(57)【要約】本発明は、ＵＶ光及び光開始剤によるＯＰＦマクロマーの光重合から作製される光架橋性の注入可能な生分解性オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）（ＯＰＦ）ヒドロゲルを提供する。様々な機械特性及び含水量を有するヒドロゲルは、前駆体溶液中のマクロマー及び架橋剤の濃度の変化により作製することができる。生分解性ＯＰＦヒドロゲルは、任意の形状の身体的欠損部へ流体として注入することができ、様々な治療剤（例えば、細胞及び／又は成長因子）を組み込ませてもよく、低侵襲的関節鏡視下技法により移植されてもよい。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）と、
不飽和ピロリジノンモノマーと、
光開始剤と
を含む、光架橋性の生分解性材料。
【請求項２】
前記モノマーがＮ−ビニルピロリジノンである、請求項１記載の光架橋性の生分解性材料。
【請求項３】
注入可能である、請求項１記載の光架橋性の生分解性材料。
【請求項４】
１つ又は複数の生理活性剤をさらに含む、請求項１記載の光架橋性の生分解性材料。
【請求項５】
軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞をさらに含む、請求項１記載の光架橋性の生分解性材料。
【請求項６】
ポロゲンをさらに含む、請求項１記載の光架橋性の生分解性材料。
【請求項７】
前記光開始剤が細胞適合性である、請求項１記載の光架橋性の生分解性材料。
【請求項８】
３０℃〜４５℃の温度範囲で光架橋する、請求項１記載の光架橋性の生分解性材料。
【請求項９】
前記材料におけるオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）対ピロリジノンモノマーの重量比が１：０．０１〜１：０．５の範囲である、請求項１記載の光架橋性の生分解性材料。
【請求項１０】
前記オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）２０重量％〜４０重量％を含む、請求項１記載の光架橋性の生分解性材料。
【請求項１１】
オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）と、
軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞と、
光開始剤と
を含む、光架橋性の生分解性材料。
【請求項１２】
オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）及び不飽和ピロリジノンモノマーを光架橋することにより調製される生分解性ヒドロゲル。
【請求項１３】
９５重量パーセント以上の水を含む、請求項１２記載の生分解性ヒドロゲル。
【請求項１４】
１つ又は複数の生理活性剤を含む、請求項１２記載の生分解性ヒドロゲル。
【請求項１５】
水溶液中で光架橋される、請求項１２記載の生分解性ヒドロゲル。
【請求項１６】
光架橋前のオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）対ピロリジノンモノマーの重量比が１：０．０１〜１：０．５の範囲である、請求項１２記載の生分解性ヒドロゲル。
【請求項１７】
オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）を光架橋することにより調製されるヒドロゲルを含む生分解性マトリックスと、
軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞と
を含む、組織再生用スカフォールド。
【請求項１８】
前記ヒドロゲルが、オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）及び不飽和ピロリジノンモノマーを光架橋することにより調製される、請求項１７記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項１９】
前記細胞が前記マトリックス中に封入される、請求項１７記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項２０】
前記細胞が前記マトリックスの表面に付着される、請求項１７記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項２１】
前記細胞が球状形態を有する、請求項２０記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項２２】
前記細胞が平板状形態を有する、請求項２０記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項２３】
多孔質である、請求項１７記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項２４】
前記ヒドロゲルが、ポロゲンの存在下でオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）を光架橋することにより調製される、請求項２３記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項２５】
多孔率７０％〜９０％を有する、請求項２３記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項２６】
前記細胞が軟骨形成細胞である、請求項１７記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項２７】
前記細胞が骨形成原細胞である、請求項１７記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項２８】
前記細胞がコラーゲン又はコラーゲン誘導体中に懸濁される、請求項１７記載の組織再生用スカフォールド。
【請求項２９】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の材料を、患者の体内へ注入すること、及び
前記材料を光架橋すること
を含む、組織再生方法。
【請求項３０】
請求項１７〜２８のいずれか１項に記載のスカフォールドを、患者の体内へ移植すること
を含む、組織再生方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願に対する相互参照］
本出願は、２００５年３月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６６４，５４０号からの優先権を主張する。
【０００２】
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
この研究は、認可番号Ｒ０１−ＡＲ４５８７１及びＲ０１−ＥＢ００３０６０により国立衛生研究所により支援された。
【０００３】
［発明の背景］
１．発明の分野
本発明は、ＵＶ光及び光開始剤によるＯＰＦマクロマーの光重合から作製される光架橋性の注入可能な生分解性オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）（ＯＰＦ）ヒドロゲルに関する。様々な機械特性及び含水量を有するヒドロゲルは、前駆体溶液中のマクロマー及び架橋剤の濃度の変化により作製することができる。生分解性ＯＰＦヒドロゲルは、任意の形状の身体的欠損部へ流体として注入することができ、様々な治療剤（例えば、細胞及び／又は成長因子）を組み込ませてもよく、低侵襲的関節鏡視下技法(minimally  invasive  arthroscopic  techniques)により移植されてもよい。
【背景技術】
【０００４】
２．関連技術の記載
成長因子のような生理活性分子の制御放出は、それが罹患部位での細胞機能の調節及び組織形成を可能にするため、組織工学の重要な一面となっている。生分解性材料内の薬物、タンパク質及び他の生理活性分子の封入は、含有される物質の放出プロファイルを制御するのに有効な方法である。
【０００５】
したがって、細胞及び薬物送達（ドラッグデリバリー）用の注入可能な光架橋性で且つ生分解性の系を提供することに継続して関心がもたれている。光重合性の分解性生体材料は、化学的に開始される熱硬化系を上回る多くの利点を提供する。光開始される反応は、生理学的温度で迅速な重合速度を提供する。さらに、開始材料が液体溶液であるため、この系は、複雑な形状の容積中に容易に配置され、続いて反応して、必要とされる寸法のポリマーを正確に形成する。
【０００６】
このアプローチでは、プレポリマーは注入により所望の部位へ導入されて、関節鏡視下技法を使用して光ファイバー・ケーブルでｉｎ  ｓｉｔｕで光硬化させるため、幾つかの外科技法の侵襲性を最低限に抑えられる（Anseth他著「組織工学及び薬物送達におけるｉｎ  ｓｉｔｕ形成性の分解性ネットワーク並びにそれらの用途(In  situ  forming  degradable  networks  and  their  application  in  tissue  engineering  and  drug  delivery)」(J  Control  Release，2002；78(1-3)：199-209)を参照）。さらに、マクロマーと光開始剤との混合物を光源に露光させることにより、マクロマーは迅速な架橋を受けて、ネットワークを形成する（Bryant他著「ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞に対するＵＶ及び可視光の光開始系の細胞適合性(Cytocompatibility  of  UV  and  visible  light  photoinitiating  systems  on  cultured  NIH/3T3  fibroblasts  in  vitro)」(J  Biomater  Sci  Polym  Ed.，2000；11(5)：439-57)を参照）。これらのネットワークを使用して、水溶性薬物及び酵素を捕捉して、制御された速度でそれらを送達することができる（Bryant他著「高い弾性率を有する分解性ＰＥＧヒドロゲルにおける軟骨細胞の封入：軟骨組織産生を促進するためのゲル構造変化の設計(Encapsulating  chondrocytes  in  degrading  PEG  hydrogels  with  high  modulus：engineering  gel  structural  changes  to  facilitate  cartilaginous  tissue  production)」(Biotechnol  Bioeng  2004  86(7)：747-55)、及びHatefi他著「生分解性の注入可能なｉｎ  ｓｉｔｕ形成性ドラッグデリバリーシステム(Biodegradable  injectable  in  situ  forming  drug  delivery  systems)」(J  Control.  Release  2002；80(1-3)：9-28)を参照）。
【０００７】
かなりの関心が寄せられている組織工学用途の１つは、軟骨における欠損の回復である。軟骨は、障害、先天性異常又は関節炎の結果として、限られた再生能力を有する身体で見出される数少ない組織の１つである。ここ１０年では、軟骨における欠損を回復させる方法を生み出すために、多くの研究努力が整形外科的組織工学に向けられてきた（Anseth他著「組織工学及び薬物送達におけるｉｎ  ｓｉｔｕ形成性の分解性ネットワーク並びにそれらの用途」(J  Control  Release  2002；78(1-3)：199-209)、及びBryant他著「光架橋性ヒドロゲルにおける軟骨形成に対する架橋密度の影響(The  effects  of  crosslinking  density  on  cartilage  formation  in  photocrosslinkable  hydrogels)」(Biomed  Sci  Instrum  1999；35：309-14)、及びBurdick他著「分解性ＰＥＧヒドロゲルからの骨誘導成長因子の送達は、骨芽細胞分化及び石灰化に影響を与える(Delivery  of  osteoinductive  growth  factors  from  degradable  PEG  hydrogels  influences  osteoblast  differentiation  and  mineralization)」(J  Control  Release  2002；83(1)：53-63)を参照）。課題の１つは、特定の細胞機能に有益であり、したがって予測可能且つ制御された様式で細胞接着、増殖、特定の表現型の発現及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）堆積を調節し得る生分解性スカフォールドの設計並びに製造である（Genes他著「修飾アルギン酸塩表面への軟骨細胞接着に対する基材力学の影響(Effect  of  substrate  mechanics  on  chondrocyte  adhesion  to  modified  alginate  surfaces)」(Arch  Biochem  Biophys  2004；422(2)：161-7)、及びLoty他著「細胞骨格修飾による鼻中隔軟骨細胞の表現型調節(Phenotypic  modulation  of  nasal  septal  chondrocytes  by  cytoskeleton  modification)」(Biorheology  2000；37(1-2)：117-25)、及びMahmood他著「ヒト関節軟骨細胞における接着媒介性シグナル伝達：生体材料化学及びテネイシンの影響(Adhesion-mediated  signal  transduction  in  human  articular  chondrocytes：the  influence  of  biomaterial  chemistry  and  tenascin)」(C  Exp  Cell  Res  2004；301(2)：179-88)を参照）。合成ポリマー上での細胞挙動は、基材の物理特性及び化学特性の両方に関連することが知られている（Mahmood他著「ヒト関節軟骨細胞における接着媒介性シグナル伝達：生体材料化学及びテネイシンの影響」(C  Exp  Cell  Res  2004；301(2)：179-88)、及びDadsetan他著「ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのレーザ表面修飾したポリエチレンテレフタレート上の細胞挙動(Cell  behavior  on  laser  surface-modified  polyethylene  terephthalate  in  vitro)」(J  Biomed  Mater  Res  2001；57(2)：183-9)、及びDadsetan他著「表面化学は、接着構造、細胞骨格組織及びマクロファージの融合を媒介する(Surface  chemistry  mediates  adhesive  structure，cytoskeletal  organization，and  fusion  of  macrophages)」(J  Biomed  Mater  Res  2004；71A(3)：439-48)を参照）。スカフォールドの物理特性は、栄養分の拡散、老廃物及び細胞間相互作用を調節することにより細胞機能を制御し得るのに対して、スカフォールドの表面化学は、タンパク質吸着を制御することにより細胞接着、形態、及び続く細胞活性に影響を及ぼす（Collier他著「化学的に修飾された表面上でのタンパク質吸着(Protein  adsorption  on  chemically  modified  surfaces)」(Biomed  Sci  Instrum  1997；33：178-83)、及びJones他著「表面修飾したポリウレタン上でのマクロファージ挙動(Macrophage  behavior  on  surface-modified  polyurethanes)」(J  Biomater  Sci  Polym  Ed  2004；15(5)：567-84)を参照）。
【０００８】
軟骨細胞は、軟骨細胞形態と機能との間で確立された密接な関係に起因する細胞−基材相互作用の研究にとって理想的なモデルである（Miot他著「ヒト鼻軟骨細胞再分化及び軟骨マトリックス堆積に対するスカフォールド組成並びに構造の影響(Effects  of  scaffold  composition  and  architecture  on  human  nasal  chondrocyte  redifferentiation  and  cartilagious  matrix  deposition)」(Biomaterials  2005；26(15)：2479-89)を参照）。この能力は、コラーゲン、プロテオグリカン及び他の分子の豊富なネットワークである軟骨ＥＣＭに主として起因する。ＥＣＭは、様々な受容体を通じて軟骨細胞と相互作用して、軟骨細胞代謝表現型及び機械的負荷に対する応答を調節する(Genes他著「修飾アルギン酸塩表面への軟骨細胞接着に対する基材力学の影響」(Arch  Biochem  Biophys  2004；422(2)：161-7)、及びSah他著「動的圧縮に対する軟骨外植片の生合成応答(Biosynthetic  response  of  cartilage  explants  to  dynamic  compression)」(J  Orthop  Res  1989；7(5)：619-36)を参照）。軟骨細胞が特異的な個々のＥＣＭシグナルにどのように応答するかを理解することにより、機械的要因により促進されることが知られている変形性関節症のような疾患の病因に対する洞察が提供される（Radin他著「ウサギの膝の組織に対する機械的負荷の影響(Effects  of  mechanical  loading  on  the  tissues  of  the  rabbit  knee)」(J  Orthop  Res  1984；2(3)：221-34)、及びCooper他著「作業活動と膝の変形性関節症(Occupational  activity  and  osteoarthritis  of  the  knee)」(Ann  Rheum  Dis  1994;53(2)：90-3)を参照）。
【０００９】
二次元での基材上でのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの軟骨細胞培養は、ＩＩ型コラーゲン及びアグリカンのような軟骨特異的タンパク質の遺伝子発現並びに産生を低減させ、且つより多くの線維芽細胞表現型へ迅速に脱分化することがわかっている。（Loeser著「細胞外マトリックスタンパク質への関節軟骨細胞のインテグリン媒介性付着(Integrin-mediated  attachment  of  articular  chondrocytes  to  extracellular  matrix  proteins)」(Arthritis  Rheum  1993；36(8)：1103-10)を参照）。多数の研究者が、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ−２）のような成長因子を使用してマイクロキャリア上で細胞を成長させること（Martin他著「２Ｄ増殖中のＦＧＦ−２及び３Ｄ培養中のＢＭＰ−２への軟骨細胞の順次暴露による増強された軟骨組織工学(Enhanced  cartilage  tissue  engineering  by  sequential  exposure  of  chondrocytes  to  FGF-2  during  2D  expansion  and  BMP-2  during  3d  cultivation)」(J  Cell  Biochem  2001；83(1)：121-8)を参照）、又はサイトカラシンＤのような細胞骨格修飾薬物を組み込むこと（Loty他著「サイトカラシンＤは、細胞形状の変化を誘導すると共にｉｎ  ｖｉｔｒｏでの軟骨形成を促進する：形態学的研究(Cytochalasin  D  induces  changes  in  cell  shape  and  promotes  in  vitro  chondrogenesis：a  morphological  study)」(Biol  Cell  1995；83(2-3)：149-61)を参照）により、単層培養で軟骨細胞増殖中に軟骨形成細胞表現型を再発現させるための技法を研究してきた。しかしながら、細胞表現型を調節する事象に対する材料特性の影響は広範囲に研究されてはいない（Mahmood他著「ヒト関節軟骨細胞における接着媒介性シグナル伝達：生体材料化学及びテネイシンの影響」(C  Exp  Cell  Res  2004；301(2)：179-88)、及びPapadaki他著「ＰＥＧＴ／ＰＢＴブロック共重合体上での骨格筋細胞及び軟骨細胞の種々の挙動は、基材の表面特性に関連する(The  different  behaviors  ofskeletal  muscle  cells  and  chondrocytes  on  PEGT/PBT  block  copolymers  are  related  to  the  surface  properties  of  the  substrate)」(J  Biomed  Mater  Res  2001；54(1)：47-58)を参照）。
【００１０】
様々な材料が、軟骨修復における使用に関して示唆されている。これらの材料としては、コラーゲン、アルギン酸塩及びヒアルロン酸のような天然ポリマー類、並びにポリアクリルアミド類、ポリ（ビニルアルコール）及びポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のような合成ポリマー類が挙げられている（Yaylaoglu他著「代用骨としてのリン酸カルシウム−ゼラチン複合材の開発及び薬物放出におけるその使用(development  of  a  calcium  phosphate-gelatin  composite  as  a  bone  substitute  and  its  use  in  drug  release)」(Biomaterials  1999;20(8)：711-9)、及びRowley他著「合成細胞外マトリックス材料としてのアルギン酸塩ヒドロゲル(Alginate  hydrogel  as  synthetic  extracellular  matrix  materials)」(Biomaterials  1999；20(1)：45-53)、及びTemenoff他著「整形外科的組織工学用の注入可能な生分解性材料(Injectable  biodegradable  materials  for  orthopedic  tissue  engineering)」(Biomaterials  2000；21(23)：2405-12)、及びJasionowski他著「軟骨細胞の３Ｄ細胞培養のための熱可逆的ゲル(Thermally-reversible  for  3-D  cell  culture  of  chondrocytes)」(J  Mater  Sci  Mater  Med  2004；15(5)：575-82)、及びNoguchi他著「人工関節軟骨としてのポリ（ビニルアルコール）ヒドロゲル：生体適合性の評価(Poly(vinyl  alcohol)  hydrogel  as  an  artificial  articular  cartilage：evaluation  of  biocompatibility)」(J  Appl  Biomater  1991；2(2)：101-7)、及びCruise他著「界面光重合されたポリ（エチレングリコール）ジアクリレート膜中に封入されたブタ膵島のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの性能(In  vitro  and  in  vivo  performance  of  porcine  islets  encapsulated  in  interfacially  photopolymerized  poly(ethylene  glycol)  diacrylate  membranes)」(Cell  Transplant  1999；8(3)：293-306)、及びWallace他著「反応性多官能性ポリエチレングリコールに基づく組織シーラント(A  tissue  sealant  based  on  reactive  multifunctional  polyethylene  glycol)」(J  Biomed  Mater  Res  2001；58(5)：545-55)を参照）。
【００１１】
オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）（ＯＰＦ）は、酸化還元開始系を伴うヒドロゲルの製造用に開発されており、使用されているマクロマーである。ＯＰＦヒドロゲルは生分解性であり、それらの機械特性及び分解速度は、マクロマー形成で使用されるＰＥＧの分子量により制御されることが報告されている(Jo他著「官能基化されたポリマーネットワークの調製のためのＧＲＧＤペプチドによるオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）マクロマーの修飾(Modification  of  oligo(poly(ethylene  glycol)fumarate)  macromer  with  a  GRGD  peptide  for  the  preparation  of  functionalized  polymer  networks)」(Biomacromolecules  2001；2(1)：255-61)、及びTemenoff他著「軟骨組織工学用のオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）ヒドロゲルの引張特性及び膨潤特性に対するポリ（エチレングリコール）分子量の影響(Effect  of  poly(ethylene  glycol)  molecular  weight  on  tensile  and  swelling  properties  of  oligo(poly(ethylene  glycol)fumarate)  hydrogels  for  carilage  tissue  engineering)」(J  Biomed  Mater  Res  2002；59(3)：429-37)、並びに米国特許第６，８８４，７７８号明細書及び米国特許出願公開第２００２／００２８１８９号明細書を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、様々な治療剤（例えば、細胞及び／又は成長因子）を組み込ませてもよく、また低侵襲的関節鏡視下技法により移植されてもよい、身体的欠損部へ流体として注入することができ、且つ当該欠損部において光架橋させることができる光架橋性の注入可能な生分解性ヒドロゲルが依然として必要とされる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
［発明の概要］
本発明は、オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）（ＯＰＦ）マクロマーから開発された生分解性ヒドロゲルを提供する。ＯＰＦヒドロゲルの重要な特徴は、それらが低出力のＵＶ光及び細胞適合性光開始剤を使用して室温で数分で架橋することである。Ｎ−ビニルピロリジノン（ＮＶＰ）は、コモノマーとして且つ光架橋促進剤として使用され得る。これらのヒドロゲルは、水性環境中で高度の膨潤を有し、９５％を超える含水量でそれらの構造完全性を維持することができる。したがって、これらのヒドロゲルは、細胞封入に適用して、数ミリメートル厚である構築物において細胞生存率を支持することができる。これは、栄養分及び廃棄物の交換が、水中でこの程度の距離にわたって行われ得るためである。さらに、合成マトリックス特性（例えば、架橋密度、含水量、弾性率及び表面張力）は、その最終用途に適合するように調整することができる。
【００１４】
この研究において、本発明者らは、ＯＰＦの架橋に関して光重合を選択する。光架橋は、従来の架橋を上回る利点（例えば、空間的制御及び時間的制御）を提供する。開始には、温度の上昇を要さず、重合速度は、ｉｎ  ｖｉｖｏ配置に関して生理条件下で十分速い。光架橋は、膵島のマイクロカプセル化、制御放出用途、血管接着及び骨修復で特に使用されている（Cruise他著「ブタ膵島に関するポリ（エチレングリコール）ジアクリレートの界面光重合における重要なパラメータの感受性研究(A  sensitivity  study  of  the  key  parameters  in  the  interfacial  photopolymerization  of  poly(ethylene  glycol)diacrylate  upon  porcine  islets)」(Biotechnol  Bioeng  1998  57(6)：655-65)、及びCruise他著「界面光重合されたポリ（エチレングリコール）ジアクリレートヒドロゲルの透過性及びネットワーク構造の特性(Charactertization  of  permeability  and  network  structure  of  interfacially  photopolymerized  poly(ethylene  glycol)diacrylate  hydrogels)」(Biomaterials  1998；19(14)：1287-94)、及びLu他著「制御放出用の多層性ポリ（ＨＥＭＡ）ヒドロゲルの光重合(Photopolymerization  of  multilaminated  poly(HEMA)  hydrogels  for  controlled  release)」(J  Control  Release  1999；57(3)：291-300)、及びDumanian他著「血栓形成を増大させずにヒト血管吻合を塞ぐ新たな光重合性血管グルー(A  new  photopolymerizable  blood  vessel  glue  that  seals  human  vessel  anastomoses  without  augmenting  thrombogenicity)」(Plast  Reconstr  Surg  1995；95(5)：901-7)、及びMuggli他著「整形外科的用途における使用のための架橋ポリ酸無水物：分解挙動及び力学(Crosslinked  polyanhydrides  for  use  in  orthopedic  applications：degradation  behavior  and  mechanics)」(J  Biomed  Mater  Res  1999；46(2)：271-8)を参照）。
【００１５】
一例では、本発明者らは、ＯＰＦの架橋に関して、長波長ＵＶ源及び細胞適合性であると報告されているＩｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９ラジカル光開始剤を用いた（Bryant他著「ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養ＮＩＨ／３Ｔ３線維芽細胞に対するＵＶ及び可視光光開始系の細胞適合性」(J  Biomater  Sci  Polym  Ed  2000；11(5)：439-57)を参照）。Ｎ−ビニルピロリジノン（ＮＶＰ）は、コモノマー且つ光架橋促進剤として使用した。促進の役割は、膵島の光封入におけるＮＶＰに関してこれまでに報告されている（Cruise他著「ブタ膵島に関するポリ（エチレングリコール）ジアクリレートの界面光重合における重要なパラメータの感受性研究」(Biotechnol  Bioeng  1998  57(6)：655-65)を参照）。本発明者らは、ヒドロゲルの機械特性、膨潤挙動及び分解速度が、ＮＶＰ濃度の変化により制御され得ることを実証した。さらに、本発明者らは、ヒドロゲル特性の変化が、これらのヒドロゲル上で培養される軟骨細胞の接着、増殖及び形態に影響を及ぼすことを示すデータを提示する。ＯＰＦヒドロゲルへの軟骨細胞の光封入もまた研究した。
【００１６】
本発明のこれらの特徴、態様及び利点並びに他の特徴、態様並びに利点は、以下の詳細な説明、図面及び添付の特許請求の範囲を考慮してより良好に理解されるようになるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
［発明の詳細な説明］
一実施態様では、本発明は、ヒドロゲルを形成するのに使用され得る光架橋性の生分解性材料を提供する。一形態では、上記材料は、オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）、不飽和ピロリジノンモノマー及び光架橋用の光開始剤を含む。上記材料は好ましくは、光の適用による患者の身体におけるｉｎ  ｓｉｔｕでの架橋のために注入可能である。１つ又は複数の生理活性剤が上記材料中に含まれてもよい。一例では、軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞が、軟骨成長及び／又は骨成長用途用に上記材料中に含まれる。上記材料は、多孔質スカフォールドの形成用のポロゲン（例えば、塩化ナトリウム粒子）を含んでもよい。別の形態では、光架橋性の生分解性材料は、オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）、軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞、並びに光開始剤を含む。本発明はまた、組織再生方法を提供し、ここで上記材料は患者の体内へ注入され、そして上記材料は光源によって光架橋されて、組織再生を可能にするためのスカフォールドを形成する。
【００１８】
この実施態様では、非限定的な例の光開始剤として、１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オン、アセトフェノン、ベンゾフェノン及びベンゾインエーテル類が挙げられる。好ましくは、光開始剤は細胞適合性である。Ｎ−ビニルピロリジノン（ＮＶＰ）は、モノマーとして、且つ光架橋促進剤として使用することができる。他の非限定的な例の促進剤としては、Ｎ，Ｎ−ジメチルトルイジン又はテトラメチル−エチレンジアミンが挙げられる。好ましくは、上記材料は、ヒトの体温での光架橋が可能であるように３０℃〜４５℃の温度範囲で光架橋する。一例の形態では、上記材料におけるオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）対ピロリジノンモノマーの重量比は、１：０．０１〜１：０．５の範囲であり、上記材料は、オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）２０重量％〜４０重量％を含む。
【００１９】
別の実施態様では、本発明は、オリゴ（ポリエチレングリコール）フマレート）及び不飽和ピロリジノンモノマーを光架橋することにより調製される生分解性ヒドロゲルを提供する。上記ヒドロゲルは、９５重量パーセント以上の水を含むことができ、構造完全性を保持することができる。上記ヒドロゲルは、１つ又は複数の生理活性剤を含んでもよい。上記ヒドロゲルは、水溶液中で光架橋され得る。好ましくは、光架橋前のオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）対ピロリジノンモノマーの重量比は、１：０．０１〜１：０．５の範囲である。
【００２０】
さらに別の実施態様では、本発明は、組織再生用スカフォールドを提供する。上記スカフォールドは、（ｉ）オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）を光架橋することにより調製されるヒドロゲル、並びに（ｉｉ）軟骨形成細胞及び骨形成原細胞から成る群から選択される細胞、を包含する生分解性マトリックスを含む。上記ヒドロゲルは、オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）及び不飽和ピロリジノンモノマーを光架橋することにより調製されてもよい。上記細胞は、マトリックス中に封入されてもよく、且つ／又は上記細胞は、マトリックスの表面へ接着されてもよい。上記細胞は、球状形態(spherical  morphology)を有してもよく、且つ／又は上記細胞は、平板状形態(flattened  morphology)を有してもよい。上記細胞は、コラーゲン又はコラーゲン誘導体（例えば、ゼラチン又はアテロコラーゲン）中に懸濁させてもよい。上記スカフォールドは多孔質であってもよく、上記ヒドロゲルは、ポロゲンの存在下でオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）を光架橋することにより調製され得る。好ましくは、上記スカフォールドは、７０％〜９０％の多孔率を有する。本発明はまた、組織再生方法を提供し、ここで上記スカフォールドは、組織再生を可能にするように患者の体内へ移植される。
【００２１】
本発明の或る特定の非限定的な例の変形形態では、生体適合性且つ生分解性のマクロマーであるオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）（ＯＰＦ）が、ＯＰＦヒドロゲルの製造に使用された。ＯＰＦは、ＵＶ光、光開始剤、及びコモノマーとしての且つ架橋剤としてのＮ−ビニルピロリジノン（ＮＶＰ）を使用して架橋させた。本発明者らは、ヒドロゲル架橋レベルは初期マクロマー溶液中のＮＶＰ濃度の変化により制御することができることを実証した。続いて、ヒドロゲルの膨潤挙動、機械特性及び分解速度に対する架橋レベルの影響を研究した。本発明者らの結果により、ヒドロゲルの平衡膨潤は架橋密度の増大に伴って減少する一方で、圧縮弾性率は増大することが示された。また、本発明者らは、ヒドロゲル分解速度がヒドロゲルの架橋レベルと相関することも実証した。ヒドロゲル分解速度は、架橋レベルが増大するにつれ減少した。細胞接着及び形態に対するヒドロゲル表面特性の影響を試験するために、軟骨細胞を、様々な架橋レベルを有するヒドロゲルの表面上で培養した。架橋レベルの変化は、ＯＰＦヒドロゲル上での軟骨細胞付着及び形態を調節するようであった。さらに、ＯＰＦヒドロゲルへ光封入された軟骨細胞の生存率を試験した。細胞生存率は、２１日後に依然として高いままであるようであった。
【００２２】
本明細書中で使用する場合、「生分解性」材料は、正常なｉｎ  ｖｉｖｏでの生理条件下で、代謝又は排泄され得る構成成分へと分解する材料である。「注入可能」とは、医療用シリンジ又は関節鏡視下デバイスにより或る部位へ送達され得る材料を意味する。「光架橋性」とは、ポリマーの官能基が、光開始剤の存在下で光子（例えば、ＵＶ光）の適用により同じポリマー又は別のモノマー若しくはポリマーの官能基と架橋し得ることを意味する。
【００２３】
「分子量」という用語は、本明細書中では「重量平均分子量」（Ｍw＝ΣiＮiＭi2／ΣiＮiＭi）を指す。重量平均分子量（Ｍw）は、様々な方法で求めることができるが（結果における幾らかの差は、用いられる方法に依存する）、ゲル透過クロマトグラフィを用いることが好都合である。本明細書中で使用する場合、「数平均分子量」（Ｍn）は、ポリマーサンプル中の全ての分子の総重量を、存在するモルの総数で除算したものを指す（Ｍn＝ΣiＮiＭi／ΣiＮi）。数平均分子量は、様々な方法で求めることができるが（結果における幾らかの差は、用いられる方法に依存する）、ゲル透過クロマトグラフィを用いることが好都合である。
【００２４】
「生理活性剤」は、本明細書中で使用する場合、身体において局所的又は全身的に作用する生理学的に或いは薬理学的に活性な物質を包含するが、これらに限定されない。生理活性剤は、疾患又は疾病の治療、予防、診断、治癒又は緩和に使用される物質、或いは身体の構造若しくは機能に影響を及ぼすか、又はそれが所定の生理学的環境に配置された後に生物学的に活性に若しくはより活性になる物質である。生理活性剤としては、酵素、有機触媒、リボザイム類、有機金属、タンパク質、糖タンパク質、ペプチド類、ポリアミノ酸類、抗体、核酸、ステロイド系分子、抗生物質、抗菌剤、サイトカイン類、成長因子、炭水化物、疎油性物質、脂質、細胞外マトリックス及び／又はその個々の構成成分、医薬品並びに治療薬が挙げられるが、これらに限定されない。
【実施例】
【００２５】
以下の実施例は、本発明をさらに例示するために提示されており、決して本発明を限定することは意図されない。
【００２６】
本実施例では、統計学的解析は、ｐ＜０．０５の有意性レベルを用いてＰｏｓｔ  Ｈｏｃ  ＡＮＯＶＡ（ボンフェローニ／ダン）を使用したＳｔａｔＶｉｅｗ  バージョン５．０．１．０(SAS  Institute  Inc．Cary，NC)を使用して実施した。
【００２７】
［Ａ．マクロマー合成］
オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）（ＯＰＦ）は、Jo他著「官能基化されたポリマーネットワークの調製のためのＧＲＧＤペプチドによるオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）マクロマーの修飾」(Biomacromolecules  2001;2(1)：255-61)で公表される方法に従って、１０ｋＤａの初期分子量を有するポリエチレングリコール（ＰＥＧ）（Aldrichから入手可能）を使用して合成した。図１Ａも参照されたい。簡潔に述べると、ＰＥＧ  ５０ｇをトルエン中で共沸蒸留させて、残留水を除去した後、蒸留塩化メチレン５００ミリリットル中に溶解した。得られたＰＥＧを氷浴に入れて、窒素で１０分間パージして、続いてＰＥＧ１モル当たりトリエチルアミン（ＴＥＡ、Aldrich）０．９モル、及びＰＥＧ１モル当たり蒸留塩化フマリル(Acros)１．８モルを滴下した。反応は、窒素環境下で維持した。続いて、反応容器を氷浴から取り出して、室温で４８時間攪拌した。精製のために、ロータリーエバポレータにより塩化メチレンを除去した。得られたＯＰＦを酢酸エチル中に溶解して、濾過して、ＴＥＡと塩化物との反応由来の塩を除去した。ＯＰＦは、酢酸エチル中で再結晶させて、一晩かけて真空乾燥した。
【００２８】
［Ｂ．マクロマーの分子量］
ＯＰＦマクロマー及び合成に使用されるＰＥＧの分子量は、モデル５１５ＨＰＬＣポンプ及びモデル２４１０屈折率検出器に接続したＷａｔｅｒｓ  ７１７  ＰｌｕｓオートサンプラーＧＰＣシステムにより測定した。テトラヒドロフラン中に溶解した後、２０ｍｇ／ｍｌの濃度のポリマー溶液２０μｌを、１ｍｌ／分の流速で、ｓｔｙｒａｇｅｌ  ＨＲ  ４Ｅカラム（７．８×３００ｍｍ、Waters）と直列に存在するｓｔｙｒａｇｅｌ  ＨＴガードカラム（７．８×３００ｍｍ、Waters）から成るカラムへ注入した。０．４７４、６．６９、１８．６及び３８ＫＤａのＭｎ並びに１．１未満の多分散を有する単分散ポリスチレン標準物質（Polysciences，Warrington，PA）を較正曲線に使用した。各材料の３つのサンプルを分析した。
【００２９】
ＧＰＣ分析により、合成したＯＰＦが、９７２７±１９６６の数平均分子量（Ｍn）及び１６２４６±３７１０の重量平均分子量（Ｍw）を有するのに対して、このＯＰＦマクロマーの生産に使用されるＰＥＧは、９１５４±４６６のＭn及び１１４６５±４０７のＭwを有することが示された。
【００３０】
［Ｃ．ヒドロゲル製造］
ヒドロゲルは、０．０５％（ｗ／ｗ）Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９ラジカル光開始剤（Ciba-Specialty  Chemicalsから入手可能）及び種々の濃度でのコモノマーとしての且つ光架橋促進剤としてのＮ−ビニルピロリジノン（ＮＶＰ）を含有する脱イオン水中に、最終濃度３３％及び２５％（ｗ／ｗ）でＯＰＦマクロマーを溶解させることにより作製された（表１を参照）。Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９の製品シートには、Ｉｒｇａｃｕｒｅ（登録商標）２９５９は、１−［４−（２−ヒドロキシエトキシ）フェニル］−２−ヒドロキシ−２−メチル−１−プロパン−１−オンであるとして、また下記構造を有するものとして記載されている：
【００３１】
【化１】
2008537499.tif 000002
【００３２】
【表１】
2008537499.tif 000003
【００３３】
マクロマー溶液を、１ｍｍスペーサを有するスライドガラス間へピペットで取り、１０分間、およそ８ｍＷ／ｃｍ2の強度で３６５ｎｍのＵＶ光（Ｂｌａｋ−Ｒａｙモデル１００ＡＰ）を使用して重合させた。図１Ｂ及び図２を参照されたい。
【００３４】
［Ｄ．ＯＰＦヒドロゲルの化学的特性］
架橋されたＯＰＦヒドロゲルは、ＦＴ−ＩＲ及びＮＭＲを使用して特性評価を行った。架橋されたＯＰＦフィルムのＦＴ−ＩＲは、減圧下での乾燥後、及び蒸留水中での平衡膨潤後にＮｉｃｏｌｅｔ  ５５０分光計により取得した。ＯＰＦマクロマーの13Ｃ核磁気共鳴（ＮＭＲ）スペクトルは、ＴＭＳを含有するＣＤＣｌ3溶液を使用してＶａｒｉａｎ  Ｍｅｒｃｕｒｙ  Ｐｌｕｓ分光計（13Ｃ＝１００．６Ｈｚ）で取得した。光架橋されたヒドロゲルの固相13ＣＮＭＲスペクトルは、サンプルを乾燥させた後にＶａｒｉａｎ  Ｉｎｏｖａ分光計（６００ＭＨＺ）を使用して得られた。
【００３５】
図３は、ＯＰＦヒドロゲルの製造用の出発材料のＦＴ−ＩＲスペクトル、並びに水和状態及び乾燥状態の両方での光架橋されたＯＰＦヒドロゲルのスペクトルを示す。ＯＰＦマクロマースペクトルにおいて約１６００ｃｍ-1に見られる小さなバンドは、フマレート二重結合に相当し、これは、ＯＰＦ光架橋にさらに関与する。フマレート基の−Ｃ＝Ｏ伸縮バンドもまた、１７２４ｃｍ-1に見られる（図３ａ）。図３ｂでは、ＮＶＰの−Ｃ＝Ｏ伸縮は、乾燥ヒドロゲルにおけるフマレート基の−Ｃ＝Ｏ伸縮と共に約１７７０ｃｍ-1に現れる。しかしながら、ヒドロゲルの水和の場合では、１７２４ｃｍ-1及び１７７０ｃｍ-1でのピークは融合して、単一のブロードバンドとして現れる。約３５００ｃｍ-1に見られるブロードバンドは、ヒドロゲル水和及び膨潤を示している。
【００３６】
図４は、架橋前及び架橋後のＯＰＦの13ＣＮＭＲを示す。ＯＰＦマクロマーに関する主要な化学シフトは７０．４ｐｐｍに見られ、ＰＥＧメチレン基に相当する。同様のピークが、光架橋後のＯＰＦの固相13ＣＮＭＲにおいて約７０．４ｐｐｍで現れる。
【００３７】
［Ｅ．ヒドロゲル特性］
１．圧縮試験
架橋後、ヒドロゲルを、穿孔器で直径１０ｍｍの円板へ切断して、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で２４時間膨潤させた。様々な膨潤ヒドロゲルの圧縮弾性率は、４Ｎ／分の速度で動的機械的分析機（ＤＭＡ−２９８０、TA  Instruments）を使用して測定した。弾性率は、低歪（２０％未満）での応力対歪曲線の傾きとして求められた。
【００３８】
図５により、ＯＰＦヒドロゲルの圧縮弾性率は、２５ｗｔ％マクロマーから製造されるヒドロゲルに関して２５〜１０２ｋＰａの範囲で前駆体溶液においてＮＶＰの濃度の増大に伴って増大したことが示される。２５ｗｔ％から３３ｗｔ％へのマクロマー濃度の増大は、ヒドロゲルの弾性率の統計学的に有意な増大を導いた。例えば、２５ｗｔ％マクロマーから製造されるＮ３０は、１０２ｋＰａの弾性率を有したが、マクロマー濃度が３３ｗｔ％へ増大すると、１６３ｋＰａに増大した。概して、弾性率の増大は、ヒドロゲル架橋密度の増大に相関した。
【００３９】
２．膨潤挙動
ＯＰＦヒドロゲルの１０ミリリットル円板を上述するように調製して、ＰＢＳ中で３７℃で平衡膨潤へ膨潤させた（２４時間）。図６を参照されたい。
【００４０】
膨潤されたサンプルは、ふき取って乾かして、秤量し（Ｗｓ）、続いて減圧下で乾燥させて、再度秤量した（Ｗｄ）。ヒドロゲルの膨潤比は、以下の方程式を使用して算出した：膨潤比＝（Ｗｓ−Ｗｄ）／Ｗｄ。
【００４１】
理論上のゾル分率は、以下の方程式（式中、ｋは、架橋前の溶液中のポリマーのおおよその重量分率を表す、ｋ＝０．３３）を使用して様々なヒドロゲルに関して算出された。実験は、膨潤測定及びゾル分率測定の両方に関してｎ＝３で実施した。ゾル分率＝（ｋＷｉ−Ｗｄ）／ｋＷｉ。
【００４２】
様々なＯＰＦヒドロゲルの平衡膨潤比を図７に示す。ヒドロゲルの膨潤比に関して、初期マクロマー溶液中のＮＶＰ濃度の増大に伴って、減少傾向が見られ、架橋剤としてのＮＶＰに関する促進の役割を示した。平衡膨潤比の変動は、様々なＮＶＰ濃度を用いて２５ｗｔ％ＯＰＦマクロマーから製造されるヒドロゲルに関して、およそ２７〜１１の範囲であった。図７は、マクロマー濃度が２５％から３３％に増大されると、予想通りにヒドロゲルの膨潤比が減少したことを示す。膨潤比のこの減少は、Ｎ５及びＮ１０に関して統計学的に有意であった（ｐ＜０．０５）のに対して、より高いＮＶＰレベルを用いたヒドロゲルの膨潤比の差は有意ではなかった。
【００４３】
３．ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分解
ヒドロゲルの円板を、ＰＢＳ  ２．５ミリリットルを含有する１２ウェル組織培養プレートのウェルに入れて、オービタルシェーカー上で３７℃でインキュベートした。ＰＢＳは、第１週目は１日おきに、それ以降は週に一度取り替えた。ヒドロゲルの膨潤比は、上述したように７日目、１４日目及び２１日目に測定した。
【００４４】
ＰＢＳ中での分解研究の結果により、より低い架橋レベルを有するヒドロゲル（Ｎ５及びＮ１０）に関する膨潤比は、１４日目までは一定であり、続いて２１日目にはそれぞれＮ５及びＮ１０に関して２３．３及び１７．５へと激的に増大することが示された（図８ａ）。膨潤比のこの増大は、ヒドロゲルネットワークが２週後に分解し始めることを示した。しかしながら、Ｎ２０及びＮ３０の膨潤比は、２１日後に依然として一定のままであり、より高い架橋レベルを有するヒドロゲルに関してより低い分解速度を示した。経時的なＰＢＳ中のＯＰＦヒドロゲルのゾル分率を図８ｂに示す。膨潤比と同様に、ヒドロゲルのゾル分率は、１４日目まで依然として一定のままであり、続いてＮ５及びＮ１０サンプルに関しては２１日目に大幅に増大したのに対して、経時的にＮ２０及びＮ３０ヒドロゲルのゾル分率において差は見られなかった。ヒドロゲルの分解速度を促進するために、さらなる実験を１Ｍ  ＫＯＨ中で実施した。重量損失データは、１０日後にＮ５及びＮ１０に関して１００％の分解を示したのに対して、Ｎ３０の８５％のみが、同じ期間に分解された。分解時間とヒドロゲル架橋密度との間に良好な相関が存在するようである。
【００４５】
４．ＯＰＦヒドロゲル上での細胞接着及び形態：組織再生誘導法における適用に関して
クローンマウス軟骨形成細胞系であるＡＴＤＣ細胞(RIKEN  Cell  Bank，Tsukuba，Ibaraki，Japan)を、５％ウシ胎児血清(Invitrogen)、１０μｇ／ｍｌヒトトランスフェリン(Roche)及び３×１０-8Ｍ亜セレン酸ナトリウム(sodium  selnite)(Sigma)を補充したダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）(Gibco  BRL，Rockville，NY，USA)並びにハムＦ１２培地(Nissui  Pharmaceutical，Japan)の１：１の混合物中で標準的な培養フラスコで集密になるまで成長させた。細胞は、５％ＣＯ2の加湿雰囲気中で維持した。培養培地は、２日毎に取り替えた。続いて、細胞をトリプシン処理して、接着実験で使用した。
【００４６】
膨潤させたヒドロゲル円板を７０％エタノールで消毒して、ＰＢＳで数回洗浄した。ヒドロゲルフィルムは、２４ウェル組織培養プレートに入れて、滅菌シリコーンゴムリング(Cole-Parmer，Vernon  Hills，IL)で固定して、細胞培養の２４時間前にＤＭＥＭ培地中でインキュベートした。懸濁軟骨形成細胞を、２×１０4個の細胞／ｃｍ2の密度でヒドロゲル上へ播種して、３７℃でインキュベートした。４時間後、培地を除去して、プレートを加温ＰＢＳですすいで、非接着細胞を除去して、新鮮な培地１ミリリットルを添加した。培地は、２〜３日毎に取り替えた。接着細胞の総数は、Jones他著「表面修飾したポリウレタン上でのマクロファージ挙動」(J  Biomater  Sci  Polym  Ed  2004;15(5)：567-84)に既に記載されているように、所望の時点で、光学顕微鏡（ＯＭ）によりとらえられる５個の２０倍対物レンズ野（０．２０８ｍｍ2）から手動で計数して、平均化して、細胞密度を求めた。２つの個別の実験の二重反復を細胞密度に関して分析した。付着された細胞の形態（モルホロジー）は、ＣＣＤカメラを装備した位相差顕微鏡（Ａｘｉｏｖｅｒｔ２５，Carl  Zeiss，Inc．Thornwood，NY）により可視化させた。ポリスチレン組織培養プレートを対照として使用した。
【００４７】
ＡＴＤＣ細胞は、上述したように、所望のマクロマー溶液中での懸濁、１ミリリットルスペーサを有する滅菌モールド（型）へピペットで取ること、及び重合により、様々なヒドロゲルネットワーク中に光封入された（１５×１０6個の細胞／ｍｌ）。得られたヒドロゲル−細胞構築物は、直径５ミリメートルの円板に切断して、１２ウェル組織培養プレートにおいて培養培地２．５ミリリットルを被せて、５％ＣＯ2を有する湿潤環境中でインキュベートした。封入後の細胞の生存率を求めるために、生／死・生存率／細胞毒性キット(Molecular  Probes，L3224)をキット指示書に従って使用した。この技法は、生存細胞を緑色に、死滅細胞を赤色に染色する。染色後、細胞は、共焦点走査型顕微鏡を使用して可視化された。
【００４８】
細胞付着：図１６は、培養の１日目及び３日目の様々な架橋レベルを有するＯＰＦ上でのＡＴＤＣ細胞密度を示す。この図に見られるように、細胞付着は、架橋レベルに依存しており、ＮＶＰ架橋剤濃度の増大に伴って増大した。１日目のＯＰＦヒドロゲル上での細胞密度に関する傾向は以下の通りである：Ｎ５（３８９±７２）＜Ｎ１０（６６２±１００）＜Ｎ２０（７９５±３０１）＜Ｎ３０（９９１±１６０）＜組織培養ポリスチレン（ＴＣＰＳ）（１１７８±１８５）。３日目には、全てのヒドロゲル上での細胞付着は、１日後の細胞付着よりわずかに高かったが、差は統計学的に有意ではなかった。
【００４９】
図９は、接着軟骨細胞が、様々な架橋レベルを有する表面上で種々の形態を示したことを示す。Ｎ５ヒドロゲル上での細胞は、球状形態を有した一方で、細胞は、架橋レベルの増大に伴ってサンプル上で拡散して、扁平となった。Ｎ２０及びＮ３０表面上での優勢な細胞形態は、ＴＣＰＳ上の細胞形態に類似した伸長線維を有する大きな扁平細胞であった。
【００５０】
５．細胞封入：細胞送達に関して
細胞送達に関するヒドロゲルの適切性を確定するために、ラット骨髄間質細胞及びマウス軟骨細胞（ＡＴＤＣ−５）をゲルへ封入して、それらの生存率を試験した。ＡＴＤＣ細胞を、３３ｗｔ％マクロマーから製造されるＮ５及びＮ１０ヒドロゲル内に播種して、培養液中で０日目、１日目、３日目、７日目及び２１日目に試験して、細胞が重合プロセスを生き延びて、これらの材料における培養中に依然として生存可能であるか否かを判定した。生存細胞（９５％を超える）は、２１日の培養期間中の全ての時点でヒドロゲル全体にわたって観察された（図１０）。さらに、生存率における差は、培養期間中のいずれの時点においてもヒドロゲルスカフォールドの厚さにわたって観察されなかった。図１０を参照されたい（ここでは、生細胞は緑色に染色された（これは、図１０における明るい領域として現れている））。
【００５１】
［Ｆ．骨欠損部への細胞送達のための多孔質ＯＰＦヒドロゲル］
多孔質ヒドロゲルは、失われた機能の臓器に取って代わるために大量の細胞を体内に移植するための適正な構造及び表面積を提供する。骨髄間質細胞（ＭＳＣ）（骨成長細胞）は、骨欠損部を充填するため、又は新たな骨全体を調製するために本発明で使用することができる。多孔質ＯＰＦヒドロゲルは、所望の形状及びサイズへ切断して、且つカテーテルにより骨欠損部へ送達させることができ、当該欠損部中で適切に位置付けられると再膨張する。必要であれば、接着剤を使用して、骨欠損部内でスポンジを骨へ接着させることができる。その後、ＭＳＣはコラーゲン中に懸濁されて、スポンジへ注入される。続いて、コラーゲンは凝固して、細胞を維持し、続いて骨組織に成長して、骨欠損部を充填する。
【００５２】
１．製造方法
多孔質ヒドロゲル（スポンジ）は、ポロゲンとしてＮａＣｌを使用して作製した。簡潔に述べると、ＯＰＦマクロマーを、０．０５％（ｗ／ｗ）の光開始剤（Ｉｒｇａｃｕｒｅ２９５９、Ciba-Specialty  Chemicals）及び０．３３％（ｗ／ｗ）  Ｎ−ビニルピロリジノン（ＮＶＰ）を含有する脱イオン水中に最終濃度３３％（ｗ／ｗ）へ希釈した。多孔率７５％、８０％及び８５％を有するヒドロゲルを得るために、マクロマー溶液１ミリリットルを、それぞれ塩化ナトリウム粒子（直径１００〜５００μｍ）の３グラム、４グラム及び５．７グラムと混合して、１０分間、およそ８ｍＷ／ｃｍ2の強度で３６５ｎｍのＵＶ光（Ｂｌａｋ−Ｒａｙ）を使用して重合させた。塩は、ポリマーをｄＨ2Ｏ中に４８時間、３回交換しながら浸漬させて、光架橋されたポリマーから浸出させた。
【００５３】
２．ヒドロゲルスポンジの形態
図１２ａは、７５％のポロゲン率を有する多孔質ヒドロゲルのＳＥＭ画像を示す。この写真は、孔が高度に相互接続されていることを明らかにする。図１２ｂ及び図１２ｃは、代表的なｍｉｃｒｏ−ＭＲ横断面及びこのスカフォールドのその膨潤状態での対応する孔−固体描写を示す。ＭＲ画像解析により、孔が高度に相互接続されていること、及び画像から算出される多孔率は、実験的ポロゲン濃度と良好に相関することが示された。
【００５４】
３．骨髄間質細胞（ＭＳＣ）単離及び培養
ＭＳＣは、既に記載されている方法に従って雄スプラーグ・ドーリーラットの大腿骨及び脛骨から単離した。（Maniatopoulos他著「若年成体ラットの骨髄から得られる間質細胞によるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの骨形成(Bone  formation  in  vitro  by  stromal  cells  obtained  from  bone  marrow  of  young  adult  rats)」(Cell  Tissue  Res．1988；254：317-330)を参照）。細胞播種に先立って、サンプルを７０％エタノールで３０分間消毒した。続いて、エタノールを吸引して、サンプルを滅菌ＰＢＳ中で１時間、３回交換しながら浸漬させた後、培地をさらに２回交換して、一晩かけてインキュベートした。２２５０００個の細胞を含有する細胞懸濁液の２５μサンプルを、２４ウェルプレートにおいてヒドロゲルフォームの最上部上へ播種して、３時間インキュベートして、細胞を付着させた。続いて、骨形成原培地１ミリリットルを各ウェルへ添加して、培地は、２〜３日毎に交換した。１日目、４日目及び１４日目に、サンプルをＰＢＳで３回洗浄して、ｄＨ2Ｏ  １ミリリットル中で−８０℃にて凍結させた。サンプルには、分析に先立って各サイクル後に３０分間の氷上での超音波処理を伴う２回の凍結／解凍サイクルを受けさせた。細胞数は、製造業者の指示書に従ってＰｉｃｏＧｒｅｅｎ  ＤＮＡキット(Molecular  probes，Eugene，OR)により決定された。
【００５５】
アルカリホスファターゼ活性は、市販のキットを使用して、製造業者の指示書(Sigma  Chemical)に従って測定した。
【００５６】
多孔質ヒドロゲル上で培養した細胞の総数は、ＤＮＡアッセイで定量化した。細胞は、１４日の期間にわたって有意な増殖を示さず、類似した細胞数が、種々の時点でスカフォールド上で観察された（図１４）。骨芽細胞表現型への骨前駆細胞の関係付けの指標であるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性は、各サンプルに関して測定されて、総細胞数により正規化された。結果により、細胞−ヒドロゲル複合材のＡＬＰ活性は、組織培養ポリスチレン上での細胞のＡＬＰ活性よりも有意に高いことが示された（図１５）。このことは、多孔質ヒドロゲルスカフォールドが、骨芽細胞表現型へのＭＳＣの分化を支持したことを示す。
【００５７】
［Ｇ．ＯＰＦヒドロゲルからの浸出可能な構成成分のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性］
ＯＰＦヒドロゲルは、材料及び方法で既に記載されているように架橋させた。架橋後、ヒドロゲルを直径１０ｍｍの円板へ切断して、７０％エタノールで消毒した後、滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。消毒後、ヒドロゲル円板を骨髄間質細胞（ＭＳＣ）培地中に入れて、４８時間インキュベートした。ＯＰＦヒドロゲルからの浸出可能な生成物を抽出するのに使用される培地の容量は、ＩＳＯ／ＥＮ１０９３５ガイドラインに従って決定した（例えば、培地１ｍｌ／検体３ｃｍ2）。既に記載されているように、同時に、ＭＳＣを９６ウェルプレートに播種して、２００００個の細胞／ｃｍ2を２４時間培養した。２４時間浸出させた後、ＯＰＦ抽出培地を１０％の希釈及び１００％で使用して、付着されたＭＳＣを全ての抽出濃度へ暴露させた。細胞生存率（代謝活性）は、製造業者のガイドライン(Promega)に従ったＭＴＳアッセイを使用して分析した。各処理の相対的な生存は、４９０ｎｍの波長での各サンプルの吸光度を対照の吸光度で除算したものとして算出した。
【００５８】
種々の配合のヒドロゲルからの浸出可能な生成物への１０分、２時間及び２４時間の暴露後のＭＳＣの生存率を、図１７に示している。これらの結果により、希釈なしの及び１０％希釈の調製されたヒドロゲルからの浸出可能な生成物は、細胞の生存率に対して有害な影響は有しなかったことが示される。
【００５９】
［Ｈ．光封入された細胞の生存率］
最終濃度３３％（ｗ／ｗ）を有するＯＰＦマクロマーを、既に記載されるように０．０５％（ｗ／ｗ）Ｉｒｇａｃｕｒｅ  ２９５９(Ciba-Specialty  Chemicals)及び種々の濃度のＮＶＰを含有するＰＢＳ中に溶解した（表１を参照）。この溶液を１５×１０6個の細胞ＭＳＣ／ｍｌと混合して、１ｍｍスペーサを有する滅菌スライドガラス間へピペットで取り、１０分間、およそ８ｍＷ／ｃｍ2の強度で３６５ｎｍのＵＶ光（Ｂｌａｋ−Ｒａｙモデル１００ＡＰ）を使用して重合させた。得られたヒドロゲル−細胞構築物（直径５ミリメートル及び厚さ１ｍｍ）を、ＭＳＣ培地２．５ｍｌを有する１２ウェル組織培養プレートに入れて、５％ＣＯ2を有する湿潤環境中でインキュベートした。構築物を１日後、７日後及び２１日後に収集して、封入された細胞の生存率を、生／死・生存率／細胞毒性キット(Molecular  Probes，L3224)を使用して求めた。
【００６０】
共焦点走査型顕微鏡により可視化される場合、生存細胞は緑色に染色され、死細胞は赤色であった。図１８における本発明者らの結果は、光封入後の９５％を超える細胞生存率を示して、生存率は、２１日後にも依然として高かった。
【００６１】
［Ｉ．論述］
ｉｎ  ｖｉｖｏでの軟骨組織再生を導くために、細胞スカフォールドは、再生位置に必要とされる初期機械特性及び化学特性を提供するように設計されなくてはならないが、同時に組織堆積用に経時的に増大する空間を付与しなければならない。本研究では、本発明者らは、架橋されたＯＰＦヒドロゲルの機械特性及び化学特性を操作することにより両方の設計要件を果たすことを目指した。特に分解速度の関数としてのこれらのＯＰＦネットワークの構造的特徴は、組織生成を支持するよう意図された。本発明者らの結果は、溶液中のマクロマー及びＮＶＰ架橋剤のパーセントを変更させることにより、ゲル特性を有意に変更させることができることを示した。図５及び図７に見られるように、より低い架橋密度を有するヒドロゲルに関してより大きな膨潤比が得られたのに対して、弾性率は、架橋密度の減少に伴って減少した。本発明者らはまた、ヒドロゲル分解速度が架橋レベルと相関することを実証した。図８で示されるＮ５及びＮ１０サンプルのゾル分率並びに平衡膨潤は、１４日後に増大した。平衡膨潤のこの増大は、フマレートエステル結合の加水分解に起因する架橋密度の減少に起因するようである。この加水分解は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）分泌のための開いた空間を創出することができる。ヒドロゲル分解速度の調節は、新たな組織再生速度に適合させる機会を提供し、残存スカフォールドの機械特性を維持しながら組織内部成長のための適切な空間を可能にする。
【００６２】
この研究で、本発明者らは、ヒドロゲル表面特性が細胞付着及び形態に影響を及ぼすと仮定した。図９は、より高い架橋レベルを有するヒドロゲル上での細胞付着が、より低い架橋レベルを有するヒドロゲル上での細胞付着よりも有意に大きかったことを示す。特定の基材上で培養される軟骨細胞の挙動は、生体材料上に吸着されるタンパク質とのインテグリン媒介性相互作用を発端とする順次的な事象、続く接着及び形態学的変化により有害であり、分化段階、したがってＥＣＭ堆積の質及び量を規制する。他のサンプルと比較する場合、より高い膨潤比を有するＮ５ヒドロゲルは、フィブロネクチンを含む血清タンパク質の非特異的吸着を低減させることが知られているスカフォールド表面でより多量の流水分子を生成すると予測される（Genes他著「修飾アルギン酸塩表面への軟骨細胞接着に対する基材力学の影響」(Arch  Biochem  Biophys  2004；422(2)：161-7)、及びMahmood他著「ヒト関節軟骨細胞における接着媒介性シグナル伝達：生体材料化学及びテネイシンの影響」(C  Exp  Cell  Res  2004；301(2)：179-88)を参照）。図８ａに示される、より高い膨潤比を有する本発明者らのヒドロゲルに関する円形状形態は、概して細胞拡散に関連するタンパク質であるフィブロネクチンの吸収の低減に起因し得る。分化された軟骨細胞の特徴的な表現型は、細胞外マトリックスタンパク質（即ち、コラーゲンＩＩ及びアグリカン）を分泌し、且つ散在性アクチンマイクロフィラメントネットワークを伴う円形細胞の表現型である。しかしながら、二次元での基材への付着時に、軟骨細胞は、別個の張線維へのフィラメント状アクチンの再組織化を伴う拡散形態を達成することが頻繁に観察されている（Genes他著「修飾アルギン酸塩表面への軟骨細胞接着に対する基材力学の影響」(Arch  Biochem  Biophys  2004；422(2)  161-7)、及びMahmood他著「ヒト関節軟骨細胞における接着媒介性シグナル伝達：生体材料化学及びテネイシンの影響」(C  Exp  Cell  Res  2004；301(2)：179-88)を参照）。より多くの線維芽細胞表現型へのこの脱分化中、アグリカン合成の付随する低減又は休止を伴って、ＩＩ型コラーゲン産生は低減されて、最終的にはＩ型コラーゲンと入れ替えられる。Mahmood他は、種々の長さのＰＥＧを含有するポリマー基材への付着軟骨細胞が種々の表現型の機能を発現することを報告している。Mahmood他は、ＴＣＰＳ及び短いＰＥＧ鎖を有するポリマー上の軟骨細胞は、限局的接着構成成分の発現の増大に伴ってより多くの線維芽細胞表現型を有するのに対して、より長いＰＥＧポリマーを有する基材上で培養された軟骨細胞におけるアクチンネットワークは散在性であり、細胞膜に向かって集中し、アクチン組織化が、分化された初代軟骨細胞のアクチン組織化と依然として類似していることを示すことを実証した。これらの見解は、様々な架橋密度を有する本発明者らのＯＰＦヒドロゲル上での細胞形態に関して見られる傾向と一致している。
【００６３】
したがって、本発明者らは、ＵＶ光がＯＰＦマクロマーの光架橋に使用することができることを示している。種々の機械的挙動及び膨潤挙動を有するヒドロゲルは、架橋剤としてのＮＶＰの濃度の変化とともに製造された。本発明者らは、ヒドロゲルが分解可能であり、分解速度は架橋レベルの変化にともなって変更することも示した。架橋レベルの変化は、ＯＰＦヒドロゲル上での軟骨細胞付着及び形態を調節するようである。さらに、ＯＰＦヒドロゲルへ光封入された軟骨細胞の生存率が試験された。細胞生存率は、２１日後に依然として高かった。この研究は、軟骨細胞の分化にとって有益であり、且つ三次元軟骨組織の生成を支持する、という特性を有するスカフォールドの設計又は選択に関する基準の識別を前進させる。
【産業上の利用可能性】
【００６４】
本発明は、細胞及びドラッグデリバリーのための注入可能な光架橋性の生分解性ヒドロゲルに関する。
【００６５】
本発明は、或る特定の実施態様を参照してかなり詳細に記載してきたが、説明の目的で提示され、且つ限定の目的で提示されていない記載の実施態様以外によって、本発明を実施することができることは、当業者に理解されよう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本明細書中に含まれる実施態様の説明に限定されるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
【図１Ａ】ポリエチレングリコール及び塩化フマリルからのオリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）（ＯＰＦ）の合成を示す図である。
【図１Ｂ】型（モールド）へのＯＰＦマクロマー注入及びＵＶ架橋を示す図である。
【図２】オリゴ（ポリ（エチレングリコール）フマレート）（ＯＰＦ）ヒドロゲルの製造に関する光架橋反応の概略図を示す。
【図３】（ａ）はＯＰＦ  １０Ｋ、ＮＶＰ、Ｉ−２９５９光開始剤並びに架橋及び乾燥後のＯＰＦヒドロゲルのＦＴ−ＩＲスペクトルを示す図であり、（ｂ）は水和ヒドロゲル対乾燥ヒドロゲルを示す図である。ＦＴ−ＩＲは、本明細書ではフーリエ変換赤外分光法を意味する。
【図４】（ａ）は溶媒中の架橋前のＯＰＦの13Ｃ−ＮＭＲを示す図であり、（ｂ）は光架橋及び乾燥後のＯＰＦの固相13Ｃ−ＮＭＲを示す図である。ＮＭＲは、本明細書では、核磁気共鳴分光法を意味する。
【図５】様々なＯＰＦヒドロゲルの圧縮弾性率を示す図である。
【図６】膨潤前（右）及び膨潤後（左）のＯＰＦヒドロゲルを示す図である。
【図７】種々の架橋レベルを有するＯＰＦヒドロゲルの平衡膨潤を示す図である。より低濃度のマクロマー及び架橋剤を有するヒドロゲルは、より高い膨潤比を有した。
【図８】架橋されたＯＰＦヒドロゲルに関する分解挙動を示す図である。３７℃で２１日にわたるＰＢＳ中のＯＰＦヒドロゲルの膨潤比（ａ）及びゾル分率（ｂ）を示す。より低い架橋レベルを有するヒドロゲル（Ｎ５及びＮ１０）は、１４後に分解し始めた。データは、平均値±ＳＴＤ（ｎ＝３）を表す。
【図９】３日後のＯＰＦヒドロゲル上での軟骨細胞接着及び拡散を示す図である：Ｎ５（ａ）、Ｎ１０（ｂ）、Ｎ２０（ｃ）、Ｎ３０（ｄ）及びＴＣＰＳ（ｅ）。より高い架橋密度を有する表面は、より多くの細胞接着及び拡散を支持する。
【図１０】２１日後の種々の配合を有するＯＰＦヒドロゲル（（ａ）Ｎ５及び（ｂ）Ｎ１０）におけるラット骨髄間質細胞の生存率を示す図である。生細胞は緑色に染色されており（これは、図１０において明るい領域として現れている）、死細胞は赤色で染色されている。倍率は全て、１０倍である。
【図１１】細胞移植のための微粒子浸出法によるヒドロゲルスポンジの製造を示す図である。
【図１２】（ａ）は走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ）によるヒドロゲル横断面を示す図であり、（ｂ）はＭｉｃｒｏ−ＭＲ断片を示す図であり、（ｃ）は７５％塩ポロゲン濃度の直径１００μｍの塩粒子を有するＯＰＦヒドロゲルの孔−固体描写を示す図である。
【図１３】（ａ）は７日後の播種細胞の代表的な共焦点顕微鏡画像（ここで、細胞は、生／死キットで染色されて、生存細胞は緑色で染色されている）を示す図であり、（ｂ）は共焦点顕微鏡で捕らえたＺ断面のスタック画像（ここで、細胞は、種々のレベルの細胞を示すようにＰｈｏｔｏＳｈｏｐ（登録商標）により人為的に着色されている）を示す図である。
【図１４】種々の多孔率を有するヒドロゲルスポンジへの細胞付着を示す図である。
【図１５】多孔質スカフォールド上での骨髄間質細胞のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）活性を示す図である。
【図１６】１日及び３日培養後のＯＰＦヒドロゲル上での細胞密度を示す図である。データは、平均値±ＳＴＤ（ｎ＝３）を表す。
【図１７】ＯＰＦヒドロゲルからの浸出可能な構成成分のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞毒性を示す図である。
【図１８】封入の（ａ）１日後、（ｂ）７日後及び（ｃ）２１日後での骨髄間質細胞（ＭＳＣ）の生存率を示す図である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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