(57)【要約】  哺乳動物のｓＲＡＧＥミメティボディポリペプチドおよび核酸が開示される。ＲＡＧＥおよびそのリガンドの結合を低下または抑制するため、ならびにＲＡＧＥが関係する疾病を処置するためのポリペプチドの利用方法がまた開示される。
2008537874.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（ＩＩ）：
（Ｒｇ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）              （ＩＩ）
［式中、Ｒｇは哺乳動物ｓＲＡＧＥ配列であり、Ｌｋはポリペプチドまたは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変部のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリン可変ヒンジ部の少なくとも一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常部であり、そしてＣＨ３は免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常部であり、そしてｔは独立して整数１〜１０である］
で表されるポリペプチド。
【請求項２】
Ｒｇが、配列番号：１の生物学的に活性なフラグメントまたは配列番号：１に実質的に相同なポリペプチドである、請求項１のポリペプチド。
【請求項３】
Ｒｇが、配列番号：１の残基３１〜１０６、３１〜２１５または３１〜３０８において示されるアミノ酸配列を有する、請求項１のポリペプチド。
【請求項４】
Ｈｇ、ＣＨ２およびＣＨ３がＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項１のポリペプチド。
【請求項５】
ＨｇのＣｙｓ２２０がＡｌａにより置換され、そしてＣＨ２−ＣＨ３のＬｅｕ２３４およびＬｅｕ２３５がＡｌａ２３４およびＡｌａ２３５に変異されている、請求項４のポリペプチド。
【請求項６】
ＨｇがＩｇＧ４サブクラスのものであり、そしてＣＨ２およびＣＨ３がＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項１のポリペプチド。
【請求項７】
Ｈｇ、ＣＨ２およびＣＨ３がＩｇＧ４サブクラスのものである、請求項１のｓＲＡＧＥミメティボディポリペプチド。
【請求項８】
ＨｇのＳｅｒ２２８がＰｒｏにより置換され、そしてＣＨ２−ＣＨ３のＰｈｅ２３４およびＬｅｕ２３５がＡｌａ２３４およびＡｌａ２３５に変異されている、請求項１のポリペプチド。
【請求項９】
ポリペプチドが少なくとも１種のＲＡＧＥリガンドに結合する、請求項１のポリペプチド。
【請求項１０】
リガンドが、進行したグリコシル化最終産物（ＡＧＥ）、アンホテリン、Ｓ１００／カルグラヌリンおよびβ−アミロイドの少なくとも１種である、請求項９のポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号：３、５、７、９、１１または１３において示される配列を有するポリペプチドを含んでなるポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１によるポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド。
【請求項１３】
配列番号：４、６、８、１０、１２または１４において示される配列、または相補的配列を有するポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１４】
配列番号：３、５、７、９、１１または１３において示されるアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１３または１４のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項１６】
請求項１によるポリペプチドを発現する細胞系。
【請求項１７】
請求項１５のベクターを含有する細胞系。
【請求項１８】
細胞系がＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＳＰ２／０またはＣＨＯ細胞である、請求項１７の細胞系。
【請求項１９】
請求項１による少なくとも１種のポリペプチドの有効な量および製薬学的に許容できる担体または希釈剤を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項２０】
請求項１９の製薬学的組成物を哺乳動物に投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＲＡＧＥの生物学的活性を改変する方法。
【請求項２１】
請求項１９の製薬学的組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、少なくとも１種のＲＡＧＥに関係する症状または疾患の症候を軽減するか、または症状または疾患を処置する方法。
【請求項２２】
ＲＡＧＥに関係する症状および疾患が、免疫疾患、心血管障害、代謝疾患、悪性疾患または神経障害である、請求項２１の方法。
【請求項２３】
ＲＡＧＥに関係する症状または疾患が、糖尿病、アルツハイマー病、動脈硬化症、腫瘍の増殖および転移、大腸炎、遅延型過敏症、多発性硬化症またはオキシダントストレスである、請求項２１の方法。
【請求項２４】
請求項１６の細胞系を培養し、そして発現されたポリペプチドを精製する段階を含んでなる、ポリペプチドを生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、哺乳動物ｓＲＡＧＥミメティボディ（ｍｉｍｅｔｉｂｏｄｙ）およびそれらの治療剤としての使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
進行したグリコシル化最終産物に対する受容体（Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｇｌｙｃａｔｅｄ  Ｅｎｄｏｐｒｏｄｕｃｔ）（ＲＡＧＥ）は、細胞表面分子の免疫グロブリンスーパーファミリーの一員である。それは、グルコース（アルドース糖）で修飾されたタンパク質または進行したグリコシル化最終産物（ＡＧＥ）に対する細胞受容体として最初に同定され、そして特性決定された（非特許文献１：非特許文献２）。ＡＧＥは、糖尿病および老化に関連する種々の障害に関係している（非特許文献３において総説されている）。ＲＡＧＥに対するＡＧＥの結合は、血管壁において炎症応答を誘導し、これがマクロまたはミクロの血管障害の発病を惹起または悪化させる。
【０００３】
またＲＡＧＥは、アンホテリン（ａｍｐｈｏｔｅｒｉｎ）、発達する脳に由来する培養皮質性ニューロンの成長を促進する基質に関連したポリペプチド、を含む他のリガンドと相互作用することが報告された（非特許文献４）。また高速移動群Ｂ１（ＨＭＧＢ１）として文献において知られているアンホテリンは、がん、炎症症状および敗血症を含む種々の疾病状態に寄与することが分かっている。非特許文献５、非特許文献６および非特許文献７参照。ＲＡＧＥの発現は、発達する軸索の先導末端において顕著に増進され、そしてアンホテリンの発現と一緒に局在化され、これが、細胞の移動ならびに腫瘍浸潤のような病理において潜在的寄与を示す。抗ＲＡＧＥ  Ｆ（ａｂ’）２または可溶性ＲＡＧＥのいずれもアンホテリンでコートされた基質において軸索の成長を抑制することが報告された（非特許文献８）。可溶性ＲＡＧＥ（ｓＲＡＧＥ）は受容体の細胞外ドメインである。さらに、ＲＡＧＥ−アンホテリン結合の遮断は、感受性マウス、Ｉｄにおいて移植腫瘍と自然発生腫瘍の両者の成長と転移を減少させた。
【０００４】
ＲＡＧＥはまた、β−アミロイド、アルツハイマー病においてニューロンの毒性および死滅の発病に結び付けられるポリペプチド、に対するニューロンおよび小膠細胞における受容体として同定された（非特許文献９）。ＲＡＧＥの発現は、β−アミロイドペプチドの沈着物および神経細繊維濃縮体に接近したニューロンにおいて特に増強される。マウスでは、ＲＡＧＥは、血液脳関門を通過するヒトβ−アミロイドー４０および−４２の輸送を仲介する（非特許文献１０）。いずれも血液脳関門を通って輸送されない抗ＲＡＧＥ  ＩｇＧまたは可溶性ＲＡＧＥの、いずれかによるＲＡＧＥ−リガンド相互作用の抑制は、アルツハイマー病のマウスモデル、Ｉｄにおいて脳実質中のβ−アミロイドの蓄積を抑制した。
【０００５】
またＲＡＧＥは、Ｓ１００Ａ２およびＳ１００／カルグラヌリン（ｃａｌｇｒａｎｕｌｉｎ）スーパーファミリーの関連メンバーに対する中枢細胞の表面受容体である（非特許文献１１）。内皮、単核食細胞およびリンパ球におけるＳ１００Ａ２と細胞ＲＡＧＥの相互作用は、重要な前炎症メディエーターの細胞活性化および生成を惹起する。マウスモデルにおいて、Ｓ１００Ａ２／ＲＡＧＥの遮断は、中枢シグナル伝達経路の活性化および炎症性遺伝子メディエーター、Ｉｄの発現によって遅延型過感作および炎症性大腸炎を消した。
【０００６】
また研究では、リガンドによるＲＡＧＥの結合が、重要な細胞のシグナル伝達経路、例えばｐ２１（ｒａｓ）、ＭＡＰキナーゼ、ＮＦ−κｂおよびｃｄｃ４２／ｒａｃの活性化
を惹起し、それによって細胞の性質を再計画させることが示された。例えば、リガンド結合では、ＲＡＧＥは、核へのＮＦ−κｂの移動、ならびに付着分子、プロコアギュラント（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）分子および炎症性タンパク質の発現の増大をもたらすシグナル伝達カスケードを始動する（非特許文献１２）。
【０００７】
研究は、ＲＡＧＥが、ホメオスタシス、発生、炎症、およびある種の疾病、例えば２型糖尿病およびアルツハイマー病に係わる種々の分子と相互作用することを示した。したがって、疾病状態に関連する場合に、これらの相互作用を遮断または抑制して、関連する病気を処置または予防することが一般に望まれるであろう。
【０００８】
ｓＲＡＧＥは、動脈硬化症、腫瘍の増殖と転移、大腸炎、遅延型過感作、実験的アレルギー性脳脊髄炎およびアルツハイマー病に関する動物疾病モデルにおいて有効であることが示され（非特許文献１３；非特許文献８；非特許文献１１；非特許文献９）、そして精製されるか、または組み換え技術により発現することができる。ｓＲＡＧＥは全長ＲＡＧＥのトランスメンブランおよび細胞外ドメインを欠如し、そして３個の免疫グロブリン様領域：免疫グロブリン可変ドメイン（Ｖドメイン）にもっとも類似するＮ末端領域とそれに続く免疫グロブリン定常部（Ｃドメイン）に類似する２個の領域を有する。
【０００９】
ｓＲＡＧＥは、ＲＡＧＥ−リガンド相互作用を研究するためにインビトロとインビボで広範に使用された。しかしながら、ラットにおけるｓＲＡＧＥの半減期は２４時間であり、そのためにｓＲＡＧＥ自体は疾病のための治療剤としては実用的ではない。さらに、抗ＲＡＧＥ  ＩｇＧは、肺のような組織において正常に発現される大量のＲＡＧＥに結合し、かつそれを抑制し、そして正常な細胞の死を誘導するであろう。かくして、ＲＡＧＥのＡＧＥ結合機能を保持しつつ、短い半減期を克服できる改変されたｓＲＡＧＥに対する要望が存在する。
【非特許文献１】Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４９８７−１４９９７，（１９９２）
【非特許文献２】Ｎｅｅｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：１４９９８−１５００４，（１９９２）
【非特許文献３】Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．１：１００２−１００４，（１９９５）
【非特許文献４】Ｈｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２５７５２−２５７６１，（１９９５）
【非特許文献５】Ｌｏｔｚｅ  ａｎｄ  Ｄｅｍａｒｃｏ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ４：１４０５−１４０９（２００３）
【非特許文献６】Ｓｃａｆｆｉｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１８：１９１−１９５（２００２）
【非特許文献７】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：２４８−２５１（１９９９）
【非特許文献８】Ｔａｇｕｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４０５：３５４−３６０（２０００）
【非特許文献９】Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３８２：６８５−６９１（１９９６）
【非特許文献１０】Ｄｅａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．９：９０７−９１３（２００３）
【非特許文献１１】Ｈｏｆｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ９７：８８９−９０１（１９９９）
【非特許文献１２】Ｋｉｓｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：３１７４０−３１７４９（１９９９）
【発明の開示】
【００１０】
本発明の１つの態様は、一般式（ＩＩ）：
（Ｒｇ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）              （ＩＩ）
［式中、Ｒｇは哺乳動物ｓＲＡＧＥ配列であり、Ｌｋはポリペプチドまたは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変部のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリン可変ヒンジ部の少なくとも一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常部であり、そしてＣＨ３は免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常部であり、そしてｔは独立して整数１〜１０である］
で表されるポリペプチドである。
【００１１】
本発明のその他の態様は、配列番号：３、５、７、９、１１または１３において示される配列を有するポリペプチドを含んでなるポリペプチドである。
【００１２】
本発明のその他の態様は、配列番号：４、６、８、１０、１２または１４において示される配列、または相補的配列を有するポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである。
【００１３】
本発明のその他の態様は、配列番号：３、５、７、９、１１または１３において示されるアミノ酸配列をコードしているポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドである。
【００１４】
本発明のその他の態様は、哺乳動物にｓＲＡＧＥミメティボディ組成物を投与することを含んでなる、哺乳動物におけるＲＡＧＥの生物学的活性を改変する方法である。
【００１５】
本発明のその他の態様は、ｓＲＡＧＥミメティボディ組成物を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、少なくとも１種のＲＡＧＥに関連する症状または障害の症候を軽減するか、あるいは処置する方法である。
【００１６】
本明細書において引用される、限定されるものではないが特許および特許出願を含む全ての公表物は、完全な記述により引用によって本明細書に組み入れられている。単一文字のアミノ酸コードは、当業者によって理解されるように本明細書では使用される。免疫グロブリン定常部におけるアミノ酸残基の番号づけは、野生型ＩｇＧ１またはＩｇＧ４  ＦｃドメインにおけるＮ末端アミノ酸である残基アミノ酸に基づく。
【００１７】
本発明は、哺乳動物ｓＲＡＧＥの性質および活性を有するポリペプチドを提供し、この場合、ポリペプチドはまた、種々のタイプの免疫グロブリン分子、例えばＩｇＡ，ＩｇＤ，ＩｇＥ，ＩｇＧまたはＩｇＭ，およびそれらのいずれかのサブクラス、例えばＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４、またはそれらの組み合わせ物を模倣していて、これ以降「ｓＲＡＧＥミメティボディ」と言及される。また本発明は、ｓＲＡＧＥミメティボディをコードしている核酸、これらの核酸を含有するベクター、宿主細胞、組成物およびｓＲＡＧＥミメティボディを作成および使用する方法を提供する。
【００１８】
ミメティボディポリペプチドおよび組成物
本発明は、一般に、一般式（Ｉ）：
（Ｐｅｐ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）              （Ｉ）
［式中、Ｐｅｐは所望の生物学的性質を有するポリペプチドであり、Ｌｋはポリペプチドまたは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変部のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリンヒンジ部の少なくとも一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常部であり、そしてＣＨ３は免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常部であり、そしてｔは独立し
て整数１〜１０である］
で表されるミメティボディポリペプチドに関する。
【００１９】
より具体的には、本発明は、ＲＡＧＥと、そのそれぞれのリガンド、例えばＡＧＥ、アンホテリン、Ｓ１００／カルグラヌリンおよびβ−アミロイドとの間の相互作用を遮断または低下することができるｓＲＡＧＥミメティボディポリペプチドに関する。ポリペプチドは、一般式（ＩＩ）：
（Ｒｇ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）              （ＩＩ）
［式中、Ｒｇは哺乳動物ｓＲＡＧＥ配列であり、Ｌｋはポリペプチドまたは化学結合であり、Ｖ２は免疫グロブリン可変部のＣ末端の一部分であり、Ｈｇは免疫グロブリンヒンジ部の少なくとも一部分であり、ＣＨ２は免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常部であり、そしてＣＨ３は免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常部であり、そしてｔは独立して整数１〜１０である］
で表される。
【００２０】
本明細書で使用されるところの、「可溶性ＲＡＧＥ」または「ｓＲＡＧＥ」は、全長ＲＡＧＥに関してトランスメンブランおよび細胞内領域を欠如しているＲＡＧＥ由来のポリペプチドを包含する。代表的な哺乳動物ｓＲＡＧＥポリペプチドは、配列番号：１において示されるアミノ酸配列を有するヒトｓＲＡＧＥの細胞外ドメインである。ｓＲＡＧＥポリペプチドが、配列番号：１の生物学的に活性なフラグメント、配列番号：１に実質的に相同であるアミノ酸配列ならびにｓＲＡＧＥの結合活性を模倣できるポリペプチドもまた含んでもよいことは、当業者によって容易に理解することができる。また、本発明において有用な哺乳動物ｓＲＡＧＥポリペプチドが、それらの生産細胞系から本発明のポリペプチドの排出を促進するために、ネイティブのＮ末端リーダー配列（配列番号：１のアミノ酸１〜３０）または他のリーダー配列を含んでもよいことは、当業者によって理解できる。
【００２１】
本明細書で使用される用語「生物学的に活性なフラグメント」は、ｓＲＡＧＥリガンドに特異的に結合できるｓＲＡＧＥポリペプチドの部分を指す。ｓＲＡＧＥの生物学的に活性なフラグメントの例は、限定されるものではないが、１種以上のＩｇ様ドメイン、例えば単一のＶドメイン（配列番号：１のアミノ酸１１〜１０６）、ＶドメインおよびＣドメイン（配列番号：１のアミノ酸３１〜２１５）またはＶドメインおよび両Ｃドメイン（配列番号：１のアミノ酸３１〜３０８）を含む。
【００２２】
ポリペプチドに関連する用語「実質的に相同な」は、場合によっては整列された場合、少なくとも約８０％相同または少なくとも約８５％相同または少なくとも約９０％相同または少なくとも約９５％相同である２個のアミノ酸配列を指す。アミノ酸相同性パーセントを決定するための整列は、当業者には周知である種々の方法において、例えば、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ８．０のＡｌｉｇｎＸコンポーネントのためのデフォルトセッティング（ｄｅｆａｕｌｔ  ｓｅｔｔｉｎｇ）（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）またはＢＬＡＳＴのように公に利用可能なコンピューターソフトウェアを使用することによって達成できる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。配列番号：１に実質的に相同なポリペプチド配列は、少なくとも１個のアミノ酸置換、欠失または挿入を有する。
【００２３】
本発明のポリペプチドにおいて、リンカー部分（Ｌｋ）は、ミメティボディに代替する方向および結合特性をもたせることによって構造的な柔軟性を提供する。代表的なリンカーは、非ペプチド化学結合またはペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸を含み、この場合、アミノ酸は２０個の天然に存在するアミノ酸から選ばれる。リンカー部分は、グリシン、アラニンおよびセリンのように立体的に障害がない多数のアミノ酸を含み、そしてＧＳ，ポリＧＳ，ＧＧＧＳ（配列番号：３２）、ＧＧＧＳおよびＧＳＧＧＧＳ（配列番号：３３）の多量体またはそれらのいずれかの組み合わせ物を含む。本発明の範囲内の他の代表的なリンカーは、２０残基以上長くてもよく、そしてグリシン、アラニンおよびセリン以外の残基を含んでもよい。
【００２４】
本発明のポリペプチドにおいて、Ｖ２は、重鎖可変部のような免疫グロブリン可変部のＣ末端ドメインの一部分である。代表的なＶ２アミノ酸配列はＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号：１６）である。
【００２５】
本発明のポリペプチドにおいて、Ｈｇは、重鎖可変部のような免疫グロブリン可変部のヒンジドメインの一部分である。代表的なＨアミノ酸配列は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号：１７）、ＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号：１８）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰ（配列番号：１９）、ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ（配列番号：２０）およびＣＰＰＣＰ（配列番号：２１）を含む。
【００２６】
本発明のポリペプチドにおいて、ＣＨ２は免疫グロブリン重鎖ＣＨ２定常部である。代表的なＣＨ２アミノ酸配列は、
【００２７】
【化１】
2008537874.tif 000003
を含む。
【００２８】
本発明のポリペプチドにおいて、ＣＨ３は免疫グロブリン重鎖ＣＨ３定常部である。代表的なＣＨ３アミノ酸配列は、
【００２９】
【化２】
2008537874.tif 000004
を含む。本発明のポリペプチドのＣＨ３領域が、ある種の組み換え系において発現される場合には切除されるそのＣ末端アミノ酸を有してもよいことは、当業者によって認識できる。
【００３０】
本発明のポリペプチドにおいて、免疫グロブリン分子のＦｃＲｎスカベンジャー受容体結合部位は、ＣＨ２およびＣＨ３領域の結合において保存されている。ＦｃＲｎの結合は飲作用で取り込まれた免疫グロブリンの細胞外空間への後戻りを可能にするので、ｓＲＡＧＥミメティボディの半減期がｓＲＡＧＥに較べて有意に延長できることが期待される。
【００３１】
本発明のポリペプチドは、場合によっては、それらのＮ末端において、式ＩＩＩにおいて示されるようにＶ１と命名される免疫グロブリン可変部のＮ末端の一部分を含有してもよい。代表的なＶ１アミノ酸配列はＱＩＱまたはＱＶＱを含む。
【００３２】
（Ｖ１−Ｒｇ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）（ｔ）      （ＩＩＩ）
本発明のポリペプチドの１つの実施態様では、単量体構造（Ｒｇ−Ｌｋ−Ｖ２−Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）は、非共有結合的に、または共有結合、例えば限定されるものではないがＣｙｓ−Ｃｙｓジスルフィド結合によって、他の単量体に連結されてもよい。この構造は、ｓＲＡＧＥの安定な二量体化を可能にし、そしてＲＡＧＥリガンドに対するその親和力を増大できると考えられる。
【００３３】
本発明のその他の実施態様は、ＲｇがＲＡＧＥの全長細胞外ドメイン（配列番号：１）の単一コピーであり、Ｖ２が天然に存在するＩｇＧのＪ領域（配列番号：１６）であり、Ｈｇが、Ｃｙｓ２２０Ａｌａ（Ｃ２２０Ａ）置換をもつ完全なＩｇＧ１ヒンジ部（配列番号：１８）であり、そしてＣＨ２とＣＨ３が、Ｌｅｕ２３４ＡｌａとＬｅｕ２３５Ａｌａ置換（Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ）をもつＩｇＧ１イソタイプサブクラス（配列番号：２８
）である、式（ＩＩ）にしたがうポリペプチドを含んでなるポリペプチドである。この実施態様の完全なポリペプチド配列は配列番号：３において示される。
【００３４】
本発明のその他の実施態様は、ＲｇがＲＡＧＥ全長細胞外ドメインのＶドメイン（配列番号：１の残基３１〜１０６）の単一コピーであり、Ｖ２が天然に存在するＩｇＧのＪ領域（配列番号：１６）であり、Ｈｇが、Ｃ２２０Ａ置換をもつ完全なＩｇＧ１ヒンジ部（配列番号：１８）であり、そしてＣＨ２とＣＨ３が、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ置換をもつＩｇＧ１イソタイプサブクラス（配列番号：２８）である、式（ＩＩ）にしたがうポリペプチドを含んでなるポリペプチドである。この実施態様の完全なポリペプチド配列は配列番号：５において示される。
【００３５】
本発明のその他の実施態様は、ＲｇがＲＡＧＥ全長細胞外ドメイン（配列番号：１）の単一コピーであり、Ｖ２が天然に存在するＩｇＧのＪ領域（配列番号：１６）であり、Ｈｇが完全なＩｇＧ４ヒンジ部（配列番号：１９）であり、そしてＣＨ２とＣＨ３がＩｇＧ４イソタイプサブクラス（配列番号：２９）である、式（ＩＩ）にしたがうポリペプチドを含んでなるポリペプチドである。この実施態様の完全なポリペプチド配列は配列番号：７において示される。
【００３６】
ＩｇＧ１とＩｇＧ４はヒンジ部におけるシステインの数で異なる。ＩｇＧ１サブクラスのように、重鎖間のジスルフィド結合に関与するＩｇＧ４ヒンジには２個のシステインが存在する。しかしながら、軽鎖へのジスルフィド結合に普通に必要とされるＩｇＧ１ヒンジにおけるシステインはＩｇＧ４ヒンジでは不在である。したがって、ＩｇＧ４ヒンジはＩｇＧ１ヒンジよりも柔軟性が低い。
【００３７】
さらに、２種のイソタイプは、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）と抗体依存性細胞の細胞毒性（ＡＤＣＣ）を媒介するそれらの能力において異なる。ＣＤＣは補体の存在下の標的の溶解（ｌｙｓｉｎｇ）である。補体活性化経路は、同族抗原と複合された分子に対する補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）の結合によって開始される。ＩｇＧ１は補体カスケードと、それに続くＣＤＣ活性の強力な誘発物質であるが、一方、ＩｇＧ４はほとんど補体誘導性活性を有しない。
【００３８】
ＡＤＣＣは細胞媒介反応であり、この反応ではＦｃ受容体（ＦｃＲ）を発現する非特異的な細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）は、標的細胞上の結合された抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を惹起する。ＩｇＧ１サブクラスはＦｃ受容体への高い親和力により結合し、そしてＡＤＣＣに貢献するが、一方ＩｇＧ４は弱くしか結合しない。エフェクター機能を活性化するＩｇＧ４の相対的無能力は、細胞を殺傷することなく細胞へのミメティボディの送達が可能であるので、望ましいことである。
【００３９】
さらにまた、ＦｃＲｎスカベンジャー受容体に対する結合部位はＩｇＧ４およびＩｇＧ１イソタイプに存在し、そして両者は類似する結合特性を有する。したがって、本発明のＩｇＧ１およびＩｇＧ４ミメティボディの薬動学は類似することが期待される。
【００４０】
免疫グロブリン領域のヒンジ−ＣＨ２−ＣＨ３部分（Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３）は、また、本発明にしたがって変異体（ｖａｒｉａｎｔ）を作成するために広く改変することができる。例えば、ミメティボディ分子によって必要とされない構造的特徴または機能的活性を提供する１種以上のネイティブな部位は除去することができるであろう。これらの部位は、例えば、残基を置換または欠失するか、部位中へ残基を挿入するか、またはこの部位を含有する部分を切り取ることによって除去されてもよい。代表的なＨｇ−ＣＨ２−ＣＨ３変異体が以下に検討される。
【００４１】
１．ジスルフィド結合形成に必要とされる部位は、本発明のミメティボディにおいて欠失または他のアミノ酸による置換によって除去することができる。典型的には、これらのモチーフに存在するシステイン残基が除去または置換される。これらの部位の除去は、ミメティボディ産生宿主細胞に存在する他のシステイン含有タンパク質によるか、またはＩｇＧ４に基づく構築物中の重鎖内ジスルフィド結合によるジスルフィド結合を回避してもよいが、一方、非共有的に一緒になる二量体ＣＨ３−ＣＨ２−ヒンジドメインについてはなお可能である。
【００４２】
ほとんどのＩｇＧ型抗体、例えばＩｇＧ１は、２個の同一の重い（Ｈ）鎖および２個の同一の軽い（Ｌ）鎖から作成されるホモ二量体であり、典型的にはＨ２Ｌ２と略記される。かくして、これらの分子は抗原結合に関して一般に二価である、すなわち、ＩｇＧ分子の両抗原結合（Ｆａｂ）アームは同一な結合特異性を有する。
【００４３】
ＩｇＧ４イソタイプ重鎖は、いずれか重鎖間または重鎖内ジスルフィド結合を形成することができるそれらのヒンジ部中にＣＰＳＣ（配列番号：１５）モチーフを含有する、すなわち、ＣＰＳＣモチーフ中の２個のＣｙｓ残基は他のＨ鎖中の対応するＣｙｓ残基とジスルフィド結合されてもよく（重鎖間）、または与えられたＣＰＳＣモチーフ内の２個のＣｙｓ残基が互いにジスルフィド結合されてもよい（重鎖内）。インビボのイソメラーゼ酵素が、ＩｇＧ４分子の重鎖間結合を重鎖内結合に変換することができ、その反対も可能である（Ａａｌｂｅｒｓｅ  ａｎｄ  Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １０５，９−１９（２００２））。したがって、ヒンジ部中に重鎖内結合をもつそれらのＩｇＧ４分子におけるＨＬペアは、互いに共有的には結び付けられないので、それらはＨＬ単量体に解離され、次いで他のＩｇＧ４分子に由来するＨＬ単量体と再び結び付いて、二重特異性のヘテロ二量体ＩｇＧ４分子を形成してもよい。二重特異性ＩｇＧ抗体では、抗体分子の２個のＦａｂは、それらが結合する抗原決定基において異なる。ＩｇＧ４のヒンジ部におけるＳｅｒ２２８をＰｒｏにより置換することは、「ＩｇＧ１様の挙動」をもたらす、すなわち、分子は重鎖間に安定なジスルフィド結合を形成し、その結果、他のＩｇＧ４分子とのＨＬ交換を受けなくなる。
【００４４】
２．Ｈ−ＣＨ２−ＣＨ３は、選択された宿主細胞と一層適合する本発明のミメティボディを作成するように改変されてもよい。例えば、本発明のミメティボディがＥ．ｃｏｌｉのような細菌細胞において組み換え技術により発現される場合、ヒンジ中のＰｒｏ−Ａｌａ配列は、Ｅ．ｃｏｌｉの酵素プロリンイミノペプチダーゼによる消化を防ぐために除去されてもよい。
【００４５】
３．ヒンジ部の一部分は、選択された宿主細胞中で発現される生産物における異質性を防ぐために、本発明のミメティボディにおいて欠失されるか、または他のアミノ酸と置換されてもよい。
【００４６】
４．１個以上のグリコシル化部位は、本発明のミメティボディにおいて除去されてもよい。典型的にグリコシル化される残基（例えば、Ａｓｎ）は、ミメティボディに対してＦｃ−依存性、細胞媒介性細胞溶解活性を与えることができる。そのような残基は欠失されても、またＡｌａのようなグリコシル化されない残基により置換されてもよい。
【００４７】
５．補体との相互作用に必要とされる部位、例えばＣ１ｑ結合部位は、本発明のミメティボディにおいて除去される。
【００４８】
６．本発明のミメティボディにおいてＦｃＲｎスカベンジャー受容体以外のＦｃ受容体
に対する結合に影響する部位は除去されてもよい。例えば、ＡＤＣＣ活性に必要であるＦｃ受容体は本発明のミメティボディにおいて除去されてもよい。例えば、ＩｇＧ１のヒンジ部中のＬｅｕ２３４／Ｌｅｕ２３５のＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの変異、またはＩｇＧ４のヒンジ部中のＰｈｅ２３４／Ｌｅｕ２３５のＰ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａへの変異は、ＦｃＲ結合を最小化し、そして補体依存性細胞毒性およびＡＤＣＣを媒介する免疫グロブリンの能力を低下させる。
【００４９】
本発明の１つの実施態様は、Ｈｇ−ＣＨ２−ＣＨ３が、ＩｇＧ４サブクラス（配列番号：３０）由来であり、そしてＳｅｒ２２８Ｐｒｏ（Ｓ２２８Ｐ）置換およびＰ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異（配列番号：３１）を含有する、式（ＩＩ）にしたがうｓＲＡＧＥミメティボディである。これらの変異とｓＲＡＧＥの（Ｖ−Ｃ−Ｃ）、（Ｖ−Ｃ）および（Ｖ）ドメインとを有する代表的なｓＲＡＧＥミメティボディポリペプチドの完全なポリペプチド配列は、それぞれ配列番号：９、１１および１３に示される。これらのミメティボディ構築物は、ＦｃＲ媒介のエフェクター機能を惹起しない均質かつ安定な集団であることが期待される。ここに示される置換および変異は代表的なものであり；本発明の範囲内のＨｇ−ＣＨ２−ＣＨ３ドメインは、他の置換、突然変異および／または欠失を含んでもよい。
【００５０】
前記のように、本発明のミメティボディの特定の例のアミノ酸配列は、配列番号：３、５、７、９、１１および１３において示される。これらの構築物の特徴は表１に示される（ｎ．ａ．＝応用不能）。
【００５１】
【表１】
2008537874.tif 000005
【００５２】
本発明は、ＲＡＧＥと少なくとも１種のそのリガンドとの間の相互作用を遮断または低下することができるｓＲＡＧＥミメティボディを含む。本発明の実施態様は、ＡＧＥ、アンホテリン、Ｓ１００／カルグラヌリンまたはβ−アミロイドまたはそれらのいずれかの組み合わせ物に対して特異的に結合するｓＲＡＧＥミメティボディを含む。本発明のミメティボディは広範な親和力によりＲＡＧＥリガンドを結合することができる。代表的なｓＲＡＧＥミメティボディは、高い親和力により少なくとも１種のＲＡＧＥリガンドを結合する。例えば、ｓＲＡＧＥミメティボディは、約１０−７Ｍ，１０−８，１０−９．１０−１０，１０−１１または１０−１２Ｍに等しいか、それ未満のＫｄによりＡＧＥ、アンホテリン、Ｓ１００／カルグラヌリンまたはβ−アミロイドまたはそれらのいずれかの組み合わせ物の少なくとも１種を結合することができる。
【００５３】
特異的なＲＡＧＥリガンドに対するｓＲＡＧＥミメティボディの親和力は、いずれかの適当な方法、例えば、ＢｉａｃｏｒｅまたはＫｉｎＥｘＡ装置、ＥＬＩＺＡおよび競合結合アッセイを使用する方法を用いて実験的に決定することができる。特異的なリガンド結合能力を有するｓＲＡＧＥミメティボディは、当業者には既知の技術によってｓＲＡＧＥ
変異体またはｓＲＡＧＥフラグメントのライブラリーから選ばれてもよい。
【００５４】
本発明のミメティボディは、少なくとも１種のリガンドの結合によって惹起されるＲＡＧＥの異常な受容体活性化の結果である疾患または症候の処置において有用である。前述のように、ＲＡＧＥおよびそのリガンドの会合は、多くの病理学的症状、例えば限定されるものではないが、１および２型糖尿病およびアルツハイマー病に深く関わっている。
したがって、本発明のその他の態様は、少なくとも１種のｓＲＡＧＥミメティボディおよび当業者には既知の製薬学的に許容できる担体または希釈剤を含んでなる製薬学的組成物である。担体または希釈剤は、溶液、懸濁液、乳濁液、コロイドまたは粉末であってもよい。
【００５５】
本発明のｓＲＡＧＥミメティボディは、治療学的または予防学的に有効な量において製薬学的組成物として調合される。用語「有効な量」は、一般に、有効な治療のために、すなわち、処置が捜し求められている症候または疾患の部分的または完全な緩和のために必要なミメティボディの量を指す。有効な治療の定義の中には、上記症候または疾患の開始の見込みを低下することを意図する予防的処置が含まれる。
【００５６】
本組成物は、場合によっては、以下に議論される疾病症状を処置するために有用な少なくとも１種のさらなる化合物、タンパク質または組成物を含有してもよい。例えば、インシュリン、メトホルミン、スルホニル尿素またはＰＰＡＲ−γアゴニストとの組み合わせ物が２型糖尿病の処置において考えられる。さらに、炎症疾患を処置するための抗炎症剤との組み合わせ物およびがんを処置するための化学療法剤との組み合わせ物もまた考えられる。
【００５７】
核酸、ベクターおよび細胞系
本発明のその他の態様は、少なくとも１種のｓＲＡＧＥミメティボディをコードしているポリヌクレオチドと相補的か、またはそれと有意な同一性を有する単離された核酸分子である。本発明の他の態様は、核酸分子をコードしている少なくとも１種の単離されたｓＲＡＧＥミメティボディを含んでなる組み換えベクターならびにこの核酸分子を発現することができる細胞系および生物体を含む。核酸、発現ベクターおよび細胞系は、一般に、本発明のミメティボディを生産するために使用できる。
【００５８】
１つの実施態様では、本発明の核酸組成物は、配列番号：３、５、７、９、１１または１３のいずれか１種に同一か、または実質的に相同なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードしている。配列番号：３、５、７、９、１１および１３に示されるポリペプチド配列をコードしている代表的な核酸配列は、それぞれ配列番号：４、６、８、１０、１２および１４において示される。また、上記核酸の実質的に類似の核酸配列および対立遺伝子変異物が提供される。
【００５９】
核酸の文脈における用語「実質的に類似の」は、適当に整列された場合、適当なヌクレオチドの挿入または欠失をもつセグメントまたはそれらの相補的鎖が、ヌクレオチドの少なくとも約６０％または少なくとも約７０％または少なくとも約８０％または少なくとも約９０％または少なくとも約９５〜９８％において同一であることを意味する。％同一性についての値は、Ｖｅｃｔｏｒ  ＮＴＩ  Ｓｕｉｔｅ  ８．０のＡｌｉｇｎＸコンポーネントのためのデフォルトセッティング（ｄｅｆａｕｌｔ  ｓｅｔｔｉｎｇ）（Ｉｎｆｏｒｍａｘ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を使用して、生成されたヌクレオチド配列の整列から得ることができる。
【００６０】
典型的には、本発明の核酸は、本発明のｓＲＡＧＥミメティボディポリペプチドの調製のための発現ベクターにおいて使用される。本発明の範囲内のベクターは、ウイルスプロ
モーター駆動のベクター、例えばＣＭＶプロモーター駆動のベクター、例えば、ｐｃＤＮＡ３．１、ｐＣＥＰ４およびそれらの誘導体、バクロウイルス発現ベクター、ショウジョウバエ発現ベクターおよび哺乳動物遺伝子プロモーター、例えばヒトＩｇ遺伝子プロモーターによって駆動される発現ベクターを含む、真核生物発現のための必須要素を提供する。他の例は、原核生物発現ベクター、例えばＴ７プロモーター駆動のベクター、例えば、ｐＥＴ４１、ラクトースプロモーター駆動のベクターおよびアラビノース遺伝子プロモーター駆動のベクターを含む。
【００６１】
また、本発明はｓＲＡＧＥミメティボディを発現する細胞系に関する。宿主細胞は原核または真核細胞であってもよい。代表的な真核細胞は、哺乳動物細胞、例えば限定されるものではないが、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、ＨｅｐＧ２、６５３、ＳＰ２／０、ＮＳ０、２９３、ＨｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫細胞、またはいずれかそれらの誘導体である。もっとも好ましくは、宿主細胞はＨＥＫ２９３、ＮＳ０、ＳＰ２／０またはＣＨＯ細胞である。本発明の細胞系は、少なくとも１種のｓＲＡＧＥミメティボディを安定して発現できる。細胞系は、当該技術分野において周知である安定または一過性トランスフェクション手法によって生成されてもよい。
【００６２】
さらに、本発明は、ｓＲＡＧＥミメティボディが検出可能または回収可能な量において発現される条件下で細胞系を培養することを含んでなる、少なくとも１種のｓＲＡＧＥミメティボディを発現する方法を提供する。また、本発明は、ｓＲＡＧＥミメティボディが検出可能または回収可能な量において発現されるような、インビトロまたはインサイチューの条件下で、ｓＲＡＧＥミメティボディコーディング核酸を翻訳することを含んでなる、少なくとも１種のｓＲＡＧＥミメティボディを生成する方法を提供する。また、本発明は前記方法のよって生産されるｓＲＡＧＥミメティボディを包含する。
【００６３】
ｓＲＡＧＥミメティボディは、限定されるものではないが、プロテインＡ精製、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオンまたは陽イオン交換クロマトグラフィー、ホスホセルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む、周知の方法によって回収および精製することができる。
【００６４】
使用の方法
ｓＲＡＧＥミメティボディは、なかんずく研究試薬および治療剤として有用である。１つの態様では、本発明は、少なくとも１種のｓＲＡＧＥミメティボディを、それを必要とする哺乳動物に提供することを含んでなる、ＲＡＧＥの生物学的活性を改変する方法に関する。ｓＲＡＧＥミメティボディは、ＲＡＧＥで活性化される細胞シグナル伝達カスケード、例えば限定されるものではないが、ＮＦ−κｂ経路を減退または抑制することができる。かくして、本発明のｓＲＡＧＥミメティボディは、ＲＡＧＥで開始される核へのＮＦ−κｂの移動により、付着（ａｄｈｅｓｉｏｎ）分子、プロコアギュラント（ｐｒｏｃｏａｇｕｌａｎｔ）分子および炎症性タンパク質の増強された発現を減少させることができる。特に、ｓＲＡＧＥミメティボディは、ＲＡＧＥのアンタゴニストとして機能することができる。用語「アンタゴニスト」は、広い意味において使用され、そしてＲＡＧＥの１種以上の生物学的活性を直接または間接的に、部分的または完全に、打ち消し、低下し、または抑制することができる分子を含む。ＲＡＧＥのそのような生物学的活性の例は、ＡＧＥ、アンホテリン、Ｓ１００／カルグラヌリンまたは□−アミロイドへのその結合、ＮＦ−□ｂ、ｐ２１（ｒａｓ）、ＭＡＰキナーゼまたはｃｄｃ４２／ｒａｃの活性化、ならびに当業者には既知の他の活性を含む。
【００６５】
さらに、本発明は、少なくとも１種のｓＲＡＧＥミメティボディの製薬学的組成物の治
療学的に有効な量を、それを必要とする患者に投与することを含んでなる、少なくとも１種のＲＡＧＥに関係する症状または疾病の症候を軽減するか、またはその症状または疾病を処置するための方法を提供する。前記のように、そのような組成物は、少なくとも１種のｓＲＡＧＥミメティボディの有効な量および製薬学的に許容できる担体または希釈剤を含有する。治療的でもまた予防的でも、与えられた療法のための有効な量は、一般に、投与の手段、標的部位および投与される他の薬剤を含む種々のファクターに依存するであろう。かくして、処置用量は、安全性と有効性を最適化するように滴定されることが必要であろう。
【００６６】
本発明の方法を用いる処置のために適当な症状および疾病は、限定されるものではないが、免疫疾患、心血管障害、代謝疾患、悪性疾患および神経障害を含む。これらの症状または疾患の非限定例は、１および２型糖尿病、アルツハイマー病、動脈硬化症、腫瘍の増殖および転移、炎症、大腸炎、遅延型過敏症、多発性硬化症および老化に関係する障害、例えばオキシダントストレスである。これらの方法は、場合によってはさらに、上記疾病を処置するために使用されるいずれかの標準的療法との同時投与または組み合わせ療法を含んでもよい。
【００６７】
投与の様式は、本発明のｓＲＡＧＥミメティボディの製薬学的に有効な量を宿主に送達するためのいかなる適当な経路であってもよい。例えば、ｓＲＡＧＥミメティボディは、非経口的投与、例えば皮下、筋肉内、皮内、静脈内または鼻内投与、または当該技術分野において既知のいかなる他の手段を介して送達されてもよい。
【００６８】
本発明は次に示す実施例を参考にさらに記述される。これらの実施例は、本発明の態様を具体的に説明するためにだけあり、本発明を限定することを意図していない。
【実施例１】
【００６９】
哺乳動物細胞におけるｓＲＡＧＥミメティボディのクローニング、発現および精製
ヒトｓＲＡＧＥをコードしているｃＤＮＡは、ヒト胎児肺５’−ＳＴＲＥＴＣＨ  Ｐｌｕｓ  ｃＤＮＡ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）からＰＣＲ増幅された。第１ラウンドの増幅は、正プライマー５’−ＧＴＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＡＡＧＣＡＧＧ−３’（配列番号：３４）および逆プライマー５’−ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＣＣＴＣＡＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＧ−３’（配列番号；３５）を用いて実施された。
【００７０】
第２ラウンドのネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）増幅は、十分量のｓＲＡＧＥｃＤＮＡを得ることが必要であった。ネステッド正プライマーはＮｃｏＩ制限酵素認識部位を含み、そしてネステッド逆プライマーはＫｐｎＩ部位を含んだ。具体的には、Ｖ領域は、正プライマー５’−ＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号：３６）および逆プライマー５’−ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧ−３’（配列番号：３７）を用いて増幅され；そしてＶ−Ｃ−Ｃ領域は、正プライマー５’−ＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧ−３’（配列番号：３６）および逆プライマー５’−ＴＴＴＧＧＴＡＣＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣ−３’（配列番号：３８）を用いて増幅された。
【００７１】
増幅されたＰＣＲ生産物（ｓＲＡＧＥのＶ領域またはＶ−Ｃ−Ｃ領域）は、標準クローニング手法を用いて中間ベクターのＮｃｏＩ／ＫｐｎＩ部位中にクローン化された。プロモーター要素、エンハンサーおよびｓＲＡＧＥコーディング配列を含有する集合された中間プラスミドのＥｃｏＲＩフラグメントは、マウスＩｇ遺伝子プロモーター駆動のヒトＩｇＧ１  △ＣＨ１  Ａｌａ／Ａｌａ発現ベクター中にクローン化された。ｓＲＡＧＥミメティボディを含有するＶ領域およびｓＲＡＧＥミメティボディを含有するＶ−Ｃ−Ｃ領域
を発現するプラスミドが生成された。
【００７２】
ｓＲＡＧＥ  ＩｇＧ１ミメティボディは、マウス骨髄腫細胞ＳＰ２／０において安定して発現され、そして標準手法にしたがうプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて順化培地から精製された。
【００７３】
ｓＲＡＧＥミメティボディはまた、ＩｇＧ４  Ｓｅｒ〜Ｐｒｏ，Ａｌａ／Ａｌａスカホールド中にクローン化された。Ｖ−ＣおよびＶ−Ｃ−ＣｓＲＡＧＥミメティボディをコードしているフラグメントを増幅するために、Ｖ−Ｃ−Ｃ含有プラスミドが鋳型として使用された。正プライマーはＮｈｅＩ部位を含み、そして逆プライマーはＢａｍＨＩ部位を含んだ。具体的には、Ｖ−Ｃ領域は、正プライマー５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号：３９）および逆プライマー５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＧＧＣＴＧＡＡＧＣＴＡＣＡ−３’（配列番号：４０）を用いて増幅され；そしてＶ−Ｃ−Ｃ領域は、正プライマー５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号：３９）および逆プライマー５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＧＧＣＴＧＧＡＡＴＧＧＧＴＧＧＣＣＡＣＡＣＡ−３’（配列番号：４１）を用いて増幅された。ＰＣＲ生産物はＮｈｅＩおよびＢａｍＨＩを用いて消化された。ＲＡＧＥのＶ様ドメイン中の内部ＢａｍＨＩ部位のために、ＰＣＲ生産物はＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩを用いて２個のフラグメント；配列番号：２のヌクレオチド１〜２７５をもつフラグメント、ヌクレオチド２７６〜６４５（Ｖ−Ｃ生産物）または２７６〜９２４（Ｖ−Ｃ−Ｃ生産物）をもつ他のフラグメントに切断された。ＩｇＧ４発現ベクター中へのｓＲＡＧＥミメティボディのクローニングは２段階を必要とした。先ず、１〜２７５フラグメントがヒトＩｇＧ４  △ＣＨ１、Ｓｅｒ〜Ｐｒｏ、Ａｌａ／Ａｌａ発現ベクターのＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ部位中にクローン化されて中間プラスミドを生成した。２７６〜６４５または２７６〜９２４フラグメントは、続いて、中間プラスミドのＢａｍＨＩ中にクローン化されて、それぞれＶ−ＣまたはＶ−Ｃ−ＣｓＲＡＧＥミメティボディを発現するプラスミドを生成した。
【００７４】
ＩｇＧ４  Ｓｅｒ〜Ｐｒｏ、Ａｌａ／Ａｌａスカホールド中にＶのみの領域をクローン化するためには、ＰＣＲは、正プライマー５’−ＴＴＴＧＣＴＡＧＣＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＣＡＧＣＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＴＴ−３’（配列番号：３９）および逆プライマー５’−ＴＴＴＧＧＡＴＣＣＴＣＣＡＴＴＣＣＴＧＴＴＣＡＴＴＧＣＣＴＧＧＣＡＣＣＧＧＡＡＡＡＴＣＣＣＣＴＣＡＴＣＣＴＧＡＡＴＣＣＣＧＡＣＡＧＣＣＧＧＡＡＧＧＡＡ−３’（配列番号：４２）を用いて実施された。ＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ消化ＰＣＲ生産物は、ヒトＩｇＧ４  △ＣＨ１、Ｓｅｒ〜Ｐｒｏ、Ａｌａ／Ａｌａ発現ベクターのＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩ部位中に１段階でクローン化された。
【００７５】
ＩｇＧ４ミメティボディは、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞において一過性に発現され、そして標準手法にしたがってプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて順化培地から精製された。
【実施例２】
【００７６】
ｓＲＡＧＥミメティボディに対するＡＧＥの結合
ＡＧＥを調製するために、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，フラクションＶ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）が、塩化カルシウムまたは塩化マグネシウムを含まないリン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）（ｐＨ７．４）中５０ｍＭグリコアルデヒドとともに非還元条件下３７℃で３日間インキュベートされた。反応を終了するために、ＡＧＥを１０倍容量のＰＢＳ（ｐＨ７．４）で透析した。最終タンパク質濃度は、Ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃ  Ａｃｉｄに基づくタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて決定された。サンプルは、カブトガニのアメーバ様細胞溶解物（ＬＡＬ）
試験を用いてタンパク質１ｍｇ当たり１未満のエンドトキシン単位（ＥＵ）を含有するように決定された。
【００７７】
固相ＥＬＩＳＡを使用してＡＧＥへのミメティボディ結合を調査した。簡単に言えば、９６穴プレートが、０．１Ｍ炭酸塩バッファー、ｐＨ９．５中、３０μｇ／ｍｌのＡＧＥにより３７℃で一夜コートされた。０．０２％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０を含有する０．１５Ｍ食塩水バッファーにおいて洗浄後、ウェルを、ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０により３７℃で２時間ブロックした。洗浄後、プレートはＰＢＳにおいて希釈された種々の濃度のｓＲＡＧＥミメティボディとともに３７℃で４５分間インキュベートされた。プレートを洗浄し、そして１％ＢＳＡ／ＰＢＳ中１：１０００希釈したＨＲＰ−標識ヤギ抗ヒトＦｃ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｃｈ，Ｗｅｓｔ  Ｇｒｏｏｖｅ，ＰＡ）を用いて３７℃で２０分間プローブした。さらなる洗浄後、プレートを、Ｓｉｇｍａ  １０４  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｓｉｇｍａ）の１００μｌ／ウェルとともに室温で１５分間インキュベートした。基質発色を硫酸（４Ｎ）２５μｌ／ウェルの添加によって停止し、そして吸光度を自動プレート分光光度計により４９０ｎｍにおいて測定した。図１において示されるように、試験されたミメティボディは全てＡＧＥに対する結合を例証した。結合親和力（ＫＤ）を表２に示す。
【００７８】
【表２】
2008537874.tif 000006
【実施例３】
【００７９】
ｓＲＡＧＥミメティボディはＲＡＧＥに対するＡＧＥの結合を低下させる
ＲＡＧＥに対するＡＧＥの結合を測定するために、１２５−Ｉ結合アッセイが実施された。ＲＡＧＥを発現する細胞（Ｕ９３７細胞）が、１０％ＦＢＳおよび１％Ｌ−グルタミン、ピルビン酸Ｎａおよび非必須アミノ酸を含有するＤＭＥＭ培地中で３７℃、５％ＣＯ２において、１．５ｘ１０６の集密が達成されるまで培養された。細胞は、１５０，０００細胞／ウェルにおいて９６穴フィルタープレートにプレートされ、そして３０μｇ／ｍｌのＦｃ対照（ｓＲＡＧＥコーディング配列を含まないＩｇＧ４ミメティボディ骨格）とともに３７℃で３０分間インキュベートされてＦｃ受容体をブロックした。ＡＧＥは１２５−Ｉで標識され、そして１２５−Ｉ−ＡＧＥが２００μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌまで２倍希釈で細胞に添加された。最大結合を可能とするために室温で２時間インキュベートした後、プレートを濾過し、そしてＰＢＳで洗浄して、未結合タンパク質を通過させながら細胞をニトロセルロース膜上に保持した。膜上の放射能をガンマカウンターを用いて測定した。非特異的結合は、無標識ＡＧＥの１００＋−倍過剰量とともに同時インキュベートすることによって測定された。非特異的結合から得られるカウントを総結合データから差し引きして、特異的結合を決定した。Ｕ９３７細胞に対するＡＧＥ結合の親和力（ＫＤ）は１１μｇ／ｍｌであると算出された。
【００８０】
Ｕ９３７細胞に対するＡＧＥ結合を低下させるｓＲＡＧＥ  ＭＭＢの能力は競合アッセイによって決定された。簡単に言えば、１２５−Ｉ−ＡＧＥ（１１μｇ／ｍｌ）をｓＲＡＧＥミメティボディとともに２時間インキュベートした。使用されたミメティボディは２
００μｇ／ｍｌから０．１μｇ／ｍｌまで２倍希釈された。１２５−Ｉ−ＡＧＥとｓＲＡＧＥミメティボディの混合物をＵ９３７に添加し、そしてＵ９３７に対するＡＧＥの結合を前記結合アッセイを用いて測定した。図２に示すように、試験されたミメティボディは、Ｕ９３７細胞に対するＡＧＥ結合の低下を例証した。試験されたミメティボディのＩＣ５０は約９０ｎＭにおいて算出された。
【実施例４】
【００８１】
ｓＲＡＧＥミメティボディはＡＧＥ誘導の遺伝子発現を低下する
ある種の遺伝子の発現のＡＧＥ刺激を示すために、ヒト臍内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を３０μｇ／ｍｌＡＧＥ，６００μｇ／ｍｌＡＧＥとともに１、４、８または１２時間インキュベートした。ポジティブ対照として、細胞を１３μｇ／ｍｌリポ多糖（ＬＰＳ）、炎症促進剤とともにインキュベートした。ネガティブ対照としては、細胞を６００μｇ／ｍｌＢＳＡとともにインキュベートした。細胞を収穫し、そして総ＲＮＡをＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて単離した。ＲＮＡはＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒにより定量された。定量的ＰＣＲはＡｓｓａｙ−ｏｎ−Ｄｅｍａｎｄプライマー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて、Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ（ＨＳ００１７４０５７）、ＲＡＧＥ（ＨＳ００１５３９５７）、ＶＥＧＦ（ＨＳ００１７３６２６）、ＩＬ−６（ＨＳ００１７４１３１）、ＧＡＰＤＨ（ＨＳ９９９９９９０５）およびＴｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ（ＨＳ００１７５２２５）について実施された、ＲＴ−ＰＣＲ産物は１８ｓＲＮＡに比較して定量された。図３に示すように、ＡＧＥは試験された各々の遺伝子のｍＲＮＡレベルを増大したが、対照ＢＳＡは増大しなかった。
【００８２】
ＡＧＥに刺激されるｍＲＮＡレベルを抑制するｓＲＡＧＥミメティボディの能力を例証するために、ＨＵＶＥＣ細胞が、６００μｇ／ｍｌＡＧＥに加えて３．３μｇ／ｍｌｓＲＡＧＥミメティボディまたは６００μｇ／ｍｌＡＧＥに加えて１３．２μｇ／ｍｌｓＲＡＧＥミメティボディとともにインキュベートされた。ＲＮＡ精製および定量的ＰＣＲは前記のように実施された。図３に示すように、ｓＲＡＧＥミメティボディは、（３Ａ）Ｔｉｓｓｕｅ  Ｆａｃｔｏｒ、（３Ｂ）ＶＥＧＦ、（３Ｃ）Ｅ−Ｓｅｌｅｃｔｉｎ、（３Ｄ）ＲＡＧＥおよび（３Ｅ）ＩＬ−６をコードしている転写物のＡＧＥ−誘導を抑制した。
【００８３】
ここに完全に記述されている本発明は、それについて多数の変更および修飾が、付随される請求項の精神または範囲を逸脱することなくなされることは当業者にとって明白であろう。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１Ａ−１Ｅ】図１〜１Ｅは、ＡＧＥに対するｓＲＡＧＥミメティボディの結合を示す。試験されたミメティボディは、１Ａ：Ｃ２２０ＡおよびＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異をもつＩｇＧ１におけるＶ（Ｖ−Ｇ１）（配列番号：５）；１Ｂ：Ｃ２２０ＡおよびＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異をもつＩｇＧ１におけるＶ−Ｃ−Ｃ（ＶＣＣ−Ｇ１）（配列番号：３）；１Ｃ：Ｓ２２８ＰおよびＰ２３４Ａ，Ｌ２３５Ａ変異をもつＩｇＧ４におけるＶ（Ｖ−Ｇ４）（配列番号：１３）；１Ｄ：Ｓ２２８ＰおよびＰ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異をもつＩｇＧ４におけるＶ−Ｃ（ＶＣ−Ｇ４）（配列番号：１１）；および１Ｅ：Ｓ２２８ＰおよびＰ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ変異をもつＩｇＧ４におけるＶ−Ｃ−Ｃ（ＶＣＣ−Ｇ４）（配列番号：９）を含む。
【図２】図２は、ｓＲＡＧＥミメティボディによるＵ９３７細胞に対するＡＧＥ結合の低下を示す。
【図３Ａ−３Ｅ】図３Ａ〜３Ｅは、組織因子（図３Ａ）；ＶＥＧＰ（図３Ｂ）；Ｅ−セレクチン（ｓｅｌｅｃｔｉｎ）（図３Ｃ）；ＲＡＧＥ（図３Ｄ）；およびＩＬ−６（図３Ｅ）に対するＡＧＥ誘導ｍＲＮＡ発現のｓＲＡＧＥミメティボディ抑制を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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