(57)【要約】  分析物の検出のための比色センサーが開示されている。比色センサーを用いる方法及び分析物の比色検出のためのキットも同様に開示されている。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
分析物を検出するための比色系において、
レセプタ、
少なくとも１つのジアセチレン化合物を含む重合組成物、
を含み、前記レセプタが前記重合組成物内に取込まれてトランスデューサを形成している比色センサー、及び
前記分析物と前記トランスデューサの間の相互作用を媒介する緩衝液組成物であって、緩衝液系が２つ以上の異なる緩衝液を含む緩衝液組成物、
を含み、前記トランスデューサが、分析物と接触した時点で色変化を示す比色系。
【請求項２】
前記緩衝液組成物が、ＨＥＰＥＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、ＰＢＳ緩衝液及びそれらの組合せから成る群から選択された２つ以上の緩衝液を含む、請求項１に記載の比色系。
【請求項３】
さらにプローブを含む、請求項１に記載の比色系。
【請求項４】
前記プローブが、フィブリノーゲン、ストレプトアビジン、ＩｇＧ及びそれらの組合せから成る群から選択されている、請求項１に記載の比色系。
【請求項５】
界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の比色系。
【請求項６】
前記トランスデューサがリポソームである、請求項１に記載の比色系。
【請求項７】
前記トランスデューサが、前記緩衝液組成物と接触した時点で色変化を示す、請求項１に記載の比色系。
【請求項８】
前記緩衝液が前記トランスデューサとのイオン相互作用により前記分析物の相互作用を媒介する、請求項１に記載の比色系。
【請求項９】
前記緩衝液組成物が、前記トランスデューサとの疎水性相互作用を増強させることによって前記分析物の前記相互作用を媒介する、請求項１に記載の比色系。
【請求項１０】
前記レセプタがリン脂質を含む、請求項１に記載の比色系。
【請求項１１】
前記リン脂質が、ホスホコリン、ホスホエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、及びそれらの組合せから成る群から選択されている、請求項１０に記載の比色系。
【請求項１２】
分析物の検出方法において、
レセプタ、及びジアセチレンを含む重合組成物を含む比色センサーを形成するステップであって、そこでは前記レセプタが前記重合組成物の中に取込まれて、色変化を示す能力をもつトランスデューサを形成する、ステップ、
前記センサーとプローブを接触させるステップ、
２つ以上の異なる緩衝液を含む緩衝液組成物の存在下で標的分析物を含有している疑いのある試料と前記センサーをさらに接触させるステップ、及び
前記分析物が存在する場合に色変化を観察するステップ、
を含む方法。
【請求項１３】
分析物の検出方法において、
レセプタ、及びジアセチレンを含む重合組成物を含む比色センサーを形成するステップであって、そこでは前記レセプタが前記重合組成物の中に取込まれて、プローブの存在下で色変化を示す能力をもつトランスデューサを形成する、ステップ、
２つ以上の異なる緩衝液を含有する緩衝液組成物の存在下で、標的分析物を含有する疑いのある試料、及び前記標的分析物と前記レセプタの両方に対する親和性をもつプローブと、前記トランスデューサとを接触させるステップ、及び
前記分析物が存在する場合に基本的にいかなる色変化もないことを観察するステップ、
を含む方法。
【請求項１４】
前記分析物が黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、プロテインＡ、ＰＢＰ２’、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から成る群から選択されている、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記観察可能な色変化が、分析物を含有している疑いのある試料と前記トランスデューサを接触させた時点から６０分以内に発生する、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その全体が本明細書に参照により援用されている２００４年１２月１７日付けの米国仮特許出願第６０／６３６，９９３号明細書に対する優先権を請求するものである。
【背景技術】
【０００２】
病原菌、特に抗生物質耐性菌の検出のための現行の技術には一般に時間がかかり、標準的に純粋な形での細菌の培養が関与している。きわめて関心の高いかかる病原菌の１つが、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）（「Ｓ．ａｕｒｅｕｓ」）であり、これは、小さい皮ふ膿瘍及び創傷感染といったような表面病巣、心内膜炎、肺炎及び敗血症といったような全身性の及び生命にかかわる身体条件、ならびに食中毒及び毒素性ショック症候群といったような中毒症を含めた広範な感染をひき起こす病原体である。黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、わずかな精選された抗生物質以外の全ての抗生物質に対する耐性をもつ。
【０００３】
様々な従来の技術を用いて病原菌の分析が試みられてきた。例えば、それらの方法には、蛍光分析免疫クロマトグラフィ（例えば米国特許第５，７５３，５１７号明細書中で記されているもののような急速分析物測定手順）、ＥＬＩＳＡ（例えば比色ＥＬＩＳＡ）及びその他の比色技術が含まれる。ポリジアセチレン（ＰＤＡ）材料を内含する比色センサーが米国特許第５，６２２，８７２号明細書及び国際公開第０２／００９２０号パンフレット、米国特許第６，３９５，５６１Ｂ１号明細書、同第６，３０６，５９８Ｂ１号明細書、同第６，２７７，６５２号明細書、同第６，１８３，７２２号明細書、及び同第６，０８０，４２３号明細書の中で記述されている。
【０００４】
ジアセチレンは、溶解状態の単量体として標準的に無色であり、熱又は化学線のいずれかにより付加重合する。重合が進むにつれて、これらの化合物は、青又は紫色に対比色変化する。熱、物理的応力、又は溶媒又は対イオンの変化といったような外部刺激に曝露された時点で、ポリジアセチレンは、平面主鎖立体構造の歪曲によって生み出されるさらなる色変化を示す。例えば、ポリジアセチレン集合は、ミノ（Ｍｉｎｏ）ら、「Ｌａｎｇｍｕｉｒ」、第８巻、５９４頁、１９９２年、チャンス（Ｃｈａｎｃｅ）ら、「Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃｓ」、第７１巻、２０６頁、１９７９年、シブタグ（Ｓｈｉｂｕｔａｇ）、「Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ」、第１７９巻、４３３頁、１９８９年、金子ら、「Ｔｈｉｎ  Ｓｏｌｉｄ  Ｆｉｌｍｓ」、第２１０巻、５４８頁、１９９２年、並びに米国特許第５，６７２，４６５号明細書に記述されているように、接合された主鎖内の立体構造変化に起因するｐＨ変化又は温度上昇に伴って、青色から赤色まで色変化するものとして知られている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当該技術分野では黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）ならびにその他の病原菌を検出する方法が記述されてきているが、検出方法を改善すると有利であると思われる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ポリジアセチレン集合に対し立体構造の変化をひき起こすような形で分析物の相互作用の結果として発生するスペクトル変化（裸眼で見えるか又は比色計で見える色変化）により分析物の存在を検出するための比色センサーを提供している。ポリジアセチレン集合は、単純なただしきわめて感応性が高い要領で分析物の存在を標示する。分析物を検出するための比色系において、レセプタ、少なくとも１つのジアセチレン化合物を含む重合組成物（これは、重合組成物はジアセチレン化合物の重合から生成されることを意味する）、を含み、レセプタが重合組成物内に取込まれてトランスデューサを形成している比色センサー、及び分析物とトランスデューサの間の相互作用を媒介する緩衝液組成物であって、緩衝液系が２つ以上の異なる緩衝液を内含する緩衝液組成物、を含み、トランスデューサが、分析物と接触した時点で色変化を示す比色系が提供されている。
【０００７】
１つの実施形態においては、緩衝液組成物は、より高いイオン強度の緩衝液とより低いイオン強度の緩衝液の組合せである。好ましい実施形態では、緩衝液組成物は、ＨＥＰＥＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液、ＰＢＳ緩衝液及びそれらの組合せから成る群から選択されている。１つの実施形態においては、緩衝液は、トランスデューサとのイオン相互作用により分析物の相互作用を媒介する。もう１つの実施形態においては、緩衝液組成物は、トランスデューサとの疎水性相互作用を増強することによって分析物の相互作用を媒介する。トランスデューサは、水溶液中に分散させられるか又は基板上にコーティングされ得る。
【０００８】
もう１つの実施形態においては、比色系はさらにプローブを含む。好ましい実施形態においては、プローブは、フィブリノーゲン、ストレプトアビジン、ＩｇＧ及びその組合せから成る群から選択される。
【０００９】
もう１つの実施形態においては、比色系はさらに界面活性剤を含む。好ましい実施形態においては、該界面活性剤は、非イオン界面活性剤を含む。
【００１０】
例示的な１つの実施形態では、比色系のトランスデューサはリポソームでありかつ／又は緩衝液組成物と接触した時点で色変化を示す。
【００１１】
例示的な１つの実施形態では、ジアセチレン化合物（すなわちポリジアセチレン材料のための出発材料）は、
【化１】
2008524593.tif 000003
という構造式のものであり、式中、Ｒ1は
【化２】
2008524593.tif 000004
を含み、そうでなければ、Ｒ2が
【化３】
2008524593.tif 000005
を含み、ここでＲ3、Ｒ8、Ｒ13、Ｒ21、Ｒ24、Ｒ31及びＲ33は独立してＣ1-Ｃ20アルキルであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ14、Ｒ16、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ22、Ｒ25及びＲ32は独立してＣ1−Ｃ14アルキレンであり、Ｒ6、Ｒ15、Ｒ18及びＲ26は独立してＣ1−Ｃ14アルキレン、Ｃ2−Ｃ8アルケニレン又はＣ6−Ｃ13アリーレンであり、Ｒ9はＣ1-14アルキレン又は−ＮＲ34−であり、Ｒ10、Ｒ12、Ｒ27及びＲ29は独立してＣ1−Ｃ14アルキレン又は（Ｃ1−Ｃ14アルキレン）−（Ｃ2−Ｃ8アリーレン）であり、Ｒ11及びＲ28は独立してＣ2−Ｃ30アルキニルであり、Ｒ17はエステル活性化基であり、Ｒ23は、Ｃ6−Ｃ13アリーレンであり、Ｒ30はＣ1−Ｃ14アルキレン又は−ＮＲ36−であり、Ｒ34及びＲ36はＣ1−Ｃ4アルキルであり、ｐは１〜５であり（ここで、「ジアセチレン」は２〜１０個のＣ−Ｃ３重結合を伴う化合物を包含するものとして使用されている）、ｎは１〜２０であり、ここでＲ1及びＲ2は同じではない。
【００１２】
１つの実施形態においては、比色系内レセプタは、ホスホコリン、ホスホエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール、及びそれらの組合せから成る群から選択されるリン脂質を含む。
【００１３】
分析物の検出方法が提供されている。該方法は、レセプタ及びジアセチレンを含む重合組成物（すなわち該重合組成物はジアセチレンの重合から誘導されている）を含む比色センサーを形成するステップであって、レセプタが重合組成物の中に取込まれて、色変化を示す能力をもつトランスデューサを形成するステップ、センサーとプローブを接触させるステップ、２つ以上の異なる緩衝液を含む緩衝液組成物の存在下で標的分析物を含有している疑いのある試料とセンサーを接触させるステップ、及び前記分析物が存在する場合に色変化を観察するステップ、を含む。
【００１４】
もう１つの実施形態においては、レセプタ及びジアセチレンを含む重合組成物を含む比色センサーを形成するステップであって、レセプタが重合組成物の中に取込まれて、プローブの存在下で色変化を示す能力をもつトランスデューサを形成するステップ、２つ以上の異なる緩衝液を含有する緩衝液組成物の存在下で、標的分析物を含有する疑いのある試料及び前記標的分析物と前記レセプタの両方に対する親和性をもつプローブと、トランスデューサとを接触させるステップ、及び分析物が存在する場合に基本的にいかなる色変化も観察しないステップを含む、分析物の検出方法が提供されている。好ましくは、標的分析物を含有している疑いのある試料とプローブを組合わせて、トランスデューサと接触させる前に混合物を形成されることができる。
【００１５】
例示的な１つの実施形態では、分析物は、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）、プロテインＡ、ＰＢＰ２’、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）から成る群から選択されている。大部分の実施形態において、比色系は、分析物とトランスデューサを接触させた時点から６０分以内に観察可能な色変化を示す。
【００１６】
定義
以下の定義済み用語について、クレーム中又は本明細書の他の場所で異なる定義が示されているのでないかぎり、これらの定義が適用されることになる。
【００１７】
本書で使用される通り、「アルキル」という用語は、規定の数の炭素原子をもつ直鎖又は有枝鎖又は環状の一価の炭化水素基を意味する。アルキル基には１個〜２０個の炭素原子を伴うものが含まれる。本書で使用される「アルキル」の例としては、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソブチル及びイソプロピルなどが含まれるが、これらに制限されるわけではない。環状部分が意図されている場合には、前記アルキル内に少なくとも３個の炭素が存在しなければならないということを理解すべきである。かかる環状部分には、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル及びシクロヘプチルが含まれる。
【００１８】
本書で使用されている「アルキレン」という用語は、規定の数の炭素原子を有する直鎖又は有枝鎖又は環状２価炭化水素基を意味する。アルキレン基には１〜１４個の炭素原子をもつものが含まれる。本書で使用される「アルキレン」の例としては、メチレン、エチレン、トリメチレン、テトラメチレンなどが含まれるが、これらに制限されるわけではない。環状部分が意図されている場合、前記アルキレンの中に少なくとも３個の炭素が存在しなければならないということを理解すべきである。かかる環状部分には、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンチレン、シクロヘキシレン及びシクロヘプチレンが含まれる。
【００１９】
本書で使用される「アルケニレン」という用語は、規定の数の炭素原子及び１つ以上の炭素−炭素２重結合をもつ直鎖又は有枝鎖又は環状２価炭化水素基を意味する。アルケニレン基には、２〜８個の炭素原子を伴うものが含まれる。本書で使用される「アルケニレン」の例としては、エテン−１，２−ジイル、プロペン−１，３−ジイルなどが含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【００２０】
本書で使用されている「アリーレン」という用語は、フェニレンといったような単環又はナフチレン又はアントリレンといったような多重縮合環をもつ２価の不飽和芳香族カルボキシル基を意味する。アリーレン基には、６〜１３個の炭素原子を伴うものが含まれる。本書で使用される「アリーレン」の例としては、ベンゼン−１，２-ジイル、ベンゼン−１，３−ジイル、ベンゼン−１，４−ジイル、ナフタレン−１，８−ジイルなどが含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【００２１】
本書で使用される「アルキレン−アリーレン」という用語は、以上で定義づけした通りのアリーレン部分に結合された以上で定義づけした通りのアルキレン部分を意味する。本書で使用される「アルキレン−アリーレン」の例としては、−ＣＨ2−フェニレン、−ＣＨ2ＣＨ2−フェニレン及び−ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−フェニレンが含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【００２２】
本書で使用される「アルキニル」という用語は、２〜３０個の炭素及び少なくとも１つの炭素−炭素３重結合を有する直鎖又は有枝鎖又は環状の一価の炭化水素基を意味する。本書で使用される「アルキニル」の例としては、エチニル、プロピニル及びブチニルが含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【００２３】
本書で使用される「分析物」という用語は、本発明のセンサー系により検出され得るあらゆる材料を意味する。かかる材料には、小分子、病原性及び非病原性生体、毒素、膜レセプタ及びフラグメント、揮発性有機化合物、酵素及び酵素基質、抗体、抗原、タンパク質、ペプチド、核酸、及びペプチド核酸が含まれるが、これらに制限されるわけではない。「標的分析物」というのは、センサー系内で検出するためにターゲティングされた材料を意味する。
【００２４】
本書で使用されている「細菌」という用語は、球菌、桿菌、スピロヘータ、スフェロプラスト、原形質体を含めた細菌であると考えられるあらゆる形態の微生物を意味する。
【００２５】
本書で使用されている「レセプタ」という用語は、標的分析物及び／又はプローブに対する親和性をもつあらゆる分子又は分子集合を意味する。レセプタには、脂質、表面膜タンパク質、酵素、レクチン、抗体、組換え型タンパク質、合成タンパク質、核酸、Ｃ−グリコシド、炭水化物、ガングリオシド及びキレート化剤といったような、天然に発生する又は合成のレセプタが含まれるがこれらに制限されるわけではない。
【００２６】
本書に使用されている「集合」又は「自己集合」という用語は、重合に先立つジアセチレン分子及びリン脂質のあらゆる自己秩序化を意味する。Ｊ．イスラエラックヴィリ（Ｉｓｒａｅｌａｃｈｖｉｌｉ）、「Ｉｎｔｅｒｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｆｏｒｃｅｓ」（第２版）、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９２年）、３２１〜４２７頁を参照のこと。
【００２７】
本書で使用される「自己集合単層」（ＳＡＭ）という用語は、自然発生的自己秩序化により一定の与えられた基板上に形成されるあらゆる秩序化極薄有機フィルムを意味する。ウルマン（Ｕｌｍａｎ）、「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｉｌｍｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１年）、２３７−３０１頁。
【００２８】
本書で使用する「トランスデューサ」という用語は、分子レベルで共有結合又は非共有結合的相互作用（例えば静電相互作用、極性相互作用、ファンデルワールス力）といったような認識事象を観察可能なシグナルへと転換する能力をもつ材料を描写する。
【００２９】
「プローブ」というのは、標的分析物及び／又はレセプタと相互作用する能力をもつ構成成分を意味する。従って、プローブは「検出可能な結合試薬」すなわち、分析物（すなわち標的分析物）及び／又はレセプタを特異的に認識し相互作用するか又はそれと結合する作用物質の１つのタイプであり、ここで該プローブは結合させられた時点で検出を可能にする特性を有する。「特異的に相互作用する」というのは、検出可能な結合剤が物理的に標的分析物又はレセプタと相互作用して、試料中に同じく存在するその他の分析物を実質的に排除するに至ることを意味する。該発明に従って有用である検出可能な結合試薬の結合は、結合の測定を可能にする安定性を有する。
【００３０】
「含む」という用語及びその変形形態は、これらの用語が明細書及びクレーム中で使われる場合、制限的意味をもたない。
【００３１】
「好ましい」及び「好ましくは」という用語は、或る種の状況下で或る利点を提供できる該発明の実施形態を意味する。しかしながら、同一の又はその他の状況においてその他の実施形態も同様に好まれるかもしれない。さらに、１つ以上の好ましい実施形態の詳説は、その他の実施形態が有用でないことを暗に意味するものではなく、又、その他の実施形態を該発明の範囲から除外するものではない。
【００３２】
本書で使用される「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、「少なくとも１つ」及び「１つ以上」という用語は、互換的に使用される。
【００３３】
本書では、全ての数字は、「約（ａｂｏｕｔ）」という語により変更されるものと仮定されている。終点による数値範囲の詳説は、その範囲内に包含される全ての数字を含む（例えば１〜５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４及び５が含まれる）。
【００３４】
本発明の以上の要約は、本発明の各々の開示された実施形態又は全ての実現を記述するように意図されたものではない。以下の記述は、例示的実施形態をより特定的に例証している。該出願全体にわたるいくつかの場所において、さまざまな組合せの中で使用可能な実施例のリストを通して指針が提供されている。各々のケースにおいて、詳説されたリストは、代表的な群として役立つにすぎず、排他的リストとして解釈されるべきではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明は、分析物の検出のための比色センサー系を提供する。該比色系は、レセプタと重合ジアセチレン材料（（必ずしもではないが）その他の構成要素を含み得る組織されたポリジアセチレン構造を意味するポリジアセチレン集合）を含む比色センサーを内含し、ここで該レセプタはポリジアセチレン内部に取込まれて、プローブ及び／又は分析物との結合時点で色変化を提供する能力をもつトランスデューサを形成する。該比色センサーは、溶解状態で又は基板上にコーティングされた状態で機能し得る。
【００３６】
ポリジアセチレン集合
本発明のジアセチレン化合物は、溶解状態で自己集合でき、例えば電磁スペクトルのＵＶ又は可視域内の電磁放射線といったようなあらゆる化学線を用いて重合され得る秩序化された集合を形成する。ジアセチレン化合物の重合は、その立体構造及び外部因子に対する曝露に応じて５７０ナノメートル（ｎｍ）未満、５７０ｎｍと６００ｎｍ（終点を含む）の間又は６００ｎｍ超の可視スペクトル内の色を有する重合反応生成物を結果としてもたらす。標準的には本書で開示されているジアセチレン化合物の重合は、結果として、ポリジアセチレン主鎖を内含する準安定青相重合体網状構造をもたらす。これらの準安定青相重合体網状構造は、例えば熱、溶媒又は対イオン（利用可能である場合）の変化、又は物理的応力といったような外部因子に対して曝露された時点で青味がかったオレンジ色から赤味がかったオレンジ色までの色変化を行う。
【００３７】
本書で開示されているジアセチレン化合物及びその重合生成物は、物理的応力に対する曝露時点で可視的色変化をするその能力により、分析物の検出用のセンシングデバイスの調製のための候補となっている。開示されているジアセチレン化合物から形成されたポリジアセチレン集合は、バイオセンシング応用においてトランスデューサとして機能し得る。
【００３８】
一定の与えられたセンシング応用のためのジアセチレン分子の構造的必要条件は、標準的に応用に特異的なものである。全体的鎖長、溶解度、極性、結晶化度及びさらなる分子修飾のための官能基の存在といった特長の全てが、有用なセンシング材料として役立つジアセチレン分子の能力を、協同して決定する。例えば、水性媒質中の分析物の生物検出の場合、ジアセチレン化合物の構造は、水中で安定した分散を形成し、着色された材料へと効率良く重合し、分析物に対する結合のため適切なレセプタ化学を取込み、かつ色変化を用いてあの結合相互作用を変換する能力を有していなくてはならない。これらの能力は、ジアセチレン化合物の構造的特長によって左右される。
【００３９】
本発明のジアセチレン化合物は、上述の能力を有し、所望の色変化を行うポリジアセチレン集合へと容易にかつ効率良く重合され得る。さらに、該ジアセチレン化合物は、なおも安定した重合可能な溶液を形成しながら、以下で記述するレセプタといったような重合不能な材料を大幅に余剰に取込むことができるようにする。
【００４０】
開示されたジアセチレン化合物（出発材料）は、ハイスループット合成方法を含め、高速高収量で合成可能である。例えばヘテロ原子といったようなジアセチレン化合物（出発材料）の主鎖中の官能基の存在は、一定の与えられたセンシング応用の必要条件を満たすための容易な構造的精緻化の可能性を提供する。ジアセチレン化合物は、例えば水といったような適切な溶媒に対してジアセチレンを添加し、混合物を音波処理し、次に標準的には２５４ｎｍの波長の紫外光で溶液を照射することにより、所望のポリジアセチレン主鎖含有網状構造の形に重合され得る。重合時点で、溶液は青味がかった紫色へと色変化する。
【００４１】
本発明において有用なジアセチレン（出発材料）は、標準的にカルボキシル基、第１級又は第３級アミン基、カルボキシルメチルエステルといったような少なくとも１つの官能基を伴って少なくとも８という平均炭素鎖長を含む。適切なジアセチレンとしては、米国特許第５，４９１，０９７号明細書（リビ（Ｒｉｂｉ）ら）、国際公開第０２／００９２０号パンフレット、米国特許第６，３０６，５９８号明細書及び国際公開第０１／７１３１７号パンフレット内で記述されているものが含まれる。
【００４２】
好ましい実施形態においては、ポリジアセチレン集合には、
【化４】
2008524593.tif 000006
という構造式のジアセチレンから結果として得られる重合化合物が含まれ、ここで式中、Ｒ1は
【化５】
2008524593.tif 000007
であり、Ｒ2は、
【化６】
2008524593.tif 000008
であり、
Ｒ3、Ｒ8、Ｒ13、Ｒ21、Ｒ24、Ｒ31及びＲ33は独立してアルキルであり、Ｒ4、Ｒ5、Ｒ7、Ｒ14、Ｒ16、Ｒ19、Ｒ20、Ｒ22、Ｒ25及びＲ32は独立してアルキレンであり、Ｒ6、Ｒ15、Ｒ18及びＲ26は独立してアルキレン、アルケニレン又はアリーレンであり、Ｒ9はアルキレン又は−ＮＲ34−であり、Ｒ10、Ｒ12、Ｒ27及びＲ29は独立してアルキレン又はアルキレン−アリーレンであり、Ｒ11及びＲ28は独立してアルキニルであり、Ｒ17はエステル活性化基であり、Ｒ23は、アリーレンであり、Ｒ30はアルキレン又は−ＮＲ36−であり、Ｒ34及びＲ36は独立してＨ又はＣ1−Ｃ4アルキルであり、ｐは１〜５であり、ｎは１〜２０であり、ここでＲ1及びＲ2は同じではない。
【００４３】
化合物の例はさらに、米国特許出願公開第２００５／０１０１７９４−Ａ１号明細書及び米国特許出願公開第２００４／０１２６８９７−Ａ１号明細書及び同第２００４／０１３２２１７−Ａ１号明細書の中で記述されている。
【００４４】
好ましい実施形態において、Ｒ1は
【化７】
2008524593.tif 000009
であり、式中Ｒ7はエチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン又はノナメチレンであり、Ｒ6は、エチレン、トリメチレン、エテニレン又はフェニレンであり、Ｒ2は、
【化８】
2008524593.tif 000010
であり、ここでＲ20はエチレン、トリメチレン、テトラメチレン、ペンタメチレン、ヘキサメチレン、ヘプタメチレン、オクタメチレン又はノナメチレンであり、Ｒ21はウンデシル、トリデシル、ペンタデシル、ヘプタデシルであり、ｐは１である。
【００４５】
該発明は、構造異性体及び幾何異性体といった異性体、塩、溶媒和物、多形体などを含めた本書に記述された化合物を包含するものである。
【００４６】
構造式ＸＸＩＩＩのジアセチレンは、ｎが標準的に１〜４であり、ｍが標準的に１０〜１４であるものとしてスキーム１に概念的に示されている通りに調製可能である。
【化９】
2008524593.tif 000011
【００４７】
構造式ＸＸＩＩＩの化合物は、例えばＤＭＦといったような適切な溶媒中での適切な酸化剤との反応により構造式ＸＸＩＩの化合物から酸化を介して調製可能である。適切な酸化剤には、ジョーンズ試薬及び重クロム酸ピリジニウムなどが含まれる。上述の反応は標準的に、０〜４０℃、一般に０℃〜２５℃の温度で１時間から４８時間、一般的には８時間行なわれる。
【００４８】
構造式ＸＸＩＩの化合物は、適切な酸塩化物との反応により、ＸＸＩの化合物から調製可能である。適切な酸塩化物としては、ラウロイルクロリド、１−ドデカノイルクロリド、１−テトラデカノイルクロリド、１−ヘキサデカノイルクロリド及び１−オクタデカノイルクロリドなどといった所望の生成物を提供するあらゆる酸塩化物が含まれる。適切な溶媒としては、エーテル、テトラヒドロフラン、ジクロロメタン及びクロロホルムなどが含まれる。前述の反応は、標準的には、トリアルキルアミン又はピリジン塩基といったような塩基の存在下で０℃〜４０℃、一般的には０℃〜２５℃の温度で１〜２４時間、一般的には３時間行なわれる。
【００４９】
構造式ＸＸＩの化合物は、市販されている（例えばｎは１〜４である）か又は、スキーム１に概略的に記され、例えばアブラムス（Ａｂｒａｍｓ）、スザンヌ（Ｓｕｚａｎｎｅ）Ｒ．、ショウ（Ｓｈａｗ）、アンジェラ（Ａｎｇｅｌａ）Ｃ．「Ｔｒｉｐｌｅ−ｂｏｎｄ  ｉｓｏｍｅｒｉｚａｔｉｏｎｓ：２−ｔｏ９−ｄｅｃｙｎ−１−ｏｌ」、Ｏｒｇ．Ｓｙｎｔｈ．（１９８８年）、第６６号、１２７〜３１頁、及びブランズマ（Ｂｒａｎｄｓｍａ）Ｌ．「Ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ  Ａｃｅｔｙｌｅｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９７１年）などの中で開示されているように、化合物ＸＩＶ及びＸＸを介して構造式ＸＶＩＩＩの化合物から調製可能である。
【００５０】
本書で開示されている通りのジアセチレン化合物は、トルエンといったような適切な溶媒の存在下で無水コハク酸、無水グルタル酸又は無水フタル酸といった無水物と構造式ＸＸＩＩの化合物を反応させることにより調製することもできる。上述の反応は標準的には、５０℃〜１２５℃、一般的に１００℃〜１２５℃の温度で、１時間〜２４時間、一般的には１５時間行なわれる。
【００５１】
重合されたジアセチレンを含む比色センサーは、分子認識事象の比色検出のための基礎として役立つことができる。該センサーは、重合の前か又は後にジアセチレン単量体に対してレセプタを添加することにより、調製可能である。レセプタは物理的混合、共有結合、及び非共有結合的相互作用（例えば静電反応、極性相互作用など）を含めた、さまざまな手段を通してポリジアセチレン集合を官能化する能力をもつ。
【００５２】
重合時点又はそれ以降に、レセプタは、分析物とレセプタの相互作用が接合されたｅｎｅ−ｙｎｅ重合体主鎖の擾乱に起因する可視的な色変化を結果としてもたらすような重合体網状構造を伴って効果的に取込まれる。
【００５３】
ポリジアセチレン集合と共にレセプタが取込まれることにより、プローブ及び／又は分析物との相互作用又は結合に応えて変形し得る構造的形状が得られる。特に有用なレセプタは、ｖ／（ａoｌc）（イスラエラックヴィリ、Ｊ．Ｎ．ら、Ｑ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、第１３号、１２１頁、１９８０年）として定義されるパッキングパラメータによって特徴づけできる標準的に棒状の分子アーキテクチャをもつ両親媒性分子の集合である［なお、式中、ｖは分子の炭化水素構成要素（例えばリン脂質又は脂肪酸の炭化水素鎖）により占有される体積であり、ａ0は極性頭部基（例えばリン脂質のリン酸頭部基又は脂肪酸のカルボン酸頭部基）により占有される有効面積であり、ｌcはいわゆる臨界長であり一般的にその環境の温度における分子の長さを記述する］。レセプタのための好ましい両親媒性分子は、１／３〜１の間のパッキングパラメータｖ／（ａ0ｌc）値をもつ分子である。
【００５４】
有用なレセプタの例としては、脂質、表面膜タンパク質、酵素、レクチン、抗体、組換え型タンパク質、合成タンパク質、核酸、ｃ−グリコシド、炭水化物、ガングリオシド及びキレート化剤が含まれるがこれらに制限されるわけではない。大部分の実施形態において、レセプタはリン脂質である。適切なリン脂質にはシルバー（Ｓｉｌｖｅｒ）、ブライアン（Ｂｒｉａｎ）Ｌ．「Ｔｈｅ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ」、第１章、１〜２４頁、（１９８５年）に記述されているもののようなホスホコリン（例えば、１，２−ジメリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）、ホスホエタノールアミン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセリン、及びホスファチジルグリセロールが含まれる。
【００５５】
１つの実施形態においては、レセプタは、問題の分析物及び／又はプローブに対する結合親和性をそれ自体が有している１つの構造を形成するべくポリジアセチレンの中で物理的に混合され分散させられる。構造には、リポソーム、ミセル、及びラメラが含まれるがこれらに制限されるわけではない。好ましい実施形態においては、該構造はリポソームである。理論により束縛する意図はないが、リン脂質が細胞膜を模倣する一方で、ポリジアセチレン集合はリポソームに発生する物理−化学的変化を可視的な色変化へと翻訳できるようにすると考えられている。調製された状態のリポソームは、明確な形態、サイズ分布及びその他の物理的特性例えば明確な表面電位を有する。
【００５６】
リポソーム中のジアセチレン化合物（出発材料）に対するレセプタの比率は、材料の選択及び所望の比色応答の選択に基づいて変動させることができる。大部分の実施形態において、リン脂質対ジアセチレン化合物（出発材料）の比率は、少なくとも２５：７５、より好ましくは少なくとも４０：６０となる。好ましい実施形態においては、リポソームは、６：４の比で混合されたジアセチレン化合物：ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3［コハク酸モノ−（１２−テトラデカノイルオキシ−ドデカ−５，７−ジイニル）エステル］、及び両性イオンリン脂質１，２−ジメリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン［ＤＭＰＣ］から成る。
【００５７】
本書では、ＰＤＡ系についての論述は、レセプタ集合内でのリポソームの使用に向けられている。しかしながらこの論述は同様に、例えばその他の平面構成を含めたその他のレセプタ集合にもあてはまる。
【００５８】
リポソームは、調製緩衝液と呼ばれる緩衝溶液中に懸濁された材料混合物のプローブ音波処理により調製される。例えば、調製緩衝液は、低イオン強度（５ｍＭ）のＮ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］緩衝液（ｐＨ＝７．２）であり得る。もう１つの有用な調製緩衝液は、低イオン強度（２ｍＭ）のトリスヒドロキシメチルアミノエタン［ＴＲＩＳ］緩衝液（ｐＨ＝８．５）である。
【００５９】
本発明の比色系は、リン脂質といったレセプタ及び重合されたジアセチレンの両方を含むリポソームとプローブが相互作用できる方法を開発するために設計されている。リポソームは、エルリッチ（Ｏｅｌｌｅｒｉｃｈ）、Ｓ．ら、Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ  Ｂ、２００４年、第１０８号、３８７１〜３８７８頁、及びズカーマン（Ｚｕｃｋｅｒｍａｎｎ）、Ｍ．Ｊ．、ハイムブルグ（Ｈｅｉｍｂｕｒｇ）Ｔ．、Ｂｉｏｐｈｙｓｉ．Ｊ．、２００１年、第８１号、２４５８〜２４７２頁の中で記述されているように、タンパク質といったようなプローブと相互作用する生体膜のためのモデルとして使用可能である。一般に、高い脂質対タンパク質濃度比では、タンパク質が、主として静電相互作用を通してリポソームの表面に吸着することになる。
【００６０】
タンパク質濃度が増大し、タンパク質に対する脂質の濃度が低下するにつれて、タンパク質は、完全に飽和するか又はリポソームを包み隠すまで、リポソームの表面に対して静電的に吸着し続ける。このプロセスが進展するにつれて、リポソーム及びタンパク質は両方共、リポソーム表面を被覆するタンパク質の疎水性セグメントがリポソーム構造の疎水性内部と相互作用し始め得るまで、形態的及び立体構造的に変化する可能性がある。この時点で、タンパク質は疎水結合した状態となり、リポソーム構造に浸透し、リポソーム構造の実質的な形態的変化を結果としてもたらし、リポソームのサイズ及び浸透性が大幅に変わる可能性がある。最終的に、タンパク質層は、懸濁安定性の喪失、綿状沈殿そして最終的に沈降をもたらし得る。
【００６１】
これらの静電相互作用の存在は、存在するタンパク質及び脂質のタイプのみならずその環境にも大きく左右される。理論により束縛されることを望むわけではないが、一定の与えられた緩衝液系のイオン強度が、リポソーム及び荷電タンパク質の両方の表面電位ひいては有意に静電相互作用するそれらの能力を立証する上で役に立つであろうと考えられている。
【００６２】
例えば、中性ｐＨで低イオン強度（２〜５ｍＭ）の緩衝液系（例えばＨＥＰＥＳ、ＴＲＩＳ）においては、荷電プローブが、ポリジアセチレンリポソームに対し静電吸着し得る。初期吸着はそれ自体、リポソームのサイズ及び形態の実質的変化を誘発せず、当初比色変化は小さい又は無視できる程度であるかもしれないが、脂質に比べて余剰にプローブが存在する場合、プローブが最終的にリポソームに対し疎水結合した状態となりその内部膜構造に進入する確率が高い。この時点で、リポソーム構造内部へのプローブの取込みにより付与される大きな機械的応力は、ポリジアセチレン立体構造を有意な形で変化させることになりその結果同時比色応答が容易に観察できるということが予想されると思われる。
【００６３】
代替的には、プローブが中性ｐＨで負に荷電されている場合、ポリジアセチレンリポソームと静電相互作用する能力は大幅に損なわれ、及びプローブとレセプタ含有ポリジアセチレンリポソームの間の疎水性相互作用に起因する比色応答を生成する能力は脅かされる可能性がある。このような場合には、中性ｐＨの高イオン強度緩衝液（＞１００ｍＭ）（例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、イミダゾール緩衝液）の使用が、（リポソームの表面電荷をスクリーニングすることにより）リポソームの表面電荷を減少させ、非荷電プローブとリポソームの直接的な疎水性相互作用を容易にし、かつリポソームの構造内部へのそのタンパク質の取込みを結果としてもたらす手段を提供することになると思われる。かくして、この場合、緩衝液系は、それでなければ起こることのない実質的な比色応答を可能にさせる一助となる。緩衝液のイオン強度がさらに高いと、リポソームの表面電位に対するその効果のためにプローブの不在下で多大な比色応答が導入され得るが、プローブが存在する場合、比色応答は、タンパク質−リポソーム疎水性相互作用に起因して著しく増強される、ということが見極められてきている。この結果は、非常に有用な実践的影響を有する。すなわち、一定の与えられた検出限界における検出時間を著しく短縮でき、喚言すると、固定された検定時間について検出限界を著しく低下させることができる。
【００６４】
この現象に基づき、比色応答を開始させるべく一定の与えられた分析物標的及びポリジアセチレンリポソームの両方と特異的に相互作用するその能力に基づいて、プローブを選択することができる。ポリジアセチレン含有リポソームの比色応答は、これらの直接分析のケースにおいてプローブ又はプローブ−分析物錯体の濃度に正比例する。
【００６５】
特定の応用のためのプローブの選択は、一部にはプローブのサイズ、形状、電荷、疎水性及び分子に対する親和性によって左右されることになる。プローブは、環境のｐＨに応じて正に荷電、負に荷電されていても、又両性イオンであってもよい。プローブの等電点よりも低いｐＨでは、プローブは正に荷電されており、この点より上では、それは負に荷電されている。本書で使用されているように、「等電点」という用語は、プローブがゼロという正味電荷をもつｐＨを意味する。
【００６６】
ポリジアセチレン／リン脂質系を用いた生化学検定を設計するためには、レセプタ（又はプローブ）の等電点を知っていることが緩衝液組合せの選択に影響を及ぼすことになる。比較的等電点が低いプローブは、リポソームの形態変化を得るのにより高いイオン強度を必要とする可能性がある。色変化を生み出すため、ＨＥＰＥＳ緩衝液といったような低イオン強度緩衝液内ではより高い等電点のタンパク質を使用することができる。
【００６７】
この一般的機序を考えると、ポリジアセチレンリポソーム組成（例えば、使用されているリン脂質の選択及びリン脂質対ジアセチレンの比）、及び使用されているプローブ（例えばポリミキシン、フィブリノーゲン、抗体）のみならず、緩衝液系の選択により立証される水環境をも考慮に入れて、検出検定を定義づけすることが重要である。
【００６８】
本発明の緩衝液組成物は、プロトン受容体対プロトン供与体の比がほぼ１である接合体酸−塩基対から成る、その他の構成要素の存在下でｐＨの変化に耐えることのできる系を提供する。さらに、本発明の緩衝液組成物は、比色センサーの構成要素と分析物の間の物理的又は化学的相互作用を媒介する。例えば、１つの実施形態においては、緩衝液組成物組成物は、レセプタと分析物の相互作用を阻害する。もう１つの実施形態においては、緩衝液組成物はレセプタと分析物の相互作用を容易にする。特に有用であり得る緩衝液組成物としては、ＨＥＰＥＳ緩衝液、イミダゾール緩衝液及びＰＢＳ緩衝液が含まれる。
【００６９】
好ましい実施形態においては、検出すべき標的分析物及び／又はプローブの選択に基づいて一定の与えられた応用のために該当するイオン強度を調整するために、緩衝液（すなわち異なる緩衝液）の組合せが用いられる。
【００７０】
２つ以上の異なる緩衝液を組合わせることは、リポソーム−タンパク質プローブの相互作用において静電構成要素と疎水性構成要素の適切な平衡を達成するように緩衝液系の物理的特性を調整する便利な手段である。
【００７１】
例えば、ｐＨが７．２であるＨＥＰＥＳ緩衝液のみを含有する系においては、ポリミキシン（等電点７．７）が正の電荷を有し、リン脂質の負に荷電されたリン脂質極性頭部基に容易に接着し、比色センサー内で青色から赤色への色変化を誘発し得る。５．３という等電点をもつフィブリノーゲンは、同じＨＥＰＥＳ緩衝液組成物内で負の電荷を有し、これが、リン脂質の極性頭部基とのあらゆる静電相互作用又は吸着を防ぐ。
【００７２】
代替的には、イミダゾール又はＰＢＳといったようなより高いイオン強度をもつ緩衝液の存在下で、イオン強度はリポソーム（又はその他のトランスデューサ構造）の形態を改変させて、疎水性部分を露呈させる。比較的高いイオン強度の緩衝液組成物を含有する比色系においては、フィブリノーゲンは、色変化をひき起こすようにリン脂質と相互作用する構造の中に疎水性部分を含有する。
【００７３】
リポソーム−タンパク質相互作用において静電構成要素と疎水性構成要素の最適な平衡を達成するための１つの便利な方法は、２つ以上の異なる緩衝液の混合物を使用することにある。例えば、異なるイオン強度で無機緩衝液（ＰＢＳ）と低イオン強度の有機緩衝液（ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ）を混合することにより、単一緩衝液のケース毎にひとくくりにされていた緩衝液特性の範囲を補うことが可能となる。従って、混合型緩衝液系は、最適化されたリポソーム−タンパク質相互反応を提供するように設計可能である。
【００７４】
混合緩衝液系は、同様に、どこまでその緩衝液系が相互作用している緩衝液であるか又は相互作用しない緩衝液であるかを調整する方法を提供する。例えば、リポソーム形態に対するその効果を調整するために、相互作用する緩衝液（ＰＢＳ、イミダゾール）を相互作用しない緩衝液（ＨＥＰＥＳ）で「希釈する」ことができる。当然のことながら、混合型緩衝液系を使用することによって反対の効果（相互作用しない緩衝液がより相互作用するものとなる）も達成可能である。
【００７５】
最終的に、類似の要領で、比色センサーとプローブの疎水性相互作用を補助できる界面活性剤構成要素を緩衝液組成物内に導入することができると思われる。本発明において特に有用でありうる界面活性剤には、非イオン界面活性剤が含まれる。ポリアルコキシ化特にポリエトキシル化された非イオン界面活性剤が、溶液中で本発明の構成要素を特に良く安定化させることができる。
【００７６】
有用であり得る非イオンタイプの界面活性剤には、以下のものが含まれる。
【００７７】
１．酸化ポリエチレンで増量されたソルビタンモノアルキラート（すなわちポリソルバート）。特に、ＮＩＫＫＯＬ  ＴＬ−１０（バレットプロダクツ（Ｂａｒｒｅｔ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）製）として市販されているポリソルバート２０がきわめて有効である。
【００７８】
２．ポリアルコキシ化アルカノール。少なくとも約１４というＨＬＢを有するＩＣＩ  スペシャリティー・ケミカルズ（Ｓｐｅｃｉａｌｔｙ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）、ウィルミントン、デラウエア州（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）から商品名称ＢＲＩＪとして市販されているものといったような界面活性剤が有用であることが証明されている。特に、それぞれ２０及び１００モルの酸化ポリエチレンを有するステアリルアルコールエトキシレートであるＢＲＩＪ７８及びＢＲＩＪ７００がきわめて有用であることが証明されてきた。同様に有用であるのは、ＢＡＳＦコーポレーション、パフォーマンス・ケミカルズ・ディビジョン（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．，Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｄｉｖ．）、マウントオリーブ、ニュージャージ州（Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）から商品名称ＰＬＵＲＡＦＡＣＡ−３９として市販されているセテアレス５５である。
【００７９】
３．ポリアルコキシル化アルキルフェノール。このタイプの有用な界面活性剤としては、それぞれＢＡＳＦ  コーポレーション、パフォーマンス・ケミカルズ・ディビジョン、マウントオリーブ、ニュージャージ州及びユニオン・カーバイド・コーポレーション（Ｕｎｉｏｎ  Ｃａｒｂｉｄｅ  Ｃｏｒｐ．）、ダンベリー、コネチカット州（Ｄａｎｂｕｒｙ，ＣＴ）から商品名称ＩＣＯＮＯＬ及びＴＲＩＴＯＮとして市販されている少なくとも約１４のＨＬＢ値を有するポリエトキシル化オクチル又はノニルフェノールが含まれる。例としては、ＴＲＩＴＯＮ×１００（ユニオン・カーバイド・コーポレーション、ダンベリー、コネチカット州）から入手可能である１５モルの酸化エチレンを有するオクチルフェノール）及びＩＣＯＮＯＬ  ＮＰ７０及びＮＰ４０（ＢＡＳＦコーポレーション、パフォーマンス・ケミカルズ・ディビジョン、マウントオリーブ、ニュージャージ州）から入手可能なそれぞれ４０及び７０モルの酸化エチレン単位を有するノニルフェノール）が含まれる。これらの界面活性剤の硫酸及びリン酸誘導体も同じく有用である。かかる誘導体の例としては、ロジア（Ｒｈｏｄｉａ）、Ｄａｙｔｏｎ、ニュージャージ州から商品名称ＲＨＯＤＡＰＥＸ  ＣＯ−４３６として市販されているアンモニウムノノキシノール−４−スルファートが含まれる。
【００８０】
４．ポラクサマ。酸化エチレン（ＥＯ）及び酸化プロピレン（ＰＯ）のブロック共重合体に基づく界面活性剤は、本発明のフィルム形成重合体を安定化する上で有効であり優れた湿潤化を提供することが示されてきた。ＨＬＢが少なくとも約１４、好ましくは少なくとも約１６であるかぎり、ＥＯ−ＰＯ−ＥＯブロック及びＰＯ−ＥＯ−ＰＯブロックの両方共が充分に働くものと予想されている。かかる界面活性剤はＢＡＳＦコーポレーション、パフォーマンス・ケミカルズ・ディビジョン、マウントオリーブ、ニュージャージ州から商品名称ＰＬＵＲＯＮＩＣ及びＴＥＴＲＯＮＩＣとして市販されている。ＢＡＳＦからのＰＬＵＲＯＮＩＣ界面活性剤は、上述のものとは異なる形で計算されるＨＬＢ値を報告している、ということが指摘される。このような状況では、ＢＡＳＦにより報告されているＨＬＢ値を使用すべきである。例えば、好ましいＰＬＵＲＯＮＩＣ界面活性剤は、それぞれ１５及び２２というＨＬＢを有するＬ−６４及びＦ−１２７である。ＰＬＵＲＯＮＩＣ界面活性剤は本発明の組成物を安定化する上でかなり有効であり、活性剤としてヨードを用いてきわめて有効であるものの、活性剤としてポビドン−ヨードを用いる組成物の抗菌活性を低減させる可能性がある。
【００８１】
５．ポリアルコキシル化エステル。エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロールなどといったようなポリアルコキシル化グリコールは、（Ｃ８−Ｃ２２）アルキルカルボン酸で部分的又は完全にエステル化され得る、すなわち、１つ以上のアルコールがエステル化され得る。少なくとも約１４及び好ましくは少なくとも約１６のＨＬＢを有するこのようなポリエトキシル化エステルが、本発明の組成物において使用するのに適している。
【００８２】
アルキルポリグリコシド。米国特許第５，９５１，９９３号明細書、（ショルツ（Ｓｃｈｏｌｚ）ら）の第９欄４４行目から始まって記述されているもののようなアルキルポリグルコシドは、本発明のフィルム形成重合体と相容性があり、重合体の安定性に寄与し得る。例としては、１０．３炭素及び１〜４グルコース単位の平均鎖長を伴う（Ｃ８−Ｃ１６）アルキル鎖長を有するグルコポン４２５が含まれる。
【００８３】
究極的には、本発明の比色材料に基づく検出系は、以下の要因のうちの１つ以上のものにより左右される：ジアセチレン化合物の分子アーキテクチャ、利用されるレセプタ部分のタイプ、ジアセチレン及びレセプタ分子のリポソーム又はその他の潜在的凝集体構造の形態（サイズ及び構造）、利用されるタンパク質プローブ、及び検定を実施するために使用される緩衝液系。
【００８４】
検出方法
本発明は、上述の比色センサーと分析物を含有する表面又は溶液試料とを接触させるステップ及び吸収測定又は裸眼での目視観察を用いて比色センサー内の色変化を検出するステップを含む、分析物の分析方法を提供する。
【００８５】
１つの変形実施形態においては、本発明はポリジアセチレン集合の中に取込まれたレセプタ及び分析物の両方と結合するための親和性をもつプローブを選択することによる、分析物の間接的検出方法を提供する。選択されたプローブは、分析物との競合的親和性を実証することになる。問題の分析物が存在する場合、該プローブはポリジアセチレン主鎖上のレセプタではなく分析物に結合し、その結果分析物の濃度と反比例した色変化をもたらすことになる。分析物が存在しない場合、プローブはポリジアセチレン主鎖上に取込まれたレセプタに結合し、その結果として青色から赤色への色変化がもたらされることになる。プローブは、分析物がセンサーに接触した後センサーと接触でき、そうでなければ混合物かセンサーに接触する前に分析物を混合し得る。
【００８６】
逆検出検定においては、プローブ及び標的分析物は、緩衝溶液中で相互作用でき、これはその後センサーと接触状態に置かれる。緩衝液中に遊離したプローブの濃度は、存在する分析物標的の量により左右される。すなわち、分析物の濃度が高ければ高いほど、残りのプローブ濃度は低くなる。センサーの比色応答は利用可能な遊離プローブの量に正比例していることから、比色応答は分析物濃度に対して反比例する。
【００８７】
一部のケースでは、プローブは、センサーと直接相互作用できる錯体を分析物と形成でき、かくして、比色応答が分析物の濃度と正比例する直接的検定を生み出すことになる。
【００８８】
１つの実施形態においては、該発明の方法は、緩衝液組成物中に分析物を含むテスト試料を提供するステップ、緩衝液組成物中にプローブを提供するステップ、テスト試料とプローブを組合せるステップ（なお該プローブがレセプタよりも分析物に対しより大きい結合親和性を示す）、及びバイオセンサーで変化を検出するステップを含む。
【００８９】
一部の検定においては、以下でさらに詳述するように、分析物標的をフラグメント化するか又はその他の形で溶解させることによりインサイチュでプローブを生成することができるということを認識することも重要である。該プローブは同様に、センサーと直接相互作用するように利用可能である生体の細胞壁上で外部に存在するタンパク質又はタンパク質フラグメントと考えることもできる。プローブと分析物の間の相互作用は、リポソームとの相互作用を除いて機能できる。代替的には、プローブは分析物と相互作用して、リポソームと相互作用する結果として得られた錯体と共に１つの錯体を形成する可能性がある。
【００９０】
プローブは、溶解状態の又は基板上にコーティングされたセンサーと接触可能である。プローブは、標的分析物及びレセプタの両方について親和性を有するあらゆる分子ということになる。本発明で使用するための考えられるプローブとしては、アラメチシン、マガイニン、グラミシジン、ポリミクシンＢ硫酸塩及びメリチン、フィブリノーゲン、ストレプトアビジン、抗体、レクチン、及びそれらの組合わせといったような膜分断ペプチドが含まれる。
【００９１】
一部の実施形態においては、抗体がプローブとして利用される。「抗体」というのは、その抗原結合フラグメントを含めた一定の与えられた抗原を特異的に結合させる能力をもつ免疫グロブリンを意味する。「抗体」という用語は、脊椎動物（例えば哺乳動物）タンパク質とも特異的反応性をもつあらゆるイソ型の全抗体（ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥなど）及びそのフラグメントを含むものとして意図されている。抗体は、従来の技術を用いてフラグメント化され得、フラグメントは全抗体と同じ要領で有用性についてスクリーニングされる。かくして、この用語には、或る種のタンパク質と選択的に反応する能力をもつ抗体分子のタンパク質分解により分割された又は組換えにより調製された部分のセグメントが含まれる。かかるタンパク質分解及び／又は組換え型のフラグメントの制限的意味のない例としては、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ）2、Ｆｖ及び、ペプチドリンカーにより接合されたＶＬ及び／又はＶＨドメインを含有する１本鎖抗体（ｓｃＦｖ）が含まれる。ｓｃＦｖ’ｓは、共有的又は非共有的に連結されて２つ以上の結合部位をもつ抗体を形成することができる。抗体は、当業者にとって既知であるあらゆる検出可能な部分を用いて標識付け可能である。
【００９２】
当該技術分野ではさまざまな抗体が知られている。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体がシグマ・アンド・アキュレート・ケミカル（Ｓｉｇｍａ  ａｎｄ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）から市販されている。好ましくは、利用されている抗体の濃度は、少なくとも１ミリリットルあたり２ナノグラム（ｎｇ／ｍｌ）である。標準的には、抗体の濃度は、少なくとも１００ナノグラム／ｍｌである。例えば、１００マイクログラム／ｍｌの濃度を利用することができる。標準的には、約５００マイクログラム／ｍｌ以下が利用される。
【００９３】
その他の実施形態においては、プローブとしてフィブリノーゲンが利用される。理論により束縛される意図はないものの、分析物上／内で発現された又は存在するフィブリノーゲン結合タンパク質がフィブリノーゲンとして反応すると考えられている。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、接触した場合にフィブリノーゲンと反応するクランピング因子と呼ばれることの多いフィブリノーゲン結合タンパク質を発現する。
【００９４】
この反応を生成するためのフィブリノーゲンの濃度は、標準的に少なくとも０．０００１ｗｔ％そして一般的には５ｗｔ％以下である。ヒト血漿及び動物（例えばウサギ）血漿は、適切なフィブリノーゲン含有培地である。市販の血漿生成物は一般にＥＤＴＡ、クエン酸塩、ヘパリンなどといった抗凝血剤を含む。ヒトに由来するフィブリノーゲンは、シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、セントルイス、ミズーリ州（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から市販されている。
【００９５】
間接的検出方法を用いて、使用されるプローブの濃度に基づいて、低い検出レベルを提供する高い感度が可能である。検出戦略としては、所望の検出濃度レベルに対応するようにプローブ濃度を選択することが可能である。プローブを用いた間接的検出方法は、一定の与えられた応用における所望の感度のためにプローブのタイプ及び濃度の周囲で系を設計できるようにする。こうしてトランスデューサは、問題となっている多数の分析物にとって汎用性のあるものとなることができる。例えば、トランスデューサと接触するプローブを分析物に対するプローブの親和性に従って変更することにより、単一のトランスデューサ（ポリジアセチレン／レセプタの組合せ）を多数の分析物の検出に役立てることができる。
【００９６】
検出すべき特に有利な分析物は、グラム陽性菌、グラム陰性菌、真菌、原生動物、マイコプラズマ、酵母、ウイルスさらには脂質エンベロープウイルスといったような病原菌（すなわち微生物）である。特に関連性ある生体としては、腸内細菌科（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）族、又はブドウ球菌株（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、連鎖球菌株（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、シュードモナス菌株（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、腸球菌株（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．）、エシェリヒア株（Ｅｓｈｅｒｉｃｈｉａ  ｓｐｐ．）、桿菌株（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、リステリア菌株（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐ．）、ビブリオ菌株（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．）、並びにヘルペスウイルス、麹菌株（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．）、フサリウ菌株（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）及びカンジダ菌株（Ｃａｎｄｉｄａ  ｓｐｐ．）属が含まれる。特に強い病原性を持つ生体としては、ブドウ球菌株（メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）といった耐性菌株を含む）、表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）、肺炎球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、無乳性連鎖球菌（Ｓ．ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、バンコマイシン耐性黄色ブドウ球菌（ＶＲＳＡ）、バンコマイシン低感受性黄色ブドウ球菌（ＶＩＳＡ）、炭素菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、黒麹菌（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・クラバツス（Ａ．ｃｌａｖａｔｕｓ）、フサリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｏｌａｎｉ）、フサリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フサリウム・クラミドスポラム（Ｆ．ｃｈｌａｍｙｄｏｓｐｏｒｕｍ）、リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａ）、腸炎ビブリオ菌（Ｖ．ｐａｒａｈｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）、豚コレラ菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｓｕｉｓ）、チフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、ねずみチフス菌（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、カンジダ・グラブラータ（Ｃ．ｇｌａｂｒａｔａ）、カンジダ・クルセイ（Ｃ．ｋｒｕｓｅｉ）、及び多剤耐性グラム陰性桿菌（ＭＤＲ）の成員がある。
【００９７】
特に有利なものは、黄色ブドウ球菌といったようなグラム陽性菌である。標準的には、これらは、細胞壁タンパク質といったような細菌に特徴的な細胞壁構成要素の存在を検出することによって検出可能である。同様に、特に有利であるのは、ＭＲＳＡ、ＶＲＳＡ、ＶＩＳＡ、ＶＲＥ及びＭＤＲを含む抗生物質耐性病原菌である。標準的には、これらは、膜タンパク質といったような内部細胞構成要素の存在を付加的に検出することによって検出可能である。
【００９８】
有利なこのような病原菌又はその他の種は、生理液例えば血液、唾液、接眼レンズ液、滑液、脳脊髄液、膿汁、汗、浸出液、尿、粘液、泌乳汁などといったあらゆる供給源に由来するものであり得るテスト試料中で分析され得る。さらに、テスト試料は、例えば創傷、皮ふ、鼻孔、頭皮、つめなどの身体部位に由来するものであり得る。本書で使用する「テスト試料」という用語は、標的分析物を含有する試料を意味する。好ましくは、試料は液体又は気体そしてより好ましくは液体である。
【００９９】
当該技術分野では、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出のためのさまざまな患者の試料採取技術が記述されている。かかる試料採取技術は、本発明の方法にも適している。患者の鼻孔を拭うことで試料を得るのが一般的である。特に好ましい試料採取技術としては、対象の（例えば患者の）前鼻孔を無菌のレーヨン綿棒で拭うことが含まれる。各々の対象の試料採取のために１本の綿棒、すなわち両小鼻について１本の綿棒が用いられる。試料採取は、対象の小鼻の前先端部の中に適切な溶液で予め湿らされているか又は乾燥したレーヨン綿棒（「Ｐｕｒｅ−Ｗｒａｐｓ」という商品名称でピューリタン（Ｐｕｒｉｔａｎ）、イーストグリンステッド、英国（Ｅａｓｔ  Ｇｒｉｎｓｔｅａｄ，ＵＫ）から市販されているもの）を挿入し、鼻孔の粘膜表面に沿って２回全周回転するべく綿棒を回転することによって実施される。その後、綿棒は直接培養されるか、又は任意には少なくとも１つの界面活性剤及び緩衝液と組合わせた形で水を標準的に含んでいる適切な溶液を用いて抽出される。
【０１００】
生理液以外に、その他のテスト試料は、その他の液体ならびに、液体培地中に溶解された固体を含み得る。有利な試料としてはプロセス蒸気、水、土、植物又はその他の植物、空気、表面（例えば汚染された表面）などが含まれ得る。
【０１０１】
テスト試料（例えば液体）は、粘性流体の希釈といったような前処理に付されてよい。テスト試料（例えば液体）は、（ろ過、蒸留、透析などによる）濃縮、希釈、ろ過、天然構成要素の不活性化、試薬の添加、化学的処理などといったような試料ポート内への注入前のその他の処理方法に付されてよい。
【０１０２】
標的分析物のシグナル検出を増強し得る１つの処理方法には、米国特許出願公開第２００５／０１５３３７０号明細書の中に記述されているように、細胞を溶解させて細胞壁フラグメントを形成するステップ及び細胞壁フラグメントを分析するステップが関与している。特に、該方法は、病原菌特に黄色ブドウ球菌に特徴的である細胞壁の１つ以上の構成要素を検出するために有用である。該方法は、未培養細胞を含むテスト試料を提供するステップ、未培養細胞を溶解させて細胞壁フラグメントを含む溶解物を形成するステップ、及び分析物に特徴的である細胞壁構成要素について細胞壁フラグメントを分析するステップを含み、ここで分析物に特徴的な細胞壁構成要素は、未溶解細胞内の同じ構成要素に関連する増強されたシグナルを表示する。
【０１０３】
細胞壁構成要素には、例えば、プロテインＡといったような細胞壁タンパク質及び接着性マトリクス分子を認識する病原菌表面構成要素（ＭＳＣＲＡＭＭ）例えばフィブリノーゲン結合タンパク質（例えばクランピング因子）、フィブロネクチン結合タンパク質、コラーゲン結合タンパク質、ヘパリン／ヘパリン関連多糖類結合タンパク質などが含まれる。プロテインＡ及びクランピング因子例えばフィブリノーゲン結合因子及びクランピング因子Ａ、Ｂ及びＥｆｂも同様に、黄色ブドウ球菌の存在を検出する方法において有用である。その他の細胞壁構成要素としては、莢膜多糖類及び細胞壁炭水化物（例えばテイコ酸及びリポテイコ酸）が含まれる。
【０１０４】
溶解作業には、細胞を溶解剤と接触させるステップ又は細胞を物理的に溶解させるステップが含まれる。溶解作業は、例えば約５℃〜約３７℃の温度、好ましくは約１５℃〜約２５℃の温度で、従来の条件下で実施可能である。有意にも、該溶解作業は、未培養細胞すなわち直接テスト試料を用いて行なわれ得るが、培養細胞も同様に使用可能である。
【０１０５】
細胞を溶解させて細胞壁フラグメントを形成させるステップ及びその結果として得られる細胞壁構成要素のシグナルの増強の結果として、比較的低い濃度で問題の種を有する試料を評価することができる。例えば或る種の実施形態については、テスト試料は比較的低濃度で病原菌特に黄色ブドウ球菌を含み得る。かかる比較的低い濃度としては、例えば病原菌１ミリリットル（ｃｆｕ／ｍｌ）あたり約５×１０4個未満のコロニー形成単位（「ｃｆｕ」）、約５×１０3ｃｆｕ／ｍｌ未満、約１０００ｃｆｕ／ｍｌ未満、さらには約５００ｃｆｕ／ｍｌといった低い濃度さえ含まれる。黄色ブドウ球菌といったような病原菌は、例えば最高５×１０7ｃｆｕ／ｍｌといった範囲の高いレベルでも検出され得る。
【０１０６】
適切な溶解剤としては、例えば、リソスタフィン、リソザイム、エンドペプチダーゼ、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニンアミダーゼ、エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニザーゼ及びＡＬＥ−１といったような酵素が含まれる。望まれる場合、さまざまな酵素組合せを使用することもできる。リソスタフィンが、黄色ブドウ球菌の存在を検出する方法において特に有用である。
【０１０７】
その他の溶解剤としては、塩（例えばカオトロピック塩）、可溶化剤（例えば洗浄剤）、還元剤（例えばＤＴＴ、ＤＴＥ、システイン、Ｎ−アセチルシステイン）、酸（例えばＨＣｌ）、塩基（例えばＮａＯＨ）が含まれる。望まれる場合には、かかる溶解剤のさまざまな組合せを使用することもできる。
【０１０８】
一例として、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）が存在する場合、テスト試料中の溶解された細胞を、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）に特徴的であるプロテインＡについて分析することができ、バイオセンサー表面上に固定化されたプロテインＡに特異的な抗体でそれを検出することができる。さらに、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌といったような溶解された細胞は、（細胞の細胞壁部分の対語としての）細胞の内部部分からタンパク質マーカーを放出する。かかるタンパク質マーカーは、抗体といったようなプローブにより検出され得る。
【０１０９】
テスト試料とプローブは、さまざまな適当な要領で組合せ可能である。１つの態様では、プローブはセンサーに提供され、テスト試料は、なお任意の順序で、別の部分として比色センサーに提供される。例えば、表面はフィブリノーゲン含有溶液でコーティングされ、任意には乾燥され得る。もう１つの態様においては、テスト試料及びプローブは混合物として組合わせられ、該混合物は比色センサーに提供される。好ましい実施形態においては、プローブは、比色センサーと接触する前に分析物を含有するテスト試料と相互作用する。
【０１１０】
有利にも、該発明の方法は、改善された感応性を有する。以下の実施例でさらに詳述される通り、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、１ミリメートルあたり５×１０4コロニー形成単位（「ｃｆｕ」）、５×１０3ｃｆｕ／ｍｌ及び５×１０2ｃｆｕ／ｍｌの濃度で検出可能である。従って、当業者であれば、本発明の方法を５×１０2ｃｆｕ／ｍｌといった低い濃度（例えば１０ｃｆｕ／ｍｌの増分で挙げられた濃度の間の任意の特定の濃度）で標的分析物を検出するために利用できるということを認識する。最高５×１０7ｃｆｕ／ｍｌにまで至る高いレベルで標的分析物を検出することも又可能である。
【０１１１】
代替的に又は付加的に、該発明の方法は有利には検出速度の改善をも結果としてもたらす。本書において利用されるデバイスは、比較的短時間で分析物を検出する能力をもつ。例えば、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）は、前述の濃度のいずれにおいても、１２０分未満（例えば９０分、６０分、３０分、１０分）で検出可能である。
【０１１２】
応用
開示されたジアセチレン化合物から形成される本発明の比色センサーは、実験室環境の外でコスト効果性、安定性が高く、精確で一貫性がありかつ迅速な診断を要求するさまざまな応用に適している。応用としては、医療現場での検査、自宅内検査診断、空気又は水伝染性の病原体及びＶＯＣの軍用及び工業用検出、及び食品加工が含まれる。
【０１１３】
１つの実施形態においては、感染の存在を診断するため生体液中のグラム陰性菌を検出するために、該比色センサーを用いることができる。例えば、尿中のグラム陰性菌の存在は、尿感染を表わすものである。本発明のポリジアセチレン集合を含む比色センサーは、溶液中又は基板上のコーティングとしてのいずれかの形で色変化を通して生体液中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）といったグラム陰性菌の存在を示すことができる。
【０１１４】
一部の実施形態においては、本発明の比色センサーは、細菌又はその他の分析物の存在の多方面判定を提供するべくその他の既知の診断方法と対を成すことができると思われる。
【０１１５】
１つの実施形態においては、本発明の比色センサーは、感染の存在を検出するべく創傷包帯と併用され得る。センサーは、創傷と直接的又は間接的に接触した状態にある層として包帯の中に組込まれ得る。該センサーは、使用中に包帯中に挿入することもできる。代替的には、米国特許第６，４２０，６２２Ｂ１号明細書の中で記述されているもののようなマイクロ流体流路を通して、創傷からセンサーが位置設定されている創傷と接触しない包帯の一部分まで創傷滲出液を導くことのできる包帯構造を考案することができると思われる。該センサーは、創傷用綿球から抽出された分析物を分析することにより、創傷感染を査定する上での独立型診断器具として使用することもできる。
【０１１６】
適切な支持体に移す前に従来のＬＢ（ラングミュアーブロジェット（Ｌａｎｇｍｕｉｒ−Ｂｌｏｄｇｅｔｔ）プロセスによりフィルムを形成させる必要なく、ポリジアセチレン集合を含むセンサーを得ることが可能である。代替的には、ポリジアセチレン集合を、Ａ．ウルマン、「Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｕｌｔｒａｔｈｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｉｌｍｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  （１９９１年）、１０１〜２１９頁に記述されている通りの既知のＬＢプロセスを用いて基板上に形成させることができる。
【０１１７】
本発明は、使い捨て接着剤製品中にバイオセンシング能力を提供することができる。センサーは内蔵式であり、測定可能な結果を搬送するために付加的な計装を必要としない。代替的には、さらに感応性を増強するため、分析物の検出後に現像される螢光「赤色」相を伴う螢光といったようなその他の分析計装と共に使用することも可能である。センサーは、特定の分析物の閾値での存在を検出することが望まれる場合、３０分未満、好ましくは１５分未満の高速スクリーニングデバイスを提供するように機能する。さらに、本発明のセンサーは使い捨であり、比較的廉価である。
【０１１８】
該発明の１つの実施形態においては、比色センサーは、溶解状態のポリジアセチレン集合の内部に取込まれたレセプタから形成されたトランスデューサを含む。該溶液は、単純なバイアルシステム中に入って提供され得、分析物は、問題の分析物に特異的なトランスデューサと共に溶液を収納するバイアルに直接添加される。代替的には、比色センサーは、キット内に多数のバイアルを含むことができ、各バイアルは、異なる分析物に特定のものであるレセプタが取込まれた状態でポリジアセチレン集合を含むトランスデューサを収納している。ポリジアセチレントランスデューサに対し直接分析物を添加できない応用のためには、２部分バイアル系を用いることができると思われる。バイアルの１つの区画は、ポリジアセチレン集合から形成されたトランスデューサを収納する第２の区画から物理的に分離されて、分析物の試料調製のための試薬を収納することができると思われる。試料調製がひとたび完了したならば、区画を分離する物理的障壁は取り除かれて、検出のために分析物がトランスデューサと混合できるようにする。
【０１１９】
調製された状態の比色センサーは、次に、基板に液滴を置いて水が蒸発できるようにすることによってか、又は適当な細孔サイズの膜を通して懸濁液を押出し、ポリジアセチレン集合を取込み、コーティングされた膜を結果として得ることによって、固体基板上にコーティングされ得、これはその後乾燥させられる。適切な膜は、一般的には、ポリカーボナート、ナイロン、ＰＴＦＥ、ポリエチレン（その他も列挙可能）といった材料を含む、２００ｎｍ以下の細孔サイズをもつものである。これらの基板を、ジアセチレン集合の重合懸濁液でコーティングすることもできるし、そうでなければ未重合形態で懸濁液をコーティングし、その後コーティングされた状態で重合させることもできる。
【０１２０】
本発明のもう１つの実施形態においては、比色センサーは、図１に描かれているようなテープ又はラベルフォーマットの急速な指示薬である。図１は、基板４０上にコーティングされたトランスデューサ３０及び粘着剤２０がコーティングされたテープ又はラベル１０を示す。本発明で使用するのに適した基板は、米国特許出願公開第２００４−０１３２２１７−Ａ１号明細書の中で記述されている通りのヨウ化メチレン（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））及びミリーＱ（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））を用いた接触角測定によって特徴づけされ得る。
【０１２１】
基板４０としては、その表面エネルギーを系統的に改変させるべく裸でかつ自己集合性単層（ＳＡＭ）で改質された、原子的に平坦なシリコン（１１１）ウェーハ上の蒸着金、原子的に平坦なシリコン（１１１）ウェーハ又はフロートガラスといったようなきわめて平坦な基板、又は紙基板、重合体インク受容性コーティング、構造化重合体フィルム、微孔フィルム及び膜材料を含むきわめてきめのあるトポロジーを有する基板が含まれ得る。
【０１２２】
乾燥時点でポリジアセチレン集合のもとの「青色」相を維持する該発明の１つの実施形態においては、基板４０は、５０°より小さいヨウ化メチレンとの前進接触角を示す。この条件は表面エネルギーの分散性成分が４０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ超であることを特徴とする基板に対応する。１変形実施形態においては、水との前進接触角が９０°未満であるこれらの特性をもつ基板が、青色及び赤色相の混合物を含有する乾燥コーティングを結果としてもたらす。この条件は、分散性表面エネルギー成分が４０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ未満であるものの、少なくとも１０ｄｙｎｅｓ／ｃｍ超の極性表面エネルギー成分をもつ表面に対応することになる。
【０１２３】
再び図１を参照すると、粘着剤２０はテープ又はラベル１０を分析物の直接的検出のための表面に貼り付けることができる。潜在的に不利な効果を最小限におさえるため、ポリジアセチレン集合を含むトランスデューサ３０から粘着剤２０を隔離する。図１では、粘着剤２０は、テープ又はラベル１０の中心に位置設定されたトランスデューサ３０をとり囲んでいる。代替的実施形態（図示せず）においては、該粘着剤及びトランスデューサは組合わされている。
【０１２４】
任意には、テープ又はラベル１０は、その粘着剤２０を含まない面に透明なウインドウを含むことになる。該ウインドウは、分析物を含む表面から該テープ又はラベル１０を除去することなくユーザーが色変化を検分することができるようにするため、トランスデューサ３０の下側で中心に位置設定されることになる。
【０１２５】
図２では、テープ又はラベル１０は、多数のトランスデューサ１１２、１１３、１１４、１１５及び１１６から成るアレイ１１１として示されている。各々のトランスデューサ１１２、１１３、１１４、１１５及び１１６は、各ポリジアセチレン集合が同じ又は異なるレセプタを取込んでいる状態で同じ又は異なるポリジアセチレン集合から形成され得る。トランスデューサ１１２、１１３、１１４、１１５及び１１６を変動させることにより、さまざまな濃度レベルで多数の分析物を検出するようにアレイ１１１を設計することが可能である。代替的には、トランスデューサ１１２、１１３、１１４、１１５のいずれか１つを、代替的診断試験で置き換えることができる。本発明と共に考慮されるその他の実施形態は、米国特許出願第１０／７３８，５７３号明細書に提供されている。
【０１２６】
分析物の試料調製を必要とする応用については、試薬を保管し２次元基板上にコーティングされた比色センサーと接触する前に分析物を混合させるためのバイアルが、キットの中に収納され得る。１つの実施形態では、該キットは、基板上にコーティングされた本発明のトランスデューサを収納するキャップシステムと共に、試薬保管と分析物調製のためのバイアルを含んでいる可能性がある。
【実施例】
【０１２７】
本発明は、以下で記述されている特定の例に制限されるものとみなされるべきではなく、むしろ、添付のクレーム中で適正に設定されている通り該発明の全ての面を網羅するものとして理解されるべきである。本発明が応用可能であるさまざまな修正、等価のプロセスならびに数多くの構造が、本明細書を再考した時点で本発明が向けられている当業者にとって容易に明らかになるであろう。実施例中の全ての部分、百分率、比率などは、相反する指示のないかぎりモルによるものである。指名供給業者の無い全ての溶媒及び試薬は、アルドリッチ・ケミカル（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ミルウォーキー、ウィスコンシン州（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から購入されたものである。水は、１８．２Ｍｏｈｍｓ／ｃｍの抵抗率でＵ−Ｖ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ浄水機ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ベッドフォード、マサチューセッツ州（Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いて精製された。
【０１２８】
デジタルカメラを用いて撮った写真を用いて比色応答（ＣＲ）を判定した。各々のポリジアセチレンセンサー試験のためのＲＧＢ（赤、緑、青）チャンネル値を得るべくアドビシステムズインコーポレーテッド（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）製のソフトウェア（商品名称：アドビ・フォトショップ（ＡＤＯＢＥ  ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ）バージョン５．０、サンノゼ、カリフォルニア州（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ））を用いて写真を走査した。赤及び青色チャンネル値は、等式ＣＲ＝（（ＰＲinitial−ＰＲsample）／ＰＲinitial）により求められ、式中、ＰＲは試料の赤色百分率値であり、ＰＲ＝Ｒvalue／（Ｒvalue＋Ｂvalue）＊１００により求められ、ここでＲvalue及びＢvalueはポリジアセチレンセンサーの赤色及び青色チャンネルの値にそれぞれ対応する。
【０１２９】
【表１】
2008524593.tif 000012
【０１３０】
調製実施例１：  ジアセチレンリポソーム懸濁液の調製
ジアセチレンＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3を米国特許出願第２００４／０１３２２１７号明細書の実施例６にある通りに調製した。基本的手順には５，７−ドデカジイン−１，１２−ジオール（ＨＯ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4ＯＨ）を塩化ミリストルと反応させるステップ及びその後その生成物を無水コハク酸と反応させて白色固体として、ジアセチレン、ＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3を生成するステップが関与していた。
【０１３１】
ジアセチレン化合物の（６：４）の混合物すなわちＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3（コハク酸モノ（１２−テトラデカノイルオキシ−ドデカ−５，７−ジイニル（ｄｉｙｎｙｌ））エステル）及び両性イオンリン脂質１，２−ジメリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、式量（Ｆ．Ｗ．）６７８（シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州より入手可）をガラスバイアル内に秤量し、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液（５ｍＭ、ｐＨ７．２）の中で懸濁させて１ｍＭ溶液を生成した。この溶液を次に２分間Ｍｉｓｏｎｉｘ  ＸＬ２０２プローブ音波処理装置（ミソニックス・インコーポレーテッド（Ｍｉｓｏｎｉｘｉｎｃ．）ファーミントン、ニューヨーク州（Ｆａｒｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）から市販されている）を用いてプローブ音波処理し、約２０時間４℃の冷蔵庫の中に入れた。このプロセスは、安定したリポソーム懸濁液の形成を結果としてもたらす。
【０１３２】
調製実施例２：  ジアセチレンリポソーム懸濁液の重合
調製実施例１で調製した懸濁液を１．２μｍ入りシリンジフィルターを通してろ過し、１０分間３ｃｍの距離をおいて２５４ｎｍのＵＶランプ（ＶＷＲサイエンティフィック・プロダクツ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ウェストチェスター、ペンシルバニア州（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）より市販）の下で試料を照射することにより重合し、その結果青色が発生するのを観察した。
【０１３３】
調製実施例３：  ジアセチレンリポソーム懸濁液のコーティング済み試料の調製
調製実施例１で調製した懸濁液を直径２００（ｎｍ）の細孔を伴う直径２５（ｍｍ）の多孔性ポリカーボナート膜（アヴェスティン、インコーポレーテッド、オタワ、カナダ（Ｏｔｔａｗａ，Ｃａｎａｄａ））上にコーティングして、比色検出試料を作った。以下の通りの手持ち操作式の押出しプロセスを用いて、膜をコーティングした。コーティングすべきポリカーボナート膜をアヴェスティン、インコーポレーテッド、オタワ、カナダ）から入手可能なＬＩＰＯＦＡＳＴという商品名称の手持ち操作式押出し機システムのステンレス鋼チャンバの中に入れた。膜は、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）ベースの底面Ｏリングを被覆した。膜の湾曲及び／又はシワを避けるように注意を払った。上面のＴＥＦＬＯＮ（登録商標）Ｏリングブロックを、膜の上面のステンレス鋼ハウジング内部に置いた。その後、手でステンレス鋼キャップを締めつけることによりチャンバを密封した。気密性シリンジ（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）５００マイクロリットル（μｌ）入り）にジアセチレンリポソームの懸濁液を充填し、ベースに取り付け、第２のシリンジをもう一方のキャップに取りつけた。第１のシリンジのリポソームを、均一な圧力を加えつつチャンバの中にゆっくりと押し込んだ。
【０１３４】
膜は、表面上のリポソームを捕獲して、第２のシリンジ内にゆっくりと清澄な緩衝液を流入させた。この動作を、１回のコーティングパスとみなした。この例において検出器として使用される膜試料は、２回コーティングパスを用いた。２回目のパスは、第２の０．５ミリリットル（ｍｌ）のリポソーム部分をすでにコーティング済みの膜に塗布することによって、第１のパスと同様に塗布された。ろ過済み緩衝液を含有する第２のシリンジを取り出し、中味を廃棄した。ステンレス鋼のエンドキャップをゆるめ、ＴＥＦＬＯＮ（登録商標）Ｏリングブロックを取り外した。湿った膜を取り出し、ガラススライド上にコーティングされた側を上にして置き、少なくとも３時間、５℃で冷蔵庫の中に入れた。試料を次に３０分間ＣａＳＯ4の入ったデシケータの中で乾燥させ、３０〜９０秒間２５４ナノメートル（ｎｍ）のＵＶ光に曝露した。
【０１３５】
ＰＤＡをコーティングした基板（２５ミリメートル（ｍｍ）の円）を４分割した。各々の４分割部分を一回の実験用の試料として使用した。
【０１３６】
調製実施例４：  リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ緩衝溶液）
リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）溶液を、１０倍ＰＢＳ液体濃縮物（ＥＭＤバイオサイエンシーズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、サンディエゴ、カリフォルニア州（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より市販）を１０倍希釈することによって調製した。これにより、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３７ｍＭの塩化ナトリウム、２．７ｍＭの塩化カリウムという塩組成物をもつＰＢＳ緩衝溶液が結果として得られる。ＰＢＳ緩衝溶液は２５℃で７．５のｐＨを有する。
【０１３７】
調製実施例５：  ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ６４を伴うリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳＬ６４緩衝溶液）の調製
調製実施例４で調製した通りのＰＢＳ緩衝溶液を取り上げ、ＰＬＵＲＯＮＩＣ  Ｌ６４界面活性剤（ＢＡＳＦコーポレーション、マウントオリーブ、ニュージャージ州から入手可）を０．２％（ｗ／ｖ）添加することにより、ＰＢＳＬ６４緩衝溶液を調製した。ＰＢＳＬ６４緩衝溶液は２５℃で７．５のｐＨを有している。
【０１３８】
調製実施例６：  黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌懸濁液の調製
黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌は、「ＡＴＣＣ２５９２３」という商品名称でアメリンカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ））から入手した。調製された無菌トリプシン大豆ブロス（ハーディー・ダイアグノステイックス（Ｈａｒｄｙ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、サンタマリア、カリフォルニア州（Ｓａｎｔａ  Ｍａｒｉａ，ＣＡ））５〜１０ミリリットルに細菌を接種することにより調製された一晩（３７℃で１７〜２２時間）のブロス培養の中で、細菌を成長させた。エッペンドルフ型式番号５８０４Ｒの遠心分離機（ブリンクマン・インスツルメンツ（Ｂｒｉｎｋｍａｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、ウェストベリー、ニューヨーク州（Ｗｅｓｔｂｕｒｙ，ＮＹ））内で１５分間遠心分離（８，０００〜１０，０００ｒｐｍ）することにより培養を洗浄し、ＰＢＳＬ６４緩衝液中に再懸濁させ、この溶液でさらに３サイクル遠心分離することにより洗浄した。
【０１３９】
調製実施例７：  表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の細菌懸濁液の調製
表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の細菌は、「ＡＴＣＣ１２２２８」という商品名称でアメリンカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州）から入手した。調製された無菌トリプシン大豆ブロス（ハーディー・ダイアグノステイックス、サンタマリア、カリフォルニア州）５〜１０ミリリットルに細菌を接種することにより調製された一晩（３７℃で１７〜２２時間）のブロス培養の中で、細菌を成長させた。エッペンドルフ型式番号５８０４Ｒの遠心分離機（ブリンクマン・インスツルメンツ、ウェストベリー、ニューヨーク州）内で１５分間遠心分離（８，０００〜１０，０００ｒｐｍ）することにより培養を洗浄し、ＰＢＳＬ緩衝液中に再懸濁させ、この溶液でさらに３サイクル遠心分離することにより洗浄した。
【０１４０】
調製実施例８：  大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌懸濁液の調製
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌は、「ＡＴＣＣ２５９２２」という商品名称でアメリンカンタイプカルチャーコレクション（ロックビル、メリーランド州）から入手した。調製された無菌トリプシン大豆ブロス（ハーディー・ダイアグノステイックス、サンタマリア、カリフォルニア州）５〜１０ミリリットルに細菌を接種することにより調製された一晩（３７℃で１７〜２２時間）のブロス培養の中で、細菌を成長させた。エッペンドルフ型式番号５８０４Ｒの遠心分離機（ブリンクマン・インスツルメンツ、ウェストベリー、ニューヨーク州）内で１５分間遠心分離（８，０００〜１０，０００ｒｐｍ）することにより培養を洗浄し、ＨＥＰＥＳ緩衝液中に再懸濁させ、この溶液でさらに３サイクル遠心分離することにより洗浄した。
【０１４１】
実施例１：  フィブリノーゲンタンパク質プローブの溶液相検出
０．５％（ｗ／ｖ）の濃度でイミダゾール緩衝液中にヒト血漿由来のフィブリノーゲン（シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州、カタログ番号ＦＲ４１２９から入手可能）を溶解させた。イミダゾール緩衝溶液中のフィブリノーゲン（１００μｌ）を調製実施例２で調製した通りの青色ポリジアセチレンリポソーム溶液１００μｌと混合した。フィブリノーゲンを含まない１００μｌのイミダゾール緩衝溶液と調製実施例２で調製した通りの青色ポリジアセチレンリポソーム溶液１００μｌを含有する対照試料も調製した。最初の２０分以内で両方の試料共青色から赤色に変化したものの、フィブリノーゲンを含有する懸濁液試料は、凝集し続け、その後合計３０分で沈殿した。対照試料の懸濁液は観察時間全体にわたり安定した状態にとどまった。
【０１４２】
実施例２：  ウサギ抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧ抗体タンパク質プローブの溶液相検出
ウサギ抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧ抗体（アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ウェストベリー、ニューヨーク州から入手、カタログ番号ＹＶＳ６８８１）を、１００μｇ／ｍｌの濃度でイミダゾール緩衝溶液中に溶解させた。イミダゾール緩衝溶液中の抗体（１００μｌ）を（調製実施例２で調製した）青色ポリジアセチレンリポソーム溶液１００μｌと混合した。抗体を含まない１００μｌのイミダゾール緩衝溶液と（調製実施例２で調製した）青色ポリジアセチレンリポソーム溶液１００μｌを含有する対照試料も調製した。最初の３０分以内で両方の試料共青色から赤色に変化したものの、抗体を含有する懸濁液試料は、凝集し続け、その２４時間後に沈殿した。対照試料の懸濁液は観察時間全体にわたり安定した状態にとどまった。
【０１４３】
調製実施例３：  黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）とＰＢＳＬ６４緩衝溶液の存在下でのフィブリノーゲンタンパク質プローブの溶液相検出
実施例１で調製した通りのイミダゾール緩衝溶液（１００μｌ）中のフィブリノーゲンを（調製実施例２の通りに調製した）青色ポリジアセチレンリポソーム溶液１００μｌ、及び調製実施例６で調製された通りの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌１０6ｃｆｕ／ｍｌを含有する１００μｌのＰＢＳＬ６４緩衝溶液と混合した。イミダゾール緩衝溶液中のフィブリノーゲン１００μｌ、青色ポリジアセチレンリポソーム溶液１００μｌ、及び黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌無しのＰＢＳＬ６４緩衝液１００μｌを混合することにより、対照試料も同様に調製した。両方の試料共、３０分で青色から赤色まで変化したが、実施例１とは対照的に、懸濁液は２４時間の観察期間全体にわたり両方の試料について安定した状態にとどまった。
【０１４４】
実施例４：  黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及びＰＢＳＬ６４緩衝溶液の存在下でのウサギ抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧ抗体タンパク質プローブの溶液相検出
調製実施例２で調製した通りの青色ポリジアセチレンリポソーム溶液を、以下の３つの異なる組合せを用いて、実施例２で調製した通りのイミダゾール緩衝溶液及び調製実施例６で調製した通りの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を含有するＰＢＳ緩衝溶液と混合した。
試料４Ａ：  １００μｌの青色ポリジアセチレンリポソーム溶液＋１００μｌのイミダゾール緩衝溶液中の抗体＋１０7ｃｆｕ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を含有する１００μｌのＰＢＳ緩衝溶液。
試料４Ｂ：  １００μｌの青色ポリジアセチレンリポソーム溶液＋１００μｌのイミダゾール緩衝溶液中の抗体＋細菌を含まない１００μｌのＰＢＳ緩衝溶液。
試料４Ｃ：  １００μｌの青色ポリジアセチレンリポソーム溶液＋抗体を含まない１００μｌのイミダゾール緩衝溶液＋細菌を含まない１００μｌのＰＢＳ緩衝溶液。
【０１４５】
４５分後の試料の色は、下表１に記録されている。
【０１４６】
【表２】
2008524593.tif 000013
【０１４７】
実施例５：  ポリジアセチレンのコーティング済み試料を用いたフィブリノーゲンタンパク質プローブの検出
調製実施例３で調製した通りの３つのポリジアセチレンコーティング済み基板を、２４ウェルのマイクロタイタープレート（ＣＯＳＴＡＲという商品名称でコーニング・インコーポレーテッド（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）、コーニング、ニューヨーク州（Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）から市販されているもの、カタログ番号３５２４）の中の１つのウェルの底面に置き、以下の溶液を添加した。
試料５Ａ：  実施例１で調製した通りのイミダゾール緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋ＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ
試料５Ｂ：  イミダゾール緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋調製実施例６で調製した通りの１０7ｃｆｕ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ
試料５Ｃ：  イミダゾール緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋調製実施例７で調製した通りの１０7ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ
【０１４８】
各々の試料が青色から赤色に変化するのに必要とされる時間は下表２に記録されている。
【０１４９】
【表３】
2008524593.tif 000014
【０１５０】
実施例６：  イミダゾール緩衝溶液中のフィブリノーゲンタンパク質プローブを用いたさまざまな濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
調製実施例３で調製した通りの６つのポリジアセチレンコーティングされた基板を、２４ウェルのマイクロタイタープレート内の別々のウェルの底面に置いた。実施例１で調製した通りのイミダゾール緩衝溶液中のフィブリノーゲン（２５０μｌ）を、調製実施例６で調製した通りの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌと混合させて、さまざまな濃度の細菌を含有する一連の試料混合物を生成した。細菌濃度は、下表３に列挙されている。異なる試料混合物をボルテックスし、５分間放置し、次に、ポリジアセチレンでコーティングした基板を収納する別々のウェルに添加した。エバーバック(Ｅｂｅｒｂａｃｈ)６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）、アナーバー、ミシガン州（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））上でマイクロタイタープレートを攪拌させた。デジタルカメラを用いて、６分後に写真を撮影した。この写真を、アドビ・システムズ・インコーポレーテッド製のソフトウェアを用いて走査した。上述の通りに、比色応答（ＣＲ）を判定した。下表３中のデータは、細菌濃度の関数としての比色応答を報告している。
【０１５１】
【表４】
2008524593.tif 000015
【０１５２】
実施例７：  抗体−ストレプトアビジン接合タンパク質プローブ及びポリジアセチレンのコーティング済み試料を用いたＰＢＳＬ６４緩衝溶液中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
２４ウェルのマイクロタイタープレートの別々のウェルの底面に、調製実施例３中で調製した通りの２つのポリジアセチレンコーティング済み基板を置いた。ストレプトアビジン接合させたウサギ抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧ抗体タンパク質プローブを、以下の要領で調製した。１００μｇ／ｍｌの濃度で、イミダゾール緩衝溶液内に、ストレプトアビジン接合抗体を溶解させた。
【０１５３】
その後、以下の溶液を調製した。
試料７Ａ：  イミダゾール緩衝溶液中のストレプトアビジン接合抗体２５０μｌ＋調製実施例４で調製した通りのＰＢＳ緩衝溶液２５０μｌ。
試料７Ｂ：  イミダゾール緩衝溶液のストレプトアビジン接合抗体２５０μｌ＋調製実施例６で調製した通りのＰＢＳ緩衝溶液の１０6ｃｆｕ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を含有するＰＢＳ緩衝溶液２５０μｌ。
【０１５４】
溶液をボルテックスし、混合後に５分間放置し、その後、ポリジアセチレンセンサーを収納する別々のウェルに対して添加した。エバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）上でマイクロタイタープレートを攪拌した。下表４は、各センサーが青色から赤色に変化するのに必要な時間を記録する。
【０１５５】
【表５】
2008524593.tif 000016
【０１５６】
実施例８：  ポリジアセチレンのコーティング済み試料を用いた抗体−ビオチン接合タンパク質プローブを使用するストレプトアビジンの検出
調製実施例３で調製した通りの４つのポリジアセチレンコーティング済み基板を、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別々のウェルの底面に置いた。（シグマ・アルドリッチ、セントルイス、ミズーリ州から市販されている、カタログ番号１３−３１５０の）ビオチン接合マウス抗プロテインＡＩｇＧモノクローナル抗体タンパク質プローブを、１００μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ緩衝溶液中に溶解させた。（ジャクソン・イムノ・リサーチ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、ウェストグローブ、ペンシルバニア州（Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）から市販されている、カタログ番号０１６−０５０−０８４の）ストレプトアビジンを１００μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳ緩衝溶液中に溶解させた。
【０１５７】
その後、以下の試料溶液を調製した。
試料８Ａ：  イミダゾール緩衝溶液３００μｌ。
試料８Ｂ：  イミダゾール緩衝溶液１５０μｌ＋ＰＢＳ緩衝溶液中のストレプトアビジン１５０μｌ。
試料８Ｃ：  イミダゾール緩衝溶液１００μｌ＋ＰＢＳ緩衝溶液中のストレプトアビジン１００μｌ＋ＰＢＳ緩衝溶液中のビオチン接合抗体１００μｌ。
試料８Ｄ：  イミダゾール緩衝溶液１５０μｌ＋ＰＢＳ緩衝溶液中のビオチン接合抗体１５０μｌ。
【０１５８】
溶液をボルテックスし、混合後に５分間放置し、その後、ポリジアセチレンセンサーを収納する別々のウェルに対して添加した。エバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）上でマイクロタイタープレートを攪拌した。下表５は、各センサーが青色から赤色に変化するのに必要な時間を記録する。
【０１５９】
【表６】
2008524593.tif 000017
【０１６０】
実施例９：  ＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲンタンパク質プローブを用いたさまざまな濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
調製実施例３で調製した通りの６つのポリジアセチレンコーティング済み基板を２４ウェルのマイクロタイタープレート中の別々のウェルの底面に置いた。０．５％（ｗ／ｖ）の濃度でＰＢＳＬ６４緩衝溶液中にフィブリノーゲンを溶解させた。同様にして、０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度でもＰＢＳＬ６４緩衝溶液中でフィブリノーゲンを溶解させた。
【０１６１】
以下の試料溶液を調製した。
試料９Ａ：  ０．５％の濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋細菌を含まないＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ。
試料９Ｂ：  ０．５％の濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋調製実施例６で調製した通りの１０3ｃｆｕ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ。
試料９Ｃ：  ０．５％の濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋１０5ｃｆｕ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ。
試料９Ｄ：  ０．０５％の濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋細菌を含まないＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ。
試料９Ｅ：  ０．０５％の濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋１０3ｃｆｕ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ。
試料１５Ｆ：  ０．０５％の濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋１０5ｃｆｕ／ｍｌの黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ。
【０１６２】
比較を目的として、次のその他の２つの試料も調製した。
試料９Ｇ：  ０．５％の濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋調製実施例７で調製した通りの１０5ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の細菌を含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ。
試料９Ｈ：  ０．０５％の濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋１０5ｃｆｕ／ｍｌの表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）の細菌を含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌ。
【０１６３】
異なる試料混合物をボルテックスし、５分間放置し、次に、ポリジアセチレンでコーティングした基板を収納する別々のウェルに添加した。エバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）上でマイクロタイタープレートを攪拌させた。デジタルカメラを用いて、３０分後に写真を撮影した。この写真を、アドビ・システムズ・インコーポレーテッド製のソフトウェア（商品名称アドビ・フォトショップ、バージョン５．０、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて走査した。下表６中のデータは、これらの試料についての比色応答（ＣＲ）を報告している。
【０１６４】
【表７】
2008524593.tif 000018
【０１６５】
実施例１０：  ＰＢＳ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲンタンパク質プローブを用いた臨床試料中の全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
６人の患者からの鼻腔用綿棒を収集し、各患者から２本ずつの綿棒、計１２の試料を収集した。鼻腔用綿棒の試料は、無菌レーヨン綿棒（「Ｐｕｒｅ−Ｗｒａｐｓ」という商品名称でピューリタン、イーストグリンステッド、英国から市販されているもの）を用いて患者の前鼻孔を拭うことによって得た。試料採取は、対象の鼻孔の前先端部の中にレーヨン綿棒を挿入し鼻孔の粘膜面に沿って綿棒を２回全周回転させることで実施した。１ｍｌのＰＢＳＬ６４緩衝溶液を用いて、各綿棒試料を溶出させた。６人の患者各々に由来する１つの試料を、調製実施例３で調製した通りのコーティング済みポリジアセチレンセンサーを用いて分析した。同じ患者からの第２の試料を、１ｍｌのＰＢＳＬ６４緩衝溶液を用いて溶出させ、培養して、下表７に報告されている比較のための細菌計数を得た。「Ｔｈｅ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ」、クロスレー（Ｃｒｏｓｓｌｅｙ）、Ｋ．Ｂ．及びアルチャー（Ａｒｃｈｅｒ）、Ｇ．Ｌ．編、Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌ  Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎ、ニューヨーク州、１９９７年、２３３〜２５２頁に記述されているこれらの実施例用の培養手順が以下に記されている。ポリジアセチレンセンサーで分析すべき試料を、０．５％（ｗ／ｖ）の濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中に溶解したフィブリノーゲン２５０μｌと各々の患者の綿棒から溶出させた溶液２５０μｌを混合することによって調製した。試料溶液をボルテックスし、５分間放置し、その後、２４ウェルのマイクロタイタープレート内の別々のウェルの底面にすでに置かれていたポリジアセチレンコーティング済みセンサー全体にわたり置いた。マイクロタイタープレートをエバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）上で攪拌した。デジタルカメラを用いて４５分後に写真を撮影した。アドビ・システムズ・インコーポレーテッド製のソフトウェア（商品名称アドビ・フォトショップ、バージョン５．０、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて写真を走査した。下表７中のデータは、細菌濃度の関数としての比色応答を報告している。
【０１６６】
【表８】
2008524593.tif 000019
【０１６７】
実施例１１：  ＰＢＳ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲンタンパク質プローブを用いた臨床試料中の溶解した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
５人の患者からの鼻腔用綿棒を収集し、各患者から２本ずつの綿棒、計１０個の試料を収集した。実施例１０の通りに試料を得た。５人の患者各々からの１つの試料を、調製実施例３で調製した通りのコーティング済みポリジアセチレンセンサーを用いて分析した。同じ患者からの第２の試料を、１ｍｌのＰＢＳＬ６４緩衝溶液を用いて溶出させ、培養して、実施例１０に記述されている通りに細菌計数を得た。ポリジアセチレンセンサーで分析すべき試料を以下の通りに調製した。まず第１に、１ｍｌの溶出された綿棒試料中に存在する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を、３μｍ／ｍｌの濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のリゾスタフィンから成る同等体積の溶解緩衝溶液（シグマ・アルドリッチ、カタログ番号Ｌ−４４０２）と混合することによって溶解させた。第２に、２５０μｌの溶解済み溶液を、０．５％（ｗ／ｖ）の濃度でＰＢＳＬ６４緩衝溶液中に溶解させたＦＢＧ２５０μｌと混合させた。試料溶液をボルテックスし、５分間放置し、その後、２４ウェルのマイクロタイタープレート内の別々のウェルの底面にすでに置かれていたポリジアセチレンコーティング済みセンサー全体にわたり置いた。マイクロタイタープレートをエバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）上で攪拌した。デジタルカメラを用いて４２分後に写真を撮影した。アドビ・システムズ・インコーポレーテッド製のソフトウェア（商品名称アドビ・フォトショップ、バージョン５．０、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて写真を走査した。下表８中のデータは、細菌濃度の関数としての比色応答を報告している。
【０１６８】
【表９】
2008524593.tif 000020
【０１６９】
実施例１２：  ＰＢＳ６４緩衝溶液中のウサギ抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧ抗体タンパク質プローブを用いた臨床試料中の溶解した黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出
６人の患者からの鼻腔用綿棒を収集し、各患者から２本ずつの綿棒、計１２個の試料を収集した。実施例１０で記述されている通りに試料採取を行った。６人の患者各々からの１つの試料を、調製実施例３で調製した通りのコーティング済みポリジアセチレンセンサーを用いて分析した。同じ患者からの第２の試料を、１ｍｌのＰＢＳＬ６４緩衝溶液を用いて溶出させ、培養して、下表９に報告されている比較のための細菌計数を得た。培養手順は実施例１０で記述されている通りに行われた。ポリジアセチレンセンサーで分析すべき試料を以下の通りに調製した。まず第１に、１ｍｌの溶出された綿棒試料中に存在する黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌を、３μｇ／ｍｌの濃度のＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のリゾスタフィンから成る同等体積の溶解緩衝溶液（シグマ・アルドリッチ、カタログ番号Ｌ−４４０２）と混合することによって溶解させた。第２に、２５０μｌの溶解済み溶液を、１００μｇ／ｍｌの濃度でＰＢＳＬ６４緩衝溶液中に溶解させたウサギ抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧ抗体（アキュレート・ケミカルズ（Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）から入手）２５０μｌと混合させた。試料溶液をボルテックスし、５分間放置し、その後、２４ウェルのマイクロタイタープレート内の別々のウェルの底面にすでに置かれていたポリジアセチレンコーティング済みセンサー全体にわたり置いた。マイクロタイタープレートをエバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）上で攪拌した。デジタルカメラを用いて２０分後に写真を撮影した。アドビ・システムズ・インコーポレーテッド製のソフトウェア（商品名称アドビ・フォトショップ、バージョン５．０、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて写真を走査した。下表９中のデータは、細菌濃度の関数としての比色応答を報告している。
【０１７０】
【表１０】
2008524593.tif 000021
【０１７１】
実施例１３：  ＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のウサギ抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧ抗体タンパク質プローブを用いた、溶解済み黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）と全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）についてのポリジアセチレンコーティング済みセンサーの検出効率の比較
（６０／４０）のジアセチレンＨＯ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）2Ｃ（Ｏ）Ｏ（ＣＨ2）4Ｃ≡Ｃ−Ｃ≡Ｃ（ＣＨ2）4Ｏ（Ｏ）Ｃ（ＣＨ2）12ＣＨ3と調製実施例１で調製された１，２−ジメリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）の処方物を、直径２００ｎｍの細孔を伴う直径２５ｍｍの多孔質ポリカーボナート膜（アヴェスティン、インコーポレーテッド、オタワ、カナダ）上にコーティングして、比色検出器試料を作った。検出器試料は、調製実施例３にある通りに調製した。
【０１７２】
ポリジアセチレンでコーティングした基板（２５ミリメートル（ｍｍ）の円）を４分割した。各々の４分割試料を１つの実験用の試料として用いた。基板を、２４ウェルのマイクロタイタープレートの別々のウェルの中に置いた。全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌ＡＴＣＣ２５９２３を含有する２５０μｌのＰＢＳＬ６４緩衝溶液と２５０μｌの抗体溶液を混合することにより、全細菌試料溶液を調製した。抗体溶液は、ＰＢＳＬ６４緩衝溶液中１００μｇ／ｍｌの濃度でウサギ抗黄色ブドウ球菌（カタログ番号ＹＶＳ６８８１、アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション）を含有していた。ＰＢＳＬ６４緩衝溶液中３マイクログラム／ミリリットルの濃度のリソスタフィン（シグマ・アルドリッチ、カタログ番号Ｌ−４４０２より市販）から成る溶解緩衝液を用いて、ＰＢＳＬ６４緩衝溶液中に溶解済み黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌ＡＴＣＣ２５９２３を含有する試料を調製した。溶解済み細菌試料溶液は、上述した通りに調製した２５０μｌの抗体溶液と混合されたＰＢＳＬ６４中の溶解済み黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌（ＡＴＣＣ２５９２３）２５０μｌで構成されていた。テスト試料中で使用された細菌の濃度は、下表１０で報告されている通り０〜１０5ｃｆｕ／ｍｌの間で変動した。細菌と抗体溶液の混合物を５分間放置し、その後、ポリジアセチレンがコーティングされた基板を収納する２４ウェルのプレート上に添加した。対照試料も比較のために調製した。対照試料は、細菌を全く含まず、単に、上述の通りに調製された抗体２５０μｌと混合されたＰＢＳ−Ｌ６４緩衝液２５０μｌで構成されていた。
【０１７３】
デジタルカメラを用いて５分毎に１枚写真を撮影した。写真はアドビ・システムズ・インコーポレーテッド（サンノゼ、カリフォルニア州）製のソフトウェア、商品名称アドビ・フォトショップ、バージョン５．０を用いて走査した。下表１０中のデータは、１５分後に測定された、対照試料と試料を含有する細菌（全細菌又は溶解済み細菌のいずれか）の間の化色応答の差を示している。
【０１７４】
【表１１】
2008524593.tif 000022
【０１７５】
実施例１４：  ウサギ抗黄色ブドウ球菌ＩｇＧ抗体タンパク質プローブ及びコーティング済みポリジアセチレンセンサーを用いた、溶解済み黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及び全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出に対する緩衝溶液組成物の効果
調製実施例３にある通りに調製された３２のポリジアセチレンでコーティングされた基板を、２４ウェルのマイクロタイタープレート内の別々のウェルの底面に置いた。
【０１７６】
以下の試料溶液を調製した。
試料１４Ａ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有する実施例２で調製した通りのＰＢＳＬ６４緩衝溶液中の抗体５００μｌ。
試料１４Ｂ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有する実施例２の中で調製した通りのＰＢＳＬ６４緩衝溶液中の抗体４００μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液１００μｌ。
試料１４Ｃ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有する実施例２の中で調製した通りのＰＢＳＬ６４緩衝溶液中の抗体３５０μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液１５０μｌ。
試料１４Ｄ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有する実施例２の中で調製した通りのＰＢＳＬ６４緩衝溶液中の抗体３００μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液２００μｌ。
試料１４Ｅ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有する実施例２の中で調製した通りのＰＢＳＬ６４緩衝溶液中の抗体２５０μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液２５０μｌ。
試料１４Ｆ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有する実施例２の中で調製した通りのＰＢＳＬ６４緩衝溶液中の抗体２００μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液３００μｌ。
試料１４Ｇ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有する実施例２の中で調製した通りのＰＢＳＬ６４緩衝溶液中の抗体１５０μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液３５０μｌ。
試料１４Ｈ：  １００μｇ／ｍｌの濃度のウサギ抗黄色ブドウ球菌（カタログ番号ＹＶＳ６８８１、アキュレート・ケミカル・アンド・サイエンティフィック・コーポレーション）を伴い、実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有する、ＨＥＰＥＳ溶液５００μｌ。
【０１７７】
全細菌又は溶解細菌のいずれも全く含有しないという点を除いて試料１４Ａ−１４Ｈと組成が同一である一連の対照試料溶液も調製した。
【０１７８】
異なる試料混合物をボルテックスし、５分間放置し、次に、ポリジアセチレンでコーティングした基板を収納する別々のウェルに添加した。エバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション（Ｅｂｅｒｂａｃｈ  Ｃｏｒｐ．）、アナーバー、ミシガン州）上でマイクロタイタープレートを攪拌させた。デジタルカメラを用いて、４０分後に写真を撮影した。この写真を、アドビ・システムズ・インコーポレーテッド製のソフトウェア（商品名称アドビ・フォトショップ、バージョン５．０、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて走査した。下表１１中のデータは、１５分後に測定された、対照試料と試料を含有する細菌（全細菌又は溶解済み細菌のいずれか）の間の化色応答の差を示している。
【０１７９】
【表１２】
2008524593.tif 000023
【０１８０】
実施例１５：  高濃度のフィブリノーゲンタンパク質プローブ及びコーティング済みポリジアセチレンセンサーを用いた、溶解済み黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及び全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出に対する緩衝溶液組成物の効果
調製実施例３で調製した通りの３２のポリジアセチレンでコーティングされた基板を、２４ウェルのマイクロタイタープレート内の別々のウェルの底面に置いた。
【０１８１】
以下の試料溶液を調製した。
試料１５Ａ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン５００μｌ。
試料１５Ｂ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン４００μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液１００μｌ。
試料１５Ｃ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン３５０μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液１５０μｌ。
試料１５Ｄ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン３００μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液２００μｌ。
試料１５Ｅ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液２５０μｌ。
試料１５Ｆ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２００μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液３００μｌ。
試料１５Ｇ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン１５０μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液３５０μｌ。
試料１５Ｈ：  ０．５％（ｗ／ｖ）の濃度のフィブリノーゲン（シグマ社から入手可能、カタログ番号ＦＲ４１２９、ロット番号０８３Ｋ７６０４）を伴い、実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有する、ＨＥＰＥＳ溶液５００μｌ。
【０１８２】
全ての試料溶液１５Ａ−１５Ｈにおいて、フィブリノーゲン０．５％（ｗ／ｖ）の濃度で緩衝溶液中に溶解させた。全細菌又は溶解細菌のいずれも全く含有しないという点を除いて試料１５Ａ−１５Ｈと組成が同一である一連の対照試料溶液も調製した。
【０１８３】
異なる試料混合物をボルテックスし、５分間放置し、次に、ポリジアセチレンでコーティングした基板を収納する別々のウェルに添加した。エバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）上でマイクロタイタープレートを攪拌した。デジタルカメラを用いて、４０分後に写真を撮影した。この写真を、アドビ・システムズ・インコーポレーテッド製のソフトウェア（商品名称アドビ・フォトショップ、バージョン５．０、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて走査した。比色応答（ＣＲ）を判定した。下表１２中のデータは、１５分後に測定された、対照試料と試料を含有する細菌（全細菌又は溶解済み細菌のいずれか）の間の化色応答の差を示している。
【０１８４】
【表１３】
2008524593.tif 000024
【０１８５】
実施例１６：  低濃度のフィブリノーゲンタンパク質プローブ及びコーティング済みポリジアセチレンセンサーを用いた、溶解済み黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）及び全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の検出に対する緩衝溶液組成物の効果
調製実施例３で調製した通りの３２のポリジアセチレンでコーティングされた基板を、２４ウェルのマイクロタイタープレート内の別々のウェルの底面に置いた。
【０１８６】
以下の試料溶液を調製した。
試料１６Ａ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン５００μｌ。
試料１６Ｂ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン４００μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液１００μｌ。
試料１６Ｃ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン３５０μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液１５０μｌ。
試料１６Ｄ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン３００μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液２００μｌ。
試料１６Ｅ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２５０μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液２５０μｌ。
試料１６Ｆ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン２００μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液３００μｌ。
試料１６Ｇ：  実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のフィブリノーゲン１５０μｌ＋ＨＥＰＥＳ緩衝溶液３５０μｌ。
試料１６Ｈ：  ０．０５％（Ｗ／ｖ）の濃度のフィブリノーゲン（シグマ社から入手可能、カタログ番号ＦＲ４１２９、ロット番号０８３Ｋ７６０４）を伴い、実施例１１で示された溶解手順によるような、１０3ｃｆｕ／ｍｌの全黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌又は１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の細菌のいずれかを含有する、ＨＥＰＥＳ溶液５００μｌ。
【０１８７】
全ての試料溶液１６Ａ−１６Ｈにおいて、フィブリノーゲンを０．０５％（ｗ／ｖ）の濃度で緩衝溶液中に溶解させた。全細菌又は溶解細菌のいずれも全く含有しないという点を除いて試料１６Ａ−１６Ｈと組成が同一である一連の対照試料溶液も調製した。
【０１８８】
異なる試料混合物をボルテックスし、５分間放置し、次に、ポリジアセチレンでコーティングした基板を収納する別々のウェルに添加した。エバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）上でマイクロタイタープレートを攪拌させた。デジタルカメラを用いて、４０分後に写真を撮影した。この写真を、アドビ・システムズ・インコーポレーテッド製のソフトウェア（商品名称アドビ・フォトショップ、バージョン５．０、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて走査した。下表１３中のデータは、１５分後に測定された、対照試料と試料を含有する細菌（全細菌又は溶解済み細菌のいずれか）の間の化色応答の差を示している。
【０１８９】
【表１４】
2008524593.tif 000025
【０１９０】
実施例１７：  プロテインＡで予め反応させたモノクローナル抗体及びコーティングされたポリジアセチレンセンサーを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の検出
ＭＲＳＡ中のＰＢＰ２’に対するモノクローナルＩｇＧ1κ抗体は、プロテインＡと相互作用する。この抗体をプロテインＡと予備反応させ、次に溶解されたＭＲＳＡ（スリーエム・カルチャー・コレクション（３Ｍ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）＃３６０）に曝露した。ＭＲＳＡの溶解のための手順を、実施例１１にある通りに遂行した。溶解されたＭＲＳＡを、実施例１３の中で記述されている通りにＰＢＳＬ６４中で調製した。溶解されこの実施例中で用いられる細菌の濃度は、１０5及び１０3ｃｆｕ／ｍｌであった。ＰＢＳＬ６４中で溶解剤のみを含有し細菌を全く伴わない対照試料を使用した。１００μｇ／ｍｌの濃度でＨＥＰＥＳ緩衝液中で、ＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体を調製した。プロテインＡ（ザイメッド（Ｚｙｍｅｄ）、サンフランシスコ、カリフォルニア州（ＳａｎＦｒａｎｓｉｓｃｏ，ＣＡ）、カタログ番号＃１０−１００６）も、２００μｇ／ｍｌの濃度でＨＥＰＥＳ緩衝液中で調製した。以下で記述するように、抗体及びプロテインＡを含有するＨＥＰＥＳ緩衝液及び細菌溶液の２つの異なる組合せを使用した。
【０１９１】
試料１７Ａ：  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体の１５０μｌ溶液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液中のプロテインＡ１００μｌと混合した。バイアルをボルテックスし、５分間放置した。
【０１９２】
その後、試料１７Ａを、細菌を全く含まない対照試料又は１０3又は１０5ｃｆｕ／ｍｌのいずれかを含有するＰＢＳＬ６４溶液２５０μｌと混合した。バイアルをボルテックスし、５分間放置した。調製実施例３で記述した通りのポリカーボナート膜上にコーティングされたＰＤＡの３つの試料を、２４ウェルのプレートの底面に置いた。変動する細菌レベルを有する溶液を別のウェル内にピペットで取った。青色からの色変化を追跡し、下表１４中で報告した。
【０１９３】
【表１５】
2008524593.tif 000026
【０１９４】
試料１７Ａ：  ＨＥＰＥＳ緩衝液中のＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体の１５０μｌ溶液を、ＨＥＰＥＳ緩衝液中のプロテインＡ５０μｌと混合した。バイアルをボルテックスし、５分間放置した。
【０１９５】
その後、試料１７Ｂを、細菌を全く含まない対照試料又は１０3又は１０5ｃｆｕ／ｍｌのいずれかを含有するＰＢＳＬ６４溶液３００μｌと混合した。バイアルをボルテックスし、５分間放置した。調製実施例３で記述した通りのポリカーボナート膜上にコーティングされたＰＤＡの３つの試料を、２４ウェルのプレートの底面に置いた。変動する細菌レベルを有する溶液を別のウェル内にピペットで取った。青色からの色変化を追跡し、下表１５中で報告した。
【０１９６】
【表１６】
2008524593.tif 000027
【０１９７】
実施例１８：  タンパク質プローブとしてのモノクローナル抗体及びコーティングされたポリジアセチレンセンサーを用いたメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（ＭＲＳＡ）の検出
ＭＲＳＡの溶解のための手順を、実施例１１にある通りに遂行した。溶解されたＭＲＳＡを、実施例１３の中で記述されている通りにＰＢＳＬ６４中で調製した。溶解されこの実施例中で用いられる細菌の濃度は、１０5及び１０3ｃｆｕ／ｍｌであった。ＰＢＳＬ６４中で溶解剤のみを含有し細菌を全く伴わない対照試料を使用した。１００μｇ／ｍｌの濃度でＨＥＰＥＳ緩衝液中で、ＰＢＰ２’に対するモノクローナルＩｇＧ1κ抗体を調製した。
【０１９８】
その後、以下の試料溶液を調製した。
試料１８Ａ：  ＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体の２５０μｌ溶液を、全く細菌を含有しないＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌと混合した。バイアルをボルテックスし、５分間放置した。
試料１８Ｂ：  ＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体の２５０μｌ溶液を、１０3ｃｆｕ／ｍｌの溶解したＭＲＳＡを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌと混合した。バイアルをボルテックスし、５分間放置した。
試料１８Ｃ：  ＰＢＳＬ６４緩衝溶液中のＰＢＰ２’に対するモノクローナル抗体の２５０μｌ溶液を、１０5ｃｆｕ／ｍｌの溶解したＭＲＳＡを含有するＰＢＳＬ６４緩衝溶液２５０μｌと混合した。バイアルをボルテックスし、５分間放置した。
【０１９９】
調製実施例３中で記述されている通りのポリカーボナート膜上にコーティングされたＰＤＡの３つの試料を２４ウェルのプレートの底面に置いた。変動する細菌レベルをもつ溶液を別々のウェル内にピペットで取り、マイクロタイタープレートをエバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）上で攪拌した。デジタルカメラを用いて４５分後に写真を撮影した。アドビ・システムズ・インコーポレーテッド製のソフトウェア（商品名称アドビ・フォトショップ、バージョン５．０、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて写真を走査した。各試料についての比色応答が下表１６で報告されている。
【０２００】
【表１７】
2008524593.tif 000028
【０２０１】
実施例１９：  ＨＥＰＥＳ緩衝溶液中のポリミキシンタンパク質プローブを用いたさまざまな濃度のＨＥＰＥＳ緩衝溶液中の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の検出
調製実施例３で調製した通りの５つのポリジアセチレンでコーティングされた基板を２４ウェルのマイクロタイタープレート内で別々のウェルの底面に置いた。（アルドリッチから市販されている）硫酸ポリミキシンＢを、２６ナノモル／ｍｌの濃度でＨＥＰＥＳ緩衝溶液中で溶解させた。
【０２０２】
以下の試料溶液を調製した。
試料１９Ａ：  細菌を含まないＨＥＰＥＳ緩衝溶液中の硫酸ポリミキシンＢ５００μｌ。
試料１９Ｂ：  調製実施例８中で調製した通りの１０3ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌を含有するＨＥＰＥＳ緩衝溶液中の硫酸ポリミキシンＢ５００μｌ。
試料１９Ｃ：  調製実施例８中で調製した通りの１０5ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌を含有するＨＥＰＥＳ緩衝溶液中の硫酸ポリミキシンＢ５００μｌ。
試料１９Ｄ：  調製実施例８中で調製した通りの１０7ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌を含有するＨＥＰＥＳ緩衝溶液中の硫酸ポリミキシンＢ５００μｌ。
試料１９Ｅ：  調製実施例８中で調製した通りの１０9ｃｆｕ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌を含有するＨＥＰＥＳ緩衝溶液中の硫酸ポリミキシンＢ５００μｌ。
【０２０３】
異なる試料混合物をボルテックスし、５分間放置し、次に、ポリジアセチレンでコーティングした基板を収納する別々のウェルに添加した。エバーバック６０００型振とう機（エバーバック・コーポレーション、アナーバー、ミシガン州）上でマイクロタイタープレートを攪拌した。デジタルカメラを用いて、３０分後に写真を撮影した。この写真を、アドビ・システムズ・インコーポレーテッド製のソフトウェア（商品名称アドビ・フォトショップ、バージョン５．０、サンノゼ、カリフォルニア州）を用いて走査した。比色応答（ＣＲ）を判定した。下表１７中のデータは、細菌濃度の関数としての比色応答を報告している。
【０２０４】
【表１８】
2008524593.tif 000029
【０２０５】
実施例２０：  ジアセチレンとしてのトリコサジイノイン酸を伴うリポソーム
トリコサジイノイン酸を伴うリポソームを、調製実施例１中の手順を用いて作った。音波処理及びリポソーム形成のためジアセチレン中１ｍＭであった１０ｍｌの溶液を提供するように、５ｍｍｏｌの７．２ｐＨのＨＥＰＥＳ緩衝液中の（６０／４０）の１０、１２−トリコサジイノイン酸／１．２−ＤＭＰＣの試料を調製した。各溶液からの１ｍｌが、乾燥するまで蒸発させられ１０ｍｌ体積の緩衝液内で再水和された時点で、ジアセチレン中１ｍＭである（６０／４０）１０，１２−トリコサジイノイン酸／１，２−ＤＭＰＣ錯体を提供するような形で、ジクロロメタン中で別々に、１０，１２−トリコサジイノイン酸及び１，２−ＤＭＰＣの原液を調製した。ジクロロメタン溶液を６ドラム入りバイアルの中に置き、次に有機溶媒を除去するまで２５〜３０℃の間の温度で減圧下で回転蒸発させた。残渣を、１０分間高真空（２００ｍトール）下でさらに乾燥させて、最後の微量の溶媒を除去した。１０ｍｌのＨＥＰＥＳ緩衝液を用いて試料を再水和した。
【０２０６】
この溶液を次に、（ミソニックス・インコーポレーテッド，ファーミントン、ニューヨーク州から市販されている）Ｍｉｓｏｎｉｘ  ＸＬ２０２プローブ超音波処理機を用いてプローブ音波処理した。これら１０ｍｌの試料について一連の音波処理パワーレベルを実施した。この範囲にはパワーレベル３、４、５及び６が含まれ、ここでパワーレベル３は１０〜２０分間実施され、パワーレベル４は２．５〜７．５分間、パワーレベル５は１〜３分間、そしてパワーレベル６は１〜２分間の長さで実施された。溶液を音波処理し、その外観をかすみ度についてマクファーランド濁度基準に比較した。０．５という格付けは、基本的に透き透っており、４．０はかすんでいた。溶液を濁度尺度上で１．０〜２．０の間の格付けまで音波処理した。音波処理の後、全ての試料を室温まで（カバーをかけた状態で）冷却させ、小胞が形成するように、２０時間５℃の冷蔵庫中に入れた。
【０２０７】
２０時間後に、一部の試料が、サイズ的に調製実施例１内のリポソームと類似しているように見える受容可能な小胞を形成した。これらの試料を次にさらなる調査のために使用した。
【０２０８】
灰色のリポソーム相を形成した試料を調製実施例３の場合と同じようにコーティングした。灰色相リポソームを２００ｎｍのポリカーボナート膜上にコーティングした。コーティングの厚みは、一回のパスにつき５００μｌで、膜１枚あたり２回から３及び４回のパスまで変動した。次にこれらを８時間冷蔵庫の中で乾燥させ、その後、一晩デシケータ内に置いた。
【０２０９】
試料を、目視により調製実施例２で作った試料と類似の青色（約０．６３０％の青色）に変化するまで２５４ナノメートル波長のランプの下でＵＶ曝露した。これらのバッチについては、約０．６４４％という最大の青色％が５〜７秒のＵＶ曝露の後に起こることが発見された。これは、調製実施例２におけるジアセチレン（類似の色には３０秒の曝露で到達した）よりもはるかに速いものである。
【０２１０】
重合した試料を４分割した。試料片を２４ウェルのタイタープレート内でウェルの底面に置いた。実施例１８中の手順に従って０、１０００ｃｆｕ／ｍｌ、１００，０００ｃｆｕ／ｍｌの抗体プラス細菌レベルを有する試料溶液２０Ａ、２０Ｂ及び２０Ｃを作り上げた。これらの溶液をデュプリケートで、重合されたＰＤＡコーティング済み試料に曝露した。タイタープレートを振とう機内に置き、振とう速度を６０サイクル／分にセットした。
【０２１１】
試料の色変化を経時的に監視した。いずれの試料も赤色には変化しなかった。それらは全て、一晩の曝露後も青色にとどまった。
【０２１２】
緩衝液系を調整しリポソーム形成のために２緩衝液系を使用することにより、このＰＤＡ系で赤色への色変化を提供するように応答を調整することが可能であると考えられている。現行の系は、調製実施例１のＰＤＡでの検出のために処方されたものである。実施例２０のＰＤＡは、小胞の表面特性及びプローブとしてその相互作用に影響を及ぼすのに充分なほど構造が異なっており、比色応答を達成するために異なる緩衝液系を必要とする。
【０２１３】
本発明の範囲及び精神から逸脱することなく、本発明に対するさまざまな修正及び改変が、当業者には明白となることだろう。本発明は、本書に記されている例示的実施形態により不当に制限されるように意図されておらず、かかる実施形態は一例として提示されているにすぎず、又、本発明の範囲はクレームによってのみ制限されるように意図されている、ということを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０２１４】
【図１】本発明の比色センサーの概略図である。
【図２】本発明の比色センサーアレイの概略図である。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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