(57)【要約】2ドメインMHCポリペプチドは、抗原特異的T細胞の病原能および病原作用の調節を含め、抗原特異的T細胞の活性を調節するのに有用である。本発明の例示的なMHCクラスIIに基づく組換えT細胞リガンド(RTL)は、共有結合したβ1およびα1ドメインを含み、MHCクラスIに基づく分子は共有結合したα1およびα2ドメインを含む。これらのポリペプチドはまた、共有結合した抗原決定基、毒性部分、および/または検出可能な標識を含んでもよい。開示するポリペプチドは抗原特異的T細胞を標的化するために使用することができ、特に、抗原特異的T細胞を検出および精製する、T細胞を誘導または活性化する、T細胞サイトカインおよび接着分子発現の制御転換による調節を含めてT細胞活性を調節する、抗原特異的T細胞により媒介される状態を処置する、自己免疫疾患または神経変性疾患を処置または予防する、軸索を保護する、ならびに脱髄を防ぐまたは逆転させるのに有用である。2008537736.tif 000079
2008537736.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まない、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドの免疫調節有効量；および
抗原決定基
を含み、
該対象におけるT細胞の1つまたは複数の免疫応答または免疫調節活性を調節するのに有効である、
哺乳動物対象における抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答を調節するための組成物。
【請求項２】
対象が哺乳動物細胞、組織、器官、または個体である、請求項1記載の組成物。
【請求項３】
MHCクラスIIポリペプチドのβ1ドメインとα1ドメインとの間の共有結合がペプチドリンカー配列によって提供される、請求項1記載の組成物。
【請求項４】
抗原決定基がペプチド抗原である、請求項1記載の組成物。
【請求項５】
抗原決定基がMHCクラスIIポリペプチドの第一ドメインのアミノ末端に共有結合されている、請求項1記載の組成物。
【請求項６】
抗原決定基が非共有結合性相互作用によりMHCクラスIIポリペプチドと会合している、請求項1記載の組成物。
【請求項７】
MHCクラスIIポリペプチドが共有結合された検出マーカーまたは毒性部分をさらに含む、請求項1記載の組成物。
【請求項８】
MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DRタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項９】
MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DQタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１０】
MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DPタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項1記載の組成物。
【請求項１１】
MHCクラスII MHC成分が、対応する天然MHCクラスII分子のCD4相互作用ドメインを除外する、請求項1記載の組成物。
【請求項１２】
MHCクラスIIポリペプチドが、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTL中に同定される自己会合界面に相当する標的部位における1つまたは複数のアミノ酸置換、付加、欠失、または再編成によって改変され、それによって改変RTLが、a)またはb)に記載のMHC成分構造を有するが無傷の自己結合界面を有する天然MHCポリペプチドを組み入れた未改変対照RTLの示す凝集と比較して、溶液中における凝集の減少を示す、請求項1記載の組成物。
【請求項１３】
MHCクラスIIポリペプチドが、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTLのβシートプラットフォーム内の疎水性残基の存在によって特徴づけられる1つまたは複数の標的部位における1つまたは複数のアミノ酸置換または欠失によって改変される、請求項1記載の組成物。
【請求項１４】
1つまたは複数の標的部位が、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTLのβシートプラットフォーム中心コア内の自己結合モチーフを規定する、請求項13記載の組成物。
【請求項１５】
1つまたは複数の標的部位が、V102、I104、A106、F108、およびL110より選択されるβシートプラットフォームの中心コア部分の残基の1つまたは任意の組み合わせを含む、請求項13記載の組成物。
【請求項１６】
1つまたは組み合わせの残基が非疎水性アミノ酸との置換によって改変される、請求項15記載の組成物。
【請求項１７】
1つまたは組み合わせの残基が極性または荷電アミノ酸との置換によって改変される、請求項15記載の組成物。
【請求項１８】
1つまたは組み合わせの残基がセリンまたはアスパラギン酸残基との置換によって改変される、請求項15記載の組成物。
【請求項１９】
1つまたは組み合わせの残基がセリンまたはアスパラギン酸残基との置換によって改変される、請求項15記載の組成物。
【請求項２０】
βシートの中心コア部分の残基V102、I104、A106、F108、およびL110がそれぞれ非疎水性アミノ酸との置換によって改変される、請求項15記載の組成物。
【請求項２１】
1つまたは複数の標的部位が、L9、F19、L28、F32、V45、V51、A133、V138、およびL141より選択されるβシートプラットフォームの残基の1つまたは任意の組み合わせを含む、請求項13記載の組成物。
【請求項２２】
T細胞受容体(TCR)媒介性Ag特異的様式でT細胞活性を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項２３】
インビトロまたはインビボでT細胞増殖または炎症性サイトカイン産生を阻害するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項２４】
哺乳動物細胞または対象における自己免疫疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項２５】
T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞の増殖を減少させるまたは防ぐのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項２６】
Tサプレッサー表現型を誘導するのに有効な組成物であり、それによって該組成物に曝露されたT細胞がT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞より選択される別の細胞の免疫活性を抑制する、請求項1記載の組成物。
【請求項２７】
T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のサイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項２８】
サイトカインがIFN-γである、請求項27記載の組成物。
【請求項２９】
サイトカインがTNF-αである、請求項27記載の組成物。
【請求項３０】
サイトカインがIL-2である、請求項27記載の組成物。
【請求項３１】
サイトカインがIL-4である、請求項27記載の組成物。
【請求項３２】
サイトカインがIL-6である、請求項27記載の組成物。
【請求項３３】
サイトカインがIL-10である、請求項27記載の組成物。
【請求項３４】
サイトカインがIL-13である、請求項27記載の組成物。
【請求項３５】
サイトカインがMCP-1である、請求項27記載の組成物。
【請求項３６】
サイトカインがTGFβ1である、請求項27記載の組成物。
【請求項３７】
サイトカインがTGFβ3である、請求項27記載の組成物。
【請求項３８】
対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるサイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項27記載の組成物。
【請求項３９】
1つまたは複数のサイトカインの発現の調節が、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項27記載の組成物。
【請求項４０】
T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数の接着/ホーミングマーカーの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項４１】
接着/ホーミングマーカーがVLA-4である、請求項40記載の組成物。
【請求項４２】
接着/ホーミングマーカーがLFA-1である、請求項40記載の組成物。
【請求項４３】
対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による接着/ホーミングマーカーの発現を調節するのに有効である、請求項40記載の組成物。
【請求項４４】
1つまたは複数の接着/ホーミングマーカーの発現の調節が、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項40記載の組成物。
【請求項４５】
T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のケモカインの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項４６】
ケモカインがRANTESである、請求項45記載の組成物。
【請求項４７】
ケモカインがMIP-2である、請求項45記載の組成物。
【請求項４８】
ケモカインがIP-10である、請求項45記載の組成物。
【請求項４９】
対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるケモカインの発現を調節するのに有効である、請求項45記載の組成物。
【請求項５０】
1つまたは複数のケモカインの発現の調節が、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項45記載の組成物。
【請求項５１】
T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のケモカイン受容体の発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項５２】
ケモカイン受容体がCCR1である、請求項51記載の組成物。
【請求項５３】
ケモカイン受容体がCCR2である、請求項51記載の組成物。
【請求項５４】
ケモカイン受容体がCCR3である、請求項51記載の組成物。
【請求項５５】
ケモカイン受容体がCCR5である、請求項51記載の組成物。
【請求項５６】
ケモカイン受容体がCCR6である、請求項51記載の組成物。
【請求項５７】
ケモカイン受容体がCCR7である、請求項51記載の組成物。
【請求項５８】
ケモカイン受容体がCCR8である、請求項51記載の組成物。
【請求項５９】
対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるケモカイン受容体の発現を調節するのに有効である、請求項51記載の組成物。
【請求項６０】
1つまたは複数のケモカイン受容体の発現の調節が、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項51記載の組成物。
【請求項６１】
T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞より選択される細胞による複数のTh1サイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項６２】
T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞より選択される細胞による複数のTh2サイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項６３】
T細胞による1つまたは複数のT細胞制御性マーカーの発現を調節するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項６４】
T細胞制御性マーカーがFoxp3である、請求項63記載の組成物。
【請求項６５】
T細胞制御性マーカーがTGFβ1である、請求項63記載の組成物。
【請求項６６】
対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞によるT細胞制御性マーカーの発現を調節するのに有効である、請求項63記載の組成物。
【請求項６７】
1つまたは複数のT細胞制御性マーカーの発現の調節が、T細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項63記載の組成物。
【請求項６８】
対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による位置、遊走、走化性、および/または浸潤の変化を誘導するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項６９】
CNS区画中の炎症性単核細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項68記載の組成物。
【請求項７０】
対象の脊髄組織中の炎症性単核細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項69記載の組成物。
【請求項７１】
CNS区画中のCD4+ T細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項68記載の組成物。
【請求項７２】
対象の脊髄組織中のCD4+ T細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項71記載の組成物。
【請求項７３】
第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まない、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドと、抗原決定基とを含む、対象におけるT細胞の1つまたは複数の免疫応答または免疫調節活性を調節するのに十分である組成物の免疫調節有効量を、該対象に投与する段階
を含む、哺乳動物対象における抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答を調節するための方法。
【請求項７４】
対象が哺乳動物細胞、組織、器官、または個体である、請求項73記載の方法。
【請求項７５】
抗原決定基がペプチド抗原である、請求項73記載の方法。
【請求項７６】
抗原決定基がMHCクラスIIポリペプチドの第一ドメインのアミノ末端に共有結合されている、請求項73記載の方法。
【請求項７７】
抗原決定基が非共有結合性相互作用によりMHCクラスIIポリペプチドと会合している、請求項73記載の方法。
【請求項７８】
MHCクラスIIポリペプチドが共有結合された検出マーカーまたは毒性部分をさらに含む、請求項73記載の方法。
【請求項７９】
MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DRタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項73記載の方法。
【請求項８０】
MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DQタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項73記載の方法。
【請求項８１】
MHCクラスIIポリペプチドが、HLA-DPタンパク質のα1およびβ1ドメイン、またはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部を含む、請求項73記載の方法。
【請求項８２】
MHCクラスII MHC成分が、対応する天然MHCクラスII分子のCD4相互作用ドメインを除外する、請求項73記載の方法。
【請求項８３】
MHCクラスIIポリペプチドが、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTL中に同定される自己会合界面に相当する標的部位における1つまたは複数のアミノ酸置換、付加、欠失、または再編成によって改変され、それによって改変RTLが、a)またはb)に記載のMHC成分構造を有するが無傷の自己結合界面を有する天然MHCポリペプチドを組み入れた未改変対照RTLの示す凝集と比較して、溶液中における凝集の減少を示す、請求項73記載の方法。
【請求項８４】
MHCクラスIIポリペプチドが、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTLのβシートプラットフォーム内の疎水性残基の存在によって特徴づけられる1つまたは複数の標的部位における1つまたは複数のアミノ酸置換または欠失によって改変される、請求項73記載の方法。
【請求項８５】
1つまたは複数の標的部位が、天然MHCポリペプチドまたは天然MHCポリペプチドを含むRTLのβシートプラットフォーム中心コア内の自己結合モチーフを規定する、請求項84記載の方法。
【請求項８６】
1つまたは複数の標的部位が、V102、I104、A106、F108、およびL110より選択されるβシートプラットフォームの中心コア部分の残基の1つまたは任意の組み合わせを含む、請求項84記載の方法。
【請求項８７】
1つまたは組み合わせの残基が非疎水性アミノ酸との置換によって改変される、請求項86記載の方法。
【請求項８８】
1つまたは組み合わせの残基が極性または荷電アミノ酸との置換によって改変される、請求項86記載の方法。
【請求項８９】
1つまたは組み合わせの残基がセリンまたはアスパラギン酸残基との置換によって改変される、請求項86記載の方法。
【請求項９０】
1つまたは組み合わせの残基がセリンまたはアスパラギン酸残基との置換によって改変される、請求項86記載の方法。
【請求項９１】
βシートの中心コア部分の残基V102、I104、A106、F108、およびL110がそれぞれ非疎水性アミノ酸との置換によって改変される、請求項86記載の方法。
【請求項９２】
1つまたは複数の標的部位が、L9、F19、L28、F32、V45、V51、A133、V138、およびL141より選択されるβシートプラットフォームの残基の1つまたは任意の組み合わせを含む、請求項84記載の方法。
【請求項９３】
組成物が、T細胞受容体(TCR)媒介性Ag特異的様式で対象におけるT細胞活性を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項９４】
組成物が、対象におけるT細胞増殖または炎症性サイトカイン産生を阻害するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項９５】
組成物が、対象における自己免疫疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項９６】
組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞の増殖を減少させるまたは防ぐのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項９７】
組成物がTサプレッサー表現型を誘導するのに有効であり、それによって該組成物に曝露されたT細胞が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞より選択される別の細胞の免疫活性を抑制する、請求項73記載の方法。
【請求項９８】
組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のサイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項９９】
サイトカインがIFN-γである、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
サイトカインがTNF-αである、請求項98記載の方法。
【請求項１０１】
サイトカインがIL-2である、請求項98記載の方法。
【請求項１０２】
サイトカインがIL-4である、請求項98記載の方法。
【請求項１０３】
サイトカインがIL-6である、請求項98記載の方法。
【請求項１０４】
サイトカインがIL-10である、請求項98記載の方法。
【請求項１０５】
サイトカインがIL-13である、請求項98記載の方法。
【請求項１０６】
サイトカインがMCP-1である、請求項98記載の方法。
【請求項１０７】
サイトカインがTGFβ1である、請求項98記載の方法。
【請求項１０８】
サイトカインがTGFβ3である、請求項98記載の方法。
【請求項１０９】
組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるサイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項98記載の方法。
【請求項１１０】
1つまたは複数のサイトカインの発現の調節が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項98記載の方法。
【請求項１１１】
組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数の接着/ホーミングマーカーの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項１１２】
接着/ホーミングマーカーがVLA-4である、請求項111記載の方法。
【請求項１１３】
接着/ホーミングマーカーがLFA-1である、請求項111記載の方法。
【請求項１１４】
組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による接着/ホーミングマーカーの発現を調節するのに有効である、請求項111記載の方法。
【請求項１１５】
1つまたは複数の接着/ホーミングマーカーの発現の調節が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項111記載の方法。
【請求項１１６】
組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のケモカインの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項１１７】
ケモカインがRANTESである、請求項116記載の方法。
【請求項１１８】
ケモカインがMIP-2である、請求項116記載の方法。
【請求項１１９】
ケモカインがIP-10である、請求項116記載の方法。
【請求項１２０】
組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるケモカインの発現を調節するのに有効である、請求項116記載の方法。
【請求項１２１】
1つまたは複数のケモカインの発現の調節が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項116記載の方法。
【請求項１２２】
組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による1つまたは複数のケモカイン受容体の発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項１２３】
ケモカイン受容体がCCR1である、請求項122記載の方法。
【請求項１２４】
ケモカイン受容体がCCR2である、請求項122記載の方法。
【請求項１２５】
ケモカイン受容体がCCR3である、請求項122記載の方法。
【請求項１２６】
ケモカイン受容体がCCR5である、請求項122記載の方法。
【請求項１２７】
ケモカイン受容体がCCR6である、請求項122記載の方法。
【請求項１２８】
ケモカイン受容体がCCR7である、請求項122記載の方法。
【請求項１２９】
ケモカイン受容体がCCR8である、請求項122記載の方法。
【請求項１３０】
組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるケモカイン受容体の発現を調節するのに有効である、請求項122記載の方法。
【請求項１３１】
1つまたは複数のケモカイン受容体の発現の調節が、T細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項122記載の方法。
【請求項１３２】
組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞より選択される細胞による複数のTh1サイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項１３３】
組成物が、対象におけるT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、およびNK細胞より選択される細胞による複数のTh2サイトカインの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項１３４】
組成物が、対象におけるT細胞による1つまたは複数のT細胞制御性マーカーの発現を調節するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項１３５】
T細胞制御性マーカーがFoxp3である、請求項134記載の方法。
【請求項１３６】
T細胞制御性マーカーがTGFβ1である、請求項134記載の方法。
【請求項１３７】
組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞によるT細胞制御性マーカーの発現を調節するのに有効である、請求項134記載の方法。
【請求項１３８】
1つまたは複数のT細胞制御性マーカーの発現の調節が、T細胞によるmRNA転写、mRNA安定性、タンパク質合成、またはタンパク質分泌の調節によってもたらされる、請求項134記載の方法。
【請求項１３９】
組成物が、対象の末梢血、脾臓、リンパ節、または中枢神経系(CNS)区画中のT細胞、マクロファージ、B細胞、樹状細胞、またはNK細胞による位置、遊走、走化性、および/または浸潤の変化を誘導するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項１４０】
組成物が、CNS区画中の炎症性単核細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項139記載の方法。
【請求項１４１】
組成物が、対象の脊髄組織中の炎症性単核細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項140記載の方法。
【請求項１４２】
組成物が、CNS区画中のCD4+ T細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項139記載の方法。
【請求項１４３】
組成物が、対象の脊髄組織中のCD4+ T細胞数の減少を媒介するのに有効である、請求項142記載の方法。
【請求項１４４】
第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まず、ポリペプチドは第一ドメインのアミノ末端に共有結合された抗原決定基をさらに含む、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドの免疫調節有効量を、細胞もしくは組織と接触させるか、または該対象に投与する段階
を含む、哺乳動物細胞、組織、または対象における抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答を調節するための方法。
【請求項１４５】
請求項1記載の組成物の免疫修飾有効量を免疫調節細胞に投与する段階；および
その後抗原決定基を免疫調節細胞に提示し、抗原決定基の提示により免疫調節細胞が誘導されて、該免疫調節細胞により免疫修飾活性がもたらされる段階
を含む、抗原決定基に対する免疫調節細胞を誘導するための方法。
【請求項１４６】
その後免疫原性刺激とともに抗原が生じた場合に、免疫調節細胞により炎症および細胞動員が減少する、請求項145記載の方法。
【請求項１４７】
抗原決定基が組織特異的抗原決定基である、請求項145記載の方法。
【請求項１４８】
免疫調節細胞が対照と比較して誘導される、請求項145記載の方法。
【請求項１４９】
免疫調節細胞がインビボにある、請求項145記載の方法。
【請求項１５０】
免疫調節細胞がインビトロにある、請求項145記載の方法。
【請求項１５１】
T細胞を請求項1記載の組成物の有効量と接触させ、それによりT細胞によるサイトカインの発現が調節される段階を含む、哺乳動物T細胞におけるサイトカインの発現を調節するための方法。
【請求項１５２】
細胞がインビボにある、請求項152記載の方法。
【請求項１５３】
細胞がインビトロにある、請求項152記載の方法。
【請求項１５４】
請求項1記載の精製MHCクラスIIポリペプチドをコードする核酸分子を含む、哺乳動物対象における免疫応答を誘発するための免疫修飾組成物。
【請求項１５５】
核酸がプロモーターと機能的に連結されている、請求項154記載の免疫修飾組成物。
【請求項１５６】
請求項1記載の組成物または請求項154記載の核酸の治療有効量を投与する段階；および
その後抗原決定基を対象に提示する段階
を含み、
対象において抗原決定基が提示された場合に、ポリペプチドまたは核酸の投与により免疫応答が減少する、
対象における抗原決定基に対する免疫応答を減少させるための方法。
【請求項１５７】
免疫応答の減少が、T細胞、マクロファージ、B細胞、またはNK細胞の流入または増殖の減少である、請求項156記載の方法。
【請求項１５８】
免疫応答の減少がサイトカイン発現の減少である、請求項156記載の方法。
【請求項１５９】
免疫応答の減少がTサプレッサー細胞応答の誘導である、請求項156記載の方法。
【請求項１６０】
請求項1記載の組成物の治療有効量を免疫調節細胞に投与する段階；および
その後抗原決定基を免疫調節細胞に提示する段階
を含み、
抗原決定基の提示により免疫調節細胞が誘導される、
抗原決定基に対する免疫調節細胞を誘導するための方法。
【請求項１６１】
その後免疫原性刺激とともに抗原が生じた場合に、免疫調節細胞により炎症および細胞動員が減少する、請求項160記載の方法。
【請求項１６２】
抗原決定基が組織特異的抗原決定基である、請求項160記載の方法。
【請求項１６３】
免疫調節細胞が対照と比較して誘導される、請求項160記載の方法。
【請求項１６４】
免疫調節細胞がインビボにある、請求項160記載の方法。
【請求項１６５】
免疫調節細胞がインビトロにある、請求項160記載の方法。
【請求項１６６】
T細胞によるサイトカインの発現を調節するのに十分である請求項1記載の組成物の有効量をT細胞と接触させる段階を含む、哺乳動物T細胞におけるサイトカインの発現を調節するための方法。
【請求項１６７】
細胞がインビボにある、請求項166記載の方法。
【請求項１６８】
細胞がインビトロにある、請求項166記載の方法。
【請求項１６９】
請求項1記載の組成物または請求項154記載の核酸の治療有効量を対象に投与する段階を含み、
対象の免疫細胞に対する抗原決定基のその後の提示により免疫媒介性疾患が処置または予防される、
対象における免疫媒介性疾患を処置または予防する方法。
【請求項１７０】
免疫媒介性疾患が、移植片拒絶、移植片対宿主病、望ましくない遅延型過敏症反応、T細胞媒介性肺疾患、インスリン依存性糖尿病、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、セリアック病、多発性硬化症、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、関節リウマチ、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎、ぶどう膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、アレルギー、または特発性肺線維症である、請求項169記載の方法。
【請求項１７１】
薬学的に許容される担体を含む請求項1記載の組成物を含む薬学的組成物。
【請求項１７２】
請求項1記載の組成物を対象に投与し、それにより疾患を処置する段階を含む、哺乳動物対象における抗原特異的T細胞によって起こる疾患を処置する方法。
【請求項１７３】
請求項1記載の組成物の免疫修飾有効量を対象に投与する段階を含む、哺乳動物対象におけるT細胞の免疫活性を調節するための方法。
【請求項１７４】
第二治療剤を対象に投与する段階をさらに含む、請求項173記載の方法。
【請求項１７５】
第二治療剤が請求項1記載の組成物との組み合わせ製剤として対象に投与される、請求項174記載の方法。
【請求項１７６】
第二治療剤が、協調的投与プロトコルにおいて、請求項1記載の組成物の対象への投与と同時に、その前に、またはその後に対象に投与される、請求項174記載の方法。
【請求項１７７】
第二治療剤が、免疫グロブリン；コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド、およびコポリマー1またはコポリマー1関連ペプチドで処置したT細胞；阻止モノクローナル抗体、トランスフォーミング増殖因子-β、抗TNFα抗体；ステロイド剤；抗炎症剤；免疫抑制剤；アルキル化剤；代謝拮抗薬；抗生物質；コルチコステロイド；酢酸グラチラマー；組換えβインターフェロン；プロテオソーム(proteosome)阻害剤；ならびにジケトピペラジンより選択される、請求項174記載の方法。
【請求項１７８】
軸索消失を改善するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１７９】
軸索消失を防ぐのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１８０】
第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まず、ポリペプチドは第一ドメインのアミノ末端に共有結合された抗原決定基をさらに含む、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドの免疫調節有効量を、細胞もしくは組織と接触させるか、または該対象に投与する段階
を含む、哺乳動物細胞、組織、または対象における、抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答由来の軸索消失を改善するための方法。
【請求項１８１】
第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まない、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドを含む、第一免疫修飾薬の免疫調節有効量；
抗原決定基；ならびに
免疫グロブリン；コポリマー1；コポリマー1関連ペプチド；およびコポリマー1またはコポリマー1関連ペプチドで処置したT細胞；阻止モノクローナル抗体、トランスフォーミング増殖因子-β、抗TNFα抗体；ステロイド剤；抗炎症剤；免疫抑制剤；アルキル化剤；代謝拮抗薬；抗生物質；コルチコステロイド；プロテオソーム阻害剤；酢酸グラチラマー；組換えβインターフェロン；およびジケトピペラジンより選択される第二免疫修飾薬
を含み、
該対象におけるT細胞の1つまたは複数の免疫応答または免疫調節活性を調節するのに有効である、
哺乳動物対象における抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答を調節するための組成物。
【請求項１８２】
請求項1記載の組成物または請求項154記載の核酸の治療有効量を対象に投与する段階を含み、
対象の免疫細胞に対する抗原決定基のその後の提示により神経変性疾患が処置または予防される、
対象における神経変性疾患を処置または予防する方法。
【請求項１８３】
神経変性疾患が、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性多巣性白質脳症、播種性壊死性白質脳症、急性播種性脳脊髄炎、シルダー病、橋中央ミエリン溶解、放射線壊死、ビンスワンゲル病、副腎白質ジストロフィー、副腎脊髄神経障害、レーバー遺伝性視神経萎縮、およびHTLV関連脊髄症である、請求項182記載の方法。
【請求項１８４】
脱髄を改善するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１８５】
脱髄を防ぐのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１８６】
脱髄を処置するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１８７】
神経フィラメントを保護するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１８８】
再ミエリン化を刺激するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１８９】
第一ドメインがヒトMHCクラスIIβ1ドメインであり、第二ドメインが哺乳動物MHCクラスIIα1ドメインであり、第二ドメインのアミノ末端は第一ドメインのカルボキシ末端に共有結合されており、MHCクラスII分子はα2ドメインもβ2ドメインも含まず、ポリペプチドは第一ドメインのアミノ末端に共有結合された抗原決定基をさらに含む、共有結合された第一および第二ドメインを含む精製MHCクラスIIポリペプチドの免疫調節有効量を、細胞もしくは組織と接触させるか、または該対象に投与する段階
を含む、哺乳動物細胞、組織、または対象における、抗原決定基に対するT細胞媒介性免疫応答由来の脱髄を改善するための方法。
【請求項１９０】
検出マーカーが放射性核種、常磁性同位体、蛍光マーカー、酵素、補助因子、化学発光化合物、または生物発光化合物である、請求項7記載の組成物。
【請求項１９１】
毒性部分が、タンパク質毒素、化学療法剤、細胞傷害性T細胞表面分子に対する抗体、リパーゼ、または放射性同位体である、請求項7記載の組成物。
【請求項１９２】
哺乳動物細胞または対象における神経変性疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１９３】
哺乳動物細胞または対象における脱髄疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１９４】
哺乳動物対象の中枢神経系への活性化炎症細胞の浸潤を防ぐまたは阻害するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１９５】
哺乳動物細胞または対象における自己免疫疾患の再発を予防するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１９６】
哺乳動物細胞または対象における神経変性疾患の再発を予防するのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１９７】
哺乳動物細胞または対象における抗炎症因子の分泌を増加させるのに有効である、請求項1記載の組成物。
【請求項１９８】
組成物が、哺乳動物細胞または対象における神経変性疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項１９９】
組成物が、哺乳動物細胞または対象における脱髄疾患に関連したT細胞の病原活性または病原能を減少させるのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項２００】
組成物が、哺乳動物対象の中枢神経系への活性化炎症細胞の浸潤を防ぐまたは阻害するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項２０１】
組成物が、哺乳動物細胞または対象における自己免疫疾患の再発を予防するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項２０２】
組成物が、哺乳動物細胞または対象における神経変性疾患の再発を予防するのに有効である、請求項73記載の方法。
【請求項２０３】
組成物が、哺乳動物細胞または対象における抗炎症因子の分泌を増加させるのに有効である、請求項73記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、抗原結合およびT細胞受容体(TCR)認識を媒介する主要組織適合遺伝子複合体(MHC)分子ドメインを含む組換えポリペプチド、ならびにこれらの組換えポリペプチドを組み入れかつ使用する関連の組成物および方法に関する。
【０００２】
政府支援の研究に関する声明
本研究の局面は、米国立衛生研究所(第A143960号、第ESI0554号、第NS41965号、第5R42NS046877号、および第1R01NS047661号)、米国多発性硬化症協会(第RG3012A号および第RG3468号)、および米退役軍人局による助成金により支援された。米国政府は、本内容において一定の権利を有する。
【０００３】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年3月18日に出願された米国仮特許出願第60/663,048号、2005年8月31日に出願された米国仮特許出願第60/713,230号、および代理人整理番号第OHSU-1-0403号において2006年3月10日に出願された「抗原特異的T細胞の操作に有用な組換えMHC分子(Recombinant MHC Molecules Useful For Manipulation Of Antigen-Specific T Cells)」という表題の米国本出願に関連すると同時に、これらの全優先権を主張し、これら優先出願はそれぞれ全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
哺乳動物において特定の抗原に対する免疫反応は、主要組織適合(MHC)複合体によるT細胞へのその抗原の提示によって開始される。MHC複合体は抗原提示細胞(APC)の表面上にあり、MHCの3次元構造は提示される抗原がうまく納まる溝または裂け目を有する。T細胞上の適当な受容体が、必要な共刺激シグナルの存在下でAPC上のMHC/抗原複合体と相互作用すると、T細胞が刺激され、細胞傷害性T細胞の機能誘導、B細胞の機能誘導およびサイトカイン産生促進を含む、よく特徴付けられた免疫系活性化事象カスケードの様々な局面を誘発する。
【０００５】
哺乳動物には、MHC分子の2つの基本的クラス、MHCクラスIおよびMHCクラスIIがある。いずれのクラスも2つの別々のタンパク質の結合により形成された大きなタンパク質複合体である。各クラスには、複合体を細胞膜に固定する膜貫通ドメインが含まれる。MHCクラスI分子は2つの非共有結合したタンパク質、すなわちα鎖とβ2ミクログロブリンとから形成されている。α鎖は3つの別個のドメイン、α1、α2およびα3を含む。α1およびα2ドメインの3次元構造は、抗原がT細胞への提示のために入り込む溝を形成する。α3ドメインは、α鎖をAPCの細胞膜に固定する膜貫通配列を含むIg折り畳み構造様ドメインである。MHCクラスI複合体は抗原と結合すると(適当な共刺激シグナル存在下で)、特異的に認識するいかなる細胞も死滅させるはたらきをするCD8細胞傷害性T細胞を刺激する。
【０００６】
非共有結合してMHCクラスII分子を形成する2つのタンパク質は、αおよびβ鎖と命名されている。α鎖はα１およびα2ドメインを含み、β鎖はβ1およびβ2ドメインを含む。抗原が入り込む裂け目は、α1およびβ1ドメインの相互作用によって形成される。α2およびβ2ドメインは、αおよびβ鎖をAPCの細胞膜に固定する膜貫通Ig折り畳み構造様ドメインである。MHCクラスII複合体は抗原と結合すると(適当な共刺激シグナル存在下で)CD4 T細胞を刺激する。CD4 T細胞の主な機能は、炎症反応を開始し、免疫系の他の細胞を調節し、かつ抗体合成に関してB細胞を支援することである。
【０００７】
MHC複合体を構成する様々なタンパク質をコードする遺伝子が、ヒトや他の哺乳動物で広く研究されている。ヒトでは、MHC分子(クラスIβ2-ミクログロブリンを除く)は、第6染色体に位置し、100以上の遺伝子を構成するHLA領域によってコードされる。クラスI MHCα鎖タンパク質の遺伝子座が3つあり、HLA-A、-Bおよび-Cと命名されている。同様にクラスII MHCαおよびβ鎖の遺伝子座が3対あり、HLA-DR(AおよびB)、HLA-DP(AおよびB)、ならびにHLA-DQ(AおよびB)と命名されている。ラットでは、クラスIα遺伝子はRT1.Aと呼ばれている一方で、クラスII遺伝子はRT1.BαおよびRT1.Bβと呼ばれている。MHC複合体の構造、機能および遺伝学的特質についてのより詳細な背景情報は、JanewayおよびTraversによるImmunobiology: The Immune System in Health and Disease, Current Biology Ltd./Garland Publishing, Inc. (1997)(ISBN 0-8153-2818-4)(非特許文献1)、ならびにBodmer et al. (1994) "Nomenclature for factors of the HLA system" Tissue Antigens vol.44, pages 1-18(非特許文献2)に見いだすことができる。
【０００８】
MHC複合体が免疫認識誘発において重要な役割を果たすことから、免疫反応を調節するためにこれらの複合体を用いる方法が開発されるようになった。例えば、「自身の」抗原(自己抗原)を認識する活性化T細胞は、自己免疫疾患および神経変性疾患(慢性関節リウマチや多発性硬化症など)で重要な役割を果たすことが知られている。単離したMHCクラスII分子(適当な抗原をのせた(loaded))はMHCクラスII複合体を伴うAPCと置換することができ、抗原特異的T細胞に結合できるという知見に基づき、何人かの研究者が単離MHC/抗原複合体を自己免疫疾患の処置に用いることができると提唱している。したがって、米国特許第5,194,425号(Sharma et al.)(特許文献1)および同第5,284,935号(Clark et al.)(特許文献2)は、特定の自己抗原をのせ、自己抗原と特異的に免疫反応するT細胞を除去するために毒素と結合させた、単離MHCクラスII複合体の使用を開示している。別の状況において、共刺激因子の非存在下における単離MHC II/抗原複合体とT細胞との相互作用によって、アネルギーとして知られる不応状態が引き起こされることが明らかにされている。(Quill et al., J. Immunol., 138：3704-3712 (1987)(非特許文献3))。この知見に続き、Sharmaら(米国特許第5,468,481号(特許文献3)および同第5,130,297号(特許文献4))およびClerkら(米国特許第5,260,422号(特許文献5))は、このような単離MHC II/抗原複合体を、特定の自己抗原ペプチドに特異的に反応するアネルギー状態のT細胞系統に治療目的で投与することができると示唆している。
【０００９】
特定の抗原を認識するT細胞の検出、定量および精製における単離MHC複合体の使用法が、診断および治療への応用のために研究されてきた。一例として、特定の自己抗原に特異的なT細胞を早期検出することによって、適当な処置法を早期に選択することが容易になると考えられる。また、抗原特異的T細胞を精製することができれば、養子免疫療法において非常に有用であると思われる。養子免疫療法は、癌患者からT細胞を除去し、インビトロでT細胞を増殖させ、次いで患者に細胞を再度導入するものである(Rosenbergらに対する米国特許第4,690,915号(特許文献6)、Rosenberg et al., New Engl. J. Med. 319：1676-1680 (1988)(非特許文献4)参照)。炎症性を有する癌特異的T細胞を単離し、増殖させることができれば、このようなアプローチの特異性と有効性を高めることができると考えられる。
【００１０】
しかしながら、今日までのところ、単離MHC/抗原複合体を用いた抗原特異的T細胞の検出、定量または精製は、多くの理由がある中でもT細胞とこのような単離複合体との結合が一過性のものであり、したがってT細胞/MHC/抗原複合体が不安定であることから、大きな成功には至っていない。これらの問題を解決するために、Altmanら(Science 274, 94-96 (1996)(非特許文献5)および米国特許第5,635,363号(特許文献7))は、大きく、共有結合した多量体構造のMHC/抗原複合体を用い、標的T細胞上の複数のT細胞受容体に同時に結合させることによってこの相互作用を安定化させる方法を提唱した。しかしながら、これらの複合体は大きく、その生成および使用は難しい。
【００１１】
診断および治療上の応用例で単離MHC/抗原複合体を用いるという概念には大きな見込みがあるとはいうものの、現在の方法は最適ではない。例えば、複合体は界面活性剤抽出によってリンパ球から単離可能であるが、このような方法は非効率的で少量のタンパク質しか得られない。さらに、様々なMHC複合体サブユニットをコードする遺伝子のクローニングによって、原核細胞での発現を通して個々のサブユニットの大量生産が容易になったものの、個々のサブユニットの適当な高次構造を有するMHC複合体への組み立てが困難であることが立証されている。
【００１２】
したがって、使用可能なMHC/抗原複合体を単離するための方法および組成物のいまだ満たされていない必要性が当技術分野には存在する。
【００１３】
本発明は、MHC/抗原複合体を単離することを目的とする。
【００１４】
本発明の別の目的は、抗原結合およびT細胞受容体認識を媒介するMHC分子ドメインを含む組換えポリペプチドを提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、抗原特異的T細胞を検出、定量化、および精製するための組成物および方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる別の目的は、T細胞活性を調節するための方法および組成物を提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、T細胞媒介性疾患を処置するための組成物および方法を提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、自己免疫疾患を処置するための組成物および方法を提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる別の目的は、神経変性疾患を処置するための組成物および方法を提供することである。
【００２０】
【特許文献１】米国特許第5,194,425号
【特許文献２】米国特許第5,284,935号
【特許文献３】米国特許第5,468,481号
【特許文献４】米国特許第5,130,297号
【特許文献５】米国特許第5,260,422号
【特許文献６】米国特許第4,690,915号
【特許文献７】米国特許第5,635,363号
【非特許文献１】Janeway and Travers, Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, Current Biology Ltd./Garland Publishing, Inc. (1997)(ISBN 0-8153-2818-4)
【非特許文献２】Bodmer et al. (1994) "Nomenclature for factors of the HLA system", Tissue Antigens, vol.44, pages 1-18
【非特許文献３】Quill et al., J. Immunol., 138:3704-3712 (1987)
【非特許文献４】Rosenberg et al., New Engl. J. Med., 319:1676-1680 (1988)
【非特許文献５】Altman et al., Science 274, 94-96 (1996)
【発明の開示】
【００２１】
例示態様の概要
本発明は、MHC分子の抗原を結合する裂け目を決定するドメインだけを含む組換えポリペプチドを用いることにより、ヒトのMHC機能を含むがそれに限定されない哺乳動物のMHC機能を模倣することができるという知見に基づいている。これらの分子は、抗原特異的T細胞の検出、定量および精製に有用である。本明細書において提供される分子はまた、臨床および検査上の応用例において、抗原特異的T細胞を検出、定量および精製するため、T細胞でアネルギーを誘導するため、またはTサプレッサー細胞を誘導するため、同様に、T細胞を刺激するため、および自己免疫疾患および神経変性疾患を含むがそれに限定されない抗原特異的T細胞が仲介する疾患を処置するためにも用いることができる。
【００２２】
本明細書においては、抗原特異的T細胞の結合が、ヒトのクラスII MHC分子の場合にはα1およびβ1ドメインだけを共有結合で(且ついくつかの例では抗原決定基に関連して)含む単量体分子を用いて達成しうることを示す。便宜上、このようなMHCクラスIIポリペプチドを本明細書ではこの後「β1α1」と呼ぶ。ヒトのMHCクラスI分子由来の等価の分子も本明細書において提供される。このような分子はクラスI分子のα1およびα2ドメインを共有結合で、且つ抗原決定基に関連して含む。このようなMHCクラスIポリペプチドを「α1α2」と呼ぶ。これらの2ドメイン分子は原核細胞または真核細胞中の組換え発現によって容易に産生し、容易に大量精製することができる。さらに、これらの分子はいかなる所望のペプチド抗原でも容易にのせることができ、一連の異なるT細胞特異性を有するMHC分子の産生を単純にする。
【００２３】
さらに、無傷のMHC分子の一部であるIg折り畳みドメインと膜貫通部分とを欠いているにもかかわらず、これらの2ドメインMHC分子は「全」MHC分子と構造的に類似した様式で再度折り畳まれ、ペプチド抗原を結合して安定なMHC/抗原複合体を形成することが示されている。さらに、これらの2ドメインMHC/エピトープ複合体はエピトープ特異的様式でT細胞と結合し、インビトロでエピトープ特異的T細胞増殖を阻害する。加えて、これらに限定されないが例えばミエリン塩基性タンパク質(MBP)のエピトープを含む抗原性エピトープをのせたヒトβ1α1分子を投与すると、種々のT細胞伝達過程が誘導され、サイトカインおよび増殖応答を含むエフェクター機能が調節を受ける。したがって、2ドメインMHC分子はT細胞活性化に対して強力かつエピトープ特異的な効果を示し、抗炎症性サイトカインの分泌を引き起こす。結果として、開示するMHC分子は、広範囲にわたるインビボおよびインビトロ用途に有用である。
【００２４】
ヒト2ドメイン分子の様々な製剤を本発明により提供する。最も基本的な形態では、ヒト2ドメインMHCクラスII分子は哺乳動物MHCクラスII分子のβ1およびα1ドメインを含み、α1ドメインのアミノ末端はβ1ドメインのカルボキシ末端に共有結合しており、ポリペプチドはα2ドメインもβ2ドメインも含まない。ヒト2ドメインMHCクラスI分子は哺乳動物クラスI分子のα1およびα2ドメインを含み、α2ドメインのアミノ末端はα1ドメインのカルボキシ末端に共有結合しており、ポリペプチドはMHCクラスIα3ドメインを含まない。大部分の用途において、これらの分子は、共有結合または非共有結合相互作用によりペプチド抗原などの抗原決定基と会合している。特定の態様において、ペプチド抗原は、クラスII分子のβ1ドメインまたはクラスI分子のα1ドメインのアミノ末端に共有結合している。2ドメイン分子はまた、蛍光標識などの検出マーカーもしくはリシンAなどの毒性部分、またはミエリン塩基性タンパク質(MBP)、プロテオリピドタンパク質(PLP)、ミエリン乏突起膠細胞糖タンパク質、インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、II型コラーゲン、サイログロブリン、サイロドキシン(thyrodoxin)、S抗原、ach(アセチルコリン)受容体、HepB抗原、百日咳毒素、ミオシンB、ロスリバーウイルス、組換えマウスTPO(rmTPO)、リポ多糖(LPS)、もしくは抗糸球体基底膜(抗GMB)などの抗原も含み得る。
【００２５】
ヒト2ドメインMHC分子をコードする核酸分子、およびこれらの分子を発現させるために簡便に用いることのできる発現ベクターもまた提供する。特定の態様において、核酸分子は、ヒト2ドメインMHC分子と同様に抗原性ペプチドをコードする配列を含む。例えば、このような核酸分子の1つは式Pr-P-B-Aで表すことができ、式中PrはP(ペプチド抗原をコードする配列)に機能的に連結されたプロモーター配列であり、BはクラスIα1またはクラスIIβ1ドメインであり、AはクラスIα2ドメインまたはクラスIIα1ドメインである。これらの核酸分子において、P、B、およびAは単一のオープンリーディングフレームを含み、その結果ペプチドおよび2つのヒトMHCドメインは1本のポリペプチド鎖として発現される。1つの態様において、BとAはリンカーによって連結される。
【００２６】
また2ドメイン分子をインビボで用いて、特定の抗原特異的T細胞を標的とすることができる。一例として、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)の一部をのせて多発性硬化症患者に投与するβ1α1分子を用いて、MBP特異的T細胞のアネルギーを誘導するかまたはサプレッサーT細胞を誘導し、ひいては病徴を軽減することができる。または、そのような分子を毒性部分と結合させて、疾患を引き起こすT細胞をより直接的に死滅させることもできる。
【００２７】
インビトロで、ヒトの2ドメインMHC分子は、T細胞を検出および定量し、T細胞機能を調節するために用いることができる。したがって、選択された抗原をのせたこのような分子は、その抗原に特異的なT細胞集団を検出、モニターおよび定量するために用いることができる。このようなことができる能力は、癌患者から採取した血液中の腫瘍抗原特異的T細胞の数、または自己免疫疾患および/または神経変性疾患をわずらう患者から採取した血液中の自己抗原特異的T細胞の数をモニターするなど、いくつかの臨床の場で有益である。これらの状況において、開示される分子は特定の治療法の進行をモニターする強力なツールである。抗原特異的T細胞をモニターし、定量する他に、開示される分子を、このような細胞を養子免疫療法用に精製するためにも用いることができる。一つの特定の非限定的な例では、開示される腫瘍抗原をのせたヒトMHC分子を癌患者からの腫瘍抗原特異的T細胞を精製するために用いることもできる。これらの細胞を次いでインビトロで増殖させ、その後癌処置の一環として患者に戻すこともできる。毒性部分と結合させて、2ドメイン分子を特定の抗原特異性を有するT細胞を死滅させるために用いることもできる。または、これらの分子は、このようなT細胞でアネルギーを誘導する、またはサプレッサーT細胞を誘導するためにも用いることができる。
【００２８】
本発明の方法および組成物はさらに、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植片対宿主病、望ましくない遅延型過敏症反応、またはT細胞媒介性肺疾患を含むがこれらに限定されないT細胞媒介性疾患に罹患したヒトおよび他の哺乳動物対象を含むがこれらに限定されない哺乳動物対象の処置において用いることができる。このような自己免疫疾患には、これらに限定されないが、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、セリアック病、多発性硬化症、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、関節リウマチ、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎、ぶどう膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、または特発性肺線維症が含まれる。本発明の方法および組成物はさらに、これらに限定されないが、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性多巣性白質脳症(PML)、播種性壊死性白質脳症(DNL)、急性播種性脳脊髄炎、シルダー病、橋中央ミエリン溶解(CPM)、放射線壊死、ビンスワンゲル病(SAE)、副腎白質ジストロフィー、副腎脊髄神経障害、レーバー遺伝性視神経萎縮、およびHTLV関連脊髄症を含むヒト神経変性疾患などの脱髄または軸索の損傷もしくは消失を起こした哺乳動物対象の処置において用いることができる。これらおよびその他の対象は、T細胞媒介性疾患を処置する、改善する、予防する、またはその進行を抑止するのに効果的なヒト2ドメイン分子の有効量を対象に投与することによって効果的に処置される。
【００２９】
本発明の組成物および方法はまた、自己免疫疾患および神経変性疾患ならびにヒトを含む哺乳動物対象において脱髄または軸索の損傷もしくは消失を引き起こすその他の状態を含むT細胞媒介性疾患またはT細胞媒介性疾患の再発の予防において用いることもできる。本発明の組成物および方法はさらに、ヒトを含む哺乳動物対象の中枢神経系に活性化炎症細胞が浸潤するのを防ぐまたは減少させるために用いることもできる。本発明の組成物および方法はさらに、例えば多発性硬化症におけるミエリン塩基性タンパク質のような、自己免疫疾患または神経変性疾患に関与する組織に特有の抗原に特異的な抗原特異的制御性細胞を誘導するためのワクチンとして用いることもできる。本発明の組成物および方法はまた、ミエリンを修復するため、およびミエリン損傷を防ぐまたは停止させるためにも使用することができる。
【００３０】
本発明の種々の製剤および組成物は、T細胞媒介性疾患の処置のために精製MHCポリペプチドと組み合わせて製剤化されるかまたは協調して投与される、1つまたは複数のさらなる活性薬剤と共に投与することができる。このようなさらなる治療剤には、これらに限定されないが、免疫グロブリン(例えば、BMS-188667などのCTLA4Ig；例えば、参照により本明細書に組み入れられるSrinivas et al., J. Pharm. Sci. 85(1)：1-4, (1996)を参照されたい)；コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド、およびコポリマー1またはコポリマー1関連ペプチドで処置したT細胞(例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,844,314号を参照されたい)；阻止モノクローナル抗体；トランスフォーミング増殖因子-β；抗TNFα抗体；酢酸グラチラマー；組換えβインターフェロン；ステロイド剤；抗炎症剤；免疫抑制剤；アルキル化剤；代謝拮抗薬；抗生物質；コルチコステロイド；プロテオソーム(proteosome)阻害剤；ならびにジケトピペラジンが含まれる。
【００３１】
本発明の前述のおよびその他の目的、特徴、局面、および利点は、以下の項によりさらに明らかになると思われる。
【００３２】
例示的な態様の詳細な説明
本発明の様々な態様の検討を容易にするため、以下の用語の定義および略語の説明を提供する。
【００３３】
β1α1ポリペプチド：
共有結合しているMHCクラスII分子のα1およびβ1ドメインを含む組換えポリペプチド。適切な高次構造を確実にするため、ポリペプチドは、β1ドメインのカルボキシ末端がα1ドメインのアミノ末端に共有結合するような配向をとる。1つの態様において、ポリペプチドはヒトβ1α1ポリペプチドであり、ヒトMHCクラスII分子のα1およびβ1ドメインを含む。ヒトβ1α1ポリペプチドの1つの特定の非限定的な例は、β1ドメインのカルボキシ末端がHLA-DR分子のα1ドメインのアミノ末端に共有結合している分子である。ヒトβ1α1ポリペプチドのさらなる特定の非限定的な例は、β1ドメインのカルボキシ末端がHLA-DR(AまたはBのいずれか)、HLA-DP(AおよびB)、およびHLA-DQ(AおよびB)分子のα1ドメインのアミノ末端に共有結合している分子である。1つの態様において、β1α1ポリペプチドはβ2ドメインを含まない。別の態様において、β1α1ポリペプチドはα2を含まない。さらなる別の態様において、β1α1ポリペプチドはα2ドメインもβ2ドメインも含まない。
【００３４】
β1α1遺伝子：
β1α1ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーター領域を含む組換え核酸配列。1つの態様において、β1α1ポリペプチドはヒトβ1α1ポリペプチドである。
【００３５】
α1α2ポリペプチド：
共有結合しているMHCクラスI分子のα1およびα2ドメインを含むポリペプチド。ポリペプチドは、α1ドメインのカルボキシ末端がα2ドメインのアミノ末端に共有結合するような配向をとる。α1α2ポリペプチドはクラスIα鎖全体に満たないクラスIα鎖を含み、通常はα鎖のα3ドメインの大部分またはすべてを除外する。α1α2ポリペプチドの特定の非限定的な例は、α1ドメインのカルボキシ末端がHLA-A、-B、または-C分子のα2ドメインのアミノ末端に共有結合しているポリペプチドである。1つの態様において、α3ドメインはα1α2ポリペプチドから除外され、したがってα1α2ポリペプチドはα3ドメインを含まない。
【００３６】
α1α2遺伝子：
α1α2ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に連結されたプロモーター領域を含む組換え核酸配列。
【００３７】
抗原(Ag)：
動物に注射または吸収される組成物を含む、動物において抗体の産生またはT細胞応答を促進し得る化合物、組成物、または物質。抗原は、異種免疫原によって誘導される産物を含む、特異的液性免疫または細胞性免疫の産物と反応する。「抗原」という用語は、関連する抗原性エピトープおよび抗原決定基をすべて含む。
【００３８】
抗原提示細胞：
抗原性ペプチドを処理し、クラスII MHC分子と共同してこれを提示し、T細胞活性化に必要な共刺激シグナルを送達し得る任意の細胞。典型的な抗原提示細胞には、マクロファージ、樹状細胞、B細胞、胸腺上皮細胞、および血管内皮細胞が含まれる。
【００３９】
自己免疫疾患：
免疫系が内在性抗原に対して免疫応答(例えば、B細胞またはT細胞応答)を生じ、結果として組織に対する損傷を生じる疾患。このような疾患には、これらに限定されないが、移植片拒絶、移植片対宿主病、望ましくない遅延型過敏症反応、T細胞媒介性肺疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、セリアック病、多発性硬化症、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、関節リウマチ、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、肺線維症、または特発性肺線維症が含まれる。
【００４０】
CD8+ T細胞媒介性免疫：
CD8+ T細胞に対する抗原の提示により実行される免疫応答。
【００４１】
cDNA(相補的DNA)：
内部の非コード部分(イントロン)および転写を決定する制御配列を欠いたDNA断片。cDNAは実験室において、細胞から抽出したメッセンジャーRNAから逆転写によって合成される。
【００４２】
サイトカイン：
細胞によって作製される、リンパ球などの他の細胞の挙動に影響を及ぼすタンパク質。1つの態様において、サイトカインは、細胞輸送に影響する分子であるケモカインである。
【００４３】
ドメイン：
ポリペプチドまたはタンパク質のドメインとは、特定の機能に一致し得るアミノ酸配列の独立した部分である。例えば、MHCクラスII分子を構成するαおよびβポリペプチドは、それぞれ2つのドメインα1、α2およびβ1、β2を有することがそれぞれ認められている。同様に、MHCクラスI分子のα鎖は、3つのドメインα1、α2、およびα3を有することが認められている。これら各分子の種々のドメインは典型的に、アミノ酸配列の連結により結合されている。本発明の1つの態様においては、リンカーまたは隣接ドメインのすべてまたは一部を含むように配列を伸長して、全ドメイン配列を組換え分子内に含める。例えば、HLA-DR Aのα1ドメインを選択する場合、選択する配列は一般にα鎖のアミノ酸残基1位から全α1ドメインにわたって伸長し、アミノ酸残基約76〜90(α1ドメインとα2ドメインの間に位置するα1ドメインのカルボキシ末端)に位置するリンカー配列のすべてまたは一部を含むことになる。種々のMHC分子ドメインの正確なアミノ酸番号は哺乳動物の種に応じて、および種内の遺伝子のクラス間で異なる。組換え分子に使用するための配列を選択する上で重要な局面は、アミノ酸番号に基づく正確な構造定義よりもむしろドメイン機能の維持である。当業者であれば、ドメイン機能は、選択したドメインの全アミノ酸配列よりも幾分少ないものを用いても維持され得ることを理解すると思われる。例えば、ドメイン機能に影響を及ぼすことなく、α1ドメインのアミノ末端またはカルボキシ末端でいくつかのアミノ酸を削除することができる。しかしながら典型的には、ドメイン配列のいずれかの末端で削除されるアミノ酸の数は10以下で、より典型的には5アミノ酸以下である。選択した特定ドメインの機能活性は、以下で詳述する通り抗原特異的T細胞増殖アッセイ法を用いて、本発明によって提供される2ドメインMHCポリペプチド(すなわち、クラスIIβ1α1またはクラスIα1α2ポリペプチド)の状況で評価することができる。例えば、特定のβ1ドメインを試験するには、β1α1分子が生成されるようにこのドメインを機能的なα1ドメインに連結し、次いで記載のアッセイ法で試験する。生物活性のあるβ1α1またはα1α2ポリペプチドは抗原特異的T細胞の増殖を少なくとも約50%阻害し、したがって成分ドメインが機能的であることが示される。典型的に、このようなポリペプチドは、このアッセイ系においてT細胞の増殖を少なくとも75%、場合によっては約90%を上回って阻害する。
【００４４】
脱髄：
神経終末を絶縁する白質中の物質であるミエリンの消失。ミエリンは、神経が最高速度で脳からメッセージを受け取りこれを解釈するのを助ける。神経終末はこの物質を失った場合、適切に機能することができず、所々に瘢痕または硬化が生じる。
【００４５】
エピトープ：
抗原決定基。これらは、抗原性のある、すなわち特定の免疫応答を誘発する分子上の特定の化学基またはペプチド配列である。抗体は特定の抗原性エピトープと結合する。
【００４６】
機能的等価物：
本明細書に記載する結果と同様の結果をもたらす、抗原エピトープまたはβ1α1もしくはα1α2ペプチドにおける配列変化。このような配列変化には、これらに限定されないが、保存的置換、欠失、変異、フレームシフト、および挿入が含まれ得る。
【００４７】
IL-10：
160アミノ酸の長さを有するサブユニットのホモ二量体タンパク質であるサイトカイン。ヒトIL-10は、マウスIL-10と73パーセントのアミノ酸相同性を有する。ヒトIL-10遺伝子は4つのエキソンを含み、第1染色体にマッピングされる(総説に関しては、de Waal-Malefyt R et al., Curr. Opin. Immunology 4：314-20, 1992；Howard and O'Garra, Immunology Today 13：198-200, 1992；Howard et al., J. Clin. Immunol. 12：239-47, 1992を参照されたい)。
【００４８】
IL-10は、レクチンによる刺激後にマウスT細胞(Th2細胞であってTh1細胞ではない)によって産生される。ヒトでは、IL-10は活性化CD 8+末梢血T細胞により、抗原特異的およびポリクローナル活性化の後にTh0、Th1、およびTh2様CD4+ T細胞クローンにより、B細胞リンパ腫により、ならびにLPS活性化単球および肥満細胞により産生される。後天性免疫不全症およびバーキットリンパ腫患者由来のB細胞系統は、大量のIL10を構成的に分泌する。
【００４９】
IL-10は様々な生物学的機能を有する。例えば、IL-10は、T細胞のTh1亜集団におけるIFN-γ、IL-2、およびTNF-αなどのいくつかのサイトカインの合成を阻害するが、Th2細胞ではこのように阻害することはない。この活性はIL-4によって拮抗される。IFN-γ産生に及ぼす阻害効果は間接的であり、補助細胞によるIL-12合成の抑制の結果であると考えられる。ヒト系では、IL-10はTh1およびTh2細胞によって産生され、これらの機能を下方制御する。IL-10はまた、とりわけサイトカインmRNAの分解を促進することによりIL-1、IL-6、およびTNF-αの合成を阻害することが知られている。IL-10の発現はまた、抗原提示の阻害をもたらし得る。ヒト単球では、IFN-γおよびIL-10は相互の産生および機能を遮断する。さらに、IL-10は、IL-12の生理的アンタゴニストであることも示されている。IL-10はまた、補助細胞の存在下でT細胞のマイトジェンまたは抗CD3誘導性増殖を阻害し、IFN-γおよびIL-2の産生を減少させる。IL-10は、Th2上清がTh1細胞によるサイトカイン合成を阻害する能力の大部分またはすべての原因であると考えられる。
【００５０】
IL-10は、高感度ELISAアッセイ法で検出することができる。さらに、マウス肥満細胞系統D36を用いてヒトIL-10をバイオアッセイすることもできる。IL-10を検出するためにフローサイトメトリー法も用いられている(Abrams et al. Immunol. Reviews 127：5-24, 1992；Fiorentino et al., J. Immunol. 147：3815-22, 1991；Kreft et al, J. Immunol. Methods 156：125-8, 1992；Mosmann et al., J. Immunol. 145：2938-45, 1990を参照されたい)。以下の実施例の項もまた参照されたい。
【００５１】
免疫応答：
刺激に対するB細胞またはT細胞などの免疫系細胞の応答。1つの態様において、応答は特定の抗原に特異的である(「抗原特異的応答」)。別の態様において、免疫応答はTh1、Th2、またはTh3応答などのT細胞応答である。さらなる別の態様において、免疫応答はサプレッサーT細胞の応答である。さらなる態様において、免疫応答は樹状細胞の応答である。
【００５２】
単離された：
「単離された」核酸は、その核酸が天然に存在する生物の細胞中の他の核酸配列、すなわち他の染色体ならびに染色体外DNAおよびRNAから実質的に分離または精製されている。「単離された」という用語はしたがって、標準的な核酸精製法によって精製された核酸を包含する。この用語はまた、宿主細胞内で組換え発現によって調製された核酸および化学合成された核酸も包含する。
【００５３】
リンカー配列：
リンカー配列とは、2つのポリペプチドドメインを共有結合するアミノ酸配列である。リンカー配列を本発明の組換えMHCポリペプチド中に含めて、連結したポリペプチドドメインに回転自由を提供し、それにより適切なドメインの折り畳みならびにドメイン間およびドメイン内結合を促進することができる。一例として、Ag-β1-α1(Ag＝抗原)を含む組換えポリペプチドにおいて、リンカー配列は、Agドメインとβ1ドメインとの間およびβ1ドメインとα1ドメインとの間に提供され得る。リンカー配列は一般に2〜25アミノ酸長であって当技術分野において周知であり、これにはChaudhary et al. (1989)によって記載されているグリシン(4)-セリンスペーサーが含まれるが、これに限定されるわけではない。他のリンカー配列は、以下の実施例の項に記載されている。
【００５４】
本発明の組換えMHCクラスIα1α2ポリペプチドは、α1ドメインのカルボキシ末端をα2ドメインのアミノ末端に連結する共有結合を含む。天然のMHCクラスIα鎖のα1およびα2ドメインは典型的に、アミノ酸リンカー配列によりこの配向で共有結合されている。この天然のリンカー配列が組換え構築物において維持されてもよく、または組換えリンカー配列をα1ドメインとα2ドメインの間に(天然のリンカー配列の代わりに、またはそれに加えて)導入してもよい。
【００５５】
哺乳動物：
この用語には、ヒトおよび非ヒト哺乳動物の両方が含まれる。同様に、「患者」または「対象」という用語には、ヒトおよび獣医学的対象の両方が含まれる。
【００５６】
神経変性疾患：
神経系の必須の細胞および/または組織成分の変質を引き起こす疾患。このような疾患には、これらに限定されないが、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性多巣性白質脳症(PML)、播種性壊死性白質脳症(DNL)、急性播種性脳脊髄炎、シルダー病、橋中央ミエリン溶解(CPM)、放射線壊死、ビンスワンゲル病(SAE)、副腎白質ジストロフィー、副腎脊髄神経障害、レーバー遺伝性視神経萎縮、およびHTLV関連脊髄症が含まれる。
【００５７】
機能的に連結された：
第一核酸配列が第二核酸配列と機能的関係に置かれている場合に、第一核酸配列は第二核酸配列と機能的に連結されている。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターはコード配列に機能的に連結されている。一般に、機能的に連結されたDNA配列は隣接しており、2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合には、オープンリーディングフレームを整列させる。
【００５８】
ORF(オープンリーディングフレーム)：
終止コドンをもたない、アミノ酸をコードする一連のヌクレオチドトリプレット(コドン)。これらの配列は通常、ポリペプチドに翻訳可能である。
【００５９】
薬学的薬剤または薬物：
対象に適切に投与した場合に、所望の処置または予防効果を誘導できる化合物または組成物。
【００６０】
薬学的に許容される担体：
本明細書に記載のポリペプチドおよび核酸と共に有用な薬学的に許容される担体は、従来の担体である。Remington's Pharmaceutical Sciences, E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)には、本明細書に記載の融合タンパク質の薬学的送達に適した組成物および製剤が記載されている。
【００６１】
一般に、担体の性質は、使用する特定の投与様式に依存する。例えば、非経口用製剤は通常、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどの薬学的および生理的に許容される液体を媒体として含む注射液を含む。固体組成物(例えば、散在、丸剤、錠剤、またはカプセル剤形態)の場合、従来の非毒性固体担体には、例えば、製薬等級のマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムが含まれ得る。投与しようとする薬学的組成物は、生物学的に中性の担体に加えて、湿潤剤もしくは乳化剤、保存剤、およびpH緩衝剤など(例えば、酢酸ナトリウムまたはソルビタンモノラウレート)の微量の非毒性補助物質を含み得る。
【００６２】
疾患を予防する(防ぐ)または処置する：
疾患を「予防する(防ぐ)」とは、例えば自己免疫疾患または神経変性疾患などの疾患になりやすい傾向にあることがわかっている人において、疾患の完全な発症を抑制することを指す。公知の素因を有する人の例は、家族に糖尿病歴のある者、または疾患の遺伝子マーカーを有する者、または対象を狼蒼もしくは関節リウマチなどの状態になりやすくする因子に曝露されたことのある者である。また「疾患を予防する(防ぐ)こと」により、公知の素因を有してまたは有さずに症状を表しているかまたは現時点で寛解期にある人において、疾患の進行を停止させるかまたは疾患の再発を阻止することができる。「処置」とは、疾患または病的状態の徴候または症状が発症し始めた後に、これを改善する治療的介入を指す。処置の有効性は、疾患の徴候もしくは症状の減少、または疾患の進行の抑止もしくは好転、症状の再発の予防、または長期寛解より評価することができる。
【００６３】
プローブおよびプライマー：
核酸プローブおよびプライマーは、本発明によって提供される核酸に基づき容易に調製することができる。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子に結合された単離された核酸を含む。典型的な標識には、放射性同位体、リガンド、化学発光物質、および酵素が含まれる。標識法および様々な目的のために適当な標識を選択する際の手引きが、例えばSambrook et al. (1989)およびAusubel et al. (1987)に述べられている。
【００６４】
プライマーは短い核酸で、好ましくはヌクレオチド15個以上の長さのDNAオリゴヌクレオチドである。プライマーは、核酸ハイブリダイゼーションによって相補的な標的DNA鎖にアニールしてプライマーと標的DNA鎖とのハイブリッドを形成し、次いでDNAポリメラーゼ酵素により標的DNA鎖に沿って伸長することができる。プライマー対は、例えばポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または他の当技術分野において公知の核酸増幅法による核酸配列の増幅のために用いることができる。
【００６５】
プローブおよびプライマーの調製法および使用法は、例えばSambrook et al. (1989)、Ausubel et al. (1987)、およびInnis et al. (1990)に記載されている。PCRプライマー対は、例えばPrimer(バージョン0.5、(著作権) 1991、Whitehead Institute for Biomedical Research、マサチューセッツ州ケンブリッジ)などのこの目的のためのコンピュータープロラムを利用することによって、既知の配列から誘導することができる。
【００６６】
精製された：
精製されたという用語は絶対的な純度を要求するものではない。むしろ、相対的な用語として意図されている。したがって、例えば、精製された組換えMHCタンパク質調製物は、含まれる組換えMHCタンパク質が細胞内の元の環境にあるタンパク質に比べて純度が高いものである。組換えMHCタンパク質の調製物は一般には、組換えMHCタンパク質が調製物の全タンパク質含量の少なくとも50%を示すように精製される。しかし、特定の適用にはより高度に精製された調製物が要求されることもある。例えば、そのような適用例に対しては、MHCタンパク質が全タンパク質含量の少なくとも75%、または少なくとも90%を構成する調製物を用いることができる。
【００６７】
組換え：
組換え核酸またはポリペプチドは、天然には生じない配列を有するもの、または2つ以上の本来は分離している配列セグメントの人工的連結によって作られた配列を有するものである。この人工的連結は化学的合成によって達成されることが多く、またはより一般的には核酸の単離セグメントの人工的操作、例えば遺伝子工学的方法によって達成される。
【００６８】
配列同一性：
アミノ酸配列間の類似性は、配列間の類似性によって表され、配列同一性とも呼ばれる。配列同一性は、同一性(または類似性もしくは相同性)のパーセンテージによって評価されることが多い。パーセンテージが高いほど2つの配列の類似性が高い。MHCドメインポリペプチドの変異体は、標準的方法を用いてアラインメントした場合、比較的高度の配列同一性を有することになる。(「MHCドメインポリペプチド」とは、MHCクラスIIポリペプチドのβ1もしくはα1ドメインまたはMHCクラスIポリペプチドのα1もしくはα2ドメインを意味する)。
【００６９】
比較のための配列アライメントの方法は、当技術分野ではよく知られている。Altschul et al. (1994)は、配列アライメント法および相同性計算の詳細な考察を提示している。NCBI Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)(Altschul et al., 1990)は配列分析プログラムblastp、blastn、blastx、tblastnおよびtblastxと関連して用いるために、National Center for Biotechnology Information (NCBI、メリーランド州ベゼスタ)を含むいくつかの供給源から、およびインターネット上で入手可能である。NCBIのウェブサイトでアクセス可能である。このプログラムを用いてどのように配列同一性を決定するかの説明は、NCBIのウェブサイトにおいて初期設定パラメーターとして利用可能である。
【００７０】
MHCドメインポリペプチドの変異体は一般に、初期設定パラメーターに設定されたNCBI Blast 2.0、gapped blastpを用い、本来のMHCドメインポリペプチドのアミノ酸配列との全長アライメントにより計算して少なくとも50%の配列同一性を有していることを特徴とする。参照配列に対するさらに高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価すると、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%または少なくとも95%のアミノ酸配列同一性などの、漸増する同一性パーセンテージを示すことになる。完全な配列よりも短いものを配列同一性について比較する場合、変異体は一般に10〜20のアミノ酸のショートウィンドウにより少なくとも75%の配列同一性を有することになり、参照配列に対するその類似性に応じて少なくとも85%または少なくとも90%もしくは95%の配列同一性を有することもある。このようなショートウィンドウによって配列同一性を決定する方法は、NCBIのウェブサイトに説明されている。MHCドメインポリペプチドの変異体は、本来のポリペプチドの生物活性も保持している。本発明の目的のために、この活性は、下記に詳細に記述されるとおり、変異ドメインを適当なβ1α1またはα1α2ポリペプチドに組み込み、インビトロで得られたポリペプチドの抗原特異的T細胞の増殖を阻害する能力、またはTサプレッサー細胞もしくはIL-10の発現を誘導する能力を調べることによって、都合よく評価される。
【００７１】
治療有効量：
疾患の進行を防ぐかもしくは疾患の退行をもたらすのに十分な、またはこれらに限定されないが、疼痛、腫脹、しびれ、痙性、めまい、眩暈、視覚障害、運動調節障害、平衡もしくは協調障害、腸管機能不全、および失調を含む、疾患によって生じる症状を軽減できる用量。
【００７２】
寛容：
抗原に対する特定の免疫応答を生成する能力の減少または欠如。寛容は多くの場合、本明細書に記載する2ドメインMHC分子の存在下において抗原と接触させた結果として生じる。1つの態様においては、B細胞応答が減少するかまたは起こらない。別の態様においては、T細胞応答が減少するかまたは起こらない。または、T細胞応答およびB細胞応答の両方が減少するかまたは起こらない。
【００７３】
形質導入されたおよび形質転換された：
ウイルスまたはベクターは、これが核酸を細胞内に伝達した場合に細胞を「形質導入する」。細胞ゲノム中への核酸の取り込みによるかまたはエピソーム複製により、DNAが細胞によって安定に複製される場合に、細胞は細胞内に形質導入された核酸によって「形質転換される」。本明細書で使用する形質転換という用語は、ウイルスベクターによるトランスフェクション、プラスミドベクターによる形質転換、ならびにエレクトロポレーション、リポフェクション、および微粒子銃加速による裸のDNAの導入を含め、核酸分子をそのような細胞内に導入することのできるすべての技法を包含する。
【００７４】
ベクター：
宿主細胞内に導入され、それによって形質転換宿主細胞を生成する核酸分子。ベクターは、複製起点など、宿主細胞内での複製を可能にする核酸配列を含み得る。ベクターはまた、当技術分野において公知である1つまたは複数の選択マーカー遺伝子およびその他の遺伝子エレメントを含み得る。「ベクター」という用語には、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ワクシニア、およびレトロウイルスベクターなどのウイルスベクターも含まれる。
【００７５】
この他の分子遺伝学において一般的に用いられる用語の定義は、Oxford University Press発行のBenjamin. Lewin, Genes V, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)；Blackwell Science Ltd.発行のKendrew et al (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, 1994 (ISBN 0-632-02182-9)；およびVCH Publishers, Inc.発行のRobert A. Meyers (eds.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, 1995 (ISBN 1-56081-569-8)に見いだすことができる。
【００７６】
以下の項に、本発明の組換えMHC分子の設計、発現および使用についての詳細な手引きが提供される。特に記載がない限り、本発明においては分子生物学、生化学および免疫学の標準的方法が用いられる。このような標準的方法は、Sambrook et al. (1989)、Ausubel et al. (1987)、Innis et al. (1990)およびHarlow and Lane (1988)に記載されている。本発明に関連する他の背景および技術的情報を提供するために、MHC分子の通常の処方物およびその使用に関する下記の米国特許が参照により本明細書に組み入れられる：第5,130,297号、第5,194,425号、第5,260,422号、第5,284,935号、第5,468,481号、第5,595,881号、第5,635,363号、第5,734,023号。
【００７７】
組換えMHCクラスIIβ1α1分子の設計
哺乳動物MHCクラスIIαおよびβ鎖タンパク質のアミノ酸配列、ならびにこれらのタンパク質をコードする核酸は、当技術分野において周知で、GenBankを含む多数の供給源から入手することができる。例示的配列は、全てその全体が参照により本明細書に組み入れられるAuffray et al. (1984)(ヒトHLA DQα)、Larhammar et al. (1983)(ヒトHLA DQβ)、Das et al. (1983)(ヒトHLA DRα)、Tonnelle et al. (1985)(ヒトHLA DRβ)、Lawrance et al. (1985)(ヒトHLA DPα)、Kelly et al. (1985)(ヒトHLA DPβ)、Syha et al. (1989)(ラットRT1.Bα)、Syha-Jedelhauser et al. (1991)(ラットRT1.Bβ)、Benoist et al. (1983)(マウスI-Aα)、Estess et al. (1986)(マウスI-Aβ)に提示されている。本発明の1つの態様においては、MHCクラスIIタンパク質はヒトのMHCクラスIIタンパク質である。
【００７８】
本発明の組換えMHCクラスII分子は、MHCクラスIIα鎖のα1ドメインに共有結合したMHCクラスIIβ鎖のβ1ドメインを含む。このα1およびβ1ドメインは哺乳動物MHCクラスIIタンパク質において明確に規定されている。一般に、α1ドメインは成熟鎖のおよそ1位〜90位の残基を含むと考えられている。MHCクラスIIタンパク質のα1とα2ドメインの間の本来のペプチドリンカー領域は、検討中の具体的なα鎖に応じて、α鎖のおよそ76位からおよそ93位のアミノ酸までである。したがって、α1ドメインはα鎖のおよそ1位〜90位のアミノ酸残基を含みうるが、当業者であれば、このドメインのC末端カットオフは必ずしも正確に規定されておらず、例えば、α鎖の70位〜100位のアミノ酸残基の間のどの点でも起こりうることを理解すると思われる。これらのパラメーター以外にも、哺乳動物の種や問題となる特定のα鎖によって、α1ドメインの組成も変わることがある。当業者であれば、アミノ酸配列の正確な数のパラメーターは、ドメイン機能の維持に比べて重要性がずっと低いことを理解すると思われる。
【００７９】
同様に、β1ドメインは一般に成熟β鎖のおよそ1位〜90位の残基を含むと考えられている。MHCクラスIIタンパク質のβ1とβ2ドメインの間のリンカー領域は、検討中の具体的なα鎖に応じて、β鎖のおよそ85位からおよそ100位のアミノ酸までである。したがって、β1タンパク質はおよそ1位〜100位のアミノ酸残基を含みうるが、当業者であればやはり、このドメインのC末端カットオフは必ずしも正確に規定されておらず、例えば、β鎖の75位〜105位のアミノ酸残基の間のどの点でも起こりうることを理解すると思われる。これらのパラメーター以外にも、哺乳動物の種や問題となる特定のβ鎖によって、β1ドメインの組成も変わることがある。ここでも当業者であれば、アミノ酸配列の正確な数のパラメーターは、ドメイン機能の維持に比べて重要性がずっと低いことを理解すると思われる。
【００８０】
ヒト、ラット、およびマウスの例示的なβ1α1分子を図1に示す。1つの態様において、β1α1分子はβ2ドメインを含まない。別の態様において、β1α1分子はα2ドメインを含まない。さらなる態様において、β1α1分子はα2ドメインもβ2ドメインを含まない。
【００８１】
これらのドメインをコードする核酸分子は、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による増幅などの標準的手段によって産生することができる。これらのドメインをコードするオープンリーディングフレームを増幅するためにプライマーを設計するための標準的なアプローチを用いることもできる。これらのドメイン増幅に適したライブラリには、例えば、問題となる哺乳動物種から調製したcDNAライブラリが含まれる。このようなライブラリは市販されているか、または標準的な方法によって調整することができる。したがって、例えば、β1およびα1ポリペプチドをコードする構築物を次の4つのプライマーを用いたPCRによって産生することができる。すなわち、β1コード領域の5'および3'末端に対応するプライマーB1およびB2と、α1コード領域の5'および3'末端に対応するプライマーA1およびA2である。β1およびα1ドメインコード領域のPCR増幅に続き、これら増幅された核酸分子をそれぞれ標準的なクローニングベクターにクローニングしてもよく、または分子同士をライゲートし、次いで適当なベクターにクローニングしてもよい。2つのコード領域の簡便なクローニングを促進するために、制限エンドヌクレアーゼ認識部位をPCRプライマー中に設計することもできる。例えば、プライマーB2およびA1はそれぞれ、増幅および選択された制限酵素による消化の後に、増幅された断片同士が容易にライゲートできるような適当な部位を含むこともできる。加えて、プライマーB1およびA2はそれぞれ、選択されたベクターのポリリンカー部位へのクローニングを容易にするために制限酵素切断部位を含むことができる。2つのドメインコード領域のライゲーションは、コード領域が機能的に連結される、すなわちオープンリーディングフレームを維持するように実施する。増幅されたコード領域を別々にクローニングする場合、引き続き断片をクローニングベクターから遊離し、ライゲーションの準備としてゲル精製することができる。
【００８２】
特定の態様において、ペプチドリンカーはβ1とα1ドメインとの間に提供される。一般に、このリンカーはアミノ酸2個から25個の長さで、各ドメインがその本来の配座に自由に折り畳まれるように、ドメイン間の柔軟性を与えるはたらきをする。このリンカー配列は、リンカー配列をコードするためのPCRプライマーを設計することによって簡便に提供される。したがって、前述の例において、リンカー配列はB2もしくはA1プライマーの一つ、またはこれらプライマーそれぞれの組み合わせによってコードされうる。
【００８３】
組換えMHCクラスIαα1α2分子の設計
哺乳動物MHCクラスIα鎖タンパク質のアミノ酸配列、ならびにこれらのタンパク質をコードする核酸は、当技術分野において周知で、GenBankを含む多数の供給源から入手することができる。例示的配列は、その全体が参照により本明細書に組み入れられるBrowning et al. (1995)(ヒトHLA-A)、Kato et al. (1993)(ヒトHLA-B)、Steinle et al. (1992)(ヒトHLA-C)、Walter et al. (1995)(ラットIa)、Walter et al. (1994)(ラットIb)、Kress et al. (1983)(マウスH-2-K)、Schepart et al. (1986)(マウスH-2-D)、およびMoore et al. (1982)(マウスH-2-I)に提示されている。1つの態様において、MHCクラスIタンパク質はヒトのMHCクラスIタンパク質である。
【００８４】
本発明の組換えMHCクラスI分子は、MHCクラスI鎖のα2ドメインに共有結合したMHCクラスIα鎖のα1ドメインを含む。これら2つのドメインは哺乳動物MHCクラスIタンパク質において明確に規定されている。一般に、α1ドメインは成熟鎖のおよそ1位〜90位の残基を含み、α2鎖はおよそ90位〜180位のアミノ酸残基を含むと考えられているが、やはり開始点および終点は正確には規定されておらず、異なるMHCクラスI分子の間で変わることになる。MHCクラスIαタンパク質のα2とα3ドメインの間の結合は一般に、成熟鎖の179位〜183位のアミノ酸領域で起こる。これらのパラメーター以外にも、哺乳動物の種や問題となる特定のα鎖によって、α1およびα2ドメインの組成も変わることがある。当業者であれば、アミノ酸配列の正確な数のパラメーターは、ドメイン機能の維持に比べて重要性がはるかに低いことを理解すると思われる。例示的なα1α2分子を図2に示す。1つの態様において、α1α2分子はα3ドメインを含まない。
【００８５】
α1α2構築物は、1位のアミノ酸と179位〜183位のアミノ酸との間の2ドメイン(α1とα2)領域をコードするリーディングフレームを増幅することによって最も簡便に構築することができるが、当業者であれば、これらの終点にはいくらかの変動が可能であることを理解すると思われる。このような分子には、α1とα2ドメインの間の本来のリンカー領域が含まれるが、必要に応じて、このリンカー領域を除去し、合成リンカーペプチドに置換することもできる。クラスIIβ1およびα1ドメインに関連して前述したとおり、MHCクラスIα1およびα2ドメインを増殖し、クローニングするために一般的考察が適用される。
【００８６】
β1α1およびα1α2分子に対する抗原性ポリペプチドの遺伝的結合
本発明のクラスIIβ1α1およびクラスIα1α2ポリペプチドは一般に抗原性ペプチドと共に用いられる。クラスIまたはクラスII MHC分子と共有結合し、T細胞によって認識されるいかなる抗原性ペプチドも、この目的のために用いることができる。ミツバチ毒アレルゲン、チリダニアレルゲン、細菌によって産生される毒素(破傷風毒素など)および自己免疫疾患に関与するヒト組織抗原に由来する抗原性ペプチドを含む、いくつかの原料由来の抗原性ペプチドが詳細に特徴付けられている。このようなペプチドについての詳細な考察が、それぞれKendrichら、Sharmaら、およびClarkらの米国特許第5,595,881号、第5,468,481号、および第5,284,935号に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み入れられる。例示的なペプチドには、これらに限定されないが、慢性関節リウマチ(II型コラーゲン)、重症筋無力症(アセチルコリン受容体)、糖尿病(インスリン、グルタミン酸デカルボキシラーゼ)、橋本甲状腺炎(サイログロブリン)、グレーブス病(サイロドキシン)、ぶどう膜炎(S抗原)、炎症性腸疾患(Ach(アセチルコリン)受容体)、セリアック病(シクロオキシゲナーゼ-2阻害剤、食餌性ニワトリ卵白リゾチーム)、神経炎(百日咳毒素)、多発性筋炎(ミオシンB、ロスリバーウイルス)、糸球体腎炎(抗GBM血清)、自己免疫性甲状腺疾患(組換えマウスTPO細胞外ドメイン)、アジソン病(クレブシエラ菌を伴う同質遺伝子的副腎抽出物)、自己免疫性ぶどう膜網膜炎(網膜抽出物)、自己免疫性膵炎(ポリイノシン：ポリシチジル酸)、原発性胆汁性肝硬変(サルモネラ・ミネソタ(Salmonella minnesota)Re595由来リポ多糖)、および多発性硬化症(ミエリン塩基性タンパク質)の病因において同定されたものが含まれる。
【００８７】
当技術分野ではよく知られているとおり(例えば、Sharmaらに対する米国特許第5,468,481号参照)、APC表面のMHC複合体における抗原の提示は一般に、完全な抗原性ペプチドを必要としない。むしろ、β1とα1ドメイン(MHC IIの場合)またはα1とα2ドメイン(MHC Iの場合)の間の溝にあるペプチドは一般に、完全な抗原性ペプチドの小さい断片である。Janeway & Travers (1997)に論じられているとおり、MHCクラスI分子のペプチド溝に位置するペプチドは、結合ポケットのサイズによって制約を受けており、一般的にはアミノ酸8個〜15個の長さ、より一般的にはアミノ酸8個〜10個の長さである(しかし、考えられる例外については、Collis et al., 1994を参照のこと)。これとは対照的に、MHCクラスII分子のペプチド溝に位置するペプチドは、このような制約を受けないためにずっと大きいことが多く、一般的には少なくともアミノ酸13個の長さがある。MHC分子にのせるためのペプチド断片は、ペプチド合成機の使用などの標準的な手段によって調製することができる。
【００８８】
本発明のβ1α1およびα1α2分子には、MHC分子へのペプチドの共有結合による方法を含む、いくつかの方法でペプチド抗原を「のせる(loaded)」ことができる。これは、発現されたペプチドにおいて抗原性ペプチドドメインがβ1α1分子の場合にはβ1、またα1α2分子の場合にはα1のN末端に連結するように、選択されたペプチドをコードする核酸配列をMHCタンパク質をコードする構築物の5'末端に機能的に連結することによって簡便に達成することができる。この結果を得るための一つの方法は、MHCコード領域を増幅するために用いるPCRプライマーに抗原をコードする配列を組み込むことである。一般に、リンカーペプチド配列をコードする配列は、抗原性ペプチドとMHCポリペプチドとをコードする分子の間に含まれることになる。前述のとおり、このようなリンカーペプチドの目的は、柔軟性を与え、ペプチドの適切な配座上の折り畳みを可能にすることである。抗原をMHCポリペプチドに連結するために、リンカーは抗原がMHCポリペプチドのペプチド溝に入り込めるだけの十分な長さがなくてはならない。ここでもまた、このリンカーはPCRプライマーに簡便に組み込むことができる。しかし、下記の実施例1に記載のとおり、抗原性ペプチドがMHCコード領域のちょうど5'末端にライゲートされる必要はない。例えば、抗原コード領域をMHCコード配列の5'末端の最初の数コドン(通常は最初の10コドン以内)に挿入してもよい。
【００８９】
MHC分子への抗原性ペプチド連結のためのこの遺伝システムは、異なる抗原性ペプチドをのせたいくつかのMHC分子を産生しようとする際に特に有用である。前述のシステムによれば、MHCコード領域の5'末端(すなわち、β1α1をコードする構築物の場合にはβ1の5'末端で、α1α2をコードする構築物の場合にはα1の5'末端)に独特の制限酵素切断部位を持つ発現ベクターを構築することができる。このような構築物に関連して、各抗原コード領域が選択された制限酵素部位に隣接する、抗原性ペプチドをコードする配列のライブラリを作製する。次いで、特定の抗原のMHC分子への結合は、(a) 抗原コード領域を選択された制限酵素によって遊離する、(b) MHC構築物を同じ制限酵素によって切断する、(c) 抗原コード領域をMHC構築物にライゲートすることによって、簡便に実施される。このやり方で、短時間に多数のMHC-ポリペプチド構築物を作製し、発現させることができる。
【００９０】
β1α1分子において抗原性ペプチドの単純な交換を可能にする発現カセットの例示的設計を図1に示す。図1Aは、抗原性ペプチドを持たない、ラットMHCクラスII RT1.B由来の基本型β1α1分子をコードする核酸配列を示す。β1ドメインの5位と6位(セリンとプロリン)の残基の間にあるペプチドおよびリンカー挿入部位の位置をτ記号で示している。抗原コード領域を組み込むために、図1A構築物挿入部位の3'から追加の塩基を連結した図1Bに示す配列を含むPCRプライマーを、図1Aに示す構築物の3'末端から読むPCRプライマーと共に用いる。増幅により、β1α1構築物に組み込まれた図1Bに示す配列を含む(すなわち、β1α1配列の5位と6位アミノ酸残基をコードするコドンの間に位置する抗原性ペプチドおよびリンカー配列を持つ)生成物が得られる。図に示す例では、抗原性ペプチドはMBP-72-89抗原である。
【００９１】
特に、MBP-72-89をコードする配列は独特のNcoIおよびSpeI制限酵素切断部位に隣接している。これらの酵素は、MBP-72-89コード領域を遊離し、他の抗原のコード領域、例えば図1Cおよび1Dに示すものと置き換えるために用いることができる。
【００９２】
発現された、抗原を共有結合により連結したβ1α1ポリペプチドの構造を図2Bに示す。図2Aは、完全なRT1B分子(β1、β2、α1、およびα2ドメインを含む)の二次構造を示す。
【００９３】
前述の説明のとおりに設計した発現カセットを含む核酸発現ベクターは、研究目的のために特に有用と考えられる。このようなベクターは一般に、抗原性ポリペプチドをコードする配列が共有結合されうるような、MHCコード領域の5'末端に提供される独特の制限酵素切断部位を有する2ドメインMHCポリペプチド(β1α1またはα1α2)をコードする配列を含む。このようなベクターは一般に、配列の高度の発現を提供するために、MHCコード領域の5'末端に機能的に連結されたプロモーターをも含む。
【００９４】
β1α1およびα1α2分子は、ペプチドを結合せずに発現および精製することもでき(下記で述べるとおり)、その場合、これらは「空」と呼ばれる。次いで空のMHC分子に、下記の「空のβ1α1およびα1α2分子への抗原負荷(loading)」に記載のとおり、選択されたペプチドをのせることができる。
【００９５】
組換えβ1α1およびα1α2分子の発現および精製
本発明のMHCポリペプチドをコードする核酸は、その最も基本的な形において、A-Bの構造を有する第一および第二の領域を含むが、ただしクラスI分子の場合には領域AはクラスIα1ドメインをコードし、領域BはクラスIα2ドメインをコードする。クラスII分子では、AはクラスIIα1ドメインをコードし、BはクラスIIβ1ドメインをコードする。リンカー配列が含まれる場合、核酸はB-L2-Aと表すことができ、ただしL2はリンカーペプチドをコードする核酸配列である。抗原性ペプチドがMHCポリペプチドに共有結合している場合、この複合体をコードする核酸分子はP-B-Aと表すことができる。コード配列がP-L2-B-L1-Aで表されるように、第二のリンカー配列が抗原性タンパク質と領域Bのポリペプチドとの間に提供されてもよい。いずれの場合にも、MHCポリペプチド(すなわち、L1、L2、B、AおよびP)を含む様々な核酸配列は、エレメントが単一のリーディングフレームに位置するように、機能的に連結される。
【００９６】
これらのMHCポリペプチドを発現する核酸構築物は、プロモーター(Pr)、エンハンサーおよび3'調節領域などの調節エレメントを含んでいてもよく、その選択はタンパク質を発現する細胞の型に基づいて決定されることになる。プロモーター配列がオープンリーディングフレームに機能的に連結される場合、配列はPr-B-A、または(抗原コード領域が含まれる場合には)Pr-P-B-Aと表すことができ、ここでPrはプロモーター配列を意味する。プロモーター配列はこれらの配列のPまたはB成分に機能的に連結され、B-AまたはP-B-A配列は単一のオープンリーディングフレームを含む。この構築物を、選択した細胞型においてMHCポリペプチドを発現するのに適したベクター中に導入する。
【００９７】
ポリペプチドの発現および精製のために多数の原核細胞および真核細胞システムが公知である。例えば、ポリペプチドをコードする構築物の上流に強力で調節されたプロモーターおよび有効なリボソーム結合部位を置くことによって、原核細胞中で異種ポリペプチドを産生することができる。適当なプロモーター配列には、β-ラクタマーゼ、トリプトファン(trp)、‘ファージT7およびλPLプロモーターが含まれる。細菌において異種タンパク質を産生するための方法およびプラスミドベクターがSambrook et al. (1989)によって記載されている。大量の2m融合タンパク質を発現するのに適した原核細胞には、大腸菌および枯草菌が含まれる。しばしば、高レベルで発現されたタンパク質が不溶性の封入体において認められる。これらの凝集体からタンパク質を抽出する方法がSambrook et al. (1989、17章参照)に記載されている。原核細胞におけるMHCポリペプチドの組換え発現は、別法として融合タンパク質の最適な発現と精製のために設計された市販のシステムを用いて都合よく得ることもできる。このような融合タンパク質は、一般に精製を容易にするタンパク質タグを含む。このようなシステムの例には、限定されないが、pMALタンパク質融合および精製システム(New England Biolabs, Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)、GST遺伝子融合システム(Amersham Pharmacia Biotech, Inc.、ニュージャージー州ピスカタウェイ)、およびpTrcHis発現ベクターシステム(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)が含まれる。例えば、pMAL発現システムは、発現したタンパク質にマルトース結合タンパク質を付加するベクターを利用する。融合タンパク質は大腸菌中で発現され、これをアミロースカラムを用いて細胞粗抽出物から精製する。必要があれば、第Xa因子などの適当なプロテアーゼを用いた処理によって、マルトース結合タンパク質ドメインを融合タンパク質から切断することができる。次いで、第二のアミロースカラムを通すことによって、マルトース結合断片を調製物から除去することができる。
【００９８】
MHCポリペプチドはまた、Invitrogen(カリフォルニア州カールスバッド)によって生産されているピヒア・パストリス(Pichia pastoris)、ショウジョウバエ(Drosophila)、バキュロウイルスおよびシンドビス発現システムを含む、真核細胞発現システムにおいても発現されうる。チャイニーズハムスター卵巣(CHO)、サル腎臓(COS)、HeLa細胞、スポドプテラ・フルジペルダ(Spodoptera frugiperda)、およびサッカロミセス・セレビジエ(Saccharomyces cerevisiae)などの真核細胞も、MHCポリペプチドを発現するために用いることができる。これらの細胞において用いるのに適した調節領域には、哺乳動物の場合にはCMV、アデノウイルスおよびSV40などからのウイルスプロモーターが含まれ、酵母細胞の場合には3-ホスホグリセリン酸キナーゼおよびアルコールデヒドロゲナーゼのプロモーターが含まれる。
【００９９】
DNAの真核細胞、特にヒトまたは他の哺乳動物細胞への移入は、今日では通常の技法である。ベクターを純粋なDNAとして、例えばリン酸カルシウムもしくはリン酸ストロンチウムによる沈降、電気穿孔法、リポフェクション、DEAEデキストラン、微量注入法、プロトプラスト融合、または微量遺伝子銃によって、レシピエント細胞に導入する(トランスフェクション)。または、核酸分子をウイルスベクターを用いた感染によって導入することもできる。例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルスを用いるシステムが開発されている。
【０１００】
哺乳動物細胞で産生されたMHCポリペプチドを、タンパク質を上清中に遊離した後に抽出し、抗MHC抗体を用いて調製した免疫親和性カラムを用いて精製することもできる。または、MHCポリペプチドを、例えばb-グロビンとのキメラタンパク質として発現させてもよい。その後、b-グロビンに対する抗体を用いてキメラタンパク質を精製する。次いで、b-グロビン遺伝子とMHCポリペプチドをコードする核酸配列との間に設計した対応するプロテアーゼ切断部位を用いて、翻訳後に2つのポリペプチド断片をお互いに分離する。b-グロビンキメラタンパク質生成のための一つの有用な発現ベクターはpSG5(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ)である。
【０１０１】
原核細胞においてMHCポリペプチドを発現させると、グリコシル化されていないポリペプチドを生じることになる。天然のグリコシル化標的部位でのポリペプチドのグリコシル化は、哺乳動物細胞などの適当な真核細胞発現システムでポリペプチドを発現させることにより達成することができる。
【０１０２】
発現したタンパク質の精製は、一般に6Mの尿素を含む塩基性溶液(一般にはpH10付近)中で実施する。次いで、精製したタンパク質の折り畳みは、中性pHの緩衝溶液(一般にはおよそpH7.4のリン酸緩衝食塩水(PBS))に対する透析によって達成される。
【０１０３】
空のβ1α1およびα1α2分子への抗原負荷
β1α1およびα1α2分子を空の形(すなわち、抗原性ペプチドが結合していない状態)で発現および精製した場合、抗原性ペプチドを標準の方法を用いて分子にのせることができる。抗原性ペプチドをMHC分子にのせるための方法は、例えば、その全体が本明細書に組み入れられるSharmaらに対する米国特許第5,468,481号に記載されている。このような方法には、精製したMHC分子と精製した抗原調製物との単純な共インキュベーションが含まれる。
【０１０４】
一例として、空のβ1α1分子(1mg/ml、40μM)を10倍過剰モル濃度のペプチド(1mg/ml、400μM)と室温で24時間インキュベートすることにより、のせることができる。その後、余分な非結合ペプチドを、PBSに対して4℃で24時間透析することにより除去することができる。当技術分野において公知のとおり、β1α1へのペプチドの結合を、放射性標識したペプチドを用いたシリカゲル薄層クロマトグラフィ(TLC)によって定量することができる。このような定量に基づき、望ましい結果を得るために負荷を変えることもできる(例えば、ペプチドの過剰モル濃度またはインキュベーションの時間を変えることにより)。
【０１０５】
その他の考察
(a) 配列の変異
前述の記載は、天然のMHCクラスIおよびクラスII分子と、これらの分子の様々なドメインを例として用いているが、当業者であれば、これらの分子およびドメインの変異体を前述と同じ方法で作製し、使用できることを理解すると思われる。したがって、本明細書においてMHCポリペプチドまたは分子のドメイン(例えば、MHCクラスIIβ1ドメイン)への言及は、言及された分子の天然型、ならびに天然型アミノ酸配列に基づくが一つまたは複数のアミノ酸配列の変異を含む分子の両方を含む。このような変異ポリペプチドは、天然分子とのアミノ酸配列の同一性の程度においても定義することができる。一般に、MHCドメイン変異体は、天然のMHCドメインの配列と少なくとも80%の配列同一性を有する。より高度に保存された変異体は、天然の配列と少なくとも90%または少なくとも95%の配列同一性を有する。MHCドメインポリペプチドの変異体はまた、天然のポリペプチドの生物活性も保持する。本発明の目的のために、下記に詳細に記載するとおり、変異ドメインを適当なβ1α1またはα1α2ポリペプチドに組み込み、得られたポリペプチドのインビトロにおける抗原特異的T細胞増殖を阻害する能力を調べることによって、その活性が簡便に評価される。
【０１０６】
変異MHCドメインポリペプチドには、天然MHCポリペプチド配列とアミノ酸配列が異なるが、特定の生物活性を保持しているタンパク質が含まれる。このようなタンパク質は、例えば部位特異的突然変異誘発またはポリメラーゼ連鎖反応によって、ドメインをコードする分子のヌクレオチド配列を操作することにより作製することができる。最も単純な改変は、類似の生化学的性質を有するアミノ酸の1つまたは複数のアミノ酸との置換、すなわち「保存的置換」を含む。機能的に類似したアミノ酸を提供する保存的置換表は、当技術分野において周知である。以下の6つの群はそれぞれ、相互に保存的置換であり、結果として生じるタンパク質の活性に及ぼす影響が最小限である可能性が高いアミノ酸を含む。
アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T)；
2) アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E)；
3) アスパラギン(N)、グルタミン(Q)；
4) アルギニン(R)、リジン(K)；
5) イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V)；および
6) フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)。(例えば、Creighton, Proteins(W. H. Freeman & Co., New York, N.Y. 1984)を参照されたい)。
【０１０７】
生物学的機能または他の特徴における、より実質的な変化は、上記に示したものよりも保存性が低い置換基を選択する、すなわち、(a) 置換部位におけるポリペプチド骨格構造、例えばシートもしくはヘリックス配座としての構造、(b) 標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または(c) 側鎖のかさ(bulk)の維持に対する影響により有意な差がある残基を選択することによって得ることができる。一般にタンパク質の性質において最大の変化を生じることが予想される置換基は、(a) 疎水性残基、例えばロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたはアラニルの代わりに親水性残基、例えばセリルまたはスレオニルが置換されている(もしくはその逆)、(b) シスチルまたはプロリルが任意の他の残基の代わりに置換されている(もしくはその逆)、(c) 電気的陰性残基、例えばグルタミルまたはアスパルチルの代わりに電気的陽性側鎖を有する残基、例えばリシル、アルギニル、またはヒスチジルが置換されている(もしくはその逆)、(d) 側鎖を持たない残基、例えばグリシルの代わりにかさ高い側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニルが置換されている(もしくはその逆)ような置換基であると考えられる。これらのアミノ酸置換または欠失または付加の影響は、前述のT細胞増殖解析法の使用によって評価することができる。
【０１０８】
核酸レベルにおいて、当業者であれば、クラスIおよびII MHCドメインをコードする天然の核酸配列を発現ベクターにおいて使用することができるが、本発明はそのような配列に制限されないことを理解すると思われる。機能性MHCドメインをコードするいかなる配列も使用することができるが、核酸配列をそれが発現される生物のコドン使用頻度に適合するよう改変することもできる。
【０１０９】
(b) 検出可能マーカーの組込み
一定のインビボおよびインビトロにおける適用のために、本発明のMHC分子を検出可能な標識に結合することができる。放射性核種(例えば、インジウム111などのγ放出線源)、常磁性同位体、蛍光マーカー(例えば、フルオレセイン)、酵素(アルカリ性ホスファターゼなど)、補助因子、化学発光化合物および生物発光化合物を含む、広範にわたる検出可能な標識が公知である。このような標識のMHCポリペプチドへの結合は、標準的方法を用いて達成される。米国特許第5,734,023号(参照により本明細書に組み入れられる)は、このような標識を用いたMHCポリペプチド誘導体の標識に関する広汎な考察を含む。検出可能マーカーを、方向を特定した様式で(すなわち、無作為に結合するのでなく)MHC分子に共有結合させようとする場合、マーカーは一般に、N末端に連結されたペプチド抗原による干渉を最小限にするために分子のC末端に連結することになる。
【０１１０】
(c) 毒性部分の結合
開示されるMHCポリペプチドの一定の使用、特に一定のT細胞集団の除去を意図したインビボでの治療への適用のために、このポリペプチドを毒性部分と結合させることができる。限定されないが、タンパク質毒素、化学療法剤、細胞毒性T細胞表面分子に対する抗体、リパーゼ、および「硬い」例えばβ放射線を放出する放射性同位体を含む、T細胞機能を破壊するのに適した多数の毒性部分が公知である。このような毒素、および毒素をMHC分子に結合させる方法の例が、米国特許第5,284,935号(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。タンパク質毒素には、リシン、ジフテリアおよびシュードモナス毒素が含まれる。化学療法剤には、ドキソルビシン、ダウノルビシン、メトトレキセート、サイトトキシンおよびアンチセンスRNAが含まれる。イットリウム90、リン32、鉛212、ヨウ素131、またはパラジウム109などの放射性同位体も用いることができる。毒性部分を、方向を特定した様式で(すなわち、無作為に結合するのでなく)MHC分子に共有結合させようとする場合、毒性部分は一般に、N末端に連結されたペプチド抗原による干渉を最小限にするために分子のC末端に連結することになる。
【０１１１】
本発明の他の局面においては、その他の点では天然の主要組織適合遺伝子複合体(MHC)ポリペプチド配列に組換えによって導入された1つまたは複数の再設計表面構造特性を組み入れたMHC成分を含む改変組換えT細胞受容体リガンド(RTL)を設計および構築する。典型的に、本発明の改変RTLは、天然MHCポリペプチド内に見出される自己結合界面内に位置するかまたはこれを規定する溶媒露出標的部位において、1つまたは複数のアミノ酸変化を導入するよう合理的に設計および構築される。
【０１１２】
改変RTLにおいて変更される自己結合界面は典型的に、天然MHCポリペプチドの、または天然MHCポリペプチドを組み入れた「未改変」RTLの自己凝集を媒介する1つまたは複数のアミノ酸残基を含む。自己結合界面は天然MHCポリペプチドの一次構造と関連があるが、この界面は、天然ポリペプチドが無傷のMHC複合体から単離され「未改変」RTLの状況に組み入れられた場合にのみ、凝集促進表面特性として現れ得る。
【０１１３】
したがって特定の態様において、自己結合界面は、無傷のMHCタンパク質中に見出される1つまたは複数の構造要素から天然ポリペプチドが単離されて初めて、未改変RTLの溶媒露出残基またはモチーフとして機能し得る。本明細書に記載する例示的なMHCクラスII RTL(例えば、連結されたβ1およびα1ドメインを含む)の場合、天然β1α1構造は、無傷のMHC II複合体中に見出されるIg折り畳み様β2およびα2ドメインの除去後に初めて、特定の溶媒露出自己結合残基またはモチーフを示す。未改変β1α1 RTLの凝集を媒介するこれらの同じ残基またはモチーフは、推測によると、(おそらくは、Ig折り畳み様β2およびα2ドメインとの会合により)天然または前駆体MHC II複合体において溶媒接近不能な構造中に「埋もれて」いるか、またはさもなくば「マスクされて」いる(すなわち、自己会合を媒介できないように妨げられている)。
【０１１４】
本発明の特定の改変RTLは、選択されたMHCクラスIもしくはMHCクラスIIドメイン、または最小限のAg認識/T細胞受容体(TCR)界面(すなわち、Ag結合およびTCR認識を媒介し得る)を形成するのに必要な複数のMHCドメインの一部を含む多ドメイン構造を含む。特定の態様において、改変RTLは、機能的なペプチド結合およびTCR認識を媒介するのに必要かつ十分なMHCクラスIまたはMHCクラスIIドメイン残基の最小サブセットを意味する「最小TCR界面」を含む。TCR認識は、本明細書に記載するように、改変RTLがAg特異的様式でTCRと相互作用して、1つまたは複数のTCR媒介性T細胞応答を誘発し得ることを必要とする。
【０１１５】
ヒトクラスII MHC分子に由来する改変RTLの場合には、RTLはほとんどの場合、MHCクラスIIタンパク質のα1およびβ1 MHCポリペプチドドメイン、または最小TCR界面を提供するのに十分なそれらの一部を含む。これらのドメインまたはその一部は、共有結合されて一本鎖(sc)MHCクラスIIポリペプチドを形成し得る。このようなRTLポリペプチドを以下「α1β1」scMHCクラスIIポリペプチドと称する。ヒトMHCクラスIタンパク質から同等のscMHC構築物を形作り、例えばクラスI MHCタンパク質のα1およびα2ドメイン(または、最小TCR界面を提供するのに十分なそれらの一部)を含むRTLであって、任意に「空」であるかまたはCD8+ T細胞エピトープを含むAgと会合したRTLを形成することができる。
【０１１６】
scMHC成分を含むRTL構築物は、ヒトにおける自己免疫疾患治療活性の予測となる哺乳動物モデル対象におけるAg誘発性自己免疫疾患応答を予防および処置するなどの用途に広く有用であることが示されている(Burrows et al., J. Immunol. 161：5987, 1998；Burrows et al., J. Immunol. 164：6366, 2000)。他の局面では、このような種類のRTLは、MBP-85-95またはBCR-ABL b3a2ペプチド(CABL)に特異的なヒトDR2拘束性T細胞クローンにおいてT細胞活性化を阻害し、かつ抗炎症性サイトカイン(例えば、IL-10)分泌を誘導することが実証されている(Burrows et al., J. Immunol. 167：4386, 2001；Chang et al., J. Biol. Chem. 276：24170, 2001)。
【０１１７】
さらなるRTL構築物を本願の発明者らが設計し試験しているが、これには、自己免疫応答を強力に阻害し、脳炎誘発性MOG-35-55ペプチドに対する免疫寛容をもたらし、EAEの臨床的および組織学的徴候を好転させることが示されたMOG-35-55/DR2構築物(VG312)が含まれる(Vandenbark et al., J. Immunol. 171：127-33, 2003)。T細胞免疫応答の調節に有用であり、本発明において使用できる多くのさらなるRTL構築物が、本発明の方法および組成物での使用に利用できる(例えば、それぞれ参照により本明細書に組み入れられる、2001年8月7日に発行された米国特許第5,270,772号；2000年5月1日に出願された米国仮特許出願第60/200,942号；2004年9月7日にBurrowsらによって出願された米国特許出願第10/936,467号；2001年8月7日に発行された米国特許第6,270,772号；2001年5月1日に出願された米国特許出願第09/847,172号；および2004年11月9日に発行された米国特許第6,815,171号を参照されたい)。
【０１１８】
本発明の改変RTLの生物学的機能および作用機序を評価するには、同族TCRを有する抗原特異的T細胞が種々のアッセイの標的T細胞として用いられている(例えば、Burrows et al., J. Immunol. 167：4386, 2001を参照されたい)。より最近になって、本願の発明者らが、RTLの構造および機能を同定し特徴づけるためのスクリーニングおよびアッセイでの使用に独自に適合化された新規T細胞ハイブリドーマを提供した(例えば、2004年7月7日に出願された米国仮特許出願第60/586,433号；およびChou et al., J. Neurosci. Res. 77：670-680, 2004を参照されたい)。本発明のこれらの局面を実行するには、T細胞ハイブリッドを構築し、同族AgおよびAPCと接触させた後にAg特異的TCR媒介性増殖応答を示すハイブリッドを選択する。Tハイブリッドのこの増殖応答は次に、T細胞ハイブリッドを、ハイブリッドのAg特異的TCR媒介性増殖応答の改変をもたらす関心対象の改変RTLと接触させることにより、検出可能に阻害または促進され得る。ハイブリッド細胞の増殖応答の改変によって、T細胞ハイブリッドと接触させた改変RTLの存在、量、および/または活性レベルが正確にかつ再現性よく示される。
【０１１９】
本発明の特定の態様において、溶液中での凝集能が低下した単離された改変組換えRTLは、共有結合された複数のMHCドメイン要素を含む一本鎖(sc)ポリペプチド形態の「MHC成分」を含む。これらのドメイン要素は典型的に、a) MHCクラスIIポリペプチドのα1およびβ1ドメイン、もしくはAg結合ポケット/T細胞受容体(TCR)界面を含むそれらの一部；またはb) MHCクラスIポリペプチドのα1およびα2ドメイン、もしくはAg結合ポケット/TCR界面を含むそれらの一部から選択される。RTLのMHC成分は、未改変RTLの天然MHCポリペプチド成分中に同定される「自己結合界面」に相当する標的部位における1つまたは複数のアミノ酸置換、付加、欠失、または再編成によって改変される。改変RTLは、同様の基礎的MHC成分構造を有するが自己結合界面を規定する天然MHCポリペプチドを組み入れた未改変対照RTLの示す凝集と比較して、溶液中における凝集傾向の著しい減少を示す。
【０１２０】
本明細書で使用する「天然MHCポリペプチド」とは、無傷の天然MHCポリペプチドを指すと同時に、整列させた天然MHCポリペプチドの配列と比較して同一のまたは高度に保存されたアミノ酸配列を有するMHCポリペプチドの操作されたもしくは合成の断片、ドメイン、複合体、またはその他の誘導体(例えば、整列させたひと続きの対応残基にわたる85%、90%、95%、またはそれ以上のアミノ酸同一性によって特徴づけられる)を指す。自己会合界面を有する「天然MHCポリペプチド」は、多くの場合、未改変RTL内に組み入れられたMHCポリペプチドドメインであり、天然MHCポリペプチドが完全に無傷の天然MHCタンパク質中に(例えば、ヘテロ二量体MHCクラスIIタンパク質複合体中に)存在する場合とは対照的に、自己会合界面はそのような状況でのみ存在し得る。
【０１２１】
したがってMHCクラスII RTLの場合、(最小TCR界面を含む)RTLのより小さくより有用な(例えば、β1α1)ドメイン構造を作製するためにβ2およびα2ドメインを除去すると、本発明によるRTL改変の標的部位を含む特定の自己結合残基またはモチーフが「脱マスキング」される(すなわち、溶媒露出される)。脱マスキングされたこれらの残基またはモチーフは、例えば部位特異的突然変異誘発により容易に変更され、凝集を減少させるかまたは排除し、RTLを水溶液中でより高度な単分散試薬とすることができる。
【０１２２】
これらの改変RTLの単分散の程度を評価するには、改変RTLと同じ基礎的ポリペプチド構造を有するが、(自己結合界面を含み、天然ポリペプチドがRTL内に組み入れられた場合に、改変のための溶媒露出標的部位を規定する1つまたは複数のアミノ酸残基またはモチーフを有する)天然MHCポリペプチド配列を特色とする未改変または「対照」RTLを使用することができる。
【０１２３】
本発明の改変RTLは、対応する未改変RTL(すなわち、天然MHCポリペプチドを含み、未改変自己結合界面を有する)と比較して、溶液中の単分散分子の割合の増加をもたらす。特定の態様において、水溶液中で単分散種として存在する未改変RTLの割合は、より高次の凝集体形態中に見出される未改変RTLと平衡を保って、全RTLタンパク質の1%と低い場合もあり、より典型的には5〜10%またはそれ未満であり得る。一方、本発明の改変RTLは、溶液中で少なくとも10%〜20%の単分散種をもたらす。他の態様においては、溶液中の単分散種の割合は、匹敵する条件下で対応する未改変RTLに関して認められる量と比較して凝集RTL種の割合が減少するのに相当して、存在する全RTLの25%〜40%から、多くの場合50%〜75%から85%、90%、95%、またはそれ以上の範囲となる。
【０１２４】
改変RTLを形成するためにMHCポリペプチド内で変更される自己結合界面は、MHCポリペプチドおよび/またはRTLの自己結合または自己会合を媒介する能力によって特徴づけられる単一もしくは複数のアミノ酸残基、またはMHCポリペプチドの既定の領域、ドメイン、もしくはモチーフを含み得る。本明細書で使用する「自己結合」および「自己会合」とは、水、生理食塩水、または血清などの生理的に適合する溶液中でMHCポリペプチドまたはRTLの凝集を促進する任意の分子間の結合または会合を指す。
【０１２５】
上記したように、MHCクラスII分子は非共有結合したαおよびβポリペプチド鎖を含む。α鎖は、α1およびα2と称する2つの別個のドメインを含む。β鎖もまた、2つのドメイン、β1およびβ2を含む。MHCクラスII分子のペプチド結合ポケットは、α1ドメイントとβ1ドメインの相互作用によって形成される。処理抗原由来のペプチドは、β1およびα1ドメインによって形成される膜遠位ポケットにおいてMHC分子に結合する(Brown et al., 1993；Stern et al., 1994)。ヒトMHCクラスII/ペプチド複合体の構造解析から(Brown et al., Nature 364：33-39, 1993；Stern et al., Nature 368：215, 1994)、結合したペプチドの側鎖が、クラスII結合溝内の多型性残基からなる「ポケット」と相互作用することが実証されている。結合したペプチドは、ペプチドを結合ポケットに繋留する位置における特定アミノ酸の強力な優先性、および他の位置における種々の異なるアミノ酸に対する広い寛容性によって特徴づけられる、クラスII対立遺伝子特異的モチーフを有する(Stern et al., Nature 368：215, 1994；Rammensee et al., Immunogenetics 41：178, 1995)。これらの特性に基づき、MHCクラスII分子の天然集団は高度に不均一である。細胞表面上のクラスII分子の所与の対立遺伝子は、2000を超える異なるペプチドを結合しこれを提示する能力を有する。さらに、結合したペプチドは、非常に遅い速度定数でクラスII分子から解離する。したがって、特定の抗原性ペプチドと結合したクラスII分子の均一な集団を作製または取得することは困難であった。
【０１２６】
HHCクラスII分子のα2およびβ2ドメインは、α鎖およびβ鎖をAPCの膜に繋留する別個の膜貫通Ig折り畳み様ドメインを含む。さらに、α2ドメインはT細胞活性化過程において規則正しいオリゴマー形成に寄与することが報告されており(Konig et al., J. Exp. Med. 182：778-787, 1995)、β2ドメインは、MHC-抗原複合体がTCRαβヘテロ二量体と相互作用する際にCD4を同時に結合するCD4結合部位を含むことが報告されている(Fleury et al., Cell 66：1037-1049, 1991；Cammarota et al., Nature 356：799-801, 1992；Konig et al., Nature 356：796-798, 1992；Huang et al., J. Immunol. 158：216-225, 1997)。
【０１２７】
本発明において使用するためのMHCクラスII分子をモデルとしたRTLは典型的に、単一ポリペプチド鎖(共有結合した抗原性ペプチドを含むおよび含まない)へと典型的には遺伝子連結されるヒトおよび非ヒトMHCクラスII分子のα1およびβ1ドメインのすべてまたは一部を含む小さな(例えば、約200アミノ酸残基)分子を含む。例示的なMHCクラスII由来「β1α1」分子は、ペプチド結合およびTCR関与(TCR結合および/または部分的もしくは完全なTCR活性化を含む)に必要な生化学的特性を保持する。これにより、構造的特徴づけおよび免疫治療用途のための、操作された大量のRTLの即時生成が提供される。MHCクラスII RTLのMHC成分は、選択されたMHCクラスII分子のMHCクラスIIα1およびβ1ドメインのすべてまたは一部を含み得る最小のAg結合/T細胞認識界面を含む。これらのRTLは、鋳型としてMHCクラスII分子の構造骨格を用いて設計される。円二色性を用いたRTLの構造的特徴づけから、これらの分子が、対応する天然(すなわち、野生型配列)MHCクラスIIヘテロ二量体中に認められる逆平行βシートプラットフォームおよび逆平行αヘリックスを保持することが示される。これらのRTLはまた、協同的な2状態の熱的折り畳み-変性遷移を示す。RTLがAgペプチドと共有結合している場合、このRTLは空のRTL分子と比較して熱的変性に対する安定性の増加を示す場合が多い。
【０１２８】
本発明の例示的な態様において、RTLの設計は、ヒトHLA-DR、HLA-DQ、および/もしくはHLA-DPタンパク質、または非ヒト(例えば、マウスまたはラット)MHCクラスIIタンパク質の結晶座標に合理的に基づく。これに関連して、例示的なRTLがHLA-DR1の結晶学的データ(PDBアクセッションコード1AQD)に基づいて設計されており、この設計パラメータは、例えばラット、ヒト、およびマウス種由来の他のMHCクラスII分子との配列アラインメントによってさらに明らかにされている。プログラムSybyl(Tripos Associates、ミズーリ州セントルイス)は、例えばO2ワークステーション(Silicon Graphics、カリフォルニア州マウンテンビュー)ならびにHLA-DR、HLA-DQ、および/またはHLA-DP分子に関して得られた座標を用いてグラフィック画像を作成するために使用できる例示的な設計ツールである。広範な結晶学的特徴づけが、Brookhaven Protein Data Bank(Brookhaven National Laboratories、ニューヨーク州アプトン)に寄託されているこれらおよびその他のMHCクラスIIタンパク質について提供されている。
【０１２９】
本発明の改変RTLの設計および構築において使用するためのHLA-DR結晶構造の詳細な説明は、例えば、Ghosh et al., Nature 378：457, 1995；Stern et al.. Nature 368：215, 1994；Murthy et al., Structure 5：1385, 1997；Bolin et al., J. Med. Chem. 43：2135, 2000；Li et al., J. Mol. Biol. 304：177, 2000；Hennecke et al., Embo J. 19：5611, 2000；Li et al., Immunity 14：93, 2001；Lang et al., Nat. Immunol. 3：940, 2002；Sundberg et al., J. Mol. Biol. 319：449, 2002；Zavala-Ruiz et al., J. Biol. Chem. 278：44904, 2003；Sundberg et al., Structure 11：1151, 2003に提供されている。HLA-DQ結晶構造の詳細な説明は、例えば、Sundberg et al., Nat. Struct. Biol. 6：123, 1999；Li et al., Nat. Immunol. 2：501, 2001；およびSiebold et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101：1999, 2004に提供されている。マウスMHC I-AU分子の詳細な説明は、例えばHe et al., Immunity 17：83, 2002に提供されている。マウスMHC クラスII I-Ad分子の詳細な説明は、例えばScott et al., Immunity 8：319, 1998に提供されている。マウスMHCクラスII I-Ak分子の詳細な説明は、例えば、Reinherz et al., Science 286：1913, 1999、およびMiley et al., J. Immunol. 166：3345, 2001に提供されている。マウスMHC対立遺伝子I-A(G7)の詳細な説明は、例えばCorper et al., Science 288：501, 2000に提供されている。マウスMHCクラスII H2-M分子の詳細な説明は、例えばFremont et al., Immunity 9：385, 1998に提供されている。マウスMHCクラスII H2-Ieβ分子の詳細な説明は、例えばKrosgaard et al., Mol. Cell 12：1367, 2003に記載されている。マウスクラスII Mhc I-Ab分子の詳細な説明は、例えばZhu et al., J. Mol. Biol. 326：1157, 2003. HLA-DP Lawrance et al., Nucleic Acids Res. 1985 Oct 25; 13(20)：7515-7528に提供されている。
【０１３０】
構造に基づく相同性モデリングは、1つまたは複数のMHCクラスIまたはクラスII分子、例えばヒトDR分子およびマウスI-Ek分子の微細な結晶座標に基づく。Burrowsらによる1つの例示的な研究において(Protein Engineering 12：771-778, 1999)、ラット、ヒト、およびマウスMHCクラスIIの一次配列が整列化され、そこから256個のα鎖アミノ酸のうちの76個が同一であること(30%)、および265個のβ鎖アミノ酸のうちの93個が同一であること(35%)が決定された。特に興味深いことには、ジスルフィド結合しているシステインの一次配列位置が3種すべてにおいて保存されており、解析された構造の骨格形跡は、重ねた場合に強力な相同性を示し、よってペプチド結合溝において異なった抗原性ペプチド結合を可能にするよう設計された側鎖置換を伴う、進化的に保存された構造モチーフが示唆される。
【０１３１】
本発明の改変RTLを構築するためのMHCクラスIおよびクラスII分子のさらなる解析は、ペプチド結合およびT細胞認識に関与するドメインを含むβシートプラットフォーム/逆平行αヘリックスの「露出された」(すなわち、溶媒接近可能な)表面に焦点をおいている。MHCクラスII分子の場合、α1およびβ1ドメインは、広範な水素結合ネットワークおよび緊密に詰め込まれ「埋もれた」(すなわち、溶媒接近不能な)疎水性コアを示す。この三次構造は、サソリ毒に特有のαヘリックス/βシート骨格に構造的完全性および熱力学的安定性を付与する分子特性と類似しており、したがってサソリ毒は本明細書において改変RTLの合理的設計を導くためのさらなる構造的特徴を提示する(例えば、Zhao et al., J. Mol. Biol. 227：239, 1992；Housset, J. Mol. Biol. 238：88-91, 1994；Zinn-Justin et al., Biochemistry 35：8535-8543, 1996を参照されたい)。
【０１３２】
これらおよびその他の比較データ源から、天然MHCクラスII分子の結晶が、βシートプラットフォームの膜近位面とα2およびβ2 Ig折り畳みドメインの膜遠位面との間にいくつかの水分子を含むことが認められている。ドメイン間の相互作用表面積に関する計算は、Connolly(Biopolymers 25：1229-1247, 1986)により記載されているようなアルゴリズムを用いて、および結晶座標(例えば、Brookhaven Protein Data Baseにおいて種々のMHCクラスII分子について提供されているような)を用いて例えばMHC II分子のβ1α1およびα2β2 Ig折り畳みドメインの分子表面を作成することによって定めることができる。
【０１３３】
例示的なヒトDR1 MHCクラスII分子(PDBアクセッション番号1SEB、1AQD)に関して、β1α1およびα2β2-Ig折り畳みドメインの表面積は、水分子ほどの大きさの半径0.14nmのプローブへの接近性により規定して、個別に計算された(Burrows et al., Protein Engineering 12：771-778, 1999)。MHCクラスIIαβヘテロ二量体の表面積は156nm2であるのに対し、β1α1構築物の表面積は81nm2、およびα2β2-Ig折り畳みドメインの表面積は90nm2であった。β1α1表面の約15nm2(18.5%)が、MHCクラスIIαβヘテロ二量体においてIg折り畳みドメインとの界面に埋もれることが判明した。β1α1ペプチド結合ドメインとIg折り畳みドメイン(α2およびβ2)との間の側鎖相互作用が解析され、これが極性相互作用によって占有されていることが示され、高度に可動性の「ボールソケット」型界面において疎水性相互作用が「潤滑剤」として働いている可能性がある。
【０１３４】
これらおよび関連のモデリング研究から、MHCクラスII分子の抗原結合ドメインがα2およびβ2 Ig折り畳みドメインの非存在下において安定した状態を維持することが示唆され、この生成はMHCクラスII「α1β1」構造を含む多くの例示的なRTLの生成について裏付けられている。関連する知見が、「空の」β1α1 RTL、ならびにラットおよびモルモット抗原性ペプチドと共有結合された4つのα1β1 RTL構築物：β1 1-Rt-MBP-72-89、β1 1-Gp-MBP-72-89、β1 1-Gp MBP-55-69、およびβ1 1-Rt-CM-2について、Burrowsら(J. Immunol. 161：5987-5996, 1998)によって記載された。これらの各構築物について、システイン(β15およびβ79)間の天然ジスルフィド結合の存在が、還元剤β-メルカプトエタノール(β-ME)を用いたまたは用いないゲルシフトアッセイにより実証された。β-MEの非存在下ではジスルフィド結合が保持され、RTLタンパク質は典型的に、構造がより小型であるためにアクリルアミドゲル中をより速く移動する。RTL上の保存されたエピトープを標識するためにMHCクラスII特異的モノクローナル抗体を使用した免疫学的知見と共にこれらのデータから、一般に、天然MHCクラスII対応物と比較したRTL分子の構造的完全性が確認される(Burrows et al., 1998、前記；Chang et al., J. Biol. Chem. 276：24170-14176, 2001；Vandenbark et al., J. Immunol. 171：127-133, 2003)。同様に、MHCクラスII由来RTLの円二色性(CD)研究から、β1α1分子が非常に規則正しい二次構造を有することが明らかになる。典型的に、この一般的構造のRTLは、すべてのクラスII抗原結合ドメインに共通したβシートプラットフォーム/逆平行αヘリックス二次構造を共有した。これに関連して、β1α1分子は、例えば約30%のαヘリックス、15%のβストランド、26%のβターン、および29%のランダムコイル構造を含むことが判明している。Agペプチド(例えば、MBP-72-89およびCM-2)と共有結合されたRTLは、同様の、しかし同一ではない二次構造特性を示す。熱変性試験から、RTL分子の高度の協同性および安定性が明らかにされ、選択されたRTLがラット脳炎誘発性T細胞を検出して阻害し、実験的自己免疫性脳脊髄炎を処置する能力を含む多くの状況において、これらの分子の生物学的完全性が実証されている。
【０１３５】
本明細書に提供する(またはすべて開示目的のために本明細書にまとめて組み入れられる引用参考文献に記載されている)これらのおよび関連の知見によれば、会合する抗原性ペプチドを含むまたは含まない本明細書のRTL構築物は、再度折り畳まれた天然MHC分子と一致した構造的および高次構造的完全性を保持する。この一般的知見は、MHCクラスIIβ1およびα1ドメインのすべてまたは一部からなる抗原結合/TCR界面に由来する可溶性一本鎖RTL分子に関する結果によって例証される。より詳細な態様において、これらの例示的なMHCクラスII RTLは、対応する天然MHCクラスIIタンパク質のα2ドメインおよびβ2ドメインを欠き、また典型的には天然MHC IIタンパク質中に見出される膜貫通および細胞質内配列を除外する。「β1α1」MHC II RTL構築物によって例証されるこれらのRTL構築物の大きさおよび複雑性が減少することにより、RTL分子が細菌封入体から高収率で即時にかつ予測可能に発現および精製されるようになる(例えば、最大で15〜30mg/l細胞培養液またはそれ以上の収率)。
【０１３６】
天然MHCクラスII分子において、Agペプチド結合/T細胞認識ドメインは、最も単純には、その上で2つの逆平行ヘリックス部分が相互作用して抗原結合溝を形成するβシートプラットフォームと称される、共に折り畳まれて三次構造を形成するαおよびβポリペプチドのα1およびβ1ドメインの明確な部分によって形成される。MHCクラスIIのペプチド結合溝が開口端であることを除いて、類似の構造がMHCクラスI分子のα1およびα2ドメインをコードする単一エキソンによって形成され、ペプチド結合/T細胞認識ドメインおよび抗原性ペプチドリガンドをコードする単一エキソン構築物の操作が可能になる。
【０１３７】
本明細書においてMHCクラスIIタンパク質について例証されるように、モデリング研究から、本発明の改変単分散RTLを設計するために重要であることが判明したβ1α1ドメイントとα2β2-Ig折り畳みドメインとの間の界面に関する重要な特徴が明らかになった。α1およびβ1ドメインは、広範な水素結合ネットワークおよび緊密に詰め込まれ「埋もれた」(すなわち、溶媒接近不能な)疎水性コアを示す。MHCクラスIIタンパク質のβ1α1部分は、α2β2-Ig折り畳み「プラットフォーム」とは独立した単一の実体として運動する能力を有し得る。これらの2つのドメイン間のリンカー領域を形成する側鎖における高度の可動性の証拠に加えて、MHCクラスII I-Ekの結晶はこの界面内にいくつかの水分子を含んでいた(Jardetzky et al., Nature 368：711-715, 1994；Fremont et al., Science 272：1001-1004, 1996；Murthy et al., Structure 5：1385, 1997)。β1α1ドメインとα2β2-Ig折り畳みドメインとの間の界面は、極性相互作用によって占有されていると考えられ、高度に可動性の「ボールソケット」型界面において疎水性残基が「潤滑剤」として働いている可能性が高い。この界面における可動性は、ペプチド抗原の結合/交換のために、α1およびβ1ドメイン内の運動の自由度に必要であると考えられる。これに代えてまたはこれと共同して、この相互作用表面は、MHCクラスII-ペプチド分子のTCRとの相互作用に関する情報をAPCに戻して情報交換する上で役割を果たす可能性がある。
【０１３８】
これらの合理的設計指針およびパラメータに従って、本発明者らは、(例えば、HLA-DR2b(DRA*0101/DRB1*1501)によって例証されるような)ヒトMHCクラスII分子のペプチド結合/TCR認識部分を含む一本鎖ヒトRTLの改変単分散誘導体の操作に成功した。この例示的なMHCクラスII分子のα1およびβ1ドメインから構築された未改変RTLは、生物活性を保持していたが、溶液中で望ましくない高次の凝集体を形成した。
【０１３９】
この例示的な未改変RTLにおける凝集の問題を解決するため、DR2由来RTLのβシートプラットフォームの改変を目的として、疎水性残基の極性(例えば、セリン)または荷電(例えば、アスパラギン酸)残基との置換に対して部位特異的突然変異誘発を行った。この合理的設計手順に従って、溶液中で主に単量体であると確定される新規RTL変異体が得られた。サイズ排除クロマトグラフィーおよび動的光散乱から、新規改変RTLが溶液中で単量体であることが実証され、円二色性を用いた構造的特徴づけから、RTLの非常に規則正しい二次構造が実証された。
【０１４０】
これらの「空の」改変RTLへのペプチド結合がビオチン化ペプチドを用いて定量化され、機能的研究から、共有結合によって繋留されたペプチドを含む改変RTLがインビトロにおいて抗原特異的T細胞増殖を阻害し得るとともに、インビボにおいて実験的自己免疫性脳脊髄炎を抑制し得ることが示された。これらの研究から、MHCクラスII分子のAg結合/TCR認識ドメインをコードするRTLが本質的に非常に強い構造であることが実証された。RTLのβシートプラットフォームを改変する部位特異的突然変異誘発を含む本明細書に記載するRTLの改変にもかかわらず、これらの分子は、前駆体クラスII構造のIg折り畳みドメインから独立した強力な生物活性を保持し、水溶液中での凝集の新たなかつ驚くべき減少を示した。再設計されたこれらおよびその他の表面特性および単分散特性を有する改変RTLは、Agペプチドを結合する、Ag特異的様式でT細胞増殖を阻害する、およびインビボにおいてとりわけ自己免疫疾患を処置する能力を保持した。
【０１４１】
前述の表面特性改変とは別のさらなる改変を本発明の改変RTLに導入することもでき、これには、派生的または「変異」RTL分子の活性にほとんど変化をもたらさない可能性の高い、RTLのMHC成分のアミノ酸配列における特に軽微な改変が含まれる。改変RTLを含む非凝集MHCドメインポリペプチドの好ましい変異体は典型的に、初期設定パラメータに設定されたNCBI Blast 2.0、gapped blastpを用いて、特定の非凝集MHCドメインポリペプチドのアミノ酸配列との全長アライメントにわたって計算される少なくとも50%の配列同一性の所有によって特徴づけられる。参照配列とのより高い類似性を有するタンパク質は、この方法によって評価した場合に、少なくとも60%、少なくとも65%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも90%、または少なくとも95%の配列同一性などのパーセント同一性の増加を示す。全配列に満たない配列が配列同一性に関して比較される場合、変異体は典型的に、10〜20アミノ酸という短い領域にわたって少なくとも75%の同一性を有し、参照配列との類似性に応じて少なくとも85%または少なくとも90%もしくは95%の配列同一性を有し得る。このような短い領域にわたる配列同一性を決定する方法は、上記の通り当技術分野において公知である。非凝集MHCドメインポリペプチドを含む改変RTLの変異体もまた、非変異改変RTLの生物活性を保持する。本発明の目的のため、この活性は、本明細書に記載した通りに、改変RTLの適切なMHC成分(例えば、β1α1 MHC成分)に変化を組み入れ、得られたRTL/Ag複合体がインビトロでAg特異的T細胞増殖を阻害する能力を測定することによって簡便に評価することができる。
【０１４２】
(d) 薬学的製剤
本発明の精製MHCポリペプチドの適切な投与経路には、これらに限定されないが、経口、頬側、経鼻、エアロゾル、局所、経皮、経粘膜、注射、徐放、放出制御、イオン導入、超音波導入、ならびにその他の簡便な送達経路、装置、および方法が含まれる。注射送達法には、これらに限定されないが、静脈内、筋肉内、腹腔内、脊髄内、髄腔内、脳室内、動脈内、および皮下注射が含まれる。
【０１４３】
選択されたMHCポリペプチドの投与量および投与計画は、主治医により決定される。治療用途の有効量は、処置しようとする状態の性質および重症度、選択された特定のMHCポリペプチド、患者の年齢および状態、ならびにその他の臨床的因子に応じて異なる。典型的に、用量範囲は約0.1μg/kg体重〜約100mg/kg体重である。他の適切な範囲には、約100μg/kg体重〜1mg/kg体重の用量が含まれる。特定の態様において、有効量は、例えば、1〜75μg/kg、10〜50μg/kg、15〜30μg/kg、または20〜30μg/kgなどのより狭い範囲内で選択される。これらのおよびその他の有効単位用量を、単回用量でまたは複数回の日用量、週用量、または月用量の形態で、例えば1日当たり、1週当たり、または1カ月当たり1から5回または2〜3回用量の投与を含む投与計画で投与することもできる。投薬スケジュールは、タンパク質に対する対象の感受性など、いくつかの臨床的因子に応じて変動し得る。投薬スケジュールの例としては、3μg/kgを週に2回、週に3回、もしくは毎日；7μg/kg用量を週に2回、週に3回、もしくは毎日；10μg/kg用量を週に2回、週に3回、もしくは毎日；または30μ/kg用量を週に2回、週に3回、もしくは毎日投与するものがある。
【０１４４】
有効量の精製MHCポリペプチドを含む本発明の組成物の送達量、送達のタイミング、および送達様式は、体重、年齢、性別、および個体の状態などの要因に応じた個体基準、T細胞媒介性疾患の重症度、投与が予防的であるか治療的であるか、ならびに薬物の送達、吸収、半減期含む薬物動態、および有効性に影響することが知られているその他の要因に基づいて日常的に調節を受ける。このようにして、本発明の製剤および方法による精製MHCポリペプチド組成物の投与後に、被験対象は、偽薬処置対象またはその他の適切な対照対象と比較して、標的としたT細胞媒介性疾患に付随する1つまたは複数の症状の10%、20%、30%、50%、またはそれ以上の減少から最大で75〜90%または95%もしくはそれ以上の減少を示す。
【０１４５】
本発明のさらなる局面では、有効量の精製MHCポリペプチド、および精製MHCポリペプチドと組み合わせて製剤化されるかまたは協調的に投与される1つまたは複数のさらなる活性薬剤を使用する組み合わせ製剤および協調的投与法が提供され、哺乳動物対象におけるT細胞媒介性疾患を調節する、軽減する、処置する、または予防するための有効な製剤または方法がもたらされる。これに関連した例示的な組み合わせ製剤および協調的処置法では、精製MHCポリペプチドを1つまたは複数の付加的または補助的治療剤と併用して使用する。T細胞媒介性疾患の処置に有用な二次的または補助的方法および組成物には、これらに限定されないが、免疫グロブリン(例えば、BMS-188667などのCRLA4Ig；例えば、参照により本明細書に組み入れられるSrinivas et al., J. Pharm. Sci. 85(1)：1-4, (1996)を参照されたい)；コポリマー1、コポリマー1関連ペプチド、およびコポリマー1またはコポリマー1関連ペプチドで処置したT細胞(例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,844,314号を参照されたい)；阻止モノクローナル抗体、トランスフォーミング増殖因子-β、抗TNFα抗体；ステロイド剤；抗炎症剤；免疫抑制剤；アルキル化剤；代謝拮抗薬；抗生物質；コルチコステロイド；プロテオソーム阻害剤；ならびにジケトピペラジンとの組み合わせ投与が含まれる。本発明の協調的投与法を実行するには、MHCポリペプチドを、本明細書で意図する1つまたは複数の二次的または補助的治療剤、例えば二次的免疫修飾薬などと、協調的処置手順において同時にまたは逐次的に投与する。協調的投与はいずれの順で行ってもよく、一方のみまたは両方(またはすべて)の活性治療剤がそれらの生物活性を個別におよび/またはまとめて発揮する期間が存在し得る。このような協調的処置法すべての際立った局面は、精製MHCポリペプチド組成物が好ましい臨床反応を誘発し得ることであるが、これは二次的治療剤によって提供される二次的臨床反応と協同的である場合もあればそうでない場合もある。多くの場合、精製MHCポリペプチドと本明細書で意図する二次的治療剤との協調的投与は、精製MHCポリペプチドおよび/または二次的治療剤のいずれか一方または両方のみによって誘発される治療反応を超える治療反応の増強をもたらす。
【０１４６】
本発明の薬学的組成物は、それらの意図した目的を達成する任意の手段によって投与することができる。本発明の精製MHCポリペプチドは一般に、使用する特定の投与様式に適した薬学的に許容される担体と併用される。本発明の精製MHCポリペプチドの剤形は、薬学的調剤の分野において、上記した投与単位の調製に適していると認識される賦形剤を含む。このような賦形剤には、限定を意図することなく、結合剤、充填剤、潤滑剤、乳化剤、懸濁剤、甘味剤、香味剤、保存剤、緩衝液、湿潤剤、崩壊剤、発泡剤、ならびにその他の簡便な賦形剤および添加剤が含まれる。
【０１４７】
したがって、T細胞媒介性疾患ならびに関連する状態および合併症を処置するための本発明の組成物は、以下のいずれか1つまたは組み合わせを含み得る：薬学的に許容される担体または賦形剤；その他の医学的薬剤；薬学的薬剤；佐剤；緩衝液；保存剤；希釈剤；ならびに当業者に公知である種々のその他の薬学的添加剤および薬剤。これらの付加的な製剤添加剤および薬剤は多くの場合、生物学的に不活性であり、有害な副作用を起こすことも活性薬剤と相互作用することもなく患者に投与することができる。
【０１４８】
本発明の精製MHCポリペプチドは必要に応じて、親水性徐放性ポリマーなどの徐放性担体を用いて放出制御剤で投与することができる。これに関連した例示的な放出制御剤には、これらに限定されないが、約100cps〜約100,000cpsの粘度を有するヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはコレステロールなどのその他の生体適合性基質が含まれる。
【０１４９】
本発明の精製MHCポリペプチドは多くの場合、任意に担体またはその他の添加剤と組み合わせて経口剤形で製剤化され投与される。薬学的製剤技術に共通した適切な担体には、これらに限定されないが、微結晶性セルロース、ラクトース、スクロース、フルクトース、グルコース、デキストロース、もしくはその他の糖類、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、セルロース誘導体、カオリン、マンニトール、ラクチトール、マルチトール、キシリトール、ソルビトール、もしくはその他の糖アルコール、乾燥デンプン、デキストリン、マルトデキストリン、もしくはその他の多糖類、イノシトール、またはこれらの混合物が含まれる。本発明において使用するための例示的な単位経口剤形には錠剤が含まれ、これは、経口単位剤形を調製する上で使用することのできる、薬学的経口単位剤形を調製する任意の簡便な方法により調製することができる。錠剤などの経口単位剤形は、これらに限定されないが、放出調節剤、流動促進剤、圧縮補助剤、崩壊剤、潤滑剤、結合剤、香味剤、香味増強剤、甘味剤、および/または保存剤を含む1つまたは複数の従来の付加的製剤成分を含み得る。適切な潤滑剤には、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸カルシウム、硬化植物油、安息香酸ナトリウム、ロイシンカーボワックス、ラウリル硫酸マグネシウム、コロイド状二酸化ケイ素、およびモノステアリン酸グリセリンが含まれる。適切な流動促進剤には、コロイド状シリカ、ヒュームド二酸化ケイ素、シリカ、タルク、ヒュームドシリカ、石膏、およびモノステアリン酸グリセリンが含まれる。コーティングに使用できる物質には、ヒドロキシプロピルセルロース、酸化チタン、タルク、甘味剤、および着色剤が含まれる。
【０１５０】
本発明のさらなる精製MHCポリペプチドは、当技術分野において公知の種々の吸入および経鼻送達形態のいずれかにおいて調製し投与することができる。患者の副鼻腔または肺胞にエアロゾル化した精製MHC製剤を沈着させることのできる装置には、定量吸入器、ネブライザー、乾燥粉末発生器、噴霧器などが含まれる。全身作用のための薬物の肺送達に適した方法および組成物は、当技術分野において周知である。さらなる可能な送達法には、吸入による深肺送達が含まれる(Edwards et al., 1997；Service, 1997)。例えば鼻腔内スプレーまたは点鼻薬など、投与のための担体が液体である適切な製剤は、精製MHCポリペプチドの水性または油性溶液および任意のさらなる活性または不活性成分を含み得る。
【０１５１】
本発明のさらなる組成物および方法が、T細胞媒介性疾患の処置に向けた精製MHCポリペプチドの局所投与に対して提供される。局所用組成物は、例えば、エアロゾルスプレー、散剤、皮膚パッチ、貼付剤(stick)、顆粒剤、クリーム剤、ペースト剤、ゲル剤、ローション剤、シロップ剤、軟膏剤、含浸スポンジ、綿棒の形態で、または水性液体、非水性液体、水中油型乳剤、もしくは油中水型乳濁液中の溶液もしくは懸濁液として、皮膚科学的または粘膜的に許容される担体中に組み入れられた精製MHCポリペプチドおよび任意のその他の活性または不活性成分を含み得る。これらの局所用組成物は、局所用組成物または送達装置中に組み入れられる水またはその他の溶媒もしくは液体の部分に溶解または分散された精製MHCポリペプチドを含み得る。経皮的投与経路は当業者に公知の皮膚透過促進剤の使用により増強できることが容易に理解され得る。このような剤形に適した製剤には、そのような中で一般的に用いられる賦形剤が組み入れられ、詳細には例えば24時間といった長期間にわたり薬物の吸収を持続するための手段(例えば、構造または基質)が組み入れられる。経皮送達はまた、超音波導入などの技法により増強することもできる(Mitragotri et al., 1996)。
【０１５２】
さらなる精製MHCポリペプチド製剤が、例えば静脈内、筋肉内、皮下、または腹腔内といった非経口投与用に提供され、これには、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、および/または製剤を哺乳動物対象の血液と等張にする溶質を任意に含み得る水性および非水性滅菌注射液；ならびに懸濁剤および/または増粘剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液が含まれる。製剤は、単位用量容器または複数回用量容器中に提供され得る。精製MHCポリペプチド製剤はまた、非経口投与後に持続放出させるためのポリマーも含み得る。非経口調製物は、そのような投与に適した溶液、分散液、または乳濁液であってよい。本薬剤はまた、非経口投与後に持続放出させるためのポリマー中に製剤化することもできる。薬学的に許容される製剤および成分は典型的に、無菌であるかまたは容易に滅菌することができ、生物学的に不活性であり、かつ容易に投与される。そのようなポリマー材料は、薬学的調剤分野の当業者に周知である。非経口調製物は典型的に、緩衝剤および保存剤、ならびに水、生理的食塩水、平衡塩類溶液、デキストロース水溶液、グリセロールなどの薬学的および生理学的に許容される注射用液体を含む。即時注射溶液、乳濁液、および懸濁液を、前述したような散剤、顆粒剤、および錠剤から調製することもできる。好ましい単位用量製剤は、有効成分の上記のような1日量もしくは1日単位、1日の部分用量、またはこれらの適切な分割物を含むものである。
【０１５３】
より詳細な態様において、精製MHCポリペプチドは送達を目的として、例えばコアセルベーション技法によりもしくは界面重合により調製されたマイクロカプセル、微粒子、もしくはミクロスフェア、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン-マイクロカプセルおよびポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中に、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球体、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、およびナノカプセル)中に、ウイルスベクターを使用して、またはマイクロエマルジョン中に封入することができる。これらの方法を用いて核酸形態で精製MHCポリペプチドを細胞に送達し、その後宿主細胞により翻訳させることができる。
【０１５４】
組換えβ1α1およびα1α2分子の例示的適用例
本発明のクラスIIβ1α1およびクラスIα1α2ポリペプチドは、広範なインビトロおよびインビボでの適用例において有用である。事実、これらのポリペプチドの生物活性の結果、無傷の精製MHC分子またはMHC分子を発現する抗原提示細胞の代わりに、多くの適用において用いることができる。
【０１５５】
開示されるポリペプチドのインビトロでの適用例には、抗原特異的T細胞の検出、定量および精製が含まれる。これらの目的のために様々な形態のMHC由来複合体を使用する方法は周知で、例えば、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み入れられる米国特許第5,635,363号および第5,595,881号に記載されている。このような適用例において、開示されるポリペプチドは溶液中で遊離していてもよく、またはプラスチック製の皿、マイクロタイタープレート、メンブレン、またはビーズの表面などの固形支持体に結合していてもよい。典型的には、このような表面はプラスチック、ナイロンまたはニトロセルロースである。遊離溶液中のポリペプチドは、蛍光活性化細胞選別装置(FACS)などの適用例で有用である。抗原特異的T細胞の検出および定量のために、ポリペプチドは好ましくは蛍光マーカーなどの検出可能マーカーで標識される。
【０１５６】
検出、定量または他の操作をしようとするT細胞は概して、患者から採取した生体試料中に存在する。生体試料は一般に血液またはリンパであるが、リンパ節、腫瘍、関節などの組織試料である場合もある。試料中のT細胞を操作するために用いられる方法の正確な詳細は、実施しようとする操作の種類や、生体試料およびMHC分子両方の物理的形状に応じて異なることが理解されると思われる。しかし、一般的には、β1α1/ペプチド複合体またはα1α2/ペプチド複合体を生体試料に添加し、混合物を十分な時間(例えば約5分から最高で数時間)インキュベートして結合させる。MHC/ペプチド複合体に結合したT細胞の検出および定量は、MHC/ペプチドが蛍光標識を含む場合の蛍光顕微鏡法およびFACSを含む、いくつかの方法によって実施することができる。MHC/ペプチド複合体が固形支持体に結合している場合、ELISAおよびRIAなどの標準的なイムノアッセイも、T細胞-MHC/ペプチド複合体を定量するために用いることができる。抗原特異的T細胞集団の定量は、疾患の経過のモニターにおいて特に有用であると思われる。例えば、多発性硬化症の患者において、MBP反応性T細胞の数を減少させるために施した治療法の効果を、患者の体内に存在する該T細胞の数を定量するためにMHC/MBP抗原複合体を用いてモニターすることができる。同様に、癌患者における抗腫瘍T細胞の数を、MHC/腫瘍抗原複合体を用いて治療の経過を通して定量し、追跡することもできる。
【０１５７】
FACSは、T細胞-MHC/ペプチド複合体を生体試料から分離するためにも用いることができ、これは特定の抗原特異的T細胞集団を、濃縮させる目的などで試料から取り出す場合に特に有用であり得る。MHC/ペプチド複合体が磁気ビーズに結合されている場合、結合するT細胞集団はMiltenyi et al. (1990)によって記載されているとおりに精製することができる。一例として、養子免疫治療処置の一環として、癌患者の血中の抗腫瘍T細胞をこれらの方法を用いて精製し、インビトロで増殖させ、患者に戻すこともできる。
【０１５８】
生体試料中の特定の抗原特異的T細胞集団を、試料を標的T細胞によって認識されるペプチドを含むMHC/ペプチド複合体と共にインキュベートすることによって、アネルギー状態にすることができる。したがって、これらの複合体が他の共刺激分子の非存在下でTCRに結合すると、T細胞でアネルギー状態が誘導される。このようなアプローチは、様々な自己免疫疾患などの標的T細胞集団が自己抗原を認識する状況において有用である。または、生体試料を毒性部分を結合したMHC/ペプチド複合体と共にインキュベートすることによって、標的T細胞集団を直接死滅させることもできる。
【０１５９】
T細胞を、本発明のポリペプチドによって抗原特異的に活性化することもできる。例えば、開示されている特定の抗原をのせたMHCポリペプチドを、プラスチック製の皿または磁気ビーズなどの固体表面に高密度で付着させることができる。T細胞を固体表面上のポリペプチドに曝露することにより、共刺激分子の非存在下にも関わらず、抗原特異的にT細胞を刺激し活性化することができる。この活性化に共刺激が不必要であるということは、MHC/ペプチド複合体に結合するT細胞上の十分な数のTCRに起因する可能性が高い。
【０１６０】
1つの態様においては、サプレッサーT細胞が誘導される。したがって、適切な状況において複合体がTCRに結合した場合、サプレッサーT細胞がインビトロで誘導される。1つの態様においては、MHC/ペプチド複合体と共にインキュベートすることにより、エフェクター機能が改変され、サイトカインプロファイルが変化する。
【０１６１】
開示するポリペプチドのインビボ用途には、抗原特異的T細胞によって媒介される状態の改善が含まれる。このような状態には、これらに限定されないが、アレルギー、自己免疫疾患、移植片拒絶、移植拒絶(transplant rejection)、移植片対宿主病、望ましくない遅延型過敏症反応、またはT細胞媒介性肺疾患が含まれる。このような自己免疫疾患には、これらに限定されないが、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、セリアック病、多発性硬化症、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、関節リウマチ、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎、ぶどう膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、慢性ベリウム症、または特発性肺線維症が含まれる。他の研究者らは、これらの状態を処置するために使用できる様々な形態のMHCポリペプチドについて記載しており、そのような系で用いられる方法は本発明のMHCポリペプチドでも同様に有用である。例示的な方法は、米国特許第5,130,297号、第5,284,935号、第5,468,481号、第5,734,023号、および第5,194,425号(参照により本明細書に組み入れられる)に記載されている。一例として、自己反応性T細胞集団においてアネルギーを誘導するためにMHC/ペプチド複合体を対象に投与することができ、または毒性部分と結合したMHC/ペプチド複合体を投与することによりこれらのT細胞集団を処置することができる。または、MHC/ペプチド複合体を対象に投与して、Tサプレッサー細胞を誘導すること、またはサイトカイン発現プロファイルを改変することができる。開示する分子はまた、癌および感染症などの特定の状態において免疫応答を高めるために用いることもできる。
【０１６２】
開示するポリペプチドのインビボ用途には、脱髄または神経軸索の損傷もしくは消失の改善もまた含まれる。このような脱髄神経軸索損傷は、自己免疫疾患、ならびにこれらに限定されないが、多発性硬化症(MS)、パーキンソン病、アルツハイマー病、進行性多巣性白質脳症(PML)、播種性壊死性白質脳症(DNL)、急性播種性脳脊髄炎、シルダー病、橋中央ミエリン溶解(CPM)、放射線壊死、ビンスワンゲル病(SAE)、副腎白質ジストロフィー、副腎脊髄神経障害、レーバー遺伝性視神経萎縮、およびHTLV関連脊髄症を含む神経変性疾患などの自己T細胞媒介性疾患によって起こり得る。
【０１６３】
脱髄または神経軸索の損傷もしくは消失を処置する際には、処置を必要とする哺乳動物対象を含む対象にRTLを投与し得る。このような投与によりミエリンの変性を防ぐかまたはミエリンを修復することができ、加えて軸索の損傷または消失を防ぐ、減少させる、または修復することができる。処置を必要とする、ヒト対象を含む対象にRTLを投与することにより、自己免疫疾患または神経変性疾患などのT細胞媒介性疾患の進行を停止させるかまたは阻止することができる。このような処置はまた、このような疾患を発症するリスクのある対象においてT細胞媒介性疾患の再発または発症を予防するために予防的に施すことも可能である。
【０１６４】
本発明の組成物および方法はまた、炎症の処置を必要とする対象において炎症を処置するために施すこともできる。炎症は、中枢神経系(CNS)、脊髄、脾臓、またはその他の体組織中に存在してよい。本発明の組成物および方法を施して、CNS、脊髄、脾臓、もしくはその他の体組織への炎症細胞の浸潤を防ぐもしくは減少させること、または抗炎症因子を上方制御することができる。
【０１６５】
本発明の組成物および方法による処置は、単独で、またはこれらに限定されないが、インターフェロンβ-1a；インターフェロンβ-1b；酢酸グラチラマー；ミトキサントロン；コルチコステロイド；これらに限定されないが、バクロフェン、ダントロレン、チザニジン、シクロベンザプリン、クロナゼパム、およびジアゼパムを含む筋弛緩薬；これらに限定されないが、プロパンテリン、トルテロジン、およびジサイクロミンを含む抗コリン薬；オキシブチニンなどの尿路鎮痙薬；これらに限定されないがアミトリプチリンおよびイミプラミンを含む三環系抗うつ薬；これらに限定されないがデスモプレシンおよびDDAVPを含む抗利尿ホルモン；これらに限定されないが、カルバマゼピン、フェニトイン、およびアセタゾラミドを含む鎮痙薬；ペモリンを含む中枢神経系刺激薬；これらに限定されないが、シタロプラム、フルオキセチン、パロキセチン、およびセルトラリンを含む選択的セロトニン再取り込み阻害薬(SSRI)；ならびに非ステロイド性抗炎症剤を含むその他の治療剤との組み合わせ製剤として、もしくはそのような治療剤と協調して施すことができる。このような組み合わせ投与は同時にまたはいずれかの順で逐次的に行うことができ、一方のみまたは両方(またはすべて)の活性治療剤がそれらの生物活性を個別におよび/またはまとめて発揮する期間が存在し得る。
【０１６６】
当技術分野において公知であるか、またはこれらに限定されないが、2001年5月1日に出願された米国特許出願第09/847,172号；2000年5月1日に出願された米国仮特許出願第60/200,942号；2002年11月7日に発行された国際公開公報第02/087613A1号；米国特許第6,270,772号；1997年9月16日に出願された米国仮特許出願第60/064,552号；および1997年10月10日に出願された米国仮特許出願第60/064,555号；2003年9月5日に出願された米国仮特許出願第60/500,660号；2004年9月7日に出願された米国特許出願第10/936,467号；ならびに2004年7月8日に出願された米国仮特許出願第60/586,433号(それぞれすべての目的のために全体として参照により本明細書に組み入れられる)を含む本出願者らの先行特許出願に開示されている特徴、方法、または材料を使用する本発明の様々なさらなる局面を本明細書に提供する。
【０１６７】
以下の実施例は本明細書の特定の局面を説明するものであり、いかなる方法においても本発明の範囲を限定するものではない。
【０１６８】
実施例1
β1α1分子のクローニング、発現およびインビトロでの折り畳み
MHCクラスIIα1ドメインのアミノ末端がMHCクラスIIβ1ドメインのカルボキシ末端に遺伝的に連結された一本鎖のポリペプチド鎖をコードする原型の核酸構築物を作製した。ラットRT1B−およびβ鎖cDNAから作製した、この原型構築物の配列を図1Aに示す(SEQ ID NO：1)。
【０１６９】
cDNAをコードするRT1Bα1およびβ1ドメインを、Konrad Reske博士、ドイツ連邦共和国マインツから供与された、クローニングされたRT1Bαおよびβ鎖cDNAコード配列(それぞれα6、β118)のPCR増幅によって調製した(Syha et al., 1989；Syha-Jedelhauser et al., 1991)。β1合成のために用いたプライマーは
2008537736.tif 000003
(XhoI 5'プライマー)(SEQ ID NO：9)；
2008537736.tif 000004
(3'ライゲーションプライマー)(SEQ ID NO：10)であった。α1合成のために用いたプライマーは
2008537736.tif 000005
(5'ライゲーションプライマー)(SEQ ID NO：11)；
2008537736.tif 000006
(KpnI 3'プライマー)(SEQ ID NO：12)であった。用いた他のプライマーは
2008537736.tif 000007
(NcoI 5'プライマー)(SEQ ID NO：13)；および
2008537736.tif 000008
(XhoI 3'プライマー)(SEQ ID NO：14)であった。第1段階はβ1およびα1ドメインをコードするcDNAの産生であった。PCRはTaqポリメラーゼ(Promega、ウィスコンシン州マディソン)を用い、鋳型としてβ118、プライマーとしてXhoI 5'プライマーおよび3'ライゲーションプライマー、ならびに鋳型としてα6 cDNA、プライマーとして5'ライゲーションプライマーおよびKpnI 3'プライマーを用い、94.5℃20秒間の変性、55℃1.5分間のアニーリング、および72℃1.5分間の伸長を28サイクル行った。PCR産物をアガロースゲル電気泳動で単離し、Gene-Clean(Bio 101, Inc.、カリフォルニア州ラホヤ)を用いて精製した。
【０１７０】
第2段階において、これらの産物をプライマーを追加せずに混合し、94.5℃5分間の熱変性後、94.5℃1分間の変性、60℃2分間のアニーリング、および72℃5分間の伸長を2サイクル行った。第3段階において、アニーリングし、伸長した産物を94.5℃5分間熱変性させ、XhoI 5'プライマーおよびKpnI 3'プライマー存在下、94.5℃20秒間の変性、60℃1分間のアニーリングおよび72℃1分間の伸長を26サイクル行った。最終PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって単離し、Gene-Cleanによる精製を行った。これにより、β1 1分子をコードする656塩基対のcDNAが生成した。β1α1分子をコードするcDNAをクローニングベクターpCR2.1(Invitrogen、カリフォルニア州カールスバッド)中にInvitrogenのTA Cloning(登録商標)キットを用いてクローニングした。pCR2.1中のcDNAを鋳型として用い、NcoI 5'プライマーおよびXhoI 3'プライマーを用い、PCRを94.5℃20秒間の変性、55℃1.5分間のアニーリングおよび72℃1.5分間の伸長28サイクルにて実施した。PCR産物を適当な制限酵素で切断し、pET21d+(Novagen、ウィスコンシン州マディソン；Studier et al., 1990)中に方向を特定してクローニングした。構築物をDNA塩基配列決定により確認した。これらの試験に用いるβ1α1分子は、β1ドメインQ12Rアミノ酸の置換を含む点で、野生型とは異なっている。
【０１７１】
ペプチド/リンカーカートリッジ(図1Aに示す)の挿入のために、下記のアプローチを用いた。ペプチド/リンカーカートリッジ(図1Aに示す)の挿入のために、下記のアプローチを用いた。210bpのペプチド/リンカーカートリッジを、XhoI 5'プライマーおよび配列
2008537736.tif 000009
(3'-MBP-72-89/リンカーライゲーションプライマー)(SEQ ID NO：15)および鋳型として元の完全長β118 cDNAを用いて増幅した。ペプチド/リンカーカートリッジcDNAのアニーリングのために5'末端に突出部分を持つ559bpのcDNAを、プライマー
2008537736.tif 000010
(5'ペプチド/リンカーライゲーションプライマー)(SEQ ID NO：16)、およびKpnI 3'プライマーおよび増幅用の鋳型として656bpのβ1α1 cDNAを用いて合成した。2つのcDNAのアニーリングおよび伸長を行った結果、完全長750bpのβ1a1/MBP-72-89構築物が得られた。NcoI 5'プライマーおよびXhoI 3'プライマーを用いたpET21d+(Novagen、ウィスコンシン州マディソン；Studier et al., 1990)にサブクローニングするために、β1α1およびβ1α1/MBP-72-89 cDNAの5'および3'末端の改変を行った。MBP-55-69/リンカーカートリッジを合成するために用いたプライマーは、
2008537736.tif 000011
(5'MBP-55-69プライマー)(SEQ ID NO：17)および
2008537736.tif 000012
(3'MBP-55-69プライマー)(SEQ ID NO：18)であった。これらをゲル精製し、アニーリングし、次いでNcoIおよびXhoIで消化したβ1α1/MBP-72-89へのライゲーションのためにNcoIおよびXhoIで切断して、β1α1/MBP-55-69共有結合構築物をコードするプラスミドを作製した。モルモットMBP-72-89/リンカーカートリッジを合成するために用いたプライマーは、
2008537736.tif 000013
(5'Gp-MBP-72-89プライマー)(SEQ ID NO：28)および
2008537736.tif 000014
(3'Gp-MBP-72-89プライマー)(SEQ ID NO：29)であった。これらをゲル精製し、アニーリングし、次いでNcoIおよびXhoIで消化したβ1α1/MBP-72-89へのライゲーションのためにNcoIおよびXhoIで切断して、β1α1/Gp-MBP-72-89共有結合構築物をコードするプラスミドを作製した。CM-2/リンカーカートリッジを生成させるために用いたプライマーは、
2008537736.tif 000015
(5'CM-2プライマー)(SEQ ID NO：19)および
2008537736.tif 000016
(3'CM-2プライマー)(SEQ ID NO：20)であった。これらをゲル精製し、アニーリングし、次いでNcoIおよびXhoIで消化したβ1α1/MBP-72-89へのライゲーションのためにNcoIおよびXhoIで切断して、β1α1/CM-2共有結合構築物をコードするプラスミドを作製した。
【０１７２】
タンパク質発現を、細胞質中にジスルフィド結合を形成させるチオレドキシンレダクターゼ突然変異体(Derman et al., 1993)を含む、いくつかの異なる大腸菌株で試験した。このような小分子では、タンパク質を6Mの尿素を含む緩衝液中で可溶化し、精製した後に折り畳み構造に戻して、物質の最大収率は封入体から容易に得られることが明らかとなった。したがって、大腸菌株BL21(DE3)細胞をβ1α1をコードする配列を含むpET21d+構築物で形質転換させた。細菌をカルベニシリン(50μg/ml)を含むLuria-Bertani(LB)ブロスの1リットルの培養液中、37℃で対数中期(OD600＝0.6〜0.8)まで増殖させた。0.5mMイソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)の添加によって、組換えタンパク質の産生を誘導した。3時間インキュベーション後、細胞を遠心分離し、処理時まで-80℃で保存した。細胞のその後の操作はすべて4℃で行った。細胞ペレットを氷冷したPBS、pH7.4中に再度懸濁し、細胞懸濁液を塩/氷/水浴中で冷却しながら20秒間4回超音波処理した。次いで、細胞懸濁液を遠心分離し、上清画分を流し、細胞ペレットを再懸濁して、PBS中で3回洗浄し、次いで20mMエタノールアミン/6M尿素、pH10に再懸濁して4時間放置した。遠心分離後、関心対象となる可溶化組換えタンパク質を含む上清を集め、精製まで4℃で保存した。組換えβ1α1構築物を精製し、XK26/20カラム(Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ)中、Source 30Qアニオン交換媒質(Pharmacia Biotech)を用い、20mMエタノールアミン/6M尿素/1M NaCl、pH10による段階的勾配法を用いたFPLCイオン交換クロマトグラフィによって濃縮した。適当なサイズの均質なピークを集め、4℃、pH7.4でPBSに対して大量に透析し、Centricon-10メンブレン(Amicon、マサチューセッツ州ベバリー)を用いた遠心限外ろ過により濃縮した。タンパク質調製物から尿素を除去し、最終pHを低下させる透析段階の結果、発現されたタンパク質が自然に再生した。均質に精製するために、仕上げ段階でHR16/50カラム(Pharmacia Biotech)中、Superdex 75媒質(Pharmacia Biotech)におけるサイズ排除クロマトグラフィーを用いた。精製タンパク質の最終収率は、細菌培養液1Lあたり15から30mgの間で変動した。
【０１７３】
分子の配座上の完全性はゲルシフト解析で検出されたシステインβ15とβ79の間のジスルフィド結合の存在によって示され、精製タンパク質が本物であることはRT1Bに特異的なOX-6モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングによって確認された。円偏光二色性(CD)により、β1α1分子が非常に規則正しい二次構造を有することが明らかである。空のβ1a1分子は約30%のαヘリックス、15%のβストランド、26%のβターン、および29%のランダムコイル構造を含む。X線結晶学によって調べたクラスII分子の二次構造との比較により、β1a1分子がすべてのクラスII抗原結合ドメインに共通のβシートプラットフォーム/逆平行αヘリックス二次構造を有するという強力な証拠が得られる。さらに、熱変性により、分子の高度の協同性および安定性が明らかとなった。
【０１７４】
実施例2
β1α1分子はエピトープ特異的にTリンパ球を結合する
前述のとおりに作製したβ1α1分子の有効性(T細胞結合特異性)を、実験的自己免疫脳脊髄炎(EAE)システムを用いて調べた。EAEは、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)を含む中枢神経系ミエリン成分に特異的なCD4+ T細胞によって仲介される、麻痺性、炎症性で、時に脱髄性の疾患である。EAEはヒト脱髄性疾患MS(Paterson, 1981)と類似の免疫学的異常を示し、前臨床治療法を試験する有用なモデルである(Weiner et al., 1993；Vandenbark et al., 1989；Howell et al., 1989；Oksenberg et al., 1993；Yednock et al., 1992；Jameson et al., 1994；Vandenbark et al., 1994)。ルイスラットにおいて、優性の脳炎誘発MBPエピトープがペプチドの72〜89位に存在する(Bourdette et al., 1991)。EAEの臨床徴候は第10〜11日に発症し、侵襲性Tリンパ球の大部分がCNS中に局在する状態で、疾患は4〜8日間持続する。
【０１７５】
精製したβ1α1分子にのせるための試験ペプチドおよび対照ペプチドを下記の通りに合成した。Gp-MBP-69-89ペプチド
2008537736.tif 000017
、ラット-MBP-69-89ペプチド
2008537736.tif 000018
、Gp-MBP-55-69ペプチド
2008537736.tif 000019
、および心ミオシンペプチドCM-2
2008537736.tif 000020
(Wegmann et al., 1994)を固相法(Hashim et al., 1986)によって調製した。Gp-MBPペプチドはウシMBP配列(Vandenbark et al., 1994；Martenson, 1984)にしたがって番号を付けた。ペプチドをβ1α1と室温で24時間混合することにより、タンパク質：ペプチドモル比1：10でβ1α1上にのせ、その後はすべての操作を4℃で実施した。次いで透析またはCentricon-10メンブレンを用いた遠心限外ろ過で、遊離ペプチド濃度が2μM未満になるまで連続して希釈・濃縮することにより、遊離ペプチドを除去した。
【０１７６】
T細胞系統およびA1ハイブリドーマを下記の通りに調製した。短期Tリンパ球系統を、本来のラットリンパ節細胞またはVandenbark et al., 1985に記載のとおり12日前にGp-MBP/CFAで免疫化したラットまたは未処理のラットからMBP-69-89ペプチドにより選択した。本試験で用いたラットVβ8.2+ T細胞ハイブリドーマC14/BW12-12A1(A1)は、以前に記載されている(Burrows et al., 1996)。簡単に言うと、A1ハイブリドーマを、Gp-BP-72-89に特異的な脳炎誘発性LEW(RTl1) T細胞クローン(White et al., 1989；Gold et al., 1991)をTCR(α/β)を持たない胸腺腫BW5147(Golding et al., 1985)と融合することによって作製した。APC(放射線照射したルイスラット胸腺腫)存在下で抗原による刺激後、細胞増殖陽性のウェルをIL-2産生について試験紙、次いで限界濃度でサブクローニングした。A1ハイブリドーマは、APC存在下で最小エピトープMBP-72-89を含む全Gp-BPまたはGp-BP-69-89により刺激すると、IL-2を分泌する。
【０１７７】
二色免疫蛍光染色解析を、FACScan機器(Becton Dickinson、カリフォルニア州マウンテンビュー)上でCellQuest(商標)ソフトウェアを用いて実施した。関連のないアイソタイプが対合する対照抗体を用いて4領域(quadrant)を決定した。ペプチドをのせた、またはのせていないβ1α1分子をA1ハイブリドーマと4℃で17時間インキュベートし(10μMのβ1α1/ペプチド)、3回洗浄し、蛍光色素(FITCまたはPE)を結合したラットクラスII特異的抗体(OX6-PE)、およびTCR Vβ8.2(PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ)で室温、15分間染色し、フローサイトメトリーで分析した。CM-2細胞系統を結合していないOX6で1時間ブロックし、洗浄し、次いでA1ハイブリドーマと同様に処理した。染色培地はPBS、2%ウシ胎仔血清、0.01%アジドであった。
【０１７８】
エピトープ特異的結合を、β1α1分子に様々なペプチドをのせ、β1α1/ペプチド複合体をMBP-72-89ペプチドを認識するA1ハイブリドーマ(Burrows et al., 1997)、または心ミオシンCM-2-特異的細胞系統とインキュベートすることにより、評価した。図3Aに示すとおり、MBP-69-89ペプチドをのせたβ1α1構築物(β1α1/MBP-69-89)はA1ハイブリドーマに特異的に結合し、平均蛍光強度(MFI)0.8x103ユニットを示したのに対し、CM-2ペプチドをのせたβ1α1構築物(β1α1/CM-2)はハイブリドーマを染色しなかった。反対に、β1α1/CM-2はCM-2系統に特異的に結合し、MFIは1.8x103ユニットであったのに対し、β1α1/MBP-69-89複合体はCM-2系統を染色しなかった(図3B)。外因性的にペプチドをのせていないβ1α1構築物は、A1ハイブリドーマ(図3A)とCM-2系統のいずれにも結合しない。したがって、結合したエピトープはβ1α1/ペプチド複合体の特異的結合の方向であった。
【０１７９】
実施例3
蛍光標識に結合したβ1α1分子
β1α1/ペプチド分子とTCR(上で用いたOX-6など)との相互作用を視覚化する際に二次抗体の使用を避けるために、発色団と直接結合したβ1α1分子を作製した。Alexa-488(商標)色素(A488：Molecular Probes、オレゴン州ユージーン)はフルオレセインと類似のスペクトルを有するが、フルオレセイン結合体よりも明るく、光安定性の高いタンパク質結合体を生成する。図4に示すとおり、MBP-69-89をのせた場合、A488結合β1α1(色素/タンパク質のモル比＝1)は、A1ハイブリドーマに結合した(MCI＝300ユニット)が、空のβ1α1は結合しなかった。
【０１８０】
実施例4
β1α1分子はインビトロでエピトープ特異的T細胞増殖を阻害する
T細胞増殖解析を、以前に記載されている(Vandenbark et al., 1985)とおり、96穴プレート中で実施した。簡単に言うと、ウェルごとに200μl中4x105個の細胞(臓器刺激解析)または2x104個のT細胞および1x106個の放射線照射APC(短期T細胞系統)を、刺激培地のみ、Con A、またはIL-2(20ユニット/ml)の追加あり、もしくは追加なしのウェル3つずつで、RPMIおよび1%ラット血清中、7%CO2、37℃でインキュベートした。培養液を3日間、最後の18時間は[3H]チミジン(0.5μCi/10μl/ウェル)存在下でインキュベートした。細胞をグラスファイバーフィルター上に回収し、液体シンチレーションにより[3H]チミジン]の取り込みを評価した。いくつかの実験においては、T細胞をβ1α1構築物(ペプチドをのせた、またはのせていない)で24時間予備処理し、洗浄し、次いで前述のIL-2存在下または不在下での増殖解析に用いた。3つのウェルから1分あたりの平均カウント±SDを計算し、群間の差をスチューデントのt検定によって求めた。
【０１８１】
一定範囲の濃度(10nM〜20μM)のペプチドをのせたβ1α1複合体を、MBP-69-89ペプチド＋APC(抗原提示細胞)で刺激する前に、MBP-69-89特異的T細胞系統と予備インキュベートした。図5に示すとおり、MBP-69-89特異的T細胞の10nM β1α1/MBP-69-89複合体とのと予備インキュベーションによって増殖が有意に阻害された(＞90%)のに対し、20μM β1α1/MBP-55-69複合体との予備インキュベーションではわずかな(27%)阻害が認められたが、有意ではなかった。メカニズム上重要なことに、β1α1/MBP-69-89複合体によって阻害された反応は、T細胞系統刺激中に20ユニット/mlのIL-2を加えることによって完全に回復することができ(図5)、T細胞がβ1α1/MBP-69-89複合体への曝露によってアネルギー状態にされたことが示唆される。
【０１８２】
実施例5
抗原をのせたβ1α1分子はEAEの誘導を抑制し、存在する徴候を処置する
8〜12週齢の雌のルイスラット(Harlan Sprague-Dawley, Inc.、インディアナ州インディアナポリス)を本試験の臨床実験に用いた。ラットをオレゴン州ポートランドの退役軍人医療センター動物管理施設(Veterans Affairs Medical Center Animal Care Facility)で、施設のガイドラインにしたがい、無菌状態で飼育した。25μgのモルモットミエリン塩基性タンパク質(GP-MBP)または200μgのGP-MBP-69-89ペプチドを、それぞれ100または400μgの結核菌株H37Ra(Difco、ミシガン州デトロイト)で補足した完全フロイントアジュバントに加えたものをラットに皮下注入することにより、活動性EAEを誘発した。2つの乳濁液によって誘発した臨床疾患の経過は本質的に同じで、発症日、持続期間、最大の重症度、および累積疾患指数が同じであった。下記の臨床評点スケールにしたがって、ラットの臨床徴候の変化を毎日評価した。すなわち、0, 徴候なし、1, 尾部弛緩、2, 後肢脱力、3, 対麻痺、および4, 前肢脱力を伴う対麻痺、瀕死状態。各罹患ラットについてEAEの経過中毎日の障害スコアを合計することによって累積疾患スコアを得、各実験群について平均累積疾患指数(CDI)を計算した。
【０１８３】
疾患を誘発してから3日、7日、9日、11日、および14日目に、表示の通りにラットにβ1α1ペプチド複合体、ペプチドのみを与えるか、またはラットを未処置のままにしておいた。図6および表1に見られるように、生理食塩水中のβ1α1/MBP-69-89複合体 300μgを静脈内注射(i.v.)すると、EAEの臨床的および組織学的徴候の誘発が抑制された。
【０１８４】
（表１）対照ラットおよびβ1α1/MBP-69-89防御ラットにおけるEAEピーク時の浸潤性脊髄細胞の特徴づけ
2008537736.tif 000021
*細胞数/脊髄x10-3
【０１８５】
不連続パーコール勾配法によって脊髄単核細胞を単離し、以前に記載されている(Bourdette et al., 1991)とおりに計数した。細胞を、ラットCD4、CD8、CD11b、CD45ra、TCR Vβ8.2およびCD134(PharMingen、カリフォルニア州サンディエゴ)に特異的な蛍光色素(FITCまたはPE)結合抗体を用い、室温で15分間染色し、フローサイトメトリーで分析した。染色パーセントに脊髄あたりの全細胞数をかけることによって、脊髄あたりの陽性染色細胞数を計算した。対照およびβ1α1/MBP-69-89で防御したラットを臨床疾患のピーク時および回復時に屠殺した。脊髄を摘出し、10%緩衝ホルマリン中に固定した。脊髄をパラフィン包埋し、光学顕微鏡検査のために切片をルクソール・ファスト・ブルー-過ヨウ素酸シッフ-ヘマトキシリンで染色した。
【０１８６】
同じ時間経過にしたがっての、わずか30μgのβ1α1/MBP-69-89複合体注入も同様に有効で、6匹のラットのうち4匹でEAEを完全に抑制し、他の2匹においても軽度の徴候が認められたにとどまった。2μgのMBP-69-89ペプチドだけ(30μgの複合体に含まれる遊離ペプチドの用量)、または300μgの空のβ1α1構築物を投与した、未処置の対照群のラットはすべて、同程度の麻痺性EAEを発症した(表2)。興味深いことに、300μgの対照β1α1/CM-2ペプチド複合体を注入すると、EAEの軽度(約30%)の抑制を示す(図6および表2)。疾患の経過に平行して、ラットは劇的な体重減少を示した(図6)が、β1α1/MBP-69-89複合体で処置したラットは実験経過中有意な体重減少を見せなかった。
【０１８７】
（表２）ルイスラットにおけるβ1α1/ペプチド複合体のEAEに対する効果
2008537736.tif 000022
aEAEはGp-BP/CFAまたはMBP-69-89/CFAのいずれかで誘発した。
b2つの実験から合わせた対照。
c値は平均±S.D.を表す。
*P 0.05
**P 0.01
【０１８８】
確立された疾患に対する構築物の効果を評価するために、ルイスラットを疾患発症第1日に300μgのβ1α1/MBP-69-89複合体で処置し、48および96時間後に追跡注入を行った。対照ラットにおけるEAEは完全な後肢麻痺まで進行したのに対し、処置したどのラットにおいても疾患の進行は見られなかった(図7)。処置群におけるEAEの軽度の経過(平均累積指数、MCI＝3±0.13)は対照群のEAEの重度の経過(MCI＝11.2±2.7)に比べて有意に低かった(p＝0.013)が、疾患持続期間(6日)は両群で同じであった。
【０１８９】
脊髄組織切片に炎症性病変が全くないことと一致して、β1α1/MBP-69-89複合体によるEAEの抑制は活動性炎症細胞のCNSへの浸潤を本質的になくした。対照群および防御群の脊髄から、疾患のピーク時および回復時に単核細胞を単離し、FACS分析によって調べた。対照群の脊髄から臨床疾患ピーク時(第14日)に単離した単核細胞の合計数は、同じ時点で評価した防御群からのものよりも40倍高かった(表1)。さらに、防御群は対照群と比較して、脊髄の活性化(OX40+)、Vβ8.2+ T細胞が72%少なかった(表1)。CD4+およびCD8+ T細胞、マクロファージおよびB細胞の数も、防御群では有意に減少した。EAEから回復した後に単離した単核細胞の数は、防御群(0.64x105細胞/脊髄)では対照群(2.9x105細胞/脊髄)に比べて4.5分の1に減少した。また防御群のラットでは、疾患からの回復後に対照群ラットと比べて脊髄中の活性化(OX40+)、Vβ8.2+ T細胞が10分の1であった。
【０１９０】
β1α1/MBP-69-89複合体による処置は、MBP-69-89に対する遅延型過敏(DTH)反応を特異的に阻害した。図8Aに示すとおり、PPDによる攻撃から24時間後の耳の厚さの変化は、β1 1またはペプチドをのせたβ1α1で処置したラットでは影響を受けなかった。しかし、図8Bに示すとおり、β1α1単独またはCM-2との複合体で処置したラットはDTH反応に影響を受けなかったが、β1α1/MBP-69-89複合体で処置したラットはMBP-69-89に対するDTH反応の劇的な阻害を示した。
【０１９１】
β1α1/MBP-69-89複合体によるEAEの処置は、リンパ節(LN)T細胞反応の阻害も引き起こした。図9に示すとおり、抑制プロトコル(図6)で処置したラット由来のLN細胞は、MBPまたはMBP-69-89ペプチドに対して対照ラットの2〜4分の1に阻害された。LN T細胞のPPDに対する反応(CFA注入によって刺激)は処置群と対照群とで同じであったため、この阻害は抗原特異的であった。疾患発症後に処置したラットで試験したT細胞反応(図7)も、IL-2可逆的に阻害された。MBPおよびMBP-69-89ペプチドに対するLN細胞の反応は、低い抗原(Ag)濃度(4μg/ml)で最適(S.I＝4〜5x)で、IL-2の追加によって2倍に増強することができた。これに対して、処置したラットでは反応が阻害され、最適LN細胞反応(±3x)にはより高いAg濃度(20〜50μg/ml)が必要であった。しかし、IL-2存在下では、Ag濃度を追加することなく対照ラットと同等のレベル(S.I.＝6〜11x)まで反応を回復することができた。
【０１９２】
本実施例において、MHCクラスIIβ1およびα1ドメインを含むポリペプチドが記載されている。これらの分子には、β2ドメイン、CD4に結合することが知られているβ2ドメイン、ならびに膜貫通および細胞質内配列が欠けている。β1α1構築物の小さいサイズと複雑性によって、細菌封入体から高収率で分子を発現し、精製することが可能となる。β1α1分子は、対立遺伝子特異的ペプチドエピトープが結合できるような形で再生し、水性緩衝液中で優れた溶解性を有することが明らかにされている。ペプチド抗原と複合体を形成すると、結合特異性がペプチド抗原によって決定され、T細胞に対するβ1α1/ペプチド複合体の直接検出をFACSによって視覚化することができる。β1α1/MBP-69-89複合体は、インビトロおよびインビボでT細胞活性化に対する強力且つ選択的阻害作用を示す。その単純さ、生化学的安定性、生物学的性質、およびヒトクラスII相同体との構造的類似性の故に、β1α1構築物はTCRリガンドの新しいクラスを産生するための鋳型の代表となる。
【０１９３】
MBP-72-89に特異的なA1ハイブリドーマを用いた直接結合試験で、β1α1/MBP-69-89によりMFIがバックグラウンドの10倍に上昇する明確な染色が見られ、β1α1/CM-2または「空」のβ1α1では染色されなかった。反対に、CM-2特異的細胞系統を用いた結合試験では、β1α1/CM-2による強力な染色が認められ、β1α1/MBP-69-89による染色は見られなかった。したがって、結合したエピトープがβ1α1/ペプチド複合体の特異的相互作用を方向付けた。抗原特異的T細胞の同定は、標識した抗イディオタイプT細胞受容体抗体を特異的マーカーとして用いる小数のシステムで可能であった(McHeyzer et al., 1995；MacDonald et al., 1993；Walker et al., 1995；Reiner et al., 1993)が、可溶性ペプチド-MHC複合体のT細胞抗原受容体からの解離速度が本質的に速い(Corr et al., 1995；Matsui et al., 1994；Syulkev et al., 1994)ため、特異的T細胞をそのリガンドで染色する一般的アプローチは失敗に終わった。4ドメインの可溶性MHC分子を含む多量体ペプチド-MHC複合体が、抗原特異的Tリンパ球を染色するのに用いられており(Altman et al., 1996)、単一のT細胞上の複数のT細胞受容体(TCR)に結合する能力を有するため、それに対応して多量体分子の解離速度が遅くなると考えられる。β1α1/ペプチド複合体による染色は特異的ではあるが、飽和までに約10時間のインキュベーション期間を要した。β1α1/MBP-69-89複合体によるA1ハイブリドーマ、およびβ1α1/CM-2によるCM-2系統の非常に明るい染色パターンと、結合飽和状態に達するまでに必要な時間を併せ考えると、この分子がいったんTCRに結合すると非常に遅い解離速度を有することが示唆される。これらの複合体およびその改変体は、定量および回収を目的として抗原特異的T細胞を直接標識するのに非常に適していると思われる。
【０１９４】
β1α1/ペプチド複合体は、T細胞に結合し、その機能を阻害する能力において非常に特異的であった。MBP特異的T細胞のインビトロでの増殖はβ1α1/MBP-69-89複合体によって＞90%阻害され、インビボでは臨床および組織学的EAEのほぼ完全な阻害が認められた。
【０１９５】
β1α1/MBP-69-89で認められた最も重要な生物活性は、インビボでMBP-69-89特異的T細胞の脳炎誘発能をほぼ完全に除去する能力であった。EAE発症後に本複合体を注入すると、明らかにMBP-69-89特異的T細胞の全身活性化を直接阻害し、炎症細胞のCNSへの動員を妨害することによって、EAEの臨床および組織学的徴候をほぼ完全に抑制した。さらに、臨床徴候発症後にβ1α1/MBP-69-89を注入すると疾患の進行が阻止され、本分子構築物の治療上の可能性が示された。興味深いことに、すでに活性化されているT細胞に対する本複合体の効果は刺激を阻害するのみならず、抗原に対する感受性も低下させ、処置後の最適な活性化には抗原濃度を10倍に上げる必要があった。
【０１９６】
薬品工学および設計の観点から、この基本型分子は大きな躍進を意味する。EAEにおいて認められたβ1α1/MBP-69-89複合体の生物学的有効性により、CNSタンパク質を対象とする炎症T細胞に関与すると考えられる、多発性硬化症などの自己免疫疾患処置のためのヒト相同体を作製する鋳型として本構築物を使用する可能性が高まる。一つの候補分子は、疾患に関連するクラスIIアレルと、対照群に比べてMS患者群により高頻度で認められることが報告されている既知の免疫優性エピトープとの両方を含む、HLA-DR2/MBP-84-102である。しかし、複数のCNSタンパク質およびその成分エピトープに対するT細胞の反応が複雑であるために、より全般的な治療にはいくつかのMHC/Ag複合体の混合物が必要であると考えられる。本明細書において報告した新規β1α1/MBP-69-89複合体によって誘発された阻害の精度は、強力且つ選択的なヒト治療剤の開発における重要な第一歩である。この新しいクラスの試薬によって、標的自己抗原であることが疑われる物質に特異的なT細胞の頻度および普及率を直接定量し、次いで罹患患者においてこのようなT細胞を選択的に除去することができると考えられる。この検出および治療の過程を通して、疑われる各T細胞の特異性が発病におよぼす影響を初めて確立することができると考えられる。
【０１９７】
実施例6
HLA-DR2由来のヒト組換えT細胞受容体リガンドの設計、操作、および生成
実験手順
相同性モデリング
ヒト、ラット、およびマウス種由来のMHCクラスII分子の配列アライメントから、これらの研究の出発点がもたらされた(Burrows et al., 1999)。Brookhaven Protein Data Bank(Brookhaven National Laboratories、ニューヨーク州アプトン)に寄託されている座標を用いて、プログラムSybyl(Tripos Associates、ミズーリ州セントルイス)およびO2ワークステーション(IRIX 6.5、Silicon Graphics、カリフォルニア州マウンテンビュー)によりグラフィック画像を作成した。構造に基づく相同性モデリングは、ヒトDR2(Smith et al., 1998；Li et al., 2000)およびDR1(Brown et al., 1996；Murthy et al., 1997)、マウスI-E k分子(Fremont et al., 1996)、ならびにサソリ毒(Zhao et al., 1992；Housset et al., 1994；Zinn-Justin et al., 1996)の微細な結晶座標に基づいた。ヒトDR2(PDBアクセッション番号1BX2)のアミノ酸残基を使用した。いくつかの残基が結晶データ中で欠けていた/存在していなかったため(Smith et al., 1998)、正確な側鎖を挿入し、構造の緻密化の過程で局所エネルギー最小化を用いてペプチド骨格を剛体としてモデル化した。
【０１９８】
組換えTCRリガンド(RTL)
ヒトRTLを生成するため、RPMI培地で培養したL466.1細胞からmRNAを単離した(Oligotex Direct mRNAミニキット；Qiagen, Inc.、カリフォルニア州バレンシア)。SuperScript II Rnase H逆転写酵素(Gibco BRL、ニューヨーク州グランドアイランド)を用いて、第一鎖の合成を行った。
【０１９９】
鋳型源として第一鎖反応物を使用し、DRB*1501およびDRA*0101 DNA配列の所望の領域を、Taq DNAポリメラーゼ(Gibco BRL、ニューヨーク州グランドアイランド)を用いてアニーリング温度55℃でPCRにより増幅した。β1を作製するために使用したプライマーは、
2008537736.tif 000023
および
2008537736.tif 000024
であった。α1を作製するために使用したプライマーは、
2008537736.tif 000025
および
2008537736.tif 000026
であった。
【０２００】
増幅反応物をゲル精製し、所望のバンドを単離した(QIAquickゲル抽出キット；Qiagen, Inc.、カリフォルニア州バレンシア)。各プライマーの5'末端の突出尾部により、各PCR増幅産物の末端に重複部分および制限部位(NcoIおよびXhoI)が付加された。2本の鎖を2段階PCR反応により連結した。第1段階では、各精製増幅産物 5μlをプライマーなしのPCR反応液 50μlに添加し、アニーリング温度55℃で5回サイクリングさせた。次いで、huNcoI→およびhuXhoI←プライマーを含む反応混合液 50μlを、最初の反応液に直接添加し、アニーリング温度50℃で25回サイクリングさせた。Taq DNAポリメラーゼ(Promega、ウィスコンシン州マディソン)を各段階で使用した。最終反応液 100μlをゲル精製し、所望のhuβ1α1増幅産物を単離した。
【０２０１】
huβ1α1挿入物をPCR 2.1プラスミドベクター(TA Cloningキット、Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)と連結し、INVa'F細菌クローニング宿主に形質転換した。PCRコロニースクリーニングを用いて単一の陽性コロニーを選択し、そこからプラスミドDNAを単離した(QIAprep Spinミニキット、Qiagen, Inc.、カリフォルニア州バレンシア)。プラスミドをNcoIおよびXhoI制限酵素(New England BioLabs Inc.、マサチューセッツ州ベバリー)で切断し、ゲル精製し、huβ1α1 DNA断片を単離した。huβ1α1 DNA挿入物をNcoI/XhoIで消化したpET-21d(+)プラスミド発現ベクター(Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マディソン)と連結し、BL21(DE3)発現宿主(Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。PCRコロニースクリーニングおよびタンパク質発現スクリーニングに基づいて、細菌コロニーを選択した。
【０２０２】
陽性コロニーからプラスミドDNAを単離し(QIAquickゲル抽出キット、Qiagen Inc.、カリフォルニア州バレンシア)、T7プライマー
2008537736.tif 000027
およびT7ターミネータープライマー
2008537736.tif 000028
を用いて配列決定した。配列を確認したのち、huβ1α1ペプチド(RTL300)の発現用に単一クローンを選択した。
【０２０３】
「空の」huβ1α1(RTL300)コード配列のβ1鎖のArg5とPro6の間に、30アミノ酸huMBP-85-99/ペプチドリンカーカートリッジを遺伝子挿入した。ペプチド-Agおよびリンカーをコードする90 bp DNA配列を、Taq DNAポリメラーゼ(Promega、ウィスコンシン州マディソン)を用いて3段階PCR反応でRTL300 DNA構築物の16位に挿入した。
【０２０４】
第1段階では、pET-21d(+)/RTL300プラスミドを2つの別個のPCR反応の鋳型として使用した。第一反応では、pET-21d(+)プラスミドのT7プライミング部位の開始点からhuβ1α1(RTL300)配列内の挿入点までの領域を以下のプライマーを用いて増幅した。
2008537736.tif 000029
および
2008537736.tif 000030
【０２０５】
第二反応では、huβ1α1(RTL300)配列内の挿入点からT7ターミネータープライミング部位の末端までの領域を以下のプライマーを用いて増幅した。
2008537736.tif 000031
および
2008537736.tif 000032
【０２０６】
各反応物をゲル精製し、所望のバンドを単離した。
【０２０７】
第2段階において、各精製増幅産物 5μlをプライマーなしの「アニール伸長」PCR反応混合液に添加し、アニーリング温度50℃で5回サイクリングした。第3段階では、プライマー
2008537736.tif 000033
およびプライマー
2008537736.tif 000034
を含むPCR「増幅混合液」50μlを次に「アニール伸長」反応液に直接添加し、全量をアニーリング温度55℃で25回サイクリングした。huMBP-85-99lig←プライマーの非相補的5'尾部は、ペプチド/リンカーカートリッジ全体をコードするDNAおよび挿入点から下流の領域を含んでいた。
【０２０８】
得られた増幅産物は第二反応で生成されたPCR産物と、それぞれの相補的な3'および5'末端を介して容易にハイブリダイズした。次いで、DNAポリメラーゼにより各プライマーの3'末端から伸張させ、全長huβ1α1/huMBP-85-99(RTL301)構築物を作製し、これを「増幅」段階における鋳型とした。アガロースゲル電気泳動を用いて反応物を精製し、所望のhuβ1α1/huMBP-85-99(RTL301)バンドを単離した。次いで、PCR産物をNcoIおよびXhoI制限酵素で切断し、ゲル精製し、同様に切断したpET-21d(+)プラスミド発現ベクターと連結し、BL21(DE3)大腸菌発現宿主に形質転換した。形質転換体をタンパク質発現、およびPCRコロニースクリーニングを用いて所望の挿入物の存在に関してスクリーニングした。陽性クローン数個からプラスミドDNAを単離し、配列決定した。huβ1α1/huMBP-85-99ペプチド(RTL301)の発現用に単一の陽性クローンを選択した。
【０２０９】
pET-21d(+)/RTL300およびpET-21d(+)/RTL301プラスミドDNA構築物の配列解析を繰り返すことで、HLA-DRA*0101(Genbankアクセッション#M60333)について以前に報告されていたものからの、358位および458位(それぞれRTL300およびRTL301での番号づけ)における同様のチミンからシトシンへの一塩基対逸脱が明らかになり、これはRTL300およびRTL301分子においてF150L変異(RTL301の番号づけ)をもたらした。
【０２１０】
部位特異的突然変異誘発を用いて、この配列をGenbank#M60333配列に復帰させた。pET-21d(+)/RTL300およびpET-21d(+)/RTL301プラスミドを鋳型として使用して、2つのPCR反応を行った。RTL300については、プライマー
2008537736.tif 000035
および
2008537736.tif 000036
を使用した。
【０２１１】
RTL301については、プライマー
2008537736.tif 000037
および
2008537736.tif 000038
を使用した。
【０２１２】
得られた2つの増幅産物をゲル精製して単離し(QIAquickゲル抽出キット、Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)、PCR産物それぞれの相補的な3'末端および5'末端に基づいて前記の通りにアニーリングして、増幅した。最終増幅反応物をゲル精製し、所望のPCR産物を単離した。次いで、それぞれ隣接しているNcoIおよびXhoI制限部位を用いて新たなpET-21d(+)プラスミドにRTL DNA構築物をサブクローニングし、これをBL21(DE3)コンピテント細胞に形質転換し、プラスミド配列を確認した。「空の」HLA-DR2β1α1由来RTL302分子およびMBP-85-99ペプチド結合RTL303分子の発現用に、陽性クローンを選択した(図2)。
【０２１３】
RTL構築物の発現およびインビトロ折り畳み
大腸菌株BL21(DE3)細胞をpET21d+/RTLベクターで形質転換した。細菌を、カルベニシリン(50μg/ml)を含むLuria-Bertani(LB)ブロスの培養液1リットル中で、37℃で対数期中期(OD600＝0.6〜0.8)まで培養した。0.5mMイソプロピルβ-D-チオガラクトシド(IPTG)の添加により、組換えタンパク質の産生を誘導した。3時間インキュベートした後、細胞を遠心分離により回収し、処理時まで-80℃で保存した。細胞のその後の操作はすべて4℃で行った。細胞ペレットを氷冷PBS、pH7.4に再懸濁し、細胞懸濁液を塩/氷/水浴中で冷却しながら20秒間4回超音波処理した。次いで、細胞懸濁液を遠心分離して上清画分を捨て、細胞ペレットを再懸濁してPBSで3回洗浄し、次いで20mMエタノールアミン/6M尿素、pH10に再懸濁して4時間放置した。遠心分離後、関心対象の可溶化組換えタンパク質を含む上清を回収し、精製するまで4℃で保存した。
【０２１４】
20mMエタノールアミン/6M尿素/1M NaCl、pH10による段階的勾配を用いて、XK26/20カラム(Pharmacia Biotech、ニュージャージー州ピスカタウェイ)中のSource 30Q陰イオン交換媒質(Pharmacia Biotech)を用いるFPLCイオン交換クロマトグラフィーにより、関心対象の組換えタンパク質を精製し濃縮した。タンパク質を20mMエタノールアミン、pH10.0に対して透析し、これによって尿素が除去され、組換えタンパク質の再折り畳みが行われた。この段階は重要であった。RTL分子構築物はいずれも正確な折り畳みに塩基性緩衝液を必要とし、その後この構築物を4℃でPBSに透析し、Centricon-10メンブレン(Amicon、マサチューセッツ州ベバリー)による遠心限外濾過により濃縮することができた。均一になるまで精製するため、HR16/50カラム(Pharmacia Biotech)中のSuperdex 75媒質(Pharmacia Biotech)でのサイズ排除クロマトグラフィーを用いる最終段階を含めた。精製タンパク質の最終収率は、15〜30mg/L細菌培養液の間で変動した。
【０２１５】
円二色性および熱遷移の測定
IF-500デジタルインターフェース、およびペプチド濃度に応じた2、1、0.5、0.1、および0.05mm光路長のサーモスタット制御石英セル(Hellma、ドイツ、ミュールハイム)を備えたJASCO J-500A分光偏光計で、CDスペクトルを記録した。データは、平均残基重量楕円率として表す。較正は一定の間隔で、(+)-10-カンファースルホン酸(Sigma)を用いて、290.5nmおよび192.5nmでそれぞれモル楕円率7780および16,160deg.cm2/dmolになるよう行った(Chen et al., 1977)。一般にスペクトルは、4秒時定数でスキャン速度5nm/分で記録した260〜180nmの4〜5スキャンの平均であった。データは0.1nm間隔で収集した。Jascoプログラムの内蔵アルゴリズムを用いてスペクトルを平均化および平滑化し、緩衝液基準を減算した。プログラムCONTIN(Provencher et al., 1981)により二次構造を推定した。222nmの固定波長で熱遷移曲線を記録した。プログラム制御の循環水浴(Lauda PM350およびRCS20D)で5℃〜90℃または95℃の温度勾配を作成した。加熱および冷却速度は12〜18℃/hであった。サーミスタおよびデジタル温度計(Omega Engineering)でセル中の温度をモニターし、XYプロッタ(HP7090A、Hewlett Packard)で記録およびデジタル化し、ディスクに保存した。遷移曲線は、標準的な式：F＝([U]−[U]u)/([U]n−[U]u)(式中、[U]nおよび[U]uはそれぞれ完全に折り畳まれたおよび完全にほどけた種の楕円率値を表し、[U]は222nmで観察される楕円率である)を用いて、折り畳まれたペプチドの比(F)に対して標準化した。
【０２１６】
実施例7
相同性モデリング
以前のタンパク質工学研究では、ラットMHCクラスII RT1.Bのα-1およびβ-1ドメインに由来する組換えT細胞受容体リガンド(RTL)について記載している(Burrows et al., 1999)。ヘテロ二量体MHCクラスIIタンパク質HLA-DR2、特に抗原結合ドメインを含むこの分子のα-1およびβ-1部分の相同性モデリング研究を、ヒトDRの結晶構造(Smith et al., 1998；Li et al., 2000；Brown et al., 1993；Murthy et al., 1997)に基づいて行った。本明細書に記載するモデリング研究では、供給源タンパク質の組織化および構造の3つの面に焦点をおいた：(1) βシートプラットフォームの膜近位面とα-2およびβ-2 Ig折り畳みドメインの膜遠位面との間の界面、(2) ペプチド結合/TCR認識ドメインを含むα-1およびβ-1ドメインの内部水素結合、および(3) TCRと相互作用すると考えられるRTLの表面。
【０２１７】
ヒトDRおよびマウスI-EKのβ-1ドメインとβ-2ドメインとの間の一次配列に相当する領域の側鎖密度から、結晶構造が無秩序であるという証拠が示され(Smith et al., 1998；Li et al., 2000；Brown et al., 1993；Murthy et al., 1997；Fremont et al., 1996)、残基側鎖が溶液中で高度の運動自由度を有して、これらの領域が2つのドメイン間のリンカー領域として働くという概念が支持される。MHCクラスII DR1およびDR2の高分解能結晶は(Smith et al., 1998；Li et al., 2000；Brown et al., 1993；Murthy et al., 1997)、βシートプラットフォームの膜近位面とα2およびβ2 Ig折り畳みドメインの膜遠位面との間に多くの水分子を含んでいた。Brookhaven Protein Data Baseから入手できるヒトDR2の結晶座標(1BX2)を用いて、Michael Connollyによって開発されたアルゴリズム(Connolly, 1986)によりβ1α1およびα2β2 Ig折り畳みドメインの分子表面を作成することにより、ドメイン間の相互作用表面積を定量化した。このアルゴリズムにおいて、分子表面は、穴およびノブを指す「重要点」によって表される。穴(形状関数の最大値)はノブ(最小値)と一致する。α1β1およびα2β2-Ig折り畳みドメインの表面積を、水分子ほどの大きさの半径0.14nmのプローブへの接近性により規定して、個別に計算した。MHCクラスIIαβヘテロ二量体の表面積は160nm2であるのに対し、RTL構築物の表面積は80nm2であり、α2β2-Ig折り畳みドメインの表面積は90nm2であった。RTL表面の約15nm2(19%)が、MHCクラスIIαβヘテロ二量体においてIg折り畳みドメインとの界面に埋もれていた。
【０２１８】
ヒト、ラット、およびマウスMHCクラスIIα鎖は30%の同一性を共有し、β鎖は35%の同一性を共有する。X線結晶学を用いて解析した構造の骨格形跡から、重ねた場合に強力な相同性が示され、進化的に保存された構造モチーフが示唆される。分子間の変動は主にペプチド結合溝を表す残基内にあり、側鎖置換が異なった抗原性ペプチド結合を可能にするよう設計されている。HLA-DRのα1およびβ1ドメインは、広範な水素結合ネットワークおよび緊密に詰め込まれ埋もれた疎水性コアを示した。この三次構造は、サソリ毒に特有のαヘリックス/βシート骨格に構造的完全性および熱力学的安定性を付与する分子特性と類似しているようである(Zhao et al., 1992；Housset, et al., 1994；Zinn-Justin et al., 1996)。MHCクラスII分子のβ1ドメインは、カルボキシル末端をβ1ドメインによって付与される逆平行βシートプラットフォームの第一鎖に共有結合するジスルフィド結合を含む。この構造はラット、ヒト、およびマウスのMHCクラスII分子間で保存されており、MHCクラスIのα2ドメイン内でも保存されている。これは、その三次構造を維持しつつ分子内の一次配列多様性を可能にする「要」として働き、重要な機能を果たしていると考えられる。さらに、保存された芳香族側鎖の「ネットワーク」(Burrows, et al, 1999)がRTLを安定化していると考えられる。本明細書に記載する研究から、抗原結合ドメインが、α2およびβ2 Ig折り畳みドメインの非存在下において安定した状態を維持することが実証される。
【０２１９】
実施例8
RTLの発現および生成
HLA-DR2α-1ドメインのアミノ末端をコードする配列をβ-1ドメインのカルボキシ末端をコードする配列につなぎ合わせることにより、新規遺伝子を構築した。この設計を有するタンパク質にRTL(「組換えTCRリガンド」)という用語を使用した(米国特許第6,270,772を参照されたい)。ここに記載する研究では、天然配列を有する「空の」RTL(RTL302)、ヒトMBP-85-99抗原性ペプチドを含む共有結合構築物(RTL303)、および生物活性が排除された、フェニルアラニンからロイシンへの単一変化(F150L、RTL303の番号づけ)を有するこれら分子の変形(RTL300、「空」；RTL301、MBP-85-99を含む)を使用した実験を提示する(図13を参照されたい)。以前の研究から、6M尿素を含む緩衝液中で可溶化および精製した後にタンパク質が再度折り畳まれ、細菌封入体から物質の最大収量が容易に得られることが実証された(Burrows et al., 1999)。RTLの精製は正攻法で行い、イオン交換クロマトグラフィーおよびその後のサイズ排除クロマトグラフィーを含めた(図14)。
【０２２０】
精製後、タンパク質を20mMエタノールアミン、pH10.0に対して透析し、これによって尿素が除去され、組換えタンパク質の再折り畳みが行われた。この段階は重要であった。RTL分子構築物はいずれも正確な折り畳みに塩基性緩衝液を必要とし、その後この構築物をインビボ試験のために4℃でPBSに透析することができた。「空の」RTLおよび抗原性ペプチド結合RTLの最終収率は、約15〜30mg/リットル培養液であった。
【０２２１】
実施例9
ヒトRTLの生化学的特徴づけおよび構造解析
天然のジスルフィド結合を再構成するためのシステイン46および110(RTL303アミノ酸の番号づけ、DR2β鎖残基15および79に相当する)の酸化が、ゲルシフトアッセイにより実証された(図15)。このアッセイでは、還元剤β-メルカプトエタノール(β-ME)を含むまたは含まない同一試料を5分間煮沸してからSDS-PAGEに供した。β-MEの非存在下ではジスルフィド結合が保持され、タンパク質は典型的に、構造がより小型であるために電気泳動過程においてアクリルアミドゲル中でより高い移動度を示す。この解析の代表的な例を「空の」RTL300およびRTL302、ならびにMBP結合RTL301およびRTL303分子について示す(図15)。生成されたRTL分子はいずれもこのパターンを示し、天然の保存されたジスルフィド結合の存在が示される。これらのデータから、分子の高次構造的完全性が確認される。
【０２２２】
円二色性(CD)から、RTL302およびRTL303の非常に規則正しい二次構造が実証された(図16；表3)。RTL303は約38%のαヘリックス、33%のβストランド、および29%のランダムコイル構造を含んでいた。X線結晶学によって決定されたクラスII分子の二次構造(Smith et al., 1998；Li et al., 2000；Brown et al., 1993；Murthy et al., 1997；Fremont et al., 1996)と比較することにより、RTL303が、すべてのクラスII抗原結合ドメインに共通したβシートプラットフォーム/逆平行αヘリックス二次構造を共有するという強力な証拠がもたらされた(表3、図16)。
【０２２３】
（表３）RTLおよびMHCクラスIIβ-1/α-1ドメインの二次構造解析
2008537736.tif 000039
aF150LはRTL303の番号づけに基づく(図2を参照)。
BRTL300のCDデータは、変数選択法を用いてフィッティングできなかった。
cβシートは、平行および逆平行βシートならびにβターン構造を含む。
【０２２４】
熱変性時の構造消失から、本研究で使用したRTLが協調的に折り畳まれていることが示された(図17)。RTL303では構造の半分が消失する温度(Tm)は約78℃であり、これはラットRT1.B MHCクラスII由来RTL201について測定されたものと類似している(Burrows et al., 1999)。共有結合したAgペプチドを含まないRTL302は、RTL303と比較してαヘリックス含量の32%の減少を示した(表3)。ヘリックス含量のこの減少は、RTL303と比較した36%(28℃)の温度安定性の減少を伴い、ペプチド結合を伴うRTL分子の、および推論ではあるがMHCクラスII分子の抗原提示プラットフォームの安定化が実証される。さらに、この傾向はラットRTL分子を用いて観察されたものと類似しているが(Burrows et al., 1999)、共有結合したペプチドによって付与される安定化はラットRTLと比較してヒトRTLでは約3倍高い。
【０２２５】
F150L改変RTL301分子は、RTL303と比較してαヘリックス含量の48%の減少(表3)および熱安定性の21%(16℃)の減少を示した。F150L改変を有し、共有結合したAgペプチドを欠くRTL300は、熱変性研究において構造消失中に協同性を示したが、RTL302およびRTL303と比較して極めて不安定であり(Tm＝48℃)、CDデータから二次構造を決定することができなかった(図16、17；表3)。熱安定性データに関する説明が、DR2aおよびDR2b MHCクラスII結晶構造(PDBアクセッションコード1FV1および1BX2；Smith et al., 1998；Li et al., 2000)による座標を用いた分子モデリング研究によってもたらされる。これらの研究から、F150が、ヒトクラスII分子において完全に保存され、ラット、マウス、およびヒトMHCクラスIIの間で高度に保存されている二次構造モチーフを安定化すると考えられる芳香族側鎖の保存されたネットワークの一部である、RTL構造の疎水性コア内の中心残基であることが実証される(図18)。
【０２２６】
（表４）F150aの4Å内の残基の相互作用
2008537736.tif 000040
aF150(RTL303の番号づけ)はDR2のβ鎖のF24である。距離は1BX2(Smith et al., 1998)による座標を用いて計算した。
b残基は図7に示す通りに番号づけし、括弧内に1BX2残基番号を示す。例えば、F150.CE2は、B:F24.CE2；ヘテロ二量体1BX2結晶構造のB鎖上の残基F24の原子CE2と等価である。C鎖は結合している抗原性ペプチドである。
【０２２７】
このモチーフは、3本の逆平行βシートストランドを、α-1ドメインの2つαヘリックス部分の間にある中央の構造化されていないひと続きのポリペプチドにつなぐ。構造モチーフはα-1ドメイン内に位置し、結合しているAgペプチドのアミノ末端が現れるペプチド結合溝の末端でα-1ドメイン面を「なしている(cap)」。
【０２２８】
このようにして、ヒトMHCクラスII分子DR2の抗原結合β1およびα1ドメインから可溶性一本鎖RTL分子が構築された。RTLは、α2ドメイン、CD4に結合することが知られているβ2ドメイン、ならびに膜貫通および細胞質内配列を欠いている。RTLでは大きさが減少するために、分子を発現させ、細菌封入体から高収率で精製することが可能になる(15〜30mg/L細胞培養液)。RTLはPBSへの透析により再度折り畳まれ、水性緩衝液中で優れた可溶性を有した。
【０２２９】
本明細書において提供するデータから、ヒトDR2由来RTL302およびRTL303が、天然MHCクラスII構造に関する結晶学的データと一致する、構造的および高次構造的完全性を保持することが明らかに実証される。MHCクラスII分子は、抗原性ペプチドを結合し、これを適切なT細胞受容体に提示する安定なヘテロ二量体を形成する(図12)。このモデルを支持する実質的な構造的および理論的証拠が存在するものの(Brown et al., 1993；Murthy et al., 1997；Fremont et al., 1996；Ploegh et al., 1993；Schafer et al., 1995)、MHCクラスII分子によって提供される状況的情報が抗原提示、T細胞認識、およびT細胞活性化において果たす正確な役割は明らかにされていない。本明細書に記載したアプローチでは、合理的なタンパク質工学を用いて、X線結晶学的データによる構造情報を組換えDNA技術と組み合わせ、天然のMHCクラスIIペプチド結合/T細胞認識ドメインに基づく一本鎖TCRリガンドを設計し生成した。天然分子において、このドメインは、最も単純には、その上で2つの逆平行ヘリックス部分が相互作用して抗原結合溝を形成するβシートプラットフォームと称される、共に折り畳まれて三次構造を形成するαおよびβポリペプチド鎖の一部に由来する。MHCクラスIIのペプチド結合溝が開口端であることを除いて、類似の構造がMHCクラスI分子のα-1およびα-2ドメインをコードする単一エキソンによって形成され、ペプチド結合/T細胞認識ドメインおよび抗原性ペプチドリガンドをコードする単一エキソン構築物の操作が可能になる(Kozono et al., 1994)。
【０２３０】
薬物工学および設計の観点から、この原型分子は大きな躍進を意味する。本明細書に記載のヒトRTL分子の開発では、ペプチド結合部(プラットフォーム2β2 Ig折り畳みドメインから1β1ドメイン)を分離し、相互に、およびT細胞受容体とMHC/ペプチドとの結合過程においてAPCとT細胞との間の細胞表面界面で起こる情報交換の巨大なネットワークから、それらの生化学的および生物学的特性を個別に研究することを可能にしている。本明細書に記載のヒトRTLの開発により、天然TCRリガンドがプラットフォーム(MHCクラスIIの2β2 Ig折り畳みドメイン)から独立して果たす特定の役割を入念に評価することが可能になる。
【０２３１】
RTL303は、APCまたは共刺激分子の非存在下でペプチド特異的Th1細胞クローンと共にインキュベートした場合、TCRを介して、定量化可能なシグナル伝達過程の一部を惹起した。これには、迅速なζ鎖リン酸化、カルシウム動員、およびERKキナーゼ活性の減少、ならびにIL-10産生が含まれた。RTL303のみを添加しても、増殖は誘導されなかった。同族RTLで前処置した後にAPCおよびペプチドで再刺激したT細胞クローンは、増殖するおよびIL-2を分泌する能力が減少し、より少ないIFN-γを分泌した(重要なことには、IL-10産生は持続した(以下を参照されたい))。これらのデータから、共活性化分子によって提供されるシグナルの非存在下で、外部TCR界面との直接的結合によって誘導される初期シグナル伝達事象が初めて解明される。
【０２３２】
モデリング研究から、β1α1ドメインとα2β2-Ig折り畳みドメインとの間の界面に関するいくつかの興味深い特徴が明らかになった。α1およびβ1ドメインは、広範な水素結合ネットワークおよび緊密に詰め込まれた埋もれた疎水性コアを示した。α1およびβ1ドメインから構成されるRTL分子は、α2β2-Ig折り畳み「プラットフォーム」とは独立した単一の実体として運動する能力を有し得る。この界面における可動性は、ペプチド抗原の結合/交換のために、α1およびβ1ドメイン内の運動の自由度に必要であると考えられる。これに代えてまたはこれと共同して、この相互作用表面は、MHCクラスII/ペプチド分子のTCRとの相互作用に関する情報をAPCに戻して情報交換する上で役割を果たす可能性がある。
【０２３３】
保存されたシステイン110(RTL303の番号づけ)の2つのヘリックスターン(7.2残基)内のアミノ酸残基の一次配列の重要な解析、および保存されたシステイン46(RTL303番号づけ)の周囲のβシートプラットフォームの解析から、分子のいくつかの興味深い特徴が明らかになり、中でも最も顕著であるのは、ヘリックスおよびβシートプラットフォームがペプチド結合溝面にそって非常に高密度であることである。興味深いことに、残基L99、E100、R103、A104、D107、R111、およびY114(図1)から構成されるヘリックスの表面露出面は、ラット、ヒト、およびマウスクラスIIのすべてにおいて保存されており、まだ判明していない機能をもたらしている可能性がある。
【０２３４】
生化学系では、協調的な過程が極めて一般的である。αヘリックスとランダムコイル構造との間の可逆的な変換は、円二色性によって容易に定量化される。ヘリックスが形成され始めると、そのヘリックスが完了するまでさらなるターンが形成される。同様に、ヘリックスがほどけ始めると、完全にほどける傾向がある。222nmにおける円偏光の吸収 対 温度の標準化プロット(融解曲線)を用いて、各RTL分子の決定的な融解温度(Tm)が規定された。融解温度は、222nmにおける偏光の吸収消失から計算される構造消失の減少の中点として定義された。RTLは、その大きさおよび生化学的安定性のために、特定の標的細胞および組織に対して操作された特異性を有するタンパク質薬物を開発するためのプラットフォーム技術として働くと考えられる。
【０２３５】
実施例10
TCRシグナル伝達
最小TCRリガンドが開発されたことで、TCRαおよびβ鎖へのMHC/ペプチド結合によって開始される情報カスケードの分析を複雑にする共刺激相互作用の非存在下で、初代T細胞およびT細胞クローンにおいてTCRシグナル伝達を研究することが可能になる。最小「T細胞受容体リガンド」は概念的に、TCRと相互作用するMHC分子の表面、およびTCRと相互作用するために外側に向いて溶媒に露出される、MHC分子の溝内に結合したペプチド内の3〜5アミノ酸残基からなる。MHCクラスIIに由来する組換えTCRリガンド(RTL)の生理化学的および生物物理学的特徴づけは、HLD-DR2のα-1およびβ-1ドメインの、抗原性ペプチドを含む種々のアミノ末端伸長を有する約200アミノ酸残基の単一エキソンとしての使用など、上記してある。これらのHLA-DR2由来RTLは折り畳まれて、天然MHCクラスII分子のペプチド結合/T細胞認識ドメインを形成する。
【０２３６】
炎症性Th1、CD4+ T細胞は、TCRおよびCD4とAPC上に存在するMHC/ペプチド複合体との連結によって開始される多段階過程で活性化される。この主要な抗原特異的シグナルは適切な状況で提示されることが必要であり、これはCD28などのさらなるT細胞表面分子とAPC上のそれらそれぞれの複合体との相互作用を介した共刺激によって提供される。共刺激の非存在下におけるTCRを介した刺激は、通常の事象とは異なり、完全な活性化からアネルギーまたは細胞死に至るまで一連の細胞応答を誘導し得る(Quill et al., 1984)。本明細書に記載したように、Ag特異的RTLを用いて、種々のヒトT細胞シグナル伝達過程が誘導され、またサイトカインプロファイルおよび増殖能を含むエフェクター機能が調節された。
【０２３７】
組換えTCRリガンド
組み換えTCRリガンドは上記の通りに生成した。
【０２３８】
合成ペプチド
MBP85-99ペプチド
2008537736.tif 000041
および「CABL」、BCR-ABL b3a2ペプチド
2008537736.tif 000042
(ten Bosch et al., 1995)は、fmoc固相合成によりApplied Biosystems 432A(カリフォルニア州フォスターシティー)ペプチド合成機で調製した。MBPペプチドは、ウシMBP配列に従って番号づけした(Martenson, 1984)。ペプチドはカルボキシ末端アミド基を有して調製し、トリフルオロ酢酸(TFA)中のチアニソール/1,2-エタンジチオール/dH2Oを用いて穏やかに振盪しながら室温で1.5時間かけて切断した。切断されたペプチドは、100%冷tert-ブチルメチルエーテルで6回洗浄して沈殿させ、凍結乾燥して、窒素下で-70℃で保存した。ペプチドの純度は、分析用Vydac C18カラムで逆相HPLCにより確認した。
【０２３９】
T細胞クローン
標準的な血清学的方法によって決定され、さらに配列特異的プライマーを用いたPCR増幅(PCR-SSP)(Olerup et al., 1992)によって確認された、HLA-DRB1*1501にとってホモ接合性である多発性硬化症(MS)患者およびHLA-DRB1*07にとってホモ接合性であるMS患者の末梢血単核細胞(PBMC)から、ペプチド特異的T細胞クローンを選択した。ヒトMBP85-99およびCABLに特異的なT細胞の頻度は、限界希釈アッセイ法(LDA)により決定した。PBMCをフィコール勾配遠心分離により調製し、0.2ml培地(1%ヒトプールAB血清、2mM L-グルタミン、 1mMピルビン酸ナトリウム、100単位/ml ペニシリンG、および100μg/ml ストレプトマイシンを含むRPMI 1640)中、50,000個PBMC/96ウェルU底プレートウェルおよび抗原提示細胞(APC)としての150,000個照射(2500ラド)PBMC/ウェルで、10μg/mlのMBP85-99またはCABLペプチドと共に5日間培養し、その後5ng/ml IL-2(R&D Systems、ミネソタ州ミネアポリス)を週に2回添加した。3週間後、視覚的顕微鏡観察により培養プレートを細胞凝集または「凝集塊形成」について調べ、各ペプチドAgにつき全部で200ウェルの中で凝集形成が「最大の」20〜30ウェルに由来する細胞を、5ng/ml IL-2中でさらに1〜2週間かけて拡大した。これらの細胞を増殖アッセイ法によりペプチド特異性について評価したが、このアッセイでは、50,000個T細胞/ウェル(3回洗浄)を、150,000個の新たに単離し照射したAPC/ウェルおよび培地のみ、10mg/ml MBP85-99、または10mg/ml CABLペプチドと共に3つ組で3日間培養し、最後の18時間は3H-Tdyを添加してインキュベートした。ペプチド添加ウェルの平均CPMを培地のみの対照ウェルの平均CPMで割って、刺激指標(S.I.)を計算した。特定のペプチド抗原について最も高いS.I.を有するT細胞単離体を選択し、5ng/ml IL-2を含む培地中で拡大したが、さらに刺激することなくクローンに応じて1〜6カ月生存した。
【０２４０】
T細胞のサブクローニングおよびT細胞数の拡大
選択されたペプチド特異的T細胞単離体を、10ng/ml 抗CD3(Pharmingen、カリフォルニア州サンディゴ)を含む培地0.2ml中、0.5個T細胞/ウェルおよび100,000個APC/ウェルで限界希釈して3日間置き、その後1〜3週間にわたり5ng/ml IL-2を週に2回添加して、サブクローニングした。増殖T細胞を有するすべてのウェルを増殖アッセイ法によりペプチド特異的応答に関してスクリーニングし、最も高いS.I.を有するウェルを選択し、IL-2を加えた培地中で続けて培養した。クローンを単一のTCR Vβ遺伝子を使用するT細胞集団と定義して、細胞のクローン性をRT-PCRにより決定した。T細胞クローンを、10% ABプール血清(Bio-Whittaker、メリーランド州)中、25cm2フラスコ当たり5x106個の照射した(4500ラド)EBV形質転換B細胞系統および25x106個の照射(2500ラド)自己APCの存在下で、10ng/ml 抗CD3で刺激することにより5日間にわたり拡大し、その後洗浄し、5ng/ml IL-2を含む培地に細胞を再懸濁し、新鮮なIL-2を週に2回添加した。拡大したT細胞をペプチド特異的増殖について評価し、最も高い増殖S.I.を有する選択された拡大T細胞クローンを実験手順に使用した。
【０２４１】
ELISAによるサイトカイン検出
72時間目に細胞培養上清を回収し、使用時まで-80℃で凍結した。IL-2、IFN-γ、IL-4、およびIL-10のサイトカイン特異的捕獲抗体および検出抗体(Pharmingen、カリフォルニア州サンディエゴ)を使用して、以前に記載されている通りに(Bebo et al., 1999)ELISAによりサイトカイン測定を行った。組換えサイトカイン(Pharmingen)を用いて各アッセイの検量線を作成し、細胞上清中のサイトカイン濃度を補間により決定した。
【０２４２】
フローサイトメトリー
2カラー免疫蛍光解析を、CellQuest(商標)ソフトウェアを用いてFACScan装置(Becton Dickinson、カリフォルニア州マウンテンンビュー)で行った。アイソタイプの一致する対照Abを用いて4領域を規定した。
【０２４３】
ホスホチロシンアッセイ
400xgで10分間遠心分離して培養液からT細胞を回収し、洗浄し、新鮮なRPMIに再懸濁した。細胞を20μM最終濃度のRTLで、37℃にて様々な時間処置した。氷冷RPMIを添加して処置を停止し、遠心分離により細胞を回収した。上清を捨て、溶解緩衝液(50mM Tris pH7.5、150mM NaCl、1% NP-40、0.5%デオキシコール酸、0.1% SDS、1mM AEBSF[4-(2-アミノエチル)ベンゼンスルホニルフッ化物、HCl]、0.8μMアプロチニン、50μMベスタチン、20μMロイペプチン、10μMペプスタチンA、1mM活性化オルトバナジウム酸ナトリウム、50mM NaF、0.25mM bpV[カリウムビスペルオキソ(1,10-フェナントロリン)オキソバナジン酸]、50μMフェニルアルシンオキシド)を直ちに添加した。4℃で15分間混合して細胞を溶解した後、試料を15分間遠心分離した。細胞溶解液を回収し、等量の試料泳動緩衝液と混合して5分間煮沸した後、15% SDS-PAGEにより分離した。ウェルタンブロット解析のため、タンパク質をPVDF膜に転写した。ウェスタンブロットブロッキング緩衝液：10mM Tris-HCl(pH7.5)、100mM NaCl、0.1% Tween-20、1% BSA。一次抗体：抗ホスホチロシン、クローン4G10(Upstate Biotechnology、ニューヨーク州レークプラシッド)。二次および三次抗体：ECFウェスタンブロットキット(Amersham、ニュージャージー州ピスカタウェイ)による。乾燥させたブロットをStorm 840スキャナー(Molecular Dynamics、カリフォルニア州サニーベール)を用いてスキャンし、ImageQuantバージョン5.01(Molecular Dynamics)を用いて化学蛍光を定量化した。
【０２４４】
ERK活性化アッセイ
ζホスホチロシンアッセイの場合と同様に、T細胞を回収しRTLで処置した。1：5000希釈した抗ホスホ-ERK(Promega、ウィスコンシン州マディソン)または1：1500希釈した抗ERKキナーゼ(New England Biolabs、マサチューセッツ州ベバリー)を用いてウェスタンブロット解析を行い、ECFウェスタンブロッティングキットを用いて可視化した。関心対象のバンドを、ζホスホチロシンアッセイについて記載した通りに定量化した。
【０２４５】
Ca2+画像化
ヒトT細胞をポリリジンコート35mmガラス底皿にプレーティングし、IL-2を含む培地中で12〜24時間培養した。CO2インキュベーター内で、培地に溶解したfura-2 AM(5mM)(Molecular Probes)を細胞に30分間負荷した。fura-2をリンスし、培地中でさらに15分間インキュベートした後、細胞をカルシウム測定に使用した。水浸対物レンズ(UmplanFL 60x/0.8、Olympus)を備えた正立顕微鏡(Axioskop FS、Zeiss)により、蛍光像を観察した。モノクロメータ(Polychrome 2、Till Photonics)により切り替えられる2波長の励起UV光(340nmまたは380nm)を、6秒間隔で73 m秒間露光した。380nm UV光の強度はバランシングフィルター(UG11、OMEGA Optical)により減衰させた。励起UV光を二色性ミラー(FT 395nm、Carl Zeiss)に反射させ、蛍光像をバンドパスフィルター(BP500-530、Carl Zeiss)に通し、画像増強管(C7039-02、Hamamatsu Photonics)により増幅し、複数フォーマット冷却CCDカメラ(C4880、Hamamatsu Photonics)に露光した。UV光露光、CCD制御、画像のサンプリングおよび取得は、デジタル画像化システム(ARGUS HiSCA、Hamamatsu Photonics)で行った。バックグラウンド蛍光を画像化システムにより減算した。記録中、細胞は、ステージヒーター(DTC-200、Dia Medical)により30℃に維持した培地中で保持した。薬物適用の量およびタイミングは、トリガー駆動性灌流システム(DAD-12、ALA Scientific instruments)により制御した。
【０２４６】
実施例11
ヒトT細胞クローンに及ぼすヒトRTLの効果
本研究では、2つの異なるMHCクラスII DR2由来RTL(HLA-DR2b：DRA*0101、DRB1*1501)を使用した(図19)。RTL303(β1α1/MBP85-99)およびRTL311(β1α1/CABL)は、単一エキソンRTLのアミノ末端において遺伝的にコードされる抗原のみが異なる。MBP85-99ペプチドはDR2患者における免疫優勢MBP決定基を表し(Martin et al., 1992)、C-ABLペプチド(ten Bosch et al., 1995)はDR2に結合するための適切なモチーフを含む。本研究で使用するヒトT細胞クローンは、DR2ホモ接合性患者およびDR7ホモ接合性MS患者から選択した。
【０２４７】
構造に基づく相同性モデリングは、ヒトDR2(Smith et al., 1998)およびDR1(Brown et al., 1993；Murthy et al., 1997)、マウスI-E k分子(Fremont et al., 1996)、ならびにサソリ毒(Zhao et al., 1992)の微細な結晶座標を用いて行った。ヒトDR2(PDBアクセッション番号1BX2)中のいくつかの残基が結晶データ中で欠けていた/存在していなかったため(Smith et al., 1998)、DR2の配列に基づく正確な側鎖を配列中に挿入し、構造の緻密化の過程で局所エネルギー最小化を用いてペプチド骨格を剛体としてモデル化した。これらの比較的小さな(約200アミノ酸残基)RTLは大腸菌で大量に産生され、封入体から精製タンパク質の最終収率15〜30mg/L細菌培養液で精製され再度折り畳まれた(Chang et al., 2001)。図19は、APC表面上のMHCクラスII分子の概略縮尺モデルである(図19A)。共有結合したMBP-85-99ペプチドを含むHLA-DR2β1α1由来RTL303分子(図19B、左)および共有結合したCABLペプチドを含むHLA-DR2β1α1由来RTL311分子(図19C、左)を、主要なTCR接触残基を表示して図19Aに示す。MBPペプチドに由来するP2 His、P3 Phe、およびP5 Lys残基は、顕著な溶媒露出残基である。これらの残基は、MBPペプチドのTCR認識に重要であることが知られている。C-ABLペプチド中の対応する残基(P2 Thr、P3 Gly、P5 Lys)も同様に示す。一見して顕著なことは、種を超えて類似している表面積の割合である。静電ポテンシャル(EP)に従って(Connolly, 1983)(図19B、19C、中央)、または親油性ポテンシャル(LP)に従って(Heiden et al., 1993)(図19B、19C、右)陰影をつけると、DR2由来RTL表面という状況において抗原のTCR認識を可能にする上で特定の役割を果たす可能性の高い分子間の巧妙さが解明される。
【０２４８】
構築物の設計により、制限酵素消化および構築物の連結を用いて、異なる抗原性ペプチドをコードする配列を置換することが可能になる。円二色性を用いた構造的特徴づけから、これらの分子が、天然クラスIIヘテロ二量体中に認められる逆平行βシートプラットフォームおよび逆平行αヘリックスを保持すること、ならびに分子が協調的な2状態の熱変性遷移を示すことが実証された(Chang et al., 2001)。共有結合したAgペプチドを有するRTLは、ラットRT1.B RTLで認められたのと同様に、「空の」RTLと比較して熱変性に対する安定性の増加を示した。
【０２４９】
単一のTCR BV遺伝子を発現するDR2およびDR7ホモ接合性ドナー由来Ag特異的T細胞クローンを用いて、Ag特異的RTLがT細胞の挙動を直接変更する能力について評価した。クローン性はTCR BV遺伝子発現により確認し、各クローンは、自己APCによって提示される特定のペプチドによって刺激された場合にのみ増殖した。DR2ホモ接合性T細胞クローンMR#3-1はMBP85-99ペプチドに特異的であり、DR2ホモ接合性クローンMR#2-87はCABLペプチドに特異的であった。DR7ホモ接合性T細胞クローンCP#1-15は、MBP85-99ペプチドに特異的であった(図20)。
【０２５０】
実施例12
RTL処置により誘導される初期シグナル伝達事象
DR2ホモ接合性T細胞クローンMR#3-1およびMR#2-87におけるζ鎖のリン酸化について試験した。MR#3-1はRTL303によって運搬されるMBP85-99に特異的であり、MR#2-87はRTL311によって運搬されるCABLペプチドに特異的である。RTLのアミノ末端における抗原性ペプチドが、2つの分子間の唯一の相違である。TCR-ζ鎖は静止T細胞において構成的にリン酸化されており、ζ鎖リン酸化のレベルの変化はTCRを介して処理される情報の最も早い指標の1つである。静止クローンにおいて、ζは、それぞれp21およびp23と称される21kDおよび23kDの一対のリン酸化タンパク質種としてリン酸化された。クローンMR#3-1を20μM RTL303で処置すると、p23/p21比の異なる変化を示し、10分の時点で最小に達した(図21)。これと同様のp23/p21比の異なる変化は、20μM RTL311で処置した場合にクローンMR#2-87でも観察された(図21)。クローンにとって特異的であるペプチドを含むRTLのみが、以前にアンタゴニストリガンドによってT細胞を活性化した後に観察された(27, 28)この種のζリン酸化を誘導した。
【０２５１】
単一細胞解析を用いて、BMP85-99ペプチドに特異的なDR2ホモ接合性T細胞クローンMR#3-1においてカルシウムレベルをモニターした。カルシウム動員はT細胞活性化の特異的結果であるという一般合意があるものの、応答のパターンおよび完全な活性化に必要な用量には議論の余地が残されている(Wulfing et al., 1997)。細胞内カルシウム動員の4つの一般的なパターンが存在するが、最も強力なもののみが完全なT細胞増殖と関連しているようである。RTL303処置が持続した高いカルシウムシグナルを誘導したのに対し、RTL301(折り畳み特性を変更する単一の点変異、F150L以外はRTL303と同一である)は、同じ期間にカルシウムシグナルの増加を示さなかった(図22)。
【０２５２】
RTLの効果を、T細胞の増殖および分化の調節に関与することが知られているRasシグナル伝達経路内の重要な成分である細胞外制御性プロテインキナーゼERK(Li et al., 1996)のレベルについてさらに評価した。活性型ERKキナーゼはそれ自体リン酸化されており(Schaeffer et al., 1999)、したがってERK活性の直接的測定は、存在する全細胞ERK(T-ERK)に対するリン酸化されたERK(ERK-P)の割合を比較することであった。RTLによる処置後15分以内に、ERK-PのレベルはAg特異的様式で大幅に減少した。20μM RTL303によりクローン#3-1でERK-Pが80%減少し、20μM RTL311によりクローン#2-87でERK-Pが90%減少した(図23)。
【０２５３】
同族T細胞クローンにおけるAg特異的RTL処置により変化した初期シグナル伝達事象は、細胞表面マーカー、増殖、およびサイトカインに及ぼすRTL処置の影響の研究へとつながった。CD25、CD69、およびCD134(OX40)の細胞表面発現を、RTLによる処置の24時間および48時間後にマルチカラーフローサイトメトリーにより解析し、APC/ペプチドまたはCon A刺激細胞と比較した。CD69(Vilanova et al., 1996)は、これらのクローンで既に非常に高かった(〜80%が陽性)。APC/ペプチドは、48〜72時間にピークに達するCD25(Kyle et al., 1989)およびCD134(Weinberg et al., 1996)のAg特異的増加を誘導したが、RTL処置はこれらの細胞表面マーカーに影響を及ぼさなかった。RTL処置により、アネキシンV染色を用いて定量化されるアポトーシス変化のごくわずかな増加が誘導されたが、これらはAg特異的ではなかった。T細胞クローンをRTLで処置した場合、溶液中に添加した場合にも、プラスチックマイクロタイタープレート上に固定化した場合にも、または抗CD28と組み合わせた場合にも増殖は誘導されなかった。
【０２５４】
APCおよびAgによる活性化時に、クローンMR#3-1(MBP85-99特異的)およびMR#2-87(CABL特異的)は、IL-2産生、高IFN-γ、およびほとんど検出不能なIL-4またはIL-10を含む古典的Th1サイトカインプロファイルを示した。図24Aに示すように、抗CD3抗体によるCD3鎖を介した活性化によって、初期の突発的な強い増殖、ならびにIL-2、IFN-γ、および驚くべきことにはIL-4の産生が誘導されたが、IL-10の産生は誘導されなかった。対照的に、RTL303による処置において、クローンMR#3-1はIFN-γの産生を維持し、加えてIL-10の産生を劇的に増加させた(図24A)。IL-10はRTL303の添加後24時間以内に現れ、その産生は、未処置またはRTL311処置対照を3桁上回るまで72時間を超えて持続した。対照的に、IL-2およびIL-4レベルはRTL誘導性の変化を示さなかった(図24A)。同様に、RTL311による処置後、クローンMR#2-87(CABL特異的)もまた24時間以内にIL-10産生の劇的な増加を示し、この産生は未処置またはRTL303処置対照を上回った状態で72時間を超えて持続した(図24B)。この場合も同様に、IL-2およびIL-4レベルは検出可能なRTL誘導性変化を示さず、IFN-γ産生は比較的一定なままであった(図6B)。IL-10への転換(switch)は精巧にAg特異的であり、クローンはクローンにとって特異的であるペプチド抗原を運搬する同族RTLに対してのみ応答した。MBP-85-99に特異的なDR7ホモ接合性T細胞クローンCP#1-15はDR2由来RTLに対して応答を示さず、IL-10のRTL誘導がやはりMHC拘束性であることが示される。
【０２５５】
抗原に対するその後の応答に及ぼすRTL前処置の影響を評価するため、抗CD3またはRTLで前処置したT細胞クローンをAPC/ペプチドで再刺激し、細胞表面マーカー、増殖、およびサイトカイン産生をモニターした。RTL前処置は、APC/ペプチドで刺激された、RTLと遭遇したことのないT細胞と比較して、APC/ペプチドによる再刺激によって誘導されるCD25、CD69、またはCD134(OX40)の細胞表面発現レベルに影響を及ぼさず、アポトーシス変化はアネキシンV染色を用いて72時間の期間にわたり認められなかった。
【０２５６】
抗CD3で前処置したT細胞は強力に阻害され、IL-2R(CD25)発現を維持しつつ71%の増殖減少および＞95%のサイトカイン産生阻害を示し(表5；図25)、これは古典的アネルギーと一致するパターンである(Elder et al., 1994)。
【０２５７】
（表５）RTLとの前培養によるT細胞クローンのAg特異的阻害
2008537736.tif 000043
*可溶性RTL303またはRTL311は200,000個T細胞/200μl培地でT細胞クローンと共に48時間培養し、その後RPMI 1640で2回洗浄してからアッセイした。
**2x105個照射(2500ラド)自己PBMCを4：1(APC：T)の比で添加して3日間おき、最後の18時間は3H-チミジンを取り込ませた。p値は、「未処置」対照との比較に基づいた。
【０２５８】
クローンMR#3-1は20μM RTL303で前処置した場合に42%の増殖阻害を示し、クローンMR#2-87は20μM RTL311で前処置した場合に57%の増殖阻害を示した(表5；図25)。クローンCP#1-15(HLA-DR7ホモ接合性ドナー；MBP85-99特異的)はRTL303またはRTL311による前処置後に増殖変化をほとんど示さなかったため、増殖の阻害はまたMHCクラスII特異的であった。RTL303で前処置しその後APC/Agで再刺激したクローンMR#3-1は、IL-2産生の25%の減少、IFN-γ産生の23%の減少を示し、IL-4産生に関しては有意な変化を示さなかった(図25)。同様に、クローンMR#2-87も、IL-2産生の33%の減少、IFN-γ産生の62%の減少を示し、IL-4産生に関しては有意な変化を示さなかった。しかし非常に重要なことには、いずれのRTL前処置T細胞クローンも、APC/ペプチドによる再刺激に際してIL-10を産生し続けた(図25)。
【０２５９】
上記の結果から、RTLで具体化される基本的なTCRリガンドがTh1細胞にシグナルを送達することが明らかに実証され、RTLとαβ-TCRシグナル伝達との特異的関与の仮説が支持される。RTLによって送達されるシグナルは、抗CD3抗体処置後に起こる生理的結果と非常に異なる生理的結果をもたらす。
【０２６０】
本明細書に記載する系において、抗CD3は、強力な初期増殖ならびにIL-2、IFN-γ、およびIL-4の分泌を誘導した(図24)。APC/抗原で再刺激した抗CD3前処置T細胞では、増殖およびIL-2を含むサイトカイン分泌のレベルが顕著に減少したが、IL-2Rの発現は保持され、したがって古典的アネルギー経路が再現されている(図25)。対照的に、RTLで直接処置すると、増殖、Th1サイトカイン応答、およびIL-2R発現は誘導されないが、IL-10分泌は強力に誘導された(図24)。RTL前処置では、APC/抗原によるT細胞の再刺激に際して、増殖応答およびTh1サイトカイン分泌は部分的に減少したが、IL-2R発現は阻害されなかった。重要なことには、これらのT細胞はIL-10を分泌し続けた(図25)。したがって、CD3鎖の抗体架橋によるT細胞の集中的活性化が、おそらくは露出されたTCR表面を介するRTLによる活性化とは大きく異なる結果をもたらしたことは明白である。おそらく、TCRとMHC/抗原との相互作用には、CD3鎖の架橋による活性化よりもより多くの成分およびより複雑な一連のシグナルが関与すると考えられ、本明細書に記載する結果から、抗CD3抗体によって誘導されるシグナル伝達は、TCRを介したリガンド誘導性活性化を正確に表していない可能性があることが示される。したがって、CD3活性化のみでは、正常な生理的経路を含まない可能性が高い。
【０２６１】
TCRの下流のシグナル伝達カスケードは非常に複雑である。受容体チロシンキナーゼとは異なり、TCRの細胞質部分は内因性の触媒活性を欠いている。代わりに、TCR結合後のチロシンリン酸化の誘導は非受容体キナーゼの発現を必要とする。Src(LckおよびFyn)ファミリーおよびSyk/ZAP-70ファミリーのチロシンキナーゼが、正常なTCRシグナル伝達に必要である(Elder et al., 1994)。膜貫通CD4共受容体は、MHCクラスIIβ-2ドメインと相互作用する。このドメインは、操作されRTLから除去されている。CD4の細胞質ドメインは細胞質チロシンキナーゼLckと強力に相互作用し、それによってCD4分子はシグナル伝達に関与できるようになる。Lckは、タンパク質間相互作用を媒介することができ(Ren et al., 1993)、またLckホモ二量体の形成を安定化し、TCRおよび共受容体CD4の同時結合後のTCRシグナル伝達を増強すると提唱されている(Eck et al., 1994)SH3ドメインを含む。以前の研究から、Lck SH3ドメインの欠失により、癌型LckがIL-2産生を増強する能力が妨げられることが示され、サイトカイン遺伝子転写の制御におけるLckの役割が示唆される(Van Oers et al., 1996；Karnitz et al., 1992)。機能的なLckを欠くT細胞は、MAPキナーゼERK1およびERK2を含む下流のシグナル伝達事象に関与しているZap-70の動員および活性化を誘導することができない(Mege et al., 1996)。
【０２６２】
完全な分子シグナル伝達回路網は依然として不明であるが、RTLはζ鎖およびERKキナーゼ活性化に対する迅速な拮抗効果を誘導する。p21型およびp23型のζの強度は非ペプチド-Ag特異的様式で共に増加したが(図21A)、p23成分のレベルの偏った減少に起因して、p21に対するp23の比はペプチド-Ag特異的様式で異なった(図21B)。ERKリン酸化に対する拮抗効果もまた、ペプチド-Ag特異的様式で異なった(図21A)。またRTL処置により、顕著なカルシウム動員が誘導された(図22)。これら3つの経路が抗原特異的様式で影響を受けるという事実から、RTLがTCRとの直接的相互作用を介してこれらの効果をもたらすことが示唆される。
【０２６３】
本明細書に記載した結果から、IL-10分泌のRTLによる抗原特異的誘導が実証される。APC/抗原によりまたは抗CD3抗体によって刺激した場合の、Th1クローンによるIL-10産生の欠如を考えると、この結果は予想外であった。さらに、APC/抗原によるRTL前処置クローンの再刺激時に、IL-10が持続して分泌されることから、この経路が再活性化の過程で実質的に衰えなかったことが示される。この結果から、RTLとのTCR相互作用が初期のIL-10産生をもたらし、特定抗原への再曝露に際してもこれが持続することが示唆される。RTLによって誘導されるTh1細胞におけるIL-10レベルの上昇は、Th1細胞およびマクロファージ活性化に及ぼすこのサイトカインの公知の抗炎症効果のために(Negulescu et al., 1996)、多発性硬化症などの自己免疫疾患に対して重要な制御的意味を有する。
【０２６４】
MSの病原は、MBP-85-99を含む1つまたは複数の免疫優勢ミエリンペプチドに対する自己反応性Th1細胞を含む可能性が高い。RTL303などのRTLは、これらのT細胞によるIL-10産生を誘導することができ、したがってそれらの病原性の可能性を中和することができる。さらに、CNSにおけるAg刺激後のIL-10の局所的産生は、同じまたは異なるAg特異性であってよいバイスタンダーT細胞、および脱髄に関与するマクロファージの活性化の阻害をもたらし得る。したがって、この重要な新規知見は、RTL結合神経抗原特異的T細胞の枠を超えた制御の可能性を意味する。CNS抗原を認識する特異的T細胞集団におけるIL-10のRTL誘導を潜在的に用いて、T細胞レパートリーを保存しながら免疫系を制御することができ、この誘導は、MSなどの複雑なT細胞媒介性自己免疫疾患の治療介入の新たな戦略を表し得る。
【０２６５】
実施例13
ワクチン接種により誘導される自己免疫疾患の処置のためのバイスタンダー抑制
アレルギー、移植片拒絶、移植拒絶、移植片対宿主病、望ましくない遅延型過敏症反応、T細胞媒介性肺疾患、インスリン依存性糖尿病(IDDM)、全身性エリテマトーデス(SLE)、関節リウマチ、セリアック病、多発性硬化症、神経炎、多発性筋炎、乾癬、白斑、シェーグレン症候群、関節リウマチ、自己免疫性膵炎、炎症性腸疾患、クローン病、潰瘍性大腸炎、活動性慢性肝炎、糸球体腎炎、強皮症、サルコイドーシス、自己免疫性甲状腺疾患、橋本甲状腺炎、グレーブス病、重症筋無力症、喘息、アジソン病、自己免疫性ぶどう膜網膜炎、尋常性天疱瘡、原発性胆汁性肝硬変、悪性貧血、交感性眼炎、ぶどう膜炎、自己免疫性溶血性貧血、肺線維症、慢性ベリウム症、および特発性肺線維症を含む種々のヒト疾患の病原は、抗原特異的CD4+ T細胞を含むと考えられる。
【０２６６】
病原性T細胞は自己抗原が存在する標的組織にホーミングし、局所的に活性化された後に、Th1リンホカインを選択的に産生すると考えられている。この事象のカスケードは、標的組織を最終的に破壊するリンパ球および単球の動員および活性化をもたらす。インビボにおけるCD4+ T細胞の活性化は、APC上に存在するMHCクラスII/ペプチド複合体によるTCRおよびCD4の同時結合(シグナル1)、ならびにCD28などの付加的なT細胞表面分子を介した共刺激(シグナル2)によって惹起される多段階過程である。共刺激シグナルの非存在下におけるTCRの結合は、正常なT細胞活性化を破壊し、アネルギーからアポトーシスにわたる一連の応答を誘導することが示されている。T細胞活性化のこのモデルに関連して、Ag駆動性免疫抑制に向けた直接的アプローチは、通常は特殊化したAPCによって提供される共刺激シグナルの非存在下において、完全なTCRリガンド、MHCの状況にあるAgを提示することである。
【０２６７】
バイスタンダー抑制とは、自己抗原の近位にある特定組織によって発現される抗原に応答する制御細胞、多くの場合にはT細胞によって生成される効果である。制御細胞は次いで、おそらくは自己免疫細胞の応答を抑制するサイトカイン(例えば、TGF-β、IL-10、またはIL-13)の産生を介して、微小環境を生成する。疾患特異的な自己抗原を決定する困難な課題がもはや必要でないため、ワクチン接種によりバイスタンダーT制御細胞を誘導する能力は、免疫に基づく自己免疫治療の有望な可能性を有する。これらの抗原特異的制御細胞を誘導するよう設計されるワクチン戦略は、自己免疫攻撃を受けている組織に特異的な抗原を提示する必要があるのみである。したがって、自己抗原が未知であるか、または複数の抗原が存在する可能性のある疾患において(例えば、多発性硬化症(MS)、1型糖尿病、または関節リウマチ)、ワクチン接種は、MHCと組み合わせて、そのような組織に特有の抗原を対象とすることのみが必要である。したがって、それぞれ、MSに関しては、ワクチン接種は例えばミエリン塩基性タンパク質(上記を参照されたい)を対象とし、糖尿病に関しては、ワクチン接種は例えばインスリンを対象とし、関節リウマチに関しては、ワクチン接種は例えばII型コラーゲンを対象とする。
【０２６８】
これらに限定されないが表6のものを含む自己免疫疾患の処置に関してMHC/ペプチド複合体の使用について試験することができる、動物に基づくいくつかの自己免疫モデルが存在する。例えば、非肥満糖尿病(NOD)マウスモデルは、動物が加齢に伴って糖尿病を発症する動物モデル系である。特定の抗原/MHC複合体の有効性を試験するには、前糖尿病段階(4週齢またはそれ以前)の動物群に、例えばインスリン-MHC複合体をワクチン接種する。次いで、糖尿病を発症する動物の数、および動物が糖尿病を発症する速度を解析する。同様に、橋本マウスモデル系では、ワクチンの有効性を試験するために、症状を発症する前の動物群にサイロドキシン/MHC複合体をワクチン接種する。次いで、疾患を発症する動物の数、および動物が疾患を発症する速度を解析する。
【０２６９】
（表６）ヒト自己免疫疾患の例
2008537736.tif 000044
【０２７０】
NODモデルまたは橋本モデルでは、非関連抗原をコードする核酸で刺激した動物と比較した場合に、または未処置対照と比較した場合に、抗原/MHC複合体によって疾患の進行が遅れるか、または疾患の発症が防御される。次いで、未処置マウスに対する養子移植により、この防御を提供する免疫細胞種について検討が行われる(例えば、未処置のNOD動物にCD4、CD8、NK、またはB細胞などの特定の免疫細胞集団を移植したNODマウスにおいて)。このようにして、炎症反応の制御に関与する細胞集団が決定される。
【０２７１】
養子移植実験のため、Balb/c群に、ペプチド/MHC複合体またはペプチド/MHC複合体をコードする核酸を投与する。CD4+、CD8+、B220、およびNK1.1+細胞を免疫磁気ビーズ分離により単離する。次いで、これらの様々な細胞種を、静脈内注射により未処理のNODマウスに移植する。次に、移植細胞が与えられたこれらの動物を疾患発症の徴候に関して観察する。ペプチド/MHC複合体を与えられた動物では、対照と比較して発症が遅延するか、または疾患が進行しない。
【０２７２】
実施例14
サイトカイン転換により実験的自己免疫性脳脊髄炎の再発率および重症度を軽減する単量体RTL
本明細書において上記したように、オリゴマー組換えTCRリガンド(RTL)は、実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)の臨床徴候を処置するのに、および脳炎誘発性ペプチドに対する長期T細胞寛容を誘導するのに有用である。本実施例では、単量体I-As/PLP139-151ペプチド構築物(RTL401)を生成し、これが、CFA中のPLP139-151ペプチドの注射後に再発性EAEを発症するSJL/Jマウスにおいて自己免疫応答を軽減するのに有用であることを実証する。空のRTL400または遊離PLP139-151ペプチドではこのようなことはないが、静脈内または皮下投与したRTL401は、SJL/Jまたは(C57BL/6xSJL)F1マウスにおいてPLP139-151ペプチドにより誘発されるEAEの再発を防ぎ、その臨床的重症度を有意に軽減したが、SJL/JマウスにおいてPLP178-191またはMBP84-104ペプチドにより誘発されるEAEも、(C57BL/6xSJL/J)F1マウスにおいてMOG35-55ペプチドにより誘発されるEAEも阻害しなかった。EAEをRTLで処置すると、末梢において安定したまたは増強されたT細胞増殖およびIL-10の分泌が起こったが、炎症性サイトカインおよびケモカインの分泌は減少した。中枢神経系(CNS)では、炎症細胞の適度な減少、超後期活性化(very late activation)Ag-4、リンパ球機能関連Ag-1、ならびに炎症性サイトカイン、ケモカイン、およびケモカイン受容体の発現の減少が起こったが、Th2関連因子、IL-10、TGF-β3、およびCCR3の発現が増強された。これらの結果から、単量体RTL治療は、PLP139-151特異的T細胞のCNSへの侵入を完全に妨げることなく、このT細胞の脳炎誘発能を抑制するサイトカイン転換を誘導し、このT細胞により炎症の重症度が軽減されることが示される。この機構は、他のEAEモデルにおいてオリゴマーRTL治療を用いて観察される機構とは異なる。これらの結果から、公知の脳炎誘発性ミエリンペプチドに対する集中的なT細胞応答を有する多発性硬化症患者における、この新たな種類のペプチド/MHCクラスII構築物の臨床的有用性が示される。
【０２７３】
上記のように、T細胞活性を調節するように設計されたRTLは典型的に、CD4結合部を有さずに、ペプチドに共有結合したα1およびβ1 MHCドメインを含む最小TCR界面のみを含む。これらの構築物は、部分的アゴニストとしてTCRを介して直接シグナルを送り(Wang et al., 2003)、ルイスラットにおいてMBP誘発性単相性EAEを予防および処置し(Burrows et al., 1998；Burrows et al., 2000)、MBP85-99またはcABLペプチドに特異的なヒトDR2拘束性T細胞クローンの活性化を抑制したが、このT細胞におけるIL-10分泌を誘導し(Burrows et al., 2001；Chang et al., 2001)、DR2トランスジェニックマウスにおいてMOG35-55ペプチドにより誘発される慢性の臨床的および組織学的EAEを好転させた(Vandenbark et al. 2003)。組換えTCRリガンド(RTL)の治療特性をさらに評価するため、RTLを設計し、CFA中のPLP139-151ペプチドの注射後に再発型のEAEを発症するSJLマウスにおいてその使用について試験した。I-As/PLP139-151ペプチド構築物から構成されるこのRTL(RTL401)は、EAEの他のモデルにおいてラットおよびヒトRTLを使用した本発明者らの以前の研究とは顕著に異なるサイトカイン転換を含む機構を介して、再発を予防し、臨床的および組織学的EAEを好転させた。
【０２７４】
マウス
SJLおよび(C57BL/6xSJL)F1マウスは、6〜7週齢の時点でJackson Immunoresearch Laboratories(メイン州バーハーバー)から入手した。マウスは、施設の指針に従ってポートランド退役軍人医療センター動物資源施設(Animal Resource Facility at the Portland Veterans Affairs Medical Center)(オレゴン州ポートランド)に収容した。
【０２７５】
抗原
マウスPLP139-151ペプチド
2008537736.tif 000045
、PLP178-191ペプチド
2008537736.tif 000046
、MOG35-55ペプチド
2008537736.tif 000047
、およびMBP84-104ペプチド
2008537736.tif 000048
は、スタンフォード大学、Beckman研究所(Beckman Institute)(カリフォルニア州パロアルト)において固相技法を用いて合成し、HPLCにより精製した。
【０２７６】
RTLの構築および生成
RTLの設計、クローニング、および発現の一般的な方法は、本明細書に上記してあり、また他所に記載されている(例えば、Burrows et al., 1998；Burrows et al., 1999；Chang et al., 2001を参照されたい)。簡潔に説明すると、Oligotex Direct mRNAミニキット(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を用いて、SJLマウスの脾細胞からmRNAを単離した。マウスI-As MHCクラスIIβ1およびα1鎖のAg結合/TCR認識ドメインのcDNAは、2対のPCRプライマーを用いてmRNAから導出した。β1鎖のアミノ末端およびα1鎖のカルボキシル末端にそれぞれNcoIおよびXhoI制限部位を付加して2段階PCRで2本の鎖を5-aaリンカー
2008537736.tif 000049
により順次連結し、RTL400を形成した。リンカー
2008537736.tif 000050
を有するPLP139-151ペプチドをRTL400のβ1ドメインの5'末端に共有結合して、RTL401を形成した。次いで、マウスI-Asβ1α1挿入物をpET21d(+)ベクターに連結し、陽性コロニーの選択および配列確認のために、Nova blue大腸菌宿主(Novagen Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。次に、RTL400およびRTL401プラスミド構築物を大腸菌株BL21(DL3)発現宿主(Novagen Inc.)に形質転換した。タンパク質の精製については、以前に記載されている(Chang et al., 2001)。精製タンパク質の最終収率は、15〜30mg/L細菌培養液の間で変動した。
【０２７７】
動的光散乱(DLS)解析
光散乱実験は、DynaPro分子サイズ測定装置(Protein Solutions、バージニア州シャーロッツビル)で行った。pH8.5の20mM Tris-Cl緩衝液中のタンパク質試料を1.0mg/mlの濃度で100nm Anodisc膜フィルター(Whatman、ニュージャージー州クリフトン)を通して濾過し、濾過試料20μlを石英キュベットに入れ、488-nmレーザービームで解析した。4℃で50スペクトルを収集し、水溶液中のタンパク質の拡散係数および相対多分散性の推定値を得た。次いで、データをDynamicsソフトウェアV.5.25.44(Protein Solutions)で解析し、緩衝液基準を減算した。データは、単位としてナノメートルを使用して、試料の流体力学半径の平均値として表した。RTLの分子量は、DynamicsソフトウェアV.5.25.44(Protein Solutions)を用いて推定した。
【０２７８】
円二色性(CD)解析
CD解析は、Aviv Model 215 CD分光計(Aviv Associates、ニュージャージー州レークウッド)を用いて、組換えタンパク質がpH8.5のTris-Cl緩衝液中に存在すること以外は以前に記載されている通りに行った(Chang et al., 2001)。内蔵アルゴリズムを用いてスペクトルを平均化および平滑化し、緩衝液基準を減算した。デコンボリューションソフトウェアパッケージ(CDNNバージョン2.1)および変数選択法(Compton et al., 1986)を用いて、二次構造を推定した。
【０２７９】
EAEの誘発およびRTLによる処置
SJLマウスの側腹部に、以前に記載されている通りに(Bebo et al., 2001)、PLP139-151ペプチド 150μgを含む乳濁液 0.2ml、および加熱殺菌した結核菌H37RA(M.Tb.；Difco、ミシガン州デトロイト) 150μgを含む等量のCFAを皮下接種した。(C57BL/6xSJL)F1マウスは、側腹部への皮下接種により、MOG35-55ペプチド 200μgまたはPLP139-151ペプチド 150μgを含む乳濁液 0.2ml、および加熱殺菌M.Tb. 200μgを含む等量のCFAで免疫化した。別の実験では、SJLマウスを、側腹部への皮下接種により、PLP139-151ペプチド 150μgもしくはPLP178-191ペプチド 150μgを含む乳濁液 0.2ml、またはMBP84-104ペプチド 200μgを含む乳濁液 0.1ml、および加熱殺菌した結核菌 200μgを含む等量のCFAで免疫化した。1週間後、MBP84-104ペプチドを免疫化したマウスに、CFA中の同じペプチドで追加免疫した。追加免疫した日およびその2日後に、マウスに百日咳毒素(Ptx；List Biological Laboratories、カリフォルニア州キャンベル) 200ngを腹腔内注射した。マウスは、以下の尺度に従ってEAEの徴候に関して毎日評価した；0、正常；1、尾部弛緩または軽度後肢脱力；2、中等度後肢脱力または軽度運動失調；3、準重度後肢脱力；4、重度後肢脱力または軽度前肢脱力または中等度運動失調；5、中等度以下の前肢脱力を伴う対麻痺；および6、重度前肢脱力もしくは重度運動失調を伴う対麻痺、または瀕死状態。
【０２８０】
疾患発症時に、マウスを、媒体(20mM Tris-HCl)；3日もしくは4日間、もしくは抗ヒスタミン(25mg/kg)と共に8日間連続して毎日静脈内投与する100μgのRTL400もしくはRTL401、または8日間皮下投与する100μgのRTL400およびRTL401、または8日間連続して静脈内もしくは皮下投与する10μg遊離PLP139-151ペプチドで処置した。対照マウス群および処置マウス群を、疾患発症率、発症日、死亡率、および再発の有無(χ2検定)の差、ならびにピーク臨床スコアおよび累積疾患指数(毎日のスコアの合計)(クラスカル・ワリス検定)の差について統計的に評価した。インビトロデータはすべて、疾患発症時に媒体またはRTL401 100μgの8日間の静脈内投与により処置したマウスから作成した。マウスは、免疫学的および組織学的解析のため、RTL401による処置後の様々な時点で屠殺した。
【０２８１】
病理組織診断
臨床疾患のピーク時にマウスから無傷の脊髄を摘出し、10%ホルマリンで固定した。脊髄は、固定しパラフィンに包埋してから切片を作製した後に精査した。脱髄および炎症性病変について評価するために、切片をルクソールファストブルー/過ヨウ素酸-シッフ-ヘマトキシリンで染色し、光学顕微鏡により解析した。炎症および脱髄の半定量的解析は、各マウスから少なくとも10枚の切片を調べることにより決定した。
【０２８２】
増殖アッセイ
表示の免疫化後の様々な時点で、媒体およびRTL処置マウスから流入領域リンパ節(LN)および脾臓を摘出した。細目スクリーンを通して組織をホモジナイズすることにより、単一細胞懸濁液を調製した。細胞を、96ウェル平底組織培養プレートで、単独の(対照)または様々な濃度の被験Ag(PLP139-151、PLP178-191、およびMBP84-104ペプチド)を添加した刺激培地中、4x105個細胞/ウェルで培養した。細胞を7% CO2中で37℃で3日間インキュベートした。インキュベーションの最後の18時間は、細胞を[メチル-3H]チミジン(PerkinElmer、マサチューセッツ州ボストン) 0.5μCiでパルスした。ガラス繊維フィルター上に細胞を回収し、液体シンチレーションカウンターによりトリチウム標識チミジンの取り込みを測定した。3つ組ウェルから平均値および標準偏差(SD)を計算した。Ag誘導性cpmから対照cpmを減算することにより、正味のcpmを計算した。
【０２８３】
サイトメトリービーズアレイ(CBA)によるサイトカイン測定
LNおよび脾臓細胞を、24ウェル平底組織培養プレートで、2μg/ml PLP139-151ペプチドを添加した刺激培地中、4x106個細胞/ウェルで48時間培養した。次いで上清を回収し、サイトカインについて試験するまで-80℃で保存した。マウス炎症CBAキットを用いて、IL-12、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-10、およびIL-6を同時に検出した(BD Biosciences、カリフォルニア州サンディゴ)。簡潔に説明すると、試料 50μlを混合捕獲ビーズ 50μlおよびマウスPE検出試薬 50μlと混合した。チューブを暗下で室温で2時間インキュベートし、続いて洗浄段階を行った。次に試料を洗浄緩衝液 300μlに再懸濁し、その後FACScanに取り込ませた。データはCBAソフトウェア(BD Biosciences)を用いて解析した。キット中に提供される混合ビーズ標準物質を用いて各サイトカインについて検量線を作成し、上清中のサイトカインの濃度を適切な検量線からの補間により決定した。
【０２８４】
超後期活性化Ag(VLA-4)およびリンパ球機能関連Ag(LFA-1)発現に関するFACS染色
以前に記載されている通りに(Bourdette et al., 1991)、脳由来の単核細胞をパーコール密度勾配で単離した。次いで、1x106個細胞当たりAb 1μlを添加することにより、細胞をCD3 FITC(BD PharMingen、カリフォルニア州サンディゴ)およびVLA-4-PEまたはLFA-1-PE(Southern Biotechnology Associates、アラバマ州バーミングハム)発現で染色した。細胞を4℃で20分間インキュベートし、次いで染色培地(1xPBS、3%FBS、0.02%アジ化ナトリウム)で2回洗浄してから、CellQuestソフトウェア(BD Biosciences)を用いてFACScan装置(BD Biosciences)でFACS解析した。二重陽性T細胞を、解析した単核細胞全体に占める割合として算出した。
【０２８５】
RNAの単離およびRT-PCR
RNeasyミニキットプロトコル(Qiagen)を用いて脊髄から全RNAを単離し、次いでオリゴ(dT)、ランダムヘキサマー、およびSuperscript RT II酵素(Invitrogen、ニューヨーク州グランドアイランド)を用いてcDNAに変換した。Quantitect SYBR Green PCRマスターミックス(Qiagen)およびプライマー(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティーにより合成)を用いて、リアルタイムPCRを行った。反応は、以下の遺伝子を検出するための記載のプライマー配列(5'から3')を用いて、ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems)で行った。
2008537736.tif 000051
【０２８６】
上記の研究において、RTLは、単相性EAEを発症したルイスラット(Burrows et al., 1998；Burrows et al.,1999)および慢性EAEを発症したTg DR2(DRB1*1501)マウス(Vandenbark et al., 2003)において、疾患の臨床的および組織学的徴候を好転させることが示された。本実施例において、SJL/JマウスにおいてPLP139-151ペプチドにより誘発される再発性EAEに対するRTL治療の有効性がさらに実証された。SJLマウスにおけるEAEの処置は、マウスMHCクラスII設計改変を必要とし、PLP139-151ペプチドに共有結合したI-As分子のα1およびβ1ドメイン(RTL401)または結合ペプチドをもたないRTL(RTL400)を含んだ。
【０２８７】
マウスRTLの生化学的特徴づけ
CD解析から、ヒトRTLが、X線結晶学によって決定される天然ヒトMHCクラスII分子のTCR認識/ペプチド結合α1β1ドメインと類似した二次構造組成を有することが示される(Chang et al., 2001；Smit et al., 1998；Li et al., 2000)。本研究において観察されたCDデータから、マウスRTLが、すべてのマウスMHCクラスII Ag結合ドメインに共通した類似の逆平行βシートプラットフォームおよびαヘリックス二次構造(Fremond et al., 1998；He et al., 2002；Scott et al., 1998)を共有することが示された。サイズ排除クロマトグラフィーデータ(図26)およびDLSを用いる流体力学解析から、精製され再度折り畳まれたRTL400およびRTL401がTris-Cl緩衝液中で単分散分子であることが示された。サイズ排除カラムからの各ピークの画分を回収し、CDにより解析した。変数選択法(Compton et al., 1986)を用いる二次構造解析から、マウスRTLが、天然マウスI-AkおよびI-Au MHCクラスII分子に類似した非常に規則正しい二次構造(Fremont et al., 1998；He et al., 2002)を維持することが示された。
【０２８８】
SJLマウスにおけるPLPペプチド誘発性EAEの用量依存的阻害
最初の前臨床試験では、EAEの確立された徴候を有するSJL/Jマウスを、PLP139-151ペプチドを含むRTL401 100μgの様々な回数の連日静脈内注射で処置した。図27に示すように、対照マウスは典型的に再発性EAEの疾患経過を表し、PLP139-151ペプチド/CFAの注射後11〜12日目に急性疾患の最初のエピソードを発症し、15日目にピーク臨床スコアを生じ、その後臨床的に改善して、この改善は20日目まで持続した。本質的にすべてのマウスにおいて、22目までに最初の再発が明白となり、27〜28日目に2次ピークに達した。マウスは一般的にその後寛解し、さらに再発したまたは慢性EAEを発症した可能性があるが、臨床経過におけるこれらの変動は個々のマウスにおいて散発的に起こった。
【０２８９】
12日目に開始し、8日間連続して継続するRTL401 100μgの静脈内注射による処置が、臨床的EAEに最大の効果を及ぼしたが(図27；表7)、より少ない回数の連日静脈内注射(連続3日間または4日間)でも、効果がわずかに低いにすぎなかった(表7)。媒体処置対照と比較すると、3つの療法はすべて、最初の24時間以内に臨床疾患を改善し、最初の臨床エピソードのピーク重症度を軽減し、本質的に再発を排除した(図27；表7)。RTL401処置は、毎日の臨床スコアを最小限に検出できる疾患にまで減少させ、これはほぼ4週間の処置の休止後でさえ維持され、また累積疾患指数を有意に減少させた(表7)。RTL401 100μgを8日間連日静脈内投与するマウスは抗ヒスタミンで処置して、RTLに対するアレルギー反応の発生を抑えた。抗ヒスタミン単独の同様の療法よるマウスの処置は、再発性EAEの経過に影響を及ぼさなかった(表7)。RTL401で処置したマウスとは対照的に、空のRTL400構築物 100μgまたはモル濃度で等価な用量の遊離PLP139-151ペプチド(10μgペプチド/注射)を抗ヒスタミンと共に8日間連日静脈内投与して処置したマウスでは、未処置の対照マウスと比較して有意な臨床的有益性が認められなかった(表7)。
【０２９０】
（表７）PLP139-151/CFAを免疫化したSJL/JマウスにおけるEAEに及ぼすRTL401およびRTL400処置の効果
2008537736.tif 000052
2008537736.tif 000053
a対照と比較した有意差、p＜0.05。
bペプチドと比較した有意差、p＜0.05。
cRTL400と比較した有意差、p＜0.05。
d抗ヒスタミンと比較した有意差、p＜0.05。
【０２９１】
図27および表8に示すように、皮下経路によって投与したRTL401 100μgの8日間の連日注射もまたEAEの処置において有効であり、わずかに再発率が減少し、静脈内注射と類似の様式で毎日の臨床スコアおよび累積疾患指標が有意に減少した。対照的に、これに匹敵する空のRTL400構築物またはモル濃度で等価な用量の遊離PLP139-151ペプチドの皮下注射は、SJLマウスにおけるEAEの臨床経過に何ら影響を及ぼさなかった。これらの結果から、RTL401の静脈内および皮下投与はいずれも、EAEの再発を軽減し、20日目にRTL処置を休止した後でさえも長期の臨床的有益性をもたらすことが実証される。
【０２９２】
（表８）PLP139-151、PLP178-191、またはMBP84-104で免疫化した雌SJLに及ぼすRTL401処置の効果
2008537736.tif 000054
2008537736.tif 000055
a対照群と処置群との間の有意差、p＜0.05。発症率：群内で発症したマウスの数。発症：EAEの最初の臨床徴候が認められた日。ピーク：最大EAEスコア。再発：48時間にわたるEAEスコアの1ポイントの減少、およびその後の48時間にわたるEAEスコアの増加を示すマウスの数。平均CDI：累積疾患指数；実験の全期間にわたる毎日のスコアの合計。
【０２９３】
ペプチド特異的でありかつ同族MHCを必要とする、EAEに及ぼすRTL処置効果
インビボにおけるRTL処置のペプチド特異性を評価するため、いずれもI-Asにより拘束される2つの異なる脳炎誘発性ペプチド、PLP178-191およびMBP84-104によりSJL/Jマウスで誘発したEAEを、RTL401を用いて処置した。RTL401 100μgの8日間の連日静脈内注射は、媒体処置対照マウスと比較して、いずれのペプチドにより誘発されるEAEの全体的重症度にも再発率にも有意に影響しなかったが(p＞0.2)、各症例において累積疾患指数のわずかな減少が認められた。EAEを有するPLP178-191およびMBP84-104ペプチド免疫化マウスにおける42日目のLN応答は、免疫化ペプチドにのみ特異的であり、PLP139-151ペプチドに対して応答は認められず、エピトープ拡散の欠如が示された。
【０２９４】
RTL処置のMHCの必要性およびペプチド特異性をさらに評価するため、RTL401を用いて、(C57BL/6xSJL)F1マウスにおいてPLP139-151ペプチドまたはMOG35-55ペプチドにより誘発されたEAEを処置した。これらのマウスはPLP139-151(I-As)およびMOG35-55(I-Eb)ペプチドを拘束するI-AsおよびI-Eb MHCクラスII分子の両方を発現しており、いずれの場合も脳炎誘発反応を生じる。図28に示すように、疾患発症時にRTL401 100μgの8日間の連日静脈内注射により処置すると、PLP139-151ペプチドにより誘発されたEAEの重症度は有意に減少したが、MOG35-55ペプチドにより誘発されたEAEでは効果が認められなかった。これらのデータから、EAEのRTL処置は、MHCおよび神経抗原ペプチドの同族の組み合わせに対して特異的であることが示された。
【０２９５】
エクスビボにおける末梢T細胞応答に及ぼすRTL401処置の効果
EAEを有する媒体対照およびRTL401処置(100μgの8日間の連日静脈内注射)SJL/Jマウスに由来するLNおよび脾細胞を、処置過程において、免疫化PLP139-151ペプチドに対する増殖応答およびサイトカイン応答について解析した。疾患発症の直後で処置の前(11日目)、処置開始の24時間後(13日目)、最初の臨床エピソードのピーク時(15日目)、最初の寛解の時点(18日目)、最初の再発の開始時(22日目)、最初の再発のピーク時(28日目)、および最初の再発の終了時(42日目)に、免疫細胞応答を評価した。DR2発現マウスにおける以前に公表された結果(Vandenbark et al., 2003)とは対照的に、EAEの経過中のいずれの時点においても、増殖応答に及ぼすRTL処置の有意な阻害効果は認められなかった。図29に例証するように、RTL401による処置により、LN培養物におけるPLP139-151ペプチドに対する増殖応答はわずかに阻害されたが、図29に示す42日目を含むいくつかの時点で脾細胞培養物の増殖は有意に増強された。対照的に、RTL401処置は、PLP139-151刺激脾細胞からのサイトカイン分泌に混合効果をもたらした(図30)。RTL401処置開始の1日後(13日目)には、対照マウスと比較してサイトカインの有意な変化は認められなかった。驚くべきことに、EAEの最初のエピソードのピーク時(15日目)に、対照マウスに対してRTL401処置マウス由来の脾細胞培養液において、炎症因子(TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-6)および抗炎症因子(IL-10)の分泌の増強が認められた。しかしながら、EAEの最初のエピソードからの寛解期に(18日目)サイトカイン像は劇的に変化し、IFN-γレベルは強度に減少し、MCP-1レベルはなお増強されたが、RTL401処置マウスにおけるTNF-α、IL-6、およびIL-10に有意差は認められなかった。最初の再発の発症時には(22日目)、RTL401処置マウスにおいて分泌されたIFN-γの有意な減少が再度認められたが、他の炎症因子に有意差は認められなかった(図30)。全身制御にとって重要であり得ることには、最初の再発の発症時およびピーク時(それぞれ22日目および28日目)に、RTL401処置マウス由来のPLP139-151反応性脾細胞による分泌IL-10レベルの顕著な増加が認められた。EAEの過程中、IgG1およびIgG2a Abが血清中に検出されたが、そのレベルはRTL401処置の結果としてわずかな変動を示すにすぎなかった。
【０２９６】
EAE過程におけるCNSに及ぼすRTL401処置の効果
EAEに及ぼすRTL401処置の効果をさらに評価するため、組織学的切片を取得し、CNS細胞の表現型および機能解析を行った。46日目に採取した脊髄の組織学的切片から、対照マウスに対してRTL401処置マウスにおける炎症性病変の軽減および脱髄の減少が示された。より具体的には、RTL処置マウス由来の脊髄は、周囲の有髄組織においてごくわずかにミエリン染色を消失してまたは明らかな消失なしに、高密度の単核細胞浸潤を示した。対照非RTL処置マウス由来の脊髄は、高密度単核細胞浸潤の複数の領域を示し、単核細胞浸潤に隣接した領域にはミエリン染色の多大な散在性消失が存在した。RTL401処置マウスに見出される炎症活性のこの減少は、処置過程にわたる脳および脊髄組織から得られる炎症性単核細胞の数の減少に反映された(図31)。炎症細胞の減少は最初の臨床エピソードの発症時およびピーク時(13日目および15日目)ならびに最初の再発の発症時(22日目)に最も顕著であり、FACS解析によって決定されるCD4+ T細胞の全体的な減少(43%から23%)およびしかしCD11b+単核細胞/マクロファージの上昇(38%から60%)によって特徴づけられた。さらに、接着/ホーミングマーカー、VLA-4およびLFA-1を発現しているT細胞の数は、EAE誘発後の22日、28日、および42日目(脳のみ)に、RTL401処置マウス由来の脳および脊髄で一貫して減少していた(図32)。15日目の、RTL-401処置マウス由来の脊髄組織のRT-PCR解析から、炎症性サイトカイン(IFN-γ、TNF-α、およびIL-6)およびケモカイン(RANTES、MIP-2、およびIP-10)のmRNA発現の中程度から強度の減少、ならびにしかしこのサイトカインの防御的役割を示す他のデータと一致する(Matejuk et al., 2004)TGF-β3の発現の増強もまた示された(図33)。IL-10の発現は、RTL処置マウス由来の脊髄においてEAE疾患過程を通して非常に低く、最初の再発期(22日目)にRTL401処置マウスにおいてわずかに増強されるにすぎなかった(図33)。興味深いことに、大部分のケモカイン受容体(CCR1、CCR2、CCR5、CCR6、CCR7、およびCCR8)の発現は、RTL401処置マウス由来の脊髄組織において、最初のエピソードのピーク時(15日目)に始まって中程度から強度に減少していた(図34)。対照的に、CCR3(Th2関連)の発現は、最初の再発期(22日および28日目)に、対照マウスに対してRTL401処置マウスから回収された脊髄組織において独特に増強されるようであった(図34)。
【０２９７】
胸髄白質に及ぼすRTLの効果
別の実験において、RTL401を用いて、SL/JマウスにおけるPLP-139-151により誘発されるEAEを処置した。EAEの発症は11日目に明白となり、20日目にピークに達した。マウスに、20日目に開始する静脈内注射によるRTL401の連続5回の処置、および32日目に開始する皮下注射による連続3回の処置を施した。CO2吸入により60日目にマウスを屠殺した。吹送により脊髄を摘出し、10%ホルマリン/PBSで固定した。パラフィン切片を調製し、ヘマトキシリンおよびエオシンで染色した。脊髄当たり10の横断面それぞれにおいて、神経病変を等級づけした。図43ならびに表9および10に見られる通り、RTL401による処置により、脊髄胸部の背側、外側、および腹側白質におけるミエリン損傷の量が有意に減少した。
【０２９８】
（表９）個々のマウスの臨床スコア
2008537736.tif 000056
【０２９９】
（表１０）ニューマン・クールズ多重比較検定を伴う、分散の一元配置ANOVA解析
*統計的に有意な比較。
2008537736.tif 000057
【０３００】
先行開示は、臨床的EAEを好転させ、長期T細胞寛容を誘導するヒトおよびラットT細胞に特異的なオリゴマーRTLの設計の成功およびその有効性の実証を示している。本実施例では、SJL/JマウスにおけるEAEの再発モデルに及ぼす単量体マウスRTL401(I-As/PLP139-151ペプチド)の設計特性および治療効果を実証する。一般的に、RTL401は、以前に設計された分子と比較して非常に類似した構造特性およびEAEに対する治療効果を有したが、標的化する脳炎誘発性T細胞の活性化および炎症特性に及ぼすその効果にいくつかの重要な相違が示された。類似の単量体型のヒトDR2 RTLが生成され、慢性EAEを発症するHLA-DR2トランスジェニックマウスにおいて試験されているが、これは本発明の種々の態様においても有用である(例えば、それぞれ全体として参照により本明細書に組み入れられる、2003年9月5日に出願された米国仮特許出願第60/500,660号；および2004年9月7日に出願された米国特許出願第10/936,437号；およびHuan et al., 2004を参照されたい)。
【０３０１】
マウスRTLのCDスペクトルによる二次構造解析から、RTL400およびRTL401が、天然のマウスI-AkおよびI-Au MHCクラスII分子に類似した非常に規則正しい二次構造(Fremont et al., 1998；He et al., 2002)を維持することが示された。組換えRTLは、システイン17と79(RTL401アミノ酸の番号づけ、マウスI-Asβ鎖残基42および104に相当する)の間の天然のジスルフィド結合を含む比較的小さい分子(〜24kDa)である。このジスルフィド結合は再折り畳みに際して保持され、このことは、還元剤、2-MEの存在下または非存在下でのRTLの電気泳動(SDS-PAGE)において移動度を比較することにより実証された。RTL400およびRTL401はいずれも2-MEの非存在下においてより高い移動度を示し、還元されたRTLと比較して構造がより小型であることが示された。同時にこれらのデータから、この分子の高次構造的完全性が最初に確認された。再折り畳みの過程において凝集する傾向のあるヒトHLA-DR2構築物およびラットI-A構築物とは異なり、マウスRTL構築物は、光散乱およびサイズ排除クロマトグラフィー解析に基づき、単分散分子であると考えられる。
【０３０２】
潜在的に臨床的に重要なことには、これらの単分散分子はインビボ投与した場合に、PLP139-151ペプチド誘発性EAEの特異的かつ顕著な阻害を誘導したが、他のミエリンペプチドにより誘発されるEAEの阻害を誘導しなかった。本明細書の研究から、EAEの臨床徴候を好転させ、RTL連日注射の3日、4日、または8日間の単一過程を完了してから少なくとも26日間再発を防ぐ、この最小TCRリガンドの強力な活性が実証された。RTL処置後の疾患の発現は最小限であったが、RTL処置DR2 Tgマウスにおいて認められる臨床徴候の完全な排除(Vandenbark et al., 2003)とは異なり、持続的であった。慢性低レベルEAEの1つの解釈は、エピトープ拡散であり得る(Lehman et al., 1992；Vanderlught, 2003)。この関連において特筆すべきは、本明細書に記載のRTL処置マウスが、PLP178-191またはMBP84-104を含む他の公知の準優位な脳炎誘発性ペプチドに対してT細胞応答を発現しなかったことである。静脈内注射により最小のEAEスコアが提供されたが、皮下注射もまた高度に効果的であった。この知見により、注射の容易さおよび過敏症反応のリスクの減少のために皮下経路の注射が好ましいヒトに対するRTL治療の将来的な応用が容易になる。このような反応は静脈内注射によるRTL処置SJL/Jマウスで示されたが、これは抗ヒスタミンの注射によって制御することができた。
【０３０３】
機構的にマウスRTL401は、DR2トランスジェニックマウスにおいて慢性EAEを阻害した本発明者らのヒトDR2/MOG35-55構築物(Vandenbark et al., 2003)およびルイスラットにおいて単相性EAEを阻害した本発明者らのRT-1B1/MBP72-89構築物(Burrows et al., 2000)と比較していくつかの相違を有すると考えられた。以前の構築物はいずれもオリゴマーであり、増殖ならびにIFN-γおよびTNF-αを含む炎症性サイトカインの分泌によって評価されるLN T細胞応答の著しい減少を誘導した。対照的に、マウスI-As/PLP139-151構築物では、PLP139-151ペプチドに対するT細胞増殖応答は有意に軽減されず、その代わりに、脾細胞増殖、ならびに処置の最初の3日間に炎症性サイトカイン(TNF-αおよびIFN-γ)および抗炎症性サイトカイン(IL-10)の両方の分泌が増強された(図30)。一般的に、炎症性サイトカインの発現における変動は、対照SJL/JマウスにおけるEAEの再発および寛解の期間を反映し、18日目(寛解)よりも15日目(最初のエピソードのピーク)および22日目(最初の再発)により多くの発現が認められた。しかしながら、RTL401で処置を継続すると、同時にIL-10レベルの上昇を維持しながら、IFN-γレベルが強度に減少した(図30)。これらのデータから、SJLマウスにおいてRTLは、なお標的器官(CNS)へのホーミングが可能である処置T細胞においてアネルギーまたはアポトーシスではなくサイトカイン変換を誘導したことが示される。興味深いことには、DR2/MBP85-99またはDR2/cABLペプチドRTLを用いてインビトロでヒトT細胞クローンを処置すると、IL-10分泌の類似の増強が起こり、ヒトにおけるRTL誘導性サイトカイン変換機構の可能性も高まった(Burrows et al., 2001)。IL-4およびIL-5などの他のTh2サイトカインも関与している可能性がある。
【０３０４】
末梢で認められる機構の相違は明らかに、CNSにおける相違ももたらした。RTL処置SJLマウス由来の脊髄組織の組織学的切片から、脱髄の低下および炎症性病変のわずかに中程度の軽減が認められた。さらに、RTL401処置マウス由来の脳および脊髄組織では、EAEから防御された、浸潤CNS細胞のより徹底的な減少を有するRTL312処置DR2マウス(Vandenbark et al., 2003)とは異なり、湿潤細胞数はわずかに減少していたにすぎなかった。最初の再発期に、RTL処置SJL/Jマウスでは、EAEにおいてCNS組織における炎症性病変の血管周囲部位への白血球の直接的ホーミングにとって重要であることが知られている接着分子、VLA-4およびLFA-1(Gordon et al., 1995；Theien et al., 2001)を発現している浸潤細胞の割合が有意に減少していた。CNS組織由来のmRNAのさらなる解析からも、炎症性サイトカイン(IFN-γ、TNF-α、およびIL-6)およびケモカイン(RANTES、MIP-2、およびIP-10)の発現の著しい減少、ならびにしかし抗炎症性サイトカイン(TGF-β3およびIL-10)の発現増強が実証された。IL-10は、IFN-γの産生およびEAEの臨床的発現を阻害することが知られており(Cua et al., 1999)、TGF-β3の発現増加およびEAE防御との関連もまた報告されている(Matejuk et al., 2004)。CNSにおける炎症性ケモカイン受容体の発現パターンはEAEの臨床疾患経過と関連していると考えられ、最初のエピソードのピーク時および/または最初の再発の開始時に最も強く発現した。
【０３０５】
これらの知見に加えて、CCR1、CCR2、およびCCR7はEAEの最初のエピソードの期間に対照マウスにおいて優先的に発現されるようであるのに対し、CCR5、CCR6、CCR8は最初の再発の期間により強く発現された。重要なことには、RTL401による処置により、EAEのいずれの臨床エピソードにおいても、これらのCCRすべての発現が減少した(図34)。EAEを有するC57BL/6マウスにおける研究では、EAEのピーク時にCNSにおけるCCR1、CCR2、およびCCR5の発現増強が認められた(Matejuk et al., 2001)。さらに、IL-12およびIL-18それぞれによる脳炎誘発性T細胞のインビトロ処置により、IFN-γ/CCR5およびTNF-α/CCR4/CCR7の発現が増強され、またEAEの伝達が増強された(Ito et al., 2003)。IL-12によるCCR5の上昇制御はまた、LFA-1媒介性接着性を増強することが報告されており(Mukai et al., 2000)、CCR7のそのリガンド、MIP-3bへの結合は、CD4+ T細胞の増殖および自己免疫の進行を促進する(Ploisx et al., 2001)。EAE期におけるそれらの発現パターンおよびRTL401によるそれらの強力な下方制御に基づき、本知見から、CCR6(Schutyser, 2003)およびCCR8(Romagnani, 2002)が、EAEに寄与する可能性のある炎症性CCRとして関係づけられた。炎症性CCRに及ぼす阻害効果とは対照的に、RTL401処置は、最初の再発の開始およびピークの期間に、Th2応答と関連づけられているCCR3(Salusto et al., 1998)の発現を強力に増強した(図34)。EAE防御マウスにおけるこのCCR3のこの増強は、TCR BV8S2決定基による処置に成功したBV8S2トランスジェニックマウスにおけるにCCR3の強力な上方制御を連想させる(Matejuk et al., 2000)。併せて考えると、これらの知見から、CCR発現の制御がRTL処置機構の重要な機能であることが示される。
【０３０６】
このようにして、脳炎誘発性PLP139-151ペプチドに応答してサイトカイン変換を促進するRTL治療の全身効果により、明らかに、CNS組織に浸潤するいくらかの能力を保持する非脳炎誘発性T細胞表現型が生成された。しかしながら、RTL401処置マウス由来の浸潤細胞では明らかに、炎症能が減少し、抗炎症因子の分泌が増強され、防御的CCRの発現が増強されていた。したがって、RTL改変T細胞によるCNSにおける疾患惹起脳炎誘発性T細胞の置換は、炎症性病変の部分的回復および臨床疾患の好転を伴った。しかしながら、持続性低レベルEAEは、本発明者らの仮定するT細胞サイトカイン変換機構により誘導される不完全な制御に起因する可能性があり、残存する小さな病変が脊髄切片中に見出された。本明細書で検討したサイトカイン変換機構は、PLP139-151ペプチドをのせた精製された天然の4ドメインI-As分子を用いて他の研究者によりSJL/Lマウスにおいて以前に報告されたアネルギー機構とも、または凝集型の2ドメインRTLで処置したHLA-DR2マウスにおける明白な欠失機構(Vandenbark, et al., 2003)とも異なる。
【０３０７】
結論として、本実施例により、SJLマウスでのEAEの再発モデルにおけるマウス最少TCRリガンドの強力な治療効果が初めて実証される。RTLの静脈内または皮下注射の単一過程により再発が予防され、IL-10、TGF-β3、およびCCR3を含むサイトカイン変換機構によって媒介されると考えられる長期の臨床的有益性が誘導され、結果としてCNS炎症および脱髄の緩和が起こる。これらの結果から、多発性硬化症などのT細胞媒介性自己免疫疾患の処置としての、この新たな種類のペプチド/MHCクラスII構築物の臨床適用が強く支持される。
【０３０８】
実施例15
実験的自己免疫性脳脊髄炎のCNSおよび末梢部位におけるT細胞生物学に及ぼすサイトカイン変換および関連のRTL効果
動物
雌SJLマウスは、7〜8週齢の時点でJackson Laboratory(メイン州バーハーバー)から入手した。マウスは、施設の指針に従ってポートランド退役軍人医療センター動物施設に収容した。
【０３０９】
RTLの構築および生成
RTL401の設計、クローニング、および発現の方法は、実施例14に上記したものを利用した。次いで、マウスI-Asβ1α1挿入物をpET21d(+)ベクターに連結し、陽性コロニーの選択および配列確認のために、Nova blue大腸菌宿主(Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。次に、RTL400およびRTL401プラスミド構築物を大腸菌株BL21(DL3)発現宿主(Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。タンパク質の精製については、以前に記載されている通りに行った(Chang et al., 2001)。精製タンパク質の最終収率は、15〜30mg/L細菌培養液の間で変動した。
【０３１０】
動的光散乱(DLS)解析
光散乱実験は、DynaPro分子サイズ測定装置(Protein Solutions, Inc.、バージニア州シャーロッツビル)で行った。pH8.5の20mM Tris-Cl緩衝液中のタンパク質試料を1.0mg/mlの濃度で100nm Anodisc膜フィルター(Whatman、ニュージャージー州クリフトン)を通して濾過し、濾過試料20μlを石英キュベットに入れ、488nmレーザービームで解析した。4℃で50スペクトルを収集し、水溶液中のタンパク質の拡散係数および相対多分散性を決定した。次いで、データをDynamicsソフトウェアV.5.25.44(Protein Solutions、バージニア州シャーロッツビル)で解析し、緩衝液基準を減算した。データは、単位としてnmを使用して、試料の流体力学半径の平均値として表した。RTLの分子量は、DynamicsソフトウェアV.5.25.44(Protein Solutions、バージニア州シャーロッツビル)を用いて決定した。
【０３１１】
円二色性(CD)解析
CD解析は、Aviv Model 215 CD分光計(Aviv Associates、ニュージャージー州レークウッド)を用いて、組換えタンパク質がpH8.5のTris-Cl緩衝液中に存在すること以外は以前に記載されている通りに行った(Chang et al., 2001)。内蔵アルゴリズムを用いてスペクトルを平均化および平滑化し、緩衝液基準を減算した。内蔵デコンボリューションソフトウェアパッケージ(CDNNバージョン2.1)および変数選択法(Compton et al., 1986)を用いて、二次構造を決定した。
【０３１２】
臓器刺激、細胞移植、およびRTL処置
SJLマウスを、完全フロイントアジュバント 200μg中のPLP139-151(ser) 150μgで免疫化した。免疫化の10日後に、リンパ節および脾臓を摘出し、2%ウシ胎仔血清を含む刺激培地中、10μg/ml PLP139-251の存在下でインビトロで48時間培養した。次いで細胞を洗浄し、1千500万個の活性化細胞(blasting cell)をSJLマウスに静脈内注射した。マウスは、以下の尺度に従ってEAEの徴候に関して毎日評価した；0＝正常；1＝尾部弛緩または軽度後肢脱力；2＝中等度後肢脱力または軽度運動失調；3＝準重度後肢脱力；4＝重度後肢脱力または軽度前肢脱力または中等度運動失調；5＝中等度以下の前肢脱力を伴う対麻痺；および6＝重度前肢脱力もしくは重度運動失調を伴う対麻痺、または瀕死状態。累積疾患指数(CDI)は、実験の全期間にわたる各マウスの毎日のEAEスコアの合計である。CDIは各群の平均値±SDとして表す。EAEの臨床徴候の発症時にマウスを3群に分割し、対照として、または抗ヒスタミンを伴うRTL401 100mlの5日間の静脈内注射、もしくはRTL401 100mlの8日間の皮下注射で処置した。マウスは、エクスビボ解析のために屠殺するまで、疾患についてモニターした。
【０３１３】
病理組織診断
臨床疾患の19日目にマウスから無傷の脊髄を摘出し、10%ホルマリンで固定した。脊髄は、固定しパラフィンに包埋してから切片を作製した後に精査した。切片は、炎症性病変を評価するためにヘマトキシリン/エオシン(HE)で染色し、光学顕微鏡により解析した。炎症の半定量的解析は、各マウスに由来する頸部、胸部、および腰部切片の少なくとも10枚の複製物を調べることにより決定した。
【０３１４】
非リン酸化神経フィラメントのウェスタンブロット(免疫ブロッティング)検出
手順は、Pitt et al. (2000)によって記載されている通りに実施した。PBS灌流脊髄を、氷冷RIPA＋緩衝液(50mM Tris-HCl、pH7.5、150mM NaCl、1% NP-40、0.5%デオキシコール酸、0.1% SDS、1mM NaCO3)およびプロテアーゼ阻害剤中でホモジナイズし、振盪しながら15分間インキュベートした。遠心分離(4℃で14,000xg、15分間)後に上清を回収し、タンパク質濃度を測定してRIPA＋緩衝液で調整した。試料をサンプリング緩衝液中で70℃にて10分間変性させ、次いで10% SDS-PAGEにより分離し、PVDF膜にブロットした。転写後、膜を3% BSA中で1時間ブロッキングした。非リン酸化神経フィラメントに特異的な一次モノクローナル抗体SMI 32(3% BSAおよび0.05% Tween-20で1：5,000希釈、Sternberger Monoclonals、メリーランド州ルーサービルから購入)と共に4℃で一晩インキュベートすることにより、免疫検出を行った。洗浄した後、ブロットを、マウスIgGに対する西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ヤギ抗体(3% BSAおよび0.05% Tween-20で1：5,000希釈、Pierce Biotechnology, Inc.、イリノイ州ロックフォードから購入)と共に1時間インキュベートし、次いで洗浄した。ブロットは、SuperSignal West Pico Chemiluminescentキット(Pierce)により発色させた。のせたタンパク質の量を管理するため、この膜をRestore Western Blot Stripping Buffer(Pierce)を用いてストリッピング処理し、Chemicon(カリフォルニア州テメキュラ)から購入した、グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素(GAPDH)に対するモノクローナル抗体で再度検出した。発色後に、フィルムをスキャンし、Image Quantソフトウェア(Amersham、ニュージャージー州ピスカタウェイ)で定量化した。
【０３１５】
増殖アッセイ
PLP特異的T細胞を、培地のみ、PLP139-151(10μg/ml)、RTL401(原液)、またはRTL401(1：10)の存在下おいてインビトロで24時間インキュベートした。次いで細胞を徹底的に洗浄し、20,000個のT細胞を96ウェル平底プレートで、単独のまたは10μg/mlもしくは2μg/mlのPLP139-151を添加した刺激培地中、2x105個抗原提示細胞と共に培養した。次いで、細胞を7% CO2中で37℃で2日間インキュベートした。インキュベーションの最後の18時間は、細胞を[メチル-3H]チミジン(Perkin Elmer、マサチューセッツ州ボストン) 0.5μCiでパルスした。ガラス繊維フィルター上に細胞を回収し、液体シンチレーションカウンターによりトリチウム標識チミジンの取り込みを測定した。3つ組ウェルから平均値および標準偏差を計算した。対照cpmに対する抗原特異的cpmの比を計算することにより、刺激指数を決定した。
【０３１６】
サイトメトリービーズアレイ(CBA)によるサイトカイン測定
各群のマウス3匹から脳をプールし、細目スクリーンを通して処理した。次いで単核細胞を40%〜80%パーコール勾配で単離し、1x106個の脳細胞を24ウェルプレートで、10μg/ml PLP-139-151ペプチドの存在下で、3x106個の照射脾細胞(補充細胞(filler cell)として使用)と共に48時間培養した。脾臓および血液単核細胞は、24ウェル平底培養プレートで、2μg/ml PLP-139-151ペプチドを添加した刺激培地中、4x106個細胞/ウェルで48時間培養した。
【０３１７】
次いで試料の上清を回収し、サイトカインについて試験するまで-80℃で保存した。マウス炎症CBAキットを用いて、IL-12p40、TNF-α、IFN-γ、MCP-1、IL-10、およびIL-6を同時に検出した(BD Bioscience)。簡潔に説明すると、試料 50μlを混合捕獲ビーズ 50μlおよびマウスPE検出試薬 50μlと混合した。チューブを暗下で室温で2時間インキュベートし、続いて洗浄段階を行った。次に試料を洗浄緩衝液 300μlに再懸濁し、その後FACScanに取り込ませた。データはCBAソフトウェア(BD Biosciences)を用いて解析した。キット中に提供される混合ビーズ標準物質を用いて各サイトカインについて検量線を作成し、上清中のサイトカインの濃度を適切な検量線からの補間により決定した。
【０３１８】
IL-13およびIL-4検出のためのELISA法
免疫化後19日目に、対照、RTL(静脈内)、およびRTL(皮下)マウスから脾臓、血液、および脳を摘出し、4x106個細胞を刺激培地中、10μg/ml PLP139-151の存在下において48時間培養した。インビトロアッセイの場合には、細胞を、PLP139-151(2μg/ml)と共にまたはこれを伴わずに、APCの存在下で培養した。上清を回収し、さらなる試験まで-80℃で凍結した。96ウェルプレートを、1xPBSまたは炭酸水素ナトリウムコーティング緩衝液中の抗マウスIL-13またはIL-4捕獲抗体(4μg/ml) 100μlでコーティングした。プレートを4℃で一晩インキュベートした。次にプレートを洗浄緩衝液(1xPBS/0.05% Tween-20)で洗浄し、ブロッキング緩衝液(1xPBS、2% BSA)で室温で2時間ブロッキングした。次いでプレートを洗浄し、試料または標準物質100μlを各ウェルに添加した。Il-13プレートは室温で2時間インキュベートし、IL-4プレートは4℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄し、ビオチン化抗体(IL-13またはIL-4) 100μlを添加した。IL-13プレートは室温で2時間インキュベートし、IL-4プレートは室温で45分間インキュベートした。次にプレートを洗浄し、100mlの1：200希釈HRPをIL-13プレートに添加し、1：400希釈HRPをIL-4プレートに添加した。プレートを室温で30分間インキュベートし、続いて洗浄段階を行った。その後、TMB色素原(KPL、メリーランド州ゲイサーズバーグ) 100μlを添加した。プレートを約30分間発色させ、停止溶液(KPL、メリーランド州ゲイサーズバーグ) 100μlを添加することにより反応を停止させた。続いて450nmで光学濃度を測定した。
【０３１９】
RNAの単離およびRT-PCR
RNeasyミニキットプロトコル(Qiagen、カリフォルニア州バレンシア)を用いて脊髄から全RNAを単離し、次いでオリゴdT、ランダムヘキサマー、およびSuperscript RT II酵素(Invitrogen、ニューヨーク州グランドアイランド)を用いてcDNAに変換した。Quantitect SYBR Green PCRマスターミックス(Qiagen)およびプライマー(ABIにより合成)を用いて、リアルタイムPCRを行った。反応は、L32ハウスキーピング遺伝子を対照として含め、以下の遺伝子を検出するための従来の市販のプライマーを用いて、ABI Prism 7000 Sequence Detection System(Applied Biosystems、カリフォルニア州フォスターシティー)で行った。
2008537736.tif 000058
媒体群と処置群の間の統計的有意差は、マン・ホイットニー検定により決定した。サイトカインレベルの差は、スチューデントのt検定により評価した。P値≦0.05を有意とみなした。
【０３２０】
RTL401により処置される受動的に誘発されたEAE
SJLマウスに、1千500万個のPLP139-151特異的T細胞を注射した。EAEの臨床徴候の発症時(6日目)に、マウスを媒体、またはRTL401の5日間の静脈内注射、またはRTL401の8日間の皮下注射で処置した(図35A)。静脈内および皮下経路の投与はいずれも、疾患の臨床徴候の抑制に非常に効果的であった。媒体処置マウス(n＝8)が累積疾患指数(CDI) 46±10.5を示したのに対し、静脈内処置マウス(n＝8)はCDI 19.5±5.1を有し、皮下処置マウスではCDI 21.4±9.9であった。静脈内および皮下処置マウスではピーク疾患スコアもまた有意に低く(媒体4.5±0.9 対 皮下群2.3±1.0 対 静脈内群2.1±0.4)、p＜0.01)、臨床スコアの持続した減少に先だつ、RTL401処置群におけるEAEのごく最小限の進行が示された。RTL401の著しい治療効果は、2回目の実験において高度に再現性があった(媒体群のCDI 50.5±4.4 対 RTL静脈内処置マウスのCDI 18.9±7.9、各群につきn＝7、p＜0.01、図35B)。疾患のピーク強度もまた、RTL静脈内処置後に顕著に抑制された(対照4.9±0.2 対 RTL処置マウス2.4±0.8)。
【０３２１】
RTL処置によるCNSにおける炎症の軽減
媒体処置マウスから19日目に摘出した脊髄の組織学的検査から、高密度でかつ限局性の単核細胞浸潤を伴う炎症性病変が示された(図40A)。対照的に、RTL401処置マウスの19日目の脊髄では、これらの病変の有意な軽減が認められた(図40B)。RTL401で処置すると、同様に、脳組織から回収される単核細胞が60%減少した(媒体から2x106個 対 RTL静脈内処置から8x105個)。
【０３２２】
RTL処置によるEAE過程における軸索の保護
再発性および進行性EAEは、MSで認められる軸索消失と類似の軸索消失を引き起こす。EAE過程における軸索生存に及ぼすRTL治療の効果を評価するため、T細胞移植後19日目のRTL401および媒体処置マウス(静脈内経路)の脊髄でウェスタンブロットを行い、非リン酸化神経フィラメント(NPNFL)を評価した。処置を開始したEAEの発症時(6日目)には、NPNFLおよび対照マーカー、GAPDHの染色のシグナル強度は、無症候性の未処理マウスと比較して、臨床スコア2.0を有するマウスで変化はなかった(図41Aおよび41B)。しかしながら、19日目の処置の完了時に、臨床スコア4.0を有する媒体処置マウスでは、未処理もしくは処置前マウス、または明らかな軸索消失が見られない臨床スコア1.5を有するRTL401処置マウスと比較して、NPNFLの染色が60%増加していた(図41Aおよび41B)。この実験および2回の反復実験の結果から、RTL401による早期処置は、神経線維を保護し、EAEの進行によるさらなる軸索消失を防ぐことが示された。
【０３２３】
RTL処置後のサイトカイン産生
19日目に、対照マウス、RTL静脈内処置マウス、およびRTL皮下処置マウスから、脾臓、血液、および脳を摘出した。単核細胞を単離して、10μg/ml PLP-139-151ペプチドの存在下で48時間培養し、次いで分泌されたサイトカインのレベルについて培養上清をアッセイした。EAEを有する媒体処置マウス由来の脾細胞では、PLP-139-151ペプチドにより誘導される優勢なサイトカインは、IFN-γおよびIL-13であった。RTL401の静脈内および皮下注射による処置により、Th1サイトカイン(TNF-α、IFN-γ、IL-6、図37)およびTh2サイトカイン(IL-13、IL-4、IL-10、図36)の産生の有意な増加が誘導された。EAEを有するマウス由来の血液細胞では、PLP-139-151ペプチドにより誘導されるサイトカインパターンは著しく異なり、IL-6の分泌が優勢であり、残りのTh1およびTh2サイトカインは低度から中程度レベルであった(図36および37)。RTL401の静脈内および皮下注射で処置すると、IL-6およびIL-4は50〜75%減少したが、IFN-γおよびIL-13産生は4倍を超えて増加した(図36および37)。TNF-αおよびIL-10レベルは最初から低く、RTL401による処置後も変化しなかった。
【０３２４】
EAEを有するマウス由来の脳単核細胞では、脾臓と同様に、IFN-γおよびIL-13が、PLP-139-151ペプチドにより誘導される優勢なサイトカインであった(図36および37)。対照的に、RTL401の静脈内および皮下注射による処置は、おそらくは浸潤リンパ球の数の減少に起因して、脳における炎症促進および抗炎症反応の両方に強力な抑制効果を及ぼした(図36および37)。VLA-4およびLFA-1発現も同様に、この場合もおそらくは細胞浸潤の減少に起因して、血液および脳において強度に減少した。
【０３２５】
インビトロにおけるPLP-139-151特異的T細胞に及ぼすRTL401前処置の効果
インビトロモデルを使用してRTLがどのようにしてT細胞応答に影響を及ぼすのかを実証するため、受動移植実験に使用したPLP-139-151ペプチド特異的T細胞を100または10μg/ml RTL401と共に24時間インキュベートし、その後照射脾細胞APCを添加し、さらに48時間インキュベートして、サイトカイン分泌プロファイルを評価した。対照として、T細胞を培地、またはRTL401構築物の100μg/ml用量中に含まれるペプチドのモル濃度等価物を表す10μg/ml遊離PLP-139-151ペプチドと共にプレインキュベートした。図42Aおよび42Bに示すように、培地と共にプレインキュベートしたPLP-139-151特異的T細胞は、無視できるレベル(＜50pg/ml)の炎症性サイトカイン(TNF-α、IFN-γ、およびIL-6)および非炎症性サイトカイン(IL-13、IL-10、およびIL-4)を産生した。遊離PLP-139-151ペプチドと共にプレインキュベートしたT細胞では、すべてのサイトカイン、特にIL-13(1,000pg/ml)およびより低度にTNF-α(400pg/ml)の分泌が実質的に増加した。T細胞を100μg/ml RL401(原液)と共にプレインキュベートすると、アッセイしたすべてのサイトカインの分泌が著しく増加し、やはりIL-13に対して優勢な効果があり(12,000pg/ml、12倍の増加)、TNF-αに対してそれよりも低い効果があった(3,000pg/ml、7.5倍の増加)。T細胞を10μg/ml RTL401(1：10)と共にプレインキュベートすると、RTL401調製物中の結合ペプチドの濃度はわずかに〜1μg/mlであるにもかかわらず、10μg/ml遊離PLPペプチドと同様のサイトカイン応答が生じた。これらの結果から、PLP特異的T細胞をRTL401と共にプレインキュベートしてから、付加的なペプチドなしにAPCを添加することにより、PLPペプチドのモル濃度等価物よりも有意に高いサイトカイン分泌が誘導され、Th2サイトカイン、IL-13の優勢な分泌が起こることが実証された。EAEの防御に対するIL-13の重要性を考えると、これらのデータから、IL-13は、RTL治療によって媒介される疾患の重症度および進行の軽減に関与する主要な制御サイトカインとして意味づけられる。
【０３２６】
RTL処置脾細胞および脊髄におけるmRNA発現
サイトカインmRNAの遺伝子発現を、RTL401で処置した、19日目の受動的EAE罹患マウスの脾臓および脊髄で評価した。RTL処置マウスの脾臓では、RTL401静脈内処置マウス由来の脾細胞において、分泌タンパク質および炎症促進性サイトカイン、IFN-γおよびTNF-αの有意な増加、さらにまたTh2サイトカインであるIL-13、IL-4、およびIL-10(図38)、Tr1サイトカイン(IL-10)、ならびに以前にEAEに対する防御と関連づけられたTGF-β3(Matejuk et al., 2003)の劇的な増加が認められた(図38)。T-regマーカーであるFoxp3またはTGF-β1の発現に有意な変化は検出されず、T-reg細胞もTh3細胞もRTL処置機構に関与していないことが示唆された(図38)。これらの変化は、表11に示す、3回の別個の実験から平均化されたデータの代表的なものである。
【０３２７】
（表１１）RTL401処置マウス 対 媒体処置マウスから3回の別個の実験で評価した脾臓および脊髄由来のリアルタイムPCRメッセージレベルの平均変化倍率±S.D.
2008537736.tif 000059
【０３２８】
RTL処置マウスの脊髄では、mRNA発現はIL-13発現に関して6倍、およびIFN-γ発現に関して2倍増加した(図39および表11)。FoxP3、IL-10、およびTGF-β1のmRNAは減少したが、IL-4、TNF-α、およびTGF-β3のmRNAは変化がなかった(図39)。
【０３２９】
上記の結果から、RTL治療が、受動的EAE(免疫化ドナーから未処理レシピエントへの活性化PLP-139-151特異的T細胞の移植により誘導される)の抑制において、能動的EAEについて実証されたのと同程度に有効であったことが示される。RTL401処置効果は、CNSへの浸潤単核細胞のより明白な(60%)減少、脊髄における最小限の炎症性病変、およびEAEの進行過程において媒体処置マウスで消失する軸索の保護に反映された。受動的EAEのRTL401治療は、PLP-139-151特異的T細胞による炎症促進性および抗炎症性サイトカインの両方の産生を増強したが、このプロファイルは、能動的に誘導されたEAEの急性期の処置過程において認められたプロファイルと非常によく似ていた。受動的EAEは早期に発症し、また能動的に誘発されたEAEが使用したCFAアジュバントの使用を含まないことから、これらの知見は、特にCFAアジュバントを使用しない臨床態様との関連において、本発明のRTL組成物および方法の治療有効性を立証するのに重要である。PLP-139-151/CFAによるEAEの能動的誘発では、CFAのために脾臓において強力なTh1応答が誘導される。したがって、CFAなしの受動的移植は、CFAが用いられないため、疾患状態をより良好に表現する。
【０３３０】
RTL401処置により、血液中では、IFN-γの比較的緩やかな増加、ならびにTNF-α、IL-4、およびIL-10のあるかなしかの変化が誘導された。本明細書において実証されたRTL治療の効果は、脾臓におけるTh1およびTh2サイトカインの分泌を増強することであった。受動的EAEのRTL処置は、ELISAおよびCBAにより決定される、IL-13およびIL-4ならびにIL-10の増加をもたらした。
【０３３１】
脾臓のRT-PCRデータから、炎症促進性および抗炎症性サイトカインの両方の発現増加が示される。しかしながら、FoxP3(T-regマーカー)およびTGF-β1(Th3マーカー)が変化しないことに留意することが重要であり、RTL治療の重要な機構がTh2サイトカインの誘導を介することが示唆される。
【０３３２】
脊髄のRT-PCRから、IL-13の増加ならびにFoxP3およびTGF-β1の減少が示され、IL-13産生Th2細胞が脊髄に侵入し、他の細胞種は侵入しないことが示唆される。IFN-γの発現もまた、RTL処置マウスの脊髄で増加する。しかしながら、IFN-γノックアウトマウスでEAEを誘発することが可能であるため、IFN-γの正確な役割は依然として不明である。
【０３３３】
脾臓、血液、およびCNSから得られたRTL標的化T細胞によるIL-13の誘導は、強力かつ持続的であった。さらに、インビトロにおけるRTL401とのプレインキュベーションは、APCの添加に際して、PLP-139-151ペプチドにさらに曝露することなく、高レベル(＞10μg/ml)のIL-13を分泌するよう、PLP-139-151特異的T細胞を刺激した。RTL401処置により、より少量のIFN-γの平行した分泌を有し、他のサイトカインの変動した産生を有するEAEのモデルが強化された。これらの結果は、RTL治療が標的化T細胞においてサイトカイン変換を誘導し、それ故に病原性T細胞が、CNSにおける炎症の軽減を助ける抗炎症性サイトカインを産生するよう再プログラムされる機構を支持する。さらに、EAEの発症時おけるRTL401による処置は、EAEを有する媒体処置マウスにおいて2週間を上回って顕著に増加した、CNSにおける軸索消失の指標である非リン酸化神経フィラメントの形成を防ぐことができた。軸索生存に及ぼすRTL401治療の保護効果は、EAEの能動的誘発モデルにおいても実証されている。
【０３３４】
RTL401によるIL-13の強力な誘導は、SJL/JマウスにおけるEAEの治療に関連したいくつかの知見を説明し得る。改変ペプチドリガンドで刺激されたPLP-139-151反応性T細胞クローンのEAE防御機能の抗体逆転によって実証されるように、IL-13はEAEにおける重要な制御サイトカインである(Young et al., 2000)。これは活性化Th2細胞により活性化され、制御機能を有すること、およびアレルギー性炎症の病原を媒介することが知られている。IL-13はIL-4と多くの特性を共有しているが、それはそれぞれの受容体中にIL-4αサブユニットが共通して存在しているためである(Hershey et al., 2003)。IL-13受容体はIL-4受容体とは異なり、B細胞、好塩基球、好酸球、肥満細胞、内皮細胞、線維芽細胞、単球、マクロファージ、呼吸上皮細胞、および平滑筋細胞を含む多くの免疫細胞および組織細胞で発現されているが(Hershey et al., 2003)、T細胞上には発現されていない(Zurawski et al., 1994)。この受容体分布により、IgG4およびIgEへのクラススイッチが促進され、RTL401を複数回静脈内注射したSJL/Jマウスで起こり得る副作用であって、そのために抗ヒスタミンが日常的に投与される過敏症が促進される(Huan, 2004)。しかしながら、これによってまた、EAEにおける病原性Th1細胞に及ぼす直接的なIL-13制御効果が排除される。またはIL-13は、サイトカイン(IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α、およびIL-12(deVries et al., 1994)、しかしIFN-γは含まれない)、反応性酸素および窒素中間体、ならびにプロスタグランジン(Hershey et al., 2003)を含む、単球およびマクロファージにより産生される炎症促進因子の産生を阻害することが示されている。RTL401処置後の血液中のPLP-139-151反応性単核細胞のサイトカインプロファイルはこの効果を再現し、IL-13レベルの強度の増強と、EAEの誘発に必須であることが知られている高炎症性サイトカイン、IL-6(Samoliova, et al., 1998)の顕著な減少が共存した。処置したマウスモデル対象の血液の解析は、ヒト対象における効果を詳細に表現する可能性がある。マウス被験動物におけるサイトカイン分泌のこのパターンは、脾臓のものと異なる。RTL処置マウスにおけるIL-4の減少を伴うIL-13の劇的な増加から、処置を受けた患者の血液中のRTL効果を、IL-13レベルをモニターするのに有用な本発明の診断および管理の方法および組成物を用いて評価できることが示される。
【０３３５】
実施例16
能動的に誘発されたEAEを有するSJLマウスのミエリンおよび軸索損傷の処置におけるRTL401の有効性
動物
雌SJLマウスは、7〜8週齢の時点でJackson Laboratory(メイン州バーハーバー)から入手した。マウスは、施設の指針に従ってポートランド退役軍人医療センター動物施設に収容した。
【０３３６】
RTLの構築および生成
RTL401の設計、クローニング、および発現の方法は、実施例14に上記したものを利用した。次いで、マウスI-Asβ1α1挿入物をpET21d(+)ベクターに連結し、陽性コロニーの選択および配列確認のために、Nova blue大腸菌宿主(Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。次に、RTL400およびRTL401プラスミド構築物を大腸菌株BL21(DL3)発現宿主(Novagen, Inc.、ウィスコンシン州マディソン)に形質転換した。タンパク質の精製については、以前に記載されている通りに行った(Chang et al., 2001)。精製タンパク質の最終収率は、15〜30mg/L細菌培養液の間で変動した。
【０３３７】
EAEの誘発およびRTL処置
完全フロイントアジュバント 200μg中のPLP139-151(ser) 150μgを接種することにより、雌SJLマウス(8匹/群)において能動的EAEを誘発した。免疫化後の20日目から開始し、1群のマウスにRTL401 100μgの5日間の連日静脈内注射を施し、その後に32日目から開始するRTL401 100μgの連続3日間の連日皮下注射を施した。免疫化後、マウスを以下の尺度に従って接種後のEAEの徴候に関して毎日評価した：0＝正常；1＝尾部弛緩または軽度後肢脱力；2＝中等度後肢脱力または軽度運動失調；3＝準重度後肢脱力；4＝重度後肢脱力または軽度前肢脱力または中等度運動失調；5＝中等度以下の前肢脱力を伴う対麻痺；および6＝重度前肢脱力もしくは重度運動失調を伴う対麻痺、または瀕死状態。媒体処置マウスは、11日目(EAEの発症)、20日目(EAEのピーク直後)、および60日目(実験終了)に屠殺した。図44に見られるように、RTL401の投与により、EAE誘発SJLマウスの平均臨床スコアが改善された。
【０３３８】
病理組織診断
免疫化後の20日目(ピーク)または60日目に、マウスにイソフルランで深く麻酔をかけ、ヘパリン処置し、0.1Mリン酸平衡緩衝液(pH7.4)中の4%パラホルムアルデヒドで10秒間、次いで0.1Mリン酸平衡緩衝液(pH7.4)中の5%グルタルアルデヒド 100mlで灌流し、その後4℃で24時間保存した。脊柱から脊髄を分離し、頸髄、胸髄、および腰髄から1〜2mm長切片を試料採取した。トルイジンブルー染色および電子顕微鏡解析による病理組織診断のため、組織を0.1Mリン酸平衡緩衝液(pH7.4)中に置き、1%四酸化オスミウム(0.1Mリン酸緩衝液中)で2.5時間かけて後固定し、エタノール中で脱水し、プラスチック中に包埋した。半薄切片(0.5μm)をトルイジンブルーで染色した。デジタルカメラを備えた複合顕微鏡により、倍率25xで像を保存した。薄切片(80〜90nm)を酢酸ウラニルおよびクエン酸鉛で染色し、JOEL 100CX電子顕微鏡を用いて検鏡した(BGGによる)。
【０３３９】
CNS形態計測解析
処置状態の予備知識なしに、組織切片を解析した。損傷を示す脊髄の割合を、胸髄中部で決定した。脊髄全体のフォトモンタージュ(最終倍率x100)上で、損傷した線維を含む後柱および外側/腹側白質の領域を囲んだ。損傷領域を赤線で表示し、SummaSketch III(Summagraphics、コネチカット州セイモア)デジタル化タブレットおよびBIOQUANTソフトウェア(R&M Biometrics、テネシー州ナッシュビル)を用いて測定した。後柱および外側/腹側白質の総面積(損傷および非損傷)の測定も行った。累積パーセント病変領域を、各領域について、および各領域を合わせた全損傷について計算した。図45に示すように、RTL401処置マウスの脊髄におけるミエリン損傷は、60日目に安楽死させた媒体処置マウスと比較して大幅に減少していた。さらに、RTL処置マウスにおけるミエリン損傷の程度を、11日目、20日目、および60日目に安楽死させた媒体処置マウスのものと比較すると、RTL401処置により、EAEにおけるミエリン損傷の発生が逆転されることが認められた。
【０３４０】
図48は、疾患ピーク時のEAEマウス(20日目に屠殺)由来の脊髄における病変領域を示す代表的な電子顕微鏡写真を含む。図48Aは、ウォーラー様軸索変性(白星印)および活動性脱髄(黒星印)を示す典型的な病変領域の低倍率視野(倍率x4,000)である。図48Bは、浸潤細胞(白星印)および再ミエリン化軸索(黒星印)を示す高倍率視野(倍率x8,000)である。図48Cは、倍率x6,700で見える活動性脱髄(黒星印)および髄鞘の消失を示し、挿入図は四角で囲んだ領域をx14,000に拡大したものである。図48Dは、倍率x5,000での活動性脱髄(白星印)、中型〜大型の再ミエリン化軸索(黒星印)、およびいくつかの非常に小さな軸索(矢頭)を示す。図48Eは、x5,000という低倍率での大きな脱髄化軸索(黒星印)を示す。図48Fは、大きな再ミエリン化軸索(黒星印)およびジストロフィー軸索の終末小体(白星印)の高倍率視野(倍率x14,000)を示す。
【０３４１】
対照マウス(図49A、B、およびC)およびRTL401処置マウス(図49D、E、およびF)由来の脊髄における病変領域を示す60日目の代表的な電子顕微鏡写真から、RTL401処置マウスにおける再ミエリン化の増加が示される。図49Aは、浸潤細胞も再生軸索発芽もほとんど認められない、著しい継続的なウォーラー様軸索変性(白星印)および脱髄(黒星印)を示す典型的な病変領域の低倍率(倍率x4,000)視野である。図49Bは、ウォーラー様軸索変性(白星印)および活動性脱髄(黒星印)を示す高倍率視野(倍率x8,000)である。図49Cは、薄い有髄鞘により示される大きな再ミエリン化軸索の高倍率視野(倍率x6,7000)である。図49D〜Fでわかるように、RTL処置マウスではより多くの再ミエリン化が認められる。図49Dは、ジストロフィー軸索(矢印)ならびに脱髄化および再ミエリン化軸索(黒星印)を含む、継続的なウォーラー様軸索変性(白星印)を示す典型的な病変領域の低倍率視野(倍率x4,000)である。しかしながら、顕著な再ミエリン化軸索およびいくつかの小さな軸索発芽(矢頭)もまた存在する。図49Eは、活動性脱髄(白星印)を起こしている大きな線維(黒星印)および3つの非常に小さな軸索/再生発芽(矢頭)の低倍率視野(倍率x5,000)である。図49Fは、比較的薄い有髄鞘により示される中型の再ミエリン化軸索(黒星印)の高倍率視野(倍率x14,000)である。
【０３４２】
ピーク疾患時(20日目)には、相当数の進行中のウォーラー様軸索変性および多数の浸潤細胞が存在した(図48)。しかしながら、再生発芽を表す可能性が最も高い再ミエリン化軸索および非常に小さな軸索の存在によって明らかにされるように(図48DおよびF)、正常な回復過程が損傷の程度を代償することができた。未処置の対照動物は、ウォーラー様軸索変性の増加、軸索脱髄の継続、および軸索発芽の欠如により示されるように(図49A〜C)、60日までに疾患経過の継続した悪化を示す。対照的に、RTL処置動物は、継続した変性の減少、再ミエリン化軸索数の増加、およびピーク疾患からの増数した軸索発芽の存在によって実証されるように(図49D〜F)、60日目にピーク疾患からの病変の軽減を示した。
【０３４３】
電子顕微鏡観察から、RTL処置が持続的な炎症を防ぎ、ピーク疾患から損傷の程度を軽減し、かつ再ミエリン化および軸索再生が起こるようにし得ることが示される。再ミエリン化および軸索発芽はまた、FK506(免疫抑制剤または非免疫抑制剤用量で)または非免疫抑制剤FK506誘導体(FK1706)(Gold, et al. 2004)を投与したSJLマウスにおいても認められ、これらが、損傷からの回復をもたらす根底にある過程にかかわらず、これらのモデルに共通した特徴であることが示される。
【０３４４】
RTL処置によるEAE過程における軸索の保護
再発性および進行性EAEは、MSで認められる軸索消失と類似の軸索消失を引き起こす。EAEマウスにおける軸索損傷のレベルを決定するため、免疫化の60日後に、各群由来のさらなるマウス4匹の脊髄を切断して胸部および腰部切片を作製した。胸髄の4つを固定し、神経フィラメントの抗体であるSMI312による全軸索の、および非リン酸化神経フィラメント(NPNFL、軸索損傷のマーカー)の抗体であるSMI32による損傷軸索の組織化学的染色に供した。免疫細胞の浸潤は、核のヘマトキシリン染色で解析した。図46Aに示すように、軸索はSMI312で暗褐色に染色され、浸潤細胞はヘマトキシリンで明るい青色に染色された。治療的介入がない場合、軸索染色は浸潤免疫細胞の存在下で顕著に減少し、大部分の神経炎症が起こる白質の外側領域においてSMI312の染色が激しく消失した。これに対してRTL401処置マウスの脊髄中の軸索は、十分に保存されていた。ヘマトキシリンブルーで染色された免疫細胞は、RTL処置マウスの脊髄においてはるかに頻度が低かった(図46AおよびC)。媒体 対 RTL401処置マウスの背側および外側/腹側骨髄における軸索消失の領域は、それぞれ31.8%および27.6% 対 3.5%および1.3%であった。統計解析から、RTL401処置が、軸索損傷および神経炎症が進行的に発達する傾向を有意に逆転させることが示された(図46BおよびC、表II)。図46Dに示すように、軸索損傷の程度は、ピアソンの相関分析によって実証されるように(r＝0.8636、P(両側)＝0.0003)神経炎症と有意に相関した。この知見から、RTL401が、免疫細胞の脊髄への浸潤を減少させることによりCNS損傷を軽減し得ることが示唆される。
【０３４５】
EAEマウスにおける進行中の損傷の程度はまた、SMI32染色を用いて損傷軸索の数を検出することによって調べた。SMI32抗体はSMI312とは異なり、損傷しかつ脱髄した軸索にのみ存在する非リン酸化神経フィラメント(NPNFL)を特異的に染色する。したがってこの染色により、軸索染色の減少よりもむしろ進行している損傷の程度が示される。図47に示すように、RTL401処置マウスは、胸髄の白質においてはるかに少ない軸索損傷および二次脱髄を示した。軸索染色の減少と類似して、進行中の軸索損傷および脱髄の程度は炎症と密接に関連していると考えられた。加えてSMI32によるNPNFLの免疫ブロットから、EAEマウスの腰髄および胸髄組織における軸索損傷が、EAEのピーク時のマウスまたは60日目に評価した媒体処置マウス由来の試料と比較して、RTL401処置後60日目に減少していたことが実証された(図41)。
【０３４６】
（表１２）RTL401処置マウスにおける統計的に有意な軸索消失軽減を実証する、ニューマン・クールズ多重比較検定を伴う、分散の一元配置ANOVA解析
*統計的に有意な比較。
2008537736.tif 000060
【０３４７】
（表１３）RTL401処置マウスにおける損傷軸索数の統計的に有意な減少を実証する、ニューマン・クールズ多重比較検定を伴う、分散の一元配置ANOVA解析
*統計的に有意な比較。
2008537736.tif 000061
【０３４８】
表12および13から、軸索消失の軽減および損傷軸索数の減少に及ぼすRTLの効果が統計的に有意であることが示される。ウェスタンブロットの結果からもまた、RTL401処置マウスの腰髄中のNPNFLレベルが、20日目(ピーク)および60日目に安楽死させた媒体処置マウスのものよりも低いことが実証された。注目すべきことには、RTL処置マウスの脊髄でははるかに少ない免疫細胞が同定され(図46および48)、RTL401が免疫細胞の浸潤を阻止することによりCNS損傷を軽減し得ることが示唆された。
【０３４９】
要約すると、RTL401は、MSの確立された段階に相当する時点である再発性EAEのピーク後に投与した場合に、CNSにおける炎症、脱髄、ならび軸索の消失および損傷を劇的に軽減することが示された。さらに、RTL401で処置することにより、髄鞘の再ミエリン化または再生が増加し、浸潤細胞によるさらなる損傷が妨げられた。したがって、疾患のピーク後に投与したRTL401の5日間の静脈内注射および3日間の皮下注射により、EAEの重症度および付随する神経軸索損傷が改善された。これらの結果は、ミエリンおよび軸策損傷を防ぐまたは処置するための、MS患者におけるRTLの臨床適用の必要な基礎を提供する。
【０３５０】
本明細書に記載した発明は、本明細書に開示する特定の製剤、方法、および材料に限定されず、したがって製剤、方法、および材料は多少変動し得ることが理解されるべきである。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるため、本明細書で使用した専門用語は特定の例示的な態様を説明する目的にのみ用いられ、限定を意図するものではないこともまた理解されるべきである。
【０３５１】
本明細書で引用した出版物および特許はすべて、説明および開示の目的で参照により本明細書に組み入れられ、例えば、ここに記載した本発明に関連して使用することのできる出版物中に記載されている材料および方法などがこれにあたる。上記したおよび本文を通じて記載した出版物は、単に本願の出願日よりも前にそれらが開示されたという理由で提供されている。本明細書中のいかなるものも、本発明者らが先行発明によってそのような開示を先行できないことを認めると解釈されるべきではない。
【０３５２】
参考文献
2008537736.tif 000062
2008537736.tif 000063
2008537736.tif 000064
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【図面の簡単な説明】
【０３５３】
【図１】図1Aは、抗原コード領域を持たない典型的β1∝1カセットの配列を示す図である。独特のNcoI、PstIおよびXhoI制限酵素切断部位を太字で示す。β1ドメインの終わりとα1ドメインの始まりを示している。図1Bは、図1Aに示した挿入部位で発現カセット中に取り込むことができるインフレーム抗原ペプチド/リンカー挿入配列の配列を示す図である。この配列は、ラットMBP-72-89抗原、埋め込まれたトロンビン切断部位を持つ柔軟なリンカー、および抗原コード領域を容易に交換するために用いることができる独特のSpeI制限酵素切断部位を含む。前述の実施例2は、MBP-72-89配列のスレオニン残基の代わりにセリンを有するモルモットからの等価のペプチド利用法について記述している。図1Cおよび1Dは、MBP-72-89抗原コード領域の代わりに発現カセット中に挿入することができる例示的なNcoI/SpeI断片を示す図である。図1CはMBP-55-69抗原を含み、図1DはCM-2抗原を含む。
【図２】図2Aおよび2Bは、β1α1分子の構造に基づくデザインを表す図である。図2Aは、脳炎誘発性MBP-69-89ペプチドをのせた(非共有結合)ラットクラスII RT1.Bを示す。図2Bは、MBP-69-89をのせた一本鎖β1α1分子を示す。
【図３】図3Aおよび3Bは、ラットT細胞に結合している抗原特異的β1α1/ポリペプチド分子の直接検出を示す図である。A1 T細胞ハイブリドーマ(BV8S2 TCR+)およびCM-2細胞系統(BV8S2 TCR-)を様々なβ1α1構成物と共に4℃で17時間インキュべートし、洗浄し、OX6-PE(α-RT1.B)または対照PE-アイソタイプにより15分間染色し、次いでFACSで分析した。CM-2系統におけるI-Aのバックグラウンド発現を標識していないOX-6でブロックした。図3Aは、A1ハイブリドーマの染色を示すヒストグラムである。図3Bは、CM-2細胞系統の染色を示すヒストグラムである。
【図４】A488を結合したβ1α1/ポリペプチド分子のラットBV8S2 TCRへの結合を表すグラフである。β1α1分子にAlexa-488色素を結合し、MBP-69-89をのせ、A1 T細胞ハイブリドーマ(BV8S2 TCR+)と4℃で3時間インキュベートし、次いでFACSにより分析した。A488-β1α1(空)およびA488-β1α1/MBP-69-89を示す。
【図５】β1α1/MBP-69-89複合体が抗原特異的増殖をIL-2可逆的に阻害することを表す棒グラフである。Gp-MBP/CFAで12日前に免疫化したラットのリンパ節細胞から得たMBP-69-89ペプチドにより選択した短期T細胞系統を、β1α1構成物で24時間前処置し、洗浄し、次いで細胞を20ユニット/mlのIL-2存在下および不在下で培養する増殖解析に用いた。細胞を3日間、最後の18時間は[3H]チミジン(0.5μCi/10μl/ウェル)存在下でインキュベートした。示した値は平均CPM±SEMである。バックグラウンドは210CPMであった。カラムa．IL-2不在の対照増殖解析。カラムb．20μMのβ1α1/MBP-55-69前処置。カラムc．10nMのβ1α1/MBP-69-89前処置。カラムd．10nMのβ1α1/MBP-69-89＋IL-2増殖解析。実験は2回行ったが、1回の代表的実験の結果を示す。*は対照培養に対してβ1α1/MBP-69-89による有意(p＜0.001)な阻害を示す。
【図６】図6A〜6Dは、実験的自己免疫脳脊髄炎からのβ1α1/MBP-69-89複合体による臨床的防御を示すグラフである。ルイスラットのグループ(n＝6)に25μgのGp-MBP/CFAを注入して臨床的EAEを活動的に誘発した。疾病誘発後、第3、7、9、11および14日に、図に示すとおりラットにβ1α1/ペプチド複合体もしくはペプチド単独を投与、または未処置で放置した。図に示すとおり、(6A)未処置または2μgのMBP-69-89ペプチド単独。(6B)食塩水中300μgのβ1α1/(空)複合体。(6C)食塩水中300μgのβ1α1/CM-2複合体。(6D)食塩水中30μgのβ1α1/MBP-69-89複合体。300μgのβ1α1/ペプチド複合体処置に対して毎日の体重(グラム、右側のy軸)をプロットしている。実験は3回行ったが、1回の代表的実験の結果を示す。値は臨床疾病の各日における平均臨床スコア±SEMを示す。30μgの複合体は2μgの遊離ペプチドと等価である。
【図７】定着したEAEのβ1α1/MBP-69-89複合体による処置を表すグラフである。ルイスラットのグループ(n＝6)に25μgのGp-MBP/CFAを注入して臨床的EAEを活動的に誘発した。臨床徴候の発症日(第11日)、第13日および第15日に、ラットに300μgのβ1α1/MBP-69-89複合体(矢印で示す)を投与、または未処置で放置した。実験は2回行ったが、1回の代表的実験の結果を示す。値は臨床疾病の各日における平均臨床スコア±SEMを示す。
【図８】図8Aおよび8Bは、β1α1/MBP-69-89複合体がMBP69-89に対するDTH反応を特異的に阻害することを示すグラフである。(8A)PPDによる攻撃後24時間における耳の厚みの変化。(8B)MPB-69-89による攻撃後24時間における耳の厚みの変化。値は平均スコア±SEMを示す。*は対照群と処置群の間の有意差を示す(p＝0.01)。実験は2回行ったが、1回の代表的実験の結果を示す。
【図９】300μgのβ1α1/MBP-69-89複合体で処置したルイスラットにおいて、MBP-69-89に対するT細胞の反応が阻害されたことを示すグラフである。対照群がEAEから回復した(第17日)後、リンパ節細胞を対照群および処置群から採取し、最適濃度のGp-MBP、Gp-MBP-69-89ペプチド、またはPPDで刺激した。*は対照群と処置群の間の有意差を示す(*p＜0.05、**P＜0.001)。処置群で、Gp MBPおよびMBP-69-89ペプチドでは阻害が認められたが、PPDに対しては見られなかったことに留意されたい。
【図１０】図10A、10B、および10Cは、例示的なヒト(DRAおよびDRB1 0101)(10A)、マウス(I-Ek)(10B)およびラット(RT1.B)(10C)β1およびα1ドメインのアミノ酸配列を示す図である(ラットの配列の開始メチオニンおよびグリシン配列は翻訳開始の理由により構成物に含まれた)。
【図１１】ヒトMHCクラスI B*5301由来の例示的なα1およびα2ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図１２】ヒトHLA-DR2由来組換えT細胞受容体リガンド(RTL)の概略モデルを示す。図12(A)は、APC表面上のMHCクラスII分子の概略縮尺モデルである。ポリペプチド骨格細胞外ドメインは、HLA-DR2の公知の結晶座標(PDBアクセッションコード1BX2)に基づく。膜貫通ドメインは、ポリグリシンαヘリックスのおよその直径である0.5nmの円柱として模式的に示される。α1、α2、β1、およびβ2ドメイン、加えてMHCクラスIIヘテロ二量体のカルボキシル末端を表示してある。図12(B)は、HLA-DR2由来の共有結合されたβ1およびα1ドメイン、ならびに共有結合されたMBP85-99ペプチドを含むRTL303分子の概略図である。RTLの図は、結合しているペプチドの長軸周囲の〜45°(y軸)および〜45°(z軸)の回転により、パネル(a)のMHCクラスII分子と対称関係にある。上図、主要なT細胞受容体(TCR)接触残基H11、F12、K14、およびN15を表示した、パネル(a)と同様の陰影づけをした略図。中図、静電ポテンシャル(EP)による陰影づけ。EPの陰影勾配は、濃い(最も正)〜薄い(最も負)の範囲である。下図、親油性ポテンシャル(LP)による陰影づけ。LPの陰影勾配は、濃い(分子の最も親油性の高い領域)〜薄い(最も疎水性の高い領域)の範囲である。
【図１３】ヒトHLA-DR2由来RTL303のヌクレオチドおよびタンパク質配列である。RTL303は、HLA-DR2(ヒトDRB1*1501/DRA*0101)のβ-1およびα-1ドメインをコードする配列、ならびにヒトMBP85-99ペプチドをコードする配列から得られた。唯一のNcoI、SpeI、およびXhoI制限部位を太字で示す。β-1ドメインの終点およびα-1ドメインの始点を矢印で示す。RTL303は、ヒトMBP85-99ペプチドをコードするインフレームのペプチド/リンカー挿入物(太字)、トロンビン切断部位が組み込まれた可動性リンカー、およびコードされたアミノ末端ペプチドを迅速に交換するために使用できる唯一のSpeI制限部位を含む。RTL301は、F150L置換を生じる単一の点突然変異以外はRTL303と同一である。本研究で使用した2つのさらなるタンパク質、RTL300およびRTL302は、それぞれRTL301およびRTL303の「空」型である。これらの分子はペプチド/リンカー挿入物(残基16〜115)を欠いている。グリシン32および51のコドン使用は、大腸菌でのタンパク質発現レベルを増加させるために、天然配列から変更してある。
【図１４】ヒトHLA-DR2由来RTL303の精製を示す。図14(A)は、RTL303のイオン交換FPLCである。挿入図左：Mr、分子量標準物質；U、非誘導細胞；I、RTL303の高レベル発現を示す誘導細胞。挿入図右：画分25〜28は部分精製RTL303を含む。図14(B)は、RTL303のサイズ排除クロマトグラフィーである。挿入図：画分41〜44、精製RTL303を含む；Mr、分子量標準物質；Red、還元RTL303；NR、非還元RTL303。
【図１５】天然のジスルフィド結合を有する、精製および再度折り畳まれたDR2由来RTLを示すウェスタンブロットのデジタル画像である。RTL試料は、還元剤β-メルカプトエタノール(β-ME)有りまたは無しでLaemmli試料緩衝液中で5分間煮沸し、その後SDS-PAGE(12%)により解析した。非還元RTL(-レーン)は還元RTL(+レーン)よりも見かけの分子量が小さく、ジスルフィド結合の存在が示される。最初および最後のレーンは、分子量標準物質である炭酸脱水酵素(31kD)およびダイズトリプシンインヒビター(21.5kD)を示す。RTL(+/-β-ME)は表示の通りである。
【図１６】DR2由来RTLが非常に規則正しい構造を有することを示す円二色性のデジタル画像である。CD測定は、0.1mmセルを使用しJasco J-500装置において、260〜180nmの範囲で20℃で行った。各タンパク質溶液の濃度値は、アミノ酸解析により決定した。緩衝液、50mMリン酸カリウム、50mMフッ化ナトリウム、pH7.8。二次構造の解析は変数選択法を用いて行った。
【図１７】熱変性に供したDR2由来RTLの高度の協同性および安定性を実証する実験のグラフである。CDスペクトルを温度の関数として222nmでモニターした。加熱速度は10℃/時間であった。グラフは、変性の割合を温度の関数として作図してある。1.0は、完全にほどけた構造に相当する。
【図１８】残基F150の4Å内の原子の相互作用の概略図である。距離は1BX2による座標を用いて計算した。挿入図：RTL303分子内の残基F150の位置。
【図１９】図19A、19B、および19Cは、ヒトHLA-DR2由来RTLの構造に基づく設計を図示する。(A)は、APC表面上のMHCクラスII分子の概略縮尺モデルである。ポリペプチド骨格細胞外ドメインは、HLA-DR1の結晶座標(PDBアクセッションコード1AQD)に基づく。膜貫通ドメインは、ポリグリシンαヘリックスのおよその直径である0.5nmの円柱として模式的に示される。MHCクラスIIヘテロ二量体のカルボキシル末端を表示してある。(B)は、共有結合したMBP85-99ペプチドを含むHLA-DR2β1α1由来RTL303分子の図である。(C)は、共有結合したC-ABLペプチドを含むHLA-DR2β1α1由来RTL311分子の図である。RTLの図は、結合しているペプチドの長軸周囲の〜45°(y軸)および〜45°(z軸)の回転により、パネル(a)のMHCクラスII分子と対称関係にある。左図、主要なTCR接触残基を表示した、パネル(A)と同様の陰影づけをした略図。中図、静電ポテンシャル(EP)による陰影づけ。EPの陰影勾配は、濃い(最も正)〜薄い(最も負)の範囲である。右図、親油性ポテンシャル(LP)による陰影づけ。LPの陰影勾配は、濃い(分子の最も親油性の高い領域)〜薄い(最も疎水性の高い領域)の範囲である。O2ワークステーション(Silicon Graphics、カリフォルニア州マウンテンビュー)およびBrookhaven Protein Data Bank(Brookhaven National Laboratories、ニューヨーク州アプトン)に寄託されている座標を用いて、プログラムSybyl(Tripos Associates、ミズーリ州セントルイス)によりグラフィック画像を作成した。RTLの構造に基づく相同性モデリングは、MBPペプチドと複合体形成したHLA-DR2(DRA*0101、DRB1*1501；例えば、Smith et al., J. Exp. Med. 188：1511, (1998)を参照されたい)の公知の結晶座標に基づいた。HLA-DR2 MBPペプチド複合体(PDBアクセッション番号1BX2)中のアミノ酸残基をCABL側鎖と置換し、構造の緻密化の過程で局所エネルギー最小化を用いてHLA-DR2のペプチド骨格を剛体としてモデル化した。
【図２０】T細胞クローンの応答を図示した一連の棒グラフである。DR2拘束性T細胞クローンである、MBP-85-99ペプチドに特異的なMR#3-1およびCABL-b3a2ペプチドに特異的なMR#2-87、ならびにMBP85-99ペプチドに特異的なDR7拘束性T細胞クローンCP#1-15を50,000個細胞/ウェルで、培地のみ、または照射した(2500ラド)凍結自己PBMC(150,000個/ウェル)およびペプチド-Ag(MBP-85-99またはCABL、10μg/ml)と共に3つ組ウェルで72時間培養し、最後の18時間は3H-チミジンを取り込ませた。示した各実験は、少なくとも2回の独立した実験の代表的なものである。バーはCPM±SEMを表す。
【図２１】RTL処置により誘導されるζ鎖リン酸化がAg特異的であることを示すグラフである。DR2拘束性T細胞クローンである、MBP-85-99ペプチドに特異的なMR#3-1またはCABL-b3a2ペプチドに特異的なMR#2-87を、培地のみで(対照)または20μM RTL303もしくはRTL311と共に37℃でインキュベートした。リン酸化ζ(ゼータ)のウェスタンブロット解析により、それぞれp21およびp23と称される21kDおよび23kDの一対のリン酸化タンパク質種が示される。バンドの定量化により、10分の時点でピークに達するp21/p23比の異なる変化が示された。示した各実験は、少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。点は平均値±SEMを表す。
【図２２】RTLで刺激したT細胞の蛍光発光比を示す。RTLは、T細胞において持続した高いカルシウムシグナルを誘導する。MBP-85-99ペプチドに特異的なDR2拘束性T細胞クローンMR#3-1におけるカルシウムレベルを、単一細胞解析によりモニターした。RTL303処置が持続した高いカルシウムシグナルを誘導したのに対し、RTL301(単一の点変異、F150L以外はRTL303と同一である)による処置は、同じ期間にカルシウムシグナルの増加を誘導しなかった。データは、各実験において少なくとも14個の個々の細胞をモニターした2回の別個の実験の代表的なものである。
【図２３】ERK活性がRTL処置T細胞において減少することを実証する一連の棒グラフである。DR2拘束性T細胞クローンである、MBP-85-99ペプチドに特異的なMR#3-1またはCABL b3a2ペプチドに特異的なMR#2-87を、添加なしで(対照)、および20μMまたは8μMのRTL303またはRTL311と共に37℃で15分間インキュベートした。15分のインキュベーション期間の終了時に、細胞を活性化リン酸化ERK(P-ERK)および全ERK(T-ERK)についてアッセイした。活性化P-ERKの定量化は、対照(未処置)細胞中の全体に対する割合として表す。示した各実験は、少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。バーは平均値±SEMを表す。
【図２４】T細胞クローンにおけるIL-10サイトカイン産生の直接的抗原特異的調節がRTL処置により誘導されたことを示す一連のグラフである。DR2拘束性T細胞クローンMR#3-1およびMR#2-87を、培地のみ(-対照)、抗CD3 mAb、20μM RTL303、またはRTL311中で72時間培養した。増殖は3H-チミジンの取り込みにより評価した。サイトカイン(pg/ml)プロファイルは、上清の免疫アッセイ(ELISA)によりモニターした。示した各実験は、少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。バーは平均値±SEMを表す。クローンMR#3-1は抗CD3に対して初期増殖を示したが、RTLに対しては示さなかった。
【図２５】RTL前処置により誘導されたIL-10サイトカイン産生がAPC/ペプチドによる刺激後に維持されたことを示す一連のグラフである。T細胞は、抗CD3またはRTL処置後に増殖するおよびサイトカインを産生する能力が減少し、このRTL効果は抗原およびMHC特異的であった。IL-10は特異的RTLによってのみ誘導され、IL-10産生はAPC/抗原による再刺激後でさえも維持された。T細胞クローンは50,000個細胞/ウェルで、培地、抗CD3、または20μM RTLと共に3つ組で48時間培養し、RPMIで一度洗浄した。洗浄後、照射した(2500ラド)凍結自己PBMC(150,000個/ウェル)およびペプチド-Ag(MBP-85-99、10μg/ml)を添加して細胞を72時間インキュベートし、最後の18時間は3H-チミジンを添加した。示した各実験は、少なくとも2回の独立した実験の代表的なものである。バーは平均値±SEMを表す。サイトカインアッセイについては、クローンを10μg/ml抗CD3または20μM RTL303もしくはRTL311と共に48時間培養し、その後RPMIで洗浄して、照射自己PBMC(2500ラド、T：APC＝1：4)およびペプチド-Ag(10∝g/ml)で72時間再刺激した。サイトカイン(pg/ml)プロファイルは、上清の免疫アッセイ(ELISA)によりモニターした。示した各実験は、少なくとも3回の独立した実験の代表的なものである。バーは平均値±SEMを表す。
【図２６】改変RTLのサイズ排除クロマトグラフィーデータを示す。精製および再度折り畳まれた改変RTL400およびRTL401を、サイズ排除クロマトグラフィーにより解析した。Superdex 75(16/60)サイズ排除カラムを一連の公知の分子量タンパク質で較正し、検量線の勾配からY＝-0.029X＋6.351(r＝0.095)が算出され、次にこれを用いて改変RTL400およびRTL401の大きさを推定した。
【図２７】RTL401の静脈内または皮下投与がSJLマウスにおいてどのようにEAEを改善するのかを示す。SJL雌マウスをPLP139-151(ser)で免疫化した。疾患発症時(12日目)に、マウスを、媒体、RTL401 0.8mgの静脈内注射、またはRTL401 0.8mgの皮下注射で8日間毎日処置した。マウスは、上記の実施例に概説した通りにスコア化した。表示したデータは、マウス12〜14匹/群の各群につき2回実験した平均値である。
【図２８】RTL処置が、MHCおよび神経抗原ペプチドの同族の組み合わせに対してどの程度特異的であるかを示す。B6XSJLマウス(I-As/I-Eb MHCクラスII分子)をPLP139-151またはMOG35-55で免疫化した。発症時に、マウス群を媒体またはRTL401 0.8mgの静脈内連日注射で8日間処置し、疾患経過をモニターした。MOG35-55免疫化マウスはRTL処置に対して応答しなかったのに対し、PLP139-151免疫化マウスは、RTL401による静脈内処置後にEAEの有意な改善を示した。表示したデータは、群当たり全部で11〜16匹のマウスを使用した2回の実験の平均値である。
【図２９】T細胞増殖応答パターンを示す。免疫化後42日目に、媒体、RTL401静脈内、およびRTL401皮下処置マウスからリンパ節および脾臓を単離した。代表的マウス3匹に由来する細胞をプールし、刺激培地中で72時間インキュベートして[3H]チミジンの存在下で最後の18時間インキュベートした後の免疫化Ag、PLP139-151に対する増殖によりT細胞応答を測定した。データは、培地のみの対象に対する正味のcpmとして表示してある。対照群と実験群との有意差は、スチューデントのt検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。
【図３０】T細胞サイトカイン応答パターンを示す。SJLマウスを、RTL401処置後の様々な時点で屠殺した。脾臓を摘出し、PLP139-151ペプチド10μgと共にインビトロで設定した。48時間後に上清を回収し、上記の通りにサイトメトリービーズアレイによりサイトカイン産生についてアッセイした。対照群と実験群との有意差は、スチューデントのt検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。データは、各群各時点につきマウス2匹の平均値およびSDとして表示してある。
【図３１】RTL処置の付加的なCNS効果を示す。RTL401処置後の様々な時点のマウスより摘出した脳および脊髄から、単核細胞を単離した。トリパンブルー排除法により細胞を計数した。表示した結果は、プールした脳または脊髄2〜3個による数である。
【図３２】RTL処置により、CNS中のT細胞上の接着分子発現が有意に減少することを示す。RTL401処置後の様々な時点の代表的なマウス2匹より摘出した脳および脊髄から、MNCを単離した。次いで、細胞を抗マウスCD3および抗マウスVLA-4または抗マウスLFA-1で染色し、CNSに浸潤しているT細胞上のこれらの接着分子の発現を同定した。表示したデータは、CD3およびVLA-4またはLFA-1について二重陽性であった、ゲートをかけた細胞全体に占める割合である。対照群と実験群との間の有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。
【図３３】リアルタイムPCRによって決定されるサイトカインおよびケモカイン遺伝子発現に及ぼすRTL処置の効果を示す。様々な時点における対照マウス2匹およびRTL処置マウス2匹より摘出した全凍結脊髄から、mRNAを単離した。cDNAを合成し、IFN-γ、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-β3、RANTES、MIP-2、およびIP-10に特異的なプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った。各遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子、L32の発現と比較して算出した。対照群と実験群との間の有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。
【図３４】媒体およびRTL処置マウスの脊髄からの、ケモカイン受容体遺伝子の相対的発現のリアルタイムPCR定量化を提供する。様々な時点における対照マウス2匹およびRTL処置マウス2匹より摘出した全凍結脊髄から、mRNAを単離した。cDNAを合成し、CCR1、CCR2、CCR3、CCR5、CCR6、CCR7、およびCCR8に特異的なプライマーを用いてリアルタイムPCRを行った。各遺伝子の発現は、ハウスキーピング遺伝子、L32の発現と比較して算出した。対照群と実験群との間の有意性は、スチューデントのt検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。
【図３５】図35Aおよび35Bは、SJLマウスにおいて受動的に誘発されたEAEに及ぼすRTL401処置の効果を示す。疾患発症時(およそ6日目)に、マウスを媒体(35A)またはRTL401 100μgの5日間の静脈内注射もしくは8日間の皮下注射、またはRTL401 100μgの5日間の静脈内注射(35B)で処置した。マウスは、実施例15に概説した通りにスコア化した。対照群と実験群との有意差は、マン・ホイットニー検定を用いて決定した(*、p＜0.05)。
【図３６】脾臓、血液、および脳におけるTh1サイトカイン発現に及ぼすRTL処置の効果を示す。
【図３７】脾臓、血液、および脳におけるTh2サイトカイン発現に及ぼすRTL処置の効果を示す。
【図３８】リアルタイムPCRによって決定される脾臓におけるサイトカイン遺伝子発現に及ぼすRTL処置の効果を示す。
【図３９】リアルタイムPCRによって決定される脊髄におけるサイトカイン遺伝子発現に及ぼすRTL処置の効果を示す。
【図４０】図40Aおよび40Bは、EAEの受動的誘発19日後の対照(媒体処置)(A)またはRTL処置(B)SJLマウスに由来する、固定し、パラフィン包埋し、ヘマトキシリン-エオシンで染色した脊髄切片の顕微鏡写真である。媒体処置脊髄の頸部切片では炎症が軽度〜中程度であるのに対し(A)、RTL処置脊髄では細胞性単核細胞浸潤がほとんど検出されない(B)ことに留意されたい。倍率は12.5xであった。矢印は、媒体処置脊髄における炎症部位を示す。表示したデータは、平均EAEスコア3.5(対照) 対 1.0(RTL401処置)を有する各群由来のマウス2匹から検査した全部で20枚の頸部切片の代表的なものである。
【図４１】図41A、41B、41C、および41Dは、RTL401処置が、受動的に誘発された(41A)および能動的に誘発された(41C)EAEを有するSJLマウスのCNSにおける、軸索損傷のマーカーである非リン酸化神経フィラメント(NPNFL)の量の減少によって示されるように、EAEを有するSJLマウスにおける軸索消失を改善することを実証する。図41Aおよび41Cは、異なった処置をしたまたは異なった時点で安楽死させたマウスに由来する全腰髄ホモジネートの代表的な免疫ブロット解析を示す。図41A中の各バンドは群ごとのマウス2匹を表し、図41C中の各バンドは各群のマウス4匹に由来する試料を表す。図41Bおよび41Dは、先行するのブロットの濃度測定解析を提供する。GAPDH＋グリセルアルデヒド3-リン酸脱水素酵素。
【図４２】図42Aおよび42Bは、100μg/ml RTL401(原液)、10μg/ml RTL401(1：10)、10μg/ml PLP-139-151ペプチド、または培地と共に24時間インキュベートした後に洗浄して、PLPペプチドを添加せずにAPCと共に48時間インキュベートした、PLP-139-151ペプチドに特異的なT細胞において、RTL401がインビトロでIL-13およびその他のサイトカインの発現増加を誘導することを実証するグラフである。(*)は、培地前処置T細胞と比較した有意差(p＜0.05)を示す。(&)は、PLP-139-151ペプチド前処置T細胞と比較した有意差(p＜0.05)を示す。データは、3回の別個の実験からプールしている。
【図４３】図43Aおよび43Bは、媒体処置EAEマウス、または20日目に開始する連続5回のRTL401静脈内処置および32日目に開始する連続3回の皮下処置を施したRTL401処置EAEマウスで60日目に屠殺したマウスの胸髄の背側(43A)および腹側/外側白質(43B)におけるミエリン損傷の形態計測解析の図表である。EAEの発症は11日目であると考えられ、EAEのピークは20日であった。各点は個々のマウスを表す。
【図４４】疾患ピーク後のRTL401の投与により、SJLマウスにおけるEAEの臨床評価が改善されることを示す図表である。
【図４５】図45Aは、免疫化60日後の、媒体(左画像)またはRTL401(右画像)で処置したEAEマウスに由来する代表的な胸髄切片の写真を提供する。組織切片はトルイジンブルーで染色し(白黒で表示)、損傷領域を手作業で赤線で囲んだ。スケールバーは、25mM(低倍率視野)または100mM(高倍率視野)である。
【図４６】図46Aは、免疫化60日後の、媒体(左画像)またはRTL401(右画像)で処置したEAEマウスに由来する胸髄切片の軸索染色の写真を提供する。正常な軸索は神経フィラメントの抗体混合物で茶褐色に染色され、浸潤免疫細胞の核はヘマトキシリンで青色に染色された。図46B〜Dは、表示のようなおよび上記実施例でさらに記載したような、RTL処置したおよびしなかったマウスの脊髄で観察された、細胞浸潤、軸索損傷、神経炎症、およびその他の病理組織学的徴候に及ぼすRTL効果に関する図示データを提供する。
【図４７】図47Aは、免疫化60日後の、媒体(左画像)またはRTL401(右画像)で処置したEAEマウスに由来する胸髄のNPNFL抗体による代表的な損傷軸索染色、および浸潤免疫細胞上のヘマトキシリンの写真を提供する。図47Bは、表示のようなおよび上記実施例でさらに記載したような、RTL処置したおよびしなかったマウスの脊髄で観察された細胞軸索損傷およびその他の病理組織学的徴候に及ぼすRTL効果に関する図示データを提供する。
【図４８】図48A〜Fは、20日目の疾患ピーク時のEAEマウスに由来する脊髄における病変領域を示す代表的な電子顕微鏡写真である。
【図４９】媒体(図49A〜C)またはRTL401(図49D〜E)による処置開始後40日である60日目に評価したEAEマウス由来の脊髄における病変領域を示す代表的な電子顕微鏡写真である。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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