(57)【要約】本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物の薬学的用途に関する。【選択図】化１2008534442.tif 000024
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
次式（Ｒ１は（Ｈ，Ｈ）または＝Ｏを表し、Ｒ２およびＲ３は各々独立してＨ、ＯＨまたはＯＣＨ３を表す）で示される３９−デスメトキシラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を神経損傷または疾患に起因する医学的症状の治療薬の調製に用いることの用途。
【化１】
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【請求項２】
次式（Ｒ１は（Ｈ，Ｈ）または＝Ｏを表し、Ｒ２およびＲ３は各々独立してＨ、ＯＨまたはＯＣＨ３を表す）で示される３９−デスメトキシラパマイシン相同物を中枢神経システムに作用し、薬剤に血液脳関門を通過させることが要求される医学的症状の治療薬の調製に用いることの用途。
【化１】
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【請求項３】
医学的症状が脳腫瘍および神経変性症からなる群より選ばれる請求項１または２の用途。
【請求項４】
脳腫瘍の治療薬である請求項３の用途。
【請求項５】
脳腫瘍が多型性神経膠芽腫である請求項４の用途。
【請求項６】
神経変性症の治療薬である請求項３の用途。
【請求項７】
神経変性症がアルツハイマー病である請求項６の用途。
【請求項８】
神経変性症が多発性硬化症である請求項６の用途。
【請求項９】
次式（Ｒ１は（Ｈ，Ｈ）または＝Ｏを表し、Ｒ２およびＲ３は各々独立してＨ、ＯＨまたはＯＣＨ３を表す）で示される３９−デスメトキシラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を、一以上の既存抗癌剤に抵抗性を有するガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療薬の調製に用いることの用途。
【請求項１０】
ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍がＰ糖タンパク質を発現している請求項９の用途。
【請求項１１】
ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍がＰ糖タンパク質の高い発現レベルを有している請求項１０の用途。
【請求項１２】
薬剤が３９−デスメトキシラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を投与するためのものである請求項１〜１１のいずれか一の用途。
【請求項１３】
薬剤がさらに一以上の治療的に有効な薬剤を含む請求項１〜１１のいずれか一の用途。
【請求項１４】
薬剤がガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療薬であり、メトトレキセート、リューコボリン、アドリアマイシン、プレニゾン、ブレオマイシン、シクロフォスファミド、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、ゴセレリン、抗ＨＥＲ２単クローン抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標名）など）、カペシタビン、塩酸ラロキシフェン、ＥＧＦＲ抑制剤）、ＶＥＧＦ抑制剤、プロテアソーム抑制剤およびｈｓｐ９０抑制剤からなる群から選ばれる一以上の薬剤をさらに含む、請求項３〜５または９〜１３のいずれか一の用途。
【請求項１５】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物が３９−デスメトキシラパマイシンである請求項１〜１４のいずれか一の用途。
【請求項１６】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物が位置９，１６または２７の一以上でラパマイシンとさらに相違している請求項１〜１４のいずれかの一の用途。
【請求項１７】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物が位置１６または２７の一以上でラパマイシンと相違している請求項１６の用途。
【請求項１８】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物が位置１６および２７でラパマイシンと相違している請求項１６の用途。
【請求項１９】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物が位置２７で水酸基を有し、すなわちＲ３がＯＨを示す請求項１６〜１８のいずれか一の用途。
【請求項２０】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物が位置２７で水素を有し、すなわちＲ３がＯＨを示す請求項１６〜１８のいずれか一の用途。
【請求項２１】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物が位置１６で水酸基を有し、すなわちＲ２がＯＨを示す請求項１６〜１８のいずれか一の用途。
【請求項２２】
次式（Ｒ１は（Ｈ，Ｈ）または＝Ｏを表し、Ｒ２およびＲ３は各々独立してＨ、ＯＨまたはＯＣＨ３を表す）で示される３９−デスメトキシラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を薬学的に許容可能なキャリアと共に用いることを特徴とする薬剤化合物。
【請求項２３】
静脈内投与のために特異的に処方される請求項２３の薬剤化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は特定の化合物の用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
ラパマイシン（rapamycin、シロリムス）（図１）は、ピペコリン酸ラクトン（Ｐａｉｖａら、１９９１年）に連結された１，２，３−トリカルボニル部分を有する、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）ＮＲＲＬ５４９１により産生される親油性マクロライド（Ｓｅｈｇａｌら、１９７５；Ｖｅｚｉｎａら、１９７５；米国特許第３，９２９，９９２号；米国特許第３，９９３，７４９号）。本発明の目的のため、ラパマイシンは、Ｆｉｎｄｌａｙら（１９８０年）または化情報索（第１１版インデックス蓄積本、１９８２〜１９８６年、ｐ６０７１９ＣＳ）の番号付け慣例よりは、ＭｃＡｌｐｉｎｅら（１９９１年）の番号付け慣例により記述される。
【０００３】
ラパマイシンは、その広範囲な生物学的活性スペクトルにより、顕著な薬理的価値を持つ（Ｈｕａｎｇら、２００３年）。この化合物は、哺乳類におけるラパマイシン標的タンパク質（ｍＴＯＲ）の効果的な阻害剤であり、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／Ａｋｔ（タンパク質キナーゼＢ）セリン／スレオニンキナーゼの下流で細胞生存および増殖をメディエートする経路を信号伝達するセリン／スレオニンキナーゼである。この阻害活性は、ラパマイシンがイムノフィリンＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）と結合した後に増幅される（Ｄｕｍｏｎ，Ｆ．Ｊ．およびＺ．Ｘ．Ｓｕ、１９９５年）。Ｔ細胞ではラパマイシンがＩＬ−２受容体からの信号伝逹を阻害し、それに続くＴ細胞の自己増殖を阻害し、免疫抑制をもたらす。ラパマイシンは、臓器移植患者のための治療において皮膚拒絶反応を防止するための免疫抑制剤として報告されている（Ｈｕａｎｇら、２００３年）。免疫抑制剤に加えて、ラパマイシンは、ガン、レステロシスなどの心臓血管疾患、多発性硬化症などの自己免疫疾患、関節リウマチ、真菌感染症、アルツハイマー病・パーキンソン病・ハンチントン病などの神経変性疾患、その他多くの疾患の治療において潜在的な治療用途を有する。
【０００４】
多様な疾患状態において有用性を有する反面、ラパマイシンには多くの大きな欠点があった。第１に、それは、化合物を細胞外に輸送してラパマイシン欠乏による細胞膜の透過を許容する細胞膜排出ポンプＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ、ＬａＰｌａｎｔｅら、２００２年、Ｃｒｏｗｅら、１９９９年）の基質である。これは投与後の化合物の吸収を減退させる。加えて、ガン細胞の多剤耐性の主要なメカニズムは細胞膜排出ポンプを介して行われるものであるため、ラパマイシンは多剤耐性（ＭＤＲ）ガン細胞に対して効果的ではない。第２に、ラパマイシンはシトクロムＰ４５０酵素によって広範囲に代謝される（Ｌａｍｐｅｎら、１９９８年）。その肝初回通過における損失は大きく、その低い経口投与バイオアベイラビィリティをより一層低下させてしまう。ラパマイシンの低いバイオアベイラビィリティにおけるＣＹＰ３Ａ４およびＰ−ｇｐの役割は、ＣＹＰ３Ａ４および／またはＰ−ｇｐ抑制剤の投与がＣＹＰ３Ａ４感染Ｃａｃｏ−２細胞からのラパマイシン排出を低下させることを実証した研究（Ｃｕｍｍｉｎｓら、２００４年）、およびＣＹＰ３Ａ４抑制剤の投与がラパマイシンの腸内代謝を減少させることを実証した研究（Ｌａｍｐｅｎら、１９９８年）において確認されている。ラパマイシンの低い経口バイオアベイラビィリティは顕著な個人間格差を生じさせ、矛盾した治療結果および臨床マネジメントにおける困難をもたらす（Ｋｕｈｎら、２００１年、Ｃｒｏｗｅら、１９９９年）。
【０００５】
したがって、Ｐ−ｇｐの基質ではなく、代謝的により安定的でしたがって改善されたバイオアベイラビィリティを有するような、新規のラパマイシン近似化合物の開発が切望されている。このような化合物は、抗ガン剤として使用されたとき、ＭＤＲガン細胞、特にＰ−ｇｐ発現ガン細胞に対してより良い効果を発揮し得る。
【０００６】
分子の化学的に利用可能な部位を用いて合成された一群のラパマイシン相同物が報告された。下記化合物に対する記述には、図１に記述されたラパマイシン分子の付番方式を適用させた。相同化または置換のための分子上の化学的に利用可能な部位には、Ｃ４０およびＣ２８ヒドロキシル基（例えば、米国特許第５，６６５，７７２号、米国特許第５，３６２，７１８号）、Ｃ３９およびＣ１６メトキシ基（例えば、ＷＯ９６／４１８０７号、米国特許第５，７２８，７１０号）、Ｃ３２、Ｃ２６およびＣ９ケト基（例えば、米国特許第５，３７８，８３６号、米国特許第５，１３８，０５１号、米国特許第５，６６５，７７２号）が含まれる。トリエンを標的にしたＣ１７、Ｃ１９および／またはＣ２１での水添は、抗真菌活性は維持するが、免疫抑制特性の相対的損失をもたらした（例えば、米国特許第５，３９１，７３０号、米国特許第５，０２３，２６２号）。分子の安全性に対する相当な改善（例えば、Ｃ３２、Ｃ４０および／またはＣ２８でのオキシムの形成、米国特許第５，５６３，１４５号、米国特許第５，４４６，０４８号）、代謝作用攻撃に対する耐性（例えば、米国特許第５，９１２，２５３号）、生体利用可能性（例えば、米国特許第５，２２１，６７０号、米国特許第５，９５５，４５７号、ＷＯ９８／０４２７９号）および前駆薬物の製造（例えば、米国特許第６，０１５，８１５号、米国特許第５，４３２，１８３号）が、相同化を通じて達成された。
【０００７】
臨床開発においてもっとも先進的なラパマイシン誘導体の二つを挙げれば、免疫抑制薬理効果を示すラパマイシンの半合成相同物である４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチル−ラパマイシン（ＲＡＤ００１、サーティカンＣｅｒｔｉｃａｎ、エベロリムスＥｖｅｒｏｌｉｍｕｓ）、（Ｓｅｄｒａｎｉ，Ｒら、１９９８年）、および４０−Ｏ−［（２，２−ビス（ヒドロキシメチル）プロピオニルオキシ］ラパマイシン、生体外において細胞成長を抑制し生体内において腫瘍成長を抑制する（Ｙｕら、２００１年）ラパマイシンのエステルであるＣＣＩ−７７９（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ社）である。ＣＣＩ−７７９は現在数多くの臨床実験において有望な抗ガン剤として使用されている。再発性グリオーマ患者におけるＣＣＩ−７７９フェースＩＩ研究に関する最近の刊行物（Ｃｈａｎｇら、２００５年）には、当該患者においてこの薬剤が低い効果しか発揮しないのは、その血液脳関門の透過性が低いことに起因している可能性があると報じられている。ＲＡＤ００１のファーマコキネティクス（ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ）の調査研究は、ラパマイシンと同様に、それがＰ−ｇｐの基質であることを示した（Ｃｒｏｗｅら、１９９９年、ＬａＰｌａｎｔｅら、２００２年）。
【０００８】
その構造がラパマイシンに近似しているにもかかわらず、本発明化合物は驚くべきほどに異なった薬理的プロファイルを示す。特に、ラパマイシンと比べて顕著に増大した細胞膜透過性と減少されたエフラックス（排出）を示し、Ｐ−ｇｐの基質ではない。加えて、３９−デスメトキシラパマイシン（39-desmethoxyrapamycin）は多剤耐性およびＰ−ｇｐ発現ガン細胞腺に対してラパマイシンよりも強力な活性を示す。ラパマイシンと比べると、３９−デスメトキシラパマイシンはＮＣＩ６０細胞腺パネルに対して顕著に異なる抑制プロファイルを示す。さらに、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は、ラパマイシンおよび臨床試験における先導的誘導体に比べて顕著に異なるファーマコキネティクスプロファイルを示す。予期しないことに、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は血液脳関門を通過する能力が増大しており、したがって脳内での有用性が向上する。
【０００９】
したがって、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物の医学的用途を提供する。該ラパマイシン相同物はラパマインと比較して顕著に異なるファーマコキネティクスを持ち、改善された血液脳関門通過性を有し、改善された代謝安定性を有し、改善された細胞膜透過性を有し、減少された排出速度を持ち、異なる腫瘍細胞抑制プロファイルを有する。この化合物は医学的に有用であり、特にガンおよび／またはＢ細胞系悪性腫瘍の治療、免疫抑制の誘導または維持、神経再生の刺激、または真菌感染症、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、炎症性疾患または繊維症の治療に効果がある。本発明は特に３９−デスメトキシラパマイシンのガンおよび／またはＢ細胞系悪性腫瘍の治療用途を提供する。
【００１０】
ラパマイシンは自食作用を刺激することが知られている（Ｒａｕｇｈｔら、２００１年）。アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病およびプリオン病（クロイツフェルト−ヤコブ病を含む）を含む数多くの疾患で、損なわれた自食作用または自食作用の統制不全が報告されており、この伝達経路の操作がこれらの病気において有益であり得ることを示唆している。最近の生体内研究によれば、ラパマイシンの投与がアグリゲートの出現を低下させ、感染ＣＯＳ−７細胞におけるポリＱおよびポリＡ発現に関連する細胞死滅を低下させることができたと報告されている（Ｒａｖｉｋｕｍａｒら、２００２年）。したがって、ラパマイシンが血液脳関門を通過することができれば、これらの結果は、ハンチントン病や他の関連する疾患の治療のための好適な候補となり得ることを示している。このことは、血液脳関門を通過することができるラパマイシン相同物の開発に対する要望が存在することを示唆している。
【００１１】
微小管関連タンパク質タウおよびその結果的アグリゲーションが不溶性の対螺旋状繊維に過リン酸化（ｈｙｐｅｒｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ）して細胞内変化を生じさせることはアルツハイマー病の特徴的なホールマークの一つであり、この神経原繊維病理の蓄積および関連する神経細胞死が認知機能低下に密接に関連している。Ａｎら（２００３年）による最近の研究は、活性化されたｐ７０Ｓ６キナーゼがアルツハイマー脳において神経原繊維病理と共に分散しており、特に、活性化されたｐ７０Ｓ６キナーゼがタングル（変化）発生前にニュートロン中で明らかに増大されていることが報告された（Ａｎら、２００３年）。硫酸亜鉛の投与がｐ７０Ｓ６キナーゼを活性化させると共に全正常過リン酸化タウのレベルを上昇させる生体外試験において、ラパマイシンで細胞を予備処理するとｐ７０Ｓ６キナーゼの活性化が３倍に低減させたと共に全正常過リン酸化タウのレベルを顕著に低減させた。したがって、これらの結果は、当該化合物が活性領域に到達することを前提として、ラパマイシンまたはラパマイシン相同物の投与がアルツハイマー病の神経原繊維病理を軽減させるのに有効であることを示している。
【００１２】
さらに、ラパマイシンは、幾つかの生体内および生体外モデル（ＡｖｒａｍｕｔおよびＡｃｈｉｍ、２００２年）において神経突起伸長および神経細胞生存を増大させると報告されており、このことは、ラパマイシンおよびその相同物が、神経細胞再生が顕著な治療効果となり得るような疾患の治療に有用であり得ることを示している。しかしながら、この有用性はそれが活性領域に到達し得ることに依存しており、したがって向上された血液脳関門通過能力を有するラパマイシン相同物が特に好適である。
【００１３】
本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物を医学的に使用することについての新規且つ驚くべき用途を提供するものであり、特に、３９−デスメトキシラパマイシンをガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療、免疫抑制の誘導または維持、神経再生の刺激、または真菌感染症、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、神経変性症状、炎症性血管疾患または繊維症の治療に使用することである。特に本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物をガンおよびＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いることの用途を提供する。一つの好適な実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物を神経疾患または神経変性疾患の治療に用いることの用途を提供する。別の好適な実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物を脳腫瘍、特に多型性グリオブラストーマの治療に用いることの用途を提供する。本発明の特定の一態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。
【発明の開示】
【００１４】
本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物、とりわけ３９−デスメトキシラパマイシンを、特にガンおよび／またはＢ細胞系悪性腫瘍の治療、免疫抑制の誘導または維持、神経再生の刺激、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、神経変性症状、炎症疾患、血管疾患および繊維症の治療、神経再生の刺激または感染症の治療に使用することについての用途に関する。特に本発明はガンおよびＢ細胞系悪性腫瘍の治療のための３９−デスメトキシラパマイシン相同物の用途に関する。一つの特定の態様において本発明はガンおよびＢ細胞系悪性腫瘍の治療における３９−デスメトキシラパマイシンの用途に関する。本発明はまた特に脳腫瘍または神経変性症の治療における３９−デスメトキシラパマイシン相同物の用途に関する。一つの特定の実施形態において、本発明は脳腫瘍または神経変性症の治療における３９−デスメトキシラパマイシンの用途を提供する。本発明はまた特に神経変性症の治療における３９−デスメトキシラパマイシン相同物の用途を提供する。特に、本発明は神経変性症の治療における３９−デスメトキシラパマイシンの用途を提供する。
【００１５】
定義
冠詞“ａ”または“ａｎ”はここでは一または一以上（すなわち少なくとも一）の文法上の対象物を指すために用いられる。一例として、“ａｎ  ａｎａｌｏｇｕｅ”は一つの相同物または一以上の相同物を意味する。
【００１６】
ここで用いる「自己免疫疾患」の語は、限定的ではないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、重症筋無力症および多発性硬化症を含む。
【００１７】
ここで用いる「炎症疾患」の語は、限定的ではないが、乾癬、皮膚炎、湿疹、脂漏、炎症性腸疾患（限定的ではないが潰瘍性大腸炎およびクローン病を含む）、肺炎（限定できではないが喘息、慢性閉塞性肺疾患、肺気腫、急性呼吸窮迫症候群および気管支炎を含む）、リウマチ性関節炎および眼ブドウ膜炎を含む。
【００１８】
ここで用いる「ガン」の語は、限定的ではないが、皮膚や限定的ではないがたとえば胸腺、前立腺、肺、腎臓、膵臓、脳、胃または腸などの体器官中の悪性または良性の細胞成長を意味する。ガンは隣接組織に侵入して、離れた器官、たとえば非限定的例示として骨や肝臓、肺または脳などに拡がっていく（転移）傾向がある。ここで用いる「ガン」の語は、非限定的な例示としてメラノーマ、リンフォーマ、白血病、繊維肉腫、横紋筋肉腫および悪性肥満細胞腫などの転移性腫瘍細胞タイプと、非限定的な例示として結腸大腸ガン、前立腺ガン、小細胞肺ガンおよび非小細胞肺ガン、乳ガン、膵臓ガン、膀胱ガン、腎臓ガン、胃ガン、グリオバストーマ、肝ガン、卵巣ガンなどの細胞ガンタイプの両方を含む。この語はさらに下記に詳述する脳腫瘍を含む。
【００１９】
ここで用いる「脳腫瘍」の語は、悪性または良性の脳内細胞成長を意味し、原発性および二次性（転移）の腫瘍を含む。原発性の脳腫瘍は、限定的ではないが、グリオーマ（多型性神経膠芽腫、星状膠細胞腫、脳幹グリオーマ、上衣腫および乏突起膠細胞腫を含む）、髄芽腫、髄膜腫、神経鞘腫（または聴神経鞘腫）、頭蓋咽頭腫、胚細胞性脳腫瘍（ジャーミノーマなど）または松果体腫瘍を含む。「脳腫瘍」の語はまた上記一群の疾患を包括的に記述するためにも用いられ、これらの語が互換的に用いられている。
【００２０】
ここで用いる「Ｂ細胞系悪性腫瘍」の語は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）などの疾患群を含む。これは血液または造血器官の新生物疾患である。これは骨髄および免疫システムの機能不全を生じさせ、宿主を感染や出血しやすいものにする。
【００２１】
ここで用いる「血液疾患」の語は、限定的ではないが、超増殖性血管障害（レステノシスおよび血管閉塞など）、アテローム性動脈硬化症、心血管疾患、脳血管障害および末梢性血液疾患（冠状動脈疾患、動脈硬化症、アテローム性動脈硬化症、非アテローム性動脈硬化症または血管壁損傷など）を含む。それはまた、眼球内血液細胞、特に脈絡膜新生血管の新生または増殖に関連する疾病、を意味するためにも使用される。
【００２２】
ここで用いる「神経再生」の語は神経細胞成長刺激を意味し、神経突起伸長および神経細胞の機能的回復を含む。神経再生がその治療に顕著に有効であろうとされる疾患および疾病は、限定的ではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン舞踏（病）、筋萎縮性側索硬化症、三叉神経痛、舌咽神経痛、ベル麻痺、筋ジストロフィー、脳卒中、進行性筋萎縮症、進行性球脊髄性筋萎縮症、変形性頸椎症、ギラン・バレー症候群、痴呆症、末梢性神経障害および末梢神経損傷を含む、これらは身体的損傷（脊髄損傷またはトラウマ、座骨神経や顔面神経の外傷や損傷など）によって生ずるか、あるいは病状（糖尿病など）によって生ずるかを問わない。
【００２３】
ここで用いる「神経障害または神経病に起因する医学的症状」の語は、限定的ではないが、神経変性症、脳腫瘍、脳感染症または脳炎、および神経ないし膠の細胞または組織の死滅ないし機能不全につながる可能性のある他の症状を含む。
【００２４】
ここで用いる「神経変性症」の語は、限定的ではないが、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、（眼咽頭型）筋ジストロフィー（眼咽頭型筋ジストロフィーを含む）、多発性硬化症、プリオン病（クロイツフェルト−ヤコブ病（ＣＪＤ）を含む）、ピック病、レビー小体病、および／または運動ニューロン病を含む。
【００２５】
ここで用いる「中枢神経に作用する医学的症状であって薬剤を血液脳関門に通過させることが必要とされるもの」の語は、限定的ではないが、神経損傷または神経症に由来する医学的症状、および効果的な治療のために薬剤を神経細胞にアクセスさせることが要求されるような他のあらゆる症状を含む。
【００２６】
ここで用いる「繊維症」の語は、細胞外マトリックスの過剰産生に関連する疾患を意味し、（限定的ではないが）サルコイドーシス、ケロイド、糸球体腎炎、末期腎臓疾患、肝繊維化症（非限定的例示として肝硬変、アルコール性肝障害および脂肪肝を含む）、慢性腎障害、手術創癒着、動脈硬化症、心臓繊維化症、肺繊維症（非限定的例示として突発性肺繊維症および突発性繊維性肺胞炎を含む）、黄斑変性症、新生児および糖尿病網膜症、化学療法または放射線誘発繊維症を含む。
【００２７】
ここで用いる「移植片対宿主拒絶病」の語は、同種幹細胞／骨髄移植後に見られる合併症を意味する。それは、ドナーから与えられた感染と闘う細胞が患者の体を異なるまたは異質であると認識したときに発症する。これらの感染攻撃細胞は、感染を攻撃するかの如く、患者の体内組織を攻撃する。ＧｖＨＤは、それが移植後最初の１００日以内に発症すれば急性とされ、移植後１００日経過後に発症すれば慢性とされる。これに関連する主な組織は肝臓、消化管および皮膚である。慢性移植片対宿主拒絶病は幹細胞／骨髄移植患者の約１０〜４０％に発生する。
【００２８】
ここで用いる「バイオアベイラビィリティ」の語は、投与後の薬剤または他の物質が生物学的活性領域で吸収されまたは有効に働く程度ないし割合を意味する。この性質は、化合物の可溶性、消化管への吸収率、タンパク質結合および代謝の程度などの数多くの要因に依存する。ここに当業界において当業者に良く知られている様々なバイオアベイラビィリティ試験を記述する（さらにＴｒｅｐａｎｉｅｒら、１９９８年、Ｇａｌｌａｎｔ−Ｈａｉｄｎｅｒら、２０００年も参照されたい）。
【００２９】
ここで用いる「存在する一以上の抗ガン剤に対するガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の抵抗性」の語は、少なくとも一つの主要な治療法がガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍に対して有効でないことを意味する。このようなガンは、正常細胞カウンターパート（すなわち同一器官の成長調節細胞）が細胞毒、細胞死または細胞静止（すなわち分裂しない）のいずれかの兆候を示す場合に、少なくとも一つの新生物剤の投与後も生存し得る特性を有している。この種のガンは特にＭＤＲガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍を含み、特に例示すれば高レベルのＰ−ｇｐを発現させるガンおよびＢ細胞系悪性腫瘍である。このような抵抗性ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の同定は物理学者または他の同種当業者の能力および通常の活動の範囲内である。
【００３０】
ここで用いる「３９−デスメトキシラパマイシン相同物」の語は下記化学式で示される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を意味する。
【化１】
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ここで、Ｒ１は（Ｈ，Ｈ）または＝Ｏを表し、Ｒ２およびＲ３は各々独立してＨ、ＯＨまたはＯＣＨ３を表す。この化合物はまた「本発明化合物」として参照され、これらの語が本出願において互換的に用いられる。
【００３１】
本発明において「３９−デスメトキシラパマイシン相同物」の語は３９−デスメトキシラパマイシンそのものを含む。
【００３２】
ここで用いる「３９−デスメトキシラパマイシン」の語は、上記化学式においてＲ１は＝Ｏを表し、Ｒ２およびＲ３は各々独立してＨ、ＯＨまたはＯＣＨ３を表すものとして示される化合物またはその薬学的に許容可能な塩を意味する。
【００３３】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物の薬学的に許容可能な塩は、薬学的に許容可能な無機または有機の酸または基から形成される慣習的な塩を含み、さらに第四アンモニウム酸添加塩をも含む。好適な酸塩についてより詳しく例示すれば、塩化水素、臭化水素、硫酸、リン酸、硝酸、過塩素酸、フマル酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、蟻酸、乳酸、マレイン酸、酒石酸、クエン酸、パルモイン酸、マロン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ナフタリン−２−スルホン酸、ベンゼンスルホン酸、ヒドロキシナフタリン酸、よう化水素酸、リンゴ酸、ステロイン酸、タンニン酸などである。シュウ酸などの他の酸はそれ自身は薬学的に許容可能なものではないが、塩として調製することにより本発明化合物およびその薬学的許容可能塩を得るための中間生成物として有用である。より詳しく好適な基酸を例示すれば、ナトリウム、リチウム、カリウム、マグネシウム、アルミニウム、カルシウム、亜鉛、Ｎ−Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミンおよびプロカインの塩である。以降において本発明による化合物を参照するときは３９−デスメトキシラパマイシンおよびその薬学的許容可能塩の両方を含む。
【００３４】
発明の記述
本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物の医学的用途に関し、特にガン、Ｂ細胞系悪性腫瘍の治療、免疫抑制の誘導または維持、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、神経変性症状、血管炎症疾患および繊維症の治療、神経再生の刺激、神経病または神経変性症状の治療または感染症の治療に使用することについての用途に関する。したがって、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を、神経の損傷または疾患に起因する医学的症状の治療に用いることについての用途を提供する。一つの特定の実施形態において、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩を、神経の損傷または疾患に起因する医学的症状の治療に用いることについての用途を提供する。別の実施形態において、本発明は、９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物を神経の損傷または疾患に起因する医学的症状の治療に用いることについての用途を提供する。
【００３５】
本発明はまた、３９−デスメトキシラパマイシン相同物、すなわち血液脳関門透過性が改善されたラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を、中枢神経に作用する医学的症状であって薬剤を血液脳関門に通過させることが必要とされるもの、すなわち血液脳関門が化合物の輸送を妨げるような医学的症状の治療に用いることについての用途を提供する。一つの特定の実施形態において、本発明は、血液脳関門が化合物の輸送を妨げる場合に、３９−デスメトキシラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩を、中枢神経システムに作用する医学的症状を治療することについての用途を提供する。別の実施形態において、本発明は、血液脳関門が化合物の輸送を妨げる場合に、９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物を、中枢神経システムに作用する医学的症状を治療することについての用途を提供する。
【００３６】
特定の一実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物をガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いる用途に関する。別の実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシンをガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いる用途に関する。別の実施形態において、本発明は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物をガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いる用途に関する。また、本発明は特に３９−デスメトキシラパマイシン相同物を脳腫瘍の治療に用いる用途を提供する。本発明はさらに３９−デスメトキシラパマイシンを脳腫瘍の治療に用いる用途を提供する。別の実施形態において本発明は、９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物を脳腫瘍の治療に用いる用途を提供する。特に、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物を多型性神経膠芽腫の治療に用いる用途を提供する。別の実施形態において本発明は、９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物を多型性神経膠芽腫の治療に用いる用途を提供する。
【００３７】
本発明はさらに３９−デスメトキシラパマイシン相同物を神経変性症の治療に用いる用途を提供する。別の実施形態において本発明は３９−デスメトキシラパマイシンを神経変性症の治療に用いる用途を提供する。別の実施形態において本発明は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物を神経変性症の治療に用いる用途を提供する。特に、神経変性症はアルツハイマー病、多発性硬化症およびハンチントン病からなる群より選ばれ得る。したがって、一つの実施形態において、本発明はアルツハイマー病の治療に３９−デスメトキシラパマイシン相同物を用いる用途を提供する。別の実施形態において、本発明はアルツハイマー病の治療に３９−デスメトキシラパマイシンを用いる用途を提供する。別の実施形態において、本発明は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物をアルツハイマー病の治療に用いる用途を提供する。別の実施形態において、本発明は多発性硬化症の治療に３９−デスメトキシラパマイシン相同物を用いる用途を提供する。別の実施形態において、本発明は多発性硬化症の治療に３９−デスメトキシラパマイシンを用いる用途を提供する。別の実施形態において、本発明は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物を多発性硬化症の治療に用いる用途を提供する。別の実施形態において、本発明はハンチントン病の治療に３９−デスメトキシラパマイシン相同物を用いる用途を提供する。別の実施形態において、本発明はハンチントン病の治療に３９−デスメトキシラパマイシンを用いる用途を提供する。別の実施形態において、本発明は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物をハンチントン病の治療に用いる用途を提供する。
【００３８】
別の実施形態において、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシン相同物、特に３９−デスメトキシラパマイシンまたは９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物の有効量を患者に投与することからなる、ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍を治療し、免疫抑制を誘導または維持し、神経再生を刺激し、真菌感染症、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、神経変性症状、炎症疾患、血管疾患または繊維症の治療法を提供する。特に本発明は、３９−デスメトキシラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を投与することからなる、神経の損傷または疾患に起因する医学的症状の治療法を提供する。特定の実施形態において、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシンを投与することからなる、神経の損傷または疾患に起因する医学的症状の治療法を提供する。別の実施形態において、本発明は、９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物を投与することからなる、神経の損傷または疾患に起因する医学的症状の治療法を提供する。本発明はまた、３９−デスメトキシラパマイシン相同物、すなわち血液脳関門透過性が向上されたラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を投与することからなる、中枢神経に作用して血液脳関門が化合物の輸送を阻害するような医学的症状の治療法を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。
【００３９】
好適には、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシン相同物の有効量を患者に投与することからなるガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療法を提供する。別の好適な実施形態において、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシン相同物の有効量を患者に投与することからなる脳腫瘍の治療法を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。特定の実施形態において、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシン相同物の有効量を患者に投与することからなる多型性神経膠芽腫の治療法を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。
【００４０】
別の好適な実施形態において、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシン相同物の有効量を患者に投与することからなる神経変性症の治療法を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。特に、神経変性症はアルツハイマー病、多発性硬化症およびハンチントン病からなる群より選ばれ得る。したがって、一つの実施形態において、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシン相同物の有効量を患者に投与することからなるアルツハイマー病の治療法を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。別の実施形態において、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシンの有効量を投与することからなる多発性硬化症の治療法を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。別の実施形態において、本発明は、３９−デスメトキシラパマイシンの有効量を投与することからなるハンチントン病の治療法を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。
【００４１】
本発明はまた、ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療、免疫抑制の誘導または維持、神経再生の刺激、感染症、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、神経変性症状、血管炎症疾患または繊維症の治療のための薬剤の製造に３９−デスメトキシラパマイシン相同物を用いる用途を提供する。特に、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を神経の損傷または疾患に起因する医学的症状の治療のための薬剤調製に使用する用途を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。
【００４２】
本発明はまた、３９−デスメトキシラパマイシン相同物、すなわち血液脳関門透過性が改善されたラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を、血液脳関門が化合物の輸送を妨げる場合に、中枢神経システムに作用する医学的症状を治療するための薬剤調製に用いる用途を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。
【００４３】
本発明はまた、具体的に、３９−デスメトキシラパマイシン相同物を脳腫瘍の治療薬の調製に使用する用途を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。特定の実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物を多型性神経膠芽腫の治療薬の調製に使用する用途を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。
【００４４】
本発明はまた、具体的に、３９−デスメトキシラパマイシン相同物を神経変性症の治療薬の調製に使用する用途を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。特に、神経変性症はアルツハイマー病、多発性硬化症およびハンチントン病からなる群より選ばれ得る。したがって、一つの実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物をアルツハイマー病の治療薬の調製に使用する用途を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。別の実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物を多発性硬化症の治療薬の調製に使用する用途を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。別の実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物をハンチントン病の治療薬の調製に使用する用途を提供する。特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。
【００４５】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物はＷＯ０４／００７７０９に記載された方法を用いて製造されるラパマイシンの類似構造的相同物である。しかしながら、それは、３９−デスメトキシラパマイシンおよび関連する相同物についてのＮＣＩ６０細胞ラインパネルの比較分析（下記表１参照）によって示されるように、ラパマイシンとは異なる活性スペクトルを示す。この比較分析ではピアソン分析を用いてＮＣＩ６０細胞ラインパネル上の２つの化合物の活性を比較し、これら２つの化合物がどのように近似しているかを示す相関係数を生成する。これはそれらの活性メカニズムの相関性をも示し得る。ラパマイシンと３９−デスメトキシラパマイシンについてのピアソン係数は０．６１４であり、これはラパマイシンとＣＣＩ−７７９（ラパマイシンの４０−ヒドロキシエステル誘導体）との間のピアソン係数０．８６（Ｄａｎｃｅｙ、２００２年）と比較されるべきである。したがって、３９−デスメトキシラパマイシン相同物はラパマイシンと比べて異なる活性スペクトルを有することが分かる。
【００４６】
【表１】
2008534442.tif 000004
【００４７】
多剤耐性（ＭＤＲ）はガンおよびＢ細胞系悪性腫瘍の治療において重要な問題である。それは多くのガンにおいて薬剤耐性の開発を遅れさせる主要な原因となっている（Ｐｅｒｓｉｄｉｓ  Ａ，１９９９年）。薬剤は当初有効に働いても一定期間を経過すると完全に有効性を失う。ＭＤＲはアデノシン三リン酸結合カセットトランスポーター（ＡＢＣトランスポーター）の増大レベル、特にＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）のためにエンコードするＭＤＲ１遺伝子またはＭＲＰ１をエンコードするＭＲＰ１遺伝子の発現の増加に関連する。ＭＤＲ１遺伝子発現レベルは異なるガン由来細胞ラインに亘って大きく変化し、幾つかの細胞ラインでは検出不能であるが、他の細胞ラインでは標準的対照と比較すると最大１０ないし１００倍の発現増加を示すことがある。
【００４８】
ラパマイシンと３９−デスメトキシラパマイシンとの間に示される活性スペクトルの相違の幾つかは、３９−デスメトキシラパマイシン相同物がＰ−ｇｐのための基質ではないことによるものと説明することができる。３９−デスメトキシラパマイシン相同物はラパマイシンに比べてＣａｃｏ−２細胞からのエフラックスが減少しており、３９−デスメトキシラパマイシンは生体外Ｐ−ｇｐ基質アッセイにおいてＰ−ｇｐのための基質であるとは示されなかった（実施例参照）。
【００４９】
したがって、本発明のさらなる態様は、３９−デスメトキシラパマイシン相同物を、一以上の現存する抗ガン剤に対して抵抗性を示すガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍、すなわちＭＤＲガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いる用途を提供する。一つの特定の態様において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシンをＰ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いる用途を提供する。さらにより好適な実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシンを高Ｐ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いる用途を提供する。特に、高Ｐ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍は比較対照に比べて２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍または１００倍増大した発現を有する。上記用途の一つの特定の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。上記用途の他の態様において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。適当な対照はＰ−ｇｐを発現しないか、Ｐ−ｇｐ発現レベルが低いか、あるいはＭＤＲ機能が低い細胞であり、当業者はそのような細胞ラインを知っているかあるいは認知することができる。適当な細胞ラインを非限定的に例示すれば、ＭＤＡ４３５／ＬＣＣ６、ＳＢＣ−３／ＣＤＤＰ、ＭＣＦ７、ＮＣＩ−Ｈ２３、ＮＣＩ−Ｈ５２２、Ａ５４９／ＡＴＣＣ、ＥＫＶＸ、ＮＣＩ−Ｈ２２６、ＮＣＩ−Ｈ３２２Ｍ、ＮＣＩ−Ｈ４６０、ＨＯＰ−１８、ＨＯＰ−９２、ＬＸＦＬ５２９、ＤＭＳ１１４、ＤＭＳ２７３、ＨＴ２９、ＨＣＣ−２９９８、ＨＣＴ−１１６、ＣＯＬＯ２０５、ＫＭ１２、ＫＭ２０Ｌ２、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１／ＡＴＣＣ、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５、ＭＤＡ−Ｎ、ＢＴ−５４９、Ｔ−４７Ｄ、ＯＶＣＡＲ−３、ＯＶＣＡＲ−４、ＯＶＣＡＲ−５、ＯＶＣＡＲ−８、ＩＧＲＯＶ１、ＳＫ−ＯＶ−３、Ｋ−５６２、ＭＯＬＴ−４、ＨＬ−６０（ＴＢ）、ＲＰＭＩ−８２２６、ＳＲ、ＳＮ１２Ｃ、ＲＸＦ−６３１、７８６−０、ＴＫ−１０、ＬＯＸ  ＩＭＶＩ、ＭＡＬＭＥ−３Ｍ、ＳＫ−ＭＥＬ−２、ＳＫ−ＭＥＬ−５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、Ｍ１４、ＵＡＣＣ−６２、ＵＡＣＣ−２５７、ＰＣ−３、ＤＵ−１４５、ＳＮＢ−１９、ＳＮＢ−７５、ＳＮＢ−７８、Ｕ２５１、ＳＦ−２６８、ＳＦ−５３９、ＸＦ４９８。
【００５０】
別の観点において本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物をＭＤＲガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療用薬剤の調製に用いる用途を提供する。特定の態様において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物をＰ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療用薬剤の調製に用いる用途を提供する。さらにより好適な実施形態において、本発明は３９−デスメトキシラパマイシン相同物を高Ｐ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療用薬剤の調製に用いる用途を提供する。特に、高Ｐ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍は比較対照に比べて２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍または１００倍増大した発現を有する。一つの特定の態様において３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。適当な対照は上記のものである。
【００５１】
サンプル中のＰ−ｇｐ発現レベルを決定する方法は後述する。
【００５２】
したがって、別の観点において本発明は、３９−デスメトキシラパマイシン相同物の治療的有効量を投与することからなるＰ−ｇｐ発現ガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療法を提供する。一つの特定の態様において３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンである。別の態様において３９−デスメトキシラパマイシン相同物は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物である。特定のガンタイプにおけるＰ糖タンパク質（Ｐ−ｇｐ）発現レベルは、限定的ではないがたとえばリアルタイムＲＴ−ＰＣＴ（Ｓｚａｋａｃｓら、２００４年；Ｓｔｅｉｎら２００２年；Ｌａｎｇｍａｎｎら、２００３年）を含む技術を用いて、免疫組織化学によって（Ｓｔｅｉｎら、２００２年）、またはマイクロアレイを用いて（Ｌｅｅら、２００３年）、当業者により決定することができる。これらの方法は単に例示として挙げたにすぎず、他の適当な方法も当業者に与えられるであろう。
【００５３】
３９−デスメトキシラパマイシンは実施例に示すように、ラパマイシンと比べるとより増大した代謝安定性を示す。既に多くの論文において、ラパマイシンの３９−メトキシ群はラパマイシンを３９−Ｏ−デスメチルラパマイシンに返還させる代謝性発作の主要な部位であると認識されている（Ｔｒｅｐａｎｉｅｒら、１９９８年）。ラパマイシンの主な代謝物質は親化合物に比べて顕著に低下した活性を有する（Ｇａｌｌａｎｔ−Ｈａｉｄｎｅｒら、２０００年、Ｔｒｅｐａｎｉｅｒら、１９９６年）。対して、３９−デスメトキシラパマイシンはもはや代謝性発作の最も顕著な部位を持たず、このことが該化合物の安定性向上につながっている（実施例参照）。ラパマイシン親化合物と同等またはそれ以上の効能を３９−デスメトキシラパマイシンが持っていることが、本発明化合物により長い半減期を与えている。これはラパマイシンを上回るさらに驚くべき３９−デスメトキシラパマイシンの優位性である。
【００５４】
上記３９−デスメトキシラパマイシンの特性（Ｐ−ｇｐのための基質ではなく、増大した代謝安定性を持ち、Ｐ−ｇｐを介しての細胞エフラックスが減少している）は、３９−デスメトキシラパマイシンがその親化合物ラパマイシンに比べてより高いバイオアベイラビリティを有することを示している。したがって、本発明は代謝安定性が向上し、細胞膜透過性が向上し、独特のガン細胞抑制プロファイルを有するラパマイシン相同物であるところの３９−デスメトキシラパマイシンを医療用途、特にガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療に用いる用途を提供する。
【００５５】
本発明はまた、３９−デスメトキシラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩を薬学的に許容可能なキャリアと共に用いてなる薬剤化合物を提供する。一つの特定の態様において本発明は３９−デスメトキシラパマイシンを含む薬剤化合物を提供する。他の態様において本発明は９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違する３９−デスメトキシラパマイシン相同物を含む薬剤化合物を提供する。一つの特定の実施形態において、本発明は特に静脈投与用に処方された上記薬剤化合物を提供する。
【００５６】
ラパマイシンおよび臨床試験において存在しあるいは存在することが見出されたＣＣＩ−７７９やＲＡＤ００１などの関連化合物は、薬理学的プロファイルが不十分であり、たとえば代謝安定性が低く、透過性が低く、Ｐ−ｇｐからのエフラックスが高レベルであり、バイオアベイラビリティが低い。本発明は、ラパマイシンと比べて薬剤性能が向上されている３９−デスメトキシラパマイシン相同物またはその薬学的に許容可能な塩の用途を提供する。
【００５７】
本発明のさらなる驚くべき観点は、現存するラパマイシン相同物に比べて３９−デスメトキシラパマイシン相同物が顕著に異なる薬物動態プロファイルを示すことである。特に３９−デスメトキシラパマイシン相同物は血液脳関門透過性が向上しており、したがってこれら化合物は所定の血液レベルに対して関連相同物と比べてより高い脳内露出が見られる。
【００５８】
薬物動態プロファイルにおけるこの相違は全く予期せざるものであり、いかなる従来技術にも示唆されていない。神経変性症および脳腫瘍を含む疾患に現在用いられている治療に伴う公知の短所は、薬剤を活性領域に運び入れることへのチャレンジである（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ、２００５年を参照）。これはまた、現存ラパマイシン相同物を治療に用いたときの問題としても報告されており、特に多型性グリオブラストーマの治療におけるＣＣＩ−７７９の効能を調査した研究は、全身濃度は適正であったけれど血液脳関門が腫瘍への薬剤輸送に対するバリアとして作用したと結論付けた（Ｃｈａｎｇ、２００５年）。本発明は、したがって、改善された血液脳関門透過性を有し、したがって脳腫瘍および神経変性症の治療について顕著な有用性を有するラパマイシン相同物を初めて開示するものである。
【００５９】
上記した形態のいずれにおいても本発明の用途のための好適な３９−デスメトキシラパマイシン相同物は、９、１６または２７位置の一以上でラパマイシンとさらに相違するものを含み、すなわち、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は３９−デスメトキシラパマイシンそのものではない。さらに好適な３９−デスメトキシラパマイシン相同物は下記のものを含む。
・３９−デスメトキシラパマイシン相同物は位置２７に水酸基を有する、すなわちＲ３はＯＨを示し、 
・３９−デスメトキシラパマイシン相同物は位置２７に水素基を有する、すなわちＲ３はＯＨを示し、または、 
・３９−デスメトキシラパマイシン相同物は位置１６に水酸基を有する、すなわちＲ３はＯＨを示す。
【００６０】
当業者であれば、本発明化合物の薬物動態プロファイルおよびバイオアベイラビリティを、当業者に知られている生体内および生体外の方法、たとえば非限定的な例示として、後述の方法やＧａｌｌａｎｔ−Ｈａｉｄｎｅｒら、２０００年およびＴｒｅｐａｎｉｅｒら、１９９８年に記述されたものをここで参照して、これらに記述された方法などを用いて決定することができるであろう。化合物のバイオアベイラビリティは多くの要因（水溶性、細胞膜透過性、タンパク質結合および代謝および安定性の程度など）によって決定され、これらは後述の実施例に記載したような生体外試験によって決定することができる。当業者には理解されていることであるが、これら要因の一以上の向上は化合物のバイオアベイラビリティを向上させることに繋がる。あるいは、３９−デスメトキシラパマイシンまたはその薬学的に許容可能な塩のバイオアベイラビリティは、下記に詳述しあるいは後述実施例に記述したような生体内方法を用いて測定することも可能である。
【００６１】
生体内アッセイ
生体内アッセイは３９−デスメトキシラパマイシンなどの化合物のバイオアベイラビリティを測定するためにも使用することができる。一般的に言えば、該化合物を腹腔内（ｉｐ）または静脈（ｉｖ）および経口（ｐｏ）の両方で試験動物に投与し、血液サンプルを所定インターバルで取り出して薬剤のプラズマ濃度の経時的変化を調べる。プラズマ濃度の経時的変化は、標準モデルを用いたパーセンテージとして該化合物の絶対的バイオアベイラビリティを算定するために用いることができる。主なプロトコルの例を下記に挙げる。
【００６２】
３９−デスメトキシラパマイシンをｉｖで３ｍｇ／ｋｇまたはｐｏで１０ｍｇ／ｋｇマウスに投薬する。血液サンプルを５分、１５分、１時間、４時間および２４時間のインターバルで取り出し、サンプル中の３９−デスメトキシラパマイシン濃度をＨＰＬＣで同定する。次いで、プラズマまたは全体血中濃度の経時的変化を用いて、プラズマまたは血中濃度−時間曲線下面積（ＡＵＣ、全身循環に到達する不変薬剤の全量に正比例する）、最大（ピーク）プラズマまたは血中薬物濃度、最大（ピーク）プラズマまたは血中薬物濃度が発生する時間（ピーク時間）などの主要なパラメータを得るために用いることができる。バイオアベイラビリティの正確な決定に用いられるその他の要因には、該化合物の消失半減期、全身クリアランス、定常状態分布容積およびＦ％が含まれる。次いでこれらのパラメータを非境界要素法または境界要素法を用いて分析して、算定されたパーセンテージのバイオアベイラビリティを得る。この種の方法の一例がＧａｌｌａｎｔ−Ｈａｉｄｎｅｒら、２０００年およびＴｒｅｐａｎｉｅｒら、１９９８年に記載されており、それらをここで参照する。
【００６３】
３９−デスメトキシラパマイシンの効能は、ここに記述され、また当業者に公知である神経変性症のための生体内モデルで試験することができる。このようなモデルは、限定的ではないが、アルツハイマー病のための、ヒト家族性アルツハイマー病（ＦＡＤ）ｐアミロイド前駆体（ＡＰＰ）の発現動物、ヒト野生型ＡＰＰの過剰発現動物、ｐアミロイド１−４２（ｐＡ）の過剰発現動物、ＦＡＤプリセニリン１（ＰＳ１）（たとえばＧｅｒｍａｎおよびＥｉｓｃｈ、２００４年）の発現動物などである。多発性硬化症については実験的自己免疫症脳炎（ＥＡＥ）モデルがある（Ｂｒａｄｉ、２００３年および実施例７参照）。パーキンソン病については１−メチル−４−フェニル−１，２，３，６−テトラヒドロピリジン（ＭＰＴＰ）モデルまたは６−ヒドロキシドーパミン（６−ＯＨＤＡ）モデルがある（たとえばＥｍｂｏｒｇ、２００４年；Ｓｃｈｏｂｅｒ  Ａ、２００４年参照）。ハンチントン病については、高度に肥大したＣＡＧリピートを持つヒトのハンチントン病（ＨＤ）遺伝子の１エクソンをマウスの生殖細胞に導入することにより産生されるＲ６ラインモデル（Ｓａｔｈａｓｉｖａｍら、１９９９年）やその他（ＨｅｒｓｃｈおよびＦｅｒｒａｎｔｅ、２００４年）を含む幾つかのモデルがある。
【００６４】
上述の本発明化合物またはその処方は従来のいかなる方法によっても投与可能であり、限定的ではないがたとえば、非経口、経口、局所（口内、舌下、経皮を含む）的に投与することができ、ステントなどの医療器具を用いて投与することができ、吸入法や注射（皮下または筋肉）によっても投与可能である。治療は一度の投薬または一定期間に亘る複数回の投薬で行うことができる。
【００６５】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物を単独で投与することも可能であるが、薬剤処方として一以上の許容されるキャリアと共に存在させることが好ましい。キャリアは本発明化合物とコンパチブルであり且つそのレシピエントに対して有害でないという意味において「許容される」ものでなければならない。好適なキャリアの数例を下記に詳述する。
【００６６】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物は単独または他の治療薬と組み合わせて投与することができ、２つ（またはそれ以上）の薬剤の併用投与は各々を単独で投与する場合に比べて格段に少ない投薬量で済み、したがってそれらの副作用を軽減させる。３９−デスメトキシラパマイシンの代謝安定性が向上されていることは、Ｐ４５０酵素を基質とする薬剤と併用したときに、ラパマイシンと併用した場合に比べて薬物相互作用を起こしにくいという特別の優位性を与えている（Ｌａｍｐｅｎら、１９９８年）。
【００６７】
したがって、一つの実施形態において、免疫抑制の誘導または維持、臓器移植拒絶反応、移植片対宿主拒絶病、自己免疫疾患、神経変性症状、血管炎症疾患の治療のために、３９−デスメトキシラパマイシン相同物を他の治療薬と併用投与する。好適な治療薬の非限定的例示として、アザチオプリン、コルチコステロイド、シクロフォスファミド、シクロスポリンＡ、ＦＫ５０６、ミコフェノール酸モフェチル、ＯＫＴ−３およびＡＴＧなどの免疫調節剤を含む。
【００６８】
別の実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物はガンまたはＢ細胞系悪性腫瘍の治療のために他の治療薬と併用投与される。好適な治療薬の非限定的例示として、メトトレキセート、リューコボリン、アドリアマイシン、プレニゾン、ブレオマイシン、シクロフォスファミド、５−フルオロウラシル、パクリタキセル、ドセタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、ドキソルビシン、タモキシフェン、トレミフェン、酢酸メゲストロール、アナストロゾール、ゴセレリン、抗ＨＥＲ２単クローン抗体（Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標名）など）、カペシタビン、塩酸ラロキシフェン、ＥＧＦＲ抑制剤（Ｉｒｅｓｓａ（登録商標）、Ｔａｒｃｅｖａ（商標名）、Ｅｒｂｉｔｕｘ（商標名）など）、ＶＥＧＦ抑制剤（Ａｖａｓｔｉｎ（商標名）など）、プロテアソーム抑制剤（Ｖｅｌｃａｄｅ（商標名）など）、Ｇｌｉｖｅｃ（登録商標）、ｈｓｐ９０抑制剤（１７−ＡＡＧなど）を含む。加えて、３９−デスメトキシラパマイシンは非限定的例示として放射線療法や手術を含む他の療法と組み合わせて投与しても良い。
【００６９】
一実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は血管系疾患の治療のために他の治療薬と併用投与される。好適な治療薬の非限定的例示として、ＡＣＥ抑制剤、アンギオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、フィブリン酸誘導体、ＨＭＧ−ＣｏＡリダクターゼ抑制剤、βアドレナリン遮断剤、カルシウムチャンネル遮断剤、抗酸化剤、抗凝集剤、血小板抑制剤（Ｐｌａｖｉｘ（商標名）など）を含む。
【００７０】
一実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は神経再生の刺激のための他の治療薬と併用投与される。好適な治療薬の非限定的例示として、神経成長因子、グリア細胞由来成長因子、脳由来成長因子、毛様体神経栄養因子、ニューロトロフィン−３などの神経栄養因子を含む。
【００７１】
一実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は感染症の治療のための他の治療薬と併用投与される。好適な治療薬の非限定的例示として、アンフォテリシンＢ、フルサイトシン、エキノカンジン（カスポファンギン、アニデュラファンギンまたはミカファンギンなど）、グリセオフルビン、イミダゾール系またはトリアゾール系抗真菌剤（クロトリマゾール、ミコナゾール、ケトコナゾール、エコナゾール、ブトコナゾール、オキシコナゾール、テルコナゾール、イトラコナゾール、フルコナゾオール、ボリコナゾールなど）を含む。
【００７２】
一実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物はアルツハイマー病の治療のための他の治療薬と併用投与される。好適な治療薬の非限定的例示として、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミンなどのコリンステラーゼ抑制剤、メマンチンなどのＮ−メチル−Ｄ−アルパラギン酸（ＮＭＤＡ）受容体拮抗薬を含む。
【００７３】
一実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は多発性硬化症の治療のための他の治療薬と併用投与される。好適な治療薬の非限定的例示として、インターフェロンβ−１ｂ、インターフェロンβ−１ａ、グラチラマー、ミトキサントロン、シクロフォスファミド、コルチコステロイド（メチルプレドニゾン、プレドニゾン、デキサメタゾンなど）を含む。
【００７４】
当業者には明らかなことであろうが、併用投与には、同一の治療レジメの一部として２またはそれ以上の治療薬を患者に輸送するいかなる手段をも含む。２またはそれ以上の薬剤を単一の処方において同時に投与することも可能であるが、これは必須ではない。これらの薬剤は異なる処方で異なる時期にも投与可能である。
【００７５】
処方は従来のように単位投薬形態として存在しても要旨、調剤分野で公知のいかなる方法によって調製しても良い。このような方法は、活性成分（本発明化合物）を一以上のアクセサリ成分を構成するキャリアに関連付けるステップを含む。一般的に言えば、活性成分を液体キャリアまたは微細に分割した固体キャリアまたはその両方に均一且つ周到に関連付けた後、必要であれば製品に仕上げることによって処方を調製する。
【００７６】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物は通常の場合、活性成分からなる薬剤処方の形態で、任意的に非毒性の有機または無機、酸または基、添加塩、薬学的に許容し得る投薬形態で、静脈内、経口または何らかの非経口ルートによって投与される。治療すべき疾患や患者および投薬ルートに応じて異なる投薬量で化合物を投与することができる。
【００７７】
注射可能な用途に好適な本発明の薬剤化合物は、無菌の水溶液または分散液を含む。さらに、該化合物は、そのような無菌の注入可能溶液または分散液の即時調整用の無菌粉体の形態であっても良い。あらゆる場合において最終的な注射可能形態は無菌でなければならず、注射を容易にするために有効な液体でなければならない。
【００７８】
この薬剤化合物は製造および保存の状態において安定的でなければならず、すなわち、細菌や菌腫のような微生物の汚染作用を廃して保存しうることが好ましい。キャリアはたとえば水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、野菜油およびこれらの適当な混合物を含む溶媒ないし分散媒体であって良い。
【００７９】
一例として、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は、即時的または時間を置いたあるいはリリースコントロールされた投与のために、香料剤や着色剤を含み得る錠剤、カプセル、胚珠、エリキシル、溶液または懸濁液の形態にして、経口、口内または舌下に投与することができる。
【００８０】
経口投与に適した３９−デスメトキシラパマイシン相同物の溶液または懸濁液はまた、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミドなどの賦形剤、ポリソルベート８０などの分散剤、表面活性剤、Ｐｈｏｓａｌ５０ＰＧ（フォスファチジルコリン、大豆脂肪酸、エタノール、モノ／ジグリセリド、プロピレングリコールおよびアスコルビン酸パルミチン酸エステルからなる）などの溶解剤を含むことができる。
【００８１】
錠剤には、微結晶セルロース、ラクトース（ラクトース一水和物、ラクトース無水物など）、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、リン酸水素カルシウムおよびグリシンなどの賦形剤、ジブチルヒドロキシトルエン（Ｅ３２１）、クロスポビドン、ヒプロメローズ、デンプン（好ましくはコーン、ポテトまたはタピオカのデンプン）、デンプングリコール酸ナトリウム、クロスカルメロースナトリウムなどの崩壊剤、ある種の錯体ケイ酸塩、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、マクロゴル８０００、サクロース、ゼラチン、アカシアなどの顆粒結合剤を含むことができる。さらに、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、ベヘン酸グリセリル、タルクなどの潤滑剤を含有しても良い。
【００８２】
類似タイプの固形化合物はゼラチンカプセル内の充填物としても使用可能である。この態様における好適な賦形剤は、ラクトース、デンプン、セルロース、乳糖または高分子ポリエチレングリコールなどである。液体懸濁物および／またはエリキシルの場合、本発明化合物は様々な甘味剤または香料剤、着色剤または顔料、乳化剤および／または懸濁剤、水やエタノール、プロピレングリコール、グリセリンおよびこれらの混合物と組み合わせて用いることができる。
【００８３】
錠剤は任意の一以上の副成分と共に圧縮または成型によって調製することができる。圧縮法による錠剤は、粉体または粒体のような自由流動形態にある有効成分を適当な機械の中で圧縮することによって調製することができる。該有効成分は、結合剤（ポビドン、ゼラチン、ヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）、潤滑剤、不活性希釈剤、防腐剤、崩壊剤（グリコールデンプンナトリウム、架橋ポビドン、架橋カルボキシメチルセルロースナトリウムなど）、表面活性剤または分散剤と任意に混合して用いることができる。成型法による錠剤は、不活性希釈剤で湿潤された粉状の化合物を適当な機械の中で成型することによって調製することができる。錠剤には任意にコーティングまたはスコアリングが施され、たとえばヒドロキシプロピルメチルセルロースを様々な配合で用いて所望のリリースプロファイルを与えることにより、その中の有効成分のリリースを遅らせ、あるいは制御するように処方することができる。
【００８４】
経口投与に適した本発明の処方は、各々が所定量の有効成分を含むカプセル剤、カシュ剤、錠剤などの個別ユニットとして、粉状物または粒状物として、水性液または非水性液中の溶液または懸濁液として、あるいは水中油型液体エマルジョンまたは油中水型液体エマルジョンとして、提供することができる。有効成分はボーラス（急速静注）投与、練り薬またはペーストとして提供することもできる。
【００８５】
口内局所投与に適した処方は、香り付けされた通常はサクロースまたはアカシアまたはトラガントなどの基質内の活性成分からなるロゼンジ、ゼラチン、グリセリン、サクロース、アカシアなどの不活性基質内の活性成分からなる芳香製剤、適当な液体キャリア内の活性成分からなるマウスウォッシュを含む。
【００８６】
上述の成分に加えて、本発明の処方は、問題となる処方のタイプを考慮して、当業界に公知である他の薬剤を含み得ることを理解しなければならない。たとえば、経口投与に適したものは香料剤を含むことができる。
【００８７】
局所投与に適合した薬剤化合物は、軟膏、クリーム、ローション、パウダー、溶液、ペースト、ジェル、含浸包帯、スプレー、エアロゾル、オイル、経皮デバイス、ダスティングパウダーなどとして設計することができる。これらの化合物は活性剤を含む従来法で調剤可能である。これらは従来公知の親水性キャリアおよび添加剤、たとえば防腐剤、薬剤の浸透をアシストする溶媒、クリームまたは軟膏内のエモリエント、ローションのためのエタノールまたはオレイルアルコールを含むことができる。このようなキャリアは化合物の約１％〜約９８％存在することができる。より一般的にはこれらは化合物の約８０％を上限として存在する。例示的に述べるにすぎないが、クリームまたは軟膏は、十分な量の親水性材料と化合物の約５〜１０重量％を含む水とを混合して所望のコンシステンシーを有するクリームまたは軟膏として製造することができる。
【００８８】
経皮投与に適合した薬剤化合物は、レシピエントの表皮と長時間密接し続けるように意図された不連続パッチとして提供することができる。たとえば、活性剤をパッチからイオントフォレーシスして供給することができる。
【００８９】
口や皮膚などの外部組織への投与のために、化合物は好ましくは局所用の軟膏またはクリームとして提供される。軟膏として設計される場合は、活性剤をパラフィン系または水溶性の軟膏ベースと共に用いることができる。
【００９０】
あるいは、活性剤を水中油クリームベースまたは油中水ベースと共にクリームに処方しても良い。
【００９１】
静脈投与の場合、流体ユニットの単位投薬量フォームは、活性剤と、非限定的例示として水やアルコール、ポリオール、グリセリン、植物性油など、特に水が好ましいが、これらの無菌ベヒクルを用いて調製される。活性成分は、使用されるベヒクルと濃度に応じて、ベヒクルに懸濁または溶解され得る。溶液を調製する場合、活性成分は注射のために水に溶解し、適当なバイアルまたはアンプルに注入する前にフィルタ殺菌してシールする。
【００９２】
好ましくは、局所麻酔薬、防腐剤、緩衝剤などの添加剤がベヒクルに溶解される。安定性を高めるために、バイアルに注入する前に化合物を凍結して真空下で水を除去することができる。凍結乾燥したパウダーは次いでバイアル内でシールされ、使用前に注射用の水バイアルが供給されて液体を再構成する。
【００９３】
非経口投与懸濁液は、活性成分が溶解される代わりにベヒクル内に懸濁され、また、ろ過を伴わずに殺菌されることを除いて、溶液の場合とほぼ同様に調製される。活性成分は無菌ベヒクルに懸濁される前にエチレン酸化物に晒されることによって殺菌される。好ましくは、活性成分の均一な分散を促進させるために、界面活性剤または湿潤剤が化合物に含まれる。
【００９４】
３９−デスメトキシラパマイシン相同物は、また、当業界において公知の医療機器を用いて投与することができる。たとえば、一実施例によれば、本発明の薬剤化合物は無針（needleless）皮下注射器を用いて投与することができる。このような注射器は、米国特許第５３９９１６３号、米国特許第５３８３８５１号、米国特許第５３１２３３５号、米国特許第５０６４４１３号、米国特許第４９４１８８０号、米国特許第４７９０８２４号または米国特許第４５９６５５６号に開示されている。本発明に有用な公知のインプラントおよびモジュールの例を挙げれば、制御された速度で投薬するためのインプラント可能なマイクロインフュージョンポンプ（micro-infusion pump）を開示する米国特許第４４８７６０３号、外皮を通して投薬する医療器具を開示する米国特許第４４８６１９４号、厳密な注入速度で薬剤をデリバーするための薬剤インフュージョンポンプを開示する米国特許第４４４７２３３号、連続薬剤デリバリーのための可変速度インプラント可能インフュージョン装置を開示する米国特許第４４４７２２４号、マルチチャンバーのコンパートメントを有する浸透性薬剤デリバリーシステムを開示する米国特許第４４３９１９６号、および、浸透性薬剤デリバリーシステムを開示する米国特許第４４７５１９６号である。一つの特定の実施形態において、３９−デスメトキシラパマイシン相同物は、ＷＯ０１／８７２６３に記述されるものや関連する刊行物あるいはＰｅｒｉｎ（Ｐｅｒｉｎ、ＥＣ、２００５年）によって記述されるものに対応するような薬剤溶出ステントを用いて投与することができる。その他多くのインプラント、デリバリーシステムおよびモジュールが当業者に知られている。
【００９５】
本発明化合物の１回投薬量は特定の化合物、関係する疾患、サブジェクト、疾患の性質および深刻度、サブジェクトの物質的な条件、および選択された投薬経路によって変わる。適切な１回投薬量は当業者であれば容易に決定することができる。
【００９６】
薬剤化合物には、投薬方法に依存して、本発明化合物が０．１重量％以上、好ましくは５〜６０重量％、より好ましくは１０〜３０％含まれる。
【００９７】
当業者には認識し得るように、本発明化合物の１回投薬量の適量と投薬間隔は、治療する症状の性質および程度、投与の形態、経路および部位、治療患者の年齢および状態などによって決定され、最終的には医師が適切な投薬量を決定する。この投薬量は適切である限り頻繁に繰り返され得る。副作用が発症した場合は、通常の臨床プラクティスに基づいて投薬の量および／または頻度を変更または減少させる。
【実施例】
【００９８】
材料および方法
【００９９】
材料
特記しない限り、下記実施例で用いたすべての試薬は市販品から入手したものである。
【０１００】
培養
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＭＮＯＱＬｈｉｓ］（ＷＯ０４／００７７０９；Ｇｒｅｇｏｒｙら、２００４年）を培地１の寒天プレート（下記）上で２８℃に維持した。芽胞株を培地１で培養した後に調製した。それは、２０％ｗ／ｖグリセリンと１０％ｗ／ｖラクトースを含む蒸留水に保存して−８０℃で保管した。凍結株０．１ｍｌを２５０ｍｌフラスコ中の５０ｍｌ培地２（下記）に接種することによって植物培養菌を調製した。この培養菌を３６〜４８時間、２８℃、３００ｒｐｍでインキュベートした。
【０１０１】
製造法
植物培養菌を２．５〜５％ｖ／ｖで培地３に接種した。６〜７日間にわたり２６℃、３００ｒｐｍで培養した。
【０１０２】
培養法
シクロヘキサンカルボン酸の供給／添加を接種２４〜４８時間後に行い、他に述べられていない限り１〜２ｍＭの最終濃度で供給した。
【０１０３】
培地１：
成分                      ソース        カタログ＃        Ｌ当たり
コーンスターチパウダー    Ｓｉｇｍａ    Ｃ−８１６０      ２．５ｇ
酵母エキス                Ｄｉｆｃｏ    ０１２７−１７        ３ｇ
炭酸カルシウム            Ｓｉｇｍａ    Ｃ５９２９            ３ｇ
硫酸鉄                    Ｓｉｇｍａ    Ｆ８６３３        ０．３ｇ
ＢＡＣＴＯ寒天                                              ２０ｇ
小麦デンプン              Ｓｉｇｍａ    Ｓ２７６０          １０ｇ
水                                                            １Ｌ
その後培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌
【０１０４】
培地２：ＲａｐＶ７菌種培地
成分                                                                                Ｌ当たり
トーストしたニュートリソイ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）                    ５ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０  デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）    ３５ｇ
コーンスチープ固形物（Ｓｉｇｍａ）                                                      ４ｇ
グルコース                                                                            １０ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                                        ２ｇ
ラクチン酸（８０％）                                                              １．６ｍＬ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                                              ７ｇ
１ＭのＮａＯＨでｐＨを７．５に調整
その後培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌
殺菌後０．１６ｍＬの４０％グルコースを各７ｍＬの培地に添加
【０１０５】
培地３：ＭＤ６培地（発酵培地）
成分                                                                                Ｌ当たり
トーストしたニュートリソイ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）                  ３０ｇ
コーンスターチ（Ｓｉｇｍａ）                                                          ３０ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０  デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）    １９ｇ
酵母（Ａｌｌｉｎｓｏｎ）                                                                ３ｇ
コーンスチープ固形物（Ｓｉｇｍａ）                                                      １ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                                                          ２．５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                                                                          ２．５ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                                      １０ｇ
ＮａＣｌ                                                                                ５ｇ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                                            １０ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                                                                  １０ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                ２．５ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                １２０ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                  ５０ｍｇ
ＭＥＳ（２−モルホリノエタンスルホン酸一水和物）                                  ２１．２ｇ
１ＭのＮａＯＨでｐＨを６．０に調整
殺菌前に０．４ｍＬのＳｉｇｍａα−アミラーゼ（ＢＡＮ２５０）を１Ｌ培地に添加
培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌
殺菌後０．３５ｍＬの滅菌４０％フルクトースと０．１０ｍＬのＬ−リシン（水中に１４０ｍｇ／ｍＬ、フィルター殺菌済）を各７ｍＬに添加
【０１０６】
培地４：ＲａｐＶ７ａ菌種培地
成分                                                                                Ｌ当たり
トーストしたニュートリソイ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）                    ５ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０  デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）    ３５ｇ
コーンスチープ固形物（Ｓｉｇｍａ）                                                      ４ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                                        ２ｇ
ラクチン酸（８０％）                                                              １．６ｍＬ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                                              ７ｇ
１ＭのＮａＯＨでｐＨを７．５に調整
その後培地を１２１℃で２０分間オートクレーブ殺菌
【０１０７】
培地５：ＭＤ６／５−１培地（発酵培地）
成分                                                                                Ｌ当たり
トーストしたニュートリソイ（ＡＤＭ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）                  １５ｇ
Ａｖｅｄｅｘ  Ｗ８０  デキストリン（Ｄｅｙｍｅｒ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ  Ｌｔｄ）    ５０ｇ
酵母（Ａｌｌｉｎｓｏｎ）                                                                ３ｇ
コーンスチープ固形物（Ｓｉｇｍａ）                                                      １ｇ
ＫＨ２ＰＯ４                                                                          ２．５ｇ
Ｋ２ＨＰＯ４                                                                          ２．５ｇ
（ＮＨ４）２ＳＯ４                                                                      １０ｇ
ＮａＣｌ                                                                              １３ｇ
ＣａＣＯ３（Ｃａｌｔｅｃ）                                                            １０ｇ
ＭｎＣｌ２・４Ｈ２Ｏ                                                                ３．５ｍｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                  １５ｍｇ
ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                １５０ｍｇ
ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ                                                                  ６０ｍｇ
ＳＡＧ４７１                                                                        ０．１ｍＬ
培地を１２１℃で３０分間オートクレーブ殺菌
殺菌後Ｌ当たり１５ｇフルクトースを添加
４８時間後０．５ｇ／ＬのＬ−リシンを添加
【０１０８】
分析法
方法Ａ
注入容量：０．００５〜０．１ｍＬ（感受性に応じた要求に従う）。ＨＰＬＣをアジレント「Ｓｐｈｅｒｉｓｏｒｂ」「Ｒａｐｉｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ」カートリッジＳＢ  Ｃ８上に、３ミクロン、３０ｍｍ×２．１ｍｍで、下記移動相で作動させた。
移動相Ａ：純水中に０．０１％蟻酸
移動相Ｂ：アセトニトリル中に０．０１％蟻酸
流速：１ｍＬ／分
０分時の５％Ｂから２．５分時の９５％Ｂまでリニアグラジエントを用い、４分間９５％Ｂに維持し、次のサイクルまでに５％Ｂに戻した。検出は、２５４ｎｍでのＵＶ吸収および／またはＭｉｃｒｏｍａｓｓｓ  Ｑｕａｔｔｒｏ−Ｍｉｃｒｏ装置を用いたエレクトロスプレーイオン化質量分析（ポジティブまたはネガティブ）によって行った。
【０１０９】
方法Ｂ
注入容量：０．０２ｍＬ。ＨＰＬＣを３ミクロンＢＤＳ  Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｌｔｄ）カラム上に、１５０ｍｍ×４．６ｍｍで、５０℃に維持し、下記移動相で作動させた。
移動相Ａ：アセトニトリル（１００ｍＬ）、トリフルオラセト酸（１ｍＬ）、１Ｍ酢酸アンモニウム（１０ｍＬ）、脱イオン水と共に１Ｌまで調製
移動相Ｂ：脱イオン水（１００ｍＬ）、トリフルオラセト酸（１ｍＬ）、１Ｍ酢酸アンモニウム（１０ｍＬ）、アセトニトリルと共に１Ｌまで調製
流速：１ｍＬ／分
１０分間で５５％Ｂから９５％Ｂまでリニアグラジエントを用った後、９５％Ｂで２分間、５５％Ｂで０．５分間、５５％Ｂでさらに２．５分間維持した。化合物の検出は２８０ｎｍでのＵＶ吸収によって行った。
【０１１０】
方法Ｃ
ＨＰＬＣシステムとしてＡｇｉｌｅｎｔＨＰ１１００を用い、３ミクロンＢＤＳ  Ｃ１８  Ｈｙｐｅｒｓｉｌ（ＴｈｅｒｍｏＨｙｐｅｒｓｉｌ−Ｋｅｙｓｔｏｎｅ  Ｌｔｄ）カラム上に、１５０ｍｍ×４．６ｍｍで、４０℃に維持し、下記移動相で作動させた。
移動相Ａ：脱イオン水
移動相Ｂ：アセトニトリル
流速：１ｍＬ／分
このシステムをＢｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ  Ｅｓｑｕｉｒｅ３０００エレクトロスプレイ質量分析装置に接続した。５００〜１０００Ｄａｌｔｏｎの走査領域に亘ってポジティブ／ネガティブ切替を用いた。１０分間で５５％Ｂから９５％Ｂまでリニアグラジエントを用った後、９５％Ｂで２分間、５５％Ｂで０．５分間、５５％Ｂでさらに２．５分間維持した。
【０１１１】
抗ガン活性のための生体外バイオアッセイ
化合物の抗ガン活性を、単分子層増殖アッセイ中の１２個のヒト腫瘍細胞ラインのパネルにおいて、ＦｒｅｉｂｕｒｇのＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ＯｎｃｏｌｏｇｙｍＯｎｃｏｔｅｓｔ  ＧｍｂＨの研究機関であるＯｎｃｏｓｔｅｓｔ試験場で生体外評価を行った。選択された１２個の細胞ラインの特性を次の表に要約して示す。
【表２】
2008534442.tif 000005
【０１１２】
Ｒｏｔｈら、１９９９年に記述されるように、ヒト腫瘍異種移植片からＯｎｃｏｔｅｓｔ細胞ラインが確立された。ドナー異種移植片の起源はＦｉｅｂｉｇら、１９９２年に記述された。他の細胞ラインが、ＮＣｌ（Ｈ４６０、ＳＦ−２６８、ＯＶＣＡＲ−３、ＤＵ１４５、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８）から得られ、またはドイツ国ＢｒａｕｎｓｈｗｅｉｇのＤＳＭＺから購入することができる（ＬＮＣＡＰ）。
【０１１３】
他に特記しない限り、すべての細胞サインは、ＲＰＭＩ１６４０培地と、１０％ウシ胎児血清と０．１ｍｇ／ｍＬゲンタミシン（ＰＡＡ、ドイツ国コルベ）を含む「すぐに混合できる」培地にて、加湿雰囲気（９５％空気、５％二酸化炭素）中で３７℃で培養した。
【０１１４】
単分子層アッセイ−プロトコル１：
変性ヨウ化プロピジウムアッセイを用いて、１２個のヒト腫瘍細胞ラインの成長に対する試験化合物の影響を評価した（Ｄｅｎｇｌｅｒら、１９９５年）。
【０１１５】
要約すれば、トリプシン化によって指数関数的位相培養（exponential phase cultures）から細胞を取り出し、細胞ラインに応じた細胞密度（５〜１０，０００の範囲で変動する細胞数／ウェル）にて９６ウェル底面平滑マイクロタイタープレートに接種してカウントした。２４時間後に回収して指数関数的な増殖を再開させた後、培地０．０１ｍｌ（プレート当たり６個の対照ウェル）または３９−デスメトキシラパマイシン含有培地をウェルに添加した。各濃度を３つ培養した。３９−デスメトキシラパマイシンを２つの濃度（０．００１ｍＭおよび０．０１ｍＭ）で適用した。４日間の連続的インキュベーションの後、３９−デスメトキシラパマイシンを用いまたは用いずに細胞培地を０．２ｍｌの水性死細胞染色用蛍光色素ＰＩ溶液（７ｍｇ／ｌ）で置換した。生存細胞の割合を測定するため、プレート凍結によって細胞を透過させた。プレートを解凍した後、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ４０００マイクロプレートリーダー（励起５３０ｎｍ、放出６２０ｎｍ）を用いて蛍光発光を測定して、生存可能な細胞の総数との直接関係を得た。
【０１１６】
増殖抑制が（被処理／対照）×１００（％Ｔ／Ｃ）として表された。活性化合物についてＩＣ５０およびＩＣ７０の値を細胞生存性に対する化合物濃度をプロットすることによって評価した。
【０１１７】
単分子層アッセイ−プロトコル２：
Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＮＣＩ）の癌スクリーニングパネルのヒト腫瘍細胞ラインを５％ウシ胎児血清と２ｍＭのＬ−グルタミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した（ＢｏｙｄおよびＰａｕｌ、１９９５年）。９６個のウェルマイクロタイタープレートに、個々の細胞ラインの倍増時間に応じて５，０００〜４０，０００細胞／ウェルの範囲のプレーティング密度で、０．１ｍＬの細胞を接種した。細胞接種後、試験薬の添加に先立って、マイクロタイタープレートを３７℃、５％ＣＯ２および９５％空気、１００％相対湿度で２４時間インキュベートした。
【０１１８】
２４時間後、各細胞ラインの２つのプレートをトリクロロ酢酸で生体内の本来の場所に（ｉｎ  ｓｉｔｕ）固定して、薬剤添加時の各細胞ラインについて細胞集団の測定を示した（Ｔｚ）。試験薬は所望の最終最大試験濃度の４００倍でジメチルスルホキシドに溶解させ、使用前に凍結保存した。薬剤添加時、凍結濃縮液から取った一定分量を解凍し、０．０５ｍｇ／ｍＬゲンタミシン含有の完全培地で所望の最終最大試験濃度の２倍になるように希釈した。さらに４個の１０倍または１／２ログシリアル希釈液を作成し、全部で５個の薬剤濃度および対照を用意した。これらの異なる薬剤希釈液の０．１ｍＬ部を培地０．１ｍＬを既に含有する適当なマイクロタイターウェルに添加し、要求される最終薬剤濃度を得た。
【０１１９】
薬物添加に続いて、プレートをさらに４８時間、３７℃で、５％ＣＯ２および９５％空気、１００％相対湿度でインキュベートした。接着細胞のため、冷たいＴＣＡの添加によりアッセイを終了させた。０．０５ｍＬの冷たい５０％（ｗ／ｖ）ＴＣＡ（最終濃度、１０％ＴＣＡ）の静かな添加により細胞を生体内の本来の場所に固定し、４℃で６０分間インキュベートした。上清を捨て、プレートを生水で５回洗浄し、空気乾燥した。１％酢酸中のスルフォローダミンＢ（ＳＲＢ）溶液（０．１ｍＬ）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１０分間インキュベートした。標本染色した後、１％酢酸で５回洗浄して未結合の染料を除去し、プレートを空気乾燥した。付着ステインを１０ｍＭトリス塩基で可溶化し、吸光度を５１５ｎｍの波長にて自動プレートリーダーで測定した。懸濁細胞については、８０％ＴＣＡ（最終濃度、１６％ＴＣＡ）を０．０５ｍＬ静に添加することにより細胞をウェルの底部に固定してアッセイを終了させた他は同様の方法を採用した。７つの吸光度測定値［時間ゼロ（Ｔｚ）、対照成長（Ｃ）、および５個の濃度レベルで薬剤が存在する下での試験成長］を用いて、各薬剤濃度レベルにおける成長率を算出した。成長抑制率を次式で算出した。
【０１２０】
Ｔｉ＞Ｔｚのとき、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００
Ｔｉ＜Ｔｚのとき、［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ）］×１００
【０１２１】
３つの投薬反応パラメータを各試験薬について算出した。５０％成長抑制（ＧＩ５０）は［（Ｔｉ−Ｔｚ）／（Ｃ−Ｔｚ）］×１００＝５０から算出した。これは、薬剤培養の間の対照細胞の正味タンパク質増大（ＳＲＢ標本染色で測定）における５０％減少をもたらす薬剤濃度である。全成長抑制（ＴＧＩ）をもたる薬剤濃度はＴｉ＝Ｔｚから算出した。治療後の正味細胞損失を示すＬＣ５０（薬剤治療の最初と比較して最後に測定されるタンパク質の５０％減少をもたらす薬剤濃度）は［（Ｔｉ−Ｔｚ）／Ｔｚ］×１００＝−５０から算出した。
【０１２２】
６０個の細胞ラインパネル中の多剤抵抗性細胞ラインを、ＮＣＩにより、ローダミンＢエフラックスによる同定（Ｌｅｅら、１９９４年）およびｍｄｒ−１のｍＲＮＡのＰＣＲ検出による同定（Ａｌｖａｒｅｚら、１９９５年）による高Ｐ−ｇｐ含有細胞ラインとして同定した。
【０１２３】
薬物動態学的分析−プロトコル１
０．１５ＭのＮａＣｌ中に４％エタノール、５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％ポリエチレングリコール４００を含有してなるベヒクル中で試験化合物を調製した。一回の１０ｍｇ／ｋｇのｐｏ投与または３ｍｇ／ｋｇのｉｖ投与をメスＣＤ１マウス群（タイムポイント毎に各化合物に３つのマウス）に対して行った。０分、４分、１５分、１時間、４時間および２４時間でグループを犠牲にして、さらなる分析のために各マウスから血液および脳を採取した。
脳サンプルを液体窒素中で急速凍結し、−２０℃で保存した。各動物からの全体血液の０．２ｍＬ最小投薬量を、抗凝固薬として、エチレンジアミン４酢酸（ＥＤＴＡ）を含有するチューブに採取し、良く混合し、−２０℃で保存した。
【０１２４】
薬物動態学的分析−プロトコル２
服用液の調製のため、５ｍｇの試験化合物を１００μＬのエタノールに溶解させて５０ｍｇ／ｍＬの化合物溶液を得た。この溶液に約２．４ｍＬの０．１５Ｍ  ＮａＣｌ（０．９％ｗ／ｖサリン）、５％ｖ／ｖＴｗｅｅｎ２０および５％ｖ／ｖＰＥＧ４００を加えて２ｍｇ／ｍＬに希釈した（最終エタノール濃度４％ｖ／ｖ）。
１０ｍｇ／ｋｇのｐｏまたは２ｍｇ／ｋｇのｉｖによる試験化合物の一回投与をメスのＢａｌｂ／Ｃマウス群に対して行った。５分、１５分、６０分、４時間、８時間および２４時間でグループを犠牲にし、約０．２ｍＬの全血サンプルをＤＥＴＡで採取して０．５ｍＭの最終濃度を得、さらに脳を除去した。全血および脳の両方を液体窒素中で急速凍結させ、分析のために固体二酸化炭素で出荷するまで−２０℃で保存した。
【０１２５】
薬物動態学的研究サンプルの分析
ＡＳＩ社（セントジョージ病院メディカルスクール、ロンドン）により分析を行った。血液および脳のサンプル内の試験化合物の濃度はＨＰＣＬによりＭＳ検出で行った。試験化合物を含まない対照の血液サンプルはＨａｒｉａｎ  Ｓｅｒａ−Ｌａｂ社（英国ラフバラ）から入手した。タイムゼロの脳サンプルを試験化合物を含まない対照の脳サンプルとして供給した。
【０１２６】
脳サンプルの調製
各脳の半球一つを５ｍＬの水でホモジナイズした。
【０１２７】
サンプルの抽出
マウスの脳または血液（０．０５ｍＬ）の対照または試験サンプル、内部標準溶液（０．１ｍＬ）、５％硫酸亜鉛溶液（０．５ｍＬ）およびアセトン（０．５ｍＬ）を２ｍＬポリプロピレンチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ社、Ｂｅａｕｍｏｎｔ  Ｌｅｙｓ、Ｌｅｉｃｅｓｔｅｒ、英国）にピペットし、内容物を最小で５分間混合した（ＩＫＡ−Ｖｉｂｒａｘ−ＶＸＲミキサー、Ｍｅｒｃｈ（ＢＤＨ）社、Ｐｏｏｌｅ  Ｄｏｒｓｅｔ、英国）。次いでチューブを遠心機で最小で２分間遠心処理した。溶媒層を、水酸化ナトリウム（０．１Ｍ、０．１ｍＬ）およびメチル−ｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ、２ｍＬ）を含有する４．５ｍＬポリプロピレンチューブにデキャンタした。次いで、チューブを最小５分間混合し（ＩＫＡ−Ｖｉｂｒａｘ−ＶＸＲミキサー）、３５００ｒｐｍで５分間遠心処理した。溶媒層を４．５ｍＬ螺旋形ポリプロピレンチューブに移し、ＳｐｅｅｄＶａｃ（登録商標）に入れて揮発乾燥させた。
【０１２８】
乾燥した抽出物を０．１５ｍＬ８０％メタノールで復元させ、最小５分間混合し（ＩＫＡ−Ｖｉｂｒａｘ−ＶＸＲミキサー）、３５００ｒｐｍで５分間遠心処理した。抽出部を次いでオートサンプラーチューブ（ＮＬＧ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ、Ａｄｅｌｐｈｉ  ＭＩＩＩ、Ｂｏｌｌｉｎｇｔｏｎ、Ｃｈｅｓｈｉｒｅ、英国）に写し、外気温にセットしたオートサンプラートレイに置いた。各抽出物から０．０３ｍＬの一定分量を分析カラムに注入するよう、オートサンプラーをプログラムした。
【０１２９】
実施例１：試験化合物の発酵と単離
１．１  ３９−デスメトキシラパマイシンの発酵と単離
後述のようにＳ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＭＮＯＱＬｈｉｓ］の培養菌を成長させ、シクロヘキサンカルボン酸（ＣＨＣＡ）で培養することにより３９−デスメトキシラパマイシンを産生した。
【０１３０】
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＭＮＯＱＬｈｉｓ］は、ＷＯ２００４／００７７０９に記述されるＭＧ２−１０株に、遺伝子ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯ、ｒａｐＱおよびｒａｐＬを含有するプラスミド導入することにより産生した。遺伝子カセットは５’インフレームヒスチジンタグ含有ｒａｐＬ遺伝子で構成された。ＷＯ０４／００７７０９に記述されているように、プラスミドはさらに、エクスコンジュガント（exconjugant）のコンジュゲーションおよび選択によるＭＧ２−１０の形質転換のための輸送源（origin of transfer）およびアプラマイシン抵抗性マーカー、および染色体（chromosome）への部位特異的遺伝子導入のためのｐｈｉＢＴ１アタッチメントを含むものであった。これらの各遺伝子の単離およびｐｏｓｔ−ＰＫＳ遺伝子の組合せを含有する遺伝子カセットの構築のために用いた方法は、ＷＯ０４／００７７０９に記述されるところによって行った。
【０１３１】
液体培養
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＭＮＯＱＬｈｉｓ］の栄養体培養菌を「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」に記述されるようにして培養した。産生培養を栄養体培養菌により０．５ｍＬで５０ｍＬチューブ内の７ｍＬ培地３に接種した。７日間に亘り２６℃、３００ｒｐｍで培養した。１：１アセトニトリルで３０分間シェイクして１ｍＬのサンプルを抽出し、１３，０００回転で１０分間延伸処理し、分析法Ｂに基づいて分析および定量化を行った（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）。産生物の確認は分析法Ｃ（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）を用いて質量分析により決定した。
【０１３２】
下記特性に記述した分析データを基に、観察されたラパマイシン相同物が所望の３９−デスメトキシラパマイシンであると認められた。
【０１３３】
発酵
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＭＮＯＱＬｈｉｓ］の培地４内の一次的栄養体培養菌を実質的に「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」に記載されるところにより培養した。培地４内の二次的栄養体培養菌を１０％ｖ／ｖ、２８℃、２５０ｒｐｍで２４時間接種した。栄養体培養菌を５％ｖ／ｖで２０Ｌ発酵槽中の培地５（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）に接種した。６日間、２６℃で培養し、インペラー先端速度を最小速度１．１８ｍｓ−１から最大速度２．７５ｍｓ−１の範囲で変化させることにより０．５ｖｖｍ．＞３０％溶解酸素を維持した。シクロヘキサンカルボン酸の供給を接種の２４時間後および４８時間後に行って、最終濃度２ｍＭを得た。
【０１３４】
抽出と精製
発酵汁（３０Ｌ）を等量メタノールで２時間撹拌した後、遠心処理（１０分間、３５００ｒｐｍ）して細胞をペレット状にした。上清をＤｉａｉｏｎ（登録商標）ＨＰ２０樹脂（４３ｇ／Ｌ）で１．５時間撹拌した後にろ過した。アセトン（合計量７．５Ｌ）で樹脂をバッチ洗浄してラパマイシン相同物を剥ぎ取り、溶剤を減圧下で除去した。得られた水性抽出物を水で２Ｌに希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×２Ｌ）で溶離した。溶剤を減圧下で除去して褐色油を得た（２０．５ｇ）。
【０１３５】
この抽出物をアセトンに溶解し、シリカに乾燥させ、シリカカラム（６×６．５ｃｍ径）に適用し、徐々に比率を変えたアセトン／ヘキサン（２０％−４０％）で抽出した。ラパマイシン相同物含有フラクションをプールし、溶剤を減圧下で除去した。残余物（２．６ｇ）をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０でクロマトグラフィ処理し（３回バッチ）、１０：１０：１クロロホルム／ヘプタン／エタノールで抽出した。半精製されたラパマイシン相同物（１．７ｇ）をＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣを用いて逆位相（Ｃ１８）プレパラティブＨＰＬＣにより精製し、２１ｍＬ／分の６５％アセトニトリル／水でＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ２１．２×２５０ｍｍ  Ｌｕｎａ５μｍＣ１８ＢＤＳカラムを溶離した。最も純粋なフラクション（ＨＰＬＣ分析、方法Ｂにより同定）を結合し、溶媒を減圧下で除去して、３９−デスメトキシラパマイシン（５６３ｍｇ）を得た。
【０１３６】
特性
３９−デスメトキシラパマイシンの１Ｈ  ＮＭＲスペクトルは標準（Ｐ．Ｌｏｗｄｅｎ、物理学博士、学位論文、ケンブリッジ大学、１９９７年）のそれと同等であった。
【０１３７】
培養抽出物のＬＣＭＳおよびＬＣＭＳｎ分析は、ラパマイシン相同物のｍ／ｚ比がラパマイシンのそれよりも３０質量単位だけ小さく、メトキシ基の欠乏と一致することを示した。観測されたイオンは、［Ｍ−Ｈ］８８２．３、［Ｍ＋ＮＨ４］＋９０１．４、［Ｍ＋Ｎａ］＋９０６．２、［Ｍ＋Ｋ］＋９２２．２。ナトリウム付加化合物のフラグメンテーションは、規定の解離経路（図２）（Ｊ．Ａ．Ｒｅａｔｈｅｒ、理学博士、学位論文、ケンブリッジ大学、２０００年）に従い、３９−デスメトキシラパマイシンとして予期されたイオンを与えた。この質量分析解離データは、シクロヘキシル成分を含むＣ２８−Ｃ４２フラグメントにメトキシ欠損が生じているラパマイシン相同物の領域を限定している。
これらの質量分析解離データは３９−デスメトキシラパマイシンの構造に完全に合致している。
【０１３８】
１．２  ２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン（27-O-desmethyl-39-desmethoxyrapamycin）の発酵と単離
後述のようにＳ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＪＭＮＯＬｈｉｓ］の培養菌を成長させ、シクロヘキサンカルボン酸（ＣＨＣＡ）で培養することにより２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンを産生した。
【０１３９】
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＪＭＮＯＬｈｉｓ］は、ＷＯ２００４／００７７０９に記述されるＭＧ２−１０株に、遺伝子ｒａｐＪ、ｒａｐＭ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬを含有するプラスミド導入することにより産生した。遺伝子カセットは５’インフレームヒスチジンタグ含有ｒａｐＬ遺伝子で構成された。ＷＯ０４／００７７０９に記述されているように、プラスミドはさらに、エクスコンジュガント（exconjugant）のコンジュゲーションおよび選択によるＭＧ２−１０の形質転換のための輸送源（origin of transfer）およびアプラマイシン抵抗性マーカー、および染色体（chromosome）への部位特異的遺伝子導入のためのｐｈｉＢＴ１アタッチメントを含むものであった。これらの各遺伝子の単離およびｐｏｓｔ−ＰＫＳ遺伝子の組合せを含有する遺伝子カセットの構築のために用いた方法は、ＷＯ０４／００７７０９に記述されるところによって行った。
【０１４０】
液体培養
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＪＭＮＯＬｈｉｓ］の栄養体培養菌を「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」に記述されるようにして培養した。産生培養を栄養体培養菌により０．５ｍＬで５０ｍＬチューブ内の７ｍＬ培地３に接種した。７日間に亘り２６℃、３００ｒｐｍで培養した。１：１アセトニトリルで３０分間シェイクして１ｍＬのサンプルを抽出し、１３，０００回転で１０分間延伸処理し、分析法Ｂに基づいて分析および定量化を行った（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）。産生物の確認は分析法Ｃ（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）を用いて質量分析により決定した。
下記特性に記述した分析データを基に、観察されたラパマイシン相同物が所望の２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンであると認められた。
【０１４１】
発酵
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＪＭＮＯＬｈｉｓ］の培地２内の一次的栄養体培養菌を実質的に「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」に記載されるところにより培養した。培地２内の二次的栄養体培養菌を１０％ｖ／ｖ、２８℃、２５０ｒｐｍで２４時間接種した。栄養体培養菌を５％ｖ／ｖで２０Ｌ発酵槽中の培地５（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）に接種した。６日間、２６℃で培養し、インペラー先端速度を最小速度１．１８ｍｓ−１から最大速度２．７５ｍｓ−１の範囲で変化させることにより０．７５ｖｖｍ．＞３０％溶解酸素を維持した。シクロヘキサンカルボン酸の供給を接種の２４時間後および４８時間後に行って、最終濃度２ｍＭを得た。
【０１４２】
抽出と精製
発酵汁（１５Ｌ）を等量メタノールで２時間撹拌した後、遠心処理（１０分間、３５００ｒｐｍ）して細胞をペレット状にした。上清をＤｉａｉｏｎ（登録商標）ＨＰ２０樹脂（４３ｇ／Ｌ）で１．５時間撹拌した後にろ過した。アセトン（合計量７．５Ｌ）で樹脂をバッチ洗浄してラパマイシン相同物を剥ぎ取り、溶剤を減圧下で除去した。得られた水性抽出物を水で２Ｌに希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×２Ｌ）で溶離した。溶剤を減圧下で除去して褐色油を得た（１２ｇ）。
この抽出物をアセトンに溶解し、シリカに乾燥させ、シリカカラム（４×６．５ｃｍ径）に適用し、徐々に比率を変えたアセトン／ヘキサン（２０％−４０％）で抽出した。ラパマイシン相同物含有フラクションをプールし、溶剤を減圧下で除去した。残余物（０．２０３ｇ）をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０でクロマトグラフィ処理し（３回バッチ）、１０：１０：１クロロホルム／ヘプタン／エタノールで希釈した。半精製されたラパマイシン相同物（１．７ｇ）をＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣを用いて逆位相（Ｃ１８）プレパラティブＨＰＬＣにより濃縮し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ２１．２×２５０ｍｍ  Ｌｕｎａ５μｍＣ１８ＢＤＳカラムを２１ｍＬ／分の６０％アセトニトリル／水で溶離した。最も純粋なフラクション（ＨＰＬＣ分析、方法Ｂにより同定）を結合し、溶媒を減圧下で除去して、２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン（１９．９ｍｇ）を得た。
【０１４３】
特性
１Ｈおよび１３Ｃ  ＮＭＲスペクトルは２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンの構造に合致しており、その割り当てを下記に示す。
【表３】
2008534442.tif 000006
【０１４４】
培養抽出物のＬＣＭＳおよびＬＣＭＳｎ分析は、ラパマイシン相同物のｍ／ｚ比がラパマイシンのそれよりも４４質量ユニット小さく、メチル基およびメトキシ基の欠損と一致することを示した。観測されたイオンは、［Ｍ−Ｈ］８６８．７、［Ｍ＋ＮＨ４］＋８８７．８、［Ｍ＋Ｎａ］＋８９２．８。ナトリウム付加化合物のフラグメンテーションは、規定の解離経路（図２）（Ｊ．Ａ．Ｒｅａｔｈｅｒ、理学博士、学位論文、ケンブリッジ大学、２０００年）に従い、２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンとして予期されたイオンを与えた。この質量分析解離データは、シクロヘキシル成分を含むＣ２８−Ｃ４２フラグメントにメトキシ欠損が生じているラパマイシン相同物の領域を限定していると共に、Ｃ１５−Ｃ２７フラグメントにＯ−メチル欠損が生じているラパマイシン相同物の領域を限定している。
これらの質量分析解離データは２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンの構造に完全に合致している。
【０１４５】
１．３  １６−Ｏ−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンの発酵と単離
後述のようにＳ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＮＯＬｈｉｓ］の培養菌を成長させ、シクロヘキサンカルボン酸（ＣＨＣＡ）で培養することにより１６−Ｏ−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンを産生した。
【０１４６】
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＮＯＬｈｉｓ］は、ＷＯ２００４／００７７０９に記述されるＭＧ２−１０株に、遺伝子ｒａｐＩ、ｒａｐＪ、ｒａｐＮ、ｒａｐＯおよびｒａｐＬを含有するプラスミド導入することにより産生した。遺伝子カセットは５’インフレームヒスチジンタグ含有ｒａｐＬ遺伝子で構成された。ＷＯ０４／００７７０９に記述されているように、プラスミドはさらに、エクスコンジュガント（exconjugant）のコンジュゲーションおよび選択によるＭＧ２−１０の形質転換のための輸送源（origin of transfer）およびアプラマイシン抵抗性マーカー、および染色体（chromosome）への部位特異的遺伝子導入のためのｐｈｉＢＴ１アタッチメントを含むものであった。これらの各遺伝子の単離およびｐｏｓｔ−ＰＫＳ遺伝子の組合せを含有する遺伝子カセットの構築のために用いた方法は、ＷＯ０４／００７７０９に記述されるところによって行った。
【０１４７】
液体培養
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＮＯＬｈｉｓ］の栄養体培養菌を「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」に記述されるようにして培養した。産生培養を栄養体培養菌により０．５ｍＬで５０ｍＬチューブ内の７ｍＬ培地３に接種した。７日間に亘り２６℃、３００ｒｐｍで培養した。１：１アセトニトリルで３０分間シェイクして１ｍＬのサンプルを抽出し、１３，０００回転で１０分間延伸処理し、分析法Ｂに基づいて分析および定量化を行った（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）。産生物の確認は分析法Ｃ（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）を用いて質量分析により決定した。
下記特性に記述した分析データを基に、観察されたラパマイシン相同物が所望の１６−Ｏ−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンであると認められた。
【０１４８】
発酵
Ｓ．ヒグロスコピカス  ＭＧ２−１０［ＩＪＮＯＬｈｉｓ］の培地２内の一次的栄養体培養菌を実質的に「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」に記載されるところにより３日間培養した。培地２内の二次的栄養体培養菌を１０％ｖ／ｖ、２８℃、２５０ｒｐｍで４８時間接種し、三次的栄養体培養菌を１０％ｖ／ｖ、２８℃、２５０ｒｐｍで２４時間接種した。栄養体培養菌を５％ｖ／ｖで３×７Ｌ発酵槽中の培地５（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）に接種した。６日間、２６℃で培養し、インペラー先端速度を最小速度０．９４ｍｓ−１から最大速度１．８８ｍｓ−１の範囲で変化させることにより０．７５ｖｖｍ．＞３０％溶解酸素を維持した。シクロヘキサンカルボン酸の供給を接種の２４時間後に行って、最終濃度１ｍＭを得た。Ｌリシンをｔ＝０で供給した。
【０１４９】
抽出と精製
発酵汁（１２Ｌ）を等量メタノールで２時間撹拌した後、遠心処理（１０分間、３５００ｒｐｍ）して細胞をペレット状にした。上清をＤｉａｉｏｎ（登録商標）ＨＰ２０樹脂（４３ｇ／Ｌ）で１．５時間撹拌した後にろ過した。アセトン（合計量７．５Ｌ）で樹脂をバッチ洗浄してラパマイシン相同物を剥ぎ取り、溶剤を減圧下で除去した。得られた水性抽出物を水で２Ｌに希釈し、ＥｔＯＡｃ（３×２Ｌ）で溶離した。溶剤を減圧下で除去して褐色油を得た（８．７５ｇ）。
この抽出物をアセトンに溶解し、シリカに乾燥させ、シリカカラム（４×６．５ｃｍ径）に適用し、徐々に比率を変えたアセトン／ヘキサン（２０％−４０％）で抽出した。ラパマイシン相同物含有フラクションをプールし、溶剤を減圧下で除去した。残余物（０．４８８ｇ）をＳｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ２０でクロマトグラフィ処理し（３回バッチ）、１０：１０：１クロロホルム／ヘプタン／エタノールで抽出した。ラパマイシン相同物含有フラクションをプールし、溶剤を減圧下で除去した。半精製されたラパマイシン相同物（１６２ｍｇ）をＧｉｌｓｏｎ  ＨＰＬＣを用いて逆位相（Ｃ１８）プレパラティブＨＰＬＣにより精製し、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ２１．２×２５０ｍｍ  Ｌｕｎａ５μｍＣ１８ＢＤＳカラムを２１ｍＬ／分の６５％アセトニトリル／水で溶離した。最も純粋なフラクション（ＨＰＬＣ分析、方法Ｂにより同定）を結合し、溶媒を減圧下で除去して、１６−Ｏ−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシン（４４．７ｍｇ）を得た。
【０１５０】
特性
培養抽出物のＬＣＭＳおよびＬＣＭＳｎ分析は、他のすべての３９−デスメトキシラパマイシン相同物よりはるかに早く溶離する新規なラパマイシン相同物の存在を示した。ラパマイシン相同物の様々なイオンについてのｍ／ｚ比はラパマイシンのそれよりも５８質量ユニット小さく、２つのＯ−メチル欠損と一致するものであった。観測されたイオンは、［Ｍ−Ｈ］−８５４．７、［Ｍ＋ＮＨ４］＋８７７．８、［Ｍ＋Ｎａ］＋８９２．７、［Ｍ＋Ｋ］＋９０８．８。ナトリウム付加化合物のフラグメンテーションは、規定の解離経路（図２）（Ｊ．Ａ．Ｒｅａｔｈｅｒ、理学博士、学位論文、ケンブリッジ大学、２０００年）に従い、１６−Ｏ−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンとして予期されたイオンを与えた。この質量分析解離データは、シクロヘキシル成分を含むＣ２８−Ｃ４２フラグメントにメトキシ欠損が生じているラパマイシン相同物の領域を限定していると共に、Ｃ１５−Ｃ２７フラグメントにＯ−メチル欠損が生じているラパマイシン相同物の領域を限定している。これらＮＭＲおよび質量分析解離データは１６−Ｏ−デスメチル−２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンの構造に完全に合致している。
【０１５１】
実施例２：抗ガン活性についての生体外バイオアッセイ
３９−デスメトキシラパマイシンの抗ガン活性の生体外評価
単分子層増殖アッセイ内の１２個のヒト腫瘍細胞ラインのパネルにおける３９−デスメトキシラパマイシンの抗ガン活性を、変性ヨウ化プロピジウムアッセイを用いて、上記一般法のプロトコル１で述べたようにして評価した。
結果は下の表４に示す通りであり、各結果は２回の実験の平均値を示す。表５は化合物およびラパマイシンの試験細胞ラインに対するＩＣ５０およびＩＣ７０を示す。
【表４】
2008534442.tif 000007
【表５】
2008534442.tif 000008
【０１５２】
３９−デスメトキシラパマイシンの多剤抵抗性（ＭＤＲ）選択的抗ガン活性の生体外評価
単分子層増殖アッセイ内のヒト腫瘍細胞ラインのＮＣＩ６０細胞ラインパネルにおける３９−デスメトキシラパマイシンの選択的ＭＤＲ抗ガン活性を、ＳＲＢ系アッセイを用いて、上記一般法のプロトコル２「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」で述べたようにして評価した。結果は下の表６に示す通りである。
【表６】
2008534442.tif 000009
１つの細胞ラインを除き、３９−デスメトキシラパマイシンはラパマイシンと比べて高ＭＤＲ発現細胞ラインに対して同等またはより高い効能を有することが分かる。
【０１５３】
実施例３：生体外ＡＤＭＥアッセイ
Ｃａｃｏ−２浸透アッセイ
２４ウェルＣｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｔｒａｎｓｗｅｌｌフォーマット中の合流型Ｃａｃｏ−２細胞（Ｌｉ、Ａ．Ｐ．、１９９２年；Ｇ．Ｍ．ら、１９９２年；Ｖｏｌｐｅ、Ｄ．Ａ．ら、２００１年）がＩｎ  Ｖｉｖｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．（ＩＶＴ  Ｉｎｃ．、バルチモア、メリーランド、米国）から提供された。尖室（apical chamber）は０．１５ｍＬのハンクス平衡緩衝液（Hanks’balanced buffer solution、ＨＢＳＳ）ｐＨ７．４、１％ＤＭＳＯ、０．１ｍＭルシファー・イエローを含んでいた。底室（basal chamber）は０．６ｍＬのＨＢＳＳ  ｐＨ７．４、１％ＤＭＳＯを含んでいた。対照および試験体を湿潤インキュベータ内で３７℃でインキュベートし、１時間１３０ｒｐｍでシェイクした。ルシファー・イエローは細胞間隙（密着結合間）経路を介してのみ透過し、ルシファー・イエローについての高い見かけ透過係数（Ｐａｐｐ）はアッセイ中の細胞損傷を示し、全てのそのようなウェルは拒絶された。プロプラノロール（トランスポーター効果は知られていないが良好な受動的透過性を持つ）およびアセブタロール（Ｐ糖タンパク質による活性的エフラックスにより減衰されて受動的透過性が低い）を対照化合物として用いた。化合物を尖室または基底室に適用する（０．０１ｍＭで）ことにより一方向および二方向フォーマットで試験した。尖室または基底室中の化合物をＨＰＬＣ−ＭＳ（方法Ａ、「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）で分析した。結果を見かけ透過係数Ｐａｐｐ（ｎｍ／ｓ）およびフラックス率（「Ａ対Ｂ」対「Ｂ対Ａ」）として示した。
【０１５４】
Ｐａｐｐ（ｎｍ／ｓ）＝［ボリュームアクセプター／（面積×ドナー）］×（△アクセプター／△時間）
ボリュームアクセプター：０．６ｍＬ（Ａ＞Ｂ）および０．１５ｍＬ（Ｂ＞Ａ）
単分子層の面積：０．３３ｃｍ２
△時間：６０分
フラックス率についての正の値は細胞の尖端面からの活性的エフラックスを示す。
【０１５５】
ヒト肝ミクロソーム（ＨＬＭ）安定性アッセイ
肝ホモジェネートが、ＣＹＰ４５０ｓ（たとえばＣＹＰ２Ｃ８、ＣＹＰ２Ｄ６、ＣＹＰ１Ａ、ＣＹＰ３Ａ４、ＣＹＰ２Ｅ１）エステラーゼ、アミダーゼおよびモノオキシゼナーゼを含む対フェースＩ（酸化的）酵素群固有脆弱性化合物の測定を与える。
【０１５６】
試験化合物をヒト肝ホモジェネートに露出し、ＬＣ−ＭＳでその消失を観測することにより半減期（Ｔ１／２）を決定した。０．００１ｍＭで化合物を４０分間、３７℃で、０．１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４でインキュベートした。０．２５ｍｇ／ｍＬタンパク質、ＮＡＤＰＨの飽和レベルのヒト肝ミクロソーム細胞下分画を補因子として用いた。時間インターバルで試験サンプルにアセトニトリルを添加してタンパク質を沈殿させ、代謝を終了させた。サンプルを遠心処理し、分析法Ａ（「Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ＆  Ｍｅｔｈｏｄｓ」参照）を用いて親化合物を分析した。
【表７】
2008534442.tif 000010
【０１５７】
実施例４：生体外結合アッセイ
ＦＫＢＰ１２
ＦＫＢＰ１２は化学的変性剤である塩酸グアニジン（ＧｄｎＨＣｌ）中で可逆的にアンフォールドし、このアンフォールドをタンパク質の内在蛍光における変化によって観測した（Ｍａｉｎら、１９９８年）。ＦＫＢＰ１２の天然状態を特異的に結合し安定させるリガンドは、タンパク質がより高い化学的変性剤濃度でアンフォールドするように変性曲線をシフトする（Ｍａｉｎら、１９９９年）。安定性の相違から、下記式を用いてリガンド結合定数を求めることができる。
【０１５８】
【数１】
2008534442.tif 000011
ここで△Ｇａｐｐは遊離およびリガンド結合形態の間のアンフォールドの自由エネルギーにおける見掛け上の相違、△ＧＨ２ＯＤ−Ｎは遊離タンパク質水中アンフォールド自由エネルギー、［Ｌ］はリガンド濃度、Ｋｄはタンパク質−リガンド複合体の解離定数である（Ｍｅｉｅｒｉｎｇら、１９９２年）。アンフォールドの自由エネルギーは下記式を用いてアンフォールド変位中間点に関連付けることができる。
【０１５９】
【数２】
2008534442.tif 000012
ここでｍＤ−Ｎは与えられたタンパク質と与えられた変性剤についての定数であって残余物のアンフォールドへの露出度変化に比例する（Ｔａｎｆｏｒｄ１９６８年およびＴａｎｆｏｒｄ１９７０年）。［Ｄ］５０％はアンフォールド中間点に対応する変性剤濃度である。我々は△ＧＬＤ−ＮをＦＫＢＰ１２の安定性におけるラパマイシンと未知リガンド（同一リガンド濃度）の相違として下記のように定義する。
【０１６０】
【数３】
2008534442.tif 000013
ここで＜ｍＤ−Ｎ＞はアンフォールド変位の平均ｍ値であり、△［Ｄ］５０％はラパマイシン−ＦＫＢＰ１２アンフォールド変位と未知リガンド−ＦＫＢＰ１２複合体アンフォールド変位の中間点の相違である。［Ｌ］＞Ｋｄの条件では△△ＧＤ−Ｎを下記式から２つの化合物の相対的Ｋｄｓに関連付けることができる。
【０１６１】
【数４】
2008534442.tif 000014
ここでＫｒａｐｄはラパマイシンの解離定数、Ｋｘｄは未知リガンドＸの解離定数である。したがって下記式が得られる。
【０１６２】
【数５】
2008534442.tif 000015
３９−デスメトキシラパマイシンのＫｄの決定のために、変性曲線を固定してｍＤ−Ｎおよび［Ｄ］５０％のための値を生成し、これらの値を用いてｍ平均値＜ｍＤ−Ｎ＞および△［Ｄ］５０％、したがってＫｘｄを算出した。
【０１６３】
【表８】
2008534442.tif 000016
【０１６４】
ｍＴＯＲ
ｍＴＯＲの抑制は、ｍＴＯＲ経路およびｐ７０Ｓ６キナーゼおよびＳ６の代用マーカーのリン酸化レベルの測定によって間接的に確立することができる（Ｂｒｕｎｎら、１９９７年；Ｍｏｔｈｅ−Ｓａｔｎｅｙら、２０００年；ＴｅｅおよびＰｒｏｕｄ、２００２年；ＨｕａｎｇおよびＨｏｕｇｈｔｏｎ、２００２年）。
【０１６５】
ＨＥＫ２９３細胞をＦＬＡＧがタグされたｍＴＯＲおよびｍｙｃがタグされた受容体と共感染させ、２４時間培養後、一晩血清飢餓させた。細胞を１００ｎＭインシュリンで刺激した後、収穫し、３回の凍結／融解サイクルで溶解した。溶解物をプールし、当量をｍＴＯＲ／受容体複合物のためのＦＬＡＧ抗体と免疫沈降させた。免疫沈降体を次のように処理した：化合物（０．００００１〜０．００３ｍＭ）で処理したサンプルを３０分間３０℃でＦＫＢＰ１２／ラパマイシン、ＦＫＢＰ１２／３９−デスメトキシラパマイシンまたはベヒクル（ＤＭＳＯ）でプレインキュベートし、非処理サンプルをキナーゼ緩衝液中でインキュベートした。免疫沈降体を次いで３ｍＭのＡＴＰ、１０ｍＭのＭｎ２＋およびＧＳＴ−４Ｅ−ＢＰ１の基質存在下でキナーゼアッセイに生体外適用した。４倍サンプルバッファで反応を停止させ、１５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ処理し、ＰＶＤＦ膜に移して、Ｐｈｏｓｐｈｏ−４Ｅ−ＢＰ１（Ｔ３７／４６）のためにプルーブした。
【０１６６】
代替的に、ＨＥＫ２９３細胞を６つのウェルプレートに接種して２４時間プレインキュベートし、一晩中血清飢餓させた。次いで細胞をベヒクルまたは化合物で３０分間３０℃で予備処理し、１００ｎＭインシュリンで３０分間３０℃で刺激し、３回の凍結／融解サイクルで溶解し、タンパク質濃度を分析した。等量タンパク質を供給してＳＤＳ−ＰＡＧＥジェル上で分離した。タンパク質を次いでＰＶＤＦ膜に移し、Ｐｈｏｓｐｈｏ−Ｓ６（Ｓ２３５／３６）またはＰｈｏｓｐｈｏ−ｐ７０  Ｓ６Ｋ（Ｔ３８９）のためにプルーブした。
【０１６７】
これらの実験の結果が図３に要約して示されている。
【０１６８】
実施例５：生体外Ｐ−ｇｐ基質アレイ
細胞ライン
この研究に用いた細胞ライン（ＭＡＣＬ  ＭＣＦ７およびＭＡＣＬ  ＭＣＦ７  ＡＤＲ）はいずれも米国Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅにより提供されたものである。
【０１６９】
細胞を一週間に一回または二回ルーチン的にｐａｓｓａｇｅした。これらを２０ｐａｓｓａｇｅを越えないだけ培養中に維持した。全ての細胞を、５％ウシ胎児血清（ＰＡＡ、ドイツ国コルベ）と０．１％ゲンタミシン（ＰＡＡ、ドイツ国コルベ）を補足したＲＭＩ１６４０培地（ＰＡＡ、ドイツ国コルベ）内で３７℃、湿潤雰囲気（９５％空気、５％ＣＯ２）で増殖した。
【０１７０】
アッセイプロトコル
上記プロトコル１に基づく変性ヨウ化プロビジウムを用いて３９−デスメトキシラパマイシンの効能を評定した（Ｄｅｎｇｌｅｒら、１９９５年）。概して言えば、指数的成長相培養からトリプシン化（trypsination）により収穫し、カウントし、９６個の底が平坦なウェルプレートに１ウェル当たり５，０００個の細胞密度で培養した。２４時間後の回収で細胞の指数的成長を再開させ、０．１８ｍｇ／ｍＬ濃度で０．０１ｍＬベラパミルまたは０．０１ｍＬ培地を細胞に添加して０．０１ｍｇ／ｍＬのウェルにおける最終ベラパミル濃度に調整した。この濃度は既述実施例において細胞に対して非毒性であるものとして見出された。３９−デスメトキシラパマイシン、タキソールまたは培地のみ（対照ウェルとして）を含む培地をウェル当たり０．０１ｍＬで添加した。３つの同じ化合物を８つの濃度で、０．０３ｍＭから１０ｎＭまで低下する範囲のハーフログステップ（half log step）に適用した。３日間の連続的薬剤露出の後、培地または化合物含有培地を０．２ｍＬの水性ヨウ化プロビジウム（ＰＩ）溶液（７ｍｇ／Ｌ）で置換した。ＰＩのみがリーク的（leaky）ないしライスした（lysed）膜を通過するので、死滅細胞のＤＮＡは染色されて測定されるが、生存細胞は染色されない。生存細胞割合を測定するため、プレートを凍結して全細胞を死滅させることによって細胞を浸透化処理した。プレートを融解した後、Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒ４０００マイクロプレートリーダー（励起５３０ｎｍ、放出６２０ｎｍ）を用いて蛍光発光を測定し、全セル数に対する直接的関係を得た。成長抑制を（試験／対照）×１００％（％Ｔ／Ｃ）として表現した。ポジティブ対照（タキソール）がベラパミルの存在または不存在下において腫瘍成長抑制変化を誘発したときに、およびベヒクル処理した対照細胞が５００を越える蛍光強度を有するときに、アッセイを評価可能であると考慮した。
【０１７１】
３９−デスメトキシラパマイシン試験溶液の調製
３９−デスメトキシラパマイシン３．３ｍＭのストック溶液をＤＭＳＯに調製し、−２０℃で保存した。ストック溶液を使用日に融解して投与の間室温保存した。ＲＰＭＩ１６４０培地を用いて希釈ステップを行い、最終濃度の18倍の溶液を得た。
【０１７２】
結果
図４は正常（ＡおよびＢ）および高Ｐ−ｇｐ発現（ＣおよびＤ）細胞ラインにおけるパクリタキセル（ＡおよびＣ）および３９−デスメトキシラパマイシン（ＢおよびＤ）についての全試験濃度における％Ｔ／Ｃ値を示す４つのグラフである。中黒菱形はパクリタキセルまたは３９−デスメトキシラパマイシン単独の投与後の値を示し、白抜き正方形は０．０１ｍｇ／ｍＬベラパミル（Ｐ−ｇｐ抑制剤）の存在下でのパクリタキセルまたは３９−デスメトキシラパマイシン投与後の値を示す。
【０１７３】
公知のＰ−ｇｐ基質であるパクリタキセルは、Ｐ−ｇｐ発現ガン細胞ラインＭＣＫ７  ＡＤＲの抑制効果が軽減していることを示し、この軽減した効果がＰ−ｇｐ抑制剤であるベラパミルの投与によって回復した（図４Ａおよび図４Ｃ）。
【０１７４】
３９−デスメトキシラパマイシンは、ベラパミルがあってもなくても、Ｐ−ｇｐ発現ガン細胞ラインＭＣＫ７  ＡＤＲの成長増殖曲線において顕著なシフトを示さなかった（図４Ｂおよび図４Ｄ）、このことは３９−デスメトキシラパマイシンがＰ−ｇｐの基質でないことを実証している。
【０１７５】
実施例６：薬物動態学的分析
６．１  ラパマイシンおよび３９−デスメトキシラパマイシンのＰＫ分析
前記した標準的方法を用いた薬物動態学的分析をラパマイシンおよび３９−デスメトキシラパマイシンについて行った。各化合物について用いたプロトコルは表９に示されている。
【０１７６】
各化合物の血液または脳組織のＡＵＣをＫｉｎｅｔｉｃａ４．４（ＩｎｎａＰｈａｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、非コンパートメントモデルおよびＡＵＣ算出のための台形モデルを用いて算出した。
【０１７７】
各化合物のｐｏおよびｉｖ投与後の分配係数（Ｒｉ）を式：Ｒｉ＝ＡＵＣＢＲＡＩＮ／ＡＵＣＢＬＯＯＤから求めた。
【０１７８】
この分析の結果を下記表９および図５に要約して示す。
【表９】
2008534442.tif 000017
【０１７９】
６．２  ラパマイシン、２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンおよび３９−デスメトキシラパマイシンのＰＫ分析
前記した標準的方法を用いた薬物動態学的分析をラパマイシン、２７−Ｏ−デスメチル−３９−デスメトキシラパマイシンおよび３９−デスメトキシラパマイシンについて行った。前記プロトコル１を用いた。
【０１８０】
各化合物の血液または脳組織のＡＵＣをＫｉｎｅｔｉｃａ４．４（ＩｎｎａＰｈａｓｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用い、非コンパートメントモデルおよびＡＵＣ算出のための台形モデルを用いて算出した。
【０１８１】
各化合物のｉｖ投与後の分配係数（Ｒｉ）を式：Ｒｉ＝ＡＵＣＢＲＡＩＮ／ＡＵＣＢＬＯＯＤから求めた。
【表１０】
2008534442.tif 000018
【０１８２】
実施例７：多発性硬化症の実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）モデルにおける活性
実験的アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は中枢神経システム（ＣＮＳ）の自己免疫性炎症および脱髄性疾患であり、多発性硬化症（ＭＳ）のための最適な動物相当物であると考えられている。全脊髄または完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）内のミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の注入によって概して感染しやすい動物に病気を誘発させることができる。ＣＮＣダメージに含まれる抗原特異的エフェクター細胞はクラスＩＩ主要組織適合性複合体（major histocompatibility complex、ＭＨＯ）制限ＣＤ４＋Ｔリンパ球である。炎症反応におけるインターリューキン−１（ＩＬ−１）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）またはインターフェロン（ＩＦＮ）などのサイトカインの役割が最近多くの注目を集めるようになってきている。抗原による活性に基づいて、Ｔ細胞が、ＥＡＥにおいて直接または間接にＣＮＳダメージに反応的である幾つかのリンフォカインを産生する。ＥＡＥの病原に含まれるであろう該リンフォカインはＩＬ−２、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−βである。ＩＬ−２はＴ細胞活性および増殖に重要な役割を果たし、一方ＩＦＮ−γはマクロファージ活性の有力なメディエータである。さらにＩＦＮ−γはＩＬ−１と同様に炎症性サイトカインの産生を誘発する。ＴＮＦおよび他の中でクラスＩＩＭＨＣ分子が、ＣＮＳ血管の内皮細胞、および脳炎誘発性Ｔ細胞に対する抗原提示に重要な役割を果たすと考えられているアストロサイト上に発現した。
【０１８３】
７．１  動物および免疫化方法
８〜１０週齢のメスのルイスラットを餌および水を自由に与えて標準実験状態（非特異的病原体フリー）に維持した。尾の根元に５０ｍＬフロイント不完全アジュバント（Ｄｉｆｃｏ、ミシガン州デトロイト）に２５ｍｇモルモット脊髄と１ｍｇマイコバクテリウム・ツベルクロシス（ヒト型結核菌）株Ｈ３７ＲＡ（Ｄｉｆｃｏ）を含有する５０ｍＬサリンを加えたものを一回注射してＥＡＥを誘発させた。
【０１８４】
７．２  臨床的および組織学的評定
免疫化処理後３０日間にわたり毎日体重とＥＡＥの臨床的兆候を測定することにより検査した。これらの臨床的評定は、治療を知らない観測者により、０＝病状なし、１＝尾に弛緩症状、２＝わずかな麻痺症状、３＝重い麻痺症状、４＝瀕死、５＝死亡と等級付けた。０〜５日間連続してラットに０〜５の等級付けを行い、臨床的症候が完全になくなって免疫化処理前の運動性に戻ったときに疾病終了と定義した。
【０１８５】
７．３  実験的治療
予防的および治療的レジメの下で試験化合物を異なる投薬量で与えた（５または１５ｍｇ／Ｋｇ  ｂｄ  ｗｔ）。研究の予防的パートについては免疫化の１日前に治療を開始し、研究の治療的パートについては免疫化処理後７日目に治療を開始した（ｐｉ）。予防的および治療的のいずれにおいても、ベヒクル処理したラットを同一実験条件で治療し、対照についても同様とした。治療は３０日ｐｉまで一週間に６日ｐｏ投与することにより行った。シクロフォスファミドをポジティブ対照として用いた。
【０１８６】
この実験の結果は図６および下の表１１に示されている。図６Ａは５および１５ｍｇ／ｋｇにおける３９−デスメトキシラパマイシンの予防的レジメの結果を示し、図６Ｂは５および１５ｍｇ／ｋｇにおける３９−デスメトキシラパマイシンの治療的レジメの効果を示す。各レジメについて４０ｍｇ／ｋｇシクロフォスファミドの効果がポジティブ対照として示されている。両方のグラフにおいて各群の中間スコアが示されている。３９−デスメトキシラパマイシンは個のもｄるにおいてシクロフォスファミドと同等の効能を有し、症状の深刻さを低減させるだけでなく症状発現期間をも低減させることが見て取れる。注目すべきは、研究中に７匹のベヒクル処理ラットのうちの５匹が死亡したため、この群の中間値は５に止まっているが、生存した残りの２匹のラットはいずれも最終的に２８日でベースラインの値に戻ったことである。
【表１１】
2008534442.tif 000019
【０１８７】
実施例８：ヌードマウスに同所的に異種移植されたグリオーマのモデルにおける３９−デスメトキシラパマイシンの抗腫瘍活性の研究
８．１  研究のための準備
８．１．１  サンプルの調製
試験化合物をエタノール（０．０２７ｍＬ／ｍｇ化合物）に溶解し、溶液が透明になるまで２０分間渦巻（vortex）処理した。エタノール溶液を適当に等分して−２０℃で保存した。このエタノール溶液をベヒクル（０．１５ＭのＮａＣｌ中に４％エタノール、５％Ｔｗｅｅｎ−２０、５％ポリエチレングリコール４００、可能な場合は無菌エンドトキシンフリー化合物で調製）で適正濃度に調整した。
８．１．２  投与手段
この試験物質および対照ベヒクルを試験マウスの尾部静脈に注射することにより静脈投与（ＩＶ、ｂｏｌｕｓ）した。マウスの直近体重に基づいて注入量を１０ｍＬ／ｋｇとした。
８．１．３  ガン細胞ライン
この研究では、４４歳のカフカス人女性の第ＩＩ級グリオブラストーマからＪ．Ｐｏｎｔｅｎが新規に見出したグリオブラストーマ細胞ラインであるＵ８７−ＭＧを用いた（Ｐｏｔｅｎら、１９６８年）。
８．１．４  細胞ラインの確立のための細胞培養条件
腫瘍細胞を単分子層として３７℃、湿潤雰囲気（５％ＣＯ２、９８％空気）で増殖した。培地は、１０％ウシ胎児血清（ＤＥ１４−８０１Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ参照）を補充した２ｍＭのＬグルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４１（ＢＥ１２−７０２Ｆ、Ｃａｍｂｒｅｘ参照）とした。細胞はプラスチックフラスコに付着した。実験に用いるため、カルシウムまたはマグネシウム無しのハンクス培地（ＢＥ１０−５４３、Ｃａｍｂｒｅｘ参照）においてトリプシン／ベルセン（ＢＥ１７−１６１Ｅ、Ｃａｍｂｒｅｘ参照）で５分間処理することにより、腫瘍細胞を培養フラスコから除去した。ヘモサイトメーターで細胞をカウントし、０．２５％トリパンブルー排除法によりそれらのバイアビリティ（生存能力）を評定した。
【０１８８】
８．２  ヌードマウス脳への定位注入によるグリオーマ誘発
マウスをガンマ源から全身放射線被曝（２．５Ｇｙ、Ｃｏ６０、ＩＮＲＡ  ＢＲＥＴＥＮＩＥＲＥ、Ｄｉｊｏｎ）させた後２４〜４８時間後、Ｕ８７−ＭＧ細胞をＤ０で定位的に注入した。腫瘍細胞の定位注入のため、０．９％ＮａＣｌ溶液中のケタミン１００ｍｇ／ｋｇ（Ｋｅｔａｍｉｎｅ５００（登録商標）、０４３ＫＥＴ２０４、Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ、フランス国、参照）およびキシラジン５ｍｇ８ｋｇ（Ｒｏｍｐｕｎ（登録商標）、００２ＲＯＭ００１、Ｃｅｎｔｒａｖｅｔ、フランス国、参照）を１回注射当たり１０ｍＬ／ｋｇを定位注射してマウスに麻酔をかけた。３つの別個独立した定位装置（Ｋｏｐｆ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ、ドイツ国およびＳｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）を用いて細胞を定位注入した。０．００２ｍＬのＲＰＭＩ−１６４０培地に再懸濁させた１×１０５のＵ８７−ＭＧ腫瘍細胞を右前頭葉に、０．００２ｍＬの細胞懸濁液として５００ｎＬ／分で注入した。
【０１８９】
８．３  治療スケジュール
Ｄ７においてマウスを計量し、それらの各々の体重に応じて３つのマウス群に無作為化した。ＭＲＩ画像処理のため、各治療群に４匹のマウスを追加した。各群の平均体重が他群と統計的に異なることのないように（変動分析）各群を選択した。試験物質の投与を次のようにして行った。
８．３．１  第１群のマウスには３日間連続して（Ｄ７〜Ｄ９、Ｄ１４〜Ｄ１６、Ｄ２１〜Ｄ２３、Ｄ２８〜Ｄ３０およびＤ３５〜Ｄ３７：（Ｑ１Ｄ×３）×５Ｗ）試験物質ベヒクルを毎日４回投与を５サイクル行った（Ｄ７〜Ｄ９、Ｄ１４〜Ｄ１６、Ｄ２１〜Ｄ２３、Ｄ２８〜Ｄ３０およびＤ３５〜Ｄ３７：（Ｑ１Ｄ×３）×５Ｗ）。各サイクルは４日間の治療中止を隔てて行った。
８．３．２  第２群のマウスには３日間連続して３９−デスメトキシラパマイシンを一回注入当たりにして３ｍｇ／ｋｇ、毎日４回投与を５サイクル行った（Ｄ７〜Ｄ９、Ｄ１４〜Ｄ１６、Ｄ２１〜Ｄ２３、Ｄ２８〜Ｄ３０およびＤ３５〜Ｄ３７：（Ｑ１Ｄ×３）×５Ｗ）。各サイクルは４日間の治療中止を隔てて行った。
８．３．３  第３群のマウスには治療を施さなかった。
治療スケジュールを下の表１２に要約して示す。
【表１２】
2008534442.tif 000020
【０１９０】
８．４  ＭＲＩ分析
脳のＭＲＩ分析をＤ２３およびＤ３７で行った。すべてのＭＲＩ分析はＰｈａｒｍａｓｃａｎ  ｍａｇｎｅｔ（Ｂｒｕｋｅｒ、Ｗｉｓｓｅｍｂｏｕｒｇ）にて４．７Ｔで行った。マウスをイソフルランによる連続麻酔の下で専用のマウスクレードル内の３８ｍｍ径の円筒形コイルに入れた。
トリパイロット（tripilot）アクイジション後、ｔｕｒｂｏＲａｒｅ  Ｔ２強調シーケンスを実行した。アクイジションは腫瘍を含む脳全体をカバーしていた。各片における腫瘍の回りの関心領域（ＲＯＩ）を手でドローイングし、全表面を合計することにより腫瘍容積を決定した。
【０１９１】
８．５  結果
図７は各治療群についての４３日までの生存グラフである。
追記すれば、結果はＴ／Ｃ％で示されており、ここにＴは３９−デスメトキシラパマイシンで治療した動物の平均生存時間を示し、Ｃはベヒクルで治療した動物の平均生存時間を示す。Ｔ／Ｃ％は次式：Ｔ／Ｃ％＝［Ｔ／Ｃ］×１００で計算される。
さらに、ＭＲＩ分析を用いて治療群ごとの平均算出腫瘍容積を算定し、その結果を要約して下の表１３に示す。ベヒクル治療した動物は全てが３７日までに死亡したので、この時期の腫瘍サイズを比較することはできなかった。
【表１３】
2008534442.tif 000021
【０１９２】
参考文献
Alvarez, M., Paull, K., Monks, A., Hose, C., Lee, J.S., Weinstein, J., Grever, M., Bates, S., Fojo, T., (1995). “Generation of a drug resistance profile by quantitation of mdr-1/P-glycoprotein in the cell lines of the National Cancer Institute Anticancer Drug Screen“, Journal of Clinical Investigation, 95, 2205-2214.
An, W.L., R.F. Cowburn, et al. (2003). "Up-regulation of phosphorylated/activated p70 S6 kinase and its relationship to neurofibrillary pathology in Alzheimer's disease." Am J Pathol 163(2): 591-607.
Avramut, M. and Achim, C.L. (2002). "Immunophilins and their ligands: insights into survival and growth of human neurons." Physiol Behav 77(4-5): 463-8.
Baker, H., Sidorowicz, A., Sehgal, S.N., and Vezina, C. (1978) “Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic. III. In vitro and in vivo evaluation”. Journal of Antibiotics 31, 539-545.
Boyd, M.R. and Paull, K.D., (1995). “Some Practical Considerations and Applications of the National Cancer Institute In Vitro Anticancer Drug Discovery Screen”, Drug Development Research 34, 91-109, 
Bradl M., Hohlfeld R. (2003), “Molecular pathogenesis of neuroinflammation”. J Neurol Neurosurg Psychiatry. 74:1364-70. 
Brunn, G.J., Fadden, P., Haystead, T.A., Lawrence, J.C. Jr.(1997) “The mammalian target of rapamycin phosphorylates sites having a (Ser/Thr)-Pro motif and is activated by antibodies to a region near its COOH terminus”, J Biol. Chem. 272(51), 32547-32550.
Brunn, G.J., Williams, J., Sabers, C., Wiederrecht, G., Lawrence, J.C., and Abraham, R.T. (1996) “Direct inhibition of the signaling functions of the mammalian target of rapamycin by the phosphoinositide 3-kinase inhibitors, wortmannin and LY294002”. EMBO Journal 15: 5256-5267.
Chang, S.M., P. Wen, et al. (2005). "Phase II study of CCI-779 in patients with recurrent glioblastoma multiforme." Invest New Drugs 23(4): 357-61.
Crowe, A., Bruelisauer, A., Duerr, L., Guntz, P., Lemaire, M., (1999), “Absorption and intestinal metabolism of SDZ-RAD and rapamycin in rats”. Drug Metab Dispos.;27(5), 627-32. 
Cummins, C.L., Jacobsen, W., Christians, U., Benet, L.Z., (2004) ?CYP3A4-Transfected Caco-2 Cells as a Tool for Understandinf Biochemical Absorption Barriers: Studies with Sirolimus and Midazolam“, The Journal of Pharmacology, 308(1), 143-155
Dancey, J.E., (2002), “Clinical development of mammalian target of rapamycin inhibitors” Hematol Oncol Clin N Am, 16, 1101-1114.
Dengler W.A., Schulte J., Berger D.P., Mertelsmann R. and Fiebig HH. (1995) “Development of a propidium iodide fluorescence assay for proliferation and cytotoxicity assay”. Anti-Cancer Drugs, 6, 522-532.
Dumont, F.J. and Su, Q.X. (1995). “Mechanism of action of the immunosuppressant rapamycin”. Life Sciences 58(5): 373-395.
Emborg M.E., (2004) “Evaluation of animal models of Parkinson's disease for neuroprotective strategies” J Neurosci Methods, 139(2):121-43; 
Fiebig H.H., Dengler W.A. and Roth T. (1999) “Human tumor xenografts: Predictivity, characterization, and discovery of new anticancer agents”. In: Fiebig HH, Burger AM (eds). Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development. Contrib. Oncol., 54: 29 - 50. 
Findlay J.A, and Radics, L. (1980) Canadian Journal of Chemistry 58:579.
Gallant-Haidner H.L., Trepanier D.J., Freitag D.G., Yatscoff R.W. 2000, “Pharmacokinetics and metabolism of sirolimus”. Ther Drug Monit. 22(1), 31-5. 
German D.C. and Eisch A.J., (2004), “Mouse models of Alzheimer's disease: insight into treatment”, Rev Neurosci, 15:353-69. 
Grass, G.M., Rubas, W., Jezyk, N., (1992) “Evaluation of CACO-2 monolayers as a predictor of drug permeability in colonic tissues”. FASEB Journal, 6, A1002.
Gregory M.A., Gaisser S, Lill R.E., Hong H, Sheridan R.M., Wilkinson B, Petkovic H, Weston A.J., Carletti I, Lee H.L., Staunton J, Leadlay PF. (2004) “Isolation and characterization of pre-rapamycin, the first macrocyclic intermediate in the biosynthesis of the immunosuppressant rapamycin by S. hygroscopicus”. Angew Chem Int Ed Engl. 43(19), 2551-3 
Hersch S.M. and Ferrante R.J., (2004), “Translating therapies for Huntington's disease from genetic animal models to clinical trials”, NeuroRx. 1(3):298-306
Huang, S. and Houghton, P.J., 2002. “Mechanisms of resistance to rapamycins”. Drug Resist. Update, 4(6), 378-391.
Huang, S., Bjornsti, M. A. and Houghton P.J. (2003). "Rapamycins: mechanism of action and cellular resistance." Cancer Biol Ther 2(3): 222-32.
Kahan, B.D., Chang, J.Y., and Sehgal, S.N. (1991) “Preclinical evaluation of a new potent immunosuppressive agent, rapamycin”. Transplantation 52: 185-191.
Kirchner, G.I., Winkler, M., Mueller L., Vidal, C., Jacobsen, W., Franzke, A., Wagner, S., Blick, S., Manns M.P., and Sewing K.-F.(2000) “Pharmacokinetics of SDZ RAD and cyclosporin including their metabolites in seven kidney graft patients after the first dose of SDZ RAD”. British Journal of Clinical Pharmacology 50:449-454.
Kuhn B., Jacobsen W., Christians U., Benet L.Z., Kollman P.A. (2001), “Metabolism of sirolimus and its derivative everolimus by cytochrome P450 3A4: insights from docking, molecular dynamics, and quantum chemical calculations”. J Med Chem. 44(12), 2027-34. 
Kuo, C.J., Chung, J.K., Fiorentino, D.F., Flanagan, W.M., Blenis, J., and Crabtree, G.R. (1992) “Rapamycin selectively inhibits interleukin-2 activation of p70 S6 kinase”. Nature 358: 70-73.
Lampen A., Zhang Y., Hackbarth I., Benet L.Z., Sewing K.F., Christians U. (1998) “Metabolism and transport of the macrolide immunosuppressant sirolimus in the small intestine”. J Pharmacol Exp Ther. 285(3), 1104-12. 
Langmann T., Mauerer R., Zahn A., Moehle C., Probst M., Stremmel W., Schmitz G. (2003) “Real-time reverse transcription-PCR expression profiling of the complete human ATP-binding cassette transporter superfamily in various tissues”. Clin Chem. 49(2), 230-8. 
Laplante A., Demeule M., Murphy G.F., Beliveau R. (2002) “Interaction of immunosuppressive agents rapamycin and its analogue SDZ-RAD with endothelial P-gp”. Transplant Proc. 34(8), 3393-5. 
Lee, J-S., Paull, K., Alvarez, M., Hose, C., Monks, A., Grever, M., Fojo, A.T., Bates, S.E., 1994. “Rhodamine efflux patterns predict P-glycoprotein substrates in the National Cancer Institute drug screen”. Molecular Pharmacology 46,627-638.
Lee J.K., Bussey K.J., Gwadry F.G., Reinhold W., Riddick G., Pelletier S.L., Nishizuka S., Szakacs G., Annereau J.P., Shankavaram U., Lababidi S., Smith L.H., Gottesman M.M., Weinstein J.N. (2003) “Comparing cDNA and oligonucleotide array data: concordance of gene expression across platforms for the NCI-60 cancer cells”. Genome Biol. 4(12), R82. 
Li, A.P. (1992) “Screening for human ADME/Tox drug properties in drug discovery”. Drug Discovery Today, 6, 357-366.
Lowden, P.A.S., (1997) Ph.D. Dissertation, University of Cambridge. “Studies on the biosynthesis of rapamycin”.
Main, E.R.G., Fulton, K.F. & Jackson, S.E. (1998). “The Context-Dependent Nature of Destabilising Mutations on the Stability of FKBP12”. Biochemistry 37, 6145-6153.
Main, E.R.G., Fulton, K.F. & Jackson, S.E. (1999). “Folding of FKBP12: Pathway of Folding and Characterisation of the Transition State”. J. Mol. Biol. 291, 429-444.
McAlpine, J.B,.Swanson S.J., Jackson, M., Whittern, D.N. (1991). “Revised NMR
assignments for rapamycin”. Journal of Antibiotics 44: 688-690.
Meiering, E.M., Serrano, L. & Fersht, A.R. (1992). “Effect of Active Site Residues in Barnase on Activity and Stability”. J. Mol. Biol. 225, 585-589.
Mothe-Satney, I., Brunn, G.J., McMahon, L.P., Capaldo, C.T., Abraham, R.T., Lawrence, J.C. Jr-. (2000) “Mammalian target of rapamycin-dependent phosphorylation of PHAS-I in four (S/T)P sites detected by phospho-specific antibodies”. J Biol Chem. 275(43), 33836-33843.
Paiva, N.L., Demain, A.L., and Roberts, M.F. (1991) “Incorporation of acetate, propionate, and methionine into rapamycin By Streptomyces hygroscopicus”. Journal of Natural Products 54: 167-177.
Pardridge, (2005), “The Blood-Brain Barrier: Bottleneck in Brain Drug Development”, NeuroRx, 2, 3-14
Perin, E.C., (2005), “Choosing a Drug-Eluting Stent: A Comparison Between CYPHER and TAXUS”, Reviews in Cardiovascular Medicine, 6 (suppl 1), ppS13-S21.
Persidis A. (1999), “Cancer multidrug resistance” Nat Biotechnol. 17: 94-5
Poten J. et al., (1968), “Long term culture of normal and neoplastic human glia.” Acta Pathol. Microbiol. Scand., 74: 465-86 
Raught B., Gingras, A-C. and Sonenberg, N.; (2001), “The target of rapamycin (TOR) proteins”, PNAS, 98(13): 7037-7044
Ravikumar, B., R. Duden, et al. (2002). "Aggregate-prone proteins with polyglutamine and polyalanine expansions are degraded by autophagy." Hum Mol Genet 11(9): 1107-17.
Reather, J. A., (2000), Ph.D. Dissertation, University of Cambridge. “Late steps in the biosynthesis of macrocyclic lactones”.
Roth T., Burger A.M., Dengler W., Willmann H. and Fiebig H.H. (1999) “Human tumor cell lines demonstrating the characteristics of patient tumors as useful models for anticancer drug screening”. In: Fiebig HH, Burger AM (eds). Relevance of Tumor Models for Anticancer Drug Development. Contrib. Oncol., 54: 145 - 156.
Sathasivam, K., C. Hobbs, et al. (1999). "Transgenic models of Huntington's disease." Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 354(1386): 963-9
Sedrani, R., Cottens, S., Kallen, J., and Schuler, W. (1998) “Chemical modifications of rapamycin: the discovery of SDZ RAD”. Transplantation Proceedings 30: 2192-2194. 
Sehgal, S.N., Baker, H., and Vezina, C. (1975) “Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic II. Fermentation, isolation and characterization”. The Journal of Antibiotics 28: 727-733.
Schober A. (2004), “Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP” Cell Tissue Res,318(1):215-24)
Stein U., Jurchott K., Schlafke M., Hohenberger P. (2002) “Expression of multidrug resistance genes MVP, MDR1, and MRP1 determined sequentially before, during, and after hyperthermic isolated limb perfusion of soft tissue sarcoma and melanoma patients”. J Clin Oncol. 20(15):3282-92. 
Szakacs G., Annereau J.P., Lababidi S., Shankavaram U., Arciello A., Bussey K.J., Reinhold W., Guo Y., Kruh G.D., Reimers M., Weinstein J.N., Gottesman M.M. 2004, “Predicting drug sensitivity and resistance: profiling ABC transporter genes in cancer cells”. Cancer Cell. 6(2):129-37. 
Tanford, C. (1968). “Protein Denaturation”. Adv. Prot. Chem. 23, 121-282.
Tanford, C. (1970). “Protein Denaturation. Part C. Theoretical models for the mechanism of denaturation”. Advances in Protein Chemistry 24, 1-95
Tee, A.R. and Proud, C.G. (2002) “Caspase cleavage of initiation factor 4E-binding protein 1 yields a dominant inhibitor of Cap-dependent translation and reveals a novel regulatory motif”. Mol. Cell. Biol. 22, 1674-1683
Trepanier D.J., Gallant H., Legatt D.F., Yatscoff R.W. (1998), “Rapamycin: distribution, pharmacokinetics and therapeutic range investigations: an update”. Clin Biochem. 31(5):345-51.
Vezina, C., Kudelski, A., and Sehgal, S.N. (1975) “Rapamycin (AY-22,989), a new antifungal antibiotic. I. Taxonomy of the producing streptomycete and isolation of the active principle”. The Journal of Antibiotics 28: 721-726.
Volpe, D.A., Faustino, P.J., Yu, L.X., (2001) “Towards standardisation of an in vitro method of drug absorption”. Pharmacopeial Forum, 27, 2916-2922.
Yu, K., Toral-Barza, L., Discafani, C., Zhang, W.G., Skotnicki, J., Frost, P., Gibbons, J.J. (2001) “mTOR, a novel target in breast cancer: the effect of CCI-779, an mTOR inhibitor, in preclinical models of breast cancer”. Endocrine-Related Cancer 8:249-258.
【図面の簡単な説明】
【０１９３】
【図１】ラパマイシンの構造を示す。
【図２】３９−デスメトキシラパマイシンの分裂経路を示す。
【図３】３９−デスメトキシラパマイシンとラパマイシンのｍＴＯＲ抑制活性を要約したウエスタンブロットを示す。
【図４】正常（ＡおよびＢ）および高Ｐ−ｇｐ発現（ＣおよびＤ）細胞ラインにおけるパクリタキセル（ＡおよびＣ）と３９−デスメトキシラパマイシン（ＢおよびＤ）についてのすべての試験濃度における％Ｔ／Ｃ値。
【図５】Ａはラパマイシンおよび３９−デスメトキシラパマイシンをｉｖおよびｐｏで一回投与した後の脳組織または血液サンプルについてのすべての０〜２４時間の曲線下面積（ＡＵＣ）を示す。Ｂは一回のｉｖ投与後の脳組織内における３９−デスメトキシラパマイシンとラパマイシンの検出レベルを経時的に示す。
【図６】Ａは予防的レジメの下でのＥＡＥモデルにおける疾患進行を示す。与えられた値はベヒクルまたは治療グループからの中間値である。Ｂは治療レジメの下でのＥＡＥモデルにおける疾患進行を示す。与えられた値はベヒクルまたは治療グループからの中間値である。
【図７】このグラフはＵ８７−ＭＧ細胞の定位注入によりグリオーマを投与したマウスの相対的生存率を示す。黒塗りの菱形は未治療グループを示し、黒塗りの四角はベヒクル処理されたグループを示し、白抜きの丸は３９−デスメトキシラパマイシンで処理されたグループを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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