(57)【要約】神経変性疾患のための生物マーカーが開示される。例えば、神経変性疾患を診断するため、ならびに疾患の進行および処置をモニタリングするために、このような生物マーカーを同定する方法、およびこのような生物マーカーを使用する方法が、開示される。また、これらの生物マーカーに関するアッセイ、キットおよび固体支持体が開示される。さらなる局面において、本発明は、特定の被験体における神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）の診断および予後のための方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において神経変性性疾患を診断する方法であって、該方法が、以下：
ａ．該診断される被験体由来の白血球もしくはその溶解物を含むサンプルにおける１種以上の選択した生物マーカーの発現または活性のレベルを評価する工程；および
ｂ．該選択した生物マーカーの発現または活性のレベルを、参照基準と比較する工程であって、該参照基準は、１個体以上のコントロール被験体中の該選択した生物マーカーの発現または活性のレベルを示す、工程
を包含し、ここで該コントロール被験体が神経変性性疾患を有する場合、該選択した生物マーカーの発現のレベルと、該参照基準との間の類似性は、該診断される被験体が該神経変性性疾患を有することを示し、そして該コントロール被験体が該神経変性性疾患を有さない場合、該選択した生物マーカーの発現のレベルと、該参照基準との間の相違は、該診断される被験体が該神経変性性疾患を有することを示す、方法。
【請求項２】
前記診断される被験体が、ヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルが、血液サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが、白血球の実質的に純粋な集団またはその溶解物を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記白血球が、好中球、単球、好塩基球、リンパ球、好酸球、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記選択した生物マーカーが、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼβ鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン、ホスホグリセレートムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ  １Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、またはそれらの組み合わせを含む１種以上のタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記選択した生物マーカーが、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ  ２７、ＨＳＰ  ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ  １、ｃｏｘ  ２、トランスフェリン、またはそれらの組み合わせを含む１種以上の転写物である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記選択した生物マーカーが、２７，１００の分子量および７．５８の等電点、２５，４００の分子量および６．２の等電点、２７，６００の分子量および５．９２の等電点、またはそれらの組み合わせを有するタンパク質を含む１種以上のタンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記発現または活性のレベルを評価する工程が、ウェスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動、質量分析（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）後のタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、タンパク質チップ発現分析、遺伝子チップ発現分析、またはレーザーデンシトメトリーを含む１つ以上の技術によって１種以上の選択した生物マーカーを分析する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記発現または活性のレベルを評価する工程が、多変量正準分析を行う工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記診断される被験体と前記コントロール被験体とが、同じ歳である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
神経変性性疾患の処置のための治療剤についてスクリーニングする方法であって、該方法が、以下：
ａ．白血球または白血球の集団と、スクリーニングされる該薬剤とを接触させる工程；および
ｂ．該神経変性性疾患についての生物マーカーの発現または活性のレベル、該神経変性性疾患の処置のための治療剤を示す該生物マーカーの発現もしくは活性のレベルの増加または減少を検出する工程、
を包含する、方法。
【請求項１３】
前記生物マーカーが、前記神経変性性疾患においてダウンレギュレートされる１種以上の遺伝子またはタンパク質であり、そして前記薬剤が、遺伝子もしくはタンパク質の発現または活性のレベルを増加させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記生物マーカーが、前記神経変性性疾患においてアップレギュレートされる１種以上の遺伝子またはタンパク質であり、そして前記薬剤が、前記遺伝子もしくはタンパク質の発現または活性のレベルを減少させる、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１２に記載の方法であって、前記治療剤が、ニューロン中の前記生物マーカーの発現または活性のレベルを変化させるか否かを決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１６】
前記ニューロンが、ドパミン作動性ニューロンである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
請求項１２に記載の方法であって、前記治療剤が、前記神経変性性疾患の動物モデルにおいて、該神経変性性疾患の発症を予防するか否か、または該神経変性性疾患の進行を遅らせるか否かを決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項１８】
前記動物モデルが、ＭＰＴＰモデルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物モデルが、６−ＯＨＤＡモデルである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記白血球が、好中球、単球、好塩基球、リンパ球、好酸球、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物マーカーが、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼβ鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン、ホスホグリセレートムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ  １Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、またはそれらの組み合わせを含む１種以上のタンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物マーカーが、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ  ２７、ＨＳＰ  ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ  １、ｃｏｘ  ２、トランスフェリン、またはそれらの組み合わせを含む１種以上の転写物である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物マーカーが、２７，１００の分子量および７．５８の等電点、２５，４００の分子量および６．２の等電点、２７，６００の分子量および５．９２の等電点、またはそれらの組み合わせを有するタンパク質を含む１種以上のタンパク質である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、核酸、抗体、ポリペプチド、または低分子である、請求項１２に記載の方法。
【請求項２５】
被験体における神経変性性疾患の進行をモニタリングする方法であって、該方法が、複数の時点において該被験体から得られた白血球またはその溶解物を含むサンプル中の該神経変性性疾患についての生物マーカーの発現または活性のレベルを比較する工程を包含する、方法。
【請求項２６】
前記被験体が、ヒトである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記被験体が、前記複数の時点の１つ以上において前記神経変性性疾患について無症候性であるか、または症状発現前である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記被験体が、前記複数の時点の１つ以上においてか、または該複数の時点の１つ以上の前に、前記神経変性性疾患に対する処置を受けなかった、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記被験体が、前記複数の時点の１つ以上においてか、または該複数の時点の１つ以上の前に、前記神経変性性疾患に対する処置を受けた、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記被験体が、ドーパミンアゴニストによって処置された、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記被験体が、前記複数の時点の１つ以上においてか、または該複数の時点の１つ以上の前に、レボドパによって処置された、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記被験体が、前記複数の時点の１つ以上においてか、または該複数の時点の１つ以上の前に、神経保護剤によって処置された、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記神経保護剤が、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、グルタミン酸作動性レセプターアンタゴニスト、ＨＤＡＣインヒビター、抗炎症剤、またはジバルプロックスナトリウムである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記生物マーカーが、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼβ鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン、ホスホグリセレートムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ  １Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、またはそれらの組み合わせを含む１種以上のタンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３５】
前記生物マーカーが、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ  ２７、ＨＳＰ  ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ  １、ｃｏｘ  ２、トランスフェリン、またはそれらの組み合わせを含む１種以上の転写物である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３６】
前記生物マーカーが、２７，１００の分子量および７．５８の等電点、２５，４００の分子量および６．２の等電点、２７，６００の分子量および５．９２の等電点、またはそれらの組み合わせを有するタンパク質を含む１種以上のタンパク質である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３７】
前記サンプルが、血液サンプルである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３８】
前記白血球が、好中球、単球、好塩基球、リンパ球、好酸球、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３９】
被験体における神経変性性疾患の処置に対する応答をモニタリングする方法であって、該方法が、該被験体の処置の間の複数の時点において該被験体から得られた白血球またはその溶解物を含むサンプル中の該神経変性性疾患についての生物マーカーの発現または活性のレベルを比較する工程を包含する、方法。
【請求項４０】
前記被験体が、ヒトである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記被験体が、前記複数の時点の１つ以上において、パーキンソン病について無症候性であるか、または症状発現前である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
前記被験体が、前記複数の時点の１つ以上においてか、または該複数の時点の１つ以上の前に、神経保護剤によって処置される、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記神経保護剤が、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、グルタミン酸作動性レセプターアンタゴニスト、抗炎症剤、キナーゼインヒビターまたはジバルプロックスナトリウムである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記生物マーカーが、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼβ鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン、ホスホグリセレートムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ  １Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、またはそれらの組み合わせを含む１種以上のタンパク質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記生物マーカーが、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ  ２７、ＨＳＰ  ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ  １、ｃｏｘ  ２、トランスフェリン、またはそれらの組み合わせを含む１種以上の転写物である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物マーカーが、２７，１００の分子量および７．５８の等電点、２５，４００の分子量および６．２の等電点、２７，６００の分子量および５．９２の等電点、またはそれらの組み合わせを有するタンパク質を含む１種以上のタンパク質である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４７】
前記サンプルが、血液サンプルである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４８】
前記白血球が、好中球、単球、好塩基球、リンパ球、好酸球、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４９】
試験被験体における神経変性性疾患についての危険を同定する方法であって、該方法が、以下：
ａ．該試験被験体から得られたサンプルから、該神経変性性疾患についての生物マーカーの発現または活性のレベルを決定する工程であって、ここで該サンプルが、白血球またはその溶解物を含む、工程；および
ｂ．該試験被験体について決定された該生物マーカーの発現のレベルまたは活性レベルと、参照被験体についての該レベルとを相関させる工程、
を包含し、該神経変性性疾患を有さない該参照被験体について決定されたレベルと、該試験被験体についての該レベルとの間の相関が、該試験被験体における該神経変性性疾患についての低い危険を同定し、そして該神経変性性疾患を有する該参照被験体について決定された該レベルと、該試験被験体についての該レベルとの間の相関が、該試験被験体における該神経変性性疾患についての高い危険を同定する、方法。
【請求項５０】
請求項４９に記載の方法であって、前記神経変性性疾患と診断された参照被験体の集団からの前記生物マーカーの前記レベル、または該神経変性性疾患を有さない参照被験体の集団からの該生物マーカーの該レベルを決定する工程をさらに包含する、方法。
【請求項５１】
前記試験被験体が、ヒトである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
前記試験被験体が、前記神経変性性疾患ついて無症候性であるか、または症状発現前である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記試験被験体と前記参照集団とが、同じ歳である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５４】
前記生物マーカーが、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼβ鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン、ホスホグリセレートムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ  １Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、またはそれらの組み合わせを含む１種以上のタンパク質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記生物マーカーが、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ  ２７、ＨＳＰ  ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ  １、ｃｏｘ  ２、トランスフェリン、またはそれらの組み合わせを含む１種以上の転写物である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記生物マーカーが、２７，１００の分子量および７．５８の等電点、２５，４００の分子量および６．２の等電点、２７，６００の分子量および５．９２の等電点、またはそれらの組み合わせを有するタンパク質を含む１種以上のタンパク質である、請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記サンプルが、血液サンプルである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
前記白血球が、好中球、単球、好塩基球、リンパ球、好酸球、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
試験被験体において神経変性性疾患を示差的に診断する方法であって、該方法が、以下：
ａ．該試験被験体由来の白血球もしくはその溶解物を含むサンプルにおける１種以上の選択した生物マーカーの発現または活性のレベルを評価する工程；および
ｂ．該選択した生物マーカーの発現または活性のレベルを参照基準と比較する工程であって、該参照基準が、１つ以上の神経病理学的なコントロール疾患を有する神経病理学的なコントロール被験体の１つ以上の集団中の該選択した生物マーカーの発現または活性のレベルを示す、工程、
を包含し、ここで該選択した生物マーカーの発現または活性のレベルと、該参照基準との間の相違または類似性が、該神経病理学的なコントロール疾患と比較した場合に該変性性疾患の示差的な診断を示す、方法。
【請求項６０】
前記被験体が、ヒトである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記被験体が、前記神経変性性疾患ついて無症候性であるか、または症状発現前である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
前記神経病理学的なコントロール被験体の集団が、アルツハイマー病、前頭側頭型痴呆、軽度の認識障害、およびパーキンソン病を有する１個体以上の被験体からなる群より選択される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６３】
前記被験体と前記コントロール被験体とが、同じ歳である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６４】
前記サンプルが、血液サンプルである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６５】
前記サンプルが、白血球の実質的に純粋な集団またはその溶解物を含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６６】
前記白血球が、好中球、単球、好塩基球、リンパ球、好酸球、またはその任意の組み合わせである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記選択した生物マーカーが、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼβ鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン、ホスホグリセレートムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ  １Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、またはそれらの組み合わせを含む１種以上のタンパク質である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６８】
前記生物マーカーが、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ  ２７、ＨＳＰ  ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ  １、ｃｏｘ  ２、トランスフェリン、またはそれらの組み合わせを含む１種以上の転写物である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６９】
前記生物マーカーが、２７，１００の分子量および７．５８の等電点、２５，４００の分子量および６．２の等電点、２７，６００の分子量および５．９２の等電点、またはそれらの組み合わせを有するタンパク質を含む１種以上のタンパク質である、請求項５９に記載の方法。
【請求項７０】
前記発現または活性のレベルを評価する工程が、ウェスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光細胞分析分離（ＦＡＣＳ）、二次元ゲル電気泳動、質量分析（ＭＳ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離イオン化飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）後のタンデム型質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、タンパク質チップ発現分析、遺伝子チップ発現分析、またはレーザーデンシトメトリーを含む１つ以上の技術によって１種以上の選択した生物マーカーを分析する工程を包含する、請求項５９に記載の方法。
【請求項７１】
１種以上の生物マーカーを備える固体支持体であって、ここで該生物マーカーが、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰシンターゼβ鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン、ホスホグリセレートムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジスムターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ  １Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、またはそれらの組み合わせを含む１種以上のタンパク質である、固体支持体。
【請求項７２】
前記生物マーカーが、２７，１００の分子量および７．５８の等電点、２５，４００の分子量および６．２の等電点、２７，６００の分子量および５．９２の等電点、またはそれらの組み合わせを有するタンパク質から選択される１種以上のタンパク質である、請求項７１に記載の固体支持体。
【請求項７３】
１種以上の生物マーカーを備える固体支持体であって、ここで該生物マーカーが、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ  ２７、ＨＳＰ  ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ  １、ｃｏｘ  ２、トランスフェリン、またはそれらの組み合わせを含む１種以上の転写物である、固体支持体。
【請求項７４】
前記固体支持体が、チップ、マイクロアレイ、ナノアレイ、またはビーズから選択される、請求項７１に記載の固体支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（Ｉ．通知）
この研究は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇからの助成金（ＬＥＡＤ  ＡＧ０９０１６、ＲＯ１  ＡＧ１４４１１、およびＡＧ００１０７−１５）およびＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒの助成金ＡＧ０８６６５およびｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎからの助成金（ＣＣＲ９７０１９１１）によって支援された。連邦政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００２】
（ＩＩ．関連出願の相互参照）
本出願は、２００４年７月１９日に出願された米国仮特許出願第６０／５８９，３１８号の利益を主張する。米国仮特許出願第Ｔ６０／５８９，３１８号は、その全体が参考として本明細書中で援用される。
【背景技術】
【０００３】
（ＩＩＩ．背景）
神経変性疾患は、数百万人の人々に影響を与え、人々の生活の質を大いに低減し、そして多くの場合、死を引き起こす。比較的一般的な神経変性疾患はパーキンソン病であり、これは毎年５０万人より多くのアメリカ人に影響を与える。パーキンソン病は、動作の緩慢（運動緩徐）、安静時の振せん、四肢および首の硬直、腰の曲がった姿勢、顔の最低限の表情、嚥下の問題（嚥下障害）、および少ない連合運動（例えば、腕の振り）によって特徴付けられる。一部の患者はまた、運動機能についてのこのような異常と関連した痴呆に直面する。パーキンソン病は加齢依存性であり、そして通常は５０歳〜７０歳の間に徐々に開始し、１０年後〜２０年後までゆっくりと進行する。
【０００４】
アルツハイマー病は、別の一般的な神経変性疾患である。アルツハイマー病の進行は、意識の徐々の変化、記憶、認識および見当識の喪失ならびに個性および知性の喪失と関連する。アルツハイマー病の罹患率は、年齢と共に劇的に増加する。
【０００５】
剖検前の神経変性疾患の正確かつ容易な診断は難題である。また、多くの神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）の病因論は、完全には理解されていない。さらに、１つの神経変性疾患に関連した症状は、しばしば、他の神経変性疾患（特に初期段階の疾患）の症状に似ている。このような難しさのため、このような神経変性疾患を患う患者を診断および処置することに関する混乱および複雑さを生じ得る。例えば、アルツハイマー病の神経線維において生じる変化は，代表的に，ニューロンにおいて起こる形態上の変化の組織学的分析の際にポジティブに診断される。アルツハイマー病の脳において遺伝子発現が変化すること、およびこの遺伝子発現を使用してアルツハイマー患者の発症および進行を識別し得ることが、示されている。しかしながら、この型の分析は患者から脳サンプルを得ることを必要とし、従って死亡認定後において大いに有用である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
パーキンソン病およびアルツハイマー病のような神経変性疾患の初期診断はその処置を補助し得るので、実施するのに正確でありかつより容易である比較的小さな侵襲性手順が望ましい。従って、神経変性疾患を区別、診断およびモニタリングするための組成物および方法が当該分野で必要とされる。本明細書中に開示される対象は、これらの必要性および他の必要性を取り上げる。例えば、神経組織をサンプリングすることよりも患者の末梢血のサンプリングすることを含む、パーキンソン病、アルツハイマー病のような神経変性疾患の診断のための方法および組成物が、本明細書中に開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（ＩＶ．要約）
開示される材料、化合物、組成物、物品、および方法の目的に従って、本明細書中に具体化されそして広範に記載されるように、開示される対象は、１つの局面において、化合物および組成物、ならびにこのような化合物および組成物を調製および使用するための方法に関する。さらなる局面において、開示される対象は、特定の被験体における神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）の診断および予後のための方法に関する。なおさらなる局面において、開示される対象は、神経変性疾患の処置のための治療剤についてスクリーニングする方法に関する。なおさらに、被験体における神経変性疾患の進行をモニタリングする方法が本明細書中に開示される。なおさらなる局面において、開示される対象は、被験体における神経変性疾患の処置への応答をモニタリングする方法、試験被験体における神経変性疾患に対する危険性を確認する方法、および試験被験体における神経変性疾患を別々に診断する方法、に関する。また、神経変性疾患のための診断アッセイ、ならびに本明細書中に開示される方法において使用され得るチップ、ビーズおよびアレイが、開示される。多くの例において、本明細書中に開示される組成物および方法は、被験体からの血液の使用、およびその血液細胞内の遺伝子発現の分析を含む。
【０００８】
以下に記載される利点は、添付の特許請求の範囲において特に指摘される構成要素および組み合わせによって理解され、達成される。前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方が単なる例示であり単なる解説であって、限定的ではないことが理解されるべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
（ＶＩ．詳細な説明）
本発明の化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法を開示し説明する前に、他に特定しない限り、これらは、無論変動し得るので、特定の方法にも特定の組換えの生物工学的方法にも限定されず、他に特定しない限り特定の試薬にも限定されないことが理解されるべきである。また、本明細書中に使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のみのためであり、限定していることを意図されないことが理解されるべきである。
【００１０】
（Ａ．定義）
本明細書および添付の特許請求の範囲において、以下の意味を有することを定義される多くの用語に対して参照がなされる。
【００１１】
本明細書および特許請求の範囲の全体を通して、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」およびこの語の他の形態（例えば、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）は、例えば他の添加物、成分、整数または工程を含むがこれらに限定されないことを意味し、そしてそれらの例のものを除外しないことが意図される。
【００１２】
本明細書および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、その文脈が他を明確に示さない限り、複数の参照を含む。従って、例えば「１つの生物マーカー」に対する参照は、このような生物マーカーの２つ以上の混合物を含み、「１つの抗体」に対する参照は、２つ以上の抗体の混合物を含み、「その被験体」に対する参照は２人以上の被験体を含む、などである。
【００１３】
範囲は、「約」１つの特定の値から、そして／または「約」別の特定の値までとして本明細書中で表され得る。このような範囲が表される場合、別の実施形態は、この１つの特定の値から、そして／または他の特定の値までを含む。同様に、値が近似値として表される場合、先行詞「約」の使用によって、この特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。各々の範囲の終点は、その他の終点に関して重要であり、かつその他の終点からは独立していることがさらに理解される。また、本明細書中に開示される多くの数値が存在し、各々の数値もその値自体に加えて「約」その特定の数値として本明細書中に開示されることが理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「約１０」もまた開示される。また、値が開示される場合、当業者に適切に理解されるように、その値「以下」、「その値以上」および値の間の可能性ある範囲もまた開示されることが理解される。例えば、値「１０」が開示される場合、「１０以下」および「１０以上」もまた開示される。また、本出願全体を通して、データは多くの異なる形式で提供されること、およびこのデータは終点および始点ならびにそれらのデータ点のあらゆる組み合わせ範囲を示すことが理解される。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点「１５」が開示される場合、１０より大きい、１０以上、１０未満、１０以下および１０に等しい、ならびに１５より大きい、１５以上、１５未満、１５以下および１５に等しいは、１０と１５との間と同様に開示されるとみなされることが理解される。
【００１４】
「任意の」および「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が起こってもよいし起こらなくてもよいこと、およびこの記載はその事象または状況が起こる場合と起こらない場合とを包含することを意味する。
【００１５】
「プローブ」は、標的核酸、代表的には配列特異的な様式で（例えば、ハイブリダイゼーションを介して）相互作用し得る分子である。核酸のハイブリダイゼーションは、当該分野で十分に理解されており、本明細書中で考察される。代表的に、プローブは、当該分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体もしくはアナログのあらゆる組み合わせから作製され得る。
【００１６】
「プライマー」は、一部の型の酵素操作を支持し得、そしてその酵素操作が起こり得るように標的核酸とハイブリダイズし得るプローブの部分集合である。プライマーは、その酵素操作を妨害しない、当該分野で利用可能なヌクレオチドまたはヌクレオチド誘導体もしくはアナログのあらゆる組み合わせから作製され得る。
【００１７】
用語「増加する」、「高める」または「上昇する」とは、コントロールレベルまたは参照レベルよりも上のレベルをいう。この用語はまた、１つの事象（例えば、ゼロであるコントロールレベルまたは参照レベルよりも上のレベル）の出現または発生を含み得る。用語「減少する」、「低減する」または「下がる」は、コントロールレベルまたは参照レベルよりも下のレベルをいう。これらの用語はまた、１つの事象（例えば、コントロールレベルも参照レベルもゼロでない場合のゼロのレベル）の不在または消失を含み得る。
【００１８】
本明細書中で使用される場合、用語「被験体」および「患者」は、相互に交換可能に使用され、そして個人を意味する。従って、「被験体」または「患者」としては、屋内動物（例えば、猫、イヌ、など）、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなｄ）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）、およびトリが挙げられ得る。「被験体」または「患者」としてはまた、哺乳動物（例えば、霊長類）が挙げられ得る。１つの特定の局面において、「被験体」または「患者」はヒトであり得る。
【００１９】
本明細書中で使用される場合、用語「サンプル」は、被験体または患者から得られる任意の生物学的材料をいう。１つの局面において、サンプルは、血液、脳脊髄液、（「ＣＳＦ」）、または尿を含み得る。他の局面において、サンプルは、全血、血漿、血液サンプル由来の富化されたリンパ球、および培養細胞（例えば、被験体からの白血球）を含み得る。サンプルはまた、生検サンプルまたは組織サンプル（神経組織が挙げられる）を含み得る。さらに他の局面において、サンプルは、全細胞および／またはその細胞の溶解物を含み得る。細胞の例としては、白血球（例えば、好中球）、単球、好塩基球、リンパ球、好酸球、またはその任意の組み合わせが挙げられる。別の特定の局面において、サンプルは、白血球、もしくは白血球の実質的に純粋な集団、またはその溶解物を含み得る。白血球の集団またはその溶解物に関して、用語「実質的に純粋」は、サンプル中の総細胞数に基づき、白血球の約１％未満、約７％未満、約１０％未満、約１２％未満、約１５％未満、約２０％未満、約２５％未満、または約３０％未満の他の細胞を含むサンプルを指すことを意図される。特定の例において、サンプルは、リンパ球、実質的に純粋なリンパ球の集団、またはリンパ球の実質的に純粋な集団の溶解物を含み得る。必要に応じて、この白血球は、選択される型に富化され得る。例えば、白血球集団はリンパ球について富化され得、そして本明細書中に開示される方法において使用される。富化は、ＦＡＣＳのような細胞ソーティング技術を使用して達成され得る。
【００２０】
「神経変性疾患」によって、脳、脊髄、中枢神経系および／または末梢神経系における神経学的機能の消失を導く、ニューロンの機能不全および／または死によって特徴付けられる任意の疾患が意味される。神経変性疾患は、慢性および急性であり得る。神経変性疾患の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：パーキンソン病、前頭側頭性痴呆（ｆｒｏｎｔａｌ−ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｄｅｍｅｎｔｉａ）、前頭側頭骨性痴呆およびパーキンソン症候群、アルツハイマー病、軽度の認識障害、びまん性レヴィー小体病、レヴィー小体型を有する痴呆、脱髄疾患（例えば、多発性硬化症および急性横断脊髄炎）、筋萎縮性側索硬化症、ハンチントン病、クロイツフェルト−ヤーコブ病、ＡＩＤｓ痴呆複合症、錐体外路障害および小脳障害（例えば、皮質脊髄系の損傷）、脳幹神経節の障害、皮質基底核神経節変性、末梢ニューロパシー（糖尿病または化学療法の処置に続発性である）、進行性核上性麻痺、小脳の構造的損傷、脊髄小脳変性（例えば、脊髄性運動失調）、フリートライヒ運動失調、小脳皮質変性、多系統変性（Ｍｅｎｃｅｌ、Ｄｅｊｅｒｉｎｅ−Ｔｈｏｍａｓ、Ｓｈｉ−Ｄｒａｇｅｒ、およびＭａｃｈａｄｏ−Ｊｏｓｅｐｈ）、多系統萎縮症、全身性障害（レフサム病、無β−リポタンパク血症、運動失調、毛細血管拡張症、およびミトコンドリア多系統障害）、運動単位の障害（例えば、神経原性筋萎縮）、中年のダウン症候群、亜急性硬化性汎脳炎、ハレルフォルデン−シュパッツ病、ボクサー性痴呆症（ｄｅｍｅｎｔｉａ  ｐｕｇｉｌｉｓｔｉｃａ）、ピック病、など。急性神経変性疾患のいくつかの例としては、脳卒中、虚血、および多発性梗塞性痴呆である。ニューロンの急性消失もまた、癲癇を患う患者の脳、ならびに低血糖発作および脳、末梢神経または脊髄の外傷性損傷を被る患者の脳を特徴付け得る。
【００２１】
本出願全体を通して、種々の刊行物が参照される。これらの刊行物のその全体の開示は、当該分野の状態をそれが有する範囲までより完全に説明するために、本出願中に参考として援用される。開示されるこれらの参照はまた、それらに含まれる材料について本明細書中に参考として個々にかつ具体的に援用され、その材料はその参照が依存する文章において考察される。
【００２２】
ここで、開示される材料、化合物、組成物、物品、デバイス、および方法についての特定の局面に対する参照が詳細になされ、それらの例は付随する実施例および図面において例示される。
【００２３】
（Ｂ．組成物および方法）
生物マーカー、および生物マーカーを同定および使用するための方法が開示される。いくつかの特定の局面において、開示される生物マーカーは、本明細書中に開示されるように、（ｉ）神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）を診断する方法、（ｉｉ）神経変性疾患の進行を追跡する方法、（ｉｉｉ）神経変性疾患の処置に対する被験体の応答をモニタリングする方法、（ｉｖ）神経変性疾患のリスクを確認する方法、（ｖ）１つの神経変性疾患を別のものと区別する方法、およびいくつかの他の方法、において使用され得る。
【００２４】
「生物マーカー」によって、被験体またはサンプルにおける状態（例えば、神経変性疾患またはその欠如）または状態の現状を識別するために使用され得る、任意のアッセイ可能な特徴または組成物を意味する。生物マーカーは、本明細書中に開示されるいくつかの例において、遺伝子であり得、この遺伝子の発現特徴を使用して、被験体またはサンプルにおける状態または状態の現状を識別し得る。他の例において、生物マーカーは遺伝子産物であり得る。「遺伝子産物」によって、転写物、核酸またはタンパク質が意味される。従って、生物マーカーが本明細書中に開示され、この生物マーカーの存在、不在、または相対量を使用して、被験体またはサンプルにおける状態または状態の現状を識別し得る。特定の例において、生物マーカーは遺伝子産物であり得、この遺伝子産物の被験体における存在または不在が、特定の神経変性疾患に罹っている被験体もしくは罹っていない被験体、神経変性疾患を発症する特定のリスクを有する被験体、または疾患の特定の状況にある被験体にとって特徴的である。なお別の例において、生物マーカーは遺伝子産物であり得、この遺伝子産物の増加または減少が、特定の神経変性疾患、神経変性疾患を発症する特定のリスク、または疾患の特定の状況を示す。別の例において、生物マーカーは種々の遺伝子産物の群であり得、その存在または不在が、特定の神経変性疾患に罹っている被験体もしくは罹っていない被験体、神経変性疾患を発症する特定のリスクを有する被験体、または疾患の特定の状況にある被験体を示す。さらなる例において、生物マーカーは遺伝子産物の群であり得、その増加性発現パターンまたは減少性発現パターンが、特定の神経変性疾患またはその欠如を特徴付ける。なおさらには、生物マーカーは遺伝子産物または遺伝子産物の群であり得、これらの発現パターンが、神経変性疾患の存在もしくは不在、または疾患の特定の予後もしくは結果に特徴的である。本明細書中で使用される場合、生物マーカーは、他の臨床試験のための代理物であり得る。本明細書中に同定される生物マーカーは、レベル、発現、活性を決定するか、または変異体を検出するために測定され得る。発現レベルまたは活性レベルを検出する場合の全体にわたって使用される場合、このことは、所定の生物マーカーの変異体を検出することが理解される。変異体としては、アミノ酸変異体もしくは核酸変異体、または翻訳後修飾された変異体が挙げられる。
【００２５】
全体を通してタンパク質が考察される場合はいつも、その反対に明記しない限り、またはその文脈において当業者により理解されるように、核酸（例えば、転写物）もまた開示される。同様に、核酸が考察される場合はいつも、そのタンパク質もまた開示される。本明細書中の遺伝子産物の考察において、その反対に明記しない限り、またはその文脈において当業者により理解されるように、タンパク質、核酸、および転写物もまた個々にかつ集約的に開示される。
【００２６】
また、生物マーカーは特定の遺伝子産物、または遺伝子産物の特定のレベルもしくは量であり得るが、生物マーカーはまた、そのような遺伝子産物のレベルまたは量が多変数正準分析において分析される場合に得られる、特定の変数であり得る（例えば、第一および／または第二の正準の変数）。
【００２７】
開示される対象のいくつかの例において、アルツハイマー病またはパーキンソン病のような神経変性疾患のための生物マーカーを使用して、被験体における疾患を診断する。そして死後のヒト脳由来の１つのニューロンまたはホモジネートにより発現されるメッセージのプロフィールを使用して神経変性疾患をコントロールサンプルから区別し得る（例えば、Ｃｈｅｅｔｈａｍ  ＪＥ，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７；７７（１）４３−４８；Ｃｈｏｗ  Ｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９８；９５：９６２０−９６２５を参照のこと）が、１つの局面において、遺伝子プロファイリングおよび／またはタンパク質プロファイリングと、多変量の正準分析とを組み合わせて、神経変性疾患（例えば、穏やかなＡＤまたは散発性ＰＤ）をコントロール血液サンプルから区別する方法が、開示される。
【００２８】
本明細書中に開示される１つの例において、ＡＤの可能性を有するとしてＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒにて診断される患者、ならびに年齢および性別を適合させたコントロールサンプルから血液が採られた。白血球をメッセンジャーＲＮＡから抽出し、増幅した。次いで、選択されたメッセージの発現レベルを、低密度アレイを使用して定量した。多変量の正準分析は、アルツハイマー病の白血球とコントロールの白血球とを区別した。研究されるメッセージの種はまた、ＡＤサンプルおよびコントロールサンプルからパーキンソン病の２症例を区別した。これらの結果は、複数の変異を利用する生物マーカーによって導かれ得るさらなる正確性を例示する。検査されるｍＲＮＡ種のクラスのうち、コントロール白血球からＡＤを最良に区別したものは、細胞周期および炎症プロセスに関与するものであった。これらの同じクラスのメンバーもまたコントロールの脳からＡＤを区別することは、脳に実際に侵入することなしにアルツハイマー病における脳の選択された現象を理解することに一貫する。アルツハイマー病の診断を考察する種々の出願および特許が存在し、２００１年１月２５日に出願された米国特許第６０／０６３，２７４号、１９９７年１０月２３日に出願された米国特許第０９／１７８，１７０号、２００１年１月２５日に出願された米国特許第０９／７７０，５３４号、および米国特許出願公開第２００５−００８４８７５（Ａ１）号が挙げられる（これらは、アルツハイマー病の診断およびそのための方法、ならびにＡＤの診断に関する遺伝子に少なくとも関係する材料についての参照として、本明細書中に援用される）。
【００２９】
同様の例は、本明細書中に示されるようにパーキンソン病に関して診断された患者について実施された。具体的には、新鮮な全血を、ＰＤ患者および年齢が適合するコントロール患者を含む患者集団から収集した。白血球タンパク質濃度は、ＰＤ患者とコントロール患者との間で濃度に差異のあるタンパク質スポットが、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．；Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して同定された。差異の測定値は統計学的試験に供された。タンパク質スポットは、コントロールと比較して、パーキンソン病において増加または減少のいずれかとして同定された。示差的に表されたスポットは、単離され、同定された。これらの結果は、末梢血由来のタンパク質分析を使用してＰＤのような神経変性疾患を診断し得ることを示す。
【００３０】
本明細書中に開示される組成物および方法は、神経変性疾患を患う被験体由来のサンプル（例えば、血液）において、特定の遺伝子の発現が変化されることの同定に基づく。開示される方法は、代表的に、被験体の血液における特定の遺伝子および遺伝子セットの発現を、コントロールサンプルにおける同じ遺伝子または遺伝子セットの発現と比較する工程を包含する。このコントロールサンプルは、同時に実施される非神経変性疾患の被験体であり得ること、またはこれは１人以上の非神経変性疾患の患者をアッセイして発現データを収集することによって作成される標準であり得ることが理解される。従って、コントロールサンプルは、連続して作成され使用される標準であり得る。例えば、標準は、本明細書中に開示される非ＡＤ症例または非ＰＤ症例の発現プロフィールによって作成され得る。この標準は、例えば、非神経変性疾患の患者または任意の他のコントロール群における１つの遺伝子または特定の遺伝子セットの平均発現レベルを含み得る。
【００３１】
特定の１局面において、被験体における神経変性疾患（例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病）を診断する方法が本明細書中に開示される。開示される方法は、診断されるべき被験体由来のサンプル（例えば、白血球またはその溶解物を含むサンプル）中の１つ以上の選択された生物マーカー（例えば、遺伝子産物）の発現レベルまたは活性レベルを評価する工程、および選択された生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを参照標準（これは、１人以上のコントロール被験体における選択された生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを示す）と比較する工程、を包含し得る。これらの方法において、選択された生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルと、参照標準との間の差異は、特定の参照標準に依存して、その被験体が特定の神経変性疾患に罹っているかまたは罹っていないことを示し得る。生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを評価および比較するための方法が、本明細書中に開示される。
【００３２】
「診断する（ｄｉａｇｎｏｓｅ）」または「診断すること（ｄｉａｇｎｏｚｉｎｇ）」および「診断（ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）」のようなこの単語の他の形態は、特定の疾患を識別するために意味される。この用語はまた、１つの特定の疾患を別の疾患から区別すること、または疾患の不在から１つの特定の疾患を区別することを意味する。「診断する」はまた、疾患の特定の段階を識別すること、疾患を発症するリスクを識別すること、または疾患の予後を識別することを意味するために本明細書中で使用される。
【００３３】
これらの特定の方法において、被験体は、本明細書に記載されるように、例えば、任意の個体（例えば、ヒト）であり得る。１例において、被験体は特定の神経変性疾患について診断され得る。診断されるべき被験体は、特定の神経変性疾患の症状を有し得るか、または被験体は特定の神経変性疾患（例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病）について無症候性であり得るかまたは症状発現前（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ）であり得る。
【００３４】
コントロール被験体は、特定の神経変性疾患（例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病）を患う被験体、疾患の特定の段階にある被験体、疾患を発症するリスクを有する被験体、または特定の神経変性疾患を患っていない被験体であり得る。１例において、診断されるべき被験体およびコントロール被験体は、年齢適合性であり、そして／または性別適合性であり得る。従って、被験体由来の１つ以上の選択された生物マーカーの発現レベルを、コントロール被験体（例えば、参照標準）における同じ生物マーカーの発現レベルと比較することによって、神経変性疾患について被験体を診断し得る。
【００３５】
生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルにおける差異または類似性は、サンプル中の１つ以上の選択された生物マーカーのレベルと、参照標準中の１つ以上の選択された生物マーカーのレベルとの間の任意の定量的または定性的な比較分析によって決定され得る。例えば、コントロール被験体が特定の神経変性疾患に罹っている場合、開示される方法を使用する場合に被験体における生物マーカーのレベルとコントロール被験体における生物マーカーのレベルとの間の類似性は、診断されるべき被験体もまた特定の神経変性疾患を有することを示し得る。別の例において、コントロール被験体が特定の神経変性疾患に罹っている場合、開示される方法を使用する場合に被験体における生物マーカーのレベルと、コントロール被験体における生物マーカーのレベルとの間の差異は、診断されべき被験体が特定の神経変性疾患に罹っていないことを示し得る。あるいは、コントロール被験体が特定の神経変性疾患にかかっていない場合、この例において、被験体における生物マーカーのレベルとコントロール被験体の生物マーカーのレベルとの間の差異は、診断されるべき被験体が特定の神経変性疾患に罹っている示し得る。なお別の例において、コントロール被験体が特定の神経変性疾患に罹っていない場合、この例において、被験体における生物マーカーのレベルとコントロール被験体における生物マーカーとの間の類似性は、診断されるべき被験体が特定の神経変性疾患に罹っていないことを示し得る。
【００３６】
さらなる例において、選択された遺伝子産物が神経変性疾患（例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病）に関して診断される被験体における遺伝子産物の生物マーカーの発現増加または活性増加を検出することによる生物マーカーとして同定される場合、被験体由来のサンプル中の生物マーカーの（参照標準と比較した）発現増加は、その被験体が神経変性疾患に罹っていることを示し得る。一方、１つ以上の選択された遺伝子産物が、神経変性疾患に関して診断される被験体における遺伝子産物の発現低下または活性低下を検出することによる生物マーカーとして同定される場合、被験体由来のサンプル中のそのタンパク質の（参照標準と比較した）発現低下は、その被験体が神経変性疾患に罹っていることを示し得る。
【００３７】
なおさらに、生物マーカーの組み合わせが、開示される方法において使用され得る。例えば、参照標準に対して１つ以上の生物マーカーが増加し得、他の生物マーカーは低下し得、これによって神経変性疾患の存在または不在を示し得る。
【００３８】
（１．発現レベルの評価）
（ａ）サンプルの収集）
注記したように、本明細書中に開示される方法は、代表的に、被験体からサンプルを収集する工程を包含する。このサンプルは、被験体の末梢血のものであり得るが、他のサンプルの使用も企図される。血液サンプルは、細胞の単離および続くこれらの細胞からの遺伝子産物の単離を可能とする任意の方法で収集され得る。例えば、血液はシリンジを介して収集され得、次いで４℃で保管され得る。血液サンプルは、ヘパリン、ＥＤＴＡもしくはＡＤＣ（黄色チューブ）または任意の他の抗凝固剤を含む（しかしこれらに限定されない）真空管に収集され得る。血液を収集および保存する別の方法は、ＰＡＸｇｅｎｅＴＭＢｌｏｏｄ  ＲＮＡチューブの使用を介して達成され得る。このことは、室温で５日まで全血の安定化および保存を可能にする。真核生物のｍＲＮＡの安定性を増強する任意の他の化合物または化学薬品の使用もまたこの手順と共に使用され得る。１つの特定の例において、ペレットは、２００μＬの緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、０．５％  Ｎｏｎｉｄｅｔ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．１Ｍ  ＮａＣｌ、１×Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ、ならびに１×Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ１および１×Ｓｉｇｍａ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ２）中で４℃にてボルテックスにかけることによって再懸濁され得る。この懸濁物は、ボルテックスを一時中断して２０分間氷上に保たれ得る。４℃において５分間１５，０００×ｇにて遠心分離した後、上清のアリコートが−７０℃で保存され得る。他の型のサンプル（例えば、尿、ＣＳＦ、組織など）の収集は、当該分野で公知の方法によって実施され得る。
【００３９】
（ｂ）細胞の収集）
代表的に、サンプルが一旦収集されると、そのサンプル中に含まれる種々の細胞が分離され得る。例えば、特定の実施形態において、サンプル中に含まれる白血球集団において遺伝子または遺伝子セットの発現パターンがアッセイされる。種々の細胞は、それら細胞から遺伝子産物が収集され得るようにそれらが最終的に維持される限り、任意の方法で単離され得る。例えば、白血球を単離する１つの方法は、例えば、その血液サンプル中に含まれる赤血球を溶解し、次いで残存する白血球を遠心分離によって収集することである。このアッセイは、白血球の部分集合（例えば、リンパ球およびそのサブクラス、単球、ならびに他の型の血液細胞）に適用され得る。さらに、非血液細胞がアッセイされ得る（例えば、皮膚、頬の擦過物、筋肉、嗅覚上皮、消化系、泌尿器系、および生殖器系由来の細胞）。溶解は任意の方法で（例えば、塩化アンモニウムの使用を介してかまたは市販の試薬（例えば、ＩＭＭＵＮＯＬＹＳＥＴＭおよびＯＰＴＩＬＹＳＥＴＭ（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｍｉａｍｉ，ＦＬ））を使用するＲＮＡｓｅの無い条件において）起こり得る。あるいは、ＨＩＳＴＯＰＡＱＵＥＴＭ（Ｓｉｇｍａ；Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）を、Ｆｉｃｏｌｌと共にまたはこれなしで使用して、抗凝血化血液を遠心分離し、赤血球から白血球を分離し得る。この目的を達成するための別の方法は、抗凝血化血液を室温で１〜２時間沈殿させて、白血球画分を収集する方法である。溶解の別の例としては、抗凝血化血液を５分間１５０ｇ〜２００ｇにて遠心分離する工程；次いでバフィーコートを除去する工程、が挙げられる。溶解のための類似の方法は当該分野で公知であり、これもまた使用され得る。
【００４０】
白血球はまた、例えば、セルソーティングのための白血球特異的マーカーを使用して収集され得る。一般的な白血球集団は、サブタイプ（例えば、Ｂ細胞、Ｔ細胞、好塩基球、好酸球、好中球、単球、および血小板ならびにこれらの一般的な分類のサブタイプ）にソーティングされ得る。マーカーとしては、ＭＨＣ糖タンパク質、インテグリン、ホーミング（ｈｏｍｉｎｇ）レセプター、Ｆｃレセプター（ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡおよびＩｇＤに対するもの）、補体レセプター（リンホカイン、インターフェロン、コロニー刺激因子に対するもの）、インスリンに対するレセプター、神経伝達物質に対するレセプター、走化性レセプター、膜酵素、および輸送タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。これらは、例えば、１７０種を超えるＣＤ抗原を認識する抗体によってソーティングされ得る。
【００４１】
代表的に、細胞（例えば、白血球）が収集されると、その白血球自体が溶解されて核酸および／またはタンパク質を収集する。これらの細胞は、任意の方法で溶解され得る。白血球の核酸はまた、４Ｍ  グアニジウムイソシアネート溶解および塩化セシウム超遠心分離を使用して、または４Ｍ  グアニジンチオシアネート／２５ｍＭ  クエン酸ナトリウム／０．５％  サルコシル／０．１Ｍ  β−メルカプトエタノールを使用して白血球を溶解し、次いで２Ｍ  ＮａＯＡｃを添加し、その後遠心分離工程およびイソプロパノール沈殿を使用して、収集され得る。さらに、核酸は、ヒドロキシアパタイトを使用して収集され得るか、または核酸は正に荷電した磁気ビーズを使用して収集され得る。核酸はまた、例えば、沈殿され得る。全ＲＮＡはまた、ＴＲＩＺＯＬＴＭ試薬（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．；Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して得られ得る。この試薬は、フェノールおよびグアニジンイソシアネートの単相の溶液である。細胞を破壊して細胞成分を溶解する間にＲＮＡの完全性を維持する任意の他の試薬もまた使用され得る。白血球のタンパク質およびペプチドはまた、「クラック緩衝液」（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ、２％  ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１０％  グリセロール、各１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、ロイペプチン、アプロチニン、および１Ｍ  オルトバナジン酸ナトリウム）中で細胞を溶解し、そして２２ゲージの針を用いて剪断することによって収集され得る。サンプルのタンパク質含量は、ＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して見積もられ得る。タンパク質（１０μｇ〜２０μｇ）は、１０％ＳＤＳでのドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用して分離され得る。
【００４２】
代表的に、総遺伝子産物（例えば、生物マーカー）は、最初に単離または収集される。このことは、核酸および／またはタンパク質を収集するための任意の手段を使用して行われ得る。これらの遺伝子産物が一旦収集されると、これらは洗浄され得、そして例えばアフィニティー系のうちの１つの型（例えば、磁気ビーズ）に対して結合され得る場合、溶出され得る。遺伝子産物を収集する工程は代表的に、サンプル中のｍＲＮＡおよび／またはタンパク質を獲得するために行われ、そして遺伝子産物の直接的収集が使用される場合には必要とされない。しかしながら、これらの遺伝子産物は、遺伝子発現の分析を可能にする任意の方法で調製され得る。
【００４３】
（ｃ）ＲＮＡの調製）
いくつかの例において、開示される方法は、いくつかのレベルのＲＮＡ調製物を含む。ＲＮＡ調製工程は、連続的な方法の一部として行われることを必要とはされないが、特定の方法において、このＲＮＡはハイブリダイズされ得るように調製されるべきである。他の方法において、ＲＮＡを使用してｃＤＮＡを生成し得、次いでこのｃＤＮＡは、例えばＰＣＲ反応のための鋳型として使用され得るか、または例えばプローブのハイブリダイゼーションを介して直接的に分析され得る。理論上、ＲＮＡ調製工程は実際の増幅工程および定量工程からは大きく離されて（例えば、別の研究室でか、またはずっと早い時間に）実施され得るが、多くの実施形態において、ＲＮＡの単離および調製、またはＤＮＡの増幅などは、この方法のうちの増幅工程および定量工程（例えば、ＰＣＲまたはハイブリダイゼーション）と同時であり得るが、このことは必要ではない。
【００４４】
ＲＮＡ調製工程が開示される方法に含まれる場合、ＲＮＡ調製の方法は、酵素操作可能なｍＲＮＡまたは酵素分析可能なＲＮＡを生成する、任意のＲＮＡ調製方法であり得る。例えば、ＲＮＡは、グアニジウムイソチオシアネート−超遠心分離方法、グアニジウムおよびフェノール−クロロホルム方法、塩化リチウム−ＳＤＳ−尿素方法、またはオリゴ（ｄＴ）セルロース方法を使用する組織溶解物からのポリＡ＋／ｍＲＮＡを使用することによって、単離され得る。ＲＮＡを単離する場合に十分なＲＮＡが単離されることが重要である。さらに、代表的に、得られたＲＮＡの量が決定され得る。例えば、代表的に少なくとも０．０１ｎｇまたは０．５ｎｇまたは１ｎｇまたは１０ｎｇまたは１００ｎｇまたは１，０００ｎｇまたは１０，０００ｎｇまたは１００，０００ｎｇのＲＮＡが単離され得る。本明細書中で考察されるように、多変量定量的ＰＣＲの増幅の間、この増幅が停止される場合に各々の標的産物の増幅が依然として約８０％、または８５％または９０％または９５％の倍化率であり続けることが重要である。ＰＣＲのサイクル数は概ねその倍化率のままであり続けるように実施され、このＰＣＲサイクル数はｃＤＮＡ生成工程において使用された総ＲＮＡ量に関係する。
【００４５】
ＲＮＡは、任意の所望の細胞または細胞型から、そして任意の器官から単離され得る（哺乳動物、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サル、およびヒト、ならびに非哺乳動物、例えば魚および両生類、ならびに植物、さらには細菌のような原核細胞が挙げられる）。
【００４６】
（ｄ）ＲＮＡ発現分析）
細胞または細胞型（例えば、白血球）が一旦収集されると、それらの細胞内に含まれる発現されたメッセンジャーＲＮＡがアッセイされ得る。このことは、任意の多くの手段（例えば、ハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ、実時間ＲＴ−ＰＣＲ、１チャネル定量的多重ＲＴ−ＰＣＲ、オリゴアレイおよび／もしくはｃＤＮＡアレイ、またはヌクレオチドの定量を導き得る任意の技術）を使用して行われ得る。このようなアプローチの例は、ＤＮＡチップ技術の使用に基づく自動化装置から誘導され得、この例は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｎａｎｏ−Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＬＬＣ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄｎａｎｏ．ｃｏｍ／に見出され得る。例えば、総ｍＲＮＡをアッセイする１つの方法は、細胞内に含まれる全ての核酸を、例えば細胞を溶解して核酸を沈殿することによって、収集することである。メッセンジャーＲＮＡは、任意の方法（例えば、ポリＴオリゴヌクレオチド（これはメッセンジャーＲＮＡ転写物上に含まれるポリＡテールと特異的にハイブリダイズする）を使用すること）で収集され得る。しかしながら、この方法は３’−ポリＡテールの存在に依存するが、特定の条件下において、このテールは分解され得る。従って、全メッセンジャーＲＮＡ（フラグメントを含む）を直接分析する別の方法は、メッセンジャー特異的プライマーを逆転写酵素と共に使用してｃＤＮＡを作製することであり得る。次いで、このｃＤＮＡは、直接的にアッセイされ得るか、または例えば、本明細書中に考察される定量的ＰＣＲを使用して増幅およびアッセイされ得る。最終的な目的は、遺伝子発現の分析であり、この分析は、遺伝子の発現を分析しそしてそれらの発現を比較する任意の方法において達成され得ることが理解される。直接的ハイブリダイゼーションまたはｍＲＮＡ同定の他の手段、およびｍＲＮＡが操作されて例えばｃＤＮＡを形成する手段が考慮され、このｃＤＮＡは、例えば、ハイブリダイゼーションまたは他の同定を介して直接分析されるか、またはこのｃＤＮＡ自体が増幅されて例えばＰＣＲ産物を生成し、この産物自体が例えばハイブリダイゼーションによって直接分析され得るか、またはそれ以外に同定もしくは操作され得ることが、理解される。遺伝子発現の同定の最終目的が実現される限り、これは本明細書中で企図される。
【００４７】
発現分析は、例えば、プローブのハイブリダイゼーションを介し得る。例えば、分析されるべき特定の遺伝子に対するプローブは、例えば、チップ上に備えられ得、そしてｍＲＮＡがそのチップへの結合について分析され得る。これらのチップは代表的にアレイ（例えば、マイクロアレイまたはマクロアレイ）といわれる。
【００４８】
（（１）マイクロアレイ）
アレイはサンプルの順番の配置であり、塩基対のルールに基づき既知ＤＮＡサンプルと未知ＤＮＡサンプルとを適合するための媒体を提供する。代表的に、未知のものを同定するプロセスが自動化される。アレイ実験は、一般的なアッセイ系を利用し得る（例えば、マイクロプレートまたは標準的なブロッティング膜）そしてサンプルを配置するために手動でなされ得るかまたはロボット工学を利用し得る。一般的に、アレイはマイクロアレイまたはマクロアレイと記載され、この差異はサンプルスポットの寸法である。マクロアレイは、約３００μｍ以上の寸法のサンプルスポットを備え、そして現行のゲルスキャナまたはブロットスキャナによって容易に画像化され得る。マイクロアレイにおけるサンプルスポットの寸法は３００μｍ以下であり得るが、代表的に直径２００μｍ未満であり得、そしてこれらのアレイは通常、１０００個のスポットを備える。マイクロアレイは代表的に、特化されたロボット工学設備および／または画像化設備を必要とし、これら設備は一般的にマイクロアレイの各々固有の適用のために構成される。この技術を記載するために文献で使用されている用語としては、バイオチップ、ＤＮＡチップ、ＤＮＡマイクロアレイ、ＧＥＮＥＣＨＩＰＴＭ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘの高密度オリゴヌクレオチドベースのＤＮＡアレイ製品（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．；Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ））および遺伝子アレイが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
ＤＮＡマクロアレイは、代表的に、一般的にはガラス基材上またはナイロン基材上に高速ロボット工学によって製造され、このアレイに対して既知の同一性を有するプローブを使用して相補的結合を測定し、これによって大量に並列の遺伝子発現研究および遺伝子発見研究を可能にする。１つのＤＮＡチップを用いた実験は、同時に数千種の遺伝子についての情報を提供し得る。開示されるマイクロアレイは、任意の目的（遺伝子発現のモニタリング、疾病の診断、遺伝子発見、薬物発見（薬理ゲノム学）、および毒性学的研究または毒性ゲノム学（ｔｏｘｉｃｏｇｅｎｏｍｉｃｓ）が挙げられる）のために使用され得ることが、本明細書中に企図される。
【００５０】
既知の同一性を有するアレイ化されたＤＮＡ配列の特性という点で、ＤＮＡマクロアレイ技術の２つの変法がある。Ｉ型アレイとＩＩ型アレイとの間の主要な差異は、Ｉ型アレイにおいては代表的に１つの配列または関連する配列のセット（例えば、対立遺伝子配列のセット）が存在し、ＩＩ型アレイにおいてはその表面上に結合された多くの異なる配列が存在する。
【００５１】
Ｉ型マイクロアレイはプローブを備え、代表的にはｃＤＮＡ（５００〜５，０００塩基長）であり、これは、ガラスのような固体表面にロボットのスポット付けを使用して固定され、そして個別にかまたは混合物においてのいずれかで標的のセットに曝される。この方法は伝統的に、ＤＮＡマイクロアレイといわれる。Ｉ型マイクロアレイを用いて、位置決めされた複数コピーの１種以上のポリヌクレオチド配列、好ましくは数コピーの１種のポリヌクレオチド配列が、基材表面の複数の規定領域上に固定される。ポリヌクレオチドは、代表的に５ヌクレオチド〜１０，０００ヌクレオチドの範囲のヌクレオチドの鎖をいう。これらの固定された数コピーのポリヌクレオチド配列は、ハイブリダイゼーション実験においてプローブとしての使用に適切である。次いで、固定された配列は、多くの異なるサンプル（代表的には、チップの異なる領域）とプローブ付けされ、その結果、固定されたサンプルにハイブリダイズするヌクレオチドを含むサンプルが同定され得る。
【００５２】
固定されたプローブでコーティングされたビーズを調製するため、ビーズは所望のプローブを含む溶液中に浸漬され、次いで共有結合手段または非共有結合手段によってビーズ上に固定される。あるいは、プローブがロッド上に固定される場合、所定のプローブはロッドの規定の領域にスポットされ得る。代表的なディスペンサーは、基材に対してマイクロピペットの位置を制御するためのロボット工学系を用いて基材に溶液を送達する、マイクロピペットを備える。試薬が同時に反応領域に送達されるように、多数のディスペンサーが存在し得る。１つの実施形態において、マイクロアレイは圧電作用に基づくインクジェット技術を使用することによって形成され、これによって目的の液体（例えば、オリゴヌクレオチド合成試薬）を収容する細いチューブがアダプタにより取り囲まれる。アダプタを横切って送られる電位変化は、このアダプタがチューブよりも異なる率で拡大して基材上に液体の小さな液滴に力を加えることを引き起こす（Ｂａｌｄｅｓｃｈｗｅｉｌｅｒら、ＰＣＴ公開ＷＯ９５／２５１１１６を参照のこと）。
【００５３】
サンプルは、目的のポリヌクレオチド（ポリヌクレオチド標的）を含む任意のサンプルであり得、そして任意の体液（例えば、血液、尿、唾液、粘液、胃液など）、培養細胞、生検材料、または他の組織調製物から得られ得る。ＤＮＡまたはＲＮＡは、当業者に周知の多くの方法のうちの任意の方法に従って、サンプルから単離され得る。例えば、核酸の精製方法は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｏｂｅｓ．ＰａｒｔＩ．Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ，Ｐ．Ｔｉｊｓｓｅｎ編  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ（１９９３）に記載される。１つの実施形態において、総ＲＮＡはＴＲＩＺＯＬＴＭ総ＲＮＡ単離試薬（Ｇｉｂｃｏ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して単離され、そしてｍＲＮＡはオリゴｄ（Ｔ）カラムクロマトグラフィーまたはガラスビーズを使用して単離される。ハイブリダイゼーションおよびプロセッシングの後、得られたハイブリダイゼーションシグナルは、サンプルに添加されたコントロールの標的ポリヌクレオチドの正確な量を反映するはずである。
【００５４】
基材上の複数の規定の領域（固定されたポリヌクレオチド）は、種々の形式で配列され得る。例えば、これらの領域は、枠の長さに垂直または平行に配列され得る。さらに、標的はその基材に直接結合される必要はなく、むしろリンカー基を介してその基材に結合されてもよい。リンカー基は、代表的に、約６原子〜５０原子の長さまで変動し得る。適切なリンカー基としては、エチレングリコールオリゴマー、ジアミン、二価酸などが挙げられる。基材表面上の反応基は、リンカーの一方の末端部分と反応してリンカーを基材に結合させる。次いで、リンカーの他方の末端がプローブに結合するために機能化される。
【００５５】
サンプルのポリヌクレオチドは、１つ以上の標識部分により標識されて、ハイブリダイズしたプローブ／標的ポリヌクレオチド複合体の検出を可能にし得る。この標識部分は、分光学的手段、光化学的手段、生化学的手段、生物電子工学的手段、免疫化学的手段、電気的手段、光学的手段、または化学的手段により検出され得る組成物を含み得る。標識部分としては、放射性同位体（例えば、３２Ｐ、３３Ｐまたは３５Ｓ）、化学発光化合物、標識化結合性タンパク質、重金属原子、分光学的マーカー（例えば、蛍光マーカーおよび色素）、磁気標識、連結化酵素、質量分析タグ、スピン標識、電子輸送のドナーおよびアクセプター、ビオチンなどが挙げられる。
【００５６】
標識化は、増幅反応（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応およびインビトロ転写反応およびインビボ転写反応）の間に実行され得る。あるいは、標識部分は、プローブ−標的複合体が一旦形成される場合のハイブリダイゼーション後に組み込まれ得る。好ましい１実施形態において、ビオチンは、上記のように、増幅工程の間に最初に組み込まれる。ハイブリダイゼーション反応後、未結合の核酸はリンス除去されて、その結果、基材に結合したまま残るビオチンのみが、ポリヌクレオチドプローブにハイブリダイズされた標的ポリヌクレオチドに結合したものである。次いで、ビオチンに高い親和性で結合するアビジン結合体化フルオロフォア（例えば、アビジン−フィコエリトリン）が添加される。
【００５７】
ハイブリダイゼーションは、ポリヌクレオチドプローブと相補的な標的とが塩基対合を介して安定な二重鎖を形成することを引き起こす。ハイブリダイゼーション方法は当業者に周知であり、そしてハイブリダイゼーションについてストリンジェントな条件は、本明細書中で考察されるように、塩濃度、温度ならびに他の化学薬品および条件によって規定され得る。さらなるパラメータ（例えば、ハイブリダイゼーションの時間、界面活性剤（ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））または溶媒（ホルムアミド）の濃度、およびキャリアＤＮＡの組み込みまたは除外）を変化させることは、当業者に周知である。これらの条件についてのさらなる変化は、当業者にすぐに明らかである（Ｗａｈｌ  ＧＭおよびＢｅｒｇｅｒ  ＳＬ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７；１５２：３９９−４０７；Ｋｉｍｍｅｌ  ＡＲ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７；１５２：５０７−５１１；Ａｕｓｕｂｅｌ  ＦＭら，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９７；ならびにＳａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）。
【００５８】
複合体の形成を検出するための方法は、当業者に周知である。１つの例において、ポリヌクレオチドプローブは蛍光標識により標識化されて、複合体生成のレベルおよび様式の測定が蛍光顕微鏡（例えば、共焦点蛍光顕微鏡）によって達成される。アルゴンイオンレーザーは蛍光標識を励起し、光電子増倍管へと放射が指向され、そして放射光の量が決定され定量化される。この検出されるシグナルは、マイクロアレイの各々の位置におけるプローブ／標的ポリヌクレオチドの量に比例するはずである。蛍光顕微鏡は、コンピューター駆動されるスキャナデバイスと組み合わせて、ハイブリダイゼーション強度の定量的二次元画像を作成し得る。スキャンされた画像を検査して、ハイブリダイズした標的ポリヌクレオチド各々の量／発現レベルを決定する。
【００５９】
示差的ハイブリダイゼーション実験において、２つ以上の異なる生物学的サンプル由来のポリヌクレオチド標的は、異なる放射波長を有する２つ以上の異なる蛍光標識により標識化される。傾向シグナルは、特定の波長を検出するための異なる光電子増倍管の組により別々に検出される。２つ以上のサンプル中の標的ポリヌクレオチドの相対量／相対発現レベルが得られる。代表的に、１つより多くのマイクロアレイが同じ試験条件下で使用される場合、マイクロアレイの蛍光強度を正規化して、ハイブリダイゼーション強度の変化量を検討し得る。１つの例において、個々のポリヌクレオチドのプローブ／標的複合体のハイブリダイゼーション強度は、各々のマイクロアレイ上に備えられる内部の正規化コントロール由来の強度を使用して正規化される。
【００６０】
ＩＩ型マイクロアレイは、オリゴヌクレオチド（例えば、約２０マー〜約８０マーのオリゴ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブのアレイを備え、このアレイはインサイチュ（チップ上）または従来の合成によって合成され、その後チップ上に固定化される。アレイは、標識されたサンプルＤＮＡに曝され、ハイブリダイズされ、そして相補的配列の同一性／量が決定される。この方法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｉｎｃ．，（Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）にて開発され、この企業は、ＤＮＡチップと「伝統的に」称され、ＧＥＮＥＣＨＩＰの商標の下で写真平板術により製造された製品を販売する。
【００６１】
遺伝子発現に対するＩＩ型アレイの使用の裏にある基本的概念は単純である：実験サンプルのｍＲＮＡ由来の標識されたｃＤＮＡまたはｃＲＮＡは、固体支持体に結合された核酸プローブにハイブリダイズする。各々のＤＮＡ位置と関連した量をモニタリングすることによって、示される各々のｍＲＮＡ種の量を推測することが可能である。ハイブリダイゼーションは核酸を検出および定量するために１０年間使用されてきたが、この技術の縮小化と拡大との組み合わせ、ならびに配列情報量を増加することは、遺伝子発現が研究される規模を大いに広げた。
【００６２】
マイクロアレイを製造することは、５インチ平方の石英ウエハを用いて開始し得る。最初に、石英は洗浄されてその表面全体に均一なヒドロキシル化を確立する。石英は天然で水和されるので、化学薬品（例えば、リンカー分子）の結合にこれは素晴らしい基材を提供し、この化学薬品は後でアレイ上でプローブを配置するために使用される。
【００６３】
このウエハはシランのバスに入れられ、これは石英のヒドロキシル基と反応して、共有結合した分子のマトリクスを形成する。これらシラン分子の間の距離はプローブのパッケージング密度を決定し、アレイに５００，０００を超えるプローブ位置または特徴をわずか１．２８平方センチメートル以内に保持させる。これらの特徴の各々は、数百万の同一のＤＮＡ分子を係留する。シランフィルムは均一なヒドロキシル密度を提供してプローブの組立を開始する。リンカー分子は、シランマトリクスに結合され、光によって空間的に活性化され得る表面を提供する。
【００６４】
プローブの合成は並行して起こり、結果としてＡ、Ｃ、ＴおよびＧのヌクレオチドを付加して鎖を同時に多重増幅する。オリゴヌクレオチド鎖が各々の工程においてヌクレオチドを受容することを規定するため、個々の特徴の寸法に対応する１８〜２０平方μｍのウインドウを有するフォトリソグラフィーマスクが、コーティングされるウェハ上に置かれる。このウインドウは各々のプローブの所望の配列に基づいてマスク上に分散される。合成の第一工程においてマスク上に紫外線が照らされ、曝されたリンカーは脱保護されてヌクレオチドのカップリングに利用可能になる。
【００６５】
所望の特徴が一旦活性化された場合、除去可能な保護基を有する１つの型のデオキシヌクレオチドは、ウェハ表面上でフラッシング（ｆｌｕｓｈ）される。ヌクレオチドは、活性化されたリンカーに結合し、合成プロセスを開始する。
【００６６】
オリゴヌクレオチドの配列における各々の位置は、４種のヌクレオチドのうちの１種に占められ得、結果としてウェハあたり２５×４（すなわち１００）の異なるマスクを明らかに必要とするが、合成プロセスはこの必要性を有意に低減するように設計され得る。マスクの使用を最小にするのを助けるアルゴリズムは、同じマスクが複数回使用され得る場合、個々のプローブの合成速度を調節して状況を確認することによって、プローブの成長を最適に調和させる方法を計算する。
【００６７】
選択および設計の重要な要素のいくつかは、意図される用途に関係なく、全てのマイクロアレイの製造に共通である。プローブのハイブリダイゼーションを最適化するストラテジーは、例えば、プローブ選択のプロセスにおいて一定に含まれる。特定のｐＨ条件、塩条件および温度条件の下でのハイブリダイゼーションは、融解温度を考慮し、そして所望のハイブリダイゼーション挙動と相関する経験則を使用することによって、最適化され得る。
【００６８】
遺伝子活性の完全な像（ｐｉｃｔｕｒｅ）を得るため、いくつかのプローブは複数のスプライシング改変体またはポリアデニル化改変体により共有される領域から選択される。他の場合、改変体間を区別する固有のプローブが好ましい。プローブ間の距離はまた、選択プロセスに算入される（ｆａｃｔｏｒ）。
【００６９】
ストラテジーの異なる組を使用して、複数のプローブを基にするアレイを遺伝子型決定するためのプローブを選択して、配列中の個々のヌクレオチドを問い合わせる。標的塩基の同一性は、標的位置においてのみ変化する４つの同一のプローブ（各々が４つの可能性ある塩基のうちの１つを含む）を使用して推測され得る。
【００７０】
あるいは、コンセンサス配列の存在が、特異的対立遺伝子を表す１種または２種のプローブを使用して試験され得る。ヘテロ接合性に混合したサンプルまたは遺伝的に混合したサンプルを遺伝子型決定するため、多くのプローブを有するアレイが作製されて冗長な情報を提供し得、結果として不明瞭な遺伝子型決定を生じる。さらに、包括的なプローブをいくつかの適用において使用して、自由度を最大にし得る。例えば、いくつかのプローブアレイは、複数の混合物（例えば、いくつかのプロトコルにおいて使用されて一ヌクレオチド多形（ＳＮＰ）を同定し得る混合物）からの個々の反応産物の分離および分析を可能する。
【００７１】
特定の例において、その発現がサンプル（例えば、末梢血）中で特定の神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病またはパーキンソン病）の診断に関係する開示される遺伝子または遺伝子セットは、マイクロアレイに結合され得る。特定の実施形態において、例えば、チップはセクションに分けられ得、そのセクションの各々は、診断セットにおける遺伝子のうちの１つに対する種々の領域および対立遺伝子を備え、そしてそのチップの別の領域はその診断セットにおける遺伝子のうちの別のものに対する種々の領域および対立遺伝子を備え得る。なお別の例において、チップの各々の領域は、そのセットにおける全ての遺伝子の全ての対立遺伝子および領域を備え得る。この型の例について多くの変形が存在し、これらは、開示される神経変性疾患の診断用遺伝子の全てまたは任意の部分集合についての全ての対立遺伝子および領域を備え、そしてこれらの開示される遺伝子の任意の領域（３塩基から全長の配列）は、固定化のためのプローブ領域として使用され得ることが理解される。さらに任意の対立遺伝子または変異体もまた使用され得る。
【００７２】
（（２）多価の１チャネル定量的ＲＴ−ＰＣＲ）
発現レベルをアッセイするための１つの特定の有用な手段は、多変量単一チャネルの定量的ＲＴ−ＰＣＲの使用を介する。これらの方法は、２００１年１１月３０日に出願された米国特許出願第６０／３３６，０９５号、２００２年７月１９日に出願された同第６０／３９７，４７５号、２００２年１２月２日に出願された同第１０／４９６，６２６号、２００１年３月１２日に出願された第６０／２７５，２２９号、および２００２年３月１２日に出願された米国特許出願第１０／０９６，７１０号において開示され、これらは、多変量単一チャネルの定量的ＲＴ−ＰＣＲに関する方法および組成物に関する少なくとも材料について、本明細書中で参考として援用される。簡潔に述べると、複数の遺伝子の発現を同時に解析するために、ＰＣＲベースの抗スループット方法を利用する。この方法は、微小量の出発材料を使用し得、そして例えば１つのみの標的が利用可能である場合、有効性について単一コピーレベル（例えば、単一の標的細胞由来の１コピーの転写物）に達し得る。例えば、４被験体に対して３連にて２０の転写物の分析のため、被験体あたり１μｇ未満の総ＲＮＡが必要とされる。開示される方法は、複数の遺伝子を同時に分析し得る。開示される方法は、単一のシグナル試薬（例えば、蛍光プローブ）を使用して複数の遺伝子を定量化し得る。
【００７３】
一般的に、本方法は、１つの細胞程度を含み得るサンプル中の多くの異なる遺伝子の発現についての定量的情報を得るのに有用である。開示される方法は定量的であるので、種々の異なる細胞状態または細胞型の間の定量レベルにおける発現パターンの比較が達成され得る。一般的に、総ＲＮＡは、任意の単離手順を使用して標的サンプルから単離され得る。次いで、このＲＮＡを使用して、任意の手順（例えば、ランダムプライマー、オリゴ−ｄｔ−プライマー、またはランダムオリゴ−ｄｔ−プライマーを使用することであり、これらのプライマーは、特定の配列の短いストレッチの３’末端に繋がって、可能性ある組み合わせ全てを変換して、これによりこのプライマーはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）と結合するポリＡ区域および非ポリＡ区域の間に連結してプライムする）を使用して第一の鎖コピーＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成し得る。次いで、このｃＤＮＡはＰＣＲ反応における鋳型として使用される。このＰＣＲ反応は、発現される遺伝子に対して特異的であるプライマーセット（順方向プライマーおよび逆方法プライマー）を用いて実施され、これらプライマーセットが追跡され得る。この反応は、所望されるだけ多くの異なるプライマーセットを含み得るが、代表的に、５〜１００の間の異なるプライマーセットを含み、この各々は単一遺伝子または単一アイソフォーム（５〜１００の間の任意の特定の数が挙げられる）に特異的である。代表的に、全てのプライマーはおよそ等モル濃度である。複数回のＰＣＲサイクル（例えば、１５サイクルであり、ＤＮＡは依然として約８０％超または約８５％超または約９０％超または約９５％超の倍化率で増幅している）を実施した後、このＰＣＲが停止される。代表的に、ＰＣＲの第一ラウンドにおいて、定量的ＰＣＲ（実時間ＰＣＲ）が実施される場合、増幅の閾値サイクルまでは到達されない。しかしながら、閾値サイクルの後、約９サイクル未満、約８サイクル未満、約７サイクル未満、約６サイクル未満、約５サイクル未満、約４サイクル未満、約３サイクル未満、約２サイクル未満、約１サイクル未満の間に増幅が進行する場合、特定の実施形態における開示される方法は、依然として機能する。第一ラウンドのサイクル数は、出発材料の量に依存する。例えば、１つの細胞実験のために２０サイクルが使用され得る。次いで、ＰＣＲ反応は、（新規の）第二ラウンドのために新規の反応チューブに分配される。各々の反応チューブは、第一のＰＣＲ混合物中に存在する特定のプライマー全てから生成される全ての産物を含む、先のＰＣＲ反応混合物の１分画を収容する。第二のＰＣＲ混合物中に、第一のＰＣＲ混合物の画分を含み、代表的には、分子ビーコンを結合されるユニバーサルプライマーに加えて、１セットの特定のプライマーまたは１セットの新規プライマーが添加され、そしてＰＣＲが実施される。代表的に、この第二ラウンドのＰＣＲは、定量的実時間ＰＣＲプロトコルを使用して実施され、これらプロトコルは例えば、ユニプライマー（ユニバーサルプライマー）がＤＮＡ配列に結合する間のクエンチャー配列からの蛍光の放出（例えば、増幅プローブのうちの１部分にハイブリダイズするプローブ）を介して、各ＰＣＲサイクルにおける蛍光の増加に依存する。実時間ＰＣＲにおいて使用される蛍光アプローチは、代表的に、蛍光レポーター色素（例えば、ＳＹＢＲグリーン、ＦＡＭ、フルオレセイン、ＨＥＸ、ＴＥＴ、ＴＡＭＲＡなど）およびクエンチャー（例えば、ＤＡＢＳＹＬ、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅなど）に基づく。ＰＣＲの伸長期の間にクエンチャーがプローブから離れる場合、レポーターの蛍光が測定され得る。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ、Ｔａｑｍａｎ  Ｐｒｏｂｅ、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ  ＰｒｉｍｅｒまたはＳｕｎｒｉｓｅ  Ｐｒｉｍｅｒなどのようなシステムは、このアプローチを使用して実時間ＰＣＲを実施する。実時間プローブに関する方法および試薬の例は、米国特許第５，９２５，５１７号；同６，１０３，４７６号；同６，１５０，０９７号および同６，０３７，１３０号に開示され、れらは、核酸の検出方法およびＰＣＲ方法に関する少なくとも材料について、本明細書中で参考として援用される。上記の工程を実施することに加え、プライマーセットについての標準曲線および代表的に各々個別のプライマーセットについての標準曲線の作成は、第二ラウンドのＰＣＲから得られたデータが標的サンプル（例えば、これは標的細胞を含む）中の元の出発材料の絶対的なコピー数と正確に相関し得るようになされるべきである。一般的な方法のこれら工程の各々ならびに試薬および方法の変法は、本明細書中に詳細に考察される。開示される方法を理解するための重要な局面は、バッチのＰＣＲ混合物中に複数の異なるプライマーセットを含む第一のＰＣＲの組み合わせであり、ここで全ての標的遺伝子産物または遺伝子産物のフラグメントが第二のＰＣＲパネルを用いて増幅され、ここでバッチＰＣＲ混合物の一部は特定のプライマーセットを用いて増幅される特異的な増幅反応が起こる。定量は、代表的に、完全なプライマーセットまたは各々個別のプライマーセットについて作成されてる標準曲線を参照して達成される。
【００７４】
（ｅ）タンパク質の調製）
いくつかの例において、開示される方法は、いくらかのレベルのタンパク質調製物またはペプチド調製物を含み得る。このタンパク質またはペプチドの調製工程は、一部の連続した方法として実施される必要はなく、特定の方法においてこのタンパク質またはペプチドは、例えば、本明細書中に開示されるように、それが分析され得るように調製されるべきである。この理論において、タンパク質またはペプチドの調製工程は、実際の分析工程から距離をおいて（例えば、別の研究室において、またはずっと早い時間において）離れて実施され得る。多くの実施形態において、タンパク質またはペプチドの分離および調整（例えば、電気泳動）は、この方法の定量工程と組み合わせて起こるが、このことは必須ではない。
【００７５】
タンパク質またはペプチドの調製工程が開示される方法に包含される場合、タンパク質またはペプチドの調製方法は、分析可能なペプチドを生成する、タンパク質またはペプチドの任意の調製方法であり得る。例えば、サンプル細胞は、「クラック緩衝液」（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１００ｍＭ  ＤＴＴ、１００μｇ／ｍｌ  ＰＭＳＦ、２％  ＳＤＳ、１０％  グリセロール、各１μｇ／ｍｌのペプスタチンＡ、ロイペプチンおよびアプロチニン、ならびに１ｍ  オルトバナジン酸ナトリウム）中で溶解され得、そして２２ゲージの針を用いて剪断され得る。サンプルのタンパク質含量は、ＤＣタンパク質アッセイ（ＢｉｏＲａｄ）を使用して見積もられ得る。タンパク質（１０μｇ〜２０μｇ）が１０％  ＳＤＳでのドデシル硫酸ナトリウム−ポリヌクレオチドアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を使用して分離され得る。代表的に、得られるタンパク質またはペプチドの量が決定され得る。
【００７６】
タンパク質またはペプチドは、任意の所望の細胞または細胞型（マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、サルおよびヒトのような哺乳動物、ならびに魚または両生類のような他の非哺乳動物、ならびに植物そして細菌のような原核細胞でさえも、挙げられる）、および任意の器官から単離され得る。
【００７７】
（ｆ）タンパク質発現分析）
開示される方法の特定の実施形態において、１つ以上のタンパク質またはペプチドの発現レベルを評価することが実施され得る。タンパク質またはペプチドの発現レベルは、本明細書中に開示される核酸分析方法に加えて、または核酸分析の代替法として、評価され得る。サンプル中の１つ以上のタンパク質の発現レベルを評価することは、当該分野で公知の種々の技術によって実施され得る。例えば、発現レベルを評価することは、二次元電気泳動、質量分析（ＭＳ）、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型−ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、表面増強レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ）、多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）と引き続くタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）、タンパク質チップ発現分析、遺伝子チップ発現分析、およびレーザーデンシトメトリー（これらの技術の組み合わせを含む）によって、１つ以上のタンパク質を分析する工程を包含し得る。タンパク質発現レベルを分析するための技術の別の例において、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡ量がアッセイされ得る。
【００７８】
いくつかの他の技術において、タンパク質に選択的に結合する抗体または他の因子を使用して、サンプル中に発現されるタンパク質の量を検出し得る。例えば、タンパク質の発現レベルは、ウエスタンブロット、免疫沈降、酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、ジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、および蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）、またはそれらの組み合わせが挙げられる（しかしこれらに限定されない）方法を使用して測定され得る。また、抗体、アプタマー、またはタンパク質に特異的に結合する他のリガンドは、いわゆる「タンパク質チップ」（タンパク質マイクロアレイ）に固定化され得、そしてサンプル中のタンパク質の発現レベルを測定するための使用され得る。他の方法において、免疫蛍光技術を使用して、サンプル中のタンパク質の発現レベルを視覚的に評価し得る。免疫蛍光技術において、タンパク質に特異的に結合する抗体が視認されて、インタクトな白血球の細胞表面上および／または透化された白血球全体を通じたタンパク質の存在を間接的に検出する。
【００７９】
用語「抗体」が広範な意味で本明細書中で使用され、そしてポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方が挙げられる。また、完全な免疫グロブリン分子に加え、用語「抗体」にはそれら免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー（重合体）、および免疫グロブリン分子のヒト化バージョンまたはそのフラグメントが挙げられる。モノクローナル抗体としては、所望のアンタゴニスト活性を示す限り、「キメラ」抗体およびそのような抗体のフラグメントが挙げられ、この抗体において、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種由来の抗体中または特定の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一であるか、またはその対応配列に相同であり、残りの鎖が、別の種由来の抗体中または別の抗体のクラスもしくはサブクラスに属する抗体中の対応配列と同一であるかまたはその対応配列に相同である（米国特許第４，８１６，５６７号およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９８４；８１：６８５１−６８５５を参照のこと）。
【００８０】
１実施形態において、αシヌクレインまたはその配座異性体に対する抗体を使用して、α−シヌクレインまたはその種々の配座異性体のレベルを同定し得る。具体的には、天然のαシヌクレインに対する抗体、ドーパミン付加されたα−シヌクレインに対する抗体およびオリゴマー性α−シヌクレインに対する抗体または凝集したα−シヌクレインに対する抗体が、使用され得る。これらの抗体ならびびこれらの調製および単離のための方法は、Ｆｅｄｅｒｏｆｆらに対する、２００５年７月１９日に出願された米国特許出願（表題「Ａｌｐｈａ−Ｓｙｎｃｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｈｅｒｅｔｏ」）に開示される。
【００８１】
タンパク質に選択的に結合する非抗体リガンドはまた、タンパク質の存在、非存在を検出するため、そして／またはタンパク質の発現を定量化するために使用され得る。例えば、リガンドは、（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような蛍光分子に結合体化されて）蛍光標識され得るか、またはリガンドは、放射標識され得る。標識されたリガンドは、サンプルと接触され得、そしてタンパク質に対するリガンドの結合が評価され得る。サンプル中のタンパク質に結合する標識されたリガンドの量は、そのサンプル中に存在する特定のタンパク質の量の指標である。タンパク質が細胞表面分子である場合、タンパク質リガンドは、インタクトな細胞のサンプルに接触されて、その細胞表面においてそのタンパク質の発現レベルが検出され得る。あるいは、サンプル中の白血球の完全性は、細胞を透過処理するかまたは溶解し、次いで溶解された白血球サンプル中のタンパク質に結合する標識されたリガンドの量を評価することによって、解決され得る。
【００８２】
標識は、抗体または非抗体リガンドに、直接的または間接的に結合され得る。直接的に標識する工程は、例えば、抗体または非抗体リガンドに標識を直接結合する工程を包含する。間接的に標識する工程は、例えば、二次抗体もしくは三次抗体または非抗体リガンドに標識を結合する工程を包含する。
【００８３】
タンパク質の発現のレベルが遺伝子レベルで調節される場合において、そのタンパク質の発現レベルは、そのタンパク質をコードする遺伝子発現レベルを検出することによって間接的にモニタリングされ得る。使用され得る遺伝子発現を検出し、そして／または定量化するのに適した方法としては、ノーザンブロット、ＲＮＡｓｅ保護分析、逆転写−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、および遺伝子チップ（例えば、ヌクレオチド発現マイクロアレイ）技術が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
必要に応じて、複数のタンパク質の発現のレベルは、同時か、またはほぼ同時に決定され得る。例えば、二次元（２Ｄ）ゲル電気泳動は、サンプル中の数千ものタンパク質の発現レベルを、同時またはほぼ同時に評価するために使用され得る。（例えば、ＶｉｅｔｏｒおよびＨｕｂｅｒ、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．、１９９７；１３５９：１８７−９９（これは、少なくともタンパク質発現のレベルを評価する方法の教示について本明細書中に参考として援用される）を参照のこと）。１つの局面において、開示される方法は、２Ｄゲル電気泳動を包含し得、ここで、タンパク質混合物が、例えば、白血球を溶解し、そしてこのタンパク質溶解物とサンプル緩衝液とを混合することによって、そのサンプルから調製される。このタンパク質混合物はゲルスラブ（ｇｅｌ  ｓｌａｂ）上にロードされ、二次元で電気泳動され、次いでこのゲルスラブは乾燥され得る。２Ｄ電気泳動による分解後、個々のタンパク質またはタンパク質の群の発現レベルが評価され得る。タンパク質レベルは、銀染色またはＣｏｏｍａｓｓｉｅ染色によって評価され得る。サンプル中のタンパク質が標識される場合、標識量を測定する工程は、タンパク質の量を評価するために使用され得る。
【００８５】
（（ｇ）遺伝子産物  発現のレベルおよび正準変量）
標的遺伝子、特定の神経変性性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）に関連して本明細書中に開示される遺伝子、および特に、疾患を有する被験体のサンプル（例えば、血液）中の神経変性性疾患の存在に関連する遺伝子（すなわち、生物マーカー）の発現のレベルの検出は、本明細書中で開示されるような任意の方法において生じ得る。いくつかの例において、代表的に必要とされることは、核酸（例えば、転写物）の検出である。他の例において、代表的に必要とされることは、タンパク質の検出である。遺伝子産物の検出のための多くの手段（例えば、放射能または蛍光または本明細書中に開示されるような任意の他の方法）が存在する。任意の手段が使用され得る。
【００８６】
代表的に、収集される任意のデータは、細胞中の一般的な発現レベルに対して正規化され得る。これは、種々の方法（例えば、β−アクチン（これは全ての細胞中に存在する）発現の転写物に対して全ての転写物を比較すること）で行われ得る。正規化の他の方法は、任意の単一の遺伝子の発現以外のアプローチに基づき得る。定量的ＰＣＲに関して、アッセイされる各メッセージに対して標準曲線が得られるべきである。次いでこれらの標準曲線は、絶対的なコピー数を導くための基礎となる。内部コントロールとしては、β−アクチン、ＧＡＰＤＨ、チューブリンなどが挙げられるが、これらに限定されず、または外部コントロールは、例えば、細胞質もしくは核のＬａｃＺ（非配偶子性（ａｇａｍｏｕｓ））、または各ハイブリダイゼーション中にスパイクされた公知の標識されたｃＲＮＡであるが、これらに限定されない。バイオチップアプローチを使用することで、データの正規化はまた、アレイのバックグラウンド全体に対して目的のサンプルを加算平均することによって得られ得る。
【００８７】
ハイブリダイゼーションに関連した特定の実施例において、ストリップする工程および再プローブする工程が存在し得、これらの工程は、読みの特異性を上昇させる。例えば、サンプルは、Ｔ７プロモーターに対してストリップされ得、そして再プローブされ得る。
【００８８】
代表的に、一旦遺伝子産物または遺伝子産物のセットの発現パターンが得られると、その発現パターンは、分析されなければならない。代表的に、この分析は、遺伝子（単数または複数）間または遺伝子セット自体の間の相対的発現レベルの統計分析のいくつかの型、およびコントロールもしくは標準遺伝子（単数または複数）または遺伝子セットに対する比較を実施する工程を含む。分析のこのような方法は、本明細書中に開示される。
【００８９】
１つの例において、生物マーカー（例えば、核酸またはタンパク質遺伝子産物）の発現のレベルは、単変量（ｕｎｉｖａｒｉａｎｔ）正準分析および／または多変量正準分析（ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｎｔ  ｃａｎｏｎｉｃａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ）に供されて、第１および／または第２の正準変量をもたらし得る。単変量試験は、周知のＴ−検定またはＮ−検定であり得る。本明細書中で使用するのに適した１つのＮ−検定は、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ｓｍｄ／ｂｉｏｓｔａｔ／ｐｅｏｐｌｅ／ｔｅｃｈｒｅｐｏｒｔｓ．ｈｔｍｌのＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ０４／０１（これは、Ｎ−検定を介する統計分析の少なくとも教示について本明細書中に参考として援用される）に開示される。
【００９０】
多変量分析の多くの方法が存在する。これらの全てが適用され得る。１つの例において、多変量分析は、市販のソフトウェア、例えば、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｙ，ＮＣ）より利用可能なＳＡＳ／ＳＴＡＴ（登録商標）ソフトウェア）を使用して実施され得る。例えば、正準分析および主要成分分析が使用され得る。これらは共に、データ行列を分析する方法を取り扱う。代表的に、正準変数は、第一の正準変数および第二の正準変数からなる。多変量分析は、複数の試験インターフェースに対する必須の非パラメトリック試験であり得る。このような多変量統計試験は、正準判別分析に依存する。この分析は、群を最良に区別する変数（メッセージ）を決定し、かつ各々の変数に対して重みを割り当てる。第一の正準変数は、正準変数１によっては計算されないままである残差分散に対して作用する。さらなる逐次代入（反復）は、縮小効果を用いて可能である。
【００９１】
正準判別分析は、階級（クラス）変数からコード化される量的変数とダミー変数のセットとの間の正準の相関分析に等価である。以下の注釈において、ダミー変数はｙと記され得、量的変数はｘと記され得る。ｘとｙの変数についての全サンプルの共分散行列は、以下である：
【００９２】
【数１】
2008506415.tif 000002
ｃがグループ数である場合、ｎｔはグループｔにおける観察数であり、Ｓｔはグループｔにおけるｘ変数についてのサンプル共分散行列であり、ｘ変数についてのクラス内にプールされる共分散は、以下である：
【００９３】
【数２】
2008506415.tif 000003
正準相関ｐｉは、以下の行列の固有値λｉの平方根である。対応する固有値はｖｉである。
【００９４】
Ｓｐｉ−１／２ＳｘｙＳｙｙ−１ＳｙｘＳｐ−１／２。
【００９５】
Ｖを固有ベクトルｖｉ（これは、列として０でない固有値に対応する）を有する行列にすると、未加工の（ｒａｗ）正準係数は、以下のように計算される：
Ｒ＝Ｓｐ−１／２Ｖ。
【００９６】
プールされたクラス内標準化した正準係数は、以下である：
Ｐ＝ｄｉａｇ（Ｓｐ）１／２Ｒ。
【００９７】
そして全サンプルで標準化した正準係数は、以下である：
Ｔ＝ｄｉａｇ（Ｓｘｘ）１／２Ｒ。
【００９８】
これは、以下の任意によって計算され得る：
ＸｃＲ
Ｘｃｄｉａｇ（Ｓｐ）１／２Ｐ
Ｘｃｄｉａｇ（Ｓｘｘ）１／２Ｔ。
【００９９】
Ｅ−１Ｈに基づく多変数試験について、ｎは観察の全数である
Ｅ＝（ｎ−１）（Ｓｙｙ−ＳｙｘＳｘｘ−１Ｓｘｙ）
Ｈ＝（ｎ−１）ＳｙｘＳｘｘ−１Ｓｘｙ。
【０１００】
上記の多変量分析は、先に注記したように、市販のソフトウェア、例えば、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｙ，ＮＣ）より利用可能なＳＡＳ／ＳＴＡＴ（登録商標）ソフトウェア）を使用して実施され得る。本明細書中に開示される方法において、遺伝子産物セット由来の発現レベルがこのようなプログラムに入力され得る。この遺伝産物のセットは、遺伝子の任意のセットであり得、例えば、本明細書中に開示されるものである。いくつかの例において、遺伝子産物のあるセットは、コントロールサンプルまたはコントロール群に対応し得、そして遺伝子産物の別のセットは、疾患に罹っているサンプルまたはサンプル群に対応し得る。遺伝子産物のレベルは、絶対的または相対的な量または濃度として入力され得る。このレベルはまた、シグナル強度（例えば、遺伝子産物の放射線分析または蛍光分析）であり得る。注記したように、多変量分析の結果は、第一正準変数および／または第二正準変数であり得る。
【０１０１】
多変量分析から生成したこの第一正準変数および／または第二正準変数は、本明細書中に開示されるように、生物マーカーに対する発現レベルの代わりに、または生物マーカーに対する発現レベルに加えて、開示される方法において使用され得る。すなわち、本明細書中に開示されるいくつかの方法において、被験体由来の１つ以上の生物マーカーの発現レベルを分析することから得られる第一正準変数および／または第二正準変数は、コントロール被験体またはコントロール被験体群由来の生物マーカーの発現レベルの多変量正準分析から得られる第一正準変数および／または第二正準変数を含む参照と比較され得る。
【０１０２】
例えば、本明細書中に示されるように、多変量正準分析は、アルツハイマー病の診断として本明細書中で使用され得る。例えば、炎症関連遺伝子を使用する場合、正準変数１についてのコントロール変数の範囲は、約−０．５〜約−３．１の間であり得、ＡＤについての範囲は約０〜約＋４．４であり得る。細胞ストレスに関係する遺伝子に対して、正準変数１に対するコントロール値の範囲は約−４．８〜約−０．１であり得、ＡＤについての範囲は約＋０．１〜約＋４．１であり得る。細胞周期／細胞死に関係する遺伝子に対して、正準変数１についてのコントロール値の範囲は約＋２．６〜約−３．１であり得、そしてＡＤについての範囲は約＋３．０〜約−２．３であり得る。これらの３つのクラスの遺伝子産物の各々は、たとえ一部が重なり合うにせよ、Ｗａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚの実行テストにより統計上有意である程度にＡＤとコントロールとの間で区別される。ＡＤとコントロールとの間の重なり合いに関して、細胞周期／細胞死は最大を有し、炎症は１症例の重なり合いを有し、そして細胞ストレスは重なり合いを示さなかった。
【０１０３】
多変量分析の結果は無論、特定の入力（例えば、特定の遺伝子産物、それら遺伝子産物の特定のレベル、および特定のサンプルセット）に依存することが注記される。従って、他の遺伝子の追加もしくは置き換え、または異なる疾患の使用は、正準変数の範囲を変化させ得る。このことは、図４と図５とを比較することによって例示され、ここで細胞ストレスに対する正準変数１は、コントロール中に２つのＰＤ患者が含まれることに起因して、図５のものと異なる。正準変数１および／または正準変数２の特定の値における変動性にもかかわらず、当業者によって認識されるとおり、疾患の識別は依然として可能である（例えば、図５において例示されるとおり）。
【０１０４】
（２．メッセージクラス）
開示される組成物および方法の中心において、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）と相関する特定のメッセージの解析がある。特定の実施形態において、これらのメッセージは１つのメッセージであり得るが、代表的に、複数クラスのメッセージおよび複数セットのメッセージが分析される。なぜなら、これらは、そのクラスまたはセット単独内に含まれる遺伝子のうちの任意の１つについての評価よりも正確な評価を提供するからである。表４は、分析され得る例示的な標的を示す。複数の遺伝子産物は、同時に解析されるのがｍＲＮＡにせよタンパク質にせよ、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病）が診断されることを可能にする。
【０１０５】
例えば、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を診断するのに有用である遺伝子の１クラスは、細胞周期転写物のクラスである。これらとしては、例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、およびプロテインキナーゼＣαが挙げられ得る。
【０１０６】
別の例において、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を診断するのに有用である遺伝子の１クラスは、炎症応答転写物のクラスである。これらとしては、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０ｒが挙げられ得る。
【０１０７】
さらに別の例において、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病）を診断するのに有用である遺伝子の１クラスは、細胞ストレス転写物のクラスである。これらとしては、例えば、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリンが挙げられ得る。
【０１０８】
なお別の例において、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリンが使用され得る。
【０１０９】
さらに他の例において、当業者に公知であるような細胞周期／細胞死、炎症およびストレスに関係する他の遺伝子が使用され得る。
【０１１０】
別の例において、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病）を診断するのに有用である遺伝子のクラスとしては、例えば、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−合成酵素β鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン（Ｐｒｏｈｉｂｉｔｉｎ）、ホスホグリセリン酸ムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジムスターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ１Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、アクチン作用性タンパク質１（ＡＩＰ１）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＩ（ＭＡＰＫＩ）、アクチンまたはそのフラグメント、グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、形質転換タンパク質ＲｈｏＡ、酸性ロイシンリッチ核ホスホプロテイン３２ファミリーメンバーＢ（ＡＮＰ３２ＢまたはＡＰＲＩＬ）、ペルオキシレドキシンＩＩ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、Ａβペプチド、Ｆｅ６５、Ｔｉｐ６０、ＳＥＲＣＡ、ＰＳ１／２、ネクチン−１ａ、および老人斑の非アミロイドβ成分（ＮＡＣＰ／ａ−シヌクレイン）が挙げられる。
【０１１１】
セットまたはクラスにおいて多数の遺伝子クラスが存在し得る。例えば、１つのセット内または１つのクラス内に、少なくとも２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、１５種、１６種、１７種、１８種、１９種、２０種、２１種、２２種、２３種、２４種、２５種、２６種、２７種、２８種、２９種、３０種、３５種、４０種、４５種、５０種、７５種、１００種の異なる遺伝子または遺伝子産物が存在し得る。さらに、また１つのセットを形成し得る特定の遺伝子の複数の対立遺伝子が存在し得ることが理解される。特定の実施形態において、分析に使用され得る１つのセットの転写物内に７種または８種の遺伝子が存在する。
【０１１２】
特定の実施形態において、１つの遺伝子（例えば、α−１抗キモトリプシン、クリスタリンおよびシクロオキシゲナーゼＩＩに関係する遺伝子産物）が分析に使用され得る。
【０１１３】
表４：分析され得る神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）に対する例示的な標的。これらの標的の一般的なクラスも提供されるが、標的は、同定されるプロセスとは他の種々のプロセスに影響する機能を有し得る。
【０１１４】
【表４−１】
2008506415.tif 000004
【０１１５】
【表４−２】
2008506415.tif 000005
【０１１６】
【表４−３】
2008506415.tif 000006
【０１１７】
【表４−４】
2008506415.tif 000007
【０１１８】
【表４−５】
2008506415.tif 000008
【０１１９】
【表４−６】
2008506415.tif 000009
【０１２０】
【表４−７】
2008506415.tif 000010
【０１２１】
【表４−８】
2008506415.tif 000011
【０１２２】
【表４−９】
2008506415.tif 000012
【０１２３】
【表４−１０】
2008506415.tif 000013
【０１２４】
【表４−１１】
2008506415.tif 000014
【０１２５】
【表４−１２】
2008506415.tif 000015
【０１２６】
【表４−１３】
2008506415.tif 000016
【０１２７】
【表４−１４】
2008506415.tif 000017
【０１２８】
【表４−１５】
2008506415.tif 000018
【０１２９】
【表４−１６】
2008506415.tif 000019
【０１３０】
【表４−１７】
2008506415.tif 000020
【０１３１】
【表４−１８】
2008506415.tif 000021
【０１３２】
【表４−１９】
2008506415.tif 000022
【０１３３】
【表４−２０】
2008506415.tif 000023
【０１３４】
【表４−２１】
2008506415.tif 000024
【０１３５】
【表４−２２】
2008506415.tif 000025
【０１３６】
【表４−２３】
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【０１３７】
【表４−２４】
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【０１３８】
【表４−２５】
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【０１３９】
【表４−２６】
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【０１４０】
【表４−２７】
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【０１４１】
【表４−２８】
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【０１４２】
【表４−２９】
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【０１４３】
【表４−３０】
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【０１４４】
【表４−３１】
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【０１４５】
【表４−３２】
2008506415.tif 000035
【０１４６】
【表４−３３】
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【０１４７】
【表４−３４】
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【０１４８】
【表４−３５】
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生物マーカーのいくつかのさらなる例は、この発現レベルが例えば参照標準に対して評価および比較され得、そして、ヒトトランスフォーマー（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ）２−β、ｈＴｒａ２−β、ヒトＳＡＦ−ｂ、Ｍａｉｎｃｌｏｎｅ、ｐｈｔ６、ＭＩＦ、ｍａｉｎｃｌｏｎｅ相互作用因子、ｐｐ１７、ＥＳＡＦ、ｈｎＲＮＰＧ、ｃｄ２様キナーゼｃｌｋ１〜４が挙げられる。生物マーカーのさらなる例としては、表５に列挙されるものが挙げられる。これらのマーカーの具体例としては、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−合成酵素β鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン、ホスホグリセリン酸ムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジムスターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ１Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、アクチン作用性タンパク質１、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の例において、適切な生物マーカーとしては、分子量（ＭＷ）２７，１００および等電点（ｐＩ）７．５８を有するタンパク質、ＭＷ２５，４００およびｐＩ６．２を有するタンパク質、ならびに分子量２７，６００およびｐＩ５．９２を有するタンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４９】
（表５．パーキンソン病患者とコントロールの被験体との間で異なる同定タンパク質）
【表５−１】
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【０１５０】
【表５−２】
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生物マーカーの他の具体例は、本明細書中に記載されるように、その発現レベルが参照標準に対して評価および比較され得、そして、アクチン作用性タンパク質１（ＡＩＰ１）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＩ（ＭＡＰＫＩ）、アクチンまたはそのフラグメント、アネキシンＡＩ、１４−３−３タンパク質ε、グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、形質転換タンパク質ＲｈｏＡ、酸性ロイシンリッチ核ホスホプロテイン３２ファミリーメンバーＢ（ＡＮＰ３２ＢまたはＡＰＲＩＬ）、ペルオキシレドキシンＩＩ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、Ａβペプチド、Ｆｅ６５、Ｔｉｐ６０、ＳＥＲＣＡ、ＰＳ１／２、ネクチン−１ａ、および老人斑の非アミロイドβ成分（ＮＡＣＰ／ａ−シヌクレイン）が挙げられる
（３．発現レベルの比較）
開示される方法のいくつかの実施形態において、生物マーカーの発現レベルが評価され（そして必要に応じて第一正準変数および／または第二正準変数が得られ）る場合、そのレベル（または正準変数）は、参照標準における生物マーカーの発現レベル（またはそれから得られた正準変数）と比較され得る。「参照標準」によって、神経変性疾患のない被験体もしくはサンプル、異なる疾患段階の被験体もしくはサンプル、または治療剤のような特定の変化の不在下での被験体もしくはサンプルからの特定の生物マーカーの発現レベルが意味される。あるいは、参照標準は、既知量の生物マーカーを含み得る。このような既知量は、神経変性疾患のない被験体、異なる疾患段階の被験体、または治療剤のような特定の変化の不在下での被験体の平均レベルと相関し得る。参照標準はまた、本明細書中に記載されるような１つ以上の異なるサンプルまたは被験体由来の１つ以上の生物マーカーの発現レベルを含み得る。例えば、参照標準は、神経変性疾患に罹っていない被験体由来のサンプル、神経変性疾患の異なる進行段階にあるサンプル、または神経変性疾患に対する処置を受けていないサンプル中の、１種以上の生物マーカーの発現レベルの評価を含み得る。別の例示的な参照標準は、神経変性疾患に罹っていない複数の被験体、神経変性疾患の異なる進行段階にある複数の被験体、または神経変性疾患に対する処置を受けていない被験体から採取されたサンプル中の１種以上の生物マーカーの発現レベルの評価を含み得る。
【０１５１】
参照標準が治療剤の不在下でのサンプルまたは被験体における１種以上の生物マーカーの発現レベルを含む場合、コントロールサンプルまたはコントロール被験体は、治療剤を用いた処置前またはその後に試験される同じサンプルまたは被験体であり得るか、あるいは治療剤の不在下での異なるサンプルまたは被験体であり得る。あるいは、参照サンプルは、特定の神経変性疾患に罹っていない複数の被験体から計算された平均発現レベルであり得る。参照標準はまた、当該分野で既知のコントロールレベルまたはコントロール値を含み得る。開示される方法の１つの局面において、神経変性疾患に関して診断される被験体の参照標準に年齢で適合することが所望され得る。参照サンプルはまた、コントロールまたはコントロール被験体群からの生物マーカーの発現レベルについての多変量正準分析から得られる第一正準変数または第二正準変数であり得る。
【０１５２】
２つの異なるサンプル（例えば、神経変性疾患に関して診断される被験体由来のサンプルおよび参照標準）からの遺伝子産物の発現レベルを比較するための１つの技術において、各々のサンプルは、２Ｄゲル電気泳動に別々に供され得る。あるいは、各々のサンプルは、別々に標識され得、そして両方のサンプルは同じ２Ｄゲル電気泳動にロードされ得る。例えば、Ｕｎｌｕら、Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９７；１８：２０７１−２０７７を参照のこと。これは、遺伝子産物の発現レベルを評価および比較するための方法の少なくとも教示のために、本明細書中に参考として援用される。各々のサンプル中の同じ遺伝子産物または同じ遺伝子産物群は、２Ｄゲル電気泳動によって分離される遺伝産物のパターン内の相対位置によって同定され得る。次いで、第一のサンプル中の１つ以上の遺伝子産物の発現レベルが、第二のサンプル中の同じ遺伝子サンプルの発現レベルと比較され得、これによって２つのサンプル間で示差的に発現される遺伝子産物または遺伝子産物群（例えば、生物マーカー）の同定を可能にする。この比較は、被験体が神経変性疾患に罹っていることが疑われる前またはその後の被験体、被験体が処置レジメンを開始する前またはその後の被験体、およびその処置レジメンの過程の経過中の被験体について、なされ得る。
【０１５３】
別の技術において、１つ以上の遺伝子産物の発現レベルは、１つのサンプル中の、発現される全遺伝子産物のうちの割合としてであり得る。この評価される発現レベルは、予め存在する参照標準と比較され得、これによって参照標準に対してそのサンプル中に示差的に発現される遺伝子産物を同定し得る
遺伝子発現レベルが参照標準から変化する遺伝子産物は、例えば、２Ｄゲルからそれら遺伝子産物を抽出し、そして同定技術（例えば、質量分析（ＭＳ））を使用することによって同定され得、その同定技術としては、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化−飛行時間型−ＭＳ（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）のような技術が挙げられる。従って、１つの局面において、サンプル（例えば、白血球を含むサンプルまたはその溶解物）中の遺伝子産物の発現を検査することによって、神経変性疾患の種々の段階（例えば、その発症および進行）に関係する生物マーカーを同定する方法が本明細書中に開示される。
【０１５４】
２Ｄ電気泳動の代わりに他の方法が、サンプル中の遺伝子発現レベルを確認して参照標準に対してそのレベルを比較するために使用され得、そして本明細書中に開示される方法において使用され得る。これらの方法のいくつかは、表面増強レーザー脱離イオン化−飛行時間型（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ）のようなスペクトル技術を利用する。他の技術は、クロマトグラフィー技術（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、または高速タンパク質液体クロマトグラフィー（ＦＰＬＣ））に依存する。多次元液体クロマトグラフィー（ＬＣ）およびタンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ）は、複数のペプチドを分離および同定し得る。Ｌｉｎｋら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９９；１７：６７６−８２を参照のこと。複数のタンパク質を同定するためのクロマトグラフィー方法は、米国特許第６，９０８，７４０号に記載される。さらに他の方法において、チップ（例えば、タンパク質結合性の抗体、リガンド、またはアプタマーのアレイ）を使用して、参照標準中よりもサンプル中に示差的に発現される遺伝子産物を同定し得る。例えば、ＧｌｏｃｋｅｒおよびＡｎｇｅｎｅｄｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  Ａｎａｌｙｔ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，２００３；７９７：２２９−２４０を参照のこと。これらの参照は、遺伝子産物の発現レベルを評価および比較するための方法の少なくとも教示のために、本明細書中で参考として援用される。
【０１５５】
異なる遺伝子発現がサンプルと参照標準とで異なる１つ以上の遺伝子産物の発現を引き起こす場合、これらの１つ以上の遺伝子産物は、さらに、示差的に発現される遺伝子転写物を同定する方法（例えば、遺伝子チップ（ヌクレオチド発現アレイ）または示差発現技術（例えば、Ｃｌｏｎｅｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡまたはＧｅｎＨｕｎｔｅｒ，Ｎａｓｈｖｉｌｌｅ，ＴＮからの示差表示キット）を使用して同定され得る。これらの参照は、タンパク質発現レベルを評価および比較するための方法の少なくとも教示のために、本明細書中で参考として援用される。
【０１５６】
遺伝子産物の発現レベルを参照標準と比較する場合、参照標準と比較した場合の遺伝子産物の発現レベルの増加は、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）を診断するための生物マーカーとしての遺伝子産物を同定し得る。あるいは、参照標準と比較した場合の遺伝子産物の発現レベルはまた、神経変性疾患を診断するための生物マーカーとしての遺伝子産物を同定し得る。最後に、参照標準と比較した場合に増加した遺伝子産物および減少した遺伝子産物の組み合わせは、神経変性疾患を診断するための生物マーカーとしての遺伝子産物を同定し得る。
【０１５７】
開示される方法によって同定される生物マーカーは、種々の他の方法において使用され得る。例えば、生物マーカーを使用して特定の神経変性疾患を診断し得る。別の例において、生物マーカーを使用して疾患の進行をモニタリングし得る。なぜなら、いくつかの生物マーカーの発現レベルは、特定の神経変性疾患が進行するにつれてより明確になり得るからである。なお別の例において、生物マーカーを使用して、疾患の処置に対する被験体の応答をモニタリングし得る。これらの使用または他の使用は、本明細書中に開示される。
【０１５８】
（４．特異的方法）
神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病またはパーキンソン病）を診断する方法が開示され、この方法は、被験体からサンプル（例えば、血液または白血球）を収集する工程、サンプル中の遺伝子セットの発現をアッセイする工程、およびこの発現をコントロールと比較する工程、を包含する。
【０１５９】
また、神経変性疾患を診断する方法が開示され、この方法は、被験体から血液サンプルを収集する工程、そのサンプル中の遺伝子セットの発現をアッセイする工程、およびこの発現をコントロールと比較する工程、を包含する。
【０１６０】
また、神経変性疾患を診断する方法が開示され、この方法は、被験体から白血球サンプルを収集する工程、その白血球中の遺伝子セットの発現をアッセイする工程、およびこの発現をコントロールと比較する工程、を包含する。
【０１６１】
また被験体が臨床的痴呆試験を用いて診断されており、この臨床的痴呆試験がＮＩＮＣＤＳ試験またはＤＳＭ−ＩＶ試験である方法が、開示される。
【０１６２】
ミニ精神状態試験（Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ（ＭＭＳＥ））において、コントロールが２７を超えるスコアを有し、そしてＡＤ患者が２２未満のスコアを有する方法が、開示される。
【０１６３】
臨床痴呆評価尺度（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｒａｔｉｎｇ  ｓｃａｌｅ（ＣＤＲ））においてＡＤ被験体が１．２または１．５を超えるスコアを有する方法が開示される。
【０１６４】
生活痴呆評価尺度（Ｂｌｅｓｓｅｄ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（ＢＤＲＳ））を使用してコントロールが決定される方法が開示される。
【０１６５】
神経変性疾患を診断する方法が開示され、この方法は、被験体から末梢血サンプルを収集する工程、このサンプル内に含まれる赤血球を溶解する工程、残存する白血球を収集する工程、この白血球を溶解して溶解されたサンプルを生成する工程、この溶解されたサンプル中の全核酸を収集して核酸サンプルを形成する工程、この核酸サンプル中のＲＮＡを単離する工程、この核酸サンプル中のＲＮＡを抽出する工程、ポリＡ  ＲＮＡを収集する工程、およびＲＮＡ転写物のセットの存在を同定する工程、を包含する。
【０１６６】
また、神経変性疾患を診断する方法が開示され、この方法は、被験体からサンプル（例えば、白血球サンプル）を収集する工程、このサンプル内のｍＲＮＡを収集する工程、このｍＲＮＡを核酸のコレクションとハイブリダイズさせる工程を包含し、ここで、核酸のコレクションは、表４に見出される１つ以上の遺伝子、例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、およびプロテインキナーゼＣα（これらは細胞周期に関する）、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０ｒ（これらは炎症系に関連する）、ならびにα−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン（これらは細胞ストレスに関する）、ならびにこれらの任意の組み合わせを含む。
【０１６７】
神経変性疾患を診断する方法が開示され、この方法は、被験体から末梢血サンプルを収集する工程、このサンプル内に含まれる赤血球を溶解する工程、残存する白血球を収集する工程、この白血球を溶解して溶解サンプルを生成する工程、この溶解サンプル中の全核酸を収集して核酸サンプルを形成する工程、この核酸サンプル中のＲＮＡを単離する工程、その核酸サンプル中のＲＮＡを抽出する工程、ポリＡ  ＲＮＡを収集する工程、およびＲＮＡ転写物のセットの存在を同定する工程、を包含する。
【０１６８】
また、神経変性疾患を診断する方法が開示され、この方法は、被験体から末梢血サンプルを収集する工程、この末梢血サンプルから白血球を収集する工程（ここで、白血球を収集する工程は末梢血サンプル中の白血球を溶解して遠心分離する工程を包含する）、この白血球を溶解する工程、この溶解された白血球から全核酸サンプルを収集する工程（ここで、核酸の収集は磁気ビーズ上での核酸の吸着を含む）、その核酸サンプルから全ＲＮＡサンプルを収集する工程、ポリＡ  ｍＲＮＡサンプルを全ＲＮＡサンプルから収集する工程、全ｍＲＮＡを診断遺伝子のセットとハイブリダイズさせる工程（ここで、診断遺伝子のセットは表４由来の１つ以上を含み、例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、およびプロテインキナーゼＣα（これらは細胞周期に関する）、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０ｒ（これらは炎症系に関連する）、ならびにα−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン（これらは細胞ストレスに関する）、ならびにこれらの任意の組み合わせを含む）、どの診断遺伝子がｍＲＮＡサンプル中でｍＲＮＡにハイブリダイズされるかを分析する工程、を包含する。
【０１６９】
アレイのデータが使用される場合、これらのデータはハウスキーピング遺伝子（例えば、ＧａｐＤＨ、シクロフィリン、またはアクチンを規格化され得る。他の方法としては、鎖プルをスパイク付け（ｓｐｉｋｉｎｇ）する工程、アレイ全体にわたってシグナル強度の平均または合計に対して規格化する工程、を包含する。
【０１７０】
（ａ）治療剤についてスクリーニングする方法）
なお別の局面において、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病）の処置のための治療剤についてスクリーニングするための方法が開示される。開示される方法は、白血球または白血球集団とスクリーニングされるべき薬剤とを接触させて、神経変性疾患のための生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを検出する工程、を包含する。あるいは、白血球の代わりに、ニューロン細胞またはその集団が使用され得る。これらの方法において、生物マーカーの発現レベルの増加または減少は、神経変性疾患の処置のための治療剤を示し得る。
【０１７１】
１つの局面において、開示される方法は、核酸、抗体、ポリペプチドまたは低分子（任意の治療剤混合物またはその組み合わせを含む）である因子をスクリーニングするために利用され得る。
【０１７２】
白血球またはその溶解物を接触させる工程は、任意の技術によって達成され得る。例えば、細胞または溶解物は、因子またはその因子を含む溶液中にに浸漬され得るかまたは沈められ得る。別の例において、細胞または溶解物は、因子またはその因子を含む溶液によりコーティングされ得るかまたは噴霧され得る。さらに別の例において、細胞または細胞溶解物は、因子またはその因を含む溶液を含む媒体（例えば、培養培地）と接触され得る。さらなる例において、細胞または溶解物は、因子またはその因子を含む溶液を注入される。白血球またはその溶解物をスクリーニングされるべき因子と接触させる工程の特定の方法は、当業者にすぐに明らかであり、サンプルのサイズ、スクリーニングされるべき特定の因子、利便性、性能などのような要因に依存する。
【０１７３】
発現レベルまたは活性レベルが検出される生物マーカーは、神経変性疾患においてダウンレギュレートされる１つ以上の遺伝子またはタンパク質であり得る。この例において、因子が遺伝子生物マーカーまたはタンパク質生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを増加させる場合、この因子は特定の神経変性疾患の処置のための治療剤を示し得る。あるいは、生物マーカーは、神経変性疾患においてアップレギュレートされ得る１つ以上の遺伝子またはタンパク質であり得る。この例において、特定の神経変性疾患の処置のための治療剤は、その薬剤が遺伝子マーカーまたはタンパク質マーカーの発現レベルまたは活性レベルを減少させる場合に示され得る。なおさらには、神経変性疾患において、ある生物マーカーはアップレギュレートされ得、一方別の生物マーカーはダウンレギュレートされ得る。この例において、この因子は、神経変性疾患においてアップレギュレートされる遺伝子生物マーカーもしくはタンパク質生物マーカーの発現レベルもしくは活性レベルを減少させ、そして／または神経変性疾患においてダウンレギュレートされる遺伝子生物マーカーもしくはタンパク質生物マーカーの発現レベルもしくは活性レベルを増加させる場合、この因子は、特定の神経変性疾患の処置のための治療剤を示し得る。
【０１７４】
開示される方法のさらなる局面において、治療剤がニューロンにおける生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを変化させるかどうかがさらに決定され得る。１つの局面において、ニューロンはドーパミン作用性ニューロンであり得る。
【０１７５】
なお別の局面において、開示される方法は、治療剤が神経変性疾患の発症を予防するかまたはその進行を遅滞させるかどうかを、その疾患の動物モデルにおいて決定する工程をさらに包含し得る。例えば、神経変性疾患がパーキンソン病である場合、適切な動物モデルとしては、ＭＰＴＰモデル、６−ＯＨＤＡモデル、パラコート（ｐａｒａｑｕａｔ）モデル、またはロテノンモデルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１７６】
（ｂ）神経変性疾患の進行をモニタリングする方法）
さらに別の局面において、被験体における神経変性疾患（例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病）の進行をモニタリングする方法が本明細書中に開示される。開示される方法は、複数の時点における被験体から得られた白血球またはその溶解物を含むサンプル中の、神経変性疾患についての生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを比較する工程を、包含する。
【０１７７】
また、被験体における神経変性疾患（例えば、パーキンソン病）の処置に対する応答をモニタリングする方法が開示される。開示される方法は、被験体の処置の間の複数の時点における被験体から得られた白血球またはその溶解物を含むサンプル中の、神経変性疾患についての生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを比較する工程を、包含し得る。
【０１７８】
これらの方法において、被験体は上記に開示されるとおり（例えば、ヒト）である。被験体はまた、複数の時点のうちの１つ以上において、神経変性疾患について無症候性であり得るかまたは病状発現前（ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ）であり得る。別の例において、被験体は、複数の時点のうちの１つ以上において、神経変性疾患のための処置を受けていない。
【０１７９】
「処置」によって、その疾患を治癒、予防または緩和する目的のため、被験体が受け入れたかまたは受ける任意の医学的介入が意味される。処置としては、薬理学的治療（例えば、薬剤の投与）、栄養治療（例えば、ビタミン、ホルモン、栄養補助食品もしくはサプリメントの投与、または食事の変更）、生理学的治療、外科手術処置、非薬理学的治療、行動修正などが挙げられるが、これらに限定されない。必要に応じて、被験体は、１以上の複数の時点において神経変性疾患のための処置を受ける。必要に応じて、被験体は、１以上の複数の時点においてドーパミンアゴニスト（例えば、レボドパ）により処置される。別の特定の例において、被験体は、１以上の複数の時点において、神経保護因子により処置される。
【０１８０】
被験体を処置するために使用され得る神経保護因子の例としては、制限されるわけではないが、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、グルタミン酸作用性レセプターアンタゴニスト、キナーゼインヒビター、ＨＤＡＣインヒビター、抗炎症剤、ジバルプロックスナトリウムまたは任意のそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。他の神経保護の例としては、以下が挙げられ得るが、これらに制限されない：塩化オビドキシム、塩化プラリドキシム、ヨウ化プラリドキシム、メシル酸プラリドキシム；クエン酸アルベリン（Ａｌｖｅｒｉｎｃ  Ｃｉｔｒａｔｅ）；臭化メチルアニソトロピン、アトロピン；アトロピンオキシド塩酸塩；硫酸アトロピン；ベラドンナ；ベナプリジン（Ｂｅｎａｐｒｙｚｉｎｅ）塩酸塩；塩酸ベンゼチミド；臭化ベンジロニウム；ペリデン；ビペリデン塩酸塩；乳酸ビペリデン；臭化クリジニウム；塩酸シクロペントレート；デキセチミド；塩酸ジサイクロミン；塩酸ジヘキシベリン；フマル酸ドマゾリン（Ｄｏｍａｚｏｌｉｎｅ  Ｆｕｍａｒａｔｅ）；エラントリン；オイカイン；エチルベンザトロピン；塩酸オイカトロピン；グリコピロレート；臭化ヘテロニウム；臭化水素酸ホマトロピン；臭化メチルホマトロピン；ヒヨスチアミン；臭化水素酸ヒヨスチアミン；硫酸ヒヨスチアミン；ヨウ化イソプロパミド；臭化メペンゾラート；硝酸メチルアトロピン；メトキジン；塩化オキシブチニン；臭化パラペンゾラート；メチル硫酸ペンタピペリウム；フェンカルバミド；メチル硫酸ポルジン；プログルミド；臭化プロパンテリン；塩酸プロペンゾレート（Ｐｒｏｐｅｎｚｏｌａｔｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；臭化水素酸スコポラミン；メチル硫酸テマトロピウム（Ｔｅｍａｔｒｏｐｉｕｍ  Ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）；塩酸チキナミド；塩酸トフェナシン；トキジン；硫酸トリアムピジン；塩酸トリヘキシフェニジル；トロピカミド。更なる例としては以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルブトイン；アメルトリド（Ａｍｅｌｔｏｌｉｄｅ）；アトリド；ブラメート；カルバマゼピン；シンロミド；シテナミド；クロナゼパム；シヘプタミド；デジナミド（Ｄｅｚｉｎａｍｉｄｅ）；ジメタジオン；ジバルプロエックス（Ｄｉｖａｌｐｒｏｅｘ）ナトリウム；エンテロバーブ（Ｅｔｅｒｏｂａｒｂ）；エトスクシミド；エトトイン；塩酸フルラゼパム；フルジナミド；ホスフェニトイン（Ｆｏｓｐｈｅｎｙｔｏｉｎ）ナトリウム；ギャバペンチン；イレプシミド（Ｉｌｅｐｃｉｍｉｄｅ）；ラモトリジン；硫酸マグネシウム；メフェニトイン；メフォバルビタール；メテントイン（Ｍｅｔｈｅｔｏｉｎ）；メトスクシミド；塩酸ミラセミド；ナバゼニル；塩酸ナフィミドン；ニトラゼパム；フェナセミド；フェノバルビタール；フェノバルビタールナトリウム；フェンスクシミド；フェニトイン；フェニトインナトリウム；プリミドン；プロガビド；ラリトリン；塩酸レマセミド（Ｒｅｍａｃｅｍｉｄｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ロピジン；サベルゾール；スチリペントール；スルチアム；チオペンタールナトリウム；塩酸チレタミン；トピラマート；トリメタジオン；バルプロ酸ナトリウム；バルプロ酸；ビガバトリン；塩酸ゾニクルゾール��Ｚｏｎｉｃｌｅｚｏｌｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）塩、ゾニサミド。抗炎症剤のさらに他の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：アルクロフェナック；ジプロピオン酸アルクロメタゾン；アルゲストンアセｔノニド；αアミラーゼ；アムシナファル；アムシナフィド；アンフェナクナトリウム；塩酸アミプリロース；アナキンラ（Ａｎａｋｉｎｒａ）；アニロラク；アニトラザフェン；アパゾン；バルサラジド二ナトリウム；ベンダザック；ベノキサプロフェン；塩酸ベンジダミン；ブロメライン；ブロペラモール；ブデソニド；カルプロフェン；シクロプロフェン；シンタゾン（Ｃｉｎｔａｚｏｎｅ）；クリプロフェン；プロピオン酸クロベタソール；酪酸クロベタゾン；クロピラク；プロピオン酸クロチカゾン；酢酸コルメタゾン；コルトドキソン；デフラザコルト；デソニド；デスオキシメタゾン；ジプロピオン酸デキサメサゾン；ジクロフェナクカリウム；ジクロフェナクナトリウム；二酢酸ジフロラゾン；ジフルミドンナトリウム；ジフルニサル；ジフルプレドナート；ジフタロン；ジメチルスルホキシド；ドロシノニド；エンドリゾン（Ｅｎｄｒｙｓｏｎｅ）；エンリモマブ；エノリカムナトリウム；エピリゾール；エトドラク；エトフェナマート；フェルビナク；フェナモール；フェンブフェン；フェンクロフェナック；フェンクロナク（Ｆｅｎｃｌｏｒａｃ）；フェンドサール；フェンピパロン；フェンチアザク；フラザロン；フルアザコルト；フルフェナム酸；フルミゾール；酢酸フルニソリド；フルニキシン；フルニキシンメグルミン；フルオコルチンブチル；酢酸フルオロメトロン；フルカゾン；フルルビプロフェン；フルレトフェン；プロピオン酸フルチカゾン；フラプロフェン；フロブフェン；ハルシノニド；プロピオン酸ハロベタストール（Ｈａｌｏｂｅｔａｓｏｌ  Ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）；酢酸ハロプレドン；イブフェナック；イブプロフェン；イブプロフェンアルミニウム；イブプロフェンピコノール；イロニダプ（Ｉｌｏｎｉｄａｐ）；インドメタシン；インドメタシンナトリウム；インドプロフェン；インドキソール；イントラゾール；酢酸イソフルプレドン；イソキセパック；イソキシカム；ケトプロフェン；塩酸ロフェミゾール；ロルノキシカム；ロテプレノールエタボネート（Ｌｏｔｅｐｒｅｄｎｏｌ  Ｅｔａｂｏｎａｔｅ）；メクロフェナム酸ナトリウム；メクロフェナム酸；二酪酸メクロリゾン；メフェナム酸；メサラミン；メセクラゾン；メチルプレドニゾロンスルペンタネート（Ｍｅｔｈｙｌｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ  Ｓｕｌｅｐｔａｎａｔｅ）；モミフルメート（Ｍｏｍｉｆｌｕｍａｔｅ）；ナブメトン；ナプロキセン；プロキセンナトリウム；ナプロキソール；ニマゾン；オルサラジンナトリウム；オルゴテイン；オルパノキシン；オキサプロジン；オキシフェンブタゾン；塩酸パラニリン（Ｐａｒａｎｙｌｉｎｅ  Ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）；ペントサンポリスルホン酸ナトリウム；フェンブタゾン（Ｐｈｅｎｂｕｔａｚｏｎｅ）グリセリン酸ナトリウム；ピルフェニドン；ピロキシカム；桂皮酸ピロキシカム；ピロキシカムオルアミン（Ｐｉｒｏｘｉｃａｍ  Ｏｌａｍｉｎｅ）；ピルプロフェン；プレドナザート；プリフェロン；プロドール酸；プロカゾン；プロキサゾール；クエン酸プロキサゾール；リメキソロン；ロマザリット（Ｒｏｍａｚａｒｉｔ）；サルコレックス；サルナセジン（Ｓａｌｎａｃｅｄｉｎ）；サルサラート；塩化サンギナリウム（Ｓａｎｇｕｉｎａｒｉｕｍ  Ｃｈｌｏｒｉｄｅ）；セクラゾン；セルメタシン；スドキシカム；スリンダク；スプロフェン；タルメタシン；タルニフルマート；タロサラート；テブフェロン（Ｔｅｂｕｆｅｌｏｎｅ）；テニダプ；テニダプナトリウム；テノキシカム；テシカム；テシミド；テトリダミン；チオピナク；ピバリン酸チキソコルトール；トルメチン；トルメチンナトリウム；トリクロニド；トリフルミダート；ジドメタシン；またはゾメピラクナトリウム。
【０１８１】
他の例において、被験体は、非薬理学的処置（すなわち、主に薬物を含まない処置）により処置され得る。このような非薬理学的薬物の例としては、脳刺激（これは代表的にＰＤにおいて使用される）、心室シャントおよび網の転移（ＡＤにおいて使用されている）が挙げられるが、これらに限定されない。さらに他の例において、被験体は行動修正により処置され得る。さらにさらなる処置の例は、遺伝子治療、移植および幹細胞を含む。
【０１８２】
開示される方法において、ある時点において評価された生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルは、別の時点において評価されたレベルと同じであり得る。このことは、特定の神経変性疾患が変化しなかった（例えば、その疾患がより悪くもより良くもならなかった）ことを示す。別の例において、初期の時点における生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルは、後期の時点におけるレベルよりも大きくてもより小さくても良い。このことは、神経変性疾患が進行していることを示す。１つの生物マーカーの発現レベルが初期の時点から後期の時点へと増加すること、かつ疾患症状の（ａ）悪化または（ｂ）改善と相関することが以前に示されている場合、後期のサンプルと比較して初期のサンプルにおいて存在する生物マーカーの量がより低いことは、その被験体の状態がそれぞれ（ａ）悪化していること、または（ｂ）改善していることを示すとみなされ得る。一方では、１つの生物マーカーの発現レベルが初期の時点から後期の時点へと減少すること、かつ疾患症状の（ａ）悪化または（ｂ）改善と相関することが以前に示されている場合、後期のサンプルと比較して初期のサンプルにおいて存在する生物マーカーの量がより高いことは、その被験体の状態がそれぞれ（ａ）悪化していること、または（ｂ）改善していることの指標であり得る。別の例において、生物マーカーの組み合わせが使用され得、ここで、その組み合わせたいくつかの生物マーカーは、疾患の進行の間に初期の時点から後期の時点へと増加し、かつ他の生物マーカーが減少する。
【０１８３】
また、生物マーカーのレベルは、治療に応答して神経変性疾患の１つ以上の症状の悪化または改善と相関し得る。処置前または処置の間の初期の時点に採取されたサンプルと、処置の間の後期の時点または処置後に採取されたサンプルとの間で遺伝発現レベルが異なっている遺伝子産物は、神経変性疾患のための処置に対する被験体の応答についての生物マーカーを識別し得る。
【０１８４】
これらの方法において、種々のサンプル間での生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルの差異は、新家変性疾患のために施された処置に対する被験体の応答を示し得る。１つの生物マーカーの発現が神経変性疾患のための処置に対して（ａ）応答するかまたは（ｂ）応答しない被験体において、増加することが以前に示されている場合、初期サンプルと比較して後期サンプル中のより多量の生物マーカーは、その被験体がその処置に対してそれぞれ（ａ）応答するかまたは（ｂ）応答しないことの指標であり得る。あるいは、生物マーカーの発現が、神経変性疾患のための処置に対して（ａ）応答するまたは（ｂ）応答しない被験体において、減少することが以前に示されている場合、初期サンプルと比較して後期サンプル中の少量の生物マーカーは、その被験体がその処置に対してそれぞれ（ａ）応答するかまたは（ｂ）応答しないことの表示であるとみなされ得る。あるいは、生物マーカーの１つの組み合わせが、神経変性疾患のための処置に対して（ａ）応答するかまたは（ｂ）応答しない被験体において減少することが以前に示されており、かつ１つ以上の他の生物マーカーが増加することが以前に示されているいる場合、初期サンプルと比較した、後期サンプル由来のその生物マーカーの組み合わせにおける生物マーカーの量の変化は、その被験体がその処置に対してそれぞれ（ａ）応答しているかまたは（ｂ）応答していないことの表示であるとみなされ得る。
【０１８５】
（ｃ）被験体における神経変性疾患に対するリスクを確認する方法）
なおさらなる局面において、試験被験体において神経変性疾患（例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病）に対するリスクを確認するための方法が、本明細書中に開示される。開示される方法は、試験被験体から得られたサンプルから、神経変性疾患についての生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを決定する工程（ここで、このサンプルは白血球またはその溶解物を含む）；およびその試験被験体に対して決定されたその生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを、参照被験体についてのレベルと相関させる工程、を包含する。この方法はさらに、神経変性疾患に関して診断される参照被験体の集団からの生物マーカーのレベル、および／または神経変性疾患に罹っていない参照被験体の集団からの生物マーカーのレベルを決定する工程をさらに包含し得る。開示される方法において、神経変性疾患に罹っていない参照集団についてのレベルと、試験被験体についてのレベルとの間の相関は、試験被験体において特定の神経変性疾患に対するリスクが低いことを確認し得る。また、神経変性疾患に罹っている参照集団について決定されたレベルと、試験被験体についてのレベルとの間の相関は、その試験被験体においてその神経変性疾患に対するリスクが高いことを確認し得る。
【０１８６】
「相関」によって、データ間の任意の関係が意味される。例えば、生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルの統計学的分析を介して、相関（例えば、標準偏差、信頼度、など）が決定され得る。相関はまた、生物マーカーの発現レベルまたか活性レベルに基づき実験的に決定され得る。
【０１８７】
遺伝子産物データ（例えば、転写物および／またはプロテオームデータ）は、後の統計学的分析に供される。技術的な変動を考慮して、各々の被験体サンプルは２Ｄゲル上で３連で泳動（ｒｕｎ）され得る（例えば、５２被験体×３ゲル＝１５６ゲル）。次いで、平均化したスポット強度をさらなる分析に使用し得る。性別、基本的な医療診断、および医療指標は、プロテオームデータと共に含まれ得る。単純な単変量の統計学的方法（例えば、２サンプルｔテスト）を使用する初期の比較は、疾患の被験体とコントロール群との間で白血球における発現が異なっているタンパク質を同定することを進め得る。２Ｄゲル電気泳動およびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析からのプロテオームデータは、統計学的ツール（ｔテストおよびＡＮＯＶＡが挙げられる）を使用して最初に分析され得る。これらツールは、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ  Ｉｍａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓソフトウェアプログラム（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．；Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）に含まれる。これらのデータにおいて大きな依存性の場合、ステップダウン多変量再サンプリングアルゴリズム（ｓｔｅｐ−ｄｏｗｎ  ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  ｒｅｓａｍｐｌｉｎｇ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を使用して、Ｔｒｏｅｎｄｌｅ，「Ａ  ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｓｔｅｐ−ｕｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｏｕｔｃｏｍｅｓ」，Ｂｉｏｍｅｔｒｉｃｓ，１９９６；５２：８４６−８５９（これは、統計学的方法についての少なくとも教示のために本明細書中に参考として援用される）に開示されるように、試験の多様性に取り組み得る。
【０１８８】
いくつかの局面において、多変量の統計学的方法は、このような研究において考慮される全ての分類および関連においてより適切であり得、かつより強力であり得る。正準識別分析は、開示される方法について全ての遺伝子産物を一緒にプロファイリングすることを使用するために実施され得る。多変量の観察に基づく群の間のロジスティック識別が使用され得る。なぜなら、これは、通常の理論に基づく線形識別分析（ｎｏｒｍａｌ−ｔｈｅｏｒｙ−ｂａｓｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）を一般的に外部で行う（ｏｕｔ−ｐｅｒｆｏｒｍ）からである（ＭｃＬａｃｈｌａｎ，「Ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｎｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ｐａｔｔｅｒｎ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」，Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２を参照のこと。これは、統計学的方法についての少なくとも教示のために本明細書中に参考として援用される）。行動指標、線形モデルおよび一般化した線形モデル（）例えば、ＮｅｌｄｅｒおよびＭｃＣｕｌｌａｇｈ，「Ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  Ｌｉｎｅａｒ  Ｍｏｄｅｌｓ」，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，１９９９（これは、線形モデルの少なくとも教示のために本明細書中に参考として援用される）に開示されるもの）に関連したタンパク質を同定することは、神経変性疾患の白血球と神経変性疾患でない白血球とにおいて示差的に発現されるタンパク質をプロファイリングするために適合されて、発現の変化が疾患の重篤度に関係しているタンパク質を同定し得る。これらのモデルはまた、一部の臨床的要因の混乱した問題を考慮に入れ得る。欠けている値は、ＬｉｔｔｌｅおよびＬｉｔｔｌｅ（Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｅｒｎ  Ｍｉｓｓｉｎｇ  Ｄａｔａ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００２（これは、統計学的方法についての少なくとも教示のために本明細書中で参考として援用される））によって提案されているように取り扱われ得る。データ分析について未知の複雑性の場合、当業者は、適切な統計学的方法を求め得、さらにはこれらの特別な目的に役立つように統計学的方法を開発およびプログラミングし得る（ＥｆｒｏｎおよびＴｉｂｓｈｉｒａｎｉ，「Ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｂａｙｅｓ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｆａｌｓｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｒａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」，Ｇｅｎｅｔ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌ．２００２；２３：７０−８６（これは、統計学的方法のついての少なくとも教示のため、本明細書中で参考として援用される））。
【０１８９】
（ｄ）１つの神経変性疾患を別の疾患から区別する方法）
別の局面において、試験被験体において神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）を示差的に診断する方法が、本明細書中に開示される。開示される方法は、試験被験体から白血球またはその溶解物を含むサンプル中の１つ以上の選択された生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを評価する工程、および１つ以上の神経病理学的なコントロール疾患に罹っている神経病理学的コントロール被験体の１つ以上の集団における選択された生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを示す参照標準に対して、選択された生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルを比較する工程、を包含する。開示される方法において、選択された生物マーカーの発現レベルまたは活性レベルと参照標準との差異は、神経病理学的コントロール疾患と比較される場合の１つの神経変性疾患の示差的な診断を示し得る。
【０１９０】
「示差的に診断する」によって、被験体における１つの特定の疾患の存在を確認すること、および／または被験体における別の疾患の不在を確認することが意味される。この語句はまた、１つの特定の疾患を、別の疾患からまたはその疾患の不在から区別することを意味する。「示差的に診断する」はまた、１つの疾患の特定の段階を識別すること、特定の疾患を発症するリスクを確認すること、または特定の疾患の予後を確認することを意味するため、本明細書中で使用され得る。
【０１９１】
「神経病理学的コントロール被験体」によって、本明細書中に記載されるように、１つ以上の神経変性疾患に罹っている被験体（例えば、ヒト）または被験体群が意味される。例えば、神経病理学的コントロール被験体は、アルツハイマー病、前頭側頭性痴呆、軽度の認識障害、およびパーキンソン病、ならびにさらなる症状を含む障害（例えば、多系統萎縮症、皮質基底核神経節変性、パーキンソン病およびアルツハイマー病）に罹っている１人以上の被験体であり得る。神経病理学的コントロール被験体はまた、特定の疾患に罹っていない被験体またはその被験体群であり得る。なおさらには、神経病理学的コントロール被験体はまた、疾患を発症する特定のリスクまたは素因を有する被験体またはその被験体群であり得る。
【０１９２】
これらの方法において、試験被験体または参照集団は、年齢もしくは性別が適合され得るか、またはその両方であり得る。
【０１９３】
（ｅ）生物マーカーを同定する方法）
神経変性疾患（例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病）についての生物マーカーが、本明細書中に開示される方法において同定され得る。１つの局面において、特定の神経変性疾患についての生物マーカーを同定するための方法は、神経変性疾患に関して診断される少なくとも１人の被験体（例えば、ヒト）由来の白血球またはその溶解物を含むサンプル中に、１つ以上の産物の発現レベルを評価する工程、およびその遺伝子産物の発現レベルを参照標準と比較する工程、を包含する。この方法において、参照標準と比較した場合の遺伝子産物の発現レベルの増加または減少が、特定の神経変性疾患についての生物マーカーとしての遺伝子産物を同定し得る。
【０１９４】
いくつかの場合において、同じ生物マーカーが、疾患の進行を診断すること、モニタリングすること、および／または疾患のための治療法に対する被験体の応答をモニタリングすることのために使用され得る。生物マーカーの発現の変化（２つ以上の異なる使用の条件下で）は、特定の神経変性疾患の病理学の根底にある、同じ基礎的経路、生化学的経路および代謝経路を反映し得る。例えば、同じ生化学的経路は、１つの遺伝子産物が神経変性疾患に罹っていない健常な被験体において特定のレベルで発現され、かつ同じ遺伝子産物がその疾患に対する処置に応答する被験体において同様のレベルで発現されることを引き起こし得る。
【０１９５】
さらに、特定の生物マーカーの発現の変化は、疾患の病理学の根底にある生化学的／代謝的経路の変化に起因し得るので、これらの生物マーカーはまた、治療標的を表す。生物マーカーの発現変化は、神経変性疾患のうちの１つ以上の症状を引き起こす場合、この生物マーカーは治療標的になり得る。治療標的は、１つ以上の候補生物マーカーの発現もしくは活性を調節する化合物、および／または神経変性疾患の１つ以上の症状を改善する化合物（すなわち、候補治療薬）を開発するための方法において使用され得る。
【０１９６】
（５．アルツハイマー病の臨床的特徴）
１００年前、Ａｌｏｉｓ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒは、彼の名前を有する神経変性疾患の主要な行動および神経病理学的特徴を記載した。ＡＤは、記憶および認識の進行性障害によって臨床的／行動的に特徴付けられる。臨床的症状のこの緩徐な進行と関係する神経病理学的変化および神経生物学的変化としては、以下が挙げられる：アミロイドプラークの蓄積および神経原線維変化（ＮＦＴ）（Ｇｅａｒｉｎｇ  Ｍら，「Ｔｈｅ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｔｏ  Ｅｓｔａｂｌｉｓｈ  ａ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ  ｆｏｒ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＣＥＲＡＤ）．Ｐａｒｔ  Ｘ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．」Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９９５；４５（３パート１）：４６１−４６６）、グリオーシス（Ｕｎｇｅｒ  ＪＷ，Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓ．Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１９９８；４３：２４−２８）、正常に加齢した細胞と比較した、樹状突起の柔軟性の低減（ＢｕｅｌｌおよびＣｏｌｅｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９７９；２０６（４４２０）：８５４−８５６；Ｆｌｏｏｄ  ＤＧら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８５；３４５（２）：３６６−３６８；Ｆｌｏｏｄ  ＤＧら，Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９８７；４０２（２）：２０５−２１６）、およびニューロン密度の低減（Ｃｏｌｅｍａｎ  ＰＤら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，１９８７；８（６）：５２１−５４５；Ｔｅｒｒｙ  ＲＤら，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９８７；２１：５３０−５３９；Ｗｅｓｔ  ＭＪら，Ｌａｎｃｅｔ，１９９４；３４４：７６９−７７２）およびシナプス密度の低減（Ｓｃｈｅｆｆ  ＳＷら，  Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，１９９０；１１（１）：２９−３７）。
【０１９７】
（６．アルツハイマーにおける遺伝子発現）
アルツハイマー病の脳組織における発現変化の研究は、約３５％と見積もられるメッセージレベルの全体的な低減を示している（Ｄｏｅｂｌｅｒ  ＪＡら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９８７；４６（１）：２８−３９）、（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ＷＳら，Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ＆  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ，１９９０；４（２）：６９−７８）、（Ｈａｒｒｉｓｏｎ  ＰＪら，Ｐｓｙｃｈｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９１；２１：８５５−８６６）。ｍＲＮＡの全体的な低減についてのこの背景に対して、選択される研究は、広範な種々の遺伝子の発現の増加および減少を実証している。アルツハイマー病において影響を受ける一部の遺伝子クラスは、ニューロン特異的様式で発現される。これらとしては、特に、シナプスの構築および機能ならびにニューロン細胞骨格と関係する選択される遺伝子の発現の減少が挙げられる（Ｇｉｎｓｂｅｒｇ  ＳＤら，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，２０００；４８（１）：７７−８７；Ｙａｏ  Ｐら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８；１８（７）：２３９９−２４１１）。ＡＤにおいて発現が変化される他のクラスの遺伝子としては、以下が挙げられる：細胞周期に関係する遺伝子（Ａｒｅｎｄｔ  Ｔ，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，２０００；２１（６）：７８３−７９６；Ｈｕｓｓｅｍａｎ  ＪＷら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，２０００；２１（６）：８１５−８２８；Ｎａｇｙ  Ｚら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，２０００；２１（６）：７６１−７６９；Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｉら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ，１９９７；１７：３５８８−３５９８）および炎症応答／ストレス応答に関係する遺伝子（概説について、Ａｋｉｙａｍａ  Ｈら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，２０００；２１（３）：３８３−４２１を参照のこと）。これらの遺伝子クラスは、神経系の外側に位置する種々の細胞型において発現され、その細胞型としては、白血球（Ｗａｋｕｔａｎｉ  Ｙら，Ｄｅｍｅｎｔｉａ，１９９５；６（６）：３０１−３０５）、単球（Ｊｕｎｇ  ＳＳら，Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ，１９９９；２０（３）：２４９−２５７）、および上皮細胞（Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ａら，Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００２；１１７（２）：１７１−１８０）、ならびに他の細胞型が挙げられる。
【０１９８】
単一のニューロンまたは死後のヒトの脳由来のホモジネートによる複数の遺伝子産物（メッセージ）の発現プロフィールについての多変量分析を使用して、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）をコントロールサンプルから区別し得る（Ｃｈｅｅｔｈａｍ  ＪＥら，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９９７；７７（１），：４３−４８、Ｃｈｏｗ  Ｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９８；９５：９６２０−９６２５）。
【０１９９】
本明細書中に開示されるように、複数の遺伝子を使用して神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）を診断することに関係するデータは、サンプル（例えば、末梢血および血中の白血球）から得られる。例えば、遺伝子セットを変化させることが使用され、そして炎症応答および細胞周期に関係する遺伝子は断定的である。本発明者らのＡｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて（軽度の）ＡＤに罹る可能性があるとして診断された患者ならびに年齢および性別が適合するコントロールサンプルから血液が採られた。メッセージは、末梢血白血球から抽出されて、増幅された（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ  Ｊら，ＰＮＡＳ  Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９２；８９（７）：３０１０−３０１４）。次いで、選択されたメッセージの発現レベルが定量された。多変量の統計学的分析は、アルツハイマーの白血球とコントロールの白血球とを区別した。細胞周期および炎症応答に関係する遺伝子の発現レベルは、ＡＤ症例の血液サンプルを、痴呆になっていないコントロール症例由来のサンプルから区別することが見出された。これらの特異的遺伝子セットおよび遺伝子クラスはまた、ＡＤの脳においても示差的に発現される遺伝子のクラスであることを示された。この研究は、３つの異なるセットの症例に関して３回繰り返された。
【０２００】
本明細書中に開示されるように、ＡＤ症例由来の末梢血白血球における細胞周期および炎症応答に関係する遺伝子発現が影響され、ＡＤの脳においてこれらの遺伝子クラスの発現変化に匹敵するという知見であった。本明細書に提示されるデータに注目して到達される２つの主要な結論が存在する：（１）複数の遺伝子の発現プロフィールは、痴呆でないコントロール症例から軽度のＡＤ（平均でＣＤＲ１．２〜１．５）を区別するのに効果的であり、そして（２）コントロール末梢血サンプル由来からＡＤを区別するとして説明される遺伝子クラスは、ＡＤの脳において変化されることを示された発現の遺伝子クラスと同様である。このことは、全身性疾患または主要な全身性の結果を有する疾患としてのＡＤの概念と一致する。
【０２０１】
（Ｃ．組成物）
開示される組成物を調製するために使用されるべき成分および本明細書中に開示される方法において使用されるべき組成物自体が開示される。これらの材料および他の材料は本明細書中に開示され、そしてこれらの材料の組み合わせ、部分集合、相互作用、群などが開示される場合に、これらの成分の各々多様な個々の組み合わせおよび順列、ならびに集約的な組み合わせおよび順列についての具体的な参照が明確には開示されないかもしれないが、各々が具体的に企図されて本明細書中に開示されることが理解される。例えば、神経変性疾患を診断する特定の方法が開示され考察され、そして多くの分子に対してなされ得る多くの改変が考察される（神経変性疾患を診断する方法を含む）場合、特に反対に示されない限り、神経変性疾患を診断する方法および可能性ある改変についての、各々および全ての組み合わせおよび順列が具体敵に企図される。従って、分子Ａ、ＢおよびＣのクラスならびに分子Ｄ、ＥおよびＦのクラスが開示され、そして組み合わせ分子Ａ〜Ｄの例が開示される場合、各々が個々に記載されていなくても、各々は個々にかつ集約的に企図されて、組み合わせＡ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−ＥおよびＣ−Ｆが開示されるとみなされるを意味する。同様に、これらの任意の部分集合または組み合わせもまた開示される。従って、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅの部分集合が開示されるとみなされる。この概念は、本出願の全ての局面において適用され、開示される組成物を作製および使用する方法における工程が挙げられるが、これに限定されない。従って、実施され得る種々のさらなる工程が存在する場合、これらのさらなる工程の各々は、開示される方法の任意の特定の実施形態またはその実施形態の組み合わせを用いて実施され得ることが理解される。
【０２０２】
（１．配列類似性）
本明細書中に考察されるように、用語「相同性」および「同一性」の使用は、類似性として同じことを意味することが理解される。従って、例えば、語「相同性」の使用が２つの非天然配列の間で使用される場合、このことは、これら２つの配列の間の進化上の関連を必ずしも示しておらず、むしろそれらの核酸配列間の類似性または関係に着目していることが理解される。進化上関係する２つの分子間の相同性を決定するための多くの方法は、それらが進化上関係するか関係しないかに関わらず配列類似性を意味する目的のため、任意の２つ以上の核酸またはタンパク質が日常的に利用される。
【０２０３】
一般的に、本明細書中に開示される遺伝子およびタンパク質についての任意の公知の改変体および誘導体または生じ得るものを定義するための１つの方法は、特定の公知配列に対する相同性に関してその変異体または誘導体を定義することによる。本明細書中に開示される特定の配列のこの同定はまた、本明細書中の他所において考察される。一般的に、本明細書中に開示される遺伝子およびタンパク質の変異体は、代表的に、少なくとも約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％の相同性を定められた配列またはその天然配列に対して有する。当業者は、２つのタンパク質または核酸（例えば、遺伝子）の相同性を決定する方法を容易に理解する。例えば、相同性は、その相同性が最も高いレベルであるように２つの配列を整列させた後に計算され得る。
【０２０４】
相同性を計算する別の方法は、開示されたアルゴリズムにより実施され得る。比較のための配列の最適な整列は、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ，１９８１；２：４８２）のアルゴリズム、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９７０；４８：４４３）の相同性整列アルゴリズム、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８８；８５：２４４４）の相同性検索方法、これらのアルゴリズムのコンピューター処理される実行（ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）、または目視検査（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）によって、実行され得る。
【０２０５】
同じ型の相同性は、例えば、Ｚｕｋｅｒ  Ｍ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９；２４４：４８−５２；Ｊａｅｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９８９；８６：７７０６−７７１０；Ｊａｅｇｅｒら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８９；１８３：２８１−３０６（これらは、核酸の整列に関係する少なくとも材料のために、本明細書中で参考として援用される）に開示されるアルゴリズムによって核酸について得られ得る。任意の方法は代表的に使用され得ること、および特定の例においてこれらの種々の方法の結果が異なり得ることが理解されるが、しかしこれらの方法のうちの少なくとも１つを用いて同一性が見出される場合に、それら配列は定められた同一性を有するといわれ、そして本明細書中に開示されることを、当業者は理解する。
【０２０６】
例えば、本明細書中で使用される場合、別の配列に対して特定の相同性パーセントを有するとして記載される配列は、上記の計算方法のうちの任意の１つによって計算される場合に記載される相同性を有する配列をいう。例えば、第一の配列がＺｕｋｅｒの計算方法を使用して計算されて８０％の相同性を有する場合、たとえこの第一の配列が任意の他の計算方法によって計算される場合に第二の配列に対して８０％の相同性を有さない場合であっても、この第一の配列は、本明細書中で定義されるように、第二の配列に対して８０％の相同性を有する。別の例として、第一の配列がＺｕｋｅｒの計算方法とＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの計算方法との両方を使用して計算されて第二の配列に対して８０％の相同性を有する場合、たとえこの第一の配列がＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの計算方法によって計算される場合でもＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの計算方法によって計算される場合でもＪａｅｇｅｒの計算方法によって計算される場合でも任意の他の計算方法によって計算される場合でも、第二の配列に対して８０％の相同性を有さない場合であっても、この第一の配列は、本明細書中に定義されるように、第二の配列に対して８０％の相同性を有する。なお別の例として、第一の配列が各々の計算方法を使用して計算されて第二の配列に対して８０％の相同性を有する場合、この第一の配列は、本明細書中に定義されるように、その第二の配列に対して８０％の相同性を有する（しかし、実際には、別々の計算方法は、しばしば、別々に計算された相同性パーセントを生じる）。
【０２０７】
（２．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション）
用語「ハイブリダイゼーション」とは、代表的に、少なくとも２つの核酸（例えば、プライマーまたはプローブおよび遺伝子）の間の配列駆動性の相互作用を意味する。配列駆動性の相互作用は、２つのヌクレオチド間または２つのヌクレオチドアナログ間または２つのヌクレオチド誘導体間にヌクレオチド特異的に起こる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧまたはＴと相互作用するＡは、配列駆動性の相互作用である。代表的に、配列駆動性の相互作用は、ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｌｉｃｋ面またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面において起こる。２つのヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、当業者に公知の多くの条件およびパラメータにより影響される。例えば、塩濃度、ｐＨおよび反応温度は全て、２つの核酸分子がハイブリダイズするかどうかに影響する。
【０２０８】
２つの核酸の間の選択的ハイブリダイゼーションについてのパラメータは、当業者に周知である。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として定義され得る。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーション工程と洗浄工程とのいずれかまたはその両方の温度および塩濃度の両方によって制御され得る。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するためのハイブリダイゼーション条件は、イオン強度の高い溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）中でのＴｍ（分子のうちの半分がそれらのハイブリダイゼーションのパートナーから解離する融解温度）より約１２℃〜２５℃低い温度でのハイブリダイゼーション、その後の、洗浄温度がＴｍよりも約５℃〜約２０℃低いように選択される温度および塩濃度の組み合わせでの洗浄工程、を包含し得る。温度条件および塩条件は、予備実験において実験的に容易に決定され、この実験において、フィルター上に固定された参照ＤＮＡのサンプルが目的の標識された核酸配列にハイブリダイズされ、次いで異なるストリンジェンシーの条件下で洗浄される。ハイブリダイゼーション温度は、代表的に、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションおよびＲＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーションに対してより高い。これらの条件は、ストリンジェンシーを達成するために上記のように、または当該分野で公知のように、使用され得る（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９；Ｋｕｎｋｅｌら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８７；１５４：３６７（これらは、核酸のハイブリダイゼーションに少なくとも関係する材料について、本明細書中で参考として援用される）。ＤＮＡ：ＤＮＡハイブリダイゼーションのための好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中での約６８℃（水溶液中）においてであり得、その後の６８℃での洗浄であり得る。所望の場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される相補性の程度が減少されるに従って低減され得、そしてさらに、変異性が調べられる任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依存する。同様に、所望の場合、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望される相同性が増加されるに従って増加され得、そしてさらに、高い相同性が所望される任意の領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依存する。全ては当該分野で公知であるとおりである。
【０２０９】
選択的ハイブリダイゼーションを定義するための別の方法は、他の核酸に結合した核酸のうちの１つの量（割合）を調べることによる。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、限定した核酸のうちの少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％が限定されない核酸に結合される場合である。代表的に、非限定プライマーは、例えば、１０倍過剰、または１００倍過剰、または１０００倍過剰で存在する。この型のアッセイは、限定プライマーと非限定プライマーとの両方が、例えば、それらのｋｄの１／１０倍、または１／１００倍、または１／１０００倍であるか、核酸分子のうちの一方のみが１／１０倍、または１／１００倍、または１／１０００倍であるか、または核酸分子の一方または両方がそれらのｋｄを超える。
【０２１０】
選択的ハイブリダイゼーションを定義する別の方法は、所望される酵素操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で酵素操作されるプライマーの割合を調べることによる。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマーのうちの少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％が、酵素操作を促進する条件下で酵素操作される場合であって、例えば、この酵素操作がＤＮＡ伸長である場合、選択的ハイブリダイゼーション条件は、プライマー分子のうちの少なくとも約６０％、約６５％、約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、約１００％が伸長される場合である。好ましい条件としてはまた、酵素がこの操作を実施するのに適切であるように、製造業者により提案される条件または当該分野で示される条件が挙げられる。
【０２１１】
相同性とちょうど同様に、２つの核酸分子間のハイブリダイゼーションレベルを決定するために、本明細書中に開示される種々の方法が存在することが理解される。これらの方法および条件は、２つの核酸分子間の異なる割合のハイブリダイゼーションを提供し得るが、他に示されない限り、任意の方法のパラメーターに合致することが十分であることが理解される。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要とされる場合であって、そしてこれらの方法の任意の１つにおいて必要とされるパラメータ内でハイブリダイゼーションが起こる限り、これは本明細書中に開示されるとみなされる。
【０２１２】
組成物または方法が、集合的または単独のいずれかでハイブリダイゼーションを決定するためのこれらの判断基準のうちの任意の１つに合致する場合に、これが本明細書中に開示される組成物または方法であることを当業者は理解することが、理解される。
【０２１３】
（３．核酸）
核酸ベースである、本明細書中に開示される種々の分子があり、例えば核酸が挙げられ、この核酸は例えば、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）の発症または進行と関係するような本明細書中に開示される任意の遺伝子、ならびに本明細書中に開示される任意のほかのタンパク質、ならびに種々の機能性核酸が挙げられる。これらの開示される核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、またはヌクレオチド置換物から構成される。これらの分子および他の分子の非限定的な例は、本明細書中に考察される。例えば、ベクターが細胞中で発現される場合、発現されるｍＲＮＡは代表的に、Ａ、Ｃ、ＧおよびＵから構成される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外来性送達を介して細胞または細胞環境中に導入される場合、このアンチセンス分子は、細胞内環境においてこのアンチセンス分子の分解を低減するヌクレオチドアナログから構成されることが有利であることが、理解される。
【０２１４】
（ａ）ヌクレオチドおよび関連分子）
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸エステル部分を含む分子である。ヌクレオチドは、ヌクレオシド間の結合を形成するそれらのリン酸エステル部を介して、互いと連結され得る。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸エステル部分は５価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定的な例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【０２１５】
ヌクレオチドアナログは、塩基部分、糖部分またはリン酸エステル部分のいずれかに対していくつかの型の改変を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する改変は、当該分野で周知であり、そして例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒロドキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２−アミノアデニンならびに筒部分またはリン酸エステル部分における改変が挙げられる。
【０２１６】
ヌクレオチド置換物は、ヌクレオチドと同様な機能特性を有するが、リン酸エステル部分を含まない分子（例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ））である。ヌクレオチド置換物は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｌｉｃｋ様式またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ様式で核酸を認識するが、リン酸エステル部分以外の部分を介して互いに連結される分子である。ヌクレオチド置換物は、適切な標的核酸と相互作用する場合、二重鎖らせん型構造をなし得る。
【０２１７】
ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに別の型の分子を結合して（結合体）、例えば細胞の取り込みを増強することもまた可能である。結合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログに対して化学的に結合され得る。このような結合体としては、例えばコレステロール部分のような脂質分子が挙げられるが、これらに限定されない（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）。
【０２１８】
Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換物のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換物のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ面は、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換物のＣ２位、Ｎ１位およびＣ６位、ならびにピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチドアナログまたはヌクレオチド置換物のＣ２位、Ｎ３位およびＣ４位を含む。
【０２１９】
Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用は、ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログのＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面上で起こる相互作用であり、この相互作用は、二重鎖ＤＮＡの主溝において露出される。このＨｏｏｇｓｔｅｅｎ面は、プリンヌクレオチドのＮ７位、およびＣ６位における反応基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
【０２２０】
（（１）プライマーおよびプローブ）
プライマーおよびプローブを含む組成物が開示され、これらは、本明細書中に開示される遺伝子と相互作用し得る。特定の実施形態において、プライマーは、ＤＮＡ増幅反応を支持するために使用される。代表的に、プライマーは、配列特異的様式で伸長され得る。配列特異的様式でのプライマーの伸長としては、そのプライマーがハイブリダイズされるかまたはそれ以外に会合される配列および／または核酸分子の組成が、そのプライマーの伸長によって生成される産物の組成または配列を指向するかまたはそれに影響する、任意の方法が挙げられる。従って、配列特異的様式でのプライマーの伸長としては、ＰＣＲ、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡ重合、ＲＮＡ転写、または逆転写が挙げられるが、これらに限定されない。配列特異的様式でプライマーを増幅する技術または条件が好ましい。特定の実施形態において、プライマーはＤＮＡ増幅反応（例えば、ＰＣＲまたは直接の配列決定）のために使用される。特定の実施形態において、プライマーはまた、非酵素技術を使用して伸長され得ることが理解され、この場合、例えば、プライマーを伸長するために使用されるヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログは、それらが化学的に反応して配列特異的様式でプライマーを伸長するように改変される。代表的に、開示されるプライマーは、その核酸またはその核酸のうちの領域とハイブリダイズするか、またはそれらプライマーは、その核酸の相補体またはその核酸のうちの領域の相補体とハイブリダイズする。
【０２２１】
プライマーまたはプローブのサイズは、表４に列挙される転写物（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３βおよびプロテインキナーゼＣαのような細胞周期に関係する転写物、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０ｒのような炎症系に関係する転写物、ならびにα−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２およびトランスフェリンのような細胞ストレスに関係する転写物、ならびに表５および表６に列挙されるタンパク質の転写物）との相互作用のためである。特定の実施形態において、プライマーまたはプローブは、そのプライマーの所望される酵素操作（例えば、ＤＮＡ増幅またはプローブもしくはプライマーの単純なハイブリダイゼーション）を支持する任意のサイズであり得る。表４に列挙された遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３βおよびプロテインキナーゼＣα（これらは細胞周期に関係する）、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０ｒ（これらは炎症系に関係する）、ならびにα−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２およびトランスフェリン（これらは細胞ストレスに関係する）、ならびに表５および表６に列挙されるタンパク質の遺伝子）に対する代表的なプライマーまたはプローブは、少なくとも６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長、１２ヌクレオチド長、１３ヌクレオチド長、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長、２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、３７ヌクレオチド長、３８ヌクレオチド長、３９ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長、４２ヌクレオチド長、４３ヌクレオチド長、４４ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、４６ヌクレオチド長、４７ヌクレオチド長、４８ヌクレオチド長、４９ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、５１ヌクレオチド長、５２ヌクレオチド長、５３ヌクレオチド長、５４ヌクレオチド長、５５ヌクレオチド長、５６ヌクレオチド長、５７ヌクレオチド長、５８ヌクレオチド長、５９ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、６１ヌクレオチド長、６２ヌクレオチド長、６３ヌクレオチド長、６４ヌクレオチド長、６５ヌクレオチド長、６６ヌクレオチド長、６７ヌクレオチド長、６８ヌクレオチド長、６９ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、７１ヌクレオチド長、７２ヌクレオチド長、７３��クレオチド長、７４ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、７６ヌクレオチド長、７７ヌクレオチド長、７８ヌクレオチド長、７９ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、８１ヌクレオチド長、８２ヌクレオチド長、８３ヌクレオチド長、８４ヌクレオチド長、８５ヌクレオチド長、８６ヌクレオチド長、８７ヌクレオチド長、８８ヌクレオチド長、８９ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、９１ヌクレオチド長、９２ヌクレオチド長、９３ヌクレオチド長、９４ヌクレオチド長、９５ヌクレオチド長、９６ヌクレオチド長、９７ヌクレオチド長、９８ヌクレオチド長、９９ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２５ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１７５ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、２２５ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長、２７５ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、３２５ヌクレオチド長、３５０ヌクレオチド長、３７５ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、４２５ヌクレオチド長、４５０ヌクレオチド長、４７５ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、５５０ヌクレオチド長、６００ヌクレオチド長、６５０ヌクレオチド長、７００ヌクレオチド長、７５０ヌクレオチド長、８００ヌクレオチド長、８５０ヌクレオチド長、９００ヌクレオチド長、９５０ヌクレオチド長、１０００ヌクレオチド長、１２５０ヌクレオチド長、１５００ヌクレオチド長、１７５０ヌクレオチド長、２０００ヌクレオチド長、２２５０ヌクレオチド長、２５００ヌクレオチド長、２７５０ヌクレオチド長、３０００ヌクレオチド長、３５００ヌクレオチド長、または４０００ヌクレオチド長である。
【０２２２】
他の実施形態において、表４に列挙される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３βおよびプロテインキナーゼＣα（これらは、細胞周期に関係する）、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０ｒ（これらは、炎症系に関係する）、ならびにα−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２およびトランスフェリン（これらは細胞ストレスに関係する））に対するプライマーまたはプローブ、ならびに表５および表６に列挙されるタンパク質の遺伝子は、６ヌクレオチド長以下、７ヌクレオチド長以下、８ヌクレオチド長以下、９ヌクレオチド長以下、１０ヌクレオチド長以下、１１ヌクレオチド長以下、１２ヌクレオチド長以下、１３ヌクレオチド長以下、１４ヌクレオチド長以下、１５ヌクレオチド長以下、１６ヌクレオチド長以下、１７ヌクレオチド長以下、１８ヌクレオチド長以下、１９ヌクレオチド長以下、２０ヌクレオチド長以下、２１ヌクレオチド長以下、２２ヌクレオチド長以下、２３ヌクレオチド長以下、２４ヌクレオチド長以下、２５ヌクレオチド長以下、２６ヌクレオチド長以下、２７ヌクレオチド長以下、２８ヌクレオチド長以下、２９ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、３１ヌクレオチド長以下、３２ヌクレオチド長以下、３３ヌクレオチド長以下、３４ヌクレオチド長以下、３５ヌクレオチド長以下、３６ヌクレオチド長以下、３７ヌクレオチド長以下、３８ヌクレオチド長以下、３９ヌクレオチド長以下、４０ヌクレオチド長以下、４１ヌクレオチド長以下、４２ヌクレオチド長以下、４３ヌクレオチド長以下、４４ヌクレオチド長以下、４５ヌクレオチド長以下、４６ヌクレオチド長以下、４７ヌクレオチド長以下、４８ヌクレオチド長以下、４９ヌクレオチド長以下、５０ヌクレオチド長以下、５１ヌクレオチド長以下、５２ヌクレオチド長以下、５３ヌクレオチド長以下、５４ヌクレオチド長以下、５５ヌクレオチド長以下、５６ヌクレオチド長以下、５７ヌクレオチド長以下、５８ヌクレオチド長以下、５９ヌクレオチド長以下、６０ヌクレオチド長以下、６１ヌクレオチド長以下、６２ヌクレオチド長以下、６３ヌクレオチド長以下、６４ヌクレオチド長以下、６５ヌクレオチド長以下、６６ヌクレオチド長以下、６７ヌクレオチド長以下、６８ヌクレオチド長以下、６９ヌクレオチド長以下、７０ヌクレオチド長以下、７１ヌクレオチド長以下、７２ヌクレオチド長以下、７３ヌクレオチド長以下、７４ヌクレオチド長以下、７５ヌクレオチド長以下、７６ヌクレオチド長以下、７７ヌクレオチド長以下、７８ヌクレオチド長以下、７９ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、８１ヌクレオチド長以下、８２ヌクレオチド長以下、８３ヌクレオチド長以下、８４ヌクレオチド長以下、８５ヌクレオチド長以下、８６ヌクレオチド長以下、８７ヌクレオチド長以下、８８ヌクレオチド長以下、８９ヌクレオチド長以下、９０ヌクレオチド長以下、９１ヌクレオチド長以下、９２ヌクレオチド長以下、９３ヌクレオチド長以下、９４ヌクレオチド長以下、９５ヌ���レオチド長以下、９６ヌクレオチド長以下、９７ヌクレオチド長以下、９８ヌクレオチド長以下、９９ヌクレオチド長以下、１００ヌクレオチド長以下、１２５ヌクレオチド長以下、１５０ヌクレオチド長以下、１７５ヌクレオチド長以下、２００ヌクレオチド長以下、２２５ヌクレオチド長以下、２５０ヌクレオチド長以下、２７５ヌクレオチド長以下、３００ヌクレオチド長以下、３２５ヌクレオチド長以下、３５０ヌクレオチド長以下、３７５ヌクレオチド長以下、４００ヌクレオチド長以下、４２５ヌクレオチド長以下、４５０ヌクレオチド長以下、４７５ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、５５０ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、６５０ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、７５０ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、８５０ヌクレオチド長以下、９００ヌクレオチド長以下、９５０ヌクレオチド長以下、１０００ヌクレオチド長以下、１２５０ヌクレオチド長以下、１５００ヌクレオチド長以下、１７５０ヌクレオチド長以下、２０００ヌクレオチド長以下、２２５０ヌクレオチド長以下、２５００ヌクレオチド長以下、２７５０ヌクレオチド長以下、３０００ヌクレオチド長以下、３５００ヌクレオチド長以下、または４０００ヌクレオチド長以下であり得る。
【０２２３】
特定の実施形態において、プライマーおよびプローブは、外側のプライマーであるように設計され、それらのプライマーが表４に見出される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３βおよびプロテインキナーゼＣα（これらは、細胞周期に関係する）、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０ｒ（これらは、炎症系に関係する）、ならびにα−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２およびトランスフェリン（これらは細胞ストレスに関係する））ならびに表５および表６に列挙されるタンパク質の遺伝子と相互作用する最も近接する点が、表４に列挙される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）ならびに表５および表６に列挙されるタンパク質の遺伝子の最も外側を規定するヌクレオチドから、０ヌクレオチド以内、１ヌクレオチド以内、２ヌクレオチド以内、３ヌクレオチド以内、４ヌクレオチド以内、５ヌクレオチド以内、６ヌクレオチド以内、７ヌクレオチド以内、８ヌクレオチド以内、９ヌクレオチド以内、１０ヌクレオチド以内、１１ヌクレオチド以内、１２ヌクレオチド以内、１３ヌクレオチド以内、１４ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、１６ヌクレオチド以内、１７ヌクレオチド以内、１８ヌクレオチド以内、１９ヌクレオチド以内、２０ヌクレオチド以内、２１ヌクレオチド以内、２２ヌクレオチド以内、２３ヌクレオチド以内、２４ヌクレオチド以内、２５ヌクレオチド以内、２６ヌクレオチド以内、２７ヌクレオチド以内、２８ヌクレオチド以内、２９ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、３１ヌクレオチド以内、３２ヌクレオチド以内、３３ヌクレオチド以内、３４ヌクレオチド以内、３５ヌクレオチド以内、３６ヌクレオチド以内、３７ヌクレオチド以内、３８ヌクレオチド以内、３９ヌクレオチド以内、４０ヌクレオチド以内、４１ヌクレオチド以内、４２ヌクレオチド以内、４３ヌクレオチド以内、４４ヌクレオチド以内、４５ヌクレオチド以内、４６ヌクレオチド以内、４７ヌクレオチド以内、４８ヌクレオチド以内、４９ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、５１ヌクレオチド以内、５２ヌクレオチド以内、５３ヌクレオチド以内、５４ヌクレオチド以内、５５ヌクレオチド以内、５６ヌクレオチド以内、５７ヌクレオチド以内、５８ヌクレオチド以内、５９ヌクレオチド以内、６０ヌクレオチド以内、６１ヌクレオチド以内、６２ヌクレオチド以内、６３ヌクレオチド以内、６４ヌクレオチド以内、６５ヌクレオチド以内、６６ヌクレオチド以内、６７ヌクレオチド以内、６８ヌクレオチド以内、６９ヌクレオチド以内、７０ヌクレオチド以内、７１ヌクレオチド以内、７２ヌクレオチド以内、７��ヌクレオチド以内、７４ヌクレオチド以内、７５ヌクレオチド以内、７６ヌクレオチド以内、７７ヌクレオチド以内、７８ヌクレオチド以内、７９ヌクレオチド以内、８０ヌクレオチド以内、８１ヌクレオチド以内、８２ヌクレオチド以内、８３ヌクレオチド以内、８４ヌクレオチド以内、８５ヌクレオチド以内、８６ヌクレオチド以内、８７ヌクレオチド以内、８８ヌクレオチド以内、８９ヌクレオチド以内、９０ヌクレオチド以内、９１ヌクレオチド以内、９２ヌクレオチド以内、９３ヌクレオチド以内、９４ヌクレオチド以内、９５ヌクレオチド以内、９６ヌクレオチド以内、９７ヌクレオチド以内、９８ヌクレオチド以内、９９ヌクレオチド以内、１００ヌクレオチド以内、１２５ヌクレオチド以内、１５０ヌクレオチド以内、１７５ヌクレオチド以内、または２００ヌクレオチド以内に存在する。
【０２２４】
特定の実施形態において、プライマーおよびプローブは、それらが外側のプライマーであるように設計され、それらのプライマーが表４に列挙される遺伝子（（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）と相互作用する最も近接する点が、表４に列挙された遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）ならびに表５および表６に列挙されたタンパク質の遺伝子の最も外側を規定するヌクレオチドから、少なくとも０ヌクレオチド、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチド、５ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、１５ヌクレオチド、１６ヌクレオチド、１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチド、２７ヌクレオチド、２８ヌクレオチド、２９ヌクレオチド、３０ヌクレオチド、３１ヌクレオチド、３２ヌクレオチド、３３ヌクレオチド、３４ヌクレオチド、３５ヌクレオチド、３６ヌクレオチド、３７ヌクレオチド、３８ヌクレオチド、３９ヌクレオチド、４０ヌクレオチド、４１ヌクレオチド、４２ヌクレオチド、４３ヌクレオチド、４４ヌクレオチド、４５ヌクレオチド、４６ヌクレオチド、４７ヌクレオチド、４８ヌクレオチド、４９ヌクレオチド、５０ヌクレオチド、５１ヌクレオチド、５２ヌクレオチド、５３ヌクレオチド、５４ヌクレオチド、５５ヌクレオチド、５６ヌクレオチド、５７ヌクレオチド、５８ヌクレオチド、５９ヌクレオチド、６０ヌクレオチド、６１ヌクレオチド、６２ヌクレオチド、６３ヌクレオチド、６４ヌクレオチド、６５ヌクレオチド、６６ヌクレオチド、６７ヌクレオチド、６８ヌクレオチド、６９ヌクレオチド、７０ヌクレオチド、７１ヌクレオチド、７２ヌクレオチド、７３ヌクレオチド、７４ヌクレオチド、７５ヌクレオチド、７６ヌクレオチド、７７ヌクレオチド、７８ヌクレオチド、７９ヌクレオチド、８０ヌクレオチド、８１ヌクレオチド、８２ヌクレオチド、８３ヌクレオチド、８４ヌクレオチド、８５ヌクレオチド、８６ヌクレオチド、８７ヌクレオチド、８８ヌクレオチド、８９ヌクレオチド、９０ヌクレオチド、９１ヌクレオチド、９２ヌクレオチド、９３ヌクレオチド、９４ヌクレオチド、９５ヌクレオチド、９６ヌクレオチド、９７��クレオチド、９８ヌクレオチド、９９ヌクレオチド、１００ヌクレオチド、１２５ヌクレオチド、１５０ヌクレオチド、１７５ヌクレオチド、または２００ヌクレオチド離れている。
【０２２５】
表４に列挙される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）ならびに表５および表６に列挙されるタンパク質の遺伝子に対するプライマーは、代表的に、それらの遺伝子の特定の領域を含む増幅ＤＮＡ産物を生成するために使用される。一般的に、その産物のサイズは、そのサイズが１ヌクレオチド以内、２ヌクレオチド以内または３ヌクレオチド以内まで正確に決定され得るようなサイズである。
【０２２６】
特定の実施形態において、この産物は、少なくとも２０ヌクレオチド長、２１ヌクレオチド長、２２ヌクレオチド長、２３ヌクレオチド長、２４ヌクレオチド長、２５ヌクレオチド長、２６ヌクレオチド長、２７ヌクレオチド長、２８ヌクレオチド長、２９ヌクレオチド長、３０ヌクレオチド長、３１ヌクレオチド長、３２ヌクレオチド長、３３ヌクレオチド長、３４ヌクレオチド長、３５ヌクレオチド長、３６ヌクレオチド長、３７ヌクレオチド長、３８ヌクレオチド長、３９ヌクレオチド長、４０ヌクレオチド長、４１ヌクレオチド長、４２ヌクレオチド長、４３ヌクレオチド長、４４ヌクレオチド長、４５ヌクレオチド長、４６ヌクレオチド長、４７ヌクレオチド長、４８ヌクレオチド長、４９ヌクレオチド長、５０ヌクレオチド長、５１ヌクレオチド長、５２ヌクレオチド長、５３ヌクレオチド長、５４ヌクレオチド長、５５ヌクレオチド長、５６ヌクレオチド長、５７ヌクレオチド長、５８ヌクレオチド長、５９ヌクレオチド長、６０ヌクレオチド長、６１ヌクレオチド長、６２ヌクレオチド長、６３ヌクレオチド長、６４ヌクレオチド長、６５ヌクレオチド長、６６ヌクレオチド長、６７ヌクレオチド長、６８ヌクレオチド長、６９ヌクレオチド長、７０ヌクレオチド長、７１ヌクレオチド長、７２ヌクレオチド長、７３ヌクレオチド長、７４ヌクレオチド長、７５ヌクレオチド長、７６ヌクレオチド長、７７ヌクレオチド長、７８ヌクレオチド長、７９ヌクレオチド長、８０ヌクレオチド長、８１ヌクレオチド長、８２ヌクレオチド長、８３ヌクレオチド長、８４ヌクレオチド長、８５ヌクレオチド長、８６ヌクレオチド長、８７ヌクレオチド長、８８ヌクレオチド長、８９ヌクレオチド長、９０ヌクレオチド長、９１ヌクレオチド長、９２ヌクレオチド長、９３ヌクレオチド長、９４ヌクレオチド長、９５ヌクレオチド長、９６ヌクレオチド長、９７ヌクレオチド長、９８ヌクレオチド長、９９ヌクレオチド長、１００ヌクレオチド長、１２５ヌクレオチド長、１５０ヌクレオチド長、１７５ヌクレオチド長、２００ヌクレオチド長、２２５ヌクレオチド長、２５０ヌクレオチド長、２７５ヌクレオチド長、３００ヌクレオチド長、３２５ヌクレオチド長、３５０ヌクレオチド長、３７５ヌクレオチド長、４００ヌクレオチド長、４２５ヌクレオチド長、４５０ヌクレオチド長、４７５ヌクレオチド長、５００ヌクレオチド長、５５０ヌクレオチド長、６００ヌクレオチド長、６５０ヌクレオチド長、７００ヌクレオチド長、７５０ヌクレオチド長、８００ヌクレオチド長、８５０ヌクレオチド長、９００ヌクレオチド長、９５０ヌクレオチド長、１０００ヌクレオチド長、１２５０ヌクレオチド長、１５００ヌクレオチド長、１７５０ヌクレオチド長、２０００ヌクレオチド長、２２５０ヌクレオチド長、２５００ヌクレオチド長、２７５０ヌクレオチド長、３０００ヌクレオチド長、３５００ヌクレオチド長、または４０００ヌクレオチド長である。
【０２２７】
他の実施形態において、この産物は、２０ヌクレオチド長以下、２１ヌクレオチド長以下、２２ヌクレオチド長以下、２３ヌクレオチド長以下、２４ヌクレオチド長以下、２５ヌクレオチド長以下、２６ヌクレオチド長以下、２７ヌクレオチド長以下、２８ヌクレオチド長以下、２９ヌクレオチド長以下、３０ヌクレオチド長以下、３１ヌクレオチド長以下、３２ヌクレオチド長以下、３３ヌクレオチド長以下、３４ヌクレオチド長以下、３５ヌクレオチド長以下、３６ヌクレオチド長以下、３７ヌクレオチド長以下、３８ヌクレオチド長以下、３９ヌクレオチド長以下、４０ヌクレオチド長以下、４１ヌクレオチド長以下、４２ヌクレオチド長以下、４３ヌクレオチド長以下、４４ヌクレオチド長以下、４５ヌクレオチド長以下、４６ヌクレオチド長以下、４７ヌクレオチド長以下、４８ヌクレオチド長以下、４９ヌクレオチド長以下、５０ヌクレオチド長以下、５１ヌクレオチド長以下、５２ヌクレオチド長以下、５３ヌクレオチド長以下、５４ヌクレオチド長以下、５５ヌクレオチド長以下、５６ヌクレオチド長以下、５７ヌクレオチド長以下、５８ヌクレオチド長以下、５９ヌクレオチド長以下、６０ヌクレオチド長以下、６１ヌクレオチド長以下、６２ヌクレオチド長以下、６３ヌクレオチド長以下、６４ヌクレオチド長以下、６５ヌクレオチド長以下、６６ヌクレオチド長以下、６７ヌクレオチド長以下、６８ヌクレオチド長以下、６９ヌクレオチド長以下、７０ヌクレオチド長以下、７１ヌクレオチド長以下、７２ヌクレオチド長以下、７３ヌクレオチド長以下、７４ヌクレオチド長以下、７５ヌクレオチド長以下、７６ヌクレオチド長以下、７７ヌクレオチド長以下、７８ヌクレオチド長以下、７９ヌクレオチド長以下、８０ヌクレオチド長以下、８１ヌクレオチド長以下、８２ヌクレオチド長以下、８３ヌクレオチド長以下、８４ヌクレオチド長以下、８５ヌクレオチド長以下、８６ヌクレオチド長以下、８７ヌクレオチド長以下、８８ヌクレオチド長以下、８９ヌクレオチド長以下、９０ヌクレオチド長以下、９１ヌクレオチド長以下、９２ヌクレオチド長以下、９３ヌクレオチド長以下、９４ヌクレオチド長以下、９５ヌクレオチド長以下、９６ヌクレオチド長以下、９７ヌクレオチド長以下、９８ヌクレオチド長以下、９９ヌクレオチド長以下、１００ヌクレオチド長以下、１２５ヌクレオチド長以下、１５０ヌクレオチド長以下、１７５ヌクレオチド長以下、２００ヌクレオチド長以下、２２５ヌクレオチド長以下、２５０ヌクレオチド長以下、２７５ヌクレオチド長以下、３００ヌクレオチド長以下、３２５ヌクレオチド長以下、３５０ヌクレオチド長以下、３７５ヌクレオチド長以下、４００ヌクレオチド長以下、４２５ヌクレオチド長以下、４５０ヌクレオチド長以下、４７５ヌクレオチド長以下、５００ヌクレオチド長以下、５５０ヌクレオチド長以下、６００ヌクレオチド長以下、６５０ヌクレオチド長以下、７００ヌクレオチド長以下、７５０ヌクレオチド長以下、８００ヌクレオチド長以下、８５０ヌクレオチド長以下、９００ヌクレオチド長以下、９５０ヌクレオチド長以下、１０００ヌクレオチド長以下、１２５０ヌクレオチド長以下、１５００ヌクレオチド長以下、１７５０ヌクレオチド長以下、２０００ヌクレオチド長以下、２２５０ヌクレオチド長以下、２５００ヌクレオチド長以下、２７５０ヌクレオチド長以下、３０００ヌクレオチド長以下、３５００ヌクレオチド長以下、または４０００ヌクレオチド長以下である。
【０２２８】
（（２）機能性核酸）
機能性核酸は、特定の機能（例えば、標的分子に結合すること、または特定の反応を触媒すること）を有する核酸である。機能性核酸分子は、以下のカテゴリーに分けられ得、これらのカテゴリーは限定していることを意味されない。例えば、機能性核酸分子としては、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重鎖形成分子、および外部誘導配列が挙げられる。これらの機能性核酸分子は、標的分子に有される特定の活性の影響因子、阻害因子（インヒビター）、調節因子、および刺激因子として作用し得か、またはこれらの機能性核酸分子は、任意の他の分子とは無関係にデノボでの活性を有し得る。
【０２２９】
機能性核酸分子は、任意の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ポリペプチド、または炭水化物鎖）と相互作用し得る。従って、機能性核酸分子は、表４に列挙される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）ならびに表５および表６に列挙されるタンパク質の遺伝子のｍＲＮＡと相互作用し得るか、または表４に列挙される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）ならびに表５および表６に列挙されるタンパク質の遺伝子のゲノムＤＮＡと相互作用し得るか、またはそれら機能性核酸分子は、表４に列挙される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）のポリペプチド産物、ならびに表５および表６に列挙されるタンパク質と相互作用し得る。しばしば機能性核酸は、標的分子と機能性核酸分子との間の配列相同性に基づいて他の核酸と相互作用するように設計され得る。他の状況において、機能性核酸分子と標的分子との間の特異的認識はその機能性核酸分子とその標的分子との間の配列相同性には基づかなく、むしろ特異的認識を起こさせる三次構造の形成に基づく。
【０２３０】
アンチセンス分子は、標準的な塩基対合または標準的でない塩基対合のいずれかを介して標的核酸分子と相互作用し得る。アンチセンス分子と標的分子との相互作用は、例えば、ＲＮＡｓｅＨ媒介性のＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド消化を介して標的分子の破壊を促進するように設計される。あるいは、アンチセンス分子は、標的分子上で正常に起こるプロセッシング機能（例えば、転写または複製）を妨害するように設計される。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づき設計され得る。標的分子のうちの最もアクセス可能な領域を見出すことによってアンチセンスの有効性を最適化するための多くの方法が存在する。例示的な方法は、インビトロでの選択実験およびＤＭＳおよびＤＥＰＣを使用するＤＮＡ改変研究である。アンチセンス分子は、１０−６以下、１０−８以下、１０−１０以下または１０−１２以下の解離定数（ｋｄ）で標的分子に結合することが好ましい。アンチセンス分子の設計および使用を助ける方法および技術の代表例は、以下の非限定的な米国特許のリストに見出され得る：第５，１３５，９１７号、第５，２９４，５３３号、第５，６２７，１５８号、第５，６４１，７５４号、第５，６９１，３１７号、第５，７８０，６０７号、第５，７８６，１３８号、第５，８４９，９０３号、第５，８５６，１０３号、第５，９１９，７７２号、第５，９５５，５９０号、第５，９９０，０８８号、第５，９９４，３２０号、第５，９９８，６０２号、第６，００５，０９５号、第６，００７，９９５号、第６，０１３，５２２号、第６，０１７，８９８号、第６，０１８，０４２号、第６，０２５，１９８号、第６，０３３，９１０号、第６，０４０，２９６号、第６，０４６，００４号、第６，０４６，３１９号、および第６，０５７，４３７号。
【０２３１】
アプタマーは、好ましくは特定の様式で、標的分子と相互作用する分子である。代表的に、アプタマーは、規定の二次構造および三次構造（例えば、ステムループまたはＧカルテット）へとフォールディングされる、長さ１５〜５０塩基の範囲である小さな核酸である。アプタマーは、低分子（例えば、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号）、およびテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号）、ならびに高分子（例えば、逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号）に結合し得る。アプタマーは、１０−１２Ｍより低い標的分子からのｋｄで非常に強固に結合し得る。アプタマーは、１０−６Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満または１０−１２Ｍ未満のｋｄで標的分子に結合することが好ましい。例えば、標的分子と、その分子上でただ１つの位置のみ異なる別の分子との間の結合親和性が１０００倍より大きな差異を有するアプタマーが単離された（米国特許第５，５４３，２９３号）。アプタマーは、バックグラウンドの結合性分子とのｋｄよりも１／１０以下、１／１００以下、１／１０００以下、１／１０，０００以下または１／１００，０００以下の標的分子とのｋｄを有することが好ましい。例えばポリペプチドに対する比較を行う場合に、バックグラウンド分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。例えば、表４に列挙された遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）または表５および表６に列挙されたタンパク質の遺伝子の特異的アプタマーを決定する場合、バックグラウンドタンパク質は、血清アルブミンであり得る。種々の標的分子に結合するアプタマーを作製および使用する方法の代表例は、以下の米国特許の非限定的な列挙において見出され得る：第５，４７６，７６６号、第５，５０３，９７８号、第５，６３１，１４６号、第５，７３１，４２４号、第５，７８０，２２８号、第５，７９２，６１３号、第５，７９５，７２１号、第５，８４６，７１３号、第５，８５８，６６０号、第５，８６１，２５４号、第５，８６４，０２６号、第５，８６９，６４１号、第５，９５８，６９１号、第６，００１，９８８号、第６，０１１，０２０号、第６，０１３，４４３号、第６，０２０，１３０号、第６，０２８，１８６号、第６，０３０，７７６号、第６，０５１，６９８号。
【０２３２】
リボザイムは、分子内または分子間のいずれかで化学反応を触媒し得る。従って、リボザイムは、触媒性核酸分子である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。天然の系において見い出されるリボザイムに基づいて、ヌクレアーゼ反応または核酸ポリメラーゼ型反応を触媒する、多くの異なる型のリボザイムが存在し、例えば、ハンマーヘッドリボザイム（例えば、以下の米国特許第５，３３４，７１１号、同第５，４３６，３３０号、同第５，６１６，４６６号、同第５，６３３，１３３号、同第５，６４６，０２０号、同第５，６５２，０９４号、同第５，７１２，３８４号、同第５，７７０，７１５号、同第５，８５６，４６３号、同第５，８６１，２８８号、同第５，８９１，６８３号、同第５，８９１，６８４号、同第５，９８５，６２１号、同第５，９８９，９０８号、同第５，９９８，１９３号、同第５，９９８，２０３号、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ９８５８０５８、ＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ９８５８０５７、ならびにＬｕｄｗｉｇおよびＳｐｒｏａｔによるＷＯ９７１８３１２であるが、これらに限定されない）、ヘパリンリボザイム（例えば、以下の米国特許第５，６３１，１１５号、同第５，６４６，０３１号、同第５，６８３，９０２号、同第５，７１２，３８４号、同第５，８５６，１８８号、同第５，８６６，７０１号、同第５，８６９，３３９号、および同第６，０２２，９６２号であるが、これらに限定されない）、およびテトラヒメナリボザイム（例えば、以下の米国特許第５，５９５，８７３号および同第５，６５２，１０７であるが、これらに限定されない））である。また、天然では見い出されないがデノボで特異的反応を触媒するように操作された、多くのリボザイムが存在する。（例えば、以下の米国特許第５，５８０，９６７号、同第５，６８８，６７０号、同第５，８０７，７１８号、同第５，９１０，４０８号であるが、これらに限定されない）。好ましいリボザイムはＲＮＡ基質またはＤＮＡ基質を切断し、より好ましくはＲＮＡ基質を切断する。リボザイムは代表的に、標的基質を認識してそれに結合し、続いて切断することを介して核酸を切断する。この認識は、しばしば、標準的な塩基対相互作用または標準でない塩基対相互作用にほとんど基づく。この特性は、リボザイムを、核酸の標的特異的切断のための特に良好な候補にさせる。なぜなら、標的基質の認識は、その表記基質の配列に基づくからである。種々の異なる反応を触媒するようにリボザイムを作製および使用する方法の代表例は、以下の非限定的な米国特許のリストに見い出され得る：第５，６４６，０４２号、同第５，６９３，５３５号、同第５，７３１，２９５号、同第５，８１１，３００号、同第５，８３７，８５５号、同第５，８６９，２５３号、同第５，８７７，０２１号、同第５，８７７，０２２号、同第５，９７２，６９９号、同第５，９７２，７０４号、同第５，９８９，９０６号、および同第６，０１７，７５６号。
【０２３３】
三重鎖形成機能性核酸分子は、二重鎖核酸または一本鎖核酸のいずれかと相互作用し得る分子である。三重鎖分子が標的領域と相互作用する場合、三重鎖と称される構造が形成され、ここで、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対合およびＨｏｏｇｓｔｅｅｎの塩基対合の両方に依存する複合体を形成する３本のＤＮＡが存在する。三重鎖分子は高い親和性および特異性で標的領域に結合し得るので、この三重鎖分子が好ましい。三重鎖形成分子は、１０−６未満、１０−８未満、１０−１０未満または１０−１２未満のｋｄで標的分子に結合することが好ましい。種々の異なる標的分子に結合する三重鎖形成分子を作製および使用する方法の代表例は、以下の非限定的な米国特許第５，１７６，９９６号、同第５，６４５，９８５号、同第５，６５０，３１６号、同第５，６８３，８７４号、同第５，６９３，７７３号、同第５，８３４，１８５号、同第５，８６９，２４６号、同第５，８７４，５６６号、および同第５，９６２，４２６号に見い出され得る。
【０２３４】
外部ガイド配列（ＥＧＳ）は、標的核酸分子に結合して複合体を形成する分子であり、そしてこの複合体はＲＮＡｓｅＰ（これは、標的分子を切断する）によって認識される。ＥＧＳは、ＲＮＡ分子を選択して特異的に標的化するように設計され得る。ＲＮａｓｅＰは、細胞内で転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をプロセッシングするのを助ける。細菌性ＲＮＡｓｅＰは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然のｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを使用することによって、実質上あらゆるＲＮＡ配列を切断するように強化（ｒｅｃｒｕｉｔ）され得る。（ＹａｌｅによるＷＯ９２／０３５６６、ならびにＦｏｒｓｔｅｒおよびＡｌｔｍａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９０；２３８：４０７−４０９）。
【０２３５】
同様に、真核生物性ＥＧＳ／ＲＮＡｓｅ  Ｐに指向されるＲＮＡ切断は、真核細胞内で所望の標的を切断するために利用され得る。（Ｙｕａｎら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９２；８９：８００６−８０１０；ＹａｌｅによるＷＯ９３／２２４３４；ＹａｌｅによるＷＯ９５／２４４８９；ＹｕａｎおよびＡｌｔｍａｎ，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９５；１４：１５９−１６８、ならびにＣａｒｒａｒａら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９５；９２：２６２７−２６３１）。種々の標的分子の切断を促進するためにＥＧＳを作製および使用するための方法の代表例は、以下の非限定的な米国特許第５，１６８，０５３号、同第５，６２４，８２４号、同第５，６８３，８７３号、同第５，７２８，５２１号、同第５，８６９，２４８号、および同第５，８７７，１６２号のリストに開示される。
【０２３６】
（４．ペプチド）
また、アミノ酸ベースである組成物（例えば、タンパク質、ペプチドおよびポリペプチド）が本明細書中に開示される。「タンパク質」、「ペプチド」または「ポリペプチド」によって、アミノ酸ベースのポリマーが意味され、これには、本明細書中に記載され、そして当業者によく理解されているような変異体、誘導体および改変体が挙げられる。アミノ酸配列の改変は、代表的に、３つのクラス：置換変異、挿入変異および欠失変異のうちの１つ以上に帰結する。挿入としては、アミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合、ならびに１アミノ酸残基または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。挿入物は通常、アミノ末端融合またはカルボキシル末端融合よりも小さなの挿入物であり、例えば、１残基〜４残基の次数である。欠失は、タンパク質配列からの１以上のアミノ酸残基の除去により特徴付けられる。代表的に、約２残基〜約６残基以下がそのタンパク質分子内の任意の１つの部位から欠失される。アミノ酸置換は代表的に１残基のものであるが、一度に複数の異なる位置において起こってもよい；挿入は通常、およそ１アミノ酸残基〜１０アミノ酸残基の次数である；そして欠失は、およそ１残基〜３０残基の次数の範囲である。置換、欠失、挿入またはこれらの任意の組み合わせは、本明細書中に開示されるタンパク質において存在し得る。用語「タンパク質」、「ペプチド」および「ポリペプチド」は、相互に交換可能に使用される。
【０２３７】
本明細書中に開示される方法において使用される例示的なタンパク質としては、以下が挙げられる：ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミンデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ合成酵素β鎖、アネキシンＩ、１４−３−３タンパク質ε、プロヒビチン、ホスホグリセリン酸ムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジムスターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ１Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、アクチン作用性タンパク質１（ＡＩＰ１）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＩ（ＭＡＰＫＩ）、アクチンまたはそのフラグメント、グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、形質転換タンパク質ＲｈｏＡ、酸性ロイシンリッチ核ホスホプロテイン３２ファミリーメンバーＢ（ＡＮＰ３２ＢまたはＡＰＲＩＬ）、ペルオキシレドキシンＩＩ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、Ａβペプチド、Ｆｅ６５、Ｔｉｐ６０、ＳＥＲＣＡ、ＰＳ１／２、ネクチン−１ａ、および老人斑の非アミロイドβ成分（ＮＡＣＰ／ａ−シヌクレイン）。
【０２３８】
（５．変異体）
神経変性疾患のため本明細書中で使用される遺伝子（例えば、表４に列挙される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン））の、多くの変異体および対立遺伝子が存在することが理解される。これらの変異体および対立遺伝子は、本明細書中に開示されるように、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病およびアルツハイマー病）を検出するために使用され得る。本明細書中に考察されるように、表４に列挙される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）からの遺伝子産物の多くの変異体が存在し、これらは公知でありそして本明細書中で企図される。代表的に、これらの変異体は、関連する核酸または遺伝子において変化したそれら変異体自身を表し、従って、例えば、対立遺伝子または系統の相違によって生じる、開示される診断遺伝子または予後の遺伝子（例えば、表４に列挙される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン））の変異体が、開示される。タンパク質または核酸の変異体および誘導体および対立遺伝子は、当業者に十分理解されており、そしてアミノ酸配列の改変を含み得る。本方法または本組成物における改変は、例えば特定の対立遺伝子を処理することによって達成され得ることが理解される。
【０２３９】
（６．配列）
例えば、表４に列挙される遺伝子（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）ならびに表５および表６に列挙される遺伝子（例えば、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−合成酵素β鎖、アネキシンＩ、１４−３−３タンパク質ε、プロヒビチン、ホスホグリセリン酸ムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジムスターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ１Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、アクチン作用性タンパク質１（ＡＩＰ１）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＩ（ＭＡＰＫＩ）、アクチンまたはそのフラグメント、グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、形質転換タンパク質ＲｈｏＡ、酸性ロイシンリッチ核ホスホプロテイン３２ファミリーメンバーＢ（ＡＮＰ３２ＢまたはＡＰＲＩＬ）、ペルオキシレドキシンＩＩ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、Ａβペプチド、Ｆｅ６５、Ｔｉｐ６０、ＳＥＲＣＡ、ＰＳ１／２、ネクチン−１ａ、および老人斑の非アミロイドβ成分（ＮＡＣＰ／ａ−シヌクレイン）およびＧｅｎＢａｎｋにおいて開示されている本明細書中で開示される任意の他のタンパク質）に関係する種々の配列が存在する。そしてこれらの配列および他の配列は、その全体において、そして本明細書中に含まれるここの配列に対して、参考として本明細書中で援用される。
【０２４０】
種々の配列は、本明細書中に提供され、そしてこれらのものおよび他のものは、ＧｅｎＢａｎｋ（ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄ．ｇｏｖ）に見い出され得る。当業者は、配列の食い違いおよび差異を解決する方法、ならびに特定の配列に関係する組成物および方法を他の関係する配列に適応させる方法を理解する。プライマーおよび／またはプローブは、本明細書中に開示され、そして当業者に公知の情報を与えられて、任意の配列に対して設計され得る。
【０２４１】
（７．代替の実施形態）
転写後のプロセスおよび翻訳後のプロセスは、本明細書中に提供される任意の変異体に関して起こり得ることが理解される。このような転写後プロセスまたは翻訳後プロセス（例えば、転写後の沈静化（しかしこれに限定されない））を測定し得る技術が開示される。
【０２４２】
（８．生物マーカーを確認する方法）
神経変性疾患に対する生物マーカーは、種々の方法で確認され得る。例えば、生物マーカーの発現は、神経変性疾患に関して診断される１人以上の被験体、およびその神経変性疾患に罹っていない１人以上の被験体において、検査され得る。これら２つの群の間で発現が変化する生物マーカーは、有効な生物マーカーであり得る。被験体の２つの群がより巨大になると、確認はより信頼性のあるものとなる。生物マーカーの発現レベルはまた、神経変性疾患に対するモデル系において評価され得る。例えば、神経変性疾患についての動物モデルの白血球含有サンプルにおいて、発現レベルが試験され得る。生物マーカー（またはそのホモログ）の発現は、神経変性疾患の動物モデルとコントロール群とにおいて評価され得る。モデル動物とコントロール動物との間で発現が変化する生物マーカーまたはそのホモログは、有効な生物マーカーであり得る。
【０２４３】
（９．固体支持体）
固体支持体（安定形態および可動形態が挙げられる）が本明細書中に開示され、ここで、少なくとも１つのアドレスが本明細書中に開示される生物マーカーまたはリガンドである。また、固体支持体が開示され、ここで、少なくとも１つのアドレスは、本明細書中に開示される任意の核酸配列もしくはペプチド配列に記載される配列、配列の一部、または配列の変異体、あるいはそれら配列に対するリガンドである。少なくとも１つのアドレスが、本明細書中に開示される任意の核酸配列に記載される配列もしくはその配列の一部、またはそれにハイブリダイズする核酸である、チップが開示される。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書中に開示される任意のペプチド配列に記載される配列もしくはその配列の一部、またはその配列に対するリガンドである、チップが開示される。
【０２４４】
また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書中に開示される任意の核酸配列中に記載される配列もしくはその配列の一部についての変異体、またはその核酸変異体にハイブリダイズする核酸である、チップが開示される。また、少なくとも１つのアドレスが、本明細書中に開示される任意のペプチド配列に記載される配列またはその配列の一部についての変異体、またはその変異体ペプチドに結合するリガンドである、チップが開示される。
【０２４５】
固体支持体としては、スライド、チップ、マイクロアレイ、およびナノアレイのような安定な支持体が挙げられ、生物マーカーまたは本明細書中に開示される生物マーカーに対する抗体もしくは非抗体リガンドのうちの任意のものを備える。固体支持体としてはまた、ビーズのような可動性支持体が挙げられ、生物マーカーまたは本明細書中に開示される生物マーカーに対する抗体もしくは非抗体リガンドのうちの任意のものを備える。
【０２４６】
（１０．コンピューター読み取り可能な媒体）
開示される核酸およびタンパク質は、ヌクレオチドまたはアミノ酸からなる配列として示され得ることが理解される。これらの配列を表す種々の方法が存在し、例えばヌクレオチドグアニンはＧまたはｇにより表され得る。動揺に、アミノ酸バリンはＶａｌまたはＶにより表され得る。当業者は、存在する種々の方法のうちの任意のもので任意の核酸配列またはタンパク質配列（それらのいずれかが本明細書中に開示されるとみなされる）を示しそして表すための方法を理解する。コンピューター読み取り可能な媒体（例えば、市販のフロッピー（登録商標）ディスク、テープ、チップ、ハードドライブ、コンパクトディスク、およびビデオディスク、または他のコンピューター読み取り可能な媒体）上でのこれら配列の提示が、本明細書中で具体的に企図される。また、開示される配列の二進コード表記が開示される。当業者は、どのコンピューター読み取り可能な媒体が有用であるかを理解する。従って、核酸配列またはタンパク質配列は、コンピューター読み取り可能な媒体に記録、記憶、または保存される。
【０２４７】
本明細書中に記載される配列に関する配列および情報を含むコンピューター読み取り可能な媒体が、開示される。
【０２４８】
（１１．キット）
本明細書中に開示される方法を実施するのに使用され得る試薬に対して描かれるキットが本明細書中に開示される。これらのキットは、本明細書中に考察される任意の試薬または試薬の任意の組み合わせ、または開示される方法の実施に必要とされるかもしくは有益である任意の試薬または試薬の任意の組み合わせを備え得る。例えば、キットは、方法の特定の実施形態において考察される増幅反応を実施するためのプライマー、ならびに目的とされるプライマーの使用に必要とされる緩衝剤および酵素を備え得る。他の例において、キットは、本明細書中に開示される１つ以上の生物マーカーならびに目的とされる生物マーカーまたはリガンドを使用するために必要とされる緩衝剤、標識，酵素、二次抗体または三次抗体などを備え得る。さらなる例において、神経変性疾患（例えば、パーキンソン病またはアルツハイマー病）について被験体を診断するためのキットが開示され、このキットは表４に記載される１つ以上のオリゴヌクレオチドを備える。
【０２４９】
（１２．診断アッセイ）
また、神経変性疾患のついての診断アッセイが開示される。開示されるアッセイは、白血球またはその溶解物を含むサンプルと、神経変性疾患についての生物マーカーに対する１つ以上の抗体またはそのフラグメントとを接触させる工程を包含する。開示される生物マーカーに対する抗体は、当該分野で公知でありそして本明細書中に開示されるように本発明者の方法に従って作製され得る。
【０２５０】
（Ｄ．組成物を作製する方法）
本明細書中に開示される方法および加持される方法を実施するのに必要とされる組成物は、特に注記されない限り、特定の試薬または組成物に対して当業者に公知の任意の方法を使用して作製され得る。
【０２５１】
（１．核酸の合成）
例えば、核酸（例えば、プライマーとして使用されるべきオリゴヌクレオチド）は、標準的な化学合成方法を使用して作製され得るか、または酵素的方法もしくは他の任意の公知の方法を使用して生成され得る。このような方法は、標準的な酵素消化、その後のフラグメントの単離（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９）の第５章および第６章を参照のこと）から、純粋な合成方法（例えば、ＭｉｌｌｉｇｅｎまたはＢｅｃｋｍａｎ  Ｓｙｓｔｅｍ  １Ｐｌｕｓ  ＤＮＡ合成機（例えば、Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，ＭＡのＭｏｄｅｌ  ８７００自動化合成機、またはＡＢＩ  Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ）を使用するシアノエチルホスホロアミダイト方法による方法）までの範囲であり得る。オリゴヌクレオチドを作製するために有用な合成方法はまた、Ｉｋｕｔａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９８４；５３：３２３−３５６，（ホスホトリエステル方法および亜リン酸トリエステル方法）およびＮａｒａｎｇら，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１９８０；６５：６１０−６２０，（リン酸トリエステル方法）によって記載される。タンパク質核酸分子は、Ｎｉｅｌｓｅｎら，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９４；５：３−７によって記載される方法のような公知の方法を使用して作製され得る。
【０２５２】
（２．ペプチドの合成）
開示されるタンパク質を生成する１つの方法は、タンパク質化学方法によって２つ以上のペプチドまたはポリペプチドを一緒に連結することである。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、Ｆｍｏｃ（９−フルオロレニルメチルオキシカルボニル）化学またはＢｏｃ（ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル）化学（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）のいずれかを使用して、現在利用可能な研究室設備を使用して化学合成され得る。当業者は、例えば開示されるタンパク質に対応するペプチドまたはポリペプチドが、標準的な化学反応によって合成され得ることを容易に認識し得る。例えば、ペプチドまたはポリペプチドは、合成され得、そしてその合成樹脂からは切断されなくても良いが、一方、ペプチドまたはポリペプチドの他のフラグメントが合成され得、その後樹脂から切断され得、これによって他のフラグメントに対して機能的にブロックされる末端基を曝し得る。ペプチド縮合方法によって、これらの２つのフラグメントは、それぞれそれらのカルボキシル末端とアミノ末端とにおけるペプチド結合を介して共有結合されて、抗体またはそのフラグメントを形成し得る（Ｇｒａｎｔ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａ  Ｕｓｅｒ  Ｇｕｉｄｅ．ＷＨ  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，Ｎ．Ｙ．，１９９２；ＢｏｄａｎｓｋｙおよびＴｒｏｓｔ編，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ  Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．，１９９３、これらは、ペプチド合成に関する少なくとも材料について、参考として本明細書中に援用され得る）。
【０２５３】
あるいは、ペプチドまたはポリペプチドは、本明細書中に開示されるように、インビボで独立して合成される。例えば、組み換え糖タンパク質生成方法における利点が使用され得、これらの方法は、トランスジェニックウサギ（ｗｗｗ．ｂｉｏｐｒｏｔｅｉｎ．ｃｏｍ）のコロニー、またはヒトＮ−グリコシル化系酵素を有する酵母の株（Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００３；３０１：１２４４−６；Ｇｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００４；２２：１４０９）によって、ヒト糖タンパク質のコスト上効率的な生成を可能にする。
【０２５４】
一旦単離されると、独立したペプチドまたはポリペプチドは、必要とされる場合、連結されて、同様のペプチド縮合反応を介してペプチドまたはそのフラグメントを形成し得る。例えば、クローニングされたペプチドセグメントまたは合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーションは、比較的短いペプチドフラグメントが結合されてより大きなペプチドフラグメント、ポリペプチドまたはタンパク質ドメイン全体を生成することを可能にする（Ａｂｒａｈｍｓｅｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１；３０：４１５１）。あるいは、合成ペプチドの本来の化学的結合を利用して、より短いペプチドからより長いペプチドまたはポリペプチドを合成して構築し得る。この方法は、２工程の化学反応からなる（Ｄａｗｓｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９４；２６６：７７６−９）。第一の工程は、未保護の合成ペプチドチオエステルと、アミノ末端にＣｙｓ残基を含む別の未保護のペプチドセグメントとの化学選択的反応であり、最初の共有結合産物としてチオエステルで連結された中間体を得る。反応条件の変更なしに、この中間体は、自発的な迅速な分子内反応を受けて、ライゲーション部位において本来のペプチド結合を形成する（Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉら，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９２；３０７：９７−１０１；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９４；２６９：１６０７５；Ｃｌａｒｋ−Ｌｅｗｉｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９１；３０：３１２８；Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９４；３３：６６２３−３０）。
【０２５５】
あるいは、未保護のペプチドセグメントが化学的に連結され、ここで、化学的ライゲーションの結果としてのペプチドセグメント間に形成される結合は、非天然の結合（非ペプチド結合）である（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒら，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９２；２５６：２２１）。この技術は、タンパク質ドメインのアナログおよび完全な生物学的活性を有する比較的純粋な多量のタンパク質を合成するために使用されている（ｄｅＬｉｓｌｅ  Ｍｉｌｔｏｎら，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＩＶ．Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，２５７−６７頁，１９９２）。
【０２５６】
（３．抗体）
開示される抗体は、抗体を生成する任意の方法を使用して作製され得る。例えば、開示されるモノクローナル抗体は、ハイブリドーマ方法（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ，１９７５；２５６：４９５により記載される方法）を使用して調製され得る。ハイブリドーマ方法において、マウスまたは他の適切な宿主動物は、代表的に、免疫化因子を用いて免疫されて、その免疫化因子に特異的に結合する抗体を産生するかまたは産生し得るリンパ球を惹起する。あるいは、リンパ球は、例えば、本明細書中に記載されるＨＩＶ  Ｅｎｖ−ＣＤ４−コレセプター複合体を使用して、インビトロで免疫され得る。
【０２５７】
モノクローナル抗体はまた、組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号に記載される方法）によって作製され得る。開示されるモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）、容易に単離され得、配列決定され得る。抗体または活性のある抗体フラグメントはまた、ファージディスプレイ技術（例えば、米国特許第５，８０４，４４０号および同第６，０９６，４４１号（これらは、抗体の調製についての少なくとも教示のために本明細書中に参考として援用される）に記載されるとおり）を使用して生成され得、スクリーニングされ得る。
【０２５８】
インビトロ方法はまた、１価の抗体を調製するのに適切である。そのフラグメント（具体的には、Ｆａｂフラグメント）を生成するための抗体の消化は、当該分野で公知の日常的な技術を使用して達成され得る。例えば、消化はパパインを使用して実施され得る。パパイン消化の例は、ＷＯ  ９４／２９３４８および米国特許第４，３４２，５６６号（これらは、抗体の調製についての少なくとも教示のために本明細書中に参考として援用される）に記載される。抗体のパパイン消化は、代表的に、２つの同一な抗原結合フラグメント（Ｆａｂフラグメントと称される）を生成し、その各々は１つの抗原結合部位およびＦｃフラグメントの残余を有する。ペプシン処置は、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原に架橋可能であるフラグメントを生じる。
【０２５９】
これらのフラグメントはまた、他の配列に結合されるにせよされないにせよ、特定の領域または特異的なアミノ酸残基の挿入、欠失、置換または他の選択される改変を含み得る。但し、その抗体または抗体フラグメントの活性が改変されていない抗体または抗体フラグメントと比較して大きく変化されることもなく損われることもない。これらの改変は、さらにいくつかの特性（例えば、ジスルフィド結合可能であるアミノ酸を除去／追加すること、その生物寿命（ｂｉｏ−ｌｏｎｇｅｖｉｔｙ）を増加させること、その分泌特性を変更すること、など）を提供し得る。いずれの場合においても、抗体または抗体フラグメントは、生物活性な特性（例えば、その同族抗原に対する特異的な結合）を有さなければならない。抗体または抗体フラグメントの機能領域または活性領域は、そのタンパク質の特異的領域の変異誘発、その後の発現および発現されるポリペプチドの試験によって、同定され得る。このような方法は、当業者に直ちに明らかであり、そして抗体または抗体フラグメントをコードする核酸の部位特異的変異誘発を含み得る。（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１９９２；３：３４８−３５４、これは、抗体の調製についての少なくとも教示のために、本明細書中に参考として援用される）。
【０２６０】
開示されるヒト抗体は、任意の技術を使用して調製され得る。ヒトモノクローナル抗体の生成のための技術の例としては、Ｃｏｌｅら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，７７頁，１９８５）により記載されるもの、およびＢｏｅｒｎｅｒら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９１；１４７（１）：８６  ９５）により記載されるものが挙げられる（これらは、抗体の調製についての少なくとも教示のために、本明細書中に参考として援用される）。ヒト抗体（およびそのフラグメント）はまた、ファージディスプレイライブラリーを使用して生成され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９１；２２７：３８１；Ｍａｒｋｓら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９９１；２２２：５８１，これらは、抗体の調製についての少なくとも教示のために、本明細書中に参考として援用される）。開示されるヒト抗体はまた、トランスジェニック動物から得られ得る。例えば、トランスジェニックの変異マウスは、免疫化に応答してヒト抗体の完全なレパートリーを産生し得、記載されている（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９３；９０：２５５１−５；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら，Ｎａｔｕｒｅ，１９９３；３６２：２５５−８；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎら，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９９３；７：３３を参照のこと。これらは、抗体の調製についての少なくとも教示のために、本明細書中に参考として援用される）。
【０２６１】
非ヒト抗体をヒト化するための方法は、当該分野で周知である。例えば、ヒト化抗体は、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８６；３２１：５２２−５、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，１９８８；３３２：３２３−７、Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８８；２３９：１５３４−６）に従って、げっ歯類ＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置き換えることによって、生成され得る。ヒト化抗体を産生するために使用され得る方法はまた、米国特許第４，８１６，５６７号、同第５６５，３３２号、同第５，７２１，３６７号、同第５，８３７，２４３号、同第５，９３９，５９８号、同第６，１３０，３６４号、および同第６，１８０，３７７号に記載される。これらは、抗体の調製についての少なくとも教示のために、本明細書中に参考として援用される。
【０２６２】
（４．組成物を作製するために求められるプロセス）
組成物を作製するためのプロセスおよびその組成物を導く中間体を作製するためのプロセスが開示される。例えば、配列番号１〜２５７の核酸およびタンパク質が開示される。これらの組成物を作製するために使用され得る種々の方法（例えば、合成化学方法および標準的な分子生物学的方法）が存在する。これらの開示される組成物および他の開示される組成物を作製する方法が具体的に開示されることが理解される。
【０２６３】
表４に記載された配列（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、プロテインキナーゼＣα、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１０ｒ、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリン）ならびに表５および表６に列挙されたタンパク質の遺伝子を含む核酸と、核酸の発現を制御する配列とを、作動可能な様式で連結する工程を含むプロセスによって作製される核酸分子が、開示される。
【０２６４】
また、表４に記載された配列に対して８０％の相同性を有する配列を含む核酸分子と、核酸の発現を制御する配列とを、作動可能な様式で連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子が、開示される。
【０２６５】
表４に記載された配列に対してストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする配列を含む核酸分子と、核酸の発現を制御する配列とを、作動可能な様式で連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子が、開示される。
【０２６６】
タンパク質（例えば、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−合成酵素β鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン、ホスホグリセリン酸ムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジムスターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ１Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、アクチン作用性タンパク質１（ＡＩＰ１）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＩ（ＭＡＰＫＩ）、アクチンまたはそのフラグメント、グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、形質転換タンパク質ＲｈｏＡ、酸性ロイシンリッチ核ホスホプロテイン３２ファミリーメンバーＢ（ＡＮＰ３２ＢまたはＡＰＲＩＬ）、ペルオキシレドキシンＩＩ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、Ａβペプチド、Ｆｅ６５、Ｔｉｐ６０、ＳＥＲＣＡ、ＰＳ１／２、ネクチン−１ａ、および老人斑の非アミロイドβ成分（ＮＡＣＰ／ａ−シヌクレイン））または表５もしくは表６に記載されたタンパク質、または遺伝子のタンパク質をコードする配列を含む核酸分子と、核酸の発現を制御する配列とを、作動可能な様式で連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子が、開示される。
【０２６７】
タンパク質（例えば、ＨＳＰ６０、ジヒドロリポアミドデヒドロゲナーゼ、ＥＲ−６０プロテアーゼ、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ−合成酵素β鎖、アネキシンＩ、１４−３−３ε、プロヒビチン、ホスホグリセリン酸ムターゼ１、アポリポタンパク質ＡＩ、スーパーオキシドジムスターゼ、ＲＮＡ結合タンパク質調節サブユニット、チェーンＡチオレドキシンペルオキシダーゼＢ、ＲＡＳ関連タンパク質ＲＡＰ１Ｂ、腫瘍拒絶抗原、ハプトグロビン、フィブリンβ、アクチン作用性タンパク質１（ＡＩＰ１）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼＩ（ＭＡＰＫＩ）、アクチンまたはそのフラグメント、グルタルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、形質転換タンパク質ＲｈｏＡ、酸性ロイシンリッチ核ホスホプロテイン３２ファミリーメンバーＢ（ＡＮＰ３２ＢまたはＡＰＲＩＬ）、ペルオキシレドキシンＩＩ、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、α−セクレターゼ、β−セクレターゼ、γ−セクレターゼ、Ａβペプチド、Ｆｅ６５、Ｔｉｐ６０、ＳＥＲＣＡ、ＰＳ１／２、ネクチン−１ａ、および老人斑の非アミロイドβ成分（ＮＡＣＰ／ａ−シヌクレイン））に対して８０％の同一性を有するタンパク質または表５もしくは表６に記載されたタンパク質をコードする配列を含む核酸分子と、核酸の発現を制御する配列とを、作動可能な様式で連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子が、開示される。
【０２６８】
表５もしくは表６に記載されたタンパク質に対して８０％の同一性を有するペプチド（ここで、表５または表６からのあらゆる変化が保存的変化である）をコードする配列を含む核酸分子と、核酸の発現を制御する配列とを、作動可能な様式で連結する工程を含むプロセスによって生成される核酸分子が、開示される。
【０２６９】
任意の開示される核酸分子を用いて細胞を形質転換するプロセスによって生成された細胞が、開示される。天然には存在しない開示される任意の核酸分子を用いて細胞を形質転換するプロセスによって生成された細胞が、開示される。
【０２７０】
開示される任意の核酸分子を発現するプロセスによって生成される、開示される任意のペプチドが開示される。開示される任意の核酸分子を発現するプロセスによって生成される、天然には存在しない開示される任意のペプチドが開示される。非天然の開示される任意の核酸を発現するプロセスによって生成される、開示される任意のペプチドが開示される。
【０２７１】
本明細書中に開示される任意の核酸分子を動物内の細胞にトランスフェクションするプロセスによって生成される動物が開示される。本明細書中に開示される任意の核酸分子を動物内の細胞にトランスフェクションするプロセスによって生成される動物が開示され、ここで、この動物が哺乳動物である。また、本明細書中に開示される任意の核酸分子を動物内の細胞にトランスフェクションするプロセスによって生成される動物が開示され、ここで、その哺乳動物がマウス、ラット、ウサギ、ウシ、ヒツジ、ブタまたは霊長類である。
【０２７２】
また、本明細書中に開示される任意の細胞を動物に加えるプロセスによって生成される動物が開示される。
【０２７３】
（Ｅ．組成物を使用する方法）
（１．研究ツールとして組成物を使用する方法）
開示される組成物は、種々の方法において研究ツールとして使用され得る。例えば、加持される組成物（例えば、配列番号１−２５７）を使用して、神経変性疾患に対する種々の治療法の効果を研究し得る。
【０２７４】
本組成物は、例えば、コンビナトリアル化学プロトコルまたは他のスクリーニングプロトコルにおける標的として使用して、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）に関係する所望の機能特性を有する分子を単離し得る。
【０２７５】
開示される組成物はまた、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病およびパーキンソン病）に関係する診断ツールとして使用され得る。
【０２７６】
開示される組成物は、本明細書中に考察されるように、マイクロアレイにおける試薬、または存在するマイクロアレイを検査する（ｐｒｏｂｅ）かもしくは分析するための試薬のいずれかとして、使用され得る。開示される組成物は、１ヌクレオチド多形を単離または同定するための任意の公知の方法において使用され得る。本組成物はまた、チップ／マイクロアレイに関係するスクリーニングアッセイのうちの任意の公知の方法において使用され得る。本組成物はまた、例えば、関係性を研究するため、または開示される組成物に関する分子モデル化分析を実施するために、開示される組成物のコンピューター読み取り可能な実施形態を使用する、任意の公知の方法において使用され得る。
【実施例】
【０２７７】
（７．実施例）
以下の実施例は、当業者に完全な開示ならびに本明細書中で主張される化合物、組成物、物品、デバイスおよび／または方法を構成し、そして評価する手段の説明を提供し、そしてこれらの実施例は、本開示を制限することを意図しない。試みは、数（例えば、量、温度など）に関する正確さを確保するために行われたが、ある程度の誤差および偏差は、認められるべきである。特に明記されない限り、部は、重量部であり、温度は、℃または外界温度であり、そして圧力は、大気圧またはそれに近いものである。
【０２７８】
（Ａ．実施例１：白血球ＲＮＡの分析によるアルツハイマー病の分子的な区別）
（１．方法）
（ａ．患者の募集）
患者を、Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｃｌｉｎｉｃ  ａｔ  Ｍｏｎｒｏｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌを介して募集した。インフォームドコンセントを行って以下の研究を開始した後、一連の痴呆の臨床試験についての情報を、患者から得た。血液サンプルを、ＲＮＡ単離のために処理するまで（１２時間未満）、４℃に保存した。
【０２７９】
本明細書に示されるデータを、被験体の３つの異なる群由来の３つの独立したサンプルから得た。これらのサンプルの各々からのＲＮＡを、抽出し、ハイブリダイズし、そして異なる時間において分析した。サンプル１は、８つのＡＤ症例および７つのコントロール症例から構成された。サンプル２は、８つのＡＤ症例および８つのコントロール症例から構成された。サンプル３は、５つのＡＤ症例、４つのコントロール症例および２つのＰＤ症例から構成された。サンプルの特徴を表１〜３において要約する。
【０２８０】
（２．被験体）
本研究に含まれるＡＤ被験体を、ＮＩＮＣＤＳ（ＭｃＫｈａｎｎ  Ｇら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９８４；３４（７）：９３９−９４４）およびＡＤについてのＤＳＭ  ＩＶ診断基準に基づいて、ＡＤであり得る（ｐｒｏｂａｂｌｅ）か、またはＡＤであると見込まれる（ｐｏｓｓｉｂｌｅ）と診断した。神経学者による実験を実施して、診断を確認し、そして疾患の重症度を測定した。疾患の重症度を、Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ（ＭＭＳＥ）（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ＭＦら、Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓ．、１９７５；１２（３）：１８９−１９８）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｒａｔｉｎｇ尺度（ＣＤＲ）（Ｈｕｇｈｅｓ  ＣＰら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９８２；１４０：５６６−５７２）、およびＢｌｅｓｓｅｄ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（ＢＤＲＳ）（Ｂｌｅｓｓｅｄ  Ｇら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９６８；１１４（５１２）：７９７−８１１）を使用して評価した。本研究に含まれるコントロール被験体は、ＭＭＳＥにおいて２７を上回って得点した一方で、ＡＤ症例は、２２を下回って得点した。ＡＤ症例の平均ＣＤＲは、１．２〜１．５の範囲であった。出血素因または凝固障害の履歴を有する任意の被験体を、除外した。
【０２８１】
（３．全血サンプルからのＲＮＡの単離）
白血球からポリＡ−ＲＮＡを抽出するために、血液のためのｍＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）を、利用した。簡単にいうと、赤血球を、選択的に溶解し、そして白血球を、遠心分離によって回収した。次いでこの白血球を、溶解し、そしてその全核酸を、磁性ガラスビーズへの非特異的な吸着および磁気分離によって回収した。一連の磁性ガラスビーズを洗浄し、そしてその磁性ガラスビーズから核酸を溶出させた後、ｍＲＮＡを、ビオチン標識したオリゴ（ｄＴ）およびストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子を使用して特異的に捕捉した。洗浄によって他の核酸（ＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）を除去した後、ｍＲＮＡサンプルを、回収し、そして後に使用するまで−８０℃に保存した。サンプルの濃度および純度を、ＯＤ２６０／２８０によって確認した。任意のＲＮＡ単離手順を使用し得ることが、理解される。
【０２８２】
（４．ｃＤＮＡアレイの構築およびハイブリダイゼーション）
使用したｃＤＮＡクローンを、表４に網羅する。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのｄｂＥＳＴデータベースを、関連する３’−ｃＤＮＡクローンについて検索し、そしてそのクローンを、配給業者から購入したか、またはそのクローンは、種々の研究室からの寄贈品であった。この研究に使用したｃＤＮＡクローンは、多くの研究者からの惜しみのない寄贈品であった：Ｊｉｍ  ＥｂｅｒｗｉｎｅからのＣＲＥＢ、ツベリン、ネスチン、サイクリンＤ１およびＧＡＤ；Ｄｅｎｉｓｅ  ＦｉｇｌｅｗｉｃｚからのＢＤＮＦ、ｂｃｌ−２、ｂｃｌ−ｘｓ、ｂｃｌ−ｘｌ、カルビンジン、およびＳＯＤ−１；Ｃｈａｗｎｓｈａｎｇ  ＣｈａｎｇからのｈＴＲ２、Ｒａｃｈｅｌ  ＮｅｖｅからのＧＡＰ−４３、ＡＰＰ、およびＰＳ１；Ｂｅｒｔ  ＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎからのＰＩ９；Ｔ．ＳｕｄｈｏｆからのシナプトタグミンＩ；Ｄｒ．ＤａｖｉからのＧＴＨ、ｐＧＴＨ４、およびｐＨＭＧＳＴ；Ｄｒ．Ｒｏｈａｒａｋｅｒからのユビキチン；Ｉｎｅｚ  Ｖｉｎｃｅｎｔからのｃｄｃ２；ならびにＳｔｅｆａｎ  ＳｔａｍｍからのＳＦ２ｆｌａｇ、Ｐｈｔ６、およびｔｒａ２−Ｃ２。残りのｃＤＮＡクローンは、Ｉ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｃＤＮＡクローンの配給業者からのｄｂＥＳＴクローンであった。
【０２８３】
ｃＤＮＡクローンの全てを、それの同一性を確認するために配列決定した。それぞれの直鎖状ｃＤＮＡの１マイクログラムを、０．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で３７℃にて３０分間変性させた。このサンプル容量を、０．３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）によって中和した。これらのｃＤＮＡを、先に記載される通り、９６ピンレプリケーター（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）を使用し、各ｃＤＮＡを４回スポットしてナイロンメンブレン（Ｍｉｃｒｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）上に直ちにプリントした（Ｃｈｏｗ  Ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８；９５：９６２０−９６２５）。このメンブレンを、ＲＮＡプローブを添加する前に、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド／５×ＳＳＰＥ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液／０．１％  ＳＤＳ／１０％デキストラン硫酸／５０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ／１００μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ）中で４２℃にて３時間プレハイブリダイズした。４２℃で一晩インキュベートした後、ブロットを、２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で５５℃にて１時間洗浄し、２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ／１０μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ  Ａ中で３７℃にて１時間洗浄し、そして２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で３７℃にて１時間洗浄した。次いでメンブレンを、ストレージホスファスクリーン（ｓｔｏｒａｇｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒ  ｓｃｒｅｅｎ）に露出した。
【０２８４】
（５．データ取得および分析）
各ドットのハイブリダイゼーション強度を、レーザーデンシトメトリースキャン（ｌａｓｅｒ  ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｉｃ  ｓｃａｎｎｉｎｇ）（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって検出した。ホスホイメージャー（ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ）分析によって得た各スポットについての値（計数）を、局所のバックグラウンドを使用して補正した。アレイ中の各スポットに沈着したｃＤＮＡの量を、全ベクター中に存在するＴ７プロモーターに特異的なオリゴヌクレオチドを用いてこのメンブレンをストリップし、そして再プローブすることによって定量化した。これらのデータは、このメンブレン上のｃＤＮＡの沈着における潜在的なスポット間の相違に対する補正を提供した。アレイにわたる正確な比較を確保するために、シグナルを、各ＲＮＡサンプルに対してアレイ中の全てのマーカー（ｃＤＮＡ）の平均を使用して正規化した。得られた標準化したデータを、正準分析によって分析した。この分析は、群を最もよく区別する変量（メッセージ）を決定し、そして各変量に対して重みを割り当てる。多変量解析に関して真実である通り、変量の数は、症例の数を越えてはならない（Ｋｓｈｉｒｓａｇｅｒ  ＡＭ、Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒ  Ｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９７２）。第１の正準変量は、群の間の最良の区別を提供する。第２の正準変量は、正準変量１によっては不明なままである残りの分散に対して効果がある。さらなる繰り返しが、漸減する効果を伴って可能である。正準分析から得られるＡＤ症例とコントロール症例との間の分別の統計的有意性を、Ｗａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚの連の検定（Ｓｉｅｇｅｌ  Ｓ、Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１−３１２、１９５６）によって評価した。
【０２８５】
（Ｂ．結果）
（１．ＡＤ血液サンプルとコントロール血液サンプルとを区別するメッセージの分類）
多変量の正準分析からの妥当な結果は、変量（この場合においてはメッセージ）の数が、使用した症例（被験体）の数より小さいことが必要である（Ｋｓｈｉｒｓａｇｅｒ  ＡＭ、Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｄｅｋｋｅｒ  Ｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９７２）ので、メッセージを、合計６４個の研究したメッセージから、７つまたは８つのメッセージのサブセットへと形成した。３つのサンプル全てにわたって調べたメッセージの５つのサブセットのうちの２つだけが、ＡＤ症例とコントロール症例との一貫した分離をもたらした。これらの２つのサブセットは、細胞周期に関連するメッセージおよび炎症応答に関連するメッセージであった。図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃは、細胞周期に関連するこれらのメッセージについて、正準変量１対正準変量２をプロットする。図２Ａ、図２Ｂ、および図２Ｃは、炎症応答に関連するこれらのメッセージについて、正準変量１対正準変量２をプロットする。
【０２８６】
これらの６つのプロットは、疾患のカテゴリーの区別が、一般に、群の間にほとんど重複を含まずに達成され得ることを示す。細胞周期メッセージの白血球発現に基づく、４１（２つのパーキンソン病症例を含む４３の症例）の症例のカテゴリー化が、ＡＤ領域中に３つのコントロール症例を含み、かつコントロール領域中にＡＤ症例を含まない症例からなる３８／４１（ＰＤを数に入れて４０／４３）と一致したことに留意すべきである。炎症系に関連する遺伝子は、ＡＤ領域中にコントロール症例を位置付けず、そしてコントロール領域中に１つのＡＤ症例を位置付けた。炎症の遺伝子は、２つのＰＤ症例と、コントロール領域およびＡＤ領域の両方とを正確に区別した。
【０２８７】
非常に小さい数の、本発明者らが標本抽出した個々のメッセージが、ＡＤ症例とコントロール症例との間の統計的に有意（またはほぼ有意）な相違を生じたことに、注目すべきである。これらは、α−１抗キモトリプシン、クリスタリンおよびシクロオキシゲナーゼＩＩであった。しかし、これらは、有意な重複を伴わずにＡＤとコントロールとを区別するために、それ自体で十分なものではない。
【０２８８】
メッセージの他のセットに対する正準変量の類似するプロットは、ＡＤメッセージのプロフィールとコントロール白血球メッセージのプロフィールとを首尾よく区別するものではなかった（データ示さず）。このことは、図１および図２に示したポジティブな結果が図１および図２に提示した２つの遺伝子セットに対して特異的であることの証拠を提供する。
【０２８９】
ここで提示したデータに関して、以下の２つの主要な結論が存在する：（１）複数の遺伝子の発現プロフィールは、軽度のＡＤ症例（平均でＣＤＲ  １．２〜１．５）と痴呆ではないコントロール症例との区別において有効であり、そして（２）本発明者らがＡＤ末梢血サンプルとコントロール末梢血サンプルとの区別として記載する遺伝子分類は、発現がＡＤの脳において変化することを示した遺伝子分類と同様である。血液細胞は、ＡＤの分子機構における基礎調査を行うために使用され得る。このような研究から得られるデータは、治療分子の設計をもたらす。さらに、血液細胞は、治療剤の臨床試験において治療上の有効性をモニタリングし、そして個々の患者の処置の有効性をモニタリングするために使用され得る。
【０２９０】
（２．複数の遺伝子の発現プロフィールは、アルツハイマー病の区別において有効である）
ＡＤの大部分の包括的な臨床診断は、多くの評価を含む複雑で高価なプロセスである（ＭｃＫｈａｎｎ  Ｇら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ：ＮＩＮＣＤＳ−ＡＤＲＤＡ  Ｗｏｒｋ  Ｇｒｏｕｐ  ｕｎｄｅｒ  ｔｈｅ  ａｕｓｐｉｃｅｓ  ｏｆ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅ  ｏｎ  Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅの報告．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９８４；３４（７）：９３９−９４４）。専門家によってでさえ、診断は、暫定的と見なされ、剖検における神経病理学的な確認に左右される。ＡＤの中心において、臨床診断は、８５〜９０％の割合で、剖検による確認に至る（Ｇｅａｒｉｎｇ  Ｍら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９９５；４５（３  Ｐｔ  ｌ）：４６１−４６６）。専門家によらない場合、剖検によって確認される診断の割合は、より低い。ＡＤの診断の費用および困難性は、容易に試料採取され、かつ上首尾の、疾患の生物マーカーに対する調査をもたらした。記載されてきたいくつかの生物マーカーは、侵襲性（例えば、脊椎穿刺（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｐら、Ｊ．Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ−Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｓｅｃｔｉｏｎ、１９９７；１０４（６−７）：７１１−７２０））であるものを含むか、または高価な設備および専門知識を必要とする（Ｋｉｌｌｉａｎｙ  ＲＪら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００２；５８（８）：１１８８−１１９６）。これらの手順は、調査研究において非常に有用であるが、これらは、慣習的で、大規模な診断上の使用に対する保障を提供しない。例えば、血液細胞（Ｎａｇｙ  Ｚら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００２；３１７（２）：８１−８４）、皮膚（Ｉｋｅｄａ  Ｋら、Ｄｅｍｅｎｔｉａ  ＆  Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ  Ｃｏｇｎｉｔｉｖｅ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、２０００；ｌｌ（５）：２４５−２５０）および尿（Ｐｒａｔｉｃｏ  Ｄら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００２；５９：９７２−９７６）から容易に得られる末梢サンプル利用する他の試験が、記載されている（Ｐａｄｏｖａｎｉ  Ａら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ  ｏｆ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００２；５９：７１−７５）。さらなる研究は、薬理学的介入に対する応答を利用する、ＡＤについての試験を記載した（Ｓｃｉｎｔｏ  ＬＦら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９９９；５２（３）：６７３−６７４）。末梢組織に基づいたＡＤサンプルとコントロールサンプルとの区別を指向したこれらの研究の多くは、ＡＤサンプルとコントロールサンプルとの間の統計的に有意な相違を生じることに成功した。しかし、これらの研究において記載される試験の臨床上の有用性は、ＡＤサンプルとコントロールサンプルとの間の有意な重複によって制限されている。本開示のデータは、この重複が、複数の変量の使用を行うことによって減少し得ることを示す。
【０２９１】
脳における発現のプロファイリングは、複数のメッセージの発現の多変量解析がＡＤの脳とコントロールの脳とを区別し得ることを示した（Ｃｈｏｗ  Ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．、１９９８；９５：９６２０−９６２５）。つい最近、複数の遺伝子の発現の多変量解析は、脳以外の組織の悪性サンプルと非悪性サンプルとを区別することに成功した（Ｗｅｌｓｈ  ＪＢら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００１；９８（３）：１１７６−１１８１）。本明細書中に提示されるデータにおいて、末梢血白血球から抽出した複数のメッセージ種の発現レベルにおける定量的データに分析を適用する工程は、ＡＤサンプルとコントロールサンプルとの分別の促進をもたらした。さらに、ＰＤ症例由来の２つのサンプルは、ＡＤサンプルおよびコントロールサンプルの両方と区別され、このことは、ＡＤサンプルとコントロールサンプルとの間にもたらされる区別が、一般的な神経変性の特性以外の特性を区別していることを示唆した。
【０２９２】
しかし、データは、非常に少数の症例の「分類を誤る」。誤分類の性質は、痴呆でないと臨床的に定義された１９症例のうちの３症例が、ＡＤ症例の間に収まる値を生じたことである。本明細書中のデータは、ある程度のＡＤ病理が存在する「症状発現前」の症例であるこれらの症例と合致する。このような示唆は、２０％もの２０歳代の者の脳がＡＤ病理を示したことを実証するＢｒａａｋｓのデータ（Ｂｒａａｋ  Ｈら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ、１９９７；１８（４）：３５１−３５７）と一致する。これらのデータは、ＡＤの拡大した症状発現前の段階の存在についての、従わざるを得ない議論を提供し、この段階の間には、明らかなＡＤの病理が存在する。
【０２９３】
ＡＤに合致する値を与えたこれらのコントロール症例に加えて、コントロール症例の間に収まった、臨床的に定義された１つのＡＤ症例（２１のうち）が存在した。この症例についての存在する臨床的かつ病理学的なデータの検索は、本発明者らのサンプルにおいてこの症例と他のＡＤ症例とを合理的に分別する特徴の区別を示さなかった。
【０２９４】
無作為か、または他の特性（例えば、増殖因子）に基づいてかのいずれかで選択された遺伝子の他のセットは、細胞周期に関連する遺伝子セットおよび炎症系に関連する遺伝子セットによって可能である範囲ほど、ＡＤサンプルとコントロールサンプルとを区別しない（データ示さず）。このことは、選択した遺伝子セットに基づく分離の本開示の知見が、本発明者らが利用した分析方法の人工産物でないことを示唆する。
【０２９５】
ここで示したデータは、本明細書中に開示される遺伝子セットが臨床的に有用であり得ることを示唆し、そしてまた、本明細書中で考察される通り、脳と末梢血液細胞との間における分子的な事象の関連性を示唆する。
【０２９６】
（３．ＡＤの脳を区別し、また、ＡＤ血液サンプルを区別する遺伝子分類）
ＡＤ末梢血白血球とコントロール末梢血白血球とを区別することが本明細書中に示される遺伝子産物の分類がまた、ＡＤの脳において変化した発現を有する遺伝子産物の分類に共通することに注目すべきである。確かに、ＡＤの脳において影響を受ける選択したニューロン特異的な遺伝子産物（例えば、ニューロンに関連する遺伝子産物）（Ｃａｌｌａｈａｎ  ＬＭら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ＆  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、２００２；６１（５）：３８４−３９５；Ｙａｏ  Ｐら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｄｉｓｅａｓｅ、２００３；１２：９７−１０９）は、白血球に関与することが予期されない。しかし、ニューロン特異的でなく、ＡＤの脳において変化した発現を有することが示された遺伝子産物が、存在する。ここで、特に注目される分子は、細胞周期に関連する分子（Ａｒｅｎｄｔ  Ｔ、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ、２０００；２１（６）：７８３−７９６；Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、１９９７；１７：３５８８−３５９８；Ｎａｇｙ  Ｚら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００２；３１７（２）：８１−８４；Ｈａｒｒｉｓ  ＰＬら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ、２０００；２１（６）：８３７−８４１；Ｗｕ  Ｑら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ、２０００；２１（６）：７９７−８０６；Ｚｈｕら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ、２０００；２１（６）：８３７−８４１）および炎症系に関連する分子（Ａｋｉｙａｍａ  Ｈら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ、２０００；２１（３）：３８３−４２１ならびにＢａｍｂｅｒｇｅｒ  ＭＥおよびＬａｎｄｒｅｔｈ  ＧＥ、Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＆  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、２００１；５４（２）：５９−７０）である。実際に、ＡＤの脳における炎症系の最近の概要は、「炎症メディエーターの実質的な教科書は、最近１５年わたり、アルツハイマー病の脳において観察された。」と記載する（Ａｋｉｙａｍａ  Ｈら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ、２０００；２１（３）：３８３−４２１）。実際に、脳以外のＡＤ組織の研究は、血液細胞（Ｎａｇｙ  Ｚら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００２；３１７（２）：８１−８４；Ｓｃａｌｉ  Ｃら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ、２００２；２３（４）：５２３−５３０）および上皮細胞（Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ａら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、２００２；１１７（２）：１７１−１８０）を含む数種の組織における、細胞周期の遺伝子（Ｎａｇｙ  Ｚら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ、２００２；３１７（２）：８１−８４；Ｓｔｉｅｌｅｒ  ＪＴら、ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ、２００１；１２（１８）：３９６９−３９７２）、ならびに炎症系遺伝子（Ｓｃａｌｉ  Ｃら、Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｇｉｎｇ、２００２；２３（４）：５２３−５３０；Ｄｅ  Ｌｕｉｇｉ  Ａら、Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ａｇｅｉｎｇ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、２００１；１２２（１６）：１９８５−１９９５；Ｋｕｓｄｒａ  Ｌ．ら、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、２０００；２０２（ｌ）：２６−３３；Ｌｏｍｂａｒｄｉ  ＶＲら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１９９９；９７（１−２）：１６３−１７１；Ｒｅｍａｒｑｕｅ  ＥＪら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ、２００１；３６：１７１−１７６）の変化した発現を示した。
【０２９７】
上記の研究は、末梢細胞および脳細胞の両方における遺伝子発現の選択した共通の変化が、一般的な全身性疾患の機構または血液と脳との間の一般的な関連の概念と一致し得ることを証明しなかった（Ｗｅｂｓｔｅｒ  Ｓら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ＆  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、１９９５；２１７：８６９−８７５；Ｋｉｍｂｅｒｌｙ  ＷＴら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００１；２７６（４３）：４０２８８−４０２９２；Ｃａｏ  Ｘら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２００１  ；２９３（５５２７）：１１５−１２０）。
【０２９８】
上記データは、細胞周期の遺伝子および炎症の遺伝子の障害された発現が、神経系の内部および外部の両方で、多くの細胞型におけるＡＤの病態生理において主要な役割を果たし得ることを示唆する。ＡＤのさらなる神経病態生理学的な局面は、細胞周期（Ｂｕｓｃｉｇｌｉｏ  Ｊら、Ｎｅｕｒｏｎ、１９９５；１４（４）：８７９−８８８；Ｆｅｒｒｅｉｒａ  Ａら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＆  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、１９９７、９（３）：２２０−２３４；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ＳＭら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９４；９１（１５）：７ｌ０４−７１０８）および結果的な細胞骨格の破壊、細胞周期を首尾良く完了する有糸分裂後ニューロン（ｐｏｓｔ  ｍｉｔｏｔｉｃ  ｎｅｕｒｏｎ）の不能に対する応答のようなプログラムされた細胞死の変種、ならびに起炎性の負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）に対する応答のような細胞死にも関連するキナーゼによるタウのリン酸化を含むこれらの中心的な事象の結果であり得る。
【０２９９】
末梢白血球による複数の遺伝子の発現のＲＮＡプロファイリング後の正準判別分析は、疾患における分子変化の分析のための生物学的手段およびアルツハイマー患者とコントロール患者との間の鑑別のための手段の両方に使用され得る。これらの方法はまた、多くの他の疾患を識別する可能性を示唆する。それは、特定の疾患を有する患者と他の疾患を有する患者との間の明確な判別を提供する個々の遺伝子（しかし、有意な相関を有する少数の遺伝子）の間の有意な相違ではなく、正しくは、多くの遺伝子の加重合計に基づく分析である。
【０３００】
末梢血白血球による遺伝子発現がＡＤにおいて影響を受けるという知見は、全身性疾患としてのＡＤの概念を補強する。さらに、末梢白血球において影響を受ける細胞周期および炎症の遺伝子分類が、ＡＤの脳において影響を受ける遺伝子分類と類似することは、おそらくＡＰＰペプチドによって惹起される脳および血液細胞におけるＡＤの対応する分子機構を示唆し、そしてその分子機構と一致する共通点である。
【０３０１】
（Ｃ．実施例２：炎症、細胞周期、およびストレスの転写物、ならびに末梢血白血球によるアルツハイマー病の分子的な区別）
（１．方法）
（ａ．患者の募集）
患者を、Ｇｅｒｉａｔｒｉｃ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ  Ｃｌｉｎｉｃ  ａｔ  Ｍｏｎｒｏｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌを介して募集した。インフォームドコンセントを行って以下の研究を開始した後、一連の痴呆の臨床試験についての情報を、患者から得た。
【０３０２】
本明細書に示されるデータを、被験体の３つの異なる群由来の３つの独立したサンプルのセットから得た。これらのサンプルの各々からの白血球ＲＮＡを、抽出し、特注のｃＤＮＡアレイにハイブリダイズしそして異なる時間において分析した。サンプル１は、８つの初期ＡＤ症例および７つのコントロール症例から構成された。サンプル２は、８つの新たな初期ＡＤ症例および８つの新たなコントロール症例から構成された。サンプル３は、５つの新たな初期ＡＤ症例、４つの新たなコントロール症例および２つ（新規）の（痴呆を有さない）パーキンソン病症例から構成された。サンプルの特徴を表１〜３において要約する。合計で２１の初期ＡＤ症例、１９のコントロール症例、および２つのＰＤ症例を、調査した。
【０３０３】
（２．被験体）
本研究に含まれるＡＤ被験体を、ＮＩＮＣＤＳ（ＭｃＫｈａｎｎ  Ｇら、Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ、１９８４；３４（７）：９３９−９４４）およびＡＤについてのＤＳＭ  ＩＶ診断基準に基づいて、ＡＤであり得る（ｐｒｏｂａｂｌｅ）か、またはＡＤであると見込まれる（ｐｏｓｓｉｂｌｅ）と診断した。神経学者による実験を実施して、診断を確認し、そして疾患の重症度を測定した。疾患の重症度を、Ｍｉｎｉ−Ｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｕｓ  Ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ（ＭＭＳＥ）（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ＭＦら、Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｉｃ  Ｒｅｓ．、１９７５；１２（３）：１８９−１９８）、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｒａｔｉｎｇ尺度（ＣＤＲ；Ｈｕｇｈｅｓら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９８２；１４０：５６６−５７２）、およびＢｌｅｓｓｅｄ  Ｄｅｍｅｎｔｉａ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅ（ＢＤＲＳ；Ｂｌｅｓｓｅｄら、Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９６８；１１４（５１２）：７９７−８１１）を使用して評価した。本研究に含まれるコントロール被験体は、ＭＭＳＥにおいて２７を上回って得点した一方で、ＡＤ症例は、２２を下回って得点した。３つのサンプルの各々におけるＡＤ症例の平均ＣＤＲは、１．２〜１．５の範囲であった。これらは、剖検によって確認した症例ではなかったので、各症例の特定した疾患のカテゴリーへの割り当ては、臨床診断の正確度に依存する。出血素因または凝固障害の履歴を有する任意の被験体を、除外した。血液サンプルを、瀉血士によって引き出し、そしてＲＮＡ単離のために処理するまで（８時間未満）、４℃に保存した。
【０３０４】
（３．全血サンプルからのＲＮＡの単離）
白血球からポリＡ−ＲＮＡを抽出するために、血液のためのｍＲＮＡ単離キット（Ｒｏｃｈｅ）を、利用した。簡単にいうと、赤血球を、選択的に溶解し、そして白血球を、遠心分離によって回収した。次いでこの白血球を、溶解し、そしてその全核酸を、磁性ガラスビーズへの非特異的な吸着および磁気分離によって回収した。一連の磁性ガラスビーズを洗浄し、そしてその磁性ガラスビーズから核酸を溶出させた後、ｍＲＮＡを、ビオチン標識したオリゴ（ｄＴ）およびストレプトアビジンでコーティングした磁性粒子を使用して特異的に捕捉した。洗浄によって他の核酸（ＤＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ）を除去した後、ｍＲＮＡサンプルを、回収し、そして後に使用するまで−８０℃に保存した。サンプルの濃度および純度を、ＯＤ２６０／２８０によって確認した。任意のＲＮＡ単離手順を使用し得ることが、理解される。
【０３０５】
（４．ｃＤＮＡアレイの構築）
アレイ中に示されるｃＤＮＡクローンを、先のマイクロアレイ研究（例えば、Ｃｈｏｗら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．１９９８；９５：９６２０−９６２５）  およびＡＤ調査の分野における目的のｃＤＮＡのサブセットに基づいて選択した。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  のｄｂＥＳＴデータベースを、関連する３’ｃＤＮＡクローンについて検索した。この研究に使用したｃＤＮＡクローンは、多くの研究者からの寄贈品であったか、またはＩ．Ｍ．Ａ．Ｇ．Ｅ．Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ  ｃＤＮＡクローンの配給業者からのｃＤＮＡクローンであった。１７２個の転写物が、アレイ中に示された。
【０３０６】
ｃＤＮＡクローンの全てを、それの同一性を確認するために独自に配列決定した。それぞれの直鎖状ｃＤＮＡの１マイクログラムを、０．２Ｎ  ＮａＯＨ／０．２ｍＭ  ＥＤＴＡ中で３７℃にて３０分間変性させた。このサンプル容量を、０．３Ｍ  ＮａＯＡｃ（ｐＨ４．５）によって中和した。これらのｃＤＮＡを、先に記載される通り、９６ピンレプリケーター（Ｎａｌｇｅ  Ｎｕｎｃ）を使用し、各ｃＤＮＡを４回スポットしてナイロンメンブレン（Ｍｉｃｒｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）上に直ちにプリントした（Ｃｈｏｗ  Ｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１９９８；９５：９６２０−９６２５）。このメンブレンを、ＲＮＡプローブを添加する前に、ハイブリダイゼーション溶液（５０％ホルムアミド／５×ＳＳＰＥ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液／０．１％  ＳＤＳ／１０％デキストラン硫酸／５０μｇ／ｍｌの変性サケ精子ＤＮＡ／１００μｇ／ｍｌのｔＲＮＡ）中で４２℃にて３時間プレハイブリダイズした。４２℃で一晩インキュベートした後、ブロットを、２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で５５℃にて１時間洗浄し、２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ／１０μｇ／ｍｌのＲＮＡｓｅ  Ａ中で３７℃にて１時間洗浄し、そして２×ＳＳＣ／０．１％  ＳＤＳ中で３７℃にて１時間洗浄した。次いでメンブレンを、ストレージホスファスクリーンに露出した。
【０３０７】
（５．データ取得および分析）
各ドットのハイブリダイゼーション強度を、レーザーデンシトメトリースキャン（Ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって検出した。ホスホイメージャー分析によって得た各スポットについての値（計数）を、局所のバックグラウンドを使用して補正した。アレイ中の各スポットに沈着したｃＤＮＡの量を、全ベクター中に存在するＴ７プロモーターに特異的なオリゴヌクレオチドを用いてこのメンブレンをストリップし、そして再プローブすることによって定量化した。これらのデータは、このメンブレン上のｃＤＮＡの沈着における潜在的なスポット間の相違に対する補正を提供した。アレイにわたる正確な比較を確保するために、シグナルを、各ＲＮＡサンプルに対してアレイ中の全てのマーカー（ｃＤＮＡ）の平均を使用して正規化した。得られた標準化したデータを、２つの単変量試験および１つの多変量試験よって分析した。この単変量試験は、ｔ検定およびＮ検定であった。後者のＮ検定は、複数の検定の推論ための、新たに考案された本質的にノンパラメトリックな検定である（ｈｔ１ｐ：／／ｗｗｗ．ｕｒｍｃ．ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ．ｅｄｕ／ｓｍｄ／ｂｉｏｓｔａｔ／ｐｅｏｐｌｅ／ｔｅｃｈｒｅｐｏｒｔｓ．ｈｔｍｌのＴｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  ０４／０１）。多変量の統計学的検定は、正準判別分析に依存する。この多変量解析を、ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．（Ｃａｒｙ，ＮＣ）製のＳＡＳ／ＳＴＡＴＴＭソフトウェア上で行った。この分析は、群を最もよく区別する変量（メッセージ）を決定し、そして各変量に対して重みを割り当てる。第１の正準変量は、群の間の最良の区別を提供する。第２の正準変量は、正準変量１によっては不明なままである残りの分散に効果がある。さらなる繰り返しが、漸減する効果を伴って可能である。
【０３０８】
（Ｄ．結果）
多変量の正準分析からの妥当な結果は、分析した変量（この場合においてはメッセージ）の数が、使用した症例（被験体）の数より小さいことが必要である（Ｋｓｈｉｒｓａｇｅｒ，ＡＭ．Ｍｕｌｔｉｖａｒｉａｔｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｄｅｋｋｅｒ，Ｍ．、１９７２）ので、メッセージを、合計１７２個の研究した転写物から、７個または８個のメッセージのサブセットへと形成した。形成したサブセットの３つは、ＡＤの脳において影響を受け、ＡＤ白血球においても影響を受けることが公知である系を特定した仮説に基づいた。転写物のこれらの３つのセットは、細胞ストレス（特に、酸化的ストレス）、炎症系、または細胞周期／アポトーシスのいずれかに関連するものであった。２つの他のサブセットを、形成した。一方は、ｔ検定における有意性に匹敵した転写物から構成され、そして一方は、使用した分析法に由来する誤った結果に対するコントロールとして無作為に選択した転写物から構成された。次いでこれらの転写物セットを利用して、初期ＡＤ被験体およびコントロール被験体の３つの独立したサンプルから得たデータを分析した。正準分析から得られるＡＤ症例とコントロール症例との間の分別の統計的有意性を、Ｗａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚの連の検定（Ｓｉｅｇｅｌ  Ｓ、Ｎｏｎｐａｒａｍｅｔｒｉｃ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ、ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．１９５６：１−３１２）によって評価した。
【０３０９】
ｔ検定による単変量解析は、ＡＤサンプルとコントロールサンプルとの間で統計学的に有意に相違する３つの転写物を示した。これらは、以下であった：α−１抗キモトリプシン、クリスタリンおよびシクロオキシゲナーゼＩＩ。Ｎ検定分析による単変量解析は、ＡＤとコントロールとの間の統計学的に有意な相違に匹敵する１つの転写物を示した。これは、ＥＲＣＣ６であった。これらの単変量の統計のいずれかによって示された転写物の全ては、有意な重複を伴わずにＡＤとコントロールとを区別するために、それ自体で十分なものではない。
【０３１０】
しかし、多変量の正準判別分析は、初期アルツハイマー病被験体の末梢血白血球とコントロール被験体の末梢血白血球との間の優れた区別を供給し得た。第１の研究は、細胞ストレス、炎症系および細胞周期／アポトーシスに関連する転写物のセットの正準判別分析が最小限の重複を伴ってＡＤとコントロールサンプルとを区別し得たことを証明した。各プロットのそれぞれの点は、１個体についての集成「値（ｓｃｏｒｅ）」［正準変量１］を表す。この値を、選択した８〜１０個の転写物多変量の正準判別分析によって決定して、細胞ストレス（例えば、α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ  ２７、ＨＳＰ  ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ  １、ｃｏｘ  ２、およびトランスフェリン）（図３Ａを参照のこと）、炎症（例えば、Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１０ｒ）（図３Ｂを参照のこと）、または細胞周期（例えば、サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅｌ、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、およびタンパク質キナーゼＣα）（図３Ｃを参照のこと）を表した。ｔ検定の有意性に基づいて選んだか、または無作為に選択した２つの転写物セットは、初期ＡＤ症例とコントロール症例とを、はっきりと区別しなかった（データ示さず）。
【０３１１】
新規の重複しない被験体のセットによる再現は、細胞ストレス、炎症系および細胞周期／アポトーシスに関連する転写物セットが、再び初期ＡＤ症例とコントロール症例とを区別し得たことを裏付けた（図４）。その後、新規のさらなる被験体のセットを募集し、白血球を回収し、ｍＲＮＡを抽出し、そして新たなアレイにハイブリダイズした。再び、この再現は、細胞ストレス、炎症系および細胞周期／アポトーシスに関連する転写物サブセットが初期ＡＤ症例とコントロール症例とを区別し得たことを裏付けた（図５）。
【０３１２】
それぞれの再現研究において、ｔ検定の有意性に基づいて選んだか、または無作為に選択した他の２つの転写物セットは、初期ＡＤ症例とコントロール症例とを、はっきりと区別しなかった。図３〜図５のこれらの９つのプロットは、疾患のカテゴリーの一般的に優れた区別が、群間でほとんど重複を伴わずに達成され得ることを示す（初期ＡＤとコントロールとの区別がｐ＜０．０１のレベルを超えて有意である（Ｗａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚの連の検定））。この分析が、２つのパーキンソン病症例と、初期ＡＤ症例およびコントロール症例とを区別したことに留意すべきである。
【０３１３】
（１．脳におけるＡＤを区別し、また、ＡＤ血液サンプルを区別する遺伝子分類）
実施例１と同様に、ＡＤ末梢血白血球とコントロール末梢血白血球とを区別することが本明細書中に示される遺伝子産物の分類はまた、ＡＤの脳において変化した発現を有することが公知である遺伝子産物の分類に共通するものである。調査した転写物の３つの分類は、同様に良好に機能しなかったようである。細胞ストレスおよび炎症系に関連する転写物は、疾患状態の転写物の区別と完全に一致したが、細胞周期の転写物は、あまり一致しなかった。それでもなお、このデータは、末梢細胞の発現プロフィールの多変量解析がアルツハイマー病の分子現象の研究に使用され得ることを示唆する。
【０３１４】
選択したＡＤの神経病理学的／神経生物学的な局面は、細胞周期の事象、細胞ストレスの事象、および炎症の事象の変化した発現の結果であり得、これらの全ては、細胞の寿命において中心的である。１つの例として、Ａβによる細胞周期のキナーゼの活性化は、細胞分裂に必要とされる細胞骨格の分解をもたらす、タウのリン酸化を生じる（Ｂｕｓｃｉｇｌｉｏら、Ｎｅｕｒｏｎ．１９９５；１４（４）：８７９−８８８；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、１９９４；９１（１５）：７１０４−７１０８）。次いで、細胞骨格分解は、神経突起の維持、輸送およびシナプスの支持に対する結果をもたらす。
【０３１５】
ここで示したデータは、使用した遺伝子分類が、診断（おそらく、初期、症状発現前または前駆の（ａｎｔｅｃｅｄｅｎｔ）診断でさえ）および治療上の有効性のモニタリングを含む種々の方法において、臨床的に有用になり得ることを示唆する。さらに、遺伝子産物の同様の分類が脳および血液の両方において影響を受けることの証拠は、末梢血細胞が、一般に、アルツハイマー病または神経変性性疾患の、選択される基本的な分子および細胞の生物学的機構の研究において、脳細胞の代理として機能し得ること許容する。ここで提示したデータは、ＡＤおよびＰＤにおいて、類似する系が脳および血液の両方において影響を受け、それらが細胞の両方の分類において完全に等しく挙動することを必要としないことを示す。
【０３１６】
（２．アレイデータの分析）
アレイデータから抽出され得る意義は、アレイの仕様および使用する分析方法に依存する。標的とされるアレイと使用する分析法との組み合わせを、ＡＤの脳において影響を受けることが公知である基本的な細胞生物学に関連する選択した分子系がまた、末梢血白血球において影響を受けることが見出されるという仮説を検証するために設計した。特に、炎症系、細胞のストレス、および細胞周期／アポトーシスに関連する転写物に集中した。従って、本明細書中で使用した標的とされるアレイを、これらの３つの系の各々に関連する複数のプローブを含むように設計した。個々の転写物のＡＤ／コントロールの相違を試験するために設計した分析法を重視するよりもむしろ、複数の転写物の同時使用を行うことによって、ＡＤとコントロールとの間の遺伝子発現のプロフィールの相違を試験し得る分析の方法を使用した。正準判別分析の伝統的な方法を、選択した。この方法は、これらの群を最も良く識別する変量（転写物）のセットを見出すために、２つ（またはそれ以上）の群の存在の知識の使用を行う。この分析は、各転写物に重みを割り当て、そしてこれらの重みは、各被験体についての「スコア」（例えば、正準変量）を計算するために使用される。この分析は、上に記載したような分析であり、そしてこの分析を、ＳＡＳ／ＳＴＡＴＴＭソフトウェアを用いて行った。それは、図３〜図５に示すこの値である。
【０３１７】
遺伝子発現のプロフィールによって疾患を区別する効果における多変量の統計的方法の値は、脳ではない疾患（卵巣癌、Ｗｅｌｓｈら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、２００１；９８（３）：１１７６−１１８１）、および脳の疾患（Ｔａｎｇら、２００４）の両方の区別を含む種々の研究において示されている。この後者の研究は、血液サンプルに由来する転写物の発現プロフィールに基づいて、３つの神経学的状態（結節硬化症複合体２、神経線維腫症１型、およびダウン症候群）を識別した。それらは、「それぞれの疾患は、分類器によって正確に区別され得る血液における独特な遺伝子発現パターンに関連していた。」と記載する。提示するデータは、個々の遺伝子異なる発現レベルが、多くの場合、疾患状態の区別において、多くの遺伝子産物の加重合計に基づく分析ほど強力ではないことを強調する。アレイデータの解釈は、発展中の活動であり続ける。
【０３１８】
（３．血液細胞および脳細胞に対する共通の効果の機構）
末梢血白血球による遺伝子発現が、脳における事象について連想させる様式でアルツハイマー病において変化するという事実は、末梢血エレメントと脳との間の連絡によって説明され得る（例えば、Ｈｉｃｋｅｙ  ＷＦら、１９９１；概説については、Ｈｉｃｋｅｙ、１９９９を参照のこと）。さらに、このような交流に対する血液脳関門の透過性は、Ａβペプチドを含む種々の因子によって増強されることが示されており（例えば、Ｆａｒｋａｓ  ＩＧら、２００３）、そして選択されたＡβペプチドは、ＡＤにおける末梢循環において増加することが示されている（概説については、Ｉｒｉｚａｒｒｙ  ＭＣ、２００４を参照のこと）。それは、血液中のＡβペプチドの供給源として血液と脳との間の連絡のみに依存する必要はない。なぜなら、血液細胞それ自体（特に、血小板）が、ＡＤにおいてＡＰＰ、ＢＡＣＥおよび他の成分を異なって発現する（例えば、Ｃｏｌｃｉａｇｈｉら、２００４；Ｂａｓｋｉｎら、２０００；Ｌｉら、１９９９；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら、１９９７）からである。これは、血液と脳との間の連絡以外（またはそれに加えて）の機構が末梢細胞に対するＡＤの効果の調節において重要な役割を果たし得ることを示唆する。循環系におけるＡβペプチドの存在は、妥当であり得るが、血管系の外の他の末梢細胞（線維芽細胞が挙げられる）が、ＡＰＰ系の成分を発現し、そしてＡＤサンプルとコントロールサンプルとの間の相違を示す（Ｅｍｉｌｉａｎｉら、２００３；Ｉｋｅｄａら、２０００；Ｚｈａｏら、２００２；Ｓｃａｌｉら、２００２；概説についてはＥｔｃｈｅｂｅｒｒｉｇａｒａｙら、１９９６；Ｇｉｂｓｏｎら、１９９６ならびにＧｉｂｓｏｎおよびＨｕａｎｇ、２００２を参照のこと）。これらのデータは、その主要な臨床上の発現が脳に対するＡＤの効果から生じる全身性疾患としてのＡＤの概念と一致する。
【０３１９】
本明細書中に開示されるように、末梢血白血球によって発現される、炎症、細胞ストレスおよび細胞周期／アポトーシスに関連する転写物の多変量解析は、初期ＡＤ症例とコントロール症例とを区別し得る。数種の他の結論が、導かれる：（１）ＡＤ白血球とコントロール白血球とを区別し得ることが本明細書中で示される転写物の分類は、ＡＤの脳において影響を受けることが公知である転写物の分類に類似する；（２）これらのデータは、ＡＤの初期（おそらく、症状発現前、前駆）の診断についての可能性、ならびに疾患の進行および治療上の有効性についてのモニタリング可能性を有し得る。
【０３２０】
（Ｅ．実施例３：末梢血白血球による、パーキンソン病の分子的な区別）
パーキンソン病のタンパク質分析は、１３人のパーキンソン病（ＰＤ）患者および９人の歳が同じのコントロール患者を含む患者集団を同定した。新鮮な全血を引き出し、赤血球を溶解し、そして白血球を収集した。白血球のタンパク質濃度を測定し、そしてタンパク質の完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、次いでＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色を行うことによって決定した。当量の白血球タンパク質溶解物を、２Ｄゲル電気泳動に供した。ゲルを、銀染色し、乾燥し、そしてレーザーデンシトメーターによってスキャンし、次いで限定したコンピューターによる比較（ｌｉｍｉｔｅｄ  ｃｏｍｐｕｔｅｒｉｚｅｄ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ）を行った（図６）。ＰＤ患者とコントロール患者との間の強度が異なるタンパク質スポットを、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．；Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）を使用して同定した。差の測定値は、統計学的検定に従った。１７個のスポットを、コントロールと比較して、パーキンソン病の増進または減少のいずれかとして同定した。異なって発現したスポットを、二重のＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色したゲルから穿孔し、そしてゲル内でのトリプシン消化に供した。単離したタンパク質を、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析を行い、次いで公然のタンパク質データベースとの比較を行った後に同定した（表６および図６）。
【０３２１】
（表６：パーキンソン病患者とコントロール被験体との間で異なる、先に同定されたタンパク質）
【０３２２】
【表６】
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（Ｆ．実施例４：アルツハイマー病についての処置を受ける患者において異なって発現した生物マーカーの同定）
研究を、バルプロ酸反応性タンパク質を同定するために行った。軽度から中程度のアルツハイマー病を有する１５人の患者を、ジバルプロックスナトリウム処置の前（ベースライン）およびその４週間後に調べた。図９は、この研究に参加した患者のいくつかの特徴を示す。末梢血サンプルを、ベースラインおよび処置の開始の４週間後において、標準的な静脈穿刺を使用して、１０ｍｌのラベンダートップチューブ（ｌａｖｅｎｄｅｒ  ｔｏｐ  ｔｕｂｅ）に回収した。サンプルを、赤血球細胞を選択的に溶解し、次いでこのサンプルの遠心分離を行い、白血球ペレットを保持し、そして−８０℃に保存することによって、白血球タンパク質について処理した。
【０３２３】
二次元（２Ｄ）ゲル分析の前に、サンプルを、氷上で素早く解凍し、そして標準的な可溶化緩衝液を使用して溶解した。タンパク質濃度を測定し、そしてタンパク質の完全性を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行い、次いでＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色を行うことによってアッセイした。等量の白血球タンパク質溶解物を、２Ｄゲル電気泳動に供し、そしてゲルを、銀染色し、乾燥し、そしてレーザーデンシトメーターによってスキャンし、次いで限定したコンピューターによる比較を行った。図１０を参照のこと。異なって発現したタンパク質スポットを、Ｐｒｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙソフトウェア（Ｎｏｎｌｉｎｅａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ製）および統計学的検定を使用して同定した。９個のスポットを、バルプロ酸療法における患者中の増加または減少のいずれかとして同定した。異なって発現したスポットを、二重のＣｏｏｍａｓｓｉｅブルー染色したゲルから穿孔し、そしてゲル内でのトリプシン消化に供し、そしてＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析（図１１を参照のこと）および公然のタンパク質データベースとの比較を使用して同定した。同定した９つの生物マーカーを、図１２に列挙し、そして記載する。これらの９つの生物マーカーは、アクチン相互作用タンパク質１（ＡＩＰ１）、マイトジェン活性化タンパク質キナーゼＩ（ＭＡＰＫＩ）、アクチンもしくはそれらのフラグメント、アネキシンＡ１、１４−３−３タンパク質ε、グルタルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、トランスフォーミングタンパク質ＲｈｏＡ、ロイシンが豊富な酸性の核リンタンパク質３２ファミリーのメンバーＢ（ＡＮＰ３２ＢまたはＡＰＲＩＬ）、またはペルオキシレドキシンＩＩを含む。
【０３２４】
これらの結果は、生物学的な白血球を含有する生物学的サンプルが、アルツハイマー病についての治療に対する患者の応答をモニタリングするのに有用である生物マーカーを同定するために使用され得ることを示す。
【０３２５】
（Ｇ．実施例５：インビトロの白血球を使用する、異なって発現したタンパク質の確認）
９つの標的のうちの３つを、バルプロ酸の存在下において２日間インビトロで培養したヒト白血球を使用して確証した。簡単にいうと、ヒト白血球を、痴呆ではない（コントロール）被験体から培養し、そして培養の開始と同時に種々の濃度（０〜５ｍＭ）のバルプロ酸に供した。白血球タンパク質を、ＳＰＳ−ＰＡＧＥ電気泳動および上記標的に対する抗体を使用したウェスタンブロッティングに供した。上記タンパク質のうちの３つに対して、バルプロ酸処置は、最初の２Ｄゲル研究において観察された変化を繰り返した（図１２）。
【０３２６】
培養した白血球におけるアネキシンＡ１およびＡＰＲＩＬの発現レベルは、バルプロ酸処置に対する応答において用量依存性の様式で減少した。これらの結果は、バルプロ酸（ＶＰＡ）によって処置した患者におけるアネキシンＡ１およびＡＰＲＩＬの発現の観察された減少と一致する。再び、実施例４の結果と一致して、ペルオキシレドキシンＩＩの発現レベルは、培養した白血球中で、ＶＰＡ処置に対する応答において用量依存性の様式で増加し、この増加は、約１．０ｍＭのＶＰＡに対する応答において発現のピークを有した。試験した生物マーカーのうち、培養した白血球におけるアクチンの発現のみが、ＶＰＡ処置患者において観察された発現パターンの変化を追跡できなかった。
【０３２７】
これらの結果は、ＶＰＡ処置したアルツハイマー病患者において同定した候補生物マーカーの（少なくともいくつか、そしておそらく、ほとんどの）発現パターンは、人工産物ではなかったことを示す（ｕｓｅ  ｉｎｄｉｃａｔｅ）。それらの結果は、異なる定量技術を使用して評価したところ、培養した細胞における生物マーカーの発現パターンと相関したからである。
【０３２８】
種々の改変および変形が本発明の範囲または精神から逸脱することなく本発明においてなされ得ることは、当業者に明らかである。本発明の他の実施形態は、本明細書の検討および本明細書中に開示された発明の実施によって、当業者に明らかである。本明細書および実施例は、添付の特許請求の範囲によって示される発明の真の範囲および精神を含む単なる例示として見なされることが意図される。
【０３２９】
【数３】
2008506415.tif 000042
【０３３０】
【数４】
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【０３３１】
【数５】
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【０３３２】
【数６】
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【０３３３】
【数７】
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【０３３４】
【数８】
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【０３３５】
【数９】
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【図面の簡単な説明】
【０３３６】
添付の図面は、本明細書に組み込まれ、そして本明細書の一部を構成し、いくつかの実施形態を例示し、そして開示される組成物および方法を説明と一緒に例示する。
【図１Ａ】図１Ａは、第１の研究についての標準変量１および標準変量２のプロットである。このプロットの標準変量ならびに図１Ｂおよび図１Ｃの標準変量は、細胞周期関連のメッセージ（サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、およびプロテインキナーゼＣα）に対するデータから導かれた。アルツハイマー疾患（「ＡＤ」）症例とコントロール（「Ｃｏｎ」）症例との間の差異についてのＷａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚ実行テストは、ｐ＜０．０５。包含されるこれらの症例は、表１に示される。
【表１】
2008506415.tif 000049
【図１Ｂ】図１Ｂは、第２の研究についての標準変量１および標準変量２のプロットである。このプロットの標準変量は、図１Ａと同じ細胞周期関連のメッセージに対するデータから導かれた。ＡＤ症例とＣｏｎ症例との間の差異についてのＷａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚ実行テストは、ｐ＜０．０５。包含されるこれらの症例は、表２に示される。
【表２】
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【図１Ｃ】図１Ｃは、第３の研究についての標準変量１および標準変量２のプロットである。このプロットの標準変量は、図１Ａと同じ細胞周期関連のメッセージに対するデータから導かれた。ＡＤ症例とＣｏｎ症例との間の差異についてのＷａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚ実行テストは、ｐ＜０．０５。包含されるこれらの症例は、表３に示される。
【表３】
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【図２Ａ】図２Ａは、第１の研究についての標準変量１および標準変量２のプロットである。このプロットの標準変量は、炎症系関連のメッセージ（Ｃ５、Ｃ１インヒビター、Ｃ５ａ、補体Ｃ３、シクロオキシゲナーゼ、ＩＬ１７、ＩＬ８、ＬＩＦ、ＴＮＦαおよびＩＬ１０ｒ）に対するデータから導かれた。ＡＤ症例とＣｏｎ症例との間の差異についてのＷａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚ実行テストは、ｐ＜０．０５。包含されるこれらの症例は、図１Ａと同じであった。
【図２Ｂ】図２Ｂは、第２の研究についての標準変量１および標準変量２のプロットである。このプロットの標準変量は、図２Ａと同じ炎症系関連のメッセージに対するデータから導かれた。ＡＤ症例とＣｏｎ症例との間の差異についてのＷａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚ実行テストは、ｐ＜０．０５。包含されるこれらの症例は、図１Ｂと同じであった。
【図２Ｃ】図２Ｃは、第３の研究についての標準変量１および標準変量２のプロットである。このプロットの標準変量は、図２Ａと同じ炎症系関連のメッセージに対するデータから導かれた。ＡＤ症例とＣｏｎ症例との間の差異についてのＷａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚ実行テストは、ｐ＜０．０５。包含されるＡＤ症例およびコントロール症例は、図１Ｃと同じであった。これには２つのパーキンソン病（「ＰＤ」）症例が追加された。
【図３】図３は、８人のＡＤ被験体および７人のコントロール被験体の最初の組（表１を参照のこと）についての第１の標準変量のプロット群である。多変量分析における細胞周期に関連の転写物は：サイクリンＤ１、サイクリンＢ、サイクリンＧ１、ｗｅｅ１、ｈＴＲ２、ＣＤＣ２５ｂ、ＧＳＫ３β、およびプロテインキナーゼＣαであった。多変量分析における炎症系関連の転写物は：Ｃ５、Ｃ１インヒビター、ＩＬ−１７ｒ、ＩＬ−８、ＬＩＦ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−１０ｒであった。多変量分析における細胞ストレス関連の転写物は：α−１抗キモトリプシン、ＨＳＰ２７、ＨＳＰ９０、クリスタリン、ＧＡＰＤＨ、フェリチンＨ、フェリチンＬ、ｃｏｘ１、ｃｏｘ２、およびトランスフェリンであった。３つ全てのプロットにおいて、初期ＡＤ症例とコントロール症例との間の差異についてのＷａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚ実行テストは、ｐ＜０．０５。
【図４】図４は、第２の組の被験体（８人のＡＤおよび８人のコントロール；表２を参照のこと）についての第１の標準変量のプロット群である。転写物は図３と同じものである。３つ全てのプロットにおいて、初期ＡＤ症例とコントロール症例との間の差異についてのＷａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚ実行テストは、ｐ＜０．０５。
【図５】図５は、第３の組の被験体（５人のＡＤ、５人のコントロールおよび２人のＰＤ）についての第１の標準変量のプロット群である。転写物は図３と同じものである。３つ全てのプロットにおいて、初期ＡＤ症例とコントロール症例との間の差異についてのＷａｌｄ−Ｗｏｌｆｏｗｉｔｚ実行テストは、ｐ＜０．０５。
【図６】図６は、銀染色した２Ｄ電気泳動ゲルである。２つの独立したヒト白血球細胞サンプルの異なるイメージは、一方のサンプル中にのみ存在するが他方には存在しないスポットを示す。
【図７】図７は、示差的に発現された単離されたタンパク質のＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析である。
【図８−１】図８は、コントロール（「ＣＴＬ」）被験体およびパーキンソン病被験体の全集団由来の末梢白血球タンパク質スポットの示差的な発現を示す１連のグラフである。コントロール被験体（ｎ＝１２）およびＰＤ（ｎ＝１２）の全集団由来のスポットの部分集合は、白血球プロテオームの示差的に発現されてたスポットを同定する能力を実証する。
【図８−２】図８は、コントロール（「ＣＴＬ」）被験体およびパーキンソン病被験体の全集団由来の末梢白血球タンパク質スポットの示差的な発現を示す１連のグラフである。コントロール被験体（ｎ＝１２）およびＰＤ（ｎ＝１２）の全集団由来のスポットの部分集合は、白血球プロテオームの示差的に発現されてたスポットを同定する能力を実証する。
【図９】図９は、実施例４に記載される実験における研究参加者の平均の基底の特徴を示すチャートの一部である。
【図１０】図１０Ａ、１０Ｂ、１０Ｃおよび１０Ｄは、銀染色されて乾燥された二次元（２Ｄ）タンパク質ゲルの４枚のスキャンした画像である。図１０Ａは、バルプロエート（ＶＰＡ）による処置の前にアルツハイマー患者から得た白血球に発現されるタンパク質のレベルを示す画像である。図１０Ｂは、ＶＰＡ処置を開始した４週間後の同じ患者からの白血球に発現されるタンパク質を示す画像である。図１０Ｃおよび図１０Ｄは、タンパク質スポット検出ソフトウェアを使用して画像が処理された後の図１０Ａおよび図１０Ｂそれぞれの画像の拡大版である。図１０Ｃおよび図１０Ｄにおいて＃２７８と標識したスポットは、ＶＰＡ処置前およびＶＰＡ処置後の示差的に発現されるタンパク質のスポットである。
【図１１】図１１は、本明細書中に開示される方法を使用して同定されてた生物マーカーの例を列挙するチャートである。
【図１２】図１２は、培養された白血球における４種の候補生物マーカーの発現に対する指示されるＶＰＡ濃度の効果を定量する４つのヒストグラムの組である。ＶＰＡ処置患者における生物マーカーとして同定される４種のタンパク質のうちの３種はまた、ＶＰＡの用量を増加させながらの処置に応答した発現の変化を実証する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
2008506415.tif 000059
【図５】
2008506415.tif 000060
【図６】
2008506415.tif 000061
【図７】
2008506415.tif 000062
【図８−１】
2008506415.tif 000063
【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2008506415.tif 000067
【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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