(57)【要約】【課題】【解決手段】  本発明は、概ね脂肪酸の生産に関し、具体的には種々の細胞における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の産生に関し、より具体的には脂肪酸、特に多価不飽和脂肪酸を生産するための微生物における異種経路の発現に関する。本発明は、特に、宿主生物でのＰＵＦＡ含有量の改善に関わるもので、この改善は、温度の減少及び／又は最適培地の設計等による発酵最適化、脂肪酸合成酵素の過剰発現、ＰＵＦＡの前駆体の生合成に関わる他の酵素の過剰発現等による代謝改変による脂肪酸への流れの改善、或いは異種遺伝子のコドン最適化又はＰＵＦＡ前駆体の生合成に関わる異種酵素の発現を介して、おこなわれる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
４つ又はそれ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸の産生方法が、非脂肪酸基質上で増殖するサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での酸素要求経路の異種発現を含むことを特徴とする、多価不飽和脂肪酸の産生方法。
【請求項２】
前記非脂肪酸基質が、排他的な炭素源であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異種発現が、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を組み合わせることを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記異種発現が、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を組み合わせることを含むことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項５】
組み合わさった前記異種発現が、デルタ−５伸長酵素、オメガ−３不飽和化酵素、及び／又はデルタ−４不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
組み合わさった前記異種発現が、デルタ−９不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
組み合わさった前記異種発現が、ＡＣＣ１、ＹＢＲ１５９Ｗ、ＥＬＯ１、ＥＬＯ２、ＥＬＯ３、ＦＡＳ１、ＦＡＳ２、ＤＧＡ１、ＬＲＯ１、ＡＲＥ１、ＡＲＥ１、及びＧＰＤ１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の過剰発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
組み合わさった前記異種発現が、ＧＰＰ１、ＧＰＰ２、及びＰＯＸ１からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組み合わさった前記異種発現が、ＡＴＰ：クエン酸リアーゼ及び／又はＡＴＰによって刺激されるイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列の異種発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
組み合わさった前記異種発現が、非リン酸化ＮＡＤＰ依存型Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド発現の異種発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
組み合わさった前記異種発現が、遺伝子ＧＤＨ１の欠失と、選択的に、ＧＤＨ２、ＧＬＮ１、及びＧＬＴ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の過剰発現とを更に含むことを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一項にもとづく方法。
【請求項１２】
組み合わさった前記異種発現が、ＴＳＣ１３、ＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＹＤＲ５３１Ｗからなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の過剰発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記異種ヌクレオチド配列が、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に最適化されたコドンであることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をミオイノシトール欠損培地で培養することを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記多価不飽和脂肪酸が、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記異種発現が、アラキドン酸, エイコサペンタエン酸及び／又はドコサエキサエン酸の含有量を増加して前記サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での総脂肪酸含有量の２％を上回る量にすることを特徴とする、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記デルタ−１２不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：５〜１０、９３、９５、及び１１３に記載のヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：５〜１０、９３、９５、及び１１３に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記デルタ−９伸長酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号：３７のヌクレオチドを含む、又は少なくとも７５％同一であることを特徴とする、請求項４乃至１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
デルタ−９不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：１〜４に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１〜４に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項６乃至１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記デルタ−８不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号：３８のヌクレオチド配列を含む、又は少なくとも７５％同一であることを特徴とする、請求項４乃至１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記デルタ−６不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３乃至１７又は１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記デルタ−６伸長酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３乃至１７、１９又は２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記デルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３乃至２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記デルタ−５伸長酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：１９、２８、２９、及び１０１に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１９、２８、２９、及び１０１に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
（ｃ）配列番号：６８に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３乃至２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
デルタ−４不飽和化素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：３５〜３６、及び１０９に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：３５〜３６、及び１０９に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
（ｃ）配列番号：７６〜７７に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項３乃至２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
オメガ−３不飽和化素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項２乃至２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
多価不飽和脂肪酸を生産する方法であって、
（ａ）デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする少なくとも４つのヌクレオチド配列を単離するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記単離されたヌクレオチド配列を含む１つ又はそれ以上のベクターを構築し、及び／又は前記単離されたヌクレオチドをサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムに取り込むステップと；
（ｃ）選択的に、ステップ（ａ）の前記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、ステップ（ｂ）の前記ベクターによって一時的にサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換させるステップと；
（ｄ）非脂肪酸基質上で前記サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を増殖させることで、前記宿主によって前記非脂肪酸を所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換するステップと；
を含み、前記多価不飽和脂肪酸を得ることを特徴とする、多価不飽和脂肪酸を生産する方法。
【請求項２８】
多価不飽和脂肪酸を生産する方法であって、
（ａ）デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする少なくとも４つのヌクレオチド配列を単離するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の前記単離されたヌクレオチド配列を含む１つ又はそれ以上のベクターを構築し、及び／又は前記単離されたヌクレオチドをサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムに取り込むステップと；
（ｃ）選択的に、ステップ（ａ）の前記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、ステップ（ｂ）の前記ベクターによって一時的にサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換させるステップと；
（ｄ）非脂肪酸基質上で前記サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を増殖させることで、前記宿主によって前記非脂肪酸を所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換するステップと；
を含み、前記多価不飽和脂肪酸を得ることを特徴とする、多価不飽和脂肪酸を生産する方法。
【請求項２９】
前記異種発現が、デルタ−９不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、オメガ−３不飽和化酵素、及び／又はデルタ−４不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を含むことを特徴とすること、請求項２７又は２８に記載の方法。
【請求項３０】
非脂肪酸基質上で増殖する場合、４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産することができることを特徴とする、遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。
【請求項３１】
排他的な炭素源としての非脂肪酸基質上で増殖する場合に、前記サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸することができることを特徴とする、請求項３０に記載の遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）。
【請求項３２】
組成物が、請求項３０又は３１に記載の遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によって生産された多価不飽和脂肪酸を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項３３】
組成物が、請求項３０又は３１に記載の遺伝子組み換え細胞によって生産された総脂肪酸組成で少なくとも２５％の多価不飽和脂肪酸を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項３４】
前記組成物が、油であることを特徴とする、請求項３２又は３３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記多価不飽和脂肪酸が、トリアシルグリセリドに取り込まれることを特徴とする、請求項３２又は３３に記載の組成物。
【請求項３６】
前記多価不飽和脂肪酸が、リン脂質に取り込まれることを特徴とする、請求項３２又は３３に記載の組成物。
【請求項３７】
前記多価不飽和脂肪酸が、遊離脂肪酸の形態であることを特徴とする、請求項３２又は３３に記載の組成物。
【請求項３８】
食品の成分としての、請求項３２乃至３７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３９】
化粧品の成分としての、請求項３２乃至３７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４０】
飼料の成分としての、請求項３２乃至３７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項４１】
飼料の成分としての、請求項２９に記載の遺伝子組換サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願に対する相互参照
本出願は、米国特許出願第６０／５７７，２４５号（２００４年６月４日出願）の優先権を主張する。
これらの出願、特許、及び文中に引用された各文献の各々、これらの出願、特許、及び文献に引用された文献の各々（「出願参考文献」）、並びに該出願参考文献に参照又は引用された各文献は、文章中又は出願及びその特許の訴訟中のいずれの場合においても、その訴訟中に提起された特許性を支持する全ての議論と同様に、本明細書の一部をなすものとして本明細書中に援用される。
【０００２】
本発明は、概ね脂肪酸の生産に関し、具体的には種々の細胞における多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の産生に関し、より具体的には脂肪酸、特に多価不飽和脂肪酸を生産するための微生物における異種経路の発現に関する。
【背景技術】
【０００３】
ＰＵＦＡは、２つ以上の二重結合と末端カルボキシラート基とを有する炭素原子が１８個以上の炭化水素長鎖を持つ多価不飽和脂肪酸である。
【０００４】
多価不飽和脂肪酸の特性は、二重結合の位置によって、非常に影響され、炭素鎖のメチル末端から数えて第３位に最初の二重結合を有するオメガ−３ＰＵＦＡと、炭素鎖のメチル末端から数えて第６位に最初の二重結合を有するオメガ−６ＰＵＦＡとが区別される。エイコサペンタエン酸は前者の群、特に５、８、１１、１４、及び１７位に二重結合を有するエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）とドコサヘキサエン酸、特に４、７、１０、１３、１６、１９位に二重結合を有するドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）に属し、一方、例えばアラキドン酸（ＡＲＡ）は後者の群に属する。
【０００５】
ＰＵＦＡはヒトにとって不可欠であり、該ＰＵＦＡがヒトの健康上、多くの有益な効果を有するものであり、その例として脳及び視覚機能の適当な発達と疾患（例えば心血管疾患及び癌）の予防が挙げられる。
【０００６】
オメガ−６ＰＵＦＡアラキドン酸は、生体膜の構造及び機能において重要な役割を果たし、生物学的活性のあるプロスタグランジン及びロイコトリエンの前駆体である。アラキドン酸は満期産児及び早期産児の神経学的及び神経生理学発育に必要であり、多くの専門機関、例えば、国際連合食糧農業機関（ＦＡＯ）及び世界保健機構（ＷＨＯ）が、特殊調整粉乳にアラキドン酸を補うことを推奨した。
【０００７】
オメガ−３ＰＵＦＡ  ＥＰＡ及びＤＨＡは、同様に、ヒトで多くの生理機能を有する。それらは人体組織の一部であり、網膜の桿体外節においてＤＨＡは全脂肪酸の６０％以上を示す。ＤＨＡは、乳児の視覚機能及び神経学的発達にとって不可欠であるとされている。早期産児及び年少乳児は、十分な量のＤＨＡを合成することができず、残りを母乳によって受ける。ＤＨＡは、心疾患等の種々の疾患に関係する危険因子を排除し、高血圧、関節炎、動脈硬化症、及び血栓症に対して好ましい効果を及ぼす。
【０００８】
種々の刊行物、特許、及び特許出願で脂肪酸基質からのＰＵＦＡ生産に重点が置かれている。近年では、リノール酸からアラキドン酸への経路は酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａ）で再構成され（Ｄｏｍｅｒｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｅａｕｄｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００）、多価不飽和脂肪酸の合成は媒質に前駆体代謝産物（リノール酸）を供給することによって確立された。
【０００９】
他の群は、再構成実験でＰＵＦＡ経路の確立した部分を持つ。例えば、特許文献１は、ヒト由来のデルタ−５不飽和化酵素の配列を開示しており、この酵素は、ジホモ−ガンマ−リノレン酸が供給される場合、酵母での発現の際にアラキドン酸を生成する。
【００１０】
特許文献２は、線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）由来のオメガ−３不飽和化酵素とバクテリア、シアノバクテリア、植物プランクトン、藻、菌類、植物、及び動物を含む種々の生物体でのその発現、更にオメガ−３不飽和化酵素を発現する生物体からの脂質の産生を記述している。この酵素は、炭素原子数が１８、２０、及び２２であるオメガ−６脂肪酸から対応のオメガ−３脂肪酸への変換を触媒する。線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）由来のオメガ−３不飽和化酵素を発現する酵母菌は、外から供給されたリノール酸及びオメガ−６ドコサテトラエン酸を、それぞれアルファ−リノレン酸及びオメガ−３ドコサペンタエン酸に変換した。
【００１１】
特許文献３は、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）由来のデルタ−５不飽和化酵素の単離と、微生物細胞、特にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での上記酵素の発現とについて述べており、またジホモ−ガンマ−リノレン酸が細胞増殖培養液に供給されるとアラキドン酸が生産されることを報告している。
【００１２】
特許文献４は、線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）由来のデルタ−６不飽和化酵素と、酵母でのその発現とについて、更にこの発現が細胞外から供給されたオレイン酸からのガンマ−リノレン酸の生産を導くことを述べている。
【００１３】
特許文献５では、微生物（例えば藻、バクテリア、及び菌類）のデルタ−５不飽和化酵素（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ由来）の発現、特に、酵母でのその発現が開示されている。
【００１４】
特許文献６は、多くの異なるヒト伸長酵素について記載されており、それらのほとんどについて、外から供給された基質として多くの異なる脂肪酸を使用している酵母における機能性に関するテストをおこなっている。
【００１５】
トランスジェニック生物でアラキドン酸を生産する方法（特許文献７）が応用されている。ここでは、本発明者は酵母でアラキドン酸の産生に導くデルタ−５デサチュラーゼの発現について説明する。しかし、それは外部基質としてジホモ−ガンマ−リノレン酸を必要とする。
【００１６】
特許文献８の発明者は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素とデルタ−５不飽和化酵素を含む種々の不飽和化酵素の発現をテストし、脂肪酸基質を細胞増殖培養液に加えることによって酵素の機能を再構成するとともに、その転化を分析している。
【００１７】
前述した全ての刊行物、特許、及び特許出願において、プロセスが説明されており、ここで、ＰＵＦＡを産生するために脂肪酸を基質として外部から供給することが必要とされる。
【００１８】
以下、非脂肪酸基質から二重結合を最大３つ持つＰＵＦＡを生産することが報告されている２、３の刊行物を説明する。
【００１９】
特許文献９では、 シネコッカス（Ｃｙｎｅｃｏｃｏｃｃｕｓ）でのシネコシスチス（Ｃｙｎｅｃｏｓｙｓｔｉｓ）由来シグマ−１２及びデルタ−６不飽和化酵素の発現が、両方とも二重結合２つ及び２二重結合３つをそれぞれ持つリノレン酸及びガンマ−リノレン酸の生産を導くことが示されている。更にまた、細菌、菌類、又は植物細胞でのプライム・ローズ由来のデルタ−６不飽和化酵素の発現が開示されており、ガンマ−リノレン酸生産のための種々の植物での前記デルタ−６不飽和化酵素の発現が含まれる。
【００２０】
特許文献１０では、内因的に得られるオレイン酸からガンマ・リノール酸を酵母で生産することが述べられている。
【００２１】
特許文献１１はデルタ−６不飽和化酵素及びデルタ−１２不飽和化酵素の発現について記載されており、また、例えば、宿主細胞でのこれらの遺伝子のそのような発現がガンマ・リノール酸の生産を導くことを報告している。
【００２２】
先行技術文献は、ＰＵＦＡ生合成に関係する異なる遺伝子の数が多いことが確認されているという事実にもかかわらず、微生物において脂肪酸以外の炭素源から４つ以上の二重結合を有する異種ＰＵＦＡ生産に成功したことを開示していない。このことは、通常ＰＵＦＡを生産しない微生物で、十分又は検出可能なタイターで、４つ以上の二重結合を有するＰＵＦＡを生産することは難しい作業であることを、明らかに示している。特許文献１２の発明者は、ＰＵＦＡ伸長に関与する４つの遺伝子の配列を記述し、かつこれらの遺伝子全ての機能を明らかにしているにも関わらず、発明者は、実施例（実施例III）で、酵母のデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−５不飽和化酵素、及びモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）伸長酵素ｃＤＮＡの発現が、結果として脂肪酸の外因的供給を必要としないアラキドン酸の生産をもたらし得ることしか推測することができなかった。
【００２３】
上記段落の中間的概要として、特許文献１２で明示される推測を除いて、微生物での非脂肪酸基質からのＰＵＦＡ及びその生産のための異種経路を発現することについて、これまでのところ何ら報告されていない。これまで、微細な宿主（例えば酵母）の非脂肪酸基質からの異種ＰＵＦＡ生産に関する報告は、リノール酸及びガンマ−リノレン酸等の二重結合が4つ未満（すなわち、二重結合が３つ以下）であるＰＵＦＡに限られていた。
【００２４】
特許文献１２で示唆される戦略に従う場合、パン酵母のアラキドン酸含有量が低いと予想される。なぜなら、この生物の脂肪酸含有量が低い（細胞の乾燥重量の約１０％）からである。更に、パン酵母中の脂肪酸は、主に炭素原子数が１６の脂肪酸からなり、最も支配的な単不飽和脂肪酸は、アラキドン酸の前駆体として用いることができないパルミトレイン酸である。酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で上記の4つの遺伝子が単に発現されることで、これら４つの遺伝子の発現は、結果として脂肪酸のアラキドン酸含有量が０．８％であるとう結果、すなわち酵母乾燥重量の０．０８％未満に対応するという結果をもたらす。
【００２５】
二重結合を６つではなく４つ及び５つ有する多不飽和オメガ−３及びオメガ−６脂肪酸の生産が最近報告されている。キー（Ｑｉ）及び同僚は、オメガ−３脂肪酸ＥＰＡ及びオメガ−６脂肪酸アラキドン酸を植物シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）で生産することが可能であった（Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。
【００２６】
キー（Ｑｉ）及び同僚は、アラキドン酸及びＥＰＡを非脂肪酸基質を用いる生物体（例えば、植物）の異種経路を経て生産し得ることを、初めて示した。著者は、デルタ−９伸長酵素、シグマ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素を同時に発現させること（アラキドン酸及びＥＰＡを生産するためのシロイヌナズナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）の内因性デルタ−１２不飽和化酵素及び内因性オメガ−３不飽和化酵素の活性を利用するアプローチ）によって、成功した。多くの酵母及び糸状菌等の微生物を含む多くの生物で、少なくとも４つ又は少なくとも５つの二重結合を有するＰＵＦＡを生産するために、少なくとも４つ又は少なくとも５つの異種遺伝子を発現する必要があると思われる。ＰＵＦＡの生産に３を超える数の異種遺伝子を同時に発現させることは、これまでなされていなかった。更に、非脂肪酸基質からの多価不飽和脂肪酸の生産は、非植物細胞では、未だ示されていない。
【００２７】
特許文献１３では、発明者は植物及び微生物の両方で機能する技術を説明している。しかし、発明者は植物で述べられた技術を確認するのみであった。
【００２８】
特許文献１４は、油性酵母を使用したアラキドン酸及びＥＰＡ等のＰＵＦＡの生産について記述している。発明者は、油性酵母を、その細胞乾燥重量の少なくとも２５％を油として蓄積し得る酵母として、定義している。発明者は、宿主細胞として、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、及びリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）等の油性酵母を使用する。それは、他の生物又は非油性酵母（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））に関する情報を提供又は主張するものではない。発明者は、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−５不飽和化酵素、及びシグマ−１７不飽和化酵素を用いて、ヤルロウィア・リポリチカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）での３つの追加酵素の異種発現によって、該発明者の技術を例証している。後者は、オメガ−３不飽和化酵素に等しい。このアプローチは、内因性デルタ−１２不飽和化酵素を利用する。
【００２９】
特許文献１５では、発明者は、非脂肪酸基質とともに脂肪酸を供給することで、酵母でのＰＵＦＡ生産が可能であることを示している。発明者は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でデルタ−４不飽和化酵素、伸長酵素及び／又はデルタ−５不飽和化酵素を発現する。ガラクトースと共にＥＰＡ又はステアリドン酸を与えることで、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）がＤＨＡを生産する。
【００３０】
ＰＵＦＡは、増加させて、食物、例えば特殊調整粉乳、更にまた医薬組成物に供給される。ＰＵＦＡの一般的供給源は、魚油である。しかし、出漁期間中、魚油の脂肪酸含有量が変動することもあり、場合によっては、環境汚染により魚油が汚染される可能性がある。これに加え、魚油には不快な匂いがあり、このことが食物補助食品としてのその使用を排除する。
【００３１】
したがって、ＰＵＦＡの一部の用途では、適切かつ高価な精製ステップが必要である。ＰＵＦＡを明確に定義された方法によって、かつ大量に生産する必要性は、今後５乃至１０年間に急激に増加し、ＰＵＦＡが多くの異なる製品でサプリメントとして使用されると予想される。高品位に対するに高まる要求を満たすために、ＰＵＦＡの焦点は再生可能な生産方法へと向けられ、このことは非脂肪酸基質を使用している生産方法を包含する。後者は、不飽和脂肪酸のより明確な生産を可能にする。
【００３２】
本発明はこの要求について言及するともに、単不飽和脂肪酸と特定のＰＵＦＡの高水準生産のための効率的で新規、経済的、及び代替的な方法を提示する。
【特許文献１】ＵＳ６，４３２，６８４
【特許文献２】ＵＳ２００２／０１７００９０
【特許文献３】ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４２２
【特許文献４】ＷＯ９９／２７１１１
【特許文献５】ＷＯ９９／３３９５８
【特許文献６】ＷＯ０２／４４３２０
【特許文献７】ＷＯ０３／０１２０９２
【特許文献８】ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７４２１
【特許文献９】ＵＳ６，３５５，８６１
【特許文献１０】ＵＳ６，１３６，５７４
【特許文献１１】ＰＣＴ／ＵＳ９８／０７１２６
【特許文献１２】ＵＳ２００３／０１７７５０８
【特許文献１３】ＷＯ２００４／０５７００１
【特許文献１４】ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１４５４１
【特許文献１５】ＷＯ２００５／０１２３６
【発明の開示】
【００３３】
本発明の要約
一態様では、本発明は、酸素要求経路の異種発現を介して非脂肪酸基質から４つ以上の二重結合を有するＰＵＦＡを生産するための、非植物、より詳しくは微生物の構築及び改変に関する。
【００３４】
別の態様では、本発明は、酸素要求経路の異種発現を介して、一種類又は数種類の排他的な炭素源として非脂肪酸基質又は基質を用いることで４つ以上の二重結合を有するＰＵＦＡを生産するための、非植物、より詳しくは微生物の構築及び改変に関する。
【００３５】
特に、本発明は、非脂肪酸基質で増殖するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での酸素要求経路の異種発現を含む４つ以上の二重結合を持つ多価不飽和脂肪酸を生産するための方法を述べる。
【００３６】
更に、本発明は単不飽和脂肪酸及び特定のＰＵＦＡの異種生産のための微生物の構築及び改変に関し、これらの例として、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン酸、ガンマ・リノール酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサテトラエン酸、ステアリドン酸、エイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、エイコサテトラエン酸、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、及び４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）が挙げられる。
【００３７】
本発明は、特にステアリン酸から単不飽和脂肪酸及びＰＵＦＡ（すなわち、異種酵素であるデルタ−９不飽和化酵素、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、オメガ−３不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、デルタ−４不飽和化酵素、又はそのサブセット（図１及び図２）の発現を通してオレイン酸、アラキドン酸、ＤＨＡ、又はＥＰＡ）への異種経路を有する遺伝学的に形質転換された微生物に関わる。
【００３８】
更に、本発明は、発酵状態の最適化を通して（例えば温度を低下させること及び／又は最適媒質を設計することによって、又は代謝改変による脂肪酸への流動を改善することを通して、例えば脂肪酸合成の過剰発現を通して、ＰＵＦＡ前駆体の生合成に関与する他の酵素の過剰発現、又は異種遺伝子の最適化を通して、或いはＰＵＦＡの前駆体（すなわち、オレイン酸）の生合成に関与する異種酵素の発現を介して、宿主生物のＰＵＦＡ含有量を改善することに関する。
【００３９】
本発明はまた、ＰＵＦＡに至る異種経路を発現する微生物から生産される少なくとも２％の多価不飽和脂肪酸を含む組成物に関する。
【００４０】
これらの実施形態及び他の実施形態は、以下の詳細な説明に開示され、又はそれから明らかであり、更にそれによって包含される。
【００４１】
本発明の詳細な説明
本発明にもとづく方法に関連して上述の特徴及び／又は態様のいずれも類推によって用途に適用されることを、理解すべきである。
【００４２】
本出願に引用される全ての特許及び非特許文献の内容全体を、本明細書の一部を構成するものとして援用する。
【００４３】
明らかなように、本発明の一態様の好ましい特徴及び特性を本発明の他の態様に適用可能である。
【００４４】
この明細書全体を通じて、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」又は「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等のその変化形は、所定の要素、整数、又はステップ、或いは複数の要素、整数、又はステップからなる群の含有を意味するものと理解され、任意の他の要素、整数、又はステップ、或いは複数の要素、整数、又はステップからなる群の排除を意味するものではない。
【００４５】
本発明者は、４つ以上の二重結合を有する非脂肪酸基質から酸素要求経路の異種発現を通してＰＵＦＡを生産するために、非植物宿主細胞、特に微生物の構築及び改変によって、多価不飽和脂肪酸を生産するための、新規かつ代替のコスト効率が非常に高い方法を開発した。
【００４６】
本発明は、オレイン酸、リノール酸、アルファ−リノレン、ガンマ・リノール酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、５，８，１１，１４，１７−エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、ドコサテトラエン酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、及び４，７，１０，１３，１６，１９−ドコサヘキサエノン酸（ＤＨＡ）等の単不飽和脂肪酸及びＰＵＦＡの異種生産のための、そのような非植物宿主細胞の構築及び改変に関する。
【００４７】
本発明は、特にステアリン酸から単不飽和脂肪酸及びＰＵＦＡ（すなわち、異種酵素であるデルタ−９不飽和化酵素、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、オメガ−３不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、デルタ−４不飽和化酵素、又はそのサブセット（図１及び図２）の発現を通してオレイン酸、アラキドン酸、ＤＨＡ、又はＥＰＡ）への異種経路を有する遺伝学的に改変された非植物細胞、特に微生物に関する。
【００４８】
したがって、一態様では、本発明は、４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産する方法を提供する。
【００４９】
特に好ましい実施形態では、上記非脂肪酸基質は、排他的な炭素源である。
【００５０】
多価不飽和脂肪酸
本文脈では、用語「多価不飽和脂肪酸」は、少なくとも４つの二重結合と端カルボキシラート基とを有する１８個の炭素原子から構成される炭化水素長鎖を持つ多価不飽和脂肪酸である。
【００５１】
好ましい実施形態では、本発明の方法によって生産される多価不飽和脂肪酸は、少なくとも４つの二重結合、例えば４つの二重結合、５つの二重結合、又は６つの二重結合を有する多価不飽和脂肪酸に関する。
【００５２】
当業者が認めるように、脂肪酸をエステル化して、スフィンゴ脂質と同様に、トリグリセリド及び／又はリン脂質を形成することが可能である。したがって、一実施形態では、本発明はそのようなエステル化産物にも関する。
【００５３】
更に、本発明の脂肪酸産物は遊離脂肪酸である。遊離脂肪酸は遊離カルボキシル基を持ち、トリアシルグリセリド、リン脂質又はスフィンゴリピド等の他のいかなる化合物とも化学的に結合せず、細胞内の任意のコンパートメントに自由に存在することができる。
【００５４】
異種発現
「発現（ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、核酸セグメントがｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡからタンパク質に翻訳されることによって機能性ポリペプチドが生産されることを意味する。
【００５５】
「異種発現（ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）」は、宿主ゲノムに天然には存在しない核酸が宿主細胞に存在し、該宿主細胞で発現されるようにしてプロモーター及びターミネーターヌクレオチド配列に対して作用可能に結合することを意味する。
【００５６】
また、本文脈では、異種発現は、更に、天然に存在する核酸に類似の機能を有する核酸の存在に関し、異種核酸産物の発現は脂肪酸組成を変える。例えば、天然酵母デルタ−９不飽和化酵素とは異なる基質特異性を持つ真菌デルタ−９不飽和化酵素の酵母での発現によって、酵母の脂肪酸組成が変わる（実施例３６）。
【００５７】
上記核酸は染色体外核酸コンストラクト上に含まれるか、又は宿主ゲノムに組み込まれる場合もある。異種発現のための核酸の単離と異種発現の好ましい実施形態のための方法とを、以下に詳しく説明する。
【００５８】
経路の異種発現は、いくつかの遺伝子が異種発現し、それらの遺伝子産物が経路内のステップを構成し、宿主には本来存在しない。
【００５９】
酸素要求経路
酸素要求経路は、経路内の少なくとも１つの酵素が機能するために酸素を必要とすることを意味する。例えば、不飽和化酵素をコードする核酸の発現は、一般に不飽和化酵素が酸素要求酵素であることから、活性のために酸素を必要とする経路に、通常は至る。
【００６０】
非脂肪酸基質
本文脈では、「非脂肪酸基質」は、脂肪酸ではなく、２個以上の炭素原子を有する任意の基質に関し、該基質の例として、限定されるものではないが、ブドウ糖、マンノース、フルクトース、蔗糖、ガラクトース、ラクトース、エリスロース、トレオース、リボース、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、リブロース、セロビオース、澱粉、グリコーゲン、トレハロース、マルトース、マルトトリオース、キシロース、アラビノース、スタキオース、ラフィノース等の糖、又は、限定されるものではないが、エタノール、乳酸、酢酸塩、及びグリセロール等の非発酵性炭素源が挙げられる。
【００６１】
排他的な炭素源又は複数の排他的な炭素源
通常、生体は、炭素、硫黄、りん、窒素、酸素、又は水素等の多量栄養素の多く又は全ての供給を必要とする。生物は、異なる炭素源（例えば、脂肪酸基質及び非脂肪酸基質）の混合物によって成長することができる。もし一つ基質又は複数の基質が１つの排他的な炭素源又は複数の排他的な炭素源であるならば、その基質又はそれらの基質のみが炭素源として生物に供給される。このことは、他の多量栄養素又は他の栄養要求（例えば、微量栄養元素及びビタミンの要求）を除外するものではない。例えば、もし非脂肪酸基質が炭素源として排他的に供給される場合である。このことが意味することは、別の炭素源が供給されることなく、非脂肪酸のみが炭素源として供給されるということである。しかし、このことは他の多量栄養素又は他の栄養要求を除外するものではない。
【００６２】
非植物宿主細胞
本文脈において、用語「非植物宿主細胞」は、微生物、動物、菌類、細菌、無脊椎動物（昆虫）、又は原生動物からなる群より選択される宿主細胞に関する。特に、それは細菌、単細胞藻類、原生動物等のミクロな生物及び酵母等のミクロな菌類に関する。
【００６３】
より詳しくは、微生物として、真菌類、とりわけ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の糸状菌（Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ，  Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ等）、サッカロミセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｓｅｖａｚｚｉ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ等）、クルイヴェロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ等）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母（Ｐ．ｓｔｉｐｉｄｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｓｏｒｂｉｔｏｐｈｉｌａ等）、又は他の酵母の属、例えばクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、又はシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられる。しかし、これらの例に限定されない。他の微生物に関して、完全に網羅するものではないが、適当な糸状菌として、とりわけ、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フシジウム（Ｆｕｓｉｄｉｕｍ）属、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の種が挙げられる。
【００６４】
細菌に関しては、完全に網羅するものではないが、適当な細菌として、例えばバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に属の種、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の種、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の種、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種が挙げられる。
【００６５】
本発明の好ましい微生物は、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、黒色麹菌（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【００６６】
現在のところ好ましい実施形態では、本発明の好ましい微生物は、いくつかの理由から酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、周知のモデル生物であり、数千に及ぶ膨大な研究が何年ものあいだ、おこなわれており、その生理学は十分に理解されており、分析ツールを利用していかなる段階（例えば、ゲノム段階、転写産物段階、タンパク質段階、代謝産物段階、及び流動段階）の代謝も調べられている。したがって、このことにより、代謝改変戦略を迅速に開発することが可能であり、それによってＰＵＦＡ収率及び生産速度を改善するために効率的な遺伝子改変標的の同定が可能となる。この他にも、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）はＧＲＡＳステータスを有し、発酵工学が確立されている。
【００６７】
構築かつ改変された微生物を公知のプロセス（ケモスタット培養、バッチ培養、供給バッチ培養等）を用いて培養することができる。
【００６８】
特定の態様では、本発明は、４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、非脂肪酸基質上で増殖する非植物宿主細胞での酸素要求経路の異種発現を含み、この際の条件は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の宿主細胞での異種発現を組み合わせることを上記方法が含まないということである。
【００６９】
好ましい実施形態は、４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産する方法を提供するもので、該方法は、非脂肪酸基質上で増殖する非植物宿主細胞での酸素要求経路の異種発現を含み、上記異種発現が特定のＡＲＡ、ＥＰＡ、及びＤＨＡの各々の個別の特異的多価不飽和脂肪酸含有量を全脂肪酸含有量の２％を越える量まで増加させる。ＡＲＡ、ＥＰＡ又はＤＨＡの方の生合成経路の中間ＰＵＦＡの含有量は、２％を超えるが、２％を越える必要はない。
【００７０】
ＰＵＦＡ含有量の増加は、以下により詳しく説明する。
【００７１】
少なくとも４つの特異的遺伝子の異種発現
本発明の一態様は、ＰＵＦＡを生産するための少なくとも４つの特異的遺伝子の同時異種発現に関する。
【００７２】
したがって、一実施形態では、本発明は、４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、非脂肪酸基質上で増殖する酵母（サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））での酸素要求経路の異種発現を含み、該異種発現がデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を組み合わせることを含む。
【００７３】
別の実施形態では、本発明は、４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、非脂肪酸基質上で増殖するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での酸素要求経路の異種発現を含み、該異種発現がデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列を組み合わせることを含む。
【００７４】
特に、一実施形態は、多価不飽和脂肪酸を生産する方法を説明するもので、この方法は、
（ａ）配列番号：１〜３８からなる群より選択されるヌクレオチド配列の１つに対して、各々が少なくとも７５％の同一性を有する少なくとも４つのヌクレオチド配列を単離するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含むベクターを構築するステップと；
（ｃ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、ステップ（ｂ）のベクターによって一時的に宿主細胞を形質転換させるステップと；
（ｄ）上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸基質が上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換されるステップと；
を含み、上記多価不飽和脂肪酸を得る。
【００７５】
より具体的には、一実施形態は多価不飽和脂肪酸を生産する方法を説明するもので、この方法は、
（ａ）デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする少なくとも４つのヌクレオチド配列を単離するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含む1つ以上のベクターを構築し、及び／又は上記単離されたヌクレオチドをサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムに取り込むステップと；
（ｃ）選択的に、ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、ステップ（ｂ）の上記ベクターによって一時的にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換させるステップと；
（ｄ）非脂肪酸基質上で上記サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を増殖させることで、上記宿主によって上記非脂肪酸が所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換されるステップと；
を含み、上記多価不飽和脂肪酸を得る。
【００７６】
別の実施形態は、多価不飽和脂肪酸を生産する方法を説明するもので、この方法は、
（ａ）デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、シグマ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする少なくとも４つのヌクレオチド配列を単離するステップと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含む1つ以上のベクターを構築し、及び／又は上記単離されたヌクレオチドをサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムに取り込むステップと；
（ｃ）選択的に、ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、ステップ（ｂ）の上記ベクターによって一時的にサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を形質転換させるステップと；
（ｄ）非脂肪酸基質上で上記サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を増殖させることで、上記宿主によって上記非脂肪酸が所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換されるステップと；
を含み、上記多価不飽和脂肪酸を得る。
【００７７】
他で言及されるように、異種発現は、デルタ−９不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、オメガ−３不飽和化酵素、及び／又はデルタ−４不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を更に含むものであってもよい。
【００７８】
詳しくは、配列番号：１〜４はデルタ−９不飽和化酵素をコードし、配列番号：５〜１０、９３、９５、及び１１３はデルタ−１２不飽和化酵素をコードし、配列番号：１１〜１５、９７、及び９９はデルタ−６不飽和化酵素をコードし、配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３はデルタ−６伸長酵素をコードし、配列番号：２２〜２７、１０５、及び１０７はデルタ−５不飽和化酵素をコードし、配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１は、オメガ−３不飽和化酵素をコードし、配列番号：１９、配列番号：１９、２８〜２９、及び１０１はデルタ−５伸長酵素をコードし、配列番号：３５〜３６、及び１０９はデルタ−４不飽和化酵素をコードし、配列番号：３７は、デルタ−９伸長酵素をコードし、更に配列番号：３８はシグマ−８不飽和化酵素をコードする。
【００７９】
一実施形態では、本発明はデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素を宿主細胞でコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含む多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関する。
【００８０】
別の実施形態では、４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、該方法は、炭素源として排他的に非脂肪酸基質上で増殖するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞での酸素要求経路の異種発現を含み、該炭素源が排他的な炭素源である。
【００８１】
上記４つの遺伝子の発現は、長さが最大１８炭素原子であり、かつ二重結合を１つ有する脂肪酸のみを内因的に生産する宿主細胞でのアラキドン酸及び／又はその中間前駆体の一つ又はそれ以上の生産を可能にする。
【００８２】
更にまた、上記経路の発現は、一般に宿主細胞でのアラキドン酸の生産を改善し、１つ又はそれ以上のその中間前駆体の改善された生産も導くことができる。この方法の一般の利点は、それが非脂肪酸基質（例えば、糖）の使用を可能にするということである。しかし、脂肪酸含有基質（例えば、植物、動物、又は微生物に由来する油）もまた使用することができる。
【００８３】
本発明の別の実施形態は、多価不飽和脂肪酸を生産する方法を提供するもので、この方法は、宿主細胞でデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含む。
【００８４】
上記４つの遺伝子の発現は、長さが最大１８炭素原子であり、かつ二重結合を１つ有する脂肪酸のみを内因的に生産する宿主細胞でのアラキドン酸及び／又はその中間前駆体の１つ又はそれ以上の生産を可能にする。
【００８５】
それに加え、上記経路の発現は、一般に、宿主細胞でのアラキドン酸及び／又はその中間前駆体の一つ又はそれ以上の生産を改善する。この方法の一般の利点は、それが非脂肪酸基質（例えば、糖）の使用を可能にするということである。しかし、脂肪酸含有基質（例えば、植物、動物、又は微生物に由来する油）もまた使用することができる。
【００８６】
第３の実施形態では、本発明は多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、宿主細胞でデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、及びデルタ−５伸長酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含む。
【００８７】
上記５つの遺伝子の発現は、ドコサテトラエン酸、より具体的には、長さが最大１８炭素原子であり、かつ二重結合を１つ有する脂肪酸のみを内因的に生産する宿主細胞でのオメガ−６ドコサテトラエン酸及び／又は１つ又はそれ以上のその中間前駆体の生産を可能にする。
【００８８】
更にまた、上記経路の発現は、一般に、宿主細胞でのオメガ−６ドコサテトラエン酸の生産を改善するとともに、１つ又はそれ以上のその中間前駆体の改善された生産も導くことができる。この方法の一般の利点は、それが非脂肪酸基質（例えば、糖）の使用を可能にするということである。しかし、脂肪酸含有基質（例えば、植物、動物、又は微生物に由来する油）もまた使用することができる。
【００８９】
別の実施形態では、本発明は多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、宿主細胞でのデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、デルタ−５不飽和化酵素、及びデルタ−５伸長酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含む。
【００９０】
上記５つの遺伝子の発現は、ドコサテトラエン酸、より具体的には、長さが最大１８炭素原子であり、かつ二重結合を１つ有する脂肪酸のみを内因的に生産する宿主細胞でのオメガ−６ドコサテトラエン酸及び／又は１つ又はそれ以上のその中間前駆体の生産を可能にする。
【００９１】
更に、上記経路の発現は、一般に、宿主細胞でのオメガ−６ドコサテトラエン酸の生産を改善するとともに、１つ又はそれ以上のその中間前駆体の改善された生産も導くことができる。この方法の一般的な利点は、非脂肪酸基質（例えば、糖）の使用を可能にすることである。しかし、脂肪酸含有基質（例えば、植物、動物、又は微生物に由来する油）もまた使用することができる。
【００９２】
さらなる実施形態では、本発明は多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、宿主細胞でのデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、及びオメガ−３不飽和化酵素をコードしている遺伝子の異種発現を組み合わせることを含む。
【００９３】
上記５つの遺伝子の発現は、長さが最大１８炭素原子であり、かつ二重結合を１つ有する脂肪酸のみを内因的に生産する宿主細胞で、オメガ６−脂肪酸の生産だけでなく、オメガ−３脂肪酸の生産も同時に、或いは別々に可能にする。特に、上記５つの遺伝子の発現は上記宿主細胞でのでエイコサペンタエン酸の生産を可能にする。
【００９４】
更にまた、上記５つの遺伝子の発現は、一般に、宿主細胞でのエイコサペンタエン酸及び／又は１つ又はそれ以上の中間前駆体（アラキドン酸を含む）の生産を改善する。この方法の一般的な利点は、非脂肪酸基質（例えば、糖）の使用である。しかし、脂肪酸含有基質（例えば、植物、動物、又は微生物に由来する油）もまた使用することができる。
【００９５】
更に別の態様では、本発明は多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、宿主細胞でのデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素並びにオメガ−３不飽和化酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含む。
【００９６】
上記５つの遺伝子の発現は、長さが最大１８炭素原子であり、かつ二重結合を１つ有する脂肪酸のみを内因的に生産する宿主細胞で、オメガ−６脂肪酸の生産だけでなく、オメガ−３脂肪酸の生産も同時又は別々に可能にする。特に、上記５つの遺伝子の発現は上記宿主細胞でのエイコサペンタエン酸の生産を可能にする。
【００９７】
更に、上記５つの遺伝子の発現は、一般的に、宿主細胞でのエイコサペンタエン酸及び／又は１つ又はそれ以上の中間前駆体（アラキドン酸を含む）の生産を改善する。この方法の一般的な利点は、非脂肪酸基質（例えば、糖）の使用である。しかし、脂肪酸含有基質（例えば、植物、動物、又は微生物に由来する油）もまた使用することができる。
【００９８】
更なる実施形態では、本発明は、多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、宿主細胞でのデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、オメガ−３不飽和化酵素、及びデルタ−５伸長酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含む。
【００９９】
上記５つの遺伝子の発現は、長さが最大１８炭素原子であり、かつ二重結合を１つ有する脂肪酸のみを内因的に生産する宿主細胞で、オメガ−６脂肪酸の生産だけでなく、オメガ‐３脂肪酸の生産も同時又は別々に可能にする。特に、上記宿主細胞でのドコサペンタエン酸の生産を可能にする。
【０１００】
更に、上記５つの遺伝子の発現は、一般に、宿主細胞でのドコサペンタエン酸及び／又は１つ又はそれ以上の中間前駆体（ドコサテトラエン酸を含む）の生産を改善する。この方法の一般的な利点は、非脂肪酸基質（例えば、糖）の使用である。しかし、脂肪酸含有基質（例えば、植物、動物、又は微生物に由来する油）もまた使用することができる。
【０１０１】
別の実施形態では、本発明は、多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、宿主細胞でのデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、デルタ−５不飽和化酵素、オメガ−３不飽和化酵素、及びデルタ−５伸長酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含む。
【０１０２】
上記６つの遺伝子の発現は、長さが最大１８炭素原子であり、かつ二重結合を１つ有する脂肪酸のみを内因的に生産する宿主細胞で、オメガ−６脂肪酸の生産だけでなく、オメガ−３脂肪酸の生産も同時又は別々に可能にする。特に、それは上記宿主細胞でのドコサペンタエン酸の生産を可能にする。
【０１０３】
更に、上記６つの遺伝子の発現は、一般に、宿主細胞でのドコサペンタエン酸及び／又は１つ又はそれ以上の中間前駆体（ドコサテトラエン酸を含む）の生産を改善する。この方法の一般的な利点は、非脂肪酸基質（例えば、糖）の使用である。しかし、脂肪酸含有基質（例えば、植物、動物、又は微生物に由来する油）もまた使用することができる。
【０１０４】
別の実施形態では、本発明は多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関しあり、この方法は、宿主細胞でのデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、オメガ−３不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、及びデルタ−４不飽和化酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含む。
【０１０５】
上記７つの遺伝子の発現は、長さが最大１８炭素原子であり、かつ二重結合を１つ有する脂肪酸のみを内因的に生産する宿主細胞で、オメガ−６脂肪酸の生産だけでなく、オメガ‐３脂肪酸の生産も同時又は別々に可能にする。特に、それは前記宿主細胞でのドコサヘキサエン酸の生産を可能にする。
【０１０６】
更にまた、前記７つの遺伝子の発現は、一般に、宿主細胞でのドコサヘキサエン酸及び／又は１つ又はそれ以上の中間前駆体（ドコサテトラエン酸を含む）の生産を改善する。この方法の一般的な利点は、非脂肪酸基質（例えば、糖）の使用である。しかし、脂肪酸含有基質（例えば、植物、動物、又は微生物に由来する油）もまた使用することができる。
【０１０７】
別の実施形態では、本発明は、多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、宿主細胞でのデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、デルタ−５不飽和化酵素、オメガ−３不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、及びデルタ−４不飽和化酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含む。
【０１０８】
上記７つの遺伝子の発現は、長さが最大１８炭素原子であり、かつ二重結合を１つ有する脂肪酸のみを内因的に生産する宿主細胞で、オメガ‐６脂肪酸の生産だけでなく、オメガ‐３脂肪酸の生産も同時又は別々に可能にする。特に、それは上記宿主細胞でのドコサヘキサエン酸の生産を可能にする。
【０１０９】
更に、上記７つの遺伝子の発現は、一般に、宿主細胞でのドコサヘキサエン酸及び／又は１つ又はそれ以上の中間前駆体（ドコサテトラエン酸を含む）の生産を改善する。この方法の一般的な利点は、非脂肪酸基質（例えば、糖）の使用である。しかし、脂肪酸含有基質（例えば、植物、動物、又は微生物に由来する油）もまた使用することができる。
【０１１０】
別の好ましい実施形態では、本発明にもとづく方法が提供され、この方法は、上記した異種発現の異なる組み合わせのいずれか１つが更に、基質としてステアリン酸を優先的に使用するデルタ−９不飽和化酵素を含む。ステアリン酸特異的デルタ−９不飽和化酵素をコードする上記遺伝子の発現は、未改変宿主細胞と比較して、パルミトオレイン酸からオレイン酸へ脂肪酸組成のシフトを可能にする。したがって、多価不飽和脂肪酸を生産するための上記経路のうちの１つと組み合わせた前記遺伝子の発現は、多価不飽和脂肪酸の生産を更に改善する。
【０１１１】
特に好ましい実施形態では、本発明は４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、排他的な炭素源である１つの非脂肪酸基質又は複数の非脂肪酸基質上で増殖するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）宿主細胞での酸素要求経路の異種発現を含み、組み合わさった異種発現がデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列をコードする異種発現からなる。  
【０１１２】
別の特に好ましい実施形態では、本発明は４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、排他的な炭素源である１つの非脂肪酸基質上で増殖するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ） 宿主細胞での酸素要求経路の異種発現を含み、組み合わさった異種発現がデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現からなる。
【０１１３】
更に特定の好ましい実施形態は、本発明にもとづく方法に関し、組み合わさった異種発現がデルタ−５伸長酵素、オメガ−３不飽和化酵素、及び／又はデルタ−４不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を更に含む。
【０１１４】
更に別の特定の好ましい実施形態は、本発明にもとづく方法に関し、組み合わさった異種発現がデルタ−９不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を、更に含む。
【０１１５】
基質
本態様によるＰＵＦＡの生産のための発酵基質は、任意の天然培地又は合成培地であってもよく、例を挙げれば、糖、例えばブドウ糖、マンノース、フルクトース、ショ糖、ガラクトース、乳糖、エリトロース、トレオース、リボース、グリセルアルデヒド、ジヒドロキシアセトン、リブロース、セロビオース、澱粉、グリコーゲン、トレハロース、マルトース、マルトトリオース、キシロース、アラビノース、スタキオース、ラフィノース、又は非発酵性炭素源、例えばエタノール、アセテート、ラクタート、又はグリセロール、又はオイル、例えば植物、動物、又は微生物に由来するオイル、又は脂肪酸、例えば酪酸、カプロン酸、カプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、アラキジン酸、パルミトレイン酸、オレイン酸、エライジン酸、ｃｉｓ−バクセン酸、リノール酸、アルファ−リノレン、ガンマ・リノール酸、ジホモ−ガンマ−リノレン酸、アラキドン酸、ＥＰＡ、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、及び４，７，１０、１３、１６、１９−ドコサエキサエン酸ＤＨＡが含まれる。
【０１１６】
宿主細胞
本文脈で、用語「宿主細胞」は、微生物、動物、菌類、バクテリア、無脊椎動物（昆虫）、植物、又は原生動物からなる群より選択される宿主細胞に関する。特に、それは酵母を含むバクテリア、ウイルス、単細胞藻類、原生動物、及び顕微鏡菌類を含む微生物に関する。
【０１１７】
現在好ましい実施形態では、上記したように宿主細胞が非植物宿主細胞である。
【０１１８】
より詳しくは、微生物として、真菌類、とりわけ、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の糸状菌（Ａ．ｎｉｇｅｒ、Ａ．ａｗａｍｏｒｉ，Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ等）、サッカロミセス（Ｓａｃｃａｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓ．ｂａｙａｎｕｓ、Ｓ．ｅｘｉｇｕｕｓ、Ｓ．ｓｅｖａｚｚｉ、Ｓ．ｕｖａｒｕｍ等）、クルイヴェロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属の酵母（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ、Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ  ｖａｒ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ、Ｋ．ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属の酵母（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ、Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｃ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ、Ｃ．ｖｅｒｓａｔｉｌｉｓ等）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属の酵母（Ｐ．ｓｔｉｐｉｄｉｓ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｓｏｒｂｉｔｏｐｈｉｌａ等）、又は他の酵母の属、例えばクリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）属、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）属、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）属、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属、又はシゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられる。他の微生物に関して、完全に網羅するものではないが、適当な糸状菌として、とりわけ、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、フサリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フシジウム（Ｆｕｓｉｄｉｕｍ）属、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、ムコル（Ｍｕｃｏｒ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の種が挙げられる。
【０１１９】
細菌に関しては、完全に網羅するものではないが、適当な細菌として、例えば、当該技術分野で周知のバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）に属の種、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属の種、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属の種、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の種、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）属の種、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属の種が挙げられる。
【０１２０】
本発明の好ましい微生物は、酵母（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、黒色麹菌（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）又は枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）である。
【０１２１】
構築かつ改変された微生物を公知のプロセス（ケモスタット培養、バッチ培養、供給バッチ培養等）を用いて培養することができる。
【０１２２】
このように、１つの好ましい実施形態では、本発明は、多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、本明細書中に述べられるように、宿主細胞での種々の不飽和化酵素及び伸長酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含み、上記宿主細胞は、植物、微生物、動物、真菌類、細菌、無脊椎動物（昆虫）又は原生動物からなる群より選択される。
【０１２３】
特に好ましい実施形態では、本発明は、多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、本明細書中に述べられるように、宿主細胞での種々の不飽和化酵素及び伸長酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含み、上記宿主細胞が上記宿主細胞が真菌類であり、好ましくは上記真菌類が糸状菌又は酵母である。
【０１２４】
一実施形態では、上記酵母は、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、クルイヴェロマイシス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、デバロミセス（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、ザイゴサッカロミセス（Ｚｙｇｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）シゾサッカロミセス（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、及びリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属の群から選択される。
【０１２５】
好ましい実施形態では、上記酵母がサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【０１２６】
別の実施形態では、上記糸状菌がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）属、リゾプス（Ｒｈｉｚｏｐｕｓ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、フシジウム（Ｆｕｓｉｄｉｕｍ）属、ジベレラ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ）属、ムコール（Ｍｕｃｏｒ）属、モルティエレラ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）属、又はトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属の群から選択される。
【０１２７】
さらなる実施形態では、上記アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属がアスペルギウス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）又はアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｄｕｌａｎｓ）の種から選択される。更に、現在最も好ましい実施形態では、上記宿主は、アスペルギウス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）である。
【０１２８】
別の好ましい実施形態では、本発明は多価不飽和脂肪酸を生産する方法に関し、この方法は、本明細書に記載されるように、宿主細胞での種々の不飽和化酵素及び伸長酵素をコードする遺伝子の異種発現を組み合わせることを含み、上記宿主が細菌である。
【０１２９】
一実施形態では、上記細菌がバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、ラクトバシラス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アセトバクター（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、又はシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）の群から選択される。
【０１３０】
現在最も好ましい実施形態では、上記細菌は枯草菌（バチラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｌｉｓ））である。
【０１３１】
現在最も好ましい別の実施形態では、上記細菌は大腸菌（エシュリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））である。
【０１３２】
好ましい実施形態では、本発明は、非脂肪酸基質上で増殖する場合に４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産することが可能な遺伝的に改変されたサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に関する。
【０１３３】
現在最も好ましい実施形態では、本発明は、本発明にもとづいて遺伝的に改変されたサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に関し、上記サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）は、排他的な炭素源としての非脂肪酸基質上で増殖する場合、４つ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産することができる。
【０１３４】
多価不飽和脂肪酸
本発明の文脈では、多価不飽和脂肪酸は４つ以上の二重結合と末端カルボキシラート基とを有する、少なくとも５つの二重結合と末端カルボキシラート基とを有する、又は６つの二重結合と末端カルボキシラート基を有する炭素原子数１８からなる炭化水素長鎖を持つ化合物に関する。
【０１３５】
上記の特異的な異種遺伝子を適用する場合、いくつかの中間生成物が形成されると思われるので、そのような中間生成物を本発明に包含する。しかし、いくつのケース或いは多くのケースで、中間生成物の一部又は全部が検出困難なほどの低濃度で存在する可能性がある。
【０１３６】
本文脈では、これらの中間生成物として、オレイン酸、リノール酸、ガンマーリノレン酸、ジホモ−ガンマ・リノール酸、エイコサジエン酸、特に１１位及び１４位に二重結合を有するエイコサジエン酸、エイコサトリエン酸、特に１１位、１４位、及び１７位に二重結合を有するエイコサトリエン酸、アラキドン酸、ドコサテトラエン酸、特に７位、１０位、１３位、及び１６位に二重結合を有するドコサテトラエン酸、アルファ・リノール酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、特に８位、１１位、１４位、及び１７位に二重結合を有するエイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、特に５位、８位、１１位、１４位、及び１７位に二重結合を有するエイコサペンタエン酸、並びにドコサペンタエン酸が考えられる。
【０１３７】
好ましい一実施形態は、本発明にもとづく方法を提供するもので、多価不飽和脂肪酸が少なくとも４つの二重結合、例えば４つの二重結合、例えば５つの二重結合、及び例えば６つの二重結合を有する。
【０１３８】
別の好ましい実施形態では、上記多価不飽和脂肪酸が非脂肪酸基質から作られる。
【０１３９】
１つの好ましい実施形態では、上記多価不飽和脂肪酸は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、シグマ−９、デルタ−５不飽和化酵素、オメガ−３不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、及びデルタ−４不飽和化酵素からなる群より選択される酵素の少なくとも１つの内因性発現が元々欠けている宿主細胞で、二重結合の数が４つ未満である脂肪酸基質から作られる。
【０１４０】
好ましい別の実施形態では、多価不飽和脂肪酸は、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群より選択される。
【０１４１】
好ましい実施形態では、上記多価不飽和脂肪酸がアラキドン酸である。
【０１４２】
具体的には、アラキドン酸を生産する方法を提供するもので、この方法は、
（ａ）配列番号：５〜１０、９３、及び９５に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列を単離、配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離、配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第３のヌクレオチド配列を単離、並びに配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第４のヌクレオチド配列を単離することと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターを構築することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）のベクターによって、一時的に、かつステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと；
（ｄ）上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと；
を含み、上記アラキドン酸を得る。
【０１４３】
或いは、代替的に、本発明はアラキドン酸を生産する方法に関し、この方法は、
（ａ）配列番号：５〜１０、９３、９５，及び１１３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：３７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：３８に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第３のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第４のヌクレオチド配列を単離することと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターを構築することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）のベクターによって、一時的に、かつステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと；
（ｄ）上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと；
を含み、上記アラキドン酸を得る。
【０１４４】
もう一つの好ましい実施形態において、上記多価不飽和脂肪酸は、エイコサペンタエン酸である。
【０１４５】
詳しくは、エイコサペンタエン酸を生産する方法を提供するもので、この方法は、
（ａ）配列番号：５〜１０、９３、９５，及び１１３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第３のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第４のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第５のヌクレオチド配列を単離することと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターを構築することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）のベクターによって、一時的に、かつステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと；
（ｄ）上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと；
を含み、上記エイコサペンタエン酸を得る。
【０１４６】
或いは、代替的に、本発明はアラキドン酸を生産する方法に関し、この方法は、
（ａ）配列番号：５〜１０、９５，及び１１３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、  配列番号：３７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、，  配列番号：３８に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第３のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第４のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第５のヌクレオチド配列を単離することと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターを構築することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）のベクターによって、一時的に、かつステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと；
（ｄ）上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと；
を含み、上記エイコサペンタエン酸を得る。
【０１４７】
好ましい一実施形態では、上記多価不飽和脂肪酸は、ドコサエキサエン酸である。
【０１４８】
詳しくは、ドコサエキサエン酸を生産する方法を提供するもので、この方法は、
（ａ）配列番号：５〜１０、９３、及び９５に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する別のヌクレオチド配列  を単離すること、配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第３のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第４のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第５のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：１９、２８、２９、及び１０１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第６のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号：３５〜３６及び１０９に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第７のヌクレオチド配列を単離することと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターを構築することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）のベクターによって、一時的に、かつステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと；
（ｄ）上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと；
を含み、上記ドコサエキサエン酸を得る。
【０１４９】
或いは、本発明はまた、ドコサエキサエン酸を生産する方法に関し、この方法は、
（ａ）配列番号：５〜１０、９３、９５，及び１１３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：３７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：３８に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第３のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第４のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第５のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：１９、２８、２９、及び１０１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第６のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号：３５〜３６及び１０９に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第７のヌクレオチド配列を単離することと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターを構築することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）のベクターによって、一時的に、かつステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと；
（ｄ）上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと；
を含み、上記ドコサエキサエン酸を得る。
【０１５０】
更に別の実施形態では、上記多価不飽和脂肪酸は、ドコサペンタエン酸である。
【０１５１】
詳しくは、ドコサペンタエン酸を生産する方法を提供するもので、この方法は、
（ａ）配列番号：５〜１０、９３、９５，及び１１３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第３のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第４のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：１９、２８、２９、及び１０１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第５のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第６のヌクレオチド配列を単離することと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターを構築することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）のベクターによって、一時的に、かつステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと；
（ｄ）上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと；
を含み、ドコサペンタエン酸を得る。
【０１５２】
好ましい一実施形態では、多価不飽和脂肪酸はドコサテトラエン酸である。
【０１５３】
詳しくは、本発明はドコサテトラエン酸を生産する方法に関し、この方法は、
（ａ）配列番号：５〜１０、９３、９５，及び１１３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する別のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第３のヌクレオチド配列を単離すること、配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第４のヌクレオチド配列を単離すること、並びに配列番号：１９、２８、２９、及び１０１に記載のヌクレオチド配列の少なくとも１つに対して、少なくとも７５％同一性を有する第５のヌクレオチド配列を単離することと；
（ｂ）ステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列を含む少なくとも１つのベクターを構築することと；
（ｃ）ステップ（ｂ）のベクターによって、一時的に、かつステップ（ａ）の上記単離されたヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の発現に十分な条件下で、宿主細胞を形質転換させることと；
（ｄ）上記宿主細胞を非脂肪酸基質にさらすことで、上記非脂肪酸を上記宿主によって所望の多価不飽和脂肪酸産物に変換することと；
を含み、ドコサテトラエン酸を得る。
【０１５４】
一実施形態では、本発明は特定のヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列は、デルタ−１２不飽和化酵素をコードする特定のヌクレオチド配列、より具体的にはアミノ酸配列の配列番号：４３〜４８をコードする配列番号：５〜１０、９３、９５、及び１１３の使用に関する。一般に、これらのデルタ−１２不飽和化酵素コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも３つ以上の付加的なヌクレオチド配列と共に使用される。最小限の付加的な３つの配列は、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列、又はデルタ−９伸長酵素、シグマ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列である。付加配列を、表１に提供される配列から選択することができる。同様の実施形態も、ヌクレオチド配列番号：５〜１０のヌクレオチド配列のいずれか１つから構成される、或いはそれに対して少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列をコードする任意のデルタ−１２不飽和化酵素に関する。
【０１５５】
具体的には、デルタ−１２不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号：５〜１０、９３、９５、及び１１３に記載のヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：５〜１０、９３、９５、及び１１３に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列と；
からなる群より選択される。
【０１５６】
本文脈では、「デルタ−１２不飽和化酵素」はオレイン酸をリノール酸に変換することが可能な酵素に関し、この意味は上記酵素の他の機能性を除外しない。
【０１５７】
一実施形態では、本発明は特定のヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列は、デルタ−９伸長酵素をコードする特定のヌクレオチド配列、より具体的にはアミノ酸配列の配列番号：７９をコードする配列番号：３７の使用に関する。一般に、このデルタ−９伸長酵素コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも３つ以上の付加的なヌクレオチド配列と共に使用される。最小限の付加的な３つの配列は、デルタ−１２不飽和化酵素、シグマ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列である。付加配列を、表１に提供される配列から選択することができる。同一の実施形態もまた、配列番号：３７のヌクレオチド配列を含む、又はそれに対して、少なくとも７５％同一性を有する任意のデルタ−９伸長酵素コード化ヌクレオチド配列に関する。
【０１５８】
本文脈では、「デルタ−９伸長酵素」はリノール酸をエイコサジエン酸に変換すること及び／又はアルファ・リノール酸をエイコサトリエン酸に変換することが可能な酵素に関し、この意味は上記酵素の他の機能性を除外しない。
【０１５９】
一実施形態では、本発明は特定のヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列は、デルタ−９不飽和化酵素をコードする特定のヌクレオチド配列、より具体的にはアミノ酸配列の配列番号：３９〜４２をコードする配列番号：１〜４の使用に関する。一般に、これらのデルタ−９不飽和化酵素コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも４つ以上の付加的なヌクレオチド配列と共に使用される。最小限の付加的な４つの配列は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９不飽和化酵素、シグマ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列、又はデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、シグマ−９、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列である。付加配列を、表１に提供される配列から選択することができる。同一の実施形態もまた、配列番号：１〜４のヌクレオチド配列を含む、又はそれに対して、少なくとも７５％同一性を有する任意のデルタ−９不飽和化酵素ヌクレオチド配列に関する。
【０１６０】
具体的には、デルタ−９不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号：１〜４に記載のヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１〜４に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列と；
からなる群より選択される。
【０１６１】
本文脈では、「デルタ−９不飽和化酵素」はステアリン酸をオレイン酸に変換すること及び／又はパルミチン酸をパルミトレイン酸に変換することが可能な酵素に関し、この意味は上記酵素の他の機能性を除外しない。
【０１６２】
一実施形態では、本発明は特定のヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列は、シグマ−８不飽和化酵素をコードする特定のヌクレオチド配列、より具体的にはアミノ酸配列の配列番号：７９をコードする配列番号：３８の使用に関する。一般に、このシグマ−８不飽和化酵素コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも３つ以上の付加的なヌクレオチド配列と共に使用される。最小限の付加的な３つの配列は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列である。付加配列を、表１に提供される配列から選択することができる。同一の実施形態もまた、配列番号：３８のヌクレオチド配列を含む、又はそれに対して、少なくとも７５％同一性を有する任意のシグマ−８不飽和酵素ヌクレオチド配列に関する。
【０１６３】
本文脈では、「シグマ−８不飽和化酵素」は、エイコサジエン酸をジホモ−ガンマ−リノレン酸に変換すること、又はエイコサトリエン酸をエイコサトリエン酸に変換することが可能な酵素に関し、この意味は上記酵素の他の機能性を除外しない。
【０１６４】
一実施形態では、本発明は特定のヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列は、デルタ−６不飽和化酵素をコードする特定のヌクレオチド配列、より具体的にはアミノ酸配列の配列番号：４９〜５３、９８、及び１００をコードする配列番号：１１〜１５、９７及び９９の使用に関する。一般に、このシグマ−８不飽和化酵素コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも３つ以上の付加的なヌクレオチド配列と共に使用される。最小限の付加的な３つの配列は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列である。付加配列を、表１に提供される配列から選択することができる。同一の実施形態もまた、配列番号：１１〜１５、９７、及び９９のヌクレオチド配列を含む、又はそれに対して、少なくとも７５％同一性を有するデルタ−６不飽和化酵素コード化ヌクレオチド配列に関する。
【０１６５】
具体的には、デルタ−６不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に記載のヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列と；
からなる群より選択される。
【０１６６】
本文脈では、「デルタ−６不飽和化酵素」はリノレン酸をガンマ−リノレン酸に変換すること及び／又はアルファ−リノレン酸をステアリン酸に変換することが可能な酵素に関し、この意味は上記酵素の他の機能性を除外しない。
【０１６７】
一実施形態では、本発明は特定のヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列は、デルタ−６伸長酵素をコードする特定のヌクレオチド配列、より具体的にはアミノ酸配列の配列番号：５４〜５９、１０２、及び１０４をコードする配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３の使用に関する。一般に、このデルタ−６伸長酵素コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも３つ以上の付加的なヌクレオチド配列と共に使用される。最小限の付加的な３つの配列は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列である。付加配列を、表１に提供される配列から選択することができる。同一の実施形態もまた、配列番号：１６〜２１，１０１、及び１０３のヌクレオチド配列を含む、又はそれに対して、少なくとも７５％同一性を有するデルタ−６伸長酵素コード化ヌクレオチド配列に関する。
【０１６８】
具体的には、デルタ−６伸長酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に記載のヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列と；
からなる群より選択される。
【０１６９】
本文脈では、「デルタ−６伸長酵素」は、ガンマ−リノレン酸をジホモ−ガンマ−リノレン酸に変換すること及び／又はステアリン酸をエイコサテトラエン酸に変換することが可能な酵素に関し、この意味は上記酵素の他の機能性を除外しない。
【０１７０】
一実施形態では、本発明は特定のヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列は、デルタ−５不飽和化酵素をコードする特定のヌクレオチド配列、より具体的にはアミノ酸配列の配列番号：６０〜６５、１００、１０６、及び１０８をコードする配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７の使用に関する。一般に、このデルタ−５不飽和化酵素コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも３つ以上の付加的なヌクレオチド配列と共に使用される。最小限の付加的な３つの配列は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、及びデルタ−６伸長酵素をコードするヌクレオチド配列である。付加配列を、表１に提供される配列から選択することができる。同一の実施形態もまた、配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７のヌクレオチド配列を含む、又はそれに対して、少なくとも７５％同一性を有するデルタ−５不飽和化コード化ヌクレオチド配列に関する。
【０１７１】
具体的には、デルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に記載のヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列と；
からなる群より選択される。
【０１７２】
本文脈では、「デルタ−５不飽和化酵素」はジホモ−ガンマ−リノレン酸をアラキドン酸に変換すること、及び／又はエイコサテトラエン酸をエイコサテトラエン酸に変換することが可能な酵素に関し、この意味は上記酵素の他の機能性を除外しない。
【０１７３】
一実施形態では、本発明は特定のヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列は、デルタ−５伸長酵素をコードする特定のヌクレオチド配列、より具体的にはアミノ酸配列の配列番号：６６〜６７、及び１０２をコードする配列番号：１９、２８〜２９、及び１０１の使用に関する。また、それは配列番号：６８のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に関する。一般に、こららのデルタ−５伸長酵素コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも４つ以上の付加的なヌクレオチド配列と共に使用される。最小限の付加的な４つの配列は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、シグマ−９、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列、又はデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、シグマ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列である。付加配列を、表１に提供される配列から選択することができる。同一の実施形態もまた、配列番号：１９、２８〜２９、及び１０１のヌクレオチド配列を含む、又はそれに対して、少なくとも７５％同一性を有するデルタ−５伸長酵素コード化ヌクレオチド配列に関し、また配列番号：６８に対して少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に関する。
【０１７４】
具体的には、デルタ−５伸長酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号：１９、２８〜２９、及び１０１に記載のヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１９、２８〜２９、及び１０１に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列と；
（ｃ）配列番号：６８に対して少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と；
からなる群より選択される。
【０１７５】
本文脈では、「デルタ−５伸長酵素」は、アラキドン酸をドコサテトラエン酸に変換すること、及び／又はエイコサペンタエン酸をドコサペンタエン酸に変換することが可能な酵素に関し、この意味は上記酵素の他の機能性を除外しない。
【０１７６】
一実施形態では、本発明は特定のヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列は、デルタ−４不飽和化酵素をコードする特定のヌクレオチド配列、より具体的にはアミノ酸配列の配列番号：７４〜７５、及び１１０をコードする配列番号：３５〜３６、及び１０９の使用に関する。また、それは配列番号：７６〜７７のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に関する。一般に、こららのデルタ−４不飽和化酵素コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも４つ以上の付加的なヌクレオチド配列と共に使用される。最小限の付加的な４つの配列は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列、又はデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、シグマ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列である。付加配列を、表１に提供される配列から選択することができる。同一の実施形態もまた、配列番号：３５〜３６、及び１０９のヌクレオチド配列を含む、又はそれに対して、少なくとも７５％同一性を有するデルタ−４不飽和化酵素ヌクレオチド配列に関し、また配列番号：７６〜７７に対して少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に関する。
【０１７７】
具体的には、デルタ−４不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号：３５〜３６、及び１０９に記載のヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：３５〜３６、及び１０９に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列と；
（ｃ）配列番号：７６〜７７に対して少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と；
からなる群より選択される。
【０１７８】
本文脈では、「デルタ−４不飽和化酵素」は、ドコサペンタノン酸をドコサヘキサノン酸に変換変換することが可能な酵素に関し、この意味は上記酵素の他の機能性を除外しない。
【０１７９】
一実施形態では、本発明は特定のヌクレオチド配列に関し、該ヌクレオチド配列は、オメガ−３不飽和化酵素をコードする特定のヌクレオチド配列、より具体的にはアミノ酸配列の配列番号：６９〜７３、８８、９０、及び１１２をコードする配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１の使用に関する。一般に、こららのオメガ−３不飽和化酵素コード化ヌクレオチド配列は、少なくとも４つ以上の付加的なヌクレオチド配列と共に使用される。最小限の付加的な４つの配列は、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列、又はデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、シグマ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列である。付加配列を、表１に提供される配列から選択することができる。同一の実施形態もまた、配列番号：１３５〜３６、及び１０９を含む、又はそれに対して、少なくとも７５％同一性を有するオメガ−３不飽和化酵素ヌクレオチド配列に関し、また配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１のヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に関する。
【０１８０】
具体的には、オメガ−３不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列は、
（ａ）配列番号：３０〜３４、８７、及び１１１に記載のヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１に記載のヌクレオチド配列に対して、少なくとも７５％同一性を有するヌクレオチド配列と；
からなる群より選択される。
【０１８１】
本文脈では、「オメガ−３不飽和化酵素」はリノール酸をアルファ−リノレン酸に、ガンマ−リノレン酸をステアリン酸に、エコサジエン酸をエイコサトリエン酸に、ジホモ−ガンマ−リノレン酸をエイコサテトラエン酸に、アラキドン酸をエイコサペンタエン酸に、及びドコサテトラエン酸をドコサペンタエン酸に変換すること、又はこれらの能力のサブセットをおこなうことが可能な酵素に関し、この意味は上記酵素の他の機能性を除外しない。
【０１８２】
一般に定義されるように（例えば、Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ，２０００参照）、「同一性」とは、本明細書では、ヌクレオチド又はアミノ酸レベルでの遺伝子間又はタンパク質間の配列同一性として定義される。したがって、本文脈では、「配列同一性」はアミノ酸レベルでのタンパク質間の同一性の程度及びヌクレオチド・レベルでの核酸間の同一性の程度である。タンパク質配列同一性は、配列が整列している時に各々の配列の所定の位置にあるアミノ酸配列を比較することによって決定される。同様に、核酸配列同一性は、複数の配列を配置する場合に各配列の所定の位置にあるヌクレオチド配列を比較することで判断される。
【０１８３】
２つのアミノ酸配列又は２つの核酸の同一率を決定するために、これらの配列を最適な比較を実施することを目的として並ばせる（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配列との最適な整列がなされるように、第１のアミノ酸又は核酸配列にギャップを導入することができる）。次に、対応するアミノ酸一又はヌクレオチド位置にあるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第２の配列の対応位置と同一のアミノ酸残基又はヌクレオチドによって第１の配列内の１つの位置が占められている場合、これらの分子はその位置で同一である。２つの配列の同一率は、これらの配列によって共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一率（％）＝同一位置数／全位置数（例えば、重複位置）×１００）。一実施形態では、２つの配列が同一の長さを有する。
【０１８４】
手作業で配列を整列させて同一アミノ酸数を数えることも可能である。或いは、同一率を決定するために、数学的アルゴリズムを用いて２つの配列を整列させることができる。２つの配列を比較するために使用し得る数学的アルゴリズムの非限定的な例は、Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：２２６４〜２２６８のアルゴリズムを改良したＫａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５８７７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムをＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０のＮＢｌＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込む。ＢＬＡＳＴヌクレオチド・サーチをＮＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝１００、ワード長＝１２）によって実行し、本発明のタンパク質分子に同一なアミノ酸配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質サーチをＸＢＬＡＳＴプログラム（スコア＝５０、ワード長＝３）によって実行し、本発明のタンパク質分子に同一なアミノ酸配列を得ることができる。比較のためのギャップ化整列を得るために、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−４０２の記載に基づいてギャップ化ＢＬＡＳＴ（Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ）を利用することができる。或いは、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係を検出する反復サーチを実施することができる。ＮＢＬＡＳＴ、ＸＢＬＡＳＴ、及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、各々のプログラムのデフォルト・パラメーターを使用することができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．参照。或いは、配列を整列させた後に配列同一性を、例えばＥＭＢＬデータベース（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｇｏｖ／ｃｇｉ−ｂｉｎ／ＢＬＡＳＴ）にあるＰｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ  ａｎｄ  ＤＪ．Ｌｉｐｍａｎ（Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８，１９９８）のプログラムによって、計算することができる。一般に、例えば「スコアリング・マトリックス」及び「ギャップ・ペナルティ」を整列のために用いることができる。本発明の文脈では、ＢＬＡＳＴＮ及びＰＳＩ  ＢＬＡＳＴのデフォルト設定が有利である。
２つの配列間の同一率の決定は、ギャップを許すかどうかにかかわりなく、上記のものと同様の技術を用いておこなうことができる。同一率の計算中、完全な一致のみがカウントされる。
【０１８５】
異種遺伝子
本発明に記載された技術は、例えば非脂肪酸基質、例えば上記したような糖源又は複合発酵基質糖の非脂肪酸基質からＰＵＦＡを生産する、遺伝的に改変された非植物宿主細胞及び宿主細胞に関する。
【０１８６】
遺伝的に形質転換された細胞は、特に、異種酵素（デルタ−９不飽和化酵素、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素オメガ−３不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、デルタ−４不飽和化酵素、又はこれらのサブセット）の発現によるステアリン酸からＰＵＦＡへの異種酸素要求経路を包含する。
【０１８７】
デルタ−９不飽和化酵素は、ステアリン酸からオレイン酸への反応と同様にパルミチン酸からパルミトレイン酸への反応を触媒する。デルタ−１２不飽和化酵素はオレイン酸からリノール酸への反応（オメガ−６経路を開始する）を触媒して、リノール酸をデルタ−６不飽和化酵素の作用によってガンマーリノレン酸に変換する。デルタ−６伸長酵素によって２つのメチル基によるガンマ−リノレン酸の延長をおこない、デルタ−５不飽和化酵素によってアラキドン酸に脱不飽和化されるジホモ−ガンマ−リノレン酸を形成する。
【０１８８】
或いは、アラキドン酸を、デルタ−９伸長酵素、シグマ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素の作用を経て、リノール酸から作ることができる。リノレン酸をデルタ−９伸長酵素によって延長することでエイコサジエン酸が形成され、これはシグマ−８不飽和化酵素の作用を経てジホモ−ガンマ−リノレン酸に変換され、最終的にアラキドン酸がデルタ−５不飽和化酵素の作用を介してジホモ−ガンマ−リノレン酸から作られる。両方の選択肢に関して、アラキドン酸がデルタ−５伸長酵素によって延長され、 Δ７、Δ１０、Δ１３、Δ１６−ドコサテトラエン酸を形成する。
【０１８９】
オメガ−３不飽和化酵素は、リノレン酸をアルファ・リノレン酸（オメガ−３経路の開始点）に変換する。オメガ−３不飽和化酵素は、多くの場合、非特異性がかなり高く、ガンマ・リノール酸をステアリン酸に、エイコサジエン酸をエイコサトリエン酸に、ジホモ−ガンマ−リノレン酸をエイコサテトラエン酸に、アラキドン酸をＥＰＡに、及びドコサテトラエン酸をとドコサペンタエン酸に変換することができる。オメガ−３経路は、オメガ−６経路と同じ酵素とそれに加えてデルタ−４不飽和化酵素とを使用する。デルタ−６不飽和化酵素はアルファ・リノール酸からステアリン酸への反応を触媒し、ステアリン酸は更にデルタ−６伸長酵素によってエイコサテトラエン酸に変換される。或いは、エイコサテトラエン酸をデルタ−９伸長酵素及びシグマ−８不飽和化酵素の作用を経て、アルファ‐リノレン酸から作ることができる。デルタ−９伸長酵素は、アルファ‐リノレン酸からエイコサトリエン酸への反応を触媒し、シグマ−８不飽和化酵素はエイコサトリエン酸からエイコサテトラエン酸への反応に触媒する。デルタ−５不飽和化酵素によるエイコサテトラエン酸への脱不飽和はＥＰＡをもたらす。ＥＰＡは、デルタ−５伸長酵素によってドコサペンタエン酸に変換され、更にそれ自体がデルタ−４不飽和化酵素によって脱不飽和化されてＤＨＡを形成する。
【０１９０】
異種遺伝子は、任意の生物、例えば真菌類、植物、動物、藻類、及び海洋原生生物、アメーバ、並びに細菌から単離することができる。生物は、オレイン酸、リノール酸、アルファ・リノール酸、ガンマ・リノール酸、ジホモ−ガンマ−リノール酸、アラキドン酸、ステアリン酸、エイコサテトラエン酸、ＥＰＡ、７，１０，１３，１６，１９−ドコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、又はＤＨＡに至る経路を有する。
【０１９１】
１つ又はそれ以上の二重結合を有する脂肪酸に至るそのような経路を持つ生物を大まかに挙げるならば、細菌、限定されるものではないが、例えばスピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）ｓｐｐ．、シネコシスチス（Ｓｙｎｅｃｈｏｓｙｓｔｉｓ）等、真菌類、例えばモルチエラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、ムコール・ロウキシ（Ｍｕｃｏｒ  ｒｏｕｘｉｉ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス・フミガーツフ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）等、植物、例えばペトロセリヌム・クリスプム（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、グリシネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、ゼア・マイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、リシナス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、コリラス・アベラナ（Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ）、ファエオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）等、及びその他、動物、例えばカエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、マス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、ラタス・ノルベジカス（Ｐａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）、レピドプテラ（Ｌｅｐｉｄｏｐｔｅｒａ）等、藻類、例えばチゾチトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、スラウストチサム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｈｕｍ）ｓｐ．、ファエオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）等、及びアメーバ、例えばジクチオステリウム・ジスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）が挙げられる。
【０１９２】
デルタ−１２不飽和化酵素の発現は、広範囲にわたる異なる生物で報告された。これらの生物として、限定されるものではないが、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、ムコール・ロウキシ（Ｍｕｃｏｒ  ｒｏｕｘｉｉ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、アスペルギルス・フミガーツフ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ヘリアンタス・アヌアス（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ  ａｎｎｕｕｓ）、ペントロセリナム・クリスパム（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、ブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、グリシネ・マクス（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、ゼア・マイス（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、リシヌス・コムニス（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、コリルス・アベラナ（Ｃｏｒｙｌｕｓ  ａｖｅｌｌａｎａ）、ファエオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、Ｃ・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、カレンデュラ・オフィシナリス（Ｃａｌｅｎｄｕｌａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、及び綿が挙げられる。しかし、これらの例に限定されるものではない（ＷＯ９４１１５１６、ＵＳ６０２５１７２、ＵＳ２００３／０１８０８０２、ＵＳ２００３／０１７２３９８、ＵＳ２００３／００７４６９４、ＵＳ２００３／０６６１０４、ＵＳ６，３７２，９６５、ＵＳ６，４４１，２７８、ＷＯ２００１８５９６８−Ａ２、ＷＯ２００１７９４９９−Ａ１、ＵＳ６３７２９６５−Ｂ１、ＷＯ２００１１４５３８−Ａ１）。
【０１９３】
デルタ−６不飽和化酵素を以下の生物で見いだすことができる。すなわち、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）, ムコール・ロウキシ（Ｍｕｃｏｒ  ｒｏｕｘｉｉ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、ピチウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、ボラゴ・オフィシナリス（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、セラトドン・プルプレウス（Ｃｅｒａｔｏｄｏｎ  ｐｕｒｐｕｒｅｕｓ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）、アネモネ・レベイレイ（Ａｎｅｍｏｎｅ  ｌｅｖｅｉｌｌｅｉ）、ファエオダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、テトラヒメナ（Ｔｅｔｒａｈｙｍｅｎａ）、カエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、プリムラセアエ（Ｐｒｉｍｕｌａｃｅａｅ）、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、カストル（Ｃａｓｔｏｒ）、イブニング・プリムロセ（ｅｖｅｎｉｎｇ  ｐｒｉｍｒｏｓｅ）、ラン藻（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、スピルリナ（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ）ｓｐｐ．、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）  （ＷＯ９９２７１１１、ＵＳ２００２／０１７００９０、ＷＯ０３／０７２７８４、ＵＳ６，４９２，１０８、ＵＳ６，６８６，１８６、ＵＳ２００２／０１５１０１９、ＵＳ２００２／０１０８１４７、ＷＯ０２／０８１７０２、ＷＯ２００２７２０２８−Ａ２、ＵＳ６３５５８６１−Ｂ１、ＷＯ２００１４４４８５−Ａ、ＪＰ２００１０９５５８８−Ａ、ＷＯ２００１２０００１−Ａ、ＷＯ２００１０２５９１−Ａ、ＷＯ２００１０４６３６−Ａ、ＪＰ２００１０９５５８８−Ａ、ＷＯ２００１７５０６９−Ａ１）。デルタ−６伸長酵素は、とりわけ、以下の生物で同定されている。すなわち、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）、カエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  Ａｌｐｉｎａ）、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、Ｃ・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）、マス・ムスクルス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、Ｔ．アウレウム（Ｔ．ａｕｒｅｕｍ）、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）、スラウストチトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）、フィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）（ＵＳ６４０３３４９、ＷＯ０３／１０２１３８、ＵＳ２００３／０１７７５０８、ＷＯ２００２４４３２０−Ａ、ＷＯ２００２０８４０１−Ａ、ＷＯ２００１５９１２８−Ａ、ＤＥ１０００５９７３−Ａ１、ＷＯ２０００５５３３０−Ａ、ＷＯ２００３０６４６３８−Ａ２）。
【０１９４】
デルタ−９伸長酵素はイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）から単離されており（ＷＯ０２０７７２１３，Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ．２００４）、またデルタ−８不飽和化酵素はユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）から単離されている（Ｗａｌｌｉｓ  ａｎｄ  Ｂｒｏｗｓｅ  １９９９）。デルタ−５不飽和化酵素は、とりわけ、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）、フェナエダクチラム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、スラウストチトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ｓｐ．ＡＴＣＣ  ２１６５、カエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、ジクチオステリウム・ジスコイデウム（Ｄｉｃｔｙｏｓｔｅｌｉｕｍ  ｄｉｓｃｏｉｄｅｕｍ）、スチゾチトリウム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）、スラウストシトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）、サプロレグニア・ジクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）、フィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、ラット、ユーグレナ（Ｅｕｇｌｅｎａ）から単離されている（ＵＳ５９７２６６４、ＷＯ９９３３９５８、ＷＯ９８４６７６５、ＷＯ０２／０８１６６８、ＷＯ２００３０１２０９２−Ａ、ＵＳ６４２８９９０−Ｂ１、ＵＳ６４３２６８４−Ｂ１、ＷＯ２００２３４９４０−Ａ、ＷＯ２０００４０７０５−Ａ、ＷＯ２０００３４４３９−Ａ、ＷＯ２００１０４６３６−Ａ、ＷＯ２００３０１２０９２−Ａ）。
【０１９５】
オメガ−３不飽和化酵素は、植物、菌類、及び線虫類、例えばペトロセリヌム・クリスプム（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、プラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、グリシネ・ソヤ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｏｙａ）、サプロレグニア・ジクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）、カエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）（すなわち、ＵＳ６１９４１６７、ＵＳ２００３０１９６２１７、Ｙａｄａｖ  ｅｔ  ａｌ．１９９３、Ｋｉｒｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）から単離され、或いはサッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）から単離することができる。
【０１９６】
とりわけ、デルタ−５伸長酵素は、マウス、ホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、カエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、スラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）に見いだされた（すなわちＵＳ２００３／０１７７５０８及びＷＯ２００２０８４０１−Ａ）。また、デルタ−４−不飽和化酵素は、真菌類、藻類、及び海洋原生動物ツラウストチリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ｓｐ．、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、ツラウストチリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）、サプロレグニア・ジクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉｎａ）、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）、その他の真菌類、藻類、及び海洋原生生物から単離することが可能であるが、これらの生物に限定されるものではない（すなわち、ＷＯ０２／０９０４９３、ＷＯ２００２２６９４６−Ａ、Ｑｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。
【０１９７】
一実施形態では、本発明は、ＰＵＦＡの生産、より詳しくは非脂肪酸基質からのアラキドン酸の生産に至る微生物でのデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５伸長酵素の同時異種発現を説明する。これらの遺伝子は、単一のプラスミド又は複数のプラスミド（例えば２つのプラスミド、３つのプラスミド、４つのプラスミド、５つのプラスミド、６つのプラスミド、７つのプラスミド、８つのプラスミド、９つのプラスミド、又は１０個のプラスミド、又はそれ以上）上で発現し得る。いくつかの異種遺伝子、例えば４つの遺伝子を担持する単一のプラスミドの使用は、有利である。なぜなら、それによってプラスミドを担持する細胞が全ての異種遺伝子を含むことが確実になる。対照的に、いくつかのプラスミドを用いる場合、細胞集団の一部は、複数のプラスミドのうちの一種類しか含まず、異質経路を発現することはない。しかし、単一のプラスミドから発現し得る異種遺伝子の数は、プラスミドの大きさが増すことで制限される。大きなプラスミドは、小さなプラスミドよりも細胞内での安定性が低下する傾向にあり、大きなプラスミドからの発現がより低くなる。したがって、現在好ましい実施形態は、１つのプラスミドあたり１乃至２つの異種遺伝子の発現を伴う。
【０１９８】
更にまた、非脂質酸基質からのＥＰＡ及び他のＰＵＦＡの生産をもたらす微生物でのデルタ−１２不飽和化酵素、オメガ−３不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする遺伝子の同時異種発現について説明している。
【０１９９】
本発明は、非脂肪酸基質からのＤＨＡの生産をもたらす微生物でのデルタ−１２不飽和化酵素、オメガ−３不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和酵素、デルタ−５伸長酵素、及びデルタ−４不飽和化酵素をコードしている遺伝子の同時異種発現を説明する。
【０２００】
本発明は、デルタ−９不飽和化酵素のさらなる発現について説明する。微生物のＰＵＦＡの生産を、パルミトレイン酸よりもオレイン酸の生産に対してよりいっそう特異的であるデルタ−９不飽和化酵素の発現によって改善することができる（図２）。近年では、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）から２種類のデルタ−９不飽和化酵素（ｏｌｅ１及びｏｌｅ２）がクローニングされている。両遺伝子とも、１６：１及び１８：１脂肪酸含有培地の供給なしに増殖することができない酵母Δｏｌｅ１突然変異体を補完する。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）のデルタ−９不飽和化酵素は両方とも、酵母内で脂肪酸含有量を１６：１不飽和化脂肪酸から１８：１不飽和化脂肪酸（オレイン酸）へシフトさせる。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を発現するΔｏｌｅ１酵母のオレイン酸含有量は、野生型Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での２１．６％と比較して、全脂質の５３．６％であった（Ｗｏｎｇｗａｔｈａｎａｒａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９）。本発明は、異種ＰＵＦＡ生合成経路とともに異種デルタ−９不飽和化酵素の発現は酵母でのＰＵＦＡの生産を高めることを示している。例えば、酵母のモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）デルタ−１２不飽和化酵素とともにモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅｌの発現は、リノール酸の生産を増加させる（例えば、５倍又はその倍数）。
【０２０１】
ヌクレオチド配列及びコンストラクト
「遺伝子」が意味することは、ヌクレオチド配列、及びＤＮＡ又はＲＮＡ配列のこともいい、これらは特定のタンパク質をコードする。上記ＰＵＦＡ不飽和化酵素及び伸長酵素をコードするヌクレオチド配列を、当該技術分野で公知の標準的技術を用いて、天然の源から単離することができる。そのような方法の１つは、全ＲＮＡの単離、オリゴ（ｄＴ）又はランダム・プライマーを用いた逆転写、それに続く配列特異的プライマーを用いたＰＣＲ増幅を含む。新規のＰＵＲＡ不飽和化酵素コード化ヌクレオチド配列及び伸長酵素コード化ヌクレオチド配列も同様に既知の方法によって単離することができる。優先的に、これらは配列同一性に基づいており、例えば、縮重プライマーを用いたＰＣＲと放射性同位元素標識ポリヌクレオチド・プローブを用いたコロニー・ハイブリダイゼーションによるＤＮＡ又はｃＤＮＡのスクリーニングを含む。或いは、単離法はポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドの機能に基づく。例えば、ｃＤＮＡ発現ライブラリーをＰＵＦＡ産生生物から生成し、ＰＵＦＡ基質の不飽和化又は伸長についてスクリーニングする。
【０２０２】
ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）は、大量の特異的ＤＮＡ塩基配列を合成する技術であり、温度寛容性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡテンプレートの生体外複製の繰り返しサイクルに基づく（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５１：２６３−２７３（１９８６）；欧州特許出願５０４２４；欧州特許出願８４７９６；欧州特許出願２５８０１７；欧州特許出願２３７３６２；欧州特許出願２０１１８４；ＵＳ４６８３２０２；ＵＳ４５８２７８８；ＵＳ４６８３１９４）。この技術は、特異的生体外オリゴヌクレオチド（名前が付けられたプライマー）のセットを利用するもので、該プライマーはテンプレートＤＮＡ上で相補的配列とアニーリングし、ＤＮＡポリメラーゼによってＤＮＡ合成をプライムする。増幅は、高温での二重鎖の融解、プライマーのアニーリング、及びＤＮＡ複製からなるサイクルを数回（通常２０〜５０回）適用することによって、達成される。既知の配列を増幅するために、通常、正確にテンプレート配列にマッチするようにしてプライマーが設計される。しかし、所望の特徴、例えば特異的制限部位をプライマーの設計を介して結果として生ずるＤＮＡフラグメントに導入される。更に、特異的な５’末端配列はプライマー配列に含まれ、後で、マッチングする３’末端配列を含むＤＮＡフラグメントに対するＰＣＲ産物の融合を可能にする。
【０２０３】
縮重プライマーを使用するＰＣＲを用いて、既知のＤＮＡ塩基配列に対して配列同一性を持つ新規ＤＮＡ塩基配列を増幅することができる。次に、プライマーの設計を、既知の配列の多数のアラインメントから推論されるように、同一性の高いＤＮＡ領域にマッチするようにしておこなう。プライマーは特定の位置に異なる塩基を含むことが可能であることから、ＰＣＲ反応に用いたプライマーは、実際のところ、オリゴヌクレオチドと異なる配列との混合物である。混合物中のオリゴヌクレオチドの一部分を標的配列にアニーリングすることで、テンプレートの増幅が可能となる。
【０２０４】
ＰＵＦＡをコードする核酸を操作するための技術、例えば、ポリペプチドをコードする核酸配列の発現ベクターへのサブクローニング、プローブの標識、ＤＮＡハイブリダイゼーション等は、一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  ｅｄ．），ＶｏＩｓ．１−３，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９）に記載されている。
【０２０５】
所望の遺伝子を単離した後に、既知の方法を用いてその配列を決定することができる。
【０２０６】
ひとたび所望のヌクレオチド配列が単離されると、それを宿主細胞で発現させることができる。宿主細胞で異種核酸を発現させることを目的として、標準的クローニング技術又は標準的生体外方法（例えばＰＣＲによる融合）を用いて、異種核酸とプロモーター及びターミネーター配列とを作用可能に結合させる。
【０２０７】
用語「プロモーター」とは、遺伝子の発現を制御することができるＤＮＡ配列のことをいう。プロモーター配列は、遺伝子の上流に位置した近位の要素及びそれよりも遠位にある要素からなる。より遠位にある要素は、しばしばエンハンサーと呼ばれる。プロモーター配列はまた、ＤＮＡ配列の転写された部位、及び／又は転写配列の下流に位置することができる。３’非コーディング配列とも呼ばれる「ターミネーター配列」は、遺伝子の下流に位置したＤＮＡ配列のことをいい、ポリアデニル化認識部位とｍＲＮＡプロセッシング又は遺伝子発現に影響を及ぼすことができる調節シグナルをコードする他の配列とを含む。異種発現に用いられるプロモーター及びターミネーター配列を異種遺伝子の天然配列から得ることができる。より頻繁に、宿主細胞の高発現ＤＮＡ配列からプロモーター及びターミネーター配列を得ることができる。例えば、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に適したプロモーター配列として、ＴＤＨ３、ＡＤＨ１、ＴＰＩ１、ＡＣＴ１、ＧＰＤ、及びＰＧＩの構成プロモーター又は構成的かつ高度に転写された酵母遺伝子の任意のプロモーターと、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、及びＧＡＬ７のガラクトース誘導プロモーターとが挙げられる。本発明は、他の酵母誘導プロモーター、例えば、銅等の重金属存在下での遺伝子発現を可能にするＣＵＰ１メタロチオネイン・プロモーター（Ｋａｒｉｎ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ，（１９８４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８１（２）：３３７−４１）についても検討する。遺伝子の抑制が要求される場合にＭＥＴ１５プロモーターを使用することもできる。適当な細菌プロモータ配列は、例えば、Ｙａｎｏｆｓｋｙ（１９８４）Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５８：１０１８−１０２４に記載される大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）トリプトファン生合成経路プロモーター及びオペレーター領域並びにＨｅｒｓｋｏｗｉｔｚ  ａｎｄ  Ｈａｇｅｎ，（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖｅ．Ｇｅｎｅｔ．，１４：３９９−４４５に記載されるλファージ（Ｐλ）のプロモーターである。多くの数のターミネーター配列が知られており、同一又は異なる属及び種に由来する種々の宿主で満足のいくものであることがわかっている。以後、プロモーター及びターミネーター配列に作用可能に結合した異種ポリヌクレオチドを発現カセットと呼ぶ。
【０２０８】
用語、作用可能に結合は、単一の核酸フラグメント上での１つの遺伝子とそれを制御する配列との結合のことをいう。例えば、プロモーターは、コード配列の発現を制御することが可能である場合に、そのコード配列に作用自在に結合する。
【０２０９】
目的とする異種遺伝子を含むコンストラクトを標準的な方法によって宿主に導入することができる。このような方法として、形質転換、例えばＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での形質転換、酢酸リチウム形質転換、スフェロプラスト化、及びＫａｒ１Δ１５突然変異体の使用（Ｇｅｏｒｇｉｅｖａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ，（２００２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３５０：２７８−８９）、プロトプラスト融合、リポフェクチン、トランスフェクチン、形質導入、接合、感染、ボリスティック・インパクト、エレクトロポレーション、又は外来ＤＮＡを宿主細胞に導入する任意の他の方法が挙げられる。簡略化のために、このような方法で操作された宿主細胞を「形質転換された」、「組み換え体」、又は「遺伝学的に改変された」という。宿主細胞に導入されるコンストラクトは、発現カセットに加えて、マーカー遺伝子を含み、該マーカー遺伝子は形質転換細胞の同定を可能とし、また染色体外発現の場合では、細胞からコンストラクトが喪失するのを防ぐ。好ましくは、マーカー遺伝子は、条件必須遺伝子をコードするもので、これは宿主細胞から欠失されている。後者の例は、酵母では、ＵＲＡ３遺伝子、ＴＲＰ１遺伝子、ＨＩＳ３遺伝子、及びＬＥＵ３遺伝子であり、これらは必須化合物であるウラシル、トリプトファン、ヒスチジン、及びロイシンを生産するためのｕｒａ３、ｔｒｐｌ、ｈｌｓ３、又はＩｅｕ２突然変異酵母細胞の能力を回復する。したがって、これらの要素が欠けた培地上で、組み換え酵母細胞の選択及び維持をおこなうことができる。或いは、標識遺伝子は抗生物質に対して耐性を付与することができ、抗生物質を含んでいる培地での組み換え細胞の選択及び維持を可能にする。
【０２１０】
表１．異種ＰＵＦＡ生成に有用な不飽和化酵素及び伸長酵素の例
2008501323.tif 000002
2008501323.tif 000003
【０２１１】
本発明の1つの実施形態において、ＰＵＦＡ生産のために必要な遺伝子は、宿主生物のゲノムに組み込まれる。同一組み換えによるサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムへの異種ポリヌクレオチド配列の組込みは、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を遺伝子操作する周知の標準的方法である。直鎖状ＤＮＡコンストラクトを、５’末端及び３’末端で標的配列に融合させることによって、酵母ゲノム内の任意の位置での組込みのための標的にすることができる。直鎖状ＤＮＡコンストラクトによる形質転換に応じて、酵母のＤＮＡ−二重鎖切断修復経路は、活性化され、そのことが直鎖状ＤＮＡ基質の標的配列と酵母ゲノムの対応配列との間での同一組み換えを媒介する。
【０２１２】
このことは、ゲノムへの直鎖状ＤＮＡコンストラクトの組込みと、酵母ゲノムの２つの標的配列間の任意の配列の同時ルーピングとをもたらす。遺伝子操作の目的によって、標的配列を酵母遺伝子の各々の側で選択することができ、その結果、その遺伝子のノックアウト、或いは互いの隣接をもたらし、標的配列の混乱を招くか、或いはゲノムが不完全になる。
【０２１３】
本発明は、ＰＵＦＡ不飽和化酵素と伸長酵素とをコードするいくつかの異種遺伝子の組込みを伴う。好ましくは、特異的ＰＵＦＡ生産に必要なすべての発現カセットを一つのプラスミド上に集め、また該プラスミドは組込みのための標識遺伝子及び標的配列を含む。標的配列は、プラスミドの直線化を可能にする固有の制限部位を含むように改変されるか、或いはもともと含む。
【０２１４】
線状化プラスミドによる酵母の形質転換後、明細書中に述べられるように、酵母菌を選択培地上にプレーティングし、異種ＤＮＡコンストラクトを含組み換え細胞を同定する。
【０２１５】
好ましくは、特異的ＰＵＦＡの生産に必要なすべての発現カセットを、一つのコンストラクト上で組み立て、同時に酵母菌のゲノムに組み込む。しかし、多くの異種遺伝子の発現が望まれる場合、個々の遺伝子を、上記したように宿主ゲノムの異なる部位に組込みこむために標的化されたいくつかの、例えば２つの異なるコンストラクトに配置することは有益であると考えられる。組み換え細胞を同定した後、２つの別々の染色体組込みを、組換株の交配によって組み合わせることができる。選択的に、適当な遺伝マーカーを導入するために、個々の組換株を中間交配を介して最初に取る。
【０２１６】
株の交配は、従来から広く用いられており、異なる遺伝子型を組み合わせる上で非常に効率的な方法である。要するに、逆の接合型（すなわち、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に関しては、交配型はＭＡＴａ及びＭＡＴアルファとして示される）を用いて、ＹＰＤ等の富栄養培地上で交配させる。通常、一倍体の株は、各々異なる選択可能な表現型（例えばアミノ酸栄養素要求性）を示し、二倍体が二重ドロップ・アウト培地で選択されるのを可能にする。或いは、交配後に細胞を栄養培地に播種し、二媒体を同定する。二倍体の同定は、細胞を減数分裂させ、いくつかの単一コロニーを芽胞形成培地に単に移すことによって、芽胞形成させる。芽胞形成培地は、例えば、唯一の炭素源として酢酸カリウムを含む培地であり、芽胞形成は顕微鏡によってモニターする。二倍体の芽胞形成後に胞子を切開し、結果として生じる一倍体株の遺伝子型を、種々の方法（例えば適当なドロップアウト・プレートに対するレプリカ平板法及びコロニーＰＣＲによる）を使用して記録する。異なる遺伝子型を組み合わせるための株の交配 は、核合体（例えばｋａｒ１Δｌ５変異体）（Ｇｅｏｒｇｉｅｖａ，Ｂ．ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．３５０：２７８−８９）が不完全である 変異体を使用することにより、有利に達成することも可能である。
【０２１７】
好ましくは、異なるプロモーターを、異種コンストラクトのいくつかの発現カセットを構築する際に使用することで、さらなる同一組み換え現象を回避するとともに、異種コンストラクトの一部分がループ・アウトするのを回避する。或いは、プロモーター配列を同じ異種コンストラクト上の２つのコピー（しかし異なる方向）に配置することで、重複配列を回避する。
【０２１８】
異種発現を改善するための周知の方法として、異種ヌクレオチド配列のコドン最適化が挙げられる。これは、目的とする宿主の高発現タンパク質で最も頻度の高いコドンから決定されるように、宿主優先コドン（ｈｏｓｔ−ｐｒｅｆｅｒｒｅｄ  ｃｏｄｏｎ）を用いておこなわれる。ＰＵＦＡ不飽和化酵素活性又は伸長酵素活性があるポリペプチドのコード配列を、文献に詳しく記載された方法で、全体的又は部分的に化学合成することができる。更に、翻訳開始コドンＡＴＧを囲んでいるヌクレオチド配列が酵母での遺伝子発現に影響するという知見が得られている。所望のポリペプチドが酵母で十分に発現されない場合、異種遺伝子のヌクレオチド配列を改変して、効率的な酵母翻訳開始配列を含むようにして最適遺伝子発現を得る。このことは、ＰＣＲに基づく部位特異的突然変異誘発による標準的方法によって又は高度に発現された酵母遺伝子の開始配列に対する融合によって達成される。
【０２１９】
ＰＵＦＡ含有パン酵母の生産
ＰＵＦＡ（例えばアラキドン酸又はＤＨＡ）への異種経路を有する組み換え酵母株を、ＰＵＦＡ含有バイオマスを大量に生産するために、実施例１０に記載したように、回分培養、回分培養、又はケモスタット培養で増殖することができる。バイオマスの回収（例えば、遠心又は濾過、及び適当な度合いまでバイオマスを可能な限り乾燥）した後、それを機能性食品成分として、例えばパン酵母、イースト抽出物、又は、化学調味料として、使用することができる。ＰＵＦＡ含有バイオマスを、機能性食品として、例えば魚油カプセルに代わるものとしての錠剤として、直接使用することもできる。
【０２２０】
このように、本発明も食品、例えば機能性食品に関し、該食品は、本発明による異種発現のための改変ではない細胞によって生産される産物と比較して、多価不飽和脂肪酸の含有量が増加している。
【０２２１】
組み換え酵母での改善ＰＵＦＡ収率に対する戦略
組み換え酵母のＰＵＦＡ収率を、いくつかの戦略で改善することできる。そのいくつかは全脂肪酸に占めるＰＵＦＡ率を高めることであり、また他のものは脂肪酸の生産を高めるために宿主の代謝改変をおこなうことを含む。
【０２２２】
全脂肪酸中のＰＵＦＡ率を増加させること
全脂肪酸中のＰＵＦＡ率を高めるために使用し得る１つの戦略は、パルミチン酸よりはむしろステアリン酸に対する基質特異性を有するデルタ−９不飽和化酵素の異種発現を伴う。そのようなデルタ−９不飽和化酵素の発現は、脂肪酸組成のオレイン酸（ＰＵＦＡ経路の前駆体）の濃度を高め、ＰＵＦＡ生産を高める（実施例９及び１２）。酵母のオレイン酸含有量を増加させることができるもう一つの戦略は、遺伝子ＥＬＯ１、ＥＬＯ２及び／又はＥＬＯ３の過剰発現を伴い、これらの遺伝子は脂肪酸伸長酵素をコードする。これらの遺伝子の過剰発現によって、炭素原子１６個有する脂肪酸の濃度に対して炭素原子１８個有する脂肪酸の濃縮を増加させることが可能である。或いは、パルミチン酸又はパルミトレイン酸の基質特異性を有する異種伸長酵素は、炭素原子数が１８個の脂肪酸の利用可能性を高める。
【０２２３】
更に、ＰＵＦＡ経路の酵素をコードしている異種遺伝子の発現効率を、異種遺伝子のコドンを最適化することによって高めることができる。異種遺伝子は、宿主細胞では希なコドンを含むと思われ、対応のｔＲＮＡの可用性は、問題の遺伝子の発現を制限している可能性がある。特定の遺伝子のコドンを最適化するために、宿主の最適コドン頻度を用いて対応のアミノ酸配列を逆翻訳する。このことは、バックトランスレーション・ツール（Ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ）Ｖ２．０プログラムを用いて実施することができる。コドン最適化遺伝子のコード鎖及び非コード鎖を、オリゴヌクレオチドが重複している形態で化学合成することができる。合成遺伝子を組み立てるために、重複オリゴヌクレオチドを互いにハイブリダイズさせ、完全二重鎖ヌクレオチド配列を再構築し、次にそれをＰＣＲで増幅することができる。
【０２２４】
脂肪酸生産を高めるための代謝改変
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、脂肪酸合成を脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）複合体（図３）でおこなう。この複合体は、２つの機能性サブユニット（α及びβ）のヘテロ多量体複合体からなる。それぞれが酵母遺伝子ＦＡＳ２及びＦＡＳ１によってコードされるアルファ及びβサブユニットの過剰発現は、実質的に、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の脂肪酸含有量を高めることができ、それによって細胞乾燥重量でのＰＵＦＡ収量が高まる。
【０２２５】
アセチルＣｏＡカルボキシラーゼは、アセチルＣｏＡからマロニルＣｏＡへの反応を触媒し、またＡＣＣｌ遺伝子産物によってコードされる。ＡＣＣｌの過剰発現は、マロニルＣｏＡプールを増加させ、それによってより効率的な脂肪酸合成が得られる。従って、ＡＣＣｌ過剰発現変異体の脂質及びＰＵＦＡの収率が上昇する（実施例３９）。
【０２２６】
代謝改変のための他の標的は、貯蔵脂質トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）の合成に関係する遺伝子を含む。酵母において、ＴＡＧ合成は、４つの遺伝子ＤＧＡ１、ＬＲＯ１、ＡＲＥ１、及びＡＲＥ２によってコードされる酵素の作用で達成される（Ｓａｎｄａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：６４７８−６４８２）。これらの遺伝子の過剰発現は、従って、ＴＡＧの含有量を増加させることができ、それによって酵母の脂肪酸全含有量を高める。特に、アシルＣｏＡ：ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼをコードするＤＧＡ１の過剰発現は、ＴＡＧ含有量を増加させ、この遺伝子単独の欠失がＴＡＧ含有量を約６０％現象させ、脂肪酸の総含有量を約４０％減少させる（Ｓａｎｄａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７７：６４７８−６４８２）  及び実施例２９。
【０２２７】
更に、ＴＡＧ及び総脂質の細胞内含有量を、ＴＡＧ合成のために必要とされる前駆体の有用性を高めることによって、増加させることができる。例えば、主なＴＡＧ前駆体であるＬ−グリセロール−３−リン酸塩の細胞内濃度の増加は、グリセロール３‐燐酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＰＤ１を過剰発現させ、グリセロール３−ホスファターゼのアイソザイムをコードするＧＰＤ２又はＧＰＰ１及びＧＰＰ２を欠失させることで、酵母において２０倍を越える（Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４  Ｍｅｔ  Ｅｎｇ  ６：１５５−１６３）。潜在的に、同一戦略を用いることで、ＧＰＰ１及びＧＰＰ２の欠失とともに、ＧＰＤ２又はＧＰＤ１及びＧＰＤ２を過剰発現させることができる。
【０２２８】
より多くのＴＡＧを生じるために、ホスファチジン酸生産に関係する遺伝子等、他の標的遺伝子を過剰発現させることができる。ここでは、リゾホスファチジン酸及びホスファチジン酸の合成を、Ｌ−グリセロール３−リン酸アシルトランスフェラーゼ及び１−アシルグリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼをコードしているＧＡＴ１及びＳＬＣ１の過剰発現によって、それぞれ増加させることができる。ホスファチジン酸プールが増加することで、より多くの前駆体がＴＡＧレベルの増加に利用される（実施例３０）。他の標的遺伝子として、ＳＰＯ１４（ホスファチジン酸及びコリンに対するホスファチジルコリンの反応を触媒するホスホリパーゼＤ）を含む（Ｘｉｅ，ｅｔ  ａｌ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（２１）：１２３４６−５１）。
【０２２９】
脂肪酸合成の主前駆体の主前駆体であるアセチルＣｏＡの有用性は、異種ＡＴＰ：クエン酸リアーゼを発現させることによって高まる。ＡＴＰ：クエン酸リアーゼは、通常、サッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような非油性酵母ででなく大部分の油性生物に存在し、クエン酸塩をアセチルＣｏＡとオキザロ酢酸とに変換する触媒作用を有する（図５）。更に、ＡＭＰ制御イソクエン酸デヒドロゲナーゼの異種発現は、  窒素限定の条件の間、クエン酸塩の蓄積をもたらす可能性がある（Ｒａｔｌｅｄｇｅ  ２００２  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ  ３０：１０４７−１０５０）。したがって、ＡＴＰ：クエン酸リアーゼ及びイソクエン酸デヒドロゲナーゼ（その活性はＡＭＰの存在による恩恵を受ける）をコードする異種遺伝子の組み合わせ発現が、宿主細胞でのアセチルＣｏＡの有用性を高め、かつ宿主細胞での脂肪酸生産を高める。
【０２３０】
大腸菌（エシュリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ））でのパントテン酸塩キナーゼの過剰発現がより高いＣｏＡレベルを引き起こすことが示された。それ故、ＹＤＲ５３１Ｗによってコードされるサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の推定上のパントテン酸塩キナーゼの過剰発現は、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でのＣｏＡプールの増加を可能にして、アセチルＣｏＡの生産を増加させると考えられる。
【０２３１】
ＦＡＳ複合体による脂肪酸合成はコファクターとしてＮＡＤＰＨを必要とし、脂肪酸生産は従って、結果としてＮＡＤＰＨの有用性が脂肪酸生産率を制御するように細胞の酸化還元を不均衡にすると思われる。この問題を解決するために、いくつかの戦略は使用されることができ、該戦略として、異種非リン酸化ＮＡＤＰ＋依存グリセルアルデヒド３‐燐酸デヒドロゲナーゼの発現（Ｂｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５検討中）とアンモニウム同化経路の改変（Ｎｉｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２  Ｍｅｔ  Ｅｎｇ２：６９−７７）とが挙げられる。ＦＡＳ１及びＦＡＳ２の過剰発現を、ＧＤＨ１の欠失と、ＮＡＤＨに依存するグルタミン酸デヒドロゲナーゼをコードするＧＤＨ２或いはアンモニア同化のＧＳ−ＧＯＧＡＴ経路を構成する酵素をコードするＧＬＴ１及びＧＬＮ１のいずれかと、組み合わせることができる（図６）。
【０２３２】
脂肪酸収率を、更に、酵母ＰＯＸ１において脂肪酸分解の構造遺伝子を欠失することによって、上昇させることができる（図７）。そのような欠失は、例えば、パルミトレイン酸の代わりにオレイン酸を合成することにより特異的である異種ステアリル−ＣｏＡ不飽和化酵素の過剰発現又は組込みと組み合わせることができ、したがってＰＵＦＡの合成が好まれる（図３）。このことは、ＰＵＦＡ及び／又は脂質の生産を更に高めるために、ＡＣＣ１の過剰発現と、更に組み合わせることができる。
【０２３３】
ＰＵＦＡ生産又は収率を改善するというもう一つの可能性は、伸長ＰＵＦＡを強化することである。例えば、ＡＲＡに対する経路のデルタ−６伸長酵素は、１８：３がマロニルＣｏＡユニットに融合する縮合反応を行う。しかし、２０：３までの１８：３の完全な伸長は、更にケト基減少、脱水、及びエノイル減少を伴う（図８）。酵母のデルタ−６伸長酵素の異種発現が結果として１８：３の伸長になるので、３つの後者の反応は内因性の酵母酵素によって触媒されなければならない。野生型酵母のこれらの酵素の機能は、超長鎖脂肪酸の形成及び外因性短鎖脂肪酸の伸長である。β−ケトアシル−ＣｏＡレダクターゼは、遺伝子ＹＢＲ１５９Ｗによってコードされる。β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡデヒドラーゼをコードしている遺伝子は、酵母で同定されなかった。脂肪酸伸長（エノイル減少）の最終的なステップは、ＴＳＣ１３遺伝子によってコードされる酵素によって触媒される。したがって、伸長効率を上昇させるために、ＹＢＲ１５９Ｗ及びＴＳＣ１３は過剰発現することができる。
【０２３４】
脂質収率及び／又はＰＵＦＡ含有量を、上記した異なる代謝改変戦略を組み合わせることによって、更に改善することもできる。このことは、例えば実施例２８、３５、及び３６に記載したように、異なる遺伝子組み換えを担持している株の交配によってなされる。
【０２３５】
上記天然酵母遺伝子の過剰発現は、本発明のＭ．アルピン（Ｍ．ａｌｐｉｎｅ）ｏｌｅ１の組み込みのために本発明で使用される戦略と類似のアプローチを用いて、天然プロモーターを強い構成プロモーター、例えばＴＤＨ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＡＣＴ１プロモーター、ＴＰＩプロモーター、又はＧＰＤプロモーターに置き換えることによって、達成されることができる（実施例７）。同様に、実施例７で述べられるように、ゲノムに組み込むことで異種遺伝子を発現させることができる。或いは、実施例２〜５に記載されているように、天然及び異種遺伝子を、プラスミド（例えば酵母エピソーム・プラスミド２μ及びＣＥＮプラスミド又は酵母組み込みプラスミド（すなわち、ＹｉＰ系）から発現させることができる。酵母遺伝子の欠失は、実施例７で述べられるものと類似のアプローチによって成し遂げられることができる。本実施例で述べられる異なる遺伝子の変更の組み合わせを、組換株の交配によって、又はベクターからの発現と染色体改変とを組み合わせることによって、おこなうことができ、それによってＰＵＦＡの生産のための効果的な改変宿主を得ることができる。
【０２３６】
当業者は、パン酵母が脂肪酸含有量が低い（約１０％の細胞乾燥重量）ので、パン酵母の異種ＰＵＦＡ経路の単純発現が結果としてアラキドン酸の低い含有量になり得ることを認める。更に、パン酵母の脂肪酸は主に炭素原子１６個有する脂肪酸からな、最も支配的な単不飽和脂肪酸はパルミトレイン酸であり、該パルミトレイン酸をアラキドン酸の合成のための前駆体として用いることはできない。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるアラキドン酸への経路の酵素をコードする４つの遺伝子を単に発現するという結果を、本明細書中に示す（実施例１２）。ここでは、これら４つの遺伝子の発現が、脂肪酸のアラキドン酸含有量を０．８％とし、或いは０．０８％未満の酵母乾燥重量に対応する。
【０２３７】
このように、本発明は宿主生物のＰＵＦＡ含有量の改善を、発酵最適化（すなわち、窒素制限、リン制限、微量栄養元素制限、ＮａＣｌ制限、ミオイノシトール制限、その他を用いる発酵）を通して、例えば、温度を低下及び／又は最適培地を設計すること、又は、代謝改変によって脂肪酸の方への流動を改善することを通して、例えば脂肪酸合成酵素（ＰＵＦＡのための前駆体の生合成に関係する他の酵素の過剰発現）の過剰発現を通して、又は異種遺伝子のコドン最適化、又は、ＰＵＦＡ（すなわちオレイン酸）の前駆体の生合成に関係する異種酵素の発現によって、おこなうことに関する。
【０２３８】
このように、本発明の好ましい実施形態は、上記宿主細胞（例えばサッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））をミオイノシトール欠損培地で培養する本発明にもとづく方法に関する。
【０２３９】
ミオイノシトール欠損培地上での増殖
ミオイノシトールに欠培地上で増殖されるいくつかの酵母種において、脂質収率が増加であることが知られている。したがって、この発明の遺伝子組み換え細胞を、脂質及びＰＵＦＡ収率が上昇するようにミオイノシトールが補充されていない培地上で増殖することが有利である。
【０２４０】
コドン使用頻度及び最適化
コドン使用頻度は、多くの場合、異なる種の間で異なる。異なるコドン使用頻度を持つ生物からの異種タンパク質の発現のために、異種タンパク質のコドン使用頻度を宿主細胞のものに一致するように変えることが有利である。したがって、タンパク質発現を改善することができる。例えば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）と比較して、コドン使用頻度は多くの多くの菌類、例えばモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）、クリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）、，及びヒストプラズマ・カプスラタス（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）、ムコール・ロウキシ（Ｍｕｃｏｒ  ｒｏｕｘｉｉ）、ムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）、アスペルギラス・フミガーツフ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、サッカロマイセス・クリベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｙｖｅｒｉ）、フィトフセラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｅｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）、ピチウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）、及びアスペルギラス・パラスチカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）、昆虫、例えばトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）、ほ乳類、例えばマス・マスクラス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）、及びホモ・サピエンス（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、藻類、例えばスラウソシトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）、ユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）、サプリレグニア・ジクリアン（Ｓａｐｒｉｌｅｇｎｉａ  ｄｉｃｌｉａｎ）、ファエオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）、サプロレグニア（Ｓａｐｒｏｌｅｇｎｉａ）、及びシュイゾチゾチトリウム・アグレガツム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）及びパブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）、蠕虫、例えばカエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）、植物、例えばアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）、プラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）、グリシネ・ソヤ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｏｙａ）、ボラゴ・オフィシナリス（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、アネモネ・レベイレイ（Ａｎｅｍｏｎｅ  ｌｅｖｅｉｌｌｅｉ）、マルチャンチア・ポリモルファ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、フィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）、ペトロセリヌム・クリスプム（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）、及びフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）、魚類、例えばシプリナス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）、及びサルモ・サラル（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）で異なる。したがって、表１に示す対応酵素のヌクレオチド配列のコドン最適化は、ＰＵＦＡ生産の増加をもたらす。
【０２４１】
したがって、本発明の好ましい実施形態は、本発明にもとづく方法に関し、異種ヌクレオチド配列はサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に最適化されたコドンである。
【０２４２】
更に、一実施形態では、本発明は本発明にもとづく方法に関し、上記組み合わさった異種発現は、ＡＣＣ１、ＹＢＲ１５９Ｗ、ＥＬＯ１、ＥＬＯ２、ＥＬＯ３、ＦＡＳ１、ＦＡＳ２、ＤＧＡ１、ＬＲＯ１、ＡＲＥ１、ＡＲＥ２、及びＧＰＤ１からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つの過剰発現を、更に含む。
【０２４３】
別の実施形態は、本発明にもとづく方法に関し、上記組み合わさった異種発現は、ＧＰＰ１、ＧＰＰ２、及びＰＯＸ１からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つの欠失を、更に含む。
【０２４４】
別の実施形態は、本発明にもとづく方法に関し、上記組み合わさった異種発現は、ＡＴＰ：クエン酸リアーゼ及び／又はＡＭＰによって刺激されるイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードしているヌクレオチド配列の異種発現を、更に含む。
【０２４５】
別の実施形態は、本発明にもとづく方法に関し、前記組み合わさった異種発現は、非リン酸化ＮＡＤＰ依存型Ｄ−グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド発現の異種発現を、更に含む。
【０２４６】
別の実施形態は、本発明にもとづく方法に関し、遺伝子ＧＤＨｌの欠失と、選択的に、ＧＤＨ２、ＧＬＮ１、及びＧＬＴ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の過剰発現とを、更に含む。
【０２４７】
別の実施形態は、本発明にもとづく方法に関し、上記組み合わさった異種発現は、ＴＳＣ１３、ＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＹＤＲ５３１Ｗからなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つの過剰発現を、更に含む。
【０２４８】
したがって、１つの実施形態において、本発明は改善された多価不飽和脂肪酸含有量に関する方法、細胞、及び組成物に関し、上記異種発現は、個々の特異的な多価不飽和脂肪酸の含有量を増加させるもので、該多価不飽和脂肪酸は、特にＡＲＡ、ＥＰＡ、及びＤＨＡであり、その増加は、総脂肪酸含有量の２％超、例えば総脂肪酸含有量の３％、総脂肪酸含有量の４％、総脂肪酸含有量の５％、総脂肪酸含有量の６％、総脂肪酸含有量の７％、総脂肪酸含有量の８％、総脂肪酸含有量の９％、総脂肪酸含有量の１０％、又はそれ以上になる。
【０２４９】
したがって、現在のところ特に好ましい一実施形態では、アラキドン酸，  エイコサペンタエン酸  及び／又はドコサエキサエン酸の含有量を、本明細書に記載した遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で総脂肪酸含有量を２％超に高める。
【０２５０】
別の実施形態では、本発明は、改善された多価不飽和脂肪酸含有量に関する方法、細胞、及び組成物に関し、前記異種発現は、個々の特異的な多価不飽和脂肪酸の含有量を、酵母乾燥重量の０．１％超、例えば酵母乾燥重量の０．２％、酵母乾燥重量の０．３％、酵母乾燥重量の０．４％、酵母乾燥重量の０．５％、酵母乾燥重量の０．６％、酵母乾燥重量の０．７％、酵母乾燥重量の０．８％、酵母乾燥重量の０．９％、酵母乾燥重量のの１％、酵母乾燥重量の２％、酵母乾燥重量の３％、酵母乾燥重量の４％、酵母乾燥重量の５％、又はそれ以上まで増加させる。
【０２５１】
ベクター
ＰＵＦＡ不飽和化酵素及び伸長酵素をコードするポリヌクレオチドを、染色体外因子から宿主生物内で発現させることができる。酵母等での染色体外遺伝子に関して、高コピー数プラスミドが好ましい。他の酵母ベクターとして、酵母複製プラスミド（ＹＲｐ）、例えば、染色体由来の複製配列を有し、中程度のコピー数（１細胞あたり２０乃至４０コピー）で増殖する２μプラスミド、並びに安定した分離を確実にする複製起点及びセントロメア配列の両方を有する酵母セントロメア・プラスミド（Ｙｃｐ；ＣＥＮプラスミドとしても知られている）が挙げられる。安定した分離を確実にする複製起点及びセントロメア配列の両方を有し、安定した分離を確実にする。異なった選択マーカーを有するいくつかの酵母発現ベクトルを、目的がいくつかの異種遺伝子を発現することである場合、組合せて使用することができる。加えて、いくつかの異種遺伝子を同じプラスミドから発現させることができる。例えばｐＥＳＣベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を使用する。それは分散ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモータ配列から同時に誘導発現を可能にする。種々の原核生物の発現系を使用することで、ｐＢＲ３２２プラスミド、ｐＵＣプラスミド、及びその誘導体を含むＰＵＦＡを合成する不飽和化酵素及び伸長酵素を発現することができる。原核生物での発現を目的として、異種遺伝子を人工オペロンに組み入れる。このことは、単一プロモーター配列が遺伝子の一群の発現を制御する。ＰＵＦＡ合成不飽和化酵素及び伸長酵素をコードするいくつかの遺伝子を、ＰＣＲによって融合することができ、その後、標準的方法を使用して細菌発現ベクターにサブクローニングすることができる。
【０２５２】
したがって、本発明の一態様は、配列暗号１〜３８からなる群より選択されるヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％配列同一性を有する少なくとも４つの単離ヌクレオチド配列を含むベクターに関する。
【０２５３】
上記に詳しく記載したように、４〜７個の異種ヌクレオチド配列の組み合わせ発現は、ＰＵＦＡ生産を可能にするものでなければならない。したがって、ベクターは、例えば、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素又は、例えば、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列を含むことができる。或いは、発現ベクターは、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、オメガ−３不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、及びデルタ−４不飽和化酵素をコードする７つの遺伝子を含むことができる。
【０２５４】
細胞間の栄養共生のため、淘汰圧が加えられている場合であっても集団のすべての細胞が特定のプラスミド・コンストラクトを含むということを、通常は予想されない。異なる選択マーカーによるいくつかの異なるベクターが使用される場合、この効果は強化される。したがって、ＰＵＦＡ生産のために必要なすべての遺伝子は、一つの発現ベクターから好ましくは発現される。しかし、大きいベクター・コンストラクト（すなわち大きさが約２０ｋｂを越えるベクター）が宿主細胞で非安定的に複製かつ分離される場合があることから、異種経路を、いくつかの、例えば２つの別々のベクターから発現することは、有益でもあろう。
【０２５５】
当業者が認めるように、個々のヌクレオチド配列を一つのベクターから、又は、別々のベクターから発現させることができる。当業者は、本発明の単離核酸フラグメントのいずれかを含んでいる宿主細胞を成功裏に形質転換、選択、及び増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝因子のことも熟知している。当業者は、異なる独立形質転換イベントが結果として発現のレベル及びパターンが異なることになり、望まれた発現レベル及びパターンを示している株を得るために多数のイベントをスクリーニングしなければならないことも、認識する。そのようなスクリーニングは、数あるなかでも、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のウエスタン分析、或いは表現型分析、例えば限定されるものではないが、脂肪酸組成の分析、高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＧＣ−ＭＳ）に連結したガスクロマトグラフィ、薄層クロマトグラフィーによって達成可能である。
【０２５６】
好ましくは、異種遺伝子はいくつかのベクターから発現される。１つ又はいくつかの異種遺伝子をＰＵＦＡ経路で遺伝子位置から発現することも有利であろう。例えば、合計３つの異なるベクター内から、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、及びオメガ−３不飽和化酵素をコードする５つの異種遺伝子を発現することによって、また付加的に遺伝子位置から異種デルタ−９不飽和化酵素を発現することで、エイコサペンタエン酸をＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）で生産することができる（実施例５８）。
【０２５７】
上記したように  、一旦ベクターが構築されると、次に該ベクターは、例えば、トランスフェクション、形質転換、及びエレクトロポレーションを含む当業者に公知の方法によって、最適な宿主細胞に導入される。
【０２５８】
次に、宿主細胞を適当な状況の下で培養することで、所望のＰＵＦＡの生産に至る遺伝子の発現を可能にし、その後、該ＰＵＦＡを回収及び精製する。
【０２５９】
遺伝子組み換え細胞
別の態様では、本発明は、本発明によるベクターを含む遺伝子組み換え細胞に関する。
【０２６０】
示されるように、本発明の更なる実施形態は、遺伝子組み換え細胞に関し、上記ベクターからの上記単離ヌクレオチド配列の発現が、結果として野生型の上記宿主細胞で生産されない多価不飽和脂肪酸を生産する上記細胞になる。
【０２６１】
組成物
１つの態様において、本発明は、本発明による遺伝子組み換え細胞によって生産される多価不飽和脂肪酸を含んでいる組成物に関する。
【０２６２】
好ましい実施形態では、本発明にもとづく遺伝的に改変されたサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によって生産される多価不飽和脂肪酸を含んでいる組成物。
【０２６３】
下記に例示するように、４つの遺伝子の異種発現を介して全脂肪酸組成物で少なくとも２５％のＰＵＦＡを含む組成物を、本発明の方法によって達成することができる。
【０２６４】
このように、現在のところ好ましい実施形態では、本発明は、本発明にもとづく遺伝子組み換え細胞によって全脂肪酸組成物で生産される少なくとも２５％の多価不飽和脂肪酸を含む組成物に関する。
【０２６５】
しかし、たとえ量がより少ないことが経済的及び技術的に重要性であるけれども、本発明は更に、全脂肪酸組成物の少なくとも２％の多価不飽和脂肪酸（例えば全脂肪酸組成物の５％の多価不飽和脂肪酸酸、例えば全脂肪酸組成物の１０％以上の多価不飽和脂肪酸酸）を含む組成物に関する。
【０２６６】
実際、より高レベルであることがよりいっそう好ましく、例えば全脂肪酸組成物のうち２５％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち３０％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち３５％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち４０％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち４５％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち５０％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち５５％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち６０％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち６５％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち７０％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち７５％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち８０％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち８５％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち９０％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち９５％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち９７％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち９８％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち９９％が多価不飽和脂肪酸、例えば全脂肪酸組成物のうち１００％が多価不飽和脂肪酸であり、単不飽和脂肪酸と特にＰＵＦＡに至る異種経路を発現する微生物等の細胞から生産される。
【０２６７】
本発明の文脈の組成物は、化合物の配合物又は混合物を意味してよい。
【０２６８】
１つの実施形態において、前記組成物は、油である。
【０２６９】
先に述べたように、ＰＵＦＡを種々の形態／処方とすることができるので、１つの実施形態において、上記多価不飽和脂肪酸をトリアシルグリセリドの形態にする。
【０２７０】
別の実施形態では、上記多価不飽和脂肪酸は、リン脂質の処方である。
【０２７１】
さらなる実施形態では、上記多価不飽和脂肪酸を遊離脂肪酸の処方にする。
【０２７２】
本発明の組成物の使用
今では、多数のデータがＰＵＦＡの利点になっている。臨床所見が集められ、それらによれば、ＤＨＡ及びＡＲＡが神経及び網膜機能の発達に有益であることから、乳児の記憶及び視力の改善に有利かもしれないことが示されている。また、早産児及び年少乳児は、充分な量のＤＨＡを合成し、母乳によって自然にＰＵＦＡを受けることが実際のところ不可能である。しかし、ＰＵＦＡは以前から牛乳と同様に特殊調整粉乳には含まれていなかった。ＤＨＡも、心血管疾患のような種々の疾患に関係するリスクファクタを低下又は除去して、高血圧、関節炎、動脈硬化、及び血栓症上にいくつかの効能を持つ。今や、両ＰＵＦＡがともに、ますます食物で、例えば特殊調整粉乳、更には製薬及び化粧品製剤のかたちで提供されることが確認されている。このような需要の高まりは、非脂肪酸基質上で増殖される場合に４つ以上の二重結合を有するＰＵＦＡを生産することできる  遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によって、再現性高く、かつ一定の品質で生産されるトリアシルグリセリド、リン脂質、又は遊離脂肪酸（ＰＵＦＡ強化）を含む油等のＰＵＦＡの供給を通して、本発明に述べられる技術でカバーすることができる。
【０２７３】
ＰＵＦＡの一般的供給源は、魚油である。しかし、魚油の脂肪酸含有量は出漁期の間、変化し、場合によっては、魚油は環境汚染によって汚染される可能性がある。この他に、魚油には不快臭がある。魚自体は、ＰＵＦＡを生産しなくて、通常藻の消費を通して、それを取り込む。今日では、ＰＵＦＡが豊富な魚油は、養殖された魚から生産される。しかし、ＰＵＦＡ含有量は、魚が供給される食事に応じて変化し得る。それに加えて、高品質な魚の供給が不足することが予測されるため、ＰＵＦＡ又は単に酵母を魚飼料に補充すること、或いはＰＵＦＡ含有量が高い飼料が有益である。
【０２７４】
このように、本発明の一実施形態は、本発明にもとづいた食品の成分として組成物の使用に関する。
【０２７５】
もう一つの実施形態は、化粧品で成分を本発明にもとづいた組成物の使用と関する。
【０２７６】
特に好ましい実施形態では、本発明は飼料の成分として、発明にもとづいた組成物の使用に関する。
【０２７７】
現在のところ最も好ましい実施形態において、本発明は飼料の成分として、発明にもとづいた遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の使用に関する。
【０２７８】
概論
組成物を、多価不飽和脂肪酸含有油ＰＵＦＡとすることが可能であり、またＰＵＦＡをトリグリセリド、リン脂質、又は遊離脂肪酸の形態にすることができる。
【０２７９】
配列の由来
配列番号：１は、デルタ−９不飽和化酵素をコードしているモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：２は、デルタ−９不飽和化酵素をコードしているクリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：３は、デルタ−９不飽和化酵素をコードしているヒストプラズマ・カプスラタス（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：４は、デルタ−９不飽和化酵素をコードしているトリコプルシア・ニ（Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：５は、デルタ−１２不飽和化酵素をコードしているモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：６は、デルタ−１２不飽和化酵素をコードしているムコール・ロウキシ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）からヌクレオチド配列である。
配列番号：７は、デルタ−１２不飽和化酵素をコードしているムコール・シルシネロイデス（Ｍｕｃｏｒ  ｃｉｒｃｉｎｅｌｌｏｉｄｅｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：８は、デルタ−１２不飽和化酵素をコードしているアスペルギルス・フミガーツフ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：９は、デルタ−１２不飽和化酵素をコードしているクリプトコッカス・カルバタス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｕｒｖａｔｕｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：１０は、デルタ−１２不飽和化酵素をコードしているカエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：１１は、デルタ−６不飽和化酵素をコードしているモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：１２は、デルタ−６不飽和化酵素をコードしているムコール・ロウキシ（Ｍｕｃｏｒ ｒｏｕｘｉｉ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：１３は、デルタ−６不飽和化酵素をコードしているボラゴ・オフィシナリス（Ｂｏｒａｇｏ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：１４は、デルタ−６不飽和化酵素をコードしているアネモネ・レベイレイ（Ａｎｅｍｏｎｅ  ｌｅｖｅｉｌｌｅｉ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：１５は、デルタ−６不飽和化酵素をコードしているカエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：１６は、デルタ−６伸長酵素。をコードしているモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：１７は、デルタ−６伸長酵素をコードしているフィスコミトレラ・パテンス（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：１８は、デルタ−６伸長酵素をコードしているカエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：１９は、デルタ−６伸長酵素をコードしているマウスからのヌクレオチド配列である。
配列番号：２０は、デルタ−６伸長酵素をコードしているスラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：２１は、デルタ−６伸長酵素をコードしているフィトフトラ・インフェスタンス（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｉｎｆｅｓｔａｎｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：２２は、デルタ−５不飽和化酵素をコードしているモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：２３は、デルタ−５不飽和化酵素をコードしているフィトフトラ・メガスペルマ（Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ  ｍｅｇａｓｐｅｒｍａ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：２４は、デルタ−５不飽和化酵素をコードしているスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ｓｐ．ＡＴＣＣ  ２１６８５からのヌクレオチド配列である。
配列番号：２５は、デルタ−５不飽和化酵素をコードしているカエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：２６は、デルタ−５不飽和化酵素をコードしているピチウム・イレグラレ（Ｐｙｔｈｉｕｍ  ｉｒｒｅｇｕｌａｒｅ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：２７は、デルタ−５不飽和化酵素をコードしているファエオダクチルム・トリコルヌツム（Ｐｈａｅｏｄａｃｔｙｌｕｍ  ｔｒｉｃｏｒｎｕｔｕｍ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：２８は、デルタ−５伸長酵素をコードしているマウスからのヌクレオチド配列である。
配列番号：２９は、デルタ−５伸長酵素をコードしているヒトからのヌクレオチド配列である。
配列番号：３０は、オメガ−３不飽和化酵素をコードしているカエノルハブジチス・エレガンス（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：３１は、オメガ−３不飽和化酵素をコードしているペトロセリヌム・クリスプム（Ｐｅｔｒｏｓｅｌｉｎｕｍ  ｃｒｉｓｐｕｍ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：３２は、オメガ−３不飽和化酵素をコードしているアラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：３３は、オメガ−３不飽和化酵素をコードしているブラシカ・ナプス（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：３４は、オメガ−３不飽和化酵素をコードしているグリシネ・ソヤ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｓｏｙａ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：３５は、デルタ−４不飽和化酵素をコードしているスラウストキトリウム・アウレウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｕｒｅｕｍ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：３６は、デルタ−４不飽和化酵素をコードしているユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：３７は、デルタ−９伸長酵素をコードしているイソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：３８は、デルタ−８不飽和化酵素をコードしているユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）からのヌクレオチド配列である。
配列番号：３９は、配列番号：１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：４０は、配列番号：２によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：４１は、配列番号：３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：４２は、配列番号：４によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：４３は、配列番号：５によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：４４は、配列番号：６によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：４５は、配列番号：７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：４６は、配列番号：８によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：４７は、配列番号：９によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：４８は、配列番号：１０によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：４９は、配列番号：１１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５０は、配列番号：１２によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５１は、配列番号：１３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５２は、配列番号：１４によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５３は、配列番号：１５によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５４は、配列番号：１６によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５５は、配列番号：１７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５６は、配列番号：１８によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５７は、配列番号：１９によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５８は、配列番号：２０によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：５９は、配列番号：２１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：６０は、配列番号：２２によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：６１は、配列番号：２３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：６２は、配列番号：２４によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：６３は、配列番号：２５によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：６４は、配列番号：２６によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：６５は、配列番号：２７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：６６は、配列番号：２８によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：６７は、配列番号：２９によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：６８は、パブロバ（Ｐａｖｌｏｖａ）由来デルタ−５伸長酵素のアミノ酸配列である。
配列番号：６９は、配列番号：３０によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：７０は、配列番号：３１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：７１は、配列番号：３２によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：７２は、配列番号：３３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：７３は、配列番号：３４によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：７４は、配列番号：３５によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：７５は、配列番号：３６によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：７６は、イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）由来デルタ−４不飽和化酵素のアミノ酸配列である。
配列番号：７７は、シュイゾチゾチトリウム・アグレガツム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｕｍ）由来デルタ−４不飽和化酵素のアミノ酸配列である。
配列番号：７８は、配列番号：３７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：７９は、配列番号：３８によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：８０は、ＡＴＰ：クエン酸リアーゼのサブユニット１をコードしているソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）由来ヌクレオチド配列である。
配列番号：８１は、配列番号：８０によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：８２は、ＡＴＰ：クエン酸リアーゼのサブユニット２をコードしているソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）由来ヌクレオチド配列である。
配列番号：８３は、配列番号：８２によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：８４はデルタ−４不飽和化酵素をコードしている合成ヌクレオチド配列であり、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に最適化されたコドンである。
配列番号：８５はデルタ−９伸長酵素をコードしている合成ヌクレオチド配列であり、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に最適化されたコドンである。
配列番号：８６はデルタ−８不飽和化酵素をコードしている合成ヌクレオチド配列であり、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に最適化されたコドンである。
配列番号：８７は、オメガ−３不飽和化酵素をコードしているサッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：８８は、配列番号：８７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：８９は、オメガ−３不飽和化酵素をコードしているモルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：９０は、配列番号：８９によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：９２は、配列番号：９１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：９３は、デルタ−１２不飽和化酵素をコードしているアスペルギラス・パラスチカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｐａｒａｓｉｔｉｃｕｓ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：９４は、配列番号：９３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：９５は、デルタ−１２不飽和化酵素をコードしているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：９６は、配列番号：９５によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：９７は、デルタ−６不飽和化酵素をコードしているマルチャンチア・ポリモルファ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：９８は、配列番号：９７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：９９は、ｄｅｌｔａ−６／デルタ−５不飽和化酵素をコードしているシプリナス・カルピオ（Ｃｙｐｒｉｎｕｓ  ｃａｒｐｉｏ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：１００は、配列番号：９９によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１０１は、ｄｅｌｔａ−６／デルタ−５伸長酵素をコードしているサルモ・サラル（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：１０２は、配列番号：１０１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１０３は、デルタ−６伸長酵素をコードしているマルチャンチア・ポリモルファ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：１０４は、配列番号：１０３によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１０５は、デルタ−５不飽和化酵素をコードしているサルモ・サラル（Ｓａｌｍｏ  ｓａｌａｒ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：１０６は、配列番号：１０５によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１０７は、デルタ−５不飽和化酵素をコードしているマルチャンチア・ポリモルファ（Ｍａｒｃｈａｎｔｉａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：１０８は、配列番号：１０７によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１０９は、デルタ−４不飽和化酵素をコードしているパブロバ・ルセリ（Ｐａｖｌｏｖａ  ｌｕｔｈｅｒｉ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：１１０は、配列番号：１０９によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１１１は、オメガ−３不飽和化酵素をコードしているサプロレイグナ・ジクリナ（Ｓａｐｒｏｌｅｉｇｎａ  ｄｉｃｌｉｎａ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：１１２は、配列番号：１１１によってコードされるアミノ酸配列である。
配列番号：１１３は、デルタ−１２不飽和化酵素をコードしているサッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来のヌクレオチド配列である。
配列番号：１１４は、配列番号：１１３によってコードされるアミノ酸配列である。
【０２８０】
実施例
実施例１
デルタ−９不飽和化酵素、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードしている遺伝子の単離
真菌類モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）は、経路を経てアラキドン酸を生産する。ここで、オレイン酸は脱飽和されて、次々にデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素とデルタ−５不飽和化酵素によって延長される。これらの酵素をコードしているヌクレオチド配列を、モルティエレラ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＣＢＳ６０８．７０から、第１鎖ｃＤＮＡを用いるＰＣＲによって増幅した。また、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）のデルタ−９不飽和化酵素をコードしているヌクレオチド配列を単離した。増幅のために用いられる所定のプライマーを、これらの酵素をコードしているＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）遺伝子の公表された配列にマッチするように設計した  。
【０２８１】
手順は以下のとおり：
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ＣＢＳ  ６０８．７０を、１００ｍｌのＧＹ培地（２０ｇ／Ｌブドウ糖、１０ｇ／Ｌイースト抽出物ｐＨ６．０）で、室温で３日間培養した。バイオマスを濾過によって集め、Ｔｒｉｚｏｌ試薬（ギブコＢＲＬ）を用いて、全ＲＮＡを単離した。約５μｇのｒＲＮＡを、プライマーとしてＯｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８を用いる逆転写（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に用いられた。第１鎖ｃＤＮＡ合成後、相補的ＲＮＡを、ＲＮアーゼ消化によって除去した。ｃＤＮＡを、次に、以下のプライマーを用いるＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ酵素、Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）のテンプレートとして用いた。すなわち、デルタ−９不飽和化酵素に対して５’ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣ３’及び５’ＣＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣ３’、デルタ−１２不飽和化酵素に対して５’ＡＡＣＣＣＴＴＴＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＣＣ３’及び５’ＡＡＡＧＴＴＧＴＧＴＣＣＧＧＴＡＡＡＴＧＣＴＴＣ３’、デルタ−６不飽和化酵素に対して３’ＧＧＡＣＴＡＧＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＣＡＧＴＧＴＧＡＧＧ５’及び３’ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＴＴＡＣＴＧＴＧＣＣＴＴＧＣＣＣＡＴＣＴＴＧＧＡＧＧ５’、デルタ６−伸長酵素に対して５’ＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＴＴＧＣＧＣＣＡＴＴＣＣ３’及び５’ＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＣ３’、並びにデルタ−５不飽和化酵素に対して５’ＡＴＧＧＧＴＡＣＧＧＡＣＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＣＣ３’及び５’ＣＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＣＧＧＡＧＴＣＣ３’。予想される大きさの結果として生じるフラグメントを、アガロース・ゲルから切り取だけでなく、ＧＦＸ−カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製した。
【０２８２】
実施例２
デルタ−１２不飽和化酵素発現のための酵母ベクターの構築
実施例１に記載したようにして単離されたデルタ−１２不飽和化酵素をコードしている遺伝子をＰＣＲによって再増幅した。この際、用いたプライマーは、５’ＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＣＡＣＣＴＣＣＣＡＡＣＡＣＴＡＴＴＧ３’及び５’ＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＴＴＡＣＴＴＣＴＴＧＡＡＡＡＡＧＡＣＣ３’である。これらのプライマーを、その遺伝子の５’及び３’にあるＸｈｏＩ及びＮｈｅＩ制限部位にそれぞれ導入し、ＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ制限ＰＣＲフラグメントをＸｈｏＩ／ＮｈｅＩ消化ｐＥＳＣ−ＴＲＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２を得た。デルタ−１２不飽和化酵素（配列番号：５）をコードしている遺伝をコードしている遺伝子の配列を、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２の２つの異なるクローンのシークエンシングによって得た。
【０２８３】
実施例３
デルタ−１２不飽和化酵素及びデルタ−６不飽和化酵素発現のための酵母ベクターの構築
実施例１に記載したようにして、デルタ−６不飽和化酵素をコードする遺伝子を単離した。結果として得られるＰＣＲフラグメントは、その遺伝子の５’及び３’末端にあるＳｐｅＩ及びＣｌａＩ制限部位を含んだ。このフラグメントをＳｐｅＩ及びＣｌａＩで制限し、ＳｐｅＩ／ＣｌａＩ消化ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２に連結した（実施例２）。結果として得られるプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６は、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下、デルタ−１２不飽和化酵素及びデルタ−６不飽和化酵素をコードする遺伝子を含んだ(図９Ａ）。デルタ−６不飽和化酵素をコードする遺伝子（配列番号：１１）の配列を、２つの異なるクローンのシークエンシングによって得た。
【０２８４】
実施例４
デルタ−６伸長酵素発現のための酵母ベクターの構築
実施例１に記載したようにして単離されたデルタ−６伸長酵素をコードしている遺伝子をＰＣＲによって再増幅した。この際、用いたプライマーは、５’ＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＡＡＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＴＣＧＡＴＴＧＣＧＣＣ３’及び５’ＧＣＴＡＧＣＣＧＣＧＧＴＡＣＣＡＡＴＴＡＣＴＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＴＧＣ３’である。これらのプライマーをその遺伝子の遺伝子の５’及び３’末端にあるＨｉｎｄＩＩＩ及びＮｈｅＩ制限部位に導入し、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ制限ＰＣＲフラグメントをＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｈｅＩ消化ｐＥＳＣ−ＵＲＡベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）に連結し、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏを得た。ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏの２つの異なるクローンをシークエンシングすることで、クローン遺伝子の配列（配列番号：１６）を得た。
【０２８５】
実施例５
デルタ−６伸長酵素及びデルタ−５不飽和化酵素発現のための酵母ベクターの構築
実施例１に記載したようにして単離されたデルタ−５不飽和化酵素をコードしている遺伝子をＰＣＲによって再増幅した。この際、用いたプライマーは、５’ＣＧＣＡＣＴＡＧＴＡＴＣＧＡＴＡＴＧＧＧＴＡＣＧＧＡＣＣＡＡＧＧ３’及び５’ＴＴＡＡＴＴＡＡＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＣＴＣＴＴＣＣＴＴＧＧＧＡＣＧ３’である。これらのプライマーを、その遺伝子の５’及び３’末端にあるＣｌａＩ及びＳａｃＩ制限部位にそれぞれ導入し、ＣｌａＩ／ＳａｃＩ制限ＰＣＲフラグメントをＣｌａＩ／ＳａｃＩ消化ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏに連結した（実施例４）。結果として得られるプラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−５は、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターの制御下、デルタ−６伸長酵素及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする遺伝子を含んだ（図９Ｂ）。デルタ−５不飽和化酵素をコードする遺伝子（配列番号：２２）の配列を、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５の２つの異なるクローンのシークエンシングによって得た。
【０２８６】
実施例６
酵母でのアラキドン酸への経路の発現
適当な遺伝マーカーを有する酵母株を、実施例２、３、４、及び５に記載したベクターを別々に、或いは組み合わせて用いることで、形質転換した。形質転換体の選択は、ウラシル及びトリプトファンを欠いた培地上でおこない、続いて同培地上でストリーク精製した。
【０２８７】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−３Ｃ（ＭＡＴａ  ｔｒｐｌ）を別々に、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２（実施例２）によって形質転換することでＦＳ０１３２１株を得、またｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６（実施例３）によってＦＳ０１３２２株を得た。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＳ０１２６７（ＭＡＴａ  ｔｒｐ１  ｕｒａ３）株をｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６及びｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ（実施例４）で同時に形質転換させ、形質転換された株をＦＳ０１３２３と命名した。同じ株もまた、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６及びｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５（実施例５）と同時形質転換をおこない、ＦＳ０１２３２４株を得た。
【０２８８】
実施例７
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅｌによる酵母ＯＬＥ１の置換
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）の対応遺伝子によるＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＬＥ１遺伝子の置換を、二連基質による同一組み換えを介して実施した（図１０）。二連基質の一方の部分は、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端に向けて）からなり、ＴＤＨ３プロモーター配列、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅｌ遺伝子、及び．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＬＥ１の標的配列下流に融合している。二連基質の第２の部分は、天然ＯＬＥ１の標的配列上流からなり、ＴＤＨ３プロモーター配列及びＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端に向けて）と融合している。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択との後に形質転換体を得た。この形質転換体は、天然ＯＬＥ１が不活性化され、また第２のＴＤＨ３プロモーター反復配列の直下流にあるＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅｌ遺伝子とＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子の一方の側にある直接反復配列として、ＴＤＨ３プロモーター配列の２つのコピーと置き換わっている。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第２の組み換えイベントを、ＵＲＡ３遺伝子を発現する細胞には毒性のある５’−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含む培地上に形質転換体を再播種することで、選択した。これによって、天然Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＬＥ１遺伝子がＴＤＨ３プロモーターの制御下でＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１によって置換されている株が得られた。この株に、それとは反対の接合型の株を交配させて所望のマーカー（芽胞形成誘発）を含ませ、胞子を切開し、更に新規一倍体の株の遺伝子型を記録することで、適当な遺伝マーカーを導入した。
【０２８９】
手順は以下のとおりである：
二連遺伝子標的基質の第１の部分を構築するために、実施例１に記載したようにして単離されたＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子（配列番号：１）をＰＣＲによって再度増幅した。この際、用いたプライマーは、５’ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣ３’及び５’ＴＴＧＴＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＴＧＡＴＡＣＣＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧＡＣＧＴＧＧ３’である。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＬＥ１の標的配列下流をＰＣＲによって増幅した。この際、テンプレートとしてＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡを用い、またプライマーとして５’ＧＴＡＴＣＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＡＡＣＴＧＣＡＡＣ３’及び５’ＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＡＣＣＧ３’を用いた。第３のＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって生成した。この際、テンプレートとして、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の下流にＴＤＨ３プロモーター配列（−１〜−１０６７）を含むプラスミドを用い、またプライマー５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧ３’を用いた。これらのＰＣＲフラグメントを、次に、ＰＣＲの２回のラウンドの過程で融合させた。最初に、プライマー５’ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣ３’及び５’ＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＡＣＣＧ３’を用いて、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を下流標的配列に融合させた。第２に、第１の融合反応の産物を、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３／ＴＤＨ３プロモーター・フラグメントに融合させた。この際、プライマー５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＡＣＣＡＧＣＡＴＣＴＡＴＴＡＡＡＧＴＡＡＡＡＴＡＣＣＧ３’を用いた。これによって、遺伝子標的二連基質の第１の部分を構成する融合生成物２／３ＵＲＡ３−ＴＤＨ３ｐ−ｏｌｅ１−ＤＯＷＮが得られた。
【０２９０】
二連基質の第２の部分を構築するために、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＯＬＥ１の標的配列上流をＰＣＲによって増幅した。この際、テンプレートとして、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡを用い、またプライマー５’ＧＣＴＧＡＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＡＧＧ３’及び５’ ＡＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＣＧＧＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＧＧＣ３’を用いた。第２のＰＣＲフラグメントの構築を、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３遺伝子の上流にあるＴＤＨ３プロモーター配列（−１〜−１０６７）をテンプレートとして含み、かつプライマー５’ＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＧ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’を含むプラスミドを用いておこなった。最後に、このフラグメントを、プライマー５’ＧＣＴＧＡＡＡＡＧＡＴＧＡＴＧＴＴＣＴＧＡＧＧ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’を用いるＰＣＲによって、上流標的配列に融合させることで、遺伝子標的二連基質の第２の部分である融合生成物ＵＰ−ＴＤＨ３ｐ−２／３ＵＲＡ３を得た。
【０２９１】
酵母ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（ＭＡＴａ  ｕｒａ３）株を、直鎖状基質２／３ＵＲＡ−３−ＴＤＨ３ｐ−ｏｌｅ１−ＤＯＷＮ及びＵＰ−ＴＤＨ３ｐ−２／３ＵＲＡ３によって形質転換し、ウラシル欠損培地上に播種した。形質転換を同一培地上でストリーク精製し、次に５−ＦＯＡ含有培地に移した。出現した組み換え体を、５−ＦＯＡ含有培地上でストリーク精製し、コロニーＰＣＲによって確認した。ＴＤＨ３プロモーター及びＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１（配列番号：１）での正しい組み込み及び突然変異の欠如を、２つの異なる形質転換体の改変領域のシークエンシングによって確認した。結果として得られるＦＳ０１３０９株の遺伝子型は、ＭＡＴａ  ＯＬＥｌ：：ＴＤＨ３ｐ−アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１であった。
【０２９２】
ＴＲＰ１マーカーをＦＳ０１３０９へ導入するために、ＦＳ０１３０９を遺伝的バックグラウンド（ＣＥＮ．ＰＫ）が同じで接合型が異なるｔｒｐ１株と交配させた。二倍体をウラシル及びトリプトファンを欠いた培地上で選択し、芽胞形成培地に移した。芽胞形成後、シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ＭＳＭ顕微鏡及びミクロマニピュレーター解剖顕微鏡を用いて胞子を切り開いた。四分子を、適当なドロップアウト・プレートに対してレプリカ・プレーティングすることで、栄養素要求性について記録し、また、コロニーＰＣＲによってＯＬＥｌ：：ＴＤＨ３ｐ−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子型を記録した。このコロニーＰＣＲでは、プライマー５’ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣ３’及び５’ＡＧＡＣＡＴＴＧＡＡＡＴＣＣＡＡＡＧＡＡＧＡＣＴＧＡＡＧＧ３’を用いた。接合型の記録は、ａ又はアルファ−接合型を持つ芝生状になった細胞に対してレプリカ・プレーティングをおこない、３００℃で培養することで交配させ、芽胞形成培地にレプリカ・プレーティングをおこない、更に３０２ｎｍＵＶ光源下でプレートを照射することで胞子を可視化することで、おこなった。接合型ＭＡＴａ  ｔｒｐｌ  ＯＬＥｌ：：ＴＤＨ３ｐ−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１及びＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐｌ  ＯＬＥｌ：ＴＤＨ３ｐ−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を持つ半数体株をそれぞれＦＳ０１３１５及びＤＳ０１３１６と命名した。
【０２９３】
実施例８
酵母での異種デルタ−９不飽和化酵素と組み合わせたアラキドン酸への経路の発現
天然ＯＬＥ１がＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）（実施例７）由来のｏｌｅ１と置換され、かつ適当な遺伝マーカーを含む酵母株を、実施例２、３、４、及び５に記載したベクターを別々に、或いは組み合わせて用いて、形質転換した。形質転換体をウラシル及びトリプトファンを欠いた培地上で選択し、同一培地上でストリーク精製した。
【０２９４】
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＳＯ１３１５株（ＭＡＴａ  ｔｒｐｌ  ＯＬＥｌ：：ＴＤＨ３ｐ−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１）を別々に、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２（実施例２）で形質転換することによってＦＳ０１３２６株を得、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６（実施例３）によってＦＳ０１３２７株を得た。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＦＳ０１３１６株（ＭＡＴａ  ｔｒｐｌ  ｕｒａ３  ＯＬＥｌ：：ＴＤＨ３ｐ−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１）をｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６及びｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ（実施例４）と同時に形質転換させ、形質転換株をＦＳ０１３２８と命名した。同一の株をｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６及びｐＥＳＣ−ＵＲＡｅｌｏ−デルタ−５（実施例５）とも同時に形質転換させ、ＦＳ１０３２９株を得た。
【０２９５】
実施例９
振とうフラスコでの組み換え酵母株による発酵
単一の酵母のコロニーを、１００ｍｌの最少培地（５ｇ／Ｌのブドウ糖、２０ｇ／Ｌのガラクトース、１５ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、１ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１４．４ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、１ｍＬ／Ｌのビタミン溶液、１ｍＬ／Ｌの微量金属溶液、ｐＨ６．５）が入ったバッフル付き振とうフラスコ（５００ｍｌ）に植え付けた。ビタミン溶液は以下のものを含む：５０ｍｇ／Ｌのビオチン、１ｇ／Ｌのパントテン酸カルシウム、１ｇ／Ｌのニコチン酸、２５ｇ／Ｌのミオイノシトール、１ｇ／ＬのチアミンＨＣＩ、１ｇ／ＬのピリドキサールＨＣＩ、及び０．２ｇ／Ｌのｐ‐アミノ安息香酸。微量金属溶液は以下のものを含む：１５ｇ／ＬのＥＤＴＡ、４．５ｇ／ＬのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ＬのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／ＬのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．５ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３ｇ／ＬのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ＬのＨ３ＢＯ３、及び０．１ｇ／ＬのＫＩ。ｕｒａ３株ＦＳ０１３０９については、０．２２μｍ滅菌フィルターでろ過することによって、１００ｍｌ／Ｌのアミノ酸カクテル（０．５ｇ／Ｌのヒスチジン、０．５ｇ／Ｌのトリプトファン、０．５ｇ／Ｌのウラシル、０．５ｇ／Ｌのロイシン）を培地に加えた。培養液を、それぞれ１８又は３０℃で９６又は７２時間振とう（１５０ｒｐｍ）してインキュベートをおこなった。インキュベーション後、バイオマスを濾過によって回収し、脂質組成を実施例１１の記載通りに分析した。
【０２９６】
実施例１０
発酵槽での組み換え酵母株による発酵
組み換え酵母株を、回分培養、硫加培養、又はケモスタット培養として操作される発酵槽で増殖させることができる。
【０２９７】
回分培養と硫加培養
前培養として、実施例９に記載したようにして、単一の酵母のコロニーを１００ｍｌの最少培地を含む５００ｍｌのバッフル付き振とうフラスコの１００ｍｌの最少培地に植え付け、３０℃で振とう（１５０ｒｐｍ）してインキュベートした。指数的に増殖している前培養を、開始濃度１ｍｇＤＷ／Ｌでの回分培養の植菌に用いた。回分培養は、実用容量を２Ｌとして検査室発酵槽（例えばＢ．Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍｅｌｓｕｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）で実施することができる。培養を目的として、合成培地を用いることができ、この合成培地は、４０ｇ／Ｌのグルコース又はガラクトース、５．０ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３．０ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、及び０．５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含み、微量金属及びビタミンは実施例９の記載どおりである。泡立ちを回避するために、消泡剤（３００μｌ／Ｌ、Ｓｉｇｍａ  Ａ−８４３６）を加える。炭素源の選択は、異種発現のために選択されるプロモーターに依存する。例えば、ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーターが用いられる場合、ガラクトースが炭素源として用いられ、構成型酵母プロモーターが用いられる場合、ブドウ糖が通常、炭素源として選択される。炭素源を、最少培地とは別に加圧滅菌した後、発酵槽に加えなけらばならない。また、ビタミンと微量金属溶液は濾過滅菌法によって高圧蒸気殺菌及び培地の冷却後、発酵槽に加えられる。培養は、一定の温度（例えば、１８℃又は３０℃）、撹拌速度６００ｒｐｍ、及び１ｖｖｍ（空気容量／液体容量／分）でおこなう。ｐＨの調整は、４ＭのＫＯＨを自動的に添加することでおこなう。バイオリアクターは冷却器を備えており、排出された気体が気体分析装置（ＩＮＮＯＶＡ、Ｂａｌｌｅｒｕｐ、Ｄｅｎｍａｒｋ）に送られ、排出気体中のＣＯ２濃度が測定される。
【０２９８】
ケモスタット培養
ケモスタット培養では、細胞を、例えば、実用容量１ＬのＡｐｐｌｉｋｏｎ社製検査室発酵槽で増殖することができる。手短に言えば、培養は、増殖制限的栄養物質（回分発酵に関しては同じ培地）としてグルコース又はガラクトースを含む特定培地が供給される。定常状態培養での希釈率（それは比成長率に等しい）は、異なる値に設定することができる（例えば、０．０５０ｈ−１、０．１０ｈ−１、０．１５ｈ−１、又は０．２０ｈ−１）。温度を一定の値（例えば、１８℃又は３０℃）に設定し、培養ｐＨを５．０に設定することができる。好気条件は培養物に空気（例えば０．５Ｌ／分）をスプレーすることによって維持される。溶存酸素濃度を、例えばインゴールド（Ｉｎｇｏｌｄ）モデル３４１００３００２によって連続的モニターすることで、飽和気体の５０％を上回る値を維持する。
【０２９９】
実施例１１
メチルエステルとしてのＰＵＦＡの分析
実施例９の記載したように、最少培地を用いて１００ｍｌ振とうフラスコで細胞の増殖を、炭素源が枯渇するまでおこなう。バイオマスの分離は、３０００ｒｐｍで遠心することによっておこない、脂質の抽出を３０ｍｌのクロロホルム／メタノール混合物（２：１、ｖ：ｖ）を用いて一晩おこなう。次のステップでは、飼料をろ過し、溶媒溶液を６ｍｌのＮａＣＩで洗い、更に飼料を窒素上で乾燥する。脂質に対して、２ｍｌのトルエンと２ｍｌ  １％の硫酸とを含むメタノールを加え、脂質のエステル交換反応のために試料を５０℃で一晩放置する。試料を５ｍｌのＮａＣＩ溶液で洗い、ボルテックスする。メチルエステルの抽出を５ｍｌのヘキサンを添加することで開始し、次いで、この試料をボルテックスし、上側のヘキサン相を除去する。更にヘキサンを５ｍｌ添加し、抽出を続ける。４ｍｌの炭酸ナトリウムをヘキサンに加え、この試料をボルテックスし、相を２０００ｒｐｍで２分間、遠心分離する。試料の乾燥は、無水硫酸ナトリウムを用いておこない、溶液をろ過して窒素上で乾燥した。乾燥試料に対して、ヘキサンを０．５ｍｌ加え、この試料をメチルエステル定量に用意する。メチルエステルの定量は質量選択検出器と組み合わさったガスクロマトグラフィ（ＧＣ／ＭＳ）を用いておこなう。ＧＣ／ＭＳは、ヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）ＨＰ  Ｇ１７２３Ａ（７０ｅＶで動作するガスクロマトグラフ−クアドロプル質量選択検出器（ＥＩ））である。カラムは、ＪＷ−１７０１（３０ｍ、２５０μｍ、内径、０．１５μｍ膜厚）である。ＭＳを、ＳＣＡＮモードで操作する。オーブン温度を、当初１７０℃とし、その後４℃／分で２２０℃まで上げる。最終温度を３分間保つ。カラムの流量は、１ｍｌＨｅ／分である。注入容量は、５μｌである。インジェクターを、すべての分析に対して、１００：１スプリットレスのスプリットで駆動する。入り口の温度を３００℃、界面温度を２３０℃、及びクアドロプル温度を１０５℃とする。検出された脂肪酸メチルエステルの確認は、１９９８ＮＩＳＴマス・スペクトル・データベース（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｌ  Ｄａｔａｂａｓｅ）によっておこない、滞留時間を標準脂肪酸メチルエステルで確認する。典型的なガスクロマトグラムを図１１に示す。
【０３００】
実施例１２
組み換え酵母株の脂肪酸組成
デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードしているＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）遺伝子を発現する組み換え酵母ＦＳ０１３２４株と、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）遺伝子に加えてＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子も発現する組み換え酵母ＦＳ０１３２９株を実施例９に記載通りに培養し、脂肪酸組成を実施例１１の記載通りに分析した。同一の遺伝的バックグラウンドの野生型株（ＦＳ０１２０１）もまた、参照として分析に含めた。ＦＳ０１３２９及びＦＳ０１２０１株を３０℃で培養し、ＦＳ０１３２４株を１７℃で培養した。
【０３０１】
分析の結果（表２）は、アラキドン酸が両方の組み換え体株で生産されたことを示している。予想通りに、アラキドン酸の割合は、ＦＳ０１３２４よりもＦＳ０１３２９で高かった（すなわち、２倍高い）。更に、ステアリン酸（１８：１）とパルミトレイン酸（１６：１）との比は、ｏｌｅ１発現株であるＦＳ０１３２９で著しく増加した。
【０３０２】
表２．組み換え酵母株ＦＳ０１３２４及びＦＳ０１３２９、及び野生型株ＦＳ０１２０１の脂肪酸組成（全脂肪酸に占める％割合）
2008501323.tif 000004
【０３０３】
実施例１４
酵母ゲノムへのデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−９、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする遺伝子の組み込み
実施例１にもとづいて単離されたデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする遺伝子を、単一プラスミド上の、別々の、強力な酵母構成プロモーター（例えば、ＴＤＨ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＰＤプロモーター、又はＴＰＩプロモーター）の下流に、各々配置する。プラスミドはまた、同一組み換えによる酵母ゲノムへの組み込みのための標的配列と直接反復配列によってフランキングされたＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３遺伝子とを含む。標的配列を改変することで、プラスミドの直線化を可能にする固有の制限部位を含むようにする。
【０３０４】
適当な酵母株（例えば、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３を持つ株と遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ＯＬＥｌ：：ＴＤＨ３ｐ−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を持つ株）を線状化プラスミドで形質転換し、形質転換体をウラシル欠損培地上で選択する。同一培地でのストリーク精製の後、５−ＦＯＡ含有培地上で、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカーのポップ・アウトを選択する。プラスミドが正しく組み込まれているかどうかをＰＣＲ及び改変領域のシークエンシングによって確認する。結果として得られる株に所望の遺伝的特徴を導入するために、接合型が反対の適当な酵母株と好配させる。二倍体の選択、芽胞形成、及び切開の後、新規の一倍体株を実施例７に記載の方法によって記録する。
【０３０５】
実施例１５
酵母発現ベクターへのデルタ−５伸長酵素のクローニング
マウス遺伝子Ｓｓｃ２は、酵母由来の脂肪酸デルタ−９伸長酵素ＥＬＯ１ｐに対する配列同一性を持つタンパク質をコードする（Ｔｖｒｄｉｋ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ヒト胎児腎臓（Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ）２９３細胞での遺伝子の発現後、該細胞から抽出したタンパク質の生体外アッセイをおこなったところ、Ｓｓｃ２遺伝子産物が２０：４（ｎ−６）及び２０：５（ｎ−３）、すなわちアラキドン酸及びエイコサペンタエン酸を伸長させることができることが示された（Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。
【０３０６】
マウスＳｓｃ２（Ｔｖｒｄｉｋ  ｅｔ  ａｌ．２０００，Ｍｏｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１）を、テンプレートとしてのマウス肝臓ｃＤＮＡ（Ｑｕｉｃｋ−Ｃｌｏｎｅ  ｃＤＮＡ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）とプラスミド５’ＧＡＡＧＡＴＣＴＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＣＣＴＴＴＧＡＴＡＡＴＧ３’及び５’ＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＣＴＴＡＴＴＧＡＧＣＣＴＴＣＴＴＧＴＣＣＧＴＣＡＴＧＣＣＡＴＴＡＧＣ３’とを用いるＰＣＲによって、単離した。これらのプラスミドは、ＢｇＩＩＩ及びＰａｃＩ制限部位を含むことから、ＢｇＩＩＩ／ＰａｃＩ消化ＰＣＲフラグメントをＢｇＩＩＩ／ＰａｃＩ消化ｐＥＳＣ−ＴＲＰベクターに連結することができ、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−５ｅｌｏが得られた。
【０３０７】
実施例１６
酵母発現ベクターへのオメガ−３不飽和化酵素のクローニング
Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ｆａｔｌ（Ｓｐｙｃｈａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）は、ＫｐＮＩ制限部位を含む遺伝子特異的フォワード・プライマーとＮｈｅＩ制限部位を含む遺伝子特異的リバース・プライマーとを用いて、Ｃ．エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）ｃＤＮＡライブラリー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）から増幅される。ＰＣＲ産物をＫｐＮＩ／ＮｈｅＩで消化し、ＫｐＮＩ／ＮｈｅＩ消化されたｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−５ｅｌｏベクター（実施例１５）に連結することで、ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−５ｅｌｏ−オメガ３が得られる。
【０３０８】
実施例１７
酵母発現ベクターへのデルタ−４不飽和化酵素のクローニング
スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ｓｐ．ＡＴＣＣ２６１８５を１００ｍｌの培地を含む５００ｍｌ振とうフラスコで、振とうしながら室温で培養した。バイオマスを回収した後、全ＲＮＡを単離し、オリゴ（ｄＴ）１２〜１８をプライマーとして使用するｃＤＮＡ調製に用いた。スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）Ｆａｄ４  の増幅を、スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ｃＤＮＡをテンプレートとし、かつ適当な制限部位を含む遺伝子特異的プライマーを用いて、おこなった。次に、Ｆａｄ４遺伝子を、適当な酵母発現ベクター（例えば、ＨＩＳ又はＬＥＵ選択を持つ高コピー・ベクター及びガラクトース誘導性又は構成プロモーター）に連結する。
【０３０９】
実施例１８
酵母でのドコサヘキサエン酸への経路の発現
ゲノムに組み込まれたデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする遺伝子を含む酵母株（実施例１４）を、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−５ｅｌｏ−オメガ−３（実施例１６）とデルタ−４不飽和化酵素（実施例１７）をコードする遺伝子を含む発現ベクターとによって、同時形質転換をおこなった。
【０３１０】
実施例１９
酵母ゲノムへのデルタ−５伸長酵素、オメガ−３不飽和化酵素、及びデルタ−４不飽和化酵素をコードする遺伝子の組み込み
デルタ−５伸長酵素、オメガ−３不飽和化酵素、及びデルタ−４不飽和化酵素をコードする遺伝子を、単一プラスミド上の、別々の、強力な酵母構成プロモーター（例えば、ＴＤＨ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＧＰＤプロモーター、又はＴＰＩプロモーター）の下流に、各々配置する。プラスミドはまた、同一組み換えによる酵母ゲノムへの組み込みのための標的配列と直接反復配列によってフランキングされたＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３遺伝子を含む。標的配列を改変することで、プラスミドの直線化を可能にする固有の制限部位を含むようにする。適当な酵母株を線状化プラスミドで形質転換し、形質転換体をウラシル欠損培地上で選択する。同一培地でのストリーク精製の後、５−ＦＯＡ含有培地上で、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３のポップ・アウトを選択する。プラスミドが正しく組み込まれているかどうかをＰＣＲ及び改変領域のシークエンシングによって確認する。結果として得られる株に所望の遺伝的特徴を導入するために、接合型が反対の適当な酵母株と好配させる。二倍体の選択、芽胞形成、及び切開の後、新規の一倍体株を実施例７に記載の方法によって記録する。
【０３１１】
実施例２０
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＰＵＦＡ生産のためのベクターの構築
ＰＵＦＡ生産に必要な遺伝子（例えば、アラキドン酸生産のためのデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−９、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする遺伝子）を、停止及び開始コドンが互いに重なり合うようにして、ＰＣＲによって融合する。適当なプライマーを使用して、固有の制限部位が融合産物の５’末端及び３’末端に導入されるようにする。融合産物を、プロモーター下流のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクター（例えば、ｐＴＸＢ１、ｐＢＲ３２２、又はｐＵＣベクター）に連結することで、人工オペロンを得る。再びＰＣＲ融合法を用い、その後、クラスターのクローニングに元々使用された３’末端制限部位での挿入によって、さらなる遺伝子（例えば、デルタ−５伸長酵素、デルタ−３不飽和化酵素、デルタ−４不飽和化酵素）をこのオペロンに添加することができる。好ましくは、発現系は構成プロモーター、例えばバクテリオファージガンマタンデム・プロモーターＰＲ、ＰＬ、又は強構成Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）プロモーターに基づく。或いは、このシステムは温度誘導性のものであり、例えばバクテリオファージガンマタンデム・プロモーターＰＲ、ＰＬをｃＩ８５７レプレッサーと組み合わせて使用され、又はＩＰＴＧ誘導性のものであり、例えばＴ７プロモーターを使用する。
【０３１２】
実施例２１
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのＰＵＦＡの生産
適当な遺伝子型のＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を、ＰＵＦＡ（実施例２１）の生産のために必要な遺伝子による人工遺伝子クラスターを含んでいる発現ベクターで形質転換し、組み換え細胞を、選択培地（例えば５ｍｇ／Ｌのアンピシリンを含むＬＢ培地）上で同定する。単一コロニーを１００ｍｌの培地に植菌する。この培地は、バッフル付き５００ｍｌ振とうフラスコに、２０ｇ／Ｌのグルコース、３ｇ／ＬのＫＨ２ＰＯ４、７ｇ／ＬのＫ２ＨＰＯ４、２ｇ／Ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．２５ｇ／ＬのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを含み、５ｍｇ・ｌ−１アンピシリンが追加されたものである。クラスターを、炭素源が枯れるまで、２００ｒｐｍで振とうさせながら、３７℃で１６〜２０時間インキュベートし、バイオマスを、実施例１１に記載したように、脂肪酸組成の分析のために回収した。ＩＰＴＧ誘導性プロモーター（例えば、Ｔ７プロモーター）を使用する場合、ＩＰＴＧを最終濃度が０．０１〜１ｍＭになるようにして添加する。
【０３１３】
実施例２２
株構築に使用される一般分子生物学的方法
実施例で用いられる標準組み換えＤＮＡ及び分子クローニング技術は、周知の技術であり、文献（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９））に記載されている。微生物培養の維持及び増殖に適する材料及び方法は、周知の技術であり、例えば、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ（Ｇｅｒｈａｒｄｔ，Ｐ．，Ｍｕｒｒａｙ，Ｒ．Ｇ．Ｅ．，Ｃｏｓｔｉｌｏｗ，Ｒ．Ｎ．，Ｎｅｓｔｅｒ，Ｅ．Ｗ．，Ｗｏｏｄ，Ｗ．Ａ．，Ｋｒｉｅｇ，Ｎ．Ｒ．，ａｎｄ  Ｂｒｉｇｇｓ，Ｇ．，Ｅｄｓ．）Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ：Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．（１９９４）に記載されている。細胞の維持及び増殖に使用される全ての薬品及び試薬は、特に指定しない限り、シグマ（Ｓｉｇｍａ）、ＤＩＦＣＯラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、又はＧＩＢＣＯ／ＢＲＬから入手した。制限酵素及びＤＮＡリガーゼは、ニューイングランド・バイオラボラトリーズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）から購入した。全てのＰＣＲ反応をフューション（Ｐｈｕｓｉｏｎ）ポリメラーゼ（Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）を用いておこなった。オリゴヌクレオチド及びシークエンシング・サービスは、ＭＷＧバイオテック（ＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｅｂｅｒｓｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＤＮＡフラグメントの精製は、ＧＦＸカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）又はＱｉａｅｘＩＩ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いておこなった。
【０３１４】
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５α細胞を、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）他（上掲）に記載されたイノウエ（Ｉｎｏｕｅ）の方法によって、形質転換受容性にした。Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を、選択的に５０ｍｇ／ｌのアンピシリンが添加されたルリア・ベルタニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）培地で、３７℃で増殖させた。
【０３１５】
酵母細胞を、概して３０℃でＹＰＤ培地又は完全ドロップ・アウト合成培地で増殖させ、ＬｉＡｃベースの方法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上記）によって、形質転換受容性にした。ゲノム改変（遺伝子の過剰発現及び欠失、異種遺伝子の組み込み）を、本質的にＥｒｄｅｎｉｚ、Ｎ．、Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ、Ｕ．Ｈ．、Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ、Ｒ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：１１７４−８３に記載されているように、ＰＣＲ生成標的化基質と選択マーカーとしてのＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３遺伝子とを用いる同一組み換えによって、おこなった。融合ＰＣＲのためのプライマー設計に関する情報を同じ刊行物で見いだすことができる。一般に、ＤＮＡフラグメントの融合は、元のＤＮＡフラグメントの増幅のために適切に設計された５’オーバーハングを持つプライマーを用いることにより、可能になった。全ての場合において、ＰＣＲ生成フラグメントを１％アガロース・ゲルから切り取り、融合ＰＣＲによる手順に先立って精製した。形質転換体を、通常、ＵＲＡプレート上で選択し、またＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３標識遺伝子のポップ・アウトを、５−ＦＯＡ培地（５−フルオロオロチン酸、７５０ｍｇ／ｌ）上にプレーティングすることによって、選択した。プロモーター及び異種遺伝子の正しい組込みを、常に、組み込みのために配列に標的配列の外でアニーリングされている１つのプライマーと、組み込まれる配列の内側にアニーリングされている１つのプライマーとを用いるＰＣＲによって確認した。遺伝子欠失もまた、欠失遺伝子の両側にプライマーを用いて、ＰＣＲによって確認した。一般に、ゲノム改変のＰＣＲ確認をコロニー−ＰＣＲ法によっておこなった。コロニー−ＰＣＲのために、小量の細胞を１０μｌのＨ２Ｏに分散し、−８０℃に約３０分間放置し、続いて３７℃で１５分間インキュベートした。次に、細胞懸濁液をＰＣＲのテンプレートとして使用した。
【０３１６】
実施例で使用した株の交配によって遺伝的特徴を組み合わせる方法は周知であり、例えばＡｄａｍｓ，Ａ．，Ｇｏｔｔｓｃｈｌｉｎｇ，Ｄ．Ｅ．，Ｋａｉｓｅｒ，Ｃ．Ａ．，ａｎｄ  Ｓｔｅａｒｎｓ，Ｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｙｅａｓｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ａ  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９９７）に記載されている。一般に反対の接合型の株は交配が可能であり、二倍体を選択して芽胞形成培地（２０ｇ／ｌの酢酸カリウム、１ｇ／ｌのグルコース、２．５ｇ／ｌの酵母エキス、ｐＨ７．０）に移し、約３日間にわたって３０℃で胞子形成させた。子嚢をＹＰＤプレート上で切開した。シンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ＭＳＭ顕微鏡及びシンガー（Ｓｉｎｇｅｒ）ＭＳＭ顕微鏡及びミクロマニピュレーター解剖顕微鏡を用いて芽胞形成培地に移した。結果として生じる四分子の接合型の記録は、ａ又はアルファ接合型を持つ芝生状になった細胞に対してレプリカ・プレーティングをおこない、３０℃で培養することで交配させ、芽胞形成培地にレプリカ・プレーティングをおこない、更に３０２ｎｍＵＶ光源下でプレートを照射することで胞子を可視化することで、おこなった。栄養要求性マーカーを、ドロップアウト・プレートに対するレプリカ平板法によって記録した。表現型によって記録されない遺伝子組み換えを、コロニー−ＰＣＲによって記録した。一般に、ゲノム組み込み又は不活性化（ノック・アウト）の確認に使用した同一プライマー・セットをもまた、四分子のコロニー−ＰＣＲ（上記参照）に使用した。
【０３１７】
株の遺伝子型を記述するために使用した遺伝子命名法は以下のとおりである。すなわち、野生型酵母遺伝子を大文字で記載し、欠失又は変異した野生型酵母遺伝子を小文字で記載する。菌類の遺伝子を小文字で記載する（例えば、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１、Ｓ．マクロスポア（Ｓ．ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）ａｃｌ１）。酵母プロモーターは、小文字のｐで示す（例えば、ＡＤＨ１及びＴＤＨ３プロモーターに対してはpＡＤＨ１及びｐＴＤＨ３）。プロモーター置換法による野生型酵母遺伝子の過剰発現は、プロモーター名の後に遺伝子名が続くことによって示す（例えば、ＡＤＨ１プロモーターによるＦＡＳ１の過剰発現及びＴＤＨ３プロモーターによるＤＧＡ１の過剰発現に対して、ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１及びｐＴＤＨ３−ＤＧＡ１）。野生型酵母遺伝子の分断をダブル・コロンによって示す（例えば、ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１、これはＰＯＸ１遺伝子が分断されており、ＴＤＨ３プロモーター及びＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子がその場所に組み込まれていることを意味している。プラスミドは、括弧内に示す。
【０３１８】
実施例２３
ｐＷＡＤ１及びｐＷＡＤ２の構築
２種類のベクター（ｐＷＡＤ１及びｐＷＡＤ２）を、ＡＤＨ１プロモーターによる遺伝子の過剰発現のための遺伝子標的基質の構築においてＰＣＲのテンプレートとして使用した。ｐＷＡＤ１及びｐＷＡＤ２を構築するために、ＡＤＨ１プロモーター（ＡＤＨ１遺伝子の直上流側の１４６７ｂｐからなる）を、酵母ゲノムＤＮＡから増幅した。この際、用いたプライマーは、５’ＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＣＣＧＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧ３’及び５’ＴＴＧＧＧＣＣＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣ３’である。これらのプライマーをプロモーター配列の５’末端にあるＣｌａＩ及びＳａｃＩＩ制限部位と３’末端にあるＸｍａＩ及びＡｐａＩ制限部位に導入した。ｐＷＡＤ１を構築するために、ＡＤＨ１プロモーター・フラグメントをＣｌａＩ及びＡｐａＩで消化し、ＣｌａＩ／ＡｐａＩ消化ｐＷＪ７１６に導入した。これによって、ＡＤＨ１プロモーターがＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の直下流に配置されたプラスミド・コンストラクトが得られた。ＡＤＨ１プロモーター配列に突然変異が生じていないことの確認は、ｐＷＡＤ１のシークエンシングによっておこなった。ｐＷＡＤ２を構築するために、ＡＤＨ１プロモーター・フラグメントを、ＳａｃＩＩ及びＸｍａＩによる消化を通してｐＷＡＤ１から放出させた。このフラグメントを精製し、ＳａｃＩＩ/ＸｍａＩ消化ｐＷＪ７１６に導入した。。これによって、ＡＤＨ１プロモーターがＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の直下流に配置されたプラスミド・コンストラクトが得られた。ｐＷＡＤ１及びｐＷＡＤ２のプラスミド・マップを図１３に示す。天然プロモーターの制御下で、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３構造を担持し、天然ターミネーター配列に結合したプラスミドｐＷＪ７１６は、ウッフェ・Ｈ・モルテンセン（Ｕｆｆｅ  Ｈ．Ｍｏｒｔｅｎｓｅｎ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏ−Ｃｅｎｔｒｕｍ  ＤＴＵ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋ）のご好意により頂いたものである。
【０３１９】
実施例２４
ＰＷＪ７１６−ＴＤ１及びｐＷＪ７１６−ＴＤ２の構築
２種類のベクター（ＰＷＪ７１６−ＴＤ１及びｐＷＪ７１６−ＴＤ２）を、ＴＤＨ３プロモーターによる遺伝子の過剰発現のための遺伝子標的基質の構築においてＰＣＲのテンプレートとして使用した。ＰＷＪ７１６−ＴＤ１及びｐＷＪ７１６−ＴＤ２を構築するために、ＴＤＨ３プロモーター（ＴＤＨ３遺伝子の直上流側の１０６７ｂｐからなる）を、酵母ゲノムＤＮＡから増幅した。この際、用いたプライマーは、５’ＴＴＧＧＧＣＣＣΠＴＴＣＣＣＧＧＧＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧ３’及び５’ＡＡＡＴＣＧＡＴＡＡＣＣＧＣＧＧＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＧ３’である。これらのプライマーをプロモーター配列の５’末端にあるＣｌａＩ及びＳａｃＩＩ制限部位と３’末端にあるＸｍａＩ及びＡｐａＩ制限部位に導入した。ＰＷＪ７１６−ＴＤ１を構築するために、ＴＤＨ３プロモーター・フラグメントをＣｌａＩ及びＡｐａＩで消化し、ＣｌａＩ／ＡｐａＩ消化ｐＷＪ７１６に導入した。これによって、ＡＤＨ１プロモーターがＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の直下流に配置されたプラスミド・コンストラクトが得られた。ＴＤＨ３プロモーター配列に突然変異が生じていないことの確認は、ＰＷＪ７１６−ＴＤ１のシークエンシングによっておこなった。ｐＷＪ７１６−ＴＤ２を構築するために、ＴＤＨ３プロモーター・フラグメントを、ＳａｃＩＩ及びＸｍａＩによる消化を通してｐＷＡＤ１から放出させた。このフラグメントを精製し、ＳａｃＩＩ/ＸｍａＩ消化ｐＷＪ７１６に導入した。これによって、ＴＤＨ３プロモーターがＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の直下流に配置されたプラスミド・コンストラクトが得られた。ＰＷＪ７１６−ＴＤ１及びｐＷＪ７１６−ＴＤ２のプラスミド・マップを図１４に示す。
【０３２０】
実施例２５
遺伝子組み換え酵母株の概要
実施例で述べられるように。いくつかの遺伝子組み換え酵母株を構築した。実施例で言及される株の概要を表３に示す。すべての改変は、ＣＥＮ．ＰＫ遺伝的バックグラウンドでおこなった。ＣＥＮ．ＰＫ１１０−１０Ｃ株とＣＥＮ．ＰＫ１１３−６Ｂ株とを交配させ、結果として生じる二倍体の子嚢を切開し、結果として生じる一倍体の株の遺伝子型を記録することによって、株ＦＳ０１２６７、ＦＳ０１２６９、及びＦＳ０１２７７を得た。
【０３２１】
表３．実施例で使用又は構築される株の概要。表はゲノム改変のみを表すもので、ＰＵＦＡ経路をプラスミドから発現している株については、表４及び１１参照。ＳＤＧ，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ＧｍｂＨ，Ｏｂｅｒｕｓｅｌ，Ｇｅｒｍａｎｙ；ＦＳ，Ｆｌｕｘｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ａ／Ｓ
2008501323.tif 000005
2008501323.tif 000006
【０３２２】
実施例２６
脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）の過剰発現
酵母脂肪酸合成酵素のベータ及びアルファ・サブユニットをそれぞれコードする２つの遺伝子ＦＡＳ１及びＦＡＳ２が、強力な酵母プロモーターによって過剰発現した。このことは、遺伝子標的二連基質に基づくプロモーター置換法を用い、野生型のＦＡＳ１プロモーター及びＦＡＳ２プロモーターをＡＤＨ１プロモーターと置き換えることによっておこなった（図１５）。この２つの遺伝子を別々に過剰発現させ、続いて株の交配を一時的変異を組み合わせた。各々の過剰発現のために、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からある二連基質の一部分を、ＡＤＨ１ プロモーター配列と過剰発現させる遺伝子の始まりに対応する標的とに融合させた。過剰発現させる遺伝子の標的配列上流からなる二連基質の第２の部分を、ＡＤＨ１プロモーター配列とＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３の部分（５’末端方向）に融合させた。二連基質による形質転換及びウラシル欠損培地上での選択をおこなった後、野生型プロモーターがノック・アウトされ、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子の片側に直接反復配列としてあるＡＤＨ１プロモーター配列の２つのコピーと置き換わった。選択マーカーのルーピング・アウトをもたらす第２の組み換えイベントの選択は、ＵＲＡ３遺伝子を発現させる細胞に対して毒性のある５’−フルオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含む培地上で形質転換を置き換えることにより、なされる。このことは、野生型プロモーターがＡＤＨ１プロモーターによって置き換わった株をもたらした。
【０３２３】
この方法を以下のとおりとした。
遺伝子標的二連基の第１部（図１５）を構築するために、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）とＡＤＨ１プロモーターとからなるフラグメントをプラスミドｐＷＡＤ１から増幅した。ＦＡＳ１の過剰発現について、プライマー対５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＴＧＧＴＣＴＴＧＴＧＧＡＧＴＡＡＧＣＧＴＣＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣ３’を、この増幅に対して使用し、またＦＡＳ２の過剰発現に対して、プライマー対５’ＣＴＴＧＡＧＴＴＣＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＴＴＣＴＴＣＴＣＡＡＣＴＴＣＣＧＧＣＣＴＴＣＡＴＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣ３’を使用した。更に、ＦＡＳ１及びＦＡＳ２のそれぞれの先頭から構成される下流標的配列を、ＦＡＳ１標的配列のプライマー対５’ＡＴＧＧＡＣＧＣＴＴＡＣＴＣＣＡＣＡＡＧＡＣＣＡＴＴＡＡＣ３’及び５’ＴＴＧＡＴＡＴＡＧＡＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣ３’と、５’ＡＴＧＡＡＧＣＣＧＧＡＡＧＴＴＧＡＧＣＡＡＧＡＡＴＴＡＧＣ３’及び５’ＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＴＧＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＡＡＣＧ３’のＦＡＳ２標的配列のプライマー対を用いることで、酵母ゲノムＤＮＡから増幅した。最後に、ＦＡＳ１及びＦＡＳ２下流標的配列を、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）とＡＤＨ１プロモーターとからなるフラグメントに融合させた。ＦＡＳ１についてはプライマー対５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＴＴＧＡＴＡＴＡＧＡＴＣＡＣＧＣＡＡＴＴＣＴＴＣＡＡＡＧＴＡＧＴＣ３’を融合反応に用い、又はＦＡＳ２についてはプライマー対５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＡＣＴＴＣＴＴＣＡＡＣＴＴＧＴＧＡＧＣＡＡＣＣＡＡＡＡＣＧ３’用いた。結果として得られる融合産物である３’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＡＤＨ１−ＤＯＷＮ（ＦＡＳ１）及び３’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＡＤＨ１−ＤＯＷＮ（ＦＡＳ２）は、ＦＡＳ１及びＦＡＳ２プロモーター置換にそれぞれ使われる標的二連基質の部分１であった。
【０３２４】
標的二連基質の部分２を構築するために、ＡＤＨ１プロモーターとＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３（５’末端方向）の２／３とからなるフラグメント末端を、はじめに、テンプレートとしてプラスミドｐＷＡＤ２を用い、ＰＣＲによって増幅した。この増幅に用いたプライマーは、５’ＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＧＧＧＧＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’であった。次に、上流標的配列を、ＦＡＳ１上流標的配列のためのプライマー５’ＣＣＧＣＴＧＴＡＣＴＡＴＧＣＧＧＴＣＴＣＧＴＣＣ３’及び５’ＡＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＴＡＴＧＣＣＡＡＡＡＡＴＧＣＣＡＡＡＡＴＧＣＣ３’と、ＦＡＳ２上流配列のための５’ＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＣ３’及び５’ＡＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＣＧＴＣＣＡＡＣＧＡＣＡＡＣＡＡＣＡＡＣＧＡＣＴＡＣＡＡＴＧＡＴＧＧ３’とを用いて、酵母ゲノムＤＮＡから増幅した。次に、上流標的配列を、すでに構築されたｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３・フラグメントに融合させた。融合反応に使用されるプライマーは、ＦＡＳ１に関しては５’ＣＣＧＣＴＧＴＡＣＴＡＴＧＣＧＧＴＣＴＣＧＴＣＣ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’であり、またＦＡＳ２に関しては、５’ＣＡＡＣＴＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＡＡＡＧＡＧＣＡＡＧＣＣ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’であった。結果として得られる融合産物ＵＰ（ＦＡＳ１）−ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３及びＵＰ（ＦＡＳ２）−ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３は、ＦＡＳ１及びＦＡＳ２置換に用いられる標的二連基質の部分２であった。
【０３２５】
ＦＡＳ１過剰発現に関しては、酵母ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（ＭＡＴａ  ｕｒａ３）株を、線状基質であるＵＰ｛ＦＡＳ１）−ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＡＤＨ１−ＤＯＷＮ（ＦＡＳ１）により、形質転換した。ＦＡＳ２の過剰発現に関しては、同一の親株を、線状基質であるＵＰ（ＦＡＳ２−ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＡＤＨ１−ＤＯＷＮ（ＦＡＳ２）により、形質転換した。形質転換体の選択及びストリーク精製をウラシル欠損培地上でおこない、次に５−ＦＯＡ含有プレートに移した。ポップ・アウト組み換え体を５−ＦＯＡ含有培地上でストリーク精製した。結果として得られる株は、ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１及びＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２という遺伝子型を有し、これらをＦＳ０１３５１及びＦＳ０１３５２とそれぞれ命名した。ＡＤＨ１プロモーターの正確な組込みとＰＣＲによって生じた突然変異の欠如とを、両方の株での改変領域のシークエンシングによって確認した。
【０３２６】
１つの株内でＦＡＳ１及びＦＡＳ２を組み合わせるために、ＦＡＳ１過剰発現変異体  ＦＳ０１３５１（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１）を最初に、ＦＳ０１２６９（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｔｒｐ１）株と交配した。二媒体をウラシル及びトリプトファン欠損培地上で選択した後、芽胞形成培地に移した。芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。結果として生じた一倍体株にｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１改変が存在することを、コロニーＰＣＲによって決定し、残存する遺伝学的特徴を標準方法を用いて記録した。交配によって生じた一倍体株の組から、遺伝子型ＭＡＴａｌｐｈａ  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１を有する株を選択し、ＦＳ０１３４２と命名した。
【０３２７】
次に、ＦＳ０１３４２（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１）をＦＳ０１３５２（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２）と交配させ、ウラシル及びトリプトファン欠損培地上で二倍体を選択した。芽胞形成培地に二倍体を移した後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。結果として生ずる一倍体株でのｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１及びｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２改変の存在をコロニーＰＣＲによって決定し、残存する遺伝学的特徴を標準方法を用いて記録した。交配によって生じた一倍体株の組から、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２を有する株を選択し、ＦＳ０１３７２と命名した。
【０３２８】
実施例２７
ＡＣＣ１の過剰発現
アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼをコードする酵母遺伝子ＡＣＣ１を、強力な酵母構成プロモーターで過剰発現させた。このことは、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法を用いて、野生型ＡＣＣ１プロモーターをＴＰＩ１プロモーターによって置き換えることでおこなった（図１５）。Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からなる二連基質の一部分を、ＴＰＩ１プロモーター配列とにＡＣＣ１の先頭部分に対応する標的配列とに融合させた。ＡＣＣ１の上流にある標的配列からなる二連基質を、ＴＰＩ１プロモーター配列とＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）とに融合させた。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択との後に、形質転換体が得られ、該形質転換体では、野生型プロモーターがノック・アウトされてＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子の片側上の直接反復配列としてのＴＰＩ１プロモーター配列の２つのコピーと置き換えられている。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第２の組み換えイベントを、ＵＲＡ３遺伝子を発現する細胞に対して毒性を示す５’−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含む培地上で形質転換体を置き換えることで、選択した。これによって、野生型ＡＣＣ１プロモーターがＴＰＩ１プロモーターと置き換わっている株が得られた。
【０３２９】
二連基質の部分１を構築するために、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）をプラスミドｐＷＪ７１６から増幅させた。この際、プライマーとして５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＴＴＴＣＴＧＧ３’を用いた。更に、ＴＰＩ１プロモーター配列を酵母ゲノムＤＮＡから増幅させた。この際、プライマーとして５’ＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧＴＡＴＧＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣ３’及び５’ＴＴＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧ３’を用いた。更に、ＡＣＣ１遺伝子の先頭部分からなる下流標的配列（すなわち、その遺伝子の最初の５５３ｂｐ）を酵母ゲノムＤＮＡから増幅させた。この際、プライマーとして、５’ＡＧＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＧＣＧＡＡＧＡＡＡＧＣＴＴＡＴＴＣＧＡＧＴＣ３’及び５’ＣＡＣＣＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＣＣ３’を用いた。これら３つのフラグメントを、ＰＣＲを２ラウンドすることで、互いに融合させた。最初に、プライマーとして５’ＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧＴＡＴＧＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣ３’及び５’ＣＡＣＣＴＡＡＡＧＡＣＣＴＣＡＴＧＧＣＧＴＴＡＣＣ３’を用いて、ＴＰＩ１プロモーター配列を下流標的配列に融合させた。次に、結果として生じた生成物を、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）を含むフラグメントに融合させた。結果として得られるフラグメント、すなわち３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＰＩ１−ＤＯＷＮ（ＡＣＣ１）が、遺伝子標的二連基質の部分１であった。
【０３３０】
二連基質の部分２を構築するために、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）をプラスミドｐＷＪ７１６から増幅させた。この際、プライマーとして、５’ＣＧＧＴＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’を用いた。ＴＰＩ１プロモーター配列を酵母ゲノムＤＮＡから増幅させた。この際、プライマーとして、５’ＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧＴＡＴＧＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣ３’及び５’ＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣＧＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧ３’を用いた。また、ＡＣＣ１の標的配列上流を、ゲノムＤＮＡから増幅させた。この際、プライマーとして、５’ＴＧＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣ３’及び５’ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＴＴＴＣＴＡＡＴＴＴＴＣＴＧＣＧＣＴＧＴＴＴＣＧ３’を用いた。これら３つのフラグメントを、ＰＣＲを２ラウンドすることで、互いに融合させた。最初に、上流標的配列をＴＰＩ１プロモーター配列に融合させた。この際、プライマーとして、５’ＴＧＴＴＣＴＧＣＴＣＴＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＣＴＴＴＣ３’及び５’ＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣＧＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧ３を用いた。次に、結果として生じるフラグメントを、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）を含むフラグメントと融合させ、遺伝子標的二連基質の部分２を構築するフラグメントＵＰ（ＡＣＣ１）−ｐＴＰＩ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３が得られた。
【０３３１】
酵母株ＦＳ０１３７２（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２）を、線状基質ＵＰ（ＡＣＣ１）−ｐＴＰＩ１−５’２／３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＰＩ１−ＤＯＷＮ（ＡＣＣ１）によって形質転換させた。形質転換体の選択及びストリーク精製をウラシル欠損培地中でおこなった後、５−ＦＯＡ含有プレートに移した。ポップ・アウト組み換え体を５ＦＯＡ含有培地上でストリーク精製した。結果として得られた株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｐＴＰＩ１−ＡＣＣ１を有していることから、この株をＦＳ０１３９２と命名した。ＴＰＩ１プロモーターの正確な組込みをコロニーＰＣＲによってチェックした。
【０３３２】
実施例２８
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＰＯＸ１遺伝子座でのＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１の組込み
デルタ−９不飽和化酵素をコードするＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子をＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムに組込み、酵母ＴＤＨ３プロモーターの制御下においた。ＴＤＨ３プロモーター及びＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子を、ベータ酸化経路の第１の酵素をコードするＰＯＸｌ１遺伝子座を組み込むことで、この遺伝子のノック・アウトが生じた。組込みを、遺伝子標的二連基質を用い、同一組み換えを介して、おこなった（図１６）。Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からなる二連基質の一部を、ＴＤＨ３ プロモーター配列、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子、及びＰＯＸ１の下流にある標的配列に融合させた。ＰＯＸ１の上流にある標的配列からなる二連基質の第２の部分を、ＴＤＨ３  プロモーター配列とＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）とに融合させた。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択の後、形質転換体を得た。この形質転換体では、ＰＯＸ１がノック・アウトされて、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子の片側にある直接反復配列としてのＴＤＨ３プロモーター配列の２つのコピーと、第２のＴＤＨ３プロモーター反復配列の直ぐ下流にあるＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子によって置換されている。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第２の組み換えイベントを、ＵＲＡ３遺伝子を発現する細胞には毒性のある５’−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含む培地上に形質転換体を再播種することで、選択した。これによって、ＰＯＸ１遺伝子が、ＴＤＨ３プロモーターの制御下でＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１によって置換されている株が得られた。
【０３３３】
手順は以下のとおり：
遺伝子標的二連基質の部分１（図１６）の構築をおこなうために、ＴＤＨ３プロモーターが後に続くＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からなるフラグメントを、プラスミドＰＷＪ７１６−ＴＤ１を用いて、ＰＣＲにより増幅した。この際、プライマーとして、５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＧＧＧＧＧＧＡＡＧＡＧＧＡＧＴＴＧＣＣＡＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧ３’を用いた。更に、実施例１の記載通りに単離したＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子（配列番号：１）をＰＣＲによって再び増幅させた。この際、プライマーとして５’ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣ３’及び５’ＴＴＧＴＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＴＧＡＴＡＣＣＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧＡＣＧＴＧＧ３’を用いた。ＰＯＸ１の下流にある標的配列をＰＣＲによって酵母ゲノムＤＮＡから増幅した。この際、プライマーとして、５’ＧＴＡＴＣＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＴＣＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＴＴＴＴＧＣ３’及び５’ＴＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣ３’を用いた。次に、これら３つのフラグメントを、ＰＣＲを２ラウンドおこなうことで、融合させた。最初に、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子を下流標的配列に融合させた。この際、プライマーとして、５’ＡＴＧＧＣＡＡＣＴＣＣＴＣＴＴＣＣＣＣＣＣＴＣＣ３’及び５’ＴＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣ３’を用いた。次に、結果として得られるフラグメントを、ＴＤＨ３プロモーターが後に続くＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）を含むフラグメントに、融合させた。結果として得られるフラグメント、すなわちｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１−ＤＯＷＮ（ＰＯＸ−１）は、標的二連基質の部分１を構成した。
【０３３４】
二連基質の第２の部分を構築するために、ＰＯＸ１の上流にある標的配列をＰＣＲによって増幅した。この際、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、プライマーとして５’ＡＡＴＴＣＧＧＴＡＡＡＴＴＣＡＡＴＧＧＧＴＡＧ３’及び５’ＴＴＡＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＴＡＡＡＴＡＴＡＧＧＧＣＴＴＡＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡＧＧ３’を用いた。更に、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）が後に続くＴＤＨ３プロモーターからなるフラグメントを、ＰＣＲによって増幅させた。この際、プラスミドｐＷＪ７１６−ＴＤ２をテンプレートとして用いた。この増幅ではプライマーとして、５’ＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＧ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’を使用した。次に、プライマーとして５’ＡＡＴＴＣＧＧＴＡＡＡＴＴＣＡＡＴＧＧＧＴＡＧＧ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’を用い、これら２つのフラグメントをＰＣＲによって融合させ、それによって、標的二連基質の部分２を構成するフラグメントＵＰ（ＰＯＸ１）−ｐＴＤＨ３−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３が得られた。
【０３３５】
酵母ＣＥＮ．ＰＫ１１３−５Ｄ（ＭＡＴａ  ｕｒａ３）株を、線状基質ｓＵＰ（ＰＯＸｌ）−ｐＴＤＨ３−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１−ＤＯＷＮ（ＰＯＸ１）によって形質転換させ、ウラシル欠損培地に播種した。形質転換体の選択及びストリーク精製をウラシル欠損培地中でおこなった後、５−ＦＯＡ含有プレートに移した。ポップ・アウト組み換え体を５ＦＯＡ含有培地上でストリーク精製した。その結果として得られた株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を有しており、該株をＦＳ０１３６７と命名した。ＴＤＨ３プロモーター及びＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１の正確な組込みと、ＰＣＲによって生じた突然変異が欠如していることを、改変領域のシークエンシングによって確認した。
【０３３６】
ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１改変と適当な遺伝マーカーとを組み合わせるために、ＦＳ０１３６７（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１）を、ＦＳ０１２６９（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｔｒｐ１）と交配させた。二倍体をウラシル及びトリプトファン欠損培地上で選択した後、芽胞形成培地に移した。芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。結果として生ずる一倍体株にｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１改変が存在することは、コロニーＰＣＲによって決定し、残存する遺伝学的特徴を標準方法を用いて記録した。交配によって生じた一倍体株の組から、遺伝子型ＭＡＴａｌｐｈａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を選択してＦＳ０１３６８と命名した。
【０３３７】
実施例２９
ＤＧＡ１の過剰発現
ジアシルグリセロール・アシルトランスフェラーゼをコードする酵母遺伝子ＤＧＡ１を、強力な酵母構成プロモーターによって過剰発現させた。このことを、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法を用いて野生型ＤＧＡ１プロモーターをＴＤＨ３プロモーターと置き換えたことによって、おこなった（図１５）。Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からなる二連基質の一部分を、ＴＤＨ３プロモーター配列とＤＧＡ１の先頭部分に一致する下流標的配列と融合させた。ＤＧＡ１の上流にある標的配列からなる二連基質の第２の部分を、ＴＤＨ３  プロモーター配列及びＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）に融合させた。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択の後、形質転換体を得た。この形質転換体では、野生型プロモーターがノック・アウトされ、かつＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子の片側にある直接反復配列としてのＴＤＨ３プロモーター配列の２つのコピーによって置き換えられた。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第２の組み換えイベントを、ＵＲＡ３遺伝子を発現する細胞には毒性のある５’−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含む培地上に形質転換体を再播種することで、選択した。このことから、野生型ＤＧＡ１プロモーターがＴＤＨ３プロモーターによって置き換えられている株が得られた。
【０３３８】
手順は以下のとおり：
遺伝子標的二連基質の部分１（図１５）の構築をおこなうために、ＴＤＨ３プロモーターが後に続くＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からなるフラグメントを、プラスミドＰＷＪ７１６−ＴＤ１を用いて、ＰＣＲにより増幅した。この際、プライマーとして、５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＴＩＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＧ３’を用いた。更に、ＤＧＡ１の先頭部分に一致する下流標的配列を、酵母ゲノムＤＮＡからＰＣＲを用いて増幅させた。この際、プライマーとして、５’ＣＧＡＡＴＡＡＡＣＡＣＡＣＡＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＴＣＡＧＧＡＡＣＡＴＴＣＡＡＴＧＡＴＡＴＡ３’及び５’ＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＣＴＴＡＴＡＧＧＧ３’を用いた。次に、これらのフラグメントを、ＰＣＲを用いて融合させた。この際、プライマーとして、５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＧＴＴＴＴＡＡＡＴＴＧＡＣＡＧＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＣＴＴＡＴＡＧＧＧ３’を用いた。結果として生ずるフラグメント３’ ｐＡＤＨ１-５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＤＨ３−ＤＯＷＮ（ＤＧＡ１）は、標的二連基質の部分１を構成した。
【０３３９】
二連基質の第２の部分を構築するために、ＤＧＡ１の上流にある標的配列をＰＣＲによって増幅した。この際、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、プライマーとして５’ＴＴＴＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＧＴＡＧＧ３’及び５’ＡＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＣＧＴＣＣＧＡＴＡＡＡＣＡＧＧＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＧＧＣＧ３’を用いた。更に、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）が後に続くＴＤＨ３プロモーターからなるフラグメントを、プラスミドｐＷＪ７１６−ＴＤ２をテンプレートとして用い、ＰＣＲによって増幅させた。この増殖で用いたプライマーは、５’ＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＡＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＧ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’であった。次に、これら２つのフラグメントを、プライマーとして５’ＴＴＴＴＧＧＣＴＧＴＴＧＴＴＣＣＡＧＧＴＣＧＴＡＧＧ  ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’を用いたＰＣＲによって融合させることで、フラグメントＵＰ（ＤＧＡ１）−ｐＴＤＨ３−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３が得られ、該フラグメントは標的二連基質の部分２を構成した。
【０３４０】
酵母ＦＳ０１２０２株（ＭＡＴａ  ｕｒａ３）を、線状基質、すなわちＵＰ（ＤＧＡ１）−ｐＴＤＨ３−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＤＨ３−ＤＯＷＮ（ＤＧＡ１）によって形質転換させ、ウラシル欠損培地に播種した。形質転換体の選択及びストリーク精製をウラシル欠損培地中でおこなった後、５−ＦＯＡ含有プレートに移した。ポップ・アウト組み換え体を５ＦＯＡ含有培地上でストリーク精製した。その結果として得られた株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｐＴＤＨ３−ＤＧＡ１を有しており、これをＦＳ０１３４４と命名した。ＴＤＨ３プロモーターの正確な組込み及びＰＣＲによって生じた突然変異が存在しないことを、改変領域のシークエンシングによって確認した。
【０３４１】
ＤＧＡ１過剰発現を適当な遺伝マーカーと組み合わせるために、ＦＳ０１３４４（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｐＴＤＨ３−ＤＧＡ１）を、ＦＳ０１２６９（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｔｒｐ１）と交配させた。二倍体をウラシル及びトリプトファン欠損培地で選択した後、芽胞形成培地に移した。芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。結果として生ずる一倍体でのｐＴＤＨ３−ＤＧＡ１の存在は、コロニーＰＣＲによって決定され、株での交配によって生じた一倍体株の組から、残存する遺伝学的特徴を、標準方法を用いて記録した。遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＴＤＨ３−ＤＧＡ１を持つ株を選択してＦＳ０１３７０と命名した。
【０３４２】
実施例３０
ＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＹＤＲ５３１Ｗ
グリセロール−３−ホスフェート・アシルトランスフェラーゼをコードする酵母遺伝子ＧＡＴ１，１−アシル−１−ｓｎ−グリセロール−３−ホスフェート・アシルトランスフェラーゼをコードするＳＣＬ１、及びパントテン酸塩キナーゼをコードすると考えられているＹＤＲ５３１Ｗという酵母遺伝子を、すべて、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法を用い、強力な構成ＴＰＩ１プロモーターによって、過剰発現させた（図１５）。各々の過剰発現について、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からなる二連基質の第一の部分を、ＴＰＩ１プロモーター配列と、過剰発現すべき遺伝子の先端部分に対応した標的配列を融合させた。過剰発現すべき遺伝子の上流にある標的配列からなる二連基質の第２の部分を、ＴＰＩ１プロモーター配列及びＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）に融合させた。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択の後、形質転換体が得られ、ここでは野生型プロモーターがノック・アウトされ、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子の片側上の直接反復配列としてＴＰＩ１プロモーター配列の２つのコピーと置換されている。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第２の組み換えイベントの選択は、５−ＦＯＡ含有培地上に形質転換体を再び播種することで、おこなった。したがって、ポップ・アウト組み換え体では、野生型プロモーターをＴＰＩ１プロモーターと置き換えることで、ＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＹＤＲ５３１Ｗの過剰発現がそれぞれ生じた。
【０３４３】
二連基質の部分１を構築するために、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向を）プラスミドｐＷＪ７１６で増幅させた。この際、用いたプライマーは、５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＴＴＴＣＴＧＧ３’であった。更に、ＴＰＩ１プロモーター配列を酵母ゲノムＤＮＡから増幅させた。この際、用いたプライマーは、５’ＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧＴＡＴＧＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣ３’及び５’ＴＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＡＡＡＡＣＴＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧ３’であった。次に、ＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＹＤＲ５３１Ｗの先頭部分からそれぞれなる下流標的配列を、ゲノム酵母ＤＮＡから増幅させた。プライマー対５’ＡＧＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＣＣＧＣＴＧＣＣ３’及び５’ＡＡＣＣＴＴＴＴＣＧＴＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＧＧ３’を用いて、ＧＡＴ１下流標的配列の増幅に用い、プライマー対５’ＡＧＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＡＧＴＧＴＧＡＴＡＧＧＴＡＧＧＴＴＣＴＴＧ３’及び５’ＡＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＡＴＡＧＡＧＣＡＣＧ３’を用いて、ＳＬＣ１標的配列の増幅に用いた。また、プライマー対５’ＡＧＴＴＴＴＴＴＴＡＡＴＴＴＴＡＡＴＣＡＡＡＡＡＡＴＧＣＣＧＣＧＡＡＴＴＡＣＴＣＡＡＧ３’及び５’ＧＡＣＴＡＧＡＡＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＡＴＡＧＣＣ３’を用いてＹＤＲ５３１Ｗ標的配列の増幅に用いた。ＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＹＤＲ５３１Ｗ下流標的配列の各々を、次にＰＣＲによってＴＰＩプロモーターに融合させた。この際、フォワード・プライマーとして５’ＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧＴＡＴＧＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣ３’、またリバース・プライマーとして５’ＡＡＣＣＴＴＴＴＣＧＴＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＧＧ３’（ＧＡＴ１標的配列との融合用）、５’ＡＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＡＴＡＧＡＧＣＡＣＧ３’（ＳＬＣ１標的配列との融合用）、５’ＧＡＣＴＡＧＡＡＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＡＴＡＧＣＣ３’（ＹＤＲ５３１Ｗ標的配列用）を用いた。最後に、結果として得られる融合産物を、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からなるフラグメントに対して、ＰＣＲにより融合した。この際、プライマーとして５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’を用い、またリバース・プライマーとして５’ＡＡＣＣＴＴＴＴＣＧＴＡＡＡＧＴＴＣＡＣＴＧＧ３’（ＧＡＴ１標的配列との融合用）、５’ＡＧＧＡＡＡＡＡＣＣＣＡＴＡＧＡＧＣＡＣＧ３’（ＳＬＣ１標的配列との融合用）、又は５’ＧＡＣＴＡＧＡＡＧＧＴＡＴＧＧＧＴＡＧＡＴＡＧＣＣ３’（ＹＤＲ５３１Ｗ標的配列用）を用いた。結果として得られるフラグメントである３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＰＩ１−ＤＯＷＮ（ＧＡＴ１）、３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＰＩ１−ＤＯＷＮ（ＳＬＣ１）、及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＰＩ１−ＤＯＷＮ（ＹＤＲ５３１Ｗ）によって、それぞれＧＡＴ１及びＳＬＣ１過剰発現に用いられる遺伝子標的二連基質の部分１を構成した。
【０３４４】
二連基質の部分２を構成するために、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向を、プラスミドｐＷＪ７１６から増幅させた。この際、プライマーとして、５’ＣＧＧＴＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’を用いた。また、ＴＰＩ１プロモーター配列を酵母ゲノムＤＮＡから増幅させた。この際、プライマーとして５’ＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＡＣＧＴＡＴＧＧＴＣＡＴＴＴＣＴＴＣＴＴＣ３’及び５’ＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣＧＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴＧ３’として用いた。更に、ＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＹＤＲ５３１Ｗの上流にある標的配列を、ＰＣＲによって酵母ゲノムＤＮＡから増幅した。この際、プライマー対として、ＧＡＴ１標的配列用に、５’ＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＧ３’及び５’ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＧ３’、ＳＬＣ１標的配列用に、５’ＴＴＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴＧＴＣＣＡＡＧＡＣ３’及び５’ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＣＣＴＴＣＡＣＣＴＴＡＡＡＣＣＣＴＴＣＣ３’、並びにＹＤＲ５３１Ｗ標的配列用に、５’ＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＧ３’及び５’ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＡＡＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＴＴＣＡＧＧＧ３’が用いられる。次に、ＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＹＤＲ５３１Ｗ上流標的配列の各々を、ＰＣＲによりＴＲＩプロモーターに融合させた。この際、リバース・プライマーとして、５’ＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣＧＴＴＴＴＡＧＴＴＴＡＴＧＴＡＴＧＴＧＴＴＴＴＴＴ３’を用い、フォワード・プライマーとして、５’ＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＧ３’（ＧＡＴ１標的配列との融合用）、５’ＴＴＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴＧＴＣＣＡＡＧＡＣ３’（ＳＬＣ１標的配列との融合用）、或いは５’ＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＣ３’（ＹＤＲ５３１Ｗ標的配列との融合用）を用いる。最後に、結果として得られる融合産物は、ＰＣＲにより、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）からなるフラグメントに融合した。この際、リバース・プライマーとして５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’、フォワード・プライマーとして５’ＧＧＴＡＡＡＧＡＡＡＡＣＴＡＣＡＡＡＴＣＴＧＧＧ３’（ＧＡＴ１標的配列との融合用）、フォワード・プライマーとして５’ＴＴＧＣＴＴＴＡＡＡＣＡＴＣＴＧＴＣＣＡＡＧＡＣ３’（ＳＬＣ１標的配列との融合用）、又は５’ＴＧＴＣＴＴＣＣＴＡＴＴＴＴＣＴＣＴＧＡＣＣＣ３’（ＹＤＲ５３１Ｗ標的配列との融合用）を使用した。結果として生ずるフラグメント、ＵＰ（ＧＡＴ１）−ｐＴＰＩ１−５’２／３  Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３、ＵＰ（ＳＬＣ１）−ｐＴＰＩ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３、及びＪＰ（ＹＤＲ５３１Ｗ）−ｐＴＰＩ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３が、それぞれＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＹＤＲ５３１Ｗの過剰発現に使用される遺伝子標的二連基���の部分２を構成した。
【０３４５】
ＧＡＴ１過剰発現について、酵母Ｆ０１３７２(ＭＡＴａ  ｕｒａ３ ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１ ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２）を線状基質ＵＰ（ＧＡＴ１）−ｐＴＰＩ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＰＩ１−ＤＯＷＮ（ＧＡＴ１）によって形質転換した。同様に、ＳＬＣ１過剰発現については、Ｆ０１３７２を線状基質ＵＰ（ＳＬＣ１）−ｐＴＰＩ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３  及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＰＩ１−ＤＯＷＮ（ＳＬＣ１）によって形質転換し、ＹＤＲ５３１Ｗ過剰発現については、Ｆ０１３７２を線状基質ＵＰ（ＹＤＲ５３１Ｗ）−ｐＴＰＵ−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＴＰＩ１−ＤＯＷＮ（ＹＤＲ５３１Ｗ）で形質転換した。形質転換体の選択及びストリーク精製をウラシル欠損培地中でおこなった後、５−ＦＯＡ含有プレートに移した。ポップ・アウト組み換え体を５ＦＯＡ含有培地上でストリーク精製した。結果として得られた株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｐＴＰＩ１−ＧＡＴ１、ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｐＴＰＩ１−ＳＬＣ１、及びＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｐＴＰＩ１−ＹＤＲ５３１Ｗを有しており、それぞれＦＳ０１３９５、ＦＳ０１３９４、及びＦＳ０１３９３と命名した。ＴＰＩ１プロモーターの正確な組込みをすべての株で、コロニーＰＣＲによって確認した。
【０３４６】
実施例３１
ＹＢＲ１５９Ｗ及びＴＳＣ１３の過剰発現
ベータ−ケトアシル−ＣｏＡ合成酵素をコードする酵母遺伝子ＹＢＲ１５９Ｗとトランス−２−エノイル−ＣｏＡ還元酵素をコードする酵母遺伝子ＴＳＣ１３とを、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法（図１５）を用いて、強い構成ＡＤＨ１プロモーターで、両方とも過剰発現させた。各々の過剰発現について、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からなる二連基質の第１の部分を、ＡＤＨ１ プロモーター配列と過剰発現させる遺伝子の先頭部分に対応する標的配列とを融合させた。過剰させる遺伝子の上流にある標的配列からなる二連基質の第２の部分を、ＡＤＨ１  プロモーター配列及びＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）に融合させた。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択の後、形質転換体を得た。この形質転換体では、野生型プロモーターをノック・アウトし、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子の片側に直接反復配列としてＡＤＨ１プロモーター配列の２つのコピーと置き換えた。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第２の組み換えイベントの選択を、５−ＦＯＡ含有培地上で形質転換体を置換させることでおこなった。ポップ・アウト組み換え体では、したがって、野生型プロモーターをＡＤＨ１プロモーターと置換することで、ＹＢＲ１５９Ｗ及びＴＳＣ１３の過剰発現がそれぞれ得られた。
【０３４７】
手順は以下の通り：
遺伝子標的二連基質（図１５）を構築するために、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）及びＡＤＨ１プロモーターのフラグメントを、プラスミドｐＷＡＤ１を増幅させた。この際、ＹＢＲ１５９Ｗ標的配列に対してはプライマー対５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣ３’を用い、ＴＳＣ１３標的配列に対してはプライマー対５’ＧＣＡＴＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＣＣＴＡＴＣＡＣＣＡＴＡＡＡＡＡＧＣＣ３’及び５’ＧＧＡＡＧＣＣＧＴＡＧＣＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣ３’を用いた。最終的に、ＹＢＲ１５９Ｗ及びＴＳＣ１３下流標的配列を、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向及びＡＤＨ１プロモーターからなるフラグメントと、ＰＣＲにより融合させた。ＹＢＲ１５９Ｗについては、プライマー対５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＧＡＣＣＡＡＣＡＴＴＡＴＴＧＡＣＣＡＡＡＡＣＧＧ３’を用いて融合反応をおこない、ＴＳＣ１３ついては、プライマー対５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＧＧＡＡＧＣＣＧＴＡＧＣＣＡＡＡＧＴＡＡＣＣ３’を用いた。結果として得られる融合産物３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ＰＡＤＨ１−ＤＯＷＮ（ＹＢＲ１５９Ｗ）及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＡＤＨ１−ＤＯＷＮ（ＴＳＣ１３）は、ＹＢＲ１５９Ｗ及びＴＳＣ１３プロモーター置換にそれぞれ用いられる標的二連基質の部分１であった。
【０３４８】
標的二連基質の部分２を構築するために、ＡＤＨ１プロモーターとＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３（５’末端方向）の２／３とからなるフラグメントを、プラスミドｐＷＡＤ２をテンプレートとして用いて、ＰＣＲにより最初に増幅させた。この増幅に用いたプライマーは、５’ＧＧＡＣＧＴＴＣＣＣＴＧＴＡＴＧＴＡＣＴＡＧＧＧＧＧＡＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＧ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’であった。次に、上流標的配列を酵母ゲノムＤＮＡから増幅させた。この際、ＹＢＲ１５９Ｗ  上流標的配列についてはプライマー対５’ＧＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＧＣＣＣ３’及び５’ＡＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＣＧＴＣＣＡＡＣＧＣＴＴＴＴＡＴＴＣＧＴＧＡＡＡＴＣＴＣ３’を用い、またＴＳＣ１３上流標的配列についてはプライマー対５’ＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＡＣ３’及び５’ＡＧＴＡＣＡＴＡＣＡＧＧＧＡＡＣＧＴＣＣＡＡＴＴＣＡＡＡＡＴＡＴＧＴＡＴＣＴＣＴＣＴＣ３’を用いた。次に、上流標的配列を、既に構築されているｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３フラグメントと融合させた。融合反応に使用したリバース・プライマーは、５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’であり、またフォワード・プライマーは５’ＧＡＡＡＡＡＡＴＣＡＴＴＧＧＡＴＧＣＣＣ３’（ＹＢＲ１５９Ｗ標的配列用）又は及び５’ＧＴＴＡＴＴＧＡＡＡＧＣＡＡＴＧＧＧＣＡＡＣ３’（ＴＳＣ１３標的配列用）であった。結果として得られる融合産物ＵＰ（ＹＢＲｌ  ５９Ｗ）−ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３ (ＴＳＣ１３)−ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３は、ＹＢＲ１５９Ｗ及びＴＳＣ１３プロモーター置換にそれぞれ用いられた標的二連基質の部分２であった。
【０３４９】
ＹＢＲ１５９Ｗ過剰発現については、酵母株Ｆ０１３７２（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ＰＡＤＨ１−ＦＡＳ２）を、線状基質ＵＰ（ＹＢＲ１５９Ｗ）−ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＡＤＨ１−ＤＯＷＮ（ＹＢＲ１５９Ｗ）によって形質転換させた。同様に、ＴＳＣ１３過剰発現については、Ｆ０１３７２を線状基質ＵＰ（ＴＳＣ１３）−ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３及び３’ｐＡＤＨ１−５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３−ｐＡＤＨ１−ＤＯＷＮ（ＴＳＣ１３）によって形質転換させた。形質転換体の選択及びストリーク精製をウラシル欠損培地中でおこなった後、５−ＦＯＡ含有プレートに移した。ポップ・アウト組み換え体を５ＦＯＡ含有培地上でストリーク精製した。結果として得られた株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｐＡＤＨ１−ＹＢＲ１５９Ｗ及びＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｐＡＤＨ１−ＴＳＣ１３を有しており、それぞれをＦＳ０１４２７及びＦＳ０１４４０と命名した。ＡＤＨ１プロモーターの正確な組込みを、両方の株でのコロニーＰＣＲによって確認した。
【０３５０】
実施例３２
菌類ＡＴＰ：クエン酸リアーゼのサブユニットをコードする遺伝子の単離
菌類ＡＴＰ：クエン酸リアーゼは、別々の遺伝子によってコードされる２つのサブユニットからなる。油性酵母ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）では、これら２つのサブユニットが遺伝子ａｃｌ１及びａｃｌ２によってコードされている（Ｍｉｎｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２０００  Ｃｕｒｒ  Ｇｅｎｅｔ  ３７：１８９−１９３）。Ｓ．マクロスポラ（Ｓ．ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）ａｃｌ１及びａｃｌ２のコード配列を、テンプレートとしてＳ．マクロスポラ（Ｓ．ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）ＣＢＳ９５７．７３由来の第１鎖ｃＤＮＡからＰＣＲによって単離した。増幅に用いた所定のプライマーは、公表されたａｃｌ１のコード配列（配列番号：８０）及びａｃｌ２のコード配列（配列番号：８２）であった。手順を以下に説明する：
【０３５１】
Ｓ．マクロスポラ（Ｓ．ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）ＣＢＳ９５７．７３を、１００ｍｌのＹＥＰＡ培地（１％酵母エキス、２％ペプトン、及び２％酢酸塩、ｐＨ６．０）で、室温で４日間にわたり撹拌しながら培養した。バイオマスを濾過によって回収し、トリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）試薬（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて全ＲＮＡを単離した。５μｇのＲＮＡを使用して逆転写（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をおこなった。この際、Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）１２−１８をプライマーとして用いた。第１鎖ｃＤＮＡ合成後、相補的ＲＮＡをＲＮアーゼ消化により取り除いた。次に、ｃＤＮＡをＰＣＲ（Ｐｈｕｓｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅ，Ｆｉｎｎｚｙｍｅｓ）のテンプレートとして用い、この際、以下のプライマーを用いた。ａｃｌ１については、５’ＧＣＡＴＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧＣＡＡＣＴＡＧＣＡＣＣ３’及び５’ＴＴＧＴＴＡＴＴＧＴＡＡＴＧＴＧＡＴＡＣＴＴＡＡＡＴＴＴＧＧＡＣＣＴＣＡＡＣＡＣＧＡＣＣ３’を用い、ａｃｌ２については、５’ＴＴＡＧＧＣＣＴＧＧＡＡＣＴＣＣＡＣＣＧＣＡＣ３’及び５’ＣＧＡＡＴＡＡＡＣＡＣＡＣＡＴＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＡＡＴＧＴＣＴＧＣＧＡＡＧＡＧＣＡＴＣ３を用いた。結果として得られた予測サイズのフラグメントを、アガロース・ゲルから切り出し、ＧＦＸカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて精製した。
【０３５２】
実施例３３
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノム内への菌類ＡＴＰ：クエン酸リアーゼのサブユニットをコードする遺伝子の取り込み
ＡＴＰ：クエン酸リアーゼ（ａｃｌ１及びａｃｌ２）の２つのサブユニットを組込むために使われる戦略を図１７に示す。ゲノムへの組込みのための親株として、ＦＳ１０３９６（ＰＯＸ１遺伝子座に組み込まれたＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を有する株）を選択した。ａｃｌ１及びａｃｌ２遺伝子を、この株のＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１遺伝子の下流に組み込んだ。この際、４種類の線状フラグメント、すなわちＡＣＬ−Ｆ１、ＡＣＬ−Ｆ２、ＡＣＬ−Ｆ３、及びＡＣＬ−Ｆ４からなる遺伝子標的基質を用いた。ＡＣＬ−Ｆ１は、正配向のＣＹＣターミネーター配列と逆配向のＡＤＨ１ターミネーター配列に加えて、ゲノム内の正しい位置に基質を向けるための上流標的配列を含む。ＡＣＬ−Ｆ１は、それに加えて、ＡＣＬ−Ｆ２の５’末端と同一である２０ｂｐの３’配列を含んだ。ＡＣＬ−Ｆ２は、ＴＤＨ３プロモーターの制御下、逆方向のａｃｌ２遺伝子を含み、正配向のＡＤＨ１プロモーターと融合した。ＡＣＬ−Ｆ２は、更に、ＡＣＬ−Ｆ３の５’末端と同一である２０ｂｐの３’配列を含むのものであった。ＡＣＬ−Ｆ３は、正配向のＡＤＨ１プロモーター配列が後に続く逆配向の完全Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子からなるものであった。ＡＣＬ−Ｆ４は、ａｃｌ１遺伝子からなり、ゲノム内の正しい位置に基質を向けるために使われる下流標的配列に融合した。更に、ＡＣＬ−Ｆ４は、ＡＣＬ−Ｆ３の３’末端と同一である２０ｂｐの５’配列を含んだ。
【０３５３】
ＡＣＬ−Ｆ１の３’末端及びＡＣＬ−Ｆ２の５’末端上、ＡＣＬ−Ｆ２の３’末端及び５’末端上、並びにＡＣＬ−Ｆ３の３’末端及びＡＣＬ−Ｆ４の５’末端の間にある重複配列は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の同一組み換えによる生体内での完全遺伝子標的基質のアセンブリを可能にした。したがって、ＦＳ０１３９６を線状基質であるＡＣＬ−Ｆ１、ＡＣＬ−Ｆ２、ＡＣＬ−Ｆ３、及びＡＣＬ−５により形質転換させ、組み込まれたゲノム位置での完全遺伝子標的基質の組込みを、ウラシル欠損培地上に形質転換体を再び播種することによって確認した。このことによって、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１がＣＹＣ１ターミネーターに今や連結するように、完全標的基質がＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１の直下流に組み込まれている株が得られた。更に、ａｃｌ２遺伝子をＴＤＨ３プロモーターによる制御下に置き、すべてが逆方向で、ＡＤＨ１ターミネーターに連結した。マーカー遺伝子Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３を正方向に組込み、このマーカーの片側で直接反復反列としてのＡＤＨ１プロモーターによってフランキングした。最後に、ａｃｌ１遺伝子をＡＤＨ１プロモーターの制御下、かつ下流標的配列に対応するＰＯＸ１ターミネーター配列の直上流に置いた（図１７）。次に、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子を、５−ＦＯＡ培地上で形質転換体を再播種することで、ループ・アウトした。
【０３５４】
手順は以下のとおり：
フラグメントＡＣＬ−Ｆ１を構築するために、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１の５’末端に対応する上流標的配列を最初に、ＰＣＲで増幅した。この際、テンプレートとしてゲノムＤＮＡを用い、プライマーとして５’ＣＡＡＣＧＣＴＡＴＣＣＧＣＴＴＴＴＡＣＣＡＧＴ３’及び５’ＣＴＡＴＴＣＧＧＣＣＴＴＧＡＣＧＴＧＧＴＣＡＧＴＧＣ３’を用いた。更に、逆配向でＣＹＣ１及びＡＤＨ１ターミネーターを含むフラグメントを、ＰＣＲにより増幅させた。この際、プラスミドｐ３００をテンプレートとして用い、またプライマーとして、５’ＧＣＡＣＴＧＡＣＣＡＣＧＴＣＡＡＧＧＣＣＧＡＡＴＡＧＣＣＧＣＴＣＴＡＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧ３’及び５’ＧＴＧＣＧＧＴＧＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＣＣＴＡＡＣＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＡ３’を用いた。その結果、フラグメントＡＣＬ−Ｆ１が得られた。
【０３５５】
フラグメントＡＣＬ−Ｆ２を構築するために、逆方向のＴＤＨ３プロモーターと正方向のＡＤＨ１プロモーターとを含むフラグメントをＰＣＲによって増幅させた。この際、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５−ＡＴ（実施例３４）をテンプレートとして用い、またプライマーとして５’ＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＧ３’及び５’ＧＴＴＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣＧＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣ３’を用いた。結果として得られるフラグメントをＰＣＲによってａｃｌ２遺伝子に融合させ、実施例１０の記載通りに単離した。この際、プライマーとして、５’ＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＧＡＡＡＣＴＡＡＧ３’及び５’ＧＴＴＡＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣＧＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣ３’を用いた。結果として得られるフラグメントをＡＣＬ−Ｆ２とした。
【０３５６】
フラグメントＡＣＬ−Ｆ３を構築するために、ＡＤＨ１プロモーターの上流にある完全Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子を含むフラグメントをプラスミドｐＷＡＤ２からＰＣＲによって増幅させた。この際、用いたフラグメントは、５’ＣＧＧＴＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣ３’及び５’ＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣ３’であった。結果として得られるフラグメントは、ＡＣＬ−Ｆ３を含むものであった。
【０３５７】
フラグメントＡＣＬ−Ｆ４を構築するために、ＰＯＸ１ターミネーター配列に対応する流標的配列をゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。この際、プライマーとして、５’ＧＴＡＴＣＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＴＣＧＡＡＣＣＣＴＣＴＧＴＴＴＴＧＣ３’及び５’ＴＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣ３’を用いた。結果として得られるフラグメントをａｃｌ１遺伝子に融合させ、実施例３２の記載通りに単離した。この際、プライマーとして、５’ＧＣＡＴＡＣＡＡＴＣＡＡＣＴＡＴＣＴＣＡＴＡＴＡＣＡＡＴＧＣＣＴＴＣＣＧＣＡＡＣＴＡＧＣＡＣＣ３’及び５’ＴＴＡＧＡＧＣＴＴＣＡＴＴＣＣＡＡＣＡＡＧＴＧＣＣ３’を用いた。
【０３５８】
酵母株ＦＳ０１３９６（ＭＡＴａ  ｕｒａ３−５２  ｔｒｐ１  ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２、実施例３６）を、線状フラグメント、すなわちＡＣＬ−Ｆ１、ＡＣＬ−Ｆ２、ＡＣＬ−Ｆ３、及びＡＣＬ−Ｆ４によって形質転換させた。形質転換体の選択及びストリーク精製をウラシル欠損培地中でおこなった後、５−ＦＯＡ含有プレートに移した。ポップ・アウト組み換え体を５ＦＯＡ含有培地上でストリーク精製した。結果として得られた株は、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−ｍｏｌｅｌ−ｐＡＤＨ１−Ｓ．マクロスポラ（Ｓ．ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）ａｃｌ１−ｐＴＤＨ３−Ｓ．マクロスポラ（Ｓ．ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）ａｃｌ２を有しており、この株をＦＳ０１４２５と命名した。完全遺伝子標的基質の正確なアセンブリと正確なゲノム位置での組込みを、コロニーＰＣＲで確認した。
【０３５９】
実施例３４
プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５−ＡＴの構築
プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５−ＡＴは、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５の分岐ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターと引き替えに、短いバージョンのＴＤＨ３及びＡＤＨ１プロモーターを含む。短いバージョン（ＴＤＨ３及びＡＤＨ１開始コドンのそれぞれ６７４及び４３９ｂｐ上流に一致するフラグメント）のＴＤＨ３及びＡＤＨ１プロモーターをＰＣＲによって増幅した。この際、酵母ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用い、またｐＴＤＨ３増幅に対してはプライマー対５’ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴΓＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＧ３’及び５’ＡＡＡＴＧＧＡＡＡＡＡＧＧＧＴＡＧＴＧＡＡＡＡＧＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡＴＣＡＡＴＡＣＴＧＣＣＡＴＴＴＣ３’を用い、またｐＡＤＨ１増幅に対してはプライマー対５’ＴＴＴＣＡＣＴＡＣＣＣＴＴＴＴＴＣＣＡＴＴＴＧＣＣＡＴＣ３’及び５’ＴＴＣＣＣＧＧＧＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣ３’を用いた。次に、２つのフラグメントをＰＣＲで融合した。この際、プライマー５’ＡＡＧＣＧＧＣＣＧＣＴＴＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＡＴＧＴＧＴＧＴＴＴＡＴＴＣＧ３’及び５’ＴＴＣＣＣＧＧＧＴＧＴＡＴＡＴＧＡＧＡＴＡＧＴＴＧＡＴＴＧＴＡＴＧＣ３’を用いた。このことによって、分岐配向にあるＴＤＨ３及びＡＤＨ１プロモーターの短いバーションからなるフラグメントが得られ、該フラグメントは、ＮｏｔＩ制限部位を５’末端に有し、またＸｍａＩ制限部位を３’末端に有した。ＮｏｔＩ及びＸｍａＩによる制限の後、フラグメントをＮｏｔＩ／ＸｍａＩ消化ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５に導入した。これによって、プラスミドｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５−ＡＴが得られ、分岐ＧＡＬ１０／ＧＡＬ１プロモーターが分岐ＴＤＨ３／ＡＤＨ１プロモーターと置き換わっている。ＰＣＲにより生じた突然変異がｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５−ＡＴにないことは、ｐＴＤＨ３/pＡＤＨ１プロモーター配列のシークエンシングによって確認した。
【０３６０】
実施例３５
アンモニア同化改変とＦＡＳ過剰発現との組合わせ
ＧＤＨ１遺伝子の欠失並びにＧＤＨ２遺伝子又はＧＬＮ１及びＧＬＴ１遺伝子の過剰発現は、酵母のアンモニア同化経路の共同因子依存性の変化をもたらし、このような改変を受けた株は、脂肪酸合成に用いられるＮＡＤＰＨの有用性が高まるように思われる。したがって、ＧＤＨ１の欠失及びＧＤＨ２の過剰発現を、ＦＡＳ１及びＦＡＳ２の過剰発現と組み合わせた。同様に、ＧＤＨ１の欠失及びＧＬＮ１及びＧＬＴ１の過剰発現もまた、ＦＡＳ１及びＦＡＳ２の過剰発現と組み合わせた。このことは、アンモニア同化改変を含む株とＦＡＳ１及びＦＡＳ２の過剰発現を含む株とを交配させることでおこなった。結果として生ずる二倍体の芽胞形成、子嚢の芽胞形成及び切開に続いて、新規の一倍体を、所望同定の遺伝的改変を有するかどうか同定した。上記アンモニア同化改変を有する本実施例で用いたＣＥＮ．ＰＫ株を、ＣＥＮ．ＭＳ１−１０Ｃ  Ｔ１及びＣＥＮ．ＭＳ５−３Ａ株から誘導した。これらの株は、Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｉｏ−Ｃｅｎｔｒｕｍ  ＤＴＵ，Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｄｅｎｍａｒｋの好意により入手されたものである。手順は以下のとおりである。
【０３６１】
ＧＤＨ１欠失及びＧＤＨ２過剰発現とをＦＡＳ１及びＦＡＳ２過剰発現と組み合わせるために、酵母株ＦＳ０１２５４（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｕｒａ３  ｇｄｈ１：：ｌｏｘＰ  ｇｄｈ２：：ＰＧＫｐ−ＧＤＨ２−ＫａｎＭＸ３）を株ＦＳ０１３７２（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１-ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２, 実施例２６）と交配させた。二倍体をウラシル及びトリプトファン欠損培地上で選択した後、芽胞形成培地に移した。芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。結果として生じる一倍体株に改変ｇｄｈ：：ＰＧＫｐ−ＧＤＨ２−ＫａｎＭＸ３が存在することを、ゲネチシン含有プレートにレプリカ・プレーティングをおこなうことで、決定した。ｇｄｈ：：ＰＧＫｐ−ＧＤＨ２−ＫａｎＭＸ３ノックアウト、ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１過剰発現、及びｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２過剰発現の存在を、適当なプライマーを用いてコロニーＰＣＲにより決定し、残りの遺伝的特徴は標準方法を用いて記録した。交配によって生じた一倍体株の組から、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ＰＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｇｄｈｌ：：ｌｏｘＰ  ｇｄｈ２：：ＰＧＫｐ−ＧＤＨ２−ＫａｎＭＸ３を有する株を選択して、これをＦＳ０１３９８と命名した。
【０３６２】
ＦＡＳ１及びＦＡＳ２を過剰ＧＤＨ１欠失、ＧＬＮ１過剰発現、及びＧＬＴ１過剰発現と組み合わせるために、連続交配をおこなった。最初に、ＦＳ０１３３５株（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｇｄｈ１：：ＰＧＫｐ−ＧＬＮ１−ＫａｎＭＸ３  ｇｌｔ１：：ＰＧＫｐ−ＧＬＴ１−ＫａｎＭＸ３）をＦＳ０１３７２（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳＺ）と交配させた。この交配から細胞を単一コロニーにストリーク・アウトし、いくつかのコロニーをマスター・プレートに移し、更に、選択されたコロニーを芽胞形成培地上での芽胞形成能について調べることで、二倍体の同定をおこなった。芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。結果として得られる一倍体株でのｇｌｎ１：：ＰＧＫｐ−ＧＬＮ１−ＫａｎＭＸ３及びｇｌｔ１：：ＰＧＫｐ−ＧＬＴ１−ＫａｎＭＸ３は、ゲネチン含有プレートへのレプリカ・プレーティングをおこなうことで、また適当なプライマーを用いてコロニーＰＣＲをおこなうことで決定した。ｇｌｔ１：：ｌｏｘＰノックアウト、ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１過剰発現、及びｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２の存在をコロニーＰＣＲによって決定し、標準方法を用いて交配型を記録した。交配によって生じた一倍体株の組から、２つの株ＦＳ０１４１９（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｇｄｈ１：：ｌｏｘＰ  ｇｌｔ１：：  ＰＧＫｐ−ＧＬＴｌ−ＫａｎＭＸ３）及びＦＳ０１４２０（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｇｄｈ１：：ｌｏｘＰ  ｇｌｔ１：：ＰＧＫｐ−ＧＬＴｌ−ＫａｎＭＸ３）を選択した。
【０３６３】
第２に、ＦＳ０１４１９及びＦＳ０１４２０を交配させ、ＦＳ０１３３５×ＦＳ０１３７２交配に関する上記記載通りに選択した。芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。結果として生ずる一倍体におけるｇｌｎｌ：：ＰＧＫｐ−ＧＬＮｌ−ＫａｎＭＸ３及びｇｌｔｌｒ：：ＰＧＫｐ−ＧＬＴｌ−ＫａｎＭＸ３の存在を、ゲニチシン含有プレートへのレプリカ・プレーティングをおこなうことで決定した。ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２過剰発現の存在を、コロニーＰＣＲによって決定し、標準法を用いて交配型を記録した。交配によって生じた一倍体株の組から、ＦＳ０１４３７株（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  pＡＤＨ１-ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｇｄｈ１：：ｌｏｘＰ  ｇｌｔ１：：ＰＧＫｐ−ＧＬＴｌ−ＫａｎＭＸ３  ｇｌｎｌ：：ＰＧＫｐ−ＧＬＮｌ−ＫａｎＭＸ３）を選択した。ＦＳ０１４３７株でのｇｄｈ１：：ｌｏｘＰ欠失及びｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２過剰発現の存在をコロニーＰＣＲで確認した。
【０３６４】
実施例３６
ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１改変とＦＡＳ過剰発現及びＡＣＣ１過剰発現との組み合わせ
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１の遺伝的組込みをＦＡＳ１及びＦＡＳ２の過剰発現と組み合わせるために、ＦＳ０１３６８（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１、実施例８）を、Ｆ０１３７２（ＭＡＴａ  ｕｒａ３ ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１-ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２、実施例２６）と交配させた。二倍体の同定を、交配から単一コロニーに細胞をストリーク・アウトし、多数のコロニーをマスター・プレートに移し、選択されたコロニーが芽胞形成培地での芽胞形成能を持つか試験することで、おこなった。芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。結果として生ずるＡＤＨ１−ＦＡＳ１及びｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２過剰発現の一倍体の存在と、ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１改変の存在とを、適当なプライマーを用いたコロニーＰＣＲで決定し、標準方法を用いて交配型を記録した。交配によって生じた一倍体株の組から、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を持つ株を選択し、これをＦＳ０１３９６と命名した。更に、遺伝子型ＭＡＴａｌｐｈａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を持つ株を選択し、これをＦＳ０１４０８と命名した。
【０３６５】
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１のゲノム組込みとＦＡＳ２の過剰発現とをＡＣＣ１過剰発現と更に組み合わせるために、ＦＳ０１４０８（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１、上記のように誘導）をＦＳ０１３９２（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｐＴＰＩ１−ＡＣＣ１、実施例２７）と交配させた。二倍体を、前述のＦＳ０１３６８×Ｆ０１３７２交配と同様に選択し、芽胞形成培地に移した。芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。結果として生じた一倍体株でのｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２及びｐＴＰＩ１−ＡＣＣ１過剰発現の存在と、ｐｏｘｌ：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１改変の存在とを、適当なプライマーを用いたコロニーＰＣＲによって決定し、交配型を標準法を用いて記録した。交配によって生じた一倍体株の組から、遺伝子型ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２  ｐＴＰＩ１−ＡＣＣ１  ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を選択し、これをＦＳ０１４２３と命名した。
【０３６６】
実施例３７
遺伝子組み換え酵母でのアラキドン酸への経路の発現
先行する実施例に記載した改変株背景でのアラキドン酸への経路を発現させるために、改変株をプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６及びｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５によって同時形質転換させた。形質転換によって生じる株の概要を表４に示す。
【０３６７】
表４．アラキドン酸産生株、それらの遺伝子型、及び親株のまとめ
2008501323.tif 000007
【０３６８】
実施例３８
振とうフラスコ内でのアラキドン酸産生酵母株の脂肪酸組成
株ＦＳ０１３２４（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１［ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６］［ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５］）とその代謝的に改変された株ＦＳ０１３７３、ＦＳ０１４１３、ＦＳ０１３６９、ＦＳ０１３７１、ＦＳ０１４１７、ＦＳ０１４１４、ＦＳ０１４１５、ＦＳ０１４１６、ＦＳ０１４１８、ＦＳ０１４２９、ＦＳ０１４３０、ＦＳ０１４３１、ＦＳ０１４３９、及びＦＳ０１４４２（実施例３７）を実施例９に記載したように、１７℃で振とうフラスコ内で培養した。炭素源欠乏後、脂質を抽出し、その株の脂質組成を実施例４５に記載したようにして分析した。分析の結果を表５に示す。ピークを完全分離するＳＰ−Ｘカラムを用いて、試料すべてを分析した。比較のために、実施例１２（表２）示す結果は、ＪＷ−１７０１カラムを用いて得られたものであり、このカラムはピークを完全に分けるものではないことから、結果として、より小さいピークの面積比の過剰評価となる。
【０３６９】
１６：０よりも１８：０に特異性が高い菌類デルタ−９不飽和化酵素をコードするＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１の導入は、１６：１のレベルを減少させ、それに対応する１８：１及びＰＵＦＡが増加をもたらした（ＦＳ０１３６９、表５ａ）。アラキドン酸の含有量は、参照株ＦＳ０１３２４に比べてＦＳ０１３６９でほぼ倍加した（全脂肪酸の０．２５８％と比べて０．６３％）。
【０３７０】
ＦＡＳ１及びＦＡＳ２の過剰発現（ＦＳ０１３７３株）とＡＣＣ１（ＦＳ０１４１３株）との過剰発現によって、参照株ＦＳ０１３２４（表５ａ）と比べてＡＲＡ含有量がわずかならが増加した。ＦＳ０１４１７株では、ＦＡＳ１及びＦＡＳ２過剰発現がＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１の発現と組み合わさった。この株の脂肪酸組成は、ＦＳ０１３６９株（唯一の遺伝子組み換えとしてＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を有する）の組成と類似していた。
【０３７１】
ＦＳ０１４１４株でパントテン酸キナーゼをコードしていると推定されるＹＤＲ５３１Ｗの過剰発現は、参照株と比べて脂肪酸組成の著しい変化をもたらさなかった。ＴＡＧ合成に関与するアシルトランスフェラーゼをすべてがコードするＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＤＧＡ１は、別々に過剰発現した（それぞれＦＳ０１４１６、ＦＳ０１４１５、及びＦＳ０１３７１）。これら３つの遺伝子のすべてについて、過剰発現によってアラキドン酸のレベルが低下した（表５ａ、表５ｂ）。また、ＳＬＣ１及びＧＡＴ１の過剰発現について、１６：１含有量は、全ＦＡの１０％まで増加した。
【０３７２】
ＧＤＨ１が欠失し、ＦＡＳ１及びＦＡＳ２に加えてＧＤＨ２を過剰発現するＦＳ０１４１８株は、ＦＳ０１３７３（ＦＡＳ１及びＦＡＳ２を過剰発現）と比較してアラキドン酸の量が少なかった（表５ｂ）。ＦＳ０１４３９株は、ＧＤＨ１が欠失し、ＦＡＳ１及びＦＡＳ２に加えてＧＬＮ１及びＧＬＴ１を過剰発現するもので、ＦＳ０１３７３での０．３９％に比べてアラキドン酸０．４４％を含有した。
【０３７３】
ＦＳ０１４３０株は、強力な酵母構成プロモーターの制御下で油性菌類ソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）由来のクエン酸リアーゼであるＡＴＰのサブユニットをコードする２つの遺伝子を持つ。また、この株は、ＦＡＳ１、ＦＡＳ２、及びＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を過剰発現する。Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を発現する株で典型的なことは、１６：１の含有量が、参照株ＦＳ０１３２４と比べて、この株では減少しているということである。ＦＳ０１４３０は、１８：１及び１８：２の含有量が高く、その親株ＦＳ０１４１７（ＦＡＳ１、ＦＡＳ２、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を過剰発現）と比較してＡＲＡ含有量がわずかながら高い。
【０３７４】
ＦＳ０１４３１株では、β−ケトアシル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子ＹＢＲ１５９Ｗが、ＦＡＳ１／ＦＡＳ２過剰発現という背景のもとで過剰発現した。ＦＳ０１４３１は、ＦＳ０１３７３（ＦＡＳ１及びＦＡＳ２を過剰発現）と比べて、高ＡＲＡ含有量を示さなかったが、１６：１の含有量は高かった（表５ｂ）。しかし、１８：３から２０：３への伸長は、１００×（２０：３＋２０：４）／（１８：３＋２０：３＋２０：４）として計算した場合、ＦＳ０１３７３での１９％変換からＦＳ０１４３１での２５％変換に改善された。
【０３７５】
表５ａ．振とうフラスコ内で分析したアラキドン酸への経路を発現する代謝的に改変された株の脂肪酸組成（全脂肪酸に占める％割合）
2008501323.tif 000008
【０３７６】
表５ｂ．振とうフラスコ内で分析したアラキドン酸への経路を発現する代謝的に改変された株の脂肪酸組成（全脂肪酸に占める％割合）
2008501323.tif 000009
【０３７７】
ＦＳ０１４４２株では、トランス−２−エノイル−ＣｏＡ還元酵素をコードする遺伝子ＴＳＣ１３がＦＡＳ１／ＦＡＳ２を過剰発現するという背景のもとで、過剰発現した。このことによって、ＦＳ０１３７３の全脂肪酸の０．３９％（ＦＡＳ１及びＦＡＳ２の過剰発現）からＦＳ０１４４２の全脂肪酸の０．７５％（ＦＡＳ１、ＦＡＳ２、及びＴＳＣ１３の過剰発現）まで、アラキドン酸含有量が著しく増加した。アラキドン酸含有量の増加は、１００×（２０：３＋２０：４）／（１８：３＋２０：３＋２０：４）として計算した場合、ＦＳ０１３７３での１９％変換からＦＳ０１４３１での５１％変換まで、伸長効率の増加によりものであった。
【０３７８】
実施例３９
振とうフラスコでのアラキドン酸産生酵母の脂質収率
参照株ＦＳ０１３２４（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１［ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６］［ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅＩｏ−デルタ−５］）と代謝的に改変された株ＦＳ０１３７３、ＦＳ０１４１３、ＦＳ０１３６９、ＦＳ０１３７１、ＦＳ０１４１７、ＦＳ０１４１４、ＦＳ０１４１５、ＦＳ０１４１６、ＦＳ０１４１８、ＦＳ０１４２９、ＦＳ０１４３０、ＦＳ０１４３１、及びＦＳ０１４３９（実施例３７）を実施例１９に記載したように、１７℃で培養した。脂質を実施例４４に記載したように抽出して定量した。改変された株の脂質収率、バイオマス収率、及びアラキドン酸収率を表６にまとめる。
【０３７９】
表６．振とうフラスコで分析したアラキドン酸産生酵母の脂質収率、バイオマス収率、アラキドン酸収率。炭素源でのアラキドン酸の収率を、脂肪酸が脂質の７０％（ｗ／ｗ）を構成するという仮定の下で計算した。アスタリスク（＊）によって印を付けた株；これらの株については、指数増殖期中程で脂肪を抽出した、を除いて、全株について炭素源の枯渇後すぐに脂肪を抽出した。
2008501323.tif 000010
【０３８０】
この分析によれば、ＦＡＳ１／ＦＡＳ２単独（ＦＳ０１３７３株）単独の過剰発現は、ＦＳ０１３２４株と比較して、脂質収量の増加をもたらさなかった。しかし他の改変（ＡＣＣ１、ＹＤＲ５３１Ｗ、ＳＬＣ１、ＧＡＴ１、又はＳ．マクロスポラ（Ｓ．ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）ａｃｌ１及びａｃｌ２のいずれかの過剰発現、ＰＯＸ１欠失、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１過剰発現、ＧＤＨ２過剰発現と組み合わせたＧＤＨ１欠失、ＧＬＮ１及びＧＬＴ１過剰発現と組み合わせたＧＤＨ１欠失）と組み合わせたＦＡＳ１／ＦＡＳ２は、参照株と比較して、脂質収率の増加をもたらさなかった。参照株ＦＳ０１３２４での０．１０ｍｇ／ｇヘキソースと比較して、この株は０．１８ｍｇ／アラキドン酸／ｇヘキソースを産生した。
【０３８１】
実施例４０
ケモスタット発酵
連続培養を、ブラウン・バイオスタット（Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｓｔａｔ）Ｂ発酵槽（Ｂｒａｕｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）でおこなった。限定最小培地中での４８時間振とうフラスコ培養から得た細胞を用い、日立製作所製Ｕ−１００分光光度計（日本東京）による測定でＯＤ６００が０．２となるように、１．０リットル培地への植菌をおこなった。発酵は、１７℃で、２ＭのＫＯＨで調製したｐＨ５．０でおこなった。泡立ちは、１リットルの培地あたり１００μｌの消泡剤（Ａｎｔｉｆｏｒｍ  ２０４，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を用いて防いだ。好気条件は、溶存酸素濃度が６０％を上回るように、流速１．５〜２．５リットル／分で滅菌空気を発酵槽にまき散らすことで得た。撹拌速度を８００ｒｐｍに保ち、流出二酸化炭素ガス濃度をブルーエル・カイヤー（Ｂｒｕｅｌ  ａｎｄ  Ｋｊａｅｒ）音響ガス分析装置（Ｂｒｕｅｌ＆Ｋｊａｅｒ，Ｄｅｎｍａｒｋ）によって測定した。炭素源が消費された後、希釈率０．０５ｈ−１で段階制御連続発酵モードを適用した。
【０３８２】
実施例４１
ケモスタット発酵で使用される増殖培地
グルコース又はエタノールを炭素源とする炭素制限培地は、１２．５ｇ／ｌのグルコース又は１０／ｌのエタノール、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／ｌのビタミン溶液、１ｍｌ／ｌの微量金属溶液を含むものとした。グルコース／ガラクトース炭素制限最少培地は、２．５ｇ／ｌのグルコース、１０ｇ／ｌのガラクトース、５ｇ／ｌの（ＮＨ４）２ＳＯ４、３ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｍｌ／ｌのビタミン溶液、及び１ｍｌ／ｌの微量金属溶液を含むものとした。上記したすべての培地について、ビタミン溶液は、５０ｍｇ／ｌのビオチン、１ｇ／ｌのパントテン酸カルシウム、１ｇ／ｌのニコチン酸、２５ｇ／ｌのミオイノシトール、１ｇ／ｌのチアミンＨＣｌ、１ｇ／ｌのピリドキサルＨＣｌ、及び０．２ｇ／ｌのパラアミノベンゾン酸を含むものとし、微量金属溶液は、１５ｇ／ｌのＥＤＴＡ、４．５ｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌのＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、０．３ｇ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．４ｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、４．５ｇ／ｌのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３ｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／ｌのＨ３ＢＯ３、及び０．１ｇ／ｌのＫＩを含むものとした。改良ミオイノシトール欠損培地は、ミオイノシトールを含まず、さもなければブドウ糖／ガラクトース・カーボンを制限された最少培地と同一のものとした。
【０３８３】
実施例４２
ＨＰＬＣ分析
培養液中のグルコース、ガラクトース、エタノール、グリセロール、酢酸塩、及びピルビン酸塩濃度は、遠心を介して培養液から細胞を取り除いた後に、ダイオネクス・スミット（Ｄｉｏｎｅｘ  Ｓｕｍｍｉｔ）ＣＬＣシステム（Ｄｉｏｎｅｘ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を用いた液体カラム・クロマトグラフィによって測定した。２１０ｎｍに設定したウオーターズ４１０ディファレンシアル（Ｗａｔｅｒｓ  ４１０  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ）屈折率検出器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）及びウオーターズ（Ｗａｔｅｒｓ）４８６同調光吸度測定器（ＵＶ検出器）とともに、アミネックス（Ａｍｉｎｅｘ）ＨＰＸ−８７Ｈカラム（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を６０℃で用いた。２つの検出器を直列に接続した。移動相として、５ｍＭのＨ２ＳＯ４を流速０．６ｍｌ／分で用いた。
【０３８４】
実施例４３
バイオマス乾燥重量測定
細胞乾燥重量の測定は、既知量の培養液を、予め計量した０．４５μｍスポア（Ｓｕｐｏｒ）膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）フィルターで濾過することで、おこなった。１容量の蒸留水で洗い、かつ１５０Ｗで１５分間にわたり電子レンジによる乾燥をおこなった後、フィルターを再び計量した。
【０３８５】
実施例４４
総脂質分析
総脂質収量を分析するために、バイオマスを、５分間、５０００ｒｐｍの遠心にかけて分離した。バイオマスを１０ｍｌの蒸留水に再び溶解させ、結果として生ずる細胞懸濁液をガラス・ビーズ法で破壊し、細胞抽出物を生成した。細胞抽出物の調製は、直径２５０乃至５００μｍのガラス・ビーズ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）１ｍｌをスクリュー・キャップが付いた微小管に入った１ｍｌの細胞懸濁液に対して添加することでおこなった。各々の細胞懸濁液に対して、６本の試験管を処理した。試験管を、ファスト・プレプ（ＦａｓｔＰｒｅｐ）ＦＰ１２０機器（Ｑｂｉｏｇｅｎｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で２０秒間、レベル４で、振とうさせた。これを各管あたり６ラウンドおこない、その際、３ラウンド後に、管を５分間氷冷させた。６００μｌの細胞抽出物を移すことで２ｍｌエッペンドルフ管内で細胞抽出物の混ぜ合わせをおこない、各々がガラス・ビーズ無しの１．２ｍｌ細胞抽出物を含む３本のエッペンドルフ管を得た。１ｍｌの細胞抽出物を、２０ｍｌクロロホルム／メタノール（２：１）を含むねじ蓋付きのガラス管に移した。この管内に窒素を拡散させ、直ちに密閉し、回転混合機にセットし、総質量抽出を一晩おこなった。これを３回反復しておこなった。抽出物をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で濾過し、回収した溶媒を、予め計量した１０ｍｌガラス管内で、４ｍｌのＮａＣｌで洗い、最終的に窒素で乾燥させた。乾燥脂質分画を持つこの管を計量し、当初の細胞懸濁液１ｍｌ中のバイオマスの乾燥重量で脂質乾燥重量を割る計算をおこなうことで、脂質収量を決定した。
【０３８６】
実施例４５
脂質のエステル転移反応とＧＣ−ＭＳ分析
総脂質量を測定するために乾燥脂を生成し（実施例４４）、また乾燥脂質を１ｍｌのトルエンと２ｍｌの１％硫酸含有メタノールに添加した。窒素との混合及び窒素の拡散後に、管を閉じ、脂質のエステル転移反応のために一晩５０℃に置いた。次に試料を５ｍｌの５％ＮａＣｌ溶液で洗浄した。続いて、５ｍｌのヘキサンを添加することで２回抽出し、試料をボルテックス処理し、有機上相を回収した。有機相を４ｍｌの２％炭酸ナトリウムで洗い、有機相を再び回収した。水相の痕跡を、無水硫酸ナトリウムを添加し、試料をワットマン（Ｗｈａｔｍａｎ）濾紙（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｅｎｇｌａｎｄ）で濾過することで取り除き、硫酸ナトリウムを除去した。次に、ヘキサン相を窒素気流で乾燥させた。乾燥した場合、二重結合を保護するために０．０１％ブチルオキシトルエン（ＢＨＴ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）含有ヘキサン０．５ｍｌに、試料を再び溶解させ、メチルセルロースについて試料を分析した。分析は、ガスクロマトグラフ質量分析計（ＧＣ／ＭＳ）を用いておこなった。ＧＣ／ＭＳ装置を、７０ｅＶで作動するガスクロマトグラフ４重質量選択検出器（ＥＩ）を備えたヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ  Ｐａｃｋａｒｄ）ＨＰＧ１７２３Ａとした。カラムとして、スペルコ（Ｓｐｅｌｃｏ）ＳＰ（登録商標）−２３８０を使用した。上記ＭＳをスキャン（ＳＣＡＮ）モードで作動させた。オーブン温度を、当初１７０℃とし、その後４℃／分で２２０℃まで上昇させた。最終温度で１５分間保った。カラム内の流れを０．６ｍｌＨｅ／分とした。注入量を１〜５μｌとした。すべての分析で、インジェクターを１００：１スプリットレスのスプリットで駆動させた。注入口の温度を３００℃とし、界面温度を２３０℃、更に四重温度１０５℃とした。検出された脂肪酸メチルエステルを、１９９８ＮＩＳＴ質量スペクトル・データベースを確認し、持続時間は標準的脂肪酸メチルエステルで確認した。
【０３８７】
実施例４６
連続発酵でのアラキドン酸産生酵母株の分析
参照株ＦＳ０１３２４（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１［ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６］ [ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５］）及び代謝改変された株ＦＳ０１３７３及びＦＳ０１４１３（実施例３７）を実施例４０に記載したようにケモスタット培養で増殖させた。培地を、実施例４１に記載したように、グルコース／ガラクトース炭素制限最小培地とした。定常状態で、上記実施例に記載したように、ＨＰＬＣ分析、バイオマス乾燥重量、脂質収量、及び脂肪酸組成の分析に、試料を供した。分析のまとめを表７に示す。
【０３８８】
表７．標準炭素制限最少培地における連続発酵でのアラキドン酸産生酵母株のアラキドン酸含有量（全脂肪酸に占める％割合）、脂質収量（バイオマス乾燥重量における％割合）、バイオマス収量（ｇ乾燥重量／ｇヘキソース）、バイオマスでのアラキドン酸収量（ｍｇアラキドン酸／ｇヘキソース）。炭素源でのアラキドン酸収量を、脂肪酸が脂質の７０％（ｗ／ｗ）を構成するという前提で計算した。
2008501323.tif 000011
【０３８９】
すべての株で、振とうフラスコ培養で既に示したものよりもケモスタット培養でのアラキドン酸含量が高かった。しかし、遺伝子組み換え株ＦＳ０１３７３及びＦＳ０１４１３は、炭素制限ケモスタット培養での参照株ＦＳ０１３２４に関連した脂質収量の改善が得られなかった。
【０３９０】
実施例４７
増加アラキドン酸収量のための培地最適化
野生株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄ、参照株ＦＳ０１３２４（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１［ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６］ [ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５］）、及び代謝改変された株ＦＳ０１３７３、ＦＳ０１４１３、ＦＳ０１４１７、及びＦＳ０１４３０（実施例３７）を、実施例４０の記載どおりに、ケモスタット培養で増殖させた。これらの実験で使用した培地は改変炭素制限最小培地であり、この培地はミオイノシトールを含まなかった（実施例４１）。定常状態で、上記実施例に記載したように、ＨＰＬＣ分析、バイオマス乾燥重量、脂質収量、及び脂肪酸組成の分析に、試料を供した。分析のまとめを表８に示す。
【０３９１】
表８．ミオイノシトール欠損炭素制限最少培地における連続発酵でのアラキドン酸産生酵母株のアラキドン酸含有量（全脂肪酸に占める％割合）、脂質収量（バイオマス乾燥重量における％割合）、バイオマス収量（ｇ乾燥重量／ｇヘキソース）、バイオマスでのアラキドン酸収量（ｍｇアラキドン酸／ｇヘキソース）。炭素源でのアラキドン酸収量を、脂肪酸が脂質の７０％（ｗ／ｗ）を構成するという前提で計算した。
2008501323.tif 000012
【０３９２】
ミオイノシトール欠損炭素制限培地では、代謝改変された株、ＦＳ０１３２４、ＦＳ−１３７３、ＦＳ０１３７３、ＦＳ０１４１３、ＦＳ０１４３０、及びＦＳ０１４１７は、すべて、参照株ＦＳ０１３２４よりもアラキドン酸の含有量が高かった。特に、ＦＳ０１４１７株は全脂肪酸の３．５％がアラキドン酸であり、それに対して参照株ＦＳ０１３２４では０．８％であった。遺伝子組み換え株の能力の概要を図１８に示す。
【０３９３】
実施例４８
全脂肪酸収量増加のための培地最適化
振とうフラスコ実験（実施例３９）の結果と比較して、改変株は、実施例４６及び４７のケモスタット培養で、参照株と比較して脂質収量の増加がみられなかった。このことは、実験が脂質集積には最適ではない炭素制限化で行われることに起因していると思われる。したがって、代謝改変された株が、脂質集積を促進する条件下で分析した場合、参照株に比較して脂質収量の増加が起こり得る。脂質蓄積のためのケモスタット条件を最適化するために、野生株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄを、異なる培地組成物で実施例４０に記載したように、ケモスタットで増殖させた。これらの実験で使用した培地は、（ｉ）炭素源としてのグルコースを有する炭素制限、（ｉｉ）炭素源としてグルコースを有する窒素制限、（ｉｉｉ）炭素源としてエタノールを有する炭素制限、或いは、（ｉｖ）炭素源としてエタノールを有する窒素制限のいずれかであった（実施例４１）。定常状態で、上記実施例に記載したように、ＨＰＬＣ分析、バイオマス乾燥重量、及び脂質収量の分析に、試料を供した。分析のまとめを表９に示す。
【０３９４】
表９．ｉ）炭素源としてのグルコースを有する炭素制限培地、ｉｉ）炭素源としてグルコースを有する窒素制限培地、ｉｉｉ）炭素源としてエタノールを有する炭素制限、或いは、ｉｖ）炭素源としてエタノールを有する窒素制限培地によるケモスタッドで増殖した野生株ＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄのバイオマス収量及び脂質収量。
2008501323.tif 000013
【０３９５】
この分析によって、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のケモスタット培養での脂質収量が、グルコース制限培地よりもむしろ窒素制限培地を用いた場合に、ほぼ倍加した。
【０３９６】
実施例４９
最適化増殖培地による連続発酵でのアラキドン酸産生酵母株の分析
参照株ＦＳ０１３２４（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１［ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６］ [ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５］）及び改変株ＦＳ０１３７３、ＦＳ０１４１３、ＦＳ０１３６９、ＦＳ０１３７１、ＦＳ０１４１７、ＦＳ０１４１４、ＦＳ０１４１５、ＦＳ０１４１６、ＦＳ０１４１８、ＦＳ０１４２９、ＦＳ０１４３０、ＦＳ０１４３１、ＦＳ０１４３９、及びＦＳ０１４４２（実施例３７）を、窒素制限、ミノイノシトール欠損培地を用いた連続培養で増殖させた。定常状態で、上記実施例に記載したように、ＨＰＬＣ分析、バイオマス乾燥重量、脂質収量、及び脂肪酸組成の分析に、試料を供した。窒素制限培地を使用することで、脂肪収量の増加を導くことが予想されることから、アラキドン酸収量の増加をもたらす。また、脂質収量の改善を目的とした遺伝子組み換えがなされた株は、窒素制限培地で参照株よりも脂質収量が高くなる可能性がある。
【０３９７】
実施例５０
デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする遺伝子を含む単一酵母発現ベクターであるｐ３００の構築
ＰＵＦＡ経路の発現に必要なプラスミドの数を少なくするために、アラキドン酸生産に必要な４つの遺伝子（−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ６−伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素をコードするＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）遺伝子）を単一のプラスミドｐ３００に配置した。ｐ３００を構築するために用いた戦略を図１９に示した。最初に、第２のＰａｃＩ制限部位をＮｈｅＩ制限部位でｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６に導入した。この目的のために、パリンドローム合成オリゴヌクレオチド５’ＣＴＡＧＣＡＡＴＴＣＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＧＡＡＴＴＧ３’を用いた。このオリゴヌクレオチドは、それ自体をアニールし、ＰａｃＩ制限部位とＮｈｅＩ制限部位に一致する両端のオーバーハングとを含む二本鎖ＤＮＡフラグメントを生ずる。このフラグメントを、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６のＮｈｅＩ制限部位にクローニングすることで、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６−ＰａｃＩが得られた。次に、背中合わせの配向にあるＡＤＨ１及びＣＹＣ１ターミネーター配列を含むフラグメントを、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６−ＰａｃＩに導入した。ＡＤＨ１−ＣＹＣ１−ターミネーター・フラグメントを構築するために、ＡＤＨ１ターミネーターをＰＣＲで増幅させ、この際プライマーとして５’ＴＧＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＴＴＧＡＧＣＧＡＣＣＴＣＡＴＧＣＴＡＴＡＣＣＴＧＡＧＡＡＡＧ３’及び５’ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＡ３’を用い、またＣＹＣ１ターミネーターをＰＣＲで増幅させ、この際プライマーとして５’ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＣＴＡＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧ３’及び５’ＡＡＣＡＣＣＴＴＣＴＣＧＡＧＡＡＣＡＣＴＴＣＧＡＧＣＧＴＣＣＣＡＡＡＡＣＣ３’を用い、両方の反応のテンプレートとしてｐＥＳＣ−ＵＲＡを用いた。ＡＤＨ１及びＣＹＣ１ターミネーター・フラグメントの精製後、それらをプライマー５’ＧＡＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＴＣＴＡＡＣＣＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧ３’及び５’ＣＣＡＴＣＧＡＴＧＧＣＧＡＡＴＴＴＣＴＴＡＴＧＡＴＴＴＡＴＧＡＴＴＴＴＴＡ３’を用いてＰＣＲにより増幅させた。これらのプライマーに含まれるＣｌａＩ及びＢｇＩＩＩ制限部位によって、ＡＤＨ１-ＣＹＣ１-ターミネーター・フラグメントをＣｌａＩ／ＢｇｌＩＩ消化ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６−ＰａｃＩに導入し、結果としてプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６−ＰａｃＩ−Ｔが得られた。ターミネーター配列に変異が存在しないことを、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６−ＰａｃＩ−Ｔのシークエンシングによって確認した。プラスミドｐ３００を構築するために、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６−ＰａｃＩ−ＴをＰａｄにより消化することで、デルタ−１２不飽和化酵素をコードするＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）遺伝子、分岐ＧＡＬ１／ＧＡＬ１０プロモーター、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）デルタ−６不飽和化酵素をコードする遺伝子、ＡＤＨ１ターミネーター、並びにＣＹＣターミネーターを含むインサート（図１９）の放出をもたらした。このインサートを、精製し、Ｐａｄ消化ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５に導入することで、結果としてプラスミドｐ３００が得られた。ｐ３００内のｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６−ＰａｃＩ−Ｔ-由来インサートの正確な配向を制限分析によって確認した。
【０３９８】
実施例５１
Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）由来オメガ−３不飽和化酵素の酵母発現ベクターへのクローニング
オメガ−３不飽和化酵素をコードするＦＡＤ３遺伝子（配列番号：３２）をＡ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ｃＤＮＡ調製品（植物正常組織第１鎖ｃＤＮＡ／シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）、ゲントール・モルキュラー・プロダクト（Ｇｅｎｔａｕｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））から増幅させた。この際、プライマーとして、５’ＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＴＴＧＴＴＧＣＴＡＴＧＧＡＣＣＡＡＣ３’及び５’ＧＧＧＧＴＡＣＣＡＴＴＡＡＴＴＧＡＴＴＴＴＡＧＡＴＴＴＧＴＣＡＧＡＡＧＣＧＴＡＡ３’を用いた。これらのプライマーによって、遺伝子の５’及び３’末端に、それぞれＸｈｏＩ及びＫｐＮＩ制限部位が導入される。Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＦＡＤ３遺伝子を、ＸｈｐＩ／ＫｐＮＩ消化ｐＥＳＣ−ＴＲＰに導入することで、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−Ａｒｏ３を得た。Ａ．タリアナ（Ａ．ｔｈａｌｉａｎａ）ＦＡＤ３に変異がないことを、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−Ａｒｏ３のシークエンシングにより確認した。
【０３９９】
実施例５２
サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）からの酵母発現ベクターへのオメガ−３不飽和化酵素のクローニング
オメガ−３不飽和化酵素をコードするＳ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３（配列番号：８７）をＳ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来ゲノムＤＮＡ調製品から増幅させた。この際、プライマーとして、５’ＧＧＴＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＣＡＴＧＴＣＴＡＴＴＧＡＡＡＣＡＧＴＣＧＧ３’及び５’ＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣＴＴ３’を用いた。これらのプライマーによって、この遺伝子の５’及び３’末端に、それぞれＸｈｏＩ及びＳａｃＩＩ制限部位を導入した。Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３遺伝子を、ＸｈｏＩ／ＳａｃＩＩ消化ｐＥＳＣ−ＴＲＰに導入し、結果としてプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ＳＫ３３を得た。クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３に変異がないことを、ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ＳＫ３３のシークエンシングにより確認した。
【０４００】
実施例５３
Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）からのオメガ−３不飽和化酵素の発現及びｐ３００の評価
酵母ＦＳ０１２６７株（ＭＡＴａ  ｔｒｐ１  ｕｒａ３）に対して、ｐ３００及びｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ＳＫ３３による同時形質転換をおこなった。形質転換体をウラシル及びトリプトファン欠損培地でおこない、更に同一培地上でストリーク精製をおこなった。形質転換株をＦＳ０１４３２と命名した。ＦＳ０１４３２を実施例９の記載どおりに振とうフラスコで増殖させ、脂肪酸組成物を実施例４５の記載どおりに分析した。ＦＳ０１４３２、参照株ＦＳ０１３２４、及びＳ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Ｙ１５９の脂肪酸分析を表１０に示した。分析の結果によれば、ＦＳ１０４３２株は、Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来オメガ−３不飽和化酵素及びアラキドン酸への経路を発現するものであり、アルファ−リノール酸と小量のステアリン酸とを含んでいた。この株のアルファ−リノール酸含有量は、ガンマ−リノール酸含有量よりも高いことから、Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）由来のオメガ−３不飽和化酵素が、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）由来のデルタ−６不飽和化酵素よりも、リノール酸をより効率的に不飽和化することを示している。
【０４０１】
表１０．ＦＳ０１３２４株（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１［ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６］［ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５］）、及びＦＳ０１４３２（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１［ｐ３００］［ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ＳＫ３３］）、及びＳ．クリイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）Ｙ１５９の脂肪酸組成。
2008501323.tif 000014
【０４０２】
ＦＳ０１３２４（２つのプラスミドからＡＲＡへの経路を発現）の脂肪酸とＦＳ０１４３２（単一のプラスミドからＡＲＡへの経路を発現）の脂肪酸とを比較すると、当初の基質オレイン酸からリノール酸への変換、並びにリノール酸の下流側にある中間体がＦＳ０１３２４よりもＦＳ０１４３２で効率が劣ることとを観察することができる。したがって、ＦＳ０１４３２では、ＦＳ０１３２４での１１．６％に比べて、２つ以上の二重結合を持つ脂肪酸がたったの６．１％しか含まれない。この減少もまた、ＦＳ０１３２４と比較した場合、ＦＳ０１４３２でのオレイン酸含有量が高いことに反映している。結論として、プラスミドｐ３００からの発現は、元のプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６及びｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５からの発現よりも効率が劣ることが明らかである。
【０４０３】
実施例５４
ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＳＫ３３の構築
ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＳＫ３３を構築するために、Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３を、ＡｐａＩ及びＮｈｅIによる消化によりｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ＳＫ３３（実施例５２）から放出させ、ＡｐａＩ/ＮｈｅＩ消化ｐＥＳＣ−ＬＥＵに導入することで、プラスミドｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＳＫ３３を得た（実施例２０Ａ）。Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３の正確な挿入を制限分析によって確認した。
【０４０４】
実施例５５
ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２の構築
ベクターｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２を構築するために、マウスＳｓｃ２を、ＢｇＩＩＩ及びＰａｃＩによる消化によりｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−５ｅｌｏ（実施例１５）から放出させ、ＢｇＩＩＩ／ＰａｃＩ消化ｐＥＳＣ−ＬＥＵに導入することで、プラスミドｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２を得た（図２０Ｂ）。マウスＳｓｃ２の正確な挿入を制限分析によって確認した。
【０４０５】
実施例５６
ベクターｐＥＳＣ−ＬＵＥ−Ｓｓｃ２−ＳＫ３３の構築
ベクターｐＥＳＣ−ＬＵＥ−Ｓｓｃ２−ＳＫ３３を構築するために、Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３を、ＡｐａＩ及びＮｈｅＩによる消化によってｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−５ｅｌｏ（実施例５２）から放出させ、ＡｐａＩ／ＮｈｅＩ消化ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２−ＳＫ３３（実施例５５）に導入することで、プラスミドｐＥＳＣ−ＬＵＥ−Ｓｓｃ２−ＳＫ３３を得た（図２０Ｃ）。Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３の正確な挿入を制限分析によって確認した。
【０４０６】
実施例５７
ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１背景でのｌｅｕ２突然変異の導入
ゲノムに組み込まれたＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を持つ株でＵＲＡ３、ｔｒｐ１、及びＬＥＵ２マーカーを各々が持つ３つのプラスミドからＰＵＦＡ経路の発現を可能にするために、ｌｅｕ２突然変異をこの株の背景に導入した。この目的のために、ＦＳ０１３５８（ＭＡＴａｌｐｈａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１）をＦＳ０１２７７（ＭＡＴａ  ｕｒａ３  Ｉｅｕ２  ｔｒｐ１）と交配させた。二倍体の同定は、単一コロニーとの交配から細胞をストリーク・アウトし、いくつかのコロニーをマスター・プレートに移し、更に、選択されたコロニーの芽胞形成培地での芽胞形成能について試験することによって、おこなった芽胞形成後、子嚢を切り開いて子嚢胞子四分子にした。ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１改変の存在は、適当なプライマーを用いたコロニーＰＣＲによって判断した。交配由来の一倍体株の組から、遺伝子型ＭＡＴａｌｐｈａ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を持つ株を選択し、これをＦＳ０１４４４と命名した。
【０４０７】
実施例５８
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でのエイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、及びドコサペンタエン酸への経路の発現
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でのエイコサペンタエン酸、ドコサテトラエン酸、及びドコサペンタエン酸への経路を発現させるために、実施例５４〜５６で構築したプラスミドを、２種類のプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６及びｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５とともに酵母に導入することで、結果として株ＦＳ０１４４６、ＦＳ０１４４７、及びＦＳ０１４４８が得られた（表１１）。
【０４０８】
表１１．株ＦＳ０１４４６、ＦＳ０１４４７、及びＦＳ０１４４８の遺伝子型
2008501323.tif 000015
【０４０９】
株ＦＳ０１４４６、ＦＳ０１４４７及びＦＳ０１４４８、並びにＦＳ０１３６９を、５ｇ／ｌグルコース及び２０ｇ／ｌガラクトースを含む限定最小培地で、振とうフラスコ内で、最初に培養（１７℃、１５０ｒｐｍ振とう）した。グルコースを消費した後、細胞がガラクトースで対数増殖しているあいだ、各々の培養の１ｍｌを新たなフラスコ（唯一の炭素源として２０ｇ／ｌガラクトースを有する１００ｍｌ最少培地を含む）に移した。次に、炭素が消費されるまで、細胞を１７℃、１５０ｒｐｍ振とうで培養し、バイオマスを回収し、脂質を実施例１０の記載どおりに抽出し、更に実施例１０の記載どおりに脂肪酸組成を分析した。株の脂肪酸組成を表１２にまとめる。
【０４１０】
表１２．株ＦＳ０１４４６、ＦＳ０１４４７、及びＦＳ０１４４８の脂肪酸組成
2008501323.tif 000016
【０４１１】
この分析によれば、ＦＡＤ３を発現する株ＦＳ０１４４６及びＦＳ０１４４８は、両方ともＳ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）の株であり、エイコサペンタエン酸を生産することがわかった（表１２、図２１）。しかし、ＦＳ０１４４７及びＦＳ０１４４８でのマウスＳｓｃ２の発現は、２０：４から２２：４（又は２０：５から２２：５）への予測された伸長をもたらすことはなかった。
【０４１２】
実施例５９
スラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）由来の合成デルタ−４不飽和化酵素のコドン最適化及び構築
【０４１３】
ラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）デルタ−４不飽和化酵素の配列（配列番号：３５）に対して、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に対するコドン最適化をおこない、合成オリゴヌクレオチドから構築した。手順は以下のとおり。
【０４１４】
デルタ−４不飽和化酵素をコードするスラウストキトリウム（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）ヌクレオチド配列に対して、「５０％理論比よりも低いコドンは破棄」というオプションを付したバックトランスレーション・ツール（Ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ）（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ）を用いて、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に対するコドン最適化をおこなった。次に、コドン最適化遺伝子（配列番号：８４）を化学合成オリゴヌクレオチドから構築した。遺伝子の構築に使用される方法を図２２に示す。センス及びアンチセンス・オリゴヌクレオチドを、その遺伝子の完全配列をカバーするように設計し、各々の相補的センス及びアンチセンス・オリゴヌクレオチドに対して、２０ｂｐ重複が達成されるように設計した（図２２）。センス・オリゴヌクレオチドは各々４０ｂｐ長であり、センス鎖の５’末端から３’末端にかけて構成的にＤ４Ｄ−Ａ０１乃至Ｄ４Ｄ−Ａ３９という番号をつけた。最初に、５つのセンス・オリゴヌクレオチドを５つの相補的アンチセンス・オリゴヌクレオチドと混合することで、二本鎖ＤＮＡの２００ｂｐ断片を構築した。例えば、１００ｐｍｏｌの各々のオリゴヌクレオチドＤ４Ｄ−０１、Ｄ４Ｄ−０２、Ｄ４Ｄ−０３、Ｄ４Ｄ−０４及びＤ４Ｄ−０５、Ｄ４Ｄ−Ｂ４０、Ｄ４Ｄ−３９、Ｄ４Ｄ−３８、Ｄ４Ｄ−３７、及びＤ４Ｄ−３６を混合して、容量５０μｌにした。次に、このオリゴヌクレオチド混合物を、サイズマーカーとともに２％アガロース・ゲルに載せ、２００ｂｐ周辺のススメアをゲルから切り取って精製した。次に、精製混合物を、オリゴヌクレオチドＤ４Ｄ−Ａ０１及びＤ４Ｄ−Ｂ３６をプライマーとして用いるＰＣＲ反応でテンプレートとして用いた。その結果として、所望の２００ｂｐフラグメントの増幅が得られ、Ｄ４Ｄ−１２、Ｄ４Ｄ−３４、Ｄ４Ｄ−５６、及びＤ４Ｄ−７８と命名した。次に、これらのフラグメントをＰＣＲによって融合して、８００ｂｐのフラグメントを２つ形成し、最終的に２つの８００ｂｐフラグメントを融合させて完全な遺伝子を形成した。最終的な融合ＰＣＲ反応を、この遺伝子の５’末端及び３’末端にＸｍａＩ及びＳａｃＩＩ制限部位を導入するプライマー５’ΛＡＴＣＣＣＧＧＧＡＣＣＡＴＧＡＣＡＧＴＴＧＧＴＴＡＣＧＡＴＧＡＧＧ３’及び５’ＡＴＣＣＧＣＧＧＴＴＡＴＧＣＴＧＣＴＣＴＴＴＧＣＣＡＡＣＴＴＴＣＧ３’を用いておこなった。
【０４１５】
実施例６０
合成デルタ−４不飽和化酵素の酵母発現ベクターへのクローニング
合成により構築された、デルタ−４不飽和化酵素（実施例５９）をコードする遺伝子をＸｍａＩ及びＳａｃＩＩによって消化し、ＸｍａＩ/ＳａｃＩＩ消化ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２に導入し、その結果としてプラスミドｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２−デルタ−４ｄが得られた（図２３）。
【０４１６】
実施例６１
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムへのＳ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３の組込み
オメガ−３不飽和化酵素をコードするＳ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３遺伝子を、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムに組込み、酵母ＧＡＬ１プロモーターの制御下に置くことで、この遺伝子をノックアウトした（実施例６６も参照）。この組込みは、遺伝子標的二連基質を用いて、同一組み換えを介しておこなった（図２４）。Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からなる二連基質の第１の部分をＧＡＬ１プロモーター配列、Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３遺伝子、及びＧＰＰ１の下流にある標的配列に融合させた。ＧＰＰ１の上流にある標的配列からなる二連基質の第２の部分に、ＧＡＬ１プロモーター配列おおびＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）を融合させた。ＧＰＰ１がノックアウトされ、第２のＧＡＬ１プロモーター反復配列の直下流にあるＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子及びＳ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３遺伝子の片側に直接反復配列として、ＧＡＬ１プロモーター配列の２つのコピーと置換された。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第２の組み換えイベントを、ＵＲＡ３遺伝子を発現する細胞には毒性のある５’−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含む培地上に形質転換体を再播種することで、選択した。この結果、ＧＰＰ１遺伝子が、ＧＡＬ１プロモーターによる制御下、Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３によって置き換えられた株が得られた。
【０４１７】
手順は以下のとおり：
遺伝子標的二連基質の第１の部分を構築するために、Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３の直上流にＧＡＬ１プロモーターを含むフラグメントを含むフラグメントを、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ＳＫ３３から増幅した（ｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ＳＫ３３の構築に関して実施例１０参照）。この際、プライマーとして、５’ＡＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＣＡＴＡＧ３’及び５’ＴＣＡＴＴＧＡＣＴＧＧＡＡＣＣＡＴＣＴＴ３’を用いた。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＰＰ１の下流にある標的配列をＰＣＲによって増幅した。この際、テンプレートとしてＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡを用い、またプライマーとして５’ＡＡＧＡＴＧＧＴＴＣＣＡＧＴＣＡＡＴＧＡＴＡＡＧＧＡＴＧＡＣＴＴＧＴＴＧＡＡＡＴＧＧＴＡＡ３’及び５’ＣＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣ３’を用いた。３’末端方向のＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３からなる第３のＤＮＡフラグメントをＰＣＲによって生成した。この際、テンプレートとしてＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３を含むプラスミドを、またプライマーとして５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＴＴＴＣＴＧＧ３’を用いた。次に、これらのＰＣＲフラグメントを、ＰＣＲを２ラウンドおこなう過程で融合した。最初に、ＧＡＬ１プロモーター及びＳ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３を含むフラグメントを下流標的配列に融合させた。この際、プライマーとして、５’ＡＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＣＡＴＡＧ３’及び５’ＣＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣ３’を用いた。次に、第１回目の融合反応の産物を３’ｐＡＤＨ１-５’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３フラグメントに融合させた。この際、プライマーとして５’ＣＴＴＧＡＣＧＴＴＣＧＴＴＣＧＡＣＴＧＡＴＧＡＧＣ３’及び５’ＣＣＡＣＡＡＧＡＣＴＧＴＴＴＣＣＡＧＡＧＣ３’を用いた。これによって得られた副産物は、遺伝子標的二連基質の第１の部分を構成する２／３ＵＲＡ３−ｐＧＡＬ１−Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３-ＤＯＷＮであった。
【０４１８】
二連基質の第２の部分を構築するために、ＧＰＰ１の標的配列上流をＰＣＲによって増幅した。この際、テンプレートとしてＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムＤＮＡを用い、またプライマーとして５’ＡＴＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＧＡＡＧＧ３’及び５’ＣＴＧＧＡＡＴＴＣＧＡＴＧＡＴＧＴＡＧＴＴＴＧＡＡＣＧＡＡＡＡＴＧＡＡＣＡＡＧＡＣＧ３’を用いた。ＧＡＬ１プロモーターをＰＣＲによって増幅した。この際、テンプレートとしてｐＥＳＣ−ＴＲＰ−ＳＫ３３を用い、またプライマーとして５’ＡＣＴＡＣＡＴＣＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＡＣＧＡＡＴＣＡＡＡＴＴＡＡＣＡＡＣＣＡＴＡＧ３’及び５’ＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＣ３’を用いた。５’末端方向のＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３からなる第３のフラグメントをＰＣＲによって増幅した。この際、プライマーとして５’ＣＧＧＴＣＴＧＣＡＴＴＧＧＡＴＧＧＴＧＧＴＡＡＣ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’を用い、またテンプレートとしてＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３を含むプラスミドを用いた。これらのＰＣＲフラグメントをＰＣＲを２ラウンドおこなう過程で融合させた。最初に、ＧＡＬ１プロモーターを、プライマー５’ＡＴＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＧＡＡＧＧ３’及び５’ＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＡＴＧＣＡＧＡＣＣＧＣＧＧＧＧＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＴＴＧＡＣ３’を用いて、上流標的配列に融合させた。次に、第１の融合反応の産物を、プライマー５’ＡＴＧＧＣＡＴＧＧＣＣＣＣＧＡＡＧＧ３’及び５’ＧＡＧＣＡＡＴＧＡＡＣＣＣＡＡＴＡＡＣＧＡＡＡＴＣ３’を用いて、’２／３Ｋ．ｌａｃｔｉｓ  ＵＲＡ３フラグメントに融合させた。これによって、遺伝子標的二連基質の第２の部分を構成するＵＰ−ｐＧＡＬ１−２／３ＵＲＡ３という融合産物が得られた。
【０４１９】
酵母株ＦＳ０１４４４（ＭＡＴアルファ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  Ｉｅｕ２  ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−ｍｏｌｅ１，実施例５７）を線状基質２／３ＵＲＡ３−ｐＧＡＬ１−Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３−ＤＯＷＮ及びＵＰ−ｐＧＡＬ１−２／３ＵＲＡ３によって形質転換させ、ウラシル欠損培地に播種した。形質転換体を同一培地上でストリーク生成し、５−ＦＯＡ培地に移し、更にコロニーＰＣＲで確認する。結果として得られた株は、遺伝子型ＭＡＴアルファ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  Ｉｅｕ２  ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−ｍｏｌｅｌ  ｇｐｐ１：：ｐＧＡＬ１−Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３を有しており、この株をＦＳ０１４６０と命名した。
【０４２０】
実施例６２
ドコサエキサエン酸への経路の発現
ドコサエキサエン酸への完全経路を発現するために、ＦＳ０１４６０（ＭＡＴアルファ  ｕｒａ３  ｔｒｐ１  Ｉｅｕ２  ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３  ＧＰＰ１：：ｐＧＡＬ１−Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３、実施例６１）を、プラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−６、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｏ−デルタ−５、及びｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２−デルタ−４ｄによって同時形質転換させた。形質転換体の選択及びストリーク精製を、ウラシル、トリプトファン、及びロイシンを欠いた培地上でおこなった。次に、形質転換株を、ＧＡＬプロモーター誘導条件（例えば、実施例９、実施例４９）下で培養し、脂肪酸組成を実施例４５の記載どおりに分析した。
【０４２１】
実施例６３
ＬＲＯ１の過剰発現
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＬＲＯ１によってコードされたアシルトランスフェラーゼを、ホスファチジルコリンの２位にあるアシル鎖からジアグリセロールへの転移を触媒することで、トリアシルグリセロールの形成をもたらす。多飽和化脂肪酸不飽和化は、主にホスファチジルコリンの２位で主に起こる（Ｄｏｍｅｒｇｕｅ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８：３５１１５−３５１２６）ことから、ＬＲＯ１の過剰発現は、多価不飽和脂肪酸のトリアシルグリセロールへの取り込みを増加せ、全体的な多価不飽和脂肪酸含有量の増加をもたらすと思われる。ＬＲＯ１は、実施例２６及び実施例３０等に記載されたように、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法（図１５）を用いて、強力な酵母プロモーター（例えば、ＴＤＨ３, ＡＤＨ１、ＴＰＩ１、又はＨＸＴ７プロモーター）によって過剰発現される。
【０４２２】
実施例６４
ＡＲＥ１及びＡＲＥ２の過剰発現
Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でＡＲＥ１及びＡＲＥ２によりコードされるアシルトランスフェラーゼは、ジアシルグリセロールへのアシル鎖の付加を触媒して、トリアシルグリセロールを形成する。ＡＲＥ１及びＡＲＥ２の過剰発現は、脂質収量の増加及び全体的な多価不飽和脂肪酸含有量の増加をもたらすと思われる。ＡＲＥ１及びＡＲＥ２は、実施例２６及び実施例３０等に記載されたように、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法（図１５）を用いて、強力な酵母プロモーター（例えば、ＴＤＨ３, ＡＤＨ１、ＴＰＩ１、又はＨＸＴ７プロモーター）によって過剰発現される。
【０４２３】
実施例６５
ＥＬＯ１、ＥＬＯ２、及びＥＬＯ３の過剰発現  
酵母遺伝子ＥＬＯ１、ＥＬＯ２、及びＥＬＯ３は、脂肪酸伸長酵素をコードする。ＥＬＯ１によってコードされた伸長酵素は、Ｃ１４脂肪酸からＣ１６種への伸長に感著する（Ｔｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１８４１３−１８４２２）。ＥＬＯ２は、長さが最大で２４炭素原子の飽和及び不飽和脂肪酸の合成に関与する伸長酵素をコードする。また、ＥＬＯ３は、基質範囲が広い伸長酵素をコードする（Ｏｈ，Ｃ．−Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：１７３７６−１７３８４）。これらの伸長酵素の過剰発現は、Ｃ１８脂肪酸含有量、多価不飽和脂肪酸経路の基質の含有量増加に寄与し、それによって多価不飽和脂肪酸の生産を高めることが可能である。ＥＬＯ１、ＥＬＯ２、及びＥＬＯ３は、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法（図１５）を用いて、実施例２６及び実施例３０に記載されたように、強力な酵母プロモーター、例えばＴＤＨ３、ＡＤＨ１、ＴＰＩ１、又はＨＸＴ７プロモーターによって過剰発現する。
【０４２４】
実施例６６
ＧＰＰ１の過剰発現並びにＧＰＰ１及びＧＰＰ２の欠失
脂質合成用の汎用前駆体は、酵母ではＧＰＤＬ１によってコードされるＮＡＤ依存グリセロール−３−ホスフェート脱水素酵素の作用によってジヒドロキシアセトンホスフェートから形成されるグリセロール−３−ホスフェートである。グリセロール−３−ホスフェートは、脂質合成経路に入るか、或いはＧＰＰ１及びＧＰＰ２によってコードされたグリセロール−３−ホスファターゼの作用によって、脱リン酸化されてグリセロールを形成することができる。ＧＰＤ１の過剰発現とＧＰＰ１及びＧＰＰ２の欠失によって、グリセロール−３−ホスフェートの有用性が高まる（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｔ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｅｔａｂ  Ｅｎｇ．６，１５５−１６３）。これらの改変を脂質合成経路でアシルトランスフェラーゼとＦＡＳ複合体の過剰発現とに組み合わせることで、脂質収量及び多価不飽和脂肪酸収量が改善されると考えられる。
【０４２５】
ＧＰＤ１は、遺伝子標的二連基質に基づいたプロモーター置換法（図１５）を用いて、実施例２６及び実施例３０に記載されたように、強力な酵母プロモーター、例えばＴＤＨ３、ＡＤＨ１、ＴＰＩ１、又はＨＸＴ７プロモーターによって過剰発現する。
【０４２６】
ＧＰＤ１及びＧＰＰ２を、再利用可能なマーカーとしてＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３とともに遺伝子標的二連基質を用いて欠失させる。二連基質の一方の部分は、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（３’末端方向）からなり、それに続いて短い配列Ｒ、並びにＧＰＰ１又はＧＰＰ２の下流にある標的配列からなる。二連基質の第２の部分は、ＧＰＰ１又はＧＰＰ２の上流にある標的配列からなり、短配列Ｒ及びＫ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３の２／３（５’末端方向）にそれぞれ融合している。二連基質による形質転換とウラシル欠損培地上での選択の後、形質転換体が得られる。この形質転換体では、ＧＰＰ１又はＧＰＰ２がそれぞれノックアウトされており、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＲＡ３マーカー遺伝子の片側にある直接反復配列として短配列Ｒの２つのコピーと置き換えられている。選択マーカーのループ・アウトをもたらす第２の組み換えイベントを、ＵＲＡ３遺伝子を発現する細胞に対して毒性を示す５’−フルオロオロチン酸（５−ＦＯＡ）を含む培地上に形質転換体を再播種することで、選択した。結果として得られた株では、ＧＰＰ１及びＧＰＰ２が欠失しており、短配列Ｒによって置き換わっている。或いは、ＧＰＰ１及びＧＰＰ２が異種遺伝子組込みのための遺伝子座として使用され、例えば実施例６６に記載されたように、結果としてこれらの遺伝子の欠失を生じる。
【０４２７】
ＧＰＤ１過剰発現及びＧＰＰ１並びにＧＰＰ２欠損を、ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ１  ｐＡＤＨ１−ＦＡＳ２ ｐＴＰＩ１−ＡＣＣ１  ｐｏｘ１：：ｐＴＤＨ３−Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１株背景でおこなった。ＧＰＤ１過剰発現株並びにＧＰＰ１及びＧＰＰ２欠損株を構築した後、これらの改変を、株間の交配により、脂質生合成経路でのアシルトランスフェラーゼの過剰発現（例えば、ＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＤＧＡ１又はＬＲＯ１の過剰発現）と組み合わせる。
【０４２８】
実施例６７
異種ＮＡＤＰ＋依存グリセルアルデヒド３−ホスフェート脱水素酵素の発現
ＮＡＤＰ＋依存グリセルアルデヒド３−ホスフェート脱水素酵素をコードするストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｕｔａｎｓ）ＧａｐＮ遺伝子（配列番号：９１）の発現は、脂肪酸合成のための細胞質性ＮＡＤＰＨの有用性を高める。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムへのＳ・ムタンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧａｐＮの組込みを、ＦＡＳ１、ＦＡＳ２、及びＡＣＣ１の過剰発現と組合わせる。
【０４２９】
Ｓ・ムタンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧａｐＮ遺伝子をＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ゲノムに組込み、酵母ＡＤＨ１プロモーターの制御下に置いた。ＡＤＨ１プロモーター及びＳ・ムタンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）ＧａｐＮ遺伝子をＧＰＰ２遺伝子座に組み込むことで、この遺伝子のノックアウトが得られる（実施例６６も参照）。この組込みは、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１（実施例２８）の組込みについての記載と同様の原理を用いて、遺伝子標的二連基質による同一組み換えを介しておこなった。
【０４３０】
実施例６８
単一株での遺伝子組み換えの組み合わせ
脂質収量及び／又は多価不飽和脂肪酸収量の改善をもたらす複数の遺伝子組み換えを、株間の交配によって、或いは異なる株背景でのプロモーター置換法を繰り返すことによって、組み合わせられる。例えば、ＦＡＳ１、ＦＡＳ２、及びＡＣＣ１の過剰発現をＧＡＴ１、ＳＬＣ１、並びにＤＧＡ１及び／又はＬＲＯ１の過剰発現と組み合わせる。
【０４３１】
実施例６９
イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）からの合成デルタ−９伸長酵素のコドン最適化及び構築
イソクリシス・ガルバナ（Ｉｓｏｃｈｒｙｓｉｓ  ｇａｌｂａｎａ）デルタ−９伸長酵素をコードする配列（配列番号：３７）及びユーグレナ・グラシリス（Ｅｕｇｌｅｎａ  ｇｒａｃｉｌｉｓ）由来の合成デルタ−８不飽和酵素をコードする配列（配列番号：３８）に対して、「５０％理論比よりも低いコドンは破棄」というオプションを付したバックトランスレーション・ツール（Ｂａｃｋｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｔｏｏｌ）（Ｅｎｔｅｌｅｃｈｏｎ）を用いて、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に対するコドン最適化をおこなう。次に、コドン最適化遺伝子（それぞれ配列番号：８５及び配列番号：８６）を、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドから構築し、この構築は、原則的に、デルタ−４不飽和化酵素の構築に関する記載（実施例５９）にもとづく。
【０４３２】
実施例７０
酵母発現ベクターへの合成デルタ−９伸長酵素及びデルタ−８不飽和化酵素のクローニング
デルタ−９伸長酵素（配列番号：８５，実施例７０）をコードするコドン最適化遺伝子を酵母発現ベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２（実施例１２）にクローニングし、その結果としてベクターｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−９ｅが得られる。更に、ベクターｐＥＳＣ−ＵＲＡ−ｅｌｓｏ−デルタ−５を適当な制限酵素によって消化することで、このプラスミド由来の、Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）デルタ６−伸長酵素をコードする遺伝子の放出が生じる。線状プラスミドを精製し、コドン最適化デルタ−８不飽和化酵素（配列番号：８６、実施例７１）をＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ） デルタ６−伸長酵素の代わりに導入する。結果として得られるプラスミドをｐＥＳＣ−ＵＲＡ−デルタ−８  デルタ−５と命名する。
【０４３３】
実施例７１
コドン最適化デルタ−９伸長酵素及びデルタ−８不飽和化酵素を介したアラキドン酸への経路の発現
好適な酵母株（例えば、ＦＳＯ１２６７、ＦＳ０１３６８、ＦＳ０１４０８、又はＦＳ０１４２３）に対してプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−９ｅ及びｐＥＳＣ-ＵＲＡ−デルタ−８  デルタ−５による同時形質転換をおこなった。結果として生じた株をＧＡＬプロモーター（例えば、実施例９、実施例４９）に導入するための適当な条件下で培養し、脂肪酸組成を実施例４５の記載どおりに分析する。
【０４３４】
実施例７２
コドン最適化デルタ−９伸長酵素及びデルタ−８不飽和化酵素を介したエイコサペンタエン酸への経路の発現
適当な酵母株（例えば、ＦＳＯ１２７７又はＦＳ０１４４４）に対してプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−９ｅ（実施例７０）、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−デルタ−８  デルタ−５（実施例７０）、及びｐＥＳＣ−ＬＥＵ−ＳＫ３３（実施例５４）による同時形質転換をおこなった。結果として生じた株をＧＡＬプロモーター（例えば、実施例９、実施例４９）に導入するための適当な条件下で培養し、脂肪酸組成を実施例４５の記載どおりに分析する。
【０４３５】
実施例７３
コドン最適化デルタ−９伸長酵素及びデルタ−８不飽和化酵素を介したドコサテトラエン酸への経路の発現
好適な酵母株（例えば、ＦＳＯ１２７７又はＦＳ０１４４４）に対してプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−９ｅ（実施例７０）、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−デルタ−８デルタ−５（実施例７０）、及びｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２（実施例５５）による同時形質転換をおこなった。結果として生じた株をＧＡＬプロモーター（例えば、実施例９、実施例４９）に導入するための好適な条件下で培養し、脂肪酸組成を実施例４５の記載どおりに分析する。
【０４３６】
実施例７４
コドン最適化デルタ−９伸長酵素及びデルタ−８不飽和化酵素を介したドコサペンタエン酸への経路の発現
好適な酵母株（例えば、ＦＳＯ１２７７又はＦＳ０１４４４）に対してプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−９ｅ（実施例７０）、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−デルタ−８デルタ−５（実施例７０）、及びｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２−ＳＫ３３（実施例５６）による同時形質転換をおこなった。結果として生じた株をＧＡＬプロモーター（例えば、実施例９、実施例４９）に導入するための好適な条件下で培養し、脂肪酸組成を実施例４５の記載どおりに分析する。
【０４３７】
実施例７５
コドン最適化デルタ−９伸長酵素及びデルタ−８不飽和化酵素を介したドコサヘキサエン酸への経路の発現
好適な酵母株ＦＳ０１４６０（実施例６１）に対してプラスミドｐＥＳＣ−ＴＲＰ−デルタ−１２  デルタ−９ｅ（実施例７０）、ｐＥＳＣ−ＵＲＡ−デルタ−８デルタ−５（実施例７０）、及びｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２−デルタ−４ｄ（実施例６０）による同時形質転換をおこなった。結果として生じた株をＧＡＬプロモーター（例えば、実施例９、実施例４９）に導入するための好適な条件下で培養し、脂肪酸組成を実施例４５の記載どおりに分析する。
【０４３８】
実施例７６
デルタ−９不飽和化酵素、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ６−伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、デルタ−５伸長酵素、及びオメガ−３不飽和化酵素をコードする遺伝子のコドン最適化
Ｍ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）デルタ−９不飽和化酵素（配列番号：１）、デルタ−１２不飽和化酵素（配列番号：５）、デルタ−６不飽和化酵素（配列番号：１１）、デルタ６−伸長酵素（配列番号：１６）、及びデルタ−５不飽和化酵素（配列番号：２２）、マウス・デルタ−５伸長酵素（配列番号：２８）、Ｓ．クルイベリ（Ｓ．ｋｌｕｙｖｅｒｉ）・オメガ−３不飽和化酵素（配列番号：８７）を、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に対してコドン最適化し、またデルタ−４不飽和化酵素をコードする合成遺伝子の構築に関する記載（実施例５９）と同様の原理を用いて、合成オリゴヌクレオチドから構築する。
【０４３９】
添付の請求項によって定義される発明は、本発明の精神又はその範囲から離れることなく、多くの明確な変形例が可能であることから、上記の説明で述べられる特定の詳述によって限定されるものではないことを、理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０４４０】
例の方法で与えられた次の詳細な説明は、記載された特定の実施例に本発明を限定することを目的とはしないが、本明細書に参照によって組み込まれた添付の図面とともに理解される：
【０４４１】
【図１】遺伝子改変微生物の多価不飽和脂肪酸の合成（オメガ−６デルタ／デルタ−６及びデルタ−６不飽和化酵素とデルタ−６伸長酵素とを使用しているオメガ−３デルタ／デルタ６経路）である。
【図２】遺伝子改変微生物の多価不飽和脂肪酸の合成（オメガ−６デルタ／デルタ８及びデルタ−９伸長酵素とデルタ−８不飽和化酵素とを使用しているオメガ−３デルタ／デルタ８経路）である。
【図３】Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の脂肪酸生合成の簡略図である。
【図４】サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でのＴＡＧ及びリン脂質への経路である。ＰＡ、ホスファチジン酸；ＤＡＧ、ジアシルグリセロール；ＴＡＧ、トリアシルグリセロール。
【図５】油性酵母及び真菌類の細胞内可溶質アセチルＣｏＡへの経路である。
【図６】サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）でのアンモニア同化である。
【図７】β酸化による脂肪酸分解である。
【図８】脂肪酸伸長である。
【図９Ａ】デルタ−１２不飽和化酵素及びデルタ−６不飽和化酵素をコードする遺伝子を発現するための酵母ベクターである。
【図９Ｂ】デルタ−６伸長酵素及びデルタ−５不飽和化酵素をコードする遺伝子を発現するための酵母ベクターである。
【図１０】Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムへのＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１の組込みのための戦略である。
【図１１】デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素を含む異種経路を有するＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から抽出した脂肪酸のガスクロマトグラム・プロフィールと、アラキドン酸の対応マス・スペクトログラムである。
【図１２】デルタ−９不飽和化酵素, デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素を含む異種経路を有するＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から抽出した脂肪酸のガスクロマトグラム・プロフィールと、アラキドン酸の対応マス・スペクトログラムである。
【図１３Ａ】ｐＷＡＤ１のプラスミド・マップである。
【図１３Ｂ】ｐＷＡＤ２のプラスミド・マップである。
【図１４Ａ】ｐＷＪ７１６−ＴＤ１のプラスミド・マップである。
【図１４Ｂ】ｐＷＪ７１６−ＴＤ２のプラスミド・マップである。
【図１５】プロモーター置換による遺伝子の過剰発現に使用される方法。ＹＦＧ、過剰発現される任意の遺伝子である。
【図１６】ＰＯＸ１座のＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムにＭ．アルピナ（Ｍ．ａｌｐｉｎａ）ｏｌｅ１を組み込むための戦略である。
【図１７】サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムにソルダリア・マクロスポラ（Ｓｏｒｄａｒｉａ  ｍａｃｒｏｓｐｏｒａ）ａｃｌ１及びａｃｌ２を組み込むための戦略である。
【図１８】サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の遺伝子組み換え株の能力の概要：全脂肪酸に占めるアラキドン酸の割合に対してプロットされた炭素源上のアラキドン酸の収率である。
【図１９】プラスミドｐ３００の構造である。
【図２０Ａ】ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ−ＳＫ３３のプラスミド・マップである。
【図２０Ｂ】ｐＥＳＣ−Ｌｅｕ  Ｓｓｃ２のプラスミド・マップである。
【図２０Ｃ】ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２−ＳＫ３３のプラスミド・マップである。
【図２１】デルタ−９不飽和化酵素, デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−９、デルタ−５不飽和化酵素、及びオメガ−３不飽和化酵素を含む異種経路を有するＳ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）から抽出した脂肪酸のガスクロマトグラム・プロフィールと、エイコサペンタエン酸の対応マス・スペクトログラムである。
【図２２】デルタ−４不飽和化酵素をコードしている合成遺伝子、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現を最適化するコドンを組み合わせるために使用される方法である。
【図２３】ｐＥＳＣ−ＬＥＵ−Ｓｓｃ２−デルタ−４ｄのプラスミド・マップである。
【図２４】オメガ−３不飽和化酵素をコードしているサッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）ＦＡＤ３をサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のゲノムに組み込むための戦略である。
【０４４２】
参考文献
ＤＥ１０００５９７３−Ａ１  
欧州特許出願第５０４２４号
欧州特許出願第８４７９６号  
欧州特許出願第２５８０１７号  
欧州特許出願第２３７３６２号  
欧州特許出願第２０１１８４号  
ＪＰ２００１０９５５８８−Ａ  
ＵＳ４６８３２０２  
ＵＳ４５８２７８８  
ＵＳ４６８３１９４  
ＵＳ５９７２６６４  
ＵＳ６０２５１７２  
ＵＳ６１３６５７４  
ＵＳ６１９４１６７  
ＵＳ６３５５８６１−Ｂ１  
ＵＳ６３５５８６１  
ＵＳ６３７２９６５  
ＵＳ６４０３３４９  
ＵＳ６４２８９９０−Ｂ１  
ＵＳ６４３２６８４  
ＵＳ６４３２６８４−Ｂ１  
ＵＳ６４４１２７８  
ＵＳ６４９２１０８  
ＵＳ６６８６１８６  
ＵＳ９８／０７４２２  
ＵＳ９８／０７４２１  
ＵＳ９８／０７１２６  
ＵＳ２００２／０１７００９０  
ＵＳ２００２／０１５１０１９  
ＵＳ２００２／０１０８１４７  
ＵＳ２００３／０１７７５０８  
ＵＳ２００３／０１８０８０２  
ＵＳ２００３／０１７２３９８  
ＵＳ２００３０１９６２１７  
ＵＳ２００３／００７４６９４  
ＵＳ２００３／０６６１０４
ＷＯ９４１１５１６
ＷＯ９８４６７６５  
ＷＯ９９２７１１１  
ＷＯ９９３３９５８  
ＷＯ２０００４０７０５−Ａ  
ＷＯ２０００３４４３９−Ａ  
ＷＯ２０００５５３３０−Ａ  
ＷＯ２００１／８５９６８−Ａ２  
ＷＯ２００１４４４８５−Ａ  
ＷＯ２００１／７９４９９−Ａ１  
ＷＯ２００１２０００１−Ａ  
ＷＯ２００１０２５９１−Ａ  
ＷＯ２００１０４６３６−Ａ  
ＷＯ２００１７５０６９−Ａ１
ＷＯ２００１／１４５３８−Ａ  
ＷＯ２００１５９１２８−Ａ  
ＷＯ０２０７７２１３  
ＷＯ２００２０８４０１−Ａ  
ＷＯ０２／０８１７０２  
ＷＯ０２／０８１６６８  
ＷＯ２００２０８４０１−Ａ  
ＷＯ０２／０９０４９３  
ＷＯ２００２２６９４６−Ａ
ＷＯ２００２３４９４０−Ａ
ＷＯ２００２４４３２０−Ａ
ＷＯ２００２／４４３２０
ＷＯ２００２７２０２８−Ａ２
ＷＯ２００３０６４６３８−Ａ２
ＷＯ２００３０１２０９２−Ａ
ＷＯ０３／０１２０９２
ＷＯ０３／０７２７８４
ＷＯ０３／１０２１３８
Adams, A., Gottschling, D. E., Kaiser, C. A., and Stearns, T. Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1997)
Altschul, S. F. et al. (1990) Basic local alignment search tool. J Mol Biol. 215, 403-410
Altschul, S. F. et al. (1997) Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402
Beaudoin,F., Michaelson,L.V., Hey,SJ., Lewis,M.J., Shewry,P.R., Sayanova,O., and Napier,J.A. (2000). Heterologous reconstitution in yeast of the polyunsaturated fatty acid biosynthetic pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97, 6421-6426.
Domergue,F., Abbadi,A., Ott,C, Zank,T.K., Zahringer>U., and Heinz,E. (2003). Acyl carriers used as substrates by the desaturases and elongases involved in very long-chain polyunsaturated fatty acids biosynthesis reconstituted in yeast. J Biol. Chem 278, 35115- 35126. Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. (1997) Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7:1174-83
Erdeniz, N., Mortensen, U.H., Rothstein, R. (1997) Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7:1174-83
Gargano S. et al. (1995) A temperature-sensitive strain of Histoplasma capsulatum has an altered delta 9-fatty acid desaturase gene. Lipids 30, 899-906.
Gerhardt, P., Murray, R.G.E., Costilow, R. N., Nester, E. W., Wood, W. A., Krieg, N. R., and Briggs, G., Eds. Manual of Methods for General Bacteriology. American Society for Microbiology: Washington, D. C. (1994)
Hastings, N., et al. (2004) Molecular cloning and functional characterization of fatty acyl desaturase and elongase cDNAs involved in the production of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids from alpha-linolenic acid in Atlantic salmon (Salmo salar). Mar Biotechnol 6, 463-474.
Hastings, N., et al. (2001) A vertebrate fatty acid desaturase with delta-5 and delta-6 activities. Proc Natl Acad Sci 98, 14304-14309.
Kajikawa, M., et al. (2004) Isolation and characterization of delta(6)-desaturase, an ELO-like enzyme and delta(5)-desaturase from the liverwort Marchantia polymorpha and production of arachidonic and eicosapentaenoic acids in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Plant MoI Biol 54, 335-352.
Karlin, S. and Altschul, S. F. (1990) Methods for assessing the statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes. Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 2264-2268
Karlin, S. and Altschul, S. F. (1993) Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 90, 5873-5877
Kirsch, C, et al. (1997) Rapid, transient, and highly localized induction of plastidial omega-3 fatty acid desaturase mRNA at fungal infection sites in Petroselinum crispum. Proc Natl Acad Sci USA 94,2079-2084
Laoteng, K et al. (2000) Delta(6)-desaturase of Mucor rouxii with high similarity to plant delta(6) desaturase and its heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophys Res Commun 279, 17-22 Liu, 
Liu, W., et al. (1999) Cloning and funcional expression of a cDINA encoding a metabolic acyl-CoA delta-9 desaturase of the cabbage looper moth, Trichoplusia ni. Insect Biochem MoI Biol 29, 435-443.
Meesters PA and Eggink G. (1996) Isolation and characterization of a delta-9 fatty acid desaturase gene from the oleaginous yeast Cryptococcus curvatus CBS 570. Yeast 12:723- 730.
Meyer,A., et al. (2003) Biosynthesis of docosahexaenoic acid in Euglena gracilis: Biochemical and molecular evidence for the involvement of a delta 4-fatty acyl group desaturase. Journal Biochemistry 42, 9779-9788
Nguyen, H.T.T. et al. (2004) Engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of L-glycerol 3-phosphate. Metab Eng. 6,155-163
Nissen, T. et al. (2000) Optimization of ethanol production in Saccharomyces cerevisiae by metabolic engineering of the ammonium assimilation. Metab Eng. 2, 69-77
Oh, C-S., Toke, D.A., Mandala, S., Martin, CE. (1997) ELO2 and ELO3, homologues of the Saccharomyces cerevisiae ELOl gene, function in fatty acid elongation and are required for sphingolipid formation. J Biol Chem 272: 17376-17384
Oura, T., et al. (2004) Saccharomyces kluyveri FAD3 encodes an omega-3 fatty acid desaturase. Microbiology 150, 1983-1990.
Passorn, S et al. (1999) Heterologous expression of Mucor rouxii delta(12)-desaturase gene in Saccharomyces cerevisiae. Biochem Biophys Res Commun 263, 47-51
Pereira, S. L, et al. (2004) Identification of two novel microalgal enzymes involved in the conversion of the omega3-fatty acid, eicosapentaenoic acid, into docosahexaenoic acid. Biochem J 384, 357-366.
Pereira, S. L, et al. (2004) A novel omega3-fatty acid desaturase involved in the biosynthesis of eicosapentaenoic acid. Biochem J 378, 665-671.
Qi et al. (2004) Production of very long chain polyunsaturated omega-3 and omega-6 fatty acids in plants. Nat. Biotechnol. 16 May 2004 doi: 10.1038/nbt972 Ratledge, C. (2002) Regulation of lipid accumulation in oleaginous micro-organisms. Biochem Soc Trans 30,1047-1050
Sakuradani, E., et al. (2005) A novel fungal omega3-desaturase with wide substrate specificity from arachidonic acid-producing Mortierella alpina 1S-4. Appl Microbiol Biotechnol 66, 648-654.
Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual (2nd ed.), VoIs. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory
Sandager, L. et al. (2002) Storage lipid synthesis is non-essential in yeast. J Biol Chem. 277, 6478-6482
Sayanova, O. et al. (1997) Expression of a borage desaturase cDNA containing an N- terminal cytochrome b5 domain results in the accumulation of high levels of delta(6)- desaturated fatty acids in transgenic tobacco. Proc Natl Acad Sci USA 94, 4211-4216.
Sijtsma,L and De Swaaf,M.E. (2004). Biotechnological production and applications of the omega-3 polyunsaturated fatty acid docosahexaenoic acid. Appl Microbiol. Biotechnol. 64, 146-153.
Toke, D. A. et al. (1996) Isolation and characterization of a gene affecting fatty acid elongation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem 271: 18413-18422
Tvrdik, P et al. (2000) Role of a new mammalian gene family in the biosynthesis of very long chain fatty acids and sphingolipids. 3. Cell Biol. 149: 707-717.
Wallis, J. G. and Browse, 3. (1999). The Deltaδ-desaturase of Euglena gracilis: an alternate pathway for synthesis of 20-carbon polyunsaturated fatty acids. Arch Biochem Biophys. 365, 307-16.
Watanabe, K., et al. (2004) Yeast Delta 12 fatty acid desaturase: gene cloning, expression, and function. Biosci Biotechnol Biochem 68, 721-727 '.
Whitney, H. M., et al. (2003) Functional charactyerisation of two cytochrome b5-fusion desaturases from Anemone leveillei: the unexpected identification of a fatty acid Delta6- desaturase. Planta 217, 983-92.
Whitney, H.M., et al. (2003) Functional charactyerisation of two cytochrome b5-fusion desaturases from Anemone leveillei: the unexpected identification of a fatty acid Delta 6-desaturase. Planta 217, 983-92
Wilson, R.A., et al. (2004) Characterization of Aspergillus parasiticus odeA gene Microbiology 150, 2881-2888. 
Wongwathanarat,P., Michaelson,L.V., Carter,A.T., Lazarus,C.M., Griffiths,G., Stobart,A.K., Archer,D.B., and MacKenzie,D.A. (1999). Two fatty acid delta9-desaturase genes, olel and ole2, from Mortierella alpina complement the yeast olel mutation. Microbiology 145 ( Pt 10), 2939-2946.
Yadav, N. S et al. (1993) Cloning of higher plant omega-3 fatty acid desaturases. Plant Physiol 103: 467-476
Zhu, M., Yu,L.J., and Wu,Y.X. (2003). An in expensive medium for production of arachidonic acid by Mortierella alpina. J Ind. Microbiol. Biotechnol. 30, 75-79
【図１】
2008501323.tif 000017
【図２】
2008501323.tif 000018
【図３】
2008501323.tif 000019
【図４】
2008501323.tif 000020
【図５】
2008501323.tif 000021
【図６】
2008501323.tif 000022
【図７】
2008501323.tif 000023
【図８】
2008501323.tif 000024
【図９Ａ】
2008501323.tif 000025
【図９Ｂ】
2008501323.tif 000026
【図１０】
2008501323.tif 000027
【図１１】
2008501323.tif 000028
【図１２】
2008501323.tif 000029
【図１３Ａ】
2008501323.tif 000030
【図１３Ｂ】
2008501323.tif 000031
【図１４Ａ】
2008501323.tif 000032
【図１４Ｂ】
2008501323.tif 000033
【図１５】
2008501323.tif 000034
【図１６】
2008501323.tif 000035
【図１７】
2008501323.tif 000036
【図１８】
2008501323.tif 000037
【図１９】
2008501323.tif 000038
【図２０Ａ】
2008501323.tif 000039
【図２０Ｂ】
2008501323.tif 000040
【図２０Ｃ】
2008501323.tif 000041
【図２１】
2008501323.tif 000042
【図２２】
2008501323.tif 000043
【図２３】
2008501323.tif 000044
【図２４】
2008501323.tif 000045
【配列表】
2008501323000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年4月4日(2006.4.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非脂肪酸基質上で増殖するサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での酸素要求経路の異種発現を含む４つ又はそれ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産する方法であって、前記異種発現が、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、及びデルタ−５不飽和化酵素、及びデルタ−９不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を組み合わせることを含むことを特徴とする、多価不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項２】
非脂肪酸基質上で増殖するサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での酸素要求経路の異種発現を含む４つ又はそれ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を生産する方法であって、前記異種発現が、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、デルタ−５不飽和化酵素、及びデルタ−９不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列を組み合わせることを含むことを特徴とする、多価不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項３】
前記非脂肪酸基質が、排他的な炭素源であることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
組み合わさった前記異種発現が、デルタ−５伸長酵素、オメガ−３不飽和化酵素、及び／又はデルタ−４不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
組み合わさった前記異種発現が、ＡＣＣ１、ＹＢＲ１５９Ｗ、ＦＡＳ１、及びＦＡＳ２からなる群より選択される少なくとも１つの遺伝子の過剰発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
組み合わさった前記異種発現が、ＰＯＸ１からなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つの欠失を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
組み合わさった前記異種発現が、ＡＴＰ：クエン酸リアーゼ及び／又はＡＴＰによって刺激されるイソクエン酸デヒドロゲナーゼをコードするヌクレオチド配列の異種発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
組み合わさった前記異種発現が、遺伝子ＧＤＨ１の欠失と、選択的に、ＧＤＨ２、ＧＬＮ１、及びＧＬＴ１から選択される少なくとも１つの遺伝子の過剰発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組み合わさった前記異種発現が、ＴＳＣ１３、ＧＡＴ１、ＳＬＣ１、及びＹＤＲ５３１Ｗからなる群より選択される遺伝子の少なくとも１つの過剰発現を更に含むことを特徴とする、請求項１乃至８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記異種ヌクレオチド配列が、サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）での発現に最適化されたコドンであることを特徴とする、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）をミオイノシトール欠損培地で培養することを特徴とする、請求項１乃至１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記多価不飽和脂肪酸が、アラキドン酸、エイコサペンタエン酸、及びドコサヘキサエン酸からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記異種発現が、アラキドン酸, エイコサペンタエン酸及び／又はドコサエキサエン酸の含有量を増加して前記サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の総脂肪酸含有量の２％を上回る量にすることを特徴とする、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記デルタ−１２不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：５〜１０、９３、９５、及び１１３に記載のヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：５〜１０、９３、９５、及び１１３に記載のヌクレオチド配列に対して少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
デルタ−９不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：１〜４に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１〜４に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１乃至１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記デルタ−５不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：２２〜２７、９９、１０５、及び１０７に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１乃至１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記デルタ−９伸長酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号：３７のヌクレオチドを含む、又は少なくとも７５％同一であることを特徴とする、請求項２乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記デルタ−８不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、配列番号：３８のヌクレオチド配列を含む、又は少なくとも７５％同一であることを特徴とする、請求項２乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記デルタ−６不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１１〜１５、９７、及び９９に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１及び／又は３乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記デルタ−６伸長酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１６〜２１、１０１、及び１０３に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項１及び／又は３乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記デルタ−５伸長酵素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：１９、２８、２９、及び１０１に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：１９、２８、２９、及び１０１に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
（ｃ）配列番号：６８に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
デルタ−４不飽和化素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：３５〜３６、及び１０９に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：３５〜３６、及び１０９に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
（ｃ）配列番号：７６〜７７に少なくとも７５％同一であるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
オメガ−３不飽和化素をコードするヌクレオチド配列が、
（ａ）配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１に示すヌクレオチド配列と；
（ｂ）配列番号：３０〜３４、８７、８９、及び１１１に示すヌクレオチド配列と少なくとも７５％同一であるヌクレオチド配列と；
からなる群より選択されることを特徴とする、請求項４乃至１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
非脂肪酸基質上で増殖する場合に、４つ又はそれ以上の二重結合を有する多価不飽和脂肪酸を製造することができる遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）であって、前記サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）が、デルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−６不飽和化酵素、デルタ−６伸長酵素、デルタ−５不飽和化酵素、デルタ−９不飽和化酵素又はデルタ−１２不飽和化酵素、デルタ−９伸長酵素、デルタ−８不飽和化酵素、デルタ−５不飽和化酵素、及びデルタ−９不飽和化酵素をコードするヌクレオチド配列の異種発現を含むことを特徴とする、多価不飽和脂肪酸の生産方法。
【請求項２５】
組成物が、請求項２４に記載の遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）によって製造した多価不飽和脂肪酸を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２６】
組成物が、請求項２４に記載の遺伝子組み換え細胞によって製造した総脂肪酸組成の少なくとも２５％多価不飽和脂肪酸を含むことを特徴とする、組成物。
【請求項２７】
前記組成物が、油であることを特徴とする、請求項２５又は２６に記載の組成物。
【請求項２８】
前記多価不飽和脂肪酸が、トリアシルグリセリドに組み込まれることを特徴とする、請求項２５又は２６に記載の組成物。
【請求項２９】
前記多価不飽和脂肪酸が、リン脂質に組み込まれることを特徴とする、請求項２５又は２６に記載の組成物。
【請求項３０】
前記多価不飽和脂肪酸が、遊離脂肪酸の形態であることを特徴とする、請求項２５又は２６に記載の組成物。
【請求項３１】
食品の成分としての、請求項２５乃至３０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３２】
化粧品の成分としての、請求項２５乃至３０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３３】
飼料の成分としての、請求項２５乃至３０のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項３４】
飼料の成分としての、請求項２４に記載の遺伝子組み換えサッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）の使用。
【国際調査報告】
2008501323.tif 000135
2008501323.tif 000136
2008501323.tif 000137
2008501323.tif 000138
2008501323.tif 000139
2008501323.tif 000140