(57)【要約】  本発明は挿入ウエルを受け入れるように適合した開口を有する受け容器を具備する透過性試験機を提供する。容器とウエルの両方は、いずれも透過性アッセイのドナー及び受容体室として使用される。容器又はウエルは多孔性支持体を具備し、それはたとえば、生物的又は生体模倣的材料からなり、それを通過して分子が透過するに適合される本発明の透過性試験機器は、Ｃａｃｏ−２型細胞アッセイ又はＰＡＭＰＡのために使用され得る。一つの態様では、容器に配置された撹拌部材が容器撹拌により支持体に隣接する水性境界層厚みを減少させる。境界層厚みは本発明の装置により約１５μｍ未満にまで減少して支持体を透過する分子は体外吸収及び輸送状態に非常に近いで透過することとなる。本発明はまたこのような装置を使用する境界層厚みを変える方法を提供する。【選択図】図１
2008501950.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
境界層厚みを減少させるための透過性測定器であって、前記機器は以下からなる：
受け容器であって、前記受け容器は開口を具備し；
前記受け容器に部分的に配置された挿入ウエルであって、前記挿入ウエルは下部部分を有し、ここで前記挿入ウエルの下部部分は多孔性支持体を有し；および
撹拌部材であって、ここで前記撹拌部材は受け容器内に配置されているものである。
【請求項２】
多孔性支持体が生物材料からなる請求項１の装置。
【請求項３】
多孔性支持体が、生体模倣材料からなる請求項１の装置。
【請求項４】
多孔性支持体が、それを透過する分子試料に適合したものである請求項１の装置。
【請求項５】
分子試料は溶液から透過し、前記溶液は受け容器又は挿入ウエル内に配置される請求項４の装置。
【請求項６】
多孔性支持体に隣接する溶液部分が境界層を構成する請求項４の装置。
【請求項７】
前記境界層が一つの厚みを有する請求項６の装置。
【請求項８】
受け容器内に装着された撹拌部材が溶液を撹拌する請求項６の装置。
【請求項９】
溶液の撹拌により境界層の厚みが変化する請求項８の装置。
【請求項１０】
溶液の撹拌を制御すると適切に境界層の厚みが変化する請求項９の装置。
【請求項１１】
境界層の厚みは約５００μｍ未満である請求項８の装置。
【請求項１２】
境界層の厚みは約１００μｍ未満である請求項１１の装置。
【請求項１３】
境界層の厚みは約５０μｍ未満である請求項１２の装置。
【請求項１４】
前記装置が受け容器に対して位置する磁石をさらに具備し、前記磁石は撹拌部材を駆動するものである請求項１の装置。
【請求項１５】
前記磁石はモーターに接続されており、前記モーターは磁石を回転させるようになっている請求項１４の装置。
【請求項１６】
モーターは磁石の回転を制御する請求項１５の装置。
【請求項１７】
前記装置が受け容器に対して位置する振動体を更に具備し、振動体は撹拌部材を駆動するものである請求項１の装置。
【請求項１８】
前記装置が第２の撹拌部材を更に具備し、前記第２の撹拌部材は挿入ウエル内に配置される請求項１の装置。
【請求項１９】
装置が、挿入ウエル内へ伸びる締結材をさらに具備し、前記締結材は第２の撹拌部材を保持するものである請求項１８の装置。
【請求項２０】
装置が挿入ウエル内に配置された保持部材を更に具備して、第２の撹拌部材が多孔性支持体と接触するのを防止している請求項１８の装置。
【請求項２１】
装置がストレイナーを更に具備し、前記ストレイナーは挿入ウエルの内部と第２の撹拌部材間に配置される請求項１８の装置。
【請求項２２】
前記第２の撹拌部材は支持体構造に可変に接続し、前記支持体構造体は挿入ウエルに対して固定される請求項１８の装置。
【請求項２３】
第２の撹拌部材が物質分子を具備する請求項１８の装置。
【請求項２４】
撹拌部材が物質分子を具備する請求項１の装置。
【請求項２５】
前記装置が更にストレイナーを具備し、該ストレイナーは受け容器内側と撹拌部材の間に配設される請求項１の装置。
【請求項２６】
前記装置は、更に受け容器内に配設の材料を具備する請求項１の装置。
【請求項２７】
前記材料が生体材料、生体模倣材料又はこれらの組み合わせである請求項２６の装置。
【請求項２８】
前記装置がさらに、受け容器内に伸びる締結材を具備し、該締結材は撹拌部材を保持するように適合される請求項１の装置。
【請求項２９】
締結材は撹拌部材が材料と接触するのを防止する請求項２８の装置。
【請求項３０】
前記装置が更に、撹拌部材が材料に接触するのを防止するために受け容器に配設される保持部材を具備する請求項１の装置。
【請求項３１】
前記装置が更に、受容体板を具備し、該受容体板は複数の受け容器、又は挿入ウエルを具備する請求項１の装置。
【請求項３２】
前記装置が更に、ドナー板を具備し、該ドナー板は複数の受け容器又は挿入ウエルを有する請求項１の装置。
【請求項３３】
境界層厚みを減少させるための透過測定機器であって、該機器は、以下を具備する：
上部部分を有する受け容器であって、受け容器の該上部部分は多孔板を具備し、ここで受け容器は開口を備え；
受け容器の開口内に部分的に配設される挿入ウエル；および
撹拌部材であって、ここで、該撹拌部材は受け容器内に配設される。
【請求項３４】
多孔板が生体材料からなる請求項３３の機器。
【請求項３５】
多孔板が生体模倣材料からなる請求項３３の機器。
【請求項３６】
多孔板が、物質分子が透過するように適合される請求項３３の機器。
【請求項３７】
物質分子は溶液から透過し、溶液は受け容器又は挿入ウエルに配置される請求項３６の機器。
【請求項３８】
前記機器はさらに第２の撹拌部材を具備し、該第２の撹拌部材は挿入ウエル内に配設される請求項３３の機器。
【請求項３９】
溶液中の物質分子の濃度をモニターするための透過機器であって、該機器は以下を具備する：
受け容器であって、該受け容器は開口を有し；
溶液であって、該溶液は受け容器内に配設され；
物質分子からなる撹拌部材であって、該撹拌部材は、受け容器内に配設の溶液へ前記分子が溶解するのに適合するものであり；および
受け容器の開口内に配設のプローブであって、該プローブは溶液内の物質分子の濃度をモニターすることが可能なもの。
【請求項４０】
境界層厚みを減少させる方法であって、該方法は以下の工程を具備する：
以下の構成の透過測定機器を用意し；
開口を有する受け容器、
受け容器の開港内に部分的に配設の挿入ウエル、
多孔板であって、該多孔板は挿入ウエルの下部部分または受け容器の上部分内に配設され；および
受け容器内に配設の撹拌部材、
多孔板を通して物質分子を透過させ、そして物質分子は受け容器又は挿入ウエル内に配設の溶液から透過するものであって、ここで多孔板に隣接する溶液部分は京界層を構成するものであり；
溶液撹拌のために撹拌部材を作動させ；そして
溶液撹拌により境界層を変化させる。
【請求項４１】
多孔板は生体材料からなる請求項４０の方法。
【請求項４２】
多孔板は生体模倣材料からなる制球項４０の方法。
【請求項４３】
溶液の撹拌が調整可能に境界層厚みを変化させる制球項４０、４１又は４２の方法。
【請求項４４】
受け容器に対して位置づけられる磁石が撹拌部材を動かす請求項４３の方法。
【請求項４５】
受け容器に対して位置づけられる振動体が撹拌部材を動かす請求項４３の方法。
【請求項４６】
境界層厚みが約５００μｍ未満である請求項４０、４１又は４２の方法。
【請求項４７】
境界層厚みが約１００μｍ未満である請求項４６の方法。
【請求項４８】
境界層厚みが約５０μｍ未満である請求項４７の方法。
【請求項４９】
前記透過測定機器が更に、受容体板を具備し、該受容体板は複数の受け容器又は挿入ウエルを具備する請求項４０の方法。
【請求項５０】
前記透過測定機器は、更にドナー板を具備し、該ドナー板は複数の受け容器又は挿入ウエルを具備する請求項４０の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の対照
本出願は２００４年６月１日出願のアメリカ合衆国仮特許出願第６０／５７５，８８３号、発明の名称  水性境界層厚みを減少させる縮小化装置と方法に係る優先権を主張するものであり、その内容はここに、参考として組み入れられる。
【０００２】
発明の背景
一般には、脳血液関門（ＢＢＢ）や胃腸系（ＧＩＴ）を経由する薬品の吸収や輸送は体外透過分析で研究される。これらの分析試験は、典型的には微孔性材料や構造体のような多孔性支持体により仕切られた溶液充填のドナー及び受容体室が特徴の装置により行われる。関心のある医薬分子の進入は、ドナー室から受容体室へ装置の多孔性支持体を通って透過する。たとえば、ＧＩＴの薬品吸収と輸送を模式化するには、生きた細胞の単層を多孔性支持体上に成長させて、脂質膜透過障壁を形成する。これらの単層にはしばしばＣａｃｏ−２型細胞を含む。かわりに、脂質膜透過障壁が、並列人造膜透過分析（ＰＡＭＰＡ）と称される試験のためである、多孔性支持体上またはその中に生体模倣材料を沈積することにより形成されることができる。
【０００３】
装置のドナーと受容体室は、種々の形式のミクロ滴定板（microtitre  plate）に組み込まれて同時に種々の分析を行う。室の欠点は、その容積が小さいので多孔性支持体に接し、例えば、生物または生体模擬材料からなる澱んだ溶液の厚い水性境界層となることである。支持体の上方または下方面に沿う厚い境界層の存在は透過の測定に有意なエラーを生じさせる。たとえば、分子の進入が多孔性支持体を通過することになるのを物理的に妨げ、それは生物的または生体模擬的材料がドナーから受容体室へ透過するのを妨げる透過障壁を形成するのである。
【０００４】
通常のＰＡＭＰＡでは、多孔性支持体の上部と下部面に隣接する水性境界層の合計の厚みは、約１，５００〜４，０００ミクロン（μｍ）である。たとえば、このような分析での透過障壁を通過する薬品の測定は境界層による抵抗で相当程度偏ることとなる。実際、医薬品研究には、所定の受容体またはドナー室に特徴の境界層の値を単に表示するのみの透過性の値を報告するような脂質化合物が多い。
【０００５】
生体内ＧＩＴでは境界層は通常約３０〜１００μｍの厚みと考えられる。さらに、ＢＢＢ境界層は１μｍ未満と推測される。標準的なCaco-2型細胞分析またはＰＡＭＰＡでは、多孔性支持体に接する水性境界層の合計の厚みは通常、１，５００μｍを超える厚みであり、層は脂質化合物の透過性を測定する限定要因となっている。このような分析では、溶液を撹拌して水性境界層を消滅させる方法が確固として確立されている。ドナーと受容体室での溶液撹拌を行う方法は、転回または線状シェーカーのような振動体上にドナーまたは受容体室を載置することである。水性境界層厚みを減少させる他の方法には、化学シンク（sink）を使用するか、多孔質支持体を通るｐＨの勾配をつけ、該支持体は、たとえば生物または生体模擬材料からなる。
【０００６】
これらの方法でも依然として水性境界層厚みを３００〜５００μｍ以下に減少させることができないものであって、この数値は生物学的条件、例えば医薬品吸収や輸送のための条件を密接に模擬化するのに必要な条件である。さらに、このような方法は、ミクロ滴定板に組み込まれたドナー及び受容体室にはあまり魅力がないものとすらなっている。たとえば、標準的な９６室数のミクロ滴定板はその端に沿う室は板を横切って高度に異方性を示し、中央に近い板よりも効率的に撹拌されるようになっている。この種の異方性は３８４または１５３６室数のようなより高密度な板においてより顕著である。
【０００７】
高密度なミクロ滴定板を使用して多い数の透過分析試験を同時に行うという観点からは、水性境界層厚みを縮小するのは、ドナーと受容体室が小さくなると境界層厚みを減少させるだけでもより激しい撹拌が必要となるので、より困難さが増すのである。このような欠点と上記した欠点とは、透過分析試験で水性境界層厚みを減少させる都合の良い方法の必要性を示す。その方法は、医薬の吸収は輸送の体外研究のための標準的なＣａｃｏ―２型細胞分析に容易に変形して、適用可能なものであるべきである。
【０００８】
発明の要約
本発明は開口を有する受け容器を具備する透過性測定機器を提供する。容器の開口は、挿入ウエル（insert  well）を受け入れるように適合される。受け容器と挿入ウエルの両方は、いずれも透過性試験のためのドナーと受容体室を具備する。加えて、挿入ウエルは多孔性支持体、それは、ウエルの下方でたとえば、配置されるか、設置されるか又は形成される。かわりに、支持体は、例えば、受け容器の上方に、配置されるか、設置されるか又は形成される。多孔性支持体は、例えば、生物的、生体模擬の、又はその両方の材料からなる。多孔性支持体は、分子が進入し、ドナー室から受容体室へ透過するように適合される。たとえば、ドナー室の溶液中の分子は、溶液から、支持体を通過して、受容体室の溶液へと透過する。
【０００９】
一つの態様では、撹拌部材が受け容器内に配置される。撹拌部材は例えば、受け容器内、挿入ウエル又はその組み合わせ内の溶液を撹拌するように作用する。溶液撹拌は多孔性支持対面の上方、下方又はその両方に隣接する境界層の厚みを減少させ得る。一般的には、挿入ウエル又は受け容器の溶液を撹拌すると、たとえば、多孔性支持体の上方又は下方の面のそれぞれに隣接する境界層の厚みを減少させる。たとえば、境界層は溶液の一部を含み、それは実質的に澱んでいる。境界層の厚みは、例えば、減少できて、そうして分子は支持体を透過し、それは、たとえば、体外吸収及び輸送に非常に近い条件下における生物又は生体模倣材料からなる。
【００１０】
本発明の装置はCaco−２型細胞のアッセイ（assay）やＰＡＭＰＡに良く適したものである。Caco−２型細胞試験には、細胞が、例えば支持体上で増殖される。ＰＡＭＰＡには、種々の生体模倣材料、たとえば支持体のその細孔中に配置されるか又は組み込まれる。本発明の装置の多孔性支持体は、支持体上のそのポア中に配置されるか又は増殖される生物又は生体模倣材料を具備することができる。本発明の装置を使用して達成される水性境界層厚みは、たとえば、１５μｍほどの薄さである。ドナー又は受容体室に配置された撹拌部材による撹拌の程度は、また境界層厚みを変えられるように調整され得る。境界層厚みを変えることにより、本発明の装置は体外吸収及び輸送、例えばＧＩＴを模擬化できる。たとえば、本発明は、撹拌部材のための調整装置又は器械を意図し、それは検量して例えば、約５００〜１５μｍの範囲の境界層厚みとするようなものである。
【００１１】
本発明の装置のための撹拌部材は、適宜の材料で構成することができる。部材はインサートであり得て、それは試験には干渉しないようなものである。たとえば、撹拌部材は磁気化されるか又は磁気化される被覆金属からなり、その被覆は不活性ポリマーからなる。部材はまたステンレス鋼のような不活性金属でもあり得る。磁気化された又は磁気化され得る部材は例えば磁石で動かされる。代わりに、部材はガラス又はプラスチック・ビーズであることもでき、それは転回又は線状プレートシェーカーのような振動体を使用して動かされる。
【００１２】
他の態様では、第２の撹拌部材が挿入ウエルに配置される。たとえば、第２の撹拌部材は、不活性で、磁石又は振動体で動かされる。本発明の装置は、また、溶液撹拌のために磁石と振動体の両方を使用することができる。一つの態様では、撹拌部材はまた分子でもある。本発明はまた受け容器、挿入ウエル又はこれらの組み合わせにおいて複数の撹拌部材の使用を意図する。
【００１３】
撹拌部材は、受け容器や挿入ウエルの適当な場所に保持され、生物的又は生体模倣材料と接触しないようになっている。部材は又は適宜に保管されて、多孔性支持体とは接触しないようになっている。本発明の装置のための撹拌部材を保持するために適宜の手段が使用される。たとえば、ウエルや容器内の回りに配置されるコンスツリクションまたはその中に位置するストレーナーにより保持され得る。かわりに、たとえばウエルや容器と連動する不活性格子などのような保持部材又は構造体が使用されて撹拌部材を適宜の場所に保持する。
【００１４】
一つの態様では、ドナーと受容体板は複数のいずれかの挿入ウエルまたは受け容器を具備する。好ましくは、このようなプレートは、標準仕様のミクロ滴定プレートである。たとえば、このようなプレートは、６、１２、２４、４８、９６、３８４または１５３６ウエル又は容器を含む。これらのプレートは、典型的には不活性で非磁化材料、たとえば、ポリカーボネートや他の熱可塑性樹脂などからなる。挿入ウエルや容器はまたこのような不活性で非磁化材料で構成され得る。本発明のドナー又は受容体プレートは、また当業者に理解されるようにロボット化装置で容易に機械操作可能なように適合され得る。本発明はまた、複数の積み重ね可能なドナー及び受容体プレートまたは複数の受け容器と挿入ウエルで、また積み重ね可能なものを使用する分析試験を意図する。
【００１５】
本発明の他の態様は、多孔性支持体の上方又は下方面に配置される生物又は生体模倣材料を含む。たとえば、同じ型の細胞が多孔性支持体の上方又は下方面で増殖され得る。同様に、異なる型の細胞が、それぞれ多孔性支持体の上方又は下方面で増殖され得る。このような生物材料の配列はしばしば、共存培養試験と称されるものである。共存培養試験はまた、多孔性支持体上に配置又は増殖した生物材料の第１の型と挿入ウエルまたは受け容器に配置されるか又は増殖する生物材料の第２の型を有することにより行われ得る。共存培養試験では、これらの材料が撹拌部材と接触しないようにする手段を講ずることが特に重要であり得るのであって、もしも接触すると材料を本質的に損傷することがある。
【００１６】
他の態様では、受け容器内にプローブが配置される。プローブは種々の原理に基づくものであり、これらは、例えば、限定されないが、熱感応、イオン選択性電極技術、分光学的方法又はこれらの組み合わせのようなものである。好ましくは、プローブは撹拌部材が物質分子（molecular  entity）からなるときに使用される。たとえば、物質分子が生物又は生体模倣材料で被覆され得て、部材が動くと物質分子はそれを通って受け容器内へ透過することとなる。透過性はプローブでモニターされ得る。
【００１７】
本発明はまた、境界層厚みを減少する方法を提供する。本方法は、本発明の一つ又はそれ以上の透過性試験機器を提供することからなる。本装置の複数でもあり得る撹拌部材は、次いで作動して好ましくは物質分子を含む溶液を撹拌する。溶液の撹拌は多孔性支持体の上方、下方の両方の面に隣接する境界層の厚みを減少することができるものであり、それはその上又はその中に配置された生物又は生体模倣材料を含み得る。例えば、実質的に滞留して多孔性支持体に隣接する溶液の一部を減少させることにより、境界層厚みは減少される。
【００１８】
境界層厚みを減少させると、物質分子は支持体を通過して透過することができるようになり、ここで、それは生物又は生体模倣材料からなり、その条件は生体内吸収及び輸送状態に非常に近似する条件となる。本方法はまた、複数もあり得る撹拌部材による撹拌の程度を調整し、上方、下方又はその両方の多孔性支持体に隣接する境界層厚みを適切に変えることができる。本発明の方法はまた上述のドナー又は受容体プレートに組み込まれた複数の容器又はウエルで遂行することができる。
【００１９】
図面の説明
本発明の他の特徴と利点は次の添付の図面と共に発明の詳細な説明から明らかである：
図１は、受け容器に配置された撹拌部材を有する本発明の装置の部分説明図である；
図２は、挿入ウエルと受け容器の両方に配置された撹拌部材を有する本発明の装置の部分説明図である；
図３は、挿入ウエルと受け容器の両方に配置又は増殖した培養細胞を有する本発明の装置の部分説明図である；
図４は、一つまたはそれ以上の撹拌部材を保持するための挿入ウエルと受け容器の両方の内部に延びる狭窄部を有する本発明の装置の部分説明図である；
図５は、一つまたはそれ以上の撹拌部材を保持するための挿入ウエルと受け容器の両方に配置される保持部材を有する本発明の装置の部分説明図である；
図６は、一つまたはそれ以上の撹拌部材を保持するための挿入ウエルと受け容器の両方に配置される保持部材を有する本発明の装置の部分説明図である；
図７は、多孔構造体の上方又は下方面に配置又は増殖する培養細胞を有する本発明の装置の部分説明図である；
図８は、挿入ウエルと受け容器の両方に配置される物質分子からなる撹拌部材を有する本発明の装置の部分説明図である；
図９は、物質分子からなる撹拌部材が付いた受け容器に配置されるプローブを有する本発明の装置の部分説明図である；
図１０は、ドナーと受容体プレートの部分説明図である；
図１１は、種々の撹拌速度で測定したイオン化酸・塩基物質分子について有効透過性対ｐＨの６つの対数グラフである；
図１２は、撹拌速度が０、１８６、６２２回転／分（ｒｐｍ）における対数境界層透過性（Ｐｕ）対数分子量（ＭＷ）のグラフである；
図１３は、１４の物質分子に基づく３６回の測定における対数Ｐｕ対対数撹伴速度（ｖ）のグラフである；
図１４は、４種の物質分子の対数Ｐｕ対対数ｖのグラフを示す；
図１５は、文献研究と本発明の装置の両方に基づく水性境界層厚みとｖの間の関係のグラフを示す。
【００２０】
本発明の詳細な説明
本発明は、挿入ウエルを受けるに適した開口を有する受け容器からなる透過性測定装置を提供する。受け容器と挿入ウエルの両方はいずれも透過性試験のドナー又は受容体室のいずれかを具備する。挿入ウエルは、多孔質支持体からなり、たとえば、壁の下部に配置、設置又は形成されてなる。かわりに、支持体は、受け容器の上部に、たとえば配置、設置又は形成されてなる。ドナー室の溶液の物質分子は多孔性支持体を透過し、受容体室の溶液中へ通り得る。好ましくは、多孔性支持体は生物、生体模倣材料又はその組み合わせからなり、たとえば、これは現生細胞膜又は非生物的脂質層である。
【００２１】
一つの態様では、溶液は受け容器内に配置の撹拌部材で撹拌される。溶液を撹拌することで、上方、下方又はその両方の多孔性支持体、ここでそれは、たとえば生物又は生体模倣材料からなり、そしてその面に隣接する水性境界層は減少することができ、それを通る物質分子の透過は生体内吸収と輸送の非常に近似したモデルとなる。一般には、挿入ウエル又は受け容器の溶液を撹拌するとたとえば、多孔性支持体の上方又は下方面にそれぞれ隣接する境界層の厚みは減少する。たとえば、支持体に隣接する境界層厚みは減少することができて、ＧＩＴにおける吸収と輸送に近似する。境界層厚みは、たとえば、実質的に澱んでそして多孔性支持体に隣接する溶液部分を減少させることにより、減少し得る。
【００２２】
本発明の装置は、水性境界層厚みを、例えば、１５μｍ未満にまで減少させることができる。撹拌部材による撹拌の程度は、また調整することができて、境界層厚みを適宜に変化させることができる。境界層厚みを適宜に変えることにより、本発明の装置はたとえば、ＧＩＴの生体内吸収と輸送を模擬化する。たとえば、検量化して約５００〜１５μｍの境界層厚みが得られる撹拌部材のための調節機器または装置を本発明は意図する。本発明の装置はまた、従来のCaco−２型細胞分析試験又はＰＡＭＰＡに使用することができ、それらでは多孔性支持体は生物又は生体模倣材料からなる。
【００２３】
図１は、本発明の部分説明図である。図のように装置２は、開口を有する受け容器６を具備する。挿入ウエル４は、開口を通して容器６に配置される。ウエル４の下方部は多孔性支持体８により構成される。多孔性支持体８は、挿入ウエル４の下部に、たとえば配置、設置、又は形成され得る。支持体はまた、その上方又は下方面に配置又は増殖する生物又は生体模倣材料を受け入れるように適合され得る。このような材料はまた、支持体８の下方と上方の両方の面に配置又は増殖できる。同様に、これらの材料は支持体の細孔に配置又は増殖し得る。たとえば、非生物的、生体模倣の脂質ベースの膜は、支持体上に又はその細孔中に組みこまれる。
【００２４】
受け容器６は撹拌部材１０を含む。部材１０は不活性であり得るので分析試験とは干渉しない。たとえば、撹拌部材は磁化されているか又は被覆が不活性高分子である磁化可能な被覆金属とすることができる。部材はまたステンレス鋼のような不活性金属でも良い。磁化又は磁化可能な部材は、たとえば磁石で動かされる。磁石は、たとえば受け容器に対して固定させて、磁石が実質的に容器の下にあるようにすることができる。
【００２５】
図１は、薄い強磁性又は常磁性円板としての部材１０は容器６の底の下にある永久磁石１４に吸着して、磁石により支持体６から離れていることを示す。磁石はモーター１６により回転され、モーターはコントローラー１８を使用して制御され得る。代わりに、撹拌部材は、回転又は線状プレート・シェーカーのような振動体を使用して動かされるガラス又は不活性プラスチック・ビーズとすることもできる。振動体はまた、例えば受け容器に対して固定して、振動体が実質的に容器下に位置させることもできる。
【００２６】
図１では、モーター１６が回転すると、撹拌部材１０も回転又は移動する。溶液が透過性機器２のウエル４又は容器６に添加されると、支持体８のたとえば上方、下方又はその両方の面に隣接した水性境界層の厚みはモーターの速度で制御され得る。一般には、受け容器に配置された撹拌部材は容器と挿入ウエルの間に配置される多孔性支持体の下方面に沿う水性境界層を主として減少させる。同様に、挿入ウエルに配置の撹拌部材は、受け容器とウエルの間に配置の多孔性支持体の上方面に沿う水性境界層を主として減少させる。たとえば、実質的に澱んで多孔性支持体に隣接する溶液部分を減少させることにより境界沿う厚みが減少され得る。
【００２７】
上記のように、境界層は実質的に澱んだ溶液部分からなる。挿入ウエル４又は受け容器６の両方の溶液は多孔性支持体８の上方及び下方面にそれぞれ隣接する実質的に澱んだ部分からなる。透過機器２のためのモーター１６の速度は多孔性支持体の上方、下方又はその両方の面に隣接する水性境界層の厚みに対して検量化され得ることを意図する。
【００２８】
例えば、図１は、目盛付けした電位差計２０を示し、それは多孔性支持体の下面に隣接する境界層厚みモーター１６とコントローラー１８を介して適宜に変えるように検量化されてなる。このモーター制御と検量化はコンピューターのハードとソフトウエアを含む従来の実験室での技法を使用して容易に遂行し得る。モーター、コントローラー及び電位差計はまた適宜に境界層厚みを変化させる例示の手段であり、本発明は他の適宜の手段を使用することもまた意図している。
【００２９】
一つの態様では、上部部分１２とフランジ１３で特徴付けられて、挿入ウエル４を収納し支持することを意図する受け容器６を具備する。上部部分は受け容器６の主本体部分の径よりもよりも大なる径を有することができる。挿入ウエル４は代わりに、実質的に容器６の外部又は内部に沿って位置する適宜の手段で支持され得て、そうして上部部分１２が容器主本体の径よりも大なる径を有する必要性がなくなる。
【００３０】
容器６と挿入ウエル４は、適宜の材料で構成され得る。たとえば、ポリカーボネート又は他の熱可塑性樹脂などのような不活性又は非磁化材が容器又はウエルの材料として使用される。本発明の機器のための不活性支持体８はまた、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエチレン  テレフターレート、またはポリカーボネートなどの適宜の材料からなる。さらに、支持体は、このましくは典型的には約１０〜２００μｍの厚みと約５〜８０％の多孔性を有する。支持体８は、しっかりとした漏れのないことで知られる適宜の締結手段により挿入ウエルに配置され、締結され、又は形成される。典型的な技術には溶剤結合、熱シール、インサート成形、及び超音波溶着がある。
【００３１】
図２は、本発明の機器の部分説明図を示す。図２において、挿入ウエル４は撹拌部材２４で撹拌されることが可能である。透過性機器２は受け容器と挿入ウエルからなる。上述のように、挿入ウエル４は、ウエルの下部に配置され、締結され、又は形成された多孔性支持体８を有する。撹拌部材２４は、ストレイナー２６に配置され、それは挿入ウエル内に配置される。ストレオナーの底は、たとえば、ウエルの内部と撹拌部材の間に配置されることにより、撹拌部材２４は支持体８とはきちんと分離される。
【００３２】
撹拌部材は、例えば、装置３４などの装置により誘導される磁場又は電磁場により駆動され、該機器は磁石、モーターまたは制御機器からなる。装置３４の部品は上述のように作動し、ここに記載の全ての又はいずれかの態様に組みこまれ得る。このような装置は例示的には、一般に、アメリカ特許第６，１７６，６０９号に記載され、ここに参照のために組み込まれる。
【００３３】
撹拌部材２４は、適宜の材料からなることができる。部材は不活性であることができ、試験に干渉しないものである。たとえば、撹拌部材は、磁気化又は磁気化しえる被覆金属であり、ここで被覆は不活性重合体である。部材はまたステンレス鋼のような不活性金属でもあり得る。磁気化又は磁気化し得る部材は、例えば磁石で駆動される。かわりに、部材はガラス又はプラスチック・ビーズであることができ、これらは軌道又は回転プレートシェーカーのような振動体を使用して駆動される。
【００３４】
ストレイナー２６には、たとえば、支持体８から所定の距離において挿入ウエル４の内部にストレイナー２６を懸架するようにフランジ２８が設けられる。挿入ウエルの外側又は内側のリング又は他の支持体等でストレイナーは懸架される。図２の右側部分説明の装置３０は、内部に配置される撹拌部材２４を設けたストレイナー２６を示す。ストレイナーは蓋３２に対して固定されることができて、それにより製造、輸送、使用が容易なように撹拌部材を保持する。ストレイナーは、たとえば、縁３６の端越しに締結により固定されることがでｋるが、ストレイナーを固定するかまたは位置決めする他の適当な達成手段が使用され得る。このような典型的な方法には、ストレイナーを蓋に結合、熱シール、超音波溶着または接着することなどが含まれる。
【００３５】
上述のように図２の多孔性支持体８は、その上面又は下面上に配置又は増殖した生物又は生体模倣材料を支えるように適合され得る。同様に、これらの材料は支持体の細孔にも配置又は増殖される。たとえば、非生物的又は生体模倣材料ベースの膜が支持体又はその細孔に組み込まれる。一つの態様では、本発明の装置は多孔性支持体の上側又は下側面上に配置又は増殖した生物又は生体模倣材料からなる。このような態様のものは共存培養試験に使用され得る。共存培養試験では、多孔性支持体の上側と下側面上に、それぞれ２種の異なる型の細胞が配置又は増殖することがまた意図される。
【００３６】
たとえば、多孔性支持体上に配置又は増殖する細胞系のような第１の生物材料と受け容器内に配置又は増殖する第２の材料を有することにより同様な試験が実行され得ることがまた認識される。図３は、挿入ウエル４の下部部分の多孔性支持体８上に配置又は増殖する第１の培養細胞とともに受け容器６の底に沿って配置又は増殖する第２の細胞培養を有する透過性装置の部分説明図を示す。このような共存培養試験には、このような生物材料が撹拌部材と接触するのを防ぐ手段を有することが特に重要であり、この接触により材料が損傷される可能性が高い。
【００３７】
たとえば、図３は、受け容器６内に含まれる第２のストレイナー４２が、撹拌部材１０が第２の培養細胞４０に接触しないように保持するのを示す。上述のように、ストレイナーは適宜の手段で容器６に対して固定される。また上述のように、ストレイナーは挿入ウエル４内に配置されてその中の撹拌部材が多孔性支持体８の上面に沿って配置又は増殖する第１の培養細胞と接触するのを防いでいる。典型的にはストレイナーは、通常の水―溶剤混合物に不活性であり得る。このようなストレイナーは、通常、非磁化網状材料で構成されるかまたは射出成形を使用して形成される。図２及び３に示されるようなストレイナーを形成するのに使用される他の典型的な方法や手段が本発明の装置に適用可能である。
【００３８】
図４は、上述したものと類似の本発明の透過機器の部分説明図を示す。図４の装置は、挿入ウエル４および受け容器６のいずれか又はその両方にリング形状の締結材４４のような締結材を備えることができる。締結材４４は、たとえば、ウエル４又は容器６の周りに配置され得る。このような締結材は、撹拌部材１０と２４を含み、それは外部の径は、対応する締結材の径よりも大であるという特徴がある。
【００３９】
典型的な撹拌部材は図４に示されるようにドーナッツ型のビット状である。他の典型的な撹拌部材は固体の円盤を含む。締結材は、部材が支持体８又はウエルもしくは容器の底とどのような配置でも物理的な接触をしないように意図される。さらに、締結材４４はまた、ウエル又は容器に射出成形で容易に組み込まれるものであるが、このような締結材を本発明の装置に組み入れるのに適当な従来の他の手段も可能である。
【００４０】
上述のように、図４に示される撹拌部材２４と１０は、ドーナッツ形状であるので、多孔性支持体８に接近することが可能であるか又は光度計分析のためにウエル４または容器６の底へ部材を通して光を通過させることができるものであり、それは部材が動かないときに好ましく生じる。この分析は多孔性支持体又はウエルもしくは容器の底の光学的品質を損なうような種類の損傷無しで遂行される。典型的な光学分析は紫外線（ＵＶ）、赤外線（ＩＲ）、近赤外、蛍光分光分析又はこれらの組み合わせである。更に加えて、受け容器６の底部分は容器自身の部分になり得るか、または容器に漏れがないような態様で配置される、設置される又は形成される適当な光学膜であり得る。このような漏れのない方法又は技術は、たとえば上記したようなものである。
【００４１】
図5は、本発明の装置の他の態様の部分説明図である。たとえば、挿入ウエル4と受け容器6のリング状部材４８は、撹拌部材１０と２４の外側径よりも小さい内側径を有しているが、撹拌部材が支持体８又は容器６の光学品質の底と物理的な接触をするのを防止している。この本発明の態様では、受け容器が光学品質の材料で成型されて、たとえば、そのため図４で示されるような締結部材が代わりに成型されることはない。
【００４２】
環状部材４８は、また撹拌部材が挿入ウエルまたは受け容器に配置又は増殖する生物又は生体模倣材料と接触するのを防止している。図５のリング状部材は保持部材又は手段の例示として示され、それは好ましくは撹拌部材を保持するのに使用されるが、他の適宜の又は従来の手段がほん発明の装置に使用され得る。追加の典型的な保持部材又は手段はここにまた記載される。
【００４３】
図６は、挿入ウエルと受け容器の両方に配置される保持部材が特徴の本発明の機器を部分的に説明する図である。例えば、保持部材は鋳込み又はインサート成型された格子５４として示され、それは挿入ウエル４及び受け容器６に対して固定されている。格子の典型的な格好は、図６の右側の部分説明図にある構造５６及び５８として示される。保持部材は、撹拌部材１０と２４が多孔性支持部材８と物理的接触をしないように意図されており、その一方で物質分子が部材と支持体を通過することができる。
【００４４】
たとえば、保持部材５４は撹拌部材で、それは鋼球であり得るが、部材１０が上昇すると支持体と物理的接触をするのを防止することができる。撹拌部材は、たとえば容器６外に位置する磁場源を使用して上昇して下降し、撹拌が達成され得る。一つの態様では、他の保持部材５０により、それはたとえば、格子として示されているが、追加のウエル又は容器が挿入ウエル４に部分的に配置されるようになる。このような配備は、二重透過試験に使用されることができる。本発明はまた、積み重ねられる挿入ウエル及び受け容器の複数を使用する試験を意図する。
【００４５】
上述のように、ガラスビーズや高密度不活性重合体のような非磁化撹拌部材には、線状又は回転しんとう機のような振動体を使用して部材の運動が達成される。図６に示す保持部材５０と５４は挿入ウエル４または受け容器６内に非磁化部材などを保持するための防護体として等しく良好に機能する。本発明の装置はまた試験の間に撹拌部材を動かすためのいくつかの異なる手段を備える。たとえば、撹拌部材は磁石と振動体により同時に駆動され得る。
【００４６】
図７における本発明の透過性機器の部分説明図は、共存培養（co-culture）試験を示す。特に、図７は、多孔性支持体８上に配置又は増殖する第１の培養細胞と支持体の下面に沿って配置又は増殖する第２の培養細胞を有する透過性機器を示す。第１と第２の培養細胞は、同一又は異なる種類の生物材料であり得る。代わりに、生体模倣材料が、多孔性材料の上または下面に沿って配置または組み込まれることができる。一つの態様では、生物と生体模倣材料の組み合わせが、支持体の両方の面に配置又は増殖され得る。上述のように、支持体により、生物又は生体模倣材料はその細孔中に配置又は増殖し得る。
【００４７】
図７に示されるように、挿入ウエル４と受け容器６は一般には上述のように配列する。図７はまた、挿入ウエルが容器の開口に部分的に配置されていることを示して、容器の先端表面がウエルを支持している。挿入ウエル４はそれを容器の底から所定の距離で容器内に懸架させることを可能とする特徴を有する。例えば、このような特徴は、フィン６４であり得る。典型的なフィンは、図７の部分説明図の右側に示されるが、フィンの他の適当な配備または特徴も代わりに使用し得る。
【００４８】
容器６の撹拌部材１０は、上記したものと類似とすることができる。挿入ウエル４の部材２４は、また上部支持体構造６０に柔軟に取り付けされるか又は結合されることができ、そうして部材は、多少は水平面内で自由に動くことができ、その一方で支持体８から所定の距離で確固として固定される。一つの態様では、支持体構造６０は、挿入ウエルに対して固定され得る。たとえば、回転する磁場により、撹拌部材が駆動されると、部材２４は、例えば、振り子が溶液撹拌をするように横に振れることができる。このような撹拌部材２４は支持構造体６０に、例えば延長部材６により結合され得るが、他の適当な手段も使用され得る。延長部材６２は、また部材２４の被覆と共に配置又は形成され得る。さらに、延長部材６２は、支持体構造６０の一部として又は別個に形成され得る。
【００４９】
図８は、上述のものに類似の本発明の透過性機器の部分説明図を示す。たとえば、この機器は、上述の態様のいずれか一つであり得るし、又はここに記載の態様のいずれか又は全ての特徴を組み込んだものであり得る。一つの態様では、受け容器６と挿入ウエル４にそれぞれ配置された撹拌部材６８と７０はいかなる形式でも物質分子の一定量を保持する手段を有することができる。物質分子は次いで、撹拌部材から溶液へ透過する。物質分子は撹拌部材により、たとえば、粉体、結晶または圧搾ペレット形状とされることができる。好ましくは、撹拌部材の唯一つが物質分子を備え、その場合、他の撹拌部材は任意に溶液撹拌に供せられる。
【００５０】
物質分子は、たとえば、撹拌部材の親水性フィルター膜の後ろ側で保持される。たとえば、図８の部分説明図の右側に示される組み立て部材７４と７８は、撹拌部材からなる物質分子の異なる可能性ある方策を例示する。この組み立て部材７４では、ドーナッツ形状の撹拌部材７１はその中心に空間を有し、物質分子を収納する。たとえば親水性材料のような濾過材はカバー７２と７６を構成し、それは部材の各側面を覆うのに使用される。
【００５１】
組み立て部材７８では、撹拌部材６９は、物質分子に空間を供する浅いボウルのような形状をしている。組み立て部材７８では、たとえば、フィルター材の単一のカバーが物質分子を保持するのに使用される。好ましくは、カバー８０は、部材６９の上に配置されて、物質分子を保持する。カバー７２、７６及び８０は、たとえば、濾過材ですべて構成されるか又は物質分子がそれを通って透過するに適したものである材料を含むことができる。このような撹拌部材の組み立て体により、物質分子に対する溶解、溶解性及び透過性の性質を同時に又は独立して研究することを可能にする。
【００５２】
濾過材カバーの一つ又はそれ以上を撹拌部材に取り付けるか又はシールすることは、適当な手段、例えば、溶剤結合、熱シーリング及び超音波溶着により行うことが出来る。図８では、受け容器６内の撹拌部材６８を図示するが、それは又挿入ウエル４内にも導入できることを理解されたい。かわりに、部材７０が、容器６内へ導入される。同様に、撹拌部材６９と７１は、挿入ウエルまたは受け容器のいずれかに配置され得る。たとえば、溶解または溶解性に基づく研究の間には、挿入ウエル４は図９に示されるように必要でないかもしれない。
【００５３】
図９は、試料を含む撹拌部材７３を有する受け容器８３を具備する本発明の透過性機器の部分説明図である。部材７３は、初めに物質分子を、たとえば親水性フィルターのようなフィルターの背中に保持することを意図している。物質分子は次いで撹拌部材から溶液へ透過する。フィルターは、撹拌部材に取り付けられるまたはシールされるカバーであり得る。代わりに、カバーは、物質分子がそれを通って透過するに適したフィルター材料の他の材料を含むことが出来る。上述のように、図９の部分説明図の右側に示される組み立て体７４と７８は、撹拌部材に物質分子を含む異なる方法の例示である。
【００５４】
図９は、容器８４の溶液に挿入されたプローブ８を示し、それにより、たとえば物質分子の溶解の間の物質分子濃度測定が可能となる。プローブは例えば、限定されないが、熱感応、イオン選択電極技術、分光方法またはこれらの組み合わせなどの種々の原理に基づくものであり得る。後者は、また、例えば光学品質の受け容器を使用することにより、溶解の間に通過または屈折した光に基づいて物質分子濃度を測定することが可能となり、それはプローブが装置に直接接触することを不用とするかもしれない。
【００５５】
典型的なドナーと受容体ミクロ滴定プレートの部分説明図が図１０に示される。ミクロ滴定プレートは、ドナー板８６と受容体板８８として示される。ドナー板は複数の挿入ウエル４を備える。さらに、プレート８８は、複数の受け容器６を備える。他の態様では、複数の挿入ウエルが受容体板を構成し、その一方でドナー板が複数の受け容器を具備する。ドナーと受容体板は共に合わさって通常の透過試験積層体を形成する。図１０は、各受け容器６に配置される撹拌部材１０を示す。図１０は又容器内での撹拌部材の種々の配向を示す。
【００５６】
典型的な撹拌部材１０は磁化したひれ足（flipper）である。この磁化フリッパーは、同時に上述の適宜の手段、例えば磁石、モーターと制御器もしくは装置を用いて駆動され得る。機器又は装置はまた検量された速度設定装置を有し得て、ウエルと容器のそれぞれに対して個々の水性境界層の厚みを適宜に制御することができる。図１０のミクロ滴定プレートのウエルと容器はまた本発明の他の態様のいずれかまたは全ての変化を含むかまたは組み込むことが出来る。
【００５７】
たとえば、挿入ウエルまたは受け容器は上述の撹拌部材のいずれの型または溶液撹拌のために当業者に公知のいずれの型のものを含むことが出来る。同様に、例えば、締結部材、保持部材、保持手段及びこれらの組み合わせは、上述の態様のいずれか一つには含まれるものである。好ましくは、図１０に示されるようなプレートは、個人の又はロボット操作による操作（複数がある）に適合した種々の方式のミクロ滴定プレートである。
【００５８】
上述のように、本発明は又プレートの納入ウエルと受け容器の両方に配置さえる生物又は生体模倣材料を意図する。このような本発明の装置では、これらの材料が撹拌部材と接触するのを防止するのが特に重要であり、その接触は潜在的に材料を損傷する。このような手段には、たとえば、上述の締結部材、保持部材又は保持手段がある。
【００５９】
本発明は、境界層厚みを減少させる方法を提供する。本方法は、本発明の一つ又はそれ以上の透過性試験機器を提供することを含む。機器の撹拌部材は次いで、駆動されて、好ましくは物質分子を含む溶液を撹拌する。溶液の撹拌は、多孔性支持体の上、下又はその両方の面に隣接する境界層厚みを減少させることができるものであり、その上又はその中に配置された生物又は生体模倣材料を含み得る。例えば、境界層厚みは、実質的に澱んでおり、そして多孔性支持体に隣接する溶液部分を減少させることにより、減少される。
【００６０】
境界層厚みの減少により、支持体を通過する物質分子の透過を可能とし、該支持体は生物又は生体模倣材料からなり,そしてそれにより密接に生体内吸収と輸送状況に近似させることができる。本方法はまた撹拌部材による撹拌の程度を制御して、多孔性支持体の上、下又はその両方の面に隣接する境界層厚みを適宜に変化させることが出来る。本発明の方法は、また上述のようにドナー又は受容体プレートに組み込まれた複数の容器又はウエルについて実行され得る。
【００６１】
以前には述べられてはいない本発明の利点を説明し、そして当業者が本発明による透過性機器を使用する助けになるように、ここに例が提供される。例示は、上述した本発明のどの変化または態様を含むか又は組み込むものである。上述の態様は、さらに又、本発明のいずれかの又は、それぞれ全ての態様を含むか又は組み込むものである。
【００６２】
たとえば、挿入ウエル又は受け容器は上述した撹拌部材のいずれの型又は溶液撹拌に適した従来公知のいずれのものも含み得る。同様に、たとえば、締結部材、保持部材、保持手段又はそれらの組み合わせが上述の態様のいずれか一つと共に含まれ得る。以下の例は、ここに提供される本開示の範囲をいかようにも制限することを意図していない。
【実施例】
【００６３】
本実施例のために５５種の種々の物質分子が使用された。これらの物質分子試料は、以下を含む。２−ナフトエ酸、４‘Ｎ−エチル−３’−メチル−シプロフォキサシン、４‘Ｎ−エチル−３’−エチル−シプロフォキサシン、エステミゾール、アムロジピン−マレイン酸塩、アンチピリン、３−ヒドロキシフェニル酢酸、エルゴノビン、安息香酸、ジルティザム−塩酸（ＨＣｌ）、デシプラミン−ＨＣｌ、フェナゾピリジン−ＨＣｌ、ジクロフェナックーナトリウム（Ｎａ）、フルルビプロフェン、フルボカミニン、イブプロフェン、イミプラミネーＨＣｌ、ケトプロフェン、ランソプラゾール、プロトリプティリン−ＨＣｌ、ナプロキセン、ノルトリプティリン、ワルファリン、ナリジク酸、ナリンゲニン、ニカルディピイン、オンダンセトロン、オクプレノノール、フェニトインーＮａ、ピンドォール、プロプラノロール−ＨＣｌ、ピロキシカム、プラゾシン−ＨＣｌ、プロベニシド、プロゲストロン、キニーネ−ＨＣｌ、サリチル酸、ティアムディピネ、ティモロール−マレイン酸塩、ジメリディン、タモキシフェン１、テルフェナディン１、アミオドアン−ＨＣｌ１、ミコナゾール−硝酸塩１、イトラコナゾール１、アルプレノノール−ＨＣｌ２、クロルプロマジン−ＨＣｌ２、ジェムフィブロジル２、インドメタシン２、プロマキネ−二リン酸塩２、ヴェラパミ−ルＨＣｌ２、メトプロロール−酒石酸塩２およびプロメタジン−ＨＣｌ２。
【００６４】
上記試料の注としては、“１”の試料は、透過性試験が緩衝液に２０％のアセトニトリルを加えて行われる、該緩衝液に不溶なもの。さらに、注の“２”の物質分子は、水性緩衝液での測定で透過性試験が得られ、緩衝液はそれに添加の２０％のアセトニトリルを含むものである。この例としては、マサチュセッツ州  ０１８０１  オボーンのピオン  社から入手できるＰＡＭＡＰＡ  エボルーション機器が使用された。ダブルーシンク（マサチュセッツ州  ０１８０１  オボーンのピオン  社）  ＧＩＴ−０もまた、以下に記載のように、多孔性支持体の材料として使用されて、透過性障壁を形成した。ＧＵＴ−ＢＯＸ（マサチュセッツ州  ０１８０１  オボーンのピオン  社）は、撹拌に供されて、環境制御にまた利用された。
【００６５】
溶液のｐＨは万能緩衝液と共にｐＨ７．４を有し化学捕捉剤を含む緩衝液を使用して調整されて、血漿タンパクを模擬していて、それはマサチュセッツ州  ０１８０１  オボーンのピオン  社から入手可能である。９６室のドナーと受容体ミクロ滴定プレートが又この実施例に使用された。受容体プレートは、マサチューセッツ州  ０１８０１  ビレリカのミリポア社から入手した。プレート室間の多孔性支持体は厚み１２５μｍであり、細孔径は０．４５μｍであった。
【００６６】
各物質分子のＰｅはｐＨ範囲約３〜１０で測定され、ほぼ等しい間隔で開いたｐＨ値を使用して有効な、物質分子のイオン化定数値（ｐＫａＦＬＵＸ）の上下の両方で結果が得られるのを確実として、これは一般には、著者アブディーフ、題名“医薬の吸収と開発”、ワイリ社出版、第１１６−２４５ページ（００３）に記載される。このＰｅを測定する方法はしばしばｐＫａＦＬＵＸ法と称される。
【００６７】
ｐＫａＦＬＵＸは透過性障壁を輸送されて通る抵抗が水性境界層によるのが５０％で、そして障壁によるのが５０％であるｐＨ値を示す。ドナー溶液試料は、各試料が約５０ミクロモル（μＭ）であり、ｐＨで変化し、その一方で受容体溶液は約７．４という一貫したｐＨを有していた。上で示したように、受容体溶液は血漿タンパクのある機能を模倣するために界面活性剤を含んでいた。
【００６８】
撹拌しないときは、ＰＡＭＰＡ積層体が形成されて、そしてＧＵＴ−ＢＯＸ中で飽和湿度の大気下で酸素と二酸化炭素は除かれて数時間までの間約２３℃で培養することが可能であった。好ましくは、培養は約４時間まで行われた。上述のように、図１０は、ＰＡＭＰＡ積層体のための典型的なドナーと受容体プレートの部分説明図を示す。たとえば、図１０の撹拌部材は、磁気化したひれ足（フリッパー）であり得て、それはＧＵＴ−ＢＯＸ中の磁石撹拌子により制御され、それにより部材が水平軸上を回転する。磁化撹拌子の速度計は、上述のように、標準的な単位であるｒｐｍよりも所望の境界層の厚みの単位で検量されていることができる。たとえば、このような検量は、回転速度が約４９〜６２２ｒｐｍにおける異なる１４個の物質分子の３６個のＰｕ値に基づいていた。
【００６９】
ＧＵＴ−ＢＯＸ中の透過時間が到達した後は、ＰＡＭＰＡ積層体は次いで分離されて、存在する物質分子の量についてドナーと受容体室が調べられた。存在する物質分子の量は、標準参照から得られるＵＶスペクトルを比較してＵＶ測定で求められた。参照ＵＶスペクトルは、約２３０〜５００ナノメーター（ｎｍ）の範囲で採られた。さらに、著者  アブディーフら、Eur.J.Pharm.１４、第２７１−２８０頁（２００１）に一般的に記載されるように、多孔性支持体と二重ＳＩＮＫ  ＧＩＴ−０  脂質に保持される材料の量を測定するために質量バランスが測定される。
【００７０】
ドナーから受容体室のＰｅは、又上述のようにｐＨ３〜１０の範囲で測定され、それはｐＫａＦＬＵＸ法の概略等しい間隔のｐＨ値を使用したものであった。Ｐｅの測定は、また多孔性支持体面積とその多孔性を説明する。特に、０．３平方センチ（ｃｍ２）の支持体面積には支持体の見かけ多孔性（εａ）を掛けて、それは０．７６となるが、これは一般的にはニールセンら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、２２、第３３−４１頁（２００４）に記載される。支持体面積と多孔性をもとめることで、ＰＡＭＰＡ法で求められる水性境界層厚みが、種々の大きさと多孔性の異なる支持体を使用する試験と比較が可能なものとする。
【００７１】
表１〜５は、ｐＫａＦＬＵＸ法により測定された上述の５３個のイオン化物質分子を含む。これらの試料はそれぞれ十分に親油性であるので、それらの固有の透過性係数はＰｕとほとんど等しいかこれより大であり、それはｐＫａＦＬＵＸ法の要件である。表１〜５のデータの大部分は撹拌していないものと、約１８６ｒｐｍで撹拌したものからのものである。プロプラノロール、デシプラミンおよびベラパミルのＰｕ値は０、４９、１１８、１８６および６２２ｒｐｍの５種の異なる速度で測定された。さらに、メトプロロールとナプロキセンは４種の異なる速度による特徴がある。タモキシフェン、クロルプロマジンインドメタシン、イタラコナゾール、ミコナソール、プロベネシドおよびニフェデピネはまた撹拌溶液で調べられた。これらの試料に使用された最高の速度は６２２ｒｐｍであった。
【００７２】
再度、数個の物質分子が約２０％アセトニトリルからなる緩衝液で調べられた。これらの試料は表１〜表５では、注で“１”として示される。溶液粘度に対するＰｕの公知の分数−１／６乗依存則が与えられると、アセトニトリルの共溶媒の使用は６２２ｒｐｍでのクロルプロマジンにより示されるような試験に実質的に影響しなかったものであり、その試験は共溶媒の有無とで調べられた。表１〜５は、以下に供せられて、表１は０ｒｐｍの撹拌で、表２は４９ｒｐｍの撹拌で、表３は１１８ｒｐｍの撹拌で、表４は１８６ｒｐｍの撹拌で、そして表５は６２２ｒｐｍの撹拌である。表１〜５は、また測定値Ｐｕ値の標準偏差（ＳＤ）を含む。
【００７３】
【表１】
2008501950.tif 000003
【００７４】
【表２】
2008501950.tif 000004
【００７５】
【表３】
2008501950.tif 000005
【００７６】
【表４】
2008501950.tif 000006
【００７７】
【表５】
2008501950.tif 000007
【００７８】
表１〜５には又、約２５℃での水性拡散性（Ｄaq）の値が挙げられており、それは実験式から近似され得る。
2008501950.tif 000008
【００７９】
この式は、著者アブディーフ、題名“医薬の吸収と開発”、ワイリ社出版、第１１６−２４５ページ（２００３）に一般式として記載される。表１〜５の境界層厚み（ｈ）はヒックスの拡散第２法則により求められて、それは以下のとおりである。
2008501950.tif 000009
【００８０】
図１１は、異なる撹拌速度で測定されたＰｅ対数とイオン化酸及び塩基のｐＨのグラフを示す。実線の曲線は以下の式により測定点と一致した。
2008501950.tif 000010
モノプロトン酸に対して。
【００８１】
そして式
2008501950.tif 000011
モノプロトン塩基に対して、そしてこれは、著者アブディーフら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、２２.第３６５−３７４頁（２００４）により一般的に記載されるものであり、そこでは、境界層厚みが撹拌でまったく除去されないとすると、ＰｅｍａｘがＰｅよりも小さい値に関連する。
【００８２】
図１１の実線曲線上の水平な点線はＰｕの実際の値を示す。破線の曲線は、真の水性ｐＫａと正確なＰｏを使って計算され、それはモノプロトン酸と塩基のために上述したものと類似の式に従う近似曲線に基づいたものである。破線の最大値はＰｏの対数値に対応する。水平な実線領域の点は限定されたほとんど全ての境界層である輸送を示す。水平の実線領域に沿う点は、選択した撹拌速度の感度を示す。
【００８３】
さらに、図１２は、０、１８６および６２２ｒｐｍにおける対数Ｐｕに対する対数ＭＷのグラフを示す。各撹拌速度で、データは以下の実験式に近似された。
2008501950.tif 000012
この式に、前述の実験式を挿入すると以下の式を得る。
2008501950.tif 000013
このように、平均境界層厚み（ｈＭＥＡＮ）は重み付け回帰分析に基づいて求められて、平均厚みの値、１４６２μｍ、１７７μｍ、９１μｍ、４７μｍおよび２８μｍが、それぞれ撹拌速度０ｒｐｍ、４９ｒｐｍ、１１８ｒｐｍ、１８６ｒｐｍおよび６２２ｒｐｍに基づく。
【００８４】
上述のようにｐＫａＦＬＵＸ法を使用して種々の撹拌速度で誘導されたＰｕ値は、また以下の対数形式の式を使用して流体力学分析をした。
2008501950.tif 000014
たとえば、図１３は、対数Ｐｕ対対数ｖのグラフであり、数個の異なる撹拌速度で調べられた１４の物質分子に基づく３６個の測定値を含む。このグラフの切片は、撹拌効率係数（Ｋ）の対数であり、勾配は流体力学係数（α）である。次いで回帰分析から撹拌ＰＡＭＰＡの平均流体力学係数がわかる。
【００８５】
Ｋは、図１３の回帰分析から２３×１０−６ｃｍｓ−１であり、αは０．７１と求められた。αの値は、アドソンら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８４、１１９７−１２０４ページ（１９９５）で報告された値  ０．８に近いが、しかしＰＡＭＰＡ  Ｋ  係数は以前に報告の最大値よりも約６倍大きい。所定の撹拌速度ではＰＡＭＰＡでの境界層厚みは最も効率的に撹拌されたＣａｃｏ−型細胞試験におけるそれよりも劇的に小さいので、この結果は重要である。
【００８６】
さらに、図１４は、種々の撹拌速度で調べた４種の異なる物質分子の個々の挙動を示す。各物質分子に対する測定点が有限であり、そして対数ｖの値が狭い範囲内であるので、図に示す近似ではαは平均値  約０．７１に規制される。たとえば、図１４に示されるように、個々のＫ値は物質分子  デシプラミンの約２２×１０−６  ｃｍ  ｓ−１からイミプラミンの２７×１０−６  ｃｍ  ｓ−１の範囲である。
【００８７】
図１５はｈとｖの関係を示し、文献からの値と本発明の装置を使用したこの実施例の値とを比較している。図示のように、実線の丸印はアドソンら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８４、１１９７−１２０４ページ（１９９５）で報告された２２℃のテストステロンに基づくデータである。破線は以下の式から計算されて、Ｄａｑは５．０×１０−６ｃｍ  ｓ−１を、Ｋは４．１×１０−６ｃｍ  ｓ−１とαに０．８とした。
【００８８】
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白抜きの丸印は、カールソンらの、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．、７、５５−６４ページ（１９９１）のデータの３７℃におけるテストステロンを示す。図１５の点線はＤaqを７．８４×１０−６  ｃｍ  ｓ−１、Ｋを０．５７×１０−６  ｃｍｓ−１とし、そしてαが１の値である。アドソンら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．、８４、１１９７−１２０４ページ（１９９５）の試験ではより高いＫであることに鑑みて、各５分間毎のＣａｃｏ−２型細胞からなる支持体のドナープレートから新規で新鮮な受容体プレートへの透過は、それは一般には“ブレーク”積層体法と称されるが、より有効な混合モデルを与える。
【００８９】
過酷シンク状態は容易に維持されえるのでブレイク積層体方法の効率はしばしば有効撹拌モデルを産出し、それにより物質分子の逆流が実質的に除去され得る。さらに、透過性障壁のドナー側に沿う境界層の抵抗のみが大量輸送に関連する動力学に寄与する。結果として、実線の丸印の境界層厚みは所定のどの撹拌速度に対する白抜き丸印のそれの半分よりも小である。本発明の装置を使用するＰＡＭＰＡに基づくデシプラミンのデータは、四角の印で示された実線の曲線であり、Ｄaqは５．９×１０−６  ｃｍ  ｓ−１であり、Ｋは２３×１０−６  ｃｍ  ｓ−１であり、αは０．７１である。図１５から明らかだが、本発明の装置を使用する撹拌効率は文献で報告されたものよりも有意に良好である。
【００９０】
本発明は好ましい態様でもってここに説明されるが、当業者は前述の明細書を見るとここに述べられた装置と方法に変化、均等物の置換、改変をもたらすことができる。上述の各態様は、また他の態様のいずれか又は全てに関して開示の変化を含むか又は組み込むものである。たとえば、挿入ウエル又は受け容器は上述のいずれかの型の撹拌部材または溶液撹拌に適した公知のいずれかのものを備える。同様に、締結材、保持部材又は保持手段、又はこれらの組み合わせは、ここに記載のいずれか一つの態様に備わるものである。特許付与により許諾される保護は添付の特許請求の範囲又はその均等物に含まれる定義のみによる範囲に限定されることを意図される。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】受け容器に配置された撹拌部材を有する本発明の装置の部分説明図
【図２】挿入ウエルと受け容器の両方に配置された撹拌部材を有する本発明の装置の部分説明図
【図３】挿入ウエルと受け容器の両方に配置又は増殖した培養細胞を有する本発明の装置の部分説明図
【図４】一つまたはそれ以上の撹拌部材を保持するための挿入ウエルと受け容器の両方の内部に延びる狭窄部を有する本発明の装置の部分説明図
【図５】一つまたはそれ以上の撹拌部材を保持するための挿入ウエルと受け容器の両方に配置される保持部材を有する本発明の装置の部分説明図
【図６】一つまたはそれ以上の撹拌部材を保持するための挿入ウエルと受け容器の両方に配置される保持部材を有する本発明の装置の部分説明図
【図７】多孔構造体の上方又は下方面に配置又は増殖する培養細胞を有する本発明の装置の部分説明図
【図８】挿入ウエルと受け容器の両方に配置される物質分子からなる撹拌部材を有する本発明の装置の部分説明図
【図９】物質分子からなる撹拌部材が付いた受け容器に配置されるプローブを有する本発明の装置の部分説明図
【図１０】ドナーと受容体プレートの部分説明図
【図１１】種々の撹拌速度で測定したイオン化酸・塩基物質分子について有効透過性対ｐＨの６つの対数グラフ
【図１２】撹拌速度が０、１８６、６２２回転／分（ｒｐｍ）における対数境界層透過性（Ｐｕ）対数分子量（ＭＷ）のグラフ
【図１３】１４種の物質分子に基づく３６回の測定における対数Ｐｕ対対数撹伴速度（ｖ）のグラフ
【図１４】４種の物質分子の対数Ｐｕ対対数ｖのグラフ
【図１５】文献研究と本発明の装置の両方に基づく水性境界層厚みとｖの間の関係のグラフ
【符号の説明】
【００９２】
２    装置
４    挿入ウエル
６    受け容器
８    多孔性支持体
１０    撹拌部材
１２    受け容器上部部分
１３    フランジ
１４  永久磁石
１６    モーター
１８    コントローラー
２０    盛付け電位差計
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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