(57)【要約】本発明は、リウマチ性関節炎(PR)の特異的シトルリン抗タンパク質自己抗体(AAPC)により認識され得る、フィブリンのα鎖及びβ鎖に由来する新規なシトルリンペプチド、並びに生体試料中の特異的PR AAPCの存在を検出するためのその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも1つのシトルリン残基を含み、かつ：
a) 配列X1PAPPPISGGGYX2AX3 (配列番号1) (ここで、X1、X2及びX3はそれぞれ、シトルリン残基又はアルギニン残基を表し、残基X2及びX3の少なくとも一方はシトルリン残基である)により規定されるペプチド；
b) 配列GPX1VVEX2HQSACKDS (配列番号2) (ここで、X1及びX2はそれぞれ、シトルリン残基又はアルギニン残基を表し、残基X1及びX2の少なくとも一方はシトルリン残基である)により規定されるペプチド；
c) 配列SGIGTLDGFX1HX2HPD (配列番号3) (ここで、X1及びX2はそれぞれ、シトルリン残基又はアルギニン残基を表し、残基X1及びX2の少なくとも一方はシトルリン残基である)により規定されるペプチド；
d) 配列VDIDIKIX1SCX2GSCS (配列番号4) (ここで、X1及びX2はそれぞれ、シトルリン残基又はアルギニン残基を表し、残基X1及びX2の少なくとも一方はシトルリン残基である)により規定されるペプチド；
e) 配列X1GHAKSX2PVX3GIHTS (配列番号12) (ここで、X1、X2及びX3はそれぞれ、シトルリン残基又はアルギニン残基を表し、残基X1、X2及びX3の少なくとも1つはシトルリン残基である)により規定されるペプチド；
f) 少なくとも1つのシトルリン残基を含む、前記a)〜e)のペプチドの1つの少なくとも5個連続するアミノ酸を含むペプチド
からなる群より選択されることを特徴とする、リウマチ性関節炎(RA)に罹患した患者の血清中に存在する抗シトルリン化タンパク質自己抗体(ACPA)により認識される単離されたペプチド。
【請求項２】
- 少なくともX3がシトルリン残基である配列番号1の配列により規定されるペプチド、又は前記シトルリン残基を含む前記配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- 少なくともX2がシトルリン残基である配列番号2の配列により規定されるペプチド、又は前記シトルリン残基を含む前記配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- 少なくともX2がシトルリン残基である配列番号3の配列により規定されるペプチド、又は前記シトルリン残基を含む前記配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- 少なくともX1がシトルリン残基である配列番号4の配列により規定されるペプチド、又は前記シトルリン残基を含む前記配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- 少なくともX3がシトルリン残基である配列番号12の配列により規定されるペプチド、又は前記シトルリン残基を含む前記配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド
からなる群より選択されることを特徴とする請求項1に記載のペプチド。
【請求項３】
- X1、X2及びX3がシトルリン残基である配列番号1の配列により規定されるペプチド、又は前記配列を含む少なくとも16アミノ酸のペプチド；
- X1及びX2がシトルリン残基である配列番号2の配列により規定されるペプチド、又は前記シトルリン残基を含む前記配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- X1及びX2がシトルリン残基である配列番号3の配列により規定されるペプチド、又は前記シトルリン残基を含む前記配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- X1及びX2がシトルリン残基である配列番号4の配列により規定されるペプチド、又は前記シトルリン残基を含む前記配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- X1、X2及びX3がシトルリン残基である配列番号12の配列により規定されるペプチド、又は前記シトルリン残基を含む前記配列の少なくとも10個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド
からなる群より選択されることを特徴とする請求項2に記載のペプチド。
【請求項４】
末端カルボキシル官能基(COOH)が、カルボキサミド官能基(CONH2)で置換されている請求項1〜3のいずれか1つに記載のペプチド。
【請求項５】
生体試料中のRA特異的ACPAの存在を検出するための請求項1〜4のいずれか1つに記載のペプチドの使用。
【請求項６】
請求項1〜4のいずれか1つに記載の少なくとも1つのペプチドを含むことを特徴とする抗原性組成物。
【請求項７】
請求項1〜4のいずれか1つに記載の配列番号1の配列のペプチドと配列番号2の配列のペプチドとを含むことを特徴とする請求項6に記載の抗原性組成物。
【請求項８】
請求項1〜4のいずれか1つに記載の配列番号3の配列のペプチド及び／又は配列番号4の配列のペプチド及び／又は配列番号12の配列のペプチドを含むことを特徴とする請求項6又は7に記載の抗原性組成物。
【請求項９】
- 生体試料中に存在する可能性があるACPAとの抗原／抗体複合体の形成を許容する条件下で、前記試料を、請求項1〜4のいずれか1つに記載の少なくとも1つのペプチド又は請求項6〜8のいずれか1つに記載の抗原性組成物と接触させ；
- いずれの適切な手段により、形成された可能性がある抗原／抗体複合体を検出する
ことを含むことを特徴とする、生体試料中のACPAの存在を検出する方法。
【請求項１０】
- ACPAへの結合について請求項1〜4のいずれか1つで規定されるペプチドと競合できる第一のシトルリン化ペプチドを提供し；
- 生体試料中に存在する可能性があるACPAとの抗原／抗体複合体の形成を許容する条件下で、前記第一のペプチドを、前記試料と接触させ；
- いずれの適切な手段により、形成された可能性がある抗原／抗体複合体を検出する
ことを含むことを特徴とする、生体試料中のACPAの存在を検出する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、リウマチ性関節炎特異的自己抗体により認識される新規なシトルリン化ペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
リウマチ性関節炎(以下、本明細書において「RA」とする)は、リウマチの最も一般的な慢性の炎症性の形である。これは自己免疫疾患であり、罹患した患者の血清は自己抗体を含み、このうちのいくつかは特異的でありかつこの疾患のマーカーを構成できるので、非常に早期段階であってもこの診断を可能にする。よって、免疫学的診断の一般的な技術で用いることができるこれらの抗体の精製された製剤を得るために、これらの抗体により認識される抗原を同定する目的で研究が行われている。
【０００３】
RA特異的自己抗体が、(プロ)フィラグリンの種々の等電変異体を認識することが示されている(総説については、例えばSERRE及びVINCENT、Autoantibodies, PETER及びSHOENFELD編, Elsevier Science Publishers, 271〜276, 1996を参照)。これらの自己抗体は、この理由から「抗フィラグリン自己抗体(AFA)」とよばれている。出願EP 0 511 116は、これらの抗体により認識されるフィラグリンファミリーの抗原の精製及び特性決定、並びにリウマチ性関節炎の診断のためのそれらの使用を記載している。
【０００４】
続いて、AFAにより同定されるフィラグリンエピトープが、ペプチジルアルギニンデイミナーゼによるアルギニン残基の変換の結果として、シトルリン残基を有するフィラグリン分子の領域として同定された(Girbal-Neuhauser Eら, J. Immunol, 162, 585〜94, 1999; Schellekens GAら, J Clin Invest, 101, 273〜81, 1998)。ヒトフィラグリンの配列に由来する種々の合成ペプチドの分析は、抗シトルリン化タンパク質自己抗体(ACPA)とも今日ではよばれている(以下の開示においてこの名称を用いる) AFAにより認識されるエピトープを形成するために、脱イミノ化(シトルリン化)が必要であることを示している。
【０００５】
シトルリン残基の周囲環境もまた重要な役割を演じることも観察されている(Girbal-Neuhauser E, 1999, 上記; Schellekens GA, 1998, 上記; Union Aら, Arthritis Rheum, 46, 1185〜95, 2002)。抗体の結合に関して「寛大(permissive)」であり、かつその性質が抗体結合親和性をおそらく改変するいくつかのアミノ酸が同定されている。これらのアミノ酸のうち、-gly-、-ser-、-his-、-thr-及び-gln-残基は、ACPAにより認識されるエピトープを有すると現在までに同定されているシトルリン化された「フィラグリン」ペプチドのシトルリン残基のすぐ周囲の環境において、最も一般的に見いだされる(Sebbag Mら, Rev Rhum, 68, 106, 2001)。
【０００６】
ACPAにより特異的に認識され、かつRAの診断に用いることができるシトルリン化されたペプチドの多数は、フィラグリンから得られている。しかし、RAに厳密に特異的ではあるが、これらの種々のシトルリン化されたペプチドのACPAについての反応性は、不均質(heterogeneous)であり、すなわち異なるペプチドが異なる個体に由来する血清により認識される。このことは、大きい個体群におけるACPAの存在を同定できる診断試薬を得るために、いくつかの異なるペプチドを組み合わせる必要があることを意味する。
【０００７】
並行して、ACPAが、滑液膜組織形質細胞により分泌され(Masson-Bessiere Cら, Clin Exp Immunol, 119, 544〜52, 2000)、この組織に存在するフィブリンα-鎖及びβ-鎖のシトルリン化された形に特異的に指向されている(Masson-Bessiere Cら, J Immunol, 166, 4177〜84, 2001)ことが示されている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明者らは、ACPAにより認識されるエピトープをより完全に特性決定することを目的として、フィブリンα-鎖及びβ-鎖により提示されるものを同定することに着手した。この目的のために、フィブリンのα-鎖の配列由来及びβ-鎖の配列由来のシトルリン化された合成ペプチドについてのACPAを含有する血清の反応性を評価した。フィラグリン由来のシトルリン化されたペプチドのACPAとの反応プロフィールの既知の不均質性からして、本発明者らは、ACPAにより認識され得る全てのフィブリンペプチドを検出するために、これらのフィラグリン由来ペプチドの場合に観察される種々の反応性プロフィールを示すACPAを含有するように選択された血清の混合物を用いた。
【０００９】
試験したペプチドは、フィブリンのα-鎖の配列及びβ-鎖の配列から得た。フィブリンのα-鎖由来の41個及びフィブリンのβ-鎖由来の31個を含む合計で72個のペプチドを選択した。分析した72個のシトルリン化されたペプチドのうち、本発明者らは、試験した血清の混合物の一方及び／又は他方と著しく反応し、かつそれによりこれらの混合物に存在するACPAのいくつかにより認識されるエピトープを有するフィブリンのα-鎖の配列由来の13個のペプチド及びβ-鎖の配列由来の5個のペプチドを同定した。
【００１０】
本発明者らは、続いて、試験した混合物を構成する各血清を用いて同定された18個の反応性ペプチドのそれぞれを個別に分析した。この分析は、試験したペプチドのほとんどについて、フィラグリン由来のシトルリン化されたペプチドの場合に以前に観察されたACPA特異性が個々のペプチドの間(interindividual)で大きく変動することを確認した。
【００１１】
さらに、このことにより、本発明者らは、予期せぬことに、フィラグリン由来のシトルリン化されたペプチドの場合に現在までに報告されているものよりもさらに広いACPAとの反応性のスペクトルを有するペプチドを同定することが可能になった。実際に、本発明者らは、5個のシトルリン化ペプチド(フィブリンα-鎖由来の4個のペプチド及びフィブリンβ-鎖由来の1個)を同定し、これらはそれぞれ個別に、分析した血清の少なくとも40%により認識され、よって主要エピトープを有していると見られた。これらのペプチドのうち、2個は血清の大部分により認識され、かつ分析した全ての血清を含む相補的反応性プロフィールも示した。これらの血清のそれぞれは、実際に、これらのペプチドの一方及び／又は他方を認識する。このことは、これらの2つのペプチドが、ACPAにより認識される種々のモチーフの非常に大多数を代表する構造的モチーフを有することを示唆する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明の主題は、少なくとも1つのシトルリン残基を含み、かつ：
a) 配列X1PAPPPISGGGYX2AX3 (配列番号1) (ここで、X1、X2及びX3はそれぞれ、シトルリン残基又はアルギニン残基を表し、残基X2及びX3の少なくとも一方はシトルリン残基である)により規定されるペプチド；
b) 配列GPX1VVEX2HQSACKDS (配列番号2) (ここで、X1及びX2はそれぞれ、シトルリン残基又はアルギニン残基を表し、残基X1及びX2の少なくとも一方はシトルリン残基である)により規定されるペプチド；
c) 配列SGIGTLDGFX1HX2HPD (配列番号3) (ここで、X1及びX2はそれぞれ、シトルリン残基又はアルギニン残基を表し、残基X1及びX2の少なくとも一方はシトルリン残基である)により規定されるペプチド；
d) 配列VDIDIKIX1SCX2GSCS (配列番号4) (ここで、X1及びX2はそれぞれ、シトルリン残基又はアルギニン残基を表し、残基X1及びX2の少なくとも一方はシトルリン残基である)により規定されるペプチド；
e) 配列X1GHAKSX2PVX3GIHTS (配列番号12) (ここで、X1、X2及びX3はそれぞれ、シトルリン残基又はアルギニン残基を表し、残基X1、X2及びX3の少なくとも1つはシトルリン残基である)により規定されるペプチド；
f) 少なくとも1つのシトルリン残基を含む、上記のa)〜e)のペプチドの1つの少なくとも5個連続するアミノ酸、好ましくは少なくとも7個連続するアミノ酸、有利には8〜14個連続するアミノ酸を含むペプチド
からなる群より選択されることを特徴とする、リウマチ性関節炎(RA)に罹患した患者の血清中に存在する抗シトルリン化タンパク質自己抗体(ACPA)により認識される単離されたペプチドである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明によるペプチドは、少なくとも5アミノ酸のサイズであり、好ましくは5〜25アミノ酸のサイズであり、最も好ましくは10〜20アミノ酸のサイズである。
【００１４】
本発明によるペプチドの好ましい実施形態によると、これは：
- 少なくともX3がシトルリン残基である配列番号1の配列により規定されるペプチド、又は該シトルリン残基を含む該配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- 少なくともX2がシトルリン残基である配列番号2の配列により規定されるペプチド、又は該シトルリン残基を含む該配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- 少なくともX2がシトルリン残基である配列番号3の配列により規定されるペプチド、又は該シトルリン残基を含む該配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- 少なくともX1がシトルリン残基である配列番号4の配列により規定されるペプチド、又は該シトルリン残基を含む該配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- 少なくともX3がシトルリン残基である配列番号12の配列により規定されるペプチド、又は該シトルリン残基を含む該配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド
から選択される。
【００１５】
特に好ましくは、本発明によるペプチドは：
- X1、X2及びX3がシトルリン残基である配列番号1の配列により規定されるペプチド、又は該配列を含む少なくとも16アミノ酸のペプチド；
- X1及びX2がシトルリン残基である配列番号2の配列により規定されるペプチド、又は該シトルリン残基を含む該配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- X1及びX2がシトルリン残基である配列番号3の配列により規定されるペプチド、又は該シトルリン残基を含む該配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- X1及びX2がシトルリン残基である配列番号4の配列により規定されるペプチド、又は該シトルリン残基を含む該配列の少なくとも5個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド；
- X1、X2及びX3がシトルリン残基である配列番号12の配列により規定されるペプチド、又は該シトルリン残基を含む該配列の少なくとも10個連続するアミノ酸のフラグメントを含むペプチド
から選択される。
【００１６】
本発明によるシトルリン化されたペプチドは、例えば、フィブリン若しくはフィブリノゲンの天然、組換え又は合成のフラグメントから、ペプチジルアルギニンデイミナーゼ(PAD)の作用により得ることができる。これらは、合成されたペプチドに1つ又は複数のシトルリン残基を直接組み込むことにより、ペプチド合成により得ることもできる。
【００１７】
本発明によるシトルリン化されたペプチドは、配列番号1〜4及び12のペプチドの誘導体又は上記で規定するそれらのフラグメントも含み、該誘導体は、ACPAによるその認識を向上することを意図する改変を有する。このような誘導体の例としては、環状ペプチド；L-アミノ酸が、再現されるペプチドの配列の逆の配列に従って一緒に連結されたretro型ペプチド；再現されるペプチドの配列の逆の配列に従って一緒に連結されたD系列のアミノ酸(天然ペプチドのL系列のアミノ酸の代わりに)からなるretro-inverso型ペプチドが挙げられる。
【００１８】
非常に有利には、該ペプチドは、末端カルボキシル官能基(COOH)がカルボキサミド官能基(CONH2)で置換されたペプチドである。この場合、特に好ましいペプチドは、C-末端残基がシトルリン残基であり、そのカルボキシル官能基がカルボキサミド官能基で置換されているものである。
【００１９】
本発明の主題は、リウマチ性関節炎に罹患した患者の血清に存在するACPAにより認識され、かつそのC-末端の端にシトルリン残基を含有し、そのカルボキシル官能基がカルボキサミド官能基で置換されているいずれのペプチドでもある。有利には、上記のペプチドは、その配列中に少なくとも1つの他のシトルリン残基を含有する。好ましくは、該ペプチドは、5〜25アミノ酸を含む。
【００２０】
C-末端のシトルリン残基のカルボキシル官能基をカルボキサミド官能基に置き換えることにより、ペプチドのACPAとの反応性を増加させるか、又は天然には反応性でないペプチドをACPAに対して反応性にすることが可能になる。
【００２１】
本発明によるシトルリン化されたペプチドは、配列番号1〜4及び12のペプチドの誘導体又は上記で規定されるそれらのフラグメントをも含み、該誘導体は、それらの合成を促進すること及び／又はそれらの安定性を改善することを意図する改変を有する。このような誘導体の例としては、そのカルボキシル基がエステル化されているか若しくはアミド基に変換されているアミノ酸及び／又はそのアミド基がアルキル化、例えばメチル化若しくはアセチル化されているアミノ酸を含むペプチドが挙げられる。ペプチドのアミノ基及びカルボキシル基は、塩基又は酸に対応する塩の形で存在できる。
【００２２】
上記のシトルリン化されたペプチドから、少なくとも1つのシトルリン残基を含むミモトープペプチド(シトルリン化ミモトープペプチド)を得ることも可能である。
これらのミモトープペプチドは、本発明の配列番号1、2、3、4及び12のペプチドの配列に基づいてその配列が規定される、この関係において「モデルペプチド」として用いられるシトルリン化されたペプチドのライブラリをスクリーニングすることにより得ることができる。
【００２３】
好ましくは、これらのペプチドライブラリは、10〜20、好ましくは12〜17アミノ酸、特に15アミノ酸のサイズの種々のペプチドを合成することにより作製される。これらのペプチドのそれぞれは、選択されたモデルペプチドと同じ位置に、選択されたモデルペプチドの配列の、少なくとも1個のシトルリン残基を含んで少なくとも2個、好ましくは少なくとも4個、有利には少なくとも6個、特に好ましくは少なくとも8個、非常に有利には少なくとも10個のアミノ酸を保存しており、その他の位置は変動可能である。
【００２４】
これらのライブラリは、以下の実施例に記載されるようにして、特に、以下の実施例1で規定されるような種々のACPA反応性プロフィールの代表である血清を用いて、有利にスクリーニングできる。
【００２５】
ミモトープペプチドの合成方法は、それら自体で公知である。例えば、参照として、"Chemical approaches to the synthesis of peptides and proteins", Paul Lloyd-Williams, Fernando Albericio and Ernest Giralt, CRC Press New York, 1997の第6章"Peptide libraries",第237〜270頁が挙げられる。
【００２６】
これらのシトルリン化されたミモトープペプチドは、単独で又はその他のシトルリン化されたペプチドとの組み合わせで、好ましくは本発明のその他のペプチドの少なくとも1つとの組み合わせで、RAの診断試験において、ACPAを認識するために用いることができる。
【００２７】
本発明の主題は、上記で規定される本発明によるペプチドの、RAのインビトロ診断の関係において生体試料中のACPAの存在を検出するための使用でもある。
【００２８】
本発明の主題は、よって、RAのインビトロ診断の関係において生体試料中のACPAの存在を検出するために用いることができる抗原性組成物であり、該組成物は、本発明による少なくとも1つのペプチドを含むことを特徴とする。
【００２９】
本発明による組成物は、本発明によるペプチドから選択される別々の種々のペプチドと互いに結合させる(associate with)ことができるか、又は本発明による1つ若しくは複数のペプチドを特にフィラグリンに由来する1つ又は複数のシトルリン化されたペプチドと結合させることができる。
本発明による抗原性組成物の好ましい実施形態によると、これは、上記で規定される配列番号1の配列の少なくとも1つのペプチドと、配列番号2の配列の少なくとも1つのペプチドとを含む。
【００３０】
この組成物は、非常に広い反応性のスペクトルを有し、早期段階でのRAを検出することも可能にする。
有利には、本発明による組成物は、上記で規定される配列番号3の配列のペプチド及び／又は配列番号4の配列のペプチド及び／又は配列番号12の配列のペプチドも含むことができる。
【００３１】
本発明による組成物は、適切な場合に、構成的なペプチドが互いに又は担体分子と、通常は共有結合により結合している多ペプチド組成物(multi-peptide compositions)の形であり得る。例としては、TAMにより特に記載される多価抗原ペプチド(MAP) (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 85, 5409〜13, 1988)が挙げられる。
【００３２】
本発明の主題は、RAのインビトロ診断の関係において、生体試料中のACPAの存在を検出する方法でもあり、該方法は：
-     生体試料中に存在する可能性があるACPAとの抗原／抗体複合体の形成を許容する条件下で、該試料を、上記で規定される本発明による少なくとも1つのペプチド又は1つの抗原性組成物と接触させ；
-     いずれの適切な手段により、形成された可能性がある抗原／抗体複合体を検出する
ことを含むことを特徴とする。
【００３３】
この検出方法は、本発明による少なくとも1つのペプチド又は1つの抗原性組成物と、適切である場合は、抗原／抗体複合体の形成を許容する反応媒体をつくるのに適するバッファー及び試薬(reagents)、及び／又は該抗原／抗体複合体を検出するための手段を含むキットにより行うことができる。
【００３４】
有利には、上記のキットは、固体の基体に固定化された本発明によるペプチド又は抗原性組成物を含む。用いることができる固体の基体の限定しない例としては、マイクロタイトレーションプレート、VIDAS (登録商標)デバイスのピペットチップ(BIOMERIEUXにより販売)、ビーズ、マイクロビーズ又はマイクロ粒子、ストリップなどを挙げることができる。
上記のキットは、1つ若しくは複数の陰性の血清、又は1つ若しくは複数の陽性の血清のような対照試料も含み得る。
【００３５】
本発明の主題は、RAのインビトロ診断の関係において、生体試料中のACPAの存在を検出する方法でもあり、該方法は：
-     ACPAへの結合について上記で規定されるような本発明によるペプチドと競合できる第一のシトルリン化されたペプチドを提供し；
-     生体試料中に存在する可能性があるACPAと抗原／抗体複合体の形成を許容する条件下で、上記の第一のペプチドを、該試料と接触させ；
-     いずれの適切な手段により、形成された可能性がある抗原／抗体複合体を検出する
ことを含むことを特徴とする。
【００３６】
特に、本発明によるペプチドと競合可能な第一のシトルリン化されたペプチドは、上記に記載されるようにして得ることができるシトルリン化ミモトープペプチドである。
【００３７】
本発明は、本発明によるペプチドの同定及びACPAについてのそれらの反応性プロフィールの証明について記載する実施例を参照する以下のさらなる記載から、より明確に理解される。
【実施例】
【００３８】
実施例1：フィラグリン由来のシトルリン化されたペプチドとのACPAの反応の不均質性の証明、及び種々の反応性プロフィールの代表である血清の混合物の取得
インビトロで脱イミノ化されたヒトフィブリノゲンに対するELISA及びイムノブロッティングの両方(Masson-Bessiere C, 2001, 上記; Nogueira L et al., Arthritis Res, 4, 90, 2002)により検出可能であるが、ラットの食道の凍結切片に対する間接的免疫蛍光(Vincent Cら, Ann Rheum Dis, 48, 712〜22, 1989)及びヒト表皮フィラグリンに対するイムノブロッティング(Vincent Cら, J Rheumatol, 25, 838〜46, 1998)によっても検出可能なACPAを示す90個の血清を用いた。これらの90個の多重陽性(multipositive)血清の反応性を、5個の異なるシトルリン化されたペプチドに関するELISAにより分析したが、ACPAに関するその反応性は、以前に確立されている。これらのペプチドは、次のとおりである。
E12D        ESSRDGSXHPRSHD          (配列番号5)
T12E        TGSSTGGXQGSHHE          (配列番号6)
E12H        EQSADSSXHSGSGH          (配列番号7)
cfc6        SHQESTXGXSRGRSGRSGS     (配列番号8)
cf48-65-4   TIHAHPGSXXGGRHGYHH      (配列番号9)
(Xは、シトルリン残基を表す)
【００３９】
ペプチドE12D、T12E及びE12Hは、Girbal-Neuhauser, E.ら(1999)により記載され、ペプチドcfc6及びcf48-65-4は、Schellekens, G.ら(1998)により記載された。
【００４０】
ELISAによる分析は、Girbal-Neuhauser, E.ら(1999)により記載されたプロトコルに従って行った。
この分析により、5個のペプチドに関して12の反応性プロフィールを同定することができた。
これらのプロフィールを、以下の表Iにまとめる。
【００４１】
【表１】
2008518898.tif 000002
【００４２】
種々のACPA反応性プロフィールをできる限り代表するために、混合物(以下、本明細書においては混合物「A」及び「B」という)を、「フィラグリン」ペプチドに対する反応性の種々のプロフィールを示す10個の血清を等しい部(parts)で混合することにより、それぞれ作製した。
【００４３】
これらの2つの混合物の組成を、以下の表IIに示す。
【表２】
2008518898.tif 000003
【００４４】
2つの混合物A及びBは、ともに、ACPA+血清の特異性の不均質性を表す。
【００４５】
実施例2：ACPAと反応するフィブリンα-鎖及びβ-鎖に由来するシトルリン化されたペプチドの同定
試験されたペプチドは、フィブリンα-鎖の配列及びフィブリンβ-鎖の配列から得た[それぞれ、フィブリノゲンのA(α)鎖(参照NPアクセッション：NP_068657)及びB(β)鎖(参照SWISSPROT FIBB_HUMAN Prim.アクセッション：P02675)の残基36〜635及び45〜491に相当する部分]。フィブリノゲンのA(α)鎖及びB(β)鎖の残基1〜635及び1〜491の配列は、それぞれ、添付の配列表に配列番号10及び配列番号11の番号の下で、及び図1A及びBにも示している。図1において太字で示す配列は、タンパク質のシグナル配列のものであり、それらのフィブリノペプチドの配列がそれに続く(A及びBのそれぞれ)。
【００４６】
フィブリンのα-鎖及びβ-鎖のそれぞれは、15アミノ酸の連続する配列に分割され、少なくとも1つのアルギニン残基を含む全てのペプチドを選択した。アルギニン残基がNH2-又はCOOH-末端に位置するペプチドの場合、配列中で末端アルギニン残基が再び中心になる(recenter)様に、第一シリーズのペプチドにオーバーラップする第二シリーズの15アミノ酸のペプチドを選択した。さらに、フィブリンα-鎖の残基621〜629に相当するペプチドを合成した。合計で、フィブリンα-鎖に由来する41個及びフィブリンβ-鎖に由来する31個を含む72個のペプチドを選択した。ペプチドのそれぞれについて、アルギニン残基を有する形(天然形)及び全てのアルギニン残基がシトルリン残基で置換された形(シトルリン化形)を、Merrifieldの固相合成法に従って、≧60%の純度で合成した[NeoMPS社(Strasbourg, France)]。
【００４７】
選択したシトルリン化ペプチドを、以下の表IIIに列挙する。
【表３】
2008518898.tif 000004
【００４８】
用いた命名法は、次のとおりである：その配列が由来するフィブリノゲンのポリペプチド鎖(α又はβ)の起源の名前、次いでペプチドのアミノ末端残基のこの配列における位置−ペプチドのカルボキシ末端残基の位置。これらの位置は、フィブリノゲンのN-末端に対して番号付与されている。Citの名称は、それがペプチドのシトルリン化された形であることを示す。シトルリン残基で置換されたアルギニン残基の位置は、添え字(index)として示す。ペプチドのシトルリン化された形のみを示す。
【００４９】
ペプチドのそれぞれの対(シトルリン化されたものとシトルリン化されていないもの)は、ACPAを含まない10個の血清の等しい部での混合物(コントロール混合物)、及び実施例1に記載されるA及びBの2つの混合物を用いるELISAによりアッセイした。
【００５０】
ペプチドは、照射ポリスチレンプレート(Nunc Maxisorp)を、3つの異なるバッファー(酢酸、pH 5.0；PBS、pH 7.4；及び炭酸、pH 9.0)中で、非常に不均質な等電点(シトルリン化されていない形について4〜12の範囲)を示すペプチド(10μg/ml)の受動的結合の機会を最適化するようにコートした後に試験した。ペプチドのそれぞれの対(天然及びシトルリン化された形)は、同じプレート上で試験し、コントロールペプチドの対、すなわちシトルリン化された「フィラグリン」ペプチドcfc6とその対応する天然ペプチドcf0 (Schellekens GA, 1998, 上記)とを各実験に含み、このことにより、アッセイ間の変動係数を算出し、補正を行うことが可能であった。
【００５１】
PBS-2% BSA中での飽和の後に、PBS 2M NaCl - 2% BSA中で1/50まで希釈した血清の混合物をインキュベートし、次いで、それらの結合を、PBS-2% BSA中で1/1000まで希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトIgGヤギIgGs (Southern)を用いて明らかにした。全てのインキュベーションは、4℃にて1時間行い、その後、PBS-0.1% Tween中で洗浄した。ペルオキシダーゼ活性は、オルトフェニレンジアミン(2 mg/ml - Sigma)の過酸化水素(0.03% - Sigma)溶液を用いて視覚化した。反応は、4M硫酸を加えることにより5分後に停止し、492 nmでの吸光度(OD)を、自動分光光度計(Multiskan, Thermo Labsystems)により測定した。
【００５２】
シトルリン化されたペプチドについての血清混合物の特異的反応性は、シトルリン化されたペプチドを用いて得られたODと対応する天然ペプチドを用いて得られたODとの差(デルタOD)に対応した。結果は、2つの測定の平均に対応する。3つのバッファーの少なくとも1つの中でのコーティングの後に、2つの混合物A及びBの少なくとも1つについて0.250より大きいデルタODを得ることができたシトルリン化されたペプチドはいずれも、反応性があると考えた。
【００５３】
分析した72個のシトルリン化されたペプチドのうち、フィブリンα-鎖の配列に由来する13個のペプチド、及びβ-鎖の配列に由来する5個のペプチドは、ACPAにより認識されるエピトープを有することが見出された。これらのペプチドのうち、6個は非常に反応性であり(デルタOD≧1.5)、8個のペプチドは中程度に反応性であり(0.5≦デルタOD＜1.5)、そして4つのペプチドは比較的無反応性であった(0.25≦デルタOD＜0.5)。その他のシトルリン化されたペプチドは、わずかに反応性であるか、又は無反応性であることが示された(0.0≦デルタOD＜0.25)。コントロール混合物との反応性は観察されず、このことにより、ACPAにより認識されるエピトープを有する反応性ペプチドを同定することができた。
【００５４】
18個の反応性ペプチドについて得られた結果を、次の表IVに示す。
【表４】
2008518898.tif 000005
【００５５】
実施例3：ACPAと反応するシトルリン化ペプチドの反応性プロフィール
最も反応性のエピトープを有する14個のペプチド(3つのコーティングバッファーの少なくとも1つを用いて、血清混合物の一方又は他方(A及びB)についてデルタOD≧0.5)を、これらのペプチドのそれぞれの反応性プロフィールを評価するために、混合物A及びBを構成する20個の血清を用いて、独立して試験した。試験は、ペプチドのそれぞれの対について、選択したコーティングバッファーがスクリーニングの間にそのペプチドに関して最も強い反応性を得ることを可能にしたもの(血清混合物A及びBについてそれぞれ得られたデルタODの合計が最大であったバッファー)である以外は、上記の実施例2と同じ条件下でELISAにより行った。さらに、血清の希釈度は、それらが脱イミノ化されたフィブリノゲン全体について等しい結合活性を有するように調整した。つまり、各血清について、脱イミノ化されたフィブリノゲンに対してELISAにより1のODを得ることを可能にする希釈度を選択した(Nogueira L, 2002, 上記)。希釈度は、1/20〜1/2700の範囲であった。
結果を、以下の表Vに示す。
【００５６】
【表５】
2008518898.tif 000006
【００５７】
実施例4：そのC-末端官能基がカルボキシル(COOH)であるか又はカルボキサミド(CONH2)であるかによるペプチドβ60-74Cit60,72,74の反応性の比較
ELISAプレートを、全てPBS中で希釈した、カルボキシ-末端シトルリン残基のC-末端官能基がアミド化されていないペプチドβ60-74Cit60,72,74 (末端COOH官能基を有する形、以下、本明細書において「非アミド化形」という)、カルボキシ-末端シトルリン残基のC-末端官能基がアミド化されたペプチドβ60-74Cit60,72,74 (末端CONH2官能基を有する形、以下、本明細書において「アミド化形」という)、及びシトルリン化されていないペプチドβ60-74 (カルボキシ-末端アルギニン残基のC-末端官能基がアミド化されていない)でコートした。実施例1で記載した血清混合物A及びBを、実施例2に記載した方法に従って試験した。実施例2と同様に、非アミド化形又はアミド化形のペプチドの特異的反応性は、これらの2つのシトルリン化ペプチドを用いて得られるODと、シトルリン化されていないペプチドβ60-74を用いて得られるODとの差に対応した。ペプチドのアミド化形の反応性は、非アミド化形のものよりも明らかに大きいことがわかったが、これは著しいものであった。結果は、2つの実験の平均に相当し、それぞれ2回の測定を含む。結果を、以下の表VIに示す。
【００５８】
【表６】
2008518898.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】フィブリノゲンのA(α)鎖及びB(β)鎖の残基1〜635及び1〜491の配列を示す。
【図１】
2008518898.tif 000008
【配列表】
2008518898000001.app
【国際調査報告】
2008518898.tif 000009
2008518898.tif 000010
2008518898.tif 000011
2008518898.tif 000012
2008518898.tif 000013
2008518898.tif 000014