(57)【要約】本発明は、電気化学発光現象を解明するための分析方法及び装置に関するものである。本発明は特に定量的なベッドサイドでの迅速臨床検査に適したものである。本発明は、伝導体/絶縁体/多孔性フィルムからなる装置に関するもので、この装置は、電子発光法および標識分子の電気的励起とそれに続く発光に基づくものであり、生物学的アフィニティによる物質の測定を行なうものである。これによってより正確に迅速に測定を行うことができる。
2008534943.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を装備した電子化学発光分析装置
−電極として働く物質は、伝導体または強力に不純物を混ぜ込んだ（ドーピ−ングした）半導体から構成され、いずれも電気絶縁体層で被覆されている。
−装置の電極は、足場で補強されており、それを通して電極が発光測定装置の励起電極に接続され得るものである。
−電極は、装置の陰極として働く。
−100 μm以下の厚さの多孔性フィルムを電極につける。
−多孔性フィルムに測定に供する試料をつける。
−試料と試薬を多孔性フィルム及び/または陰極にもってきて互いに反応をさせる。
−励起パルスを測定する試料に与えると分析対象物の量に応じた発光シグナルが現れる。
【請求項２】
特許請求の範囲１に示した装置では陰極は、シリコンまたはアルミニウムであり、その表面には酸化層がある。
【請求項３】
特許請求の範囲１に示した装置では電極にかぶせる多孔性フィルムの厚さは、1-20 μm が好適である。フィルムと電極は溶媒を通して生物学的アフィニティ反応や電気発光測定において接触するようになっている。
【請求項４】
特許請求の範囲１に示した装置では、多孔性フィルムは発光測定中に除去される。
【請求項５】
特許請求の範囲１−４にある全ての装置では、電極の表面或は電極と接触している多孔性フィルム或はそれらをくみ上げたものが分析しようとする分子に結合している生物学的アフィニティ分子で被覆されている。
【請求項６】
特許請求の範囲１の装置によると、測定を開始する前に、この装置で特異的に反応する分子は固体または不定形状態で装置の表面につけておく。
【請求項７】
特許請求の範囲１−６の全ての装置には、以下のことが含まれている。:
-     電極は、試験片装置の構造的な基盤となっている。
-     電極及び/または多孔性フィルムは生物学的吸着剤で被覆されている。  
-    乾燥した標識生物学的分子を含む多孔性フィルムを電極と接触させる。
-     試料及び/または緩衝液は生物学的アフィニティ反応を開始するように多孔性フィルムに近づける。
-      生物学的アフィニティ反応を進行させる。
-     生物学的アフィニティ反応を停止する
-     多孔性フィルムは電極から除去される。
-     測定は、電子発光装置で行なう。
【請求項８】
特許請求の範囲１−７に示した装置では、電極は多孔性フィルムを機械的力で除去できるように被覆してある。
【請求項９】
特許請求の範囲１−８に示した装置では、第一義的な機械的力は、可塑性のある物質から得られる。
【請求項１０】
特許請求の範囲１−９に示した装置では、滑らかな陰極の質の管理または電極の被覆の質の管理を原子間力及び/またはトンネル顕微鏡で行なう。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、電気化学発光現象を解明するための分析方法及び装置に関するものである。本発明は特に定量的なベッドサイドでの迅速臨床検査に適したものである。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
現在、迅速、高感度且つ定量性のよい 臨床検査技術が強く求められている。このような技術は、公衆衛生、研究、農業、環境保護、獣医学、および工業生産管理分野等の広い市場に公的な者である。分析にあたっての感度、速度、堅牢性、安定性等の改善及び低価格性を臨床検査技術の領域で達成できたならばこれらは極めて広い範囲の新しい応用領域を開拓できる。
【０００３】
非常に高い感度は、ある種の臨床装置で達成されているが、極めて高価である。一方、免疫クロマトグラフィーに代表される方法は、十分に安価であるが、その市場性は限定されている。上に示したような要因が満たされる技術は、将来の臨床検査において重要な位置を占め、大きな市場が期待できる。
【０００４】
臨床検査においてはさまざまの分析原理が実用化されている。例えは放射能測定、酵素免疫法（ELISA）、比色法、蛍光や陰極性電気化学発光に基づく方法及び熱電子誘導（陽極法）電気化学発光に基づくもの(ECL)が知られている。熱電子誘導ECLはKulmala
S., et al の特許US 6251690に記載がある。これらの技術はいずれも感度、耐久性、安定性、速度及び価格にその優位性がある。これらの技術的な違いによって装置の物理的限界及び方法の優位性が現れている。例えば放射能に依存する者は、放射性化合物の崩壊に伴う時間的な制約及び安全性及び環境問題がその放射性物質の廃棄に関して問題がある。また、多くの感受性の高い方法は、高度な熟練者でなければできない複雑且つ難しい技術が必要である。分析方法の複雑性であればあるほど試験装置の値段及び試験の価格が高くなる。複雑な装置について言えば、現在陰極性電気化学発光技術が普及してきているが、装置を動かすには複雑な実験室ロボットを操作できる熟練者が必要であり、しかも測定には何度もの洗浄や準備が必要である。このような要因は分析当たりのコストを上げ、廃棄物を増やすことに繋がっている。従ってこれらは小規模の実験室や医局など（ベッドサイドや治療用分析）では使用できない。
【０００５】
商業的に有利な方法は、分析対象物が決まっていて混合物中でも測定できる、いわゆる標識化合物を測定することを原理とするものである。生物学的分子の特性に基づく測定においては、免疫化学的分析方法にみられるように、即適しようとする物質（X）は、固相に吸着させた抗体に混合物を流して選択的に吸着せしめて、その吸着させたものを（X）に対して特異的なもう一つの標識抗体を用いて測定することを原理としている。標識は、放射性物質、酵素、吸光物質、蛍光物質、燐光物質、金属錯体など抗体に共有結合しているものを用いている。又は、純化した（X）を標識し、これを用いて未知量の（X）をその競合的な希釈度を測定することで分析できる。
【０００６】
一般的に電気化学発光（ECL）の利点は、電気的励起成分が安価であることと光学系の単純さにある。臨港に比較すると幾つかのその欠点を補うことができる。これまで行われてきた不活性電極を陰極とする電気化学発光は非水系溶媒を用いる比較的単純な装置で有機性発光体を用いることである。しかしながら、生物学的なアフィにティ分析法では、水溶液系に応用できることが広く期待されている。生物学的試料は、ほとんどの場合非有機溶媒中にある。従って、これらの測定系は水系あるいは少なくともミセル状態の水系で行うことになる。ごく限られた遷移金属キレート剤が水系または水ミセル状態での陰極ECLのECL標識として利用されている。
【０００７】
陰極ECLとして商業的化学分析機器に最も広く使われているのはルビジウムキレート：Ru(bpy)32+の誘導体を用いるほうほうである。ここでは標識化合物の相の検出はミセル中で起こる。教科書で知られているように、ミセル混合物は、制御できない複雑なミセルの平衡状態によって起こるさまざまの分布状態を引き起こしやすい。そこでミセルに依存しない熱電子誘導ECLは、陰極ECLに比べて多くの重要な利点がある。この方法は、免疫法及びDNAハイブリダイゼーション法の両方に用いることができる（非特許文献１および２）（Blackburn, G., et al., 1991, Clin. Chem. 37: 1534-1539;
Kenten, J., et al. 1992, Clin. Chem. 33: 873-879）.。Roche Diagnostics
Ltd.二よって開発された免栄分析法及びDNAまたはRNAプローブ法は、時期粒子で行われているもので、標識化合物は金電極におく必要がある（特許文献２および３）(Massey; Richard J., et al. US 5746974; Leland; Jonathan
K., et al. US 5705402)。しかしながら磁性体ラテックス粒子を再現性高く取り扱うことは難しいので、その利用は複雑で、しかも精密な液体をとりあつかえる高価な実験実ロボット(たとえば
Elecsys 1010 and 2010)を持っているところにかぎられていた。更に、金電極を大量に使い続けるには分析毎に長時間の洗浄と準備が必要である(非特許文献３、Elecsys Service Manual, p. 70).
【０００８】
いろいろな優れた面がこの方法にあるが、バイオアフィニティ分析における熱電子誘導ECの欠点は、分析制度をあげるために必要な反応分子が平衡に達するまでに長時間の反応が時間が必要になることである。本発明によれば、薄い多孔質のフィルムを電極に入れること（以下これを特許請求の範囲１−１０に示すようにCIPTと呼ぶ）で非常に大きな改良ができる。
【０００９】
（参考文献）
【特許文献１】Kulmala S., et al 、特許US 6251690
【特許文献２】Massey; Richard J., et al. US 5746974
【特許文献３】Leland; Jonathan K., et al. US 5705402
【非特許文献１】Blackburn, G., et al., 1991, Clin. Chem. 37、1534-1539
【非特許文献２】Kenten, J., et al. 1992, Clin. Chem. 33、873-879
【非特許文献３】Elecsys Service Manual, p. 70
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明によれば、既に知られている複雑な装置と同じ分析をはるかに単純安価な装置で達成できる。ここでは、免疫アッセイやDNAハイブリダイゼーションを使用する電極表面の多孔性フィルム(CIPF-装置)上で行える。測定装置と測定セルはベッドサイドで使用できるように安価になっている。
【００１１】
本発明で言う多孔性フィルムとは、厚さ１００μｍ以下の液体を透過できるフィルムを指し、これはECL陽極に被せられるものである。陽極ECL電極は、陰極ECL電極と異なり、よく使われている通常のものとは全く異なるものである。その理由は、陽極には特許文献４、による絶縁性フィルムをその表面にもっていることである。多孔性フィルムは、先に述べた絶縁体を陽極を被覆している。本発明による電極は、少なくとも2種類のフィルム、電気を通さない絶縁体フィルムとその上に１００μｍ以下の厚さの多孔性フィルム、をもっている。多孔性フィルムは、先に述べた絶縁性のものと異なり伝導性のものである。従って多孔性フィルムは、特許文献４に記載のものとは全く異なるものである。陰極ECLにおいて、さまざまの多孔性物質を電極自体あるいは電極の被膜として用いること特許文献５，６，および７がこれまでにおこなわれている。しかしながらこれらの発明における多孔性物質の利用の目的は、本発明と異なるものである。陽極ECLは陰極ECLとは電気化学的に異なる原理に基づいて機能している（なかんずく、電極からの励起域の距離が異なる。）から、本発明の多孔性フィルムは決して電極として働かない。多孔性フィルムを電極の上に設置することで以前の技術では考えられない、驚くべき性質が見出された。さらに均質なサンプル層が迅速に陽極の上に多孔性フィルムによって迅速に拡げられる。
【００１２】
本発明は、伝導性・絶縁性・多孔性フィルム装置（CIPF）,とくに陽極の構成にかかわるものである。実施例８に示すように、きわめて多様な標識化合物を励起することが可能である。CIPF装置の原理は、図１に記載してある。この装置は、液体の試料または緩衝液を投入して液体を多孔性フィルムと接触させることで試料または緩衝液が電極全体に拡がることで起動する。この装置は、驚くほど迅速に免疫アッセイ系として働くことが判明した。さらに驚くべきことにこの装置で標識物質は多孔性フィルム中で１００μｍ以下で励起されることが判明した。本発明によれば、CIPF装置、センサー、プローブからなる安価な使い捨て電極を作ることができ、これまでのECL電極に代わる使い捨て電極ができる。同時に旧来装置による微粒子を扱う精巧なロボットによる戦場は平衡運用が不要になる。
【００１３】
本発明は、これまでの技術や装置に比べてPOC市場に格段に安価で迅速な試験を提供できる革新的なものである。ECL機構と各種の多孔性フィルムの原理による測定を結合して達成されたものである。
【００１４】
各種の多孔性物質が免疫クロマト（非特許文献４）の原理に基づくアッセイにおいて液体輸送やろ過に用いることができることは以前から知られている。しかしこれらの方法は定量性がなく、これまでの電気化学的原理とはまったく異なる陽極ECLの構成よるものではない。
【００１５】
微流体系またはマイクロリットル系においては、しばしば気泡の問題、熱拡散による悪影響、層流による問題（流れのなかでの混合が起こらないこと）、毛管現象による表面張力の問題などが起こる。この発明では新規な多孔性フィルムを用いることでろ過のみならず均一で一様に拡散した液体の流れを得ることができる。この現象は、電子誘導ECLの滑らかなシリコン電極を用いることで可能になる。
【００１６】
さらにCIPF装置は、ECL検出法およびその装置構成によって、アッセイにおける全血のサンプル調製や処理を極めて簡便化を可能にできる。多孔性フィルムを微流体法に用いることでこれまでの方法の不便だったところを大幅に改善できた。
【００１７】
本発明は、分析試料と試薬を均一にECL上に拡げる装置とそれに続く電気的励起を電極上で免疫アッセイおよびDNAプローブ法に基づく迅速に測定する装置から構成されている。
【００１８】
本発明の完成は、１００μｍ以下の厚さの多孔性フィルムを装備したCIPF装置で流体の均一性を得ることとバイオアフィニティアッセイにおけるECLを基本とした検出法でのマイクロ量の液体のフローセルまたは微量液体層セルの均一な拡散を担保することで達成されている。なお、これらの装置の特性は、特許請求の範囲１から１０に記載されている。本発明は、陽極ECLの実用性を担保する方法と装置に特に焦点を絞ったものである。さらに、この特許の特徴は、陽極での励起が電極の近くで起こることである（近接アッセイ原理）。補助的役割を果たす多孔性フィルム電極に近接して置かれており、これは、他の方法にはないものである。また一方、多孔性フィルムは、バイオアフィニティ反応を開始し、その後のECLの測定前に外れるように電極に装着してある。しかしながら測定は多孔性フィルムを通して直接行うことができる。標識化合物は、多孔性フィルムの上または、電極にまたは使用する電極の表面で乾燥させることができる。多孔性フィルムと使用する電極とのつながりは１００μｍ以下が適切である。多孔性フィルムは共有結合または吸着によって表面に結合させることができることはすでにしられているところである（例： Schleicher & Schuell Ltdの製品.）、しかし、それらではECLに利用するとの考えは入っていない。
【００１９】
本発明の主なる部分は、ECL使用電極である。熱電子誘導ECLの電極物質は、伝導体を薄い絶縁体フィルムで被覆したものでその物質は米国特許US 6251690 (Kulmala et al.)にあるようにアルミニウムまたはシリコンである。最も好適な材料は、扁平な酸化シリコンであり厚さ１−１０nmの絶縁体で被覆され、絶縁体のフィルムの厚さは３−４nmであることが望ましい。しかしながらシリコン基質は、チャンネル（通り道）があるか表面の状態を就職して液体の流れや電気的性質をよくするために改善がなされている。シリコンチップのサイズは用途や同時に測定する試料の数によって異なる。典型的なシリコンチップの大きさは４ｘ９nmで、厚さは１ｍｍ以下である。シリコンチップは、支持構造体に付設されている。支持構造体は装置の大きさや使用する装置の仕様によってさまざまな形にできる。典型的な支持構造体は、プラスチックスからできている。それは環境にやさしくまた、廃棄も簡単である。フィルムのとくせいによってプローブフィルムは湿または乾の状態で支持構造体の表面に置かれたシリコンチップの上に広げられる。
【００２０】
本発明の電極の表面に置く多孔性フィルムの特徴は、微細孔をもち、その厚さが１００μｍ以下のものである。本発明で使う物質は市販品でMillipore, MSI, Sartorius, Pall, Sigma、 DuPontなどから入手できる。多孔性フィルムは、層移動に関して一方向性でも両方向性でもよい。また微粒子のsinteringを行う。多孔性フィルムの材料は、選択の余地はあるがそれには限り狩り、PTFE,  ポリビニリデンフロライド、ポリカーボネート、ポリスルフォン、ナイロン、セルロースエステルなどがその候補である。このようなフィルムは、いろいろな孔径、厚さ、物理化学的性質のものが市販品としてある。好適なろ過材としては、ガラスフィルター、ろ紙、素焼きのろ過材を上げることができる。
【００２１】
多孔性フィルムのCIPF装置への利用はこれまでのバイオアフィニティアッセイ法に比べて格段の利点がある。多孔性フィルムを用いることで試料は抗体を被覆した電極に均一に広げることがかのうになった。多孔性フィルムは、流体の流れを均一化し、微細流系での気泡の発生（ECL固有の問題）を防ぎ、熱拡散、望ましくない表面張力、層流などを防ぐ特徴があり、微流体系セルや微細セルにおける問題を解決できた。
【００２２】
多孔性フィルムがECL−原理によるバイオアフィニティアッセイにおいて１００μｍ以下と十分に薄い場合には、反応化合物も電極の上に置いた多孔性フィルムの近くにもってこれるので多孔性フィルムは電極の表面と接触する液体中にあることになる。理論的考察（特許文献８、US 6251690, Kulmala S.  ら) などに相反して、本発明の結果によると電極からの励起パルスは、想定していたよりも電極からはるかに遠方から多孔性フィルム中にある標識化合物を励起すること、即ち１００μｍの厚さの多孔性フィルムで起こることがわかった。電極の用面は、既知の方法で抗体またはDNAで被覆できる、そして結合している標識分子は電気パルスで励起される。多孔性フィルムの場合は、用いた試料や試薬は、測定前でも望んだときに何時でも除去できる。
【００２３】
患者からの試料（plasma、血清、全血、髄液、尿など）を多孔性フィルムに載せて乾燥して保存しておくことが可能である。これは、極めて大きな本発明の優位性である。たとえば試料の輸送も簡単になる。試料を載せた多孔性フィルム通常の運転に用いるCIPF装置の一部として挿入することも可能である。また本発明ですでに記載のように定量分析も可能である。
【００２４】
電極または多孔性フィルムの表面をよく知られている方法で抗体や抗原を高い濃度で被覆することも可能である。本発明によれば電極や多孔性フィルムの表面への被服は、実施例に示すように、Langmuir-Blodgettフィルムで被覆できる。
【００２５】
製造面から見てCIPF装置を乾燥状態で保存できることは優位性がある。こうすることで装置は液体試料や緩衝液を多孔性フィルムの表面に加えることで多孔性フィルムと電極の間のバイオアフィニティ反応の条件を適切にすることができる。
【００２６】
本発明に記載のCIFP装置は、装置の支持構造体に加えて、多孔性フィルム、電極より構成されており、さらに装置の使いやすさを考慮した部品や覆いからできている。分析を全血については、実施例に示すように血球細胞を除く特殊な多孔性フィルムを用いることになる。本発明による装置は、励起と発光を測定する電極と接続している電気的接合部位がついている。典型的な本発明における装置は、自動化システムで大量生産が可能である。CIFPそうちの様々の部品生産及び組立ては、基本的には既知の方法によっている。
【００２７】
本発明の電極材料としては滑らかな表面であることが望ましい。電極を被服するバイオアフィニティ材料に質は、CIPF装置の昨日にとって極めて重要である。従って、その質の制御は極めて精密なトンネルを作製できる原子電子顕微鏡に直接依存するものである。このようなことは例えば活性のある被覆抗体（ほかの臨床分析方法では実質的にできない方法）を直接監視しながら行うことになる。仕上がって質的制御の程度が本発明の最も強力なものの一つであり、これが本臨床検査の最も重要な部分を成すものである。陰極をポリスチレンで被覆する通常の方法では、上記のようなことは達成できない。その理由は、注入成型法によるポリスチレンの表面は、粗過ぎて表面材料上の分子を同定できないからである。
【００２８】
迅速定量試験および例えば全血試料の前処理、たとえば全血の前処理は、本発明に示す方法及び装置で非常に単純化できる。また例えば、全血試料の場合のヘパリン処理が不要になる。分析試料を拡げた多孔性フィルムは、血液細胞が電極と接触しないようにしている。また血液細胞がついている多孔性フィルムは、バイオアフィニティ物質で被覆した電極を取り出して洗浄することで簡単に洗浄できる。当然のことであるがヘパリン処理した試料の測定も、この装置及び方法で可能である。
【００２９】
実用電極（陽極のECL, Al, Siなど）またはこの実用電極を被覆する薄い多孔製フィルムは抗体で被覆できる。もしも多孔性のフィルムが抗体/抗原/RNA/DNAで被覆されていると測定は多孔性フィルムをつけたまま測定ができる。しかし実用電極が多孔性フィルムを認識できる分析材料で被覆されているときはECL測定の前にこれらの被覆を除く必要がある。本発明のECL測定は熱電子誘導発光に基づいて行われることが望ましい(特許文献８、US
6251690)。
【００３０】
CIPF装置にはその応用に応じた発明から構成される多様なやりかたがある。本発明によると典型的な分析試料を搭載した分離試験片から構成されている。試料は、抗体で被覆したシリコン電極の表面に拡げた多孔性フィルム上に拡げてある。試料は、多孔性フィルム上にて乾燥させた標識したバイオアフィニティ分子を溶解する。多孔性フィルムはテープでスライドする蓋の部分に取り付ける。それは試料を吸い上げて載せ反応している間は実用電極の上にあって洗浄および測定の前に取り除かれることになる。テープには実用電極に相当する孔が開いていて、多孔性フィルムは、その端の部分がテープと接着することになる。試料が試料用の孔に区割られると乾燥した標識抗体をつけた多孔性フィルムが溶解し、抗原抗体反応が抗体で被覆した実用電極表面で起こる。多孔性のフィルムは液体の均一な拡散媒体として働くことになる。また気泡の発生を防止し、且つ微量液体に見られる種々の問題を防止する。試験片は測定装置に移動して、バイオアフィニティ反応は、しんとうの有り無しを問わず達成できる。しんとうは、測定セルの本体についているしんとう用モーターまたは混合もさまざまの手法で行うことができる。望みの平衡に達したところで、試験片を測定セルに移し、同時に薄い多孔性のフィルムをかけた実用電極を洗浄・測定するようにスライドアップする。ECLシステムでは、対抗電極は、測定セルの組み込まれた部品として装着されている。測定セルの大きさは50-500
μLである。ヘテロなバイオアフィニティ/免疫アッセイには試験片の洗浄が必須であるが、ホモな系ではECL測定だけがあればよい。洗浄および測定溶液は同じ組成である。洗浄は、測定セルを数回の満欠を繰り返して行う。溶液の移送は、測定装置に装備されているポンプで行う。測定後セルをすすぐことが必要である。この場合も装置に装備したバルブで洗浄/測定液または蒸留水の導入の切り替えを行う。簡便携帯迅速測定ECL装置には装備した液体の移送システムはないが使い捨て試験片に溶液の容器がついている。
【００３１】
バイオアフィニティアッセイ用のECL測定装置では、薄い多孔性フィルム（例えば、ニトロセルロース）は、抗体で被覆あるいは抗体に浸漬してあるのでCIPFの原理で使用可能であるが、さきにのべたものの改良型のセルや試験片（フィルム反応装置）が必要である。なぜならば反応が多孔性フィルムで起こるので、試験片は大きくして開放蓋を多孔性フィルムの洗浄/測定のためのセルも大きくする必要がある。
【００３２】
先に記載したフィルム反応型CIPF装置は、より複雑な実験室装置に応用できる。実用電極は、セルについている。そしてミクロフローセルのようになっている。陰極は一面伝導性の金属で被覆したもの（例えばZnO
グラスまたはITOフィルム）またはスチールネットまたは細いワイヤーからなるネット構造になっている。多孔性フィルムは電極間に固定あるいは固定せずにせっちしてある。多孔性フィルムとそのカバーは対極電極に強固についていて、その実用電極の長さを越えるので、フローセルはフローチューブあるいはミクロリッターサイズの吸引容器を対極に備えている。またはCIPF装置全体またはセンサーは液体のプラスチックス製の流路の内部に試料と洗浄液流入口とをつないだ形になっている。装置の構成は陰極の対極を実用の陽極電極の回りに配置するようになっている。試料、標識、洗浄の溶液を拡げる最も好適な方法は、ヘテロ系では電極間の多孔性フィルムである。ホモの系では洗浄を伴わないのでより簡便に行える。これは、陽極ECLがバイオアフィニティー反応で標識体が電極の表面に濃縮されて励起が起こる原理によっている（いわゆる近接効果による）。
【００３３】
標識試薬は多孔性フィルムに乾燥させて取り付けられる。バイオアフィニティー標識体の乾燥には、多孔性フィルム材料はポリカーボネートやニトロセルロースに代用される100 &micro;m以下の厚さにできるものなら何でもよい。実用電極の品質保証には原子顕微鏡（AFM）を用いることが好ましい。実用電極は、抗体を物理的な吸着現象または共有結合で被覆する。またLangmuir-Blodget
(LB)&#8211;フィルムおよび Langmuir-Shaefer 法で抗体表面の厚さを決めている。
【００３４】
【特許文献４】US  6645776 B (Kulmala et al.)
【特許文献５】US  4280815 A, Technicon
【特許文献６】US  5324457A, Univ Texas Instruments
【特許文献７】US  6090545A, Meso Scale Technologies
【特許文献８】US  6251690 (Kulmala ら)
【非特許文献４】Hybritech Inc.、 Clinical Chemistry 31 (1985) 1427
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
次に発明の内容の例示を表や非限定例示や図によってあきらかにする。本発明は、以下の実施例で更に詳しく説明されるが、これらは本発明の範囲を規制するものではない。
【００３６】
実施例１：  熱酸化、抗体での被覆およびスライスによるシリコンウエファーからの絶縁フィルムで被覆した電極の調製
シリコンウエファーの酸化  ウエファー（シリコンウエファー：抵抗が0.01-0.023 Wcm、p++ホウ素でドープ、方向性＜１００＞、厚さは525+/-25 mm,  Okmetic Oyj社製造)  をRCAで通常の企業で行われている洗浄を行い、７７℃のオーブンに入れる。そのときの外気は、窒素９５％。温度をさらに８５０℃にまで上げる。また酸素分圧を上げて、窒素９０％、酸素１０％として所定の時間反応を保持した。ウェファーに純粋の窒素を３０分吹きつけて、温度を７００℃に下げてからこれをオーブンから取り出した。
以下に示すようなものが酸化時間を変化させることで得られた。
【００３７】
【表１】
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【００３８】
厚さはレーザー光の偏光変化をエリプソメーターで測定することで実施した。薄膜での方法では、屈折率は一定で1.465の値を酸化膜に用いた。表面保護テープを磨いていないシリコンウエファーに貼り付けた。スライスするウエファーをスライス基底に取り付け、コンピューター制御下にあるダイヤモンド製の刃でシリコンセンサーの規定の大きさにスライスした。
【００３９】
抗体の被覆は、例えばスライスしたがまだ保護テープがついているシリコンウエファーを磨いた面を下にしてプラスチックボールに入れた被覆用溶液（50 mM Trizma base, 0.05% NaN3, 0.9% NaCl, pH 7.8 with HCl, 抗-CRP 抗体
7.0 &micro;g/mL; Medix Biochemica Oy Ab 抗-hCRP クローン
6405, 1.0 mg/ml).に浮かべて行った。被覆量は、ウエファー当たり50  mL、または4.5 &micro;g 抗体/ cm2であった。被覆は、湿度の高いところで一夜かけて行った。それから新しい飽和溶液(50 mM Trizma base,
0.05% NaN3, 0.9% NaCl, 0.1 % BSA, 6% D-sorbitol, 1 mM CaCl2*H2O, pH 7.8 with
HCl)を入れたボールでさらに一夜被覆を行った。保存するには、スライスし、被覆した使用可能なシリコンセンサーを備えたプレートを３０℃2.5時間乾燥して、乾燥剤を入れた密閉型の容器に入れて冷蔵庫に入れておく。試験片を組み立てるには、シリコンスライスを貯蔵庫から取り出し、保護テープを除いて試験片に設置した(図２)。図９は、抗体被覆したCTPF装置の貯蔵安定性を示している。ECLシグナルへの酸化層の厚さによる影響が図１０に示してある。図１１にterbium-2,6-bis[N,N-bis(carboxymethyl)-aminomethyl]-4-bentsoylphenolキレート標識の溶液に結合しないで存在するときに対する濃度依存性を示してある。図１２には、各種の有用な標識用発光源のスペクトルが示してあり、全てのスペクトル(紫外―可視-近赤外)が陽極ECL装置および分析法に使えることが示されている。
【００４０】
実施例２
標準溶液で示されるヘテロCRP免疫アッセイオおよび図１と２と同様の試験片および測定セル
CRP免疫アッセイを実施例１により調製したシリコンチップで行った。図１と２に示すように試験片を構築した。スライドできる多孔性フィルムで被覆した試験片をセルで測定し、その装置は図３Aに示してある。免疫アッセイはECL検出装置を装備した多孔性フィルムを用いて行った。この他に、少し改変した試験片について、図３Bに記載した使い捨て測定セルを用いて実施できる。
【００４１】
乾燥した標識物質をつけた試験片をスライドできる部分に多孔性フィルムに装着した。外部の大きさが7.00 x 12.0 mm (厚さ 6-11 um, 1x105 &#8211; 6x108 holes/cm2, Whatman)であるポリカーボネート多孔性フィルムをシリコンチップ（4.00 x 9.00 mm）の開口部と同じ大きさ(3M
465, 補強材のない両面アクリルテープ)を有するテープ枠に挿入した。多孔性フィルムでの標識物質の乾燥は、次のように行った。標識抗体(Medix
Biochemica Oy Ab 抗-hCRP クローン 6404、2.22 mg/ml) を入れた溶液(50 mM Trizma base、0.05%
NaN3, 0.9% NaCl, 0.5 % BSA、0.05% bovine gammaglobulin, 0.01% Tween 20、1 mM  CaCl2・H2O,
pH 7.7 with HCl、さらにTb-2,6-bis  [N,N-bis-  (carboxy-methyl  )aminomethyl]-  4-bentsoylphenol  -chealate
labeled antibody 0.074 mg/mlを含んでいる。)を0.5 &micro;Lピペットで採り、多孔性フィルム(12.0 x 7.00 mm)の中心に直径2 mmの大きさに滴下して、乾燥した。乾燥は、一夜かけて室温で行った。
【００４２】
免疫アッセイ用の標準サンプル(CRP 濃度 0.3、1.0、3.0、 10.0、 30.0、 100.0、 300.0、 1000.0、 3000.0 ng/ml)を試験管にCRP
(Scripps, cat.no. C0124、 2.37 mg/ml CRP) を標準溶液(50 mM Trizma base, 0.05% NaN3,
0.9% NaCl, 0.5 % BSA, 1 mM CaCl2・H2O, pH 7.7 with HCl).で段階希釈して作成した。3.5-&micro;Lの試料を試験片の蓋(図１)の多孔性フィルムに、ピペットですいあげて水平に載せる、ここで試料は乾燥した標識物質を溶かした。試料は、測定装置に垂直に移送し、シリコンで被服した多孔性フィルムを5分間測定セルに付帯しているモーターでしんとうさせながら反応させた。反応後枠つきの多孔性フィルムをシリコンからスライドして動かし、試験片は洗浄/測定セルに移動した。セルは、洗浄/測定溶液(50
mM Na2B4O7, 0.1 % NaN3, 0.003% Tween 20, pH 7.9
with H2SO4)を4回投入し、3回取り除きを行った。最後の投入後ECL(f = 10 Hz, Q = 20 &micro;As, pulsing time  250 &micro;s, 60 pulses, U = 25 V)を特許文献８、US 6251690に記載の方法で発光装置で測定した。測定セルから試料を吸引して除去し、シリコン片を取り除いた。セルに次のシリコン試料を入れる前に３回洗浄を繰り返した。最後の充填は蒸留水で行った。セルの洗浄法は図４に示した。CRP免疫アッセイの標準線は図１３に示してある。
【００４３】
実施例３
シリコン陽極のまわりにつけた陰極から構成される測定セルを用いたTb−キレートの測定
図５Aに示してある実験法に準じて、シリコン電極をテープで接すの底に貼り付け、表面まで紫外線で高分子化する接着材(Loctite
322 or EPO-TEK OG 142)で満たした。高分子化後テープを除去した。測定セルを実施例２に示した洗浄/測定溶液で満たした。ここに用いたTbキレートの濃度を10-3
mol/lとした。ECLを測定(f = 20 Hz, I = 316 mM, pulsing time 500 &micro;s, U = 67 V)し、デジタルカメラで写真を撮った。写真を撮るために１０回のパルスを集めた。図５Bに電極全体から発光が起こっていることが示されている。
【００４４】
実施例４  
図3の電極単位をプラスチックス製の底部に接着して両方の電極が容易に接触できるようにする。試験片は図6A,６Bに示してある。図7に示してあるように実施例２と同じように同じ原理で試験片を構築できる。従って一つの電極単位を試験片に加えることで多くのアッセイを同時並行的に実施できる。アッセイ部位は陰極または陽極として働くことになる。このような試験片を図８に示してある。
【００４５】
実施例５  血清試料を用いたヘテロCRP免疫アッセイ
既知の血清試料（基準実験室で比濁法で測定し、CRP濃度が133000, 37000, 13000, 7000, 234 ng/mLであるものを希釈してECL免疫アッセイ法で測定した。試料は、希釈液(50
mM Trizma base, 0.05% NaN3, 0.9% NaCl, 0.5 % BSA, 1 mM CaCl2*H2O, pH 7.7
adjusted with HCl)で100倍に希釈して、実施例2のようにして測定した。結果の曲線は図14の通りである。
【００４６】
実施例６  標準溶液によるホモ系CRP免疫アッセイ
ホモ系のCRP免疫アッセイを実施例2に示すように標準溶液を用い、ECL検出法に基づいたCIPF装置で実施した。ただし、以下の改変を加えた。即ち反応後試験片を測定セルに押し込み、洗浄は行わずに測定溶液を直接にポンプで満たして実施した。ホモ系免疫アッセイの結果は、図１５に示してある。
【００４７】
実施例７
標準試料を用いたヘテロ系TSH免疫アッセイ
ヘテロ系ｈTSH免疫アッセイは、CRPを用いて行った実施例２と原理的に同様にして行った。シリコンチップをつけた試験片を実施例1と同様にして準備した。シリコンチップの抗体被覆溶液の組成は、0.1 M MES, 0.03
M H3BO3, 0.5 mM K-citrate, 0.025% glutaraldehyde, 0.05% 牛ガンマグロブリンに6.87 mg/mL の抗体 (MIT0406 MOAB 抗hTSH Medix Biotech Inc. USA)を含むものとその飽和溶液、50 mM Trizma base, 0.1% BSA, 0.1
% NaN3, 0.1% Tween 20, pH 7.5 adjusted with H2SO4で構成されている。また、標識抗体 (Monoclonal 抗-hTSH, clone 5404, 5.5 mg/mL, Medix
Biochemica Oy Ab) を
Tb-2,6-bis[N,N-  bis(carboksymethyl)aminomethyl]-4-bentsoylphenol
キレートで標識したものを先に記載した試験片の多孔性フィルムの上に乾燥させたものである。
【００４８】
標準試料(TSHの濃度を0.1, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0, and
100.0 mIU/Lとした。
)は、TSH標準液(Wallac, DELFIA hTSH kit, 324
mIU/mL TSH)を希釈液 (50 mM Trizma base, 0.05% NaN3, 0.9% NaCl, 0.5 %
BSA, 1 mM CaCl2*H2O, pH 7.7 adjusted with HCl).で希釈して試験管に準備した。洗浄および測定は実施例2に示すように行ったが、反応はしんとうしながら15分間おこなった。ヘテロ系hＴＳＨ免疫アッセイの標準曲線は図１６に示す通りである。
【００４９】
実施例８
血清試料を用いたヘテロ系のhTSH免疫アッセイ
ヘテロ系ｈTSH免疫アッセイは、CRPを用いて行った実施例２と原理的に同様にして行った。シリコンチップをつけた試験片を実施例1と同様にして準備した。シリコンチップの抗体被覆溶液の組成は、0.1 M MES, 0.03 M H3BO3,
0.5 mM K-citrate, 0.025% glutaraldehyde, 0.05% 牛ガンマグロブリンに6.87 mg/mL の抗体 (MIT0406 MOAB 抗hTSH Medix Biotech Inc. USA)を含むものとその飽和溶液、50 mM Trizma base, 0.1% BSA,
0.1 % NaN3, 0.1% Tween 20, pH 7.5 adjusted with H2SO4で構成されている。また、標識抗体 (Monoclonal 抗-hTSH, clone 5404, 5.5 mg/mL, Medix
Biochemica Oy Ab) を Tb-2,6-bis[N,N-  bis  (carboksymethyl)  aminomethyl]-  4-bentsoylphenol キレートで標識したものを先に記載した試験片の多孔性フィルムの上に乾燥させたものである。
【００５０】
血清標準試料(TSHの濃度を0.1, 1.0, 3.0, 10.0, 30.0, and
100.0 mIU/Lとした。)は、TSH標準液(Scripps Laboratories, Inc., San Diego,
USA)を血清で希釈した。血清TSHの濃度は、0.45 mU/Lであった。洗浄および測定は実施例2に示すように行ったが、反応はしんとうしながら15分間おこなった。hＴＳＨ免疫アッセイの標準曲線は図１７に示す通りである。
【００５１】
実施例９
全血を用いたヘテロ系TSH
ヘテロ系ｈTSH免疫アッセイは、実施例７と原理的に同様にして行った。全血標準液(TSH 濃度 1.0, 3.0, 10.0, and 30.0 mIU/L)は、TSH標準液(Scripps
Laboratories, Inc., San Diego, USA )をヘパリン処理した全血で希釈して作成した。全血中のTSH濃度は、0.5 mU/Lであった。洗浄および測定は実施例５に示すように行った。ヘテロ系全血hＴＳＨ免疫アッセイの標準曲線は図１８に示す通りである。
【００５２】
実施例１０
シリコン陽極を用いた抗体で被覆したニトロセルロース多孔性フィルムでのCRP免疫アッセイ法
ニトロセルロース多孔性フィルム(7x4mm, Schleicher & Schuell, 12 &micro;m) を抗-CRP 抗体
(10&micro;g/mL)で反応緩衝液(50 mM Tris-HCl, pH 7.8, 0.05%
NaN3, 0.9% NaCl)中で一夜室温で反応させて被覆した。その後ニトロセルロースを飽和液で洗浄し、最終的に多孔性フィルムは飽和溶液に一夜室温で放置した。飽和後、多孔性フィルムをろ紙の上で乾燥した。
【００５３】
抗体で被覆した多孔性フィルムは装置(図19)に変えたフローセルに接着させ、標準CRP50
&micro;Lをその上に載せた。5分間反応させ多孔性フィルムを1 mL 洗浄/測定溶液 (50 mM
ホウ酸緩衝液, pH 7.9, 0.1% NaN3, 0.003 % Tween 20)でセル内で洗浄し、Tb キレートで標識した抗体50
&micro;Lをその上に加えた。さらに5分か反応後多孔性フィルムを1 mLの洗浄/測定溶液で洗浄した。洗浄後ECLを500
&micro;Lの洗浄/測定溶液中で条件 (f = 5 Hz, Q = 20 &micro;As, pulsing time 250 &micro;s, 500 pulses, U=34,8 V).のもとで測定した。
典型的な標準ky北線は図２０に示してある。
【００５４】
実施例１１
Langmuir-Blodget
(LB) フィルムで被覆した電極とよう面の分子精査
実験は、通常のLangmuir 凹み(trough)でおこなった。表面張力は、Wilhelmyプレート法で精度0.2mN/m で測定した。蛋白質フィルムの調製は、固体フィルム202,151、Nagagawa
T. (1991)および固体フィルム180,61（Owaku, K.,（１９８９）に従って行った。調製したフィルムをLangmuir-Shaefer法に従って電極板に移した。被覆に用いた蛋白質はB型肝炎の表面抗原に対するマウスのモノクローナル抗体である。LBフィルムは、水/空気の境界をTris-HCl buffer (10mM, pH 8.2) とアルキル化ポリエチレンイミン(Aldrich, Germany)を用いてあく精した。
【００５５】
LBで被覆した原子間力トンネルイメージをNanoscope II FM instrument
(Digital Instruments)を用いて作成した。装置は一定の電流（トンネリング）または一定の偏差（原子間力）をもって機能した。画像は、少なくとも30分は安定であり、2次元フーリエ解析を行えた。25x15 nmの大きさの円形のパターンが観測され、これは抗体と同定された。表面密度は、1x1015 molecules /m-2と推定された。これらの比較結果は図２１に示してある。
【非特許文献５】Nagagawa T. (1991)
【非特許文献６】Owaku, K.,（１９８９）
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】本発明の成果である伝導性及び絶縁性多孔質フィルム装置（CIPF）の模式図  電極の構造は、伝導体（１）、絶縁体(2)及び多孔性フィルム（３）を含んでいる。この構造体をCIPFと呼ぶ。
【００５７】
【図２】CIPF原理に基づく陽極ECL−読取装置の試験片の作製法の例示。絶縁フィルムで覆われたシリコン(Si)チップを通して熱電子が注入される。図は、またスライドできるsledgeに装着した多孔性フィルムを示している。スライドできる覆い（蓋）と試験片の構造は、低い位置でSiチップ表面に多孔性フィルムを装着できるように構成されている。覆い(蓋)を上方向にスライドすると多孔性フィルム陽極の表面を覆い、上部にあるアーム部分に位置づけられる。試験片の例(図２)では、試験片は、可動性の覆い(蓋)をもっており、これがアーム（３）に沿って動くと、これがせり上がり（９）、アームの一番端に固定される。分析すべき試料は開口部（２）を通して加える。多孔性フィルム（５）は、開口部（２）の下に置かれ、フィルムはスパイク（８）をつけたSi電極（６）に対向して設置する。シリコンの下には、金属製の伝導体(7)を置き、そこには外部電源への接続部位（４）がついている。
【００５８】
【図３】発光読み取りセル構造。図３A：セル(1)内にある試験片（４）は、測定部位に置かれている。振とう用モーター（３）が試験片を電気的に励起できる接続部（２）を含むセルの上部に接続させてある。洗浄は、接続部（２）を使って行う。洗浄液・測定駅はスチール製の接続管（６）を通して測定セルに導入される。この接続管は、陰極となる。溶液の吸入はもう一つのパイプ（７）を通して行われる。試験片の電気的な接触部（４）は、試験片お上部に位置している。
【００５９】
【図４】測定セルの洗浄システムの組立て。  ヘリスタポンプ（１）が洗浄液（５）をチューブ(2)を通してセル（４）に移送する。同じペルスタポンプがセルの上部から他の部位よりも効率的に他のチューブ（３）を使って行う。バルブ（９）は、セル中上部からか、下部からかの選別を行う。細い管のバルブ（１０）を閉じると、セルはその下部からない溶液を排出できる。必要に応じて、バルブ（３）を調節してセルの洗浄ができる（６）。
【００６０】
【図５】試験片に付設した使い捨てのセル。図５A：シリコン電極が伝道部（３）に電気絶縁体（２）を用いて付設されている。図５B: 発光を電極全面からの取り出し方を示してある。
【００６１】
【図６】試験片。  図６Aは、上部からの試験片の見取図である。図６Bは、試験片の下部からの見取図である。シリコン電極（１）は、試験片に電気的絶縁体（２）を用いて付設されている。陽極(1)及び陰極（２）とは試験片の背面から直接電気的に接触している。
【００６２】
【図７】試験片上では全ての試薬が乾燥状態で準備されており、分析の開始、終了を制御できるようになっている。図７Aには試験片が使用可能な状態のものが示されている。枠（１）の下部には薄い多孔性のフィルム（２）が全ての試薬が乾燥状態準備されている。多孔性のフィルムをシリコンの表面にかぶせるが、電極とは接触していない。可塑性物質（３）の構築は枠のしたに挿入してあたかもバネのように作動させる。サンプルが多孔性のフィルム（２）上に加えられるとサンプルは乾燥してある試薬を溶解する。シリコン電極の表面で起こる反応は、枠を下に押し付けることで開始される。
【００６３】
【図８】多重項目試験片  数個の反応場を試験片に設けることができる。一部をそれぞれ陽性及び陰性対照とすることもできる。
【００６４】
【図９】CIPF装置と発光読取器で異種由来のhCRP免疫アッセイを1年間行ったときのシリコンチップの安定性。CRPの濃度は、それぞれ(a)0, (b) 10, (c) 30, (d) 100 ng/mlであった。
【００６５】
【図１０】陽極にECLを用い、シリコンチップの酸化相の厚さの影響。(a)10-7 M Tb(III)を2,6-bis{N,N-bis(carboxymethyl)aminoethyl}-4-benzoylと錯体をつくったもの、(b)測定駅(対照)
【００６６】
【図１１】純粋のterbium2,6-bis{N,N-bis(carboxymethyl)  aminoethyl}-4-benzoyl錯体を標識発光体としてECL読取器と試験片(CIPF)を使った測定標準曲線。測定用セルは測定緩衝液と標識発光体で満たした。
【００６７】
【図１２】抗体の標識（(ANS 4-amino-1-naphthalenesulfonate, FMOC-OH = hydrolyzed9-fluorenylimethyl chloroformate, Tb(III)-L1 =Tb(III)-chelated by2,6-bis[N,N-bis(karboxymethyl)aminomethyl]  -4-bentzoylphenol, Ru(bpy)32+ =rutenium(II) tris-(2,2’-bipyridine chelate,Yb(III)-L1 = Yb(III)-chelated 2,6-bis[N,N-bis(karboxymethy)aminomethyl]-4-bentsoylphenol).に好適な各種発光体の構造とECLスペクトル。紫外部、可視部及ぼ近赤外部の全てのスペクトル域を利用できる。測定はCIPF側の定器と発光読取器でおこなった。
【００６８】
【図１３】異種hCRP免疫アッセイの標準測定曲線（実施例2参照）。
【００６９】
【図１４】血清サンプルを用いた 異種hCRP免疫アッセイ(実施例３参照)
【００７０】
【図１５】標準サンプルを用いた異種hCRP免疫アッセイ(実施例４参照)
【００７１】
【図１６】標準サンプルを用いた異種hCRP免疫アッセイの測定標準曲線(実施例５参照)
【００７２】
【図１７】血清サンプルを用いた 異種hCRP免疫アッセイの測定標準曲線。hTSHの標準品を血清中で作成した。(実施例６参照)
【００７３】
【図１８】全血サンプルを用いた 異種hCRP免疫アッセイの測定照準曲線。hTSHの標準品をヘパリン処理した全血中で作成した。(実施例７参照)。測定は、CIPF装置と発光測定器（図９、実施例２）を用いて行った。
【００７４】
【図１９】図１９AはCIPF装置のフローセル型のものを示す。ここでは、アフィニティ反応が多孔性フィルムまたは陽極上で行われる。図１９Bにはその構成が分かるように側面（７）の断面が示されている。多孔性フィルム（４）は、液体の移送体として働いている。さらにさまざまの試薬(例えば標識した抗体)をその上で乾燥できる。ECLの測定は、多孔性フィルム（４）を通して直接測定できる。サンプルは、多孔性フィルム上に直接載せることで免疫反応を開始できる。液体はセル（６）を通して十分にくわえられる。そこでは陰極（５）とシリコン電極（３）の間に十分な電解接触が行われる。洗浄は入り口（１）と出口（２）を通して行われ、液体は、多孔性フィルムに添って移動する。サンプル添加用の穴のある蓋をチェンバー（６）の上に置くこともできる。
【図２０】図２０A  この装置を用いて測定した異種ｈCRP免疫反応の標準測定曲線を図１５に示してある。（実施例２参照）
【図２１】シリコンチップ抗体を物理的に吸着させて被覆するAFMの質的制御イメージ。
【図２】
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【図２２】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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