(57)【要約】本発明は免疫治療組成物、およびヒトＣＤ１９抗原に結合し、好ましくはヒトＡＤＣＣを媒介する治療抗体を用いてヒト対象においてＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害を治療および予防する方法に関する。本発明は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのヒトまたはヒト化抗−ＤＣ１９抗体を含む医薬組成物に関する。本発明は、好ましくはヒトＡＤＣＣを媒介するＩｇＧ２またはＩｇＧ４ヒトイソタイプのヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物に関する。また、本発明は、ヒトＡＤＣＣを媒介するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４イソタイプのキメラ化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態において、本発明はモノクローナルヒト、ヒト化、またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物に関する。
2008546647.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬上許容される担体中にＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのモノクローナルヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物。
【請求項２】
医薬上許容される担体中に治療有効量のＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのモノクローナルキメラ化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物。
【請求項３】
前記ＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのモノクローナルキメラ化抗−ＣＤ１９抗体の治療有効量が約１ｍｇ／ｋｇ患者体重未満である請求項２記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記ＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのモノクローナルキメラ化抗−ＣＤ１９抗体の治療有効量が約２ｍｇ／ｋｇ患者体重未満である請求項２記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記抗−ＣＤ１９抗体がＩｇＧ１ヒトイソタイプ抗体である請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記抗−ＣＤ１９抗体がＩｇＧ３ヒトイソタイプ抗体である請求項１または２記載の医薬組成物。
【請求項７】
医薬上許容される担体中に、ヒト抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する治療有効量のモノクローナルヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物。
【請求項８】
医薬上許容される担体中の、ヒト抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するモノクローナルキメラ化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物。
【請求項９】
前記抗−ＣＤ１９抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ヒトイソタイプのものである請求項７または８記載の組成物。
【請求項１０】
前記抗−ＣＤ１９抗体は少なくとも４ないし７日の半減期を有する請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記組成物が１５００ｍｇ／ｍ２以下の用量の抗−ＣＤ１９抗体を含む請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項１２】
前記組成物が３７５ｍｇ／ｍ２以下の用量の抗−ＣＤ１９抗体を含む請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記組成物が１．５ｍｇ／ｍ２以下の用量の抗−ＣＤ１９抗体を含む請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記組成物が０．５μｇ／ｍ２以下の用量の抗−ＣＤ１９抗体を含む請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
前記抗−ＣＤ１９抗体が検出可能に標識される請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記抗−ＣＤ１９抗体は裸の抗体である請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記抗−ＣＤ１９抗体が治療化合物にコンジュゲートされた請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記抗−ＣＤ１９抗体が細胞傷害性剤にコンジュゲートされた請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記抗−ＣＤ１９抗体が診断剤にコンジュゲートされた請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記抗−ＣＤ１９抗体が静細胞剤にコンジュゲートされた請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記抗−ＣＤ１９抗体がアポトーシスを誘導する剤にコンジュゲートされた請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記抗−ＣＤ１９抗体は二特異的である請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記二特異的抗−ＣＤ１９抗体がエフェクター細胞に結合することについて特異性を有する請求項２０記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記抗−ＣＤ１９抗体のＡＤＣＣ機能が、インビトロにてエフェクター細胞による標的細胞溶解を媒介する該抗−ＣＤ１９抗体の能力を測定することによって評価される請求項７記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記抗−Ｄ１９抗体が抗体ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂの重鎖ＣＤＲ３領域、あるいはＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂ抗体の重鎖ＣＤＲ３領域に対して少なくとも２５％アミノ酸配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ３領域を含む請求項１、２、７または８記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂ抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域、またはＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂ抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域に対して少なくとも２５％アミノ酸配列同一性を有する重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を含む請求項２３記載の医薬組成物。
【請求項２７】
循環Ｂ細胞を枯渇させるのに十分な量の抗−ＣＤ１９抗体を受容体に投与することを含み、ここに、該抗−ＣＤ１９抗体は、単独で、または１以上の他の治療剤と組み合わせて投与される、それを必要とするヒト移植体受容体において液性拒絶を治療または予防する方法。
【請求項２８】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、循環Ｂ細胞または循環免疫グロブリン、または双方を枯渇させるのに十分な量にて移植に先立って投与され、ここに、該抗−ＣＤ１９抗体は、単独で、または１以上の他の治療剤と組み合わせて投与される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
移植に先立って、移植片を、該移植片からＢ細胞を枯渇させるのに十分な量の抗−ＣＤ１９抗体と接触させることを含む、それを必要とする移植体受容体において移植片拒絶、または移植片−対−宿主病を予防する方法。
【請求項３０】
前記移植片をエクスビボにて抗−ＣＤ１９抗体と接触させる請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
さらに、前記移植片を、抗−Ｔリンパ球抗体または抗−胸腺細胞グロブリンの１以上と接触させる請求項２９記載の方法。
【請求項３２】
前記方法が、急性または慢性液性拒絶を治療するためのものである請求項２７記載の方法。
【請求項３３】
前記拒絶が：循環抗−ドナーアロ抗体によって特徴付けられる潜在的液性応答；循環抗−ドナーアロ抗体およびＣ４ｄ沈積によって特徴付けられるサイレント反応；および循環抗−ドナーアロ抗体、Ｃ４ｄ沈積、および組織病理学によって特徴付けられる臨床下拒絶よりなる群から選択される初期段階液性拒絶である請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
前記拒絶が循環抗−ドナーアロ抗体、Ｃ４ｄ沈積、組織病理学、および移植片機能不全によって特徴付けられる請求項３２記載の方法。
【請求項３５】
前記受容体が検出可能なレベルの循環抗−ＨＬＡアロ抗体を有する請求項２７、２８または２９いずれか１記載の方法。
【請求項３６】
前記受容体が、造血系細胞移植体、膵臓島細胞の同種異系移植体、あるいは心臓移植体、腎臓−膵臓移植体、腎臓移植体、肝臓移植体、肺移植体、および膵臓移植体よりなる群から選択される固体器官移植体の受容体である請求項２７または２９いずれか１記載の方法。
【請求項３７】
前記移植体が膵臓島細胞の同種異系移植体の受容体である請求項２７、２８または２９いずれか１記載の方法。
【請求項３８】
前記移植体が造血細胞移植体の受容体である請求項２７、２８または２９いずれか１記載の方法。
【請求項３９】
前記１以上の他の治療剤はアドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、サイクロスポリンＡ、サイトキシン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、マイコフェノレートモフェチル、非ステロイド抗−炎症剤、ラパマイシン、シロリムス、およびタクロリムスよりなる群から選択される請求項２７または２８記載の方法。
【請求項４０】
前記１以上の他の治療剤がＯＫＴ３ＴＭ（ムロモナブ−ＣＤ３）、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｇ、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｈ（アレムツズマブ）、またはＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｍ、ＳＩＭＵＬＥＣＴＴＭ（バシリキシマブ）、ＺＥＮＡＰＡＸＴＭ（ダクリズマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（リツキシマブ）、および抗−胸腺細胞グロブリンよりなる群から選択される抗体である請求項２７または２８記載の方法。
【請求項４１】
前記抗−ＣＤ１９抗体の投与は、移植片拒絶の治療または予防用の治療養生法を含む請求項２７記載の方法。
【請求項４２】
前記治療養生法が、さらに、免疫抑制療法、抗−リンパ球療法、免疫吸着、またはプラズマフェレシスの１以上を含む請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫抑制療法が、ステロイド、サイトカイン転写の阻害剤、ヌクレオチド合成の阻害剤、成長因子シグナル伝達の阻害剤、およびＴ細胞インターロイキン２受容体の阻害剤よりなる群から選択される１以上の化合物を受容体に投与することを含む請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
前記ステロイドがコルチコステロイドである請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
サイトカイン転写の前記阻害剤はサイクロスポリンＡまたはタクロリムスである請求項４３記載の方法。
【請求項４６】
ヌクレオチド合成の前記阻害剤がアザチオプリンまたはマイコフェノレートモフェチルである請求項４３記載の方法。
【請求項４７】
成長因子シグナル伝達の前記阻害剤がシロリムスまたはラパマイシンである請求項４３記載の方法。
【請求項４８】
Ｔ細胞インターロイキン２受容体の前記阻害剤がダクリズマブまたはバシリキシマブである請求項４３記載の方法。
【請求項４９】
前記抗−リンパ球療法が、ＯＫＴ３ＴＭ（ムロノナブ−ＣＤ３）、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｇ、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｈ（アレムツズマブ）、またはＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｍ、ＳＩＭＵＬＥＣＴＴＭ（バシリキシマブ）、ＺＥＮＡＰＡＸＴＭ（ダクリズマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（リツキシマブ）、および抗−胸腺細胞グロブリンよりなる群から選択される１以上の抗体を受容体に投与することを含む請求項４２記載の方法。
【請求項５０】
前記抗−ＣＤ１９抗体がヒト抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体よりなる群から選択されるモノクローナル抗体である請求項２７または２９いずれか１記載の方法。
【請求項５１】
前記抗−ＣＤ１９抗体がヒト抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する請求項５０記載の方法。
【請求項５２】
前記抗−ＣＤ１９抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプ抗体である請求項５０記載の方法。
【請求項５３】
前記抗−ＣＤ１９抗体がＩｇＧ２またはＩｇＧ４ヒトイソタイプ抗体である請求項５０記載の方法。
【請求項５４】
前記抗−ＣＤ１９抗体が少なくとも４ないし７日である半減期を有する請求項５０記載の方法。
【請求項５５】
前記抗−ＣＤ１９抗体が非経口、腹腔内、静脈内、皮下または筋肉内経路によって投与される請求項５０記載の方法。
【請求項５６】
前記抗−ＣＤ１９抗体が静脈内または皮下経路によって投与される請求項５０記載の方法。
【請求項５７】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、３７．５ｍｇ／ｍ２以下の用量にて皮下経路によって投与される請求項５５記載の方法。
【請求項５８】
前記抗−ＣＤ１９抗体が１．５ｍｇ／ｍ２以下の用量にて投与される請求項５７記載の方法。
【請求項５９】
治療有効養生法の抗−ＣＤ１９抗体を受容体に投与することを含む、それを必要とするヒト移植体受容体において液性拒絶を治療または予防する方法。
【請求項６０】
前記方法が急性または慢性液性拒絶を治療するためのものである請求項５９記載の方法。
【請求項６１】
前記拒絶が：循環抗−ドナーアロ抗体によって特徴付けられる潜在的液性応答；循環抗−ドナーアロ抗体およびＣ４ｄ沈積によって特徴付けられるサイレント反応；および循環抗−ドナーアロ抗体、Ｃ４ｄ沈積、および組織病理学によって特徴付けられる臨床下拒絶よりなる群から選択される初期段階液性拒絶である請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
前記拒絶が循環抗−ドナーアロ抗体、Ｃ４ｄ沈積、組織病理学、および移植片機能不全によって特徴付けられる請求項６０記載の方法。
【請求項６３】
前記受容体が検出可能なレベルの循環抗−ＨＬＡアロ抗体を有する請求項５９記載の方法。
【請求項６４】
前記受容体が心臓移植体、腎臓−膵臓移植体、腎臓移植体、肝臓移植体、肺移植体、および膵臓移植体よりなる群から選択される同種異系固体器官移植体の受容体である請求項５９記載の方法。
【請求項６５】
前記受容体が膵臓島細胞の同種異系移植体の受容体である請求項５９記載の方法。
【請求項６６】
前記受容体が造血細胞移植体の受容体である請求項５９記載の方法。
【請求項６７】
さらに、免疫抑制療法、抗−リンパ球療法、免疫吸着、およびプラズマフェレシスの１以上を含む請求項５９記載の方法。
【請求項６８】
さらに、抗−ＣＤ２０抗体、抗−ＣＤ２２抗体、および抗−ＣＤ５２抗体よりなる群から選択される１以上の抗体を投与することを含む請求項５９記載の方法。
【請求項６９】
前記養生法が、さらに、単球またはマクロファージの機能を増強させる化合物を投与することを含む請求項５９記載の方法。
【請求項７０】
前記養生法が、抗−ＣＤ１９抗体の受容体への単一投与を含む請求項５９記載の方法。
【請求項７１】
前記養生法が、抗−ＣＤ１９抗体の受容体への１を超える投与を含む請求項５９記載の方法。
【請求項７２】
前記養生法が単一治療剤としての抗体の投与を含む請求項５９記載の方法。
【請求項７３】
前記養生法が１以上の他の治療剤と組み合わせた抗体の投与を含む請求項５９記載の方法。
【請求項７４】
前記１以上の他の治療剤がアドリアミイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、サイクロスポリンＡ，サイトキシン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、マイコフェノレートモフェチル、非ステロイド抗−炎症剤、ラパマイシン、シロリムスおよびタクロリムスよりなる群から選択される請求項７３記載の方法。
【請求項７５】
前記１以上の他の治療剤がＯＫＴ３ＴＭ（ムロモナブ−ＣＤ３）、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｇ、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｈ（アレムツマブ）、またはＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｍ、ＳＩＭＵＬＥＣＴＴＭ（バシリキシマブ）、ＺＥＮＡＰＡＸＴＭ（ダクリツマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（リツキシマブ）、および抗−胸腺細胞グロブリンよりなる群から選択される抗体である請求項７３記載の方法。
【請求項７６】
投与される前記養生法が循環Ｂ細胞または循環免疫グロブリン、または双方を少なくとも５０％だけ枯渇させる請求項５９記載の方法。
【請求項７７】
投与される前記養生法が前記受容体においてパネル反応性アロ抗体を低下させる請求項５９記載の方法。
【請求項７８】
前記抗−ＣＤ１９抗体がヒト抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する請求項５９記載の方法。
【請求項７９】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、循環Ｂ細胞または循環免疫グロブリン、または双方を枯渇させるのに十分な量にて、ヒト抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する請求項５９記載の方法。
【請求項８０】
前記抗−ＣＤ１９抗体がヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体よりなる群から選択されるモノクローナル抗体である請求項５９記載の方法。
【請求項８１】
前記抗−ＣＤ１９抗体がヒトまたはヒト化抗体である請求項８０記載の方法。
【請求項８２】
前記抗−ＣＤ１９抗体が少なくとも４ないし７日である半減期を有する請求項８０記載の方法。
【請求項８３】
前記抗−ＣＤ１９抗体がＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプ抗体である請求項８０記載の方法。
【請求項８４】
前記抗−ＣＤ１９抗体がＩｇＧ２またはＩｇＧ４ヒトイソタイプ抗体である請求項８０記載の方法。
【請求項８５】
前記抗−ＣＤ１９抗体が非経口、腹腔内、または筋肉内経路によって投与される請求項５９記載の方法。
【請求項８６】
前記抗−ＣＤ１９抗体が静脈内または皮下経路によって投与される請求項５９記載の方法。
【請求項８７】
前記抗−ＣＤ１９抗体が３７．５ｍｇ／ｍ２以下の用量にて皮下経路によって投与される請求項８６記載の方法。
【請求項８８】
前記抗−ＣＤ１９抗体が１．５ｍｇ／ｍ２以下の用量で投与される請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
循環Ｂ細胞または循環免疫グロブリン、または双方における少なくとも７５％枯渇が達成される請求項２７、２９または７６いずれか１記載の方法。
【請求項９０】
循環Ｂ細胞または循環免疫グロブリンにおける前記枯渇が少なくとも７日の期間で観察される請求項８９記載の方法。
【請求項９１】
循環Ｂ細胞または循環免疫グロブリンにおける前記枯渇が少なくとも３０日の期間で観察される請求項８９記載の方法。
【請求項９２】
循環Ｂ細胞または循環免疫グロブリンにおける前記枯渇が少なくとも６ヶ月の期間で観察される請求項８９記載の方法。
【請求項９３】
循環Ｂ細胞または循環免疫グロブリン、または双方を枯渇させるのに十分な量のヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を移植体受容体に投与することを含む、それを必要とするヒト移植体受容体において移植後リンパ系増殖障害を治療または予防する方法。
【請求項９４】
さらに、抗−ウイルス剤を投与することを含む請求項９３記載の方法。
【請求項９５】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、抗体ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも２５％配列同一性を有する重鎖ＣＤＲを含む請求項２７記載の方法。
【請求項９６】
前記重鎖ＣＤＲがＨＣＤＲ３である請求項９５記載の方法。
【請求項９７】
前記ＨＣＤＲ３が抗体ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂのＨＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して１００％配列同一性を有する請求項９６記載の方法。
【請求項９８】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、抗体ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の各々のアミノ酸配列に対して少なくとも２５％配列同一性を有する重鎖ＣＤＲを含む請求項９５記載の方法。
【請求項９９】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、抗体ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂの重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３の各々のアミノ酸配列に対して１００％配列同一性を有する重鎖ＣＤＲを含む請求項９８記載の方法。
【請求項１００】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、さらに、抗体ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂの軽鎖ＣＤＲを含む請求項９５記載の方法。
【請求項１０１】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、抗体ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂの軽鎖ＣＤＲを含む請求項９９記載の方法。
【請求項１０２】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、配列番号：１６または配列番号：１８に対して少なくとも２５％アミノ酸配列同一性を有する可変軽鎖を含む請求項２７記載の方法。
【請求項１０３】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、抗体ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂの重鎖可変ドメインアミノ酸配列に対して少なくとも２５％配列同一性を有する重鎖可変ドメインを含む請求項２７記載の方法。
【請求項１０４】
前記抗−ＣＤ１９抗体が、さらに、抗体ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂの軽鎖可変ドメインアミノ酸配列に対して少なくとも２５％配列同一性を有する軽鎖可変ドメインを含む請求項１０３記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、米国仮特許出願第６０／６８９，０３３号（２００５年６月８日出願）および同第６０／７０１，３６５号（２００５年７月２０日出願）に対し、米国特許法第１１９条（ｅ）の下の優先権を主張する。これらの仮特許出願は、その全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明は、ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅより受けた助成金番号ＣＡ１７７６、ＣＡ１０５００１およびＣＡ９６５４７の下、ならびにｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈのｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅより受けた助成金番号ＡＩ５６３６３の下において、部分的に政府の支援によって行われた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
（１  序論）
本発明は、ヒトＣＤ１９抗原に結合する治療抗体を用いてヒト移植片受容体において移植片−対−宿主病（ＧＶＨＤ）、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害を治療および予防する方法に向けられる。好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法の治療抗−ＣＤ１９抗体は、ヒト抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。本発明は、さらに、ＩｇＧ１および／またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのヒト、ヒト化、またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体を含む組成物に向けられる。本発明は、さらに、好ましくはヒトＡＤＣＣを媒介するＩｇＧ２および／またはＩｇＧ４ヒトイソタイプのヒト、ヒト化、またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体を含む組成物に向けられる。また、本発明は、モノクローなるヒト、ヒト化、またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体を含む。
【背景技術】
【０００４】
（２  発明の背景）
細胞性（Ｔ細胞−媒介）および液性（抗体、Ｂ細胞−媒介）の双方の免疫は、今日、移植片拒絶において重要な役割を演じていることが知られている。移植片拒絶におけるＴ細胞−媒介免疫の重要性はよく確立されているが、急性および慢性拒絶における液性免疫の臨界的役割は最近明らかになったに過ぎない。その結果、移植片拒絶の治療および予防の進歩の殆どは、Ｔ細胞活性化を標的とする治療剤から開発されたものである。移植片拒絶の治療についてＦＤＡに認可された最初の治療モノクローナル抗体は、Ｔ細胞のＣＤ３受容体に対して向けられたマウスモノクローナル抗体ＯＲＴＨＯＣＬＯＮＥ−ＯＫＴ３ＴＭ（ムロモナブ−ＣＤ３）であった。ＯＫＴ３は、モノクローナル抗−ＣＤ５２  ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ抗体、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｇ、ＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｈ（アレムツヅマブ）、およびＣＡＭＰＡＴＨ−１Ｍ、およびポリクローナル抗−胸腺細胞抗体製剤（抗−胸腺細胞グロブリンともいう、または「チモグロビン」または「チモグロブリン」ともいわれる「ＡＴＧ」）を含めた、多数の他の抗−リンパ球に向けられた抗体によって接合されてきた。移植片拒絶の予防について認可された他のＴ細胞抗体はキメラモノクローナル抗体ＳＩＭＵＬＥＣＴＴＭ（バシリキシマブ）およびヒト化モノクローナル抗体ＺＥＮＡＰＡＸＴＭ（ダクリズマブ）を含み、その双方は活性化されたＴ細胞の高−親和性ＩＬ−２受容体を標的とする。
【０００５】
移植片拒絶における液性免疫の重要性は超急性拒絶に制限されると最初は考えられ、そこでは、移植片受容体は移植に先立って抗−ドナーＨＬＡ抗体を保有し、その結果、抗体抑制の有効治療養生法の不存在下で移植片は迅速に破壊される。最近、液性免疫もまた急性および慢性双方の拒絶を媒介する重要な因子であることが明らかとなった。例えば、臨床的観察は、（「抗−ＭＨＣアロ抗体」ともいわれる）クラスＩまたはクラスＩＩ抗−ＨＬＡアロ抗体を発生させることができる患者における移植片の生存は、そのような抗体を発生させることができない患者における移植片生存と比較して低下したことを示した。臨床および実験データもまた、他のドナー−特異的アロ抗体および自己抗体が拒絶の臨界的メディエーターであることを示す。同種移植片拒絶におけるドナー−特異的抗体についての役割を裏付ける証拠の最近のレビューについては、非特許文献１参照。
【０００６】
Ｂ細胞表面マーカーは、一般には、Ｂ細胞悪性疾患、障害、自己免疫疾患、および移植拒絶の治療のための標的として提案されてきた。例えば、抗−ＣＤ１９抗体を記載する、２００５年３月３１日に公開されたＨａｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，特許文献１参照。Ｂ細胞表面マーカーの例はＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、およびＣＤ８６白血球表面マーカーを含む。これらのマーカーに特異的に結合する抗体が開発されており、いくつかは、Ｂ細胞関連障害、特に癌の治療について、最近では、同種移植片拒絶および移植関連障害の予防および治療についてテストされている。しかしながら、急性および慢性移植片拒絶における液性免疫の役割の比較的最近の認識のため、液性免疫を標的とする現在の治療剤および戦略は、細胞性免疫を標的とするものよりも余りよく開発されていない。
【０００７】
液性免疫を標的とするための利用可能な戦略は抗体枯渇養生法、および抗−Ｂリンパ球に向けられた抗体を含む。液性免疫を標的とするための免疫学的戦略の最近のレビューについては、非特許文献２参照。抗体枯渇の例は、静脈内免疫グロブリンでの受容体の治療、免疫吸着、およびプラズマフォレシスによるドナー−反応性抗体の除去を含む。抗−Ｂリンパ球に向けられた抗体の殆どの報告は、抗−ＣＤ２０抗体、特に、いくつかのＢ細胞悪性疾患の治療でＦＤＡに認可されたキメラマウス−ヒト抗−ＣＤ２０モノクローナル抗体であるＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（リツキシマブ）に焦点を当ててきた。より最近では、リツキシマブは、移植−関連治療養生法で用いるために評価されてきた。例えば、リツキシマブは、プレ−移植片コンディショニング養生法において、急性性拒絶のための治療養生法において、および混合された結果を持つ、ＡＢＯ−不適合腎臓移植に対する抗−ＡＢＯ抗体を低下させるために用いることが報告されている。Ｓｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献３）は、移植を待っている透析患者のコンディショニングのためにリツキシマブを用いる対立−用量、用量−エスカレーション１相試験を報告した。結果は、単一剤としての、リツキシマブがＢ細胞の亜集団を部分的に枯渇させ、パネル反応性アロ抗体を低下させたことを示した。しかしながら、Ｖｉｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献４）は、腎臓移植を待っている患者においてリツキシマブの単一−用量を用いるパネル反応性アロ抗体における中程度の低下を報告したに過ぎない。Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献５）は、ステロイド治療、または抗−胸腺細胞グロブリンおよびプラズマフォレシスとの組合せ療法に従前は応答しなかった急性拒絶を治療するためのリツキシマブの使用を報告した。脾臓摘出の必要性無くして、免疫吸着、プラズマフォレシス、および静脈内免疫グロブリンのような他の戦略との組合せにおけるリツキシマブコンディショニングもまた、ＡＢＯ−不適合腎臓移植との関連において報告された（非特許文献６；非特許文献７）参照。
【０００８】
ヒトＣＤ１９分子は、形出細胞、および悪性Ｂ細胞への最後の分化を通じて、限定されるものではないが、プレ−Ｂ細胞、初期発生におけるＢ細胞（すなわち、未成熟Ｂ細胞）、成熟Ｂ細胞を含めたヒトＢ細胞の表面で発現される構造的に区別される細胞表面受容体である。Ｂ細胞のより広いレパートリーを標的化することができるにおける抗−ＣＤ２０抗体よりも優れた抗−ＣＤ１９抗体の利点にも拘らず、移植免疫両方でのそれらの指標は、第一に、Ｂ細胞の同定およびモニタリングに制限されてきた。移植における抗−ＣＤ１９に向けられた抗体の更なる使用がＢａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（非特許文献８）によって報告された。Ｂａｒｆｉｅｌｄは、ドナー末梢幹細胞移植片からエクスビボにてＴおよびＢリンパ球を捕獲して、移植に先立って移植片における同種異系リンパ球を低下させるためのアフィニティ試薬として用いられる磁気マイクロビーズにコンジュゲートされた抗−ＣＤ３抗体および抗−ＣＤ１９抗体を報告した。
【０００９】
移植片拒絶の治療および予防に加えて、Ｂ細胞に向けられた抗体を用いて、ポスト−移植片リンパ系増殖障害（ＰＴＬＤ）を治療してきた（非特許文献９参照）。ＰＴＬＤは過剰増殖Ｂ細胞によって特徴付けられ、移植片に由来する、または受容体において潜在的な、エプスタインバールウイルス感染Ｂ細胞に関連付けられている。Ｓｃｈａａｒ  ｅｔ  ａｌ．は、膵臓−腎臓、肝臓、心臓、および腎臓の固体器官移植変に続いて危険性が高い患者におけるＰＴＬＤの治療のための五段階のプロトコルを報告した。（非特許文献１０）。養生法は、一定量の免疫抑制剤の低下と組み合わせたイソタイプＩｇＧ２ａのマウス抗−ＣＤ１９モノクローナル抗体、および抗−ウイルス剤、インターフェロン−アルファ、およびガンマ−グロブリンの添加を含むものであった。
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００７０６９３号明細書
【非特許文献１】Ｒｉｆｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００５  ７９：Ｓ１４−Ｓ１８
【非特許文献２】Ｓｎａｎｏｕｄｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００５  ７９：Ｓ３３−３５
【非特許文献３】Ｓｉｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，２００４  １３：５５−６２
【非特許文献４】Ｖｉｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｉｔｏｎ，２００４  ７７：５４２
【非特許文献５】Ｂｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２００４  ４：９９６
【非特許文献６】Ｔｙｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００３  ７６：７３０
【非特許文献７】Ｓｏｎｎｅｎｄａｙ，Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，２００４  ４：１３１５
【非特許文献８】Ｂａｒｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｔｈｅｒａｐｙ，２００４  ６：１−６
【非特許文献９】Ｌｅ  Ｖａｓｓｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，２００３  ７：３７０−７５
【非特許文献１０】Ｓｃｈａａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２００１  ７１：４７−５２
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（３  発明の要旨）
本発明は、免疫治療組成物、およびヒトＣＤ１９抗原に結合し、好ましくはヒトＡＤＣＣを媒介する治療抗体を用いてヒト対象においてＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害を予防および治療する方法に関する。特別な実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、ＡＤＣＣ、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、またはＢ細胞のアポトーシスを媒介する。本発明は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物に関する。本発明は、好ましくはヒトＡＤＣＣを媒介するＩｇＧ２またはＩｇＧ４ヒトイソタイプのヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物に関する。本発明は、ヒトＡＤＣＣを媒介するＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のキメラ化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物に関する。好ましい実施形態において、本発明は、モノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物に関する。
【００１１】
本発明の方法は、例えば、ヒト対象においてＣＤ１９に向けられた免疫療法を評価するためのトランスジェニックマウスモデルを用いて示される。
【００１２】
１つの実施形態において、本発明は、医薬上許容される担体中のＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのモノクローナルヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物を提供する。もう１つの実施形態において、本発明は、医薬上許容される担体中の治療有効量のＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのモノクローナルキメラ化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物を提供する。関連する実施形態において、治療有効量のＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのモノクローナルキメラ化抗−ＣＤ１９抗体は１ｍｇ／ｋｇ患者体重未満である。他の関連する実施形態において、治療有効量のＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのモノクローナルキメラ化抗−ＣＤ１９抗体は２ｍｇ／ｋｇ患者体重よりも大きい。
【００１３】
１つの態様によると、本発明は、医薬上許容される担体中の、ヒト抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する治療有効量のモノクローナルヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物を提供する。もう１つの態様によると、本発明は、医薬上許容される担体中の、ヒト抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介するモノクローナルキメラ化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物を提供する。
【００１４】
本発明は、循環Ｂ細胞、または循環免疫グロブリン、または双方を枯渇させるのに十分な量の抗−ＣＤ１９抗体を受容体に投与することを含むそれを必要とするヒト移植片受容体において液性拒絶を治療または予防する方法を提供し、ここに、抗−ＣＤ１９抗体は単独で、あるいは１以上の他の治療剤と組み合わせて投与される。１つの実施形態において、液性拒絶に対する予防を必要とする移植片受容体は、移植に先立った検出可能な循環抗−ＨＬＡアロ抗体を有する患者または患者集団として確認される。もう１つの実施形態において、患者または患者集団は、移植に先立ってパネル反応性アロ抗体を有するものとして確認される。もう１つの実施形態において、液性拒絶に対する治療を必要とする移植片受容体は、検出可能な循環抗−ＨＬＡアロ抗体ポスト−移植を有する患者または患者集団として確認される。もう１つの実施形態において、患者または患者集団はパネル反応性アロ抗体ポスト−移植を有するものとして確認される。もう１つの実施形態において、患者または患者集団は、ＡＢＯ血液型不適合ドナーからの移植片を必要とするとして確認される。
【００１５】
ある実施形態において、本発明は、循環Ｂ細胞、または循環免疫グロブリン、または双方を枯渇させるのに十分な量の抗−ＣＤ１９抗体を移植に先立って受容体に投与することを含むそれを必要とするヒト移植片受容体において液性拒絶を予防するための方法を提供し、ここに、抗−ＣＤ１９抗体は単独で、あるいは１以上の他の治療剤と組み合わせて投与される。他の実施形態において、本発明は、移植片からＢ細胞を枯渇させるのに十分な量の抗−ＣＤ１９抗体と移植前に移植片を接触させることを含むそれを必要とするヒト移植片受容体において移植片拒絶または移植片−対−宿主病を予防する方法を提供する。１つの実施形態において、移植片をエクスビボにて抗−ＣＤ１９抗体と接触させる。もう１つの実施形態において、該方法は、さらに、移植片を、抗−Ｔリンパ球抗体または抗−胸腺細胞グロブリンの１以上と接触させることを含む。
【００１６】
ある実施形態において、本発明は、循環Ｂ細胞、または循環免疫グロブリン、または双方を枯渇させるのに十分な量の抗−ＣＤ１９抗体を受容体に投与することを含むそれを必要とするヒト移植片受容体において液性拒絶を治療する方法を提供し、ここに、抗−ＣＤ１９抗体は単独で、または１以上の他の治療剤と組み合わせて投与される。１つの実施形態において、拒絶は急性または慢性液性拒絶である。１つの実施形態において、液性拒絶に対する治療を必要とする移植片受容体は、循環抗−ドナーアロ抗体によって特徴付けられる潜在的液性応答、循環抗−ドナーアロ抗体およびＣ４ｄ沈着によって特徴付けられるサイレントな反応、または循環抗−ドナーアロ抗体、Ｃ４ｄ沈着、および組織病理学によって特徴付けられる臨床下拒絶のような、初期段階の拒絶における患者または患者集団として確認される。もう１つの実施形態において、液性拒絶に対する治療を必要とする移植片受容体は、循環抗−ドナーアロ抗体、Ｃ４ｄ沈着、組織病理学、および移植片機能不全によって特徴付けられる拒絶の段階にある患者または患者集団として確認される。
【００１７】
また、本発明は、治療有効養生法の抗−ＣＤ１９抗体を受容体に投与することを含むそれを必要とするヒト移植片受容体において液性拒絶を治療または予防する方法に関する。１つの実施形態において、養生法は、さらに、単球またはマクロファージ機能を増強させる化合物を投与することを含む。１つの実施形態において、該養生法は、抗−ＣＤ１９抗体の受容体への単一投与を含む。もう１つの実施形態において、養生法は、抗−ＣＤ１９抗体の受容体への１を超える投与を含む。１つの実施形態において、養生法は、単一治療剤としての抗体の投与を含む。１つの実施形態において、養生法は、１以上の他の治療剤と組み合わせた抗体の投与も含む。
【００１８】
ある実施形態において、本発明は、１以上の治療剤と組み合わせた抗−ＣＤ１９抗体の投与を提供し、該治療剤は、アドリアマイシン、アザチオプリン、ムスルファン、シクロホスファミド、サイクロスポリンＡ、サイトキシン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、マイコフェノレートモフェチル、非ステロイド抗−炎症剤、ラパマイシン、シロリムスおよびタクロリムスよりなる群から選択される。関連実施形態において、１以上の他の治療剤がＯＫＴ３ＴＭ（ムロモナブ−ＣＤ３）、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｈ（アレムツヅマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｇ、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｍ、ＳＩＭＵＬＥＣＴＴＭ（バシリキシマブ）、ＺＥＮＡＰＡＸＴＭ（ダクリズマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（リツキシマブ）、および抗−胸腺細胞グロブリンよりなる群から選択される抗体である。
【００１９】
１つの態様によると、本発明は、同種移植片に対する液性応答を発生する危険性があるとして特徴付けられる移植片受容体においてＧＶＨＤおよび拒絶を治療および予防する方法を提供する。関連する実施形態において、受容体は検出可能なレベルの循環抗−ＨＬＡアロ抗体を有する。
【００２０】
本発明の特別な実施形態において、移植片受容体は、心臓移植片、腎臓−膵臓移植片、腎臓移植片、肝臓移植片、肺移植片、および膵臓移植片よりなる群から選択される同種異系固体器官移植片の受容体である。１つの実施形態において、受容体は、膵臓島細胞の同種異系移植片の受容体である。もう１つの実施形態において、受容体は、造血系細胞移植片、例えば、骨髄移植片および／または末梢血液幹細胞の移植片の受容体である。
【００２１】
また、本発明は、移植片拒絶の治療または予防のための治療養生法の一部としての抗−Ｃ１９抗体の投与を提供する。１つの実施形態において、治療養生法は、さらに、１以上の免疫抑制療法、抗−リンパ球療法、免疫吸着、またはプラズマフォレシスを含む。特別な実施形態において、免疫抑制療法は、ステロイド、サイトカイン転写の阻害剤、ヌクレオチド合成の阻害剤、成長因子シグナル伝達の阻害剤、およびＴ細胞インターロイキン２受容体の阻害剤よりなる群から選択される１以上の化合物を移植片受容体に投与することを含む。特別な実施形態において、抗−リンパ球療法は、ＯＫＴ３ＴＭ（ムロモナブ−ＣＤ３）、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｈ（アレムツヅマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｇ、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｍ、ＳＩＭＵＬＥＣＴＴＭ（バシリキシマブ）、ＺＥＮＡＰＡＸＴＭ（ダクリズマブ）、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（リツキシマブ）、および抗−胸腺細胞グロブリンよりなる群から選択される１以上の抗体を受容体に投与することを含む。
【００２２】
本発明の方法のある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体、およびキメラ抗体よりなる群から選択されるモノクローナル抗体である。好ましくは、抗−ＣＤ１９抗体はヒト抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。ある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体はＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプ抗体である。他の実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体は、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ヒトイソタイプ抗体である。１つの実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体は少なくとも４ないし７日である半減期を有する。
【００２３】
本発明の特別な実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体は非経口、腹腔内、または筋肉内経路によって投与される。他の実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体は静脈内または皮下経路によって、好ましくは、３７．５ｍｇ／ｍ２以下の用量にて、または１．５ｍｇ／ｍ２以下の用量にて皮下経路によって投与される。
【００２４】
本発明によって提供される方法の好ましい実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体は、移植片受容体において、循環Ｂ細胞を低下または枯渇させるのに、循環免疫グロブリン（Ｉｇ）を低下または枯渇させるのに、または循環Ｂ細胞および循環Ｉｇの双方を低下または枯渇させるのに有効な量にて投与される。１つの実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体は、受容体への移植片の移植に先立って移植片において、Ｂ細胞を低下または枯渇させるのに、免疫グロブリン（Ｉｇ）を低下または枯渇させるのに、またはＢ細胞およびＩｇ双方を低下または枯渇させるのに有効な量にて投与される。１つの実施形態において、本発明によって提供される方法は、循環Ｂ細胞において少なくとも５０％または少なくとも７５％枯渇を達成する。関連実施形態において、循環Ｂ細胞における枯渇は、少なくとも７日、少なくとも３０日、または少なくとも６ヶ月の期間で観察される。もう１つの好ましい実施形態において、本発明の方法は、移植片受容体においてパネル反応性アロ抗体を少なくとも５０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％だけ低下させるのに有効である。
【００２５】
また、本発明は、循環Ｂ細胞を枯渇させるのに有効な量のヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を移植片受容体に投与することを含むそれを必要とするヒト移植片受容体においてポスト−移植片リンパ系増殖障害を治療または予防する方法に関する。１つの実施形態において、本発明は、さらに、抗−ウイルス剤を移植片受容体に投与することを提供する。
【００２６】
（３．１  定義）
本明細書中で用いるように、用語「抗体」および「複数抗体」（免疫グロブリン）とは、（全長モノクローナル抗体を含めた）モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つの無傷抗体から形成された多特異的抗体（例えば、二特異的抗体）、ヒト抗体、ヒト化抗体、カメライズド抗体、キメラ抗体、単一−鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦｖ）、単一−鎖抗体、単一ドメイン抗体、ドメイン抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、所望の生物学的活性を呈する抗体断片、ジスルフィド−連結Ｆｖｓ（ｓｄＦｖ）、および抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体（例えば、本発明の抗体に対する抗−Ｉｄ抗体を含む）、イントラボディ、および前記のいずれかのエピトープ−結合断片をいう。特に、抗体は、免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な断片、すなわち、抗原−結合部位を含有する分子を含む。免疫グロブリン分子はいずれのタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）またはサブクラスのものでもあり得る。
【００２７】
天然抗体は、通常、２つの同一の軽（Ｌ）鎖、および２つの同一の重（Ｈ）鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖蛋白質である。各軽鎖は１つのジスルフィド共有結合によって重鎖に連結しており、他方、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽鎖は規則的に間隔を設けた鎖内ジスルフィドブリッジも有する。各重鎖は１つの末端の可変ドメイン（ＶＨ）、続いての多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は１つの端部において可変ドメイン（ＶＬ）およびその他の端部において定常ドメインを有し；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインと整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖可変ドメインの間で界面を形成すると考えられている。そのような抗体は、限定されるものではないが、ヒト、サル、ブタ、ウマ、ウサギ、イヌ、ネコ、マウス等を含めたいずれかの哺乳動物に由来し得る。
【００２８】
用語「可変」とは、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列がかなり異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合特異性を担うという事実をいう。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインを通じて均一に分布しているのではない。それは、軽鎖および重鎖双方の可変ドメイン中で相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれるセグメントに濃縮されている。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる。天然重鎖および軽鎖の可変ドメインは、各々、β−シート構造に連結する、ある場合にはその一部を形成するループを形成する、３つのＣＤＲによって連結された、かなりβ−シート立体配置を採用する４つのＦＲ領域を含む。各鎖におけるＣＤＲはＦＲ領域によって近接して一緒に保持され、他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の高原−結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１）参照）。定常領域は一般には抗原結合に直接的には関与しないが、抗原結合親和性に影響する可能性があり、ＡＤＣＣにおける抗体の参画のような種々のエフェクター機能を呈することができる。
【００２９】
用語「超可変領域」は、本明細書中で用いる場合、その抗原に対する結合を担う抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」からのアミノ酸残基（例えば、軽鎖可変領域における残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）および８９−９７（Ｌ３）、および重鎖可変領域における３１−３５（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））、および／または「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメインにおける残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）および９１−９６（Ｌ３）、および重鎖可変領域における２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で定義するように超可変領域残基以外の可変ドメイン残基であり、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体、ダイアボディ、バクシボディ、線状抗体、および二特異的抗体を含む。
【００３０】
用語「モノクローナル抗体」とは、本明細書中で用いるように、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、該集団を含む個々の抗体は、微量に存在し得る可能な天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一抗原部位に対して向けられる。さらに、典型的には異なる決定基（エピトープ）に向けられた異なる抗体を含む慣用的な（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、各モノクローナル抗体は抗原上の単一決定基に対して向けられる。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、それらが、他の免疫グロブリン生産細胞によって汚染されないハイブリドーマ細胞によって合成される。別法として、モノクローナル抗体は、モノクローナル抗体をコードする重鎖および軽鎖遺伝子で安定にまたは一過的にトランスフェクトされた細胞によって生産され得る。
【００３１】
修飾語「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の生産から得られる抗体の特徴を示し、いずれかの特定の方法による抗体のエンジニアリングを必要とすると解釈されるべきではない。用語「モノクローナル」は、本明細書中においては、いずれかの真核生物、原核生物、またはファージクローンを含めた細胞のクローナル集団に由来する抗体をいい、抗体が作製された方法をいわない。例えば、本発明に従って用いられるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって測定することができ、あるいは例えばＣｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）において記載された技術を用いるファージ抗体ライブラリーからの単離を含めたいずれかの組換えＤＮＡ方法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）によって作製することができる。これらの方法を用いて、モノクローナル哺乳動物、キメラ、ヒト化、ヒト、ドメイン抗体、ダイアボディ、バクシボディ、線状抗体、および二特異的抗体を生産することができる。
【００３２】
用語「キメラ」抗体は、重鎖および／または軽鎖の少なくとも１つの部分が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるかまたは、相同であり、鎖の少なくとも１つの他の部分がもう１つの種に由来する、またはもう１つのクラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、またはそれに対して相同である抗体、ならびに所望の生物学的活性を呈する限りはそのような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。注目するキメラ抗体は、本明細書中においては、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザルまたはマカクザルのような旧世界サル）に由来する可変ドメイン抗原−結合配列、およびヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００３３】
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、所望の特異性、親和性および能力を有する、受容体の超可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類のような非ヒト種の（ドナー抗体）の超可変領域からの残基によって置き換えられたヒト免疫グロブリン（受容体抗体）である。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域（ＦＲ）残基は対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は受容体抗体で、またはドナー抗体で見出されない残基を含むことができる。これらの修飾を行って、抗体の性能をさらに洗練させる。一般に、ヒト化抗体は、超可変ループの全て、または実質的に全てが、非ヒト免疫グロブリンのそれに対応し、かつＦＲの全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメインの実質的に全て含むであろう。ある実施形態において、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれの少なくとも一部を含むであろう。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；およびＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）参照。
【００３４】
「ヒト抗体」は、抗原挑戦に応答して特異的ヒト抗体を生産するように「作製」されており、かつ当該分野で知られたいずれかの方法によって生産することができる、ヒトに由来する抗体、またはトランスジェニック生物から得られる抗体であり得る。好ましい技術によると、ヒト重鎖および軽鎖座のエレメントが、内因性重鎖および軽鎖座の標的化された破壊を含む胚性幹細胞系に由来する生物の株に導入される。トランスジェニック生物はヒト抗原に特異的なヒト抗体を合成することができ、該生物を用いて、ヒト抗体を分泌するハイブリドーマを生産することができる。ヒト抗体は、重鎖および軽鎖が１以上のヒトＤＮＡの源に由来するヌクレオチド配列によってコードされる抗体でもあり得る。十分にヒトの抗体もまた、遺伝子または染色体トランスフェクション方法、ならびにファージライブラリー技術、またはインビトロ活性化Ｂ細胞によって構築することができ、その全ては当該分野で知られている。
【００３５】
「ＣＤ１９」抗原とは例えば、ＨＤ２３７またはＢ４抗体によって同定される約９０ｋＤａの抗原を言う（Ｋｉｅｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＩＩ，１２：１１１９（１９８７））。ＣＤ１９は、限定されるものではないが、（ナイーブＢ細胞、抗原−刺激Ｂ細胞、記憶Ｂ細胞、形質細胞、およびＢリンパ球を含めた）プレ−Ｂ細胞、Ｂ細胞、および小胞樹状細胞を含めた、形質細胞への最後の分化を通じての幹細胞段階からのＢ−系列細胞の分化を通じて細胞に見出される。また、ＣＤ１９はヒト胎児組織中のＢ細胞で見出される。好ましい実施形態において、本発明の抗体によって標的化されるＣＤ１９抗原はヒトＣＤ１９抗原である。
【００３６】
「抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害」および「ＡＤＣＣ」とは、非特異的細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）が標的細胞上の結合した抗体を認識し、引き続いて、標的細胞の溶解を引き起こす細胞−媒介反応を言う。好ましい実施形態においてそのような細胞はヒト細胞である。いずれかの特定の作用メカニズムに制限されるつもりはないが、ＡＤＣＣを媒介するこれらの細胞傷害性細胞は一般にＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する。ＡＤＣＣを媒介するための一次細胞であるＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩを発現し、他方、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＶを発現する。造血系細胞でのＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２（１９９１）にまとめられている。分子のＡＤＣＣ活性を評価するためには、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されたもののようなインビトロＡＤＣＣアッセイを行うことができる。そのようなアッセイに対する有用なエフェクター細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。別法として、あるいは加えて、注目する分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されたもののような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【００３７】
「補体依存性細胞傷害」または「ＣＤＣ」とは、補体活性化を開示させ、補体の存在下で標的を溶解する分子の能力をいう。補体活性化経路は、補体系（Ｃ１ｑ）の第一の成分の、同族抗原と複合体化した分子（例えば、抗体）への結合によって開始される。固体活性化を評価するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）に記載されたＣＤＣアッセイを行うことができる。
【００３８】
「エフェクター細胞」は、１以上のＦｃＲを発現し、エフェクター機能を実行する白血球である。好ましくは、細胞は少なくともＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＶを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を行う。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例は末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞および好中球を含み；ＰＢＭＣおよびＮＫ細胞が好ましい。好ましい実施形態において、エフェクター細胞はヒト細胞である。
【００３９】
用語「Ｆｃ受容体」または「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載するのに用いる。好ましいＦｃＲは天然配列ヒトＦｃＲである。さらに、好ましいＦｃＲはＩｇＧ抗体（ガンマ受容体）ものである。対立遺伝子変種および、別法として、これらの受容体のスライスされた形態を含めた、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよび／またはＦｃγＲＩＶサブクラスの受容体を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体は、その細胞質ドメインにおいて主として異なる同様なアミノ酸配列を有するＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）およびＦｃγＲＩＩＢ（「阻害受容体」）を含む。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメインに免疫受容体チロシン−ベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢはその細胞質ドメインにおいて、免疫受容体チロシン−ベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する（Ｄａｅｒｏｎ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５：２０３−２３４（１９９７）参照）。ＦｃＲはＲａｖｅｔｅｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：４５７−９２（１９９１）；Ｃａｐｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ，４：２５−３４（１９９４）；およびｄｅ  Ｈａａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｌａｂ．Ｃｌｉｎ．Ｍｅｄ．，１２６：３３０−４１（１９９５）にレビューされている。将来同定されるべきものを含めた他のＦｃＲは、ここでは、用語「ＦｃＲ」に含まれる該用語は、母性ＩｇＧの胎児への導入を担う新生受容体ＦｃＲｎを含む（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１７：５８７（１９７６）およびＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４；２４９（１９９４））。
【００４０】
「Ｆｖ」は、抗原−認識および結合部位を含有する抗体断片である。この領域は密な、非共有結合または共有結合会合した１つの重鎖および１つの軽鎖可変ドメインのダイマーよりなる。Ｆｖ立体配置においては、各可変ドメインの３つのＣＤＲは、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面の抗原−結合部位を規定するように相互作用する。集合的に、これらの６つのＣＤＲは抗原−結合特異性をＦｖ断片に付与する。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）さえが抗原を認識しそれに結合する能力を有するが、完全な結合部位よりも低い親和性におけるものである。
【００４１】
本明細書中に記載する処理で用いるべきエピトープに対する抗体の「親和性」は当該分野でよく理解された用語であって、抗体のエピトープへの結合の程度または強さを意味する。親和性は、限定されるものではないが、平衡解離定数（ＫＤまたはＫｄ）、見掛けの平衡解離定数（ＫＤ’またはＫｄ’）、およびＩＣ５０（競合アッセイにおいて５０％阻害を行うのに必要な量）を含めた当該分野で知られた多数の方法で測定し、および／または表現することができる。本発明の目的では、親和性は、エピトープに結合する抗体の所与の集団に対する平均親和性であると理解される。ｍＬ当たりのｍｇ  ＩｇＧまたはｍｇ／ｍＬ換算の本明細書中で報告するＫＤ’の値は血清のｍＬ当たりのｍｇ  Ｉｇを示すが、血漿を用いることができる。抗体親和性を本明細書中で記載する治療方法の投与、または本明細書中で記載する治療方法についての選択のための基礎として用いる場合、抗体親和性は治療の前および／または間に測定することができ、得られた値は、ヒト患者が治療のための適切な候補であるか否かを評価するのに臨床家によって使用され得る。
【００４２】
「エピトープ」は当該分野でよく理解された用語であって、抗体への特異的結合を呈するいずれかの化学基を意味する。「エピトープ」は抗原を含むこともでき、これはエピトープを含有し、また、それ自体が特異的に抗体に結合する基または分子である。
【００４３】
本明細書中で用いるように、「Ｂ細胞表面マーカー」は、それに結合する剤で標的化することができるＢ細胞の表面に発現される抗原である。例示的なＢ細胞表面マーカーはＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤ７５、ＣＤ７７、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤ８４、ＣＤ８５、およびＣＤ８６白血球表面マーカーを含む。特に注目するＢ細胞表面マーカーは哺乳動物の他の非−Ｂ細胞組織と比較してＢ細胞で優先的に発現され、前駆体Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞双方で発現され得る。１つの実施形態において、好ましいマーカーは、最後に分化した形質細胞段階を通るプロ／プレ−Ｂ細胞段階からの系統の分化を通じてＢ細胞で見出されるＣＤ１９である。
【００４４】
本明細書中で用いるように、用語「抗体半減期」は、その投与に続いての抗体分子の平均生存時間の尺度である抗体のファルマコキネティック特性を意味する。抗体半減期は、例えば、血清中で測定して、患者の身体またはその特異的区画から既知量の免疫グロブリン５０％を排出するのに必要な時間、すなわち、循環半減期として、または他の組織におけるものとして表現することができる。半減期は１つの免疫グロブリンまたは免疫グロブリンのクラスからもう１つのものまで変化し得る。一般に、抗体半減期の増加の結果、投与された抗体についての循環における平均滞留時間（ＭＲＴ）の増加がもたらされる。
【００４５】
用語「イソタイプ」とは、抗体の分類をいう。抗体の定常ドメインは一般には抗原の結合に関与しないが、抗原結合親和性に影響でき、ＡＤＣＣのような種々のエフェクター機能を呈することができる。重鎖定常領域のアミノ酸配列に依存して、与えられた抗体または免疫グロブリンは免疫グロブリンの５つの主なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭの１つに帰属させることができる。これらのクラスのいくつかはさらにサブクラス（イソタイプ）例えば、ＩｇＧ１（ガンマ１）、ＩｇＧ２（ガンマ２）、ＩｇＧ３（ガンマ３）、およびＩｇＧ４（ガンマ４）、およびＩｇＡ１およびＩｇＡ２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常領域は、各々、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスの構造および三次元立体配置はよく知られている。種々のヒト免疫グロブリンクラスのうち、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、およびＩｇＭのみが補体を活性化することが知られている。ヒトＩｇＧ１およびＩｇＧ３はヒトにおいてＡＤＣＣを媒介することが知られている。
【００４６】
本明細書中で用いるように、用語「免疫原性」は、化合物が免疫応答を惹起できることを意味する（特異的抗体の生産および／または特異的Ｔ細胞の増殖の刺激）。
【００４７】
本明細書中で用いるように、用語「抗原性」は、化合物が抗体によって認識され、または抗体に結合し、免疫応答を誘導できることを意味する。
【００４８】
本明細書中で用いるように、用語「結合力」は、抗体が抗原に結合する総じての結合の強さ（すなわち、双方の抗体アーム）の尺度である。抗体結合力は、限定されるものではないが、Ｇｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈ．，４４：１１−２４（１９９３）によって記載される間接的蛍光抗体の修飾によるような当該分野で知られたいずれかの手段を用いて抗原過剰で結合した抗原−抗体の解離にを測定することによって決定することができる。
【００４９】
用語「治療する」、「治療している」または「の治療」（または文法的に同等の用語）とは、対象の疾患のひどさが低下し、または少なくとも部分的に改善され、または軽減されること、および／または少なくとも１つの臨床的徴候におけるある程度の軽減、緩和または減少が達成されること、および／または疾患の進行における阻害または遅延、および／または疾患または病気の予防またはその開始の遅延があることを意味する。用語「治療する」、「治療している」または「の治療」は、自己免疫疾患または障害を管理することも意味する。かくして、用語「治療する」、「治療している」または「の治療」（または文法的に同等な用語）とは、予防的および治療的双方の処置養生法をいう。
【００５０】
本明細書中で用いるように、特定の結果を達成するのに「十分量」または「十分な量」とは、（治療有効量の投与によって）所望により治療的に有効である所望の効果を生じるのに有効な本発明の抗体または組成物の量をいう。例えば、「十分量」または「十分な量」は、Ｂ細胞を枯渇させるのに十分な量であり得る。
【００５１】
本明細書中で用いるように、「治療有効」量は、いくらかの改良を供する、または対象に利益となる量である。別の言い方をすれば、「治療有効」量は、少なくとも１つの臨床的徴候におけるある程度の軽減、緩和および／または減少を供する量である。本発明の方法によって治療することができる障害に関連する臨床的徴候は当業者によく知られている。さらに、当業者であれば、ある程度の利益が対象に供される限り、治療上の効果は完全または治癒的である必要はないことは認識するであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５２】
（５  発明の詳細な説明）
本発明は、免疫治療組成物、およびＣＤ１９抗原に結合し、好ましくはヒトＡＤＣＣを媒介する治療抗体を用いてヒト移植片受容体においてＧＶＨＤ、移植片拒絶、および移植後リンパ球増殖障害を治療および予防する方法に関する。特別な実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体はＡＤＣＣ、補体依存性細胞傷害、またはアポトーシスを媒介する。本発明の組成物および方法は、免疫系の無傷の他の機能的エレメントおよび細胞型を残してＢ細胞を特異的に標的とする利点を有する。従って、１つの態様において、本発明は、余り標的化されていない治療剤および養生法よりも少ないおよび／またはひどさが低い合併症に関連するＧＶＨＤ、移植片拒絶、および移植後リンパ系増殖障害を治療および予防するための組成物および方法を提供する。１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、本発明の方法および組成物の不存在下で可能であるより低い用量の伝統的な治療剤と組み合わせて用いられる。もう１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、放射線療法、高−用量化学療法、または脾臓摘出のようなよりひどい形態の療法に対する必要性を軽減する。
【００５３】
本発明の組成物および方法は、他のＢ−細胞指向性免疫療法よりも広いＢ細胞の集団を標的とする利点も有する。例えば、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、骨髄Ｂ細胞、循環Ｂ細胞、および成熟抗体−分泌Ｂ細胞を標的とするのに効果的である。従って、本発明の方法および組成物は、循環Ｂ細胞ならびに循環免疫グロブリンを低下させまたは枯渇するのに効果的である（例えば、図１３および１４参照）。
【００５４】
ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体および組成物は、単独で、あるいはＧＶＨＤおよび移植片拒絶の治療または予防上の他の治療剤または養生法と組み合わせて、移植に先立ってまたはその後に、移植片受容体に投与することができる。例えば、本発明の抗−ＣＤ１９抗体および組成物を用いて、同種異系移植片の移植に先立って、またはその後に移植片受容体からアロ抗体を枯渇させることができる。また、本発明の抗−ＣＤ１９抗体および組成物を用いて、ＧＶＨＤおよび移植片拒絶に対する予防として、移植に先立って、またはドナーにおいて、エクスビボにて移植片から抗体生産細胞を枯渇させることもできる。
【００５５】
液性拒絶のための予防または治療を必要とする移植片受容体は、当該分野における知識および技量に従って同定される。例えば、移植片拒絶に対する予防を必要とする移植片受容体は、移植に先立って検出可能な循環抗−ＨＬＡアロ抗体を有する患者または患者集団として同定することができる。もう１つの例において、患者または患者集団は、移植に先立ってパネル反応性アロ抗体を有するものとして同定される。移植片受容体ポスト−移植における検出可能な循環抗−ＨＬＡアロ抗体の存在を用いて、本発明に従って、液性拒絶用の治療を必要とする患者または患者集団を同定することもできる。液性拒絶用の治療を必要とする患者または患者集団は、移植片受容体が液性拒絶を発生する危険性があるか、あるいは既に液性拒絶を発生していることを示す他の臨床的基準に従って同定することもできる。例えば、液性拒絶用の治療を必要とする移植片受容体は、循環抗−ドナーアロ抗体によって特徴付けられる潜在的液性応答のような液性拒絶の初期段階における患者または患者集団として同定することができる。液性拒絶の初期段階は、循環抗−ドナーアロ抗体およびＣ４ｄ沈積によって特徴付けられるサイレントな反応、または循環抗−ドナーアロ抗体、Ｃ４ｄ沈積、および組織病理学によって特徴付けられる臨床下拒絶でもあり得る。より後の段階においては、受容体は、例えば、循環抗−ドナーアロ抗体、Ｃ４ｄ沈積、組織病理学、および移植片機能不全によって、当該分野における知識および技量に従って特徴付けられる液性拒絶の臨床的症状を表す患者または患者集団として同定される。
【００５６】
本発明は、ＧＶＨＤ、拒絶エピソード、または移植後リンパ系増殖障害の発生、ひどさ、または持続を低下させるのに効果的な組成物および方法を提供する。ある実施形態において、本発明の組成物および方法は、個体組織または器官移植片の虚血性再灌流負傷に対する宿主応答を減衰させるのに効果的である。好ましい実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物および方法は、移植片受容体における移植片の生存を延長するのに効果的である。
【００５７】
本発明は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのヒト、ヒト化またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物に関する。また、本発明は、好ましくはヒトＡＤＣＣを媒介するＩｇＧ２またはＩｇＧ４ヒトイソタイプのヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物に関する。ある実施形態において、本発明は、当該分野で公知の手段によって生産することができるモノクローナルヒト、ヒト化またはキメラ化抗−ＣＤ１９抗体を服務医薬組成物に関する。
【００５８】
ＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害を治療または予防するための治療処方および養生法を記載する。本発明は、受容体にとってオートロガス、同種異系または外因性である移植片を含む。本発明によって含まれる移植片のタイプは、限定されるものではないが、骨髄移植片、末梢血液幹細胞移植片、皮膚移植片、動脈および静脈移植片、膵臓島細胞移植片、および腎臓、肝臓、膵臓、胸腺および心臓の移植体を含めた組織および器官移植片を含む。用語「移植片」および「移植体」は本明細書中においては相互交換可能に用いられる。１つの実施形態において、オートゴラス移植片は骨髄移植片、動脈移植片、静脈移植片、または皮膚移植片である。１つの実施形態において、同種移植片は骨髄移植片、角膜移植片、腎臓移植体、心臓移植体、肝臓移植体、肺移植体、膵臓移植体、膵臓島細胞移植体、または腎臓および膵臓の組合せ移植体である。１つの実施形態において、移植片は外因性移植片であり、好ましくは、ここで、ドナーはブタである。本発明の組成物および方法を用いて、限定されるものではないが、人工関節、ステントまたはペースメーカーデバイスを含めた、非−生物学的移植片またはインプラントに対する有害な免応答を抑制することもできる。
【００５９】
本発明の抗−ＣＤ１９抗体、組成物および方法を用いて、移植体の必要性を最初に生じさせる特定の症状、または移植された組織の特定のタイプに関することなく、ＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害を治療または予防することができる。しかしながら、移植体、および移植された組織のタイプに対する必要性を生じさせた適応症は、その包括的養生法は本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物および方法を含む、ＧＶＨＤ、移植片拒絶、および移植後リンパ系増殖障害の治療または予防用の包括的な治療養生法に対する基礎を提供することができる。診断基準および治療養生法のより詳細な記載は、セクション５．５および５．６に供される。
【００６０】
（５．１  抗−ＣＤ１９抗体の創製）
（５．１．１  ポリクローナル抗−ＣＤ１９抗体）
ポリクローナル抗体は、関連抗原およびアジュバントの複数皮下（ｓ．ｃ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）注射によって動物において生起される。二官能性または誘導体化剤、例えば、スルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通じてのコンジュゲーション）、（リジン残基を通じる）Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２を用いて、関連抗原を、免疫化すべき種において免疫原性である蛋白質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシチログロビン、または大豆トリプシン阻害剤にコンジュゲートさせるのが有用であろう。
【００６１】
例えば、１００μｇまたは５μｇの蛋白質またはコンジュゲート（各々、ウサギまたはマウス用）を３容量のフロイントの完全アジュバントと組み合わせ、溶液を複数部位にて皮内注射することによって、動物を抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して免疫化する。１ヵ月後に動物に、複数部位における皮下注射によって、フロイントの不完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの元の量の１／５ないし１／１０をブースター注射する。７ないし１４日後に、動物から血液を採取し、抗体力価について血清をアッセイする。力価プラトーまで動物にブースター注射する。好ましくは、動物に、異なる蛋白質にコンジュゲートさせ、および／または異なる架橋剤を介する以外は同一抗原のコンジュゲートをブースター注射する。コンジュゲートは、蛋白質融合としての組換え細胞培養で作製することもできる。また、ミョウバンのような凝集剤を適切に用いて、免疫応答を増強させる。
【００６２】
（５．１．２  モノクローナル抗−ＣＤ１９抗体）
本発明のモノクローナル抗−ＣＤ１９抗体はヒトＣＤ１９抗原に対する結合特異性を呈し、好ましくは、ヒトＡＤＣＣを媒介することができる。これらの抗体は、ハイブリドーマ、組換え体、およびファージディスプレイ技術、またはその組合せの使用を含めた、当該分野で知られた広く種々の技術を用いて生じさせることができる。抗体は高度に特異的であり、単一抗原性部位に対して向けられる。さらに、典型的には、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む慣用的な（ポリクローナル抗体）調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体はヒトＣＤ１９抗原上の単一決定基に対して向けられる。例えば、本発明に従って用いるべきモノクローナル抗体は、マウス抗体（または他の非ヒト哺乳動物、例えば、ラット、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ラクダ等に由来する抗体）、またはトランスジェニック動物に由来するヒト抗体を生じさせるのに用いることができるＫｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，  ２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製することができる。（米国特許第６，０７５，１８１号、第６，１１４，５９８号、第６，１５０，５８４号、および第６，６５７，１０３号参照）。別法として、モノクローナル抗体は組換えＤＮＡ方法によって作製することができ（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号参照）、キメラおよびヒト化抗体を含む。「モノクローナル抗体」は、例えば、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）およびＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから単離することもできる。
【００６３】
作製された抗−ＣＤ１９抗体は、限定されるものではないが、以下に記載された技術、およびそれらの技術に対する改良を含めた当該分野で公知のいずれの手段によって生産することもできる。大規模な高収率生産は、典型的には、作製された抗−ＣＤ１９抗体を生産する宿主細胞を培養し、宿主細胞培養から抗−ＣＤ１９抗体を回収することを含む。
【００６４】
（５．１．３  ハイブリドーマ技術）
モノクローナル抗体は、当該分野で知られ、例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｈａｍｍｅｒｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ，５６３−６８１（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，ＮＹ，１９８１）（該文献を引用によりその全体を援用する）に教示されたものを含めたハイブリドーマ技術を用いて生産することができる。例えば、ハイブリドーマ方法においては、マウス、またはハムスターもしくはマカック属サルのような他の適当な宿主動物を免疫化して、免疫化で用いる蛋白質に特異的に結合する抗体を生産する、または生産することができるリンパ球を誘導する。別法として、リンパ球をインビトロで免疫化することができる。次いで、ポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いてリンパ球を骨髄腫細胞と融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。
【００６５】
かく調製されたハイブリドーマ細胞は、好ましくは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖または生存を阻害する１以上の物質を含有する適当な培養基に撒き、そこで増殖させる。例えば、もし親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠如するならば、ハイブリドーマのための培養基は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、チニジンを含み（ＨＡＴ培地）、その物質はＨＧＰＲＴ−欠乏細胞の増殖を妨げる。
【００６６】
好ましい骨髄腫細胞は、効果的に融合し、選択された抗体−生産細胞による抗体の安定な高レベル生産を支持し、ＨＡＴ培地のような培地に対して感受性であるものである。これらの中で、好ましい骨髄腫細胞系は、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡから入手可能なＭＯＰＣ−２１およびＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、およびＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ，ＵＳＡから入手可能なＳＰ−２またはＸ６３−Ａｇ８．６５３細胞のようなマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞系の、ヒトモノクローナル抗体の生産について記載されている（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３：３００１（１９８４）；Ｂｒｏｄｅｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ．５１−６３（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，１９８７））。
【００６７】
ハイブリドーマ細胞は増殖する培養基を、ヒトＣＤ１９抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の生産についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生産されたモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈澱によって、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）のようなインビトロ結合アッセイによって決定さえる。
【００６８】
所望の特異性、親和性および／または活性の抗体を生産するハイブリドーマ細胞を同定した後、クローンを限界希釈方法によってサブクローンし、標準的な方法によって増殖させることができる（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。この用途の適当な培養基は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ１６４０培地を含む。加えて、ハイブリドーマ細胞は動物中の腹水腫瘍としてインビボで増殖させることができる。
【００６９】
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気詠動、透析、またはアフィニティクロマトグラフィーのような慣用的な免疫グロブリン精製手法によって培養基、腹水液、または血清から適切に分離される。
【００７０】
（５．１．４  組換えＤＮＡ技術）
本発明の抗−ＣＤ１９抗体をコードするＤＮＡは、（例えば、抗−ＣＤ１９抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いることによって）慣用的手法を用いて容易に単離し、配列決定される。ハイブリドーマ細胞はそのようなＤＮＡの好ましい源として働く。一旦単離されれば、ＤＮＡを発現ベクターに入れ、次いで、これを、そうでなければ免疫グロブリン蛋白質を生産するＥ．ｃｏｌｉ細胞、シミアンＣＯＳ細胞、チニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞のような宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞において抗−ＣＤ１９抗体の合成を得ることができる。
【００７１】
ファージディスプレイ方法においては、機能的抗体ドメインが、それらをコードするポリヌクレオチド配列を運ぶファージ粒子の表面に提示される。特に、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列は動物ｃＤＮＡライブラリー（例えば、侵された組織のヒトまたはマウスｃＤＮＡライブラリー）から増幅される。ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡを、ＰＣＲによってｓｃＦｖリンカーと一緒に組換え、ファゲミドベクターにクローン化される。ベクターをＥ．ｃｏｌｉにおいてエレクトロポレーションに付し、Ｅ．ｃｏｌｉをヘルパーファージで感染させる。これらの方法で用いるファージは、ｆｄおよびＭ１３を含めたフィラメント状ファージであり、ＶＨおよびＶＬドメインは通常組換えによりファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩいずれかに融合させる。特定の抗原に結合する抗原−結合ドメインを発現するファージは、例えば、標識された抗原、あるいは個体表面またはビーズに結合した、またはそれに捕獲された抗原を用いて抗原で選択し、または同定することができる。本発明の抗体を作製するのに用いることができるファージディスプレイ方法の例は、その各々をここに引用してその全体を援用する、Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８２：４１−５０；Ａｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１８４：１７７−１８６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４：９５２−９５８；Ｐｅｒｓｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｇｅｎｅ，１８７：９−１８；Ｂｕｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，５７：１９１−２８０；国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＧＢ９１／Ｏ１  １３４；国際公開番号ＷＯ９０／０２８０９，ＷＯ９１／１０７３７，ＷＯ９２／０１０４７，ＷＯ９２／１８６１９，ＷＯ９３／１１２３６，ＷＯ９５／１５９８２，ＷＯ９５／２０４０１，およびＷＯ９７／１３８４４；および米国特許第５，６９８，４２６号、第５，２２３，４０９号、第５，４０３，４８４号、第５，５８０，７１７号、第５，４２７，９０８号、第５，７５０，７５３号、第５，８２１，０４７号、第５，５７１，６９８号、第５，４２７，９０８号、第５，５１６，６３７号、第５，７８０，２２５号、第５，６５８，７２７号、第５，７３３，７４３号、および第５，９６９，１０８号に開示されているものを含む。
【００７２】
前記文献に記載されているように、ファージ選択の後、ファージからの抗体コーティング領域を単離し、それを用いて、ヒト抗体を含めた全抗体、またはいずれかの他の所望の抗原−結合断片を生じさせ、例えば、後に記載するように、哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含めたいずれかの所望の宿主で発現させる。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２断片を組換えにより生じさせるための技術を、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９２／２２３２４；Ｍｕｌｌｉｎａｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１２（６）：８６４−８６９；Ｓａｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，ＡＪＲＩ，３２：２６−３４；およびＢｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４０：１０４１−１０４３（該文献を引用してその全体を援用する）に記載されたもののような当該分野で公知の方法を用いて使用することもできる。
【００７３】
さらなる実施形態において、抗体は、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載された技術を用いて生じさせた抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）は、ファージライブラリーを用いる、各々、マウスおよびヒト抗体の単離を記載する。鎖シャッフリングを、高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生産（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトーリアル感染およびインビボ組換えで用いることができる（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））。かくして、これらの技術は、抗−ＣＤ１９抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行できる代替法である。
【００７４】
全抗体を生じさせるためには、ＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列、制限部位、および制限部位を保護するためのフランキング配列を含めたＰＣＲプライマーを用いて、ｓｃＦｖクローンにおいてＶＨおよびＶＬ配列を増幅することができる。当業者に知られたクローニング技術を利用し、ＰＣＲ増幅ＶＨドメインを、ＶＨ定常領域、例えば、ヒトガンマ４定常領域を発現するベクターにクローン化することができ、ＰＣＲ増幅ＶＬドメインを、ＶＬ定常領域、例えば、ヒトカッパまたはラムダ定常領域を発現するベクターにクローン化することができる。好ましくは、ＶＨおよびＶＬドメインを発現するためのベクターは、ＥＦ−１αプロモーター、分泌シグナル、可変ドメインのためのクローニング部位、定常ドメイン、およびネオマイシンのような選択マーカーを含む。ＶＨおよびＶＬドメインは、必要な定常領域を発現する１つのベクターにクローン化することもできる。次いで、重鎖変換ベクターおよび軽鎖変換ベクターを細胞系へ共トランスフェクトして、当業者に知られた技術を用い、全長抗体、例えば、ＩｇＧを発現する安定なまたは一過性細胞系を生じさせる。
【００７５】
ＤＮＡは、例えば、相同マウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインについてのコーディング配列で置き換えることによって（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、あるいは非−免疫グロブリンポリペプチドについてのコーディング配列の全てまたは部分を免疫グロブリンコーディング配列に共有結合連結することによって修飾することもできる。
【００７６】
（５．１．５  キメラ抗体）
ここに、抗−ＣＤ１９抗体は、具体的には、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来する、または特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同であり、他方、該鎖の一部が、もう１つの種に由来する、またはもう１つの抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一であるか、または相同であるキメラ抗体（免疫グロブリン）、ならびに所望の生物学的活性を呈する限りはそのような抗体に断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））。ここに、注目するキメラ抗体は、非ヒト霊長類（例えば、ヒヒ、アカゲザルまたはマカクザルのような旧世界サル）に由来する可変ドメイン抗原−結合配列およびヒト定常領域は配列を含む「霊長類化」抗体を含む。（米国特許第５，６９３，７８０号）。
【００７７】
（５．１．６  ヒト化抗体）
ヒト化抗体は、限定されるものではないが、ＣＤＲ−グラフティング（例えば、その各々をここに引用してその全体を援用する、欧州特許  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．ＥＰ２３９，４００；国際公開  Ｎｏ．ＷＯ９１／０９９６７；および米国特許第５，２２５，５３９号、第５，５３０，１０１号、および第５、５８５、０８９号参照）、ベニアリングまたはリサーフィシング（例えば、その各々をここに引用してその全体を援用する、欧州特許  Ｎｏｓ．ＥＰ５９２，１０６およびＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｉａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４；およびＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３）、鎖シャフリング（例えば、ここに引用してその全体を援用する米国特許第５，５６５，３３２号を参照）、および、例えば、各々をここに引用して援用する、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４２６６４、米国特許出願公開ＵＳ２００５／００４８６１７、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開番号ＷＯ９３１７１０５、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９−２５（２００２），Ｃａｌｄａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３−６０（２０００），Ｍｏｒｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７−７９（２０００），Ｂａｃａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８−８４（１９９７），Ｒｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９（１０）：８９５−９０４（１９９６）、Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（２３Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ−５９７７ｓ（１９９５），Ｃｏｕｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５（８）：１７１７−２２（１９９５），Ｓａｎｄｈｕ  ＪＳ，Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９−１０（１９９４），ａｎｄ  Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５（３）：９５９−７３（１９９４）に開示された技術を含めた当該分野で公知の種々の技術を用いて生産することができる。しばしば、フレームワーク領域におけるフレームワーク残基はＣＤＲドナー抗体からの対応する残基で置換して、抗原結合を改変し、好ましくは改良する。これらのフレームワーク置換は、例えば、ＣＤＲおよびフレームワーク残基の相互作用のモデリングによって当該分野で良く知られた方法によって同定して、抗原結合および配列比較で重要なフレームワーク残基を同定して、特定の位置における通常でないフレームワーク残基を同定する（例えば、ここに引用してその全体を援用する、Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号、およびＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３参照）。
【００７８】
ヒト化抗−ＣＤ１９抗体は、非ヒトである源からそれに導入された１以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には、「インポート」可変ドメインから取られた「インポート」残基といわれる。かくして、ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリン分子からの１以上のＣＤＲおよびヒトからのフレームワークを含む。抗体のヒト化は当該分野で良く知られており、実質的には、ヒト抗体の対応する配列の代わりにげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列で置き換えることによって、すなわち、ＣＤＲ−グラフティングによって（その内容をここに引用してその全体を援用する、（ＥＰ２３９，４００；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９１／０９９６７；および米国特許第４，８１６，５６７号；第６，３３１，４１５号：第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；６，５４８，６４０号）、Ｗｉｎｔｅｒおよび共同研究者の方法（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３９：１５３４−１５３６（１９８８））に従って行うことができる。そのようなヒト化キメラ抗体は、実質的に無傷未満のヒト可変ドメインが非ヒト種からの対応する配列によって置き換えられている。現実的には、ヒト化抗体は、典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくはいくつかのＦＲ残基がげっ歯類抗体における同様な部位からの残基によって置きかえられたヒト抗体である。抗−ＣＤ１９抗体のヒト化は、ベニアリングまたはリサーフィシング（ＥＰ５９２，１０６；ＥＰ５１９，５９６；Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９−４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５−８１４（１９９４）；およびＲｏｇｕｓｋａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１：９６９−９７３（１９９４））、または鎖シャッフリング（その内容を、ここに引用してその全体を援用する、（米国特許第５，５６５，３３２号）によって達成することもできる。
【００７９】
ヒト化抗体を作製するのに用いるべき重鎖および軽鎖双方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させることである。いわいる「ベスト−フィット」方法に従って、げっ歯類抗体の可変ドメイン配列は、公知のヒト可変−ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングされる。次いで、げっ歯類のそれに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のためのヒトフレームワーク（ＦＲ）として許容する（その内容をここに引用してその全体を援用する（Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。もう１つの方法は、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同一フレームワークをいくつかの異なるヒト化抗−ＣＤ１９抗体で用いることができる（その内容をここに引用してその全体を援用する、（Ｃａｒｔｅｒ  ｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３））。
【００８０】
抗−ＣＤ１９抗体は、ＣＤ１９に対する高い親和性の保持、または他の好都合な生物学的特性を持つものとしてヒト化することができる。本発明の１つの態様によると、ヒト化抗体は、親およびヒト化配列の３次元モデルを用いる親配列および種々の概念的ヒト化産物の分析のプロセスによって調製される。三次元免疫グロブリンモデルは共通に利用可能であり、当業者に精通している。選択された候補免疫グロブリン配列の可能な三次元立体配座構造を説明し、表示するコンピュータプログラムが入手可能である。これらのディスプレイの精査は、候補免疫グロブリン配列の機能化における残基のありそうな役割の分析、すなわち、ＣＤ１９に結合する候補免疫グロブリンの能力に影響する残基の分析を可能とする。このように、ＣＤ１９に対する増大した親和性のような所望の抗体特徴が達成されるように、ＦＲ残基を受容体および輸入配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に直接的かつ最も実質的に関与する。
【００８１】
「ヒト化」抗体は、本発明における元の抗体として同様な抗原性特異性、ヒトＣＤ１９抗原に結合する能力を保有する。しかしながら、ヒト化のある方法を用い、ヒトＣＤ１９抗原に対する抗体の結合の親和性および／または特異性は、その内容をここに引用してその全体を援用するＷｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９４：１５１（１９９９）によって記載されているように、「向けられた進化」の方法を用いて増加させることができる。
【００８２】
（５．１．７  ヒト抗体）
ヒトにおける抗体のインビボ使用については、ヒト抗体を用いるのは好ましいであろう。完全にヒトの抗体は、ヒト対象の治療的処置で特に望ましい。ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列に由来する抗体ライブラリーを用いる前記したファージディスプレイ（これらの技術の改良を含む）を含めた、当該分野で公知の種々の方法によって作製することができる。また、その各々をここに引用してその全体を引用する、米国特許第４，４４４，８８７号および第４，７１６，１１１号；およびＰＣＴ  公開  ＷＯ９８／４６６４５、ＷＯ９８／５０４３３、ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９８／１６６５４、ＷＯ９６／３４０９６、ＷＯ９６／３３７３５、およびＷＯ９１／１０７４１参照。ヒト抗体は、重鎖および軽鎖がヒトＤＮＡの１以上の源に由来するヌクレオチド配列によってコードされる抗体でもあり得る。
【００８３】
また、ヒト抗−ＣＤ１９抗体は、機能的内因性免疫グロブリンを発現することができないが、ヒト免疫グロブリン遺伝子を発現することができるトランスジェニックマウスを用いて生産することもできる。例えば、ヒト重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子複合体はランダムに、あるいは相同組換えによってマウス胚性幹細胞に導入することができる。別法として、ヒト可変領域、定常領域、および多様性領域は、ヒト重鎖および軽鎖遺伝子に加えて、マウス胚性幹細胞に導入することができる。マウス重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子は、別々に、あるいは相同組換えによりヒト免疫グロブリン遺伝子座の導入と同時に、非機能的とすることができる。例えば、キメラおよび生殖系突然変異体マウスにおける抗体重鎖接合領域（ＪＨ）遺伝子のヘテロ接合性欠失の結果、内因性抗体生産の完全な阻害がもたらされる。修飾された胚性幹細胞を拡大培養し、胚盤胞にマイクロインジェクションして、キメラマウスを得る。次いで、キメラマウスを育種して、ホモ接合性子孫が得られ、これはヒト抗体を発現する。トランスジェニックマウスを選択された抗原、例えば、本発明のポリペプチドの全部または一部で通常に免疫化する。ヒトＣＤ１９抗原に対して向けられた抗−ＣＤ１９抗体は、慣用的なハイブリドーマ技術を用いて、免疫化されたトランスジェニックマウスから得ることができる。トランスジェニックマウスによって保有されるヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化の間に再配置され、引き続いて、クラススイッチングおよび体細胞突然変異を受ける。かくして、そのような技術を用い、限定されるものではないが、ＩｇＧ１（ガンマ１）およびＩｇＧ３を含めた治療的に有用なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥ抗体を生産するのが可能である。ヒト抗体を生産するためのこの技術の外観については、ＬｏｎｂｅｒｇおよびＨｕｓｚａｒ（Ｉｎｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３：６５−９３（１９９５））参照。ヒト抗体およびヒトモノクローナル抗体を生産するためのこの技術、およびそのような抗体を生産するためのプロトコルの詳細な議論については、例えば、その各々をここに引用してその全体を援用する、ＰＣＴ  公開番号ＷＯ９８／２４８９３、ＷＯ９６／３４０９６、およびＷＯ９６／３３７３５；および米国特許第５，４１３，９２３号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，５６９，８２５号；第５，６６１，０１６号；第５，５４５，８０６号；第５，８１４，３１８号；および第５，９３９，５９８号参照。加えて、Ａｂｇｅｎｉｘ，Ｉｎｃ．（Ｆｒｅｅｍｏｎｔ，ＣＡ）およびＧｅｎｐｈａｒｍ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）のような会社は、前記したのと同様な技術を用いて選択された抗原に対して向けられたヒト抗体を提供するのに従事することができる。抗原挑戦に際してヒト抗体の生産をもたらす生殖系突然変異体マウスにおけるヒト生殖系免疫グロブリン遺伝子アレイの導入の特別な議論については、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ  ���ｔ  ａｌ．，Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，７；３３（１９９３）；ａｎｄ  Ｄｕｃｈｏｓａｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５５：２５８（１９９２）参照。
【００８４】
ヒト抗体はファージ−ディスプレイライブラリーに由来することもできる（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）；Ｖａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９（１９９６））。ファージディスプレイ技術（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５３（１９９０））を用いて、免疫化されていないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロにてヒト抗体および抗体断片を生産することができる。この技術に従って、抗体Ｖドメイン遺伝子を、Ｍ１３またはｆｄのようなフィラメント状バクテリオファージの主たるまたは従たるコート蛋白質遺伝子いずれかにイン−フレームクローン化し、ファージ粒子の表面の機能的抗体断片として提示する。フィラメント状粒子はファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含有するため、抗体の機能的特性に基づいた選択の結果、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択ももたらされる。かくして、ファージはＢ細胞の特性のいくらかを模倣する。ファージディスプレイは種々の様式で行うことができ；それらのレビューについては、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ．ａｎｄ  Ｃｈｉｓｗｅｌｌ，Ｄａｖｉｄ  Ｊ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４−５７１（１９９３）参照。Ｖ−遺伝子セグメントのいくつかの源をファージディスプレイで用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫化されていないマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小さなランダムコンビナトーリアルライブラリーからの抗−オキサゾロン抗体の多用なアレイを単離した。免疫化されていないヒトドナーからのＶ遺伝子のレパートリーを構築し、（自己−抗原を含めた）抗原の多用なアレイに対する抗体は、Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１），またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２：７２５−７３４（１９９３）によって記載された技術に実質的に従って単離することができる。また、その各々をここに引用してその全体を援用する米国特許第５，５６５，３３２号および第５，５７３，９０５号参照。
【００８５】
ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞によって生じさせることもできる（その各々を、ここに引用してその全体を援用する、米国特許第５，５６７，６１０号および第５，２２９，２７５号参照）。また、ヒト抗体は、限定されるものではないが、Ｒｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１２１：１４０−１６７（１９８６））によって記載されたもののようなハイブリドーマ技術を用いてインビトロで生じさせることもできる。
【００８６】
（５．１．８  改変された／突然変異体抗体）
本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体は突然変異体抗体であり得る。本明細書中で用いるように、「抗体突然変異体」または「改変された抗体」とは、抗−ＣＤ１９抗体のアミノ酸残基の１以上が修飾されている抗−ＣＤ１９抗体のアミノ酸配列変種をいう。抗−ＣＤ１９抗体のアミノ酸配列に対する修飾は、その抗原に対する抗体の親和性または活動性を改良するための配列に対する修飾、および／またはエフェクター機能を改良するためのＦｃ部分に対する修飾を含む。修飾は、いずれかの公知の抗−ＣＤ１９抗体、または本明細書中に記載されたように同定された抗−ＣＤ１９抗体に対してなすことができる。そのように改変された抗体は、必然的に、公知の抗−ＣＤ１９抗体に対して１００％未満の配列同一性または同様性を有する。好ましい実施形態において、改変された抗体は、抗−ＣＤ１９抗体の重鎖または軽鎖いずれかの可変ドメインのアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、または７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または同様性を有するアミノ酸配列を有するであろう。好ましい実施形態において、改変された抗体は、抗−ＣＤ１９抗体の重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、または７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または同様性を有するアミノ酸配列を有するであろう。好ましい実施形態において、改変された抗体はヒトＣＤ１９の結合能力を維持するであろう。ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、ＨＢ１２ａの重鎖に対応する配列番号：２（図５Ａ）のアミノ酸配列に対して約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一である重鎖を含む。ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、ＨＢ１２ｂの重鎖に対応する配列番号：４（図５Ｂ）のアミノ酸配列に対して約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一である重鎖を含む。ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、ＨＢ１２ａの軽鎖に対応する配列番号：１６（図６Ａ）のアミノ酸配列に対して約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一である軽鎖を含む。ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、ＨＢ１２ｂの軽鎖に対応する配列番号：１８（図６Ｂ）のアミノ酸配列に対して約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上同一である軽鎖を含む。好ましい実施形態において、改変された抗体は、抗−ＣＤ１９の軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３のアミノ酸配列に対して少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％、６５％、または７５％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、最も好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸配列同一性または同様性を有するアミノ酸配列を有するであろう。ＨＢ１２ａおよびＨＢ１２ｂ抗−ＣＤ１９抗体を生産するハイブリドーマは、ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−６５８０およびＰＴＡ−６５８１下で寄託されている。
【００８７】
この配列に関する同一性または同様性は、本明細書中においては、配列を成立させ、ギャップを導入して、必要であれば、最大パーセント配列同一性を達成した後に、抗−ＣＤ１９抗体残基に対して同一（すなわち、同一残基）または同様（すなわち、共通の側鎖特性に基づいて同一の基からのアミノ酸残基、後記参照）である候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。可変ドメインの外側の抗体配列へのＮ−末端、Ｃ−末端、または内部延長、欠失または挿入のいずれも、配列同時性または同様性に影響すると解釈されるべきではない。
【００８８】
当該分野で知られている「％同一性」は、それらの配列を比較することによって決定されるように、２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチドの間の関係の尺度である。一般に、比較すべき２つの配列を成立させて、配列の間の最大相関を与える。２つの配列の成立を調べ、決定された２つの配列の間の正確なアミノ酸またはヌクレオチド対応性を与える位置の数を、整列の合計長さで割り、１００を掛けて、％同一性の数字を得る。この％同一性の数字は、同一または非常に似た長さの配列に特に適切であって、高度に相同である、比較すべき配列の全長にわたって、または同等でない長さの配列により適切であって、またはより低いレベルの相同性を有する、より短い規定された長さにわたって決定することができる。
【００８９】
例えば、配列は、「．ａｌｎ」の延長を持つファイルを生じさせるＵｎｉｘ（登録商標）下のソフトウェアｃｌｕｓｔａｌＷと整列させることができ、次いで、このファイルを、該．ａｌｎファイルを開くＢｉｏｅｄｉｔプログラム（Ｈａｌｌ，Ｔ．Ａ．１９９９，ＢｉｏＥｄｉｔ：ａ  ｕｓｅｒ−ｆｒｉｅｎｄｌｙ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｅｄｉｔｏｒ  ａｎｄ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）９５／９８／ＮＴ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．４１：９５−９８）に輸入することができる。Ｂｉｏｅｄｉｔウインドウにおいて、個々の配列を（一度に２つ）選択し、それらを整列させることができる。この方法は、全配列の比較を可能とする。
【００９０】
２以上の配列で同一性を比較するための方法は当該分野において良く知られている。かくして、例えば、プログラムはＷｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，  ｖｅｒｓｉｏｎ  ９．１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡから入手可能なＤｅｖｅｒｅｕｘ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：３８７−３９５，１９８４）から入手可能である。２つの配列の間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴニズムを用いて達成することができる。例えば、プログラムＢＥＳＴＦＩＴおよびＧＡＰを用いて、２つのポリヌクレオチドの間の％同一性、および２つのポリペプチド配列の間の％同一性を決定することができる。ＢＥＳＴＦＩＴは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ，２：４８２−４８９，１９８１）の「局所的相同性」アルゴリズムを用い、２つの配列の間の同様性の最良単一領域を見出す。ＢＥＳＴＦＩＴは、長さが同様でない２つのポリヌクレオチドまたは２つのポリペプチド配列を比較するのにより適しており、プログラムはより短い配列がより長い配列の部分を表すことを仮定する。比較において、ＧＡＰは、Ｎｅｄｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−３５４，１９７０）のアルゴリズムに従って、「最大同様性」を見出す２つの配列を整列させる。ＧＡＰは、ほぼ同一長さである配列を比較するのにより適しており、整列は全長さにわたって予測される。好ましくは、各プログラムで用いるパラメーター「ギャップ重み」および「長さ重み」は、各々、ポリヌクレオチドについては５０および３およびポリペプチドについては１２および４である。好ましくは、％同一性および同様性は、比較されている２つの配列が最適に整列する場合に決定される。
【００９１】
配列の間の同一性および／または同様性を決定するための他のプログラムも当該分野で知られている。例えば、プログラムのＢＬＡＳＴファミリー（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢ），Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，ＵＳＡから入手可能であって、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖにおけるＮＣＢＩのホームページを通じて接近可能な、Ｋａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：５８７３−５８７７において修飾されたＫａｒｌｉｎ  ＆  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：２２６４−２２６８）。これらのプログラムは、２つの配列の比較で利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的例を例示する。そのようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３−４１０のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラムに取り込まれる。ＢＬＡＳＴヌクレオチドサーチを、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、語長＝１２で行って、本発明の抗−ＣＤ１９抗体の全てまたは部分をコードする核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴ蛋白質サーチをＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で行って、本発明の蛋白質分子に相同なアミノ酸配列を得る。比較目的のためのギャップを入れた整列を得るためには、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２に記載されたように利用することができる。別法として、ＰＳＩ−Ｂｌａｓｔを用いて、分子（Ｉｄ．）の間の遠い関係を検出する反復サーチを行うことができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ、およびＰＳＩ−Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ参照。配列の比較で利用される数学的アルゴリズムのもう１つの好ましい非限定的例は、Ｍｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列整列ソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に取り込まれる。アミノ酸配列を比較するためのＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、１２のギャップ長さペナルティ、および４のギャップペナルティを用いることができる。
【００９２】
当該分野で公知の配列の間の同一性および／または同様性を決定するためのプログラムのもう１つの非限定的例は、ＦＡＳＴＡ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅの一部として利用可能な、Ｐｅａｒｓｏｎ  Ｗ．Ｒ．ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ  Ｄ．Ｊ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８５：２４４４−２４４８，１９８８）である。好ましくは、ＢＬＯＳＵＭ６２アミノ酸置換マトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｓ．ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  Ｊ．Ｇ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）を、ヌクレオチド配列が比較の前にまずアミノ酸配列に翻訳される場合を含めたポリペプチド配列比較で用いる。
【００９３】
アミノ酸配列の間の同一性および／または同様性を決定するための当該分野で知られたプログラムのなおもう１つの非限定的例は、プログラムのデフォルトアルゴリズムおよびパラメーター設定：ｂｌｏｓｕｍ６２、ギャップ重み８、長さ重み２で利用されるＳｅｑＷｅｂソフトウェア（ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅに対するウェブ−ベースのインターフェース：Ｇａｐプログラム）である。
【００９４】
２つの配列の間のパーセント同一性は、ギャップを許容し、または許容することなく、前記したものと同様な技術を用いて決定することができる。パーセント同一性を計算するにおいて、典型的には、正確なマッチをカウントする。
【００９５】
好ましくは、プログラムＢＥＳＴＦＩＴを用いて、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関してクエリーポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の％同一性を決定し、クエリーおよび参照配列は、最適に整列させ、プログラムのパラメーターはデフォルト値にて設定する。
【００９６】
改変された抗体を生じさせるためには、１以上のアミノ酸改変（例えば、置換）を、種−依存性抗体の超可変領域の１以上に導入する。別法として、あるいは加えて、フレームワーク領域残基の１以上の改変（例えば、置換）を抗−ＣＤ１９抗体に導入することができ、ここに、これらの結果、第二の哺乳動物種からの抗原に対する抗体突然変異体の結合親和性の改良がもたらされる。修飾するためのフレームワーク領域残基の例は、抗原に直接的に非共有結合する（Ａｍｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２３３：７４７−７５３（１９８６））；ＣＤＲの立体配座と相互作用し、／それに影響する（Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１−９１７（１９８７））；および／またはＶＬ−ＶＨ界面において参画するものを含む（ＥＰ２３９  ４００Ｂ１）。ある実施形態においては、そのようなフレームワーク領域残基の１以上の修飾の結果、第二の哺乳動物種からの抗原に対する抗体の結合親和性の増強がもたらされる。例えば、約１ないし約５のフレームワーク残基を、本発明のこの実施形態において改変することができる。時々、これは、超可変領域残基のいずれも改変されていない場合でさえ、プレ臨床試験で用いるのに適した抗体突然変異体を得るのに十分であろう。しかしながら、通常、改変された抗体はさらなる超可変領域改変を含むであろう。
【００９７】
改変される超可変領域残基は、特に、第二の哺乳動物種からの抗原に対する抗−ＣＤ１９抗体の出発結合親和性が、そのようなランダムに生じた改変された抗体を容易にスクリーニングすることができるようなものである場合に、ランダムに変化させることができる。
【００９８】
そのような改変された抗体を生じさせるための１つの有用な手法は、「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。ここに、超可変領域残基の１以上を、アラニンまたはポリアラニン残基によって置き換えて、第二の哺乳動物種からの抗原とアミノ酸との相互作用を行う。次いで、置換に対する機能的感受性を示すそれらの超可変領域残基を、置換の部位において、または該部位のためにさらなるまたは他の突然変異を導入することによって精錬する。かくして、アミノ酸配列を導入するための部位を予め決定しつつ、突然変異の性質はそれ自体予め決定される必要がない。このようにして生じるＡｌａ−突然変異体を、本明細書中に記載するようにその生物学的活性についてスクリーニングする。
【００９９】
そのような改変された抗体を生じさせるためのもう１つの手法は、ファージディスプレイを用いる親和性成熟を含む（Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５４：８８９−８９６（１９９２）ａｎｄ  Ｌｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３０（４５）：１０８３２−１０８３７（１９９１））。簡単に述べれば、数個の超可変領域部位（例えば、６ないし７の部位）を、各部位において全ての可能なアミノ酸置換を生じさせるように突然変異させる。かく生じた抗体突然変異体を、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物に対する融合としてフィラメント状ファージ粒子から一価様式で提示する。次いで、ファージ−提示突然変異体を、ここに開示したようにそれらの生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０１００】
抗体配列における突然変異は、置換、内部欠失を含めた欠失、融合蛋白質、またはアミノ酸配列内のおよび／またはそれに隣接するアミノ酸残基の保存的置換を生じさせる付加を含めた付加を含むことができるが、その結果、該変化が機能的に同等な抗−ＣＤ１９抗体を生じさせる点において「サイレント」な変化をもたらす。保存的アミノ酸置換は、関連残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性、および／または両親媒性における同様性に基づいてなすことができる。例えば、非−極性（疎水性）アミノ酸はアラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンを含み；極性中性アミノ酸はグリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アルパラギンおよびグルタミンを含み；正に荷電した（塩基性）アミノ酸はアルギニン、リジン、およびヒスチジンを含み；および負に荷電した（酸性）アミノ酸はアスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。加えて、グリシンおよびプロリンは、鎖の向きに影響し得る残基である。非保存的置換は、もう１つのクラスに代えてこれらのクラスの１つのメンバーで交換することを含むであろう。さらに、所望であれば、非古典的アミノ酸または化学的アミノ酸アナログを置換または付加として抗体の配列に導入することができる。非古典的アミノ酸は限定されるものではないが、一般に、通常のアミノ酸のＤ−異性体、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコシン、シトルリン、システイン酸、ｔ−ブチルグリシン、ｔ−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロ−アミノ酸、β−メチルアミノ酸のようなデザイナーアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、およびアミノ酸アナログを含む。
【０１０１】
もう１つの実施形態において、修飾のために選択される部位はファージディスプレイを用いて親和性突然変異させる（前記参照）。
【０１０２】
当該分野で知られた突然変異誘発のためのいずれの技術を用いて、抗体配列においてアミノ酸置換をなす目的で、あるいは制限部位を作り出し／欠失させて、さらなる操作を容易とするために、ＤＮＡ配列中の個々のヌクレオチドを修飾することもできる。そのような技術は、限定されるものではないが、化学的突然変異誘発、インビトロ部位−特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８（１９８５）；Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５３：６５５１（１９７８））、オリゴヌクレオチド−指向性突然変異誘発（Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：４２３−４６３（１９８５）；Ｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５５：５５８−５６８（１９８７））、ＰＣＲ−ベースの重複延長（Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，７７：５１−５９（１９８９））、ＰＣＲ−ベースのメガプライマー突然変異誘発（Ｓａｒｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，８：４０４−４０７（１９９０））等を含む。修飾は、二本鎖ジデオキシＤＮＡ配列決定によって確認することができる。
【０１０３】
本発明のある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体を修飾して、融合蛋白質：すなわち、異種蛋白質、ポリペプチドまたはペプチドに融合した抗体、または断片を生じさせることができる。ある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体の一部に融合した蛋白質は、ＡＤＥＰＴの酵素成分である。抗−ＣＤ１９抗体との融合蛋白質として作製することができる他の蛋白質またはポリペプチドの例は、限定されるものではないが、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗−ウイルス蛋白質、ゲロニン、ジフレリアトキシン、Ｐｓｅｕｂｏｍｏｎａｓエキソトキシン、およびＰｓｅｕｂｏｍｏｎａｓエンドトキシンのようなトキシンを含む。例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４７：６４１（１９８６），ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，４４：４３（１９９４）参照。用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非−結合性活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｃｓ  ｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンチン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ，ＰＡＰＩＩ，およびＰＡＰ−Ｓ）ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ  ９３／２１２３２参照。
【０１０４】
さらなる融合蛋白質は、遺伝子−シャッフリング、モチーフ−シャッフリング、エキソン−シャッフリングおよび／またはコロン−シャッフリング（集合的に「ＤＮＡシャッフリング」という）の技術を介して生じさせることができる。ＤＮＡシャッフリングを使用して、抗体またはその断片の活性を改変するのに使用することができる（例えば、より高い親和性およびより低い解離速度を持つ抗体またはその断片）。一般に、米国特許第５，６０５，７９３号；第５，８１１，２３８号；第５，８３０，７２１号；第５，８３４，２５２号；および第５，８３７，４５８号、およびＰａｔｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，８：７２４−３３；Ｈａｒａｙａｍａ，１９９８，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１６（２）：７６−８２；Ｈａｎｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２８７：２６５−７６；ａｎｄ  Ｌｏｒｅｎｚｏ  ａｎｄ  Ｂｌａｓｃｏ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，２４（２）：３０８−３１３（これらの特許および刊行物の各々をここに引用してその全体を援用する）参照。抗体は、さらに、ここに引用してその全体を援用する、全てＬｅｄｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，に対する米国公開２００３０１１８５９２、米国公開２００３３０１３３９３９、およびＰＣＴ公開ＷＯ  ０２／０５６９１０に記載された結合−ドメイン免疫グロブリン融合蛋白質であり得る。
【０１０５】
本発明のある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体を修飾して、その等電点（ｐＩ）を変化させることができる。全てのポリペプチドのような抗体は、ポリペプチドが正味の電荷を運ばないｐＨと一般的には定義されるｐＩを有する。当該分野においては、蛋白質の溶解性は、溶液のｐＨが蛋白質の等電点（ｐＩ）と等しい場合に典型的には最も低いことが知られている。本明細書中で用いるように、ｐＩ値は支配的な電荷形態のｐＩと定義される。蛋白質のｐＩは、限定されるものではないが、等電点電気泳動および種々のコンピュータアルゴリズムを含めた種々の方法によって決定することができる（例えば、Ｂｊｅｌｌｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１４：１０２３参照）。抗体のＦａｂドメインの熱的融解温度（Ｔｍ）は、抗体の熱的安定性の良好なインジケータとなることができ、さらに、シェルフライフの指標を提供することができる。より低いＴｍは、より多い凝集−より低い安定性を示し、他方、より高いＴｍはより低い凝集−より高い安定性を示す。かくして、ある実施形態において、より高いＴｍを有する抗体が好ましい。蛋白質ドメイン（例えば、Ｆａｂドメイン）のＴｍは、例えば、示差走査熱量測定によって、当該分野で知られたいずれかの標準的な方法を用いて測定することができる（例えば、Ｖｅｒｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７８：３９４−４０４；Ｖｅｒｍｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｊ．７９：２１５０−２１５４参照）。
【０１０６】
従って、本発明のさらなる非限定的実施形態は、特定の等電点（ｐＩ）または融解温度（Ｔｍ）のようなある好ましい生化学的特徴を有する本発明の修飾された抗体を含む。
【０１０７】
より具体的には、１つの実施形態において、本発明の修飾された抗体は５．５ないし９．５の範囲のｐＩを有する。なおもう１つの特定の実施形態においては本発明の修飾された抗体は約５．５ないし約６．０、または約６．０ないし約６．５、または約６．５ないし約７．０、約７．０ないし約７．５、または約７．５ないし約８．０、約８．０ないし約８．５、または約８．５ないし約９．０、または約９．０ないし約９．５の範囲のｐＩを有する。他の特定の実施形態において、本発明の修飾された抗体は、５．５ないし６．０、または６．０ないし６．５、または６．５ないし７．０、または７．０ないし７．５、または７．５ないし８．０、または８．０ないし８．５、または８．５ないし９．０、または９．０ないし９．５の範囲のｐＩを有する。なおより具体的には、本発明の修飾された抗体は、少なくとも５．５、または少なくとも６．０、または少なくとも６．３、または少なくとも６．５、または少なくとも６．７、または少なくとも６．９、または少なくとも７．１、または少なくとも７．３、または少なくとも７．５、または少なくとも７．７、または少なくとも７．９、または少なくとも８．１、または少なくとも８．３、または少なくとも８．５、または少なくとも８．７、または少なくとも８．９、または少なくとも９．１、または少なくとも９．３、または少なくとも９．５のｐＨを有する。他の特定の実施形態において、本発明の修飾された抗体は、少なくとも約５．５、または少なくとも約６．０、または少なくとも約６．３、または少なくとも約６．５、または少なくとも約６．７、または少なくとも、約６．９、または少なくとも約７．１、または少なくとも約７．３、または少なくとも約７．５、または少なくとも約７．７、または少なくとも約７．９、または少なくとも約８．１、または少なくとも約８．３、または少なくとも約８．５、または少なくとも約８．７、または少なくとも約８．９、または少なくとも約９．１、または少なくとも約９．３、または少なくとも約９．５のｐＩを有する。
【０１０８】
抗体中のイオン化可能残基の数および位置を変化させることによって、溶解性を最適化することが可能である。例えば、ポリペプチドのｐＩは、（例えば、アラニンのような非荷電残基に代えてリジンのような荷電したアミノ酸で置き換えることによって）適当なアミノ酸置換をなすことによって操作することができる。いずれかの特定の理論に拘束されるつもりはないが、抗体のｐＩの変化をもたらす該抗体のアミノ酸置換は、抗体の溶解性および／または安定性を改良することができる。当業者であれば、いずれのアミノ酸置換が、所望のｐＩを達成するのに特定の抗体で最も適切であるかを理解するであろう。１つの実施形態において、置換を本発明の抗体において生じさせて、ｐＩを変化させる。（前記した）ＦｃγＲへの改変された結合をもたらすＦｃ領域の置換もまた、ｐＩの変化をもたらすことができると具体的に考えられる。もう１つの実施形態において、Ｆｃ領域の置換を具体的に選択して、ＦｃγＲ結合における所望の変化およびｐＩのいずれかの所望の変化双方を行う。
【０１０９】
１つの実施形態において本発明の修飾された抗体は、６５℃ないし１２０℃の範囲のＴｍを有する。特定の実施形態において、本発明修飾された抗体は、約７５℃ないし約１２０℃、約７５℃ないし約８５℃、または約８５℃ないし約９５℃、または約９５℃ないし約１０５℃、または約１０５℃ないし約１１５℃、または約１１５℃ないし約１２０℃の範囲のＴｍを有する。他の特定の実施形態において、本発明の修飾された実施形態は７５℃ないし１２０℃、または７５℃ないし８５℃、または８５℃ないし９５℃、または９５℃ないし１０５℃、または１０５℃ないし１１５℃、または１１５℃ないし１２０℃の範囲のＴｍを有する。なお他の特定の実施形態において、本発明の修飾された抗体は少なくとも約６５℃、または少なくとも約７０℃、または少なくとも約７５℃、または少なくとも約８０℃、または少なくとも８５℃、または少なくとも約９０℃、または少なくとも約９５℃、または少なくとも約１００℃、または少なくとも約１０５℃、または少なくとも約１０５℃、または少なくとも約１０５℃、または約１２０℃のＴｍを有する。なお他の特定の実施形態において、本発明の修飾された抗体は、少なくとも６５℃、または少なくとも７０℃、または少なくとも７５℃、または少なくとも８０℃、または少なくとも８５℃、または少なくとも９０℃、または少なくとも９５℃、または少なくとも１００℃、または少なくとも１０５℃、または少なくとも１１０℃、または少なくとも１１５℃、または少なくとも１２０℃のＴｍを有する。
【０１１０】
（５．１．９  ドメイン抗体）
本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体は、ドメイン抗体、例えば、ヒト抗体の重鎖（ＶＨ）または軽鎖（ＶＬ）の可変領域に対応する抗体の小さな機能的結合ユニットを含有する抗体であり得る。ドメイン抗体の例は、限定されるものではないが、治療標的に対して特異的なＤｏｍａｎｔｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）およびＤｏｍａｎｔｉｓ  Ｉｎｃ．（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）から入手可能なものを含む（例えば、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９；米国特許第６，２９１，１５８号；第６，５８２，９１５号；第６，６９６，２４５号；および６，５９３，０８１号）参照。ドメイン抗体の商業的に入手可能なライブラリーを用いて、抗−ＣＤ１９ドメイン抗体を同定することができる。ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、ＣＤ１９機能的結合ユニットおよびＦｃγ受容体機能的結合ユニットを含む。
【０１１１】
（５．１．１０  ダイアボディ）
用語「ダイアボディ」とは２つの抗原−結合部位を持つ小さな抗体断片をいい、その断片は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ）中の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に連結された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。余りにも短くて、同一鎖状の２つのドメインの間の対合を可能としないリンカーを用いることによって、ドメインはもう１つの鎖の相補的ドメインと強制的に対合し、２つの抗原−結合部位を作り出す。ダイアボディは、例えば、ＥＰ  ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１；およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）により十分に記載されている。
【０１１２】
（５．１．１１  バクシボディ）
本発明のある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体はバクシボディである。バクシボディはダイマーポリペプチドである。バクシボディの各モノマーは、ヒンジ領域およびＣγ３ドメインを通じて第二のｓｃＦｖに連結されたａｐｃ上の表面分子に対する特異性を持つｓｃＦｖよりなる。本発明の他の実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体断片をｓｃＦｖの１つとして含有するバクシボディを用いて、破壊すべきＢ細胞およびＡＤＣＣを媒介するエフェクター細胞を隣接させることができる。例えば、Ｂｏｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許出願公開番号２００４０２５３２３８参照。
【０１１３】
（５．１．１２  線状抗体）
本発明のある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体は線状抗体である。線状抗体は、抗原−結合領域の対を形成するタンデムＦｄセグメント（ＶＨ−ＣＨＩ−ＶＨ−ＣＨＩ）の対を含む。線状抗体は、二特異的または一特異的であり得る。Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）参照。
【０１１４】
（５．１．１３  親抗体）
本発明のある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体は親抗体である（親抗体は、本発明に開示される改変された／突然変異体抗体と比較してその１以上の超可変領域中のまたはそれに隣接する１以上のアミノ酸残基において欠如する、またはそこで結合するアミノ酸配列を含む抗体である。かくして、親抗体は、本発明に開示された抗体突然変異体の対応する超可変領域よりも短い超可変領域を有する。親ポリペプチドは（天然に生じる対立遺伝子変種を含めた）天然配列、（すなわち、天然に生じる）抗体、または天然に生じる配列の（他の挿入、欠失および／または置換のような）予め存在するアミノ酸配列修飾を持つ抗体を含むことができる。好ましくは親抗体はヒト化抗体またはヒト抗体である。
【０１１５】
（５．１．１４  抗体断片）
「抗体断片」は、全長抗体の部分は、一般には、その抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子；および抗体断片から形成された多特異的抗体を含む。
【０１１６】
伝統的には、これらの断片は無傷抗体の蛋白質分解消化を介して誘導された（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２４：１０７−１１７（１９９２）ａｎｄ  Ｂｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）参照）。しかしながら、これらの断片は組換え宿主細胞によって今日は直接的に生産することができる。例えば、抗体断片は前記した抗体ファージライブラリーから単離することができる。別法として、Ｆａｂ’−ＳＨ断片はＥ．ｃｏｌｉから直接的に回収し、化学的にカップリングさせて、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２））。もう１つのアプローチによるとＦ（ａｂ’）２断片は組換え宿主細胞培養から直接単離することができる。抗体断片の生産のための他の技術は技量のある実施者に明らかであろう。他の実施形態において選択される抗体は単一−抗体はＦｖ断片（ｓｃＦｖ）である。例えば、ＷＯ  ９３／１６１８５参照。ある実施形態において、抗体はＦａｂ断片ではない。
【０１１７】
（５．１．１５  二特異的抗体）
二特異的抗体は少なくとも２つの異なるエピトープに対する結合特異性を有する抗体である。例示的な二特異的抗体は、Ｂ細胞表面マーカーの２つの異なるエピトープに結合することができる。他のそのような抗体は第一のＢ細胞マーカーに結合することができ、さらに、第二のＢ細胞表面マーカーに結合することができる。別法として、抗−Ｂ細胞マーカー結合アームを、Ｔ細胞受容体分子（例えば、ＣＤ２またはＣＤ３）、またはＩｇＧに対するＦｃ受容体（ＦｃγＲ）のような白血球上のトリガリング分子に結合するアームと組み合わせて、Ｂ細胞に対する細胞防御メカニズムに焦点を合わせることができる。二特異的抗体を用いて、細胞傷害性剤をＢ細胞に局所化することができる。これらの抗体はＢ細胞マーカー結合マーカーおよび細胞傷害性剤（例えば、サポリン、抗−インターフェロンα、ビンカアルカロイド、リシンＡ鎖、メトラ−エキセートまたは放射性同位体ハプテン）に結合するアームを保有する。二特異的抗体は、全長抗体または抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）二特異的抗体）として調製することができる。
【０１１８】
二特異的抗体を作製するための方法は当該分野で知られている（例えば、Ｍｉｌｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３０５：５３７−５３９（１９８３）；Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１０；３６５５−３６５９（１９９１）；Ｓｕｒｅｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１２１：２１０（１９８６）；Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）；Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）；Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）；米国特許第４，４７４，８９３号；第４，７１４，６８１号；第４，９２５，６４８号；第５，５７３，９２０号；第５，６０１，８１号；９５，７３１，１６８号；４，６７６，９８０号；および第４，６７６，９８０号、ＷＯ  ９４／０４６９０；ＷＯ  ９１／００３６０；ＷＯ  ９２／２００３７３；ＷＯ  ９３／１７７１５；ＷＯ  ９２／０８８０２；およびＥＰ  ０３０８９）参照。
【０１１９】
本発明のある実施形態においては、該組成物および方法は、Ｄａｎｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９２：４７５０−４７５７（１９９８）によって記載された二特異的抗体のようなヒトＣＤ１９、およびＴ細胞受容体のＣＤ３イプシロン鎖に対する特異性を持つ二特異的マウス抗体を含まない。好ましい実施形態においては、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体が二特異的である場合、抗−ＣＤ１９抗体はヒトまたはヒト化されており、ヒトＣＤ１９、およびＴ細胞上のエピトープに対する特異性を有するか、あるいは例えば、単球／マクロファージおよび／またはナチュラルキラー細胞のようなヒトエフェクター細胞に結合して、細胞死滅を行うことができる。
【０１２０】
（５．１．１６  エフェクター機能の作製）
本発明の抗−ＣＤ１９抗体をエフェクター機能に関して修飾して、例えば、ＧＶＨＤまたは抗体を拒絶を治療するにおける有効性を増強させるのが望ましいであろう。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域における鎖間のジスルフィド結合形成を可能とすることができる。かく生じたホモダイマー抗体は、改良された内部化能力および／または増大した補体−媒介細胞殺傷および／または抗体−依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を有することができる。Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）ａｎｄ  Ｓｈｏｐｅｓ，Ｂ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２）参照。増強された活性を持つホモダイマーは、Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３）に記載されたヘテロ二機能性架橋剤を用いて調製することができる。別法として、デュアルＦｃ領域を有し、それにより、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力を有することができる抗体を作製することができる。Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，３：２１９−２３０（１９８９）参照。
【０１２１】
エフェクター機能を改変するような抗体のＦｃ領域の作製の他の方法は当該分野で知られている（例えば、ＦＣγＲＩＩＡに対する結合親和性と比較して、Ｆｃ領域を改変して、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性を増強させることを記載する、共にＫｏｅｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，に対する米国特許公開番号２００４０１８５０４５およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００４／０１６７５０参照；また、Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，に対するＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９９／５８５７２、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，対するＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９９／５１６４２、およびＤｅｏ  ｅｔ  ａｌ．；対する米国特許第６，３９５，２７２号参照；その開示をここに引用してその全体を援用する）。ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性を減少させるためにＦｃ領域を修飾する方法も当該分野で知られている（例えば、その開示をここに引用してその全体を援用する、共にＲａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，に対する米国特許公開番号２００１００３６４５９およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０１／７９２９９参照）。野生型Ｆｃ領域と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またはＦｃγＲＩＩＡに対する増強されて結合親和性を持つ変種Ｆｃ領域を有する修飾された抗体もまた記載されている（例えば、その開示をここに引用してその全体を援用する、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に対するＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００４／０６３３５１参照）。
【０１２２】
当該分野で知られたインビトロアッセイを用いても本発明の組成物および方法で用いる抗−ＣＤ１９抗体が、セクション５．３．２に記載されたもののように、ＡＤＣＣを媒介させることができるか否かを決定することができる。
【０１２３】
（５．１．１７  変種Ｆｃ領域）
本発明は、変種Ｆｃ領域を含む蛋白質の処方を提供する。すなわち、天然に生じるＦｃ領域、例えば、１以上の天然に生じないアミノ酸残基を含むＦｃ領域。また、本発明の変種Ｆｃ領域には、アミノ酸欠失、付加および／または修飾を含むＦｃ領域が含まれる。
【０１２４】
本明細書中で用いるように、Ｆｃ領域は、第一の定常領域免疫グロブリンドメインを排除する抗体の定常利用息を含むポリペプチドを含むと理解されるであろう。かくして、Ｆｃとは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメインおよびＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメインおよびそれらのドメインに対してＮ−末端側のフレキシブルなヒンジをいう。ＩｇＡおよびＩｇＭでは、ＦｃはＪ鎖を含むことができる。ＩｇＧでは、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣガンマ２およびＣガンマ３（Ｃγ２およびＣγ３）、およびＣガンマ１（Ｃγ１）およびＣガンマ２（Ｃγ２）の間のヒンジを含む。Ｆｃ領域の境界は変化し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常は、そのカルボキシル−末端に対して残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むと定義され、ここに、ナンバリングはＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  ９１−３２４２，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｆｉｅｌｄ，ＶＡ）におけるようなＥＵ指標に従う。「Ｋａｂａｔに記載されたＥＵ指標」とは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．ａｕｐｒａに記載されたヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基ナンバリングをいう。Ｆｃは単離におけるこの領域、あるいは抗体、抗体断片、またはＦｃ融合蛋白質の関係でのこの領域をいうことができる。Ｆｃ変種蛋白質は、Ｆｃ領域を含む抗体、Ｆｃ融合、またはいずれかの蛋白質もしくは蛋白質ドメインであり得る。特に好ましいのは、Ｆｃの天然に生じない変種の変種Ｆｃ領域を含む蛋白質である。注意：多形は、限定されるものではないが、Ｋａｂａｔ２７０、２７２、３１２、３１５、３５６、および３５８を含めた多数のＦｃ位置で観察されており、かくして、示された配列番号：および先行技術における配列の間のわずかな差が存在しえる。
【０１２５】
本発明は、匹敵する分子（例えば、野生型Ｆｃ領域を有することを除いて同一のアミノ酸配列を有する蛋白質）に対して、Ｆｃリガンドに対する改変された結合特性を有するＦｃ変種蛋白質（例えば、Ｆｃ受容体、Ｃ１ｑ）を含む。結合特性の例は、限定されるものではないが、結合特異性、平衡解離定数（ＫＤ）、解離および会合速度（各々、ＫｏｆｆおよびＫｏｎ）、結合親和性および／または結合力を含む。一般には、低いＫＤを持つ結合分子（例えば、抗体のようなＦｃ変種蛋白質）が、高いＫＤを持つ結合分子よりは好ましいことは理解される。しかしながら、いくつかの場合には、ＫｏｎまたはＫｏｆｆの値はＫＤの値よりも重要であろう。当業者であればいずれの動的パラメーターが所与の抗体適用で最も重要であるかを決定することができる。
【０１２６】
そのリガンドに対するＦｃドメインの親和性および結合特異性は、限定されるものではないが、平衡方法（例えば、抗素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ））、またはキネティックス（例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）分析）、ならびに間接的結合アッセイ、競合的阻害アッセイ、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）、ゲル電気詠動およびクロマトグラフィー（例えば、ゲル濾過）のような他の方法を含めた、Ｆｃ−ＦｃγＲ相互作用、すなわち、ＦｃγＲへのＦｃ領域の特異的結合についての当該分野で公知の種々のインビトロアッセイ方法（生化学的または免疫学的ベースのアッセイ）によって決定することができる。これらのおよび他の方法は、調べるべき成分の１以上上の標識を利用し、および／または限定されるものではないが、色原体、蛍光、ルミネセントまたは同位体標識を含めた種々の検出方法を使用することができる。結合親和性およびキネティックスの詳細な記載は、抗体−免疫原相互作用に焦点を当てる、Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｒａｖｅｎ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ（１９９９）で見出すことができる。
【０１２７】
例えば、負のレギュレーターＦｃγＲＩＩＢへのＦｃ結合を変化させないままにするか、または低下さえさせつつ、１以上の正のレギュレーター（例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ）へのＦｃ結合を増強させる修飾は、ＡＤＣＣ活性を増強させるのにより好ましいであろう。別法として、１以上の正のレギュレーターへの結合を低下させ、および／またはＦｃγＲＩＩＢへの結合を増強した修飾は、ＡＤＣＣ活性を低下させるのに好ましいであろう。従って、結合親和性の比率（例えば、平衡解離定数（ＫＤ））は、Ｆｃ変種のＡＤＣＣ活性が増強されたか、または低下されたかを示すことができる。例えば、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢの平衡解離定数（ＫＤ）の比率は、改良されたＡＤＣＣ活性に相関し、他方、該比率の増加はＡＤＣＣ活性の減少に相関する。加えて、Ｃｌｑへの結合を増大させた修飾は、ＣＤＣ活性を増強させるのに好ましく、他方、Ｃｌｑへの結合を低下させた修飾は、ＣＤＣ活性を低下させ、または排除するのに好ましいであろう。
【０１２８】
１つの実施形態において、本発明のＦｃ変種は、匹敵する分子に対する増大した親和性でもってＦｃγＲＩＩＩＡに結合する。もう１つの実施形態において、本発明のＦｃ変種は増大した親和性をもってＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、匹敵する分子に対して変化しない結合親和性をもってＦｃγＲＩＩＢに結合する。なおもう１つの実施形態において、本発明のＦｃ変種は増大した親和性でもってＦｃγＲＩＩＩＡに結合し、匹敵する分子に対して減少した親和性でもってＦｃγＲＩＩＢに結合する。なおもう１つの実施形態において、本発明の匹敵する分子に対して減少したＦｃ変種は、ＦｃγＲＩＩＩＡ／ＦｃγＲＩＩＢ平衡解離定数（ＫＤ）の比率を有する。
【０１２９】
１つの実施形態においてＦｃ変種蛋白質は、匹敵する分子に対して１以上のＦｃリガンドへの結合を増強させた。もう１つの実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、匹敵する分子のそれよりも少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも８０倍、または少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍大きいＦｃリガンドに対する親和性を有する。特定の実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、Ｆｃ受容体に対する増強された結合を有する。もう１つの特定の実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡに対する増強された結合を有する。なおもう１つの特定の実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質はＦｃ受容体ＦｃγＲｎに対する増強された結合を有する。なおもう１つの特定の実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は匹敵する分子に対してＣｌｑに対する増強された結合を有する。
【０１３０】
本発明の１つの実施形態において、抗体は、１０−５Ｍ未満、または１０−６Ｍ未満、または１０−７Ｍ未満、または１０−８Ｍ、１０−９Ｍ未満、または１０−１０Ｍ未満、または１０−１１Ｍ未満、または１０−１２Ｍ未満、または１０−１３Ｍ未満の解離定数、またはＫｄ（ｋｏｆｆ／ｋｏｎ）をもってＣＤ１９およびその抗原断片に結合する。
【０１３１】
もう１つの実施形態において、本発明の抗体は、１×１０−３ｓ−１未満の、または３×１０−３ｓ−１未満のＫｏｆｆでもってＣＤ１９および／またはその抗原性断片に結合する。他の実施形態において、抗体は１０−３ｓ−１未満、５×１０−３ｓ−１未満、１０−４ｓ−１未満、５×１０−４ｓ−１未満、１０−５ｓ−１未満、５×１０−５ｓ−１未満、１０−６ｓ−１未満、５×１０−６ｓ−１未満、１０−７ｓ−１未満、５×１０−７ｓ−１未満、１０−８ｓ−１未満、５×１０−８ｓ−１未満、１０−９ｓ−１未満、５×１０−９ｓ−１未満、または１０−１０ｓ−１未満のＫｏｆｆでもってＣＤ１９およびその抗原性断片に結合する。
【０１３２】
もう１つの実施形態において、本発明の抗体は、少なくとも１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０５Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０６Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも５×１０７Ｍ−１ｓ−１、少なくとも１０８Ｍ−１ｓ−１、または少なくとも１０９Ｍ−１ｓ−１の会合速度定数またはｋｏｎ速度でもってＣＤ１９および／またはその抗原性断片に結合する。
【０１３３】
もう１つの実施形態において、本発明のＦｃ変種は、匹敵する分子に対して約２倍および約１０倍の間、または約５倍、および約５０倍の間、または約２５倍、および約２５０倍の間、または約１００倍、および約５００倍の間、または約２５０倍、および約１０００倍の間減少する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。もう１つの実施形態において、本発明のＦｃ変種は、匹敵する分子に対して２倍および１０倍の間、または５倍、および５０倍の間、または２５倍、および２５０倍の間、または１００倍、および５００倍の間、または２５０倍、および１０００倍の間減少する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。特定の実施形態において該Ｆｃ変種は、匹敵する分子に対して少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも７倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも２０倍、または少なくとも３０倍、または少なくとも４０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも６０倍、または少なくとも７０倍、または少なくとも８０倍、または少なくとも９０倍、または少なくとも１００倍、または少なくとも２００倍、または少なくとも４００倍、または少なくとも６００倍だけ低下するＦｃγＲＩＩＩＡに対する平衡解離定数（ＫＤ）を有する。
【０１３４】
Ｆｃ領域を含む蛋白質の血清中半減期は、ＦｃＲｎに対するＦｃ領域の結合親和性を増加させることによって増加させることができる。１つの実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、匹敵する分子に対して増強された血清中半減期を有する。
【０１３５】
「抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害」または「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球、およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲｓ）に結合した分泌Ｉｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原−担持標的細胞に特異的に結合し、引き続いて、サイトトキシンで標的細胞を殺傷するのを可能とする細胞傷害の形態をいう。標的細胞の表面に向けられた特異的高親和性ＩｇＧ抗体は細胞傷害性細胞を「同伴し」、そのような殺傷に絶対的に必要とされる。標的細胞の溶解は細胞外であり、直接的な細胞間の接触を必要とし、補体を含まない。抗体に加えて、抗原−担持標的細胞に特異的に結合する能力を有するＦｃ受容体を含む他の蛋白質、具体的には、Ｆｃ融合蛋白質は、細胞−媒介細胞傷害を行うことができる。単純のために、Ｆｃ融合蛋白質の活性に由来する細胞−媒介細胞傷害もまた本明細書中においてはＡＤＣＣ活性という。
【０１３６】
ＡＤＣＣによる標的細胞の溶解を媒介するいずれかの特定のＦｃ変種蛋白質の能力をアッセイすることができる。ＡＤＣＣ活性を評価するために、注目するＦｃ変種蛋白質を、標的細胞の細胞溶解をもたらす抗原抗体複合体によって活性化することができる免疫エフェクター細胞と組み合わせて、標的細胞に加える。細胞溶解は、一般には、溶解された細胞からの標識（例えば、放射性基質、蛍光色素または天然細胞内蛋白質）の放出によって検出される。そのようなアッセイについての有用なエフェクター細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。インビトロＡＤＣＣアッセイの具体的な例は、Ｗｉｓｅｃａｒｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，７９：２７７−２８２；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，１６６：１３５１−１３６１；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２５８：１８３−１９１；Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，  １８４：２９−３８に記載されている。別法として、あるいは加えて、注目するＦｃ変種蛋白質のＡＤＣＣ活性は、例えば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，９５：６５２−６５６に開示されたもののような動物モデルにおいて、インビボで評価することができる。
【０１３７】
１つの実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、匹敵する分子に対して、増強されたＡＤＣＣ活性を有する。特定の実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、匹敵する分子のそれよりも少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍大きいＡＤＣＣ活性を有する。もう１つの特定の実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩＡへの増強された結合を有し、および匹敵する分子に対して、増強されたＡＤＣＣ活性を有する。他の実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、匹敵する分子に対して、増強されたＡＤＣＣ活性および増強された血清中半減期の双方を有する。
【０１３８】
「補体依存性細胞傷害」および「ＣＤＣ」とは、補体の存在下における標的細胞の溶解をいう。補体活性化経路は、同族抗原と複合体化した、分子、例えば、抗体への補体系の第一の成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始させる。補体活性化を評価するためには、例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３に記載されたＣＤＣアッセイを行うことができる。１つの実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、匹敵する分子に対して、増強されたＣＤＣ活性を有する。特定の実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、匹敵する分子のそれらよりも少なくとも２倍、または少なくとも３倍、または少なくとも５倍、または少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍、または少なくとも１００倍大きなＣＤＣ活性を有する。他の実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、匹敵する分子に対して、増強されたＣＤＣ活性および増強された血清中半減期を共に有する。
【０１３９】
１つの実施形態において、本発明は処方を提供し、ここに、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵ指標によってナンバリングして２３４、２３５、２３６、２３９、２４０、２４１、２４３、２４４、２４５、２４７、２５２、２５４、２５６、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６９、２９６、２９７、２９８、２９９、３１３、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３２、３３３、および３３４よりなる群から選択される１以上の位置において天然に生じないアミノ酸残基を含む。所望により、Ｆｃ領域は、当業者に知られたさらなるおよび／または代替位置において天然に生じないアミノ酸基を含むことができる（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；第６，２７７，３７５号；第６，７３７，０５６号；ＰＣＴ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ＷＯ  ０１／５８９５７；ＷＯ  ０２／０６９１９；ＷＯ  ０４／０１６７５０；ＷＯ  ０４／０２９２０７；ＷＯ  ０４／０３５７５２およびＷＯ  ０５  ／０４０２１７参照）。
【０１４０】
特定の実施形態において、本発明は、Ｆｃ変種蛋白質処方を提供し、ここに、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵ指標によってナンバリングして２３４Ｄ、２３４Ｅ、２３４Ｎ、２３４Ｑ、２３４Ｔ、２３４Ｈ、２３４Ｙ、２３４Ｉ、２３４Ｖ、２３４Ｆ、２３５Ａ、２３５Ｄ、２３５Ｒ、２３５Ｗ、２３５Ｐ、２３５Ｓ、２３５Ｎ、２３５Ｑ、２３５Ｔ、２３５Ｈ、２３５Ｙ、２３５Ｉ、２３５Ｖ、２３５Ｆ、２３６Ｅ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、２３９Ｎ、２３９Ｑ、２３９Ｆ、２３９Ｔ、２３９Ｈ、２３９Ｙ、２４０Ｉ、２４０Ａ、２４０Ｔ、２４０Ｍ、２４１Ｗ、２４１Ｌ、２４１Ｙ、２４１Ｅ、２４１Ｒ、２４３Ｗ、２４３Ｌ、２４３Ｙ、２４３Ｒ、２４３Ｑ、２４４Ｈ、２４５Ａ、２４７Ｖ、２４７Ｇ、２５２Ｙ、２５４Ｔ、２５６Ｅ、２６２Ｉ、２６２Ａ、２６２Ｔ、２６２Ｅ、２６３Ｉ、２６３Ａ、２６３Ｔ、２６３Ｍ、２６４Ｌ、２６４Ｉ、２６４Ｗ、２６４Ｔ、２６４Ｒ、２６４Ｆ、２６４Ｍ、２６４Ｙ、２６４Ｅ、２６５Ｇ、２６５Ｎ、２６５Ｑ、２６５Ｙ、２６５Ｆ、２６５Ｎ、２６５Ｉ、２６５Ｌ、２６５Ｈ、２６５Ｔ、２６６Ｉ、２６６Ａ、２６６Ｔ、２６６Ｍ、２６７Ｑ、２６７Ｌ、２６９Ｈ、２６９Ｙ、２６９Ｆ、２６９Ｒ、２９６Ｅ、２９６Ｑ、２９６Ｄ、２９６Ｎ、２９６Ｓ、２９６Ｔ、２９６Ｌ、２９６Ｉ、２９６Ｈ、２６９Ｈ、２６９Ｇ、２９７Ｓ、２９７Ｄ、２９８Ｈ、２９８Ｉ、２９８Ｔ、２９８Ｆ、２９９Ｉ、２９９Ｌ、２９９Ａ、２９９Ｓ、２９９Ｖ、２９９Ｈ、２９９Ｆ、２９９Ｅ、３１３Ｆ、３２５Ｑ、３２５Ｌ、３２５Ｉ、３２５Ｄ、３２５Ｅ、３２５Ａ、３２５Ｔ、３２５Ｖ、３２５Ｈ、３２７Ｇ、３２７Ｗ、３２７Ｎ、３２７Ｌ、３２８Ｓ、３２８Ｍ、３２８Ｄ、３２８Ｅ、３２８Ｎ、３２８Ｑ、３２８Ｆ、３２８Ｉ、３２８Ｖ、３２８Ｔ、３２８Ｈ、３２８Ａ，３２９Ｆ、３２９Ｈ、３２９Ｑ、３３０Ｋ、３３０Ｇ、３３０Ｔ、３３０Ｃ、３３０Ｌ、３３０、３３０Ｖ、３３０Ｉ、３３０Ｆ、３３０Ｒ、３３０Ｈ、３３２Ｄ、３３２Ｓ、３３２Ｗ、３３２Ｆ、３３２Ｅ、３３２Ｎ、３３２Ｑ、３３２Ｔ、３３２Ｈ、３３２Ｙ、および３３２Ａよりなる群から選択される少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸残基を含む。所望により、Ｆｃ領域は、当業者に知られたさらなるおよび／または代替の天然に生じないアミノ酸残基を含むことができる（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；第６，２７７，３７５号；第６，７３７，０５６号；ＰＣＴ特許公開ＷＯ  ０４／５８９５７；ＷＯ  ０２／０６９１９；ＷＯ  ０４／０１６７５０；ＷＯ  ０４／０２９２０７；ＷＯ  ０４／０３５７５２およびＷＯ  ０５／０４０２１７参照）。
【０１４１】
もう１つの実施形態において、本発明はＦｃ変種蛋白質処方を提供し、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵ指標によってナンバリングして２３９、３３０および３３２よりなる群から選択される１以上の位置において少なくとも天然に生じないアミノ酸を含む。特定の実施形態において、本発明はＦｃ変種蛋白質処方を提供し、ここに、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵ指標によってナンバリングして２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅよりなる群から選択される少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含む。所望により、Ｆｃ領域は、さらに、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵ指標によってナンバリングして２５２、２５４、２５６よりなる群から選択される１以上の位置においてさらなる天然に生じないアミノ酸を含むことができる。特定の実施形態において、本発明はＦｃ変種蛋白質処方を提供し、ここに、Ｆｃ領域は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵ指標によってナンバリングして２３９Ｄ、３３０Ｌおよび３３２Ｅよりなる群から選択される少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸を含み、１以上の位置における少なくとも１つの天然に生じないアミノ酸は、Ｋａｂａｔに記載されたＥＵ指標によってナンバリングして２５２Ｙ、２５４Ｔおよび３５６Ｅよりなる群から選択される。
【０１４２】
１つの実施形態において、本発明のＦｃ変種は、Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１５：６３７−４０；Ｄｕｎｃａｎ  ｅｔ  ａｌ，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：５６３−５６４；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７：２６５７−２６６２；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９２，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２９：５３−５９；Ａｌｅｇｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ５７：１５３７−１５４３；Ｈｕｔｃｈｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９２：１１９８０−１１９８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９５，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．，４４：１１１−１１７；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｆａｓｅｂ  Ｊ．，９：１１５−１１９；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．，５４：１０１−１０４；Ｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ，１９９６，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：４９６３−４９６９；Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２９：２６１３−２６２４；Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：４１７８−４１８４；Ｒｅｄｄｙ  ｅｔ  ａｌ，２０００，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６４：１９２５−１９３３；Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００：１６−２６：Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：２５７１−２５７５；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７６：６５９１−６６０４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．，８２：５７−６５；Ｐｒｅｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．，３０：４８７−４９０）；米国特許第５，６２４，８２１号；第５，８８５，５７３号；第５，６７７，４２５号；第６，１６５，７４５号；第６，２７７，３７５号；第５，８６９，０４６号；第６，１２１，０２２号；第５，６２４，８２１号；第５，６４８，２６０号；第６，５２８，６２４号；第６，１９４，５５１号；第６，７３７，０５６号；第６，８２１，５０５号；第６，２７７，３７５号；米国特許公開番号２００４／０００２５８７およびＰＣＴ公開  ＷＯ  ９４／２９３５１；ＷＯ  ９９／５８５７２；ＷＯ  ００／４２０７２；ＷＯ  ０２／０６０９１９；ＷＯ  ０４／０２９２０７；ＷＯ  ０４／０９９２４９；ＷＯ  ０４／０６３３５１に開示されたもののような他の公知のＦｃ変種と組み合わせることができる。また、本発明には、欠失、付加および修飾を含むＦｃ領域である。Ｆｃドメインのさらに他の修飾／置換／付加／欠失は当業者に容易に明らかであろう。
【０１４３】
天然に生じないＦｃ領域を生じさせるための方法は当該分野で公知である。例えば、アミノ酸置換および／または欠失は、限定されるものではないが、部位−特異的突然変異誘発（Ｋｕｎｋｅｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：４８８−４９２（１９８５））、ＰＣＲ突然変異誘発（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ“ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ｐｐ．１７７−１８３（１９９０））、およびカセット突然変異誘発（Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３４：３１５−３２３（１９８５））を含めた突然変異誘発方法によって生じさせることができる。好ましくは、部位−特異的突然変異誘発は、重複−延長ＰＣＲ方法（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｎ  “ＰＣＲ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ”，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．６１−７０（１９８９））によって行われる。別法として、重複−延長ＰＣＲ（Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｉｂｉｄ．）の技術を用いて、いずれかの所望の突然変異を標的配列に導入することができる（出発ＤＮＡ）。例えば、重複−延長方法におけるＰＣＲの第一ラウンドは、外側プライマー（プライマー１）および内側突然変異誘発プライマー（プライマー３）で、および別々に第二の外側プライマー（プライマー４）および内側プライマー（プライマー２）で標的配列を増幅し、２つのＰＣＲセグメント（セグメントＡおよびＢ）を得ることを含む。内側突然変異誘発プライマー（プライマー３）は、所望の突然変異を特定する標的配列へのミスマッチを含有するように設計される。ＰＣＲの第二ラウンドにおいて、ＰＣＲの第一ラウンドの産物（セグメントＡおよびＢ）は、２つの外側プライマー（プライマー１および４）を用いてＰＣＲによって増幅される。得られた全長ＰＣＲセグメント（セグメントＣ）を制限酵素で消化し、得られた制限断片を適当なベクターにクローン化する。突然変異誘発の第一の工程として、（例えば、Ｆｃ融合蛋白質、抗体または単純にＦｃ領域をコードする）出発ＤＮＡを突然変異誘発ベクターに操作可能にクローン化する。プライマーは、所望のアミノ酸置換を反映するように設計される。変種Ｆｃ領域の生成で有用な他の方法は当該分野で公知である（例えば、米国特許第５，６２４，８２１号；第５，８８５，５７３号；第５，６７７，４２５号；第６，１６５，７４５号；第６，２７７，３７５号；第５，８６９，０４６号；第６，１２１，０２２号；第５，６２４，８２１号；第５，６４８，２６０号；第６，５２８，６２４号：第６，１９４，５５１号；第６，７３７，０５６号；第６，８２１，５０５号；第６，２７７，３７５号；米国特許公開番号２００４／０００２５８７およびＰＣＴ公開ＷＯ  ９４／２９３５１；ＷＯ  ９９／５８５７２；ＷＯ  ００／４２０７２；ＷＯ  ０２／０６０９１９；ＷＯ  ０４／０２９２０７；ＷＯ  ０４／０９９２４９；ＷＯ  ０４／０６３３５１）。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、Ｆｃ変種蛋白質は、１以上の作製されたグリコ形態、すなわち、Ｆｃ領域を含む分子に共有結合された炭水化物組成物を含む。作製されたグリコ形態は、限定されるものではないが、エフェクター機能の増強または低下を含めた種々の目的で有用であろう。作製されたグリコ形態は、例えば、作製されたまたは変種発現株を用いることによって、１以上の酵素、例えば、ＤＩ  Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ）での共発現によって、種々の生物または種々の生物からの細胞系においてＦｃ領域を含む分子を発現させることによって、またはＦｃ領域を含む分子が発現された後に炭水化物を修飾することによって、当業者に知られたいずれかの方法によって生じさせることができる。作製されたグリコ形態を生じさせるための方法は当該分野で公知であり、限定されるものではないが、Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：１７６−１８０；Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００１７  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．，７４：２８８−２９４；Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７７：２６７３３−２６７４０；Ｓｈｉｎｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．，２７８：３４６６−３４７３、米国特許第６，６０２，６８４号、Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．１０／２７７，３７０；Ｕ．Ｓ．Ｓｅｒ．Ｎｏ．１０／１１３，９２９；ＰＣＴ  ＷＯ  ００／６１７３９Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ  ０１／２９２２４６Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ  ０２／３１１１４０Ａ１；ＰＣＴ  ＷＯ  ０２／３０９５４Ａ１；ＰｏｔｉｌｌｅｇｅｎｔＴＭ  技術（Ｂｉｏｗａ，Ｉｎｃ．，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）；ＧｌｙｃｏＭＡｂＴＭ  グリコシル化作製技術（ＧＬＹＣＡＲＴ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＧ，Ｚｕｒｉｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）に記載されたものを含む。例えば、ＷＯ  ０００６１７３９；ＥＡ０１２２９１２５；ＵＳ  ２００３０１１５６１４；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４，ＪＭＢ，３３６：１２３９−４９参照。
【０１４５】
（５．１．１８  抗体のグリコシル化）
なお、もう１つの実施形態において、本発明に従って利用される抗体のグリコシル化修飾する。例えば、グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、該抗体はグリコシル化を欠如する）。グリコシル化を改変して、例えば、標的抗原に対する抗体の親和性を存科されることができる。そのような炭水化物修飾は、例えば、抗体配列内でグリコシル化の１以上の部位を改変することによって達成することができる。例えば、１以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の排除をもたらし、それにより、その部位におけるグリコシル化を排除する１以上のアミノ酸置換をなすことができる。そのようなグリコシル化は、抗原の抗体に対する親和性を増加させることができる。そのようなアプローチは、米国特許第５，７１４，３５０号および第６，３５９，８６１号にさらに詳細に記載されている。別法として、Ｆｃ領域に存在するグリコシル化部位の排除をもたらす１以上のアミノ酸置換をなすことができる（例えば、ＩｇＧのアスパラギン２９７）。さらに、グリコシル化抗体を、必要なグリコシル化マシーナリーを欠如する細菌細胞で生産することができる。
【０１４６】
加えて、または別法として、低下した量のフコシル残基を有する低フコシル化抗体または増大した二等分ＧｌｃＮＡｃ構造を有する抗体のような、グリコシル化の改変されたタイプを有する抗体を作製することができる。そのような改変されたグリコシル化パターンは、抗体のＡＤＣＣ能力を増大させることが示されている。そのような炭水化物修飾は、例えば、改変されたグリコシル化マシーナリーを持つ宿主細胞において抗体を発現させることによって達成することができる。改変されたグリコシル化マシーナリーを持つ細胞は当該分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現し、それにより、改変されたグリコシル化を持つ抗体を生産するために、宿主細胞として用いることができる。例えば、Ｓｈｉｅｌｄｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：２６７３３−２６７４０；Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１７：１７６−１ならびに欧州特許Ｎｏ：ＥＰ１，１７６，１９５；ＰＣＴ公開  ＷＯ  ０３／０３５８３５；ＷＯ  ９９／５４３４２参照。また、抗体の改変されたグリコシル化を記載するＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２４：２１０−２１５；および公開された米国特許出願ＵＳ２００６／００４０３５３；ＵＳ２００６／０３４８３０；ＵＳ  ２００６／００３４８２９；ＵＳ２００６／００３４８２８；ＵＳ２００６／００２９６０４およびＵＳ２００６／００２４３０４も参照。
【０１４７】
（５．２  抗−ＣＤ１９抗体の製造／生産）
一旦所望の抗−ＣＤ１９抗体が作製されたならば、抗−ＣＤ１９抗体は、抗体の大規模な製造のための当該分野で良く知られた方法を用いて商業的規模で生産することができる。例えば、これは、限定されるものではないが、後に記載するもののような組換え発現系を用いて達成することができる。
【０１４８】
（５．２．１  組換え発現系）
本発明の抗体またはその変種の組換え発現は、一般には、抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を必要とする。一旦本発明の抗体分子、または抗体の重鎖または軽鎖、または（好ましくは、必ずしも必要ではないが、重鎖または軽鎖可変ドメインを含有する）その部分が得られたならば、抗体分子の生産のためのベクターは、当該分野でよく知られた技術を用いて組換えＤＮＡ技術によって生産することができる。例えば、ここに引用してその全体を援用する米国特許第６，３３１，４１５号参照。かくして、抗体をコードするヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドを発現することによって、蛋白質を調製する方法は本明細書中に記載されている。当業者によく知られた方法を用いて、抗体コーディング配列および適当な転写および翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝子組換えを含む。本発明は、かくして、プロモーターに操作可能に連結された、本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列、抗体の重鎖または軽鎖、抗体の重鎖または軽鎖可変ドメインまたはその部分、または重鎖または軽鎖ＣＤＲを含む複製可能なベクターを提供する。そのようなベクターは、抗体分子の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含むことができ、（例えば、国際公開番号ＷＯ  ８６／０５８０７およびＷＯ  ８９／０１０３６；および米国特許第５，１２２，４６４号参照）、抗体の可変ドメインを全重鎖、全軽鎖、または全重鎖および軽鎖の双方の発現用のそのようなベクターにクローン化することができる。
【０１４９】
代替実施形態において、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体は、抗−ＣＤ１９抗体のすべてまたは一部を生産するように、標的化相同組換えを用いて作製することができる（米国特許第６，０６３，６３０号、第６，１８７，３０５号、および第６，６９２，７３７号参照）。ある実施形態において、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体は、抗−ＣＤ１９抗体の全部または一部を生産するように、ランダム組換え技術を用いて作製することができる（米国特許第６，３６１，９７２号、第６，５２４，８１８号、第６，５４１，２２１号、および第６，６２３，９５８号参照）。また、抗−ＣＤ１９抗体を、Ｃｒｅ−媒介部位−特異的相同組換えを用い、修飾された免疫グロブリン遺伝子座を含む細胞のゲノム配列から抗体を発現する細胞において生産することもできる（米国特許第６，０９１，００１号参照）。ヒト抗体の生産が望まれる場合、宿主細胞はヒト細胞系であるべきである。これらの方法は、有利には、抗体分子を永久的に発現する安定な細胞系を作製するのに用いることができる。
【０１５０】
一旦発現ベクターが慣用的技術によって宿主細胞に導入されれば、次いで、本発明の抗体を生産するための慣用的技術によってトランスフェクトされた細胞を培養する。かくして、本発明は、異種プロモーターに操作可能に連結された、本発明の抗体をコードするポリヌクレオチドまたはその断片、またはその重鎖または軽鎖、またはその部分、または本発明の単一−鎖抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する宿主細胞を含む。二本鎖抗体の発現についての好ましい実施形態において、重鎖および軽鎖の双方をコードするベクターを、後に詳細に記載するように、全免疫グロブリン分子の発現のために宿主細胞において共発現させることができる。
【０１５１】
種々の宿主−発現ベクター系を利用して、抗−ＣＤ１９抗体の作製および精製で用いることができる本発明の抗−ＣＤ１９抗体、またはその部分を発現させることができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号参照）。例えば、ヒトサイトメガロウイルスからの主要即時型遺伝子プロモーターエレメントのようなベクターと組み合わせて、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）のような哺乳動物細胞は、抗体用の効果的発現系である（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，４５：１０１（１９８６）；ａｎｄ  Ｃｏｃｋｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：２（１９９０））。加えて、挿入された抗体配列の発現を変調し、あるいは所望の特異的様式にて抗体遺伝子産物を修飾し、プロセッシングする宿主細胞株を選択することができる。蛋白質産物のそのような修飾（ｑ例えば、グリコシル化）およびプロセッシング（例えば、切断）は蛋白質の機能で重要であろう。異なる宿主細胞は、蛋白質および遺伝子産物の翻訳後プロセッシングおよび修飾につき特徴および特定のメカニズムを有する。適当な細胞系または宿主系を選択して、発現された抗体またはその部分の正しい修飾およびプロセッシングを保障することができる。この目的で、一次転写体の適切なプロセッシング、遺伝子産物のグリコシル化、およびリン酸化のための細胞マシーナリーを保有する真核生物宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物宿主細胞は、限定されるものではないが、ＣＨＯ、ＶＥＲＯ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９８、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＮＳ０（いずれの免疫グロブリン鎖も内因的に生産しないマウス骨髄腫細胞系）、ＣＲＬ７Ｏ３ＯおよびＨｓＳ７８Ｂｓｔ細胞を含む。
【０１５２】
好ましい実施形態において、ヒトリンパ球を不滅化することによって発生したヒト細胞系を用いて、モノクローナルヒト抗−ＣＤ１９抗体を組換えにより生産することができる。好ましい実施形態において、ヒト細胞系ＰＥＲ．Ｃ６．（Ｃｒｕｃｅｌｌ，Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）を用いて、モノクローナルヒト抗−ＣＤ１９抗体を組換えにより生産することができる。
【０１５３】
細菌系において、発現すべき抗体分子を意図した使用に依存して、多数の発現ベクターを有意に選択することができる。例えば、大量のそのような抗体を発現すべき場合、抗−ＣＤ１９抗体を含む医薬組成物の創製では、容易に精製される高レベルの融合蛋白質産物の発現を指令するベクターが望ましいであろう。そのようなベクターは、限定されるものではないが、融合蛋白質が生産されるように、抗体コーディング配列をｌａｃＺコーディング領域とイン・フレームにてベクターに個々に連結できるＥ．ｃｏｌｉ発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ，１２：１７９１（１９８３））；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ  ＆  Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１３：３１０１−３１０９（１９８５）；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ  ＆  Ｓｃｈｅｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２４：５５０３−５５０９（１９８９））；などを含む。ｐＧＥＸベクターを用いて、グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合蛋白質として外来性ポリペプチドを発現することもできる。一般に、そのような融合蛋白質は可溶性であって、マトリックスグルタチオンアガロースビーズへの吸着および結合、続いての、遊離グルタチオンの存在下での溶出によって溶解されせた細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部位から放出できるように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計される。
【０１５４】
昆虫系においては、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして用いて外来性遺伝子を発現させる。該ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ細胞において増殖する。抗体コーディング配列はウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個々にクローン化し、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下におくことができる。
【０１５５】
哺乳動物宿主細胞においては、多数のウイルス−ベースの発現系を利用することができる。アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合、注目する抗体コーディング配列をアデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三部リーダー配列に連結されることができる。次いで、このキメラ遺伝子を、インビトロ、またはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入することができる。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入の結果、生きた、かつ感染した宿主において抗体分子を発現することができる組換えウイルスがもたらされるであろう（例えば、Ｌｏｇａｎ  ＆  Ｓｈｅｎｋ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：３５５−３５９（１９８４）参照）。挿入された抗体コーディング配列の効果的な翻訳には、特異的開始シグナルも必要であろう。これらのシグナルはＡＴＧ開始コドンおよび隣接配列を含む。さらに、開始コドンは、一般には、全インサートの翻訳を保障するために、望まれるコーディング配列のリーディングフレームとイン・フェーズであるべきである。これらの外因性転写制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成双方の種々の起源のものとすることができる。発現の効率は、適当な転写エンハンサーエレメント、転写ターミネーターなどを含めることによって増強させることができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，１５３：５１−５４４（１９８７）参照）。
【０１５６】
組換え蛋白質の長期高収率生産では、安定な発現が好ましい。例えば、抗体分子を安定に発現する細胞系を作製することができる。ウイルス複製起点を含有する複製発現ベクターを用いる一過性発現系よりはむしろ、適当な発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）によって制御されたＤＮＡ、および選択マーカーで宿主細胞を形質転換することができる。外来性ＤＮＡの導入に続き、作製された細胞を豊富化培地中で１ないし２日増殖させることができ、次いで、選択培地にスイッチする。組換えプラスミド中の選択マーカーは選択に対する抵抗性を付与し、細胞がその染色体にプラスミドを安定に組込み、増殖して、今度は細胞系にクローン化し、拡大培養することができるフォーカスを形成するのを可能とする。抗−ＣＤ１９抗体をコードするプラスミドを用いて、培養中の生産に適したいずれかの細胞系に遺伝子／ｃＤＮＡを導入することができる。別法として、「標的化ベクター」と呼ばれるプラスミドを用いて、発現制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）を宿主細胞中の適切な染色体位置に導入して、抗−ＣＤ１９抗体についての内因性遺伝子を「活性化する」ことができる。
【０１５７】
多数の選択系を用いることができ、これは、限定されるものではないが、各々、ｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｒＴ−細胞で使用される単純疱疹ウイルスチマミジンキナーゼ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１１：２２３（１９７７））、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｓｚｙｂａｌｓｋａ  ＆  Ｓｚｙｂａｌｓｋｉ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，４８：２０２（１９９２））、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ｌｏｗｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２２：８−１７（１９８０））遺伝子を含む。また、抗−代謝産物耐性は、以下の遺伝子：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Ｗｉｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：３５７（１９８０）；Ｏ’Ｈａｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：１５２７（１９８１））；マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ  ＆  Ｂｅｒｇ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：２０７２（１９８１））；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｗｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ａｎｄ  Ｍｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢ  ＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３））；およびヒグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏ（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，３０：１４７（１９８４））についての選択の基礎として用いることができる。組換えＤＮＡ技術の当該分野で共通に知られた方法をルーチン的に適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、そのような方法は、例えば、ここに引用して援用する、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）；ａｎｄ  ｉｎ  Ｃｈａｐｔｅｒｓ  １２  ａｎｄ  １３，Ｄｒａｃｏｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９４）；Ｃｏｌｂｅｒｒｅ−Ｇａｒａｐｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：１に記載されている。
【０１５８】
抗体分子の発現レベルは、ベクター増幅によって増大させることができる（レビューについてはＢｅｂｂｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｈｅｎｔｓｃｈｅｌ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｇｅｎｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｏｎｅｄ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌ．３，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９８７）参照）。抗体を発現するベクター系中のマーカーが増幅可能である場合、宿主細胞の培養に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させるであろう。増幅された領域は抗体遺伝子に会合しているため、抗体の生産も増加するであろう（Ｃｒｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，３；２５７（１９８３））。抗体の発現レベルは、周囲のクロマチンを再形成し、活性な人工転写ドメインの形態で導入遺伝子発現を増強する技術を含めた組換え蛋白質生産の分野における当業者に知られた組換え方法およびツールの使用を介して増幅することができる。
【０１５９】
宿主細胞は本発明の２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第一のベクター、および軽鎖由来ポリペプチドをコードする第二のベクターで共トランスフェクトすることができる。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等な発現を可能とする同一選択マーカーを含有することができる。別法として、重鎖および軽鎖双方のポリペプチドをコードし、それを発現することのできる単一ベクターを用いることができる。そのような状況において、重鎖の前に軽鎖を置いて、過剰の毒性遊離重鎖を回避すべきである（Ｐｒｏｕｄｆｏｏｔ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：５６２−５６５（１９８６）；ａｎｄ  Ｋｏｈｌｅｒ，１９８０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：２１９７−２１９９（１９８０））。重鎖および軽鎖についてのコーディング配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含むことができる。
【０１６０】
いったん本発明の抗体分子が組換え発電によって生産されたならば、それは、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、特にプロテインＡ後に特異的抗原に対する親和性によるアフィニティ、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心、差別溶解性によって、または蛋白質の精製用のいずれかの他の標準的な技術によって、免疫グロブリン分子の精製についての分野で知られたいずれの方法によっても精製することができる。さらに、本発明の抗体またはその断片を、本明細書中に記載された、またはそうでなければ当該分野で知られた異種ポリペプチド配列に融合させて、精製を容易とすることができる。
【０１６１】
（５．２．２  抗体の精製および単離）
組換え技術を用いる場合、抗体は細胞内でペリプラズム空間で生産することができ、あるいは培地に直接的に分泌することができる。抗体を細胞内で生産するのならば、最初の工程として、粒上デブリス、宿主細胞または溶解した断片いずれかを、例えば、遠心または限外濾過によって除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１６３−１６７（１９９２）は、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム空間に分泌される抗体を単離するための手法を記載する。簡単に述べれば、細胞をペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、およびフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）の存在下で３０分間にわたって解凍する。細胞デブリスは遠心によって除去することができる。抗体突然変異体を培地に分泌させる場合、そのような発現系からの上清を、一般には、まず、商業的に入手可能な濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外濾過ユニットを用いて濃縮する。ＰＭＳＦのようなプロテアーゼ阻害剤を前記工程のいずれかで含めて、蛋白質分解を阻害することができ、抗生物質を含めて、不慮の汚染の成長を妨げることができる。
【０１６２】
細胞から調製された抗体組成物は、例えば、単独で、あるいは他の精製工程と組み合わせて、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、および／またはアフィニティクロマトグラフィーを用いて精製することができる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適当性は、抗体突然変異体に存在するいずれの免疫グロブリンＦｃドメインの種およびイソタイプにも依存する。プロテインＡを用いて、ヒトγ１、γ２、またはγ４重鎖に基づいて抗体を精製することができる。（Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６２：１−１３（１９８３））。プロテインＧは全てのマウスイソタイプについて、およびヒトγ３について推奨される（Ｇｕｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，５：１５６７１５７５（１９８６））。アフィニティーリガンドが付着されたマトリックスは最もしばしばアガロースであるが、他のマトリックスを利用することができる。制御された多孔ガラスまたはポリ（スチレンジビニル）ベンゼンのような機械的に安定なマトリックスが、アガロースで達成することよりも早い液速およびより短い処理時間を可能とする。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）が精製で有用である。イオン−交換カラムでの分別、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカでのクロマトグラフィー、ヘパリンでのクロマトグラフィー、（ポリアスパラギン酸カラムのような）アニオンまたはカチオン交換樹脂でのＳＥＰＨＡＲＯＳＥ、等電点、電気泳動、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび硫酸アンモニウム沈殿のような蛋白質精製用の他の技術もまた、回収すべき抗体に依存してやはり利用可能である。
【０１６３】
いずれかの予備的精製工程に続き、注目する抗体および汚染物を含む混合物、約２．５ないし４．５の間のｐＨの溶出緩衝液を用いる低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに付すことができ、好ましくは、（例えば、約０ないし０．２５Ｍ塩の）低い塩濃度で行うことができる。
【０１６４】
（５．３  治療抗−ＣＤ１９抗体）
本発明の組成物および方法で用いる抗−ＣＤ１９抗体は、好ましくは、ヒト抗体、または好ましくはヒトＡＤＣＣを媒介するヒト化抗体であり、あるいは好ましくはヒトＡＤＣＣを媒介する公知の抗−ＣＤ１９抗体から選択される。ある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体はキメラ抗体とすることができる。好ましい実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体はモノクローナルヒト、ヒト化、キメラ抗−ＣＤ１９抗体である。本発明の組成物および方法で用いる抗−ＣＤ１９抗体は、好ましくは、ヒト抗体、またはＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプのヒト化抗体である。他の実施形態において、本発明の組成物および方法で用いる抗−ＣＤ１９抗体は、好ましくは、ヒト抗体、あるいは好ましくはＡＤＣＣを媒介するＩｇＧ２またはＩｇＧ４ヒトイソタイプのヒト化抗体である。
【０１６５】
そのような抗体は前記した技術を用いて創製することができるが、本発明の他の実施形態においては、本明細書中に記載されたマウス抗体ＨＢ１２ａおよびＨＢ１２ｂ、または他の商業的に入手可能な抗−ＣＤ１９抗体をキメラ化し、ヒト化し、あるいはヒト抗体に作製することができる。
【０１６６】
例えば、用いることができる公知の抗−ＣＤ１９抗体は、限定されるものではないが、
ＨＤ３７（ＩｇＧ１）（ＤＡＫＯ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ），ＢＵ１２（Ｇ．Ｄ．Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ），４Ｇ７（ＩｇＧ１）（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｊ４．１１９（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｋｒｅｆｅｌｄ，Ｇｅｒｍａｎｙ），Ｂ４３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），ＳＪ２５Ｃ１（ＢＤ  ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ），ＦＭＣ６３（ＩｇＧ２ａ）（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔ‘ｌ．，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３４：１１５７−１１６５（１９９７）；Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒｒａｐｙ，４１：５３−６０（１９９５）：ａｎｄ  Ｚｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，６９：４１１−４２２（１９９１）），Ｂ４（ＩｇＧ１）（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３１：２４４−２５０（１９８３），および／またはＨＤ２３７（ＩｇＧ２ｂ）（Ｆｏｕｒｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，１９８９；ａｎｄ  Ｐｅｚｚｕｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：２７９３−２７９９（１９８７））を含む。
【０１６７】
ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、配列番号：２（図５Ａ）のアミノ酸配列を含むＨＢ１２ａの重鎖を含む。他の実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、配列番号：４（図５Ｂ）のアミノ酸配列を含むＨＢ１２ｂの重鎖を含む。
【０１６８】
ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、配列番号：１６（図６Ａ）のアミノ酸配列を含むＨＢ１２ａの軽鎖を含む。他の実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、配列番号：１８（図６Ｂ）のアミノ酸配列を含むＨＢ１２ｂの軽鎖を含む。
【０１６９】
ある実施形態において、抗体は、前記したもの（例えば、ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂ）のような（例えば、ＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプに対する）公知の抗体のイソタイプがスイッチされた変種である。
【０１７０】
本発明の組成物および方法で用いられる抗−ＣＤ１９抗体は裸の抗体、免疫コンジュゲートまたは融合蛋白質である。好ましくは、本発明の組成物および方法で用いられる前記した抗−ＣＤ１９抗体は、それで処理されたヒトにおいて、Ｂ細胞および循環免疫グロブリンを低下させ、または枯渇させることができる。Ｂ細胞の枯渇は、循環Ｂ細胞におけるもの、または限定されるものではないが、骨髄、脾臓、腸−関連リンパ系組織、および／またはリンパ節のよう特定の組織におけるものであり得る。そのような枯渇は、抗体−依存性細胞−媒介細胞傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）、Ｂ細胞増殖の阻害、および／または（例えば、アポトーシスを介する）Ｂ細胞死滅の誘導のような種々のメカニズムを介して達成することができる。Ｂ細胞の「枯渇」とは、セクション５．４．３に記載したように、循環Ｂ細胞および／または特別な組織におけるＢ細胞の少なくとも約２５％、４０％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上だけの低下を意味する。特別な実施形態において、実質的に全ての検出可能なＢ細胞は循環および／または特別な組織から枯渇される。循環免疫グロブリン（Ｉｇ）の「枯渇」とは、セクション５．４．３に記載されるように、少なくとも約２５％、４０％、５０％、６５％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれ以上だけの低下を意味する。特別な実施形態において、実質的にすべての検出化なＩｇは循環から枯渇される。
【０１７１】
（５．３．１  ヒトＣＤ１９結合に対する阻害剤のスクリーニング）
結合アッセイを用いて、ヒトＣＤ１９抗原に結合する抗体を同定することができる。結合アッセイは直接的結合アッセイとして、または競合−結合アッセイとして行うことができる。結合は、標準的なＥＬＩＳＡまたは標準的フローサイトメトリーアッセイを用いて検出することができる。直接的結合アッセイにおいては、候補抗体を、ヒトＣＤ１９抗原への結合についてテストする。ある実施形態において、スクリーニングアッセイは、第二の工程において、ヒトＣＤ１９を発現するＢ細胞の細胞死滅またはアポトーシスを引き起こす能力を測定することを含む。競合−結合アッセイは、他方、公知の抗−ＣＤ１９抗体、またはヒトＣＤ１９に結合する他の化合物と競合する候補抗体の能力を評価する。
【０１７２】
直接的結合アッセイにおいては、ヒトＣＤ１９抗原を、候補抗体のヒトＣＤ１９抗原への結合を可能とする条件下で、候補抗体と接触させる。結合は溶液中で、または固体表面で行うことができる。好ましくは、候補抗体は検出のために予め標識する。限定されるものではないが、ルミネセント、蛍光または放射性同位体、またはそれを含有する基あるいは酵素または色素のような非放射性標識のようないずれの検出可能な化合物も標識で用いることができる。結合が起こるのに、十分なインキュベーション時間の後、反応を、過剰なまたは非特異的に結合した抗体を除去する条件および操作に暴露する。典型的には、それは適当な緩衝液での洗浄を含む。最後に、ＣＤ１９−抗体複合体の存在を検出する。
【０１７３】
競合−結合アッセイにおいては、候補抗体を、公知の抗−ＣＤ１９抗体（または他の化合物）のヒトＣＤ１９抗原への結合を阻害し、または置き換えるその能力について評価する。ＣＤ１９の標識された公知のバインダーを候補抗体と混合し、候補抗体を加え、または加えることなく、それらの間の相互作用が通常は起こる条件下に置くことができる。ヒトＣＤ１９に結合するＣＤ１９の標識された公知のバインダーの量を、候補抗体の存在または不存在下で結合した量と比較することができる。
【０１７４】
好ましい実施形態において、抗体抗原複合体の形成および検出を容易とするために、結合アッセイは、固体表面に固定化された１以上の成分で行われる。種々の実施形態において、個体支持体は、限定されるものではないが、ポリカルボネート、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ガラス、ニトロセルロース、デキストラン、ナイロン、ポリアクリルアミドおよびアガロースであり得る。支持体の立体配置はビーズ、膜、ミクロ粒子、マイクロタイタープレート、試験管のような反応容器または他の反応容器の内部表面を含むことができる。ヒトＣＤ１９または他の成分の固定化は、共有結合または非共有結合付着を介して達成することができる。１つの実施形態において、付着は付着した抗体を介する間接的なものであってよい。もう１つの実施形態において、ヒトＣＤ１９抗原および負の対照に、固体表面への付着が抗−ＧＳＴ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）のような商業的に入手可能な抗体によって媒介できるように、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）のようなエピトープを付す。
【０１７５】
例えば、そのようなアフィニティー結合アッセイは、固体支持体に固定化されたヒトＣＤ１９抗原を用いて行うことができる。典型的には、結合反応の非移動成分、この場合は、候補抗−ＣＤ１９抗体を標識して、検出を可能とする。ルミネセント、クロモフォア、蛍光または放射性同位体、またはそれを含有する基、および酵素または色素のような非放射性標識のような、種々の検出方法が利用可能であり、用いることができる。好ましい実施形態において、候補抗−ＣＤ１９抗体は、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓから入手可能）のような、フルオロフォアで標識する。
【０１７６】
最後に、固体表面に残存する標識は、当該分野で調べたいずれかの検出方法によって検出することができる。例えば、もし候補抗−ＣＤ１９抗体がフルオロフォアで標識されるならば、フルオリメーターを用いて複合体を検出することができる。
【０１７７】
好ましくは、ヒトＣＤ１９抗原は、ヒトＣＤ１９抗原を発現する無傷細胞、またはヒトＣＤ１９抗原を含有する単離された膜の形態で結合アッセイに加えられる。かくして、ヒトＣＤ１９抗原への直接的な結合は、候補抗−ＣＤ１９抗体の存在および不存在下で、培養中の、または動物モデルにおける無傷細胞にてアッセイすることができる。標識された候補抗−ＣＤ１９抗体を、ヒトＣＤ１９抗原を発現する細胞と、またはそのような細胞から得られた粗製抽出物と混合することができ、候補抗−ＣＤ１９抗体を加えることができる。単離された膜を用いて、ヒトＣＤ１９と相互作用する候補抗−ＣＤ１９抗体を同定することができる。例えば、単離された膜を用いる典型的な実験においては、細胞を遺伝子工学により作製して、ヒトＣＤ１９抗原を発現させることができる。膜は標準的な技術によって収穫し、インビトロ結合アッセイで用いることができる。標識された候補抗−ＣＤ１９抗体（例えば、蛍光標識抗体）を膜に結合させ、特異的活性についてアッセイする；特異的結合は、過剰の未標識（冷）候補抗−ＣＤ１９抗体の存在下で行われる結合アッセイとの比較によって決定される。別法として、可溶性ヒトＣＤ１９抗原を組換えにより発現させ、非−細胞ベースのアッセイで利用して、ヒトＣＤ１９抗原に結合する抗体を同定することができる。組換えにより発現されたヒトＣＤ１９ポリペプチドは、非−細胞ベースのスクリーニングアッセイで用いることができる。別法として、ヒトＣＤ１９抗原の結合部分の１以上に対応するペプチド、あるいはヒトＣＤ１９抗原の結合部分の１以上を含有する融合蛋白質を非−細胞ベースのアッセイ系で用いて、ヒトＣＤ１９抗原の部分に結合する抗体を同定することができる。非−細胞ベースのアッセイにおいては、組換えにより発現されたヒトＣＤ１９は、当業者によく知られた手段によって、試験管、マイクロタイターウェルまたはカラムのような個体基材に付着される（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａ参照）。次いで、テスト抗体を、ヒトＣＤ１９抗原に結合するその能力についてアッセイする。
【０１７８】
別法として、結合反応は溶液中で行うことができる。このアッセイにおいては、標識された成分を溶液中のその結合パートナーと相互作用させる。もし、標識された成分およびその結合パートナーの間のサイズの差がそのような分離を可能とするならば、そのポアが、その結合パートナーではなく未結合標識成分の、またはそのパートナーに結合した標識成分の通過を可能とする超フィルターを通って結合反応の産物を通過させることによって達成することができる。また、分離は、結合パートナーに対する抗体などのような、溶液から標識された成分の結合パートナーを捕獲することができるいずれかの試薬を用いて達成することもできる。
【０１７９】
１つの実施形態において、例えば、プラスチックビーズのような固相に連結された、精製されたヒトＣＤ１９抗原、またはその誘導体、アナログ、断片またはドメインを含有するカラムを通って連続ファージディスプレイライブラリーからファージを通過させることによって、ファージライブラリーをスクリーニングすることができる。洗浄緩衝液のストリンジェンシーを改変することによって、ヒトＣＤ１９抗原に対して高い親和性を持つペプチドを発現するファージを豊富化することが可能である。カラムから単離されたファージをクローン化することができ、親和性を直接的に測定することができる。いずれの抗体およびそれらのアミノ酸配列がヒトＣＤ１９抗原に最強の結合を付与するかを知ると、コンピュータモデルを用いて、ＣＤ１９抗原および候補抗体の間の分子接触を同定することができる。
【０１８０】
本発明のこの態様のもう１つの特定の実施形態において、固体支持体は、マイクロタイター皿に付着されたヒトＣＤ１９抗原を含有する膜である。候補抗体は、例えば、マイクロタイター皿におけるライブラリーメンバーの発現を可能とする条件下で培養したライブラリー抗体を発現する細胞に結合することができる。ヒトＣＤ１９に結合するライブラリーメンバーを収穫する。そのような方法は、一般には、例えば、Ｐａｒｍｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｍｉｔｈ，１９８８，Ｇｅｎｅ，７３：３０５−３１８；Ｆｏｗｌｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，１３：４２２−４２７；ＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９４／１８３１８；および前記で引用された文献に記載されている。ヒトＣＤ１９抗原への結合として同定された抗体は、前記した抗体のタイプまたは修飾のいずれかのものとすることができる。
【０１８１】
ある実施形態において、スクリーニングアッセイは、第二の工程において、ヒトＣＤ１９を発現するＢ細胞の細胞死滅またはアポトーシスを引き起こす能力を決定することを含む。実行できる色素を利用するアッセイ、カスパーゼを検出し分析する方法、およびＤＮＡ破壊を測定するアッセイを用いて、注目する抗−ＣＤ１９抗体と共にインビトロで培養した細胞のアポトーシス活性を評価することができる。例えば、アネキシンＶまたはＴｄＴ−媒介ｄＵＴＰニック−末端標識（ＴＵＮＥＬ）アッセイをＤｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０３：２７１８−２７２５（２００４）に記載されたように、行って、アポトーシス活性を検出することができる。ＴＵＮＥＬアッセイは、ＤＮＡストランド破壊への取込みのためのフルオレセイン−標識ｄＵＴＰと共に注目する細胞を培養することを含む。次いで、フローサイトメトリーによる分析のために細胞を処理する。アネキシンＶアッセイは、アポトーシス細胞の表面の露出したＰＳを特異的に認識するフルオレセイン−コンジュゲーテッド抗体を用い、原形質膜の外側へのホスファチジルセリン（ＰＳ）の露出を検出する。コンジュゲーションにおいて、ヨウ化プロピジウムのような実行可能色素を用いて、初期アポトーシス細胞から後期アポトーシス細胞を排除することができる。注目する細胞を抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析する。さらに、抗体のアポトーシス活性をアッセイするための技術は当該分野でよく知られている。例えば、Ｃｈａｏｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５４（７）：３０９６−１０４（１９９５）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ｓｌ．，Ｂｌｏｏｄ，９９（４）：１３１４−１３１８（２００２）；Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ；Ｓｔｅｅｎｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．，８５：３２３−３２，（２００３）参照。
【０１８２】
（５．３．２  ヒトＡＤＣＣエフェクター機能についての抗体のスクリーニング）
ヒトＩｇＧクラスの抗体は本発明で用いるのに好ましい。なぜならば、それらは血清中の長い半減期のような機能的特徴を有し、種々のエフェクター機能を媒介することができるからである。（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １（１９９５））。ヒトＩｇＧクラス抗体は、さらに、以下の４つのサブクラス：ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類される。非常に多数の研究が、ＩｇＧクラス抗体のエフェクター機能としてＡＤＣＣおよびＣＤＣについてこれまで行われており、ヒトＩｇＧクラスの抗体の中では、ＩｇＧ１サブクラスがヒトにおいて最高のＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性を有することが報告されている。（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７））。
【０１８３】
ヒトＩｇＧ１サブクラス抗体のＡＤＣＣ活性およびＣＤＣ活性の発現は、一般には、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞または活性化されたマクロファージのようなエフェクター細胞の表面に存在する抗体に対する受容体（以下、「ＦｃγＲ」という）への抗体のＦｃ領域の結合を含む。種々の補体成分が結合することができる。結合に関しては、抗体のヒンジ領域およびＣ領域の第二のドメイン（以下、「Ｃγ２ドメイン」という）における数個のアミノ酸残基が重要であり（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２３，１０９８（１９９３），Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８６，３１９（１９９５），Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７））およびＣγ２ドメイン（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６５，８８（１９９７））における糖鎖も重要であると提唱されている。
【０１８４】
本発明の抗−ＣＤ１９抗体をエフェクター機能に関して修飾して、例えば、抗体のＡＤＣＣおよび／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を増強させることができる。これは、抗体のＦｃ領域へ１以上のアミノ酸置換を導入することによって達成することができる。別法として、または加えて、システイン残基をＦｃ領域に導入し、この領域における鎖間ジスルフィド結合の形成を可能とすることができる。このようにして、改良された内部化能力および／または増大した補体−媒介細胞殺傷およびＡＤＣＣを有することができるホモダイマー抗体を創製することができる（Ｃａｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７６：１１９１−１１９５（１９９２）ａｎｄ  Ｓｈｏｐｅｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８：２９１８−２９２２（１９９２））。ヘテロ二官能性架橋剤を用いて、増強された活性を持つホモダイマー抗体を創製することができる（Ｗｏｌｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：２５６０−２５６５（１９９３））。また、抗体は、増強された補体溶解およびＡＤＣＣ能力をもたらす２以上のＦｃ領域を有するように作製することもできる（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，（３）２１９−２３０（１９８９））。
【０１８５】
エフェクター機能を改変するように抗体のＦｃ領域を作製する他の方法は当該分野で知られている（例えば、ＦＣγＲＩＩＡに対する結合親和性と比較して、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性を増強させるようにＦｃ領域を改変することを記載する共にＫｏｅｎｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，に対する米国特許公開番号２００４０１８５０４５およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００４／０１６７５０；また、Ａｒｍｏｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，に対するＰＣＴ公開番号ＷＯ  ９９／５８５７２、Ｉｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，に対するＷＯ  ９９／５１６４２、およびＤｅｏ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第６，３９５，２７２号も参照；その開示を引用してその全体を援用する）。Ｆｃ領域を修飾して、ＦｃγＲＩＩＢに対する結合親和性を減少させる方法も当該分野で知られている（例えば、その開示をここに引用してその全体を援用する、共にＲａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，に対する米国特許公開番号２００１００３６４５９およびＰＣＴ公開番号ＷＯ  ０１／７９２９９）。野生型Ｆｃ領域と比較して、ＦｃγＲＩＩＩＡおよび／またＦｃγＩＩＡに対する増強された結合親和性を持つ変種Ｆｃ領域を有する修飾された抗体も記載されている（例えば、その開示をここに引用してその全体を援用する、Ｓｔａｖｅｎｈａｇｅｎ  ｅｔ  ａｌ．に対するＰＣＴ公開番号ＷＯ  ２００４／０６３３５１）。
【０１８６】
各々、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＶと呼ばれる少なくとも４つの異なるタイプのＦｃγＲが見出されている。ヒトにおいては、ＦｃγＲＩＩおよびＦｃγＲＩＩＩはさらに、各々、ＦｃγＲＩＩａおよびＦｃγＲＩＩｂ、およびＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩＩｂに分類される。ＦｃγＲは免疫グロブリンスーパーファミリーに属する膜蛋白質であり、ＦｃγＲＩＩ、ＦｃγＲＩＩＩ、およびＦｃγＲＩＶは２つの免疫グロブリン−様ドメインを含有する細胞外領域を有するα鎖を有し、ＦｃγＲＩは、構成成分として、３つの免疫グロブリン−様ドメインを含有する細胞外領域を有するα鎖を有し、α鎖はＩｇＧ結合活性に関与する。加えて、ＦｃγＲＩおよびＦＣγＲＩＩＩは、α鎖と会合してシグナル伝達機能を有する構成成分としてγ鎖またはζ鎖を有する（Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１８，７０９（２０００），Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１９，２７５（２００１））。ＦｃγＲＩＶはＢｒｕｈｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｍｅｄ．，（Ｃａｎａｄａ）２７：３Ｄ（２００４）によって記載されている。
【０１８７】
注目する抗−ＣＤ１９抗体のＡＤＣＣ活性を評価するために、米国特許第５，５００，３６２号または第５，８２１，３３７号に記載されたもののようなインビトロＡＤＣＣアッセイを用いることができる。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。例えば、補体活性化および／またはＡＤＣＣによって標的細胞の溶解を媒介するいずれかの特定の抗体の能力をアッセイすることができる。注目する細胞を増殖させ、インビトロで標識し；抗体を、抗原抗体複合体によって活性化することができる免疫細胞：すなわち、ＡＤＣＣ応答に関与するエフェクター細胞と組み合わせて細胞培養に加える。抗体を補体活性化についてテストすることもできる。いずれの場合においても、標的細胞の細胞溶解は、溶解された細胞からの標識の放出によって検出される。事実、抗体は、補体および／または免疫細胞の源として患者自身の血清を用いてスクリーニングすることができる。次いで、インビトロテストにおいて、ヒトＡＤＣＣを媒介することができる抗体をその特定の患者で治療的に用いることができる。別法として、または加えて、注目する分子のＡＤＣＣ活性を、たとえば、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（ＵＳＡ），９５：６５２−６５６（１９９８）に記載されたもののような動物モデルにおいてインビボで評価することができる。さらに、ＡＤＣＣのレベルおよび、所望により、抗体のＣＤＣ活性を変調する（すなわち、増加または減少させる）ための技術は当該分野でよく知られている。例えば、米国特許第６，１９４，５５１号参照。本発明の抗体は、好ましくは、ＡＤＣＣおよび／またはＣＤＣを誘導することができ、あるいは誘導する能力を有するように修飾されている。好ましくは、ＡＤＣＣ機能を測定するためのそのようなアッセイは、ヒトエフェクター細胞を用いて実行して、ヒトＡＤＣＣ機能を評価する。
【０１８８】
（５．３．３  免疫コンジュゲートおよび融合蛋白質）
本発明のある態様によると、治療剤またはトキシンを、本発明の組成物および方法で用いるために、キメラ化、ヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体にコンジュゲートすることができる。ある実施形態において、これらのコンジュゲートは融合蛋白質として創製することができる（セクション５．１．８参照）。治療剤およびトキシンの例は、限定されるものではないが、カリケアミシンおよびエスペラミシンのような分子のエネジインファミリーのメンバーを含む。化学トキシンはドゥオカルマイシン（例えば、米国特許第５，７０３，０８０号および米国特許第４，９２３，９９０号参照）、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シス−白金、エトポシド、ブレオマイシンおよび５−フルオロウラシルよりなる群から取ることもできる。化学療法剤の例はアドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（ａｒａ−ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール（ドセタキセル）、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンｃ、マイトキサントロン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号参照）、メルファラン、および他の関連ナイトロジェンマスタードも含む。
【０１８９】
本発明の免疫コンジュゲートで用いることができる他のトキシンは、毒性デシチン、リシンのような植物トキシン、アブリン、モデクシン、ブツリナ、およびジフテリアトキシンを含む。もちろん、種々のトキシンの組合せを１つの抗体分子にカップリングさせ、それにより、種々の細胞傷害を収容することもできよう。本発明の組合せ療法で適切に使用されるトキシンの例はリシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅＩ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗−ウイルス蛋白質、ゲロニン、ジフテリントキシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンである。例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４７：６４１（１９８６），ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，４４：４３（１９９４）参照。用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびその断片は、ジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非−結合活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｍｏｓａ）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、α−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンチン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、Ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クルシン、クロチン、Ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシン、エヌマイシンおよびトリコテセンを含む。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ  ９３／２１２３２参照。
【０１９０】
適当なトキシンおよび化学療法剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）に、およびＧｏｏｄｍａｎ  Ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ‘ｓ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）に記載されている。他の適当なトキシンおよび／または化学療法剤は当業者に知られている。
【０１９１】
本発明の抗−ＣＤ１９抗体もまた、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学療法剤、ＷＯ  ８１／０１１４５）を活性な抗−癌薬物に変換するプロドラッグ−活性化酵素に抗体をコンジュゲートさせることによってＡＤＥＰＴで用いることができる。例えば、ＷＯ  ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号参照。ＡＤＥＰＴで有用な免疫コンジュゲートの酵素成分は、それをそのより活性な細胞傷害性形態に変換するようにプロドラッグに作用できるいずれの酵素も含む。
【０１９２】
本発明の方法で有用な酵素は限定されるものではないが、ホスフェート−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアルカリ性フォスファターゼ；スルフェート−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５−フルオロシトシンを抗癌薬物５−フルオロウラシルに変換するのに有用なシトシンデアミナーゼ；ペプチド−含有プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用な、セラチアプロテアーゼ、テルモリシン、スブチリシン、カルボキシペプチダーゼおよび（カテプシンＢおよびＬのような）カテプシンのようなプロテアーゼ；Ｄ−アミノ酸置換基を含有するプロドラッグを変換するのに有用なＤ−アラニルカルボキシペプチダーゼ；グリコシル化プロドラッグを遊離薬物に変換するのに有用なβ−ガラクトシダーゼおよびノイラミニダーゼのよな炭水化物−切断酵素；α−ラクタムで誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なβ−ラクタマーゼ；および各々、フェノキシアセチルまたはフェニルアセチル基でそれらのアミン窒素において誘導体化された薬物を遊離薬物に変換するのに有用なペニシリンＶアミダーゼまたはペニシリンＧアミダーゼのようなペニシリンアミダーゼを含む。別法として、「アブザイム」としてやはり当該分野で知られている、酵素活性を持つ抗体を用いて、本発明のプロドラッグを遊離活性薬物に変換することができる（例えば、Ｍａｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２８：４５７−４５８（１９８７）参照）。抗体−アブザイムコンジュゲートは、自己免疫疾患または障害によって侵されたヒトの一部に望まれるアブザイムの送達用に本明細書中に記載されたように調製することができる。
【０１９３】
本発明の酵素は、先に議論したヘテロ二官能性架橋剤の使用のような当該分野でよく知られた技術によって抗体に共有結合させることができる。別法として、本発明の酵素の少なくとも機能的に活性な部分に連結された本発明の抗体の少なくとも抗原−結合領域を含む融合蛋白質を、当該分野でよく知られた組換えＤＮＡ技術を用いて構築することができる（例えば、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１２：６０４−６０８（１９８４）参照）。
【０１９４】
本発明の抗−ＣＤ１９抗体の共有結合修飾を本発明の範囲内に含める。それらは化学的合成によって、または適用可能であれば、抗体の酵素的または化学的切断によってなすことができる。抗−ＣＤ１９抗体の共有結合修飾の他のタイプは、抗体の標的化アミノ酸残基を、選択された側鎖またはＮ−またはＣ−末端残基と反応できる有機誘導体化剤と反応させることによって分子に導入される。
【０１９５】
最も普通には、システイニル残基をクロロ酢酸またはクロロアセタミドのようなα−ハロアセテート（および対応するアミン）と反応させて、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得る。同様に、ヨード−試薬を用いることもできる。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸、クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリベンゾエート、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール、またはクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１、３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【０１９６】
ヒスチジル残基はｐＨ５．５ないし７．０におけるジエチルピロカルボネートとの反応によって誘導体化される。なぜならば、この剤はヒスチジル側鎖に対して比較的特異的だからである。臭化パラ−ブロノフェナシルも有用であり；反応は、ｐＨ６．０において０．１Ｍナトリウムカコジレート中で好ましくは行われる。
【０１９７】
リジルおよびアミノ−末端残基はコハク酸または他のカルボン酸無水物と反応する。これらの剤での誘導体化は、リジニル残基の電荷を逆にする効果を有する。α−アミノ−含有残基および／またはε−アミノ−含有残基を誘導体化するための他の適当な試薬はメチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサール、ピリドキサール、クロロボロハイドライド、トリニトロベンゼンスルホン酸、０−メチルイソ尿素、２，４−ペンタンジオン、およびグリオキシレートとのトランスアミナーゼ−触媒反応のようにイミドエステルを含む。
【０１９８】
アルギニル残基は、１または数個の慣用的な試薬、とりわけ、フェニルグリオキサール、２、３−ブタンジオン、１、２−シクロヘキサンジオン、およびニンヒドリンとの反応によって修飾される。アルギニル残基の誘導体化は、グアニジン感応基の高いｐＫａのため反応はアルカリ性条件下で行う必要がある。さらに、これらの試薬はリジンのε−アミノ基ならびにアルギニンのイプシロン−アミノ基と反応させることができる。
【０１９９】
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンとの反応によって、チロシル残基へスペクトル標識を導入するのに特に興味深く成すことができる。最も普通には、Ｎ−アセチルイミダゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、各々、Ｏ−アセチルチロシル種および３−ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基は、ラジオイムノアッセイへ用いるために、１２５Ｉまたは１３１Ｉを用いてヨウ素化して、標識された蛋白質を調整する。
【０２００】
カルボキシル側鎖基（アスパルチルまたはグルタミル）は、１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３−（４−アゾニア−４、４−ジメチルフェニル）カルボジイミドのような、ＲおよびＲ´が異なるアルキル基であるカルボジイミド（Ｒ−−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−−Ｒ´）との反応によって選択的に修飾される。さらに、アスパルチルおよびグルタミル残基はアンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換される。
【０２０１】
グルタミニルおよびアスパラギニル残基は、頻繁に、各々、対応するグルタミルおよびアスパルチル残基に脱アミド化される。これらの残基は中性または塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に入る。
【０２０２】
他の修飾はプロリンおよびリジンのヒドロキシル化、セリルまたはスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｏｃｏ，ｐｐ．７９−８６（１９８３））、Ｎ−末端アミンのアセチル化、およびいずれかのＣ−末端カルボキシル基のアミド化を含む。
【０２０３】
共有結合修飾のもう１つのタイプは、グリコシドを抗体に化学的にまたは酵素的にカップリングさせることを含む。これらの手法は、それらが、Ｎ−またはＯ−結合グリコシル化に対するグリコシル化能力を有する宿主細胞における抗体の生産を必要としない点において有利である。用いるカップリング態様に依存して、糖を（ａ）アルギニンおよびヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのそれのような遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニンまたはヒドロキシプロリンのそれのような遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプトファムのそれのような芳香族残基、（ｆ）グルタミンのアミド基に付着させることができる。これらの方法は１９８７年９月１１日に公開されたＷＯ  ８７／０５３３０、およびＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６（１９８１）に記載されている。
【０２０４】
（５．４  医薬処方、投与および用量）
本発明の医薬処方は、有効成分として、ヒト、ヒト化、またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体を含有する。該処方は、ヒト患者への投与に適した重量または用量の単位中に、所望の応答を生じされるのに有効な量の裸の抗体、免疫コンジュゲート、または融合蛋白質を含有し、好ましくは滅菌されている。該応答は、例えば、限定されるものではないが、循環免疫グロブリン枯渇、循環Ｂ細胞枯渇、組織Ｂ細胞枯渇、またはＧＶＨＤ、拒絶エピソード、または移植後リンパ系増殖障害の発生、ひどさ、または持続の低下のような、抗−ＣＤ１９抗体組成物の生理学的効果を決定することによって測定することができる。他のアッセイは当業者に知られており、応答のレベルを測定するのに使用することができる。
【０２０５】
（５．４．１  医薬処方）
抗−ＣＤ１９抗体組成物は医薬上許容される担体で処方することができる。用語「医薬常許容される」とは、有効成分の生理学的活性の有効性に干渉しない１以上の非毒性物質を意味する。そのような製剤は、ルーチン的に、塩、緩衝剤、保存剤、適合する担体、および所望により他の治療剤を含有することができる。そのような医薬上許容される製剤は、ヒトへの投与に適した、ルーチン的に適合する補体または液体充填剤、希釈剤またはカプセル化物質も含有することができる。医薬で用いる場合、塩は医薬上許容されるべきであるが、医薬上許容されない塩を便宜には用いて、その医薬上許容される塩を調製することができ、本発明の範囲から排除されない。そのような薬理学的におよび医薬的に許容される塩は、限定されるものではないが、以下の酸：塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ホウ酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製されたものを含む。また、医薬上許容される塩は、ナトリウム、カリウムまたはカルシウム塩のようなアルカリ金属またはアルカリ土類塩として調製することができる。用語「担体」は、それと有効成分が組み合わされて、適用を容易とする。有機または無機の天然または合成成分を示す。医薬組成物の成分は、所望の医薬効果を実質的に損なう相互作用がないように、本発明の抗体と、または相互に共混合することができる。
【０２０６】
本発明のある態様によると、抗−ＣＤ１９抗体組成物は、所望の程度の純度を有する抗体または免疫コンジュゲートを凍結乾燥した処方または水性溶液の形態にて、任意の生理学的に許容される担体、賦形剤または安定化剤と混合することによって貯蔵のために調製することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９９９））。許容される担体、賦形剤、または安定化剤は使用する用量および濃度において受容体にとって非毒性であり、ホスフェート、シトレート、および他の有機酸のような緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含めた抗酸化剤；（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンのようなアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールのような）保存剤；低分子量（約１０未満の残基）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンのような蛋白質；ポリビニルピロリドンのような親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンのようなアミノ酸；グルコース、マンノースまたはデキストリンを含めた単糖、二糖、および他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、またはソルビトールのような糖類；ナトリウムのような塩−形成カウンター−イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−蛋白質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のようなノニオン界面活性剤を含む。
【０２０７】
抗−ＣＤ１９抗体組成物は、所望により、塩化ベンザルコニウム；クロロブタノール；パラベンおよびチメロザールのような適当な保存剤を含有することができる。
【０２０８】
抗−ＣＤ１９抗体組成物は、便宜には、単位投与形態にて提供することができ、製剤の分野で良く知られた方法のいずれかによって調製することができる。全ての方法は、１以上の補助的成分を構成する担体と活性剤とを一緒にする工程を含む。一般に、組成物は、活性化合物を液体担体、微粉砕固体担体、または双方と均一に且つ親密に一緒にし、次いで、必要であれば、製品を成型することによって調製される。
【０２０９】
非蛍光投与に適した組成物は、便宜には、好ましくは受容体の血液と等張である、抗−ＣＤ１９抗体の滅菌水性または非水性製剤を含む。この製剤は、適当な分散または湿潤剤および懸濁化剤を用いて公知の方法に従って処方することができる。滅菌注射製剤は、例えば、１，３−ブタンジオール中の溶液としての、非毒性の非蛍光的に許容される希釈剤または溶媒中の滅菌注射溶液または懸濁液とすることもできる。使用することができる許容されるビークルおよび溶媒の中身は、水、リンゲル液、および等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、滅菌不揮発性油は、便宜には、溶媒または懸濁化媒体として使用される。この目的では、いずれの味のよい不揮発性油も使用することができ、これは合成モノ−またはジ−グリセリドを含む。加えて、オレイン酸のような脂肪酸を注射剤の調製で用いることができる。蛍光、皮下、静脈内、筋肉内等の投与用に適した担体処方は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡに見出すことができる。ある実施形態において、種々の投与経路に適した担体処方は、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭに記載されたのと同一または同様とすることができる。ここに引用してその全体を援用する、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｖａｌｅ，ＮＪ，２００５），ｐｐ．９５８−９６０  ａｎｄ  １３５４−１３５７参照。本発明のある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体組成物は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、二水和物、ポリソルベート８０、および滅菌水で静脈内投与用に処方され、ここに、組成物のｐＨはほぼ６．５に調整される。当業者であれば、静脈内注射は、迅速に抗体を分布させるにおいて循環の徹底性のため有用な投与形態を提供するのを認識する。しかしながら、静脈内投与は、血管系の内皮細胞および内皮下マトリックスを含む血管バリアーによる制限に付される。皮下または筋肉内注射のような、またはリンパ管のカテーテル処理によるリンパ内投与経路もまた、自己免疫疾患または障害を治療する有用な手段を提供する。好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体は皮下自己−投与される。そのような好ましい実施形態において、組成物は、約５０ｍｇ／ｍＬにて凍結乾燥薬剤として、または液体緩衝液（例えば、ＰＢＳおよび／またはシトレート）中で処方される。
【０２１０】
ここに、処方は、治療すべき特定の適応症に必要な１を超える活性化合物、好ましくは、相互に悪影響しない補充的な活性を持つものを含有することもできる。例えば、免疫抑制剤をさらに供するのが望ましいであろう。そのような分子が、意図した目的で有効な量と組み合わせて供される。
【０２１１】
また、有効成分は、例えば、コアセルベーション技術によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル、例えば、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフィア、マイクロエマルジョン、ナノ−粒子およびナノカプセル）中の、またはマクロエマルジョン中の、各々、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに包括することもできる。そのような技術はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に開示されている。
【０２１２】
インビボ投与で用いるべき処方は典型的には滅菌されている。これは、滅菌濾過膜を通じての濾過によって容易に達成される。
【０２１３】
維持−放出製剤を調製することができる。維持−放出製剤の適当な例は、抗−ＣＤ１９抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半浸透マトリックスを含み、そのマトリックスは成型品、例えば、フィルムまたはマイクロカプセルの形態である。維持−放出マトリックスの例はポリエステルヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸およびγエチル−Ｌ−グルタメートのコポリマー、非−分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴＴＭのような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸ロイプロリドから構成される注射マイクロスフィアー）、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のようなポリマーは１００日間にわたって分子の放出を可能とするが、ある種のヒドロゲルはより短い時間に蛋白質を放出する。カプセル化された抗体が長時間体内に残存する場合、それらは３７℃における水分への暴露の結果として変性または凝集するかも知れず、その結果、生物学的活性の喪失、および免疫原性の可能な変化がもたらされる。合理的戦略は、関与するメカニズムに応じて安定化について工夫することができる。例えば、もし凝集メカニズムが、チオ−ジスルフィド相互交換を介する分子間Ｓ−Ｓ結合形成であると判明すれば、安定化は、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、その水分を制御し、適当な添加剤を用い、次いで、特定のポリマーマトリックス組成物を開発することによって達成することができる。ある実施形態において、本発明の組成物で用いる医薬上許容される担体は、ヒトＡＤＣＣまたはＣＤＣに影響しない。
【０２１４】
本明細書中に開示された抗−ＣＤ１９抗体組成物は免疫リポソームとして処方することもできる。「リポソーム」は、ヒトへの（本明細書中に開示された抗−ＣＤ１９抗体のような）薬物の送達で有用な種々のタイプの脂質、リン脂質および／または界面活性剤から構成される小胞である。リポソームの成分は、生物学的膜の脂質配置と同様に、二層形成にて共通に配置される。本発明の抗体を含有するリポソームは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：３６８８（１９８５）；Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４０３０（１９８０）；および米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されたような当該分野で知られた方法によって調製される。増強された循環時間を持つリポソームは米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリンコレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物での逆相蒸発方法によって生じさせることができる。リポソームは、規定されたポアサイズのフィルターを介して押し出して、所望の直径を持つリポソームが得られる。本発明の抗体は、ジスルフィド相互交換反応を介して、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２５７：２８６−２８８（１９８２）に記載されたようにリポソームにコンジュゲートすることができる。治療剤をリポソーム内に含有することもできる。Ｇａｂｉｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．（１９）１４８４（１９８９）参照。
【０２１５】
好ましい医薬処方のいくつかは限定されるものではないが以下のものを含む。
（ａ）１００ｍｇ（１０ｍＬ）または５００ｍｇ（５０ｍＬ）単一−使用バイアルいずれか中の１０ｍｇ／ｍＬの濃度で供される抗−ＣＤ１９抗体の静脈内（ｉｖ）投与用の滅菌無保存剤液体濃縮物。生成物は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、ポリソルベート、および注射用の滅菌水を用いてｉｖ投与用に処方することができる。例えば、生成物は、９．０ｍｇ／ｍＬの塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍＬクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍＬのポリソルベート８０、および注射用滅菌中で処方することができる。ｐＨは６．５に調整される。
（ｂ）皮下（ｓ．ｃ．）注射用の単一−使用ガラスバイアル中の滅菌された凍結乾燥粉末。生成物はスクロース、Ｌ−ヒスチジン塩酸一水和物、Ｌ−ヒスチジンおよびポリソルベート２０で処方することができる。例えば、各単一−使用バイアルは１５０ｍｇの抗−ＣＤ１９抗体、１２３．２ｍｇスクロース、６．８ｍｇのＬ−ヒスチジン塩酸一水和物、４．３ｍｇのＬ−ヒスチジン、および３ｍｇのポリソルベート２０を含有することができる。１．３ｍＬの注射用滅菌水での単一−使用バイアルの復元は、１．２５ｍＬ（１００ｍｇ／ｍＬ）の抗体当たり１２５ｍｇを送達するためのほぼ１．５ｍＬ溶液を与える。
（ｃ）静脈内（ｉ．ｖ．）投与用の滅菌された無保存剤凍結乾燥粉末。生成物はα−トレハロース二水和物Ｌ−ヒスチジンＨＣｌ、ヒスチジンおよびポリソルベート２０  ＵＳＰで処方することができる。例えば、各バイアルは４４０ｍｇの抗−ＣＤ１９抗体、４００ｍｇのα，α−トレハロース二水和物、９．９ｍｇのＬ−ヒスチジンＨＣｌ、６．４ｍｇのＬ−ヒスチジン、および１．８ｍｇのポリソルベート２０、ＵＳＰを含有することができる。保存剤として１．１％ベンジルアルコールを含有する、２０ｍＬの注射用精菌水（ＢＷＦＩ）、ＵＳＰでの復元により、ほぼ６のｐＨの２１ｍｇ／ｍＬ抗体を含有する多用量溶液を得る。
（ｄ）抗−ＣＤ１９抗体がスクロース、ポリソルベート、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物および二塩基性リン酸ナトリウム二水和物で処方される。例えば、各単一−使用バイアルは、１００ｍｇの抗体、５００ｍｇのスクロース、０．５ｍｇのポリソルベート８０、２．２ｍｇの一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、および６．１ｍｇの二塩基性リン酸ナトリウム二水和物を含有することができる。保存剤は存在しない。１０ｍＬの注射用滅菌水ＵＳＰでの復元に続いて、得られるｐＨはほぼ７．２である。
（ｅ）単一−使用の１ｍＬのプレフィルシリンジにて供される皮下投与用の滅菌した無保存剤溶液。生成物は塩化ナトリウム、一塩基性リン酸ナトリウム一水和物、二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、クエン酸ナトリウム、クエン酸一水和物、マンニトール、ポリソルベート８０および注射用水ＵＳＰで処方することができる。水酸化ナトリウムを加えて、ｐＨを約５．２に調整することができる。
【０２１６】
例えば、各シリンジは、０．８ｍＬ（４０ｍｇ）の薬物生成物を送達するように処方することができる。各０．８ｍＬは、４０ｍｇの抗−ＣＤ１９抗体、４．９３ｍｇの塩化ナトリウム、０．６９ｍｇの一塩基性リン酸ナトリウム二水和物、１．２２ｍｇの二塩基性リン酸ナトリウム二水和物、０．２４ｍｇのクエン酸ナトリウム、１．０４のクエン酸一水和物、９．６ｍｇのマンニトール、０．８ｍｇのポリソルベート８０、および注射用水ＵＳＰを含有する。
（ｆ）滅菌注射用水（ＳＷＦＩ）、ＵＳＰで復元され、皮下（ｓ．ｃ．）注射として投与される、単一−使用バイアルに含有された、滅菌された無保存剤凍結乾燥粉末。生成物はスクロース、ヒスチジン塩酸一水和物、Ｌ−ヒスチジンおよびポリソルベートで処方することができる。例えば、７５ｍｇバイアルは、１２９．６ｍｇまたは１１２．５ｍｇの抗−ＣＤ１９抗体、９３．１ｍｇのスクロース、１．８ｍｇのＬ−ヒスチジン塩酸一水和物、１．２ｍｇのＬ−ヒスチジン、および０．３ｍｇのポリソルベート２０を含有することができ、０．９ｍＬのＳＷＦＩ、ＵＳＰで復元された後に、０．６ｍＬ中の７５ｍｇの抗体を送達するように設計される。１５０ｍｇのバイアルは、２０２．５ｍｇまたは１７５ｍｇの抗−ＣＤ１９抗体、１４５．５ｍｇのスクロース、２．８ｍｇのＬ−ヒスチジン塩酸一水和物、１．８ｍｇのＬ−ヒスチジン、および０．５ｍｇのポリソルベート２０を含有することができ、１．４ｍＬのＳＷＦＩ、ＵＳＰでの復元の後に、１．２ｍＬ中の１５０ｍｇの抗体を送達するように設計される。
（ｇ）注射用滅菌水で復元される滅菌された凍結乾燥生成物。生成物は、マンニトール、ヒスチジンおよびグリシンを用いて、筋肉内（ＩＭ）注射用の単一−使用バイアルとして処方することができる。例えば、各単一−使用バイアルは、１００ｍｇの抗体、６７．５ｍｇのマンニトール、８．７ｍｇのヒスチジン、および０．３ｍｇのグリシンを含有することができ、１．０ｍＬの注射用滅菌水で復元した場合に、１．０ｍＬ中の１００ｍｇの抗体を送達するように設計される。別法として、各単一−使用バイアルは、５０ｍｇの抗体、４０．５ｍｇのマンニトール、５．２ｍｇのヒスチジンおよび０．２ｍｇのグリシンを含有することができ、０．６ｍＬの注射用滅菌水で復元した場合に、５０ｍｇの抗体を送達するように設計される。
（ｈ）１００ｍｇ／ｍＬの濃度で供給される、筋肉内（ＩＭ）注射用の滅菌された無保存剤溶液。生成物は、ヒスチジン、グリシン、および注射用滅菌水で単一−使用バイアル中に処方できる。例えば、各単一−使用バイアルは、１ｍＬ中の１００ｍｇの抗体を送達するように設計された、１．２ｍＬの容量中の１００ｍｇの抗体、４．７ｍｇのヒスチジン、および０．１ｍｇのグリシンで処方することができる。別法として、各単一−使用バイアルは、０．５ｍＬ中の５０ｍｇの抗体を送達するように設計された、０．７ｍＬまたは０．５ｍＬの容量中で、５０ｍｇの抗体、２．７ｍｇのヒスチジンおよび０．０８ｍｇのグリシンで処方することができる。
【０２１７】
ある実施形態において、本発明の医薬組成物は４℃で安定である。ある実施形態において、本発明の医薬組成物は室温で安定である。
【０２１８】
（５．４．２  抗体半減期）
ある実施形態において、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体の半減期は少なくとも約４ないし７日である。ある実施形態において、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体の平均半減期は、少なくとも約２ないし５日、３ないし６日、４ないし７日、５ないし８日、６ないし９日、７ないし１０日、８ないし１１日、８ないし１２日、９ないし１３日、１０ないし１４日、１１ないし１５日、１２ないし１６日、１３ないし１７日、１４ないし１８日、１５ないし１９日、または１６ないし２０日である。他の実施形態において、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体の半減期は約５０日までとすることができる。ある実施形態において、本発明の組成物および方法の抗体の半減期は、当該分野で公知の方法によって延長することができる。そのような延長は、今度は、本発明の抗体組成物の投与の量および／または頻度を低下させることができる。改良されたインビボ半減期を持つ抗体、およびそれらを調製するための方法は、米国特許第６，２７７，３７５号；および国際公開番号ＷＯ  ９８／２３２８９およびＷＯ  ９７／３４６１に開示されている。
【０２１９】
インビボでの本発明の抗−ＣＤ１９抗体の血清循環は、抗体のＮ−またはＣ−末端へのＰＥＧの部位−特異的コンジュゲーションを通じて、またはリジル残基に存在するイプシロン−アミノ基を介して、多官能性リンカーの有りまたは無しにて、高分子量ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）のような不活性ポリマー分子を抗体に付着させることによっても延長することができる。生物学的活性の最小喪失をもたらす直鎖または分岐したポリマーの誘導体化が用いられるであろう。コンジュゲーションの程度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび質量分析によって綿密にモニターして、ＰＥＧ分子の抗体への適切なコンジュゲーションを確認することができる。未反応ＰＥＧは、サイズ−排除によって、またはイオン−交換クロマトグラフィーによって抗体−ＰＥＧコンジュゲートから分離することができる。ＰＥＧ−誘導体化抗体は、例えば、本明細書中に記載されたイムノアッセイによって、当業者に知られた方法を用いて、結合活性について、ならびにインビボ効率についてテストすることができる。
【０２２０】
組成物の抗体の血漿中半減期は、重鎖および／または軽鎖遺伝子核酸配列に１以上の変化を導入して、所望のアミノ酸の変化を生じさせることにより、抗体のアミノ酸配列を改変することによって延長することができる。そのような変化は、限定されるものではないが、可変領域フレームワークの領域の、および／またはＦｃ定常領域の変化を含むことができよう。抗体遺伝子配列を改変するための技術は当該分野でよく知られている。
【０２２１】
さらに、組成物の抗体をアルブミンにコンジュゲートさせて、抗体をインビボでより安定とし、またはインビボでより長い半減期を有するようにすることができる。該技術は当該分野で良く知られている。例えば、その全てをここに引用して援用する、国際公開番号ＷＯ  ９３／１５１９９、ＷＯ  ９２／１５２００およびＷＯ  ０１／７７１３７および欧州特許Ｎｏ．ＥＰ４１３，６２２参照。
【０２２２】
（５．４．３  投与および用量）
本発明に従うと、セクション５．４．３において本明細書中に記載された投与の方法および用量の各々は、セクション５．６に記載された抗−ＣＤ１９免疫療法プロトコルで用いることができる。
【０２２３】
ヒト患者への本発明の組成物の投与は、限定されるものではないが、静脈内、皮内、経皮、皮下、筋肉内、吸入（例えば、イアルゾルを介する）、バッカル（例えば、舌下）、局所（すなわち、気道表面を含めた、皮膚および粘膜双方の表面）、クモ膜下腔内、関節内、胸膜内、大脳内、動脈内、腹腔内、経口、リンパ内、鼻、直腸または膣投与、局所的カテーテルを通じての灌流、または直接的病巣内注射を含めたいずれの経路によることもできる。好ましい実施形態において、本発明の組成物は、規定された期間、例えば、０．５ないし２時間）にわたって与えられる静脈内プッシュまたは静脈内注入によって投与される。当該分野で知られたように、いずれかの与えられた場合における最も適当な経路は、対象の種、年齢、性別および総じての状態、治療すべき状態の性質およびひどさ、および／または投与される特定の組成物（すなわち、用量、処方）の性質のような因子に依存するが、本発明の組成物はペリスタ手段によって、またはデポの形態で送達することができる。特定の実施形態において投与の経路は、１週間に１回または２回の、一定時間にわたるボーラスまたは継続的注入を介するものである。他の特定の実施形態において投与の経路は、所望により毎週１回または２回の部位（例えば、大腿、腰、臀部、腕）に与えられる皮下注射によるものである。１つの実施形態において、本発明の組成物および／または方法は、外来患者ベースで投与される。
【０２２４】
ある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体を含む組成物の量は、ｍｇ／ｋｇ患者体重の単位で測定される。他の実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体を含む組成物の用量は、ｍｇ／ｋｇ患者無脂肪体重（すなわち、体重から体脂肪含有量を引いたもの）の単位で測定される。なお他の実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体を含む組成物の用量は、ｍｇ／ｍ２患者体表面積の単位で測定される。なお他の実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体を含む組成物の用量は、患者に投与される用量当たりのｍｇの単位で測定される。用量の全ての測定は、本発明の組成物および方法と組み合わせて用いることができ、用量単位は当該分野において標準的な手段によって変換することができる。
【０２２５】
当業者であれば、用量は、移植体受容体またはドナーの年齢、性別、および身体的状態、ならびにＢ細胞または抗体枯渇の所望の程度、および／または用いるべき特定の抗体または抗原−結合断片を含めた多数の因子に基づいて選択することができ、当業者によって決定できることを認識するであろう。ある実施形態において、特定の用量は、養生法は、移植前コンディショニング、移植後維持、または急性または慢性拒絶の移植後処置について示されているか否かに依存して変化するであろう。例えば、移植前コンディショニング、移植後維持養生法に必要なものよりも、より高い用量が活性拒絶エピソードの処置で必要であろう。ある実施形態において、移植前または後予防で選択される特定の用量は、患者が液性応答を発生する高い、中程度、または低い危険性があると評価されるか否かのような因子によっても影響され得る。例えば、液性免疫応答を発声する高い危険性のある患者は、危険性が低いと評価された患者よりも高い予防用量を必要とするであろう。他の実施形態において、さらなる因子影響用量は、初期または後期液性拒絶の臨床的適応症があるか否かを含むことができる。例えば、潜在的、サイレントな、または前臨床液性応答のような初期段階拒絶の処置にはより低い用量が必要であり、他方、移植片機能障害の適応症を呈するもののようなより進んだ段階の拒絶を治療するのにより高い用量を必要とするであろう。ある実施形態において、選択された特定の用量は、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物が、ＧＶＨＤ、移植片拒絶、または移植後リンパ系増殖障害の治療または予防用の処置的養生法を含むか、またはそれと組み合わせて用いられるかに依存して用いられるであろう。特別な実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９組成物を１以上の他の治療剤と組み合わせて用いる場合には、より低い用量を用いる。好ましい実施形態において本発明の抗体および組成物と組み合わせて用いられる１以上の他の治療剤はそうでなければ必要とされる用量よりも低い。
【０２２６】
本発明の組成物の有効量は、インビトロテスト系から、または（例えば、ＧＶＨＤまたは拒絶の）動物モデルテスト系から由来する用量、応答曲線から外挿することができる。抗体の効果の評価のためのモデルおよび方法は、当該分野で知られている（ここに、引用してその全体を援用する、Ｗｏｏｌｄｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ８９（８）：２９９４−２９９８（１９９７），Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．４２（７）：８２１−８３１（２００５），Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｈｅｕｍ．５０（６）：１８８４−１８９６（２００４），Ｎａｎｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３（１１）：７０１０−７０１６（２００４））。
【０２２７】
ある実施形態において、移植前コンディショニング、移植後維持、または急性または慢性拒絶移植後処置のような特定の養生法については、抗体療法についての当該分野で標準的な治療養生法については、本発明の組成物および方法と共に用いることができる。１つの実施形態において、養生法は移植前コンディショニング養生法であって、本発明の組成物および方法を用いて、受容体または移植片、または移植片および受容体双方をコンディショニングする。
【０２２８】
本発明の方法で用いることができる投与養生法の例は、限定されるものではないが、毎日、毎週３回（間歇的）、毎週または１４日毎を含む。ある実施形態において、投与養生法は、限定されるものではないが、毎月の投与、または６ないし８週間後との投与を含む。
【０２２９】
当業者であれば、用量は、一般には、維持養生法と比較して、初期処置ではより高いおよび／またはより大きな投与頻度であることを認識するであろう。
【０２３０】
本発明の実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体はＢ細胞に結合し、かくして、（本明細書中に記載されているように）、Ｂ細胞のより効果的な（すなわち、より低い用量における）枯渇をもたらすことができる。患者のＢ細胞の表面でのヒトＣＤ１９の密度が高い場合より高い結合の程度が達成され得る。例示的な実施形態において、（所望により、医薬組成物の１部としての医薬上許容される担体中の）抗体の用量は、少なくとも約０．０００５、０．００１、０．０５、０．０７５、０．１、０．２５、０．３７５、０．５、１、２．５、５、１０、２０、３７．５、または５０ｍｇ／ｍ２および／または約５００、４７５、４５０、４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、６０、５０、３７．５、２０、１５、１０、５、２．５、１、０．５、０．３７５、０．１、０．０７５、または０．０１ｍｇ／ｍ２未満である。ある実施形態において、用量は約０．０００５ないし約２００ｍｇ／ｍ２の間、約０．００１および１５０ｍｇ／ｍ２の間、約０．０７５および１２５ｍｇ／ｍ２の間、約０．３７５および１００ｍｇ／ｍ２の間、約２．５および７５ｍｇ／ｍ２の間、約１０および約７５ｍｇ／ｍ２の間、および約２０および５０ｍｇ／ｍ２の間、関連する実施形態において用いる抗−ＣＤ１９抗体の用量は少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９，５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５ｍｇ／ｋｇ患者体重である。ある実施形態において、用いる裸の抗−ＣＤ１９抗体の用量は少なくとも約１ないし１０、５ないし１５、１０ないし２０、または１５ないし２５ｍｇ／ｋｇ患者体重である。ある実施形態において、用いる抗−ＣＤ１９抗体の用量は少なくとも約１ないし２０、３ないし１５、または５ないし１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。好ましい実施形態において、用いる抗−ＣＤ１９抗体の用量は少なくとも約５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇの患者体重である。ある実施形態において、（所望により、医薬組成物の一部としての医薬上許容される担体中の）抗体の単一投与単位は少なくとも約０．５、１、２、４、６、８、１０、１２、１４、１５、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、３００、３５０、３７５、または１５００マイクログラム／ｍ２とすることができる。ある実施形態において、用量は単一投与単位当たり１ｇまでである。
【０２３１】
前記用量の全ては例示的なものであって、本発明の組成物および方法と組み合わせて用いることができるが、抗−ＣＤ１９抗体を免疫抑制剤または抗−リンパ球剤と組み合わせて用いる場合には、前記したより低い用量が好ましい。ある実施形態において、患者がＣＤ１９密度野より低いレベルを有する場合、前記したより低い用量が好ましい。好ましい実施形態において、１以上の免疫抑制剤を含む治療養生法に本発明の１以上の抗−ＣＤ１９抗体を含めることは、抗−ＣＤ１９抗体組成物の不存在下で必要とされる用量よりも、１以上の免疫抑制剤のより低い用量を必要とする。
【０２３２】
キメラ抗−ＣＤ１９抗体を用いる本発明のある実施形態において、キメラ抗体の用量または量は、約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、または１６ｍｇ／ｋｇ患者体重よりも大きい。キメラ抗−ＣＤ１９抗体を用いる本発明の他の実施形態において、キメラ抗体の用量または量は、約１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、または０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重未満である。
【０２３３】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、本発明の抗体および／または組成物は、約３７５ｍｇ／ｍ２よりも低い用量にて；約３７．５ｍｇ／ｍ２よりも低い用量にて；約０．３７５ｍｇ／ｍ２よりも低い用量にて；および／または０．０７５ｍｇ／ｍ２および約１２５ｍｇ／ｍ２の間の用量にて投与することができる。本発明の方法の好ましい実施形態において、投与養生法反復間隔で投与される低い用量を含む。例えば、１つの実施形態において本発明の組成物は、ほぼ約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０，９０、１００、１２５、１５０、１７５、または２００日ごとの間隔で、約３７５ｍｇ／ｍ２よりも低い用量で投与することができる。
【０２３４】
特定の用量は、少なくとも約１、２、３、５、７、１０、１４、２０、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、または１８０日またはそれ以上の期間、本発明の組成物および方法を用いて治療したヒトにおいて、Ｂ細胞枯渇をもたらすことができる。ある実施形態において、（表面免疫グロブリンを発現しない）プレ−Ｂ細胞が枯渇される。ある実施形態において、（表面免疫グロブリンを発現する）成熟Ｂ細胞が枯渇される。他の実施形態において、Ｂ細胞の全ての非−悪性タイプは枯渇を呈することができる。Ｂ細胞のこれらのタイプのいずれかを用いて、Ｂ細胞枯渇を測定することができる。Ｂ細胞枯渇は血清のような体液中で、または骨髄のような組織において測定することができる。本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｂ細胞は、本発明の組成物および方法を用いる前に治療された患者におけるＢ細胞レベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％だけ枯渇される。本発明の方法の好ましい実施形態において、Ｂ細胞は、ヒトについての典型的な標準的Ｂ細胞レベルと比較して、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％だけ枯渇される。関連実施形態においてヒトについての典型的な標準的なＢ細胞レベルは、年齢、性別、体重および他の因子に関して治療された患者に匹敵する患者を用いて決定される。
【０２３５】
本発明のある実施形態において、約１２５ｍｇ／ｍ２以下の抗体または抗原−結合断片の用量は、少なくとも約７、１４、２１、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、または２００日の間のＢ細胞枯渇をもたらす。もう１つの代表的な実施形態において、約３７．５ｍｇ／ｍ２以下の用量は、少なくとも約７、１４、２１、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、または２００日の間、Ｂ細胞を枯渇させる。なお他の実施形態において、約０．３７５ｍｇ／ｍ２以下の用量は、少なくとも約７、１４、２１、３０、４５または６０日の間のＢ細胞の枯渇をもたらす。もう１つの実施形態において約０．０７５ｍｇ／ｍ２以下の用量は、少なくとも約７、１４、２１、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、または２００日の間のＢ細胞の枯渇をもたらす。なお他の実施形態において、約０．０１ｍｇ／ｍ２、０．００５ｍｇ／ｍ２または０．００１ｍｇ／ｍ２以下さえの用量は、少なくとも約３、５、７、１０、１４、２１、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、または２００日の間のＢ細胞の枯渇をもたらす。これらの実施形態によると用量はいずれかの適当な経路によって投与することができるが、所望により、皮下経路によっても投与される。
【０２３６】
もう１つの態様において、本発明は、Ｂ細胞枯渇が、現在利用できる方法で使用されるよりも抗体または抗体断片のより低い用量で達成することができるという発見を提供する。かくして、もう１つの実施形態において、本発明は、ヒト移植体受容体に、ＣＤ１９に特異的に結合する抗体の有効量を投与することを含む、Ｂ細胞を枯渇し、および／またはＧＶＨＤ液性拒絶、または移植後リンパ系障害を治療または予防する方法を提供し、ここに、約５００、４７５、４５０、４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、６０、５０、３７．５、２０、１０、５、２．５、１、０．５、０．３７５、０．２５、０．１、０．０７５、０．０５、０．００１、０．０００５ｍｇ／ｍ２以下の用量は、Ｂ細胞（循環および／または組織Ｂ細胞）の枯渇および／または少なくとも約３、５、７、１０、１４、２１、３０、４５、６０、７５、９０、１２０、１５０、１８０、または２００日以上の間の、少なくとも２５％、３５％、５０％、６０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％またはそれ以上の循環免疫グロブリンの枯渇をもたらす。代表的な実施形態において、約１２５ｍｇ／ｍ２または７５ｍｇ／ｍ２以下の用量は、Ｂ細胞の少なくとも約５０％、７５％、８５％、または９０％の枯渇、および／または約７、１４、２１、３０、６０、７５、９０、１２０、１５０、または１８０日の間の、循環免疫グロブリンの枯渇をもたらす。他の実施形態において、約５０、３７．５または１０ｍｇ／ｍ２の用量は、Ｂ細胞の少なくとも約５０％、７５％、８５％または９０％枯渇、および／または少なくとも約７、１４、２１、３０、６０、７５、９０、１２０または１８０日の間の循環免疫グロブリンの枯渇をもたらす。なお他の実施形態において、約０．３７５または０．１ｍｇ／ｍ２の用量は、Ｂ細胞の少なくとも約５０％、７５％、８５％、または９０％枯渇、および／または少なくとも約７、１４、２１、３０、６０、７５、または９０日の間の循環免疫グロブリンの枯渇をもたらす。さらなる実施形態において、約０．０７５、０．０１、０．００１、または０．０００５ｍｇ／ｍ２の用量は、Ｂ細胞の少なくとも約５０％、７５％、８５％、または９０％枯渇、および／または少なくとも約７、１４、２１、３０、または６０日の間の循環免疫グロブリンの枯渇ももたらす。
【０２３７】
本発明のある実施形態において、用量を上昇させ、または低下させて、血液において、または限定されるものではないが骨髄のような組織において一定の容量を維持することができる。関連実施形態において、用量は約２％、５％、８％、１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、および９５％だけ上昇させ、または低下させて、本発明の組成物および方法の抗体の所望のレベルを維持する。
【０２３８】
ある実施形態において、本発明は、エクスビボにて移植片を、Ｂ細胞および／またはＩｇを移植片から枯渇させるのに十分な量の本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物の１以上と接触させることを含む、Ｂ細胞を枯渇させる方法、および／または免疫グロブリン（Ｉｇ）を枯渇させ、および／またはＧＶＨＤまたは液性拒絶を治療または予防する方法を提供する。
【０２３９】
ある実施形態において、本発明の組成物および方法に対する患者の免疫原性応答に基づいて、用量を調整することができ、および／または注入速度を低下させることができる。
【０２４０】
本発明の方法の１つの態様によると、本発明の抗−ＣＤ１９抗体および／または組成物の負荷用量をまず投与し、続いて、治療すべきＧＶＨＤ、拒絶エピソードまたは移植後リンパ系増殖障害が緩和されるまで投与される維持用量を投与することができる。１つの実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体および／または組成物の負荷用量および／または維持用量に対して、１以上の免疫抑制剤または療法を含む規定された治療コースを続ける。
【０２４１】
本発明の方法のもう１つの態様によると、移植体受容体を本発明の組成物および方法で予め処置して、免疫脱感作し、免疫原性応答を最小化し、本発明の組成物および方法の有害効果を最小化することができる。
【０２４２】
（５．４．４  毒性テスト）
本発明の組成物および／または治療養生法の許容性、毒性および／または効率は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死である用量）、ＥＤ５０（集団の５０％において治療有効量）、ＩＣ５０（５０％阻害を達成するのに有効な用量）を決定するための細胞培養または実験動物における標準的な医薬手法によって決定することができる。好ましい実施形態において、用量は、循環Ｂ細胞または循環免疫グロブリン、または双方の少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％枯渇を達成するのに有効な用量である。毒性および治療効果の間の用量比率は治療指標であって、それは比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表すことができる。大きな治療指標を呈する療法が好ましい。毒性副作用を呈する療法を用いることができるが、そのような剤をＣＤ１９−発現細胞に標的化して、ＣＤ１９陰性細胞に対する潜在的損傷を最小化し、それにより、副作用を低下させる送達系を設計するのに注意を払うべきである。
【０２４３】
細胞培養アッセイおよび動物実験から得られたデータを、ヒトで用いるための組成物および／または治療養生法のある範囲の用量を処方するのに用いることができる。そのような剤の用量は、毒性をほとんどまたは全く伴わないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に好ましくは存在する。用量は、使用する投与形態、および利用する投与経路に依存して、この範囲内で変化することができる。本発明の方法で用いるいずれの療法でも、治療有効用量は、適当な動物モデルによって見積もることができる。動物モデルの種に依存して、用量は、例えば、Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ａｇｅｎｔｓ  ｉｎ  ｍｏｕｓｅ，ｒａｔ，ｍｏｎｋｅｙ，ｄｏｇ，ａｎｄ  ｈｕｍａｎ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，ＮＣＩ  １９６６  ４０：２１９−２４４によって供されるように、当該分野で認められた様式に従ってヒトの使用のための規模とする。細胞培養アッセイから得られたデータは、潜在的毒性を予測するのに有用であり得る。動物実験を用いて、特定の用量を処方して、細胞培養で決定したＩＣ５０（すなわち、徴候の半最大阻害を達成するテスト化合物の濃度）を含む循環血漿濃度範囲を達成することができる。そのような情報を用いて、ヒトにおいて有用な用量をより正確に決定することができる。血漿薬剤レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーＥＬＩＳＡによってまたは細胞ベースのアッセイによって測定することができる。
【０２４４】
（５．５  患者の診断および治療養生法）
本発明のある態様によると、本発明の組成物および方法で用いる治療養生法および用量は、例えば、患者を液性拒絶を発生する危険性におく臨床的発現、またはそのような拒絶が発生している臨床的証拠を含めた多数の因子に基づいて選択する。用語「液性」および「抗体−媒介」は本明細書中においては相互交換可能に用いる。
【０２４５】
患者が液性拒絶を発生する危険性を評価するための基準は、当該分野における知識および技量によって確立される。１つの実施形態において、陽性補体依存性細胞傷害または抗−グロブリン増強補体依存性細胞傷害クロスマッチは、患者が液性拒絶の高い危険性にあることを示す。１つの実施形態において、陽性クロスマッチまたは以前の陽性補体依存性脂肪傷害または抗−グロブリン増強補体依存性細胞傷害クロスマッチは、患者が液性拒絶に対して中程度の危険性があることを示す。１つの実施形態において、陰性クロスマッチは、患者が液性拒絶に対して低い危険性にあることを示す。
【０２４６】
適当な治療養生法は、特定の患者または患者集団に対して当業者によって決定され得る。特定の実施形態において、治療養生法は、移植前コンディショニング養生法、移植後維持養生法、あるいは急性または慢性拒絶に対する移植後治療養生法である。ある実施形態において、特定の養生法は、液性応答発生する低い危険性にあると評価される患者に対する養生法と比較して液性応答を発生する高いまたは中程度の危険性にあると評価される患者に対して変化させる。
【０２４７】
ある実施形態において、特定の養生法は、液性拒絶の段階に応じて変化させ、より攻撃的な療法が拒絶のより遅い段階において患者に示される。液性拒絶の段階は、当該分野における知識および技量に従って分類することができる。例えば、液性拒絶の段階は以下の基準に従って段階ＩないしＩＶの内の１つとして分類することができる；循環抗−ドナーアロ抗体特に抗−ＨＬＡ抗体によって特徴付けられる段階Ｉ潜在的応答；循環抗−ドナーアロ抗体、特に抗−ＨＬＡ抗体、およびＣ４Ｄ沈積によって特徴付けられるが組織学的変化または移植片機能不全を伴わない段階ＩＩサイレント反応；循環抗−ドナーアロ抗体、特に抗−ＨＬＡ抗体、Ｃ４ｄ沈積、および組織病理学によって特徴付けられるが、移植片機能不全を伴わない段階ＩＩＩ臨床下拒絶；循環抗−ドナーアロ抗体、特に抗−ＨＬＡ抗体、Ｃ４Ｄ沈積、組織病理学、および移植片機能障害によって特徴付けられる段階ＩＶ液性拒絶。
【０２４８】
用量応答曲線を当該分野で標準的なプロトコルを用いて作製して、特定の養生法で、例えば、移植に先立ってのコンディションによる養生法で、およびＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害の予防および治療のための移植後養生法で用いるための本発明の組成物の有効量を決定することができる。一般に、液性拒絶を発声する高い危険性がある患者、および拒絶の１以上の臨床的インジケータをすでに呈する患者は、高い危険性がない、または活性拒絶のいずれの適応症も呈しない患者と比較して長期間にわたって投与することができるより高い用量および／またはより頻繁な用量を必要とするであろう。
【０２４９】
本発明の抗−ＣＤ１９抗体、組成物および方法を実行して、単独で、または他の治療剤または治療養生法と組み合わせて、ＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害を治療することができる。ＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害の治療または予防のための他の治療養生法は、例えば、抗−リンパ球療法、ステロイド療法、抗体枯渇療法、免疫抑制療法、およびプラズマフォレシスを含むことができる。
【０２５０】
抗−リンパ球療法は、サイモグロブリンとも言われる抗−胸腺細胞グロブリンの移植体受容体への投与を含むことができる。抗−リンパ球療法は、Ｔ細胞表面抗原に対して向けられた１以上のモノクローナル抗体の投与を含むこともできる。そのような抗体の例は、限定されるものではないが、ＯＫＴ３ＴＭ（ムロモナブ−ＣＤ３）、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｈ（アレムツヅマブ）、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｇ、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ−１Ｍ、ＳＩＭＵＬＥＣＴＴＭ（バシリキシマブ）、およびＺＥＮＡＰＡＸＴＭ（ダクリズマブ）を含む。特別な実施形態において、抗−リンパ球療法は、限定されるものではないが、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（リツキシマブ）を含めたＢ細胞に対して向けられた１以上のさらなる抗体を含む。
【０２５１】
ステロイド療法はコロチゾル、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、デキサメタゾン、およびインドメタシンよりなる群から選択される１以上のステロイドの移植体受容体への投与を含むことができる。好ましくは、１以上のステロイドは、限定されるものではないが、コロチゾル、プレドニゾン、およびメチルプレドニゾロンを含めた、コルチコステロイドである。
【０２５２】
抗体枯渇療法は、例えば、静脈内免疫グロブリンの移植体受容体の投与を含むことができる。抗体枯渇療法は、移植に先立っての、エクスビボでの移植片に適応される免疫吸着療法を含むこともできる。免疫吸着は、いずれかの適当な技術、例えば、プロテインＡ親和性、または抗−ＣＤ３抗体、抗−ＣＤ１９抗体、抗−ＣＤ２０抗体、および抗−ＣＤ２２抗体のようなＴ細胞またはＢ細胞表面マーカーに対して向けられた抗体を用いる抗体ベースの親和性技術を用いて達成することができる。
【０２５３】
免疫抑制療法は、サイトカイン転写（例えば、サイクロスポリンＡ、タクロリムス）、ヌクレオチド合成（例えば、アザチオプリン、マイコフェノレートモフェチル）、成長因子シグナル伝達（例えば、シロリムス、ラパマイシン）、およびＴ細胞インターロイキン２受容体（例えば、ダクリズマブ、バキリキシマブ）の阻害剤のような１以上の免疫抑制剤の投与を含むことができる。特別な実施形態において、本発明の組成物および方法と組み合わせて用いられる免疫抑制剤は、以下の：アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、サイクロスポリンＡ（「ＣｙＡ」）、サイトキシン、フルダラビン、５−フルオログラシル、メトトレキサート、マイコフェノレートモフェチル（ＭＯＦＥＴＩＬ）、非ステロイド抗−炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、ラパマイシンおよびタクロリムス（ＦＫ５０６）の１以上を含む。免疫抑制剤は、補体の抑制剤、例えば、Ｂｕｅｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２００１  １６７：５３７５−８０）に記載された、可溶性補体受容体−１、抗−Ｃ５抗体、または小細胞阻害剤を含むこともできる。
【０２５４】
１つの実施形態において、本発明の組成物方法は、限定されるものではないが、タクロリムスおよびマイコフェノレートモフェチル療法、免疫吸着、静脈内免疫グロブリン療法、およびプラズマフェレシスを含めた液性拒絶を抑制するための１以上の治療養生法と組み合わされる。
【０２５５】
（５．５．１  診断および臨床基準）
本発明は、ヒト移植体受容体において、ＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植体後リンパ系増殖障害を治療および予防するための抗体、組成物および方法を提供する。本発明の組成物および方法は、移植体に対する必要性を生起させた特定の適応症にも拘らず用いることができる。同様に、ＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害の治療および予防の使用は、移植を意図したまたは移植された組織の特定のタイプによって制限されない。
【０２５６】
１つの実施形態において、本発明は、ヒト移植体受容体において液性拒絶を予防するための組成物および方法を提供し、ここに、移植体受容体は、液性拒絶を発生する増大した危険性がある患者または患者集団と定義される。そのような患者は「感作された」ということもできる。感作された患者の同定のための基準は、技量がある実行者に知られている。そのような基準は、例えば、検出可能なレベルの、ＨＬＡ抗原に対する循環抗体、例えば、抗−ＨＬＡアロ抗体を有する患者を含むことができる。そのような基準は、従前の移植、妊娠、または複数血液輸血を受けたことがある患者を含むこともある。液性拒絶に対して増大した危険性がある患者は、不完全なドナー受容体ＨＬＡマッチングを有するもの、およびＡＢＯ−不適合である移植も含む。感作された個体は、移植に先立った予備処理またはコンディショニングに対する好ましい候補である。感作された個体もまた、液性拒絶の予防用の移植後維持養生法についての好ましい候補である。
【０２５７】
１つの実施形態において、本発明の抗体、組成物および方法は、急性または慢性拒絶のための治療養生法を含む、またはそれと組み合わせて用いる。特別な実施形態において、該拒絶は段階Ｉ、段階ＩＩ、段階ＩＩＩ、または段階ＩＶ液性拒絶として特徴付けられる。
【０２５８】
１つの実施形態において、本発明の抗体、組成物および方法は、初期段階液性拒絶の治療のための治療養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。特別な実施形態において、初期段階液性拒絶は段階Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩ拒絶である。初期段階液性拒絶の臨床的適応症は当該分野における知識および技量によって決定され、これは、例えば、循環ドナー−特異的抗−ＨＬＡ抗体の患者における発生、移植片バイオプシンにおけるＣ４ｄおよびＣ３ｄ沈積のような抗体活性の補体マーカーの存在、および移植片バイオプシンにおける抗−ＨＬＡ抗体の存在を含むことができる。初期段階液性拒絶の他の適応症は技量がある実行者に知られており、これは、例えば、抗−内皮抗体、特に抗−ビメンチン交代の発生、および非古典的ＭＨＣクラスＩ−関連鎖Ａ（ＭＩＣＡ）アロ抗体の発生を含むことができる。
【０２５９】
１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、部分的には移植片機能不全によって特徴付けられる液性拒絶の治療のための治療養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。特別な実施形態において、液性拒絶のための治療を必要とする患者または患者集団は、移植片機能不全についての当該分野で知られた基準に従って同定される。移植片の特定のタイプについてのそのような基準の例は、以下のセクションに掲げる。他の実施形態において、液性拒絶についての治療を必要とする患者または患者集団は、組織学的基準のような、組織移植片のタイプに対して特別な他の基準に従って同定される。そのような基準の例も以下のセクションに掲げる。
【０２６０】
（５．５．１．１  骨髄移植体）
本発明の組成物および方法は、骨髄移植体受容体において、ＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害を治療または予防するのに有用である。１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、移植前コンディショニング養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。
【０２６１】
１つの実施形態において、本発明の組成物および方法を用いて、移植に先立って、骨髄移植片からＢ細胞を枯渇させる。移植片はいずれかの適当な源、例えば、血液幹細胞索、末梢血液幹細胞または骨髄穿刺からのものであってよい。抹消血液幹細胞は、適当なコンディショニング養生法に続いてドナー血液から収穫することができる。適当な養生法は当該分野で知られており、例えば、ドナー血液の収穫に先立って以下の１以上をドナーに投与することを含むことができる：ＮＥＵＰＯＧＥＮ、ＧＭ−ＣＳＦのようなサイトカイン、低容量化学療法養生法、およびケモカイン療法。移植片は、移植体受容体にとって同種異系またはオートロガスいずれかであってよい。移植片は異種移植片であってもよい。
【０２６２】
本発明の組成物および方法は、骨髄移植についての造血系適応症がある多数の関連で有用である。１つの実施形態において、オートロガス骨髄移植片は、Ｂ細胞白血病またはリンパ種、好ましくは急性リンパ芽球白血病（「ＡＬＬ」）または非−ホジキンリンパ腫について示され、本発明の組成物および方法は、移植片を汚染する残存悪性細胞の枯渇のために用いる。１つの実施形態において、オートロガス骨髄移植体は、ウイルス感染、例えば、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）に関連するウイルス感染を無くすことができない患者のために示され、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物および方法を用いて、ウイルスを保有するかもしれないＢ細胞の移植片を枯渇させる。もう１つの実施形態において、移植片は同種異系移植片であって、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物および方法は、ＧＶＨＤに対する予防として移植片からドナーＢ細胞を復活させるのに用いられる。
【０２６３】
１つの実施形態において、適応症はＢ細胞関連自己免疫疾患であり、本発明の組成物および方法を用いて、化学療法または放射線療法コンディショニング養生法の必要性なくして、患者から有害なＢ細胞を枯渇させる。１つの実施形態において、本発明の組成物は、化学療法または放射線療法養生法と組み合わせて投与され、その養生法は、本発明の組成物の不存在下で投与される用量よりも低い用量の１以上の化学治療剤、または低い用量の放射線を含む。１つの実施形態において、患者は、化学療法または放射線療法に続いてオートロガス骨髄移植片を受け、ここに、移植片は、本明細書中に記載された組成物および方法を用いて移植前に有害なＢ細胞が枯渇されている。
【０２６４】
骨髄移植体が必要な、またはそれが有益に見える患者または患者集団は、当該分野における知識および技量に従って同定される。骨髄移植のための候補であり得る患者の例は、癌または自己免疫疾患もしくは障害の治療のために化学療法または放射線療法を受けたことがある患者、および免疫系の細胞に存在するウイルス感染後除去できない患者を含む。
【０２６５】
（５．５．１．２  肝臓移植体）
本発明の組成物および方法は、肝臓移植体受容体においてＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害を治療または予防するのに有用である。特別な実施形態において、拒絶は急性または慢性拒絶である。１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、肝臓移植体受容体におけるＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害の予防で用いる。１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、移植前コンディショニング養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いる。１つの実施形態において、本発明の組成物は、移植体受容体に投与される。１つの実施形態において、本発明の組成物は移植に先立ってエクスビボにて移植体と接触させる。
【０２６６】
肝臓移植体は、当該分野における知識および技量に従って決定されたいずれの適当な源からのものであってもよい。１つの実施形態において、肝臓はＨＬＡにマッチした同種異系移植片である。もう１つの実施形態において、肝臓は、好ましくはブタドナーからの異種移植片である。１つの実施形態において、肝臓エクスビボで用いて、患者の血液を濾過する。例えば、体外灌流。体外灌流は、肝臓透析の形態であり、そこでは、患者は体外に維持された肝臓に外科的に連結される。この手法は、時々、「生体、人工肝臓」と言われる。この実施形態に従うと、本発明の組成物および方法を用いて、患者の血液を汚染するかも知れない肝臓抗原に対する抗体の発生を予防する。
【０２６７】
１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、ＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害の治療および予防のための改良された治療養生法を含む。特別な実施形態において、本発明の組成物および方法は改良された治療養生法を含み、ここに、該改良は、伝統的な免疫抑制剤に伴う合併症の減少した発生および／またはひどさに存在する。１つの実施形態において、腎臓毒性、肝臓毒性、および多毛症の発生および／またはひどさは、サイクロスポリンＡまたは他のカルシヌエリン阻害剤に頼る伝統的な養生法と比較して、低下する。１つの実施形態において、肥満、骨ジストロフィー、真性糖尿病の発生および／またはひどさ、および細菌およびウイルス感染に対する罹患性は、コルチコステロイドに頼る伝統的な養生法と比較して低下する。
【０２６８】
好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法は、抗−リンパ球抗体療法の不存在下で用いられる用量よりも低い用量の１以上の伝統的な免疫抑制剤と組み合わせて用いられる。好ましくは、より低い用量は、１以上の伝統的な免疫抑制剤に関連する１以上の合併症の減少した発生および／またはひどさをもたらす。
【０２６９】
肝臓移植体を必要とする、またはそれが有用なような患者または患者集団は、当該分野における知識および技量に従って同定される。肝臓移植についての候補であり得る患者の例は、以下の疾患、病気または障害の１以上を有する個人を含む：急性肝臓不全、アミロイドーシス、ビリルビン排出障害、胆道閉鎖症、バッド−キアーリ症候群、慢性活性自己免疫肝炎、（Ｂ型肝炎およびＣ型肝炎、アルコール性硬変、または原発性胆嚢硬変を含めたウイルス性肝炎いずれかに関連する）硬変、胆管炎、先天性第ＶＩＩＩまたはＩＸ因子障害、銅代謝障害、嚢胞性線維症、糖原形成、高コレステロール血症、リピドーシス、ムコ多糖症、原発性硬化性胆管炎、ポルフィリン代謝障害、プリンおよびピリミジン代謝障害、および肝臓および肝臓内胆管、胆嚢系、胆嚢通路、または消化系の原発性良性および悪性新生物。
【０２７０】
肝臓移植体を必要とする、またはそれから利益を受けるような患者または患者集団の同定のための臨床的な基準は、当該分野における知識および技量に従って決定することができる。そのような基準は、例えば、以下の徴候：疲労、体重喪失、上腹部疼痛、純度、黄疸、肝臓拡張、脱色された尿、上昇したアルカリ性フォスファターゼ、およびガンマグルタミルペプチダーゼ活性、上昇したビリルビンレベル、減少した血清アルブミン、上昇した肝臓−特異的酵素、低い胆汁生産、増加した血液尿素窒素、増大したクレアチニンおよび／または抗−好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）力価、再発静脈瘤出血、難治性腹水、自然発生細菌腹膜炎、難治性脳障害、重症黄疸、亢進された合成機能障害、突然の生理学的劣化、および激症肝不全の１以上を含む。
【０２７１】
（５．５．１．３  腎臓移植体）
本発明の組成物および方法は、腎臓移植体受容体においてＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害を治療または予防するのに有用である。本明細書中で用いる、用語「腎臓移植体」は腎臓の移植体、および腎臓および膵臓の組み合わせた移植体を含む。特別な実施形態において、拒絶は急性拒絶または慢性拒絶として特徴付けられる。
【０２７２】
１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は移植前コンディショニング養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。１つの実施形態において、本発明の組成物の１以上の単一用量は、患者または患者集団において、パネル反応性抗体を低下させ、およびＢ細胞を枯渇させるのに有効である。もう１つの実施形態において、本発明の組成物の１以上の複数用量は、患者または患者集団において、パネル反応性抗体を低下させ、およびＢ細胞を枯渇させるのに有効である。１つの実施形態において、本発明の組成物の１以上の単一用量は、１以上の免疫抑制剤と組み合わせて投与され、患者または患者集団において、パネル反応性抗体を低下させ、およびＢ細胞を枯渇させるのに有効である。
【０２７３】
ある実施形態において、本発明の組成物および方法は、腎臓移植体を受けた患者においてＧＶＨＤおよび移植片拒絶を治療または予防するためのものである。１つの実施形態において、患者は拒絶の臨床的徴候を未だ呈していない。関連する実施形態において、本発明の組成物および方法は、移植体受容体において、移植片拒絶の予防のための維持養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、臨床下液性拒絶の治療のためである。関連する実施形態において、臨床下液性拒絶のための治療を必要とする患者または患者集団は、移植片からのバイオプシーにおけるＣｄ４沈積の検出によって、または循環抗−ＨＬＡ抗体の検出によって示される。
【０２７４】
１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、移植体受容体において、急性または慢性拒絶エピソードの治療のための治療養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。１つの実施形態において、急性または慢性拒絶エピソードのための治療を必要とする患者または患者集団は、拒絶の１以上の臨床的インジケータの検出によって同定される。特別な実施形態において、拒絶の１以上の臨床的インジケータは、移植から１週間ないし６週間の後に検出される。１つの実施形態において、拒絶の１以上の臨床インジケータは、移植から６、１２、１８、２４、３６、４８、または６０月後に検出される。好ましい実施形態において、急性拒絶はバイオプシーで確認された急性液性拒絶である。
【０２７５】
１つの実施形態において、本発明の組成物の１以上は、急性拒絶の治療のための治療的養生法を含む。特別な実施形態において、治療養生法は、さらに、以下の：プラズマフォレシス、タクロリムス／マイクフェノレート、静脈内免疫ブログリン、プロテインＡでの免疫吸着、および抗−ＣＤ２０抗体の１以上を含む。１つの実施形態において、患者は、拒絶の発生に先立って免疫抑制プロトコルに付された。特別な実施形態において、免疫抑制プロトコルは、サイクロスポリン、アザチオプリン、およびステロイド療法の１以上を含む。
【０２７６】
急性液性拒絶の臨床的インジケータは、当該分野で知られており、例えば、腎臓機能の突然のひどい劣化、尿量過少症、および危うい腎臓灌流を含む。さらなるインジケータは、例えば、バイオプシーでの管周毛細管中の炎症細胞、および循環ドナー−特異的アロ抗体を含む。１つの実施形態において、患者は、腎臓同種移植片の液性拒絶についての以下の診断基準の１以上で表される：（１）急性組織負傷の形態学的証拠；（２）人工フィブリン様壊死におけるＣ４ｄ沈積または免疫ブログリンおよび補体のような抗体作用の証拠；および（３）ドナーＨＬＡ抗原またはドナー内皮抗原に対する検出可能な循環抗体。１つの実施形態において、患者は前記診断基準の全ての３つで表される。
【０２７７】
１つの実施形態において、患者は、急性液性拒絶の前記診断基準の１以上で表され、本発明の組成物は、以下の免疫抑制剤の１以上と組み合わせて用いられて、急性液性拒絶を治療する：静脈内免疫ブログリン、抗−胸腺細胞グロブリン、抗−ＣＤ２０抗体、マイコフェノレートモフェチル、またはタクロリムス。もう１つの実施形態において、本発明の組成物は、１以上の免疫抑制剤、およびプラズマフォレシスまたは免疫吸着のような患者からのアロ抗体の除去のための手法と組み合わせて用いられる。
【０２７８】
１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、慢性腎臓同種移植片拒絶の治療のための治療養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。１つの実施形態において、本発明の組成物の１以上は、単独で、あるいは例えば、抗−ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、タクロリムス、シロリムス、およびミゾリビンを含めた１以上の免疫抑制剤と組み合わせて用いられる。好ましい実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体の１以上を、タクロリムスおよびマイコフェノレートと組み合わせて用いる。
【０２７９】
腎臓における慢性拒絶の臨床インジケータは、当該分野で知られており、例えば、内膜単核細胞を伴う動脈内膜線維症（慢性同種移植片血管に障害）、糸球体基底膜の重複（慢性同種移植片糸球体障害）、管周基底膜のラミネーション、管周毛細管中のＣ４ｄ、および検出可能な循環ドナーＨＬＡ−反応性抗体を含むことができる。好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法は、移植片病巣が発生する前に慢性拒絶を治療するための治療養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。
【０２８０】
もう１つの実施形態において、治療を必要とする患者または患者集団は、移植体糸球体障害の１以上の慢性インジケータを有するものとして同定される。関連する実施形態において、本発明の組成物は、１以上の治療剤を含む治療養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。好ましい実施形態において、治療養生法は、腎臓機能を安定化させ、移植片拒絶を阻害するのに有効である。特別な実施形態において、１以上の治療剤は、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害剤および／または受容体アンタゴニスト、静脈内免疫ブログリン、抗−胸腺細胞グロブリン、抗−ＣＤ２０抗体、マイコフェノレートモフェチル、またはタクロリムスを含む。好ましくは、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、他の治療剤の有りまたは無しにて、マイコフェノレートモフェチルおよびタクロリムスと組み合わせて用いられる。プラズマフォレシスを治療養生法の一部として用いてもよい。
【０２８１】
腎臓移植体を必要とする、それから利益を受けるような患者または患者集団は、当該分野における知識および技量に従って同定される。腎臓移植についての候補であり得る患者の例は、アミロイドーシス、糖尿病（Ｉ型またはＩＩ型）、糸球体病（例えば、糸球体腎炎）、痛風、溶血性尿毒症症候群、ＨＩＶ、遺伝性腎臓病（例えば、多嚢胞腎臓病、先天性閉塞性尿路疾患、シスチン症、またはプルーンベリー症候群）、他の腎臓病（例えば、後天性閉塞性腎臓障害、急性管壊死、急性間隙性腎炎）、慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーテス、または鎌状赤血球貧血と診断された患者を含む。腎臓移植体についての他の候補は、インスリン欠乏症、高血圧、ひどい負傷または火傷、主要外科的処置、心臓病または心臓発作、肝臓病またか肝臓不全、血管病（例えば、進行性全身硬化症、腎臓動脈血栓、強皮症）、膀胱尿管逆流、およびある種の癌（例えば、偶然の癌腫、リンパ腫、多発性骨髄種、腎臓細胞癌腫、ウィルムス腫）を有する患者を含む。腎臓移植体についての他の候補は、たとえば、ヘロイン使用者、従前に膵臓移植片を拒絶した個人、および抗生物質サイクロスポリン、または化学療法を含む治療養生法を受けている個人を含むことができる。
【０２８２】
腎臓移植片を必要とする、またはそれから利益を受けるような患者または患者集団の胴体のための臨床的基準は、当該分野における知識および技量に従って決定することができる。そのような基準は、例えば、以下の：尿の問題、出血、容易な打撲傷、疲労、混乱、悪心および嘔吐、食欲減退、（貧血からの）青ざめた皮膚、筋肉、関節、脇腹部および胸における痛み、骨の痛みまたは骨折、および痒みの１以上を含むことができる。
【０２８３】
（５．５．１．４  心臓移植体）
本発明の組成物および方法は、心臓移植体受容体において、ＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害を治療または予防するのに有用である。特別な実施形態において、拒絶は急性または慢性拒絶である。１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、移植前コンディショニング養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。
【０２８４】
ある実施形態において、本発明の組成物および方法は、心臓移植体受容体において、急性液性拒絶のための治療養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。特別な実施形態において、治療養生法は、さらに、以下の：プラズマフォレシス、静脈内免疫グロブリン、および抗−ＣＤ２０抗体療法の１以上を含む。急性液性拒絶のための治療を必要とする患者または患者集団は、急性液性拒絶の臨床的適応症の１以上の検出によって同定される。急性液性拒絶の臨床的インジケータの例は以下の１以上を含むことができる：ショックによって規定される血液動力学機能不全、低血圧、減少した心拍数、および毛細管楔形肺動脈圧の上昇。特別な実施形態において、急性液性拒絶は、移植後６、１２、１８、２４、３６、４８、または６０月以内に診断される。
【０２８５】
１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、心臓移植体受容体において、拒絶の予防のための処置的養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。１つの実施形態において、拒絶に対する予防を必要とする移植体受容体は、以下の危険因子：女性の性、サイトメガロウイルス血清陽性、パネル反応性抗体に対する上昇した応答、陽性移植前および／または後クロスマッチ、および免疫抑制剤での予備的感作の１以上を有する患者または患者集団として定義される。
【０２８６】
１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、心臓移植体受容体における移植片劣化の治療または予防のためである。１つの実施形態において、移植片劣化のための治療、またはそれに対する予防を必要とする移植片受容体は液性拒絶の以下の臨床的適応症の１以上を有する患者または患者集団として定義される：毛細血管中での免疫グロブリン、Ｃ１ｑ、Ｃ３、および／またはＣ４ｄの沈積、毛細血管内のＣＤ６８−陽性細胞の証拠、およびバイオプシーに際しての炎症細胞による移植片の浸潤の証拠。１つの実施形態において、本発明の組成物は、以下の免疫抑制剤の１以上と組み合わせて用いて、心臓移植体受容体における移植片劣化を治療する：静脈内免疫グロブリン、抗−胸腺細胞グロブリン、抗−ＣＤ２０抗体、マイコフェノレートモフェチル、またはタクロリモス。もう１つの実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物は、１以上の免疫抑制剤、およびプラズマフォレシスまたは免疫吸着のような患者からのアロ抗体の除去のための手法と組み合わせて用いられる。
【０２８７】
１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、慢性心臓拒絶、好ましくは移植体冠動脈病とも言われる慢性同種移植片血管障害の治療のための治療養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。もう１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、危険性がある患者または患者集団において移植体冠動脈病の予防のための処置的養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。移植体冠動脈病を発生する危険性がある患者または患者集団を同定するための基準は当該分野で知られており、例えば、貧弱にマッチした移植体を有する患者、循環抗−ＨＬＡ抗体を発生する患者、および心臓移植体後早期の液性拒絶の１以上の臨床的適応症を発生する患者を含むことができる。
【０２８８】
心臓移植体を必要とする、またはそれから利益を受けるような患者または患者集団は、当該分野における知識および技量に従って同定される。心臓移植についての候補であり得る患者の例は、以下の病気および障害のいずれかと診断されたことのあるものを含む：冠動脈病、心筋障害（心臓の非炎症病）、鬱血性心不全に伴う心臓弁の病気、他の療法に応答しない生命を脅かす異常な心臓の律動、特発性心筋障害、虚血性心筋障害、拡張心筋障害、虚血性心筋障害、それに対して慣用的な療法は存在しない、またはそれに対して慣用的な療法は失敗した先天性心臓病。
【０２８９】
心臓移植体を必要とする、またはそれから利益を受けるような患者または患者集団の同定のための臨床的基準は当該分野における知識および技量に従って決定することができる。そのような基準は、例えば、以下の１以上を含むことができる：２５％未満の拍出割合難治性狭心症、または慣用的療法に対する悪性心臓不整脈無応答、および２ウッド単位未満の肺血管耐性。加えて、心臓移植体を必要とする患者または患者集団は、当該分野における知識および技量に従って一連のテストを行うことによって同定することができる。そのようなテストは、例えば、休止およびストレスエコカルジオグラム、ＥＫＧ、血液クレアチニンレベルのアッセイ、冠動脈アーテリオグラフィーおよび右側−および左側−心臓カテーテル処理を含めた心肺評価を含む。
【０２９０】
（５．５．１．５  肺移植体）
本発明の組成物および方法は、肺移植体受容体において、ＧＶＨＤ、液性拒絶、および移植後リンパ系増殖障害を予防および治療するのに有用である。特別な実施形態において、拒絶は急性または慢性拒絶として特徴付けられる。１つの実施形態において、本発明の組成物および方法は、移植前コンディショニング養生法を含み、またはそれと組み合わせて用いられる。
【０２９１】
肺移植体を必要とする、またはそれから利益を受けるような患者または患者集団は、当該分野における知識および技量に従って同定される。肺移植についての候補であり得る患者の例は以下の病気または疾患の１つを有する患者を含む：気管支拡張症、慢性閉塞性肺病、嚢胞性線維症、アイゼンメンガー症候群またはアイゼンメンガー症候群を伴う先天性肺病気腫、肺の好酸球肉芽腫、または原因不明性組織球増殖症、吸入−火傷外傷、リンパ管平滑筋腫症（ＬＡＭ）、原発性肺高血圧、肺線維症（肺の瘢痕）、またはサルコイドーシス。
【０２９２】
肺移植体を必要とする、またはそれから利益を受けるような患者または患者集団の同定のための臨床的基準は、当該分野における知識および技量に従って決定することができる。そのような基準は、例えば、以下の１以上を含むことができる：慢性閉塞性肺病（ＣＯＰＤ）、および以下のインジケータの１以上によって特徴付けられるアルファ１−抗トリプシン欠乏症気腫：予測される２５％未満のポスト気管支拡張剤ＦＥＶ１、休止低酸素血漿、すなわち、５５ないし６０ｍｍＨｇ未満のＰａＯ２、高炭酸ガス症、二次的肺高血圧、ＦＥＶ１の減衰の迅速な速度、または生命を脅かす亢進；以下のインジケータの１以上によって特徴付けられる嚢胞性線維症：予測される３０％未満のポスト気管支拡張剤ＦＥＶ１、休止低酸素症、高炭酸ガス症、または亢進の増大する頻度およびひどさ；以下のインジケータの１以上によって特徴付けられる特発性肺線維症：生命力（ＶＣ）および予測される６０ないし６５％未満のＴＬＣおよび休止低酸素症；医学的療法を受けている最中の臨床的ラジオグラフィー、生理学的進行によって特徴付けられる二次的肺高血圧；以下のインジケータの１以上によって特徴付けられる原発性肺高血圧：ＮＹＨＡ機能クラスＩＩＩまたはＩＶ、１０ｍｍＨｇよりも大きな平均右心房圧力、５０ｍｍＨｇよりも大きな平均肺動脈圧、２．５Ｌ／分／ｍ２未満の心臓指標、および長期プロスタサイクリン注入を伴う療法の失敗。
【０２９３】
（５．５．１．６  移植後リンパ系増殖障害）
成功した移植に必要な免疫抑制は、Ｂ細胞起源の移植後リンパ系増殖障害を引き起こしかねない。一般に、移植後リンパ系増殖障害にはエプスタイン−バールウイルス感染細胞が伴う。移植後リンパ系増殖障害（ＰＴＬＤ）は、良性自己制限性モノヌクレオーシス−様症候群ないし攻撃的非−ホジキンリンパ腫の酷さの範囲であり得る。本発明の組成物および方法を用いて、いずれかの移植体から生起するＰＴＬＤを治療することができる。好ましくは、移植体は個体器官移植体、例えば、心臓移植体、肝臓移植体、腎臓移植体、または組み合わされた膵臓−心臓移植体である。好ましい実施形態において、本発明の組成物および方法を用いて、他の免疫抑制療法の一時的休止または低下を含む治療養生法の一部としてＰＴＬＤを治療する。
【０２９４】
１つの実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物は以下の１以上を含めた治療養生法の一部として投与される：高用量静脈内ガンマグロブリン、サイトカイン、抗−ウイルス剤、および抗−ＣＤ２０モノクローナル抗体。好ましくは、治療養生法は免疫抑制療法の一時的停止または低下を含む。好ましい実施形態において、静脈内ガンマグロブリンは１ないし５日間、好ましくは３日間の０．４ｇ／ｋｇ日用量で投与され、サイトカインは少なくとも７日間投与されるインターフェロンアルファである。１つの実施形態において、１以上のサイトカインが養生法で用いられる。１つの実施形態において、１以上の抗−ウイルス剤が療法で用いられる。抗−ウイルス剤は当業者に知られたいずれかの適当な抗−ウイルス剤から選択することができる。１つの実施形態において、抗−ウイルス剤はアシクロビールまたはガンシクロビールである。好ましくは、抗−ウイルス剤は少なくとも１または２週間投与される。また、抗−ウイルス剤はより長い期間、例えば、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月または５ヶ月の間投与することもできる。
【０２９５】
（５．５．２  試料または対象におけるＣＤ１９密度の決定）
要求されるものではないが、ＣＤ１９密度についてのアッセイを使用して、さらに、患者の診断を特徴付けることができる。細胞に結合する抗体の密度を決定するための方法は、当業者に知られている（例えば、特異的ＣＤ抗原の細胞表面密度を評価する方法を開示するＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１６５：６６３５−６６４３（２０００）参照）。他の標準的な方法はスカチャード（Ｓｃａｔｃｈａｒｄ）分析を含む。例えば、抗体または断片を単離し、放射性標識し、放射性標識した抗体の特異的活性を測定することができる。次いで、抗体を、ＣＤ１９を発現する標的細胞と接触させる。細胞に関連する放射能を測定し、特異的活性に基づいて、細胞に結合した抗体または抗体断片の量を決定することができる。
【０２９６】
別法として、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）分析を使用することができる。一般に、抗体または抗体断片を、ＣＤ１９を発現する標的細胞に結合させる。次いで、抗体に結合する第二の試薬、例えば、フルオロクローム標識抗−免疫グロブリン抗体を加える。次いで、フルオロクローム染色を測定し、それを用いて、細胞に結合する抗体または抗体断片の密度を決定することができる。
【０２９７】
もう１つの適当な方法として、抗体または抗体断片は、フルオロフォアのような検出可能な標識で直接的に標識し、標的細胞に結合させることができる。蛋白質に対する標識の比を決定し、それに結合した既知量の標識を持つ標準ビーズと比較する。細胞に結合した標識の量の公知の標準との比較を用いて、細胞に結合した抗体の量を計算することができる。
【０２９８】
なおもう１つの態様において、本発明は、試料または個体において、ＣＤ１９の存在および／または密度をインビトロまたはインビボで検出する方法を提供する。これは、病気および治療の効果をモニターするのに、および投与すべき抗体の用量を決定し、調整するのにも有用であり得る。該インビボ方法は、ＰＥＴ（陽電子射出断層撮影法）またはＳＰＥＣＴ（単光子放射型コンピュータ断層撮影法）のようなイメージング技術を用いて行うことができる。別法として、共有結合したキレーターを用い、抗−ＣＤ１９抗体をインジウムで標識できよう。得られた抗体は、ＺＥＶＡＬＩＮＴＭ（インジウム標識抗−ＣＤ２０ｍＡｂ）（Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）を用いてＣＤ２０抗原をイメージするのと同様な方法で、標準ガンマカメラを用いてイメージすることができる。
【０２９９】
１つの実施形態において、該インビボ方法は、テストすべき試料を、本発明の抗体およびヒトＣＤ１９抗原の間の複合体の形成を可能とする条件下で、所望により対照試料と共に、本発明のヒト抗−ＣＤ１９抗体と接触させることによって行うことができる。次いで、（例えば、ＦＡＣＳ分析またはウェスタンブロッティングを用いて）複合体形成を検出する。テスト試料と共に対照試料を用いる場合、複合体は双方の試料において検出され、試料の間の複合体の形成のいずれかの統計学的に有意な差は、テスト試料におけるヒトＣＤ１９の存在を示す。
【０３００】
他の実施形態において、平均蛍光強度をＣＤ１９密度の尺度として用いることができる。そのような実施形態において、Ｂ細胞は患者から除去され、蛍光標識で標識されているＣＤ１９抗体で染色し、蛍光強度をフローサイトメトリーを用いて測定する。蛍光強度を測定し、Ｂ細胞当たりの強度の平均として表すことができる。そのような方法を用い、ＣＤ１９密度の代表である平均蛍光密度は、本発明の方法および組成物を用いる処置の前および後で、または患者およびＢ細胞での通常レベルのｈＣＤ１９の間の患者につき比較することができる。
【０３０１】
Ｂ細胞でのＣＤ１９発現の密度が決定されている患者において、ＣＤ１９の密度は、決定および／または用量の調整および／または本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体で用いる治療養生法に影響し得る。例えば、ＣＤ１９の密度が高い場合、ヒトにおいてあま余り効果的でなくＡＤＣＣを媒介する抗−ＣＤ１９抗体を用いるのが可能であろう。ある実施形態において、本発明の組成物および方法を用いて治療された患者が低いＣＤ１９密度を有する場合、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体のより高い用量を用いることができる。１つの実施形態において、本発明の組成物および方法を用いて治療された患者が低いＣＤ１９密度を有する場合、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体の低い用量を用いることができる。ある実施形態において、本発明の組成物および方法を用いて治療された患者が高いＣＤ１９密度を有する場合、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体のより低い用量を用いることができる。ある実施形態において、ＣＤ１９密度を患者におけるＣＤ２０密度と比較することができ、ＣＤ１９密度を、ヒトについての、または特定の患者集団についての平均ＣＤ１９密度と比較することができ、あるいはＣＤ１９密度を、療法に先立って、または自己免疫疾患または障害の開始に先立って、患者におけるＣＤ１９レベルと比較することができる。ある実施形態において、本発明の組成物および方法を用いて治療された患者は、ＣＤ１９がＢ細胞の表面に存在する自己免疫疾患または障害を有する。
【０３０２】
（５．６  免疫療法プロトコル）
本発明に従って、セクション５．６に記載された免疫療法プロトコルの各々は、セクション５．４．３に記載された投与の経路および方法、および用量を利用することができる。
【０３０３】
「抗−ＣＤ１９免疫療法」と本明細書中でいう治療養生法／プロトコルで用いる抗−ＣＤ１９抗体組成物は裸の抗体、免疫コンジュゲートおよび／または融合蛋白質であり得る。本発明の組成物は、単一剤療法として、あるいは他の治療剤または養生法と組み合わせて用いることができる。抗−ＣＤ１９抗体または免疫コンジュゲートは、１以上の治療剤の投与に先立って、それと同時に、またはその後に投与することができる。本発明の組成物での組み合わせ治療養生法で用いることができる治療剤は、細胞の機能を阻害し、または妨げ、および／または細胞の破壊を引き起こすいずれの物質も含む。好ましくは、該剤は、リンパ球の機能を阻害し、または妨げ、および／またはリンパ球の破壊を引き起こす。その例は、限定されるものではないが、サイトカイン転写の阻害剤（例えば、サイクロスポリンＡ、タクロリムス）、ヌクレオチド合成（例えば、アザチオプリン、マイコフェノレートモフェチル）、成長因子シグナル伝達（例えば、シロリムス、ラパマイシン）、およびＴ細胞インターロイキン２受容体（例えば、ダクリズマブ、バシリキシマブ）のような免疫抑制剤を含む。好ましい実施形態において、免疫抑制剤は以下の：アドリアマイシン、アザチオプリン、ブスルファン、シクロホスファミド、サイクロスポリンＡ（ＣｙＡ）、サイトキシン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、メトトレキサート、マイコフェノレートモフェチル（ＭＯＦＥＴＩＬ）、非ステロイド抗−炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、ラパマイシン、およびタクロリムス（ＦＫ５０６）の１以上を含む。他の例は、放射性同位体、化学療法剤、ならびに細菌、真菌、植物または動物起源の酵素的に活性なトキシンのようなトキシン、またはその断片を含む。
【０３０４】
本明細書中に記載された治療養生法、または所望の治療養生法は、天然ＣＤ１９抗原に加えて、またはその代わりに、ヒトＣＤ１９抗原を発現するセクション６．２において以下に記載するマウスモデルのようなトランスジェニック動物モデルを用いて効率についてテストすることができる。かくして、抗−ＣＤ１９抗体治療養生法を動物モデルでテストして、ヒトへの投与の前に有効性を決定することができる。
【０３０５】
（５．６．１  抗−ＣＤ１９免疫療法）
本発明に従うと、「抗−ＣＤ１９免疫療法」は、本明細書中に記載された治療養生法のいずれかに従った、本発明の抗−ＣＤ１９抗体のいずれかの投与を含む。抗−ＣＤ１９抗体は裸の抗体、免疫コンジュゲートまたは融合蛋白質として投与することができる。
【０３０６】
抗−ＣＤ１９免疫療法は、ＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害の治療または予防のための単一剤治療剤としての抗−ＣＤ１９抗体の投与を含む。抗−ＣＤ１９免疫療法は、ＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害を発生する増大した危険性があるヒト患者を治療する方法を含む。抗−ＣＤ１９免疫療法は、段階によって特徴づけられてきたＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害の初期段階を持つヒト患者を治療する方法を含む。抗−ＣＤ１９免疫療法は、段階によって特徴付けられてきたＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害の後期段階を持つヒト患者を治療する方法を含む。抗−ＣＤ１９免疫療法は、抗−ＣＤ１９抗体がＡＤＣＣ、ＣＤＣまたはアポトーシスを媒介する、ＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害を治療または予防する方法を含む。抗−ＣＤ１９免疫療法は、ＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害を治療する方法を含み、ここに、抗−ＣＤ１９抗体は、患者がＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害のためのいずれかの他の治療を受ける前に投与される。
【０３０７】
好ましい実施形態において、ＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害を経験しているヒト対象は、抗−ＣＤ１９抗体を投与することによって治療することができる。ある実施形態において、抗−ＣＤ１９抗体は、好ましくはヒトＡＤＣＣを媒介するヒトまたはヒト化抗体である。ＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害の初期段階の場合には、（マウスおよびキメラ抗体を含めた）好ましくはＡＤＣＣを媒介するいずれの抗−ＣＤ１９抗体もヒト対象で用いることができ；しかしながら、ヒトおよびヒト化抗体が好ましい。
【０３０８】
ＩｇＧ１またはＩｇＧ３ヒトイソタイプの抗体が療法で好ましい。しかしながら、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４ヒトイソタイプを用いることができ、但し、それらはヒトＡＤＣＣを媒介するものとする。そのようなエフェクター機能は、インビトロまたはインビボにてエフェクター細胞によって標的細胞溶解を媒介する問題とする抗体の能力を測定することによって評価することができる。
【０３０９】
用いる抗体の用量は、受容体において、循環Ｂ細胞を枯渇させ、または移植片からＢ細胞を枯渇させ、または循環免疫グロブリン（Ｉｇ）を枯渇させるか、あるいは受容体において循環Ｂ細胞および免疫グロブリンを共に枯渇させるのに十分であるべきである。療法の進行は、血液試料を分析することによって患者においてモニターすることができる。臨床的改良の他の徴候を用いて、療法をモニターすることができる。
【０３１０】
本発明の組成物および方法に関連して用いることができるＢ細胞およびＩｇの枯渇を測定する方法は当該分野で良く知られており、限定されるものではないが、以下の実施形態を含む。１つの実施形態において、循環Ｂ細胞枯渇は、特異的にＢ細胞に結合し、それにより、それを同定し、数えるのを可能とする抗−ＣＤ１９抗体以外の試薬を用いてフローサイトメトリーで測定することができる。他の実施形態において、血液中のＢ細胞およびＩｇレベルは、標準血清分析を用いてモニターすることができる。そのような実施形態において、Ｂ細胞枯渇は、Ｂ細胞によって生産されることが知られている抗体に対する量を規定することによって間接的に測定される。次いで、その抗体のレベルをモニターして、Ｂ細胞の枯渇および／または機能的枯渇を決定する。もう１つの実施形態において、Ｂ細胞枯渇は、Ｂ細胞を同定するための免疫化学染色によって測定することができる。そのような実施形態において、患者から抽出されたＢ細胞または組織、あるいはＢ細胞を含む血清を顕微鏡スライドにのせ、標識し、存在または不存在について調べることができる。関連する実施形態において、療法に先立って、および療法の後に抽出されたＢ細胞の間で比較を行って、Ｂ細胞の存在の差を決定する。
【０３１１】
抗−ＣＤ１９抗体を単一剤療法として投与する本発明の実施形態において、本発明では、異なる治療養生法の使用が考えられる。治療養生法は、養生法が移植前コンディショニング、移植後維持、または急性または慢性拒絶の移植後治療について示されるか否かに依存して１以上の治療サイクルを含むことができる。特定の養生法は、患者が液性応答を発生する高い、中程度、または低い危険性があると評価されるか否かにも依存し得る。拒絶の関係では、移植片に対する液性応答の見掛けの段階は、選択された治療養生法に影響し得る。好ましくは、移植前コンディショニングでは、単一サイクルを投与する。単一サイクルは受容体に、または移植片にあるいは受容体および移植片双方に投与してもよい。ＧＶＨＤ、液性拒絶、またはリンパ系増殖障害の移植後維持または予防では、好ましくは、複数サイクルが投与される。拒絶エピソードの治療では、好ましくは、単一高用量サイクルが投与され、続いて、単独で、または他の治療養生法と組み合わせて１以上のより低い用量が投与される。他の治療養生法は、例えば、Ｔ細胞またはＢ細胞に向けられた１以上の抗生物質、抗生物質、抗−ウイルス剤、抗体枯渇療法、または免疫抑制剤を含むことができる。もし１を超えるサイクルが必要とされるならば、いずれかの２つの治療サイクルの間の時間を固定し、または可変として、ＧＶＨＤ、液性拒絶、またはリンパ系増殖障害を発生する患者の危険性評価を含めた、患者−特異的差を収容することができ、あるいは患者における液性拒絶の段階は拒絶で既に示されている。他の患者−特異的差は、例えば、療法に対する応答性、薬物許容性、回復時間、ファルマコキネティック（ＰＫ）パラメーター、および／または薬理学的応答を含む。例えば、ある実施形態において、いずれかの２つの治療サイクルの間の時間は約２、４、６、８または１０日；２月、４月、８月、１２月、１８月、または２４月であり得る。ある実施形態において、いずれかの２つの治療サイクルの間の時間は約１、３、５、７、または９日；１月、３月、５月、９月、１１月、１７月、１９月、２１月、または２５月であり得る。ある実施形態において、いずれかの２つの治療サイクルの間の時間は約２ないし４、３ないし５、６ないし８、７ないし９、８ないし１０、９ないし１１、１０ないし１２、１１ないし１３、１２ないし１４、１３ないし１５、１４ないし１６、１５ないし１７、１６ないし１８、１７ないし１９、１８ないし２０、１９ないし２１、２０ないし２２、２１ないし２３、または２２ないし２４月であり得る。ある実施形態において、いずれかの２つの治療サイクルの間の時間は、約２４月である。
【０３１２】
サイクル当たりの本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物の注射の数は固定し、または可変としてＧＶＨＤ、液性拒絶、またはリンパ系増殖障害を発生する患者の危険性評価を含めた、患者−特異的差を可能とすることができ；あるいは患者における液性拒絶の段階は既に拒絶で示されている。他の患者−特異的差は、例えば、療法に対する応答性、薬物許容性、回収時間、ＰＫパラメーター、および／または薬理学的応答を含む。ある実施形態において、サイクル当たりの注射の数は１、２、３、４、５、または６注射であり得る。ある実施形態において、サイクル当たりの注射の数は１注射である。
【０３１３】
いずれかの注射では、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物の投与される用量を固定し、または可変として、初期薬物負荷を可能とし、および／または質量、体表面積、病気活動、病気応答性、薬物許容性、回復時間、ＰＫパラメーターおよび／または薬理学的応答の患者−特異的差を説明することができる。ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物の注射当たりの投与される用量は約０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重、０．３ｍｇ／ｋｇ患者体重、約１．０ｍｇ／ｋｇ患者体重、２．０ｍｇ／ｋｇ患者体重、約４．０ｍｇ／ｋｇ患者体重、または１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物の注射当たりの投与される用量は約０．１ないし０．３、０．３ないし０．５、０．５ないし０．７、０．７ないし０．９、０．９ないし１．１、１．１ないし１．３、１．３ないし１．５、１．５ないし１．７、１．７ないし１．９、１．９ないし２．１、２．１ないし２．３、２．３ないし２．５、２．５ないし２．７、２．７ないし２．９、２．９ないし３．１、３．１ないし３．３、３．３ないし３．５、３．５ないし３．７、３．７ないし３．９、３．９ないし４．１、４．１ないし４．３、４．３ないし４．５、４．５ないし４．７、４．７ないし４．９、４．９ないし５．１、５．１ないし５．３、５．３ないし５．５、５．５ないし５．７、５．７ないし５．９、５．９ないし６．１、６．１ないし６．３、６．３ないし６．５、６．５ないし６．７、６．７ないし６．９、６．９ないし７．１、７．１ないし７．３、７．３ないし７．５、７．５ないし７．７、７．７ないし７．９、７．９ないし８．１、８．１ないし８．３、８．３ないし８．５、８．５ないし８．７、８．７ないし８．９、８．９ないし９．１、９．１ないし９．３、９．３ないし９．５、９．５ないし９．７、９．７ないし９．９、または９．９ないし１０．１ｍｇ／ｋｇ患者体重である。ある実施形態において、注射当たりの投与される用量は約０．３ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０３１４】
もし１を超える注射が必要であれば、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物のいずれかの２つの注射の間の時間を固定し、または可変とし、ＧＶＨＤ、液性拒絶、またはリンパ系増殖障害を発生する患者危険性評価を含めた患者−特異的差を収容することができ；あるいは患者における液性拒絶の段階はすでに拒絶で示されている。他の患者−特異的差は、例えば、病気活動、療法に対する病気応答性、薬物許容性、回復時間、ＰＫパラメーター、および／または薬理学的応答を含む。ある実施形態において、いずれかの２つの注射の間の時間は約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３２、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、または４５日である。ある実施形態において、いずれかの２つの注射の間の時間は、約１ないし３、１ないし５、１ないし１０、１ないし１５、１ないし２０、１ないし２５、１ないし３０、１ないし３５、１ないし４０、または１ないし４５日である。ある実施形態において、いずれかの２つの注射の間の時間は１日である。
【０３１５】
本発明のある態様によると、本発明の組成物および方法で用いる抗−ＣＤ１９抗体は裸の抗体である。関連実施形態において、用いる裸の抗−ＣＤ１９抗体の用量は少なくとも約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５ｍｇ／ｋｇ患者体重である。ある実施形態において、用いる裸の抗−ＣＤ１９抗体の用量は少なくとも約１ないし１０、５ないし１５、１０ないし２０、または１５ないし２５ｍｇ／ｋｇ患者体重である。ある実施形態において、用いる裸の抗−ＣＤ１９抗体の用量は少なくとも約１ないし２０、３ないし１５、または５ないし１０ｍｇ／ｋｇ患者体重である。好ましい実施形態において、用いる裸の抗−ＣＤ１９抗体の用量は少なくとも約５、６、７、８、９、または１０ｍｇ／ｋｇの患者体重である。
【０３１６】
ある実施形態において、用量は４ないし８連続週間の間に毎週投与される抗−ＣＤ１９抗体の約３７５ｍｇ／ｍ２を含む。ある実施形態において、用量は、４ないし８連続週の間、毎週投与される、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ｍｇ／ｋｇ患者体重である。
【０３１７】
前記した抗−ＣＤ１９抗体の例示的な用量はセクション５．４．３に記載したように投与することができる。１つの実施形態において、前記用量は単一−用量注射または注入である。他の実施形態において、用量は一定期間に渡って投与される。他の実施形態において、用量は一定期間に渡って複数回投与される。該期間は日、月または週間で測定できる。抗−ＣＤ１９抗体の複数用量を、毒性副作用をバランスさせつつ治療効果を達成するのに適した間隔で投与することができる。例えば、複数用量を用いる場合、間隔を、抗体での反復治療に先立って患者の単球カウントの回復を可能とするような時間にするのが好ましい。この投与養生法は治療の効率を最適化するであろう。というのは、単球集団は患者におけるＡＤＣＣ機能を反映するからである。
【０３１８】
ある実施形態において、本発明の組成物は、患者が療法に対して応答性である限り、ヒト患者に投与される。他の実施形態において、本発明の組成物は、ＧＶＨＤまたは拒絶エピソードがおさまるまで、ヒト患者に投与される。もう１つの実施形態において、本発明の組成物は移植片機能が実質的に回復するまでヒト患者に投与され、次いで、患者は、もう１つの拒絶エピソードが示されるまで本発明の組成物は投与されない。１つの実施形態において、本発明の組成物は、リンパ系増殖障害が、循環Ｂ−リンパ球の数の低下、および／または循環免疫グロブリンのレベルの低下によって示して、軽減されるまでヒト患者に投与される。例えば、患者は約４ないし８週間、前記用量のいずれかで治療することができ、その間に、患者は病気の進行についてモニターされる。もし病気の進行が停止し、または逆行するならば、患者が再発し、すなわち、治療される病気が再度起こり、または進行するまで、本発明の組成物は患者に投与されない。この再発または進行に際して、患者は、最初に用いられた同一投与養生法にて、または前記した他の用量を用いて再度治療することができる。
【０３１９】
ある実施形態において、本発明の組成物は、負荷用量、続いて、一定期間にわたっての複数のより低い用量（維持用量）として投与することができる。そのような実施形態において、用量はタイミングを計ることができ、量を調整して、効果的なＢ細胞枯渇を維持することができる。好ましい実施形態において、負荷用量は約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、または１８ｍｇ／ｋｇ患者体重であり、維持用量は少なくとも約５ないし１０ｍｇ／ｌｋｇ患者体重である。好ましい実施形態において、維持用量は７、１０、１４または２１日ごとの間隔で投与される。維持用量は、毒性が示されるまで、血小板カウントが減少するまで、ＧＶＨＤまたは拒絶の証拠がなくなるまで、患者が抗−ＣＤ抗体組成物に対する免疫応答を生じるまで、あるいは病気が末期状態まで進行するまで無限に継続することができる。なお他の実施形態において、本発明の組成物は、病気が最終段階まで進行するまでヒト患者に投与される。
【０３２０】
患者の循環単球レベルが治療養生法の一部としてモニターされる本発明の実施形態において、投与される抗−ＣＤ１９抗体の用量を間隔を空けて、単球カウントの回復を可能とすることができる。例えば、本発明の組成物は８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０日毎の間隔で投与することができる。
【０３２１】
抗−ＣＤ１９抗体がトキシンとコンジュゲートされ、またはトキシンと組み合わされて投与される本発明の実施形態において、当業者であれば、抗−ＣＤ１９抗体の用量はトキシン用量に基づいて調整することができ、およびトキシン用量は用いるべきトキシンの特定のタイプに依存することを認識するであろう。典型的には、トキシンを用いる場合、抗−ＣＤ１９抗体の用量は、裸の抗−ＣＤ１９抗体で用いる用量未満であろう。適当な用量は、当該分野でよく知られた技術を用いて特定のトキシンに対して決定することができる。例えば、用量範囲実験を行って、トキシンと共に投与し、またはトキシンにコンジュゲートされる場合の、抗−ＣＤ１９抗体の最大許容用量を決定することができる。
【０３２２】
（５．６．２  免疫調節剤との組合せ）
本発明の抗−ＣＤ１９免疫療法は、１以上の免疫調節剤と組み合わせて用いることができる。このアプローチにおいて、キメラ化抗体の使用が好ましく；ヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体の使用が最も好ましい。組合せ療法についての本発明で用いるように、用語「免疫調節剤」とは、宿主の免疫系を抑制し、マスクし、または増強するように作用する物質をいう。
【０３２３】
免疫調節剤の例は、限定されるものではないが、サイトカイン、ペプチド、および抗体（例えば、ヒト、ヒト化、キメラ、モノクローナル、ポリクローナル、Ｆｖｓ、ＳｃＦｖｓ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２断片またはエピトープ結合断片）のような蛋白質性剤、核酸分子（例えば、アンチセンス核酸分子、ｉＲＮＡおよび三重ラセン）、小分子、有機化合物、および無機化合物を含む。特に、免疫調節剤は、限定されるものではないが、メトトレキサート、レフルノミド、シクロホスファミド、サイトキサン、イムラン、サイクロスポリンＡ、ミノサイクリン、アザチオプリン、抗生物質（例えば、ＦＫ５０６（タクロリムス））、メチルフレドニゾロン（ＭＰ）、コルチコステロイド、ステロイド、マイコフェノレートモフェチル、ラパマイシンン（シロリムス）、ミゾリビン、デオキシスペルギアリン、ブレキナール、マロニトリロアミンド（例えば、レフルナミド）、Ｔ細胞受容体モジュレーター、およびサイトカイン受容体モジュレーターを含む。免疫抑制剤の例は、限定されるものではないが、マイコフェノレートモフェチル（ＣＥＬＬＣＥＰＴＴＭ）、Ｄ−ペニシラニン（ＣＵＰＲＩＭＩＮＥＴＭ、ＤＥＰＥＮＴＭ）、メトトレキサート（ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸＴＭ、ＴＲＥＸＡＬＬＴＭ）、およびヒドキシクロロキン硫酸（ＰＬＡＱＵＥＮＩＬＴＭ）を含む。
【０３２４】
免疫調節剤は、サイトカインの生産を抑制し、自己−抗原発現をダウンレギュレートし、または抑制し、あるいはＭＨＣ抗原をマスクする物質を含む。そのような剤の例は２−アミノ−６−アリール−５−置換ピリミジン（米国特許第４，６６５，０７７号）、アザチオプリン（またはアザチオプリンに対して有害反応があれば、シクロホスファミド）；ブロモクリプチン；（米国特許第４，１２０，６４９号）に記載されているように、ＭＨＣ抗原をマスクする）グルタルアルデヒド；ＭＨＣ抗原およびＭＨＣ断片についての抗−イディオタイプ抗体；サイクロスポリンＡ；グルココルチコステロイド、例えば、プレドニゾン、メチルプレドニゾロン、およびデキサメタゾンのようなステロイド；抗−インターフェロン−γ、−βまたは−α抗体を含めたサイトカイン、またはサイトカイン受容体アンタゴニスト；抗−腫瘍壊死因子−α抗体；抗−腫瘍壊死因子−β抗体；抗−インターロイキン−２抗体および抗−ＩＬ−２受容体抗体；抗−Ｌ３Ｔ４抗体；異種抗−リンパ球グロブリン；汎−Ｔ細胞抗体、好ましくは抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ−３結合ドメインを含有する可溶性ペプチド（１９９０年７月２６日に公開されたＷＯ  ９０／０８１８７）；ストレプトキナーゼ：ＴＧＦ−β；ストレプトドルナーゼ；宿主からのＲＮＡまたはＤＮＡ；ＦＫ  ５０６；ＲＳ−６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞受容体（米国特許第５，１１４，７２１号）；Ｔ細胞受容体断片（Ｏｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５１：４３０−４３２（１９９１）；ＷＯ  ９０／１１２９４；ａｎｄ  ＷＯ  ９１／０１１３３）；およびＴ１０Ｂ９のようなＴ細胞受容体抗体（ＥＰ  ３４０，１０９）を含む。
【０３２５】
サイトカインの例は、限定されるものではないが、リンホカイン、モノカイン、および伝統的なポリペプチドホルモンを含む。サイトカインの中にはヒト成長ホルモン、Ｎ−メチオニルヒト成長ホルモン、およびウシ成長ホルモンのような成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；シロキシン；インスリン；プロインスリン；レラキシン；プロレラキシン；卵胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体ホルモン（ＬＨ）のような糖蛋白質ホルモン；肝臓成長ホルモン；線維芽細胞成長ホルモン；プロラクチン；胎盤ラクトーゲン；腫瘍壊死因子−α；ムレリアン−阻害物質；マウスゴナドトロピン−関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮成長ホルモン；インテグリン；トロンボポエチン（ＴＰＯ）；ＮＧＦ−αのような神経成長因子；血小板−成長因子；ＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−αのようなトランスフォーミング成長因子（ＴＧＦ）；インスリン−様成長因子−Ｉおよび−ＩＩ；エリスロポエチン（ＥＰＯ）；骨誘導因子；インターフェロン；マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）；顆粒球−マクロファージ−ＣｇＰ（ＧＭ−ＣＳＰ）；および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）；ＩＬ−１、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５，ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５のようなインターロイキン（ＩＬ）；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−βのような腫瘍壊死因子；およびＬＩＦおよびキットリガンド（ＫＬ）を含めた他のペプチド因子が含まれる。本明細書中で用いるように、用語「サイトカイン」は、天然源からの、または組換え細胞培養からの蛋白質、および天然配列サイトカインの生物学的活性同等体を含む。ある実施形態において、該方法はさらに、対象に１以上の免疫変調剤、好ましくはサイトカインを投与することを含む。好ましいサイトカインはインターロイキン−１（ＩＬ−１）、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５，ＩＬ−１８、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、トロンボポエチンおよびγインターフェロンよりなる群から選択される。
【０３２６】
ある実施形態において、免疫変調剤はサイトカイン受容体モジュレーターである。サイトカイン受容体モジュレーターの例は、限定されるものではないが、可溶性サイトカイン受容体（例えば、ＴＮＦ−α受容体の細胞外ドメイン、またはその断片、ＩＬ−１β受容体の細胞外ドメイン、またはその断片、およびＩＬ−６受容体の細胞外ドメイン、またはその断片）、サイトカインまたはその断片（例えば、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β）、インターフェロン（ＩＦＮ）−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、およびＧＭ−ＣＳＦ）、抗−サイトカイン受容体抗体（例えば、抗−ＩＬ−２受容体抗体、抗−ＩＬ−４受容体、抗−ＩＬ−６受容体抗体、抗−ＩＬ−１０受容体抗体、および抗−ＩＬ−１２受容体抗体）、抗−サイトカイン抗体（例えば、抗−ＩＦＮ受容体抗体、および抗−ＴＮＦ−α抗体、抗−ＩＬ−１β抗体、抗−ＩＬ−６抗体、および抗−ＩＬ−１２抗体）を含む。特別な実施形態において、サイトカイン受容体モジュレーターはＩＬ−４、ＩＬ−１０、またはその断片である。もう１つの実施形態において、サイトカイン受容体モジュレーターは抗−ＩＬ−１  β抗体、抗−ＩＬ−６抗体、抗−ＩＬ−１２受容体抗体、およびＴＮＦ−α抗体である。もう１つの実施形態において、サイトカイン受容体モジュレーターはＴＮＦ−α受容体の細胞外ドメインまたはその断片である。ある実施形態において、サイトカイン受容体モジュレーターはＴＮＦ−αアンタゴニストではない。
【０３２７】
ある実施形態において、免疫調節剤はＴ細胞受容体モジュレーターである。Ｔ細胞受容体モジュレーターの例は、限定されるものではないが、抗−Ｔ細胞受容体抗体（例えば、抗−ＣＤ４抗体（例えば、ｃＭ−Ｔ４１２（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ）、ＩＤＥＣ−ＣＥ９．１（登録商標）（ＩＤＥＣおよびＳＫＢ）、ｍＡＢ  ４１６２Ｗ９４、オルトクローン（ＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅおよびＯＫＴｃｄｒ４ａ（Ｊａｎｓｓｅｎ−Ｃｉｌａｇ）、抗−ＣＤ３抗体、抗−ＣＤ５抗体（例えば、抗−ＣＤ５リシン−結合免疫コンジュゲート）、抗−ＣＤ７抗体（例えば、ＣＨＨ−３８０（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、抗−ＣＤ８抗体、抗−ＣＤ４０リガンドモノクローナル抗体、抗−ＣＤ５２抗体（例えば、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ（Ｉｌｅｘ））、抗−ＣＤ２モノクローナル抗体）、およびＣＴＬＡ４−免疫グロブリンを含む。
【０３２８】
ある実施形態において、免疫変調剤はＴＮＦ−αアンタゴニストである。ＴＮＦ−αアンタゴニストの例は、限定されるものではないが、抗生物質（例えば、インフリキシマブ（ＲＥＭＩＣＡＤＥＴＭ；Ｃｅｎｔｏｃｏｒ）、Ｄ２Ｅ７（Ａｂｂｏｔｔ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ／Ｋｎｏｌｌ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏ．，Ｍｔ．Ｏｌｉｖｅ，ＮＪ）、ＨＵＭＩＲＡＴＭおよびＣＤＰ−８７０（共にＣｅｌｌｔｅｃｈ／Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｓｌｏｕｇｈ，Ｕ．Ｋ．）としても知られているＣＤＰ５７１およびＴＮ３−１９．１２（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：２７６２−２７６６；Ｔｈｏｒｂｅｃｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７３７５−７３７９））、可溶性ＴＮＦ−α受容体（例えば、ｓＴＮＦ−Ｒ１（Ａｍｇｅｎ）、エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬＴＭ；Ｉｍｍｕｎｅｘ）およびそのラットホモログＲＥＮＢＲＥＬＴＭ、ＴＮＦｒＩ、ＴＮＦｒＩＩ（Ｋｏｈｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：８３３１−８３３５）、およびＴＮＦ−α  Ｉｎｈ（Ｓｅｃｋｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７：５１８８−５１９２）に由来するＴＮＨα由来の可溶性阻害剤）、ＩＬ−１０、ＴＮＦＲ−ＩｇＧ（Ａｓｈｋｅｎａｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１０５３５−１０５３９）、マウス生成物ＴＢＰ−１（Ｓｅｒｏｎｏ／Ｙｅｄａ）、ワクチンＣｙｔｏＴＡｂ（Ｐｒｏｔｈｅｒｉｃｓ）、アンチセンス分子１０４８３８（ＩＳＩＳ）、ペプチドＲＤＰ−５８（ＳａｎｇＳｔａｔ）、サリドマイド（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＣＤＣ−８０１（Ｃｅｌｇｅｎｅ）、ＤＰＣ−３３３（Ｅｕｐｏｎｔ）、ＶＸ−７４５（Ｖｅｒｔｅｘ）、ＡＧＩＸ−４２０７（ＡｔｈｅｒｏＧｅｎｉｃｓ）、ＩＴＦ−２３５７（Ｉｔａｌｆａｒｍａｃｏ）、ＮＰＩ−１３０２１−３１（Ｎｅｒｅｕｓ）、ＳＣＩＯ−４６９（Ｓｃｉｏｓ）、ＴＡＣＥ  ｔａｒｇｅｔｅｒ（Ｉｍｍｕｎｉｘ／ＡＨＰ）、ＣＬＸ−１２０５００（Ｃａｌｙｘ）、Ｔｈｉａｚｏｌｏｐｙｒｉｍ（Ｄｙｎａｖａｘ）、アウラノフィン（Ｒｉｄａｕｒａ）（ＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｅｅｃｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉａｌｓ）、キナクリン（メパクリンジクロロ水和物）、フィニダップ（Ｅｎａｂｌｅｘ）、Ｍｅｌａｎｉｎ（Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、およびＵｒｉａｃｈによる抗−ｐ３８  ＭＡＰＫ剤を含む。
【０３２９】
これらの免疫調節剤は本発明の抗−ＣＤ１９抗体と同時に、または別々の時点で投与され、当該分野で記載されたものと同一またはそれ未満の用量で用いられる。好ましい免疫調節剤は、例えば、処置が予防的であるか否か、またはそれがＣＶＨＤまたは移植片拒絶の初期または後期段階を治療するものであるか、またはならびに患者の病歴を含めた多くの因子に依存するが、一般的な総じての優先性が、該剤がサイクロスポリンＡ、グルココルチコステロイド（最も好ましくは、プレドニゾンまたはメチルプレドニゾロン）、ＯＫＴ−３モノクローナル抗体、アザチオプリン、ブロモクリプリン、異種抗−リンパ球グロビン、またはその混合物から選択されることである。
【０３３０】
（５．６．３  抗−炎症剤および療法との組合せ）
本発明の抗−ＣＤ１９抗体、組成物および方法は１以上の抗−炎症剤と組み合わせることができる。いずれの抗−炎症剤も当業者によく知られており、本発明の組成物および方法で用いることができる。
【０３３１】
非−炎症剤の非限定的例は、非ステロイド抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、ステロイド抗炎症薬、ベータ−アゴニスト、抗−コリン作動性剤、およびメチルキサンチンを含む。ＮＳＡＩＤの例は、限定されるものではないが、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ（ＣＥＬＥＢＲＥＸＴＭ）、ジクロフェナック（ＶＯＬＴＡＲＥＮＴＭ）、エドロラック（ＬＯＤＩＮＥＴＭ）、フェノプロフェン（ＮＡＬＦＯＮＴＭ）、インドメタシン（ＩＮＤＯＣＩＮＴＭ）、ケトララック（ＴＯＲＡＤＯＬＴＭ）、オキサプロジン（ＤＡＹＰＲＯＴＭ）、ナブメントン（ＲＥＬＡＦＥＮＴＭ）、スリンダック（ＣＬＩＮＯＲＩＬＴＭ）、トルメンチン（ＴＯＬＥＣＴＩＮＴＭ）、レフェコキシブ（ＶＩＯＸＸＴＭ）、ナプロキセン（ＡＬＥＶＥＴＭ、ＮＡＰＲＯＳＹＮＴＭ）、ケトプロフェン（ＯＲＵＤＩＳＴＭおよびＡＣＴＲＯＮＴＭ）、ナブメトン（ＲＥＬＡＦＥＮＴＭ）、ジクロフェナック＆ミソプロストル（ＡＲＴＨＲＯＴＥＣＴＭ）、イブプロフェン（ＭＯＴＲＩＮＴＭ、ＡＤＶＩＬＴＭ、ＮＵＰＲＩＮＴＭ）、ケトロラック（ＴＯＲＡＤＯＬＴＭ）、バルデコキシブ（ＢＥＸＴＲＡＴＭ）、メロキシカム（ＭＯＢＩＣＴＭ）、フルルビプロフェン（ＡＮＳＡＩＤＴＭ）、およびピロキシカム（ＦＥＬＤＥＮＥＴＭ）を含む。そのようなＮＳＡＩＤは、シクロオキシゲナーゼ酵素（例えば、ＣＯＸ−１および／またはＣＯＸ−２）を阻害することによって機能する。
【０３３２】
ステロイド抗炎症薬の例は、限定されるものではないが、グルココルチコイド、デキサメタゾン（ＤＥＣＡＤＲＯＮＴＭ）、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、プレドミゾン（ＤＥＬＴＡＳＯＮＥＴＭ）、プレドニゾロン、トリアムシノロン、アズルフィジン、ならびにプロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエンのようなエイコサノイドを含む。
【０３３３】
病気−修飾抗−リウマチ薬物（ＤＭＡＲＤ）は、本発明の組成物および方法の抗−ＣＤ１９抗体と組み合わせて用いることもできる。ＤＭＡＲＤは、免疫系を抑制し、炎症を減少させることによって働くが、ＤＭＡＲＤは他の薬物との比較をもたらすことを示すのに時間がかかる。ＤＭＡＲＤの例は、限定されるものではないが、ヒドロキシクロロキン（ＰＬＡＱＵＥＮＩＬＴＭ）、クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮＴＭ）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮＴＭ）、レフルノミド（ＡＲＡＶＡＴＭ）、メトトレキサートおよびサイクロスポリン（ＮＥＯＲＡＬＴＭ）を含む。
【０３３４】
ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９免疫療法は抗−炎症療法と組み合わせることができる。そのような療法の比限定的例は、プロテイン−Ａ免疫吸着療法である。この療法に従うと、患者の血液を濾過して、抗体、および炎症を促進する免疫抗体を除去する。この濾過は当業者によく知られた方法によって達成することができる。
【０３３５】
これらの抗−炎症剤および療法は本発明の抗−ＣＤ１９抗体と同時に、または別々の時間に投与され、本明細書中に記載したのと同一またはより低い用量で使用される。好ましい抗−炎症剤は、処置が予防的であるか否か、またはＧＶＨＤまたは移植片拒絶の初期または後期段階を治療すべきか否か、またはならびに患者の病歴を含めた多くの因子に依存するであろう。
【０３３６】
（５．６．４  治療抗生物質との組合せ）
本発明の抗−ＣＤ１９抗体、組成物および方法は、限定されるものではないが、（例えば、米国特許出願公開番号２００５／００７０６９３、米国特許第５，４８４，８９２号、米国出願シリアル番号１０／３７１，７９７の米国特許出願公開番号２００４／０００１８２８で、米国出願シリアル番号１０／３７２，４８１の米国特許出願公開番号２００３／０２０２９７５、および米国仮出願シリアル番号６０／４２０，４７２に記載されている；その各々の全内容は、ＣＤ２２抗原および抗−ＣＤ２２抗体の教示のためにここに引用する）抗−ＣＤ１９抗体、抗−ＣＤ２０抗体、抗−ＣＤ５２抗体、および抗−ＣＤ２２抗体を含めた１以上の他の抗体と組み合わせて投与することができる。抗体は好ましくはモノクローナル抗体である。１つの実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体、組成物および方法は、ＲＩＴＵＸＡＮＴＭ（Ｃ２Ｂ８；ＲＩＴＵＸＩＭＡＢＴＭ；ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）のような抗−ＣＤ２０抗体と組み合わせて投与される。本発明の抗体と組み合わせて用いられることができる、または本発明の組成物で用いることができる治療抗体の他の例は、限定されるものではないが、ＨＥＲＣＥＰＴＩＮＴＭ（Ｔｒａｓｔｕｚｕｍａｂ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＭＹＬＯＴＡＲＧＴＭ（Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂ  ｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ；Ｗｙｅｔｈ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＣＡＭＰＡＴＨＴＭ（Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ；Ｂｅｒｌｅｘ）、ＺＥＶＡＬＩＮＴＭ（Ｉｐｒｉｔｕｍｏｍａｂ  ｔｉｕｘｅｔａｎ；Ｂｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ）、ＢＥＸＸＡＲＴＭ（Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｃｏｒｉｘａ）、ＥＲＢＩＴＵＸＴＭ（Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ；Ｉｍｃｌｏｎｅ）、ＡＶＡＳＴＩＮＴＭ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ；Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、およびＬｙｍｐｈｏＳｔａｔＴＭ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含む。
【０３３７】
ある実施形態において、抗−ＣＤ１９および抗−ＣＤ２０および／または抗−ＣＤ２２抗体を、いずれかの適当な比率にて、所望により同一医薬組成物中で投与することができる。説明すると、抗−ＣＤ１９および抗−ＣＤ２０抗体の比率は約１０００：１、５００：１、２５０：１、１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：５００、または１：１０００以上の比率とすることができる。同様に、抗−ＣＤ１９および抗−ＣＤ２２抗体の比率は約１０００：１、５００：１、２５０：１、１００：１、９０：１、８０：１、７０：１、６０：１、５０：１、４０：１、３０：１、２０：１、１９：１、１８：１、１７：１、１６：１、１５：１、１４：１、１３：１、１２：１、１１：１、１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１、１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７、１：１８、１：１９、１：２０、１：３０、１：４０、１：５０、１：６０、１：７０、１：８０、１：９０、１：１００、１：２５０、１：５００、または１：１０００以上の比率であり得る。
【０３３８】
（５．６．５  単球またはマクロファージ機能を増強する化合物との組合せ）
本発明の方法のある実施形態において、単球またはマクロファージ機能を増強する化合物（例えば、少なくとも約２５％、５０、７５％、８５％、９０％、９５％以上）を抗−ＣＤ１９免疫療法と組み合わせて用いることができる。そのような化合物は当該分野で知られており、限定されるものではないが、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１２）、およびインターフェロン（例えば、アルファまたはガンマ感染）のようなサイトカインを含む。
【０３３９】
単球またはマクロファージの機能または増強を増強させる化合物は、抗体、免疫コンジュゲートまたは抗原−結合断片として同一の医薬組成物に処方することができる。別々に投与する場合、抗体−断片および化合物は（相互から数時間以内に）同時に投与することができ、同一の療法のコースの間に投与することができ、あるいは順次に投与することができ、すなわち、患者はまず抗体／断片処置のコース、次いで、マクロファージ／単球機能増強させ、またその逆である化合物のコースを受ける）。そのような実施形態において、単球またはマクロファージの機能を増強させる化合物は、本発明の他の治療養生法および／または組成物での処置に先立って、それと同時に、またはその後にヒト対照に投与される。１つの実施形態においてヒト対象は、ヒトについての正常な範囲内にある血液白血球、単球、好中球、リンパ球および／または好塩基球カウントを有する。ヒト血液白血球（合計）についての正常な範囲は約３．５ないし約１０．５（１０９／Ｌ）である。ヒト血液好中球についての正常な範囲は約１．７ないし約７．０（１０９／Ｌ）であり、単球についての正常な範囲は約０．３ないし約０．９（１０９／Ｌ）であり、リンパ球についての正常な範囲は約０．９ないし約２．９（１０９／Ｌ）であり、好塩基球の正常な範囲は約０ないし約０．３（１０９／Ｌ）であって、好酸球の正常な範囲は約０．０５ないし約０．５（１０９／Ｌ）である。他の実施形態において、ヒト対象は、ヒトについての正常な範囲未満である血液白血球カウント、例えば、少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、または０．８（１０９／Ｌ）白血球を有する。
【０３４０】
本発明のこの実施形態は本発明の抗体、免疫コンジュゲートまたは抗体断片にて、または当該分野で公知の他の抗体にて実施することができ、抗−ＣＤ１９、抗−ＣＤ２０および／または抗−ＣＤ２２抗体療法に対して耐性である対象（例えば、Ｃ２Ｂ８のような現存の抗体での療法）、化学療法で現在治療されている、あるいは従前に治療されたことがある対象Ｂ細胞障害において再発したことがある対象、免疫寛容である対象、またはそうでなければマクロファージまたは単球機能が損なわれた対象で特に適している。療法に対して耐性である、あるいは自己免疫疾患または障害が再発した患者の罹患率は、少なくとも部分的には、マクロファージまたは単球の機能の損傷に帰すことができる。かくして、本発明は、抗−ＣＤ１９抗体および抗原−結合断片を投与する方法と組み合わせて用いるべき、ＡＤＣＣおよび／またはマクロファージおよび／または単球機能を増強させる方法を提供する。
【０３４１】
（５．６．６  化学治療剤との組合せ）
（裸の抗体、免疫コンジュゲート、または融合蛋白質を用いる）抗−ＣＤ１９免疫療法は、限定されるものではないが、化学療法、放射線免疫療法（ＲＩＴ）、化学療法および外部ビーム放射線（組み合わせた様式の療法、ＣＭＴ）、または組み合わせた様式の放射線免疫療法（ＣＭＲＩＴ）単独、またはその組合せ等を含めた他の療法と組み合わせて用いることができる。ある好ましい実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体療法は、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド−ヒドロキシドキソルビシン−オンコビン（ビンクリスチン）−プレドニゾロン）と組み合わせて投与することができる。本明細書中で用いるように、用語「と組み合わせて投与される」とは、抗−ＣＤ１９免疫療法が使用される他の療法前に、間に、または引き続いて投与することができることを意味する。
【０３４２】
ある実施形態において、抗−ＣＤ１９免疫療法は、細胞傷害性放射性核種または放射線治療同位体と組み合わせられる。例えば、２２５ＡＣ、２２４ＡＣ、２１１Ａｔ、２１２Ｂｉ、２１３Ｂｉ、２１２Ｐｂ、２２４Ｒａ、または２２３Ｒａのようなアルファ線放射同位体。別法として、細胞傷害性放射性核種は１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、９０Ｙ、１３１Ｉ、６７Ｃｕ、１７７Ｌｕ、１５３Ｓｍ、１６６Ｈｏ、または６４Ｃｕのようなベータ線放射同位体であり得る。さらに、細胞傷害性放射性核種はオージェ電子および低エネルギー電子を放射でき、同位体１２５Ｉ、１２３Ｉまたは７７Ｂｒを含む。他の実施形態において、同位体は１９８Ａｕ、３２Ｐ等であり得る。ある実施形態において、対象に投与される放射性核種の量は約０．００１ｍＣｉ／ｋｇおよび約１０ｍＣｉ／ｋｇの間である。
【０３４３】
いくつかの好ましい実施形態において、対象に投与される放射性核種の量は約０．１ｍＣｉ／ｋｇおよび約１．０ｍＣｉ／ｋｇの間である。他の好ましい実施形態において、対象に投与される放射性核種の量は約０．００５ｍＣｉ／ｋｇおよび０．１ｍＣｉ／ｋｇの間である。
【０３４４】
ある実施形態において、抗−ＣＤ１９免疫療法は化学的トキシンまたは化学治療剤と組み合わせられる。好ましくは、化学トキシンまたは化学療法剤はカリケアミシンおよびエスペラミジンのようなエネジイン；ドゥオカルマイシン、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シス−白金、エトポシド、ブレオマイシンおよび５−フルオロウラシルよりなる群から選択される。
【０３４５】
抗−ＣＤ１９免疫療法との組合せ療法で用いることができる適当な化学トキシンまたは化学療法剤は、カリケアミシンおよびエスペラミシンのような分子のエネジインファミリーのメンバーを含む。化学トキシンはドゥオカルマイシン（例えば、米国特許第５，７０３，０８０号および米国特許第４，９２３，９９０号）、メトトレキサート、ドキソルビシン、メルファラン、クロラムブシル、ＡＲＡ−Ｃ、ビンデシン、マイトマイシンＣ、シス−白金、エトポシド、ブレオマイシンおよび５−フルオロウラシルよりなる群から取ることもできる。化学療法剤の例はアドリアマイシン、ドキソルビシン、５−フルオロウラシル、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、シクロホスファミド、チオテパ、タキソテール（ドセタキセル）、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキサート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファミド、マイトマイシンｃ、マイトキサントロン、ビンクレイスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラミシン（米国特許第４，６７５，１８７号）、メルファランおよび他の関連ナイトロジェンマスタードも含む。
【０３４６】
他の実施形態において、例えば、「ＣＶＢ」（１．５ｇ／ｍ２シクロホスファミド、２００ないし４００ｍｇ／ｍ２エトポシド、および１５０ないし２００ｍｇ／ｍ２カルムスチン）を本発明の組合せ療法で用いることができる。他の適当な組合せ化学治療養生法は当業者によく知られている。例えば、Ｆｒｅｅｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｏｎ−Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ  Ｌｙｍｐｈｏｍａｓ，”ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｖｏｌｕｍｅ２，３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｈｏｌｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），ｐｐ．２０２８−２０６８（Ｌｅａ  ＆  Ｆｅｂｉｇｅｒ  １９９３）参照。他の適当な組合せ化学療法養生法はＣ−ＭＯＰＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プロカルバジンおよびプレドニゾン）、ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾン）、ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾンおよびロイコボリン）、およびＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシンおよびロイコボリン）を含む。さらなる有用な薬物は酪酸フェニルおよびブロスタチン−１を含む。好ましい多様式療法において、化学治療薬物およびサイトカイン双方は本発明に従って抗体、免疫コンジュゲートまたは融合蛋白質と共投与される。該サイトカイン、化学治療薬物および抗体、免疫コンジュゲートまたは融合蛋白質はいずれかの順序で、または一緒に投与することができる。
【０３４７】
本発明の組成物および方法で用いるのに好ましい他のトキシンは毒性レシチン、リシンのような植物トキシン、アブリン、モデクシン、ボツリナおよびジフテリアトキシンを含む。もちろん、種々のトキシンの組合せを１つの抗体分子にカップリングさせ、それにより、可変細胞傷害を収容することもできる。本発明の組合せ療法で適切に使用されるトキシンの例は、リシン、アブリン、リボヌクレアーゼ、ＤＮａｓｅ  Ｉ、ブドウ球菌エンテロトキシン−Ａ、アメリカヤマゴボウ抗−ウイルス蛋白質、ゲロニン、ジフテリアトキシン、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエキソトキシン、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓエンドトキシンである。例えば、Ｐａｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，４７：６４１（１９８６），ａｎｄ  Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃｉａｎｓ，４４：４３（１９９４）参照。用いることができる酵素的に活性なトキシンおよびその断片はジフテリアＡ鎖、ジフテリアトキシンの非−結合活性断片、（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａからの）エキソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデクシンＡ鎖、アルファ−サルシン、Ａｌｅｕｒｉｔｅｓ  ｆｏｒｄｉｉ蛋白質、ジアンチン蛋白質、Ｐｈｙｔｏｌａｃａ  ａｍｅｒｉｃａｎａ蛋白質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、およびＰＡＰ−Ｓ）、ｍｏｍｏｒｄｉｃａ  ｃｈａｒａｎｔｉａ阻害剤、クリシン、クロチン、ｓａｐａｏｎａｒｉａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ阻害剤、ゲロニン、マイトゲリン、レストリクトシン、フェモマイシン、エノマイシンおよびトリコテセンを含む。例えば、１９９３年１０月２８日に公開されたＷＯ  ９３／２１２３２参照。
【０３４８】
適当なトキシンおよび化学治療剤はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９ｔｈ  Ｅｄ．（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９９５）、およびＧｏｏｄｍａｎ  ａｎｄ  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，７ｔｈ  Ｅｄ．（ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．１９８５）に記載されている。他の適当なトキシンおよび／または化学治療剤は当業者に知られている。
【０３４９】
本発明の抗−ＣＤ１９免疫療法は、プロドラッグ（例えば、ペプチジル化学治療剤、ＷＯ  ８１／０１１４５参照）を活性な抗癌薬物に変換するプロドラッグ−活性化酵素と組み合わせることもできる。例えば、ＷＯ  ８８／０７３７８および米国特許第４，９７５，２７８号参照。そのような組合せの酵素成分は、プロドラッグに作用して、それにより、活性な細胞傷害性形態に変換できるいずれの酵素も含む。本出願で用いる用語「プロドラッグ」とは、親薬物と比較して腫瘍細胞に対してあまり細胞傷害性でなく、かつ酵素的に活性化され、あるいはより活性な親形態に変換できる医薬上活性な物質の前駆体または誘導体形態をいう。例えば、Ｗｉｌｍａｎ，“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ“Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ，１４，ｐｐ．３７５−３８２，６１５ｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ  Ｂｅｌｆａｓｔ（１９８６）ａｎｄ  Ｓｔｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．“Ｐｒｏｄｒｕｇｓ：Ａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ｔｏ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，”Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄ．），ｐｐ．２４７−２６７，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ（１９８５）参照。本発明の抗−ＣＤ１９抗体と組み合わせて用いることができるプロドラッグは、限定されるものではないが、ホスフェート−含有プロドラッグ、チオホスフェート−含有プロドラッグ、スルフェート−含有プロドラッグ、ペプチド−含有プロドラッグ、Ｄ−アミノ酸−修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、α−ラクタム−含有プロドラッグ、所望により置換されていてもよいフェノキシアセタミド−含有プロドラッグ、または所望により置換されていてもよいフェニルアセタミド−含有プロドラッグ、５−フルオロシトシン、およびより活性な細胞傷害性遊離薬物に変換することができる他の５−フルオロウリジンプロドラッグを含む。本発明で用いられるプロドラッグ形態に誘導体化することができる細胞傷害性薬物の例は、限定されるものではないが、前記した化学治療剤を含む。
【０３５０】
ある実施形態において、本発明の組成物および方法の投与は、毒性療法の遅延を可能とすることができ、不必要な副作用および化学療法に伴う合併症の危険性を回避するのを助けることができ、および化学療法に対する耐性の発達を遅延させることができる。ある実施形態において、毒性療法および／または毒性療法に対する耐性は、本発明の組成物および方法を投与される患者において遅延され、約６ヶ月、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０年まで遅延される。
【０３５１】
（５．６．７  他の治療剤との組合せ）
ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体および細胞傷害性剤を含む融合蛋白質は、例えば、組換え技術またはペプチド合成によって作製することができる。
【０３５２】
尚もう１つの実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９抗体は、腫瘍プレ標的化で利用するための（ストレプトアビジンのような）「受容体」にコンジュゲートさせることができ、ここに、アンタゴニスト−受容体コンジュゲートは患者に投与され、続いて、除去剤を用いて循環から未結合コンジュゲートが除去され、次いで、治療剤（例えば、放射性ヌクレオチド）にコンジュゲートされた「リガンド」（例えば、ビオチン）が投与される。
【０３５３】
ある実施形態において、治療養生法は、本発明の抗−ＣＤ１９抗体組成物の細胞傷害性効果を緩和する化合物を含む。そのような化合物は鎮痛剤（例えば、アセトアミノフェン）、ビスホスホネート、抗ヒスタミン（例えば、クロルフェニラミンマレイン酸）、およびステロイド（例えば、デキサメタゾン、レチノイド、デルトイロ、ベタメタゾン、コルチゾル、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラロコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）を含む。
【０３５４】
ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９免疫療法と組み合わせて用いる治療剤は小分子（すなわち、約２５００ダルトン未満の分子量を有する無機または有機化合物）である。例えば、小分子のライブラリーはＳｐｅｃｓ  ａｎｄ  ＢｉｏＳｐｅｃｓ  Ｂ．Ｖ．（Ｒｉｊｓｗｉｊｋ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）、Ｃｈｅｍｂｒｉｄｇｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、Ｃｏｍｇｅｎｅｘ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．（Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）、およびＭａｙｂｒｉｄｇｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｌｔｄ．（Ｃｏｒｎｗａｌｌ  ＰＬ３４  ＯＨＷ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）から商業的に入手することができる。
【０３５５】
ある実施形態において、抗−ＣＤ１９免疫療法は抗菌剤と組み合わせて投与することができる。抗菌剤の非限定的例は、細菌感染を阻害しおよび／または低下させ、細菌の複製を阻害しおよび／または低下させ、または他の細胞または対象への細菌の拡大を阻害および／または低下させる蛋白質、ポリペプチド、ペプチド、融合蛋白質、抗体、核酸分子、有機分子、無機分子、および小分子を含む。抗菌剤の具体的例は、限定されるものではないが、ペニシリン、セファロスポリン、イミペナム、アクストレオナム、バンコマイシン、シクロセリン、バシトラシン、クロラムフェニコール、エリスロマイシン、クリンダマイシン、テトラサイクリン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、ゲンタマイシン、アミカシン、カナマイシン、ネオマイシン、スペクチノマイシン、トリメトプリム、ノルフロキサシン、リファンピン、ポリミキシン、アンフォテリシンＢ、ミスタチン、テトコナゾール、イソニアジド、メトロニダゾール、およびペンタミジンのような抗生物質を含む。
【０３５６】
ある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９免疫療法は、抗−真菌剤と組み合わせて投与することができる。抗−真菌剤の具体的な例は、限定されるものではないが、アゾール薬物（例えば、ミコナゾール、ケトコナゾール（ＮＩＺＯＲＡＬ（登録商用））、カスポフンギン酢酸（ＣＡＮＤＩＤＡＳ（登録商標））、イミダゾール、トリアゾール（例えば、降るコナゾール（ＤＩＦＬＵＣＡＮ（登録商標）））、およびイトラコナゾール（ＳＰＯＲＡＮＯＸ（登録商標）））、トリエン（例えば、ミスタチン、アンフォテリシンＢ（ＦＵＮＧＩＺＯＮＥ（登録商標））、アンフォテリシンＢ脂質複合体（「ＡＢＬＣ」）（ＡＢＥＬＣＥＴ（登録商標））、アンフォテリシンＢコロイド分散液（「ＡＢＣＤ」）（ＡＭＰＨＯＴＥＣ（登録商標））、リポソームアンフォテリシンＢ（ＡＭＢＩＳＯＮＥ（登録商標）））、ヨウ化カリウム（ＫＩ）、ピリミジン（例えば、フルシトシン（（ＡＮＣＯＢＯＮ（登録商標）））、およびボリコナゾール（ＶＦＥＮＤ（登録商標））を含む。抗菌剤および抗−真菌剤の投与は、本発明の方法で起こりかねない感染症の効果またはエスカレーションを緩和させることができ、ここに、患者Ｂ細胞は有意に枯渇される。
【０３５７】
本発明のある実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９免疫療法は、前記した剤の１以上と組み合わせて投与されて、本発明の組成物の投与に伴いかねない毒性副作用を緩和させることができる。他の実施形態において、本発明の抗−ＣＤ１９免疫療法は、抗体投与、化学療法、トキシンまたは薬物の副作用を緩和させるのに用いられる当該分野で良く知られた１以上の剤と組み合わせて投与することができる。
【０３５８】
本発明のある実施形態において、本発明の組成物は、限定されるものではないが、ニフェジピン（ＰＲＯＣＡＲＤＩＡ（登録商標）、ＡＤＡＬＡＴ（糖力商標））、アムロドピン（ＮＯＲＶＡＳＣ（登録商標））、イスラジピン（ＤＹＮＡＣＩＲＣ（登録商標））、ジルチアゼム（ＣＡＲＤＩＺＥＭ（登録商標）、ＤＩＬＡＣＯＲ  ＸＲ（登録商標））、ニカルジピン（ＣＡＲＤＥＮＥ（登録商標））、ニソルジピン（ＳＵＬＡＲ（登録商標））、およびフェロジピン（ＰＬＥＮＤＩＬ（登録商標））のようなカルシウムチャネルブロッカーと組み合わせて、またはそれでの治療養生法において投与することができる。
【０３５９】
本発明のある実施形態において、本発明の組成物は、限定されるものではないが、ロサルタン（ＣＯＺＡＡＲ（登録商標））およびバルサルタン（ＤＩＯＶＡＮ（登録商標））のようなアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニストと組み合わせて、またはそれでの治療養生法で投与することができる。
【０３６０】
本発明のある実施形態において、本発明の組成物は、プラゾシン（ＭＩＮＩＰＲＥＳＳ（登録商標））、ドキサゾシン（ＣＡＲＤＵＲＡ（登録商標））、およびペントキシフィリン（ＴＲＥＮＴＡＬ（登録商標））と組み合わせて、またはそれでの治療養生法において投与することができる。
【０３６１】
本発明のある実施形態において、本発明の組成物は、高−用量化学療法（メルファラン、メルファラン／プレドニゾン（ＭＰ）、ビンクリスチン／ドキソルビシン／デキサメタゾン（ＶＡＤ）、リポソームドキソルビシン／ビンクリスチン、デキサメダゾン（ＤＶｄ）、シクロホスファミド、エトポシド／デキサメタゾン／シタラビン、シスプラチン（ＥＤＡＰ））、幹細胞移植体（例えば、オートロガス幹細胞移植または同種異系幹細胞移植、および／またはミニ−同種異系（非−骨髄破壊的）幹細胞移植）、放射線療法、ステロイド（例えば、コルチコステロイド、デキサメタゾン、サリドマイド／デキサメタゾン、プレドニゾン、メルファラン／プレドニゾン）、支持的療法（例えば、ビスホスホネート、成長因子、抗生物質、静脈内免疫グロブリン、低−用量放射線療法、および／または整形外科介入）、ＴＨＡＬＯＭＩＤＴＭ（サリドマイド、Ｃｅｌｇｅｎｅ）、および／またはＶＥＬＣＡＤＥＴＭ（ボルテゾミブ、Ｍｉｌｌｅｎｎｉｕｍ）と組み合わせて、またはそれでの治療養生法で投与することができる。
【０３６２】
本発明の抗−ＣＤ１９免疫療法をもう１つの抗生物質または複数抗生物質および／または剤と組み合わせて投与する本発明の実施形態において、さらなる抗生物質または複数抗生物質および／または剤は本発明の抗体の投与に対していずれの配列で投与することもできる。例えば、さらなる抗体または複数抗体は、本発明の抗−ＣＤ１９抗体または免疫コンジュゲートのヒト対象への投与の前に、それと同時に、および／または引き続いて投与することができる。さらなる抗体または複数抗体は、本発明の抗体と同一医薬組成物にて存在させることができ、および／または異なる医薬組成物にて存在させることができる。本発明の抗体の投与の用量および態様、およびさらなる抗体または複数抗体の用量は、本出願で供される、または当該分野で良く知られた投与の投与量および態様の教示のいずれかに従って、同一または異なるものとすることができる。
【０３６３】
（５．７  免疫再構成をモニターするにおける抗−ＣＤ１９抗体の使用）
本発明は、ヒトＣＤ１９抗原に免疫特異的に結合する、抗−ＣＤ１９抗体、およびその組成物も含み、ここに、抗−ＣＤ１９抗体は診断または検出可能剤にコンジュゲートされる。好ましい実施形態において、抗体はヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体である。そのような抗−ＣＤ１９抗体は、免疫抑制療法または骨髄移植に続いて免疫系再構成をモニタリングするのに有用であり得る。そのようなモニタリングは、限定されるものではないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリ性フォスファターゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリネステラーゼのような種々の酵素；限定されるものではないが、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンのような補欠分子族；限定されるものではないが、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリスリンのような蛍光物質；限定されるものではないが、ルミノールのようなルミネセント物質；限定されるものではないが、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびアクオリンのようなバイオルミネセント物質；限定されるものではないが、ヨウ素（１３１Ｉ、１２５Ｉ、１２３Ｉ、１２１Ｉ）、炭素（１４Ｃ）、硫黄（３５Ｓ）、トリチウム（３Ｈ）、インジウム（１１５Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１２Ｉｎ、１１１Ｉｎ）、およびテクネチウム（９９Ｔｃ）、タリウム（２０１Ｔｉ）、ガリウム（６８Ｇａ、６７Ｇａ）、パラジウム（１０３Ｐｄ）、モリブデン（９９Ｍｏ）、キセノン（１３３Ｘｅ）、フッ素（１８Ｆ）、１５３Ｓｍ、１７７Ｌｕ、１５９Ｇｄ、１４９Ｐｍ、１４０Ｌａ、１７５Ｙｂ、１６６Ｈｏ、９０Ｙ、４７Ｓｃ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１４２Ｐｒ、１０５Ｒｈ、９７Ｒｕ、６８Ｇｅ、５７Ｃｏ、６５Ｚｎ、８６Ｓｒ、３２Ｐ、１５３Ｇｄ、１６９Ｙｂ、５１Ｃｒ、５４Ｍｎ、７５Ｓｅ、１１３Ｓｎ、および１１７Ｔｉｎのような放射性物質；種々の陽電子射出断層撮影法、非放射性常磁性金属イオン、および放射性標識され、または特異的放射性同位体にコンジュゲートされる分子を用いる陽電子放射金属を含めた検出可能な物質に、ヒトＣＤ１９抗原に免疫特異的に結合する抗−ＣＤ１９抗体をカップリングさせることによって達成することができる。容易に測定することができるいずれの検出可能な標識も抗−ＣＤ１９抗体にコンジュゲートさせることができ、自己免疫疾患または障害を診断するのに用いることができる。検出可能な物質は、当該分野で公知の技術を用い、直接的に、あるいは（例えば、当該分野で公知のリンカーのような）中間体を介して間接的に抗体にカップリングまたはコンジュゲートさせることができる。例えば、本発明に従って診断剤として用いるための抗体にコンジュゲートすることができる金属イオンについては、米国特許第４、７４１、９００号参照。ある実施形態において、本発明は、診断または検出可能剤にコンジュゲートされた抗−ＣＤ１９抗体を含む診断キットを提供する。
【０３６４】
（５．８  キット）
本発明は、ＧＶＨＤ、液性拒絶、または移植後リンパ系増殖障害の予防、治療、管理または軽減のための本発明の組成物が満たされた１以上の容器を含む医薬パックまたはキットを提供する。
【０３６５】
本発明は、前記方法で、用いることができるキットを提供する。１つの実施形態において、キットは１以上の容器中に本発明の組成物を含む。もう１つの実施形態において、キットは１以上の容器中に本発明の組成物を含み、および１以上の他の容器中に、ＧＶＨＤ、移植片拒絶、または移植後リンパ系増殖障害の予防、管理または治療で有用な１以上の予防または治療剤を含む。好ましくは、該キットは、さらに、ＧＶＨＤ、移植片拒絶、または移植後リンパ系増殖障害を予防し、治療し、管理し、または軽減するための指示書、ならびに投与の方法のための副作用および用量の情報を含む。そのような容器と所望により一緒にできるのは、医薬または生物学的製品の製造、使用または販売に関連する政府当局によって処方される様式の通知であり、この通知は、ヒト投与についての製造、使用または販売の当局による認可を反映する。
【実施例】
【０３６６】
（６  実施例）
以下の実施例において、ヒトＣＤ１９指向性免疫療法を評価するためにトランスジェニックマウスモデルを用いた。これらのデータは、ＣＤ１９抗原に結合し、ＡＤＣＣを媒介する抗体は、ＦｃγＲ（好ましくは、ＦｃγＲＩＩＩ、またはＦｃγＲＩＶ）を発現し、ＡＤＣＣを運ぶエフェクター細胞を有する対象において、インビボでＢ細胞枯渇を誘導するのに効果的である。そのような抗体を用いて、インビボにてＢ細胞の持続性枯渇を誘導することができ、ある実施形態においては、循環、脾臓、およびリンパ節から実質的に全てのＢ細胞を排除することができる。驚くべきことに、比較的低密度のＣＤ１９抗原を発現する骨髄Ｂ細胞およびそれらの前駆体は同様に枯渇される。Ｂ細胞枯渇の有効性は、ヒトＣＤ１９のいずれの領域に抗−ＣＤ１９抗体が結合するかに依存しないが、（患者試料中の）ＣＤ１９密度によって影響される。Ｂ細胞クリアランスの効率は、ＡＤＣＣを媒介する抗−ＣＤ１９抗体の能力に相関することができる。抗−ＣＤ１９抗体を用いるＢ細胞クリアランスの効率は、宿主エフェクターＦｃγＲ発現／機能に相関することもできる。
【０３６７】
（６．１  材料および方法）
本明細書中に記載されたマウスＨＢ１２ａおよびＨＢ１２ｂ抗−ＣＤ１９抗体は、ヒトＣＤ１９に結合する抗体の例である。そのような抗体を用いて、セクション５．１にて前記した技術を用いてヒト、ヒト化、またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体を作製することができる。ＨＢ１２ａおよびＨＢ１２ｂ抗体としてのヒトＣＤ１９またはその部分に対して同一特異性を有するヒト、ヒト化、またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体が、本発明の組成物および方法で用いるのに考えられる。特に、ＨＢ１２ａまたはＨＢ１２ｂとしての、同一または同様な重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、および／またはＣＤＲ３領域を有するヒト、ヒト化、またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体が、本発明の組成物および方法で用いるのに考えられる。
【０３６８】
抗体の創製および配列分析。ＨＢ１２ａおよびＨＢ１２ｂ抗体を、ヒトＣＤ１９をコードするｃＤＮＡでトランスフェクトされたマウスプレ−Ｂ細胞系で免疫化されたＢａｌｂ／ｃマウスで創製した（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１４：３８８４−９４（１９９４））。双方の抗体は、１９９３年１１月３日ないし７日にボストンで開催されたｔｈｅ  Ｆｉｆｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓに提出した。
【０３６９】
重鎖遺伝子の利用は、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ（登録商標），Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて１ないし５×１０６ハイブリドーマ細胞から抽出されたＲＮＡを用いて決定した。第一ストランドｃＤＮＡは、ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ（登録商標）（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からの２００ユニットのＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  ＩＩＩ登録商標）逆転写酵素および第一ストランドｃＤＮＡ合成緩衝液、ＰＲＯＭＥＧＡ（登録商標）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からの２０ｎｇのランダムヘキサマープライマーおよび２０ユニットのＲＮＡｓｅ阻害剤、およびＤｅｎｖｉｌｌｅ（Ｍｅｔｕｃｈｅｎ，ＮＪ）からの８０ナノモルのｄＮＴＰを用いて、２μｇの全ＲＮＡからの２０μＬの容量で合成した。重鎖（ＶＨ）遺伝子のＰＣＲ増幅用の鋳型として、１μＬのｃＤＮＡ溶液を用いた。ＰＣＲ反応は、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．３）、５ｍＭ  ＮＨ４Ｃｌ、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８００μＭ  ｄＮＴＰ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ）、４００ピコモルの各プライマー、および１０％ｐｆｕプルーフリーディングポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，ＣＡ）を含む２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から構成される５０μＬ容量の反応混合物中で行った。ＶＬについては、ＰＣＲ反応は、２０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．４）、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、８００μＭ  ｄＮＴＰ（Ｄｅｎｖｉｌｌｅ）、４００ピコモルの各プライマー、および１０％ｐｆｕプルーフリーディングポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でスパイクされた２．５ＵのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から構成される５０μＬ容量の反応混合物中で行った。３分間の変性工程の後、増幅を３２サイクル（１分間の９４℃、１分間の５８℃、１分間の７２℃）、続いての７２℃における１０分の延長（Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒ，Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）にて行った。重鎖ｃＤＮＡは、従前に記載されている（Ｋａｎｔｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：１１７５−１１８６（１９９７））無差別センス５’ＶＨプライマー（ＭｓＶＨＥ；５’ＧＧＧ  ＡＡＴ  ＴＣＧ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＡＧＣ  ＴＧＣ  ＡＧＧ  ＡＧＴ  ＣＴＧ  Ｇ３’）（配列番号：１９）、およびＣγコーディング領域に対して相補的なアンチセンスプライマー（プライマーＣγ１；５’ＧＡＧ  ＴＴＣ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＧＧＣ  ＴＣＡ  ＧＧＧ  Ａ３’）（配列番号：２０）を用いて増幅した。
【０３７０】
軽鎖遺伝子利用は、重鎖について記載したように抽出された細胞質ＲＮＡを用いて決定した。５’可変領域ヌクレオチド配列は、ＧｅｎｅＲａｃｅｒＴＭ  キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて作製されたｃＤＮＡから得た。全ＲＮＡを子ウシ腸フォスファターゼで脱リン酸化した。５’キャップ構造は、タバコ酸ピロフォスファターゼで無傷全長ｍＲＮＡから除去した。ｎＲＮＡをｃＤＮＡに転写した後、ＧｅｎｅＲａｃｅｒＰＣＲプライマーのための既知の５’プライミング部位を供する４  ＲＮＡリラーゼを用い、ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ＲＮＡオリゴをｎＲＮＡの５’末端に連結させた。連結したｎＲＮＡを、ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＴＭ  ＩＩＩＲＴおよびＧｅｎｅＲａｃｅｒランダムプライマーで逆転写した。第一のストランドｃＤＮＡを、（ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ＲＮＡオリゴに相同な）ＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’プライマー、および定常領域特異的アンチセンス３’プライマー（ＧＡＣ  ＴＧＡ  ＧＧＣ  ＡＣＣ  ＴＣＣ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  ＴＡＡ  ＣＴＧ）（配列番号：２１）を用いて増幅させた。１０％ｐｆｕプルーフリーディングポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を加えた２．５ＵのＴａｑＤＮＡポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用い、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎによって推奨されるように、緩衝液を含む５０μＬの容量中でタッチダウンＰＣＲ増幅を行った。２分間の変性工程の後にＴａｑおよびｐｆｕを加え、増幅を３工程：３０秒間の９４℃、６０秒間の７２℃の５サイクル；３０秒間の９４℃、６０秒間の７２℃の５サイクル；３０秒間の９４℃、３０秒間の６５℃、６０秒間の７２℃、続いての７２℃における１０分間の延長の２０サイクルで行った。２．５ＵのＴａｑを加え、延長をさらに１０分間進行させて、無傷３’Ａ−突出を確実とした。増幅されたＰＣＲ産物を配列決定のためのｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクターにクローン化し、ＯｎｅＳｈｏｔ（登録商標）ＴＯＰ１０コンピテント細胞に形質転換した。８クローンからのＤＮＡインサートを、重鎖について記載したように、ｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター特異的「Ｍ１３順方向」および「Ｍ１３逆方向」プライマーを用いて各ｍＡｂ軽鎖について配列決定した。
【０３７１】
精製された重鎖および軽鎖ＰＣＲ産物を、軽鎖について記載したようにＡｍｐｌｉＴａｑ（登録商標）ＤＮＡポリメラーゼ、および初期ＰＣＲ増幅で用いる同一プライマーまたはｐＣＲ４−ＴＯＰＯでベクター特異的プライマーでのＰｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ系を用いる増幅の後にＡＢＩ  ３７７  ＰＲＩＳＭ（登録商標）ＤＮＡシーケンサーを用いて両方向にて直接的に配列決定した。ＨＢ１２ａおよびＨＢ１２ｂ重鎖および軽鎖領域を、センスおよびアンチセンスＤＮＡ双方のストランドで完全に配列決定した。
【０３７２】
抗体および免疫蛍光分析。本明細書中で用いるヒトＣＤ１９抗原に結合するモノクローナルマウス抗−ＣＤ１９抗体は、ＨＢ１２ａ（ＩｇＧ１）およびＨＢ１２ｂ（ＩｇＧ１）、ＦＭＣ６３（ＩｇＧ２ａ、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏａｌ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ）、Ｂ４（ＩｇＧ１，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｍｉａｍｉ，ＦＬ）（Ｎａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３３１：２４４−２５０（１９８３））、およびＨＤ２３７（ＩｇＧ２ｂ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｓｈｏｐ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ，１９８９）、ＨＤ３７抗体のイソタイプスイッチ変種（Ｐｅｚｚｕｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１３８：２７９３−２７９９（１９８７））を含んだ。他の抗体は：マウスＣＤ１９、ＭＢ１９−１（ＩｇＡ）（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：４３７１−４３７８（１９９６））に結合するモノクローナルマウス抗−ＣＤ１９抗体；モノクローナルマウスＣＤ２０特異的抗体（Ｕｃｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６：１１９−１２９（２００４））；Ｂ２２０抗体ＲＡ３−６Ｂ２（ＤＮＡＸ  Ｃｏｒｐ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；Ｔｈｙ１．２抗体（ＣＡＬＴＡＧＴＭ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）；およびＣＤ５、ＣＤ４３およびＣＤ２５抗体（ＢＤ  ＰＨＡＲＭＩＮＧＥＮＴＭ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）を含むものであった。イソタイプ−特異的および抗−マウスＩｇまたはＩｇＭ抗体はＳｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ）からのものであった。
【０３７３】
ｈＣＤ１９  ｃＤＮＡ（Ｔｅｄｄｅｒ  ａｎｄ  Ｉｓａａｃｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４３：７１２−７１７（１９８９））でトランスフェクトされたマウスプレ−Ｂ細胞系、３００．１９（Ａｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２７：３８１−３８８（１９８１））、または単一−細胞白血球懸濁液を、確立された手法に従って、各抗体の所定の最適濃度を用いて氷上で染色した（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：３８８４−３８９４（１９９４））。リンパ球の前方および側方光散乱特性を持つ細胞は、ＦＡＣＳＣＡＮ（登録商標）またはＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ（登録商標）フローサイトメーター（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）で分析した。バックグラウンド染色は、ゲートを細胞の≧９８％を排除するように位置させて、非反応性対照抗体（ＣＡＬＴＡＧＴＭ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いて決定した。調べた各試料については、単核細胞の前方および側方光散乱特性を持つ１万細胞を、４−１０ｌｏｇスケールで示される蛍光強度にて、可能な場合には常に各資料について分析した。
【０３７４】
マウス。ヒトＣＤ１９（ｈ１９−１）を発現するトランスジェニックマウスおよびそれらの野生型（ＷＴ）同腹子を従前に記載されているように産生した（Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：３８８４−３８９４（１９９４））。ＴＧ−１マウスは元のｈ１９−１ファウンダー（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｂ６／ＳＪＬ）から創製し、少なくとも７世代、Ｃ５７ＢＬ／６バックグラウンドに交差させた。ＴＧ−２マウスは元のｈ１９−４ファウンダー（Ｃ５７ＢＬ／６×Ｂ６／ＳＪＬ）から創製した。複数世代の戻し交配の後、ＴＧ−１＋／＋マウスを入手し、そのＢマウスは、ヒトＢ細胞で見出されるのとほぼ同一の密度にて細胞表面密度のヒトＣＤ１９を発現した。ヒトＣＤ１９発現マウスは、いくつかの研究においてさらに記載され、モデルとして用いられている（Ｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：３９−５０（１９９５）；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：１１５５８−１１５６２（１９９５）；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：４３７１−４３７８（１９９６）；Ｔｅｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，６：１０７−１１８（１９９７）；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：４６６２−４６６９（１９９７）；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５９：３２７８−３２８７（１９９７）；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９４：１３１５８−１３１６２（１９９７）；Ｉｎａｏｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８６：１９２３−１９３１（１９９７）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６２：７０８８−７０９４（１９９９）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１１：１９１−２００（１９９９）；Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔｅ  ｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９７：６６８７−６６９２（２０００）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，１３：４７−５７（２０００）；Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：６６３５−６６４３（２０００）；Ｚｉｐｆｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：６８７２−６８７９（２０００）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６６：２４１２−２４１９（２００１）；Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：２４６９−２４７８（２００１）；Ｈａｓｅｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６７：３１９０−３２００（２００１）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６：４４８２０−４４８２７（２００１）；Ｆｕｊｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６８：５４６５−５４７６（２００２）；Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０９：１４５３−１４６２（２００２）；Ｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，１０２：１３７４−８０（２００３）；Ｓｈｏｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：４０６２−４０７２（２００３））。ＣＤ１９−欠乏（ＣＤ１９−／−）マウスおよびそれらのＷＴ同腹子の従前に記載されている（Ｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：３９−５０（１９９５））。トランスジェニックマウスにおけるヒトＣＤ１９の発現は、内因性マウスＣＤ１９発現を降下させることが示されており（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：４３７１−４３７８（１９９６）およびＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：４６６２−４６６７（１９９７））、内因性マウスＣＤ１９発現のこの降下に関する仮定も評価されている（Ｓｈｏｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１７１：４０６２−４０７２（２００３））。ヒトＣＤ１９を発現するトランスジェニックマウスにおけるＣＤ１９発現の密度もまた評価されている（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６５：６６３５−６６４３（２０００））。
【０３７５】
ＴＧ−１＋／＋マウスを、Ｔａｃｏｎｉｃ農場（Ｇｅｒｍａｎｔｏｗｎ，ＮＹ）からのＦｃｒ（Ｆｃ受容体）共通γ鎖（ＦｃＲγ）−欠乏マウスＦｃＲγ−／−、Ｂ６．１２９Ｐ２−Ｆｃｅｒｇ１ｔｍ１）で育種して、ｈＣＤ１９＋／−  ＦｃＲγ−／−およびＷＴ同腹子を得た。ｃ−Ｍｙｃ導入遺伝子に対してヘミ接合性のマウス（Ｅμ−ｃＭｙｃＴＧ，Ｃ５７Ｂ１／６Ｊ−ＴｇＮ（ＩｇｈＭｙｃ）；Ｔｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）は記載されている通りであった（Ｈａｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１６７：３５３（１９８８）ａｎｄ  Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３１８：５３３（１９８５））。ｃ−ＭｙｃＴＧマウス（Ｂ６／１２９バックグラウンド）をｈＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋マウスと交配させて、ＰＣＲスクリーニングによって判断して、ヘミ接合性ｈＣＤ１９ＴＧ−１＋／−  ｃＭｙｃＴＧ＋／−子孫を得た。Ｒａｇ１−／−（Ｂ６．１２９Ｓ７−Ｒａｇ１ｔｍ１Ｍｏｍ／Ｊ）マウスはＴｈｅ  Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙからのものであった。マクロファージ−欠乏マウスは、クロドロネート−カプセル化リポソーム（０．１ｍＬ／１０グラム体重；Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の、標準的な方法（Ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊｅｎ  ａｎｄ  Ｓａｎｄｅｒｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１７４：８３−９３（１９９４））に従った−２、１および４日におけるＣ５７ＢＬ／６マウスへの尾静脈注射によって創製した。全てのマウスを特異的無病原体バリアー施設に収容し、最初に、６ないし９週齢で用いた。
【０３７６】
ＥＬＩＳＡ。血清Ｉｇ濃度は、アフィニティ−精製マウスＩｇＭ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ３、およびＩｇＡ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）を用いて、記載されているように（Ｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：３９（１９９５））標準曲線を作製することによるＥＬＩＳＡによって測定した。ｄｓＤＮＡ、ｓｓＤＮＡおよびヒストンに対する血清ＩｇＭおよびＩｇＧ自己抗体レベルは、記載されているように（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：４３７１（１９９６））、子ウシ胸腺二本鎖（ｄｓ）ＤＮＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、（一本鎖（ＳＳ）ＤＮＡを含有する）煮沸された子ウシ胸腺ＤＮＡまたはヒストン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）被覆マイクロタイタ−プレートを用いるＥＬＩＳＡによって測定した。
【０３７７】
免疫療法。２００μＬホスフェート−緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の滅菌抗−ＣＤ１９および未反応イソタイプ対照抗体（０．５ないし２５０μｇ）を両側尾静脈を介して注射した。特に断りのない限り、全ての実験は２５０μｇの抗体を用いた。血液白血球数は、赤血球細胞溶解後にヘモサイトメーターによって定量し、Ｂ２２０＋Ｂ細胞頻度は、フローサイトメトリー分析での免疫蛍光染色によって測定した。ヒトおよびマウスにおける抗体用量は、Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｔｏｏｌ  Ｄｏｓｅ  Ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ  （ｗｗｗ．ｆｄａ．ｇｏｖ／ｃｄｅｒ／ｃａｎｃｅｒ／ａｎｉｍａｌｆｒａｍｅ．ｈｔｍ）を用いて比較した。
【０３７８】
免疫化。２ヶ月齢ＷＴマウスを、生理食塩水中の５０μｇの２，４，６−トリニトロフェニル（ＴＮＰ）−コンジュゲーテッドリポ多糖（ＬＰＳ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）または２５μｇの２，４−ジニトロフェノール−コンジュゲーテッド（ＤＮＰ）−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）で腹腔内免疫化した。また、マウスは、フロイントの完全アジュバント中の１００μｇのＤＮＰ−コンジュゲーテッドキーホールリンペットヘモシアニン（ＤＮＰ−ＫＬＨ，ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）−ＮＯＶＡＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）Ｃｏｒｐ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）で腹腔内免疫化し、フロイントの不完全アジュバント中のＤＮＰ−ＫＬＨで２１日後にブースター注射した。示された免疫化の前および後にマウスから採血した。個々の血清試料中のＤＮＰ−またはＴＮＰ−特異的抗体力価を、標準的な方法（Ｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，３：３９−５０（１９９５））に従って、ＤＮＰ−ＢＳＡ（ＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭ（登録商標）−ＮＯＶＡＢＩＯＣＥＭ（登録商標）Ｃｏｒｐ．，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）またはＴＮＰ−ＢＳＡ（Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓａｎ  Ｒａｆａｅｌ，ＣＡ）を被覆したＥＬＩＳＡプレートを用いて二連で測定した。ＴＮＰ−ＬＰＳ免疫化マウスからの血清をＤＮＰ−ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）からの血清で１：４００希釈し、ＤＮＰ−ＢＳＡ免疫化マウスをＥＬＩＳＡ分析のために１：１０００希釈した。
【０３７９】
統計学的分析。全てのデータは平均±ＳＥＭとして示す。スチューデントのｔ−検定を用いて、試料平均の間の差の有意性を決定した。
【０３８０】
（６．２  実施例１：トランスジェニックマウスにおけるヒトＣＤ１９発現）
本明細書中に記載されたトランスジェニックｈＣＤ１９ＴＧマウス、またはヒトＣＤ１９を発現する他のトランスジェニックマウスを用いて、投与の濃度、量またはタイミングの変動のような、ヒト、ヒト化またはキメラ抗−ＣＤ１９抗体を含む異なる治療養生法を評価した。異なる治療養生法のヒト患者における有効性は、以下に記載する２つのインジケータ、すなわち、ある種の体液および／または組織におけるＢ細胞枯渇、およびＢ細胞に結合するモノクローナルヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体の能力を用いて予測することができる。特別な実施形態において、ヒトＣＤ１９トランスジェニックマウスにおいて有効な治療養生法は、本発明の組成物および方法と共に用いて、ヒトにおいて自己免疫疾患または障害を治療することができる。
【０３８１】
ヒトＣＤ１９が、ヒトＣＤ１９導入遺伝子を発現するトランスジェニックマウス（ヘミ接合性ＴＧ−１＋／−）からのＢ細胞で発現されるか否かを決定するために、Ｂ細胞をこれらのマウスの骨髄、血液、脾臓および腹腔洗液から抽出した。細胞を、ＣＤ１９に結合するマウスモノクローナル抗−ＣＤ１９抗体と接触させることによって、ヒトＣＤ１９およびマウスＣＤ１９発現をこれらの細胞において評価した。Ｂ系統細胞への抗体の結合は、フローサイトメトリー分析での２色免疫蛍光染色を用いて検出した。
【０３８２】
結果を、骨髄（ＢＭ）、血液、脾臓および腹腔洗液（ＰＬ）についての、ヒトＣＤ１９（ｈＣＤ１９）（ｙ−軸）の検出された発現に対してプロットされたマウスＣＤ１９（ｍＣＤ１９）（ｘ−軸）の検出された発現のグラフにて図１Ａに示す。軸の単位は、下側左での１で開始する４デカド（ｄｅｃａｄｅ）対数スケールを表す。ヒトＣＤ１９（Ｂｅｃｋｍａｎ／Ｃｏｕｌｔｅｒ）に結合するＢ４抗−ＣＤ１９抗体を用いて、ヒトＣＤ１９発現を可視化し、マウスＣＤ１９（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ）に結合する１Ｄ３  ＣＤ１９抗体を用いて、（図１Ｂおよび１Ｃでも用いられる）マウスＣＤ１９発現を可視化した。ヒトＣＤ１９発現はヒトＢ細胞発生の間に徐々に増加するが、マウスＣＤ１９はマウス骨髄Ｂ細胞発生の間に高レベルで発現される。図１Ａは、ヒトＣＤ１９発現が、血液、脾臓および腹腔洗液（ＰＬ）で見出される末梢Ｂ細胞でのマウスＣＤ１９発現と平行することを示し、これは、（ヒトＣＤ１９に結合する）マウス抗−ｈＣＤ１９抗体が末梢Ｂ細胞集団に結合することを示す。加えて、骨髄（ＢＭ）由来Ｂ細胞の小さな集団は内因性マウスＣＤ１９を発現するが、ヒトＣＤ１９は発現しない（ヒトＣＤ１９に結合するモノクローナルマウス抗−ＣＤ１９抗体）。かくして、骨髄Ｂ細胞はヘミ接合性ＴＧ−１＋／−マウスにおいて２つのカテゴリー、ｈＣＤ１９＋ｍＣＤ１９＋である成熟Ｂ系統細胞、およびｍＣＤ１９＋に過ぎない余り成熟していないＢ系統細胞に入る（図１Ａ）。これらの結果は、これらのトランスジェニックマウスにおけるヒトＣＤ１９発現がＢ細胞成熟化に相関することを示すＺｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，１４：３８８４−３８９４（１９９４））の発見と合致する。血液、脾臓および腹腔内の全ての成熟Ｂ細胞はｈＣＤ１９＋であると共にｍＣＤ１９＋であった。
【０３８３】
各々、平均蛍光強度によって評価して、ｍＣＤ１９およびｈＣＤ１９の相対的発現レベル（ｈＣＤ１９についてはマウス抗−ＣＤ１９およびｍＣＤ１９についてはマウス抗−ＣＤ１９）を図１Ｂに示す。ｈＣＤ１９導入遺伝子（ＴＧ−１＋／＋）についてホモ接合性であるＴＧ−１マウスの中で、血液で生じたＢ細胞上でのｈＣＤ１９発現はヒトＢ細胞上でのｈＣＤ１９発現と匹敵した。ＴＧ−１＋／＋、ＴＧ−１＋／−、およびＴＧ−２＋／＋トランスジェニックマウス系におけるｈＣＤ１９およびｍＣＤ１９発現の相対的密度を比較するために、血液由来Ｂ細胞を抽出し、前記したようにＣＤ１９発現についてアッセイした。結果は、ヒト血液Ｂ細胞、ｈＣＤ１９ＴＧマウス（左側）からのＴＧ−１＋／＋、ＴＧ−１＋／−、およびＴＧ−２＋／＋血液Ｂ細胞についてのパーセントヒトＣＤ１９発現（左側）、および野生型（ＷＴ）マウス血液細胞で、ｈＣＤ１９ＴＧマウスからのＴＧ−１＋／＋、ＴＧ−１＋／−、およびＴＧ−２＋／＋ＣＤ１９＋血液Ｂ細胞についてのパーセントマウスＣＤ１９発現を示すヒストグラムにて図１Ｂで示す。値（平均蛍光強度の直線値）は、（１００％として示した）ヒトまたは野生型（ＷＴ）マウスからの血液Ｂ細胞と比較したＣＤ１９発現（±ＳＥＭ）の平均相対密度を表す。結果は、ホモ接合性ＴＧ−１＋／＋マウスにおいては、血液Ｂ細胞は、ヒト血液Ｂ細胞よりも約７２％高い平均蛍光強度によって測定された密度にてｈＣＤ１９を発現した。ＴＧ−１＋／−マウスにおける血液Ｂ細胞はヒト血液Ｂ細胞と同様な密度にてｈＣＤ１９を発現し、他方、ＴＧ−２＋／＋マウスにおける血液Ｂ細胞は、ヒト血液Ｂ細胞よりも６５％低い密度にてｈＣＤ１９を発現した。
【０３８４】
ＴＧ−１＋／−マウス組織からのＢ細胞におけるｈＣＤ１９およびｍＣＤ１９発現の相対密度のさらなる比較を、骨髄、血液、脾臓、リンパ節からのＢ細胞についての抗−ＣＤ１９抗体染色の平均蛍光強度（ＭＦＩ±ＳＥＭ）、およびｈＣＤ１９（左側）およびｍＣＤ１９（右側）のＰＬを示すヒストグラムにおいて図１Ｃに示す。結果は、ＴＧ−１＋／−マウスにおいて、ｈＣＤ１９は、骨髄（ヒト血液レベルの６３％）＜血液（１００％）＜脾臓（１２１％）＝リンパ節（１２０％）および＜腹腔（１７７％）においてＢ２２０＋細胞によって増大するレベルで発現されたことを示す。ヒトＣＤ１９発現は、ｍＣＤ１９発現に対して小さな影響を有した。ｈＣＤ１９およびｍＣＤ１９についてのｍＲＮＡのレベルは変化しなかった。
【０３８５】
ＩｇＧ１（ＨＢ１２ａ、ＨＢ１２ｂ、Ｂ４）、ＩｇＧ２ａ（ＦＭＣ６３）およびＩｇＧ２ｂ（ＨＤ２３７）イソタイプの（ヒトＣＤ１９に結合する）マウス抗−ｈＣＤ１９抗体が異なって反応するか否かを判断するために、血液および脾臓Ｂ２２０＋Ｂ細胞をＴＧ−１＋／−マウスから単離した。単離された細胞を前記した抗−ＣＤ１９抗体とインビトロで接触させ、フローサイトメトリー分析にてイソタイプ−特異的ＰＥ−コンジュゲーテッド二次抗体を用いて可視化されたモノクローナル抗体染色を用い、ヒトＣＤ１９発現トランスジェニックマウス（ｈＣＤ１９ＴＧ）Ｂ細胞に結合するそれらの能力について評価した。
【０３８６】
結果を、５μｇ／ｍＬにおける、ＩｇＧ２ｂ（マウスイソタイプ）、ＩｇＧ２ａ（マウスイソタイプ）、およびＩｇＧ１（マウスイソタイプ）抗−ＣＤ１９抗体についての蛍光強度（ｘ−軸）−対−相対的Ｂ細胞数（ｙ−軸）のグラフにおいて図１Ｄに示す。抗−ＣＤ１９抗体で染色されたＢ２２０＋細胞の蛍光強度は実線で示し、イソタイプがマッチした対照（ＣＴＬ）の蛍光強度をダッシュ線として示す。各抗体は、５μｇ／ｍＬの濃度における脾臓Ｂ細胞との飽和レベルの反応性に到達した。結果は、ＴＧ−１＋／−マウスからのマウス血液および脾臓Ｂ２２０＋Ｂ細胞上での抗−ＣＤ１９抗体結合密度が、テストした抗体イソタイプについて、および血液および脾臓双方のＢ細胞について均一であることを示す。
【０３８７】
平均蛍光強度が抗−ＣＤ１９抗体イソタイプから独立しているか否かを決定するために、（ＭＦＩ±ＳＥＭ）同一抗−マウスＩｇ二次抗体を用いてｈＣＤ１９  ｃＤＮＡでトランスフェクトされたマウスプレ−Ｂ細胞系３００．１９を染色することによって、（５μｇ／ｍＬの）個々の抗−ＣＤ１９抗体の結合活性を評価した。抗体染色（ＭＦＩ±ＳＥＭ）は、フローサイトメトリー分析にて、マウスＩｇ−特異的ＰＥ−コンジュゲーテッド二次抗体を用いて可視化した。結果を、ＨＢ１２ａ、ＨＢ１２ｂ、Ｂ４、ＦＭＣ６３、ＨＤ２３７抗−ＣＤ１９抗体および対照抗体（ＣＴＬ）についての、ｈＣＤ１９  ｃＤＮＡ−トランスフェクト３００．１９細胞への（染色強度によって示した；ｙ−軸）抗−ＣＤ１９抗体結合のヒストグラムにおいて図１Ｅに示す。各抗体は、抗−ＣＤ１９抗体イソタイプとは独立した特徴的平均蛍光強度でもって細胞を染色し、ＨＢ１２ｂは最低レベルの染色を示し、ＨＤ２３７は最高レベルを示した。かくして、示された結果は、３００．１９細胞が、ＣＤ１９にインビトロで結合する抗−ＣＤ１９抗体の能力の比較のためのモデルインビトロ系であることを示す。
【０３８８】
かくして、一緒に考え合わすと、図１に示された結果は、ｈＣＤ１９ＴＧマウスおよび３００．１９細胞が、ｈＣＤ１９がある範囲の密度にわたって発現される場合に、Ｂ細胞に結合する抗−ｈＣＤ１９抗体の能力を評価するための適切なインビトロおよびインビボモデル系を表すことを示す。
【０３８９】
図１ＡないしＤは、各遺伝子型の≧３マウスで得られた結果を表す。
【０３９０】
（６．３  実施例２：インビボでのＢ細胞の抗−ＣＤ１９抗体検出）
（ヒトＣＤ１９に結合する）マウス抗−ＣＤ１９抗体を、インビボにてｈＣＤ１９ＴＧ（ＴＧ−１＋／−）血液、脾臓、およびリンパ節Ｂ細胞を枯渇させるそれらの能力について評価した。各抗体を２５０または５０μｇ／マウス、ヒトにおける抗−ＣＤ２０療法につき４回第一に与えられた３７５ｍｇ／ｍ２用量よりも約１０ないし５０倍低い単一用量にてマウスに与えた（Ｍａｌｏｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，１５：３２６６−７４（１９９７）およびＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１２：１７６３−９（１９９８））。
【０３９１】
結果を、ＨＢ１２ａ、ＨＢ１２ｂ、またはＦＭＣ６３抗−ＣＤ１９抗体または対照でのＣＤ１９またはイソタイプがマッチした対照ＣＴＬ処理から７日後におけるＢ細胞量のプロットにおいて図２Ａに示す。別々のプロットは、各抗−ＣＤ１９抗体についてのリンパ節、脾臓および血液組織に対して供される。ゲーテッドリンパ球のパーセンテージは、フローサイトメトリー分析での免疫蛍光染色によって測定して、ＴＧ−１＋／−マウスの血液、脾臓およびリンパ節からの代表的なＢ細胞枯渇を示す。図２Ｂは、抗−ＣＤ１９（閉じた丸印）またはイソタイプ−対照（開いた丸印）抗体での処理に続いてのＢ２２０＋血液Ｂ細胞の平均数（ｍＬ当たり±ＳＥＭ）を示す。時刻０の後に示される値は、１時間において得られたデータを表す。図２Ｃおよび図２Ｄは、示された用量における抗−ＣＤ１９（塗り潰した棒線）または対照（開いた棒線）抗体でのＴＧ−１＋／−マウスの処理後の、各々、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を示す。図２ＢないしＤにおいて、抗−ＣＤ１９またはイソタイプ−対照抗体処理マウス（データ点当たり≧３マウス）についての平均結果の間の有意差を示す；対照に対する比較において、＊Ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【０３９２】
各抗体は、７日までには、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞頻度（図２Ａ）および数（図２ＣないしＤ）に対する優れた枯渇効果にて、処理から１時間以内に循環Ｂ細胞の大部分を枯渇させた（図２Ｂ）。ＨＢ１２ａ抗体は７日までには、血液Ｂ細胞の９８％、および脾臓およびリンパ節Ｂ細胞の９０ないし９５％を枯渇させた。同様に、ＨＢ１２ｂ、Ｂ４、ＦＭＣ６３、およびＨＤ２３７抗体は、各々、血液Ｂ細胞の９９％、９６％、９９％、および９７％を枯渇させた。ＨＢ１２ｂ、Ｂ４、ＦＭＣ６３、およびＨＤ２３７抗体は、各々、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞の８８ないし９３％、６４ないし８５％、７２ないし９５％、および８８ないし９０％を枯渇させた。少数の残存する末梢Ｂ細胞は、骨髄からの潜在的出現体であった表現型的に未成熟の細胞を第一に表した。ＣＤ１９抗体のいずれも、ＷＴマウスに与えた場合に有意な効果を有さず、同一条件下で与えられたイソタイプがマッチした対照抗体はＢ細胞の数に影響しなかった（図２ＡないしＤ）。かくして、抗−ｈＣＤ１９抗体は７日までには、ｈＣＤ１９ＴＧマウスの循環、脾臓およびリンパ節からＢ細胞を効果的に枯渇させた。ＴＧ−１＋／−マウスにおけるＢ細胞枯渇のまとめを表１に掲げる。
【０３９３】
（表１）
【０３９４】
【表１】
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ａＢ細胞サブセットは：骨髄（ＢＭ）プロ−Ｂ（ＣＤ４３＋ＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏ）、プレ−Ｂ（ＣＤ４３−ＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏ）、未成熟（Ｂ（ＩｇＭ＋Ｂ２２０ｌｏ）、成熟Ｂｌａ（ＣＤ５＋Ｂ２２０ｈｉ）；腹腔Ｂｌａ（ＣＤ５＋Ｂ２２０ｌｏ）、Ｂ２（ＣＤ５−Ｂ２２０ｈｉ）であった。
ｂ値（±ＳＥＭ）は、抗体処理（２５０μｇ）から７日後のマウスに存在する細胞数（×１０−６）を示す。ＢＭ値は両側大腿骨についてのものである。血液数は／ｍＬ当たりである。ＬＮ数は両側鼡径および腋窩節についてのものである。マウスの数は括弧に入れて示す。平均の間の有意さが示される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【０３９５】
（６．３．１  骨髄Ｂ細胞の枯渇）
公知の抗−ＣＤ１９抗体をｈＣＤ１９ＴＧマウスにおいてテストして、そのような抗体が種々の体液および組織からのＢ細胞を枯渇させるのに有効であるか否かを決定した。本明細書中に記載するアッセイを用いて、他の抗−ＣＤ１９抗体、例えば、ヒトＣＤ１９抗原の特異的部分に結合する抗−ＣＤ１９抗体はＢ細胞を効果的に枯渇させるであろう。Ｂ細胞を枯渇させることができるとして同定された抗−ＣＤ１９抗体を用いる結果をヒト出の使用に相関させることができる。同定された抗体の特性を持つ抗体を、ヒトにおける自己免疫疾患および障害の治療のために本発明の組成物および方法で用いることができる。図３Ａないし３Ｆは、ＣＤ１９抗体処理に続いての骨髄Ｂ細胞枯渇を示す。
【０３９６】
図３Ａは、リンパ球の前方−および側方−散乱特性を持つ細胞のフローサイトメトリー分析での４色免疫蛍光染色によって評価されたＴＧ−１＋／−骨髄Ｂ細胞亜集団によるｈＣＤ１９およびｍＣＤ１９発現についての、蛍光強度（ｘ−軸）−対−相対的Ｂ細胞数（ｙ−軸）のグラフを示す。プロ−Ｂ細胞はＣＤ４３＋ＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏと定義され、プレ−Ｂ細胞はＣＤ４３−ＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏであり、未成熟Ｂ細胞はＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏであって、成熟Ｂ細胞はＩｇＭ−Ｂ２２０ｈｉであった。棒グラフ（右側）は、各Ｂ細胞サブセットによるＣＤ１９発現についての相対的平均ＭＦＩ（±ＳＥＭ）値を示す（≧３マウス／データ点）。ｈＣＤ１９ＴＧマウスにおけるように（図１Ａ）、ＣＤ１９発現はＢ細胞成熟としてのヒトにおいて異種であり、骨髄を出る。プロ−Ｂ細胞（２０％、ＣＤ４３ｈｉＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏ）の小さな割合のみがＴＧ−１＋／−マウスにおいてｈＣＤ１９を発現し、他方、殆どのプレ−Ｂ細胞はｈＣＤ１９＋であって、骨髄における成熟Ｂ細胞の大部分は、比較的高いレベルでｈＣＤ１９を発現した。プロ−Ｂ細胞の半分（５５％、ＩｇＭ−Ｂ２２０＋）はＴＧ−＋／−マウスにおいてｍＣＤ１９を発現し、他方、ｍＣＤ１９は、比較的高いレベルにおける、骨髄細胞でのプレ−Ｂ細胞および成熟Ｂ細胞の大部分による発現であった。
【０３９７】
図３Ｂは、フローサイトメトリー分析での２色免疫蛍光染色によって評価されたＦＭＣ６３またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）処理から７日後における、ｈＣＤ１９ＴＧマウスでのｈＣＤ１９＋細胞の枯渇を示す。数は、示されたゲート内での細胞の相対的頻度を表す。結果は、各マウス遺伝子型の３つの同腹子対で得られたものを表す。ＣＤ１９抗体処理に続いて、ＴＧ−１＋／＋、ＴＧ−１＋／−およびＴＧ−２＋／＋マウスの骨髄におけるｈＣＤ１９＋細胞のほとんど大部分は、２５０μｇ／マウスが与えられたＦＭＣ６３抗体によって枯渇された。
【０３９８】
図３Ｃは、ＴＧ−１＋／−マウスの抗−ＣＤ１９、またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）処理から７日後における、代表的なＢ２２０＋Ｂ細胞枯渇を示す。棒グラフのタイプは、抗体処理マウスの両側大腿骨内のＢ２２０＋細胞の合計数（±ＳＥＭ）を表す。試料平均（群当たり≧３マウス）の間の有意な差が示される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。予期せぬことに、低ないし検出不能レベルでｈＣＤ１９を発現したｍＣＤ１９＋プレ−Ｂ細胞の大きな割合も、骨髄から枯渇された。これに合致してＦＭＣ６３、ＨＢ１２ａ、ＨＢ１２ｂ、Ｂ４およびＨＤ２３７抗体は、骨髄Ｂ２２０＋細胞の大部分を枯渇させた。
【０３９９】
図３Ｄは、３色免疫蛍光染色によって評価した、ＴＧ−１＋／−マウスのＦＭＣ６３、またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）処理から７日後における、代表的な骨髄Ｂ細胞サブセット枯渇を示す。ＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏプロ−／プレ−Ｂ細胞を、ＣＤ４３発現に基づいてさらに細分した（下側パネル）。図３Ｅは、２色免疫蛍光染色によって評価した、ＣＤ１９ＴＧマウス計のＦＭＣ６３、またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）処理から７日後における、骨髄のＣＤ２５＋Ｂ２２０ｌｏプレ−Ｂ細胞の代表的な枯渇を示す。結果は、異なる日に行った実験からのものであり、ゲートは同一でなかった。個々の骨髄亜集団を分析すると、ＣＤ４３ｈｉＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏプロ−Ｂ細胞（図３Ｄ）の大部分は、ＴＧ−１＋／＋、ＴＧ−１＋／−またはＴＧ−２＋／＋マウスにおけるＦＭＣ６３抗体処理によって影響されず、他方、ＣＤ２５＋ＣＤ４３ｌｏＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏプレ−Ｂ細胞（図３Ｅ）の大部分は枯渇された。図３Ｆは、≧３同腹子対のＦＭＣ６３（閉じた棒線）または対照（開いた棒線）抗体処理から７日後における両側大腿骨内のプロ−Ｂ、プレ−Ｂ、未成熟、および成熟Ｂ細胞の数（±ＳＥＭ）を示す棒グラフを示す。結果は、未成熟および成熟Ｂ細胞の大部分は、ＴＧ−１＋／＋、ＴＧ−１＋／−またはＴＧ−２＋／＋マウスの骨髄からやはり枯渇されたことを示す。かくして、ほとんどのｈＣＤ１９＋細胞は、ＣＤ１９抗体処理によって骨髄から枯渇され、低レベルでｈＣＤ１９を発現したプレ−Ｂ細胞を示す。
【０４００】
（６．３．２  腹腔Ｂ細胞の枯渇）
ＴＧ−１＋／−マウスにおける腹腔Ｂ細胞は、主として、慣用的（Ｂ２）Ｂ細胞（図４Ａ）のＣＤ５−ＩｇＭｌｏＢ２２０ｈｉサブセットよりもほぼ２５％高い密度でｈＣＤ１９を発現したＣＤ５＋ＩｇＭｈｉＢ２２０ｌｏＢ１細胞の存在のため、他の組織Ｂ細胞（図１Ａおよび図１Ｃ）よりも高いレベルでｈＣＤ１９を発現する。図４ＢないしＣは、腹腔Ｂ細胞が抗−ＣＤ１９抗体処理に対して感受性であることを示す。
【０４０１】
図４Ａは、ヒトおよびマウスＣＤ１９発現（ｘ−軸）−対−腹腔ＣＤ５＋Ｂ２２０＋Ｂ１ａおよびＣＤ５−Ｂ２２０ｈｉＢ２（慣用的）Ｂ細胞の相対数（ｙ−軸）のプロットを  示す。腹腔リンパ球の単一−細胞の懸濁液をフローサイトメトリー分析での３色免疫蛍光染色によって調べた。棒グラフは、ＴＧ−１＋／−マウスの３同腹子対によるＣＤ１９発現についての平均ＭＦＩ（±ＳＥＭ）値を表す。
【０４０２】
図４Ｂは、ＣＤ１９（２５０μｇにおけるＨＢ１２ａ、ＨＢ１２ｂ、およびＦＭＣ６３；５０μｇのＢ４およびＨＤ２３７）抗体または対照抗体（２５０μｇ）で処理されたＴＧ−１＋／−マウスからの腹腔Ｂ２２０＋細胞の枯渇を示す。数は、７日における示されたゲート内でのＢ２２０＋細胞の相対的頻度を表す。棒グラフの値は、抗体処理マウス（群当たり≧３マウス）の腹腔内におけるＢ２２０＋細胞の合計数（±ＳＥＭ）を表す。試料平均の間の有意さが示される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。結果は、２５０μｇ／マウスでの抗−ＣＤ１９抗体処理が、７日までに腹腔Ｂ２２０＋Ｂ細胞の有意な割合を枯渇したことを示す。図４Ｂに示された結果は、部分的には、Ｂ１および慣用的Ｂ２細胞双方の枯渇によって説明される。ｈＣＤ１９がＴＧ−１＋／＋マウスにおいて最高密度で発現される場合、Ｂ１およびＢ２細胞の大部分が枯渇された。しかしながら、Ｂ１およびＢ２細胞のＣＤ１９−媒介枯渇は、ｈＣＤ１９レベルがより低いＴＧ−１＋／−およびＴＧ−２＋／＋マウスにおいて効率は低かった。かくして、腹腔Ｂ細胞は、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞よりも抗−ＣＤ１９抗体−媒介枯渇に対してより抵抗性であったが、平均蛍光強度を用いて評価して、ＣＤ１９抗体処理は、ＣＤ１９発現のそれらの密度に依存して腹腔Ｂ１およびＢ２細胞を枯渇させた。
【０４０３】
図４Ｃは、ｈＣＤ１９ＴＧマウスの抗−ＣＤ１９抗体または対照抗体処理から７日後における、ＣＤ５＋Ｂ２２０＋Ｂ１ａおよびＣＤ５−Ｂ２２０ｈｉＢ２  Ｂ細胞の代表的な枯渇を示す。数は、示されたゲート内での各Ｂ細胞サブセットの相対的頻度を表す。棒グラフの値は、抗体処理マウス（群当たり≧３マウス）の腹腔内の各細胞サブセットの合計数（±ＳＥＭ）を表す。試料平均の間の有意差が示される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【０４０４】
（６．３．３  区別される抗−ＣＤ１９抗体はＢ細胞クリアランスを媒介する。）
ＨＢ１２ａおよびＨＢ１２ｂ抗−ＣＤ１９抗体が公知の抗−ＣＤ１９抗体から区別されるかを決定するために、本明細書中で用いる各抗−ＣＤ１９抗体可変領域のアミノ酸配列を分析した（図５Ａおよび５Ｂ、６Ａおよび６Ｂ、７Ａおよび７Ｂ）。
【０４０５】
図５Ａは、ＨＢ１２ａ抗−ＣＤ１９抗体の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ接合配列についてのヌクレオチド（配列番号：１）および予測されるアミノ酸（配列番号：２）配列を示す。５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は、二重下線によって示され、冗長なプライマーを用いたので現実のＤＮＡ配列から変化し得る。Ｖ、ＤおよびＪ配列の間の近似的接合境界は、垂直棒線（｜）によって配列中に示される。下方の場合の文字におけるヌクレオチドは、体細胞過剰突然変異についての接合境界または腹腔部位におけるヌクレオチド付加いずれかを示す。抗体（Ｅ）のアミノ−末端残基は残基１としてマークされる。
【０４０６】
図５Ｂは、ＨＢ１２ｂ抗−ＣＤ１９抗体の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ接合配列についてのヌクレオチド（配列番号：３）および予測されるアミノ酸（配列番号：４）配列を示す。５’ＰＣＲプライマーと重複する配列は二重下線によって示され、冗長なプライマーを用いたので現実のＤＮＡ配列から変化し得る。Ｖ、Ｄ、およびＪ配列の間の近似的接合境界は、垂直棒線（｜）によって配列中に示される。下方の場合の文字におけるヌクレオチドは、体細胞過剰突然変異についての接合境界または腹腔部位におけるヌクレオチド付加いずれかを示す。抗体（Ｅ）のアミノ−末端残基は残基１としてマークされる。
【０４０７】
図６Ａは、ＨＢ１２ａ抗−ＣＤ１９抗体の軽鎖Ｖκ−Ｊκ接合配列についてのヌクレオチド（配列番号：１５）および予測されるアミノ酸（配列番号：１６）配列を示す。図６Ｂは、ＨＢ１２ｂ抗−ＣＤ１９抗体の軽鎖Ｖ−Ｊ接合配列についてのヌクレオチド（配列番号：１７）および予測されるアミノ酸（配列番号：１８）配列を示す。アミノ酸配列分析によって推定される成熟分泌蛋白質のアミノ−末端アミノ酸は数字１としてナンバリングされる。３’ＰＣＲプライマーと重複する配列は二重下線によって示される。Ｖ−Ｊ−Ｃ領域についての予測される接合境界は、太線で示した体細胞過剰突然変異についての腹腔部位を表すＪ領域ヌクレオチドで示される（／）。
【０４０８】
図７Ａおよび７Ｂは、公表されたマウス抗−ＣＤ１９抗体のアミノ酸配列整列を示す。図７Ａは、コンセンサス配列（配列番号：５）、ＨＢ１２ａ（配列番号：２）、４Ｇ７（配列番号：６）、ＨＢ１２ｂ（配列番号：４）、ＨＤ３７（配列番号：７）、Ｂ４３（配列番号：８）、およびＦＭＣ６３（配列番号：９）を含めた重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ接合配列についての配列整列を示す。各抗体Ｖ、ＤおよびＪ領域についてのコーディング配列のアミノ酸ナンバリングおよび起源の表示は慣用的方法（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））に従い、ここに、アミノ酸１ないし９４、および相補性−決定領域（ＣＤＲ１および２はＶＨ遺伝子によってコードされる。ダッシュは、同様なアミノ酸配列の整列を最大化するために配列に挿入されたギャップを示す。ドットは、各抗−ＣＤ１９抗体、およびすべての抗体についてのコンセンサスアミノ酸配列の間の同一性を示す。ＣＤＲ，領域は明瞭性のため強調する。図７Ｂは、抗−ＣＤ１９抗体の軽鎖Ｖκアミノ酸配列分析を示す。コンセンサス配列（配列番号：１０）、ＨＢ１２ａ（配列番号：１６）；ＨＢ１２ｂ（配列番号：１８）；ＨＤ３７（配列番号：１１）、Ｂ４３（配列番号：１２）、ＦＭＣ６３（配列番号：１３）、および４Ｇ７（配列番号：１４）を整列させる。各抗−ＣＤ１９抗体についてのコーディング配列のアミノ酸ナンバリングおよび起源の表示は慣用的方法に従う（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）。予測されるシグナル配列切断部位に続くアミノ酸は１とナンバリングされる。ダッシュは、同様なアミノ酸配列の整列を最大化するために配列に挿入されたギャップを示す。ＣＤＲ領域は明瞭性のために強調する（ボックスに入れる）。
【０４０９】
本実験で調べた各抗−ＣＤ１９抗体は、インビボにて有意な数のＢ細胞を枯渇させたため、各抗−ＣＤ１９抗体可変領域のアミノ酸配列を評価して、これらの抗体が配列が異なり、異なるＣＤ１９エピトープに潜在的に結合するか否かを決定した。抗体は、各抗体分子の可変領域内の特異的アミノ酸によって媒介される分子相互作用を介して標的抗原に結合する。かくして、蛋白質抗原、およびこれらの抗原上の特異的エピトープに結合する抗体の間の複雑な相互作用は、各抗体、およびその特異的アミノ酸配列に対してほとんどユニークである。抗原および抗体相互作用における複雑性のこのレベルは、ほとんどの蛋白質抗原に対する多用な抗体レパートリーの反映である。標的抗原の抗体相互作用は、主として、抗体分子の相補性−決定領域（ＣＤＲ）内のアミノ酸によって媒介されるため、フレームワークアミノ酸もまた抗原−結合活性に対してやはり臨界的である。かくして、構造的に同様な抗体は同一抗原または標的分子の領域に結合するようであり、他方、異なるＶおよびＣＤＲ領域を持つ構造的に同様でない抗体は、異なる分子相互作用を介して抗原の異なる領域と相互作用するようである。
【０４１０】
標的抗原の同一分子領域（またはエピトープ）と相互作用し、それに結合する抗体は定義により構造的に同様であるため、ＨＢ１２ａ、ＨＢ１２ｂ、ＦＭＣ６３、およびＨＤ３７（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，１９６：５１−６２（１９９６）；Ｌｅ  Ｇａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ，４５３：１６４−１６８（１９９９））、２Ｇ７（Ｍｅｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ，３：３０５−３２０（１９８４）；Ｂｒａｎｄｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．，２７：１２６４−１２７０（１９９９））、およびＢ４３（Ｂｅｊｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５５：２３４６−２３５１（１９９５））抗体を含めた他の公表された抗−ＣＤ１９抗体のアミノ酸配列を比較した。抗−ＣＤ１９抗体の重鎖は、Ｖ１Ｓ３９、Ｖ１Ｓ５６、Ｖ１Ｓ１３６、またはＶ２Ｓ１遺伝子セグメントに由来するＶ領域、ＦＬ１６．１遺伝子セグメントに由来するＤ領域およびＪ２またはＪ４遺伝子セグメントいずれかに由来するＪ領域を持つＶ（Ｄ）Ｊ遺伝子セグメントの異なる組合せを介して作製した（表２）。Ｂ４３およびＨＤ３７抗体の公表された重鎖および軽鎖可変領域は、アミノ酸配列が実質的に同一であった（図７ＡないしＢ）。このレベルの保存は、これらの抗体の各々がヌクレオチドレベルにおいてやはり顕著に同様であり、ＶＨ（Ｄ）ＪＨおよびＶＬＪＬ接合を有する事実を反映し、ほとんどの差は各ｃＤＮＡ配列をＰＣＲ増幅するための冗長なプライマーの使用によって説明される。これは、ＨＤ３７およびＢ４３および抗体が、たとえ同一でなくても共通の起源を有し、従って、ＣＤ１９蛋白質上の同一のエピトープに結合することを示す。ＨＢ１２ａおよび４Ｇ７抗体もまた他の抗−ＣＤ１９抗体から区別された。ＨＢ１２ａおよび４Ｇ７抗体の重鎖領域は同様であって、同一の生殖系ＶＨ（Ｄ）ＪＨ遺伝子セグメントに由来したように見えたが、異なる接合境界をＤ−ＪＨ組み立てで用いた（図７Ａ）ＨＢ１２ｂ抗体は区別されるＶＨ遺伝子セグメントを利用し（表２）、他の抗−ＣＤ１９抗体から区別して異なるＣＤＲ３配列を有した（図７Ａ）。ＦＭＣ６３抗体もまた、他の抗−ＣＤ１９抗体からの非常に区別されるアミノ酸配列を有した。
【０４１１】
（表２）
【０４１２】
【表２】
2008546647.tif 000004
Ｎ．Ｄ．、測定せず
ａ括弧に入れた数字は、ＣＤ１９抗体コーディング遺伝子、およびＰＣＲプライマーと重複する領域を除いた、現在のデータベースで同定される最も相同な生殖系配列の間のヌクレオチド差の数を示す。
ｂ遺伝子配列についてのＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）アクセッション番号
図７Ｂに示すように、ＨＢ１２ａ、ＨＢ１２ｂ、ＦＭＣ６３、４Ｇ７、およびＨＤ３７／Ｂ４３抗体は、各々、区別される軽鎖遺伝子を利用する（図７Ｂ）。軽鎖は、複数ＶおよびＪ遺伝子セグメントから作製した。これらの６つの抗−ＣＤ１９抗体ＨおよびＬ鎖配列間の相同性の欠如は、これらの抗体がヒトＣＤ１９上の数個の区別される部位に結合することを示唆する。対合した重鎖および軽鎖のアミノ酸配列の比較は、さらに、これらの抗−ＣＤ１９抗体のほとんどが構造的に区別され、従って、異なる分子相互作用を介してヒトＣＤ１９に結合することを示す。かくして、インビボにてＢ細胞を枯渇させる抗−ＣＤ１９抗体の能力は、同一部位においてＣＤ１９に結合する限定された数の抗体に制限されず、これは、クラスとしての抗−ＣＤ１９抗体の一般的特性である。
【０４１３】
（６．３．４  ＣＤ１９密度は、ＣＤ１９抗体−誘導Ｂ細胞枯渇の有効性に影響する。）
Ｂ細胞を枯渇する抗−ＣＤ１９抗体の能力は、ＣＤ１９密度に依存するか否かを決定するために、ＨＢ１２ｂおよびＦＭＣ６３抗−ＣＤ１９抗体を、変化するレベルのＣＤ１９発現を有するマウスに投与した。結果は、Ｂ細胞上のヒトＣＤ１９密度、および抗体イソタイプが抗−ＣＤ１９抗体の存在下でのＢ細胞の枯渇に影響し得ることを示す。同一アッセイを用いて、他の抗−ＣＤ１９抗体が効果的にＢ細胞を枯渇できるか否かを決定することができ、結果を変化するレベルのＣＤ１９発現を持つヒト患者の処置と相関させることができる。かくしてセクション５．５．３に記載されたヒト対象においてＣＤ１の存在および密度を調べるための方法を用いて、それについてある種の抗−ＣＤ１９抗体がＢ細胞を枯渇させることができる患者または患者集団を同定することができ、および／または抵当な用量を決定することができる。
【０４１４】
前記で示した結果は、テストした全ての５つの抗−ＣＤ１９抗体が、２５０または５０μｇで用いた場合に、ＴＧ−１＋／−マウスにおいて同様に有効であるが、血液骨髄および脾臓からのＢ細胞についてのＢ細胞枯渇の程度は、抗体イソタイプＩｇＧ２ａ＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ２ｂと相関するように見えたことを示す（図２Ａないし２Ｄ）。従って、ＨＢ１２ｂ（ＩｇＧ１）およびＦＭＣ６３（ＩｇＧ２ａ）抗体の有効性を、異なる密度でＣＤ１９を発現するホモ接合性ＴＧ−１＋／＋、ヘテロ接合性ＴＧ−１＋／−およびホモ接合性ＴＧ−２＋／＋マウスにおいて比較した（図１ＡないしＥ）。
【０４１５】
ＣＤ１９密度が抗−ＣＤ１９抗体−誘導Ｂ細胞枯渇の有効性に影響するか否かを調べるために、代表的な血液および脾臓Ｂ細胞枯渇を、ＨＢ１２ｂ（図８Ａ）またはＦＭＣ６３（図８Ｂ）抗体処理（７日、２５０μｇ／マウス）後にｈＣＤ１９ＴＧマウスにおいて調べた。数字は、ゲーテッドＢ２２０＋リンパ球のパーセンテージを示す。棒グラフは、抗−ＣＤ１９抗体（閉じた棒線）またはイソタイプ−対象（開いた棒線）抗体での処理後における（ｍＬ当たりの）血液または脾臓（合計数）Ｂ細胞の数（±ＳＥＭ）を示す。抗−ＣＤ１９抗体またはイソタイプ対照抗体処理マウス（データ点当たり≧３マウス）についての平均結果の間の有意さが示される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【０４１６】
図８Ａないし８Ｄに示された結果は、ＣＤ１９の密度がインビボにて抗−ＣＤ１９抗体によるＢ細胞枯渇の効率に影響することを示す。ＴＧ−２＋／＋マウスにおける低レベルのＣＤ１９発現は、７日においてＨＢ１２ｂ抗体による循環または組織Ｂ細胞枯渇に顕著な影響を有した（図８Ａ）。ＴＧ−１＋／＋、ＴＧ−１＋／−およびＴＧ−２＋／＋マウスによるＣＤ１９発現の差もまた、ＦＭＣ６３抗体による循環および組織Ｂ細胞枯渇に影響したが、循環Ｂ細胞枯渇を有意には変化させなかった（図８Ｂ）。
【０４１７】
ＣＤ１９密度がＣＤ１９  ｍＡｂ−媒介Ｂ細胞枯渇における重要な因子であることをさらに確認するために、ＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋およびＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋Ｂ細胞の相対的枯渇速度を直接的に比較した。ＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋およびＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋マウスからの脾臓細胞を、ｈＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋からの未分画脾臓細胞を標識することによってＣＦＳＥで異なって標識し、ｈＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋マウスは、製造業者の指示に従って、各々、０．１および０．０１μＭ  ＶｙｂｒａｎｔＴＭ  ＣＦＤＡ  ＳＥ（ＣＦＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。ＣＦＳＥ−標識脾臓細胞の間でのＢ２２０＋細胞の相対的頻度は、フローサイトメトリー分析での免疫蛍光染色によって決定した。引き続いて、同等数のＣＦＳＥ−標識Ｂ２２０＋ｈＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋およびｈＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋脾臓細胞（２．５×１０５）を３つの野生型Ｂ６マウスの腹腔な注射した。１時間後にマウスにＦＭＣ６３または対照ｍＡｂ（２５０μｇ、腹腔内）いずれかを与えた。２４時間後に標識したリンパ球は、フローサイトメトリーによって評価して、ＣＦＳＥ−標識Ｂ２２０＋およびＢ２２０−細胞の相対的頻度につき回復した。図８Ｃにおける各ヒストグラム中のゲートは、ＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋（ＣＦＳＥｈｉｇｈ）およびＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋（ＣＦＳＥｌｏｗ）は脾臓細胞集団内のＢ２２０＋細胞の頻度を示す。棒グラフは、対照ｍＡｂ−処理マウスに対する抗−ＣＤ１９ｍＡｂ処理マウスに存在するＣＦＳＥ標識細胞集団の数を示す。結果は、≧３野生型受容体マウスに導入されたｈＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋脾臓細胞（塗り潰した棒線）およびｈＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋脾臓細胞（開いた棒線）を表し、試料平均（±ＳＥＭ）の間の有意さが示された；＊＊ｐ＜０．０１。
【０４１８】
個々のマウスの抗−ＣＤ１９または対照ｍＡｂ処理から２４時間後にＢ細胞クリアランスを評価した。ＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞は、対照ｍＡｂ−処理マウスと比較して抗−ＣＤ１９ｍＡＢ処理マウスにおけるＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋Ｂ細胞よりも有意に速い速度（ｐ＜０．０１）で枯渇された（図８Ｃ）。さらに、抗−ＣＤ１９ｍＡｂ処理マウスにおけるＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞に対するＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞の相対的頻度は、対照ｍＡｂ処理マウスにおけるＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞に対するＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋Ｂ２２０＋Ｂ細胞の比率よりも有意に低かった（ｐ＜０．０１）。同様に、抗−ＣＤ１９または対照ｍＡｂマウスにおけるＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋およびＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋ＣＦＳＥ−標識Ｂ２２０−細胞の数もまた匹敵した。かくして、高密度ＣＤ１９を発現するＣＤ１９ＴＧ−１＋／＋Ｂ細胞は、低密度でＣＤ１９を発現するＣＤ１９ＴＧ−２＋／＋Ｂ細胞よりも速い速度で枯渇された。
【０４１９】
図８Ｄは、ＣＤ１９（太線）、ＣＤ２０（細線）またはイソタイプがマッチした対照（ＣＴＬ，ダッシュ線）抗体（５μｇ／ｍＬ）で染色されたＢ２２０＋の蛍光密度を示し、抗体染色はフローサイトメトリー分析にてイソタイプ−特異的ＰＥ−コンジュゲーテッド二次抗体を用いて可視かされた。結果は４つの実験で得られたものを表す。結果は、ＴＧ−１＋／−マウスからの脾臓Ｂ２２０＋Ｂ細胞上の相対的抗−ｈＣＤ１９および抗−ｍＣＤ２０抗体結合密度を示す。抗−ｍＣＤ２０抗体結合の密度が、いずれの抗体イソタイプが各抗体で用いられたかにかかわらず、１０ないし６４％と、抗−ＣＤ１９抗体結合と同様に高かった（図８Ｄ）。ｍＣＤ２０発現はｈＣＤ１９発現よりも一般には低かったが、ＴＧ−１＋／−におけるｈＣＤ１９発現のレベルは、依然として、ヒトＢ細胞で見出されるｈＣＤ１９発現のレベルに匹敵する（図１Ｂ）。かくして、抗−ＣＤ１９抗体は、比較的低密度でｈＣＤ１９を発現したＴＧ−２＋／＋Ｂ細胞を有効に枯渇させた（図１Ｂ）が、ＴＧ−１＋／＋およびＴＧ−１＋／−Ｂ細胞による高レベルＣＤ１９発現は、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ１抗体の有効性の相対的差を不明瞭とした。ＴＧ−１およびＴＧ−２トランスジェニックマウスにおけるＢ細胞の数およびｈＣＤ１９発現の密度の間には直接的な逆相関があるが、ｈＣＤ１９の密度は、Ｂ細胞の枯渇に寄与する重要な因子である。抗−ＣＤ１９抗体レベルは、２５０μｇ／マウスで投与した場合に飽和された（また、図１２における飽和レベル参照）。かくして、遊離抗−ＣＤ１９抗体レベルは、Ｂ細胞数にかかわらず過剰であった。
【０４２０】
（６．４  実施例３：組織Ｂ細胞枯渇はＦＣγＲ−依存性である。）
以下のアッセイを用いて、抗−ＣＤ１９抗体によるＢ細胞枯渇は、ＦｃγＲ発現に依存するか否かを決定した。ある種のＦｃγＲを欠如するマウスとｈＣＤ１９ｔｇを異種交配させるプロセスを通じ、ｈＣＤ１９を発現し、ある種のＦｃγＲの発現を欠如するマウスを  作製した。そのようなマウスをアッセイで用いて、ＦｃγＲ発現に関係する経路、例えば、ＡＤＣＣを介してＢ細胞を枯渇させる抗−ＣＤ１９抗体の能力を評価した。かくして、これらのアッセイで同定された抗−ＣＤ１９抗体を用いて、セクション５．１で前記された技術を用いてキメラ、ヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を作製することができる。そのような抗体は、今度は、ヒトにおける自己免疫疾患および障害の治療のために本発明の組成物および方法で用いることができる。
【０４２１】
先天性免疫系は、ＦｃγＲ−依存性プロセスを介する抗−ＣＤ２０抗体処理に続いて、Ｂ細胞枯渇を媒介する。マウスエフェクター細胞はＩｇＧについて４つの異なるＦｃγＲくらす、高−親和性ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、低−親和性ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）、およびＦｃγＲＩＶ分子を発現する。ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃγＲＩＶはヘテロオリゴマー複合体である、ここに、各リガンド−結合α鎖は共通のγ鎖（ＦｃＲγ）と会合する。ＦｃＲγ鎖発現はＦｃγＲの組み立て、およびマクロファージによるファゴサイトーシスを含めたエフェクター機能のＦｃγＲトリガリングに必要である。ＦｃＲγ−／−マウスは高−親和性ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）および低−親和性ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）およびＦｃγＲＩＶ分子を欠如するため、ｈＣＤ１９を発現するＦｃＲγ−／−マウスを  用いて、抗−ＣＤ１９抗体処理に続いての組織Ｂ細胞枯渇におけるＦｃγＲの役割を評価した。図９Ａは、ＦｃＲγ＋／−またはＦｃＲγ−／−同腹子の抗−ＣＤ１９またはイソタイプ対照抗体処理から７日後における代表的な血液および脾臓Ｂ細胞枯渇を示す。数字は、示されたゲート内におけるＢ２２０＋リンパ球のパーセンテージを示す。図９Ｂは、０日におけるＦｃＲγ−／−同腹子の抗体処理から７日後における血液および組織Ｂ細胞枯渇を示す。血液では、時刻０後に示された値は、１時間において得られたデータを表す。棒グラフは、マウス（群当たり≧３マウス）の抗−ＣＤ１９（塗り潰した棒線）またはイソタイプ対照（開いた棒線）抗体処理後における平均Ｂ２２０＋Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を表す。抗−ＣＤ１９またはイソタイプ−対照抗体処理マウスについての平均結果の間の有意な差が示される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図９Ａおよび９Ｂに示された結果は、抗−ＣＤ１９抗体処理に続いてのＢ細胞枯渇がＦｃＲγ−依存性であることを示す。対照ＩｇＧ２ａ抗体で処理されたＦｃＲγ−／−同腹子と比較すると、ＦＭＣ６３抗体処理に続いて、ＦｃＲγ−／−マウスにおける骨髄、血液、脾臓、リンパ節および腹腔Ｂ細胞の数に有意な変化はなかった。対照的に抗−ＣＤ１９抗体処理は、ＦｃＲγ＋／−同腹子においてほとんどのＢ細胞を枯渇させた。かくして、抗−ＣＤ１９抗体処理は、主として、ＦｃγＲＩおよびＦｃγＲＩＩＩ発現を必要とする経路を通じて血液および組織Ｂ細胞を枯渇させる。
【０４２２】
図９Ｃは、単球−枯渇ｈＣＤ１９ＴＧ−１＋／−マウスにおける代表的なＢ細胞数を示す。マウスを−２、１および４日にクロドロネート−リポソームで処理し、０日にＦＭＣ６３（ｎ＝９）、イソタイプ対照（ｎ＝６）、またはＣＤ２０（ｎ＝３）ｍＡｂ（２５０μｇ）を与えた。ＰＢＳ−リポソームおよびＦＭＣ６３抗−ＣＤ１９抗体（Ｎ＝３）で処理したマウスを対照として供した。代表的な血液および脾臓Ｂ細胞枯渇を、示されたゲート内でのリンパ球のパーセンテージと共に抗体処理から７日後に示される。
【０４２３】
図９Ｄは、（Ｃ）におけるような抗体処理から７日後の血液および組織Ｂ細胞枯渇を示す。棒グラフは、マウス（群当たり≧３マウス）の抗体処理後の平均Ｂ２２０＋Ｂ細胞数（±ＳＥＭ）を表す。血液では、値は、ＦＭＣ６３抗−ＣＤ１９抗体で処理したＰＢＳ−処理マウス（閉じた三角形）、または対照抗体（開いた丸印）、ＣＤ２０抗体（閉じた四角）、またはＦＭＣ６３抗−ＣＤ１９抗体（閉じた丸印）で処理した単球−枯渇マウスにおける循環Ｂ細胞の数を示す。イソタイプ−対象ｍＡｂ−処理マウスおよび他の群についての平均結果の間の有意差が示される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。
【０４２４】
図９に示された結果は、抗−ＣＤ１９抗体処理に続いてのＢ細胞枯渇がＦｃＲγおよび単球−依存性であることを示す。リポソーム−カプセル化クロドロネートでの処理によってマクロファージ−欠乏とされたマウスは、ＦＭＣ６３、抗−ＣＤ２０（ＭＢ２０−１１）または対照抗−ＣＤ１９抗体処理から１日後に循環Ｂ細胞を有意に枯渇させず、ＦＭＣ６３抗体処理はＰＢＳ−負荷リポソームで処理されたマウスにおいて循環Ｂ細胞を排除した（図９ＣないしＤ）。４ないし７日後に、循環Ｂ細胞の数はＦＭＳ６３および抗−ＣＤ２０抗体処理双方によって有意に枯渇され、抗−ＣＤ１９抗体処理はクロドロネート−処理マウスにおいてＢ細胞数に対してより劇的な効果を有する。同様に、抗−ＣＤ１９および抗−ＣＤ２０抗体処理は、対照抗体処理同腹子に対して７日においてクロドロネート−処理マウスにおいて骨髄Ｂ２２０＋細胞数を５５％だけ減少させ、他方、抗−ＣＤ１９抗体処理はＰＢＳ−処理マウスにおいて骨髄Ｂ２２０＋細胞数を８８％だけ減少させた。抗−ＣＤ１９抗体処理は、対照抗体処理同腹子に対して７日にクロドロネート−処理マウスにおいて脾臓Ｂ細胞数を５２％だけ減少させ、他方、抗−ＣＤ２０抗体処理はＢ細胞を最小に枯渇させ、抗−ＣＤ１９抗体処理はＰＢＳ−処理マウスにおいて脾臓Ｂ細胞数を８９％だけ減少させた。抗−ＣＤ１９抗体処理および抗−ＣＤ２０抗体処理は共に対照抗体処理同腹子に対して７日にクロドロネート−処理マウスにおいてリンパ節Ｂ細胞数を４８ないし５３％だけ減少させ、他方、抗−ＣＤ１９抗体処理は、ＰＢＳ処理マウスにおいてリンパ節Ｂ細胞数を９３％だけ減少させた。血液、脾臓およびリンパ節において、抗−ＣＤ１９抗体処理は、ＰＢＳ処理同腹子におけるよりもクロドロネート−処理マウスにおいて有意に効率は低かった（ｐ＜０．０１）。これらの治験は、インビボにおけるＣＤ１９＋およびＣＤ２０＋Ｂ細胞の枯渇についての主要エフェクター細胞としてのマクロファージを示唆し、抗−ＣＤ１９抗体療法が、単球の数または機能が低下した場合に、抗−ＣＤ２０１９抗体療法よりも有効であり得ることを示す。
【０４２５】
（６．５  実施例４：抗−ＣＤ１９抗体−誘導Ｂ細胞欠失は持続的である。）
Ｂ細胞枯渇の有効性および持続を評価するために、ｈＣＤ１９ＴＧマウスに抗−ＣＤ１９抗体の単一低用量２５０μｇ注射を投与した。図１０ＡないしＣは、抗−ＣＤ１９抗体処理に続いてのＢ細胞枯渇の持続および用量応答を示す。図１０Ａは、０日におけるＴＧ−１＋／−マウスのＦＭＣ６３またはイソタイプ−対照抗体処理に続いての血液Ｂ２２０＋Ｂ細胞およびＴｈｙ−１＋Ｔ細胞の数を示す。値は、各群における６匹のマウスからの平均（±ＳＥＭ）結果を表す。結果は、循環Ｂ細胞が、続く１３週間にわたって血液で生じるＢ細胞の暫時の回復でもって１３週間枯渇したことを示す。Ｔｈｙ−１＋Ｔ細胞表示は、抗−ＣＤ１９処理の結果として変わらなかった。
【０４２６】
図１０Ｂないし１０Ｃは、抗体処理から１１、１６および３０週間後の図１０Ａに示されたマウスにおける代表的な組織Ｂ細胞枯渇を示す。数字は、示されたゲート内でのＢ２２０＋リンパ球のパーセンテージを示す。図１０Ｂにおける結果は、骨髄、血液、脾臓、リンパ節および腹腔が抗体処理から１１週間後にＢ細胞を実質的に欠如したことを示す（試料平均の間の有意な差が示される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１）。循環Ｂ細胞の最初の出現の後、循環Ｂ細胞数が正常な範囲に到達するのに＞１０のさらなる週間を必要とした。抗体処理から１６週間後までに、血液、脾臓、ＬＮおよびＰＬのＢ細胞は回復し始め、他方、ＢＭ  Ｂ細胞区画は未処理対照から有意に異ならなかった。図１０Ｃに示すように、３０週間までには、全ての組織は正常な対象におけるのと匹敵するレベルのＢ細胞が以前のように集団を形成した。
【０４２７】
図１０Ｄは、血液、骨髄および脾臓のＢ細胞枯渇についての抗−ＣＤ１９抗体用量応答を示す。マウスを、０日に抗−ＣＤ１９抗体で処理し、組織Ｂ細胞提示を７日に評価した。結果は、各抗体用量について各群において３匹のマウスで得られたものを表す。対照抗体用量は２５０μｇであった。試料平均の間の有意な差が示される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。２μｇ／マウスと低い単一ＦＭＣ６３抗体用量は有意数の循環Ｂ細胞を枯渇させ、他方、１０μｇのＨＢ１２ｂ抗体は循環Ｂ細胞数を有意に低下させるのに必要であった（図１０Ｄ）。７日までの骨髄および脾臓Ｂ細胞の有意な枯渇は、５倍高い抗体用量の１０ないし５０μｇ／マウスを必要とした。かくして、比較的低い用量におけるＣＤ１９抗体処理は、有意な時間の間、循環および組織Ｂ細胞の大部分を枯渇させることができる。
【０４２８】
（６．５．１  抗−ＣＤ１９抗体の投与後におけるＢ細胞表面でＣＤ１９は執拗に存在する。）
ＣＤ１９内部化がインビボでＢ細胞枯渇に影響したか否かは、ＨＢ１２ａ、ＨＢ１２ｂおよびＦＭＣ６３抗体処理（２５０μｇ）後に細胞−表面ＣＤ１９発現を比較することによって評価した。
【０４２９】
図１１Ａないし１１Ｃは、ＨＢ１２ａ（図１１Ａ）、ＨＢ１２ｂ（図１１Ｂ）、ＦＭＣ６３（図１１Ｃ）またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）でインビボ処理したＴＧ−１＋／−マウスにおける細胞表面ＣＤ１９発現およびＢ細胞クリアランスを示す。時刻０（抗−ＣＤ１９投与前）における、および抗体投与から１、４および２４時間後において、脾臓Ｂ細胞を収穫し、フローサイトメトリー分析にてインビトロで細胞をイソタイプ−特異的二次抗体で処理することによって、ＣＤ１９（太線）および対照（細線）抗体結合について評価した。単離されたＢ細胞を、フローサイトメトリー分析にてインビトロで飽和濃度の各ＣＤ１９抗体＋イソタイプ特異的二次抗体でインビトロにてやはり処理した。各時点は一匹のマウスについての結果を表す。図１１Ａないし１１Ｃに表される結果は、細胞表面ＣＤ１９がインビボでの抗体結合に続いて細胞表面から排除されないことを証明し、脾臓Ｂ細胞の大部分は、均一な高レベルの細胞表面ｈＣＤ１９を抗体処理後２４時間までの間発現したが、Ｂ細胞のサブセットは、ＦＭＣ６３抗体処理後１時間において低下したレベルのｈＣＤ１９を発現したことを示す（図１１Ｃ）。図１１Ａないし１１Ｃに示された結果は、Ｂ細胞の表面のＣＤ１９の量が一定であることも示し、ＡＤＣＣを媒介するＢ細胞の能力が維持されることを意味する。
【０４３０】
結果は、ＣＤ１９が驚くべきことに、抗−ＣＤ１９抗体の投与後に予測されるよりも低いレベルの内部化を呈したことを示す。特に、結果は、ＣＤ１９が、予期せぬことに、抗−ＣＤ１９抗体の結合に続いて細胞表面に執拗に存在し、かくして、Ｂ細胞はＡＤＣＣ活性に対して接近可能なままであることを示す。これらの結果は、部分的には、本発明の抗−ＣＤ１９抗体および治療養生法がなぜ、自己免疫疾患および障害を治療するのに有効であるかを示す。
【０４３１】
図１２Ａないし１２Ｃは、Ｂ細胞の枯渇の程度、およびｈＣＤ１９に結合し、かくして、他の抗−ｈＣＤ１９抗体の結合を阻害する抗−ＣＤ１９抗体の能力を記載する。図１２Ａにおける結果は、ＦＭＣ６３（２５０μｇ）のＴＧ−１＋／−マウスへの単一投与の結果、抗体投与から１時間以内に血液および脾臓Ｂ細胞が共に有意に枯渇されることを示す。この実験において、抗−ＣＤ１９抗体投与に先立って、あるいはそのうち種々の時点、１、４または２４時間後に、血液および脾臓を収穫し、Ｂ細胞頻度を評価した。血液試料を抗−Ｔｈｙ１．２および抗−Ｂ２２０染色して、下側右象限においてＢ細胞を同定した。脾臓細胞を抗−ＩｇＭおよび抗−Ｂ２２０抗体で染色した、示されたゲート内でＢ細胞を同定した。各時点は１匹のマウスでの結果を表す。予期せぬことに、血液Ｂ細胞は脾臓Ｂ細胞よりも迅速に除去された。
【０４３２】
図１２Ａに記載されたＢ細胞枯渇は、投与された抗体が、投与から１時間以内に、ｈＣＤ１９上の利用可能な抗体−結合部位を飽和したことを示唆した。この観察を確認するために、マウスをＦＭＣ６３（ｈＣＤ１９）結合抗体またはイソタイプ−対照抗体いずれかで処理した。その後種々の時点において、血液および脾臓Ｂ細胞をフルオロクローム−コンジュゲーテッドＢ４抗体で染色して、ｍＣＤ１９＋またはｍＣＤ２０＋Ｂ細胞の表面の占有されていない抗体結合部位を同定した。上方および下方−右側象限内の細胞の頻度を占めす。各時点は、一匹のマウスからの結果を表す。結果は、ＦＭＣ６３処理の結果、脾臓よりも迅速に枯渇される血液Ｂ細胞での実験の間にわたってｈＣＤ１９担持細胞が徐々に枯渇したことを示す。各時点において残存するＢ細胞はｍＣＤ１９またはｍＣＤ２０のそれらの発現によって同定することができるが、Ｂ４によって染色されず、これは、投与されたＦＭＣ６３が残存するＢ細胞に結合したことを示唆する。これらの治験は、インビボでＢ細胞に結合し、それを枯渇させるＦＭＣ６３の能力を確認する。さらに、ＦＭＣ６３はＢ４結合を妨げ、これは、これらの抗体がｈＣＤ１９上の重複するエピトープを認識することを示唆する。図１２Ｃの結果により、ＨＢ１２ｂ抗体処理（２５０μｇ）もまた、投与から１時間以内にｈＣＤ１９上の抗体−結合部位を飽和し、その結果、ｈＣＤ１９陽性Ｂ細胞を枯渇することが確認される。予期せぬことに、ＨＢ１２ｂ抗体はＢ４抗体の結合を完全には阻害せず、これは、ＦＭＣ６３とは異なり、ＨＢ１２ｂが、Ｂ４によって認識されるものとは区別されるｈＣＤ１９上のエピトープを認識することを示唆する。図１２Ｂないし１２Ｃに示される結果は、ほとんどの抗−ＣＤ１９抗体がほとんどの他の抗−ＣＤ１９抗体の結合を阻害することを証明し、これは、ほとんどの抗−ＣＤ１９抗体が、ＣＤ１９蛋白質上の同様な、同一の、または重複する領域またはエピトープに結合することを示す。別法として、これらの観察は、抗体分子のサイズと比較したＣＤ１９細胞外ドメインの比較的小さなサイズにも由来し得る。
【０４３３】
（６．６  実施例５：抗−ＣＤ１９抗体処理は、液性免疫および自己免疫を無くする。）
本実施例に記載されたアッセイを用いて、抗−ＣＤ１９抗体が免疫応答を排除または弱めることができるか否かを決定することができる。これらのアッセイで同定された抗−ＣＤ１９抗体を用いて、セクション５．１にて前記した技術を用いてキメラ、ヒトまたはヒト化抗−ＣＤ１９抗体を作製することができる。そのような抗体は、今度は、自己免疫疾患および障害のヒトにおける治療用の本発明の組成物および方法で用いることができる。
【０４３４】
血清抗体レベルに対する抗−ＣＤ１９抗体−誘導Ｂ細胞枯渇の効果は、ｈＣＤ１９ＴＧ＋／−マウスに抗−ＣＤ１９抗体の単一注射を与えることによって評価した。図１３Ａは、ＣＤ１９抗体処理がＴＧ−１＋／−マウスにおいて血清免疫グロブリンレベルを低下されることを示す。二ヶ月齢同腹子を０日においてＦＭＣ６３（閉じた丸印）または対照（開いた丸印）抗体（２５０μｇ）の単一注射で処理した。抗体レベルをＥＬＩＳＡによって測定し、平均値（±ＳＥＭ）を≧５マウスの各群について示す。ＣＤ１９または対照ｍＡｂ−処理マウスの間の差は有意であった；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。結果は、１ないし２週間後には、血清ＩｇＭ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＡ抗体レベルは有意に低下され、少なくとも１０週間の間は低下したままであったことを示す。（図１３Ａ）。ＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａ血清レベルは処理から６週間および４週間のちに有意に正常未満であった。
【０４３５】
ｈＣＤ１９ＴＧ＋／−マウスは２ヶ月齢後に検出可能な自己抗体を生産する（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５７：４３７１（１９９６））ため、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡおよびヒストンへも血清自己抗体結合を評価した。図１３Ｂは、抗−ＣＤ１９抗体処理が、抗−ＣＤ１９抗体処理の後に、自己抗体抗−ｄｓＤＮＡ、抗−ｓｓＤＮＡおよび抗−ヒストン自己抗体を低下させることを示す。結果は、抗−ＣＤ１９抗体処理が２週間のちに血清ＩｇＭ自己抗体レベルを有意に低下させ、１０週間までの間、イソタイプ−スイッチドＩｇＧ自己抗体の発生を妨げたことを示す（図１３Ｂ）。かくして、Ｂ細胞枯渇は急性および長期抗体応答を実質的に低下させ、正常および病原性免疫応答のクラス−スイッチングを減弱化した。
【０４３６】
Ｔ細胞−非依存性タイプ１（ＴＩ−１）およびタイプ２（ＴＩ−２）抗体応答に対するＢ細胞枯渇の影響を、抗−ＣＤ１９抗体（ＦＭＣ６３）または対照抗体処理から７日に、ｈＣＤ１９ＴＧ＋／−マウスを（０日に）ＴＮＰ−ＬＰＳまたはＤＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌで免疫化することによって評価した。有意なハプテン−特異的ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡ抗体応答は、いずれの抗原で免疫化した抗−ＣＤ１９抗体−処理マウスにおいても観察されなかった（図１４Ａおよび１４Ｂ）。Ｔ細胞−依存性（ＴＧ）Ａｇ、ＤＮＰ−ＫＬＨに対する抗体応答もまた、免疫化から７日前に抗−ＣＤ１９抗体で処理したマウスを用いて評価した（図１４Ｂ）。図１４Ｃは、抗−ＣＤ１９抗体で処理されたＤＮＰ−ＫＬＨ免疫化マウスは低下した液性免疫を示したことを示す。同腹子を、０日における一次免疫化の７日前にＦＭＣ６３（閉じた丸印）、対照（開いた丸印）抗体（２５０μｇ）で処理し、示した日に血清を得た。ＤＮＰ−ＫＬＨ免疫化のために、２１日に、すべてのマウスを１００μｇのＤＮＰ−ＫＬＨで挑戦させた。全ての値は、各群の５匹のマウスからの血清を用いて得られた平均（±ＳＥＭ）ＥＬＩＳＡ  ＯＤ単位である。抗−ＣＤ１９または対照抗体−処理マウスの間の差は有意であった；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１結果は、対照抗体−処理同腹子が、ＤＮＰ−ＫＬＨ免疫化から７日のちに一次ＩｇＭ抗体応答を生じ、２１日における抗原挑戦後に二次応答を生じたことを示す（図１４Ｃ）。しかしながら、有意なハプテン−特異的ＩｇＭ、ＩｇＧまたはＩｇＡ抗体応答は、抗原で免疫化された、またはそれで再度挑戦されたＣＤ１９  ＭＡｂ−処理マウスで検出されなかった。二次抗体応答に対するＢ細胞枯渇の効果を評価するために、マウスをＤＮＰ−ＫＬＨで免疫化し、１４日のちに抗−ＣＤ１９抗体で処理した（矢印）（図１４Ｄ）。２１日までには、血清ＩｇＭ、ＩｇＧ、およびＩｇＡ抗−ＤＮＰ抗体応答は、ＣＤ１９ｍＡｂ−処理マウスにおいて、対照ｍＡｂで処理した免疫化マウスのそれ未満のレベルまで低下していた。しかしながら、２１日にＤＮＰ−ＫＬＨでの対照ｍＡｂ−処理マウスの再挑戦は、有意な二次抗体応答を誘導し、他方、ＣＤ１９  ｍＡｂ−処理マウスはＤＮＰ−ＫＬＨ再挑戦のちに抗−ＤＮＰ抗体を生じなかった。かくして、ＣＤ１９  ｍＡｂ−誘導Ｂ細胞枯渇は一次および二次双方の抗体応答を実質的に低下させ、液性免疫応答のあいだのクラス−スイッチングを妨げた。
【０４３７】
（６．７  実施例６：抗−ＣＤ２０抗体処理と組み合わせた抗−ＣＤ１９抗体処理）
本明細書中で記載されたアッセイを用いて、化学療法、トキシン療法または放射線療法と組み合わせた、他の組合せまたはコンジュゲート療法、例えば、抗−ＣＤ１９抗体が添加剤のような有益な効果を有するか、またはＢ細胞の相加的枯渇以上を有するかを決定することができる。動物モデルでテストした組合せ療法の結果を、当該分野でよく知られた手段によってヒトに相関させることができる。
【０４３８】
抗−ＣＤ２０抗体は、インビボにてヒトおよびマウスＢ細胞を枯渇させるのに効果的である。従って、抗−ＣＤ１９（ＦＭＣ６３）および抗−ＣＤ２０（ＭＢ２０−１１）抗体での同時処理の利点を評価して、これがＢ細胞枯渇を増強させたか否かを決定した。マウスを最適下２μｇ用量の各抗体で個々に、または１μｇの双方の抗体の組合せで、または組み合わせた２μｇの用量で処理した。図１５は、０日において、対照（２５０μｇ）、ＦＭＣ６３（ＣＤ１９、２μｇ）、ＭＢ２０−１１（各々１μｇ）、またはＦＭＣ６３＋ＭＢ２０−１１（各々２μｇ）抗体で処理したＴＧ−１＋／−マウスの結果を示す。血液Ｂ細胞の数は時刻０、１時間、１日、４日および７日に測定した。組織Ｂ細胞数は７日に測定した。値は３匹のマウスの群からの平均（±ＳＥＭ）を表す。図１５で示された結果は、同時抗−ＣＤ１９および抗−ＣＤ２０抗体処理が有益であることを示す。１μｇの双方の抗体の組合せで処理されたマウスにおけるＢ細胞の枯渇は中程度、または２μｇの各個々の抗体でのマウスの処理後に観察された枯渇と同様であった（図１５）。しかしながら、２μｇの双方の抗体でのマウスの同時処理は、いずれかの抗体単独で観察されたよりも有意に多いＢ細胞枯渇に導いた。かくして、組み合わせた抗−ＣＤ１９および抗−ＣＤ２０抗体用法は、Ｂ細胞枯渇を増強させた有益な効果を有した。これは、個々のＢ細胞の表面へのより治療的に有効な抗体分子の蓄積に由来する。
【０４３９】
（６．８  実施例７：皮下（Ｓ．Ｃ．）抗−ＣＤ１９抗体投与は治療的に有効である。）
本明細書中に記載されたアッセイを用いて、抗−ＣＤ１９抗体の皮下投与経路が有効にＢ細胞を枯渇されるかできるか否かを決定することができる。動物モデルでテストした異なる送達経路の有効性の結果を、当該分野でよく知られた手段によってヒトに相関させることができる。
【０４４０】
静脈内投与された抗−ＣＤ１９抗体は循環および組織Ｂ細胞を有効に枯渇させるため、皮下または腹腔内投与された抗−ＣＤ１９がＢ細胞を同程度枯渇させたか否かを評価した。野生型マウスを、２５０μｇのＦＭＣ６３抗体で皮下（ｓ．ｃ．）腹腔内（ｉ．ｐ．）またはｉ．ｖ．いずれかで処理した。値は、フローサイトメトリーによって評価された、７日（ｎ≧３）における（ｍＬ値の）平均（±ＳＥＭ）血液、骨髄、脾臓、リンパ節、および腹腔Ｂ２２０＋Ｂ細胞数を表す。マウスの各群についての平均結果の間の有意差が対照との比較において示される；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１。図１６における結果は、ＣＤ１９抗体の皮下（ｓ．ｃ．）腹腔内（ｉ．ｐ．）およびｉ．ｖ．投与がインビボにて循環および組織Ｂ細胞を有効に枯渇させることを示す。循環および組織Ｂ細胞のほとんど大部分は、ｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、またはｓ．ｃ．いずれかで２５０μｇ用量としての抗−ＣＤ１９抗体が与えらたマウスで枯渇された（図１６）。予期せぬことに、抗−ＣＤ１９抗体のｉ．ｐ．投与は、ｉ．ｖ．処理よりも有利に良好に腹腔Ｂ細胞を枯渇させなかった。従って、抗−ＣＤ１９抗体を用いて、≦６４ｍｇ  ｓ．ｃ．注射として与えた場合に、循環および組織Ｂ細胞を共に有効に枯渇させることができる。抗−ＣＤ１９抗体は１０μｇ用量ｉ．ｖ．に下げるまで有効である（図１０Ｄ）ため、より低いｓ．ｃ．抗体用量さえ効果的なようである。
【０４４１】
本発明は範囲が本明細書中に記載された特別な実施形態によって制限されるべきではない。事実、記載されたものに加えて本発明の種々の修飾は、これまでの記載および添付の図面から当業者に明らかとなるであろう。そのような修飾は特許請求の範囲の範囲内に入ることを意図する。
【０４４２】
種々の刊行物がここに引用されたが、その開示を引用してその全体を援用する。
【０４４３】
【数１】
2008546647.tif 000005
【図面の簡単な説明】
【０４４４】
【図１Ａ】図１Ａないし１ＥはｈＣＤ１９ＴＧマウス系によるＣＤ１９の発現を示す。図１ＡはｈＣＤ１９ＴＧ（ＴＧ−１＋／−）マウスからのＢ細胞によるヒトおよびマウスＣＤ１９を示す。
【図１Ｂ】図１Ａないし１ＥはｈＣＤ１９ＴＧマウス系によるＣＤ１９の発現を示す。図１Ｂは、ｈＣＤ１９ＴＧマウスからのＣＤ１９＋血液Ｂ細胞によるヒトおよびマウスＣＤ１９発現の相対的平均密度を示す。
【図１Ｃ】図１Ａないし１ＥはｈＣＤ１９ＴＧマウス系によるＣＤ１９の発現を示す。図１Ｃは、ＴＧ−１＋／−マウス組織からのＴＧ−１＋／−マウス組織からのＢ２２０＋Ｂ細胞によるｈＣＤ１９およびｍＣＤ１９発現の相対的密度を示す。
【図１Ｄ】図１Ａないし１ＥはｈＣＤ１９ＴＧマウス系によるＣＤ１９の発現を示す。図１Ｄは、ＴＧ−１＋／−マウスからのマウス血液および脾臓Ｂ２２０＋ＢについてのＣＤ１９抗体結合密度を示す。
【図１Ｅ】図１Ａないし１ＥはｈＣＤ１９ＴＧマウス系によるＣＤ１９の発現を示す。図１Ｅは、ｈＣＤ１９  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた３００．１９細胞への抗−ＣＤ１９抗体を示す。
【図２Ａ】図２Ａないし２Ｄは、ｈＣＤ１９ＴＧマウスにおける血液、脾臓、およびリンパ節Ｂ細胞枯渇を示す。図２Ａは、ＴＧ−１＋／−マウスの抗−ＣＤ１９または、イソタイプがマッチした対照（ＣＴＬ）抗体治療から７日後における血液、脾臓、およびリンパ節からの代表的なＢ細胞枯渇を示す。
【図２Ｂ】図２Ａないし２Ｄは、ｈＣＤ１９ＴＧマウスにおける血液、脾臓、およびリンパ節Ｂ細胞枯渇を示す。図２Ｂは、抗−ＣＤ１９抗体による循環Ｂ細胞枯渇のタイムコースを示す。
【図２Ｃ】図２Ａないし２Ｄは、ｈＣＤ１９ＴＧマウスにおける血液、脾臓、およびリンパ節Ｂ細胞枯渇を示す。図２Ｃおよび図２Ｄは、示された量における、抗−ＣＤ１９（塗り潰ぶした棒線）または対照（塗り潰ぶしていない棒線）抗体でのＴＧ−１＋／−マウスの処理後における各々、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞の数（±ＳＥＭ）を示す。
【図２Ｄ】図２Ａないし２Ｄは、ｈＣＤ１９ＴＧマウスにおける血液、脾臓、およびリンパ節Ｂ細胞枯渇を示す。図２Ｃおよび図２Ｄは、示された量における、抗−ＣＤ１９（塗り潰ぶした棒線）または対照（塗り潰ぶしていない棒線）抗体でのＴＧ−１＋／−マウスの処理後における各々、脾臓およびリンパ節Ｂ細胞の数（±ＳＥＭ）を示す。
【図３Ａ】図３Ａないし３Ｆは、抗−ＣＤ１９抗体処理後の骨髄Ｂ細胞枯渇を示す。図３Ａは、フローサイトメトリー分析での４−色免疫蛍光染色によって評価したＴＧ−１＋／−骨髄Ｂ細胞亜集団による代表的なｈＣＤ１９およびｍＣＤ１９発現を示す。
【図３Ｂ】図３Ａないし３Ｆは、抗−ＣＤ１９抗体処理後の骨髄Ｂ細胞枯渇を示す。図３Ｂは、フローサイトメトリー分析での２−色免疫蛍光染色によって評価したＦＭＣ６３またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）治療から７日後におけるｈＣＤ１９ＴＧマウスの骨髄でのｈＣＤ１９＋細胞の枯渇を示す。
【図３Ｃ】図３Ａないし３Ｆは、抗−ＣＤ１９抗体処理後の骨髄Ｂ細胞枯渇を示す。図３Ｃは、ＴＧ−１＋／−マウスのＣＤ１９またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）治療から７日後における骨髄での代表的なＢ２２０＋Ｂ細胞枯渇を示す。
【図３Ｄ】図３Ａないし３Ｆは、抗−ＣＤ１９抗体処理後の骨髄Ｂ細胞枯渇を示す。図３Ｄは、３−色免疫蛍光染色によって評価したＴＧ−１＋／−マウスのＦＭＣ６３またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）治療から７日後における代表的なＢ細胞サブセット枯渇を示す。ＩｇＭ−Ｂ２２０ｌｏプロ／プレ−Ｂ細胞をさらにＣＤ４３発現に基づいて細分した（下側パネル）。
【図３Ｅ】図３Ａないし３Ｆは、抗−ＣＤ１９抗体処理後の骨髄Ｂ細胞枯渇を示す。図３Ｅは、２−色免疫蛍光染色によって評価したｈＣＤ１９ＴＧマウス系のＦＭＣ６３またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）治療から７日後におけるＣＤ２５＋Ｂ２２０ｌｏプレ−Ｂ細胞の代表的な枯渇を示す。
【図３Ｆ】図３Ａないし３Ｆは、抗−ＣＤ１９抗体処理後の骨髄Ｂ細胞枯渇を示す。図３Ｆは、≦同腹子対のＦＭＣ６３（閉じた棒線）または対照（開いた棒線）抗体処理から７日後における両側大腿骨内のプロ−Ｂ、プレ−Ｂ、未成熟および成熟Ｂ細胞の数（±ＳＥＭ）を示す棒グラフを示す。
【図４Ａ】図４Ａないし４Ｃは、腹腔Ｂ細胞が抗−ＣＤ１９抗体処理に対して感受性であることを示す。図４Ａは、腹腔ＣＤ５＋Ｂ２２０＋ＢｌａおよびＣＤ５−Ｂ２２０ｈｉＢ２（慣用的）Ｂ細胞によるヒトおよびマウスＣＤ１９発現を示す。
【図４Ｂ】図４Ａないし４Ｃは、腹腔Ｂ細胞が抗−ＣＤ１９抗体処理に対して感受性であることを示す。図４Ｂは、ＣＤ１９（２５０μｇのＨＢ１２ａ、ＨＢ１２ｂ、およびＦＭＣ６３；５０μｇのＢ４およびＨＤ２３７）抗体または対照抗体（２５０μｇ）で処理したＴＧ−１＋／−マウスからの腹腔Ｂ２２０＋細胞の枯渇を示す。
【図４Ｃ】図４Ａないし４Ｃは、腹腔Ｂ細胞が抗−ＣＤ１９抗体処理に対して感受性であることを示す。図４Ｃは、ｈＣＤ１９ＴＧマウスの抗−ＣＤ１９または対照抗体処理から７日後におけるＣＤ５＋Ｂ２２０＋ＢｌａおよびＣＤ５−Ｂ２２０ｈｉＢ２  Ｂ細胞の代表的な枯渇を示す。
【図５Ａ】図５Ａは、ＨＢ１２ａ抗−ＣＤ１９抗体の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ接合配列についてのヌクレオチド（配列番号：１）および予測されるアミノ酸（配列番号：２）配列を示す。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＨＢ１２ｂ抗−ＣＤ１９抗体の重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ接合配列についてのヌクレオチド（配列番号：３）および予測されるアミノ酸（配列番号：４）配列を示す。
【図６Ａ】図６Ａは、ＨＢ１２ａ抗−ＣＤ１９抗体の軽鎖配列についてのヌクレオチド（配列番号：１５）および予測されるアミノ酸（配列番号：１６）配列を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、ＨＢ１２ｂ抗−ＣＤ１９抗体の軽鎖配列についてのヌクレオチド（配列番号：１７）および予測されるアミノ酸（配列番号：１８）配列を示す。
【図７Ａ】図７Ａないし７Ｂは、公表されたマウス抗−（ヒト）ＣＤ１９抗体のアミノ酸配列整列を示す。図７Ａは、コンセンサス配列（配列番号：５）、ＨＢ１２ａ（配列番号：２）、４Ｇ７（配列番号：６）、ＨＢ１２ｂ（配列番号：４）、ＨＤ３７（配列番号：７）、Ｂ４３（配列番号：８）、およびＦＭＣ６３（配列番号：９）を含めた重鎖ＶＨ−Ｄ−ＪＨ接合配列についての配列整列を示す。
【図７Ｂ】図７Ａないし７Ｂは、公表されたマウス抗−（ヒト）ＣＤ１９抗体のアミノ酸配列整列を示す。図７Ｂは、抗−ＣＤ１９抗体の軽鎖Ｖκアミノ酸配列分析を示す。コンセンサス配列（配列番号：１０）、ＨＢ１２ａ（配列番号：１６、ＨＢ１２ｂ（配列番号：１８）、ＨＤ３７（配列番号：１１）、Ｂ４３（配列番号：１２）、ＦＭＣ６３（配列番号：１３）、および４Ｇ７（配列番号：１４）が整列される。
【図８Ａ】図８Ａないし８Ｃは、ＣＤ１９密度が、インビボにて抗−ＣＤ１９抗体によるＢ細胞枯渇の効率に影響することを示す。ｈＣＤ１９ＴＧマウスにおける代表的な血液および脾臓Ｂ細胞枯渇が、ＨＢ１２ｂ（図８Ａ）またはＦＭＣ６３（図８Ｂ）抗体処理後において示される（７日、２５０μｇ／マウス）。図８Ｃは、ＴＧ−１＋／−マウスからの血液Ｂ２２０＋Ｂ細胞についての相対的抗−ＣＤ１９抗体−結合密度を示す。図８Ｄは、ｈＣＤ１９ＴＧマウスからの脾臓Ｂ２２０＋Ｂ細胞についての相対的抗−ＣＤ１９抗体−結合密度を示す。
【図８Ｂ】図８Ａないし８Ｃは、ＣＤ１９密度が、インビボにて抗−ＣＤ１９抗体によるＢ細胞枯渇の効率に影響することを示す。ｈＣＤ１９ＴＧマウスにおける代表的な血液および脾臓Ｂ細胞枯渇が、ＨＢ１２ｂ（図８Ａ）またはＦＭＣ６３（図８Ｂ）抗体処理後において示される（７日、２５０μｇ／マウス）。図８Ｃは、ＴＧ−１＋／−マウスからの血液Ｂ２２０＋Ｂ細胞についての相対的抗−ＣＤ１９抗体−結合密度を示す。図８Ｄは、ｈＣＤ１９ＴＧマウスからの脾臓Ｂ２２０＋Ｂ細胞についての相対的抗−ＣＤ１９抗体−結合密度を示す。
【図８Ｃ】図８Ａないし８Ｃは、ＣＤ１９密度が、インビボにて抗−ＣＤ１９抗体によるＢ細胞枯渇の効率に影響することを示す。ｈＣＤ１９ＴＧマウスにおける代表的な血液および脾臓Ｂ細胞枯渇が、ＨＢ１２ｂ（図８Ａ）またはＦＭＣ６３（図８Ｂ）抗体処理後において示される（７日、２５０μｇ／マウス）。図８Ｃは、ＴＧ−１＋／−マウスからの血液Ｂ２２０＋Ｂ細胞についての相対的抗−ＣＤ１９抗体−結合密度を示す。
【図８Ｄ】図８Ｄは、ｈＣＤ１９ＴＧマウスからの脾臓Ｂ２２０＋Ｂ細胞についての相対的抗−ＣＤ１９抗体−結合密度を示す。
【図９Ａ】図９Ａないし９Ｄは、抗−ＣＤ１９抗体処理に続くＢ細胞枯渇がＦｃＲγ−および単球−依存性であることを示す。図９Ａ；ｈＣＤ１９ＴＧ−１＋／−ＦｃＲγ＋／−またはＴＧ−１＋／−ＦｃＲγ−／−同腹子のＣＤ１９またはイソタイプ−対照抗体処理から７日後における代表的な血液および脾臓Ｂ細胞枯渇。
【図９Ｂ】図９Ａないし９Ｄは、抗−ＣＤ１９抗体処理に続くＢ細胞枯渇がＦｃＲγ−および単球−依存性であることを示す。図９Ｂ；０日におけるＦｃＲγ−／−の抗体処理から７日後の血液および組織Ｂ細胞枯渇。
【図９Ｃ】図９Ａないし９Ｄは、抗−ＣＤ１９抗体処理に続くＢ細胞枯渇がＦｃＲγ−および単球−依存性であることを示す。図９Ｃ；単球−枯渇ｈＣＤ１９ＴＧ−１＋／−  マウスにおける代表的なＢ細胞数。
【図９Ｄ】図９Ａないし９Ｄは、抗−ＣＤ１９抗体処理に続くＢ細胞枯渇がＦｃＲγ−および単球−依存性であることを示す。図９Ｄ；抗体処理の７日後における血液および組織Ｂ細胞枯渇。
【図１０Ａ】図１０Ａないし１０Ｄは、抗−ＣＤ１９抗体処理後のＢ細胞枯渇の持続および用量応答を示す。図１０Ａは、０日におけるＴＧ−１＋／−マウスのＦＭＣ６３またはイソタイプ−対照抗体処理に続いての血液Ｂ２２０＋Ｂ細胞およびＴｈｙ−１＋Ｔ細胞の数を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａないし１０Ｄは、抗−ＣＤ１９抗体処理後のＢ細胞枯渇の持続および用量応答を示す。図１０ＢないしＣは、抗体処理から１１、１６および３０週間後の図１０Ａに示したマウスにおける代表的な組織Ｂ細胞枯渇を示す。図１０Ｄは、血液、骨髄、および脾臓Ｂ細胞枯渇についての抗−ＣＤ１９抗体用量応答を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａないし１０Ｄは、抗−ＣＤ１９抗体処理後のＢ細胞枯渇の持続および用量応答を示す。図１０ＢないしＣは、抗体処理から１１、１６および３０週間後の図１０Ａに示したマウスにおける代表的な組織Ｂ細胞枯渇を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａないし１０Ｄは、抗−ＣＤ１９抗体処理後のＢ細胞枯渇の持続および用量応答を示す。図１０Ｄは、血液、骨髄、および脾臓Ｂ細胞枯渇についての抗−ＣＤ１９抗体用量応答を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａないし１１Ｃは、ＣＤ１９がインビボにて抗体結合後に内部化されないことを示す。ＨＢ１２ａ（図１１Ａ）、ＨＢ１２ｂ（図１１Ｂ）、ＦＭＣ６３（図１１Ｃ）またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）でインビボで処理されたＴＧ−１＋／−マウスにおける細胞表面ＣＤ１９発現およびＢ細胞クリアランス）。
【図１１Ｂ】図１１Ａないし１１Ｃは、ＣＤ１９がインビボにて抗体結合後に内部化されないことを示す。ＨＢ１２ａ（図１１Ａ）、ＨＢ１２ｂ（図１１Ｂ）、ＦＭＣ６３（図１１Ｃ）またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）でインビボで処理されたＴＧ−１＋／−マウスにおける細胞表面ＣＤ１９発現およびＢ細胞クリアランス）。
【図１１Ｃ】図１１Ａないし１１Ｃは、ＣＤ１９がインビボにて抗体結合後に内部化されないことを示す。ＨＢ１２ａ（図１１Ａ）、ＨＢ１２ｂ（図１１Ｂ）、ＦＭＣ６３（図１１Ｃ）またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）でインビボで処理されたＴＧ−１＋／−マウスにおける細胞表面ＣＤ１９発現およびＢ細胞クリアランス）。
【図１２Ａ】図１２Ａないし１２Ｃは、インビボでの抗−ＣＤ１９抗体結合に続いてのＣＤ１９飽和を示す。図１２Ａは、インビボでＦＭＣ６３またはイソタイプがマッチした対照抗体（２５０μｇ）で処理したＴＧ−１＋／−マウスにおけるＢ細胞クリアランスを示す。
【図１２Ｂ】図１２Ａないし１２Ｃは、インビボでの抗−ＣＤ１９抗体結合に続いてのＣＤ１９飽和を示す図１２Ｂは、ＦＭＣ６３抗体処理（２５０μｇ）が投与から１時間内におけるｈＣＤ１９上の抗−結合部位を飽和することを示す。
【図１２Ｃ】図１２Ａないし１２Ｃは、インビボでの抗−ＣＤ１９抗体結合に続いてのＣＤ１９飽和を示す図１２Ｃは、ＨＢ１２ｂ抗−ＣＤ１９抗体処理（２５０μｇ）が、図１２Ｂで評価された投与から１時間以内にｈＣＤ１９上の抗体−結合部位を飽和することを示す。
【図１３Ａ】図１３Ａないし１３Ｂは、抗−ＣＤ１９抗体処理がＴＧ−１＋／−マウスにおいて血清免疫グロブリンおよび自己抗体レベルを低下させることを示す。図１３Ａは、抗−ＣＤ１９抗体処理後の血清免疫グロブリンレベルを示し、
【図１３Ｂ】図１３Ａないし１３Ｂは、抗−ＣＤ１９抗体処理がＴＧ−１＋／−マウスにおいて血清免疫グロブリンおよび自己抗体レベルを低下させることを示す。図１３Ｂは抗−ｄｓＤＮＡ、抗−ｓｓＤＮＡおよび抗−ヒストン自己抗体レベルを示す。
【図１４Ａ】図１４Ａないし１４Ｂは、抗−ＣＤ１９抗体処理が、ＴＧ−１＋／−  マウスにおいて液性免疫応答をブロックすることを示す。抗体−処理マウスを図１４Ａ  ＴＮＰ−ＬＰＳ、図１４Ｂ  ＴＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌおよび図１４Ｃないし１４Ｄ  ＴＮＰ−ＫＬＨで免疫化した。同腹子を、（ＡないしＣ）０日における一次免疫化の７日前、または（Ｄ）１４日後いずれかにＦＭＣ６３（閉じた丸印）または対照（開いた丸印）抗体（２５０μｇ）で処理した。
【図１４Ｂ】図１４Ａないし１４Ｂは、抗−ＣＤ１９抗体処理が、ＴＧ−１＋／−  マウスにおいて液性免疫応答をブロックすることを示す。抗体−処理マウスを図１４Ａ  ＴＮＰ−ＬＰＳ、図１４Ｂ  ＴＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌおよび図１４Ｃないし１４Ｄ  ＴＮＰ−ＫＬＨで免疫化した。同腹子を、（ＡないしＣ）０日における一次免疫化の７日前、または（Ｄ）１４日後いずれかにＦＭＣ６３（閉じた丸印）または対照（開いた丸印）抗体（２５０μｇ）で処理した。
【図１４Ｃ】図１４Ａないし１４Ｂは、抗−ＣＤ１９抗体処理が、ＴＧ−１＋／−  マウスにおいて液性免疫応答をブロックすることを示す。抗体−処理マウスを図１４Ａ  ＴＮＰ−ＬＰＳ、図１４Ｂ  ＴＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌおよび図１４Ｃないし１４Ｄ  ＴＮＰ−ＫＬＨで免疫化した。同腹子を、（ＡないしＣ）０日における一次免疫化の７日前、または（Ｄ）１４日後いずれかにＦＭＣ６３（閉じた丸印）または対照（開いた丸印）抗体（２５０μｇ）で処理した。
【図１４Ｄ】図１４Ａないし１４Ｂは、抗−ＣＤ１９抗体処理が、ＴＧ−１＋／−  マウスにおいて液性免疫応答をブロックすることを示す。抗体−処理マウスを図１４Ａ  ＴＮＰ−ＬＰＳ、図１４Ｂ  ＴＮＰ−Ｆｉｃｏｌｌおよび図１４Ｃないし１４Ｄ  ＴＮＰ−ＫＬＨで免疫化した。同腹子を、（ＡないしＣ）０日における一次免疫化の７日前、または（Ｄ）１４日後いずれかにＦＭＣ６３（閉じた丸印）または対照（開いた丸印）抗体（２５０μｇ）で処理した。
【図１５】図１５は、同時抗−ＣＤ１９および抗−ＣＤ２０抗体処理が相加的であることを示す。
【図１６】図１６は、抗−ＣＤ１９抗体の皮下（Ｓ．Ｃ．）、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）およびｉ．ｖ．投与がインビボにて循環および組織Ｂ細胞を効果的に枯渇させることを示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月1日(2008.4.1)
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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