(57)【要約】  アナライトを含有する液体試料と固体支持体表面を接触させ、そして該表面での結合事象を検出することにより、アナライトと固体支持体表面に固定化された結合剤との相互作用を測定する方法を提供し、ここで試料は固体支持体表面と相互作用できるアナライト以外少なくとも１種の分子種を含有する複雑な媒体に基づいている。この方法は、アナライトを含有する試料と固体支持体表面とを接触させる前に、アナライトを含まない試料媒体と該表面とを接触させることを包含している。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アナライトを含有する液体試料と固体支持体表面とを接触させ、そして該表面での結合事象を検出することにより、アナライトと固体支持体表面に固定化された結合剤との相互作用を測定する方法であって、試料は固体支持体表面と相互作用できるアナライト以外の少なくとも１種の分子種を含有する複雑な媒体に基づいており、該方法はアナライトを含有する複雑な媒体と固体支持体表面とを接触させる前に、アナライトを含まない試料媒体と該表面とを接触させることを包含することを特徴とする、上記方法。
【請求項２】
アナライトの固定化結合剤への結合を測定することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
固体支持体表面とアナライト含有試料とを接触させた後に、アナライトを含まない試料媒体と再度接触させ、そして該表面からのアナライトの解離を測定することを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
少なくとも１つの相互作用の結合定数、解離定数、結合速度定数および解離速度定数を測定することを特徴とする、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
試料中のアナライトの濃度を測定することを特徴とする、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
試料が、希釈剤で希釈された複雑な媒体を含むことを特徴とする、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
複雑な媒体が体液であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
体液が、脳脊髄液、唾液、母乳、尿、胆汁、血清、血漿、涙液、およびホモジナイズした生検試料、好ましくは血清および血漿、特にヒト血漿およびヒト血清から選択されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
複雑な媒体が、細胞培養培地、細胞溶解物、植物粗抽出物、液体食料品、抽出された食料品、および溶解された食料品、から選択されることを特徴とする、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
試料中の複雑な媒体の含量が、約１〜約１００％、好ましくは約１０〜約１００％、より好ましくは約３０〜約１００％、特に約３０〜約５０％であることを特徴とする、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
アナライトが低分子量化合物であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
試料が、薬物を患者に投与した後で患者から採取された血漿または血清に基づいており、そしてアナライトを含まない試料媒体が薬物を投与する前の患者から採取された血漿または血清に基づいていることを特徴とする、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
固体支持体表面がセンサー表面を含有し、そして該表面への結合がセンサー表面の特性の測定可能な変化を生じさせることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
固体支持体表面での結合事象がリアルタイムで検出されることを特徴とする、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
固体支持体表面での結合事象が時間に対する検出された結合レベルに関する結合曲線により表されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
センサー表面がバイオセンサーの部分であることを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
バイオセンサーがエバネセント波の感知、好ましくは表面プラズモン共鳴（SPR）に基づくことを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
方法がフローセル中で実施されることを特徴とする、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
薬物の血漿結合性向を測定する方法であって、この方法が、（ｉ）血漿を含有する複雑な媒体中、および（ｉｉ）複雑ではない媒体中で、薬物に対する固定化結合剤への該薬物の結合を測定すること、ならびに血漿含有媒体中の薬物の結合と複雑ではない媒体中の薬物の結合とを比較することを含み、この血漿含有媒体中での薬物の結合の測定が、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法に従って実施されることを特徴とする、上記方法。
【請求項２０】
分子結合相互作用を検出する分析システムであって、以下の：
少なくとも１つの感知表面を含むセンサー装置；
少なくとも１つの感知表面での分子結合相互作用を検出するための検出手段；
時間ごとの相互作用の進行を表す検出データを提供するための手段；
を含み、このシステムがさらに、請求項１〜１９のいずれかに記載の方法の段階を実施するためのコンピューター処理手段を含むことを特徴とする、上記分析システム。
【請求項２１】
プログラムがコンピューター上で作動しているとき請求項１〜１９のいずれかに記載の方法の段階を実施するための、コンピューターで読み取り可能な媒体上に保存された、または電気的もしくは光学的シグナル上で処理されたプログラムコード手段を含んでいるコンピュータープログラム製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固体支持体表面における分子相互作用の検出に関し、より特定すれば、体液のような複雑な媒体に基づく試料中に存在するアナライトと、該アナライトに対する固定化された結合剤との間の相互作用を測定するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子間の相互作用を特徴づけるために、とりわけ生体分子の検出および相互作用を目的とするアッセイとの関連で各種の分析技術が使用されている。例えば、抗体−抗原相互作用は多くの、生物学、免疫学および薬理学を含む分野で基本的な重要性を有している。この関連で多くの分析技術が、抗体のような「リガンド（ligand）」の固体支持体への結合とそれに続く該リガンドと抗原のような「アナライト（analyte）」との接触を包含している。リガンドとアナライトとの接触に続いて、リガンドがアナライトに結合する能力のような相互作用の指標であるいくつかの特性が測定される。相互作用の測定の後、遊離のリガンドを「再生し（regenerate）」、それによりリガンド表面を次の分析測定のために再利用できるようにするためにリガンド−アナライト対の解離を可能なようにすることがしばしば望まれている。
【０００３】
リアルタイムでそうした分子の相互作用をモニターできる分析用センサーシステムはますます関心を集めている。これらのシステムは多くの場合光学的バイオセンサーに基礎をおいており、通常相互作用分析センサーまたは生体特異的（biospecific）相互作用分析センサーと呼ばれている。そうしたバイオセンサーシステムの代表的なものが、ビアコア社（Biacore AB）（ウプサラ、スエーデン）から販売されているビアコア(R)（Biacore(R)）計測機器であり、これは試料中の分子と感知表面（sensing surface）上に固定化した分子構造との間の相互作用を検出するために、表面プラズモン共鳴（SPR）を用いている。ビアコア(R)システムを用いて、標識化を使用せずにリアルタイムで試料中の特定の分子の存在および濃度だけでなく、分子相互作用についての追加の相互作用パラメータ、例えば、会合速度定数および解離速度定数を測定することができる。
【０００４】
しかしアナライトが例えば血漿のような複雑な媒体中に存在する場合は、該測定は、通常血漿中に存在しそして固相表面と相互作用し非特異的な結合を生じさせるアナライト以外の分子種によって著しく妨害されるだろう。このことは、特に低分子量のアナライトに対して通常解釈の難しい測定結果をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、アナライトが複雑な媒体中に存在する場合の、アナライトと固相表面との相互作用を検出するに際しての上記の課題を解決することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
上記およびその他の目的および利点は、固体支持体表面と相互作用できる１種またはそれ以上の分子種を含有する複雑な媒体中にアナライトが存在する場合に、固体支持体表面に固定化された結合剤またはリガンドとアナライトとの間の相互作用を測定するための新規な方法により提供される。本発明によれば、モニターされる固体支持体表面が最初にアナライトを含まない複雑な媒体と接触させられ、その後直ちにアナライトを含有する複雑な媒体と接触させられる場合に、固体支持体表面での非特異性結合の測定結果への影響を少なくとも実質的に減少させることができる。複雑な媒体と固体支持体との全ての非特異的な結合は、それによりアナライト含有媒体と表面とが接触する前に少なくとも実質的な程度にまで発生し、そして次に表面で検出された追加の全ての変化は、それゆえに大体においてアナライトとの結合に帰することができる。
【０００７】
したがって一つの局面で本発明は、アナライトを含有する液体試料と固体支持体表面とを接触させ、そして該表面での結合事象を検出することによってアナライトと固体支持体表面に固定化された結合剤との相互作用を測定する方法を提供し、ここで試料は、固体支持体表面と相互作用できるアナライト以外の少なくとも１種の分子種を含有する複雑な媒体に基づいており、該方法はアナライトを含有する複雑な媒体と固体支持体表面とを接触させる前に、アナライトを含まない試料媒体と該表面とを接触させることを含むことによって特徴付けられる。
【０００８】
他の局面で、本発明は薬物の血漿との結合性向を測定する方法を提供するもので、この方法は、（ｉ）血漿を含有する複雑な媒体中、および（ii）複雑でない媒体中に存在する薬物と該薬物に対する固定化結合剤との結合を測定し、そして血漿含有媒体中の薬物の結合と複雑でない媒体中の薬物の結合とを比較することを含み、ここで血漿含有媒体中の薬物の結合の測定は、上記の第一の方法の局面に従って行われる。
【０００９】
さらに他の局面では、本発明は分子相互作用を研究するための分析システムを提供し、これは該方法の段階を実施するためのプログラムコード手段を含むコンピューター処理手段を包含する。
【００１０】
なお他の局面では、本発明は、この方法の段階を実施するための、コンピューター読み取り可能な媒体上に保存された、または電気的もしくは光学的シグナル上で実行される、プログラムコード手段を含むコンピュータープログラム製品を提供する。
【００１１】
本発明のこれらのおよび他の局面は、添付の図面および続く詳細な説明を参照することで明確になるであろう。
【００１２】
前述のように、本発明は、固体支持体表面での結合事象の検出に関連するアッセイまたは研究において複雑な試料媒体の非アナライト成分の非特異的な影響を減少させまたは排除する方法に関している。表面結合相互作用は多くの異なった相互作用分析技術によって特徴付けることができる。最近になって、標識なしのバイオセンサー技術がそのような相互作用分析の強力な道具となってきた。商業的に利用可能なバイオセンサーには、表面プラズモン共鳴（SPR）を基にしリアルタイムでの表面相互作用のモニターを可能にする前述のビアコア(R)システム装置が含まれる。
【００１３】
SPRの現象は周知であり、異なった屈折率の２つの媒体間の界面における特定の条件下で光が反射するときにSPRが生起し、そして該界面が金属フィルム、典型的には銀または金により被覆されていると言うだけで十分だろう。ビアコア(R)装置ではこの媒体は試料および、微小流体（microfluidic）フローシステムにより試料と接触するセンサーチップのガラスである。この金属フィルムはチップ表面上の金の薄層である。SPRは特定の反射角度で反射光強度の減少を生じさせる。この最小反射光強度の角度は、反射光から反対側（ビアコア(R)システムでは試料側）の表面に近接した屈折率によって変化する。
【００１４】
ビアコア(R)システムの模式図を図１で示した。センサーチップ１は、フローチャネル５を介してアナライト４（例えば抗原）を伴う試料流に曝露された、捕捉分子（リガンド）３、例えば抗体を支持している、金フィルム２を有している。光源７からの単色性ｐ−偏光６は、プリズム８によりこの光が全反射されるガラス／金属界面９にカップルされる。反射光線１０の強度は光学検出ユニット１１により検出される。
【００１５】
試料中の分子がセンサーチップ表面上の捕捉分子に結合するとき、濃度、そしてそれゆえに表面の変化とSPRの応答の屈折率の変化が検出される。相互作用の経過の間の時間に対する応答のプロッテングにより、該相互作用の進行の定量的測定が提供される。そうしたプロットは通常センサーグラムと呼ばれる。ビアコア(R)システムでは、SPR応答値は共鳴単位（RU）で表される。１RUは最小反射光強度の角度で0.00001°の変化を表し、多くのタンパク質に関してセンサー表面上で約１pg／mm2の濃度の変化におおよそ等しい。アナライトを含有する試料がセンサー表面と接触するとき、センサー表面に結合している捕捉分子（リガンド）は、「結合（association）」と呼ばれる段階で、アナライトと相互作用する。この段階は試料が最初にセンサー表面と接触するようになったとき、センサーグラム上ではRUの増加として示される。反対に、「解離（dissociation）」は試料流が、例えば緩衝液流により置換されたときに通常生じる。この段階はアナライトが表面結合リガンドから解離したときに、センサーグラム上ではゆっくりとしたRUの降下として示される。
【００１６】
センサーチップ表面での可逆的相互作用の代表的なセンサーグラム（結合曲線）を図２に示しており、感知表面は試料中のアナライトと相互作用する固定化捕捉分子（例えば抗体）を保持している。縦軸（ｙ−軸）は応答（ここでは共鳴単位RUで）を示し、および横軸（ｘ−軸）は時間（ここでは秒ｓで）を示している。最初に緩衝液を感知表面上に通してセンサーグラム中でベースライン応答Ａを与える。試料注入の間アナライトの結合によるシグナルの増加が観察される。この結合曲線の部分Ｂは通常「結合相」と呼ばれる。結局は共鳴シグナルがＣで平坦になる定常状態条件に達する。試料注入の終了時に試料が緩衝液の連続流で置換されて、そしてシグナルの減少が表面からのアナライトの解離または放出を反映する。この結合曲線の部分Ｄは、通常、「解離相」と呼ばれる。この結合／解離曲線の形態は、相互作用の反応速度（kinetics）に関する価値ある情報を提供し、そして共鳴シグナルの高さは表面濃度を表す（すなわち、相互作用から来る応答が表面上の質量濃度の変化に関連する）。
【００１７】
アナライトＡと表面結合（固定化）捕捉分子Ｂとの間の可逆的反応（質量移動は制限されていない）を仮定する（一次反応速度）：
【数１】
2008503753.tif 000003
【００１８】
アナライトを注入する間のＡの表面濃度の変化率は次の等式である：
【数２】
2008503753.tif 000004
（ここで Γ は結合したアナライトの濃度であり、Γmax はこの表面の最大結合容量であり、ｋass は結合速度定数であり、ｋdiss は解離速度定数であり、そしてＣはバルクのアナライト濃度である）この式をならべかえると次の等式が与えられる：
【数３】
2008503753.tif 000005
全ての濃度が同じ単位で測定された場合はこの等式は次のように書き換えることができる：
【数４】
2008503753.tif 000006
（ここでＲはRUで表した応答である。）積分型では、この等式は次のようになる：
【数５】
2008503753.tif 000007
【００１９】
解離速度は次のように表せる：
【数６】
2008503753.tif 000008
そして積分型では次のようになる：
【数７】
2008503753.tif 000009
【００２０】
親和性は結合定数ＫA＝ｋass／ｋdissまたは解離定数ＫD＝ｋdiss／ｋassで表す。
【００２１】
分子相互作用の反応速度の測定のためのより詳しい説明は、例えばKarlsson, R. およびFaelt, A. (1997) Journal of Immunological Methods, 200, 121-133 を参照できる。
【００２２】
ところで、試料がアナライトの他にセンサー表面と相互作用する可能性のある１種またはそれ以上の分子種をも含む「複雑な媒体（complex medium）」である場合は、そうした分子種の存在により生じる非特異的な結合が該表面での測定を著しく妨害し、特に目的のアナライトが低分子量化合物（通常、分子量が約100〜約1,000、典型的には約500〜約800、である有機化合物を意味し、時には「小分子」とも呼ばれる）である場合に、解釈の難しい結合曲線を与える可能性があることは容易にわかる。
【００２３】
本発明によれば、センサー表面上でアナライトが複雑な媒体中に存在する場合に、アナライト含有試料媒体と該表面を接触させる前にアナライトを含まない複雑な試料媒体と接触させれば、たとえ低分子量分子であっても、該アナライトに対する固定化結合剤への結合が成功裡に測定できることが見出された。このように実施することによって、センサー表面に対する非特異的な結合は該表面がアナライトを含まない複雑な媒体と接触したときに主に発生する。次いで試料をセンサー表面と接触させた場合には、この非特異的な結合プロセスは少なくとも実質的に減少しそして試料測定は少なくともずっと少ない程度までしか妨害されないだろうし、同時にそのことは以下の実施例で実証されるだろう。
【００２４】
好ましくは、センサー表面はアナライト含有試料媒体と接触した後、再度アナライトを含まない複雑な媒体と接触させられ、該アナライトに対する固定化結合剤からの該アナライトの解離が、結合剤への結合と同じ環境下で生じるようにする。したがって、上記のビアコア(R)システムを参照して、本発明の液体注入順序は、先行技術の方法である＜緩衝液＞、＜アナライト含有試料媒体＞、＜緩衝液＞とは異なって、＜アナライトを含まない試料媒体＞、＜アナライト含有試料媒体＞、＜アナライトを含まない試料媒体＞であるだろう。
【００２５】
試料が基づく複雑な媒体は目的とする１種またはそれ以上のアナライトを含有するような多数の媒体から選択することができる。複雑な媒体の例には脳脊髄液、唾液、母乳、尿、胆汁、血清、血漿、涙液、およびホモジナイズした生検試料のような体液、ならびに細胞培養培地、細胞溶解物、植物粗抽出物、抽出または溶解された食料品、液体食料品、例えば飲料（ミルク、果汁、ビール等）が包含される。
【００２６】
分析するべき特定の複雑な媒体に応じて、試験試料は採取した原試料であっても、または適切な希釈剤による原試料の希釈液であってもいい。一般に試料中の複雑な媒体の含量は約１〜約１００％（ｖ／ｖ）、通常は約１０〜約１００％（ｖ／ｖ）であり、特に約３０〜約１００％（ｖ／ｖ）、例えば約３０〜約５０％（ｖ／ｖ）である
【００２７】
例えば複雑な試料媒体がヒト血漿または血清に基づく場合は、アナライト含有媒体は薬物を投与した後の患者から採取された血漿または血清に基づくことができ、そして次にアナライトを含まない試料媒体は薬物を投与する前の同じ患者から採取された血漿または血清に基づくことができる。
【００２８】
したがって本発明の方法は、複雑な媒体中のアナライトと該アナライトに対する固定化結合剤との間の分子相互作用に関する反応速度およびアフィニティー定数（結合定数、解離定数、結合速度定数および解離速度定数が含まれる）の測定に使用できる。もちろん、本発明の方法はまた複雑な媒体中の１種またはそれ以上のアナライトの濃度の測定のためにも使用できる。結合剤支持表面とアナライトを含有する複雑な媒体との接触の前に、および場合によっては後で、該表面とアナライトを含まない複雑な媒体とを接触させることとは別に、反応速度およびアフィニティー定数と同時にアナライト濃度の測定もそれ自体を公知の方法で実施することができる。
【００２９】
本発明の変法において、該方法は各種の薬物の血漿結合性向（例えば、アフィニティー）を比較するために使用される。より特定すれば、薬物の固定化受容体に対する結合が特に上記の結合曲線の形態において、固定化受容体を有する表面と（ｉ）緩衝液に溶解した薬物、および（ii）血漿を加えた緩衝液に溶解した薬物とを接触させることによって測定され、そして次に結合レベル、または好ましくは結合曲線が比較される。薬物が血漿に結合する場合、それにより得られた血漿存在下での固定化受容体に対する結合は、緩衝液中にのみ存在する薬物と比較して実質的に減少しているだろう。一つの薬物濃度での測定が多くの場合に十分であろう。
【００３０】
上記の方法がビアコア(R)システムのいくつかの局面で実施される一方、本発明は、他の多くの固体支持体表面での結合相互作用を検出するための技術、例えば、放射能標識、発色団、蛍光団、散乱光のためのマーカー、電気化学的活性マーカー（例えば、電位差測定法に基づく電界効果トランジスタ）、電場活性マーカー（電気伝導放出）（electro-stimulated emission）、磁気活性マーカー、熱活性マーカー、化学発光部分または遷移金属のような標識に依存する技術、ならびに、いわゆる無標識検出システムと関連して使用できることが理解される。しかしながら、特に化学センサーまたはバイオセンサー技術を基にする場合には、リアルタイム検出システムが好ましい。
【００３１】
バイオセンサーは、固体の物理化学的トランスデューサと直接に結合するか、またはトランスデューサと結合している可動性担体ビーズ／粒子による分子認識のための構成成分（例えば固定化抗体を伴った層）を用いる装置として、広義に定義されている。そうしたセンサーは典型的には無標識技術、例えば、質量変化、屈折率または固定化層の厚さの検出に基づいているが、またある種の標識化に依存するセンサーも存在する。典型的なセンサー検出技術には、それには限定されないが、質量検出方法、例えば、光学的、熱−光学的および圧電的または音響波的（例えば、表面弾性波（SAW）および水晶振動子微量平衡（QCM）を含む）方法；ならびに、電気化学方法、例えば、電位差測定、電気伝導度測定、電流測定およびキャパシタンス／インピーダンス方法が包含される。光学的測定方法に関しての代表的な方法は、質量表面濃度を検出する方法、例えば、外部および内部反射方法の両方を含む反射光学方法であり、これは角度、波長、偏光または位相分解（phase resolved）であってよく、例えばエバネセント波（ellipsometry wave）偏光解析法およびエバネセント波分光法（EWS、または内部反射分光法）であり、これらはいずれも表面プラズモン共鳴（SPR）を介したエバネセント場の増強を含めることができ、ブルースター（Brewster）屈折角計測法、臨界屈折角計測法、漏れ全反射（FTR）、散乱増強標識を含むことができる散乱全内部反射（STIR）、光導波路センサー；外部反射イメージング、エバネセント波を基にしたイメージング、例えば、臨界角度分解イネージング、ブルースター角度分解イメージング、SPR角度分解イメージング等が挙げられる。さらに、測光的およびイメージング／顕微鏡法「それ自体」または反射方法と組み合わせた、例えば表面増感ラマン分光法（SERS）、表面増感共鳴ラマン分光法（SERRS）、エバネセント波蛍光発光法（TIRF）および燐光発光法、ならびに導波路干渉計、導波路漏れモード分光法、反射干渉分光法（RIfS）、透過型干渉法、ホログラフィー分光法、および原子間力顕微鏡法（AFR）を挙げることができる。
【００３２】
現在市販されているものは、特にSPRを基にしたバイセンサーシステムである。そうしたSPRバイオセンサーの例には上記のビアコア(R)機器が含まれる。ビアコア(R)機器の技術的側面およびSPRの現象に関する詳細な議論は、米国特許5,313,264で見出すことができるだろう。バイオセンサー感知表面のためのマトリクス被覆に関するより詳細な情報は、例えば、米国特許5,242,828および5,436,161で与えられる。さらに、ビアコア(R)機器に関連するバイオセンサーチップの技術的側面の詳細な議論は米国特許5,492,840で見出される。上記の米国特許の全開示は参照により本願に組み入れられる。
【００３３】
本発明の方法をフローセル中、例えば上記のビアコア(R)機器で使用されているタイプで実施することが多くの場合便利だろう。本発明で使用できる他のフローセルもまた当業者には周知であり、本願では記載する必要はない。
【００３４】
本願で用いられる「固体支持体」という表現は広く解釈されるべきであり、そして１種またはそれ以上の結合剤を固定化でき、そしてそれらの分子相互作用が選択された特定の検出システムで検出できるあらゆる固体（柔軟なまたは硬い）基質を意味している。基質は生物学的、非生物学的、有機、無機またはそれらの混合物であることができ、そして円盤状、球状、円状等のあらゆる都合の良い形状を有する、粒子、紐、沈殿物、ゲル、シート、管、球、容器、毛細管、パッド、切片、フィルム、プレート、スライド等の形態をとることができる。基質表面はあらゆる二次元的構造を有することができ、そして例えば段状、稜線状、こぶ状、段丘状等が含まれ、材料の層の表面は基質の残余の表面とは違ってもいい。
【００３５】
以下の実施例において、本発明の種々の局面を説明のためにより特定して非限定的に開示する。
【実施例】
【００３６】
この実施例は、唾液含有緩衝液中のヨーフェノキシ酸（α−エチル−３−ヒドロキシ−２，４，６−トリヨードヒドロ−桂皮酸）と固定化ヒト血清アルブミン（HSA）との相互作用を測定するための、本発明方法の使用を説明するものである。ヨーフェノキシ酸はHASと結合するがIgGとは結合しないことが知られており、したがって参照として使用される。唾液成分はHASとIgGの両方に非特異的に結合する。
【００３７】
計測機器
ビアコア(R)3000機器（ビアコア社、ウプサラ、スエーデン）を用いた。この機器は金表面での表面プラズモン共鳴（SPR）検出に基づいており、試料および移動用緩衝液を４つの個別に検出されるフローセル（Fc1〜Fc4と表示された）を通して１つずつまたは連続して通過させるための微小流体（micro-fluidic）システムを用いている。センサーチップは、共有結合したカルボキシメチル修飾デキストラン重合体ハイドロゲルを伴う金被覆表面を有するシリーズCM5認定等級（ビアコア社、ウプサラ、スエーデン）を用いた。この機器からの出力は、検出器の応答（「共鳴単位」、RU、で測定された）を時間の関数としてプロットした「センサーグラム」である。1000 RUの増加は、センサー表面上での約１ng／mm2の質量増加に対応する。
【００３８】
２つの液体、ＡおよびＢを、＜液体Ａ＞＜液体Ｂ＞＜液体Ａ＞の順で注入するプロトタイプのTRIINJECT コマンドを用いた（Andersson, Karl, 等 (1999) PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 37, 494-498）。
【００３９】
センサーチップの固定化
ビアコア(R)3000機器の３個のフローチャネル、Fc1、Fc2およびFc3、を用いた。抗ミオグロビンIgG（自家作成試薬）およびヒト血清アルブミン（HSA）（シグマ・アルドリッチ社、ミズリー、米国）をアミン・カプリングキット（ビアコア社、ウプサラ、スエーデン）を用いて、製造者の指示書に従って固定化した。移動用緩衝液（running buffer）は10 mM酢酸ナトリウム緩衝液pH 5.0（ビアコア社、ウプサラ、スエーデン）であった。センサーチップは以下のように固定化した：
Fc1：  ブランク
Fc2：  約8600 RU IgG（参照用）
Fc3：  約11000 RU ヒト血清アルブミン（HSA）
Fc4：  約9000 RU ヒト血清アルブミン（HSA）
【００４０】
センサーグラムがFc1からFc4を記録している間、Fc2およびFc3を記録するセンサーグラムのみを分析に使用した。
【００４１】
唾液のIgGおよびHASに対する非特異的な結合の測定
以下の２つの緩衝液を調製した：
HBS１％：１％DMSO（リーデル・デ・ハーエン（Riedel de Haen）、ゼールツ、ドイツ）を含有するHBS-EP（ビアコア社、ウプサラ、スエーデン）。
HBSS１％：１％DMSO（リーデル・デ・ハーエン）および30％唾液（健常人男性から供与）を含有するHBS-EP（ビアコア社）。
【００４２】
ビアコア(R)3000機器のトリインジェクト（triinject）コマンドを用いて、HBS１％である液体Ａ、およびHBS１％またはHBSS１％のいずれかである液体Ｂを連続的にフローセル１から３（Fc1、Fc2、Fc3）上に注入した。すなわち、注入順序は、それぞれ＜HBS１％＞ ＜HBS１％＞ ＜HBS１％＞、および＜HBS１％＞ ＜HBSS１％＞ ＜HBS１％＞であった。準備および洗浄段階の間に用いる、移動用緩衝液はHBS-EP（ビアコア社、ウプサラ、スエーデン）であった。HSA表面（Fc3）について得られたセンサーグラムを図３にオーバーレイ・プロットとして示す。図中でＡで示された点線はトリインジェクト中の液体ＢがHBSS１％である場合のセンサーグラムを示し、そして図中でＢで示された実線はトリインジェクト中の液体ＢがHBS１％である場合のセンサーグラムを示している。
【００４３】
図３中の区分10の間、機器は移動用緩衝液で注入の準備をする。区分11および13はトリインジェクト中で、この場合HBS１％中での＜液体Ａ＞である。区分12は実際の試料の注入で、すなわちトリインジェクト中で＜液体Ｂ＞である。12A はHBSS１％ に対応し、そして12ＢはHBS１％に対応する。区分14は移動用緩衝液による洗浄である。 各区分移動でのセンサーグラムの応答レベル（RU）の急激なシフトは、それぞれの液体のバルクでの屈折率の差異を反映しており、各区分の間の応答レベルの、より緩和な変化は特異的または非特異的な相互作用に対応している。区分12Ａと12Ｂとを比較したとき、区分12Ａは12Ｂより著しくより大きな勾配を有しており、このことは12Ａ中の唾液成分が表面に結合したことを示している。
【００４４】
同様な実験で、HBSS１％の試料注入はHBSS1％中に「埋め込まれ」た、すなわち＜液体Ａ＞および＜液体Ｂ＞は両方ともHBSS１％であった。２つのそうした注入からのセンサーグラムを、図４でオーバーレイ・プロットとして示し（図３中のようにフローセル３からのシグナル）、区分21から23は図３の区分11から13に対応している。図４に示されたように、急速な非特異的成分の結合による区分21中の早期の大きな浮動（drift）が存在する。区分21から22への移動の時点で、この浮動は減少する。特に、区分22の間の浮動は区分12の間のものより低く、このことは表面が試料を注入したときに既に非特異的成分により予備のインキュベーションをされてる場合、シグナルは同程度まで非特異的結合に影響されないことを示している。
【００４５】
３０％唾液中のヨーフェノキシ酸とHASとの相互作用の測定
HBSS１％中での50μM ヨーフェノキシ酸（シグマ・アルドリッチ社、ミズリー、米国）を＜液体Ｂ＞として、およびHBSS１％を＜液体Ａ＞として用い、そしてトリインジェクト注入をFc1、Fc2およびFc3上でシリーズに行った。検出はFc3（HSA-表面）およびFc2（IgG-表面）で行った。Fc3から得られたセンサーグラムは参照のFc2のセンサーグラムを差し引くことによって「補正」された。得られた参照の差し引きセンサーグラム（Fc3-Fc2）を図５でオーバーレイ・プロットとして示す。図中でＥで示された実線はトリインジェクト中の液体ＢがHBSS１％中の50μM ヨーフェノキシ酸である場合のセンサーグラムを示し、そして図中でＦで示された点線はトリインジェクト中の液体ＢがHBSS１％である場合のセンサーグラムを示している。
【００４６】
図５において、区分31、32Fおよび33はHBSS1％であり、そして区分32EはHBSS１％中の50μM ヨーフェノキシ酸である。区分31〜33の間の勾配はHSA（Fc3）に対してより、低い速度でIgG（Fc2）に非特異的に結合する唾液成分によるものである。しかし、非特異的結合の影響はヨーフェノキシ酸を区分32で注入したときには安定している。区分32Eおよび32Fからわかるようにヨーフェノキシ酸の結合は容易に定量化できる。
【００４７】
IgGとHASとの間の非特異的結合の差異を補正するために、緩衝液注入からのセンサーグラム（図５中のＦ）はヨーフェノキシ酸注入からのセンサーグラム（図５中のＥ）から差し引くことができる。ヨーフェノキシ酸のHSAへの結合は、HBSS１％で３回そしてHBS１％中で３回、特徴付けられ、そしてこのようにして補正されて得られたセンサーグラムが図６に示される。唾液含有緩衝液のセンサーグラムが点線（Ｄ）で示され、一方純粋な緩衝液のセンサーグラムが実線（Ｃ）で示される。図６に示されるように、センサーグラムＤ（唾液含有緩衝液）はセンサーグラムＣ（純粋な緩衝液）と合致し、このことはこの方法が複雑なマトリクス中での分子相互作用を特徴付けるときに好都合であることを示している。
【００４８】
したがって、表面を試料と接触させる前にHSAおよびIgG表面を非特異的に結合する唾液成分で予備インキュベーションすることにより、ヨーフェノキシ酸の相互作用の測定を妨害する可能性のある試料媒体からの非特異的結合が最小化される。そのために、本発明の方法は特に小分子が複雑な試料媒体中のリガンドにいかに結合するかを測定する場合の、可能性のある非特異的結合の影響を最小化するために適している。
【００４９】
本発明は、上記の本発明の特定の実施態様に限定されないが、しかし本発明の範囲は付随する請求の範囲により確立されることを理解するべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】SPRを基にしたバイオセンサーシステムの図示的な側面図である。
【図２】アナライトと該アナライトに対する固定化結合剤との間の相互作用に関して、時間に対して検出器の応答を示しているセンサーグラム（sensorgram）である。
【図３】（ｉ）点線で純粋な緩衝液の注入の間に埋め込まれた唾液含有緩衝液の注入に関するセンサーグラム、および（ii）実線で純粋な緩衝液の逐次注入に関するセンサーグラムのオーバーレイ・プロットである。
【図４】それぞれが唾液含有緩衝液の３回の逐次注入を表す、２つのセンサーグラムのオーバーレイ・プロットである。
【図５】（ｉ）実線で唾液含有緩衝液の注入の間に埋め込まれた唾液含有緩衝液中のヨーフェノキシ酸注入に関するセンサーグラム、および（ii）点線で対応する唾液含有緩衝液の逐次注入に関するセンサーグラムのオーバーレイ・プロットである。
【図６】点線が、図５のセンサーグラム（ｉ）に対応するセンサーグラムから、図５のセンサーグラム（ii）に対応するセンサーグラムを差し引くことにより得られた、３つの補正したオーバーレイ・プロットであり、そして、実線が、純粋な緩衝液中のヨーフェノキシ酸の注入に関する対応するセンサーグラムである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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