(57)【要約】  本発明は、生体分子固定用ビーズ及びこれを用いたバイオチップの製造方法に係り、さらに詳しくは、生体分子を固定する支持体とチップ基板の表面に対する粘着剤としての特徴を同時に持つ粘着性ビーズ、及び前記粘着性ビーズに生体分子を結合させ、生体分子が固定されたビーズの水性懸濁液を製造した後、これを基板上に固定することを特徴とするバイオチップの製造方法に関するものである。  本発明による粘着性ビーズは、生体分子を固定する支持体とチップ基板の表面に対する粘着剤としての特徴を同時に持つため、別途の装置及び処理過程なしにバイオチップ上に直接固定させることができる。
2008501043.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性媒質に親水性モノマー、主単量体及び共単量体を乳濁させた後、重合させて製造された、生体分子を固定する支持体とチップ基板の表面に対する粘着剤としての特徴を同時に持つ粘着性ビーズ。
【請求項２】
前記親水性モノマーが、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、アクリルアミド、グリシジルメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、パリトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、リノレン酸、アリルアルコール及びビニルアルコールよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１に記載の粘着性ビーズ。
【請求項３】
前記主単量体が、ブタジエン、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、エチルヘキシルアクリレート及びオクチルアクリレートよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１に記載の粘着性ビーズ。
【請求項４】
前記共単量体が、酢酸ビニル、アクリロニトリル、アクリルアミド、スチレン、メチルメタクリレート及びメチルアクリレートよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１に記載の粘着性ビーズ。
【請求項５】
次の工程を含む、粘着性ビーズの製造方法：
（ａ）乳化剤水溶液に単量体を添加し、混合して乳濁液を作る工程；
（ｂ）水性媒質に親水性モノマーを添加し、窒素雰囲気下で約７５℃まで昇温した後、ここに前記（ａ）工程で得られた乳濁液を添加し、攪拌して乳濁させる工程；及び
（ｃ）前記（ｂ）工程で得られた乳濁液に重合開始剤を添加した後、反応させる工程。
【請求項６】
前記水性媒質が、水、エタノール、メタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン及びＮＭＰよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記親水性モノマーが、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、アクリルアミド、グリシジルメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、パリトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、リノレン酸、アリルアルコールおよびビニルアルコールよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記単量体が、ブタジエン、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、エチルヘキシルアクリレート及びオクチルアクリレートよりなる群から選ばれた少なくとも一つの主単量体と、酢酸ビニル、アクリロニトリル、アクリルアミド、スチレン、メチルメタクリレート及びメチルアクリレートよりなる群から選ばれた少なくとも一つの共単量体とを含有することを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記乳化剤が、ラウリル硫酸ナトリウム、ゼラチン、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、臭化セチルトリメチルアンモニウム及びオレイン酸ナトリウムよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記重合開始剤が、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、アゾビスブチロニトリル（ＡＩＢＮ）及び過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）よりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記主単量体と前記共単量体の配合比が、前記粘着性ビーズのガラス転移温度（Ｔｇ）によって決定され、前記ガラス転移温度（Ｔｇ）はバイオチップの製作または使用温度より０〜４５℃低いことを特徴とする、請求項８に記載の方法。
【請求項１２】
次の工程を含む、バイオチップの製造方法 ：
（ａ）請求項１乃至請求項４の何れか一項に記載の粘着性ビーズに生体分子を付着させ、生体分子を固定したビーズの水性懸濁液を製造する工程；及び
（ｂ）前記水性懸濁液を基板上に固定させる工程。
【請求項１３】
前記（ｂ）工程が、水性懸濁液を基板上にスポッティングさせた後、これを乾燥させて基板上に固定させることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記スポッティングが、インクジェットによって行うことを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記粘着性ビーズに生体分子を付着させる方法が、疎水性吸着法、共有結合法及び静電気的引力による結合法よりなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記生体分子が、核酸、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、酵素基質、リガンド及びコファクターよりなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記基板が、マイクロウェル、スライド基板及びラボ・オン・チップの微細流路よりなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【請求項１８】
前記基板の材料が、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー、ポリノルボルネン、スチレン−ブタジエンコポリマー、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ガラス、シリコン、ヒドロゲル、金属、セラミック及び多孔性メンブレインよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とする、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１２に記載の方法によって製造され、生体分子が付着している粘着性ビーズが基板に固定されているバイオチップ。
【請求項２０】
次の工程を含む、試料内の標的物質の検出方法：
（ａ）請求項１９に記載のバイオチップに、標的物質を含有する試料を適用する工程；及び
（ｂ）前記バイオチップ上の生体分子と特異的に結合する標的物質を検出する工程。
【請求項２１】
前記標的物質の検出が、放射線同位元素や発光または発色染料などの生体標識子を用いた検出法、生体酵素を用いた酵素免疫測定法(ＥＬＩＳＡ)、電気化学的免疫測定法、粒子を用いた免疫比濁法、及び蛍光発色団を用いた検出法よりなる群から選ばれた少なくとも一つを使用することを特徴とする、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ビーズが基板に固定されている、ラミブジン耐性を有するＢ型肝炎ウィルスの感染の有無を確認するバイオチップであって、請求項１乃至請求項４の何れか一項に記載の粘着性ビーズに配列番号１または配列番号２のＳＮＰ(一塩基多型)が付いているバイオチップ。
【請求項２３】
請求項１乃至請求項４の何れか一項に記載の粘着性ビーズがチップ基板の表面に全体的または局部的にコートされている凸凹構造物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子固定用ビーズ及びこれを用いたバイオチップの製造方法に係り、さらに詳しくは、生体分子を固定する支持体とチップ基板の表面に対する粘着剤としての特徴を同時に持つ粘着性ビーズ、及び前記粘着性ビーズに生体分子を結合させ、生体分子が固定されたビーズの水性懸濁液を製造した後、これを基板上に固定することを特徴とするバイオチップの製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体分子の固定が可能な固定相支持体は、生体分子間の選択的親和力(affinity)を利用する多くの生物学的な応用分野で広く活用されており、代表的には、アガロース、セルロース、多孔性ガラス、シリカ、アルミナ、ゼオライトなどの天然支持体と、ポリアクリルアミド系ビーズ、ポリメタクリル酸系ビーズ、ポリスチレン系ビーズ、メンブレインなどの合成支持体がある(Regnier, F.E., J. Chromatogr. Sci., 14:316, 1976; Hjerten, S., Anal. Biochem., 3:109, 1962)。
【０００３】
このような固定相支持体は、タンパク質の分離・精製またはアフィニティークロマトグラフィなどの伝統的な分野の他にも、ハイ・スループット・スクリーニング(High Throughput Screening; ＨＴＳ)と診断の用途に用いられるバイオチップ(biochip)分野で生体分子をチップ基板に固定するための担体として広く活用されている(Sato, K., Adv. Drug Deliv. Rev., 55:379, 2003; Andersoon, H., Electrophoresis, 22:249, 2001; Choi, J.W., Biomed. Microdevices, 3:191, 2001)。これは、従来から当該分野で使用されてきた自己組立(self-assembly)のような２次元固定方法の技術的な限界点、すなわち生体分子の集積化と生理活性の保存が難しい問題を解決するための代案として提案されたものである。固定相支持体の存在により、３次元の広い表面積を用いて生体分子を高濃度で担持し、これをチップ基板上に固定することによって、生体分子の生体親和的な集積化が可能になった。
【０００４】
使用可能な固定相支持体としては、いろいろな形態がある。例えば、メンブレイン形態は、セルロースのように特徴的な多孔構造を持つ広い表面を生体分子の固定面として活用する支持体であり、高分子マトリックス形態は、基板上にグルコース、ポリリシン、キトサン、デキストラン、ポリアリルアミン、ポリビニルアルコールなどの生体親和性高分子からなる薄い高分子マトリックスを形成して固定化面を広くし、生体分子の基板に対する立体障害を改善した支持体である(韓国特許公開第２００４−０００４７２５号； Yakovleva, J., Biosens. Bioelectron., 19:21, 2003; Gill, I., Trends in Biotechnology, 18:282, 2000; US 5,034,428; US 5,482,996)。
【０００５】
一方、ビーズ形態の支持体は、球状を有する個々のビーズに生体分子を固定し、これを集めて広い表面積の３次元構造体を成すようにする固定化支持体であって、チップ基板上に形成させる場合、バイオチップとしての活用が可能である(Sato, K., Adv. Drug Deliv. Rev., 55:379, 2003); Andersoon, H., Electrophoresis, 22:249, 2001; Choi, J.W., Biomed. Microdevices, 3:191, 2001)。前記メンブレインまたは高分子マトリックス支持体は、生体分子の固定が外部と接触する表面の周囲に制限されるか、或いは生体分子の固定力を高めるために共有結合的に結合する場合、外部環境に敏感な酵素またはその他のタンパク質の生理活性を維持することが難しいという幾つかの欠点を有する。これに反し、ビーズ支持体は、既に生体分子が固定した個々のビーズを使用して３次元構造体を作るため、表面積の活用率が高く、生体分子の活性を維持させる多様な固定化方法を活用することができるため、利点が大きい。特に、取り扱いが非常に容易なので、ラボ・オン・チップ(Lab-on-a-chip)のように微細流路内に生体分子を固定しなければならないバイオチップ製作工程においてチップの製造を容易にする、適した材料となる。
【０００６】
また、既存のビーズは、それ自体がチップ基板に対する粘着性を持たないため、微細流路内にビーズを固定するための別途の方法が必要であるという欠点がある。現在まで開発されて使用されるビーズを固定する代表的な方法としては、物理的な障壁を用いてビーズを微細流路内に閉じ込める方法、磁場を用いて固定する方法、及び超音波またはレーザピンセット(laser tweezer)を用いた方法がある。ところが、これらの方法は、ビーズの選択に制限があり、チップを製作する加工工程が複雑であり、光学測定時のノイズが大きく、チップの内部或いは外部に別途の装置が必要であるという欠点を有する。そのため、ラボ・オン・チップの目的として適用するには多少非経済的であるという問題点がある(Sato, K., Adv. Drug Deliv. Rev., 55:379, 2003; Andersoon, H., Electrophoresis, 22:249, 2001; Choi, J.W., Biomed. Microdevices, 3:191, 2001; Meng, A., Transducers, Sendai, Japan, 876, 1999; Dorre, K., Bioimaging, 5:139, 1997)。
【０００７】
一方、本出願人は、プローブ、またはプローブが固定されたビーズを粘着剤を用いて基板の表面に固定させることを特徴とするバイオチップの製造方法について特許出願（韓国特許出願第１０−２００４−１０４９４４号）したことがある。前記特許によれば、プローブが固定されたビーズを基板に、物理的な障壁または電場によらず粘着剤によって固定させることが可能であるが、これも、やはり、ビーズを基板に固定させるためには別途の粘着剤を添加しなければならないという煩わしさが依然として存在する。
【０００８】
したがって、当業界では、生体分子を固定する支持体と、チップ基板の表面に対する粘着剤としての特徴を同時に持っており、別途の装置及び処理過程なしにバイオチップ上に直接固定させることが可能な粘着性ビーズ、及びこれを用いたバイオチップの開発が切望されている。
【特許文献１】韓国特許公開第２００４−０００４７２５号
【特許文献２】US 5,034,428
【特許文献３】US 5,482,996
【非特許文献１】Regnier, F.E., J. Chromatogr. Sci., 14:316, 1976
【非特許文献２】Hjerten, S., Anal. Biochem., 3:109, 1962
【非特許文献３】Sato, K., Adv. Drug Deliv. Rev., 55:379, 2003
【非特許文献４】Andersoon, H., Electrophoresis, 22:249, 2001
【非特許文献５】Choi, J.W., Biomed. Microdevices, 3:191, 2001
【非特許文献６】Yakovleva, J., Biosens. Bioelectron., 19:21, 2003
【非特許文献７】Gill, I., Trends in Biotechnology, 18:282, 2000
【非特許文献８】Sato, K., Adv. Drug Deliv. Rev., 55:379, 2003)
【非特許文献９】Andersoon, H., Electrophoresis, 22:249, 2001
【非特許文献１０】Choi, J.W., Biomed. Microdevices, 3:191, 2001
【非特許文献１１】Meng, A., Transducers, Sendai, Japan, 876, 1999
【非特許文献１２】Dorre, K., Bioimaging, 5:139, 1997
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
そこで、本発明者らは、生体分子を固定する支持体と、チップ基板の表面に対する粘着剤としての特徴を同時に持っているため、別途の装置及び処理過程なしにバイオチップ上に直接固定させることが可能な粘着性ビーズ、及びこれを用いたバイオチップを開発するために鋭意努力した結果、本発明を完成するに至った。
【００１０】
本発明の目的は、生体分子を固定する支持体と、チップ基板の表面に対する粘着剤としての特徴を同時に持つ粘着性ビーズ、及びその製造方法を提供することにある。
【００１１】
本発明の他の目的は、前記粘着性ビーズに生体分子を付着させ、生体分子を固定したビーズの水性懸濁液を製造した後、これを基板上に固定させることを特徴とするバイオチップの製造方法、及び前記方法によって製造されたバイオチップを提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記目的を達成するために、本発明は、水性媒質に親水性モノマー、主単量体(mainmonomer)及び共単量体(comonomer)を乳濁させた後、重合させて製造された、生体分子を固定する支持体とチップ基板の表面に対する粘着剤としての特徴を同時に持つ粘着性ビーズを提供する。
【００１３】
本発明において、前記親水性モノマーは、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、アクリルアミド、グリシジルメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、パリトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、リノレン酸、アリルアルコール及びビニルアルコールよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とすることができ、前記主単量体は、ブタジエン、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、エチルヘキシルアクリレート及びオクチルアクリレートよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とすることができ、前記共単量体は、酢酸ビニル、アクリロニトリル、アクリルアミド、スチレン、メチルメタクリレート及びメチルアクリレートよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とすることができる。
【００１４】
本発明は、また、（ａ）乳化剤水溶液に単量体を添加し、混合して乳濁液（emulsion）を作る工程と、（ｂ）水性媒質に親水性モノマーを添加し、窒素雰囲気下で約７５℃まで昇温した後、ここに前記（ａ）工程で得られた乳濁液を添加し、攪拌して乳濁させる工程と、（ｃ）前記（ｂ）工程で得られた乳濁液に重合開始剤を添加した後、反応させる工程とを含む、粘着性ビーズの製造方法を提供する。
【００１５】
本発明による粘着性ビーズの製造方法において、前記水性媒質は、水、エタノール、メタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン及びＮＭＰよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とすることができ、前記親水性モノマーは、メタクリル酸、アクリル酸、イタコン酸、ヒドロキシエチルメタクリレート、ヒドロキシプロピルメタクリレート、アクリルアミド、グリシジルメタクリレート、ポリエチレングリコールアクリレート、ポリエチレングリコールメタクリレート、パリトレイン酸、オレイン酸、リノール酸、アラキドン酸、リノレン酸、アリルアルコールおよびビニルアルコールよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とすることができる。
【００１６】
本発明による粘着性ビーズの製造方法において、前記単量体は、ブタジエン、エチルアクリレート、ブチルアクリレート、エチルヘキシルアクリレート及びオクチルアクリレートよりなる群から選ばれた少なくとも一つの主単量体と、酢酸ビニル、アクリロニトリル、アクリルアミド、スチレン、メチルメタクリレート及びメチルアクリレートよりなる群から選ばれた少なくとも一つの共単量体とを含有することを特徴とすることができる。また、前記主単量体と前記共単量体の配合比は前記粘着性ビーズのガラス転移温度（Ｔｇ）によって決定され、前記ガラス転移温度（Ｔｇ）はバイオチップの製作または使用温度より０〜４５℃低いことを特徴とすることができる。
【００１７】
本発明による粘着性ビーズの製造方法において、前記乳化剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ゼラチン、メチルセルロース、ポリビニルアルコール、臭化セチルトリメチルアンモニウム及びオレイン酸ナトリウムよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とすることができ、前記重合開始剤は、過硫酸カリウム、過硫酸アンモニウム、アゾビスブチロニトリル（ＡＩＢＮ）及び過酸化ベンゾイル（ＢＰＯ）よりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とすることができる。
【００１８】
本発明は、また、（ａ）粘着性ビーズに生体分子を付着させ、生体分子が固定されたビーズの水性懸濁液を製造する工程と、（ｂ）前記水性懸濁液を基板上に固定させる工程とを含む、バイオチップの製造方法を提供する。
【００１９】
本発明によるバイオチップの製造方法において、前記（ｂ）工程は、水性懸濁液を基板上にスポッティング(spotting)させた後、これを乾燥させて基板上に固定させることを特徴とすることができ、前記スポッティングは、インクジェットによって行うことを特徴とすることができ、前記粘着性ビーズに生体分子を付着させる方法は、疎水性吸着法、共有結合法及び静電気的引力による結合法よりなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とすることができる。
【００２０】
本発明によるバイオチップの製造方法において、前記生体分子は、核酸、アミノ酸、タンパク質、ペプチド、脂質、炭水化物、酵素基質、リガンド及びコファクターよりなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とすることができ、前記基板は、マイクロウェル、スライド基板及びラボ・オン・チップの微細流路よりなる群から選ばれたいずれか一つであることを特徴とすることができ、前記基板の材料は、ポリメチルメタクリレート、ポリカーボネート、ポリスチレン、環状オレフィンコポリマー、ポリノルボルネン、スチレン−ブタジエンコポリマー、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ガラス、シリコン、ヒドロゲル、金属、セラミック及び多孔性メンブレインよりなる群から選ばれた少なくとも一つであることを特徴とすることができる。
【００２１】
本発明は、また、前記方法によって製造され、生体分子が付着している粘着性ビーズが基板に固定されているバイオチップを提供する。
【００２２】
本発明は、また、（ａ）バイオチップに、標的物質を含有する試料を適用する工程と、（ｂ）前記バイオチップ上の生体分子と特異的に結合する標的物質を検出する工程とを含む、試料内標的物質の検出方法を提供する。
【００２３】
前記標的物質の検出は、放射性同位元素や発光(luminescence)または発色染料などの生体標識子(biolabel)を用いた検出法、生体酵素を用いた酵素免疫測定法(enzyme-linked immunoassay、ＥＬＩＳＡ)、電気化学的免疫測定法(electrochemical immunoassay)、粒子を用いた免疫比濁法(particle turbidimetric immunoassay)、及び蛍光発色団(fluorophore)を用いた検出法よりなる群から選ばれた少なくとも一つを使用することを特徴とすることができる。
【００２４】
本発明は、また、配列番号１または配列番号２のＳＮＰ(single nucleotide polymorphism)が付いている粘着性ビーズが基板に固定されている、ラミブジン耐性Ｂ型肝炎ウィルスの感染の有無を確認するバイオチップを提供する。
【００２５】
本発明は、また、粘着性ビーズがチップ基板の表面に全体的にまたは局部的にコートされている凸凹構造物を提供する。
【００２６】
本発明のさらなる他の特徴及び具体例は、以下の詳細な説明及び添付された特許請求の範囲からさらに明確になるであろう。
【００２７】
図１から図１７の説明を以下に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明は、生体分子を固定する支持体と、チップ基板の表面に対する粘着剤としての特徴を同時に持つ粘着性ビーズ、その製造方法、前記粘着性ビーズに生体分子が付着しているビーズが基板に固定されているバイオチップ及びその製造方法に関するものである。以下に、本発明によるバイオチップの製造方法を工程別に説明する。
【００２９】
（第１工程：粘着性ビーズを含有する水性懸濁液の製造）
本発明の粘着性ビーズは水性懸濁液中で粘着性質のある固形分をいい、粘着性を持たせる主単量体、固形性を持たせる共単量体、及び水系分散のための親水性モノマーを基本構成物質とする。
【００３０】
本発明の粘着性ビーズは、水性媒質に主単量体、共単量体及び親水性モノマーを混合し、通常の重合方法、例えば懸濁、乳化、分散、マイクロ乳化、ミニ乳化、逆乳化重合などの方法で製造することができ、重合条件に応じて多様なサイズのビーズを得ることができる。生体分子を固定する支持体として用いるために、通常、数十ナノメートル〜数ミクロンの直径に製造する。
【００３１】
また、前記ビーズに支持体と粘着剤としての２つの機能を同時に与えることは、ビーズを構成する主単量体と共単量体の配合比を調節することにより可能である。具体的には、主単量体の柔軟でねっとりした粘着特性と共単量体の堅い固形特性を用いて、バイオチップの使用環境で同時に現われうる共重合比率を選択することにより可能である。この際、主単量体と共単量体の配合比を決定する最も重要な要因は、製造されたビーズが持つ固有のガラス転移温度（Ｔｇ）であり、前記Ｔｇはバイオチップの製作または使用温度より０〜４５℃低いことが好ましい。例えば、常温（２５℃）でバイオチップを製作または使用する場合、粘着性ビーズのＴｇは、常温より０〜４５℃低い温度である−１５〜２５℃の範囲が好ましく、−１５〜１０℃の範囲がさらに好ましい。
【００３２】
（第２工程：粘着性ビーズへの生体分子の固定及びこれを含有するビーズ水性懸濁液の製造）
本発明のバイオチップは、チップ基板上に固定される生体分子の集積率を高めるために、広い表面積を持つ粘着性ビーズを媒介体として活用する。
【００３３】
生体分子をビーズに固定する方法としては、疎水性のビーズ自体の表面と相互作用させる疎水性吸着法、ビーズを構成する共重合体鎖の特定の反応基を利用する共有結合法、静電気力による結合法などがある。前記ビーズの水性懸濁液を製造するときに用いられる水性媒質は、水性特性を有する任意の溶媒を使用することができる。すなわち、前記水性媒質には、水、エタノール、メタノール、ＤＭＦ、ＤＭＳＯ、アセトン、ＮＭＰがあるが、これらに限定されず、好ましくは水を使用することができる。
【００３４】
（第３工程：ビーズ水性懸濁液のスポッティング）
前記生体分子を固定したビーズの懸濁液は、その懸濁液を基板上にスポッティングすることにより、基板の表面への固定化が可能である。前記スポッティングは、当業界で通常用いられる任意のスポッティング方法を用いることができ、代表的にインクジェットによるスポッティング方法を用いることができる。インクジェット方法を用いる場合、本発明によるビーズ水性懸濁液を定量的に基板上に噴射することが容易なので有利である。
【００３５】
粘着性ビーズを固定する基板は、バイオチップ分野で使用される多様な基板が使用できるが、その代表的な例としては、マイクロウェル、スライド基板またはラボオンチップ微細流路があるが、これらに限定されるものではない。また、前記基板の材料としては、ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリスチレン（ＰＳ）、環状オレフィンコポリマー、ポリノルボネン、スチレン−ブタジエンコポリマー（ＳＢＣ）、アクリロニトリルブタジエンスチレン、ガラス、シリコン、ヒドロゲル、金属、セラミック、多孔性メンブレインが使用でき、これらに限定されるものではない。
【００３６】
（第４工程：乾燥）
乾燥は、スポテッィングによるバイオチップを製造するときに用いられる通常の乾燥方法が使用でき、例えば常温乾燥がある。物質に応じて適切な乾燥温度があるが、タンパク質の場合は１５〜３３℃であり、ＤＮＡの場合は１５〜９０℃である。
【００３７】
前記のような過程を経て製造されたバイオチップを走査電子顕微鏡で観察した結果、図１及び図２に示すように、固着過程を経ながら現われるビーズが基板上に結合することを確認することができる。その結果から、本発明による粘着性ビーズを用いてバイオチップの製作が可能であることが分かった。
【００３８】
（本発明によって製造されたバイオチップの応用）
本発明は、生体分子が固定された粘着性ビーズを前記チップ基材上にスポッティングして固定し、検出しようとする標的物質試料を適用する工程と、前記生体分子に特異的に結合した標的物質を検出する工程とを含む、検出試料内に存在する標的物質の有無及び含量の分析に応用することができる。
【００３９】
また、本発明による粘着性ビーズは、それ自体をチップ基板の表面に全体的または局部的にコートし、ビーズからなる凸凹構造物を製造するのに使用することができる（図７）。このような立体的な構造物は、バイオチップ内でいろいろの有用な機能、例えば検出部に適用されて生体分子を直接スポッティングして固定する多面積基板の表面として使用されるか、或いは毛細管の流れを利用するラボオンチップの特定の微細流路に適用されて疎水性作用による流体遅延部として活用できる。
【実施例】
【００４０】
以下、実施例によって本発明をさらに詳細に説明するが、これらの実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎない。本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものと解釈してはならないのは、当業界で通常の知識を有する者には自明なことであろう。
【００４１】
（実施例１：粘着性ビーズを含有する水性懸濁液の製造）
主反応器(reactor)に脱イオン水６２２．１ｇとイタコン酸３．５ｇを投入し、窒素雰囲気下で７５℃まで昇温させた。別途の反応器にブチルアクリレート３５．０ｇ、メチルメタクリレート３１．４ｇ、アリルメタクリレート０．１ｇ及び３重量％ラウリル硫酸ナトリウム水溶液１．２ｇを混合した乳濁液を準備した。
【００４２】
主反応器の温度が安定すると、前記別途の反応器で準備した乳濁液を投入し、１時間以上攪拌して十分乳濁させた後、３重量％硫酸カリウム水溶液を２回にわたって７．０ｇと１．０ｇを投入し、２時間反応を行うことにより、粘着性ビーズを含む重合物を合成した。
【００４３】
前記重合物を透析(dialysis)とイオン交換樹脂を用いて洗浄した後、脱イオン水に希釈することにより、粘着性ビーズを含む水性懸濁液を製造した。前記粘着性ビーズは、投入される乳化剤の量を調節してその大きさを調節することができる。図３は、様々な量の乳化剤であるラウリル硫酸ナトリウムを用いて製造されたビーズを粒度分析した結果を示し、０．１〜０．０５重量％範囲の乳化剤を投入する場合、平均サブマイクロサイズ水準のビーズが製造されることが分かった。
【００４４】
一方、共重合体である粘着性ビーズのガラス転移温度は、一般に、主単量体の高分子であるポリブチルアクリレートと共単量体の高分子であるポリメチルメタクリレートが有するガラス転移温度の中間値に相当する値を示す。したがって、各単量体の配合比を調節することにより、目的のガラス転移温度を有する粘着性ビーズを製造することができた（図４）。
【００４５】
図５は、互いに異なるガラス転移温度（Ｔｇ）を持つビーズを走査電子顕微鏡で観察した写真である。図５を参照すると、常温乾燥条件で、ガラス転移温度が低いビーズは、粘着性が強くて基板に容易に粘着されるが、フィルム化されて立体構造を持たず、これに対し、ガラス転移温度が高いビーズは、固形性が強くてはっきりとしたビーズ形状を示すが、壊れ易くて基板によく固着されない傾向を示した。したがって、常温乾燥する場合、−１５〜１０℃範囲のガラス転移温度を持つ粘着性ビーズが適切であることが分かった。
【００４６】
（実施例２：生体分子の濃度による固定化効率試験）
前記実施例１で製造されたビーズの表面は、生体分子が固定される面と基板に粘着される面の両方ともを持っているので、全体ビーズの表面積において生体分子が占める面積を調節して、本発明の目的である粘着性ビーズの使用効率を調節することができる。
【００４７】
固定化生体分子として牛血清アルブミン(bovine serum albumin)のリン酸緩衝（ｐＨ７．２）水溶液を０．１６、０．３１、０．９３、１．５５、３．１０ｍｇ／ｍＬの濃度で準備した後、前記ビーズを２重量％含む水性懸濁液と１：１の比率で混合し、常温で１４時間振盪して反応させた。反応終了後、遠心分離して上澄液を集めた後、固定化されていない牛血清アルブミンの量を測定し、ビーズに固定された牛血清アルブミンの量を定量した（図６）。その結果、図６に示すように、固定化される生体分子の反応量を調節することにより、ビーズ表面の被覆率を調節することができた。
【００４８】
（比較例１：固定時間による固定比率の測定及びポリスチレンビーズとの比較試験）
前記ビーズに固定される生体分子の量を反応時間に応じて測定し、商用化された代表的なビーズであるポリスチレンビーズの場合と比較した。
【００４９】
牛血清アルブミンのリン酸緩衝（ｐＨ７．２）水溶液１．６ｍｇ／ｍＬと、実施例１で製造した粘着性ビーズ（直径５１０ｎｍ）またはポリスチレンビーズ（直径６００ｎｍ）を２重量％含む水性懸濁液とを準備し、実施例２と同様の方法で固定化過程を行った。ビーズに生体分子を固定化させる反応時間による、表面被覆率を測定した（図７）。その結果、図７に示すように、実施例１で製造された粘着性ビーズの場合、反応時間を調節することにより、生体分子の表面被覆率を調節することができ、且つ商用化されたポリスチレンビーズと同等の優れた固定化効率を示すことが分かった。
【００５０】
（実施例３：粘着性ビーズの濃度によるスポットの形状）
粘着性ビーズを用いたバイオチップの製作において、基板に形成されたスポットの形状は、分注されるビーズ水性懸濁液のビーズ含量に影響される。
【００５１】
実施例１で製造された粘着性ビーズ（平均直径５１０ｎｍ、Ｔｇ−８℃）を含むビーズ水性懸濁液０．０５、０．１、０．５、１重量％をそれぞれ準備し、ポリメチルメタクリレート基板上にそれぞれ０．５ｍＬずつスポッティングした。前記基板を常温で１２時間乾燥させた後、各スポットの表面形状を観察した（図８）。その結果、図８に示すように、スポット内ビーズの含量が高くなるほど、固着されたビーズの密度が大きくなることが分かるが、０．５重量％を超えると、ビーズが複層として固着されて高分子鎖の挙動によるフィルム化が行われることが分かった。
【００５２】
（実施例４：粘着性ビーズのコーティングによる凸凹構造物の形成）
実施例１で製造された粘着性ビーズ（直径５１０ｎｍ、Ｔｇ−８℃）８．５重量％を含むビーズ水性懸濁液をポリメチルメタクリレート基板の表面に全体的または局部的に浸漬コートした（図９）。その結果、図９に示すように、単層のビーズからなる凸凹構造物が形成されることを確認することができた。このような凸凹構造物は、バイオチップ内で多面積基板の表面または流体遅延構造としての活用が可能である。
【００５３】
（実施例５：スポットの自己蛍光測定及び非特異的タンパク質結合）
本発明のビーズをバイオチップに応用するための事前実験であって、ビーズ水性懸濁液をチップ基材上にナノスポッティングし、自己蛍光(autofluorescence)と非特異的な結合(non-specific binding)の度合いを測定した。
【００５４】
３．１ｍｇ／ｍＬ濃度の牛血清アルブミンまたはＳＡＨ（Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン）で標識した牛血清アルブミンのリン酸水溶液２００μＬと、実施例１で製造された２重量％粘着性ビーズ水性懸濁液２００μＬとを混合し、常温で１５時間振盪して反応させた。反応終了の後、遠心分離過程を経て洗浄した後、全ビーズ含量が０．２及び０．４重量％の懸濁液をそれぞれ製造した。前記ビーズ水性懸濁液をインクジェットレイヤーを用いて５０ｎＬの体積でポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）基板上にスポッティングし、蛍光イメージスキャナ（エクソン社）を用いて、固着されたスポットの自己蛍光強度を測定した（図１０）。定量結果、図１０に示すように、粘着性ビーズスポットの自己蛍光強度は、３を超えないＳＮ比（ＳＮＲ：signal to noise ratio）であることが分かった。
【００５５】
一方、前記のような方法でスポッティングされた、牛血清アルブミンがコートされたビーズを抗ＳＡＨ抗体水溶液で処理してタンパク質の非特異的な結合の度合いを定量した（図１１）。図１１の定量結果に示すように、抗ＳＡＨ抗体の非特異的な結合反応の後に測定したスポットの蛍光強度は、３を超えないＳＮ比であるため、タンパク質の非特異的結合が殆どないことが分かった。
【００５６】
自己蛍光強度及び非特異的な結合が微々であるという前記実験結果は、本発明のビーズと標的物質との反応の際に前記ビーズが標的物質の蛍光検出を妨害しないことを意味し、これにより本発明のビーズ支持体がバイオチップに適切に使用できることが分かった。
【００５７】
（実施例６：ＳＡＨ標的物質に対する競合的な免疫検出）
ＳＡＨ標的物質を検出することが可能なバイオチップを製作するために、前記実施例５と同様の方法で、粘着性ビーズに牛血清アルブミンとＳＡＨ標識牛血清アルブミンをそれぞれコートし、リン酸緩衝液を水性媒質として、０．４重量％ビーズ水性懸濁液を製造した。前記製造されたビーズ水性懸濁液をＰＭＭＡスライドに５０ｎＬ体積でスポッティングした後、３０℃で３０分、常温で２０時間乾燥させ、その後３重量％牛血清アルブミンと０．０５体積％のＴｗｅｅｎが含まれたリン酸緩衝液（ｐＨ７．４）で３０分間ブロッキングし、洗浄した。蛍光検出のために、Ｃｙ３で標識した２次抗体(secondary antibody)を抗ＳＡＨ抗体と、予め３０分間反応させた後、検出しようとする標的物質である様々な濃度のＳＡＨを混合して、チップのスポットと競合的に免疫反応を行った。
【００５８】
ＳＡＨ濃度によるスポットの蛍光スキャナ写真及び検出結果を図１２及び図１３（−●−）にそれぞれ示した。蛍光シグナルは、標的物質ＳＡＨを添加していないときのシグナルを１００にして相対値で示した。本実施例で製作されたチップの競合的な免疫検出によるＳＡＨの検出は、標的物質ＳＡＨが存在しない場合に比べて９０％以上蛍光シグナルが減少し、このときの検出上限(highest detection limit)は約２〜５μＭであった。
【００５９】
（比較例２：２次元生体分子固定化法との比較）
本発明の粘着性ビーズを用いた３次元固定化法の優秀性を検証するために、生体分子固定化法として商用化された従来の２次元固定化法と、免疫検出性能を比較した。
【００６０】
生体分子の２次元固定化が可能な代表的なチップとして、Ｎｕｎｃ社のＭａｘｉＳｏｒｐチップを選択してＳＡＨ標的物質に対する競合的な免疫検出を試験し、その結果を実施例６と比較した。
【００６１】
牛血清アルブミンとＳＡＨ（Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン）標識牛血清アルブミンを、それぞれグリセロール２０体積％が含まれたリン酸緩衝液に０．５ｍｇ／ｍＬの濃度溶液で準備した後、ＭａｘｉＳｏｒｐにスポッティングし、恒湿チャンバー(humidity chamber)で２０時間乾燥させた。スポッティングされたチップを洗浄した後、実施例６と同様の方法で競合的な免疫反応を行った。その結果、図１３（−■−）に示すように、競合反応による蛍光シグナルの最大減少値は約５０％であり、標準定量範囲は０．０１〜０．５μＭであって、実施例６の粘着性ビーズを用いた固定化法の検出水準に大きく及んでいない。
【００６２】
前記結果は、ＭａｘｉＳｏｒｐチップを用いた従来の２次元固定化法は生体分子の集積化の度合いが低く、チップの表面に対する立体障害が大きいことに起因している。この結果より、本発明による粘着性ビーズを用いたバイオチップが従来のバイオチップより相対的に優れることを確認することができた。
【００６３】
（実施例７：特異的なＳＮＰ検出）
Ｂ型肝炎治療剤ラミブジン耐性を有するＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）の感染有無の確認に用いられるオリゴヌクレオチド配列を前記粘着性ビーズに固定して、ＤＮＡ検出応用分野の一つである一塩基多型(ＳＮＰ：single nucleotide polymorphism)を検出した。 
【００６４】
ラミブジン耐性を有するＨＢＶは、ウィルスポリメラーゼ(polymerase)のＹＭＤＤモチーフが変異したものであって、一般的には、Ｍｅｔ５５２がイソロイシン(isoleucine)に置換されたＹＩＤＤ変異体が存在する。ＹＭＤＤモチーフを発現する配列番号１の正常配列とＹＩＤＤモチーフを発現する配列番号２の変異配列間には只一つの塩基しか差異がない（表１）。
【００６５】
ＹＭＤＤモチーフを有するＨＢＶポリメラーゼ遺伝子配列に相補的な正常プローブと、ＹＩＤＤ変異体の遺伝子配列に相補的な変異プローブを、それぞれ前記粘着性ビーズを用いてチップの表面に固定した後、蛍光染料で標識したＨＢＶポリメラーゼ遺伝子配列（ターゲット）に対して選択的な検出が可能であるかを試験した。
【００６６】
【表１】
2008501043.tif 000003
【００６７】
それぞれのオリゴヌクレオチドプローブを効果的に粘着性ビーズに固定するために、スルホサクシニミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)を用いて牛血清アルブミンとカップリングし、これを実施例６と類似の方法で粘着性ビーズにコートした。
【００６８】
プラスチック基板上に前記ビーズ水性懸濁液を０．４重量％の濃度で５０ｎＬずつナノスポッティングして遺伝子チップを製作した。前記チップを脱イオン水で３分間洗浄し、８０μＬブロッキング溶液（２０Ｘ ＳＳＣ ３ｍＬ、ホルムアミド１．３５ｍＬ、１重量％ＢＳＡ５００μＬ、脱イオン水１５０μＬ）を用いて４０℃で３０分間処理した後、さらにターゲット試料（０ｎＭ〜１００ｎＭ）を５μＬ添加して、４０℃で１時間ハイブリダイズさせた。非特異的結合をしているターゲット配列を除去するために、２Ｘ ＳＳＣで１０分間、０．２Ｘ ＳＳＣで１０分間洗浄し、蛍光スキャナで分析した。図１４は、本実施例によるバイオチップを用いてＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のポリメラーゼ遺伝子配列を有するオリゴクレオチドのＳＮＰ(single nucleotide polymorphism)を多様な濃度で検出した蛍光スキャナ写真であり、図１５は、図１４の蛍光スキャナ写真を分析した蛍光シグナル強度を示すグラフである。
【００６９】
測定した蛍光スキャナ写真から蛍光シグナル強度を分析した結果、標的物質であるターゲット試料に対して相補的な正常プローブが、一つの塩基が異なる変異プローブと比較して約４．１倍高い識別能を示すことを確認することができた。この結果から、本発明によるバイオチップはＳＮＰのような遺伝子の検出目的としても有用であることを分かった。
【００７０】
（実施例８：タンパク質標的物質に対する直接免疫検出）
標的物質として実施例６で例示したＳＡＨのような低分子物質ではないタンパク質抗体に対しても、前記粘着性ビーズを用いた免疫検出が可能であることを試験した。
【００７１】
タンパク質抗原としては、ＢＳＡ(bovine serum albumin)を使用した。実施例６と類似の方法でＢＳＡ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、antigen grade）がコートされた粘着性ビーズを製造した後、ＰＭＭＡ基板上にスポッティングしてＩｇＧ（免疫グロブリン）を検出することが可能な簡単なバイオチップを製作した。表面ブロッキングのために、１Ｘ ＰＢＳ緩衝水溶液で希釈した３０％ヒト血清(human serum)を用いて常温で３０分間処理した。陰性対照群として抗−ＳＡＨ ＩｇＧ（ポリクローナル抗体、５０μｇ／ｍＬ）を選択し、陽性対照群として抗−ＢＳＡ ＩｇＧ（モノクローナル抗体、５０μｇ／ｍＬ）を選択し、前記チップ基板上で４５分間常温反応させた後、２次抗体としてＣｙ３蛍光染料で標識した抗−マウス−Ｃｙ３（ポリクローナル、１０μｇ／ｍＬ）を常温で２０分間反応させた。１Ｘ ＰＢＳ緩衝水溶液で、非特異的な結合をしている残りの抗体を洗い出した後、蛍光スキャナを用いて蛍光シグナルを検出した。図１６は、本発明のバイオチップを用いて、タンパク質抗原である免疫グロブリン（ＩｇＧ）を直接免疫検出法で検出した蛍光スキャナ写真であり、図１７は、図１６の蛍光スキャナ写真を分析した蛍光シグナル強度を示したグラフである。
【００７２】
測定した蛍光スキャナ写真から蛍光シグナル強度を分析した結果、標的物質であるＩｇＧに対して特異的な陽性対照群が非特異的な陰性対照群と比較して、７．７（陽性シグナル強度／陰性シグナル強度）の検出能を示すことが確認できた。この結果から、本発明によるバイオチップはタンパク質抗原の検出目的としても有用であることが分かった。
【００７３】
以上、本発明の特定の内容部分を詳細に記述したが、当業界における通常の知識を有する者において、このような具体的な技術は好適な実施様態に過ぎないもので、これによって本発明の範囲が制限されるものでない点は明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付された特許請求の範囲およびその等価物によって定義されるべきである。
【産業上の利用可能性】
【００７４】
本発明による粘着性ビーズは、生体分子を固定する支持体とチップ基板の表面に対する粘着剤としての特徴を同時に有し、別途の装置及び処理過程なしにバイオチップ上に直接固定させることができる。また、本発明の粘着性ビーズは、固定化する生体分子の反応量及び生体分子をビーズに固定する反応時間に応じて、ビーズ表面の被覆率を調節することができるという利点がある。更にその上、商用化された既存のビーズと類似の固定化効率を示しながらも、従来の２次元生体分子固定化法と比較して生体分子の集積化率が高くてバイオチップを小型に製造することができるため、経済的な面においても優れるという効果がある。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】本発明による粘着性ビーズ（６００ｎｍ）が基板上に固着されたことを走査電子顕微鏡で１０，０００倍拡大観察した写真である。
【図２】図１のビーズを９００，０００倍拡大観察した写真である。
【図３】投入する乳化剤の含量に応じてビーズの大きさが変化することを示すグラフである。
【図４】主単量体と共単量体の共重合比に応じて、製造されるビーズのガラス転移温度（Ｔｇ）が変化することを示すグラフである。
【図５】互いに異なるガラス転移温度を有するビーズを走査電子顕微鏡で観察した写真である。
【図６】生体分子の濃度が高いほど生体分子のビーズに対する表面被覆率が増加することを示すグラフである。
【図７】ビーズに生体分子を固定する反応時間に応じて、生体分子の本発明の粘着性ビーズ及びポリスチレンビーズに対する表面被覆率が増加することを示すグラフである。
【図８】粘着性ビーズを含むビーズ水性懸濁液をそれぞれの重量％別にポリメチルメタクリレート基板上にスポッティングしたことを走査電子顕微鏡で観察した写真である。
【図９】プラスチック基板を粘着性ビーズ水性懸濁液で浸漬コートして形成された凸凹構造物を走査電子顕微鏡で観察したものである。
【図１０】タンパク質が固定された粘着性ビーズの水性懸濁液をチップ基板上にスポッティングして形成したスポットの自己蛍光を測定して定量したグラフである。
【図１１】タンパク質が固定された粘着性ビーズの水性懸濁液をチップ基板上にスポッティングして形成したスポットに非特異的なタンパク質を処理して結合の度合いを定量したグラフである。
【図１２】本発明のバイオチップを用いて多様な濃度のＳＡＨ（Ｓ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン）で競合的な免疫検出法により検出した蛍光スキャナ写真である。
【図１３】本発明のバイオチップとＮｕｎｃ社のＭａｘｉＳｏｒｐチップを用いて標的物質ＳＡＨに対する競合的免疫検出を行った結果を示すグラフである。
【図１４】本発明のバイオチップを用いてＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）のポリメラーゼ遺伝子配列を有するオリゴヌクレオチドのＳＮＰ(single nucleotide polymorphism)を様々な濃度で検出した蛍光スキャナ写真である。
【図１５】図１４の蛍光スキャナ写真を分析した蛍光シグナル強度を示すグラフである。
【図１６】本発明のバイオチップを用いて、タンパク質抗原である免疫グロブリン（ＩｇＧ）を直接免疫検出法で検出した蛍光スキャナ写真である。
【図１７】図１６の蛍光スキャナ写真を分析した蛍光シグナル強度を示すグラフである。
【図１】
2008501043.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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2008501043.tif 000022
2008501043.tif 000023