(57)【要約】Ｔｉｅ１及びＴｉｅ２は膜貫通ドメインを包含するレセプターチロシンキナーゼタンパク質である。Ｔｉｅ１及びＴｉｅ２は内皮細胞上に存在する。本開示は内皮細胞の活性及び新脈管形成を阻害するものを包含するＴｉｅ１、Ｔｉｅ２及びＡｎｇに結合する抗体のような薬剤を説明する。薬剤は新脈管形成関連障害を治療するために使用できる。一局面において、本発明は、被験体におけるＴｉｅ複合体形成またはＴｉｅ複合体成分間の相互作用を調節する方法を特徴とする。
2008532476.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、ここで該タンパク質がＴｉｅ１エクトドメインに結合し、そして、
（Ａ）該重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は以下の特性：
ｉ）（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）を包含するＨＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）を包含するＨＣ  ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号７２７）を包含するＨＣ  ＣＤＲ３；
の１つ以上を含み；
および／または、
（Ｂ）該軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は以下の特性：
ｉ）Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）を包含するＬＣ  ＣＤＲ１であって、ここでＸ１はセリンであるか非存在であり得る、ＬＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）を包含するＬＣ  ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ｑ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｈ（配列番号７２８）を包含するＬＣ  ＣＤＲ３；
の１つ以上を含む、タンパク質。
【請求項２】
前記重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が下記：
ｉ）（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）を包含するＨＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）を包含するＨＣ  ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号７２７）を包含するＨＣ  ＣＤＲ３；
を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が下記：
ｉ）Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）を包含するＬＣ  ＣＤＲ１であって、ここでＸ１はセリンであるか非存在であり得る、ＬＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）を包含するＬＣ  ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ｑ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｈ（配列番号７２８）を包含するＬＣ  ＣＤＲ３；
を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列がＥ３クローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、そして前記ＬＣ可変ドメイン配列がＥ３クローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項５】
（ｉ）Ｅ３抗体のＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、（ｉｉ）それぞれＥ３抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であるＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列、あるいは（ｉｉｉ）それぞれＥ３のＨＣまたはＬＣ可変ドメインをコードする核酸に高ストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸によりコードされるＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項６】
インビトロでＨＵＶＥＣ細胞による管形成を阻害する、請求項１〜５の何れかに記載のタンパク質。
【請求項７】
前記タンパク質がＦａｂである、請求項１〜６の何れかに記載のタンパク質。
【請求項８】
前記タンパク質がＩｇＧである、請求項１〜７の何れかに記載のタンパク質。
【請求項９】
重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質であって、ここで該タンパク質がＴｉｅ１エクトドメインに結合し、そしてＴｉｅ１への結合についてＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４と競合するか、あるいは、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するか、あるいは、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４により認識されるエピトープと共通の少なくとも１、２または３つの残基を有するエピトープに結合する、タンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れかに記載のタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む薬学的組成物。
【請求項１１】
被験体における脈管発生を阻害する方法であって、該方法が下記工程：
請求項１〜９の何れかに記載のＴｉｅ１結合タンパク質を脈管発生の阻害が必要な障害を有するか、その危険性を有する被験体に投与する工程
を包含する、方法。
【請求項１２】
前記Ｔｉｅ１結合タンパク質が下記の特性：
（１）Ｅ３抗体の少なくとも２つのＣＤＲを含む可変ドメイン配列のうちの少なくとも１つ；
（２）Ｅ３抗体の対応する可変ドメインのＣＤＲに合計で少なくとも８５％同一であるＣＤＲ配列を含む可変ドメイン配列のうちの少なくとも１つ；
（３）可変ドメインの少なくとも１つがＥ３抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であること；
（４）タンパク質がＴｉｅ１への結合に関してＥ３と競合するか、または、Ｔｉｅ１上のＥ３により結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合すること、および、
（５）タンパク質がＥ３またはＥ３ｂのＨＣまたはＬＣ可変ドメインをコードする核酸に高ストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸によりコードされるドメインを含むこと；
の１つ以上を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗体がＥ３の可変ドメインを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記薬剤が被験体における脈管発生を低減するために有効な量および／または時間で投与される、請求項１１〜１３の何れかに記載の方法。
【請求項１５】
前記被験体が脈管構造依存性の癌または腫瘍を有する、請求項１１〜１４の何れかに記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
抗癌療法である第２の療法を提供する工程を更に包含する、請求項１１〜１６の何れかに記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の療法が化学療法である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２の療法が、ＶＥＧＦ経路を介したシグナリングを拮抗する薬剤を投与する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第２の療法が、ベバシズマブを投与する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２の療法が、５−ＦＵ、ロイコボリンおよび／またはイリノテカンを投与する工程を包含する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
術後のアジュバント療法を提供する方法であって、該方法が、腫瘍を除去するための手術を受けている被験体に請求項１に記載のＴｉｅ１結合タンパク質を投与する工程を包含する、方法。
【請求項２３】
前記Ｔｉｅ１結合タンパク質が、（ａ）Ｅ３抗体の重鎖可変ドメインに少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン配列およびＥ３抗体の軽鎖可変ドメインに少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン配列；
（ｂ）Ｔｉｅ１への結合に関してＥ３と競合する抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列；
または、
（ｃ）Ｅ３抗体の重鎖可変ドメインのＣＤＲのうちの１、２または３つ、および、Ｅ３抗体の軽鎖可変ドメインのＣＤＲのうちの１、２または３つ；
を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
手術の４８時間以内に前記Ｔｉｅ１結合タンパク質が投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
手術の前後に前記Ｔｉｅ１結合タンパク質が投与される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
配列番号７２３および配列番号７２４を含む単離されたタンパク質。
【請求項２７】
各々がＴｉｅ１に結合する２つの抗原結合部位を含む、請求項２６に記載のタンパク質。
【請求項２８】
請求項１に記載のタンパク質の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列をコードする、単離された核酸。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本出願は、米国出願番号１１／０４９，５３６（２００５年２月２日出願）の一部継続出願であり、この１１／０４９，５３６は、米国出願番号１０／９１６，８４０（２００４年８月１２日出願）の一部継続出願であり、これは米国出願番号６０／４９４，７１３号（２００３年８月１２日出願）に対して優先権を主張する。本出願はまた、ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０２６１１６（２００４年８月１２日出願）の一部継続出願であり、これは米国出願番号６０／４９４，７１３（２００３年８月１２日出願）に対して優先権を主張する。上記出願の各々の内容は、それらの全体が参考として本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（背景）
血管により供給される酸素および栄養素は、組織の発達と機能にとって極めて重要である。実際、心臓血管系は胚で発達する最初の器官系である。器官形成中および組織または腫瘍の発達中、成長細胞の循環系への近接は、血管および器官実質の調和した成長によって確保される。血管の発達または血管形成を調節することにより病気を予防または治療することが可能であり得る。
【０００３】
血管は、内皮細胞の内層および周皮細胞または平滑筋細胞の外層からなる。最初の管状構造物は内皮細胞により形成され、続いてこの内皮細胞は、周皮細胞および平滑筋細胞を補充して形成された管状構造物を外筒で覆う。中胚葉に由来する内皮前駆細胞の分散した個体群からの血管のｄｅ  ｎｏｖｏ形成を脈管形成と呼ぶ。この初生のネットワークは、発芽、分裂および再造形等の連続的な形態形成のイベントを受けて、大きい血管から分岐した小さな血管までの階層血管ネットワークを発生させる。これらの連続的な形態形成のイベントをまとめて血管形成と呼ぶ。以前の研究は、血管の脈管形成と血管形成の発達を媒介する多くの内皮細胞特異的レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）およびそれらの同起源のリガンドを同定した。血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーおよびそれらのリセプターは初期の胚の脈管叢組織の形成中に機能する一方で、アンギオポイエチン（Ａｎｇ）およびそれらのレセプターＴｉｅ２、ならびにエフリンおよびそれらのＥｐｈレセプターがその後の再造形プロセスに関与する。血管形成およびリンパ管形成応答に関与するレセプターの検討については、例えば、非特許文献１を参照されたい。
【０００４】
Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２は、内皮細胞および造血細胞でほとんど排他的に発現されるＲＴＫである。これらの２つのレセプターは、胚形成の間の脈管構造の正常な発達に必要とされる。これら２つのＴｉｅレセプターは、他のＲＴＫファミリーメンバーとは異なり細胞外ＥＧＦホモロジードメインを含むので、ＲＴＫサブファミリーを形成する。例えば、非特許文献２および特許文献１を参照のこと。マウスにおけるＴｉｅ１遺伝子の標的された破壊は、広範な出血および欠損微小血管完全性によって特徴付けられる致死性の表現型を生じる。例えば、非特許文献３を参照のこと。Ｔｉｅ２ヌル胚は、内皮細胞周囲を支持する細胞の不適切な漸増に起因する、脈管再構築および成熟の欠損を有する。脈管形成（Ａｎｇ、例えば、Ａｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４）は、Ｔｉｅ２と相互作用するタンパク質である。
【特許文献１】国際公開第９３／１４１２４号パンフレット
【非特許文献１】Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌｅｃ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  （２００１）２：２５７
【非特許文献２】Ｐａｒｔａｎｅｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１２，（１９９２），１６９８
【非特許文献３】Ｐｕｒｉら，ＥＭＢＯ  Ｊ．１４，（１９９５），５８８４
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（要旨）
一局面において、本発明は、被験体におけるＴｉｅ複合体形成またはＴｉｅ複合体成分間の相互作用を調節する方法を特徴とする。その方法はＴｉｅ１に結合する薬剤を被験体に投与することを包含する。例えば薬剤はＴｉｅ１自己会合（例えばホモ２量体化）を促進し、または、以下のもの、すなわちＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびアンジオポエチン（Ａｎｇ；例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３またはＡｎｇ４）の少なくとも２つの間の会合に拮抗する。一実施形態において、薬剤の結合はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤の結合はＴｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。
【０００６】
一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１に結合する。一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、薬剤はＴｉｅ１の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりＴｉｅ１をＴｉｅ１と会合させ、そしてＴｉｅ１のＴｉｅ２および／またはＡｎｇとの会合を防止する。薬剤はＴｉｅ１への結合のために少なくとも２つの結合価を有する。一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１のリン酸化、例えばＴｉｅ１の自己リン酸化を増大させる。この増大はＴｉｅ１の自己会合に依存することができるが必須ではない。
【０００７】
一実施形態において、薬剤は、ヒトＴｉｅ１の細胞外ドメインに結合するタンパク質、例えば抗体を包含する。例えば、抗体は以下のもの、即ち、ヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換えのもののうち１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１の第１のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ１）または第２のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ２）に結合することができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のＥＧＦ様ドメイン（例えば第１、第２または第３のＥＧＦ様ドメイン）に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のフィブロネクチンＩＩＩ型リピートに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号２のアミノ酸残基２４〜１２４、７４〜１７４、１２４〜２２４、１７４〜２７４、２２４〜３２４、２７４〜３７４、３２４〜４２４、３７４〜４７４、４２４〜５２４、４７４〜５７４、５２４〜６２４、５７４〜６７４、６２４〜７２４、６７４〜７５９または７２４〜７５９に結合する。
【０００８】
一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１エクトドメインに結合するタンパク質を包含し、そして、重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含する。タンパク質は更に以下、即ち、（１）可変ドメイン配列の少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体のＣＤＲ少なくとも１つ（例えばＥ３またはＥ３ｂ抗体のＣＤＲ１、２または３つ）を含み；（２）可変ドメイン配列の少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体の対応する可変ドメインのＣＤＲに合計で少なくとも８５％同一であるＣＤＲ配列を含み、（３）可変ドメインの少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であり、そして（４）タンパク質はＴｉｅ１への結合に関してＥ３またはＥ３ｂと競合するか、または、Ｔｉｅ１上のＥ３またはＥ３ｂにより結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するという特性の１つ以上を包含する。Ｔｉｅ１への結合に関してＥ３と競合する抗原結合部位を含む抗体の例は、Ｍ００４４Ｂ０８、Ｍ００５６Ｇ０８、Ｍ００４５Ｂ０３、Ｍ００５３Ｆ０４、Ｍ００５５Ｅ１０、Ｍ００６０Ｈ０１、Ｍ００５４Ｈ１０、Ｍ００５８Ｆ０３および関連する抗体を包含する。
【０００９】
一実施形態において、薬剤はＥ３またはＥ３ｂ抗体のＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメイン、または、Ｅ３またはＥ３ｂ抗体のＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメインと少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９８、９９％同一の配列を包含する。一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列はＥ３またはＥ３ｂクローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含し、そしてＬＣ可変ドメイン配列はＥ３またはＥ３ｂクローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を包含する。一実施形態において、薬剤はＥ３またはＥ３ｂ抗体を含む。ＬＣ可変ドメイン配列は配列番号１１６を包含することができる。ＨＣ可変ドメイン配列は配列番号１１４を包含することができる。一実施形態において、ＨＣおよびＬＣフレームワーク領域はヒト型である。一実施形態においては、薬剤は配列番号７２３および配列番号７２４を包含する。
【００１０】
一実施形態において、薬剤はＴｉｅ２に結合する。一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤の結合は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、薬剤はＴｉｅ２の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりＴｉｅ２をＴｉｅ２と会合させ、そしてＴｉｅ２のＴｉｅ１および／またはＡｎｇとの会合を防止する。一実施形態において、薬剤は、ヒトＴｉｅ２の細胞外ドメインに結合するタンパク質、例えば抗体を包含する。例えば、抗体は以下のもの、即ち、ヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換えのもののうち１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２の第１のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ１）または第２のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ２）に結合することができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２のＥＧＦ様ドメイン（例えば第１、第２または第３のＥＧＦ様ドメイン）に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２のフィブロネクチンＩＩＩ型リピートに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号１６２のアミノ酸残基１９〜１１９、６９〜１６９、１１９〜２２９、１６９〜２６９、２２９〜３２９、２６９〜３６９、３２９〜４２９、３６９〜４６９、４２９〜５２９、４６９〜５６９、５２９〜６２９、５６９〜６６９、６２９〜７２９、６６９〜７４５または７２９〜７４５に結合する。
【００１１】
一実施形態において、薬剤はＡｎｇ（例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３またはＡｎｇ４）に結合する。一実施形態において、薬剤はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、薬剤の結合は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。一実施形態において、薬剤はＡｎｇに結合する抗体のようなタンパク質を包含する。例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のＮ末端ドメイン（例えばＡｎｇ１のＮ末端５０アミノ酸）に結合する。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のコイルドコイルドメインに結合する。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のフィブリノーゲン様ドメインに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号１６３のアミノ酸残基１〜１００、５０〜１５０、１００〜２００、１５０〜２５０、２００〜３００、２５０〜３５０、３００〜４００、３５０〜４５０、４００〜４９７または４５０〜４９７に結合する。
【００１２】
一実施形態において、薬剤は重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含するタンパク質を含む。一実施形態において、ＨＣおよびＬＣフレームワーク領域はヒト型である。一実施形態において。薬剤はまたＦｃドメインも包含する。一実施形態において、薬剤はヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメインを包含する。一実施形態において、重鎖の定常ドメインはアロタイプ、（ａ，ｚ）アロタイプまたは何れかの他のアロタイプである。
【００１３】
一実施形態において、薬剤は血管発生または新脈管形成を低減するために有効な量において投与される。一実施形態において、被験体は新脈管形成関連障害を有する。一実施形態において、被験体は例えば新生物障害、転移癌、新脈管構造依存性の癌または腫瘍、炎症性障害、関節リウマチまたは乾癬を有する。一実施形態において、タンパク質は全身投与される。
【００１４】
別の実施形態においては、タンパク質は以下の活動、即ち、新芽形成、分離、血管リモデリング、脈管形成および細管形成の１つ以上を低減するために有効な量で投与される。方法は本明細書に記載する他の特徴を包含する。
【００１５】
一局面において、本発明は被験体における内皮細胞活性を低減または阻害する方法を包含し、その方法は、被験体において内皮細胞活性を低減または阻害するために有効な量のＴｉｅ複合体形成を低減または阻害する薬剤を投与することを包含する。方法は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
【００１６】
一局面において、本発明はＴｉｅ１のリン酸化を促進する薬剤を投与することによる内皮細胞活性を低減する方法を包含する。一実施形態において、リン酸化は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。
【００１７】
別の局面において、本発明は内皮細胞活性を低減する方法を包含し、方法はシグナリング経路を活性化する薬剤を投与することによる。一実施形態においてシグナリング経路は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。例えば薬剤はＴｉｅ１自己リン酸化を増大させる。方法は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
【００１８】
一局面において、本発明は被験体におけるＴｉｅ複合体形成を調節するための抗体を包含し、ここで抗体は以下のもの、即ち、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２およびアンジオポエチン（Ａｎｇ）の少なくとも２つの間の会合に拮抗する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ複合体成分に、または、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇの１つ以上に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態において、抗体は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。
【００１９】
一実施形態において、抗体はＴｉｅ１に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、抗体の結合は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、抗体はＴｉｅ１の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりＴｉｅ１をＴｉｅ１と会合させ、そしてＴｉｅ１のＴｉｅ２および／またはＡｎｇとの会合を防止する。別の実施形態において、抗体はＴｉｅ１のリン酸化を増大および／またはＴｉｅ１のＴｉｅ２またはＡｎｇとの会合を防止する。一実施形態において、抗体はヒトＴｉｅ１の細胞外ドメインに結合する抗体を包含する。例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１の第１のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ１）または第２のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ２）に結合することができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のＥＧＦ様ドメイン（例えば第１、第２または第３のＥＧＦ様ドメイン）に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のフィブロネクチンＩＩＩ型リピート領域に結合する。一実施形態において、抗体は配列番号２のアミノ酸残基２４〜１２４、７４〜１７４、１２４〜２２４、１７４〜２７４、２２４〜３２４、２７４〜３７４、３２４〜４２４、３７４〜４７４、４２４〜５２４、４７４〜５７４、５２４〜６２４、５７４〜６７４、６２４〜７２４、６７４〜７５９または７２４〜７５９に結合する。
【００２０】
一実施形態において、抗体はＴｉｅ１エクトドメインに結合し、そして重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含し、タンパク質は更に以下、即ち、（１）可変ドメイン配列の少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体のＣＤＲ少なくとも１つを含み；（２）可変ドメイン配列の少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体の対応する可変ドメインのＣＤＲに合計で少なくとも８５％同一であるＣＤＲ配列を含み、（３）可変ドメインの少なくとも１つがＥ３またはＥ３ｂ抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であり、そして（４）タンパク質はＴｉｅ１への結合に関してＥ３またはＥ３ｂと競合するか、または、Ｔｉｅ１上のＥ３またはＥ３ｂにより結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するという特性の１つ以上を包含する。例えば、抗体は少なくとも２価であり、例えばＴｉｅ１に結合する抗原結合部位少なくとも２つを有する。一実施形態において、抗体はＥ３、Ｅ３ｂ（例えばＤＸ−２２２０）またはＤＸ−２２４０を含む。
【００２１】
一実施形態において、抗体はＥ３またはＥ３ｂ由来の可変ドメイン１つ以上、または、そのような可変ドメインに少なくとも７０、８０、８５、９０、９５、９８、９９％同一の可変ドメイン配列を包含する。一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列はＥ３またはＥ３ｂクローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を包含し、そしてＬＣ可変ドメイン配列はＥ３またはＥ３ｂクローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を包含する。一実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列は配列番号１１６を包含する。一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列は配列番号１１４を包含する。一実施形態において、ＨＣおよびＬＣフレームワーク領域はヒト型である。
【００２２】
一実施形態において、抗体はＴｉｅ２に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、抗体の結合は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。別の実施形態においては、抗体はＴｉｅ２の自己会合、例えばホモ二量体化を増強し、そしてこれによりＴｉｅ２をＴｉｅ２と会合させ、そしてＴｉｅ２のＴｉｅ１またはＡｎｇとの会合を防止する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のリン酸化を増大させる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１のＴｉｅ２またはＡｎｇとの会合を防止する。一実施形態において、抗体はヒトＴｉｅ２の細胞外ドメインに結合する抗体を包含する。抗体はこれ等の特性の１つ以上を有してよく、例えば抗体はＴｉｅ１のリン酸化を促進し、Ｔｉｅ１のＴｉｅ２またはＡｎｇとの会合を防止してよい。
【００２３】
例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２の第１のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ１）または第２のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（Ｉｇ２）に結合することができる。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２のＥＧＦ様ドメイン（例えば第１、第２または第３のＥＧＦ様ドメイン）に結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ２のフィブロネクチンＩＩＩ型リピート領域に結合する。一実施形態において、抗体は配列番号１６２のアミノ酸残基１９〜１１９、６９〜１６９、１１９〜２２９、１６９〜２６９、２２９〜３２９、２６９〜３６９、３２９〜４２９、３６９〜４６９、４２９〜５２９、４６９〜５６９、５２９〜６２９、５６９〜６６９、６２９〜７２９、６６９〜７４５または７２９〜７４５に結合する。
【００２４】
一実施形態において、抗体はＡｎｇに結合する。一実施形態において、抗体はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇのヘテロマー複合体の形成に拮抗する。別の実施形態においては、抗体の結合は、Ｔｉｅ１とＴｉｅ２の間、Ｔｉｅ１とＡｎｇの間、または、Ｔｉｅ２とＡｎｇの間の会合に拮抗することができる。例えば、抗体はヒト、ヒト化、非免疫原性、単離、モノクローナルおよび組換え型の１つ以上であることができる。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のＮ末端ドメイン（例えばＡｎｇ１のＮ末端５０アミノ酸）に結合する。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のコイルドコイルドメインに結合する。一実施形態において、抗体はＡｎｇ１のフィブリノーゲン様ドメインに結合する。一実施形態において、抗体は配列番号１６３のアミノ酸残基１〜１００、５０〜１５０、１００〜２００、１５０〜２５０、２００〜３００、２５０〜３５０、３００〜４００、３５０〜４５０、４００〜４９７または４５０〜４９７に結合する。
【００２５】
一実施形態において、抗体は重鎖（ＨＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列を包含する。
【００２６】
一実施形態において、ＨＣおよびＬＣフレームワーク領域はヒト型である。一実施形態において、抗体はまたＦｃドメインを包含する。一実施形態において、抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４の定常ドメインを包含する。
【００２７】
一実施形態において、抗体は血管発生または新脈管形成を低減するために有効な量において投与される。一実施形態において、抗体は全身投与される。一実施形態において、抗体は以下の活動、即ち、新芽形成、分離、血管リモデリング、脈管形成および細管形成の１つ以上を低減するために有効な量で投与される。
【００２８】
一局面において、本発明は本明細書に記載した抗体の可変ドメイン１つ以上を包含する単離されたタンパク質を包含する。
【００２９】
一局面において、本発明は本明細書に記載した抗体の可変ドメインを包含するポリペプチドをコードするコーディング配列を包含する核酸を包含する。
【００３０】
一局面において、本発明は本明細書に記載した抗体を包含する薬学的組成物を包含する。組成物および抗体は本明細書記載の他の特徴を包含できる。
【００３１】
一局面において、本発明は新脈管形成関連障害の治療のための本明細書記載の抗体を包含する。抗体および治療は本明細書記載の他の特徴を包含できる。
【００３２】
一局面において、本発明は新脈管形成関連障害を治療するための医薬の製造のための本明細書記載の抗体を包含する。医薬および抗体は本明細書記載の他の特徴を包含できる。
【００３３】
一局面において、本発明は第２の治療、例えば抗癌療法と組み合わせて第１の薬剤を投与することを包含する第１の治療を提供する方法を包含する。第１の薬剤はＴｉｅ複合体形成を低減するか、またはＴｉｅ１ホモ二量体化を増大させる薬剤である。例えば第１の薬剤はＴｉｅ１結合タンパク質である。一実施形態において、第２の療法は放射線療法または手術を包含する。一実施形態において、第２の療法は第２の薬剤を投与することを包含する。例えば、第２の薬剤はＴｉｅ複合体形成を拮抗または低減するか、またはＴｉｅ１ホモ二量体化を増大させる。一実施形態において、第２の薬剤はＶＥＧＦ経路を介したシグナリングに拮抗する薬剤、例えばＶＥＧＦ拮抗剤抗体、例えばベバシズマブ；ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ阻害剤またはＶＥＧＦ経路シグナリングに拮抗する他の薬剤である。後述する「複合療法」も参照できる。
【００３４】
別の局面において、本発明はＴｉｅ複合体形成を低減する薬剤および抗癌剤を包含する組成物を包含する。例えば、抗癌剤はＴｉｅ複合体形成に拮抗する第２の薬剤またはＶＥＧＦ経路に拮抗する第２の薬剤であることができる。
【００３５】
一局面において、本発明はＴｉｅ１リン酸化を促進することにより内皮細胞活性を低減する抗体を特徴とする。例えば抗体は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。
【００３６】
一つの局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。この結合タンパク質は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合する。例えば、このタンパク質は、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和性ＫＤで結合する。
【００３７】
一実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のＣＤＲは、ヒト、霊長類、非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）または合成のものである。一実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のフレームワーク領域は、ヒト、霊長類または非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）のものである。
【００３８】
一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列は一つ以上の以下の特性を含む：
ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１：
（ＡＧＳＲ）−Ｙ−（ＧＶＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＦ）（配列番号１１７）
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）または
（ＡＧＳＩＭＲＮＨ）−Ｙ−（ＡＧＴＶＭＫＰＱ）−Ｍ−（ＡＧＳＴＶＭＹＷＦＫＨ）（配列番号１１９）；
ｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１２１）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２２）
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）（配列番号１２３）または
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＰＳ）−Ｔ−（ＹＶＨ）−Ｙ−Ａ−Ｄ（配列番号７２２）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）；
ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３：
Ｖ−（４または５残基）−Ｆ−Ｄ−（Ｉ／Ｙ）（配列番号１２４）、
Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２５）、
（ＧＶ）−Ｎ−Ｙ−Ｙ−（ＧＹＤ）−Ｓ−（ＳＤ）−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２６）、
（ＧＶＤ）−（ＡＧＬＮ）−（ＬＹＲ）−（ＧＳＴＬＹＨ）−（ＧＹＤ）−（ＡＧＳＹＦＰ）−（ＳＦＤ）−（ＡＧＹＤ）−（ＩＹ）−（ＧＦＤ）−（ＹＤＰ）−（ＩＰ）−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２７）、
Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号７２７）、
ＶＮＹＹＤＳＳＧＹＧＰＩＡＰＧＬＤＹ（配列番号１２８）または
Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−（ＡＹ）−Ｆ−Ｄ−（Ｙ１）（配列番号７０５）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）。
【００３９】
一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は一つ以上の以下の特性を含む：
ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１：
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−Ｘ１−Ｙ−Ｌ−（ＡＮ）（配列番号１２９）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−Ｓ−（ＹＳ）−Ｌ−（ＡＬＮ）（配列番号７０６）、
Ｔ−Ｇ−Ｔ−（ＳＮ）−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｇ−（ＧＳ）−Ｙ（配列番号７０７）、
（ＳＣＱ）−（ＧＳ）−（ＤＳ）−（ＮＳ）−（ＩＬ）−（ＧＲ）−Ｓ−（ＹＫＮ）−（ＹＳ）−（ＶＡ）（配列番号７０８）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｚ−Ｌ（配列番号１３０）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）（ＳＹ）−（ＬＹ）−（ＡＬＮ）（配列番号１３１）または
Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）（式中、Ｘ１はセリンであるか、または不在であり得る）；
ｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＳＲ２：
Ｘ−Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３３）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３４）、
（ＤＧ）−（ＡＶ）−Ｓ−Ｎ−（ＲＬ）−（ＡＰ）−（ＳＴ）（配列番号７０９）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３５）または
（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）；および
ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）、
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３７）、
（ＬＱ）−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＫＮ）−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３８）、
Ｑ−Ｑ−Ｘ−Ｓ−（ＳＮ）−（ＷＳ）−Ｐ−Ｘ−Ｔ−Ｆ（配列番号７１０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
Ｙ−（ＴＧ）−（ＳＧ）−Ｓ−（ＰＧＳ）−（ＴＮ）−Ｘ−（ＶＴ）（配列番号７１１）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
Ｑ−Ｑ−（ＹＲ）−（ＧＳ）−Ｓ−（ＳＷ）−Ｐ−Ｒ−Ｘ１−Ｔ（配列番号１３９）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であるか、または不在であり得る）、
Ｑ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｈ（配列番号７２８）、
（ＬＱ）−（ＬＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＲＰ）−（ＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＴＩ）（配列番号１４０）または
（ＬＱ）−（ＬＲＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＡＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＳＶＲＰ）−（ＳＴＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＳＴＩ）（配列番号１４１）。
【００４０】
一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は一つ以上の以下の特性を有する：
ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１：
Ｓ−Ｘ−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列番号１４２）または
Ｔ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸（例えば、ＧまたＲ）であり、Ｘ２は任意のアミノ酸（例えば、ＹまたはＮ）であり、Ｘ３は任意のアミノ酸（例えば、Ｆ、ＮまたはＫ）であり、Ｘ４は任意のアミノ酸（例えば、脂肪族、例えば
ＶまたはＡ）である）；
ｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２：
（ＤＥ）−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４４）、
（ＤＥ）−（ＶＤ）−（ＳＴＤＮ）−（ＹＲＤＮ）−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４５）；
ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：
（ＳＱ）−Ｓ−（ＳＹ）−（ＡＳＩＤ）−（ＧＳＲ）−（ＳＴ）−（ＳＴＲＮ）−（ＳＴＹＲ）−（ＡＴＬＹ）−（ＳＶＷＱ）（配列番号１４６）。
【００４１】
一実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ２は以下のとおりのアミノ酸配列を含む：
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４７）または（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４８）。
【００４２】
一実施形態において、タンパク質は、ｐ−Ｆ３、Ｅ３またはＥ３ｂの対応するＣＤＲ配列に関連するＨＣ  ＣＤＲ１およびＨＣ  ＣＤＲ２配列を含む。例えば、タンパク質は、配列ＭＹＧＭ（配列番号１４９）をＨＣ  ＣＤＲ１に対応する位置に含む。この配列の後に小さいアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリンまたはセリンが続き得る。別の実施例において、タンパク質は、配列ＶＩＳＰＳＧＧＸ１ＴＸ２ＹＡＤＳＡＶＫＧ（配列番号１５０）をＨＣ  ＣＤＲ２に対応する位置に含む。例えば、Ｘ１は親水性アミノ酸、例えばグルタミンまたはアスパラギンであり得る。例えば、Ｘ２は小さいアミノ酸、例えばグリシン、アラニン、バリンまたはセリンであり得る。
【００４３】
一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列は以下の特徴、即ち、Ｋａｂａｔ３１位におけるアミノ酸残基がＡ、Ｈ、Ｋ、Ｎ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴ、例えばＨ、Ｎ、ＲまたはＳであり；Ｋａｂａｔ３２位におけるアミノ酸残基がＹであり；Ｋａｂａｔ３３位におけるアミノ酸残基がＧ、Ｋ、Ｐ、ＲまたはＶ、例えばＫまたはＶであり；Ｋａｂａｔ３４位におけるアミノ酸残基がＭであり；Ｋａｂａｔ３５位におけるアミノ酸残基がＡ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、ＳまたはＶ、例えばＧＨＭまたはＶであり；Ｋａｂａｔ５０位におけるアミノ酸残基がＧ、Ｒ、ＳまたはＶ、例えばＳまたはＶであり；Ｋａｂａｔ５１位におけるアミノ酸残基がＩであり；Ｋａｂａｔ５２位におけるアミノ酸残基がＳまたはＹ、例えばＹであり；Ｋａｂａｔ５２ａ位におけるアミノ酸残基がＰまたはＳ、例えばＰであり；Ｋａｂａｔ５３位におけるアミノ酸残基がＳであり；Ｋａｂａｔ５４位におけるアミノ酸残基がＧであり；Ｋａｂａｔ５５位におけるアミノ酸残基がＧであり；Ｋａｂａｔ５６位におけるアミノ酸残基がＡ、Ｆ、Ｈ、Ｉ、Ｑ、ＷまたはＹ、例えばＡ、ＷまたはＹであり；Ｋａｂａｔ５７位におけるアミノ酸残基がＴであり；Ｋａｂａｔ５８位におけるアミノ酸残基がＲ、Ｓ、ＴまたはＹ、例えばＹであること；の１つ以上を有することができる。一実施形態において、ＣＤＲ３の長さは８〜１８アミノ酸、例えば８〜１２、８〜１０、または１５〜１７アミノ酸である。
【００４４】
一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲは、本明細書中に記載される抗体のＨＣ可変ドメインにも適合するモチーフに適合する。同様に、一実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲは、本明細書中に記載される抗体のＬＣ可変ドメインにも適合するモチーフに適合する。さらに別の実施形態において、ＣＤＲに適合したモチーフは、本明細書中に記載される抗体で対となるＨＣおよびＬＣに基づく。
【００４５】
一実施形態において、Ｈ１およびＨ２の超可変ループは、本明細書中に記載される抗体と同じ標準構造を有する。一実施形態において、Ｌ１とＬ２の超可変ループは本明細書中に記載の抗体と同じ標準構造を有する。
【００４６】
一実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列は少なくとも５個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも３個、４個または５個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１５個、１６個または１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１０個、１２個、１４個、１５個、１６個または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１４個、１５個、１６個または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも７個または８個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５個、６個、７個または８個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ３配列と同一である。
【００４７】
一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲは本明細書中に記載されるモチーフに適合して、該モチーフは本明細書中に記載されるクローン、例えばＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣ可変ドメインに適合するモチーフの組となる。例えば、このタンパク質は、配列番号１１８および配列番号１６０、例えばＥ３  ＨＣ可変ドメインに適合するモチーフを含み得る。
【００４８】
一実施形態において、ＬＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列は、少なくとも１０個、１１個または１２個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７個、８個、９個、１０個または１１個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施形態において、ＬＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも６個または７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５個、６個または７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＬＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも８個、９個または１０個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７個、８個、９個または１０個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣのＣＤＲ３配列と同一である。
【００４９】
一実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列の二つまたは三つのＣＤＲは、本明細書中に記載されるモチーフに適合して、該モチーフが、本明細書中に記載されるクローン、例えばＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣ可変ドメインに適合するモチーフの組となる。例えば、このタンパク質は、配列番号１３２、配列番号１３６および配列番号１６１、例えばＥ３  ＬＣ可変ドメインに適合するモチーフを含み得る。
【００５０】
一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【００５１】
一実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【００５２】
一実施形態において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、および本明細書中の任意の他の抗体からなる群から選択されるクローンのＨＣおよびＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【００５３】
一実施形態において、ＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメインの一つ以上のフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３および／またはＦＲ４）のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４、または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣおよびＬＣ可変ドメインの対応するフレームワーク領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【００５４】
一実施形態において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列はＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４または本明細書に記載した他の抗体の可変ドメインをコードする核酸にハイブリダイズ（例えば高ストリンジェンシー下）する核酸によりコードされる配列を含む。
【００５５】
一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列は、ヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。
【００５６】
タンパク質は、Ｔｉｅ１を発現する細胞、例えば内皮細胞に結合し得る。一実施形態において、タンパク質は、血小板（例えば、静止および／または活性化血小板）に実質的に結合しない（例えば、検出可能に結合しない）。
【００５７】
一実施形態において、タンパク質はインビトロのＨＵＶＥＣによる管形成を阻害する。例えば、Ｅ３抗体はインビトロのＨＵＶＥＣによる管形成を阻害する（例えば実施例１８に記載の条件下）。一実施形態において、タンパク質はインビボＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグ試験において新脈管形成を阻害する。例えばＥ３抗体は例示的な試験（例えば実施例２１に記載する例示的な試験を参照）において新脈管形成を阻害できる。
【００５８】
一実施形態において、タンパク質は、組織切片中のメラノーマ関連構造物（例えば、メラノーマ組織）のみならず、周囲構造物の抗原を認識する。一実施形態において、タンパク質は、組織切片中の正常な皮膚の血管を染色しない。
【００５９】
一実施形態において、タンパク質はＴｉｅ１に特異的に結合し、例えば、該タンパク質は別のヒトタンパク質（例えば、Ｉｇ様ドメイン、ＥＧＦ様ドメインまたはフィブロネクチンタイプＩＩＩリピートを有するＴｉｅ１以外の天然タンパク質であるＴｉｅ２、またはヒト血清アルブミン）に比較して、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、１０３倍または１０４倍、優先的にＴｉｅ１に結合する。一実施形態において、タンパク質は、本明細書中に記載されるＴｉｅ１ドメインに結合する。
【００６０】
別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１の活性を調節するタンパク質（例えば、単離タンパク質）、例えばＴｉｅ１レセプターにより特徴付けられる。例えば、このタンパク質は天然のものではない。一実施形態において、タンパク質は、ＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のＣＤＲは、ヒト、霊長類、非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）または合成のものである。一実施形態において、重鎖および／または軽鎖可変ドメイン配列の一つ以上のフレームワーク領域は、ヒト、霊長類または非げっ歯類（例えば、非マウスまたは非ラット）のものである。別の実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリン可変ドメインを実質的に含まず、例えばタンパク質は、独立してＴｉｅ１と相互作用するペプチド、または免疫グロブリン可変ドメインを含まないポリペプチドを含む。
【００６１】
一実施形態において、タンパク質はＴｉｅ１タンパク質の活性、例えば実施例２に記載したＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３２おける活性を活性化する。この試験において活性化を示すタンパク質は他の条件、例えばインビボにおいて拮抗剤として挙動できる。
【００６２】
一実施形態において、タンパク質は、Ｅ３、Ｅ３ｂもしくは他の抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、Ｅ３、Ｅ３ｂもしくは本明細書中に記載の他の抗体の各ＣＤＲと、ＣＤＲ領域において少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、同一であるＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。一実施形態において、タンパク質はＴｉｅ１への結合に関してＥ３、Ｅ３ｂもしくは本明細書中に記載の他の抗体と競合するか、あるいはＥ３、Ｅ３ｂもしくは本明細書中に記載の他の抗体により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープ、またはＥ３、Ｅ３ｂもしくは本明細書中に記載の他の抗体により認識されるエピトープと共通する少なくとも一つ、二つもしくは三つの残基を有するエピトープに結合する。
【００６３】
一実施形態において、活性化タンパク質は、Ｔｉｅ１細胞外ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメイン等のキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存性細胞が、ＩＬ−３の不在において生存することを可能とする。
【００６４】
一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１の二量体化を引き起こし得る。一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１のＲＴＫドメインの自己リン酸化を引き起こし得る。
【００６５】
一実施形態において、タンパク質は、Ｅ３もしくはＥ３ｂ抗体と共働して、（例えば、Ｔｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞アッセイにおいて）Ｔｉｅの活性を活性化する。一実施形態において、タンパク質は、Ｇ２もしくはＣ７抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、またはＣＤＲ領域において少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、同一であるドメインを含む。一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１への結合に関してＧ２もしくはＣ７と競合するか、あるいはＧ２もしくはＣ７により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープ、またはＧ２もしくはＣ７により認識されるエピトープと共通する少なくとも一つ、二つもしくは三つの残基を有するエピトープに結合する。
【００６６】
別の実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１タンパク質の活性を中和する。例えば、このタンパク質は、Ｅ３またはＥ３ｂ抗体の能力を少なくとも部分的に阻害して、Ｔｉｅタンパク質に作用し得る。一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１細胞外ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメイン等のキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存性細胞がＩＬ−３の不在において生存することを可能とするＥ３またはＥ３ｂ抗体の能力を少なくとも部分的に阻害し得る。
【００６７】
一実施形態において、タンパク質のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列は、Ｂ２またはＤ１１の各免疫グロブリン可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、同一であるアミノ酸配列を含む。
【００６８】
一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、Ｂ２、Ｄ１１、Ａ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３およびＰ−Ｃ６からなる群から選択される抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、あるいはＣＤＲ領域において各抗体のＣＤＲ領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％、同一である免疫グロブリンドメインを含む。例えば、このタンパク質は、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和力ＫＤで結合する。
【００６９】
一実施形態において、タンパク質は、天然のＴｉｅ１結合タンパク質の能力がＴｉｅタンパク質と相互作用することを少なくとも部分的に阻害し得る。
【００７０】
タンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
【００７１】
別の局面において、本発明は、例えば、蛍光励起細胞分離により検出されるように、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合するが、血小板には実質的に結合しない抗体（例えば、単離された抗体）により特徴付けられる。例えば、抗体は、活性化血小板および／または静止血小板には実質的に結合しない。一実施形態において、抗体は内皮細胞に結合する。一実施形態において、タンパク質はモノクローナル抗体である。この抗体は、他の特性を有する他のＴｉｅ１結合抗体を含まない（例えば、血小板と結合するＴｉｅ１結合抗体を含まない）調製物中に提供し得る。この抗体は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
【００７２】
別の局面において、本発明は、非刺激状態の内因性Ｔｉｅ１タンパク質と比較して、Ｅ３またはＥ３ｂ抗体により安定化した立体配座のＴｉｅ１タンパク質に優先的に結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１に独立して結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのペプチド）を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載の他の特徴を含み得る。
【００７３】
別の局面において、本発明は、単量体Ｔｉｅ１タンパク質に比較して、二量体立体配座のＴｉｅ１タンパク質に優先的に結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してＴｉｅ１に結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのペプチド）を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
【００７４】
別の局面において、本発明は、ＡｎｇまたはＴｉｅ１との相互作用に偏する立体配座のＴｉｅ２タンパク質に優先的に結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してＴｉｅ２に結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのペプチド）を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。本発明はまた、これらの特性のうちの１つ以上を有する核酸アプタマーにより特徴付けられる。
【００７５】
別の実施形態において、本発明はＡｎｇタンパク質に優先的に結合し、そしてＴｉｅ１およびＴｉｅ２との相互作用を調節（例えば阻害）するタンパク質（例えば単離されたタンパク質）を特徴とする。一実施形態において、タンパク質は免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを包含する。別の実施形態において、タンパク質はＡｎｇに独立して結合するペプチド（例えば３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸より短い長さのもの）を包含する。例えばペプチドはジスルフィド結合１、２または３つを含むことができる。タンパク質は本明細書に記載した他の特徴を包含できる。本発明は又これ等の特性の１つ以上を有する核酸アプタマーを包含する。
【００７６】
別の局面において、本発明は、２×１０−７Ｍ未満のＫＤでＴｉｅ１外部ドメインのエピトープに結合するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。このエピトープは、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４もしくは本明細書中に記載される別の抗体が結合したエピトープ、または少なくとも一つ、二つもしくは三つの共通する残基を含むエピトープとオーバーラップするか、またはその一部であるか、またはそれを含む。例えば、このタンパク質は、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和力ＫＤで結合する。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してＴｉｅ１に結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのペプチド）を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。本発明はまた、これらの特性のうちの１つ以上を有する核酸アプタマーにより特徴付けられる。
【００７７】
別の局面において、本発明は、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＴｉｅ１外部ドメインへの結合を競合的に阻害するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、免疫グロブリンＨＣおよびＬＣドメインを含む。別の実施形態において、タンパク質は、独立してＴｉｅ１に結合するペプチド（例えば、３０、２８、２５、２２、２０、１８、１６または１４アミノ酸未満の長さのペプチド）を含む。例えば、このペプチドは、一つ、二つまたは三つのジスルフィド結合を含み得る。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
【００７８】
別の局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含み、かつＴｉｅ１外部ドメインの活性を中和するタンパク質（例えば、単離されたタンパク質）により特徴付けられる。一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ１は：Ｑ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｓ（配列番号１５１）またはＲ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｘ−Ｓ−Ｓ−Ｙ−Ｌ−Ａ（配列番号１５２）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であるか、または必要に応じて脂肪族、例えばイソロイシンもしくはバリンである）を含む。
【００７９】
一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ２は：Ａ−Ｓ−Ｘ１−Ｒ−Ｘ２−Ｔ（配列番号１５３）またはＤ−Ａ−Ｓ−Ｘ１−Ｒ−Ｘ２−Ｔ（配列番号１５４）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じて親水性アミノ酸、例えばセリンもしくはアスパラギンであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じて脂肪族もしくは小さい脂肪族、例えばアラニンもしくはバリンである）を含む。一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列のＣＤＲ３は；Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２−Ｗ−Ｐ−Ｒ（配列番号１５５）またはＸ１−Ｑ−Ｒ−Ｓ−Ｘ２−Ｗ−Ｐ−Ｒ−Ｔ（配列番号１５６）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてロイシンもしくはグルタミンであり、Ｘ２は任意のアミノ酸であるか、または必要に応じてリジンもしくはセリンである）を含む。一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１への結合に関してＢ２および／またはＤ１１抗体と競合するか、あるいはＢ２および／またはＤ１１のＴｉｅ１への結合を競合的に阻害する。
【００８０】
一実施形態において、タンパク質は、Ｅ３またはＥ３ｂ抗体により刺激されるＴｉｅ１活性を中和する。一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１の二量体化を阻害する。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
【００８１】
別の局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質であって、該タンパク質がＴｉｅ１外部ドメインに結合し、かつヒトまたは非マウス定常ドメイン（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４定常ドメイン）を含む単離された単一特異性タンパク質により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
【００８２】
別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合する単離されたヒト抗体により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
【００８３】
別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合し、かつ起源が非ヒトであって５個、４個、３個もしくは２個未満のペプチド（長さが６〜９アミノ酸のペプチド）または潜在的なヒトＴ細胞エピトープである５個、４個、３個または２個未満のペプチドを含む単離された抗体（例えば、単離された抗体）により特徴付けられる。一実施形態において、抗体は、起源が非ヒトであるか、または潜在的なヒトＴ細胞エピトープであるペプチド（長さが６〜９アミノ酸のもの）は含まない。
【００８４】
一実施形態において、抗体は、脱免疫化（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ）を含む方法により得られる。例えば、この抗体は、脱免疫化される（例えば、完全に脱免疫化される）。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
【００８５】
別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１外部ドメインに結合し、かつ改変Ｆｃドメイン（例えば、改変ヒトＦｃドメイン）を含む単離された抗体により特徴付けられる。例えば、抗体は、例えばＦｃ機能を変える改変を含み得る。例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域を、一つ以上の残基、例えば米国特許第５，６４８，２６０号中の番号によると、例えば残基２３４と２３７のうちの一つ以上において変異させ得る。他の例示的な改変は、米国特許第５，６４８，２６０号に記載される改変を含む。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
【００８６】
別の局面において、本発明は、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和力ＫＤでＴｉｅ１レセプターに結合する単離されたタンパク質により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載される他の特徴を含み得る。
【００８７】
別の局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質であって、該タンパク質がＴｉｅ１外部ドメインに結合し、かつ例えば、非霊長類ＣＤＲ（例えば、非マウスまたは非ウサギＣＤＲ）または合成ＣＤＲである少なくとも一つ以上のＣＤＲを含む、単離されたタンパク質により特徴付けられる。このタンパク質は、本明細書中に記載の他の特徴を含み得る。
【００８８】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１に結合する抗原結合タンパク質の免疫グロブリンＨＣ可変ドメインを包含するポリペプチドをコードするコーディング配列を包含する単離された核酸を特徴とする。核酸またはポリペプチドは本明細書に記載した他の特徴１つ以上を包含できる。核酸は改変されたコドン１つ以上を包含できる。一実施形態において、核酸は配列番号７２５および／または７２６を包含する。また、特徴となるのは、配列番号７２５および／または７２６を包含する哺乳類発現ベクターである。
【００８９】
一実施形態において核酸は更に免疫グロブリンＨＣ可変ドメイン、例えば本明細書に記載したＨＣドメインを包含するポリペプチドをコードする第２のコーディング配列を包含する。一実施形態において、核酸は更にコーディング配列に作動可能に連結したプロモーターを包含する。
【００９０】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１に結合する抗原結合タンパク質の免疫グロブリンＨＣまたはＬＣ可変ドメインを集合的に包含するポリペプチド鎖１つ以上をコードするコーディング配列１つ以上を包含する核酸を特徴とする。一実施形態において、可変ドメイン少なくとも１つをコードする核酸セグメントは例えばストリンジェントな条件下（例えば高ストリンジェンシー条件下）で本明細書に記載した核酸にハイブリダイズし、例えば可変ドメインをコードする領域にハイブリダイズし、そして、そのような領域に長さの少なくとも８０、８５、９０、９５または９８％である。核酸は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
【００９１】
別の局面において、本発明は抗原結合タンパク質のＨＣ可変ドメインを包含するポリペプチドをコードする第１の核酸配列および抗原結合タンパク質のＬＣ可変ドメインを包含するポリペプチドをコードする第２の核酸配列を含有する宿主細胞を特徴とし、ここで抗原結合タンパク質は２×１０−７Ｍ未満のＫＤでＴｉｅ１に結合する。一実施形態において、ＨＣまたはＬＣ可変ドメインはヒトＣＤＲ少なくとも１つを包含する。抗原結合タンパク質は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
【００９２】
別の局面において、本発明はＨＣ可変領域を包含するポリペプチドをコードする第１の核酸およびＬＣ可変領域を包含するポリペプチドをコードする第２の核酸を含有する宿主細胞を特徴とし、ここでＨＣおよびＬＣの可変領域は各々、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０およびｓ−Ｈ４よりなる群から選択されるクローンのＨＣおよびＬＣ可変ドメインの対応するアミノ酸配列に少なくとも７０、８０、８５、９０、９２、９５、９７、９８、９９または１００％同一のものを包含する。抗原結合タンパク質は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
【００９３】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１と相互作用する本明細書に記載したタンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを包含する薬学的組成物を特徴とする。
【００９４】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１と相互作用する本明細書に記載したタンパク質を包含する治療用組成物を特徴とし、ここで組成物は滅菌され、被験体への投与のために適している。
【００９５】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１細胞外ドメインを包含するキメラレセプターおよびシグナルを発生できる非相同の細胞内配列を発現するシグナル依存性またはシグナル応答性の細胞を準備すること；細胞に候補化合物を接触させること；およびシグナルに依存している細胞の特性を評価することを包含する方法を特徴とする。一実施形態において、細胞内配列はＥｐｏＲタンパク質の細胞内配列の少なくとも領域を包含する。方法は例えば候補化合物または複数の化合物の活性を評価するために使用できる。
【００９６】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１細胞外ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメインを包含するキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存細胞を提供すること；ＩＬ−３の濃度が細胞の生存性を持続させるために十分ではない条件下で細胞に候補化合物を接触させること；および細胞の特性を評価することを包含する方法を特徴とする。方法は例えば候補化合物または複数の化合物の活性を評価するために使用できる。一実施形態において、特性は生存性である。一実施形態において評価することはＭＴＴ試験を包含する。一実施形態において、方法は更に被験体に候補化合物を投与することを包含する。例えば、候補化合物は、タンパク質、例えば免疫グロブリン可変ドメインを包含するタンパク質を包含する。
【００９７】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１活性を調節する化合物を発見する方法を特徴とする。方法は、化合物候補複数を準備すること；および本明細書に記載した方法を用いて複数の化合物の各々を評価することを包含する。
【００９８】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１細胞外ドメインの領域および非相同の細胞内配列を包含するキメラ膜貫通タンパク質を発現する培養細胞を特徴とする。一実施形態において、細胞内配列はＥｐｏＲ細胞内ドメインの領域を包含する。一実施形態において、細胞は生存性のためにはＩＬ−３またはＴｉｅ１を必要とする。例えば、細胞はキメラ膜貫通タンパク質の非存在下ではＩＬ−３依存性であるが、Ｅ３またはＥ３ｂ抗体の存在下およびＩＬ−３の非存在下では生存性である。
【００９９】
別の局面において、本発明は単離された哺乳類細胞（例えばＴｉｅ１細胞外ドメインの領域および非相同の細胞内配列を包含するキメラ膜貫通タンパク質を発現する細胞）およびＴｉｅ１結合タンパク質を包含する調製品を特徴とし、ここでＴｉｅ１結合タンパク質は細胞の生存正の維持のために必要である。
【０１００】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１結合タンパク質およびＴｉｅ１細胞外ドメインの領域および非相同の細胞内配列を包含するキメラ膜貫通タンパク質を発現する培養細胞を包含するキットを特徴とする。
【０１０１】
別の局面において、本発明は候補化合物を評価する方法を特徴とする。方法は（ｉ）（ａ）Ｔｉｅ１細胞外ドメインおよびキナーゼドメインの領域を包含する不溶性タンパク質および（ｂ）ＡＴＰを含有する細胞または膜の画分；（ｉｉ）キナーゼドメインの活性を改変するリガンド；および（ｉｉｉ）候補化合物を包含する調製品を準備すること；および不溶性タンパク質のリン酸化の状態を評価することを包含する。
【０１０２】
別の局面において、本発明は候補化合物を評価する方法を特徴とする。方法は（ｉ）Ｔｉｅ１タンパク質またはＴｉｅ１細胞外ドメインの領域を少なくとも包含する膜貫通タンパク質およびＡＴＰを包含する細胞または膜画分、（ｉｉ）Ｔｉｅ１または膜貫通タンパク質の自己リン酸化を促進するリガンド；および（ｉｉｉ）候補化合物を包含する調製品を準備すること；およびＴｉｅ１タンパク質のリン酸化の状態を評価することを包含する。
【０１０３】
一実施形態において、リガンドは抗体である。一実施形態において、リガンドはＥ３またはＥ３ｂ抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＣＤＲ領域に少なくとも９０％同一であるドメインを包含する。一実施形態において、方法は更に被験体に候補化合物を投与することを包含する。
【０１０４】
別の局面において、本発明は（ｉ）Ｔｉｅ１細胞外ドメインの領域少なくとも１つを包含する膜貫通タンパク質およびＡＴＰを包含する細胞または膜画分；および（ｉｉ）Ｔｉｅ１または膜貫通タンパク質の自己リン酸化を促進するリガンドを包含する調製品を準備すること；および膜貫通タンパク質のリン酸化の状態を評価することを包含する方法を特徴とする。
【０１０５】
別の局面において、本発明は（ｉ）Ｔｉｅ１の自己リン酸化をアゴナイズすることができ、および／または（ｉｉ）Ｔｉｅ１細胞外ドメインおよびＥｐｏＲ細胞内ドメインを包含するキメラレセプターを発現するＩＬ−３依存性細胞をＩＬ−３の濃度が細胞の生存性を持続させるために十分ではない条件下で生存性に維持することができるリガンドに哺乳類細胞を接触させること；および哺乳類細胞を評価することを包含する方法を特徴とする。一実施形態において、細胞は内因性のＴｉｅ１タンパク質を発現する。一実施形態において、細胞は内皮細胞である。一実施形態において、方法は更にリガンド以外の被験化合物に哺乳類細胞を接触させることを包含する。例えばリガンドは抗体である。例えば、リガンドはＥ３またはＥ３ｂ抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＣＤＲ領域に少なくとも９０％同一であるドメインを包含する。
【０１０６】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１の活性を調節できる薬剤に哺乳類細部またはその画分を接触させること；および哺乳類細胞またはその画分を評価することを包含する方法を特徴とする。一実施形態において、薬剤は細胞生存時に細胞に接触させ、そして評価は細胞の画分を単離することを包含する。一実施形態において、薬剤はタンパク質、例えば抗体またはペプチドである。一実施形態において、薬剤はＥ３またはＥ３ｂ抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＥ３またはＥ３ｂ抗体のＣＤＲ領域に少なくとも９０％同一であるドメインを包含する。一実施形態において、薬剤はＢ２またはＤ１１抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＢ２またはＤ１１抗体のＣＤＲ領域に少なくとも９０％同一であるドメインを包含する。一実施形態において、薬剤はＡ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３またはＰ−Ｃ６抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＡ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３またはＰ−Ｃ６抗体のＣＤＲ領域に少なくとも７０、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９または１００％同一であるドメインを包含する。一実施形態において、薬剤はＧ２またはＣ７抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたはＧ２またはＣ７抗体のＣＤＲ領域に少なくとも９０％同一であるドメインを包含する。薬剤は本明細書記載の他の特徴を包含することができる。
【０１０７】
別の局面において、本発明は被験化合物を評価する方法を特徴とする。方法は被験化合物存在下のＴｉｅ１の活性を調節する薬剤とＴｉｅ１細胞外ドメインの少なくとも領域を包含するタンパク質との間の相互作用を評価することを包含する。一実施形態において、薬剤、被験化合物は、８０００、７０００、６０００、５０００または３０００ダルトン未満の分子量を有する小型有機化合物である。例えば評価は、被験化合物の存在下、薬剤にＴｉｅ１細胞外ドメインの少なくとも領域を包含するタンパク質を包含する細胞を接触させることを包含する。別の例においては、評価はＴｉｅ１細胞外ドメインの少なくとも領域を包含するタンパク質、薬剤および被験化合物を包含する無細胞調製品を形成することを包含する。
【０１０８】
別の局面において、本発明は（ｉ）Ｔｉｅ１細胞外ドメインを包含するタンパク質、および（ｉｉ）Ｔｉｅ１の活性を調節（例えばアゴナイズまたは拮抗）できるＴｉｅ１結合タンパク質を包含する人工タンパク質複合体を特徴とする。一実施形態において、リガンドは抗体（例えば本明細書に記載した抗体）である。例えば、リガンドはＥ３、Ｅ３ｂ、Ｂ２、Ｄ１１、Ａ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３、Ｐ−Ｃ６、Ｇ２およびＣ７よりなる群から選択される抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインまたは対応する抗体のＣＤＲ領域にＣＤＲ領域において少なくとも９０％同一である免疫グロブリンドメインを包含する。一実施形態において、複合体は哺乳類細胞の膜画分中、および／または、被験体中に存在する。
【０１０９】
別の局面において、本発明はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇと相互作用するタンパク質（例えば本明細書に記載したタンパク質）を包含する組成物を、被験体における新脈管形成を低減するため、または、他の態様において被験体における障害を治療または防止するために有効な量で被験体に投与することを包含する方法を特徴とする。例えばタンパク質は１０−８Ｍ、５・１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、１０−１０Ｍ、１０−１１Ｍまたは１０−１２Ｍ未満の親和性ＫＤでＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する。
【０１１０】
一実施形態において、タンパク質はＴｉｅ１結合タンパク質である。タンパク質は少なくとも２つの結合価を有し、その各々がＴｉｅ１に結合する。例えば結合価の少なくとも１、２または全てがＴｉｅ１への結合に関してＥ３と競合する結合部位であることができる。一実施形態において、タンパク質はＴｉｅ１への結合に関してＥ３と競合するか、またはＴｉｅ１上のＥ３により結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合する。
【０１１１】
一実施形態において、タンパク質は重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む。タンパク質は更に、以下の特性、即ち、（１）Ｅ３抗体のＣＤＲ少なくとも１つを含む可変ドメイン配列少なくとも１つ；（２）Ｅ３抗体の対応する可変ドメインのＣＤＲに合計で少なくとも８５％同一であるＣＤＲ配列を含む可変ドメイン配列少なくとも１つ；（３）可変ドメインの少なくとも１つがＥ３抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であること；および（４）タンパク質がＴｉｅ１への結合に関してＥ３と競合するか、または、Ｔｉｅ１上のＥ３により結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合すること、の１つ以上を包含する。
【０１１２】
一実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン配列のＣＤＲの１つ以上はヒト、霊長類、非げっ歯類（例えば非マウスまたは非ラット）または合成の型である。一実施形態において、重鎖および／または軽鎖の可変ドメイン配列のフレームワーク領域の１つ以上はヒト、霊長類または非げっ歯類（例えば非マウスまたは非ラット）型である。
【０１１３】
一実施形態において、重鎖は、以下の特性のうちの一つ以上を有する。
【０１１４】
ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１：
（ＡＧＳＲ）−Ｙ−（ＧＶＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＦ）（配列番号１１７）、
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）または
（ＡＧＳＩＭＲＮＨ）−Ｙ−（ＡＧＴＶＭＫＰＱ）−Ｍ−（ＡＧＳＴＶＭＹＷＦＫＨ）（配列番号１１９）；
ｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−Ｘ−Ｔ−Ｘ−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１２１）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２２）、
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）（配列番号１２３）；または
Ｘ−Ｉ−Ｙ−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＰＳ）−Ｔ−（ＹＶＨ）−Ｙ−Ａ−Ｄ（配列番号７０４）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）；
ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３：
Ｖ−（４または５残基）−Ｆ−Ｄ−（Ｉ／Ｙ）（配列番号１２４）、
Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２５）、
（ＧＶ）−Ｎ−Ｙ−Ｙ−（ＧＹＤ）−Ｓ−（ＳＤ）−Ｇ−Ｙ−Ｇ−Ｐ−Ｉ−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２６）、
（ＧＶＤ）−（ＡＧＬＮ）−（ＬＹＲ）−（ＧＳＴＬＹＨ）−（ＧＹＤ）−（ＡＧＳＹＦＰ）−（ＳＦＤ）−（ＡＧＹＤ）−（ＩＹ）−（ＧＦＤ）−（ＹＤＰ）−（ＩＰ）−Ａ−Ｐ−Ｇ−Ｌ−Ｄ−Ｙ（配列番号１２７）、
ＶＮＹＹＤＳＳＧＹＧＰＩＡＰＧＬＤＹ（配列番号１２８）または
Ｇ−Ｘ−Ｘ−Ｇ−（ＡＹ）−Ｆ−Ｄ−（ＹＩ）（配列番号７０５）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）。
【０１１５】
一実施形態において、軽鎖は、以下の特性のうちの一つ以上を含む：
ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ１：
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−Ｘ１−Ｙ−Ｌ−（ＡＮ）（配列番号１２９）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−Ｓ−（ＹＳ）−Ｌ−（ＡＬＮ）（配列番号７０６）、
Ｔ−Ｇ−Ｔ−（ＳＮ）−Ｓ−Ｄ−Ｖ−Ｇ−（ＧＳ）−Ｙ（配列番号７０７）、
（ＳＧＱ）−（ＧＳ）−（ＤＳ）−（ＮＳ）−（ＩＬ）−（ＧＲ）−Ｓ−（ＹＫＮ）−（ＹＳ）−（ＶＡ）（配列番号７０８）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−Ｖ−Ｓ−Ｓ−Ｘ−Ｌ（配列番号１３０）、
Ｒ−Ａ−Ｓ−Ｑ−Ｓ−（ＩＶ）−Ｓ−（ＳＲ）−（ＳＹ）−（ＬＹ）−（ＡＬＮ）（配列番号１３１）または
Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）（式中、Ｘ１はセリンであるか、または不在であり得る）；
ｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２：
Ｘ−Ａ−Ｓ−Ｘ−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３３）（式中、Ｘは任意のアミノ酸であり得る）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−Ｒ−Ａ−Ｔ（配列番号１３４）、
（ＤＧ）−（ＡＶ）−Ｓ−Ｎ−（ＲＬ）−（ＡＰ）−（ＳＴ）（配列番号７０９）、
（ＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３５）または
（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）；および
ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：
Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３７）、
（ＬＱ）−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＫＮ）−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲ）−（ＴＩＹ）−Ｔ（配列番号１３８）、
Ｑ−Ｑ−Ｘ−Ｓ−（ＳＮ）−（ＷＳ）−Ｐ−Ｘ−Ｔ−Ｆ（配列番号７１０）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
Ｙ−（ＴＧ）−（ＳＧ）−Ｓ−（ＰＧＳ）−（ＴＮ）−Ｘ−（ＶＴ）（配列番号７１１）（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）、
Ｑ−Ｑ−（ＹＲ）−（ＧＳ）−Ｓ−（ＳＷ）−Ｐ−Ｒ−Ｘ１−Ｔ（配列番号１３９）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸であるか、または存在しない）、
（ＬＱ）−（ＬＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＲＰ）−（ＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＴＩ）（配列番号１４０）または
（ＬＱ）−（ＬＲＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＡＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＳＶＲＰ）−（ＳＴＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）−（ＳＴＩ）（配列番号１４１）。
【０１１６】
一実施形態において、重鎖は以下の特性：
ｉ）下記：
（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）または、
（ＡＧＳＩＭＲＮＨ）−Ｙ−（ＡＧＴＶＭＫＰＱ）−Ｍ−（ＡＧＳＴＶＭＹＷＦＫＨ）（配列番号１１９）
のアミノ酸配列を包含するＨＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）下記：
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＮＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）、
（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＮＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−Ａ−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１２２）、または、
（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）（配列番号１２３）、
のアミノ酸配列を包含するＨＣ  ＣＤＲ２；
ｉｉｉ）下記：
ＡＰＲＧＹＳＹＧＹＹＹ（配列番号７１２）
のアミノ酸配列を包含するＨＣ  ＣＤＲ３；
の１つ以上を包含する。
【０１１７】
一実施形態において、軽鎖は以下の特性：ｉ）以下：Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）、ただしＸ１はセリンまたは非存在であるもののアミノ酸配列を包含するＬＣＣＤＲ１；ｉｉ）以下：（ＴＡＧＤ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号７１３）または（ＡＧＴＫＤＥＨ）−Ａ−Ｓ−（ＳＴＮ）−（ＬＲ）−（ＡＶＥＱ）−（ＳＴ）（配列番号１３６）のアミノ酸配列を包含するＬＣＣＤＲ２；およびｉｉｉ）以下：Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＨＷＲ）−（ＴＩＹ）（配列番号７１４）、（ＬＱ）−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＫＮ）−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＨＷＲ）−（ＴＩＹ）（配列番号７１５）、または、（ＬＱ）−（ＬＱ）−（ＳＹＦＲＤ）−（ＧＳＹＮ）−（ＳＴＲＫＮ）−（ＳＴＹＷＦ）−（ＲＰ）−（ＩＬＭＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号７１６）のアミノ酸配列を包含するＬＣＣＤＲ３；の１つ以上を包含する。
【０１１８】
一実施形態において、軽鎖は以下の特性のうちの一つ以上を含む：ｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１：Ｓ−Ｘ−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３（配列場号１４２）またはＴ−（ＧＲ）−（ＳＴ）−Ｓ−Ｘ５−（ＮＤ）−（ＩＶ）−（ＡＧ）−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｙ−Ｘ４−Ｓ（配列番号１４３）（式中、Ｘ１は任意のアミノ酸（例えば、ＧまたはＲ）であり、Ｘ２は任意のアミノ酸（例えば、ＹまたはＮ）であり、Ｘ３は任意のアミノ酸（例えば、Ｆ、ＮまたはＫ）であり、Ｘ４は任意のアミノ酸（例えば、脂肪族、例えば、ＶまたはＡ）である）；ｉｉｉ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２：（ＤＥ）−Ｖ−Ｎ−Ｎ−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４４）；（ＤＥ）−（ＶＤ）−（ＳＴＤＮ）−（ＹＲＤＮ）−Ｒ−Ｐ−Ｓ（配列番号１４５）；ｖ）以下のとおりのアミノ酸配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３：（ＳＱ）−Ｓ−（ＳＹ）−（ＡＳＩＤ）−（ＧＳＲ）−（ＳＴ）−（ＳＴＲＮ）−（ＳＴＹＲ）−（ＡＴＬＹ）−（ＳＶＷＱ）（配列番号１４６）。
【０１１９】
一実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ２は、以下のとおりのアミノ酸配列を含む：（ＧＳＶＷ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＡＧＶＭＹＷＰＱＨ）−Ｔ−（ＡＧＳＴＬＶＭＹＦＫＨ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４７）または（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−ＳＧ−Ｇ−（ＷＱ）−Ｔ−（ＧＹ）−Ｙ−（ＡＴ）−Ｄ−Ｓ−Ｖ−Ｋ−Ｇ（配列番号１４８）。
【０１２０】
一実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ１アミノ酸配列は、少なくとも５個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも３個、４個または５個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ１配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１５個、１６個または１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１０個、１２個、１４個、１５個、１６個または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ２アミノ酸配列は、少なくとも１７個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも１４個、１５個、１６個または１７個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＨＣ  ＣＤＲ３アミノ酸配列は、少なくとも７個または８個のアミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５個、６個、７個または８個のアミノ酸は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣのＣＤＲ３配列と同一である。
【０１２１】
一実施形態において、ＬＣＣＤＲ１アミノ酸配列は少なくとも１０、１１または１２アミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７、８、９、１０または１１アミノ酸はクローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書に記載した他の抗体のＬＣ  ＣＤＲ１配列と同一である。一実施形態において、ＬＣＣＤＲ２アミノ酸配列は少なくとも６または７アミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも５、６または７アミノ酸はクローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書に記載した他の抗体のＬＣ  ＣＤＲ２配列と同一である。一実施形態において、ＬＣＣＤＲ３アミノ酸配列は少なくとも８，９または１０アミノ酸の長さを有し、そのうち少なくとも７、８、９または１０アミノ酸はクローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書に記載した他の抗体のＬＣ  ＣＤＲ３配列と同一である。
【０１２２】
一実施形態において、ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１２３】
一実施形態において、ＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１２４】
一実施形態において、ＨＣおよびＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列は、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０およびｓ−Ｈ４からなる群から選択されるクローンのＨＣおよびＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１２５】
一実施形態において、ＨＣおよび／またはＬＣ可変ドメインの一つ以上のフレームワーク領域（例えば、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、および／またはＦＲ４）のアミノ酸配列は、クローンＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体のＨＣおよびＬＣ可変ドメインの対応するフレームワーク領域と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。
【０１２６】
一実施形態において、軽鎖可変ドメイン配列は、ヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。一実施形態において、重鎖可変ドメイン配列はヒト性、またはヒトにおいて非免疫原性である。
【０１２７】
タンパク質は、Ｔｉｅ１を発現する細胞、例えば内皮細胞に結合し得る。一実施形態において、タンパク質は、血小板に実質的に結合しない（例えば検出可能に結合しない）。
【０１２８】
一実施形態において、タンパク質は、Ｔｉｅ１に特異的に結合し、例えば、別のヒトタンパク質（例えば、Ｉｇ様ドメイン、ＥＧＦ様ドメインまたはフィブロネクチンタイプＩＩＩリピートを有するＴｉｅ１以外の天然タンパク質であるＴｉｅ２、またはヒト血清アルブミン）と比較して、少なくとも１０倍、５０倍、１００倍、１０３倍または１０４倍、優先的にＴｉｅ１に結合する。一実施形態において、タンパク質は、本明細書中に記載のＴｉｅ１ドメインに結合する。
【０１２９】
一実施形態において、タンパク質は局所的に送達される。一実施形態において、タンパク質は全身に送達される。
【０１３０】
一実施形態において、被験体は、血管形成の低減を必要とするか、またはそのように同定されている。例えば、この被験体は、血管形成関連疾患を有する。別の例において、被験体は、腫瘍性障害、例えば、転移性癌を有する。例えば、この被験体は、血管形成に依存する癌または腫瘍を有する。腫瘍は固形腫瘍、例えば直径が少なくとも１、２、３、５、８または１０ｍｍの腫瘍であることができる。一実施形態において、固形腫瘍は低酸素コアを有する。方法は更に代謝拮抗剤（例えば５−ＦＵとロイコボリン）、イリノテカン（または他のトポイソメラーゼ阻害剤）、ドキソルビシン、ベバシズマブまたはこれ等の薬剤の全てを投与することを包含してよい。方法は拮抗剤投与前に、被験体を評価することおよび被験体における固形腫瘍を検出することを包含できる。
【０１３１】
別の実施形態においては、被験体は炎症性障害、例えば関節リウマチ、乾癬、リウマチ様またはリウマチ性の炎症性疾患、または他の慢性炎症障害、例えば慢性喘息、動脈または移植後のアテローム性動脈硬化症および子宮内膜症を有する。治療できる他の障害は、脱調節された、または望ましくない新脈管形成、例えば眼の新生血管形成、例えば網膜症（糖尿病性網膜症および加齢関連黄斑変性を包含する）、血管芽腫、血管腫および動脈硬化を包含する。
【０１３２】
一実施形態において、タンパク質を、以下の活性のうちの一つ以上を低減するのに有効な量で投与する：血管の出芽、分裂および再造形。一実施形態において、タンパク質を、脈管形成または細管形成を低減させるのに有効な量で投与する。
【０１３３】
一実施形態において、該方法はさらに、投与前に、血管形成の低減を必要とする被験体として被験体を同定する工程を包含する。一実施形態において、この方法はさらに、タンパク質を連続的または別個の丸薬にて投与する工程を包含する。一実施形態において、この方法はさらに、投与期間中の被験体をモニタリングする工程を包含する。例えば、このモニタリングは、被験体の血管を（局所的または全体的に）画像化する工程を包含する。別の例において、このモニタリングは、被験体において、腫瘍の大きさまたは腫瘍の容量を評価する工程を包含する。
【０１３４】
別の局面において、本発明は：本明細書中に記載のタンパク質（例えば、Ｔｉｅ１活性を低下させるタンパク質）を含む組成物を、被験体のＴｉｅ１活性を低下させるのに有効な量で被験体に投与する工程を含む方法により特徴付けられる。この方法は、本明細書中に記載の他の特徴を含み得る。
【０１３５】
別の局面において、本発明は：本明細書中に記載のタンパク質（例えば、Ｔｉｅ１活性を調節し得るタンパク質）を含む組成物を、被験体の内皮細胞の活性を調節するのに有効な量で被験体に投与する工程を包含する方法により特徴付けられる。一実施形態において、タンパク質は、循環中に送達される。
【０１３６】
一実施形態において、組成物は、内皮細胞を治療に対して増感させ、増感させた内皮細胞を阻害、死滅、剥離または抑止する治療を被験体に提供するのに有効である。
【０１３７】
別の局面において、本発明は：（ｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こり得る条件下において、サンプル（および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）を、Ｔｉｅ１に結合するタンパク質、例えば本明細書中に記載のタンパク質と接触させる工程；ならびに（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とサンプル（および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）との複合体の形成を検出する工程を含む方法により特徴付けられる。
【０１３８】
別の局面において、本発明は：（ｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こり得る条件下において、Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を、被験体（および必要に応じて、コントロール被験体）に投与する工程；ならびに（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質と被験体のＴｉｅ１分子との複合体の形成を検出する工程、あるいは被験体中のＴｉｅ１結合タンパク質の分布またはＴｉｅ１結合タンパク質の少なくとも一つの位置を検出する工程を含む方法により特徴付けられる。一実施形態において、Ｔｉｅ１タンパク質は、Ｔｉｅ１の活性を調節しない。Ｔｉｅ１結合タンパク質は、本明細書中に記載のタンパク質であり得る。一実施形態において、リガンドは、活性化Ｔｉｅ１を検出する。
【０１３９】
Ｔｉｅ１に結合する抗体は好ましくは単一特異性、例えばモノクローナル抗体、またはその抗原結合フラグメントである。例えば、この抗体は生細胞上のＴｉｅ１、例えば内因性Ｔｉｅ１分子または異種核酸から発現するＴｉｅ１分子を認識し得る。一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、主要な内皮細胞と相互作用する。用語「単一特異性抗体」は、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体をいう。この用語は、単一の分子種として、例えば同種の単離細胞の個体群から生成される抗体をいう「モノクローナル抗体」を含む。「モノクローナル抗体組成物」とは、抗体の単一分子種を含む組成物中の抗体またはそのフラグメントの調製物をいう。一実施形態において、モノクローナル抗体は、哺乳動物細胞により生成される。一種以上のモノクローナル抗体種を組み合わせ得る。
【０１４０】
Ｔｉｅ１結合抗体は、全長（例えば、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、ＩｇＭ、ＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２）、ＩｇＤおよびＩｇＥ）であり得るか、または抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２またはｓｃＦｖフラグメント）のみを含み得る（例えば、Ｆｃドメイン、またはＣＨ２、ＣＨ３もしくはＣＨ４配列を含まない）。この抗体は、二つの重鎖免疫グロブリンおよび二つの軽鎖免疫グロブリンを含み得るか、または単一鎖抗体であり得る。抗体は、必要に応じて、κ、λ、α、γ、δ、εまたはμ定常領域遺伝子から選択される定常領域を含み得る。Ｔｉｅ１結合抗体は、実質的にヒト抗体からの重鎖および軽鎖定常領域、例えば、ヒトＩｇＧ１定常領域またはその一部を含み得る。
【０１４１】
一実施形態において、抗体（またはそのフラグメント）は、組換え抗体または改変抗体、例えば、キメラ、ヒト化、脱免疫化またはインビトロで生成される抗体である。用語「組換え」または「改変」ヒト抗体は、本明細書中で使用される場合、組換え手段により調製、発現、作成または単離されるすべての抗体、例えば、宿主細胞にトランスフェクトした組換え発現ベクターを用いて発現させた抗体、組換え体から単離させた抗体、コンビナトリアル抗体ライブラリー、ヒト免疫グロブリン遺伝子導入動物（例えば、マウス）から単離させた抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他ＤＮＡ配列へのスプライシングをともなう任意の他の手段により調製、発現、作成もしくは単離された抗体を含むことが意図される。そのような組換え抗体は、ヒト化抗体、ＣＤＲ移植抗体、キメラ抗体、脱免疫化抗体、インビトロで生成される抗体を含み、必要に応じて、ヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に由来する定常領域を含み得る。
【０１４２】
一実施形態において、抗体は、Ｔｉｅ１に結合する公知のモノクローナル抗体（例えば、ＷＯ９５／２６３６４に記載される抗体、例えば３Ｃ４Ｃ７Ｇ６および１０Ｆ１１Ｇ６）が結合するエピトープとは異なるエピトープに結合する。別の実施形態において、抗体は、Ｔｉｅ１に結合する公知のモノクローナル抗体、例えば、３Ｃ４Ｃ７Ｇ６および１０Ｆ１１Ｇ６と競合しない。さらに別の実施形態において、抗体は、本明細書中に記載されるリガンド、例えば、Ｅ３抗体と競合しない。
【０１４３】
本明細書中に開示されるタンパク質（例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合するタンパク質）のオーバーラップしているエピトープと結合するか、あるいはこれらのタンパク質の結合を競合的に阻害する抗体または他の因子（例えば、タンパク質または非タンパク質因子）もまた、本発明の範囲内にある。例えば、抗体または他の因子は、単一特異性抗体、例えば、Ｅ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載される別の抗体のオーバーラップしているエピトープと結合するか、あるいはこの抗体のＴｉｅ１への結合を競合的に阻害するか、またはその逆である（例えば、リガンドの結合を競合的に阻害する単一特異性抗体）。オーバーラップしているエピトープは、少なくとも一つの共通するアミノ酸を含み得る。互いの結合を競合的に阻害する因子は、オーバーラッピングするエピトープに必ずしも結合しない。例えば、それらは立体傷害により、またはＴｉｅ１の立体配座を変えることにより結合を阻害し得る。
【０１４４】
結合タンパク質の任意の組合せ、例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇの異なるドメインに結合する二つ以上の抗体（例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇの細胞外ドメイン上の二つの異なるエピトープに結合する抗体（例えば、二重特異性抗体））の組み合わせは、本発明の範囲内にある。
【０１４５】
一実施形態において、Ｔｉｅ１結合抗体またはその抗原結合フラグメントは、少なくとも一つの軽鎖もしくは重鎖の免疫グロブリン（または好ましくは、少なくとも一つの軽鎖免疫グロブリンおよび少なくとも一つの重鎖免疫グロブリン）を含む。好ましくは、各免疫グロブリンは、抗Ｔｉｅ１軽鎖もしくは重鎖の可変領域のそれぞれから、すなわち、本明細書中に記載される抗体（例えばＥ３、Ｅ３ｂ、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３、ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０、ｓ−Ｈ４または本明細書中に記載の別の抗体）の可変領域から、ＣＤＲに実質的に同一である少なくとも一つ、二つ、好ましくは三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する軽鎖または重鎖可変領域を含む。
【０１４６】
一局面において、本発明はＴｉｅ１リン酸化を増大させることにより内皮細胞活性を低減する薬剤（例えば抗体）を特徴とする。一実施形態において、抗体は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。
【０１４７】
一局面において、本発明はシグナリング経路を活性化することにより内皮細胞活性を低減する薬剤（例えば抗体）を特徴とする。一実施形態において、抗体は内皮細胞の分化、例えば新芽形成、分離および管形成を低減する。この薬剤誘導作用はＴｉｅ１の自己会合とは独立しているか、依存していることができる。
【０１４８】
１つの局面において、本発明は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質により特徴付けられ、このタンパク質は、Ｔｉｅ１と結合し、外部ドメインおよび重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、以下の特性の１つ以上を含む：ｉ）
【０１４９】
【数１】
2008532476.tif 000003
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＨＣ  ＣＤＲ１；ｉｉ）
【０１５０】
【数２】
2008532476.tif 000004
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＨＣ  ＣＤＲ２；ｉｉｉ）
【０１５１】
【数３】
2008532476.tif 000005
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＨＣ  ＣＤＲ３。
【０１５２】
一実施形態において、タンパク質はまた、１つ以上の以下の特性を含む軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む：ｉ）
【０１５３】
【数４】
2008532476.tif 000006
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＬＣ  ＣＤＲ１；ｉｉ）
【０１５４】
【数５】
2008532476.tif 000007
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＬＣ  ＣＤＲ２；ｉｉｉ）
【０１５５】
【数６】
2008532476.tif 000008
からなる群からのクローンのアミノ酸配列またはそのような配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一である配列を含むＬＣ  ＣＤＲ３。
【０１５６】
一実施形態において、タンパク質は、クローンのＨＣ可変ドメインのアミノ酸配列
【０１５７】
【数７】
2008532476.tif 000009
と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列を含む。
【０１５８】
一実施形態において、タンパク質は、クローンのＬＣ可変ドメインのアミノ酸配列
【０１５９】
【数８】
2008532476.tif 000010
と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％同一であるＬＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列を含む。
【０１６０】
本明細書中に記載の抗体または他の結合タンパク質（例えば、Ｔｉｅ１結合タンパク質、Ｔｉｅ２結合タンパク質またはＡｎｇ結合タンパク質）を、被験体に投与し得、または非誘導体化形態もしくは非結合体化形態でインビトロに用い得る。他の実施形態において、結合タンパク質を、誘導体化、改変し得、あるいは別の機能性分子、例えば別のタンパク質（例えば、Ｆｃドメインの１つ、ＨＳＡなど）、ポリマー（例えば、ＰＥＧ）同位体、細胞または不溶性支持体に結合させ得る。例えば、結合タンパク質は、１つ以上の他の分子的実体、とりわけ例えば、抗体（例えば、タンパク質が二重特異性または多重特異性抗体を形成する抗体である場合）、毒素、放射性同位体、治療（例えば、細胞毒性または細胞静止）因子または部分に機能的に（例えば、化学的結合、遺伝子融合、非共有結合性会合またはそれ以外によって）連結し得る。例えば、結合タンパク質は、放射性イオン（例えば、α−、γ−またはβ−エミッター）、例えばヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、レニウム（１８６Ｒｅ）またはビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）に連結し得る。
【０１６１】
別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１に結合する免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメイン、例えば本明細書中に記載の免疫グロブリンの重鎖または軽鎖の可変ドメインを含むポリペプチドをコードするコード配列を含む核酸により特徴付けられる。例えば、核酸として、本明細書中に記載される特定の核酸配列、本明細書中に記載されるアミノ酸配列（例えば、特定の核酸配列）と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、同一である核酸、または本明細書中に記載される核酸配列（例えば、特定の核酸配列、例えば
【０１６２】
【数９】
2008532476.tif 000011
のうちの１つ以上の可変ドメインをコードする核酸配列）と（例えば、本明細書中に記載される条件下、例えば高緊縮条件下で）特異的にハイブリダイズする核酸、あるいはそのフラグメント（例えば、ＣＤＲをコードするフラグメント）を挙げ得る。
【０１６３】
本明細書中に記載の核酸は、さらに、コード配列に作動可能に連結させたプロモーターを含み得る。核酸は、第一および第二のコード配列を含み得、例えば、ここで第一のコード配列は、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードし、第二のコード配列は、免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを含むポリペプチドをコードする。
【０１６４】
別の局面において、本発明は、重鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第一核酸および軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第二核酸を含む宿主細胞により特徴付けられる。重鎖可変領域および軽鎖可変領域は、結合してＴｉｅ１結合タンパク質を形成し得る。これらの可変領域は、本明細書中に記載される一つ以上の特性（例えば本明細書中に記載される配列と、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の同一性）を有し得る。本発明はまた、Ｔｉｅ１結合抗体を提供する方法を含む。この方法は、本明細書中に記載される宿主細胞を提供する工程；ならびに軽鎖および重鎖の可変領域の集合体が、Ｔｉｅ１と相互作用する抗原結合タンパク質を形成し得る条件下で、宿主細胞中に第一および第二の核酸を発現させる工程を含み得る。
【０１６５】
別の局面において、本発明は、組成物、例えば、薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤または安定剤、および本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合タンパク質（例えば、抗体またはそのフラグメント）のうちの少なくとも一つを含む薬学的組成物を提供する。一実施形態において、組成物（例えば、薬学的組成物）は、上記Ｔｉｅ１結合タンパク質の二つ以上からなる組合せを含む。
【０１６６】
別の局面において、本発明は、単独での使用または他の治療様式（例えば、細胞静止剤または標識剤、例えば本明細書中に記載される細胞毒剤または標識剤）と組み合わせての使用のためのＴｉｅ１結合抗体（またはそのフラグメント）、例えば本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合抗体（またはそのフラグメント）を、Ｔｉｅ１抗体の使用法またはＴｉｅ１関連疾患、例えば内皮細胞関連疾患、例えば関節リウマチまたは転移性癌を治療、予防または検出するような薬剤の組合せについての説明書とともに含むキットにより特徴付けられる。
【０１６７】
別の局面において、Ｔｉｅ１に結合する結合タンパク質は免疫グロブリンではないポリペプチドである。例えばポリペプチドは可変の長さ、例えば４〜１００アミノ酸残基長、好ましくは５〜７５、６〜５０、または７〜４０アミノ酸残基長、またはより好ましくは８〜３０または１０〜２５アミノ酸残基長のものであることができる。一部の実施形態においては、ポリペプチドは非標準的な、または、合成のアミノ酸残基、例えばノルロイシン、セレノシステイン、ピロリジン等を包含する。一部の実施形態においては、ポリペプチドは交差結合基、例えばジスルフィド結合を形成するシステイン残基２つ、またはペプチドを環化するために使用できる化学的交差結合部分の何らかの別の型を包含する。他の好ましい実施形態においては、ポリペプチドは、例えばポリペプチドの溶解度または循環半減期を増大させるために、ポリエチレングリコールまたは可溶性タンパク質への融合を用いるなどして修飾することができる。
【０１６８】
標的結合タンパク質は別のタンパク質、例えばアミノまたはカルボキシ末端おいて標的に結合しないタンパク質と物理的に会合（例えば融合）することができる。例えば、標的結合タンパク質は血清中滞留を増大させるか、安定性を改変するタンパク質、例えばアルブミン、例えば血清アルブミン、例えばＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）と会合（例えば融合）することができる。別の例においては、標的結合タンパク質は精製を容易にする部分、例えば精製タグ、例えばＨｉｓ、ＰＥＧ、または官能性の部分、例えばＦｃに物理的に会合（例えば融合）される。
【０１６９】
別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１に特異的に結合するタンパク質を同定する方法により特徴付けられる。好ましい実施形態において、本発明は：Ｔｉｅ１抗原を提供する工程；ディスプレイライブラリ（例えば、ファージディスプレイライブラリーメンバー）を提供する工程；このライブラリーに存在するメンバーを同定する工程を包含し、このメンバーが、Ｔｉｅ１抗原に特異的に結合するタンパク質を発現する。用語「Ｔｉｅ１抗原」は、長さが少なくとも８アミノ酸であるＴｉｅ１の任意の抗原フラグメントをいう。例えば、Ｔｉｅ１抗原として、Ｔｉｅ１外部ドメインフラグメント、例えば、折り畳まれたタンパク質ドメインを含むフラグメント（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）が挙げ得る。一部の実施形態において、Ｔｉｅ１抗原はヒト起源であり、例えばヒトＴｉｅ１の細胞外ドメインまたはそのフラグメント（例えば、本明細書中に記載されるフラグメント）を含む。このＴｉｅ１抗原は、必要に応じて別のポリペプチド（例えばＦｃドメイン）に融合させた組換えポリペプチドであり得、またはＴｉｅ１をその表面に発現する細胞（例えば、内皮細胞）であり得る。他の好ましい実施形態において、Ｔｉｅ１抗原は、活性化立体配座を有し、例えばＴｉｅ１抗原は、二量体立体配座または本明細書中に記載されるＥ３もしくはＥ３ｂ抗体により安定化した立体配座である。
【０１７０】
本明細書中に記載される方法は、例えば実質的に完全なゲノム（例えば改変遺伝子ＩＩＩを含む）を有するバクテリオファージに基づくライブラリーおよびファージミド核酸を含むバクテリオファージ粒子に基づくライブラリーに適用可能である。用語「バクテリオファージライブラリーメンバー」および「ファージ」は、両種のライブラリーのメンバーを包含する。用語「バクテリオファージ粒子」は、核酸をパッケージするバクテリオファージコートタンパク質から形成された粒子をいう。パッケージした核酸は、改変バクテリオファージゲノムまたはファージミドであり得、例えば、バクテリオファージの複製開始点を含むが基本的なファージ遺伝子を欠如し、「ヘルパーファージ」またはｉｎ  ｔｒａｎｓで供給されるファージ遺伝子の助けなくしてはＥ．ｃｏｌｉで増殖し得ない核酸であり得る。
【０１７１】
他の実施形態において、本発明は、Ｔｉｅ１に特異的に結合するタンパク質を同定する方法により特徴付けられる。該方法は、Ｔｉｅ１抗原（例えば、Ｔｉｅ１外部ドメインの領域）を提供する工程；非ヒト動物をＴｉｅ１抗原により免疫する工程；ならびにＴｉｅ１と相互作用する免疫グロブリンを産生する細胞を単離する工程を包含する。例えば、この方法は、動物（例えば、免疫マウス）の脾臓からハイブリドーマ細胞を作製する工程；ならびにＴｉｅ１抗原に特異的に結合する抗体を発現する個々のハイブリドーマ細胞株を同定する工程を包含する。例えば、この
好ましい実施形態において、Ｔｉｅ１抗原はヒト起源であり、例えばヒトＴｉｅ１の細胞外ドメインまたはその一部のフラグメント（例えば、Ｔｉｅ１のＨＡ結合ドメイン）を含む。Ｔｉｅ１抗原は、別のポリペプチド（例えば、精製ハンドル（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｈａｎｄｌｅ））に必要に応じて融合させた組換えポリペプチドであり得、またはＴｉｅ１（例えば、内皮細胞）をその表面に発現する細胞であり得る。他の好ましい実施形態において、Ｔｉｅ１抗原は活性化立体配座を有し、例えば二量体化している。
【０１７２】
好ましい実施形態において、この方法は、さらに、同定されたファージまたはハイブリドーマから核酸分子を単離する工程を包含し、この核酸分子が、Ｔｉｅ１抗原に特異的に結合するポリペプチドまたは抗体をコードする。この単離した核酸分子を、本明細書中に記載されるように、治療因子を生成するために使用し得る。
【０１７３】
別の局面において、本発明は、本明細書中に記載の方法により同定されるタンパク質をコードする核酸により特徴付けられる。好ましい実施形態において、核酸は、重鎖および軽鎖の免疫グロブリン、または本明細書中に記載される免疫グロブリンフラグメントをコードする配列を含む。例えば、本発明は、本明細書中に記載されるようなＴｉｅ１結合抗体分子の重鎖および軽鎖の可変領域をそれぞれコードする第一および第二の核酸により特徴付けられる。ともに機能する重鎖と軽鎖をコードする配列は、異なる核酸分子上または同じ核酸分子上に存在し得る。別の局面において、本発明は、本明細書中に記載される核酸を含む宿主細胞およびベクターにより特徴付けられる。
【０１７４】
さらに別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１結合抗体、またはその抗原結合フラグメントを生成する方法により特徴付けられる。この方法は：重鎖可変領域（例えば、本明細書中に記載されるような重鎖可変領域）を含むポリペプチドをコードする第一核酸を含む宿主細胞を提供する工程；軽鎖可変領域（例えば、本明細書中に記載されるような軽鎖可変領域を含むポリペプチドをコードする第二核酸を提供する工程；ならびに上記軽鎖および重鎖の可変領域の集合体が、Ｔｉｅ１と相互作用する抗原結合タンパク質を形成し得る条件下で、上記第一および第二の核酸を宿主細胞中に発現させる工程を包含する。これら第一および第二の核酸は、連結または未連結であり得、例えば同じベクターまたは異なるベクター上にそれぞれ発現し得る。第一および第二の核酸は、同じ分子の成分であり得、または異なる分子（例えば、異なる染色体またはプラスミド）上に存在し得る。
【０１７５】
宿主細胞は、真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、酵母細胞）、または原核細胞（例えば、大腸菌）であり得る。例えば哺乳動物細胞は、培養細胞または細胞株であり得る。例示的な哺乳動物細胞として、リンパ球細胞株（例えば、ＮＳ０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９４、卵母細胞および形質転換動物の細胞（例えば、哺乳動物内皮細胞）が挙げられる。例えば、本明細書中に記載される抗体をコードする核酸は、形質転換動物において発現し得る。一実施形態において、核酸を組織特異的プロモーター（例えば、乳腺特異的プロモーター）の制御下に置き、抗体を形質転換動物中に生成する。例えば、抗体分子は、形質転換動物（例えば、遺伝子導入ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ヤギまたは齧歯動物）の乳中で分泌される。単鎖抗体を生成するために、重鎖および軽鎖の可変ドメインの両方を含む単一ポリペプチドをコードするように核酸を構成する。
【０１７６】
Ｔｉｅ１は、広範な癌に関連して過剰発現することがわかった。Ｔｉｅ結合タンパク質（例えば、抗体）を有する腫瘍脈管構造上のＴｉｅ１の標的化を、腫瘍成長および転移が低減するように脈管構造を阻害、破壊、さもなければ中和するために使用し得る。これらのタンパク質は、例えば毒性ペイロードと結合し得、または直接的な機能的阻害を媒介し得る。ＡＤＣＣの原因となり得るタンパク質（例えば、Ｆｃドメインを有するタンパク質）もまた使用し得る。
【０１７７】
別の局面において、本発明は、細胞（例えば内皮細胞）の活性、例えば、細胞（例えば内皮細胞（例えば、癌（例えば、腫瘍）周辺の内皮細胞）の増殖、付着、成長または生存等の細胞活性を阻害する方法により特徴付けられる。例示的な方法は、細胞を、細胞の付着、移動、成長または増殖を阻害するのに十分な量でＴｉｅ１結合タンパク質と接触させる工程を包含する。Ｔｉｅ１結合タンパク質を投与する方法は、例えば障害（ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、例えば炎症性障害（例えば、関節リウマチ、狼瘡、再狭窄、乾癬、移植片対宿主反応または多発性硬化症）または癌障害（例えば、悪性または転移性疾患）を治療または予防するのに有効な量のＴｉｅ１結合タンパク質を、被験体（例えば、実験動物またはヒト患者）に投与することにより、該疾患を治療または予防するために使用し得る。
【０１７８】
Ｔｉｅ１結合タンパク質を、血管形成関連障害、特に血管形成依存性癌および腫瘍を処置または予防するために使用し得る。血管形成関連疾患としては、これらに限定されないが、固形腫瘍；腫瘍転移；良性腫瘍（例えば、血管腫、聴神経腫、神経線維腫、トラコーマ、および化膿性肉芽腫；関節リウマチ）；乾癬；眼血管形成疾患、例えば、糖尿病性網膜症、早熟性網膜症、黄班変性、角膜移植拒絶、血管新生緑内障、水晶体後繊維増殖症、ルベオーシス；Ｏｓｌｅｒ−Ｗｅｂｂｅｒ症候群；心筋血管形成；プラーク新血管形成；末梢血管拡張症；血友病関節；血管線維腫；および傷の肉芽形成が挙げられる。
【０１７９】
「血管形成依存性癌および腫瘍」は、それらの成長（容積および／または質量の拡大）のために、血管の数および密度を増大して血液を供給することを必要とする癌腫瘍である。一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、そのような癌および腫瘍の退縮を引き起こす。「退縮」とは腫瘍の質量および大きさの縮小、例えば少なくとも２％、５％、１０％または２５％の減少をいう。
【０１８０】
更に又、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２は造血細胞中で発現される（Ｋｕｋｋ  ｅｔ  ａｌ（１９９７）Ｂｒ．Ｊ．Ｈａｅｍａｔｏｌ．９８：１９５；Ｉｗａｍａ  ｅｔ  ａｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９５：３０１）。従って、別の実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は造血状態、例えば造血系の癌を治療するために使用される。造血系の癌の例は、造血系起源の過形成／新生物の細胞、例えば骨髄様、リンパ様または赤血球様の系統から生じる細胞またはその前駆細胞から誘導された癌を包含する。例示される癌は急性前骨髄性白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリー細胞白血病（ＨＬＬ）およびヴァルデンストレームマクログロブリン血症（ＷＭ），非ホジキンリンパ腫、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ球性白血病（ＬＧＦ）、Ｂ細胞慢性リンパ球性白血病、脊髄形成異常症候群およびホジキン病を包含する。
【０１８１】
別の特徴においては、本発明は細胞（インビトロ、エクスビボまたはインビボ）、例えば内皮細胞、例えば癌、例えば腫瘍の近接部の内皮細胞を接触させる方法を特徴とする。方法はＴｉｅ１と相互作用する薬剤（例えばタンパク質）、例えば本明細書に記載したタンパク質を準備すること、および検出可能なリガンド−細胞複合体少なくとも１つが形成されるのに十分な量のタンパク質に細胞を接触させることを包含することができる。タンパク質は例えば標識または細部毒性の実体、例えば免疫グロブリンＦｃドメインまたは細胞毒性剤を包含できる。
【０１８２】
別の局面において、本発明は例えば被験体にアジュバント療法として本明細書に記載した薬剤を投与することを特徴とする。アジュバント療法は腫瘍の全てまたは部分を除去する手術を被験体が受けた後（例えば神経膠芽細胞腫または結腸直腸癌、乳癌または肺癌の手術の後）に被験体に投与される術後治療薬であることができる。例えば、薬剤はＴｉｅ１複合体形成を阻害するか、Ｔｉｅ１ホモ二量体化を促進するか、または、Ｔｉｅ１リン酸化を増大させるタンパク質である。例えば薬剤はＴｉｅ１に結合するタンパク質（例えば抗Ｔｉｅ１抗体）である。一実施形態において、薬剤は手術の６、１２、２４、４８または１００時間以内に投与する。薬剤は手術前並びに後に投与できる。
【０１８３】
例示される薬剤は（ａ）Ｅ３抗体の重鎖可変ドメインに少なくとも８５、９０、９５、９８または９９％同一である重鎖可変ドメイン配列およびＥ３抗体の軽鎖可変ドメインに少なくとも８５、９０、９５、９８または９９％同一である軽鎖可変ドメイン配列；（ｂ）Ｔｉｅ１への結合に関してＥ３と競合する抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列；または（ｃ）Ｅ３抗体の重鎖可変ドメインのＣＤＲの１、２または３つおよびＥ３抗体の軽鎖可変ドメインのＣＤＲの１、２または３つ、を包含するＴｉｅ１結合剤である。本明細書に記載する他のＴｉｅ１結合剤、例えば、Ｍ００５９Ａ０２、Ｍ００４５Ａ０２＊、Ｍ００５４Ｇ０５、Ｍ００５３Ｆ０５、Ｍ００５３Ｇ０５、Ｍ００６１Ｃ０６、Ｍ００４５Ｂ０１、Ｍ００４６Ｇ１２、Ｍ００４６Ｈ１１、Ｍ００５３Ａ０２、Ｍ００５３Ａ０５、Ｍ００４６Ｂ０６、Ｍ００４４Ｂ１０、Ｍ００４４Ｂ０８、Ｍ００５６Ｇ０８、Ｍ００４５Ｂ０３、Ｍ００５３Ｆ０４、Ｍ００５５Ｅ１０、Ｍ００６０Ｈ０１、Ｍ００５４Ｈ１０またはＭ００５８Ｆ０３の重鎖可変ドメインに少なくとも８５、９０、９５、９８、９９％または１００％同一である重鎖可変ドメイン配列、およびＭ００５９Ａ０２、Ｍ００４５Ａ０２＊、Ｍ００５４Ｇ０５、Ｍ００５３Ｆ０５、Ｍ００５３Ｇ０５、Ｍ００６１Ｃ０６、Ｍ００４５Ｂ０１、Ｍ００４６Ｇ１２、Ｍ００４６Ｈ１１、Ｍ００５３Ａ０２、Ｍ００５３Ａ０５、Ｍ００４６Ｂ０６、Ｍ００４４Ｂ１０、Ｍ００４４Ｂ０８、Ｍ００５６Ｇ０８、Ｍ００４５Ｂ０３、Ｍ００５３Ｆ０４、Ｍ００５５Ｅ１０、Ｍ００６０Ｈ０１、Ｍ００５４Ｈ１０またはＭ００５８Ｆ０３の軽鎖可変ドメインに少なくとも８５、９０、９５、９８、９９％または１００％同一である軽鎖可変ドメイン配列を包含するＴｉｅ１結合剤も使用できる。
【０１８４】
別の局面において、本発明は、治療、例えば細胞の阻害、除去または殺傷、または、細胞の活性少なくとも１つの弱化の方法を特徴とする。方法はＴｉｅ１結合タンパク質、例えば本明細書に記載したリガンドを準備すること、および、細胞の活性少なくとも１つを弱化、細胞を阻害、除去または殺傷するために十分な量のタンパク質に細胞を接触させることを包含する。接触はインビトロまたはインビボであってよい。例えば細胞は内皮細胞、例えば癌、例えば腫瘍の近接部にある内皮細胞であることができる。タンパク質は細胞毒性の実体を包含できる。Ｔｉｅ１結合タンパク質または本明細書に記載した他の薬剤を投与する方法は、例えば障害、例えば内皮細胞系の障害、血管障害、創傷治癒または癌性の障害（例えば悪性または転移性の障害）を治療または防止するために、そのような障害を治療または防止するために十分な量のＴｉｅ１結合タンパク質を被験体（例えば実験動物またはヒト患者）に投与することにより、使用することができる。
【０１８５】
Ｔｉｅ１結合タンパク質または本明細書中に記載される他の因子は、例えばインビトロまたはエクスビボで培養中の細胞に使用し得る。例えば、内皮細胞（例えば、癌生検材料中の内皮細胞）を、インビトロにおいて培地中で培養し得、Ｔｉｅ１結合タンパク質を培地に加えることにより、接触工程を実施し得る。この方法を、被験体に存在する細胞（例えば、癌性または転移性細胞）に対して、インビボ（例えば、治療または予防）プロトコルの一部として実施し得る。インビボ実施形態について、接触工程を被験体中で実施し、この工程は、タンパク質の細胞への結合および細胞の付着、移動、成長または増殖の阻害の両方を可能とするのに有効な条件下で、Ｔｉｅ１結合タンパク質を被験体に投与する工程を包含する。
【０１８６】
Ｔｉｅ１結合タンパク質または本明細書中に記載される他の因子を、例えば、造血癌、固形腫瘍、軟組織腫瘍および転移病巣、特に、血液供給または血管形成を必要とする腫瘍等の癌性疾患を処置または予防するために使用し得る。固形腫瘍の例としては、例えば、種々の器官系（例えば、肺、胸、リンパ節、胃腸管（例えば、結腸）および尿生殖器管（例えば、腎臓、尿路上皮細胞）、咽頭を侵す）の肉腫、腺癌および癌腫等の悪性腫瘍、ならびに、例えば、ほとんどの結腸癌、直腸癌、腎臓細胞癌腫、肝臓癌、肺の非小細胞癌腫、小腸癌および食道癌等の悪性腫瘍を含む腺癌が挙げられる。被験体は、哺乳動物、例えば霊長類、好ましくは高等霊長類、例えばヒト（例えば、本明細書中に記載される障害、例えば内皮細胞に基づく障害、例えば癌を有するかまたはその危険性のある患者）であり得る。
【０１８７】
Ｔｉｅ１結合抗体またはそのフラグメント、例えば本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合抗体またはそのフラグメントを、被験体に対して、全身的に（例えば、経口、非経口、皮下、静脈内、筋内、腹腔内、鼻腔内、経皮、または吸入により）、局所的に、または鼻、喉および気管支等の粘膜への適用により投与し得る。
【０１８８】
これらの方法は、例えば：腫瘍サイズの減少；癌マーカー（例えば、癌特異抗原レベル）の減少；新しい病巣出現（例えば骨スキャンにおいて）の減少；新たな疾患関連症状の出現の減少；または軟組織塊の大きさの減少または安定化；あるいは臨床転帰の改善に関連する任意のパラメーターのうちの一つ以上の減少について、被験体をモニタリングする工程をさらに包含し得る。被験体は、以下の期間：処置開始前；処置中；または処置の一つ以上の要素を投与した後の一つ以上の期間中、モニタリングし得る。モニタリングは、同じＴｉｅ１結合タンパク質によるさらなる処置の必要性、またはさらなる因子によるさらなる処置の必要性を評価するために使用し得る。一般的に、上記パラメーターの一つ以上の減少は、被験体の状態の改善を示す。モニタリングに関する情報は、例えば電子形態またはデジタル形態で記録され得る。
【０１８９】
Ｔｉｅ１結合タンパク質は、非結合体化形態にて単独で使用することにより、Ｔｉｅ１発現細胞の付着、移動または溢出を阻害するか、またはＴｉｅ１発現細胞を剥離または死滅させ得る。Ｔｉｅ１結合タンパク質が抗体である場合、剥離または死滅を、例えば、補体媒介細胞溶解および／またはエフェクター細胞媒介細胞死滅等の抗体依存性細胞死滅機構により媒介し得る。他の実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、Ｔｉｅ１発現細胞を死滅または剥離するのに効果的な物質、例えば、細胞毒性因子または細胞毒性部分に結合（例えば、直接的かまたは間接的な物理的会合、共有または非共有結合）し得る。例えば、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、放射性イオン（例えば、α−、γ−またはβ−エミッター）、例えば、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、ルテチウム（１７７Ｌｕ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）またはビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）に結合し得る。
【０１９０】
本発明の方法および本明細書中に記載される組成物を、他の治療様式と組合せて使用し得る。一実施形態において、これらの方法は、Ｔｉｅ１結合タンパク質、例えば、Ｔｉｅ１結合抗体またはそのフラグメントを、疾患を処置または予防するのに有効な量で、細胞毒性因子と組み合せて、被験体に投与する工程を包含する。Ｔｉｅ１結合タンパク質および細胞毒性因子は、同時または逐次的に投与され得る。他の実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質または本明細書中に記載される他の因子は、外科的および／または放射線手法と組み合わせて使用される。
【０１９１】
別の局面において、本発明は、サンプル中、インビトロ（例えば、生物学的サンプル、組織生検材料、例えば癌病巣）で、Ｔｉｅ１タンパク質またはＴｉｅ１を発現する細胞（例えば内皮細胞）の存在を検出するための方法により特徴付けられる。この主題の方法を、本明細書中に記載される障害（例えば、癌障害）を評価、例えば診断または段階付けるために使用し得る。この方法は：（ｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こり得る条件下で、サンプル（および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）を、本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合タンパク質と接触させる工程；ならびに（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とサンプル（および必要に応じて、参照サンプル、例えばコントロールサンプル）との複合体の形成を検出する工程を包含する。複合体の形成は、Ｔｉｅ１タンパク質（例えば、活性化Ｔｉｅ１タンパク質）の存在を示すものであり、本明細書中に記載される処置に対する適合性または必要性を示し得る。例えば、参照サンプル、例えばコントロールサンプルに比較して、サンプル中の複合体の形成の統計的に有意な変化は、このサンプル中のＴｉｅ１（例えば、活性化Ｔｉｅ１）の存在を示している。
【０１９２】
さらに別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１（例えば、活性化Ｔｉｅ１）の存在をインビボ（例えば、被験体中のインビボ画像化）で検出するための方法を提供する。この主題の発明を、本明細書中に記載される障害、例えば癌障害を評価、例えば診断、位置特定または段階付けるために使用し得る。この方法は：（ｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こり得る条件下で、Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント）を、被験体（および必要に応じて、コントロール被験体）に投与する工程；ならびに（ｉｉ）このＴｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１との複合体の形成を検出する工程を包含し、参照（例えば、コントロール被験体または被験体のベースライン）に比較して、被験体中の複合体形成の統計的に有意な変化が、Ｔｉｅ１の存在を示している。被験体内の特定の位置でのＴｉｅ１の存在は、内皮細胞関連障害、例えば、血管形成関連障害（例えば、癌（例えば転移性癌））、または本明細書中に記載される他の血管形成関連障害を示すことができる。
【０１９３】
腫瘍細胞はＴｉｅ１を発現することができる。一局面において、本発明は被験体由来のサンプルを準備し、そして、サンプル中の細胞内のＴｉｅ１発現を評価する方法を特徴とする。一実施形態において、Ｔｉｅ１発現水準の評価の結果を比較コントロール、例えば比較コントロール数値または比較コントロール特性と比較する。例えば、評価されたサンプル上のＴｉｅ１発現は比較参照の数値と同様、低値または高値であってよい。比較コントロールの数値または性質はコントロールサンプル、統計値（例えば平均、メジアン等）または任意の数値を用いながら測定される。例えばコントロールサンプルは正常サンプル、例えば同じか異なる被験体に由来する腫瘍細胞を含まない使用であることができる。比較コントロールと相対比較した場合の変化（例えば増大）はサンプルが腫瘍細胞を包含すること、例えば被験体が腫瘍保有としての適応症であることを示している。
【０１９４】
他の実施形態において、本明細書中に記載される障害（例えば、炎症または癌障害）を診断または段階付ける方法を提供する。この方法は：（ｉ）この障害を有するか、またはその危険性のある被験体を同定する工程；（ｉｉ）この障害に侵された組織または細胞のサンプルを入手する工程；（ｉｉｉ）結合因子とＴｉｅ１タンパク質との相互作用が起こり得る条件下で、このサンプルまたはコントロールサンプルを、Ｔｉｅ１結合タンパク質と接触させる工程（ｉｖ）ならびに複合体の形成を検出する工程を包含する。参照サンプル、例えばコントロールサンプルに対して、Ｔｉｅ１結合タンパク質との複合体の形成の統計的に有意な増加は、障害または障害の段階を示している。例えば、固形腫瘍に位置する腫瘍細胞上の活性化Ｔｉｅ１の発見は、腫瘍が転移性癌に進行していることを示し得る。
【０１９５】
好ましくは、インビボおよびインビトロ診断法に使用されるＴｉｅ１結合タンパク質を、結合または非結合の結合因子の検出を促進する検出可能な物質で、直接的または間接的に標識する。適切な検出可能な物質としては、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、放射性イオン、例えば、インジウム（１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１３１Ｉまたは１２５Ｉ）、イットリウム（９０Ｙ）、アクチニウム（２２５Ａｃ）、ビスマス（２１２Ｂｉまたは２１３Ｂｉ）、イオウ（３５Ｓ）、炭素（１４Ｃ）、トリチウム（３Ｈ）、ロジウム（１８８Ｒｈ）またはリン（３２Ｐ）に結合する。別の実施形態において、このＴｉｅ１結合タンパク質を、ＮＭＲ造影剤で標識する。
【０１９６】
一局面において、本発明は腫瘍の脈管構造を画像化する方法を特徴とし、方法はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合するタンパク質、例えば本明細書に記載したタンパク質を準備すること、ただしここでタンパク質は画像化剤に物理的に会合しているものであること；例えば腫瘍を有する患者にタンパク質を投与すること；および、例えば腫瘍の脈管構造を検出するために患者を画像化することを包含する。
【０１９７】
一局面において、本発明は血液骨新生物障害を有する患者を治療する方法を特徴とし、方法は血液骨新生物障害（例えば造血細胞の増殖性障害、例えば白血病）を有する患者にＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合するタンパク質、例えば本明細書に記載したタンパク質を投与することにより障害を治療することを包含する。
【０１９８】
一局面において、本発明は被験体を診断および治療する方法を特徴とし、方法はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに関連するパラメーターを評価すること；およびパラメーターが比較コントロールと相対比較して改変されている場合は本明細書に記載したタンパク質を患者に投与することにより被験体を治療することを包含する。一実施形態において、パラメーターは例えば被験体の組織中のタンパク質またはｍＲＮＡの水準を示す数値を包含する。一実施形態において、比較コントロールは比較コントロールの被験体、例えば年齢／性別がマッチした被験体、例えばコントロールまたは正常な被験体に関して求めた数値を包含する。
【０１９９】
一局面において、本発明は被験体を治療する方法を特徴とし、方法は、比較コントロールと比較して上昇したＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇの生体分子または活性を有する被験体に本明細書に記載したタンパク質を投与することを包含する。方法は例えば被験体が比較コントロールと比較して上昇したＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇの生体分子または活性を有するかどうかを調べるために被験体を評価することを包含できる。一実施形態において、被験体は上昇したＴｉｅ１タンパク質またはｍＲＮＡ水準を有する。
【０２００】
本発明はまた、広範なアミノ酸配列および核酸配列、例えば、本明細書中に記載される配列または本明細書中に記載される配列に関連する配列を包含するポリペプチドおよび核酸を提供する。例えば、本発明は、本明細書中に記載される各ポリペプチドをコードする核酸により特徴付けられる。この核酸は、同系コドン、または各々のポリペプチドを産生するように翻訳され得る任意の組のコドンを含み得る。そのようなポリペプチドは、多鎖タンパク質の個々のサブユニット、例えば、複数の異なるポリペプチド鎖を含む抗体を含む。この核酸はまた、発現されない核酸フラグメントまたはベクターであり得るが、免疫グロブリン可変領域（例えば、本明細書中に記載されるＣＤＲ等）の少なくとも一部またはその補体をコードする配列を含む。そのような核酸を、有用な構築物、細胞およびタンパク質を調製するために使用し得る。さらに、本発明は、本明細書中に記載される核酸を含む宿主細胞により特徴付けられる。この細胞は、本明細書中に記載されるタンパク質を、例えばその表面に発現し得る。本発明はまた、本明細書中に記載される核酸によりコードされるアミノ酸配列を含むタンパク質、または本明細書中に記載される核酸にハイブリダイズするタンパク質を含む。
【０２０１】
本明細書中で使用される場合、用語「抗体」は、少なくとも一つの免疫グロブリン可変ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質をいう。例えば、抗体は、重（Ｈ）鎖可変領域（本明細書中ではＶＨと略す）および軽（Ｌ）鎖可変領域（本明細書中ではＶＬと略す）を含み得る。別の例において、抗体は、二つの重（Ｈ）鎖可変領域および二つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む。用語「抗体」は、抗体の抗原結合フラグメント（例えば、単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄフラグメント、ＦｖフラグメントおよびｄＡｂフラグメント）ならびに完全抗体を包含する。
【０２０２】
ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域が点在する「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と呼ばれる超可変性の領域にさらに再分割され得る。このフレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、正確に定義されている（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，  Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７を参照）。Ｋａｂａｔの定義を、本明細書中で使用する。ＶＨおよびＶＬのそれぞれは、典型的には三つのＣＤＲおよび四つのＦＲから成っており、アミノ末端からカルボキシ末端に、以下の順：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。
【０２０３】
「免疫グロブリンドメイン」は、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインに由来するドメインをいう。免疫グロブリンドメインは、典型的には約７つのβストランドから構成される二つのβシート、および保存されたジスルフィド結合を含む（例えば、Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．  Ｂａｒｃｌａｙ  １９８８  Ａｎｎ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５を参照）。免疫グロブリン可変領域の超可変ループの標準構造は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ．１４（１８）：４６２８−３８に記載されるように、その配列から推測され得る。
【０２０４】
本明細書中で使用される場合、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」とは、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成し得るアミノ酸配列をいう。例えばこの配列は、天然の可変ドメインのアミノ酸配列のすべてまたは一部を含み得る。例えばこの配列は、一つ、二つまたはそれ以上のＮまたはＣ末端アミノ酸、内部アミノ酸を除外し得、一つ以上の挿入物または付加的な末端アミノ酸を含み得、あるいは他の改変物を含み得る。一実施形態において、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と会合して、標的結合構造物（または「抗原結合部位」）、例えばＴｉｅ１と相互作用する（例えばＴｉｅ１へ結合するか、またはＴｉｅ１を阻害する）構造物を形成し得る。
【０２０５】
抗体のＶＨ鎖またはＶＬ鎖は、重鎖または軽鎖定常領域の全てまたは一部をさらに含むことで、それぞれ免疫グロブリン重鎖または軽鎖を形成し得る。一実施形態において、抗体は二つの免疫グロブリン重鎖および二つの免疫グロブリン軽鎖からなる四量体であり、これらの免疫グロブリン重鎖または軽鎖は、例えばジスルフィド結合により相互に結びついている。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の三つのドメインを含む。軽鎖定常領域は、ＣＬドメインを含む。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の多様な細胞（例えば、エフェクター細胞）および典型的な補体系の第一成分（Ｃｌｑ）等の宿主組織または因子への抗体の結合を媒介する。用語「抗体」とは、ＩｇＡ型、ＩｇＧ型、ＩｇＥ型、ＩｇＤ型、ＩｇＭ型（ならびにそれらのサブタイプ）のインタクトな免疫グロブリンを含む。免疫グロブリンの軽鎖は、κまたはλ型であり得る。一実施形態において、抗体は、グリコシル化している。抗体は、抗体依存性細胞毒性および／または補体媒介細胞毒性に対して機能し得る。
【０２０６】
抗体の一つ以上の領域はヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。例えば、一つ以上の可変領域はヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。例えば、一つ以上のＣＤＲが、ヒトのもの（例えば、ＨＣ  ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、ＬＣ  ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３）であり得る。各軽鎖ＣＤＲは、ヒトものであり得る。ＨＣ  ＣＤＲ３は、ヒトものであり得る。一つ以上のフレームワーク領域が、ヒトのもの（例えば、ＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）であり得る。一実施形態において、全てのフレームワーク領域はヒトのもの（例えば、ヒトの体細胞、例えば免疫グロブリンを産生する造血細胞、または非造血細胞に由来する）であり得る。一実施形態において、ヒト配列は、例えば生殖細胞系核酸によりコードされる生殖細胞系配列である。一つ以上の定常領域はヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。別の実施形態において、フレームワーク領域（例えば、集団的にＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、または集団的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）または抗体全体の少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％または９８％がヒトのものであり得、効果的にはヒトのものである。例えば、ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３は、集団的に、軽鎖または重鎖配列をコードする座のヒト生殖細胞系Ｖセグメントによりコードされるヒト配列と、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９５％、９８％または９９％同一であり得る。
【０２０７】
抗体の全てまたは一部は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによりコードされ得る。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子が挙げられる。全長免疫グロブリン軽鎖（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端（約１１０アミノ酸）にて可変領域遺伝子によりコードされ、ＣＯＯＨ末端にてκまたはλ定常領域遺伝子によりコードされている。全長免疫グロブリン重鎖（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、同様に可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）および他の上記の定常領域遺伝子のうちの一つ、例えばγ（約３３０アミノ酸をコードする）によりコードされている。軽鎖は、軽鎖可変ドメインを含む任意のポリペプチドをいう。重鎖は、重鎖可変ドメインを含む任意のポリペプチドをいう。
【０２０８】
全長抗体（または単に「抗体部分」または「フラグメント」）の「抗原結合フラグメント」との用語は、本明細書中で使用される場合、目的の標的に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の一つ以上のフラグメントをいう。全長抗体の「抗原結合フラグメント」との用語に包含される結合フラグメントの例として、（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわちＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価フラグメント；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結した二つのＦａｂフラグメントを含む二価フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；ならびに（ｖｉ）官能性を保持する単離された相補性決定ドメイン（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖフラグメントの二つのドメインであるＶＬおよびＶＨは、別個の遺伝子によりコードされているが、それらは組換え法を使用して、合成リンカーにより結合され得る。この合成リンカーは、ＶＬおよびＶＨ領域が対となり、単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として公知の一価分子を形成する単一タンパク質鎖として、これらの領域が作製されることを可能とする。例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい。
【０２０９】
抗体フラグメントは、当業者に公知の従来的な技術を含む任意の適切な技術を使用して得られる。用語「単一特異性抗体」とは、特定の標的、例えばエピトープに対して単一の結合特異性および親和性を示す抗体をいう。この用語は、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」を含み、本明細書中で使用される場合、単一の分子組成を有する抗体またはそのフラグメントの調製物をいう。本明細書中で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）をいう。
【０２１０】
一実施形態において、抗体のＨＣまたはＬＣは、ヒト生殖細胞系配列によりコードされるアミノ酸配列に対応する配列、例えばフレームワーク領域および／またはＣＤＲ中のものを含む。例えば抗体は、ヒトＤＰ４７抗体由来の配列を含み得る。一実施形態において、抗体の一つ以上のコドンが、生殖細胞系核酸配列に関して変更されるが、同一のアミノ酸配列をコードするように選択される。コドンは、例えば、特定の系において発現を最適化したり、制限酵素部位を作製したり、サイレントフィンガープリントを作製するよう選択し得る。
【０２１１】
一実施形態において、抗体ＨＣのＣＤＲ２は、ＤＰ４７のＣＤＲ２に見られるアミノ酸と同一である少なくとも１１、１２、１３、１４または１５アミノ酸位置を含む。
【０２１２】
「ヒト化」免疫グロブリン可変領域とは、免疫グロブリン可変領域が、正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「ヒト化」免疫グロブリンの説明は、例えば、米国特許第６，４０７，２１３号および米国特許第５，６９３，７６２号を含む。
【０２１３】
「有効なヒト」免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が、正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「有効なヒト」抗体は、抗体が正常なヒトにおいて免疫原性応答を誘発しないような、十分な数のヒトアミノ酸位置を含む抗体である。
【０２１４】
本明細書においては、「Ｔｉｅ複合体」とはＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびアンジオポエチン（Ａｎｇ）を包含するヘテロマー複合体を指す。複合体はＴｉｅ１およびＴｉｅ２の細胞外ドメインの会合により部分的には形成され、そして更にＡｎｇも包含する。本明細書においては、「複合体メンバー」とはヘテロマーＴｉｅ複合体に包含されるタンパク質を指す。従って、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇは全て複合体メンバーである。「Ａｎｇ」という用語は全てのアンジオポエチン、例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４を包含する。ヘテロマーＴｉｅ複合体はＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇ以外に他のタンパク質も包含できる。複合体形成に拮抗するタンパク質またはリガンドは複合体の他のメンバーの少なくとも１つとのＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇの会合を阻害または低減し、そしてこれにより、Ｔｉｅ２シグナリングおよび下流の作用、例えば新脈管形成を低減する。新脈管形成は初期の血管の形成および後期の血管のリモデリングおよび形態学的変化を包含する血管の発生（例えば血管またはリンパ管の発生）の全ての段階を包含する。
【０２１５】
本明細書においては、「アゴニスト」および「拮抗剤」という用語は特定の活性または作用の意味における特性を説明するものである。例えばＥ３またはＥ３ｂ抗体はＴｉｅ１の自己会合（例えばホモ二量体化）を促進するという意味においてアゴニストであることができ、そしてなお、ＨＵＶＥＣによるＴｉｅ複合体の形成および管形成を低減または阻害するという意味においては拮抗剤である。同様に、Ｔｉｅ１シグナリング経路の意味においてアゴニストである薬剤は内皮細胞の新芽形成、分離および管形成の意味においては拮抗剤であることができる。
【０２１６】
「Ｔｉｅ１エクトドメイン」という用語はＴｉｅ１タンパク質の細胞外領域、例えば配列番号２のアミノ酸２５〜７５９を概ね包含する領域を指す。他の例示される領域はＥＧＦ様ドメイン１つ以上（例えば配列番号２の２１４〜２５６、２５８〜３０３、３０３〜３４５、２１４〜３０３、２５８〜３４５または２１４〜３４５）；Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン１つ以上（例えば４３〜１０５、４３〜４２６、３７２〜４２６）；フィブロネクチンＩＩＩ型リピートの１つ以上（例えば配列番号２の４４６〜５４０、５４３〜６３９、６４３〜７４４、４４６〜６３９、５４３〜７４４または４４６〜７４４）；およびこれ等の組み合わせを包含する領域である。「第１のＩｇ様Ｃ２型ドメイン」および「Ｉｇ１」という用語は、他のＩｇ様Ｃ２型ドメイン（第２のこのようなドメイン）と相対比較して、タンパク質のアミノ末端に最も近く位置するＴｉｅ１またはＴｉｅ２における免疫グロブリン様ドメインを指す。例えばＴｉｅ１については、第１の免疫グロブリン様Ｃ２型ドメインは概ね残基４３〜概ね残基１０５に位置し、そして第２の免疫グロブリン様Ｃ２型ドメインは概ね残基３７２〜概ね残基４２６に位置する。
【０２１７】
本明細書中で使用される場合、「結合親和性」とは、見掛け会合定数Ｋａをいう。Ｋａは、解離定数（Ｋｄ）の逆数である。リガンドは、例えば特定の標的分子に対して少なくとも１０５Ｍ−１、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１または１０８Ｍ−１の結合親和性を有する。第二標的に比較して、第一標的に対するリガンドの高い親和性結合は、第二標的への結合に関するＫａ（または絶対値Ｋｄ）よりも、第一標的への結合に関する高いＫａ（または小さい絶対値Ｋｄ）により示し得る。そのような場合、リガンドは、第二標的に比較して第一標的に対する特異性を有する。結合親和性の違いは（例えば、特異性または他の比較に関して）、少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍または１０００倍であり得る。例えば、Ｔｉｅ１結合タンパク質は、別の抗原、例えばＴｉｅ２、ＥＧＦ、フィブロネクチンまたはヒト血清アルブミンよりも少なくとも１．５倍、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍または１０００倍、優先的にＴｉｅと結合し得る。Ｔｉｅ１結合タンパク質はまた、種特異的または種一般的（例えば、二種類以上の種に由来するＴｉｅ１タンパク質に結合し得る）であり得る。
【０２１８】
結合親和性は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴または分光法（例えば、発光アッセイを用いる）等の種々の方法により決定され得る。これらの技術を使用して、結合または遊離のリガンドの濃度をリガンド（または標的）濃度の関数として測定し得る。結合リガンド（［結合］）の濃度は、遊離リガンド（［遊離］）の濃度および標的上のリガンドの結合部位の濃度に関連付けられ、ここで（Ｎ）は下記式による１標的分子あたりの結合部位の数である。
【０２１９】
［結合］＝Ｎ・［遊離］／（（１／Ｋａ）＋［遊離］）
Ｋａの定量的測定はルーチンではあるが、必ずしも正確なＫａの測定を行う必要はなく、例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析等の方法を使用して決定される親和性の定性的測定値を得れば十分な場合もあるが、Ｋａに比例するので、より高い親和性が、参照よりも例えば２倍、５倍、１０倍、２０倍または５０倍高いかどうかの決定等の比較に使用し得る。結合親和性は、典型的には０．０１Ｍ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０中で評価する。
【０２２０】
「単離された組成物」は、単離された組成物を入手し得る天然サンプルの少なくとも一つの成分の少なくとも９０％から取り除かれる組成物をいう。人工的または天然に生成される組成物は、種または目的の種の個体群が重量／重量で少なくとも５％、１０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％純粋である場合に、「少なくとも」ある程度の純度を有する「組成物」となり得る。
【０２２１】
「エピトープ」は、リガンド、例えば抗原結合タンパク質（例えばＦａｂまたは抗体）が結合する標的化合物上の部位をいう。この標的化合物がタンパク質である場合、例えばエピトープは、リガンドが結合するアミノ酸を言い得る。オーバーラップするエピトープは、少なくとも一つの共通アミノ酸残基を含んでいる。
【０２２２】
本明細書中で使用される場合、用語「実質的に同一」（または「実質的に相同」）とは、第一および第二のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列が類似の活性を有するように、第二アミノ酸配列またはヌクレオチド配列に同一または等価な（例えば、類似の側鎖、例えば保存アミノ酸置換物を有する）十分な数のアミノ酸残基またはヌクレオチドを含む第一のアミノ酸配列またはヌクレオチ配列をいうために本明細書中で使用される。抗体の場合、第二の抗体は同じ特異性を有し、同上のものの少なくとも５０％の親和性を有する。
【０２２３】
本明細書中に開示される配列に類似または相同（例えば少なくとも約８５％の配列同一性）である配列もまた、本出願の一部である。一部の実施形態において、配列同一性は、約８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上であり得る。あるいは、核酸セグメントが、選択的なハイブリダイゼーション条件（例えば、高ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、該ストランドの補体にハイブリダイズする場合、実質的な同一性が存在する。核酸は全細胞中、細胞溶解物中、または部分的に精製されるか、実質的に純粋な形態で存在して得る。
【０２２４】
二つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（これらの用語は本明細書中で相互交換可能に使用される）の算定は、下記のとおり実施される。それら配列は、最適な比較の目的のために配列する（例えば、最適配列のために、第一および第二のアミノ酸または核酸配列の一つまたは両方にギャップを導入し得、比較の目的のために、非相同配列を無視し得る）。好ましい実施形態において、比較の目的のために配列される参照配列の長さは、その参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、さらに好ましくは少なくとも５０％、よりさらに好ましくは少なくとも６０％、よりさらに好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一配列中の位置が、第二配列中の対応する位置として、同じアミノ酸残基またはヌクレオチドにより占められる場合、それらの分子はその位置において同一である（本明細書中で使用される場合、アミノ酸または核酸「同一性」は、アミノ酸または核酸「相同性」と同義である）。二つの配列間の相同性パーセントは、ギャップの数および各ギャップの長さを考慮して、二つの配列の最適配列のために導入される必要のある配列により共有される同一位置の数の関数である。
【０２２５】
配列の比較および二配列間の同一性パーセントの決定は、数学的アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態において、二アミノ酸配列間の同一性パーセントを、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２マトリックスかまたはＰＡＭ２５０マトリックス、ならびに１６、１４、１２、１０、８、６または４のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６の長さウエイトを使用して、ＧＳＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（（１９７０）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４８：４４４−４５３）アルゴリズムを使用して決定する。さらに別の好ましい実施形態において、二ヌクレオチド配列間の同一性パーセントを、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスならびに４０、５０、６０、７０または８０のギャップウエイトおよび１、２、３、４、５または６の長さウエイトを使用して、ＧＣＧソフトウエアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して決定する。特に好ましいパラメーターの組（および分子が、本明細書中に記載される配列同一性または相同性制限の範囲にある場合に、どのパラメーターを決定に適用するか不確かな場合に用いられるべきパラメーター組）は、ギャップペナルティー１２、ギャップ拡張ペナルティー４およびフレームシフトギャップペナルティー５を用いるＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアリングマトリックスである。
【０２２６】
本明細書中で使用される場合、用語「相同」とは、「類似」と同義であり、目的の配列が、一つ以上のアミノ酸置換物の存在により参照配列と異なることを意味する（但し、適度のアミノ酸挿入または欠損は存在し得る）。参照配列に対する相同性または類似性の程度を算定する現在のところ好ましい手段は、それぞれの場合で、算定された配列関連性の有意性を決定するためのアルゴリズムデフォルトまたは推奨されるパラメーターを使用したＢＬＡＳＴアルゴリズム（ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ），Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤから入手可能）を使用することによる。二アミノ酸配列間または二ヌクレオチド配列間の同一性パーセントは、ＰＡＭ１２０ウエイト残基表、ギャップ長さペナルティー１２およびギャップペナルティー４を使用して、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（（１９８９）ＣＡＢＩＯＳ，  ４：１１−１７）のアルゴリズムを使用しても決定し得る。
【０２２７】
本明細書中で使用される場合、用語「低ストリンジェンシー、中ストリンジェンシー、高ストリンジェンシー、または非常に高いストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする」とは、ハイブリダイゼーションおよび洗浄についての条件を説明する。ハイブリダイゼーション反応を実施するための指針は、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出され得る。水性法および非水性法がこの引用文献に記載されており、いずれの方法も使用し得る。本明細書中で言及されるハイブリダイゼーションの具体的な条件は、以下のとおりである：１）約４５℃での６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中の低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、それに続く少なくとも５０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの二回の洗浄（洗浄の温度は、低ストリンジェンシー条件では５５℃まで上昇させ得る）；２）約４５℃での６×ＳＳＣ中の中ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、それに続く６０℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの一回以上の洗浄；３）約４５℃での６×ＳＳＣ中の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、それに続く６５℃での０．２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳでの一回以上の洗浄；および４）非常に高いストリンジェンシー条件は、６５℃の０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ、それに続く６５℃での０．２×ＳＳＣ、１％ＳＤＳでの一回以上の洗浄。
【０２２８】
本明細書中に記載されるタンパク質は、本明細書中に記載される特定のタンパク質に対し、機能に対して実質的な効果を有さない変異（例えば、保存アミノ酸置換または非必須アミノ酸置換）を有し得ることが理解される。特定の置換が許容されるかどうか、つまり、結合活性等の所望の生物学的特性に悪影響を与えるかどうかを、Ｂｏｗｉｅら（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０に記載されるように決定し得る。「同類アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基により置換されるアミノ酸置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野で定義されている。これらのファミリーは、塩基側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む。例えば、フレームワークおよびＣＤＲアミノ酸残基が、一つ以上の同類置換を含むことが可能である。
【０２２９】
「非必須」アミノ酸残基は、生物学的活性を無効にすることなく、さらに好ましくは生物学的活性を実質的に変えることなく、結合物質（例えば、抗体）の野生型配列から変更させる得る残基であるが、「必須」アミノ酸残基はそのような変化を生じさせる。
【０２３０】
一般的に、「Ｘ」がアミノ酸残基を示すために用いられる場合、任意のアミノ酸（例えば２０種類の天然アミノ酸のいずれか）または少なくともその部分集合（例えば、１９種類の非システインアミノ酸のいずれか）を、その位置で使用し得る。
【０２３１】
用語「ポリペプチド」または「ペプチド」（これらは相互交換可能に使用し得る）とは、ペプチド結合により連結された長さが３以上のアミノ酸、例えば３〜３０、１２〜６０、もしくは３０〜３００、または３００アミノ酸を超えるポリマーをいう。ポリペプチドは一つ以上の非天然アミノ酸を含み得る。典型的にポリペプチドは、天然アミノ酸のみを含む。「タンパク質」は、一つ以上のポリペプチド鎖を含み得る。したがって、用語「タンパク質」は、ポリペプチドを包含する。タンパク質またはポリペプチドは、一種以上の改変、例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化等を含み得る。用語「小さいペプチド」は、長さが３〜３０アミノ酸、例えば長さが８〜２４アミノ酸であるポリペプチドを記載するために使用され得る。
【０２３２】
統計的な有意性を、任意の技術分野で公知の方法により決定し得る。例示的な統計的検定としては、スチューデントＴ試験、Ｍａｎｎ  Ｗｈｉｔｎｅｙ  Ｕ非パラメーター試験およびＷｉｌｃｏｘｏｎ非パラメーター統計的検定を含む。一部の統計的に有意な関係は、０．０５または０．０２未満のＰ値を有する。特定のリガンドは、統計的に有意な差（例えば、Ｐ値＜０．０５または０．０２）を、例えば特異性または結合性について示し得る。
【０２３３】
本発明の他の特徴および利点は下記の詳細な説明および別添の特許請求の範囲からより明白となる。本発明の実施形態は、本明細書中に記載される特徴のいかなる組合せも含み得る。いかなる場合も、用語「実施形態」は、本明細書中（例えば、別の実施形態）に開示される１つ以上の他の特徴を必ずしも排除しない。本出願で引用されたすべての参考文献、特許出願および公開された特許の内容を、本明細書中で参考として明確に援用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２３４】
（詳細な説明）
本開示は特に、Ｔｉｅ複合体の成分、例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇに結合する薬剤（結合タンパク質およびリガンドとも称する）を提供する。このような薬剤の例は、タンパク質、例えば小型ペプチド（例えば７〜２５アミノ酸の環状または線状ペプチド）、ポリペプチド（例えば少なくとも２０アミノ酸のポリペプチド）、または多重鎖のタンパク質（例えば少なくとも２つのペプチドまたはポリペプチドを包含する）を包含する。多重鎖タンパク質の例は別個の重鎖および軽鎖を有するＩｇＧ完全長抗体である。ポリペプチドの例は１本鎖抗体である。
【０２３５】
薬剤は特定の特性、例えばＴｉｅ１／Ｔｉｅ２／Ａｎｇ複合体形成に拮抗する能力、Ｔｉｅ１ホモ二量体化を促進する能力およびＴｉｅ１リン酸化を促進する能力を有するものを選択できる。例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する薬剤はヘテロマーＴｉｅ複合体の形成に拮抗するその能力に関して試験できる。この複合体の拮抗によりＴｉｅ２シグナリングおよびその下流の作用、例えば新脈管形成の促進が低減される。
【０２３６】
Ｔｉｅ１は、膜貫通ドメインを含むレセプターチロシンキナーゼタンパク質である。Ｔｉｅ１は、ほぼ内皮細胞のみに存在する。したがって、Ｔｉｅ１結合タンパク質を使用して、例えば内皮細胞を特異的に認識し、または標的とし得る。また、一部のＴｉｅ１結合タンパク質を、内皮細胞と共働または拮抗させるために使用し得る。一部の実施形態において、これらのＴｉｅ１結合タンパク質は、特定の構造的特徴物（例えば下記の特徴物）、下記の特徴物の組み合わせ、および／または下記の構造的特徴物に少なくとも一つのアミノ酸を含むエピトープに対して親和性を有する（配列は、下記の実施例１、配列番号２に与えられるアミノ酸配列に関連する）。
【０２３７】
【数１０】
2008532476.tif 000012
Ｔｉｅ２は膜貫通ドメインを包含するレセプターチロシンキナーゼタンパク質である。Ｔｉｅ２はほぼ内皮細胞上のみに存在する。従って例えば内皮細胞を特異的に認識するか、これをターゲティングするためにＴｉｅ２結合タンパク質を使用することができる。一部のＴｉｅ２結合タンパク質はまた内皮細胞の活性を調節（例えばアゴナイズまたは拮抗）するためにも使用できる。一部の実施形態においては、これ等のＴｉｅ２結合タンパク質は特定の構造的特徴、特徴の組み合わせ、および／または、構造的特徴において少なくとも１つのアミノ酸を包含するエピトープに対する親和性を有している。Ｔｉｅ２の構造的特徴の例は、２つのＩｇ様ドメイン、３つのＥＧＦ様ドメインおよび３つのフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを包含する。
【０２３８】
アンジオポエチンはＴｉｅ２に結合するリガンドのファミリーである。一部のＡｎｇ結合タンパク質（例えば抗体または人工Ａｎｇ結合タンパク質）は内皮細胞をアゴナイズまたは拮抗するために使用できる。一部の実施形態においては、これ等のＡｎｇ結合タンパク質は特定の構造的特徴、特徴の組み合わせ、および／または、構造的特徴において少なくとも１つのアミノ酸を包含するエピトープに対する親和性を有している。例示される構造的特徴は約５０アミノ酸のＮ末端領域、コイルドコイルドメインまたはフィブリノーゲン様ドメインを包含する。
【０２３９】
Ａｎｇ結合タンパク質の例はＡｎｇの多量体化を阻害するタンパク質（例えば４量体を形成するＡｎｇタンパク質の能力）、Ａｎｇ−Ｔｉｅ２相互作用を阻害するタンパク質、およびＴｉｅ１−Ｔｉｅ２−Ａｎｇの三元複合体を阻害するタンパク質を包含する。阻害性のタンパク質は既存の相互作用を妨害することにより、または、相互作用の発生を防止することにより機能することができる。
【０２４０】
Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２はその細胞外ドメインを介して会合し、そしてアンジオポエチン（Ａｎｇ）、例えばＡｎｇ１、Ａｎｇ２、Ａｎｇ３およびＡｎｇ４とのヘテロマー複合体を形成することができる。このヘテロマー複合体はＴｉｅ２により媒介される細胞内シグナリングカスケードを活性化する。即ち、このヘテロマー複合体の拮抗性の形成はＴｉｅ２シグナリングおよびその下流の作用、例えば新脈管形成を阻害することへの新しい試み方を提供する。複合体形成はＴｉｅ１またはＴｉｅ２の細胞外ドメインに結合するか、または、Ａｎｇに結合するタンパク質により拮抗されることができ、これによりその複合体へのリクルートメントを防止するか、またはその多量体化を防止する。
【０２４１】
Ｔｉｅ１に結合するタンパク質を発見するための１つの方法は、ライブラリーを準備すること、および、Ｔｉｅ１抗原またはそのフラグメントに結合するタンパク質をコードするメンバー１つ以上をライブラリーから選択することを包含する（例えば細胞外ドメイン、ＥＧＦドメイン、フィブロネクチンリピートまたはＩｇスーパーファミリードメイン（例えばＩｇ様Ｃ２型２ドメイン））。選択は多くの方法において実施できる。例えばライブラリーはディスプレイライブラリであることができる。Ｔｉｅ１にタグ付けし、組換え発現させることができる。Ｔｉｅ１を精製し、支持体、例えばアフィニティービーズまたは常磁性体ビーズまたは他の磁気的に応答する粒子に結合させる。Ｔｉｅ１はまた細胞表面上で発現させることもできる。例えばＴｉｅ１が活性化された場合にのみ細胞に特異的に結合するディスプレイライブラリのメンバーを選択できる。類似した操作法を実施することによりＴｉｅ２またはそのフラグメントに結合するタンパク質を発見することができる（例えば細胞外ドメイン、ＥＧＦドメイン、フィブロネクチンリピートまたはＩｇスーパーファミリードメイン（例えばＩｇ様Ｃ２型２ドメイン））。類似した方法を実施することによりＡｎｇまたはそのフラグメントに結合するタンパク質を発見することもできる（例えばＮ末端ドメイン、コイルドコイルドメインまたはフィブリノーゲン様ドメイン）。
【０２４２】
Ｔｉｅ複合体メンバーに結合できるものとして発見されたタンパク質はそのヘテロマー複合体形成に拮抗する能力、Ｔｉｅ１リン酸化を促進する能力、および／または、Ｔｉｅ１ホモ２量体形成を促進する能力について後述する実施例に記載する通り試験することができる。ヘテロマー複合体の拮抗性の形成として発見されたタンパク質はそのような治療を必要とする被験体、例えば新脈管構造依存性癌または腫瘍または他の新脈管形成関連障害を有する被験体を治療するための薬学的組成物中に使用できる。
【０２４３】
（例示されるＴｉｅ１モジュレーター）
一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質はＴｉｅ１の活性を調節できる。例えばＴｉｅ１結合タンパク質は実施例２に記載するＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験においてＴｉｅ１アゴニストまたは拮抗剤として機能できる。このＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験におけるＴｉｅ１アゴニストは特定の条件、例えばＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験の条件の下に内皮細胞の特定の活性を刺激することができる。
【０２４４】
一部のＴｉｅ１結合タンパク質は内皮細胞におけるホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）活性および／またはＡｋｔキナーゼ活性を増大させる。Ｋｏｎｔｏｓ等はＴｉｅ１の原形質ドメインがＰＩ３キナーゼのｐ８５サブユニットと会合してＰＩ３キナーゼ活性を活性化することができることを示唆している。Ｋｏｎｔｏｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２２：１７０４−１７１３。Ｔｉｅ１原形質ドメインはまたタンパク質チロシンホスファターゼＳｈｐ２とも会合する。例えばＭａｒｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ａｄｖ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．Ｂｉｏｌ．４７６：３５−４６を参照できる。
【０２４５】
一部のＴｉｅ結合タンパク質はＴｉｅ１の原形質ドメイン、例えば概ねアミノ酸１１１７におけるモチーフＹＶＮにおけるチロシンの二量体化および／またはチロシンリン酸化（例えば自己リン酸化の結果として）を増大させる場合がある。
【０２４６】
Ｔｉｅ１結合タンパク質は細胞試験において評価できる（例えば実施例２において後述するＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験において）。例示される細胞試験は成長因子レセプターの細胞内ドメインに融合されたＴｉｅ１エクトドメインを包含するキメラレセプターが発現される成長因子依存性細胞を用いる。細胞は必須成長因子の非存在下であるがただし被験化合物、例えばＴｉｅ１結合タンパク質の存在下において生育する能力について評価する。Ｔｉｅ１結合タンパク質がＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験においてＴｉｅ１をアゴナイズする場合は、Ｔｉｅ１キメラのシグナリング活性はその同族体レセプターを介して必要な成長因子による刺激の代替となりえる。即ち、必要な成長因子の非存在下における細胞の生存は、Ｔｉｅ１結合タンパク質がＴｉｅ１エクトドメインと相互作用をすることの指標として用いることができる。
【０２４７】
Ｔｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験におけるＴｉｅ１アゴニストは他の条件下、例えばインビボにおいて、Ｔｉｅ１活性の阻害剤として挙動する場合があり、そしてインビトロの特性とは無関係にインビボの新脈管形成の阻害剤として有用であってよい。
【０２４８】
Ｔｉｅ１結合タンパク質は例えば内皮細胞の活性を低減するために使用できる。例えば一部のＴｉｅ１結合タンパク質は内皮細胞におけるホスファチジルイノシトール３キナーゼ（ＰＩ３キナーゼ）活性、Ｓｈｐ２活性および／またはＡｋｔキナーゼ活性を低減するために使用できる。一部のＴｉｅ１結合タンパク質はまたＴｉｅ１の原形質ドメイン、例えば概ねアミノ酸１１１７におけるモチーフＹＶＮにおけるチロシンの二量体化および／またはチロシンリン酸化（例えば自己リン酸化の結果として）を低減する場合がある。
【０２４９】
Ｔｉｅ１結合タンパク質は細胞試験において活性を評価できる。例えば結合タンパク質は、本明細書に記載した細胞試験（例えば実施例２において後述するＴｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢａＦ３細胞試験）において、他のリガンド、例えばＥ３抗体がＴｉｅ１活性を調節することを防止する能力について試験することができる。
【０２５０】
（ディスプレイライブラリ）
多くの方法を、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ、そのフラグメント、１つ以上のこれらのタンパク質またはそのフラグメントを含む複合体に結合するタンパク質を同定するために使用し得る。一実施形態において、ディスプレイライブラリは、そのようなタンパク質を同定するために使用される。ディスプレイライブラリは、実体の集合であり；各実体は、利用可能なタンパク質成分、およびこのタンパク質成分をコードまたは同定する回収可能な成分を含む。タンパク質成分は、任意の長さ（例えば、３アミノ酸〜３００を超えるアミノ酸）であり得る。選択において、ライブラリーの各メンバーのタンパク質成分を標的（例えば、Ｔｉｅ１タンパク質）により調べ、このタンパク質成分がその標的に結合する場合、ディスプレーライブラリーメンバーを、例えば支持体上の保持により同定する。この方法を、他の標的（例えば、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ、そのフラグメント、１つ以上のこれらのタンパク質またはそれらのフラグメントを含む複合体）に適合させ得る。
【０２５１】
保持されるディスプレーライブラリーメンバーを、支持体から回収し、分析する。この分析は、類似または異なる条件下での増幅およびその後の選択を含み得る。例えば、ポジティブ選択およびネガティブ選択を交互に行い得る。この分析はまた、タンパク質成分のアミノ酸配列の決定および詳細な特性付けのためのタンパク質成分の精製を含み得る。種々のフォーマットを、ディスプレイライブラリに対して使用し得る。例としては以下が挙げられる。
【０２５２】
（ファージディスプレー）
一つのフォーマットは、ウイルス、特にバクテリオファージを利用する。このフォーマットは「ファージディスプレー」と呼ばれる。タンパク質成分は、典型的にはバクテリオファージコートタンパク質に共有結合する。この結合は、コートタンパク質に融合させたタンパク質成分をコードする核酸の翻訳から生じる。この結合は、柔軟性のあるペプチドリンカー、プロテアーゼ部位、またはストップコドンの阻害の結果として導入されるアミノ酸を含み得る。ファージディスプレーは、例えばＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９号；Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７；ＷＯ９２／１８６１９；ＷＯ９１／１７２７１；ＷＯ９２／２０７９１；ＷＯ９２／１５６７９；ＷＯ９３／０１２８８；ＷＯ９２／０１０４７；ＷＯ９２／０９６９０；ＷＯ９０／０２８０９；ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２：３７１−８；Ｆｕｃｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ  Ａｎｔｉｂｏｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ  １２：７２５−７３４；Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２２６：８８９−８９６；Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８；Ｇｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）ＰＮＡＳ  ８９：３５７６−３５８０；Ｇａｒｒａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７３−１３７７；Ｒｅｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．  ２６７：１２９−４９；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ  １９：４１３３−４１３７；およびＢａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＰＮＡＳ  ８８：７９７８−７９８２に記載されている。
【０２５３】
ファージディスプレーシステムは、繊維状ファージ（ファージｆ１、ｆｄおよびＭ１３）ならびに他のバクテリオファージ（例えば、Ｔ７バクテリオファージおよびラムドイドファージ；例えばＳａｎｔｉｎｉ（１９９８）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２８２：１２５−１３５；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｉｎｎｏｖａｔｉｏｎｓ  ６：１−６；Ｈｏｕｓｈｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２６８：３６３−３７０を参照）について開発された。繊維状ファージディスプレーシステムは、典型的には、遺伝子ＩＩＩタンパク質等のマイナーコートタンパク質および遺伝子ＶＩＩＩタンパク質、メジャーコートタンパク質への融合物を使用するが、遺伝子ＶＩタンパク質、遺伝子ＶＩＩタンパク質、遺伝子ＩＸタンパク質またはそのドメイン等、他のコートタンパク質への融合物もまた使用し得る（例えば、ＷＯ００／７１６９４を参照）。一実施形態において、この融合は、遺伝子ＩＩＩタンパク質のドメイン、例えばアンカードメインまたは「スタンプ」への融合である（例えば、遺伝子ＩＩＩタンパク質アンカードメインの説明については、米国特許第５，６５８，７２７号を参照）。示されるタンパク質を、非ペプチド結合、例えば非共有結合または非ペプチド共有結合を使用して、コートに物理的に会合させ得る。例えば、ジスルフィド結合および／またはｃ−ｆｏｓおよびｃ−ｊｕｎコイル状コイルを、物理的会合のために使用し得る（例えば、Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｇｅｎｅ  １３７：６９およびＷＯ０１／０５９５０を参照）。
【０２５４】
タンパク質成分を示すバクテリオファージを生育し得、標準的なファージ調製法、例えば生育培地からのＰＥＧ析出を使用して集め得る。個々のディスプレーファージの選択後に、選択されたファージを使用して細胞を感染させることにより、選択されたタンパク質成分をコードする核酸が得られる。個々のコロニーまたはプラークを集め、核酸を単離し、配列決定し得る。
【０２５５】
（細胞系ディスプレー）
さらに別のフォーマットにおいて、ライブラリーは細胞ディスプレイライブラリである。タンパク質は、細胞、例えば真核または原核細胞の表面に示される。例示的な原核細胞としては、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ細胞および胞子（例えばＬｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １３：３６６）が挙げられる。例示的な真核細胞としては、酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、ＨａｎｓｅｕｌａまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）が挙げられる。酵母表面ディスプレーは、例えば、Ｆａｂフラグメント等の免疫グロブリンタンパク質を示すために使用し得る酵母ディスプレーシステムならびに重鎖および軽鎖の組合せを生むための交配の使用を記載するＢｏｄｅｒおよびＷｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７およびＷＯ０３／０２９４５６に記載されている。
【０２５６】
（リボソームディスプレー）
ＲＮＡおよびこのＲＮＡによりコードされるポリペプチドは、このＲＮＡを翻訳し、発生期のポリペプチドをなお付着させているリボソームを安定化することによって物理的に会合させ得る。典型的には、高い二価Ｍｇ２＋濃度および低い温度が使用される。例えば、Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：９０２２およびＨａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２８７−９２；Ｈａｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３２８：４０４−３０；およびＳｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２３１（１−２）：１１９−３５を参照されたい。
【０２５７】
（ポリペプチド−核酸融合物）
別のフォーマットは、ポリペプチド−核酸融合物を利用する。共有結合させたピュロマイシン基を含むポリペプチド−核酸融合物は、例えばＲｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４：１２２９７−１２３０２および米国特許第６，２０７，４４６号に記載されるように、ｍＲＮＡのインビトロ翻訳により生じさせ得る。次いで、ｍＲＮＡをＤＮＡへと逆転写し、ポリペプチドに架橋させ得る。
【０２５８】
（他のディスプレーフォーマット）
さらに別のディスプレーフォーマットは、タンパク質成分が、ポリペプチドを同定する非核酸タグに結合した非生物学的ディスプレーである。例えば、このタグは、ポリペプチドを示すビーズに結合させた化学タグまたは高周波タグであり得る（例えば、米国特許第５，８７４，２１４号を参照）。
【０２５９】
ディスプレー技術はまた、結合タンパク質（例えば、標的の特定のエピトープと相互作用する抗体）を得るために使用され得る。これは、例えば、特定のエピトープが欠如するか、またはエピトープ内で（例えばアラニンにより）変異させた競合する非標的分子を使用することにより実施し得る。そのような非標的分子は、ディスプレイライブラリを標的に結合させる際に競合する分子として、または、例えば標的に対して特異的ではないディスプレーライブラリーメンバーを解離させる洗浄溶液中に捕捉するための前溶出剤として、下記のようなネガティブ選択手順に使用し得る。
【０２６０】
（反復選択）
一つの好ましい実施形態において、ディスプレイライブラリ技術を反復様式で使用する。第一のディスプレイライブラリを使用して、標的に対する一つ以上の結合タンパク質を同定する。次いで、これらのタンパク質を、例えば変異誘発法を使用して改変し、第二のディスプレイライブラリを形成する。次いで、高親和性結合タンパク質を、例えばさらに高いストリンジェンシーまたはさらに競合的な結合および洗浄条件を使用することにより、第二ライブラリーから選択する。
【０２６１】
一部の実施において、変異誘発は、公知の領域または結合インターフェースにあると思われる領域を標的とする。例えば、同定された結合タンパク質が抗体である場合、変異誘発を、本明細書中に記載されるように重鎖または軽鎖のＣＤＲ領域に向けさせ得る。さらに、変異誘発を、ＣＤＲの近くのまたはＣＤＲに隣接するフレームワーク領域、例えば、ＣＤＲ結合部の特に１０、５または３アミノ酸内のフレームワーク領域に向けさせ得る。抗体の場合、変異誘発を、例えば正確な段階的改善のために、１個または２〜３個のＣＤＲに限定することもできる。
【０２６２】
一部の例示的な変異誘発技術として、エラープローンＰＣＲ（Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ  １：１１−１５）、組換え（例えば、ＵＳＳＮ  １０／２７９，６３３を参照）、ランダム切断を使用するＤＮＡシャッフリング（Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  ３８９−３９１；「核酸シャッフリング」と呼ばれる）、ＲＡＣＨＩＴＴ（商標）（Ｃｏｃｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１９：３５４）、部位特異的変異誘発（Ｚｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  １０：６４８７−６５０４）、カセット変異誘発（Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ（１９９１）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０８：５６４−５８６）および縮重オリゴヌクレオチドの取り込み（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：３２４５）が挙げられる。
【０２６３】
反復選択の一例において、本明細書中に記載される方法を使用して、標的に対する少なくとも最少の結合特異性または最少の活性、例えば１ｎＭ、１０ｎＭまたは１００ｎＭを超える結合の平衡解離定数でＴｉｅ１に結合する結合タンパク質をディスプレイライブラリからまず同定する。最初に同定された結合タンパク質をコードする核酸配列を、変異の導入のための鋳型核酸として使用し、例えば、最初の結合タンパク質と比較して特性（例えば、結合親和性、反応速度または安定性）を向上させた第二結合タンパク質を同定する。
【０２６４】
（オフ−レート選択）
遅い解離速度は、特にポリペプチドとそれらの標的との相互作用に関して高い親和性を
予測し得るので、本明細書中に記載される方法を使用して、標的との結合相互作用に関して所望の（すなわち低下した）動態学的解離速度を有する結合タンパク質を単離し得る。
【０２６５】
解離が遅い結合タンパク質をディスプレイライブラリから選択するために、固定した標的にライブラリーを接触させる。次いで、この固定した標的を、非特異的または弱く結合する生体分子を除去する第一溶液で洗浄する。次いで、固定した標的を、飽和量の遊離標的、すなわち粒子に結合しない標的の複製を含む第二溶液で溶出する。遊離標的は、標的から解離する生体分子に結合する。再結合は、さらに低い濃度の固定した標識に対して飽和量の遊離標的により効果的に妨げられる。
【０２６６】
第二溶液は、実質的に生理学的またはストリンジェントである溶液条件を有し得る。典型的には、第二溶液の溶液条件は第一溶液の溶液条件と同一である。第二溶液の分画は、後の分画から先のものを区別するために時間的順序で集められる。後の分画は先の分画中の生体分子よりも標的から遅い速度で解離する生体分子を含む。また、長期のインキュベーション後でさえも標的に結合したままであるディスプレーライブラリーメンバーを回収することも可能である。これらはカオトロピック条件を使用して解離させるか、もしくは標的に結合させながら増幅し得る。例えば、標的に結合したファージを、細菌細胞に接触させ得る。
【０２６７】
（特異性のための選択とスクリーニング）
「選択」とは、ディスプレイライブラリの多くのメンバーを標的に接触させ、結合したものを回収、増殖させるプロセスをいう。この選択は、例えば１０１０メンバーを超える多くのメンバーを有するライブラリーからの選択であり得る。「スクリーニング」とは、単離されたライブラリーメンバーを標的への結合について一つずつ調べるプロセスをいう。自動化により、数千の候補物質を高度な並行プロセスでスクリーニングし得る。本明細書中に記載されるディスプレイライブラリ選択法は、非標的分子に結合するディスプレーライブラリーメンバーを捨てる選択プロセスを含み得る。非標的分子の例として、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリードメインまたはＥＧＦドメインを含む分子の細胞外ドメイン、およびＴｉｅ１以外（例えば、Ｔｉｅ２）またはＴｉｅ２以外（例えば、Ｔｉｅ１）またはＴｉｅ１およびＴｉｅ２以外のレセプターチロシンキナーゼが挙げられる。一つの実施において、いわゆる「ネガティブ選択」工程を、標的と、関連する非標的分子と、関連するが異なる非標的分子とを区別するために使用される。ディスプレイライブラリまたはそのプールを非標的分子に接触させる。非標的に結合しないサンプルのメンバーを集め、その後の標的分子への結合のための選択か、場合によってはその後のネガティブ選択のためにも使用する。ネガティブ選択工程は、標的分子に結合するライブラリーメンバーの選択前でも選択後でもよい。
【０２６８】
別の実施において、スクリーニング工程を使用する。ディスプレーライブラリーメンバーを標的分子との結合のために単離した後に、各単離ライブラリーメンバーを、非標識分子（例えば、上記の非標的）との結合能力について調べる。例えば、高スループットＥＬＩＳＡスクリーニングを、このデータを得るために使用し得る。また、ＥＬＩＳＡスクリーニングを、標的に対する各ライブラリーメンバーの結合に関する定量的なデータを得るために使用し得る。非標的結合データおよび標的結合データを比較して（例えば、コンピュータおよびソフトウエアを使用して）、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、Ａｎｇ、そのフラグメント、または１つ以上のそのような成分を含む複合体に特異的に結合するライブラリーメンバーを同定する。
【０２６９】
本明細書中に記載されるディスプレイライブラリの選択およびスクリーニング法は、標的分子上の特定の部位に結合するディスプレーライブラリーメンバーについての選択または選択するスクリーニングプロセスを含み得る。例えば、高濃度の本明細書中に記載される抗体による溶出を使用して、溶出に使用された抗体が結合するエピトープに近いか、またはそれにオーバーラップするエピトープに結合するファージを選択し得る。したがって、緩衝液中にＥ３抗体の使用の有無に関わらずＥＬＩＳＡを実施することにより、Ｔｉｅ１のＥ３結合部位に結合するファージがスクリーニングし得る。
【０２７０】
以下の記載は、ファージミドＦａｂライブラリーを使用して、Ｔｉｅ１に結合する抗体を同定する一つの例示的方法を提供する。例えば、三回の選択を、標的タンパク質の減少量（例えば、一回目、二回目および三回目でそれぞれ１００μｇ、５０μｇおよび５０μｇ）を用いて実施し得る。標的はストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ）に固定化する。ライブラリーを、各回の選択前のストレプトアビジン被覆磁気ビーズに対して、および必要に応じて共通の精製ハンドルを含み得る無関係のタンパク質に対して除去（ｄｅｐｌｅｔｅ）する。例えば、標的がＦｃドメインとの融合物として生成される場合、ライブラリーを可溶性Ｔｒａｉｌ−Ｆｃ（市販のＦｃ融合タンパク質）に対して除去し得る。この除去プロセスはＦｃバインダーを除去する。
【０２７１】
各回の選択は、例えば、２サイクルのストレプトアビジン磁気ビーズ除去、１サイクルのファージのＴｉｅ１被覆ビーズへの結合、１０サイクルの洗浄、結合ファージの溶出、および次回のために濃縮したファージの増殖を含み得る。１０回の洗浄後、Ｔｉｅ１被覆ビーズに結合したファージを直接的に増幅し得るか、または増幅前に溶出し得る。三回の選択後、個々のクローンを９６ウエルマイクロタイタープレートで生育させ、ファージＥＬＩＳＡによりＴｉｅ１結合活性について個々にスクリーニングし得る。ＥＬＩＳＡは、Ｔｉｅ１、特異性コントロールおよび関連のないコントロールへの結合の評価を含み得る。単離物を、選択プロセスから生じる多様性を決定するためにＤＮＡフィンガープリンティングし得る。例えばポジティブ単離物は、オリゴヌクレオチドプライマーＭ１３リバースおよび遺伝子ＩＩＩフォワードによりＰＣＲ増幅され得る（例えば、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１を参照）。生成物は、ＢｓｔＮＩフィンガープリンティングにより分析し得る。
【０２７２】
結合タンパク質を示すファージによるＥＬＩＳＡを実施する例示的な方法は、以下のとおりである。個々のクローンを生育させ、既に記載されるように（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１）回収し得る。ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルＩｍｍｕｌｏｎ  ２ＨＢプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ中ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ（商標）ストレプトアビジン（Ｐｉｅｒｃｅ）１μｇ／ウェルで被覆し、４℃で一晩インキュベートする。ＰＢＳで３回洗浄後、１００μＬのビオチニル化Ｔｉｅ１タンパク質を固定化ストレプトアビジンと室温で３０〜６０分間結合させる。次いで、Ｔｉｅ１被覆ウェルを３００μＬの２％乳／１×ＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（２％ＭＰＢＳＴ）で、３７℃にて２時間、ブロックする。これらのウェルを、２％ＭＰＢＳＴで室温にて一時間ブロックしておいた１００μＬのファージ培養上清とともにインキュベートする。ウェルを１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０．１％（ＰＢＳＴ）で５回洗浄し、抗Ｍ１３−ＨＲＰ第二抗体の１：５，０００希釈物１００μＬとともに、室温にて１時間、インキュベートする。これらのウェルを、ＴＭＢ溶液による展開前にＰＢＳＴで５回洗浄し、６３０ｎｍで読む。
【０２７３】
細胞ＥＬＩＳＡのために、細胞をＰＢＳで一回洗浄し、ＰＢＳの１×１０６〜２×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁させる。９６ウェル組織培養プレート（Ｆａｌｃｏｎ，ＶＷＲ）の１ウェルあたり１〜２×１０５細胞の最終濃度を使用し得る。これらの細胞を、等量の０．２％グルタルアルデヒド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、３７℃で１２分間インキュベートすることにより固定する。次いで、自動プレート洗浄器（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．）を使用して、それらをＰＢＳで三回洗浄し、２００μＬの２％ＭＰＢＳＴで室温にて一時間ブロックする。このＥＬＩＳＡの残りの手順を、１×ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ０．０５％を洗浄およびインキュベーションに使用する以外は上記のように実施し得る。
【０２７４】
（生殖細胞系抗体）
抗体の可変領域を一つ以上の生殖細胞系配列にさらに類似させるために、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２、またはＡｎｇに結合する抗体（例えば、本明細書中に記載される抗体）を改変し得る。例えば、抗体は、一つ、二つ、三つまたはそれ以上のアミノ酸置換を、例えばフレームワークまたはＣＤＲ領域に含み得、それを参照生殖細胞系配列にさらに類似させ得る。一つの例示的な生殖細胞系列化方法は；単離された抗体の配列に類似する（例えば、特定のデータベースで最も類似する）一つ以上の生殖細胞系配列を同定する工程を包含し得る。次いで、（アミノ酸レベルでの）変異を、付加的に、組み合わせて、またはその両方で単離された抗体中に引き起こし得る。例えば、いくつかまたはすべての可能な生殖細胞系変異をコードする配列を含む核酸ライブラリーを作る。次いで、変異抗体を評価して、例えば、単離抗体に対して一つ以上のさらなる生殖細胞系残基を有し、かつなお有用である（例えば、機能的な活性を有する）抗体を同定する。一実施形態において、できるだけ多くの生殖細胞系残基を単離抗体に導入する。
【０２７５】
一実施形態において、変異誘発を使用して、一つ以上の生殖細胞系残基を置換するかまたはＣＤＲ領域に挿入する。例えば、生殖細胞系ＣＤＲ残基は、改変される可変領域に対して類似（例えば、最も類似）する生殖細胞系配列からのものであり得る。変異誘発後、抗体の活性（例えば、結合または他の機能的な活性）を評価して、生殖細胞系残基（単数または複数）が許容されるかどうかを決定し得る。類似の変異誘発をフレームワーク領域内で実施し得る。
【０２７６】
生殖細胞系配列の選択は異なる方法で実施し得る。例えば、生殖細胞系配列が、選択性または類似性についての所定の基準、例えば、少なくともある程度の割合の同一性、例えば少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または９９．５％の同一性を満たす場合、この生殖細胞系配列を選択し得る。選択は、少なくとも２、３、５または１０の生殖細胞系配列を使用して実施し得る。ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の場合、類似の生殖細胞系配列の同定は、そのような一つの配列を選択することを含み得る。ＣＤＲ３の場合、類似の生殖細胞系配列の同定は、そのような一つの配列を選択することを含み得るが、アミノ末端部分およびカルボキシ末端部分に別個に寄与する二つの生殖細胞系配列の使用を含み得る。他の実施において、二つまたは三つ以上の生殖細胞系配列を、例えば共通配列を形成するために使用する。
【０２７７】
一実施形態において、特定の参照可変ドメイン配列、例えば本明細書中に記載される配列に関して、関連可変ドメイン配列が、参照ＣＤＲ配列中の残基（ヒト生殖細胞系配列（すなわち、ヒト生殖細胞系核酸によりコードされるアミノ酸配列）で対応する位置の残基と同一である残基）と同一でないＣＤＲアミノ酸位置の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または１００％を有する。
【０２７８】
一実施形態において、特定の参照可変ドメイン配列、例えば本明細書中に記載される配列に関して、関連可変ドメイン配列が、ヒト生殖細胞系配列、例えば、参照可変ドメイン配列に関連した生殖細胞系配列からのＦＲ配列に同一であるＦＲ領域の少なくとも３０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を有する。
【０２７９】
したがって、感心の所与の抗体に類似の活性を有するが、一つ以上の生殖細胞系配列、特に一つ以上のヒト生殖細胞系配列にさらに類似する抗体を単離し得る。例えば、抗体はＣＤＲ（例えばフレームワーク領域）以外の領域中の生殖細胞系配列に少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％同一であり得る。さらに、抗体は、改変される可変領域に類似する（例えば、最も類似する）生殖細胞系配列からの生殖細胞系残基である、ＣＤＲ領域中の少なくとも１個、２個、３個、４個または５個の生殖細胞系残基を含み得る。主要な関心の生殖細胞系配列はヒト生殖細胞系配列である。抗体の活性（例えば、結合活性）は元の抗体のファクター、すなわち１００、１０、５、２、０．５、０．１および０．００１の範囲内であり得る。
【０２８０】
Ｖカッパの例示的生殖細胞系参照配列として、Ｏ１２／Ｏ２、Ｏ１８／Ｏ８、Ａ２０、Ａ３０、Ｌ１４、Ｌ１、Ｌ１５、Ｌ４／１８ａ、Ｌ５／Ｌ１９、Ｌ８、Ｌ２３、Ｌ９、Ｌ２４、Ｌ１１、Ｌ１２、Ｏ１１／Ｏ１、Ａ１７、Ａ１、Ａ１８、Ａ２、Ａ１９／Ａ３、Ａ２３、Ａ２７、Ａ１１、Ｌ２／Ｌ１６、Ｌ６、Ｌ２０、Ｌ２５、Ｂ３、Ｂ２、Ａ２６／Ａ１０およびＡ１４が挙げられる。例えばＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４（１８）：４６２８−３を参照されたい。
【０２８１】
ＨＣ可変ドメインについての生殖細胞系参照配列は、特定の標準構造、例えば、Ｈ１およびＨ２超可変ループ中の１〜３構造物を有する配列に基づき得る。免疫グロブリン可変ドメインの超可変ループの標準構造を、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４（１８）：４６２８−３８に記載のようにその配列から推測し得る。１〜３構造を有する例示的配列として：ＤＰ−１、ＤＰ−８、ＤＰ−１２、ＤＰ−２、ＤＰ−２５、ＤＰ−１５、ＤＰ−７、ＤＰ−４、ＤＰ−３１、ＤＰ−３２、ＤＰ−３３、ＤＰ−３５、ＤＰ−４０、７−２、ｈｖ３００５、ｈｖ３００５ｆ３、ＤＰ−４６、ＤＰ−４７、ＤＰ−５８、ＤＰ−４９、ＤＰ−５０、ＤＰ−５１、ＤＰ−５３およびＤＰ−５４が挙げられる。
【０２８２】
（多様性）
ディスプレイライブラリおよび他のライブラリーは、示されたポリペプチドの一つ以上の位置で変異を含む。所与の位置での変異は合成または天然のものであり得る。一部ライブラリーには、合成および天然の多様性の両方が含まれる。
【０２８３】
（合成的多様性）
ライブラリーは、人工的に合成された配列を起源とする多様な核酸配列の領域を含み得る。典型的には、これらは、各所与の位置でのヌクレオチドの分布を含む縮重オリゴヌクレオチドの集団から形成される。所与の配列の包含は分布に関してランダムである。合成的多様性を生む縮重の一例は、ＮＮＮ（ここで、Ｎは等しい比率の４ヌクレオチドのいずれかである）を含むオリゴヌクレオチドである。
【０２８４】
合成的多様性は、例えば、所与のトリヌクレオチドでの核酸配列のコドンの数をＮＮＮよりも小さい分布に限定するようにさらに阻害し得る。例えば、そのような分布は、コドンの幾つかの位置の４個未満のヌクレオチドを使用して構築し得る。さらに、トリヌクレオチド付加技術を使用して、分布をさらに阻害し得る。いわゆる「トリヌクレオチド付加技術」は、例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ  ３４：３１５−３２３、ＵＳ４，７６０，０２５およびＵＳ５，８６９，６４４に記載される。
【０２８５】
（天然の多様性）
ライブラリーは、異なる天然配列を起源とする（またはそれに基づいて合成された）多様な核酸配列の領域を含み得る。ディスプレイライブラリに含み得る天然の多様性の例は、免疫細胞に存在する配列の多様性である（下記も参照）。核酸はこれらの免疫細胞から調製され、ポリペプチドディスプレーのフォーマットに取り入れられる。
【０２８６】
（抗体ディスプレイライブラリ）
一実施形態において、ディスプレイライブラリはタンパク質の多様なプールを表わし、各々のタンパク質は、免疫グロブリンドメイン、例えば免疫グロブリン可変ドメインを含む。ディスプレイライブラリは、例えば、ヒト抗原を認識するヒトまたは「ヒト化」抗体を同定するのに特に有用である。そのような抗体を、内皮関連障害、例えば、転移性癌等のヒト障害を処置する治療法として使用し得る。抗体の定常領域とフレームワーク領域はヒトのものであるために、これらの治療抗体は抗原として認識され、標的とされることを自ら避け得る。また、定常領域はヒト免疫系のエフェクター機能を補充するために最適化される。インビトロのディスプレー選択プロセスは、正常なヒト免疫系が自己抗原に対する抗体を生成することができないことを克服する。
【０２８７】
典型的な抗体ディスプレイライブラリは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインを含むポリペプチドを示す。「免疫グロブリンドメイン」とは、免疫グロブリン分子の可変または定常ドメインに由来するドメインをいう。免疫グロブリンドメインは典型的には約７つのβストランドから構成される二つのβシートおよび、保存されたジスルフィド結合を含む（例えば、Ａ．Ｆ．  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ  １９８８  Ａｎｎ．Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：３８１−４０５を参照）。免疫グロブリン可変領域の超可変ループの標準構造は、Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９−８１７；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８）；およびＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４（１８）：４６２８−３８に記載のように、その配列から推測し得る。ディスプレイライブラリは、抗体をＦａｂフラグメント（例えば、二つのポリペプチド鎖を使用するもの）または単鎖Ｆｖ（例えば、単一のポリペプチド鎖を使用するもの）として示し得る。他のフォーマットも使用し得る。
【０２８８】
Ｆａｂおよび他のフォーマットの場合のように、示された抗体は、軽鎖または重鎖の一部として定常領域を含み得る。一実施形態において、各鎖は、例えばＦａｂの場合のように、一つの定常領域を含む。他の実施形態において、さらなる定常領域が示される。
【０２８９】
抗体ライブラリーを多くのプロセスにより構築し得る（例えば、ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８−３０；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２１：３７１−８を参照）。さらに、各プロセスの要素は、他のプロセスの要素と組み合わせ得る。変異が単一の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）または複数の免疫グロブリンドメイン（例えば、ＶＨおよびＶＬ）中に導入されるように、これらのプロセスを使用し得る。変異は、例えば、重鎖および軽鎖可変ドメインのいずれかまたは両方のそのような領域に言及するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の一つ以上の領域において、免疫グロブリン可変ドメイン中に導入し得る。一実施形態において、変異を所与の可変ドメインのすべての三つのＣＤＲ中に導入する。別の好ましい実施形態において、変異を例えば重鎖可変ドメインのＣＤＲ１およびＣＤＲ２に導入する。いずれの組合せも可能である。
【０２９０】
一つのプロセスにおいて、抗体ライブラリーは、ＣＤＲをコードする多様なオリゴヌクレオチドを、核酸の対応するドメインに挿入することにより構築される。オリゴヌクレオチドはモノマーヌクレオチドまたはトリヌクレオチドを使用して合成し得る。例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６は、トリヌクレオチド合成およびオリゴヌクレオチドを受容するために設計された制限部位を用いた鋳型を使用してオリゴヌクレオチドをコードするＣＤＲを構築するための方法を記載している。
【０２９１】
別のプロセスにおいて、動物、例えば、非ヒト動物（例えば、げっ歯類）をＴｉｅ１で免疫する。動物は、必要に応じて、抗原で追加免疫して、応答をさらに刺激する。次いで、脾臓細胞を動物から単離し、ＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸を増幅し、ディスプレイライブラリでの発現のためにクローニングする。非ヒト動物は一つ以上のヒト免疫グロブリン遺伝子配列を含み得る。例えば、動物は完全なヒト免疫グロブリン遺伝子座を含み得る。また、動物は不活性化内因性免疫グロブリン遺伝子座を有し得る。
【０２９２】
さらに別のプロセスにおいて、抗体ライブラリーは、単純な（ｎａｉｖｅ）生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子（例えば、ヒト遺伝子）から増幅された核酸から構築される。この増幅された核酸はＶＨおよび／またはＶＬドメインをコードする核酸を含む。免疫グロブリンをコードする核酸の供給源を以下に記載する。増幅は、例えば保存定常領域にアニールするプライマーを用いるＰＣＲ、または別の増幅方法を含み得る。
【０２９３】
免疫グロブリンドメインまたはそのフラグメントをコードする核酸は、例えばヒト、霊長類、マウス、ウサギ、ラクダまたはげっ歯類の免疫細胞から得られる。一例において、細胞は特定の性質について選択される。成熟の多様な段階のＢ細胞を選択し得る。別の例において、Ｂ細胞はナイーブである。
【０２９４】
一実施形態において、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて、表面結合ＩｇＭ、ＩｇＤまたはＩｇＧ分子を発現するＢ細胞を選別する。さらに、ＩｇＧの異なるアイソタイプを発現するＢ細胞を単離し得る。別の好ましい実施形態において、Ｂ細胞またはＴ細胞をインビトロで培養する。これらの細胞を、例えばフィーダー細胞とともに培養するか、またはマイトジェンもしくは他の調節剤（例えばＣＤ４０に対する抗体、ＣＤ４０リガンドまたはＣＤ２０、酢酸ミリスチン酸ホルボール、細菌性脂質多糖体、コンカナバリンＡ、フィトヘマグルチニンまたはアメリカヤマゴボウマイトジェン）を加えることによりインビトロで刺激し得る。
【０２９５】
さらに別の実施形態において、細胞を、免疫障害（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、関節リウマチ、脈管炎、シェーグレン症候群、全身性硬化症または抗リン脂質症候群）を有する被験体から単離する。被験体はヒトまたは動物、例えばヒト疾患用の動物モデルまたは類似の障害を有する動物であり得る。さらに別の実施形態において、細胞を、ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニック非ヒト動物から単離する。
【０２９６】
一つの好ましい実施形態において、細胞は体細胞超変異のプログラムを活性化している。例えば、抗免疫グロブリン、抗ＣＤ４０および抗ＣＤ３８抗体による処理によって、細胞を免疫グロブリン遺伝子の体細胞変異誘発を受けるように刺激し得る（例えば、Ｂｅｒｇｔｈｏｒｓｄｏｔｔｉｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６６：２２２８を参照）。別の実施形態において、細胞はナイーブである。
【０２９７】
免疫グロブリン可変ドメインをコードする核酸を、下記の例示的な方法により天然のレパートリーより単離し得る。最初に、ＲＮＡを免疫細胞から単離する。全長（すなわち、キャップされた）ｍＲＮＡを（例えば、キャップされていないＲＮＡをウシ小腸ホスファターゼにより脱リン酸化することにより）分離する。次いで、キャップをタバコ酸性ピロホスファターゼで除去し、逆転写を使用してｃＤＮＡを生成する。
【０２９８】
第一（アンチセンス）鎖の逆転写を、任意の適切なプライマーを用いる任意の方法により実施し得る。例えば、ｄｅ  Ｈａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ  ２７４：１８２１８−３０を参照されたい。プライマー結合領域は、例えば異なるアイソタイプの免疫グロブリンを逆転写するために、異なる免疫グロブリン間で一定であり得る。プライマー結合領域はまた、特定のアイソタイプの免疫グロブリンに特異的であり得る。典型的には、プライマーは少なくとも一つのＣＤＲをコードする配列に対して３’である領域に特異的である。別の実施形態において、ポリ−ｄＴプライマーが使用され得る（そして重鎖遺伝子にとって好ましくあり得る）。
【０２９９】
合成配列を逆転写鎖の３’末端に連結し得る。合成配列を、逆転写後のＰＣＲ増幅中のフォワードプライマー結合のプライマー結合部位として使用し得る。合成配列の使用は、利用可能な多様性を完全に捕捉する異なるフォワードプライマーのプールを使用する必要性を回避し得る。
【０３００】
次いで、例えば、一回以上の回数で、可変ドメインをコードする遺伝子を増幅する。複数の回数を用いる場合、ネステドプライマーを、高められた正確性のために使用し得る。次いで、この増幅した核酸を、ディスプレーライブラリーベクターにクローニングする。
【０３０１】
核酸配列を増幅する任意の方法を、増幅のために使用し得る。多様性を最大化し、多様性を偏らせない方法が好ましい。多様な技術を、核酸増幅のために使用し得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ；米国特許第４，６８３，１９５号および米国特許第４，６８３，２０２号、Ｓａｉｋｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０，１３５０−１３５４）は、核酸合成の一巡を駆動する多様な温度のサイクルを利用する。転写に基づく方法は、ＲＮＡポリメラーゼによりＲＮＡ合成を利用して核酸を増幅する（米国特許第６，０６６，４５７号、米国特許第６，１３２，９９７号、米国特許第５，７１６，７８５号、Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）２４４：３３１−３４；Ｓｔｏｆｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８８）２３９：４９１）。ＮＡＳＢＡ（米国特許第５，１３０，２３８号、米国特許第５，４０９，８１８号および米国特許第５，５５４，５１７号）は転写、逆転写、およびＲＮＡＳＥＨに基づく分解のサイクルを利用してＤＮＡサンプルを増幅する。さらに他の増幅方法は、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ；米国特許第５，８５４，０３３号および米国特許第６，１４３，４９５号）および鎖置換増幅（ＳＤＡ；米国特許第５，４５５，１６６号および米国特許第５，６２４，８２５号）を含む。
【０３０２】
（第二スクリーニング法）
標的に結合する候補ディスプレーライブラリーメンバーの選択後、各候補ディスプレーライブラリーメンバーを、例えば標的に対するその結合性をさらに特性付けるためにさらに分析し得る。同様に、他の方法により得られる候補結合タンパク質（例えば免疫化等による）も分析し得る。各候補結合タンパク質は、一種類以上の第二スクリーニングアッセイに供し得る。アッセイは、結合的性質、触媒的性質、生理学的性質（例えば、細胞毒性、腎臓クリアランス、免疫原性）、構造的性質（例えば、安定性、立体配座、オリゴマー化状態）または別の機能的性質に関するものであり得る。同じアッセイは繰返して使用され得るが、例えばｐＨ、イオンまたは熱感受性を決定するために異なる条件で使用され得る。
【０３０３】
適切であれば、アッセイは、ディスプレーライブラリーメンバーを直接に使用するか、あるいは示されたポリペプチドをコードする核酸から生成された組換えポリペプチド、または示されたポリペプチドの配列に基づいて合成された合成ペプチドを使用し得る。結合的性質ための例示的なアッセイは、以下を含む。
【０３０４】
（ＥＬＩＳＡ）
ディスプレイライブラリによりコードされるタンパク質を、結合的性質に関してＥＬＩＳＡアッセイを使用してスクリーニングすることもできる。例えば、各タンパク質を、底表面が標的（例えば、限定量の標的）で被覆されたマイクロタイタープレートに接触させる。プレートを緩衝液で洗浄して非特異的結合のポリペプチドを除去する。次いで、プレートに結合したタンパク質の量を、ポリペプチド（例えば、ポリペプチドのタグまたは定常部）を認識し得る抗体を用いてプレートを調べることにより決定する。抗体は、適切な基質が提供される場合に発色生成物を生成するアルカリホスファターゼ等の酵素に結合させる。タンパク質を、細胞から精製し得、または例えば繊維状バクテリオファージコートとの融合物としてディスプレーライブラリーフォーマットでアッセイし得る。あるいは、標的分子（例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇ）を発現する細胞（例えば生存するものまたは固定されたもの）を、マイクロタイタープレート中にプレートし、ディスプレイライブラリに存在するか、選択によりディスプレイライブラリから得られたペプチド／抗体の親和性を調べるために使用し得る。
【０３０５】
（細胞結合アッセイ）
結合タンパク質（例えば、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇ結合タンパク質）を、一つ以上の細胞タイプ、例えば内皮細胞または血小板と相互作用する能力について評価し得る。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）は、タンパク質と細胞との相互作用を調べる一つの例示的な方法である。この結合タンパク質を、細胞への結合前またはその後に蛍光体により直接または間接的に標識し、次いで細胞をＦＡＣＳ選別機でカウントする。
【０３０６】
例えば、下記の方法を使用して、Ｔｉｅ１結合タンパク質が血小板または他の細胞タイプと相互作用するかどうか評価し得る。
【０３０７】
血小板の単離。ヒト血液は、説明を受けて同意した健康なボランティアから得られる。例えば、静脈血を１／６容量のＡＣＤ（１００ｍｌのｄＨ２Ｏ中の２．５ｇのクエン酸ナトリウム、１．５ｇのクエン酸および２．５ｇのグルコース）に集める。血液を、８００×ｇで室温にて１５分間遠心分離機で分離し、血小板に富む血漿を取り出し、３７℃にて６０分間、１ｍＭアセチルサリチル酸の存在下にインキュベートした後に、１０００×ｇで室温にて１０分間、遠心分離機で分離する。血小板のペレットを、ＨＥＰＥＳ緩衝Ｔｙｒｏｄｅ溶液（１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５ｍＭグルコース、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、０．２％ウシ血清アルブミンおよび０．０５Ｕ／ｍＬアピラーゼ）で、２×１０８細胞／ｍｌの密度で再懸濁し得る。例えば、Ｋｏｒｎｅｃｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２６５：１０，０４２−１０，０４８およびＮａｉｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．３１０：１５５−１６２）も参照されたい。
【０３０８】
ＦＡＣＳ。例えば、血小板のＦＡＣＳ分析に関し、細胞を、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳ（４×１０５細胞／サンプル）中、ＰＧＥ１（１ｍｇ／ｍＬ）の存在下に再懸濁し、候補Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えば、約５μｇ／ｍＬ）またはコントロールとともにインキュベートし得る。２２℃での１時間のインキュベーション後に、細胞を、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄し、５０μＬの１／１００希釈ＦＩＴＣ標識二次抗体で処理し、３０分間氷上でインキュベートし、洗浄し、０．１％ＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁する。サンプルをイムノサイトメトリーシステムズフローサイトメーター（ＦＡＣＳＯＲＴ（商標），Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）を使用して分析する。例えば、Ｍａｌｇｏｒｚａｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｌｏｏｄ，Ｖｏｌ．９５  Ｎｏ．８（４月１５日）ｐｐ．２６００〜２６０９も参照されたい。
【０３０９】
さらに、単離血小板からのＳＤＳ−ｐａｇｅ分離タンパク質のウェスタン分析、および免疫沈降により血小板を評価し得る。さらに他の方法は、Ｔｉ１結合タンパク質が結合している（例えば被覆している）表面に細胞を結合する工程を包含する。
【０３１０】
他の細胞タイプは当該技術分野で公知の方法により、ＦＡＣＳのために調製し得る。
【０３１１】
（均一結合アッセイ）
候補ポリペプチドの標的との結合性相互作用を、均一アッセイを使用して分析し得る（すなわちアッセイのすべての成分を加えた後、さらなる液体操作を必要としない）。例えば、蛍光共鳴エネルギー転移（ＦＲＥＴ）を均一アッセイとして使用し得る（例えば、Ｌａｋｏｗｉｃｚら、米国特許第５，６３１，１６９号；Ｓｔａｖｒｉａｎｏｐｏｕｌｏｓら、米国特許第４，８６８，１０３号を参照）。第一分子（例えば、分画中に同定された分子）上の蛍光体標識を、その放出される蛍光エネルギーが、第二分子（例えば標識）が第一分子に接近している場合に第二分子上の蛍光標識により吸収され得るように選択する。第二分子上の蛍光標識は、それが転移エネルギーを吸収する際に蛍光を発する。標識間のエネルギー転移の効率は、それらの分子を分ける距離に関連するので、それら分子間の空間的関係を評価し得る。結合が分子間に起こる状況において、アッセイでの「レセプター」分子標識の蛍光発光を最大とすべきである。ＦＲＥＴによるモニタリングに適するように構成される結合事象は、当該技術分野で周知の標準的な蛍光検出手段により（例えば、蛍光光度計を使用して）、好都合に測定し得る。第一または第二の結合分子の量を滴定することにより、結合曲線を生成して平衡結合定数を推測し得る。
【０３１２】
（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ））
ディスプレイライブラリから単離された分子と標的との結合相互作用を、ＳＰＲを私用して分析し得る。ＳＰＲまたは生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）は、いずれの相互作用物質を標識することなしにリアルタイムで生物特異的相互作用を検出する。ＢＩＡチップの結合表面における質量変化（結合事象を示す）は、表面に近い光の屈折率の変化をもたらす（表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）の光学的現象）。屈折度の変化は、生体分子間のリアルタイム反応を示すものとして測定される検出可能なシグナルを生じる。ＳＰＲを使用する方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号；Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５およびＢＬＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）により提供されるオンラインリソース）に記載されている。
【０３１３】
ＳＰＲからの情報を使用して、平衡解離定数（Ｋｄ）、および生体分子の標的への結合に関するＫｏｎとＫｏｆｆ等の動態学的パラメーターの正確で定量的な測定を提供し得る。そのようなデータを、異なる生体分子を比較するために使用し得る。例えば、異なるタンパク質を比較して、標的に対する高い親和性を有するか個体、または遅いＫｏｆｆを有する個体を同定し得る。この情報を、構造／活性の関係（ＳＡＲ）を進展させるためにも使用し得る。例えば、親タンパク質の成熟したものの動態学的パラメーターおよび平衡結合パラメーターを親タンパク質のパラメーターと比較し得る。特定の結合パラメーター、例えば高い親和性および遅いＫｏｆｆに関係する所与の位置の変異アミノ酸を同定し得る。この情報は、構造的モデル化（例えば、ホモロジーモデリング、エネルギー最少化、または結晶構造解析もしくはＮＭＲによる構造決定を使用する）と組み合わせ得る。その結果、タンパク質とその標的との物理的相互作用の理解を公式化し、他の設計プロセスを案内するために使用し得る。
【０３１４】
（タンパク質アレイ）
ディスプレイライブラリから同定されたタンパク質を、固体支持体（例えばビーズまたはアレイ）に固定化し得る。タンパク質アレイのために、各ポリペプチドを支持体上の独自のアドレスに固定化する。典型的には、アドレスは二次元アドレスである。タンパク質アレイを以下に説明する（例えば、診断を参照）。タンパク質アレイを使用して、任意の複数のタンパク質を、例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇとの相互作用に関して評価することも可能である。
【０３１５】
（細胞アッセイ）
ライブラリーを宿主細胞に形質転換することにより、候補タンパク質をライブラリーから選択し得る；ライブラリーは、ディスプレイライブラリから事前に同定し得る。例えば、ライブラリーは、ポリペプチドをコードし、かつ発現を（例えばタンパク質が細胞内に産生され、細胞から分泌され、または細胞表面に結合するように）方向付けるセグメントを含むベクター核酸配列を含み得る。これらの細胞を、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇと結合する（例えば、細胞の表現型または細胞媒介活性の変化により検出されるような）タンパク質に関してスクリーニングまたは選択し得る。例えば、Ｔｉｅ１に結合する抗体の場合、その活性は自己リン酸化、ＰＩ３キナーゼの活性化、ＡＫＴの活性化、または内皮細胞活性の変化（例えば、増殖）であり得る。
【０３１６】
別の実施形態において、細胞のライブラリーは、細胞アレイの形を有する。細胞アレイは、任意の適切な検出可能活性に関して同様にスクリーニングし得る。他の実施形態において、競合結合アッセイを使用して、Ｔｉｅ１と結合させる参照タンパク質と競合するタンパク質を同定する。同様に、エピトープマッピングを使用して、Ｔｉｅの特定のエピトープと結合するタンパク質を同定し得る。Ｔｉｅ１のフラグメントおよび変異体を、結合タンパク質同定プロセス、例えば特性付け、スクリーニングまたは免疫化の一つ以上にも使用し得る。
【０３１７】
（標的結合抗体を得る方法）
ディスプレイライブラリの使用に加えて、標的結合抗体を得るため、またはディスプレイライブラリの使用と組み合わせて他の方法を使用し得る。例えば、Ｔｉｅ１外部ドメインまたはその領域を、非ヒト動物、例えばげっ歯類における抗原として使用し得る。同様に、Ｔｉｅ２もしくはＡｎｇ、またはその領域を、非ヒト動物、例えばげっ歯類における抗原として使用し得る。
【０３１８】
一実施形態において、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、ヒトＩｇ遺伝子座の大型フラグメントを用いてマウス抗体産生を欠如するマウス系統を設計し得る。ハイブリドーマ技術を使用して、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的Ｍａｂを生成かつ選択し得る。例えば、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標），Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４），ＵＳ２００３００７０１８５、ＷＯ９６／３４０９６（１９９６年１０月３１日公開）およびＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ９６／０５９２８号（１９９６日４月２９日出願）を参照されたい。
【０３１９】
別の実施形態において、モノクローナル抗体を、非ヒト動物から得、次いで改変、例えばヒト化または脱免疫化する。Ｗｉｎｔｅｒは、ヒト化抗体を調製するために使用し得るＣＤＲグラフト化法を記載している（英国特許出願ＧＢ２１８８６３８Ａ（１９８７年３月２６日出願）；Ｗｉｎｔｅｒ  ＵＳ５，２２５，５３９）。特定のヒト抗体のすべてのＣＤＲが、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部で置換されるか、またはＣＤＲの一部のみが、非ヒトＣＤＲで置換され得る。ヒト化抗体を所定の抗原に結合させるために必要とされる、ＣＤＲの数を取り替えさえすればよい。
【０３２０】
ヒト化抗体を、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変領域の配列を、ヒトＦｖ可変ドメインからの等価な配列で置換することにより生成し得る。ヒト化抗体を生成する一般的方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．Ｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７，Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４およびＱｕｅｅｎら、ＵＳ５，５８５，０８９、ＵＳ５，６９３，７６１およびＵＳ５，６９３，７６２により提供される。これらの方法は、重鎖または軽鎖の少なくとも一つからの免疫グロブリンＦｖ可変領域の全てまたは一部をコードする核酸配列を、単離、操作および発現する工程を包含する。そのような核酸の供給源は、当業者に周知であり、例えば上記のように所定の標的に対して抗体を産生するハイブリドーマから得られ得る。次いで、ヒト化抗体またはそのフラグメントをコードする組換えＤＮＡを、適切な発現ベクターにクローニングし得る。
【０３２１】
標的結合抗体はまた、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７（これらの内容は、本明細書中に参考として、具体的に援用される）に開示の方法によりヒトＴ細胞エピトープの特異的な欠失または「脱免疫化」により改変され得る。簡単に説明すると、抗体の重鎖および軽鎖可変領域を、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドに関して分析し得る；これらのペプチドは（ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に定義されるような）潜在的なＴ細胞エピトープに相当する。潜在的なＴ細胞エピトープの検出のために、「ペプチドスレディング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）」と呼ばれるコンピュータモデル化アプローチを適用し得、さらにヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースを、ＷＯ９８／５２９７６およびＷＯ００／３４３１７に記載されるようなＶＨおよびＶＬ配列に存在するモチーフを求めて調べ得る。これらのモチーフは、任意の１８種類の主要なＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプに結合し、したがって、潜在的なＴ細胞エピトープを構成する。検出された潜在的なＴ細胞エピトープを、可変領域中の少数のアミノ酸残基を、好ましくは単一アミノ酸置換によって置換することで除去し得る。可能な保存的置換が行なわれる限り、ヒト生殖細胞系抗体配列中のこの位置に共通するアミノ酸を、しばしば、しかし排他的ではなく、使用し得る。ヒト生殖細胞系配列は、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，  Ｉ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２；Ｃｈｏｔｈｉａ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．２２７：７９９−８１７に開示されている。Ｖ  ＢＡＳＥディレクトリは、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的なディレクトリを提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，Ｉ．Ａ．ら（編）ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）。脱免疫変化を同定した後、ＶＨとＶＬをコードする核酸を、変異誘発または他の合成方法（例えば、デノボ合成、カセット置換等）により構築し得る。変異誘発された可変配列は、必要に応じて、ヒト定常領域（例えば、ヒトＩｇＧ１またはκ定常領域）に融合させ得る。
【０３２２】
ある場合においては、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体機能に重要であると知られているか、予測されている残基を含む。例えば、潜在的なＴ細胞エピトープは、通常、ＣＤＲに偏向する。さらに、潜在的なＴ細胞エピトープは、抗体の構造および結合にとって重要なフレームワーク残基に生じ得る。これらの潜在的なエピトープを除去する変化は、ある場合では、例えば、変化する場合および変化しない場合で鎖を作製し検査することによるさらに厳密な検査を必要とする。可能な場合には、ＣＤＲにオーバーラップする潜在的なＴ細胞エピトープをＣＤＲ外での置換により除去した。ある場合では、ＣＤＲ内の変更は単なるオプションであり、したがって、この置換がある場合およびない場合の変異体を検査すべきである。他の場合には、潜在的なＴ細胞エピトープを除去するために必要とされる置換は、抗体結合に決定的であり得るフレームワーク内の残基位置にある。これらの場合、この置換がある場合およびない場合の変異体を検査すべきである。よって、ある場合では、最適な脱免疫化抗体を同定するために、いくつかの変異体脱免疫化重鎖および軽鎖可変領域を設計し、多様な重鎖／軽鎖組合せを検査する。次いで、異なる変異体の結合親和性を、脱免疫化の程度、すなわち可変領域に残る潜在的なＴ細胞エピトープの数と共に考慮することにより、最終的な脱免疫化抗体の選択を行い得る。脱免疫化は、非ヒト配列を含む抗体、例えば、ネズミの抗体または他の非ヒトモノクローナル抗体を改変するために使用され得る。脱免疫化は、ディスプレイライブラリから単離された抗体を改変するために使用され得る。
【０３２３】
（内皮細胞アッセイ）
標的結合タンパク質または候補結合タンパク質を、細胞アッセイを使用して特性付け、例えば、結合タンパク質が細胞に接触した場合の細胞表現型または他の活性の変化を評価し得る。典型的には、この細胞は、Ｔｉｅの外部ドメインの少なくとも一部を含むタンパク質を発現する。一部実施形態において、この細胞は、Ｔｉｅ１（例えば全長の成熟Ｔｉｅ１タンパク質）、Ｔｉｅ２を発現し、および／またはＡｎｇと接触する。
【０３２４】
内皮細胞増殖。内皮増殖阻害活性について、ウシ毛管内皮細胞増殖アッセイ、ニワトリＣＡＭアッセイ、マウス角膜アッセイ等の生物学的活性アッセイを使用し、移植腫瘍に対する結合タンパク質の効果を評価して、候補結合タンパク質を検査し得る。ニワトリＣＡＭアッセイは、例えば、Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ”Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７９（２）、１９９４年１０月２１日、ｐｐ．３１５〜３２８に記載されている。簡単に説明すると、インタクトな卵黄を有する３日齢のニワトリ胚を卵から分離して、ペトリ皿に置く。三日間のインキュベーション後、検査すべきタンパク質を含むメチルセルロースディスクを、個々の胚のＣＡＭに適用する。４８時間のインキュベーション後、胚およびＣＡＭを観察して、内皮細胞の成長が阻害されるかどうかを決定する。マウス角膜アッセイは、成長因子含有ペレットを疑われる内皮成長阻害物質を含む別のペレットとともに、マウスの角膜に移植すること、角膜で作られた毛細管のパターンを観察することを包含する。
【０３２５】
血管形成。血管形成は、例えば、臍静脈、冠状動脈または皮膚細胞等の多様な内皮細胞系を用いてアッセイし得る。適切なアッセイとして、増殖を測定するアラマーブルー系アッセイ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから利用可能）；血管形成増強物質または阻害物質の存在または不在下に、細胞の膜貫通移動を測定するＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｆａｌｃｏｎ  ＨＴＳ  ＦｌｕｏｒｏＢｌｏｃｋ（商標）細胞培養挿入物の使用等の、蛍光分子を使用する移動アッセイ；およびＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）またはコラーゲンＩ上の内皮細胞による管状構造物の形成に基づく細管形成アッセイが挙げられる。
【０３２６】
細胞付着。細胞付着アッセイは、候補標的結合タンパク質の存在または不在下に、細胞の精製付着タンパク質への付着または細胞同士の付着を測定する。細胞／タンパク質付着アッセイは、細胞の精製タンパク質への付着を調節する物質の能力を測定する。例えば、組換えタンパク質を生成し、ＰＢＳで２．５ｇ／ｍＬに希釈し、マイクロタイタープレートのウェルを被覆するために使用する。ネガティブコントロールに使用されるウェルは、被覆しない。次いで、被覆したウェルを洗浄し、１％ＢＳＡでブロックし、再び洗浄する。化合物を、最終検査濃度の２倍まで希釈し、ブロックされ被覆されたウェルに加える。次いで、細胞をウェルに加え、未結合の細胞を洗浄除去する。保持された細胞を、カルセイン−ＡＭ等の膜浸透性蛍光染料を加えることによりプレート上で直接標識し、そのシグナルを蛍光マイクロプレートリーダーで定量する。
【０３２７】
細胞／細胞付着アッセイを、細胞の細胞同士の結合を調節する候補標的結合タンパク質の能力を測定するために使用し得る。これらのアッセイは、選択された付着タンパク質を天然に、または組換えにより発現する細胞を使用し得る。例示的なアッセイにおいて、細胞付着タンパク質を発現する細胞を、他の細胞（同じ細胞タイプ以上のものか、または細胞が付着する別のタイプの細胞）とともにマルチウエルプレートのウェルにプレートする。付着し得る細胞を、ＢＣＥＣＦ等の膜浸透性蛍光染料で標識し、候補結合タンパク質の存在下で単層に付着させる。未結合細胞を洗浄除去し、蛍光プレートリーダーを使用して結合細胞を検出する。高スループット細胞付着アッセイもまた、記載されている。例えば、Ｆａｌｓｅｙ  Ｊ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ  Ｃｈｅｍ．Ｍａｙ−Ｊｕｎｅ  ２００１；１２（３）：３４６−５３を参照されたい。
【０３２８】
管形成。管形成アッセイを、一般的に、細胞外マトリックスの環境を刺激するマトリックス基質上に管構造物を形成する培養細胞（一般的に、内皮細胞）の能力をモニターするために使用し得る。例示的な基質として、４℃にて液体であり、３７℃にて固体ゲルを形成するＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、すなわち、ラミニン、コラーゲンＩＶおよびへパリン硫酸プロテオグリカンを含む基底膜タンパク質の抽出物が挙げられる。他の適切なマトリックスは、コラーゲン、フィブロネクチンおよび／またはフィブリン等の細胞外成分を含む。細胞を、前血管形成刺激物質により刺激し、それらの細管形成能力を画像化により検出する。細管は、刺激を用いて一晩インキュベーションした後に一般的に検出し得るが、それよりも長い時間枠または短い時間枠も使用し得る。管形成アッセイは、当該技術分野で周知である（例えば、Ｊｏｎｅｓ  Ｍ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ５：１４１８−１４２３）。これらのアッセイは伝統的に血清によるか、または成長因子ＦＧＦもしくはＶＥＧＦによる刺激を伴う。一実施形態において、このアッセイは無血清培地で培養された細胞を用いて実施する。一実施形態において、アッセイを、一つ以上の前血管形成物質、例えば炎症性血管形成因子（例えば、ＴＮＦ−αまたはＦＧＦ、ＶＥＧＦ、フォルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、ＴＮＦ−α、エフリン）の存在下で行われる。
【０３２９】
細胞移動。内皮細胞移動の例示的アッセイは、ヒト微小血管内皮（ＨＭＶＥＣ）移動アッセイである。例えば、Ｔｏｌｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １２２，４９７−５１１を参照。移動アッセイは当該技術分野で公知の（例えば、Ｐａｉｋ  Ｊ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１１８３０−１１８３７を参照）。一例において、培養内皮細胞を、典型的な細胞サイズよりも一般的に小さい気孔サイズのマトリックス被覆多孔性薄膜上にまく。この薄膜は、典型的にはトランスウエルポリカーボネート膜（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｍａｓｓ．）等の膜であり、一般的に、前血管形成刺激を含む低いチャンバーと液体中で接触した上部チャンバーの一部である。移動は一般的に刺激を用いた一晩のインキュベーション後にアッセイするが、それよりも長い時間枠または短い時間枠も使用し得る。移動は薄膜を横断する細胞の数として評価し、ヘモトキシリン溶液（ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ．）による細胞の染色によるか、または細胞数の決定の任意の他の方法により検出し得る。別の例示的な設定では、細胞を蛍光標識し、移動を蛍光の読み、例えばＦａｌｃｏｎ  ＨＴＳ  ＦＬＵＯＲＯＢＬＯＣ（商標）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）を使用して検出する。一部の移動が刺激の不存在下に観察される一方で、移動は前血管形成因子に応答して大きく増加する。このアッセイを使用して、標的結合タンパク質の内皮細胞移動に対する効果を検査し得る。
【０３３０】
出芽アッセイ。例示的な出芽アッセイは、コラーゲンゲル系マトリックスに埋め込まれた内皮細胞（「スフェロイド」）の細胞数で定義されるスフェロイド集合体を使用する三次元のインビトロ血管形成アッセイである。スフェロイドは、細胞外マトリックス中への侵入による毛細管様構造物の出芽（「細胞出芽」という）とその後の複合体合流ネットワーク形成の出発点となり得る（Ｋｏｒｆｆ  ａｎｄ  Ａｕｇｕｓｔｉｎ，１９９９，Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１２：３２４９−５８）。例示的な実験設定において、スフェロイドは、４００個のヒト臍静脈内皮細胞を、非吸着性の９６ウエルプレートの各ウェルに分注し、スフェロイドを一晩凝集させることにより調製される（Ｋｏｒｆｆ  ａｎｄ  Ａｕｇｕｓｔｉｎ：Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １４３：１３４１−５２，１９９８）。スフェロイドを採取し、９００μｌのメトセル−コラーゲン溶液にまき、２４ウエルプレートの各ウェルに分注し、コラーゲンゲルを重合させる。試験物質を３０分後に、試験物質の１０倍濃度作用希釈物の１００μｌをゲル上部に分注することによって加える。プレートを３７℃にて２４時間インキュベートする。実験インキュベーション時間の最後にパラホルムアルデヒドを加えることにより皿を固定する。内皮細胞の出芽強度を、自動化イメージ分析システムにより定量して、１スフェロイドあたりの累積出芽丈を決定し得る。
【０３３１】
一部実施形態において、標的結合タンパク質は、本明細書中に記載されるアッセイ、例えば本明細書中に記載される細胞アッセイに対し、統計的に有意な効果を有する。
【０３３２】
（タンパク質産生）
標準的な組換え核酸法を使用して、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する結合タンパク質を発現し得る。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ＆  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎ．Ｙ．（２００１）およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）に記載の技術を参照されたい。一般的に、結合タンパク質をコードする核酸配列を、核酸発現ベクターにクローニングする。タンパク質が複数のポリペプチド鎖を含む場合、各鎖を発現ベクター、例えば同じまたは異なる細胞で発現される同じまたは異なるベクターにクローニングし得る。抗体を産生する方法も、以下に提供する。
【０３３３】
（抗体産生）
一部の抗体（例えば、Ｆａｂ）を、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）中に生成し得る。例えば、Ｆａｂが、ディスプレー実体とバクテリオファージタンパク質（またはそのフラグメント）との間の阻害ストップコドンを含むファージディスプレーベクター中の配列によりコードされている場合、ベクター核酸を、ストップコドンを阻害し得ない細菌細胞中に移し替え得る。この場合Ｆａｂは、遺伝子ＩＩＩタンパク質に融合せず、培地中に分泌される。
【０３３４】
抗体はまた、真核細胞中に生成され得る。一実施形態において、これらの抗体（例えば、ｓｃＦｖ）は酵母細胞、例えばＰｉｃｈｉａ（例えば、Ｐｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５１：１２３−３５を参照）、ＨａｎｓｅｕｌａまたはＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ中で発現される。
【０３３５】
一実施形態において、抗体は哺乳動物細胞で作られる。クローン抗体またはその抗原結合フラグメントを発現するのに好ましい哺乳動物宿主細胞として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載のｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含み、例えばＫａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０２−６２１に記載のようにＤＨＦＲ選択可能マーカーとともに使用される）、リンパ球細胞株、例えば、ＮＳ０ミエローマ細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞、およびトランスジェニック動物、例えばトランスジェニック哺乳動物からの細胞が挙げられる。例えば、細胞は乳腺の外皮細胞である。
【０３３６】
免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞中のベクターの複製を調節する配列（例えば、複製開始点）および選択可能マーカー遺伝子等の付加的な配列を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、米国特許第４，６３４，６６５号および米国特許第５，１７９，０１７号を参照）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、Ｇ４１８、ハイグロマイシンまたはメトトレキサート等の薬品に対する耐性を、ベクターが導入された宿主細胞に与える。好ましい選択可能マーカー遺伝子として、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅によるｄｈｆｒ−宿主細胞における使用用）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。別の例示的な発現系は、Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．ＣＨから利用可能なグルタミンシンターゼ（ＧＳ）ベクター系である（例えば、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２（４）：４８−５２；Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ．８１（６）：６３１−６３９を参照）。
【０３３７】
抗体またはその抗原結合部分の組換え発現の例示的な系において、抗体重鎖および抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウム媒介トランスフェクションによりｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖および軽鎖の遺伝子を、エンハンサー／プロモーター調節要素（例えば、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルス等に由来するもの、例えばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素またはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節要素）にそれぞれ作動可能に連結させて遺伝子の高レベルの転写を駆動する。組換え発現ベクターはまた、ＤＨＦＲ遺伝子を有し、これはこのベクターをトランスフェクトしたＣＨＯ細胞の、メトトレキセート選択／増幅を使用した選択を可能とする。選択された形質転換宿主細胞を培養して抗体重鎖および軽鎖を発現させ、インタクトな抗体を培養培地から回収する。標準的な分子生物学技術を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞にトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、抗体を培養培地から回収する。例えば、一部の抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧによるアフィニティークロマトグラフィーにより単離し得る。
【０３３８】
コドンの使用は宿主細胞のコドンバイアスに合致させることができ、例えばＣＨＯ細胞の場合は、これはコドンバイアスＣｒｉｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ遺伝子に合致させる。更に又、極めて高い（＞８０％）または極めて低い（＜３０％）ＧＣ含量の領域は可能な場合は回避することができる。旨適化過程の間、以下のシス作用配列モチーフ、即ち、内部ＴＡＴＡボックス；カイ部位およびリボソーム進入部位；ＡＴリッチまたはＧＣリッチ配列ストレッチ；ＡＲＥ、ＩＮＳ、ＣＲＳ配列エレメント；リピート配列およびＲＮＡ二次構造；および（クリプティック）スプライスドナーおよびアクセプターの部位、分岐点、は回避する。２つのＳＴＯＰコドンを用いることにより効率的な終止を確保することができる。配列のコドン旨適化はＳｈａｒｐ，Ｐ．Ｍ．，Ｌｉ，Ｗ．Ｈ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５（３）．１９８７に従って評価することができる。標準的なコドンアダプテーション指数（ＣＡＩ）を使用できる。希少なコドンは０〜４０のクオリティークラスを有するものを包含する。
【０３３９】
本発明は例えば向上したコドンまたは配列の特徴を包含するように本明細書に記載した配列と相対比較して改変されている単離された核酸分子を特徴とし、重鎖または軽鎖のコーディング配列を含む単離された核酸分子を包含する。例えば重鎖または軽鎖のコーディング配列内のコドンの少なくとも３０、４０、５０、６０、６５、７０、７５または８０％が哺乳類細胞における非希少または頻繁なコドンであるか、または、重鎖または軽鎖のコーディング配列が哺乳類細胞、例えばチャイニーズハムスター細胞（Ｃｒｅｃｅｔｕｌｕｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ）において５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０％未満の希少コドンを包含する。一実施形態において、コドンアダプテーション指数は０．６、０．７、０．８、０．８５、０．９０、０．９２、０．９４、０．９５、０．９６、０．９７または０．９８より高値である。
【０３４０】
一実施形態において、重鎖コーディング配列は（ｉ）本明細書に記載した抗体重鎖（例えば配列番号７２３に示すＥ３重鎖）を含むポリペプチド、（ｉｉ）本明細書に記載した抗体重鎖コーディング配列（例えば配列番号７２３）に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるポリペプチド、または（ｉｉｉ）本明細書に記載した抗体重鎖可変ドメイン（例えばＥ３重鎖可変ドメイン）のＣＤＲを有する重鎖可変ドメイン配列を含むポリペプチドをコードする。一実施形態において、重鎖コーディング配列は少なくとも２、３、５、６、８、９、１０または１５コドンにおいて配列番号７０３と異なる。
【０３４１】
一実施形態において、軽鎖コーディング配列は（ｉ）本明細書に記載した抗体軽鎖（例えば配列番号７２４に示すＥ３軽鎖）を含むポリペプチド、（ｉｉ）本明細書に記載した抗体軽鎖コーディング配列（例えば配列番号７２４）に少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８または９９％同一であるポリペプチド、または（ｉｉｉ）本明細書に記載した抗体軽鎖可変ドメイン（例えばＥ３軽鎖可変ドメイン）のＣＤＲを有する軽鎖可変ドメイン配列を含むポリペプチドをコードする。一実施形態において、軽鎖コーディング配列は少なくとも３、５、６、８、９、１０または１５コドンにおいて配列番号７０２と異なる。
【０３４２】
一実施形態において、例えばａｌａ−ＧＣＧコドン１つ以上はＧＣＣに変更することができ；ａｒｇ−ＣＧＴコドン１つ以上はＣＧＣに変更することができ；ｐｒｏ−ＣＣＧコドン１つ以上はＣＣＣ、ＣＣＴまたはＣＣＡに変更することができ；ｓｅｒ−ＴＣＧコドン１つ以上はＴＣＣに変更することができ；および／またはｔｈｒ−ＡＣＧコドン１つ以上はＡＣＣに変更することができる。
【０３４３】
コドン改変（例えばコドン旨適化）配列を抗体の製造に使用できる。例示される方法は抗体コーディング核酸を包含する哺乳類細胞を準備すること、および、細胞内に核酸を発現させること、例えばタンパク質が発現される条件下に細胞を維持することを包含する。抗体コーディング核酸は哺乳類発現ベクター、例えば細胞内に導入されたベクター内に提供することができる。細胞は非ヒト哺乳類細胞、たとえばＣＨＯ細胞でありうる。
【０３４４】
Ｆｃドメインを含む抗体のために、抗体産生系は、好ましくはＦｃ領域がグリコシル化されている抗体を合成する。例えば、ＩｇＧ分子のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン中のアスパラギン２９７でグリコシル化されている。このアスパラギンは、二分岐型のオリゴ糖による修飾部位である。このグリコシル化はＦｃγレセプターおよび補体Ｃ１ｑにより媒介されるエフェクター機能に必要とされることが、示されている（Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｏｆ（１９９２）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１−８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６）。好ましい実施形態において、Ｆｃドメインは、アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物発現系で生成される。Ｆｃドメインはまた、他の真核翻訳後修飾を含み得る。
【０３４５】
抗体はまた、トランスジェニック動物により生成され得る。例えば、ＵＳ５，８４９，９９２は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺で抗体を発現する方法を記載している。乳特異的プロモーター、ならびに関心の抗体および分泌のためのシグナル配列をコードする核酸を含むトランスジーンが構築される。そのようなトランスジェニック哺乳動物の雌により産生される乳は、そこで分泌された関心の抗体を含んでいる。この抗体を乳から精製し得、または一部の利用においては直接的に使用し得る。
【０３４６】
Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する抗体を、例えば天然、ヒトまたは部分的にヒトの免疫グロブリン遺伝子座を有する例えば動物を使用して、免疫化によっても生成し得る。そのような抗体は、任意のアロタイプ、例えば、ａ，ｚアロタイプ、ｆアロタイプまたは非Ａアロタイプであり得る。非ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列、例えば特定の位置で、例えば以下の位置の一つ以上（好ましくは少なくとも５、１０、１２またはすべて）で共通ヒトアミノ酸残基の置換を含むようにも改変し得る：（軽鎖の可変ドメインのＦＲにおいて）、４Ｌ、３５Ｌ、３６Ｌ、３８Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、５８Ｌ、４６Ｌ、６２Ｌ、６３Ｌ、６４Ｌ、６５Ｌ、６６Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、６９Ｌ、７０Ｌ、７１Ｌ、７３Ｌ、８５Ｌ、８７Ｌ、９８Ｌおよび／または（重鎖の可変ドメインのＦＲにおいて）２Ｈ、４Ｈ、２４Ｈ、３６Ｈ、３７Ｈ、３９Ｈ、４３Ｈ、４５Ｈ、４９Ｈ、５８Ｈ、６０Ｈ、６７Ｈ、６８Ｈ、６９Ｈ、７０Ｈ、７３Ｈ、７４Ｈ、７５Ｈ、７８Ｈ、９１Ｈ、９２Ｈ、９３Ｈおよび／または１０３Ｈ（Ｋａｂａｔのナンバリングによる）。例えば、ＵＳ６，４０７，２１３を参照されたい。
【０３４７】
（Ｔｉｅ１産生）
Ｔｉｅ１外部ドメインタンパク質、Ｔｉｅ１タンパク質またはＴｉｅ１リポソームを生成する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、ＷＯ９３／１４１２４を参照されたい。Ｔｉｅ２およびＡｎｇを生成する方法は、同様に公知である。例えば、米国特許第６，５２１，４２４号、米国特許第６，３７６，６５３号；ＷＯ９６／１１２６９；ＷＯ９６／３１５９８を参照されたい。
【０３４８】
（ビオチニル化法）
多様な方法が、タンパク質、例えば免疫グロブリンタンパク質または標的タンパク質をビオチニル化するために利用し得る。例えば、タンパク質を５倍モル過剰のスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンと共に、５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０、１００ｍＭ  ＮａＣｌ中で、４℃にて一晩インキュベートし得る。遊離ビオチンは、例えば１０ｋＤａ分子量カットオフメンブレンを有するＢＩＯＭＡＸ（登録商標）装置を使用して、ＰＢＳ、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０へのバッファー交換または透析により除去する。タンパク質１モルあたりに導入されるビオチン分子の数は、製造者（Ｐｉｅｒｃｅ）により記載されるようにＨＡＢＡアッセイを使用して決定し得る。
【０３４９】
（薬学的組成物）
別の局面において、本発明は、Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する物質、例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合すると同定された、あるいは本明細書中に記載さる抗体分子、他のポリペプチドまたはペプチドを含み、薬学的に受容可能なキャリアとともに処方された組成物、例えば薬学的に受容可能な組成物を提供する。薬学的組成物は、標識結合タンパク質（例えば、インビボ画像化用）ならびに治療組成物を包含する。
【０３５０】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能なキャリア」とは、生理学的に適合性のあるあらゆる溶媒、分散媒体、被覆物、抗細菌および抗カビ剤、等張吸収遅延剤等を含む。好ましくは、キャリアは（例えば、注射または点滴による）静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または表皮投与に適している。投与経路に応じて、結合タンパク質は、化合物を不活性化し得る酸の作用および他の自然な状態から該化合物を保護する物質で被覆され得る。
【０３５１】
「薬学的に受容可能な塩」とは、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、任意の望ましくない毒物学的効果を付与しない塩をいう（例えば、Ｂｅｒｇｅ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９）。そのような塩の例として、酸付加塩と塩基付加塩が挙げられる。酸付加塩としては、非毒性の無機酸、例えば塩酸、硝酸、リン酸、硫酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、亜リン酸等に由来する塩、ならびに非毒性の有機酸、例えば脂肪族モノおよびジカルボン酸、フェニル置換アルカン酸、ヒドロキシアルカン酸、芳香族酸、脂肪族および芳香族スルホン酸等に由来する塩が挙げられる。塩基付加塩として、アルカリ土類金属、例えば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム等に由来する塩、ならびに非毒性の有機アミン、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、プロカイン等に由来する塩が挙げられる。
【０３５２】
組成物は、多様な形態であり得る。これらは、例えば、液体、半固体および固体投与形態、例えば溶液（例えば、注射可能溶液および点滴可能溶液）、分散液または懸濁液、錠剤、丸剤、粉剤、リポソームおよび座薬を含む。好ましい形態は、投与および治療的利用の意図される形態に依存する。典型的な好ましい組成物は、例えばヒトに抗体を投与するために使用される組成物と類似組成物等、注射可能溶液または点滴可能溶液の形態である。投与の好ましい形態は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。好ましい実施形態において、標的結合タンパク質は、静脈内点滴または注射により投与される。別の好ましい実施形態において、標的結合タンパク質は、筋肉内注射または皮下注射により投与される。
【０３５３】
語句「非経口投与」および「非経口に投与される」とは、本明細書中で使用される場合、腸内および局所投与以外の通常注射による投与形態を意味し、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、鞘内、嚢内、胸膜内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、気管内、皮下、角皮下、動脈内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内への注射ならびに点滴が挙げられる。
【０３５４】
組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたは高薬物濃度に適する他次元の構造物として調合し得る。無菌の注射可能な溶液は、結合タンパク質を、必要とされる上記成分の一つまたはその組合せとともに適切な溶媒中に必要とされる量で混合し、続いてろ過滅菌することにより調製し得る。一般的に、分散液は、塩基性分散媒体および上記からの必要とされる他の成分を含む無菌ビヒクルに活性化合物を混合することにより調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌粉末の場合、好ましい調製方法は、先に無菌ろ過した溶液から活性成分および任意の更なる所望の成分の粉末を生成する真空乾燥および凍結乾燥である。溶液の適切な流動性は、例えば、レシチン等の塗料の使用により、分散液の場合に必要とされる粒径の維持、および界面活性剤の使用により維持され得る。注射可能な組成物の長期の吸収は、吸収を遅らせる物質、例えばモノステアリン酸塩およびゼラチンを、この組成物に含ませることによりもたらされ得る。
【０３５５】
本明細書中に記載される結合タンパク質を、当該技術分野で公知の種々の方法により投与し得るが、多くの利用のために好ましい投与経路／形態は、静脈注射または点滴である。例えば、治療の利用のために、標的結合タンパク質は、例えば、３０ｍｇ／分、２０ｍｇ／分、１０ｍｇ／分、５ｍｇ／分または１ｍｇ／分未満の速度で静脈内点滴により投与して、約１〜１００ｍｇ／ｍ２または７〜２５ｍｇ／ｍ２の用量を達成し得る。投与経路および／または形態は、所望の結果に応じて変更する。ある実施形態において、活性化合物は、移植物等の制御された放出調合物およびマイクロカプセル化送達系等、該化合物を急速な放出に対して保護するキャリアとともに調製し得る。エチレンビニルアセテート、ポリアンヒドリド、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸等の生分解可能で生物適合性のポリマーを使用し得る。そのような処方物の多くの調製方法が特許されているか、一般的に公知である。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０３５６】
ある実施形態において、結合タンパク質を、例えば不活性希釈液または同化可能な食用キャリアとともに経口投与し得る。また、この化合物（および所望であれば、他の成分）を、硬質または軟質のゼラチンカプセルに封入するか、錠剤へと圧縮するか、あるいは被験体の食事に直接混合し得る。経口治療投与のために、この化合物を、賦形剤とともに混合し、摂取可能な錠剤、バッカル剤、トローチ剤、カプセル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、カシェ剤等の形態で使用し得る。本明細書中に記載される化合物を非経口投与以外で投与するために、化合物の不活化を防止する物質で化合物を被覆するか、または化合物をこの物質とともに投与することが必要となり得る。
【０３５７】
薬学的組成物を、当該技術分野で公知の医療デバイスにより投与し得る。例えば、好ましい実施形態において、薬学的組成物を、米国特許第５，３９９，１６３号、米国特許第５，３８３，８５１号、米国特許第５，３１２，３３５号、米国特許第５，０６４，４１３号、米国特許第４，９４１，８８０号、米国特許第４，７９０，８２４号または米国特許第４，５９６，５５６号で開示されるデバイス等の無針皮下注射デバイスにより投与し得る。移植物およびモジュールの例として、医薬を調節速度で投与する移植可能なマイクロ点滴ポンプを開示している米国特許第４，４８７，６０３号、医薬を経皮で投与する治療デバイスを開示している米国特許第４，４８６，１９４号、医薬を正確な点滴速度で送達する医薬点滴ポンプを開示している米国特許第４，４４７，２３３号、連続的な薬物送達用の変流量移植可能点滴装置を開示している米国特許第４，４４７，２２４号、マルチチャンバー区画を有する浸透薬物送達システムを開示している米国特許第４，４３９，１９６号および浸透医薬供給システムを開示する米国特許第４，４７５，１９６号が挙げられる。勿論、多くの他のそのような移植物、送達システムおよびモジュールもまた、公知である。
【０３５８】
ある実施形態において、本明細書中に記載される結合タンパク質は、インビボでの適切な分布を保証するように処方し得る。例えば、血液脳関門（ＢＢＢ）は、多くの高親水性化合物を排除する。本発明の治療タンパク質が、（所望なら）ＢＢＢを確実に横断させるために、それらを、例えばリポソーム中に処方し得る。リポソームの製造方法については、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；米国特許第５，３７４，５４８号；および米国特許第５，３９９，３３１号を参照されたい。リポソームは、特定の細胞または器官に選択的に運ばれる一つ以上の部分を含み得、したがって、標的薬物送達を向上させ得る（例えば、Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５を参照）。
【０３５９】
投与レジメンを、最適な所望される応答（例えば、治療的応答）を提供するように調節する。例えば、単一の巨丸薬を投与してもよいし、いくつかに分けた用量を経時的に投与してもよいし、用量を治療状況の必要性によって示されるように比例的に増減してもよい。非経口組成物を、投与の容易さおよび投薬量の均一性のための投薬単位形態で調合することは特に好都合である。本明細書中で使用される投薬単位形態は、治療をされる被験体に単位投薬量として適した物理的に別々の単位をいい；各単位は、必要とされる薬学的キャリアと共同して所望の治療効果を生じるように算定された所定量の活性化合物を含む。投薬単位形態の規格は、（ａ）活性化合物の独自の特性および達成すべき特定の治療効果および（ｂ）個人における感受性処置のために活性化合物の配合技術分野に内在する制限により規定され、これらに直接的に依存し得る。
【０３６０】
本明細書中に記載される抗体の治療有効量または予防有効量についての例示的で非限定的な範囲は、０．１ｍｇ〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。標的結合タンパク質を、３０ｍｇ、２０ｍｇ、１０ｍｇ、５ｍｇまたは１ｍｇ／分未満の速度で静脈内点滴により投与して、約１ｍｇ〜１００ｍｇ／ｍ２または約５ｍｇ〜３０ｍｇ／ｍ２の用量を達成し得る。抗体よりも分子量の小さい結合タンパク質については、適正量を、比例的に小さくし得る。投薬量の値は、緩和すべき状態のタイプおよび重篤度により変更し得ることに注意すべきである。さらに、任意の特定の被験体に対しては、特異的投薬レジメンを、個人の必要性、および組成物を投与するかもしくは組成物投与を監督する者の専門的な判断に基づいて、経時的に調節すべきであり、本明細書中で提示する投薬量の範囲は例示的なものにすぎず、請求される組成物の範囲もしくは実施を限定する意図はないことを理解されるべきである。
【０３６１】
薬学的組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本明細書中に記載される標的結合タンパク質を使用して調製し得る。「治療有効量」とは、所望の治療成果を達成するために必要な投与量で、そのために必要な期間、有効な量をいう。治療有効量の組成物は、個人の病状、年齢、性別および体重等の因子、および個人において所望の応答を誘発する結合タンパク質の能力に従って変更し得る。治療有効量はまた、治療的に有益な効果が組成物の任意の毒性または有害な効果にまさる量でもある。「治療有効量」は、好ましくは測定可能なパラメーター、例えば炎症または腫瘍の成長速度を、処置されない被験体と比較して、少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、なおさらに好ましくは少なくとも８０％阻害する。化合物の測定可能なパラメーター（例えば、癌）の阻害能力は、ヒト腫瘍における効力を予測する動物モデル系で評価し得る。あるいは、組成物のこの性質を、当業者に公知のアッセイによってインビトロでの阻害等の化合物の阻害能力を調べることにより評価し得る。
【０３６２】
「予防有効量」とは、所望の予防成果を達成するために必要な投与量で、そのために必要な期間、有効な量をいう。典型的には、予防用量は疾患前または疾患の初期段階で被験体に使用されるために、予防有効量は、治療有効量よりも少なくなる。
【０３６３】
Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する結合タンパク質および使用（例えば、処置、予防または診断における使用）に関する説明書を含むキットもまた、本発明の範囲内にある。一実施形態において、診断用途についての説明書は、インビトロで、例えばサンプルで、例えば炎症障害または癌もしくは腫瘍性障害を有する患者からの生検または細胞中、あるいはインビボでＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇを検出するための、標的結合タンパク質（例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または他のポリペプチドもしくはペプチド）の使用を含む。別の実施形態において、治療用途の説明書は、癌もしくは腫瘍性障害を有する患者において推奨される投与量および／または投与形態を含む。さらに、このキットは、診断剤または治療剤、例えば本明細書中に記載される診断剤または治療剤等の少なくとも一つのさらなる試薬および／または必要に応じて一つ以上の分離した医薬品に調合される一つ以上のさらなる標的結合タンパク質を含み得る。
【０３６４】
一実施形態において、標的結合タンパク質（例えば、本明細書中に記載されるＴｉｅ１抗体）を、遺伝子に基づくベクター（例えば、導入遺伝子）から、またはアデノウイルス送達により生成し得る。
【０３６５】
（安定化および保持）
一実施形態において、標的結合タンパク質（例えば、本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合タンパク質、ポリペプチド、抗体またはアプタマー）を、循環中、例えば血液、血清、リンパ液または他の組織中でその安定化および／または保持を向上させる部分と物理的に会合させる。
【０３６６】
例えば、標的結合因子を、ポリマー、例えば、実質的に非抗原性のポリマー（例えば、ポリオキシアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシド）と会合させ得る。適切なポリマーは、重量により実質的に変化する。約２００〜約３５，０００、約１，０００〜約１５，０００、および２，０００〜約１２，５００の範囲の数平均分子量を有するポリマーが本発明の目的のために通常選択される。の分子量が好ましく、２，０００〜約１２，５０００が特に好ましい。
【０３６７】
例えば、標的結合因子を、水溶性ポリマー、例えば親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコールおよびポリビニルピロリドンと複合化させ得る。そのようなポリマー非限定的なリストは、ポリアルキレンオキシドホモポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化ポリオール、その共重合体およびそのブロック共重合体（但し、ブロック共重合体の水溶性は維持されている）を含む。さらなる有用なポリマーとして、ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレンおよびポリオキシエチレンおよびポリオキシプロピレンのブロック共重合体（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）；ポリメタクリレート；カルボマー；糖モノマーＤ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸を含む分鎖または非分鎖の多糖、例えばホモ多糖およびヘテロ多糖、例えばラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸性ムコ多糖の多糖サブユニット、例えばヒアルロン酸；糖アルコールのポリマー、例えばポリソルビトールおよびポリマンニトール等；ヘパリンまたはヘパロンが挙げられる。
【０３６８】
また、他の化合物、例えば細胞毒、標識、または他の標的因子、例えば別の標的結合因子もしくは非関連因子を、同じポリマーに連結し得る。モノ活性化アルコキシ末端ポリアルキレンオキシド（ＰＡＯ）、例えば、モノメトキシ末端ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）；Ｃ１−４アルキル末端ポリマー；およびビス活性化ポリエチレンオキシド（グリコール）を架橋のために使用し得る。例えば、ＵＳ５，９５１，９７４を参照されたい。
【０３６９】
その最も一般的な形態で、ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧは、ヒドロキシル基の末端を有し、以下の一般構造を有する、直鎖状または分枝状のポリエーテルである：
ＨＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
ＰＥＧは、エポキシ環上のヒドロキシドイオンの求核攻撃により開始されるエチレンオキシドのアニオン性開環重合により合成され得る。ポリペプチド改変に特に有用なのは、以下の一般構造を有するモノメトキシＰＥＧ、ｍＰＥＧである：
ＣＨ３Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−ＯＨ
さらなる説明については、例えばＲｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ５４：４５９−４７６を参照されたい。
【０３７０】
一実施形態において、架橋前のポリマーは水溶性である必要はないが、水溶性であるのが好ましい。一般的に、架橋後の生成物は水溶性であり、例えば、少なくとも約０．０１ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは少なくとも約１ｍｇ／ｍｌの水溶性を示す。さらに、ポリマーは複合形態で高い免疫原性であるべきではなく、また、この複合体が静脈内点滴または注射等の経路により投与されることを意図するのであれば、そのような経路と適合しない粘度を有するべきではない。
【０３７１】
一実施形態において、このポリマーは、反応性のある単一の基のみを含む。これはタンパク質分子の架橋を避けるのに役立つ。しかし、架橋を低減するために反応条件を最大化すること、または実質的に同質の誘導体を回収するために反応生成物をゲルろ過もしくはイオン交換クロマトグラフィーにより精製することは、本明細書中の範囲内にある。他の実施形態において、ポリマーは、複数の因子をポリマーの主鎖に連結するために二つ以上の反応基を含む。再び、ゲルろ過やイオン交換クロマトグラフィーを使用して、所望の誘導体を実質的に同質な形態で回収し得る。
【０３７２】
ポリマーの分子量は、約５００，０００Ｄまでの範囲であり得、好ましくは少なくとも約２０，０００Ｄ、または少なくとも約３０，０００Ｄ、または少なくとも約４０，０００Ｄである。選択される分子量は、達成される複合体の有効な大きさ、ポリマーの性質（例えば、直鎖状または分枝状等の構造）および誘導体化の程度に依存し得る。
【０３７３】
共有結合による架橋は、例えばＮ末端アミノ基およびリジン残基に見受けられるイプシロンアミノ基、ならびに他のアミノ、イミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、ヒドロキシルまたは他の親水基への架橋によって標的結合因子（例えば、タンパク質）をポリマーへ連結するために使用し得る。ポリマーは、多官能性（普通は二官能性）架橋剤を使用することなく標的結合タンパク質に直接共有結合させ得る。アミノ基への共有結合は、シアヌル酸塩化物、カルボニルジイミダゾール、アルデヒド反応性基（ＰＥＧアルコキシド＋ブロモアセトアルデヒドのジエチルアセタール；ＰＥＧ＋ＤＭＳＯおよび無水酢酸、または塩化ＰＥＧ＋４−ヒドロキシベンズアルデヒドのフェノキシド、活性化スクシンイミジルエステル、活性化ジチオカルボネートＰＥＧ、２，４，５−トリクロロフェニルクロロホルメートまたはＰ−ニトロフェニルクロロホルメート活性化ＰＥＧ）に基づく公知の化学により達成される。カルボキシル基はカルボジイミドを使用してＰＥＧ−アミンに結合させることにより誘導体化し得る。スルフヒドリル基は、マレイミド置換ＰＥＧ（例えば、アルコキシ−ＰＥＧアミン＋スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート）ＷＯ９７／１０８４７またはＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａから市販されているＰＥＧ−マレイミド）に結合させることにより誘導体化し得る。あるいは、例えばＰｅｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：１１２６−１１３０（１９９４）に記載されるように、結合タンパク質上の遊離アミノ基（例えば、リジン残基上のイプシロンアミノ基）を、２−イミノ−チオラン（Ｔｒａｕｔの試薬）によりチオール化し、次いで、ＰＥＧのマレイミド含有誘導体に結合させ得る。
【０３７４】
標的結合因子（例えば、タンパク質）へ結合させ得る機能性ＰＥＧポリマーは、例えばＳｈｅａｒｗａｔｅｒ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｎｃ．（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａ．）から入手し得る。そのような市販されているＰＥＧ誘導体として、例えば、アミノ−ＰＥＧ、ＰＥＧアミノ酸エステル、ＰＥＧ−ヒドラジド、ＰＥＧ−チオール、ＰＥＧ−スクシナート、カルボキシメチル化ＰＥＧ、ＰＥＧ−プロピオン酸、ＰＥＧアミノ酸、ＰＥＧスクシンイミジルスクシナート、ＰＥＧスクシンイミジルプロピオナート、カルボキシメチル化ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧのスクシンイミジルカルボネート、アミノ酸ＰＥＧのスクシンイミジルエステル、ＰＥＧ−オキシカルボニルイミダゾール、ＰＥＧ−ニトロフェニルカルボネート、ＰＥＧトレシレート（ｔｒｅｓｙｌａｔｅ）、ＰＥＧ−グリシジルエーテル、ＰＥＧ−アルデヒド、ＰＥＧビニルスルホン、ＰＥＧ−マレイミド、ＰＥＧ−オルトピリジル−ジスルフィド、ヘテロ機能性ＰＥＧ、ＰＥＧビニル誘導体、ＰＥＧシランおよびＰＥＧホスフォリド（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｄｅ）が挙げられる。これらのＰＥＧ誘導体を結合させる反応条件は、Ｔｉｅ１結合タンパク質、ＰＥＧ化の所望の程度、および利用されるＰＥＧ誘導体に応じて変更し得る。ＰＥＧ誘導体の選択に伴う幾つかの因子として、所望の結合点（例えばリジンまたはシステインＲ基）、誘導体の加水分解安定性および反応性、結合の安定性、毒性および抗原性、分析の適切性等が挙げられる。任意の特定の誘導体の使用の具体的な説明は、製造者から入手し得る。
【０３７５】
標的結合因子（例えば、Ｔｉｅ１結合タンパク質）およびポリマーの複合体は、例えばゲルろ過またはイオン交換クロマトグラフィー、例えばＨＰＬＣにより未反応の出発物質から分離し得る。複合物の非相同種は、互いから同様に精製される。また、未反応のアミノ酸のイオン的性質の違いのために、異なる種（例えば、一つまたは二つのＰＥＧ残基を有するもの）の分離も可能である。例えば、ＷＯ９６／３４０１５を参照されたい。
【０３７６】
標的結合タンパク質は安定化または保持機能を与えるタンパク質、例えばアルブミン、例えばヒト血清アルブミンと物理的に会合させることもできる。ＵＳ２００４０１７１７９４は血清アルブミンにタンパク質を物理的に会合させるための例示される方法を記載している。例えばヒトアルブミンの配列またはそのフラグメント、ＥＰ２０１２３９、ＥＰ３２２０９４ＷＯ９７／２４４４５、ＷＯ９５／２３８５７、特に米国特許２００４０１７１７９４およびＷＯ０１／７９４８０の配列番号１８に示されるヒトアルブミンの成熟型、または、他の脊椎動物由来のアルブミンまたはそのフラグメント、またはこれ等の分子の類縁体または変異体、またはそのフラグメントが例示される。他の例示されるヒト血清アルブミンタンパク質は以下のセットの点突然変異、Ｌｅｕ−４０７〜Ａｌａ、Ｌｅｕ−４０８〜Ｖａｌ、Ｖａｌ−４０９〜Ａｌａ、およびＡｒｇ−４１０〜Ａｌａ；またはＡｒｇ−４１０〜Ａｌａ、Ｌｙｓ−４１３〜Ｇｌｕ、およびＬｙｓ−４１４〜Ｇｌｎ（例えば国際公開ＷＯ９５／２３８５７およびＵＳ２００４０１７１７９４の配列番号１８参照）の１つまたは両方を包含することができる。
【０３７７】
（アプタマー）
一実施形態において、本発明は標的タンパク質結合剤、例えばアプタマーを特徴とする。核酸「アプタマー」という用語は本明細書においては、少なくとも５ヌクレオチドの内部非二重らせん核酸構造を包含するコンホーメーションを有する核酸分子を指す。アプタマーは自己相補性の領域を有する１本鎖核酸分子であることができる。例示されるアプタマーは核酸以外の標的分子に、例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する核酸分子を包含する。特定のアプタマーはまたＴｉｅ複合体の形成を調節するか、または、本明細書に記載した標的結合剤の特性１つ以上を有してよく、そして標的結合タンパク質の代わりに使用できる。
【０３７８】
選択されたアプタマーを標準的な核酸増幅操作法により回収できるため、アプタマーをインビトロでスクリーニングすることができる。方法は例えば選択の後期の回において、選択されたアプタマーをプールに分割し、そしてプール内の各アプタマーを蛍光団のような検出可能な標識で修飾することにより増強することができる。標識の特性を機能的に改変するアプタマーを有するプールを発見することができる。このようなプールを反復して分割し、再分析することにより、所望の特性を有する個々のアプタマーを発見することができる（例えばＪｈａｖｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：１２９３参照）。
【０３７９】
更に又、アプタマーをスクリーニングしてインビボの活性の有るもの得ることができる。例えば夾雑状態の核酸は、細胞内に導入された発現ベクター内にクローニングすることができる。発現された夾雑状態の核酸から得られるＲＮＡアプタマーをスクリーニングして生物学的活性のあるものを得ることができる。活性を有する細胞を単離して選択されたＲＮＡアプタマーに関する発現ベクターを回収することができる。
【０３８０】
治療用オリゴマー（例えばアプタマー）の重要な特徴は投与されたオリゴマーの骨格の設計である。一部の実施形態においては、インビボで安定であり、オリゴマーがホスホジエステル結合を攻撃するヌクレアーゼのような内因性ヌクレアーゼに対して抵抗性であるような構造のヌクレオシド内結合を骨格は含有する。同時に、オリゴマーは標的ＤＮＡまたはＲＮＡにハイブリダイズするその能力を保持している（Ａｇａｒｗａｌ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．６：３００９；Ａｇａｒｗａｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：７０７９）。修飾されたオリゴヌクレオチドは代替となるヌクレオシド結合を用いて構築できる。これ等の例示される結合の数種はＵｈｌｍａｎｎ，Ｅ．  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．（１９９０）Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ９０：５４３−５８４に記載されている。これ等に包含されるものは、メチルホスホネート（リン結合酸素の１つがメチルにより置き換えられているもの）；ホスホロチオエート（イオウがこれ等の酸素の１つを置き換えている）および種々のアミデート（ＮＨ２または有機アミン誘導体、例えばモルホリデートまたはピペラジデートが酸素を置き換えている）である。これ等の置換により増強された安定性が得られる。ＷＯ９１／１５５００はヌクレオシド内結合の１つ以上がイオウ系の結合、典型的にはホスホジエステルと同配性および等電性であるスルファメートジエステルで置き換えられている種々のオリゴヌクレオチド類縁体を記載している。ＷＯ８９／１２０６０は同様にスルフィド、スルホキシドおよびスルホンを含有する結合を開示している。ＷＯ８６／０５５１８は立体規則性重合体３’，５’結合の変異体を示唆している。米国特許５，０７９，１５１は２’，５’ホスホジエステル結合を介して１本鎖ＤＮＡに連結している分枝鎖ＲＮＡのｍｓＤＮＡ分子を開示している。米国特許５，２６４，５６２は式Ｙ’ＣＸ’２Ｙ’（ただし式中Ｙ’は独立してＯまたはＳであり、そして各Ｘ’は安定化置換基であり独立して選択されるものである）の修飾された結合を記載している。モルホリノ型のヌクレオチド内結合は米国特許５，０３４，５０６に記載されており、一部の場合においては相補標的配列に対するオリゴマーの増大した親和性を与える。米国特許５，２６４，５６２および５，５９６，０８６は標的ＲＮＡおよびＤＮＡへの強力なハイブリダイゼーションが可能な修飾されたヌクレオチド結合を有する修飾されたオリゴヌクレオチドを開示している。
【０３８１】
（処置）
Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合する結合因子は、治療的および予防的有用性を有する。例えば、これらの結合因子は培養中、例えばインビトロまたはエクスビボで細胞に投与して、または被験体に例えばインビボで投与して、内皮細胞障害、血管発達障害、傷の治癒、炎症疾患および癌、特に転移性癌等の多様な障害の処置、予防および／または診断を行い得る。用語「処置する」または「処置」とは、因子を単独または一つ以上の他の因子（例えば第二因子）と組み合わせて被験体、例えば患者、例えば、疾患（例えば、本明細書中に記載される障害）、障害の症状または障害に対する疾病素質を有する患者に、例えば、障害、障害の症状または障害に対する疾病素質を治療、治癒（ｈｅａｌ）、緩和、軽減、変化、矯正、改善、向上または影響するための、適用または投与をいう。細胞を処置するとは、細胞の活性の減少、例えば、細胞の管または脈管を形成する能力の減少をいう。減少は、活性の全体的な除去を必ずしも必要としないが、細胞の活性または数の減少、例えば統計的に有意な減少を必要とする。
【０３８２】
本明細書中で使用される場合、疾患を処置するのに有効な結合因子の量、または「治療有効量」とは、被験体に対する一回または複数回の投与の際に、細胞、例えば内皮細胞（例えば、Ｔｉｅ１発現内皮細胞）または癌細胞（特にその転移細胞）を処置するのに、または、そのような処置のない場合に期待される以上に、治癒を長期化し、本明細書中に記載される障害を有する被験体を緩和、救済または改善するのに有効な結合因子の量をいう。ある場合には、治療有効量は、結合因子の、処置されないコントロールマウスと比較して、ヌードマウスモデルにおける異種移植片の腫瘍の大きさを低下させる能力を評価することにより確定し得る。本明細書中で使用される場合、腫瘍もしくは他の新生物の「成長の阻害」は、その成長および転移を遅延、中断、阻止または停止することをいい、必ずしも新生物成長の全体的な除去を示すものではない。
【０３８３】
本明細書中で使用される場合、障害を予防するのに有効な標的結合因子の量、または標的結合因子の「予防有効量」は、被験体に対する一回または複数回の投与の際に、疾患（例えば内皮細胞関連障害、血管発達障害、炎症性疾患または癌）の発生または再発を防止または遅延するのに有効である標的結合因子、例えば、Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えば、本発明中に記載のＴｉｅ１結合抗原）の量を意味する。
【０３８４】
治療することができる被験体はヒトおよび非ヒト動物を包含する。例えばヒトは異常な細胞増殖または細胞分化を特徴とする障害を有するヒト患者であることができる。「非ヒト動物」という用語は全ての脊椎動物、例えば非哺乳類（例えばニワトリ、両生類、爬虫類）および哺乳類、例えば非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ等を包含する。
【０３８５】
本明細書に記載した結合剤は例えば癌（例えば固形腫瘍）または新脈管形成関連障害を治療するために被験体において新脈管形成を低減するために使用できる。方法は例えば新脈管形成、障害の症状、または障害の進行を調節するために十分な量で患者に結合剤を投与することを包含する。薬剤（例えばＴｉｅ１結合タンパク質、例えば抗Ｔｉｅ１抗体、例えばＥ３）は治療有効量が達成される前に複数回（例えば少なくとも２、３、５または１０回）投与してよい。
【０３８６】
結合剤、例えばＴｉｅ１結合タンパク質は、癌の治療または防止のために使用できる。一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質によるＴｉｅ１活性の低減は腫瘍の近傍および周囲の新脈管形成を低減または防止することができ、これにより、腫瘍の生育を低減または防止する。別の実施形態においては、新生物は異常に増殖している内皮細胞または造血細胞を包含する。Ｔｉｅ１結合タンパク質は癌細胞自体を調節するため、例えばＴｉｅ１を発現する新生物性の細胞を殺傷または除去するために使用できる。例えば細胞は造血細胞である。
【０３８７】
処置され得る癌の例として、これらに限定されないが、固形腫瘍、軟組織腫瘍および転移病巣が挙げられる。固形腫瘍の具体例として、多様な器官系の悪性腫瘍、例えば肉腫、腺癌および癌腫、例えば、肺、胸、リンパ管、胃腸（例えば、結腸）および尿生殖器管（例えば、腎臓細胞、尿路上皮細胞）、咽頭、前立腺、卵巣に影響を与える腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えばほとんどの結腸癌、直腸癌、腎臓細胞腺癌、肝臓癌、肺の非小細胞腺癌、小腸の癌等の腺癌を含む。また、上記癌の転移病巣を、本明細書中に記載されるＴｉｅ１結合タンパク質および他の因子を使用して、処置または予防し得る。
【０３８８】
処置され得る固形腫瘍の更なる例として、多様な器官系の悪性腫瘍、例えば肺、胸、リンパ節、胃腸（例えば結腸）および尿性器管、前立腺、卵巣、咽頭に影響を与える腫瘍、ならびに悪性腫瘍、例えばほとんどの結腸癌、腎臓細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣癌、肺の非小細胞癌腫、小腸の癌および食道の癌等の腺癌を治療するために有用でありうる。治療可能な例示的な固体腫瘍として、繊維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨形成肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、Ｅｗｉｎｇ腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、胃腸系癌腫、結腸癌腫、膵臓癌、乳癌、泌尿生殖細胞系癌腫、卵巣癌、前立腺癌、扁平細胞癌腫、基底細胞癌腫、腺癌、汗腺癌腫、皮脂腺癌腫、乳頭状癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌腫、肝癌、胆管癌、絨毛膜癌、精上皮腫、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、内分泌系癌、睾丸腫瘍、肺癌腫、小細胞肺癌腫、非小細胞癌腫、膀胱癌腫、上皮癌腫、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽細胞腫および網膜芽細胞腫が挙げられる。
【０３８９】
また、Ｔｉｅ１結合タンパク質を使用して、造血組織起源の過形成性／新生細胞、例えば、骨髄、リンパ球または赤血球系列に由来する細胞、またはその前駆細胞、特にＴｉｅ１を発現するような細胞の増殖を阻害し得る。例えば、本明細書中に記載される結合タンパク質を、これらに限定されないが、急性前骨髄白血病（ＡＰＭＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）および慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）（Ｖａｉｃｋｕｓ，Ｌ．（１９９１）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ．ｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．／Ｈｅｍｏｔｏｌ．１１：２６７−９７に概説）等の、多様な骨髄障害の処置に使用し得る。処置され得るリンパ系悪性腫瘍として、これらに限定されないが、急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）、例えば、Ｂ由来ＡＬＬとＴ由来ＡＬＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、前リンパ性白血病（ＰＬＬ）、ヘアリーセル白血病（ＨＬＬ）およびＷａｌｄｅｎｓｔｒｏｍのマクログロブリン血症（ＷＭ）が挙げられるが、これらに限定されない。悪性リンパ腫のさらなる形態として、非ホジキンスリンパ腫およびその変種、末梢Ｔ細胞リンパ腫、成人Ｔ細胞白血病／リンパ腫（ＡＴＬ）、皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）、大顆粒リンパ性白血病（ＬＧＦ）ならびにホジキンス病が挙げられるが、これらに限定されない。Ｔｉｅ１は急性骨髄性白血病および骨髄異形成症候群（Ｖｅｒｓｔｏｖｓｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｌｅｕｋ，Ｌｍｐｈｏｍａ）、Ｂ細胞慢性リンパ性白血病（Ａｇｕａｙｏ  ｅｔ  ａｌ，２００１．Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（４）：２７９−８５．）において上方調節されることが示されるので、Ｔｉｅ１と相互作用する結合タンパク質を使用して、これら疾病の検出、処置または予防し得る。
【０３９０】
従って、造血系障害、例えば造血系の癌を有するか、その危険性のある被験体を、Ｔｉｅ１結合タンパク質、例えばＴｉｅ１ホモ二量体化を増大させるＴｉｅ１結合タンパク質、またはＴｉｅ複合体形成に拮抗する結合タンパク質を投与することにより治療することができる。例えばＴｉｅ１結合タンパク質は抗Ｔｉｅ１抗体、例えば本明細書に記載した抗体であることができる。結合タンパク質の投与は例えば１回より多い投薬を用いながら治療濃度を達成するための複数回投与を包含できる。例えば、投与は約週一回、２日毎または３日毎等とすることができる。
【０３９１】
Ｔｉｅ１と結合するタンパク質および他の因子を投与する方法は、「薬学的組成物」にも記載される。使用される分子の適切な投薬量は、被験体の年齢および体重ならびに使用される特定の薬剤に依存する。結合タンパク質を、望ましくない相互作用、例えば、天然または病理学的因子とＴｉｅ１との間の相互作用を阻害、減少させる競合因子として使用し得る。
【０３９２】
一実施形態において、Ｔｉｅ１結合タンパク質を使用して、細胞、例えば、内皮細胞をインビボで阻害する（例えば、細胞の少なくとも一つの活性を阻害し、増殖、移動、成長または生存力を低下させる）。結合タンパク質はそれだけで使用し得、または因子（例えば細胞毒薬物、細胞毒酵素、または放射性同位体と複合体化して使用し得る。この方法は、結合タンパク質をそれのみ、または細胞毒薬物と結合させて、そのような処置を必要とする被験体に投与する工程を包含する。
【０３９３】
Ｔｉｅ１結合タンパク質はＴｉｅ１発現内皮細胞を認識し、そして癌細胞、例えば癌性の肺、肝臓、結腸、乳房、卵巣、上皮、喉頭および軟骨の細胞、そして特にその転移性の細胞に会合している（例えばその近接部にあるか、それと混在している）内皮細胞に結合することができるため、Ｔｉｅ１結合タンパク質は何れかのこのような細胞を阻害（例えば少なくとも１つの活性を阻害、生育および増殖を低減、または殺傷）し、そして新脈管形成を阻害するために使用できる。癌近傍の内皮細胞活性を低減することは栄養、生育シグナル等に関して内皮細胞に依存している可能性の有る癌細胞を間接的に阻害（例えば少なくとも１つの活性を阻害、生育および増殖を低減、または殺傷）することができる。
【０３９４】
或いは、結合タンパク質は癌性の細胞の周辺の細胞に結合するが、癌性の細胞を直接または間接的に阻害（例えば少なくとも１つの活性を阻害、生育および増殖を低減、または殺傷）するために十分癌性の細胞に接近している。即ち、Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えば毒素で、例えば細胞毒で修飾されている）を用いて選択的に阻害（例えば癌性の組織における細胞を殺傷または除去）することができる（癌性の細胞自体および癌と会合しているかそれを侵襲している内皮細胞）。
【０３９５】
結合タンパク質は種々の細胞毒性薬品、例えば治療薬、放射線を発する化合物、植物、カビまたは細菌を起源とする分子、生物学的タンパク質およびこれ等の混合物を送達するために使用してよい。細胞毒性薬品は細胞内で作用する細胞毒性薬剤、例えば毒素、短レンジ放射線発射物質、例えば短レンジ高エネルギーα線発射物質であることができる。
【０３９６】
正常、良性の過形成性または癌性の細胞を殺傷または除去するためには、第１の結合タンパク質を、プロドラッグ活性化物質の近傍に存在する場合のみ活性化されるプロドラッグにコンジュゲートする。プロドラッグ活性化物質は第２の結合タンパク質、好ましくは標的分子上の非競合部位に結合するものにコンジュゲートする。２つの結合タンパク質が競合または非競合の結合部位に結合するかどうかは、従来の競合結合試験により調べることができる。例示される薬品−プロドラッグの対はＢｌａｋｅｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５６：３２８７−３２９２に記載されている。
【０３９７】
天然の補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）または抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を介して抗原発現細胞を排除するためにＴｉｅ１結合タンパク質をインビボで直接使用することができる。本明細書に記載した結合タンパク質は補体結合エフェクタードメイン、例えばＩｇＧ１、２または３のＦｃ部分、または補体に結合するＩｇＭの相当する部分を包含できる。一実施形態において、標的細胞の集団には本明細書に記載した結合剤および適切なエフェクター細胞をエクスビボで投与する。投与は補体または補体を含有する血清を添加することにより補給できる。更に本明細書に記載した結合タンパク質をコーティングした標的細胞の貪食作用は補体タンパク質の結合により向上させることができる。別の実施形態においては、補体結合エフェクタードメインを包含する結合タンパク質をコーティングした標的細胞を補体により溶解する。
【０３９８】
癌を治療するための本明細書に記載した治療方法の使用は多くの利点を有する。Ｔｉｅ１の発現は腫瘍への栄養および酸素の供給を増大させるように血管およびリンパ管を包含する脈管構造の変化を刺激する腫瘍内部で生じる低酸素シグナルに応答して誘導される場合がある。特定のＴｉｅ１結合タンパク質（例えばＥ３および関連抗体）はそれらが腫瘍の脈管構造の変化を阻害することができ、そして腫瘍内圧力の低下を誘発する可能性があるため、特に有効である場合がある。これ等の薬剤はまた従来の薬剤が腫瘍内に浸透することが困難であった状況において治療薬として非常に適している。更に又、Ｔｉｅ１結合タンパク質は造血を無影響下におくことができる。治療は臨床パラメーターを用いて有効にモニタリングできる。或いは、これ等のパラメーターを用いてそのような治療を何時使用すべきかを示すことができる。
【０３９９】
Ｔｉｅ１結合タンパク質、例えばＴｉｅ１ホモ二量体化を増大させるＴｉｅ１結合タンパク質またはＴｉｅ複合体形成に拮抗する結合タンパク質を被験体に投与することにより炎症性障害、例えば乾癬または関節リウマチを治療または防止することができる。
【０４００】
乾癬。乾癬は鱗片形成および炎症を特徴とする慢性の皮膚疾患である。乾癬が発症すると、典型的には皮膚のパッチが肥厚化、赤化し、そしてプラークと称される銀色味を帯びた鱗片で被覆されるようになる。乾癬は最も頻繁には肘、膝、頭皮、下部背面、顔面、手掌および足裏に生じる。疾患は又、手爪、足爪および口と生殖器の内部の軟組織に生じる場合も有る。乾癬患者の約１０％が関節炎の症状をもたらす関節の炎症を有している。患者は統計Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ  Ｇｌｏｂａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ（ｓＰＧＡ）を用いて評価でき、そして、軽度〜極めて重度の６カテゴリの範囲のカテゴリ評点を受ける。評点はプラーク、鱗片化および紅斑に基づく。本発明の治療方法を用いてこれ等の指標の少なくとも１つの改善を達成することができる。
【０４０１】
関節リウマチ（ＲＡ）は疼痛、浮腫、強直、および、主に関節機能の消失を誘発する慢性炎症性疾患である。ＲＡは頻繁には滑膜、即ち保護嚢を形成している関節を包囲する膜において発症する。ＲＡに罹患した多くの個体において白血球が循環系から滑膜に浸潤し、連続した異常な炎症（例えば滑膜炎）を誘発する。その結果、滑膜が炎症を起こし、発熱、赤色化、浮腫および疼痛を誘発する。軟骨内のコラーゲンが徐々に破壊され、関節空間が狭小化し、最終的には骨を損傷する。炎症は罹患領域に糜爛性の骨損傷を生じさせる。この過程の間、滑膜の細胞が成長し、異常に分裂し、正常では薄膜である滑膜を肥厚化し、そして浮腫を有する腫脹した触感の関節をもたらす。ＲＡは種々の臨床的尺度で評価することができる。一部の例示される指標は総Ｓｈａｒｐ評点（ＴＳＳ）、Ｓｈａｒｐ糜爛評点およびＨＡＱ障害指数を包含する。本発明の治療方法を用いてこれ等の指標の少なくとも１つの改善を達成することができる。
【０４０２】
Ｔｉｅ１結合タンパク質（例えばＴｉｅ１のホモ二量体化を増大させるＴｉｅ１結合タンパク質）またはＴｉｅ複合体形成に拮抗する結合タンパク質を被験体に投与することにより網膜の障害、例えば増殖性網膜症、例えば糖尿病性網膜症、虚血性網膜症、または未熟児網膜症；脈絡膜新生血管形成；水晶体新生血管形成；角膜新生血管形成；虹彩新生血管形成；または結膜新生血管形成を治療または防止することができる。結合タンパク質は病的な眼の新生血管形成に関連する網膜剥離の危険性を低減するために使用できる。一部の場合においては、結合タンパク質は結膜下投与により投与される。
【０４０３】
（併用療法）
本明細書に記載した結合タンパク質は癌を治療するための他の治療法、例えば手術、放射線療法および化学療法の１つ以上と組み合わせて投与できる。例えばＴｉｅ複合体形成に拮抗するか、またはＴｉｅシグナリング活性を調節するタンパク質（例えばＴｉｅ１ホモ二量体化および／またはリン酸化を促進するタンパク質）はまた他の抗癌療法、例えば放射線療法、化学療法、手術または第２の薬剤の投与と組み合わせて使用できる。例えば第２の薬剤はＶＥＧＦのシグナリング経路にターゲティングするか、負の調節を行うものであることができる。この後者のクラスの例はＶＥＧＦ拮抗剤（例えば抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブ）およびＶＥＧＦレセプター拮抗剤（例えば抗ＶＥＧＦレセプター抗体）を包含する。１つの特定の組み合わせはベバシズマブを包含する。組み合わせは更に５−ＦＵおよびロイコボリンおよび／またはイリノテカンを包含できる。
【０４０４】
「併用」という用語は同じ患者を治療するために２つ以上の薬剤または療法を使用することを指し、ここで薬剤または療法の使用または作用は時間的にオーバーラップする。薬剤または療法は同時（例えば患者に投与される単一の製剤として、または、同時に投与される２つの別個の製剤として）または何れかの順序で逐次的に投与することができる。逐次的投与は異なる時間に行われる投与である。１つの薬剤と別の薬剤の投与の間の時間は数分、数時間、数日または数週間であることができる。本明細書に記載したＴｉｅ１結合タンパク質の使用はまた、別の治療薬の投薬量を低減するため、例えば投与される別の薬剤に関わる副作用を低減するため、例えばベバシズマブのような抗ＶＥＧＦ抗体の副作用を低減するために使用できる。従って、複合とはＴｉｅ１結合タンパク質非存在下で使用されるものよりも少なくとも１０、２０、３０または５０％低用量で第２の薬剤を投与することを包含することができる。
【０４０５】
更に又、被験体は第１および第２の薬剤を投与することにより新脈管形成関連障害に対して治療されることができる。例えば、第１の薬剤は早期の段階の新脈管形成を調節し、そして第２の薬剤はその後の段階の新脈管形成を調節するか、またはやはり早期の段階の新脈管形成を調節する。第１および第２の薬剤は単一の薬学的組成物を用いて投与するか、別個に投与することができる。一実施形態において、第１の薬剤はＶＥＧＦ経路拮抗剤（例えばＶＥＧＦの阻害剤（例えばＶＥＧＦ−Ａ、−Ｂまたは−Ｃ）またはＶＥＧＦレセプター（例えばＫＤＲまたはＶＥＧＦレセプターＩＩＩ（Ｆｌｔ４））またはｂＦＧＦ経路拮抗剤（例えばｂＦＧＦに結合する抗体またはｂＦＧＦレセプター）である。他のＶＥＧＦ経路拮抗剤もまた本明細書中または別途記載されている。一実施形態において、第２の薬剤は腫瘍内において、血管の組立および安定化を阻害または低減し、血管またはリンパ管の維持を妨害し、或いはリンパ管の分布を改変する。例えば、第２の薬剤はＴｉｅ複合体の形成を阻害するか、またはＴｉｅ１ホモ二量体化を促進するものを包含する。例えば第２の薬剤は本明細書に記載したＴｉｅ１結合タンパク質である。
【０４０６】
腫瘍が特定の大きさ（例えば〜１〜２ｍｍ）に達すれば、腫瘍はその体積を増大させる前に新しい脈管構造を必要とする。腫瘍新脈管形成の早期の段階は、宿主からの新しい血管の生育および血管による腫瘍の浸潤を刺激するための腫瘍からのシグナル、例えばＶＥＧＦの分泌を包含する。例えばＶＥＧＦは内皮細胞の増殖を刺激し、これが次に組立てられて血管となる。腫瘍新脈管形成の後期の段階は血管の組立および安定化をもたらすシグナルを包含できる。この組立および安定化には内皮細胞と血管の内皮細胞を包囲する血管周囲細胞との間の相互作用が関与している。例えばＴｉｅ１は血管の組立および安定化において、および、血管周囲細胞と内皮細胞の間の会合の維持において、役割を果たしている。即ち、新脈管形成関連障害を治療するための効果的な治療には新脈管形成の早期の段階を調節する薬剤（例えばＶＥＧＦ経路拮抗剤、例えば抗ＶＥＧＦ（例えばベバシズマブ）または抗ＶＥＧＦレセプター（例えば抗ＫＤＲ）抗体；または他の前脈管形成経路の拮抗剤、例えば抗ｂＦＧＦ抗体または抗ｂＦＧＦレセプター（例えば抗ｂＦＧＦレセプター−１、−２または−３）抗体）および腫瘍新脈管形成の後期の段階を調節する薬剤（例えばＴｉｅ１の拮抗剤（例えば抗Ｔｉｅ１抗体（例えば本明細書に記載した抗体、例えばＥ３抗体））またはＴｉｅ２の拮抗剤（例えば抗Ｔｉｅ２抗体）またはＡｎｇの抗体（例えば抗Ａｎｇ抗体（例えば抗Ａｎｇ２抗体）または抗Ａｎｇ２ペプチド（例えば阻害性Ａｎｇ２ペプチド））の組み合わせが関与する。これ等の薬剤の１つ以上を組み合わせて使用する。これ等の薬剤の１つ以上はまた他の抗癌療法、例えば放射線療法または化学療法と組み合わせて使用してよい。
【０４０７】
例示されるＶＥＧＦレセプター拮抗剤はＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼの活性の阻害を包含する。４−［４−（１−アミノ−１−メチルエチル）フェニル］−２−［４−（２−モルホリン−４−イル−エチル）フェニルアミノ］ピリミジン−５−カルボニトリル（ＪＮＪ−１７０２９２５９）は血管内皮成長因子レセプター−２（ＶＥＧＦ−Ｒ２）の経口使用可能な選択的ナノモル阻害剤である５−シアノピリミジンの構造クラスの１つである。別の例にはＰＩＫ−７８７／ＺＫ２２５８４（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）、ＳＵ５４１６、ＳＵ１１２４８（Ｐｆｉｚｅｒ）およびＺＤ６４７４（［Ｎ−（４−ブロモ−２−フルオロフェニル）−６−メトキシ−７−［（１−メチルピペリジン−４−イル）メトキシ］キナゾリン−４−アミン］）を包含する。Ｔｉｅ１結合タンパク質と組み合わせて使用できる更に他の薬剤は広域特異性のチロシンキナーゼ阻害剤、例えばＳＵ６６６８である。例えばＢｅｒｇｅｒｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１，１２８７−１２９５を参照できる。
【０４０８】
第二の物質または治療法は、別の抗癌剤または治療法であり得る。抗癌剤の非限定的な例として、例えば、抗微小管剤、トポイソメラーゼ阻害物質、代謝拮抗物質、分裂阻害物質、アルキル化剤、挿入剤、シグナル伝達経路に干渉可能な物質、アポトーシスを促進する物質、放射線、および他の腫瘍関連抗原に対する抗体（ネイキッド（ｎａｋｅｄ）抗体、免疫毒素および放射性複合体を含む）が挙げられる。特定のクラスの抗癌剤の例を、以下に詳細に提供する：抗チューブリン／抗微小管（例えば、パクリタキセル、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソテール）；トポイソメラーゼＩ阻害物質（例えば、イリノテカン、トポテカン、カンプトテシン、ドキソルビシン、エトポシド、ミトザントロン、ダウノルビシン、イダルビシン、テニポシド、アンサクリン、エピルビシン、メルバロン（ｍｅｒｂａｒｏｎｅ）、塩酸ピロキサントロン）；代謝拮抗物質（例えば、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、メトトレキセート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、シタラビン／Ａｒａ−Ｃ、トリメトレキサート、ゲンシタビン、アシビシン、アラノシン、ピラゾフリン（ｐｙｒａｚｏｆｕｒｉｎ）、Ｎ−ホスホルアセチル−Ｌ−アスパレート＝ＰＡＬＡ、ペントスタチン、５−アザシチジン、５−アザ２’−デオキシシチジン、アラ−Ａ、クラドリビン（ｃｌａｄｒｉｂｉｎｅ）、５−フルオロウリジン、ＦＵＤＲ、チアゾフリン、Ｎ−［５−［Ｎ−（３，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソキナゾリン−６−イルメチル）−Ｎ−メチルアミノ］−２−テノイル］−Ｌ−グルタミン酸；アルキル化剤、例えば、シスプラチン、カルボプラチン、ミトマイシンＣ、ＢＣＮＵ＝カルムスチン、メルファラン、チオテパ、ブスルファン、クロランブシル、プリカマイシン、ダカルバジン、リン酸イホスファミド、シクロホスファミド、窒素マスタード、ウラシルマスタード、ピポブロマン、４−イポメアノール（ｉｐｏｍｅａｎｏｌ）；他の作用機構により作用する物質、例えば、ジヒドロレンペロン、スピロムスチンおよびデシペプチド；インターフェロン等の例えば抗腫瘍応答を増強する生物学的応答改変剤；アクチノマイシンＤ等のアポトーシス物質；および抗ホルモン、例えば、タモキシフェン等の抗エストロゲン、または例えば、４’−シアノ−３−（４−フルオロフェニルスルホニル）−２−ヒドロキシ−２−メチル−３’−（トリフルオロメチル）プロピオンアニリドなどの抗アンドロゲン。
【０４０９】
併用療法は他の療法の副作用を低減する薬剤を投与することを包含してよい。薬剤は抗癌治療の副作用を低減する薬剤であることができる。例えば薬剤はロイコボリンであることができる。
【０４１０】
Ｔｉｅ１結合タンパク質または本明細書に記載した他の結合タンパク質を投与することを包含する併用療法はまた別の新脈管形成関連障害（例えば癌以外の障害、例えば望ましくない内皮細胞増殖または望ましくない炎症が関わっている障害、例えば関節リウマチ）を有するかその危険性を有する被験体を治療するために使用できる。
【０４１１】
（診断用途）
Ｔｉｅ１に結合する結合タンパク質（例えば、抗体、例えば本明細書中に記載される抗体）は、インビトロおよびインビボの診断、治療および予防の有用性を有する。
【０４１２】
一つの局面において、本発明はＴｉｅ１の存在を、インビトロ（例えば、組織、生検等のサンプル、例えば癌組織等の生物学的サンプル）またはインビボ（例えば、被験体者におけるインビボ画像化）で検出する診断方法を提供する。本方法は、（ｉ）サンプルをＴｉｅ結合タンパク質に接触させ；そして（ｉｉ）Ｔｉｅ１結合タンパク質とサンプルとの複合体の形成を検出する工程を包含する。この方法はまた、参照サンプル（例えば、コントロールサンプル）を結合タンパク質に接触させ、参照サンプルに対する複合体形成と比較した場合の結合タンパク質とサンプルとの複合体形成の程度を決定する工程を包含し得る。コントロールサンプルまたは被験体と比較した場合のサンプル中または被験体中の複合体の形成の変化、例えば統計的に有意な変化は、サンプル中のＴｉｅ１の存在を示し得る。Ｔｉｅ１結合タンパク質は、結合または非結合の抗体の検出を容易とする検出可能な物質で、直接的または間接的に標識し得る。適切な検出可能な物質として、種々の酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射活性物質が挙げられる。
【０４１３】
Ｔｉｅ１結合タンパク質とＴｉｅ１との複合体形成は、Ｔｉｅ１と結合する結合タンパク質かまたは非結合タンパク質のいずれかを測定または可視化することにより検出し得る。従来的な検出アッセイ、例えば酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫測定法（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学を使用し得る。さらにＴｉｅ１結合タンパク質を標識するために、サンプル中のＴｉｅ１の存在を、検出可能な物質で標識したスタンダードおよび非標識Ｔｉｅ１結合タンパク質を利用して競合免疫アッセイによって検定し得る。このアッセイの一例において、生物学的サンプル、標識スタンダードおよびＴｉｅ１結合因子を合わせ、非標識結合タンパク質と結合した標識スタンダードの量を決定する。サンプル中のＴｉｅ１の量は、Ｔｉｅ１結合因子に結合した標識スタンダードの量に逆比例する。
【０４１４】
蛍光体および発色基標識結合タンパク質を調製し得る。抗体および他のタンパク質は、約３１０ｎｍまでの波長を有する光を吸収するので、蛍光部分は３１０ｎｍを超える波長、好ましくは４００ｎｍを超える波長において、実質的な吸収を有するように選択されるべきである。多様な適切な蛍光体および発色基が、Ｓｔｒｙｅｒ（１９６８）Ｓｃｉｅｎｃｅ，１６２：５２６およびＢｒａｎｄ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４１：８４３−８６８に記載されている。結合タンパク質を、従来的な手順、例えば米国特許第３，９４０，４７５号、米国特許第４，２８９，７４７号および米国特許第４，３７６，１１０号に記載される手順により蛍光発色基で標識し得る。上記の所望の多くの性質を有する蛍光体の一方のグループは、フルオレセインおよびローダミンを含むキサンテン染料である。蛍光化合物のもう一方のグループはナフチルアミンである。蛍光体または発色基でいったん標識すると、結合タンパク質は、例えば蛍光顕微鏡（共焦点またはデコンボリューション顕微鏡等）を使用して、サンプル中のＴｉｅ１の存在または位置を検出するために使用し得る。
【０４１５】
（組織学的分析）
本明細書中に記載される結合タンパク質を使用して、免疫組織化学を実施し得る。例えば、抗体の場合、抗体を標識（例えば精製タグまたはエピトープタグ）を用いて合成するか、または標識または標識結合基を複合化することにより脱離可能に標識し得る。例えば、キレーターを抗体に連結し得る。次いでこの抗体を、例えば顕微鏡スライドグラス上の組織の固定片である組織学的調製物に接触させる。結合のためのインキュベーション後に、調製物を洗浄して非結合抗体を除去する。次いで調製物を、例えば顕微鏡を使用して分析して、抗体が調製物に結合したかどうかを同定する。該方法は、内皮細胞または内皮細胞により形成された組織、例えば血管を評価するために使用し得る。抗体（または他のポリペプチドもしくはペプチド）は、結合時に非標識であり得る。結合および洗浄後、抗体を標識して検出し得るようにする。
【０４１６】
（タンパク質アレイ）
Ｔｉｅ１結合タンパク質は、タンパク質アレイ上に固定化し得る。タンパク質アレイを診断ツールとして、例えば医学的サンプル（例えば、単離された細胞、血液、血清、生検サンプル等）をスクリーニングし得る。勿論、タンパク質アレイはまた、例えばＴｉｅ１または他の標的分子（例えばヒアルロン酸）に結合する他の結合タンパク質を含み得る。
【０４１７】
ポリペプチドアレイを生成する方法は、例えば、Ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：９８９−９９４；Ｌｕｅｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０：１０３−１１１；Ｇｅ（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８，ｅ３，Ｉ−ＶＩＩ；ＭａｃＢｅａｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９：１７６０−１７６３；ＷＯ０１／４０８０３およびＷＯ９９／５１７７３Ａ１に記載されている。アレイ用ポリペプチドは、例えば市販のロボット装置を使用して、高速でスポットし得る。アレイ基板は、例えばニトロセルロース、プラスチック、ガラス、例えば表面改変ガラスであり得る。このアレイは、多孔性マトリックス、例えばアクリルアミド、アガロースまたは別のポリマーを含み得る。
【０４１８】
例えばアレイは、例えば上記のＤｅ  Ｗｉｌｄｔに記載されるような抗体のアレイであり得る。結合タンパク質を作る細胞は、配列された（ａｒｒａｙｅｄ）フォーマットでフィルター上に生育し得る。ポリペプチド産生を誘導し、発現されたポリペプチドをフィルターに細胞位置で固定化する。タンパク質アレイを、標識標的に接触させて、各固定化ポリペプチドに対する標的の結合程度を決定し得る。標的が非標識の場合、例えば、標識プローブを使用するサンドイッチ法を使用して非標識標的の結合を検出し得る。アレイの各アドレスでの結合の程度に関する情報は、プロフィールとして、例えばコンピュータデータベースに保存し得る。タンパク質アレイを複製して、これを使用して、例えば標的および非標的の結合プロフィールを比較し得る。
【０４１９】
（ＦＡＣＳ（蛍光活性化細胞選別））
標的結合タンパク質を使用して、細胞（例えばサンプル（例えば、患者サンプル）中の細胞）を標識し得る。この結合タンパク質はまた、蛍光化合物に連結している（または連結可能である）。次いで、これらの細胞を、蛍光活性化細胞選別（例えば、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ  ＣＡから入手可能な選別機を使用する；ＵＳ５，６２７，０３７；５，０３０，００２；および５，１３７，８０９も参照）を使用して選別し得る。細胞が選別機を通過するに際に、レーザービームが蛍光化合物を励起し、検出器が通過する細胞の数を計数し、蛍光化合物が細胞に連結しているかどうかを蛍光を検出することにより決定する。各細胞に結合した標識の量を定量し、分析してサンプルを特性付け得る。
【０４２０】
この選別機は、細胞を偏向させ、結合タンパク質に結合した細胞を、結合タンパク質に結合しない細胞から分離し得る。分離された細胞を、培養および／または特性付け得る。
【０４２１】
（インビボ画像化）
さらに別の実施形態において、本発明は、Ｔｉｅ１を発現する癌組織の存在をインビボで検出する方法を提供する。この方法は、被験体にＴｉｅ１結合タンパク質を投与する工程；および被験体においてＴｉｅ１結合タンパク質を検出する工程を包含する。この検出工程は、複合体の位置または形成の時期を決定する工程を包含し得る。この方法は、被験体（例えば、被験体の体の部位）をスキャン、そうでない場合は画像化する工程を包含し得る。別の方法は、（ｉ）被験体（例えば、癌または腫瘍性障害を有する患者）に検出可能なマーカーと複合化したＴｉｅ１結合抗体を投与し；（ｉｉ）被験体を、Ｔｉｅ１発現組織または細胞に対するこの検出可能なマーカーを検出する手段に供する工程を包含する。例えば、この方法を使用して、血管または内皮細胞（例えばＴｉｅ１発現内皮細胞）の位置を可視化し得る。被験体を、例えば、ＮＭＲまたは他の断層撮影手段により画像化し得る。
【０４２２】
診断用画像化に有用な標識の例として、１３１Ｉ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、９９ｍＴｃ、３２Ｐ、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃおよび１８８Ｒｈ等の放射性標識、蛍光体およびローダミン等の蛍光標識、核磁気共鳴活性標識、ポジトロン放射断層撮影（「ＰＥＴ」）スキャナにより検出可能なポジトロン放射同位元素、ルシフェリン等の化学発光分析計、およびペルオキシダーゼまたはホスファターゼ等の酵素マーカーが挙げられる。また、短距離検出器プローブにより検出可能な放射性同位体等の短距離放射線エミッターを使用し得る。この結合タンパク質を、公知の技術を使用して、そのような試薬で標識し得る。例えば、抗体の放射標識に関する技術について、Ｗｅｎｓｅｌ  ａｎｄ  Ｍｅａｒｅｓ（１９８３）Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ  ＹｏｒｋおよびＤ．Ｃｏｌｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１２１：８０２−８１６を参照されたい。
【０４２３】
放射標識結合タンパク質を、インビトロ診断試験のためにも使用し得る。放射性同位元素で標識されたタンパク質の特定の活性は、半減期、放射性標識の同位体の純度、およびこの標識をどのようにタンパク質に導入するかに依存する。
【０４２４】
腫瘍関連新生血管形成に対する効果的な画像化剤が必要である。Ｔｉｅ１は腫瘍関連脈管構造においてアップレギュレートされる。本明細書に記載した結合タンパク質はそのような脈管構造の画像化のために使用できる。
本明細書に記載した結合タンパク質は数種の方法において画像化のために使用できる。結合タンパク質を９９ｍＴｃ、１８６Ｒｅまたは１８８Ｒｅのような画像化剤に対するキレート剤に物理的に会合、例えばカップリングさせることができる。９９ｍＴｃおよび１８８Ｒｅはシングルフォトンエミッションコンピューター断層撮影（ＳＰＥＣＴ）画像化に適するガンマ線を発射する。放射性のフッ素（１８Ｆ）、インジウム（１１１Ｉｎ）、ヨウ素（１２３Ｉ、１３１Ｉ）、ガリウム（６Ｇａ、６７Ｇａ）、炭素（１１Ｃ）、タリウム（２０１Ｔｌ）および他の元素を画像化剤として使用してよい。
【０４２５】
結合タンパク質は又、画像化剤としての使用に適する放射性核種またはスピン標識を包含する粒子、例えばナノ粒子に、共有結合的または非共有結合的に結合することができる。結合タンパク質はＭＲＩを介した画像化を可能にするスピン標識に連結できる。Ｂｏｔｎｅｒ等（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ．（２００４）１０８：２０２３−２０２９）は例示されるガドリニウム標識ペプチドを用いたＭＲＩ画像化を記載している。本明細書に記載した結合タンパク質は画像化のために同様に標識できる。
【０４２６】
Ｃｈｅｎ等（Ｊ．Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．，（２００４）４５：１７７６−１７８３）は小型ＰＥＧ分子（平均分子量３．４ＫＤａ）をカップリングするとαｖβ３−結合ペプチドのその薬力学が向上したことを示している。結合タンパク質（例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇ結合タンパク質）はクリアランス速度および経路を調節するためにＰＥＧ分子にカップリングできる。
【０４２７】
陽電子発射断層撮影（ＰＥＴ）は６４Ｃｕおよび１８Ｆのような陽電子発射物質のような画像化剤と共に使用できる。これ等の同位体はより入手し易くなっている。６４Ｃｕはキレート剤ＤＯＴＡ中に捕獲できる。ＤＯＴＡ誘導体はタンパク質に共有結合できる。一実施形態において、ＤＯＴＡ誘導体１つ以上をリジン側鎖基を介して結合タンパク質（例えばＦａｂ）に結合する。
【０４２８】
Ｆａｂ類はそれらがａ）かなり急速に系から消失するため、注射数分内に画像化が可能になり、そしてｂ）効率的に腫瘍に浸透することから、画像化のために有用な結合剤である。
【０４２９】
Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２またはＡｎｇに結合するＦａｂ類は例えばＥ．ｃｏｌｉ中、または真核細胞中で製造できる。Ｆａｂ類はプロテインＡ上のクロマトグラフィーにより精製できる。イオン交換クロマトグラフィーもまた使用できる。画像化に使用するためには、所望の放射性核種または他の画像化剤に適するキレート形成基の共有結合により、使用時にＦａｂを標識することができる。Ｆａｂ類は又ＭＲＩ画像化を可能にするために結合されたスピン標識を有することもできる。Ｆａｂ類は又画像化に適する放射性核種またはスピン標識を包含する粒子（例えばナノ粒子）に結合することもできる。特定の実施形態においては、クリアランスの速度および経路を調節するためにＰＥＧ分子にＦａｂ類をカップリングしてよい。他の実施形態においては、Ｆａｂ類はその急速なクリアランス特性を維持するためにＰＥＧにはカップリングしない。
【０４３０】
ポリペプチドの放射性同位体（例えば、１４Ｃ、３Ｈ、３５Ｓ、１２５Ｉ、３２Ｐ、１３１Ｉ）による標識操作は、一般的に公知である。例えば、トリチウム標識化手順は、米国特許第４，３０２，４３８号に記載されている。例えばネズミのモノクローナル抗体に適合させるようなヨウ素化、トリチウム標識化および３５Ｓ標識化手順は、例えば、Ｇｏｄｉｎｇ，Ｊ．Ｗ．（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｐｒａｃｔｉｃｅ：ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．Ｌｏｎｄｏｎ；Ｏｒｌａｎｄｏ：Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６．ｐｐ．１２４−１２６）およびそこで引用された参考文献により記載されている。抗体等のポリペプチドをヨウ素化する他の手順は、Ｈｕｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ（１９６２）Ｎａｔｕｒｅ  １４４：９４５，Ｄａｖｉｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９７４）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３：１０１４−１０２１および米国特許第３，８６７，５１７号および米国特許第４，３７６，１１０号に記載されている。画像化に有用な放射標識元素としては、例えば１２３Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｉｎおよび９９ｍＴｃが挙げられる。抗体をヨウ素化する手順は、Ｇｒｅｅｎｗｏｏｄ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９６３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．８９：１１４−１２３；Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉｓ，Ｊ．（１９６９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１１３：２９９−３０５；およびＭｏｒｒｉｓｏｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９７１）Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２８９−２９７により記載されている。９９ｍＴｃ標識化の手順は、Ｒｈｏｄｅｓ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｂｕｒｃｈｉｅｌ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍａｇｉｎｇ：Ｔｈｅ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｓｓｏｎ  １１１−１２３（１９８２）およびそこで引用された参考文献により記載されている。１１１Ｉｎ標識化抗体に適した手順は、Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５：１４７−１５７，Ｈｎａｔｏｗｉｃｈ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｒａｄｉａｔｉｏｎ，３５：５５４−５５７およびＢｕｃｋｌｅｙ，Ｒ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｆ．Ｅ．Ｂ．Ｓ．１６６：２０２−２０４に記載されている。
【０４３１】
放射標識結合タンパク質の場合、結合タンパク質は患者に投与され、結合タンパク質が反応する抗原を有する腫瘍に局在化され、例えばガンマカメラまたは放射断層撮影法を使用する、放射性核スキャンニング等の公知の技術を使用してインビボで検出または「画像化」される。例えば、Ａ．Ｒ．Ｂｒａｄｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｓ  ｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ”，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｒ．Ｗ．Ｂａｌｄｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（ｅｄｓ．），ｐｐ．６５−８５（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９８５）を参照されたい。あるいは、ポジトロン放射トランスアキシャル断層撮影スキャナ、例えばＢｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに位置するＰｅｔ  ＶＩと呼ばれるもの等を、放射性標識がポジトロン（例えば、１１Ｃ、１８Ｆ、１５Ｏおよび１３Ｎ）を放射する場合に使用し得る。
【０４３２】
（ＭＲＩ造影剤）
磁気共鳴影像法（ＭＲＩ）は、生体の被験体の内部特徴を視覚化するためにＮＭＲを使用するもので、予後、診断、治療および手術に有用である。ＭＲＩは、明らかな有益性として放射性トレーサー化合物なしに使用し得る。いつくかのＭＲＩ技術が、ＥＰ−Ａ−０  ５０２  ８１４に要約されている。一般的に、異なる環境下の水プロトンの緩和時間定数Ｔ１およびＴ２に関連する違いを使用して画像を作る。しかし、これらの違いは鮮明な高解像度画像を提供するには不十分であり得る。
【０４３３】
これらの緩和時間定数の違いは造影剤により増強し得る。そのような造影剤の例として、多くの磁性剤、例えば（主にＴ１を変える）常磁性剤、および（主にＴ２応答を変える）強磁性または超常磁性剤が挙げられる。キレート（例えば、ＥＤＴＡ、ＤＴＰＡおよびＮＴＡキレート）は、幾つかの常磁性物質（例えば、Ｆｅ３＋、Ｍｎ＋２、Ｇｄ＋３）を連結（およびその毒性を低下）するために使用し得る。他の物質は、例えば、直径が１０μｍ未満で約１０ｎＭまでの粒子の形態であり得る。粒子は、強磁性、反強磁性または超常磁性の特性を有し得る。粒子は、例えば、マグネタイト（Ｆｅ３Ｏ４）、γ−Ｆｅ２Ｏ３、フェライト、および遷移元素の他の磁性無機化合物を含み得る。磁性粒子は、非磁性物質を有する磁性結晶および非磁性物質を有さない磁性結晶のうちの一つ以上の磁性結晶を含み得る。非磁性物質として、合成または天然のポリマー（例えば、セファロース、デキストラン、デキストリン、デンプン等）が挙げられる。
【０４３４】
（ｉ）実質的にすべての天然の豊富なフッ素原子が１９Ｆ同位体であり、よって実質的にすべてのフッ素含有化合物がＮＭＲ活性であり；（ｉｉ）多くの化学的に活性なポリフルオロ化化合物、例えばトリフルオロ酢酸無水物が比較的安価で市販されており、かつ（ｉｉｉ）ヘモグロビン代用物として酸素を運ぶために利用されているペリフルオロ化ポリエーテル等の多くのフッ素化化合物が、ヒトにおける使用に対し医学的に受容可能であると見出されたゆえに、標的結合タンパク質はまた、ＮＭＲ活性１９Ｆ原子または複数のそのような原子を含む指示基（ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）により標識し得る。そのようなインキュベーションの時間を許した後、全身ＭＲＩを、Ｐｙｋｅｔｔ（１９８２）Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，２４６：７８−８８に記載される装置等の装置を使用して癌組織を検出し、画像化する。
【０４３５】
標的結合タンパク質、例えば本明細書中に記載される結合タンパク質を評価することから得られた情報を機械に適合する媒体、例えばコンピュータ読み取り可能またはコンピュータアクセス可能な媒体上に記録し得る。この情報はコンピュータ表示として、例えばデータベース（例えば、結合タンパク質を使用した画像化の場合、一つまたは複数の被験体についての画像のデータベース）中に保存し得る。用語「コンピュータ表示」とは、コンピュータが処理し得る形態である情報を意味する。コンピュータ表示を保存する行為は、コンピュータによる処理に適した形態で情報を置く行為をいう。
【０４３６】
また、Ｔｉｅ１に結合する結合タンパク質、および診断使用のための説明書、例えばインビトロで（例えば、サンプル、例えば癌または腫瘍性障害を有する患者からの生検材料または細胞中の）Ｔｉｅ１を検出するか、またはインビボで例えば被験体を画像化することによりＴｉｅ１を検出するための標的結合タンパク質（例えば、抗体またはその抗原結合フラグメント、または他のポリペプチドもしくはペプチド）の使用のための説明書を含むキットも本発明の範囲にある。このキットは、標識または付加的な診断剤等の少なくとも一つの付加的な試薬をさらに含み得る。インビボ使用のために、結合タンパク質を、薬学的組成物として処方し得る。
【０４３７】
下記例は、制限するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【０４３８】
（実施例１：Ｔｉｅ１配列）
例示的なＴｉｅ１アミノ酸配列（配列番号２）は以下のとおりである：
【０４３９】
【数１１】
2008532476.tif 000013
Ｔｉｅ１をコードする例示的な核酸配列（配列番号１）は以下のとおりである：
【０４４０】
【数１２】
2008532476.tif 000014
。
【０４４１】
（実施例２：選択と主要なスクリーニング）
本発明者らは、免疫グロブリンをＦａｂフラグメントとして示す非常に大きなファージライブラリーからＴｉｅ１特異的抗体を選択するためにファージディスプレーを使用した。Ｔｉｅ１に特異的な抗体を単離するために、ファージ表示Ｆａｂ抗体ライブラリーを、ヒトＦｃまたはヒスチジン精製タグに対して融合させたＴｉｅ１細胞外ドメインに対して選択した。
【０４４２】
溶液中の選択は、ストレプトアビジン被覆磁気ビーズ（Ｍ−２８０−ＤＹＮＡＬ（登録商標））上に補足されたビオチン標識抗原を使用して実施した。Ｔｉｅ１を発現する細胞上での選択は、ＫＩＮＧＦＩＳＨＥＲ（商標）自動化磁気ビーズ捕捉デバイスを使用して実施した。固定化抗原上での選択は、Ｔｉｅ１−Ｆｃで被覆したイムノチューブを使用して実施した。幾つかの選択法が使用された。
【０４４３】
ストラタジー１：ラウンド１（５００ｍＭビオチン標識Ｔｉｅ１／磁気ビーズ）、ラウンド２（１×１０７Ｔｉｅ１発現細胞／Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ）、ラウンド３（１×１０７Ｔｉｅ１発現細胞／Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ）
ストラタジー２：ラウンド１（５００ｍＭビオチン標識Ｔｉｅ１／磁気ビーズ）、ラウンド２（１×１０７Ｔｉｅ１発現細胞／Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ（商標））、（３００ｍＭビオチン標識Ｔｉｅ１／磁気ビーズ）
ストラタジー３：ラウンド１（５μｇ／ｍｌのＴｉｅ１  Ｆｃ被覆イムノチューブ）、ラウンド２（Ｔｉｅ１−Ｆｃ被覆イムノチューブ）、ラウンド３（Ｔｉｅ１  Ｆｃ被覆イムノチューブ＋ヒトＩｇＧを用いた除去）。
【０４４４】
選択ストラタジーから回収したライブラリーメンバーを、ファージＥＬＩＳＡでの抗原結合について検査した。各単離物を、被覆Ｔｉｅ１  Ｆｃへの結合について検査した。ストラタジー１は、いずれの結合クローンも同定しなかったが、ストラタジー２は１３個のポジティブクローンを同定した（ｎ＝９５）。ストラタジー３は８６個の結合クローンを同定した（ｎ＝９５）。
【０４４５】
選択されたクローンの配列分析は、重鎖の選択されたＣＤＲ３に基づき分類し、独自のＶＨ−ＣＤＲ３配列を有する２３個の異なる抗体を得た。
【０４４６】
本発明者らは、ディスプレーライブラリーベクターからのＶＨおよびＶＬコード配列を、哺乳動物の発現ベクター系の二つのベクターに再クローニングすることにより、選択されたＦａｂを完全なヒトの抗体として再フォーマットした。これらのベクターは、ヒトカッパ定常ドメインおよびヒトガンマ−１重鎖定常領域を含む。両ベクターを、対応する完全ＩｇＧの発現および生成のために哺乳動物ＣＨＯ−Ｋ１細胞にトランスフェクトした。これらの抗体は下記を含む数種のアッセイを使用して特性付けた：１．Ｔｉｅ１をトランスフェクトした細胞および主要ヒト内皮細胞のウェスタンブロッティングおよび免疫沈降；２．Ｔｉｅ１をトランスフェクトした細胞および主要ヒト内皮細胞の免疫蛍光；３．ＢａＦ３細胞および主要ヒト内皮細胞中のＴｉｅ１の刺激および阻害；ならびに４．ヒト組織の免疫染色。
【０４４７】
本発明者らは、Ｔｉｅ１と相互作用する２３個の抗体を同定した。図７〜３６を参照されたい。再フォーマットされたクローンの配列確認後、それらをＨＥＫ２９３Ｔ細胞の一時的なトランスフェクションで使用した。成長後、ＩｇＧを、プロテインＡカラムを使用して培養上清から精製した。精製したＩｇＧ１の量を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを使用して決定した。
【０４４８】
Ｔｉｅ１特異的ＩｇＧの特異性を、マウス肺微小血管内皮細胞（ＬＥＩＩ）、およびＴｉｅ１発現構築物をトランスフェクトしたＬＥＩＩ−Ｔｉｅ１細胞で細胞ＥＬＩＳＡ全体により決定し得る。細胞を１０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウエルプレートにまき、４％パラホルムアルデヒドを使用して固定した。ＩｇＧ１のＬＥ１１細胞への結合の染色および検出は、ＨＲＰ複合ウサギ抗ヒトＨＲＰによる標準的な標識およびＴＭＢ染色を使用して検出する。精製ＩｇＧ１のＬＥＩＩ−Ｔｉｅ１をトランスフェクトした細胞への結合は、内因的に発現するＴｉｅ１タンパク質に対して補正し得る。あるいは、内因性Ｔｉｅ１をほとんど持たない細胞または全くもたない細胞を、分析のためにも使用し得る。
【０４４９】
結合抗体の少なくとも一つ（Ｅ３）は、ＢａＦ３細胞バイオアッセイでＴｉｅ１活性化抗体として作用する。本発明者らは、一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞およびヒト主要内皮細胞におけるＥ３  ＩｇＧ処置に応答するＴｉｅ１リン酸化を研究した。本発明者らの結果は、Ｅ３  ＩｇＧがＴｉｅ１レセプターを活性化することを示す。ＢａＦ３細胞バイオアッセイ（「Ｔｉｅ１／ＥｐｏＲキメラＢＡＦ細胞アッセイ」ともいわれる）は、Ｔｉｅ１レセプターを架橋するリガンドの能力の指標を提供し得る。アッセイは人為的であるため、非天然のＴｉｅ−Ｅｐｏ融合タンパク質の架橋は、インビボ機能を調節するリガンドの能力を予測するかどうか分からない。
【０４５０】
起こり得る天然のリガンドの代わりにＥ３を使用して、インビトロおよびインビボでのＴｉｅ１のいくつかの機能を特性付け得る。Ｅ３と相互作用するＴｉｅ１の領域は、Ｔｉｅ１活性化または阻害のために小分子化合物の標的となり得る。
【０４５１】
Ｅ３は一つの特定のＴｉｅ１活性化アッセイで作用するが、Ｅ３およびこのアッセイにおける他のポジティブ物はまた、他の機能に関して、または他のコンテキストにおいて阻害効果を有し得る。例えばＥ３は、ＨＵＶＥＣ細胞による管形成を阻害し得る。以下を参照されたい。
【０４５２】
さらに、本発明者らは、ＢａＦ３細胞生検においてＥ３により与えられた生存効果を阻害する二つの抗体を見出した。これらの二つの抗体は、ＢａＦ３アッセイにおいてＥ３により誘導されたＴｉｅ１の二量体化を阻害し得る。Ｂ２およびＤ１１の二つの抗体は、Ｅ３と組み合わせて使用される場合、Ｔｉｅ１／ＥｐｏＲ細胞の生存性を完全にブロックした。
【０４５３】
（方法）
（細胞培養）
ＣＯＳ１細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、グルタミンおよび抗生物質を補ったダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ）で培養した。ネズミのＢａ／Ｆ３前Ｂリンパ細胞を、１０％ＦＣＳ、グルタミン、抗生物質および２ｎｇ／ｍｌインターロキン−３（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）で補ったＤＭＥＭで培養した。ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手したヒト皮膚微小管内皮細胞（ＨＤＭＶＥＣ）を、供給者により提供された内皮細胞培地で培養し、４〜７継代で使用した。
【０４５４】
（ウェスタンブロッティングおよび免疫沈降）
製造者の指示に従ってＦＵＧＥＮＥ６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ＣＯＳ１細胞にｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５（１０ｃｍ細胞培養プレートあたり１μｇのＤＮＡ）をトランスフェクトし、４８時間インキュベート後、染色した。免疫沈降のために、Ｔｉｅ１をトランスフェクトした細胞およびＨＭＶＥＣ細胞を、アプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦおよびバナジン酸ナトリウムを補ったＤＯＣ−ＲＩＰＡ細胞溶解緩衝液（５０ｍＭトリス塩酸、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、０．１％ＳＤＳ、１％ＤＯＣ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）に溶解させた。免疫沈降を、等量の細胞溶解物から、ポリクローナル抗ヒトＴｉｅ１抗体（Ｒ＆Ｄ）、モノクローナル抗Ｖ５抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、または２３種類の抗Ｔｉｅ１抗体（１μｇ／ｍｌ）と一緒に１〜２時間インキュベートし、その後にプロテインＧ−セファロース（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＡＢ）とともに１時間インキュベートすることにより実施した。免疫沈降物をＰＢＳ−Ｔで二回およびＰＢＳで二回洗浄した後に、Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液による溶出および８％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ中での分離を行った。ブロットは、２３種類の抗Ｔｉｅ１抗体（５μｇ／ｍｌ）、およびそれに続くＨＲＰと複合化した抗ヒトＦｃ抗体により精査した。
【０４５５】
（免疫蛍光染色）
ガラスカバースリップ上のＣＯＳ１細胞に、製造者の指示に従ってＦＵＧＥＮＥ（商標）６（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、ｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５（Ｖ５−エピトープをｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１の３末端に付加した）（１０ｃｍの細胞培養プレートあたり１μｇ  ＤＮＡ）を一時的にトランスフェクトし、４８時間インキュベート後、染色した。細胞を、４℃にて１０分間、４％パラホルムアルデヒドで固定した。必要であれば、これらの細胞を、ＰＢＳ中の０．２％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００により５分間、浸透性にした。非特異的な結合部位を、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡで３０分間インキュベートすることによりブロックした。次いでこれらの細胞を、抗Ｔｉｅ１抗体（５μｇ／ｍｌ）および抗Ｖ５抗体により室温にて１時間染色し、続いてＦＩＴＣ複合化抗ヒト抗体（ＤＡＫＯ、４０μｇ／ｍｌ）およびＴＲＩＴＣ複合化抗マウス抗体（ＤＡＫＯ、１５μｇ／ｍｌ）とともに、３０分間インキュベートした。Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３２５８フルオロクローム（Ｓｉｇｍａ、０．５μｌ／ｍｌ）を核の染色のために使用した。
【０４５６】
（ＢａＦ３バイオアッセイ）
バイオアッセイ用にＴｉｅ１−ＥｐｏＲ発現Ｂａ／Ｆ３細胞を作るために、ＢａＦ３前Ｂ細胞に、マウスエリスロポイエチンレセプターの膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインと融合させたヒトＴｉｅ１の細胞外ドメインを含むキメラレセプターを発現する核酸を安定的にトランスフェクトした。使用した核酸を、ｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクター中のＴｉｅ１−ＥｐｏＲキメラｃＤＮＡであった。キメラレセプターをコードする核酸を、ヒトＴｉｅ１のＰＣＲ増幅細胞外部分（Ｘ６０９７５のｐｂ  ３７−２３１６）をＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩフラグメントとしてｍＥｐｏＲ−ｐｃＤＮＡベクターにクローニングすることにより構築した。ＥｐｏＲの膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと融合させたＴｉｅ１の細胞外部分からなるキメラレセプターをコードするｃＤＮＡを、ｐＥＦ−ＢＯＳ発現ベクターにサブクローニングした。ベクターを線状化し、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Ｚｅｏベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともにＢａＦ３細胞へトランスフェクトした。安定した細胞プールを、２５０μｇ／ｍｌ  Ｚｅｏｃｉｎによる選択により生成した。幾つかのクローンにおけるＴｉｅ１／ＥｐｏＲ融合タンパク質の発現を、ＥｐｏＲに対する抗体によるウェスタンブロッティングにより分析した。
【０４５７】
アッセイを実施するために、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲキメラを発現するＢａＦ３細胞を、９６ウエルマイクロタイタープレートに、指定された濃度の抗Ｔｉｅ１抗体の存在下で５００００細胞／ウェルへと分割した。この研究で使用したＥ３抗体は、生殖細胞系Ｅ３抗体（ＤＸ−２２２０）であった。コントロールとして、Ｔｉｅ１−ＥｃｏＲを発現しないＺｅｏｃｉｎ耐性プールを使用した。４８時間後、細胞の生存度は、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリムブロミド（Ｓｉｇｍａ）、０．５ｍｇ／ｍｌ）を加え、続いてさらに２時間培養し、等しい容量の細胞溶解溶液（１０％ＳＤＳ、１０ｍＭ  ＨＣｌ）を加え、一晩３７℃にてインキュベートすることにより決定した。吸光度は５４０ｎｍで測定した。
【０４５８】
（Ｔｉｅ１リン酸化アッセイ）
ＣＯＳ１細胞にｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５をトランスフェクトした。トランスフェクトの２４時間後、これらの細胞の血清を８時間欠乏させ、次いでＥ３  ＩｇＧで処理した。Ｔｉｅ１リン酸化アッセイのために、指示されるとおり、ＨＤＭＶＥＣを１０ｃｍの皿でコンフルエンス近くまで培養し、無血清培地で欠乏させ（８〜１６時間）、刺激した。刺激後、これらの細胞を細胞溶解緩衝液（ＲＩＰＡ−ＤＯＣ：５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、０．１％ＳＤＳ、０．５％ＤＯＣ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡをアプロチニン、ロイペプチン、ＰＭＳＦおよびバナジン酸ナトリウムで補ったもの）に溶解させた。トランスフェクトしたＣＯＳ１細胞またはＨＤＭＶＥＣから浄化した溶解物を、抗Ｖ５または抗Ｔｉｅ１  Ｂ９でそれぞれ免疫沈降させた。タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、ニトロセルロースに移し、抗ホスホチロシンおよび抗Ｔｉｅ１（Ｒ＆Ｄシステム）抗体を使用してイムノブロットした。
【０４５９】
（ヒト組織の免疫染色）
免疫組織化学における抗Ｔｉｅ１抗体の反応性を評価するために、ヒト腎臓と肺の５μｍの凍結切片を、室温にて３０分間乾燥させ、冷アセトンで１０分間固定した。スライドをＰＢＳで洗浄し、ＰＢＳ中０．０３％Ｈ２Ｏ２で１５分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を低下させた。ＴＮＢ（室温にて３０分）を使用して、非特異的結合をブロックし、切片をＴｉｅ１抗体とともに１０μｇ／ｍｌの濃度で一晩＋４℃にてインキュベートした。ＰＢＳによる数回の洗浄後、ビオチニル化抗ヒト抗体（１：３００、Ｚｙｍｅｄ）を組織に加えた。シグナルを、ＴＳＡキットを使用することにより増幅し、ＡＥＣ染色で検出した。
【０４６０】
（結果）
Ｔｉｅ１をトランスフェクトした細胞および主要ヒト内皮細胞のウェスタンブロッティング、免疫沈降および免疫蛍光（表１を参照）。
【０４６１】
【表１】
2008532476.tif 000015
２３種類の選択された抗Ｔｉｅ１抗体の結合能力を確かめるために、本発明者らはまずｐｃＤＮＡ３−Ｔｉｅ１−Ｖ５（Ｖ５タグ付き）をトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞、および主要内皮細胞を使用して、ウェスタンブロッティングおよび免疫沈降を実施した。次に、抗Ｔｉｅ１抗体が生細胞内でＴｉｅ１を認識するかどうかを調べるために、これらの細胞を免疫蛍光染色により調査した。分析されたすべての抗体がトランスフェクトしたＴｉｅ１と内因性Ｔｉｅ１の両方を認識したが、表１に示されているように結合親和性の違いが検出された。
【０４６２】
（Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲをトランスフェクトしたＢａ／Ｆ３細胞およびヒト主要内皮細胞におけるＴｉｅ１の刺激および阻害）
Ｔｉｅ１に対するリガンドは同定されなかったが、本発明者らはＴｉｅ１結合タンパク質の以下の効率的なスクリーニング法を使用した。インターロイキン−３依存前Ｂリンパ球（Ｂａ／Ｆ３）細胞に、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ融合タンパク質を発現する構築物をトランスフェクトした。ＢａＦ３細胞はＩＬ−３依存性であるために、それらはＩＬ−３が提供されないと死滅する。しかし、Ｔｉｅ−ＥｐｏＲレセプターを発現するＢａＦ３細胞は、培地が、天然リガンドかまたは人工的模倣物のいずれかであるＴｉｅ１結合タンパク質を含む場合、生存または増殖し得る。細胞生存は、例えばミトコンドリアの活性を測定する比色ＭＴＴアッセイにより定量し得る。
【０４６３】
ＢａＦ３細胞アッセイからの結果は、検査した２３種類の異なるモノクローナル抗体のうち、わずかにＥ３  ＩｇＧのみがＴｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞の生存を促進し得たが、コントロールとして使用されたＥｐｏＲ  ＢａＦ３細胞の生存度はＥ３  ＩｇＧによって影響されなかったことを示した。Ｅ３  ＦａｂフラグメントはＴｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞の生存度に効果を有さなかったので、免疫グロブリン分子のＩｇＧ部分はＥ３  ＩｇＧの生存作用に必要ではなかった。５０ｎｇ／ｍｌのＥ３  ＩｇＧの濃度は、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞生存アッセイにおいてほぼ最大の生存度を与え、この生存度は、用量依存的であった。
【０４６４】
Ｔｉｅ１の細胞外ドメインに結合するＥ３  ＩｇＧがＴｉｅ１の自己リン酸化を誘導するかどうかを検査するために、Ｅ３  ＩｇＧ処理に応答するＴｉｅ１レセプターリン酸化レベルを一時的にトランスフェクトしたＣＯＳ１細胞およびヒト主要内皮細胞において調査した。ＣＯＳ１細胞に、Ｖ５タグ付きの全長Ｔｉｅ１  ｃＤＮＡを含む発現ベクターをトランスフェクトし、血清欠乏後にこれらの細胞をＥ３  ＩｇＧ（２００ｎｇ／ｍｌ）で処理した。細胞溶解物を幾つかの時間点で抽出し、Ｔｉｅ１を抗Ｖ５で免疫沈降させた後、抗ホスホチロシンおよび抗Ｔｉｅ１抗体を使用したウェスタンブロッティングを行った。その結果は、Ｔｉｅ１は１０〜３０分間のＥ３  ＩｇＧ刺激後にチロシンリン酸化されることを示した。Ｅ３  ＩｇＧが主要内皮細胞中のＴｉｅ１リン酸化を誘発するかどうかを決定するために、ＨＤＭＶＥＣ細胞を血清欠乏させ、幾つかの濃度のＥ３で６０分間刺激した。次いで、Ｔｉｅ１を細胞溶解物から免疫沈降させ、抗ホスホチロシンブロッティング分析に供したところ、５０〜２００ｎｇ／ｍｌでのＥ３  ＩｇＧ刺激に続き、レセプターリン酸化を示した。さらに高い濃度のＥ３（５００〜１０００ｎｇ／ｍｌ）がＴｉｅ１リン酸化を誘発したが、その応答はより急速で、刺激の５分後に最も顕著であった。
【０４６５】
Ｅ３  ＩｇＧ誘発Ｔｉｅ１活性化の動態を調べるために、細胞をＥ３  ＩｇＧ（２００ｎｇ／ｍｌ）で刺激し、リセプターリン酸化を様々な時間点で調査した。Ｔｉｅ１リン酸化はＥ３  ＩｇＧ処理の１５〜３０分後に最も激しかったが、リン酸化は１時間に及び持続した。
【０４６６】
調査された任意の他のモノクローナル抗体が、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ  Ｂａ／Ｆ３アッセイにおいてＥ３  ＩｇＧの生存効果を阻害するかどうかを決定するために、抗体をＥ３  ＩｇＧと組み合わせて研究した。１００ｎｇ／ｍｌ濃度のＥ３  ＩｇＧを、１００（１：１）または５００（１：５）ｎｇ／ｍｌの他の抗体とともに使用して、Ｔｉｅ１−ＥｐｏＲ細胞の生存度を測定した。Ｅ３  ＩｇＧと試験抗体（１：１および１：５の比率にある）との両方の組合せからの結果は類似しており、２３抗体のうち２抗体（Ｂ２およびＤ１１）がＥ３  ＩｇＧの生存効果を完全にブロックしたことを示した。幾つかの抗体（Ａ２、Ａ１０、Ｐ−Ｂ１、Ｐ−Ｂ３およびＰ−Ｃ６）は、Ｅ３  ＩｇＧの生存作用をある程度阻害し、抗体のうち２つ（Ｇ２およびＣ７）が、Ｅ３  ＩｇＧとの組合せにおいてＴｉｅ１／ＥｐｏＲ  ＢａＦ３細胞の生存を促進した。
【０４６７】
（ヒト組織の免疫染色）
抗Ｔｉｅ１抗体は、培養細胞中のヒトＴｉｅ１と反応する。ビオチニル化抗Ｔｉｅ１抗体を使用して、標識ストレプトアビジンまたはアビジンを使用して結合抗体を検出することにより、抗体が肺および腎臓ならびに腫瘍からのヒト組織サンプルを染色し得るかどうかを決定することもできる。
【０４６８】
（実施例３：例示的配列）
例示的な免疫グロブリン可変ドメインの配列を、図７〜３６に示す。
【０４６９】
（実施例４：抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧを使用したＨＵＶＥＣ細胞による管形成の阻害
）
インビトロでの血管形成を阻害するＥ３の能力を明らかにするために、ヒト臍帯内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）による管形成を阻害する能力について精製Ｅを調査した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、新鮮なヒト臍帯静脈をトリプシン−ＥＤＴＡ（１×）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃にて２０〜２５分間、処理することにより得た。これらの細胞を、接着因子（ＡＦ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で被覆したＴ−２５フラスコ中、１０％ＦＣＳ、０．４％ＢＢＥ、１％  １−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンを補ったＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。一次培養物を温かいトリプシン−ＥＤＴＡで分離して、二代または三代の継代でコンフルエントになったときに使用した。これらの細胞を１：２の分離比率で、単層の約６０〜８０％のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。細胞を分離するために、ＨＵＶＥＣ単層をトリプシン／ＥＤＴＡ（５００μｌ／皿）で３７℃にて３分間処理した。トリプシン活性を、３体積分の完全ＲＰＭＩ培地を加えることにより停止した。これらの細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰返して分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。
【０４７０】
二継代後、ＨＵＶＥＣを、７．５体積分の２ｍｇ／ｍｌコラーゲン（コラーゲンＲ；Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１体積分の１０×ＭＥＭ、１．５体積分のＮａＨＣＯ３（１５．６ｍｇ／ｍｌ）を混合することにより調製されたコラーゲンゲル（１．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩ  ５０μｌ）上のそれらの培養培地（９６ウエルプレートで４０×１０３／５０μｌ／ウェル）にまき、約１体積分のＮａＯＨによりｐＨを７．４に調節した。次いで、１時間３０分後に培養培地を捨て、これらの細胞をコラーゲンの新しい層（１．５ｍｇ／ｍｌ、新しい調製物、５０μｌ／ウェル）で被覆した。ゲルの重合後、培養培地を、Ｅ３抗体（１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下に各ウェルに加えた。このアッセイを、コントロール（１ｎｇ／ｍｌ〜１０μｇ／ｍｌ）として使用されるストレプトアビジン抗体を用いて実施した。培養表面上の管ネットワークの全長を、ＭＥＴＡＶＵＥ（商標）ソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により×４０倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を、視野±ＳＥＭ（相対単位）あたりの平均管面積として示した。各アッセイを少なくとも３回実施した。
【０４７１】
Ｅ３は、１０ｎｇ／ｍｌの濃度でさえもＨＵＶＥＣによる管形成の有力な阻害物質である。コントロール抗ストレプトアビジンは、ＨＵＶＥＣの管を形成する能力に対して効果を有さない。この結果は、Ｅ３が血管形成の少なくとも一局面を阻害し得ることを示している。
【０４７２】
（実施例５：調和させた腫瘍および正常組織切片に結合するＥ３の免疫組織化学的分析）
主要な腫瘍および正常組織におけるＥ３のＴｉｅ１への結合を評価するために、抗体をＩｇＧとして生成し、ビオチン標識した。Ｅ３抗体ならびに二つの他の抗Ｔｉｅ１抗体Ｂ２およびＤ１１を全長ＩｇＧ分子として再フォーマットした。これらのＩｇＧをコードする核酸を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一時的にトランスフェクトした。一時的な細胞トランスフェクション用のプラスミド調製を、ＨＰ−ＧＥＮＥＬＵＴＥ（商標）ＭＩＤＩ調製キット（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＮＡ０２００）を使用して実施した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．カタログ番号Ｑ４０１）をトランスフェクションの２４時間前にまいた；１０ｃｍ培養皿一枚あたり６×１０６細胞をプレートした。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１１６６８０１９）を製造者の指示に従って使用し、トランスフェクションを実施した。１０ｃｍ皿１枚あたり５マイクログラムのプラスミドＤＮＡを使用した。細胞を、１０％「超低ＩｇＧ」ウシ胎仔血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６２５００７８）を補ったＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１９６６０２１）中、３７℃にて５％ＣＯ２で、水飽和雰囲気下で培養した。馴化培地をトランスフェクションの７２時間および１４４時間後に集め、プールし、滅菌ろ過した。
【０４７３】
ＰＢＳで平衡化した１００μｌのプロテインＡビーズ（ｒプロテインＡセファロース４ファストフロー、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１７−１２７９−０１）を細胞培養上清に加え、これらを４℃にて一晩、例えば５０ｍｌチューブ中で回転させた。ビーズを遠心分離で集め、９６ウェルろ過プレート（ＵＮＩ−ＦＩＬＴＥＲ  ８００ＧＦ／Ｂ、Ｗｈａｔｍａｎ、カタログ番号７７００−２８０３）に移し、真空マニホールド（Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ、カタログ番号７６０６８１）を使用してＰＢＳで徹底的に洗浄した。抗体の溶出を、ビーズを４００μｌの１２．５ｍＭのクエン酸に再懸濁することにより達成した。３０〜６０秒のインキュベーション後、真空マニホールドを使用して、ビーズ溶出液を９６ウエルコレクションプレート（ＵＮＩＰＬＡＴＥ７５０、Ｗｈａｔｍａｎ、カタログ番号７７０１−５７５０）のウェルに集めた。コレクションプレートの各ウェルは、６０μｌの１Ｍ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）緩衝液を含み、溶出分画を即座に中和した。溶出工程を抗体回収を最大化するために二回実施した。次いで、溶出サンプルを、透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｓｅｒ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅｓ、ＭＷＣＯ１０，０００、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号６６３８０）を使用して、ＰＢＳに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌ溶液が１．３５の吸光度を有すると想定して、タンパク質濃度を２８０ｎｍでの吸収から決定した。調製物の品質を、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【０４７４】
Ｔｉｅ１抗体を、ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ―ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ２１３３１）を使用してビオチニル化した。Ｔｉｅ−１／ＦｃおよびＴｉｅ−１−Ｈｉｓについては、反応を２時間、氷上で、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中、５倍モル過剰のビオチニル化剤の存在下で実施した。抗体については、反応を２時間、氷上でＰＢＳ中、１５倍モル過剰のＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチンの存在下で実施した。この反応を、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５（５０ｍＭの最終濃度）の添加により停止し、続いて氷上で１時間インキュベートした。次いで、サンプルをＰＢＳに対して透析した。
【０４７５】
種々の正常および腫瘍組織切片を、ビオチニル化抗体で染色した。マウスモノクローナル抗体抗Ｔｉｅ１抗体（７ｅ８）（Ａｌｉｔａｌｏ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｈｅｌｓｉｎｋｉ）をポジティブコントロールとして使用した。一次抗体なしの切片を、ネガティブコントロールとした。すべてのサンプルは新鮮な凍結組織であり、染色をＴＳＡキット（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて実施した。アセトン固定（１０〜２０分、−２０℃）後、スライドを０．７３％Ｈ２Ｏ２で１０分間処理して、内因性ペルオキシダーゼ活性を減少させ、続いてＴＮＢ緩衝液で３０分間ブロックした。切片（５〜１０ｍｍ厚）を、一次抗体（１０μｇ／ｍｌ）とともに、４℃にて一晩、インキュベートした。マウスモノクローナル抗ｔｉｅ１抗体（７ｅ８）を有する切片を、ストレプトアビジン−ＨＲＰを加える前にビオチニル化抗マウス抗体（ＶｅｃｔａＳｔａｉｎ）で処理した。シグナルを、ＴＳＡキットを使用して増幅し、ＡＥＣ（２３５ｍｌ  ＮａＡｃ、１５ｍｌ  ＡＥＣ（保存溶液：１６００ｍｇの３−アミノ−９−エチル−カルバゾールおよび４８０ｍｌのＮ−ジメチルホルムアミド）、２５０μｌのＨ２Ｏ２）により可視化した。
【０４７６】
一般に、Ｔｉｅ−１発現は、調和する正常な組織を比較した場合、腫瘍組織中で上方調節された。しかし、腫瘍組織において、抗Ｔｉｅ１抗体は脈管に加えて他の構造物を染色した。さらに、あるエピトープの発現で若干の組織特異性が観察された。例えば、Ｅ３抗体は肺および腎臓中の脈管を染色したが皮膚では染色せず、一方、Ｂ２抗体は胸よりも他の正常な組織で血管を非常に弱く染色した。Ｔｉｅ−１の外部ドメインの腫瘍組織への放出は、観察された違いを説明し得る。
【０４７７】
皮膚組織において、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体は、血管を非常に弱く染色したが、ネズミ７ｅ８コントロール抗体は正常な皮膚で明瞭な染色を与えた。メラノーマ組織において、７ｅ８抗体は脈管のみを染色したが、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体も他の周囲構造物を染色した。染色パターンは、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体３抗体すべてについて類似していた。
【０４７８】
肺組織において、本発明者らは、Ｅ３抗体が肺の大静脈を特に明瞭に染色することを観察したが、Ｄ１１および７ｅ８はわずかな染色を与えた。Ｂ２はこれらの同じ静脈を染色しなかった。Ｔｉｅ−１の発現は、肺癌腫を劇的に上方調節し、すべての抗体は、正常な肺からのサンプルよりも肺癌腫を有するサンプル中でより強く脈管を染色した。肺腫瘍において、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体は、脈管以外の構造物を染色した。
【０４７９】
腎臓において、Ｅ３およびＤ１１抗体は脈管に加えて腎臓細管を染色した。Ｂ２は細管または脈管の非常に弱い染色のみを与えたが、７ｅ８は血管のみを染色した。副腎腫組織において、Ｅ３抗体のみが明瞭な染色を与えた。
【０４８０】
胸において、Ｅ３は乳腺組織の静脈および毛細管で最も明るい染色を与え、Ｂ２および７ｅ８は類似の染色を与えたが、Ｄ１１はこれらの構造をかなり弱く染色した。乳癌腫において、Ｔｉｅ−１発現は実質的に上方調節され、Ｅ３、Ｂ２およびＤ１１抗体は脈管に加えて他の構造物も染色した。
【０４８１】
（実施例６：フローサイトメトリーを使用した抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧのマウス内皮細胞系への結合）
本発明者らは、Ｅ３がマウスＴｉｅ１とｉｎ  ｓｉｔｕで交差反応するかどうかを評価し、よって、本発明者らがマウス腫瘍異種移植模型におけるＥ３活性を評価し得る場合は、マウス内皮細胞への結合を検査し、ヒト細胞系およびトランスフェクトした細胞系と比較した。
【０４８２】
Ｔｉｅ−１抗体およびコントロールＭａｂのマウス内皮細胞への特異的な結合を、フローサイトメトリー分析（ＦＡＣＳｓｃａｎ，Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，Ｅｐｉｃｓ，Ｃｏｕｌｔｅｒ）により測定した。マウス内皮細胞系であるＭＳ１、Ｌｅ−２、Ｂｅｎｄ３、ＳＶＥＣ（ＡＴＣＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）およびＴｉｅ−１をトランスフェクトしたＬｅ−２細胞を染色した。細胞染色は既存のプロトコルから改良された。約２００，０００細胞を各実験に使用した：トリプシン処理後、細胞をＰＢＳ中で一回洗浄し、ＰＢＳ、１０％熱不活化ヒト血清（インキュベーション緩衝液）に再懸濁した。特異性を検査するために、抗体を異なる希釈で室温にて１時間インキュベートした。細胞を遠心分離により３分間６１１ｇで遠沈させた。インキュベーションとインキュベーションの間に細胞をＰＢＳで二回洗浄した。次いで、関連するビオチニル化抗体（ストレプトアビジンに対するＡ２、Ｔｉｅ−１に対するＥ３）を加え、室温にて１時間インキュベートした。軽鎖を生殖細胞系列化するＥ３  ＤＸ−２２１０抗体を、これらの調査に使用した。この後に、インキュベーション緩衝液中で、室温にて１時間、ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ，Ｄｅｎｍａｒｋ）とともにインキュベートした。最終インキュベーション工程後、結合抗体を、ＦＡＣＳＣａｎおよびＥｐｉｃｓ  Ａｌｔｒａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，Ｃｏｕｌｔｅｒ）によるフローサイトメトリーを用いることにより検出し、結果を分析した。
【０４８３】
インキュベーション中０．１％の最終濃度でインキュベーション緩衝液にサポニンを加える以外は、細胞内Ｔｉｅ−１を上記のように測定した。抗Ｔｉｅ−１抗体Ｅ３は、ｉｎ  ｓｉｔｕでＥ３のマウスおよびヒトＴｉｅ１との交差反応性を示すマウス内皮細胞系に結合する。フローサイトメトリーによって検出されるマウス細胞系中の結合パターンは、マウス細胞において、主要ヒト内皮細胞系と比較して高い細胞表面染色が存在する点において、ＨＵＶＥＣでの結合パターンとは異なる。ＤＸ−２２１０をマウス内皮細胞系ならびにＨＵＶＥＣコントロール細胞の両方を、明確に染色した。これらの細胞をサポニンで処理した際、蛍光シグナルが変化したが、このことは、隔離されたＴｉｅ１のかなりの細胞内プールを示している。
【０４８４】
（実施例７：フローサイトメトリーを使用するヒト血小板に結合する抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧの決定）
Ｔｉｅ−１に対する精製ポリクローナルヤギ抗血清（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる結合実験は、以前の研究でヒト血小板への結合を示した（Ｔｓｉａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３７：４３７−４２）。この研究からの結論は、血小板が、Ｔｉｅ１の発達の問題を示し得るＴｉｅ−１免疫反応の大きなプールを治療標的として代表するということであった。抗体Ｅ３が血小板に結合するかどうかを決定するために、本発明者らは、活性化および非活性化の両方の血小板に対するフローサイトメトリー分析を実施し、染色パターンを精製抗Ｔｉｅ１ポリクローナル血清と比較した。
【０４８５】
血小板活性化を避けるために、血小板ＧｅｌＳｅｐキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）キットを製造者の指標に従って使用し、健康なドナーの血漿からヒト血小板を単離した。血小板を、トロンビンを０．８Ｕ／ｍｌの最終濃度に加えることにより活性化した。活性化血小板を非活性化血小板から区別するために、二重染色をＴｉｅ−１抗体／コントロール抗体および抗体ＣＤ４２（全血小板）またはＣＤ６２（活性化血小板）を用いて実施した。
【０４８６】
調製後、血小板をＧｅｌＳｅｐキット、１０％熱不活化ヒト血清（インキュベーション緩衝液）の緩衝液２に再懸濁し、１時間インキュベートした。特異性を検査するために、ビオチニル化抗体であるヒト抗Ｔｉｅ１（Ｅ３）、ヒト抗ストレプトアビジン（Ａ２−ＳＶ、Ｔｉｅ１と結合しない抗体）、ヒト抗ＦＩＴＣおよびヤギ抗Ｔｉｅ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）を、１検査あたり５０００００血小板とともに、異なる希釈（２μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ）で一時間、室温でインキュベートした。血小板を遠心分離により１０分間６１１ｇで遠沈させた。インキュベーションとインキュベーションの間に血小板をＧｅｌＳｅｐキットの緩衝液１で二回洗浄した。次いで、抗ＣＤ４２−ＰｅｒｃＰまたは抗ＣＤ６２−ＰｅｒｃＰとともにストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリンを室温にて３０分間、インキュベーション緩衝液中でインキュベートした。最後のインキュベーションおよび洗浄後に、結合タンパク質の検出をＦＡＣＳｓｃａｎおよびＥｐｉｃｓ  Ａｌｔｒａ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｏｘｎａｒｄ，Ｃｏｕｌｔｅｒ）によるフローサイトメトリーを用いて実施し、結果を分析した。細胞は、非活性化血小板を用いた場合、全血小板についてＳＳＣおよび抗ＣＤ４２−ＰｅｒｃＰ上でゲート（ｇａｔｅ）され、活性化血小板についてＳＳＣおよび抗ＣＤ６２−ＰｅｒｃＰ上でゲートされた。
【０４８７】
ポリクローナルヤギ抗Ｔｉｅ−１抗体は、検査された条件下に血小板に実際に結合する。この結合は、血小板が活性化されている場合は少ない。コントロール的に、ヒト抗Ｔｉｅ１抗体Ｅ３は、全血小板に対しても、活性化血小板に対しても有意な結合を示さない（図１）。
【０４８８】
（実施例１０：抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧによる免疫沈降を使用したヒト血小板におけるＴｉｅ１免疫反応性の評価）
Ｔｉｅ−１に対する精製ポリクローナルヤギ抗血清（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いる以前の研究は、ヒト血小板への結合を示した（Ｔｓｉａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）。この研究からの結論は、血小板が、Ｔｉｅ１の発達の問題を示し得るＴｉｅ−１免疫反応性の大きなプールを治療標的として代表するということであった。抗体Ｅ３が血小板に結合する可能性を排除するために、血小板およびＨＵＶＥＣから調製された溶解物の免疫沈降を実施した。活性化と不活性化の両方の血小板を調査した。
【０４８９】
抗Ｔｉｅ−１抗体であるＢ２、Ｄ１１、Ｅ３、ヤギポリクローナル抗体ＡＦ６１９（Ｒ＆Ｄ）およびネガティブコントロール抗体抗ＦＩＴＣおよび抗ストレプトアビジンを使用した。ＨＵＶＥＣをトリプシン処理により培養皿から回収し、血小板を血小板ＧｅｌＳｅｐキット（Ｂｉｏｃｙｔｅｘ，Ｍａｒｓｅｉｌｌｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を製造者の指針に従って用い、調製した。一回の免疫沈降実験につき、３〜５×１０６および３×１０８細胞血小板を、検査された各抗体のために使用した。血小板および細胞をＰＢＳで洗浄し、１４００ｒｐｍで４分間遠沈させ、上清を除去した。次いで、細胞を、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％デオキシコール酸（ＤＯＣ）および０．５％ＮＰ−４０を含む１ｍｌ細胞溶解緩衝液中で５分間、溶解させた。溶解した細胞を１０分間、１４，０００ｒｐｍで遠沈させ、５μｇ／ｍｌ抗体を上清に加え、ローテータ上で４℃にてインキュベートした。１００μｌ／サンプルプロテインＡビーズ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を細胞溶解緩衝液で３回洗浄し（遠心速度：１５秒、２０００ｒｐｍ）、次いで抗体とともにインキュベートした細胞溶解物を、４℃にて３０分間加えた。次いで、ビーズを、５０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、０．５％ＤＯＣ、０．５％ＮＰ−４０を含む洗浄緩衝液で３回洗浄した。最後に、ビーズを遠沈させ、ペレットをサンプル緩衝液に等量で再懸濁させて、ＳＤＳ−ｐａｇｅおよびウェスタンブロッティングを実施した。ウェスタンブロッティングにおいて、Ｔｉｅ−１をポリクローナルヤギ抗Ｔｉｅ−１抗体で検出した。この研究の結論は、Ｅ３は、ＨＵＶＥＣにおいてＴｉｅ−１を免疫沈降し得るが、血小板においては免疫沈降し得ないということである。
【０４９０】
（実施例８：抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧによる染色によって決定されたＨＵＶＥＣ細胞中のＴｉｅ１の分布）
本発明者らは、ＨＵＶＥＣ中のＥ３の染色パターンを、共焦点顕微鏡を使用して分析した。ＨＵＶＥＣをトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、６００００細胞の密度でゼラチン被覆顕微鏡スライド上にスポットし、２４時間加湿インキュベーターで３７℃にてインキュベートした。細胞を風乾し、４％パラホルムアルデヒドで室温にて２０分間固定した。スライドを、ＰＢＳで洗浄した。これらのスライドを、１０％熱不活化ヒト血清（インキュベーション緩衝液）とともにインキュベートした。
【０４９１】
Ｔｉｅ−１への特異的な結合を測定するために、ビオチニル化抗体Ｅ３およびビオチニル化ネガティブコントロール抗体Ａ２を、１０μｇ／ｍｌの濃度で使用し、室温にて一時間インキュベートした。スライドを、ＰＢＳで二回洗浄した。次いで、ストレプトアビジン−Ｒ−フィコエリトリン（Ｄａｋｏ，Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）を加え、室温にて一時間インキュベートした。最後のインキュベーションおよび洗浄後、結合抗体の検出を、共焦点顕微鏡を用いて実施した。
【０４９２】
Ｅ３は、共焦点顕微鏡により検出されたように特異的にＨＵＶＥＣに結合する。染色は主に細胞内に位置し、細胞表面局在Ｔｉｅ１の小さいプールと比べてＴｉｅ１の大きな細胞内プールを示唆する。このＥ３の所在は、細胞骨格タンパク質とＴｉｅ１との共存と一致した。
【０４９３】
（実施例９：抗Ｔｉｅ１  Ｅ３のフレームワーク領域に置かれた体細胞変異の生殖細胞系列残基への変換）
ヒトにおけるＥ３の潜在的な免疫原性を減少させるために、ＬＣフレームワーク領域中のすべての非生殖細胞系列アミノ酸残基を訂正して生殖細胞系列に戻した。Ｅ３のＬＣを、すべてのκおよびλ軽鎖生殖細胞系列遺伝子を含むデータベースで調製した最初の分析を実施した。このＥ３のＬＣは、ＤＰＫ４に最も近い相同性を有することが示され、生殖細胞系列フレームワーク領域に対してＥ３中に三つの置換が同定された。
【０４９４】
本発明者らは、ＤＰＫ４生殖細胞系列フレームワーク領域と同一の配列を含むようにＬＣフレームワーク領域を改変したＥ３の生殖細胞系列の変種を構築した。生殖細胞系列Ｅ３抗体は、所望の配列をコードする核酸を設計することにより構築した。Ｅ３  ＬＣ変異ドメインをコードする核酸に対する変更は、ＰＣＲおよび他の標準的な分子生物学的技術により行い、核酸配列決定により確かめた。
【０４９５】
例示的な生殖細胞系列化軽鎖可変ドメインＥ３配列は以下のとおりである：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＧＨＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＶＰＫＬＬＩＹＴＡＳＴＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＦＮＳＹＰＨＴＦＧＱＧＴＲＬＥＩＫ（配列番号１５９）。変更位置に下線が付けてある。
【０４９６】
本発明者らは、Ｅ３抗体の生殖細胞系列化変種を可溶性ＦａｂおよびＩｇＧの両方として生成した。ポジティブｓＦＡＢを発現するクローンのＦａｂカセットを、オリゴヌクレオチドでＰＣＲ増幅し、ヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域を含む哺乳動物の発現ベクター中に連結し、ＸＬ１  Ｂｌｕｅ  ＭＲＦ’細胞中にエレクトロポレートした。原核リボソーム結合配列および遺伝子の３リーダー配列を哺乳動物の内部リボソーム入口および重鎖リーダー配列によって置換した。再フォーマットした抗体クローンを配列決定してクローニング操作後に正確性を確かめた。無エンドトキシンＤＮＡを調製し、一時的トランスフェクションの研究に用いた。
【０４９７】
（実施例１０：ＥＬＩＳＡにおける組換えＴｉｅ１−Ｆｃへの結合のための生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−Ｆａｂの生成および検査）
Ｅ３フレームワークの任意の体細胞変異の生殖細胞系列残基への変換が、結合活性になんらかの効果を有するかどうかを評価するために、可溶性Ｆａｂを生成した。親Ｅ３  Ｆａｂを含む可溶性発現ベクターおよび生殖細胞系列化Ｅ３  Ｆａｂ構築物を、１００μｇ／ｍｌアンピシリンおよび２％グルコースを含む２×ＴＹブロスで３０℃にて一晩生育し、この一晩の培養物の４ｍｌを使用して、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンおよび０．１％のグルコースを含む４００ｍｌの２×ＴＹブロスに接種した。細胞を３７℃で０．８〜１．０のＯＤ６００まで生育し、１ｍＭのＩＰＴＧを加え、培養物を３０℃で４時間維持した。培養物を４，０００ｒｐｍで４℃にて１５分間遠沈させた。上清を捨て、ペレットを、プロテアーゼ阻害物質（プロテアーゼ阻害物質反応混液錠剤［Ｒｏｃｈｅ］：１錠剤を１ｍｌの水に溶解し、ＴＥＳ緩衝液で５０倍に希釈する）を含む４．８ｍｌの氷冷ＴＥＳ緩衝液（０．２Ｍトリス塩酸、０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍスクロース、ｐＨ８．０）に再懸濁させた。５０ｍｌのＦａｌｃｏｎチューブに移し、氷上に５〜１０分間置く。このインキュベーション中、遠心ボトルを、プロテアーゼ阻害物質を含む５．２５ｍｌのＴＥＳ：Ｈ２Ｏ（１：３）で洗浄し、これを細胞に加える。２０分間以上氷上でインキュベートする。３０００ｇで４℃にて１５分間回転させ、上清を新しい遠心チューブに移す。細胞ペレットを、１５ｍＭのＭｇＳＯ４およびプロテアーゼ阻害物質を含む６ｍｌのＴＥＳに再懸濁し、氷上で１５分間インキュベートする。３０００ｇで１５分間、４℃にて遠心する。上清を遠心チューブに移し、８０００ｇで４℃にて２０分間回転させる。上清を集め、ＰＢＳに対して透析する。Ｆａｂを金属キレートクロマトグラフィーにより精製した。透析したペリプラズム抽出物を１ｍｌのＴＡＬＯＮ（商標）金属アフィニティー樹脂（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とともにインキュベートし、室温にて２時間回転させる。ビーズを空の重力カラム（Ｐｏｌｙ−Ｐｒｅｐクロマトグラフィーカラム、Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カタログ７３１−１５５０）に移す。ビーズをＰＢＳ中の５ｍＭイミダゾールで洗浄し、ＦａｂをＰＢＳ中の１５０ｍＭイミダゾールにより溶出する。透析カセット（ＳＬＩＤＥ−Ａ−ＬＹＳＥＲ（商標）透析カセット、ＭＷＣＯ  １０，０００、Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号６６３８０）を使用してＰＢＳに対して透析し、１ｍｇ／ｍｌ溶液が０．８６の吸光度を有するとみなして２８０ｎｍでの吸光度からタンパク質濃度を決定する。調製物の品質を、還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析し得る。
【０４９８】
０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５）１００マイクロリットルあたり、５００ｎｇまたは５０ｎｇの精製組換えヒトＴｉｅ１−Ｆｃ標的抗原でＩＭＭＵＬＯＮ（商標）２ＨＢプレートのウェルを一晩被覆した。親のＥ３、Ｅ３生殖細胞系列（Ｅ３ｇ）またはネガティブコントロール可溶性Ｆａｂを、ＰＢＳＴの１００マイクロリットルあたり５マイクログラムかまたは１マイクログラムでウェルに充填した。組換えヒトＴｉｅ１−Ｆｃ標的抗原を、適切な量の酢酸に溶解し、次に０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム緩衝液（ｐＨ９．６）中に１００マイクロリットルあたり５００ｎｇおよび５０ｎｇの最終濃度に希釈する。標的抗原をウェルに加えた後、マイクロタイタープレートを一晩４℃でインキュベートする。次に、このプレートをＰＢＳＴで５回洗浄し、３７℃で２時間、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックする。このプレートを再び洗浄緩衝液でプレート回洗浄し、ＰＢＳＴおよびＰＢＳＴ１００マイクロリットルあたり５または１マイクログラムの精製Ｆａｂの１ウェルあたり１００マイクロリットルを加えた後、室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで７回洗浄した後、ＰＢＳＴ中の抗ｓＦａｂ−ＨＲＰの１００マイクロリットルの１：５０００希釈物を加えた（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔ＃３１４１４）。ウェルを７回洗浄した後、１００マイクロリットルのＴＭＢ−Ｈ２Ｏ２溶液を各ウェルに加え、プレートをＥＬＩＳＡで６３０ｎｍにて読んだ。Ｅ３および生殖細胞系列化Ｅ３の両方が、このアッセイで組換えヒトＴｉｅ−１−Ｆｃ標的抗原に結合した。
【０４９９】
（実施例１１：ＢＩＡコアにおける組換えヒトＴｉｅ１への結合のための生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−Ｆａｂの生産および検査）
組換え精製ヒトＴｉｅ１   −Ｆｃ抗原（原液  ２．４５ｍｇ／ｍｌ）を、ＥＺ−リンクスルホ−ＮＨＳ−ＳＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，カタログ２１３３１）を使用してビオチニル化した。この反応を、２時間、氷上で、５０ｍＭ炭酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ９．６中で、５倍モル過剰のビオチニル化剤の存在下で実施し、トリスＨＣｌ、ｐＨ７．５（５０ｍＭ最終濃度）を加えて停止し、続いて氷上で１時間インキュベートした。次いで、サンプルをＰＢＳに対して透析した。次いで、抗原をＨＢＳ中で１／１００倍に希釈し、次いで、ストレプトアビジンチップ上に捕捉した。これを８３０ＲＵ（共鳴単位）の密度に被覆した。すべての分析を、ＨＢＳ緩衝液中で実施した。親Ｆａｂ  Ｅ３および生殖細胞系列化Ｅ３  Ｆａｂを上記のように調製した。０．５８７ｍｇ／ｍｌ（１１７４０ｎＭ）の原液をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／５８７に希釈して、２０ｎＭの原液を得て、生殖細胞系列化Ｆａｂ  Ｅ３  ０．０２５ｍｇ／ｍｌ（５００ｎＭ）をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／２５に希釈して２０ｎＭの原液を得た。連続的な希釈物を各Ｆａｂ調製物から作製し、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭおよび１．２５ｎＭ溶液を得た。会合フェーズとして、サンプルを３０μｌ／分で４分間、注入（ｋｉｎｊｅｃｔ）プログラムを使用して注入した。１０分間の解離フェーズが続き、いずれの残っているサンプルも、１８秒間の５ｍＭ  ＮａＯＨ＋１Ｍ  ＮａＣｌの一回の注入によりＴｉｅ−１  Ｆｃ表面から５０μｌ／分の流速で取り除いた。すべてのサンプルについて実施し、２部１式（ｉｎ  ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）で分析した。
【０５００】
センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを使用して分析した。分析から、Ｅ３抗体の生殖細胞系列化は抗体の結合活性に対して最少の効果を有したことがわかる。
【０５０１】
【表２】
2008532476.tif 000016
。
【０５０２】
（実施例１２：ＢＩＡコアを使用した組換えヒトＴｉｅ１への結合についての生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧと親抗Ｔｉｅ１  Ｅ３との親和性比較）
結合挙動が、体細胞変異の生殖細胞系列残基へ変換して戻すことにより影響を受けるかどうかを評価するために、生殖細胞系列化抗体を生成し、ＩｇＧとして検査した。生殖細胞系列化Ｅ３−ＩｇＧ構築物を使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に一時的にトランスフェクトし、この構築物を精製した。
【０５０３】
生殖細胞系列化Ｅ３  ＩｇＧ１原液０．６３ｍｇ／ｍｌをｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈し、親Ｅ３  ＩｇＧ１原液０．５６ｍｇ／ｍｌ（２１４３−００１）をｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈した。ＩｇＧを直接的にＣＭ５チップに被覆した。チップの表面を０．０５Ｍ  ＮＨＳ／０．２Ｍ  ＥＤＣの７分間のパルスで活性化させ、７８０ＲＵ生殖細胞系列化Ｅ３−ＩｇＧおよび７２８非生殖細胞系列Ｅ３  ＩｇＧが表面に被覆されるまでＩｇＧを流した。すべてのフロー細胞を、続いて１Ｍ塩酸エタノールアミン、ｐＨ８．５の７分間のパルスで脱活性化した。すべての分析をＨＢＳ緩衝液中で実施した。精製組換えヒトＴｉｅ１  ＦｃをＨＢＳで１／２８．７に希釈して、４００ｎＭの原液を得た。連続的な希釈物を作製して、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭおよび２５ｎＭのＴｉｅ１  Ｆｃ原液を得た。会合フェーズの分析ために、サンプルは３０μｌ／分で８．３分間、注入（ｋｉｎｊｅｃｔ）プログラムを使用して注入した。この後に４０分間の解離フェーズが続いた。表面に会合して残っている任意の抗原を、３０秒間の１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の二回の注入によりＩｇＧ表面から５０μｌ／分の流速で剥ぎ取った。すべてのサンプルについて実施し、２部１式で分析した。
【０５０４】
センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを使用して分析した。生殖細胞系列化はヒトＴｉｅ１
Ｆｃに関してＥ３  ＩｇＧの結合活性に対して最少の影響力を有した。
【０５０５】
【表３】
2008532476.tif 000017
。
【０５０６】
（実施例１３：ＢＩＡコア中の組換えマウスＴｉｅ１への結合のための生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−Ｆａｂの生産および試験）
マウスＴｉｅ１−Ｆｃ抗原（０．５ｍｇ／ｍｌ原液）を、確立された手順を使用してビオチニル化し、ＨＢＳで１／１００倍に希釈後、これをストレプトアビジンチップへの捕捉に使用した。これを７４０ＲＵの共鳴値に被覆した。すべての分析をＨＢＳ緩衝液中で実施した。親Ｆａｂ  Ｅ３  ０．５８７ｍｇ／ｍｌ（１１７４０ｎＭ）をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／５８７に希釈し、２０ｎＭの原液を得、生殖細胞系列化Ｆａｂ  Ｅ３  ０．０２５ｍｇ／ｍｌ（５００ｎＭ）をＨＢＳ＋ＢＳＡ中で１／２５に希釈して２０ｎＭの原液を得た。連続的な希釈物を各Ｆａｂ調製物から作製し、１０ｎＭ、５ｎＭ、２．５ｎＭおよび１．２５ｎＭを得た。会合フェーズのために、サンプルは３０μｌ／分で４分間、注入（ｋｉｎｊｅｃｔ）プログラムを用いて注入した。この後に１０分間の解離フェーズが続き、いずれの残っているサンプルも、１８秒間の５０ｍＭ  ＮａＯＨ＋１Ｍ  ＮａＣｌの一回の注入によりＴｉｅ１  Ｆｃ表面から５０μｌ／分の流速で剥ぎ取った。すべてのサンプルについて実施し、２部１式で分析した。
【０５０７】
センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを使用して分析した。Ｅ３抗体の生殖細胞系列化は、抗体の結合活性に対して最少の効果を有した。
【０５０８】
【表４】
2008532476.tif 000018
。
【０５０９】
（実施例１４：ＢＩＡコアを使用した組換えマウスＴｉｅ１への結合に対する生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１  Ｅ３−ＩｇＧと親抗Ｔｉｅ１  Ｅ３との親和性比較）
結合挙動が、体細胞変異の生殖細胞系列へ変換して戻ることにより影響を受けるかどうかを評価するために、生殖細胞系列化抗体を生成し、ＩｇＧとして検査した。生殖細胞系列化Ｅ３を記載されるようにＩｇＧに再フォーマットした。次いで、これを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞に確立された手順を使用して一時的にトランスフェクトした。ＩｇＧを、確立された手順を使用するプロテインＡカラムクロマトグラフィーを使用して培養上清から精製し、次いで、得られたＩｇＧを、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡコア）を使用して結合活性について検査した。生殖細胞系列化Ｅ３  ＩｇＧ１原液０．６３ｍｇ／ｍｌ（２１４６−００２）を、ｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈し、親Ｅ３  ＩｇＧ１原液０．５６ｍｇ／ｍｌ（２１４３−００１）を、ｐＨ４．５の緩衝液で１／５０に希釈した。ＩｇＧを直接的にＣＭ５チップに被覆した。チップの表面を、０．０５Ｍ  ＮＨＳ／０．２Ｍ  ＥＤＣの７分間のパルスで活性化し、７８０ＲＵ生殖細胞系列Ｅ３−ＩｇＧおよび７２８非生殖細胞系列化Ｅ３  ＩｇＧが表面を被覆されるまでＩｇＧを流した。すべての流れる細胞を、次に１Ｍ  塩酸エタノールアミン、ｐＨ８．５の７分間のパルスで脱活性化した。すべての分析を、ＨＢＳ緩衝液中で実施した。精製した組換えマウスＴｉｅ１  ＦｃをＨＢＳで１／６．５に希釈して、４００ｎＭの原液を得た。連続的な希釈物を作製し、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭおよび２５ｎＭのＴｉｅ１  Ｆｃ原液を得た。会合フェーズの分析ために、サンプルを３０μｌ／分で８．３分間、注入（ｋｉｎｊｅｃｔ）プログラムを使用して注入した。この後に４０分間の解離フェーズが続いた。表面に会合して残っているいずれの抗原も、３０秒間の１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の二回の注入によりＩｇＧ表面から５０μｌ／分の流速で除去した。すべてのサンプルについて実施し、２部１式で分析した。
【０５１０】
センサーグラムを、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（商標）ソフトウエア３．１で１：１モデルを用いる同時ｋａ／ｋｄ適合プログラムを使用して分析した。生殖細胞系列化プロセスは、マウスＴｉｅ１  Ｆｃに関するＥ３  ＩｇＧの結合活性に対し、最少の影響力を有した。
【０５１１】
【表５】
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。
【０５１２】
（実施例１５：ＨＵＶＥＣを用いる管形成アッセイにおける生殖細胞系列抗Ｔｉｅ１−Ｅ３および親抗Ｔｉｅ１−Ｅ３のＩＣ５０の比較）
生殖細胞系列化Ｅ３（ＤＸ−２２２０）とその親抗体（ＤＸ−２２００）を、コラーゲンタイプＩマトリックス中の管形成アッセイで評価した。ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（新しく単離したもの）を、ヒト臍帯静脈をトリプシン−ＥＤＴＡ（１×）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃にて２０〜２５分間、処理することにより得た。次いで細胞を、接着因子（ＡＦ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）で被覆したＴ−２５フラスコ中、１０％ＦＣＳ、０．４％ＢＢＥ、１％  １−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補ったＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。一次培養物を温かいトリプシン−ＥＤＴＡで分離し、二代または三代の継代でコンフルエントになったときに使用した。培養中これら細胞を１：２の分離比率で、単層の約６０〜８０％のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。ＨＵＶＥＣ単層を、トリプシン／ＥＤＴＡ（５００μｌ／皿）で３７℃にて３分間処理した。トリプシン活性を、３体積分の完全ＲＰＭＩ培地を加えることにより停止した。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰り返すことにより分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。ＨＵＶＥＣ（継代２）を、７．５体積分の２ｍｇ／ｍｌコラーゲン（コラーゲンＲ；Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１体積分の１０×ＭＥＭ、１．５体積分のＮａＨＣＯ３（１５．６ｍｇ／ｍｌ）を混合することにより調製されたコラーゲンゲル（１．５ｍｇ／ｍｌのコラーゲンＩ  ５０μｌ）上のそれらの培養培地（９６−ウエルプレートの４０×１０３／５０μｌ／ウェル）にまき、約１体積分のＮａＯＨによりｐＨを７．４に調節した。次いで、１時間３０分後、培養培地を捨て、細胞をコラーゲンの新しい層（１．５ｍｇ／ｍｌ、新しい調製物、５０μｌ／ウェル）で被覆した。ゲルの重合後、培養培地を、Ｅ３抗体（ＤＸ−２２００）または生殖細胞系列化Ｅ３抗体（ＤＸ−２２２０）（０．１ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下または不存在下に各ウェルに加えた。培養表面上の管ネットワークの全長を、ＭＥＴＡＶＵＥ（商標）ソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により×４０倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を視野±ＳＥＭ（相対単位）あたりの平均脈管面積として表した。各アッセイを少なくとも３回実施した。その結論は、３体細胞変異のＥ３中の生殖細胞系列アミノ酸への変換はＥ３の効力にほとんど効果を有さなかったということである。親Ｅ３（図２Ａおよび図２Ｂ）および生殖細胞系列Ｅ３（図２Ｃおよび図２Ｄ）の両方は、１０ｎｇ／ｍｌ未満、すなわち６６ｐＭのＩＣ５０を有してインビトロで管形成を阻害する。
【０５１３】
予備研究は、ＤＸ−２２４０  Ｆａｂの一価のＦａｂバージョンがＨＵＶＥＣにおける管形成を阻害し得ないことを示した。したがって、このアッセイにおいて、細胞ベースのアッセイでの効果を誘発するために二価性が必要である。
【０５１４】
（実施例１６：マウス内皮細胞を用いた管形成アッセイにおける生殖細胞系列化抗Ｔｉｅ１−Ｅ３の分析）
マウスＴｉｅ１交差反応性およびマウスＴｉｅ１に対する生物活性を評価するために、Ｅ３および生殖細胞系列化Ｅ３の両方を、マウス内皮細胞系（ＬＥＩＩ）を使用してインビトロでの管形成を阻害する能力について評価した。
【０５１５】
ＬＥＩＩ肺マウス内皮細胞系（ＡＴＣＣ）を、Ｔ−２５フラスコで、１０％ＦＣＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシンで補ったＧＬＵＴＡＭＡＸ（商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｔｄ．，Ｐａｉｓｌｅｙ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）を有するＭＥＭ培地中で培養した。培養中、細胞を１：５の分離比率で、単層の約８０％のおおよその密度で培養することにより増殖状態で維持した。ＬＥＩＩ単層を、トリプシン／ＥＤＴＡ（５００μｌ／皿）で３７℃にて３分間処理した。トリプシン活性は３体積分の完全ＭＥＭ培地を加えることにより停止した。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを繰り返すことにより分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。ＬＥＩＩ細胞を、基底膜（ＢＩＯＣＯＡＴ（商標）  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上のそれらの培養培地（９６ウエルプレートの２０〜４０×１０３／５０μｌ）にまいた。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（３７℃にて３０分間、５％ＣＯ２環境）の重合後、所望の分子（４．１０５細胞／ｍｌ；５０μｌ／ウエル）の存在下に完全培養培地に再懸濁させた内皮細胞懸濁液を各ウェルに加えた。次いで、血管形成アッセイプレートを３７℃にて１６〜１８時間、５％ＣＯ２雰囲気でインキュベートした。次いで、管ネットワークの全長を、ＭＥＴＡＶＵＥ（商標）ソフトウエア（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）により×４０倍で定量した。トリプリケートウエルからの結果を、視野±ＳＥＭ（相対単位）あたりの平均脈管面積として表した。各アッセイを少なくとも２回実施した。生殖細胞系列化Ｅ３はマウス内皮細胞における管形成の強力な阻害物質である。
【０５１６】
（実施例１７：抗Ｔｉｅ１−Ｅ３ＩｇＧを使用したマウス腫瘍組織切片の免疫組織学的分析）
本発明者らは、抗体Ｅ３がマウス異種移植片（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）におけるマウス内皮細胞に結合するかどうかを決定した。免疫組織化学は、ビオチニル化Ｅ３  ＩｇＧ１（ａ，ｚアロタイプ）抗体およびコントロール抗体である抗ＣＤ３１（内皮細胞特異的マーカー）および抗ＰＣＮＡ（増殖細胞核抗原）を用いて実施した。ＳＷ４８０細胞（ＡＴＣＣ）を含むマウス異種移植片からのホルマリン固定腫瘍組織を、ヒト抗Ｔｉｅ１抗体Ｅ３の結合パターンについて検査した。パラフィン包埋組織の５μｍ切片を脱パラフィンし、再水和し、温かいクエン酸緩衝液（０．０１Ｍクエン酸ナトリウム、９５℃にてｐＨ６）で４５分間で前処理した。スライドを新しいクエン酸緩衝液で２０分間冷却し、蒸留水ですすいだ。スライドを過酸化水素処理し（ＰＢＳ中０．３％Ｈ２Ｏ２）、５％ＦＣＳ、５％熱不活性化ヒト血清（ＨＳ）を含むＰＢＳととともに１時間プレインキュベートした。抗体のインキュベーションとインキュベーションとの間に、スライドを３回５分間、ＰＢＳで洗浄した。ビオチニル化抗体Ｅ３とＡ２をＰＢＳ、１０％ＨＳで１０μｇ／ｍｌの濃度まで希釈し、１時間室温でインキュベートした。次に、スライドをアビジン−ＨＲＰ（Ｄａｋｏ）とともに３０分間、室温でインキュベートした。染色をＡＥＣ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，  Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ）とＨ２Ｏ２により検出した。ペルオキシダーゼ反応を水を加えて停止し、スライドをヘマトキシリンで向流染色した。組織をそれらの結合反応性について評価した。染色パターンは、マウス内皮細胞Ｔｉｅ１の染色に一致し、Ｅ３によって発現されるＴｉｅ１はまた、マウス異種移植中のＳＷ４８０腫瘍細胞により発現されるＴｉｅ１に結合する。
【０５１７】
（実施例１８：ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグ試験におけるＥ３活性）
Ｅ３ＩｇＧ抗体の生殖細胞系の変異体をＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグにおいてｂＦＧＦにより誘導された新脈管形成に関するインビボ試験において評価した。成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号３５４２３０）にｂＦＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号２３４−ＦＳＥ）を８０ｎｇ／ｍｌ添加した。Ａ２−ＳＶまたはＩｇＧ４Ｅ３抗体（１０μｇ／ｍｌ）またはＰＢＳをＮＭＲＩｎｕ／ｎｕマウスの腹部領域に皮下注射した（マトリゲル１５０μｌ／プラグ）。
【０５１８】
第１の試験においては、ｂＦＧＦおよび可溶性ＶＥＧＦＲ−１（１０μｇ／ｍｌ）を添加したＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をマウス２匹に注射し、新脈管形成阻害剤に関するポジティブコントロールとした。移植後７日においてマウスを麻酔し、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を心臓を介して灌流した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグおよび肝臓の小片を摘出し、パラフィン包埋した。切片を切り出し、ヘマトキシリンエオシン染色した（Ｈ＆Ｅ）。
【０５１９】
染色によればＰＢＳおよびＡ２−ＳＶ抗体投与プラグにおいてＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）の修飾および血管様構造の形成が明らかになった。Ｅ３抗体および可溶性ＶＥＧＦＲ１添加プラグは単細胞を含有していたが、マトリックスの修飾や細胞の組織化の何れもこれ等のプラグには観察されなかった。この結果は生殖細胞系のＥ３抗体がインビボのＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）において新脈管形成を阻害することを示している。
【０５２０】
第２の試験においては、マウスに上記の通り投与し、次に移植後８日に麻酔し、フルオレセインコンジュゲートトマト（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｍｔｕｍ）レクチン（ＰＢＳ２００μｌ中１００μｇ；Ｖｅｃｔｏｒ、カタログ番号ＦＬ−１１７１）を尾静脈内に注射した。５分間循環させた後、ＰＢＳ１０ｍｌ、次いでＰＢＳ中４％ＰＦＡ１０ｍｌで心臓を介して灌流した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグおよび腎臓の小片を摘出し、ＯＣＴ（Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ）中に凍結した。ＤＡＰＩ（Ｖｅｃｔｏｒ）を含有するＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（商標）マウント用培地を用いて切片上で核を可視化し、蛍光顕微鏡下に分析した。
【０５２１】
フルオレセインレクチンによるＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）の染色によれば、ＰＢＳおよびコントロール抗体（Ａ２−ＳＶ）を含有するプラグについては染色ポジティブ物質が判明したが、Ｅ３抗体含有プラグには染色は観察されなかった。コントロールとして同じマウス由来の腎臓および肝臓の血管はフルオレセインレクチンによる明確な染色を示していなかった。
【０５２２】
これ等２つの実験の結果は、抗Ｔｉｅ１抗体Ｅ３がｂＦＧＦ誘導新脈管形成をインビボで阻害できることを示唆している。
【０５２３】
Ｅ３抗体の潜在的な抗新脈管形成活性を更に検討するために、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグにおけるｂＦＧＦ誘導内皮細胞管形成に対するＤＸ−２２１０（生殖細胞系軽鎖のＥ３抗体）の作用を調べる第３の試験を実施した。ＨＵＶＥＣ、ｂＦＧＦおよびＸＤ−２２１０、Ａ２−ＳＶ（ネガティブコントロールＩｇＧ）またはＰＢＳを添加した成長因子低減ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）をＢａｌｂ／ｃｎｕ／ｎｕマウスの腹部領域に皮下注射した（１５０ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）μｌ／プラグ）。移植後８日においてマウスを麻酔し、フルオレセインコンジュゲートトマト（ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｏｎ  ｅｓｃｕｌｅｍｔｕｍ）レクチンを尾静脈内に注射した。５分間循環させた後、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグおよび肝臓と腎臓を摘出し、ＯＣＴ培地中に凍結した。ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）プラグ中の血管の量を定量するために、切片を切り出し、抗ＣＤ３１抗体を用いて内皮細胞含有量に関して染色するか、または、蛍光顕微鏡下に分析することにより機能的血管の量を評価した（トマトレクチン染色）（データ示さず）。更に又、単位面積当たりの血管の量を定量した。これ等の結果はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）試験においてＤＸ−２２１０がｂＦＧＦ誘導新脈管形成を７０％阻害したことを示していた（図３）。
【０５２４】
（実施例１９：複合体形成に対するリガンドの作用の評価）
Ｔｉｅ１、Ｔｉｅ２およびＡｎｇを包含するヘテロマー複合体の形成を阻害することにより、または、ヘテロマー複合体が形成された後にそれを妨害することによりその形成に拮抗する能力について、複合体メンバー、例えばＴｉｅ１、Ｔｉｅ２およびアンジオポエチンに結合する候補タンパク質（例えばＥ３またはＥ３ｂ抗体）を試験する。
【０５２５】
複合体形成を妨害する候補タンパク質の能力を試験するために、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２を発現する細胞に、Ｔｉｅ１および／またはＴｉｅ２へのＡｎｇの結合を可能とするために十分な時間、Ａｎｇを投与する。複合体が破壊されるために十分な時間、細胞を候補タンパク質と接触させる。細胞に膜非透過性交差結合剤、例えばＤＴＳＳＰを投与することによりタンパク質を化学的に交差結合させる。細胞溶解物を調製し、複合体メンバーに特異的な抗体を用いて免疫沈降に付す。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動で分離し、複合体メンバーに特異的な抗体を用いて免疫ブロッティングする。ポジティブコントロールの免疫沈降−免疫ブロッティングもまた実施し、その際、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２を発現する細胞にＡｎｇは投与するが候補タンパク質は投与しないとするか、または、非特異的タンパク質を投与する。候補タンパク質の投与により、ポジティブコントロールと比較して、免疫沈降メンバーと会合している免疫沈降メンバーが結合していない複合体メンバーの量が減少していれば、候補タンパク質は複合体形成の拮抗剤である。
【０５２６】
候補タンパク質が複合体形成を阻害するかどうか調べるために、Ｔｉｅ１およびＴｉｅ２を発現する細胞に候補タンパク質を投与した後にＡｎｇを細胞に投与する以外は、同様の実験を実施する。細胞を候補タンパク質非存在下において複合体形成を可能にする十分な時間インキュベートする。上述した通り、細胞に候補タンパク質を投与しないか、または非特異的タンパク質を投与するポジティブコントロールを実施する。次に投与細胞を溶解し、そして免疫沈降および免疫ブロッティングを上述の通り実施する。
【０５２７】
複合体形成を阻害するか、または複合体を破壊することにより複合体形成に拮抗する候補タンパク質は、次に、本明細書に記載する試験において新脈管形成に対するそれらの作用について試験する。
【０５２８】
（実施例２０：Ｔｉｅ２アミノ酸配列）
例示的なＴｉｅ２アミノ酸配列は、以下のとおりである：
【０５２９】
【数１３】
2008532476.tif 000020
。
【０５３０】
（実施例２１：Ａｎｇ１アミノ酸配列）
例示的なＡｎｇ１アミノ酸配列は、以下のとおりである：
【０５３１】
【数１４】
2008532476.tif 000021
。
【０５３２】
（実施例２２：生殖細胞系の残基への抗Ｔｉｅ１Ｅ３重鎖のフレームワーク３領域に位置する突然変異の変換）
患者への投与の後のＥ３抗体の潜在的免疫原性の危険性を制限するため、フレームワーク領域内の全非生殖細胞系突然変異を生殖細胞系のアミノ酸残基に戻るように補正した。抗Ｔｉｅ１Ｅ０３抗体をＤｙａｘＦａｂ２００ライブラリーから単離した。このライブラリーにおいて、ＨＣフレームワーク領域は独特であり、ＤＰ４７生殖細胞系セグメント（Ｖ３−３２）に相当する。合成ＨＣ−ＣＤＲ１−ＣＤＲ２サブライブラリの構築はオーバーラップするオリゴヌクレオチドの組立とその後の部分的ＰＣＲサイクルを通じて行ったため、突然変異はこれ等の２工程の一方により導入されている可能性がある。従って、Ｅ０３抗体のＨＣをＤＰ４７生殖細胞系遺伝子配列にアラインさせる分析を実施した。フレームワーク領域の３番に位置する１つの非生殖細胞系突然変異が発見され、ここではメチオニン残基がバリン残基により置き換えられていた。
【０５３３】
この突然変異を修復するための方策を設計した。生殖細胞系残基の導入はＣＤＲのフレームワークにフランキングする領域における内部制限部位の存在により容易なものとした。実際、ＦＡＢ３１０ライブラリー内に存在するＨＣ−ＣＤＲ１−ＣＤＲ２サブライブラリの設計は、各ＣＤＲの夾雑化がフレームワークフランキング領域内の独特の制限部位の存在により可能となるような方法で行った。補正すべきバリン残基はＸｂａＩ部位の３’側近傍のＦＲ３領域に位置するため、ＸｂａＩ配列および補正されたメチオニン生殖細胞系残基の両方を含有するプライマーを設計した。変化はＣＨ１領域においてアニーリングする３’リバースプライマー（ＣＪ−リフトＮｈｅＲＥＶ）と組み合わせたＴｏｐＸｂａＩ−Ｍフォワードプライマーを用いたＰＣＲにより導入した。次に約１８０ｂｐのＰＣＲフラグメントを形成した。生殖細胞系ＰＣＲプライマーは以下の通りである：
【０５３４】
【数１５】
2008532476.tif 000022
。
【０５３５】
（実施例２３：生殖細胞系重鎖Ｔｉｅ１Ｅ３のクローニング）
Ｅ３重鎖に導入された生殖細胞系の残基が抗体の生物学的活性に影響するかどうか調べるために、生殖細胞系Ｅ３抗体（「Ｅ３ｂ」またはＤＥ−２２２０と称する）を含有する可溶性Ｆａｂ発現ベクターを構築した。実施例２２のＰＣＲフラグメント一夜５０Ｕ／μｇＸｂａＩ制限酵素で消化した後、５時間２５Ｕ／μｇＢｓｔＥＩＩで消化した。切断されたＰＣＲ産物を次に１％ＴＡＥアガロース分取用ゲル上で精製した。Ｔｉｅ１Ｅ３生殖細胞系軽鎖配列を含有する同様に消化されたファージミド発現ベクター（ｐＭＩＤＩ）のライゲーションを室温で３時間実施した。５ナノグラムの新しくライゲーションした物質をＴＧ１菌体内にエレクトロポレーションにより導入した。突然変異の補正の確認は２０個の無作為に選択した単離体の重鎖の配列決定により行った。得られたコーディングコンストラクトはＦａｂフォーマットにおける生殖細胞系ＨＣおよび生殖細胞系ＬＣ配列をコードしている配列を含有していた。（ＦａｂＥ３ｂと称する）。
【０５３６】
（実施例２４：Ｅ３ｂ（ＤＸ−２２２０）の製造および精製）
Ｅ３ｂＦａｂ抗体をヒトＩｇＧ１に再フォーマットした。次にこのコンストラクトをＨＥＫ２９３Ｔ細胞を一過性にトランスフェクトするために使用した。一過性細胞トランスフェクションのためのプラスミド調製物はＱｉａｇｅｎフィルタープラスミドマキシキット（Ｑｉａｇｅｎ、カタログ番号１２２６３）を用いて得た。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒ  Ｃｏｒｐ．，カタログ番号Ｑ４０１）をトランスフェクション前２４時間播種し；ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（商標）（ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（商標）−１０チャンバー、Ｃｏｒｎｉｎｇ、カタログ番号３２７１）培養容器当たり２２０×１０６個の細胞をプレーティングした。トランスフェクションはＧｅｎｅＪｕｉｃｅ（商標）試薬（ＶＷＲ、カタログ番号ｎｏｖｇ７０９６７−３）を用いながら製造元の説明書に従って実施した。プラスミドＤＮＡ６５０マイクログラムをＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（商標）当たり使用した。細胞は１０％「超低濃度ＩｇＧ」ウシ胎児血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１６２５００７８）を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号３１９６６０２１）中、３７℃、５％ＣＯ２、水分飽和雰囲気下に培養した。トランスフェクション後７２、１４４および２１６時間後にコンディショニングした培地を採取し、プールし、そして濾過滅菌した。
【０５３７】
細胞培養上澄みを０．５ＭＮａＣｌ含有ＰＢＳに対して平衡化させた２５ｍｌのｒプロテインＡＦＦカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−１２７９−０２）にロードした。カラムを０．５ＭＮａＣｌ含有ＰＢＳ、次に０．１Ｍ酢酸ナトリウムｐＨ５．０で洗浄してウシＩｇＧを除去し、抗体を１２．５ｍＭクエン酸で溶出させた。抗体を含有する画分（５ｍｌ）を１５０μｌの１Ｍトリス塩酸ｐＨ９．０を添加することにより中和した。
【０５３８】
Ｅ３ｂ抗体はカチオン交換により更に精製した。抗体を５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐＨ５．０に対して透析し、そして同じ緩衝液で平衡化したＨｉＬｏａｄ２６／１０ＳＰセファロースＨＰカラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号１７−１１３８−０１）上にロードした。抗体を１ＭＮａＣ含有５０ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ５．０で溶出させた（１０カラム容量で一次勾配）。抗体含有画分をプールし、ＰＢＳに対して透析した。抗体濃度は１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度が１．３６の吸光度を有するものと仮定して２８０ｎｍにおける吸光度から計算した。
【０５３９】
（実施例２５：ＢＩＡｃｏｒｅにおけるＴｉｅ１／ＦｃへのＥ３ｂ−ＩｇＧ１の結合試験）
生殖細胞系Ｅ３ｂＩｇＧ１保存溶液（０．５６ｍｇ／ｍｌ）および親Ｅ３ＩｇＧ１保存溶液（０．４１ｍｇ／ｍｌ）を１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５で５０倍希釈した。ＩｇＧ類は直接ＣＭ５チップ上にコーティングした。チップの表面を０．０５ＭＮＨＳ／０．２ＭＥＤＣの７分パルスで活性化し、生殖細胞系Ｅ３ｂの８２３ＲＵおよび親Ｅ３の７８８ＲＵが表面上にコーティングされるまで、チップ上にＩｇＧを流した。全ての流動細胞はその後、１Ｍ塩酸エタノールアミンｐＨ８．５の７分パルスにより脱活性化した。その後の全ての実験はＨＢＳ緩衝液中で実施した。
【０５４０】
精製した組換えヒトＴｉｅ１／ＦｃをＨＢＳ中終濃度２００、１００、５０、２５および１２．５ｎＭに希釈した。サンプルをｋｉｎｊｅｃｔプログラムを用いながら８．３分間、３０μｌ／分で注射した。その後５０分の解離相を設けた。残存する抗原は全て、１０ｍＭグリシンｐＨ１．５の３０秒インジェクション２回により表面から除去した。
【０５４１】
この方法を用いて得られたセンサーグラムを以下に示す。目視による分析によれば、解離（ｋｏｆｆ）は極めて緩徐であり（長い解離時間にも関わらず極めて少量の画分のＴｉｅ１／Ｆｃが解離した）、これは極めて堅固な相互作用を示唆している。興味深いことにここで測定したＩｇＧの解離速度は相当するＦａｂ類（後述する実施例２９参照）のものよりも遥かに緩徐であり、１価のＦａｂから２価のＩｇＧへの移行に際して親和性（アビディティ）が有意に増大することを示していた。
【０５４２】
（実施例２６：：ＢＩＡｃｏｒｅにおけるＴｉｅ１／ＦｃへのＥ３ｂ−Ｆａｖの結合試験）
生殖細胞系残基への体性の復帰突然変異の変換により結合挙動が何らかの影響を受けないかどうかを調べるために、親および生殖細胞系のＥ３ｂ抗体を作成してＦａｂフラグメントとしてＢｉａｃｏｒｅにおいて試験した。ここではＩｇＧ類に対して行ったこと（実施例２８参照）とは対称的に、そして、１価の相互作用を測定するために、表面上に直接コーティングした抗原上にＦａｂ類を流した。
【０５４３】
組換えヒトＴｉｅ１／ＦｃをＣＭ５チップ上にコーティングした。チップの表面をまず０．０５ＭＮＨＳ／０．２ＭＥＤＣの７分パルスで活性化し、次に７５０ＲＵが表面上にコーティングされるまでチップ表面上にＴｉｅ１／Ｆｃ（１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０中２μｇ／ｍｌ）を流した。全ての流動細胞はその後、１Ｍ塩酸エタノールアミンｐＨ８．５の７分パルスにより脱活性化した。その後の全ての実験はＨＢＳ緩衝液中で実施した。
【０５４４】
親および生殖細胞系のＥ３ｂＦａｂを調製した。連続希釈（５０、２５、１２．５、６．２５および３．１２５ｎＭ）をＨＢＳ緩衝液中に調製した。ＫＩＮＪＥＣＴ（登録商標）プログラムを用いながら５．３分間、３０μｌ／分でサンプルを注射した。その後１０分の解離相を設け、残存するＦａｂは５０ｍＭＮａＯＨ／１ＭＮａＣｌの単回１８秒インジェクションにより表面から除去した。
【０５４５】
１：１モデルと仮定しながらＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（登録商標）ソフトウエア３．１の同時ｋａ／ｋｄフィッティングプログラムを用いてセンサーグラムを分析した。この分析により、Ｅ３抗体の生殖細胞系はＴｉｅ１／Ｆｃに対向した親和性に与える影響は僅かまたは皆無であることが証明された。
【０５４６】
【数１６】
2008532476.tif 000023
。
【０５４７】
（実施例２７：管形成試験における生物学的活性に関するＥ３ｂ−ＩｇＧの試験）
本試験の目的は、親Ｅ３内の生殖細胞系に戻るようにＨＣ突然変異を補正することが生物学的活性に対して何らかの作用を有するかどうか調べることであった。ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）（新しく単離）は３７℃で２０〜２５分間トリプシン−ＥＤＴＡ（１×）（Ｇｉｂｃｏ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でヒト臍帯静脈を処理することにより得た。次に細胞を１０％ＦＣＳ、０．４％ＢＢＥ、１％ｌ−グルタミン、１％ペニシリン／ストレプトマイシを添加したＲＰＭ１６４０培地中結合因子（ＡＦ）（Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）をコーティングしたＴ−２５フラスコ中で培養した。一次培養物を温トリプシン−ＥＤＴＡで脱着させ、第２または第３継代においてコンフルエントとなった時点で使用した。培養中は約６０〜８０％の単層の概ねの密度においてスプリット比１：２で細胞を培養することによりこれ等を増殖状態に維持した。ＨＵＶＥＣ単層を３分間３７℃においてトリプシン／ＥＤＴＡ（５００μｌ／皿）で処理した。トリプシンの作用は完全ＲＰＭＩ培地３容量を添加することにより停止させた。細胞を慎重に掻き取り、ピペッティングを反復して分離し、最後にＰＢＳで洗浄した。ＨＵＶＥＣ（第３継代）は、７．５容量の２ｍｇ／ｍｌコラーゲン（ＣｏｌｌａｇｅｎＲ；Ｓｅｒｖａ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、１容量の１０ＸＭＥＭ、１．５容量のＮａＨＣＯ３（１５．６ｍｇ／ｍｌ）およびｐＨを７．４に調節するための〜１容量のＮａＯＨを混合することにより調製したコラーゲンゲル（コラーゲンＩ１．５ｍｇ／ｍｌを５０μｌ）上でその培地（４０×１０３／５０μｌ／９６穴プレートウェル）中に播種した。１時間３０分後、今度は培地を廃棄し、細胞を新しいコラーゲン層（１．５ｍｇ／ｍｌ、新しく調製、５０μｌ／ウェル）で被覆した。ゲル重合後、Ｅ３ｂ−ＩｇＧ１または親Ｅ３抗体（１ｐｇ／ｍｌ〜１０ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下、各ウェルに培地を添加した。内皮管形成は倒立顕微鏡を用いて評価した。低倍率（×４０）における各ウェルの中央の顕微鏡写真を画像キャプチャーソフトウエアと共にＮｉｋｏｎカメラを用いて撮った。顕微鏡写真における管形成はＭＥＴＡＶＵＥ（商標）ソフトウエアを用いて定量的（総管長）に分析した（データ示さず）。完全内皮細胞生育培地中の未投与ＨＵＶＥＣによる管形成をコントロールとして使用した。３連のウェルから得られた結果は、視野当たりの平均管面積±ＳＥＭ（相対的単位）として表示した（図４）。結論として、Ｅ３ｂ−ＩｇＧ１は管形成を阻害する。ＨＣ突然変異の補正は生物学的活性に対して有意な作用を有さなかった。
【０５４８】
（実施例２８：例示されるＴｉｅ１結合配列）
以下に示すものは免疫グロブリン軽鎖および重鎖の可変ドメインの例示される配列である：
【０５４９】
【数１７】
2008532476.tif 000024
【０５５０】
【数１８】
2008532476.tif 000025
【０５５１】
【数１９】
2008532476.tif 000026
【０５５２】
【数２０】
2008532476.tif 000027
【０５５３】
【数２１】
2008532476.tif 000028
【０５５４】
【数２２】
2008532476.tif 000029
【０５５５】
【数２３】
2008532476.tif 000030
【０５５６】
【数２４】
2008532476.tif 000031
【０５５７】
【数２５】
2008532476.tif 000032
【０５５８】
【数２６】
2008532476.tif 000033
【０５５９】
【数２７】
2008532476.tif 000034
【０５６０】
【数２８】
2008532476.tif 000035
【０５６１】
【数２９】
2008532476.tif 000036
【０５６２】
【数３０】
2008532476.tif 000037
【０５６３】
【数３１】
2008532476.tif 000038
【０５６４】
【数３２】
2008532476.tif 000039
【０５６５】
【数３３】
2008532476.tif 000040
【０５６６】
【数３４】
2008532476.tif 000041
【０５６７】
【数３５】
2008532476.tif 000042
【０５６８】
【数３６】
2008532476.tif 000043
【０５６９】
【数３７】
2008532476.tif 000044
【０５７０】
【数３８】
2008532476.tif 000045
【０５７１】
【数３９】
2008532476.tif 000046
【０５７２】
【数４０】
2008532476.tif 000047
【０５７３】
【数４１】
2008532476.tif 000048
【０５７４】
【数４２】
2008532476.tif 000049
【０５７５】
【数４３】
2008532476.tif 000050
【０５７６】
【数４４】
2008532476.tif 000051
【０５７７】
【数４５】
2008532476.tif 000052
【０５７８】
【数４６】
2008532476.tif 000053
【０５７９】
【数４７】
2008532476.tif 000054
【０５８０】
【数４８】
2008532476.tif 000055
【０５８１】
【数４９】
2008532476.tif 000056
【０５８２】
【数５０】
2008532476.tif 000057
【０５８３】
【数５１】
2008532476.tif 000058
【０５８４】
【数５２】
2008532476.tif 000059
【０５８５】
【数５３】
2008532476.tif 000060
【０５８６】
【数５４】
2008532476.tif 000061
【０５８７】
【数５５】
2008532476.tif 000062
【０５８８】
【数５６】
2008532476.tif 000063
【０５８９】
【数５７】
2008532476.tif 000064
【０５９０】
【数５８】
2008532476.tif 000065
【０５９１】
【数５９】
2008532476.tif 000066
【０５９２】
【数６０】
2008532476.tif 000067
【０５９３】
【数６１】
2008532476.tif 000068
【０５９４】
【数６２】
2008532476.tif 000069
【０５９５】
【数６３】
2008532476.tif 000070
【０５９６】
【数６４】
2008532476.tif 000071
【０５９７】
【数６５】
2008532476.tif 000072
【０５９８】
【数６６】
2008532476.tif 000073
【０５９９】
【数６７】
2008532476.tif 000074
【０６００】
【数６８】
2008532476.tif 000075
【０６０１】
【数６９】
2008532476.tif 000076
【０６０２】
【数７０】
2008532476.tif 000077
【０６０３】
【数７１】
2008532476.tif 000078
【０６０４】
【数７２】
2008532476.tif 000079
【０６０５】
【数７３】
2008532476.tif 000080
【０６０６】
【数７４】
2008532476.tif 000081
【０６０７】
【数７５】
2008532476.tif 000082
【０６０８】
【数７６】
2008532476.tif 000083
【０６０９】
【数７７】
2008532476.tif 000084
【０６１０】
【数７８】
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【０６１１】
【数７９】
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【０６１２】
【数８０】
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【０６１３】
【数８１】
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【０６１４】
【数８２】
2008532476.tif 000089
【０６１５】
【数８３】
2008532476.tif 000090
【０６１６】
【数８４】
2008532476.tif 000091
【０６１７】
【数８５】
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【０６１８】
【数８６】
2008532476.tif 000093
【０６１９】
【数８７】
2008532476.tif 000094
【０６２０】
【数８８】
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【０６２１】
【数８９】
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【０６２２】
【数９０】
2008532476.tif 000097
【０６２３】
【数９１】
2008532476.tif 000098
。
【０６２４】
（実施例２９：例示されるＴｉｅ１抗体）
表５（図３７）および６（図３８）は本明細書に記載した例示される軽鎖および重鎖の可変領域のＣＤＲ領域を示す。図３９（表９）は例示される抗体の一部の特性を示す。
【０６２５】
本明細書に記載した一部の抗体は関連する可変ドメインを包含する。同じ可変ドメインは異なるパートナーの可変ドメインと共に機能できる。例えば、Ｍ００４４−Ｇ０６およびＭ００４４−Ｂ０５はＨＣ可変ドメインを共有しているが異なるＬＣ可変ドメインを有し、これはＭ００４４−Ｇ０７とＭ００４４−Ｂ０５の場合と同様である。同じＨＣ可変ドメインを有する他の抗体は、ＨＣ５４（Ｍ００５３−Ｄ１２）と１９（Ｍ００４４−Ｈ０５）；ＨＣ５９（Ｍ００５３−Ｆ０５）と１９（Ｍ００４４−Ｈ０５）；ＨＣ７２（Ｍ００５４−Ｈ１０）と２５（Ｍ００４５−Ｂ０３）；およびＨＣ９８（Ｍ００５６−Ｆ１１）と５７（Ｍ００５３−Ｅ０８）を包含する。同じＬＣ可変ドメインを有する一部の抗体は、ＬＣ１１４（Ｍ００５９−Ａ０６）と１０５（Ｍ００５７−Ｈ０７）：ＬＣ１３０（Ｍ００６２−Ｅ１１）と１０６（Ｍ００５７−Ｈ０７）：およびＬＣ１１５（Ｍ００５７−Ｂ０２）と１２（Ｍ００４４−Ｆ０３）を包含する。一部の抗体は同じＣＤＲ３を有する。例えばＣＤＲ３配列ＱＧＧＧＧＲＡＦＤＩはＭ００５６−Ｃ０４およびＭ００５６−Ｆ０２に存在する。ＣＤＲ３配列ＩＡＧＧＡＹＨＬＤＹはＭ００５６−Ｅ０８およびＭ００６１−Ｃ０５に存在する。
【０６２６】
一部の場合においては、抗体は非生殖細胞系の残基を包含する。このような非生殖細胞系の残基の１つ以上は例えば生殖細胞系の残基を回復するために修飾することができる。例示される非生殖細胞系残基はＬ４５Ｆ（例えばＭ００５３−Ｄ０６参照）；Ｖ４８Ｆ（例えばＭ００６２−Ｃ０８参照）；デルタＳ５３（例えばＭ００４５−Ｂ０１；Ｍ００４７−Ｄ０３；Ｍ００５５−Ｄ１２；Ｍ００６１−Ａ０３参照）；デルタＧ５４（例えばＭ００５３−Ａ０３参照）；Ｔ５７Ｉ（例えばＭ００４６−Ｂ１０参照）；Ｅ８５Ｄ（例えばＭ００５６−Ｈ１２参照）；Ｔ８７Ｍ（例えばＭ００５３−Ｆ０６；Ｍ００５５−Ｅ１２；Ｍ００５６−Ｂ０８参照）；Ｖ８９Ｌ（例えばＭ００４４−Ｂ０８；Ｍ００４７−Ｄ０１；Ｍ００６０−Ｂ０２；Ｍ００６２−Ｈ０１参照）；Ｖ８９Ｍ（例えばＭ００４４−Ｂ１０；Ｍ００４５−Ｃ１２；Ｍ００４５−Ｄ０７；Ｍ００５３−Ｂ１１；Ｍ００５５−Ｂ１２；Ｍ００５５−Ｅ０６；Ｍ００５６−Ａ０１；Ｍ００５６−Ｇ１２；Ｍ００５８−Ｇ０３；Ｍ００５９−Ａ０６；Ｍ００６０−Ｈ０１；Ｍ００６１−Ｆ０７参照）；Ｖ８９Ｔ（例えばＭ００４４−Ｈ０７；Ｍ００４６−Ａ１１；Ｍ００４６−Ｂ１０；Ｍ００４７−Ｄ０３；Ｍ００５５−Ｃ０７；Ｍ００５５−Ｄ０３；Ｍ００５５−Ｇ０２参照）；Ａ９３Ｔ（例えばＭ００４５−Ａ０２；Ｍ００５３−Ｆ０８；Ｍ００５６−Ｈ１２；Ｍ００５８−Ｅ０９；Ｍ００５９−Ａ０２；Ｍ００６１−Ｃ０６；Ｍ００６２−Ｇ０６参照）；およびＴ１０７Ｋ（例えばＭ００４５−Ｂ０３参照）を包含する。
【０６２７】
（実施例３０：ＤＸ−２２２０抗体の配列）
ＤＸ−２２２０は完全長のＩｇＧ１生殖細胞系ヒト抗Ｔｉｅ１抗体Ｅ３ｂである。ＤＸ−２２２０の配列は以下の通りである：
【０６２８】
【数９２】
2008532476.tif 000099
【０６２９】
【数９３】
2008532476.tif 000100
。
【０６３０】
（実施例３１：ＤＸ−２２２０はヌードマウスにおける結腸直腸癌異種移植腫瘍の進行を緩徐化させる）
マウス（ｎｕ／ｎｕ）に５×１０６個のＳＷ−４８０（結腸直腸癌）細胞を皮下移植した。１２日後、腫瘍が約１００〜２００ｍｇに達した時点で、マウスを５群に分割し、以下の薬剤を投与（または未投与のまま）した。
１−未投与
２−ベヒクル（ＰＢＳ）
３−シスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ／ＩＶ、ｑ２ｄ×５回）
４−Ａ２−ＳＶ（ネガティブコントロール抗体、１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、ｑ２ｄ×１４回）
５−ＤＸ−２２２０（抗Ｔｉｅ１抗体、１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、ｑ２ｄ×１４回）
試験全体を通じて、発生した何れの腫瘍の長さ（Ｌ）および幅（Ｗ）もカリブレーションされたｖｅｒｎｉｅｒカリパスを用いてミリメートル単位で測定し、Ｌは２つの寸法のより長いほうとした。適宜、長球楕円に関する数式：Ｍ＝（Ｌ×Ｗ２）／２を用いて腫瘍重量（Ｍ）をミリグラム単位で計算した。表７は群の各々に関する腫瘍の平均重量（ｍｇ）を示す。Ａ２−ＳＶはストレプトアビジンに結合するアイソタイプマッチ（ＩｇＧ１）のネガティブコントロール抗体である。
【０６３１】
【表７】
2008532476.tif 000101
表７に示す動物実験の結果を図５にグラフで示す。ＤＸ−２２２０はベヒクル（ＰＢＳ）投与コントロール動物と比較した場合に腫瘍の進行を４４％緩徐化させた。更に又ＤＸ−２２２０は化学療法剤コントロール（シスプラチン）と同様に有効であった。
【０６３２】
（実施例３２：ＢＩＡＣｏｒｅにおけるヒトおよびマウスＴｉｅ１への結合のための生殖細胞系抗Ｔｉｅ１Ｅ３ＦａｂおよびＩｇＧの製造および試験）
発現および精製。Ｆａｂ類はペリプラズム内への分泌のためのＰｅｌＢリーダー配列を含有する発現ベクターを用いてＥ．ｃｏｌｉ菌株ＴＧ１内で生産した。誘導のために使用した条件下において（１ｍＭＩＰＴＧ存在下３０℃一夜インキュベート）、分泌されたＦａｂの大部分はペリプラズムよりも培地中に局在した。分泌されたＦａｂは清澄化された培地にプロテインＡ樹脂を添加することにより回収した。次にこのプロテインＡ樹脂をカラムに充填することによりＰＢＳ洗浄および５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭＮａＣｌｐＨ２．５による溶離を容易にした。１ＭＨＥＰＥＳの半容量を添加することによりｐＨをほぼ中性とした後に緩衝液をＰＢＳに交換した。精製された生殖細胞系Ｅ３（ＤＸ−２２２０）Ｆａｂの濃度はＯＤ２８０１．４＝１．０ｍｇ／ｍｌを用いて求めた。
【０６３３】
トランスフェクション剤としてＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）２０００またはＧＥＮＥＪＵＩＣＥ（登録商標）の何れかを用いてＨＥＫ２９３Ｔ細胞中で一時的にＩｇＧを生産した。抗体はトランスフェクション後７２、１４４および２１６時間に採取した細胞から生産された。コンディショニングされた培地から得られたＩｇＧの精製は本質的にはＦａｂの精製に関して上記したプロトコルと同様に行った。精製されたＩｇＧの濃度はＯＤ２８０１．４＝１．０ｍｇ／ｍｌを用いて求めた。
【０６３４】
前臨床の動物実験については、ＩｇＧは２段階の精製操作、即ちまずプロテインＡクロマトグラフィー、次いでイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）を用いて精製した。精製されたＩｇＧは内毒素濃度、浸出プロテインＡ、ＤＮＡ含有量および宿主細胞タンパク質を試験するために生化学的分析に付した。
【０６３５】
生化学的分析
ＦａｂおよびＩｇＧのアフィニティー分析はＢＩＡｃｏｒｅ３０００機器を用いて表面プラズモン共鳴により実施した。この分析のためには、Ｔｉｅ１の細胞外ドメインの２量体（Ｔｉｅ１−Ｆｃ融合タンパク質）および単量体（Ｔｉｅ１−ＨＩＳ）の型の両方を使用した。これらの実験に使用したセンサーチップはＣＭ５（デキストランコーティング）であり、これは標準的なアミンカップリング化学を介したチップへのタンパク質の固定を可能にする。流動抗体の濃度は表面プラズモン共鳴に基づいた方法を用いて測定した。高密度プロテインＡセンサーチップを用いた場合、質量輸送制限条件下において、応答シグナルは被験サンプル中の抗体の濃度にのみ依存する。この方法はＫＤの正確な測定のために重要なパラメーターである抗体濃度の厳密な測定を可能にする。
【０６３６】
Ｔｉｅ１ＨＩＳタンパク質４７０ＲＵをＣＭ５センサーチップ上にコーティングし、５、２０、１００および５００ｎＭのＦａｂを、系が質量輸送制限されない速度である４段階の異なる流量（１０、３０，５０および８０μｌ／ｓ）においてチップ上に流動させた。速度論的データは、典型的には、被分析物の濃度の範囲と３つの異なるチップ被覆密度を用いて測定された。良好なシグナルを与えた最低コーティング密度から得られたデータを典型的に選択したところ、これは５０〜１００ＲＵの範囲内にある場合が多かった。このような低いコーティング密度を用いることにより、２価の分析被験体（ＩｇＧまたはＴｉｅ１Ｆｃ融合タンパク質）を用いる場合でさえも頻繁に、ＢＩＡＥＶＡＬＵＡＴＩＯＮ（登録商標）３．０ソフトウエアを用いてセンサー曲線を１．１モデルにフィットさせることが可能となる。２価の分析被験体について１：１にフィットさせるモデルは不可能である場合には、曲線は２：１モデルを用いてフィットさせた。発生したデータは表８に示す通りである。
【０６３７】
【表８】
2008532476.tif 000102
本明細書に記載した抗Ｔｉｅ１抗体はヒトおよびマウスのＴｉｅ１分子の両方に結合する。抗Ｔｉｅ１ＦａｂのマウスＴｉｅ１−Ｆｃ融合タンパク質への結合を抗Ｔｉｅ１ＦａｂのヒトＴｉｅ１−Ｆｃ融合タンパク質への結合と比較した。これらの実験の両方においてＴｉｅ１−Ｆｃ融合タンパク質はセンサーチップ上に固定し、そして抗Ｔｉｅ１Ｆａｂを分析被験体として使用した。これらの実験条件下において抗Ｔｉｅ１ＦａｂはヒトおよびマウスのＴｉｅ１−Ｆｃ融合タンパク質の両方について極めて近似したＫＤ（〜３ｎＭ）値を有している（表９）。動物薬効実験で使用したもの、即ちＣＭ５センサーチップに固定化したＴｉｅ１−Ｆｃおよび分析被験体として用いた抗Ｔｉｅ１を模倣した条件下において、測定されたＫＤ値は０．２ｎＭであった。この１０倍超の親和性の増大は、多価表面（固定化Ｔｉｅ１−Ｆｃ）への２価分子（抗Ｔｉｅ１）の結合から生じるアビディティの作用を示している。
【０６３８】
（実施例３３：ＤＸ−２２４０の配列：生殖細胞系列化ＦアロトタイプＥ３抗体の配列）
【０６３９】
【数９４】
2008532476.tif 000103
軽鎖は場合により更に以下のシグナル配列：軽鎖シグナル配列：ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＨＳ（配列番号７２９）を包含することができる。重鎖は場合により更に以下のシグナル配列：ＭＧＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＡＨＳ（配列番号７３０）を包含することができる。
【０６４０】
（実施例３４：ＧＳ−ＣＨＯ細胞系統由来のＤＸ−２２４０の特性化）
抗Ｔｉｅ１抗体ＤＸ−２２４０（軽鎖および重鎖の生殖細胞系およびｆ−アロタイプ）抗体をＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で生産した。ＤＸ−２２４０を発現する安定なＣＨＯ細胞系統を作成した。標準的な分子生物学のクローニング技術を用いて、ＤＸ−２２４０由来の軽鎖および重鎖をＬｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ．ＣＨから入手可能なグルタミンシンターゼ（ＧＳ）ベクター系に挿入した（例えばＣｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）ＢｉｏＰｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ２（４）：４８−５２；Ｂａｒｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｂｉｏｅｎｇ．８１（６）：５３１−６３９参照）。次に軽鎖および重鎖をそれぞれ含有する一重ベクターコンストラクトを組み合わせて単一の二重遺伝子ベクターを作成した。次にこのＤＮＡコンストラクトを用いてＭＳＸ選択圧力下に生育する安定なＣＨＯ細胞系統を作成した。次にこれ等のクローンの１つを増殖させ、単一の４０Ｌの攪拌バイオリアクターに播種し、１２日間の過程に亘って運転した。この運転の終了後、清澄化ＣＨＯ培養上澄み３６リットルを２００ｍｌプロテインＡＸＫ５０カラムにロードした。カラムをまずＰＢＳｐＨ７．４で洗浄し、次いで、ＰＢＳ＋０．４ＭＮａＣｌｐＨ７．４で洗浄、次いで、ＰＢＳｐＨ７．４で最終洗浄した後に低ｐＨ溶出を行った。ＤＸ−２２４０ＩｇＧ１をまず０．１Ｍクエン酸ＮａｐＨ３．５で、次に同じ緩衝液のｐＨ３．０を用いて溶出した。ｐＨ３．０においてシャープなタンパク質ピークが溶出した。ｐＨ３．０溶出物はＤＸ−２２４０を示す優勢なピークとその直ぐ後に溶出する低濃度の夾雑物を含有していた。高水準の純度（＞９５％）のＤＸ−２２４０が得られた。
【０６４１】
（実施例３５：ＤＸ−２２４０抗体をコードする核酸の配列最適化）
ＣＨＯ細胞内でのＤＸ−２２４０の発現を向上させるために、旨適化されたコドンおよび配列を有する合成遺伝子を組み立てた。操作に含まれるものはコドンの旨適化、ＣｐＧアイランドおよびスプライス部位の分析である。旨適化ＤＸ−２２４０配列を合成し、そしてグルタミンシンターゼ（ＧＳ）ベクター系内に再フォーマットした。例示されるコドン旨適化配列は以下の通りである。
【０６４２】
【数９５】
2008532476.tif 000104
【０６４３】
【数９６】
2008532476.tif 000105
。
【０６４４】
（実施例３６：マウスにおける薬物動態および生体分布試験）
ＤＸ−２２４０（ＨＥＫ２９３Ｔ細胞内で生産）のインビボ薬物動態および安定性は、使用可能なチロシン残基上でタンパク質をヨウ素化すること、および、単回静脈内投与後のマウスにおける血漿クリアランスおよび安定性を測定することにより調べた。サンプルはＩＯＤＯ−ＧＥＮ（登録商標）試薬を用いた間接的方法により放射性ヨウ素化した（Ｐｉｅｒｃｅの方法、Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：１５４８；（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４８：３１１７の記載参照）。サンプルを１２５Ｉ−ＮａＩ溶液と共に９分間インキュベートし、その時点においてチロシン（１０ｍｇ／ｍｌ、飽和溶液）を添加することにより反応をクエンチングした。約１５分後、５μｌ分を計数のための標準として採取した。各標識反応につき、１２５Ｉ標識物質（約０．６ｍｌ）を単一の５ｍｌＤ塩１８００ポリアクリルアミドカラム（Ｐｉｅｒｃｅ）を用いて精製した。カラムを２．５％ＨＳＡ含有２５ｍＭＴｒｉｓ、０．４ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄することにより非特異的部位を、そして次にＨＳＡを含有しない同じ緩衝液で広範にブロッキングした。サンプルを適用し、カラムを０．３ｍｌずつのシリーズで溶出した。全タンパク質画分中の適用放射能の回収は＞７５％であり、適用放射能の総回収量は＞９０％であった。標識タンパク質のピーク濃度を含有する画分を動物注射用にプールした。注射液を調製するために、プール物をトリス緩衝液（ｐＨ７．５）で希釈し、１００μｌの注射容量が約１０μｇの標識物質を含有するようにした。
【０６４５】
放射標識化合物を含有する溶液を尾静脈注射により全マウスに投与した。投与後の所定時間において、動物を屠殺し、血液サンプルを採取して分析に付した。放射標識化合物の注射後の試験の時点は注射後約０、７、１５、３０、９０分、４時間、８時間、１６時間、２４時間、４８時間および７２時間とした。各時点において４匹を屠殺した。屠殺時に０．５ｍｌ分の血液を抗凝固剤（０．０２ｍｌＥＤＴＡ）管中に採取した。遠心分離によりにより血球から血漿を分離し、血漿画分を２区分に分割し、１つを凍結し、１つは即時分析用に４℃保存した。
【０６４６】
分析では全サンプルのガンマカウンター計数を行った。この単回用量ｉｖ試験において、ＤＸ−２２４０は５時間未満の比較的短いマウス半減期を示した。これ等のマウスにおけるＤＸ−２２４０の生体分布の分析によれば、肺（１２．８５％ＩＤ／ｇ）、脾臓（７．４４％ＩＤ／ｇ）、腎臓（８．３４％ＩＤ／ｇ）、肝臓（５．４２％ＩＤ／ｇ）および心臓（４．０４％ＩＤ／ｇ）において３０分後にこの抗体の一部の蓄積が判明した。ＤＸ−２２４０は内皮細胞の表面上のＴｉｅ１とのその相互作用により、肺のような高度な脈管形成領域に蓄積すると考えられる。従って、ＤＸ−２２４０の複数の投与がマウス血清中のこの抗体の有効定常状態濃度を達成するためには必要となる場合がある。ＤＸ−２２２０を投与した腫瘍担持マウスから採集した３日毎の投薬後の眼血液並びに末梢血液のサンプルについてＥＬＩＳＡを実施した。各場合において、血清中ＤＸ−２２２０濃度は平均５００μｇ／ｍｌであり、マウス中の短い血清中半減期にもかかわらず、この抗体の有効定常状態濃度がＤＸ−２２２０の僅か３回の投与の後に達成できる。
【０６４７】
更に又、ＤＸ−２２４０のインビボの安定性を試験するための血漿サンプルのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を実施した。マウスにおけるＤＸ−２２４０の不安定性は血清からのこの化合物の急速なクリアランスに寄与している可能性がある。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析は０分、３０分、９０分、２４時間および７２時間において２血漿サンプルに対して実施した。放射標識ＤＸ−２２４０の分析はこの化合物が分解および血漿中の成分との相互作用の両方に対してインビボで安定であることを示していた。従って、マウスにおけるＤＸ−２２４０の比較的急速な半減期はこの化合物の分解によるものではない。
【０６４８】
（実施例３７：ＤＸ−２２２０はヌードマウスにおける肺癌異種移植腫瘍の進行を緩徐化する）
ヒトＬＮＭ３５肺癌異種移植片を担持するマウスにおける腫瘍生育に対するＤＸ−２２２０の作用を試験した。これ等の試験では、ＬＭＮ３５細胞は無胸腺ヌードマウスの胸部側面に皮下注射した。腫瘍細胞移植４日後、１週間３回２０ｍｇ／ｋｇの用量でＤＸ−２２２０またはＡ２−ＳＶ（ネガティブコントロール抗体）の投与を開始した。腫瘍サイズは抗体投与後６、８および１０日目に測定した。
【０６４９】
図６に示す通り、ＤＸ−２２２０はこのマウス異種移植片モデルにおいて腫瘍の進行を有意（ｐ＝０．０３７）に緩徐化（〜６０％）した。更に又、ＤＸ−２２２０を投与したマウスは体重の有意な減少を示さなかった。これ等のデータを合わせれば、ＤＸ−２２２０はインビボにおいて有意な腫瘍生育阻害活性を有している。
【０６５０】
（実施例３８：ＤＸ−２２２０はヌードマウスにおける腫瘍の進行を緩徐化する）
上記したインビボの試験のほかに、４種の別のマウス異種移植試験を実施した。これ等の試験はＳＷ−４８０またはＬＮＭ３５試験において使用した何れかのプロトコルに従って実施した。これ等の試験の結果を以下に示す。
【０６５１】
ＬＬＣ（マウス肺癌腫）            投与開始後１４日目に２０％阻害
ＰＣ−３（ヒト前立腺癌）          投与開始後２８日目に２４％阻害
ＬＮＭ３５＃３（ヒト肺癌腫）          投与開始後２１日目に３０％阻害
Ｃｏｌｏ２０５（ヒト結腸直腸癌）  作用無し
これ等の結果はＥ３抗Ｔｉｅ１抗体が種々の腫瘍型に対して作用を有することを示唆し、このことは広範な治療用途を示している。
【０６５２】
（実施例３９：正常組織の免疫組織化学分析）
Ｅ３抗Ｔｉｅ１抗体の免疫反応性の潜在的領域を評価するための一連の非悪性の正常ヒト組織に対する一連の免疫組織化学分析を実施した。最小限のバックグラウンドおよびシグナル最大検出をもたらすような、好ましい組織保存条件並びに旨適抗体濃度を調べるために、ビオチニル化ＤＸ−２２２０およびＩｇＧアイソタイプコントロール抗体を用いて選択された正常ヒト組織の低温およびパラホルムアルデヒド固定切片の両方に対して抗体滴定実験を実施した。一次抗体として使用するビオチニル化ＤＸ−２２２０およびビオチニル化ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体、および、発色原としてのＤＡＢと共にストレプトアビジンＨＲＰよりなる基本的検出系を用いた試験のための一次抗体については、２０μｇ／ｍｌの濃度を選択した。組織は又、ポジティブコントロール抗体（抗ＣＤ３１抗ビメンチン）で染色することにより、組織抗原を温存し、そして免疫組織化学分析に供することができるようにする。ＣＤ３１およびビメンチン染色がポジティブである組織のみを残りの試験のために選択した。ネガティブコントロールは一次抗体に非存在下の隣接切片に対する全免疫組織化学的操作法を実施することよりなるものとした。スライドはＮｉｋｏｎ顕微鏡に連結したＤＶＣ１３１０Ｃデジタルカメラを用いて画像化した。
【０６５３】
ネガティブコントロール（または一次抗体）のスライドは腎尿細管上皮内および場合により顆粒球に散発する弱いバックグラウンド染色をしばしば示したが、全ての他の細胞型は、ポジティブコントロール細胞系統（ＨＭＥＣ、ヒト微小血管内皮細胞）およびポジティブコントロール結腸癌を含めて、均一にネガティブであった。ＩｇＧアイソタイプコントロール抗体は顆粒球、マクロファージ、副腎皮質、腎尿細管上皮、ファロピアン管上皮、肝細胞、ライディヒ細胞および甲状腺の弱いバックグラウンド染色を示した。ポジティブコントロールの細胞系統（ＨＭＥＣ）およびポジティブコントロールの結腸癌は無染色またはバックグラウンド染色を示した。
【０６５４】
ＤＸ−２２２０はＨＭＥＣ細胞系統内の中等度の膜染色、および、マクロファージ、一部の癌細胞および結腸癌ポジティブコントロールサンプル内の内皮細胞の染色を示した。正常組織内においては、抗体はマクロファージ、脳の小グリア細胞、頚部の扁平上皮の弱い乃至は中等度の染色、骨格筋、ランゲルハンス島および胎盤内皮の弱い染色を示した。これらの観察結果は、以前の報告から推測されるとおり、一部の内皮、造血および上皮の組織におけるＴｉｅ１の低水準発現と合致している。ランゲルハンス島の染色は予想外であり、今後検討しなければならない。他の弱い染色の大部分はＩｇＧアイソタイプコントロールで観察されたものと同様であった。ＩｇＧアイソタイプコントロールのバックグラウンドをＤＸ−２２２０の分析結果から差し引けば、副腎、膀胱、血液、骨髄、ニューロン、乳房、結腸、内皮、眼、ファロピアン管、心臓、腎臓、肝臓、肺、リンパ球、卵巣、膵臓外分泌腺、下垂体、前立腺、皮膚、脊髄、脾臓、精巣の精上皮、胸腺リンパ球、尿管および子宮を含めて、組織の大部分はネガティブであった。
【０６５５】
（実施例４０：血小板試験）
Ｔｉｅ１は血小板上に発現されるという報告があった（Ｔｓｉａｍｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｖａｓｃ．Ｒｅｓ．３７（６）：４３７）。Ｅ３抗Ｔｉｅ１抗体との血小板免疫反応性の可能性はＦＡＣＳ分析および免疫沈降試験により調べた。ＤＸ−２２２０は血小板への有意な結合を示さず、そして血小板抽出物からＴｉｅ１を免疫沈降させなかった。更に又血小板の集塊化および凝集に対するＤＸ−２２００およびＤＸ−２２１０の作用も調べた。リストセチン、即ち血小板膜糖タンパク質ＧＰＩｂ（ＣＤ４２）へのフォン・ビルブランド因子（ｖＷＦ）の結合を媒介することにより血小板の集塊化を誘導するコファクターを血小板集塊化のポジティブコントロールとして使用した。トロンビン（比較コントロール）のような生理学的アゴニストに匹敵する動態および程度をもって血小板を活性化し、血小板凝集を誘導するためにポジティブコントロールとしてＣＤ９に対する抗体を使用した。ＤＸ−２２００およびその軽鎖生殖細胞系変異体ＤＸ−２２１０の何れも血小板の集塊化または凝集を誘導しなかった。
【０６５６】
（実施例４１：臍帯血幹細胞試験）
血液先祖細胞（幹細胞）への結合特性を評価するために、Ｇ−ＣＳＦ可動化末梢血液細胞上の抗Ｔｉｅ１抗体（または適切なネガティブコントロール抗体）および骨髄細胞を用いたＦＡＣＳ分析を実施した。慨すれば細胞を１０％熱不活性化ヒトＡＢ血清／２％マウス血清でブロックした。結合はビオチニル化ＥＤＸ−２２２０またはビオチニル化Ａ２ネガティブコントロール抗体を用いて開始した。細胞を洗浄後、一次抗体をＦＩＴＣ標識ストレプトアビジンを用いて検出した。更に３０分のインキュベーション時間の後、残存する赤血球を溶解し、そして遠心分離後に得られた細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁した後にＦＡＣＳ分析に付した。データの取得はＦａｃｓＤｉｖａ（登録商標）ソフトウエアを用いてＦＡＣＳＣａｎｔｏ（登録商標）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）上で実施した。ＳＳＣ／ＣＤ４５上の活動ゲーティングを使用した。先祖細胞をＣＤ４５＋、ＣＤ３４＋細胞上でゲーティングし、そして少なくとも１００，０００ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋計数値で自動的に獲得した。
【０６５７】
Ｔｉｅ１の発現は特定の造血系悪性疾患において報告されているが、本実験はネガティブコントロールのＩｇＧＡ０２およびＥ３抗Ｔｉｅ１抗体ＤＸ−２２２０は何れも、ＣＤ４５＋ＣＤ３４＋血液先祖細胞の染色はポジティブではなかったことを示している。この所見は特定の化学療法剤とは異なり、Ｅ３でＴｉｅ１をターゲティングすることは幹細胞に対して悪影響を与えないという仮説を裏付けている。
【０６５８】
（実施例４２：インビトロ造血試験）
ヒト骨髄様および赤血球様の先祖細胞に対する抗Ｔｉｅ１抗体（ＤＸ−２２２０およびＤＸ−２２４０）の作用をメチルセルロース系インビトロコロニー試験を用いて評価し、そして巨核球先祖細胞はコラーゲン系インビトロ試験に付した。ＤＸ−２２２０およびＤＸ−２２４０の何れも１００μｇ／ｍｌまでの濃度ではこのインビトロ試験の特定の条件においてはコロニー形成を阻害しなかった。
【０６５９】
インビボの骨髄剥離モデルを用いたマウス造血系の回復に対するＥ３抗Ｔｉｅ１抗体ＤＸ−２２４０の作用を評価した。マウスに第０日に５−ＦＵを注射し、次にＤＸ−２２４０またはネガティブコントロール抗体の何れかを投与した。注射後の種々の時点（第２、４、６、８、１０、１２および１４日）において、コントロール群および投与群からマウス４匹を屠殺し、末梢血および大腿骨を採取した。末梢血および大腿骨細胞を分析して以下を測定した。
・大腿骨当たりの総核化細胞
・骨髄様および赤血球様の先祖細胞の両方に関する骨髄コロニー形成細胞の頻度
・大腿骨当たりの総造血系ＣＦＣ
・大腿骨当たりの総巨核球系ＣＦＣ
・成熟細胞の総白血球数および分画分析
ＤＸ−２２４０は５−ＦＵ投与後のマウス造血系の回復に対する作用を有していなかった。このことはこれ等の試験条件下においてＤＸ−２２４０が血液学的毒性を有さないというインビトロの所見を裏付けている。即ち、それは赤血球とリンパ球の生産を維持するために必要な正常な造血機能を妨害しないことから、治療薬として特に有用である。
【０６６０】
抗Ｔｉｅ１抗体は又、移植腫瘍に対するその作用について評価した。腫瘍細胞をマウスの腹部領域に皮下注射した（Ｂａｌｂ／Ｃｎｕ／ｎｕ雌性マウス、５〜６週齢）。以下の腫瘍細胞、即ち肺癌腫（マウス同系Ｌｅｗｉｓ肺癌腫（ＬＬＣ））；ヒト肺癌腫ＬＮＭ３５；攻撃的ヒト結腸癌腫クローン（ＳＷ４８０Ｒ）を試験した。抗Ｔｉｅ１抗体の投与は移植後４〜６日に開始した。抗Ｔｉｅ１抗体またはコントロール抗体（Ａ２抗ストレプトアビジン抗体）を２日毎に２０ｍｇ／ｋｇで腹腔内投与した。腫瘍容量は２日毎に測定し、０．５×高さ×幅×深さで計算した。
【０６６１】
Ｅ３抗Ｔｉｅ１抗体（別名ＤＸ−２２４０）はＬＬＣ（約２０％の作用、ｐ＝０．０７８；ＡＮＯＶＡ、単一ファクター試験）およびＬＮＭ３５の原発腫瘍生育を阻害する。１つの試験において、この抗Ｔｉｅ１抗体は原発腫瘍生育を６０％阻害している（最大応答）。（２日毎ではなく一週間に僅か２回の投薬で抗体の用量を倍増しても原発腫瘍生育に対しては中等度の作用しかもたらされなかった。）このＳＷ４８０Ｒ腫瘍はこれ等の条件下では抗体投与に応答しなかった。実施例３４に記載した通り、抗体はＳＷ４８０細胞の腫瘍成育の阻害について（即ち誘導体ＳＷ４８０Ｒ細胞よりも）有効であった。
【０６６２】
６０％阻害が観察された実験から得た腫瘍切片の組織学的分析によれば、抗Ｔｉｅ１抗体投与腫瘍中の血管は、血管密度は改変されていなかったものの、異なる形態特徴を有していた。抗Ｔｉｅ１抗体投与腫瘍においては、血管は腫瘍細胞の小葉間に隔壁様の構造を形成していた。これ等の腫瘍は又、コントロール抗体投与腫瘍よりも高い壊死性を示していた。平滑筋の分布（抗平滑筋アクチン抗体染色により検出）も又改変されていた。抗Ｔｉｅ１抗体投与腫瘍におけるリンパ管もまたより散在しており、ある程度拡張しており、そして数例においては隣接する管腔が集合して糸状になっていた。これ等の観察結果は、この抗Ｔｉｅ抗体が、腫瘍の壊死および腫瘍内の血管の組織化に対して特有の作用を有していることを示している。
【０６６３】
（実施例４３：併用療法の評価）
動物モデルを使用して併用療法を評価することができる。例えば複合物（腹腔内）がＨＴ２９、ＣＯＬＯ２０５またはＰＣ３の異種移植片を有する雌性ＮＣｒｎｕ／ｎｕマウスにおける腫瘍生育を調節する能力について試験することができる。一部の例示される試験法を以下に示す。
【０６６４】
【数９７】
2008532476.tif 000106
別のレジメンは以下のとおりである：
【０６６５】
【数９８】
2008532476.tif 000107
Ａ２−ＳＶはコントロールの抗ストレプトアビジン抗体である。各群１２匹を使用できる。臨床兆候、群平均体重を毎日評価する。個体別体重および腫瘍負荷は一週間に２回評価する。試験の終了時に、組織サンプルを腫瘍、肝臓、肺、脾臓、心臓、軸性結節、腎臓および子宮から採取することができる。
【０６６６】
他の実施形態は添付の特許請求の範囲に包含される。
【図面の簡単な説明】
【０６６７】
【図１】図１はＴｉｅ１を有する血小板特異的マーカーＣＤ４３による標識およびＥ３抗体による標識を示す２バリアントＦＡＣＳプロットを示す。僅かにバックグラウンド数のＣＤ４２ポジティブ細胞がＥ３抗体により標識されている。
【図２−１】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは生殖細胞系Ｅ３（２Ｃおよび２Ｄ）を親Ｅ３（２Ａおよび２Ｂ）と比較した場合の分岐点数ｖｓ抗体濃度のプロットである。
【図２−２】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃおよび２Ｄは生殖細胞系Ｅ３（２Ｃおよび２Ｄ）を親Ｅ３（２Ａおよび２Ｂ）と比較した場合の分岐点数ｖｓ抗体濃度のプロットである。
【図３】図３はＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）を用い、そして生殖細胞系Ｅ３抗体を評価したインビボ試験から得られたフルオレセイン−レクチンで染色されたマトリゲルにおける血管密度のグラフである。
【図４】図４は親Ｅ３およびＥ３ｂ（生殖細胞系）タンパク質を用いたＨＵＶＥＣにおける管形成の結果を示す。
【図５】図５はｎｕ／ｎｕマウスにＳＷ−４８０結腸直腸癌細胞を移植し、ＤＸ−２２２０（１０ｍｇ／ｋｇ）、シスプラチン（４ｍｇ／ｋｇ）またはコントロールを投与した動物試験の結果をグラフで示したものである。コントロール条件は、未投与、ＰＢＳベヒクルのみ、または非特異的アイソタイプマッチＩｇＧ１抗体（Ａ２−ＳＶ）（１０ｍｇ／ｋｇ）とした。腫瘍重量はｙ軸にプロットし、腫瘍細胞注射後の日数はｘ軸にプロットした。
【図６】図６はｎｕ／ｎｕマウスにＬＮＭ３５肺癌細胞を移植し、ＤＸ−２２２０（２０ｍｇ／ｋｇ）または非特異的アイソタイプマッチＩｇＧ１抗体（Ａ２−ＳＶ）（２０ｍｇ／ｋｇ）を投与した動物試験の結果をグラフで示したものである。腫瘍体積（ｍｍ３）はｙ軸にプロットし；腫瘍細胞注射後の日数はｘ軸にプロットした。
【図７】図７Ａおよび７Ｂはそれぞれクローンｐ−Ａ１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図８】図８Ａおよび８Ｂはそれぞれクローンｐ−Ａ５の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図９】図９Ａおよび９Ｂはそれぞれクローンｐ−Ａ６の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０Ａおよび１０Ｂはそれぞれクローンｐ−Ａ１０の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｂ１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｂ３の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｃ６の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｄ６の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｄ１０の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｄ１２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｆ３の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｆ４の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂはそれぞれクローンｐ−Ｇ３の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂはそれぞれクローンｓ−Ａ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２１】図２１Ａおよび２１Ｂはそれぞれクローンｓ−Ａ１０の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２２】図２２Ａおよび２２Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｂ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２３】図２３Ａおよび２３Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｂ９の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２４】図２４Ａおよび２４Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｃ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２５】図２５Ａおよび２５Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｃ７の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２６】図２６Ａおよび２６Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｃ１０の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２７】図２７Ａおよび２７Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｄ１１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２８】図２８Ａおよび２８Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｅ１１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図２９】図２９Ａおよび２９Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｇ４の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３０】図３０はクローンｓ−Ｇ９の軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３１】図３１Ａおよび３１Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｇ１０の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３２】図３２Ａおよび３２Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｈ１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３３】図３３Ａおよび３３Ｂはそれぞれクローンｓ−Ｈ４の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３４Ａ】図３４Ａおよび３４ＢはそれぞれクローンＧ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３４Ｂ】図３４Ａおよび３４ＢはそれぞれクローンＧ２の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３５】図３５および３６はそれぞれクローンｐ−Ａ１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３６】図３５および３６はそれぞれクローンｐ−Ａ１の重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図３７−１】図３７は表５であり、重鎖配列の概要である。
【図３７−２】図３７は表５であり、重鎖配列の概要である。
【図３７−３】図３７は表５であり、重鎖配列の概要である。
【図３７−４】図３７は表５であり、重鎖配列の概要である。
【図３８−１】図３８は表６であり、軽鎖配列の概要である。
【図３８−２】図３８は表６であり、軽鎖配列の概要である。
【図３８−３】図３８は表６であり、軽鎖配列の概要である。
【図３８−４】図３８は表６であり、軽鎖配列の概要である。
【図３８−５】図３８は表６であり、軽鎖配列の概要である。
【図３９】図３９は表９であり、一部の例示されるＴｉｅ１結合抗体の特性を示す。
【図１】
2008532476.tif 000108
【図２−１】
2008532476.tif 000109
【図２−２】
2008532476.tif 000110
【図３】
2008532476.tif 000111
【図４】
2008532476.tif 000112
【図５】
2008532476.tif 000113
【図６】
2008532476.tif 000114
【図７】
2008532476.tif 000115
【図８】
2008532476.tif 000116
【図９】
2008532476.tif 000117
【図１０】
2008532476.tif 000118
【図１１】
2008532476.tif 000119
【図１２】
2008532476.tif 000120
【図１３】
2008532476.tif 000121
【図１４】
2008532476.tif 000122
【図１５】
2008532476.tif 000123
【図１６】
2008532476.tif 000124
【図１７】
2008532476.tif 000125
【図１８】
2008532476.tif 000126
【図１９】
2008532476.tif 000127
【図２０】
2008532476.tif 000128
【図２１】
2008532476.tif 000129
【図２２】
2008532476.tif 000130
【図２３】
2008532476.tif 000131
【図２４】
2008532476.tif 000132
【図２５】
2008532476.tif 000133
【図２６】
2008532476.tif 000134
【図２７】
2008532476.tif 000135
【図２８】
2008532476.tif 000136
【図２９】
2008532476.tif 000137
【図３０】
2008532476.tif 000138
【図３１】
2008532476.tif 000139
【図３２】
2008532476.tif 000140
【図３３】
2008532476.tif 000141
【図３４Ａ】
2008532476.tif 000142
【図３４Ｂ】
2008532476.tif 000143
【図３５】
2008532476.tif 000144
【図３６】
2008532476.tif 000145
【図３７−１】
2008532476.tif 000146
【図３７−２】
2008532476.tif 000147
【図３７−３】
2008532476.tif 000148
【図３７−４】
2008532476.tif 000149
【図３８−１】
2008532476.tif 000150
【図３８−２】
2008532476.tif 000151
【図３８−３】
2008532476.tif 000152
【図３８−４】
2008532476.tif 000153
【図３８−５】
2008532476.tif 000154
【図３９】
2008532476.tif 000155
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月11日(2007.7.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質を含む、被験体において脈管発生を阻害するための薬学的組成物であって、ここで該タンパク質がＴｉｅ１エクトドメインに結合し、そして、
（Ａ）該重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は以下の特性：
ｉ）（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）を包含するＨＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）を包含するＨＣ  ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号７２７）を包含するＨＣ  ＣＤＲ３；
の１つ以上を含み；
および／または、
（Ｂ）該軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は以下の特性：
ｉ）Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）を包含するＬＣ  ＣＤＲ１であって、ここでＸ１はセリンであるか非存在であり得る、ＬＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）を包含するＬＣ  ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ｑ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｈ（配列番号７２８）を包含するＬＣ  ＣＤＲ３；
の１つ以上を含み、
ここで該タンパク質は、第２の抗癌療法とともに投与される、薬学的組成物。
【請求項２】
前記重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が下記：
ｉ）（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）を包含するＨＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）を包含するＨＣ  ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号７２７）を包含するＨＣ  ＣＤＲ３；
を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項３】
前記軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列が下記：
ｉ）Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）を包含するＬＣ  ＣＤＲ１であって、ここでＸ１はセリンであるか非存在であり得る、ＬＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）を包含するＬＣ  ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ｑ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｈ（配列番号７２８）を包含するＬＣ  ＣＤＲ３；
を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項４】
前記ＨＣ可変ドメイン配列のアミノ酸配列がＥ３クローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含み、そして前記ＬＣ可変ドメイン配列がＥ３クローン由来のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３配列を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項５】
（ｉ）Ｅ３抗体のＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン、（ｉｉ）それぞれＥ３抗体のＨＣおよびＬＣ免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であるＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列、あるいは（ｉｉｉ）それぞれＥ３のＨＣまたはＬＣ可変ドメインをコードする核酸に高ストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸によりコードされるＨＣおよび／またはＬＣ免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項６】
前記タンパク質がＦａｂである、請求項１〜５の何れかに記載の薬学的組成物。
【請求項７】
前記タンパク質がＩｇＧである、請求項１〜６の何れかに記載の薬学的組成物。
【請求項８】
前記タンパク質が、Ｔｉｅ１への結合についてＥ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４と競合するか、あるいは、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４により認識されるエピトープとオーバーラップするエピトープに結合するか、あるいは、Ｅ３、Ｇ２、ｐ−Ａ１、ｐ−Ａ１０、ｐ−Ｂ１、ｐ−Ｂ３、ｐ−Ｃ６、ｐ−Ｄ１２、ｐ−Ｆ３、ｐ−Ｆ４、ｐ−Ｇ３，ｓ−Ａ１０、ｓ−Ｈ１、ｓ−Ａ２、ｓ−Ｂ２、ｓ−Ｂ９、ｓ−Ｃ１０、ｓ−Ｃ２、ｓ−Ｃ７、ｓ−Ｄ１１、ｓ−Ｅ１１、ｓ−Ｇ１０またはｓ−Ｈ４により認識されるエピトープと共通の少なくとも１、２または３つの残基を有するエピトープに結合する、請求項１に記載の薬学的組成物。
【請求項９】
前記タンパク質が下記の特性：
（１）Ｅ３抗体の少なくとも２つのＣＤＲを含む可変ドメイン配列のうちの少なくとも１つ；
（２）Ｅ３抗体の対応する可変ドメインのＣＤＲに合計で少なくとも８５％同一であるＣＤＲ配列を含む可変ドメイン配列のうちの少なくとも１つ；
（３）可変ドメインの少なくとも１つがＥ３抗体の対応する免疫グロブリン可変ドメインに少なくとも８５％同一であること；
（４）タンパク質がＴｉｅ１への結合に関してＥ３と競合するか、または、Ｔｉｅ１上のＥ３により結合されたエピトープとオーバーラップするエピトープに結合すること、および、
（５）タンパク質がＥ３またはＥ３ｂのＨＣまたはＬＣ可変ドメインをコードする核酸に高ストリンジェンシーでハイブリダイズする核酸によりコードされるドメインを含むこと；
の１つ以上を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１０】
前記抗体がＥ３の可変ドメインを含む、請求項１〜８のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、脈管構造依存性の癌または腫瘍を有する被験体における脈管発生を阻害する、請求項１〜１０の何れかに記載の薬学的組成物。
【請求項１２】
前記腫瘍が固形腫瘍である、請求項１１に記載の薬学的組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、第２の抗癌療法とともに投与され、該第２の抗癌療法は、化学療法剤を包含する、請求項１〜１２のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１４】
前記組成物が、第２の抗癌療法とともに投与され、該第２の抗癌療法は、ＶＥＧＦ経路を介したシグナリングを拮抗する薬剤を包含する、請求項１〜１２のいずれかに記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
前記ＶＥＧＦ経路を介したシグナリングを拮抗する薬剤が、ベバシズマブである、請求項１４に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
前記化学療法剤が、５−ＦＵ、ロイコボリンおよび／またはイリノテカンである、請求項１３に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
腫瘍を除去するための手術を受けた被験体に術後のアジュバント療法を提供するための薬学的組成物であって、該薬学的組成物は、重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列を含む単離されたタンパク質を含み、ここで該タンパク質がＴｉｅ１エクトドメインに結合し、そして、
（Ａ）該重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は以下の特性：
ｉ）（ＡＧＳＩＭＲＨ）−Ｙ−（ＧＶＭＫ）−Ｍ−（ＧＳＶＭＦＨ）（配列番号１１８）を包含するＨＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）（ＧＳＶ）−Ｉ−（ＳＹ）−Ｐ−Ｓ−Ｇ−Ｇ−（ＷＮＱ）−Ｔ−（ＧＹ）（配列番号１６０）を包含するＨＣ  ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ａ−Ｐ−Ｒ−Ｇ−Ｙ−Ｓ−Ｙ−Ｇ−Ｙ−Ｙ−Ｙ（配列番号７２７）を包含するＨＣ  ＣＤＲ３；
の１つ以上を含み；
および／または、
（Ｂ）該軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は以下の特性：
ｉ）Ｒ−Ａ−Ｓ−（ＲＥＱ）−（ＧＳＴＲＮ）−（ＩＶ）−（ＧＳＴＩＲＮ）−（ＳＴＩＲＨ）−Ｘ１−（ＳＹＷＮＨ）−（ＬＶ）−（ＡＳＮ）（配列番号１３２）を包含するＬＣ  ＣＤＲ１であって、ここでＸ１はセリンであるか非存在であり得る、ＬＣ  ＣＤＲ１；
ｉｉ）Ｑ−Ｑ−（ＳＹＦＲ）−（ＧＳＹＮ）−Ｓ−（ＳＴＹＷ）−（ＲＰ）−（ＬＷＲＨ）−（ＴＩＹ）（配列番号１６１）を包含するＬＣ  ＣＤＲ２；および、
ｉｉｉ）Ｑ−Ｑ−Ｆ−Ｎ−Ｓ−Ｙ−Ｐ−Ｈ（配列番号７２８）を包含するＬＣ  ＣＤＲ３；
の１つ以上を含む、薬学的組成物。
【請求項１８】
前記Ｔｉｅ結合タンパク質が、
（ａ）Ｅ３抗体の重鎖可変ドメインに少なくとも９０％同一である重鎖可変ドメイン配列およびＥ３抗体の軽鎖可変ドメインに少なくとも９０％同一である軽鎖可変ドメイン配列；
（ｂ）Ｔｉｅ１への結合に関してＥ３と競合する抗原結合部位を形成する重鎖可変ドメイン配列および軽鎖可変ドメイン配列；
または、
（ｃ）Ｅ３抗体の重鎖可変ドメインのＣＤＲのうちの１、２または３つ、および、Ｅ３抗体の軽鎖可変ドメインのＣＤＲのうちの１、２または３つ；
を含む、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
手術の４８時間以内に前記Ｔｉｅ結合タンパク質が投与される、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
手術の前後に前記Ｔｉｅ結合タンパク質が投与される、請求項１７に記載の薬学的組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成20年5月1日(2008.5.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008532476000001.app
【国際調査報告】
2008532476.tif 000156