(57)【要約】  本発明は、ペプチド配列Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｐ−Ｚｎ、或いはその薬学的又は生理学的に許容される塩を含有する腫瘍ターゲッティング単位に関する。本発明はまた、少なくとも１種のエフェクター単位に直接に、又は間接的にカプリングされている少なくとも１種の本発明によるターゲッティング単位を含有する腫瘍ターゲッティング剤に関する。本発明はさらにまた、本発明による少なくとも１種のターゲッティング単位又は少なくとも１種のターゲッティング剤を含有する診断組成物又は医薬組成物に関し、及び本発明によるターゲッティング単位又はターゲッティング剤の癌又は癌関連疾病を処置するための、特に非小細胞肺癌又はその転移体を処置するための医薬の製造における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ペプチド配列：
Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｐ−Ｚｎ
式中、
Ｘはアラニン、セリン又はホモセリン、或いはその構造的又は機能的類縁体であり；
Ｒはアルギニン又はホモアルギニン、或いはその構造的又は機能的類縁体であり；
Ｙはアルギニン、ホモアルギニン、アラニン、ロイシン、セリン、ホモセリン、バリン又はプロリン、或いはその構造的又は機能的類縁体であり；或いは
Ｒ及びＹは一緒になって、アルギニン又はホモアルギニンの少なくとも１種の光学異性体、或いは少なくとも１個のグアニル又はアミジノ基、或いは非局在化陽電荷を有するか、又はプロトン化を経て非局在化陽電荷を得ることができる関連基を含有するその構造的又は機能的類縁体であるか、又はこれらを包含する単位を構成しており；
Ｐはプロリン又はその構造的又は機能的類縁体であり；
Ｚはいずれかのアミノ酸残基であり、ここで各Ｚｎは相違していてもよく、類似していてもよく、又は同一であってもよく；及び
ｎは０〜７の整数である；
を含有するターゲッティング単位、或いはその薬学的に又は生理学的に又は診断的に許容される塩であって、上記単位が腫瘍に対し特異的に標的を定めるものであることを特徴とするターゲッティング単位。
【請求項２】
上記腫瘍が肺癌腫瘍である、請求項１に記載のターゲッティング単位。
【請求項３】
上記肺癌が非小細胞肺癌腫瘍である、請求項１又は２のいずれかに記載のターゲッティング単位。
【請求項４】
Ｘがアラニン或いはその構造的又は機能的類縁体である、請求項１〜３のいずれかに記載のターゲッティング単位。
【請求項５】
Ｘがセリン或いはその構造的又は機能的類縁体である、請求項１〜３のいずれかに記載のターゲッティング単位。
【請求項６】
Ｙがアルギニン或いはその構造的又は機能的類縁体である、請求項１〜５のいずれかに記載のターゲッティング単位。
【請求項７】
Ｙがアラニン或いはその構造的又は機能的類縁体である、請求項１〜５のいずれかに記載のターゲッティング単位。
【請求項８】
ｎが０〜６である、請求項１〜７のいずれかに記載のターゲッティング単位。
【請求項９】
ｎが０〜５である、請求項８に記載のターゲッティング単位。
【請求項１０】
ｎが０〜４である、請求項９に記載のターゲッティング単位。
【請求項１１】
ｎが０〜３である、請求項１０に記載のターゲッティング単位。
【請求項１２】
ｎが０である、請求項１１に記載のターゲッティング単位。
【請求項１３】
該ペプチドが直鎖状である、請求項１〜１２のいずれかに記載のターゲッティング単位。
【請求項１４】
該ペプチドが環状であるか、又は環状構造の一部分を構成している、請求項１〜１２のいずれかに記載のターゲッティング単位。
【請求項１５】
配列番号１〜配列番号７３により同定されるペプチドからなる群から選択される、請求項１〜１４のいずれかに記載のターゲッティング単位。
【請求項１６】
ＡＲＲＰＫＬＤ（配列番号：１）、ＳＲＲＰＫＬＤ（配列番号：６５）、ＡＲＲＰ（配列番号：６６）、ＳＲＡＰ（配列番号：６７）、ＡＲＡＰ（配列番号：６８）、ＳＲＶＰ（配列番号：６９）、ＳＲＬＰ（配列番号：７０）、ＡＲＬＰ（配列番号：７１）、ＡＲＰＰ（配列番号：７２）、ＳＲＲＰ（配列番号：７３）からなる群から選択される、請求項１５に記載のターゲッティング単位。
【請求項１７】
少なくとも１種のエフェクター単位に、直接的に又は間接的にカプリングされている請求項１〜１６のいずれかに記載のターゲッティング単位の少なくとも１種を含有する腫瘍ターゲッティング剤。
【請求項１８】
該エフェクター単位が直接的又は間接的検出剤又は治療剤である、請求項１７に記載の腫瘍ターゲッティング剤。
【請求項１９】
該検出剤がキレーター、金属複合体、濃縮同位元素、放射性物質、常磁性物質、親和性標識、又は蛍光或いは発光標識を包含する、請求項１８に記載の腫瘍ターゲッティング剤。
【請求項２０】
該検出剤が希土類金属を包含する、請求項１８に記載の腫瘍ターゲッティング剤。
【請求項２１】
該検出剤がベータ−又はアルファ−発射物質を包含する、請求項１８に記載の腫瘍ターゲッティング剤。
【請求項２２】
該検出剤がガドリニウム又はユーロピウムを包含する、請求項１８に記載の腫瘍ターゲッティング剤。
【請求項２３】
該治療剤が細胞毒性物質、細胞増殖抑制物質及び放射線発射性物質からなる群から選択される、請求項１８に記載の腫瘍ターゲッティング剤。
【請求項２４】
該治療剤がパクリタキセル、ビノレルビン、イリノテカン、シスプラチン、カルボプラチン、ドキソルビシン、ドーノルビシン、メトトレキサート、ゲムシタビン、アルファ−又はベータ−発射物質又はホウ素を包含する、請求項２３に記載の腫瘍ターゲッティング剤。
【請求項２５】
少なくとも１種の任意の単位をさらに含有する、請求項１７〜２４のいずれかに記載の腫瘍ターゲッティング剤。
【請求項２６】
少なくとも１種の請求項１〜１６のいずれかに記載のターゲッティング単位、又は少なくとも１種の請求項１７〜２５のいずれかに記載のターゲッティング剤を含有する診断組成物又は医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１〜１６のいずれかに記載のターゲッティング単位、又は請求項１７〜２５のいずれかに記載のターゲッティング剤の治療における使用。
【請求項２８】
請求項１〜１６のいずれかに記載のターゲッティング単位、又は請求項１７〜２５のいずれかに記載のターゲッティング剤の診断における使用。
【請求項２９】
請求項１〜１６のいずれかに記載のターゲッティング単位、又は請求項１７〜２５のいずれかに記載のターゲッティング剤の癌又は癌関連疾病の処置用医薬の製造における使用。
【請求項３０】
該癌又は癌関連疾病が固形体腫瘍又はその転移体である、請求項２９に記載の使用。
【請求項３１】
該固形体腫瘍が非小細胞肺癌又はその転移体である、請求項３０に記載の使用。
【請求項３２】
請求項１〜１６のいずれかに記載のターゲッティング単位、又は請求項１７〜２５のいずれかに記載のターゲッティング剤の癌又は癌関連疾病の診断用診断組成物の製造における使用。
【請求項３３】
癌又は癌関連疾病の処置方法であって、請求項２６に記載の医薬組成物の治療有効量を、その必要性を有する患者に付与することを包含する処置方法。
【請求項３４】
該癌又は癌関連疾病が肺癌又はその転移体である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該固形体腫瘍が非小細胞肺癌又はその転移体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
癌又は癌関連疾病の診断方法であって、請求項２６に記載の医薬組成物の診断に適する量を、その必要性を有する患者に付与することを包含する診断方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明はターゲッティング剤、特に腫瘍ターゲッティング剤、例えば肺腫瘍、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）ターゲッティング剤に関し、該ターゲッティング剤は少なくとも１種のターゲッティング単位及び少なくとも１種のエフェクター単位を含有する。本発明はまた、腫瘍ターゲッティング単位及びそのモチーフ、例えば肺腫瘍及びＮＳＣＬＣターゲッティング単位及びそのモチーフに関する。さらにまた、本発明はこのようなターゲッティング剤又はターゲッティング単位を含有する医薬組成物及び診断組成物に関し、さらにまた本発明はこのようなターゲッティング剤及びターゲッティング単位を薬学的又は診断的用具として使用することに関する。本発明はさらに、このようなターゲッティング剤及びターゲッティング単位を医薬組成物又は診断組成物の製造に使用することに関する。さらにまた、本発明は癌、例えば肺癌、特に非小細胞肺癌を診断又は処置するためのキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
悪性腫瘍は、中でも人間及び動物にとって最大の健康上の問題であり、最も一般的な死亡原因であり、また中でも若年の個人にとって最大の健康上の問題である。利用可能な癌の処置方法は、数十年にわたる徹底的努力にもかかわらず全く制限されている。治療的処置、通常化学療法及び／又は放射線治療と組み合わされた手術は時には有効であるが、悪性腫瘍は依然として、毎年、無限数の生命を必要としている。実際に、治療的処置は、病気を初期に診断できない場合にはほとんど達成されない。さらに、或る種の癌はあるとしても、治療することができる場合は稀である。
【０００３】
この非常に望ましくない状況には種々の理由があり、最も重要な理由は大部分の処置計画が、手術を除いて、充分な選択性に欠けているという事実にあることは明白である。慣用されている化学療法剤は腫瘍の悪性細胞のみに作用せず、その他の細胞に対して、特に例えば造血細胞及び上皮細胞などの急速に分裂する種類の細胞に対して高度に毒性であり、格別に望ましくない副作用をもたらす。同じことが放射線治療にも当てはまる。
【０００４】
さらに、２つの主要問題が悪性固形体腫瘍の手術に頼らない処置を困難にしている。腫瘍内部の生理学的障壁は、全部の癌細胞への有効濃度の治療剤の供給を妨害し、また遺伝子的及び後天的メカニズムから生じる後天的医薬耐性は利用できる医薬の効果を減少させる。
また、患者の継続管理を包含する癌及び転移（ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ）の診断及び腫瘍及び転移に対する処置の効果の研究において、信頼でき、感受性であり、またさらに選択的である方法及び薬剤は格別に有利である。現時点で使用されている方法の全部、例えば核磁気共鳴造影法、Ｘ線法、組織学的染色法などは依然として、腫瘍組織、転移腫瘍組織又は腫瘍細胞に対する、及び／又は腫瘍内皮に対する特異的又は選択的検出にかかわり実在に標的を定めることができる薬剤に欠けている。
【０００５】
肺癌は男性及び女性の両方において癌関連死亡の先導的要因である。非小細胞肺癌（ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）は、全肺癌の８０％近くにのぼり、小細胞肺癌（ｓｍａｌｌ  ｃｅｌｌ  ｌｕｎｇ  ｃａｎｃｅｒ）は、全肺癌の２０％近くにのぼる。肺癌と診断された患者の１０％のみが５年以上生存するものと推定されている。多くの場合、診断時に、癌はすでに広がっており、唯一の効果的処置である手術による処置も不可能である。さらに、手術的に治療段階にある癌患者は数種の別の病気を患っており、これが外科手術を不可能にする。早期診断は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の処置の成功にとって必須である。現時点まで、早期診断には問題が多く、スパイラルコンピュータ断層造影法（ｓｐｉｒａｌ  ｃｏｍｐｕｔｅｒ  ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ）が唯一の満足すべき結果をもたらす方法である。しかしながら、スパイラルＣＴは方法として高価であり、また判別試験として実用的でない。
【０００６】
常習的治療（手術、化学療法及び放射線治療）を受けた患者の長期間生存率はわずかである。進行したＮＳＣＬＣの処置にプラチナ含有医薬と組合わせて使用されている現時点の治療剤、例えば有糸分裂抑制剤（パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）及びドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）などのタキサン類）、代謝拮抗剤（ゲムシタビン（ｇｅｍｓｉｔａｂｉｎｅ））、ビンカアルカロイド類（ビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ））、及びトポイソメラーゼ阻害剤（イリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎｅ））などは治療効果の閾値に達している。
【０００７】
肺腫瘍の細胞に対し特異的であるモノクローナル抗体は、肺癌処置用のターゲッティング剤として臨床的有望性を示している。しかしながら、２つの事実、すなわち大きいサイズ及び肝臓及び網内皮系による抗体分子の非特異的吸収に基づいて、抗体−ターゲッティング治療にはいくつかの主要な限界が存在する。サイズが大きいことは抗体医薬の貧弱な腫瘍浸透をもたらし、またしばしば免疫応答を生じる。他方、肝臓及び網内皮系による非特異的吸収は肝臓及び骨髄に対する投与量制限性毒性をもたらす。
【０００８】
ターゲッティングペプチドはヒト癌の標的を定めた処置のための優れた代替物質であり、またサイズが比較的小さいことから、これらは抗体ターゲッティングに付随する問題のいくつかを克服することができる。ペプチドの利点には次の利点がある：より大きい安定性、ペプチドは数週間にわたり室温で保存することができる；製造費用が安価である（合成製造対組換え製造）；迅速な薬物動態；変化させることができる排泄経路；及び最終ターゲッティング剤の量あたりでより高い活性。
【０００９】
タイプが相違する細胞及び組織に帰巣するペプチドを開示する多くの刊行物が存在する。これらのいくつかは癌ターゲッティングペプチドとして有用であると主張されている。開示された中で、最も初期に同定された帰巣性ペプチドはＲｕｏｓｌａｈｔｉ等により、例えば米国特許第６，１８０，０８４号に記載されたＮＧＲ−レセプターターゲッティングペプチド及びインテグリンである。
国際特許公開ＷＯ００／１２７３８は異種遺伝子放出用の標的を定めたアデノウイルスベクターを開示している。この開示されているベクターは、例えばＮＱＮＳＲＲＰＳＲＡなどのペプチド配列を含有するものとして開示されており、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーターレセプター（ＵＰＡＲ）を標的としている。
【００１０】
国際特許公開ＷＯ０２／０２０８２２は選択的に結合するペプチドを同定するための、例えばＣＳＲＲＰＥＶＶＣによるバイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）方法を開示している。ＣＳＲＲＰＥＶＶＣは間葉幹細胞に標的を定めるものと主張されている環状ペプチドである。
ＮＳＣＬＣ細胞に対し特異的に標的を定めるペプチドが同定されたことを開示する刊行物は存在していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
従って、ＮＳＣＬＣの診断及び治療に有用なターゲッティング剤が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の簡単な説明）
本発明は、肺癌、さらに特に非小細胞肺腫瘍に標的を定める腫瘍ターゲッティング単位に関し、該ターゲッティング単位はペプチド配列Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｐ−Ｚｎ、或いはその薬学的又は生理学的に許容される塩又は誘導体を含有する。上記配列において、Ｘはアラニン、セリン又はホモセリン、或いはその構造的又は機能的類縁体であり；Ｒはアルギニン又はホモアルギニン、或いはその構造的又は機能的類縁体であり；Ｙはアルギニン、アラニン、ロイシン、セリン、バリン又はプロリンであり；Ｐはプロリン又はその構造的又は機能的類縁体であり；Ｚはいずれかのアミノ酸残基であり、ここで各Ｚｎは相違していてもよく、類似していてもよく、又は同一であってもよく；及びｎは０〜７の整数である。本発明によるターゲッティング単位は直鎖状又は環状であることができ、或いは環状構造の一部分を構成していることができる。本発明はさらに、少なくとも１種のエフェクター単位に直接的又は間接的にカプリングしている少なくとも１種の本発明によるターゲッティング単位を含有する腫瘍ターゲッティング剤に関する。好ましくは、このエフェクター単位は直接的又は間接的検出剤又は治療剤である。
【００１３】
本発明はさらにまた、少なくとも１種の本発明によるターゲッティング単位又は少なくとも１種の本発明によるターゲッティング剤を含有する医薬組成物又は診断組成物に関し、さらにまた本発明は本発明によるターゲッティング単位又はターゲッティング剤を癌又は癌関連疾病を処置するための、特に非小細胞肺癌又はその転移体を処置するための医薬の製造に使用することに関する。
本発明はさらにまた、非小細胞肺癌又はその転移体を処置するために、治療有効量の本発明による医薬組成物を、その必要性を有する患者に付与することによって癌又は癌関連疾病を処置する方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
（発明の詳細な説明）
本発明の目的は新規腫瘍ターゲッティング剤を提供することにあり、このターゲッティング剤は少なくとも１種のターゲッティング単位及び任意に少なくとも１種のエフェクター単位を含有する。重要な実施形態において、本発明は肺の固形体腫瘍に標的を定めることができる少なくとも１種のモチーフを含有するターゲッティング単位を提供する。特定の実施形態として、本発明は非小細胞肺癌細胞に特異的に標的を定める腫瘍ターゲッティングモチーフ及びターゲッティング単位を提供する。
【００１５】
少なくとも１種のエフェクター単位とカプリングしていてもよい本発明によるターゲッティング単位は、特に転移体を包含する癌、好ましくは肺の腫瘍及び転移体の処置及び診断に治療的に及び診断的に有用である。さらにまた、本発明によるターゲッティング剤は細胞の分離、選択、分別及び濃縮に有用である。
本発明の第二の目的は少なくとも１種の本発明によるモチーフを含有する少なくとも１種のターゲッティング剤又は少なくとも１種のターゲッティング単位を含有する医薬組成物及び診断組成物を提供することにある。このような組成物は腫瘍の破壊に、又はそれらの増殖の防止に、或いは癌の診断に使用することができる。
【００１６】
転移体の早期診断は癌の処置の成功にとって非常に重要であることから、本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤の使用は腫瘍転移の早期診断にとって重要である。
本発明の第三の目的は癌、好ましくは転移体を包含する肺癌の新規処置方法及び／又は新規診断方法及びこれらの処置及び／又は診断用キットを提供することにある。
本発明によるターゲッティング単位はそのままで、又は少なくとも１種のエフェクター単位とカプリングさせて使用することができる。
【００１７】
本発明の目的のために本明細書で使用されている「癌」の用語は最も広い意味で用いられており、形質転換細胞又は悪性細胞を包含する全ての病気又は症状を包含する。当技術において、癌はそれらの組織起源（組織学的タイプ）に従い５種の主要カテゴリに分類される：癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ）、肉腫（ｓａｒｃｏｍａｓ）、脊髄腫（ｍｙｅｌｏｍａｓ）及びリンパ腫（ｌｙｍｐｈｏｍａｓ）（これらは固形体腫瘍タイプの癌である）、ならびに白血病（これは「液体癌」（ｌｉｑｕｉｄ  ｃａｎｃｅｒｓ）である）。本発明で使用されているものとして、癌の用語は主として、検出可能な固形体腫瘍が存在していない場合、又は悪性又は形質転換細胞、「癌細胞」が健康な組織中のその他の細胞の中に散在して、又は浸潤して拡散しているように見える場合の病気状態を包含する固形体腫瘍を特徴とするタイプの病気の全部を包含する用語である。
【００１８】
本明細書において、「アミノ酸」及び「アミノアルコール」の用語は、ジアミノ、トリアミノ、オリゴアミノ及びポリアミノ酸及びアルコール；ジカルボキシル、トリカルボキシル、オリゴカルボキシル及びポリカルボキシルアミノ酸；ジヒドロキシ、トリヒドロキシ、オリゴヒドロキシ及びポリヒドロキシアミノアルコール；及び１個以上のカルボキシル基又はヒドロキシル基と１個又は２個以上のアミノ基を含有する類縁化合物をまた包含するものとする。
【００１９】
確立されている命名法に従い、「ペプチド」の用語は、ペプチド結合によって一緒に結合し、アミノ酸鎖を形成しているアミノ酸鎖（ペプチド単位）を意味する。ペプチドは以下で説明するように直鎖状又は環状であることができる。本発明の目的にかかわり、１個又は２個以上のＤ−アミノ酸、ベータ−アミノ酸及び／又はその他の非天然アミノ酸（例えば、非天然側鎖を有するアミノ酸）を包含する化合物はまた、「ペプチド」の用語に包含される。本発明の目的にかかわり、「ペプチド」の用語は修飾されているアミノ酸を包含するペプチジル類縁化合物を包含するものとする。このような修飾は、例えば置換基の導入又は存在；「臨時」の官能性基、例えばアミノ、ヒドラジノ、カルボキシル、ホルミル（アルデヒド）又はケト基、或いは別の分子の導入又は存在；ならびに官能性基又はその他の分子の非存在又は分離を包含することができる。この用語はまた、アミノ酸及び／又はカルボキシ末端が修飾されている類縁化合物、例えばペプチドアミド化合物及びＮ−置換アミド化合物、ペプチドヒドラジド化合物、Ｎ−置換ヒドラジド化合物、ペプチドエステル化合物などの類縁化合物、及びアミノ末端−ＮＨ２基を含有していないか、又は例えば修飾されているアミノ−末端アミノ基或いはアミノ−末端アミノ基の代わりにイミノ基又はヒドラジノ基を有する基を包含するペプチド、ならびにカルボキシ−末端カルボキシル基を含有していないか、又はその代わりに修飾基を有するペプチドなどを包含する。
【００２０】
「ペプチド類縁化合物」を形成するペプチドの修飾に使用することができる可能な反応タイプの数種の例には、例えば縮合及び親核性付加反応、ならびにエステル化、アミド形成、置換アミドの形成、Ｎ−アルキル化、ヒドラジドの形成、塩形成がある。塩形成はいずれかのタイプの塩、例えばアルカリ又はその他の金属塩、アンモニウム塩、有機塩基による塩、酸付加塩などであることができる。ペプチジル類縁化合物は対応するペプチドから、又は直接に（別の経路を経て）、合成することができる。
【００２１】
本発明によるペプチドの「構造的又は機能的類縁体」（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ａｎａｌｏｇｕｅｓ）の表現は、アミノ酸からなる化合物ではない化合物、アミノ酸単独ではない化合物、或いはその結合単位の一部又は全部が修飾アミノ酸である化合物を包含するものとして使用されている。当業者に充分に認識されているように、この目的には種々のタイプの結合単位を使用することができる。これらの化合物の生物学系における機能はペプチドの機能と本質的に同様である。すなわち、これらの化合物と元のペプチドとの間の類似性は、構造的及び機能的類似に基づいている。このような化合物は、これらが元のペプチドの機能、形状及び／又は構造に類似していることから、ペプチド偽装類縁化合物と称される。本発明の目的にかかわり、これらの化合物は「ペプチド」の用語に包含される。
【００２２】
本発明によるペプチドの機能的類縁体は、腫瘍、腫瘍組織、腫瘍細胞又は腫瘍内皮への結合にかかわり、これらが類似するペプチドのこれらの結合に本質的に類似している結合能力を有することを特徴としている。
【００２３】
一例として、起源ペプチドの一次配列に基づき類縁体を含有するベンゾラクタム又はピペラジンのような化合物を使用することができる（Ａｄａｍｓ等、１９９９；Ｎａｋａｎｉｓｈｉ  ａｎｄ  Ｋａｈｎ、１９９６；Ｈｏｕｇｈｔｅｎ等、１９９９；Ｎａｒｇｕｎｄ等、１９９８）。多くの種々のタイプのペプチド偽装物質が科学刊行物及び特許文献に報告されており、また当業者に充分に知られている。ペプチド偽装物質（類縁体）は、例えば１種又は２種以上の下記構造要素を含有することができる：還元アミド類、ヒドロキシメチレン及び／又はヒドロキシエチルアミンイソステア類（ｉｓｏｓｔｅｒｅｓ）、Ｎ−メチルアミノ酸類、尿素誘導体、チオ尿素誘導体、環状尿素及び／又はチオ尿素誘導体、ポリ（エステルイミド）類、ポリエステル類、エステル類、グアニジン誘導体、環状グアニジン類、イミダゾイル化合物、イミダゾリニル化合物、イミダゾリジニル化合物、ラクタム類、ラクトン類、芳香族環化合物、二環状化合物、ヒダントイン及び／又はチオヒダントイン類、ならびに種々のその他の構造体。
【００２４】
ペプチド偽装化合物の合成には、かなりのタイプの化合物を多数の市場供給源から利用することができる（例えば、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｆｌｕｋａ  ＣｈｅｍｉｅＧｍｂＨ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，２０００及びＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ２０００  Ｃａｔａｌｏｇ，Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ＡＧ，Ｌａｕｆｅｌｆｉｎｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ，２０００）。ペプチド偽装化合物と元のペプチドとの間の類似性は構造的及び／又は機能的類似に基づいている。従って、ペプチド偽装化合物は元のペプチドの性質を偽装し、また本発明の目的のために、それらの結合能力はこれらが類似しているペプチドに類似している。
【００２５】
ペプチド偽装化合物は、例えば起源アミノ酸には見られない非天然アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸又は非天然側鎖を含有するアミノ酸、或いはｂ−アミノ酸など）から構成することができ、或いはこれらの化合物は他の化合物又は構造単位からなることができ、又は他の化合物又は構造単位から形成することができるものと考えることができる。合成ペプチド偽装化合物の例には、Ｎ−アルキルアミノ環状尿素、チオ尿素、ポリエステル類、ポリ（エステルアミド）類、二環状グアニジン類、ヒダントイン類、チオヒダントイン類、及びイミダゾール−ピリジノ−インオール類を包含する（Ｈｏｕｇｈｔｅｎ等、１９９９及びＮａｒｇｕｎｄ等、１９９８）。このようなペプチド偽装化合物は本発明によるペプチドの「構造的又は機能的」類縁体であるものと特徴付けることができる。
【００２６】
本発明の目的のために「ターゲッティング単位」の用語は、腫瘍、腫瘍組織及び好ましくは、腫瘍間質、腫瘍柔組織及び／又は腫瘍の細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に対して選択的ターゲッティングが可能である化合物、ペプチド又はその構造的又は機能的類縁化合物を表す。さらに特に、このターゲッティング単位は細胞表面に、特異的分子に、又は細胞表面上又は細胞内の構造体に結合することができるか、或いはこれらは細胞間に存在する細胞外マトリックスと会合することができる。このターゲッティング単位はまた、内皮細胞又は腫瘍血管系の細胞外マトリックスに結合することもできる。このターゲッティング単位はまた、腫瘍塊、腫瘍細胞及び転移腫瘍の細胞外マトリックスに結合することもできる。
【００２７】
一般に、「ターゲッティング」又は「結合」の用語は、本発明によるターゲッティング単位が腫瘍、腫瘍細胞及び／又は腫瘍組織に対し、例えばインビトロにおける腫瘍生検でインビボ又はエキストラビボペプチド競合試験により、又はその場での免疫学的染色により、或いは当業者にとって既知の方法により、その結合を明白に測定し、決定することができる程度にまで結合するか、接着するか、付着するか、又は親和性を示すことを表す。腫瘍ターゲッティングの用語は、ヒト又は動物身体に投与された場合、ターゲッティング単位が腫瘍に対し特異的に結合することを意味する。この特異的会合にかかわり当技術で使用されているもう一つの用語には、「ホーミング」（ｈｏｍｉｎｇ）がある。この結合が通常的試料処理に対し、例えば生理学的塩類溶液又はその他の生理学的に許容される塩溶液、或いは生理学的ｐＨの緩衝剤溶液による洗浄及びすすぎ処理に対し耐えるに充分に強力である場合、或いはインビボにおける腫瘍標的に対する結合が、その機能を発揮するためのエフェクター単位に対し充分に長時間にわたり該標的に結合する場合、本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤は、インビトロで腫瘍標的に結合するものと考える。
【００２８】
本発明によるターゲッティング剤又はターゲッティング単位の腫瘍への結合は「選択的」である。このことは、本発明によるターゲッティング剤又はターゲッティング単位が正常細胞及び器官には結合しないか、又は腫瘍に比較して充分に低い程度で正常細胞及び器官に結合することを意味する。
本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤の薬学的に又は生理学的に又は診断学的に許容される塩及び誘導体は、塩類、エステル類、アミド類、ヒドラジド類、Ｎ−置換アミド類、Ｎ−置換ヒドラジド類、ヒドロキサミン酸誘導体、その脱カルボキシル化及びＮ−置換誘導体を包含する。その他の適当な薬学的に許容される誘導体は、当業者が容易に認識できることである。
【００２９】
本発明は、特定のアミノ酸配列又はモチーフを有する一群の直鎖状又は環状ペプチドがインビボで腫瘍に、特にＮＳＣＬＣ腫瘍に、及びインビトロで腫瘍細胞に選択的に標的を定めることができることを見出したことに基づいている。すなわち、本発明によるペプチドは、ヒト又は動物対象に投与された場合、腫瘍に特異的に結合することができるが、身体の正常組織には結合しない。
本発明による腫瘍ターゲッティング単位はファージディスプレイライブラリー（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ）のバイオ−パンニングによって同定された。ファージディスプレイは、無作為ペプチドのライブラリーがファージゲノムの遺伝子ＩＩＩ中にそのコードＤＮＡ配列を挿入することによってファージカプシドタンパク質ｐＩＩＩの一部としてバクテリオファージの表面に発現される方法である。ｐＩＩＩライブラリーはファージ粒子１個あたりそれぞれ各ペプチドの複写３〜５個を表示する（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｏｔｔ，１９９３）。
【００３０】
ファージディスプレイペプチドライブラリーをバイオ−パンニングによってスクリーニングし、非小細胞肺癌に特異性であるペプチドを選択する。このバイオ−パンニングの原理は、１）ホモゲナイズされた組織試料のファージライブラリーへの曝露、２）未結合ファージの洗浄、及び３）標的組織に結合したファージの救出を包含する。１〜３回の反復工程によって、元のファージライブラリーの別のペプチドに比較して標的組織に対し高度の結合親和性を有する高度に濃縮されたペプチドが得られる。本発明において、例の部分でさらに詳細に説明されているように、ファージディスプレイペプチドライブラリーを非小細胞癌患者の原発性腫瘍から採取された組織試料に対しパンニングした。
【００３１】
本発明によるターゲッティングモチーフ
ここに驚くべきことに、下記４アミノ酸モチーフが腫瘍及び腫瘍細胞に対し、特にＮＳＣＬＣに対し標的を定め、選択的結合を示すことが見出された：
Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｐ
式中、
Ｘはアラニン、セリン又はホモセリン、或いはその構造的又は機能的類縁体であり；Ｒはアルギニン又はホモアルギニン、或いはその構造的又は機能的類縁体であり；Ｙはアルギニン、ホモアルギニン、アラニン、ロイシン、セリン、ホモセリン、バリン又はプロリン、或いはその構造的又は機能的類縁体であり；Ｐはプロリン、又はその構造的又は機能的類縁体である。
【００３２】
本発明による特に好適なモチーフは、Ｘがアラニンであり、及びＹがアルギニンであるモチーフ、すなわちＡ−Ｒ−Ｒ−Ｐである。
Ｘは好ましくは、アラニンであるか、或いは側鎖を有していないか、又はその側鎖（１個又は２個以上）に最多で４個、さらに好ましくは最多で３個、さらに好ましくは最多で２個の非水素原子を含有するその構造的又は機能的類縁体である。アラニンの構造的又は機能的類縁体は、例えば該化合物のいずれかの光学異性体、例えば３−クロロアラニン、３−フルオロアラニン、２−アミノブタン酸、４−フルオロ−２−アミノブタン酸、４−クロロ−２−アミノブタン酸、３−シアノアラニン、３−シクロプロピルアラニン、２−アミノ−３−ブテン酸及び２−アミノ−３−ブチン酸などを包含する。
【００３３】
本発明によるもう一つの好適態様において、Ｘはセリン又はホモセリン、或いは少なくとも１個のヒドロキシル基又は水素結合を形成することができる他の酸素含有基、好ましくはヒドロキシル基を含有する、その構造的又は機能的類縁体である。
セリン又はホモセリンの構造的又は機能的類縁体はまた、例えばその同族体；又はアミノ酸、アミノアルコール、ジアミノアルコール、トリ−、オリゴ−又はポリ−アミノアルコール、或いは少なくとも１個のヒドロキシル基、エステル化ヒドロキシル基、メトキシ基、他のエーテル化ヒドロキシル（エーテル）基、ケトキシム基、アルドキシム基、ヒドロキサミン酸基、或いはケトン又はアルデヒドカルボキシル基を含有するアミノ酸類縁体又は誘導体であることができる。
【００３４】
セリン又はホモセリンの構造的又は機能的類縁体の例には、そのいずれかの光学異性体、イソセリン、アロ−スレオニン、フェニルイソセリン、２−アミノ−３−（３，４−ジヒドロキシフェニル）−３−ヒドロキシプロピオン酸、Ｓ−（２−ヒドロキシエチル）−システイン、２−アミノ−４−ヒドロキシペンタンジオン酸、Ｏ−ホスホ−セリン、Ｏ−スルホ−セリン、スタチン、ベータ−（２−チエニル）セリン、Ｏ−ホスホスレオニン、２−アミノ−３−メチルオキシプロピオン酸、ならびにチロニン、４−メトキシ−フェニルアラニン、２−アミノチロシン、３−アミノチロシン、３−ヨウドチロシン、３，５−ジブロモチロシン、３，５−ジヨウドチロシン、いずれかその他のモノ−又はジ−又はトリ−又はテトラハロゲン化チロシン、３−ニトロチロシン、３，５−ジニトロチロシン、Ｏ−ホスホチロシン、Ｏ−スルホチロシン、及びまた例えば２−アミノマロン酸、２−アミノマロン酸モノエチルエステル及び２−アミノ−３−オキソブタン酸ならびにそのモノエステルなどの化合物がある。
【００３５】
本発明に従い、Ｒはアルギニン、ホモアルギニン及びカナバニンの任意の光学異性体；ならびにその構造的又は機能的類縁体、好ましくは少なくとも１個のグアニル基、アミジノ基、又は非局在化陽電荷を有するか、又はプロトン化により非局在化陽電荷を獲得することができる関連基を含有する類縁体を包含する。
【００３６】
アルギニン又はホモアルギニンの構造的又は機能的類縁体の例は、カナバニン、２−アミノ−８−グアニジノ−オクタン酸、２−アミノ−７−グアニジノ−オクタン酸、２−アミノ−６−グアニジノ−オクタン酸、２−アミノ−５−グアニジノ−オクタン酸、２−アミノ−７−グアニジノ−ヘプタン酸、２−アミノ−６−グアニジノ−ヘプタン酸、２−アミノ−５−グアニジノ−ヘプタン酸、２−アミノ−４−グアニジノ−ヘプタン酸、２−アミノ−５−グアニジノ−ヘキサン酸、２−アミノ−４−グアニジノ−ヘキサン酸、２−アミノ−３−グアニジノ−ヘキサン酸、２−アミノ−４−グアニジノ−ペンタン酸及び２−アミノ−３−グアニジノ−ペンタン酸、ならびにこれらの化合物のＮ−メチル化及びジメチル化誘導体を包含する。
【００３７】
本発明に従い、Ｙはアルギニン、アラニン、ロイシン、セリン、バリン又はプロリン、或いはその構造的又は機能的類縁体から選択することができる。
アルギニン、アラニン及びセリンの構造的又は機能的類縁体の例は上記で説明されている。
【００３８】
ロイシン及びバリンの構造的又は機能的類縁体の例には：
（ａ）アミノ酸及びそれらの１個の側鎖又は２個以上の側鎖として、或いはそれらの１個の側鎖又は２個以上の側鎖中に、炭素原子、ケイ素原子、少なくとも１個の炭素原子に結合したハロゲン原子、エーテル酸素及びチオエーテルイオウからなる群から選択される少なくとも１個、好ましくは少なくとも２個の同一又は相違する原子を含有する少なくとも１個の分枝状、非分枝状又は脂環式構造基を含有するアミノ酸の類縁化合物及び誘導体（例えば、アミノアルコール及びポリアミノ酸）；又は
（ｂ）分枝状、非分枝状又は環状非芳香族の親油性又は疎水性アミノ酸又はアミノ酸の類縁化合物又は誘導体、或いはその構造的又は機能的類縁体、或いは１個又は２個以上の親油性カルボラン型又はその他の親油性ホウ素含有側鎖（１個又は２個以上）、或いはその／それらの同等体（１種又は２種以上）、或いは別の親油性ケージ型構造を有するカルボン酸類縁化合物又は誘導体或いはアミノ酸類縁化合物又は誘導体；
がある。
【００３９】
従って、Ｙは、例えばバリン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、ノルロイシン、ノルバリン、アロ−ロイシン、２−アミノブタン酸、２−アミノ−２−メチルプロピオン酸、２−アミノ−４，４−ジメチルペンタン酸、４，５−ジヒドロロイシン、２−アミノ−６−イソプロピルアミノ−ヘキサン酸、４−アミノ−６−メチルヘプタン酸、３−アミノ−６−メチルヘプタン酸、２−アミノ−６−メチルヘプタン酸、ｔｅｒｔ−ロイシン、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸、４−アミノ−５−シクロヘキシル−ペンタン酸、２−アミノ−２−シクロヘキシル酢酸、２−アミノ−３−シクロヘキシルプロピオン酸、２−アミノ−４−シクロヘキシルブタン酸、２−アミノ−３−シクロペンチルプロピオン酸、２−アミノ−４−シクロペンチルブタン酸、２−アミノ−３−シクロブチルプロピオン酸、２−アミノ−４−シクロブチルブタン酸、
【００４０】
２−アミノ−３−シクロプロピルプロピオン酸、２−アミノ−４−シクロプロピルブタン酸、２−アミノ−３−（１−シクロペンテニル）−プロピオン酸、２−アミノ−４−（１−シクロペンテニル）−ブタン酸、２−アミノ−３−エチルスルファニルプロピオン酸、２−アミノ−３−メチルスルファニルプロピオン酸、３−フルオロアラニン、３−クロロアラニン、３，３−ジシクロヘキシルアラニン、２−アミノ−３−プロペン酸、２−アミノ−４，４−ジメチルペンタン酸又はスタチン、或いは上記化合物のいずれかのＮ−メチル類縁化合物、上記化合物のいずれかのＮ−エチル類縁化合物、上記化合物のいずれかの他のＮ−アルキル類縁化合物、アルファ−メチル類縁化合物（２−メチル−類縁化合物）、上記化合物のいずれかのアルファ−エチル類縁化合物（２−エチル−類縁化合物）、
或いは上記化合物のいずれかの他のアルファ−アルキル類縁化合物（２−アルキル類縁化合物）の全ての光学又は幾何学的異性体；
【００４１】
或いは２−アミノブタン酸、２−アミノ−２−メチルプロピオン酸、４−アミノ−５−シクロヘキシル−３−ヒドロキシペンタン酸、４−アミノ−５−シクロヘキシルペンタン酸、２−アミノ−２−シクロヘキシル酢酸、２−アミノ−３−シクロヘキシルプロピオン酸、２−アミノ−４−シクロヘキシルブタン酸、２−アミノ−３−エチルスルファニルプロピオン酸、２−アミノ−３−メチルスルファニルプロピオン酸、２−アミノ−４，４−ジメチルペンタン酸、アロ−イソロイシン、４，５−ジヒドロロイシン、２−アミノ−６−イソプロピルアミノ−ヘキサン酸、ノルロイシン、ノルバリン、スタチン、４−アミノ−６−メチルヘプタン酸、３−アミノ−６−メチルヘプタン酸、２−アミノ−６−メチルヘプタン酸、或いは上記化合物のいずれかのＮ−メチル類縁化合物、又は上記化合物のいずれかのＮ−エチル類縁化合物、又は他のＮ−アルキル類縁化合物、アルファ−メチル類縁化合物（２−メチル類縁化合物）、アルファ−エチル類縁化合物（２−エチル類縁化合物）、又は他のアルファ−アルキル類縁化合物（２−アルキル類縁化合物）であることができる。
【００４２】
本発明に従い、Ｒ及びＹはまた一緒になって、アルギニン又はホモアルギニンのいずれかの光学異性体、或いは少なくとも１個のグアニル又はアミジノ基、或いは非局在化陽電荷を有するか、又はプロトン化を経て非局在化陽電荷を得ることができる関連基を含有するその類縁体を包含する単位を構成していてもよい。
本発明に従い、Ｐはプロリンのいずれかの光学又は幾何学的異性体；ならびにヘテロ環状又は炭素環状環構造基、或いは二重結合を含有する構造基を有する構造的又は機能的類縁体を包含し、ここで上記類縁体は好ましくは、プロリンの立体又はニック−形成性性質と同様の又は類似する立体又はニック−形成性性質を有する。
【００４３】
本発明によるモチーフＸ−Ｒ−Ｙ−Ｐは大型構造体、例えばペプチド又は数種の別の構造体の一部分を構成していてもよい。この対象化合物又は構造体はまた、１個以上のモチーフＸ−Ｒ−Ｙ−Ｐを含有することができ、またこれらのモチーフの配向及び方向は変えることができる。
【００４４】
本発明によるターゲッティング単位
本明細書に定義されている本発明による腫瘍ターゲッティングモチーフを含有する構造的又は機能的類縁体を包含するペプチドが腫瘍、特に肺腫瘍に、及び非小細胞肺癌細胞腫瘍に標的を定め、そこに選択的結合を示すことがまた見出された。本発明による腫瘍ターゲッティングモチーフ及び７個までの追加のアミノ酸残基又はその類縁基を含有するペプチドはまた、このようなターゲッティング及び選択的結合性を示し、これは本発明の特に好適な実施形態である。
このようなペプチドは、例えばそれらのサイズが小さいこと及びこれらを容易に、信頼性を持って、安価に製造することができることから本発明によるターゲッティング単位として格別に有利に使用することができる。本発明によるペプチドはサイズが小さいことから、精製、分析及び品質制御が容易であり、商品として有用である。
【００４５】
本発明による好適腫瘍ターゲッティング単位は、上記定義のとおりの腫瘍ターゲッティングモチーフＸ−Ｒ−Ｙ−Ｐ及び天然アミノ酸、非天然アミノ酸、最多で３０個の非水素原子及び無制限の水素原子を含有するアミノ酸類縁化合物；及びその分子量及び／又は式重量が最高で２７０である他の構造単位及び残基からなる群から選択される追加の残基を含有する。この場合、追加の残基の数は０〜７個、好ましくは０〜６個、好ましくは０〜５個、好ましくは０〜４個、最も好ましくは０〜３個の範囲である。
【００４６】
本発明によるターゲッティング単位は好ましくは、直鎖状である。本発明による直鎖状ペプチドは製造が迅速であり、容易であり、また安価である。このことは、こような単位が合成後のいずれかの追加の処理（環化など）を必要とせず、また環化に必要である複雑なオルトゴナル性及びその他の防護ならびに追加の官能性基が不必要であることによるものである。直鎖状ペプチドへの追加の単位の結合はさらに容易である。このことは、例えば環化の目的に「予備」の官能性基を必要とせず、或いは高価で、複雑なオルトゴナル防護の使用を必要としないことなどによるものである。本発明のいくつかの好適実施形態において、ヒト身体における直鎖状ペプチドの効果的な分解は、例えば迅速なクリアランスが要求される診断用途において、さらに分解が遅い物質の使用に比較し有利である。
【００４７】
本発明のもう一つの実施形態において、環状ペプチドが好適であることもある。従って、本発明によるターゲッティング単位は、環状であってもよい。環状ペプチドは通常、インビボでさらに安定であり、当業者に知られているように、かなりの別の生物学的系において、それらの非環状対抗ペプチドと比較してより安定である。本発明によるさらに安定なペプチドは或る種の目的、例えば或る種の治療用途において格別に好適である。
【００４８】
本発明による好適ターゲッティング単位は下記配列を含有することができる：
Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｐ−Ｚｎ
式中、Ｘ−Ｒ−Ｙ−Ｐは上記定義のとおりであり、Ｚはアミノ酸残基又はその構造的又は機能的類縁基であり；及びｎは０〜７、好ましくは０〜６、０〜５、０〜４、最も好ましくは０〜３の整数である。
特に好適なターゲッティング単位は、Ｚがヒスチジン又はトリプトファン以外のいずれかのアミノ酸残基である単位である。特に好適なターゲッティング単位は、Ｚが次のアミノ酸の少なくとも１個を含有する単位である：リジン、ロイシン又はアスパラギン酸、或いはその構造的又は機能的類縁体。
【００４９】
リジンの構造的又は機能的類縁体の例には、リジン又はオルニチンのいずれかの光学異性体及びその構造的又は機能的類縁体があり、好ましくは少なくとも１個のアミノ基又は置換アミノ基或いは陽電荷を有するか、又はプロトン化を経て陽電荷を獲得することができる他の窒素含有基を含有する。
【００５０】
アスパラギン酸の構造的又は機能的類縁体の例は、グルタミン酸又はアスパラギン酸のいずれかの光学異性体、ならびに水素結合を形成することができる少なくとも１個の酸素原子を含有する、その構造的又は機能的類縁体を包含し、好ましくは少なくとも１個のカルボキシル基、エステル化カルボキシル基、ヒドロキサミン酸官能性基、エステル化ヒドロキサミン酸官能性基、アルコール性又はフェノール性ヒドロキシル基、エステル化アルコール性又はフェノール性ヒドロキシル基、ケト基又はアルデヒド官能性基を含有し、さらに好ましくは少なくとも１個のカルボキシル基、ヒドロキサミン酸官能性基、エステル化ヒドロキサミン酸官能性基、アルコール性又はフェノール性ヒドロキシル基、エステル化アルコール性又はフェノール性ヒドロキシル基を含有し、さらにまた好ましくは少なくとも１個のカルボキシル基、エステル化カルボキシル基、ヒドロキサミン酸官能性基、アルコール性ヒドロキシル基又はエステル化アルコール性ヒドロキシル基を含有し、最も好ましくは少なくとも１個のカルボキシル基又はエステル化カルボキシル基を含有するその構造的又は機能的類縁体を包含し、或いは１個又は２個以上のオキソ官能性基、好ましくは−ＳＯ３−、−ＯＳＯ３−、いずれかの無機ホスフェート基又はそのエステルを含有するその構造的又は機能的類縁体を包含する。
【００５１】
本発明による好適ターゲッティング単位は、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）：１〜配列番号：７３で同定されているペプチドからなる群から選択される単位を包含する。本発明による格別に好適なターゲッティング単位は、ＡＲＲＰＫＬＤ（配列番号：１）、ＳＲＲＰＫＬＤ（配列番号：６５）、ＡＲＲＰ（配列番号：６６）、ＳＲＡＰ（配列番号：６７）、ＡＲＡＰ（配列番号：６８）、ＳＲＶＰ（配列番号：６９）、ＳＲＬＰ（配列番号：７０）、ＡＲＬＰ（配列番号：７１）、ＡＲＰＰ（配列番号：７２）、ＳＲＲＰ（配列番号：７３）を包含する。
【００５２】
本発明によるターゲッティング剤
少なくとも１種の本発明による腫瘍ターゲッティング単位及び少なくとも１種のエフェクター単位を含有するターゲッティング剤は癌細胞及び癌組織に対し標的を定め、これらに対し選択的結合を示すことがまた、ここに見出された。
本発明による腫瘍ターゲッティング剤は任意に、リンカー、溶解性修正剤、安定剤、電荷修正剤、スペーサー、溶解又は反応又は反応性修正剤、中間単位又は中間エンハンサー又は膜相互反応単位又はその他の局所経路単位、付着単位、結合単位及び分布関与単位などの単位（１種又は２種以上）を含有することができる。本発明による腫瘍ターゲッティング剤中のこのような付加単位は、いずれかこの目的に適する手段によって相互に結合することができる。
【００５３】
対象又は関連タイプの構造体、分子及び基の相互結合に関して、かなりの可能性が当業者に知られている。各種単位は直接に、又は１種又は２種以上の同一、類似及び／又は相違するリンカー単位によって結合させることができる。本発明による腫瘍ターゲッティング剤は、例えば以下に図で示されている無制限のタイプのいずれかなどの相違する構造を有することができる：
【００５４】
【化１】
2008539209.tif 000002
【００５５】
ここで、ＥＵは「エフェクター」単位を表し、及びＴＵは「ターゲッティング」単位を表し、またｎ、ｍ及びｋは独立して、０を除くいずれかの整数である。
本発明によるターゲッティング剤において、多くの別の医薬及び別の物質として、該ターゲッティング単位をエフェクター単位又はその他の単位による立体的又は電子的「混乱」から防護するために、或いは防止又は「遮蔽」するために、例えばアミノ酸及びそれらの類縁化合物、例えば長鎖状オメガ−アミノ酸などのスペーサー又はリンカーを含有するものと考えることができる。
【００５６】
本発明によるターゲッティング剤において、樹枝状又は環状構造体を使用は、その活性を増加させるために、例えば複数のエフェクター単位又は追加単位を導入する可能性を得るために有用であることがある。
本発明による好適ターゲッティング剤は、構造：ＥＵ−ＴＵ−ＯＵ、ＴＵ−ＥＵ−ＯＵ又はＴＵ−ＯＵ−ＥＵを包含し、ここでＴＵは上記定義のとおりの本発明によるターゲッティング単位であり、及びＥＵ及びＯＵは下記群から選択されるエフェクター単位又は任意の単位である：
【００５７】
エフェクター単位、リンカー単位、溶解性修正剤単位、安定剤単位、電荷修正剤単位、スペーサー単位、溶解及び／又は反応及び／又は反応性修正剤単位、中間及び／又は中間エンハンサー及び／又は膜相互反応単位及び／又はその他の局所経路及び／又は局所付着／局所結合及び／又は分布関与単位、吸着増強剤単位、及びその他の関連単位；及び
少なくとも１種のこのような単位を含有するペプチド配列及びその他の構造体；及び
２０個よりも多くない、好ましくは１２個よりも多くない、さらに好ましくは６個よりも多くない、天然及び／又は非天然アミノ酸；及び
２５個よりも多くない非水素原子及び無制限数の水素原子；
ならびにその塩、エステル、誘導体及び類縁体。
【００５８】
エフェクター単位
本発明の目的にかかわり、「エフェクター単位」（ＥＵ）は、分子又は基又は他の化学実在物質又は大型粒子（例えばコロイド状粒子など）；リポソーム、ナノ粒子又はミクロ粒子を意味する。適当なエフェクター単位はまた、ナノデバイス又はナノチップ又はそれらの類似物品；或いは上記のいずれかの組合わせ、及びエフェクター単位の構成部分を相互に、又はターゲッティング剤の別の部分に接合するための任意の化学的構造体を包含することができる。エフェクター単位はまた、該エフェクター単位の安定性又は溶解性を修正する分子を含有することができる。
【００５９】
本発明に従いエフェクター単位によって付与される好適効果には、標的を定めた腫瘍の治療（生物学的、化学的又は物理的）効果；診断の目的にかかわり腫瘍又は腫瘍細胞を検出又は造影できる性質；又は種々の用途における該ターゲッティング剤の使用に関連する結合能力がある。
【００６０】
本発明に従うエフェクター単位の好適（生物学的）活性は、治療効果である。このような治療活性の例には、例えば細胞毒性、細胞静止効果、細胞の分化を生じさせる能力、又は分化程度を増加させる効果、又は表現型変更又は代謝変更、化学走性活性、免疫調節活性、痛み軽減活性、放射性活性、細胞サイクルに影響を及ぼす能力、アポトーシスを生じさせる能力、ホルモン性活性、酵素性活性、細胞をトランスフェクションする能力、遺伝子をトランスフェクションする能力、１個又は２個以上の遺伝子の「ノックアウト」（ｋｎｏｃｋ−ｏｕｔ）を仲介する能力、遺伝子置き換え又は「ノックイン」（ｋｎｏｃｋ−ｉｎ）を生じさせる能力、遺伝子又はタンパク質発現を減少、阻止又はブロックする能力、抗血管形成活性、熱又は外部照射線又は電場或いは磁場からの他のエネルギイを収集する能力、細胞の遺伝子情報又は外部関連情報の転写、翻訳又は複製に影響を及ぼす能力、及び転写後又は翻訳後の事象に影響を及ぼす能力などがある。
【００６１】
本発明に従うエフェクター単位によって達成できる他の好適治療作用は、熱（遅速）ニュートロン（ニュートロン捕獲体によって適当な核放射活性にするため）の使用、又は例えばエステル結合又は他の結合を加水分解できる酵素の投与、或いは本発明による標的を定められた酵素の投与に基づくことができる。
【００６２】
本発明に従うエフェクター単位の検出に適する好適機能の例には、放射線活性、常磁性、強磁性、フェリ磁性、又はいずれかのタイプの磁性、或いはＮＭＲ分光分析により検出される能力、又はＥＰＲ（ＥＳＲ）分光分析により検出される能力、又はＰＥＴ及び／又はＳＰＥＣＴ造影にかかわる適応性、又は免疫原性構造体の存在、又は抗体又は抗体断片又は抗体型構造体の存在、又は金粒子の存在、又はビオチン又はアビジン又は他のタンパク質の存在、及び／又は発光及び／又は蛍光及び／又は燐光活性、或いは腫瘍、腫瘍細胞、内皮細胞及び転移体の電子顕微鏡、光学顕微鏡（ＵＶ及び／又は可視光線）、赤外線顕微鏡、原子力顕微鏡又はトンネリング（ｔｕｎｎｅｌｉｎｇ）顕微鏡による検出を強化する能力などがある。
【００６３】
本発明に従うエフェクター単位の好適結合能力の例は、下記能力を包含する：
ａ）金属イオン（１種又は２種以上）結合能力、例えばキレート形成による、
ｂ）細胞毒性、細胞壊死性又は代謝影響物質、或いはこのような物質にその場で変換されうる物質に対する結合能力、
ｃ）ヒスチジンタグ又はその他のタグなどの物質又は構造体に対する結合能力、
ｄ）酵素又は修飾酵素に対する結合能力、
ｅ）ビオチン又はその類縁体に対する結合能力、
ｆ）アビジン又はその類縁体に対する結合能力、
【００６４】
ｇ）インテグリン又はその他の細胞接着、移動又は細胞内シグナル生成に包含される物質に対する結合能力、
ｈ）ファージ結合能力、
ｉ）リンパ球又はその他の血液細胞に対する結合能力、
ｊ）バイオパンニングにより、又はその他の方法により選択された抗体又は構造体の存在に基づいていずれか予め選択された物質に結合する能力、
ｋ）シグナル生成又は増幅に使用される物質に対する結合能力、
ｌ）治療物質に対する結合能力。
【００６５】
このような結合は、例えばキレート形成、共有結合の形成、抗体−抗原型親和性、イオン対又はイオン会合形成、アビジン−ビオチン型の特異的相互作用、或いはいずれかの形式又は様相の結合又は親和性の結果であることができる。
１種又は２種以上のエフェクター単位又はそれらの一部分はまた、ターゲッティング単位それら自体の一部であることもできる。すなわち、エフェクター単位は、例えばターゲッティング単位の１種又は２種以上の原子又は核であることができ、例えば放射性原子又は放射能を発生することができる原子、或いは常磁性原子又はＭＲＩ又はＮＭＲ分光分析によって容易に検出することができる原子（例えば、炭素−１３）であることができる。追加の例には、例えばホウ素含有構造体、例えばカルボラン型親油性側鎖がある。
【００６６】
エフェクター単位は、ターゲッティング剤のエフェクター単位の大部分、又は好ましくは全部、又は実質的に全部が例えばヒト又は動物対象、或いは研究又は処置中の生物学的試料における実質的（必要）ターゲッティング方法の期間中にわたりターゲッティング単位に結合したままであるのに充分に強力であるいずれかの方式の結合又は構造又はそれらの組合わせによってターゲッティング単位に結合させることができる。
【００６７】
エフェクター単位又はそれらの一部分はターゲッティング単位に結合したまま残ることができ、或いはエフェクター単位又はそれらの一部分は自発的化学反応又は平衡化によって、又は自発的酵素性プロセス又はその他の生物学的プロセスによって、又は加水分解性酵素又はその他の化学物質の投与などの計画的操作又は処理の結果として、ターゲッティング単位から部分的に又は完全に加水分解させるか、又は別様に分解させることもできる。本発明に従い酵素などの標的が定められた物質の投与によって酵素性プロセス又はその他の反応を生じさせるか、又は強化することもできる。
エフェクター単位又はそれらの一部分は、ターゲッティング剤から加水分解させることができ、或いは腫瘍（例えば、細胞内、細胞膜又は細胞外マトリックス）に、或いはそれらの近辺に存在する種々の加水分解性酵素の１種又は２種以上の作用によって、より小さい単位に加水分解させることもできる。
【００６８】
本発明によるターゲッティングは、身体内の何処ででも生じる非特異的加水分解が１種又は２種以上のエフェクター単位（１個又は２個以上）の故意の加水分解に許容され、有用であることがある場合でさえも、非常に迅速であることは考慮されるべきことである。この理由は、適当な場合（例えば、立体障害、又はいずれかのこのような妨害作用がなくても）、身体の加水分解性酵素の存在にもかかわらず、このような加水分解がターゲッティング剤の安全なターゲッティングを可能にするほど緩慢であることによるものである。このことは当業者に非常に充分に理解されていることである。加水分解後、不溶性生成物又は細胞中に迅速に吸収されるか、又はそれらの表面に結合される生成物の生成はまた、腫瘍又はそれらの近辺に留まらせるために、ターゲッティングされたエフェクター単位又はそれらの断片などにとって有益であることができる。
【００６９】
本発明の好適実施形態において、エフェクター単位は直接的又は間接的に、治療又はその他の作用、シグナル検出、予め選択された物質（生物学的物質、分子、イオン、微生物又は細胞を包含する）の結合の「増幅」を可能にする。
このような「増幅」は、例えば下記非制限的タイプの１種又は２種以上に基づくことができる：
−他の物質（例えば、抗体、蛍光性抗体、別の「標識付け」された物質、アビジンなどの物質）をさらに結合させることができる他の物質のエフェクター単位による結合。この場合、好ましくは数種の追加の物質の分子又は「単位」を各エフェクター単位にそれぞれ結合させることができる；
−エフェクター単位が結合可能な１種以上の実体、例えばタンパク質を含有する。この場合、直接的増幅が可能にされる；
−１種以上の工程における増幅。
【００７０】
本発明による好適エフェクター単位は下記群から選択することができる：
−細胞増殖抑制又は細胞毒性薬剤
−アポトーシスを生じさせるか、又は強化させる薬剤
−酵素又は酵素阻害剤
−代謝拮抗剤
−膜機能を撹乱させることができる薬剤
−放射性又は常磁性物質
−１種又は２種以上の金属イオンを含有する物質
−ホウ素、ガドリニウム、リチウムを含有する物質
−ニュートロン捕獲治療に適する物質、例えばホウ素又はカルボラン
−標識付けされた物質
−インターカレーター及びこれらを含有する物質
−酸化剤又は還元剤
−ヌクレオチド及びそれらの類縁体
−金属キレート又はキレート形成剤。
【００７１】
本発明の特に好適な態様において、エフェクター単位はアルファ発射剤である。
本発明の別の好適態様において、エフェクター単位は銅キレート、例えばトランス−ビス（サリシルアルドキシメート）銅（ＩＩ）及びその類縁化合物、或いは白金化合物、例えばシスプラチン（ｃｉｓｐｌａｔｉｎ）及びカルボプラチン（ｃａｒｂｏｐｌａｔｉｎ）などを含有することができる。
さらに特に、進行したＮＳＣＬＣの処置において、白金化合物と組合わせて下記薬剤又はそれらの構造的又は機能的類縁化合物を使用することができる：有糸分裂抑制剤／タキサン類（ｔａｘａｎｅｓ），例えばパクリタキセル（ｐａｃｌｉｔａｘｅｌ）又はドセタキセル（ｄｏｃｅｔａｘｅｌ）、或いは代謝拮抗物質、例えばゲムシタビン（ｇｅｍｓｉｔａｂｉｎｅ）又はメトトレキサート（ｍｅｔｏｔｒｅｘａｔｅ）、或いはビンカアルカロイド、例えばビノレルビン（ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ）、或いはアルキル化剤、例えばイソホスファミド又はシクロホスファミド、或いは抗生物質、例えばブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎｅ）又はミトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎｅ）、或いはトポイソメラーゼ阻害剤、例えばイリノテカン（ｉｒｉｎｏｔｅｃａｎｅ）又はトポテカン（ｔｏｐｏｔｅｃａｎｅ）。
【００７２】
例えば内在化（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）を細胞中で生じさせるか、又は強化させるために使用することができる相違する種類の構造体、物質及び群が知られており、例えばＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ；ペネトラチン（Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ）（Ｐｒｏｃｈｉａｎｔｚ，１９９６）、ならびにステアリル誘導体（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｎｏｔｅｓ  Ｍａｇａｚｉｎｅ，２０００）がある。
アポトーシス−誘発性構造体として、例えばミトコンドリア膜内部細胞と相互作用することが報告されているペプチド配列ＫＬＡＫＬＡＫを含有させることができる（Ｅｌｌｅｒｂｙ等、１９９９）。
【００７３】
細胞選別又はいずれかの関連用途を包含する本発明の実施形態で使用する場合、例えば下記の本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤を使用することができる：
ａ）磁性粒子にカプリング又は結合されている、
ｂ）プラスティック、ガラス又はその他の固形、多孔質、繊維状物質−形態又はその他の表面（１種又は２種以上）などに吸着、カプリング、連結又は結合されている、
ｃ）カラム又は関連装置に使用することができる１種又は２種以上の物質又は材料中に、又はこれらの物質又は材料上に、吸着、共有結合又は別段の連結、カプリング又は結合されている、
ｄ）沈殿、遠心分離、又は別段の分離又は除去することができる１種又は２種以上の物質又は材料中に、又はこれらの物質又は材料上に、吸着、共有結合又は別段の連結、カプリング又は結合されている。
【００７４】
本発明によるターゲッティング剤の任意の単位（ＯＵ）
本発明によるターゲッティング剤及びターゲッティング単位は場合により、例えば下記の単位などの追加の単位を含有することができる：
本発明によるターゲッティング単位、エフェクター単位、又はその他の任意の単位を相互にカプリングさせるためのリンカー単位；
ターゲッティング単位又はそれらの加水分解生成物の溶解性を変更するための溶解性修正単位；
合成、修飾、プロセッシング、保存又はインビボ又はインビトロにおける使用の期間中、ターゲッティング単位又はターゲッティング剤の構造を安定化するための安定剤単位；ターゲッティング単位又はターゲッティング剤、或いはそれらの出発物質の電荷を変更するための電荷修正単位；
【００７５】
生成物又はそれらの出発物質の立体的障害又は構造的ひずみを減少又は開放する場合、ターゲッティング剤又はそれらの出発物質の特定単位間の距離を増加するためのスペーサー単位；
反応性修飾単位；
ターゲッティング又はターゲッティング剤の取込みを強化するためのインターナリゼーション性単位又はエンハンサー単位；
例えばターゲッティング剤のインビボ吸着を強化する吸着強化単位、例えば脂肪溶解性又は水溶性構造体；或いは
その他関連単位。
【００７６】
多数の適当なリンカー単位が当技術で知られており、適当なリンカーの例には下記リンカーがある：
１．アミノ基を含有する単位を結合させる場合；環状無水物、ジカルボン系又は多価の活性化又は誘導体化されていてもよいカルボン酸、２個又は３個以上の反応性ハロゲンを有する化合物、或いは少なくとも１個の反応性ハロゲン原子及び少なくとも１個のカルボキシル基を有する化合物；
２．カルボキシル基又はその誘導体を含有する単位を結合させる場合；、少なくとも２個の同一又は相違する基、例えばアミノ、置換アミノ、ヒドロキシル、−ＮＨＮＨ２−又はその置換形態、該目的用のその他公知の基（活性化剤を使用することができる）；
【００７７】
３．アミノ基又はカルボキシル基を結合させる場合、例えばアミノ酸又はそれらの活性化或いは保護形態又は誘導体；
４．ホルミル基又はケト基を他の基に結合させる場合、例えば少なくとも１個の−Ｎ−ＮＨ２又は−Ｏ−ＮＨ２又は＝Ｎ−ＮＨ２基などを含有する化合物；
５．数個のアミノ含有単位を結合させる場合、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡ又はポリカルボン酸又はその無水物、そのエステル、又はそのアシルハライドなどのポリカルボン酸系物質；
６．アミノ基を含有する物質をホルミル基又はカルボキシル基を含有する物質に結合させる場合、ヒドラジノカルボン酸など、好ましくはヒドラジノ分子又はカルボキシル基が保護されているか、又は活性化されている化合物、例えば４−（ＦＭＯＣ−ヒドラジノ）安息香酸；
【００７８】
７．有機構造体を金属イオンに結合させる場合、有機構造体にカプリングさせることができる物質（例えば、それらの−ＣＯＯＨ基又はそれらのＮＨ２基による）、或いはその内在部分である物質、及びポリカルボン酸部分をさらに含有する物質、例えばＥＤＴＡ−又はＤＴＰＡ−様構造体、数個のヒスチジンを含有するペプチドなど、数個のシステイン又はその他のそれぞれ−ＳＨ基を含有する分子を含有するペプチド、或いは有機構造体への金属イオンの結合に使用することができる官能性基を含有する他のキレート形成剤。
【００７９】
多数の種々の上記物質及び別のタイプの適当な結合剤が当技術で知られている。
多数の適当な溶解性修正単位は当技術で知られている。適当な溶解性修正単位は下記例を包含する：
−水溶性を増加させる場合、ＳＯ３−、Ｏ−ＳＯ３−、ＣＯＯＨ、ＣＯＯ−、ＮＨ２、ＮＨ３＋、ＯＨ、ホスフェート基、グアニジノ又はアミジノ基、或いはその他のイオン性又はイオン化性基又は糖型構造体を含有する分子；
−脂肪溶解性又は有機溶媒中における溶解性を増加させる場合、（長鎖）脂肪族分枝状又は非分枝状アルキル又はアルケニル基、環状非芳香族基（例えば、シクロヘキシル基）、芳香族環又はステロイド構造体を含有する単位。
【００８０】
当技術で知られている多数の単位を安定剤単位として使用することができ、例えば立体障害を増加させる場合、嵩だかの構造体（例えば、ｔｅｒｔ−ブチル基、ナフチル基、アダマンチル基、及び関連基など）を使用することができ、また酵素性加水分解を防止又は妨害させる場合、Ｄ−アミノ酸及びその他の非天然アミノ酸（ベータ−アミノ酸、オメガ−アミノ酸、非常に長い側鎖を有するアミノ酸など）を使用することができる。
陽電荷、陰電荷又は両電荷を有する単位は、電荷修正単位として使用することができ、陽電荷、陰電荷又は両電荷を有する単位に変換することができるか、変換する構造体であることができる。
【００８１】
スペーサー単位は非常に重要であることがあり、このような単位を使用する必要性は構造体中の別の成分（例えば、使用される生物学的活性剤及びそれらの作用メカニズム）及び使用される合成プロセスに依存する。
適当なスペーサー単位は、例えば長鎖状又は糖型構造体（過剰に高い親油性を有するものを除く）又は大型環状構造体を包含する。適当な化合物は当技術で入手することができる。好適種類のスペーサー単位の一つは長鎖状オメガ−アミノ酸である。このような化合物はまた、アミノ−含有単位とカルボキシル−含有単位との間のリンカー単位として使用することもできる。かなり多くのこのような化合物がそのままの形態で及び各種の保護誘導体の形態で市販されている。
【００８２】
加水分解（自発化学的加水分解又は身体自体の酵素或いは患者に投与された酵素による酵素的加水分解）に感受性である単位は、エフェクター単位がターゲッティング剤から遊離することが望まれる場合、例えば細胞内又は細胞外ＤＮＡ又はレセプター結合を内在化する場合、非常に有利であることができる。この目的に適する単位には、例えば１個又は２個以上のエステル又はアセチル官能性基を含有する構造体が包含される。挙げられている目的にかかわり、各種プロテアーゼを使用することができる。プロドラッグの製造に使用されるかなり多くの基が加水分解性の増加又は加水分解の発生に、溶解反応に、又はその他の分解プロセスに適当であることができる。
【００８３】
本発明によるエフェクター単位、ターゲッティング単位及び任意の単位は１種以上の機能を同時的に果たすことができる。すなわち、一例として、ターゲッティング単位は同時にエフェクター単位であることができ、或いは数種のエフェクター単位を包含することができる；スペーサー単位は同時に、リンカー単位又は電荷修正単位又はその両方であることができる；安定剤単位は別のエフェクター単位の性質とは相違する性質を有するエフェクター単位であることができる；などが挙げられる。エフェクター単位は、例えば数種の類似する機能又は相違する機能を有することもできる。
【００８４】
本発明の好適実施形態の一つにおいて、腫瘍ターゲッティング剤は１種以上の相違するエフェクター単位を含有する。このような場合、このエフェクター単位は、例えば診断用単位及び治療用単位であることができる。すなわち、一例として、ホウ素ニュートロン治療の場合、そのエフェクター単位がホウ素原子を含有するのに加えて、該薬剤の投与後に患者においてインビボ検出又は定量することができるターゲッティング剤を使用すると好ましく、これにより、例えば該薬剤が処置されるべき腫瘍に不適当に蓄積したか否かを確認することができ、或いはニュートロン処置の時機を最適にすることができる。この目的は、例えばホウ素原子（好ましくは、同位元素−濃縮ホウ素）及びＮＭＲＩなどで検出可能な基を含有するエフェクター単位を含有するような本発明によるターゲッティング剤を使用することによって達成することができる。同様に、１種以上の治療的に有用なエフェクター単位の存在は好適であることがある。さらに、ターゲッティング単位及びターゲッティング剤は、所望により、１種又は２種以上の「古典的」又はその他の腫瘍治療方法、例えば手術、化学療法、他のターゲッティング療法、放射線治療、免疫療法などと組合わせて使用することができる。
【００８５】
本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤の製造
本発明によるターゲッティング単位は好ましくは、合成ペプチドである。ペプチドは広く種々の周知の技術によって、例えば固相合成法（ＦＭＯＣ−、ＢＯＣ−及びその他の保護スキーム、各種樹脂方式）、溶液合成法（ＦＭＯＣ、ＢＯＣ及びその他の変法）、及びこれらの組合わせ方法によって合成することができる。この目的用の自動式装置／デバイスはまた、商業的に入手することができ、決まりきった合成及び精製事業と同様である。これら手段の全部は当業者に非常に充分に知られている。数種の方法及び材料について、下記刊行物が例として挙げられる：Ｂａｃｈｅｍ  ＡＧ，ＳＡＳＲＩＮＡ（１９９９）、Ｔｈｅ  ＢＡＣＨＥＭ  Ｐｒａｃｔｉｓｅ  ｏｆ  ＳＰＰＳ（２０００）、Ｂａｃｈｅｍ  ２００１  ｃａｔａｌｏｇｕｅ（２００１）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ２０００  Ｃａｔａｌｏｇ（２０００）、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｏｍｉｍｅｔｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２０００）、及びＴｈｅ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｃａｔａｌｏｇ  ＆  Ｓｏｌｉｄｅ  Ｐｈａｓｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（ＳＰＯＣ）Ｈａｎｄｂｏｏｋ９８／９９。ペプチド合成はまた、例により例示されている。
【００８６】
当技術で知られているように、１種又は２種以上の保護基の使用はしばしば、推奨され、重要であり、及び／又は必要である。広く種々の保護基が当技術で知られており、例えばＦＭＯＣ、ＢＯＣ及びトリチル基など、さらにまた例で挙げられているその他の保護基などがある。保護基はしばしば、アミノ、カルボキシル、ヒドロキシル、グアニル及び−ＳＨ基の保護に、ならびにいずれか反応性基／官能性基に使用される。
当業者にとって周知であるように、活性化はしばしば、カルボキシル官能性基活性化及び／又はアミノ基の活性化を包含する。
【００８７】
保護はまた、オルトゴナル（ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ）及び／又はセミ／クアジ／プソイド−（ｓｅｍｉ／ｑｕａｓｉ／ｐｓｅｕｄｏ−）又はトゴナル（ｔｈｏｇｏｎａｌ）であることができる。保護及び活性化基、物質及びそれらの使用は例で例示されており、また本明細書で引用されている刊行物に記載されており、ならびに当技術で公知の多数の刊行物及び他の情報源に開示されている（例えば、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，１９９９）。
固相合成用樹脂はまた、当技術で周知であり、例及び上記引用刊行物に記載されている。
【００８８】
環状ペプチドは通常、生物学的環境で特に安定であり、従って好適である。本発明による環状構造体は、例えば国際特許公開ＷＯ２００４／０３１２１９（この刊行物を引用してここに組み入れる）に記載されているようなオルトゴナル的に保護されているアミノ酸の使用に基づく方法によって合成することができる。
本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤はまた、縮合タンパク質として製造することができ、又は当技術で公知のその他適当な組換えＤＮＡ法によって製造することができる。このような本発明によるペプチドの製造手段は、エフェクター単位及び／又は任意の単位がペプチド又はタンパク質である場合に特に好適である。有用なタンパク質エフェクター単位の一例は、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）である。
【００８９】
本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤の利点
診断又は治療用途を目的とするペプチドに関連する問題が知られている。これらの問題の一つは配列の長さから派生する：特に保護−脱保護を必要とするか、又は副反応を生じる複雑な残基の存在などの別の合成上の問題が存在する場合、配列が長く成長すると所望の生成物の合成がますます困難になる。
【００９０】
長く、また問題の多いアミノ酸残基を有する生成が困難な配列を含有する公知ペプチドに比較して、本発明によるペプチドは明白に優れている。本発明によるターゲッティング単位は容易に、かつ確実に合成することができる。多くの従来技術のペプチドに比較して、本発明によるターゲッティング単位及びモチーフは問題の多い塩基性アミノ酸リジン及びヒスチジンを含有する必要がなく、またトリプトファンを含有する必要がないという点で有利である。これらのアミノ酸は全部がペプチド合成において重大な副反応を生じさせることがあり、またこれらのアミノ酸によって、所望の生成物の収率は急速に低下されることがあり、或いは適当な量又は適当な品質を有する生成物を得ることが不可能になることさえある。
【００９１】
それらのさらに小さいサイズ、従って合成工程が劇的に少ないことから、本発明によるペプチドは従来技術の大部分のターゲッティングペプチドに比較して生成が容易であり、また安価である。
ヒスチジンは本発明による生成物には不必要であることから、ラセミ化の危険性は無関係になる。このことは本発明による生成物の経済的な合成にとって格別に有利であるばかりでなく、また精製及び分析ならびに品質制御において、ヒスチジンのいずれのラセミ化も考慮しなくてもよいという点で有利である。このことはまた、ヒト及び動物への投与を安全で、さらに率直にする。
【００９２】
本発明によるターゲッティング単位のサイズが小さいことから、総合価格は劇的に減少され、また精製がより容易で、さらに確実であることから良好な生成物を多量に得ることができる。さらにまた、精製の確実性は治療及び診断用途における毒性残留物の問題及び致命的な、又は別段の重大な副作用の問題を少なくする。
本発明によるターゲッティング単位はまた、それらの高い溶解性、特異性、無毒性及び非免疫原性によって格別に有利である。従来技術のターゲッティングペプチドの大きな問題は、それらの水溶解性又は一般的溶解性が通常、非常に低く、極端に低いことさえあることにある。従って、良好なターゲッティング性質及び優れた溶解性を有し、合成及び精製が容易であるターゲッティングペプチドは緊急に求められている。本発明は、優れたターゲッティング性質、容易で安価な合成及び精製をもって、さらに格別に疎水性であるカルボランにカプリングされていても、格別に良好な水溶解性を有するターゲッティングペプチドを提供することによって、これらの問題を解消する。
【００９３】
本発明によるターゲッティング剤の固相合成において、エフェクター単位及び任意の追加単位は、保護基の分離がエフェクター単位又は任意の単位の分解を生じさせる危険を伴うことなく、樹脂に結合されたままでターゲッティングペプチドに結合させることができる。同様の利点は溶液合成の場合にも当てはまる。
本発明及び本発明による生成物、方法及び使用におけるもう一つの重要な利点は、生成物が高度に選択的で、かつ強力なターゲッティング性を有することにある。
【００９４】
抗体又は抗体断片を用いる標的を定めた治療に比較して、本発明による生成物及び方法は数種の理由で格別に有利である。大型生体分子の場合、潜在的免疫学的危険及び関連危険の存在は明白である。本発明によるターゲッティング剤、単位及びモチーフなどの小型合成分子に比較して、アレルギイ反応はこのような生成物にとって格別に問題になる。
抗体又は抗体断片を用いるターゲッティングに比較して、本発明によって開示されている生成物及び方法は、それらの構造を必要に応じて、又は所望により容易に変更することができることから格別に有利である。ヒスチジン、トリプトファン、チロシン及びスレオニンなどの特定のアミノ酸は、所望により排除することができ、また必要な官能性基は非常に少ない。他方、ターゲッティング効果を乱すことなく、種々の相違する構造体を包含させることができ、これにより特定の用途に特別の価値を有する特異的な所望の性質を得ることができる。
【００９５】
本発明によるターゲッティング剤の使用
本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤は、例に示されているように、これらがインビボで腫瘍に対し、特にＮＳＣＬＣ腫瘍に対し選択的に標的を定めることから癌の診断及び治療に有用である。エフェクター単位は所望の効果、検出又は治療に応じて選択することができる。所望の効果はまた、ターゲッティング単位内にエフェクターを含有させるなどによって達成することができる。放射線治療に用いる場合、ターゲッティング単位それ自体が、例えば放射活性に標識付けされていてもよい。
【００９６】
本発明はまた、有効量の本発明による少なくとも１種のターゲッティング剤を含有する診断組成物に関する。本発明によるターゲッティング剤の診断上の有効量は、例えば選択されるエフェクター単位に応じて、１フェムトｍｏｌ〜１０ｍｍｏｌの範囲であることができる。ターゲッティング剤に加えて、本発明による診断組成物は、場合により、担体、溶媒、ベヒクル、懸濁剤、標識付与剤及びその他の診断組成物に慣用される添加剤を含有することができる。このような診断組成物は腫瘍、腫瘍細胞及び転移体、特に肺の腫瘍、さらに特に非小細胞肺癌腫瘍及びＮＳＣＬＣ型の腺癌の診断に有用である。
【００９７】
本発明による診断組成物は液体、ゲル又は固体製剤に、或いは吸入剤などの製剤に調製することができ、好ましくは本発明によるターゲッティング剤を約１ｘ１０−１０ｍｇ／ｌ〜２５ｘ１０４ｍｇ／ｌの範囲の濃度で含有する水性液体に調製することができる。この組成物はまた、安定剤、洗剤、例えばポリソルベート、ならびにその他の添加剤をさらに含有することができる。これらの成分の濃度は、使用される組成に格別に依存する。この診断組成物は、インビボ又はインビトロで使用することができる。
本発明はまた、ターゲッティング剤及びターゲッティング単位を癌処置用医薬組成物の製造に使用することを包含する。
【００９８】
本発明はまた、本発明による少なくとも１種のターゲッティング剤の治療有効量を含有する医薬組成物に関する。この医薬組成物は、本発明によるターゲッティング剤又はターゲッティング単位、或いはその治療的に許容される塩、エステル又は別の誘導体を含有する医薬組成物の治療有効量を投与することによって癌疾病の処置、予防又は緩和に使用することができる。この組成物はまた、相違する組合わせのターゲッティング剤及びターゲッティング単位を標識付与剤、造影剤、医薬及びその他の添加剤とともに含有することができる。
【００９９】
本発明によるターゲッティング剤の治療有効量は該医薬組成物の組成に応じて変えることができる。好ましくは、本発明による医薬組成物は、約０．００００１ｍｇ／ｌ〜２５０ｇ／ｌ、さらに好ましくは約０．００１ｍｇ／ｌ〜５０ｇ／ｌ、最も好ましくは０．０１ｍｇ／ｌ〜２０ｇ／ｌの変化する濃度でターゲッティング剤を含有することができる。
本発明による医薬組成物は本発明によるターゲッティング剤の投与に有用である。経口使用、静脈又は局所注射、又は注入、又は吸入に適する医薬組成物は特に好適である。該医薬組成物は、インビボ又はエクスビボで使用することができる。
【０１００】
これらの製剤は凍結乾燥することができ、投与前に再構成することができ、或いは、すぐに投与できる形状、例えば溶液、懸濁液、懸濁液−溶液などとして、或いは一般に粉末、濃縮物、凍結液体及びいずれかその他の種類の形態又は形状で保存することができる。これらの製剤はまた、使用前に、混合し、次いで可能な別段の操作及び／又は処理などを行う分離した構成成分からなることができる。液体製剤は、再構成をすることなく投与することができるという利点を備えている。溶液製剤のｐＨは約１〜約１２の範囲、好ましくは生理学的ｐＨ付近である。この溶液の浸透圧は、例えば塩化ナトリウム及び／又は糖、ポリオール及び／又はアミノ酸及び／又は類似の成分を用いて好適数値に調整することができる。該組成物はさらに、薬学的に許容される賦形剤及び／又は安定剤、例えばアルブミン、糖及び各種ポリオール、ならびにいずれか許容される添加剤、又はその他の活性成分、例えば化学療法剤を含有することができる。
【０１０１】
本発明はまた、癌の処置を必要とする患者に治療有効量の本発明による医薬組成物を投与することによって癌、特に固形癌を処置する方法に関する。
治療用量は、利用可能なターゲッティング剤及びターゲッティング単位をインビトロ又はインビボ試験系において試験することによって実験的に決定することができる。適当な治療有効量は次いで、これらの試験から推定することができる。
経口投与の場合、ターゲッティング単位及びターゲッティング剤が安定であって、腸器官から適度に吸収されることが重要である。
本発明による医薬組成物は全身的に、非全身的に、局所的に又は局部的に、非経口的に、ならびに経口的に、例えば皮下、静脈内、筋肉内、経口、鼻内に、肺エアゾル又は粉末により、特定の臓器又は領域中への注射又は注入により、口腔に、頭内又は腹腔内などに投与することができる。
【０１０２】
本発明による腫瘍ターゲッティング剤の投与量及び投与計画は、癌処置の臨床分野の当業者によって容易に決定することができる。一般に、この投与量は、例えば使用されるターゲッティング剤のタイプ；年齢；健康状態；処置される医学的状態；なされている場合、現時点での処置の種類；処置の頻度及び所望の効果の性質；性別；症状の持続期間；及びなされている場合、反対の指示、及び担当医師により調整されるべき他の諸問題；などを考慮して変えることができる。本発明によるターゲッティング単位又はターゲッティング剤のヒト患者に対する好適投与量は、ボーラス又は反復投与として、例えば一日投与量として、約１ｘ１０−９ｍｇ／体重ｋｇ〜約４０ｍｇ／体重ｋｇの範囲で変えることができる。
【０１０３】
本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤ならびに医薬組成物はまた、ＤＮＡ又はＲＮＡ或いはその構造的及び機能的類縁体、例えばホスホロチオエート、又はペプチド核酸（ＰＮＡ）を腫瘍中及びそれらの転移体に、或いはインビトロで単離細胞及び臓器に供給するためのターゲッティングデバイスとして、すなわちインビボ及びインビトロの両方における遺伝子治療用の道具として使用することもできる。このような場合、これらのターゲッティング剤又はターゲッティング単位は、ウイルスキャプシド又はエンベロープの、リポソームの、或いはその他のＤＮＡ／ＲＮＡの「容器」（ｃｏｎｔａｉｎｅｒｓ）又は関連物質の一部であることができ、又はＤＮＡ／ＲＮＡ又は上記その他の分子に直接にカプリングさせることもできる。本発明の特に好適な実施形態において、ターゲッティング剤は１個の連続分子としてペプチド結合を介して結合されているアミノ酸鎖又はその構造的又は機能的類縁化合物としてＴＵを含有し、及びＰＮＡ又はその類縁体としてＥＵを含有する。このようなターゲッティング剤は遺伝子発現の遺伝子産物−特異性阻害（サイレンシング）（ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ）用の小型干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ；この場合、「ｓｉＰＮＡ」）の細胞内供給に使用することができる。
【０１０４】
本発明はまた、インビボ及びインビトロにおける癌又は癌細胞の診断、検出又は分析用のキット及びキット構成成分を包含する。このようなキットは少なくとも１種の本発明によるターゲッティング剤又はターゲッティング単位を検出可能な診断要素とともに含有する。このキットは、例えば免疫学的方法、放射性又は酵素性方法或いはその他の当技術で公知の方法による検出のための単位とカップリングしているターゲッティング剤又はターゲッティング単位を包含することができる。
【０１０５】
さらにまた、本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤、ならびにターゲッティングモチーフ及び配列は、上記目的のいずれかのためのペプチド模擬化合物の設計に先導化合物として使用することができる。
さらにまた、本発明によるターゲッティング単位及びターゲッティング剤、ならびにターゲッティングモチーフ及び配列は、そのままで、又は他の材料にカプリングさせて、細胞、分子及び関連生物学的標的の単離、精製及び同定に使用することができる。
【０１０６】
下記例は本発明の好適実施形態をさらに説明するものであり、本発明の範囲を制限しようとするものではない。本発明の概念を種々の方法で実行できることは、技術的進歩として、当業者に明白であろう。本発明及びその実施形態は上記例に制限されるものではなく、特許請求の範囲内で変えることができる。
【実施例】
【０１０７】
実施例１
患者試料をバイオ−パンニングするための一般的スクリーニング方法
ファージディスプレイライブラリー。Ｓｍｉｔｈ及びＳｃｏｔｔ（１９９３）による標準的方法を使用した。臨床試料のスクリーニングに用いられるファージディスプレイライブラリーをｆＵＳＥ５ベクターでクローン形成し、及び構造体Ｘ７及びＸ１０のクローンを形成した；すなわち、これらは７個又は１０個のランダムアミノ酸を含有する直鎖状体であった。このライブラリーは別々に分離して、又は混合物として使用した。ファージ増幅用のホストとしては、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ９１ｋａｎを使用した。
【０１０８】
消去式パンニング（ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎａｌ  ｐａｎｎｉｎｇ）。バイオ−パンニングは正常な肺に結合するファージクローンの消去を伴い開始した。腫瘍切除中に分離される手術による肺切除から採取した正常な肺組織を、プロテアーゼ阻害剤（Ｐ１）；１０ｍＭ  ＰＭＳＦ（パラ−メチル−スルホニル−フルオライド）、アプロチニン（Ａｐｒｏｔｉｎｉｎ）（１０ｍｇ／ｍｌ）、ロイペプチン（Ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ）（１０ｍｇ／ｍｌ）を含有する氷冷ＤＭＥＭ（ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の培地）中に入れた。組織試料は小細胞培養プレートのＤＭＥＭ−Ｐ１  １ｍｌ中でレーザ刃により細分化した。この試料をエッペンドルフ管に移し、次いでＤＭＥＭ−Ｐ１  １ｍｌにより洗浄した。
【０１０９】
試料は４０００ｒｐｍで５分間、遠心分離し、次いでＤＭＥＭ−Ｐ１  １ｍｌ中で２５℃において４５分間にわたり、ファージ（１種又は２種以上のペプチドライブラリー）の１０１０形質転換性単位（ＴＵ）とともにインキュベートした。この後、試料を１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＤＭＥＭ−Ｐ１により３回、洗浄した。
【０１１０】
カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）（ｋａｎ）１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ（ルリアンブロス（Ｌｕｒｉａｎ  ｂｒｏｔｈ））中のＫ９１ｋａｎ細菌  １ｍｌ、ＯＤ６００（光学濃度：６００ｎｍ）１−１．５を、正常肺組織には結合しないファージ粒子を含有する上清に２５℃において２５分間かけて感染させた。感染後、１００μｇ／ｍｌ  ｋａｎ含有ＬＢにより容積を２ｍｌに増加させた。次いで、感染細菌を、各２００μｌ中テトラサイクリン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ）（ｔｅｔ）４０μｇ／ｍｌ含有ＬＢ寒天プレート上にプレート形成した。これらのプレートを＋３７℃で一夜にわたりインキュベートした。
【０１１１】
翌日、さらに増殖させるために、該プレートから細菌コロニーをＬＢ  ２００ｍｌ（１００μｇ／ｍｌｋａｎ、２０μｇ／ｍｌ  ｔｅｔ）中に一緒に集めた。この培養物を３７℃で１〜１．５時間かけて増殖させた。
次いで、これらの細菌を５０００ｒｐｍで１５分間かけてペレット化した。増幅されたファージを含有する上清を、０．０４ｇ／ｍｌまでのＰＥＧ（ポリエチレングリコール）及び０．０３ｇ／ｍｌまでのＮａＣｌの添加により沈殿させた。これらのファージを氷上で＋４℃において一夜にわたり振り混ぜた。この後、ファージを＋４℃において１００００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によりペレット化した。生成するペレットをＴＢＳ（トリス−緩衝溶液）中に再懸濁し、次いで上記のとおり、ＰＥＧ／ＮａＣｌの添加により氷上で＋４℃において１時間かけて再沈殿させた。
【０１１２】
次いで、これらのファージを＋４℃において１４０００ｒｐｍで２０分間かけてペレット化した。最後に、これらのペレットを０．０２％  ＮａＮ３含有ＴＢＳ  １ｍｌ中に再懸濁し、次いで＋４℃で保存した。
ファージの力価測定（ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）。臨床試料のバイオ−パンニングの次のラウンドのために、このＴＢＳファージストックの力価（ｔｉｔｅｒ）を下記のとおりにして測定した：ホスト細菌の感染用に数種の希釈（１：１０００〜１：１ｘ１０７）を行った。感染後、細菌をテトラサイクリン（ｔｅｔ）４０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天プレート上でプレート形成し、これらのプレートを＋３７℃において一夜にわたりインキュベートした。
翌日、コロニーを計数することによって力価を計算した（ＴＵ／ｍｌ  ＴＢＳファージストック）。
【０１１３】
臨床腫瘍試料におけるファージ表示。組織試料は非小細胞肺癌患者の原発性腫瘍から手術により分離し、冷ＤＭＥＭ−Ｐ１に入れた。試料の一部は組織学的検査用に取っておいた。これらの腫瘍試料のタイプ及び性質を先ず、ＮＳＣＬＣであるものとしてベリフィケーションした。その後、ＮＳＣＬＣのサブタイプ及びその段階の詳細を組織学的に特定した。
組織試料をプロテアーゼ阻害剤含有ＤＭＥＭ  １ｍｌを含有する小細胞培養管においてレーザ刃により細分化した。これらの試料をエッペンドルフ管に移し、次いでＤＭＥＭ−Ｐ１  １ｍｌにより洗浄した。
【０１１４】
試料を４０００ｒｐｍで５分間にわたり遠心処理し、次いでＤＭＥＭ−Ｐ１  １ｍｌ中のファージ（１種又は２種以上のペプチドライブラリーから）１０１０ＴＵとともに２５℃において１５分間にわたりインキュベートした。この後、試料を１％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）含有ＤＭＥＭ−Ｐ１で３回、洗浄した。
カナマイシン（ｋａｎ）１００μｇ／ｍｌを含有するＬＢ中のＫ９１ｋａｎ細菌１ｍｌ、ＯＤ６００：１−１．５を、選択的に結合したファージ粒子を含有する洗浄ペレットにより２５℃で２５分間かけて感染させた。感染後、１００μｇ／ｍｌ  ｋａｎ含有ＬＢにより２ｍｌに増加させた。
【０１１５】
次いで、感染細菌を、下記のとおりにテトラサイクリン（ｔｅｔ）４０μｇ／ｍｌ含有ＬＢ寒天プレート上でプレート形成した：３種の希釈（１：５０、１：５００、１：５０００）の２列平行プレート及び各２００μｌの上記Ｋ９１ｋａｎ培養物の残り。これらのプレートを＋３７℃で一夜にわたりインキュベートした。
引続く２４〜４８日間、ＬＢｔｅｔプレートからコロニーをファージＤＮＡのスクリーニング用の９６−ウエルミクロプレートに採取した。別法では、クローンは後刻の分析用に−２０℃で保存した。
スクリーニング用にコロニーを採取した後、残りの細菌コロニーは、さらに増殖させるためにプレートから２００ｍｌ  ＬＢ（１００μｇ／ｍｌｋａｎ、２０μｇ／ｍｌｔｅｔ）に集めた。この培養物を３７℃で１〜１．５時間かけて増殖させた。
【０１１６】
次いで、これらの細菌を５０００ｒｐｍで１５分間かけてペレット化した。増幅されたファージを含有する上清を、０．０４ｇ／ｍｌまでのＰＥＧ及び０．０３ｇ／ｍｌまでのＮａＣｌの添加により沈殿させた。これらのファージを氷上で＋４℃において一夜にわたり振り混ぜた。この後、ファージを＋４℃における１００００ｒｐｍで２０分間の遠心分離によりペレット化した。生成するペレットをＴＢＳ中に再懸濁し、次いで上記のとおり、ＰＥＧ／ＮａＣｌの添加により氷上で＋４℃において１時間かけて再沈殿させた。次いで、これらのファージを氷上で＋４℃において１４０００ｒｐｍで２０分間かけてペレット化した。最後に、これらのペレットを０．０２％  ＮａＮ３含有ＴＢＳ  １ｍｌ中に再懸濁し、次いで＋４℃で保存した。臨床試料のバイオ−パンニングの次のラウンドのために、このＴＢＳファージストックの力価を上記のとおりに測定した。
腫瘍ターゲッティングペプチドの選択的濃縮を達成するために、上記のとおりにして調製したファージストックを、３〜６回の臨床試料バイオ−パンニングに使用した。
【０１１７】
ペプチド濃縮の監視。選択的に濃縮されたペプチドの配列数を測定するために、ＤＮＡ配列決定を、先行する二次バイオ−パンニングからの各ファージコロニーを代表する２４〜４８のコロニーについて行った。
最初のコロニーＰＣＲを行い、スクリーニング用ＤＮＡを生成した。９６−ウエルプレートのウエルにおいて、細菌コロニーをＴＢＳ緩衝溶液１０ｍｌに懸濁し、この懸濁液５μｌをＰＣＲ反応に付した。次いで、ＰＣＲ−Ｍｉｘを調製した：一反応あたりのＰＣＲ−Ｍｉｘは：１０ｍＭ  ｄＮＴＰ’ｓ  ０．１ｍｌ、鋳型  ５．０μｌ、Ｆ１−フォワードプライマー（１５μＭ）０．７μｌ、Ｆ１−リバースプライマー（１５μＭ）０．７μｌ、１０ｘダイナザイム（Ｄｙｎａｚｙｍｅ）緩衝溶液４μｌ、ダイナザイムポリメラーゼ（＝１Ｕ）０．５μｌ及び最終容積を４０ｍｌにするｄＨ２Ｏ  ２９μｌである。使用されたＰＣＲプログラムの設定は、９６℃で５分間、次いで１分間の３工程、１）９２℃で３０秒間、２）６０℃で３０秒間、及び３）７２℃でサイクルであった。この３工程サイクルを３５回、反復した。ＰＣＲ増幅に使用されたプライマーの配列は、Ｆ１−Ｆについて５’−ｇＣＡＡｇＣＴｇＡＴＡＡＡＣＣｇＡＴＡＣＡＡＴＴＡＡＡｇｇ−３’であり、またＦ１−Ｒについて５’−ｇＣＣＣＴＣＡＴＡｇＴＴＡｇＣｇＴＡＡＣｇＡＴＣ−３’であった。
【０１１８】
配列決定に先立ち、ファージコロニーのＤＮＡ挿入物の増幅を電気泳動によって確認した。配列決定は上記Ｆ１−Ｆ及びＦ１−Ｒプライマーを用いるＡＬＦ自動式ＤＮＡ配列決定装置（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて行った。
ヒト肺腫瘍組織のバイオ−パンニングにより選択的に濃縮されたペプチド配列。肺腫瘍に選択的に結合するペプチドを表１に列挙する。濃縮ペプチド配列は４〜６回のエクソビボ  バイオ−パンニングラウンドから収集した。
【０１１９】
【表１】
2008539209.tif 000003
【０１２０】
実施例２
合成ペプチドの製造
全部のペプチド合成は手動式で、又は自動式合成装置（Ａｐｐｌｉｅｄ  ４３３Ａ又はＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ  ３９６ＤＣ）を用いて行った。この方法はＮ−ＦＭＯＣ保護及びＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ活性化に基づく固相ペプチド合成であった。使用された合成樹脂はＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂、又はシステアミン−２−クロロトリチル樹脂又は予備装填されているＦＭＯＣ−アミノ酸Ｗａｎｇ樹脂であった。自動式合成において、製造業者により推奨されている標準的操作方法及び試薬を使用した。
【０１２１】
これらの合成における主要試薬は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｅから、又はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから入手した：Ｆｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ（「Ａ」で表す）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ（「Ｄ」で表す）、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ（「Ｇ」で表す）、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔＢｏｃ）−ＯＨ（「Ｋ」で表す）、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ（「Ｌ」で表す）、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（「Ｐ」で表す）、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（「Ｒ」で表す）。スペサーアミノ酸：Ｆｍｏｃ−１１−アミノ−３，６，９−ウンデカン酸（「ＰＥＧ」で表す）は、Ｋｕｏｐｉｃ大学、Ｆｉｎｌａｎｄから購入し、従来開示されているとおりに調製されていた（Ｂｏｕｍｒａｈ等、１９９７）。
【０１２２】
リンカー：２−アミノエタンチオールはシステアミン樹脂の分解を経て生成した。２個のアミノ基のオルトゴナル保護の観点から分枝状構造の生成には、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨを使用した。１個のカルボキシルを介してカプリングされている金属キレート化剤Ｄｏｔａ、すなわち１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸は、Ｍａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ，Ｄａｌａｓ，ＴｅｘａｓからＤｏｔａトリス（ｔ−Ｂｕエステル）の固相カプリングによって配合した。
【０１２３】
標識：Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒからのチオール反応性標識付け試薬、ｐ−ヨウドアセトアミドベンジル−ＤＴＰＡのユウロピウム（ＩＩＩ）キレートをパーキン  エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の推奨方法に従いスルフヒドリル担持ペプチドとカプリングさせた。
【０１２４】
本明細書において、下記略語を使用する：
「Ａｃ」は、ＣＨ３Ｃ（Ｏ）、すなわちアセチルを表す（アクチニウムではない）。
「ＡＤＧＡ」は、Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａを表す。
「ＡＭＢ−ＤＴＰＡ−Ｅｕ」は、一級アミノ基を介してカプリングされている（ｐ−（（２−アミノエチルメルカプト）アセトアミド）ベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−ペンタ酢酸のＥｕ３＋−キレートを表す。
「アミド」は、カルボキシル基（例えば、ペプチドのＣ−末端に存在する）に結合したＮＨ２基を表す。
「Ｄｏｔａ」は、１個のカルボキシルを介してカプリングされている１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸、すなわち（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ））４マイナスＯＨ  １個を表す。
「ＤＰＬＫＲＡＲ」は、Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇを表す。
「ＤＴＰＡ」は、ジエチレントリアミン−Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−ペンタ酢酸を表す。
【０１２５】
「ＤＴＰＡ−Ｅｕ」は、ＤＴＰＡのＥｕ３＋−キレートを表す。
「ＥＡＴ」は、２−アミノエタンチオール、すなわちエチレンアミノチオール、すなわち−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨを表す。
「Ｇ３」は、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙを表す。
「ＧＡ」は、Ｇｌｙ−Ａｌａを表す。
「ＧＡＡＧ」は、Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙを表す。
「ＰＥＧ」は、ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）を表す。
「ＥＧ」は、ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨを表す。
「ビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）」は、Ｄ−ビオチニル、すなわちそのカルボキシル基を介してカプリングされているビタミンＨを表す。
「カルボラン（Ｃａｒｂｏｒａｎｅ）」は、５−（１−ｏ−カルボラニル）−ペンタノイル基、Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ２）４−Ｃ２Ｂ１０Ｈ１１を表す。
【０１２６】
試薬のリスト
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨ、ＣＡＳ  Ｎｏ．２９０２２−１１−５、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃａｔ．Ｎｏ．０４−１２−１００１、分子量：２９７．３ｇ／ｍｏｌ。
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ、ＣＡＳ  Ｎｏ．１５４４４５−７７−９、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＥＮ９１１０９７、分子量：６４８．８ｇ／ｍｏｌ。
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｅｕ−ＯＨ、ＣＡＳ  Ｎｏ．３５６６１−６０−０、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＥＮ９１１０４８、分子量：３５３．４ｇ／ｍｏｌ。
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｐｒｏ−ＯＨ、ＣＡＳ  Ｎｏ．７１９８９−３１−６、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＥＮ９１１０６０、分子量：３３７．４ｇ／ｍｏｌ。
Ｆｍｏｃ−Ｌ−Ｌｙｓ−ＯＨ、ＣＡＳ  Ｎｏ．７１９８９−２６−９、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．ＧＥＮ９１１０５１、分子量：４６８．６ｇ／ｍｏｌ。
【０１２７】
システアミン−２−クロロトリチル樹脂、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ０１−６４−０１０７、ｓｕｂｓｔ．：１．３３ｍｍｏｌ／ｇ。
ＲｉｎｋアミドＭＢＨＡ樹脂、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ０１−６４−０１０７、ｓｕｂｓｔ．：１．３３ｍｍｏｌ／ｇ。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ樹脂、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４０１４２１、０．６５ｍｍｏｌ／ｇ。
Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ樹脂（カルボキシル末端「Ｇｌｙ−ＯＨ」を表す）、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４０１４２１、０．６５ｍｍｏｌ／ｇ。
Ｏ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂（「ＥＧ」で表す）、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ  ｐｒｏｄｕｃｔ、Ｎｏ．０１−６４−０２３５。
Ｄ−ビオチン（ビタミンＨ）、ＣＡＳ  Ｎｏ．５８−８５−５、Ｓｉｇｍａ  Ｂ−４５０１、分子量：２４４．３ｇ／ｍｏｌ。
５−（１−ｏ−カルボラニル）−ペンタン酸（「カルボラン」で表す）、Ｋａｔｃｈｅｍ、Ｐｒａｇｕｅ、Ｃｚｅｃｈ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ、分子量：２４４．３４ｇ／ｍｏｌ。
【０１２８】
ペプチド合成の一般的方法：手動式固相合成。質量分析測定。
全部の手動式合成方法は、２〜４の有孔度を有する焼結ガラスフィルタディスク、先端に存在するポリプロピレン又はフェノール系プラスティックねじ付栓（密封用）、及び２個のＰＴＦＥキイストップコック（１個はフィルタディスクの真下に存在し（排出用）及び１個はねじ付栓頚部の肩部分上に傾斜角度で存在する（アルゴンガス導入用））を備えた密封可能なガラスロートで行った。
このロートに適当な固相合成樹脂及び各処理用の溶液を装填し、適当な期間、「手首運動」様ボトルシェーカを用いて効果的に振り混ぜ、次いで中程度のアルゴンガス圧力を適用して濾過した。
【０１２９】
この合成の１サイクル（１個のアミノ酸付加）の一般的方法は下記のとおりであった：
適当な合成樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ又はＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍから）に、推奨されている保護基を有する１種又は２種以上のアミノ酸単位からなるＦＭＯＣ−ペプチド（＝そのアミノ−末端アミノ基が９−フルオレニルメチルオキシカルボニル基により保護されている）約０．２５ｍｍｏｌを装填した；樹脂約０．５ｇ（０．５ｍｍｏｌ）は以下に示す方法で処理した、各処理工程は、別段の記載がないかぎり、指示溶液又は溶媒１０ｍｌとの１〜２分間の振り混ぜ及び濾過を包含する。
【０１３０】
「ＤＣＭ」はジクロロメタンを意味し、また「ＤＭＦ」はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドとの振り混ぜを意味する（ＤＭＦの代わりにＮＭＰ、すなわちＮ−メチルピロリジノンを使用することもできる）。
処理工程は下記のとおりであった：
１．        ＤＣＭ、１０〜２０分間の振り混ぜ
２．        ＤＭＦ
３．        ５分間、ＤＭＦ中の２０％（容積％）ピペリジン
４．        １０分間、ＤＭＦ中の２０％（容積％）ピペリジン
５〜７．    ＤＭＦ
８〜１０．  ＤＣＭ
１１．      ＤＭＦ
１２．      活性化アミノ酸（製造方法は下記に示す）０．７５ｍｍｏｌのＤＭＦ溶液、２時間の振り混ぜ
１３〜１５．ＤＭＦ
１６〜１８．ＤＣＭ。
【０１３１】
最後の処理（１８）後、アルゴンガスを約１５分間にわたり樹脂に通し、次いでこの樹脂をアルゴン下に保存した（当合成を追加の単位とともに継続する場合、密封した反応ロート中で）。
樹脂上のアミノ酸又はペプチド鎖に付加されるべき９−フルオレニルメチルオキシカルボニル−Ｎ−保護アミノ酸（ＦＭＯＣ−アミノ酸）の活性化は、処理工程Ｎｏ．１２の前に別の容器において以下で挙げられている試薬を用いて行った。すなわち、ＦＭＯＣ−アミノ酸（０．７５ｍｍｏｌ）をＤＭＦ約３ｍｌに溶解し、ＤＭＦ中のＨＯＢｔの０．５Ｍ溶液１．５ｍｌに溶解したＨＢＴＵ  ０．７５ｍｍｏｌの溶液により１分間かけて処理し、次いで直ちに、２．０Ｍ  ＤＩＰＥＡ溶液  ０．７５ｍｌで５分間かけて処理した。
【０１３２】
ＦＭＯＣ−アミノ酸の活性化に使用された活性化試薬は下記のとおりであった：
ＨＢＴＵ＝２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＣＡＳＮｏ．［９４７９０−３７−１］、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４０１０９１、分子量：３７９．３ｇ／ｍｏｌ。
ＨＯＢｔ＝１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、ＤＭＦ中０．５Ｍ溶液、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４００９３４。
ＤＩＰＥＡ＝Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、Ｎ−メチルピロリドン中の２．０Ｍ溶液、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ、Ｃａｔ．Ｎｏ．４０１５１７。
【０１３３】
上記方法を適当な保護基を有する相違するＦＭＯＣ−アミノ酸を用いて数サイクル反復し、「樹脂結合」ペプチド（すなわち、適当なペプチドの樹脂状供給源）を生成する。この方法はまた、或る種のエフェクター単位又はリンカー単位、例えばＤｏｔａ又はＦＭＯＣ−Ｔｅｇ（すなわち、Ｆｍｏｃ−１１−アミノ−３，６，９−ウンデカノイル基）の樹脂結合ペプチドへの結合方法を提供する。また、上記したこの一般的カプリング方法を用いて、ほとんど最初の単位（配列のＣ−末端部位）を、Ｒｉｎｋアミド樹脂に、又はシステアミン樹脂に連結することができる。システアミン樹脂の場合、このピペリジンによる初期処理（工程３〜１１）は、第一サイクルでは不必要である。
【０１３４】
Ｎ−末端アセチル化生成物が要求される場合、工程１２において活性化ＦＭＯＣ−アミノ酸の代わりに無水酢酸を用いる以外は、上記方法を行った：Ｎ−メチルピロリジン中のＮ，Ｎ−プロピルエチルアミンの２．０Ｍ溶液４倍量中に混合されている無水酢酸１容量。
樹脂から解離は下記試薬混合物を用いて行った：
トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）  ９２．５容量％
水  ２．５容量％
エタンジチオール  ２．５容量％。
【０１３５】
工程１〜１０（上記一般的方法に記載されているとおり）を経て保護ＦＭＯＣ基を分離した後、この樹脂をＤＣＭで洗浄し、アルゴン流下に乾燥させ、次いで上記試薬混合物３部（各部１０ｍｌ）によりそれぞれ１時間かけて処理した。これらの処理は上記の方法でアルゴン雰囲気下に行った。この処理から３時間後、濾過から得られたＴＦＡ溶液を減圧下に回転蒸発器を用いて濃縮し、次いでアルゴンを再装填した。精製は逆相高速液体クロマトグラフイ（ＨＰＬＣ）法により粒子サイズ１０マイクロメーターのＣ−１８型カラムを備えた「Ｗａｔｅｒｓ６００」ポンプ装置及びその組成を３０分の間に９９．９％水／０．１％ＴＦＡから９９．９％アセトニトリル／０．１ＴＦＡまで変える直鎖状溶質勾配を用いて行った。このＨＰＬＣカラムの寸法は２５ｃｍｘ２１．２ｍｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ  ｃａｔ．ｎｏ．５６７２１２−Ｕ）及び１５ｃｍｘ１０ｍｍ（Ｓｕｐｅｌｃｏ  ｃａｔ．ｎｏ．５６７２０８−Ｕ）であった。検出は２１８ｎｍにおける吸光に基づき、「Ｗａｔｅｒｓ２４８７」装置を用いて行った。
【０１３６】
上記切断混合物はまた、下記保護基を同時に分離した：リジンの側鎖の保護に使用されたｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）；アルギニンの側鎖の保護に使用された２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾファン−５−スルホニル（Ｐｂｆ）；アスパラギン酸の側鎖カルボキシル基の保護に使用されたｔｅｒｔ−ブチルエステル（ＯｔＢｕ）；また上記切断混合物は類似構造体（チオール、グアニル、カルボキシル）上のこれらの保護基の分離に常用することができる。
この方法で合成された化合物は簡単に提示されている（本明細書でも）配列において「右から左」に構成することができる、すなわちペプチド鎖のＣ−末端から開始することもできる。
【０１３７】
採用された質量分析法
マトリックス支持レーザ脱着イオン化−フライト時間（Ｍａｔｒｉｘ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｆｈｔ）（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）。
装置の型式
ブルカー  ウルトラフレックス（Ｂｒｕｋｅｒ  Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ）ＭＡＬＤＩ  ＴＯＦ／ＴＯＦ質量分析計
装置供給業者
Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃ  ＧｍｂＨ
Ｆａｈｒｅｎｈｅｉｔｓｒａｓｓｅ  ４
Ｄ−２８３５９  Ｂｒｅｍｅｎ
ドイツ国
【０１３８】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ陽イオン反射モード
外部標準：
アンギオテンシンＩＩ、アンギオテンシンＩＩ、物質Ｐ（ＲＰＫＰＱＱＦＦＧＬＭ）、ボムベシン（ｂｏｍｂｅｓｉｎ）、ＡＣＴＨ（１−１７）ＡＣＴＨ（１８−３９）、ソマトスタチン（ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ）２８、及びブラディキニン（ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）１−７。
マトリックス：
アルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（トリフルオロ酢酸０．１％含有水性６０％アセトニトリル中の２ｍｇ／ｍｌ溶液、又は酸感受性試料の場合、アセトンのみ）。
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ陰イオン反射モード
外部標準：
コルシストキニン（ｃｈｏｌｅｃｙｓｔｏｋｉｎｉｎ）及びグルカゴン又は［Ｇｌｕ１］−フィブリノーゲンペプチドＢ。
マトリックス
アルファ−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（アセトン中の飽和溶液）。
【０１３９】
試料の調製：
試料は上記マトリックス溶液により１０−１００ピコモル／マイクロリッター濃度で混合し、次いで標的上で乾燥させた。
波長３３７ｎｍにおいて窒素レーザを減圧で「発射」することによってイオン化する。プローブプレートの電圧は陽イオン反射モードで１９ｋｖであり、また陰イオン反射モードで−１９ｋｖであった。
【０１４０】
スペクトルにかかわる一般的注意点（陽イオンモードの場合のみ）：
全部の場合、同位元素サテライトに基づくその典型的な細かい構造によるＭ＋１（すなわち１個のプロトン付加）シグナルが、明白に支配的であった。ほとんどの場合、このＭ＋１パターンは類似するが、格別に弱いＭ＋２３におけるピークバンドを付随した（Ｎａ＋付加）。Ｍ＋１及びＭ＋２３におけるバンドに加えて、Ｍ＋３９（Ｋ＋付加）又はＭ＋５６（Ｆｅ＋付加）におけるバンドをまた、かなりの場合に見出すことができた。
合成例内で報告されている分子質量値は各要素の最も豊富な同位元素に、すなわち「正確な質量」に相当した。
【０１４１】
実施例３
ターゲッティング剤ＩＳ２５７の合成
Ａｃ−ＡＲＲＰＫＬＤ−アミド（ＩＳ２５７）、すなわちＣＨ３−Ｃ（Ｏ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＮＨ２の合成は、上記の一般的方法に従い手動式で行い、ＲｉｎｋアミドＮＢＨＡ樹脂に基づいていた。試薬（試薬リストの項で上記）は合成方向で上記配列に従い使用した（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨから出発、すなわち右から左）。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：８９６．５１Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：８９５．５４Ｄａ。
【０１４２】
実施例４
ターゲッティング剤ＨＰ１９６の合成
ＡＤＧＡ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＧＡＡＧ（ＨＰ１９６）、すなわちＨ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ２の合成は、上記の一般的方法に従い手動式で行い、ＲｉｎｋアミドＮＢＨＡ樹脂に基づいていた。試薬（試薬リストの項で上記）は合成方向で上記配列に従い使用した（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨから出発、すなわち右から左の方向）。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：１４２４．８Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１４２３．８Ｄａ。
【０１４３】
実施例５
ターゲッティング剤ＨＰ１９９の合成
ペプチド配列ＡＤＧＡ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＧＡＡＧに含まれているターゲッティング単位ＡＲＲＰＫＬＤを含有し、及びこのペプチド配列のＣ−末端に存在するスぺーサー単位を経るスルフヒドリル担持リンカー単位を含有するターゲッティング剤ＡＤＧＡ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＧＡＡＧ−ＰＥＧ−Ｇ３−ＥＡＴの合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ４３３Ａペプチド合成装置を用い、システアミン−２−クロロトリチル樹脂及び固相Ｆｍｏｃ−ケミストリイ及び必要な保護アミノ酸試薬（通常、通常の様式で用いられるＦｍｏｃ−ＯＥＧ−ＯＨを包含する）に基づいて行った。
このターゲッティング剤の構造は次のとおりである：Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨ。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：１８４５．２７Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１８４３．９３Ｄａ。
【０１４４】
実施例６
ターゲッティング剤ＨＰ２０１の合成
ターゲッティング単位ＡＲＲＰＫＬＤおよターゲッティング単位のＣ−末端に存在するスペーサー単位を経るスルフヒドリル担持リンカー単位を含有するターゲッティング剤Ａｃ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＧＡＡＧ−ＰＥＧ−Ｇ３−ＥＡＴの合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ４３３Ａペプチド合成装置を用い、システアミン−２−クロロトリチル樹脂及び固相Ｆｍｏｃ−ケミストリイ及び必要な保護アミノ酸試薬（通常、通常の様式で用いられるＦｍｏｃ−ＯＥＧ−ＯＨを包含する）に基づいて行った。プロリンの次のアルギニンは二重の処理により結合させ、またＮ−末端をアセチル化により封鎖した。
このターゲッティング剤の構造は次のとおりである：Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｇｌｙ３−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨ。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：１５７２．８５Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１５７１．８２Ｄａ。
【０１４５】
実施例７
ターゲッティング剤Ａ４８の合成
ペプチド配列ＡＲＲＰＫＬＤ−ＧＡに含まれているターゲッティング単位ＡＲＲＰＫＬＤを含有し、及びこのターゲッティング単位のＣ−末端に存在するスルフヒドリル担持リンカー単位を含有するターゲッティング剤Ａｃ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＧＡ−ＥＡＴの合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ４３３Ａペプチド合成装置を用い、システアミン−２−クロロトリチル樹脂及び固相Ｆｍｏｃ−ケミストリイ及び必要な保護アミノ酸試薬に基づいて行った。Ｎ−末端はアセチル化した。
このターゲッティング剤の構造は次のとおりである：ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨ。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：１０８５Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１０８３．６０Ｄａ。
【０１４６】
実施例８
ユウロピウム−標識付けターゲッティング剤  Ａ４８−Ｅｕの合成
そのＣ−末端にメルカプト基を有するターゲッティング剤Ａｃ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＧＡ−ＥＡＴを、パーキン−エルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ−Ｗａｌｌａｃ  Ｏｙ．Ｔｕｒｋｕ，Ｆｉｎｌａｎｄ）からのチオール反応性（ヨウドアセトアミド活性化）ＩＡＡ−ＤＴＰＡユウロピウムキレートによりパーキン−エルマーの指示に従い処理した。
【０１４７】
すなわち、ペプチド（コードＡ４８）６．６ｍｇを０．０５Ｍ  ＮａＨＣＯ３  １ｍｌ中に溶解した。このペプチド溶液に０．０５  ＮａＨＣＯ３  １．５ｍｌ中の（ｐ−ヨウドアセトアミドベンジル）ジエチレントリアミン−Ｎ１，Ｎ２，Ｎ３，Ｎ３−ペンタ酢酸のＥｕ３＋−キレート（８ｍｇ）を添加した。ｐＨを８．５に調整した後、この溶液を光から保護し、次いで３０℃で一夜にわたり放置した。生成物：ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−ｐ−ＣＨ２ＣＯＮＨ−ベンジル−ＤＴＰＡユウロピウムキレートは、０．０５Ｍ酢酸アンモニウムによって緩衝されている水−アセトニトリル溶出液勾配を用いてＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、次いで陰イオンモードのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析により同定した。陰イオンＭ−１測定値：典型的アイソトーピック分布を伴う１７７０．７４Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１７７１．６８Ｄａ。
【０１４８】
実施例９
ターゲッティング剤Ａ４９の合成
ターゲッティング単位ＡＲＲＰＫＬＤを含有し、及びこのターゲッティング単位のＣ−末端でスペーサーを経てスルフヒドリル担持リンカー単位を含有するターゲッティング剤Ａｃ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＧＡＡＧ−ＰＥＧＳＵ−ＥＡＴの合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｅｍｓ４３３Ａペプチド合成装置を用い、システアミン−２−クロロトリチル樹脂及び固相Ｆｍｏｃ−ケミストリイ及び最初のアミノ酸（１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカンアミンコハク酸）を除いて普通に保護されているアミノ酸試薬に基づいて行った［「ＰＥＧＳＵ」はＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２Ｃ（Ｏ）を表す］。このための試薬は、製品番号：ＮｅｏＭＰＳのＦＡ１８８０１（Ｓｔｒａｓｂｏｕｒｇ，Ｆｒａｎｃｅ）：Ｆｍｏｃ−１−アミノ−４，７，１０−トリオキサ−１３−トリデカンアミンコハク酸であり、通常のＦｍｏｃ−アミノ酸と同様の合成に使用した。そのＮ−末端はアセチル化した。
【０１４９】
このターゲッティング剤の構造は次のとおりである：ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨ。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：１５１４．８６Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１５１３．８４Ｄａ。
【０１５０】
実施例１０
ターゲッティング剤Ｆ５Ｍ−Ａ４９の合成
フルオレセイン標識付けしたターゲッティング剤を、フルオレセイン−５−マレイミド（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて合成した。この反応において、ペプチドＡ４９を、そのスルフヒドリル基を経て標識のマレイミド部分にカプリングさせた。このカプリング反応において、Ｆ５Ｍ及びＡ４９はカプリング用緩衝溶液（１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ２、２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中で４ｍＭにした。この反応におけるＦ５Ｍのモル濃度はＡ４９のモル濃度の３倍である。この反応は、光から保護して一夜にわたり３７℃で混合することによって行った。この反応をβ−メルカプトエタノールの添加により終了させ、次いでＨＰＬＣを用いて精製し、その後、凍結乾燥させた。使用時、Ｆ５Ｍ−Ａ４９はＰＢＳ、ｐＨ７．４に溶解した。
【０１５１】
このターゲッティング剤の構造は次のとおりである：ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ−（ＣＨ２）３−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）３−ＣＨ２−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨＣＨ２ＣＨ２Ｓ−Ｃ２Ｈ３（ＣＯＯＨ）−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−（Ｃ２０Ｈ１１Ｏ５）、すなわち、Ａ４９のフルオレセイン−５−スクシンアミド酸チオエーテル誘導体である。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：１９５９．９５Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１９５８．９２Ｄａ。
【０１５２】
実施例１１
ターゲッティング剤ＨＰ１９２の合成
ターゲッティング単位ＡＲＲＰＫＬＤを含有し、及びこのターゲッティング単位のＣ−末端でスペーサーを経て金属キレート化剤Ｄｏｔａを含有するターゲッティング剤Ｄｏｔａ−Ｌｙｓ−（Ａｃ−ＡＲＲＰＫＬＤ−（ＰＥＧ）２）−アミド（ＨＰ１９２）の合成は、上記一般的方法に従い手動式で行い、ＲｉｎｋアミドＮＢＨＡ樹脂にカプリングさせたＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｍｔｔ）−ＯＨに基づいていた。Ｄｏｔａトリス−ｔ−Ｂｕ−エステルを通常の方法に従い樹脂上でＬｙｓ（Ｍｔｔ）とカプリングさせた。この合成を継続する前に、保護基４−メチルトリチル基（すなわち、Ｍｔｔ）を、試薬混合物：ジクロロメタン中の４％トリフルオロ酢酸／１％エタンジオールを用いる引続く２回の１０分間の処理によってリジン部分の側鎖から分離した。脱保護後であって最初のＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨのカプリングの前に、次の洗浄を行った：２回のジクロロメタンによる洗浄、１回のジクロロメタン中０．１Ｍエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンによる洗浄、及び３回のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドによる洗浄。
【０１５３】
この合成は下記の相当するアミノ酸試薬を用いて一般的方法に従い手動式で継続した：Ｆｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨ（２サイクル）、Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（ｔＢｏｃ）−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ、Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ（２サイクル）及びＦｍｏｃ−Ａｌａ−ＯＨ。２時間の最終終了カプリングは、試薬混合物：４倍容量のＮ−メチルピロリジノン（すなわち、ＮＭＰ）中２Ｍのエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミンと混合されている１容量の無水酢酸を用いて行った。３部のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及び４部のジクロロメタンにより洗浄した後、生成物は上記常法で単離した。
【０１５４】
このターゲッティング剤の構造は次のとおりである：Ｄｏｔａ−Ｌｙｓ［ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＰＥＧ−ＰＥＧ］−ＮＨ２。
このペプチド配列ＡＲＲＰＫＬＤはＮ−末端でアセチル化し、次いで２個のアミノ酸単位（ＰＥＧ）を経てリジンの側鎖とカプリングされている。「ＰＥＧ」はＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）を表す。「Ｄｏｔａ」は１個のカルボキシル基を経てカプリングされている１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸を表す、すなわち（ＣＨ２ＣＨ２Ｎ（ＣＨ２ＣＯＯＨ））４マイナス１個のＯＨを表す。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：１７８８．９４Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１７８８．０Ｄａ。
【０１５５】
実施例１２
化合物ＨＰ１８７及びＩＳ２４８のための出発物質ＨＰ１８６の合成
ターゲッティング単位ＡＲＲＰＫＬＤを含有し、及びこのペプチド配列のＣ−末端にスペーサー単位を含有するターゲッティング剤Ａｃ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＥＧ−Ｈの合成は、上記一般的方法に従い手動式で行い、ＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍからのＯ−ビス−（アミノエチル）エチレングリコールトリチル樹脂（製品番号０１−６４−０２３５）に基づいていた。試薬（試薬リストの項に記載のとおり）を上記配列に従い合成方向で使用し（Ｆｏｍｃ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＯＨ、から出発、すなわち右から左）、そのＮ−末端はアセチル化によって封じた。樹脂の切断は一般的方法とは相違する方法で行い、保護基を保持した。
【０１５６】
この樹脂をジクロロメタン中２％（容量による）トリフルオロ酢酸で２回、それぞれ１５分間かけて処理した。濾過溶液は該酸と等モル量のピリジン上に注ぎ入れ、次いで生成物を水により沈殿させ、次いで減圧乾燥させた。この生成物はそのまま使用した。その同定は先の生成物（コードＨＰ１８６及びＩＳ２４８）の分析に基づいていた。
この原料化合物の構造は：ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（ｔＢｏｃ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２である。「ＥＧ」はＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−を表す。
【０１５７】
実施例１３
ターゲッティング剤ＨＰ１８７の合成
ターゲッティング単位ＡＲＲＰＫＬＤを含有し、及びこのペプチド配列のＣ−末端でスペーサー単位を経てビオチン担持リンカー単位を含有するターゲッティング剤Ａｃ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＥＧ−ビオチン（ＨＰ１８７）の合成は、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍからのビス（６−カルボキシ−ＨＯＢｔ）−Ｎ−（２−アミノエチル）−アミノメチルポリスチレン樹脂（製品番号０１−６４−０１７９）上で行った。この樹脂を３倍過剰量のビオチンとＰｙＢｒｏＰ（ブロモ−トリスピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、ＣＡＳ  Ｎｏ．１３２７０５−５１−２、分子量：４６６．２ｇ／ｍｏｌ、Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、製品番号：０１−６２−００１７）との混合物及び６倍過剰量のＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中のＤＩＰＥＡと５時間かけて振り混ぜた後、樹脂を一般的手動式固相合成方法について上記されているようにＤＭＦ及びジクロロメタンで洗浄した。ビオチンを用いる処理を１３時間にわたり反復し、次いで洗浄した。次いで、２５％過剰の樹脂を、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド中の上記原料化合物（コードＨＰ１８６）を含有する保護ターゲッティング単位とともに一夜にわたり振り混ぜた。この溶液を濾過し、残留物をジクロロメタンにより抽出し、次いで集めた溶液を蒸発乾燥させ、次いで上記のとおりに脱保護（及び樹脂の切断）に慣用の９２％ＴＦＡ／水試薬混合物で処理し、次いでＨＰＬＣにより精製した。
【０１５８】
このターゲッティングの構造は：ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ−ビオチニルである。ここで、ビオチンはそのカルボキシル基を介して該ターゲッティング単位のＣ−末端で「ＥＧ」スペーサーにカプリングされている。
生成物の同定はＱ−ＴＯＦ  ＥＳ＋質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：１２５３．８１Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１２５２．７１Ｄａ。
【０１５９】
実施例１４
ターゲッティング剤ＩＳ２４８の合成
ターゲッティング単位ＡＲＲＰＫＬＤを含有し、及びこのペプチド配列のＣ−末端でスペーサー単位を経て複数のホウ素担持エフェクター単位を含有するターゲッティング剤Ａｃ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＥＧ−カルボランの合成。
このターゲッティング剤の構造は、ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）４−（１−ｏ−カルボラニル）である。ここで、５−（１−ｏ−カルボラニル）−ペンタン酸はそのカルボキシル基を介して該ターゲッティング単位のＣ−末端で「ＥＧ」スペーサーにカプリングされている。
【０１６０】
ターゲッティング単位ＡＲＲＰＫＬＤを含有し、及びまたこのペプチド配列のＣ−末端でスペーサー単位を経て複数のホウ素担持エフェクター単位を含有するターゲッティング剤Ａｃ−ＡＲＲＰＫＬＤ−ＥＧ−カルボランの合成は、有機溶液中で行った。すなわち、５−（１−ｏ−カルボラニル）−ペンタン酸０．１８５ｍｏｌ及びＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍからのＷＳＣ  ０．１９２ｍｏｌ（１−エチル−３−（３’−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド．ＨＣｌ、ＣＡＳＮｏ．２５９５２−５３−８、分子量：１５５．２＋３６．５）（製品番号：０１−６２−００１１））をジクロロメタン１．５ｍｌに溶解した。２０分後、上記原料化合物（コードＨＰ１８６）を含有する保護ターゲッティング単位０．０６２ｍｏｌを上記溶液と一緒に合わせ、次いで室温で一夜にわたり攪拌した。次いで、この混合物を蒸発乾燥させ、次いで９５％ＴＦＡ／５％水混合物で２時間かけて処理した。蒸発後、この残留物をジエチルエーテルとすり混ぜ、次いで沈殿をＨＰＬＣにより精製した。
【０１６１】
このターゲッティングの構造は：ＣＨ３Ｃ（Ｏ）−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−（ＣＨ２）４−（１−ｏ−カルボラニル）である。ここで、５−（１−ｏ−カルボラニル）−ペンタン酸はそのカルボキシル基を介して該ターゲッティング単位のＣ−末端で「ＥＧ」スペーサーにカプリングされている。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：１０個のホウ素原子により影響される典型的アイソトーピックパターンの最高ピークを表す陽イオンＭ＋１測定値：１２５４．８７Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１２５４．８６Ｄａ（１２５３．８９Ｄａはアイソトーピックパターンの最高ピークを表す）。
【０１６２】
実施例１５
各種ターゲッティング単位の合成
１５種の化合物を合成した：６種のターゲッティングペプチドＡＲＲＰＫＬＤ（すなわち、Ａｌａ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ）では、１個のアミノ酸残基を、Ａ（すなわち、アラニン）で置き換えることによる、すなわちＡＡＲＲＫＬＤ、ＡＲＡＰＫＬＤ、ＡＲＲＡＫＬＤ、ＡＲＲＰＡＬＤ、ＡＲＲＰＫＡＤ、及びＡＲＲＰＫＬＡ。５種のターゲッティングペプチドでは、Ｋ（すなわち、リジン）を、Ｄ（すなわち、アスパラギン酸）で、Ｏ（すなわち、オルニチン）で、Ｒ（すなわち、アルギニン）で、又はＹ（すなわち、チロシン）で置き換えることによる、すなわちＡＲＲＰＤＬＤ、ＡＲＲＰＯＬＤ、ＡＲＲＰＲＬＤ、又はＡＲＲＰＹＬＤ。４種のターゲッティングペプチドでは、Ｌ（すなわち、ロイシン）を、Ｉ（すなわち、イソロイシン）で、Ｖ（すなわち、バリン）で、又はＦ（すなわち、フェニルアラニン）で置き換えることによる、すなわちＡＲＲＰＫＩＤ、ＡＲＲＰＫＶＤ、及びＡＲＲＰＫＦＤ。最後の２種のターゲッティングペプチドでは、Ｄ（すなわち、アスパラギン酸）を、Ｎ（すなわち、アスパラギン）で、又はＫ（すなわち、リジン）で置き換えることによる、すなわちＡＲＲＰＫＬＮ及びＡＲＲＰＫＬＫ。
【０１６３】
これら１５種の合成はＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ  ３９６ＤＣマルチチャンネル合成装置（Ｓｕｐｐｌｉｅｒ：Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ，Ｌｏｕｉｓｖｉｌｌｅ，Ｋｅｎｔｕｃｋｙ，ＵＳＡ）を用いて行い、予備装填されているＷａｎｇ樹脂に基づいていた。合成方法はＮ−ＦＭＯＣ保護及びＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＤＩＰＥＡ活性化に基づく固相ペプチド合成であった。装置製造業者により推奨されている標準的操作及び試薬を使用した。
【０１６４】
実施例１６
対照ペプチドＢＴＫ１４８の合成
比較ペプチドＡＤＧＡ−ＤＰＬＫＲＡＲ−ＧＡＡＧの合成はＡｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｈｅｍ  Ｔｅｃｈ  ３９６ＤＣペプチド合成装置により行い、グリシンＷａｎｇ樹脂及び固相Ｆｍｏｃ−ケミストリイ、ならびに慣用の保護アミノ酸試薬に基づいていた。
構造：Ｈ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＯＨ。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：１４２４．７５Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１４２５．８Ｄａ。
【０１６５】
実施例１７
対照ペプチドＨＰ２０５の合成
ごちゃ混ぜのペプチド配列及び該ペプチド配列のＣ−末端にスペーサー単位を経てスルフヒドリル担持リンカー単位を含有する比較化合物ＡＤＧＡ−ＤＰＬＫＲＡＲ−ＧＡＡＧ−ＰＥＧ−Ｇ３−ＥＴＡの合成は、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ４３３Ａペプチド合成装置で行い、システアミン−２−クロロトリチル樹脂及び固相Ｆｍｏｃ−ケミストリイ、ならびに慣用の保護アミノ酸試薬（試薬方法で用いられる慣用ではないＦｍｏｃ−ＰＥＧ−ＯＨを包含する）に基づいていた。
この化合物の構造は：Ｈ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−Ｇｌｙ３−ＮＨＣＨ２ＣＨ２ＳＨである。
生成物の同定はＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析に基づいていた：陽イオンＭ＋１測定値：１８４４．９１Ｄａ。アイソトーピックＭ計算値：１８４３．９３Ｄａ。
【０１６６】
実施例１８
インビトロ及びインビボ試験に使用される細胞系の説明
この例において、別段の記載がない場合、下記細胞系及び培養条件を使用した。
非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）腺癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ２３（これはまた、本明細書において「ＮＣＩ−Ｈ２３」とも称する）は、従来から開示されている（Ｌｉｔｔｉｌｅ等、１９８３）。この細胞系は重炭酸ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、グルコース４．５ｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１．０ｍＭナトリウムピルベート、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％胎児ウシ血清を含有するように調節された２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭ１１６４培地において培養した。
【０１６７】
ＮＳＣＬＣ腺癌細胞系Ａ５４９（これはまた、本明細書において「Ａ５４９」と称する）は、従来から開示されている（Ｇｉａｒｄ等、１９７３）。Ｈａｍ’ｓ−Ｆ−１２培地は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％胎児ウシ血清を含有するように調節した。
ＮＳＣＬＣ類表皮癌細胞系ＮＣＩ−Ｈ５２０（これはまた、本明細書において「ＮＣＩ−Ｈ５２０」と称する）は、従来から開示されている（Ｂａｎｋｓ−Ｓｃｈｌｅｇｅｌ等、１９８５）。この細胞系は重炭酸ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、グルコース４．５ｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１．０ｍＭナトリウムピルベート、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％胎児ウシ血清を含有するように調節された２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭ１１６４培地において培養した。
【０１６８】
ＮＳＣＬＣ大細胞ガン腫細胞系ＮＣＩ−Ｈ４６０（これはまた、本明細書において「ＮＣＩ−Ｈ４６０」と称する）は、従来から開示されている（Ｂａｎｋｓ−Ｓｃｈｌｅｇｅｌ等、１９８５）。この細胞系は重炭酸ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、グルコース４．５ｇ／Ｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１．０ｍＭナトリウムピルベート、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％胎児ウシ血清を含有するように調節された２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０培地において培養した。
ヒト原発肺動脈平滑筋細胞（ＰＡＳＭＣ）（これはまた、本明細書において「ＰＡＳＭＣ」（ＣＡＭＢＲＥＸ、ＣＣ−２５８１）と称する）を、Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ  ＳｍＧＭ（登録商品名）−２  Ｂｕｌｌｅｔｋｉｔ（ＣＣ−３１８２）を用いて培養した。表皮内癌細胞系ＨｅＬａ（これはまた、本明細書において「ＨｅＬｅ」と称する）は、従来から開示されている（Ｓｃｈｅｒｅｒ等、１９５３）。この細胞系は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、及び１０％胎児ウシ血清を含有するように調節されたダルベッコの変性イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄ  ＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ）において培養した。
【０１６９】
マウス繊維芽細胞系ＮＩＨ３１３（これはまた、本明細書において「ＮＩＨ３１３」と称する）は、従来から開示されている（Ｋｏｇａ等、１９７９）。この細胞系は２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％胎児ウシ血清を含有するように調節されたＤＭＥＭ培地において培養した。
マウス胎胚内皮細胞系Ｅ１０Ｖ（これはまた、本明細書において「Ｅ１０Ｖ」と称する）は、従来から開示されている（Ｇａｒｌａｎｄａ等、１９９４）。この細胞系は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％胎児ウシ血清を含有するように調節されたＤＭＥＭ培地において培養した。
マウス血管内皮細胞系ＳＶＥＣ４−１０（これはまた、本明細書において「ＳＶＥＣ４−１０」と称する）は、従来から開示されている（Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ、１９９０）。この細胞系は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％胎児ウシ血清を含有するように調節されたＤＭＥＭ培地において培養した。
【０１７０】
ヒトメラノーマ細胞系Ｃ８１６１／Ｍ１（これはまた、本明細書において「Ｃ８１６１／Ｍ１」と称する）は、従来から開示されている（Ｂｒｅｇｍａｎ、１９８６）。この細胞系は、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシン及び１０％胎児ウシ血清を含有するように調節されたＤＭＥＭ培地において培養した。
【０１７１】
実施例１９
非小細胞肺癌細胞への不動化ターゲッティング剤の選択的結合
評価用プレートの調製：Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄマレイミド活性化透明空プレート（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｐｒｏｄ＃．１５１５０）に、本発明によるターゲッティング剤を３０μｇ／ｍｌの濃度で塗布した。インキュベーションは２０℃で一夜かけて行った。これらのウエルから未結合ペプチドを含有する結合用緩衝溶液を分離した。
これらのウエルをブロッキング用緩衝溶液（リン酸塩緩衝塩類溶液（ＰＢＳ）、ｐＨ７中の０．０５％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０、１．０％ＢＳＡ））によりブロッキングした。ＰＢＳは次のとおりに調製した：ＮａＣｌ  ４０ｇ、ＫＣｌ  １ｇ、ＮａＨＰＯ４ｘ２Ｈ２Ｏ  ７ｇ及びＫＨ２ＰＯ４  １ｇを脱イオン化Ｈ２Ｏ  １０００ｍｌに溶解した。対照として、空ウエルをブロッキング用緩衝溶液で処理することによってブランクウエルを調製した。これらのプレートを２０℃で１時間３０分間、インキュベートした。
インキュベーション後、これらのプレートをＰＢＳで３回洗浄した。
【０１７２】
細胞結合試験：培地１５０μｌ容量中の細胞７５０００個を、塗布ウエルに添加し、次いで３７℃で３０分間かけてインキュベートした。細胞結合後、これらのウエルをＰＢＳで３０分かけて洗浄した。ターゲッティング剤が結合した細胞の検出はＭＴＴ試験法（例２３に詳細に記載されている、細胞毒性）に基づいていた。ウエルにＭＴＴ試薬１０μｌ及び培地９０μｌを添加した。このプレートを＋３７℃で３時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、ウエルに溶解用緩衝溶液１００μｌを添加し、３７℃でインキベートした。翌日、プレートの吸光度をＥＬＩＳＡ−読取り機（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ，ｍｕｌｔｉｓｋａｎＥＸ）により５６０ｎｍで測定した。
【０１７３】
細胞結合には、細胞系ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２０、Ａ５４９、Ｈｅｌａ及びＮＩＨ３Ｔ３（例１８に記載されている）及びターゲッティング剤ＨＰ１９９、ＨＰ２０１及びＨＰ２０５（例５、６、１７に記載されている）を使用した。
ＮＳＣＬＣ細胞系のターゲッティング剤に対する高度に選択的な結合を示すこの細胞結合試験の結果は、図１に示されている。ＮＳＣＬＣ細胞系ＮＣＩ−Ｈ２３（Ａ）、Ａ５４９（Ｂ）及びＮＣＩ−Ｈ５２０（Ｃ）は不動化ターゲッティング剤ＨＰ１９９及びＨＰ２０１に選択的に結合し、他方対照細胞系ＰＡＳＭＣ（Ｄ）、ヒト原発肺動脈平滑筋細胞系及びＮＩＨ３Ｔ３（Ｅ）、マウス繊維芽細胞系は結合しない。また、ＮＳＣＬＣ細胞系は対照ペプチドＨＰ２０５（３）に結合しない。これらの結果は５６０ｎｍにおいて測定された吸光度として示される。
【０１７４】
実施例２０
非小細胞肺癌細胞への蛍光ターゲッティング剤の選択的結合
Ａ５４９細胞及びＨｅＬａ細胞（例１８に記載されている）をガラススライド上で増殖させ、ＰＢＳで洗浄し、次いでメタノールで固定した。蛍光ターゲッティング剤Ｆ５Ｍ−Ａ４９（例１０に記載されている）を使用し、これらの細胞を下記のとおりにして染色した：細胞を先ず、ブロッキング用緩衝溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７中の０．０５％ツイーン２０、１．０％ＢＳＡ）により２０℃で１時間かけてブロッキングした。ガラススライド上の細胞をＦ５Ｍ−Ａ４９ターゲッティング剤２０μｇ（ＰＢＳ中５０μｇ／ｍｌ、ｐＨ７．４）とともにインキュベートした。対照として、ターゲッティング剤添加前に、Ｆ５Ｍ−Ａ４９の結合をＰＢＳ、ｐＨ７．４中５００μｇ／ｍｌ）中のＩＳ２５７ターゲッティング単位２０μｇ（例３に記載の遊離ペプチド）と競合させた。陰性対照として、いずれのターゲッティング剤とも共にインキュベートしない細胞を使用した。染色後、細胞を対象ガラス上にマウンテックス（ｍｏｕｎｔｅｘ）（Ｈｉｓｔｏｌａｂ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ  Ｌｔｄ．）により固定した。この後、細胞を蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，Ｊｅｎａ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により観察した。この試験は、Ａ５４９細胞が強力に染色され、ＨｅＬａ細胞は染色されないことを示した。またＡ５４９に結合するＦ５Ｍ−Ａ４９は遊離ペプチドＩＳ２５７でブロックされた。すなわち、この染色結果はフルオレセイン標識付けしたターゲッティング剤
（Ｆ５Ｍ−Ａ４９）のＡ５４９ＮＳＣＬＣ細胞系への選択的結合を証明している。
【０１７５】
実施例２１
ターゲッティング剤細胞結合競合試験
５０００細胞、Ａ５４９、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２０、ＮＣＩ−Ｈ４６０及び対照細胞ＰＡＳＭＣ及びＨｅＬａ（例１８に記載されている）を、例１８に記載の条件に従い多ウエルプレートで増殖させる。これらのウエルに、ターゲッティング剤Ａ４８−Ｅｕ（例８に記載されている）を添加し、５ｐＭの最終濃度を得る。次いで、これらの細胞を３７℃で３０分間かけてインキュベートする。この競合試験用に、相違するターゲッティング単位、ターゲッティング単位変種、及び対照ペプチド（例３、４、１５及び１６に記載されている）５０ｐＭをそれぞれ、それ自体の一連のウエルに、Ａ４８−Ｅｕターゲッティング剤の添加に先立って添加する。
【０１７６】
３０分のインキュベーション後、細胞をＰＢＳにより５回、洗浄する。ＰＢＳを分離し、細胞を次いで誘発溶液（Ｉｎｄｕｃｅｒ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｔｄ）中で５分間にわたり振り混ぜる。この後、Ｖｉｃｔｏｒ  ＩＩＩ蛍光測定器（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｔｄ）を用いて蛍光消滅時間により蛍光を測定する。
結果は、ターゲッティング剤Ａ４８−ＥｕのＮＳＣＬＣ細胞への結合が、それらの配列中にＸＲＸＰモチーフを含有するターゲッティング単位変種の全部により選択的にブロックされることを示す。さらにまた、対照細胞系ＰＡＳＭＣ及びＨｅＬａにおいては、ターゲッティング剤Ａ４８−Ｅｕの結合は見出されない。
【０１７７】
実施例２２
腫瘍を有するマウスにおけるターゲッティング剤のインビボ生体分布
この例では、ターゲッティング剤Ａ４８−Ｅｕ（例８に記載されている）の生体分布を２種の相違するタイプの原発性腫瘍、Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ５２０について証明する。本発明による被験ターゲッティング剤はインビボで原発性腫瘍に選択的に標的を定めることを示す。
【０１７８】
実験的腫瘍を生成するために、Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ５２０  ＮＳＣＬＣ細胞系（例１８に記載されている）１ｘ１０７細胞を、無胸腺ヌードマウス株（Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の両方の横腹中に注入した。腫瘍が約０．２ｇに達した時点で、腫瘍を採取した。腫瘍を有するマウスを、ドミトール（Ｄｏｍｉｔｏｒ）６０μｌ（無菌水１ｍｌ中のメチル−パラヒドロキシベンズ．１ｍｇ／ｍｌ、プロピル−パラヒドロキシベンズ．１ｍｇ／ｍｌ、塩化ナトリウム９ｍｇ／ｍｌ、Ｏｒｉｏｎ  Ｐｈａｒｍａから）及びケタラー（Ｋｅｔａｌａｒ）（無菌水１ｍｌ中のケタミン１ｍｇ／ｍｌ、ベンゼトンクロライド（ｂｅｎｚｅｔｈｏｎ．Ｃｈｌｏｒｉｄ）１ｍｇ／ｍｌ、Ｐｆｉｚｅｒから）の注射により麻酔し、その後アベルチン（Ａｖｅｒｔｉｎ）０．０２ｍｌ／体重ｇ［２−メチル−２−ブタノール  １０ｍｌ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）中の２，２，２−トリブロモエタノール１０ｇ（Ｆｌｕｋａ）］を腹腔内に投与した（ｉ．ｐ．）。
【０１７９】
ターゲッティング剤Ａ４８−Ｅｕの生体分布パターンを測定するために、Ａ４８−Ｅｕターゲッティング剤２７５ｎｍｏｌを無胸腺ヌードマウスの尾静脈に生理塩類溶液（Ｂａｘｔｅｒ）中の２００μｌの容量で注射した。マウスに次いで、生理塩類溶液６０ｍｌを心臓を通過する灌流により注入した。腫瘍を包含する臓器及び組織を採取した。
【０１８０】
各種組織中のＥｕ含有量を測定するために、組織試料０．２ｇを誘導結合プラズマ法質量分析（ＩＣＰ−ＭＳ）を用いる分析用に採取した。この試料を、マイクロ波オーブン（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙ−ｃｏｕｐｌｅｄ  ｐｌａｓｍａ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ）中でＨＮＯ３−Ｈ２Ｏ２混合物（２，５ｍｌＨＮＯ３＋０．５ｍｌＨ２Ｏ２）に溶解した。この試料を次いで、１％ＨＮＯ３を用いて３０ｍｌに希釈した。１０ｎｇ／ｍｌベリリウムを次いで、内部標準として試料に添加した。試料全部を次いで、標準ＩＣＰ−ＭＳ装置（ＶＧ  Ｐｌａｓｍａ  Ｑｕａｄ．２＋；Ｖａｒｉａｎ）を用いて分析した。この結果をｎｇランタニド／ｇマウス組織として計算した（表２）。
【０１８１】
【表２】
2008539209.tif 000004
【０１８２】
マウス組織で検出されたユウロピウムの量の比較は、Ａ４８−Ｅｕターゲッティング剤が正常組織に比較し、Ａ５４９腫瘍に対し強力に、かつ選択的に蓄積したことを示した。ただし、腎臓及び肝臓は高い信号を示したが、これは該ターゲッティング剤がこれらの経路で排泄されるためである。
１５．７：１の見出された高い腫瘍対筋肉比は、Ａ４８−ＥｕのＡ５４９腫瘍への高度に選択的な結合をさらに証明している。
従って、使用されたターゲッティング剤は高度に選択的な腫瘍ターゲッティング性質を示す。
【０１８３】
実施例２３
細胞毒性試験
この試験において、細胞系を２種の相違する濃度（５０μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌ）のＩＳ２５７ターゲッティング単位（例３に記載されている）に、２〜３日間にわたり露呈し、該ペプチドの毒性を試験した。細胞生存率の測定はＭＴＴ（Ｔｈｉａｚｏｌｙｌ  ｂｌｕ、Ｓｉｇｍａ  Ｍ−５６５５）テトラゾリウム塩を用いて行った。ＭＴＴは、生存している細胞中でのみ活性である「スクシネート−テトラゾリウムレダクターゼ」系によって水不溶性ホルマザン染料に分解される。ホルマザンを１０％ＳＤＳ−０．０１Ｍ  ＨＣｌにより可溶化した後、ＥＬＩＳＡ分析計（ＴｈｅｒｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｃａｎ  ＥＸ）において５６０ｎｍで定量した。１００％毒性を示す陽性対照として、ＣｕＳＡＯ２［トランス−ビス（サリチルアルドキシメート）銅（ＩＩ）］（Ｅｌｏ  ＯＨ、Ｌｕｍｍｅ  ＰＯ．、１９８５）７．５μｇ／ｍｌを使用した。
【０１８４】
方法：細胞はＴＥ  １ｍｌにより１〜５分かけて細胞培養皿（φ９ｃｍ）からトリプシン化し、次いで５０ｍｌファルコン（Ｆａｌｃｏｎ）管に移した。この後、その容積を細胞系特異培地２０ｍｌに増加し、次いで細胞をブルカー（Ｂｕｒｋｅｒ）チャンバーに移し、次いで培地中で細胞系に応じて２５００〜３５００細胞／１００μｌの濃度に希釈した。２個又は３個、２４時間、４８時間（及び７２時間）の９６−ウエルマイクロプレート、は下記のとおりに調製した：９６−ウエルプレートの第一カラムには、１００μｌ培地／ウエル（ｗ／ｏ細胞）を充填し、実験に必要なカラムの残りには細胞溶液１００μｌを充填し、これにより各ウエルが２５００〜３０００の細胞を含有するようにした。この後、細胞を細胞培養インキュベータ中で一夜にわたり放置した。
【０１８５】
翌日、培地４０μｌを全部のウエルから分離するが、ただし培地のみを含有するウエル及び細胞のみを含有するウエルは除いた（相違する細胞系が同一プレートで使用された場合、各細胞系のカラムの１個は触れずにおく）。
次いで、適当な媒質中のＩＳ２５７ターゲッティング単位４０μｌを最終濃度が５０μｇ／ｍｌ及び５００μｇ／ｍｌになるようにして２種の濃度でウエルに添加し、ウエルの容積を１００μｌに戻した。同様に、対照物質Ｃｕ（ＳＡＯ）２  ４０μｌを１個のカラムの全部のウエルに添加し、最終濃度を７．５μｌにした。このプレートをインキュベータ内で２４時間（４８時間又は７２時間）、インキュベートした。翌日、細胞形態を顕微鏡により分析した。この後、ＰＢＳ中５ｍｇ／ｍｌ  ＭＴＴ試薬１０μｌをプレート上の全ウエルに添加し、次いでプレートを３７℃で３時間かけてインキュベートした。最後に、０．０１Ｍ  ＨＣｌ中の１０％ＳＤＳ  １００μｌを全ウエルに添加し、次いでこのマイクロプレートを３７℃で３時間かけてインキュベートした。
【０１８６】
翌日、上記ＭＴＴ試験を行った。生存数は下記式に従い計算した：
平均中毒細胞吸光値  −  平均ＤＭＥＭ吸光値
――――――――――――――――――――――＝生存数
平均生存細胞吸光値  −  平均ＤＭＥＭ吸光値
【０１８７】
被験細胞系：例１８に記載されている全部で９種の細胞系をＩＳ２５７ターゲッティング剤に対して試験した。
ＮＳＣＬＣ細胞系 その他の細胞系
Ａ５４９          腺癌            Ｃ８１６１／Ｍ１    メラノーマ
ＮＣＩ−Ｈ２３    腺癌            ＨｅＬａ            上皮内癌腫
ＮＣＩ−Ｈ５２０  上皮癌腫        ＮＩＨ３Ｔ３        マウス繊維芽
ＮＣＩ−Ｈ４６０  大細胞癌腫      Ｅ１０Ｖ            マウス胚内皮
ＳＶＳＣ４−１０    マウス血管内皮
【０１８８】
１Ｓ２５７ターゲッティング単位は、被験細胞系の全部に対し無毒性であることが見出された。陽性対照として使用されたＣｕＳＡＯ２、７．５μｇ／ｍｌは、１時間の処置後に１００％細胞殺滅を示した。この結果の例は図２に生存数対時間として示されている。図２はこの結果を生存数対時間として示すものである。
ターゲッティング単位ＩＳ２５７を、２種の最終濃度、５０μｇ／ｍｌ（１）及び５００μｇ／ｍｌ（２）中のＮＳＣＬＣ細胞系ＮＣＩ−Ｈ２３にそれぞれ添加した。陽性対照として使用されたＣｕＳＡＯ２、７．５μｇ／ｍｌ（３）は、１時間の処置後に１００％細胞殺滅を示した。２回又は３回の時点（２４時間、４８時間、７２時間）で観察を行った。細胞殺滅／生存数はＭＴＴ試験法を用いて分析した。
【０１８９】
実施例２４
インビボ細胞毒性
ターゲッティング単位ＩＳ２５７（例３に記載されている）１ｍｇを無菌生理塩類溶液中の１００μｌの容量で無胸腺ヌードマウスの尾静脈中に注射した（ｉ．ｖ．）。注射後、直後３０分の間、及び翌日に１５分の間、マウスの挙動を観察した（無注射マウスとの比較）。この試験には３匹のマウスを使用した（プラス無注射対照）。この試験で、ターゲッティング単位ＩＳ２５７の注射はマウスに対していずれの毒性も有していなかった。
【０１９０】
実施例２５
本発明によるターゲッティング単位の免疫原性試験
マウス及び免疫化：この試験には、雌の６〜８週齢のｂａｌｂ／ｃ雌マウス（Ｈａｒｔａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，オランダ）を使用した。ターゲッティング単位ＩＳ２５７（例３に記載されている）を０．５ｍｇ／ｍｌ及び０．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で無菌塩類溶液に溶解した。１群５匹のマウスを、０日目にターゲッティング単位５０μｇの腹腔内投与により初期免疫化した。引続く免疫化を１４日目、２８日目、５６日目及び８４日目にターゲッティング単位２５μｇを用いて行った。マウスの尾静脈から０日目に採血し（免疫化前血液）、その後、４２日目、７０日目及び９８日目（終点血液）に採血した。血液は試験管に採集し、次いで血清を３５００ＲＰＭにおける７分間の遠心分離によって浄化した。マウスからの血清試料を集め、血清学的試験に使用した。
【０１９１】
血清学的抗体試験：ターゲッティング単位ＩＳ２５７により免疫化したマウスからの血清及び非免疫化対照マウスからの血清中の抗ターゲッティング単位抗体レベルを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により捕獲抗原としてターゲッティング剤ＨＰ２０１（例６に記載されている）を用いて試験した。簡単に言えば、ＰＢＳ（ｐＨ７．０）中のＨＰ２０１の３０μｇ／ｍｌ溶液１５０μｌを使用し、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ  マレイミド活性化透明ストリッププレート（Ｐｉｅｒｃｅ）のウエルに４℃で一夜かけて塗布した。これらのウエルをブロッキング溶液（ＰＢＳ、ｐＨ７．０中３％ＢＳＡ、０．０５％ツイーン）により３７℃で１．５時間かけてブロックした。終点血液からの被験血清又は対照血清のブロッキング溶液中１：４０希釈液を１５０μｌの容量でウエルに添加し、次いで３７℃で２時間にわたりインキュベートした。これらのウエルを洗浄用緩衝溶液（０．０５％ツイーン５０含有ＰＢＳ）により５回、洗浄し、次いでヤギ抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭのホースラディシュペルオキシダーゼ結合アフィニピュア（Ａｆｆｉｎｉｐｕｒｅ）（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅｒｃｈ  Ｅｕｒｏｐｅ  Ｌｔｄ．）の１：１０００希釈液１５０μｌとともに３７℃で１時間かけてインキュベートし、次いでベルオキシダーゼ用ＤＡＢ（３，３’−ジアミノベントジジン）基質キット（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出した。
【０１９２】
陽性対照として、ホースラディシュペルオキシダーゼ結合アフィニピュアヤギ抗−マウスＩｇＧ＋ＩｇＭ（１０μｇ／ｍｌ）を使用し、Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ  マレイミド活性化透明ストリッププレート（Ｐｉｅｒｃｅ）のウエルに４℃で一夜かけて塗布した。陽性対照のシグナルの発現はＤＡＢ基質キットで直接に行った。プレートはＥＬＩＳＡブレート読取装置（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｒｅｍｓ  Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ  ＥＸ）を使用し、４０５ｎｍで読取った。ターゲッティング単位ＩＳ２５７は、血清学的抗体検定法において無免疫原性であることが見出された。すなわち抗−ターゲッティング単位抗体を検出することはできなかった。
【０１９３】
これらの結果は図３に示されている。本発明によるターゲッティング単位により免疫化されたマウスは、いずれの免疫応答も発現しない。ターゲッティング単位ＩＳ２５７により免疫化されたマウスからの血清中の抗体レベル（Ａ）及び非免疫化マウスからの血清中の抗体レベル（Ｂ）は酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）により捕獲抗原としてＨＰ２０１を用いて評価した（１）。陽性対照として、ヤギ抗−マウス抗体を使用した（２）。これらの結果は、４０５ｎｍにおける吸光度の測定値として示される。
【０１９４】
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2008539209.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１９５】
（図面の簡単な説明）
下記において、添付図面を引用する好適実施形態によって本発明をさらに詳細に説明する。
【図１】図１はターゲッティング剤に対するＮＳＣＬＣ細胞系の選択的結合を示している。
【図２】図２は本発明によるペプチドがインビトロで無毒性であることを示している。
【図３】図３は本発明によるペプチドが非免疫原性であることを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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