(57)【要約】望ましくない新脈管構造（ＮＶ）を含む疾患の治療のための組成物および方法を提供する。本発明は、血管形成促進性生化学経路（ｐｒｏ−ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ｐａｔｈｗａｙ）の選択的阻害（ＶＥＧＦ経路遺伝子発現の阻害および罹患ＮＶ組織に局在化した阻害を含む）によってＮＶを調節する治療を提供する。ポリマー抱合体およびＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する核酸分子を含む組織標的化ナノ粒子組成物を提供する。本発明のナノ粒子組成物を、単独またはＶＥＧＦ経路アンタゴニストなどの他の治療薬と組み合わせて使用することができる。組成物および方法を、癌、眼疾患、関節炎、および炎症性疾患などのＮＶ疾患の治療のために使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの核酸薬および薬学的に許容可能なキャリアを含む薬学的組成物であって、該核酸薬が被験体においてＲＮＡ干渉を誘導し、該被験体において望ましくないか不適切な新血管形成を増強する遺伝子発現を阻害することがきる薬学的組成物。
【請求項２】
前記核酸薬がｄｓＲＮＡまたはｄｓＤＮＡのいずれかから選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が、被験体におけるＲＮＡ干渉を誘導し、該被験体において望ましくないか不適切な新血管形成を増強する少なくとも２つの遺伝子の発現を阻害することができる少なくとも２つの核酸薬を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
各遺伝子が、ＶＥＧＦ経路、ＥＧＦ経路、ＦＧＦ経路、ＨＩＦ経路、細胞増殖経路、細胞生存経路、およびその組み合わせにおける新血管形成を増強する遺伝子からなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記少なくとも１つの核酸薬が二本鎖ＲＮＡ分子を含み、各ＲＮＡ鎖が２５ヌクレオチド長である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記核酸薬が、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ  Ｒ１、ＶＥＧＦ  Ｒ２から選択されるＶＥＧＦ経路遺伝子を標的化するＲＮＡｉである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
一方のＲＮＡ鎖（センス鎖）が、
５’−ｒ（ＣＣＵＧＡＵＧＡＧＡＵＣＧＡＧＵＡＣＡＵＣＵＵＣＡ）−３’
の配列を有し、他方のＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が、
５’−ｒ（ＵＧＡＡＧＡＵＧＵＡＣＵＣＧＡＵＣＵＣＡＵＣＡＧＧ）−３’
の配列を有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
一方のＲＮＡ鎖（センス鎖）が、
５’−ｒ（ＧＡＧＡＧＡＵＧＡＧＣＵＵＣＣＵＡＣＡＧＣＡＣＡＡ）−３’
の配列を有し、他方のＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が、
５’−ｒ（ＵＵＧＵＧＣＵＧＵＡＧＧＡＡＧＣＵＣＡＵＣＵＣＵＣ）−３’
の配列を有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
一方のＲＮＡ鎖（センス鎖）が、
５’−ｒ（ＣＡＣＡＡＣＡＡＡＵＧＵＧＡＡＵＧＣＡＧＡＣＣＡＡ）−３’
の配列を有し、他方のＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が、
５’−ｒ（ＵＵＧＧＵＣＵＧＣＡＵＵＣＡＣＡＵＵＵＧＵＵＧＵＧ）−３’
の配列を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＲＮＡ干渉により、前記被験体中のｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞中のヒトＶＥＧＦタンパク質レベルが、ｓｉＲＮＡ処理から２４時間後に７５％を超えて減少する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＲＮＡ干渉により、前記被験体中のｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞中のヒトＶＥＧＦタンパク質レベルが、ｓｉＲＮＡ処理から１２０時間後に６０％を超えて減少する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記核酸薬が平滑末端化二本鎖ＲＮＡ分子であり、各ＲＮＡ鎖が２５ヌクレオチド長であり、該ＲＮＡ分子（２５塩基対のｓｉＲＮＡ）が哺乳動物の細胞または組織におけるヒトＶＥＧＦＲ２遺伝子発現を標的特異的に阻害することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
一方のＲＮＡ鎖（センス鎖）が、
５’−ｒ（ＣＣＵＣＵＵＣＵＧＵＡＡＧＡＣＡＣＵＣＡＣＡＡＵＵ）−３’
の配列を有し、他方のＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が、
５’−ｒ（ＡＡＵＵＧＵＧＡＧＵＧＵＣＵＵＡＣＡＧＡＡＧＡＧＧ）−３’
の配列を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
一方のＲＮＡ鎖（センス鎖）が、
５’−ｒ（ＣＣＣＵＵＧＡＧＵＣＣＡＡＵＣＡＣＡＣＡＡＵＵＡＡ）−３’
の配列を有し、他方のＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が、
５’−ｒ（ＵＵＡＡＵＵＧＵＧＵＧＡＵＵＧＧＡＣＵＣＡＡＧＧＧ）−３’
の配列を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
一方のＲＮＡ鎖（センス鎖）が、
５’−ｒ（ＣＣＡＡＧＵＧＡＵＵＧＡＡＧＣＡＧＡＵＧＣＣＵＵＵ）−３’
の配列を有し、他方のＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が、
５’−ｒ（ＡＡＡＧＧＣＡＵＣＵＧＣＵＵＣＡＡＵＣＡＣＵＵＧＧ）−３’
の配列を有する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ干渉により、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞中のヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質レベルが、ｓｉＲＮＡ処理から２４時間後に７５％を超えて減少する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１７】
前記ＲＮＡ干渉により、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞中のヒトＶＥＧＦＲ２タンパク質レベルが、ｓｉＲＮＡ処理から１２０時間後に６０％を超えて減少する、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１８】
前記核酸薬が平滑末端化二本鎖ＲＮＡ分子であり、各ＲＮＡ鎖が２５ヌクレオチド長であり、該ＲＮＡ分子（２５塩基対のｓｉＲＮＡ）が哺乳動物細胞におけるヒトＶＥＧＦＲ１遺伝子発現を標的特異的に阻害することができる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
一方のＲＮＡ鎖（センス鎖）が、
５’−ｒ（ＧＣＣＡＡＣＡＵＡＵＵＣＵＡＣＡＧＵＧＵＵＣＵＵＡ）−３’
の配列を有し、他方のＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が、
５’−ｒ（ＵＡＡＧＡＡＣＡＣＵＧＵＡＧＡＡＵＡＵＧＵＵＧＧＣ）−３’
の配列を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項１９】
一方のＲＮＡ鎖（センス鎖）が、
５’−ｒ（ＣＣＣＵＣＧＣＣＧＧＡＡＧＵＵＧＵＡＵＧＧＵＵＡＡ）−３’
の配列を有し、他方のＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が、
５’−ｒ（ＵＵＡＡＣＣＡＵＡＣＡＡＣＵＵＣＣＧＧＣＧＡＧＧＧ）−３’
の配列を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
一方のＲＮＡ鎖（センス鎖）が、
５’−ｒ（ＣＣＵＣＡＡＧＡＧＣＡＡＡＣＧＵＧＡＣＵＵＡＵＵＵ）−３’
の配列を有し、他方のＲＮＡ鎖（アンチセンス鎖）が、
５’−ｒ（ＡＡＡＵＡＡＧＵＣＡＣＧＵＵＵＧＣＵＣＵＵＧＡＧＧ）−３’
の配列を有する、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２１】
前記ＲＮＡ干渉により、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞中のＶＥＧＦＲ１タンパク質レベルが、ｓｉＲＮＡ処理から２４時間後に７５％を超えて減少する、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＲＮＡ干渉により、ｓｉＲＮＡトランスフェクト細胞中のヒトＶＥＧＦＲ１タンパク質レベルが、ｓｉＲＮＡ処理から１２０時間後に６０％を超えて減少する、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
少なくとも３つの２５マーのｓｉＲＮＡオリゴを含み、該オリゴがｈＶＥＧＦ、ｈＶＥＧＦＲ１、およびｈＶＥＧＦＲ２の発現を阻害する、請求項２に記載の組成物。
【請求項２４】
少なくとも３つのｓｉＲＮＡオリゴを含み、該オリゴがｈＶＥＧＦ、ｈＥＧＦ、およびｈＰＤＧＦ、ならびにその受容体からなる群から選択される３つの遺伝子の発現を阻害する、請求項２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記核酸薬が標的化合成ベクターである、請求項１に記載の組成物。
【請求項２６】
前記ベクターが、腫瘍の新脈管構造に標的化されている、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
前記ベクターが標的化ペプチド、ホモ二官能型活性化ＰＥＧリンカー、およびポリアミン含有薬を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
前記標的化ペプチドがＲＧＤペプチドである、請求項２７に記載の組成物。
【請求項２９】
前記ベクターが、ホモ二官能型活性化ＰＥＧ、ＲＧＤ−２Ｃペプチド、ポリアミン含有薬、およびｓｉＲＮＡ分子の混合物から調製された自己アセンブリベクターである、請求項２８に記載の組成物。
【請求項３０】
望ましくないか不適切な新血管形成に関連する遺伝子経路の機能を阻害する非核酸治療薬をさらに含む、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
前記治療薬がモノクローナル抗体である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記抗体がＶＥＧＦに結合する、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
被験体の望ましくないか不適切な新血管形成に関連する疾患を治療する方法であって、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の組成物を該被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項３４】
被験体の望ましくないか不適切な新血管形成に関連する疾患を治療する方法であって、望ましくないか不適切な新血管形成に関連する遺伝子経路の機能を阻害する非核酸治療薬と組み合わせた請求項１〜２９のいずれか１項に記載の組成物を、該被験体に投与する工程を含む方法。
【請求項３５】
前記治療薬がモノクローナル抗体である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記抗体がＶＥＧＦに結合する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記新血管形成が腫瘍組織、眼区分、または関節組織である、請求項３３または３４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年４月１２日に出願された米国特許出願第６０／６７０，７１７号の利益を請求しており、その内容は、その全体が本明細書中に参考として援用される。本出願はまた、以下の出願に関連し、その内容もまた、その全体が参考として援用される：ＰＣＴ／ＵＳ０３／２４５８７、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｏｆ  Ｄｏｗｎ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｂｙ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３８５７、ＲＮＡｉ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｆｏｒ  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｙｅ  Ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；ＰＣＴ／ＵＳ２００５／００３８５８、Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ＲＮＡｉ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は、望ましくない新脈管構造（ＮＶ）、しばしば、血管の異常または過剰な増殖および成長を含む疾患の治療のための組成物および方法を提供する。ＮＶ自体の発達は、多くの場合、不都合な結果を招くか、疾患の初期段階であり得る。血管形成の新規の治療アンタゴニスト（ＶＥＧＦ経路のアンタゴニストを含む）の導入にもかかわらず、ＮＶを調節するための眼の治療は不十分であり、疾患の進行を阻害するか望ましくない血管形成を逆転するためのＮＶの有効な治療法に対するニーズ満たされていないものが多くあり、これが増大しつつある。ＮＶが正常な生物学的過程でもあり得るので、好ましくは、望ましくないＮＶの阻害は罹患組織に対して選択的に行われ、好ましくは、罹患組織への治療分子の選択的送達が必要である。
【０００３】
本発明は、血管形成促進性生化学経路の選択的阻害（ＶＥＧＦ経路遺伝子発現の阻害および罹患ＮＶ組織に局在化した阻害を含む）によってＮＶを調節する治療を提供することによってこの困難を克服する。本発明は、ポリマー抱合体を含み、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を誘導する核酸分子をさらに含む組織標的化ナノ粒子組成物およびその使用方法を提供する。本発明は、ＮＶ、より好ましくはＶＥＧＦ経路で活性な各遺伝子または遺伝子の組み合わせの阻害のための組成物および方法を提供する。本発明のｄｓＲＮＡナノ粒子組成物を、単独または他の治療薬（標的化治療薬（モノクローナル抗体および小分子インヒビターなどのＶＥＧＦ経路アンタゴニストを含む）ならびにＥＧＦおよびその受容体、ＰＤＧＦおよびその受容体、ＭＥＫ、またはＢｃｒ−Ａｂｌを阻害する標的化治療薬）、免疫療法、および化学療法と組み合わせて使用することができる。本発明はまた、被験体のＮＶ疾患（癌、眼疾患、関節炎、および炎症性疾患を含む）の治療のための組成物および方法を提供する。
【背景技術】
【０００４】
（発明の背景）
最近の米国ＦＤＡ承認治療薬（アバスチンおよびマキュゲン（Ｍａｃｕｇｅｎ）を含む）は、ＮＶ疾患にいくらかの利点がある。いくつかのこれらの薬剤は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）への結合およびその作用の阻害によって作用するが、これらの薬剤は多くの患者で有効ではない。臨床研究で評価された他の薬剤は、ＶＥＧＦの受容体またはシグナル伝達のためにこれらの受容体によって使用される「下流」タンパク質への結合およびその作用の阻害によっていくつかの利点を得ることができるという徴候を示す。このＶＥＧＦ「経路」を調節するための手段によってＮＶレベルを調製することができ、患者によっては利点が得られるというのが現状である。さらに、一連の小分子キナーゼインヒビターについての研究により、複数のキナーゼタンパク質、ＶＥＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＦＬＴ３、およびＫｉｔに活性を有するスニチニブと呼ばれるインヒビターがＮＶ疾患に対してより良好な臨床的利点を付与することが見出された。しかし、これらの利点は、ほとんどの患者で依然として不適切であり、ＶＥＧＦ経路を調節するためのより良好な治療手段が依然として必要である。現在開発されている薬剤のほとんどがＶＥＧＦまたはその受容体（ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２）のアンタゴニストである。アンタゴニストの使用によって生じる１つの問題は、ＶＥＧＦ産生を増加させるための、罹患組織による応答のようである。したがって、ＮＶの治療的調節を改良するための魅力的な手段は、ＶＥＧＦ経路のタンパク質の産生を阻害する、すなわち、その遺伝子発現を下方制御することであり、小さな干渉ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）のインビボ送達によるＲＮＡ干渉の誘導によってこれを行う。
【０００５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、二本鎖ＲＮＡが配列特異的様式で遺伝子発現を阻害する転写後過程である。ＲＮＡｉ過程は、少なくとも以下の２つの工程で起こる。第１の工程中に、内因性リボヌクレアーゼによって長いｄｓＲＮＡがより短い２１または２３ヌクレオチド長のｄｓＲＮＡに切断される。他方の第２の工程では、より小さなｄｓＲＮＡが適合配列を有するｍＲＮＡ分子の分解を媒介し、結果として、この遺伝子の発現が選択的に下方制御される。このＲＮＡｉ効果を、細胞内の標的配列へのより長い二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）またはより短い小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）のいずれかの導入によって達成することができる。最近、標的遺伝子に相補的なｄｓＲＮＡを生成するプラスミドの導入によってＲＮＡｉを達成することもできることが証明された。
【０００６】
ＲＮＡｉ法は、ショウジョウバエ（２０、２２、２３、２５）、線虫（１４、１５、１６）、およびゼブラフィッシュ（２０）の遺伝子融合決定実験で首尾よく使用されている。これらのモデル生物では、化学合成されたより短いｓｉＲＮＡまたはインビトロで転写されたより長いｄｓＲＮＡの両方が標的遺伝子配列を有効に阻害することができると報告されている。非ヒト哺乳動物およびヒトの細胞培養物でＲＮＡｉ効果が首尾よく達成される方法が報告されている（３９〜５６）。しかし、ＲＮＡｉ効果は、成体動物モデルで見出すのが困難であった（５７）。これはいくつかの理由：哺乳動物細胞への長い二本鎖ＲＮＡの導入によって抗ウイルス免疫応答（インターフェロンの上方制御を含む）を誘発し、所望の治療効果に対して有害または有利であり得る細胞のアポトーシスおよび死滅が起こり得ること：標的細胞（特に、動物）へのｄｓＲＮＡ侵入効果が低いこと；短いｄｓＲＮＡ分子が血液から尿に急速に排出されること；ＲＮアーゼのヌクレアーゼ活性によってＲＮＡ分子を分解することができることを含む；のためである。ＲＮＡｉが遺伝子標的の確認および核酸療法の両方に適用される可能性があるにも関わらず、動物疾患モデルへのＲＮＡｉ分子の不十分な送達により、テクノロジーの進行の妨げとなっている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、インビボでのＲＮＡｉ分子の送達方法の改良が非常に重要であることが明らかである。ＲＮＡｉを誘導する核酸分子の組織標的化送達が非常に重要であることも明らかである。ＶＥＧＦ経路遺伝子に対して選択的なＲＮＡｉを誘導する核酸分子の送達方法がＮＶ疾患の治療に非常に有利であることも明らかである。本発明の組成物および方法によってこれらのニーズに対処する。
【０００８】
（発明の要旨）
したがって、本発明の目的は、ＮＶ病理発生に関連する遺伝子発現、より詳細には、ＶＥＧＦ経路中の遺伝子発現の下方制御によって疾患の進行を逆転するために血管形成過程を調整するためにＲＮＡｉを利用することである。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、哺乳動物における１つまたは複数のＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法を提供することである。本発明のさらなる目的は、１つまたは複数のＶＥＧＦ経路遺伝子のみまたは他の薬剤（同一のＶＥＧＦ経路のアンタゴニストを含む）との組み合わせの発現の阻害によってＮＶ疾患を治療するための組成物および方法を提供することである。
【００１０】
これらの目的の達成のために、二本鎖ＲＮＡ分子を含む組成物を哺乳動物の組織に投与する工程と、前記ＲＮＡ分子が内因性ＶＥＧＦ経路遺伝子の発現を特異的に減少または阻害することとを含む、内因性ＶＥＧＦ経路遺伝子を下方制御するための組成物および方法を提供した。内因性遺伝子のこの下方制御を、ＶＥＧＦ経路の活性に起因するかこれによって悪化する疾患の治療に使用することができる。疾患は、ヒト疾患においてであり得る。
【００１１】
医薬品有効成分（ＡＰＩ）として処方物に関連するｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む核酸組成物を適用する工程を含み、処方物がポリマーを含むことができ、核酸組成物がＶＥＧＦ経路遺伝子発現を減少させて疾患におけるＮＶを阻害することができる、望ましくないＶＥＧＦ経路遺伝子発現に関連する哺乳動物疾患を治療する方法も提供した。疾患は、癌または前癌状態の成長であり得、組織は、例えば、腎臓組織、乳房組織、結腸組織、前立腺組織、肺組織、または卵巣組織であり得る。
【００１２】
本明細書中で使用するとき、「オリゴヌクレオチド」およびこれに基づいた類似の用語は、天然に存在するヌクレオチドから構成される短いオリゴおよび合成または修飾されたヌクレオチドから構成されるオリゴに関する。オリゴヌクレオチドは、１０またはそれを超えるヌクレオチド長、１５、１６、１７、１８、１９、２０、またはそれを超えるヌクレオチド長、２１、２２、２３、２４、またはそれを超えるヌクレオチド長、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれを超えるヌクレオチド長、３５またはそれを超えるヌクレオチド長、４０またはそれを超えるヌクレオチド長、４５またはそれを超えるヌクレオチド長、約５０までのヌクレオチド長であり得る。
【００１３】
ｓｉＲＮＡであるオリゴヌクレオチドは、１５ヌクレオチドと３０ヌクレオチドとの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。多くの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、１９ヌクレオチドと２７ヌクレオチドとの間の任意の数のヌクレオチドを有し得る。
【００１４】
多くの実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２つの平滑末端、２つの付着末端、または１つの付着末端を含む１つの平滑末端を有し得る。付着末端のオーバーハングヌクレオチドは、１〜４つまたはそれを超えるヌクレオチドの範囲であり得る。
【００１５】
好ましい実施形態では、本発明は、平滑末端を有する２５塩基対のｓｉＲＮＡを提供する。
【００１６】
用語「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」を、本明細書中で同意語として使用する。
【００１７】
組成物は、高分子キャリアをさらに含み得る。高分子キャリアは、ＲＮＡ分子に結合してナノ粒子を形成するカチオン性ポリマーを含み得る。カチオン性ポリマーは、例えば、ヒスチジン残基およびリジン残基を含むアミノ酸コポリマーであり得る。ポリマーは、分岐ポリマーを含み得る。組成物は、標的化合成ベクターを含み得る。合成ベクターは、核酸キャリアとしてカチオン性ポリマー、立体保護物質として親水性ポリマー、標的細胞選択薬として標的化（またはターゲティング（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ））リガンドを含み得る。ポリマーは、ポリエチレンイミンもしくはポリヒスチジン−リジンコポリマー、または核酸キャリアモジュールとして使用することができるポリリジン修飾された化学的ポリカチオン性キャリアもしくは他の有効なポリカチオン性キャリアを含み得る。親水性ポリマーは、ポリエチレングリコール、ポリアセタール、またはポリオキサゾリンを含み得る。標的化リガンドは、ＲＧＤ配列、糖、もしくは糖アナログ、ｍＡｂもしくはｍＡｂのフラグメント、または任意の他の有効な標的化部分を含むペプチドを含み得る。
【００１８】
これらの方法のいずれかでは、組織に組成物と実質的に同時に、または組成物の適用の後で電場を印可することができる。本発明の組成物および方法は、内因性ＶＥＧＦ経路遺伝子または変異内因性遺伝子と適合する配列を有するｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを含み、変異遺伝子中の少なくとも１つの変異が遺伝子のコード領域または調節領域中に存在し得る。これらの方法のいずれかでは、内因性遺伝子は、ＶＥＧＦ経路遺伝子（成長因子遺伝子、タンパク質セリン／トレオニンキナーゼ遺伝子、タンパク質チロシンキナーゼ遺伝子、タンパク質セリン／トレオニンホスファターゼ遺伝子、タンパク質チロシンホスファターゼ遺伝子、受容体遺伝子、および転写因子遺伝子を含む）からなる群から選択され得る。選択された遺伝子は、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｒ１、ＶＥＧＦ−Ｒ２、ＶＥＧＦ−Ｒ３、ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８９、ＶＥＧＦ２０６、ＲＡＦ−ａ、ＲＡＦ−ｃ、ＡＫＴ、Ｒａｓ、ＮＦ−Ｋｂからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子を含み得る。選択された遺伝子は、ＮＶに関連する他の生化学経路由来の１つまたは複数の遺伝子（ＨＩＦ、ＥＧＦ、ＥＧＦｒ、ｂＦＧＦ、ｂＦＧＦｒ、ＰＤＧＦ、およびＰＤＧＦｒを含む）を含み得る。選択された遺伝子は、ＮＶと組み合わせて操作される他の生化学経路由来の１つまたは複数の遺伝子（Ｈｅｒ−２、ｃ−Ｍｅｔ、ｃ−Ｍｙｃ、およびＨＧＦを含む）を含み得る。
【００１９】
本発明はまた、複数の遺伝子（ｓｉＲＮＡのカクテル（ｓｉＲＮＡ−ＯＣ）を含む）を阻害するためにＲＮＡｉを誘導する核酸薬（ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ａｇｅｎｔ）のための組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、実質的に同時に複数の遺伝子を阻害することができるか、複数の遺伝子を連続的に阻害することができる。好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡ−ＯＣ薬は、３つのＶＥＧＦ経路遺伝子（ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２）を阻害する。別の好ましい実施形態では、ｓｉＲＮＡ−ＯＣを、実質的に同時に投与する。本発明は、標的化された遺伝子ｍＲＮＡ中の配列とのｓｉＲＮＡ配列の広範な適合に由来する遺伝子阻害選択性を有する薬剤を提供する。ＶＥＧＦ経路中の異なる遺伝子を阻害する実質的に類似の物理化学的性質を有するｓｉＲＮＡ薬も提供する。ｓｉＲＮＡ配列と大きく異なるナノ粒子組成物も提供する。複数の内因性遺伝子のインヒビターで治療することができるヒト疾患、具体的にはＮＶ関連疾患の治療方法も提供する。ある場合には実質的に同時に投与し、他の場合には連続的に投与する治療薬の組み合わせによるヒト疾患の治療方法も提供する。
【００２０】
本発明の１つの態様は、癌、関節炎、失明、感染症、および炎症性疾患のための組成物および方法を提供する。本発明の別の態様では、ＲＮＡｉ誘導する核酸薬を、同一の治療レジメンで他の治療薬（小分子およびモノクローナル抗体（ｍＡｂ）などであるが、これらに限定されない）と組み合わせて使用する。
【００２１】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかとなるであろう。しかし、詳細な説明および特定の例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、本発明の精神および意図の範囲内での種々の変更および修飾がこの詳細な説明から当業者に明らかとなるので、例示のみを目的として記載していると理解すべきである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（詳細な説明）
本発明は、典型的には、複数のタンパク質の特性、異常に過剰発現した病因因子、および病因タンパク質の複数の機能障害によって特徴づけられるＮＶ疾患の治療のための組成物および方法を提供する。本発明は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を活性化するｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドなどの核酸薬を提供し、この核酸薬は配列特異的様式の遺伝子発現の高選択的インヒビターである。本発明は、タンパク質活性の調整（タンパク質発現レベルおよびタンパク質の転写後修飾の減少を含む）によるＮＶ阻害を提供する。
【００２３】
癌では、腫瘍形成過程は、他のタンパク質の過小発現も重要な役割を果たすが、癌遺伝子、血管形成因子、成長因子、および変異腫瘍抑制因子の異常な過剰発現の結果であると考えられている。ｓｉＲＮＡ分子がインビトロおよびインビボの両方で腫瘍形成遺伝子を「ノックダウンする」ことができ、有意な抗腫瘍効果が得られるという概念が多くの証拠によって支持される。本発明の組成物および方法は、ヒトＶＥＧＦ経路遺伝子配列を特異的に標的化するｓｉＲＮＡの腫瘍内送達を使用して、４０〜８０％の腫瘍成長阻害が達成される、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５細胞、および１４８３細胞誘導性異種移植片腫瘍モデルにおけるヒトＶＥＧＦの実質的ノックダウンを証明する。ＶＥＧＦ経路遺伝子発現の阻害は、腫瘍の微小血管系を変化させ、腫瘍細胞のアポトーシスを活性化し、細胞傷害性化学療法薬の有効性を増強することができる抗血管形成効果を誘導することが認識される。しかし、抗血管形成薬および化学療法薬の抗腫瘍有効性を有意に改良するために、多くの場合に全身投与によって高濃度の薬物が局所的に腫瘍組織に蓄積するような有効性の高い送達方法が必要である。
【００２４】
本発明者らは、どの標的が疾患経路を調節するのかを決定し、それによって薬物開発の試みを有効にする薬物の標的を立証する方法を記載している（ＰＣＴ／ＵＳ０２／３１５５４を参照のこと）。本発明者らはまた、動物組織への核酸の送達に適切なテクノロジーを記載している。ＷＯ０１／４７４９６号（その内容全体が本明細書中で参考として援用される）を参照のこと。これらの方法は、核酸を投与し、「標準」ヌクレオチド送達試薬と比較して、有効性を有意に増加させる（例えば、７倍）ことができる。したがって、本方法は、組織中で強い核酸活性（候補標的タンパク質活性を含む）を提供する。このプラットフォームは、組織中の候補遺伝子を立証するための強力なツールである。
【００２５】
さらに、本発明者らは、動物組織で遺伝子サイレンシングを行うためにこれらの方法を使用した。遺伝子サイレンシングは、候補標的遺伝子の立証および治療方法として非常に望ましい。最近、二本鎖ＲＮＡが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれる現象によって遺伝子特異的サイレンシングを誘導することが証明された。ＲＮＡｉの機構は依然として完全に理解されていないが、初期の結果により、種々の細胞型（哺乳動物細胞を含む）においてインビトロでＲＮＡｉ効果を達成することができることを示唆している。標的ｍＲＮＡに対して標的化された二本鎖ＲＮＡにより、標的を分解し、それにより、対応する遺伝子のサイレンシングを引き起こす。巨大な二本鎖ＲＮＡは、酵素ダイサーを含むＲＮアーゼＩＩＩ様活性によって２１〜２３ヌクレオチド長のより小さなフラグメントに切断される。ｓｉＲＮＡとして公知のこれらのより短いフラグメント（小さな干渉ＲＮＡ）がｍＲＮＡの切断を媒介すると考えられている。
【００２６】
最近、ＲＮＡｉ機構による遺伝子の下方制御が線虫および他の下等生物で研究されているにも関わらず、培養物中での哺乳動物におけるその有効性についてはごく最近になって証明された。ホタルルシフェラーゼ遺伝子レポーター系を使用してマウスにおいてＲＮＡｉ効果が最近証明された。ヒト疾患を治療するための核酸治療薬の研究および臨床応用のためにインビボでの遺伝子阻害についてのＲＮＡｉテクノロジープラットフォームを開発するために、本発明者らは、マウス疾患モデルにおいていくつかのインビボ研究を行った。これらの実験では、腫瘍関連リガンド（ヒトＶＥＧＦ）または受容体（マウスＶＥＧＦＲ２）を標的化するｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡのいずれかを、異種移植されたヒトＭＣＦ−７由来腫瘍またはヒトＭＤＡ−ＭＢ−４３５腫瘍を保有するヌードマウスに送達した。本発明者らは、初めて、ＲＮＡｉが腫瘍細胞中の標的遺伝子をインビボで有効にサイレンシングし、結果として、腫瘍成長を阻害することができることを証明することができた。
【００２７】
本発明者らは、ＶＥＧＦ経路遺伝子を阻害するｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを使用した広範な種々のＮＶ疾患の治療のための組成物および治療方法を初めて得た。発明を本明細書中に詳述するが、当業者は発明の全範囲を認識するだろう。
【００２８】
Ａ．ＶＥＧＦ経路遺伝子阻害のための強力なｓｉＲＮＡ
本発明は、種々の物理化学的構造を有するＶＥＧＦ経路遺伝子配列を標的化して阻害する核酸薬を提供する。本発明の１つの好ましい実施形態は、３’オーバーハングを有する１９塩基対のｄｓＲＮＡおよび平滑末端を有する２５塩基対のｄｓＲＮＡを含むｓｉＲＮＡと呼ばれる核酸薬を使用する。平滑末端を有する２５塩基対のｄｓＲＮＡを含む本発明のｓｉＲＮＡは、最も強力なインヒビターのうちのいくつかであり、最も長い阻害持続時間を有することが多い。したがって、天然に存在しない化学的アナログ（ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡキメラオリゴヌクレオチドの２’−Ｏ−メチルリボースアナログ、ならびに核酸オリゴヌクレオチドの他の化学的アナログを含む）の組み込みが本発明で有用である。ｓｉＲＮＡのセンス鎖中に２’−Ｏ−メチルリボースを含むか含まず、且つヒトＶＥＧＦ配列を標的化する２５塩基対のｓｉＲＮＡは、ＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５細胞および動物における腫瘍成長において７０〜８０％までの強力且つ持続可能な効果を示す。ＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５細胞培養物におけるこの阻害効果は、５日間持続した。本発明によって提供された１つの態様は、ヒト遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡであり、コードされた配列も他の哺乳動物種（他の霊長類、マウス、およびラットなどであるが、これらの種に限定されない）を標的化する。当業者に周知の方法を使用して、本発明によって提供されるｓｉＲＮＡを同定および選択することができる。ＶＥＧＦ経路遺伝子を標的化する多くの他のｓｉＲＮＡ型が本発明によって提供され、他のｓｉＲＮＡ型が当業者に理解される。
ａ．ヒトＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ：
２５塩基対の平滑末端：
【００２９】
【化１】
2008537752.tif 000002
【００３０】
【化２】
2008537752.tif 000003
３’に２つのヌクレオチド（ＴＴ）オーバーハングを有する１９塩基対：
【００３１】
【化３】
2008537752.tif 000004
ｂ．ヒトＶＥＧＦ受容体１特異的ｓｉＲＮＡ：
２５塩基対の平滑末端：
【００３２】
【化４】
2008537752.tif 000005
３’に２つのヌクレオチド（ＴＴ）オーバーハングを有する１９塩基対：
【００３３】
【化５】
2008537752.tif 000006
ｃ．ヒトＶＥＧＦ受容体２特異的ｓｉＲＮＡ：
２５塩基対の平滑末端：
【００３４】
【化６】
2008537752.tif 000007
３’に２つのヌクレオチド（ＴＴ）オーバーハングを有する１９塩基対：
【００３５】
【化７】
2008537752.tif 000008
２５塩基対のｓｉＲＮＡオリゴは、ヒトおよびマウスの両方由来の対応する遺伝子を標的化することができる
別の実施形態では、２５塩基対のｓｉＲＮＡ配列を、対応するｍＲＮＡ配列に対して選択した（ヒトＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、およびＥＧＦＲ遺伝子を含む）。選択された配列は、ヒト遺伝子に特異的なだけでなく、対応するマウス遺伝子にも特異的である（ヒトＶＥＧＦｍＲＮＡに対する配列は、マウスＶＥＧＦｍＲＮＡに対する配列でもあることなど）。
【００３６】
抗腫瘍有効性が腫瘍組織中のヒト遺伝子およびマウス遺伝子のノックダウンに依存するので、２５塩基対のｓｉＲＮＡオリゴは、マウス異種移植片腫瘍研究に非常に有用である。例えば、腫瘍細胞（ヒト起源）および内皮細胞（マウス起源）の両方由来のＶＥＧＦ発現の、両配列を標的化するｓｉＲＮＡオリゴでのノックダウンにより、より良好な抗腫瘍有効性が得られる。
【００３７】
一方で、実際の薬物を毒物学および過剰投与（ｅｘａｇｇｅｒａｔｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）の両方について試験するので、試験動物（例えば、マウスまたはサル）およびヒトの遺伝子由来の両遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡオリゴを使用した毒性研究は非常に有用である。
【００３８】
以下の配列は、ヒト遺伝子およびマウス遺伝子の両方由来のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ１、ＰＤＧＦＲ−α、ＰＤＧＦＲ−β、およびＥＧＦＲのｍＲＮＡを標的化する２５塩基対のｓｉＲＮＡオリゴ配列であり、これらのうちのいくつかはそのサルおよびイヌ対応物を標的化することもできる。
【００３９】
ヒト、マウス、ラット、マカクザル、イヌのＶＥＧＦｍＲＮＡ配列を標的化する２５塩基対のＶＥＧＦｓｉＲＮＡ
【００４０】
【化８】
2008537752.tif 000009
【００４１】
【化９】
2008537752.tif 000010
ヒトおよびマウスのＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡ配列の両方を標的化する２５塩基対のＶＥＧＦＲ２ｓｉＲＮＡ配列
【００４２】
【化１０】
2008537752.tif 000011
ヒトおよびマウスのＶＥＧＦＲ１ｍＲＮＡ配列の両方を標的化する２５塩基対のＶＥＧＦＲ１ｓｉＲＮＡ配列
【００４３】
【化１１】
2008537752.tif 000012
【００４４】
【化１２】
2008537752.tif 000013
ヒトおよびマウスのＰＤＧＦＲ−αの両方を標的化する２５塩基対のｓｉＲＮＡ配列
【００４５】
【化１３】
2008537752.tif 000014
【００４６】
【化１４】
2008537752.tif 000015
ヒトおよびマウスのＰＤＧＦＲ−βの両方を標的化する２５塩基対のｓｉＲＮＡ配列
【００４７】
【化１５】
2008537752.tif 000016
ヒトおよびマウスのＥＧＦＲの両方を標的化する２５塩基対のｓｉＲＮＡ配列
【００４８】
【化１６】
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別の実施形態は、同一の薬物ペイロード（ｐａｙｌｏａｄ）におけるこれらのオリゴの組み合わせの使用である。疾患過程に関与する３つまたはそれを超える遺伝子を標的化する３つまたはそれを超える２５塩基対のｓｉＲＮＡを、同一のナノ粒子中にパッケージングし、同一の投与経路（または異なる経路）によって送達させた場合、複数の遺伝子発現のノックダウンによって特定の腫瘍形成経路を有効に遮断することができるので、この治療はより有効である。以下の組み合わせを、本明細書に適用した同一の一般的原理を使用して、さらに拡大することができる。
【００４９】
２５塩基対のｓｉＲＮＡオリゴ（それぞれが、ヒトおよびマウスの両方由来の対応する遺伝子を標的化することができる）の組み合わせは、より強い治療（多標的化）効果を達成することができる：
１．ＶＥＧＦ経路の標的化：
【００５０】
【化１７】
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ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２を標的化する２５塩基対のｓｉＲＮＡオリゴとの多くの他の組み合わせを、最良の抗血管形成効果を得るために、同一または異なる比率の各成分のいずれかによって構成することができる。
【００５１】
２．ＶＥＧＦおよびＥＧＦ経路の両方の標的化：
【００５２】
【化１８】
2008537752.tif 000019
ｓｉＲＮＡオリゴの異なる組成および同等または異なる比率を有するこれらの３つの遺伝子を標的化する他の配列との多くの他の組み合わせを作製することができる。
【００５３】
３．ＶＥＧＦ、ＰＤＧＦ、およびＥＧＦ経路の標的化：
【００５４】
【化１９】
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【００５５】
【化２０】
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ｓｉＲＮＡオリゴの異なる組成および同等または異なる比を有するこれらの３つの遺伝子を標的化する他の配列との多くの他の組み合わせを作製することができる。
【００５６】
３つを超える配列との組み合わせを作製することもできる。
【００５７】
【化２１】
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【００５８】
【化２２】
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Ｂ．ＶＥＧＦ経路遺伝子阻害の組み合わせ
ＮＶ阻害のための本発明の組成物および方法の開発時に多数の要因を検討した。第１に、ＮＶ疾患は複雑であり、複数のタンパク質、異常に過剰発現した疾患に起因する遺伝子、および疾患に起因するタンパク質の複数の機能障害の結果である。第２に、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を活性化する核酸薬は、配列特異的様式で遺伝子発現を高度に選択するインヒビターである。第３に、タンパク質活性の調整によるＮＶの阻害を、多数の方法（タンパク質機能の阻害（アンタゴニスト）、タンパク質機能の刺激（アゴニスト）、タンパク質発現レベルの減少、およびタンパク質の転写後修飾を含む）によって行うことができる。ＮＶ疾患の処置は、理想的には、疾患の進行に極めて重要な特定の生物学的経路を有効に遮断するための高度な治療作用（リガンドおよびその受容体の両方の機能の同時遮断、受容体活性および下流シグナル伝達タンパク質の同時遮断、ならびに経路の冗長な要素の同時遮断を含む）が必要である。これは、ＮＶ疾患およびＶＥＧＦ経路に当てはまる。
【００５９】
しかし、２つ、３つ、またはそれを超えるタンパク質に選択性を示す１つの薬剤の同定は、不可能ではないが、困難であり、しばしば実用的ではない。この困難を克服するために、現代医学では薬物の組み合わせを使用する傾向がある。腫瘍学への適用において、化学療法薬の組み合わせが顕著な抗癌有効性を達成している。１つの例は、前立腺癌由来の複数の骨転移を有する口腔咽頭癌の治療のためのドセタキセル、イフォスファミド、およびシスプラチンの併用療法の使用である（２）。他の治療領域では、別の例は、コルチコステロイド、メトロニダゾール、およびバンコマイシンの組み合わせを使用した潰瘍性大腸炎の治療である（３）。不十分に制御された２型糖尿病の治療のために、グリメピリド（ｇｌｉｍｅｐｉｒｉｄｅ）とメトホルミンとの組み合わせ療法へのロシグリタゾン添加の有効性および安全性が評価された（４）。
【００６０】
臨床研究で顕著な治療有効性が証明されているにもかかわらず、供給源の相違、製造過程の相違、および化学的性質の相違に起因するより高い投薬量の毒性および長期使用の安全性は常に大きな懸念材料である。これらの問題を克服するために、本発明の１つの態様は、同一治療において複数の病原遺伝子を標的化するためにｓｉＲＮＡの組み合わせを使用した、組み合わせ効果を達成するために固有の利点を提供するためのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド遺伝子インヒビターの使用である。本発明によって得られる１つの利点は、全てのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドが化学的および薬理学的に非常に類似しており、同一の供給源および同一の製造過程に由来し得るという結果である。本発明によって得られる別の利点は、複数のｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドをナノ粒子調製物などの１つの調製物中に処方することができることである。
【００６１】
したがって、本発明の１つの態様は、複数のＶＥＧＦ経路遺伝子の特異的且つ選択的阻害を達成し、その結果としてＮＶ疾患の阻害およびより良好な臨床的利点を達成するためにｓｉＲＮＡ薬を組み合わせることである。本発明は、多くのｓｉＲＮＡ標的化の組み合わせ（その受容体（ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）を含む）、並行（ｐａｒａｌｌｅｌ）成長因子（ＰＤＧＦおよびＥＧＦを含む）およびその受容体、下流シグナル伝達因子（ＲＡＦおよびＡＫＴを含む）、および転写因子（ＮＦＫＢを含む）、ならびにその組み合わせとのＶＥＧＦ自体を標的化する組み合わせを含む）を提供する。好ましい実施形態は、ＶＥＧＦを阻害するｓｉＲＮＡとその受容体ＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ１）およびＶＥＧＦＲ２（ＫＤＲ）の２つとの組み合わせである。別の好ましい実施形態は、ＶＥＧＦを阻害するｓｉＲＮＡおよびその受容体、ＰＤＧＦおよびその受容体、ならびにＥＧＦおよびその受容体との組み合わせである。さらに別の好ましい実施形態は、ｓｉＲＮＡ阻害ＶＥＧＦおよびその受容体と下流シグナル伝達との組み合わせである。
【００６２】
ＮＶ疾患治療のための治療薬としてｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを組み合わせることができる。本発明の１つの実施形態では、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドを、カクテルとして共に混合することができ、別の実施形態では、これらを同一の経路または異なる経路および処方によって連続的に投与することができ、さらに別の実施形態では、いくつかをカクテルとして投与し、いくつかを連続的に投与することができる。ＮＶ疾患を治療するためのｓｉＲＮＡの他の組み合わせおよびその組み合わせ方法が当業者に理解されているであろう。
【００６３】
Ｃ．ＶＥＧＦ経路のアンタゴニストと遺伝子阻害との組み合わせ
疾患は、複雑であり、且つ複数の病理学的過程が存在することが多く、さらに、病微の重症度が多様であり、これらが患者によって変動することが多い。多くの疾患は、病因遺伝子もしくは疾患調節遺伝子の異常な過剰発現、外来感染性生物、またはその両方に起因する。疾患の進行、長期治療に対する減少した応答の発達、および薬物耐性も単剤治療または様式の臨床的利点を制限する。このような制限を克服するための１つの手段は、治療と薬物との組み合わせの使用による。
【００６４】
したがって、本発明の１つの態様は、ＮＶ疾患の強く、持続可能で、頑強な阻害および優れた臨床的利点を達成するためにｓｉＲＮＡ薬を他の薬剤と組み合わせることである。本発明は、ｓｉＲＮＡ薬の他の薬剤との複数の組み合わせ（ＶＥＧＦ自体およびその受容体のための治療ｓｉＲＮＡとＶＥＧＦ自体のアンタゴニストおよびその受容体（アバスチンなど）との組み合わせを含む）を提供する。本発明はまた、治療ｓｉＲＮＡ薬と経口で利用可能なキナーゼインヒビター（ＳＵ１１２４８など）との組み合わせも提供する。本発明はまた、治療ｓｉＲＮＡ薬と免疫療法との組み合わせも提供する。本発明のさらに別の実施形態は、ｓｉＲＮＡを抗増殖薬と組み合わせることである。ＮＶ疾患を治療するためのｓｉＲＮＡ薬と他の薬剤との他の組み合わせが当業者に理解されるであろう。
【００６５】
Ｄ．処方および投与
合成試薬に基づいた、組織に標的化可能な核酸送達系を開発するための近年の努力によって有望な結果が得られている。頑強にするために、有効な送達系は、複数の選択レベル（すなわち、疾患組織での選択的局在化および病変を駆動する生化学経路の選択的阻害）を有するべきである。さらに、最も有効な現在の治療法は、冗長な病理学的経路を遮断する「多標的化（ｍｕｌｔｉ−ｔａｒｇｅｔｅｄ）」治療薬（すなわち、複数の作用機構を有するデザイナー「ダーティ（ｄｉｒｔｙ）」ドラッグ）が必要である。優れたアプローチは、疾患を同時に標的化して核酸薬を標的細胞および正確な細胞内区画に送達させる「賢明な」ナノ粒子を使用するであろう。
【００６６】
１つの実施形態では、本発明は、３つのさらなる特性を有する組織標的化可能な送達を含むｓｉＲＮＡｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの処方物を提供する。これらの性質は、細胞質にｓｉＲＮＡを放出することができるコアへの核酸結合、非特異的相互作用からの保護、および細胞取り込みをもたらす組織標的化である。これらの必要な性質の全てを１つの分子中に有する物質は存在しない。本発明は、必要な複数の性質を組み合わせてアセンブリするための３つの材料のモジュラー抱合体（ｍｏｄｕｌａｒ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）を使用する組成物および方法を提供する。種々の性質が組み込まれるようにこれらをデザインおよび合成し、ｓｉＲＮＡペイロードと混合してナノ粒子を形成することができる。これらの実施形態に基づいて、好ましい実施形態は、これらの細胞に特異的なペプチドリガンドを保護ポリマーの一方の末端にカップリングし、他方の末端に核酸のためのカチオン性キャリアをカップリングすることによって新脈管構造を標的化するモジュラーポリマー抱合体を含む。このポリマー抱合体は、３つの機能ドメインを有し、これらはしばしば三官能性ポリマー（ＴＦＰ）と呼ばれる。この抱合体のモジュラーデザインにより、各成分が個別に置換され、至適化される。別のアプローチは、予め形成したナノ粒子上に表面コーティングを付着させることであった。ポリマー上への立体ポリマーコーティングの吸着は自己限定的であり、一旦立体層が形成され始めると、ポリマーのさらなる付加が妨げられる。本発明の組成物および方法から、概して他の２つの機能と無関係の３つの各機能の至適化に有効な方法が得られる。
【００６７】
核酸コア粒子の形成
核酸の送達薬は、核酸の生物活性を発揮することができる様式で、細胞内部への核酸の接近の増加を補助しなければならない。合成材料を使用した核酸治療薬についてのこの困難に取り組むための試みには、単純なカチオン性脂質およびインビトロＤＮＡトランスフェクション試薬として開発されたポリマー複合体の使用が含まれる。細胞への核酸の挿入および生物活性の獲得の両方が非常に困難であることが即座に見出された。例えば、輸送のための安定な核酸パッケージを達成することが可能であるが、これが核に核酸を放出するか細胞質にｓｉＲＮＡを放出する必要性を満たすために調整することが常に簡単というわけではない。また、インビトロで有効な多数のカチオン性脂質およびポリマーは、インビボで投与した場合に活性を保持しない。不運なことに、その理由は依然としてほとんど知られておらず、インビボで活性な複合体を開発するための予測値はほとんど得られていない。ＲＮＡを使用した研究は非常に遅れており、今までのところ、ｓｉＲＮＡに関心が寄せられたのは最近である。それにもかかわらず、しばしば肺組織をＤＮＡ複合体の静脈内投与からトランスフェクトすることができる。ペイロードとしてｓｉＲＮＡを使用した場合、類似の生物活性が認められている。
【００６８】
最近の研究により、広範な能力を有すると考えられる所定のポリペプチド構造から構成される１つのカチオン性ポリマークラスが同定されている。直鎖形態および分岐形態をカバーする所定の構造を有するこのクラスの多数のメンバーを合成することができ、これらがインビトロおよびインビボの両方で生物活性を付与することが見出されている。これらは、いくつかの核酸型（プラスミドおよびＤＮＡおよびＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む）で活性を有することが示されている。このカチオン性ポリマークラスが成功した理由は、特定の構造（分岐を含む）を組み込み、組み合わされたカチオン性を有するポリマーを形成するために硬い塩基と弱塩基との混合物を使用するデザインに起因するようである。完全に天然アミノ酸から構成されているが非天然の分岐を有するこの特定のクラスの別の利点は、その生分解性である。至適化のために使用される少なくとも２つの性質を有するポリマーが得られた場合、ｓｉＲＮＡとの有効なコア複合体の形成のための材料の継続的開発を絞り込み、安定性と細胞質への放出とのバランスを取るためのさらなる改良に重点的に取り組むことができる。至適化されたコア形成ポリマーを、他の機能のための基礎材料として使用することができる。
【００６９】
保護的立体コーティング
外部細胞膜に類似した外部脂質二重層を有する均一なリポソームを迅速に認識し、血液から除去する。それにもかかわらず、ウイルス粒子と異なり、ナノ技術は広範な合成ポリマーの化学的性質にアクセスすることができる。ＰＥＧ、ポリアセタール、およびポリオキサゾリンなどの親水性ポリマーは、コロイド状薬物の送達系（リポソーム、ポリマー、または静電ナノ粒子を問わない）の表面上に「立体」保護層を有効に形成し、血液からの免疫クリアランスを減少することが証明されている。この立体ＰＥＧ層の使用は最初に開発され、立体的に安定化されたリポソームを使用して最も広範に研究されている。本発明は、立体ポリマーコーティングに加えて、表面電荷の化学的減少などの別のアプローチを提供する。
【００７０】
立体バリアおよび生物学的結果が化学的性質ではなく物理的性質に由来することは強い証拠である。いくつかの他の親水性ポリマーがＰＥＧの代替物として報告されている。立体的に安定化したリポソームについての物理研究により、ポリマー層の物理的挙動のための強い機械的基盤が証明されており、これを使用して他の粒子型に類似のコーティングを行うことができる。しかし、物理研究によって核酸とのポリマー複合体の表面上に類似のポリマー層の形成および類似の生物学的性質の達成が示された一方で、本発明者らは、現在、所望の生物学的性質（血液からの免疫クリアランスからの保護）を正確に予想するために物理的性質を使用するための十分な情報を欠いている。
【００７１】
その物理的性質のばらつきが制御されたナノ粒子複合体の構築およびその生物学的性質の決定がさらに研究されている。多くのリポソーム研究から、生物活性に対して最も大きな影響を及ぼす物理的性質を種々のサイズの２つのポリマーのマトリックスの合成およびグラフト密度によって得ることができることが明らかである。表面立体層の機能が物理的性質に起因する一方で、至適な抱合体の化学的性質は依然として立体ポリマーおよびこれにカップリングするキャリアの特定の化学的性質に依存することに留意されたい。
【００７２】
表面立体ポリマー層を有するナノ粒子の形成方法も関連するパラメーターである。本発明の１つの実施形態は、立体ポリマーをキャリアポリマーにカップリングして核酸と自己アセンブリする抱合体を得て、核酸が立体ポリマー表面層を有するナノ粒子を形成する方法を提供する。別の実施形態は、予め形成したナノ粒子上に表面コーティングを付着させることである。自己アセンブリでは、表面立体層の形成は、キャリアポリマーとペイロードとの相互作用に依存し、粒子表面と反応させるための立体層の形成による浸透に依存しない。この場合、キャリアポリマーが核酸ペイロードと結合する能力に及ぼす立体ポリマーの影響は粒子形成に悪影響を及ぼし得、したがって、表面立体層に悪影響を及ぼし得る。これが起こる場合、キャリア上の立体ポリマーのグラフト密度は、その最大値を超えるか、構造のグラフティング特性が適切ではない。
【００７３】
特定の組織を標的化する表面露呈リガンド
ナノ粒子が選択的に標的細胞の内部に到達する能力は、特定の受容体媒介取り込みを誘導する能力にある。この能力は、本発明において、結合特異性を有する露呈リガンドによって得られる。コロイド送達系の標的化について多くのリガンド型が広範に研究されている一方で、その多くが抗体に依存していた。２０年以上前に、リポソーム表面に抗体をカップリングする（通常、免疫リポソームと呼ばれる）という考えが構築された。リガンド密度に影響を及ぼす１つの重要なパラメーターが明らかになっている。広範な研究によってインビトロで良い結果が得られているが、ごく最近になってインビボで肯定的な結果が得られ始めており、現在、小分子薬の送達について臨床開発の段階に到達している。
【００７４】
抗体は、リガンドとして使用するための多くの要件（良好な結合選択性、ほぼ任意の受容体についてのほぼ日常的な調製、およびナノ粒子型とは無関係のタンパク質結合方法への広い適用性を含む）を満たす傾向がある。モノクローナル抗体でさえ、血液脳関門を通過するための使用の兆候を示す。他方では、これらは理想的ではない。標的化リガンドとして、抗体は非常に巨大なタンパク質（約１５０Ｋｄ）である。化学的カップリングのために過剰なＣｙｓアミノ酸残基を導入するか他の固有の部位を同定することができない限り、このことが、特異的配向を得るための抱合を困難にしている。短縮形態（「ｓｃＦｖ」など）を使用してサイズを小さくすることができるが、親和性が喪失し得る。
【００７５】
抗体の別の問題のある性質は、その複数の生物活性であり、生物活性の多くが哺乳動物免疫系におけるその役割の一部である抗原結合に関連しないドメインに伝えられる。これらの免疫活性を活用することができるが、この活性はまた、免疫クリアランスを回避するナノ粒子立体層の役割を干渉し得る。天然のリガンドである他のタンパク質も標的化ナノ粒子について考慮されている（トランスフェリン受容体のためのトランスフェリン、第ＶＩＩ因子および第ＶＩＩａ因子タンパク質ならびにそのフラグメントなど）。これらの薬剤は良好な候補であり得るが、その首尾のよい使用には、特異的カップリング化学、結合活性を喪失しないカップリング、および免疫クリアランスを再導入することのない粒子上の曝露を同定するための相当な努力が必要である。
【００７６】
好ましいリガンドクラスは、内在化受容体に対して強い選択的結合親和性を有する低分子量の化合物である。研究によって、葉酸およびチアミンのようなビタミン、小麦胚凝集素またはｅ−セクレチンに対するシアリルルイスＸのようなポリサッカリド、およびインテグリンに対するＲＧＤのようなペプチド結合ドメインなどの天然の代謝産物が評価された。インビボパニング法を使用した場合でさえ、ファージディスプレイライブラリーを使用して天然または非天然の配列をスクリーニングすることができるので、ペプチドは多用途のリガンドクラスを提供する。このようなファージディスプレイ法により、配列と無関係に容易にカップリングするために１つの末端で非対合Ｃｙｓ残基を保持することができる。新脈管構造へのナノ粒子の標的化送達のためにＲＧＤペプチドを使用した最近のインビボでの成功は、このアプローチが有効なリガンドの主な要件を非常に有効に満たすことができることを示す（リガンド結合を干渉しないか、依然として免疫クリアランスを誘導する特定の化学的性質によって標的細胞での受容体媒介性の選択的取り込みが可能である）。
【００７７】
本発明の好ましい実施形態は、ＲＧＤ−２Ｃペプチドリガンド抱合体を含む。ＲＧＤ−２Ｃリガンドは、新脈管構造および腫瘍新脈管構造付近の細胞に局在化し、核酸含有ナノ粒子が細胞内に内在化し、核酸が放出されて核酸の有効な生物活性が得られる。
【００７８】
本発明の別の好ましい実施形態は、２つまたはそれを超えるリガンドのリガンド−抱合体の混合物、または２つまたはそれを超えるリガンドの抱合体を含む。本発明の好ましい実施形態は、ＲＧＤペプチドリガンドと第ＶＩＩ因子タンパク質またはそのペプチドフラグメントもしくは化学的アナログとの混合物を含む。本発明の別の好ましい実施形態は、ＲＧＤペプチドリガンドとリガンド結合ｅ−セクレチンとの混合物を含む。本発明の別の好ましい実施形態は、ＲＧＤペプチドリガンドとアポＥタンパク質またはそのペプチドリガンドもしくは化学的アナログとの混合物を含む。本発明の別の好ましい実施形態は、ＲＧＤペプチドリガンドと腫瘍細胞結合リガンド（葉酸、トランスフェリン、ポルフィリン、ｂＦＧＦ、およびＥＧＦなど）との混合物を含む。本発明の別の好ましい実施形態は、３つまたはそれを超えるこれらのリガンドの混合物を含む。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態は、キャリアの１のドメインにおける２つまたはそれを超えるリガンドと該キャリアの第２のドメインにおけるポリアミン薬との抱合体を含む。
【００８０】
本発明の好ましい実施形態は、リガンド抱合体の混合物を含む。リガンド抱合体の混合物は、同一のキャリア薬および任意選択的にキャリアの同一ドメインに抱合したリガンドを含み得るか、またはリガンド抱合体の混合物は、異なるキャリア薬または任意選択的にキャリア薬の異なるドメインに抱合したリガンドを含み得る。リガンド抱合体の混合物は、さらに、保護剤、融合誘導因子、またはキャリア薬（ＰＥＧまたはポリアセタール）、ｐＨ感受性ポリマー、ポリアミン、またはヒスチジン−リジンコポリマーから構成され得る。
【００８１】
本発明の組成物および方法は、ポリマー、ポリマー抱合体、脂質、ミセル、自己アセンブリコロイド、ナノ粒子、立体的に安定化されたナノ粒子、またはリガンド指向性ナノ粒子を含むＲＮＡｉの投与を提供する。ＷＯ０１／４９３２４号（その全体が本明細書中で参考により援用される）に記載の標的化合成ベクター型を、ＲＮＡｉを誘導する本発明の核酸の全身送達のために使用することができる。１つの実施形態では、ＰＥＩ−ＰＥＧ−ＲＧＤ（ポリエチレンイミン−ポリエチレングリコール−アルギン−グリシン−アスパラギン酸）合成ベクターを調製し、例えば、ＷＯ０１／４９３２４号の実施例５３および５６に記載のように使用することができる。このベクターを使用して、静脈内注射によってＲＮＡｉを全身送達した。当業者は、当該分野で公知の他の標的化合成ベクター分子を使用することができることを認識している。例えば、ベクターは、ＲＮＡｉおよび少なくとも１つの複合体形成試薬を含むコア複合体で構成されている内殻（ｉｎｎｅｒ  ｓｈｅｌｌ）を有し得る。
【００８２】
ベクターはまた、融合誘導部分を含み得る。この融合誘導部分は、コア複合体に固定されているかコア複合体に直接組み込むことができる殻を含み得る。ベクターは、さらに、ベクターを安定化し、タンパク質および細胞への非特異的結合を減少させる外殻（ｏｕｔｅｒ  ｓｈｅｌｌ）部分を有し得る。外殻部分は、親水性ポリマーを含み得、そして／または融合誘導部分に固定することができる。外殻部分を、コア複合体に固定することができる。ベクターは、標的組織および細胞集団へのベクターの結合を増強する標的化部分を含み得る。適切な標的化部分は当該分野で公知であり、ＷＯ０１／４９３２４号に詳述されている。
【００８３】
ａ．ＶＥＧＦ経路ｓｉＲＮＡを含むＲＧＤ標的化ナノ粒子の調製
本発明の１つの実施形態は、抗ＶＥＧＦ経路ｓｉＲＮＡの短いｄｓＲＮＡ分子のＲＧＤ媒介性リガンド指向性ナノ粒子調製物のための組成物および方法を提供する。図２９および３０は、ｓｉＲＮＡを含むＲＧＤ−２Ｃ媒介性組織標的化ナノ粒子の製造方法を示す。標的化リガンド、ＲＧＤ含有ペプチド（ＡＣＲＧＤＭＦＧＣＡ）を、立体ポリマー（ポリエチレングリコールまたは類似の性質を有する他のポリマーなど）に抱合する。このリガンド−立体ポリマー抱合体を、ポリエチレンイミンなどのポリカチオンまたはヒスチジン−リジンコポリマーなどの他の有効な材料にさらに抱合する。抱合体は、共有結合または非共有結合であり得、共有結合は切断不可能であり得るか、加水分解または還元剤などによって切断可能であり得る。ヘテロ二官能性ポリマー（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＶＳ（市販の試薬（Ｎｅｋｔａｒ））など）、製造のために調製されたヘテロ二官能性薬、またはホモ二官能性ポリマー（ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ（市販の試薬（Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ））など）、または製造のために調製されたホモ二官能性薬を使用して、抱合体を調製することができる。本発明の１つの好ましい実施形態は、ホモ二官能性ＮＨＳ−ＰＥＧ−ＮＨＳ薬（ＲＡＰＰ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅから市販されている試薬など）の使用を含み、これを最初に固相合成によって調製したＲＧＤ−２Ｃペプチドとカップリングし、市販のＰＥＩなどのポリアミン含有ポリマーまたは固相合成によって調製したヒスチジン−リジンコポリマーとカップリングする。
【００８４】
本発明の別の好ましい実施形態は、ＲＧＤ−ＰＥＧ−ポリアミン抱合体とポリアミンポリマー（ＰＥＩなど）またはヒスチジン−リジンコポリマーとの第１の組み合わせ、および該ポリマー混合物とｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドの第２の混合物との第２の組み合わせを含む。ポリマー抱合体を含むかポリマー抱合体と他のポリマー、脂質、またはミセルとの混合物を含む溶液（リガンド、立体ポリマー、または融合誘導因子を含む材料など）を、核酸（１つの実施形態では、目的の遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡ）を含む溶液と所望の比率で混合してｓｉＲＮＡを含むナノ粒子を得る。
【００８５】
この実施形態では、ナノ粒子を、ポリマー抱合体および核酸を含む層状ナノ粒子自己アセンブリによって形成する。負電荷の核酸と正電荷のポリマー抱合体セグメントとの間の非共有結合性静電相互作用によって自己アセンブリ過程が駆動されてナノ粒子が形成される。この過程は、核酸を含む一方の溶液をポリマー抱合体を含む別の溶液に添加し、その後に撹拌するか同時に撹拌する２つの溶液の簡潔な混合を含む。１つの実施形態では、混合物中の正電荷の成分と負電荷の成分との比を、各溶液の濃度の適切な調整または溶液の添加体積の調整によって決定する。別の実施形態では、２つの溶液を、スタティックミキサーなどの混合装置を使用して連続流条件下で混合する（図３０）。この実施形態では、２つまたはそれを超える溶液を、溶液の流れがスタティックミキサー内で混合される溶液比が得られる比率および圧力でスタティックミキサーに導入する。並行または直列の配置されるようにミキサーを配置することが可能である。
【００８６】
Ｅ．処方物の組み合わせおよび電場
一定の適用のために、電場を適用するか適用しないでＲＮＡｉを投与することができる。これを使用して、例えば、腫瘍組織への直接的注入および血管形成組織または新脈管構造を有する組織内またはその付近への直接的注入によって本発明のＲＮＡｉ分子を送達することができる。ｓｉＲＮＡは、適切な薬学的キャリア（例えば、生理食塩水または緩衝化生理食塩水など）中に存在し得る。
【００８７】
本発明は、概して記載するように、以下の実施例を参照してより容易に理解される。この実施例は、例示を目的として記載され、本発明を制限することを意図しない。
【実施例】
【００８８】
実施例１：ＶＥＧＦＲ２を標的化するｓｉＲＮＡ二重鎖とＶＥＧＦに対するベバシズマブ（アバスチン）との組み合わせ使用による腫瘍成長阻害
材料と方法
試薬：アバスチン、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体（２５ｍｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）；マウスＶＥＧＦＲ２に対するｓｉＲＮＡ、配列
【００８９】
【化２３】
2008537752.tif 000024
ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）；１．５ｇの２，２，２トリブロモエタノールおよび１．５ｍｌのｔ−アミルアルコール（カタログ番号Ｔ４８４０−２、カタログ番号２４０４８−６、Ａｌｄｒｉｃｈ）から作製されたアベルチンを含む１００ｍｌ蒸留水（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。マウス：５〜６週齢の胸腺欠損雌ヌードマウスを、ＴＡＣＯＮＩＣから購入し、従来どおりに収容した。全ての調査は、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌのガイドラインに従った。Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍａｒｙｌａｎｄの動物施設は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって完全に認可されている。細胞：結腸癌細胞株ＤＬＤ−１（ＣＣＬ−２２１，ＡＴＣＣ）を、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、重炭酸ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、グルコース４．５ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、およびピルビン酸ナトリウム１．０ｍＭ、１０％ウシ血清アルブミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。
【００９０】
手順：１）コンフルエンス付近のＤＬＤ−１細胞を採取し、無血清ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。２）０．４ｍｌ／マウスのアベルチンを腹腔内に使用してマウスを麻酔した。３）異種移植片腫瘍モデルの確立のために、１億個の細胞を含む無血清ＲＰＭＩ培地０．１ｍｌを、マウスの左横腹に注射した。４）腫瘍細胞の接種から５日後に、成長した腫瘍のサイズをキャリパーを使用して測定した。次いで、マウスを、群あたり８匹の６つの群に無作為にグループ化した。５）実験デザインおよび投与スキームを以下のように行った。６）ＲＰＰとの複合体を形成した後に、尾静脈注射によってｓｉＲＮＡを送達させた。
【００９１】
【化２４】
2008537752.tif 000025
結果および考察
１．ＶＥＧＦＲ２特異的ｓｉＲＮＡのｄｓＲＮＡ自体を保有するＲＧＤリガンド指向性ナノ粒子は、２ｍｇ／ｋｇ  ｓｉＲＮＡのみでの反復全身静脈投与後に腫瘍成長を阻害することができた（図１）。
【００９２】
２．このｓｉＲＮＡベースの抗血管形成活性（ＶＥＧＦＲ２の標的化）は、ＶＥＧＦモノクローナル抗体（ｍＡｂ）媒介性抗血管形成を増強し、それにより、腫瘍成長をさらに阻害することができた（図１）。
【００９３】
３．多数の生化学経路が悪性新形成に独立するか集合的に重要であり得るにもかかわらず、血管新生が多くの癌型の成長に重要であると広く認められている。したがって、血管形成過程は、必然的に腫瘍薬開発のための最も標的化される領域の１つとなっている。血管新生に関与する多数の因子のうち、ＶＥＧＦは、重要な調節因子であり、アバスチン（結腸癌の成長を阻害することが証明されているＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体）によって達成される臨床的利点が得られる治療効果を可能にすることができる因子であると考えられている。ＮＶ標的化ＶＥＧＦｓｉＲＮＡ遺伝子阻害の組み合わせは、組み合わせプロトコールで投与した場合、アンタゴニスト治療薬に付加されるという証拠を示す。
【００９４】
４．例は、同一の治療レジメンでの遺伝子インヒビターおよびｍＡｂインヒビターなどのアンタゴニストの使用が治療血管を改善するのに非常に有益であることを示す。
【００９５】
５．ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ＶＥＧＦＲ２特異的ｓｉＲＮＡを送達するナノ粒子で処置した腫瘍サンプル中のＶＥＧＦＲ２ｍＲＮＡレベルが、未処置腫瘍の発現レベルと比較して劇的に下方制御されたことを直接証明した（図２）。
【００９６】
６．免疫組織化学（ＩＨＣ分析）は、新脈管構造のマーカーであるＶＥＧＦＲ２およびＣＤ３１についてタンパク質レベルのノックダウンが起こったことを示した（図３）。
【００９７】
７．ナノ粒子／ＶＥＧＦＲ２ｓｉＲＮＡ処置のみおよびアバスチンとの組み合わせ由来の血液サンプル中のＩＦＮ−α活性についてのＥＬＩＳＡ測定は、ＩＦＮ活性の任意の有意な（検出可能な）上方制御または誘導を示さず（図４）、これは、ＮＶの阻害および腫瘍成長の阻害が非特異的インターフェロン媒介効果に起因しないことを示した。
【００９８】
まとめ
本実施例は、本発明が、薬剤が病原遺伝子の発現および病原タンパク質の生物学的機能の両方を阻害し、それにより治療有効性が増強される、同一の治療レジメンでモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と組み合わせた小さな干渉ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチド遺伝子インヒビターを使用した癌治療のための組成物および方法を提供することを示す。さらに、本実施例は、特定の生物経路（例えば、血管形成経路）を有効に阻害し、それにより、疾患の進行を阻害する治療を得るためのリガンド（例えば、ＶＥＧＦ）およびその受容体（例えば、ＶＥＧＦＲ２）の両方の同時遮断の実例を提供する。したがって、２つの強力且つ標的化された生物学的インヒビター（ＲＮＡｉおよびｍＡｂ）が寄与する阻害活性の組み合わせ適用は、ＮＶ疾患（癌を含む）の有効な治療手段である。
【００９９】
実施例２．インビトロおよびインビボでのｓｉＲＮＡ媒介性ＶＥＧＦサイレンシング
ヒトＶＥＧＦ１６５特異的ｓｉＲＮＡを、リポフェクタミンによってＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５細胞（ｈＶＥＧＦ過剰発現）にトランスフェクトして、細胞中のｈＶＥＧＦｍＲＮＡをノックダウンした（図２の上のパネル）。エレクトロポレーション手順を使用して、ＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５細胞をｈＶＥＧＦ１６５特異的ｓｉＲＮＡによってトランスフェクトして、ＥＬＩＳＡ分析を使用して分析したところ、ｈＶＥＧＦ発現を下方制御した。
【０１００】
ｈＶＥＧＦ１６５特異的ｓｉＲＮＡを腫瘍内投与によって繰り返し送達させた場合、ＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５細胞誘導性異種移植片腫瘍の成長は有意に阻害された。ｈＶＥＧＦｍＲＮＡ発現を試験するために腫瘍組織を回収した場合、この発現がＲＴ−ＰＣＲ分析に基づいて有意に下方制御され、この阻害がさらに確証された。同一のｈＶＥＧＦ１６５特異的ｓｉＲＮＡを使用して、本発明者らはまた、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ、１４８３細胞）異種移植片モデルを使用して、７日間隔での５回の腫瘍内投与によって腫瘍成長阻害を証明することができた。各注射には、１０μｇの特異的ｓｉＲＮＡを含む１５〜３０μＬの無ＲＮアーゼ水溶液が必要である。
【０１０１】
実施例３．２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子発現のサイレンシングにおいて、３’オーバーハングを有する標準的な１９塩基対のｓｉＲＮＡよりも強力である。
【０１０２】
１つのインビトロｓｉＲＮＡトランスフェクション研究では、エレクトロポレーション媒介トランスフェクション法を使用して、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）を過剰発現するＭＣＦ／１６５乳癌細胞を、２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ−ａ、ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ−ｂ、ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ−ｃ、Ｌｕｃ−２５−ｓｉＲＮＡ）または３’オーバーハングを有する１９塩基対のｓｉＲＮＡ（ｈＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ−ａ、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ）でトランスフェクトした。４×１０６個のＭＣＦ７／１６５細胞を、ｓｉＲＮＡ５μｇと混合した２００μｌのｓｉＰＯＲＴｓｉＲＮＡエレクトロポレーション緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）に再懸濁し、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ  ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したエレクトロポレーション処理に供した。エレクトロポレーションのパラメーターは以下である：電圧５００ｖ、持続時間６０μｓ、パルス数２、パルス間隔１秒。トランスフェクトした細胞を、２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃のインキュベーターにて５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクションから２４時間後、各ウェル由来の培養培地を採取し、培地中のヒトＶＥＧＦタンパク質濃度を、市販のｈＶＥＧＦ  ＥＫＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。
【０１０３】
標準的な１９塩基対のｈＶＥＧＦｓｉＲＮＡ処置細胞よりも２５塩基対のｈＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ処置細胞の方が有意により強いｈＶＥＧＦ標的遺伝子阻害が認められた。標準的な１９塩基対のｈＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ−ａでトランスフェクトした細胞で認められる約６０％のｈＶＥＧＦタンパク質の減少と比較して、ｓｉＲＮＡトランスフェクションから２４時間後の２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ分子でトランスフェクトした細胞の培養培地中の７５％を超える分泌ｈＶＥＧＦタンパク質が減少した。非特異的配列コントロールである２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｓｉＲＮＡ（Ｌｕｃ−２５−ｓｉＲＮＡ）または３’オーバーハングを有する標準的なＧＦＰ−ｓｉＲＮＡは、同一のｓｉＲＮＡトランスフェクション条件下でＶＥＧＦ発現に影響を及ぼさなかった（図７）。
【０１０４】
実施例４．２５塩基対の平滑末端化二本酸ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子サイレンシングの延長を媒介した
別の１つのインビトロｓｉＲＮＡトランスフェクション研究では、エレクトロポレーション媒介トランスフェクション法を使用して、ヒトＶＥＧＦ（ｈＶＥＧＦ）を過剰発現するＭＣＦ／１６５乳癌細胞を、２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｓｉＲＮＡ（ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ−ａ、ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ−ｂ、ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ−ｃ、Ｌｕｃ−２５−ｓｉＲＮＡ）または３’オーバーハングを有する１９塩基対のｓｉＲＮＡ（ｈＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ−ａ、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ａ）でトランスフェクトした。４×１０６個のＭＣＦ７／１６５細胞を、２μｇまたは５μｇのｓｉＲＮＡと混合した２００μｌのｓｉＰＯＲＴｓｉＲＮＡエレクトロポレーション緩衝液（Ａｍｂｉｏｎ）に再懸濁し、Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｓｑｕａｒｅ  Ｐｏｒａｔｏｒ  ＥＣＭ８３０（ＢＴＸ，Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用したエレクトロポレーション処理に供した。エレクトロポレーションのパラメーターは以下である：電圧５００ｖ、持続時間６０μｓ、パルス数２、パルス間隔１秒。トランスフェクトした細胞を、２４ウェルプレートに５×１０４細胞／ウェルの密度で播種し、３７℃のインキュベーターにて５％ＣＯ２で培養した。トランスフェクションから２４時間後、４８時間後、７２時間後、９６時間後、および１２０時間後、各ウェル由来の培養培地を採取し、新鮮な培養培地と置換した。種々の時点で採取した培地中のヒトＶＥＧＦタンパク質濃度を、市販のｈＶＥＧＦ  ＥＫＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定した。ｓｉＲＮＡ媒介性ｈＶＥＧＦノックダウンを、各非特異的コントロールｓｉＲＮＡで処置した細胞中で測定したｈＶＥＧＦタンパク質レベルを使用して正規化した。
【０１０５】
試験した各時点での標準的な１９塩基対のｈＶＥＧＦｓｉＲＮＡ処置細胞よりも２５塩基対のｈＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ処置細胞の方が有意により強く延長されたｈＶＥＧＦ標的遺伝子阻害が認められた。ｓｉＲＮＡ処置から１２０時間後に、５μｇの標準的な１９塩基対のｈＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ−ａでトランスフェクトした細胞で認められる２０％未満のｈＶＥＧＦタンパク質の減少と比較して、５μｇの２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ分子でトランスフェクトした細胞の培養培地中の６０％を超える分泌ｈＶＥＧＦタンパク質が減少した（図８）。２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ分子について用量依存性ｓｉＲＮＡ媒介性ｈＶＥＧＦ遺伝子阻害も認められた。
【０１０６】
本発明者らの所見に基づいて、２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ分子によってより強く標的ＶＥＧＦ遺伝子が阻害されるだけでなく、有効な標的ＶＥＧＦ遺伝子阻害が有意により長く持続する。例えば、５μｇの標準的な１９塩基対のｈＶＥＧＦｓｉＲＮＡを使用して達成されるたった４８時間での６０％を超えるｈＶＥＧＦタンパク質の減少と比較して、２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｈＶＥＧＦｓｉＲＮＡを使用して少なくとも１２０時間の６０％を超えるタンパク質が減少した。したがって、２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｓｉＲＮＡは、より有意な治療有効性を得ることができるより強力な標的遺伝子インヒビターである。
【０１０７】
さらなる情報には、以下が含まれる。（１）Ｌｕｃ−２５−ｓｉＲＮＡは、
【０１０８】
【化２５】
2008537752.tif 000026
の配列を有する。（２）ｈＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ−ａは、
【０１０９】
【化２６】
2008537752.tif 000027
の配列を有する。（３）ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡは、
【０１１０】
【化２７】
2008537752.tif 000028
の配列を有する。（４）ｈＶＥＧＦ−２５−ｓｉＲＮＡ−ｃ：
【０１１１】
【化２８】
2008537752.tif 000029
実施例５．２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｓｉＲＮＡは、インビトロでヒトＶＥＧＦＲ１発現およびＶＥＧＦＲ２発現を有効にノックダウンする
ヒトＶＥＧＦＲ１を特異的に標的化する３つの２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｓｉＲＮＡを、エレクトロポレーションによってＨＵＶＥＣ細胞中にトランスフェクトした。膜結合ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ１の遊離細胞外フラグメントを、ＥＬＩＳＡアッセイによってトランスフェクションから９６時間後に測定した。ＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ二重鎖は、細胞培養上清液中の細胞溶解タンパク質および遊離フラグメントの両方について、２つの他のｓｉＲＮＡと比較して、最も強いＶＥＧＦＲ１サイレンシング活性を示した（図９および１０）。ヒトＶＥＧＦＲ２遺伝子を標的化する３つの２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｓｉＲＮＡを評価するための同一のアプローチを使用した場合、本発明者らは、３つ全ての二重鎖が、トランスフェクション時点から２４時間後および７２時間後の両方で強いサイレンシング活性を示すことを見出した（図１１）。
【０１１２】
実施例６．２５塩基対の平滑末端化二本鎖ｓｉＲＮＡは、ＭＤＡ−ＭＢ−４３５異種移植片腫瘍において強い抗腫瘍有効性を媒介した
ヒトＶＥＧＦ１６５遺伝子配列を標的化する２５塩基長のｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＶＥＧＦおよびｂＦＧＦタンパク質発現が高いことが公知のＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞株を使用して、５日毎に１０μｇの３回の反復腫瘍内投与後に（図１２）、強い腫瘍成長阻害活性が証明された。
【０１１３】
実施例７．ＨＳＶ誘導性眼新血管形成モデルにおいて、ＶＥＧＦ遺伝子、ＶＥＧＦＲ１遺伝子、およびＶＥＧＦＲ１遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡカクテルは、これらの遺伝子の１つのみを標的化各ｓｉＲＮＡのいずれよりも強力である
最近、本発明者らは、動物疾患モデルにおいて、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２を標的化するｓｉＲＮＡを含むｓｉＲＮＡカクテルがこれらの遺伝子の１つのみを標的化するｓｉＲＮＡよりも強い抗血管形成有効性を達成することができることを証明した。このアプローチを使用して、本発明者らは、病理学的血管形成で重要な役割を果たすＶＥＧＦ経路を有効に遮断することができた（図１３）。
【０１１４】
豊富な潜在的に生物活性を示すＣｐＧ含有モチーフを含むＨＳＶ  ＤＮＡは、強力な血管形成因子である血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を誘導することができ、抗体でのＶＥＧＦの中和によってＨＳＶ誘導性血管形成が最小化された。生物活性ＣｐＧ含有オリゴデオキシヌクレオチド（ＯＤＮ）がＶＥＧＦの誘導を介して新血管形成を誘導することも示す都合の良いモデルも確立した。このモデルは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）がＶＥＧＦの発現および反応性を抑制する治療的可能性を評価するために本研究で使用される。
【０１１５】
材料および方法
試薬
ホスホロチオエートＯＤＮは、Ｄｅｎｎｉｓ  Ｍ．Ｋｌｉｎｍａｎ（Ｂｉｏｌｏｇｉｅｓ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ）から提供された。本研究で使用した刺激ＯＤＮの配列は、
【０１１６】
【化２９】
2008537752.tif 000030
であった。その後、ＯＤＮ１４６６と１５５５との等モル混合物を使用して研究を行った。遺伝子標的およびｓｉＲＮＡの分子デザイン。３つのｍＶＥＧＦ経路因子（ｍＶＥＧＦＡおよび２つのｍＶＥＧＦ受容体（ｍＶＥＧＦＲ１およびｍＶＥＧＦＲ２））を、ＲＮＡｉによって標的化した。各遺伝子標的のために、２つの標的配列を、同一のｍＲＮＡ場の異なる位置に割り当てた。上記標的配列に対応するｓｉＲＮＡをデザインした。これらのｓｉＲＮＡを、Ｔｕｓｃｈｌ．１４，１５によって提案されたガイドラインに従ってデザインした。デザインしたｓｉＲＮＡ（センス鎖およびアンチセンス鎖の二重鎖）を、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）によって合成した。全てのｓｉＲＮＡは、３’末端に２つのヌクレオチド（ＴＴ）オーバーハングを有する２１ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡオリゴであった。ｍＶＥＧＦＡの標的化配列は、
【０１１７】
【化３０】
2008537752.tif 000031
であった。
【０１１８】
ｍＶＥＧＦＲ１の標的化配列は、
【０１１９】
【化３１】
2008537752.tif 000032
であった。ｍＶＥＧＦＲ２の標的化配列は、
【０１２０】
【化３２】
2008537752.tif 000033
であった。非関連ｓｉＲＮＡコントロール（それぞれＬａｃＺおよびホタルルシフェラーゼの２つの標的配列）の合成を使用した。これらは、
【０１２１】
【化３３】
2008537752.tif 000034
であった。各ｓｉＲＮＡのためにａとｂとの等モル混合物を使用して、その後の研究を行った。
【０１２２】
マウス：５〜６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｈ−２ｄ）を、Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）から購入し、従来通りに収容した。全ての調査は、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌのガイドラインに従った。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ（Ｋｎｏｘｖｉｌｌｅ，ＴＮ）の動物施設は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって完全に認可されている。
【０１２３】
ウイルス：ＨＳＶ−ＩのＲＥ（Ｄｒ．Ｒｏｂｅｒｔ  Ｌａｕｓｃｈ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａｌａｂａｍａ，Ｍｏｂｉｌｅ，ＡＬから寄贈）を、全手順で使用した。ウイルスを、ベロ細胞単層（カタログ番号ＣＣＬ８１；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）で成長させ、滴定し、使用するまで８０℃にてアリコートで保存した。
【０１２４】
ｓｉＲＮＡのインビトロ有効性
インビトロでのＲＮＡｉの有効を試験するために、以下の細胞株を使用した。ＲＡＷ２６４．７γＮＯ細胞（ＣＲＬ−２２７８，ＡＴＣＣ）を使用して、これらの細胞中に自発的に発現されるＶＥＧＦＡ遺伝子のｓｉＶＥＧＦＡ特異的ノックダウンの有効性を試験した。細胞を、１０％ウシ胎児血清を含むＲＰＭＩを含む６ウェルプレートに、５％ＣＯ２にて３７℃で一晩プレートした。細胞プレーティングの翌日に、細胞を、リポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して、異なる濃度のｓｉＶＥＧＦＡまたはｓｉＬｕｃ（それぞれ、０．０．１、０．５、１．０、または２．０＿ｇ／ｍｌ／ウェル）でトランスフェクトした。２４時間後、逆転写酵素−ポリメラーゼＲＮＡ抽出およびＲＴ−ＰＣＲのために、これらの細胞からＲＮＡを抽出した。ＳＶＲ細胞（ＣＲＬ−２２８０，ＡＴＣＣ）を使用して、これらの細胞上で構成性に発現するＶＥＧＦＲ１遺伝子のｓｉＶＥＧＦＲ１特異的ノックダウンの有効性を試験した。細胞を、５％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を含む６ウェルプレートプレートに、５％ＣＯ２にて３７℃で一晩プレートした。細胞プレーティングの翌日に、細胞を、リポフェクタミン２０００を使用して、異なる濃度のｓｉＶＥＧＦＲ１またはｓｉＬｕｃ（それぞれ、０、０．１、０．５、または１．０＿ｇ／ｍｌ／ウェル）でトランスフェクトした。４８時間後、ＲＳＰＣＲのためにこれらの細胞からＲＮＡを抽出して、ＶＥＧＦＲ１を検出した（ＲＮＡ抽出およびＮＡＴｅｍｐｌａｔ特異的ＰＣＲ（ＲＳ−ＰＣＲ）を参照のこと）。２９３細胞（ＣＲＬ−１５７３，ＡＴＣＣ）を使用して、外因性ｍＶＥＧＦＲ２のノックダウンの検出のためにｍＶＥＧＦＲ２発現プラスミドでトランスフェクトした。細胞を、５％ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグル培地を含む６ウェルプレートプレートに、５％ＣＯ２にて３７℃で一晩プレートした。細胞プレーティングの翌日に、細胞を、リポフェクタミン２０００を使用して、プラスミドｐＣＩ−ＶＥＧＦＲ２（０．２＿ｇ／２ｍｌ／ウェル）およびｓｉＶＥＧＦＲ２（ａ、ｂ、ａ＿ｂ）またはｓｉＬｕｃ（それぞれ、０、０．１、０．５、または１．０＿ｇ／ウェル）で同時トランスフェクトした。４８時間後、ＲＳ−ＰＣＲのためにこれらの細胞からＲＮＡを抽出して、ＶＥＧＦＲ２を検出した。
【０１２５】
角膜マイクロポケットアッセイ
本研究で使用した角膜マイクロポケットアッセイは、Ｋｅｎｙｏｎ  ａｎｄ  ｃｏｌｌｅａｇｕｅｓの一般的プロトコールを遵守した。角膜に挿入するためのペレットを、既知量のＣｐＧＯＤＮ、スクラルフェート（１０ｍｇ，Ｂｕｌｃｈ  Ｍｅｄｉｔｅｃ，Ｖａｅｒｌｏｓｅ，Ｄｅｎｍａｒｋ）、およびハイドロンポリマーを含むエタノール（１２０ｍｇ／１ｍｌエタノール；Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）を組み合わせ、１５ｍｍ２の合成メッシュ片（Ｓｅｆａｒ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ，ＭＯ）に適用することによって作製した。混合物を風乾し、メッシュの繊維をバラバラにして、ＣｐＧ  ＯＤＮを含むペレットを得た。立体顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｔｅｍｓ，Ｗｅｔｚｌａｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）下でマイクロポケットを作製し（群あたり４つの眼）、ＣｐＧ  ＯＤＮを含むペレットをマイクロポケットに挿入した。ペレット移植から４日後および７日後に、立体顕微鏡下でキャリパー（Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して血管形成を評価した。新血管の長さは角膜輪部の血管の輪から角膜の中心に向かって発生しており、新血管の幅を測定し、クロックアワー（ｃｌｏｃｋ  ｈｏｕｒ）で示した。４つの各クロックアワーは、この環境で３０°に等しい。楕円公式に従って血管形成領域を計算した。
【０１２６】
ｓｉＲＮＡのインビボ送達
ペレット移植から４日後および７日後に角膜輪部をモニタリングした。ペレット移植から４日後に、コントロールｓｉＬａｃＺで得られた阻害と比較して、３つ全ての試験ｓｉＲＮＡを使用して角膜新血管形成が有意に阻害された（ｐ＜０．０５）。３つの試験したｓｉＲＮＡの組み合わせは、最も有効なインヒビターであり、新血管形成が約６０％減少した（ｐ＜０．０１）。
【０１２７】
ＶＥＧＦ経路遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡの全身送達によるＣｐＧ誘導性新血管形成の阻害
各標的化ｓｉＲＮＡの抗血管形成効果および全身ｓｉＲＮＡ送達の有効性を試験するために、ペレット移植から６時間後および２４時間後に、ＣｐＧ  ＯＤＮ含有マイクロポケットを有するマウスに、ｓｉＶＥＧＦＡ、ｓｉＶＥＧＦＲ１、ｓｉＶＥＧＦＲ２、これら３つの混合物、またはコントロールｓｉＬａｃＺを含む４０μｇのｓｉＲＮＡを静脈内（ｉ．ｖ．）に単回投与した。これらの実験では、腫瘍血管形成に関する以前の研究でｓｉＲＮＡの血管外送達を促進することが示されたポリマー（「Ｔａｒｇｅｔｒａｎ」）を使用した。ペレット移植から４日後および７日後に、血管形成範囲を測定した。使用した全試薬は、それぞれ、ペレット移植から４日後に、ｓｉＬａｃＺ処置群と比較して、新血管形成の有意な阻害が誘導された（ｐ＜０．０５）。局所投与で認められるように、３つの試験試薬の混合物により、最も有効なインヒビターが得られた（平均４０％阻害、ｐ＜０．０１）。さらなる実験では、ポリマービヒクル（ｖｅｈｉｃｌｅ）の機能を、ポリマー中に溶解するかＰＢＳ中に溶解した試験混合物の抗新血管形成活性の比較によって評価した。これらの実験により、結果は初期の試験期間でのみ有意であったが（ｐ＜０．０５）、ポリマービヒクルの使用によってＰＢＳビヒクルを使用した場合よりも抗新血管形成が有効であることが明らかとなった。この結果は、ＶＥＧＦ系遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡの静脈内投与によって眼の新血管形成を調節することができ、ＲＧＤ媒介性ｄｓＲＮＡナノ粒子送達の使用によって治療効果の有効性が増強されることを証明する。
【０１２８】
全身送達におけるｓｉＲＮＡの有効な抗血管形成用量を決定するために、ペレット移植から６時間後および２４時間後に、ＣｐＧ  ＯＤＮ含有マイクロポケットを有するマウスに、ｓｉＶＥＧＦＡ、ｓｉＶＥＧＦＲ１、ｓｉＶＥＧＦＲ２、またはコントロールｓｉＬａｃＺとＴａｒｇｅＴｒａｎビヒクルとの混合物を含む１０、２０、４０、８０μｇのｓｉＲＮＡを静脈内に単回投与した。ｓｉＲＮＡの投与により、用量依存様式で、ＣｐＧ誘導性血管形成が阻害された。
【０１２９】
ＨＳＫモデルにおけるＶＥＧＦ経路遺伝子に対するｓｉＲＮＡの治療的適用
以前の研究は、ＨＳＫモデルにおいてＶＥＧＦがＨＳＶ特異的血管形成の誘導に重要な血管形成因子であることを示した。ＶＥＧＦ経路遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡの投与がＨＳＫの発症を阻害するかどうかを評価するために、マウスの角膜表面を傷付け、１×１０５個のＨＳＶ−１ＲＥを感染させた。次いで、ウイルス感染から１日後および３日後に、マウスに、ポリマービヒクルとのｓｉＲＮＡの１０μｇ（局所送達のための結膜下注射）または４０μｇ（全身送達のための尾静脈注射）の混合物（ｓｉＶＥＧＦＡ、ｓｉＶＥＧＦＲ１、およびｓｉＶＥＧＦＲ２の等モル混合物）を単回投与した。図４に示すように、ｓｉＬｕｃコントロールで処置した動物と比較して、ＶＥＧＦ経路遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡで局所または全身に処置したマウスで血管形成およびＨＳＫの重症度が有意に減少した（ｐ＜０．０５）。８０％ｌのｓｉＬｕｃコントロール処置した眼が臨床的に明らかな病変（感染後（ｐ．ｉ．）の１０日目にスコア２またはそれを超える）を発症した一方で、ＶＥＧＦ経路遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡで処置した眼は、このような病変を４２％（局所送達）または５０％（全身送達）しか発症しなかった。さらに、感染後１０日目までに、１２のコントロール眼の９つで血管形成スコアが６より高いが、局所送達または全身送達のいずれかによってＶＥＧＦ経路遺伝子に対するｓｉＲＮＡで処置したマウスでは、１２の眼のうちの５つのみが６より高かった。まとめると、これらの結果は、ＶＥＧＦ経路遺伝子に対するｓｉＲＮＡの投与が血管形成の阻害によってＨＳＫの発症を減少させることを示す。
【０１３０】
実施例８．ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ１を標的化するｓｉＲＮＡカクテルは、ＲＯＰ眼新血管形成モデルにおける非常に強い抗血管形成薬である
眼の新血管形成は、種々の疾患に関連し、視力が著しく低下し、最終的に失明する。これらの障害のうち、糖尿病性網膜症（ＤＲ）、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、網膜静脈閉塞（ＲＶＯ）、および未熟児網膜症（ＲＯＰ）が一般的である。刺激因子と阻害因子との不均衡によってＮＶ（ＮＶ）を生じ、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、血管の透過性、膨張、および内皮細胞移動、増殖を引き起こす刺激因子のうちの最も重要な因子である（１）。
【０１３１】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、標的化遺伝子に順に相同な二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される広範な生物に置ける配列特異的転写後遺伝子サイレンシング過程である。本実施例では、ＶＥＧＦ経路を標的化する小さな干渉ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチド（ｓｉＲＮＡ）を使用して、酸素誘導性網膜症によって誘導されるＮＶを阻害した。
【０１３２】
材料および方法
ｓｉＲＮＡのデザインおよび合成
ｓｉＲＮＡは、Ｉｎｔｒａｄｉｇｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎから寄贈された。３つのｍＶＥＧＦ経路因子（ｍＶＥＧＦＡおよび２つのｍＶＥＧＦ受容体（ｍＶＥＧＦＲ１およびｍＶＥＧＦＲ２））を、ＲＮＡｉによって標的化し、これをｓｉＭｉｘと呼んだ。コントロールとしてルシフェラーゼを標的化するｓｉＲＮＡを、ｓｉＬｕｃと呼んだ。
【０１３３】
酸素誘導性網膜新血管形成のマウスモデル
本発明者ら（Ｓｍｉｔｈら（２））が使用したモデルは、未熟児網膜症を模倣している。生後７日目（Ｐ７）に、マウスおよびその母親を、最終酸素画分が７５□±２％になるように酸素と空気との混合物によって通気した密閉インキュベーター（自家製）に入れた。酸素レベルを、１日に少なくとも３回チェックした。Ｐ１２に、マウスを大気に戻した。Ｐ１７に、動物を屠殺した。
【０１３４】
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ｃｏｌｌｅｇｅおよびＧｕａｎｇｚｈｏｕ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅの実験動物センターから購入した。全ての調査は、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌのガイドラインに従った。
【０１３５】
ｓｉＲＮＡのインビボ送達
局所送達のために、Ｐ１２およびＰ１３に、３２ゲージのＨａｍｉｌｔｏｎ  ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏ，Ｒｅｖｏ，ＮＶ）によって、深い麻酔下でｓｉＭｉｘ（４μｇ／２μｌ／眼）を、左目に結膜下または硝子体内に送達させ、ｓｉＬｕｃ（４μｇ／２μｌ／眼）を、右目に送達させた。全身投与のために、ｓｉＲＮＡ（１５μｇ／５０μｌ／マウス）をＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩポリマー抱合体調製物（ＴａｒｇｅＴｒａｎ）と混合し、Ｐ１２およびＰ１３に腹腔内送達させた。
【０１３６】
網膜血管造影法（４）
Ｐ１７に、前に記載のように、５０ｍｇ／ｍｌフルオレセイン標識デキストランの塩化ナトリウム溶液を使用した心臓潅流によって動物を屠殺した。両眼を摘出し、１０％緩衝化ホルムアルデヒド中にて室温で０．５〜１時間固定した。前部を切り取り、感覚網膜を慎重に除去した。網膜を放射状に切断し、光り受容体が下に向くようにグリセリン中に平らに置いた。網膜上に覆いガラスを置き、マニキュア液で密封した。全載網膜を、蛍光顕微鏡法によって試験した。網膜のＮＶ領域を、ソフト（Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓ□Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，ＵＳＡ□）によって測定した。
【０１３７】
凍結切片（５）
眼を取り出し、至適な切断温度にて包埋化合物（Ｍｉｌｅｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）中で凍結した。眼の凍結切片（１０μｍ）を、ビオチン化ＧＳＡで組織化学的に染色した。スライドを、メタノール／Ｈ２Ｏ２中にて４□で１０分間インキュベートし、Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水（ＴＢＳ）０．０５Ｍ（ｐＨ７．６）で洗浄し、１０％の正常なウシ血清中で３０分間インキュベートした。スライドを、ビオチン化ＧＳＡと３７□で１時間インキュベートし、ＴＢＳ０．０５Ｍでのリンス後、これらをアルカリホスファターゼに結合したアビジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）と室温で４５分間インキュベートした。ＴＢＳ０．０５Ｍで１０分間洗浄した後、スライドをジアミノベンジジンとインキュベートして褐色反応生成物を得て、エオシンで対比染色し、Ｃｙｔｏｓｅａｌを使用してマウントした。定量的評価を行うために、眼全体を１０μｍの連続切片に切断した。この切断は、虹彩を含む第１の切片から開始し、虹彩を含む眼の反対側の最後の切片まで続き、１０番目の切片毎にＧＳＡで染色し、全部で１５切片を染色した。ＧＳＡ染色切片を顕微鏡で試験し、デジタルカラービデオカメラを使用して画像をデジタル化した。Ｉｍａｇｅ−Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して、網膜表面上のＧＳＡ染色細胞を描写し、その領域を測定した。局所注射のために、各眼由来の全測定値を、１つの実験値として使用した。全身注射のために、マウスの両眼の平均を１つの実験値として使用した。
【０１３８】
ＲＴ−ＰＣＲ
Ｐ１４およびＰ１７にマウスを屠殺し、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ＵＳＡ）を使用して網膜から総ＲＮＡを抽出した。２６０ｎｍの２８０ｎｍに対する比で総ＲＮＡを定量し、のＲＮＡ２μｇを、ｃＤＮＡ合成キット（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ，ＵＳＡ）によってｃＤＮＡに変換した。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、およびｂ−アクチン（ＲＮＡ完全性のコントロールおよび内部標準として作用する）をコードするＲＴ生成ｃＤＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲを使用して増幅した。１．５μｌのｃＤＮＡの増幅を、１μｌのセンスおよびアンチセンスならびに２．５ＵのＴａｑポリメラーゼを使用して行った。オリゴヌクレオチドプライマー配列は以下である：
【０１３９】
【化３４】
2008537752.tif 000035
ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２のＥＬＩＳＡ
Ｐ１４およびｐ１７にマウスを屠殺し、氷上で網膜を即座に抽出した。サンプルを、細胞溶解緩衝液（哺乳動物細胞溶解キット、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  Ｂｉｏ  Ｂａｓｉｄ  Ｉｎｃ，Ｃａｎａｄａ）中で均質化し、１２，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を、ＢＣＡタンパク質定量分析キット（Ｓｈｅｎｅｒｙ  Ｂｉｏｃｏｌｏｒ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌｇｙ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｃｈｉｎａ）によってタンパク質濃度について分析した。サンプルを、１ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで希釈した。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２のレベルを、ＱｕａｎｔｉｋｉｎｅＭマウスのＶＥＧＦ、ｓＶＥＧＦＲ１、およびｓＶＥＧＦＲ２免疫アッセイキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）を使用してそれぞれ決定した。各群および各時点について６〜１２の組織サンプルを分析した。
【０１４０】
結果および考察
網膜ＮＶに及ぼすｓｉＲＮＡの影響についてのフルオレセイン血管造影評価
正常なｐ１７マウスの網膜は、表面および深部の両方に血管層（血管の接続によって連結している）を有し、これは視神経から周囲まで伸びていた。低酸素状態に曝露されたＰ１７コントロールマウス由来の網膜は、潅流網膜と非潅流網膜との間の接合部表面から伸長した多くの新血管の房（高フルオレセイン）を含んでいた。ｓｉＬｕｃまたはｓｉＭｉｘの結膜下注射後、網膜は多くのＮＶも有しており、この領域は明らかに異ならなかった。それに対して、ｓｉＭｉｘのガラス体内注射および腹腔内注射後のＮＶ領域は、有意にコントロール未満であった。
【０１４１】
網膜ＮＶの組織学的定量によるｓｉＲＮＡ効果の評価
内境界膜（ＩＬＭ）の前のＧＳＡ陽性細胞（新血管形成）の測定によって網膜ＮＶも組織学的に評価した。Ｐ１７正常酸素（ｎｏｒｍｏｘｉｃ）マウスの網膜は、表面上に中程度の深い血管を有し、ＩＬＭの前に内皮細胞を含まなかった。低酸素状態に曝露したＰ１７マウスの網膜は、表面上に複数の新血管の房を含んでおり、これらがガラス体内にいくらか伸長していた。ｓｉＬｕｃまたはｓｉＭｉｘの結膜下注射を使用して処置したマウスの網膜は、ＮＶ領域が異ならなかった。ｓｉＭｉｘのガラス体内注射および腹腔内注射後のＮＶ領域は、ｓｉＬｕｃ注射と比較して明らかに減少した。
【０１４２】
ｓｉＲＮＡの硝子体内注射および腹腔内注射後のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２のｍＲＮＡレベルの減少
ＶＥＧＦ経路遺伝子に対するｓｉＲＮＡ処置がＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２のｍＲＮＡレベルを減少させるかどうかに取り組むために、ｓｉＲＮＡの硝子体内注射および腹腔内注射後のＰ１４およびＰ１７に網膜を回収した。ＲＴ−ＰＣＲによってｍＲＮＡレベルを測定した。ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２のｍＲＮＡの発現は、ｓｉＬｕｃで処置したコントロール網膜と比較して、ＶＥＧＦ経路遺伝子に対するｓｉＭｉｘで処置した網膜で減少した（Ｐ＜０．０５）。
【０１４３】
ｓｉＲＮＡの硝子体内適用および腹腔内適用後のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の発現レベルの減少
ＶＥＧＦ経路遺伝子を標的化するｓｉＲＮＡ処置がＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２タンパク質の産生を減少させるかどうかを評価するために、ＥＬＩＳＡを使用して、Ｐ１４およびＰ１７のｓｉＲＮＡ処置網膜中のＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２タンパク質を測定した。表１および２に示すように、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２タンパク質レベルは、ｓｉＬｕｃを投与したコントロールと比較してｓｉＭｉｘを投与したもので低かった。
【０１４４】
酸素および栄養素の需要と供給との不均衡は、ＶＥＧＦの上方制御を誘導する新血管形成の開始因子である。ＶＥＧＦは、内皮細胞の強力な分裂誘発因子であるだけでなく、血管透過性および膨張も誘導する。これらの生物活性は、高親和性膜貫通型自己リン酸化チロシンキナーゼ受容体へのＶＥＧＦの結合によって媒介される（５）。３つの異なるＶＥＧＦ受容体（すなわち、ＶＥＧＦＲ１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ−１またはＦｌｔ−１）、ＶＥＧＦＲ２（キナーゼインサートドメイン含有受容体またはＫＤＲ）、およびＶＥＧＦＲ３（ｆｍｓ系チロシンキナーゼ−４またはＦｌｔ−４））が同定されている。ＶＥＧＦＲ１およびＶＥＧＦＲ２は、主に血管に発現し、ＶＥＧＦＲ３はリンパ内皮に発現する（６）。ＶＥＧＦの硝子体内レベルおよび網膜内レベルの増加は、虚血性網膜症の動物モデルだけでなく患者における網膜新血管形成に関連する。これらのデータにより、ＶＥＧＦシグナル伝達が網膜新血管形成の良好な治療標的であることが示唆される（５）。
【０１４５】
マウスの酸素誘導性網膜症は、世界的に広く認識されている。Ｅｒｉｃ  ＡＰら（７）は、低酸素症から６〜１２時間後にＶＥＧＦのｍＲＮＡレベルが劇的に増加し、これが数日間上昇したままであり、次いで、網膜症の後退と共にベースラインに向けて減少したと報告している。それにより、本発明者らは、上方制御前にＶＥＧＦ合成を干渉するために、Ｐ１２およびＰ１３にｓｉＲＮＡを送達させた。ｓｉＭｉｘの硝子体内注射および腹腔内注射で処置した網膜のＮＶ領域がｓｉＬｕｃ注射よりも低いという全載（ｗｈｏｌｅ  ｍｏｕｎｔ）および凍結切片の結果が証明された。すなわち、ｓｉＭｉｘは、網膜ＮＶを明らかに阻害することができる。機構を調査するために、Ｐ１４およびＰ１７での網膜ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２発現を試験し、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルがｓｉＬｕｃコントロールより低かった。これらによって、ｓｉＭｉｘが網膜ＮＶを阻害するＶＥＧＦ経路遺伝子の阻害によることが示唆された。
【０１４６】
しかし、結膜下注射後に明らかな相違は認められず、それにより、局所的に有効に濃縮されなかったと結論づけられる。硝子体内注射後、硝子体内に高濃度のｓｉＲＮＡが存在し、ｓｉＲＮＡを網膜新血管内皮細胞にトランスフェクトした。しかし、この注射により、眼内出血および眼内炎などを引き起こし得る。腹腔内注射は比較的安全であり、豊富な腹腔毛細管を介してｓｉＲＮＡを血液に吸収させることができる。しかし、ｓｉＲＮＡは非特異的（ｎｊｏｎｓｐｅｃｉｇｉｃ）器官（肝臓、肺、および脾臓を含む）に容易に捕捉される。したがって、どのようにしてｓｉＲＮＡのトランスフェクション効率を増強させるのかが非常に重要である。ビヒクルＴａｒｇｅＴｒａｎは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびアルギニン−グリシン−アスパラギン酸ペプチド配列（ＲＧＤ）から構成される。ＰＥＩは、ｓｉＲＮＡのリン酸塩の負電荷に結合する。ＲＧＤモチーフは、活性化内皮細胞のインテグリンリガンドとして同定された。内皮細胞は、多数の異なるインテグリンを発現し、インテグリンαｖβ３およびα５β１は血管形成時に重要であることが示された。両方のインテグリンは、露呈したＲＤＧトリペプチド部分を有するマトリックスタンパク質の受容体であり、血管形成時の活性化内皮細胞で最も顕著である。したがって、Ｔａｒｇｅｔｒａｎの適用により、ｓｉＲＮＡのトランスフェクション効率を改善することができる。Ｋｉｍ  Ｂら（８）は、ｓｉＭｉｘの結膜下注射および静脈内注射がマウスにおけるＣＰＧ誘導性角膜新血管形成を阻害することができると報告している。他の新血管疾患に適用することもできる。
【０１４７】
実施例９．リガンド指向性ナノ粒子ｓｉＲＮＡは、全身投与を使用して、腫瘍に特異的に送達することができる
この自己アセンブリｓｉＲＮＡナノ粒子は、これらを静脈内（ＩＶ）注射によって全身投与した場合に新脈管構造ターゲティング特性を示した。ルシフェラーゼレポート遺伝子系を使用して、このｓｉＲＮＡナノ粒子系の腫瘍特異的ターゲティング能力が明らかとなった。
【０１４８】
実施例１０．リガンド指向性ナノ粒子ｓｉＲＮＡは、マウス同系モデル（神経膠芽腫（ｎｅｕｒｏｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ））で立証された強い抗腫瘍薬である
ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩナノ粒子中にパッケージングした蛍光標識ｓｉＲＮＡを使用して、静脈内（ｉｖ）投与由来の標的化ナノ粒子系を使用したｓｉＲＮＡの腫瘍標的化送達を証明する。
【０１４９】
マウス腫瘍モデル
雌ヌードマウス（６〜８週齢）を、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手し、標準的なげっ歯類固形飼料および水を自由に与え、１２時間の明暗サイクルで上部がフィルターのケージに保持した。国内規制に従って実験を行い、この実験は、動物実験倫理委員会支部（ｌｏｃａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｅｔｈｉｃａｌ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅｅ）によって承認された。１×１０６個のＮ２Ａ細胞のマウスの側腹への接種によって皮下Ｎ２Ａ腫瘍を誘導した。約０．５〜１ｃｍ３の腫瘍体積で、尾静脈への０．２ｍｌ溶液の静脈内注射によってナノプレックス（ｎａｎｏｐｌｅｘ）または遊離ｓｉＲＮＡをマウスに投与した。４０μｇの蛍光標識ｓｉＲＮＡを、遊離形態またはＰＥＩ−もしくはＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩナノ粒子として注射した。注射から１時間後に、組織を解剖し、蛍光に適した解剖顕微鏡を使用して試験した。デジタルカメラを具備し、ＭｇｎａＦｉｒｅ２．０カメラソフトウェアが作動するＰＣに接続したＯＬｙｍｐｕｓ  ＳＺＸ１２蛍光顕微鏡（ＯＩｐｔｒｏｎｉｃｓ，Ｇｏｌｅｔａ，ＣＡ）を使用して組織の顕微鏡試験を行った。各組織について等しい露光時間で写真を撮影した。
【０１５０】
結果：遊離蛍光標識ｓｉＲＮＡの微静脈による静脈内注射は、肺、肝臓、または腫瘍組織中にいかなる有意な蓄積も示さなかった。ＰＥＩ−ナノ粒子を使用して送達されたｓｉＲＮＡは、肺組織中に最も蓄積され、肝臓および腫瘍がこれに続いた。ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩナノ粒子を使用して送達されたｓｉＲＮＡは、腫瘍組織中に最も高レベルで蓄積された。ＰＥＩ−ナノ粒子と比較して、肺蓄積が非常に減少し、肝臓蓄積は非常に少なかった。この実験は、ＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩナノ粒子を使用したｓｉＲＮＡの腫瘍標的化送達を示す。
【０１５１】
ＶＥＧＦＲ２に対して標的化されたｓｉＲＮＡを含む腫瘍標的化ナノ粒子処方物を使用して、腫瘍血管形成および腫瘍成長のＲＮＡｉ媒介性阻害を研究した。４０μｇのｓｉＲＮＡ／注射の用量でのナノ粒子処方物の静脈内注射によって、皮下腫瘍保有マウスを処置した。３日毎に注射を繰り返し、腫瘍の成長を評価し、コントロール処方物で処置した動物と比較した。実験終了時に血管形成の阻害を評価した。
【０１５２】
マウス腫瘍モデル
雌ヌードマウス（６〜８週齢）を、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手し、標準的なげっ歯類固形飼料および水を自由に与え、１２時間の明暗サイクルで上部がフィルターのケージに保持した。国内規制に従って実験を行い、この実験は、動物実験倫理委員会支部によって承認された。１×１０６個のＮ２Ａ細胞のマウスの側腹への接種によって皮下Ｎ２Ａ腫瘍を誘導した。約０．５〜１ｃｍ３の腫瘍体積で、尾静脈への０．２ｍｌ溶液の静脈内注射によってナノプレックス（ｎａｎｏｐｌｅｘ）または遊離ｓｉＲＮＡをマウスに投与した。ｓｉＲＮＡを含むナノ粒子処方物を、所与のＮ／Ｐ比でのｓｉＲＮＡ溶液とポリマー溶液との簡単な混合によって調製した。
【０１５３】
腫瘍成長阻害研究のために、腫瘍が触診可能になった時（腫瘍細胞接種から７日後）に実験を開始した。処置は、４０μｇのｓｉＲＮＡ／マウスを含むＲＰＰ−ナノプレックスの３日毎の尾静脈を介した静脈投与からなる。治療割り当てを伏せた観察者によってデジタルキャリパーを使用して腫瘍成長を一定の間隔で測定した。各測定は、約９０°離れた２方向における腫瘍の直径からなる。腫瘍体積を、０．５２×最長直径×最短直径２として計算した。実験終了時に、動物を屠殺し、腫瘍組織および周辺の皮膚を切り出し、顕微鏡用スライドガラス上に置いた。脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）および血管形成についての組織の試験を、上記の蛍光組織測定のために記載されたＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡およびカメラ装置を使用した顕微鏡法によって行った。組織に光を通過させて皮膚中の血管を可視化し、デジタル画像を撮影し、上記のように保存した。ウェスタンブロッティングのために、その直後に組織を瞬間冷凍した。
【０１５４】
結果：ＶＥＧＦＲ２ｓｉＲＮＡを含むナノ粒子処方物で処置した動物で有意な腫瘍成長阻害が認められた。非特異的ｓｉＲＮＡで処置した動物は、未処置動物と比較して、いかなる実質的な腫瘍成長阻害も示さなかった。血管成長の有意な阻害が腫瘍周囲に認められ、ＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡ処置マウスにおける血管形成の阻害を示す。コントロールｓｉＲＮＡで処置したマウスは、未処置動物と類似の血管成長を示した。異なる処置群の動物から回収した腫瘍溶解物のウェスタンブロット分析は、ＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡ処置動物においてＶＥＧＦＲ２の実質的減少示したのに対して、コントロールｓｉＲＮＡ処置動物ではＶＥＧＦＲ２の減少は認められなかった。これらの実験は、静脈内投与由来の腫瘍組織へのｓｉＲＮＡの送達を明白に証明する。腎臓細胞癌モデルにおいて腫瘍成長を阻害するためのＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩナノ粒子中にパッケージングしたＶＥＧＦＲ２ｓｉＲＮＡの有効性を、７８６−Ｏ異種移植片腫瘍モデルを使用して研究した。実施例７に類似の実験手順を、本研究で使用した。簡単に述べれば、雌ヌードマウス（６〜８週齢）を、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手した。５×１０６個の７８６−Ｏ細胞のマウスの側腹への接種によって皮下７８６−Ｏ腫瘍を誘導した。腫瘍体積が約１００ｍｍ３に到達した場合、尾静脈を介したＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡ溶液を含むＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩナノ粒子の静脈内注射によって処置を開始した。コントロール処置群に、非特異的ｓｉＲＮＡまたは生理食塩水を含むナノ粒子を投与した。３日毎の注射を使用して、処置を数日間繰り返した。実施例７に記載のように、３日毎に１回腫瘍体積を測定した。結果：ＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡナノ粒子処方物で処置した動物で有意な腫瘍成長阻害が認められた。コントロールｓｉＲＮＡナノ粒子で処置した動物で有意な腫瘍成長阻害は認められなかった。本実験は、腫瘍標的化ナノ粒子処方物によって送達されたＶＥＧＦＲ２ｓｉＲＮＡが腫瘍成長阻害を達成することができることを証明する。
【０１５５】
リガンド指向性ｓｉＲＮＡナノ粒子を、腫瘍血管形成活性に及ぼすＶＥＧＦノックダウンの影響の評価のために、Ｎ２Ａ膠芽細胞腫細胞の皮下接種を使用してＣ５７マウスモデルに全身投与した。雌ヌードマウス（６〜８週齢）を、Ｔａｃｏｎｉｃ（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）から入手し、標準的なげっ歯類固形飼料および水を自由に与え、１２時間の明暗サイクルで上部がフィルターのケージに保持した。国内規制に従って実験を行い、この実験は、動物実験倫理委員会支部によって承認された。１×１０６個のＮ２Ａ細胞のマウスの側腹への接種によって皮下Ｎ２Ａ腫瘍を誘導した。約０．５〜１ｃｍ３の腫瘍体積で、尾静脈への０．２ｍｌ溶液の静脈内注射によってナノプレックスまたは遊離ｓｉＲＮＡをマウスに投与した。Ｎ／Ｐ比が２で上記のようにナノプレックス溶液を調製した。組織分布実験のために、４０ｍｇの蛍光標識ｓｉＲＮＡを、遊離形態またはＰ−もしくはＲＰＰナノプレックスとして注射した。注射から１時間後に、組織を解剖し、蛍光に適した解剖顕微鏡を使用して試験した。デジタルカメラを具備し、ＭｇｎａＦｉｒｅ２．０カメラソフトウェアが作動するＰＣに接続したＯＬｙｍｐｕｓ  ＳＺＸ１２蛍光顕微鏡（ＯＩｐｔｒｏｎｉｃｓ，Ｇｏｌｅｔａ，ＣＡ）を使用して組織の顕微鏡試験を行った。各組織について等しい露光時間で写真を撮影した。
【０１５６】
同時送達実験では、プラスミドおよびｓｉＲＮＡをそれぞれ１：１００のモル比で混合し（４０ｍｇのｐＬｕｃと１３ｍｇのｓｉＲＮＡとの混合）、連続送達実験では、４０ｍｇのプラスミドを最初に送達させ、２時間後に４０ｍｇのｓｉＲＮＡを送達させた（モル比１：３００）。ナノプレックス注射から２４時間後に組織を解剖し、秤量し、磁性ビーズを含む２ｍｌチューブ（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）中の氷冷レポーター溶解緩衝液（Ｐｒｏｍｅｇａ）に入れた。組織を、Ｆａｓｔｐｒｅｐ  ＦＰ１２０マグネティックホモジナイザー（Ｑ−Ｂｉｏｇｅｎｅ）を使用して均質化し、サンプルを、Ｍｏｎｏｌｉｇｈｔ２０１０照度計（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）を備えたルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、レポーター酵素活性についてアッセイした。腫瘍成長阻害研究では、腫瘍細胞の接種から７日後に収容が触診可能になった時に実験を開始した。処置は、４０ｍｇのｓｉＲＮＡ／マウスを含むＲＰＰ−ナノプレックスの３日毎の尾静脈を介した静脈投与からなる。治療割り当てを伏せた観察者によってデジタルキャリパーを使用して腫瘍成長を一定の間隔で測定した。各測定は、約９０°離れた２方向における腫瘍の直径からなる。腫瘍体積を、０．５２×最長直径×最短直径２として計算した。
【０１５７】
実験終了時に、動物を屠殺し、腫瘍組織および周辺の皮膚を切り出し、顕微鏡用スライドガラス上に置いた。脈管形成（ｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ）および血管形成についての組織の試験を、上記の蛍光組織測定のために記載されたＯｌｙｍｐｕｓ顕微鏡およびカメラ装置を使用した顕微鏡法によって行った。組織に光を通過させて皮膚中の血管を可視化し、デジタル画像を撮影し、上記のように保存した。ウェスタンブロッティングのために、その直後に組織を瞬間冷凍した。
【０１５８】
ｓｉＲＮＡ  ＲＰＰ−ナノプレックスによる腫瘍成長阻害。マウスにＮ２Ａ腫瘍細胞を接種し、未処置のままにするか、４０ｍｇ／マウスの用量でのｓｉＬａｃＺまたはｓｉＶＥＧＦＲ２を含むＲＰＰ−ナノプレックスでの尾静脈注射によって処置した。腫瘍が触診可能になった時点で（２０ｍｍ３）、処置を開始した。ＶＥＧＦＲ２配列特異的ｓｉＲＮＡのみが腫瘍成長を阻害するのに対して、ＬａｃＺｓｉＲＮＡでの処置は、未処置コントロール（ｎ＝５）と比較して、腫瘍成長率に影響を及ぼさなかった。
【０１５９】
実施例１１．リガンド指向性ナノ粒子ｓｉＲＮＡは、異種移植片腫瘍モデル（腎臓癌）で立証された強い抗腫瘍薬である
腎臓癌細胞株を有するマウス異種移植片モデルにおけるリガンド指向性ｓｉＲＮＡナノ粒子も試験した。実施例１０と同一の送達経路を使用して、同一の材料および同一の手順によってｓｉＲＮＡナノ粒子を製造した。２ｍｇ／ｋｇの投薬量を使用した３日間隔での５回の反復送達を、コホートあたり６匹の動物を使用して行った。有意な腫瘍成長阻害が認められた。
【０１６０】
実施例１２．リガンド指向性ナノ粒子ｓｉＲＮＡは、異種移植片腫瘍モデル（結腸直腸癌）で立証された強い抗腫瘍薬である
ＶＥＧＦＲ２遺伝子をターゲティングするｓｉＲＮＡナノ粒子を使用して、本発明者らは、ヒト結腸直腸癌細胞株ＤＬＤ−１を有するマウス異種移植片モデルにおける抗腫瘍有効性をさらに試験した。
【０１６１】
材料および方法。試薬：アバスチン、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体（２５ｍｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）；ＶＥＧＦＲ２配列に対するｓｉＲＮＡ（付録１）；ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）；１．５ｇの２，２，２トリブロモエタノールおよび１．５ｍｌのｔ−アミルアルコール（カタログ番号Ｔ４８４０−２、カタログ番号２４０４８−６、Ａｌｄｒｉｃｈ）から作製されたアベルチンを含む１００ｍｌ蒸留水（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。マウス：５〜６週齢の胸腺欠損雌ヌードマウスを、ＴＡＣＯＮＩＣ（）から購入し、従来どおりに収容した。全ての調査は、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌのガイドラインに従った。Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍａｒｙｌａｎｄの動物施設は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって完全に認可されている。細胞：結腸癌細胞株ＤＬＤ−１（ＣＣＬ−２２１，ＡＴＣＣ）を、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、重炭酸ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、グルコース４．５ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、およびピルビン酸ナトリウム１．０ｍＭ、１０％ウシ血清アルブミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。
【０１６２】
試薬
アバスチン、ＶＥＧＦに対するモノクローナル抗体（２５ｍｇ／ｍｌ、Ｇｅｎｅｔｅｃｈ）；ＶＥＧＦＲ２配列に対するｓｉＲＮＡ（付録１）；ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）；１．５ｇの２，２，２トリブロモエタノールおよび１．５ｍｌのｔ−アミルアルコール（カタログ番号Ｔ４８４０−２、カタログ番号２４０４８−６、Ａｌｄｒｉｃｈ）から作製されたアベルチンを含む１００ｍｌ蒸留水（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）。マウス：５〜６週齢の胸腺欠損雌ヌードマウスを、ＴＡＣＯＮＩＣ（）から購入し、従来どおりに収容した。全ての調査は、Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｕｎｃｉｌのガイドラインに従った。Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｉｎ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ  Ｍａｒｙｌａｎｄの動物施設は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅによって完全に認可されている。細胞：結腸癌細胞株ＤＬＤ−１（ＣＣＬ−２２１，ＡＴＣＣ）を、Ｌ−グルタミン２ｍＭ、重炭酸ナトリウム１．５ｇ／Ｌ、グルコース４．５ｇ／Ｌ、ＨＥＰＥＳ１０ｍＭ、およびピルビン酸ナトリウム１．０ｍＭ、１０％ウシ血清アルブミンを含むＲＰＭＩ１６４０培地中で成長させた。手順：１）コンフルエンス付近のＤＬＤ−１細胞を採取し、無血清ＲＰＭＩ培地に再懸濁した。２）０．４ｍｌ／マウスのアベルチンを腹腔内に使用してマウスを麻酔した。３）異種移植片腫瘍モデルの確立のために、１億個の細胞を含む０．１ｍｌ無血清ＲＰＭＩ培地を、マウスの背側の左横腹に注射した。４）腫瘍細胞の接種から５日後に、成長した腫瘍のサイズを、キャリパーを使用して測定した。次いで、マウスを、群あたり７匹の群に無作為にグループ化した。３つの異なる投薬レジメンを適用した：それぞれ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、および４ｍｇ／ｋｇ。４ｍｇ／ｋｇの高用量で最も強い腫瘍活性を示したが、３つの処置群で有意に異なる量ではない。異なる比較を用いて、４ｍｇ／ｋｇの高用量のｓｉＲＮＡナノ粒子が５ｍｇ／ｋｇアバスチン処置よりも強い抗腫瘍有効性を示すことが見出された。
【０１６３】
参考文献：
【０１６４】
【化３５】
2008537752.tif 000036
【０１６５】
【化３６】
2008537752.tif 000037
【０１６６】
【化３７】
2008537752.tif 000038
表Ｂ１−１  ヒトＶＥＧＦ特異的ｓｉＲＮＡ配列（平滑末端を有する２５塩基対）。
【０１６７】
【化３８】
2008537752.tif 000039
表Ｂ１−３  ヒトＶＥＧＦＲ１特異的ｓｉＲＮＡ配列（平滑末端を有する２５塩基対）。
【０１６８】
【化３９】
2008537752.tif 000040
表Ｂ１−５  ヒトＶＥＧＦＲ２特異的ｓｉＲＮＡ配列（平滑末端を有する２５塩基対）。
【０１６９】
【化４０】
2008537752.tif 000041
【図面の簡単な説明】
【０１７０】
【図１】図１は、ＲＧＤペプチドリガンドのみまたはアバスチン処置との組み合わせによって標的化されたＶＥＧＦ経路のｓｉＲＮＡナノ粒子組成物によるＤＬＤ−１結腸異種移植片腫瘍成長の阻害を示す。同一の治療レジメンでＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡインヒビターおよびアバスチン（ベバシズマブ）との治療薬の組み合わせを使用して、ヒト結腸癌（ＤＬＤ−１）異種移植片腫瘍モデルにおいてより強い抗腫瘍有効性が認められた。
【図２】全身送達によって新脈管造を標的化するＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、３日毎の４回の反復投与後に結腸癌異種移植片マウスモデル（ＤＬＤ−１腫瘍）において強い有効性を示した。ＲＴ−ＰＣＲの結果は、ｍＲＮＡレベルでのＶＥＧＦＲ２遺伝子発現のノックダウンを示す。
【図３】全身送達によって新脈管造を標的化するヒトＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、３日毎の４回の反復投与後に結腸癌異種移植片マウスモデル（ＤＬＤ−１腫瘍）において強い有効性を示した。免疫組織化学画像は、腫瘍組織におけるＶＥＧＦＲ２およびＣＤ３１発現の下方制御を示す。
【図４】全身送達によって新脈管造を標的化するヒトＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡナノ粒子は結腸癌異種移植片マウスモデル（ＤＬＤ−１腫瘍）において強い有効性を示す一方で、第２の送達から２４時間後のマウス血流において有意なＩＦＮ−α誘導は観察されなかった。
【図５】ヒトＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ（３’末端オーバーハングを有する１９塩基対）は、ＲＴ−ＰＣＲおよびＥＬＩＳＡによって評価したところ、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方でインビトロおよびインビボでのｈＶＥＧＦ発現のサイレンシングに有効である。２つの上の図は、ｍＲＮＡレベルおよびタンパク質レベルの両方での有意なｈＶＥＧＦノックダウンを示した。下のパネルは、腫瘍組織中でｈＶＥＧＦ発現が有意に下方制御される、ＭＣＦ−７／ＶＥＧＦ１６５細胞誘導性異種移植片モデルにおけるｓｉＲＮＡ媒介ｈＶＥＧＦノックダウンの抗腫瘍活性を示す。
【図６】ヒトＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ（３’末端オーバーハングを有する１９塩基対）は、腫瘍成長阻害が起こるインビボでのｈＶＥＧＦ発現のサイレンシングに有効である（ＨＮＳＣＣ１４８３細胞）。７日間隔でエレクトロポレーション増強を使用して、腫瘍内送達を５回繰り返した。
【図７】ヒトＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ（２５塩基対の平滑末端）は、１９塩基対のｓｉＲＮＡよりもインビトロでのｈＶＥＧＦ発現のサイレンシングにより有効であり、且つより強力である。
【図８】ヒトＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ（２５塩基対の平滑末端）は、１９塩基対のｓｉＲＮＡよりもインビトロでのｈＶＥＧＦ発現のサイレンシングに有効であり、且つより持続時間が長い。
【図９】ヒトＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ（２５塩基対の平滑末端）は、４８時間後のインビトロでのｈＶＥＧＦＲ１発現のサイレンシングに有効である。
【図１０】ヒトＶＥＧＦＲ１−ｓｉＲＮＡ（２５塩基対の平滑末端）は、７２時間後のインビトロでのｈＶＥＧＦＲ１発現のサイレンシングに有効である。
【図１１】ヒトＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡ（２５塩基対の平滑末端）は、２つの異なる時点におけるインビトロでのｈＶＥＧＦＲ２発現のサイレンシングに有効である。
【図１２】ＭＤＡ−ＭＢ−４３５乳癌細胞株を使用して、ヒトＶＥＧＦ−ｓｉＲＮＡ（２５塩基対の平滑末端）は、腫瘍成長阻害が起こるインビボでのｈＶＥＧＦ発現のサイレンシングに有効である。
【図１３】血管形成経路を遮断するための同一の処置においてＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２を標的化するｓｉＲＮＡカクテルを使用するための概念フレームワーク（ｃｏｎｃｅｐｔ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ）。
【図１４】マウスＨＳＫモデルの眼組織におけるＶＥＧＦ発現のＶＥＧＦ  ｓｉＲＮＡ媒介阻害。
【図１５】マウスＨＳＫモデルの眼組織における個別または組み合わせたＶＥＧＦ経路遺伝子のＶＥＧＦ経路ｓｉＲＮＡ媒介阻害。
【図１６】ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２を標的化するｓｉＲＮＡカクテルは、局所（左）または全身（右）送達のいずれかを使用するとき、ＨＳＶ誘導性癌血管形成マウスモデルにおいて試験された同一投薬量において、任意の１つの各ｓｉＲＮＡ標的化個別遺伝子よりも有効である。
【図１７】ＨＳＫマウスモデルの眼組織中のＶＥＧＦ経路ｓｉＲＮＡカクテルの局所および全身投与によって達成される血管形成阻害の比較。
【図１８】ＨＳＫマウスモデルの眼組織における病変のＶＥＧＦ経路ｓｉＲＮＡカクテル媒介性阻害の薬理学的効果。
【図１９】潅流／フラットマウント測定におけるマウス網膜血管形成モデルの眼組織における、疾患の誘導から１７日後または１４日後のＶＥＧＦ経路ｓｉＲＮＡカクテルの投与による血管形成の阻害。
【図２０】ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２を標的化するｓｉＲＮＡカクテルは、低酸素症によって誘導される早産（ＲＯＰ）マウスモデルの網膜症において非常に有効な抗血管形成活性を示す。
【図２１】ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２を標的化するｓｉＲＮＡカクテルは、低酸素症によって誘導される早産（ＲＯＰ）マウスモデルの網膜症において非常に有効な抗血管形成活性を示す。
【図２２】ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦＲ１、およびＶＥＧＦＲ２を標的化するｓｉＲＮＡカクテルは、異なるキャリアを使用した異なる投与経路で眼の血管形成を有意に阻害する。ＩＰ送達は、リガンド指向ナノ粒子によって媒介される。
【図２３】ｓｉＲＮＡ送達のための自己アセンブリしたナノ粒子。予め作製したＲＧＤ−ＰＥＧ−ＰＥＩ抱合体水溶液をｓｉＲＮＡ水溶液と混合し、記載のようにナノ粒子を自己アセンブリする。ナノ粒子は比較的サイズが均一であり、５０〜１００ｎｍである。
【図２４】新脈管構造を標的化するｓｉＲＮＡナノ粒子は、標識されたｓｉＲＮＡペイロード（左）およびルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するプラスミドペイロード（右）を使用した腫瘍標的化特性を示した。
【図２５】新脈管構造を標的化するＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、３日毎の４回の反復投与後に神経芽細胞腫同系マウスモデル（Ｎ２Ａ腫瘍）において強い有効性を示した。
【図２６】新脈管構造を標的化するＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、３日毎の５回の反復投与後に腎臓癌異種移植片マウスモデル（７８６−Ｏ腫瘍）において強い有効性を示した。
【図２７】新脈管構造を標的化するＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、３日毎の４回の反復投与後に結腸癌異種移植片マウスモデル（ＤＬＤ−１腫瘍）において強い有効性を示した。３つの異なる投薬量を、本研究で使用した。
【図２８】新脈管構造を標的化するＶＥＧＦＲ２−ｓｉＲＮＡナノ粒子は、３日毎の４回の反復投与後に結腸癌異種移植片マウスモデル（ＤＬＤ−１腫瘍）において強い有効性を示した。４ｍｇ／ｋｇのＶＥＧＦＲ２の投与により、５ｍｇ／ｋｇと同一の抗腫瘍有効性が得られた。
【図２９】ホモ二官能性活性化ＰＥＧ、ＲＧＤ−２Ｃペプチド、ポリアミン含有薬、およびｄｓＲＮＡの混合物の原材料から開始する、ＲＧＤ−ポリマー抱合体およびナノ粒子−ｓｉＲＮＡ調製物の生成のための製造フローチャート。
【図３０】２つの溶液（ポリマー抱合体を含むポリマー溶液および３つのｄｓＲＮＡ薬を含むｓｉＲＮＡ溶液）から開始するナノ粒子−ｓｉＲＮＡ調製物を製造するためのスタティックミキサーの使用。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１６】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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