(57)【要約】本発明は、ヒトインターフェロンベータ変異体を開示する。詳細には、本発明は天然型ヒトインターフェロンベータに比べて１本または２本の糖鎖が追加された形態のヒトインターフェロンベータ変異体を開示する。
2008518631.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択されるヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドにおいて、Ｃ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含み、その位置にＮ−結合型糖鎖を含む、ヒトインターフェロンベータ変異体：
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド；
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド。
【請求項２】
ヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドが、配列番号１のアミノ酸配列からなる天然型ヒトインターフェロンベータであることを特徴とする、請求項１記載のヒトインターフェロンベータ変異体。
【請求項３】
ヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドが、（ｃ）のポリペプチドであり、該ポリペプチドは配列番号１の２７番アミノ酸であるアルギニンがスレオニンまたはセリンに置換されて、アスパラギン−グリシン−スレオニン／セリン−ロイシンからなる配列番号１の２５〜２８番のアミノ酸配列を含むことにより、その位置にＮ−結合型糖鎖を追加で含むことを特徴とする、請求項１記載のヒトインターフェロンベータ変異体。
【請求項４】
ヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドが、（ａ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドであり、該ポリペプチドは２７番アミノ酸であるアルギニンがスレオニンまたはセリンに置換されている配列番号１のアミノ酸配列を有し、前記置換によってアスパラギン−グリシン−スレオニン／セリン−ロイシンからなる２５〜２８番のアミノ酸配列を含むことにより、その位置にＮ−結合型糖鎖を追加で含むことを特徴とする、請求項１記載のヒトインターフェロンベータ変異体。
【請求項５】
下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択されるヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドにおいて、配列番号２の２５〜２８番に相当するアスパラギン−グリシン−スレオニン／セリン−ロイシン配列を保存することにより、その位置にＮ−結合型糖鎖を含むヒトインターフェロンベータ変異体：
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド；
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド。
【請求項６】
ヒトインターフェロンベータ活性を有するポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を有するポリペプチドであることを特徴とする、請求項５記載のヒトインターフェロンベータ変異体。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項８】
ヒトインターフェロンベータ変異体が、配列番号１のアミノ酸配列のＣ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含むヒトインターフェロンベータ変異体であることを特徴とする、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
ヒトインターフェロンベータ変異体が、配列番号２のアミノ酸配列を含むヒトインターフェロンベータ変異体であることを特徴とする、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
ヒトインターフェロンベータ変異体が、配列番号２のアミノ酸配列のＣ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含むヒトインターフェロンベータ変異体であることを特徴とする、請求項７記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
請求項７〜１０のいずれか１項に記載のヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチドを含む、動物細胞でヒトインターフェロンベータを発現させる発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１１に記載の発現ベクターで形質転換された動物細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の動物細胞を培養する工程を含む、ヒトインターフェロンベータ変異体の製造方法。
【請求項１４】
請求項１〜６のいずれか１項に記載のヒトインターフェロンベータ変異体を含む薬剤学的組成物。
【請求項１５】
薬剤学的組成物が、天然型ヒトインターフェロンベータが有する薬理効果を有することを特徴とする、請求項１４記載の薬剤学的組成物。
【請求項１６】
薬剤学的組成物が、天然型ヒトインターフェロンベータが有する薬理効果を有し、該薬理効果が、多発性硬化症、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、ＨＩＶ関連疾病およびＣ型肝炎からなる群から選択される疾病の予防または治療の薬理効果であることを特徴とする、請求項１４記載の薬剤学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ヒトインターフェロンベータ変異体、より詳細には、天然型ヒトインターフェロンベータに比べて１本または２本の糖鎖が追加された形態のヒトインターフェロンベータ変異体に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
インターフェロン（ＩＦＮｓ）は、サイトカインの一種で抗ウイルス活性を示し、細胞増殖を抑制して、自然免疫反応を調節する機能を有する。その中でインターフェロンベータ（interferon-beta；ＩＦＮ−β）は、５個のアルファヘリックスを有する球形タンパク質で、大きさは２２ｋＤであり、糖鎖を除去すると１８ｋＤになる（Ａｒｄｕｉｎｉ等、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９年，第８巻，１８６７−１８７７頁）。
【０００３】
インターフェロンベータの臨床適用に関する研究は活発に進行中であり、特に多発性硬化症に対する症状の緩和、軽減または治療剤として脚光を浴びている（Ｇｏｏｄｋｉｎ等，Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｐｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｉｎｇ−ｒｅｍｉｔｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ、１９９９年）。
【０００４】
多発性硬化症以外にもインターフェロンベータは、抗ウイルス活性、細胞成長抑制または抗成長活性、リンパ球細胞毒性増大活性、免疫調節活性、標的細胞の分化誘導または抑制活性、大食細胞活性化活性、サイトカイン生成増加活性、細胞毒性Ｔ細胞の効果増加活性、ナチュラルキラー細胞増加活性等の多様な免疫学的活性により、癌、自己免疫疾患及びウイルス感染、ＨＩＶ関連疾病、Ｃ型肝炎、リウマチ性関節炎等に治療等の効果があるという報告がある（Ｐｉｌｌｉｎｇ等，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９９年，第２９巻，１０４１−１０５０頁；Ｙｏｕｎｇ等，Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，１９９８年，第５１巻，６８２−６８９頁；Ｃｉｒｅｌｌｉ等，Ｍａｊｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｕｓｅｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，１９９５年，第３巻，２７−８７頁）。
【０００５】
ヒトインターフェロンベータは糖タンパク質の一種であるが、このようなタンパク質に結合された糖鎖部分はそのタンパク質の活性に重要な役目をする。
【０００６】
したがって、糖タンパク質の場合、糖鎖を付加するとその活性が増加する場合があり得る。
【０００７】
国際特許公開第９６／２５４９８号や米国特許第５，６１８，６９８号は、糖タンパク質であるｈＴＰＯ、ｈＥＰＯに一つ以上の糖鎖を導入することよって活性が増加したことを開示している。
【０００８】
本発明も前述した観点で糖タンパク質であるヒト天然型インターフェロンベータに糖鎖を導入し、その活性や機能が増加または向上したヒトインターフェロンベータ変異体を開示する。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の目的は、ヒト天然型インターフェロンベータに糖鎖を導入し、その活性や機能が増加または向上したヒトインターフェロンベータ変異体を提供することにある。
【００１０】
その他、本発明の他の目的や他の態様等は以下で提示する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、一側面において、ヒトインターフェロンベータ変異体に関するものである。
【００１２】
本発明のヒトインターフェロンベータ変異体は、天然型ヒトインターフェロンベータに糖鎖を１本ないし２本追加した形態を取ることで、天然型ヒトインターフェロンベータに比べて向上または増加した抗ウイルス活性、細胞成長抑制活性、免疫調節機能、生体内での半減期を示す（下記の図７〜１０参照）。
【００１３】
本発明者等は、下記の実施例で確認されるように、配列番号１のアミノ酸配列を有する天然型ヒトインターフェロンベータの２７番アミノ酸であるアルギニン（Ｒ）をスレオニン（Ｔ）またはセリン（Ｓ）に置換したり、該天然型ヒトインターフェロンベータのＣ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン（Ｇ−Ｎ−Ｉ−Ｔ−Ｖ）配列を追加したポリペプチドを動物細胞で発現製造した場合に、一つまたは二つのＮ−結合型糖鎖が追加で付加されることによって、天然型ヒトインターフェロンベータに比べて活性または機能が増加または向上したヒトインターフェロンベータ変異体を得ることができた。
【００１４】
本発明は、このような実験結果に基づいて提供されるものである。
【００１５】
天然型ヒトインターフェロンベータに比べて、その活性または機能が増加または向上した本発明のヒトインターフェロンベータ変異体は、天然型ヒトインターフェロンベータまたは天然型ヒトインターフェロンベータ変異体のアミノ酸配列のＣ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含み、その位置にＮ−結合型糖鎖を含むことを特徴とする。
【００１６】
特許請求の範囲および本明細書において、前記「天然型ヒトインターフェロンベータ変異体」は、天然型ヒトインターフェロンベータに由来するアミノ酸配列の全部または一部を有しながらヒトインターフェロンベータ活性を有するすべてのポリペプチドを含む意味である。
【００１７】
前記「ヒトインターフェロンベータ活性」とは、あるポリペプチドがヒトインターフェロンベータとして同定されるのに十分な一つ以上の活性と定義される。そのような活性としては、すでに前述したような多発性硬化症に対する軽減、緩和または治療活性、抗ウイルス活性、細胞成長抑制活性、抗成長活性、抗増殖活性、リンパ球細胞毒性増大活性、免疫調節活性、標的細胞の分化誘導または抑制活性、サイトカイン生成増加活性、細胞毒性Ｔ細胞効果増加活性、大食細胞効果増加活性、ナチュラルキラー細胞増加活性、癌予防または治療活性、自己免疫疾患予防または治療活性、ウイルス感染予防または治療活性、ＨＩＶ関連疾病の予防または治療活性、Ｃ型肝炎予防または治療活性、リウマチ性関節炎予防または治療活性等を例示することができる。
【００１８】
また前記「天然型ヒトインターフェロンベータに由来するアミノ酸配列の全部または一部を有するポリペプチド」とは、天然型ヒトインターフェロンベータのアミノ酸配列である配列番号１のアミノ酸配列全体またはその実質的な部分を含むポリペプチドや、そのようなポリペプチドと実質的に類似のポリペプチドを含む意味である。
【００１９】
ここで、前記「配列番号１のアミノ酸配列全体の実質的な部分を含むポリペプチド」とは、配列番号１のアミノ酸配列を有する天然型ヒトインターフェロンベータに比べて活性は低いとしても、依然ヒトインターフェロンベータの活性を保持する配列番号１のアミノ酸配列の一部分を含むポリペプチドと定義され、前記「配列番号１のアミノ酸配列全体またはその実質的な部分と実質的に類似のポリペプチド」とは、配列番号１の天然型ヒトインターフェロンベータに比べて活性は低いとしても、ヒトインターフェロンベータの活性を依然保持しながら一つ以上の置換されたアミノ酸を含む配列番号１のアミノ酸配列全体またはその実質的な部分を含むポリペプチドと定義される。
【００２０】
配列番号１で表されるアミノ酸配列全体の実質的な部分を含むポリペプチドは、配列番号１で表されるアミノ酸配列のＮ−末端部分及び／またはＣ−末端部分が欠失したポリペプチドであってもよく、配列番号１で表されるアミノ酸配列全体またはその実質的な部分と実質的に類似のポリペプチドとして、一つ以上のアミノ酸が置換されたポリペプチドであって、置換前のアミノ酸が置換されたアミノ酸と化学的に等価のもの、例えば疎水性アミノ酸であるアラニンが他の疎水性のアミノ酸、例えばグリシン、またはさらに疎水性のアミノ酸、例えば、バリン、ロイシンまたはイソロイシンに置換されたものを挙げることができる。
【００２１】
もちろん場合によって、Ｎ−末端部分、Ｃ−末端部分、または置換されたアミノ酸がヒトインターフェロンベータの活性に必須なモチーフに関与することで、Ｎ−末端部分及び／またはＣ−末端部分を欠失したポリペプチドや置換したアミノ酸を含むポリペプチドが、ヒトインターフェロンベータ活性を示さない場合があり得るが、そうであっても、配列番号１に由来する前記のポリペプチドが、前記例示された活性中の一つ以上を有するかどうかを確認することにより、及び／またはその他に本発明の出願時に当該技術分野で公知のヒトインターフェロンベータの同定に関連する方法により、そのような活性を有しないポリペプチドを活性を有するポリペプチドと区分して検出することは、当業者の通常の能力の範囲内に属する。
【００２２】
上述した内容を総合して考慮すれば、本発明のヒトインターフェロンベータ変異体は、下記のポリペプチドの一つにおいて、Ｃ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含み、その位置にＮ−結合型糖鎖を含みながら、ヒトインターフェロンベータ活性を有する変異体と定義することができる。
【００２３】
（ａ）配列番号１で表されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号１で表されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド；
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド
【００２４】
ゆえに、本発明のヒトインターフェロンベータ変異体は、Ｃ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含みながら、その位置にＮ−結合型糖鎖を含むヒトインターフェロンベータ活性を有するすべてのポリペプチドとして理解されなければならない。
【００２５】
このように、本発明のヒトインターフェロンベータ変異体は、Ｃ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含みながら、その位置にＮ−結合型糖鎖を含むヒトインターフェロンベータ活性を有するすべてのポリペプチドとして定義され理解されるが、本発明の好ましいヒトインターフェロンベータ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列を含む天然型ヒトインターフェロンベータのＣ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含みながらその位置にＮ−結合型糖鎖を含むポリペプチドである。
【００２６】
また、本発明の好ましいヒトインターフェロンベータ変異体は、配列番号１のアミノ酸配列全体またはその実質的な部分を含むポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド（前記（ｃ）のポリペプチド）であって、Ｃ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリンを含むことで、その位置にＮ−結合型糖鎖を含む以外に、配列番号１の２７番アミノ酸であるアルギニンがスレオニンやセリンに置換されて、アスパラギン−グリシン−スレオニン／セリン−ロイシンからなる配列番号１の２５〜２８番のアミノ酸配列を含むことによって、その位置にＮ−結合型糖鎖を追加で含むポリペプチドである。
【００２７】
前記本発明のヒトインターフェロンベータ変異体の最も好ましい形態は、配列番号１のアミノ酸配列を有する天然型ヒトインターフェロンベータの２７番アミノ酸であるアルギニンがスレオニンやセリンに置換されることで、その位置にＮ−結合型糖鎖を含み、また、Ｃ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列を含むことで、その位置にＮ−結合型糖鎖を追加で含むポリペプチドである。
【００２８】
本発明の下記の実施例は、天然型ヒトインターフェロンベータに比べて糖鎖が２本付加した形態の変異体の活性または機能が、糖鎖が１本付加した形態の変異体よりさらに向上または増加することを示している（下記の実施例５〜６及び図７〜１０参照）。
【００２９】
一方、本発明のヒトインターフェロンベータ変異体は、次のように他の方式で定義することも可能である。
具体的には、本発明のヒトインターフェロンベータ変異体は、ヒトインターフェロンベータ活性を有する下記のポリペプチドの一つにおいて、配列番号２のアミノ酸配列の中でアスパラギン−グリシン−スレオニン／セリン−ロイシンからなる２５〜２８番のアミノ酸配列を保存することで、その位置にＮ−結合型糖鎖が付加したポリペプチドと定義することができる。
【００３０】
（ａ）配列番号２で表されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチド；
（ｂ）配列番号２で表されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド；
（ｃ）前記（ａ）または（ｂ）のポリペプチドと実質的に類似のポリペプチド
【００３１】
特許請求の範囲および本明細書において、前記「アスパラギン−グリシン−スレオニン／セリン−ロイシンからなる２５〜２８番のアミノ酸配列が保存される」の意味は、アスパラギン−グリシン−スレオニン／セリン−ロイシンからなる２５〜２８番のアミノ酸配列が、前記（ｂ）または（ｃ）のポリペプチド（すなわち、配列番号２で表されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチドまたは配列番号２で表されるアミノ酸配列全体またはその実質的な部分と実質的に類似のポリペプチド）に必ず存在するということである。
【００３２】
本発明のヒトインターフェロンベータ変異体が前記のように他の方式で定義される場合、本発明の好ましいヒトインターフェロンベータ変異体は、配列番号２で表されるアミノ酸配列全体を含むポリペプチドにおいて、アスパラギン−グリシン−スレオニン／セリン−ロイシンからなる２５〜２８番のアミノ酸配列位置にＮ−結合型糖鎖が付加したポリペプチドである。
【００３３】
前記配列番号２のアミノ酸配列は、天然型アミノ酸配列を示す配列番号１のアミノ酸配列においてその２７位のアミノ酸であるアルギニンがスレオニン／セリンに置換した配列である。
【００３４】
一方、前記「配列番号２で表されるアミノ酸配列の実質的な部分を含むポリペプチド」や「配列番号２で表されるアミノ酸配列全体またはその実質的な部分と実質的に類似のポリペプチド」については、すでに定義した意味がそのまま有効である。
【００３５】
本発明は、他の側面において、前述のヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチドに関するものである。
【００３６】
ここで「前述のヒトインターフェロンベータ変異体」は、前記二つの方式で定義した本発明のヒトインターフェロンベータ変異体、および、その各々の好ましい態様のヒトインターフェロンベータ変異体を全て含む意味である。
【００３７】
当業者であれば、その通常の能力を活用して、あるアミノ酸配列が与えられた場合、そのアミノ酸配列に基づいてそのアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを容易に作製することができる。
【００３８】
特許請求の範囲および本明細書において、前記「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡの重合体を全て含む意味として定義される。
【００３９】
一方、活性という側面からみた場合、前記ポリヌクレオチドとしては、配列番号１のアミノ酸配列からなる天然型ヒトインターフェロンベータのＣ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列が付加したヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチド、または、配列番号２からなるヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチドが好ましく、配列番号１のアミノ酸配列からなる天然型ヒトインターフェロンベータのＣ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン配列が付加する一方、配列番号１のアミノ酸配列の２７番アミノ酸であるアルギニンがスレオニンやセリンに置換したヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチドがさらに好ましい。
【００４０】
本発明は、また他の側面において、動物細胞で本発明のヒトインターフェロンベータ変異体を発現させることができる、前述のポリヌクレオチドを含む動物細胞発現ベクターに関するものである。
【００４１】
本発明のヒトインターフェロンベータ変異体は、天然型ヒトインターフェロンベータ変異体に比べて１本または２本の糖鎖を追加に含む。このような糖鎖の付加が、動物細胞で一般的に起きる現象であることを考慮すると、前記動物細胞発現ベクターは具体的には、
（ｉ）前述のヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｉ）前記（ｉ）のポリヌクレオチド配列に作動可能に連結された、ＲＮＡ分子を形成させるプロモーター；
（ｉｉｉ）リーダー配列をコードするポリヌクレオチド；
（ｉｖ）複製基点；及び
（ｖ）前記ＲＮＡ分子の３’−末端のポリアデニル化を惹起させる３’−非翻訳領域
を基本的に含む。
【００４２】
前記プロモーターは、転写を活性化できる配列をいい、そのような配列は、当該技術分野において公知であり、同様に翻訳されたタンパク質を糖化が起きる小胞体に移動させるリーダー配列、および前記リーダー配列とｍＲＮＡとを安定化させる役目をする前記３’−非翻訳領域も、当該技術分野において公知である。
【００４３】
一方、本発明の発現ベクターは、選択的にリポーター（例：ルシフェラーゼ及びβ−グルクロニダーゼ）遺伝子や選択標識遺伝子として抗生剤（例：ネオマイシン、カルベニシリン、カナマイシン、スペクチノマイシン、ハイグロマイシン等）耐性遺伝子等を含むことができ、また選択的にエンハンサーを含むことができる。
【００４４】
一方、本発明の動物細胞発現ベクターとして使用し得るものとしては、ｐＳＶ２−ｎｅｏ（サザンとベルグ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１９８２年，第１巻，３２７−３４１頁参照）、ｐＣＡＧＧＳ（ニワ等、Ｇｅｎｅ，１９９１年，第１０８巻，１９３−２００頁）、ｐｃＤＬ−ＳＲα２９６（タケベ等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１９８８年，第８巻，４６６−４７２頁参照）、ｐＡｃ３７３（ロッコウ等、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９８８年，第６巻，４７−５５頁参照）等を例示することができるが、上に例示されたベクターは、必要によって前述のプロモーター、リーダー、複製基点、３’−非翻訳領域、リポーター遺伝子、選択標識遺伝子、エンハンサー等を含むことができる。
【００４５】
本発明は、また他の側面において、前記発現ベクターにより形質転換された動物細胞、及びそのような動物細胞を培養してヒトインターフェロンベータ変異体を生産する方法に関するものである。
【００４６】
特許請求の範囲および本明細書において、形質転換とは、外来性ポリヌクレオチド（本発明ではヒトインターフェロンベータ変異体をコードするポリヌクレオチドを意味する）が導入されることによる宿主細胞の遺伝子型の変形を意味し、その形質転換に使用された方法とは無関係に、外来性ポリヌクレオチドが宿主細胞内に導入されたことを意味する。宿主細胞内に導入された外来性ポリヌクレオチドは、宿主細胞のゲノム内に統合されて維持されたり、統合されないで維持されることができるが、本発明は両者全てを含む。
【００４７】
一方、前記で動物細胞とは、組換えタンパク質の生産に使用し得る哺乳動物細胞および昆虫細胞を含む意味であり、本発明に使用し得る動物細胞としては、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、Ｃ−１２７細胞、ＢＨＫ細胞、ラットＨｅｐ  Ｉ細胞、ラットＨｅｐ  ＩＩ細胞、ＴＣＭＫ細胞、ヒト肺細胞、ヒト肝腫瘍細胞、ＨｅｐＧ２細胞、マウス肝細胞、ＤＵＫＸ細胞、２９３細胞等を挙げることができ、昆虫細胞としては、カイコ培養細胞等を挙げることができる。
【００４８】
本発明は、また他の側面において、前述の本発明のヒトインターフェロンベータ変異体を含む薬剤学的組成物に関するものである。
【００４９】
本発明の薬剤学的組成物に含まれるヒトインターフェロンベータは、多発性硬化症治療剤として主に使用されてきたが、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、ＨＩＶ関連疾病、Ｃ型肝炎等の治療にも使用することができるという報告があり（Ｐｉｌｌｉｎｇ等，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１９９９年，第２９巻，１０４１−１０５０頁）、また、その新たな薬理効果が引き続き報告されている。
【００５０】
このような理由で、本発明の薬剤学的組成物における薬理効果は、多発性硬化症治療剤としての薬理効果だけではなく、ヒトインターフェロンベータが有するその他のすべての薬理効果を含むものであると理解されなければならない。
【００５１】
また、そのような薬理効果は、ヒトインターフェロンベータの薬理効果として現在まで知られた薬理効果だけではなく、今後明らかにされる薬理効果も含む意味として理解されなければならないだろう。
【００５２】
本発明の薬剤学的組成物は、本発明によって得られる活性または機能が増加したヒトインターフェロンベータ変異体を含むことに特徴があるので、本発明の薬剤学的組成物が上記薬物の現在まで知られた薬理効果だけではなく、追って明らかにされる薬理効果を含んでも、本発明の範囲が不当に拡大されるものではない。
【００５３】
しかし、ヒトインターフェロンベータ変異体が多発性硬化症治療剤として広く使用されて来た点、そして、すでに癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、ＨＩＶ関連疾病、Ｃ型肝炎等の治療効果が明らかにされているという点で、前記薬理効果はこのような薬理効果であることが好ましい。
【００５４】
一方、本発明の薬剤学的組成物は、経口投与されたり、その他、経皮、皮下、静脈または筋肉を含む多くの経路を通じて投与することができる。
【００５５】
また、前記本発明の薬剤学的組成物は、さまざまな剤形に製剤化することができる。製剤化する場合には、通常使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤及び界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を使用して製剤化することができる。
【００５６】
また、ヒト患者を処置する場合、本発明の薬剤学的組成物の典型的な１日投与量は、一般的に０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であってもよく、１回または数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の薬剤学的組成物の実際の投与量は、投与経路、患者の年齢、性別及び体重、及び患者の重症度等の多くの関連因子に照らして決定されるものなので、前記投与量は、いかなる意味においても本発明の範囲を制限するものと理解されてならない。
【００５７】
以下、本発明を実施例により説明する。但し、本発明の範囲はこのような実施例に限定されるものではない。
【００５８】
実施例１：突然変異により一つ以上のＡｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列が付加したインターフェロンベータ変異体遺伝子の作製
【００５９】
配列番号１のヒトインターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）のアミノ酸配列（図１）中のＲ２７（２７位のアミノ酸であるアルギニン）をスレオニン（Ｔ）またはセリン（Ｓ）に人工的に変異させ、または、ＩＦＮ−βのＣ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン（Ｇ−Ｎ−Ｉ−Ｔ−Ｖ）配列を付加するために、配列番号３の天然型インターフェロンベータ遺伝子を鋳型にして部位特異的変異導入法／ＤＮＡ合成法を使用した。
【００６０】
すなわち、突然変異をさせようとする部位を対象にプライマーセットを製作した。ここで、インターフェロンベータ変異体遺伝子を取得するために使用したオーバーラッピングＰＣＲのためのプライマーセットを下記に示す。
【００６１】
ｉ）Ｒ２７Ｔ作製用プライマーセット
Ｒ２７Ｔ−５’：ＧＣＡＡＴ  ＴＧＡＡＴ  ＧＧＧＡＣ  ＧＣＴＴＧ  ＡＡＴＡＣ  ＴＧＣＣＴ  Ｃ  （配列番号４）
Ｒ２７Ｔ−３’：ＧＡＧＧＣ  ＡＧＴＡＴ  ＴＣＡＡＧ  ＣＧＴＣＣ  ＣＡＴＴＣ  ＡＡＴＴＧ  Ｃ  （配列番号５）
ｉｉ）Ｒ２７Ｓ作製用プライマーセット
Ｒ２７Ｓ−５’：ＧＣＡＡＴ  ＴＧＡＡＴ  ＧＧＧＡＧ  ＴＣＴＴＧ  ＡＡＴＡＣ  ＴＧＣＣＴ  Ｃ  （配列番号６）
Ｒ２７Ｓ−３’：ＧＡＧＧＣ  ＡＧＴＡＴ  ＴＣＡＡＧ  ＡＣＴＣＣ  ＣＡＴＴＣ  ＡＡＴＴＧ  Ｃ  （配列番号７）
ｉｉｉ）ＧＮＩＴＶ作製用プライマーセット
ＧＮＩＴＶ−５’：ＣＴＴＡＣ  ＡＧＧＴＴ  ＡＣＣＴＣ  ＣＧＡＡＡ  ＣＧＧＴＡ  ＡＴＡＴＣ  ＡＣＴＧＴ  ＣＴＧＡＡ  ＧＡＴＣＴＣＣＴＡＧＣＣＴＧＴＣＣ  （配列番号８）
ＧＮＩＴＶ−３’：ＧＡＡＴＧ  ＴＣＣＡＡ  ＴＧＧＡＧ  ＧＣＴＴＴ  ＧＣＣＡＴ  ＴＡＴＡＧ  ＴＧＡＣＡ  ＧＡＣＴＴ  ＣＴＡＧＡＧＧＡＴＣＧＧＡＣＡＧＧ  （配列番号９）
【００６２】
（前記でＲ２７ＴおよびＲ２７Ｓは、各々インターフェロンベータ遺伝子を変異させて２７位のアルギニンがスレオニンまたはセリンに置換したタンパク質をコードする遺伝子をいい、ＧＮＩＴＶはインターフェロンベータ遺伝子を変異させてＣ−末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリン（Ｇ−Ｎ−Ｉ−Ｔ−Ｖ）が付加したタンパク質をコードする遺伝子をいう。以下同様）
【００６３】
図２に示したように、インターフェロンベータ遺伝子を含むプラスミドｐＧＥＭ−Ｔ  Ｅａｓｙベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ、米国）を鋳型に使用し、２個のオーバーラッピングプライマーセットとＰｆｕ−ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ重合酵素とを使用してＰＣＲを遂行した。ＰＣＲ用反応液は、５μｌの１０×反応緩衝溶液に５〜５０ｎｇの鋳型遺伝子、１２５ｎｇのプライマー対、および１μｌのｄＮＴＰ  ｍｉｘを添加して最終的に超純水で５０μｌになるように容積を合わせ、１μｌのＰｆｕ  Ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ重合酵素（２．５Ｕ／μｌ）を添加して調製した。９５℃で３０秒間反応させて鋳型遺伝子を変性させた後、９５℃で３０秒、５５℃で６０秒、６８℃で４８０秒のサイクルを１２回反復した。ＰＣＲで合成した反応物を１μｌのＤｐｎＩ（１０Ｕ／μｌ）により３７℃で４時間処理し、メチル化された鋳型遺伝子を除去した。氷上で溶かしたＸＬ１−ｂｌｕｅ大腸菌細胞に１μｌのＤｐｎＩ処理された反応液を添加した後、４２℃で４５秒間熱を加え、氷冷した。大腸菌細胞に５００μｌの培養培地を添加して３７℃で１時間培養した後、遠心分離により細胞を回収した。回収した細胞をＬＢ寒天培地に塗抹して３７℃で１６時間以上、コロニーが形成されるまで培養した。コロニーのプラスミドＤＮＡを分離した後、インターフェロンベータ変異体遺伝子は、ＤＮＡシーケンサーにより配列を確認した。その結果、部位特異的変異導入により２７位のアミノ酸が、スレオニン（Ｒ２７Ｔ）、またはセリン（Ｒ２７Ｓ）をコードするコドンに変わった。また、天然ヒトインターフェロンベータＣ末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリンからなるアミノ酸配列（ＧＮＩＴＶ）をコードするコドンを添加した。これを含むプラスミドを、ｐＧＥＭＴ−ＩＦＮ−β−Ｒ２７Ｔ、ｐＧＥＭＴ−ＩＦＮ−β−Ｒ２７Ｓ、ｐＧＥＭＴ−ＩＦＮ−β−ＧＮＩＴＶと名付けた。
【００６４】
ｐＧＥＭＴ−ＩＦＮ−β−Ｒ２７ＴとｐＧＥＭＴ−ＩＦＮ−β−Ｒ２７Ｓを鋳型にして、前記ＧＮＩＴＶ用オーバーラッピングプライマーセット（ｉｉｉ）とＰｆｕ−ｔｕｒｂｏ  ＤＮＡ重合酵素とを使用して同一条件でＰＣＲを遂行した後、前記のようにクローニングした。その結果、２７番アミノ酸の位置にスレオニンまたはセリンがコードされ、インターフェロンベータＣ末端にグリシン−アスパラギン−イソロイシン−スレオニン−バリンからなるアミノ酸配列をコードするコドンが付加された遺伝子を得た。これを含むプラスミドを、ｐＧＥＭＴ−ＩＦＮ−β−Ｒ２７Ｔ＋ＧＮＩＴＶ、ｐＧＥＭＴ−ＩＦＮ−β−Ｒ２７Ｓ＋ＧＮＩＴＶと名付けた。
【００６５】
下記の＜表１＞は、本発明において作製したインターフェロンベータ変異体遺伝子５種をクローニングしたプラスミドを示したものである。
【００６６】
【表１】
2008518631.tif 000003
【００６７】
実施例２：発現ベクターの作製及びＣＯＳ細胞へのトランスフェクション及び細胞培養
実施例１で作製したインターフェロンベータ変異体の遺伝子を含むプラスミドを鋳型に使用して、プライマーＰ１（ＣＣＧＧＡＡＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＡＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＴＣＴＣＣＴＣＣＡＡＡ、配列番号１０）とＰ２（ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＣＴＴＡＡＡＣＡＧＣＡＴＣＴＧＣＴＧＧＴＴＧＡ、配列番号１１）とを使用してＰＣＲを遂行し、人工的に置換されたインターフェロンベータをコードする遺伝子を得た（図３）。ここで、ＤＮＡ重合酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用し、この遺伝子末端は、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位を有する。ｐＣＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）と上で増幅したＩＦＮ−β遺伝子とを制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとで各々処理した。アガロースゲルで線形化したｐｃＤＮＡ３．１とＩＦＮ−β変異体遺伝子をＱｉａｇｅｎ溶出キットを使用して回収した後、ライゲーション反応を経て大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。ＬＢ−アンピシリン固形培地で一晩培養した後、現れたコロニーからプラスミドを分離し、制限酵素ＥｃｏＲＩとＸｈｏＩとで処理して、１％アガロースゲル電気泳動でＩＦＮ−β遺伝子が挿入されたコロニーのみを選択した。選択されたコロニーのプラスミドＤＮＡのＩＦＮ−β遺伝子の塩基配列を確認した。このプラスミドをｐＣＤＮＡ３．１−ＩＦＮ−β−Ｘ（ここでＸは、インターフェロンベータ変異体の番号）と名付けた。
【００６８】
作製した組換え発現ベクターのうち、天然型インターフェロンベータ、インターフェロンベータ変異体Ｒ２７Ｔ、Ｒ２７Ｓ、Ｒ２７Ｔ＋ＧＮＩＴＶ、Ｒ２７Ｓ＋ＧＮＩＴＶに該当する発現ベクターを各々ＣＯＳ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５０）にトランスフェクトした。すなわち、前培養したＣＯＳ細胞を２×１０５細胞／ｍｌ濃度で６０ｍｍ組職培養プレートに接種した後、２４時間培養した。前述の各々の組換え発現ベクターＤＮＡ２μｇおよび７μｌのリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）試薬を、血清を含まないＤＭＥＭ培地１００μｌに各々添加して常温で１５分間反応させた後、２溶液を互いに混合して再び常温で１５分間反応させてリポフェクチン−ＤＮＡ複合体を形成した。前記リポフェクチン−ＤＮＡ複合体に血清を含まないＤＭＥＭを添加した後、それをＣＯＳ細胞上にそっと載せて３７℃、５％ＣＯ２培養器で６時間培養してトランスフェクトした。各々の発現ベクターをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ、ＪＲＨ）、５０μｇ／ｍｌペニシリン、５０μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ培地を使用して、３７℃、５％ＣＯ２条件下で４８時間培養した。培養しながら３日から５日間、馴化培養液を収集した。
【００６９】
実施例３：インターフェロンベータ変異体の特性確認
実施例３−１：糖鎖追加の確認
実施例２に記載のトランスフェクトＣＯＳ細胞から１〜２μｇの組換えヒトインターフェロンベータ及びインターフェロンベータ変異体を含む培養上清を、室温でウサギ抗インターフェロンベータポリクローナル抗体で一晩免疫沈降した。前記抗体を含む培養上清に、ＰＢＳで１：１に懸濁したプロティンＡセファロース樹脂を２０〜８０μｌ添加して常温で１時間反応させた。試料を遠心分離して、沈殿物をＰＢＳで洗浄した。沈殿物の一部を酵素Ｎ−グリカナーゼで処理してＮ−結合型糖鎖を切断した。Ｎ−グリカナーゼで処理した沈殿物と処理していない沈殿物を１５％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、ニトロセルロースメンブレンに移して、ルンケル（Ｒｕｎｋｅｌ）等が発表した方法（Ｒｕｎｋｅｌ等、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１９９８年、第１５巻、６４１−６４９頁）によってマウス抗インターフェロンベータモノクローナル抗体を使用したウエスタンブロット法で分析した。
【００７０】
インターフェロンベータ変異体と形質転換したＣＯＳ細胞の培養上清を分析した結果、天然型インターフェロンベータに比べてタンパク質分子量の増加が確認された（図５）。このようなタンパク質分子量が増加したインターフェロンベータ変異体をＮグリカナーゼで処理したところ、糖鎖が除去されて分子量が減少した（図５）。
【００７１】
実施例３−２：インターフェロンベータ変異体の活性比較
天然型インターフェロンベータとインターフェロンベータ変異体の活性を比べるために、ＥＩＡによりインターフェロンタンパク質の量を定量した。抗ウイルス活性試験法により天然型インターフェロンベータ及びインターフェロンベータ変異体の力価を測定した。
【００７２】
ＥＩＡは、ＰＢＬ社のキットを使用して製造者の指示に従って実施した。すなわち、酵素免疫測定キット中の抗体吸着プレートの指定された各ウェルに希釈液を各々１００μｌずつ加えて、希釈液に適切に希釈した国際標準液及び検液を１００μｌ加えてよく混ぜた後、室温で１時間反応させた。ここで、国際標準液は、ヒトＩＦＮ−β国際標準（英国ＮＩＢＳＣ社）アンプル１本を再構成バッファー１ｍｌに溶解した後、バイアル当り１００μｌずつ分注して−７０℃に保管し、使用する際に−７０℃からバイアルを取り出して解凍した後、希釈液に希釈して使用した。各ウェルの残余反応液を除去して洗浄溶液で２５０μｌずつ３回洗浄した後、各ウェルに１００μｌずつの酵素抗体接合体液を加えて再び室温で１時間反応させた。反応後、反応液を除去して洗浄溶液で２００μｌずつ３回洗浄した後、残余液を全て除去して調製した基質−発色溶液１００μｌずつを加えた後、室温で３０分間反応させた。反応が終わった後、各ウェルに反応停止液１００μｌずつを加え、反応を停止させてよく混ぜた後、４５０ｎｍで吸光度を測定した。標準液の濃度を横軸、吸光度（Ａ４５０ｎｍ）を縦軸にして標準曲線から国際標準液と検液各々の吸光度によるヒトＩＦＮ−β濃度数値を求めて、そこに各々の希釈比を掛けて得た３種の希釈液濃度数値の平均値を計算して、国際標準サンプルと検液の測定値を求めた後、最終濃度を計算した。抗ウイルス活性試験法は、実施例６に記述したのと同じ方法で実施した。ＣＯＳ細胞で一過性に発現させた種々のインターフェロンベータ変異体の培養液でのＥＩＡと抗ウイルス力価測定比を＜表２＞に示した。このような結果によって、糖鎖が付加して分子量増加が確認され、天然型インターフェロンベータに比べて活性が同一または増加したインターフェロンベータ変異体であることが分かった。このようなインターフェロンベータ変異体を大量生産するために、前述のインターフェロンベータ変異体発現ベクターをＣＨＯ細胞株にトランスフェクトした。
【００７３】
【表２】
2008518631.tif 000004
【００７４】
＋＋  分子量が２６ｋＤａで１本の糖鎖が付加している。
＋＋＋＋  分子量が３０ｋＤａで２本の糖鎖が付加している。
【００７５】
実施例４：トランスフェクション及び細胞培養（ＣＨＯ細胞）
６０ｍｍ細胞培養容器でＣＨＯ細胞（ＤＧ４４）を増殖させ、４０〜８０％コンフルエント程度に（１〜４×１０５細胞／６０ｍｍディッシュ）培養した。ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）社のリポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ）試薬３μｌと細胞培地（α−ＭＥＭ、無血清、無抗生剤）９７μｌとをよく混合して、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＩＦＮ−β−Ｘ  ＤＮＡ（０．１μｇ／μｌ以上、約２μｇ）とｐＳＰ７２−ＤＨＦＲ（０．２μｇ）を添加して室温で３０分間反応させた後、用意した前記細胞に加えた（図４）。１日経過後、Ｇ４１８を５００μｇ／ｍｌになるように添加した培地（α−ＭＥＭ、１０％  ＦＢＳ）に交換した。約７〜１０日間デオキシリボヌクレオシド及びリボヌクレオシドが欠乏したα−ＭＥＭ最小培地に入れ替えて培養することで、トランスフェクトされた細胞を選択した。以後、ＣＨＯ  ＤＨＦＲ＋トランスフェクト細胞を２次選択した。２次選択されたＣＨＯ  ＤＨＦＲ＋トランスフェクト細胞を限界希釈法で９６ウェルプレートにクローニングして選択培地で継続培養した後、ＭＴＸ（メトトレキサート、米国Ｓｉｇｍａ社）濃度を２０ｎＭから１０００ｎＭまで２倍ずつ漸次増加させて、１０％血清含有最小培地で培養しながら、ＭＴＸ選択培地で成長するＭＴＸ抵抗性クローンを３次選択した。
【００７６】
１μＭで１ヶ月以上培養して良好に増殖する細胞株について単細胞分離をした。まず、９６ウェルマルチプレートに各ウェル当り１個の単一細胞を入れて培養した後、その中で単一細胞のみが入ったものを選択した。以後、ＥＩＡ定量分析により発現量が優秀な候補群を選択した。このように選択した候補群を、２４ウェルプレート、そして６ウェルプレートに順次に移して培養した。このように培養した候補群をＥＩＡ定量分析を使用して再び選択して、最終インターフェロンベータ高発現細胞株を確立した。前記で作製した組換えＣＨＯ細胞株のインターフェロンベータ生成量を測定した結果、天然型インターフェロンベータ細胞株は１．８μｇ／ｍｌ／２４時間である一方、インターフェロンベータ変異体を産生するＣＨＯ−Ｒ２７Ｔ細胞株は６．５μｇ／ｍｌ／２４時間、ＣＨＯ−Ｒ２７Ｔ−ＧＮＩＴＶ細胞株は７．０μｇ／ｍｌ／２４時間でＩＦＮ−βを生産することを確認した。これは、天然型の細胞株より３倍以上高い。
【００７７】
実施例５：ＣＨＯ細胞株により産生された一つ以上の糖鎖が付加したインターフェロンベータの精製
実施例４に記載の突然変異配列を一つまたは二つ以上含む細胞株を、セルファクトリー（ｃｅｌｌ  ｆａｃｔｏｒｙ；Ｎｕｎｃ社、Ｃａｔ  Ｎｏ．１７００６９）を使用して培養した。１０％ＦＢＳ含有α−ＭＥＭ培地で各発現細胞株を５×１０４細胞／ｍｌに希釈し、セルファクトリーに継代して、５％ＣＯ２、３７℃で７２時間培養し、細胞増殖を確認した。ＰＢＳで３回洗浄して血清成分を最大限除去し、無血清培地（Ｓｉｇｍａ  Ｃ８７３０）に置換した。無血清培地に置換した後、２４時間ごとに培養液を回収して、新しい無血清培地を添加した。計４回にわたり培養液を回収して精製した。ブルーセファロース樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）２００ｍｌをＸＫ５０／２０カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ−Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に充填後、緩衝液Ａ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）を１０Ｃ．Ｖ．（ｃｏｌｕｍｎ  ｖｏｌｕｍｅ）流し、平衡状態に達するようにした。平衡状態のカラムに除菌ろ過した培養液を２０ｍｌ／分の流速で流し、ＵＶ検出器で波長２８０ｎｍにてモニターした。緩衝液Ｂ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、３０％エチレングリコール、ｐＨ７．４）をカラムに流して未吸着成分を洗浄し、緩衝液Ｃ（２０ｍＭリン酸ナトリウム、１Ｍ  ＮａＣｌ、６０％エチレングリコール、ｐＨ７．４）で樹脂に付着したタンパク質を溶出した。溶出液をＰＢＳに対して透析し、濃縮器（Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ、Ｃｕｔ  ｏｆｆ  １０，０００）で濃縮して、再度ＰＢＳに対して透析した。
【００７８】
実施例６：ＣＨＯ細胞株が産生した一つ以上の糖鎖が付加したインターフェロンベータの理化学的性質の分析
実施例６−１：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロット
実施例５で精製した試料に５×サンプル緩衝溶液（１２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５％ＳＤＳ、５０％グリコール、０．１％β−メルカプトエタノール、１ｍｇ／ｍｌブロモフェノールブルー）を１：４の割合で混合して、９５℃で５分間前処理した後、分子量標準品とともに１５％ポリアクリルアミドゲルのウェルに２０μｌずつローディングして展開した。電気泳動が終わった後、クマシーブリリアント染色液で染色した後、脱色液で脱色した結果、天然型インターフェロンベータは糖鎖がないタンパク質である約１８．０ｋＤａのバンドと糖鎖があるタンパク質である約２２．０ｋＤａのバンドを示して、１本の糖鎖が付加したＩＦＮ−βは約２６．０ｋＤａのバンドが加えられ、２本の糖鎖が付加したＩＦＮ−βは約３０．０ｋＤａのバンドが加えらたことが確認された（図６）。
【００７９】
実施例６−２：糖鎖末端のシアル酸付加の確認試験
精製したタンパク質は、全てＰＢＬ社が提供するヒトＩＦＮ−βＥＬＩＳＡキット（Ｈｕｍａｎ  ＩＦＮ−β  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ）を使用してインターフェロンベータの含量を測定した。そして、イトウ・マサキ（Ｍａｓａｋｉ  Ｉｔｏ等．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００２年、第３００巻、２６０頁）の方法の変法により、各タンパク質のシアル酸含量を測定した。シアル酸は、８０℃で１時間、０．１Ｎ塩酸で反応させて糖タンパク質から分離し、その中の一部をタカラ社が供給するシアル酸蛍光標識キットを使用してシアル酸に蛍光物質を標識して、ＨＰＬＣで含量分析した。その結果を、天然型インターフェロンベータとインターフェロンベータ変異体対シアル酸の重量の％比で＜表３＞に示した。
【００８０】
【表３】
2008518631.tif 000005
【００８１】
実施例７：ＣＨＯ細胞が発現するインターフェロンベータ変異体の生物学的活性
実施例７−１：Ｒ２７Ｔ、Ｒ２７Ｓ及びＧＮＩＴＶインターフェロンベータ変異体の抗ウイルス活性
Ｒ２７Ｔ、Ｒ２７Ｔ＋ＧＮＩＴＶ、ＧＮＩＴＶ、および糖鎖が除去されたインターフェロンベータ（ＩＦＮβ−１ｂ）の抗ウイルス活性を、天然型インターフェロンベータ（ＩＦＮβ−１ａ）を基準に、相対的に比較した。天然型インターフェロンベータには、セロノ（Ｓｅｒｏｎｏ）のＲｅｂｉｆを使用した。
【００８２】
Ａ５４９細胞を、１０％ＦＢＳ、ＭＥＭ非必須アミノ酸１００×溶液、および１００ｍＭピルビン酸ナトリウムが添加されたＭＥＭ培地で培養した。分析当日、細胞を前記の新鮮な培地に入れ、細胞密度を３×１０５細胞／ｍｌに調整した。試験区及び対照区インターフェロンベータを、前記培地に希釈した。希釈は、９６ウェルマルチプレート内で、各ウェルが１００μｌ／ウェルを含むようにして２倍段階希釈した。すべてのサンプルは、２個ずつ用意した。１００μｌの培地のみ（インターフェロンベータ無し）を含む対照区ウェルも含めた。１００μｌの細胞を各ウェルに添加した後、プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２０時間インキュベートした。プレートから培地を除去し、前記培地に希釈したＥＭＣＶ（１０００ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）１００μｌを各ウェルに添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で２２時間インキュベートした後、培地を除去してクリスタルバイオレットで染色した。染色液を除去した後、２−メトキシエタノール１００μｌを添加して染色液を抽出し、４５０ｎｍで吸光度を測定して抗ウイルス活性を決定した。
【００８３】
糖鎖が除去されたインターフェロンベータ（ＩＦＮβ−１ｂ）は、同一条件で低い活性を示し、それに比べてＲ２７Ｔ及びＲ２７Ｔ＋ＧＮＩＴＶ、ＧＮＩＴＶは、天然型インターフェロンベータ（ＩＦＮβ−１ａ；Ｒｅｂｉｆ）と比べて高い活性を示した。糖鎖が２本追加されたＲ２７Ｔ＋ＧＮＩＴＶは、天然型に比べて４倍程度高い活性を示し、糖鎖が１本追加されたＲ２７Ｔは３倍程度高い活性を示した（図７）。
【００８４】
実施例７−２：細胞増殖の抑制
細胞増殖に対するインターフェロンベータ変異体の効果を調査した。抗ウイルス活性と同様に天然型インターフェロンベータ（ＩＦＮβ−１ａ）を基準に相対比較し、天然型インターフェロンベータとしてセロノ（Ｓｅｒｏｎｏ）のＲｅｂｉｆを使用した。抗増殖活性は、Ｄａｕｄｉ細胞を使用して調査した。
【００８５】
Ｄａｕｄｉ細胞を１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌストレプトマイシン、２ｍＭグルタミン、および１０％ＦＢＳを添加したＲＰＭＩ  １６４０培地で培養した。試験区及び対照区インターフェロンベータを、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ  １６４０培地で、９６ウェルマルチプレート内にて、各ウェルが１００μｌ／ウェルを含むように２倍段階希釈した。すべてのサンプルは、２個ずつ用意した。細胞を９６ウェルマルチプレートに１×１０４細胞／ウェルの濃度で添加して、３７℃、５％ＣＯ２で４０〜４８時間インキュベートした。続けて、３［Ｈ］チミジン１μＣｉを含む培地５０μｌをウェルに添加して、６時間インキュベートした後、細胞を回収して取り込んだ放射線活性の量を測定した。
【００８６】
インターフェロンベータ変異体は、Ｄａｕｄｉ細胞の増殖を抑制し、活性は投与量依存的だった。糖鎖が除去されたインターフェロンベータ（ＩＦＮβ−１ｂ）は、低い抗増殖活性を示し、Ｒ２７Ｔ、Ｒ２７Ｔ＋ＧＮＩＴＶ、およびＧＮＩＴＶは、天然型インターフェロンベータ（ＩＦＮβ−１ａ）より高い活性を示した。変異したインターフェロンベータの活性は、Ｒ２７Ｔ＋ＧＮＩＴＶ、Ｒ２７Ｔ、ＧＮＩＴＶの順であった（図８）。
【００８７】
実施例７−３：免疫調節機能
天然型インターフェロンベータ及び変異体の免疫調節機能は、Ａ５４９細胞でＭＨＣクラスＩの活性化を通じて測定した。
【００８８】
Ａ５４９細胞は、１０％ＦＢＳと２ｍＭグルタミンとを含むＤＭＥＭ培地で培養した。細胞を、２倍段階希釈した天然型インターフェロンベータ、変異体、または糖鎖がないインターフェロンベータ（ＩＦＮβ−１ｂ）が添加された培地に１×１０５細胞／ｍｌの密度で接種して、４８時間３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートした。５ｍＭ  ＥＤＴＡが添加されたハンクス緩衝塩（Ｈａｎｋ’ｓ  ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｔ）溶液で細胞を処理した後、遠心分離で回収した。細胞ペレットをＦＡＣＳバッファーに２×１０７細胞／ｍｌの密度で懸濁した後、ＦＡＣＳ分析でＭＨＣクラスＩの発現量を測定した。ビオチンとカップリングした抗ＨＬＡ  ＡＢＣ抗体と、フルオレセインとカップリングしたストレプトアビジンとを測定に使用し、すべてのサンプルは２個ずつ用意した。
【００８９】
インターフェロンベータ変異体の免疫増強効果は、天然型インターフェロンベータ（ＩＦＮβ−１ａ）と同等か、または若干高かった。上記の他の二つの活性と同様に、インターフェロンベータ変異体の効果は、ＧＮＩＴＶ、Ｒ２７Ｔ、Ｒ２７Ｔ＋ＧＮＩＴＶの順に高くなった。糖鎖が付加していないインターフェロンベータ（ＩＦＮβ−１ｂ）は、その濃度に比べて低い免疫調節効果を示した（図９）。
【００９０】
実施例７−４：薬物速度論定数の検討
in vivo活性試験は、ＣＨＯ細胞で発現させたインターフェロンベータ変異体を投与したラットの血中インターフェロンベータ変異体の経時的濃度変化を測定する方法で実施した。in vivo活性試験に使用した実験動物はＨｓｄ：スプラグ−ドーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットのメスで、体重分布は２４６．３〜２５８．１ｇであり、恒温（２４±１℃）、恒湿（５５％）、照明時間１２時間に設定された動物室で１週間程度馴化させた後使用した。試験期間中、動物は、同一飼育室で飼育した。
【００９１】
１群が４匹になるように体重を指標にした層別無作為抽出によってラットを４群に分け、各々天然型インターフェロンベータ投与群、各変異体投与群及び薬剤を投与しない無処理群に設定した。実験２日前に頚静脈にカテーテルを手術により挿入した。カテーテル挿入ラットの平均体重は、２５３．５ｇだった。
【００９２】
天然型インターフェロンベータ及び各インターフェロンベータ変異体を、ラットの尾静脈に検体として注射した。注射後、１、５、１５、３０分、１時間１５分、３時間、５時間、８時間の時点で、頚静脈カテーテルを採血前に食塩水で洗浄してから０．３ｍｌ採血した。採血後、カテーテルにはヘパリン食塩水（５０ＩＵ／ｍｌ）を充填し、管の閉塞を防止した。採血した血液は、直ちに抗凝固剤クエン酸ナトリウム４％溶液で処理して凝固を防ぎ、遠心分離した後、血球を除いた血漿を回収し、−７０℃に凍結した。実験動物の血中インターフェロンベータの量は、抗ウイルス試験法で測定した。図１０には、天然型インターフェロンベータ及び変異体のラットの時間別血中残留濃度を示した。そして、このような残留濃度を根拠に薬物速度論定数を求めた。
【００９３】
その結果は、＜表４＞に示したとおりである。糖鎖が２本追加されたＲ２７Ｔ＋ＧＮＩＴＶ、Ｒ２７Ｓ＋ＧＮＩＴＶインターフェロンベータ変異体は、天然型インターフェロンベータに比べて３倍の半減期延長効果があった。その次に糖鎖が１本追加されたインターフェロンベータ変異体Ｒ２７Ｔ、Ｒ２７Ｓ、ＧＮＩＴＶの場合、天然型インターフェロンベータに比べて２倍の半減期延長効果があった。
【００９４】
【表４】
2008518631.tif 000006
【産業上の利用可能性】
【００９５】
上述したように、本発明によればヒト天然型インターフェロンベータに比べてその活性や機能が増加または向上したヒトインターフェロンベータ変異体を提供することができる。
【００９６】
本発明のヒトインターフェロンベータ変異体は、天然型ヒトインターフェロンベータより１本ないし２本の糖鎖を追加的に含むことで、天然型ヒトインターフェロンベータに比べて向上または増加した抗ウイルス活性、細胞増殖抑制活性、免疫調節機能、生体内半減期を有する。これは、ヒトインターフェロンベータの投与用量及び投与回数を低減することができることを意味する。
【００９７】
一方、本発明によれば、前記ヒトインターフェロンベータ変異体をコードする遺伝子とそのような遺伝子を含む動物細胞発現ベクター、そのような発現ベクターで形質転換された動物細胞、そのような動物細胞を培養してヒトインターフェロンベータ変異体を製造する方法、及びヒトインターフェロン変異体を含む薬剤学的組成物を同時に提供できる。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】インターフェロンベータの遺伝子及びタンパク質の配列を示した図である。人工的に置換されるアミノ酸配列を四角で表示した。
【図２】ヒトインターフェロンベータの遺伝子の特定の部位を部位特異的変異導入により人工的に変異させる過程を示した模式図である。第１段階は、作製したプライマー対が遺伝子配列の特定の部位に結合して、ＤＮＡポリメラーゼによって遺伝子が置換された遺伝子に新しく合成される段階をいう。第２段階では、合成されたインターフェロンベータ遺伝子を含むＰＣＲ反応液中のメチル化されたインターフェロンベータ鋳型遺伝子を制限酵素Ｄｐｎ  Ｉで処理して除去した後、大腸菌に形質転換する段階を示す。
【図３】インターフェロンベータ変異体を発現させるための発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＩＦＮ−βの構築過程を示した模式図である。
【図４】インターフェロンベータを発現させるための発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１−ＩＦＮ−βとｐｓｐ７２−ＤＨＦＲとを動物細胞に導入するためにコトランスフェクトする過程を示した模式図である。
【図５】ＣＯＳ細胞を使用して発現させたインターフェロンベータ変異体を電気泳動してウエスタンブロットで確認した結果、および、同変異体をＮグリカナーゼで切断して、それを電気泳動してウエスタンブロットで確認した結果を示した図である。１次抗体は、ヒトインターフェロンベータに対するモノクローナル抗体を使用し、２次抗体はＨＲＰ標識ウサギ抗マウス免疫クロブリン抗体を使用した。
【００９９】
【図６】ＣＨＯ細胞培養液から精製したインターフェロンベータ変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を示した図である。
【図７】ＣＨＯ細胞を使用して発現させたインターフェロンベータ変異体と天然型インターフェロンベータの抗ウイルス活性を比べた結果を示した図である。
【図８】ＣＨＯ細胞を使用して発現させたインターフェロンベータ変異体と天然型インターフェロンベータの細胞増殖に対する阻害効果を比べた結果を示した図である。
【図９】ＣＨＯ細胞を使用して発現させた天然型インターフェロンベータ及びインターフェロンベータ変異体の免疫調節機能を、Ａ５４９細胞でのＭＨＣクラスＩの活性化を通じて測定し、それを比べた結果を示した図である。
【図１０】ＣＨＯ細胞を使用して発現させた天然型インターフェロンベータ及びインターフェロンベータ変異体のラットの時間別血中残留濃度を示した図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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