(57)【要約】  本発明は、血管の形成(例えば血管新生)を妨げるための、例えば腫瘍増殖を妨げるための予防的または治療的処置に関する。特に本発明は、アンジオモチンに対する免疫応答を生み出すために使用することができる、完全アンジオモチン分子またはその断片を含むワクチンまたは医薬品に関する。本発明はさらに、予防的または治療的処置において使用するための、完全アンジオモチン分子またはその断片に特異的な抗体を提供する。
2008539188.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管新生および/または腫瘍形成を調節するための、単離または組換えp130アンジオモチンポリペプチド。
【請求項２】
単離または組換え哺乳動物p130アンジオモチンである、請求項1に記載のポリペプチド。
【請求項３】
単離または組換えヒトp130アンジオモチンである、請求項2に記載のポリペプチド。
【請求項４】
(i)配列番号1の配列、または
(ii)配列番号1と少なくとも80%および/または少なくとも90%および/または少なくとも95%および/または少なくとも98%の同一性を有し、機能性ポリペプチドを与える配列、または
(iii)配列番号1または(ii)の配列の機能性断片を含み、
p80アンジオモチンまたはp80アンジオモチンの断片ではない、請求項1から3のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
配列番号1の機能性断片が配列番号1のアミノ酸残基1〜409からなる、請求項4に記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項1から5のいずれか一項に記載のp130アンジオモチンポリペプチドと結合することができる、抗体またはその断片。
【請求項７】
配列番号1の残基1〜残基409によって定義されるp130アンジオモチンポリペプチドの領域とは結合することができるが、p80アンジオモチンポリペプチドとは結合することができない、請求項6に記載の抗体または断片。
【請求項８】
配列番号1の残基410〜残基1084によって定義されるp130アンジオモチンポリペプチドの領域とは結合することができるが、p80アンジオモチンポリペプチドとは結合することができない、請求項6に記載の抗体または断片。
【請求項９】
配列番号1の残基871〜残基1013によって定義されるp130アンジオモチンポリペプチドの領域とは結合することができるが、p80アンジオモチンポリペプチドとは結合することができない、請求項6に記載の抗体または断片。
【請求項１０】
請求項1から5のいずれか一項に記載のp130アンジオモチンポリペプチドと結合することができる抗体を生成するための、請求項1から5のいずれか一項に記載のアンジオモチンポリペプチドおよび/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)の使用。
【請求項１１】
医薬において使用するための、請求項1から5のいずれか一項に記載のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または請求項6から9のいずれか一項に記載の抗体または断片。
【請求項１２】
血管新生および/または腫瘍形成を調節するための医薬品の製造における、請求項1から5のいずれか一項に記載のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または請求項6から9のいずれか一項に記載の抗体または断片の使用。
【請求項１３】
前記医薬品が血管新生および/または腫瘍形成を予防するかつ/または低下させる、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
血管新生関連疾患または障害を有する対象を治療するための医薬品の製造における、請求項1から5のいずれか一項に記載のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または請求項6から9のいずれか一項に記載の抗体または断片の使用。
【請求項１５】
血管新生および/または腫瘍形成および/または血管新生関連疾患または障害を有するか、あるいはその危険性がある対象に予防接種するためのワクチンの製造における、請求項1から5のいずれか一項に記載のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または請求項6から9のいずれか一項に記載の抗体または断片の使用。
【請求項１６】
血管新生関連疾患または障害が癌、固形腫瘍、血管腫、眼内血管新生、糖尿病性網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチ、炎症状態、乾癬、腸の慢性炎症、喘息または子宮内膜症である、請求項14または15の使用。
【請求項１７】
試験サンプル中の血管新生および/または腫瘍形成の検出および/または測定における、請求項6から9のいずれか一項に記載の抗体または断片の使用。
【請求項１８】
血管新生および/または腫瘍形成を調節するための医薬組成物であって、有効量の請求項1から5のいずれか一項に記載のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または請求項6から9のいずれか一項に記載の抗体または断片、ならびに医薬賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
【請求項１９】
血管新生および/または腫瘍形成を予防するかつ/または低下させる、請求項18に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
血管新生および/または腫瘍形成を調節するためのワクチンであって、有効量の請求項1から5のいずれか一項に記載のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、ならびに賦形剤または希釈剤を含むワクチン。
【請求項２１】
ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または抗体またはその断片の作用を補助または補強するための少なくとも1つの添加剤をさらに含む、請求項20に記載のワクチンまたは請求項18または19に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記少なくとも1つの添加剤が免疫賦活分子である、請求項21に記載のワクチンまたは請求項21に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記免疫賦活分子がサイトカインまたはサイトカインをコードするポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)である、請求項22に記載のワクチンまたは請求項22に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
細胞または細胞抽出物を含む、請求項20から23のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項２５】
細胞がアンジオモチンポリペプチドを担持した抗原提示細胞、またはコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)をトランスフェクトした抗原提示細胞である、請求項24に記載のワクチン。
【請求項２６】
前記細胞がアンジオモチンを発現する腫瘍細胞、またはアンジオモチンを発現する内皮細胞である、請求項25に記載のワクチン。
【請求項２７】
哺乳動物でアンジオモチンに対する免疫応答を生み出す方法であって、
(iii)請求項1から5のいずれか一項に記載のアンジオモチンポリペプチド、またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)を用いて、哺乳動物から回収した免疫細胞をex vivoで刺激する段階と、
(iv)刺激した免疫細胞を哺乳動物に戻すことによりアンジオモチンに対する免疫応答が生じるように、この細胞を哺乳動物に戻す段階、
を含む方法。
【請求項２８】
前記哺乳動物がヒトである、請求項27に記載の方法。
【請求項２９】
前記免疫応答が予防的または治療的に働いて血管新生関連疾患の発症または進行を阻害する、請求項27または28に記載の方法。
【請求項３０】
前記コードポリヌクレオチドが、
(i)配列番号2のポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、または
(ii)配列番号2と少なくとも80%および/または少なくとも90%および/または少なくとも95%および/または少なくとも98%の同一性を有し、かつ/または65℃で2×SSCの条件下で配列番号2とハイブリダイズすることができ、かつ/または機能性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、または
(iii)機能性ポリペプチドをコードする配列番号2の断片を含み、
前記ポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)が、p80アンジオモチンまたはp80アンジオモチンの断片をコードしない、請求項10から17のいずれか一項に記載の使用、または請求項18、19または21のいずれか一項に記載の医薬組成物、または請求項20から26のいずれか一項に記載のワクチン、または請求項27から29のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管形成を妨げるための、例えば腫瘍増殖、網膜疾患、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、慢性関節リウマチおよび炎症状態を妨げるための予防的または治療的処置に関する。
【背景技術】
【０００２】
1つの形の予防的または治療的処置は予防接種である。ワクチンは、病原体による病気から人間を保護するであろう免疫応答を刺激するために投与される、病原体またはその成分由来の調製物である。治療用(処置用)ワクチンは疾患の発症後に投与され、疾患の進行を低下または停止させることを目的とする。予防(予防用)ワクチンは、初期の疾患発症を予防することを目的とする。ワクチンに使用する病原体は、例えば全菌体死菌(不活化)、生弱毒(弱体化)病原生物であってよく、人為的に製造することができる。
【０００３】
ワクチンは、宿主の免疫系を刺激して、主な標的に対する抗体および/または免疫細胞(細胞毒性T細胞)を特異的に生成することによってその作用を媒介する。これらの標的は「抗原」として知られている。標的抗原に対する免疫応答の刺激は、免疫性を与えた宿主の身体に存在する病原体の免疫介在性の破壊および排除をもたらす。ひとたび刺激されると、免疫系はさらに、標的物質による二次感染または疾患の発症に対する監視を保つ。したがってワクチンは、既存の疾患を制御し、かつ将来のその悪化または再発を抑制する1つの有効な方法である。
【０００４】
標的抗原に対して予防接種するための様々な方法が存在する。これらの方法の幾つかは、完全タンパク質、タンパク質の断片に対応する合成ペプチド、および/またはタンパク質をコードするDNA/RNA配列を注射することを含む。DNAおよびRNAを送達するための送達媒体には、遺伝子を発現する改変型ウイルス、サイトカインまたは成長因子などの他の免疫賦活剤と共に抗原を発現する裸DNA/RNAまたは組換えプラスミドがある。
【０００５】
予防接種に対する代替として、宿主外で作製され当該の抗原に特異的である治療用抗体を用いて宿主を治療することによって、予防的または治療的処置を実施することができる。
【０００６】
所望の抗原またはエピトープに対する抗体を作製、単離および使用するための方法は、当業者にはよく知られている。例えば抗体は、当技術分野で知られている標準的な方法を使用して、適切な宿主動物(例えばマウス、ウサギまたはヤギなど)において産生することができ、粗製抗血清として使用することができるか、あるいは例えば親和性による精製によって精製することができる。組換え抗体の分子ライブラリーからの選択、あるいは適切なフレームワーク領域への相補性決定領域(CDR)の移植またはシャッフリングを含めたよく知られている分子生物学の方法を使用して、望ましい特異性の抗体を代わりに作製することができる。ヒト抗体は、よく知られている分子生物学の技法を使用して、組換えライブラリーから選択することができ、かつ/または非ヒト抗体由来のCDRをヒトフレームワーク領域に移植することによって作製することができる。このような抗体は療法治療用物質として使用することができる。例えば、治療用抗体を含む薬剤を、対象中に導入して対象の免疫応答を調節することができる。例えば、対象中のある抗原に特異的な治療用抗体はその抗原に対する免疫応答を刺激し、それによって免疫応答を誘導および/または促進し、回復を助長するはずである。
【０００７】
脈管形成は幹細胞の内皮細胞への分化であり、これは次いで血管を形成する。血管新生は、既存の血管からの血管の形成である。血管形成、血管新生化および脈管化などの用語は、脈管形成と血管新生の両方を含む。
【０００８】
血管新生(血管形成の一例)は、既存の血管からの出現のプロセスによる新たな毛細血管の形成であり、発生中ならびに幾つかの生理的および病的状態中に起こる(Folkman、1995、Nature Medicine、1: 27〜31)。血管新生のプロセスによる新たな血管の形成は、内皮細胞増殖、移動、策状組織および管を形成するための相互作用および接着、ならびに最後に成熟を含めた複雑な一連の事象を含む。生理学上、血管新生は組織の成長、傷の治癒、および女性の生殖機能に必要不可欠であり、網膜疾患、アテローム性動脈硬化症、子宮内膜症、慢性関節リウマチおよび炎症状態などの病的プロセスの構成要素である。しかし、長年にわたる血管新生の関心の大部分は、固形腫瘍が危険な大きさより大きく増大するためには、それらは周囲の基質から内皮細胞を動員して、その独自の内因性微小循環を形成しなければならないという概念に由来する。血管新生化を促進するために、内皮細胞の増殖および移動を刺激するさまざまな因子を腫瘍は放出する。このような因子には、血管内皮細胞増殖因子(VEGF)および塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、インターロイキン-8(IL-8)胎盤増殖因子、およびチミジンホスホリラーゼ(血小板由来内皮細胞増殖因子; Relf et al.、1997、Cancer Research、57: 963〜9)がある。したがって、これらのシグナル経路に干渉しそれによって腫瘍の血管新生を阻害する分子を発見するための、多大な尽力が捧げられてきている。
【０００９】
血管新生の標的化は、伝統的な腫瘍細胞破壊療法と比較しておそらく幾つかの利点を有する。最も顕著な利点は、全ての固形腫瘍は血管新生依存的であり、標的内皮細胞に療法を容易に利用することができ、それらはゲノムが安定しており、療法に対する耐性が生じる傾向が低いことである。癌細胞発現タンパク質を標的化することの明らかな欠点の1つは、急激な細胞増殖および分裂による遺伝的変異性および多大な淘汰圧であり、この欠点は耐性機構ならびに他の経路の開始および使用のため、このような薬剤を無効にすることが多い。
【００１０】
血管新生の阻害は、いずれも眼部血管の過剰成長が原因である糖尿病性網膜症および黄斑変性に関する、初期の有望性も示している。これらの障害では、血管が眼中の正常な構造に干渉し、あるいは眼球の背面に光が到達するのを阻害する。新たな血管はそれ自体が主な病状であり、血管の成長を停止させることによって失明を予防する可能性がある。
【００１１】
アンギオスタチン(プラスミノゲンの38kDaのタンパク質分解断片)、抗血管新生抗トロンビンIII、エンドスタチン(コラーゲンXVIII断片)、インターフェロンα/β/γ、プロラクチン16kDa断片およびトロンボスポンジン-1(TSP-1)などの、多数の天然に存在する血管新生阻害剤が同定されてきており、これらはin vitroおよびin vivoモデルにおいて様々な程度の影響を示す。これらの阻害剤は内皮細胞を標的化し、血管新生を阻害する。例えばアンギオスタチンの観察される阻害は、内皮細胞がどの血管新生因子によって刺激されるかとは無関係である(Eriksson et al.、2003 FEBS Letts.、536: 19〜24)。これは、VEGF-受容体キナーゼ活性を阻害するVEGFまたは低分子量化合物と結合する抗体などの物質と対照的である。大部分の腫瘍は様々な血管新生因子を発現し、ただ1つの血管新生経路の標的化は腫瘍の広がりを阻害するのに充分ではないことが示される。したがって、内皮細胞を直接標的化する療法には、複数の腫瘍誘導因子によって制御される血管新生の問題を回避する可能性がある。しかし、他方ではこのような療法は、成熟血管を考慮しながら血管新生化のプロセスと関係がある内皮細胞の特異的標的化を可能にするという、課題に取り組まなければならない。
【００１２】
アンジオモチンという名称の80kDaの分子(「p80アンジオモチン」)が、血管新生阻害剤、アンギオスタチンと結合する、その能力によって同定された(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254; WO99/66038)。p80アンジオモチンは、2つの他のメンバー、アンジオモチン様タンパク質1(Amot1)および2(Amot2)と共に新たなタンパク質ファミリーに属する。これらのタンパク質は、保存的コイルドコイルドメインおよびC末端PDZ結合モチーフによって特徴付けられる(Nishimura et al.、2002、J.Biol.Chem.、277: 5583〜5587; Bratt et al.、2002、Gene、298: 69〜77)。p80アンジオモチンは、細胞外アンギオスタチン結合ドメインを含むので、その関連タンパク質と異なる。p80アンジオモチンは内皮細胞中で主に発現され、内皮細胞の移動およびin vitroでの管形成に対するアンギオスタチンの阻害効果に介在する(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)。マウス大動脈内皮(MAE)細胞中のp80アンジオモチンの発現は、化学走性因子に対する移動応答性を増大させる(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)。移動における役割は、前側臓側内胚葉における移動欠陥のために約70%のノックアウトマウスが第7〜8日胚中に死んだ、マウスにおけるp80アンジオモチンのノックアウト実験からの発見によってさらに強調される(Shimono and Behringer、2003、Current Biology、13: 613〜7)。
【００１３】
初代細胞および細胞系におけるp80アンジオモチンの発現パターンのリアルタイムPCR分析は、アンジオモチンは内皮細胞中で主に発現されることを示している。p80アンジオモチンのin vivoマッピングは、ヒト胎盤などの血管新生組織および腫瘍組織中での発現を明らかにしている。これらのデータは、アンジオモチンは内皮細胞において血管新生中に上方制御されることを示唆する。WO99/66038はp80アンジオモチン、および例えば薬剤スクリーニング標的としてのその使用を論じている。
【００１４】
(「p130アンジオモチン」と名付けられた)130kDaであるp80アンジオモチンの新規のスプライスイソ型が、近年同定されている。このさらに大きなイソ型は延長したN末端ドメインを含み、p80アンジオモチンとは異なるがそれと関連した血管新生における役割を果たす。
【特許文献１】WO99/66038
【特許文献２】PCT/EP2004/014573
【特許文献３】米国特許第4,708,871号
【特許文献４】WO97/40177
【特許文献５】米国特許第5,869,445号
【特許文献６】WO02/053181
【特許文献７】米国特許第5,951,988号
【特許文献８】WO92/07573
【特許文献９】WO94/10323
【非特許文献１】Folkman、1995、Nature Medicine、1: 27〜31
【非特許文献２】Relf et al.、1997、Cancer Research、57: 963〜9
【非特許文献３】Eriksson et al.、2003 FEBS Letts.、536: 19〜24
【非特許文献４】Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254
【非特許文献５】Shimono and Behringer、2003、Current Biology、13: 613〜7
【非特許文献６】Levchenko et al.、2003、J Cell Sci.、116: 3803〜3810
【非特許文献７】Bratt et al.、2002、Gene、298: 69〜77
【非特許文献８】Morrison et al.、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81、6851〜6855
【非特許文献９】Better et al.、1988、Science、240: 1041
【非特許文献１０】Skerra et al.、1988、Science、240、1038
【非特許文献１１】Bird et al.、1988、Science 242: 423
【非特許文献１２】Huston et al.、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85: 5879
【非特許文献１３】Ward et al.、1989 Nature 341、544
【非特許文献１４】Winter et al.、1991、Nature、349、293〜299
【非特許文献１５】London et al.、2003、Cancer Gene Ther.、10: 823〜832
【非特許文献１６】Epitope Mapping Protocols (1996) Methods Mol Biol 66 (Glenn E Morris、Ed、Humana Press、Totowa、New Jersey
【非特許文献１７】Geysen et al.、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、81: 3998〜4002
【非特許文献１８】Geysen et al.、1986、Mol.Immunol.、23: 709〜715
【非特許文献１９】Hopp et al.、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、78: 3824〜3828
【非特許文献２０】Kyte et al.、1982、J Mol.Biol.、157: 105〜132
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【非特許文献４７】Bueler、1999、Biol.Chem.、380: 613〜22
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【非特許文献５０】Nestle et al.、1998、Nature Med.、4: 328〜332
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【非特許文献５４】Nanni et al.、2001、J.Exp.Med.、194: 1195
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【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明は、血管の形成(血管新生)を妨げる免疫応答を生み出すための、完全p130アンジオモチン分子またはその断片に相当するワクチンの使用を提供する。本発明はさらに、p130アンジオモチン分子を用いた予防接種、ならびに血管新生化によって生成または悪化する腫瘍増殖および他の疾患に重要である血管の形成を予防するためのワクチンの使用法を提供する。
【００１６】
本発明はさらに、血管の形成(血管新生)を妨げるための、および/または血管新生化によって生成または悪化する腫瘍増殖および他の疾患に重要である血管の形成を予防するための医薬品として使用するための、p130アンジオモチンに特異的な治療用抗体、およびその断片を提供する。
【００１７】
本発明の第1の態様は、血管新生および/または腫瘍形成を調節するための、単離または組換えp130アンジオモチンポリペプチドを提供する。
【００１８】
ポリペプチドを単離するための様々な方法が、当業者に知られている。例えばポリペプチドは、親和性による精製を使用することによって、タンパク質を発現する細胞から単離することができる。組換えポリペプチドを生成するための方法もよく知られており、細菌、酵母菌、昆虫および哺乳動物細胞系での発現を含む。ポリペプチドを単離するための方法、および組換えポリペプチドを発現させるための方法は、例えばSambrook et al.、2001、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd Edition)中で論じられている。
【００１９】
「ポリペプチド」に、ペプチド結合によって互いに結合した約10個以上のアミノ酸(またはその誘導体)の鎖を含める。本発明のポリペプチドは、1つまたは複数の化学基(例えば、リン酸基およびファルネシル基など)を加えることによって修飾することができる。本発明は、グリコシル化されているかあるいはされていないポリペプチドも含む。酵母菌または哺乳動物発現系において発現されるポリペプチドは、発現系に応じて、原型分子と分子量およびグリコシル化パターンが同等であるか、あるいはわずかに異なる可能性がある。例えば、大腸菌などの細菌中でのポリペプチドをコードするDNAの発現は、非グリコシル化分子を典型的には与える。真核生物タンパク質のN-グリコシル化部位は、アミノ酸トリプレットAsn-A1-Z(この場合A1はプロリン以外の任意のアミノ酸であり、Zはセリンまたはスレオニンである)によって特徴付けられる。不活性N-グリコシル化部位を有するポリペプチドの変異体は、オリゴヌクレオチド合成および結合または部位特異的突然変異誘発技法などの、当業者に知られている技法によって生成することができ、これらは本発明の範囲内にある。あるいは、N-結合グリコシル化部位を本発明のポリペプチドに加えることができる。
【００２０】
「p130アンジオモチン」に、任意の完全長の天然に存在する130kDaのアンジオモチンポリペプチド(例えば、実施例中に本発明者によって記載されるp130アンジオモチンポリペプチド)、または天然に存在するp130アンジオモチンポリペプチドまたはその断片との抗原交差反応性を保持する、その任意の変異体を含める。
【００２１】
ポリペプチドは単離または組換え哺乳動物p130アンジオモチンであることが好ましく、単離または組換えヒトp130アンジオモチンであることがより好ましい。
【００２２】
ポリペプチドは、
(i)配列番号1の配列、または
(ii)配列番号1と少なくとも80%および/または少なくとも90%および/または少なくとも95%および/または少なくとも98%の同一性を有し、機能性ポリペプチドを与える配列、または
(iii)配列番号1または(ii)の配列の機能性断片を含み、
p80アンジオモチンまたはp80アンジオモチンの断片ではないポリペプチドを含むことがより好ましい。
【００２３】
用語「アンジオモチン」は当業者によく知られており、コイルドコイルおよびC末端PDZ結合ドメインを有しており、細胞表面結合タンパク質であると考えられ、アンギオスタチンと結合し内皮細胞の移動および管形成に対するアンギオスタチンの阻害効果に介在すると考えられる、ポリペプチドを含む。天然に存在するアンジオモチンポリペプチドの例は、以下の: Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254; WO99/66038; Levchenko et al.、2003、J Cell Sci.、116: 3803〜3810; Bratt et al.、2002、Gene、298: 69〜77; GenBankアクセッション番号: NP_573572(ヒト)中に与えられている。
【００２４】
しかし、p80アンジオモチンポリペプチドおよびその断片と同一であるp130アンジオモチンポリペプチドおよび/またはその断片は、本発明のポリペプチドであるとは考えられない。
【００２５】
「機能性ポリペプチドおよび/または配列番号1の機能性断片」に、配列番号1の細胞機能の一部分または全てを示す配列番号1の任意の断片を含める。配列番号1の機能性断片は、p80アンジオモチンとの類似性を有していないp130アンジオモチンのN末端領域であることが好ましく、配列番号1のアミノ酸残基1〜409を含むかあるいはそれらからなる断片であることがより好ましい。実施例中に示すように、p130アンジオモチンのN末端は、ストレスファイバーを誘導し細胞の形状を変えることができ、これらはいずれも血管新生の助長と関係がある完全長p130アンジオモチンの機能である。
【００２６】
本発明の第2の態様は、本発明のp130アンジオモチンポリペプチドと結合することができる抗体またはその断片を提供する。
【００２７】
抗体は、ジスルフィド結合によって結合したMr50,000〜70,000の2つの同一のポリペプチド(「重鎖」と呼ばれる)を含み、その各々は、Mr25,000のポリペプチドの同一対(「軽鎖」と呼ばれる)の1つと結合している。異なる抗体分子の重鎖の個々のN末端間、および異なる抗体分子の個々の軽鎖間には相当な配列の変動性が存在し、したがってこれらの領域は、「可変ドメイン」と呼ばれている。逆に、異なる抗体分子の重鎖の個々のC末端間、および異なる抗体分子の個々の軽鎖間には相当な配列の類似性が存在し、したがってこれらの領域は、「定常ドメイン」と呼ばれている。
【００２８】
抗原結合部位は、重鎖と軽鎖の対の可変ドメイン中の超可変領域から形成される。超可変領域は相補性決定領域(CDR)としても知られており、リガンドに対する抗体の特異性を決定する。重鎖(VH)および軽鎖(VL)の可変ドメインは3個のCDRを典型的には含み、フレームワーク領域(FR)として知られるその各々は、低い変動性で配列の側面に位置する。
【００２９】
抗体の可変重鎖(VH)および可変軽鎖(VL)ドメインは、抗原認識、初期のプロテアーゼによる消化実験によって最初に認められた事実と関係がある。げっ歯類抗体の「ヒト化」によって他の確証が見出された。げっ歯類起源の可変ドメインは、生成する抗体がげっ歯親抗体の抗原特異性を保持するように、ヒト起源の定常ドメインと融合させることができる(Morrison et al.、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81、6851〜6855)。
【００３０】
抗原特異性は可変ドメインによって与えられ、定常ドメインと無関係であることは、いずれも1つまたは複数の可変ドメインを含む抗体断片の、細菌における発現に関する実験から知られている。これらの分子はFab様分子を含む(Better et al.、1988、Science、240: 1041)。Fv分子(Skerra et al.、1988、Science、240、1038);VHおよびVLパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドによって結合している単鎖Fv(ScFv)分子(Bird et al.、1988、Science 242: 423; Huston et al.、1988、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、85: 5879)および単離Vドメインを含むシングルドメイン抗体(dAb)(Ward et al.、1989 Nature 341、544)。その特異的結合部位を保持する抗体断片の合成に関する技法の一般的な総説は、Winter et al.、1991、Nature、349、293〜299中に見られる。
【００３１】
「ScFv分子」に、VHおよびVLパートナードメインが柔軟なオリゴペプチドによって結合している分子を意味する。
【００３２】
抗体断片を使用することの利点は、完全抗体を使用することより数倍である。小さな大きさの断片は、固形組織の優れた浸透性などの改善された薬理学的性質をもたらし得る。補体結合などの完全抗体のエフェクター機能は除かれる。Fab、Fv、ScFvおよびdAb抗体断片はいずれもEscherichia coli(大腸菌)において発現され、そこから分泌される可能性があり、したがって多量の前記断片の容易な生成を可能にする。
【００３３】
完全抗体、およびF(ab')2断片は「二価」である。「二価」に、前記抗体およびF(ab')2断片が2つの抗原結合部位を有することを意味する。対照的に、Fab、Fv、ScFvおよびdAb断片は、ただ1つの抗原結合部位を有する一価である。
【００３４】
所望の抗原またはエピトープに対する抗体を作製、単離および使用するための方法は、当業者にはよく知られている。例えば抗体は、当技術分野で知られている標準的な方法を使用して、適切な宿主動物(例えばマウス、ウサギまたはヤギなど)において産生することができ、粗製抗血清として使用することができるか、あるいは例えば親和性による精製によって精製することができる。組換え抗体の分子ライブラリーからの選択、あるいは適切なフレームワーク領域への相補性決定領域(CDR)の移植またはシャッフリングを含めたよく知られている分子生物学の方法を使用して、望ましい特異性の抗体を代わりに作製することができる。ヒト抗体は、よく知られている分子生物学の技法を使用して、組換えライブラリーから選択することができ、かつ/または非ヒト抗体由来のCDRをヒトフレームワーク領域に移植することによって作製することができる。
【００３５】
抗体または断片は、配列番号1の残基1〜残基409によって定義されるp130アンジオモチンポリペプチドの領域とは結合することができるが、p80アンジオモチンポリペプチドとは結合することができないことが好ましい。配列番号1の残基1〜409は、p80アンジオモチンのポリペプチド配列と同一性を有していないp130アンジオモチンのN末端に対応する。
【００３６】
抗体または断片は、配列番号1の残基410〜残基1084によって定義されるp130アンジオモチンポリペプチドの領域とは結合することができるが、p80アンジオモチンポリペプチドとは結合することができないことが好ましい。配列番号1の残基410〜1084は、p80アンジオモチンのポリペプチド配列と類似性を有するp130アンジオモチンのC末端に対応する。
【００３７】
抗体または断片は、配列番号1の残基871〜残基1013によって定義されるp130アンジオモチンポリペプチドの領域とは結合することができるが、p80アンジオモチンポリペプチドとは結合することができないことが好ましい。配列番号1の残基871〜1013は、p80アンジオモチンのアンギオスタチン結合ドメインのポリペプチド配列と類似性を有する、p130アンジオモチンのアンギオスタチン結合ドメインに対応する。
【００３８】
抗体は、ヒト抗体であることが好ましい。
【００３９】
p80アンジオモチンポリペプチドおよびその断片と結合することができる抗体を、本発明の抗体であると考えることはできない。
【００４０】
本発明の第3の態様は、本発明のp130アンジオモチンポリペプチドと結合することができる抗体を生成するための、本発明のアンジオモチンポリペプチドおよび/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)の使用を提供する。
【００４１】
所望の抗原またはエピトープに対する抗体(例えば、本発明のp130アンジオモチンポリペプチド)を作製、単離および使用するための方法は当業者にはよく知られており、前に論じた方法を含む。
【００４２】
本発明の第4の態様は、医薬において使用するための、本発明のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または本発明の抗体または断片を提供する。
【００４３】
「ポリヌクレオチド」に、DNA(デオキシリボ核酸)および/またはRNA(リボ核酸)の一本鎖および/または二本鎖分子ならびにそれらの誘導体を含める。「コードポリヌクレオチド」に、その配列が翻訳されて所望のポリペプチドを形成し得るポリヌクレオチドを含める。「アンチセンスポリヌクレオチド」に、コードポリヌクレオチドのコード鎖と相補的であるポリヌクレオチドを含める。
【００４４】
本発明者は、p130アンジオモチンおよびp80アンジオモチンは、脈管形成および/または血管新生を調節する際に役割を果たすことを実証している。特に、これらのポリペプチドは、細胞の移動、細胞の大きさおよび管形成を調節することによる脈管形成および/または血管新生の促進と関係がある。本発明のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または本発明の抗体または断片は、したがって医薬において使用できる可能性がある。
【００４５】
脈管形成および/または血管新生を制御する分子プロセスの調節制御の消失によって特徴付けられる、幾つかの医学的状態が存在する。例えば、脈管形成/血管新生関連疾患には、癌(特に固形腫瘍)、血管腫、眼内血管新生、糖尿病性網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチ、炎症状態(乾癬、腸の慢性炎症、喘息など)および子宮内膜症がある。
【００４６】
本発明者は、その開示が参照により本明細書に組み込まれているPCT/EP2004/014573中に、アンジオモチン分子(特に、p80アンジオモチン)は、脈管形成および/または血管新生に対する療法および/または予防または治療剤として有効に使用することができることを以前に示している。
【００４７】
本発明の第5の態様は、血管新生および/または腫瘍形成を調節するための医薬品の製造における、本発明のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド、および/または本発明の抗体または断片の使用を提供する。
【００４８】
ポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を医薬品、医薬組成物およびワクチンに配合するための方法は、当業者にはよく知られている。本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を含む医薬品、医薬組成物およびワクチンの好ましい配合物は、実施例中に記載する。
【００４９】
医薬品は、血管新生および/または腫瘍形成を予防するかつ/または低下させることが好ましい。
【００５０】
血管新生および/または腫瘍形成を検出および/または測定するために、幾つかのよく知られている方法を使用することができ、これらの方法を使用して、医薬品が血管新生および/または腫瘍形成を予防するかつ/または低下させるかどうかを、決定することができることは理解されるはずである。予防接種の有効性は、例えば酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を使用して抗体力価を分析すること、酵素結合イムノスポット(ELISPOT)アッセイを使用して、γ-インターフェロン生成によるT細胞活性化を間接的に測定することによって測定することができる。循環する内皮細胞のレベルを定量化することもでき、首尾良い予防接種のための代理マーカーとして使用することができる。血管新生の「レベル」は、実施例中およびTroyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254中に記載されたように、内皮細胞の管形成および存在を決定することによって測定することができる。
【００５１】
例えばマイクロメーターを使用して腫瘍の大きさおよび体積を測定することによって、腫瘍を検出および/または測定することができる。腫瘍中の血管新生化は、(例えば、London et al.、2003、Cancer Gene Ther.、10: 823〜832中に記載されたのと同様の)「Matrigel-plug」アッセイ、またはスキン-フラップウインドウ-チャンバモデルなどのイメージングによるアッセイを含めた、様々な既知のアッセイによって評価することができる。
【００５２】
本発明の第6の態様は、血管新生関連疾患または障害を有する対象を治療するための医薬品の製造における、本発明のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または本発明の抗体または断片の使用を提供する。
【００５３】
本発明の第7の態様は、血管新生および/または腫瘍形成および/または血管新生関連疾患または障害を有するか、あるいはその危険性がある対象に予防接種するためのワクチンの製造における、本発明のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または本発明の抗体または断片の使用を提供する。
【００５４】
血管新生関連疾患または障害は癌、固形腫瘍、血管腫、眼内血管新生、糖尿病性網膜症、黄斑変性、慢性関節リウマチ、炎症状態、乾癬、腸の慢性炎症、喘息または子宮内膜症であることが好ましい。
【００５５】
脈管形成/血管新生関連疾患の危険性がある患者は、癌の危険性がある患者、特に固形腫瘍の危険性がある患者、例えば固形腫瘍につながる癌を形成する遺伝的素因を有する患者、または固形腫瘍の環境的危険性がある患者であってよい。例えば、癌の危険性がある患者は、結腸中にポリープを示す癌家系の病歴を有する人間、子宮頸癌と関係があるヒトパピローマウイルスの系統に感染している、および/または子宮頸癌の初期の変化を実証するパップスメアを受けることが知られている女性であってよい。
【００５６】
治療する対象はヒト、例えば(前に定義したような)血管新生関連疾患または状態を有するか、あるいはその危険性があるヒトであることが好ましい。あるいはレシピエントは、このような状態を有するか、あるいはその危険性がある動物、例えば家畜動物(例えば、ネコまたはイヌ)、あるいは農業において重要な動物、例えばウシ、ヒツジ、ヤギ、または家禽類であってよい。
【００５７】
医薬品または治療剤は、予防治療剤または療法治療剤であってよい。
【００５８】
所望の抗原またはエピトープに対する抗体を作製、単離および使用するための方法は、当業者にはよく知られており前に論じている。このような抗体を療法中に使用することができる。例えば、治療用抗体を含む医薬品を対象に導入して、その対象の免疫応答を調節することができる。例えば、対象中の抗原に特異的な治療用抗体は、その抗原に対する免疫応答を刺激し、それによって免疫応答を誘導および/または助長し、回復を促進するはずである。治療用抗体をその必要性がある患者に投与するための方法は、当技術分野でよく知られている。本発明の抗体を治療用抗体として使用して、p130アンジオモチンに対する対象中の免疫応答を調節し、好ましくはその対象における血管新生を阻害するかつ/または低下させることができることは理解されるはずである。
【００５９】
本発明のアンジオモチンポリペプチドまたはポリヌクレオチドを対象に投与することによって、あるいは対象の免疫細胞を対象の身体外で本発明のアンジオモチンポリペプチドまたはポリヌクレオチドに曝し、次に曝露した免疫細胞(および/またはそれらの子孫)を対象に戻すことによって、予防接種を実施することができる。
【００６０】
本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを免疫原として用いる予防接種の範囲は制限されず、タンパク質、ペプチドおよび遺伝子系予防接種戦略を含む。例えばワクチンは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチド、あるいはその免疫賦活誘導体または断片を含むことができる。タンパク質またはペプチド系およびポリヌクレオチド/遺伝子系ワクチン要素を、同時あるいは逐次的に対象に投与することは望ましい可能性がある。これは強力で、広範囲またはよりバランスのとれた免疫応答を促進し得る。
【００６１】
誘導体には、(A)原型タンパク質のアミノ酸配列が1つまたは複数のアミノ酸位置で修飾されて分子の免疫原性が増大している、本発明のポリペプチドの類似体、(B)1つまたは複数のアミノ酸の化学修飾体、生成するペプチドの免疫原性を増大させるための、人工化学基による前記アミノ酸上に本来存在する1つまたは複数の化学基の置換体など、(C)本発明のポリペプチドの断片に対応するペプチドと、免疫原タンパク質(例えば、キーホールリンペットヘモシアニン-KLH)またはハプテン(すなわち、ジニトロフェノール-DNPなどの小さな化学分子)の複合体があるが、これらだけには限られない。
【００６２】
ワクチンは、レシピエント中の内因性p130アンジオモチンに対する耐性を破壊し免疫応答を生み出すことができると考えられる。例えば、ヒト中の血管形成に対して有効なワクチンは有効量のヒトp130アンジオモチン分子および/またはそのコードポリヌクレオチドを含むことができ、p130アンジオモチン分子またはコードされているp130アンジオモチンポリペプチドは、内因性p130アンジオモチン中に存在し接触可能であるエピトープに対する免疫応答を促進する、完全長アンジオモチンまたはその断片であってよい。
【００６３】
ワクチンは(抗原として)1つまたは複数の腫瘍抗原、および他の知られている血管新生因子、例えばアンギオスタチン受容体をさらに含むことができる。
【００６４】
例えば、Her2/neu腫瘍抗原、癌遺伝子の断片の膜透過細胞外(TMEC)部分をコードするプラスミドは、ヒトアンジオモチン分子をコードするプラスミドと相乗作用して、腫瘍の発達を低下させることができる。TMEC部分は、ヒトHer2/neu癌遺伝子の相同体であるラットp185(TMEC)の、膜透過および細胞外(TMEC)部分に由来してよい。これは、どのようにしてアンジオモチン系ワクチンが「アジュバント」として腫瘍抗原と相乗作用することができるかを例証し、これはこの例ではHer2/neuに由来するが、癌/精巣腫瘍抗原由来の抗原(例えば、MAGE、BAGE、GAGE、NY-ESO-1ファミリーの抗原)、分化抗原(例えば、MART-1/MelanA、MC1R、Gp100、PSA、PSM、チロシナーゼ、TRP-1および-2)、広く発現される抗原ART-4、CAMEL、CEA、Cyp-B、hTERT、iCE、MUC1および2、PRAME、P15、RUTおよび2、SART-1および3、WT1)、ならびに他のさらに特有または共通の抗原(例えば、AFP、b-カテニン、カスパーゼ-8、CDK-4、ELF2、G250、HSP70、HST-2、KIA A0205、MUM-1、2および3、RAGE)、ウイルス抗原(例えば、HPV-E7、EBV抗原)、または融合タンパク質由来の抗原(例えば、bcr-abl、Del-cain、LDL/FUT、TEL/AML1由来の抗原)などの例だけには限られず、これらを含めた、ヒト腫瘍中で発現される任意の腫瘍抗原に由来する可能性がある。腫瘍抗原は、完全組換えタンパク質、プラスミド、ペプチド、あるいはそれらの断片または一部分(例えば、クラスIまたはクラスIIエピトープ)として投与することができる。
【００６５】
ワクチンは、腫瘍抗原または抗原因子に対する1つまたは複数の抗体もさらに含むことができる。したがって本発明は、Her2/neu抗原(例えば、ヘルセプチン/トラスツズマブ)、リンパ腫上のCD20抗原、結腸直腸癌上のEpCAM抗原に対する抗体だけには限られず、これらを含めた、腫瘍抗原に対する抗体と組み合わせたアンジオモチンワクチンも含む。
【００６６】
ワクチンは、p130アンジオモチン分子に対する免疫応答を生み出すことを目的とする。生成する免疫応答は、腫瘍および他の疾患状態の生成および/または維持に必要とされる新たな毛細管の形成を阻害し得る。さらに(あるいは代替的に)、これまでp130アンジオモチンは腫瘍細胞において検出されていないが、少量のアンジオモチンが幾つかの悪性腫瘍によって発現される可能性があり、したがって腫瘍特異的抗原として働く可能性がある。理論によって縛られずに、本発明は、p130アンジオモチンと反応性がある特異的T細胞および/または抗体がp130アンジオモチンを発現する腫瘍細胞を認識し破壊する、ワクチンを使用する予防接種(すなわち、本明細書に記載したのと同様の予防接種)を含む。腫瘍特異的抗原としてアンジオモチンを使用する予防接種に関する全ての形式および手法は、抗血管新生効果のための予防接種に関して示したのと同じ方法を使用する。
【００６７】
当業者によく知られているように、分子の選択およびワクチン(すなわち、レシピエントの免疫系によって作用する物質)の投与形式は、直接的な治療剤のそれとは異なる。例えば、ワクチンとして投与されるアンジオモチン分子またはアンジオモチン分子をコードするポリヌクレオチド間の違いは、非ワクチンアンジオモチン治療物質とは反対に、以下の1つまたは複数を含み得る。
【００６８】
非ワクチン治療物質は、アンジオモチン分子の機能(例えばアンギオスタチンと結合する能力、または細胞要素と相互作用する能力)を維持しなければならない。他方で、ワクチン分子は機能性アンジオモチン分子である必要はないが、原型アンジオモチン分子と免疫交差反応性がある免疫応答を生み出す、最小の非機能性誘導体(断片含む)または類似体であってよい(ただしそうである必要はない)。
【００６９】
通常ワクチン用量は、例えば「体重1kg当たり」ベースで測定して、非ワクチンの治療用量より1または2桁低い。
【００７０】
ワクチンは、免疫応答を促進するサイトカイン、BCGおよび/またはミョウバンなどの「アジュバント」を含むことができる(あるいはそれらを付随することができる)。非ワクチン療法に関しては、このような付属物は存在しない。本発明の例において、例えば「自己」タンパク質に対して免疫処置するとき、すなわちヒト中のヒトタンパク質に対して免疫処置するとき、アジュバントは特に重要である可能性がある。
【００７１】
特に、(血管新生を遅らせる際の)アンジオモチン分子の作用機構を考えると、非ワクチン治療物質は、2または3週間に1回の追加抗原刺激を含むワクチン投与とは反対に、ほぼ毎日投与しなければならないはずである。例えば、数週間の間隔での1回または2回の投与が、遺伝子ワクチンまたはポリペプチド/ペプチドワクチンのいずれかに必要である可能性がある。
【００７２】
非ワクチンベクターは、高レベルで機能性分子(例えば、本発明のポリペプチド)を発現する能力を有していなければならず、これを実際に実施するのは非常に困難である。DNAワクチンは、はるかに低いレベルで免疫抗原を発現することができる。多くの適切なベクターおよびプロモーターシステム、例えばCMVプロモーター系システムが知られている。免疫抗原は、原型アンジオモチンに対する免疫応答を生み出すことができそれに充分な、最小非機能性ペプチドまたはアンジオモチンのドメイン(抗体および/またはT-細胞)であってよい。機能性アンジオモチン分子を使用する必要はない。
【００７３】
本発明の医薬組成物、医薬品またはワクチンを局部、局所、全身、あるいは経腸的に投与して、長期間続く免疫を生み出すことができる。生成する免疫応答は新たな血管の形成を妨げ、血管新生化の予防は、腫瘍形成または他の脈管形成/血管新生関連疾患に対する予防または治療効果を発揮する。
【００７４】
使用する本発明のポリペプチドの断片は、少なくとも1つのドメイン、すなわち完全長ポリペプチドにおいてフォールディングするであろう形式と同様の形式で独立にフォールディングすることができる、あるいはそうすることができると予想される部分を含むことができる。(例えば、疎水性および/またはαヘリックスを形成する可能性の分析を組み込んだ)コンピュータ分析を使用する、このようなドメインの同定法はよく知られている。ポリペプチドは分解され、ペプチド断片として提示されるので、独立にフォールディングする能力は抗体応答を生み出す際に重要である可能性はあるが、T細胞応答の誘導に重要であるとは考えられない。
【００７５】
p130アンジオモチンの1つまたは複数のエピトープを提示する、1つまたは複数のペプチドまたはペプチド模倣化合物を使用することができる。例えば、例えば約15、12、10または9アミノ酸までの短いペプチド(またはこのような短いペプチドをコードするポリヌクレオチド)を使用することができる。当業者によく知られているように、エピトープによってミモトープが含まれる。
【００７６】
エピトープ配列は、Epitope Mapping Protocols (1996) Methods Mol Biol 66 (Glenn E Morris、Ed、Humana Press、Totowa、New Jersey; 米国特許第4,708,871号; Geysen et al.、1984、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、81: 3998〜4002; Geysen et al.、1986、Mol.Immunol.、23: 709〜715中に記載された技法などの、よく知られている技法によって同定することができる。線状または立体配座エピトープは、例えばX線結晶学または2D-核磁気共鳴から誘導した構造データを使用して同定することができる。(Hopp et al.、1981、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、78: 3824〜3828およびKyte et al.、1982、J Mol.Biol.、157: 105〜132のアルゴリズムに基づくOxford Molecular Groupから入手可能であるOMIGAソフトウェアを使用して作製したプロットなどの)抗原性または疎水性プロットも、エピトープを同定する際に有用である可能性がある。
【００７７】
ワクチン中の抗原として抗体を使用することができる。例えば、目的とする標的(例えばアンジオモチン)に対する抗体に対する抗体が投与され、免疫系のB細胞は、目的とする標的をも認識するその抗体に対する抗体を産生する。これは抗イディオタイプワクチンと呼ばれ、目的とする標的に対する抗体を投与する受動的な抗体療法とは異なる。
【００７８】
本発明はさらに、p130アンジオモチン系ワクチンと、内皮細胞または生成物を標的化する他の型の抗アンジオモチン療法の組合せを提供する。したがって、例えばワクチンは、血管新生促進ポリペプチドに対する免疫原として作用するのに適した、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド(またはペプチド模倣化合物)、例えばVEGFR-2(例えばアクセッション番号AF063658)またはTie2(例えばアクセッション番号BC035514)をさらに含むことができる。これらの他の血管新生促進ポリペプチド由来の配列(例えばVEGFR-2配列)は、本発明のポリペプチド/ポリヌクレオチドと同じまたは異なるポリペプチド(または適切にはポリヌクレオチド)中に含まれてよい。治療剤またはワクチンは、例えばpDNAワクチン、ウイルスベクターとして投与され、あるいはDC細胞中で発現され、あるいはDC細胞に担持させる、抗腫瘍効果を有するサイトカインまたは腫瘍抗原の投与に基づく免疫療法剤をさらに含むことができる。
【００７９】
当業者には明らかであるように、ワクチンは他のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを含むことができる。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは例えば、組換え生物、好ましくは微生物、好ましくはポリペプチドを発現することができる微生物、すなわちアンジオモチンのアミノ酸配列を発現することができる微生物、またはポリペプチドをコードする核酸を発現用の宿主細胞に送達することができる微生物、またはそれらの一部、またはそれらの生成物(細胞培養上清など)の形でワクチン中に含まれてよい。当業者によく知られているように、組換え微生物は非毒性微生物であることが好ましい。組換え微生物は、例えばビフィズス菌またはラクトバチラス、または弱毒化サルモネラまたはBCGまたは弱毒化大腸菌であってよい。例えばWO97/40177の教示を利用することによって、組換え微生物はあるいは植物であってよい。
【００８０】
他の代替では、完全真核細胞またはこれらの細胞によって含まれる物質のいずれかで、ワクチンを作製することができる。例えば細胞は、ワクチンが目的とする型の生物に由来してよい。細胞は、本発明のポリペプチドを発現することができる、かつ/または本発明のポリヌクレオチドをトランスフェクトした細胞系に由来する細胞などの組換え体であってよい。細胞は照射、熱殺傷またはパラ-ホルムアルデヒド固定、および免疫処置用に使用することができる。
【００８１】
細胞は、本発明のp130アンジオモチンを発現する腫瘍細胞、またはp130アンジオモチンを発現するヒト起源または他種由来の異種個体の新たに移植または培養した内皮細胞、またはp130アンジオモチンまたはこの分子の一部分をトランスフェクトした細胞、およびそれらを発現する細胞であってよい。あるいは細胞は、本発明のポリペプチドを担持させたかあるいは本発明のポリヌクレオチドをトランスフェクトした、樹状細胞(DC)などの抗原提示細胞(APC)であってよい。腫瘍細胞ワクチン(p130アンジオモチン抗原を必ずしも含み得ない)を、本発明のワクチンと共に使用することができる。全菌体ワクチン用に、腫瘍細胞を患者から採取し、実験室中で増殖させる。次いで腫瘍細胞を処理して、1)それらがそれ以上増殖することができない、かつ2)患者に感染する可能性があるものが存在しないことを確実にする。
【００８２】
2つの型の全菌体癌用ワクチンが存在する。自己由来の全菌体ワクチンは、患者の独自の全菌体不活化腫瘍細胞を用いて作製する。同種異系の全菌体ワクチンは、誰か他人の全菌体不活化腫瘍細胞または組み合わせた数人の腫瘍細胞を用いて作製する。
【００８３】
APCワクチンは抗原提示細胞、一般に樹状細胞を含む。例えば癌用ワクチンは、腫瘍抗原で初回抗原刺激したかあるいはそれらの存在下で増殖させた、樹状細胞から作製することができる。抗原で初回抗原刺激した樹状細胞(またはAPC)はそれらの表面上に腫瘍抗原を有し、注射するとT細胞を強く活性化することができる。
【００８４】
抗原ワクチンは、1つまたは複数の腫瘍中に含まれる抗原を含む。幾つかの抗原は特定の型の全ての癌に共通であり、幾つかの抗原は個体に特有である。異なる型の癌の腫瘍間で共有される抗原は少ない。
【００８５】
本発明のポリペプチドは、例えばアンジオモチンのエピトープまたはミモトープに相当するペプチド模倣化合物であってよい。用語「ペプチド模倣化合物」は、立体配座および療法剤としての特定のペプチドの望ましい特徴を模倣しているが、望ましくない特徴は回避している化合物を指す。
【００８６】
ペプチドに関する療法用途は、経口生物学的利用能の欠如およびタンパク質分解による劣化のために制限される。典型的には、例えばペプチドは、エクソおよびエンドペプチダーゼによってin vivoで急速に分解し、一般に非常に短い生物学的半減期をもたらす。考えられる療法剤としてのペプチドの他の欠陥は、経口投与によるその生物学的利用能の欠如である。胃腸管内のタンパク質分解酵素によるペプチドの分解は、おそらく重要な貢献要因である。しかし、急速な代謝産物の不活性化を受けない小さな環状ペプチドでさえ、乏しい経口生物学的利用能をそれにもかかわらず示すことが認められているので、問題はさらに複雑である。これはおそらく、腸膜を介した輸送があまりないこと、ならびに肝臓抽出およびその後の腸への分泌による血液からの急速な除去によるものである。これらの観察結果は、多数のアミド結合が経口生物学的利用能に干渉し得ることを示唆する。ペプチド薬剤を経口投与するとき、ペプチド鎖中のアミノ酸残基を結びつけるペプチド結合は、分かれる可能性があると考えられる。
【００８７】
ペプチド模倣化合物を設計および合成するための、幾つかの異なる手法が存在する。Sherman and Spatola(1990、J.Am.Chem.Soc.、112: 433)により開示された手法などの一手法では、1つまたは複数のアミド結合を、様々な化学官能基によってほぼアイソタクチック式に置換する。この段階的手法は、活性類似体が得られている点で幾つかの成功に見合っている。幾つかの場合、これらの類似体は、その天然に存在する相当物より長い生物学的半減期を有することが示されている。それにもかかわらず、この手法には幾つかの制約がある。2個以上のアミド結合の首尾良い置換は、これまで稀である。したがって、生成する類似体は、分子中の他の場所の酵素失活の影響を依然として受けやすい状態である。ペプチド結合を置換するとき、新たなリンカー部分は、ペプチド結合とほぼ同じ電荷分布およびほぼ同じ平面を有することが好ましい。
【００８８】
レトロ-インベルソペプチド模倣化合物(その中のペプチド結合が逆である)は、当技術分野で知られている方法、例えばMeziere et al.、1997、J Immunol.、159: 3230〜3237中に記載された方法によって合成することができる。この手法は、側鎖の方向ではなく骨格に関する変化を含む偽ペプチドの作製を含む。CO-NHペプチド結合の代わりにNH-CO結合を含むレトロ-インベルソペプチドは、タンパク質分解に対してより耐性がある。
【００８９】
他の手法では、D-アミノ酸およびN-メチルアミノ酸などの、様々な非コードまたは修飾アミノ酸を使用して、哺乳動物のペプチドを修飾している。あるいは、環状化などの共有結合の修飾によって、あるいはγ-ラクタムまたは他の型の架橋の取り込みによって、推定される生物活性のある立体配座を安定化させている。例えば、Veber et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、75: 2636 (1978)およびThursell et al.、Biochem.Biophys.Res.Comm.、111: 166 (1983)を参照のこと。
【００９０】
多くの合成戦略間の共通のテーマは、ペプチド系フレームワーク中への幾つかの環状部分の導入となっている。環状部分はペプチド構造の立体配座空間を制限し、これはしばしば、特定の生物学的受容体に対するペプチドの高い親和性をもたらす。この戦略の付加的利点は、ペプチド中への環状部分の導入が、細胞のペプチダーゼに対する低下した感受性を有するペプチドをもたらす可能性もあることである。
【００９１】
環状で安定状態のペプチド模倣化合物を合成するための一手法は、閉環メタセシス反応(RCM)である。この方法は、ペプチド前駆体を合成し、それをRCM触媒と接触させて立体配座が制限されたペプチドを生成させる段階を含む。適切なペプチド前駆体は、2個以上の不飽和C-C結合を含むことができる。この方法は、固相ペプチド合成技法を使用して実施することができる。この実施形態では、固相担体と結合した前駆体をRCM触媒と接触させ、次いで生成物を固相担体から切断して、立体配座が制限されたペプチドを生成させる。
【００９２】
1つまたは複数のアミノ酸残基が化学的に修飾されているポリペプチドは、そのポリペプチドを合成する前後に抗原として使用することができる。ただしポリペプチドの機能、すなわちin vivoでの特異的な免疫応答の生成は、実質的に変わらない状態であるものとする。このような修飾には、酸または塩基、特に生理的に許容される有機または無機酸および塩基との塩の形成、末端カルボキシル基のエステルまたはアミドの形成、およびN-t-ブトキシカルボニルなどのアミノ酸保護基の結合がある。このような修飾は、in vivo代謝からポリペプチドを保護することができる。ポリペプチドはマンノシル化することができ、あるいは他の場合は修飾してその抗原性を増大させることができ、あるいはその抗原性および/または免疫原性を増大させるために化合物と組み合わせることができる。
【００９３】
p130アンジオモチン由来のアゴニストエピトープの使用も、本発明中に含まれる。アゴニストエピトープを設計して、MHCクラスIまたはMHCクラスII拘束性CD8またはCD4+T細胞のさらに効率の良い活性化により、免疫系をさらに効率良く活性化させる。T細胞エピトープからアゴニストエピトープを設計するために、2つの一般的な手法が本発明中に含まれる。一手法は、充分なHLAクラスIまたはクラスIIの結合をもたらす、HLAアンカー残基の修飾を必要とする。この手法は、腫瘍抗原または微生物抗原由来の幾つかのHLAクラスI結合ペプチドに関する成功に適用されてきている。あるいは、T細胞受容体(略してTCR)との接触と関係がある残基の置換は、T細胞による増大した応答をもたらす可能性もあり、本発明によって含まれると考えられる。
【００９４】
一般に、当業者によく知られており、例えば米国特許第5,869,445号中に記載されているように、アミノ酸置換体を様々な方法で作製して、本発明内の変異体の他の実施形態を提供することができる。最初に例えば、アミノ酸置換体を保存的に作製することができる。すなわち置換アミノ酸を、ポリペプチドの二次構造およびヒドロパシー性が実質的に変わらないペプチド化学の分野の当業者が予想し得るように、類似の性質を有するアミノ酸に置換する。一般に、アミノ酸の以下の群が保存的変化を示す:(1)ala、pro、gly、glu、asp、gln、asn、ser、thr;(2)cys、ser、tyr、thr;(3)val、ile、leu、met、ala、phe;(4)lys、arg、his;および(5)phe、tyr、trp、his。非保存的変化の一例は、一群のアミノ酸と他群由来のアミノ酸を置換することである。
【００９５】
アミノ酸置換体を作製して本発明の変異体を生成する他の方法は、クラスIIMHC分子(CD4+T細胞応答に関して)またはクラスIMHC分子(CD8+T細胞応答に関して)と結合する可能性を有するT細胞モチーフ中のアミノ酸を、同定し置換することである。クラスIIMHC分子と結合する理論上の可能性を有するモチーフを有するペプチドセグメントは、コンピュータ解析によって同定することができる。例えば、タンパク質配列解析用パッケージ、T細胞認識の可能な部位を識別するように設計した幾つかのコンピュータアルゴリズムを組み込んだT Sitesを使用することができる(Feller and de la Cruz、1991、Nature 349: 720〜721)。2つの検索アルゴリズムを使用する:(1)Feller and de la Cruz、1991、Nature 349: 720〜721; Margalit et al.、1987、J.Immunol.138: 2213〜2229中に記載されたAMPHIアルゴリズムは、α-らせん構造の周期性および両親媒性に従いエピトープモチーフを同定する。;(2)RothbardおよびTaylorのアルゴリズムは、電荷および極性パターンに従いエピトープモチーフを同定する(Rothbard and Taylor、1988、EMBO J.、7: 93〜100)。両モチーフを有するセグメントは、クラスIIMHC分子と結合するのに最も適している。CD8+T細胞は、クラスIMHC分子と結合するペプチドを認識する。Falk et alは、特定のMHC分子と結合するペプチドは認識可能な配列モチーフを共有すると決定している(Falk et al.、1991、Nature、351: 290〜296)。HLA-A2.1の溝中の結合に関するペプチドモチーフは、培養細胞系のHLA-A2.1分子から除去したペプチドのエドマン分解によって定義されている(表2、Falk et al由来、上記)。この方法は、位置2(L)および9(V)に存在する主要アンカー残基を有する9アミノ酸長であるとして、典型的または平均的なHLA-A2.1結合ペプチドを同定した。位置2(M)、4(E,K)、6(V)、および8(K)に一般的に存在する強い結合残基が同定されている。同定したモチーフは、多くの結合ペプチドの平均を表す。
【００９６】
エピトープ(例えばエピトープ形成アミノ酸配列、または抗血管新生エピトープを含むと考えられる領域)は、1コピーとして、あるいは多数のコピー、例えばタンデムリピートとして存在し得る。このようなタンデムまたは多数のリピートは、担体の使用を不要にするほどそれ自体が充分抗原性である可能性がある。1つに接合したN末端およびC末端を有するループとして形成されること、あるいは1つまたは複数のCys残基を末端に加えて抗原性を増大させる、かつ/またはジスルフィド結合の形成を可能にすることが、ポリペプチドに有利である可能性がある。エピトープ、例えばエピトープ形成アミノ酸配列が、担体、好ましくはポリペプチドと共有結合する場合、したがって、エピトープ形成アミノ酸配列がループを形成するような配列であることが好ましい。
【００９７】
現在の免疫学の理論によれば、免疫系を刺激するため、あるいは免疫系の刺激を増大させるために、任意の免疫配合物中に担体機能が存在しなければならない。本発明の前の態様に関する前に定義したエピトープは、例えば架橋によって、血清アルブミン、ミオグロビン、細菌毒素、およびキーホールリンペットヘモシアニンなどの別の担体と結合することができる。本発明のポリペプチドは、それ自体が担体またはアジュバントとして働くことができる。免疫系中のT細胞の助力を誘導するさらに近年開発された担体には、(ヌクレオカプシドタンパク質とも呼ばれる)B型肝炎コア抗原、Thr-Ala-Ser-Gly-Val-Ala-Glu-Thr-Thr-Asn-Cysなどの推定T細胞エピトープ、β-ガラクトシダーゼおよびインターロイキン-1の163〜171ペプチドがある。後者の化合物は担体として、あるいはアジュバントとして、あるいはこの両者として多様に考えることができる。
【００９８】
あるいは、同じまたは異なるエピトープの数個のコピーを互いに架橋させることができ、この状況では、このような別の担体は存在しないが、このような架橋によって担体機能を与えることはできる。適切な架橋剤には、SigmaおよびPierceのカタログ中などに列挙された架橋剤、例えばグルタルアルデヒド、カルボジイミドおよびスクシニミジル4-(N-マレイミドメチル)シクロヘキサン-1-カルボキシレートがあり、後者の架橋剤は(存在する場合)C末端システイン残基上の-SH基を利用する。O'Sullivan et al.、1979、Anal.Biochem.、100: 100〜108中に概略的に記載された方法などの、ポリペプチドを架橋させる任意の従来法を使用することができる。例えば、第1の部分をチオール基で補うことができ、第2の部分はこれらのチオール基と反応することができる二官能性物質、例えばヨード酢酸(NHIA)またはN-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオ)プロピオン酸(SPDP)のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル、結合種間にジスルフィド架橋を取り込むヘテロ二官能性架橋剤と反応させることができる。例えばm-マレイミドベンゾイル-N-ヒドロキシスクシンイミドエステルと共に得られる、アミドおよびチオエーテル結合は、ジスルフィド結合より一般にin vivoで安定性がある。
【００９９】
他の有用な架橋剤には、穏やかな条件下でのスルヒドリル基の脱保護を可能にする第1級アミン用のチオール化試薬である(Julian et al.、1983、Anal.Biochem.、132: 68)、S-アセチルチオグリコール酸N-ヒドロキシスクシンイミドエステル(SATA)、ジメチルスベリミデートジヒドロクロリドおよびN,N'-o-フェニレンジマレイミドがある。
【０１００】
適切な宿主中での適切なヌクレオチド配列の発現によってポリペプチドが調製される場合、したがって、担体として働くペプチド配列との融合産物として、ポリペプチドが発現されることが有利である可能性がある。Kabigenの「Ecosec」システムは、このような配列の一例である。
【０１０１】
有用である可能性がある他のアジュバントには、WO02/053181中に論じられたアジュバント、例えばDDA(米国特許第5,951,988号を参照)を含むVSA3がある。
【０１０２】
適切な組換えポリペプチドまたはポリヌクレオチドを調製するために使用することができる適切なベクターまたは構築体は、当業者には知られているはずである。必要とされる1つまたは複数のポリペプチドを発現することができるポリヌクレオチドは、当業者によく知られている技法を使用して調製することができる。
【０１０３】
ヒトまたは動物にポリヌクレオチドを投与して、抗原性ポリペプチド(すなわち、アンジオモチンおよび場合によっては他のポリペプチド由来の配列)の発現をヒトまたは動物中でもたらすことができるように、レシピエント中でポリペプチドを発現することができることが、ポリペプチドに望ましい可能性がある。ポリペプチド、例えばp130アンジオモチンは、以下に記載するように任意の適切なポリヌクレオチド(遺伝子構築体)から発現させ、レシピエントに送達することができる。典型的には、ポリペプチドを発現する遺伝子構築体は、翻訳されて前記ポリペプチドを合成し得る転写ポリヌクレオチド(例えばmRNA)分子をレシピエントの細胞中で発現することができるプロモーターと作動可能に連結した、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む。適切なプロモーターは当業者に知られているはずであり、前記ポリペプチドを(例えば、樹状細胞または他の抗原提示細胞あるいはそれらの前駆体中で)発現させることが望ましいかどうかに応じて、至る所で発現される遺伝子、例えばハウスキーピング遺伝子または組織選択的遺伝子用のプロモーターを含むことができる。樹状細胞または樹状前駆体細胞選択的プロモーターを使用することが好ましいが、特にポリヌクレオチドの送達または取り込みが選択した細胞、例えば樹状細胞または前駆体を標的化する場合、これは必須ではない。樹状細胞選択的プロモーターは、CD83またはCD36プロモーターを含むことができる。
【０１０４】
発現されるかあるいは本発明のワクチンと組み合わせることが望ましい可能性がある他のポリペプチド/タンパク質には、サイトカインまたは増殖因子などの免疫賦活剤がある。例にはGM-CSF、IL-2、IL12またはIL-15がある。発現されるかあるいは含まれる可能性がある他の免疫賦活剤は、いわゆるToll受容体と結合する因子であり、小さな免疫賦活分子イミクイモド、フラジェリンまたは非メチル化細菌CpGモチーフまたはCpGモチーフを主成分とするオリゴヌクレオチドなどの微生物の生成物を含む。
【０１０５】
ポリペプチドを発現することができるポリヌクレオチド配列は、前記配列の発現に必要な制御エレメントと作動可能に連結していることが好ましい。
【０１０６】
「作動可能に連結した」は、要素の正常機能を実施することができるような並置を指す。したがって、制御エレメントと「作動可能に連結した」コード配列は、抗原(または免疫賦活分子)をコードする核酸配列が、制御配列の制御下で発現され得る形状を指す。
【０１０７】
「制御配列」は、特定の宿主生物中での作動可能に連結したコード配列の発現に必要な核酸配列を指す。例えば、真核生物細胞に適した制御配列は、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサーである。
【０１０８】
「ベクター」は、一本鎖、二本鎖、環状またはスーパーコイルドDNAを含むDNA分子を意味する。適切なベクターにはレトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ポックスウイルスおよび細菌プラスミドがある。レトロウイルスベクターは、宿主のゲノムにそれらのゲノムをランダムに組み込むことによって複製するレトロウイルスである。適切なレトロウイルスベクターは、WO92/07573中に記載されている。
【０１０９】
ウイルスベクターは、人々を病気にしないこと、または如何なる疾患も伝播させないことを目的とする。これらのウイルスは、それらがヒト細胞に感染するとき、細胞がその表面に必要とされる抗原を作製および提示するように、研究室において遺伝子工学処理することができる。このウイルスは、人々を病気にするのに充分な数ではなく、免疫応答を開始するのに充分なごく少数のヒト細胞に感染することができる。
【０１１０】
ウイルスを遺伝子工学処理してサイトカインを作製し、免疫細胞の活性化を手助けするタンパク質をウイルス表面に提示させることもできる。これらは単独あるいはワクチンと共に与えて、免疫応答に助力することができる。
【０１１１】
アデノウイルスは、線状二本鎖DNAゲノムを含む。適切なアデノウイルスベクターは、Rosenfeld et al.、1991、Science、252: 432中に記載されている。
【０１１２】
アデノ関連ウイルス(AAV)はパルボウイルス科に属し、約4〜6KBの一本鎖DNAゲノムを含む。
【０１１３】
ポックスウイルスベクターは大きなウイルスであり、遺伝子を挿入することができる数個の部位を有する。それらは熱安定性であり、室温で保存することができる。安全性試験は、ポックスウイルスベクターには複製欠陥があり、宿主から宿主あるいは環境中に移動させることはできないことを示す。
【０１１４】
ワクチンを特定の細胞群、例えばAPCに向けることは、例えば注射部位を選定すること、標的化ベクターおよび送達系を使用すること、またはレシピエントからのこのような細胞群の選択的精製、およびペプチドまたは核酸のex vivo投与のいずれかによって実施することができる(例えば、Zhou et al.、1995、Blood、86: 3295〜3301; Roth et al.、1996、Scand.J.Immunology 43、646〜651中に記載されたのと同様に樹状細胞を分類することができる)。さらに、標的化ベクターは、適切な位置での抗原の発現を誘導する組織または腫瘍選択的プロモーターを含むことができる。
【０１１５】
本発明のポリヌクレオチドを含む遺伝子構築体はDNAまたはRNAであってよいが、それはDNAであることが好ましい。遺伝子構築体は、ヒト細胞への送達に適合していることが好ましい。
【０１１６】
遺伝子構築体を細胞中に導入する、あるいは動物の身体から除去する手段および方法は、当技術分野で知られている。例えば本発明の構築体は、(分裂)細胞のゲノム中に構築体が挿入されるように、任意の好都合な方法、例えばレトロウイルスに関する方法によって細胞中に導入することができる。標的化レトロウイルスは本発明中の使用において利用可能であり、例えば、特異的結合親和性を与える配列を既存のウイルスenv遺伝子に遺伝子工学処理することができる(これおよび遺伝子療法用の他の標的化ベクターの総説に関してはMiller & Vile、1995、Faseb J.、9: 190〜199を参照)。
【０１１７】
好ましいレトロウイルスベクターは、Verma & Somia、1997、Nature、389: 239〜242中に記載されたベクターなどの、レンチウイルスベクターであってよい。
【０１１８】
他の方法は、限られた時間、またはゲノム中への組み込み後の長時間の、発現用の細胞中への構築体の単純な送達に関する。後者の手法の一例はリポソームを含む(Nassander et al.、1992、Cancer Res.、52: 646〜653)。他の送達法は、抗体-ポリリシン架橋によって外部DNAを有するアデノウイルス(Curiel Prog.Med.Virol.、40: 1〜18を参照)および担体としてトランスフェリン-ポリカチオン複合体(Wagner et al.、1990、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、87: 3410〜3414)を含む。第1のこれらの方法では、ポリカチオン-抗体複合体を、本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体を用いて形成し、この場合抗体は、野生型アデノウイルス、または抗体と結合する新たなエピトープが導入されている変異体アデノウイルスのいずれかに特異的である。ポリカチオン部分は、リン酸骨格との静電気的相互作用によってDNAと結合する。アデノウイルスは、不変のファイバーおよびペントンタンパク質を含むので、細胞中に内在化され、本発明のDNA構築体と共に細胞中に運ばれる。ポリカチオンがポリリシンである場合、それが好ましい。
【０１１９】
適切であり得る細菌送達法は、Dietrich、2000、Antisense Nucleic Acid Drug Delivery、10: 391〜399中に記載されている。例えば弱毒細菌系統は、粘膜表面を介した組換えワクチンの投与を可能にする。異種抗原を発現させるために弱毒細菌を一般的に遺伝子工学処理するが、他の手法は真核生物抗原発現ベクター(DNAワクチン)を送達するために細胞内細菌を利用する。この戦略は、細菌感染を介した、マクロファージおよび樹状細胞(DC)などの専門の抗原提示細胞(APC)へのDNAの直接の送達を可能にする。DNAワクチン送達に使用される細菌は、APC、例えばシゲラおよびリステリアによるファゴサイトーシス後に宿主細胞のサイトゾルに入り、あるいはそれらはサルモネラなどのファゴソーム区画中に留まる。細菌担体の2つの細胞内局在化は、本発明の首尾良いDNAワクチンベクターの送達に適している可能性がある。
【０１２０】
本発明のアンジオモチンポリペプチドの発現は、誘導性細菌プロモーター、例えば細菌が宿主生物環境(例えば宿主の消化管)に遭遇する、あるいはそこに入る、あるいは宿主細胞と結合する、あるいは宿主細胞に入ると誘導されるプロモーターの制御下であってよい。
【０１２１】
本発明のポリヌクレオチドは、「遺伝子銃」皮内予防接種、筋肉内注射、あるいは皮内または筋肉内に注射し次いで注射部位での皮膚または筋肉内「エレクトロポレーション」を続けるプラスミドDNA予防接種として投与して、予防接種の有効性を高めることができる。
【０１２２】
DNAはアデノウイルスによって送達することもでき、この場合、例えば以下に記載するようにDNAはアデノウイルス粒子内に存在する。
【０１２３】
受容体介在性エンドサイトーシスを使用してDNAマクロ分子を細胞中に運ぶ、高い有効性の核酸送達系を利用することができる。これは、鉄輸送タンパク質であるトランスフェリンと、核酸と結合するポリカチオンを結合させることによって実施される。ヒトトランスフェリン、またはニワトリの相同体コンアルブミン、またはこれらの組合せを、ジスルフィド結合によって小さなDNA結合タンパク質プロタミンまたは様々な大きさのポリリシンと共有結合させる。これらの修飾トランスフェリン分子は、その同種受容体と結合し細胞中への有効な鉄輸送を介在する、その能力を維持している。トランスフェリン-ポリカチオン分子は、核酸の大きさ(短いオリゴヌクレオチド〜21キロベースペアのDNA)とは無関係に本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体と電気泳動安定性の複合体を形成する。トランスフェリン-ポリカチオンと本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体の複合体を標的細胞に供給するとき、細胞中での構築体からの高レベルの発現が予想される。
【０１２４】
Cotten et al.、1992、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、89: 6094〜6098の方法によって生成された欠陥または化学的不活性アデノウイルス粒子のエンドソーム破壊活性を使用する、高い有効性の本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体の受容体介在性送達も使用することができる。この手法は、アデノウイルスはリソソームを通過せずにエンドソームからそれらのDNAを放出することができるように適合しており、例えばトランスフェリンの存在下において本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体と結合し、アデノウイルス粒子と同じ経路によって細胞により構築体が取り込まれるという事実に頼っているようである。
【０１２５】
この手法は、複合レトロウイルス構築体を使用する必要がない、レトロウイルス感染によって生じるゲノムの永続的な修飾がない、かつ標的発現系は標的送達系と結びついており、したがって他の細胞型に対する毒性を低下させるという利点を有する。
【０１２６】
「裸DNA」およびカチオン性および中性脂質と複合体形成したDNAも、本発明のDNAをレシピエントの細胞中に導入する際に有用である可能性がある。遺伝子療法のための非ウイルス手法は、Ledley、1995、Human Gene Therapy、6: 1129〜1144中に記載されている。典型的にはDNAがアデノウイルス、またはアデノウイルス様粒子内に保持されている、WO94/10323中に記載された修飾アデノウイルス系などの、他の標的送達系も知られている。Michael et al.、1995、Gene Therapy、2: 660〜668は、アデノウイルスを修飾して細胞選択的部分を繊維タンパク質を加えることを記載している。Bischoff et al.、1996、Science、274: 373〜376中に記載されたアデノウイルスなどの、p53-欠陥性ヒト腫瘍細胞中で選択的に複製する突然変異アデノウイルスも、細胞に本発明の遺伝子構築体を送達するのに有用である。他の適切なウイルスまたはウイルス様粒子には、HSV、AAV、ワクシニア、レンチウイルスおよびパルボウイルスがある。
【０１２７】
イムノリポソーム(抗体誘導型リポソーム)は、例えばCD1、CD14またはCD83に対する抗体を使用して樹状細胞または前駆体(あるいは前に示した、他の樹状細胞または前駆体細胞表面分子)に関して可能であるように、抗体が利用可能である細胞表面タンパク質を過剰発現する細胞系を標的化する際に特に有用である。イムノリポソームを調製するために、MPB-PE(N-[4-(p-マレイミドフェニル)ブチリル]-ホスファチジルエタノールアミン)を、Martin & Papahadjopoulos、1982、J.Biol.Chem.、257: 286〜288の方法に従って合成する。MPB-PEをリポソーム二重層中に取り込ませて、抗体、またはその断片とリポソーム表面を共有結合させることができる。例えばDNAまたは他の遺伝子構築体の溶液中にリポソームを形成し、次に0.8MPaまでの窒素圧下での0.6μmおよび0.2μmの孔径を有するポリカーボネート膜フィルターを介した連続的な押し出しによって、リポソームに、標的細胞に送達するための本発明のDNA構築体または他の遺伝子構築体を都合よく担持させる。押し出し後、被包型DNA構築体を、45分間80000×gでの超遠心分離によって遊離DNA構築体から分離させる。脱酸素バッファー中で新たに調製したMPB-PE-リポソームは新たに調製した抗体(またはその断片)と混合させ、一晩一定回転の攪拌下で4℃において、窒素雰囲気中でカップリング反応を実施する。イムノリポソームは、45分間80000×gでの超遠心分離によって非結合抗体から分離させる。イムノリポソームは、例えば腹膜内に、あるいは標的細胞が存在する部位、例えば皮下に直接注射することができる。
【０１２８】
細胞中でのポリペプチド(例えば抗原性ポリペプチド)の発現を一時的に制御することができることが望ましい可能性があることは、理解されるはずである。したがって、例えばレシピエントに投与することができる小分子の濃度によって調節され得るプロモーターの制御下において、(小分子が前記プロモーターの活性化または抑制に影響を与えるかどうかに応じて)ポリペプチドの発現を活性化または抑制することが望ましいとき、ポリペプチドの発現が直接的または間接的(以下参照)であることは望ましい可能性がある。このことは、発現構築体が安定している、すなわち少なくとも1週間、1、2、3、4、5、6、8カ月、あるいは1年または複数年の間、前記細胞中で(任意の必要な調節分子の存在下において)ポリペプチドを発現することができる場合、非常に有益である可能性があることは、理解されるはずである。発現構築体は、1カ月未満の間前記細胞中でポリペプチドを発現することができることが好ましい。本発明の好ましい構築体は、調節可能なプロモーターを含むことができる。調節可能なプロモーターの例には、以下の論文: Rivera et al.、1999、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、96: 8657〜62(ラパマイシンによる制御、経口投与可能な薬剤、2つの別個のアデノウイルスまたはアデノ関連ウイルス(AAV)ベクター、1つは誘導性ヒト成長ホルモン(hGH)標的遺伝子をコードするベクター、およびもう1つは二部分のラパマイシン制御型転写因子を使用する); Magari et al.、1997、J Clin.Invest.、100: 2865〜72(ラパマイシンによる制御); Bueler、1999、Biol.Chem.、380: 613〜22 (アデノ関連ウイルスベクターの総説); Bohl et al.、1998、Blood、92: 1512〜7 (アデノ関連ベクターにおけるドキシサイクロンによる制御); Abruzzese et al.、1996、J.Mol.Med.、74: 379〜92(誘導因子、例えばホルモン、増殖因子、サイトカイン、細胞増殖抑制、照射、熱ショックおよび関連応答要素の総説)中で言及されたプロモーターがある。テトラサイクリン-誘導性ベクターも使用することができる。哺乳動物細胞培養物中での発現を調節するのに有用であることが示されている比較的非毒性である抗生物質によって、これらは活性化される。さらに、ステロイド受容体複合体は、転写前にDNAベクターが分離されるはずである核に入るので、ステロイド系誘導物質は特に有用である可能性がある。
【０１２９】
この系は、2つのレベルで発現を調節することによって、例えば前に論じ当業者に知られている、組織選択的プロモーター、および外来誘導物質/抑制物質、例えば小分子によって制御されるプロモーターを使用することによって、さらに改善することができる。したがって、1つの調節レベルは適切なポリペプチドコード遺伝子と誘導性プロモーターの結合を含む可能性があり、一方他の調節レベルは、(誘導性プロモーターからのポリペプチド(例えば抗原性ポリペプチド)コード遺伝子の発現を制御する)必要な誘導性転写因子をコードする遺伝子を誘導するための組織選択的プロモーターの使用に関する。遺伝子構築体の細胞型特異的標的化によって、制御をさらに改善することができる。
【０１３０】
本発明の遺伝子構築体は、当技術分野でよく知られている方法を使用して調製することができる。
【０１３１】
療法剤または分子(ワクチン)、例えば本発明の抗原分子、例えばp130アンジオモチンポリペプチドおよび/またはそのコードポリヌクレオチド、および/または抗体、あるいはこれらの配合物は、経口および非経口(例えば皮内または筋肉内)注射を含めた任意の従来法によって投与することができる。好ましい経路には経口、鼻腔内または筋肉内注射がある。治療は、一定期間の1回投与または複数回の投与からなっていてよい。前に論じた誘導物質、例えば小分子誘導物質は経口投与することができることが好ましいことは、理解されるはずである。
【０１３２】
遺伝子構築体、例えば本発明のコードポリヌクレオチド(またはアンチセンスポリヌクレオチド)を含むアデノウイルスベクター構築体を、レシピエントの細胞に送達する方法は、当業者によく知られているはずである。特に、養子療法プロトコルを使用することができ、あるいはより好ましくは、遺伝子銃を使用して、例えば皮膚中の樹状細胞に構築体を送達することができる。
【０１３３】
養子療法プロトコルは、Nestle et al.、1998、Nature Med.、4: 328〜332およびDe Bruijn et al.、1998、Cancer Res.、58: 724〜731中に記載されている。
【０１３４】
療法剤(ワクチン)は、何か他の方法によって疾患の治療を受けている対象に与えることができる。したがって、治療法は単独で使用することができるが、アジュバント療法として、例えば腫瘍抗原を標的化する従来の予防法または治療法または免疫療法と共に、治療法を使用することが望ましい。例えば、ペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチドまたは死菌腫瘍細胞として投与される、本発明のワクチンと腫瘍抗原に基づくワクチンの組合せは、適切な併用療法である可能性がある。
【０１３５】
本明細書に記載する療法分子、例えば抗原分子または免疫賦活分子は単独で投与することができるが、1つまたは複数の許容される担体と共に医薬配合物としてそれを提示することが好ましい。(核酸またはポリペプチドであってよい)療法分子と適合性がありそのレシピエントに害がないという意味で、担体は「許容される」ものでなければならない。典型的には担体は、滅菌状態であり発熱物質を含まない水または生理食塩水であるはずである。
【０１３６】
医薬組成物は、組成物の抗原性および/または免疫原性を高めるための要素、例えば前に論じたアジュバントおよび/またはサイトインをさらに含むことができる。多価抗原(抗原の集合体)が有用である可能性がある。
【０１３７】
市販型のサイトインは、免疫系を一般的に追加抗原刺激するための非特異的免疫療法剤として、かつ腫瘍ワクチンなどの他の免疫療法剤と共に与えられるアジュバントとして使用されてきている。GM-CSFは非特異的免疫療法剤として、かつ他の型の免疫療法剤と共に与えられるアジュバントとして癌に対して試験されている。
【０１３８】
様々な他の化合物は免疫系の活性を追加抗原刺激することが知られており、特にワクチン療法用の可能性のあるアジュバントとして現在研究中である。幾つかの最も一般的に研究されているアジュバントを以下に列挙するが、多くの他のアジュバントが開発中である。
【０１３９】
レバミゾール、寄生虫感染に対して最初に使用された薬剤は、幾つかの化学療法剤と共に使用すると、結腸直腸癌を有する人々の間の生存率を改善することが近年分かってきている。レバミゾールは、Tリンパ球を活性化させることができるので、免疫療法用アジュバントとして使用されることが多い。レバミゾールは現在、幾つかの段階の結腸直腸癌を有する人々に一般的に使用されており、他の型の癌用の治療物質として臨床試験において試験されている。
【０１４０】
水酸化アルミニウム(ミョウバン)は、癌用ワクチンの臨床試験において使用される最も一般的なアジュバントの1つである。それは、B型肝炎ウイルスを含めた幾つかの感染物質に対するワクチンにおいて既に使用されている。
【０１４１】
カルメットゲラン桿菌(BCG)は、結核を引き起こす細菌と関係がある細菌である。免疫系に対するBCG感染の影響によって、この細菌は抗癌免疫療法の1つの形として有用となる。BCGは、癌に対して使用された最も初期の免疫療法剤の1つであった。BCGは、表在性膀胱癌用の一般的な治療剤としてFDAに承認されている。他の癌における非特異的アジュバントとしての、その有用性も試験されている。研究者達は、化学療法、放射線療法、または他の型の免疫療法を使用するとき、BCGを注射して付加的な追加抗原刺激を免疫系に与えることを考えている。
【０１４２】
フロイント不完全アジュバント(IFA)は、幾つかの実験用療法剤と共に与えて免疫系を刺激するのを助け、癌用ワクチンに対する免疫応答を増大させる。IFAは、白い鉱油に溶けた乳化剤からなる液体である。
【０１４３】
QS-21は、メラノーマに対して使用されるワクチンに対する免疫応答を増大させる、植物エキスから作製された比較的新しい免疫刺激物質である。
【０１４４】
DETOXは、他の比較的新しいアジュバントである。DETOXは細菌の細胞壁の一部分から作製され、脂肪の一種である。DETOXは様々な免疫療法剤と共に使用して、免疫系を刺激する。
【０１４５】
キーホールリンペットヘモシアニン(KLH)は、癌ワクチン療法の有効性を高めるために使用される他のアジュバントである。それは海洋軟体動物の1型から抽出される。
【０１４６】
ジニトロフェニル(DNP)は、腫瘍抗原と結合し高い免疫応答を引き起こすことができるハプテン/小分子である。これを使用して、幾つかの癌用ワクチンにおいて腫瘍細胞を改変する。
【０１４７】
本発明の第8の態様は、試験サンプル中の血管新生および/または腫瘍形成の検出および/または測定における、本発明の抗体または断片の使用を提供する。例えば、血清、腫瘍タンパク質抽出物または腫瘍から抽出したmRNAなどの試験サンプルを使用して、p80-および/またはp130アンジオモチンポリヌクレオチドおよび/またはポリペプチドおよび/またはp80-および/またはp130アンジオモチンに対する抗体のレベルを定量化することができる。ELISAおよび/またはリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(PCR)アッセイを含めた、多くのよく知られている方法をこの目的のために使用することができる。血管新生および/または腫瘍形成の検出および/または測定は、分析する試験サンプルに応じてin vitroおよび/またはin vivo法を使用して実施することができることは理解されるはずである。
【０１４８】
本発明の第9の態様は、血管新生および/または腫瘍形成を調節するための医薬組成物であって、有効量の本発明のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または本発明の抗体または断片、ならびに医薬賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１４９】
「有効量」に、血管新生および/または腫瘍形成を調節するのに充分である量を含める。ヒトなどの対象中の血管新生および/または腫瘍形成のレベルを測定するための方法は、当業者によく知られている。
【０１５０】
例えば腫瘍形成は、マウス乳癌系D2F2、およびリンパ腫系EL-4などのネズミ腫瘍細胞系において評価することができる。in vivoでの腫瘍形成は、マウス乳癌ウイルスプロモーターの制御下での形質転換ラットHer.2/neu癌遺伝子の過剰発現の結果として腫瘍を自然に発症する、マウストランス遺伝子乳癌モデル、BALB-neuTなどのモデル系において測定することができる(Boggio et al.、1998、J.Exp.Med.、188: 589〜96)。
【０１５１】
これらのモデルにおける宿主免疫系の状態は、CD8+およびCD4+T細胞応答を測定する既知の免疫アッセイ、例えばELISPOTアッセイ、サイトカイン放出アッセイおよびT細胞増殖アッセイなど、ならびに抗体応答を測定するためのアッセイ、例えばELISAアッセイおよびフローサイトメトリーによるアッセイなどを使用することによって評価することができる。腫瘍中の血管新生化は、(例えば、London et al.、2003、Cancer Gene Ther.、10: 823〜832中に記載されたのと同様の)「Matrigel-plug」アッセイ、またはスキン-フラップウインドウ-チャンバモデルなどのイメージングによるアッセイを含めた、様々な既知のアッセイによって評価することができる。
【０１５２】
一定量の本発明のポリペプチドおよび/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)および/または抗体または断片を用いる治療の前後に、このような方法を使用することによってin vivoにおける有効量を測定して、対象中の血管新生のレベルを測定することができる。あるいは、例えば実施例中に記載した方法を使用してin vitroで医薬品を試験することによって、医薬品の有効範囲の概念を得ることができる。
【０１５３】
医薬組成物は、血管新生および/または腫瘍形成を予防するかつ/または低下させることが好ましい。
【０１５４】
本発明の第10の態様は、血管新生および/または腫瘍形成を調節するためのワクチンであって、有効量の本発明のアンジオモチンポリペプチド、および/またはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、ならびに賦形剤または希釈剤を含むワクチンを提供する。
【０１５５】
ワクチン候補が予防的(すなわち、腫瘍細胞で攻撃した動物において腫瘍を予防するために)、かつ治療的(すなわち、ワクチンの投与が前に確定した腫瘍の退化を引き起こす)に働くことができることを実証する、幾つかの動物試験が存在する(例えば: Cavallo et al.、1993、Cancer Res.、21: 5067; Nanni et al.、2001、J.Exp.Med.、194: 1195)。
【０１５６】
本発明のワクチンまたは本発明の医薬組成物は、ポリペプチドおよび/またはポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、および/または抗体またはその断片の作用を補助または補強するための少なくとも1つの添加剤をさらに含むことが好ましい。
【０１５７】
より好ましくは、少なくとも1つの添加剤は免疫賦活分子であり、サイトカインまたはサイトカインをコードするポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)であることが好都合である。
【０１５８】
好ましくは、本発明のワクチンまたは本発明の医薬組成物は細胞または細胞抽出物を含み、それはより好ましくは、本発明のアンジオモチンポリペプチドを担持しているか、あるいは本発明のそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)をトランスフェクトしたAPCである。
【０１５９】
細胞はアンジオモチンを発現する腫瘍細胞、またはアンジオモチンを発現する内皮細胞であることが好都合である。
【０１６０】
本発明の第11の態様は、
哺乳動物で本発明のアンジオモチンポリペプチドに対する免疫応答を生み出す方法であって、
(i)本発明のアンジオモチンポリペプチドまたはそのコードポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)を用いて哺乳動物から回収した免疫細胞をex vivoで刺激する段階と、
(ii)刺激した免疫細胞を哺乳動物に戻すことによりアンジオモチンに対する免疫応答が生じるように、この細胞を哺乳動物に戻す段階、
を含む方法を提供する。
【０１６１】
哺乳動物はヒトであることが好ましい。
【０１６２】
免疫応答は予防的または治療的に働いて、血管新生関連疾患の発症または進行を阻害することが好ましい。
【０１６３】
本発明のこの態様では、対象の免疫細胞を本発明のポリペプチドによってex vivo(すなわち、対象の身体の外)で刺激する。このポリペプチドは患者の免疫細胞、特にT細胞に対して提示し、次に本発明のポリヌクレオチドを抗原提示細胞(APC)にトランスフェクトすることができる。抗原提示細胞は、本発明のポリペプチドまたはそれに由来するペプチドを用いて外面を事前に処理することも可能である。リンパ球を刺激する能力を有する任意の細胞型は、抗原提示細胞としてここで操作的に定義し、これらは骨髄の単球またはリンパ球様細胞由来の樹状細胞(DC)、およびマイトジェンによって刺激されあるいは例えばエプスタインバーウイルス(EBV)によって不死化状態になるB細胞を含むと考えられる。
【０１６４】
患者への再度の刺激した免疫細胞の適合移植は、移植される免疫細胞、主にCD8+またはCD4+型のT細胞によって内皮細胞中で発現されるアンジオモチンを認識することによる血管新生の阻害、およびしたがって腫瘍または他の血管新生関連疾患の進行の制限をもたらすことができる。患者への再度の刺激した免疫細胞の適合移植は、移植される免疫細胞、主にCD8+またはCD4+型のT細胞によって腫瘍抗原として腫瘍細胞中で発現されるアンジオモチンを認識することにより、腫瘍の進行の制限をもたらすこともできる。
【０１６５】
好ましくは、本発明の使用、医薬組成物、ワクチンまたは方法において、コードポリヌクレオチドは、
(i)配列番号2のポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)、または
(ii)配列番号2と少なくとも80%および/または少なくとも90%および/または少なくとも95%および/または少なくとも98%の同一性を有し、かつ/または65℃で2×SSCの条件下で配列番号2とハイブリダイズすることができ、かつ/または機能性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または
(iii)機能性ポリペプチド断片をコードする配列番号2の断片を含み、
ポリヌクレオチド(および/またはアンチセンスポリヌクレオチド)は、p80アンジオモチンまたはp80アンジオモチンの断片をコードしない。
【０１６６】
本発明のポリヌクレオチドおよび/またはアンチセンスポリヌクレオチドは、p80アンジオモチンポリペプチドをコードするポリヌクレオチドおよびその断片と同一であるものは含まない。
【０１６７】
本発明のポリヌクレオチドは、必要な宿主および/または標的細胞中でのその複製および/または発現を可能にするために、前に記載した制御配列および/またはベクター配列をさらに含むことができる。
【０１６８】
同じ遺伝子をコードする2つの核酸は、類似しているが同一ではないヌクレオチド配列を有し得ることは、当技術分野でよく知られている。遺伝子のヌクレオチド配列の変形は、(i)タンパク質またはその断片を生成するために使用可能である。したがって前記遺伝子によってコードされるタンパク質と特異的に結合する抗体を調製するために使用可能である配列、あるいは(ii)直前に定義したタイプ(i)の遺伝子または変形に対応するアンチセンス配列である。例えば、原型コドンと同じアミノ酸をコードする、異なるコドンを置換することができる。あるいは置換コドンは、タンパク質の活性または免疫原性に影響を与えないか、あるいはその活性または免疫原性を改善する可能性がある異なるアミノ酸をコードすることができる。例えば、参照により本明細書に組み込まれているBotstein et al.、1985、Science、229: 193〜1210中に記載されたのと同様に、部位特異的突然変異誘発または他の技法を利用して、置換、挿入、欠失、および転位などの1つまたは多数の突然変異を作製することができる。このような改変型遺伝子は、既知の技法を本明細書に含まれる教示に適合させることによって得ることができるので、このような改変型遺伝子は特許請求する本発明の範囲内にある。
【０１６９】
さらに、本発明の遺伝子配列(またはその断片)を使用して、高ストリンジェンシーの条件下でそれとハイブリダイズする他のDNA配列を得ることができることは、当業者によって理解されるはずである。このようなDNAは任意のゲノムDNAを含む。したがって、本発明の遺伝子は、本発明の方法中で同定した遺伝子の推定アミノ酸配列と50%を超える同一性を有するアミノ酸配列、または本発明の方法中で同定した遺伝子と少なくとも55パーセント、好ましくは60パーセント、および最も好ましくは70パーセントの相同性を示すDNA配列をコードするDNAを含む。ただしこのような相同的DNAが、本発明の方法中で使用可能であるものとする。本発明の遺伝子は、ウシロドプシンの少なくとも200アミノ酸の配列と20%を超える同一性を有するアミノ酸配列をコードするDNAも含む。
【０１７０】
DNA-DNA、DNA-RNAおよびRNA-RNAハイブリダイゼーションは、0.1×SSCと6×SSCの間を含む水溶液中で、55℃と70℃の間の温度において実施することができる。温度が上昇するかあるいはSSC濃度が低下すると、ハイブリダイゼーション条件がより厳しくなることは、当技術分野でよく知られている。「高ストリンジェンシー」に、2×SSCおよび65℃を意味する。1×SSCは0.15MのNaCl/0.015Mのクエン酸ナトリウムである。
【０１７１】
遺伝子の変異体には、比較的短い伸張部分(例えば20〜50ヌクレオチド)が、本発明の遺伝子の同等の伸張部分と高度の相同性(少なくとも50%および好ましくは少なくとも90または95%)を有するが、2遺伝子間の全体的な相同性ははるかに低い可能性がある遺伝子がある。これは、タンパク質の一般的な構造が異なるときでさえ、重要な活性または結合部位が共有される可能性があるためである。
【０１７２】
ハイブリダイゼーション反応の「ストリンジェンシー」は当業者によって容易に決定され、一般的にはプローブ長、洗浄温度、および塩濃度に応じた実験に基づく計算値である。一般に、長いプローブは適切なアニーリングのために高い温度を必要とするが、一方で短いプローブは低い温度を必要とする。ハイブリダイゼーションは一般に、その融解温度未満の環境中に相補鎖が存在するときに再アニーリングする、変性DNAの能力に依存する。プローブとハイブリダイズ可能な配列の間の望ましい相同性の程度が高いほど、使用することができる相対温度は高くなる。ハイブリダイゼーション反応のストリンジェンシーのさらなる詳細および説明に関しては、Ausubel et al.、1995、Current Protocols in Molecular Biology(Wiley Interscience Publishers)またはProtocols Online URL: www.protocol-online.net/molbio/index.htm)を参照のこと。
【０１７３】
「厳しい条件」または高ストリンジェンシーは、(1)洗浄用に低いイオン強度および高い温度、例えば0.1×SSC、0.2%SDS（65〜70℃）を使用することによって確認することができる。
【０１７４】
「適度に厳しい条件」は、Sambrook et al.、2001、Molecular Cloning: A Laboratory Manual(3rd Edition)により記載されたのと同様に確認することができ、前に記載した条件より厳しくない、洗浄溶液およびハイブリダイゼーション条件(例えば温度、イオン強度、および%SDS)の使用を含む。適度に厳しい条件の一例は、0.2×SSC、0.1%SDS、58〜65℃である。当業者は、必要に応じて温度、イオン強度などを調節してプローブ長、プローブと標的部位の間の相同性の程度などの要因を適応させる方法を理解しているはずである。したがって、当該の配列以外に、当該の配列のそれとは異なる追加的または代替的なプローブ配列も、当該の配列のスクリーニングにおいて有用であろうと考えられる。
【０１７５】
本発明の幾つかの態様を具体化する好ましい非制限的な実施例を、以下の図面を参照しながらここで記載する。
【０１７６】
(実施例)
(実施例1-実験データ)
物質および方法
細胞培養
p80-およびp130アンジオモチンを安定して発現するMAE細胞(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)を、ダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Sigma)中に保った。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞は、F-12HAMを含むDMEM中に保った。p80またはp130を安定して発現するCHO細胞は、リポフェクタミン2000(Gibco)を使用してpcDNA3およびp80アンジオモチンまたはp130アンジオモチンのいずれかの挿入体をCHO細胞にトランスフェクトし、0.4mg/mlでG418を有するクローンを選択することによって作製した。ウシ毛細血管内皮(BCE)細胞を、2ngのbFGF/mlを補ったDMEM中で培養した。すべての細胞培養培地に、10%ウシ胎児血清(Gibco)、100単位/ペニシリン1ml、100μg/mlストレプトマイシンおよび2mML-グルタミンを補った。
【０１７７】
自然に不死化させたマウス大動脈内皮(MAE)細胞(Bastaki et al.、1997、Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol.、17: 454〜464)、および(Dr G Nolan、スタンフォード大学、Palo Alto、CAによって与えられた)エコトロピックレトロウイルス生成Phoenix eco細胞を、10%ウシ胎児血清、1%グルタミンおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)(Sigma)中で増殖させた。
【０１７８】
安定的にトランスフェクトしたMAE細胞を、5μg/mlのピューロマイシン(ベクター、p80アンジオモチンおよびp130アンジオモチン)または800μg/mlのG418(p130特異的N末端)の存在下で増殖させた。293T細胞は、10%ドナーウシ血清および抗生物質を補ったDMEM培地中で増殖させた。M21細胞は、5〜10%FCSおよび2mMグルタミンを含むRPMI1640培地中で増殖させた。BAE細胞は、10%ウシ胎児血清、1%グルタミンおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で増殖させた。hTERT+-BCE細胞は、10%BCS、2ng/mlFGF-2、1%グルタミンおよび1%ペニシリン/ストレプトマイシンを含むDMEM中で増殖させた。
【０１７９】
プラスミド構築体
cDNAp80アンジオモチンおよびp130アンジオモチンをpENTR-2Bベクター(Gateway、Invitrogen)にサブクローニングし、次いでLR組換え反応(Gateway、Invitrogen)を使用して、変形Gateway指定ベクターpcDNA3(Invitrogen)または(Dr H Land、LCRF、ロンドン、UKによって提供された)pBABEに組換えた。flag標識タグ型MAGI-1bおよびMAGI-1cは、記載されたもの(Dobrosotskaya et al.、2000、Biochem.Biophys.Res.Common.、270: 903〜9)と同様であった。N末端構築体は、Dr A Shimono、Center for Developmental Biology、神戸、日本からの親切な贈り物であった。
【０１８０】
抗体
アンジオモチンに対する3つの異なるポリクローナル抗体を使用した。1つはアンギオスタチン結合ドメインに対する抗体(B3抗体)(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)、1つはC末端に対する抗体(TLE抗体)(Ernkvist et al.、2005、提示済み)、および1つはp130アンジオモチンのN末端に対する抗体であった(Ernkvist et al.、2005、提示済み)(図9A)。以下のマウスモノクローナル抗体を使用した。9E10抗mycタグ(Santa Cruz)、M2抗flag標識タグ(Sigma)、AC-15抗アクチン(Sigma)、1A12抗ZO-1(Zymed Laboratories Inc.)、C060抗カベオリン(Transduction Laboratories)、349抗パキシリン(Transduction Laboratories)およびラットモノクローナルMec13.3抗CD31/PECAM(BD Pharmingen)。
【０１８１】
アンジオモチンの異なるドメインに対するウサギポリクローナル抗体を作製した。p130アンジオモチンに特異的な266アミノ酸の断片を使用して、N末端抗体を生成した。アンギオスタチン結合ドメインを使用して、アンジオモチンの細胞外部分に対する抗体を作製した(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)。24個の大部分のC末端アミノ酸に対応するペプチドを使用して、C末端抗体を作製した
【０１８２】
免疫沈降
溶解バッファー(50mMのTris-HCl pH7.4、0.2%のNonidetP40、150mMのNaCl、1mMのEDTAおよびプロテアーゼ阻害剤)を用いて細胞を抽出した。4℃で1時間事前免疫または免疫血清のいずれかを用いて溶解物を免疫沈降させた。ペレットは溶解バッファーで3回洗浄し、1×サンプルバッファー中に再懸濁させ、SDS-PAGEによって分析した。インゲル消化および質量分析用に、5グラムの293T細胞を50mlの溶解バッファーに溶かした。上清を20分間17,000rpmでの遠心分離によって浄化した。セファロースCL-4Bと結合した事前免疫および免疫抗ゲミニン抗体の500μlの50%スラリーを、90分間4℃での免疫沈降用に使用した。ペレットはRIPAバッファー(50mMのTris-HCl pH7.4、150mMのNaCl、1mMのEDTA、1%のNP40、1%のデオキシコール酸、0.1%SDSおよびプロテアーゼ阻害剤)で3回洗浄した。室温で2分間100mMのエタノールアミンを用いてサンプルを溶出させ、Lamelliサンプルバッファーを用いて変性させ、SDS-PAGE上で分析した。銀染色後、バンドを切除し質量分析を施した。
【０１８３】
p130アンジオモチンのクローニング
p130配列由来のタンパク質分解断片の質量分析によって、p80に由来したペプチド、およびp80アンジオモチンの5'「UTR」であるとしたがって考えたものに由来したペプチド(図1B中のボールド体)、およびデータベース中の2つのEST(BI058583およびCK001189.1)に由来したペプチドを示した。延長部分は、ゲノムDNA中の配列、p80cDNAの5'端から7キロベース上流と一致し、それが上流エクソンに由来したことが示唆された。我々はこれらのESTを得ることができなかったので、我々はゲノム配列を含むPACクローン(AC004827.1)を使用し、PCRによって上流エクソンを増幅させ、それをアンジオモチンp80cDNAの5'端と連結させた。生成したcDNAは、ESTのBI058583およびCK001189.1の公開済みの配列およびp130アンジオモチンの全ORFを含んでいた。
【０１８４】
ウエスタンブロット
タンパク質を7.5%標準SDS-PAGEゲル(Bio-Rad)上で分離し、半乾燥ブロッティングによってProtranニトロセルロース膜に移した。膜は5%でのPBDとのインキュベーションによってブロッキングし、一晩+4℃で一次抗体と共にインキュベートし、次にHRP-ロバ抗ウサギまたはHRP-ヒツジ抗マウス(Amersham Biosciences)と共に室温で1時間インキュベートした。フィルターはPBS+0.05%tween中で数回洗浄し、ウエスタンブロッティング用ルミノール試薬(Santa Cruz)を用いてシグナルを目に見える状態にした。
【０１８５】
細胞溶解物をSDS-PAGEによって分析し、タンパク質をニトロセルロース膜に移した。非特異的結合を、10%乾燥ミルクを0.1%tweenを含むPBS(PBS-T)に溶かしたもので1時間ブロッキングした。5%乾燥ミルクを溶かしたPBS-T中で一晩4℃において、C末端ペプチドアンジオモチンポリクローナル抗体(1:500)またはアンジオモチンの細胞外ドメインに対するポリクローナル抗体(1:2000)と共に、膜をインキュベートした。二次抗体(抗ウサギHRP)は1:10000に希釈し(Amersham)、室温で1時間インキュベートした。その後、プログラムLAS1000(Fujifilm)によって処理能力が高い暗箱(Fujifilm)中で、Santa Cruz Biotechnology Incからの検出システムを使用して、ニトロセルロース膜を目に見える状態にした。マウス成体組織、胚または胎盤由来のタンパク質を含む市販の供給元(RNWAY研究室)から購入した膜を、前と同様にインキュベートした。
【０１８６】
ビオチン化の実験
約1千万個の細胞を含むコンフルエントな10cmプレートをPBS中で二回軽くすすぎ、PBSに溶かしたNHS-Sulfo-LC-ビオチン(Pierce Inc.)(0.4mg/ml)またはDMSOに溶かしたNHS-LC-ビオチン(0.4mg/ml)と共に、室温で30分間インキュベートした。次いでプレートをPBSですすいだ。対照プレートはPBSのみとインキュベートした。1mlの溶解バッファー(20mMのHEPES、140mMのKCl、5mMのMgCl2、10mMのβ-グリセロホスフェート、3%のポリエチレン-9-ラウリルエーテル(Thesit)およびプロテアーゼ阻害剤カクテル、pH7.4)を加え、ラバーポリスマンを使用して細胞を採取した。溶解物は30000gで25分間遠心分離にかけ、1μgのB3アンジオモチン抗体または1μgのモノクローナル抗パキシリン抗体および30μlのプロテインGセファローススラリー(Pierce Inc.)のいずれかとインキュベートすることによって、上清に免疫沈降法を施した。ビーズは溶解バッファー中で1回洗浄し、1%のThesitを含む溶解バッファー中で三回洗浄した。タンパク質は30μlのLaemliバッファーを用いて溶出させ、半分の物質を10%プレキャスト標準ゲル(Bio-Rad)上に載せた。ビオチン化タンパク質はウエスタンブロットによって検出し、この場合5%ノンファットミルクを含むPBSに溶かしたHRP結合ストレプトアビジン(Pierce Inc.)と共に一晩、膜をインキュベートした。
【０１８７】
アンギオスタチン結合アッセイ
ヒトアンジオモチン(kringle1〜4)を、製造者(Pierce Inc.)のプロトコルに従いIodogen法によってヨウ素125で標識した。比放射能は15000cpm/ngタンパク質であると推定した。結合アッセイ用に、p80アンジオモチンまたは空ベクターを安定して発現するHeLa細胞を、12ウエルプレート中でコンフルエントになるまで増殖させた。1mg/mlのBSAを含むPBSで細胞を洗浄した。2時間10ng/mlの放射標識アンギオスタチンと共に細胞をインキュベートした。次いで細胞を1mg/mlのBSAを含むPBSで五回洗浄し、1%のTritonX-100をPBSに溶かしたものを用いて溶解させ、ガンマ線測定装置中で放射活性を測定した。
【０１８８】
トリプシン処理
6センチメートルのペトリ皿上で増殖させたコンフルエントな状態の細胞を、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで二回洗浄し、2μg/mlで1mlのシークエンシング用トリプシン(Sigma)と共に、あるいはPBS単独で37℃において示した時間インキュベートした。細胞をPBS中で1回洗浄し、75μlのLaemliバッファーを加えることによって、この実験を終わらせた。サンプルはウエスタンブロットによって分析した。
【０１８９】
バイオインフォマティクス分析
膜貫通ヘリックスは、Predict Protein(http://www.embl-heidelberg.de/predictprotein/predictprotein.html)(Rost et al.、1996、Protein Sci.、5: 1704〜1718)およびTmpred (http://www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html)を用いて予想した。
【０１９０】
免疫蛍光
培養細胞をチャンバースライドに平板培養し、一晩増殖させ接着させた。室温で10分間4%のPFA中に細胞を固定した。必要なときは、1分間0.1%トリトンX-100(Sigma)を細胞に浸透させた。非特異的反応性は、1時間ブロッキングバッファー中に一次抗体を加える前に、5%ウマ血清をPBSに溶かした溶液と共に1時間インキュベートすることによって阻害した。抗体の結合は蛍光標識二次抗体(Dako and Molecular Probes)を用いて検出した。F-アクチンはテキサス-レッドファロイジン(Molecular Probes)を用いて目に見える状態にした。スライドはVector Laboratoriesからの固定媒体上に載せ、Zeiss Axioplan2顕微鏡で見て、AxioCam HRmカメラおよびAxiovision4.2ソフトウェアを使用して画像を回収した。サイトカラシンB(Sigma)で処理した細胞を、固定前に1時間50μg/mlのサイトカラシンBで処理した。次いで細胞を、前に記載したのと同様に染色した。
【０１９１】
胎盤切片の免疫染色:胎盤の切片を、以前に記載された方法(Fisher et al.、1989、J.Cell Biol.、109: 891〜902; Damsky et al.、1992、J.Clin.Invest.、89: 210〜222)を使用することによって二重間接的な免疫局在化用に処理した。簡単に言うと、切片を冷アセトン中で5分間固定し、次いでPBS中でさらに5分間洗浄した。非特異的反応性は、一次抗体の混合物を加える前に30分間の0.2%BSA/PBSのインキュベーションによって阻害した。ラット抗ヒトサイトケラチンモノクローナル抗体7D3(Damsky et al.、1992、J.Clin.Invest.、89: 210〜222)を1:50の希釈で使用した。ウサギ抗ヒトアンジオモチンを1:50の希釈で使用した。1時間後、細胞をPBSですすぎ、ローダミンまたはフルオレシンと結合した適切な種特異的二次抗体(Jackson ImmunoResearch Lab、Inc)と共に細胞をインキュベートした。PBS中でさらに三回洗浄した後、カバーガラスをスライド上に載せ、Zeiss Axiophotエピ蛍光顕微鏡(Thornwood、NY)を用いて調べた。
【０１９２】
培養細胞の免疫蛍光
チャンバースライド(Falcon)上の細胞プレートをPBS中で軽くすすぎ、4%パラ-ホルムアルデヒド中に10分間固定し、(他に言及しない場合)0.05%のトリトンx-100で30秒間処理した。次いで細胞を5%ウマ血清と共に60分間インキュベートし、5%ウマ血清に希釈した一次抗体と共に1時間インキュベートし、PBS中で四回洗浄し、テキサスレッドウマ抗マウス(Vector Laboratories Inc.)または5%ウマ血清に希釈したFITCブタ抗ウサギ(DAKO)と共に1時間インキュベートした。F-アクチンはテキサスレッドファロイジン(Molecular Probes)を用いて目に見える状態にした。試料はVectashield固定媒体およびDAPI(Vector Laboratories Inc.)上に載せた。Zeiss Axioplan2顕微鏡において画像を得て、Zeiss AxiovisionソフトウェアおよびAdobe Photoshopを用いて処理した。
【０１９３】
アンジオモチン誘導アッセイ
500000のBCE細胞を示した密度で平板培養し、24時間後に細胞層をPBSで二回軽くすすぎ、ティッシュペーパーに移し、100μlの2×SDS-pageローディングバッファーを加えることによって溶かした。サンプルはTLE抗体を使用してウエスタンブロットによって分析した。残留PBSのため増大するプレートの大きさと共にサンプル体積は増大し、したがって溶解物の体積の10%を添加した。アクチンに対する抗体でブロット試料をプローブ処理することによって、等しい添加を確認した。
【０１９４】
マウス網膜の免疫蛍光
殺傷したC57BL6マウス由来の目を4%パラ-ホルムアルデヒド/PBS中に4℃で2〜3時間固定し、PBS中で洗浄した。網膜は以前に記載されたのと同様に切開し(Chan-Ling et al.、1990、Curr.Eye Res.、9: 459〜478)、浸透/ブロッキングバッファー、PBB:1%のBSA、0.5%のトリトンX-100および5%の正常ヤギ血清を含むPBS中で、室温において2時間インキュベートした。次いで網膜を、PBBバッファーに希釈した一次抗体と共に4℃で一晩インキュベートした。室温においてPBSで六回洗浄した後、PBS+0.5%BSA、0.25%のトリトンX-100および5%の正常ヤギ血清に希釈した二次抗体と共に、暗所内で室温において2時間網膜をインキュベートした。二次抗体は、FITC結合ブタ抗ウサギ(Dako)AlexaFluor594ヤギ抗マウス(Molecular Probes)およびRPEヤギ抗ラットIgGマウス(Southern Biotechnology Associates)であった。網膜はVectashield固定媒体(Vector labs)に平らに載せた。
【０１９５】
MAGI-1を用いた免疫沈降
1日前に6cmのペトリ皿上に平板培養した二百万個のCHO細胞に、2μgの各プラスミドDNAおよびリポフェクタミン2000試薬(Life Technologies)をトランスフェクトした。溶解バッファー、150mMのNaCl、50mMのTris-HCl pH7.4、0.5%のトリトンX-100およびプロテアーゼ阻害剤中で、トランスフェクション後48時間で細胞を採取した。細胞溶解物は4℃で15分間攪拌回転させ、4℃において5分間13000rpmで遠心分離にかけた。上清を回収し、ブラッドフォード法によって全タンパク質を測定するために使用した。1.5mgの全タンパク質を示した溶解物は、20μlのプロテインAビーズを用いて事前に浄化し、次いで各IPサンプルに対する5μgの抗アンジオモチンまたは抗FLAG抗体と共に、攪拌下で4℃において6時間インキュベートした。その後、30μlのプロテインAビーズを各IPサンプルに加え、4℃において一晩攪拌した。インキュベーション後、ビーズを溶解バッファーで二回洗浄し、Lammeliサンプルバッファー中に再懸濁させ、沸騰させ、7.5%標準プレキャストゲル(Bio-Rad)によって解像した。免疫蛍光染色用に、40000個のCHO細胞をチャンバースライドに平板培養し、0.35μgの各プラスミドおよびリポフェクタミン2000試薬をトランスフェクトした。
【０１９６】
凝集アッセイ
カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSで二回すすぐことによってCHO細胞を脱着させ、0.02%のEDTA(Sigma)と共に脱着するまでインキュベートし、カルシウムおよびマグネシウムを含まないハンクス平衡塩溶液(HBSS)(Sigma)中に再懸濁させ、HBSS中で1回洗浄し、2%のFBSを補ったHBSS中に100000個の細胞/mlまで再懸濁させ、カルシウムおよびマグネシウムを含まないPBSに対して透析した。1%のBSAで事前にコーティングした24ウエルプレート中に、ウエル当たり50000個の細胞を添加した。このとき、絶対多数の細胞が単細胞であった。示した場合CaCl2(2mM)およびアンギオスタチン(5μg/ml)を加えた。プラットホーム型ローターにおいて80rpmでの攪拌中に、60分間37℃において細胞を凝集させた。5%の最終濃度までグルタルアルデヒドを加えることによって実験を停止した。各ウエルからの少なくとも5つの領域を10倍の倍率で撮影し、細胞の凝集に関して分析した。細胞の合計数(NO)を数え、60分での細胞凝集の数(N60)を数えた。記載されたのと同様に(Hirata et al.、2001、J Biol.Chem.、276: 16223〜16231)(NO-N60)/NOとして、凝集指数を計算した。約500個の細胞をそれぞれの条件に関して評価した。
【０１９７】
浸透性アッセイ
24ウエル形式の膜上で増殖させた細胞層を介してFITC標識デキストランを拡散させることに基づく、Chemicon Inc.からのIn Vitro血管浸透性アッセイキットを、製造者の教示書に従い使用した。簡単に言うと、膜挿入当たり10000個の細胞でCHO細胞を接種し、5日間で単層を形成した。三連または四連の挿入体をそれぞれの条件に関して使用した。示した場合、アンギオスタチン(2μg/ml)を実験の開始の1時間前にウエルに加えた。FITC-デキストランを上側チャンバーに加え、100μlのサンプルを5、15、60および120分で下側チャンバーから採取した。485nmの励起波長および530nmの発光波長を使用して、Bio-TekFL600プレートリーダーにおいて蛍光を測定した。細胞培養培地のバックグランド蛍光は差し引いた。細胞を含まない膜挿入を介したFITC-デキストランの拡散を平行して測定して、細胞単層の完全性を確実にした。
【０１９８】
細胞領域の定量化
陽性細胞を検出するためにC末端アンジオモチンポリクローナル抗体で細胞を染色し、次いでファロイジンで染色して全細胞を目に見える状態にした。Zeiss Axioplan2顕微鏡に付属したAxioCam HRmカメラを用いて写真を撮影した。Fujifilmイメージゲージバージョン4.0において細胞領域を測定した。ボックスプロットおよび統計的計算はStatview5.0.1で行った。
【０１９９】
in vitroでの創傷治癒
細胞をチャンバースライドに平板培養し、コンフルエントな状態まで一晩増殖させた。200μlのピペットを用いて創傷を作製した。創傷の写真は30分(時間地点0)、3.5時間(時間地点3時間)および6.5時間(時間地点6時間)後に撮影した。創傷端中の細胞間の距離を測定した。創傷縫合率を示すために、時間地点0と時間地点3時間および6時間を比較した。統計的計算はStatview5.0.1で行った。
【０２００】
移動アッセイ
Boydenチャンバー移動アッセイを記載されたのと同様に実施した(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)。簡単に言うと、無血清培地中の30000個の細胞をそれぞれのウエルに添加し、4時間で0.05%血清に移動させた。移動しなかった細胞は除去し、残りの細胞は固定し、ギムザ染色液で染色した。ウエル当たり3箇所の領域を顕微鏡下で計数した。
【０２０１】
移動アッセイを、初期に記載されたのと同様に(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)、48ウエルの化学走性チャンバー(Neuroprobe Inc)を使用して改変型Boydenチャンバーにおいて実施した。簡単に言うと、8ミクロンのNucleoporeのポリビニルピロリジンを含まないポリカーボネートフィルターを、一晩100μg/mlのコラーゲン1型(Cohension、Palo Alta、USA)でコーティングした。hTERT+-BCE細胞は、16時間0.2%のFCS-DME培地中で飢餓状態にした。アンギオスタチンの阻害活性を試験するために、hTERT+-BCE、およびベクターおよびアンジオモチンMAE細胞を、5μg/mlのアンギオスタチンと共に1時間プレインキュベートした。細胞をトリプシン処理し、0.1%のウシ血清アルブミン(BSA)を含むDMEM中に再懸濁させ、上側チャンバーのそれぞれのウエルに、アンギオスタチンを含むかあるいは含まない30,000個の細胞を加えた。塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF;Peprotech EC Ltd.)を、下側チャンバーにおいて化学走性物質として20ng/mlで使用した。化学走性チャンバーは10%CO2で37℃において3〜5時間インキュベートし、コラーゲンでコーティングしたポリカーボネートフィルターを介して細胞を移動させた。フィルターの上側表面上の移動しなかった細胞を除去し、フィルターはギムザ染色液(VWR International Ltd)で染色した。領域当たりの移動した細胞の合計数を20倍の倍率で数え、それぞれのサンプルは3つの独立した実験において四連で試験した。
【０２０２】
胎盤組織の回収
インフォームドコンセントを、組織を回収した全ての患者から得た。妊娠期間中の女性(6〜22週)から胎盤組織を1時間以内の手順で回収し、抗生物質を含むPBSで繰り返し洗浄し、氷上に置いた。
【０２０３】
細胞性栄養膜細胞の単離
公開された方法(Fisher et al.、1989、J.Cell Biol.、109: 891〜902; Kliman et al.、1986、Endocrinology、118: 1567〜1582)によって、集めた第1期-または第2期-第3期の胎盤から細胞を単離した。簡単に言うと胎盤を、絨毛膜絨毛の間質中心から細胞性栄養膜細胞の前駆細胞を脱着する、一連の酵素による消化に施した。ひとたび脱着した後、細胞をPercoll勾配で精製し、無血清培地:DMEM、4.5g/Lのグルコース(Sigma Chemical Co.、セントルイス、MO)および2%のNutridoma(Boehringer Mannheim Biochemicals)、1%のペニシリン/ストレプトマイシン、1%のピルビン酸ナトリウム、1%のHepesおよび1%ゲンタマイシン(UCSF細胞培養施設)中で15時間、Matrigelコーティング支持体(Collaborative Biomedical Products)上で培養した。
【０２０４】
侵襲性アッセイ
侵襲性アッセイを、以前に記載されたのと同様に実施した(Damsky et al.、1992、J Clin.Invest.、89: 210〜222; Librach et al.、1991、J.Cell Biol.、113: 437〜449)。簡単に言うと、単離した細胞性栄養膜細胞(0.25×106)を、Matrigelでコーティングしたポリカーボネートフィルター(孔径8μm)を含むTranswell挿入体(6.5mm、Costar)上に平板培養した。実験した培養物は5μg/mlで培養培地に加えたアンギオスタチンを含んでいた。48時間後、ヒトサイトケラチンと特異的に反応する7D3抗体で培養物を染色して、細胞性栄養膜細胞を目に見える状態にした。フィルターを支持体から分離し、それらの上側表面を下にしてスライドに載せた。フィルターの下側表面上のサイトケラチン陽性細胞および細胞突起の数を数えた。それぞれの実験条件は三連で試験し、アッセイ全体は三回実施した。データは、細胞性栄養膜細胞および細胞性栄養膜細胞の突起の合計数として表した。データの統計的有意性はスチューデントのt-検定によって分析した。
【０２０５】
結果
アンジオモチンの新規なスプライシングイソ型の同定
他の目的で設計した免疫沈降の実験中、我々は293T細胞においてアンジオモチンの新規なイソ型を同定した。293T細胞を免疫沈降分析に施し、免疫沈降物はSDSポリアクリルアミド電気泳動(SDSPAGE)によって分離し、銀染色によって検出した。80および130kDaに対応する2つのバンドを切断し、インゲル消化によるタンパク質分解および質量分析法によって同定した。2つのタンパク質由来のトリプシン消化産物のシークエンシングによって、80kDaバンドおよび130kDaタンパク質バンドをp80アンジオモチンのイソ型として同定した。アンジオモチン特異的抗体を使用するウエスタンブロット分析によって、293T細胞においてアンジオモチンの2つのイソ型が存在することを確認した(図1A)。
【０２０６】
p130アンジオモチンでは、アミノ酸1〜409はp130アンジオモチンに特異的なN末端部分を形成し、アミノ酸410〜1084はp80アンジオモチンに対応し、p130アンジオモチンのC末端部分を形成する(図1B)。N末端延長部を有するこのイソ型を生成するエクソン2と3の間の可変スプライシングによって、p130アンジオモチンを作製する(図1C)。したがって我々は、p130アンジオモチンのN末端ドメインに特異的なポリクローナル抗体を作製した。ウエスタンブロットにより分析すると、この抗体はp130を特異的に認識するが、p80イソ型は認識しない(図1D)。
【０２０７】
アンジオモチンの発現
p130アンジオモチンは妊娠期間に胎盤中で発現されるが、胚中では適切に発現されない。
【０２０８】
アンジオモチンノックアウトマウスは、原腸形成中に異常な内臓内胚葉細胞の移動を示し、マウスの70%において胚の死をもたらすので、アンジオモチンは胚形成中に重要な役割を果たす(Shimono and Behringer、2003、Current Biol.、13: 613〜7)。したがって我々は、マウス胚形成中のアンジオモチンのイソ型の一時的な発現パターンを分析した。第5〜19日胚由来のマウス胚(E)のウエスタンブロットは、胎児発育中のタンパク質レベルの増大と共にE6からのp80アンジオモチンの発現を示した。p130アンジオモチンの発現は検出されなかった(図2A)。E15由来の胚溶解物の過剰露出は、p130アンジオモチンの弱い発現を示した(データ示さず)。したがって我々は、p80アンジオモチンは胚形成中に発現される主要形であると結論付けた。次いで我々は、異なる段階の妊娠期間由来の胎盤サンプルを用いたウエスタンブロット手法を使用して、他の胚組織中でのアンジオモチンの発現を分析した。E11から妊娠期間の最後まで発現されたp80アンジオモチン以外に、p130アンジオモチンの発現をE13〜E16の胎盤中のみで検出した(図2B)。成体マウス組織中のアンジオモチンタンパク質レベルの分析によって、p130アンジオモチンの発現は胸腺および精巣に限られていたが、一方p80アンジオモチンは異なる成体組織中でさらに多量に発現されたことを示した(図2C)。
【０２０９】
細胞レベルでのp130アンジオモチンおよびp80アンジオモチンの発現を測定するために、我々は293T細胞、細胞性栄養膜細胞、hTERT+-BCE細胞およびウシ大動脈内皮(BAE)細胞由来の細胞溶解物を試験した。図2D中に示すように、試験した全ての細胞型がアンジオモチンの2つのイソ型を生成する。
【０２１０】
アンジオモチンの局在
アンジオモチンは初代内皮細胞中の密着結合部分に局在し、細胞密度によって制御される。
【０２１１】
初代細胞における細胞外染色パターンを確認するために、同等量のp80-およびp130アンジオモチンを発現するBCE細胞を用いた同じ実験(Ernkvist et al.、2005、提示済み)を、我々は実施した。膜浸透化を使用せずに、アンギオスタチン結合ドメインに対する抗体によって、MAE細胞のそれと同等のパターンを有する細胞の約10%を染色した。陰性対照として使用したGSTに対する対照抗体は染色しなかった(データ示さず)。我々は、コンフルエントな状態の初代細胞においてアンジオモチンの局在の調査を進めた。驚くことに、アンギオスタチン結合ドメインに対する抗体は、界面活性剤の不在下ではコンフルエントな状態の細胞において検出可能な染色を示さず、細胞がコンフルエントな状態であるときアンギオスタチン結合ドメインが隠れることが示唆された(図3A)。しかし、アンジオモチンのC末端に対する抗体は、細胞間接触において強い免疫反応性を示した。局在はZO-1、密着結合部分(TJ)のマーカーと重複した。ZO-1に時折陽性であった細胞内集合体らしきものにおいて、アンジオモチンを検出することもできた。このこと、およびアンギオスタチン結合ドメインに対する抗体を使用すると、わずか10%のコンフルエントな状態未満の細胞が表面の免疫反応性を示し、完全にコンフルエントな状態の細胞は免疫反応性を示さなかったという観察結果は、アンジオモチンが細胞表面、これらの細胞中の細胞間接触の位置に動員されることを示唆した。コンフルエントな状態の細胞をアンギオスタチン(5μg/ml)で処理することによって、アンジオモチンの局在が変わることはなかった(データ示さず)。
【０２１２】
BCE細胞がよりコンフルエントな状態であったとき、蛍光染色はより強いようであった。これを調べるために、我々はBCE細胞を異なる密度で平板培養し、ウエスタンブロットによってアンジオモチンの発現を分析した。細胞が互いに接触部分を形成することができたとき、アンジオモチンのp80-イソ型とp130-イソ型の両方の発現が25000細胞/cm2で強く誘導された(図3C)。細胞間接触部分の形成によってアンジオモチン発現の発現が調節されると、我々は結論付けた。
【０２１３】
アンジオモチンは、内皮細胞中in vivoでは細胞間接触部分に局在する
我々は、内皮細胞in vivoにおけるアンジオモチンの局在の分析を進めた。マウスの網膜では、網膜の末端および後にさらに深い層に向かう視神経中の血管から血管が生じる、出生後(P)第1〜14日中に血管新生が起こる。我々は出生後P第5日にマウス由来の網膜血管の全載染色を実施し、免疫蛍光法によってアンジオモチンの発現を分析した。CD31/PECAM、内皮細胞のマーカーと共に、内皮細胞中でアンジオモチンを発現させた(図4A)。これはアンジオモチンの発現が、網膜中では内皮細胞に特異的であることを示す。アンジオモチンの染色はZO-1シグナルと重複し、アンジオモチンは内皮細胞中in vivoでは細胞間接触部分に局在することが示された(図4BおよびC)。
【０２１４】
アンジオモチンはCHO細胞中の密着結合部分に局在し、ZO-1を動員する
我々は、細胞間接触のモデル系として使用されることが多いCHO細胞を使用して、TJにおけるアンジオモチンの機能を調べた。我々はp80アンジオモチン、p130アンジオモチンまたは空ベクターを発現するCHO細胞の安定した系を作製した。ウエスタンブロット分析では、トランスフェクションは予想分子量のバンドの出現をもたらした(図5A)。しかし、p130アンジオモチンをトランスフェクトした細胞では、他のバンドが120kDaおよび80kDaで出現し、以前に報告されたように(Ernkvist et al.、2005、提示済み)、p130mRNA中の他のインフレームATGが翻訳開始部位として働き得ることが示された。CHOp130クローンは、p80クローンより幾分少ない量でタンパク質を発現した。野生型細胞および空ベクターをトランスフェクトした細胞は、検出可能な量のタンパク質を発現しなかった。
【０２１５】
我々は、免疫蛍光法によってCHO細胞中のアンジオモチンの局在を分析した。p130アンジオモチンは細胞間に局在しており、一方p80は細胞質およびTJに局在していた。細胞間接触部分では、アンジオモチン染色はZO-1と重複し(図5B)、これはアンジオモチンがZO-1と同時局在することを示し(図5B)、アンジオモチンがZO-1と同時局在することを示す。前に報告されたように(17)、時折p130は、ファロイジンで染色したF-アクチンストレスファイバーと共に病巣に局在した。対照細胞で見られなかった方法でこれらの病巣にZO-1が動員された可能性があり(図5B)、これはアンジオモチンがZO-1の局在を調節することができることを示す。
【０２１６】
p130アンジオモチンのN末端ドメインはアクチンに局在し、ストレスファイバーを安定化させる。
我々が前に報告したように、p80アンジオモチンは葉状仮足に局在する(図6A〜C)(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)。p130アンジオモチンおよびp80アンジオモチンの亜細胞レベルの局在を比較するために、マウス大動脈内皮細胞(MAE)に、個々のイソ型をコードする構築体を再度トランスフェクトした。ポリクローナル陽性細胞はピューロマイシンを用いて選択し、発現はウエスタンブロット分析によって検出した(図2D)。p130アンジオモチンを再度トランスフェクトした細胞は、130kDaのバンドを示しただけでなく80kDaで弱いバンドも示し、p130アンジオモチンのオープンリーディングフレーム(ORF)は、2つのイソ型を生成することができることが示された。これらのタンパク質を再度トランスフェクトしたMAE細胞をC末端特異的抗体で染色し、p130アンジオモチン陽性細胞の染色は、非常に規則的なパターンの小さな直線ドットを示した(図6D)。M21メラノーマおよび293T細胞は、p130アンジオモチンをトランスフェクトしたとき類似の構造を示したので、この染色パターンはMAE細胞に限られなかった(データ示さず)。繊維状p130アンジオモチンの発現パターンは、p130アンジオモチンはF-アクチンに局在する可能性があることを示唆した。考えられるアクチンの関係を評価するために、p130アンジオモチンを発現するMAE細胞を、テキサス-レッド結合ファロイジンでF-アクチンに関して、およびp130アンジオモチンに関して染色した。断片的なp130アンジオモチンの染色は、大部分の位置においてF-アクチンとの直接の重複を示した(図6D〜F)。染色からの興味深い観察結果は、ベクター細胞(図6J〜L)およびp80アンジオモチン細胞は、p130アンジオモチンと同じアクチンファイバーのパターンを有していないことである。p130アンジオモチンはストレスファイバーを誘導し、一方ベクターおよびp80アンジオモチン発現細胞は少量のアクチンファイバーを有する。これは、p130アンジオモチンはストレスファイバーを安定化させることを示す。
【０２１７】
p130アンジオモチンとF-アクチンの同時局在をさらに分析するために、我々はコンピュータによるデコンボルーションおよび3Dイメージングソフトウェアを使用して、p130アンジオモチンとF-アクチンの重複を測定した。図3Mは、1つのストレスファイバーにおけるアンジオモチンとアクチンの同時局在を示す。
【０２１８】
次に我々は、p130アンジオモチンに特有であるN末端部分が、アクチンとの結合に介在しているかどうか調べた。この目的のために、p130アンジオモチンに特異的であるN末端ドメインをMAE細胞に一過性トランスフェクトした。N末端断片の免疫染色はストレスファイバーとの完全な同時局在を示したが、完全長p130アンジオモチンに特徴的な断片的パターンは欠いていた(図6G〜I)。同様の染色パターンを、N末端ドメインをトランスフェクトしたHeLaおよびM21細胞においても観察した(データ示さず)。これらの結果は、p130アンジオモチンのN末端中の409のアミノ酸がストレスファイバーと結合することを示す。
【０２１９】
p130アンジオモチンをトランスフェクトした細胞と同様に、N末端をトランスフェクトした細胞はベクターおよびp80アンジオモチン細胞より多量のストレスファイバーを有しており、p130アンジオモチンのN末端はよりストレスファイバー様のパターンを誘導することが示された。
【０２２０】
p130アンジオモチンがF-アクチンと結合するかどうか調べるために、我々はアクチン脱重合剤サイトカラシンBで細胞を処理した。図7D中に示したように、p130アンジオモチンの断片的な染色パターンは、サイトカラシンBで処理した細胞中で中断した。中断したp130アンジオモチンの染色は、アクチンの凝集構造体のファロイジン染色と完全に重複した(図7D〜F)。次に我々は、p130アンジオモチンのN末端ドメインをMAE細胞にトランスフェクトし(図7G〜I)、これらの細胞はサイトカラシンBで処理した。再び、N末端染色はアクチンの凝集構造体と完全に重複した(図7J〜L)。染色が細胞破壊によるものではなかったことを確実にするため、我々はチューブリンおよびシトクロムCも染色した。チューブリンおよびシトクロムCのいずれの染色も、サイトカラシンB処理によって影響を受けなかった(データ示さず)。我々はさらに、p80アンジオモチンをトランスフェクトしたMAE細胞をサイトカラシンBで処理した。p80アンジオモチンの葉状仮足染色は中断されたが、全てのp80アンジオモチン陽性細胞において検出された細胞内染色は影響を受けなかった(データ示さず)。
【０２２１】
アンジオモチンのトポロジー
アンギオスタチンは細胞表面上でアンジオモチンと結合する
p80アンジオモチンをトランスフェクトしたマウス大動脈内皮細胞(MAE細胞)は、in vitroで移動および管形成を妨げることによってアンギオスタチンに応答することを、我々は以前に報告している。これは、p80アンジオモチンがアンギオスタチンの受容体であることを示唆する。しかし配列分析によって判断すると、アンジオモチンは、膜中へのタンパク質の挿入を介在し得る明らかなシグナルペプチドを有していない。p80アンジオモチンが何らかの細胞外ドメインを有するかどうか調べるために、我々はSulfo-NHS-LC-ビオチン、ビオチンとタンパク質を結合させる反応基を有するビオチン誘導体と共にMAE細胞をインキュベートした。Sulfo-NHS-LC-ビオチンは水溶性であり、完全状態の細胞膜に浸透しないはずである。Sulfo-NHS-LC-ビオチンとのインキュベーション後、我々は細胞溶解物を、アンジオモチン、または陰性対照として、細胞内タンパク質パキシリンのいずれかに対する免疫沈降法に施した。免疫沈降物はHRP結合アビジンを用いたウエスタンブロットによって分析した。図8A中に見られるように、p80アンジオモチンはビオチン化され、一方パキシリンはビオチン化されなかった。しかしパキシリンは、疎水性の膜浸透性類似体、NHS-LC-ビオチンを用いてビオチン化することができた(データ示さず)。内因性p80アンジオモチンも、ウシ毛細血管内皮(BCE)細胞を用いた同様の実験を実施したとき、初代細胞においてビオチン化することができた(図15)。アンギオスタチンは、これらの細胞の増殖を阻害するその能力によって最初に同定されたので、このことは興味深い(O'Reilly et al.、1994、Cell、79: 315〜328)。アンジオモチンが細胞外エピトープを有することを確認するために、我々は様々な時間トリプシンでMAE細胞を処理し、ウエスタンブロッティングによって細胞溶解物を分析した。トリプシンは80分以内に大部分のp80アンジオモチンを分解し、一方細胞内に存在するアクチンは分解されなかった(図16)。
【０２２２】
我々は以前に、アンジオモチンをトランスフェクトしたHeLa細胞は、FITC標識アンギオスタチンと結合し内在化することができる(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)ことを示している。アンギオスタチンとアンジオモチン発現細胞の結合を確認するために、アンジオモチンを安定して発現するHeLa細胞を、異なる濃度でヨウ素化アンギオスタチンと共にインキュベートし、シンチレーションを測定した(図8B)。アンギオスタチンは飽和式に11ng/mlの半最高濃度で、あるいはKdの近似値と考えることができる0.3nMで、これらの細胞と結合した。アンギオスタチンは、如何なる高度でも対照細胞とは結合しなかった。100倍濃度の冷アンギオスタチンは、標識アンギオスタチンの結合と競合し得る。しかし、1000倍濃度が必要とされると思われたので、標識アンギオスタチンの結合を完全に阻害すると思われる量のアンギオスタチンを加えることはできなかった。結論として我々のデータは、アンジオモチンは細胞表面に局在し、そこでアンギオスタチンと結合することを示す。
【０２２３】
アンジオモチンのトポロジー
次に我々は、アンジオモチンのトポロジーの分析を進めた。配列分析によって、p80アンジオモチンは3つの異なるドメインを含む。N末端半分がコイルド-コイルを形成すると予想され(Bratt et al.、2002、Gene、298: 69〜77)、C末端は細胞の運動性を調節するのに重要である推定PDZ-結合ドメインを有する(Levchenko et al.、2003、J.Cell Sci.、116: 3803〜3810)。酵母菌ツーハイブリッドスクリーニングにおいて同定されたアンギオスタチン結合ドメインは、ポリペプチドの中心領域に位置する135残基の部分的に疎水性であるドメインである(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)(図9A)。p130アンジオモチンは、保存型グルタチオン多量モチーフを有する延長したN末端ドメインを含む。バイオインフォマティクス分析は、アンギオスタチン結合領域の疎水性部分中に3個までの推定膜貫通ヘリックスを、アンジオモチンが含むことを示唆する(データ示さず)。アンギオスタチン結合ドメインは細胞外に存在し、N末端コイルド-コイルおよびPDZ結合ドメインは細胞内に存在したと、我々は仮定した。
【０２２４】
一般に、免疫蛍光試験では、細胞膜を抗体用に浸透可能にして細胞内エピトープを染色しなければならない。膜内外のアンジオモチンのトポロジーを調べるために、界面活性剤TritonX-100による事前の処理有りまたは無しで、アンジオモチンの異なるドメインを対象とする抗体を用いたコンフルエントな状態未満の細胞の免疫蛍光染色を使用した。我々は3つの異なるポリクローナルウサギ抗体:アンギオスタチン結合ドメインを対象とする抗体(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)、大部分のC末端の24残基を対象とする抗体、およびp130アンジオモチンのN末端を対象とする抗体を使用した(図9A)。アンギオスタチン結合ドメインを対象とする抗体は事前の膜抽出無しで染色することができ、このドメインは細胞外エピトープを有することが示唆された(図9B)。完全細胞膜の対照として、我々はカベオリンの細胞内N末端ドメインを染色し、これによってトリトンX-100で処理した細胞のみを染色した。対照的に、アンジオモチンのC末端を対象とする抗体は、染色するために浸透処理を必要とした(図9B)。トリトンX-100を使用したとき、この抗体は、アンギオスタチン結合ドメインを対象とする抗体と同様の染色パターンで細胞を染色した。これはC末端は細胞内に存在するが、このエピトープは細胞外に存在し、C末端と結合したマスキングタンパク質を界面活性剤が除去した後に抗体に利用可能となるという可能性を形式上排除することはできないことを示す。しかし、このエピトープがPDZ結合ドメインを含み、このようなドメインは知られている限り常に細胞内に存在するという事実は、前の結論の反証となる。同じ方法によって、p130アンジオモチンのN末端を対象とする抗体も、細胞を最初に浸透処理したときのみ免疫反応性を示し、このドメインは細胞内に存在することが示された(図9C)。最後に、同じ方法でp80アンジオモチンのN末端を分析するために我々は、N末端中にmyc-タグを有するアンジオモチン用の構築体をMAE細胞にトランスフェクトした。我々は、トランスフェクションマーカーとして緑色蛍光タンパク質(GFP)プラスミドをコトランスフェクトした。N末端のmyc-タグの染色は浸透処理を必要とし(図9E)、アンジオモチンのN末端は細胞内に存在することが示された。結論としてこれらのデータは、アンジオモチンのN末端およびC末端は細胞内に存在し、アンギオスタチン結合ドメインの側面に位置する疎水性領域は2つの膜貫通ヘリックスを形成し、細胞外空間中のアンギオスタチン結合の中心部分は取り去る可能性があることを示す。
【０２２５】
p130アンジオモチンのアンギオスタチン結合モチーフは細胞表面に露出する
前述の事項および以前の研究(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254; Bratt et al.、2005、提示済み)において示されたように、p80アンジオモチンは細胞外アンギオスタチン結合ドメインを含む。したがって我々は、アンギオスタチン結合モチーフがp130アンジオモチン発現細胞中では細胞表面に露出するかどうか分析した。p130アンジオモチンを発現した非浸透処理MAE細胞は、細胞外アンギオスタチン結合ドメインを対象とするポリクローナル抗体で染色した。さらに細胞をファロイジンと共にインキュベートして、細胞の外側膜が完全な状態であったことを確認した。p130アンジオモチンの同じ断片的なパターンは、ファロイジン染色に陰性であった非浸透処理細胞において観察することができた(図10A〜C)。アンジオモチンの細胞内C末端ドメインを対象とするポリクローナル抗体で染色した細胞中では、p130アンジオモチンの染色を検出することはできなかった(図10D〜F)。これらの結果は、p130アンジオモチンは、p80アンジオモチンと同様に細胞外アンギオスタチン結合ドメインも含むことを示す。
【０２２６】
アンジオモチンの機能
アンジオモチンはMAGI-1と相互作用する
アンジオモチンとZO-1が同時局在したことによって、我々はアンジオモチンとZO-1を同時免疫沈降させようと試みた。しかし、そのような相互作用を見いだすことはできなかった。吸蔵とアンジオモチンの間の相互作用を確定することもできなかった。次に我々は、内皮細胞において内皮細胞選択的接着分子(ESAM)の細胞質ドメインと結合することが報告されてきているMAGI-1、ZO-1と関係がある膜結合グアニル酸キナーゼ(MAGUK)へと我々の関心を向けた(Wegmann et al.、2004、Exp.Cell Res.、300: 121〜133)。p80またはp130アンジオモチンを一時的に発現するCHO細胞では、MAGI-1cではなくflag標識MAGI-1イソ型MAGI-1bおよびMAGI-1c、MAGI-1bをp130アンジオモチンと共に免疫沈降させることはできたが、p80アンジオモチンと共に免疫沈降させることはできなかった。さらに、p80アンジオモチンではなくp130-をflag標識抗体と共に免疫沈降させることもできた(図11A)。免疫蛍光性の試験によって、CHO細胞中での発現時にp130とMAGI-1bが同時局在したことが明らかになった(図11B)。したがって、p130アンジオモチンのN末端ドメインはMAGI-1b、またはMAGI-1bと相互作用するタンパク質と結合することができる。
【０２２７】
アンジオモチンは細胞の移動および浸透性を調節する
細胞間接触におけるアンジオモチンの機能を分析するために、我々は細胞凝集アッセイを実施した。これらは、短期の凝集アッセイ中カルシウムの存在または不在下においてアンジオモチンは細胞凝集に介在せず、アンギオスタチンはアンジオモチンをトランスフェクトした細胞の凝集に対して影響がなかったこと(データ示さず)を示した。我々は、TJの浸透性を調節する際のアンジオモチンの役割の調査を進めた。この目的のために我々は、浸透膜上で増殖させた細胞の層を介したFITC標識デキストランの拡散を測定した、in vitro浸透性アッセイを使用した。蛍光は時間依存式に増大したが、対照細胞と比較してアンジオモチン発現細胞中では著しく遅かった。1時間後、p130アンジオモチン発現細胞は対照細胞と比較して88%低い浸透性を示し、p80アンジオモチン細胞は70%低い浸透性を示した(図12A)。これは、アンジオモチンはTJに局在するだけでなく、それ自体がTJ機能に影響を与え得ることを示す。しかしアンギオスタチンは、p80-またはp130アンジオモチン細胞において浸透性に影響を与えなかった(図12B)。Boydenチャンバーアッセイでは、p80アンジオモチンを安定して発現するMAE細胞は少ない移動によってアンギオスタチンに応答し、一方MAE対照細胞は応答しない(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)。CHO細胞が同様に挙動するかどうか調べるために、我々はp80-またはp130アンジオモチンを発現するCHO細胞を用いてBoydenチャンバーの実験を実施した。結果は図12C中に示す。p80-またはp130アンジオモチンを発現するCHO細胞は、50%の運動性の低下でアンギオスタチンに応答した。したがって、アンギオスタチンの影響は細胞移動の阻害に限られ、アンギオスタチンはアンジオモチン介在のTJの調節に影響を与えなかった。
【０２２８】
p130アンジオモチンは細胞の形状に影響を与える
p130アンジオモチンを再度トランスフェクトしたMAE細胞は、ベクターおよびp80アンジオモチン発現細胞と比較して、より多くのストレスファイバーを含んでおり平らな形状を示した。細胞はアンジオモチン発現用にファロイジンで染色して、細胞の外形を目に見える状態にした。物質および方法中に記載したのと同様に、アンジオモチン染色に陽性であった細胞を写真撮影し、その細胞領域を測定した。p130アンジオモチンまたはN末端ドメインを発現するMAE細胞の中央領域は、図13A中にボックスプロット図で示すように、p80アンジオモチンまたはベクター細胞より2倍を超えて大きかった。これらの結果は、p130アンジオモチンは細胞骨格編成および細胞の形状を調節し、これらの影響に介在するタンパク質のN末端部分であることを示す。
【０２２９】
p130アンジオモチンはアンギオスタチンによって阻害される
我々の以前の試験は、アンジオモチンはトランスフェクト細胞の移動を促進することを示している。したがって我々は、in vitro創傷治癒アッセイを使用して、MAE細胞の移動率に対するp130アンジオモチン発現の影響を調べた。このアッセイでは、p80アンジオモチン、p130アンジオモチンまたはベクターをトランスフェクトしたMAE細胞をコンフルエントな状態まで増殖させ、ピペットでこすることによって創傷を後に作製した。創傷の端から移動細胞の最先端の距離を分析することによって、移動率を推定した。創傷治癒からの結果は、p80アンジオモチンの発現は創傷への移動をほぼ2倍刺激し、一方ベクター細胞およびp130アンジオモチンは、同様の移動率を有していたことを実証した(図13B)。次に我々は、p130アンジオモチンを発現するMAE細胞がアンギオスタチンに応答するかどうか分析した。最初に我々は、アンギオスタチンがp130アンジオモチン陽性細胞の細胞形状に影響を与える可能性があるかどうかを調べた。これらの細胞は5μg/mlアンギオスタチンで一晩インキュベートし、固定し翌日分析した。結果は、アンギオスタチン処理はp130アンジオモチン細胞の細胞領域に有意に影響を与えなかったことを示した(データ示さず)。
【０２３０】
p80アンジオモチンを発現するMAE細胞の移動は、Boydenチャンバーアッセイ(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)においてアンギオスタチンによって阻害されることを、我々は以前に示している。したがって我々は、アンギオスタチンの存在または不在下でのp130アンジオモチン、p80アンジオモチン、およびベクター細胞の移動を比較した。ベクタートランスフェクト細胞の移動はbFGFの存在下では刺激されたが、アンギオスタチンの存在下では阻害されなかった。p130アンジオモチンおよびp80アンジオモチンのbFGF刺激型移動は、アンギオスタチンの存在下でそれぞれ160および175パーセント阻害された。これはbFGFの不在下での移動レベル未満である(図13C)。
【０２３１】
hTERT+-BCE細胞はp80アンジオモチンおよびp130アンジオモチンを内因的に発現するので、我々は移動チャンバーアッセイにおいてhTERT+-BCE細胞を試験した。bFGFの存在下でのhTERT+-BCE細胞の移動をシミュレートし、アンギオスタチンで処理したとき85%阻害された(図13D)。我々の結果は、アンギオスタチンが内皮細胞の移動を阻害することを示す以前の報告(Claesson-Welsh et al.、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95: 5579〜5583)と一致する。
【０２３２】
アンギオスタチンは細胞性栄養膜細胞の侵襲を阻害する
細胞性栄養膜細胞は、分化して子宮を侵襲することができ内皮細胞に似た特性をそこで示す腫瘍に似た性質を得た、ヒト胎盤の分化内皮細胞である(Red-Horse et al.、2004、J.Clin.Invest.、114: 744〜754中に総説された)。これはPECAM、VE-カドヘリン、VCAM-1、αvおよびαvβ3インテグリンのその発現によって示される。以前に我々は、内皮細胞中でのみアンジオモチンの発現を検出した。しかし、ヒト細胞性栄養膜細胞もp130アンジオモチンおよびp80アンジオモチンのイソ型を発現するので(図2D)、我々は胎盤切片を染色した。図14中に示すように、染色は浮遊絨毛、固定絨毛および基板中でのサイトケラチンとアンジオモチンの同時局在を示し、p80アンジオモチンとp130アンジオモチンの両方が全ての細胞性栄養膜細胞群(例えば原種、侵襲性)中で発現されるが、分化した多核細胞性栄養膜細胞中では発現されないことが示された(図14A〜F)。
【０２３３】
次に我々は、多量の内因性p130アンジオモチンおよびp80アンジオモチンを発現する細胞性栄養膜細胞の侵襲が、アンギオスタチン処理によって影響を受けたかどうかを試験した。侵襲アッセイはアンギオスタチンの存在または不在下で実施した。48時間後、侵襲細胞をサイトケラチンモノクローナル抗体で染色し、物質および方法中に記載したのと同様に実験を記録した。その結果は、アンギオスタチンを加えた実験では、細胞性栄養膜細胞の侵襲は対照と比較して約3倍下方制御されたことを示した(図14G)。
【０２３４】
考察
我々はアンジオモチンの新規なスプライシングイソ型を同定しており、これは細胞の形状を調節しアンギオスタチンによる内皮細胞移動の阻害に介在する。p130アンジオモチンは延長したアミノ末端ドメインを含むが、それ以外は80kDaのその短いイソ型と同一である。N末端ドメインの最初の243個のアミノ酸は、Amotl-1およびAmotl-2と58%の相同性を示す。これら243個のアミノ酸内には、3個のタンパク質間で100%保存されている約8〜10アミノ酸からなるグルタミンが豊富な5群の保存領域が存在する。Amotl-2の細胞局在および機能に関してはほとんど知られていないが、Amotl-1(JEAP)は外分泌線細胞中で特異的に発現され、in vitroおよびin vivoにおいて密着結合部分中のZO-1に局在することが示されてきている(Nishimura et al.、2002、J.Biol.Chem.、277: 5583〜7)。p130アンジオモチンの亜細胞レベルの局在は、MAE細胞中のp80アンジオモチンとは異なった。p80アンジオモチンに関して観察した葉状仮足の染色とは対照的に、p130アンジオモチンはF-アクチンと重複する規則的で断片的なパターンで発現された。この染色パターンは、繊維接着において見られたテンシン(Zamir et al.、1999、J.Cell Sci.、112: 1655〜1669)、またはα-アクチニン、アクチン結合タンパク質(Belkin and Koteliansky、1987、FEBS Letts、220: 291〜4; Otey et at.、1990、J.Cell Biol.、111:721〜9)のパターンとは重複しなかった(データ示さず)。
【０２３５】
p130アンジオモチンを発現する細胞は、p80アンジオモチンを発現する細胞と比較して多くのストレスファイバーを含んでおり、改変された細胞形状および約二倍の細胞領域の増大をもたらした。ROCK抑制剤Y27632を加えると、ストレスファイバーの形成が妨げられたので、これはRho活性型キナーゼ活性に依存する(Worthylake and Burridge、2003、J.Biol.Chem.、278: 13578〜13584; Nobes and Hall、1999、J.Cell Biol.、144: 1235〜1244)(データ示さず)。p130アンジオモチンのN末端ドメインをトランスフェクトしたMAE細胞の染色は、p130アンジオモチンプラスミドを再度トランスフェクトした細胞に関して観察した断片的なパターンとは反対に、F-アクチンと一致した同時局在を示した。N末端断片の発現はストレスファイバーの同様の蓄積をもたらし、p130アンジオモチンに関してみられた増大した細胞形状をもたらした。これは、N末端ドメインはアクチン標的配列を含み、トランスフェクト細胞においてストレスファイバーの安定化に介在することを示す。p130とN末端断片の両方の染色は、サイトカラシンD、アクチン脱重合剤での処理後ファロイジン染色と依然として関係があり、N末端ドメインがアクチンへのp130アンジオモチンの標的化に介在することをさらに示した。p130アンジオモチンの断片的な膜局在は、p80アンジオモチンに対応するC末端領域が、ストレスファイバーと共にp130アンジオモチンの一部分を編成することを実証する。さらに、C末端はp130アンジオモチンを細胞の中心部分に集め、一方N末端のみの発現は細胞全体に局在する。
【０２３６】
マウス大動脈内皮細胞中でのp80およびp130の異なる細胞内発現パターンも、イソ型が異なる細胞機能を有することを示す。p80アンジオモチンを過剰発現するMAE細胞は、化学走性因子に応答して100%高い移動率を有すること(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254)を、我々は以前に示している。さらに、p80の発現はin vivoにおいて、腫瘍の増殖および周囲の筋肉組織への侵襲を助長する(Levchenko et al.、2004、Oncogene、23: 1469〜1473)。細胞移動におけるアンジオモチンの役割は、アンジオモチン欠陥マウスは、腹部内臓内胚葉における移動欠陥のために第7〜8日胚で子宮内において死ぬ(Shimono and Behringer、2003、Curr.Biol.、13: 613〜7)という発見によってさらに強調される。しかし、MAE細胞中のp130アンジオモチンの発現は、Boydenチャンバーまたは創傷治癒アッセイで分析して移動率に有意に影響を与えなかった。p130-とp80アンジオモチンイソ型の両方が、アンジオモチンタンパク質ファミリーの他の2つのメンバーに存在しないアンギオスタチン結合ドメインを含む(Bratt et al.、2002、Gene、298: 69〜77)。p130アンジオモチンのアンギオスタチン結合ドメインは、細胞表面に露出しているp80アンジオモチンのそれと類似していることを、我々はここで示す。p130アンジオモチンをトランスフェクトしたMAE細胞にアンギオスタチンを加えることによって、p80発現細胞のそれと同様の有効度で細胞移動を阻害した。しかしアンギオスタチンは、ストレスファイバーの形成またはp130アンジオモチン発現細胞の細胞形状に影響を与えなかった。これらのデータは、アンギオスタチンは主に、p80ドメインによって誘導される可能性があるシグナル経路に干渉することを示す。
【０２３７】
胚形成中および成体組織中のp130アンジオモチンの分布は、その発現が厳密に調節されていることを示す。p130アンジオモチンは胸腺、精巣および胎盤中のみで見られ、一方その短いイソ型はさらに広く分布している。胎盤中では、内皮細胞および細胞性栄養膜細胞によってアンジオモチンが発現される。後者の細胞は、脱落膜に侵襲し子宮細動脈、およびそれより低い程度で静脈の内皮内層を置換する、それらの能力によって特徴付けられる。この重要なプロセスが子宮-胎盤の循環を確定する(Bratt et al.、2002、Gene、298: 69〜77中に総説されている)。興味深いことに、侵襲性細胞性栄養膜細胞は内皮の特性を得て、他の場合内皮に特異的な遺伝子(例えば、PECAMEおよびVE-カドヘリン)を発現する。内皮細胞およびヒト細胞性栄養膜細胞はこれまで、アンジオモチンの2つのイソ型を発現することが示されてきている唯一の初代細胞である。したがって2つの細胞型は、移動または侵襲の阻害によってアンギオスタチンにも応答する。
【０２３８】
血管の形成は、対象とする細胞の移動を誘導する周辺組織からの誘導シグナルを含む(Carmeliet、2000、Nature Med.、6: 389〜395中に総説されている)。先端細胞は、糸状仮足の延長によって化学走性勾配を感知する(Gerhardt et al.、2003、J.Cell Biol.、161: 1163〜1177)。管形成は、細胞の細胞骨格を再形成して、中空の液体充満型内腔を囲む閉状単層を形成することも含む。細胞結合部分の形成は内皮層を塞いで細胞間の漏出を防ぎ、先端と基底膜ドメインの間の境界を示す(Bazzoni and Dejana、2004、Physiol.Rev.、84: 869〜901中に総説されている)。ここで我々は、内皮細胞がアンジオモチンの2つのイソ型であるp80およびp130を発現することを示す。
【０２３９】
これらのイソ型は血管新生中に異なる役割を果たし、この場合p80アンジオモチンは細胞の移動を助長し、p130アンジオモチンは管形成中の内皮細胞の形態の変化と関係があると、我々は推測する。
【０２４０】
我々は、p80-とp130アンジオモチンの両方が一体型膜タンパク質である証拠を提供する。我々はさらに、2つのイソ型がin vitroおよびin vivoにおいて内皮細胞中でZO-1と同時局在することを示す。このデータは、アンジオモチンは内皮密着結合部分のタンパク質複合体の新規な要素であり、内皮の細胞間結合部分の構築において機能的役割を果たす可能性があることを示す。
【０２４１】
我々は、膜一体型タンパク質としてのアンジオモチンのモデルに関する以下の証拠を提供する:
1.完全トランスフェクトおよび初代内皮細胞の細胞表面標識によって、アンジオモチンはビオチン化された。
2.アンジオモチンのエピトープはトリプシン分解に敏感である。
3.アンギオスタチンはアンジオモチンをトランスフェクトした細胞の表面と特異的に結合する。
4.アンギオスタチン結合ドメインを対象とする抗体は、トランスフェクト細胞の細胞表面上でアンジオモチンと結合する。アンジオモチンは細胞表面に局在し、そこでアンギオスタチンの受容体として働くことができると、我々は結論付ける。抗体マッピングは、アンギオスタチン結合ドメインの側面に位置する疎水性領域が2つの膜貫通ヘリックスを形成し、アンギオスタチン結合ドメインの中心部分を細胞表面に露出した状態にすることができる、アンジオモチンの膜貫通モデルを示唆する。
【０２４２】
タンパク質合成中の小胞体(ER)の膜中へのペプチドの取り込みで始まる古典的な分泌経路によって、アンジオモチンが膜に到達しないことを示す配列分析によって判断して、アンジオモチンはシグナルペプチドを欠いている。(Keenan et al.、2001、Ann.Rev.Biochem.、70: 755〜775)。しかし、タンパク質は膜中に挿入することができ、あるいは他の機構によって分泌させることができる(Nickel、2003、Eur.J.Biochem.、270: 2109〜2119)。したがって、非古典的分泌と通常呼ばれる経路によって、タンパク質を分泌させることができる。このようなタンパク質の例はbFGF (Prudovsky et al.、2002、J.Cell Biol.、158: 201〜8)、チオレドキシン(Tanudji et al.、2003、Am.J.Physiol.Cell Physiol.、284: C1272〜1279)、およびTSAP6(Amzallag et al.、2004、J.Biol.Chem.、279: 46104〜46112)である。シグナルペプチドを欠いておりしたがってタンパク質合成中にER中に挿入されない、膜タンパク質の例も存在する。尾部結合型タンパク質、例えばシナプトブレビンと通常呼ばれる一群の膜タンパク質は、翻訳後に膜中に挿入される(Whitley et al.、1996、J.Biol.Chem.、271: 7583〜7586)。しかし、我々が提案したアンジオモチンのモデルは、このクラスの膜タンパク質に属するアンジオモチンに反証する。さらに、真核生物細胞中で寄生虫Leishmaniaによって発現されるタンパク質HASPBを、細胞質部分由来の原形質膜の内側葉状部に挿入し、次いで膜を介して移動させることもできる(Denny et al.、2000、J.Biol.Chem.、275: 11017〜11025)。アンギオスタチンとも興味深いことに結合する(Tuszynski et al.、2002、Microvasc.Res.、64: 448〜462)アネキシンは、膜中に挿入することができる膜結合タンパク質であり、膜結合状態から膜に広がる状態への移行を含む機構によって膜に広がる形状をとる(Langen et al.、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA.、95: 14060〜14065)。我々のデータは、シグナルペプチドを欠いている一方で、アンギオスタチン結合ドメインの側面に位置する疎水性ヘリックスを膜中に挿入することによって、依然として膜に広がる形状をとることができる点で、アネキシンおよびHASPBと同様の性質をアンジオモチンが有することを示唆する。
【０２４３】
以前のデータは、アンジオモチンの発現は増大した細胞の運動性と関係があり、この影響はアンギオスタチンによって阻害されることを示し、アンギオスタチンはアンジオモチン誘導型の細胞の運動性を阻害することによって血管新生を抑制することが示唆される(Troyanovsky et al.、2001、J.Cell.Biol.、152: 1247〜1254; Levchenko et al.、2003、J Cell Sci.、116: 3803〜3810; Levchenko et al.、2004、Oncogene、23: 1469〜1473; Shimono and Behringer、2003、Current Biol.、13: 613〜7)。この試験は、アンジオモチンは細胞の運動性を調節する(Folkman、1995、Nature Medicine、1: 27〜31)以外に、in vivoおよびin vitroにおいて細胞間接触部分に局在し、CHO細胞にトランスフェクトすると(Hanahan and Folkman、1996、Cell、86: 353〜364)、TJタンパク質ZO-1と同時局在し(O'Reilly et al.、1994、Cell、79: 315〜328)、ZO-1をストレスファイバーに動員し(Ji et al.、1998、Faseb J.、12: 1731〜8)、浸透性を調節しかつ(Claesson-Welsh et al.、1998、Proc.Natl.Acad.Sci.USA、95: 5579〜5583)、TJタンパク質MAGI-1と結合し同時局在することを示す。我々は、アンジオモチンはTJタンパク質であると結論付ける。以前に我々は、第9.5日胚で調べて内皮細胞中で優性ネガティブアンジオモチンを発現するトランスジェニックマウスは、脳内の重度の出血につながる漏出性血管を示したこと(Levchenko et al.、2003、J Cell Sci.、116: 3803〜3810)を報告しており、これはTJの浸透性を低下させる際のアンジオモチンの役割と一致する発見である。
【０２４４】
血管新生中、細胞は新たな血管の部位に移動し、次いで成熟した密着結合部分および接着結合部分を有する機能的血管に成熟する。移動および成熟の両方が血管新生中の重要なステップであり、我々のデータおよび以前の発見は、アンジオモチンは両方を調節することができることを示唆している。同様の方法で、膜貫通TJタンパク質であるJAM-1は細胞間の浸透性を低下させるだけでなく(Tanudji et al.、2003、Am.J.Physiol.Cell Physiol.、284: C1272〜1279)、内皮細胞のbFGF誘導型の運動性にも必要とされる(Amzallag et al.、2004、J.Biol.Chem.、279: 46104〜46112; Whitley et al.、1996、J.Biol.Chem.、271: 7583〜7586)。この試験では、アンギオスタチンはアンジオモチン誘導型の運動性に特異的に影響を与えたが、アンジオモチン調節型の浸透性には影響を与えなかった。これは、アンギオスタチンは血管新生と関係がある運動性内皮細胞のみに影響を与え、確立した血管中の内皮細胞には影響を与えないことを示す。さらに、臨床試験においてアンギオスタチンが血管浸透性を増大させることは報告されていない(Denny et al.、2000、J.Biol.Chem.、275: 11017〜11025)。
【０２４５】
アンジオモチンはどのようにして浸透性を調節するのだろうか?アンジオモチンの細胞外ドメインは同型結合と関係があり、閉塞部分またはclaudinと非常に似たTJ中の密閉部分として作用する可能性がある。他の可能性は、アンジオモチンの影響は二次的であること、およびTJへの他のタンパク質のシグナルおよび/または動員の結果である。アンジオモチン様1/JEAPも、TJに局在することが報告されているが(Dejana、2004、Nat.Rev.Mol.Cell Biol.、5: 261〜270)、このタンパク質およびタンパク質ファミリーのメンバーであるアンジオモチン様2は、アンギオスタチン結合ドメインを欠いているので(Bratt et al.、2002、Gene、298: 69〜77)、アンジオモチンのみがアンギオスタチンの影響のメディエーターであると、我々は予想する。
【０２４６】
我々はp80アンジオモチンではなくp130-がTJタンパク質MAGI-1bと相互作用することを示しており、これはp130アンジオモチンの409残基のN末端延長ドメインが、この相互作用に必要であることを示す。p130アンジオモチンとMAGI-1の間の直接の相互作用を我々は示していないが、p130のN末端が、MAGI-1のWWドメインの結合モチーフとして働き得るPpxYモチーフを含めた、幾つかのプラリン多量ドメインを含むことを記すことは興味深い(Dobrosotskaya and James、2000、Biochem.Biophys.Res.Comm.、270: 903〜9; Kay et al.、2000、Faseb J.、14: 231〜241)。しかし、アンジオモチンそれ自体が、細胞間接触部分に局在し浸透性を調節するので、MAGI-1との相互作用はアンジオモチンをTJに向けるのに必ずしも必要ではない。
【０２４７】
細胞の運動性およびTJはいずれも、アクチン細胞骨格およびRhoファミリーのGTPaseによって厳密に制御されている。例えば、RhoとRacの両方が細胞の運動性の2つの最も重要な制御物質として認識される一方で(Burridge and Wennerberg、2004、Cell、116: 167〜179)、この2つはそれぞれPar-3およびPar-6の下流のTJ形成を制御する際に重要である(Chen and Macara、2005、Nat.Cell Biol.、7: 262〜9; Ozdamar et al.、2005、Science、307: 1603〜1609; Patrie et al.、2002、J.Biol.Chem.、277: 30183〜30190)。アンジオモチンはアクチン細胞骨格に影響を与えることによって、浸透性と運動性の両方を制御すると考えられる。実際、アンギオスタチンおよびアンジオモチンがRhoシグナルと関係がある証拠が存在し(Ernkvist et al.、2005、提示済み; Gupta et al.、2001、EMBO Rep.、2: 536〜540)(Bratt and Holmgren)、アクチン細胞骨格の調節がアンジオモチンの2つの性質の中心にあると推測することになる。これと一致して、MAGI-1はアクチン結合タンパク質α-アクチニン4およびシナプトポジンと結合する(Patrie et al.、2002、J.Biol.Chem.、277: 30183〜30190)。
【０２４８】
VEGF抗体ベバシツマブを用いて得た有望な結果(Hurwitz et al.、2004、N.Engl.J Med.、350: 2335〜42)は、我々が抗血管新生療法の段階に突入していることを示すだけでなく、他の血管新生阻害剤が必要とされることも示す。我々の結果は、アンジオモチンのアンギオスタチン結合ドメインと結合する抗体を設計する理論的根拠を与える。VE-カドヘリンを阻害することによって細胞間相互作用に影響を与える抗血管新生抗体を、成熟血管の浸透性に影響を与えず血管新生のみを阻害するように設計することができる(Corada et al.、2002、Blood、100: 905〜11)ことが示されてきている。この試験は、アンギオスタチン模倣抗体は、成熟血管中の内皮細胞の細胞間接触部分に影響を与えずに細胞移動のみを調節することによって、血管新生を阻害することができることを示唆する。
【０２４９】
(実施例2-好ましい医薬品配合物ならびに投与の形態および用量)
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、注射による徐放性薬剤送達系を使用して送達することができる。これらは注射の頻度を減らすために特異的に設計する。このような系の一例は、生分解性ミクロスフェア中に組換えヒト成長ホルモン(rhGH)を被包するニュートロピン徐放性製剤(Neutropin Depot)であり、ひとたび注射すると、rhGHを一定持続期間ゆっくりと放出する。
【０２５０】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、必要な部位に薬剤を直接放出する外科手術による移植用デバイスによって投与することができる。例えば、ビトラサートはガンシクロビルを目に直接放出して、CMV網膜炎を治療する。この毒性物質を疾患部位に直接施用することによって、薬剤の重大な全身副作用なしで有効な療法を実施する。
【０２５１】
エレクトロポレーション療法(EPT)システムを投与に利用することもできる。細胞にパルス電場を送達するデバイスは、薬剤に対する細胞膜の浸透性を高め、細胞内への薬剤送達の有意な増大をもたらす。
【０２５２】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、エレクトロインコーポレーション(EI)によって送達することもできる。皮膚の表面上の30ミクロン径までの小さな粒子が、エレクトロポレーションにおいて使用するそれと同一または類似の電気パルスを経るときEIが起こる。EIでは、これらの粒子は皮膚の角質層およびさらに深部の層を介して誘導される。粒子に薬剤または遺伝子を担持あるいはコーティングすることができ、あるいは粒子は単に、そこを介して薬剤が進入できる孔を皮膚中に作製する「弾丸」として働くことができる。
【０２５３】
他の投与法は、熱感受性であるReGel注射用システムである。体温未満では、ReGelは注射用液体であり、一方体温では、ReGelはゆっくりと侵食し知られている安全な生分解性ポリマーに溶解する、ゲルの塊を直ぐに形成する。バイオポリマーが溶解すると、活性薬剤が経時的に送達される。
【０２５４】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、「Trojanペプチド」によって細胞に導入することができる。輸送性を有し原形質膜を介して親水性化合物を運ぶことができる、浸透物質と呼ばれるクラスのポリペプチドが存在する。この系は細胞質および核に直接オリゴペプチドを向けることができ、非細胞型特異的かつ非常に有効である可能性がある(Derossi et al.、1998、Trends Cell Biol.、8、84〜87)。
【０２５５】
好ましくは、本発明の医薬品配合物は、1日用量または単位、1日用量未満あるいは適切な割合の用量の活性成分を含む単位剤形である。
【０２５６】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、任意の非経口経路によって、活性成分を含む医薬品配合物の形で、場合によっては非毒性の有機、または無機酸、塩基、添加塩の形、薬剤として許容される剤形で投与することができる。治療する障害および患者、ならびに投与の経路に応じて、様々な用量で組成物を投与することができる。
【０２５７】
ヒトの療法では、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を単独で投与することができるが、一般には目的とする投与の経路および標準的薬剤慣習に関して選択される適切な医薬賦形剤、希釈剤または担体と混合させて投与するはずである。
【０２５８】
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は非経口、例えば静脈内、動脈内、腹膜内、髄腔内、脳室内、胸骨内、頭蓋内、筋肉内または皮下に投与することもでき、あるいはそれらは注入技法によって投与することができる。それらは他の物質、例えば溶液を血液と等張にするのに充分な塩またはグルコースを含むことができる滅菌水溶液の形で使用するのが最良である。必要な場合、水溶液は適切に緩衝状態にしなければならない(好ましくは3〜9のpH)。滅菌条件下での適切な非経口配合物の調製は、当業者によく知られている標準的な製薬技法によって容易に実施される。
【０２５９】
非経口投与に適した配合物には、抗酸化剤、バッファー、静菌剤、および配合物を目的とするレシピエントの血液と等張にする溶質を含むことができる水性および非水性滅菌注射溶液、ならびに懸濁剤および増粘剤を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁液がある。配合物は単位用量または多用量容器、例えば密閉アンプルおよびバイアル中に存在してよく、使用の直前に滅菌状態の液体担体、例えば注射水の添加のみを必要とする凍結-乾燥(凍結乾燥)状態で保存することができる。即興の注射溶液および懸濁液を、前に記載した種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製することができる。
【０２６０】
一般にヒトでは、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体の経口または非経口投与は好ましい経路、最も好都合な経路である。
【０２６１】
獣医学的用途に、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体は、通常の獣医学的慣習に従い適切に許容される配合物として投与し、獣医師は個々の動物に最適であろう用量レジメンおよび投与経路を決定するはずである。
【０２６２】
本発明の医薬組成物の配合物は好都合なことに単位剤形で存在することができ、製薬の分野でよく知られている任意の方法によって調製することができる。このような方法は、活性成分と1つまたは複数の補助成分を構成する担体を結合させるステップを含む。一般に配合物は、活性成分と液体担体または細分固体担体あるいは両方を均一かつ密接に結合させ、次いで必要な場合は、生成物の形状を整えることによって調製する。
【０２６３】
好ましい単位剤形配合物は、1日用量または単位、1日用量未満あるいは適切な割合の用量の活性成分を含む配合物である。
【０２６４】
本発明の好ましい送達系は、本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を含侵させたヒドロゲルを含むことができ、子宮頚部に挿入し、適切な子宮頚部熟成または女性の生殖系に対する他の望ましい影響がひとたび生じた後に引き出すことができるタンポンに、ヒドロゲルを載せることが好ましい。
【０２６５】
前に詳細に述べた成分以外に、本発明の配合物は、問題の型の配合物と関係がある当技術分野の他の従来物質を含むことができることは理解されるはずである。
【０２６６】
(実施例3-代表的な医薬品配合物)
本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび抗体を単独で投与することはできるが、1つまたは複数の許容可能な担体と共に医薬品配合物として、それを示すことが好ましい。本発明の化合物と適合性がありそのレシピエントに有害ではないという意味で、担体は「許容可能」でなければならない。典型的には担体は、滅菌済みで発熱物質を含まない水または生理食塩水であるはずである。
【０２６７】
以下の実施例は、活性成分が本発明のポリペプチド、ポリヌクレオチドおよび/または抗体である、本発明による医薬品配合物を示す。
【０２６８】
(実施例3A:眼病用溶液)
活性成分                  0.5g
塩化ナトリウム、分析等級  0.9g
チオメサール              0.001g
水を精製                  100ml
pHを調整                 7.5
【０２６９】
(実施例3B:カプセル配合物)
配合物A
前の実施例C中の配合物Dの成分を混合させ、および二部分の硬質ゼラチンカプセルに充填することによってカプセル配合物を調製する。配合物B(下記)は同様の方法で調製する。
【０２７０】
配合物B
mg/カプセル
活性成分                        250
ラクトースB.P.                  143
デンプングリコール酸ナトリウム  25
ステアリン酸マグネシウム        2
420
【０２７１】
配合物C
mg/カプセル
活性成分                      250
Macrogol4000BP              350
600
【０２７２】
Macrogol4000BPを溶解させ、溶解物中に活性成分を分散させ、および溶解物を二部分の硬質ゼラチンカプセルに充填することによってカプセル配合物を調製する。
【０２７３】
配合物D
mg/カプセル
活性成分                      250
レシチン                      100
アラキス油                    100
450
【０２７４】
レシチンおよびアラキス油中に活性成分を分散させ、および分散液を軟質、弾性ゼラチンカプセルに充填することによってカプセルを調製する。
【０２７５】
配合物E(放出制御カプセル)
押し出し機を使用して成分a、b、およびcを押し出し、次に押し出し物の球形化および乾燥によって、以下の放出制御カプセル配合物を調製する。乾燥ペレットを次いで放出制御膜(d)でコーティングし、二部分の硬質ゼラチンカプセルに充填する。
【０２７６】
mg/カプセル
活性成分                      250
微晶質セルロース              125
ラクトースBP                 125
エチルセルロース              13
513
【０２７７】
(実施例3C:注射用配合物)
活性成分                                          0.200g
滅菌の、発熱物質を含まないリン酸バッファー(pH7.0)  10mlに
【０２７８】
活性成分をリン酸バッファーの大部分に溶かし(35〜40℃)、次に体積を調節し、滅菌のミクロ孔フィルターを介して滅菌の10ml琥珀色のガラスバイアル(タイプ1)に濾過し、滅菌のクロージャーおよびオーバーシールで密閉する。
【０２７９】
(実施例3D:筋肉内注射)
活性成分                          0.20g
ベンジルアルコール                0.10g
グリコフロール75(登録商標)        1.45g
注射水、適量                      3.00ml
【０２８０】
活性成分はグリコフロール中に溶かす。次いでベンジルアルコールを加えて溶解させ、3mlまで水を加える。次いで混合物を滅菌のミクロ孔フィルターを介して濾過し、滅菌の3mlのガラスバイアル(タイプ1)中に密閉する。
【０２８１】
(実施例3E:シロップ懸濁液)
活性成分                  0.2500g
ソルビトール溶液          1.5000g
グリセロール              2.0000g
分散性セルロース          0.0750g
安息香酸ナトリウム        0.0050g
香料、Peach17.42.3169    0.0125ml
精製水、適量              5.0000ml
【０２８２】
安息香酸ナトリウムを精製水の一部分に溶かし、ソルビトール溶液を加える。活性成分を加え分散させる。グリセロール中に、増粘剤(分散性セルロース)を分散させる。2つの分散液を混合させ、精製水を用いて必要とされる体積に調節する。懸濁液をさらにせん断処理することによって、必要に応じてさらなる増粘性を得る。
【０２８３】
(実施例3F:座薬)
mg/座薬
活性成分  (63μm)*                                 250
ハードファット、BP(Witepsol H15-Dynamit Nobel)    1770
2020
*活性成分は、少なくとも90%の粒子が63μm径以下である粉末として使用する。
【０２８４】
Witepsol H15の5分の1を、最高45℃でスチームジャケット付きの鍋中に溶かす。活性成分は200μmのシーブを介して移動させ、均質な分散が得られるまで、切断用ヘッドを備えるシルバーソンを使用して混合しながら溶けた基質に加える。混合物は45℃に保ち、残りのWitepsol H15を懸濁液に加え、攪拌して均質な混合を確実にする。懸濁液全体を250μmのステンレス鋼製スクリーンに通し、連続的に攪拌しながら40℃に冷却する。38℃〜40℃の温度で、2.02gの混合物を適切なプラスチック製成形体に充填する。座薬は室温まで冷却する。
【０２８５】
(実施例3G:ペッサリー)
mg/ペッサリー
活性成分                  250
無水デキストロース        380
ジャガイモデンプン        363
ステアリン酸マグネシウム    7
1000
【０２８６】
前述の成分を直接混合し、生成した混合物を直接圧縮することによってペッサリーを調製する。
【０２８７】
(実施例3H-クリームおよび軟膏)
Remington、The Science and Practise of Pharmacy、19th ed.、The Philadelphia College of Pharmacy and Science、ISBN0-912734-04-3中に記載されている。
【０２８８】
(実施例3I-ミクロスフェア配合物)
本発明の化合物は、Cleland(1997、Pharm.Biotechnol.10: 1〜43および2001、J.Control.Release 72: 13〜24)中に記載されたミクロスフェア配合物などの、ミクロスフェア配合物を使用して送達することもできる。
【図面の簡単な説明】
【０２８９】
【図１】図１Ａは、p130アンジオモチン、アンジオモチンの新規なスプライシングイソ型の同定の図である。24aaのC末端のアンジオモチンを対象とするウサギポリクローナル抗体は、293T細胞中で80kDaおよび130kDaの2つのタンパク質を認識する。NIS=非免疫血清。図１Ｂは、p130アンジオモチン、アンジオモチンの新規なスプライシングイソ型の同定の図である。293T細胞を免疫沈降に施し、SDSPAGEで分離し、タンパク質は銀染色によって目に見える状態にした。80kDaおよび130kDaのバンドを抽出し、質量分析法によって分析した。赤色(ボールド体太字)は、p130イソ型に特有であるタンパク質分解断片由来の配列を表す。青色の配列(下線太字)(410〜1084)は、p80タンパク質中でも見られたペプチドに対応する。一致した配列を同定して個々のペプチド断片を区別したとき、イタリックを使用した。図１Ｃは、p130アンジオモチン、アンジオモチンの新規なスプライシングイソ型の同定の図である。新たなオープンリーディングフレームを、p130アンジオモチンのN末端延長部を生成するエクソン2と3の間の可変スプライシングによって作製する。青色(1)はp130アンジオモチン中のグルタミン多量ドメイン、赤色(2)はコイルド-コイル、黄色(3)はアンギオスタチン結合ドメイン、および青緑色(4)はPDZ結合ドメインに対応する。図１Ｄは、p130アンジオモチン、アンジオモチンの新規なスプライシングイソ型の同定の図である。p130アンジオモチンのN末端中の266個のアミノ酸に対して作製したウサギポリクローナル抗体は、ウエスタンブロットにより分析して、アンジオモチンの130kDaのイソ型を特異的に検出する。PI=免疫前血清、I=免疫血清。
【図２】図２Ａは、胚および成体マウス組織中でのp130アンジオモチンの発現の図である。第5〜19日胚由来のマウス胚中のアンジオモチンタンパク質レベルのウエスタンブロット分析。p80アンジオモチンは第5〜18日胚から発現され(矢じり)、一方p130アンジオモチンタンパク質を検出することはできなかった。図２Ｂは、胚および成体マウス組織中でのp130アンジオモチンの発現の図である。マウス胎盤の溶解物のウエスタンブロット分析は、第11〜19日胚からのp80アンジオモチンの発現を示す(矢じり)。p130アンジオモチンは、第13〜16日胚から発現した(矢印)。図２Ｃは、胚および成体マウス組織中でのp130アンジオモチンの発現の図である。マウス成体組織の分析は、心臓、肺、肝臓、脾臓、卵巣、肝臓、胸腺、精巣および胎盤中でのp80アンジオモチンの発現を示す(矢じり)。p130アンジオモチンは胸腺、精巣および胎盤中のみで見られる(矢じり)。星印は非特異的バンドを示す。Lu、肺;Li、肝臓;Spl、脾臓、Ki、腎臓;St、胃;SI、小腸;SkM、骨格筋;Ov、卵巣;Th、胸腺;Te、精巣;Ut、子宮、PI、胎盤。図２Ｄは、胚および成体マウス組織中でのp130アンジオモチンの発現の図である。ベクター、p80アンジオモチンおよびp130アンジオモチンを再度トランスフェクトしたMAE細胞のウエスタンブロット分析、および293T細胞、細胞性栄養膜細胞、hTERT+-BCE細胞およびBAE細胞中での2つのイソ型の内因的発現。矢印はp130およびp80のバンドの位置を示す。
【図３】図３Ａは、初代ウシ毛細血管内皮細胞中で、アンジオモチンがZO-1と同時局在することを示す図である。アンギオスタチン結合ドメインに対する抗体(緑色)は、コンフルエントな状態未満のウシ毛細血管内皮(BCE)細胞の細胞表面上でアンジオモチンと結合する。カベオリンの細胞内エピトープに対する抗体(赤色)は、完全な細胞膜用の対照として使用した。細胞がコンフルエントな状態になったとき細胞表面の染色が消失した。図３Ｂは、初代ウシ毛細血管内皮細胞中で、アンジオモチンがZO-1と同時局在することを示す図である。内因性アンジオモチンは、コンフルエントな状態のBCE細胞中でZO-1と同時局在する。コンフルエントな状態のBCE細胞はトリトンX-100を用いて浸透処理し、アンジオモチンのC末端に対する抗体(緑色)およびZO-1に対する抗体(赤色)を用いて染色した。2つの画像のオーバーレイを示し(合同)、同時局在は黄色として表す。図３Ｃは、初代ウシ毛細血管内皮細胞中で、アンジオモチンがZO-1と同時局在することを示す図である。アンジオモチンのp80およびp130イソ型の発現は、細胞密度によって調節される。細胞は示した密度で平板培養し、ウエスタンブロットによってアンジオモチンの発現を分析した。バーは20μmを表す。
【図４】図４Ａは、アンジオモチンが、出生後マウスの網膜の血管新生中、血管中にZO-1と同時局在することを示す図である。出生後第5日からのマウスの網膜を、ZO-1(赤色)、CD31/PECAM(赤色)に対する抗体およびアンジオモチンのC末端に対する抗体(緑色)を使用して全載蛍光顕微鏡法によって分析した。2つの画像のオーバーレイを示し(合同)、同時局在は黄色として表す。内皮細胞のマーカーCD31/PECAMによって示されるように、アンジオモチンは血管中で発現される。図４Ｂは、アンジオモチンが、出生後マウスの網膜の血管新生中、血管中にZO-1と同時局在することを示す図である。出生後第5日からのマウスの網膜を、ZO-1(赤色)、CD31/PECAM(赤色)に対する抗体およびアンジオモチンのC末端に対する抗体(緑色)を使用して全載蛍光顕微鏡法によって分析した。2つの画像のオーバーレイを示し(合同)、同時局在は黄色として表す。アンジオモチンは、網膜血管中の細胞間接触部分にZO-1と同時局在する。図４Ｃは、アンジオモチンが、出生後マウスの網膜の血管新生中、血管中にZO-1と同時局在することを示す図である。出生後第5日からのマウスの網膜を、ZO-1(赤色)、CD31/PECAM(赤色)に対する抗体およびアンジオモチンのC末端に対する抗体(緑色)を使用して全載蛍光顕微鏡法によって分析した。2つの画像のオーバーレイを示し(合同)、同時局在は黄色として表す。細胞間接触部分中のアンジオモチンとZO-1の同時局在を示す血管の一部分の拡大図。バーは10μmを表す。
【図５】図５は、アンジオモチンが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中にZO-1と同時局在することを示す図である。CHO細胞はp80-またはp130アンジオモチンに関してpcDNA3およびcDNAをトランスフェクトし、安定した細胞系を作製した。アンジオモチンのC末端に対する抗体を使用するウエスタンブロットによる、CHO細胞系中でのアンジオモチンの発現の分析。Wt、野生型細胞、Vec、ベクタートランスフェクト細胞。図５Ｂは、アンジオモチンが、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)細胞中にZO-1と同時局在することを示す図である。CHO細胞に、p80-またはp130アンジオモチンのcDNAを有するpcDNA3をトランスフェクトし、安定した細胞系を作製した。CHO細胞中のアンジオモチンの局在を、蛍光顕微鏡法によって分析した。アンジオモチンのC末端に対する抗体(緑色)およびZO-1に対する抗体で、CHO細胞を染色した。2つの画像のオーバーレイを示し(合同)、同時局在は黄色として表す。ファロイジンを用いた染色により測定して、p80アンジオモチンは細胞質およびTJに局在し、一方p130アンジオモチンはF-アクチンファイバーに局在する(矢印)。ZO-1がp130-陽性病巣にストレスファイバーと共に動員された(矢じり)。バーは10μmを表す。
【図６】図６Ａは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。p80アンジオモチンを再度トランスフェクトしたMAE細胞を、アンジオモチンウサギポリクローナル抗体(緑色)およびテキサスレッド結合ファロイジン(赤色)で二重染色し、p80イソ型が移動細胞の葉状仮足に局在したことを示した。図６Ｂは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。p80アンジオモチンを再度トランスフェクトしたMAE細胞を、アンジオモチンウサギポリクローナル抗体(緑色)およびテキサスレッド結合ファロイジン(赤色)で二重染色し、p80イソ型が移動細胞の葉状仮足に局在したことを示した。図６Ｃは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。p80アンジオモチンを再度トランスフェクトしたMAE細胞を、アンジオモチンウサギポリクローナル抗体(緑色)およびテキサスレッド結合ファロイジン(赤色)で二重染色し、p80イソ型が移動細胞の葉状仮足に局在したことを示した。図６Ｄは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。p130アンジオモチンを再度トランスフェクトしたMAE細胞の同じ染色によって、異なる亜細胞レベルの局在が生じる。p130アンジオモチンは断片的なパターンでストレスファイバーに局在した。図６Ｅは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。p130アンジオモチンを再度トランスフェクトしたMAE細胞の同じ染色によって、異なる亜細胞レベルの局在が生じる。p130アンジオモチンは断片的なパターンでストレスファイバーに局在した。図６Ｆは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。p130アンジオモチンを再度トランスフェクトしたMAE細胞の同じ染色によって、異なる亜細胞レベルの局在が生じる。p130アンジオモチンは断片的なパターンでストレスファイバーに局在した。図６Ｇは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。p130アンジオモチンのN末端ドメインをコードする標識タグ構築体をトランスフェクトしたMAE細胞を、標識抗体およびファロイジンで染色した。標識抗体による染色によってF-アクチンとの完全な重複を示した。図６Ｈは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。p130アンジオモチンのN末端ドメインをコードする標識タグ構築体をトランスフェクトしたMAE細胞を、標識抗体およびファロイジンで染色した。標識抗体による染色によってF-アクチンとの完全な重複を示した。図６Ｉは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。p130アンジオモチンのN末端ドメインをコードする標識タグ構築体をトランスフェクトしたMAE細胞を、標識抗体およびファロイジンで染色した。標識抗体による染色によってF-アクチンとの完全な重複を示した。図６Ｊは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。MAE-ベクター細胞を、アンジオモチンポリクローナル抗体およびファロイジンで染色した。図６Ｋは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。MAE-ベクター細胞を、アンジオモチンポリクローナル抗体およびファロイジンで染色した。図６Ｌは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。MAE-ベクター細胞を、アンジオモチンポリクローナル抗体およびファロイジンで染色した。図６Ｍは、p130アンジオモチンのN末端ドメインは、ストレスファイバーの形成を誘導することを示す図である。p130アンジオモチンおよびファロイジン染色の三次元映像化は、ストレスファイバーへのp130アンジオモチンとF-アクチン凝集体の同時局在を示した。スケールバー:20μm。
【図７】図７Ａは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。MAE-p130アンジオモチン細胞を、アンジオモチン(緑色)およびF-アクチン(ファロイジン、赤色)に関して染色した。図７Ｂは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。MAE-p130アンジオモチン細胞を、アンジオモチン(緑色)およびF-アクチン(ファロイジン、赤色)に関して染色した。図７Ｃは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。MAE-p130アンジオモチン細胞を、アンジオモチン(緑色)およびF-アクチン(ファロイジン、赤色)に関して染色した。図７Ｄは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。50μg/mlのサイトカラシンB処理の1時間後の、MAE-p130アンジオモチン細胞の同じ染色。p130アンジオモチンの凝集構造体は、破壊されたアクチンファイバーと完全に重複した。図７Ｅは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。50μg/mlのサイトカラシンB処理の1時間後の、MAE-p130アンジオモチン細胞の同じ染色。p130アンジオモチンの凝集構造体は、破壊されたアクチンファイバーと完全に重複した。図７Ｆは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。50μg/mlのサイトカラシンB処理の1時間後の、MAE-p130アンジオモチン細胞の同じ染色。p130アンジオモチンの凝集構造体は、破壊されたアクチンファイバーと完全に重複した。図７Ｇは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。p130アンジオモチンの標識タグN末端をトランスフェクトしたMAE細胞を、標識抗体およびファロイジンで染色した。図７Ｈは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。p130アンジオモチンの標識タグN末端をトランスフェクトしたMAE細胞を、標識抗体およびファロイジンで染色した。図７Ｉは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。p130アンジオモチンの標識タグN末端をトランスフェクトしたMAE細胞を、標識抗体およびファロイジンで染色した。図７Ｊは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。50μl/mlのサイトカラシンBを加えた1時間後の、N末端トランスフェクトMAE細胞の同じ染色。N末端の凝集構造体は、破壊されたアクチンファイバーと完全に重複した。スケールバー:20μm。図７Ｋは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。50μl/mlのサイトカラシンBを加えた1時間後の、N末端トランスフェクトMAE細胞の同じ染色。N末端の凝集構造体は、破壊されたアクチンファイバーと完全に重複した。スケールバー:20μm。図７Ｌは、p130アンジオモチンは、ストレスファイバーの破壊後F-アクチンと結合した状態であったことを示す図である。50μl/mlのサイトカラシンBを加えた1時間後��、N末端トランスフェクトMAE細胞の同じ染色。N末端の凝集構造体は、破壊されたアクチンファイバーと完全に重複した。スケールバー:20μm。
【図８】図８Ａは、アンギオスタチンが、細胞表面上でアンジオモチンと結合することを示す図である。p80アンジオモチンを安定して発現するマウス大動脈内皮(MAE)細胞を、Sulfo-NHS-LC-ビオチンと共にインキュベートし、アンジオモチンまたはパキシリンのアンギオスタチン結合ドメインに対する抗体を用いた免疫沈降法(IP)に施し、次にHRP結合アビジンを用いてブロッティングした。アンジオモチンはビオチン化され、一方細胞内タンパク質のパキシリンはビオチン化されなかった。インプットの対照レーンは、免疫沈降法中で使用した量の2%を表す。図８Ｂは、アンギオスタチンが、細胞表面上でアンジオモチンと結合することを示す図である。p80アンジオモチンを安定して発現するHeLa細胞とヨウ素化アンギオスタチンの結合。その結合は11ng/ml、または0.3nMの半最高濃度で飽和的であった。
【図９】図９Ａは、アンジオモチンのトポロジーの図である。p80-およびp130アンジオモチンのドメイン構造。アンジオモチンに対する3つの異なるポリクローナル抗体:C末端を対象とする抗体、アンギオスタチン結合ドメインを対象とする抗体、およびp130アンジオモチンのN末端を対象とする抗体を使用して、MAE細胞におけるアンジオモチンのトポロジーを調べた。エピトープはドメインを介した水平線として示す。これらの抗体は、空ベクターを発現する対照細胞とは反応しなかった(示さず)。さらに、myc抗体を使用してN末端にp80アンジオモチンタグを局在させた。図９Ｂは、アンジオモチンのトポロジーの図である。アンギオスタチン結合ドメインに対する抗体(緑色)は、細胞表面上でp80アンジオモチンと結合する。カベオリンの細胞内エピトープに対する抗体(赤色)は、完全細胞膜の対照として使用した。対照的に、アンジオモチンのC末端に対する抗体(緑色)のみ、細胞を界面活性剤で最初に処理したとき免疫反応性を示した。図９Ｃは、アンジオモチンのトポロジーの図である。アンギオスタチン結合ドメインに対する抗体(緑色)は、完全細胞膜を有する細胞上でp130アンジオモチンと結合する。ここでは、ファロイジン(赤色)は完全細胞膜の対照として使用した。p130アンジオモチンのN末端に対する抗体は、浸透処理なしで染色しなかった。ベクター細胞は抗体で染色しなかった。図９Ｄは、アンジオモチンのトポロジーの図である。N末端myc-タグを有するp80アンジオモチンを発現する細胞のみが、浸透処理細胞を染色した。バーは20μmを表す。図９Ｅは、アンジオモチンのトポロジーの図である。p80-およびp130アンジオモチンのトポロジーに関して示唆されるモデル。
【図１０】図１０Ａは、p130アンジオモチンのアンギオスタチン結合ドメインは、細胞表面に露出することを示す図である。細胞膜の浸透処理なしの、細胞外アンギオスタチン結合ドメインに対する抗体で染色したMAE-P130アンジオモチン細胞は、細胞表面上のp130アンジオモチンの染色を示した。陽性細胞はテキサスレッド結合ファロイジン染色に陰性であり、したがって細胞膜が完全な状態であったことが示された。図１０Ｂは、p130アンジオモチンのアンギオスタチン結合ドメインは、細胞表面に露出することを示す図である。細胞膜の浸透処理なしの、細胞外アンギオスタチン結合ドメインに対する抗体で染色したMAE-P130アンジオモチン細胞は、細胞表面上のp130アンジオモチンの染色を示した。陽性細胞はテキサスレッド結合ファロイジン染色に陰性であり、したがって細胞膜が完全な状態であったことが示された。図１０Ｃは、p130アンジオモチンのアンギオスタチン結合ドメインは、細胞表面に露出することを示す図である。細胞膜の浸透処理なしの、細胞外アンギオスタチン結合ドメインに対する抗体で染色したMAE-P130アンジオモチン細胞は、細胞表面上のp130アンジオモチンの染色を示した。陽性細胞はテキサスレッド結合ファロイジン染色に陰性であり、したがって細胞膜が完全な状態であったことが示された。図１０Ｄは、p130アンジオモチンのアンギオスタチン結合ドメインは、細胞表面に露出することを示す図である。細胞内C末端に対するポリクローナル抗体およびファロイジンによる染色は、p130アンジオモチンまたはファロイジンに関する陽性染色を示さなかった。スケールバー:20μm。図１０Ｅは、p130アンジオモチンのアンギオスタチン結合ドメインは、細胞表面に露出することを示す図である。細胞内C末端に対するポリクローナル抗体およびファロイジンによる染色は、p130アンジオモチンまたはファロイジンに関する陽性染色を示さなかった。スケールバー:20μm。図１０Ｆは、p130アンジオモチンのアンギオスタチン結合ドメインは、細胞表面に露出することを示す図である。細胞内C末端に対するポリクローナル抗体およびファロイジンによる染色は、p130アンジオモチンまたはファロイジンに関する陽性染色を示さなかった。スケールバー:20μm。
【図１１】図１１Ａは、p130アンジオモチンは、MAGI-1と相互作用することを示す図である。p80またはp130アンジオモチンを発現するCHO細胞由来の溶解物、およびMAGI-1BまたはMAGI-1Cの標識タグ構築体を、標識抗体またはアンジオモチンのC末端に対する抗体と共に免疫沈降させ、次に標識抗体またはアンジオモチンのC末端に対する抗体でイムノブロッティングした。タンパク質の発現はイムノブロッティングした全溶解物によって確認した。図１１Ｂは、p130アンジオモチンは、MAGI-1と相互作用することを示す図である。p130アンジオモチンは、CHO細胞中でMAGI-1と同時局在する。p130アンジオモチンおよびMAGI-1Bを発現するCHO細胞を、標識抗体(赤色)およびアンジオモチンのC末端に対する抗体(緑色)で免疫染色した。2つの画像のオーバーレイを示し(合同)、同時局在は黄色として表す。バーは10μmを表す。
【図１２】図１２Ａは、アンジオモチンは、浸透性および移動を調節することを示す図である。p80-およびp130アンジオモチンを安定して発現するCHO細胞を、細胞層の浸透性および細胞の移動を調節するそれらの能力に関して分析した。浸透性チャンバーで増殖させたCHO細胞単層の浸透性を、経時的な細胞層を介したFITC-デキストランの拡散として測定した。菱形、ベクター;四角形、p80アンジオモチン;十字形、p130アンジオモチン。各時間地点からの三連での1つの代表的な実験からの、平均および平均の標準誤差を示す。3つの実験からデータを集めたとき、スチューデントのt-検定によりベクター-p80およびベクター-p130に関してp<0.05であった。図１２Ｂは、アンジオモチンは、浸透性および移動を調節することを示す図である。p80-およびp130アンジオモチンを安定して発現するCHO細胞を、細胞層の浸透性および細胞の移動を調節するそれらの能力に関して分析した。アンギオスタチンは、アンジオモチン発現CHO細胞の細胞浸透性に影響を与えない。FITC-デキストランの浸透性は1時間後Aと同様に測定した。図１２Ｃは、アンジオモチンは、浸透性および移動を調節することを示す図である。p80-およびp130アンジオモチンを安定して発現するCHO細胞を、細胞層の浸透性および細胞の移動を調節するそれらの能力に関して分析した。アンギオスタチンは、アンジオモチン発現CHO細胞の細胞移動を阻害する。細胞はBoydenチャンバー中で自然に、あるいは0.05%血清に移動させた。標準偏差および顕微鏡の視野当たりの移動細胞の平均数を示す。
【図１３】図１３Ａは、p130アンジオモチンは細胞の形状に影響を与え、アンギオスタチンは移動の阻害に介在することを示す図である。MAE-p130アンジオモチン、N末端ドメインをトランスフェクトしたMAE細胞、MAE-p80アンジオモチン細胞およびMAE-ベクターを染色し、物質および方法中に記載されたのと同様に細胞領域を推定した。p130アンジオモチンまたはそのN末端断片を発現した細胞は、p80アンジオモチンおよびベクター細胞より2倍を超えて大きかった。3つの星印はp<0.001を示す。図１３Ｂは、p130アンジオモチンは細胞の形状に影響を与え、アンギオスタチンは移動の阻害に介在することを示す図である。p130アンジオモチン、p80アンジオモチンおよびベクターを発現するMAE細胞をコンフルエントな状態まで増殖させ、ピペットでこすることによって創傷を作製した。3および6時間後に移動率を測定した。p80アンジオモチン細胞は、p130アンジオモチン細胞およびベクター細胞のほぼ2倍速く移動した。3つの星印はp<0.001を示す。図１３Ｃは、p130アンジオモチンは細胞の形状に影響を与え、アンギオスタチンは移動の阻害に介在することを示す図である。MAE-p130アンジオモチン、MAE-p80アンジオモチンおよびMAE-ベクター細胞を、移動チャンバーアッセイにおいて試験した。細胞はbFGF有りまたは無しで、およびアンギオスタチン有りまたは無しで処理した(5μg/ml)。ベクター細胞の移動はbFGFの存在下では刺激されたが、アンギオスタチンの存在下では阻害されなかった。p80アンジオモチンのbFGF刺激型移動は、アンギオスタチンの存在下で175パーセント阻害された。p130アンジオモチンのbFGF刺激型移動は、アンギオスタチンの存在下で160パーセント阻害された。図１３Ｄは、p130アンジオモチンは細胞の形状に影響を与え、アンギオスタチンは移動の阻害に介在することを示す図である。p80およびp130アンジオモチンを内因的に発現するhTERT+-BCE細胞を、移動チャンバーアッセイにおいて分析した。移動はbFGFによって刺激され、アンギオスタチンの存在下で85%阻害された。
【図１４】図１４Ａは、細胞性栄養膜細胞はp80アンジオモチンおよびp130アンジオモチンを発現し、アンギオスタチンに応答することを示す図である。アンジオモチンのC末端に対するポリクローナル抗体およびサイトケラチンを検出するモノクローナル抗体(細胞性栄養膜細胞のマーカー)で染色したヒト胎盤切片(第2期-第3期)は、浮遊絨毛(FV)、固定絨毛(AV)および基板(BP)においてサイトケラチンとアンジオモチンの同時局在を示した。倍率=400倍。図１４Ｂは、細胞性栄養膜細胞はp80アンジオモチンおよびp130アンジオモチンを発現し、アンギオスタチンに応答することを示す図である。アンジオモチンのC末端に対するポリクローナル抗体およびサイトケラチンを検出するモノクローナル抗体(細胞性栄養膜細胞のマーカー)で染色したヒト胎盤切片(第2期-第3期)は、浮遊絨毛(FV)、固定絨毛(AV)および基板(BP)においてサイトケラチンとアンジオモチンの同時局在を示した。倍率=400倍。図１４Ｃは、細胞性栄養膜細胞はp80アンジオモチンおよびp130アンジオモチンを発現し、アンギオスタチンに応答することを示す図である。アンジオモチンのC末端に対するポリクローナル抗体およびサイトケラチンを検出するモノクローナル抗体(細胞性栄養膜細胞のマーカー)で染色したヒト胎盤切片(第2期-第3期)は、浮遊絨毛(FV)、固定絨毛(AV)および基板(BP)においてサイトケラチンとアンジオモチンの同時局在を示した。倍率=400倍。図１４Ｄは、細胞性栄養膜細胞はp80アンジオモチンおよびp130アンジオモチンを発現し、アンギオスタチンに応答することを示す図である。アンジオモチンのC末端に対するポリクローナル抗体およびサイトケラチンを検出するモノクローナル抗体(細胞性栄養膜細胞のマーカー)で染色したヒト胎盤切片(第2期-第3期)は、浮遊絨毛(FV)、固定絨毛(AV)および基板(BP)においてサイトケラチンとアンジオモチンの同時局在を示した。倍率=400倍。図１４Ｅは、細胞性栄養膜細胞はp80アンジオモチンおよびp130アンジオモチンを発現し、アンギオスタチンに応答することを示す図である。アンジオモチンのC末端に対するポリクローナル抗体およびサイトケラチンを検出するモノクローナル抗体(細胞性栄養膜細胞のマーカー)で染色したヒト胎盤切片(第2期-第3期)は、浮遊絨毛(FV)、固定絨毛(AV)および基板(BP)においてサイトケラチンとアンジオモチンの同時局在を示した。倍率=400倍。図１４Ｆは、細胞性栄養膜細胞はp80アンジオモチンおよびp130アンジオモチンを発現し、アンギオスタチンに応答することを示す図である。アンジオモチンのC末端に対するポリクローナル抗体およびサイトケラチンを検出するモノクローナル抗体(細胞性栄養膜細胞のマーカー)で染色したヒト胎盤切片(第2期-第3期)は、浮遊絨毛(FV)、固定絨毛(AV)および基板(BP)においてサイトケラチンとアンジオモチンの同時局在を示した。倍率=400倍。図１４Ｇは、細胞性栄養膜細胞はp80アンジオモチンおよびp130アンジオモチンを発現し、アンギオスタチンに応答することを示す図である。アンギオスタチン処理(5μg/ml)は、in vitroでマトリゲルの細胞性栄養膜細胞の侵襲を劇的に制御した(p<0.001)。データの統計的有意性はスチューデントのt-検定によって分析した。
【図１５】内因性p80アンジオモチンが、ウシ毛細血管内皮(BCE)細胞中でビオチン化されることを示す図である。図8の凡例中に記載した実験と同様の実験をBCE細胞において実施して、p80アンジオモチンが何らかの細胞外ドメインを有するかどうかを測定した。
【図１６】p80アンジオモチンが、細胞外エピトープを有することを示す図である。p80アンジオモチン(「p80Amot」)を発現するMAE細胞を5、10、20、40および80分間トリプシンで処理し、細胞溶解物はウエスタンブロッティングによって分析した。トリプシンは80分間以内に大部分のp80アンジオモチンを分解し、一方で細胞内に存在するアクチンは分解されなかった。    [配列番号１]p130アンジオモチンのポリペプチド配列の図である。(p80アンジオモチンの配列と類似性を有していない)p130アンジオモチンのN末端ドメインには下線を引かず、p80アンジオモチンと類似性を有するp130アンジオモチンの配列に下線を引く。    [配列番号２]p130アンジオモチンのポリヌクレオチド配列の図である。(p80アンジオモチンの配列と類似性を有していない)p130アンジオモチンのN末端ドメインをコードするポリヌクレオチド配列には下線を引かず、p80アンジオモチンと類似性を有するp130アンジオモチンのポリヌクレオチド配列に下線を引く。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図８】
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【図１０】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図９】
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【図１１】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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