(57)【要約】  本発明は、卵巣癌及び肺癌の診断、スクリーニング、処置、及び予防におけるＰＳＫ−１の新規な使用に関する。本発明は、ワクチン、ＰＳＫ−１に免疫特異的である抗体、及びＰＳＫ−１と相互作用する物質、又はＰＳＫ−１の発現若しくは活性を調節し、或いはＰＳＫ−１をコードする核酸の発現を調節する物質を含めた、ＰＳＫ−１を含む組成物も提供する。
2008540624.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌の処置及び／又は予防のための薬物を製造するための、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用し、又はＰＳＫ−１ポリペプチドの発現若しくは活性を調節する物質の使用。
【請求項２】
前記物質が、抗体、その機能的に活性なフラグメント、誘導体、又は類似体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記抗体が、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、若しくは二重特異性であり、又は治療用部分、検出可能な標識、第二の抗体若しくはそのフラグメント、エフェクター分子若しくはレポーター分子、細胞傷害物質、若しくはサイトカインにコンジュゲートしている、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
癌の処置及び／又は予防のための薬物を製造するための、ＰＳＫ−１ポリペプチドの使用。
【請求項５】
前記薬物がワクチンである、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
ＰＳＫ−１ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含み、若しくはそれからなり、
（ｂ）ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を保持する配列番号１のアミノ酸配列に対して、１つ若しくは複数のアミノ酸の置換、修飾、欠失、若しくは挿入を有する誘導体であり、又は
（ｃ）少なくともアミノ酸１０個の長さであり、ＰＳＫ−１の活性を保持する、上記（ａ）若しくは（ｂ）のフラグメントである、
請求項１から５までのいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用し、又はＰＳＫ−１ポリペプチドの発現若しくは活性を調節する物質の治療有効量を投与することを含む、癌の処置及び／又は予防のための方法。
【請求項８】
前記物質が、抗体、その機能的に活性なフラグメント、誘導体、又は類似体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体が、モノクローナル、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、若しくは二重特異性であり、又は治療用部分、検出可能な標識、第二の抗体若しくはそのフラグメント、エフェクター分子若しくはレポーター分子、細胞傷害物質、若しくはサイトカインにコンジュゲートしている、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
ＰＳＫ−１ポリペプチドを含む組成物の治療有効量を投与することを含む、癌の処置及び／又は予防のための方法。
【請求項１１】
前記組成物がワクチンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ＰＳＫ−１ポリペプチドが、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含み、若しくはそれからなり、
（ｂ）ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を保持する配列番号１のアミノ酸配列に対して、１つ若しくは複数のアミノ酸の置換、修飾、欠失、若しくは挿入を有する誘導体であり、又は
（ｃ）少なくともアミノ酸１０個の長さであり、ＰＳＫ−１の活性を保持する、上記（ａ）若しくは（ｂ）のフラグメントである、
請求項７から１１までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
（ａ）前記ポリペプチドを候補物質と接触させるステップと、
（ｂ）候補物質が前記ポリペプチドと相互作用をするか否かを決定するステップと
を含む、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する抗癌剤をスクリーニングするための方法。
【請求項１４】
候補物質とＰＳＫ−１ポリペプチドとの間の相互作用の決定が、候補物質と前記ポリペプチドとの結合を定量的に検出することを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
（ｉ）候補物質の存在下での前記ポリペプチドの発現若しくは活性を、候補物質の非存在下若しくはコントロール物質の存在下での前記ポリペプチドの発現若しくは活性と比較するステップと、
（ｉｉ）候補物質が前記ポリペプチドの発現若しくは活性に変化をもたらすか否かを決定するステップと
を含む、ＰＳＫ−１ポリペプチドの発現又は活性を調節する抗癌剤をスクリーニングする方法。
【請求項１６】
前記ポリペプチドの発現又は活性を、予め決定した参照範囲と比較する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
パート（ｉｉ）が、さらに試験するために、又は抗癌剤としての治療用若しくは予防用の使用のために、前記ポリペプチドと相互作用し、又は前記ポリペプチドの発現若しくは活性を調節する物質を選択することをさらに含む、請求項１５又は１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ポリペプチドと相互作用し、又は前記ポリペプチドの発現若しくは活性の変化をもたらす、請求項１３から１７までのいずれか一項に記載の方法により同定される物質。
【請求項１９】
対象から得た生物学的サンプルにおいてＰＳＫ−１ポリペプチドの発現を検出及び／又は定量するステップを含む、前記対象における癌をスクリーニングし、且つ／又は診断し若しくは予後診断し、且つ／又は癌の治療の有効性をモニタリングする方法。
【請求項２０】
前記ポリペプチドの発現を、予め決定した参照範囲又はコントロールと比較する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
検出のステップが、
（ａ）サンプルを、ＰＳＫ−１ポリペプチドに特異的である捕獲試薬と接触させるステップと、
（ｂ）捕獲試薬と、サンプルにおける前記ポリペプチドとの間に結合が起こったか否かを検出するステップと
を含む、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
ステップ（ｂ）が、直接的又は間接的に標識した検出試薬を用いて捕獲したポリペプチドを検出することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
捕獲試薬が固相上に固定化されている、請求項２１又は２２に記載の方法。
【請求項２４】
ポリペプチドを、ＰＳＫ−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて検出及び／又は定量する、請求項１３から１７までのいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
抗体が検出可能な標識、又は第２の抗体若しくはそのフラグメントにコンジュゲートしている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
ＰＳＫ−１ポリペプチドに特異的な捕獲試薬、試薬、及び使用のための指示書を含む、診断用キット。
【請求項２７】
癌腫が、乳癌、肺癌、卵巣癌、又は骨肉腫である、請求項１から６までのいずれか一項に記載の使用、又は請求項７から１７まで若しくは１９から２５までのいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリペプチドＰＳＫ−１のターゲティング、前記ポリペプチドと相互作用し、又は前記ポリペプチドの発現若しくは活性を調節する物質、そのような物質を同定するための方法、及び癌の診断におけるＰＳＫ−１の使用を含む、癌の処置及び／又は予防のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
乳癌は、女性で最も頻繁に診断される癌である。乳癌を初期に検出するためのスクリーニングプログラムの実施により、並びに、外科切除を増強するための、化学療法、放射線治療、及び抗エストロゲン剤治療などの抗癌処置の出現により、乳癌患者の生存は向上している。しかし、癌細胞は化学療法薬に対する耐性を発生させ、又はそれらのホルモン感受性を失わせ、しばしば不治である再発又は転移性の疾患をもたらすので、いくつかの乳房腫瘍は、このような処置に対して抵抗性になっている。より最近では、腫瘍細胞に対する宿主の免疫反応を開始させ標的とする手段として、癌のワクチン及びモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などの免疫療法の発展に注目が集まっている（Ｇｒｅｅｎ，ＭＣ．ら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ．Ｒｅｖ．、２６巻、２６９〜２８６頁；Ｄａｖｉｓ，ＩＤ．、２０００年，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、７８巻、１７９〜１９５頁；Ｋｎｕｔｈ，Ａ．ら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４６巻、Ｓ４６〜５１頁；Ｓｈｉｋｕ，Ｈ．ら、２０００年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４６巻、Ｓ７７〜８２頁；Ｓａｆｆｒａｎ，ＤＣ．ら、１９９９年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  Ｒｅｖ．、１８巻、４３７〜４４９頁）。ｅｒｂＢ２／ＨＥＲ２−ｎｅｕ受容体タンパク質を認識するｍＡｂであるハーセプチンは、転移性の乳癌に対する処置として用いられている。化学療法だけを受けている患者と比べた場合、化学療法とハーセプチンを組み合わせると、疾患が進行するまでの時間を延長することが示されている（Ｂａｓｅｌｇａ，Ｊ．ら、１９９８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５８巻、２８２５〜２８３１頁）。しかし、ハーセプチンは、腫瘍がｅｒｂＢ２タンパク質を過剰発現している患者の１０〜２０％を処置するのに有効であるにすぎない。したがって、生存している対象における乳癌を診断するのに感受性があり、且つ特異的な生物マーカーとして使用するための、新規な乳癌関連のタンパク質を同定する、ますます重要な必要性が存在する。さらに、速やかに、強力に、特異的に、且つより少ない副作用で働く、乳癌を処置するための新規な治療用物質が明らかに必要とされている。
【０００３】
肺癌は、男性及び女性の両方における癌の死亡の大きなパーセント値を占めている。肺癌には２つの主要なタイプ、即ち、非小細胞肺癌、及び小細胞肺癌がある。処置は外科手術、並びに可能な場合は化学療法及び放射線治療に限られている。肺癌の処置における問題は、前悪性の疾患を有するヒトをより念入りにモニタリングし、化学防御薬で処置することができるように、初期の検出のよりよい手段を開発すること、及び肺癌を処置するよりよい治療法を開発することである。
【０００４】
卵巣癌は、婦人科の癌のうち最も致命的であり、より一般的な上皮性の卵巣癌の罹患者の約７０％が、後期の疾患を最初に呈する。癌が上腹部に広がってしまうので、生存率は、初期の疾患を示す患者に比べて著しく低減する。卵巣癌は、一般にシスプラチンベースの化学療法で処置され、シスプラチン耐性の獲得によりしばしば再発し（Ｙａｈａｔａ，Ｈ．ら、２００２年、Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．、１２８巻、６２１〜６頁）、それゆえ、新規な薬物及び新規な治療上の標的が必要とされている。現在のマーカーは、大集団に適用可能である十分な感受性及び特異性を欠くので、卵巣癌の新規なマーカーも必要とされている（Ｒａｉ，Ａ．ら、２００２年、Ａｒｃｈ．Ｐａｔｈｏｌ．Ｌａｂ．Ｍｅｄ．、１２６巻、１５１８〜２６頁）。
【０００５】
骨肉腫は、骨の病変を特徴とする、主に小児期の疾患である。２０％を超える患者が、最も頻繁には生検による確定診断で、後期の骨肉腫と診断される。処置は、一般には外科手術と組み合わせた化学療法である。したがって、新規な治療上の標的、及び、また、初期の診断を可能にする骨肉腫のマーカーに対する必要性が存在する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＰＳＫ−１と同一のポリペプチド配列は、国際公開ＷＯ０１／２５２６８、ＷＯ００／５８４７３、ＷＯ０１／５７１９０、及び０２／６０３１７に開示されている。ＷＯ２００４０４８９３８は、軟部組織肉腫の検出におけるＰＳＫ−１に対する抗体の使用を開示している。乳房、肺、若しくは卵巣の癌、又は骨肉腫におけるＰＳＫ−１の関与を示唆する特許又は出願はない。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、ＰＳＫ−１は、癌の処置及び／又は予防に対する新規な治療上の標的を示すという発見に基づくものである。
【０００８】
したがって、本発明は、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用し、又はＰＳＫ−１ポリペプチドの発現若しくは活性を調節する物質の治療有効量を投与することを含む、癌の処置及び／又は予防のための方法を提供する。
【０００９】
ＰＳＫ−１ポリペプチドは、
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含み、若しくはそれからなり、
（ｂ）ＰＳＫ−１の活性を保持する配列番号１のアミノ酸配列に対して、１つ若しくは複数のアミノ酸の置換、修飾、欠失、若しくは挿入を有する誘導体であり、又は
（ｃ）少なくともアミノ酸１０個の長さであり、ＰＳＫ−１の活性を保持する、上記（ａ）若しくは（ｂ）のフラグメントである
ポリペプチドを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
「ポリペプチド」の語は、ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質を含む。これらは別段の定義がなされない限り、交換可能に用いられる。
【００１１】
本発明において、「癌腫」の語は、皮膚、又はより一般には身体組織の裏打ち、例えば、乳房、前立腺、肺、腎臓、膵臓、胃、膀胱、又は腸に見られる上皮に生じる、悪性の新規な増殖を含む。癌腫は、隣接の組織中に浸潤し、遠位の器官、例えば、骨、肝臓、肺、又は脳に拡張（転移）する傾向がある。
【００１２】
本発明の一実施形態では、癌腫は乳癌である。別の一実施形態では、癌腫は肺癌である。さらなる実施形態では、癌腫は、卵巣癌であり、なお別の実施形態では、癌は骨肉腫である。
【００１３】
本発明の方法で用いる物質には、制限なく、ＰＳＫ−１ポリペプチド、若しくはＰＳＫ−１ポリペプチドをコードする核酸分子と相互作用する（例えば、それに結合し、若しくは認識する）ことができる物質、又はＰＳＫ−１ポリペプチドの相互作用、発現、活性、若しくはＰＳＫ−１ポリペプチドをコードする核酸分子の発現を調節することができる物質が含まれる。このような物質には、制限なく、抗体、核酸（例えば、ＤＮＡ、及びＲＮＡ）、炭化水素、脂質、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチドミメティックス、小分子、並びに他の薬物が含まれる。
【００１４】
したがって、本発明は、癌の処置及び／又は予防のための薬物を製造するためのＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用し、又はＰＳＫ−１ポリペプチドの発現若しくは活性を調節する物質の使用も提供する。
【００１５】
最も好ましくは、癌の処置及び／又は予防に使用するための物質は、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用し（即ち、それと結合し、若しくはそれを認識し）、又はその活性を調節する抗体である。したがって、癌の処置及び／又は予防のための薬物を製造するための、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する抗体の使用が提供される。また、ＰＳＫ−１と相互作用する抗体の治療有効量を対象に投与することを含む、前記対象における癌の処置及び／又は予防の方法も提供される。
【００１６】
ＰＳＫ−１ポリペプチドと特異的に相互作用する抗体が最も好ましい。特異的に相互作用する（例えば、認識する、又はそれに結合する）ことは、抗体が、他のポリペプチドに対するよりもＰＳＫ−１ポリペプチドに対して大きな親和性を有することを意味する。
【００１７】
一実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する抗体を用いて、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）及び／又は補体依存性細胞傷害活性（ＣＤＣ）をもたらすことができる。このような場合では、抗体は、全長のネイキッドの抗体が好ましい。別の実施形態では、抗体は、機能的な効果、例えば、アゴニストの、又はアンタゴニストの抗体を有する。最も好ましくは、ＡＤＣＣを媒介する抗体は、機能的な効果も有し、例えば、抗体は、例えば、ＰＳＫ−１ポリペプチドに対するリガンドの結合を防止する阻止抗体であってよく、且つ／又は抗体は、直接的又は間接的にシグナル経路を阻害し、若しくは活性化することができる。本発明の別の態様では、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する抗体を用いて、前記ポリペプチドの活性を阻害することができる。一例では、ＰＳＫ−１ポリペプチドと交互作用する抗体を用いて、細胞の増殖を阻害することができる。したがって、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する抗体を用いて細胞の増殖を阻害する方法を提供する。さらなる一実施形態では、抗体は、アポトーシス促進性である。
【００１８】
特定の実施形態では、抗体は、癌関連の間質細胞上に提示されたＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する。
【００１９】
他の実施形態では、本発明は、例えば、それだけには限定されないが、抗体又はそのフラグメントが、場合によりＮ末端又はＣ末端で、別のタンパク質（又はその部分、好ましくはタンパク質の、少なくとも１０、２０、若しくは５０個のアミノ酸の部分）のアミノ酸配列に共有結合（例えば、ペプチド結合）により融合している場合に、抗体の融合タンパク質（又はその機能的に活性なフラグメント）の治療上の使用を提供する。好ましくは、抗体、又はそのフラグメントは、抗体の定常ドメインのＮ末端で他のタンパク質に連結している。別の一態様では、抗体の融合タンパク質は、本明細書に記載するようにポリペプチドの枯渇又は精製を促進し、ｉｎ  ｖｉｖｏで半減期を増大し、上皮のバリアを越えた免疫系への抗原の送達を増強することができる。
【００２０】
場合により治療用部分にコンジュゲートしている抗体を、単独で、或いは細胞傷害性因子、及び／又はサイトカインと組み合わせて、治療用に用いることができる。特に、ＰＳＫ−１抗体を、細胞傷害物質、放射性核種、又は薬物部分などの治療用物質と組み合わせて、所与の生物学的反応を修飾することができる。治療用物質は、古典的な化学療法剤に限定されると解釈すべきではない。したがって、本発明で用いるための抗体を、１つ又は複数のエフェクター分子とコンジュゲートしてもよい。エフェクター分子は、単一のエフェクター分子、又は本発明の抗体に結合することができる単一の部分を形成するように連結している２つ若しくはそれを超えるそのような分子を含むことができることが理解されよう。エフェクター分子に連結している抗体フラグメントを得ることが望ましい場合は、抗体フラグメントがエフェクター分子に、直接又はカップリング剤により連結している、標準の化学的手順又は組換えＤＮＡ手順により、これを調製することができる。このような治療用物質を抗体に連結するための技術は、当技術分野ではよく知られている（例えば、Ｒｅｉｓｆｉｅｌｄら編、「モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」の中の、Ａｒｎｏｎら、「癌治療における薬物の免疫ターゲティングのためのモノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」１９８５年、２４３〜５６頁、編集Ａｌａｎ  Ｒ、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ；「薬物送達の制御（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」第２版、Ｒｏｂｉｎｓｏｎら編集の中の、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍら、「薬物送達のための抗体（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ）」、１９８７年、６２３〜５３頁、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．；「モノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ）８４年：生物学的及び臨床学的適用（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」の中の、Ｔｈｏｒｐｅ、「癌治療における細胞傷害物質の抗体キャリア  総説（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  Ｏｆ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ）」；Ｐｉｎｃｈｅｒａら、１９８５年編集、４７５〜５０６頁；Ｂａｌｄｗｉｎら（編集）、「癌の検出及び治療のためのモノクローナル抗体（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」の中の「癌治療における放射標識した抗体の治療的使用の分析、結果、及び未来の展望（Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｒｅｓｕｌｔｓ，Ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ  Ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｕｓｅ  Ｏｆ  Ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」１９８５年、３０３〜１６頁、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ｔｈｏｒｐｅら、１９８２年、「抗体−毒素コンジュゲート体の調製及び細胞傷害の特質（Ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ａ��ｄ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  Ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｔｏｘｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ）」、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、６２巻、１１９〜５８頁、並びにＤｕｂｏｗｃｈｉｋら、１９９９年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、８３巻、６７〜１２３頁を参照されたい）。特定の化学的手順には、例えば、ＷＯ９３／０６２３１、ＷＯ９２／２２５８３、ＷＯ８９／００１９５、ＷＯ８９／０１４７６、及びＷＯ０３０３１５８１に記載されているものが含まれる。或いは、エフェクター分子が、タンパク質又はポリペプチドである場合は、連結は、例えば、融合のタンパク質を生成するための、ＷＯ８６／０１５３３、及びＥＰ０３９２７４５に記載されている組換えのＤＮＡ手順を用いて実現することができる。したがって、抗体又はそのフラグメントを、共有結合（例えば、ペプチド結合）により、別のタンパク質（若しくはその部分、好ましくはタンパク質の少なくとも１０、２０、又は５０個のアミノ酸部分）のアミノ酸配列に、場合によりＮ末端又はＣ末端で融合することができる。抗体又はそのフラグメントが、抗体の定常ドメインのＮ末端で他のタンパク質に連結していることが好ましい。
【００２１】
本明細書で用いられるエフェクター分子の語には、例えば、抗悪性腫瘍薬、薬物、毒素、生物学的に活性なタンパク質、例えば酵素、他の抗体若しくは抗体フラグメント、合成の若しくは天然に存在するポリマー、核酸若しくはそのフラグメント、例えばＤＮＡ、ＲＮＡ、及びそれらのフラグメント、放射性核種、特に放射性ヨウ素、放射性同位元素、キレート化した金属、ナノ粒子、並びにレポーター群、例えば、ＮＭＲ又はＥＳＲ分光法により検出することができる蛍光化合物又は化合物（複数）が含まれる。
【００２２】
エフェクター分子の例には、細胞に有害な（例えば、死滅させる）あらゆる物質を含む細胞毒素、又は細胞傷害物質が含まれ得る。例として、コンブレスタチン（ｃｏｍｂｒｅｓｔａｔｉｎ）、ドラスタチン、エポチロン、スタウロスポリン、メイタンシノイド、スポンジスタチン、リゾキシン、ハリコンドリン、ロリジン、ヘミアスターリン、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、エチジウムブロミド、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルヒチン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、及びピューロマイシン、並びにこれらの類似体又はホモログが含まれる。
【００２３】
エフェクター分子には、また、それだけには限定されないが、葉酸拮抗薬（例えば、アミノプテリン、及びメトトレキセート）、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオエパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド（ｃｙｃｌｏｔｈｏｓｐｈａｍｉｄｅ）、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、並びにシス−ジクロロジアミン白金（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラサイクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）、及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、アントラマイシン（ＡＭＣ）、カリケアマイシン又はデュオカルマイシン、ＣＣ−１０６５、エネジエイン（ｅｎｅｄｉｅｙｎｅ）、ネオカルチノスタチン）、並びに有糸分裂阻害剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）が含まれる。さらに詳しくは、Ｇａｒｎｅｔｔ、２００１年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５３巻、１７１〜２１６頁を参照されたい。
【００２４】
他のエフェクター分子には、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９０Ｙ、Ｌｕ１７７、ビスマス２１３、カリホルニウム２５２、イリジウム１９２、及びタングステン１８８／レニウム１８８、２１１アスタチンなどのキレート化した放射性核種；並びに、それだけには限定されないがアルキルホスホコリン、トポイソメラーゼＩ阻害薬、タキソイド、及びスラミンなどの薬物が含まれ得る。
【００２５】
さらなるエフェクター分子には、タンパク質、ペプチド、及び酵素が含まれる。対象の酵素には、それだけには限定されないが、タンパク質分解酵素、加水分解酵素、リアーゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼが含まれる。対象のタンパク質、ポリペプチド、及びペプチドには、それだけには限定されないが、免疫グロブリン；アブリン、リシンＡ、シュードモナスの外毒素、若しくはジフテリア毒素などの毒素；メイタンシノイド（例えば、それだけには限定されないが、ＤＭ１）、インスリンなどのタンパク質、腫瘍壊死因子、α−インターフェロン、β−インターフェロン、神経増殖因子、血小板由来増殖因子、若しくは組織プラスミノーゲン活性化因子、血栓性物質；又は血管新生阻害剤、例えば、アンジオスタチン、若しくはエンドスタチン、アンジオゲニン、ゲロニン、ドルスタチン（ｄｏｌｓｔａｔｉｎ）、マイナーグルーブバインダー、ビス−イド−フェノールマスタード（ｂｉｓ−ｉｄｏ−ｐｈｅｎｏｌ  ｍｕｓｔａｒｄ）；又はリンホカイン、インターロイキン−１（ＩＬ−１）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、若しくは他の増殖因子などの生物学的反応修飾物質が含まれる。
【００２６】
他のエフェクター分子には、例えば診断に有用な、検出可能な物質が含まれ得る。検出可能な物質の例には、様々な酵素、補欠分子族、蛍光材料、発光材料、生物発光材料、放射性核種、ポジトロン放出金属（ポジトロン放出断層撮影に使用するための）、及び非放射性の常磁性の金属イオンが含まれる。一般には、診断として用いるための、抗体とコンジュゲートし得る金属イオンについてはＵＳ４，７４１，９００を参照されたい。適切な酵素には、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適切な補欠分子族には、ストレプトアビジン、アビジン、及びビオチンが含まれ、適切な蛍光材料には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、及びフィコエリスリンが含まれ、適切な発光材料には、ルミノールが含まれ、適切な生物発光材料には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、及びエクオリンが含まれ、適切な放射性核種には、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、及び９９Ｔｃが含まれる。
【００２７】
一実施形態では、放射性核種及びプロドラッグなどの細胞傷害物質は、腫瘍をプレターゲティングすることができる。特に、抗体依存性の酵素介在性プロドラッグ療法（ＡＤＥＰＴ）は、腫瘍に対するプロドラッグのプレターゲティングを伴う（Ｎｉｃｕｌｅｓｃｕ−Ｄｕｖａｚら、１９９９年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．、１４巻、５１７〜５３８頁；Ｓｙｒｉｇｏｓら、１９９９年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、１９巻、６０５〜６１３頁）。本発明で用いるための抗体には、例えば、それだけには限定されないが、あらゆるタイプの分子の共有結合性の結合により、修飾されている類似体及び誘導体が含まれる。前記結合が免疫特異的な結合を損なわないのが好ましい。一態様では、抗体を第２の抗体にコンジュゲートして、抗体のヘテロ結合体を形成することができる（ＵＳ４，６７６，９８０を参照されたい）。
【００２８】
操作された抗体フラグメントは、負荷量の大きい薬物の選択的な腫瘍のターゲティングのために、立体的に安定化した（ステルス）リポソームの表面に結合していることもできる（例えば、Ｐａｒｋら、１９９５年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９２巻、１３２７〜１３３１頁；Ｐａｒｋら、１９９７年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．，１１８巻、１５３〜１６０頁を参照されたい）。
【００２９】
さらなる一例では、エフェクター分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体の半減期を増大し、且つ／又は抗体の免疫原性を低減し、且つ／又は上皮のバリアを越えた免疫系への抗体の送達を増強することがある。このタイプの適切なエフェクター分子の例には、ポリマー、デキストラン、ヒドロキシプロピルメタクリルアミド（ＨＰＭＡ）、アルブミン、アルブミン結合性タンパク質、又はアルブミン結合性化合物、例えばＰＣＴ／ＧＢ２００５／００２０８４に記載されているものが含まれる。
【００３０】
エフェクター分子がポリマーである場合は、それは一般に、合成の、又は天然に存在するポリマー、例えば、場合により置換されている直鎖若しくは分枝鎖のポリアルキレン、ポリアルキレンポリマー、若しくはポリオキシアルキレンポリマー、又は分枝、若しくは非分枝の多糖、例えば、ホモ−若しくはヘテロ−多糖であってよい。例えば、（Ｖｅｒｏｎｅｓｅ及びＰａｓｕｔ、２００５年、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ、１０巻（２１）、１４５１〜１４５８頁；Ｐａｓｕｔら、２００４年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐａｔｅｎｔｓ、１４巻（６）、８５９〜８９４頁）を参照されたい。
【００３１】
上記に記載した合成のポリマー上に存在することがある、特定の任意選択の置換基には、１つ又は複数のヒドロキシ、メチル、又はメトキシ基が含まれる。
【００３２】
合成ポリマーの特定の例には、場合により置換されている、直鎖又は分枝鎖のポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）ポリ（ビニルアルコール）、又はそれらの誘導体、特に、場合により置換されているポリ（エチレングリコール）、例えばメトキシポリ（エチレングリコール）、又はその誘導体が含まれる。
【００３３】
特定の天然に存在するポリマーには、ラクトース、アミロース、デキストラン、グリコーゲン、又はそれらの誘導体が含まれる。
【００３４】
本明細書で用いられる「誘導体」には、反応性の誘導体、例えば、マレイミドなどのチオール−選択性の反応性基が含まれることが意図される。反応性基は、直接、又はリンカーセグメントを介してポリマーに連結していてよい。このような基の残余は、いくつかの場合では、抗体フラグメントとポリマーとの間の連結基として生成物の部分を形成することが理解されよう。
【００３５】
ポリマーのサイズは、望み通りに変化してよいが、一般には平均分子量が５００Ｄａから５００００Ｄａまで、好ましくは５０００から４００００Ｄａまで、より好ましくは２００００から４００００Ｄａまでの範囲である。ポリマーサイズは、例えば、腫瘍などのある組織に局在する能力、又は循環半減期の延長など、生成物の意図された使用をもとに、特に選択され得る（再考には、Ｃｈａｐｍａｎ、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、５４巻、５３１〜５４５頁を参照されたい）。したがって、例えば、生成物が循環を離れ、組織を透過することが意図される場合、例えば、腫瘍の処置で用いる場合には、小分子量の、例えば分子量約５０００Ｄａのポリマーを用いると有利であり得る。生成物が循環に残存する適用では、高分子量の、例えば、２００００Ｄａから４００００Ｄａまでの範囲の分子量を有するポリマーを用いると有利であり得る。
【００３６】
特に好ましいポリマーには、ポリアルキレンポリマー、例えば、ポリ（エチレングリコール）、又は特に、メトキシポリ（エチレングリコール）、又はその誘導体、及び特に分子量が約１５０００Ｄａから約４００００Ｄａまでの範囲のものが含まれる。一例では、本発明で用いるための抗体は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）部分に結合している。一つの特定の例では、抗体は抗体フラグメントであり、ＰＥＧ分子は、あらゆる利用可能なアミノ酸側鎖、又は抗体フラグメントに位置する末端のアミノ酸の官能基、例えば、あらゆる遊離のアミノ基、イミノ基、チオール基、ヒドロキシル基、又はカルボキシル基によって結合していてよい。このようなアミノ酸は、天然に抗体フラグメントに生じることができ、又は組換えＤＮＡ方法を用いてフラグメント中に操作して入れることができる（例えば、ＵＳ５，２１９，９９６、ＵＳ５，６６７，４２５、ＷＯ９８／２５９７１を参照されたい）。一例では、本発明の抗体分子は、修飾されているＦａｂフラグメントであり、修飾は、エフェクター分子の結合を可能にする、その重鎖の１つ又は複数のアミノ酸Ｃ末端終末に対する付加である。好ましくは、さらなるアミノ酸は、それに対してエフェクター分子が結合することができる１つ又は複数のシステイン残基を含む、修飾されているヒンジ領域を形成する。複数の部位を用いて、２つ又はそれを超えるＰＥＧ分子を結合することができる。
【００３７】
好ましくは、ＰＥＧ分子は、抗体フラグメントに位置する少なくとも１つのシステイン残基のチオール基によって共有結合している。修飾されている抗体フラグメントに結合している各ポリマー分子は、フラグメントに位置するシステイン残基のイオウ原子に共有結合していることがある。共有結合は、一般にはジスルフィド結合であり、又は特に、イオウ−炭素結合である。チオール基が結合ポイントとして用いられる場合、好適に活性化されているエフェクター分子、例えば、マレイミド及びシステインの誘導体などのチオール選択性の誘導体を用いることがある。上記に記載したように、ポリマーで修飾した抗体フラグメントの調製における出発材料として、活性化したポリマーを用いることができる。活性化したポリマーは、α−ハロカルボキシル酸、若しくはエステル（例えば、ヨードアセトアミド）、イミド（例えば、マレイミド）、ビニルスルホン、又はジスルフィドなどのチオール反応基を含むあらゆるポリマーであってよい。このような出発材料は、市販で入手することができ（例えば、Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  Ｉｎｃ．、Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ、アラバマ州、米国から）、又は従来の化学的手順を用いて市販の出発材料から調製することができる。特定のＰＥＧ分子には、２０Ｋのメトキシ−ＰＥＧ−アミン（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒ；Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ；及びＳｕｎＢｉｏから入手可能）、並びにＭ−ＰＥＧ−ＳＰＡ（Ｎｅｋｔａｒ、以前のＳｈｅａｒｗａｔｅｒから入手可能）が含まれる。
【００３８】
一実施形態では、抗体は、ＰＥＧ化されている、即ち、例えばＥＰ０９４８５４４号に開示されている方法にしたがって、それに共有的に結合しているＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））を有する修飾されているＦａｂフラグメントである［「ポリエチレングリコールの化学、生物工学的及び生物医学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９２年、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ（編集）、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、「ポリエチレングリコールの化学及び生物学的応用（Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」、１９９７年、Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ  Ｈａｒｒｉｓ及びＳ．Ｚａｌｉｐｓｋｙ（編集）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  ＤＣ、並びに「生物医学科学のためのバイオコンジュゲーションタンパク質連結技術（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｕｐｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、１９９８年、Ｍ．Ａｓｌａｍ及びＡ．Ｄｅｎｔ、Ｇｒｏｖｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｃｈａｐｍａｎ，Ａ．、２００２年、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、２００２、５４巻、５３１〜５４５頁も参照されたい］。一例では、ＰＥＧは、ヒンジ領域でシステインに結合している。一例では、ＰＥＧが修飾しているＦａｂフラグメントは、修飾されているヒンジ領域で単一のチオール基に共有結合しているマレイミド基を有する。リシン残基は、マレイミド基に共有結合することができ、リジン残基上の各々のアミン基に、約２００００Ｄａの分子量を有するメトキシポリ（エチレングリコール）ポリマーが結合していることができる。Ｆａｂフラグメントに結合しているＰＥＧの全分子量は、したがって、約４００００Ｄａであることができる。
【００３９】
一例では、エフェクター分子はＰＥＧであり、（ＷＯ９８／２５９７１、及びＷＯ２００４０７２１１６）に記載されている方法を用いて結合しており、この場合、リシル−マレイミド基は、重鎖のＣ末端終末でシステイン残基に結合しており、リシル残基の各アミノ基は、分子量約２００００Ｄａを有するメトキシポリ（エチレングリコール）残基に共有結合している。抗体に結合しているＰＥＧの全分子量は、したがって、約４００００Ｄａである。
【００４０】
別の一例では、エフェクター分子は、国際特許公開ＷＯ２００５／００３１６９、ＷＯ２００５／００３１７０、及びＷＯ２００５／００３１７１に記載されている方法を用いて抗体フラグメントに結合していることができる。
【００４１】
ＰＳＫ−１ポリペプチド、又は前記ポリペプチドを発現する細胞を用いて、抗体、例えば、前記ＰＳＬ−１ポリペプチドを特異的に認識する抗体を生成することができる。ＰＳＫ−１ポリペプチドに対して産生された抗体を、よく知られているルーチンのプロトコールを用いて、ポリペプチドを動物、好ましくは非ヒトの動物に投与することにより得ることができる。
【００４２】
本明細書で用いられる「抗体」の語には、完全な抗体、及び機能的に活性なそのフラグメント又は誘導体が含まれ、それだけには限定されないが、単鎖抗体、２価、３価、若しくは４価の抗体、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、単一ドメイン抗体、修飾されているＦａｂフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’及びＦ（ａｂ’）２フラグメント、並びに上記のあらゆるもののエピトープ結合性フラグメントであってよい（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２３巻（９）、１１２６〜１１３６頁を参照されたい）。一例では、抗体は、天然の、又は修飾されているヒンジ領域を有するＦａｂ’フラグメントである。数々の修飾されているヒンジ領域が、例えば、ＵＳ５，６７７，４２５、ＷＯ９９１５５４９号、及びＷＯ９８２５９７１にすでに記載されており、これらは参照として本明細書に組み入れられる。別の一例では、抗体には、ＷＯ２００５００３１６９、ＷＯ２００５００３１７０、及びＷＯ２００５００３１７１に記載されているものが含まれる。
【００４３】
抗体には、免疫グロブリン分子、及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原に特異的に結合する抗原結合性部位を含む分子が含まれる。本発明の免疫グロブリン分子は、免疫グロブリン分子のあらゆるクラス（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、若しくはＩｇＡ）、又はサブクラスであることができる。抗体の定常領域ドメインが存在する場合は、抗体分子の提唱されている機能を考慮して、特に必要とされ得るエフェクター機能を考慮して選択され得る。例えば、定常領域ドメインは、ヒトのＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、又はＩｇＭドメインであってよい。特に、抗体分子が治療上の使用を企図し、抗体のエフェクター機能が必要とされる場合は（例えば、ＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣＣ）、特にＩｇＧ１及びＩｇＧ３アイソタイプのヒトＩｇＧ定常領域ドメインを用いることができる。或いは、抗体分子が治療上の使用を企図し、抗体のエフェクター機能が必要とされない場合は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４アイソタイプを用いることができる。
【００４４】
本発明で用いるための抗体は、当技術分野では知られているあらゆる適切な方法により生成することができる。このような抗体には、それだけには限定されないが、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体、ファージディスプレイ由来の抗体、又はキメラの抗体が含まれる。
【００４５】
モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒ及びＭｉｌｓｔｅｉｎ、Ｎａｔｕｒｅ、１９７５年、２５６巻、４９５〜４９７頁）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ、１９８３年、4巻、７２頁）、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら、「モノクローナル抗体と癌治療（Ｍｏｎｏｃｌｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、７７〜９６頁、Ａｌａｎ  Ｒ、Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ、１９８５年）など、当技術分野では知られているあらゆる方法により調製することができる。
【００４６】
本発明で用いるための抗体を、例えば、Ｂａｂｃｏｏｋ，Ｊ．ら、１９９６年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９３巻（１５）、７８４３〜７８４８頁、ＷＯ９２／０２５５１、ＷＯ２００４／０５１２６８、及びＷＯ２００４／１０６３７７によって記載されている方法により、特異的な抗体を生成するように選択された単一のリンパ球から産生された免疫グロブリン可変領域のｃＤＮＡをクローニングし、発現することにより、単一のリンパ球抗体方法を用いて産生することもできる。
【００４７】
キメラの抗体は、軽鎖及び重鎖の遺伝子が、異なる種に属する免疫グロブリンの遺伝子セグメントから構成されるように遺伝子操作された免疫グロブリン遺伝子によってコードされる抗体である。
【００４８】
ヒト化の抗体は、非ヒト種からの１つ又は複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びヒト免疫グロブリン分子からのフレームワーク領域を有する抗体分子である（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９を参照されたい）。
【００４９】
組換えの抗体を創作し、製造するための方法は、当技術分野ではよく知られている（例えば、Ｂｏｓｓら、ＵＳ４，８１６，３９７；Ｃａｂｉｌｌｙら、ＵＳ６，３３１，４１５；Ｓｉｍｍｏｎｓら、２００２年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２６３巻、１３３〜１４７頁；Ｓｈｒａｄｅｒら、ＷＯ９２／０２５５１；Ｏｒｌａｎｄｉら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻、３８３３頁；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ、３２２巻、３２３頁；Ｑｕｅｅｎら、ＵＳ５，５８５，０８９；Ａｄａｉｒ、ＷＯ９１／０９９６７；Ｍｏｕｎｔａｉｎ及びＡｄａｉｒ、１９９２年、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．Ｅｎｇ．Ｒｅｖ、１０巻、１〜１４２頁；Ｖｅｒｍａら、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、２１６巻、１６５〜１８１頁；Ｈｏｌｌｉｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、２００５年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、２３巻（９）、１１２６〜１１３６頁を参照されたい）。
【００５０】
本発明で用いるための抗体は、当技術分野では知られている、様々なファージディスプレイ方法を用いて産生することもでき、Ｂｒｉｎｋｍａｎら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８２巻、４１〜５０頁；Ａｍｅｓら、１９９５年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１８４巻、１７７〜１８６頁；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈら、１９９４年、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２４巻、９５２〜９５８頁；Ｐｅｒｓｉｃら、１９９７年、Ｇｅｎｅ、１８７巻、９〜１８頁；並びにＢｕｒｔｏｎら、１９９４年、Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、５７巻、１９１〜２８０頁；ＷＯ９０／０２８０９；ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、及びＷＯ９５／２０４０１、並びにＵＳ５，６９８，４２６、５，２２３，４０９、５，４０３，４８４、５，５８０，７１７、５，４２７，９０８、５，７５０，７５３、５，８２１，０４７、５，５７１，６９８、５，４２７，９０８、５，５１６，６３７、５，７８０，２２５、５，６５８，７２７、５，７３３，７４３、及び５，９６９，１０８によって開示されているものが含まれる。
【００５１】
また、トランスジェニックマウス、及び、他の哺乳動物を含む他の生物体を用いて、抗体を生成することができる（例えば、ＵＳ６，３００，１２９を参照されたい）。
【００５２】
ＰＳＫ−１ポリペプチドを、本発明による処置及び／又は予防の方法に用いるための物質を同定するのに用いることができる。
【００５３】
本発明のさらなる一態様は、
（ａ）前記ポリペプチドを候補物質と接触させるステップと、
（ｂ）候補物質が前記ポリペプチドと相互作用するか否かを決定するステップと
を含む、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用をする抗癌剤をスクリーニングする方法を提供する。
【００５４】
好ましくは、候補物質とＰＳＫ−１ポリペプチドとの間の相互作用を決定することは、候補物質と前記ポリペプチドと結合を定量的に検出することを含む。
【００５５】
（ｉ）候補物質の存在下で前記ポリペプチドの発現又は活性を、候補物質の非存在下、若しくはコントロール物質の存在下での、前記ポリペプチドの発現又は活性と比較するステップと、
（ｉｉ）候補物質が前記ポリペプチドの発現又は活性の変化をもたらしたか否かを決定するステップと
を含む、ＰＳＫ−１ポリペプチドの発現又は活性を調節する抗癌剤をスクリーニングする方法をさらに提供する。
【００５６】
好ましくは、ＰＳＫ−１ポリペプチドの発現及び／又は活性を、予め決定した参照の範囲又はコントロールと比較する。
【００５７】
より好ましくは、この方法は、癌の処置及び／又は予防に用いるのにさらに試験するために、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用し、又はＰＳＫ−１ポリペプチドの相互作用、発現、若しくは活性を調節することができる物質を選択することをさらに含む。当業者であれば、上記のスクリーニング方法は、ＰＳＫ−１核酸分子と相互作用し、又はＰＳＫ−１核酸分子のＰＳＫ−１ポリペプチドの発現若しくは活性を調節する抗癌剤をスクリーニングするのにも好適であることが明らかであろう。
【００５８】
本発明は、癌の処置及び／又は予防のための物質を同定し、又は物質の有効性を検証するために、薬物の発見で用いるためのアッセイも提供する。これらの方法を用いて同定される物質は、薬物の発見のための主要な物質として用いることができ、又は治療的に用いることができる。ＰＳＫ−１ポリペプチドの発現は、例えば、免疫アッセイ、ゲル電気泳動とその後の可視化、ｍＲＮＡ若しくはＰＳＫ−１ポリペプチド活性の検出、又は本明細書で教示されるあらゆる他の方法、若しくは当業者に知られている方法により、アッセイすることができる。このようなアッセイを用いて、臨床上のモニタリング、又は薬物の開発において、候補物質をスクリーニングすることができる。
【００５９】
物質は、広範囲の候補物質から選択することができる。候補物質の例には、それだけには限定されないが、核酸（例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡ）、炭水化物、脂質、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ペプチドミメティックス、小分子、及び他の薬物が含まれる。生物学的ライブラリー、空間的に対処可能な平行な固相若しくは液相のライブラリー、デコンボルーションを必要とする合成のライブラリー方法、「１ビーズ１化合物」のライブラリー方法、及びアフィニティークロマトグラフィー選択を用いた合成のライブラリー方法を含む、当技術分野で知られるコンビナトリアルライブラリーの方法におけるあらゆる多数の取組みを用いて、物質を得ることができる。生物学的ライブラリーの取組みは、ペプチドのライブラリーに適しており、他の４つの取組みは、ペプチド、非ペプチドのオリゴマー、又は化合物の小分子ライブラリーに適用可能である（Ｌａｍ、１９９７年、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓ．、１２巻、１４５頁、Ｕ．Ｓ．５，７３８，９９６、及びＵ．Ｓ．５，８０７，６８３）。
【００６０】
分子ライブラリーを合成するための本明細書に基づく適切な方法の例は、当技術分野では、例えば、ＤｅＷｉｔｔら、１９９３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０巻、６９０９頁；Ｅｒｂら、１９９４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１巻、１１４２２頁；Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎら、１９９４年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３７巻、２６７８頁；Ｃｈｏら、１９９３年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２６１巻、１３０３頁；Ｃａｒｒｅｌｌら、１９９４年、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３巻、２０５９頁；Ｃａｒｅｌｌら、１９９４年、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．、３３巻、２０６１頁；及びＧａｌｌｏｐら、１９９４年、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３７巻、１２３３頁に見ることができる。
【００６１】
化合物のライブラリーは、例えば、溶液で（例えば、Ｈｏｕｇｈｔｅｎ、１９９２年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１３巻、４１２〜４２１頁）、又はビーズ上で（Ｌａｍ、１９９１年、Ｎａｔｕｒｅ、３５４巻、８２〜８４頁）、チップ（Ｆｏｄｏｒ、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ、３６４巻、５５５〜５５６頁）、細菌（ＵＳ５，２２３，４０９）、芽胞（ＵＳ５，５７１，６９８、５，４０３，４８４、及び５，２２３，４０９）、プラスミド（Ｃｕｌｌら、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８９巻、１８６５〜１８６９頁）、又はファージ（Ｓｃｏｔｔ及びＳｍｉｔｈ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９頁、３８６〜３９０頁；Ｄｅｖｌｉｎ、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４９巻、４０４〜４０６頁；Ｃｗｉｒｌａら、１９９０年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７巻、６３７８〜６３８２頁；並びにＦｅｌｉｃｉ、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２巻、３０１〜３１０頁）で提示され得る。
【００６２】
一実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する（例えば、結合する）物質を、ＰＳＫ−１ポリペプチドを発現する細胞の集団が候補物質と接触する細胞ベースのアッセイで同定し、候補物質がポリペプチドと相互作用する能力を決定する。好ましくは、候補物質がＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する能力を、参照範囲又はコントロールと比較する。別の実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドを発現する細胞の第１及び第２の集団を、候補物質又はコントロール物質と接触させ、候補物質がポリペプチドと相互作用する能力を、候補物質とコントロール物質との間の相互作用における違いと比較することにより決定する。所望により、このタイプのアッセイを用いて、複数の（例えば、ライブラリーの）候補物質を、ＰＳＫ−１ポリペプチドを発現する複数の細胞の集団を用いてスクリーニングすることができる。所望により、このアッセイを用いて、複数の（例えば、ライブラリーの）候補物質をスクリーニングすることができる。細胞は、例えば、原核生物起源（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、又は真核生物起源（例えば、酵母菌又は哺乳動物）であることができる。さらに、細胞はＰＳＫ−１ポリペプチドを内因性に発現することができ、又は細胞を遺伝子操作してポリペプチドを発現することができる。いくつかの実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチド又は候補物質を、例えば、放射性の標識（例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、若しくは１２５Ｉ）で、又は蛍光の標識（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリスリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、若しくはフルオレスカミン）で標識して、ポリペプチドと候補物質との間の相互作用を検出できるようにする。
【００６３】
別の実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する（例えば、それに結合する）物質を、ＰＳＫ−１ポリペプチドを発現するサンプルが候補物質と接触させ、候補物質がポリペプチドと相互作用する能力を決定する無細胞のアッセイ系で同定する。好ましくは、候補物質がＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する能力を、参照範囲又はコントロールと比較する。好ましい実施形態では、天然又は組換えのＰＳＫ−１ポリペプチドを含む第１及び第２のサンプルを、候補物質又はコントロール物質と接触させ、候補物質がポリペプチドと相互作用する能力を、候補物質とコントロール物質との間の相互作用における違いと比較することにより決定する。所望により、このアッセイを用いて、複数のＰＳＫ−１ポリペプチドサンプルを用いて複数の（例えば、ライブラリーの）候補物質を、スクリーニングすることができる。例えば、ポリペプチドを、特異的にそれを認識しそれに結合する固定化した抗体と接触させることにより、又はポリペプチドの精製した調製物をタンパク質に結合するようにデザインされた表面と接触させることにより、ポリペプチドを最初に固定化することが好ましい。ポリペプチドは、部分的に、若しくは完全に精製されていてよく（例えば、部分的に、若しくは完全に他のポリペプチドがない）、又は細胞溶解物の部分であってもよい。さらに、ポリペプチドは、ＰＳＫ−１ポリペプチドを含む融合タンパク質であってもよく、又は生物学的に活性なその部分及びグルタチオニン（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｉｎｅ）−Ｓ−トランスフェラーゼなどのドメインであってもよい。或いは、ポリペプチドを、当業者にはよく知られている技術を用いてビオチン化してもよい（例えば、ビオチン化キット、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州）。候補物質がポリペプチドと相互作用する能力を、当業者には知られている方法により複製することができる。
【００６４】
一実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドを、ＰＳＫ−１ポリペプチドに結合し、又はそれと相互作用する他のタンパク質を同定するための２ハイブリッドアッセイ又は３ハイブリッドアッセイで、「ベイトタンパク質」として用いる（例えば、ＵＳ５，２８３，３１７；Ｚｅｒｖｏｓら、１９９３年、Ｃｅｌｌ、７２巻、２２３〜２３２頁；Ｍａｄｕｒａら、１９９３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８巻、１２０４６〜１２０５４頁；Ｂａｒｔｅｌら、１９９３年、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、１４巻、９２０〜９２４頁；Ｉｗａｂｕｃｈｉら、１９９３年、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ、８巻、１６９３〜１６９６頁；及びＷＯ９４／１０３００を参照されたい）。当業者であれば理解するように、このような結合性タンパク質は、ＰＳＫ−１ポリペプチドによるシグナルの伝播に関与する可能性もある。例えば、これらはＰＳＫ−１ポリペプチドに関与するシグナル経路の上流又は下流のエレメントであり得る。或いは、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用するポリペプチドを、ＰＳＫ−１ポリペプチドを含むタンパク質コンジュゲート体を単離することにより同定することができ（前記ポリペプチドは１つ又は複数の他のポリペプチドと直接的に又は間接的に相互作用することができ）、質量分析法又はウェスタンブロッティングなどの当技術分野では知られている方法を用いて関連するタンパク質を同定する（例えば、Ｂｌａｃｋｓｔｏｃｋ，Ｗ．及びＷｅｉｒ，Ｍ、１９９９年、Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７巻、１２１〜１２７頁；Ｒｉｇａｕｔ，Ｇ、１９９９年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１７巻、１０３０〜１０３２頁；Ｈｕｓｉ，Ｈ．、２０００年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、３巻、６６１〜６６９頁；Ｈｏ，Ｙ．ら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ、４１５巻、１８０〜１８３頁；Ｇａｖｉｎ，Ａ．ら、２００２年、Ｎａｔｕｒｅ、４１５巻、１４１〜１４７頁を参照されたい）。
【００６５】
全ての場合において、候補物質が、ＰＳＫ−１ポリペプチドと直接的又は間接的に相互作用する能力を、当業者には知られている方法により決定することができる。例えば、それだけには限定されないが、候補物質とＰＳＫ−１ポリペプチドとの間の相互作用を、フローサイトメトリー、シンチレーションアッセイ、活性アッセイ、質量分析法、顕微鏡、免疫沈降、又はウェスタンブロット分析により決定することができる。
【００６６】
なお別の実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドと競合的に相互作用する（即ち、競合的に結合する）物質を、競合的結合アッセイで同定し、候補物質がＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する能力を決定する。好ましくは、候補物質がＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する能力を、参照範囲又はコントロールと比較する。好ましい実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチド、及びＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用することが知られているタンパク質の両方を発現する細胞の、第１及び第２の集団を、候補物質又はコントロール物質と接触させる。次いで、候補物質が、ＰＳＫ−１ポリペプチドと競合的に相互作用する能力を、細胞の第１及び第２の集団における相互作用と比較することにより決定する。別の実施形態では、代替の第２の集団又は細胞のさらなる集団を、ＰＳＫ−１ポリペプチドと競合的に相互作用することが知られている物質と接触させることができる。或いは、ＰＳＫ−１ポリペプチドと競合的に相互作用する物質を、ＰＳＫ−１ポリペプチド、及びＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用することが知られているタンパク質を含む第１及び第２のサンプルを、候補物質又はコントロール物質と接触させることにより、無細胞のアッセイ系で同定する。次いで、候補物質が、ＰＳＫ−１ポリペプチドと競合的に相互作用する能力を、第１及び第２のサンプルにおける相互作用を比較することにより決定する。別の実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドを含む代替の第２のサンプル又はさらなるサンプルを、ＰＳＫ−１ポリペプチドと競合的に相互作用することが知られている物質と接触させてもよい。いずれにせよ、ＰＳＫ−１ポリペプチド及び知られている相互作用性のタンパク質を、天然で発現させてもよく、組換えで発現させてもよい。候補物質を内因性に加えてもよく、又は天然若しくは組換えで発現させてもよい。
【００６７】
別の実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドと別の物質との間の相互作用を調節する物質、例えば、それだけには限定されないが、タンパク質を、知られている相互作用性の物質の存在下で、ＰＳＫ−１ポリペプチドを発現する細胞と候補の調節性物質とを接触させ、相互作用を調節する候補物質を選択することにより、細胞ベースのアッセイで同定することができる。或いは、ＰＳＫ−１ポリペプチドと別の物質との間の相互作用を調節する物質、例えば、それだけには限定されないが、タンパク質を、候補物質の存在下で、ポリペプチドを、ポリペプチドと相互作用することが知られている物質と接触させることにより、無細胞のアッセイ系で同定することができる。調節性の物質は、抗体、補助因子、阻害物質、活性化物質として作用することができ、又はＰＳＫ−１ポリペプチドと知られている物質との間の相互作用に対して、アンタゴニスト効果若しくはアゴニスト効果を有することができる。上記に記載したように、知られている物質がＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する能力を、当技術分野では知られている方法により決定することができる。細胞ベースであっても、無細胞であっても、これらのアッセイを用いて、複数の（例えば、ライブラリーの）候補物質をスクリーニングすることができる。
【００６８】
別の実施形態では、細胞ベースのアッセイ系を用いて、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を調節する（即ち、刺激し、又は阻害する）ことができる物質を同定する。したがって、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を、候補物質の存在下で、天然で、又は組換えでＰＳＫ−１ポリペプチドを発現する細胞の集団で測定する。好ましくは、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を、参照範囲又はコントロールと比較する。好ましい実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を、天然で、又は組換えでＰＳＫ−１ポリペプチドを発現する細胞の第１及び第２の集団で、物質の存在下又は候補物質の非存在下で（例えば、コントロール物質の存在下で）測定し、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を比較する。次いで、候補物質を、この比較に基づいて、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性のモジュレーターとして同定することができる。或いは、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を、ＰＳＫ−１ポリペプチドが天然、又は組換えのいずれかである、無細胞のアッセイ系で測定することができる。好ましくは、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を、参照範囲又はコントロールと比較する。好ましい実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を、候補物質の存在下又は非存在下で第１及び第２のサンプルで測定し、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を比較する。次いで、候補物質を、この比較に基づいて、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性のモジュレーターと同定することができる。
【００６９】
ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を、下流のエフェクター、例えば、それだけには限定されないが、セカンドメッセンジャー（例えば、ｃＡＭＰ、細胞内Ｃａ２＋、ジアシルグリセロール、ＩＰ３など）のレベル若しくは活性に対するその作用を検出し、触媒若しくは酵素の活性を検出し、レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）の誘導を検出し、又は当業者が知っているように好適である場合は、細胞の反応、例えば、増殖、分化、若しくは形質転換を検出することにより評価することができる（活性の測定技術については、例えば、ＵＳ５，４０１，６３９を参照されたい）。次いで、候補物質のコントロール物質に対する作用を比較することにより、候補物質を、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性のモジュレーターと同定することができる。適切なコントロール物質には、ＰＢＳ又は通常の食塩水が含まれる。
【００７０】
別の実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドの生成若しくは分解を担い、又はＰＳＫ−１ポリペプチドの翻訳後修飾を担う酵素などの物質、若しくは生物学的に活性なその部分を同定することができる。最初のスクリーニングでは、実質的に純粋な、天然の、又は組換えで発現されたＰＳＫ−１ポリペプチド、核酸、若しくは細胞抽出物、又は天然の、若しくは組換えで発現されたＰＳＫ−１ポリペプチド、若しくは核酸を含む他のサンプルを、このような物質を同定するために、ＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸のプロセシングを担うことがある複数の候補物質（例えば、それだけには限定されないが、ライブラリーとして示される複数の物質）と接触させる。候補物質が、ＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸の生成、分解、又は翻訳後修飾を調節する能力を、制限なく、フローサイトメトリー、放射標識、キナーゼアッセイ、ホスファターゼアッセイ、免疫沈降、及びウェスタンブロット分析、又はノーザンブロット分析を含む、当業者には知られている方法によって決定することができる。
【００７１】
なお別の実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドを発現する細胞を、複数の候補物質と接触させる。このような物質がＰＳＫ−１ポリペプチドの生成、分解、又は翻訳後修飾を調節する能力を、上記に記載したように当業者には知られている方法により決定することができる。
【００７２】
一実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドの発現を調節（例えば、下方制御）する物質を、細胞ベースのアッセイ系で同定する。したがって、ＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸を発現する細胞の集団を候補物質に接触させ、候補物質がＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸の発現を変える能力を、参照範囲又はコントロールと比較することにより決定する。別の一実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドを発現する細胞の第１及び第２の集団を、候補物質又はコントロール物質に接触させ、候補物質がＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸の発現を変える能力を、細胞の第１の集団と第２の集団との間でのＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸の発現のレベルにおける違いを比較することによって決定する。さらなる一実施形態では、第１の集団におけるＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸の発現を、参照範囲又はコントロールとさらに比較することがある。所望により、このアッセイを用いて、複数の（例えば、ライブラリーの）候補物質をスクリーニングすることができる。例えば、細胞は、原核生物起源（例えば、大腸菌）でもよく、又は真核生物起源（例えば、酵母菌若しくは哺乳動物）でもよい。さらに、細菌はＰＳＫ−１ポリペプチド若しくは核酸を内因性に発現することができ、又はＰＳＫ−１ポリペプチド若しくは核酸を発現するように遺伝子操作することができる。候補物質がＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸の発現を変える能力を、当業者には知られている方法により、例えば、制限なく、フローサイトメトリー、放射標識、シンチレーションアッセイ、免疫沈降、ウェスタンブロット分析、又はノーザンブロット分析によって決定することができる。
【００７３】
別の実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸の発現を調節する物質を、動物モデルで同定する。適切な動物の例には、それだけには限定されないが、マウス、ラット、ウサギ、サル、モルモット、イヌ、及びネコが含まれる。用いられる動物が癌のモデルを代表することが好ましい。したがって、哺乳動物の第１及び第２のグループに、候補物質又はコントロール物質を投与し、候補物質がＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸の発現を調節する能力を、哺乳動物の第１と第２のグループとの間の発現のレベルにおける違いを比較することによって決定する。望まれる場合には、哺乳動物の第１及び第２グループにおけるＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸の発現レベルを、哺乳動物のコントロールグループにおけるＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸のレベルと比較することができる。候補物質又はコントロール物質を、当技術分野では知られている手段により投与することができる（例えば、経口的に、直腸から、又は腹腔内若しくは静脈内など非経口的に）。ポリペプチド又は核酸の発現における変化を、上記に概説した方法により評価することができる。特定の一実施形態では、治療有効量の物質を、例えば、それだけには限定されないが、腫瘍のサイズにおける低減など、疾患の発症を遅らせ、又は進行の速度を緩めるための、疾患の症状における回復又は改善をモニタリングすることにより決定することができる。癌に精通した医師に知られている技術を用いて、候補物質が、疾患に関連する１つ又は複数の症状を変更したか否かを決定することができる。
【００７４】
当業者であれば、ＰＳＫ−１ポリペプチドを、構造ベースのデザインの物質、特に前記ポリペプチドの活性を調節する（例えば、刺激又は阻害する）ように働く小分子のための方法で用いることができることも理解され、前記方法は：
１）前記ポリペプチドの３次元構造を決定するステップと、
２）おそらく物質の反応性部位又は結合性部位であるポリペプチド内の３次元構造を推測するステップと、
３）推測された反応性部位若しくは結合性部位と反応し、又は結合することが予想される候補物質を合成するステップと、
４）候補物質が前記ポリペプチドの活性を調節することができるか否かを試験するステップと
を含む。
【００７５】
上記に記載した方法は、おそらく反復性の過程であることが理解されよう。
【００７６】
本明細書で論じたように、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する物質は、癌の処置及び／又は予防における使用が見出される。このような使用では、物質を、一般には医薬組成物の形態で投与する。
【００７７】
したがって、本発明にしたがって、ＰＳＫ−１ポリペプチドと相互作用する物質、並びに薬学的に許容できる希釈剤、賦形剤、及び／又は担体を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、ワクチンとしての使用も見出すことができ、ワクチン使用に許容できるさらなる成分を含むことができ、当業者には知られている１つ又は複数の適切なアジュバントをさらに含むことができる。
【００７８】
以降、本発明で用いる物質、処置及び／又は予防で用いるＰＳＫ−１ポリペプチド及びＰＳＫ−１核酸を、「有効物質」と呼ぶ。本明細書で、特定の有効物質又は物質の組合せを用いて、疾患又は状態を処置し又は防止する方法に言及する場合は、このような言及は、疾患又は状態の処置及び／又は予防のための薬物の調製における、有効物質又は物質の組合せの使用を含むことが意図されることを理解されたい。癌の治療で使用するための抗体も提供する。
【００７９】
組成物は、通常、薬学的に許容できる担体を通常含む、滅菌の医薬組成物の部分として提供される。この組成物は、あらゆる適切な形態（患者にそれを投与する望ましい方法に応じて）であることができる。
【００８０】
本発明の有効物質を、薬物の投与に従来用いられているあらゆる経路により対象に投与してよく、例えば、非経口的に、経口的に、局所的に（バッカル、舌下、若しくは経皮を含み、又は直接皮膚の細胞中への粒子が媒介する細胞内送達を用いて）、或いは吸入により投与することができる。粒子が媒介する送達は、Ｈａｙｎｅｓ，ＪＲ、２００４年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４巻、８８９〜９００頁によって記載されている。あらゆる所与の場合における最も適切な投与経路は、特定の有効物質、関与する癌、対象、並びに疾患の性質及び重症度、並びに対象の身体の状態に依存する。
【００８１】
有効物質を、１つ又は複数の他の治療上有効な（例えば、抗腫瘍の）化合物と、組み合わせて、例えば、同時に、逐次に、又は別々に投与することができる。
【００８２】
医薬組成物は、１投与量あたり予め決定した量の本発明の有効物質を含む単位投与量形態で提示すると便利であり得る。このような単位は、例えば、それだけには限定されないが、処置する状態、投与経路、並びに対象の年齢、体重、及び状態に応じて、７５０ｍｇ／ｋｇから０．１ｍｇ／ｋｇを含むことができる。
【００８３】
本発明で用いるための薬学的に許容できる担体は、例えば、投与経路に応じて、広範囲の形態をとることができる。
【００８４】
経口投与用の組成物は、液体でもよく、又は固体でもよい。経口の液体調製物は、例えば、水性若しくは油性の懸濁液剤、溶液剤、乳剤、シロップ剤、又はエリキシル剤の形態であってよく、或いは、使用前に水又は他の適切なビヒクルで再構成するための乾燥製品として提示してもよい。経口の液体調製物は、当技術分野で知られている懸濁化剤を含むことができる。
【００８５】
粉末剤、カプセル剤、及び錠剤などの経口の固体調製物の場合は、デンプンなどの担体、糖、微結晶性セルロース、希釈剤、顆粒化剤、滑沢剤、結合剤、崩壊剤なども含まれ得る。錠剤及びカプセル剤は投与が容易であるので、最も有利な経口の投与量単位形態を代表し、この場合固体の製薬上の担体を一般に使用する。上記に述べた通常の投与量形態の他に、本発明の有効物質を、徐放性の手段、及び／又は送達装置により投与してもよい。錠剤及びカプセル剤は、例えば、結合剤（例えば、シロップ、アラビアゴム、ゼラチン、ソルビトール、トラガカントゴム、若しくはポリビニルピロリドン）、充填剤（例えば、ラクトース、糖、トウモロコシデンプン、リン酸カルシウム、ソルビトール、若しくはグリシン）、錠剤化滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、若しくはシリカ）、崩壊剤（例えば、バレイショデンプン）、又は許容できる湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）など、従来の担体又は賦形剤を含むことができる。錠剤は、通常の製薬上の実践でよく知られている方法にしたがって、標準的な水性又は非水性の技術によりコーティングすることができる。
【００８６】
経口投与に適する本発明の医薬組成物は、各々が予め決定された量の有効物質を粉末若しくは顆粒として含む、カプセル剤、カシェ剤、又は錠剤などの別々の単位として、或いは溶液、又は水性の溶液、非水性の溶液、水中油型乳液、若しくは油中水型乳液における懸濁液として提示することができる。このような組成物は、薬学上のあらゆる方法により調製することができるが、全ての方法には、１つ又は複数の必要な成分を構成する担体と、有効物質を関連させるステップが含まれる。一般には、有効物質を均一且つ密接に液体の担体、又は微細にした固体の担体、又はその両方と混合し、次いで、必要であれば生成物を望ましい体裁に成形することにより、組成物を調製する。例えば、錠剤は、任意選択で１つ又は複数の付属の成分とともに、圧縮し、又は成形することにより調製することができる。
【００８７】
非経口投与に適する医薬組成物は、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合した水における、本発明の有効物質の溶液剤又は懸濁液剤として調製することができる。分散液は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの油における混合物で調製することもできる。貯蔵及び使用の通常の条件下では、これらの調製物は、微生物の増殖を防ぐための保存剤を含む。
【００８８】
注射用の使用に適する薬剤形態には、抗酸化剤、バッファー、静菌薬、及び意図する受容者の血液と組成物を等張にする溶質を含むことがある水性又は非水性の滅菌注射溶液、並びに、懸濁化剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が含まれる。処方箋に応じて調合される注射用溶液、分散液、及び懸濁液を、滅菌の粉末剤、顆粒剤、及び錠剤から調製することができる。
【００８９】
医薬組成物を、当技術分野では知られている医療機器で投与することができる。例えば、好ましい実施形態では、本発明の医薬組成物を、ＵＳ５，３９９，１６３、５，３８３，８５１、５，３１２，３３５、５，０６４，４１３、４，９４１，８８０、４，７９０，８２４、又は４，５９６，５５６に開示されている装置などの、無針皮下注射装置で投与することができる。本発明に有用なよく知られている埋め込み及びモジュールの例には、制御された速度で薬物を分散するための埋め込み可能なマイクロインフュージョンポンプを開示しているＵＳ４，４８７，６０３号、皮膚を通して薬物を投与する治療用装置を開示しているＵＳ４，４８６，１９４、正確な注入速度で薬物を送達するための薬物注入ポンプを開示しているＵＳ４，４４７，２３３、薬物を継続的に送達するための流速可変の埋め込み可能な注入器具を開示しているＵＳ４，４４７，２２４、複数のチャンバーのコンパートメントを有する浸透圧性の薬物送達システムを開示しているＵＳ４，４３９，１９６、及び浸透圧性の薬物送達システムを開示しているＵＳ４，４７５，１９６が含まれる。他の多くのこのような埋め込み、送達システム、及びモジュールは、当業者には知られている。
【００９０】
ある実施形態では、本発明の薬物組成物を、確実にｉｎ  ｖｉｖｏで適切に分配するように配合することができる。例えば、血液脳関門は多くの親水性の高い化合物を排除し、リポソームで薬物組成物を送達するのが好ましいことがある。したがって、本発明の一実施形態では、本発明の有効物質をリポソームに配合し、より好ましい一実施形態では、リポソームはターゲティング部分を含む。最も好ましい実施形態では、リポソームにおける治療用化合物を、腫瘍の近位の部位にボーラス注射により送達する。
【００９１】
リポソームは、ｉｎ  ｖｉｖｏで長持ちするステルスリポソームであってよい。リポソームを製造する方法については、例えば、ＵＳ４，５２２，８１１、５，３７４，５４８、及び５，３９９，３３１を参照されたい。ワクチンのリポソーム、特にいわゆるビロソームに関しては（再考には、Ｆｅｌｎｅｒｏｖａら、２００４年、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５巻、５１８〜５２９頁を参照されたい）、これらはＭｏｓｅｒら（２００３年、Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ、２巻、１８９〜１９６頁）、Ｂｕｎｇｅｎｅｒら（２００２年、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｒｅｐ．、３２３〜３３８頁、及びＭａｓｔｒｏｂａｔｔｉｓｔａら（２００２年、Ｊ．Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｒｅｓ．、１２巻、５７〜６５頁）に記載されているように製造することができる。リポソームは、特定の細胞又は器官中に選択的に輸送される１つ又は複数の部分を含むことができ、したがってターゲットにした薬物送達を増強する（例えば、Ｒａｎａｄｅ，ＶＶ、１９８９年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２９巻、６８５頁を参照されたい）。例示のターゲティング部分には、葉酸又はビオチン（例えば、米国特許第５，４１６，０１６号）、マンノシド（Ｕｍｅｚａｗａら、１９８８年、Ｂｉｏｃｈｅｍ.Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．、１５３巻、１０３８頁）、抗体（Ｂｌｏｅｍａｎ，ＰＧら、１９９５年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３５７巻、１４０頁；Ｍ．Ｏｗａｉｓら、１９９５年、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．、３９巻、１８０頁）、界面活性剤タンパク質Ａ受容体（Ｂｒｉｓｃｏｅら、１９９５年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１２３３巻、１３４頁）が含まれ、これらの異なる種は、本発明の製剤、及び本発明の分子の成分であるｐ１２０を含むことがある（Ｓｃｈｒｅｉｅｒら、１９９４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６９巻、９０９０頁）；Ｋｅｉｎａｎｅｎ，Ｋ．及びＬａｕｋｋａｎｅｎ，ＭＬ．、１９９４年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．、３４６巻、１２３頁；Ｋｉｌｌｉｏｎ，ＪＪ．及びＦｉｄｌｅｒ，ＩＪ、１９９４年、Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ、４巻、２７３頁も参照されたい。
【００９２】
有効物質の製剤を、肺、局所、又は眼科的としてフルオロカーボンで送達してもよく、フルオロカーボン中の有効物質の懸濁液、逆相のフルオロカーボン中の水の乳液、フルオロカーボン中の油の乳液、多重エマルジョン、マイクロエマルジョン、フルオロカーボンゲル、フッ素化リポソーム、及びフッ素化した小管が含まれる。
【００９３】
組成物は、例えば、安定性を増大するために密封したアンプル及びバイアルなどの、単位投与量の、又はマルチドーズの容器で提示してもよく、使用直前に注射用水などの滅菌の液体の担体の添加だけを必要とするフリーズドライの（凍結乾燥の）条件下で貯蔵してもよい。滅菌の液体の担体は別々のバイアル又はアンプルで供給することができ、例えば、水、エタノール、多価アルコール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール）、それらの適切な混合液、並びに植物油を含む、溶媒又は分散媒体であることができる。局所麻酔薬、保存剤、及び緩衝剤などの物質が、滅菌の液体の担体に含まれると有利であり得る。
【００９４】
局所投与に適合する医薬組成物は、軟膏剤、クリーム剤、懸濁剤、ローション剤、粉末剤、溶液剤、パスタ剤、ゲル剤、含浸包帯、スプレー剤、エアロゾル剤、又は油剤、経皮デバイス、散布剤などとして配合することができる。これらの組成物は、有効物質を含む従来の方法により調製することができる。したがって、これらは、適合性の従来の担体及び添加物、例えば、保存剤、薬物の浸透を助ける溶剤、クリーム剤若しくは軟膏剤における皮膚軟化薬、及びローション剤用のエタノール若しくはオレイルアルコールを含むこともできる。このような担体は、組成物の約１％から約９８％までとして存在してよい。より通常には、これらは組成物の約８０％までを構成する。例示にすぎないが、クリーム剤又は軟膏剤は、望ましい粘稠度を有するクリーム剤又は軟膏剤を生成するのに十分な量で、十分な量の親水性の材料及び水を混合し、化合物約５〜１０重量％を含むことにより調製される。
【００９５】
経皮投与に適合された医薬組成物は、長時間レシピエントの上皮と密接な接触を保持するように意図された個々のパッチ剤として提示してもよい。例えば、有効物質は、イオン浸透療法により、パッチ剤から送達され得る。
【００９６】
外部の組織、例えば口及び皮膚に適用するには、組成物を局所用の軟膏剤又はクリーム剤として適用するのが好ましい。軟膏剤で配合する場合、有効物質を、パラフィンの、又は水混和性の軟膏基剤のいずれかと一緒に用いることができる。或いは、有効物質を水中油型クリーム基剤又は油中水型基剤と一緒にクリーム剤に配合してもよい。
【００９７】
口における局所投与に適合された医薬組成物には、トローチ剤、パステル剤、及び含嗽剤が含まれる。
【００９８】
目に対する局所投与に適合された医薬組成物には、有効物質が適切な担体、特に水溶性の溶剤に溶解又は懸濁している点眼剤が含まれる。これには、上記のような、局所用の軟膏剤又はクリーム剤も含まれる。
【００９９】
担体が固体である、直腸投与に適する医薬組成物は、単位投与量の座剤として提示されるのが最も好ましい。適切な担体には、ココアバター、若しくは他のグリセリド、又は当技術分野で一般に用いられる材料が含まれ、座剤は、軟化し、又は融解した担体と組み合わせた混合により形成し、その後冷却し、型に成形することにより形成すると便利であり得る。これらは、また浣腸剤として投与してもよい。
【０１００】
膣投与に適合された医薬組成物は、膣座薬、タンポン、クリーム剤、ゲル剤、パスタ剤、泡、又はスプレーの組成物として提示してもよい。これらは、当技術分野で一般に用いられるように皮膚軟化薬又は基剤を含むことができる。
【０１０１】
ワクチンとしての使用に適合された医薬組成物は、サイトカイン、ケモカイン、共刺激の分子、又は免疫反応を増幅し指示する他の免疫調節物質などのアジュバントを含むことができる。例えば、医薬組成物は、樹状細胞のリクルートを誘発するサイトカイン（例えば、ＧＭ−コロニー刺激因子）と、樹状細胞の成熟を誘発する共刺激の分子（例えば、ＣＤ４０Ｌ又はアゴニストの抗ＣＤ４０）との相乗的な組合せを有するＰＳＫ−１ポリペプチドを、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５などの他のＴｈ１／細胞傷害Ｔ細胞抑制性サイトカインと組み合わせて含むことができる。アジュバントとして用いるためにＰＳＫ−１ポリペプチドとプレインキュベートした樹状細胞を、ｅｘ  ｖｉｖｏで産生することができる。他の相乗効果の組合せが、動物モデルで記載されている（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら、２００１年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１巻、２０９〜２１９頁）。別のアジュバントは、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチドである。医薬組成物は、また、ＰＳＫ−１ポリペプチド、ｐａｎ−ＨＬＡ−ＤＲ−結合性ペプチドなどの広範なＭＨＣクラスＩＩ結合、内因性のヘルパーのエピトープ（例えば、Ｓｈｉｒａｉ  Ｍ．、１９９６年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．、１７３巻、２４〜３１頁；Ｍｅｌｉｅｆ，ＣＪら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．、１８８巻、１７７〜１８２頁）、又は増強されたヘルパーエピトープ（例えば、Ａｈｌｅｒｓ  ＪＤら、２００１年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、１０８巻、１６７７〜１６８５頁）も含むことができる。
【０１０２】
有効物質の投与すべき投与量は、特定の有効物質、関与する癌、対象、並びに疾患の性質及び重症度、並びに対象の身体状態、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組合せ、反応の感度、治療に対する耐容性／反応、並びに選択された投与の経路にしたがって変化し、用いるべき好適な投与量を医師が最終的に決定する。この投与量を、好適な限りしばしば繰り返すことができる。一般には、治療有効量は、０．０１ｍｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇから２０ｍｇ／ｋｇである。投与の頻度は、抗体分子の半減期及びその効果の持続時間に依存する。抗体分子の半減期が短い場合は（例えば、２から１０時間）、１日あたり１回又は複数回の投与することが必要なことがある。或いは、抗体分子の半減期が長い場合は（例えば、２から１５日）、１日１回、１週間に１回、又は１カ月若しくは２カ月ごとに１回、投与する必要があるにすぎないことがある。副作用が発症した場合は、投与の量及び／又は頻度を、通常の臨床上の実践にしたがって変え、又は低減することができる。
【０１０３】
医薬組成物は、１投与量あたり本発明の有効物質の予め決定された量を含む単位投与量形態で提示すると便利であり得る。特に、本発明の抗体分子を投与する投与量は、処置すべき状態の性質、存在する炎症の程度、及び抗体分子を予防的に用いるのか存在する状態を処置するのかに依存する。
【０１０４】
ヒト及び動物における癌の処置及び／又は予防では、抗体を含む医薬組成物を、治療上又は予防上有効な投与量（例えば、腫瘍の増殖の阻害及び／又は腫瘍細胞の遊走の阻害をもたらす投与量）で、注射、及び抗体ベースの臨床製品に対して当技術分野で知られている投与のその他の経路などのあらゆる適切な投与経路を用いて、患者（例えば、ヒト対象）に投与することができる。
【０１０５】
組成物は、投与方法に応じて、０．１重量％、好ましくは１０〜６０重量％から、又はそれを超えた本発明の有効物質を含むことができる。
【０１０６】
組成物を患者に個々に投与してもよく、又は他の物質、薬物、若しくはホルモンと組み合わせて（例えば、同時に、逐次に、又は別々に）投与してもよい。
【０１０７】
ＰＳＫ−１ポリペプチドは、癌の処置及び／又は予防において有用でもあり得る。したがって、ＰＳＫ−１ポリペプチドを、好ましくはワクチンとして含む組成物の治療有効量を投与することを含む、癌の処置及び／又は予防のための方法を提供する。癌の処置及び／又は予防のための薬物を製造するためのＰＳＫ−１ポリペプチドの使用も提供する。本発明の方法で使用するためにＰＳＫ−１ポリペプチドを提供する場合、これらを単離された形態で提供するのが好ましい。ＰＳＫ−１ポリペプチドを少なくともある程度まで精製してあるのがより好ましい。ＰＳＫ−１ポリペプチドは、組換えの方法を用いて生成し、合成的に生成し、又はこれらの方法の組合せにより生成することもできる。ＰＳＫ−１ポリペプチドは、実質的に純粋な、即ち、実質的な程度まで他のタンパク質がない形態で提供され得る。
【０１０８】
組換えのＰＳＫ−１ポリペプチドを、発現系を含む遺伝子操作された宿主細胞から、当技術分野ではよく知られている過程により調製することができる。したがって、本発明は、また、ＰＳＫ−１ポリペプチド又はＰＳＫ−１核酸を含む発現系に、このような発現系で遺伝子操作された宿主細胞に、及び組換え技術によるＰＳＫ−１ポリペプチドの生成に関する。無細胞の翻訳系をやはり用いて、組換えのポリペプチドを生成することもできる（例えば、ウサギ網状赤血球溶解物、コムギ胚芽可溶化液、Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｌｔｄ．、Ｌｅｗｅｓ、英国からのＳＰ６／Ｔ７ｉｎ  ｖｉｔｒｏＴ＆Ｔ及びＲＴＳ  １００大腸菌ＨＹ転写及び翻訳キット、並びにＰｒｏｍｅｇａ  ＵＫ、Ｓｏｕｔｈａｍｐｔｏｎ、英国からのＴＮＴ  Ｑｕｉｃｋ  ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ／Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）。
【０１０９】
組換えのＳＫ−１ポリペプチドを生成するために、宿主細胞を遺伝子操作して、ＰＳＫ−１核酸に対する発現系又はその部分を組み入れることができる。このような組入れは、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＤ−デキストラン媒介形質移入、トランスベクション（ｔｒａｎｓｖｅｃｔｉｏｎ）、マイクロインジェクション、陽イオン性脂質媒介性形質移入、電気穿孔、形質導入、スクレープローディング（ｓｃｒａｐｅ  ｌｏａｄｉｎｇ）、バリスティック導入、又は感染など、当技術分野ではよく知られている技術を用いて行うことができる（例えば、Ｄａｖｉｓら、「分子生物学における基本的な方法（Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、１９８６年、及びＳａｍｂｒｏｏｋら、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、第２版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ニューヨーク州、１９８９年を参照されたい）。
【０１１０】
宿主細胞の代表的な例には、細菌細胞の、例えば、大腸菌、レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ）、放線菌類（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、及び枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）細胞；真菌細胞、例えば、酵母菌細胞、及びアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）細胞；昆虫細胞、例えばショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２、及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）  Ｓｆ９細胞；動物の細胞、例えばＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨｅＬａ、Ｃ１２７、３Ｔ３、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、及びＢｏｗｅｓメラノーマ細胞；並びに植物の細胞が含まれる。
【０１１１】
例えば、制限なく、染色体の、エピソームの、及びウィルス由来の系の、例えば、細菌のプラスミド由来、バクテリオファージ由来、トランスポゾン由来、酵母菌のエピソーム由来、挿入因子由来、酵母菌の染色体エレメント由来、バキュロウィルス、パポバウィルス（例えば、ＳＶ４０）、ワクシニアウィルス、アデノウィルス、鶏痘ウィルス、仮性狂犬病ウィルス、及びレトロウィルスなどのウィルス由来のベクター、並びにこれらの組合せに由来するベクター、例えば、プラスミド及びバクテリオファージの遺伝因子（例えば、コスミド及びファージミド）に由来するものなどの広範囲の発現系を用いることができる。発現系は、発現を調節し、生じさせる、コントロール領域を含むことができる。一般に、宿主にポリペプチドを生成させるために、核酸を維持し、伝播し、又はＰＳＫ−１ポリペプチドの発現することができるあらゆる系又はベクターを用いることができる。好適な核酸配列は、任意の様々なよく知られている、ルーチンの技術によって、例えば、上述のＳａｍｂｒｏｏｋらに述べられた技術によって、発現系中に挿入することができる。好適な分泌のシグナルを、ＰＳＫ−１ポリペプチド中に組み入れて、翻訳されたタンパク質を小胞体の細胞内腔、細胞膜周辺腔、又は細胞外の環境中に分泌させることができる。これらのシグナルはＰＳＫ−１ポリペプチドに内在性であってよく、又は異種性のシグナルであってもよい。
【０１１２】
ＰＳＫ−１ポリペプチドを、細胞ベースのスクリーニングアッセイで用いるために発現させようとする場合は、ポリペプチドが細胞表面で生成されるのが好ましい。この場合には、スクリーニングアッセイで用いる前に細胞を回収してよい。ＰＳＫ−１ポリペプチドが培地中に分泌される場合は、前記ポリペプチドを単離するために培地を回収することができる。細胞内に生成される場合は、ＰＳＫ−１ポリペプチドを回収する前に、細胞を最初に溶解しなければならない。
【０１１３】
ＰＳＫ−１ポリペプチドは、組換えの細胞培養物から、又は他の生物学的供給源から、硫酸アンモニウム又はエタノール沈澱、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトクロマトグラフィー、分子ふるいクロマトグラフィー、遠心分離方法、電気泳動方法、及びレシチンクロマトグラフィーを含めた、よく知られている方法により、回収し、精製することができる。一実施形態では、これらの方法の組合せを用いる。別の実施形態では、高速液体クロマトグラフィーを用いる。さらなる実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体を用いて、前記ポリペプチドのＰＳＫ−１ポリペプチドを含むサンプルを枯渇させ、又は前記ポリペプチドを精製することができる。ポリペプチドが単離及び又は精製の間に変性した場合は、当技術分野ではよく知られている技術をリフォールディングに用いて、天然又は活性のＰＳＫ−１ポリペプチドの立体配座を再生してもよい。本発明の状況では、ＰＳＫ−１ポリペプチドを、制限なく、血液サンプル、若しくは白血球サンプル、例えばＢ細胞などのあらゆる供給源からの生物学的サンプルから、又は乳房、卵巣、若しくは肺の組織などの組織サンプルにおいて得ることができる。
【０１１４】
ＰＳＫ−１ポリペプチドは、「成熟した」タンパク質の形態であってもよく、又は融合タンパク質などのより大型のタンパク質の部分であってもよい。分泌型の配列又はリーダー配列である、プレ−、プロ−、若しくはプレプロ−タンパク質の配列を含むさらなるアミノ酸配列、或いはアフィニティータグ（例えば、それだけには限定されないが、複数のヒスチジン残基、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、又はｍｙｃタグ）などの、精製において助けとなる配列を含むと有利であることが多い。組換えの生成の間に安定性をもたらすことができるさらなる配列も用いることができる。このような配列を、さらなる配列又はその部分として切断可能な配列を組み入れることにより、所望により任意選択で除去することができる。したがって、ＰＳＫ−１ポリペプチドを、他のポリペプチドを含む他の部分に融合することができる。このようなさらなる配列及びアフィニティータグは、当技術分野ではよく知られている。
【０１１５】
アミノ酸置換は、当技術分野では知られているように保存的であってもよく、又は半保存的であってもよく、ポリペプチドの望ましい活性に著しく影響を及ぼさないことが好ましい。置換は、天然に存在してもよく、又は例えば変異原性を用いて、導入してもよい（例えば、Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎら、１９７８年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２５３巻、６５５１頁）。したがって、アミノ酸の、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンは、相互に（脂肪族の側鎖を有するアミノ酸）置換することがしばしばあり得る。これらの可能な置換のうち、グリシン及びアラニンを用いて相互に置換し（これらは比較的短い側鎖を有するので）、バリン、ロイシン、及びイソロイシンを用いて相互に置換する（これらは疎水性である長い脂肪族の側鎖を有するので）ことが好ましい。相互に置換することがしばしば可能である他のアミノ酸には、それだけには限定されないが：
フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン（芳香族側鎖を有するアミノ酸）、
リシン、アルギニン、及びヒスチジン（塩基性側鎖を有するアミノ酸）、
アスパラギン酸、及びグルタミン酸（酸性側鎖を有するアミノ酸）、
アスパラギン、及びグルタミン（アミドの側鎖を有するアミノ酸）、
システイン、及びメチオニン（含硫側鎖を有するアミノ酸）、並びに
アスパラギン酸、及びグルタミン酸は、それぞれホスホセリン、及びホスホスレオニンに置換することができる（酸性側鎖のあるアミノ酸）
が含まれる。
【０１１６】
特定の一実施形態では、置換されたアミノ酸は、ＰＳＫ−１ポリペプチドの活性に著しく影響を及ぼし、優勢のネガティブな活性をペプチドに与えるように特異的に選択され得る。別の実施形態では、置換されたアミノ酸は、ポリペプチドを恒常的に活性にするように特異的に選択され得る。
【０１１７】
一実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドのエピトープのアミノ酸配列の修飾は、通常エピトープの増強と呼ばれ、ワクチンの効力を改善するために用いられ、ＭＨＣ（主要な組織適合性コンジュゲート体）分子に対するペプチドの親和性における増大、及び／又はＴ細胞のトリガリングにおける増大、及び／又は血清ペプチダーゼによるペプチドのタンパク質分解の阻害をもたらす。このような場合には、誘発されたＴ細胞は、エピトープが増強する配列に加えて天然のペプチド配列を依然として認識する。
【０１１８】
修飾には、天然に存在する修飾が含まれ、例えば、制限なく、翻訳後修飾、及び、変異原性によって導入され得るものなど、天然に存在しない修飾も含まれる。
【０１１９】
好ましくはＰＳＫ−１ポリペプチドの誘導体は、図１（配列番号１）に示すアミノ酸配列に少なくとも７０％の同一性を有し、より好ましくは少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の同一性を有する。同一性パーセント値は、当技術分野ではよく知られている概念であり、例えば、それだけには限定されないが、ＮＣＢＩから入手可能なＢＬＡＳＴ（登録商標）ソフトウェアを用いて計算することができる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９０年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜４１０頁；Ｇｉｓｈ，Ｗ．及びＳｔａｔｅｓ，Ｄ．Ｊ．、１９９３年、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．、３巻、２６６〜２７２頁；Ｍａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．ら、１９９６年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２６６巻、１３１〜１４１頁；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら、１９９７年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、２５巻、３３８９〜３４０２頁；Ｚｈａｎｇ，Ｊ．及びＭａｄｄｅｎ，Ｔ．Ｌ．、１９９７年、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．、７巻、６４９〜６５６頁）。このような誘導体はＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を保持している。このような活性には、抗体結合能が含まれる。
【０１２０】
ＰＳＫ−１ポリペプチドのフラグメントは、本発明の方法においてやはり有用であることもあり、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントを含み、配列番号１のアミノ酸配列は、フラグメントの長さにわたって少なくとも７０％相同である。好ましくは、前記フラグメントは、少なくともアミノ酸１０個の長さであり、好ましくは、これらはアミノ酸が少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個の長さである。フラグメントはその長さにわたって、図１に示したアミノ酸配列（配列番号１）に対して少なくとも７０％同一性を有し、より好ましくは、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％同一性を有する。このようなフラグメントはＰＳＫ−１ポリペプチドの活性を保持している。このような活性には、抗体結合能が含まれる。
【０１２１】
ＰＳＫ−１ポリペプチドが、癌の処置及び／又は予防で使用するための医薬組成物の有効物質である場合、組換えのＰＳＫ−１ポリペプチドを用いるのが好ましい。特定の一実施形態では、融合タンパク質の細胞中への侵入を促進するＨＩＶ／Ｔａｔタンパク質のタンパク質形質導入ドメインなど、別のポリペプチドに融合しているＰＳＫ−１ポリペプチドが（Ａｓｏｈ，Ｓら、２００２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９９巻、１７１０７〜１７１１２頁）、癌の処置及び／又は予防のための薬物の製造に用いるために提供される。
【０１２２】
別の態様では、癌を有する対象におけるＰＳＫ−１ポリペプチドの検出を用いて、特に、本発明の方法にしたがって処置するのに好適な患者の集団を同定することができる。
【０１２３】
したがって、本発明は、対象における癌をスクリーニングし、且つ／又は診断若しくは予後診断し、且つ／又は癌治療の有効性をモニタリングする方法を提供し、前記対象から得た生物学的サンプルにおいてＰＳＫ−１ポリペプチドを検出及び／又は定量するステップを含む。スクリーニング及び／又は診断の方法で使用するためのＰＳＫ−１ポリペプチドは、好ましくは：
（ａ）配列番号１のアミノ酸配列を含み、又はそれから成り、
（ｂ）ＰＳＫ−１の活性を保持する配列番号１のアミノ酸配列に比べて、１つ又は複数のアミノ酸の置換、修飾、欠失、又は挿入を有する誘導体であり、或いは、
（ｃ）配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドのフラグメントであり、少なくともアミノ酸１０個の長さであり、フラグメントの長さにわたって少なくとも７０％の同一性を有し、ＰＳＫ−１の活性を保持している。
【０１２４】
一態様では、発現を予め決定した参照範囲と比較する。好ましくは、検出のステップは：
（ａ）サンプルを、上記（ａ）から（ｃ）に規定したポリペプチドに特異的である捕獲試薬と接触させるステップと、
（ｂ）サンプルにおける捕獲試薬と前記ポリペプチドとの間で結合が起こったか否かを検出するステップと
を含む。
【０１２５】
別の実施形態では、固相上に固定化されていることがある、直接的又は間接的に標識されている検出試薬を用いて、捕獲したポリペプチドを検出する。
【０１２６】
特定の実施形態では、ＰＳＫ−１ポリペプチドは分泌され得る。このような分泌されたＰＳＫ−１は、血液、痰、尿、又は他の生体液などの体液において検出を受けやすい。さらなる実施形態では、分泌されたＰＳＫ−１は、細胞膜に結合し、細胞外に提示される。このようなＰＳＫ−１は、抗体ベースの治療、又は小分子ベースの治療など、治療のための標的を提示し得る。
【０１２７】
ＰＳＫ−１ポリペプチドを検出／定量するための便利な手段は、抗体の使用を伴う。ＰＳＫ−１ポリペプチドを免疫原として用いて、上記に記載した当技術分野では知られている方法を用いて前記ポリペプチドと相互作用する（結合又は認識する）抗体を産生させることができる。したがって、さらなる態様では、本発明は、対象における癌をスクリーニング及び／若しくは診断するための、又は抗癌治療の効力をモニタリングするための少なくとも１つのＰＳＫ−１ポリペプチドに特異的に結合する抗体の使用を提供する。特定の実施形態では、抗−ＰＳＫ−１ポリペプチド抗体を用いて診断する方法を用いて、本発明の方法による処置に好適な患者の集団を同定することができる。
【０１２８】
ヒト組織の生物学的サンプル、及び／又はそのサブフラクション、例えば、それだけには限定されないが、膜、サイトゾル、若しくは核のサブフラクションにおけるＰＳＫ−１の発現を検出することにより、ＰＳＫ−１抗体を、とりわけ、癌の診断にも用いることができる。
【０１２９】
さらなる態様では、生物学的サンプルにおいてＰＳＫ−１ポリペプチドを検出する方法は、直接的又は間接的に標識した検出試薬を用いて、前記サンプルにおけるＰＳＫ−１ポリペプチドの量を検出及び／又は定量することを含む。ＰＳＫ−１ポリペプチドを、制限なく、免疫沈降とその後のドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動、２次元ゲル電気泳動；ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射線アッセイ、蛍光イムノアッセイ、及びタンパク質Ａイムノアッセイなどの技術を用いた競合的及び非競合のアッセイ系を含む、当技術分野では知られているあらゆる免疫アッセイの手段により検出することができる。
【０１３０】
抗体の抗原との相互作用の検出は、抗体を検出可能な物質、例えば、それだけには限定されないが、酵素（例えば、西洋ワサビのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、アセチルコリンエステラーゼ）、補欠分子族（例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン）、蛍光材料（例えば、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライド、フィコエリスリン）、発光材料（例えば、ルミノール）、生物発光材料（例えば、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、エクオリン）、放射性核種（例えば、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、９９Ｔｃ）、ポジトロン放出性金属、又は非放射性常磁性金属イオン（ＵＳ４，７４１，９００を参照されたい）に連結することにより促進することができる。
【０１３１】
本発明は、上記に定義したＰＳＫ−１ポリペプチドに対する捕獲試薬（例えば、抗体）を含む、診断用キットも提供する。さらに、このようなキットは、以下：
（１）スクリーニングし、診断し、予後診断し、治療用にモニタリングをするための、又はこれらの適用のあらゆる組合せのための捕獲試薬を用いるための指示書、
（２）捕獲試薬に対する標識した結合パートナー、
（３）その上に捕獲試薬が固定化されている固相（例えば、試薬ストリップ）、及び
（４）スクリーニングし、診断し、予後診断し、若しくは治療用の使用、又はこれらのあらゆる組合せに対する規制認可を示す、ラベル又は挿入物
の１つ又は複数を任意選択で含むことができる。
【０１３２】
捕獲試薬に対して標識されていない結合パートナーが提供される場合、抗−ＰＳＫ−１ポリペプチド捕獲試薬それ自体を、検出可能なマーカー、例えば、化学発光性の、酵素の、蛍光の、又は放射性の部分（上記を参照されたい）で標識してもよい。
【０１３３】
当業者であれば、ＰＳＫ−１核酸の検出及び／又は定量を、対象における癌のスクリーニング及び／又は診断若しくは予後診断の方法、並びに／或いは癌治療の有効性をモニタリングする方法で用いることができることは、やはり明らかであろう。
【０１３４】
特に文脈によって示されない限り、ＰＳＫ−１核酸は、以下の特徴の１つ又は複数を有することができ、したがって：
ｄ）配列番号２のＤＮＡ配列、又はそのＲＮＡ同等物を含み、又はそれらから構成されることができ、
ｅ）ｄ）の配列に相補的である配列を有することができ、
ｆ）ＰＳＫ−１ポリペプチドをコードする配列を有することができ、
ｇ）ｄ）、ｅ）、及びｆ）の任意のものと実質的な同一性を示す配列を有することができ、又は
ｈ）少なくとも１５ヌクレオチドの長さである、ｄ）、ｅ）、ｆ）、若しくはｇ）のフラグメントである
核酸分子を含み、
１つ又は複数の以下の特徴を有することができる：
１）ＤＮＡでも、若しくはＲＮＡでもよい、
２）一本鎖でも、若しくは二本鎖でもよい、
３）実質的に純粋な形態であり得る。したがって、汚染性のタンパク質、及び／又は他の核酸が実質的にない形態で提供することができる、
４）イントロンがあっても、若しくはイントロンがなくてもよい（例えば、ｃＤＮＡとして）。
【０１３５】
ＰＳＫ−１核酸のフラグメントは、ヌクレオチドが少なくとも２０個、少なくとも３０個、少なくとも５０個、少なくとも１００個、又は少なくとも２５０個の長さであることが好ましい。
【０１３６】
本発明は、上記（ｄ）〜（ｈ）に記載したＰＳＫ−１核酸に相補的であり、前記ＰＳＫ−１核酸にハイブリダイズすることができる核酸の使用も提供する。このような核酸分子を「ハイブリダイズする」核酸分子と呼ぶ。例えば、それだけには限定されないが、ハイブリダイズする核酸分子は、プローブ又はプライマーとして有用であり得る。ハイブリダイズする核酸分子は、その長さに沿って、上記（ｄ）〜（ｈ）の範囲内の核酸分子と、高い度合の配列同一性を有することができる（例えば、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９８％の配列同一性）。上記で論じたあらゆる核酸分子にハイブリダイズすることができる、ハイブリダイズする核酸分子の、例えば、ハイブリダイズするアッセイにおける使用も、本発明に含まれる。
【０１３７】
対象における癌の治療のスクリーニング、予後診断、診断、及びモニタリングに、ハイブリダイゼーションアッセイを用いることができる。したがって、このようなハイブリダイゼーションアッセイは：
ｉ）対象から得た、核酸を含む生物学的サンプルを、ＰＳＫ−１核酸分子とハイブリダイズすることができる核酸プローブと、ハイブリダイゼーションが起こり得るような条件下で接触させること、及び
ｉｉ）あらゆる得られたハイブリダイゼーションを検出し、又は測定すること
を含む。
【０１３８】
好ましくは、このようなハイブリダイズする分子は、少なくとも１０個のヌクレオチドの長さであり、好ましくは少なくとも２５個、又は少なくとも５０個のヌクレオチドの長さである。より好ましくは、ハイブリダイズする核酸分子は、上記（ｄ）から（ｈ）の任意の１つの範囲内の核酸と特異的にハイブリダイズする。最も好ましくは、ハイブリダイゼーションは、厳密なハイブリダイゼーション条件下で起こる。厳密なハイブリダイゼーション条件の一例は、約０．９Ｍである塩溶液を用いて約３５℃から約６５℃までの温度で試みられたハイブリダイゼーションが行われる場合である。しかし、当業者であれば、プローブの長さ、塩基の組成、存在するイオンのタイプなどの変数を考慮に入れるために、適宜このような条件を変化させることができる。
【０１３９】
本発明は、ＰＳＫ−１ポリペプチドをコードするＲＮＡにハイブリダイズすることができる核酸プローブ、適切な試薬、及び使用のための指示書を含む診断用キットも提供する。
【０１４０】
さらなる実施形態では、１つ又は複数の容器に、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（例えば、Ｉｎｎｉｓら、１９９０年、「ＰＣＲプロトコール（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ）」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州を参照されたい）、リガーゼ連鎖反応（ＥＰ  ３２０，３０８を参照されたい）、Ｑβレプリカーゼの使用、環状プローブ反応、又は当技術分野では知られている他の方法により、好適な反応条件下で少なくとも１部分のＰＳＫ−１核酸分子の増幅をプライムすることができる１対のプライマーを含む診断用キットを提供する。典型的には、プライマーは、少なくとも８個のヌクレオチドの長さであり、好ましくは少なくとも１０個から２５個のヌクレオチドの長さであり、より好ましくは１５個から２５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの場合では、少なくとも３０個又は少なくとも３５個のヌクレオチドの長さのプライマーを用いることができる。
【０１４１】
なお別の態様では、本発明は、癌の処置及び／又は予防において使用するための薬物の製造における、少なくとも１つのＰＳＫ−１核酸の使用を提供する。
【０１４２】
特定の一実施形態では、ハイブリダイズするＰＳＫ−１核酸分子をアンチセンス分子として用いて、相補的なＰＳＫ−１核酸に結合することによりＰＳＫ−１ポリペプチドの発現を変え、且つ、癌の処置及び／又は予防若しくは防止に用いることができる。アンチセンスの核酸には、ＰＳＫ−１ポリペプチドをコードするＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）の一部分に相補的ないくつかの配列のおかげでハイブリダイズすることができるＰＳＫ−１核酸が含まれる。アンチセンスの核酸は、このようなポリペプチドをコードするｍＲＮＡのコード領域及び／又は非コード領域に相補的であることができる。最も好ましくは、ＰＳＫ−１ポリペプチドの発現は、アンチセンスの核酸の使用により阻害される。したがって、本発明は、ＰＳＫ−１ポリペプチドをコードする遺伝子又はｃＤＮＡの遺伝子に対してアンチセンスである少なくとも８個のヌクレオチドを含む核酸の、治療用又は予防用の使用を提供する。
【０１４３】
別の実施形態では、本明細書に規定したポリペプチドをコードする遺伝子配列を、ポリペプチドの遺伝子発現を低減するための、よく知られている遺伝子「ノックアウト」の、リボザイム又は三重らせん方法と組み合わせて用いることにより、ＰＳＫ−１ポリペプチドのレベル又は活性を低減することにより、癌の症状を寛解することができる。この取組みでは、リボザイム又は三重らせん分子を用いて、遺伝子の活性、発現、又は合成を調節し、したがって、癌の症状を寛解する。このような分子は、突然変異の、又は非突然変異の標的の遺伝子の発現を低減又は阻害するようにデザインされていることがある。このような分子を生成し、使用するための技術は、当業者にはよく知られている。
【０１４４】
内因性のＰＳＫ−１ポリペプチドの発現は、標的の相同組換えを用いて、ポリペプチドをコードする遺伝子、又はそのような遺伝子のプロモーターを、不活性化し、又は「ノックアウト」することにより、やはり低減することができる（例えば、Ｓｍｉｔｈｉｅｓら、１９８５年、Ｎａｔｕｒｅ、３１７巻、２３０〜２３４頁；Ｔｈｏｍａｓ及びＣａｐｅｃｃｈｉ、１９８７年、Ｃｅｌｌ、５１巻、５０３〜５１２頁；Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、１９８９年、Ｃｅｌｌ、５巻、３１３〜３２１頁；並びにＺｉｊｌｓｔｒａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻、４３５〜４３８頁を参照されたい）。例えば、内因性のＰＳＫ−１遺伝子（ポリペプチドをコードする遺伝子のコード領域又は制御領域のいずれか）に相同なＤＮＡが隣接する非機能性のポリペプチド（又は完全に非関連のＤＮＡ配列）をコードする突然変異の遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｖｏで標的の遺伝子を発現する細胞に形質移入するために、選択マーカー及び／又はネガティブの選択マーカーと一緒に又はそれなしで用いることができる。ＤＮＡ構築物を、標的の相同の組換えにより挿入することで、標的の遺伝子の不活性化がもたらされる。
【０１４５】
別の実施形態では、核酸を遺伝子治療により投与する（例えば、Ｈｏｓｈｉｄａ，Ｔ．ら、２００２年、Ｐａｎｃｒｅａｓ、２５巻、１１１〜１２１頁；Ｉｋｕｎｏ，Ｙ．、２００２年、Ｉｎｖｅｓｔ．Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ．Ｖｉｓ．Ｓｃｉ．、２００２年、４３巻、２４０６〜２４１１頁；Ｂｏｌｌａｒｄ，Ｃ．、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９巻、３１７９〜３１８７頁；Ｌｅｅ  Ｅ．、２００１年、Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．、７巻、７７３〜７８２頁を参照されたい）。遺伝子治療は、対象に、発現された、又はＰＳＫ−１ポリペプチドの発現可能なＰＳＫ−１核酸を投与することを意味する。当技術分野で利用可能な遺伝子治療のためのあらゆる方法を、本発明にしたがって用いることができる。
【０１４６】
治療用のＰＳＫ−１核酸の患者中への送達は、直接的なｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子治療（即ち、患者を核酸若しくは核酸含有ベクターに直接曝す）、又は間接的なｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療（即ち、細胞を最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏで核酸で形質転換し、次いで患者中に移植する）であることができる。
【０１４７】
例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏの遺伝子治療では、例えば、ＵＳ４，９８０，２８６、又はＲｏｂｂｉｎｓら、１９９８年、Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．、８０巻、３５〜４７頁に記載されているように、それが細胞内になるような方法で、即ち、欠損した、又は弱毒化したレトロウィルス又は他のウィルスのベクターを用いた感染により、ＰＳＫ−１核酸を含む発現ベクターを投与する。
【０１４８】
当技術分野で知られている様々なレトロウィルスのベクターは、Ｍｉｌｌｅｒら（１９９３年、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．、２１７巻、５８１〜５９９頁）に記載されているものなどがあり、これは、ウィルスのゲノムのパッケージング、及び、引き続き宿主細胞のＤＮＡ中への組込みに必要とされないこれらのレトロウィルスの配列を欠失するように修飾されている。アデノウィルスのベクターも、非分裂性の細胞に感染する能力によって有利であり、用いることができ、そのような大容量のアデノウィルスのベクターは、Ｋｏｃｈａｎｅｋ（１９９９年、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、１０巻、２４５１〜２４５９頁）に記載されている。用いることができるキメラのウィルスのベクターは、Ｒｅｙｎｏｌｄｓら（１９９９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ、１巻、２５〜３１頁）によって記載されているものである。ハイブリッドベクターも使用でき、これはＪａｃｏｂｙら（１９９７年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ、４巻、１２８２〜１２８３頁）によって記載されている。
【０１４９】
ネイキッドのＤＮＡの直接注射、又は微粒子銃（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｇｕｎ（登録商標）；Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ、Ｄｕｐｏｎｔ）の使用によるもの、又は脂質でそれをコーティングすることも、遺伝子治療で用いることができる。細胞表面の受容体／形質移入化合物は、又はリポソーム、微粒子若しくはマイクロカプセルにおけるカプセル化により、又は核に侵入することが知られているペプチドに連結させて核酸を投与することにより、又は受容体が媒介するエンドサイトーシスを受けやすいリガンドへ連結してそれを投与することによって（Ｗｕ及びＷｕ、１９８７年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６２巻、４４２９〜４４３２頁）、対象の受容体を特異的に発現する細胞型を標的にするのに用いることができる。
【０１５０】
別の実施形態では、ＰＳＫ−１核酸を含む核酸リガンド化合物を生成することができ、この化合物ではリガンドが、エンドソームを破壊するようにデザインされた膜融合性のウィルスのペプチドを含んでおり、そのためＰＳＫ−１核酸はその後のリソゾームの分解を避けることができる。ＰＳＫ−１核酸は、ＷＯ９２／０６１８０、ＷＯ９３／１４１８８、及びＷＯ９３／２０２２１に記載されているものなど特異的な受容体を標的にすることにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで、細胞に特異的なエンドサイトーシス、及び発現の標的にされることがある。或いは、核酸を細胞内に導入し、相同の組換えにより発現のために宿主細胞のゲノム内に組み入れることができる（Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻、４３５〜４２８頁）。
【０１５１】
ｅｘ  ｖｉｖｏの遺伝子治療では、組織培養を用いて遺伝子をｉｎ  ｖｉｔｒｏで細胞内に移動し、細胞を、皮下注射、皮膚移植片中への細胞の適用、及び組換えの血液細胞（例えば、造血幹細胞又は前駆細胞）の静脈内注射など、様々な方法により患者に送達する。
【０１５２】
遺伝子治療の目的でＰＳＫ−１核酸をその中に導入することができる細胞には、例えば、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、及び血液細胞が含まれる。用いることができる血液細胞には、例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球、造血細胞、又は前駆細胞などが含まれる。
【０１５３】
一態様では、医薬組成物は、ＰＳＫ−１核酸を含み、前記核酸は、適切な宿主でＰＳＫ−１ポリペプチド又はそのキメラのタンパク質を発現する発現ベクターの部分である。特に、このような核酸は、ポリペプチドのコード領域に作動可能に連結しているプロモーターを有し、前記プロモーターは、誘導性又は構成的（及び、場合により組織特異的）である。別の特定な実施形態では、コード配列及びあらゆる他の望ましい配列に、ゲノムにおける望ましい部位で相同組換えを促進する領域が隣接している核酸分子を用い、したがって、核酸の染色体内発現をもたらしている（Ｋｏｌｌｅｒ及びＳｍｉｔｈｉｅｓ、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８６巻、８９３２〜８９３５頁；Ｚｉｊｌｓｔｒａら、１９８９年、Ｎａｔｕｒｅ、３４２巻、４３５〜４３８頁）。
【０１５４】
ＰＳＫ−１核酸を、標準のクローニング及びスクリーニングの技術を用いて、ヒト細胞におけるｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡライブラリーから、発現遺伝子配列断片（ＥＳＴ）分析を用いて得ることができる（Ａｄａｍｓ，Ｍ．ら、１９９１年、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５２巻、１６５１〜１６５６頁；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ら、１９９２年、Ｎａｔｕｒｅ、３５５巻、６３２〜６３４巻；Ａｄａｍｓ，Ｍ．ら、１９９５年、Ｎａｔｕｒｅ、３７７巻、補巻３〜１７４頁）。ＰＳＫ−１核酸を、またゲノムのＤＮＡライブラリーなどの天然の供給源から得ることもでき、又はよく知られている、市販の技術を用いて合成することができる。上記に記載したＰＳＫ−１ポリペプチドに対するコード配列を含むＰＳＫ−１核酸を、前記ポリペプチドの組換えの生成に用いることができる。ＰＳＫ−１核酸は、成熟したポリペプチドに対するコード配列を単独で、又は他のコード配列とともに読み枠における成熟したポリペプチドに対するコード配列、例えば、リーダー配列又は分泌性の配列をコードするもの、プレ、プロ、若しくはプレプロタンパク質配列、切断可能な配列、又はアフィニティータグ若しくはポリペプチドの生成の間に安定性を付与するさらなる配列などの他の融合ペプチド部分を含むことができる。好ましいアフィニティータグには、多数のヒスチジン残基（例えば、Ｇｅｎｔｚら、１９８９年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、８６巻、８２１〜８２４頁を参照されたい）、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、又はｍｙｃタグが含まれる。ＰＳＫ−１核酸は、転写された、非転写の配列、スプライシング及びポリアデニル化のシグナル、リボソーム結合性部位、並びにｍＲＮＡを安定化する配列などの、非コードの５’及び３’配列も含むことができる。
【０１５５】
上記のＰＳＫ−１ポリペプチド誘導体は、コードされたタンパク質中に１つ又は複数のアミノ酸置換、付加、又は欠失が導入されるように、１つ又は複数のヌクレオチドの置換、付加、又は欠失を、ＰＳＫ−１核酸のヌクレオチド配列中に導入することにより創り出すことができる。当業者には知られている標準の技術を用いて、例えば、部位特異的突然変異誘発、及びＰＣＲ媒介性の突然変異誘発を含む突然変異を導入することができる。保存的なアミノ酸置換が、１つ又は複数の予想された非必須のアミノ酸残基でなされるのが好ましい。
【０１５６】
ＰＳＫ−１ポリペプチドをコードするＰＳＫ−１核酸は、ヒト以外の種からのホモログ及びオルソログを含めて、好適なライブラリーを厳密なハイブリダイゼーション条件下で、上記（ｄ）〜（ｈ）に記載したＰＳＫ−１核酸の配列を有する標識したプローブでスクリーニングするステップ、及び全長のｃＤＮＡと前記核酸配列を含むゲノムのクローンとを単離するステップを含むプロセスにより得ることができる。このようなハイブリダイゼーション技術は、当技術分野ではよく知られている。厳密なハイブリダイゼーション条件の一例は、約０．９Ｍの塩溶液を用いて約３５℃から約６５℃までの温度で試みられたハイブリダイゼーションを行う場合である。しかし、当業者であれば、プローブの長さ、塩基の組成、存在するイオンのタイプなどの変数を考慮に入れるために、適宜このような条件を変えることができる。高度の選択性を求めて、二本鎖を形成するのに低塩又は高温条件などの比較的厳密な条件を用いる。高度に厳密な条件には、６５℃で、０．５Ｍ  ＮａＨＰＯ４、７％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ中フィルター結合したＤＮＡへのハイブリダイゼーション、及び６８℃で、０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中の洗浄を含む（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．ら編集、１９８９年、「分子生物学における最近のプロトコール（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｉ巻、Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．、及びＪｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、２、１０、３頁）。いくつかの適用に対しては、二本鎖の形成に厳密性の劣る条件が必要とされる。中等度に厳密な条件には、４２℃での０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳにおける洗浄が含まれる（Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９年、上述）。ハイブリダイゼーション条件を、ハイブリッドの二本鎖を不安定化するために、増加量のホルムアミドの添加により、より厳密性を付与することもできる。このように、特定のハイブリダイゼーション条件は、容易に操作することができ、一般には適宜選択される。一般に、５０％ホルムアミド存在下の好都合なハイブリダイゼーション温度は、本明細書に定義するポリペプチドをコードする遺伝子のフラグメントに９５〜１００％同一であるプローブでは４２℃、９０〜９５％の同一性では３７℃、７０〜９０％の同一性では３２℃である。
【０１５７】
当業者であれば、多くの場合で、単離されたｃＤＮＡ配列は、ポリペプチドをコードする領域がｃＤＮＡの５’終端で短く切断される点で、不完全であることを理解するであろう。これは、本質的にプロセッシビティ（酵素が重合反応の間テンプレートに結合したままである能力の尺度）の低い酵素である逆転写酵素が、ｃＤＮＡ合成の第１の鎖の間にｍＲＮＡテンプレートのＤＮＡのコピーを完成することができない結果である。
【０１５８】
全長のｃＤＮＡを得るための方法、又は短いｃＤＮＡを延長するための方法は、ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ終端の迅速な増幅；例えば、Ｆｒｏｈｍａｎら、１９８８年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８５巻、８９９８〜９００２頁）など、当技術分野ではよく知られている。最近の技術の修飾は、Ｍａｒａｔｈｏｎ（登録商標）技術（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．）によって例示され、より長いｃＤＮＡに対する検索を著しく単純化している。この技術は、選択された組織から抽出されたｍＲＮＡから調製されたｃＤＮＡを使用しており、その後アダプター配列を各終端上に連結している。次いで、ＰＣＲを行って、遺伝子特異的な、及びアダプター特異的なオリゴヌクレオチドプライマーの組合せを用いて、ｃＤＮＡの失われた５’終端を増幅する。次いで、通常、アダプター配列におけるさらなる３’をアニールするアダプター特異的なプライマー、及び既知の遺伝子配列におけるさらなる５’をアニールする遺伝子特異的なプライマーである、増幅した生成物とアニールするようにデザインされているネステッドプライマーを用いて、ＰＣＲ反応を繰り返す。この反応の生成物を、次いで、ＤＮＡ配列決定、及び生成物を存在するｃＤＮＡに直接結合して完全な配列を得ることによって、又は５’プライマーのデザインに対する新しい配列方法を用いて別々の全長のＰＣＲを行うことによって構築された、全長のｃＤＮＡにより分析することができる。
【０１５９】
本発明のさらなる態様は、癌の処置及び／又は予防で有用なワクチン組成物に関する。上記に記載したＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸を、癌の処置及び／又は予防のためのワクチンの生成に用いることができる。このような材料は、抗原性及び／又は免疫原性であることができる。抗原性には、対象に抗体を産生させるのに用いることができ、又は実際に対象に抗体反応を誘発することができるタンパク質又は核酸が含まれる。免疫原性の材料には、対象に免疫反応を誘発することができるタンパク質又は核酸が含まれる。したがって、後者の場合では、タンパク質又は核酸は、抗体反応を産生することができるだけではなく、更に、非抗体ベースの免疫反応、即ち細胞性又は体液性の反応を産生することができる可能性がある。前記ポリペプチドの抗原性又は免疫原性を担う抗原性又は免疫原性のポリペプチド、即ちエピトープ又はエピトープ（複数）の領域を同定することが可能であり得ることは、当技術分野ではよく知られている。当業者にはよく知られているアミノ酸及びペプチドの特徴を用いて、ＰＳＫ−１ポリペプチドの抗原指数（ある領域が抗原性である可能性の尺度）を予想することができる。例えば、Ｃｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎ、Ｇａｒｎｉｅｒ−Ｒｏｂｓｏｎ、Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ、Ｋａｒｐｌｕｓ−Ｓｃｈｕｌｔｚ分析、又は「ペプチド構造」プログラム（Ｊａｍｅｓｏｎ及びＷｏｌｆ、１９８８年、ＣＡＢＩＯＳ、４巻（１）、１８１頁）、並びに「スレッディング（Ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と呼ばれる技術（Ａｌｔｕｖｉａ  Ｙ．ら、１９９５年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２４９巻、２４４頁）を用いることができる。したがって、ＰＳＫ−１ポリペプチドは、１つ若しくは複数のこのようなエピトープを含むことができ、又はそれらの抗原性／免疫原性の性質を保持するようにそのような領域に十分類似していることができる。
【０１６０】
特定の実施形態では、ワクチンで使用するための医薬組成物の有効物質としてのＰＳＫ−１ポリペプチドは、短いペプチドであり、好ましくはアミノ酸５から２０個の長さ、より好ましくはアミノ酸７から１５個、最も好ましくはアミノ酸８から１０個の長さである。このようなペプチドは、ワクチンの有効性を増強するために、修飾されているエピトープを含むことがある。このような修飾は、（ａ）ペプチドの主要組織適合性コンジュゲート分子に対する親和性の増大、（ｂ）Ｔ細胞受容体のトリガリングの増大、又は（ｃ）血清のペプチダーゼによるペプチドのタンパク質分解の阻害の役割を果たすことができる。
【０１６１】
ポリペプチド又は核酸は胃において分解されることがあるので、ワクチン組成物を非経口的（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、若しくは皮内注射）により、又は細菌若しくはウィルスのベクター（例えば、ＰＳＫ−１核酸配列を含むアデノウィルスのベクター）を用いた細胞の形質移入若しくは感染により投与することが好ましい。
【０１６２】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、
ａ）対象に免疫反応を誘発することにおけるこのようなワクチンの使用、及び
ｂ）対象に有効量のＰＳＫ−１ポリペプチド又は核酸を、好ましくはワクチンとして投与するステップを含む、対象における癌の処置及び／若しくは予防のための方法、又は対象を癌に対してワクチン接種する方法
を提供する。
【０１６３】
本発明の各実施形態の好ましい特色は、必要な変更を加えた各々の他の実施形態に関するものである。それだけには限定されないが、本明細書に引用した特許及び特許出願を含めた全ての出版物は、各個々の出版物が特に、及び個々に、完全に述べたように本明細書に参照として組み入れられることが示されるように、本明細書に組み入れられる。
【実施例】
【０１６４】
本発明は、次に、以下の実施例を参照にして記載するが、以下の実施例は例示にすぎず、本発明の範囲を限定するものと決して解釈してはならない。
【０１６５】
（実施例１）
腎臓腫瘍由来細胞系統及び慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）細胞からのＰＳＫ−１タンパク質の単離
細胞の原形質膜調製物におけるタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、分析した。
【０１６６】
１ａ−細胞培養
ヒト腎臓癌腫由来細胞であるＣＡＫＩ−２（ＥＣＡＣＣカタログ番号９３１２０８１９）を、９５％空気及び５％二酸化炭素の湿潤雰囲気中３７℃で、ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳで培養した。
【０１６７】
１ｂ−細胞分画及び原形質膜の産生
患者の同意を得て、ＣＬＬサンプルがＲｏｙａｌ  Ｍａｒｓｄｅｎ  ＮＨＳ  Ｔｒｕｓｔより提供された。Ｂ−ＣＬＬ細胞（１０９）を、４℃で５分間、１０００×ｇで遠心分離することにより洗浄し、これをさらに２回繰り返した。細胞ペレットをホモジナイゼーションバッファー（２５０ｍＭショ糖、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭバナジン酸塩、及び０．０２％アジドプロテアーゼ阻害物質）に再懸濁した。細胞を、ボールベアリングホモジナイザー（８．００２ｍｍボール、ＨＧＭ  Ｌａｂ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）を用いて、約９５％の細胞が破壊されるまで分画した。Ｐａｓｑｕａｌｉら（１９９９年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、７２２巻、８９〜１０２頁）が記載した方法を用いて、膜を分画した。分画した細胞を、４℃で１０分間、３０００×ｇで遠心分離し、核を含まない上清を６０％ショ糖クッション上に層積し、４５分間、１０００００×ｇで遠心分離した。膜を、パスツールピペットを用いて回収し、予め形成した１５から６０％のショ糖グラジエント上に層積し、１７時間、１０００００×ｇで回転した。
【０１６８】
精製した膜の調製物を、腎臓細胞系であるＣＡＫＩ−２から単離した。接着性の細胞（２×１０８）をＰＢＳで３回洗浄し、プラスチック製のセルリフターを用いて掻き取った。細胞を、４℃で５分間、１０００×ｇで遠心分離し、細胞ペレットをホモジナイゼーションバッファー（２５０ｍＭショ糖、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  バナジン酸、及び０．０２％アジド、プロテアーゼ阻害物質）に再懸濁した。細胞を、ボールベアリングホモジナイザー（８．００２ｍｍボール、ＨＧＭ  Ｌａｂ  ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ）を用いて、約９５％の細胞が破壊されるまで分画した。Ｐａｓｑｕａｌｉら（Ｐａｓｑｕａｌｉ  Ｃ．ら、１９９９年、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ、７２２巻、８９〜１０２頁）が記載した方法を用いて、膜を分画した。分画した細胞を、４℃で１０分間、３０００×ｇで遠心分離し、核を含まない上清を、６０％ショ糖クッション上に層積し、４５分間、１０００００×ｇで遠心分離した。膜を、パスツールピペットを用いて回収し、予め形成した１５から６０％のショ糖グラジエント上に層積し、１７時間、１０００００×ｇで回転させた。
【０１６９】
分画したショ糖グラジエントからのタンパク質を、４〜２０％１Ｄゲル（Ｎｏｖｅｘ）上に流し、ウェスタンブロットにかけた。
【０１７０】
１ｃ−１Ｄ−ゲル分析に対する原形質膜分画の調製
トランスフェリンの免疫反応性を有するが、酸化還元酵素ＩＩ又はカルネキシンの免疫反応性のない原形質膜分画を同定し、プールした。原形質膜分画を代表するこのプールを、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭバナジン酸塩、０．０２％アジドで少なくとも４倍希釈し、ＳＷ４０又はＳＷ６０チューブに加え、ゆっくりと加速及び減速して、４５分間、１０００００×ｇで遠心分離した。得られた膜のペレットから上清を除去し、ペレットをＰＢＳ−ＣＭで３回洗浄した。膜のペレットを、２％ＳＤＳの６３ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４に可溶化した。タンパク質のアッセイを行い、その後、メルカプトエタノール（最終２％）、グリセロール（１０％）、及びブロモフェノールブルー（最終０．００２５％）を加えた。最終タンパク質濃度１マイクログラム／マイクロリットルを、１Ｄ−ゲルのローディングに用いた。
【０１７１】
１ｄ−１Ｄゲル技術
タンパク質又は膜のペレットを、１Ｄサンプルバッファー（約１ｍｇ／ｍｌ）に可溶化し、混合物を５分間、９５℃に加熱した。
【０１７２】
Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｈｅｍｅｌ  Ｈｅｍｐｓｔｅａｄ、英国）から購入したプレキャスト８〜１６％グラジエントゲル上の１Ｄゲル電気泳動を用いて、サンプルを分離した。界面活性剤の抽出物から得た、タンパク質混合物３０〜５０マイクログラムを含むサンプルを、マイクロピペットを用いて積み重なっているゲルのウェルに適用した。画像化後に分離しているゲルを挿入することによるキャリブレーションに、分子量マーカー（１０、１５、２５、３７、５０、７５、１００、１５０、及び２５０ｋＤａ）を含むウェルが含まれた。３０ｍＡの電流をゲルに約５時間、又はブロモフェノールブルーのマーカー色素がゲルの底部に達するまで適用することにより、タンパク質の分離を行った。
【０１７３】
電気泳動後、ゲルプレートをこじ開け、ゲルを定着液（１０％酢酸、４０％エタノール、５０％水）のトレイに配置し、一夜振盪した。次いで、ゲルをプライマー溶液（７．５％酢酸、０．０５％  ＳＤＳのＭｉｌｌｉ−Ｑ水の溶液）で振盪することにより３０分間プライムし、その後、蛍光色素（０．０６％ＯＧＳ色素の７．５％酢酸溶液）と３時間振盪してインキュベートした。好ましい蛍光色素は、米国特許第６，３３５，４４６号に開示されている。この目的ではＳｙｐｒｏ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、オレゴン州）が適切な代替の色素である。
【０１７４】
染色したゲルのデジタル画像を、青色蛍光モードでＳｔｏｒｍ  Ｓｃａｎｎｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｃ、米国）上でスキャニングすることにより得た。捉えた画像を用いて、インゲルのタンパク質分解用に切り取るためのゲルの領域を決定した。
【０１７５】
１ｅ−選択されたタンパク質の回収及び分析
ステンレススチール製のメスの刃を用いて、ゲルの垂直方向の各レーンを切り取った。トリプシンで消化したペプチドを産生するために、トリプシンでのインゲルの消化を用いて、タンパク質を処理した（Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｔｒｙｐｓｉｎ、Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ、米国）。回収したサンプルを２つに分けた。ＭＡＬＤＩ分析の前に、サンプルを脱塩し、Ｃ１８  Ｚｉｐ  Ｔｉｐｓ（登録商標）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｅｄｆｏｒｄ、マサチューセッツ州）を用いて濃縮した。Ｃ１８  ＳＰＥ材料を組み入れたナノＬＣシステム（ＬＣ  Ｐａｃｋｉｎｇｓ、アムステルダム、オランダ）を用いて、タンデム質量分析法用のサンプルを精製した。回収したペプチドのプールを、脱離に波長３３７ｎｍのレーザー、及び反射モードの分析を用いて、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析計（Ｖｏｙａｇｅｒ  ＳＴＲ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ、マサチューセッツ州）により分析した。プールを、また、Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  Ｔｉｍｅ−ｏｆ−Ｆｌｉｇｈｔ（Ｑ−ＴＯＦ）質量分析計（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ、Ａｌｔｒｉｎｃｈａｍ、英国）を用いて、ナノ−ＬＣタンデム質量分析（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）により分析した。部分的にアミノ酸の配列決定をするために、並びにＣＬＬ及び腎臓癌細胞の膜タンパク質を同定するために、トリプシンペプチドの解釈されていないタンデム質量スペクトルを、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／でアクセス可能なＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）が所有する非重複のデータベースにおける、パブリックドメインのタンパク質が構築するタンパク質エントリーのデータベースに対して、ＳＥＱＵＥＳＴ検索プログラム（Ｅｎｇら、１９９４年、Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、５巻、９７６〜９８９頁）、バージョンｖ．Ｃ．１を用いて検索した。データベースの同定のための判定基準には、トリプシンの切断特異性；データベースから回復したペプチドにおける１セットのａ、ｂ、及びｙイオンの検出；並びにカルバミドメチル化を説明する全てのＣｙｓ残基の質量の増加が含まれる。ＳＥＱＵＥＳＴプログラムを用いたスペクトル−スペクトル相関によるタンパク質の同定の後、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルで検出された質量を、同定したタンパク質内のトリプシン消化したペプチドに割り当てた。ＳＥＱＵＥＳＴプログラムを用いてトリプシン消化したペプチドの解釈されていないＭＳ／ＭＳスペクトルで検索をすることによりアミノ酸配列が同定できない場合は、当技術分野で知られている方法を用いて、ペプチドのタンデム質量スペクトルを手操作で解釈した（ペプチドイオンの低エネルギーフラグメント化の質量スペクトルを解釈する場合は、Ｇａｓｋｅｌｌら、１９９２年、Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．、６巻、６５８〜６６２頁を参照されたい）。ＷＯ０２／２１１３９に記載されている方法も、質量スペクトルの解釈に用いることができる。
【０１７６】
２つのタンデムスペクトル（図１において太字及び下線で示してある）、並びに複数の質量の一致（図１において太字及び下線で示してある）が、それぞれ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ及びＧｅｎｂａｎｋ受諾番号Ｑ９ＵＪ４７及びＣＡＢ５７９５０．１に一致することが見出された。
【０１７７】
（実施例２）
定量的ＲＴ−ＰＣＲ（Ｔａｑｍａｎ）分析を用いた、ＰＳＫ−１の正常組織の分布及び疾患組織の上方制御
組織サンプルをＣｌｉｎｏｍｉｃｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．、メリーランド州、及びＡｒｄａｉｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｌｅｘｉｎｇｔｏｎ、マサチューセッツ州から得た。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて、正常組織及び腫瘍組織におけるＰＳＫ−１発現を定量的に測定した。ＰＣＲに用いたプライマーは以下の通りである：
センス、５’−ｔｇａａａｇｇｇｔｃｔｃｇｃｔｇｇａｔｇａｇ−３’（配列番号３）
アンチセンス、５’−ｇａｔｔｇｇｃａｇｇｔｇｔｃｔｃｔｇａｃａｇ−３’（配列番号４）。
【０１７８】
ｃＤＮＡ５ｎｇ、ＳＹＢＲ緑色配列検出試薬（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、並びにセンス及びアンチセンスプライマーを含む反応を、ＡＢＩ７７００配列検出システム（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）上でアッセイした。ＰＣＲ条件は、５０℃２分間１サイクル、９５℃１０分間１サイクル、及び９５℃１５秒、６５℃１分間で４０サイクルであった。ＰＣＲ生成物の蓄積を、ＳＹＢＲの緑色蛍光における増大としてリアルタイムで測定し、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒプログラムｖ１．６．３（ＰＥ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてデータを分析した。蛍光及び増幅サイクルに対する、始めのテンプレートのコピー数に関する検量線を、増幅されたＰＣＲ生成物をテンプレートとして用いて生成し、各サンプルにおけるＰＳＫ−１コピー数を計算するのに用いた。
【０１７９】
比較的低い発現レベルのＰＳＫ−１が正常組織に見られ、最高のレベルが脳に見られた。それとは対照的に、ＰＳＫ−１発現のレベルは、乳癌サンプル及び細胞系統、卵巣癌サンプル及び細胞系統、並びに骨肉腫サンプル及び骨肉腫細胞系であるＳＡＯＳ２で、大幅に増大した（図３）。これらのデータは、ＰＳＫ−１が、癌の診断のためのマーカーであり、癌における治療的介入のための標的であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１８０】
【図１】ＰＳＫ−１のアミノ酸配列（配列番号１）を示す図である。
【図２】図１のＰＳＫ−１ポリペプチドの対応する核酸配列（配列番号２）を示す図である。
【図３】ＰＳＫ−１ｍＲＮＡの分布を示す図である。ｍＲＮＡレベルを、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにより定量し、ｃＤＮＡのｎｇあたりのコピー数として表してある。パネルＡは、正常の乳房組織、乳癌組織（「Ｍ」若しくは「Ｃ」で始まる）、又は乳癌細胞系（ＢＴ２０からＺＲ１７５）を示す。パネルＢは、正常の肺組織、肺癌組織（「Ｃ」で始まる）、及び肺癌細胞系ＭＲＣ５からＡ５４９である。パネルＣは、正常の卵巣、卵巣癌組織（「Ｃ」で始まる）、及び卵巣癌細胞系（ＯＶ９０からＡ２７８０）を示す。パネルＤは、骨肉腫組織、及びＳＡＯＳ骨肉腫由来細胞系を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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