(57)【要約】  本発明は、配列番号１に構造的に関連したアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチド、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ組成物ならびにそのようなポリペプチドおよび組成物の使用に関する。配列番号１は完全長スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡｈｐＣ配列を含有する。アミノＨｉｓタグおよび３個の追加的なカルボキシルアミノ酸を含有する配列番号１の誘導体はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫応答をもたらすことが判明した。
2008532483.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１に対して又は配列番号１の断片に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチド免疫原であって、前記ポリペプチドがスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫をもたらし、ならびに前記ポリペプチド免疫原が配列番号１のポリペプチドではない、ポリペプチド免疫原。
【請求項２】
前記アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸１７８−１８９を含む、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が配列番号１に対して少なくとも９５％同一である、請求項２のポリペプチド。
【請求項４】
前記ポリペプチドが配列番号２のアミノ酸２２−２１３からなる、請求項３のポリペプチド。
【請求項５】
前記ポリペプチドが実質的に精製されている、請求項３のポリペプチド。
【請求項６】
配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列およびカルボキシル末端またはアミノ末端において前記アミノ酸配列に共有結合した１以上の追加的領域または部分とを含んでなる免疫原であって、各領域または部分が、独立して、以下の特性、すなわち、免疫応答の増強、精製の促進またはポリペプチド安定性の促進の少なくとも１つを有する領域または部分から選ばれる、免疫原。
【請求項７】
配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるポリペプチドおよび配列番号３に対して少なくとも８５％同一であるポリペプチドを含んでなる精製された免疫原。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項記載の免疫原の免疫学的に有効な量と医薬上許容される担体とを含んでなる、患者において防御免疫応答を誘導しうる組成物。
【請求項９】
アジュバントを更に含む、請求項８の組成物。
【請求項１０】
請求項１から５のいずれか一項のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含んでなる核酸。
【請求項１１】
発現ベクターである、請求項１０の核酸。
【請求項１２】
請求項１から５のいずれか一項のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組換え遺伝子を含んでなる組換え細胞。
【請求項１３】
防御免疫をもたらすスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）請求項１２の組換え細胞を、前記ポリペプチドが発現される条件下で増殖させ、および
（ｂ）前記ポリペプチドを精製する工程を含んでなる、製造方法。
【請求項１４】
請求項７の免疫原に結合する可変領域を含んでなる単離された結合性タンパク質。
【請求項１５】
（ａ）（１）前記結合性タンパク質を選択するために前記免疫原を使用し、または（ａ）（２）前記結合性タンパク質の産生を誘導するために前記免疫原を使用し、
（ｂ）前記抗原結合性タンパク質を実質的に精製する工程を含む製造方法により製造される、請求項１４の結合性タンパク質。
【請求項１６】
前記結合性タンパク質が抗体である又は抗体フラグメントを含む、請求項１５の結合性タンパク質。
【請求項１７】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対して患者を治療する方法であって、
（ａ）配列番号１または配列番号１の断片に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む免疫原（前記ポリペプチドはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫をもたらす）の免疫学的に有効な量、
（ｂ）請求項１から７のいずれか一項の免疫原の免疫学的に有効な量、
（ｃ）請求項１４の結合性タンパク質の有効量
の１以上を前記患者に投与する工程を含んでなる方法。
【請求項１８】
前記患者がヒトである、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対して前記患者を予防的に治療する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫原が請求項１から７のいずれか一項記載の免疫原である、請求項１８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫応答を誘導するためのポリペプチドに関する。
【背景技術】
【０００２】
本出願の全体にわたって引用されている参考文献は、特許請求されている本発明の先行技術であると自認するものではない。
【０００３】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）は、多種多様な疾患および状態を引き起こす病原体である。スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）により引き起こされる疾患および状態の具体例には、菌血症、感染性心内膜炎、毛包炎、フルンケル、カルブンケル、インペチゴ、水疱性インペチゴ、フレグモーネ、ボトリオミセス症、毒性ショック症候群、火傷様皮膚症候群、中枢神経系感染症、感染性および炎症性眼疾患、骨髄炎ならびに関節および骨の他の感染症、ならびに気道感染症が含まれる（Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｉｎｃ．１９９７）。
【０００４】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染およびスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の広がりを抑制するためには、免疫学に基づく方法を用いることが可能である。免疫学に基づく方法には受動および能動免疫が含まれる。受動免疫では、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）を標的化する免疫グロブリンを使用する。能動免疫はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する免疫応答を誘導する。
【０００５】
潜在的なスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ワクチンはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）多糖およびポリペプチドを標的化する。標的化は、適当なスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）多糖またはポリペプチドをワクチン成分として使用して達成されうる。可能なワクチン成分として使用しうる多糖の具体例には、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）５および８型莢膜多糖が含まれる（Ｓｈｉｎｅｆｉｅｌｄら，Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．３４６：４９１−４９６，２００２）。可能なワクチン成分として使用しうるポリペプチドの具体例には、コラーゲン粘着性物質、フィブリノーゲン、結合タンパク質およびクランピング因子が含まれる（Ｍａｍｏら，ＦＥＭＳ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １０：４７−５４，１９９４，Ｎｉｌｓｓｏｎら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０１：２６４０−２６４９，１９９８，Ｊｏｓｅｆｓｓｏｎら，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １８４：１５７２−１５８０，２００１）。
【０００６】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチド配列に関する情報はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ゲノムの配列決定から得られている（Ｋｕｒｏｄａら，Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１２２５−１２４０，２００１，Ｂａｂａら，Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：１８１９−１８２７，２０００，１９９７年７月３０日付け公開のＫｕｎｓｃｈら，欧州特許公開ＥＰ  ０  ７８６  ５１９）。ゲノム配列決定から得られたポリペプチド配列を特徴づけるために、ある程度はバイオインフォマティクスが用いられている（１９９７年７月３０日付け公開のＫｕｎｓｃｈら，欧州特許公開ＥＰ  ０  ７８６  ５１９）。
【０００７】
潜在的抗原をコードする遺伝子の特定を補助するために、例えば提示技術を用いるような技術および感染患者からの血清が使用されている（２００１年１２月２７日付け公開のＦｏｓｔｅｒら，国際公開番号ＷＯ  ０１／９８４９９，２００２年８月１日付け公開のＭｅｉｎｋｅら，国際公開番号ＷＯ  ０２／０５９１４８，Ｅｔｚら，ＰＮＡＳ  ９９：６５７３−６５７８，２００２）。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明は、配列番号１に構造的に関連したアミノ酸配列またはその断片を含むポリペプチド、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ組成物ならびにそのようなポリペプチドおよび組成物の使用に関する。配列番号１は完全長スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡｈｐＣ配列を含有する。アミノＨｉｓタグおよび３個の追加的なカルボキシルアミノ酸を含有する配列番号１の誘導体はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫応答をもたらすことが判明した。
【０００９】
「防御」免疫または免疫応答に対する言及は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する検出可能なレベルの防御を示す。防御のレベルは、動物モデル（例えば、本明細書に記載されているもの）を使用して評価されうる。
【００１０】
したがって、本発明の第１の態様は、配列番号１に対して又は配列番号１の断片に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチド免疫原を記載する。ここで、前記ポリペプチドはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫をもたらし、前記ポリペプチド免疫原は配列番号１のポリペプチドではない。免疫原に対する言及は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫をもたらしうることを示す。
【００１１】
配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むことに対する言及は、配列番号１関連領域が存在し追加的ポリペプチド領域が存在しうることを示す。基準配列に対する同一性（％）（同一％とも称される）は、ポリペプチド配列を前記基準配列に対して整列（アライン）させ、対応領域内の同一アミノ酸の数を決定することにより決定される。この数を前記基準配列（例えば、配列番号１）内のアミノ酸の総数で割り算し、ついで１００を掛け算し、最も近い整数に丸める。
【００１２】
本発明のもう１つの態様は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫をもたらすポリペプチドと、カルボキシル末端またはアミノ末端において前記ポリペプチドに共有結合した１以上の追加的領域または部分とを含む免疫原を記載する。ここで、各領域または部分は、独立して、以下の特性、すなわち、免疫応答の増強、精製の促進またはポリペプチド安定性の促進の少なくとも１つを有する領域または部分から選ばれる。
【００１３】
「追加的領域または部分」に対する言及は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡｈｐＣ領域とは異なる領域または部分を示す。前記追加的領域または部分は例えば追加的ポリペプチド領域または非ペプチド領域でありうる。
【００１４】
本発明のもう１つの態様は、ＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ組成物から構成される精製された免疫原を記載する。ＡｈｐＣ成分は、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるポリペプチドを含む。ＡｈｐＦ成分は、配列番号３に対して少なくとも８５％同一であるポリペプチドを含む。精製されたものに対する言及は、前記組成物が、ＡｈｐＣおよびＡｈｐＦが天然で付随している１以上の他のポリペプチドを欠く環境中に存在すること、および／または存在する全タンパク質の少なくとも約１０％に相当することを示す。
【００１５】
好ましくは、前記組成物は実質的に精製されている。「実質的に精製された」ＡｈｐＣおよびＡｈｐＦ組成物は、ＡｈｐＣおよびＡｈｐＦポリペプチドが天然で付随している全て又はほとんどの他のポリペプチドを欠く環境中に存在する。
【００１６】
「精製（された）」または「実質的に精製（された）」に対する言及は、ポリペプチドがいずれかの精製を受けることを要求するものではなく、例えば、精製されていない化学合成ポリペプチドを包含しうる。
【００１７】
本発明のもう１つの態様は、患者においてスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫を誘導しうる組成物を記載する。前記組成物は、医薬上許容される担体と、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫をもたらす免疫学的に有効な量の免疫原とを含む。
【００１８】
免疫学的に有効な量は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御免疫をもたらすのに十分な量である。前記量は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の可能性または重症度を有意に抑制するのに十分なものであるべきである。
【００１９】
本発明のもう１つの態様は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する防御免疫をもたらすポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む核酸を記載する。組換え遺伝子は、適切な転写およびプロセシングのための調節要素（これは翻訳および翻訳後要素を含みうる）と共にポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する。前記組換え遺伝子は宿主ゲノムから独立して存在することが可能であり、あるいは宿主ゲノムの一部でありうる。
【００２０】
組換え核酸は、その配列および／または形態の点では天然では見出されない核酸である。組換え核酸の具体例には、精製された核酸、天然で見出されるものとは異なる核酸を与える一緒になった２以上の核酸領域、互いに天然で付随している１以上の核酸領域（例えば、上流または下流領域）の非存在が含まれる。
【００２１】
本発明のもう１つの態様は組換え細胞を記載する。前記細胞は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫をもたらすポリペプチドをコードする組換え遺伝子を含む。
【００２２】
本発明のもう１つの態様は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫をもたらすポリペプチドの製造方法を記載する。前記方法は、前記ポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する組換え細胞を増殖させ、前記ポリペプチドを精製することを含む。
【００２３】
本発明のもう１つの態様は、宿主において前記ポリペプチドをコードする組換え核酸を含有する組換え細胞を増殖させ、前記ポリペプチドを精製する工程を含む方法により製造されたスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫をもたらすポリペプチドを記載する。種々の宿主細胞を使用することが可能である。
【００２４】
本発明のもう１つの態様は、単離されたＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ結合タンパク質を記載する。前記結合タンパク質は、ＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ複合体に結合する抗体可変領域を含む。
【００２５】
「単離（された）」に対する言及は、天然で見出されるものとは異なる形態を示す。そのような異なる形態は、例えば、天然で見出されるものとは異なる純度および／または天然で見出されない構造体でありうる。天然で見出されない構造体には、異なる領域が一緒になった組換え構造体、例えば、１以上のマウス相補性決定領域（ＣＤＲ）がヒトフレームワークスカフォールド上に挿入されたヒト化抗体、抗体結合タンパク質由来の１以上のＣＤＲが別のフレームワークスカフォールド内に挿入されたハイブリッド抗体、および軽可変ドメインおよび重可変ドメインをコードする遺伝子が互いにランダムに組合された天然ヒト配列に由来する抗体が含まれる。
【００２６】
単離されたタンパク質は、好ましくは、血清タンパク質を実質的に含有しない。血清タンパク質を実質的に含有しないタンパク質は、ほとんど又は全ての血清タンパク質を欠く環境中に存在する。
【００２７】
本発明のもう１つの態様は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対して患者を治療する方法を記載する。前記方法は、
（ａ）配列番号１または配列番号１の断片に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む免疫原（前記ポリペプチドはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫をもたらす）の免疫学的に有効な量、
（ｂ）配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるポリペプチドまたは配列番号３に対して少なくとも８５％同一であるポリペプチドを含む免疫原性組成物、あるいは
（ｃ）ＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ結合タンパク質の有効量
のうちの１以上を患者に投与する工程を含む。
【００２８】
個々の用語が互いに矛盾しない限り、「または（もしくは）（あるいは）」は一方または両方の可能性を示す。場合によっては、一方または両方の可能性を強調するために「および／または」のような表現が用いられる。
【００２９】
「含む（含んでなる）」のような非限定的用語に対する言及は追加的な要素または工程を許容する。場合によっては、「１以上」のような表現は、追加的な要素または工程の可能性を強調するために非限定的用語と共に又はそれを伴わずに用いられる。
【００３０】
明示的に示されていない限り、単数表現は単数を示すと限定されるものではない。例えば、「細胞」は複数の細胞を除外するものではない。場合によっては、可能な複数の存在を強調するために、１以上のような表現が用いられる。
【００３１】
本発明の他の特徴および利点は、種々の実施例（具体例）を含む本明細書に記載の更なる説明から明らかである。記載されている実施例（具体例）は、本発明の実施に有用な種々の成分および方法を例示する。前記実施例（具体例）は、特許請求されている本発明を限定するものではない。本開示に基づき、当業者は、本発明の実施に有用な他の成分および方法を特定し使用することが可能である。
【００３２】
発明の詳細な説明
配列番号１関連ポリペプチドが防御免疫をもたらす能力は、配列番号２を使用する後記実施例において例示されている。配列番号２は、アミノＨｉｓタグおよび３つの追加的カルボキシルアミノ酸を含有する配列番号１の誘導体である。Ｈｉｓタグはポリペプチドの精製および特定を促進する。
【００３３】
配列番号１に構造的に関連したポリペプチドには、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）株に存在する種々の対応領域および天然に存在する領域の誘導体を含有するポリペプチドが含まれる。配列番号１のアミノ酸配列は図１の太字領域により示される。図１は、配列番号２に存在するアミノＨｉｓタグおよび追加的なカルボキシルアミノ酸をも示す。
【００３４】
Ｉ．ＡｈｐＣ配列
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡｈｐＣは元々は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アルキルヒドロペルオキシドレダクターゼ（ＡｈｐＣ）に対して著しい類似性を有する、浸透圧上昇ショックにより誘導されるタンパク質として同定された（Ａｍｓｔｒｏｎｇ−Ｂｕｉｓｓｅｒｅｔら，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：１６５５−１６６１，１９９５）。種々の類似性のＡｈｐＣホモログが哺乳類の脳、および多数の細菌種を含む種々の生物に存在する（Ｃｈａｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：７０１７−７０２１，１９９４，Ｙａｎら，Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ６：２７４−２８２，２００１）。
【００３５】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡｈｐＣ関連配列には種々の参考文献において種々の名称が付与されている。種々の名称の例はＴＩＧＲ（ＳＡ０４５２）；Ｂａｂａら，Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：１８１９−１８２７，２００２（ＭＷ０３５７）；Ｋｕｒｏｄａら，Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１２２５−１２４０，２００１（ＳＡＶ０３８１）；およびＯｈｔａら，ＤＮＡ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １：５１，２００４（ＳＡＶ０３８１およびＳＡＶ０７７３）に記載されている。
【００３６】
図２は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（配列番号１）およびスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）およびスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）（配列番号６）に存在するＡｈｐＣ関連配列に関する配列比較を示す。他のＡｈｐＣ配列から、更なる比較を行うことが可能である。
【００３７】
公知ＡｈｐＣ配列と比較した場合の高い度合の配列類似性または連続的なアミノ酸の存在に基づき、他の天然に存在するＡｈｐＣ配列を特定することが可能である。連続的なアミノ酸は特徴的なタグを与える。種々の実施形態において、天然に存在するＡｈｐＣ配列は、配列番号１の場合と同様に少なくとも２０個、少なくとも３０個または少なくとも５０個の連続的なアミノ酸を有する、および／または配列番号１に対して少なくとも８５％の配列類似性もしくは同一性を有する、スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、好ましくはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）において見出される配列である。
【００３８】
配列類似性は、当技術分野で公知の種々のアルゴリズムおよび技術により決定されうる。一般に、配列類似性は、配列の１つにおいてギャップ、付加および置換を許容しつつ最大のアミノ酸同一性を得るために２つの配列を整列（アライン）させる技術により決定される。
【００３９】
配列類似性は、例えば、ラライン（ｌａｌｉｇｎ）なるプログラム（≪ｓｉｍ≫プログラム用にＨｕａｎｇおよびＭｉｌｌｅｒにより開発されたもの，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．１２：３３７−３５７，１９９１）を利用する局所アライメント手段を用いて決定されうる。オプションおよび環境変数は、−ｆ＃ギャップ内の第１残基に関するペナルティ（デフォルトで−１４）、−ｇ＃ギャップ内の各追加的残基に関するペナルティ（デフォルトで−４）  −ｓ  ｓｔｒ（ＳＭＡＴＲＩＸ）択一的（ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ）スコアリングマトリックスファイルのファイル名である。タンパク質配列の場合には、配列アライメントのためのデフォルト−ｗ＃（ＬＩＮＬＥＮ）出力ライン長（６０）により、ＰＡＭ２５０が使用される。
【００４０】
ＩＩ．配列番号１関連ポリペプチド
配列番号１関連ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含有する。「ポリペプチド」に対する言及は最小または最大のサイズ限界を示すものではない。
【００４１】
配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるポリペプチドは、配列番号１からの約２８個までのアミノ酸改変を含有する。各アミノ酸改変は、独立して、アミノ酸の置換、欠失または付加である。種々の実施形態において、配列番号１関連ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも９０％、少なくとも９４％または少なくとも９９％同一である；０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸改変だけ配列番号１と異なる；あるいは配列番号１から実質的になる。
【００４２】
本発明の１つの実施形態は、配列番号１のアミノ酸１７８−１８９に対して少なくとも８５％、少なくとも９５％または１００％同一である配列を含む又は前記配列から実質的になるポリペプチド免疫原に関する。他の実施形態においては、配列番号１のアミノ酸１７８−１８９を含むポリペプチドは、合計でせいぜい１３、１５、２０、２５、５０、１００または１５０個のアミノ酸よりなり、および／またはその全体のポリペプチドは配列番号１の領域に対して少なくとも８５％、少なくとも９０％または同一であり、配列番号１のアミノ酸１７８−１８９を含む。存在しうる追加的なアミノ酸には、追加的な配列番号１のアミノ酸または他のアミノ酸領域が含まれる。好ましい追加的なアミノ酸はアミノ末端メチオニンである。
【００４３】
示されているアミノ酸「から実質的になる」に対する言及は、言及されているアミノ酸が存在し、追加的なアミノ酸が存在しうることを示す。追加的なアミノ酸はカルボキシルまたはアミノ末端に位置しうる。種々の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個の追加的なアミノ酸が存在する。
【００４４】
配列番号１のポリペプチドまたはその断片に改変を施して、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫を誘導する誘導体を得ることが可能である。改変は、例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫を誘導する能力を保有する誘導体を得るために、あるいは防御免疫をもたらすことに加えて、特定の目的を達成しうる領域をも有する誘導体を得るために、行うことが可能である。
【００４５】
潜在的な改変の設計の指針として、図２に示す配列比較および他のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡｈｐＣ配列との比較を用いることが可能である。また、アミノ酸の公知特性を考慮して改変を施すことが可能である。
【００４６】
一般には、活性を保有するよう種々のアミノ酸を置換する場合には、類似した特性を有するアミノ酸を置換することが好ましい。アミノ酸の置換の場合に考慮されうる要因には、アミノ酸のサイズ、電荷、極性および疎水性が含まれる。アミノ酸の特性に対する種々のアミノ酸Ｒ基の効果が当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−２００２，Ａｐｐｅｎｄｉｘ  １Ｃを参照されたい）。
【００４７】
活性を維持するようアミノ酸を置換する際には、置換アミノ酸は、１以上の類似特性（例えば、ほぼ同じ電荷および／またはサイズおよび／または極性および／または疎水性）を有するべきである。例えば、ロイシンからバリンへの、リシンからアルギニンへの、およびグルタミンからアスパラギンへの置換は、ポリペプチドの機能の変化を引き起こさない優れた候補である。
【００４８】
特定の目的を達成するための改変には、前記ポリペプチドの産生もしくは効力またはコード化核酸のクローニングを促進するよう設計されたものが含まれる。ポリペプチドの産生は、組換え発現に適した開始コドン（例えば、メチオニンをコードするもの）の使用により促進されうる。前記メチオニンは後に細胞プロセシング中に除去されうる。クローニングは、例えば、アミノ酸の付加または変化を伴いうる制限部位の導入により促進されうる。
【００４９】
免疫応答を誘導するポリペプチドの効力はエピトープ増強により増強されうる。エピトープ増強は、ＭＨＣ分子に対するペプチドアフィニティを改善するためのアンカー残基の改変を含む技術およびＴ細胞受容体に対するペプチド−ＭＨＣ複合体のアフィニティを増加させる技術のような種々の技術を用いて行われうる（Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ  １：２０９−２１９，２００１）。
【００５０】
好ましくは、前記ポリペプチドは、精製されたポリペプチドである。「精製されたポリペプチド」は、それが天然で付随している１以上の他のポリペプチドを欠く環境中に存在し、および／または存在する全タンパク質の少なくとも約１０％に相当する。種々の実施形態において、精製されたポリペプチドは、サンプルまたは調製物中の全タンパク質の少なくとも約５０％、少なくとも約７５％または少なくとも約９５％に相当する。
【００５１】
１つの実施形態においては、前記ポリペプチドは「実質的に精製」されている。実質的に精製されたポリペプチドは、前記ポリペプチドが天然で付随している全て又はほとんどの他のポリペプチドを欠く環境中に存在する。例えば、実質的に精製されたスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチドは、すべて又はほとんどの他のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ポリペプチドを欠く環境中に存在する。環境は例えばサンプルまたは調製物でありうる。
【００５２】
「精製（された）」または「実質的に精製（された）」に対する言及は、ポリペプチドがいずれかの精製を受けることを要求するものではなく、例えば、精製されていない化学合成ポリペプチドを包含しうる。
【００５３】
ポリペプチドの安定性は、ポリペプチドのカルボキシルまたはアミノ末端を修飾することにより増強されうる。可能な修飾の具体例には、アミノ末端保護基、例えばアセチル、プロピル、スクシニル、ベンジル、ベンジルオキシカルボニルまたはｔ−ブチルオキシカルボニル；およびカルボキシル末端保護基、例えばアミド、メチルアミドおよびエチルアミドが含まれる。
【００５４】
本発明の１つの実施形態においては、ポリペプチド免疫原は、カルボキシル末端またはアミノ末端において前記ポリペプチドに共有結合した１以上の追加的領域または部分を含有する免疫原の一部であり、ここで、各領域または部分は、独立して、以下の特性、すなわち、免疫応答の増強、精製の促進またはポリペプチド安定性の促進の少なくとも１つを有する領域または部分から選ばれる。ポリペプチドの安定性は、例えば、アミノまたはカルボキシル末端に存在しうるポリエチレングリコールのような基を使用して増強されうる。
【００５５】
ポリペプチドの精製は、精製を促進させるための基をカルボキシルまたはアミノ末端に付加することにより促進されうる。精製を促進させるために使用しうる基の具体例には、アフィニティータグを付与するポリペプチドが含まれる。アフィニティータグの具体例には、６ヒスチジンタグ、ｔｒｐＥ、グルタチオンおよびマルトース結合タンパク質が含まれる。
【００５６】
免疫応答をポリペプチドが引き起こす能力は、免疫応答を一般に増強する基を使用することにより増強されうる。ポリペプチドに対する免疫応答を増強するためにポリペプチドに連結されうる基の具体例には、例えばＩＬ−２のようなサイトカインが含まれる（Ｂｕｃｈａｎら，２０００．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ３７：５４５−５５２）。
【００５７】
ＩＩＩ．ＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ免疫原
ＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ免疫原は、ＡｈｐＣおよびＡｈｐＦを含有する組成物である。ＡｈｐＣ成分は配列番号１関連ポリペプチドから構成される。ＡｈｐＦ成分は配列番号３関連ポリペプチドから構成される。
【００５８】
配列番号１関連ポリペプチドは、配列番号１に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含有する。配列番号１関連ポリペプチドの種々の実施形態が前記ＩＩ節に記載されている。
【００５９】
配列番号３関連ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含有する。各アミノ酸改変は、独立して、アミノ酸の置換、欠失または付加である。種々の実施形態において、配列番号３関連ポリペプチドは、配列番号３に対して少なくとも９０％、少なくとも９４％、少なくとも９９％または同一である；０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸改変だけ配列番号３と異なる；あるいは配列番号３から実質的になる。
【００６０】
配列番号３関連ポリペプチドに改変を施して、配列番号１関連ポリペプチド成分と共に使用する誘導体を得ることが可能である。改変は、例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫を誘導する能力を保有する全組成物を得るために、あるいは防御免疫をもたらすことに加えて、特定の目的を達成しうる領域をも有する全組成物を得るために、行うことが可能である。
【００６１】
ＡｈｐＦ成分の設計を補助するために使用しうる異なるＡｈｐＦ配列を図５Ａおよび５Ｂに示す。ポリペプチドに改変を施すための更なる指針は前掲ＩＩ節に記載されている。
【００６２】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＡｈｐＦ関連配列には種々の参考文献において種々の名称が付与されている。種々の名称の例はＴＩＧＲ（ＳＡ０４５１）；Ｂａｂａら，Ｌａｎｃｅｔ  ３５９：１８１９−１８２７，２００２（ＭＷ０３５６）；Ｋｕｒｏｄａら，Ｌａｎｃｅｔ  ３５７：１２２５−１２４０，２００１（ＳＡＶ０３８０およびＳＡ０３６５）；およびＥｎｒｉｇｈｔら，ＰＮＡＳ  ９９：９７８６−９７９１，２００２（ＳＡＳ０３５７およびＳＡＲ０３９８）に記載されている。
【００６３】
ＡｈｐＣおよびＡｈｐＦ組成物は、好ましくは、両方の成分を発現する構築物を使用して組換え的に製造される。例えば、ａｐｈＣおよびａｈｐＦを共発現させるために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を操作することが可能であり、ＡｈｐＣおよびＡｈｐＦ複合体を単離することが可能である。ポリペプチドの製造に関する更なる指針および具体例を後記ＩＶ節に記載する。
【００６４】
ＩＶ．ポリペプチドの製造
ポリペプチドは、化学合成を伴う技術および前記ポリペプチドを産生する細胞からの精製を伴う技術を含む標準的な技術を用いて製造されうる。ポリペプチドの化学合成のための技術は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｖｉｎｃｅｎｔ，Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，Ｄｅｃｋｅｒ，１９９０を参照されたい）。組換えポリペプチドの製造および精製のための技術も当技術分野でよく知られている（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−２００２を参照されたい）。
【００６５】
細胞からのポリペプチドの入手は、前記ポリペプチドを製造するための組換え核酸技術を用いることにより促進される。ポリペプチドを製造するための組換え核酸技術は、前記ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を細胞内に導入し又は細胞内で産生させ、前記ポリペプチドを発現させることを含む。
【００６６】
組換え遺伝子は、ポリペプチドの発現のための調節要素と共に、ポリペプチドをコードする核酸を含有する。組換え遺伝子は細胞ゲノム内に存在することが可能であり、あるいは発現ベクターの一部でありうる。
【００６７】
組換え遺伝子の一部として存在しうる調節要素には、前記ポリペプチドをコードする配列に天然で付随している調節要素、および前記ポリペプチドをコードする配列に天然では付随していない外因性調節要素が含まれる。組換え遺伝子を特定の宿主内で発現させるためには又は発現レベルを増加させるためには、外因性プロモーターのような外因性調節要素が有用でありうる。一般には、組換え遺伝子中に存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および場合によって存在するオペレーターが含まれる。真核細胞内でのプロセシングのための好ましい要素はポリアデニル化シグナルである。
【００６８】
細胞内での組換え遺伝子の発現は発現ベクターの使用により促進される。好ましくは、組換え遺伝子に加えて発現ベクターも、宿主細胞内での自律複製のための複製起点、選択マーカー、一定数の有用な制限酵素部位、および高いコピー数の潜在性を含有する。発現ベクターの具体例としては、クローニングベクター、修飾されたクローニングベクター、特別に設計されたプラスミドおよびウイルスが挙げられる。
【００６９】
遺伝暗号の縮重のため、特定のポリペプチドをコードするために多数の異なるコード化核酸配列が用いられうる。ほとんど全てのアミノ酸は、異なる組合せのヌクレオチドトリプレット、すなわち「コドン」によりコードされているため、遺伝暗号の縮重が生じる。アミノ酸は、以下のとおりに、コドンによりコードされる。
Ａ＝Ａｌａ＝アラニン：コドンＧＣＡ、ＧＣＣ、ＧＣＧ、ＧＣＵ。
Ｃ＝Ｃｙｓ＝システイン：コドンＵＧＣ、ＵＧＵ。
Ｄ＝Ａｓｐ＝アスパラギン酸：コドンＧＡＣ、ＧＡＵ。
Ｅ＝Ｇｌｕ＝グルタミン酸：コドンＧＡＡ、ＧＡＧ。
Ｆ＝Ｐｈｅ＝フェニルアラニン：コドンＵＵＣ、ＵＵＵ。
Ｇ＝Ｇｌｙ＝グリシン：コドンＧＧＡ、ＧＧＣ、ＧＧＧ、ＧＧＵ。
Ｈ＝Ｈｉｓ＝ヒスチジン：コドンＣＡＣ、ＣＡＵ。
Ｉ＝Ｉｌｅ＝イソロイシン：コドンＡＵＡ、ＡＵＣ、ＡＵＵ。
Ｋ＝Ｌｙｓ＝リシン：コドンＡＡＡ、ＡＡＧ。
Ｌ＝Ｌｅｕ＝ロイシン：コドンＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＡ、ＣＵＣ、ＣＵＧ、ＣＵＵ。
Ｍ＝Ｍｅｔ＝メチオニン：コドンＡＵＧ。
Ｎ＝Ａｓｐ＝アスパラギン：コドンＡＡＣ、ＡＡＵ。
Ｐ＝Ｐｒｏ＝プロリン：コドンＣＣＡ、ＣＣＣ、ＣＣＧ、ＣＣＵ。
Ｑ＝Ｇｌｎ＝グルタミン：コドンＣＡＡ、ＣＡＧ。
Ｒ＝Ａｒｇ＝アルギニン：コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧ、ＣＧＵ。
Ｓ＝Ｓｅｒ＝セリン：コドンＡＧＣ、ＡＧＵ、ＵＣＡ、ＵＣＣ、ＵＣＧ、ＵＣＵ。Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン：コドンＡＣＡ、ＡＣＣ、ＡＣＧ、ＡＣＵ。
Ｖ＝Ｖａｌ＝バリン：コドンＧＵＡ、ＧＵＣ、ＧＵＧ、ＧＵＵ。
Ｗ＝Ｔｒｐ＝トリプトファン：コドンＵＧＧ。
Ｙ＝Ｔｙｒ＝チロシン：コドンＵＡＣ、ＵＡＵ。
【００７０】
配列番号１または配列番号３関連ポリペプチドの組換え核酸発現のための適当な細胞は原核生物および真核生物である。原核生物細胞の具体例には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）；スタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー、例えばスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）；ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー、例えばラクトバシラス・プランタルム（Ｌ．ｐｌａｎｔａｒｕｍ）；ラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のメンバー、例えばラクトコッカス・ラクティス（Ｌ．ｌａｃｔｉｓ）；およびバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属のメンバー、例えばバシラス・サチリス（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）が含まれる。真核生物細胞の具体例には、哺乳類細胞；昆虫細胞；酵母細胞、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属のメンバー（例えば、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｓ））、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属のメンバー（例えば、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈ．ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ））、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）またはクルイベロミセス・フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ））およびシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属のメンバー（例えば、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ））が含まれる。
【００７１】
組換え遺伝子の産生、細胞内への導入および組換え遺伝子発現のための技術は当技術分野でよく知られている。そのような技術の具体例はＡｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−２００２およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９のような参考文献に記載されている。
【００７２】
所望により、特定の宿主内での発現はコドン最適化により増強されうる。コドン最適化は、より好ましいコドンの使用を含む。種々の宿主におけるコドン最適化のための技術が当技術分野でよく知られている。
【００７３】
ポリペプチドは、翻訳後修飾、例えばＮ−結合グリコシル化、Ｏ−結合グリコシル化またはアセチル化を含有しうる。「ポリペプチド」、またはポリペプチドの「アミノ酸」配列に対する言及は、宿主細胞（例えば、酵母宿主）からの翻訳後修飾の構造を有する１以上のアミノ酸を含有するポリペプチドを含む。
【００７４】
翻訳後修飾は化学的に、または適当な宿主を使用することにより得られうる。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）においては、末端前アミノ酸の性質が、Ｎ末端メチオニンが除去されるかどうかを決定するらしい。さらに、末端前アミノ酸の性質は、Ｎ末端アミノ酸がＮα−アセチル化されるかどうかをも決定する（Ｈｕａｎｇら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２６：８２４２−８２４６，１９８７）。もう1つの例には、分泌リーダー（例えば、シグナルペプチド）の存在により分泌のために標的化されるポリペプチドが含まれ、この場合、前記タンパク質はＮ−結合またはＯ−結合グリコシル化により修飾される（Ｋｕｋｕｒｕｚｉｎｓｋａら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５６：９１５−９４４，１９８７）。
【００７５】
Ｖ．アジュバント
アジュバントは、免疫応答の生成において免疫原を補助しうる物質である。アジュバントは、以下のうちの１以上のような種々のメカニズムにより機能しうる：抗原の生物学的または免疫学的半減期の延長、抗原提示細胞への抗原の運搬の改善、抗原提示細胞による抗原のプロセシングおよび提示の改善、ならびに免疫調節性サイトカインの産生の誘導（Ｖｏｇｅｌ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３０（ｓｕｐｐｌ．３）：Ｓ２６６−２７０，２０００）。
【００７６】
免疫応答の生成を補助するためには、多種多様なタイプのアジュバントが使用されうる。個々のアジュバントの具体例には、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムもしくはアルミニウムの他の塩、リン酸カルシウム、ＤＮＡ  ＣｐＧモチーフ、モノホスホリルリピドＡ、コレラ毒素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素、百日咳毒素、ムラミルジペプチド、フロインド不完全アジュバント、ＭＦ５９、ＳＡＦ、免疫刺激性複合体、リポソーム、生分解性ミクロスフェア、サポニン、非イオン性ブロック共重合体、ムラミルペプチド類似体、ポリホスファゼン、合成ポリヌクレオチド、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２、ＩＬ−１２およびＩＳＣＯＭＳが含まれる（Ｖｏｇｅｌ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３０（ｓｕｐｐｌ  ３）：Ｓ２６６−２７０，２０００，Ｋｌｅｉｎら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８９：３１１−３２１，２０００；Ｒｉｍｍｅｌｚｗａａｎら，Ｖａｃｃｉｎｅ  １９：１１８０−１１８７，２００１，Ｋｅｒｓｔｅｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  ２１：９１５−９２０，２００３，Ｏ’Ｈａｇｅｎ  Ｃｕｒｒ．Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｏｒｄ．，１：２７３−２８６，２００１）。
【００７７】
ＶＩ．患者
「患者」は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しうる哺乳動物を意味する。患者は予防的または治療的に治療されうる。予防的治療は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の可能性または重症度を軽減するのに十分な防御免疫をもたらす。治療的治療は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染の重症度を軽減するために行われうる。
【００７８】
予防的治療は、本明細書に記載の免疫原を含有するワクチンを使用して行われうる。そのような治療は、好ましくは、ヒトに対して行われる。ワクチンは、一般集団、またはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染のリスクの高い者に投与されうる。
【００７９】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染のリスクの高い者には、医療従事者、入院患者、低下した免疫系を有する患者、手術を受けた患者、カテーテルまたは血管装置のような外来インプラントを受けた患者、免疫低下を招く療法を受けている患者、および火傷または創傷損傷のリスクの高い職業の者が含まれる（Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｃｒｏｓｓｌｅｙ  ａｎｄ  Ａｒｃｈｅｒ（編），Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ  Ｉｎｃ．１９９７）。
【００８０】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に感染しうる非ヒト患者には、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、ウマ、イヌ、ネコ、サル、ラットおよびマウスが含まれる。非ヒト患者の治療は、ペットおよび家畜を防御するのに、および特定の治療の効力を評価するのに有用である。
【００８１】
ＶＩＩ．混合（組合せ）ワクチン
本明細書に記載の免疫原は、免疫応答を誘導するために、単独で又は他の免疫原と組合せて使用されうる。存在しうる追加的な免疫原には、１以上の追加的なスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）免疫原、例えば前記の「背景技術」において記載されているもの、１以上の他のスタヒロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）生物、例えばスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、スタヒロコッカス・ヘモリティカス（Ｓ．ｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、スタヒロコッカス・ワーネリ（Ｓ．ｗａｒｎｅｒｉ）またはスタヒロコッカス・ラグネンシス（Ｓ．ｌｕｇｕｎｅｎｓｉｓ）を標的化する１以上の免疫原、ならびに他の感染生物を標的化する１以上の免疫原が含まれる。
【００８２】
ＶＩＩＩ．動物モデル系
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に対する防御免疫応答を生成する免疫原の効力を評価するために、動物モデル系を使用した。前記動物モデルは、定常期の細胞から調製され、適切に力価測定され、静脈内投与されたスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が関与する遅い速度論の致死モデルであった。この遅い速度論の死亡は、細菌感染に打つ勝つための特異的免疫防御のための十分な時間（例えば、２４時間ではなく１０日間）を与える。
【００８３】
定常期のスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）細胞は、固形培地上で増殖させた細胞から入手されうる。それは液体培地からも入手されうるが、固形培地上で増殖させた細胞での結果は、より良好な再現性を示した。細胞は固形培地上で一晩にわたって簡便に増殖されうる。例えば、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、倍加時間が約２０〜３０分間である条件下、約１８〜約２４時間増殖されうる。
【００８４】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の効力を維持するための標準的な技術を用いて固形または液体培地から単離されうる。単離されたスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、例えば、グリセロールを含有するリン酸緩衝食塩水中の洗浄された高密度懸濁液（＞１０９コロニー形成単位（ＣＦＵ）／ｍＬ）として−７０℃で保存されうる。
【００８５】
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）チャレンジは、第１日または第２日から開始して約７〜１０日間の期間にわたって動物モデルにおいて約８０〜９０％の死亡率を与える効力を示すべきである。力価測定実験は、保存されたスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）接種物の効力をモニターするために動物モデルを使用して行われうる。前記力価測定実験は接種実験の約１〜２週間前に行われうる。
【００８６】
ＩＸ．抗体
配列番号１関連ポリペプチドおよびＡｈｐＣ−ＡｈｐＦ組成物を含有する免疫原を使用して、前記免疫原に又はスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に結合する単離された結合性タンパク質を得ることが可能である。そのような結合性タンパク質は、ポリペプチドの精製、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の特定またはスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）感染に対する治療的もしくは予防的治療における用途を含む種々の用途を有する。好ましくは、前記結合性タンパク質は血清タンパク質を実質的に含有しない。
【００８７】
結合性タンパク質は第１可変領域および第２可変領域を含む。前記可変領域は重鎖または軽鎖由来の抗体可変領域の構造を有する。抗体重鎖および軽鎖可変領域は、フレームワーク上に間隔をあけて存在する３つの相補性決定領域を含有する。前記相補性決定領域は主として、特定のエピトープの認識をもたらす。抗体結合性タンパク質の具体例には、一本鎖抗体、完全抗体、抗体フラグメントおよびそれらの誘導体が含まれる。
【００８８】
好ましい抗原結合性タンパク質はモノクローナル抗体である。「モノクローナル抗体」に対する言及は、同じ又は実質的に同じ相補性決定領域および結合特異性を有する一群の抗体を示す。モノクローナル抗体におけるばらつきは、前記抗体が同一構築物から製造された場合に生じるものである。
【００８９】
モノクローナル抗体は、例えば、特定のハイブリドーマから、および前記抗体をコードする１以上の組換え遺伝子を含有する組換え細胞から製造されうる。前記抗体は２以上の組換え遺伝子によりコードされることが可能であり、この場合、１つの遺伝子は重鎖をコードし、１つの遺伝子は軽鎖をコードする。
【００９０】
抗体可変領域を含有する抗体フラグメントには、Ｆｖ、ＦａｂおよびＦａｂ２領域が含まれる。各Ｆａｂ領域は、可変領域および定常領域から構成される軽鎖と、可変領域および定常領域を含有する重鎖領域とを含有する。軽鎖は定常領域を介してジスルフィド結合により重鎖に連結される。Ｆａｂ領域の軽鎖および重鎖可変領域は、抗原結合に関与するＦｖ領域を与える。
【００９１】
また、抗体可変領域は、一本鎖抗体およびミニボディ（ｍｉｎｉｂｏｄｙ）のような、可変領域を含有するタンパク質の一部でありうる。一本鎖抗体は、リンカーにより互いに連結された軽鎖および重鎖可変領域を含有する。前記リンカーは例えば約５〜１６アミノ酸でありうる。ミニボディは、約８０ｋＤａの二価二量体へと自己集合する一本鎖−ＣＨ３融合タンパク質である。
【００９２】
可変領域の特異性は、より保存的な隣接領域（フレームワーク領域とも称される）の間に介在する３つの超可変領域（相補性決定領域とも称される）により決定される。フレームワーク領域および相補性決定領域に関連したアミノ酸は、Ｋａｂａｔら，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，１９９１に記載されているとおりに番号付けされ、整列（アライン）されうる。
【００９３】
一本鎖抗体、抗体または抗体フラグメントのような抗原結合性タンパク質を製造するための技術は当技術分野でよく知られている。そのような技術の具体例には、ファージ提示技術の利用、げっ歯類抗体の特定およびヒト化、ならびにＸｅｎｏＭｏｕｓｅまたはＴｒａｎｓ−Ｃｈｒｏｍｏマウスを使用するヒト抗体の製造が含まれる（例えば、Ａｚｚａｚｙら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３５：４２５−４４５，２００２，Ｂｅｒｇｅｒら，Ａｍ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．３２４（１）：１４−４０，２００２）。
【００９４】
当技術分野でよく知られた技術を用いて、マウス抗体をヒト化することが可能であり、ＣＤＲをヒト抗体フレームワーク上にグラフティングすることが可能である。そのような技術は全般的には、マウス可変領域をヒト抗体フレームワーク上にグラフティングし必要に応じて更なる修飾を行うことによるマウス抗体のヒト化に関して記載されている（例えば、Ｏ’Ｂｒｉｅｎら，Ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ＣＤＲ  Ｇｒａｆｔｉｎｇ，ｐ  ８１−１００，  Ｆｒｏｍ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ  ２０７：Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（ＷｅｌｓｃｈｏｆおよびＫｒａｕｓｓ編）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，２００３）。
【００９５】
抗原結合性タンパク質は、好ましくは、組換え核酸技術を用いて又はハイブリドーマの使用により製造される。組換え核酸技術はタンパク質合成のための核酸鋳型の構築を含む。ハイブリドーマは、抗原結合性タンパク質を産生する不死化細胞系である。
【００９６】
抗原結合性タンパク質をコードする組換え核酸は、実際に前記コード化タンパク質のための工場として働く宿主細胞内で発現されうる。前記組換え核酸は、宿主細胞ゲノムから自律して又は宿主細胞ゲノムの一部として存在する、抗原結合性タンパク質をコードする組換え遺伝子を与えうる。
【００９７】
組換え遺伝子は、タンパク質の発現のための調節要素と共にタンパク質をコードする核酸を含有する。一般には、組換え遺伝子内に存在する調節要素には、転写プロモーター、リボソーム結合部位、ターミネーター、および所望により存在するオペレーターが含まれる。真核細胞内でのプロセシングのための好ましい要素はポリアデニル化シグナルである。抗体関連イントロンも存在しうる。抗体または抗体フラグメントの製造のための発現カセットの具体例は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｐｅｒｓｉｃら．Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８，１９９７，Ｂｏｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３９：１５３−１６６，２０００，Ｌｉａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４７：１１９−１３０，２００１）。
【００９８】
細胞内の組換え遺伝子の発現は、発現ベクターを使用して促進される。好ましくは、発現ベクターは、組換え遺伝子に加えて、宿主細胞内での自律的複製のための複製起点、選択マーカー、限られた数の有用な制限酵素部位および潜在的な高コピー数をも含有する。抗体および抗体フラグメントの製造のための発現ベクターの具体例は当技術分野でよく知られている（例えば、Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ  １８７：９−１８，１９９７，Ｂｏｅｌら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３９：１５３−１６６，２０００，Ｌｉａｎｇら，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４７：１１９−１３０，２００１）。
【００９９】
所望により、当技術分野でよく知られた技術を用いて（Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８，Ｍａｒｋｓら，米国特許第６，７４３，６２２号を参照されたい）、抗体をコードする核酸を宿主染色体内に組込むことが可能である。
【０１００】
組換え抗原結合性タンパク質の発現には、原核生物（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）およびストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ））および真核生物（例えば、酵母、バキュロウイルスおよび哺乳類）に由来する細胞系を含む多種多様な細胞系が使用されうる（Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇら，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｓｐｅｋｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，１９９９）。
【０１０１】
組換え抗原結合性タンパク質の発現のための好ましい宿主は、適切な翻訳後修飾を伴って抗原結合性タンパク質を産生しうる哺乳類細胞である。翻訳後修飾には、ジスルフィド結合形成およびグリコシル化が含まれる。もう１つのタイプの翻訳後修飾はシグナルペプチドの切断である。
【０１０２】
適切なグリコシル化は抗体機能に重要でありうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６１：１−２０，２００２）。天然に存在する抗体は、重鎖に結合した少なくとも１つのＮ−結合炭水化物を含有する（前掲）。他のＮ−結合炭水化物およびＯ−結合炭水化物が存在することが可能であり、抗体機能に重要でありうる（前掲）。
【０１０３】
効率的な翻訳後修飾を得るために種々のタイプの哺乳類宿主細胞が使用されうる。そのような宿主細胞の具体例には、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）、ＨｅＬａ、Ｃ６、ＰＣ１２および骨髄腫細胞が含まれうる（Ｙｏｏら，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２６１：１−２０，２００２，Ｐｅｒｓｉｃら，Ｇｅｎｅ  ７８７：９−１８，１９９７）。
【０１０４】
ハイブリドーマは、例えばＡｕｓｕｂｅｌ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，１９８７−１９９８、Ｈａｒｌｏｗら，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８およびＫｏｈｌｅｒら，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６，４９５−４９７，１９７５に記載されているような技術を用いて製造されうる。
【０１０５】
Ｘ．投与
免疫原および結合性タンパク質は、当技術分野でよく知られた技術と共に本明細書に記載の指針を用いて、製剤化され、患者に投与されうる。医薬投与全般に関する指針は、例えばＶａｃｃｉｎｅｓ  ＰｌｏｔｋｉｎおよびＯｒｅｎｓｔｅｉｎ編，Ｗ．Ｂ．Ｓａｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９９；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２０ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｇｅｎｎａｒｏ編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，２０００；ならびにＭｏｄｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＢａｎｋｅｒおよびＲｈｏｄｅｓ編，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，１９９０（これらのそれぞれを参照により本明細書に組み入れることとする）に記載されている。
【０１０６】
医薬上許容される担体は免疫原の保存および患者への免疫原の投与を促進する。医薬上許容される担体は、バッファー、注射用無菌水、正常食塩水またはリン酸緩衝食塩水、スクロース、ヒスチジン、塩およびポリソルベートのような種々の成分を含有しうる。
【０１０７】
免疫原および結合性タンパク質は皮下、筋肉内または粘膜のような種々の経路により投与されうる。皮下および筋肉内投与は、例えば針または噴射式注射器を使用して行われうる。
【０１０８】
適当な投与計画は、好ましくは、患者の年齢、体重、性別および医学的状態；投与経路；所望の効果；ならびに使用する個々の化合物を含む、当技術分野でよく知られた要因を考慮して決定される。前記免疫原または結合性タンパク質は多数回投与（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ）ワクチン形態で使用されうる。用量は１．０μｇ〜１．０ｍｇの全ポリペプチドの範囲よりなると予想され、本発明の種々の実施形態においては、前記範囲は０．０１ｍｇ〜１．０ｍｇおよび０．１ｍｇ〜１．０ｍｇである。
【０１０９】
投与の時機は、当技術分野でよく知られた要因に左右される。初回投与後、１以上の追加用量を投与して抗体価を維持または増強することが可能である。投与計画の一例は、第１日、第１ヶ月、第３投与としての第４、６または１２ヶ月の投与、および必要に応じて行う、間隔をあけて投与する追加的な追加投与であろう。
【０１１０】
実施例
以下に記載の実施例は本発明の種々の特徴を更に詳しく例示するものである。前記実施例は本発明の実施のための有用な方法をも例示する。これらの実施例は、特許請求されている本発明を限定するものではない。
【実施例１】
【０１１１】
防御免疫
本実施例は、配列番号１関連ポリペプチドが動物モデルにおいて防御免疫をもたらしうることを例示する。防御免疫をもたらすために、配列番号１のＨｉｓタグ付き誘導体である配列番号２を使用した。
【０１１２】
配列番号２のクローニングおよび発現
ｐＥＴ１６ｂベクター（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）から、前記ベクターによりコードされるＮ末端ヒスチジン残基および終止コドンを伴って発現されるよう、ＣＯＬ  ＳＡ０４５２によりコードされるタンパク質を設計した。前記ベクターは、ヒスチジンタグの後の９個の追加的なアミノ酸およびカルボキシル末端の３個の追加的なアミノ酸をもコードする。第１セリンコドンから始まって終止コドンの前の末端イソロイシン残基で終わるＣＯＬ  ＳＡ０４５２を増幅するＰＣＲプライマーを設計した。フォワードおよびリバースプライマーはそれぞれ、５’ＧＧＧＡＡＴＴＣＣＡＴＡＴＧＴＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＡＡＧＡＡＡＴＣＴＴＡＣＣ３’（配列番号７）および５’ＧＧＧＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＴＡＣＣＴＡＣＴＡＡＡＴＣＴＡＡＡＣＣＡＧ３’（配列番号１１）であり、前記発現ベクター内へのクローニングを促進するための追加的な制限部位（下線部）、すなわち、ＮｄｅＩ（フォワードプライマー）およびＢｐｕ１１  ０２１Ｉ（リバースプライマー）ならびにＧＣクランプを含有していた。
【０１１３】
ゲノムＤＮＡをスタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ＣＯＬ株ＭＢ５３９３から精製し、ＰＣＲ用の鋳型として使用した。５０ｍＬの培養をディフコ・トリプティック・ソイ・ブロス（Ｄｉｆｃｏ  Ｔｒｙｐｔｉｃ  Ｓｏｙ  Ｂｒｏｔｈ）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓｐａｒｋｓ，ＭＤ）中、３７℃で一晩成長させ、前記細胞を遠心分離により集めた。前記細胞を５ｍＬの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．５）、２５％  スクロース中で１回洗浄し、５０μｇ／ｍＬ  リソスタフィン（ｌｙｓｏｓｔａｐｈｉｎ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含有する同じ溶液に再懸濁させた。前記混合物を３７℃で１時間インキュベートし、ついで２．５ｍＬの０．２５Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）を加えた。氷上で１５分間のインキュベーションの後、７．５ｍＬの２％  サルコシルを加え、前記混合物を穏やかに攪拌し、氷上で更に３０分間静置した。０．１Ｍ  酢酸ナトリウム中の１５０μＬのＲＮアーゼ５ｍｇ／ｍＬを加え、前記混合物を３７℃で１時間インキュベートした。つぎに０．６ｍＬのプロテイナーゼＫ（２５ｍｇ／ｍＬ）を加え、前記インキュベーションを２時間継続し、ついで４℃で一晩のインキュベーションを行った。前記ライセートを、穏やかに回転により１５ｍＬの水飽和フェノールで室温で３０分間抽出した。
【０１１４】
相を分離するために、前記混合物を室温で４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。水相を集め、前記フェノール抽出を更に２回反復した。つぎに前記水相を等容量のクロロホルムで１０回抽出した。最終抽出の後、水相を集め、容量を測定し、半分の容量の７．５Ｍ  酢酸アンモニウムを加えた。
【０１１５】
前記ＤＮＡを、２容量の１００％  エタノールを加えることにより沈殿させ、ガラス棒に巻きつけることにより集めた。前記ＤＮＡを、４μＬのジエチルピロカルボナートを含有する５．０ｍＬのＴＥに４℃で一晩溶解した。前記エタノール沈殿を更に２回反復した。
【０１１６】
ａｈｐＣ遺伝子を、二重に調製した５０μＬ容量の反応液中、ＰＣＲにより増幅した。それぞれは２５０ｎｇのゲノムＤＮＡ、１２５ｎｇの各フォワードおよびリバースプライマー、１マイクロリットルの１０ｍＭ  ｄＮＴＰ、２．５単位の天然Ｐｆｕポリメラーゼならびに１×Ｐｆｕバッファー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  ＣＡ）を含有していた。熱サイクル条件は以下のとおりであった：９４℃で５分間の１サイクル；９４℃で４５秒間、５６℃で４５秒間、７２℃で１分間の３０サイクル；７２℃で１０分間の１サイクル。増幅されたＤＮＡ配列（５８４ｂｐ）を適当な制限酵素で消化し、Ｇｅｎｅ  Ｃｌｅａｎ  ＩＩ（登録商標）（ＱＢＩＯｇｅｎｅ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を前記製造業者の説明に従い使用してゲル精製した。前記ＤＮＡを、ＰＣＲプライマー内に作製されたＮｄｅＩ／Ｂｐｕ１１０２Ｉ部位を使用してｐＥＴ１６ｂベクター内に連結し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＮｏｖａＢｌｕｅコンピテント細胞（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内に導入した。
【０１１７】
前記形質転換混合物を、ｉｍＭｅｄｉａ（商標）Ａｍｐ  Ａｇａｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を前記製造業者の説明に従い使用して調製された、それぞれ１００μｇ／ｍＬのアンピシリン、ＩＰＴＧおよびＸ−ｇａｌを含有する低塩レノックス（Ｌｅｎｎｏｘ）Ｌブロス寒天プレート上で３７℃で一晩成長させた。コロニーを選択し、５０μｇ／ｍＬ  アンピシリンを含有するルリア・ブロス（Ｌｕｒｉａ  Ｂｒｏｔｈ）（ＬＢ）内で成長させ、ＤＮＡミニプレップを作製し（Ｐｒｏｍｅｇａ）、インサートの適合性を制限エンドヌクレアーゼ消化により確認した。２つのミニプレップからのプラスミドＤＮＡを配列決定し、所望の配列からのＤＮＡ変化を含有しないクローンを選択し、ｐＡｈｐＣ５と命名した。
【０１１８】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬＲ（ＤＥ３）コンピテント細胞（ＥＭＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）をｐＡｈｐＣ５で形質転換し、アンピシリン（１００μｇ／ｍＬ）を含有するＬＢプレート上で増殖させた。ａｈｐＣの発現に関して試験するために、単離されたコロニーを５ｍＬの液体ＬＢ（アンピシリン）内に接種し、３７℃、２２０ｒｐｍで６時間インキュベートした。前記培養物を４℃に維持し、翌日、出発ＯＤ６００が０．０２となるよう２０．０ｍＬのＬＢブロス（アンピシリン）内に接種した。前記培養物を、ＯＤ６００＝０．８となるまで３７℃、２２０ｐｍで４時間インキュベートした。発現の誘導を３つの異なる温度で比較した。４５μＬの１００ｍＭ  ＩＰＴＧを３つの４．５ｍＬの培養容量（１ｍＭの最終ＩＰＴＧ濃度）に加え、すべて２２０ｒｐｍで振とうしながら３７℃で３時間および２５℃または１８℃で２４時間インキュベートした。ライセートの調製のために、未誘導および誘導培養からのそれぞれ１．５ｍＬおよび１．０ｍＬの培養容量を遠心分離により集め、３００μＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  ＨＴ（ＥＭＤ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）および３μＬのプロテイナーゼインヒビターカクテル（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）に再懸濁させた。前記混合物を氷上で５分間維持し、ついで３回（それぞれ１０秒間で、各間隔に冷却を行った）超音波処理した。「可溶性」および「不溶性」画分を得るために、前記混合物を１４，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離した。上清を「可溶性」と命名し、ペレットを３００μＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  ＨＴおよび３μＬのプロテイナーゼインヒビターカクテルに再懸濁させ、「不溶性」と命名した。ＢＩＯ−ＲＡＤ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｄｙｅ  Ｒｅａｇｅｎｔ系（ＢＩＯ−ＲＡＤ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を前記製造業者の説明に従い使用してタンパク質濃度を測定した。
【０１１９】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクーマシー染色によるａｈｐＣ（配列番号３によりコードされているもの）の発現の分析のために、サンプルを、還元および変性条件下、１×ＴｒｉｓグリシンＳＤＳバッファー（ＢＩＯ−ＲＡＤ）中、４〜１５％  勾配Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎゲル（ＢＩＯ−ＲＡＤ）上の電気泳動に付した。タンパク質のサイズを推定するために、１５〜２５０ｋＤａの基準体（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を、前記ライセートと並べて泳動させた。前記ゲルを、クーマシーＧ２５０染色であるＢｉｏ−Ｓａｆｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ（ＢＩＯ−ＲＡＤ）を前記製造業者のプロトコールに従い使用して染色した。
【０１２０】
３つ全ての温度で誘導されたサンプルから調製されたライセートにおいて、２４−ｋＤａのタンパク質が特異的に検出された。３つ全ての温度で良好な発現が得られ、ａｈｐＣは可溶性画分および不溶性画分の両方に局在していた。２５℃での誘導は、可溶性ａｈｐＣを産生させるための最適温度であった。
【０１２１】
配列番号２の精製
２０リットルの実効容量を有する攪拌タンク発酵槽（３０リットルの規模）への前記小規模法の直接的な大規模化を達成した。接種物を、５０ｍＬのルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地（＋アンピシリン）を含有する２５０ｍＬフラスコ内で培養し、それに１ｍＬの凍結種培養物を接種し、これを６時間培養した。１ｍＬのこの種（シード）を使用して、５００ｍＬのＬＢ培地（＋アンピシリン）を含有する２リットルのフラスコに接種し、１６時間インキュベートした。大規模発酵槽（３０リットルの規模）を２０リットルのＬＢ培地（＋アンピシリン）共に培養に付した。前記発酵槽の発酵パラメーターは以下のとおりであった：圧力＝５ｐｓｉｇ、攪拌速度＝３００ｒｐｍ、気流＝７．５リットル／分および温度＝３７℃。細胞を６００ｎｍの波長で１．３の光学密度単位の光学密度（ＯＤ）になるまでインキュベートし、１ｍＭの濃度のイソプロピル−β−Ｋ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）で誘導した。ＩＰＴＧでの誘導時間は２時間であった。細胞を、温度を１５℃へ低下させることにより回収し、５００ＫＭＷＣＯ中空繊維カートリッジに通過させることにより濃縮し、８，０００×ｇ、４℃で２０分間遠心分離した。上清をデカントし、前記組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）湿潤細胞ペレットを−７０℃で凍結させた。
【０１２２】
凍結組換え大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞ペースト（２４グラム）を解凍し、２容量の細胞溶解バッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ８．０、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  イミダゾール、２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０およびプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標），ＥＤＴＡ非含有，Ｒｏｃｈｅ＃１８７３５８０−５０ｍＬの細胞溶解バッファー当たり錠剤１個））に再懸濁させた。ベンゾナーゼ（ＥＭ＃１．０１６９７．０００２）を１２５単位／ｍＬで前記細胞懸濁液に加えた。ライセートはマイクロフルイダイザーで調製した。前記ライセートを４℃で３時間攪拌し、１０，０００×ｇ、４℃で１０分間の遠心分離により清澄化した。上清をガラス繊維プレフィルター  ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濾過し、ＮａＣｌを５Ｍ  ストック溶液から０．５Ｍの最終濃度になるまで加えた。前記濾過上清をＮｉ−ＮＴＡアガロースクロマトグラフィー樹脂（Ｑｉａｇｅｎ＃３０２５０）に加え、スラリーを４℃で一晩混合した。クロマトグラフィー樹脂のスラリーをクロマトグラフィーカラム内に注ぎ、未結合画分をカラム出口から重力により集めた。前記カラムを１０カラム容量の洗浄バッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ８．０、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  塩化マグネシウム、１０ｍＭ  イミダゾール、２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０およびプロテアーゼインヒビターカクテル（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標），ＥＤＴＡ非含有，Ｒｏｃｈｅ＃１８７３５８０−５０ｍＬの洗浄バッファー当たり錠剤１個））で洗浄した。前記カラムを溶出バッファー（５０ｍＭ  リン酸ナトリウム，ｐＨ７．４、０．３Ｍ  イミダゾール、２ｍＭ  塩化マグネシウム、０．１％  Ｔｗｅｅｎ−８０および２０ｍＭ  ２−メルカプトエタノール）で溶出した。タンパク質を含有する画分を、ポンソーＳ染色を伴うニトロセルロースメンブレン上のドットブロットにより特定し、最高タンパク質濃度を含有する画分をプールしてＮｉ−ＩＭＡＣ産物を得た。前記Ｎｉ−ＩＭＡＣ産物をＳＥＣにより分画した。前記産物タンパク質を含有するＳＥＣ画分を、クーマシー染色を伴うＳＤＳ／ＰＡＧＥにより特定した。産物含有ＳＥＣ画分をプールしてＳＥＣ産物を得た。ＳＥＣ産物を滅菌濾過し、０．２ｍｇ／ｍＬの最終濃度でアルミニウムヒドロキシホスファートアジュバント上に吸着させた。
【０１２３】
スタヒロコッカス・アウレウスチャレンジの準備
スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）をＴＳＡプレート上、３７℃で一晩増殖させた。５ｍｌのＰＢＳをプレート上に加え、無菌スプレッダーで前記細菌を穏やかに再懸濁させることにより、前記細菌をＴＳＡプレートから洗い落とした。Ｓｏｒｖａｌｌ  ＲＣ−５Ｂ遠心機（ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を使用して、前記細菌懸濁液を６０００ｒｐｍで２０分間遠心した。前記ペレットを１６％  グリセロールに再懸濁させ、アリコートを−７０℃で凍結保存した。
【０１２４】
使用前に接種物を解凍し、適当に希釈し、感染に使用した。ナイーブマウスにおいて遅い速度論の死亡を誘発する適当な用量を決定するために、各ストックを少なくとも３回力価測定した。前記モデルの再現性が保証されるよう、前記細菌接種物の効力（８０〜９０％の致死性）を一貫してモニターした。各チャレンジ実験の１０日前に、１０匹の対照動物（アジュバントのみで免疫されたもの）の群をチャレンジし、モニターした。
【０１２５】
配列番号２のポリペプチドに関する防御研究
２つの独立した実験において、２０匹のＢＡＬＢ／ｃマウスのそれぞれをアルミニウムヒドロキシホスファートアジュバント（４５０μｇ／注射）上の３用量の配列番号２のポリペプチド（２０μｇ／注射）で免疫し、２０匹のマウスのそれぞれにアルミニウムヒドロキシホスファートアジュバント（４５０μｇ／注射）を注射した。アルミニウムヒドロキシホスファートアジュバント（ＡＨＰ）はＫｌｅｉｎら，Ｊｏｕａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ８９，３１１−３２１，２０００に記載されている。前記物質を、第０日、７日および２１日に、２回の５０μｌの筋肉内注射として投与した。第２８日に前記マウスから採血し、それらの血清を配列番号２のポリペプチドに対する反応性に関してＥＬＩＳＡによりスクリーニングした。
【０１２６】
各実験の第３５日に、前記マウスを、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（用量  ７×１０８  ＣＦＵ／ｍｌ）の静脈内注射によりチャレンジした。前記マウスを生存に関して１１日間にわたってモニターした。第１実験の終了時に、ＡＨＰ対照群では５匹のマウスが生存したのに対して、配列番号２ポリペプチド免疫化群では１２匹のマウスが生存した。結果を図６Ａに示す。第２実験においては、ＡＨＰ対照群では７匹のマウスが生存したのに対して、配列番号２ポリペプチド免疫化群では１１匹のマウスが生存した。結果を図６Ｂに示す。
【０１２７】
他の実施形態も特許請求の範囲内である。いくつかの実施形態が示され記載されているが、本発明の精神および範囲から逸脱することなく種々の修飾が施されうる。
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は配列番号１および配列番号２のアミノ酸配列を示す。配列全体が配列番号２である。太字で示されている部分が配列番号１である。下線領域はアミノＨｉｓタグ領域およびカルボキシル末端の追加的アミノ酸である。
【図２】図２は、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来のＡｈｐＣ配列（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）１）とスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来のＡｈｐＣ配列（配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）６；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１６７５２）との間の比較を示す。アミノ酸の相違が太字で示されている。
【図３】図３は、配列番号２をコードする核酸配列（配列番号５）を示す。追加的なＨｉｓタグおよびカルボキシルアミノ酸コード領域が太字で示されている。
【図４】図４は、配列番号３をコードするＤＮＡ配列（配列番号４）を示す。
【図５Ａ】図５Ａおよび５Ｂは、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来の異なるＡｈｐＦ配列、すなわち、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９２４４１）、９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ００４８２３）および１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＸ５７１８３）ならびにスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来のＡｈｐＦ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１６７５２）の間の配列比較を示す。アミノ酸の相違が太字で示されている。
【図５Ｂ】図５Ａおよび５Ｂは、スタヒロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）由来の異なるＡｈｐＦ配列、すなわち、配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：）３（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ９２４４１）、９（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＰ００４８２３）および１０（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＸ５７１８３）ならびにスタヒロコッカス・エピデルミディス（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）由来のＡｈｐＦ配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１６７５２）の間の配列比較を示す。アミノ酸の相違が太字で示されている。
【図６Ａ】図６Ａおよび６Ｂは、アルミニウムヒドロキシホスファートアジュバント中の配列番号２のポリペプチド（黒丸）またはアジュバントのみ（三角）のいずれかを使用した実験からの結果を示す。
【図６Ｂ】図６Ａおよび６Ｂは、アルミニウムヒドロキシホスファートアジュバント中の配列番号２のポリペプチド（黒丸）またはアジュバントのみ（三角）のいずれかを使用した実験からの結果を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【配列表】
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