疎水性、静電性、または水素結合特徴が、各ドメインの水接触可能表面に与えられる。疎水性は次のように示される：褐色、最も疎水性；青色、最も親水性。静電性（スペクトル連続体）は次のように示される：赤色、最も正電荷（＋１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）；青色、最も負電荷（−１０ｋｃａｌ／ｍｏｌ）。水素結合電位（Ｈ結合）は次のように示される：赤色、供与体；青色、受容体。Ａｌｓタンパク質は、これらの特性の複合に基づいて３つの群に識別される。たとえばＡｌｓ群Ａタンパク質、Ａｌｓ１ｐ、Ａｌｓ３ｐ、およびＡｌｓ５ｐでの同様の疎水性、静電性、および水素結合プロフィールに注意する。これに対して、Ａｌｓ群Ｂメンバー、Ａｌｓ６ｐおよびＡｌｓ７ｐは、Ａｌｓ群Ａとの疎水性および静電性特徴に著しい相違を示す。生化学プロフィールに加えて、３つのドメイン間の予測された構造の相違に注意する。
【図１４】Ａｌｓファミリータンパク質の構造−機能関係の概念モデル。Ａｌｓタンパク質は、３つの一般的な成分より成る：Ｎ末端ドメイン、タンデム反復、およびＣ．アルビカンス細胞壁と相互作用するグリコシルホスファチジルイノシトールアンカーを含有するセリン／トレオニンリッチＣ末端ドメイン。図示するように、Ａｌｓタンパク質は、免疫グロブリンスーパーファミリーを特徴とする拡張スパンが挿入される、複数の保存逆平行βシート領域（ＣＲ１−ｎ）を含有する。ＨＶＲを含有するループ／コイル構造がβシートドメインから突出している。特異性Ａｌｓタンパク質ＨＶＲの三次元物理化学特性はおそらく、カンジダに付着および侵入機能を与える宿主基質との相互作用を支配している。例示目的で、わずか３つのＮ末端βシート／コイルドメインおよびその各ＣＲ／ＨＶＲ成分を示す。この突出は図１３に示す構造画像に対して直角に見られていることに注意する。
【図１５】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎによる（退役繁殖）マウスの免疫化は、次の播種性カンジダ症の間の生存を改善する。Ａｌｓ１ｐプラスアジュバントによって免疫化されたマウスの生存。異なる日における２通りの実験にて群当たりマウス１６匹；Ａｄｊ．＝アジュバント。＊ｐ＜０．０５対アジュバント。
【図１６】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎによる免疫化は、退役繁殖および若年マウスの生存を改善する。Ｃ．アルビカンスの迅速に死に至る１０６個の接種で感染させた、退役繁殖（Ａ）および若年（Ｂ）マウスの生存。異なる日における２通りの実験にて群当たりマウス１６匹；Ａｄｊ．＝アジュバント。＊ｐ＜０．０５対アジュバント対照。
【図１７】抗ｒＡｌｓｐ−Ｎ力価は生存に関連しない。アジュバントを用いて、または用いずに抗ｒＡｌｓｐ−Ｎの可変用量で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスにおいて産生された抗ｒＡｌｓｐ−Ｎポリクローナル抗体の力価。Ａｄｊ．＝アジュバント。２００μｇ対その他すべてについて、＊ｐ＜０．００５。
【図１８】ｒＡｌｓｐ−Ｎの保護用量のみが、Ｃ．アルビカンス刺激Ｔｈ１脾細胞の増加を誘発する。ｒＡｌｓｐ−Ｎワクチンの異なる用量による、Ｔｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ±ＩＬ−４−）およびＴｈ２（ＣＤ４＋ＩＮＦ−γ−ＩＬ−４＋）脾細胞の誘発。免疫化マウス（群当たりｎ＝９）からの脾細胞を、加熱死滅させた予備発芽Ｃ．アルビカンスによって４８時間刺激して、３色フローサイトメトリーによって分析した。＊ｐ＝０．０３対アジュバント。
【図１９】ｒＡｌｓｐ−Ｎの保護用量のみが、ｒＡｌｓｐ−Ｎ刺激Ｔｈ１遅延型過敏症の上昇を誘発する。ｒＡｌｓｐ−ＮまたはＣＦＡ単独でワクチン接種したマウス（群当たりｎ＝９〜１２）の、足蹠浮腫によって評価される遅延型過敏症。マウスを表示量のｒＡｌｓｐ−Ｎによって免疫化して、次にｒＡｌｓｐ−Ｎ  ５０μｇを足蹠内へ注射した。足蹠浮腫を２４時間後に評価した。＊ｐ＜０．０５対アジュバント、０．２μｇ、および２００μｇ。
【図２０】ｒＡｌｓｐ−Ｎワクチンは、防御免疫を誘発するためにＢ細胞ではなく、Ｔ細胞を必要とする。Ｂ細胞欠損、Ｔ細胞欠損（ヌード）、および類遺伝子性野生型Ｂａｌｂ／ｃ対照マウス（群当たりｎ＝７または８）を、ｒＡｌｓｐ−Ｎ＋アジュバントまたはアジュバント単独でのワクチン化後に同時に評価された。＊ｐ＜０．０４対アジュバント単独、¶Ｐ＝０．００３対野生型アジュバント処置。
【図２１】ｒＡｌｓｐ−Ｎを用いたＳＱワクチン接種は、免疫適格マウスにてＤＴＨ応答を誘発する。足蹠浮腫は、ＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たりｎ＝１０）の足蹠へのｒＡｌｓｐ−Ｎ  ５０μｇの注射２４時間後に評価した。中央値を黒色棒として示す。Ｗｉｌｃｏｘｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定により＊ｐ＝０．００２対対照。
【図２２】ｒＡｌｓｐ−Ｎワクチンは、血行性播種性カンジダ症の免疫適格マウスの生存を改善して、組織の真菌負荷を低下させる。Ａ）次に尾静脈を介してＣ．アルビカンスに感染される、ワクチン接種またはＢＡＬＢ／ｃマウス（２．５または５ｘ１０５個接種で群当たりそれぞれｎ＝７または１０）マウス。各実験は感染３０日後に終了させ、すべての残存マウスは良好に見えた。Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定により＊ｐ＜０．０５対対照。Ｂ）Ｃ．アルビカンスの５ｘ１０５個の分芽胞子によって尾静脈を介して感染させたＢＡＬＢ／ｃマウス（群当たりｎ＝７）における腎臓真菌負荷。ｙ軸はアッセイの検出下限を反映する。中央値は黒色棒として示す。Ｗｉｌｘｏｃｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定により＊ｐ＝０．０１対対照
【図２３】ｒＡｌｓｐ−Ｎワクチンは、好中球減少マウスでＤＴＨ反応を誘発して、次の血行性播種性カンジダ症の間のその生存を改善する。Ａ）足蹠浮腫は、ＢＡＬＢ／ｃマウスの足蹠へのｒＡｌｓｐ−Ｎ  ５０μｇの注射２４時間後に評価した（対照ではｎ＝１０、ｒＡｌｓｐ−Ｎではｎ＝７）。Ｗｉｌｘｏｃｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定により＊ｐ＝０．００６対対照。Ｂ）Ｃ．アルビカンスの２．５ｘ１０４個の分芽胞子によって感染させた好中球減少マウスの生存（２回の実験から群当たりｎ＝１６）。Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定により＊ｐ＝０．００７対アジュバント対照
【図２４】ｒＡｌｓｐ−Ｎワクチンは、口腔咽頭カンジダ症マウスの舌の組織学的真菌病変の重症度を減弱する。群当たりＮ＝４マウス。盲検観察者によって本文に記載するように生成された炎症スコア。Ｗｉｌｘｏｃｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定により＊ｐ＝０．０３。
【図２５】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンではなく、ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎが、Ｃ．アルビカンスを接種したマウスの膣の真菌コロニー形成を減弱する（Ｗｉｌｘｏｃｏｎ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定により、＊ｐ＝０．０１対ＣＦＡのみワクチン接種されたマウス）群当たりＮ＝１１マウス。
【図２６】Ｓ．アウレウスのクランピング因子Ａ（ｃｌｎ６７Ａ）に対するＡｌｓ１ｐ相同性マップを示す。Ｃ．アルビカンスおよびＳ．アウレウスＣ１ｆＡからのコンセンサス機能性部位は、Ａｌｓ１ｐ相同性モデルにマップされた。Ａｌｓ１ｐおよびＣ１ｆＡのＮ末端からの多数の残基はコンセンサス間隙モチーフにマップして、それはそこで両方のアドヘシンに関して起こることが予測される基質への結合である。
【図２７】ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンが、スタフィロコッカス症マウスの生存を改善する。（＊ｐ＜０．００３対ＣＦＡのみでワクチン接種されたマウス、Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ検定による）。群当たりＮ＝２２マウス。
【図２８】抗体力価は個々のワクチン接種マウスでの防御度に相関しないが、それらはワクチン接種マウスからワクチン未接種マウスを区別する。ＣＦＡのみ、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ  ２０μｇそれぞれによって免疫価されたＢａｌｂ／ｃマウスにて産生された、抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎまたは抗ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎポリクローナル抗体の力価。全体として抗体力価と生存との間に著しい相関があり（ｒｈｏ＝０．４７４、ｐ＝０．００５７）、抗体力価がワクチン防御の代用マーカーとして使用されうることを示している。しかしながらＣＦＡのみが投与されたマウスによるデータが除外されるとき、抗体力価とｒＡｌｓ１ｐ−ＮまたはｒＡｌｓ３ｐ−Ｎをワクチン接種されたマウスの生存との間には相関がなく（ｒｈｏ  ０．０４１１４３、ｐ＝０．８４７）、抗体がワクチンの防御の支配的な機構らしくないことを示す。
【図２９】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが血行性播種性カンジダ症から非近交系ＣＤ１マウスを防御することを示す。Ａ）ＣＤ１マウス（群当たりｎ＝８）は、ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（２０μｇ）＋ＣＦＡ、またはＣＦＡのみと共にＳＱをワクチン接種され、ブーストの１４日後にＣ．アルビカンスＳＣ５３１４によって尾静脈を介して感染させた。Ｂ）ＣＤ１マウス（群当たりｎ＝８）は、各種の用量のアルムを含むｒＡｌｓ１ｐ−Ｎと共に、またはアルムのみと共にＳＱをワクチン接種され、ブーストの１４日後にＣ．アルビカンスＳＣ５３１４によって尾静脈を介して感染させた。Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定により＊ｐ＜０．０５対アジュバント対照。
【図３０】ｒＡｌｓ１ｐ−ＮワクチンがＣ．アルビカンスの複数の菌株の１つに感染したＢａｌｂ／ｃマウスの生存を改善することを示す。ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびＣＦＡ対ＣＦＡのみによって免疫化され、Ｃ．アルビカンス１５５６３（７ｘ１０５個の分芽細胞）、１６２４０（４ｘ１０５個の分芽細胞）、または３６０８２（４ｘ１０５個の分芽細胞）によって尾静脈を介して感染されたＢａｌｂ／ｃマウスの生存（群当たりｎ＝８マウス）。Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ  Ｓｕｍ検定により＊ｐ＜０．０５対アジュバント対照。
【図３１】ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎワクチンが、カンジダの複数の非アルビカンス種に感染したＢａｌｂ／ｃマウスにおける組織真菌負荷を低下させることを示す。Ｂａｌｂ／ｃマウス（群当たりｎ＝５）はＣＦＡまたはＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ（２０μｇ）をワクチン接種され、Ｃ．グラブラータ、Ｃ．クルセイ、Ｃ．パラプシローシス、またはＣ．トロピカリスによって尾静脈を介して感染された。感染性接種を種名の下のカッコ内に示す。腎臓真菌負荷を接種５日後に決定した。ｙ軸はアッセイの検出下限を反映する。複数の比較での非パラメトリックＳｔｅｅｌ検定により＊ｐ＜０．０５対アジュバント対照。
【図３２】ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ免疫化マウスがｒＡｌｓ１ｐ−Ｎに対して交差反応する抗体を産生したことを示す。ＣＦＡのみ、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ、またはＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎで免疫化された個々のマウスの力価。ＣＦＡおよびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでは、群当たりＮ＝７マウス；ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでは、ｎ＝６マウス。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定により、＊ｐ＜０．０５対ＣＦＡのみ；＊＊ｐ＜０．００２対ＣＦＡのみ＆ｐ＜０．０１１対ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ。棒は中央値を示す。
【図３３】ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎの両方が、生体内遅延型過敏症応答に関してマウスを初回刺激したことを示す。マウス（ＣＦＡおよびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでは、群当たりＮ＝７マウス；ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでは、ｎ＝６）は、ＣＦＡのみ、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ、またはＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでそれぞれワクチン接種された。生体内での遅延型過敏症は足蹠浮腫によって測定した。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定により、＊ｐ＜０．０５対ＣＦＡのみ。棒は中央値を示す。
【図３４】ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンがマウス血行性播種性カンジダ症に対して同様の有効性を媒介したことを示す。Ｃ．アルビカンスの５ｘ１０５個の分芽胞子によって尾静脈を介して感染されたＢａｌｂ／ｃマウスの生存（ＣＦＡおよびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでは２回の実験から群当たりｎ＝１５、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎでは２回の実験からｎ＝１４）。実験は感染２８日後に終了させ、残存するすべてのマウスは良好に見えた。Ｌｏｇ  Ｒａｎｋ検定により＊ｐ＜０．０００１対ＣＦＡ対照。
【図３５】生体内遅延型過敏症が播種性カンジダ症の間に生存と相関していたことを示す。抗ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎまたは抗ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎ抗体力価および足蹠浮腫反応を、Ｃ．アルビカンスによる尾静脈を介した感染の２日前に測定した（ＣＦＡおよびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでは群当たりｎ＝７、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎではｎ＝６）。Ｓｐｅａｒｍａｎ  Ｒａｎｋ  ｓｕｍ検定によって決定された相関。
【図３６】ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチンがマウス口腔咽頭カンジダ症の間の組織真菌負荷を著しく低下させたことを示す。口腔咽頭カンジダ症のマウスにおける舌真菌負荷（ＣＦＡではｎ＝７、ｒＡｌｓ１ｐ−ＮおよびｒＡｌｓ３ｐ−Ｎワクチン接種群では８）。ｙ軸はアッセイの検出下限を反映する。Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ検定により、＊ｐ＝０．００５対ＣＦＡ。
【図３７】マウスカンジダ膣炎でｒＡｌｓ３ｐ−ＮがＣＦＡのみおよびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎの両方と比較して膣真菌負荷を低下させたことを示す。ＣＦＡ、ＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ、またはＣＦＡ＋ｒＡｌｓ３ｐ−Ｎでワクチン接種されたマウスにおける膣真菌負荷（２回の実験から群当たりｎ＝１１）。ｙ軸はアッセイの検出下限を反映する。複数の比較についてのＳｔｅｅｌ検定によって、＊ｐ＜０．０２対ＣＦＡおよびＣＦＡ＋ｒＡｌｓ１ｐ−Ｎ。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
2008540453.tif 000016
【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
2008540453.tif 000021
【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008540453.tif 000057