(57)【要約】【解決手段】本発明は、核酸のより効率的な洗浄のための器具および方法に関し、および該方法を実施するためのキットに関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶解物から核酸を単離および洗浄するための方法であって、
ａ）核酸を含む生物学的試料が溶解緩衝液で溶解され；
ｂ）必要ならば、溶解で得られる調製物が中性化緩衝液で中和され；
ｃ）得られた反応混合物がその後一般式（Ｉ）の１つもしくはそれ以上の化
合物または該化合物の水溶液と混合され、および無機マトリックス、好ましくはケイ素系マトリックスと接触させられ; 
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-     （Ｉ）
（該式において、
Ｙは窒素またはリンを表わすことができ；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、Ｃ6−Ｃ26−アラルキル残基だけでなく、未分岐または分岐Ｃ1−Ｃ20−アルキル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルケニル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルキニル残基、および／または、Ｃ6−Ｃ20−アリル残基を表わすことができ；ならびに
Ｘ-は無機または有機の一価もしくは多価塩基酸の陰イオンを表わすことができる。）
ｄ）該核酸が洗浄緩衝液で洗浄され；
ｅ）該核酸が単離される
という点で特徴付けられる方法。
【請求項２】
Ｒ1がより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４、１６または１８炭素原子を有するものを表わし、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれメチル基を表わし、およびＹは窒素を表わすという点で特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ1がアラルキル残基、好ましくはベンジル基を表し、Ｒ2はより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４または１６炭素原子を有するものを表し、およびＲ3およびＲ4はそれぞれメチル基を表わすという点で特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対イオンＸが臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩（Ｆｏｒｍｉａｔｅ）、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩またはコハク酸塩であるという点で特徴付けられる請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
２００ｍＭの水酸化ナトリウムおよび１重量％／ＶのＳＤＳを含む水溶液が溶解緩衝液として使用されるという点で特徴づけられる請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
２〜３Ｍの酢酸カリウム水溶液が中性化緩衝液として使用されるという点で特徴付けられる請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
好ましくは３００〜１０００ｍＭ、特に好ましくは４００〜８００ｍＭ、格別に好ましくは５００〜ｍＭの一般塩水溶液が洗浄緩衝液として使用され、および／または、７０〜９０％のエタノール水溶液、好ましくはpH 7.5のトリス／塩酸を含むエタノール水溶液が洗浄緩衝液として使用されるという点で特徴付けられる請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
無機マトリックスへの核酸の結合のための一般式（Ｉ）の化合物の使用。
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-   （Ｉ）
（該式において、
Ｙは窒素またはリンを表わすことができ；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、Ｃ6−Ｃ26−アラルキル残基だけでなく、未分岐または分岐Ｃ1−Ｃ20−アルキル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルケニル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルキニル残基、および／または、Ｃ6−Ｃ20−アリル残基を表すことができ；ならびに
Ｘ-は無機または有機の一価もしくは多価塩基酸の陰イオンを表わすことができる。）
【請求項９】
Ｒ1がより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４、１６または１８炭素原子を有するものを表わし、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれメチル基を表わし、およびＹは窒素を表わすという点で特徴付けられる請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
Ｒ1がアラルキル残基、好ましくはベンジル基を表し、Ｒ2はより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４もしくは１６炭素原子を有するものを表し、およびＲ3ならびにＲ4はそれぞれメチル基を表わすという点で特徴付けられる請求項８に記載の使用。
【請求項１１】
対イオンＸが臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩（Ｆｏｒｍｉａｔｅ）、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩またはコハク酸塩であるという点で特徴付けられる請求項８〜１０のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１２】
無機マトリックスが金属酸化物もしくは金属混合酸化物に基づく多孔および／または非多孔性担体から構成されるという点で特徴付けられる請求項８〜１１のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
該無機マトリックスがケイ素−酸素化合物、好ましくは二酸化ケイ素、またはケイ酸塩からなるという点で特徴付けられる請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
無機マトリックスがガラス、シリカゲルまたはゼオライトからなるという点で特徴付けられる請求項１２に記載の使用。
【請求項１５】
無機マトリックスが酸化アルミニウム、二酸化チタンおよび／または二酸化ジルコニウムからなるという点で特徴付けられる請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
該指定された金属酸化物の混合物が使用されるという点で特徴付けられる請求項１３〜１５のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１７】
核酸、特に一重ヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドだけでなく一重および／または二重鎖のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの結合のための請求項８〜１６のうちのいずれか１項に記載の使用。
【請求項１８】
ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよび／またはプラスチドＤＮＡであるという点で特徴付けられる請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および／または核内低分子ＲＮＡ（ｓｎ−ＲＮＡ）であるという点で特徴付けられる請求項１７に記載の使用。
【請求項２０】
下記部品を含む、核酸を単離および／または洗浄するためのキット。
-  一般式（Ｉ）の化合物、必要ならば水溶液中に存在し、および／または
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-   （Ｉ）
（該式において、
Ｙは窒素またはリンを表わすことができ；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、Ｃ6−Ｃ26−アラルキル残基だけでなく、未分岐または分岐Ｃ1−Ｃ20−アルキル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルケニル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルキニル残基、および／または、Ｃ6−Ｃ20−アリル残基を表すことができ；ならびに
Ｘ-は無機または有機の一価もしくは多価塩基酸の陰イオンを表わすことができる。）
-  必要ならば溶解緩衝液、および／または
-  必要ならば中性化緩衝液、および／または
-  必要ならば洗浄緩衝液、および／または
-  必要ならば溶出緩衝液、および／または
-  必要ならば核酸を結合しうる無機マトリックス。
【請求項２１】
Ｒ1がより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４、１６もしくは１８炭素原子を有するものを表し、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれメチル基を表わし、およびＹは窒素を表わすという点で特徴付けられる請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
Ｒ1がアラルキル残基、好ましくはベンジル基を表し、Ｒ2はより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４もしくは１６炭素原子を有するものを表し、およびＲ3ならびにＲ4はそれぞれメチル基を表わすという点で特徴付けられる請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
対イオンＸが臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩またはコハク酸塩であるという点で特徴付けられる請求項２０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、下記一般式に関する陽イオン洗浄剤を使用して核酸を洗浄および単離する方法に関する：
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ-   （Ｉ）
該式において、
Ｙは窒素またはリンを表わすことができ、
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、Ｃ6−Ｃ26−アラルキル残基だけでなく、未分岐または分岐Ｃ1−Ｃ20−アルキル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルケニル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルキニル残基、および／または、Ｃ6−Ｃ20−アリル残基を表すことができ、ならびに
Ｘ-は無機または有機の一価もしくは多価塩基酸の陰イオンを表わすことができる。
【０００２】
陽イオン化合物はアンモニア塩からなり、Ｒ1はより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４、１６もしくは１８炭素原子を有するものを表わし、ならびにＲ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれメチル基を表わす組成が好ましい。
【０００３】
さらに、Ｒ1がアラルキル基、好ましくはベンジル基を表し、Ｒ2はより高級のアルキル残基、好ましくは１２、１４もしくは１６炭素原子を有するものを表し、およびＲ3ならびにＲ4はそれぞれメチル基を表わす組成が好ましい。
【０００４】
原則として、Ｃ1−Ｃ6−アルキルは、１〜６炭素原子を有する分岐または未分岐炭化水素残基を表わし、必要ならば該炭化水素残基は互いに同じものまたは異なりうる１またはそれ以上のハロゲン原子−好ましくはフッ素−で代用することができる。
【０００５】
次の炭化水素残基が例として引用される：
メチル、エチル、プロピル、１−メチルエチル（イソプロピル）、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１−メチルプロピルおよび１−エチル−２−メチル−プロピル。
【０００６】
より高級なアルキル残基は、分岐または未分岐Ｃ7−Ｃ20−アルキル残基を表し、必要ならば該アルキル残基は互いに同じものもしくは異なりうる１またはそれ以上のハロゲン原子−好ましくはフッ素−で代用することができる。
次の炭化水素残基が例として引用される：
分岐または未分岐ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、テトラデシル、ヘキサデシル、オクタデシルおよびエイコサイル。
【０００７】
原則として、Ｃ3−Ｃ6−アルケニルは、１もしくはおそらくそれ以上の二重結合を持つ３〜６炭素原子を有する分岐または未分岐炭化水素残基を表わし、必要ならば該炭化水素残基は互いに同じものもしくは異なりうる１またはそれ以上のハロゲン原子−好ましくはフッ素−で代用することができる。
【０００８】
次の炭化水素残基が例として引用される：
２−プロペニル（アリル）、２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−ペンテニル、３−ペンテニル、４−ペンテニル、１−メチル−２−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、３−メチル−２−ブテニル、１−メチル−３−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、１，２−ジメチル−２−プロペニル、１−エチル−２−プロペニル、２−ヘキセニル、３−ヘキセニル、４−ヘキセニル、５−ヘキセニル、１−メチル−２−ペンテニル、２−メチル−２−ペンテニル、３−メチル−２−ペンテニル、４−メチル−２−ペンテニル、１−メチル−３−ペンテニル、２−メチル−３−ペンテニル、３−メチル−３−ペンテニル、４−メチル−３−ペンテニル、１−メチル−４−ペンテニル、３−メチル−４−ペンテニル、４−メチル−４−ペンテニル、１，１−ジメチル−２−ブテニル、１，１−ジメチル−２−ブテニル、１，１−ジメチル−３−ブテニル、１，２−ジメチル−２−ブテニル、１，２−ジメチル−３−ブテニル、１，３−ジメチル−２−ブテニル、１，３−ジメチル−３−ブテニル、２，２−ジメチル−３−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−３−ブテニル、１−エチル−２−ブテニル、１−エチル−３−ブテニル、２−エチル−１−ブテニル、２−エチル−２−ブテニル、２−エチル−３−ブテニル、１，１，２−トリメチル−２−プロペニル、１−エチル−１−メチル−２−プロペニルおよび１−エチル−２−メチル−２−プロペニル。
【０００９】
原則として、Ｃ3−Ｃ6−アルキニルは、１もしくはおそらくそれ以上の三重結合を持つ３〜６炭素原子を有する分岐または未分岐炭化水素残基を表わし、必要ならば該炭化水素残基は互いに同じものもしくは異なりうる１またはそれ以上のハロゲン原子−好ましくはフッ素−で代用することができる。
【００１０】
次の炭化水素残基が例として引用される：
２−プロピニル（プロパルギル）、２−ブチニル、３−ブチニル、１−メチル−２−プロピニル、２−メチル−２−プロピニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、１−メチル−２−ブチニル、２−メチル−２−ブチニル、３−メチル―２−ブチニル、１−メチル−３−ブチニル、２−メチル−３−ブチニル、３−メチル−３−ブチニル、１，１−ジメチル−２−プロピニル、１，２−ジメチル−２−プロピニル、１−エチル−２−プロピニル、２−ヘキシニル、３−ヘキシニル、４−ヘキシニル、５−ヘキシニル、１−メチル−２−ペンチニル、２−メチル−２−ペンチニル、３−メチル−２−ペンチニル、４−メチル−２−ペンチニル、１−メチル−３−ペンチニル、２−メチル−３−ペンチニル、３−メチル−３−ペンチニル、４−メチル−３−ペンチニル、１−メチル−４−ペンチニル、３−メチル−４−ペンチニル、４−メチル−４−ペンチニル、１，１−ジメチル−２−ブチニル、１，１−ジメチル−２−ブチニル、１，１−ジメチル−３−ブチニル、１，２−ジメチル−２−ブチニル、１，２−ジメチル−３−ブチニル、１，３−ジメチル−２−ブチニル、１，３−ジメチル−３−ブチニル、２，２−ジメチル−３−ブチニル、２，３−ジメチル−２−ブチニル、２，３−ジメチル−３−ブチニル、１−エチル−２−ブチニル、１−エチル−３−ブチニル、２−エチル−１−ブチニル、２−エチル−２−ブチニル、２−エチル−３−ブチニル、１，１，２−トリメチル−２−プロピニル、１−エチル−１−メチル−２−プロピニルおよび１−エチル−２−メチル−２−プロピニル。
【００１１】
他に定義されない限り、アリルは、好ましくは１つまたは２つのヘテロ原子をおそらく含むことができる４〜２２炭素原子を有する単核または多核芳香族残基を表す。
例は次のとおりである：
フェニル、ナフチル、アンスラシルおよびピロル、フラン、チオフェン、ピリジン、ピリダジン、ピリミジンまたはピラジンで、必要ならば該残基は１もしくはそれ以上のハロゲン原子−好ましくはフッ素−で代用することができ、またはアルキル基により互いに独立して１もしくは数回代用することができる。
【００１２】
アラルキルは上の定義に従って単核または多核性のアリル残基を意味し、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ3−Ｃ6−アルケニルもしくはＣ3−Ｃ6−アルキニルの橋状結合によって陽イオンの部分的な構造に結合せしめ、Ｃ1−Ｃ6−アルキル、Ｃ3−Ｃ6−アケニルおよびＣ3−Ｃ6−アルキニルの定義が結果的に適用する。本発明の目的として、ベンジル基が好ましい。
【００１３】
好ましい陰イオンは、臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩（Ｆｏｒｍｉａｔｅ）、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩またはコハク酸塩である。
【背景技術】
【００１４】
核酸を単離する方法は当該分野においてよく知られている。したがって、当該分野で最も確立している方法の１つによれば、（部分的にさらにタンパク質分解酵素の使用により）強変性および減少条件下にある核酸を含む出発原料を可溶化すること、ならびに透析またはエタノール沈殿によって水層から放出せしめた核酸を単離することによって、ＤＮＡは生物学的出発原料−たとえば、細胞および組織のような−から単離される（Ｊ．サンブロック（Ｓａｍｂｒｏｃｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッチェ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）およびＴ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、１９８９年、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ”）。
【００１５】
該方法の主な不利な点は、細胞および特に組織からの核酸の単離自体が非常に時間浪費的であるということを示し、ならびに頻繁に２日よりさらなる日数を費やしうるという事実に見出せる。さらに、該方法は、装置に相当な支出を必要とし、皮膚を刺激しまたは健康を害するフェノールもしくはクロロホルムのような物質の使用を含む。
【００１６】
該状況の観点で、代替方法が当該分野における初期段階に開発され、上記の核酸の抽出に含まれる不利な点が回避できるようにすることが意図されている。
【００１７】
すべての該方法は、アガロースゲルからＤＮＡ断片を予備的および分析的に洗浄するためのヴォゲルステイン（Ｖｏｇｅｌｓｔｅｉｎ）およびガレスピー（Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ）によってはじめて開発および記載された方法（Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1979, 76, 615-619）に基づく。該方法は、カオトロピック塩（ＮａＪ）の飽和溶液中に単離されるべきＤＮＡバンドを含むアガロースを溶解することと、ガラス粒子にＤＮＡを結合することとを兼ね備えている。次に、ガラス粒子に固定されたＤＮＡは洗浄剤（２０ｍＭのトリス塩酸[ｐＨ７．２]、２００ｍＭの塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）；２ｍＭのＥＤＴＡ；５０％ｖ／ｖのエタノール）で洗浄され、そしてその後担体粒子から脱着する。
【００１８】
該方法論は、今日までに一連の改良を受けており、現在において様々な出所の、核酸を抽出および洗浄する異なる方法に使用されている（マルコ（Marko）, M.A., チッパーフィールド（Chipperfield）, R. およびビルンボイム（Birnboim）, H.G., Anal. Biochem., 121, (1982) 382〜387頁）。
【００１９】
したがって、多数の試薬の組合せ（いわゆるキット）が、該種の核酸抽出を実施するために市販されている。
【００２０】
ほとんどの該市販キットは、異なるカオトロピック塩類溶液の存在の下で無機担体類へ核酸を結合する十分によく知られた原理に基づいており、および担体材料として微細磨ガラス粉末の懸濁物（例えば、グラスミルク（Ｇｌａｓｍｉｌｋ）、  ＢＩＯ  １０１、ラ  ジョラ（Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）、ＣＡ）、ダイアトミックアース(シグマ（Ｓｉｇｍａ）)またはシリカゲル（ヨーロッパ特許６１６６３９号）でさえ使用する。
【００２１】
核酸を単離する方法は、原則的に多数の様々な応用に実用的であり、ブームら（Ｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ）に開示されている［ＥＰ３８９０６３Ａ１］。 該ヨーロッパ特許出願において、ＤＮＡ結合固体層のカオトロピック緩衝液とともに出発原料を保温することにより、核酸を含む出発原料から核酸を単離するための方法が記載されている。カオトロピック緩衝液は、出発原料の溶解およびさらに固体層への核酸の結合の両方を実現する。該方法はさらに小試料量から核酸を単離するために適しており、特にウイルスの核酸を単離する分野に実用性を見出す。
【００２２】
出発原料のおそらく困難な溶解により展開する問題は、（特に複合出発原料からのゲノムＤＮＡの単離に対する）核酸単離用の一連の市販製品によって解決することができるが、しかしながら、該製品は出発原料の溶解をタンパク質分解酵素を使用する通常の緩衝液の中で実施するので、該方法はもはやブームらの開示による上の方法を特徴付ける古典的な「単一チューブ方法」ではないという主な不利な点を隠す。例えば、その後の遠心分離膜への核酸の結合に必要なカオトロピックイオンは、溶解が完了したとき、追加的に溶解調製物に加えられなければならない。カオトロピック塩類のタンパク質分解機能はよく知られており、および当然直ちに効率的な溶解に必要なタンパク質分解酵素を破壊するので、いかなる状況でも該カオトロピックイオンは溶解緩衝液の一部を形成することができない。
【００２３】
一連の不利な点にもかかわらず、カオトロピック塩類を使用する核酸単離方法は世界中で確立されており、市販製品を使用して大衆に利用されている。該システムは、実施するに際して非常に簡便であり、およびすべての場合において次の原理に従って進む：
・出発原料の溶解、その後の遠心分離カラム内の担体懸濁物上に配置されているガラスまたはシリカ膜の固体層への核酸の結合；
・結合せしめた核酸の洗浄、 および
・低イオン強度の緩衝液を用いた核酸の溶出；
【００２４】
すべての該システムは、カオトロピック塩類の存在で各々の担体表面に核酸を結合することに基づいており、つまり、少なくとも一つの緩衝溶液は主要要素としてカオトロピック塩を含む。ある状況の下では、該緩衝液には溶解緩衝液、または−タンパク質分解酵素を使用するシステムにおいて−溶解が完了した後に出発原料に加えられる必要な結合緩衝液をさらに適用できる。
【００２５】
負に帯電せしめた、中性もしくは塩基性タンパク質溶液を塩析するためのホフマイスター・シリーズは、適切なカオトロピック塩類の選択根拠を形成する。カオトロピック塩類は、タンパク質を変性し、水中で無極性物質の溶解度を増加し、および疎水的相互作用を破壊することで特徴付けられる。当該分野によれば、十分根拠のある該特徴は、選択された固体層への核酸の結合を促進するために、カオトロピック塩類緩衝液システムで水環境の多重構造の破壊ももたらす。核酸を単離するための最もよく知られた試薬類は、過塩素酸ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、ヨウ化カグアニジニウム−イソ−チオシアン酸塩およびグアニジニウム塩酸塩である。しかしながら、それらは一方ではコスト強制的であり、および他方ではある程度まで有毒または刺激性である。
【００２６】
カオトロピック塩類の存在における無機担体類への核酸の結合の物理化学的な原理は、専門家団体で説明されている。無機担体類表面への核酸の結合は、核酸が無機材料、特にガラスまたはシリカ粒子の表面に吸着することによって水環境の多重構造を破壊することにある。カオトロピックイオンの存在は水環境の多重構造を破壊するために常に必要である。カオトロピック塩類の濃度が高い場合、反応はほとんど定量的に進む。記載せしめた該物理化学的知識の結果として、核酸の結合固体層へ核酸を結合するための高イオン強度カオトロピック塩類を備えた緩衝液組成をすべての市販システムは含まなければならないと当該分野の中で仮定されている。
【００２７】
さらに、上記の不利な点が回避されうることによって、カオトロピック物質の使用もしくはフェノールの使用なしで運用する適切な方法も当該分野において知られている。国際特許出願ＷＯ ００／０３４４６３は、複合出発原料から核酸を単離する該種の方法を開示する。該方法において、少なくとも１つのアンチカオトロピック塩成分を有しおよびいわゆるアルコール結合化学で作用する溶解／結合緩衝液システムが使用される（インバイテック（Ｉｎｖｉｔｅｋ）、ベルリンによって製造されたＩｎｖｉｓｏｒｂ(登録商標)プラスミド・キット）。
【００２８】
しかしながら、アルコールの使用はまたいくつかの不利な点を有し、特に下記事項を含む：
・単離されるべきプラスミド−特にＲＮＡとの汚染を防ぐために、アルコールと溶解試料の正確に決定された容量比は、プラスミドの単離のために非常に注意深く正確に維持されなければならない。
・カオトロピックおよびアルコール結合化学の両方ともが、エンドトキシンで強度に汚染されているＤＮＡ単離物という結果をもたらす。追加の洗浄工程は、固体層−通常ある膜への結合を維持することを可能にするために、大量のアルコールを含む緩衝液の使用で制限される。他の物質の使用を必要とする選択的な洗浄工程は、それゆえに、この目的にほとんど使用することができない。
・単離されたＤＮＡ中のエンドトキシン含量は、該方法で単離されたＤＮＡのさらなる使用の―たとえば製薬への応用における問題に結びつく場合がある。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２９】
従って、本発明の目的は、上記の当該分野の不利な点を最初に克服することにある。
【課題を解決するための手段】
【００３０】
固体マトリックスに核酸を結合するために、一般式（Ｉ）の陽イオン洗浄剤の使用によって該問題は解決される。適切なマトリックス−例えばセルロースのような−は当該分野において知られている。本発明によれば、しかしながら、シリカまたはガラス繊維のマトリックスが好ましい。
【００３１】
本発明に係る方法シーケンス原理の主な特徴は、例としてプラスミド調製を使用して、以下のように記載することができる：
【００３２】
細菌は、実施上の目的のために、ペレットの形で存在した後に、該細菌を含む培地から最初に単離される。次の工程で、該ペレットは再懸濁緩衝液を使用して再懸濁される。この種の再懸濁緩衝液は当該分野において知られている（例えば：５０ｍＭのトリス−塩酸、ｐＨ  ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ＲＮａｓｅ  Ａを有する）。
【００３３】
得られた再懸濁液は、たとえば、２００ｍＭの水酸化ナトリウム、１％のＳＤＳのような溶解緩衝液と混合される（ここで使用することができる溶解緩衝液は、当該分野において当業者に同様に知られている）。溶解後、該調製物がとる形によって、該調製物は中性化緩衝液によって中和される。ここで使用することができる中性化緩衝液も、当該分野において大多数の当業者に親しまれている。該緩衝液は、例えば、５のｐＨ価を有する３Ｍの酢酸カリウム水溶液のような緩衝液を含む。
【００３４】
必要ならば、生じた反応混合物はろ過される。適切なフィルターは当該分野において知られ市販されている（たとえば、キアゲン（ＱＩＡＧＥＮ）社、Ｄ−４０７２４ ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）からのＱＩＡｆｉｌｔｅｒ(登録商標) ミディ（Ｍｉｄｉ））。その後、溶解物は一般式（Ｉ）の１つまたはそれ以上の化合物と好ましくは水溶液中において混合せしめ、および混合の後にシリカカラム、好ましくはいわゆるスピンカラムに置かれる（実施プロトコールによって、一般式（Ｉ）の化合物は、「より穏やかに溶解する」ため溶解緩衝液に既に加えることができる／さらにＰａｒｔ４参照） 。
【００３５】
全量を収容するためのスピンカラムの利用可能な容量が十分でない場合、液体の全量を収容することができる漏斗の形をしている希釈器具をスピンカラム上に置くことができる。反応混合物は移送されるか、もしくは真空の適用もしくは遠心分離することによりカラムを通して吸収され、必要とされた核酸、ここではプラスミドＤＮＡは、表面、好ましくはシリカ表面に結合する。
【００３６】
必要ならば、カラムはその後洗浄緩衝液で数回洗浄される。この種の洗浄緩衝液も当該分野において知られており、たとえば「ＰＥ緩衝液」（キアゲン、ヒルデン）のような緩衝液を含む。
【００３７】
必要ならば遠心分離によって洗浄緩衝液の残留物をカラム材料から取り除くことができる。
【００３８】
最後に、結合せしめた核酸は、同様に当該分野において知られている溶出緩衝液を備えたカラムから溶出される。
【００３９】
したがって、本発明は核酸を単離および洗浄するための方法に関し、一般的に下記工程で記載することができる：
−  核酸を含む生物学的試料を溶解すること；
−  必要ならば、溶解に起因する調製物を中和すること；
−  得られた反応混合物と、一般式（Ｉ）の１つまたはそれ以上の化合物または該化合物の水溶液とを混合すること、および反応混合物をシリカ系マトリックスに接触させること；
−  核酸を洗浄すること；
−  核酸を単離すること。
【００４０】
さらに、本発明は、２００ｍＭの水酸化ナトリウムおよび１重量％／ＶのＳＤＳを含む水溶液が溶解緩衝液として使用される上記の方法に関する。
【００４１】
さらに、本発明は２〜３Ｍの酢酸カリウム水溶液が中性化緩衝液として使用される上記の方法に関する。
【００４２】
さらに、本発明は、好ましくは３００〜１０００ｍＭ、特に好ましくは４００〜８００ｍＭ、格別に好ましくは５００〜ｍＭの食塩溶液が洗浄緩衝液として使用される上記の方法に関する。
【００４３】
さらに、本発明は、７．５のｐＨ価を有する緩衝作用のある７０〜９０％のエタノール水溶液が洗浄緩衝液として使用される上記の方法に関する。
適切な緩衝液は当該分野において知られており、たとえば、トリス／塩酸、ＭＯＰＳおよび他のものと同様の緩衝混合液を含む。
【００４４】
さらに、本発明は、無機マトリックスへの核酸の可逆的な結合のための一般式（Ｉ）の化合物の使用に関し、該マトリックスは金属酸化物もしくは金属混合酸化物に基づいた多孔性および／または非多孔性担体から構成することができ、および好ましくはケイ素酸素化合物、特に好ましくは二酸化ケイ素（シリカ）からなり、またはケイ酸塩からなり、またはガラス、シリカゲルもしくはゼオライトからなることができる。
【００４５】
さらに、無機マトリックスは酸化アルミニウム、二酸化チタンもしくは二酸化ジルコニウムからなることができ、または代替的に指定された金属酸化物の混合物を使用することができる。
【００４６】
特に、本発明は、核酸の結合のための一般式（Ｉ）の化合物の使用に関し、該核酸は単一のヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドと同様に一重および／または二重鎖ＤＮＡおよび／またはＲＮＡの形で存在することができ、ならびに、ＤＮＡの場合において、ＤＮＡは、すなわちゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよび／または色素体ＤＮＡ（ｐｌａｓｔｉｄｅ ＤＮＡ）であり、ならびに、ＲＮＡの場合には、ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および／または核内低分子ＲＮＡ（ｓｎ−ＲＮＡ）である。
【００４７】
最後に、本発明は、少なくとも一般式（Ｉ）の化合物を含む、核酸の単離および／または洗浄用のキットに関する。
【実施例】
【００４８】
実施例：
本発明は、今後次の実施例によって例証される：
【００４９】
次の略語が使用される：
ＣＴＡＢ      臭化セチルトリメチルアンモニウム
臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム
ＴＴＡＢ      臭化テトラデシルトリメチルアンモニウム
ＤｏＴＡＢ    臭化ドデシルトリメチルアンモニウム
ＤＴＡＢ      臭化デシルトリメチルアンモニウム
ＯＴＡＢ      臭化オクチルトリメチルアンモニウム
ＧＥＬ        アガロースゲルの濃度計評価によって決定された収量
ｍｉｎ        分（間）
ＰＥ緩衝液    市販の洗浄緩衝液 (キアゲン、Ｄ−４０７２４ ヒルデン)
ＥＣ緩衝液    細胞培養における使用のための市販の緩衝液
（キアゲン、Ｄ−４０７２４  ヒルデン）
ＲＬＴ緩衝液  市販の溶解／結合緩衝液 （キアゲン、Ｄ−４０７２４  ヒルデン）
ＥＢ緩衝液    市販の溶出緩衝液（キアゲン、Ｄ−４０７２４  ヒルデン）
ＤＰ３緩衝液  市販の中性化緩衝液（キアゲン、Ｄ−４０７２４  ヒルデン）
Ｓ３緩衝液    市販の中性化緩衝液（キアゲン、Ｄ−４０７２４  ヒルデン）
ＣＥ３緩衝液  市販の抽出緩衝液（キアゲン、Ｄ−４０７２４  ヒルデン）
OD            ２６０ｎｍにおける光度測定によって決定された収量。
（光学濃度）
RT            室温 （約２０〜２５°Ｃ）
X             多測定の平均値
【００５０】
パート１：
陽イオン洗浄剤を使用する核酸の洗浄および単離
【００５１】
他に述べられない限り、実施例１〜４は次のプロトコールに従って実施された：
【００５２】
「中規模」の大腸菌からのプラスミドＤＮＡ調製用プロトコール（１）：
１．２ｍｌの再懸濁緩衝液に細菌ペレットを再懸濁する；
２．２ｍｌの溶解緩衝液を加え、−その後、約３分間溶解する；
３．２ｍｌの中性化緩衝液を加えて、ひっくり返すことにより混合する；
４．ＱＩＡｆｉｌｔｅｒ(登録商標) ミディに直ちに移し、ＲＴで３分間保温し、およびろ過する；
５．スピンカラム上に１０ｍｌの希釈器具を置き、ＱＩＡｖａｃ(登録商標)上に配置する；
６．溶解物に２ｍｌの洗浄剤を加えて、徹底的に混合して、およびカラム上に置く；
７．混合物を通して吸収し、真空を除く；
８．希釈器具を廃棄する；
９．回収チューブの中にスピンカラムを置く；
１０．７５０μｌの塩緩衝液を加えることにより膜の選択的な洗浄をし、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する；
１１．７５０μｌのＰＥ緩衝液を加えることにより膜を洗浄し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する；
１２．緩衝液残留物を除去するために１４，０００ｒｐｍで１分間もう一度遠心分離する；
１３．１．５ｍｌのエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）チューブ上にスピンカラムを置く；
１４．２００μｌのＥＢ緩衝液で溶出する。膜上にピペットで移し、１分間保温し、遠心分離する（１４，０００ｒｐｍで１分）。
【００５３】
実施例１：いわゆる「アルコール」結合化学と比較して、洗浄剤を使用する本発明による結合化学の比較 。
本プロトコール（１）に従って、２５ｍｌのＤＨ５α／ｐＣＭＶβ培養液（高コピープラスミド）を２ｍｌ、２．５ｍｌおよび４ｍｌのそれぞれの洗浄剤（０．５Ｍの塩化ナトリウム中の４重量％）またはイソプロパノールで沈殿した：
【００５４】
表１および２
【表１】
2008506654.tif 000002
【表２】
2008506654.tif 000003
【００５５】
表３および４
【表３】
2008506654.tif 000004
【表４】
2008506654.tif 000005
【００５６】
上のデータが示すように、より高い収量と同じものに対するアルコール系結合と比較して、洗浄剤結合システムはより大きな安定性を有する。
【００５７】
実施例２：塩濃度による結合および選択性の制御
本実施例では、各場合において２５ｍｌのＤＨ５α／ｐＢＲＣＭＶβ培養液（低コピープラスミド）をプロトコール（１）に従って異なる塩濃度のＣＴＡＢで結合した。
【００５８】
２回測定の平均値は下の表５および６の各場合に再現される：
【００５９】
表５および６
【表５】
2008506654.tif 000006
【表６】
2008506654.tif 000007
【００６０】
実験結果は、適切な塩濃度を選ぶことにより、要求された核酸の選択結合の最適条件を設定できることを明確に示す。さらに、０．８Ｍの塩化ナトリウム濃度に対する測光計および濃度計測定の同一価は、必要とされるプラスミドＤＮＡだけがそれぞれの調製で発見されることになるという証拠を提供する。
【００６１】
実施例３：ＲＮＡ汚染除去用の塩を含む洗浄緩衝液の使用。
陽イオン洗浄剤が「可溶性陰イオン交換体」とみなされる場合、該陽イオン洗浄剤は、膜に結合した後に不要な核酸を除去し、およびその後の追加的な結合選択性を得るためのステップ勾配（ｓｔｅｐ  ｇｒａｄｉｅｎｔ）によって可能であるべきである。
【００６２】
本例示では、各場合において５０ｍｌのＤＨ５α／ｐＢＲＣＭＶβ培養液（低コピープラスミド）をプロトコール（１）に従って０．８Ｍの塩化ナトリウム中の１％のＣＴＡＢで膜に結合した。結合せしめたＤＮＡは、その後異なる食塩濃度（プロトコール（１）の選択工程１０）の洗浄緩衝液で洗浄された：
ａ）選択洗浄工程なし
ｂ）３００ｍＭの塩化ナトリウム
ｃ）６００ｍＭの塩化ナトリウム
ｄ）８００ｍＭの塩化ナトリウム
【００６３】
表７および８
【表７】
2008506654.tif 000008
【表８】
2008506654.tif 000009
【００６４】
上の表に示された実験データは、図１中のグラフ形において再現される。膜上の洗浄剤核酸混合体が陰イオン交換体に結合せしめる核酸と同じ方法で作用することを該結果は示す。したがって、汚染は適切な塩濃度を備えた洗浄緩衝液を使用することにより選択的に除去されうる。
【００６５】
さらに、８より多くの炭素原子の鎖長を有する、上で特定されたすべての洗浄剤で、同一純度（ＯＤ／ＧＥＬ価が実際に同一）のプラスミドＤＮＡをシリカ膜に結合できることが示されている。同時に、該収量は、溶液の使用洗浄剤および使用塩濃度（イオン強度）に依存する。
【００６６】
ここで、結合はまたＤＮＡ沈殿の抑制が生じない低塩濃度で起こることが示されている。
【００６７】
実施例４：単離ＤＮＡの品質：
単離ＤＮＡの品質を評価するために、アルコール結合化学および陽イオン洗浄剤を有する結合の間で比較が実施された。結果は次の表９および１０に示される：
【００６８】
a) エンドトキシン汚染用実験 (EU/μg DNA):
【００６９】
表９および１０
【表９】
2008506654.tif 000010
【表１０】
2008506654.tif 000011
【００７０】
アルコール結合化学を使用する場合のエンドトキシン含量は、シリカ技術によってＤＮＡ調製として通常の範囲にあるが、ＣＴＡＢ調製の場合の汚染は陰イオン交換カラムを使用してのみ通常達成せしめる範囲にある。
【００７１】
b) エンドトキシン過敏細胞（Ｈｕｈ７）のトランスフェクション（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）結果：
トランスフェクションは危機的な応用であり、使用プラスミドＤＮＡが汚染（特にエンドトキシン）からできるかぎり離れていなければならない。細胞はスーパーフェクト（ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ）プロトコール（キアゲン、Ｄ−４０７２４  ヒルデン）によってトランスフェクト（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔ）された。陰イオン交換カラム（ウルトラピュア（Ｕｌｔｒａｐｕｒｅ）  １００、キアゲン、Ｄ−４０７２４  ヒルデン）によって単離されたプラスミドは対照（１００％）として使用された。
【００７２】
達成された結果は、図２に示される。
【００７３】
トランスフェクションの結果は、ＣＴＡＢで単離されたＤＮＡに対して約１００％、つまり陰イオン交換カラム（ウルトラピュア  １００）による調製物と同一の値を示した。
【００７４】
他方で、イソプロパノール結合での調製物は、高エンドトキシン価と一致した著しくより悪いトランスフェクション結果をもたらした（上を参照）。
【００７５】
パート２：細胞溶解物の事前清浄化の省略
他に述べられない限り、実施例５〜８は次のプロトコールに従って実施された：
【００７６】
（１．５ｍｌの細菌培養のための）ある「小規模」での大腸菌からのプラスミドＤＮＡの迅速調製用プロトコール（２）：
１．１５０ｍｌの再懸濁緩衝液中に細菌ペレットを再懸濁する；
２．１５０μｌの溶解緩衝液を加える。約３分間溶解する；
３．１５０ｍｌの中性化緩衝液を加え、ひっくり返すことにより混合する；
４．溶解物に３００ｍｌの洗浄剤を加えて、徹底的に混合し、カラム上に置く；
５．遠心分離する（１４，０００ｒｐｍで１分）；
６．７５０μｌのＰＥ緩衝液を加えることにより洗浄し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
７．緩衝液残留物を除去するために１４，０００ｒｐｍで１分間一度以上遠心分離する。
８．１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ上にスピンカラムを置く；
９．１００μｌのＥＢ緩衝液で溶出する。膜の上にピペットで移し、１分間放置し、および遠心分離する（１４，０００ｒｐｍで１分間）。
【００７７】
実施例５：溶解物の清浄化を省略する場合における結合の最適化
本実施例で、各場合においての１．５ｍｌのＤＨ５α／ｐＢＲＣＭＶβ培養液（高コピー）をプロトコール（２）に従って異なる塩濃度のＣＴＡＢで結合した。２回測定の平均値を各場合に与える。
【００７８】
洗浄剤中の必要な塩濃度を溶解物の清浄化の結果に基づいて最適化した：
指定された塩濃度を備えた３００μｌの１％ＣＴＡＢ溶液を各場合において使用した。
【００７９】
図３からわかるとおり、最良の結果は１．２および１．４Ｍの塩化ナトリウムで得られた。該塩濃度で溶解物の清浄化を生ずるさらなる結合はないことはここで注目されるべきである。これとは対照的に、０．８Ｍの塩化ナトリウムは、溶解物清浄用の決定された最適濃度（実施例２参照）で、相当により悪い結果にこの場合結びついた。
【００８０】
実施例６：スピン型を用いた調製
本実施例では、各場合において１．５ｍｌのＤＨ５α／ｐＣＭＶβ培養液（高コピー）をプロトコール（２）に従って１．２Ｍの塩化ナトリウムまたはイソプロパノール中の１％のＣＴＡＢで沈殿した。
【００８１】
ＤＰ３緩衝液（３Ｍの酢酸アンモニウム、ｐＨ  ５．５）およびＳ３緩衝液（２Ｍの酢酸カリウム、ｐＨ  ５．５）は、中性化緩衝液として各場合において使用された。キアゲン有限会社からのＱＩＡｐｒｅｐ（クイアプレップ）調製は追加的な比較として使用された。
【００８２】
図４が示すとおり、イソプロパノールを使用する場合より陽イオン洗浄剤ＣＴＡＢを用いると２倍の収量が得られる。Ｓ３緩衝液を用いた調製物は、陽イオン結合に対してわずかにより低い収量のみを示し、および、これまで通りに、ＯＤとＧＥＬの間において良好な一致を示した。これとは対照的に、イソプロパノールを使用した場合、ＯＤにおいてあまりに高い過定量があった。
【００８３】
実施例７：自動化された、９６ウェル型（ｗｅｌｌ  ｆｏｒｍａｔ）での調製。
本実施例において、ＤＨ５α／ｐＣＭＶβ培養（高コピー）の振とうフラスコ培養液は、１．５ｍｌの形で９６ウェルプレート中に分注された。その後、ＤＮＡ結合を形成するためにＣＴＡＢまたはイソプロパノールを備えた分析ロボット（例えば、ＢＲ８０００／キアゲン有限会社）で一度に１枚の９６ウェルプレートが調製された。
【００８４】
最新のＤＰ９６プロトコールがイソプロパノールを用いて単離するために選択された（各場合において、１００μｌの溶解緩衝液、１８０μｌのイソプロパノール；いわゆる「低容量プロトコール」）。ＣＴＡＢを用いる単離として、以前に使用されたスピンプロトコール（各場合において、１５０μｌの溶解緩衝液、３００μｌのＣＴＡＢ溶液）にできるかぎり近いプロトコール・バージョンが選ばれた。
【００８５】
ＯＤ260あたりの収量は、すべての９６ウェルに対して決定された（表１１および１２を参照）。さらに、アガロースゲルの濃度計分析は、収量を決定するために一度に７ウェルに対して実施された。
【００８６】
図５は、７つの無作為に選ばれたウェルのＯＤおよびＧＥＬの比較を示す。新しい結合化学の利点は、選択範囲に対する収量で明確に見られうる。ＯＤとＧＥＬの間の一致は、両方の場合において等しく良好である。
【００８７】
該相違は、７つの選択された試料を用いるよりも９６ウェルすべてで決定された以下の表１１および１２中の値においてそれほど明白でないが、それでもおよそ２〜３倍高い。
【００８８】
表１１および１２
【表１１】
2008506654.tif 000012
【表１２】
2008506654.tif 000013
【００８９】
実施例７：得られたＤＮＡの品質：
異なる応用が単離されたＤＮＡの品質を決定するために実施された：
【００９０】
ａ）制限分析
実施例７において単離されたプラスミドＤＮＡ試料は塩過敏制限酵素で分解された。基準として、陰イオン交換カラム（例えば、ＵＰ１００／キアゲン有限会社）を使用して最初に単離したもの以外の同じプラスミドを使用した。すべての分解試料が０．７ｋｂの予期せしめた追加バンドを有することを図６は明確に示す。基準試料との相違を検知することができなかった。
【００９１】
ｂ）配列決定能力
以下の表１３からわかるとおり、使用されたすべてのＤＮＡ試料は平均およそ８００ｂｐとなる非常にに良好な読み長さ（ｒｅａｄ ｌｅｎｇｔｈ）を有する。個々の塩基の信号強度および判読可能の早期開始は、単離されたプラスミドＤＮＡの品質が配列決定に対してあまりに良好に適しているということもまた示す。
【００９２】
【表１３】
2008506654.tif 000014
【００９３】
ｃ）エンドトキシン含量の測定：
シリーズ４の試料のエンドトキシン含量はＬＡＬカイネティックキット（  ＬＡＬＫｉｎｅｔｉｃ  Ｋｉｔ（キャンブレックス（Ｃａｍｂｒｅｘ））  によって決定された。
使用ＤＮＡのエンドトキシンｕｎｉｔｓ／μｇ：
2008506654.tif 000015
該測定は、カオトロピック結合化学を備えた従来のシリカ調製と同じ桁のエンドトキシン汚染レベルをもたらした（実施例４参照）。
【００９４】
これと対照的に、溶解物の清浄化のないアルコール結合化学に対する値はほぼ１０より高い因数だった。
【００９５】
結論：
実施例５〜７が示すように、アルコール結合化学と近似の方法において（ＷＯ  ０３／０４０３６４も参照）、新しい結合化学も溶解物の清浄化を省略することを可能にし、とりわけ高生産性の応用または自動システムに関して大きな利点である。
【００９６】
実施例６が示すように、自動化プロトコール（２）は、あまりに容易に既存のシステムによって提供されうる。アルコール結合化学と比較して、陽イオン結合化学は、品質に関して同じかまたはよりよい―相当により高い収量でプラスミドＤＮＡを生産する。
【００９７】
パート３：その後のＤＮＡ洗浄
任意サイズのＤＮＡの洗浄に関するいくつかの例は以下に挙げられる。そうする際に、酵素反応後の遊離ヌクレオチドもしくはプライマーの分離およびより大きなＤＮＡ分子だけでなくプライマーの選択的な単離が対象とされた。
【００９８】
反対に述べられない限り、以下のプロトコール（３）に従って実施例９〜１１は実施され、小規模のシリカ膜に結合するための陽イオン洗浄剤を備えたその後の洗浄シーケンスを表す。
【００９９】
サイズに依存するＤＮＡの選択的結合用プロトコール（３）
１．試料を洗浄剤と混合する；
２．よく混合し、およびカラムに置く；
３．遠心分離する（１４，０００ｒｐｍで１分）；
４．７５０μｌのＰＥ緩衝液を加えることにより洗浄し、１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離する。
５．緩衝液残留物を除去するために１４，０００ｒｐｍで１分間もう一度遠心分離する。
６．１．５ｍｌのエッペンドルフチューブ上にスピンカラムを置く；
７．１００μｌのＥＢ緩衝液で溶出する。膜の上にピペットで移し、１分間放置し、および遠心分離する（１４，０００ｒｐｍで１分間）。
【０１００】
与えられた実施例９〜１１は、異なるＤＮＡ分子の結合を区別するために利用することができる３つの異なるパラメーターを実証する：
・使用洗浄剤の量
・ｐＨ価
・結合調製に含まれるイオン（陽イオン）
【０１０１】
これらの３つのパラメーターは十分な組み合わせの選択肢を提供すべきであり、いくつかの要求された選択性を容易に達成することができる。
【０１０２】
実施例９：１００ｂｐ断片の選択的結合
各場合において２μｇの１００ｂｐ断片または２０量体（ｍｅｒ）が５０μｌのＥＢ緩衝液に溶かされ、ＴＴＡＢ溶液（各場合において３００μｌ）の異なる希釈液で混合され、上記のプロトコール（３）に従ってさらに処理された。
【０１０３】
図７中で示された結果は、２０量体のほぼ定量的な消耗を使用洗浄剤量（ここでは：０．０７％）により単独で達成することができることを示す。
【０１０４】
実施例１０：適切なｐＨ価の選択による２０量体オリゴヌクレオチドの選択的結合
各場合において１μｇの２０量体または１００ｂｐ断片は、１００μｌのＥＢ緩衝液（１０ｍＭのトリス／塩酸、ｐＨ  ８．５）に溶かされ、そして３００μｌの０．０５％の酢酸緩衝ＴＴＡＢ溶液（１５ｍＭ酢酸／酢酸ナトリウム、ｐＨ価  ５；７および９）で混合された。該試料は、上記のプロトコール（３）に従ってさらに処理された。
【０１０５】
図８中で示された結果は回復を示し、およびそれゆえに、ｐＨ５において２０量体および１００ｂｐ断片の両方の結合を示す。これとは対照的に、２０量体だけがより高いｐＨ価で結合せしめた。これは、本発明による結合化学によって、適切なｐＨ価の選択を通じてＤＮＡ断片の必要な単離を単独に達成することができることを示す。
【０１０６】
実施例１１：適切な陽イオンを選ぶことによる１００ｂｐ断片の選択的結合もしくは非結合
各場合において２μｇの２０量体もしくは１００ｂｐ断片もしくはｐＵＣ２１プラスミドを、５０μｌのＥＢ緩衝液（１０ｍＭのトリス／塩酸、ｐＨ  ８．５）に溶かし、および５０μｌの約５．５のｐＨ価で適切な酢酸溶液（以下のリストａ〜ｄを参照）と混合した。これに、５００ｍＭの塩化ナトリウムにおける５０μｌの４％ＣＴＡＢ溶液を加え、上記のプロトコール（３）に従ってさらに処理した。
ａ）２Ｍの酢酸カリウム
ｂ）１Ｍの酢酸マグネシウム
ｃ）１Ｍの酢酸カルシウム
ｄ）１Ｍの酢酸マンガン（ＩＩ）
【０１０７】
２０量体はすべての場合において分離されたが、プラスミドｐＵＣ２１は毎回結合されたままだった。使用する陽イオンに依存して、１００ｂｐ断片を結合するか、または結合することができないかもしれない。
【０１０８】
したがって、必要なＤＮＡ分子に対して、使用せしめる陽イオンの選択を通じてのみある一定の選択性が達成されうることを図９は示す。
【０１０９】
パート４：（ＤＮＡと由来タンパク質を含めた）ＲＮＡの単離
以下では、生物学的材料からＲＮＡを単離するためにどのような新しい結合化学を使用することができるかが示されるであろう。ここで、該溶解は、たとえばタンパク質を単離するために長く使用されているような、正常な穏やかな溶解緩衝液によって生じる。本発明によれば、しかしながら、該緩衝液は、一方ではＲＮＡを安定させて、他方ではシリカ膜への結合を促進する陽イオン洗浄剤を含んでいる。
【０１１０】
該方法について、すべての核酸が初期の結合工程で結合され、および、その後、該核酸は既に知られている緩衝液で選択的に交互に溶出される。
【０１１１】
高濃度のカオトロピック塩類でＲＮＡ分解酵素（ＲＮａｓｅｓ）を不活性化することによりＤＮＡが安定せしめる知られた従来方法とは対照的に、陽イオン洗浄剤へ結合する場合において、該ＲＮＡは攻撃から保護される。これは、試料中のタンパク質の存在が該タンパク質の生物学的機能を保持し、およびさらにシリカスピンカラムの突破個体からの由来形で処理されうることを意味する。
【０１１２】
これは、これまでに知られているシステムと比較して全く著しい利点を提供し、該試料は同時的なＲＮＡの分解を備えた由来タンパク質の単離用に使用されている前半分と、およびタンパク質の同時的な変性を備えた核酸単離用に使用されている後半分に分割されなければならなく、試料の該後半分は、各場合に廃棄されなければならないという不利な点とともに、異質試料材料が分割されるときに、あまりに容易に変造された結果に導くことができる。
【０１１３】
本発明に係る方法によって、全く同一の溶解物からのＲＮＡおよびタンパク質レベルの機能的な研究を実施することもまた初めて可能である。好都合に、ゲノムＤＮＡも単離され、分析中に非常に重要になることができ、該分析における観察は遺伝的背景（変異）の原因のために確かめられる。
【０１１４】
他に述べられない限り、下記の実施例１２および１３は次のプロトコールに従って実施された：
試料からのＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）および由来タンパク質の単離用プロトコール（４）
（１２ウェル細胞培養型用プロトコール）
１．培地を除去し、１ｍｌのＥＣ緩衝液で細胞を洗浄する；
２．５分間氷上でプレートを冷却する；
３．細胞を４００μｌの溶解緩衝液（１．６容量のＣＥ３抽出緩衝液＋１容量の８％ＴＴＡＢを水の中で）と混合し、室温で５分間維持する。
（由来タンパク質の単離に一般に使用されるいかなる緩衝液も、その後に適切な量の陽イオン洗浄剤に混合せしめる溶解緩衝液の基礎として使用される。）
４．細胞をこすり取り、溶解物を３倍量で上下にピペッティングすることにより均質化する；
５．市販のスピンカラム（例えば、ＲＮイージー（ＲＮｅａｓｙ）スピンカラム／キアゲン有限会社）を使用して、溶解物を遠心分離する。
６．その後に別々に分析せしめるタンパク質分画は、突破個体で発見されることになる。
７．得られた核酸をたっぷり含んだスピンカラムは、３５０μｌの市販カオトロピック緩衝液（例えば、ＲＬＴ緩衝液／キアゲン有限会社）ですすがれる；
８．該突破個体は回収され、１０工程でさらに処理される。
９．スピンカラムは、続いてＰＥ緩衝液で洗浄され、およびカラム上に残っているｇＤＮＡがＥＢ緩衝液で溶出される。
１０．２５０μｌの１００％エタノールとともにＲＮＡを含むＲＬＴ突破個体を混合する；
１１．新しいＲＮイージースピンカラムを使用して遠心分離する
１２．および、例えば、ＲＮイージーミニ・ハンドブック、キアゲン有限会社／２００１年６月記載からの「動物細胞からの合計ＲＮＡの単離用ＲＮイージーミニ・プロトコール」／ステップ４、３２頁によって、必要なＲＮＡを単離する。
【０１１５】
実施例１２：ＲＮＡおよびＤＮＡの単離
ＨｅＬａ Ｓ３細胞は１２ウェル細胞培養型において培養され、および各場合において４ウェルは２つの異なる共通のタンパク質溶解緩衝液（リストａおよびｂを参照）および洗浄剤としてのＣＴＡＢで溶解された。適切なＲＮイージー調製は参考 ｃ）として使用された（キアゲン有限会社）。
ａ）１００ｍＭの塩化ナトリウム中に１％のＣＴＡＢを備えたβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇ ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ）溶解緩衝液（以下を参照）（終濃度１８８ｍＭ）
ｂ）３００ｍＭの塩化ナトリウム中に１％のＣＴＡＢを備えたＣＥ３細胞抽出緩衝液（終濃度８０４ｍＭ）
ｃ）ＲＮイージーミニ（キアゲン）
β−ガラクトシダーゼ溶解緩衝液：
１０ｍＭのトリス、ｐＨ  ７．４
１ｍＭのＥＤＴＡ
１００ｍＭの塩化ナトリウム
５ｍＭのＭｇＣｌ2
１％のＮＰ４０
【０１１６】
ＲＮＡとｇＤＮＡは、その後上記のプロトコール（４）に従って単離された。
【０１１７】
特に調製ａ）およびｃ）の比較において、すでに知られた緩衝液の組み合わせで本発明に係る方法を用いて該ＲＮＡおよびＤＮＡが同時に単離されうることを、図１０および１１に示された結果は明確に示す。ここでの収量および品質は確立されたシステムと比較可能である。
【０１１８】
開発中に実施された最終３７５ｍＭまでのＣＥ３溶解緩衝液に対する塩化ナトリウム濃度の最適化もまた引き続き比較可能な結果に結びついた。
【０１１９】
実施例１３：単離されたタンパク質の品質
ＨｅＬａ Ｓ３細胞は１２ウェル細胞培養型で培養され、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を運ぶプラスミドでトランスフェクトされた。４８時間後、細胞は上記のプロトコール（４）に従って溶解せしめ、各場合において４ウェルは２つの異なる共通のタンパク質溶解緩衝液（リストａおよびｂを参照）で混合された。
【０１２０】
β−ガラクトシダーゼ活性測定で使用された標準溶解緩衝液を備えた溶解は対照として使用された。
ａ）３％ＴＴＡＢを備えた溶解緩衝液
ｂ）３％ＴＴＡＢを備え、その後にＲＮイージースピンカラムを使用して遠心分離された溶解緩衝液
ｃ）標準β−ガラクトシダーゼ溶解緩衝液（組成は実施例１２を参照）
【０１２１】
タンパク質分画はその後ＴＴＡＢを沈殿するために３％のＳＤＳ溶液の一容量と混合された。酵素活性はＳＤＳ沈殿前後で測定された。
【０１２２】
ウェルのβ−ガラクトシダーゼを備えた反応溶液の黄色呈色によって実証されたとおり（示されない）、得られたタンパク質は引き続き生物学的活性である。これは、高モル（ｈｉｇｈｌｙ ｍｏｌａｒ）カオトロピックおよびその後目的としてＲＮＡ分解酵素の不活性化を有する強変性緩衝液で作用する当該分野において十分に知られている方法においては不可能である。
【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、実施例３におけるＲＮＡ汚染除去用の塩を含む洗浄緩衝液の使用に関する実験データを示す。
【図２】図２は、実施例４における単離ＤＮＡの品質を評価するためのエンドトキシン過敏細胞のトランスフェクション実験に関する実験データを示す。
【図３】図３は、実施例５における溶解物の清浄化を省略する場合における結合の最適化に関する実験データを示す。
【図４】図４は、実施例６におけるスピン型を用いた調製に関する実験データを示す。
【図５】図５は、実施例７における自動化された９６ウェル型を用いた調製に関する実験データを示す。
【図６】図６は、実施例７における得られたＤＮＡの品質を評価するための制限分析に関する実験データを示す。
【図７】図７は、実施例９における１００ｂｐ断片の選択的結合に関する実験データを示す。
【図８】図８は、実施例１０における適切なpH価の選択による２０量体オリゴヌクレオチドの選択的結合に関する実験データを示す。
【図９】図９は、実施例１１における適切な陽イオンを選ぶことによる１００ｂｐ断片の選択的結合もしくは非結合に関する実験データを示す。
【図１０】図１０は、実施例１２におけるＲＮＡおよびＤＮＡの単離実験におけるＲＮＡ単離に関する実験データを示す。
【図１１】図１１は、実施例１２におけるＲＮＡおよびＤＮＡの単離実験におけるｇＤＮＡ単離に関する実験データを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月14日(2007.5.14)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
溶解物から核酸を単離および洗浄するための方法であって、
ａ）核酸を含む生物学的試料が溶解緩衝液で溶解され；
ｂ）必要ならば、溶解で得られる調製物が中性化緩衝液で中和され；
ｃ）得られた反応混合物がその後一般式（Ｉ）の１つもしくはそれ以上の化合物または
該化合物の水溶液と混合され、および無機マトリックス、好ましくはケイ素系マトリックスと接触させられ; 
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ- （Ｉ）
（該式において、
Ｙは窒素またはリンを表わすことができ；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、Ｃ6−Ｃ26−アラルキル残基だけでなく、未分岐または分岐Ｃ1−Ｃ20−アルキル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルケニル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルキニル残基、および／または、Ｃ6−Ｃ20−アリル残基を表わすことができ；ならびに
Ｘ-は無機または有機の一価もしくは多価塩基酸の陰イオンを表わすことができる。）
ｄ）該核酸が洗浄緩衝液で洗浄され；
ｅ）該核酸が単離される
という点で特徴付けられる方法。
【請求項２】
Ｒ1がより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４、１６または１８炭素原子を有するものを表わし、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれメチル基を表わし、およびＹは窒素を表わすという点で特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ｒ1がアラルキル残基、好ましくはベンジル基を表し、Ｒ2はより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４または１６炭素原子を有するものを表し、およびＲ3およびＲ4はそれぞれメチル基を表わすという点で特徴付けられる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対イオンＸが臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩（Ｆｏｒｍｉａｔｅ）、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩またはコハク酸塩であるという点で特徴付けられる請求項１〜３のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
２００ｍＭの水酸化ナトリウムおよび１重量％／ＶのＳＤＳを含む水溶液が溶解緩衝液として使用されるという点で特徴づけられる請求項１〜４のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
２〜３Ｍの酢酸カリウム水溶液が中性化緩衝液として使用されるという点で特徴付けられる請求項１〜５のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
好ましくは３００〜１０００ｍＭ、特に好ましくは４００〜８００ｍＭ、格別に好ましくは５００〜ｍＭの一般塩水溶液が洗浄緩衝液として使用され、および／または、７０〜９０％のエタノール水溶液、好ましくはpH 7.5のトリス／塩酸を含むエタノール水溶液が洗浄緩衝液として使用されるという点で特徴付けられる請求項１〜６のうちのいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
無機マトリックスへの核酸の結合のために使用される一般式（Ｉ）の化合物。
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ- （Ｉ）
（該式において、
Ｙは窒素またはリンを表わすことができ；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、Ｃ6−Ｃ26−アラルキル残基だけでなく、未分岐または分岐Ｃ1−Ｃ20−アルキル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルケニル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルキニル残基、および／または、Ｃ6−Ｃ20−アリル残基を表すことができ；ならびに
Ｘ-は無機または有機の一価もしくは多価塩基酸の陰イオンを表わすことができる。）
【請求項９】
Ｒ1がより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４、１６または１８炭素原子を有するものを表わし、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれメチル基を表わし、およびＹは窒素を表わすという点で特徴付けられる請求項８に記載の化合物。
【請求項１０】
Ｒ1がアラルキル残基、好ましくはベンジル基を表し、Ｒ2はより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４もしくは１６炭素原子を有するものを表し、およびＲ3ならびにＲ4はそれぞれメチル基を表わすという点で特徴付けられる請求項８に記載の化合物。
【請求項１１】
対イオンＸが臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩（Ｆｏｒｍｉａｔｅ）、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩またはコハク酸塩であるという点で特徴付けられる請求項８〜１０のうちのいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１２】
無機マトリックスが金属酸化物もしくは金属混合酸化物に基づく多孔および／または非多孔性担体から構成されるという点で特徴付けられる請求項８〜１１のうちのいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１３】
該無機マトリックスがケイ素−酸素化合物、好ましくは二酸化ケイ素、またはケイ酸塩からなるという点で特徴付けられる請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
無機マトリックスがガラス、シリカゲルまたはゼオライトからなるという点で特徴付けられる請求項１２に記載の化合物。
【請求項１５】
無機マトリックスが酸化アルミニウム、二酸化チタンおよび／または二酸化ジルコニウムからなるという点で特徴付けられる請求項１２に記載の化合物。
【請求項１６】
該指定された金属酸化物の混合物が使用されるという点で特徴付けられる請求項１３〜１５のうちのいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
核酸、特に一重ヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドだけでなく一重および／または二重鎖のＤＮＡおよび／またはＲＮＡの結合のための請求項８〜１６のうちのいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１８】
ＤＮＡがゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡおよび／またはプラスチドＤＮＡであるという点で特徴付けられる請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
ＲＮＡがメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）および／または核内低分子ＲＮＡ（ｓｎ−ＲＮＡ）であるという点で特徴付けられる請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
下記部品を含む、核酸を単離および／または洗浄するためのキット。
-  一般式（Ｉ）の化合物 、必要ならば水溶液中に存在し、および／または
Ｙ+Ｒ1Ｒ2Ｒ3Ｒ4Ｘ- （Ｉ）
（該式において、
Ｙは窒素またはリンを表わすことができ；
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4は、互いに独立して、Ｃ6−Ｃ26−アラルキル残基だけでなく、未分岐または分岐Ｃ1−Ｃ20−アルキル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルケニル残基、Ｃ3−Ｃ6−アルキニル残基、および／または、Ｃ6−Ｃ20−アリル残基を表すことができ；ならびに
Ｘ-は無機または有機の一価もしくは多価塩基酸の陰イオンを表わすことができる。）
-  必要ならば溶解緩衝液、および／または
-  必要ならば中性化緩衝液、および／または
-  必要ならば洗浄緩衝液、および／または
-  必要ならば溶出緩衝液、および／または
-  必要ならば核酸を結合しうる無機マトリックス。
【請求項２１】
Ｒ1がより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４、１６もしくは１８炭素原子を有するものを表し、Ｒ2、Ｒ3およびＲ4はそれぞれメチル基を表わし、およびＹは窒素を表わすという点で特徴付けられる請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
Ｒ1がアラルキル残基、好ましくはベンジル基を表し、Ｒ2はより高級なアルキル残基、好ましくは１２、１４もしくは１６炭素原子を有するものを表し、およびＲ3ならびにＲ4はそれぞれメチル基を表わすという点で特徴付けられる請求項２０に記載のキット。
【請求項２３】
対イオンＸが臭化物、塩化物、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、シュウ酸塩またはコハク酸塩であるという点で特徴付けられる請求項２０に記載のキット。
【国際調査報告】
2008506654.tif 000027
2008506654.tif 000028
2008506654.tif 000029
2008506654.tif 000030
2008506654.tif 000031