(57)【要約】  哺乳類循環において延長された滞留時間を有し、有機リン酸塩中毒の予防及び治療的処置において使用し得る有機リン酸塩スカベンジャーを提供する。該スカベンジャーは、リシン残基の１部を部位特異性変異誘発により他の残基で置換した均一にPEG化したセリンヒドロラーゼである。該ヒドロラーゼのアミノ酸配列中のリシン残基の１部をPEGカップリングのために選定し、他の１部を置換のために選定する；選定は、該ヒドロラーゼ表面が、該ヒドロラーゼについて描写した3-Dモデルを回転させることよって得られた全ての可能性ある図面においてPEGカップリングのための少なくとも１個の遊離アミノ酸を示すのを確実にしなければならない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
有機リン酸塩スカベンジング及び/又は加水分解活性を有する均一にPEG接合させた(PEG化)低リシン変異体セリンヒドロラーゼ。
【請求項２】
PEG鎖が、前記ヒドロラーゼの分子の所定の部位に接合されている、請求項１記載のPEG化ヒドロラーゼ。
【請求項３】
前記PEG鎖が、前記低リシン変異体の全ての残存リシン残基のε-アミノ基に接合されている、請求項２記載のPEG化ヒドロラーゼ。
【請求項４】
前記低リシン変異体が、部位特異性変異誘発によって得られる、請求項１記載のPEG化ヒドロラーゼ。
【請求項５】
前記変異体ヒドロラーゼが、所定の2〜5個を除いた全てのリシン残基を別のアミノ酸残基により置換することによって得られる、請求項１記載のPEG化低リシン変異体ヒドロラーゼ。
【請求項６】
有機リン酸塩スカベンジャーとして使用する、請求項１記載のPEG化ヒドロラーゼ。
【請求項７】
前記ヒドロラーゼが、コリンエステラーゼである、請求項１〜６のいずれか１項記載の有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有するPEG化セリンヒドロラーゼ。
【請求項８】
前記ヒドロラーゼが、アセチルコリンエステラーゼ及びブチリルコリンエステラーゼから選ばれる、請求項１記載の有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有するPEG化セリンヒドロラーゼ。
【請求項９】
比活性が、非変異体化非PEG化酵素の比活性の少なくとも約10％である、請求項１記載の有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有するPEG化変異体セリンヒドロラーゼ。
【請求項１０】
低下した免疫原性を有する、請求項１記載の有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有する均一にPEG化したセリンヒドロラーゼ。
【請求項１１】
哺乳類循環において増大した長寿命を有する、請求項１記載の有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有する均一にPEG化したセリンヒドロラーゼ。
【請求項１２】
PEGが、約200〜約100,000ダルトンの分子量を有する、請求項１記載の均一にPEG化したヒドロラーゼ。
【請求項１３】
PEGが、約2000〜約40,000ダルトンの分子量を有する、請求項１２項記載の均一にPEG化したヒドロラーゼ。
【請求項１４】
PEGが、約5000〜約20,000ダルトンの分子量を有する、請求項１３項記載の均一にPEG化したヒドロラーゼ。
【請求項１５】
下記の工程を含む、請求項１記載の均一PEG化ヒドロラーゼの製造方法。
i) 有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有し既知のアミノ酸配列を有するセリンヒドロラーゼを調製する工程、
ii) 前記ヒドロラーゼの分子に接合させるPEG鎖の数を選定し、前記配列内の接合鎖の位置を選定する工程、
iii) 前記ヒドロラーゼの部位特異性変異誘発を生じさせ、PEG鎖を接合させるために工程ii)で予め決定したリシン残基を除いた分子内の全てのリシン残基を他のアミノ酸残基で置換し、それによって前記ヒドロラーゼの低リシン変異体を得る工程、
iv) 工程iii)からの低リシン変異体を活性化PEGと反応させ、それによって有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有し、低下した免疫原性並びに哺乳類循環において増大した安定及び寿命を有する均一に接合したセリンヒドロラーゼを得る工程。
【請求項１６】
有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有する前記セリンヒドロラーゼがコリンエステラーゼであり、下記の工程を含む、請求項１５記載の方法。
i) 既知のアミノ酸配列を有するコリンエステラーゼを調製する工程、
ii) n-1個を除く全てのリシン残基を他のアミノ酸で置換し且つ接合反応用の末端アミノ基を含むn個の遊離アミノ基を残し、nの初期値が3である可能性ある全ての変異体(ジリシン酵素)を選定する工程、
iii) 工程ii)の前記変異体の各々の三次元構造を、必要に応じて、末端アミノ基及びリシン残基のアミノ基に対してマークした位置を含む相応する二次元表示と一緒に描写する工程、
iv) 工程iii)の各変異体を、その構造をX軸を中心に90°、Y軸を中心に90°更にZ軸を中心に90°連続して回転させることによって検証して、12の異なる回転位置及び12の相応する二次元正面図を得、各位置を、少なくとも１個の遊離アミノ基が前記正面図に存在する場合には陽性として、遊離のアミノ基が前記正面図に存在しない場合には陰性として評価する工程、
v) 前記12の回転位置の少なくとも１つにおいて陰性として評価した変異体の全てを廃棄し、12の位置全てにおいて陽性として評価した変異体の１つを真の変異体構築用に選定するか、或いは、可能性ある変異体の全てを廃棄した場合は、nの値を１増大させる(トリリシンコリンエステラーゼ及びより高級のリシンコリンエステラーゼ)工程ii)を工程iii)〜v)に亘って続行する工程、
vi) 工程v)からの前記選定した変異体を、既知の変異体化及び組換えタンパク質発現方法を使用して構築し、それによって組換え低リシン酵素変異体を得る工程、及び、
vii) 工程vi)からの前記変異体を、PEGのような非免疫原性ポリマーと、該ポリマーの鎖を前記遊離アミノ基の各々にカップリングさせ得る条件下に反応させ、それによって、低下した免疫原性及び哺乳類循環における増大した安定性を有する均一に接合させたタンパク質を得る工程。
【請求項１７】
下記の工程を更に含む、請求項１６記載の方法。
viii) 工程ii)〜vii)を、より高いn値を使用して繰返してより均一に接合した変異体タンパク質を得る工程、
ix) 前記接合変異体タンパク質を評価して所望特性を判定する工程、及び、
x) 大規模生産用の最良の１つを選定する工程。
【請求項１８】
前記変異体の所望特性を改良する、前記リシン置換とは無関係のさらなる変異誘発を生じさせる工程を更に含む、請求項１５〜１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
前記所望特性が、比活性、熱安定性、抗原性、免疫原性、哺乳類循環における安定性、及び哺乳類循環における寿命から選ばれる１以上の項目を含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
リシンを置換する前記アミノ酸が、システイン又は疎水性アミノ酸ではない、請求項１５記載の方法。
【請求項２１】
前記ヒドロラーゼが、アセチルコリンエステラーゼ(AChE)及びブチリルコリンエステラーゼ(BChE)である、請求項１５〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
PEGが、約200〜約100,000ダルトンの分子量を有する活性化メトキシポリエチレングリコールを含む、請求項１５記載の方法。
【請求項２３】
前記ヒドロラーゼが、AChEであり、接合させるPEG鎖の選定数が3〜5である、請求項１６記載の均一にPEG化したヒドロラーゼの製造方法。
【請求項２４】
3〜5個のリシン残基を別のアミノ酸で置換したヒトAChEを含む、請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
前記アミノ酸が、アラニンである、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
位置338のフェニルアラニンをアラニンによって置換することを更に含む、請求項２４記載の方法。
【請求項２７】
前記PEG化AChEが、2時間以上のマウス循環における半減期を有する、請求項２３記載の方法。
【請求項２８】
2〜5個のリシン残基を別のアミノ酸によって置換しているAChE変異体に残存アミノ基を介して所定部位にカップリングさせた3〜6個のPEG鎖を含む、均一にPEG化したAChE。
【請求項２９】
低下した免疫原性を有する、請求項２８記載の均一にPEG化したAChE。
【請求項３０】
哺乳類循環における増大した安定性を有する、請求項２８記載の均一にPEG化したAChE。
【請求項３１】
前記AChEが、ヒト組換え酵素である、請求項２８記載の均一にPEG化したAChE。
【請求項３２】
前記変異体が、位置K23、K332及びK348におけるアラニンによるリシンの置換を含む、請求項２８記載の均一にPEG化したAChE。
【請求項３３】
前記変異体が、位置K23、K332及びK470におけるアラニンによるリシンの置換を含む、請求項２８記載の均一にPEG化したAChE。
【請求項３４】
前記変異体が、位置K23、K348、K470及びK496におけるアラニンによるリシンの置換を含む、請求項２８記載の均一にPEG化したAChE。
【請求項３５】
前記変異体が、位置K23、K332、K496及びK538におけるアラニンによるリシンの置換を含む、請求項２８記載の均一にPEG化したAChE。
【請求項３６】
位置338におけるアラニンによるフェニルアラニンの置換を更に含む、請求項３２〜３５のいずれか１項記載の均一にPEG化したAChE。
【請求項３７】
有機リン酸塩(OP)スカベンジャーとして使用するための、請求項２８〜３６のいずれか１項記載の均一にPEG化したAChE。
【請求項３８】
解毒剤として使用するための、請求項１〜５のいずれか１項記載の有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有する均一にPEG化した低リシン変異体セリンヒドロラーゼ。
【請求項３９】
解毒剤として使用するための、請求項２８〜３６のいずれか１項記載の均一にPEG化したAChE。
【請求項４０】
OP中毒の治療又は予防用製薬組成物の製造における、請求項１〜５のいずれか１項記載の有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有する均一にPEG化した低リシン変異体セリンヒドロラーゼの使用。
【請求項４１】
OP中毒の治療又は予防用製薬組成物の製造における、請求項２８〜３６のいずれか１項記載の均一にPEG化したAChEの使用。
【請求項４２】
請求項１〜５のいずれか１項記載の有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有する均一にPEG化した低リシン変異体セリンヒドロラーゼを含み、必要に応じて、製薬上許容し得る担体、希釈剤、アジュバント又は賦形剤を更に含む、OP中毒の治療又は予防用製薬組成物。
【請求項４３】
請求項２８〜３６のいずれか１項記載のPEG化AChEを含み、必要に応じて、製薬上許容し得る担体、希釈剤、アジュバント又は賦形剤を更に含む、OP中毒の治療又は予防用製薬組成物。
【請求項４４】
下記の工程を含むことを特徴とする、既知のアミノ酸配列を有する活性AChEの循環半減期の増進方法。
i) 2〜4個のリシン残基のみを残存させ、他のリシン残基をアラニンで置換している前記AChEの可能性ある変異体の三次元構造を形成する工程、
ii) 前記構造の各々を、X軸を中心に90°、Y軸を中心に90°更にZ軸を中心に90°連続して回転させて、各々の構造において12の異なる回転位置及び12の相応する二次元正面図を得、そして、検証した12の回転位置の全てにおいて前記正面図内に少なくとも１個の遊離のアミノ基を示す可能性ある変異体のみを受入れ、残りの不確実な変異体を廃棄する工程、
iii) 工程ii)において受入れたようなリシン-アラニン置換の所定数及び位置を有する１種以上の真の変異体を構築する工程、及び、
iv) 工程iii)からの前記選定変異体(１種以上)を、活性化非免疫原性ポリマーと、該ポリマーをAChE中の全ての遊離アミノ基にカップリングさせ得る条件下に反応させ、それによって、低下した免疫原性を有し且つ哺乳類循環における増大した安定性を有する均一にPEG化したAChEを得る工程。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（技術分野）
本発明は、最高の薬物動態性能及び最高の免疫学的寛容性を有する均質に接合させたセリンヒドロラーゼに関し、詳細には、低リシン(hypolysine)変異体アレー(array)を使用するPEG化コリンエステラーゼに関する。
【０００２】
（背景技術）
アセチルコリンエステラーゼ(AChE)の主な役割は、神経伝達物質アセチルコリン(ACh)の急速加水分解によるコリン作動性シナプス中でのインパルス伝達の終結である。神経因子サリン及びサモン或いは農業用殺虫剤のようなある種の有機リン酸塩(OP)化合物は、アセチルコリンエステラーゼ(AChE)類及びブチリルコリンエステラーゼ(BChE)類のようなコリンエステラーゼ(ChE)類を、酵素活性部位中のセリン残基の急速リン酸化によって阻害する。これらOP因子の急性毒性は、末梢及び中枢神経系中のAChEの阻害による運動及び呼吸不全をもたらす。
OP因子に対するChE類の高反応性により、これらの生体分子の毒性OP因子封鎖のための外来性スカベンジャーとして或いはOP因子がその生理学的ターゲットに到達する前の破壊剤としての提案がなされている。しかしながら、OPスカベンジング又は加水分解活性を有する適切なセリンヒドロラーゼ類の大規模生産は、各種起源の組換え酵素が実験動物の循環において比較的短寿命であるという事実によって妨げられている[例えば、Kronman C. et al.: Biochem. J. 311 (1995) 959-67；Chitlaru T. et al.: Biochem. J. 336 (1998) 647-58]。ポリエチレングリコール(PEG)成分の組換えヒトAChEのC-末端切断形(ΔC-rHuAChE)への制御された接合において、本発明者等は、マウスの循環において酵素活性の寿命を増大させている(WO 02/087624号)。その修飾度合により更にまた付加PEG鎖の長さにより互いに異なる複数のPEG化(= ペグ化) AChEのアレーの薬物動態性能を検証することによって、酵素の循環滞留が有意に改善されること並びに平均滞留時間(MRT)が、修飾されていないrHuAChEのMRTと比較したとき、50倍ほど高く増大することを実証している。MRTは、投与分子の生物体による平均保持時間長を反映しており、クリアランスプロフィールを二重指数(bi-exponential)薬物動態モデルに適応させることに由来する半減期値とは対照的に、ノンコンパートメント薬物動態モデルに従ってクリアランスデータを分析することによって得られる。上記の修飾HuAChEは、マウスにおいて2100分以上のMRT値を示していた。そのような値は、マウスにおいて今日まで報告されている如何なる既知の形の組換え又は生来の血漿由来のコリンエステラーゼ(ChE)とも一致しない。血清由来ヒトBChE、ウマBChE、又はウシ胎仔AChEについてマウスにおいて報告されている最高MRT値は、およそ1,400分である[例えば、Kronman C. et al.: Biochem. J. 311 1995) 959-67]。本発明者等は、更に、アカゲザルにおけるPEG化rHuAChE循環滞留の増大も実証している[Cohen O. et al.: Biochem. J. 378 (2004) 117-28)]。
【０００３】
上述したChE類の薬理学的安定性の実質的増大は、セリンヒドロラーゼを有機リン酸塩スカベンジャーとして使用する方向性に対する障害を取除いている。しかしながら、医薬用途における酵素系解毒剤は、改良された安定性及び保有活性のみならず、好ましくは良好に特徴付けした組成も示さなければならない。医薬用途における所望の薬剤は、好ましくは、１つの化学構造を有すべきであるが、タンパク質のPEG化は、PEGと反応部位、例えば、タンパク質分子において利用し得るリシンε-アミノ基とのランダムに形成された結合を含む各種構造体の混合物に相応する不均質な生成物を生じる。例えば、タンパク質がPEG分子とのカップリングにおいて同様に利用可能な8個の遊離アミノ酸を有する場合、理論的には256種の異なる組合せを得ることが可能である。実際的には、全ての可能性が同じ確率で具現化されることはないものの、肉眼的には通常より多くの成分として見受ける不均質組成物が得られるであろう。従って、本発明の目的は、セリンヒドロラーゼの均一にPEG化した調製物を提供することである。
米国特許出願第2004/00822765号は、1つの位置のみに１個のPEG鎖を接合させたエリスロポイエチンを開示しており、上記タンパク質中の少数の利用し得るアミノ基をうまく活用している。しかしながら、一般的には、多くの利用し得る遊離の結合部位が存在し、更にまた、通常は、１個よりも多くのポリマー鎖をタンパク質にカップリングさせることが好ましい。従って、本発明のもう１つの目的は、任意の所定数及び任意の所定位置の結合部位を含む均一にPEG化したセリンヒドロラーゼの一般的な製造方法を提供することである。
【０００４】
Onda等 [Onda M. et al.: Bioconjugate Chem. 14 (2003) 480-7]は、最終のPEG化のために減少させたリシン残基数を有する組換え抗毒素の変異体の製造を開示し、この変異誘発の残留抗毒素活性に対する効果を評価している。米国特許出願第2005/0114037号は、どのような位置及びタイプのカップリングが上記タンパク質の比活性を低下させ得るのかを推定するコンピュータ手法に関する。本発明は、主として、接合タンパク質の免疫原性を低下させることに関する。また、本発明の目的は、接合PEG鎖の数及び位置を、必要に応じて、野生タイプに存在するある種の遊離アミノ基を欠如する変異体の三次元構造を利用して予め決定する工程、及び最終のカップリングにおける遊離アミノ基の接近性に応じて適切な変異体を選定する工程を含む、有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有し、低下させた免疫原性を有する均一にPEG化させたセリンヒドロラーゼの製造方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、哺乳類循環において延長された循環滞留時間を示すPEG化セリンヒドロラーゼの均質調製物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、マウス循環においては1000分以上又は霊長類の循環においては4000分以上の平均滞留時間(MRT)値を示すアセチルコリンエステラーゼの均一にPEG化した調製物を提供することである。
本発明のさらなる目的は、霊長類の循環において十分な活性及び循環寿命を示す均一にPEG化したAChEの製造方法を提供することである。
また、本発明のもう１つの目的は、有機リン酸塩(OP)類のスカベンジングにおける使用のための、PEG化AChEをベースとする均質薬剤を提供することである。
また、本発明は、OP類中毒の予防及び治療的処方におけるPEG化AChEの使用を提供することを目的とする。
また、本発明の目的は、低免疫原性を示す、OP類中毒の治療又は予防用製薬組成物を提供することである。
本発明の他の目的及び利点は、説明の進捗とともに明らかとなるであろう。
【発明の開示】
【０００５】
本発明は、有機リン酸塩スカベンジング及び/又は加水分解活性を有し、PEG鎖を好ましくは当該酵素分子の所定の位置に接合させている均一にPEG接合させた(PEG化)低リシン変異体セリンヒドロラーゼを提供する。PEG鎖は、上記低リシン変異体の全ての残存リシン残基のε-アミノ基に接合させる。上記低リシン変異体は、既知の部位特異性変異誘発法によって得ることができる。上記タンパク質分子中の、所定数のリシン残基、好ましくは3個又は4個のリシン残基を除いた全てのリシン残基を、別のアミノ酸残基によって置換する。この別の残基は、上記酵素の所望特性に有害な効果を有してなく或いは接合過程を干渉しない任意のアミノ酸残基であり得る。本発明の好ましい実施態様においては、上記ヒドロラーゼは、コリンエステラーゼであり、アセチルコリンエステラーゼ又はブチリルコリンエステラーゼから選択し得る。本発明のPEG化セリンヒドロラーゼは、十分な加水分解活性を有し、好ましくは、その比活性は、非変異体化非PEG化酵素のヒドロラーゼ比活性の少なくとも約10％である。本発明のPEG化酵素は、低下した免疫原性を有し、更に、哺乳類循環において延長した寿命を有する。
【０００６】
本発明は、有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有し既知のアミノ酸配列を有するセリンヒドロラーゼを調製する工程；上記ヒドロラーゼの分子に接合させるPEG鎖の数を選定し、上記配列内の接合鎖の位置を選定する工程；上記ヒドロラーゼの部位特異性変異誘発を生じさせ、PEG鎖を接合させるために工程(ii)で予め決定した分子内のリシン残基を除いた全てのリシン残基を他のアミノ酸残基で置換し、それによって上記ヒドロラーゼの低リシン変異体を得る工程；工程iii)からの低リシン変異体を活性化PEGと反応させ、それによって有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有し、低下した免疫原性並びに哺乳類循環において増大した安定及び寿命を有する均一に接合したセリンヒドロラーゼを得る工程を含む、均一にPEG化した低リシン変異体セリンヒドロラーゼの製造方法を提供する。１つの実施態様においては、本発明は、以下の工程を含む、遊離アミノ基を介してポリマーを均一に接合させた所望のヒドロラーゼ活性を有するタンパク質の製造方法を提供する：i) 既知のアミノ酸配列を有するタンパク質を調製する工程；ii) n-1個を除く全てのリシン残基を他のアミノ酸残基で置換し且つ接合反応用の末端アミノ基を含むn個の遊離アミノ基を残し、nの初期値が3である可能性ある全ての可能性ある変異体(ジリシン酵素)を選定する工程；iii) 工程ii)の上記変異体の各々の三次元構造を、必要に応じて、末端アミノ基及びリシン残基のアミノ基に対してマークした位置を含む相応する二次元表示と一緒に描写する工程；iv) 工程iii)の各変異体を、その構造をX軸を中心に90°、Y軸を中心に90°更にZ軸を中心に90°連続して回転させることによって検証して、12の異なる回転位置及び12の相応する二次元正面図を得、各位置を、少なくとも１個の遊離アミノ基が上記正面図に存在する場合には陽性として、遊離のアミノ基が上記正面図に存在しない場合には陰性として評価する工程；v) 上記12の回転位置の少なくとも１つにおいて陰性として評価した変異体の全てを廃棄し、12の位置全てにおいて陽性として評価した変異体の１つを真の変異体構築用に選定するか、或いは、可能性ある変異体の全てを廃棄した場合は、nの値を１増大させる工程ii) (トリリシン酵素又はより高級リシンの酵素)を工程iii)〜v)に亘って続行する工程；vi) 工程v)からの上記選定した変異体を、既知の変異体化及び組換えタンパク質発現方法を使用して構築し、それによって組換え低リシン酵素変異体を得る工程；及び、vii) 工程vi)からの上記変異体を、非免疫原性ポリマーと、該ポリマーの鎖を上記遊離アミノ基の各々にカップリングさせ得る条件下に反応させ、それによって、低下した免疫原性及び哺乳類循環における増大した安定性を有する均一に接合させたタンパク質を得る工程。本発明に従う方法は、好ましくは、viii) 上記工程ii)〜vii)を、より高いn値を使用して繰返してより均一に接合した変異体タンパク質を得る工程；ix) 上記接合変異体タンパク質を評価して所望特性を判定する工程；及び、x) 大規模生産用の最良の１つを選定する工程を更に含む。上記所望特性は、比活性、熱安定性、抗原性、免疫原性及び哺乳類循環における安定性から選ばれる１以上の項目を含む。工程ii)においてリシンを置換する上記アミノ酸は、アラニン、又���中性置換、即ち、接合体の所望特性に対して負の効果を有していない置換を示す他の任意のアミノ酸であり得る。上記タンパク質をリシン残基部位で変異体化して各位置でのカップリングを阻止する以外に、本発明の幾つかの実施態様においては、生成物を更に改良するか或いは得られる接合体の特性をその意図する機能に調節するために他の変異体化も行う；或いは、他の変異体化又は修飾を行ってリシン残基以外の上記タンパク質の他の基へのPEGカップリングを阻止することもできる。
【０００７】
本発明の好ましい実施態様においては、上記PEG化ヒドロラーゼは、PEGを含むAChE接合体である。勿論、デキストラン、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド、ポリビニルアルコール、及び他のポリアルキレンオキシド類のような他のポリマー類も、本発明の方法について説明したのと同様な方式で使用し得る。本発明の好ましい実施態様においては、上記ポリマーは、活性化メトキシPEGのようなポリエチレングリコール(PEG)を含む。このPEGは、約200〜約100,000ダルトン、例えば、約2000〜約40,000ダルトン、好ましくは約5000〜約20,000ダルトンの分子量を有し得る。好ましい実施態様においては、本発明の方法は、方法の工程ii)における上記値nが3〜5である均一にPEG化したAChEを提供する。上記AChEは、好ましくは、3〜5個のリシン残基がアラニン残基によって置換され且つ位置338のフェニルアラニンがアラニンによって更に置換されているヒトAChEである。上記方法によって調製したPEG化AChEは、1000分以上のマウス循環における平均滞留時間値を有し得る。
本発明は、更に、均一にPEG化したAChEに関する。本発明に従う均一にPEG化したAChEは、2〜5個のリシン残基を他のアミノ酸で置換したAChE変異体に残存アミノ基を介して所定位置にカップリングさせた3〜6個のPEG鎖を含み得る。本発明のPEG化AChEは、低下した免疫原性及び哺乳類循環における増大した安定性を有する。本発明の好ましいPEG化AChEは、PEG化ヒトAChE組換え酵素である。１つの好ましい実施態様においては、PEG化AChE酵素は、位置K23、K332及びK348；又はK23、K332及びK470；K23、K348、K470及びK496；又はK332, K496及びK538でのアラニンによるリシンの置換を含む。本発明の１つの好ましい実施態様においては、均一にPEG化したAChEは、位置338でのアラニンによるフェニルアラニンの置換を含む。
【０００８】
もう１つの局面においては、本発明は、有機リン酸塩(OP)スカベンジャーとしての又は解毒剤としての使用のための上述したような均一にPEG化したAChEを提供する。
また、本発明は、有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有する均一にPEG化した低リシン変異体セリンヒドロラーゼ(例えば、AChE、BChE、パラオキソナーゼ、ホスホトリエステラーゼ)の、OP中毒の治療又は予防用製薬組成物の製造における使用に関する。好ましい実施態様においては、上記ヒドロラーゼは、AChEである。
本発明は、有機リン酸塩スカベンジング又は加水分解活性を有する均一にPEG化した低リシン変異体セリンヒドロラーゼを含み、必要に応じて製薬上許容し得る担体、希釈剤、アジュバント又は賦形剤を更に含むOP中毒の治療又は予防用製薬組成物を提供する。本発明の好ましい実施態様においては、上記ヒドロラーゼは、AChE又はBChEである。
更にもう１つの局面においては、本発明は、i) 2〜4個のリシン残基のみを残存させ、他のリシン残基をアラニンで置換している上記AChEの可能性ある変異体の三次元構造を描写する工程；ii) 上記構造の各々を、X軸を中心に90°、Y軸を中心に90°更にZ軸を中心に90°連続して回転させて、各々の構造において12の異なる回転位置及び12の相応する二次元正面図を得；そして、検証した12の回転位置の全てにおいて上記正面図内に少なくとも１個の遊離のアミノ基を示す可能性ある変異体のみを受入れ、残りの不確実な変異体を廃棄する工程；iii) 工程ii)において受入れたようなリシン-アラニン置換の所定数及び位置を有する１種以上の真の変異体を構築する工程；及び、iv) 工程iii)からの上記選定変異体(１種以上)を、活性化非免疫原性ポリマーと、該ポリマーをAChE中の全ての遊離アミノ基にカップリングさせ得る条件下に反応させ；それによって、低下した免疫原性を有し且つ哺乳類循環における増大した安定性を有する均一にPEG化したAChEを得る工程を含む既知のアミノ酸配列を有する活性AChEの循環半減期の増進方法を提供する。
本発明の上記及び他の特徴及び利点は、下記の実施例により、また、添付図面を参照すれば、より容易に明白となるであろう。
【０００９】
（発明を実施するための最良の形態）
以下、製薬組成物において使用するPEG化アセチルコリンエステラーゼ(PEG-AChE)を合理的に設計し得る方法を提示する。本発明に従うPEG-AChEは、哺乳類循環において長滞留時間を有する十分に活性な均質物質である。上記均質性及び上記循環安定性は、非免疫原性ポリマー鎖とカップリングさせるに当ってAChEタンパク質中の遊離アミノ基の適切な組合せを選定し、上記AChEタンパク質から末端アミノ基を除く選定しなかった遊離アミノ基を上記タンパク質のアミノ酸配列のターゲット変異体化によって除去し、変異体化AChE中の全ての残存遊離アミノ基を上記ポリマー鎖とカップリングさせることによって達成する。上記の適切な組合せの選定は、有利には、上記AChEの三次元(3D)モデルを構築し、上記3Dモデルの表面上で上記遊離アミノ基を位置付けすることを含み得る。
上記合理的な設計は、本発明者等の様々な観察を組合せることによって可能であり、その幾つかは、全く驚くべきことのようである。先ず、本発明者等は、上記酵素の活性又は安定性にとって不可欠であり得るリシン残基を求めて、アラニンによって置換したリシン残基を有する加工酵素(ΔC-AChE)の数種の変異体を調製し、リシン残基は不可欠ではないことを見出した(例えば、図２参照)。多くの可能性ある変異体をその潜在的医薬用途の点から判別するために、また、既知のアミノカップリング化学を使用して非免疫原性ポリマーを上記タンパク質表面に結合させることによってこれら変異体の免疫原性を低下させ且つ血漿中での半減期を増進させることを意図しながら、本発明者等は、SYBYLモデル化ソフトウェアを使用して理論的3D構造を構築し、この理論的構造内の遊離リシンアミノ基を位置付けしマークした。上記ポリマーによる上記タンパク質表面を被覆することが酵素活性を中和する、例えば、抗体のような因子に対する酵素の接近性を低下させるものと推定し、どのような基準が上記モデル表面上で上記隠蔽ポリマーへの結合点の正しい組合せを選定するに当って当てはまるのかを課題として、本発明者等は、マークした遊離アミノ基を有するΔC-AChEの3Dモデルを回転させた。最後に、本発明者等は、以下の条件を策定した：上記モデルを繰返し90°回転させたとき、観察者に対して回転させた面に遊離アミノ基(潜在的結合点)を欠くものはない。本発明者等が構築した数種の変異体を比較すると、上記の仮説的基準の実際的値が確認された；モデル構造が90°の回転中に少なくとも１個の空の面を示す変異体は、モデル構造が空でない面のみを示す変異体よりも薬物動態的に安定性が低いことが判明した。上記モデルに基づき、数種のC-末端切断組換えヒトAChE(ΔC-AChE)変異体を構築しPEG化した。薬物動態測定値は、マウス及びサル双方の循環における顕著な安定性を示している。更にまた、得られた生成物は、医薬用途に適する均質な物質であることも判明している。
【００１０】
即ち、AChEの3Dモデル中のリシン残基の空間的位置の判定は、変異体化部位の組合せの選定及びPEG結合部位に対する指針として機能した。上記マクロ分子表面のPEG鎖による効率的な被覆の重要性を考慮し、マクロ分子モデルの主軸周りの模擬回転を使用した上記の研究上の仮説は、有用であることが判明した；表面上には、少なくとも１個の固定点(PEGターゲット部位)が常に存在しなければならない。例えば、位置53及び538において(アラニンで置換した5個の残存リシン残基を有する)、また、位置470及び538において二重の残存リシンを含む２つの異なるジリシン-AChE構造のX軸を中心とする回転(図４)は、K53/K538酵素が何ら固定点のない半球形表面を示したのに対し、そのような空表面はK470/K538酵素においては観察できなかった(他の軸を中心とする回転は、双方の酵素形状において空表面のない等価の結果が得られていた)。後者の変異体は、PEG化後、隠蔽ポリマーによって全ての表面が被覆されることが予測され得たのに対し、前者の変異体は、その少なくとも１つの表面上では有害作用にさらされると予測されるであろう。そして、実際に、後者の変異体は、マウス循環において、前者の変異体のほぼ2倍長く持続していることを証明している(図５)。
更に、本発明者等は、表面当り１個よりも多い固定点を含ませることが酵素表面被覆率に少ない程度で寄与するであろうと、従って、例えば、0°回転における表面がK470/K538酵素におけるような１個のリシンの代りに２個のリシン残基を示すK53/K332/K538酵素の場合(図４)、薬物動態性能は、ほんの中程度に高いであろうと推定した。固定点のさらなる追加は、酵素被覆率を有意に高めることは期待されず、5個のPEG鎖(4個のリシン及び１個の末端アミノ基)を含むK53/K348/K495/K538酵素は、4個のPEG鎖を有するK53/K332/K538よりもあまり良好な薬物動態性能を示していないことを示唆していた。この種の分析に基づく上記の推定は、げっ歯類及び非ヒト霊長類において実施した薬物動態試験において確認された(図５参照)。従って、表面被覆率を考慮することに由来する本発明によって提供される指針は、タンパク質、糖タンパク質、リポタンパク質等上のエピトープ又は翻訳後修飾決定基又は他の潜在的相互作用部位を隠蔽するのに有用である。
【００１１】
当業者であれば、AChEの例において証明した原理が他のタンパク質においても有効であることは、承知していることである。従って、１つの局面においては、本発明は、セリンヒドロラーゼのようなタンパク質の免疫原性を、該タンパク質を遊離アミノ基を介してPEGのようなポリマーに均一に接合させることによって低下させる方法に関し、その接合は、所定の結合部位において生じる。本発明の方法は、既知の配列のタンパク質に対して適用し得、タンパク質中の接合部位を選定する工程を含み、好ましくは、リシン残基を選定した部位以外の全ての位置において別のアミノ酸残基で置換した全ての想定変異体を評価し、n-1個の遊離アミノ基を残存させ、末端アミノ基と一緒にn個の接合反応用部位を得る工程を含む。４個よりも少ない遊離アミノ基を有するそのような変異体は、あまり好ましくなく、nの初期値は好ましくは4であることを意味する。そのような変異体は、３個のリシン残基を含有し(トリリシンタンパク質)、PEG化後、タンパク質分子当り４個のPEG鎖を含有し得る。本発明の方法は、既知のコンピュータ法を使用しての検討した変異体の各々についての三次元構造の描写を利用し得、好ましくは、コンピュータ描写構造を、二次元表示において、この表示上に明白にマークした遊離アミノ基の位置と一緒に表示する。各々検討した3D構造を、利用可能なプログラムを使用して３本の主軸を中心として90°連続して回転させ、12の可能性ある表示の各々をタンパク質面上の遊離アミノ基(結合点、カップリングのために接触可能な)の存在について評価する。位置の評価は、手で行ってもよく、或いは自動化してもよい。少なくとも１個の遊離アミノ基を含有する各面を陽性として、他の全ての面を陰性として表す。全ての回転表示が陽性であるタンパク質構造体を、真の変異体タンパク質を構築し、PEG化するための良好な候補として受入れ、他の全ての構造体は排除し廃棄する。遊離アミノ基がほんの少数しか存在しないとき、或いは遊離アミノ基が互いに接近して集結している場合、全ての検討した変異体を廃棄することが起り得る；その場合、５個又はそれ以上のリシン残基を検討する変異体中に保持させて、テトラリシンタンパク質、ペンタリシンタンパク質等を生成させる。この模擬作業後、選定した組合せを、既知の変異体化及び組換えタンパク質の発現方法を使用して具現化し、それによって、必要に応じて特性決定すべき１種以上の組換え低リシン酵素変異体を得、その後、PEGのような活性化非免疫原性ポリマーと反応させる。
【００１２】
PEG接合用の最適ターゲット部位を決定するこの方法は、治療上興味ある他のタンパク質(例えば、BChE、パラオキソナーゼ、ホスホトリエステラーゼ)においても、長期寿命循環分子への転換が必要な場合はいつでも、或いは免疫学的寛容性を増大させるべき場合、或いは修飾タンパク質と任意の所定のレセプターとの相互作用を低減させるべき場合に使用し得る。当業者であれば、そのことについて承知しているであろうし、また、活性化ポリマーのタンパク質への接合は、リシン残基の部位のみならず、おそらくは末端アミノ基又は酸化させていないシステイン残基等のような他の反応基においても生じることを考慮するであろう。
本発明は、接合タンパク質(例えば、AChE、BChE、パラオキソナーゼ、ホスホトリエステラーゼ)を、製薬組成物において、良好に特徴付けされた均質物質として使用することを可能にする。図１０は、本発明に従う均質生成物の製造を例示している。とりわけ、PEG化アセチルコリンエステラーゼは、現在、スカベンジング、解毒又は他の生物学的機能用の活性な非免疫原性均質物質として利用可能である。
【００１３】
（実施例）
本発明を、以下の実施例において、更に説明し例示する。
実施例
１連の低リシンAchE変異体の構築、産生及び製造
組換えヒトAChEのC-末端切断形を、開示されているようにして調製した[Kryger G. et al: Act. Cryst D56 (2000) 1385-94]。上記切断HuAChE (ΔC-HuAChE)の配列をコードするDNAを、これもレポーター遺伝子cat及び選択マーカーneoを発現する三連(tripartite)発現ベクター中に挿入した[Velan B. et al.: J. Biol. Chem. 266 (1991) 23977-84；Kronman C. et al.: Gene 121 (1992) 295-304]。１連の種々の低リシンAChE発現ベクターを構築した。１個のリシン残基をアラニンで置換した７種の構築物(K23A、K53A、K332A、K348A、K470A、K496A、K538A)を、部位特異性変異誘発によって産生させた。2〜7個のリシン残基をアラニンで置換した12種の構築物(図１)を、上記単一リシン変異体間での適切なフラグメントの交換により産生させた。
高レベルのrHuAChE及びrHuAChE変異体を発現する安定に移入したHEK-293細胞系の産生及び分泌酵素の精製は、以前に開示されているようにして実施した[Velan B、前出；Kronman C、前出]。
【００１４】
低リシンAChE変異体の熱安定性及び比活性の測定
本質的な塩ブリッジに関与するリシンのような重要リシンの除去は、タンパク質の人工的及び生物学的機能の重大な欠損をもたらし得る。従って、AChE分子からの選定したリシン残基の合理的な除去は、酵素完全性に対するリシン除去の効果を評価することを必要とする。このために、上記の安定細胞系の各々から得られた各種低リシンAChEタンパク質生成物をELISAによって定量し、酵素活性を判定し[Ellman G.L. et al.: Biochem. Pharmacol. 7 (1961) 88-95]、各変異体生成物の比活性を、酵素活性をタンパク質量で割ることによって算出した(図２)。一重及び二重リシン変異体の場合には、比活性は、野生タイプ酵素(6.5U/μg)の比活性から有意な形(10倍偏差)では偏差してなかった。これらの結果は、個々のリシン残基のいずれの除去も酵素の動態性能を変化させていないことを示唆している。多重リシン変異体の殆どは、一重変異体の範囲内である比活性を示していた(図２)。選定した多重リシンAChE変異体に対する数種のOP因子の阻害定数の測定により、リシン残基の除去が変異体化AChEのOP化合物に対する反応性を変化させていないことが実証された。
この基準にのみ基づき、任意のリシン残基を除去してPEG化用の修飾AChEを産生させ得、これらの比活性を測定することによっては検知されていない種々のリシン残基の機能的役割におけるさらなる妥当な差異を、各低リシン形を他の試験に供することによって更に明白にし得る。このために、各低リシン変異体を熱安定性について検証して、あるリシンが酵素の物理化学的完全性の維持においてより多くの役割を果たし、そのために置換すべきでないかどうかを判定した。この判定は、各変異体化AChEを51℃で種々の時間長でインキュベートし、その後、残留酵素活性を測定することによって達成された。各変異体AChE形の各々の熱減衰曲線を描き、半減期時間値を測定した。一重及び二重リシン変異体化形は、全て、野生タイプ酵素の値(T1/2 51℃ = 8.9分)と有意に異ならない(10倍偏差)熱減衰値を示した。従って、２つの基準、即ち、比活性及び熱安定性に基づき、本発明者等は、AChEの場合、各リシン残基が酵素完全性にとって重要である空間構造の構成成分ではないことを判定し得た。
２個よりも多いリシンを置換した多重リシン変異体を検証することによって、K470A変異を含む酵素形のみが、野生タイプ酵素と比較したとき、熱安定性の10倍よりも僅かに大きい低下を示していることが実証された。しかしながら、酵素のPEG化形は修飾していない酵素よりも熱安定性であるので(図３参照)、K470の除去は、中程度の形でのみ酵素安定性に影響を与え、そのPEG化形においては低リシンAChEの全体的性能に対して殆ど又は全く作用を有しないことを証明し得る。事実、図６におけるように、K470を除去したPEG化テトラリシンAChE (K23A/K348A/K470A/K496A)の薬物動態性能は、K470を置換していないテトラリシンAChE (K23A/K332A/K496A/K538A)の薬物動態性能と本質的に同一である。
【００１５】
選択的リシン残基の除去
三次元モデルの分析を、SYBYLモデル化ソフトウェア(Tripos社)を使用して、Silicon Graphicsワークステーションにおいて行った。モデルは、ΔC-HuAChE [Kryger等、2000年]の三次元構造に基づく。
AChEの3Dモデル中でのリシン残基の空間位置の決定は、変異体化低リシンAChEの選定形状を選択するための、PEG結合及びその後の薬物動態分析のための指針として機能する。本発明者等の研究上の想定は、PEG鎖によるマクロ分子表面の効率的な被覆は、マクロ分子をそのいずれかの主軸を中心として回転させたとき、表面に少なくとも１個の固定点(PEGターゲット部位)が常に存在すべきことが必要であるということであった。
【００１６】
好ましい低リシンPEG-AChE形状の決定及びそのマウスにおける性能
3〜7個のリシン残基を変異化した低リシンAChE酵素形を、PEG接合後、マウスにおけるその薬物動態挙動についてモニターした(図５)。rHuAChE中の第一級アミンへのPEG鎖の結合を、以前に本質的に開示されているようにして、プロピオン酸スクシンイミジル活性化メトキシPEG (SPA-PEG；Nektar社)を使用して実施した[Cohen O. et al.: Biochem. J. 357 (2000) 795-802；Cohen, O. et al.: Biochem. J. 378 (2004) 117-128]。マウスにおけるクリアランス試験(酵素サンプル当り3〜6匹のICR雄マウス)及び薬物動態プロフィールの分析を、以前に本質的に開示されているようにして実施した[Kronman C. et al.: Biochem. J. 311 (1995) 959-67]。試験は、動物実験に関する地区倫理委員会によって承認された。マウスに、各rHuAChE調製物(0.1ml PBS中20μg/マウス)を注入した。血液サンプル中の残留AChE活性を測定し、全ての値を血液中の背景加水分解活性に対して補正した(試験実施の1時間前に採血したサンプルを使用して)。注入直後に採取したサンプル中のAChE活性値に100％の値を与え、残留活性の算出に使用した。投与前マウスの血液中の背景コリンエステラーゼ値は、2単位/ml未満であった。薬物動態パラメーターMRT (投与分子が生物体中で滞留する平均時間長を反映する平均滞留時間)は、WinNonlinコンピュータプログラムを使用して、ノンコンパートメント薬物動態モデルに従うクリアランスデータを分析することによって得た。
PEG結合用の1個、2個、3個及び4個のターゲット部位を含有する各PEG化AChEはマウスにおいては、平均滞留時間値を増大させることに特徴を有する。同じ数のリシン残基を含有するがPEG化に利用し得る正確なリシン位置において異なる酵素形は、K23A/K53A/K332A/K348A/K496A及び23A/K332A/K348A/K470A/K496AのMRT値によって実証されているように、循環において異なっているのが明らかであり、PEGターゲットリシン残基の空間的分布の重要性を証明している。最適の薬物動態性能は、AChE酵素形がPEG化に利用し得る少なくとも3〜4個のリシン残基、好ましくは4個のリシン残基を含む場合に達成されている。
【００１７】
好ましい低リシンPEG-AChE形状の決定及びその非ヒト霊長類における性能
3〜7個のリシン残基を変異化した低リシンAChE酵素形を、PEG接合後、アカゲザル(Macaca mulatta)におけるその薬物動態挙動についてモニターした(図５)。動物の処置は、USDA動物保護法に概説されている規約及びThe Guide for Care and Use of Laboratory Animals (米国国立衛生研究所、1996年)に明記されている条件に従い、薬物動態試験は、動物実験に関する地区倫理委員会によって承認された。
サルに、1000単位の各AChEをi.v.注入した(注入容量 < 1ml/kg)。血液サンプル(0.25ml)を種々の時間長でMicrotainerチューブ(Becton, Dickinson and Co.社、米国)中に採取し、Eppendorfマイクロヒュージ内で1分間10,000rpmで遠心分離し、血清サンプル中のAChE活性を測定するまで-20℃にて保存した。酵素活性は、上述したようにして、イソ-OMPA介在BChE阻害後に測定した。注入2分後に採取したサンプル中のAChE活性値を投入活性として表し、試験全体に亘る残留活性の算出において使用した。AChE値は、試験実施の1時間前に採血した血液サンプルにおいて測定した背景活性値に対して補正した。外来投与AChEは、背景内生イソ-OMPA-抵抗性ChE活性よりも少なくとも20倍高かった。クリアランスプロフィール及び薬物動態パラメーターの分析は、マウスにおいて実施した試験において説明したようにして行った。
これらの薬物動態試験は、各PEG化低リシンAChEの循環滞留時間が、マウスと比較したとき、サルにおいて著しく高い(7日目まで)ことを実証していた。更に、マウスにおいて観察されているように、各低リシンAChE変異体の平均滞留時間値は、PEG化に利用し得るリシン残基の数に影響を受けている。ランダムにPEG化したΔC-AChEの性能に匹敵する最適の薬物動態性能は、AChE酵素形がPEG化に利用し得る少なくとも3〜4個のリシン残基、好ましくは4個のリシン残基を含む場合に達成されている。総合すれば、これらの知見は、リシン含有量の調節が各種動物モデルにおいて同様な形でタンパク質薬物動態に影響を与えており、従って、除去におけるリシン選定の法則(酵素活性、タンパク質安定性、空間分布の基準に基づく)は、全体に亘って有効であり、特定の試験系に限られることはない。
【００１８】
PEG結合による抗原性AChE決定基隠蔽の証拠
組換えヒトAChE又は他の酵素の生体スカベンジャーとしての使用は、これらタンパク質の繰返しの投与を必要とし得る。このことは、抗体の発現に至り得、今度は、抗体が、循環からの生体スカベンジャーを封鎖し得る。線状で可撓性の荷電していない親水性ポリマーを酵素上の利用し得るが本質的でない基に結合させることは、抗原決定基を被覆する酵素の周りにシェルを与え、検査用の可撓性の親水性表面を免疫過程により与えることにより、免疫応答が誘発される外来物質として内部酵素が認識することを阻止する。マクロファージのような抗原提示細胞による分解の低減、分解後のペプチドの幾つかのエピトープの隠蔽又はB細胞上のレセプターへの結合の阻止は、全て、PEG修飾タンパク質に低下した免疫原性を授与するに当って役割を果たし得る[Tsusumi Y. et al: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97 (2000) 8548-53]。
PEG化rHuAChEの抗原性を、160ngのΔC-rHuAChE又はPEG化rHuAChEのいずれかを種々の量のポリクローナルマウス抗-HuAChE [Shafferman A. et al. J. Biol. Chem. (1992) 17640-48]と一緒にインキュベートすることによって試験し、その後、プロテインG-アガロースビーズで処理した。
免疫沈降を、上清中の残留AChE活性を測定することによって評価した。結果(図６)は、修飾していない酵素と異なり、酵素のPEG化形は抗-AChE抗体によって有効には沈降しないことを明らかに実証しており、PEG成分の付加は、酵素を免疫認識から有効に隠蔽していることを示唆している。
以前の研究により、AChE分子が、レセプター介在アシアロ糖タンパク質除去又はAChEアミノ酸エピトープの種特異性認識のような種々のメカニズムによって循環から排除され得ることは実証されている。これらの過程によるAChEの循環性排除は、PEG成分のAChEへの付加により有効に低減されており、PEG化が、AChE分子を種々の排除メカニズムに効率的に接近不能にする保護シールドを与えることを示唆していた。PEG付加によりAChE分子を抗-AChE抗体によって認識されない形に転換するという知見は、PEGによってもたらされる隠蔽の一般的性質を示しており、このことはタンパク質系治療薬と広範囲の宿主関連メカニズム間の相互作用を阻止する有効な方法として機能することを示唆している。
【００１９】
PEG-AChEは囓歯類において修飾していないAChEよりも免疫原性が低い
AChEの免疫学的特性に対するPEG化の効果を評価するために、PEG化rHuAChEの免疫能力と修飾していないrHuAChEの免疫能力を、それらのマウスへの投与後に比較した。そのため、修飾していないAChE、3-PEG AChE及び4〜5-PEG AChEをマウス(n=10)に１月間隔で繰返し投与し、抗-AChE抗体産生をモニターした(図７)。修飾していないAChEを投与したマウスは、２回目投与の後でさえも実質的な抗-AChE抗体レベルを示し(抗体力価 = 7週間で1500)、抗体レベルは、３回目の投与後有意に増大した(抗体力価 = 11週間で9000)。対照的に、抗-ChE抗体レベルは、4〜5-PEG AChEを投与したときは、およそ20倍低かった(抗体力価は、7及び11週間で、それぞれ、130及び400であった)。PEG-AChEが異種動物モデル(マウスでのヒトAChE)においてさえも有意の抗体産生を誘発し得ないことは、PEG付加がAChE分子の“免疫学的に不活性”な形への転換をもたらしていること実証している。従って、PEG付加は、AChEの薬物動態特性を改良するのみならず、酵素分子を宿主免疫系から有効に隠蔽する。
3-PEG AChE投与後の抗-AChE抗体産生を検証すると(図７)、この場合の抗体レベル(抗体力価 = 7及び11週間でそれぞれ660及び1800)は、修飾していないAChEの場合(抗体力価 = 7及び11週間でそれぞれ1500及び9000)におけるよりも依然として有意に低く、更に、これらのレベルは、4〜5-PEG AChEの繰返し投与から得られるレベル(抗体力価 = 7及び11週間でそれぞれ130及び400)よりもなおかつ高い。これらの結果は、宿主免疫系からのAChE分子の有効な隠蔽はPEG付加において利用し得るターゲット部位の数に依存していること並びに低レベルのPEG化は抗体産生を誘発し得る露出表面領域を有するPEG化酵素形の生成をもたらすことを実証している。リシン含有調整がPEG化酵素の薬物動態及び免疫特性の双方を同じ形で決定しているという知見(3-PEG AChE：低めの循環滞留性、低めの免疫寛容性；4〜5-PEG AChE：高めの循環滞留性、高めの免疫寛容性)は、本発明者等がリシン除去を選定するのにその空間的分布に基づいて確立した法則はPEG化タンパク質薬物の均質な免疫学的に不活性な分子形への効率的な転換において実施すべきことを示唆している。
【００２０】
PEG-AChEは霊長類において修飾していないAChEよりも免疫原性が低い
PEG化rHuAChEによって誘発された抗-AChE抗体レベルを、修飾していないrHuAChE又はFBS-AChEによって誘発された抗-AChE抗体レベルと、それらのアカゲザルへの投与後に比較した。そのために、修飾していないもしくはPEG修飾AChEまた異種FBS-AChE(アジュバント含まず)をサルに１月間隔で繰返し投与し、抗-AChE抗体産生をELISAによりモニターした(図８)。異種FBS-AChEの繰返し投与は、３回目投与後に抗-AChE抗体の発現をもたらし、抗体レベルは、さらなる投与後に有意に上昇した。予測したように、修飾していなくほぼ同種のヒトAChEの繰返し投与は、５回目の投与後のみ抗-AChE抗体の発現をもたらしたが、最も有意なことに、PEG化ヒトAChEのアカゲザルにおける繰返し投与は、６回目の投与後でさえも検出し得る免疫応答を誘発し得なかった。従って、PEG付加は、非ヒト霊長類においてAChEの免疫原性を有意に低下させる。
【００２１】
改良された生体スカベンジング能力を有するPEG-低リシンAChEの生成
ヒトAChEの位置338のフェニルアラニン残基のアラニンによる置換は、ソマンに対するその反応性を著しく損なうことなくソマニルアダクトのエージング低下を示す酵素形の生成をもたらし、従って、OP生体スカベンジャーとしてより有効である[Ordentlich A. et al.: J. Biol. Chem. 271 (1996) 11953-62；Shafferman A. et al.: Biochem. J. 318 (1996) 833-40] 。この変異をテトラリシンAChE酵素に取込ませてK23A/K332A/K348A/F338A AChE酵素形を生成させた。この酵素種をPEG接合に供し、マウス中でのその薬物動態性能についてモニターした。図９に示すように、上記調整酵素は、親テトラリシンAChE K23A/K332A/K348Aと同様な形で循環中に滞留していた。従って、消失した“エージング”特性を低リシンAChE型内に植付けて、優れたPEG-AChE系生体OPスカベンジャーを生成させ得る。この知見は、他の動的特長を循環長寿命PEG修飾酵素に導入してOP中毒の治療処置用の最適化酵素生成物を生成させることもできることを示唆している。
【００２２】
本発明を幾つかの特定の実施例に関して説明してきたけれども、多くの修正及び変更が可能である。従って、特許請求の範囲内において、本発明は、詳述した以外においても実施し得ることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】種々のAChE種の選定及びその製造を示す図式である。
【図２】種々の位置においてリシンをアラニンにより置換しているC-末端切断組換えヒトAChE (ΔC-AChE)変異体及び野生タイプの熱安定性及び比活性を示す表である。
【図３】ランダムにPEG化した及びPEG化していないΔC-AChEの高温での失活を示すグラフである。
【図４】SYBYLモデル化ソフトウェアにより構築したΔC-AChEの3Dモデルを特定のリシン残基に対してマークした位置と一緒に示す図である。
【図５】種々の位置においてリシンをアラニンにより置換しているΔC-AChE変異体の数種のPEG化種及び野生タイプのマウス及びサルにおける平均滞留時間(MRT)値を示す表である。
【図６】PEG化ΔC-AChEの、PEG化していないΔC-AChEと比較して低下した抗原性を実証するグラフである(双方の種を生体外においてポリクローナル抗-AChE抗体と反応させ、プロテインG-アガロースにより免疫複合体を除去した後に残留活性について確認した)。
【図７】PEG化していない又は種々にPEG化したΔC-AChEを繰返し投与することによって誘発させたマウスにおける抗-AChE抗体の産生を示すグラフである。
【図８】PEG化及び異なる種由来の２つのタイプの生来のAChEにより繰返しの注入後に誘発させたサルにおける抗-AChE抗体の産生を示すグラフである。
【図９】テトラリシンΔC-AChE変異体及び相応するF338A変異体の残留活性の時間依存性を示し、位置338におけるさらなるフェニルアラニン変異が循環中の酵素安定性に対して有害な作用を有していないことを実証する図である。
【図１０】本発明に従う均一に接合させた酵素のSDS-PAGEによる分析を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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