(57)【要約】  本発明は、改善された感度で、感染性または病原性プリオンタンパク質を検出する方法に関する。本発明によれば、サンプル中の非病原性プリオンタンパク質PrPcと低分子のプロテアーゼ感受性PrPSc凝集体とを相互作用させて高分子のプロテアーゼ耐性PrPSc凝集体を形成させることによる、自発的変換反応によってプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScが新たに形成される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)調査するサンプルを準備するステップ、
(b)サンプル中に内因的に存在するプロテアーゼ感受性の病原性プリオンタンパク質PrPScを、これと非病原性プリオンタンパク質PrPcと相互作用させてプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScを生じさせることにより、形成されているPrPSc凝集体を少しも分解させることなく変換するステップ、
(c)プロテアーゼと共にインキュベートするステップ、および
(d)サンプル中のプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScを測定するステップを含む、サンプル中のプリオンタンパク質PrPScを検出する方法。
【請求項２】
ウシ、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギまたはヒト由来のプリオンタンパク質を検出するための、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、脳、神経組織またはリンパ細網系などの組織あるいは体液に由来することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤含有サンプルを調査することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ(b)が、プロテアーゼ感受性プリオンタンパク質PrPScが自発的にプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScに変換する条件下でのサンプルのインキュベーションを含むことを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
インキュベーションを20〜55℃、特に40〜50℃の温度で実施することを特徴とする、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
インキュベーションを少なくとも10分間、特に10〜120分間継続することを特徴とする、請求項5または6に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（b）の前に超音波処理を実施することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
外来の非病原性プリオンタンパク質PrPcをサンプルに添加することを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
同種の非病原性プリオンタンパク質PrPcを添加することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（c）でプロテイナーゼKを用いることを特徴とする、請求項10に記載の方法。
【請求項１２】
プロテイナーゼKを50〜100μg/mlの濃度で用いることを特徴とする、請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
ステップ（d）で定量的測定を行うことを特徴とする、請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１４】
ステップ(d)における測定を、免疫学的方法を用いて行うことを特徴とする、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１５】
測定をウエスタンブロットを用いて行うことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
測定をイムノアッセイを用いて行うことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１７】
測定をサンドイッチアッセイ、特にサンドイッチELISAを用いて行うことを特徴とする、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
TSE疾患を診断するための、請求項1〜17のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１９】
ヒトにおけるTSE疾患を検出するための、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
家畜、生産動物および野生動物におけるTSE疾患を検出するための、請求項18に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、改善された感度で、感染性または病原性プリオンタンパク質を検出する方法に関する。このために、サンプル中の非病原性プリオンタンパク質PrPcとプロテアーゼ感受性の低分子量のPrPSc凝集体とが相互作用して高分子量のプロテアーゼ耐性PrPSc凝集体を形成する自発的な変換反応によって、プロテアーゼ耐性プリオンタンパク質がデノボ形成される。
【背景技術】
【０００２】
プリオンはクールー、変異型クロイツフェルト‐ヤコブ病（vCJD）、ウシにおける海綿状脳症（BSE）、慢性消耗病（CWD）およびスクレイピーなどの伝達性海綿状脳症（TSE）の原因となる感染性粒子である。プリオンの主な構成成分は糖タンパク質PrPScであり、これは正常な細胞表面タンパク質PrPcの高次構造が変化したアイソフォームである（Prusiner, PNAS USA 95, 1363-1383, 1998）。疾患に関連するプリオン分子PrPScは正常なPrPcプリオン分子の変換により複製することができる。
【０００３】
プリオンの複製は、溶液中で熱力学的平衡状態にあるPrPcとPrPScに基づく「核生成／重合（nucleation/polymerization）」モデルに従って生じると考えられている（JarrettおよびLandsbury, Cell, Vol 73, 1055-1058, 1993; Masel, JansenおよびNowak, Biophys. Chem. 77, 139-152, 1999）。
【０００４】
このモデルは、感染性の粒子はPrPScの多量体の高次凝集体を構成するが、単量体PrPSc分子は不安定であり他のPrPSc分子との凝集によってのみ安定化されるという原理に基づくものである。したがって、複製の律速段階は核の形成であり、この核がその後作用してPrPSc凝集体をさらに安定化させる。
【０００５】
PrPScオリゴマーは、凝集体の末端に新しいPrPc分子が付加され、変換されかつ組み込まれるにつれて伸長する。従って、そのような「核生成プリオン複製」の動力学は、サンプル中に存在するPrPSc核の数、およびPrPcとPrPScが互いに相互作用する可能性によって制限される。
【０００６】
これまでプリオンタンパク質PrPScはTSE型の疾患を診断するために利用可能な唯一のマーカーであった。しかし、PrPScの濃度は脳内でさえ非常に低いものであるため、TSE疾患の比較的遅い段階でのみ診断上検出することが可能である。その結果、TSE疾患を検出するために存在する診断方法は非常に制限されている。
【０００７】
したがって、PrPScの検出の感度を増大させる努力がなされている。近年、プリオン複製における上述のモデルに基づき、サンプル中のPrPSc検出の感度を増大させる方法が開発された（Saborioら, Nature 411, 810-813; 2001およびSoto, Biochem. Soc. Trans. 30, 569-574, 2002, WO 02/04954）。PMCA（protein misfolding cyclic amplification）と称するこの方法は、調査するサンプルを非病原性PrPcと接触させ、サンプル中に存在する少量のPrPScと添加したPrPcとを相互作用させて凝集体を形成させ、形成した凝集体を分解し、病原性PrPScをサンプル中で測定することを含む。この方法は、通常、実験的に促進された数サイクルのプリオン複製からなる。各サイクルは2つの段階からなる。第1段階では、非常に少量のPrPScが二、三のPrPc分子と相互作用してPrPcを変化させ、それによってPrPSc凝集体の成長を誘導する。
【０００８】
第2段階では、超音波処理を用いてこれらの凝集体を小部分に分割し、その結果、各サイクルにおいて可能な核数が指数関数的に増大する。この方法のサイクル性により、少なくとも理論上は、PrPScを検出するために望まれる増幅状態を得るのに必要なだけ多くの数のサイクルが可能になる。
【０００９】
最終的にこの方法は、凝集体の成長段階および鋳型ユニットの増殖段階からなるサイクル反応を用いて、PrPc基質を利用することによる鋳型ユニット数の指数関数増殖を達成することを目的とする。
【００１０】
ハムスターモデルに応用されたPMCA法は、最近、マウス、ヒツジ、ヤギ、ウシおよびヒトなどの別の種についても記載され、用いられる種によって付されるべき増幅に必要な超音波処理の強さは、明らかに、特に関連のPrPSc重合体の凝集状態に基づいて変更する必要があるという注釈がされている（Anderesら, Poster presentation, Transmissible Spongiform Encephalopathies. New perspectives for prion therapeutics, International Conference, December 1.-3., 2002, Paris, France）。
【００１１】
しかし、プリオンを増幅するためのサイクル法は技術的問題を生ずる傾向があるようであり、また、記載されているように長いインキュベーション/音波処理サイクルが必要である。
【００１２】
Tzabanら（Biochemistry 41, 12868-12875, 2002）は、以前知られていなかったプロテアーゼ感受性PrPSc種が、プリオンに感染したハムスターの脳内に低分子量の凝集体の形態で存在することを報告している。凝集体のプロテアーゼ耐性は、凝集体のサイズが増加するにつれて増加する。しかし、この所見が診断と関連し得るという具体的な示唆はない。
【００１３】
Lucassenら（Biochem. 42 (2003), 4127-4135）は、プロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScが、スクレイピーに感染したハムスターまたはマウスの脳ホモジネートと同種の正常な脳ホモジネートとを混合することによって、in vitroで増幅されることを報告している。
【００１４】
Horiuchiら（PNAS USA, 97 (2000), 5836-5841）は、異種および同種間でマウスとハムスターのPrPアイソフォームの結合相互作用を研究している。これらの結果によれば、同種のPrP-感受性とPrP-耐性との結合は、異種PrP-感受性の結合と比較して好ましいものではない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
本発明の根本にある目的は、サンプル中の病原性プリオンタンパク質PrPScを検出するための、簡単、迅速かつ敏感な方法を提供することであった。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
この目的は、
(a)調査するサンプルを準備するステップ、
(b)サンプル中に内因的に存在するプロテアーゼ感受性の病原性プリオンタンパク質PrPScを、これと非病原性プリオンタンパク質PrPcとを相互作用させてプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScを生じさせることにより、形成されているPrPSc凝集体を少しも分解させることなく変換するステップ、
(c)プロテアーゼと共にインキュベーションするステップ、および
(d)サンプル中のプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScを測定するステップを含む本発明に従って達成される。
【００１７】
この発明による方法は、プロテアーゼ感受性PrPSc凝集体の存在（Tzabanら、上記参照のこと）およびプロテアーゼ耐性PrPSc凝集体を生じる自発的変換反応に関るこれらの驚くべき能力を基礎とする。
【００１８】
この発明は、改善された程度の感度で、感染性プリオンタンパク質を検出する方法に関する。サンプル中の内因性の天然PrPcとプロテアーゼ感受性の低分子量のPrPSc凝集体とが相互作用して、高分子量のプロテアーゼ耐性PrPSc凝集体を形成する自発的な変換反応によって、プロテアーゼ耐性PrPScがデノボ形成される。
【００１９】
これに関連して、PrPSc陽性サンプル中には、高分子量のプロテアーゼ耐性PrPSc凝集体に加えて、プロテアーゼ感受性の低凝集PrPScも、いろいろな凝集状態の不均質な重合体サイズで存在すると考えられる。この低凝集のPrPScは、サンプル中に内因的に存在するPrPcによって、増幅サイクルを取り入れることなくプロテアーゼ耐性PrPSc凝集体の形成を可能にする自発的変換反応の鋳型として用いられ得る。
【００２０】
したがって、適切な条件下で、高凝集かつプロテアーゼ耐性であるPrPSc重合体の濃度の増加がサンプル中に存在する非病原性PrPcによって引き起こされる。すなわち、サンプル中に内因的に存在するPrPcと添加された外来PrPcが、適切な場合に、低凝集で成長可能なPrPSc結晶核に結合されることになる。次に、これはプロテアーゼ耐性PrPSc凝集体数の増加、およびいろいろな検出法によるPrPSc検出感度のはっきりと認識可能な増加をもたらす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
この発明による方法は、ウシ、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギまたはヒトなど、種々の生物由来のプリオンタンパク質を検出するのに適切である。これは、例えばヒトにおいて、あるいは家畜、生産動物および野生動物においても同様に、TSE疾患を診断することに用いることができる。
【００２２】
その最も単純な実施形態では、この方法は、スフィンゴミエリン/コレステロールに富む界面活性剤耐性膜（DRM）、すなわち脂質膜（lipid raft）と称するもの（BaronおよびCaughey, Journal Biological Chemistry 2003, Geb 19,出版前にインターネットで公開）またはカベオラ様ドメイン（CLD）（Veyら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 93, 14945-14949, 1996）が存在し、PrPcとPrPScとがグリコシルホスファチジルイノシトール（GPI）アンカーによって確実に結合され、PrPcからPrPScへの変換が促進される膜可溶化条件下でサンプルをインキュベートするステップからなる。
【００２３】
そして適切な条件下で、いわゆる自発的変換反応がPrPc/PrPSc-脂質膜相互作用によって生じ、低凝集のプロテアーゼ感受性PrPSc（sPrPSc）から高分子量のプロテアーゼ耐性PrPSc超凝集体（superaggregate）（rPrPSc）への変換を生じさせる。
【００２４】
この方法の利点は自明である：
−実施が単純、
−内因性PrPc基質の利用、
−内因的に存在し、かつ従来はプロテアーゼ消化によって失われていた低凝集のsPrPScを利用すること、および従来の検出方法の感度を増加させるために、このsPrPScを高凝集のｒPrPScへ変換すること、
−ほんのわずかな濃度のPrPSc鋳型（プロテアーゼ感受性（すなわちsPrPSc）状態）が潜在的に高含量のPrPcと共に存在する組織および、例えば軟膜等の細胞血構成成分におけるPrPScの検出に関する感度の増加。
【００２５】
この方法のステップ(a)は調査するサンプルを準備することからなる。サンプルはプリオンタンパク質を含み得る組織または体液、例えば脳、神経組織またはリンパ細網系（例えば血液または血液構成成分）に由来し得る。サンプルは通常、脂質膜保存性界面活性剤、例えばTriton X100などの非イオン性界面活性剤を含むホモジネートの形態で調製される。特に、ウシおよびヒト由来のサンプルの場合は、SDSなどのイオン性界面活性剤を添加しないことが好ましい。血液、細胞血構成成分、軟膜等の体液からなるサンプルは、プリオンタンパク質含有細胞を濃縮することによって（例えば抗血液凝固剤添加全血由来のリンパ球その他の単核細胞（例えばAccuspin System Histopaque 1077, Sigma Diagnostics）を単離することによって）調製することができる。サンプルは実質的な生理的条件下、例えばpH 6〜8および50〜500mmolのNaCl/lに対応する塩濃度で調製されることが好ましい。プロテアーゼ阻害剤、またはプロテアーゼ阻害剤の組合せ（例えばprotease inhibitor cocktail complete, Roche Diagnostics）をサンプルに添加して、サンプル中に存在する内因性プロテアーゼを不活化するのが好都合である。ホモゲナイズ後に直接サンプルを用いるか、または新鮮な（すなわち前凍結していない）サンプルを用いることが好ましい。
【００２６】
この発明の方法のステップ（b）は、プロテアーゼ感受性プリオンタンパク質PrPScが自発的にプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScへ変換する条件下でサンプルをインキュベートすることからなるのが好ましい。この自発的変換では、非病原性プリオンタンパク質PrPcがサンプル中に存在するプロテアーゼ感受性プリオンタンパク質PrPScに結合されることになる。
【００２７】
適切な場合には、それ自体がサンプル中に存在する低分子量のPrPSc凝集体と結合することができる外来の非病原性プリオンタンパク質PrPc、例えばPrPcホモジネートを、感度をさらに増大する目的でサンプルに添加することができる。サンプルに添加される物質は、ホモゲナイズ後に凍結されていない新鮮なホモジネートであることが好ましい。
【００２８】
サンプルは20〜55℃、特に35〜50℃の温度でインキュベートされるのが好ましい。インキュベーションは感度の効果的な増加を達成するのに十分な時間で行われる。インキュベーションは少なくとも10分間、例えば10〜240分、そして特に好ましくは15〜120分続けることが好ましい。適切な場合には、サンプル中に初めから存在する高分子量のPrPSc凝集体が低分子量の凝集体に分解される分解ステップをステップ（b）の前に実施することができる。例えば、そのようなステップは単一の超音波処理を含むことができる。しかし、この発明による方法がステップ(b)で形成される凝集体を分解することなく、特にあらゆる増幅サイクルなしに（すなわち、特に数回の連続的な超音波処理/インキュベーションサイクルなしに）実施されることは明確にされるものとする。
【００２９】
この発明の方法の(c)に合致するプロテアーゼは、非病原性プリオンタンパク質PrPcを切断することができるが、少なくとも高分子量の凝集体に由来するPrPScが切断に対して大方の場合耐性であるように選択される。適切なプロテアーゼの一例はプロテイナーゼKである。プロテイナーゼKを50〜100μg/mlの濃度で使用することが特に好ましい。
【００３０】
この発明の方法のステップ（d）は、サンプル中のプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScを測定することからなる。この測定は従来技術で公知のあらゆる方法を用いて定性的および/または定量的に実施することができる。適切な方法の例は、病原性プリオンタンパク質が特定の抗体との反応によって測定される免疫学的方法である。
【００３１】
特に好適な実施形態では、プリオンタンパク質はウエスタンブロット法によって測定される。このためには、サンプルを変性条件下で例えばSDS-PAGEにより電気泳動的に分画し、サンプル中に含まれるタンパク質を、例えばニトロセルロース膜またはポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜といった適切な膜にブロットする。その後、膜上のプリオンタンパク質を、直接標識することができるかまたは標識した二次抗体を用いて検出することができるポリクローナルあるいはモノクローナル抗プリオン抗体との反応によって可視化する。これに関連して、酵素的に標識すること、および検出可能な基質、例えば化学発光基質を用いることが好ましい。市販の抗プリオン抗体は実施例に明記される。
【００３２】
一方、測定は、あらゆる前電気泳動分画なしに、サンプルを適切な検出試薬と接触させるイムノアッセイによって行うことができる。イムノアッセイをプリオンタンパク質に対する固相抗体（solid phase-side antibody）（例えばビオチニル化抗体）と、プリオンタンパク質に対する標識化（例えば酵素標識化）抗体とを用いたサンドイッチアッセイとして実施するのが好ましい。検出のために、抗プリオン抗体と、標識した二次抗体としての酵素−抗体コンジュゲートとを、検出可能な酵素基質と共に用いるサンドイッチELISAを用いることが特に好ましい。
【実施例】
【００３３】
以下の実施例によってさらに本発明を説明する。
【００３４】
実施例１：自発的変換反応によるウシPrPScの増幅
延髄の閂領域から得た、BSEウシの脳ホモジネート（10％スクロース中20％,Ribolyser）（VLAケース99/00946）を氷で冷やしながら100倍に希釈した：
(a)延髄の閂領域から得た正常なウシの脳ホモジネート（protease inhibitor cocktail complete（Roche Diagnostics）と0.5％のTriton X100を含有するPBSバッファー中の10％ホモジネート）、または
(b)10%の正常なハムスターの脳ホモジネート（protease inhibitor cocktail complete（Roche Diagnostics）と0.5％のTriton X100を含有するPBSバッファー中の10％ホモジネート）。
【００３５】
ハムスターのホモジネート（ハムスターPrPc）はウシPrPcとの比較のための対照として用いた。
【００３６】
ホモジネートはHybaidセラミックビーズを含有するホモジネーション容器中でRibolyser装置を用いて調製した。protease inhibitor cocktail completeを含有するPBSバッファー中で正常な脳をホモゲナイズした後にTriton-X100を添加し、サンプルをエッペンドルフ遠心分離機中、3000gで3分間遠心分離した。
【００３７】
正常な脳由来の上清を氷浴に置き、BSEの脳ホモジネートと混合した。200μlのアリコートを以下の処理手順に供した。0分はサンプルが氷浴で維持されたことを意味する。
【００３８】
以下のサンプルを図1で調査した：
分子量マーカー：図1、レーン2；
正常なウシの脳（消化対照）：図1、レーン3；
正常なハムスターサンプルで希釈したBSEウシの脳：図1、レーン4；
正常なウシサンプルで希釈したBSEウシの脳：
室温（25℃）で0/15/30/60分間、500rpmで振とうしながら（エッペンドルフシェーカー）インキュベーション：図1、レーン5〜8；
47℃で0/15/30/60分間、500rpmで振とうしながら（エッペンドルフシェーカー）インキュベーション：図1、レーン9〜12；
ビーカー共振器（BR30）とサンプル保持装置（EH3）とを備えたマイクロ超音波処理器（microsonicator）（Bandelin Electronik, Sono plus, Berlin）を用いた単一の超音波処理（1パルス15秒、強度50％）後、47℃で0/15/30/60分間、500rpmで振とうしながら（エッペンドルフシェーカー）インキュベーション：図1、レーン13〜16。
【００３９】
以下のサンプルを図2で調査した：
分子量マーカー：図2、レーン2；
正常なハムスターの脳（消化対照）：図2、レーン2；
正常なハムスターサンプルで希釈したBSEウシの脳：
室温（25℃）で0/60分間、500rpmで振とうしながら（エッペンドルフシェーカー）インキュベーション：図2、レーン3〜4；
47℃で0/60分間、500rpmで振とうしながら（エッペンドルフシェーカー）インキュベーション：図2、レーン5〜6；
ビーカー共振器（BR30）とサンプル保持装置（EH3）とを備えたマイクロ超音波処理器（Bandelin Electronik, Sono plus, Berlin）を用いた単一の超音波処理（1パルス15秒、強度50％）後、47℃で0/60分間、500rpmで振とうしながら（エッペンドルフシェーカー）インキュベーション：図2、レーン7〜8；
正常なウシの脳（消化対照）：図2、レーン9；
ウシサンプルで希釈したBSEウシの脳：
47℃で0/15/30/60分間振とうしながらインキュベーション：図2、レーン10〜13；
単一の超音波処理および47℃で0/15/30/60分間のインキュベーション：図2、レーン14〜17。
【００４０】
この直後にサンプルをプロテイナーゼK（100μg/ml）で消化した（37℃で60分間）。反応をプロテアーゼ阻害剤PMSFを終末濃度が40mMになるように添加することによって停止した。サンプルをSDS-PAGEに供した後にPVDF膜上にエレクトロブロッティングした。膜をブロッキングし、洗浄し（Dig blocking and washing buffer reagent, Roche Diagnostics）そしてモノクローナル抗プリオン抗体L42（R-Biopharm, Darmstadt, 250 ng/ml）と共にインキュベートした（1時間、室温）。その後、ヒツジ抗マウスIgG-アルカリホスファターゼ（40mU/ml）コンジュゲートFabフラグメント（Roche Diagnostics）と共に30分間インキュベートした。膜上での反応性はCDP-Star化学発光基質の使用（10分）に続くLumilmagerシステム（Roche Diagnostics）による可視化によって明らかにした。ウエスタンブロットにおいて、モノクローナル抗プリオン抗体L42はヒト、ウシおよびヒツジのPrPとは反応しているが、ハムスターのPrPとは良い場合でも非常に弱い反応性を示している。
【００４１】
図1および2に記載した結果は、感度の著しい改善は47℃でのインキュベーションによって達成されたことを示している。感度の更なる獲得は、インキュベーション前に一度超音波処理する（sonifying）ことによって達成することができた。
【００４２】
実施例２：自発的な変換反応によるハムスターPrPScの増幅
スクレイピーハムスターの脳を滅菌した組織粉砕機を用いてハンクス平衡塩類溶液中でホモジナイズして10％のホモジネートを得た。その後ホモジネートを約2000gで15分間遠心分離し、生じた上清を−70℃で保存した。
【００４３】
正常なハムスターの脳の10％ホモジネートを、protease inhibitor cocktail（Roche Diagnostics）を含む氷冷したPBSバッファー中で、Ultraturraxホモジナイザーを用いて調製した。Triton-X100を添加して0.5％の終末濃度とし、サンプルをエッペンドルフ遠心分離機中、3000gで3分間遠心分離した。延髄の閂領域に由来するウシの脳の10％ホモジネートを対照として調製した。
【００４４】
正常な脳由来の上清をスクレイピーハムスターの脳ホモジネートと混合した（1：160、1：320）。60μlのアリコートを以下の処理ステップに供し、図3で調査した：
分子量マーカー：図3、レーン１；
正常なハムスターの脳（消化対照）：図3、レーン2；
希釈したスクレイピーハムスターの脳：
ハムスターPrPScを、対照としてのハムスターPrPcまたはウシPrPcと共に室温（25℃）で30分間、500rpmで振とうしながら（エッペンドルフシェーカー）インキュベーション：図3、レーン3と4（1：160希釈）ならびにレーン10と11（1：320希釈）；
ビーカー共振器（BR30）とサンプル保持装置（EH3）とを備えたマイクロ超音波処理器（Bandelin Electronik, Sono plus, Berlin）を用いた単一の超音波処理（各々強度50％で0.9秒の10パルス）後、47℃で60分間、500rpmで振とうしながら（エッペンドルフシェーカー）インキュベーション：図3、レーン5（1：160希釈）およびレーン12（1：320希釈）；
超音波処理/インキュベーションサイクルを2〜5回実施：図3、レーン6〜9（1：160希釈）およびレーン13〜16（1：320希釈）。
【００４５】
この直後にサンプルをプロテイナーゼK（100mg/ml）で消化した（37℃で60分間）。反応を、Pefablockを10mMの終末濃度となるまで添加することによって停止した。サンプルをSDS-PAGEに供し、その後PVDF膜上にエレクトロブロッティングした。膜をブロッキング/洗浄し（Dig blocking and washing buffer reagent, Roche Diagnostics）、モノクローナル抗プリオン抗体3F4（Signet Laboratories, USA, 500 ng/ml）と共にインキュベートし（室温で1時間）、その後ヒツジ抗マウスIgG-アルカリホスファターゼ（40mU/ml）コンジュゲートFabフラグメント（Roche Diagnostics）と共に30分間インキュベートした。膜上での反応性は、CDP-Star化学発光基質の使用（15分）に続くLumilmagerシステム（Roche Diagnostics）による可視化によって明らかにした。ウエスタンブロットにおいて、モノクローナル抗体3F4はヒトおよびハムスターのPrPとは反応しているが、ウシPrPは全く認識していない。
【００４６】
この実験結果は図3に記載されている。図中に矢印で示すように、ウエスタンブロット後、モノクローナル抗体3F4はハムスターのPrPcがレーン4および11に依然として過剰に存在している事実に起因して、SDSゲルの移動方向前面の免疫反応性ペプチド消化産物と反応している。単一の超音波処理によりPrPcの代わりにPrPScの有意な増加を生じている（レーン5/12；図中の矢印を参照）。レーン6〜9および13〜16についてはPMCA法（2〜5サイクル）を用いた。検出可能なPrPScにおける減少をレーン9と16で認めることができる。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】図1は、実施例1で行った電気泳動の結果を示す図である。
【図２】図2は、実施例1で行った電気泳動の結果を示す図である。
【図３】図3は、実施例2で行った電気泳動の結果を示す図である。
【図１】
2008532475.tif 000002
【図２】
2008532475.tif 000003
【図３】
2008532475.tif 000004
【手続補正書】
【提出日】平成17年4月18日(2005.4.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)調査するサンプルを準備するステップ、
(b)サンプル中に内因的に存在するプロテアーゼ感受性の病原性プリオンタンパク質PrPScを、これと非病原性プリオンタンパク質PrPcとを相互作用させて、形成されているPrPSc凝集体を分解させることなくプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScを生じさせることにより変換するステップであって、プロテアーゼ感受性プリオンタンパク質PrPScが自発的にプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScに変換する条件下で、20〜55℃、特に40〜50℃の温度でサンプルをインキュベーションすることを含むステップ、
(c)プロテアーゼと共にインキュベートするステップ、および
(d)サンプル中のプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScを測定するステップ
を含む、サンプル中のプリオンタンパク質PrPScを検出する方法。
【請求項２】
ウシ、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギまたはヒト由来のプリオンタンパク質を検出するための、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
サンプルが、脳、神経組織またはリンパ細網系などの組織あるいは体液に由来することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
界面活性剤含有サンプルを調査することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
インキュベーションを少なくとも10分間、特に10〜120分間継続することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（b）の前に超音波処理を実施することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
外来の非病原性プリオンタンパク質PrPcをサンプルに添加することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
同種の非病原性プリオンタンパク質PrPcを添加することを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（c）でプロテイナーゼKを用いることを特徴とする、請求項8に記載の方法。
【請求項１０】
プロテイナーゼKを50〜100μg/mlの濃度で用いることを特徴とする、請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（d）で定量的測定を行うことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ(d)における測定を、免疫学的方法を用いて行うことを特徴とする、請求項1〜11のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１３】
測定をウエスタンブロットを用いて行うことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１４】
測定をイムノアッセイを用いて行うことを特徴とする、請求項12に記載の方法。
【請求項１５】
測定をサンドイッチアッセイ、特にサンドイッチELISAを用いて行うことを特徴とする、請求項14に記載の方法。
【請求項１６】
TSE疾患を診断するための、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１７】
ヒトにおけるTSE疾患を検出するための、請求項16に記載の方法。
【請求項１８】
家畜、生産動物および野生動物におけるTSE疾患を検出するための、請求項16に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】平成19年1月30日(2007.1.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
(a)調査するサンプルを準備するステップ、
(b)サンプル中に内因的に存在するプロテアーゼ感受性の病原性プリオンタンパク質PrPScを、これと非病原性プリオンタンパク質PrPcとを相互作用させて、形成されているPrPSc凝集体を分解させることなくプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScを生じさせることにより変換するステップであって、プロテアーゼ感受性プリオンタンパク質PrPScが自発的にプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScに変換する条件下で、20〜55℃、特に40〜50℃の温度でサンプルをインキュベーションすることを含むステップ、
(c)プロテアーゼと共にインキュベートするステップ、および
(d)サンプル中のプロテアーゼ耐性プリオンタンパク質PrPScを測定するステップ
を含む、サンプル中のプリオンタンパク質PrPScを検出する方法。
【請求項２】
サンプルが脳、神経組織またはリンパ細網系などの組織あるいは体液に由来することを特徴とする、ウシ、マウス、ハムスター、ヒツジ、ヤギまたはヒト由来のプリオンタンパク質を検出する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
界面活性剤含有サンプルを調査することを特徴とする、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
インキュベーションを少なくとも10分間、特に10〜120分間継続することを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（b）の前に超音波処理を実施することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
外来の非病原性プリオンタンパク質PrPcをサンプルに添加することを特徴とする、請求項１〜5のいずれか1項に記載の方法。
【請求項７】
同種の非病原性プリオンタンパク質PrPcを添加することを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（c）でプロテイナーゼKを用い、好ましくは50〜100μg/mlの濃度で用いることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（d）で定量的測定を行うことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１０】
ステップ(d)における測定を、免疫学的方法を用いて、特にウエスタンブロット、又はサンドイッチアッセイ、特にサンドイッチELISAなどのイムノアッセイを用いて行うことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の方法。
【請求項１１】
TSE疾患、特にヒト、家畜、生産動物及び／又は野生動物におけるTSE疾患を診断するための、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
【国際調査報告】
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