(57)【要約】  本発明は、ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・フェリントシェンシス、ラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリおよびそれらの組合せからなる群から選択される生きた微生物を含むセレンに富むバイオマス、前記セレンに富むバイオマスの調製方法、ならびに前記バイオマスを含む食品調製物、栄養補助製品および食品補助剤に関する。さらに、非常に大量にセレンを濃縮する能力を有しており、したがって本発明の方法における使用に特に有用であるラクトバチリスの新しい株について記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
セレンに富むバイオマスの調製方法であって、前記バイオマスが
（ｉ）ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・フェリントシェンシス、ラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリおよびそれらの組合せからなる群から選択された微生物を、前記微生物がセレンを蓄積するように、セレン塩を含む栄養培地中で培養すること；ならびに
（ｉｉ）セレンに富む微生物を培地から分離すること
によって得られることを特徴とする調製方法。
【請求項２】
培地から分離した微生物をさらに凍結乾燥または乾燥の操作に供して、凍結乾燥または乾燥したセレンに富むバイオマスを得る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
微生物がラクトバチルス・ロイテリＤＳＭ１６１４３、ラクトバチルス・フェリントシェンシスＤＳＭ１６１４４およびラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリＤＳＭ１６３４１からなる群から選択される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
セレン塩が亜セレン酸塩である、請求項１〜３いずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
培地が液体培地である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
培地が、無機塩、炭素源、窒素源、ビタミン源、微量元素源およびそれらの混合物からなる群から選択される、前記微生物を増殖するための通常の栄養素を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記培地のｐＨが２．５〜８、好ましくは３．５〜７．５の範囲である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記微生物を、前記培地中、２５〜４５℃、好ましくは３２〜４０℃の範囲の温度で培養する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記微生物を、前記培地中で６〜４０時間、好ましくは８〜３６時間培養する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
遠心分離または精密濾過によって前記微生物を培地から分離する、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法によって得ることができる、セレンに富むバイオマス。
【請求項１２】
生きた微生物を含む、請求項１１に記載のバイオマス。
【請求項１３】
２００４年１月１７日に寄託番号ＤＳＭ１６１４３の下でＤＳＭＺに寄託されたラクトバチルス・ロイテリ株ＬＢ２ＢＭ、２００４年１月１７日に寄託番号ＤＳＭ１６１４４の下でＤＳＭＺに寄託されたラクトバチルス・フェリントシェンシス株ＬＢ６ＢＭ、２００４年４月５日に寄託番号ＤＳＭ１６３４１の下でＤＳＭＺに寄託されたラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリ株ＬＢ２６ＢＭ、およびそれらの組合せからなる群から選択される微生物を含む、請求項１１または１２に記載のバイオマス。
【請求項１４】
プロバイオティック剤としての請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のセレンに富むバイオマスの使用。
【請求項１５】
食品補助剤、栄養補助製品または食品調製物を調製するための、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のセレンに富むバイオマスを、適切なビヒクルおよび／または賦形剤と組み合わせて含む、プロバイオティック活性を有する組成物。
【請求項１７】
少なくとも１０９ＣＦＵ／ｇの細菌負荷を有する、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１６または１７に記載のプロバイオティック活性を有する組成物を含む、食品調製物、食品補助剤または栄養補助製品。
【請求項１９】
２００４年１月１７日に寄託番号ＤＳＭ１６１４３の下でＤＳＭＺに寄託されたラクトバチルス・ロイテリ株ＬＢ２ＢＭ、２００４年１月１７日に寄託番号ＤＳＭ１６１４４の下でＤＳＭＺに寄託されたラクトバチルス・フェリントシェンシス株ＬＢ６ＢＭおよび２００４年４月５日に寄託番号ＤＳＭ１６３４１の下でＤＳＭＺに寄託されたラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリ株ＬＢ２６ＢＭからなる群から選択される微生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セレンに富むバイオマス、その調製方法、ならびに前記バイオマスを含むプロバイオティック製品および栄養補助製品に関する。本発明はさらに、本発明の方法における使用に適した、ラクトバチリス属に属する新しい微生物株に関する。
【背景技術】
【０００２】
セレンは、主にセレノシステインとしてグルタチオンペルオキシダーゼおよびＩ型５’−ヨードチロシン脱ヨウ素酵素などの重要な酵素の組成に含まれているので、動物およびヒトのどちらにおいても必須の元素である。前者の酵素はヒドロペルオキシドの還元を触媒して細胞変性およびヒドロキシルラジカルの形成を防ぎ、後者はサイロキシンを甲状腺ホルモンの代謝に重要な活性ホルモンであるトリヨードサイロニンへと変換する。
【０００３】
ヒトにおける重篤なセレン欠乏状態が、癌、心血管病、高血圧、脳卒中、ならびに腎臓および肝臓の疾患などの病態の危険性の上昇に関連していることが観察されている。しかし、このような欠乏状態は、セレンに富んだ食事を用いて、または例えば食品補助剤を用いて無機もしくは有機型のセレンを投与することによって、補正することができる。また、セレンの投与は、細胞変性のプロセスおよびフリーラジカル形成に対抗することに有効であることが判明している。
【０００４】
人体によるセレン酸塩または亜セレン酸塩の利用はセレン化物の形成に伴う還元性プロセスによって行われ、これらはその後、従来にないアミノ酸、具体的にはＳｅ−メチオニンおよびＳｅ−システイン中に取り込まれる。
【０００５】
多くの微生物（細菌、酵母および真菌）は亜セレン酸塩の存在下で増殖し、タンパク質中にセレン−アミノ酸として取り込むためにそれをセレン元素またはセレン化物へと還元することができる。
【０００６】
セレンを含む生体分子を合成する能力は、ラクトバチリス属の一部の乳酸菌について記載されている（Ｃａｌｏｍｍｅ他、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９５；Ａｎｄｒｅｏｎｉ他、Ａｎｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２０００；５０、７７〜８８）。
【０００７】
したがって、ラクトバチリスの株が現在プロバイオティック目的で用いられており、これらの微生物が有機型のセレンを濃縮する能力により、それらの補助剤としての使用が拡張され得る。Ｖ．Ａｎｄｒｅｏｎｉ他、Ａｎｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、２０００；５０、７７〜８８は、様々な起源由来の一部のラクトバチリスがセレンを蓄積する能力について記載している。
【０００８】
今回、本発明者らは、驚くべきことに、ヒトの糞便試料から単離した、ラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｕｃｈｎｅｒｉ／ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ）種、ラクトバチルス・フェリントシェンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｉｎｔｏｓｈｅｎｓｉｓ）種およびラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）種に属する微生物が文献中に報告されている株（Ｃａｌｏｍｍｅ他、Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９５；Ａｎｄｒｅｏｎｉ他、Ａｎｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｅｎｚｉｍｏｌ．、２０００）と比較して平均して１０倍以上高い量でセレンを蓄積する能力を有することを発見した。したがって、これらのラクトバチリス種は、特に前記バイオマスのプロバイオティック剤および／または栄養補助剤としての使用を視野に入れた場合に、セレンに富むバイオマスの調製に特に適している。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
したがって、本発明の第１の目的は、セレンに富むバイオマスの調製方法であって、前記バイオマスを
（ｉ）ラクトバチルス・ロイテリ、ラクトバチルス・フェリントシェンシス、ラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリおよびそれらの組合せからなる群から選択される微生物を、前記微生物がセレンを蓄積するようにセレン塩を含む栄養培地中で培養すること；ならびに
（ｉｉ）セレンに富む微生物を培地から分離すること
によって得ることを特徴とする調製方法である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の方法では、以下に報告する研究から明らかなように、細胞中に蓄積された大量のセレンを含む微生物を含むバイオマスが得られる。さらに、これらの研究により、バイオマスによって蓄積されたセレンの一定割合が有機型、具体的にはＳｅ−メチオニンおよびＳｅ−システインの形態であること、また、これが、Ｓｅ−アミノ酸の形態にありセレン含有タンパク質中に取り込まれているセレンは人体に容易に吸収されるので、バイオマスをプロバイオティック剤として用いることを視野に入れた場合の一利点を構成することが実証されている。
【００１１】
セレンに富むバイオマスを調製する本発明の方法は、ラクトバチリス属の微生物の増殖に適した、セレン塩、例えば亜セレン酸塩、好ましくは亜セレン酸ナトリウムを添加した栄養培地中で微生物を培養する、発酵の第１段階を企図する。栄養培地は、炭素源、例えばグルコース、スクロースおよび／またはラクトース；窒素源、例えばペプトン、カゼインの加水分解物、肉エキスおよび／または酵母抽出物；無機塩；微量元素源ならびにビタミン、例えばコーンスティープリカーなどを含む液体培地であることが好ましい。
【００１２】
発酵は、好ましくは２５℃〜４５℃、より好ましくは３２℃〜４０℃の温度で行う。液体培地のｐＨ値は、好ましくは２．５〜８．０、より好ましくは３．５〜７．５である。発酵時間は、好ましくは６〜４０時間、より好ましくは８〜３６時間である。発酵は、好気性、微好気性および／または嫌気性条件で行うことができる。
【００１３】
バイオマスの増殖および細胞中でのセレンの蓄積が起こる発酵段階ののち、得られたバイオマスを、培地から、好ましくは遠心分離または精密濾過によって、細胞が無傷に保たれるように分離する。したがって、本発明の方法は、生きた微生物を含む、セレンに富む微生物のバイオマスを得ることを可能にする。
【００１４】
所望する場合は、次いで、得られたバイオマスを従来の方法に従って凍結乾燥または乾燥の操作に供することができる。
【００１５】
さらに、本発明者らは、ヒト糞便試料から、それぞれＬＢ２ＢＭ、ＬＢ６ＢＭおよびＬＢ２６ＢＭと呼ばれる、ラクトバチリス属に属する３つの新しい微生物株を単離し、これらは、セレン、特にＳｅ−メチオニンおよびＳｅ−システインの形態での濃縮について高い能力を有するので、本発明の方法における使用に特に有利であることが判明した。これらの株は、ラクトバチルス・ロイテリ種（ＬＢ２ＢＭ）、ラクトバチルス・フェリントシェンシス種（ＬＢ６ＢＭ）およびラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリ種（ＬＢ２６ＢＭ）に属するものであると同定された（実施例１１参照）。これら微生物株の培養物は、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダペスト条約の下、国際寄託当局Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｆｕｒ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ（ＤＳＭＺ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、ドイツ）に寄託されている：
【００１６】
【表１】
2008501329.tif 000002
【００１７】
既に記載したように、本発明の方法によって得ることができるセレンに富むバイオマスは、無機型および有機型のセレンをどちらも高濃度で含むので、プロバイオティック剤としての使用に特に適している。
【００１８】
この目的のために、バイオマスを様々な形態で調製することができる。例えば、これを食物製品、好ましくは乳またはヨーグルトなどの乳製品に加えて、プロバイオティック活性を有する食品調製物を得ることができる。あるいは、これを、プロバイオティック活性を有する組成物、例えば栄養補助調製物などの経口投与するための食品補助剤もしくは非食品調製物を調製するために、適切なビヒクルおよび／または賦形剤と組み合わせて用いることができる。この目的のためには、バイオマスを凍結乾燥または乾燥した組成物の形態で用いることが好ましい。
【００１９】
プロバイオティック組成物または栄養補助組成物中で用いる凍結乾燥または乾燥した生成物の細菌負荷は、好ましくは少なくとも１０１０ＣＦＵ／ｇ〜１０１１ＣＦＵ／ｇである。
【００２０】
凍結乾燥または乾燥した組成物の調製には、脱脂乳、ラクトース、グルコース、酵母抽出物、ジャガイモデンプン、グルタミン酸ナトリウム、イノシトール、クエン酸ナトリウム、ゼラチン、マルトデキストリン、ステアリン酸マグネシウム、アスコルビン酸、ステアリン酸およびそれらの組合せなどの保護剤を加えて、湿バイオマスを液体培地、例えば水または滅菌した生理溶液中に懸濁させる。
【００２１】
その後、凍結乾燥について上述したもののうちから不活性物質を用いて凍結乾燥および／または乾燥した組成物をプロバイオティックの調製用に希釈し、好ましくは少なくとも１０９ＣＦＵ／ｇの細菌負荷を得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
以下の実施例は例示目的で提供し、いかなる様式でも本発明の範囲を限定することを意図しない。
【００２３】
実施例１
８ｍｇ／ｌの亜セレン酸Ｎａ（Ｎａ２ＳｅＯ３）を加えた２００ｍｌのＭＲＳ培地を５００ｍｌのフラスコ中で滅菌した。１８時間、３７℃で攪拌せずに事前に増殖させたラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリＬｂ２６ＢＭ−ＤＳＭ１６３４１の種培養液を、５％の量でフラスコに播種した。その後、培養物をシェーカー内で２４時間、８０ｒｐｍで増殖させた。培養の完了後、遠心分離によってバイオマスを収穫した。実施例９に記載の技法によってバイオマスの処理および分析を行った。細胞によって蓄積された全セレン量は１．８７ｍｇ／ｇｄ．ｗ．であった；Ｓｅ−メチオニンの量は３６．５７ｎｇ／ｍｇｄ．ｗ．であり、Ｓｅ−システインの量は１３５．７０ｎｇ／ｍｇｄ．ｗ．であった。
【００２４】
実施例２
実施例１に記載のようにラクトバチルス・フェリントシェンシス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｅｒｉｎｔｈｏｓｈｅｎｓｉｓ）Ｌｂ６ＢＭ−ＤＳＭ１６１４４を培養した。２４時間培養したのち、蓄積された全セレン量は１．１ｍｇ／ｇｄ．ｗ．であった；Ｓｅ−メチオニンの量は１２．６３ｎｇ／ｍｇｄ．ｗ．であり、Ｓｅ−システインの量は６．６０ｎｇ／ｍｇｄ．ｗ．であった。
【００２５】
実施例３
実施例１に記載のようにラクトバチルス・ロイテリＬｂ２ＢＭ−ＤＳＭ１６１４３を培養した。２４時間培養したのち、蓄積された全セレン量は０．７ｍｇ／ｇｄ．ｗ．であった；Ｓｅ−メチオニンの量は１１．３９ｎｇ／ｍｇｄ．ｗ．であり、Ｓｅ−システインの量は８３．７８ｎｇ／ｍｇｄ．ｗ．であった。
【００２６】
実施例４
ラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリＬｂ２６ＢＭ−ＤＳＭ１６３４１を、１５Ｌ／１０Ｌの５％のコーンスティープリカー（ｐＨ７．０、１００℃、１５分間で前処理したもの）および８ｍｇ／ｌの亜セレン酸Ｎａを加えたＭＲＳ培地を含む発酵槽中で培養し、その後、ｌｏｇ６（すなわち発酵開始から６時間後）から４時間毎に５ｍｇ／ｌを４回加えた。発酵槽にｌｏｇ１６の種の５％を播種し、ｐＨ６．６でｌｏｇ２０まで維持した。０．５１／ｌ／分の空気流を用いて培養物をゆっくりと攪拌し（６０ｒｐｍ）、ｌｏｇ２５で完了したとみなした。遠心分離によってバイオマスを収穫し、４．２ｇ／ｌの乾重量を得た。全セレン蓄積量２．２１ｍｇ／ｇｄ．ｗ．が得られた。
【００２７】
実施例５
実施例４に示したように、ラクトバチルス・フェリントシェンシスＬｂ６ＢＭ−ＤＳＭ１６１４４を１５Ｌの発酵槽中で培養した。４．８ｇｄ．ｗ．のバイオマスが得られた。蓄積された全セレン量は２．０９ｍｇ／ｇｄ．ｗ．であった。
【００２８】
実施例６
実施例４に示したように、ラクトバチルス・ロイテリＬｂ２ＢＭ−ＤＳＭ１６１４３を１５Ｌの発酵槽中で培養した。４．１ｇｄ．ｗ．のバイオマスが得られた。蓄積された全セレン量は１．９１ｍｇ／ｇｄ．ｗ．であった。
【００２９】
実施例７
２８．１ｇｄ．ｗ．のラクトバチルス・フェリントシェンシスＬｂ６ＢＭ−ＤＳＭ１６１４４に等しい１００ｇの湿バイオマスを滅菌した生理溶液で洗浄し、３％のアスコルビン酸、３％のグルタミン酸Ｎａ、および４％のイノシトールを含み、ＮａＯＨでｐＨ６．２に調節した溶液５２０ｍｌに再懸濁させ、その後、凍結乾燥した。４．３×１０１１ＣＦＵ／ｇの細菌負荷を有する５４ｇの凍結乾燥した組成物が得られた。
【００３０】
実施例８
実施例７に記載のように２８．１ｇｄ．ｗ．のラクトバチルス・ロイテリＬｂ２ＢＭ−ＤＳＭＺ１６１４３に等しい１００ｇの湿バイオマスを調製し、３％のアスコルビン酸および３％のグルタミン酸Ｎａを含む水溶液に約４０％（ｗ／ｖ）の濃度で再懸濁させた。「噴霧乾燥機」を用いて懸濁液を乾燥させ、３．４×１０１０ＣＦＵ／ｇの細菌負荷を有する乾燥した組成物が得られた。
【００３１】
実施例９
分析方法
細胞によって蓄積されたセレン
実施例１、２および３から得られたバイオマスを、消耗した培地から遠心分離によって分離した。バイオマスを洗浄し、洗浄水を消耗した培地に加えた。次いで、時間ゼロ（Ｔ０）および２４時間の発酵後（Ｔ２４）における培地中のセレンの量、ならびに細胞によって蓄積されたセレンの量を決定した。得られた結果を以下の表に示した。
【００３２】
【表２】
2008501329.tif 000003
【００３３】
セレン含有量の決定
細胞質の可溶性画中および粒子状画分中のＳｅ（ＩＶ）の量は、一定電流での電位差測定分析によって決定した。この分析は、Ｔｒａｃｅ  Ｌａｂ  ＰＳＵ２０を用いて行った。この機器ではｐｐｂ未満のレベルでも微量元素が決定され、非常に好感度の分析方法が用いられている。分析には３つの標準電極が用いられている。それらは、ガラス質−炭素電極、白金電極およびカロメル電極である。
【００３４】
ガラス質−炭素電極：これは、Ｓｅを測定する電極である。分析中、その先端は水銀の非常に薄い膜に覆われている。
【００３５】
白金電極：これは、電気分解中に対極として役割を果たす。
【００３６】
カロメル電極：これは参照電極であり、金属を吸収せず、飽和ＫＣｌを含む。
【００３７】
金属の性質および濃度次第で、後者は稼動中の電極上に別々に堆積される。水銀フィルム上に堆積される金属の量は、試料中の金属イオンの濃度および電気分解の時間に比例する（電極上に堆積される金属の量は、電気分解時間の増加に伴って増加する）。
【００３８】
セレン含有量を決定するために用いた方法はＳＥ−ＡＤＤ方法であり、これには、２５０μｌの標準物質（５ｐｐｍのＳｅ）の添加が企図される。セレンの読取範囲は１０ｐｐｂ〜１００ｐｐｂでなければならない。
【００３９】
未加工の細胞抽出物の調製
Ｓｅ−アミノ酸の含有量の決定には、まず未加工の細胞抽出物を調製した。これには、細胞ペレットを溶解液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ−０．３ｍＭのＮａＣｌ）に、ｐＨ８．０、１対５の比（５ｍｌの溶解液中１ｇのペレット）で再懸濁させた。細胞壁の溶解を完了させるために、リゾチーム溶液（５０ｍｇ／ｍｌ）をペレット１ｇあたり２０μｌの量で加えた。混合物を１時間、４℃で攪拌し、その後、８サイクルの超音波処理（３０秒間のサイクル、氷中で１分間の休止を設ける）に供した（Ｂａｎｄｅｌｉｎ  ＨＤ  ２０７０−Ｕ超音波処理器）。混合物を１５０００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＪＡ２０ローター）で１時間、５℃で遠心分離して、細胞質の可溶性画分を粒子状画分（膜および壁）から分離した。沈殿後、取り込まれたセレンおよびセレン含有アミノ酸の含有量について細胞質タンパク質の分析を行った。
【００４０】
Ｓｅ−アミノ酸の含有量の決定
Ｓｅ−アミノ酸の含有量の決定には、１ｍｌの蒸留水を各試料に加え、事前に無機化かつ凍結乾燥し、そのようにして得られた溶液のｐＨをＮａＯＨで７．５に調節した。次に、プロテイナーゼＫの水溶液を１対１０の比で各試料に加えた。混合物を３７℃で攪拌しながら２４時間インキュベーションした。トリクロロ酢酸を１０％の最終濃度まで加えることによってタンパク質を沈殿させた。懸濁液を遠心分離し、上清を採取し、使用時まで−２０℃で保管した。試料の１つのアリコートで全セレン含有量を決定し、Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍ．、２００２；５０、５７２２〜５７２８に記載のＬＣ／ＭＳ方法を用いて、別のアリコートでＳｅ−メチオニンおよびＳｅ−システインの量を決定した。
【００４１】
実施例１０
胃液酸度および胆汁に対するラクトバチリスの耐性の決定
本発明の株の、酸度に対する耐性は、ｐＨ２．００の胃液と９０分間接触させた後のその生存を評価することによって試験した（Ｊ．Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂ．２００１；９０、２６８〜２７８）。ＭＲＳ培地中、嫌気条件、３７℃で１８時間増殖した後に採取した細胞を、ペプトン水に再懸濁させた。等容積のこの細菌懸濁液（０．１ｍｌ）を、６ｍｌの胃液および６ｍｌの「対照管」溶液に加えて、約１×１０８ＣＦＵ／ｍｌの最終濃度を得た。どちらの微生物懸濁液についても３７℃で９０分間インキュベーションを行った。１０倍希釈（ｄｅｃｉｍａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）およびＭＲＳ寒天培地上にプレーティングを行うことによって、Ｔ０および９０分後に採取した試料の生細胞の計数を行った。残りの容量は、９５００ｒｐｍ（Ｂｅｃｋｍａｎ、ＪＡ２０ローター）で２０分間、５℃で遠心分離して、胆汁に対する耐性を決定するために胆汁酸塩溶液中に懸濁させる細胞を得た。この目的のために、細胞を、ペプトン（１ｇ／ｌ）および胆汁（３ｇ／ｌ）を添加した６ｍｌの０．１Ｍのリン酸緩衝液、ｐＨ６．５に再懸濁させ、３７℃で３時間インキュベーションを行った。同時に、対照細胞を、同じ緩衝溶液であるが胆汁が存在しない緩衝溶液６ｍｌに再懸濁させ、上述と同様にインキュベーションを行った。上述と同様に、Ｔ０および胆汁に３時間曝した後に採取した試料の細菌負荷の決定を実施した。
【００４２】
酸性環境中でインキュベーションを行った細胞に対する乳の保護効果を、それぞれ胆汁酸塩への暴露および酸度に対して感受性のある２つの株、すなわちＬ．ロイテリＬｂ２ＢＭおよびＬ．ブーフネリ／パラブーフネリＬｂ２６ＢＭについて評価した。この目的のために、ｐＨ２．０に酸性化した脱脂乳溶液中に細胞を播種し、この溶液（ｐＨ２．０に９０分間）および胆汁酸塩溶液（１８０分間）に曝した後にＣＦＵ／ｍｌの数を決定した。
【００４３】
胃液酸度に対する耐性
【表３】
2008501329.tif 000004
【００４４】
胆汁酸塩の効果
【表４】
2008501329.tif 000005
【００４５】
ｐＨ２．０の脱脂乳および胆汁の存在下における株の応答
【表５】
2008501329.tif 000006
【００４６】
実施例１１
株ＬＢ２ＢＭ、ＬＢ６ＢＭおよびＬＢ２６ＢＭの同定
本発明の株ＬＢ２ＢＭ、ＬＢ６ＢＭおよびＬＢ２６ＢＭはＡＲＤＲＡ技法（増幅リボソームＤＮＡ制限分析）を用いて同定し、これには、ユニバーサルプライマーを用いて１６ＳのｒＤＮＡ遺伝子をコードしているＤＮＡ領域を増幅し、その後、得られた増幅産物を制限酵素で消化することが企図される。その後、制限断片の配列決定を行い、得られた配列とパーセント相同性に基づいて株を同定するための既知の配列とのアラインメントを行った。
【００４７】
材料および方法
ＤＮＡの抽出
３７℃で２４時間インキュベーションを行った滅菌したＭＲＳ培地中のブロス培養物の細胞からＤＮＡを抽出した。約２ｍｌのブロス培養物を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、採取したペレットを１．８５ｍｌの細胞懸濁液に均一に再懸濁させた。５０μｌのＲＮａｓｅミックスを混合物に加え、素早く攪拌した後、１００μｌの細胞溶解／変性溶液を加えた。懸濁液を５５℃で１５分間恒温装置に保持し、２５μｌのプロテアーゼミックスを添加し、５５℃で２時間保持した。５００の塩析混合物を加えた後、１．５ｍｌを４℃で１０分間保持し、１３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。２ｍｌのＴＥ（１０ｍＭのトリス−ＨＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８、無菌的）ならびに８ｍｌの１００％エタノールを上清に加えた。ガラス棒で回収したＤＮＡ鎖に５００μｌの７０％エタノールを添加し、１１０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。水相を除去した後、これを３７℃で２４時間保持し、その後、ＴＥ（約２００μｌ）に再懸濁させ、使用時まで−２０℃で保管した。ＤＮＡの抽出は、１×ＴＡＥ緩衝液中の０．７％アガロースゲル（ｗ／ｖ）での電気泳動によって確認した。
【００４８】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）
ゲノムの特定の部分をＰＣＲ技術によって増幅した。ＰＣＲ増幅反応は、滅菌した２００μｌエッペンドルフを用いて、事前に定義した２５μｌの反応容量で実施した。
【００４９】
反応混合物は以下から構成されていた：
−最終反応容量の１／２５の割合で用いた、ポリメラーゼ連鎖増幅反応を開始させる鋳型となる株のＤＮＡ（鋳型ＤＮＡ）；
−Ｔａｑポリメラーゼの酵素活性を安定化するのに必要なＭｇ２＋イオンを供給するＭｇＣｌ２（１．７５ｍＭ）の溶液。
−相補的な配列点において事前に変性させたＤＮＡ相補鎖と対合する２つのオリゴヌクレオチドプライマー（０．２μＭ）、すなわち「順方向」反応（ｆ）用に１つおよび「逆方向」反応（ｒ）用に１つ。プライマーの３’遊離末端は、酵素活性の開始点を提供する。プライマーは増幅する領域に応じて変化し、以下に示す。
−デオキシリボヌクレオチド三リン酸（０．２ｍＭ）の混合物（ｄＮＴＰ＝ｄＡＰＴ＋ｄＣＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ｄＴＴＰ）。
−開始鋳型上での新しいＤＮＡの合成の反応を触媒する熱安定性酵素Ｔａｑポリメラーゼ（Ｂｉｏｌｉｎｅ、英国）；その活性の至適温度は７０℃である；用いた酵素は５ユニット／μｌの濃度で供給する。
−酵素反応に最適なイオン強度およびｐＨを作り出す機能を有する、トリス−ＨＣｌ（１００ｍＭ、ｐＨ８．３）およびＫＣｌ（５００ｍＭ）からなる酵素Ｔａｑポリメラーゼの緩衝液、最終容量の１／１０の割合で加えた。
−反応が起こる手段を表し、所望の容量に達することを可能にする、滅菌した蒸留水。
【００５０】
外来性ＤＮＡによる反応物の汚染を防ぐために以下の注意を払った：
−滅菌フード、層流の下での反応混合物の調製；
−用いたすべての材料の滅菌；
−それぞれの増幅反応に、鋳型ＤＮＡ以外のすべての反応物質を含む陰性対照を含めること。
【００５１】
鋳型ＤＮＡとは別に上記で特定したすべての反応物質を適切な量で含む反応混合物を、１．５ｍｌのエッペンドルフ中で調製した。その後、反応混合物を０．２ｍｌのエッペンドルフ中でアリコートに分割し、次いでそれに鋳型を加えた。Ｔａｑポリメラーゼが非特異的に作用することを防ぐために、試料を迅速に氷中に置いた。
【００５２】
増幅の結果は１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルでの電気泳動によって確認した。陰性対照の電気泳動プロフィール中にバンドが存在しない場合は、反応物は汚染されていないとみなされた。
【００５３】
以下に示す表は、細菌リボソームの１６Ｓサブユニットをコードしている１６ＳのｒＤＮＡ遺伝子を増幅するための反応混合物中で用いた反応物質の濃度を示している。
【００５４】
真正細菌のユニバーサルプライマー２７ｆ５’−ＡＧＡ  ＧＴＴ  ＴＧＡ  ＴＣＣ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＡＧ−３’（配列番号１）および１４９５ｒ５’−ＣＴＡ  ＣＧＧ  ＣＴＡ  ＣＣＴ  ＴＧＴ  ＴＡＣ  ＧＡ−３’（配列番号２）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｌ）を用いた。これらは、大腸菌の１６ＳのｒＤＮＡ遺伝子のそれぞれ第２７個目および第１４９５個目のヌクレオチドに位置し、ほぼ完全な増幅を可能にする。
【００５５】
【表６】
2008501329.tif 000007
【００５６】
＊ユニットは、３０分間に７４℃の温度で１０ｎｇのｄＮＴＰを取り込む酵素の量として定義される。酵素は熱安定性であり、開始鋳型上での新しいＤＮＡの合成の反応を触媒する。
【００５７】
調製の直後、反応物を含む試験管をＰＣＲ  ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＴ  Ｓｙｓｔｅｍ  ２４００（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）用の熱サイクラーに入れ、以下の熱サイクルを適用した：９５℃で３分間の変性；９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で２分間を３５サイクル；次いで７２℃で１５分間の最終伸長段階。
【００５８】
増幅の結果は、１×ＴＡＥ緩衝液中の１．５％（ｗ／ｖ）アガロースゲルでの電気泳動によって確認した。１６ＳのｒＤＮＡの増幅はすべて、約１５００個のヌクレオチドの増幅バンドの存在によって検出することができる。ゲル上で目に見えるバンドに対応するＤＮＡの分子量は、１００ｂｐの倍数の長さを有するＤＮＡ断片の混合物であるＬａｄｄｅｒ  １００  ｂｐ  Ｐｌｕｓを流すことによって生じたバンドと比較することによって判明する。
【００５９】
制限酵素を用いた消化
得られた増幅産物は、制限酵素ＨｈａＩ、ＨｉｎｆＩ、Ａｆａを用いて消化した。
【００６０】
各株の１６ＳのｒＤＮＡの消化反応は、１０μｌの容量で、以下の試薬を用いて実施した：
−増幅バンドの強度に応じて異なる量の増幅したＤＮＡ；
−各酵素１０×の特異的緩衝液（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；
−制限酵素（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）（１０Ｕ／μｌ）；
−容量を１０μｌにするためのＭｉｌｌｉＱ水。
【００６１】
以下の表は、１６ＳのｒＤＮＡ断片を消化するために反応混合物中で用いた試薬の量を示す。
【００６２】
【表７】
2008501329.tif 000008
【００６３】
試薬をエッペンドルフに入れ、３７℃で１２時間インキュベーションを行った。試料を−２０℃で保管し、その後、試料を特徴付けるバンドの重量を評価するためにＬａｄｄｅｒ  ５０  ｂｐを用いて、１×ＴＡＥ緩衝液中の３％（ｗ／ｖ）アガロースゲルでの電気泳動によって分析した。
【００６４】
１６ＳのｒＤＮＡの酵素消化により、異なる分子量の様々なバンドから形成されたプロフィールが、分析した配列上に存在する酵素によって認識された部位の関数として作成される。バンドの合計は増幅した断片の長さ（１５００ｂｐ）を超えてはならない。
【００６５】
ＤＮＡのゲル電気泳動
操作条件には、０．０４Ｍのトリス−塩基、０．０２Ｍの氷酢酸、０．００１ＭのＮａ２−ＥＤＴＡ、ｐＨ８からなるトリス−酢酸−ＥＤＴＡ（ＴＡＥ）ランニング緩衝液中での水平アガロースゲルの使用が企図される。室温で実行し、ゲルの寸法の関数として一定電位９０Ｖ〜１１０Ｖを維持する。ＤＮＡ断片がゲルの長さの約２／３を覆ったら実効を停止する。
【００６６】
アガロースの濃度は、分離するＤＮＡ分子の大きさに応じて０．７％〜３％に変化する：
−ＤＮＡの抽出の確認には０．７％
−１６ＳのｒＤＮＡの増幅の確認には１．５％
−制限酵素を用いたＤＮＡの消化の確認には３％。
【００６７】
電気泳動実行用のゲルは、アガロースを１×ＴＡＥ緩衝液に溶かすことによって調製した。ウェルに載せる前に、ＤＮＡを１：５（ｖ／ｖ）の比で４０％（ｗ／ｖ）のスクロース、０．０５％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー、０．１ＭのＥＤＴＡ、ｐＨ８、および０．５％（ｗ／ｖ）のドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）からなるゲルローディング溶液と混合した。
【００６８】
ゲルの最初および最後のウェルには既知の分子量の分離したＤＮＡバンドを含むマーカーを載せ、これを用いて、塩基対（ｂｐ）で表される試料の長さを評価する。実行が完了したのち、マーカーは既知のＤＮＡ長に対応する分離したバンドを有する電気泳動プロフィールを示す。
【００６９】
バンドがゲルの約２／３まで進んだのち、ゲルを光から話して０．５ｍＭの臭化エチジウム溶液（Ｓｉｇｍａ）に１５〜３０分間浸した。その後、ゲルを蒸留水で約１５分間洗浄し、Ｇｅｌ  Ｄｏｃ画像収集システム（Ｂｉｏｒａｄ）に接続したＵＶトランスイルミネータの光の中で写真撮影した。
【００７０】
ＰＣＲ産物の精製
ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットのプロトコルを用いて増幅産物の７０ｂｐ〜１０ｋｂを精製した。精製した産物（約４５０μｌ）は、使用時まで−２０℃で、２ｍｌマイクロチューブ中で保管した。
【００７１】
ＤＮＡの沈殿
酢酸Ｎａ（ｐＨ５、３Ｍ）を精製した産物に、得られたＤＮＡの容量の１／１０の割合で加え、その後、１００％のエタノールをＤＮＡの２．５倍容量の割合で加えた。
【００７２】
上清を除去するためにこれを４℃で２０分間、１４０００ｒｐｍで遠心分離した。５００μｌの７０％エタノールを加えた後、沈殿物を４℃で１５分間遠心分離した。上清を除去したのち、エッペンドルフ内に残留エタノールを恒温装置内、３７℃で約１５分間、その後フードの下で蒸発させた。沈殿物を２３μｌのＴＥ、ｐＨ８に再懸濁させ、使用時まで４℃で保管した。
【００７３】
ＤＮＡの定量
Ｇｅｌ  Ｄｏｃ画像収集システム（Ｂｉｏｒａｄ）を用いて試料の蛍光を既知の濃度のマーカーの蛍光と比較することによって、増幅した産物を定量した。
【００７４】
１．５％のアガロースゲルを調製した。ウェルに既知の分子量のマーカーの２つの混合物を載せた。これらはそれぞれ以下から形成される：
１）２０μｌのマーカーＬｏｗ  Ｒａｎｇｅ  Ｍａｓｓ  Ｒｕｌｅｒ（商標）（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）
２）１０μｌのマーカーＬｏｗ  Ｒａｎｇｅ  Ｍａｓｓ  Ｒｕｌｅｒ（商標）（ＭＢＩ  Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ）。
【００７５】
２μｌの試料ＤＮＡを２μｌのブロモフェノールブルーおよび６μｌのＭｉｌｌｉＱ水と混合した。１０μｌの混合物をゲルに載せた。
【００７６】
配列決定
配列決定反応は、２００ｎｇのＰＣＲ産物、６ｐｍｏｌのプライマー２７ｆおよび１４９５ｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４μｌの緩衝液（２．５×）ならびに蛍光色素で標識したヌクレオチドの混合物を含む４μｌの「ＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒ」プリミックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いたＰＣＲ増幅によって実施した。最終容量は２０μｌであった。増幅反応にはＢｉｏｍｅｔｒｉａサーマルサイクラーを用い、以下の熱サイクルを適用した：９５℃で２分間の変性；９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、６０℃で４分間を２５サイクル；次いで６０℃で１５分間の最終伸長段階。次に、標識したヌクレオチドの精製を実施した：ＱＵＩＣＫ  ＲＵＮ試料を遠心分離し、１．５ｍｌのエッペンドルフに移し、これに２μｌの酢酸Ｎａおよび８０μｌの１００％エタノールを加えた。この全体を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を除去したのち、１ｍｌの７０％エタノールを加えた。１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離したのち、上清を除去し、混合物をフードの下に１５分間置くことで残留エタノールを蒸発させた。残渣を約１３μｌのＭｅｇａ  ＢＡＣ緩衝液に再懸濁させ、これを２０秒間ボルテックス攪拌した。ＱＵＩＣＫ  ＲＵＮを遠心分離し、試料を１．５ｍｌのエッペンドルフに移し、その後、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ３１０Ａシーケンサーに入れ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍキャピラリー電気泳動の実行を実施した。
【００７７】
相同性の調査
Ｆａｓｔａ３プログラムおよびＧｅｎｅＳｔｅａｍ  Ａｌｉｇｎプログラムを用いて、得られた配列とＧｅｎＢａｎｋおよびＥＭＢＬデータベースに存在する配列とのアラインメントを行った。各株用に用いた配列、配列決定された塩基の数、パーセント相同性および各株が帰因する種を以下に示す。
【００７８】
ＬＢ２ＢＭ−ＤＳＭ１６１４３
ラクトバチルス・ロイテリ
配列決定された塩基の数  ８６０
％相同性：９９．５
ＬＢ２ＢＭ  順方向（配列番号３）
ＬＢ２ＢＭ  逆方向（配列番号４）
【００７９】
ＬＢ６ＢＭ−ＤＳＭ１６１４４
ラクトバチルス・フェリントシェンシス
配列決定された塩基の数  ７４８
％相同性：９８．９
ＬＢ６ＢＭ  順方向（配列番号５）
ＬＢ６ＢＭ  逆方向（配列番号６）
【００８０】
ＬＢ２６ＢＭ−ＤＳＭ１６３４１
ラクトバチルス・ブーフネリ／パラブーフネリ
配列決定された塩基の数  ４８５
％相同性：９９．４
ＬＢ２６ＢＭ  順方向（配列番号７）
ＬＢ２６ＢＭ  逆方向（配列番号８）
【配列表】
2008501329000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月5日(2007.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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