(57)【要約】本発明は一般に、インテグリン介在性細胞活性を調節する方法およびそのために有用な作用物質に関する。より具体的には、本発明は、GPIに関連したシグナル伝達を調節することによってインテグリン介在性細胞活性を調節する方法を企図する。本発明の方法は、とりわけて、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なインテグリン介在性細胞活性を特徴とする状態の治療および/または予防において有用である。本発明はさらに、対象のインテグリン依存性シグナル伝達メカニズムを調節することができる作用物質を同定および/または設計するための方法も対象としている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、インテグリン介在性細胞活性を制御するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法。
【請求項２】
GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、異常なインテグリン介在性細胞活性を特徴とする状態の治療および/または予防のための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法。
【請求項３】
インテグリンがαβインテグリンである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
αβインテグリンが白血球に特異的な受容体である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
インテグリン受容体が以下のうちの1種である、請求項4記載の方法：
(i)αLβ2；
(ii)αMβ2；
(iii)αxβ2；
(iv)αDβ2；または
(v)αEβ7。
【請求項６】
αβインテグリン受容体がコラーゲン受容体である、請求項3記載の方法。
【請求項７】
インテグリン受容体が以下のうちの1種である、請求項6記載の方法：
(i)α1β1；
(ii)α2β1；
(iii)α10β1；または
(iv)α11β2。
【請求項８】
αβインテグリン受容体がラミニン受容体である、請求項3記載の方法。
【請求項９】
ラミニン受容体が以下のうちの1種である、請求項8記載の方法：
(i)α3β1；
(ii)α6β2；
(iii)α6β4；または
(iv)α7β2。
【請求項１０】
αβインテグリン受容体がRGD受容体である、請求項3記載の方法。
【請求項１１】
RGD受容体が以下のうちの1種である、請求項10記載の方法：
(i)α5β1；
αVβ1；
α8β1；
αVβ3；
αVβ5；
αVβ6；
αVβ8；
αIIbβ3.
αVβ3；
αVβ3。
【請求項１２】
αβインテグリン受容体が以下のうちの1種である、請求項3記載の方法：
(i)α4β2；
α4β7；
α9β7。
【請求項１３】
GPIが完全なGPIである、請求項3記載の方法。
【請求項１４】
完全なGPIが以下のうちの1種である、請求項13記載の方法：
i)Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシル-グリセロール
ii)Manα1(Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシル-グリセロール
iii)エタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシル-グリセロール
iv)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシル-グリセロール
v)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1-6Manα1(EtN-リン酸)-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
vi)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸)-6Manα1(EtN-リン酸)-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
vii)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
viii)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸,GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
ix)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸,Galβ-GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
x)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸,シアル酸-Galβ-GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xi)エタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1(EtN-リン酸)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xii)エタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1(EtN-リン酸,GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xiii)エタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1(EtN-リン酸,Galβ-GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xiv)エタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1(EtN-リン酸,シアル酸-Galβ-GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xv)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸)-6Manα1(EtN-リン酸)-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xvi)末端のエタノールアミンリン酸が存在しない上記の1〜15番
xvii)イノシトールの2位にアシル鎖も含む上記の1〜16番
xviii)ジアシルグリセロールが完全に飽和した脂肪酸を含む上記の1〜17番
xix)ジアシルグリセロールがsn1位およびsn2位のいずれかまたは双方に不飽和脂肪酸を含む、上記の1〜18番
xx)ジアシルグリセロールの代わりに、限定されるわけではないが、アルキルアシルグリセロール、モノアルキルグリセロール、セラミドなどを含む任意の脂質またはリン脂質が存在する、上記の1〜19番
xxi)マンノース残基が、他の任意の6炭糖、アミノ糖、アミノ酸、リン酸、ホスホン酸、硫酸、スルヒドリルなどでさらに置換されている、上記の1〜20番
xxii)Man-3残基、すなわち保存されているグリカンコア中のイノシトールから最も離れたマンノース残基が、最大6アミノ酸長の任意の配列のペプチドにさらに連結されている、上記の1〜21番であって、ここでα結合は、必要な限りどの場所でもβ結合で置換され得(逆もまた同じ)、数値は、必要に応じて他の任意の結合位置で置き換えられ得る結合位置を表し、すべての場合において、脂質は、任意の所望の鎖長および飽和度のものでよく、不飽和結合は、脂質鎖上の任意の所望の位置にあってよい。
【請求項１５】
GPIがGPIイノシトールグリカンドメインである、請求項記載の方法。
【請求項１６】
GPIイノシトールグリカンドメインが以下のうちの1種である、請求項23記載の方法：
(i)エタノールアミン-リン酸-(Manα1,2)-Manα1,2Manα1,6Manα1,4GlcN-myo-イノシトールホスホグリセロール；
(ii)X1-X2-X3-X4-エタノールアミン-リン酸-(Manα1,2)-Manα1,2Manα1,6Manα1,4GlcN-myo-イノシトールホスホグリセロール(X1、X2、X3、およびX4は、任意の4つのアミノ酸である)；
2008501725.tif 000008
であって、式中、EtNはエタノールアミンであり、Pはリン酸であり、Mはマンノースであり、GはN-アセチル化されていないグルコサミンであり、[G]は任意のN-アセチル化されていないヘキソサミンであり、Inoはイノシトールまたはイノシトール-ホスホグリセロールであり、[X]は他の任意の置換基であり、αは、必要な限りどの場所でもβ結合で置換され得るα結合を表し、かつ数値は、必要に応じて他の任意の結合位置で置き換えられ得る結合位置を表す。
【請求項１７】
Xが糖である、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
GPIが、以下の構造を示す誘導体である、請求項3記載の方法：
EtN-P-(Manα1,2)-6Mα1,2Mα1,6Manα1,4GlcNH2α1-myo-イノシトール-1,2環状リン酸(EtNはエタノールアミンであり、Pはリン酸であり、かつMはマンノースである)。
【請求項１９】
GPIが、以下の構造を示す誘導体である、請求項3記載の方法：
NH2-CH2-CH2-PO4-(Manα1-2)6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcNH2-6myo-イノシトール-1,2環状リン酸。
【請求項２０】
インテグリン介在性細胞活性が、サイトカイン、ホルモン、または増殖因子のシグナル伝達である、請求項3記載の方法。
【請求項２１】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子がインスリンである、請求項20記載の方法。
【請求項２２】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子がインスリン様成長因子1である、請求項21記載の方法。 
【請求項２３】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子が神経成長因子である、請求項21記載の方法。
【請求項２４】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子が上皮成長因子である、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子が脳由来神経栄養因子である、請求項21記載の方法。
【請求項２６】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子がニューロトロフィン3である、請求項21記載の方法。
【請求項２７】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子が甲状腺刺激ホルモンである、請求項21記載の方法。
【請求項２８】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子が肝増殖因子である、請求項21記載の方法。
【請求項２９】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子が線維芽細胞増殖因子である、請求項21記載の方法。
【請求項３０】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子が形質転換増殖因子βである、請求項21記載の方法。
【請求項３１】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子が卵胞刺激ホルモンである、請求項21記載の方法。
【請求項３２】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子がヒト絨毛性ゴナドトロピンである、請求項21記載の方法。
【請求項３３】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子が甲状腺刺激ホルモンである、請求項21記載の方法。
【請求項３４】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子が副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)である、請求項21記載の方法。
【請求項３５】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子がエリスロポエチンである、請求項21記載の方法。
【請求項３６】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子がトロンボポエチンである、請求項21記載の方法。
【請求項３７】
サイトカイン、ホルモン、または増殖因子がインターロイキン2である、請求項21記載の方法。
【請求項３８】
インテグリン介在性細胞活性の制御が増強作用である、請求項4〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
GPI分子とインテグリンの相互作用を誘導することによって増強作用が実現される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
ジアシルグリセロールを含む完全に脂質付加されたGPIとインテグリンの相互作用を誘導することによって増強作用が実現される、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
調節が、GPIとインテグリンの相互作用の上方制御である、請求項4〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
相互作用を作動させるタンパク質性または非タンパク質性分子に細胞を接触させることによって上方制御が実現される、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
GPIまたはその誘導体に細胞を接触させることによって上方制御が実現される、請求項41記載の方法。
【請求項４４】
GPIまたはその誘導体が請求項13〜19のいずれか一項記載のGPI分子である、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
インテグリンの細胞表面発現を上方制御することによって上方制御が実現される、請求項41記載の方法。
【請求項４６】
インテグリンをコードする遺伝子の転写および/または翻訳を上方制御することによって、インテグリンの細胞表面発現の上方制御が実現される、請求項45記載の方法。
【請求項４７】
インテグリンをコードする核酸分子を細胞に導入することによって、インテグリンの細胞表面発現の上方制御が実現される、請求項45記載の方法。
【請求項４８】
調節が、GPIとインテグリンの相互作用の下方制御である、請求項4〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
相互作用を拮抗するタンパク質性または非タンパク質性分子に細胞を接触させることによって下方制御が実現される、請求項40記載の方法。
【請求項５０】
アンタゴニストが、GPIおよび/またはインテグリンを対象とする抗体である、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
アンタゴニストが、可溶性インテグリン分子である、請求項49記載の方法。
【請求項５２】
インテグリンDNAの転写および/または翻訳を下方制御する核酸分子を細胞に導入することによって、下方制御が実現される、請求項48記載の方法。 
【請求項５３】
分子がRNAiまたはアンチセンスDNAである、請求項52記載の方法。
【請求項５４】
NGF活性が増強され、インテグリンが神経細胞インテグリンであり、以下の構造である、請求項23記載の方法。
2008501725.tif 000009
【請求項５５】
細胞活性がマクロファージ活性化であり、該活性化が上方制御され、かつGPIがエタノールアミン-リン酸-5Manα1-2Manα1-6Manα1-GlcN1-6-イノシトールである、請求項3記載の方法。
【請求項５６】
方法がインビトロで実施される、請求項1〜55のいずれか一項記載の方法。
【請求項５７】
方法がインビボで実施される、請求項1〜55のいずれか一項記載の方法。
【請求項５８】
状態がII型糖尿病であり、インテグリン分子がインスリン受容体と同じ細胞上で発現され、かつGPIと該インテグリンの相互作用が増強される、請求項2記載の方法。
【請求項５９】
GPIが完全である、請求項58記載の方法。
【請求項６０】
状態がプリオンに関連した神経変性状態であり、GPIがプリオンGPIであり、かつGPIとインテグリンの相互作用が拮抗される、請求項2記載の方法。
【請求項６１】
本明細書において後に定義する調節物質を1種または複数種の薬学的に許容される担体および/または希釈剤と共に含む薬学的組成物。
【請求項６２】
GPIおよび/またはインテグリンまたはその機能的等価物もしくは誘導体を含む試験系を推定上の作用物質に接触させる段階、ならびに調節された機能的相互作用に関してスクリーニングする段階を含む、GPIとインテグリンまたはその機能的等価物もしくはその誘導体との相互作用を調節することができる作用物質を検出するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、インテグリン介在性細胞活性を調節する方法およびそのために有用な作用物質に関する。より具体的には、本発明は、GPIに関連したシグナル伝達を調節することによってαβインテグリン介在性細胞活性を調節する方法を企図する。本発明の方法は、とりわけて、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なインテグリン介在性細胞活性を特徴とする状態の治療および/または予防において有用である。本発明はさらに、対象のインテグリン依存性シグナル伝達メカニズムを調節することができる作用物質を同定および/または設計するための方法も対象としている。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書において著者によって参照される刊行物の文献詳細は、本明細書の最後にアルファベット順に集められる。
【０００３】
本明細書における任意の先行技術の参照は、その先行技術がオーストラリアにおいて共通の一般的知識の一部分を形成することの承認でも、いかなる形態の示唆でもなく、かつ、そのようにみなされるべきではない。
【０００４】
グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)は、すべての真核生物に共通な糖脂質のクラスである(McConville MJ, et al.,(1993) Biochem. J., 294, 305)。これらは、ホスファチジルイノシトール(PI)に構造的に関連しており、進化的に保存されているグリカンコア配列Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcNにグリコシド結合によって連結されたPIから構成されている。この4糖のグリカンコアは、種および組織に特異的な方式で、糖、リン酸、およびエタノールアミン基でさらに置換され得る。GPI脂肪酸部分は、ジアシルグリセロール、アルキルアシルグリセロール、モノアルキルグリセロール、またはセラミドのいずれかであり得、イノシトール環に付加的な脂質修飾を有する。全体像は、特定のコアの特徴を共有しているが脂肪酸組成および保存されているグリカンコアに対する側鎖の修飾において高レベルの変異を有する、密接に関連した糖脂質ファミリーに関する。
【０００５】
GPIは、多くの様々なタンパク質種のC末端に連結されて、または細胞膜の外層中に「遊離」して存在することができる。遊離GPIの機能は、依然として不明である。GPI機能に関する最も有力な見解は、このクラスの分子が、タンパク質に対する新規な形態の膜アンカーとして役立つというものである(Ferguson MAJ(1992) Biochem Soc Trans. 20, 243)。しかしながら、1980年代後半および1990年代前半から半ばのいくつかの研究は、ホルモン作用の受容体後メディエーターとしてGPI由来イノシトールホスホグリカン(IPG)を意味づける間接的なものから状況的なものに至る証拠を提供するように思われた(Saltiel AR, et al.,(1983) Science 233,967, Saltiel AR, et al.,(1987) Biochem. Biophys. Res. Commun., 149, 1084, Saltiel AR,(1991) J. Bioenerg. Biomemb., 23, 29, Chan BL, et al.,(1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 1756, Repressa J, et al.,(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88,8016, Vivien D, et al.,(1993) J. Cell. Physiol., 155, 437, Eardley DD, et al.,(1991) Science, 251,78, Merida I, et al,(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 9421, Martiny L, et al.,(1990) Cell. Signal, 2, 21, Fanjul LF, et al.,(1993) J. Cell. Physiol., 155, 273, Devemy E, et al.,(1994) Cell. Signal., 6, 523)。この見解によれば、それらの同族受容体へのホルモンの結合は、細胞表面のGPIを加水分解してIPGを遊離させる1種または複数種の定義されていないホスホリパーゼの活性化をもたらし得る。IPGは、受容体後のインスリンシグナル伝達のいくつかの局面を媒介する細胞外「セカンドメッセンジャー」として作用することが提唱されている。この見解は、過去および現在もなお、多くの権威者によって異説とみなされており、かつ研究者の大半にも受け入れられていない。ホルモン/サイトカイン感受性の哺乳動物GPIの構造はまだ1つも発表されていない；実際、これらの推定上のセカンドメッセンジャーがGPI由来のIPGであるという提唱それ自体が依然として推論的である。これらの研究の大部分は10年前から始まり、現在の調査はこの見解を支持しない。したがって、シグナル伝達物質としてのGPIの役割およびそれらの考え得る作用メカニズムの双方、およびさらに言えばこのクラスの分子の全般的な重要性に関して、科学界では相当な疑いおよびさらに言えば懐疑論が残っている。
【０００６】
GPIアンカー機能に関する最も有力な見解は、それらがタンパク質に対する新規な形態の膜アンカーとして役立ち(Ferguson MAJ(1992) Biochem Soc Trans. 20, 243)、かつラフト会合のための選別シグナルとして機能するというものである。GPIアンカー型タンパク質は、細胞表面の極めて特殊なマイクロドメイン(「ラフト」、「カベオラ複合体」、「界面活性剤抵抗性膜(DRM)」、「糖脂質豊富膜(GEM)」、「界面活性剤不溶性の糖脂質豊富ドメイン(DIG)」などとして公知)内に局在している。これらの構造体は、スフィンゴ脂質に富む珍しい脂質組成物ならびにカベオリンおよびβ-インテグリンなどのタンパク質を有し(Mayor S, et al.,(1994) Science, 264, 1948, Lisanti MP, et al.(1995) Mol. Mem. Biol., 12, 121, Bohulslav J, et al.,(1995) J. Exp. Med., 181, 1381) 、かつ専用のシグナル伝達複合体に相当すると考えられているシグナル伝達分子の受け入れ先(host)を有する。それでもなお、いくつかのGPIアンカー型タンパク質は細胞内部に重要なシグナル伝達能力を有する。すなわち、これらが乱された場合、一定の生物学的応答が生じる。これは2つの考え得るメカニズム(相互に排他的ではない)の1つまたは双方を介して生じるというのが共通見解である：
(i)GPIアンカー型タンパク質は、そのタンパク質ドメインを介して、ラフト内部の1種もしくは複数種の確かな「シグナル伝達パートナー」と結合し得る。すなわち、GPIアンカー型タンパク質の生理学的に適切な混乱は、1種もしくは複数種の別のタンパク質分子(GPIアンカー型「イニシエーター」のタンパク質成分に対する特異性を有するが、シグナル伝達を開始することができる膜貫通ドメインをそれ自体が有する)との結合を引き起こす。図1にこれを概略的に示す；または、
(ii)GPIアンカー型タンパク質は、ごく少数の分子しか含まない極めて小型のラフト構造体中にあるが、架橋された場合もしくは生理学的に乱された場合、これらの小型ラフトが合体してはるかに大型のラフトを形成し、これにより、次いで細胞内領域におけるシグナル伝達分子の結合が可能になるというもの。
【０００７】
これらの双方のモデルにおいて、GPIの役割は、直接的なシグナル伝達にも、糖脂質それ自体による他のシグナル伝達パートナーとの相互作用にも全く関係していない：GPIは単に適切なタンパク質をラフトに配置するのに役立つだけであり、シグナル伝達は他のプロセスによって実施される。
【０００８】
それでもなお、長年の間に、原生動物に由来するGPIが、外来性アゴニストとして哺乳動物細胞に直接添加された場合にシグナル伝達プロセスを開始できることが示された。例には、マクロファージおよび血管内皮細胞における多数の炎症誘発性遺伝子座の遺伝子発現の制御が含まれる(Almeida, I. C. and Gazzinelli, R. T.,(2001) J. Leukocyte Biol. 70,467)。
【０００９】
原生動物由来のGPIが受容体と相互作用してシグナルを伝達し得る方法に関しては2つの競合する見解がある。現在疑問を持たれておらず、かつ広く支持されている見解は、標的の哺乳動物細胞における原生動物GPIの生物活性は、単にToll様受容体(TLR)ファミリーのメンバーによるそれらの検出の結果として生じるというものである。先天性免疫系は、微生物の「病原体関連分子パターン」を認識する特異的受容体の使用によって、侵入してくる病原体の存在を感知することができ(Schofield、前掲)、かつ、これらの受容体の活性化が宿主の応答を開始させる。これらの応答は、先天性免疫に関与しているシグナル伝達分子を動員および活性化するToll様受容体(TLR)として公知である宿主膜タンパク質の古来のファミリーによって媒介されることが示されている(Schofield、前掲)。ヒトゲノムは、少なくとも10種のTLRファミリーメンバーをコードしており(Schofield、前掲)。これらは、様々な病原体に由来する脂質、タンパク質、および核酸生成物を認識する(Tachado  前掲)。今日まで、標的の宿主細胞に添加された外来性の原生動物GPIによって媒介されるシグナル伝達に関して唯一報告されている説明は、TLR-2によるGPI認識を実証する研究(Campos, M.A. et al.,(2002) J Immunol 167： 416)から得られ、このToll様受容体は(TLR-4による同様の活性と共に)微生物糖脂質の認識に従事することが最も明瞭である。したがって、TLRはGPIの生物活性の媒介を担っていると現在一般に考えられている。
【００１０】
指示された方式で細胞の機能活性を調節することが、依然として多くの疾患状態を予防的および/または治療的に処置するための極めて需要の多い手段であるということに鑑みて、細胞の機能活性が制御されるメカニズムとそれらのメカニズムを調節することができる手段の双方を十分に解明することの必要性は大きい。
【００１１】
本発明につながる研究において、驚くべきことに、現在の定説とは異なり、GPIが実はインテグリン介在性細胞活性においてシグナル伝達物質として非常に重要な役割を果たしていることが確認された。さらに、GPIがこの結果を実現するメカニズムは、このようなメカニズムが存在し得ることを仮定していた少数のグループによって提唱されていたシグナル伝達メカニズムモデルに関連していない。具体的には、完全なGPI(すなわちグリカン成分および脂肪アミノ成分を含むもの)のシグナル伝達メカニズムが2シグナルのメカニズムであることが確認された。この「2シグナル」モデル(付加的なシグナルを除外しない)において、GPIグリカンは、グリカンに特異的な受容体として機能するインテグリンに結合する(図13)。これらは、初めから「ラフト」内に位置していてもよく、またはGPIグリカンへの結合後にこれらの構造体に移行してもよい。グリカンの結合は、srcキナーゼおよびMAPキナーゼカスケードのメンバーを伴うシグナル伝達プロセスを開始させる。結合後、脂質付加されたGPIはまた、ホスホリパーゼによって加水分解されて、単独およびインテグリン介在性シグナルとの相乗作用の双方で作用して下流の代謝および遺伝子発現のエンドポイントを促進する脂質性セカンドメッセンジャーを生成し得る(図13)。
【００１２】
この細胞シグナル伝達メカニズムの解明は次に、GPIとインテグリンの相互作用またはそれから生じるシグナル伝達に関連した事象のいずれかを制御することによってインテグリン介在性細胞活性を調節することを対象とする方法論の発展を促進した。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲全体を通して、文脈において特に指示がない限り、「含む(comprise)」という単語、ならびに「comprises」および「comprising」などの変形は、記載した整数もしくは段階、または整数もしくは段階のグループを包含するが、他の整数および段階、ならびに整数および段階のグループのどれも除外しないことを意味するものと理解される。
【００１４】
本発明の一つの局面は、GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、インテグリン介在性細胞活性を制御するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させる(agonising)ことにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法を対象としている。
【００１５】
GPIとαβインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、αβインテグリン介在性細胞活性を制御するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法も提供される。
【００１６】
GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含み、インテグリンがサイトカインに対する受容体と同じ細胞上で発現される、サイトカインシグナル伝達を増強するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該サイトカインシグナル伝達が増強される方法が提供される。
【００１７】
GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含み、インテグリンがインスリンに対する受容体と同じ細胞上で発現される、インスリンシグナル伝達を増強するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該インスリンシグナル伝達が増強される方法が提供される。
【００１８】
本発明は、より好ましくは、完全なGPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、αβインテグリン介在性細胞活性を制御するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法を提供する。
【００１９】
他の好ましい態様において、GPIのイノシトールグリカンドメインとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、αβインテグリン介在性細胞活性を制御するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法が提供される。
【００２０】
本発明の他の局面は、GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、異常なインテグリン介在性細胞活性を特徴とする状態の治療および/または予防のための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法を対象としている。
【００２１】
より具体的には、本発明は、GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、異常なαβインテグリン介在性細胞活性を特徴とする状態の治療および/または予防のための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法を対象としている。
【００２２】
一つの好ましい態様において、本発明は、GPIとαβインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含み、インテグリンがインスリン受容体と同じ細胞上で発現される、II型糖尿病の治療および/または予防のための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることによりインスリンシグナル伝達が増強される方法を対象としている。
【００２３】
他の好ましい態様において、本発明は、プリオンGPIとαβインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、プリオンに関連した神経変性状態を治療的および/または予防的に処置するための方法であって、該相互作用の拮抗により、天然タンパク質を異常型に転換するプリオンに関連した触媒作用が下方制御される方法を対象としている。
【００２４】
さらに別の局面において、本発明は、本明細書において先に定義した調節物質を1種または複数種の薬学的に許容される担体および/または希釈剤と共に含む薬学的組成物を企図する。本発明のさらに別の局面は、本発明の方法において使用される場合の、本明細書において先に定義した作用物質に関する。
【００２５】
本発明のさらに別の局面は、GPIおよび/またはインテグリンまたはその機能的等価物もしくは誘導体を含む試験系を推定上の作用物質に接触させる段階、ならびに調節された機能的相互作用に関してスクリーニングする段階を含む、GPIとインテグリンまたはその機能的等価物もしくはその誘導体との相互作用を調節することができる作用物質を検出するための方法を提供する。
【００２６】
発明の詳細な説明
本発明は、細胞シグナル伝達の媒介におけるGPIの作用の性質およびメカニズムの解明に部分的に基づいている。具体的には、GPIに関連したシグナル伝達事象が、インテグリン介在性細胞活性事象において非常に重要な役割を果たしていることが確認された。この結論により、異常または望ましくないインテグリン介在性細胞活性を特徴とする状態を処置するための治療方法および/または予防方法の合理的設計が現在可能である。さらに、GPIとインテグリンとの相互作用を模倣または調節する作用物質の同定および/または設計が現在容易になっている。
【００２７】
したがって、本発明の一つの局面は、GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、インテグリン介在性細胞活性を制御するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法を対象としている。
【００２８】
本発明をいずれか1つの理論または作用様式に限定するわけではないが、インテグリンは、様々な細胞-細胞外マトリックスおよび細胞-細胞相互作用において機能し、かつ創傷治癒、細胞分化、血管外遊出、およびアポトーシスなどの細胞活性に関与している膜貫通型受容体タンパク質の公知のファミリーである(図9)。機能的インテグリンは、非共有結合的に会合したαおよびβ膜貫通型糖タンパク質サブユニットを含むヘテロダイマーである(図10)。18種のαサブユニットおよび8種のβサブユニットが同定されており、これらは結合して24種の完全体のインテグリンを形成する(図11)。これらのαサブユニット間の構造は極めて類似している。いずれも、20〜30アミノ酸ストレッチ分の間隔を空けた、30〜40アミノ酸からなる相同な繰り返し配列7つを細胞外ドメイン中に含む。細胞の最も外側にある3または4つの繰り返し配列は、陽イオン結合特性を有する配列を含む。様々なβ-1αヘテロダイマーは多様なリガンド特異性を有しているため、α鎖がそのリガンド特異性に関与していることは明らかである。いくつかのヘテロダイマーのペア形成は制限されており、例えば、β-4はα-6サブユニットとペアになる。いくつかのインテグリンメッセンジャーRNAの選択的スプライシングは、さらなる多様性を促進する。インテグリン鎖は、リガンドに接着する長い細胞外ドメイン、および受容体を細胞の細胞骨格に連結させる短い細胞質内ドメインを有する傾向がある。インテグリンは、数多くのリガンドに結合することができる。一般的なリガンドは、例えばフィブロネクチンおよびラミニンであり、これらは双方とも細胞外マトリックスの一部分である。双方とも、複数のインテグリンによって認識される。これらのインテグリンは、ファミリー、例えばβ1サブユニットを有するVLAファミリー；β2サブユニットを有する、LFA-1およびMac-1を含むLEUCAMファミリー；ならびにサブユニットβ3〜β8を有する他のインテグリンのグループに分類される。細胞表面上で発現されるインテグリンのタイプは、その細胞がどの分子に結合するかを決定し、かつ、様々な環境において変更され得る。例えば、形質転換増殖因子βは、線維芽細胞上のα1β1、α2β1、α3β1、およびα5β1インテグリン、ならびに線維芽細胞および骨肉腫細胞上のαvβ3インテグリンの発現を増加させ；インターロイキン-1βは骨肉腫細胞上のβ1の発現を増大させ；かつ創傷に応答して、普通ならインテグリンα6β4を発現するケラチノサイトがα5β1(VLA-1、フィブロネクチン受容体)を発現し、その結果、ケラチノサイトが次いで細胞マトリックス中のフィブロネクチン上に移動し、それによって創傷を覆うと考えられる。
【００２９】
したがって、「インテグリン」への言及は、インテグリンファミリーのメンバーのすべての形態の分子ならびにそれらの機能的な誘導体、相同体、および模倣体への言及として理解されるべきである。「インテグリン」への言及は、αおよびβサブユニットのモノマー型またはこれらのサブユニットのホモダイマーもしくはヘテロダイマーのいずれにも及ぶ。「インテグリン」への言及はまた、対象のαおよび/またはβサブユニットmRNAの選択的スプライシングの結果生じるαおよび/またはβサブユニットのアイソフォーム、またはこれらのタンパク質の機能的変異体もしくは多形性の変種を含む分子にも及ぶ。好ましくは、該インテグリンは、αβヘテロダイマー(本明細書において「αβインテグリン」と呼ばれる)である。
【００３０】
したがって、より具体的には、GPIとαβインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、αβインテグリン介在性細胞活性を制御するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法が提供される。
【００３１】
「インテグリン介在性細胞活性」への言及は、インテグリンを介した刺激の結果として細胞が実施することができる機能活性のうちの任意の1種または複数種への言及として理解されるべきである。やはり本発明を限定するわけでは決してないが、多数のタイプのGPIのうちの任意のものによるインテグリンの刺激は、広範な細胞の機能的結果のうちの任意の1種または複数種の誘導を最終的にもたらす複雑な一連のシグナル伝達事象の誘導を結果として生じ、各結果の特殊性はGPIそれ自体およびそれが結合するインテグリンの双方の性質に主として依存している。これに関して、GPIがそれ自体で特有の機能的結果を起こすこと、または他の無関係の分子によって生成されるシグナルを増幅もしくはそうでなければ増強することの双方が見出された。例えば、インスリンシグナル伝達は、GPIによって増幅されるシグナルである。これに関して、多くの細胞は、そのGPIリガンドによって結合されると、その受容体に結合するインスリンと同時に補助的なシグナルを提供する、細胞表面αβインテグリンを発現する。同様に、GPIは、サイトカイン、ホルモン、および増殖因子の作用を増強するのにも使用され得る。例えば、必要なレベルの活性を実現するために高濃度のいくつかのサイトカインを使用すると、毒性を生じ得る(例えば、神経成長因子は、極めて高濃度で使用される場合のみインビボで有用であるが、これは通常、深刻な副作用をもたらす)。しかしながら、問題となっているサイトカイン受容体を発現する細胞に補助的なシグナルを提供するのに適したGPIを使用することにより、高濃度のサイトカイン、ホルモン、または増殖因子を使用して活性レベルのそのような上昇を実現する結果として起こる有害な毒性副作用を伴わずに、サイトカインの活性を増強する手段が提供される。本明細書において提供される実例に限定することを意図しないが、神経細胞に由来するGPIの天然の構造に基づいて化学合成したGPIは、神経組織においてシグナルを提供し、かつNGFの機能活性を増強することができる。好ましくは、該インテグリン介在性細胞活性は、サイトカイン、ホルモン、または増殖因子のシグナル伝達の増強作用である。
【００３２】
「サイトカイン」への言及は、任意の可溶性タンパク質ホルモンまたはホルモン様分子への言及として理解されるべきである。これに関して、「ホルモン」、「増殖因子」、「インターロイキン」、または「コロニー刺激因子」としても代わりに参照されることがある分子クラスへの言及である。
【００３３】
この好ましい態様によれば、GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含み、インテグリンがサイトカインに対する受容体と同じ細胞上で発現される、サイトカインシグナル伝達を増強するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該サイトカインシグナル伝達が増強される方法が提供される。
【００３４】
好ましくは、該サイトカインはインスリンである。
【００３５】
したがって、GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含み、インテグリンがインスリンに対する受容体と同じ細胞上で発現される、インスリンシグナル伝達を増強するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該インスリンシグナル伝達が増強される方法が提供される。
【００３６】
GPI-インテグリン相互作用によって増強され得るホルモン、増殖因子、およびサイトカインの他の例は、インスリン様成長因子1、神経成長因子、上皮成長因子、脳由来神経栄養因子、ニューロトロフィン3、甲状腺刺激ホルモン、肝増殖因子、線維芽細胞増殖因子、形質転換増殖因子β、卵胞刺激ホルモン、ヒト絨毛性ゴナドトロピン、甲状腺刺激ホルモン、副腎皮質刺激ホルモン(ACTH)、エリスロポエチン、トロンボポエチン、インターロイキン2などである。GPI-インテグリン相互作用のアゴニストを使用して、天然の状態のまたは薬剤として供給されたこれらの分子の作用を増強することができる。逆に、アンタゴニストを使用して、天然の状態のまたは薬剤として供給されたこれらの作用物質の活性を改変または下方制御することができる。改変は、該因子とその同族受容体との相互作用から起こる下流のシグナル伝達プロセスの一部分または全体に対する選択的影響を含む。
【００３７】
やはり、本発明をいずれか1つの理論または作用様式に限定するわけではないが、他の多くの細胞表面受容体とは違って、インテグリンは一般に低親和性(106〜109リットル/モル)でリガンドに結合し、かつ10〜100倍高い濃度で細胞表面上に通常存在している。しかしながら、インテグリンは、接触点(focal contact)およびヘミデスモソームなど細胞表面上の特定の位置で、ある特定の最低限の密度を上回る場合にのみそれらのリガンドに結合することができる。インテグリンが細胞表面全体に散在的に分布している場合、接着は起こらない。
【００３８】
しかしながら、適切な刺激の後、インテグリンは例えば接触点中でクラスターを形成し、それらが結合した弱い親和力が、細胞外マトリックス結合のために十分な接着能力を有する細胞表面上の班を生じる。インテグリン-リガンド相互作用は、細胞表面上のインテグリンのクラスター形成および活性化を伴い、その活性化はまた、いくつかの細胞内事象を媒介する細胞内のシグナル伝達経路中へのシグナル伝達も伴う。インテグリンを介するシグナル伝達は、接着斑(focal adhesion)、すなわち細胞骨格および他のタンパク質が濃縮される動的部位の形成に依存し、これらは多数のシグナル伝達経路を区分するのに役立ち、そこでシグナル伝達のクロストーク、制御、および統合が起こることができる(図12)。
【００３９】
GPIは、真核生物の間で広範に分布しており、T.ブルセイ(T.brucei)、T.クルーズ(T.cruzi)、プラスモディウム(Plasmodium)、リーシュマニア(Leishmania)、およびトキソプラズマ(Toxoplasma)、ならびに酵母、昆虫、魚類、および多数の哺乳動物供給源からの記載がある(最近の総説については、McConville, M. J. and Ferguson, M. A.,(1993) Biochem. J.294： 305 and Stevens, V. L.(1995) Biochem. J. 310：361を参照されたい)。GPIは、ホスファチジルイノシトール(PI)のmyo-イノシトール環の6位に連結された保存されているグリカンコア(Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcNH2)からなる。GPIは、グリコシルトランスフェラーゼの作用によるPIへの糖残基の連続付加によって、小胞体(ER)の細胞質側表面上で形成される。次いで、完成したGPIは膜を通過してERの管腔側へと移行され、そこから、遊離型でまたはタンパク質との共有結合型で細胞表面に移送され得る。このグリカンコアの4糖は、種および組織に特異的な方式で、糖、リン酸、およびエタノールアミン基でさらに置換され得る。GPI脂肪酸部分は、ジアシルグリセロール、アルキルアシルグリセロール、モノアルキルグリセロール、またはセラミドのいずれかであり得、イノシトール環に付加的なパルミトイル化またはミリストイル化を有する。全体像は、特定のコアの特徴を共有しているが脂肪酸組成および保存されているグリカンコアに対する側鎖の修飾において高レベルの変異を有する、密接に関連したファミリーに関する。
【００４０】
したがって、「GPI」への言及は、すべての形態のGPIおよびその誘導体、変異体、または等価物への言及を含むものとして読み取られるべきである。GPI誘導体の例は、脂質ドメインのすべてまたは一部を欠いたGPIである。本発明によれば、GPIのグリカンおよび脂質ドメインの双方の構造の変異に応じて、シグナル伝達および薬理学的活性の特異性が存在することが確認された。例えば、神経細胞に由来するGPIの天然の構造に基づいて化学合成したGPIは、神経組織においてシグナルを発し、かつNGFの活性を増強することができるが、マクロファージを活性化できるより単純なグリカンを有するGPI(エタノールアミン-リン酸-5Manα1-2Manα1-6Manα1-GlcN1-6-イノシトール)とは異なり、マクロファージにおいてはほとんど活性を有さないことが示された。これは、グリカンの組成に応じた作用の組織特異性を示唆する。同様に、単純なグリカンを有するが脂肪酸組成が異なるGPIは、標的細胞に対する特有の効果を示し、これは脂質組成に応じた作用特異性を証明する。したがって、GPIの組織特異性は、グリカン構造の変異ならびに脂質組成(脂質の数、イノシトールへの連結部位、鎖長、飽和度、および結合のタイプ、例えばエーテル、エステル、もしくはセラミド結合)に応じたシグナル伝達作用の多様性によって提供される。グリカン組成に応じた作用の特異性は、異なる組織における様々なインテグリン受容体の示差的発現を反映している。
【００４１】
好ましくは、該GPIは、グリカンおよび脂質ドメインの双方を含む(本明細書において特に「完全なGPI」と呼ばれる)。しかしながら、脂質に由来するシグナルは、脂質付加されたGPIからインテグリンへの結合後に生成され得るが、インテグリンに結合する単独のGPIグリカンはそれでもなおいくつかの生物学的に重要なシグナルおよび細胞応答を生じさせることができるため、本発明はまた、脂質ドメインを欠いているGPI分子などのGPI誘導体の使用にも及ぶ。したがって、これに関して、脂質ドメインを欠いているGPIへの言及は、上記に定義したGPI誘導体または「GPIイノシトールグリカンドメイン」として本明細書において同義的に言及され得ることが理解されるべきである。これに関して、「GPIイノシトールグリカンドメイン」または「GPI誘導体」への言及(脂質付加されてないGPIの文脈における)は、すべての形態のGPIイノシトールグリカンドメインへの言及を含むものとして読み取られるべきである。「GPIイノシトールグリカン」という用語は、限定されるわけではないが「イノシトールグリカン」(IG)、「イノシトールホスホグリカン」(IPG)、「ホスホイノシトールグリカン」(PIG)、「リン酸オリゴ糖」(POS)などの用語と同義的に使用され、かつこれらの用語によって記述される分子は、「GPIイノシトールグリカン」分子として理解されるべきである。また、「GPIイノシトールグリカンドメイン」への言及が、限定されるわけではないが、イノシトールグリカンドメインに脂質ドメインを連結するグリセロールリンカー配列、脂質ドメインの非機能的部分、またはアミノ酸ペプチドなどの非イノシトールグリカン分子と連結、結合、またはそうでなければ会合したGPIイノシトールグリカンドメインへの言及を含むことも理解されるべきである。同様に、脂質付加されたGPIもまた、アミノ酸配列などの非GPI分子と連結、結合、またはそうでなければ会合され得る。
【００４２】
したがって、本発明はより好ましくは、完全なGPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、αβインテグリン介在性細胞活性を制御するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法を提供する。
【００４３】
他の好ましい態様において、GPIのイノシトールグリカンドメインとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、αβインテグリン介在性細胞活性を制御するための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法が提供される。
【００４４】
本明細書において先に詳述したように、完全なGPIによって誘導される2シグナルメカニズムが同定された。この「2シグナル」メカニズム(付加的なシグナルの発生を除外しない)によれば、GPIイノシトールグリカンドメインは、グリカンに特異的な受容体として機能するインテグリンに結合する(図13)。これらは、初めから「ラフト」内に位置していてもよく、またはGPIイノシトールグリカンドメインへの結合後にこれらの構造体に移行してもよい。生理学的かつ薬理学的に適切な濃度でも、すべてのGPIイノシトールグリカンドメインがすべてのインテグリンに結合するわけではないという点で、グリカン/インテグリンのペアには特異性が存在する。GPIグリカン構造を改変すると、様々なインテグリンに結合する親和力がより高くまたは低くなる。グリカンの結合は、srcキナーゼおよびMAPキナーゼカスケードのメンバーを伴うシグナル伝達プロセスを開始させる。結合後、脂質付加されたGPIは、ホスホリパーゼによって加水分解されて、単独およびインテグリン介在性シグナルとの相乗作用の双方で作用して下流の代謝および遺伝子発現のエンドポイントを促進する脂質性セカンドメッセンジャーの生成をもたらす(図13)。
【００４５】
GPIイノシトールグリカンドメインとインテグリンの間の相互作用の特異性は、個々の細胞型のインテグリン介在性細胞活性を調節するための極めて正確なメカニズムを提供する。24種の現在公知のインテグリンと様々な特有のGPI構造体の組合せは、多数の潜在的なインテグリン/GPIグリカンペア形成を提供し、それによってこれら特有のインテグリン/GPIグリカン組合せのそれぞれによる作用の著しい特異性を提供する。したがって、本発明の方法に従って特定のインテグリン介在性細胞活性を調節するためには、問題となっている細胞のインテグリン受容体の関連するGPIリガンドまたは対象のインテグリン分子の性質のいずれかの構造を知る必要がある。特定のGPI-インテグリン組合せのアゴニスト、模倣体、またはアンタゴニストについてスクリーニングしようとするのである限り、関連するインテグリンおよびそれに結合されるGPIの双方の構造を知ることが好ましい。上記に詳述したように、インテグリンおよびGPIファミリーの双方のメンバーが広範に同定され、かつ特徴づけられたということに鑑みて、機能的なGPI-インテグリン結合を同定することは、GPIのグリカンドメインとインテグリンの間の結合の程度および親和力に関してスクリーニングするルーチンなアッセイ法を実施するということになると考えられる。一つの実施例では、これらの組合せを迅速に同定するためのハイスループットな方式でこれを設定することができる。これに関して、インテグリンファミリーのメンバーは文献において十分に記載されている。また同様に、様々なGPIイノシトールグリカンドメイン構造体が公知であり、例えば以下の一般的構造体が含まれる；
(i)エタノールアミン-リン酸-(Manα1,2)-Manα1,2Manα1,6Manα1,4GlcN-myo-イノシトールホスホグリセロール；
(ii)X1-X2-X3-X4-エタノールアミン-リン酸-(Manα1,2)-Manα1,2Manα1,6Manα1,4GlcN-myo-イノシトールホスホグリセロール(X1、X2、X3、およびX4は、任意の4つのアミノ酸である)；
2008501725.tif 000002
(式中、EtNはエタノールアミンであり、Pはリン酸であり、Mはマンノースであり、GはN-アセチル化されていないグルコサミンであり、[G]は任意のN-アセチル化されていないヘキソサミンであり、Inoはイノシトールまたはイノシトール-ホスホグリセロールであり、[X]は他の任意の置換基であり、αは、必要な限りどの場所でもβ結合で置換され得るα結合を表し、かつ数値は、必要に応じて他の任意の結合位置で置き換えられ得る結合位置を表す。)
好ましくは、Xは糖である。
【００４６】
本発明において使用され得る完全に脂質付加されたGPI組成物の例には、以下のものが含まれるが、それらに限定されるわけではない：
i)Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシル-グリセロール
ii)Manα1(Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシル-グリセロール
iii)エタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシル-グリセロール
iv)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシル-グリセロール
v)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1-6Manα1(EtN-リン酸)-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
vi)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸)-6Manα1(EtN-リン酸)-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
vii)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
viii)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸,GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
ix)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸,Galβ-GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
x)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸,シアル酸-Galβ-GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xi)エタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1(EtN-リン酸)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xii)エタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1(EtN-リン酸,GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xiii)エタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1(EtN-リン酸,Galβ-GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xiv)エタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1(EtN-リン酸,シアル酸-Galβ-GalNAcβ1-4)-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xv)エタノールアミン-リン酸-6Manα1(Manα1-2)-2Manα1(EtN-リン酸)-6Manα1(EtN-リン酸)-4GlcN1-6-イノシトール-ホスホ-ジアシルグリセロール
xvi)末端のエタノールアミンリン酸が存在しない上記の1〜15番
xvii)イノシトールの2位にアシル鎖も含む上記の1〜16番
xviii)ジアシルグリセロールが完全に飽和した脂肪酸を含む上記の1〜17番
xix)ジアシルグリセロールがsn1位およびsn2位のいずれかまたは双方に不飽和脂肪酸を含む、上記の1〜18番
xx)ジアシルグリセロールの代わりに、限定されるわけではないが、アルキルアシルグリセロール、モノアルキルグリセロール、セラミドなどを含む任意の脂質またはリン脂質が存在する、上記の1〜19番
xxi)マンノース残基が、他の任意の6炭糖、アミノ糖、アミノ酸、リン酸、ホスホン酸、硫酸、スルヒドリルなどでさらに置換されている、上記の1〜20番
xxii)Man-3残基、すなわち保存されているグリカンコア中のイノシトールから最も離れたマンノース残基が、最大6アミノ酸長の任意の配列のペプチドにさらに連結されている、上記の1〜21番。
【００４７】
α結合は、必要な限りどの場所でもβ結合で置換され得(逆もまた同じ)、数値は、必要に応じて他の任意の結合位置で置き換えられ得る結合位置を表す。すべての場合において、脂質は、任意の所望の鎖長および飽和度のものでよい。不飽和結合は、脂質鎖上の任意の所望の位置にあってよい。
【００４８】
これらの構造体のうちの任意のものを、任意の位置で、かつ任意のタイプの結合を用いて、リン酸、ホスホグリセロール、ヘキソサミン、アミノ酸、チオールなどの陽性、陰性、または中性電荷を有する置換基によってさらに改変してよい。これらの構造体を、脂質ドメインへの結合配列を提供するために、任意の数のアミノ酸を付加することによってさらに改変してよい。
【００４９】
本明細書における「誘導体」への言及は、一つの好ましい態様において、末端のイノシトール-ホスホグリセロールがイノシトール-1,2環状リン酸で置換されているGPIイノシトールグリカンドメイン誘導体を包含すると理解されるべきである。本発明を限定するわけでは決してないが、このような置換は、図14で例示されるようなある種の形態の化学合成が使用される場合に特徴的な結果である。例えば、該GPIイノシトールグリカンは次の構造を示し得る：
EtN-P-(Manα1,2)-6Mα1,2Mα1,6Manα1,4GlcNH2α1-myo-イノシトール-1,2環状リン酸(EtNはエタノールアミンであり、Pはリン酸であり、かつMはマンノースである)。
NH2-CH2-CH2-PO4-(Manα1-2)6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcNH2-6myo-イノシトール-1,2環状リン酸
【００５０】
N-アセチル化されていないヘキソサミンは、グルコサミンまたは他の任意の不安定な亜硝酸置換基を含むことが理解されるべきである。これらの構造体のうちの任意のものを、任意の位置で、かつ任意のタイプの結合を用いて、限定されるわけではないが、リン酸、ホスホグリセロール、ヘキソサミン、アミノ酸、またはチオールなどの陽性、陰性、または中性電荷を有するものを含む置換基によってさらに改変してよいこともさらに理解されるべきである。
【００５１】
本発明を限定するわけでは決してないが、接着斑キナーゼ(FAK)は、インテグリンと結合し、かつインテグリンを介した接着班において一般に存在するチロシンキナーゼである。FAKが活性化およびリン酸化されると、このキナーゼは、シグナル伝達カスケード中の他のシグナル伝達タンパク質をリン酸化し得る。細胞骨格の再構築に関与しているパキシリンは、FAKの標的である。FAK活性化の1つの結果は、迅速な細胞骨格再編成である。マイトジェン活性化プロテインキナーゼ(MAPK)の活性化が、インテグリン-リガンド結合(RGDペプチド、フィブロネクチン、ラミニン)後に起こり、細胞質から核へのMAPKの移行が結果として起こる。MAPKはまた、FAK非依存性経路においてインテグリン結合キナーゼ(ILK)によっても活性化され得る。ホスホリパーゼC-γ(PLC-γ)のチロシンリン酸化の誘導および接着斑へのその動員が、β2-インテグリン活性化に関して報告された。PLC-γの活性化により、リン脂質のホスファチジルイノシトール2リン酸(PIP2)が加水分解されてジアシルグリセロール(DAG)およびイノシトール3リン酸(IP3)となる。DAGは、タンパク質キナーゼC(PKC)活性化因子であり、一方、IP3は、ミトコンドリアのカルシウム貯蔵からのカルシウム放出を媒介する。
【００５２】
本明細書において先に詳述したように、完全なGPIは二重のシグナルを提供することが現在では確認されている。具体的には、GPIイノシトールグリカンドメインは、本発明において発生することが確認された特有のグリカン-インテグリン結合によって細胞特異性を提供することに加えて、srcキナーゼおよびMAPキナーゼカスケードのメンバーを伴うシグナル伝達プロセスを開始させる。グリカン結合後、脂質付加されたGPIは、ホスホリパーゼによって加水分解されて、単独およびインテグリン介在性シグナルとの相乗作用の双方で作用して下流の代謝および遺伝子発現のエンドポイントを促進する脂質性セカンドメッセンジャーを生成し得る。それでもなお、完全なGPIのグリカンおよび脂質ドメインによって提供される二重のシグナル伝達の寄与により、完全なGPIは好ましいシグナル伝達手段であるが、GPIイノシトールグリカンドメイン単独でも、インテグリンに結合し、かつ一段階のシグナルによって、インテグリンを介した細胞機能を調節する生物学的に重要なシグナルを送達できることが理解されるべきである。
【００５３】
これに関して、GPIとそのインテグリン受容体との「機能的相互作用」の調節への言及は、この相互作用の機能的結果を調節すること、すなわち、1種または複数種のシグナルの誘導への言及として理解されるべきである。これは一般に、GPIとインテグリンの間の物理的相互作用を調節することによって達成されると考えられる。しかしながら、他の手段による機能的結果の改変にまで及ぶこともまた理解されるべきである。例えば、完全なGPIの脂質ドメインを介したシグナル伝達は、その加水分解を通して促進される。したがって、この加水分解事象の調節は、GPI-インテグリン相互作用の機能的結果を調節する代替手段を提供する。好ましい態様において、該機能的相互作用は物理的相互作用である。
【００５４】
完全なGPIの生物活性の多くは、GPIに由来する脂質による脂質依存性キナーゼの活性化、例えばGPIに由来するジアシルグリセロールによるPKCの活性化およびGPIに由来するセラミドによるスフィンゴミエリナーゼ経路の活性化の結果として生じる。したがって、望ましい生化学的および薬理学的特性を実現するためのルートとして、イノシトールグリカンと共に脂質依存性経路の活性化につながる代替経路を使用することが可能であり、例えばジアシルグリセロールを含む完全に脂質付加されたGPIは、先に示したように、インスリン模倣物質としてIPG単独より実質的により強力であり、かつこれらのGPI濃度におけるこの活性は、PKCアンタゴニストによって妨害され得る。しかしながら、IPGのインスリン様の活性は、別のルートによってPKCの活性化を引き起こすホルボールエステルの添加によりそれ相応に増強され得る。同様に、GPIによるマクロファージの活性化は、ジアシルグリセロールの存在に依存し、かつ単独のIPGは比較的効果が低い。しかしながら、IPGはホルボールエステルと共にマクロファージを活性化することができ、かつIPGは実際、PKCを介して作用する他のアゴニスト、例えばインターフェロン-γとの相乗作用を示す。したがって、公知のPKCもしくはスフィンゴミエリナーゼ活性化物質、または様々な関連するスフィンゴミエリナーゼもしくはPKCアイソフォームの1種もしくは他種を活性化する他のホルモン、サイトカイン、もしくは増殖因子と共にIPGおよびGPIを使用することは、本発明の範囲内である。
【００５５】
インテグリン介在性細胞活性におけるGPIおよびインテグリンの役割、ならびにこれらの2種の分子間の相互作用の性質の双方の解明により、インテグリン介在性細胞活性を制御するためのメカニズムが現在提供される。「制御される」とは、上方制御または下方制御されることを意味する。例えば、GPIとインテグリンとの相互作用の拮抗は、インテグリン介在性細胞活性の発生または程度を下方制御または抑制する手段を提供し、例えばプリオン(これらはGPIタンパク質である)によって誘発されて生じるような、天然タンパク質を異常型に転換する触媒作用を下方制御する。逆に、インテグリン介在性細胞活性が望ましいのであれば、本発明の方法は次に、GPI/インテグリン相互作用の作動を介してこのような活性の上方制御を促進する。例えば、インスリンシグナル伝達などのサイトカインシグナル伝達の増強作用。
【００５６】
「誘導またはそうでなければ作動させる」への言及は、以下への言及として理解されるべきである：
(i)インテグリン介在性細胞活性を実施もしくは増強するためにGPIとインテグリンとの相互作用を誘導すること；または
(ii)その最初の誘導に続いてGPI/インテグリン相互作用を上方制御、増大、もしくはそうでなければ作動させること、例えばGPIの脂質ドメインの結合に続いて起こる加水分解段階を作動させること、もしくはそのインテグリン受容体分子へのGPI結合の親和力を増加させること。
【００５７】
逆に、GPIとインテグリンとの相互作用を「阻害またはそうでなければ拮抗する」とは、以下への言及である：
(i)GPIとインテグリンとの相互作用を防止すること；または
(ii)GPIとインテグリンとの既存の相互作用を無効または効果が低くなるように拮抗すること(例えば、これらの2種の分子の結合親和力を減少させること)。
【００５８】
GPIとインテグリンの間の相互作用の調節(上方制御または下方制御の意味のいずれか)は、部分的または全面的であり得ることが理解されるべきである。部分的調節は、所与の細胞上で普通なら起こると考えられるGPI/インテグリン相互作用の一部のみが、本発明の方法によって影響を及ぼされる場合(例えば本発明の方法が、インテグリンを介した刺激を細胞が受ける時間の一部の間のみ細胞に適用される、または対象の細胞に接触させる作用物質が、細胞内のGPI/インテグリン相互作用を飽和状態にするのに不十分な濃度で提供される)に起こるのに対し、全面的調節は、すべてのGPI/インテグリン相互作用が調節される場合に起こる。
【００５９】
GPIとインテグリンの間の相互作用の調節は、以下を含むいくつかの技術のうちの任意のものによって実現され得るが、それらに限定されるわけではない：
(i)特定のGPIとインテグリンの間の相互作用を作動させるまたは拮抗する、タンパク質性または非タンパク質性分子を被験体中に導入すること(例えば、可溶型の適切なインテグリン分子を導入すると、競合的にGPIに結合し、それにより、細胞表面のインテグリン分子への結合のためにGPIを利用できなくなる)；
(ii)目的のGPIまたはその誘導体、模倣体、もしくは等価物を被験体中に導入すること；
(iii)適切なインテグリン受容体分子の上方または下方制御を誘導し、それにより、GPI分子によって誘導されるシグナル伝達の程度を効果的に調節すること。インテグリン受容体発現のこのような制御は、
・該インテグリンをコードする遺伝子の転写および/または翻訳を調節すること
・適切なインテグリンまたはその誘導体、相同体、もしくは類似体をコードする核酸分子を適切な細胞集団中に導入すること
によって実現され得る。
【００６０】
「作用物質」への言及は、GPIとインテグリンとの相互作用を調節する任意のタンパク質性または非タンパク質性分子への言及として理解されるべきであり、例えば上記の(i)〜(iii)の箇所で詳述した分子が含まれる。対象の作用物質は、他の任意のタンパク質性または非タンパク質性分子と連結、結合、またはそうでなければ会合され得る。例えばそれは、局在化された領域に標的化することを可能にする分子と会合され得る。
【００６１】
該タンパク質性分子は、融合タンパク質を含む天然、組換え、もしくは合成の供給源から、または例えば天然物スクリーニングに従って誘導され得る。該非タンパク質性分子は、例えば天然物スクリーニングなど天然供給源から誘導され得、または化学的に合成され得る。例えば、GPIイノシトールグリカンドメインは、図14において詳述する方法論に従って合成され得る。
【００６２】
本発明は、GPI/インテグリン相互作用のアゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる該GPIまたはインテグリンの化学的類似体を企図する。化学的アゴニストは、該GPIまたはインテグリンから必ずしも誘導され得ないが、いくつかの立体配置的類似性を共有し得る。または、化学的アゴニストは、該GPIまたはインテグリンの特定の生理化学的特性を模倣するように特異的に設計され得る。アンタゴニストは、該GPIおよびインテグリンを相互作用させないように妨害、阻害、またはそうでなければ防止することができる任意の化合物でよい。アンタゴニストには、該GPIもしくはインテグリン、または該GPIもしくはインテグリンの一部分に特異的なモノクローナル抗体、および対象の細胞におけるインテグリンの遺伝子またはmRNAの転写または翻訳を防止するアンチセンス核酸が含まれる。発現の調節は、抗原、RNA、リボソーム、DNAザイム、RNAアプタマー、抗体、または共抑制に使用するのに適した分子を利用して実現され得る。このような分子の同定において使用するのに適したスクリーニング方法を以下により詳細に記述する。
【００６３】
該タンパク質性または非タンパク質性分子は、直接的または間接的に作用してGPIとインテグリンの相互作用を調節し得る。該分子は、それがGPIまたはインテグリン分子と結合する場合には直接的に作用する。該分子は、それがGPIまたはインテグリン以外の分子と結合する場合には間接的に作用し、この他の分子が直接的または間接的にGPIとインテグリンの相互作用を調節する。したがって、本発明の方法は、制御段階からなるカスケードの誘導を介したGPI/インテグリン相互作用の制御を包含する。好ましくは、該分子は直接的に作用する。
【００６４】
本明細書において先に定義した調節物質のスクリーニングは、限定されるわけでは決してないが、インテグリン遺伝子またはその機能的等価物もしくは誘導体を含む細胞をある作用物質と接触させる段階、およびインテグリンタンパク質の産生もしくは機能活性の調節、インテグリンをコードしている核酸分子の発現の調節、またはインテグリンを介した機能的結果の活性もしくは発現の調節に関してスクリーニングする段階を含むいくつかの適切な方法のうちの任意のものによって実現され得る。このような調節の検出は、ウェスタンブロット法、電気泳動移動度シフトアッセイ法、および/またはルシフェラーゼ、CATなどインテグリン活性のレポーターの読取りなどの技術を利用して実現され得る。
【００６５】
インテグリン遺伝子またはその機能的等価物もしくは誘導体は、試験の対象である細胞中に天然に存在するものでもよく、または試験するために宿主細胞中にトランスフェクトされたものでもよいことが理解されるべきである。さらに、天然に存在するまたはトランスフェクトされた遺伝子は、構成的に発現され得、それによって、核酸レベルもしくは発現産物レベルのいずれかでインテグリン活性を下方制御する作用物質をスクリーニングするのに特に有用なモデルを提供し、またはこの遺伝子は活性化を必要とし得、それによって、インテグリン発現を上方制御する作用物質をスクリーニングするのに特に有用なモデルを提供する。さらに、インテグリン核酸分子が細胞中にトランスフェクトされる限り、その分子はインテグリン遺伝子全体を含んでもよく、またはインテグリン産生物の発現を制御する部分などその遺伝子の一部分を含むだけでもよい。例えば、インテグリンプロモーター領域が、試験の対象である細胞中にトランスフェクトされ得る。これに関して、プロモーターのみが利用される場合、例えばそのプロモーターをレポーター遺伝子に結合させることによって、プロモーター活性の調節の検出を実現することができる。例えば、このプロモーターはルシフェラーゼまたはCATレポーターに結合され得、それぞれ蛍光強度またはCATレポーター活性の調節を介してこの遺伝子の発現の調節を検出することができる。
【００６６】
別の実施例において、検出の対象は、インテグリンそれ自体ではなく、下流のインテグリン制御の標的または機能的結果であり得る。さらに別の実施例は、最小限のレポーターに結合されたインテグリン結合部位を含む。これは、インテグリン発現の調節それ自体が検出の対象ではない間接的な系の例である。正しくは、インテグリン介在性シグナル伝達が制御する分子または機能活性の調節が観察される。
【００６７】
これらの方法は、合成、コンビナトリアル、化学、および天然のライブラリーを含む、タンパク質性または非タンパク質性物質など推定上の調節物質のハイスループットなスクリーニングを実施するためのメカニズムを提供する。これらの方法は、インテグリン発現を調節する、またはGPI分子とインテグリンの相互作用を調節する作用物質の検出を容易にする(この後者の目的は、例えばGPIを上述のスクリーニングアッセイ法に導入し、かつGPI-インテグリン結合の作動もしくは拮抗のいずれかまたは機能的結果を検出することによって実現され得る)。これらのアッセイ法はまた、特定のインテグリン分子に対するGPIリガンドを同定するためにGPI分子の集団をスクリーニングするのにも適用することができる。後述するように、これらのアッセイ法は、GPI/インテグリン結合のアゴニスト/アンタゴニストについてスクリーニングするハイスループットな方法のための、およびインテグリン介在性細胞活性を上方制御するのに適したGPIまたはGPI模倣体を同定するための基本原理を提供する。
【００６８】
「発現」という用語は、核酸分子の転写および翻訳を意味する。「発現産物」への言及は、核酸分子の転写および翻訳から産生される産生物への言及である。
【００６９】
このような状況においては、まず第1に機能的結果を評価する必要がないことがあり、その代わりに、GPIとインテグリンの間の物理的相互作用の発生または調節についてスクリーニングするだけでよい。これは、例えばこれらの分子のうちの1種を固相に結合させ、かつその後、固定化されたGPIまたはインテグリンに結合する能力について推定上の結合パートナーの集団をスクリーニングすることによって実現され得る。これもやはり、個々のインテグリン分子に対するGPIリガンドを同定するため、またはGPIもしくはインテグリン分子との相互作用の機能的影響に関してその後で分析することができるリード化合物を同定するために特に有用な手段を提供する。
【００７０】
本明細書において記述する分子(例えばGPIもしくはインテグリンまたは他のタンパク質性もしくは非タンパク質性物質)の「誘導体」には、天然または非天然いずれかの供給源に由来する断片、一部分、または変種が含まれる。非天然供給源には、例えば組換えまたは合成の供給源が含まれる。「組換え供給源」とは、対象のタンパク質性分子が回収される元となる細胞供給源が遺伝子改変されていることを意味する。これは、例えばその特定の細胞供給源による産生の速度および量を増加またはそうでなければ増大するために存在し得る。一部分または断片には、例えば、その分子の活性領域が含まれる。タンパク質の誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失、または置換から誘導され得る。アミノ酸挿入による誘導体には、アミノおよび/またはカルボン酸末端の融合物ならびに単一または複数のアミノ酸の配列内挿入物が含まれる。アミノ酸配列挿入変種は、1つまたは複数のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位中に導入されたものであるが、ランダムな挿入もまた、結果として生じる産生物の適切なスクリーニングを伴えば可能である。欠失変種は、配列からの1つまたは複数のアミノ酸の除去を特徴とする。アミノ酸置換変種は、配列中の少なくとも1つの残基が除去され、かつ異なる残基がその場所に挿入されているものである。アミノ酸配列への付加には、上記に詳述したように、他のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質との融合が含まれる。
【００７１】
誘導体にはまた、ペプチド、ポリペプチド、または他のタンパク質性もしくは非タンパク質性分子に融合された、完全なタンパク質の特定のエピトープまたは一部分を有する断片も含まれる。例えば、GPIまたはその誘導体は、特定の組織に対する標的性を促進するための分子に融合され得る。本明細書において企図される分子の類似体は、限定されるわけではないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質合成の間の非天然アミノ酸および/またはそれらの誘導体の組込み、ならびに架橋剤およびタンパク質性分子またはそれらの類似体に立体配置的制約を課す他の方法の使用を含む。
【００７２】
本発明の方法に従って利用され得る核酸配列の誘導体は、単一もしくは複数のヌクレオチドの置換、欠失、および/または他の核酸分子との融合を含む付加から同様に誘導され得る。本発明において利用される核酸分子の誘導体には、オリゴヌクレオチド、PCRプライマー、アンチセンス分子、核酸分子の共抑制および融合に使用するのに適した分子が含まれる。核酸配列の誘導体には、縮重変種も含まれる。
【００７３】
GPIまたはインテグリンの「変種」は、変種の元の形態のGPIまたはインテグリンの機能活性のうちの少なくとも一部分を提示する分子を意味すると理解されるべきである。変種は、任意の形態をとってよく、かつ天然または非天然に存在するものでよい。変異体分子は、改変された機能活性を提示するものである。
【００７４】
「相同体」とは、その分子が、本発明の方法に従って処置されているもの以外の種に由来することを意味する。これは、例えば処置されているもの以外の種が、処置を受けている被験体によって天然に産生されるGPIのものと類似し、かつ適切な機能特質を提示するある形態のGPIを産生することが確認される場合に存在し得る。
【００７５】
化学的および機能的等価物は、対象の分子の機能活性のうちの任意の1種または複数種を提示する分子として理解されるべきであり、機能的等価物は、化学合成されたものなど任意の供給源から誘導され得、または天然物スクリーニングなどのスクリーニングプロセスを経て同定され得る。
【００７６】
化学的もしくは機能的等価物またはアゴニスト的もしくはアンタゴニスト的物質は、コンビナトリアルケミストリーもしくは組換えライブラリーのハイスループットなスクリーニングなど周知の方法を利用して、または天然物スクリーニングに従って、設計および/または同定することができる。
【００７７】
例えば特定の親基の置換を多数有する有機分子が使用される場合、有機低分子を含むライブラリーがスクリーニングされ得る。
【００７８】
一般的な合成スキームは公開されている方法に従い得る(例えば、Bunin BA, et al.(1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91：4708-4712； DeWitt SH, et al.(1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90： 6909-6913)。手短に言えば、連続的な各合成段階において、選択された複数の異なる置換基のうちの1つを、整列させた試験管の選択されたサブセットのそれぞれに添加する。その際、ライブラリーを作製するのに使用されるそれらの異なる置換基の起こり得る並べ換えすべてを生じるような試験管のサブセットを選択する。1つの適切な並べ換え戦略は、米国特許第5,763,263号において概説されている。
【００７９】
現在、生物学的に活性な化合物を探索するためにランダムな有機分子のコンビナトリアルライブラリーを使用することに広く関心が持たれている(例えば、米国特許第5,763,263号を参照されたい)。このタイプのライブラリーのスクリーニングによって発見されたリガンドは、天然のリガンドを模倣もしくは妨害するのに、または生物学的標的の天然に存在するリガンドに干渉するのに有用となり得る。この文脈において、例えば、それらはより強力な薬理学的効果などの諸特性を提示するGPI類似体を開発するための開始点として使用され得る。GPIもしくはインテグリンまたはその機能的部分は、本発明に従って、様々な固相または液相の合成法によって形成されるコンビネーションライブラリーにおいて使用され得る(例えば米国特許第5,763,263号およびその中に引用されている参照文献を参照されたい)。米国特許第5,753,187号において開示されているものなどの技術を使用することによって、何百万もの新しい化学的および/または生物学的化合物が、数週間未満でルーチン的にスクリーニングされ得る。同定された多数の化合物のうちで、適切な生物学的活性を提示しているもののみがさらに解析される。
【００８０】
ハイスループットなライブラリースクリーニング方法に関して、生体分子、高分子複合体、または細胞など選択された生物学的物質と特異的に相互作用できるオリゴマーまたは低分子のライブラリー化合物は、前述したものなど一連の周知の方法から当業者によって容易に選択されるコンビナトリアルライブラリー装置を利用してスクリーニングされる。このような方法において、ライブラリーの各メンバーは、選択された作用物質と特異的に相互作用する能力についてスクリーニングされる。この方法を実施する際、化合物を含む試験管中に生物学的物質を入れ、各試験管中の個々のライブラリー化合物と相互作用させる。この相互作用は、所望の相互作用の存在を観察するのに使用することができる検出可能なシグナルを生成するように設計される。好ましくは、生物学的物質は水溶液中に存在し、かつ他の条件は所望の相互作用に応じて適合される。例えば、物質を検出するための機能に基づくまたは機能に基づかない任意の周知の方法によって、検出は実施され得る。
【００８１】
特定のGPIの活性を模倣する分子をスクリーニングすることに加えて、インテグリン介在性細胞活性の機能活性を上方または下方制御するためにGPI-インテグリン結合に対して作動的にまたは拮抗的に機能する分子を同定および利用することもまた望ましくなり得る。このような分子の使用を以下により詳細に記述する。対象の分子がタンパク質性である限り、それは、例えば、融合タンパク質を含む天然もしくは組換え供給源から、または例えば前述のスクリーニング法に従って誘導され得る。非タンパク質性分子は、例えば、上記に確認した方法論に従って同様に同定または生成された化学的または合成分子でよい。したがって、本発明は、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができる、GPIまたはインテグリンの化学的類似体の使用を企図する。化学的アゴニストは、GPIまたはインテグリンから必ずしも誘導され得ないが、いくつかの立体配置的類似性を共有し得る。または、化学的アゴニストは、GPIまたはインテグリンの特定の生理化学的特性を模倣するように特異的に設計され得る。アンタゴニストは、GPIまたはインテグリンが正常な生物学的機能を実施するのを妨害、阻害、またはそうでなければ防止することができる任意の化合物でよい。アンタゴニストには、GPIもしくはインテグリンまたはそれらの一部分に特異的なモノクローナル抗体が含まれる。
【００８２】
最も好ましい態様において、GPI受容体としてインテグリンを同定することにより、受容体のアゴニスト活性についてのコンビナトリアルライブラリーおよび天然または合成産物のスクリーニングが提供され、その際、これらの活性はGPIまたはIPGの生物学的諸特性を反映している。例えば、精製されたまたは細胞表面上で発現させられた組換えインテグリンは、炭水化物もしくはペプチド組成物からなるコンビナトリアルライブラリーの結合を測定するため、または細胞応答への影響など所望の生物学的エンドポイントをスクリーニングするためのマルチアレイスクリーニング法を含むアッセイ法において使用され得る。このようなアッセイ法はまた、様々な候補物の受容体に対する親和力を測定するためにプラズモン共鳴または類似の方法も使用し得る。同様に、インテグリンおよび変異型で細胞または動物をトランスフェクションすると、細胞シグナル伝達の特定の特性および薬理学的用法を有する変種のIPGまたはGPI構造体候補物をさらに同定することが可能となる。
【００８３】
本明細書において企図されるインテグリンまたは他のタンパク質性調節物質の類似体は、限定されるわけではないが、側鎖の修飾、ペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質合成の間の非天然アミノ酸および/または誘導体の組込み、ならびに架橋剤およびそれら類似体に立体配置的制約を課す他の方法の使用を含む。このような改変が取り得る個々の形態は、対象分子がタンパク質性または非タンパク質性であるかどうかに依存すると考えられる。個々の改変の性質および/または安定性は、当業者によってルーチン的に測定され得る。
【００８４】
例えば、本発明によって企図される側鎖改変の例には、アルデヒドとの反応とそれに続くNaBH4による還元による還元的アルキル化によるもの；アセトイミド酸メチルによるアミジン化；無水酢酸によるアシル化；シアナートによるアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸(TNBS)によるアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸によるアミノ基のアシル化；ならびにピリドキサール-5-リン酸によるリジンのピリドキシル化とそれに続くNaBH4による還元などアミノ基の改変が含まれる。
【００８５】
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサール、およびグリオキサールなどの試薬との複素環系縮合生成物の形成によって改変され得る。
【００８６】
カルボキシル基は、O-アシルイソ尿素形成とその後に続く、例えば対応するアミドへの誘導体化を経るカルボジイミド活性化によって改変され得る。 
【００８７】
スルフィドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドによるカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物との混合ジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸、または他の置換されたマレイミドとの反応；4-クロロメルクリ安息香酸塩、4-クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノールおよび他の水銀の使用による水銀誘導体の形成；アルカリ性pHにおけるシアナートによるカルバモイル化などの方法によって改変され得る。
【００８８】
トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドによる酸化または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはスルフェニルハライドによるインドール環のアルキル化によって改変され得る。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンによるニトロ化によって変更されて3-ニトロチロシン誘導体を形成し得る。
【００８９】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の改変は、ヨード酢酸誘導体によるアルキル化またはジエチルピロカルボナートによるN-カルボエトキシル化によって実現され得る。
【００９０】
タンパク質合成の進行中の非天然アミノ酸および誘導体の組込みの例には、限定されるわけではないが、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニン、および/またはアミノ酸のD-異性体の使用が含まれる。本明細書において企図される非天然アミノ酸の一覧表を表1に記載する。
【００９１】
【表１】
2008501725.tif 000003
2008501725.tif 000004
2008501725.tif 000005
【００９２】
架橋剤は、例えば、(CH2)nスペーサー基(n=1〜n=6)を有する2官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ2官能性架橋剤、ならびにN-ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応性部分および別の基特異的反応性部分を通常含むヘテロ2官能性試薬を用いて、3次元の立体配置を安定化させるのに使用することができる。
【００９３】
本発明の方法は、インビトロおよびインビボの双方における細胞機能の調節を企図する。好ましい方法はインビボで個体を治療することであるが、それでもなお、本発明の方法はインビトロ環境において適用されるのが望ましい場合があることが理解されるべきである。
【００９４】
本発明の別の局面は、疾患状態の治療および/または予防と関連した本発明の使用に関する。本発明をいずれか1つの理論または作用様式に限定するわけではないが、広範なインテグリン介在性細胞活性により、この分子は健康状態および疾患状態の双方の生物学的プロセスのすべての局面に不可欠な機能的成分となっている。したがって、本発明は、異常なまたはそうでなければ望ましくないインテグリン介在性細胞活性を調節するための貴重な手段を提供する。
【００９５】
本発明を限定するわけでは決してないが、インテグリンは、CD14、FcγRIIIB、およびuPARなど様々な白血球表面上のいくつかのGPI結合タンパク質に結合することが公知である。これらのタンパク質は、炎症反応に密接に関与している。これらの分子とインテグリンとの結合は、結合されたGPIアンカーとインテグリンレクチン部位の結合によって特異的に媒介される。このモデルは、GPIとは異なりタンパク質-インテグリン相互作用またはタンパク質上の特有のN結合型グリコシル化のいずれかの結果としてその相互作用が生じるとする提唱されているモデルと対照的である。したがって、インテグリンとGPIとの相互作用をアンタゴニストによって阻害することは、白血球受容体生物学に関連した臨床状態、特に敗血症、関節炎および虚血再潅流傷害の治療において有用である。
【００９６】
したがって、GPI-インテグリン相互作用の促進または阻害は、(i)外傷に続発する神経、脊髄、もしくは中枢神経系の損傷、年齢に関連した記憶喪失および神経変性疾患を含む自己免疫もしくは代謝の変化、または脳卒中に続発する虚血後損傷もしくは移植後合併症の治療；(ii)感染症、アルコール/薬物乱用、薬物感受性、または自己免疫によって引き起こされる肝臓損傷の治療；(iii)手術もしくは外傷、または虚血もしくは自己免疫によって誘発される組織損傷の後の創傷治癒を促進するためのFGFおよびEGF様の活性；(iv)副腎萎縮を伴う疾患状態、例えば結核の治療；(v)造血の促進および細胞分化の制御のため；(vi)適切な脂質組成を有するGPIが適切なアポトーシスもしくは細胞死のシグナルを与え、または細胞増殖を下方制御するのに役立つ癌および新形成の治療のため、に有用である。
【００９７】
したがって、本発明の他の局面は、GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、異常なインテグリン介在性細胞活性を特徴とする状態の治療および/または予防のための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法を対象としている。
【００９８】
より具体的には、本発明は、GPIとインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、異常なαβインテグリン介在性細胞活性を特徴とする状態の治療および/または予防のための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される方法を対象としている。
【００９９】
一つの好ましい態様において、該GPIは完全なGPIである。
【０１００】
他の好ましい態様において、該GPIはGPIイノシトールグリカンドメインである。
【０１０１】
好ましくは、該調節は、本明細書において先に記述したような作用物質の投与を介して実施される。
【０１０２】
「異常な」細胞活性への言及は、過活動な細胞活性、望ましくないという点で不適切である生物学的に正常な細胞活性、または不十分な細胞活性への言及として理解されるべきである。例えば、プリオン感染を特徴とする神経変性疾患は、天然のタンパク質を異常型に転換するGPI-インテグリンを介した触媒作用を伴うことが公知である。プリオンはすべてGPIタンパク質である。このような状況においては、このような活性を下方制御することが望ましい。さらに別の実施例においては、II型糖尿病においてインスリンシグナル伝達を治療的に増強すること(またはII型糖尿病を発症しやすい患者において予防的にそのようにすること)が望ましい。別の実施例では、GPIシグナル伝達を介してその増強作用を調節することによってサイトカインの活性を上方または下方制御することが望ましい場合がある。これは、炎症性の状態において特に有用となり得る。
【０１０３】
したがって、一つの好ましい態様において、本発明は、GPIとαβインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含み、インテグリンがインスリン受容体と同じ細胞上で発現される、II型糖尿病の治療および/または予防のための方法であって、該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることによりインスリンシグナル伝達が増強される方法を対象としている。
【０１０４】
他の好ましい態様において、本発明は、プリオンGPIとαβインテグリンとの機能的相互作用を調節する段階を含む、プリオンに関連した神経変性状態を治療的および/または予防的に処置するための方法であって、該相互作用の拮抗により、天然タンパク質を異常型に転換するプリオンに関連した触媒作用が下方制御される方法を対象としている。
【０１０５】
これらの好ましい態様によれば、該GPIは完全なGPIである。
【０１０６】
本明細書において使用される「哺乳動物」という用語は、ヒト、霊長類、家畜動物(例えばヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ)、実験用試験動物(例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット)、伴侶動物(例えばイヌ、ネコ)および捕獲した野生動物(例えばキツネ、カンガルー、シカ)を含む。好ましくは、哺乳動物はヒトまたは実験用試験動物である。さらにより好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０１０７】
「有効量」とは、少なくともある程度所望の応答を達成するのに、あるいは発症を遅延させもしくは進行を抑制し、または治療しようとする特定の状態の発症もしくは進行を完全に停止させるのに必要な量を意味する。この量は、治療される個体の健康および身体の状態、治療される個体の分類学的群、所望の保護の程度、組成物の処方、医学的状況の評価、および他の関連する因子に応じて変動する。この量は、ルーチンな試験によって測定され得る比較的広い範囲に及ぶであろうことが予想される。
【０１０８】
本明細書における「治療」および「予防」への言及はその最も広い文脈において考慮されるべきである。「治療」という用語は、被験体が完全に回復するまで治療されることを必ずしも意味しない。同様に、「予防」は、被験体が最終的に疾患状態に陥らないことを必ずしも意味しない。したがって、治療および予防は、特定の状態の症状の改善、または特定の状態を発症するリスクを防止もしくはそうでなければ低減させることを含む。「予防」という用語は、特定の状態の重症度または発症を低減させることとみなされ得る。「治療」もまた、存在する状態の重症度を低減させ得る。
【０１０９】
本発明はさらに、他の治療計画にその哺乳動物を供すると共に作用物質を投与するなど治療法の組合せも企図する。例えば、重度のII型糖尿病に罹患している患者は、本発明の作用物質およびインスリンの組合せによって治療され得る。
【０１１０】
薬学的組成物の形態での調節物質の投与は、任意の従来手段によって実施され得、かつ個々の調節物質の性質に応じて変わると考えられる。薬学的組成物の調節物質は、個々の症例に応じて変わる量で投与された場合に治療活性を示すことが企図される。この変化量は、例えばヒトまたは動物および選択される調節物質に応じて変わる。広範囲の用量が適用可能となり得る。
【０１１１】
患者を考慮すれば、例えば、1日当たり体重1キログラム当たり約0.1μg〜約1μgの調節物質が投与され得る。用量計画は、最適な治療応答を提供するように調整され得る。例えば、幾つかに分割した用量を毎日、毎週、毎月、または他の適切な時間間隔で投与してよく、または状況の緊急性によって、適応するように用量を比例的に減少させてもよい。
【０１１２】
調節物質は、経口、静脈内(水溶性の場合)、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内、もしくは坐剤の経路または植込錠(例えば徐放分子を用いる)によってなど簡便な方式で投与され得る。調節物質は、酸付加塩または例えば亜鉛、鉄などとの金属錯体(本出願の目的のための塩としてみなされる)など薬学的に許容される非毒性塩の形態で投与され得る。このような酸付加塩の例は、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩などである。有効成分が錠剤の形態で投与される場合は、錠剤は、トラガント、トウモロコシデンプン、またはゼラチンなどの結合剤；アルギン酸などの崩壊剤；およびステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤を含んでよい。
【０１１３】
投与経路には、人工呼吸器、気管内、鼻咽頭、静脈内、腹腔内、皮下、頭蓋内、皮内、筋肉内、眼内、くも膜下腔内、脳内、鼻腔内、輸注、経口、直腸、点滴静注パッチ、および植込錠が含まれるがこれらに限定されない。
【０１１４】
これらの方法によって、本発明によって定義される作用物質は、1種または複数種の他の化合物または分子と共に併用投与され得る。「併用投与される」とは、同じもしくは異なる経路を介した同じ製剤もしくは2種の異なる製剤における同時投与、または同じもしくは異なる経路による逐次投与を意味する。例えば、対象の作用物質は、その効果を増大させるためにアゴニスト的物質と共に投与され得る。「逐次」投与とは、2つのタイプの分子を投与する間の秒、分、時間、または日レベルの時間差を意味する。これらの分子は、任意の順序で投与され得る。
【０１１５】
本発明の別の局面は、哺乳動物における異常なインテグリン介在性細胞活性を特徴とする状態を治療するための薬剤の製造における、本明細書において先に定義した作用物質の使用であって、該作用物質がGPIとインテグリンとの相互作用を調節し、かつ該相互作用を誘導またはそうでなければ作動させることにより該細胞活性が上方制御され、かつ該相互作用を阻害またはそうでなければ拮抗することにより該細胞活性が下方制御される使用を企図する。
【０１１６】
好ましくは、該インテグリンはαβインテグリンである。
【０１１７】
一つの好ましい態様において、該GPIは完全なGPIである。
【０１１８】
他の好ましい態様において、該GPIはGPIイノシトールグリカンドメインである。
【０１１９】
さらにより好ましくは、該状態がII型糖尿病であり、かつインテグリン介在性細胞活性の該調節がインスリンシグナル伝達の増強作用であり、または該状態がプリオンによって誘発された神経変性状態であり、かつインテグリン介在性細胞活性の該調節が天然タンパク質を異常型に転換するプリオンに関連した触媒作用の下方制御である。
【０１２０】
さらに別の局面において、本発明は、本明細書において先に定義した調節物質を1種または複数種の薬学的に許容される担体および/または希釈剤と共に含む薬学的組成物を企図する。該作用物質は、有効成分と呼ばれる。
【０１２１】
注射用途に適した薬剤形態には、無菌水溶性液剤(水溶性の場合)もしくは分散剤、および無菌の注射液剤もしくは分散剤を即時調製するための無菌粉末が含まれ、またはクリーム剤の形態もしくは局所適用に適した他の形態でもよい。これは製造および保管時の条件下で安定でなくてはならず、かつ細菌および真菌類などの微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液状ポリエチレングリコールなど)、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒体でよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどの被覆剤の使用によって、分散系の場合は必要な粒径の維持によって、およびスーパーファクタント(superfactant)の使用によって維持され得る。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって実現され得る。多くの場合、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましいと考えられる。注射用組成物の持続性の吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中で使用することによって実現され得る。
【０１２２】
無菌の注射液剤は、必要に応じて上記に列挙した様々な他の成分と共に、適切な溶媒中に必要な量の活性化合物を混合し、続いてろ過滅菌することによって調製される。一般に、分散剤は、基本となる分散媒体および上記に列挙したもののうち必要な他の成分を含む無菌ビヒクル中に滅菌した様々な活性成分を混合することによって調製される。無菌注射液剤を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥技術であり、これらでは、活性成分および任意の付加的な所望の成分の予め滅菌ろ過した溶液からその粉末が生じる。
【０１２３】
これらの有効成分が適切に保護される場合、例えば不活性な希釈剤と共にまたは吸収可能な可食性担体と共にそれらを経口投与してよく、または硬いもしくは軟らかい殻のゼラチンカプセル剤中に封入してよく、または圧縮して錠剤にしてもよく、または食餌の食品に直接混合してもよい。経口的な治療的投与の場合、活性化合物を賦形剤と混合し、経口摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤などの形態で使用してよい。このような組成物および調製物は、少なくとも1重量%の活性化合物を含むべきである。当然、組成物および調製物の比率は変動してよく、かつ好都合には単位重量の約5〜約80％の間でよい。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な投与量が得られると考えられるような量である。本発明による好ましい組成物および調製物は、経口単位剤形が約0.1μg〜2000mgの活性化合物を含むように調製される。
【０１２４】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などはまた、以下に挙げるような成分も含み得る：ゴム、アカシア、トウモロコシデンプン、もしくはゼラチンなどの結合剤；リン酸2カルシウムなどの賦形剤；トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの滑沢剤；およびスクロース、ラクトース、もしくはサッカリンなどの甘味剤を添加してよく、またはペパーミント、ヒメコウジ油、もしくはサクランボ香味料などの矯味剤。単位剤形がカプセル剤である場合、上記のタイプの材料に加えて液状担体も含んでよい。他の様々な材料が、被覆剤としてまたは単位用量の物理的形態を別の方法で改変するために存在してよい。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤は、セラック、糖、またはその双方で被覆され得る。シロップ剤またはエリキシル剤は、活性化合物、甘味剤としてのスクロース、保存剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、ならびにサクランボまたはオレンジ風味の矯味剤を含み得る。当然、任意の単位剤形を調製するのに使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、かつ使用される量において実質的に無毒性であるべきである。さらに、1種または複数種の活性化合物は、持続放出性の調製物および製剤中に組み込まれ得る。
【０１２５】
薬学的組成物はまた、調節物質をコードしている核酸分子を有する、標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターなどの遺伝的分子も含んでよい。ベクターは、例えばウイルスベクターでもよい。
【０１２６】
本発明のさらに別の局面は、本発明の方法において使用される場合の、本明細書において先に定義した作用物質に関する。
【０１２７】
本発明のさらに別の局面は、GPIおよび/またはインテグリンまたはその機能的等価物もしくは誘導体を含む試験系を推定上の作用物質に接触させる段階、ならびに調節された機能的相互作用に関してスクリーニングする段階を含む、GPIとインテグリンまたはその機能的等価物もしくはその誘導体との相互作用を調節することができる作用物質を検出するための方法を提供する。
【０１２８】
「GPI」および「インテグリン」への言及は、GPIもしくはインテグリン発現産物、またはインテグリンタンパク質のGPI結合領域などGPIもしくはインテグリン分子の一部分もしくは断片のいずれかへの言及として理解されるべきである。
【０１２９】
「試験系」への言及は、受容体とそのリガンドの間の相互作用を調節することができる作用物質をスクリーニングするための手段を提供する任意の適切なインビトロまたはインビボの系への言及として理解されるべきである。好ましくは、この系は、推定上の調節物質のハイスループットなスクリーニングを容易にするインビトロの系である。これに関して、試験系は、物理的または機能的レベルのいずれかまたは双方でスクリーニングし得る。例えば、これは、GPIとインテグリンの物理的相互作用の調節に関してのみスクリーニングし得、または関連するインテグリン介在性細胞活性の調節など、機能的読取りに基づいて相互作用の調節に関してスクリーニングし得る。このようなスクリーニング技術は、本明細書において先に詳述した。それでもなお、この方法による検出の対象である「作用物質」は、GPIとインテグリンの間の相互作用を、これらの分子のうちの1種もしくは双方に適切に結合することによって作動させもしくは拮抗するものでよく、またはそれは、関連するGPIまたはインテグリン分子を模倣し、もしくは実際に相当するものでよいこともまた理解されるべきである。この後者の局面は、様々なインテグリン受容体に対するリガンドの役割を果たすGPIを正確に同定するためにGPIおよびインテグリン分子のパネルをスクリーニングする場合に特に重要である。
【０１３０】
以下の非限定的な実施例を参照することによって、本発明をさらに記述する。
【０１３１】
実施例1
完全なGPI(グリカンに加えて脂肪酸)によって提供される2シグナルメカニズムが同定された。この最小の「2シグナル」メカニズム(付加的なシグナルを除外しない)において、GPIグリカンは、グリカンに特異的な受容体として機能するインテグリンに結合する(図13)。これらは、初めから「ラフト」内に位置していてもよく、またはGPIグリカンへの結合後にこれらの構造体に移行してもよい。グリカン/インテグリンのペアには特異性が存在する。すなわち、生理学的かつ薬理学的に適切な濃度でも、すべてのGPIグリカンがすべてのインテグリンに結合するわけではないと考えられる。GPIグリカン構造を改変すると、一連のインテグリンに結合する親和力がより高くまたは低くなり得る。グリカンの結合は、srcキナーゼおよびMAPキナーゼカスケードのメンバーを伴うシグナル伝達プロセスを開始させる。結合後、脂質付加されたGPIはまた、ホスホリパーゼによって加水分解されて、単独およびインテグリン介在性シグナルとの相乗作用の双方で作用して下流の代謝および遺伝子発現のエンドポイントを促進する脂質性セカンドメッセンジャーを生成し得る(図13)。
【０１３２】
脂質に由来するシグナルは、脂質付加されたGPIからインテグリンへの結合後に生成され得るが、インテグリンに結合する単独のGPIグリカンは少なくともいくつかの生物学的に重要なシグナルおよび細胞応答を生じさせることができる。
【０１３３】
グリカンおよび脂質ドメインの双方の構造の変異に応じたシグナル伝達および薬理学的活性の特異性が証明された。例えば、ニューロンに由来するGPIの天然の構造に基づいて化学合成したGPIは、神経組織においてシグナルを発し、かつNGFの活性を増強することができるが、マクロファージを活性化できるより単純なグリカンを有するGPIのエタノールアミン-リン酸-6Manα1-2Manα1-6Manα1-4GlcN1-6-イノシトールとは異なり、マクロファージにおいてはほとんど活性を有さないことが示された。これは、グリカンの組成に応じた作用の組織特異性を示唆する。同様に、単純なグリカンを有するが脂肪酸組成が異なるGPIは、標的細胞に対して非常に異なる効果を有し、これは脂質組成に応じた作用特異性を証明する。グリカン組成に応じた作用の特異性は、異なる組織における様々なインテグリン受容体の示差的発現を反映している。
【０１３４】
GPI受容体としてインテグリンを同定することにより、受容体のアゴニスト活性についてのコンビナトリアルライブラリーおよび天然または合成産物のスクリーニングが容易になり、その際、これらの活性はGPIまたはIPGの生物学的諸特性を反映する。例えば、精製されたまたは細胞表面上で発現させられた組換えインテグリンは、炭水化物もしくはペプチド組成物からなるコンビナトリアルライブラリーの結合を測定するため、または細胞応答への影響など所望の生物学的エンドポイントをスクリーニングするためのマルチアレイスクリーニング法を含むアッセイ法において使用される。このようなアッセイ法は、様々な候補物の受容体に対する親和力を測定するためにプラズモン共鳴または類似の方法を使用する。同様に、インテグリンおよび変異型で細胞または動物をトランスフェクションすると、細胞シグナル伝達の特定の特性および薬理学的用法を有する変種のIPGまたはGPI構造体の候補物をさらに同定することが可能となる。グリカンに特異的な受容体ドメインを含む組換えインテグリンは、同定可能なシグナルを生成することができるレポーター分子に結合もしくは融合され、推定上リガンドを含む化学的もしくは生物学的試料に接触させられ、かつ結合に関してスクリーニングされる。別の実施例では、インテグリンまたはグリカン結合部位を含む断片もしくは誘導体は固定化され、かつ推定上のリガンドのアフィニティー精製のために使用される。推定上のリガンドの受容体への結合はまた、プラズモン共鳴または類似の方法によって測定される。
【０１３５】
本明細書において記述する本発明には、具体的に記述したもの以外の変更や修正の余地があることが、当業者には理解されよう。本発明は、すべてのこのような変更および修正を含むことを理解されたい。本発明はまた、本明細書において言及または記述される段階、特徴、組成物、および化合物のすべてを個別にまたはまとめて含み、かつ該段階または特徴の任意の2つもしくはそれ以上の任意およびすべての組合せを含む。
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【図面の簡単な説明】
【０１３６】
【図１】GPIアンカー型タンパク質が細胞中にシグナルを伝達し得るメカニズムに関する2つの競合する見解の概略図を示す。従来の解釈は、GPIアンカー型タンパク質のタンパク質成分が、シグナル伝達をすることができる膜貫通ドメインおよび細胞質内ドメインを有するシグナル伝達パートナーに対する結合特異性を有していると考える(右側に示す)。本発明者らはさらに、GPIアンカーそれら自体が、シグナルを細胞中に伝達するインテグリンに結合することを提唱する(左側に示す)。さらに、同様のシグナル伝達が、「遊離の」細胞表面GPIおよび外来起源のGPIのインテグリンへの結合を介して生じ得る。
【図２】指定された合成グリカンの略図を示す。
【図３】グリカンをBSAキャリアタンパク質に結合させるのに使用される方法を示す。システインをグリカンの代わりに用いる偽の結合手順もまた使用された。
【図４】FACS解析によって検出された、CR3またはMac-1としても公知のαMβ2インテグリンでトランスフェクトされたCHO細胞への蛍光標識されたBSA-GPI-グリカンの結合(11.5%)、および蛍光標識されたBSA-システインの低レベルの結合(0.69%)、ならびに偽のトランスフェクトされたCHO細胞(CHO-Neo)への双方の構築体の低レベルの結合を示すヒストグラムを提示する。2番目の図で示されるCHO-Neo細胞への蛍光標識されたBSA-GPI-グリカンの結合のわずかな増加(0.4％に対して5.08%)は、CHO-Neo細胞中で構成的に発現されるMac-1以外のインテグリンへの結合を反映している可能性がある。
【図５】リン酸化ERK特異的抗体を用いたウェスタンブロットによって測定した、精製の様々な段階のGPIがCHO-Mac1細胞中のERKを活性化する能力を、対照のCHO-Neoと比較して示す。アニソマイシンはERK活性化の対照として使用されている。
【図６】リン酸化MEKおよびリン酸化PKCの特異的抗体を用いたウェスタンブロットによって測定した、CHO-Mac1細胞における精製された天然GPIによるMEKおよびPKCの活性化の経時変化を、対照のCHO-Neoと比較して示す。
【図７】リン酸化ERK特異的抗体を用いたウェスタンブロットによって測定した、CHO-Mac1細胞中のERKの活性化における遊離GPIおよび徹底的なプロナーゼ消化によってGPIアンカー型タンパク質から誘導されるGPI(セリン結合GPI)の用量反応を、対照のCHO-Neoと比較して示す。
【図８】CHO-Mac1細胞は、100nMのGPIに曝露されて10分以内に微小繊維および仮足の形成を伴う急速な細胞骨格再編成を受けることを示す。
【図９】GPI(下の2つの図)または培地(上の図)に10分間曝露させ、次いで固定し、かつFITC標識抗インテグリン抗体(CD18)またはファロイジン(赤)で染色したCHO-Mac1細胞を示す。培地に曝露された細胞と比較して、GPIに曝露された細胞は、リガンド結合後のインテグリンの再局在化と一致する、Mac1分布のはるかに顕著な点状(punctuate)パターンを示していることが明らかである。
【図１０】現在公知のインテグリン鎖の一覧である。
【図１１】αおよびβインテグリン鎖の現在理解されている会合を示す。
【図１２】インテグリン-リガンド結合が起こると活性化される下流のシグナル伝達プロセスのうちのいくつかを示す概略図である。
【図１３】インテグリンへの結合後のGPI活性に関する本発明者らの2シグナルモデルを概説する概略図である。
【図１４】グリカン合成の概略図である。1.試薬：a.4、AgOTf、NIS、CH2Cl2/Et2O(38%a)；b.NaOMe、CH2Cl2/MeOH(83%)；c.6、TMSOTf、CH2Cl2(75%)；d.NaOMe、CH2Cl2/MeOH(71%)；e.7、TMSOTf、CH2Cl2(92%)；f.NaOMe(69%)；g.8、TBSOTf、CH2Cl2(98%)；h.NaOMe(83%)；i9、TMSOTF、CH2Cl2(84%)；j.(CH2OH)2、CSA、CH3CN(81%)；k.Cl2P(O)OMe,Pyr.(88%)；l、TBAF、THF(61%)；m、11、テトラゾール、CH3CN；n.t-BuOOH,CH3CN(84%、2段階)；o.DBU、CH2Cl2；P.Na、NH3、THF(75%,2段階)。(AgOTf、トリフルオロメタンスルホン酸銀；NIS、N-ヨードスクシンイミド；CH2Cl2、ジクロロメタン、Et2O、ジエチルエーテル；NaOMe、ナトリウムメトキシド；MeOH、メタノール；TMFOTf、トリメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート；TBSOTf、tert-ブチルジメチルシリルトリフルオロメタンスルホナート；CSA、カンファースルホン酸；CH3CN、アセトニトリル；Cbz、カルボベンジルオキシ；Pyr、ピリジン；TBAF、テトラブチルアンモニウムフルオリド；THF、テトラヒドロフラン；DBU、1,8-ジアザビシクロ[5,4,0]ウンデカ-7-エン；Obn、O-ベンジル)
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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