(57)【要約】  本発明の態様は、遠隔サンプルからＤＮＡ断片を提供する組成物および方法に関する。特定の態様において、ＤＮＡを含む遠隔サンプルが提供され、ＤＮＡは前記遠隔サンプルから単離し、前記単離したＤＮＡはメチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を可能にする方法で処理される。さらに、特定の実施例は、遠隔サンプル由来のＤＮＡのメチル化分析の組成物および方法を提供する。他の態様は、バイサルファイト処理したＤＮＡの全ゲノム増幅の組成物および方法を提供する。【選択図】  なし
2008537888.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
遠隔サンプル由来のＤＮＡ断片を提供する方法であって、
ＤＮＡを含む遠隔サンプルを提供することと、
前記遠隔サンプルからＤＮＡを単離することと、
メチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を可能にする試薬または酵素によって、単離したＤＮＡを処理することと、
を含む、遠隔サンプル由来のＤＮＡ断片を提供する方法。
【請求項２】
前記遠隔サンプルのＤＮＡは、ＤＮＡの約５％未満、約３％未満、約１％未満、または約０．１％未満が限定された細胞、細胞集団、組織、または器官に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記遠隔サンプルは、１ｍｌ中約１００ｎｇ未満のＤＮＡ、１ｍｌ中約６０ｎｇ未満のＤＮＡ、または１ｍｌ中約１０ｎｇ未満のＤＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
ＤＮＡの損失を、高収量のＤＮＡによって特徴付けられるＤＮＡの単離方法の選択、高精度および高信頼性によって特徴付けられる非メチル化シトシンとメチル化シトシンの区別をする方法の選択、高精度なピペット操作、ピペット操作器具の再使用、およびＤＮＡと接触した器具の再使用から成る群から選択される少なくとも１つの方法によって最小限にする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記遠隔サンプルの体積が、少なくとも約１．５ｍｌ、約２ｍｌ、約３ｍｌ、約４ｍｌ、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、約９ｍｌ、約１０ｍｌ、約１１ｍｌ、約１２ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌ、または約５０ｍｌである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記遠隔サンプルが、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、体液サンプル、唾液サンプル、尿サンプル、精液サンプル、胸腔液サンプル、胸腔液サンプル、脳脊髄液サンプル、上皮表面の塗抹標本、喀痰試料、糞便サンプル、射精サンプル、涙液サンプル、汗サンプル、リンパ液サンプル、気管支洗浄液サンプル、胸水サンプル、髄膜液サンプル、腺液サンプル、微細針吸引液サンプル、乳頭吸引液サンプル、髄液サンプル、結膜液サンプル、膣液サンプル、十二指腸液サンプル、膵液サンプル、および胆液サンプルを含む群から選択される少なくとも１つのサンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記遠隔サンプルが血漿であり、前記遠隔サンプルの提供が、
個体から少なくとも約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、約５０ｍｌの血液を得ることと、
穏やかに混合することを含め、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を血液に加えることと、
穏やかに混合することを含め、血液を最終濃度約２．２μｍｏｌ／ｌ、約３．２μｍｏｌ／ｌ、約３．７μｍｏｌ／ｌ、約４．０μｍｏｌ／ｌ、約４．５μｍｏｌ／ｌ、約４．９μｍｏｌ／ｌ、約５．４μｍｏｌ／ｌ、約５．９μμｍｏｌ／ｌ、または約６．９μｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ二カリウム（エチレンジアミン四酢酸二カリウム）に調節することと、
血液‐ＥＤＴＡ混合物を約７５０×ｇ、約１０００×ｇ、約１５００×ｇ、または約２０００×ｇで約４分、約８分、約１０分、約１２分、または約２０分間、約１℃、約４℃、約７℃、約１０℃、約１５℃、約２１℃、または約２７℃で遠心分離することと、
前記血漿を新しい容器に移動することと、
前記血漿を約７５０×ｇ、約１０００×ｇ、約１５００×ｇ、または約２０００×ｇで約４分、約８分、約１０分、約１２分、または約２０分間、約１℃、約４℃、約７℃、または約１０℃で遠心分離することと、
再遠心分離した血漿を新しい容器に移動することと、
血漿含有サンプルを約０℃、約２℃、約４℃、約６℃、または約１０℃で冷却することと、
血漿含有サンプルを少なくとも約−１０℃、約−２０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−８０℃、約−９０℃、または約−１９６℃で凍結、保管、または運搬する、
個体から血液を得ることから対応する再遠心分離した血漿を凍結するまでの遠隔サンプルの提供を約１、約２、約３、約４、約５、約６、または約８時間以内に実施することのうち、１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記遠隔サンプルが尿であり、前記遠隔サンプルの提供が、
前立腺の触診、前立腺マッサージ、またはその両方を前立腺の中心から前立腺の左側、前立腺の右側または両側へ約１０秒、約３０秒、約５０秒、約６０秒、約７５秒、または約１２０秒間実施することと、
排せつされた尿の最初の約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌを収集することと、
ＥＤＴＡを前記尿に加えることと、
前記尿を最終濃度約３ｍｍｏｌ／ｌ、約６ｍｍｏｌ／ｌ、約７ｍｍｏｌ／ｌ、約８ｍｍｏｌ／ｌ、約９ｍｍｏｌ／ｌ、約９．８０ｍｍｏｌ／ｌ、約１０ｍｍｏｌ／ｌ、約１１ｍｍｏｌ／ｌ、約１２ｍｍｏｌ／ｌ、約１３ｍｍｏｌ／ｌ、約１４ｍｍｏｌ／ｌ、約１８ｍｍｏｌ／ｌ、または約２５ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）でｐＨ約５．０、約６．０、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約１０に調節することと、
尿含有サンプルを約０℃、約２℃、約４℃、約６℃、または約１０℃に冷却することと、
尿含有サンプルを少なくとも約−２０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−８０℃、約−９０℃、または約−１９６℃で凍結、保管または運搬することと、
排せつされた尿の最初のｍｌを収集することから対応する尿‐ＥＤＴＡ混合物を凍結するまでの尿サンプルの提供を約１５、約３０、約４５、約６０、約７５、約９０、または約１２０分以内に実施することのうち、１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記遠隔サンプルが、前記遠隔サンプルの提供の後でサブサンプルに分けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記遠隔サンプルまたは前記遠隔サンプルの少なくとも１つの成分が、遠隔サンプルの提供の後で濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
濃縮が、限外ろ過、体積減少、またはその両方を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＤＮＡの単離が、
前記遠隔サンプルをプロテアーゼで処理することと、
前記遠隔サンプルを少なくとも１つのタンパク質変性試薬または溶液で処理することと、
遠隔サンプルの前記ＤＮＡをＤＮＡ精製装置に接触させることと、
前記ＤＮＡを前記ＤＮＡ精製装置で洗浄することと、
前記ＤＮＡを前記ＤＮＡ精製装置から回収することのうち、１つ以上を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記プロテアーゼが、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、カルボキシプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびプロテイナーゼＫから成る群から選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＤＮＡ精製装置が、限外ろ過、Ｍｉｃｒｏｃｏｎろ過装置、ろ過装置、シリカ表面、シリカ膜、磁気粒子、ポリスチロール粒子、ポリスチロール表面、正電荷を持つ表面、正電荷を持つ膜、荷電膜、荷電表面、荷電交換膜、荷電交換面、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ‐５Ｋｉｔのカラム、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｅｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのカラム、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔのカラム、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅの一構成要素、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔの一構成要素、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔの一構成要素、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡおよびＲＮＡ精製Ｋｉｔの一構成要素、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、およびそれらの均等物から成る群から選択される少なくとも１つである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＤＮＡの単離が、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔ、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔ、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌ、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌ、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡおよびＲＮＡ精製Ｋｉｔ、またはＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔから成る群から選択される少なくとも１つのキットの使用によって実行される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
異なるサンプル由来の単離したＤＮＡが、プール、濃縮あるいはプールおよび濃縮される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記単離したＤＮＡの濃縮が、限外ろ過、Ｍｉｃｒｏｃｏｎろ過装置、ろ過装置、エタノール沈殿、プロパノール沈殿、シリカ表面、シリカ膜、磁気粒子、ポリスチロール粒子、正電荷を持つ表面、および正電荷を持つ膜、荷電膜、荷電表面、荷電交換膜、荷電交換面、真空濃縮、遠心分離機を用いた真空濃縮、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ‐５Ｋｉｔのカラム、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｅｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのカラム、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔのカラム、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅの一構成要素、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔの一構成要素、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔの一構成要素、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡおよびＲＮＡ精製Ｋｉｔの一構成要素、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、およびそれらの均等物から成る群から選択される少なくとも１つの方法を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
メチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を可能とする前記試薬が、非メチル化シトシンをウラシルへ変換し、メチル化シトシンをそのままにする試薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
非メチル化シトシンをウラシルへ変換し、メチル化シトシンをそのままにする前記試薬が、バイサルファイト試薬である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
バイサルファイト試薬によるＤＮＡの処理が、
ＤＮＡを含む約１０〜約２５０μｌの溶液と約４５〜約７５０μｌのバイサルファイト溶液を混合することを含み、前記バイサルファイト溶液は、約４．８３〜約４．９３ｍｏｌ／ｌの亜硫酸水素を含んで約５．４５〜約５．５０の範囲のｐＨを有し、
約５〜約５００μｌの有機ラジカルスカベンジャー液を加えることを含み、前記有機ラジカルスカベンジャー液は、有機溶媒および約１０〜約７５０ｍｍｏｌ／ｌの６‐ヒドロキシ‐２，５，７，８‐テトラメチル‐クロマン‐２‐カルボン酸を含み、
約８５〜約１００℃の初期温度上昇を含め、約８５〜約１００℃までの約２〜約５回のさらなる温度上昇を伴い（いずれの場合も約０．５〜約１０分）約０〜約８０℃の温度範囲で反応が行われる温度プロトコルを、約２〜約１８時間適用することを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
ＤＮＡを含む約５０〜約１５０μｌの溶液と約１７７〜約５３１μｌのバイサルファイト溶液を混合することと、
約７３〜約２１９μｌのジオキサン溶液を加えることを含み、前記ジオキサン溶液は１，４‐ジオキサンに溶解した約１５７ｍｍｏｌ／ｌの６‐ヒドロキシ‐２，５，７，８‐テトラメチル‐クロマン‐２‐カルボン酸を含み、
約９４〜約１００℃の初期温度上昇を含め、約９４〜約１００℃までの約２〜約５回のさらなる温度上昇を伴い（いずれの場合も約３〜約５分）約５７〜約６５℃の温度範囲で反応が行われる温度プロトコルを、約３〜約１６時間適用することを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡを含む約５０〜約１５０μｌの溶液と約９５〜約２８５μｌのバイサルファイト溶液を混合することと、
ジエチレングリコールジメチルエーテルに溶解した約５００ｍｍｏｌ／ｌの６‐ヒドロキシ‐２，５，７，８‐テトラメチル‐クロマン‐２‐カルボン酸を含むＤＭＥ溶液約１５〜約４５μｌを加えることと、
約９４〜約１００℃の初期温度上昇を含め、約９４〜約１００℃までの約２〜約５回のさらなる温度上昇を伴い（いずれの場合も約３〜約５分）約５７〜約６５℃の温度範囲で反応が行われる温度プロトコルを、約３〜約１６時間適用することとを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前期メチル化状態の区別を可能にする試薬または酵素でのＤＮＡの処理が、処理したＤＮＡの精製を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記処理したＤＮＡの精製が、限外ろ過、Ｍｉｃｒｏｃｏｎろ過装置、ろ過装置、エタノール、プロパノール、シリカ表面、シリカ膜、磁気粒子、ポリスチロール粒子、正電荷を持つ表面、および正電荷を持つ膜、荷電膜、荷電表面、荷電交換膜、荷電交換面、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ‐５Ｋｉｔのカラム、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｅｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのカラム、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔのカラム、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅの一構成要素、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔの一構成要素、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔの一構成要素、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡおよびＲＮＡ精製Ｋｉｔの一構成要素、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｒｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素から成る群から選択される少なくとも１つの方法の使用を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
約５０〜約１０００μｌの水をバイサルファイト反応後のサンプルに加えることと、
混合物をＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置に適用し、その後、約１０，０００〜約１８，０００×ｇで約１０〜約３０分間遠心分離することと、
約１００〜約８００μｌの約０．２ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムで洗浄し、その後、約１０，０００〜約１８，０００×ｇで約６〜約２５分間遠心分離することと、
約１００〜約８００μｌの約０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムを適用し、その後、約１０，０００〜約１８，０００×ｇで約６〜約２５分間遠心分離することと、
約１００〜約４００μｌの水またはＴＥ緩衝液を適用し、その後、約１０，０００〜約１８，０００×ｇで約６〜約２５分間遠心分離することを１〜約８回繰り返すことと、
約１５〜約６５℃に加熱した約２５〜約２００μｌのＴＥ緩衝液の適用、約１５〜約６５℃で約１〜約３０分間の培養、その後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎろ過装置の反転、および約５００〜約５，０００×ｇで約０．５〜約３０分間の遠心分離によって溶出することとを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
ａ）２００μｌの水をバイサルファイト反応後のサンプルに加えることと、
ｂ）混合物をＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置に適用し、その後、約１４，０００×ｇで約２０分間遠心分離することと、
ｃ）約４００μｌの約０．２ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムで洗浄し、その後、約１４，０００×ｇで約１０〜約１４分間遠心分離することと、
ｄ）約４００μｌの約０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムを適用し、その後、約１４，０００×ｇで約１０〜約１４分間遠心分離することと、
ｅ）約４００μｌの水またはＴＥ緩衝液を適用し、その後、約１４，０００×ｇで約１２分間遠心分離することを１〜約４回繰り返すことと、
ｆ）約５０℃に加熱した約４５〜約７０μｌのＴＥ緩衝液の適用、約５０℃で約１０分間の培養、その後、Ｍｉｃｒｏｃｏｎろ過装置の反転、および約１，０００×ｇで約７分間の遠心分離によって溶出することとを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ステップｂにおいて、前記混合物の一部をステップｂのＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置に適用することと、
ステップｂの後、約４００μｌのＴＥ緩衝液を適用し、ＴＥ緩衝液ｐＨ８は約１０ｍｍｏｌ／ｌトリス‐ヒドロキシメチル‐アミノ‐メタンおよび約０．１ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡを含み、その後、約１４，０００×ｇで約１２分間遠心分離することと、
ステップｃにおいて、約０．２ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムを室温で約１０分間培養することと、
ステップｄにおいて、約０．１ｍｏｌ／ｌ水酸化ナトリウムを室温で約１０分間培養することのうち、少なくとも１つをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１つの核酸を増幅する方法であって、
少なくとも１つの核酸分子を含む核酸サンプルを提供することと、
前記サンプル由来の少なくとも１つの核酸分子を前記核酸分子内のメチル化塩基と前記核酸分子内の非メチル化塩基を区別する酵素または試薬で処理することと、
前記サンプル由来の少なくとも１つの核酸分子の少なくとも１つの鎖を少なくとも１つのヌクレオチドまたはＰＮＡ‐モノマーによって伸長することと、
少なくとも１つの伸長した核酸分子を増幅することと、
を含む、少なくとも１つの核酸を増幅する方法。
【請求項２９】
前記伸長が、少なくとも１つの核酸の少なくとも１つの鎖が、
１つ以上の単一ヌクレオチドまたはＰＮＡ‐モノマー、
１つ以上のオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ‐オリゴマー、
提供される核酸サンプル由来の第２の核酸、または
それらの組み合わせによって伸長することを特徴とする、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記伸長が、単独で触媒したテンプレートである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記伸長が、トランスフェラーゼ、リン含有基を移動させるトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、リボヌクレオチドトランスフェラーゼ活性を有する酵素、ポリリボヌクレオチドヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＲＮＡウリジルトランスフェラーゼ、リガーゼ、リン酸エステル結合を形成するリガーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ依存ＤＮＡリガーゼ、単鎖ＤＮＡリガーゼ、分子内環状化を触媒するＡＴＰ依存単鎖ＤＮＡリガーゼ、ＣｉｒｃリガーゼｓｓＤＮＡリガーゼからなる群から選択される少なくとも１つの酵素を用いて触媒される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記メチル化塩基と非メチル化塩基を区別する酵素または試薬が、バイサルファイト試薬である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記提供される核酸が、少なくとも一部分においてＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記核酸サンプルの提供が、断片化、ランダムな断片化、機械的応力による断片化、酵素を用いた断片化、ヌクレアーゼを用いた断片化、および制限エンドヌクレアーゼを用いた断片化の少なくとも１つを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記少なくとも１つの伸長した核酸分子の増幅が、ポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リガーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡｓｅの少なくとも１つを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記少なくとも１つの伸長した核酸分子の増幅が、増幅法、ＰＣＲ法、等温増幅法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの方法の使用を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
前記提供される核酸分子のメチル化が、増幅法、ＰＣＲ法、等温増幅法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、メチル化特異的増幅法、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）法、ネステッドＭＳＰ法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法、検出法、メチル化特異的検出法、バイサルファイトシークエンス法、ＤＮＡ‐アレイを用いた検出、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いた検出、ＣｐＧ島マイクロアレイを用いた検出、制限酵素を用いた検出、同時メチル化特異的増幅および検出法、ＣＯＢＲＡ法、リアルタイムＰＣＲ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTMリアルタイムＰＣＲ法、ＭＳＰ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM  ＡｌｇｏTM法、ＱＭ法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、ＭＳＰ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、メチル化感受性プライマー伸長、およびＭｓ‐ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）法、およびそれらの組み合わせから成る群から選択される少なくとも１つの方法による分析を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３８】
少なくとも１つのＤＮＡ分子を含むＤＮＡサンプルを提供することと、
前記提供される少なくとも１つのＤＮＡ分子の少なくとも１つの鎖を少なくとも１つの単一ヌクレオチドまたはＰＮＡ‐モノマーによって伸長することと、
前記伸長した少なくとも１つのＤＮＡ鎖を前記ＤＮＡ分子内のメチル化シトシンと前記ＤＮＡ分子内の非メチル化シトシンを区別する酵素または試薬で処理することと、
少なくとも１つの伸長した鎖を含む少なくとも１つの処理したＤＮＡ分子を増幅することと、
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３９】
前記提供される少なくとも１つのＤＮＡ分子の少なくとも１つの鎖の伸長が、末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび１つ以上のヌクレオチドを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記処理したＤＮＡ分子の増幅が、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーが少なくとも一部分において前記ＤＮＡ分子の伸長した部分にハイブリッド形成する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１つの二重鎖ＤＮＡ分子または少なくとも２つの単鎖ＤＮＡ分子を含むＤＮＡサンプルを提供することと、
前記提供されるＤＮＡを、前記ＤＮＡ内のメチル化シトシンと前記ＤＮＡ内の非メチル化シトシンを区別する酵素または試薬で処理し、処理した単鎖ＤＮＡ分子は分けられることと、
前記処理した単鎖ＤＮＡ分子の少なくとも１つを少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ‐オリゴマーあるいは少なくとも１つのさらなる処理した単鎖ＤＮＡ分子によって伸長することと、
処理および伸長の後、少なくとも１つの単鎖ＤＮＡ分子を増幅することと、
を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項４２】
前記少なくとも１つの処理した単鎖ＤＮＡ分子の伸長が、単鎖ＤＮＡリガーゼを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＤＮＡ分子の増幅が、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーが少なくとも一部分において処理した単鎖ＤＮＡ分子の伸長した部分にハイブリッド形成することを特徴とする、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記処理した単鎖ＤＮＡ分子が伸長ステップの間に分子内で連結し、前記増幅が、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーが環状の処理した単鎖ＤＮＡ分子の任意の部位でハイブリッド形成する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
前記遠隔サンプルのＤＮＡにおける少なくとも１つのシトシンであって、それぞれが限定された位置にあるシトシンのメチル化状態を決定することと、
前記遠隔サンプルのＤＮＡにおけるメチル化パターンを決定することのうち、少なくとも１つを含む、前記遠隔サンプルのＤＮＡにおける少なくとも１つのシトシンのメチル化状態、メチル化パターン、またはその両方を決定するための、請求項１に記載の方法。
【請求項４６】
メチル化状態、メチル化パターン、またはその両方の決定が、増幅法、ＰＣＲ法、等温増幅法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、メチル化特異的増幅法、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）法、ネステッドＭＳＰ法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法、検出法、メチル化特異的検出法、バイサルファイトシークエンス法、ＤＮＡ‐アレイを用いた検出、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いた検出、ＣｐＧ島マイクロアレイを用いた検出、制限酵素を用いた検出、同時メチル化特異的増幅および検出法、ＣＯＢＲＡ法、リアルタイムＰＣＲ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  リアルタイムＰＣＲ法、ＭＳＰ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM  ＡｌｇｏTM法、ＱＭ法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、ＭＳＰ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、メチル化感受性プライマー伸長、およびＭｓ‐ＳＮｕＰＥ（メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長）法から成る群から選択される少なくとも１つの方法の使用を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＣｐＧの位置が１つのＤＮＡ断片内に含まれ、シスに集中し、メチル化パターンが状態Ａによって特徴付けられる細胞、細胞集団、組織、または個体由来のＤＮＡと状態Ｂによって特徴付けられる細胞、細胞集団、組織、または個体由来のＤＮＡで異なる、少なくとも２つの前記ＣｐＧの位置のメチル化状態を含む少なくとも１つのメチル化パターンの同定と、
カットオフ値と同等またはそれ以上のパーセント値が状態Ａを示し、カットオフ値未満のパーセント値が状態Ｂを示す、またはカットオフ値未満のパーセント値が状態Ａを示し、カットオフ値と同等またはそれ以上のパーセント値が状態Ｂを示す、ＤＮＡ断片の混合物内で同定したメチル化パターンによって特徴付けられるＤＮＡ断片のパーセントに対するカットオフ値を選択することとをさらに含む、マーカーを同定するための請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
前記マーカーの同定が、
約２０％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の感受性と、
約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の特異性のうち、少なくとも１つによって可能となる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
結腸癌マーカーが、
少なくとも約２５％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の感受性と、
少なくとも約６５％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の特異性のうち、少なくとも１つによって同定される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記カットオフ値が、
約１５％、約２５％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％以上の感受性と、
約２０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の特異性の基準の少なくとも１つによって選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
状態を診断する、状態の予後を提供する、状態の治療反応を予測する、状態の素因を決定する、状態の素因を予測する、状態の進行を決定する、状態の進行を予測する、状態を等級分けする、状態を病期分類する、状態の区分、状態の特性化、またはそれらの組み合わせのうち、少なくとも１つのための、請求項４７に記載の方法であって、状態とは健全な状態または有害事象であって、前述の１つは、ＤＮＡ断片の混合物内で事前に同定したメチル化パターンによって特徴付けられたＤＮＡ断片に対するパーセント値から推定され、ＣｐＧの位置の対応するメチル化状態は、本明細書に記載される実施例によって測定され、
パーセント値が選択されるカットオフ値と同等またはそれ以上の場合の状態Ａに対し前述の１つを推定することと、
パーセント値が選択されるカットオフ値未満の場合の状態Ｂに対し前述の１つを推定することと、
パーセント値が選択されるカットオフ値より大きいの場合の状態Ｂに対し前述の１つを推定することと、
パーセント値が選択されるカットオフ値と同等またはそれ以下の場合の状態Ａに対し前述の１つを推定することのうち、少なくとも１つをさらに含む、方法。
【請求項５２】
状態Ａ、状態Ｂ、またはその両方が、健全な状態または少なくとも１つの有害事象であって、前記有害事象は、望ましくない薬物間相互作用、癌、増殖性疾患またはそれに伴う関連疾患、ＣＮＳ機能不良、損傷または疾患、攻撃性の症状または行動障害、脳障害の臨床的、心理的および社会的因果関係、精神障害および人格障害、認知症および／または関連症候群、消化管機能不全の循環器疾患、呼吸器系の機能不良、損傷または疾患、病変、炎症、感染、免疫および／または回復、発育過程異常としての体の機能不良、損傷または疾患、皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能不良、損傷または疾患、内分泌および代謝の機能不良、損傷または疾患、および頭痛または性的機能不良から成る群から選択される少なくとも１つのカテゴリーを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５３】
容器と、
尿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
血漿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
ＤＮＡ単離のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
ＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
バイサルファイト変換したＤＮＡの増幅のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
メチル化状態またはメチル化パターン決定のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
前請求項の１つに記載される方法を実行するための説明のうち、少なくとも１つを含む、請求項１、請求項２８、またはその両方の方法を実行するためのキット。
【請求項５４】
容器と、
尿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
血漿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
ＤＮＡ単離のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
ＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
メチル化状態またはメチル化パターン決定のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
前請求項の１つに記載される方法をを実行するための説明と、
を含む、請求項５３の方法を実行するためのキット。
【請求項５５】
バイサルファイト変換したＤＮＡの増幅のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
容器と、
バイサルファイト変換したＤＮＡの増幅のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
を含む、キット。
【請求項５７】
バイサルファイト変換したＤＮＡの増幅のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせが、
リガーゼ活性、末端トランスフェラーゼ活性、またはその両方と、
ポリメラーゼ活性と、
少なくとも１つのプライマーと、
少なくとも１つのヌクレオチド、少なくとも１つのオリゴマー、またはその両方と、
を含む、請求項５３または５６に記載のキット。
【請求項５８】
前記リガーゼ活性が、単鎖ＤＮＡリガーゼであり、
前記末端トランスフェラーゼ活性が、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼであり、
前記ポリメラーゼ活性が、ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ転写酵素、追加酵素としてのＲＮＡｓｅと結合してのＲＮＡ転写酵素、またはリガーゼであり、
前記１つまたは複数のプライマーが、ランダムなプライマー、グアニン欠乏のランダムなプライマー、特異的プライマー、遺伝子特異的プライマー、または伸長特異的プライマーであり、
前記オリゴマーが、オリゴヌクレオチドまたは少なくとも１つのＰＮＡ‐モノマーおよび５’または３’末端ヌクレオチドのキメラオリゴマーであり、
それらの組み合わせである、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
前請求項の１つに記載されるバイサルファイト処理したＤＮＡの増幅を実行するための説明またはマニュアルをさらに含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項６０】
ＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項５６に記載のキット。
【請求項６１】
ＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせが、
バイサルファイト試薬と、
ラジカルスカベンジャーと、
を含む、請求項５３または６０に記載のキット。
【請求項６２】
血漿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせが、
ＥＤＴＡを含む容器と、
陰圧を含む容器と、
シリンジと、
遠心分離に適する１つ以上の容器と、
１つ以上のピペットと、
血漿含有サンプルを冷却、凍結、保管、移動、またはそれらの組み合わせに適する１つ以上の容器と、
症例報告書と、
過程チェックリストのうち、少なくとも１つを含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項６３】
尿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせが、
尿収集カップと、
ピペットと、
尿含有サンプルを冷却、凍結、保管、移動、またはそれらの組み合わせに適するＥＤＴＡを含む１つ以上の容器と、
症例報告書と、
過程チェックリストのうち、少なくとも１つを含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項６４】
遠隔サンプルまたは遠隔サンプルの少なくとも１つの成分を濃縮するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
バイサルファイト処理したＤＮＡを精製するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせのうち、少なくとも１つをさらに含む、請求項５３に記載のキット。
【請求項６５】
少なくとも１つのＤＮＡのメチル化状態、少なくとも１つのＤＮＡのメチル化レベル、または少なくとも１つのＤＮＡメチル化パターンの分析のための前請求項の１つに記載される方法またはキットの使用。
【請求項６６】
ａ）病変した細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡ断片の混合物内にある限定されたメチル化パターンによって特徴付けられるＤＮＡ断片の割合を検出することと、
ｂ）健康な細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡ断片の混合物内にある限定されたメチル化パターンによって特徴付けられるＤＮＡ断片の割合を検出することと、
ｃ）前記病変した細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡの割合と前記健康な細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡの差異に基づいて指標特異的対象を明確にすることと、
を含む、指標特異的対象を同定するための請求項６５に記載の方法またはキットの使用。
【請求項６７】
前記指標特異的対象が、ＤＮＡ切片、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチドまたは代謝化合物である、請求項６６に記載の方法またはキットの使用。
【請求項６８】
前記ＤＮＡ切片、前記ＲＮＡ分子、前記タンパク質、前記ペプチドまたは前記代謝化合物のそれ自体が周知であるモジュレータが、病変した細胞、細胞集団または組織の特異的な適応に割り当てられる、請求項６７に記載の方法またはキットの使用。
【請求項６９】
特異的な適応、または特異的な癌の適応の場合、医薬用組成物を調製するための請求項６８によって割り当てられる前記モジュレータの使用。
【請求項７０】
患者または個体に関して、状態を診断する、状態を予知する、治療反応を予測する、状態の素因を診断する、状態の進行を診断する、状態を等級分けする、状態を病期分類する、状態の区分、状態の特性化、またはそれらの組み合わせのうち、少なくとも１つのための請求項６５に記載される方法またはキットの使用であり、状態が健全な状態または有害事象であって、有害事象が、望ましくない薬物間相互作用、癌、増殖性疾患またはそれに伴う関連疾患、ＣＮＳ機能不良、損傷または疾患、攻撃性の症状または行動障害、脳障害の臨床的、心理的および社会的因果関係、精神障害および人格障害、認知症および／または関連症候群、消化管機能不全の循環器疾患、呼吸器系の機能不良、損傷または疾患、病変、炎症、感染、免疫および／または回復、発育過程異常としての体の機能不良、損傷または疾患、皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能不良、損傷または疾患、内分泌および代謝の機能不良、損傷または疾患、および頭痛または性的機能不良を含む群から選択される少なくとも１つのカテゴリーを含む、使用。
【請求項７１】
状態Ａと状態Ｂが異なる細胞状態である、細胞または組織を区別し、細胞分化を研究するための請求行６５に記載の方法またはキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、遠隔サンプル由来のＤＮＡ断片を提供する、概して新規であり且つ実質的に改善された組成物および方法、およびそれらの分析法に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年４月１５日出願の６０／６７２，２４２号、２００５年５月２日出願の６０／６７６，９９７号、２００５年７月８日の６０／６９７，５２１号、２００５年１０月４日出願の６０／７２３，６０２号、２００６年３月８日出願の６０／７８０，２４８号の米国暫定特許出願に対する優先権の利益を請求し、すべて参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
【０００３】
配列表
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯＳ：１‐１５を含む書面における配列表は、本出願の一部として本明細書に含まれ、かつ添付される。
【０００４】
本発明の態様の背景
医療検査の開発  疾患（癌など）治癒の可能性は、多くの場合、疾患の一刻も早い検出に大きく依存する。また、頻繁に、疾患の素因を見つけることや、例えば疾患が既に進んでいる場合、疾患に対する最も期待できる治療を推定することが有利となる。このような一刻も早い検出、予測または推定によって、直接および関連の治療コストが削減される。また、患者の生活の質の向上も保証される。
このことは、疑わしい疾患を有する個人からの多くのサンプルの検査を行わなければならず、大多数はその疾患にかかっていないかもしれないという状況を引き起こす。あるいは、診断された疾患にかかっている患者の場合で多くのサンプルの検査を行う必要があり、また所定の治療効果が見られる割合はごく少ない。
一般に、検査はできるだけ高い感受性、特異性、精度を有していることが望ましい。感受性は、検査される個人の対象疾患を正確に検出する検査の性能の尺度である。感受性の低い検査では、偽陰性を示す割合が高くなる。すなわち疾患を有する個人がその特定の疾患を有さないと間違って認識される。偽陰性の潜在的な危険性は、ある一定の期間、罹患している個人が診断されず治療されないままとなることであり、その間病気が後期へと進行し、ある場合は治療が効果的とならない可能性がある。数学的には、感受性＝ＴＰ／（ＴＰ＋ＦＮ）と示される。ここでＴＰは真陽性の結果を表し、ＦＮは偽陰性の結果を表す。真陽性の結果とは、検査は陽性であり病気が存在するということを意味し、偽陰性の結果とは、検査は陰性であり病気は存在しないということを意味する。
感受性が低い検査の例として、ＨＩＶに対するタンパク質ベースの血液検査がある。この種の検査は、疾患が確定し相当な量のウイルスが血流に侵入するまで、ウイルスの存在を検出できないため感受性が低い。対照的に、感受性が高い検査の例として、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用するウイルス量検出がある。この種の検査は非常に少量のウイルスも検出できるため、高い感受性を得ることができる。高い感受性は、診断されなかった際の影響が大きい場合、特に重要である。
一方、特異性は、病状のない患者を正確に認識する検査性能の尺度である。特異性の低い検査では、偽陽性を示す割合が高くなる。すなわち個人がその疾患を有していると間違って認識される。偽陽性の欠点は、付帯リスク、感情的および金銭的ストレスを伴う、患者の健康に悪影響を及ぼす可能性のある不必要な医療処置または治療を患者に対して強いることである。高い特異性を有する診断学的検査の開発を難しくする疾患の特徴は、特に癌の病気の機序には頻繁に複数の遺伝子およびタンパク質が関与するということである。さらに、ある種のタンパク質は病状と関連性のない理由で増加することがある。数学的に特異性は特異性＝ＴＮ／（ＦＰ＋ＴＮ）と表示される。ここで、ＴＮは真陰性の結果を表し、ＦＰは偽陽性の結果を表す。真陰性の結果とは、検査は陰性であり病気が存在しないことである。偽陽性の結果とは、検査は陽性であり病気は存在しないということを意味する。
特異性が高い検査の例として、ｐ５３突然変異の検出が可能な遺伝子ベースの検査がある。特異性は、更なる診断処置または医療介入に関連するコストやリスクが非常に高い場合に重要である。
精度は、一方では、検査されている個人の対象疾患を正確に検出する検査性能の尺度であり、他方では、病状のない患者を正確に認識する性能の尺度である。したがって、精度は検査の感受性および特異性を同時に表すものである。数学的には、精度＝（ＴＰ＋ＴＮ）／Ｎと表され、ＴＰは真陽性の結果、ＴＮは真陰性の結果、Ｎは検査された患者数を表す。
一般に、自明の理由から、最適な検査は（もちろん好ましくはすべてであるが）以下の基準の少なくとも１つによってさらに特徴付けられる。つまり（ｉ）高度な標準化、（ii）自動化への大きな可能性、（iii）サンプルの相互汚染の防止、（iv）低処理労力、（ｖ）低コスト、（vi）処理の容易性、（vii）高再現性、（viii）高信頼性である。
もちろん、上記項目のすべては検査自体のみに適用されるわけではない。サンプルの収集から実際の検査開始までの作業の流れにも適用される。すなわち、適切な作業の流れは、上記項目を備えた検査を可能にするはずである。
【０００５】
検査の出発物質  コスト削減および患者の生活の質の向上のためには、非侵襲的に実施可能な検査は有利である。これが不可能な場合、患者にできるだけ影響を与えずに簡単に行える低コストまたはそれらの組み合わせが可能な侵襲的手段で実施されることが望ましい。そのため、例えば、血液、痰、排せつ物または体液などの遠隔サンプル（remote sample）は検査のための最適な出発物質である。
しかしながら、遠隔サンプルの使用は、ＤＮＡの量の少なさ、特に病変した細胞または組織に起因するＤＮＡの量の少なさによってかなり限定される。したがって、サンプルの収集から実際の検査開始までの作業の流れは、高収量のＤＮＡが必要ということが特徴とならざるを得ない。
ほとんどの場合、該当するＤＮＡはサンプルにおいてかなり希釈される。通常、１％未満しか問題の根底にかかわる検査に関連しない。これは、検査前のＤＮＡの収集、提供、および処理という作業の流れが高収量のＤＮＡを要するという特徴があること強調するものである。
遠隔サンプルの使用に対する更なる困難は、サンプルが大量の細胞およびそれに伴うＤＮＡによって汚染されることがあるということである。汚染は、検査が基づく問題と完全に無関係である。例えば、上記の汚染物とは、糞便サンプル中の大腸菌などのバクテリアまたは血漿や血清サンプル中の赤血球である。これらの汚染物は、該当するＤＮＡの検出を妨害する、または大量に存在する場合、特に重大である。先の例では、該当するＤＮＡの割合が非常に少ないため、それ以上検出ができない。そのため、検査前のＤＮＡの収集、提供、および処理という作業の流れは、上記の汚染物を効率的に除去することを確実にしなければならない。
また、該当するＤＮＡは、遠隔サンプルにおいて部分的に分解していることがある。これは、遠隔サンプルの種類および遠隔サンプルの収集および取扱法にもよる。遠隔サンプル中のＤＮＡの断片化は１００ｂｐ以下の断片サイズまで減少させることが可能である。したがって、サンプルの収集から検査開始までの作業の流れにおいて、大きなＤＮＡ断片と同様に小さなＤＮＡ断片も提供され、ＤＮＡがそれ以上断片化されないことを確実にしなければならない。
これらの問題を扱う文献は多数存在する。本明細書において、例示的にＤｉｅｈｌ  Ｆら（２００５）ＰＮＡｓ、１０２（４５）、１６３６８‐１６３７３およびＬｉ  Ｊら（２００６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、８（１）、２２‐３０が挙げられる。
【０００６】
メチル化分析  近年明らかになったように、疾患、疾患の素因を検出する、または特定の病気治療法に対して予想される反応を推定する最も有力で期待される方法の１つとして、患者のゲノムＤＮＡのメチル化分析がある。
多くの疾患、特に癌は、組み換え遺伝子発現を伴う。これは、遺伝子そのものの突然変異である場合があり、組み替えタンパク質の発現またはタンパク質や酵素の抑制または過剰発現を引き起こす。しかしながら、発現の調節は、エピジェネティックな修飾、特にＤＮＡメチル化パターンの変更によっても起こる場合がある。当該のエピジェネティックな修飾は、実際のＤＮＡコード配列に影響を与えない。ＤＮＡメチル化処理には健康に大きな影響があることが判明し、メチル代謝のメチル化処理および修飾およびＤＮＡメチル化に関する知識が、疾患の理解、疾患の予防、診断および治療に対して不可欠であるということが明らかであると思われる。
哺乳類の全ゲノムのほんの一部を示す遺伝子の精密な管理は、ゲノムにおけるＤＮＡの主体はコード化していないという事実を考慮して規制を含む。イントロン、反復成分および潜在的、能動的転移因子を含む当該の「トランク」ＤＮＡの存在は、それらの耐久性のある抑制（サイレンシング）に対する有効な機構を必要とする。明らかに、５メチルシトシンを形成するＳ‐アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）依存ＤＮＡメチルトランスフェラーゼによるシトシンのメチル化は、ＤＮＡ‐タンパク質相互作用の修飾に対する当該の機序を示す。遺伝子は、たとえ隣の転写または非転写領域が広範囲でメチル化されていても、メチル化のないプロモーターによって転写可能である。これは、機能遺伝子のプロモーターの使用および規制を可能にするが、転移因子を含むトランクＤＮＡは抑制される。メチル化は架橋された遺伝子の長期抑制のためにも起こり、転写ユニットにおけるメチル化が起こる場所によって、転写の程度の減少または増加のどちらかを引き起こす場合がある。
哺乳類における完全に自然のＤＮＡメチル化は、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼにコントロールされるシトシン‐グアノシン（ＣｐＧ）ジヌクレオチド回文配列にほぼ限定される。ＣｐＧジヌクレオチドは、全ジヌクレオチドの約１〜２％であり、ＣｐＧ島へ繋がる。当業者に認識される定義によると、領域は、２００ｂｐを超えるＣ＋Ｇ含量が少なくとも５０％で、期待されたＣＧジヌクレオチドと比較して実際に観察されたＣＧジヌクレオチドの割合が０．６より大きい場合、ＣｐＧ島とみなされる（Ｇａｒｄｉｎｅｒ‐Ｇａｒｄｅｎ  Ｍ、Ｆｒｏｍｍｅｒ  Ｍ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６、２６１‐２８２）。通常、ＣｐＧ島には、１００ｂｐの長さの配列に少なくとも４つのジヌクレオチドがある。
プロモーター領域に位置するＣｐＧ島は、対応する遺伝子の発現に対する規制機能を頻繁に有する。例えば、ＣｐＧ島が低メチル化の場合、遺伝子は発現可能である。一方、高メチル化は、発現の抑制を頻繁に引き起こす。通常、癌抑制遺伝子は低メチル化である。しかし、それらが高メチル化になると、それらの発現は抑制される。これは、癌組織において多く見られる。それに反して、癌遺伝子は健康な組織において高メチル化であるが、癌組織においては多くの場合、低メチル化である。
シトシンのメチル化には、タンパク質の結合が通常禁止されるという効果があり、遺伝子の転写を規制する。これは、遺伝子の発現に変化をもたらす。癌に関して、細胞分裂を規制する遺伝子の発現はそれによって変化し、例えば、アポトーシス遺伝子の発現は下方制御されるが、癌遺伝子の発現は上方制御される。また、高メチル化は、規制に長期影響を与える。ヒストンからアセチル基を取り除くタンパク質は、シトシンがメチル化される時、ドメインをＤＮＡに結合させるそれらの５メチルシトシンによって結合することができる。これは、ヒストンを脱アセチル化し、それ自体がＤＮＡのパッケージをより厳重にする。そのため、調節タンパク質はＤＮＡへの結合から除外されない。
その結果、ＤＮＡメチル化パターンの効率的な検出は、疾患を理解するための新規な方法の開発、疾患の予防、診断および治療、および疾患に関連する対象をスクリーニングするための重要な手段である。しかし一方では、ＤＮＡメチル化を効率的に検出する方法は、ゲノムＤＮＡという出発物質に関して高い品質標準を要する。好ましくは、標準は以下のものである。
【０００７】
Ｉ）限定された状態に特異的なメチル化パターンによって特徴付けられるＤＮＡの十分な量は、使用されたＤＮＡサンプルにおいて構成される。このＤＮＡの十分な量は、メチル化パターン自体だけではなく、メチル化パターンを検出する方法にもよる。通常の値は、約２０ｐｇ〜約１０ｎｇの範囲にある。しかし、患者から得られたサンプル中のこのＤＮＡの実際の量は少なくとも４〜８倍の因数であり、かなり多いと考えられなければならない。この理由として、サンプル提供よびサンプル処理の間のＤＮＡの損失、例えばＤＮＡ単離がある。
II）使用されたＤＮＡサンプルは、望ましいメチル化パターンを検出するための選ばれた方法を妨害するかもしれないＤＮＡがあってはならない。
III）使用されたＤＮＡサンプルは、好ましくは、根本的な問題とは無関係であるＤＮＡの大量の汚染も含んではならない。これは、例えば、糞便サンプル中の大腸菌のＤＮＡまたは血漿または血清サンプル中の赤血球のＤＮＡである。
IV）使用されたＤＮＡは、好ましくは、ヌクレオチドまたはＤＮＡ骨格の一部ではない塩基だけでなく、付随または連結タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ＲＮＡを有するべきではない。これらは、メチル化の検出を立体的に妨害する。
【０００８】
技術的に顕著な必要性  現在、出願者は任意の関連する先行技術の方法を意識していない。したがって、関連するということは、上記で特定されるように、遠隔サンプルからＤＮＡを提供する、メチル化分析に適するＤＮＡを提供する、および一般的医療検査の基準を満たすことを意味する。
以下の文献は最も近い先行技術とみなされる。Ｕｔｔｉｎｇ  Ｍら（２００２）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、８、３５‐４０。この研究は、尿または血液の浮遊性ＤＮＡを使用するマイクロサテライトマーカー分析が膀胱癌の診断およびスクリーニングに関連することがあることを示す。サンプルからのＤＮＡの提供だけではなくサンプル提供も、標準手順にしたがって実行される。
Ｗｏｎｇ  Ｉ．Ｈ．Ｎ．ら（２００３）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、９、０４７‐１０５２は、ＲＴＱ‐ＭＳＰと呼ばれる新規な方法を記述し、それはＭＳＰ（メチル化感受性ＰＣＲ）とリアルタイムＰＣＲの組み合わせである。著者らは、診断した肝細胞癌患者の血漿、血清および血液細胞における特定の癌由来のＤＮＡ配列の検出は可能であることを証明する。
米国６，９２７，０２８号には、メチル化特異的ＰＣＲを用いた生体サンプルにおける異なる個体の細胞から由来するＤＮＡ種を区別する方法が記載される。サンプルからのＤＮＡの提供だけではなくサンプル提供も、標準手順にしたがって実行される。
Ｌｅｃｏｍｔｅ  Ｔ．ら（２００２）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、１００、５４２‐５４８は、ＫＲＡＳ２突然変異、ｐ１６遺伝子プロモーターメチル化、またはその両方の存在を調べるために、結腸直腸癌患者の血漿由来の自由型循環ＤＮＡを検査した。著者らは、血液中に自由型循環の癌関連ＤＮＡが検出されない患者と比較して、血液中の自由型循環の癌関連ＤＮＡを有する患者は、２年無再発生存の可能性が低いことを提案する。
【０００９】
本発明の態様の要約
本発明の態様は、遠隔サンプルからＤＮＡ断片を提供する組成物および方法に関する。
特定の態様は、遠隔サンプル由来のＤＮＡ断片を提供する組成物および方法を提供し、その中からＤＮＡを含む遠隔サンプルが提供され、ＤＮＡは前記遠隔サンプルから単離し、前記単離したＤＮＡはメチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を可能にする方法で処理される。特定の態様は、遠隔サンプルを提供する組成物および方法を提供し、前記遠隔サンプルは、ＤＮＡのサブセットのみが関連し、ＤＮＡ濃度は約１００ｎｇ／ｍｌ未満であることを特徴とする。特定の態様は、ＤＮＡの損失を最小限にする組成物および方法を提供する。特定の態様は、遠隔サンプルからできるだけ多くのＤＮＡを単離する組成物および方法を提供する。好ましくは、これらの態様は細分ステップ、濃縮ステップ、またはそれらの組み合わせから成る。
さらに、特定の実施例は、遠隔サンプル由来のＤＮＡのメチル化分析の組成物および方法を提供する。特定の実施例は、マーカーの同定のための組成物および方法を提供する。特定の実施例は、マーカーの使用方法を提供する。
他の態様は、バイサルファイト（bisulfite）処理したＤＮＡの全ゲノム増幅の組成物および方法を提供する。
更なる態様は、本発明の方法を実行するためのキットおよび本発明の方法の実施例を提供する。
【００１０】
発明の態様の詳細な説明
さまざまな技術的目標を達成するため、本発明の態様は組成物および遠隔サンプル由来のＤＮＡ断片を提供する方法を教示する。上述の組成物および方法は、ＤＮＡを含む遠隔サンプルを提供し、ＤＮＡを遠隔サンプルから単離し、および単離されたＤＮＡを試薬または酵素で処理することを含み、これらはメチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を可能にする。
特定の態様は、遠隔サンプルを提供する膨大な数の既知の方法の中から、メチル化および非メチル化ＤＮＡの区別を可能にする、ＤＮＡ単離法および処理法を見つける方法を提供し、これらの方法は、原則として本発明の技術的目標を解決するために使用されることができる。特定の態様は、膨大な数の既知の方法の中から、メチル化分析、マーカーの同定および同定マーカーの使用を見つける方法をさらに提供し、これらの方法は、原則として本発明の技術的目標を解決するために使用されることができる。特定の態様は、実際に技術的な目的を満たす形で、これらの方法それぞれの適切な組み合わせおよび調整を提供する。
【００１１】
本発明の態様の利点
特定の態様において、例示的な発明の方法は以下のような利点を持つ。
‐高収量のＤＮＡが提供されることによって特徴付けられる。これは、遠隔サンプルが低レベルのＤＮＡ、特に低レベルの該当するＤＮＡしか含まないことを特徴とするにもかかわらず達成される。一方、多くの場合において、遠隔サンプルの量は限定されない。したがって、本発明によれば、好ましくは多量の遠隔サンプルがプロセスされる。とりわけ、膨大な数の可能なＤＮＡの単離方法の中から、大量の開始サンプルを使用することができるＤＮＡの単離方法が選択された。本発明によって、遠隔サンプルをサブサンプルに分割し、ＤＮＡ単離を並行して実施し、単離されたＤＮＡをプールし、そしてＤＮＡを更なるプロセスに適した体積に濃縮することによって、さらに大量のサンプルとすることができる。
提供される高収量のＤＮＡは、完全かつ信頼できる識別を可能とし、同時に膨大な識別法の中から更なるＤＮＡ断片化を最小限にする、メチル化と非メチル化シトシンを識別する方法の選択によってさらに確認される。
また、ＤＮＡの単離ステップおよびバイサルファイト処理ステップ後の高収量のＤＮＡは、本発明にしたがい、バイサルファイト処理したＤＮＡの全ゲノム増幅の任意のステップを適用することでさらに上昇させることができる。
本例示的な発明の方法は、汚染が最も回避されることにさらに特徴付けられる。これは、個体から採取されたサンプルのうち対象外の成分を効果的に除去するサンプル収集の実施例に基づく。例えば、血漿サンプルを提供するための血液からの赤血球の除去である。それにより、すべての赤血球を効果的に除去しつつ、しかし一方でそれらの破壊を最小限にすることは特に重要である。なぜなら、これは赤血球を除去する理由である、赤血球ＤＮＡの遊離を引き起こすからである。さらに、本発明によれば、ＤＮＡの単離方法は、サンプルの交差汚染の可能性を排除する、膨大な数の可能なＤＮＡの単離方法の中から選択される。総合すれば、本発明によって提供されたＤＮＡは、所望のメチル化パターンを検知する選ばれた方法を阻害する恐れのあるＤＮＡ汚染がない。
例示的な本発明の方法は、ＤＮＡ小断片に加えＤＮＡ長断片もまた提供されることをさらに特徴とする。第一に、これは本発明にしたがって、少なくとも１００ｂｐのＤＮＡ断片を膨大なＤＮＡの単離方法の中から高効率に単離するＤＮＡの単離方法を選択することによって可能となる。第二に、これは本発明にしたがって、ＤＮＡ濃縮、バイサルファイト処理、特にバイサルファイト処理したＤＮＡの精製および／または脱スルホン化、および全ゲノム増幅のための本発明の方法を、膨大なその他の可能な方法の中から選択することによって可能となる。
例示的な本発明の方法は、提供されるＤＮＡは、それらが出発遠隔サンプル中にあることから、ＤＮＡ小断片に加え、ＤＮＡ長断片もまた含むことをさらに特徴とする。この特別な利点は本発明に従い、ｉ）少なくとも１００ｂｐほどの小さいＤＮＡ小断片に加え、ＤＮＡ大断片もまた単離するＤＮＡの単離方法を、膨大な数の可能なＤＮＡの単離方法の中から選択することにより、ｉｉ）ＤＮＡ小断片に加え、ＤＮＡ大断片もまた保持する、バイサルファイト処理したＤＮＡのＤＮＡ濃縮および精製のための装置を膨大な数の可能な装置の中から選択することにより、および、ｉｉｉ）バイサルファイト処理したＤＮＡの全ゲノム増幅の任意のステップによって、バイサルファイト処理したＤＮＡ小断片に加え、大きいものもまた効果的に増幅することによって達成される。
例示的な本発明の方法は、提供されるＤＮＡは、付随またはリンクタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ＲＮＡ、ヌクレオチドまたは塩基、および干渉する化学試薬を含まないことをさらに特徴とする。本発明によれば、これは、ｉ）付随またはリンクタンパク質、ペプチド、アミノ酸、ＲＮＡ、ヌクレオチドまたは塩基の効率的な除去によって特徴付けられるＤＮＡの単離方法が、膨大な数の可能なＤＮＡの単離方法の中から選択されること、ｉｉ）膨大な数の可能な装置のうち、付随ヌクレオチドまたは塩基を効果的に除去する、バイサルファイト処理したＤＮＡのＤＮＡ濃縮および精製のための装置、および、ｉｉｉ）更なるＤＮＡ断片化を最小限にする、メチル化シトシンと非メチル化シトシンを識別する方法が、膨大な数の識別法の中から選択されること、に基づく。かかる成分の除去は、これがメチル化分析を立体的に妨げる恐れがあるために特に重要である。
総合すれば、上記で説明した利点により、例示的な本発明の方法は、遠隔サンプルをメチル化分析に使用することが可能である。特に、上述の使用は、信頼でき、再現性があることを特徴とする。これらは、医療検査のための二つの必要条件である。
しかし、もちろん、例示的な本発明の方法はまた、別の好ましい医療検査の基準によって特徴付けられる。本例示的な発明の方法によれば、多量のサンプルをプロセスすることができる。例えば、例示的な発明の方法は、プレートスケールにて行うことが可能である。さらに、異なるステップを自動化し、標準化することができ、したがってロボット工学もまた使用することができる。この異なるステップは、低処理労力によってさらに特徴付けられる。プレートスケールによる実行、自動化および標準化の方法の適合性、および低処理労力は、またコストの削減にもつながる。また、すでに低費用で入手できる装置およびソリューションを使用することにより、コストはさらに削減される。本発明の方法のその他の利点は、その実行には標準的な実験装置のみが必要であるため、すべてのステップを簡単に実施することができることである。その単純さ、その自動化の適合性、その低処理労力、およびその簡単な取り扱いのため、本発明の方法はまた高い信頼性および再現性を持つ。
それゆえ、本例示的な発明の方法は、メチル化をベースとする医療検査において遠隔サンプルを使用可能にする。言い換えれば、これは実施が簡単で、低コストの、非侵襲的手段または患者になるべく影響を与えない侵襲的手段に基づく、メチル化をベースとする医療検査を可能にする。
例示的な本発明の方法はまた、メチル化をベースとしたマーカーの発見における遠隔サンプルを可能にする。特に、高い感受性、高い特異性、または両方によって特徴付けられるマーカーの同定を可能にする。
【００１２】
発明の態様の方法
本発明の方法は、遠隔サンプル由来のＤＮＡ断片を提供する方法である。本発明によれば、本方法は以下のステップを含む。ＤＮＡを含む遠隔サンプルの提供、遠隔サンプルからのＤＮＡの単離、および、メチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を可能にする試薬または酵素による、単離したＤＮＡの処理。これらのステップの実現において、ＤＮＡ断片は遠隔サンプルから提供される。
すなわち、特定の態様において、本発明の方法は、遠隔サンプル由来のＤＮＡ断片を提供する方法であって、
ＤＮＡを含む遠隔サンプルの提供と、
遠隔サンプルからのＤＮＡの単離と、
メチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を可能にする試薬または酵素による、単離したＤＮＡの処理と、を含む方法である。
【００１３】
特定の態様において、本発明の方法は、遠隔サンプルの収集および予備処理を含む方法である。この遠隔サンプルは、これにより、ゲノムＤＮＡを含むことを特徴とする。本発明の方法は、収集され予備処理された遠隔サンプルからのＤＮＡの抽出をさらに含む。本発明によれば、抽出されたＤＮＡは、特定の位置において、そのＤＮＡがメチル化されたものか否かを区別することを可能にする処理にしたがう。かかる処理はどのような種類の処理でもよい。好ましくは、その処理は酵素または試薬の使用を含むものである。ここで、酵素はどのような種類の酵素でもよいが、好ましくは、この酵素はタンパク質またはＲＮＡ分子である。上述の試薬もまた、どのような種類の試薬でもよく、例えば、化学試薬、医薬用試薬、生物学試薬または医療用試薬であるがこれに限定されない。
１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルのＤＮＡは、ＤＮＡのうち約５％未満、約３％未満、約１％未満、または約０．１％未満が限定された細胞、細胞集団、組織、または器官由来であることに特徴付けられる方法である。好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルのＤＮＡは、ＤＮＡのうち約１％未満が限定された細胞、細胞集団、組織、または器官由来であることに特徴付けられる方法である。
１つの実施例によれば、提供された遠隔サンプルは、同じ限定された細胞、細胞集団、組織または器官に由来する、約５％未満、約３％未満、約１％未満、または約０．１％未満のＤＮＡを含む。好ましくは、約１％未満のＤＮＡが、同じ限定された細胞、細胞集団、組織または器官由来である。ここで、上述のＤＮＡは、限定された対立遺伝子ゲノム遺伝子座において、同じメチル化パターンを持つことを特徴とする。
本発明の１つの実施例において、上述のＤＮＡの有無は、約９９％以上の信頼区間、約９５％以上の信頼区間、約９０％以上の信頼区間、約８０％以上の信頼区間、約７０％以上の信頼区間、約６０％以上の信頼区間で検知されることができる。特に好ましいのは約９５％以上の信頼区間である。
【００１４】
１つの実施例によれば、上述のＤＮＡの割合は、約９９％以上、約９５％以上、約９０％以上、約８０％以上、約７０％以上、または約６０％以上の信頼区間内において決定されることができる。好ましくは、約９５％以上の信頼区間が適用される。
１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルは１ｍｌ中に約１００ｎｇ未満のＤＮＡ、１ｍｌ中に約６０ｎｇ未満のＤＮＡ、または１ｍｌ中に約１０ｎｇ以下のＤＮＡを含むことに特徴付けられる方法である。好ましい１つの実施例において、この遠隔サンプルは、１ｍｌの遠隔サンプル中に約１０ｎｇ以下のＤＮＡを含む。
１つの実施例によれば、遠隔サンプルミリリットル中に約１，０００ｎｇ未満、約５００ｎｇ未満、約１００ｎｇ未満、約８０ｎｇ未満、約６０ｎｇ未満のＤＮＡ、約４０ｎｇ未満、約２０ｎｇ未満、１０ｎｇ未満、約１ｎｇ未満、または約０．１ｎｇ未満を含む遠隔サンプルが考慮される。好ましくは、遠隔サンプルのＤＮＡ濃縮は１０ｎｇ／ｍｌ未満である。
１つの実施例において、本発明の方法は、高収量のＤＮＡによって特徴付けられるＤＮＡの単離方法の選択、高精度および高信頼性、ピペット操作の高精度、ピペット操作器具の再使用、ＤＮＡと接触した器具の再使用によって特徴付けられる、非メチル化およびメチル化シトシンの区別の方法の選択を含む、少なくとも１つの群から選択されたものによってＤＮＡの損失が最小限になる方法である。
１つの実施例によれば、できるだけ多くの該当するＤＮＡがメチル化分析に提供されることは非常に重要である。この重要性は、遠隔サンプルのＤＮＡは、内在する問題に関連するＤＮＡを少量の割合のみしか含まないことに基づく。これはすでに上述されている。したがって、好ましくは、ＤＮＡの損失は次のうち少なくとも１つの条件によって最小限にされうる。ａ）適切なＤＮＡ抽出方法の選択、ｂ）ゲノム遺伝子座または対立遺伝子がメチル化か否かを区別する適切な方法の選択、ｃ）ピペット操作が高精度であることの保証、ｄ）ピペット操作器具の再使用、およびｅ）遠隔サンプルのＤＮＡと接触した器具の再使用。
適切なＤＮＡの抽出方法とは、高収量のＤＮＡを可能にし、確保する方法である。これは、標準化の可能性、自動化の可能性、高信頼性、高再現性を持ち、および、例えば、しかしこれに限定されないが、他の遠隔サンプルのＤＮＡの汚染の排除によってさらに特徴付けられる。もちろん、適切な方法はまた、上記に記載の医療検査、遠隔サンプルのプロセス、およびメチル化分析の基準をできるだけ満たさねばならない。したがって、１つの好ましい実施例において、ＤＮＡはＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ）の少なくとも１つの構成要素、または少なくともそれに関連する器具によって抽出される。
メチル化と非メチル化ゲノム遺伝子座または対立遺伝子を区別する適切な方法は、高信頼性および高精度を伴ってできるだけ高い割合の区別を可能にし、確実にすることを特徴とする。好ましくは、この区別は、メチル化されることのできるほとんどすべての場所で可能である。さらに、適切な方法は、ＤＮＡの断片化をもたらすべきでない。もちろん、適切な方法はまた、上記に記載の医療検査、遠隔サンプルのプロセス、およびメチル化分析の基準をできるだけ満たさねばならない。したがって、１つの好ましい実施例において、ＤＮＡはＷＯ０５／０３８０５１（本参照は全体として組み込まれる）に本質的に実施される記載のとおりにバイサルファイトによって処理される。
【００１５】
ピペット操作の高精度は、必要な量のＤＮＡだけが続くステップに移され、できるだけ多くの遠隔サンプルＤＮＡを利用することを可能にすることを特徴とする。また、これは、最適量のＤＮＡおよび他の試薬が使用されることをさらに確実にする。これは、最適な反応およびよって質の高いＤＮＡをもたらす。例えば、これに限定されないが、分解によるＤＮＡの損失は、よって最小化される。
このピペット操作器具の再使用もまた、有利である。当技術分野で周知のように、ＤＮＡは例えばピペットの先のようなプラスチックの表面に結合している。しかし、上述のＤＮＡにすでに一度接触した表面に結合するＤＮＡはそれより少ない。もちろん、例えば、これに限定されないが、マイクロタイタープレート、管、カラムなどのＤＮＡ容器にも同じことが言える。しかし、再利用もまた汚染の危険によって制限される。したがって、遠隔サンプルのＤＮＡと接触した器具のみが、同じ患者または一人の患者から採取されたサンプル由来のサンプルまたはＤＮＡに再利用される。別の好ましい実施例において、遠隔サンプルＤＮＡと接触した器具の使用は最小限とされる。
１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルの体積が少なくとも約１．５ｍｌ、約２ｍｌ、約３ｍｌ、約４ｍｌ、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、約９ｍｌ、約１０ｍｌ、約１１ｍｌ、約１２ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌ、または約５０ｍｌである方法である。好ましい１つの実施例において、遠隔サンプルの体積は、少なくとも約３６ｍｌ、約３８ｍｌ、約４０ｍｌ、約４２ｍｌ、または約４５ｍｌである。特に好ましい実施例において、遠隔サンプルの体積は、少なくとも約４０ｍｌである。別の好ましい実施例において、遠隔サンプルの体積は、少なくとも約１５ｍｌ、約１８ｍｌ、約２０ｍｌ、約２３ｍｌ、または約２５ｍｌである。特に好ましい実施例において、遠隔サンプルの体積は、少なくとも約２０ｍｌである。さらに好ましい実施例において、遠隔サンプルの体積は、少なくとも約少なくとも約４ｍｌ、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、または約９ｍｌである。特に好ましい実施例において、遠隔サンプルの体積は、少なくとも約６ｍｌまたは約８ｍｌである。
１つの実施例によれば、遠隔サンプルは個体から採取される。上述の遠隔サンプルは、少なくとも約１．５ｍｌ、約２ｍｌ、約３ｍｌ、約４ｍｌ、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、約９ｍｌ、約１０ｍｌ、約１１ｍｌ、約１２ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌ、または約５０ｍｌの体積を有する。好ましくは、体積は少なくとも約３６ｍｌ、約３８ｍｌ、約４０ｍｌ、約４２ｍｌ、または約４５ｍｌである。最も好ましくは、体積は少なくとも約４０ｍｌである。同じく好ましくは、体積は少なくとも約１５ｍｌ、約１８ｍｌ、約２０ｍｌ、約２３ｍｌ、または約２５ｍｌであり、また、最も好ましくは、体積は少なくとも約２０ｍｌである。同じく好ましくは、体積は少なくとも約４ｍｌ、約５ｍｌ、約６ｍｌ、約７ｍｌ、約８ｍｌ、または約９ｍｌである。最も好ましくは、体積は少なくとも約６ｍｌまたは約８ｍｌである。
【００１６】
１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルが少なくとも、血液サンプル、血漿サンプル、血清サンプル、体液サンプル、唾液サンプル、尿サンプル、精液サンプル、胸腔液サンプル、腹腔液サンプル、脳脊髄液サンプル、上皮表面の塗抹標本、喀痰試料、糞便サンプル、射精サンプル、涙液サンプル、汗サンプル、リンパ液サンプル、気管支洗浄液サンプル、胸水サンプル、髄膜液サンプル、腺液サンプル、微細針吸入液サンプル、乳頭吸引液サンプル、髄液サンプル、結膜液サンプル、膣液サンプル、十二指腸液サンプル、膵液サンプル、または胆汁サンプルを含む群から選択されたものである、方法である。
１つの実施例によれば、遠隔サンプルはどのような種類のサンプルでもよい。好ましくは、遠隔サンプルは、主に上述のサンプルの別の成分から離れて位置する、少なくとも１つの構成要素を含むことを特徴とするサンプルである。例えば、血液は、赤血球に関しては遠隔サンプルではないが、肺中に位置する腫瘍に由来するＤＮＡ断片に関しては遠隔サンプルである。好ましい１つの実施例によれば、遠隔サンプルは、血液サンプル、血漿、血清、体液、唾液、尿、精液、胸腔からの液、腹腔からの液、脳脊髄液、上皮表面からの塗布標本、痰、糞便、射精された精液、涙液、汗、リンパ液、気管支洗浄、胸水、髄膜液、腺液、微細針吸入液、乳頭吸引液、髄液、結膜液、膣液、十二指腸液、膵液液、または胆汁である。当業者はおそらく更なる遠隔サンプルを知っているであろう。もちろん、これらのサンプルもまた、本発明の方法にしたがって使用されることができる。
１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルが血漿であり、遠隔サンプルの提供が、
個体から少なくとも約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、約５０ｍｌの血液を得ることと、
穏やかに混合することを含め、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を追加する、
血液を、最終濃度約２．２μｍｏｌ／ｌ、約３．２μｍｏｌ／ｌ、約３．７μｍｏｌ／ｌ、約４．０μｍｏｌ／ｌ、約４．５μｍｏｌ／ｌ、約４．９μｍｏｌ／ｌ、約５．４μｍｏｌ／ｌ、約５．９μｍｏｌ／ｌ、または約６．９μｍｏｌ／ｌの穏やかに混合することを含む二カリウムＥＤＴＡ（二カリウムエチレンジアミン四酢酸）に調節することと、
血液‐ＥＤＴＡ混合物を、約７５０ｘｇ、約１０００ｘｇ、約１５００ｘｇ、または約２０００ｘｇにて、約４分、約８分、約１０分、約１２分、または約２０分、約１℃、約４℃、約７℃、約１０℃、約１５℃、約２１℃、または約２７℃にて遠心分離機で分離することと、
血漿を新しい容器に移すことと、
血漿を、約７５０ｘｇ、約１０００ｘｇ、約１５００ｘｇ、または約２０００ｘｇにて、約４分、約８分、約１０分、約１２分、または約２０分、約１℃、約４℃、約７℃、または約１０℃にて遠心分離機で分離することと
再度遠心分離機で分離した血漿を新しい容器に移す、
サンプルを含む血漿を、約０℃、約２℃、約４℃、約６℃、または約１０℃にて冷却することと、
サンプルを含む血漿を、少なくとも約−１０℃、約−２０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−８０℃、約−９０℃、または約−１９６℃にて凍結、保存または運搬することと、および、
個体から血液を得ることから開始し、対応する再び遠心分離機にかけて分離した血漿を凍結して終了する遠隔サンプルの提供を、約１、約２、約３、約４、約５、約６、または約８時間以内に実施することのうち、１つ以上を含む方法である。
【００１７】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルは血漿である。好ましい１つの実施例によれば、血漿の提供は、
個体から少なくとも約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、約５０ｍｌの血液を得ることと、
穏やかに混合することを含む、ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）を血液に加えることと、
血液を、ただちに少なくとも約２回、約４回、約６回、約８回、約１０回、約１２回、約１４回、または約１８回反転することにより、最終濃度約２．２μｍｏｌ／ｌ、約３．２μｍｏｌ／ｌ、約３．７μｍｏｌ／ｌ、約４．０μｍｏｌ／ｌ、約４．５μｍｏｌ／ｌ、約４．９μｍｏｌ／ｌ、約５．４μｍｏｌ／ｌ、約５．９μｍｏｌ／ｌ、または約６．９μｍｏｌ／ｌの穏やかに混合することを含む二カリウムＥＤＴＡ（二カリウムエチレンジアミン四酢酸）に調節することと、
血液‐ＥＤＴＡ混合物を、約７５０ｘｇ、約１０００ｘｇ、約１５００ｘｇ、または約２０００ｘｇにて、約４分、約８分、約１０分、約１２分、または約２０分、約１℃、約４℃、約７℃、約１０℃、約１５℃、約２１℃、または約２７℃にて、遠心分離機にかけて分離することと、
除いた上相を新しい容器に移し、その中で遠心分離機にかけた容器がまっすぐに保たれ、ピペットが傾けられて遠心分離機にかけた容器の末端および除いた上相の表面に接触し、少しの量の除いた上相を、その表面が次の層、軟膜層から約２０ｍｍ、約１０ｍｍ、約７ｍｍ、約５ｍｍ、または約４ｍｍ離れるまで移すことと、
血漿サンプルを、約７５０ｘｇ、約１０００ｘｇ、約１５００ｘｇ、または約２０００ｘｇにて、約４分、約８分、約１０分、約１２分、または約２０分、約１℃、約４℃、約７℃、または約１０℃にて、遠心分離機にかけて分離することと、
再び遠心分離機にかけて分離した血漿サンプルを新しい容器に移し、その中に約２０ｍｌ、約１２ｍｌ、約８ｍｌ、約５ｍｌ、または約４ｍｌ以上の、最も低い、再び遠心分離機にかけて分離した血漿サンプルが遠心分離容器に残ることと、
血液サンプル、血漿サンプルまたは中間サンプルを、約０℃、約２℃、約４℃、約６℃、または約１０℃で冷却することと、
血漿サンプルまたは中間サンプルを、少なくとも約−１０℃、約−２０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−８０℃、約−９０℃、または約−１９６℃で凍結、保存、または運搬することと、および、
個体から血液を得ることから開始し、対応する再び遠心分離機にかけて分離した血漿サンプルを凍結して終了する遠隔サンプルの提供を、約１、約２、約３、約４、約５、約６、または約８時間以内に実施することのうち、１つ以上のステップを含む。
【００１８】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルは血漿サンプルであり、遠隔サンプルの提供は、
個体から、少なくとも約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、または約５０ｍｌの血液を得ることと、
血液を最終濃度約３．７μｍｏｌ／ｌ、約４．０μｍｏｌ／ｌ、約４．５μｍｏｌ／ｌ、約４．９μｍｏｌ／ｌ、または約５．４μｍｏｌ／ｌの穏やかに混合することを含む二カリウムＥＤＴＡ（二カリウムエチレンジアミン四酢酸）に調節することと、
血液‐ＥＤＴＡ混合物を、約約１５００ｘｇにて約１０分、約４℃で遠心分離機にかけて分離し、好ましくは遠心分離機を停止するのにブレーキを使用しない。
血漿を新しい容器に移すことと、
血漿を約１５００ｘｇにて約１０分、約４℃で遠心分離機にかけて分離し、好ましくは遠心分離機を停止するのにブレーキを使用しないことと、
再び遠心分離機にかけて分離した血漿を新しい容器に移すことと、
サンプルを含む血漿を、約０℃、約２℃、または約４℃で冷却することと、
サンプルを含む血漿を、少なくとも約−７０℃、約−８０℃、または約−９０℃で冷却、保存、または運搬することと、および、
個体から血液を得ることから開始し、対応する再び遠心分離機にかけて分離した結晶を凍結して終了する遠隔サンプルの提供を、約４時間以内に実施することのうち、１つ以上を含む方法である。
【００１９】
好ましい１つの実施例によれば、遠隔サンプルは血漿サンプルであり、血漿サンプルの提供は、
個体から、少なくとも約３５ｍｌ、約４０ｍｌ、約４５ｍｌ、または約５０ｍｌの血液を得ることと、
血液を、最終濃度約３．７μｍｏｌ／ｌ、約４．０μｍｏｌ／ｌ、約４．５μｍｏｌ／ｌ、約４．９μｍｏｌ／ｌ、または約５．４μｍｏｌ／ｌの、ただちに約１０回反転することによる穏やかに混合することを含む、二カリウムＥＤＴＡ（二カリウムエチレンジアミン四酢酸）に調節することと、
血液‐ＥＤＴＡ混合物を、約約１５００ｘｇにて、約１０分、約４℃、遠心分離機にかけて分離し、好ましくは遠心分離機を停止するのにブレーキを使用しないことと、
除いた上相を新しい容器に移し、その中で遠心分離機にかけた容器がまっすぐに保たれ、ピペットが傾けられて遠心分離機にかけた容器の末端および除いた上相の表面に接触し、少しの量の除いた上相を、その表面が次の層、軟膜層から約５ｍｍ離れるまで移すことと、
血漿サンプルを、約１５００ｘｇにて、約１０分、約４℃で遠心分離機にかけて分離し、好ましくは遠心分離機を停止するのにブレーキを使用しないことと、
再び遠心分離機にかけて分離した血漿サンプルを新しい容器に移し、その中に約５ｍｌ以上の、最も低い、再び遠心分離機にかけて分離した血漿サンプルが遠心分離容器に残ることと、
血液サンプル、血漿サンプルまたは中間サンプルを、約０℃、約２℃、または約４℃で冷却することと、
血漿サンプルまたは中間サンプルを、少なくとも約−７０℃、約−８０℃、または約−９０℃で冷却、保存、または運搬することと、および、
個体から血液を得ることから開始し、対応する再び遠心分離機にかけて分離した血漿サンプルを凍結して終了する遠隔サンプルの提供を、約４時間以内に実施することのうち、１つ以上のステップを含む。
【００２０】
１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルは尿であり、遠隔サンプルの提供は、
前立腺の触診、前立腺マッサージ、またはその両方を、前立腺の中心から前立腺の左側、前立腺の右側、または両側へ約１０秒、約３０秒、約５０秒、約６０秒、約７５秒、または約１２０秒実施することと、
排せつされた尿の最初の約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌを採取することと、
ＥＤＴＡを尿に加えることと、
尿を、最終濃度約３ｍｍｏｌ／ｌ、約６ｍｍｏｌ／ｌ、約７ｍｍｏｌ／ｌ、約８ｍｍｏｌ／ｌ、約９ｍｍｏｌ／ｌ、約９．８０ｍｍｏｌ／ｌ、約１０ｍｍｏｌ／ｌ、約１１ｍｍｏｌ／ｌ、約１２ｍｍｏｌ／ｌ、約１３ｍｍｏｌ／ｌ、約１４ｍｍｏｌ／ｌ、約１８ｍｍｏｌ／ｌ、または約２５ｍｍｏｌ／ｌ、のＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）でｐＨ約５．０、約６．０、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約１０に調整することと、
尿含有サンプルを、約０℃、約２℃、約４℃、約６℃、または約１０℃で冷却することと、
尿含有サンプルを、少なくとも約−２０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−８０℃、約−９０℃、または約−１９６℃で冷却、保存、または運搬することと、および、
排せつされた尿の最初のミリリットルを採取することから、対応する尿‐ＥＤＴＡの混合物を凍結するまでの尿サンプルの提供を、約１５、約３０、約４５、約６０、約７５、約９０、または約１２０分以内に実施することのうち、１つ以上を含む方法である。
【００２１】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルは尿である。１つの実施例によれば、尿サンプルの提供は、
前立腺の触診、前立腺マッサージ、またはその両方を、前立腺の中心から前立腺の左側、前立腺の右側、または両側へ約１０秒、約３０秒、約５０秒、約６０秒、約７５秒、または約１２０秒実施することと、
前立腺の触診、前立腺マッサージ、または両方の直後に、排せつされた尿の最初の約５ｍｌ、約１０ｍｌ、約１５ｍｌ、約２０ｍｌ、約２５ｍｌ、約３０ｍｌ、約４０ｍｌを採取することと、
二カリウムＥＤＴＡを尿にただちに加えることと、
尿を最終濃度約３ｍｍｏｌ／ｌ、約６ｍｍｏｌ／ｌ、約７ｍｍｏｌ／ｌ、約８ｍｍｏｌ／ｌ、約９ｍｍｏｌ／ｌ、約９．８０ｍｍｏｌ／ｌ、約１０ｍｍｏｌ／ｌ、約１１ｍｍｏｌ／ｌ、約１２ｍｍｏｌ／ｌ、約１３ｍｍｏｌ／ｌ、約１４ｍｍｏｌ／ｌ、約１８ｍｍｏｌ／ｌ、または約２５ｍｍｏｌ／ｌの、採取後ただちに反転することによる穏やかに混合することを含むＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）で、ｐＨ約５．０、約６．０、約７．０、約７．５、約８．０、約８．５、約９．０、約１０に調整することと、
尿サンプルを、約０℃、約２℃、約４℃、約６℃、または約１０℃で冷却することと、
尿サンプルを、少なくとも約−２０℃、約−５０℃、約−６０℃、約−７０℃、約−８０℃、約−９０℃、または約−１９６℃で冷却、保存、または運搬することと、および、
排せつされた尿の最初のミリリットルを採取することから、対応する尿サンプルを凍結するまでの尿サンプルの提供を、約１５、約３０、約４５、約６０、約７５、約９０、または約１２０分以内に実施することのうち、少なくとも１つ以上のステップを含む。
【００２２】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルの提供が、
前立腺の触診、前立腺マッサージ、またはその両方を、前立腺の中心から前立腺の左側、前立腺の右側、または両側へ約６０秒実施することと、
排せつされた尿の最初の約２０ｍｌを採取することと、
尿を、最終濃度約９ｍｍｏｌ／ｌ、約９．８０ｍｍｏｌ／ｌ、約１０ｍｍｏｌ／ｌ、または約１１ｍｍｏｌ／ｌ、のＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）でｐＨ約７．５、約８．０、または約８．５に調整することと、
尿含有サンプルを、約０℃、約２℃、または約４℃で冷却することと、
尿含有サンプルを、少なくとも約−７０℃、約−８０℃、または約−９０℃で冷却、保存、または運搬することと、および、
尿サンプルの提供を、排せつされた尿の最初のミリリットルを採取し、対応する尿‐ＥＤＴＡの混合物を約６０分以内に凍結して実施することのうち、１つ以上を含む方法である。
【００２３】
好ましい１つの実施例によれば、遠隔サンプルは尿サンプルであり、尿サンプルの提供は、
前立腺の触診、前立腺マッサージ、またはその両方を、前立腺の中心から前立腺の左側、前立腺の右側、または両側へ約６０秒実施することと、
前立腺の触診、前立腺マッサージ、または両方の直後に、排せつされた尿の最初の約２０ｍｌを採取することと、
尿を最終濃度約９ｍｍｏｌ／ｌ、約９．８０ｍｍｏｌ／ｌ、約１０ｍｍｏｌ／ｌ、または約１１ｍｍｏｌ／ｌ、採取後ただちに反転することによる穏やかに混合することを含むＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）で、ｐＨ約７．５、約８．０、または約８．５に調整することと、
尿サンプルを、約０℃、約２℃、または約４℃で冷却することと、
尿サンプルを、少なくとも約−７０℃、約−８０℃、または約−９０℃で冷却、保存、または運搬することと、および、
排せつされた尿の最初のミリリットルを採取することから、対応する尿サンプルを凍結するまでの尿サンプルの提供を、約６０分以内に実施することのうち、少なくとも１つを含む。
【００２４】
１つの実施例において、遠隔サンプルの提供は、照合表、標準化されたプロトコル、または両方のプロセスを含む。
【００２５】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルの提供は、照合表、プロトコル、または両方の使用を含む。好ましい１つの実施例によれば、遠隔サンプルの提供に使用される照合表は、必要な、実施されねばならないもののみの、または両方の、アクションの段階的な記述を含む。これは、予防措置に関する注意書きをさらに含んでもよい。１つの実施例によれば、遠隔サンプルの提供に使用されるプロトコルは、ｉ）好ましくは数字と文字、または好ましくはバーコードのようなコンピュータ可読のコードである、少なくとも１つの遠隔サンプル同定番号の提供および使用、ｉｉ）サンプルに関する特性データの記録、ｉｉｉ）サンプルが採取された個体の特性盲検データの記録、ｉｖ）またはこれらの組み合わせを含む。
【００２６】
１つの実施例において本発明の方法は、遠隔サンプルの提供の後に、遠隔サンプルが異なるサブサンプルに分割される方法である。
【００２７】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルは異なるサブサンプルに分けられる。これは、患者から採取されたサンプルから高収量のＤＮＡを得るために特に行われる。１つの実施例によれば、一人の患者から採取された遠隔サンプルの体積は、更なるプロセスに適した体積よりも大きくなりうる。したがって、採取された遠隔サンプルは、サブサンプルにに分けられる。これらのサブサンプルは、次に、さらに遠隔サンプルとみなされる。好ましくは、これらの遠隔サンプルは、並行してプロセスされる。遠隔サンプルを分けることは、ＤＮＡの抽出ステップに関して特に行われる。
【００２８】
１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルまたは少なくとも遠隔サンプルの１つの成分が、遠隔サンプルの提供の後に濃縮される方法である。
【００２９】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルは濃縮されている。１つの実施例によれば、少なくとも遠隔サンプルの１つの成分は濃縮されている。好ましくは、この成分は、成分を含むＤＮＡである。遠隔サンプルまたは少なくともその１つの成分の濃縮は、患者から採取したサンプルから高収量のＤＮＡを得るために特に行われる。１つの実施例によれば、一人の患者から採取された遠隔サンプルの体積は、更なるプロセスに適した体積より大きくなりうる。したがって、採取された遠隔サンプル、または遠隔サンプルのうち少なくとも１つの構成要素が濃縮される。好ましい１つの実施例において、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔまたはそのうち少なくとも１つの構成要素は、ｉ）遠隔サンプルの提供、ｉｉ）ＤＮＡの単離、ｉｉｉ）メチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を可能にする、ＤＮＡの試薬または酵素による処理ｉｖ）またはこれらの組み合わせのために使用される。
【００３０】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、濃縮が限外ろ過、体積減少、またはその両方を含む方法である。好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、濃縮がタンパク消化を含む方法である。上述の好ましい実施例は、ＤＮＡ単離とは無関係に、またはそのサブステップとして行われる。
【００３１】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルまたは遠隔サンプルのうち少なくとも１つの構成要素の濃縮は、限外ろ過、体積減少、またはその両方を含む。好ましくは、濃縮はタンパク質の消化を含む。上述の実施例は、遠隔サンプルの提供の一部、またはそれらはＤＮＡの単離の一部のいずれかである。好ましい１つの実施例によれば、遠隔サンプルまたはその少なくとも１つの構成要素の濃縮は、プロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、カルボキシプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、プロテイナーゼＫ、限外ろ過装置、例えばＹ−３０  Ｍｉｃｒｏｃｏｎカラムを含むがこれに限定されないＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置、ろ過装置、シリカ表面、シリカ膜、磁気粒子、ポリスチロール粒子、ポリスチロール表面、正電荷を持つ表面、正電荷を持つ膜、荷電膜、荷電表面、荷電交換膜、荷電交換面、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５  Ｋｉｔのカラム、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのカラム、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔのカラム、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅの一構成要素、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔの一構成要素、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔの一構成要素、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、またはＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、エタノール沈殿、プロパノール沈殿、またはとりわけ遠心分離を用いた減圧濃縮を含む群から選択される少なくとも１つを含む。当業者であれば、上記の明細および名前の挙がったキットを考慮するにあたり、別の適切な装置またはキットを選択することを知っている。上述の装置またはキットは当技術分野で周知であるが、現在の製造業者一覧は以下を参照されたい。
【００３２】
１つの実施例において、本発明の方法は、ＤＮＡの単離が、
遠隔サンプルをプロテアーゼで処理することと、
遠隔サンプルを少なくとも１つのタンパク質変性試薬または溶液で処理することと、
遠隔サンプルのＤＮＡをＤＮＡ精製装置に接触させることと、
ＤＮＡをＤＮＡ精製装置で洗浄することと、および、
ＤＮＡ精製装置からＤＮＡを回収することのうち、１つ以上を含む方法である。
【００３３】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルは、ｉ）遠隔サンプルをプロテアーゼまたはタンパク質分解試薬で処理する、ｉｉ）遠隔サンプルを少なくともタンパク質変性試薬または溶液で処理し、ＤＮＡをＤＮＡ精製装置に接触させることによって精製し、ＤＮＡを洗浄し、ＤＮＡをＤＮＡ精製装置から溶離するステップのうち、少なくとも１つのステップにしたがう。
【００３４】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルからのＤＮＡの単離は、タンパク質分解試薬による処理を含む。かかる試薬は、当業者に周知のどのような種類の試薬でもよい。例えば、しかしこれに限定されないが、タンパク質分解試薬は臭化シアンである。
１つの実施例によれば、遠隔サンプルからのＤＮＡの単離は、タンパク質変性試薬による処理を含む。かかる試薬は、当業者に周知のどのような種類の試薬でもよい。例えば、しかしこれに限定されないが、タンパク質変性試薬は、塩酸グアニジンまたは尿素のようなカオトロピック塩、またはドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）のような洗浄剤である。
【００３５】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルからのＤＮＡの単離は、とりわけ精製装置と接触している場合、ＤＮＡの洗浄を含む。適切な溶液および試薬は、当技術分野で周知である。例えば、しかしこれに限定されないが、この洗浄溶液は、水中エタノール７０％のような水を含む短鎖アルコールのどのような混合物でもよい。
【００３６】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルからのＤＮＡの単離は、ＤＮＡ精製装置からのＤＮＡの溶離を含む。かかる試薬は、当業者に周知のどのような種類の試薬でもよい。例えば、しかしこれに限定されないが、溶出液は、水またはＤＮＡ精製装置とともに供給される任意の溶出緩衝液である。
【００３７】
１つの実施例において、本発明の方法は、プロテアーゼによる遠隔サンプルの処理を用いたＤＮＡの単離を含み、このプロテアーゼは、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、カルボキシプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびプロテイナーゼＫを含む群から選択される少なくとも１つである方法である。
【００３８】
１つの実施例によれば、遠隔サンプルからのＤＮＡの抽出は、セリンプロテアーゼ、チオールプロテアーゼ、カルボキシプロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、およびプロテイナーゼＫを含む群から選択される少なくとも１つのプロテアーゼの使用を含む。
【００３９】
１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルのＤＮＡをＤＮＡ精製装置と接触させるを用いたＤＮＡの単離を含み、このＤＮＡ精製装置は、限外ろ過、例えばＹ−３０  Ｍｉｃｒｏｃｏｎカラムを含むがこれに限定されないＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置、ろ過装置、シリカ表面、シリカ膜、磁気粒子、ポリスチロール粒子、ポリスチロール表面、正電荷を持つ表面、正電荷を持つ膜、荷電膜、荷電表面、荷電交換膜、荷電交換面、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５  Ｋｉｔのカラム、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのカラム、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔのカラム、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅの一構成要素、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔの一構成要素、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔの一構成要素、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、またはＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素を含む群から選択される少なくとも１つである方法である。当業者であれば、例えば、エタノール沈殿またはプロパノール沈殿、とりわけ遠心分離による減圧濃縮のようなものを含むがこれに限定されない、別の可能性を考慮することもある。当業者であれば、上記の明細および名前の挙がったキットを考慮するにあたり、別の適した装置またはキットを選択することを知っている。上述の装置またはキットは当技術分野で周知である。現在の製造業者は、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  ＶｏｌｕｍｅまたはＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ＫｉｔはＲｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔ、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  ＫｉｔまたはＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉ  ＫｉｔはＱｕｉａｇｅｎ，  Ｉｎｃ．、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  ＫｉｔはＩｎｖｉｔｅｋ  Ｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｆuｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＆  Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ  ｍｂＨ、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌまたはｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌはｃｈｅｍａｇｅｎ  ＡＧ、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＫｉｔはＧｅｎｔｒａ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔはＥｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｍｉｃｒｏｃｏｎろ過装置はＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  ��ｎｃ．、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５ＫｉｔはＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ＫｉｔはＰｒｏｍｅｇａ  Ｕ．Ｓ．、およびＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ＫｉｔはｂｉｏＭeｒｉｅｕｘ  ＳＡである。もちろん、本発明が作成された時点、または将来において入手可能であれば、これらの装置またはキットの均等物に基づく限り、別の装置またはキットが使用されてもよい。
【００４０】
１つの実施例によれば、ＤＮＡ単離または抽出に使用されるＤＮＡ精製装置は、限外ろ過、例えばＹ−３０  Ｍｉｃｒｏｃｏｎカラムを含むがこれに限定されないＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置、ろ過装置、シリカ表面、シリカ膜、磁気粒子、ポリスチロール粒子、ポリスチロール表面、正電荷を持つ表面、正電荷を持つ膜、荷電膜、荷電表面、荷電交換膜、荷電交換面、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５  Ｋｉｔのカラム、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのカラム、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔのカラム、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅの一構成要素、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔの一構成要素、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔの一構成要素、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、エタノール沈殿、プロパノール沈殿、またはとりわけ遠心分離を用いた減圧濃縮を含む群から選択される少なくとも１つの基準によって特徴付けられる。もちろん、上記の明細および名前の挙がったキットを読む間、その使用が当業者にとって明らかである限りにおいて、本発明に基づいて別の適した装置またはキットが使用されてもよい。
【００４１】
１つの実施例において、本発明の方法は、ＤＮＡの単離が、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔ、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔ、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌ、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌ、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、またはＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔを含む群から選択される、少なくとも１つのキットを使用することによって行われる方法である。当業者であれば、上記の明細および名前の挙がったキットを考慮するにあたり、別の適した装置またはキットを選択することを知っている。上述のキットは当技術分野で周知である。対応する製造業者の名称は、上記を参照されたい。もちろん、本発明が作成された時点、または将来において入手可能であれば、これらのキットの均等物に基づく限り、別のキットが使用されてもよい。
【００４２】
１つの実施例によれば、以下のうち少なくとも１つのキットがＤＮＡ抽出に使用される。ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔ、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔ、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌ、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌ、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、またはＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ。当業者であれば、上記に名前が挙げられたキットを読む間に、別のキットを考慮することもある。もちろん、それらは本発明にしたがって使用されてもよい。これには、とりわけ上記に記載のキットと同じ技術に基づくが、異なるかまたは類似の名前を持つか、または異なる製造業者によって製造されるキットも含む。
【００４３】
上述のキットをＤＮＡの単離に使用することは、それぞれが以下の基準を満たすので好ましい。ｉ）高収量のＤＮＡ、ｉｉ）相互汚染の防止、ｉｉｉ）高度な標準化、ｉｖ）高度な自動化、ｖ）低処理労力、ｖｉ）低コスト、ｖｉｉ）処理の容易性、ｖｉｉｉ）サンプルに現れる、小さな断片、大きな断片ともに精製される、ｉｘ）高再現性、ｘ）高信頼性、ｘｉ）タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ＲＮＡ、核酸、または塩基の効率的な除去。
【００４４】
好ましい１つの実施例によれば、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  またはＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  ＫｉｔがＤＮＡ単離に使用される。この理由は、それらが上記に記載の基準を最も満たすからである。
【００４５】
特定の好ましい１つの実施例によれば、最も高い再現性および最も高い信頼性を持つため、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  ＶｏｌｕｍｅがＤＮＡ単離に使用される。
【００４６】
１つの実施例において、本発明の方法は、異なるサンプルに由来する単離されたＤＮＡは、プールされ、濃縮されるか、またはプールされ、および濃縮される。
【００４７】
１つの実施例によれば、同じ個体に由来する抽出されたＤＮＡはプールされる。１つの実施例によれば、同じ個体に由来する抽出されたＤＮＡは高濃度化される。
【００４８】
１つの実施例によれば、同じ個体に由来する抽出されたＤＮＡはプールされ、および同時に高濃度化される。
【００４９】
１つの実施例において、本発明の方法は、単離されたＤＮＡが濃縮され、および単離されたＤＮＡの濃縮が、限外ろ過、例えばＹ−３０  Ｍｉｃｒｏｃｏｎカラムを含むがこれに限定されないＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置、ろ過装置、エタノール沈殿、プロパノール沈殿、シリカ表面、シリカ膜、磁気粒子、ポリスチロール粒子、正電荷を持つ表面、正電荷を持つ膜、荷電膜、荷電表面、荷電交換膜、荷電交換面、減圧濃縮、遠心分離を用いた真空濃縮、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５  Ｋｉｔのカラム、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのカラム、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔのカラム、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅの一構成要素、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔの一構成要素、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔの一構成要素、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、またはＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素を含む群から選択される少なくとも１つである方法である。当業者であれば、上記の明細および名前の挙がったキットを考慮するにあたり、別の適した装置またはキットを選択することを知っている。上述のキットは当技術分野で周知である。現在の製造業者に関しては、上述のものを参照されたい。もちろん、本発明が作成された時点、または将来において入手可能であれば、同等の上述の装置またはキットに基づく限り、別の装置またはキットが使用されてもよい。
【００５０】
１つの実施例によれば、ＤＮＡの高濃度化は、以下のうち少なくとも１つ、またはその組み合わせを用いて行われる。限外ろ過、例えばＹ−３０  Ｍｉｃｒｏｃｏｎカラムを含むがこれに限定されないＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置、ろ過装置、エタノール沈殿、プロパノール沈殿、シリカ表面、シリカ膜、磁気粒子、ポリスチロール粒子、正電荷を持つ表面、正電荷を持つ膜、荷電膜、荷電表面、荷電交換膜、荷電交換面、真空濃縮、遠心分離を用いた真空濃縮、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  ＆  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５  Ｋｉｔのカラム、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのカラム、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔのカラム、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅの一構成要素、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔの一構成要素、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔの一構成要素、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、またはＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素。
【００５１】
上述の装置を使用することは、これらが遠隔サンプルに基づく以下の医療検査の基準を最も満たすので特に好ましい。ｉ）高収量のＤＮＡ、ｉｉ）相互汚染の防止、ｉｉｉ）高度な標準化、ｉｖ）高度な自動化、ｖ）低処理労力、ｖｉ）低コスト、ｖｉｉ）処理の容易性、ｖｉｉｉ）サンプルに現れる、小さな断片、大きな断片ともに精製される、ｉｘ）高再現性、ｘ）高信頼性、ｘｉ）タンパク質、ペプチド、アミノ酸、ＲＮＡ、核酸、または塩基の効率的な除去。
【００５２】
特に好ましい１つの実施例によれば、それらが最も高いＤＮＡの収量を持ち、およびサンプルに現れる、小さな断片、大きな断片ともに回収することを可能にするため、限外ろ過装置、とりわけＭｉｃｒｏｒｏｎろ過装置が高濃度化または濃縮に使用される。
【００５３】
１つの実施例において、本発明の方法は、メチル化シトシンと非メチル化シトシンの区別を可能にする試薬が、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、メチル化シトシンをそのままにする試薬である方法である。
【００５４】
１つの実施例によれば、特定の位置における、ＤＮＡがメチル化か否かを区別することを可能にする処理は、メチル化シトシンをそのままにしながら、非メチル化シトシンのウラシルへの変換をもたらす処理である。かかる処理は、どのような種類の処理であってもよい。好ましくは、この処理は酵素または試薬の使用を含む。ここで、酵素はどのような酵素であってもよいが、好ましくは、酵素はタンパク質またはＲＮＡ分子である。上述の試薬もまたどのような試薬であってもよく、例えば、しかしこれに限定されないが、化学試薬、医薬用試薬、生物学試薬または医療用試薬である。
【００５５】
１つの実施例において、本発明の方法は、区別を可能にする試薬として、変換試薬を含み、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、メチル化シトシンをそのままにする試薬はバイサルファイト試薬である方法である。当業者であれば、バイサルファイト試薬の適用方法を知っている。バイサルファイト試薬のＤＮＡへの適用に適したキットは、例えば、しかしこれに限定されないが、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｍｅｔｈｙｌａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ  Ｉｎｃ．）、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ）など、入手可能である、
【００５６】
１つの実施例によれば、メチル化シトシンをそのままにしながら、非メチル化シトシンのウラシルへの変換をもたらす処理は、バイサルファイト試薬の使用を含む。当業者であれば、バイサルファイト処理のための適切な方法またはキットを知っている。例えば、しかしこれに限定されないが、キットは、ＥＺ  ＤＮＡ  Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−Ｇｏｌｄ  Ｋｉｔ（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｍｅｔｈｙｌａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｅｐｉｇｅｎｔｅｋ  Ｉｎｃ．）、ＭｅｔｈｙｌＥａｓｙ  ＤＮＡ  Ｂｉｓｕｌｐｈｉｔｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄ）であってもよい。
【００５７】
好ましい１つの実施例によれば、バイサルファイト処理は原則的にＷＯ０５／０３８０５１（本参照は全体によって組み込まれる）の記述にしたがって行われる。これにしたがい、１つの実施例において、ＤＮＡはバイサルファイト試薬と反応し、上述の反応は、ジオキサン群からの化合物、その誘導体の１つおよび類似の脂肪族の環状エーテルの存在下において行われることを特徴とする。
【００５８】
１つの実施例において、ＤＮＡはバイサルファイト試薬と反応し、上述の反応は、以下の式の化合物の存在下において行われることを特徴とする。
【００５９】
2008537888.tif 000003
【００６０】
ｎ＝１−３５０００
ｍ＝１−３
Ｒ１＝Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、Ｂｕ
Ｒ２＝Ｈ、Ｍｅ、Ｅｔ、Ｐｒ、Ｂｕ
【００６１】
ゆえに、好ましいのはｎ−アルキレングリコール化合物であり、特にそのジアルキルエーテルであり、および特にジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）である。
【００６２】
バイサルファイト変換は、溶液とＤＮＡ固相に結合したＤＮＡの両方において行うことができる。好ましくは、亜硫酸ナトリウムよりも水に溶けやすいため、重亜硫酸ナトリウム（＝亜硫酸水素ナトリウム／メタ重亜硫酸ナトリウム）が使用される。重亜硫酸塩は、不均化により水溶液中でシトシン変換に必要な亜硫酸水素アニオンを発生させる。以下においてバイサルファイト濃度が検討される場合、これは反応液中の亜硫酸水素および亜硫酸アニオンの濃度を参照する。本発明による方法には、濃度範囲０．１から６ｍｏｌ／ｌが可能である。特に好ましいのは、濃度範囲１から６ｍｏｌ／ｌ、であり、最も特に好ましいのは、２〜４ｍｏｌ／ｌである。しかし、ジオキサンが使用されるとき、使用できるバイサルファイトの最大濃度は小さくなる（下記参照）。バイサルファイト濃度の選択において、高濃度のバイサルファイトは高い変換をもたらすが、低いｐＨのために高い分解速度をももたらすことを考慮しなければならない。
【００６３】
ジオキサンは、異なる濃度で用いることができる。好ましくは、ジオキサンの濃度は合計１０から３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）であり、特に好ましいのは２０から３０％であり、および最も特に好ましいのは２２から２８％であり、特に２５％である。３５％を超えるジオキサン濃度は、これが反応液中に二つの相を形成する結果となるため、問題がある。ジオキサン濃度が２２〜２８％の特に好ましい実施例において、最終的な好ましいバイサルファイト濃度は合計３．３から３．６ｍｏｌ／ｌであり、またジオキサン濃度が２５％の最も特に好ましい実施例においては、合計３．５ｍｏｌ／ｌである（例を参照）。
【００６４】
本発明に基づくｎ−アルキレングリコール化合物は、異なる濃度範囲において使用することができる。ＤＭＥは、好ましくは１〜３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度で使用される。好ましくは５と２５％の間があり、および最も好ましくは１０％のＤＭＥである。
【００６５】
本発明に基づいて用いられる好ましいスカベンジャーは、クロマン誘導体であり、例えば、６−ヒドロキシ−２，５，７，８，−テトラメチルクロマン２−カルボン酸（Ｔｒｏｌｏｘ−ＣTMとしても知られる）である。更なるスカベンジャーは、特許出願ＷＯ  ０１／９８５２８（＝ＤＥ  １００  ２９  ９１５；＝ＵＳ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  １０／３１１，６６１、全体として本明細書に組み込まれる）に掲載されている。
【００６６】
バイサルファイト変換は、０から９５℃の広い温度範囲において行われることができる。しかし、温度が高いほどＤＮＡの変換と分解の速度は両者とも増加するため、好ましい１つの実施例において、反応温度は０から８０℃の間であり、好ましくは３０から８０℃の間である。特に好ましいのは、５０〜７０℃の範囲であり、最も特に好ましいのは５７〜６５℃の間である。バイサルファイト処理の至適反応時間は、この反応時間に依存する。反応時間は普通、合計１から１８時間の間である。（Ｇｒｕｎａｕ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１，２９（１３）：Ｅ６５−５参照、参照することにより全体として本明細に組み込まれる）。反応時間は通常、反応温度６０℃で４〜６時間である。
【００６７】
本発明による方法の特に好ましい実施例において、バイサルファイト変換は温和な反応温度で行われるが、そこで反応温度は、変換の過程において少なくとも一度、短時間の間、明らかに上昇する。これにより、バイサルファイト変換の有効性は、驚くほど明らかに増加することができる。この短期間の温度上昇は、以下で「熱スパイク」と命名される。熱スパイク外の「標準」反応温度は、基本の反応温度として示される。基本反応温度は、上述のとおり、合計０から８０℃の間であり、好ましくは３０〜８０℃の間であり、さらに好ましくは５０〜７０℃の間であり、もっとも好ましくは５７〜６５℃の間である。
【００６８】
熱スパイク中における反応温度は、少なくとも一回の熱スパイクにより、８５℃以上に上昇する。至適な回数の熱スパイクは、基本反応温度の関数である。至適な回数の熱スパイクが多いほど、基本反応温度は低くなる。それぞれの場合において、少なくとも一回の熱スパイクが必要である。また、一方、原則的に、熱スパイクは何回でも考えられる。もちろん、温度上昇が大きければ、ＤＮＡの分解速度もまた上昇し、至適な変換はもはや保証されないということが考慮されなければならない。熱スパイクの好ましい回数は、ゆえに、各回１から１０回の熱スパイクの間であり、基本反応温度に依存する。２から５回の熱スパイクは、ゆえに、特に好ましい。熱スパイクは、好ましくは８５から１００℃に、特に好ましくは９０〜１００℃に、そして最も好ましくは９４℃〜１００℃に反応温度を上昇させる。
【００６９】
熱スパイク時の持続時間はまた、反応バッチの体積に依存する。全体の反応液を通して、温度が均一に上昇することを確実にしなければならない。サーモサイクラー使用時の２０μｌの反応バッチには、持続時間１５秒から１．５分、特に持続時間２０から５０秒が好ましい。特に好ましい１つの実施例において、持続時間は３０秒である。体積１００μｌにおいて行う場合、好ましい範囲は３０秒から５分の間であり、特に１から３分の間である。特に好ましいのは、１．５〜３分である。体積６００μｌには、持続時間１から６分が好ましく、特に２から４分の間である。特に好ましいのは、持続時間３分である。当業者であれば、さまざまな反応体積に関連して、適切な熱スパイクの持続時間を容易に決定することができる。上記に記載の熱スパイクの使用は、上記に記載の変性溶剤が使用されない場合においても、バイサルファイト変換反応において有意によりよい変換速度をもたらす。
【００７０】
本発明によれば、別の既知の方法および従来技術のキットに比べ、数々の重要な利点を有するため、上述のバイサルファイトによるＤＮＡの処理が特に好ましい。これらの利点とは、ｉ）高収量の変換ＤＮＡ、ｉｉ）メチル化シトシンをそのままにしながら、非メチル化シトシンのほぼ完全な変換、およびｉｉｉ）更なるＤＮＡ断片がほとんどないことである。これらの利点は、ｉ）ＤＮＡの熱変性、ｉｉ）比較的低いバイサルファイト濃度、ｉｉｉ）ややもう少しアルカリ寄りのｐＨ、およびｉｖ）さらに効率的でさらに効果的なラジカルスカベンジャーの使用のため、より穏やかな反応条件に基づく。
【００７１】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、
約１０から約２５０μｌのＤＮＡを含む溶液を、ｐＨが約５．４５から約５．５０の範囲で、約４．８３から約４．９３ｍｏｌ／ｌの亜硫酸水素塩を含むバイサルファイト溶液である、約４５から約７５０μｌのバイサルファイト溶液と混合することと、
約５から約５００μｌの、有機溶剤および約１０から約７５０ｍｍｏｌ／ｌの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−カルボン酸を含む有機ラジカルスカベンジャー液である、有機ラジカルスカベンジャー液を加えることと、
温度プロトコルを約２から約１８時間適用することと、を含み、約８５から約１００℃の温度までの初期温度上昇を含め、それぞれ約０．５から約１０分、約８５から約１００℃の温度までの約２から約５回の更なる温度上昇を伴い、約０から約８０℃の温度範囲でそれぞれ反応が行われる、バイサルファイト試薬でＤＮＡを処理する方法である。
【００７２】
好ましい１つの実施例によれば、処理は、
約１０から約２５０μｌのＤＮＡを含む溶液を、ｐＨが約５．４５から約５．５０の範囲で、約４．８３から約４．９３ｍｏｌ／ｌの亜硫酸水素塩を含むバイサルファイト溶液である、約４５から約７５０μｌのバイサルファイト溶液と混合することと、
約５から約５００μｌの、有機溶剤および約１０から約７５０ｍｍｏｌ／ｌの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−カルボン酸を含む有機ラジカルスカベンジャー液である、有機ラジカルスカベンジャー液を加えることと、
温度プロトコルを約２から約１８時間適用することと、をさらに含み、約８５から約１００℃の温度までの初期温度上昇を含め、それぞれ約０．５から約１０分、約８５から約１００℃の温度までの約２から約５回の更なる温度上昇を伴い、約０から約８０℃の温度範囲でそれぞれ反応が行われる、バイサルファイト試薬の使用を含む。
【００７３】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、ＤＮＡを、
約５０から約１５０μｌのＤＮＡを含む溶液を、約１７７から約５３１μｌのバイサルファイト溶液と混合することと、
約７３から約２１９μｌの、１，４−ジオキサンに溶解した約１５７ｍｍｏｌ／ｌの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−カルボン酸を含むジオキサン溶液である、ジオキサン溶液を加えることと、および
温度プロトコルを約３から約１６時間適用することを含み、約５７から約６５℃の温度までの初期温度上昇を含め、それぞれ約約３から約５分、約９４から約１００℃温度までの約２から約５回の更なる温度上昇を伴い、約９４から約１００℃の温度範囲でそれぞれ反応が行われる、バイサルファイト試薬で処理する方法である。
【００７４】
特定の好ましい実施例において、ＤＮＡのバイサルファイト処理は、
約５０から約１５０μｌのＤＮＡを含む溶液を、約１７７から約５３１μｌのバイサルファイト溶液と混合することと、
約７３から約２１９μｌの、１，４−ジオキサンに溶解した約１５７ｍｍｏｌ／ｌの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−カルボン酸を含むジオキサン溶液である、ジオキサン溶液を加えることと、および
温度プロトコルを約３から約１６時間適用することを含み、約９４から約１００℃の温度までの初期温度上昇を含め、それぞれ約３から約５分、約９４から約１００℃温度までの約２から約５回の更なる温度上昇を伴い、約５７から約６５℃の温度範囲でそれぞれ反応が行われる。
【００７５】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、ＤＮＡを、
約５０から約１５０μｌのＤＮＡを含む溶液を、約９５から約２８５μｌのバイサルファイト溶液と混合することと、
約１５から約４５μｌの、ジエチレングリコールジメチルエーテルに溶解した約５００ｍｍｏｌ／ｌの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−カルボン酸を含むＤＭＥ溶液である、ＤＭＥ溶液を加えることと、および
温度プロトコルを約３から約１６時間適用することを含み、約９４から約１００℃の温度までの初期温度上昇を含め、それぞれ約３から約５分、約９４から約１００℃温度までの約２から約５回の更なる温度上昇を伴い、約５７から約６５℃の温度範囲でそれぞれ反応が行われる、バイサルファイト試薬で処理する方法である。
【００７６】
特定の好ましい実施例において、ＤＮＡのバイサルファイト処理は、
約５０から約１５０μｌのＤＮＡを含む溶液を、約９５から約２８５μｌのバイサルファイト溶液と混合することと、
約１５から約４５μｌの、ジエチレングリコールジメチルエーテルに溶解した約５００ｍｍｏｌ／ｌの６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−クロマン−２−カルボン酸を含むＤＭＥ溶液である、ＤＭＥ溶液を加えることと、および
温度プロトコルを約３から約１６時間適用することを含み、約９４から約１００℃の温度までの初期温度上昇を含め、それぞれ約３から約５分、約９４から約１００℃温度までの約２から約５回の更なる温度上昇を伴い、約５７から約６５℃の温度範囲でそれぞれ反応が行われる。
【００７７】
１つの実施例によれば、本発明の方法は、バイサルファイト処理したＤＮＡがメチル化分析の方法に直接したがう方法である。これはＰＣＲに基づく方法における相互汚染の防止の観点から、特に好ましい。本実施例は基本的に、ＵＳ  １１／２４８，７２１（本参照は、参照することによって全体として組み込まれる）の記述に基づいて行われる。これにより、ＤＮＡメチル化分析に適した、汚染除去されたＤＮＡが提供される。本実施例は、ＤＮＡが、上記に記載の溶液を含むバイサルファイト試薬で培養されることを特徴とする。これは非メチル化シトシンのスルホン化、脱アミノ化、または両方をもたらす。脱アミノ化は水溶液中における自然過程であり、スルホン化ウラシルを含むＤＮＡをもたらす。しかし脱スルホン化は発生しない。
【００７８】
別個のステップにおいて、スルホン化ウラシルを含むＤＮＡは、核酸を含有する非スルホン化ウラシルを特異的に分解する酵素に接触し、培養される。かかる酵素は、例えばウラシル−ＤＮＡ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）である。
【００７９】
汚染を除去したテンプレートＤＮＡをポリメラーゼベースの増幅反応へ提供する好ましい１つの実施例において、スルホン化したおよび／または脱アミノ化したテンプレートＤＮＡは、ポリメラーゼ媒介性の増幅反応、または増幅ベースの検出アッセイに必要なＵＮＧ活性および成分と混合される。ＵＮＧを使用して核酸を含有する非スルホン化ウラシルを分解した後、ＵＮＧ活性は終了し、テンプレートＤＮＡは温度の上昇によって脱スルホン化される。続いて、テンプレートＤＮＡはすぐに増幅されることができる状態となる。
【００８０】
好ましい１つの実施例において、分解、終結、脱スルホン化および増幅は、ポリメラーゼベースの増幅反応および／または増幅ベースのアッセイ中、単一チューブ内で起こる。好ましくは、かかる増幅はｄＴＴＰではなく、ｄＵＴＰの存在下において実施される。
【００８１】
好ましい１つの実施例において、バイサルファイト処理後にスルホン化した、または部分的にまたは全体的に脱アミノ化したＤＮＡは、いかなる事前の脱スルホン化なしに、ポリメラーゼベースの増幅反応および／または増幅ベースのアッセイに直接したがう。脱スルホン化は、増幅反応の初期の温度上昇中に起こる。
【００８２】
これらの特定の実施例は、既知のバイサルファイト処理方法と比べ、バイサルファイト処理後の精製ステップが不必要となる利点を有する。これは、コストおよび取り扱い労力を削減し、バイサルファイト処理したＤＮＡの損失を最小限にし、また時間の節約をもたらす簡略化である。
【００８３】
１つの実施例において、本発明の方法は、メチル化状態の区別を可能にする試薬または酵素によるＤＮＡの処理が、処理したＤＮＡの精製を含む方法である。
【００８４】
１つの実施例によれば、メチル化シトシンをそのままにしながら、非メチル化シトシンのウラシルへの変換をもたらす処理は、バイサルファイト処理したＤＮＡの精製を含む。１つの実施例によれば、かかる精製は、上述のものをアルカリ試薬または溶液と接触させることによる、バイサルファイト処理したＤＮＡの脱スルホン化を含む。
【００８５】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、処理したＤＮＡの精製が、限外ろ過、Ｍｉｃｒｏｃｏｎろ過装置、ろ過装置、エタノール、プロパノール、シリカ表面、シリカ膜、磁気粒子、ポリスチロール粒子、正電荷を持つ表面、正電荷を持つ膜、荷電膜、荷電表面、荷電交換膜、荷電交換面、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５  Ｋｉｔのカラム、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのカラム、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔのカラム、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅの一構成要素、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔの一構成要素、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔの一構成要素、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、またはＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素を含む群から選択された少なくとも一つを使用することを含む方法である。当業者であれば、上記の明細および名前の挙がったキットを考慮するにあたり、別の適した装置またはキットを選択することを知っている。上述のキットは当技術分野で周知である。現在の製造業者については、上記を参照されたい。もちろん、本発明が作成された時点、または将来において入手可能であれば、これらの装置またはキットの均等物に基づく限り、別の装置またはキットが使用されてもよい。
【００８６】
１つの実施例によれば、バイサルファイト処理したＤＮＡの精製は、以下の少なくとも一つか、またはその組み合わせの使用を含む。限外ろ過、Ｍｉｃｒｏｃｏｎろ過装置、ろ過装置、エタノール、プロパノール、シリカ表面、シリカ膜、磁気粒子、ポリスチロール粒子、正電荷を持つ表面、正電荷を持つ膜、荷電膜、荷電表面、荷電交換膜、荷電交換面、ＺＲ  ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５  Ｋｉｔのカラム、Ｗｉｚａｒｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔのカラム、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔのカラム、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅの一構成要素、ＱＩＡａｍｐ  ＵｌｔｒａＳｅｎｓ  Ｖｉｒｕｓ  Ｋｉｔの一構成要素、ＲＴＰ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｕｐｅｒｓｅｎｓｅ  Ｋｉｔの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  Ｖｉｒａｌ  ＤＮＡ／ＲＮＡ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、ｃｈｅｍａｇｉｃ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ  ｓｐｅｃｉａｌの一構成要素、Ｈｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｖｉｒａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔの一構成要素、Ｐｕｒｅｇｅｎｅ  ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、ＭａｓｔｅｒＰｕｒｅTM  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素、またはＮｕｃｌｉＳｅｎｓ(登録商標)  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔの一構成要素。
【００８７】
好ましい１つの実施例によれば、バイサルファイト処理したＤＮＡの精製、脱スルホン化、または精製および脱スルホン化には、これらが最も高収量のバイサルファイト処理したＤＮＡを含み、バイサルファイト処理後にサンプルに現れる、バイサルファイト処理した大きい断片とともに、バイサルファイト処理した小さい断片の回収も可能であるため、限外ろ過装置、とりわけＭｉｃｒｏｒｏｎろ過装置が使用される。
【００８８】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、処理されたＤＮＡの精製が、
約５０から約１０００μｌの水をバイサルファイト反応後にサンプルに追加することと、
混合液をＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置に適用し、続いて遠心分離機にかけて約１０，０００から約１８，０００ｘｇで約１０から約３０分分離することと、
約０．２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム約１００から約８００μｌで洗浄し、続いて約１０，０００から約１８，０００ｘｇで約６から約２５分遠心分離機にかけて分離することと、
約０．１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム約１００から約８００μｌを適用し、続いて約１０，０００から約１８，０００ｘｇで約６から約２５分遠心分離機にかけて分離することと、
約１００から約４００μｌの水またはＴＥ緩衝液を適用し、続いて約１０，０００から約１８，０００ｘｇで約６から約２５分遠心分離機にかけて分離することを１から約８回繰り返して、適用することと、
約１５から約６５℃に予熱した約２５から約２００μｌのＴＥ緩衝液を使用して溶離し、約１５から約６５℃の温度で約１から約３０分培養し、続いてＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置の反転および約５００から約５，０００ｘｇで約０．５から約３０分の遠心分離、を含む方法である。
【００８９】
好ましい１つの実施例によれば、バイサルファイト処理したＤＮＡの精製および脱スルホン化は、
約５０から約１０００μｌの水をバイサルファイト反応後にサンプルに追加することと、
混合液をＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置に適用し、続いて遠心分離機にかけて約１０，０００から約１８，０００ｘｇで約１０から約３０分分離することと、
約０．２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム約１００から約８００μｌで洗浄し、続いて約１０，０００から約１８，０００ｘｇで約６から約２５分遠心分離機にかけて分離することと、
約０．１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム約１００から約８００μｌを適用し、続いて約１０，０００から約１８，０００ｘｇで約６から約２５分遠心分離機にかけて分離することと、
約１００から約４００μｌの水またはＴＥ緩衝液を適用し、続いて約１０，０００から約１８，０００ｘｇで約６から約２５分遠心分離機にかけて分離することを、１から約８回繰り返して適用することと、
約１５から約６５℃に予熱した約２５から約２００μｌのＴＥ緩衝液を使用して溶離し、約１５から約６５℃の温度で約１から約３０分培養し、続いてＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置の反転および約５００から約５，０００ｘｇで約０．５から約３０分の遠心分離、を含む。
【００９０】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、処理されたＤＮＡの精製が、
ａ）２００μｌの水をバイサルファイト反応後にサンプルに追加することと、
ｂ）混合液をＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置に適用し、続いて約１４，０００ｘｇで約２０分遠心分離機にかけて分離することと、
ｃ）約０．２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム約４００μｌで洗浄し、続いて約１４，０００ｘｇで約１０から約１４分遠心分離機にかけて分離することと、
ｄ）約０．１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム約４００μｌを適用し、続いて約１４，０００ｘｇで約１０から約１４分遠心分離機にかけて分離することと、
ｅ）約４００μｌの水またはＴＥ緩衝液を適用し、続いて約１４，０００ｘｇで約１２分遠心分離機にかけて分離することを、１から約４回繰り返して適用することと、
ｆ）約５０℃に予熱した、約４５から約７０μｌのＴＥ緩衝液を使用して溶離し、約５０℃の温度で約１０分培養し、続いてＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置の反転および約１，０００ｘｇで約７分の遠心分離を含む、方法である。
【００９１】
特定の好ましい実施例において、バイサルファイト処理したＤＮＡの精製および脱スルホン化は、
ａ）２００μｌの水をバイサルファイト反応後にサンプルに追加することと、
ｂ）混合液をＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置に適用し、続いて約１４，０００ｘｇで約２０分遠心分離機にかけて分離することと、
ｃ）約０．２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム約４００μｌで洗浄し、続いて約１４，０００ｘｇで約１０から約１４分遠心分離機にかけて分離することと、
ｄ）約０．１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウム約４００μｌを適用し、続いて約１４，０００ｘｇで約１０から約１４分遠心分離機にかけて分離することと、
ｅ）約４００μｌの水またはＴＥ緩衝液を適用し、続いて約１４，０００ｘｇで約１２分遠心分離機にかけて分離することを、１から約４回繰り返して適用することと、
ｆ）約５０℃に予熱した、約４５から約７０μｌのＴＥ緩衝液を使用して溶離し、約５０℃の温度で約１０分培養し、続いてＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置の反転および約１，０００ｘｇで約７分の遠心分離を含む。
【００９２】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、処理されたＤＮＡの精製が、
ステップｂにおいて、混合物を少量ずつステップｂのＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置に適用することと、
ステップｂに続いて、約１０ｍｍｏｌ／ｌのトリヒドロキシメチルアミノメタンおよび約０．１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡを含有するＴＥ緩衝液ｐＨ８である、約４００μｌのＴＥ緩衝液を適用することと、続いて約１４，０００ｘｇで約１２分遠心分離機にかけて分離することと、
ステップｃにおいて、約０．２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムを、室温で約１０分培養することと、
ステップｄにおいて、約０．１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムを、室温で約１０分培養することのうち、少なくとも一つをさらに含む方法である。
【００９３】
特定の好ましい実施例において、バイサルファイト処理したＤＮＡの精製および脱スルホン化は、上記に記載された少なくとも一つに加え、
ステップｂにおいて、混合物を少量ずつステップｂのＭｉｃｒｏｃｏｎろ過装置に適用することと、
ステップｂに続いて、約１０ｍｍｏｌ／ｌのトリヒドロキシメチルアミノメタンおよび約０．１ｍｍｏｌ／ｌのＥＤＴＡを含有するＴＥ緩衝液ｐＨ８である、約４００μｌのＴＥ緩衝液を適用することと、続いて約１４，０００ｘｇで約１２分遠心分離機にかけて分離することと、
ステップｃにおいて、約０．２ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムを、室温で約１０分培養することと、
ステップｄにおいて、約０．１ｍｏｌ／ｌの水酸化ナトリウムを、室温で約１０分培養することをさらに含む方法である。
【００９４】
好ましい１つの実施例によれば、バイサルファイト処理したＤＮＡまたはバイサルファイト処理して精製したＤＮＡは、いかなる更なる分析にも優先して、全ゲノム増幅にしたがう。
【００９５】
好ましい１つの実施例において、本発明の方法は、
少なくとも１つの核酸分子を含む核酸サンプルを提供することと、
少なくとも１つの核酸分子に由来する上述のサンプルを、上述の核酸分子内のメチル化塩基と、上述の核酸分子内の非メチル化塩基を区別する酵素または試薬で処理することと、
上述のサンプルに由来する少なくとも１つの核酸分子の少なくとも一本の鎖を、少なくとも１つのヌクレオチドまたはＰＮＡ−モノマーで伸長することと、
少なくとも１つの伸長した核酸分子を増幅することを含む、少なくとも１つの核酸を増幅する方法である。ここで、上述のサンプルに由来する少なくとも１つの核酸分子を処理するステップと、上述のサンプルに由来する少なくとも１つの核酸分子少なくとも１つの鎖を伸長するステップは、順序不同に行われてもよい。
【００９６】
好ましい１つの実施例によれば、少なくとも１つの核酸が増幅される。この増幅は、どのような順序不同で行われてもよい以下のステップを含む。核酸サンプルを提供することにより、少なくとも１つの核酸分子を提供すること。少なくとも１つのヌクレオチドまたはＰＮＡ−モノマーによって、少なくとも１つの核酸分子の少なくとも１本の鎖を伸長すること。少なくとも１つの核酸分子を、上述の核酸分子内のメチル化塩基と、上述の核酸分子内の非メチル化塩基を区別する酵素または試薬で処理すること。少なくとも１つの核酸分子を増幅すること。したがって、好ましくは、少なくとも１つの核酸分子の伸長された、または処理されて伸長された部分は、上述の少なくとも１つの核酸分子の増幅に使用される。
【００９７】
好ましい１つの実施例において、伸長は、少なくとも１つの核酸の少なくとも１本の鎖が、
１つ以上の単一ヌクレオチドまたはＰＮＡ−モノマーによって、
１つ以上のオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマーによって、
提供された核酸サンプルに由来する第２の核酸、または
その組み合わせによって伸長されることを特徴とする。
【００９８】
好ましい１つの実施例によれば、上述の少なくとも一本の鎖は、１つ以上のオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマーによって、好ましくは上記に記載のものと同じ、提供された核酸サンプルに由来する第２の核酸によって、またはそれらの組み合わせによって１つ以上の単一ヌクレオチドまたはＰＮＡモノマーのいずれかに引き伸ばされる。ヌクレオチド、オリゴヌクレオチドまたは第２の核酸は、引き伸ばしに適した、および当業者に周知のどのような種類のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体であってもよい。好ましくは、しかしこれに限定されないが、ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、確定リボヌクレオチドまたはＰＮＡ−モノマーである。好ましくは、しかしこれに限定されないが、オリゴヌクレオチドは、オリゴデオキシリボヌクレオチド、オリゴリボヌクレオチド、またはＰＮＡ−オリゴマーであり、さらに好ましくは、ＰＮＡ−オリゴマーは、少なくとも１つのヌクレオチドがキメラオリゴマーの５’または３’側に位置するヌクレオチドおよびＰＮＡ−モノマーの任意のキメラオリゴマーである。上述の第２の核酸は、提供されたサンプルから成るか、または本発明の方法中に追加されるどのような核酸でもよい。この第２の核酸は、既知のまたは未知の配列であることができる。これは、内因性でも人工でもよい。好ましくは、第２の核酸は、核酸サンプルとともに提供された、バイサルファイト処理した内因性核酸である。
【００９９】
好ましい１つの実施例において、伸長は独立した触媒テンプレートである。
【０１００】
好ましい１つの実施例によれば、伸長にはテンプレートは使用されない。これは伸長がランダムに、または使用される１つ以上の酵素または更なる反応条件にしたがって起こることを意味する（例えば、しかしこれに限定されないが、提供されたヌクレオチドによる）。
【０１０１】
好ましい１つの実施例において、伸長は、トランスフェラーゼ、リン含有基を移動させるトランスフェラーゼ、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）、リボヌクレオチドトランスフェラーゼ活性を伴う酵素、ポリリボヌクレオチド・ヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ｔＲＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼ、ＲＮＡウリジリルトランスフェラーゼ、リガーゼ、リガーゼ形成リン酸エステル結合、ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ依存ＤＮＡリガーゼ、単鎖ＤＮＡリガーゼ、ＡＴＰ依存単鎖ＤＮＡリガーゼ触媒分子内環状化、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ｓｓＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅを含む群から選択された、少なくとも１つの酵素を用いて触媒される。
【０１０２】
好ましい１つの実施例によれば、伸長反応は、少なくとも１つの酵素を用いて触媒される。上述の酵素は、トランスフェラーゼ活性、リン含有基を移動させるトランスフェラーゼ活性、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、ＤＮＡヌクレオチジルエキソトランスフェラーゼ活性、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性、リボヌクレオチドトランスフェラーゼ活性を伴う酵素、ポリリボヌクレオチド・ヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、ｔＲＮＡヌクレオチジルトランスフェラーゼ活性、ＲＮＡウリジリルトランスフェラーゼ活性、リガーゼ活性、リガーゼ形成リン酸エステル結合活性、ＤＮＡリガーゼ活性、ＡＴＰ依存ＤＮＡリガーゼ活性、単鎖ＤＮＡリガーゼ活性、ＡＴＰ依存単鎖ＤＮＡリガーゼ触媒分子内環状化活性、ＣｉｒｃＬｉｇａｓｅ  ｓｓＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ活性を含む群から選択された少なくとも１つの活性を有する。適切な酵素は、当業者に周知である。特定の好ましい実施例において、触媒酵素はＴｅｒｍｉｎａｌ  Ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＴｄＴ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｔ＃  Ｍ０２５２Ｓ／Ｌ）である。その他の特定の好ましい実施例によれば、触媒酵素はＣｉｒｃＬｉｇａｓｅTM  ｓｓＤＮＡ  Ｌｉｇａｓｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｔ＃ＣＬ４１１１Ｋ／ＣＬ４１１５Ｋ）である。
【０１０３】
好ましい１つの実施例において、メチル化塩基と非メチル化塩基を区別する酵素または試薬は、バイサルファイト試薬である。
【０１０４】
好ましい１つの実施例によれば、メチル化シトシンと非メチル化シトシンを区別する酵素または試薬は、バイサルファイト試薬である。区別に適切な試薬および適切な方法は、上述されている。当業者であれば、上述の試薬の使用を調整するやり方または、場合によっては上述の方法をバイサルファイト処理したＤＮＡの増幅に調整するやり方を知っている。
【０１０５】
好ましい１つの実施例において、提供された核酸は少なくとも部分的にＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡである。
【０１０６】
好ましい１つの実施例によれば、核酸サンプルとともに提供された核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）またはその変形であり、例えば、しかしこれに限定されないが、固定リボ核酸（ＬＮＡ）である。もちろん、提供される核酸は、上述の種類の核酸の組み合わせであってもよい。
【０１０７】
好ましい１つの実施例において、核酸サンプルの提供は、断片化、ランダムな断片化、機械的応力による断片化、試薬を用いた断片化、酵素を用いた断片化、ヌクレアーゼを用いた断片化、制限エンドヌクレアーゼを用いた断片化のうち、少なくとも１つを含む。
【０１０８】
好ましい１つの実施例によれば、核酸サンプルの提供は、含まれる核酸の断片化も含む。断片化の適切な方法は、当業者に周知である。好ましくは、断片化の方法は、ランダムな断片化、機械的応力による断片化、試薬を用いた断片化、酵素を用いた断片化、ヌクレアーゼを用いた断片化、制限酵素を用いた断片化のうち、１つ以上によって特徴付けられる。
【０１０９】
好ましい１つの実施例において、少なくとも１つの伸長した核酸分子の増幅は、ポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リガーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅのうち、少なくとも１つを含む。
【０１１０】
好ましい１つの実施例によれば、伸長した核酸は、ポリメラーゼ、耐熱性ポリメラーゼ、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、リガーゼ、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮａｓｅを含む群から選択された、１つ以上の酵素または試薬を用いて増幅される。
【０１１１】
好ましい１つの実施例において、少なくとも１つの伸長した核酸分子の増幅は、増幅法、ＰＣＲ法、等温増幅法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、またはこれらの組み合わせを含む群から選択された、少なくとも１つの方法の使用を含む。
【０１１２】
好ましい１つの実施例によれば、伸長した核酸は、増幅法、ＰＣＲ法、等温増幅法、ＮＡＳＢＡ法、ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法、ＬＣＲ法、またはこれらの組み合わせによって増幅される。増幅の適切な方法は、ＲＡＣＥ  ＰＣＲ法を除き、本明細においてすでに説明されている。当業者であれば、場合によって、上述の適切な方法をバイサルファイト処理したＤＮＡの増幅に調整するやり方を知っている。
【０１１３】
好ましい１つの実施例において、提供された核酸分子のメチル化は、増幅法、ＰＣＲ法、等温増幅法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、メチル化特異的増幅法、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）法、ネステッドＭＳＰ法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法、検出法、メチル化特異的検出法、バイサルファイトシークエンス法、ＤＮＡアレーを使用した検出、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用した検出、ＣｐＧ島マイクロアレイを用いた検出、制限酵素を用いた検出、同時メチル化特異的増幅および検出法、ＣＯＢＲＡ法、リアルタイムＰＣＲ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTMリアルタイムＰＣＲ法、ＭＳＰ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM  ＡｌｇｏTM法、ＱＭ法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、ＭＳＰ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、メチル感受性プライマー伸長法、およびＭｓ−ＳＮｕＰＥ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法、またはこれらの組み合わせを含む群から選択された少なくとも１つの方法を含んで分析される。
【０１１４】
好ましい１つの実施例によれば、提供された核酸分子は、そのメチル化に関して分析される。好ましくはそのシトシンメチル化に関する。適切な方法は、例えば、しかしこれに限定されないが、増幅法、ＰＣＲ法、等温増幅法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、メチル化特異的増幅法、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）法、ネステッドＭＳＰ法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法、検出法、メチル化特異的検出法、バイサルファイトシークエンス法、ＤＮＡアレーを使用した検出、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用した検出、ＣｐＧ島マイクロアレイを用いた検出、制限酵素を用いた検出、同時メチル化特異的増幅および検出法、ＣＯＢＲＡ法、リアルタイムＰＣＲ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTMリアルタイムＰＣＲ法、ＭＳＰ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM  ＡｌｇｏTM法、ＱＭ法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、ＭＳＰ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、メチル感受性プライマー伸長法、およびＭｓ−ＳＮｕＰＥ  （Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法、またはこれらの組み合わである。上述の方法は、以下に詳述される。
【０１１５】
１つの特に好ましい実施例は、
少なくとも１つのＤＮＡ分子を含むＤＮＡサンプルを提供することと、
上述の提供された少なくとも１つのＤＮＡ分子の少なくとも１本の鎖を、少なくとも１つの単一ヌクレオチドまたはＰＮＡ−モノマーによって伸長することと、
伸長された少なくとも１本のＤＮＡ鎖を、上述のＤＮＡ分子内のメチル化シトシンと、上述のＤＮＡ分子内の非メチル化シトシンを区別する酵素または試薬で処理することと、
少なくとも一本の伸長された鎖を含む少なくとも１つの処理されたＤＮＡ分子を増幅することを含む。
【０１１６】
特定の好ましい実施例において、バイサルファイト処理したものを増幅する、上述の含まれるステップは、ｉ）少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む、ＤＮＡサンプルを提供するｉｉ）上述の提供された少なくとも１つのＤＮＡ分子の少なくとも１本の鎖を、少なくとも１つの単一ヌクレオチドまたはＰＮＡ−モノマーによって伸長する、ｉｉｉ）伸長された少なくとも１本のＤＮＡ鎖を、上述のＤＮＡ分子内のメチル化シトシンと、上述のＤＮＡ分子内の非メチル化シトシンを区別する酵素または試薬で処理する、ｉｖ）少なくとも一本の伸長された鎖を含む少なくとも１つの処理されたＤＮＡ分子を増幅する、という順序で行われる。もちろん、追加のステップが、上述のステップの前、途中、または後に含まれてもよい。
【０１１７】
好ましい１つの実施例において、提供された少なくとも１つのＤＮＡ分子の少なくとも１本の鎖の伸長は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼおよび１つ以上のヌクレオチドを含む。
【０１１８】
特定の好ましい実施例において、提供されたＤＮＡ分子の少なくとも１本の鎖は、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、好ましくは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼＴｄＴ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ  Ｃａｔ＃  Ｍ０２５２Ｓ／Ｌ）を使用して伸長される。また、伸長は、リボヌクレオチドの存在下において、好ましくは、アデノシン三リン酸塩のみの存在下、チミジン三リン酸塩のみの存在下、グアノシン三リン酸塩のみの存在下、シチヂン三リン酸塩の存在下、またはウラシル三リン酸塩のみの存在下のいずれかにおいて行われる。さらに好ましくは、デオキシヌクレオチドの存在下において、好ましくはデオキシアデノシン三リン酸塩のみの存在下、デオキシチミジン三リン酸塩のみの存在下、デオキシグアノシン三リン酸塩のみの存在下、デオキシシチヂン三リン酸塩のみの存在下、またはデオキシウラシル三リン酸塩のみの存在下のいずれかにおいて行われる。ＴｄＴは、上述の少なくとも１本の単鎖の引き伸ばしを、それぞれのヌクレオチドを末端ヌクレオチドの一本の単鎖の３’ヒドロキシル基に重合することによって触媒する。ＴｄＴは、ｄＡテイルに追加して、またはｄＴテイルに追加して、３００〜４００のヌクレオチドを、および約１０〜１００のヌクレオチドを、ｄＧテイリングまたはｄＣ−テイリングに３０分以内に加える。
【０１１９】
好ましい１つの実施例において、処理されたＤＮＡ分子の増幅は、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、上述のＤＮＡ分子の伸長された部分に、少なくとも部分的にハイブリッド形成することを特徴とする。
【０１２０】
特定の好ましい実施例において、伸長されたバイサルファイト処理した単鎖ＤＮＡ分子は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用して増幅される。したがって、上述のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、全体的にまたは部分的に、伸長されたバイサルファイト処理した単鎖ＤＮＡ分子の伸長された部分にハイブリッド形成する。特定の好ましい実施例において、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、伸長された部分に、全体的にハイブリッド形成する。したがって、核酸サンプルとともに提供された全ゲノムの増幅が達成される。さらに、本実施例は核酸サンプルにおいて提供された全ゲノムの代表的な増幅が、大量に増幅されることを特徴とする。その他の特定の好ましい実施例によれば、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、伸長された部分の一部分のみにハイブリッド形成する。したがって、該当する箇所の特異的な増幅が達成される。
【０１２１】
好ましい１つの実施例によれば、増幅のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、処理されたＤＮＡ鎖に全体的にハイブリッド形成する。この好ましい実施例はすでに、伸長ステップが不必要であるその他の実施例の一部である。本実施例によれば、少なくとも１つの核酸が核酸サンプルの形状として提供され、提供された核酸サンプルは、上述の提供された核酸内のメチル化および非メチル化塩基を区別する酵素または試薬を使用して処理され、処理された核酸は、上述の処理された核酸にハイブリッド形成する、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用して増幅される。好ましい１つの実施例において、上述の少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマーは、グアニンをもたず、アデニン、チミンおよびシトシンを豊富に含む。
【０１２２】
その他の特定の好ましい実施例は、
少なくとも１つの二重鎖ＤＮＡ分子、または少なくとも２本の単鎖ＤＮＡ分子を含むＤＮＡサンプルを提供することと、
提供されたＤＮＡを、単鎖ＤＮＡ分子が提供される、上述のＤＮＡ中のメチル化シトシンと上述のＤＮＡ中の非メチル化シトシンを区別する酵素または試薬で処理することと、
上述の処理された単鎖ＤＮＡ分子のうち少なくとも１つが、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマーによって、または少なくとも１つの追加の処理された単鎖ＤＮＡ分子によって伸長されることと、
少なくとも１つの単鎖ＤＮＡ分子を、処理および伸長の後に増幅することを含む。
【０１２３】
特定の好ましい実施例において、バイサルファイト処理したものを増幅する、上述の含まれるステップは、ｉ）少なくとも１つのＤＮＡ分子を含むＤＮＡサンプルを提供する、ｉｉ）提供されたＤＮＡを、上述のＤＮＡ分子内のメチル化シトシンと、上述のＤＮＡ分子内の非メチル化シトシンを区別する酵素または試薬で処理する、ｉｉｉ）提供され、処理されたＤＮＡのうち少なくとも１本の鎖を、少なくとも１つの単一ヌクレオチドまたはＰＮＡ−モノマーによって伸長する、および、ｉｖ）少なくとも１つの伸長された鎖を含む少なくとも１つの処理されたＤＮＡ分子を増幅する、という順序で行われる。もちろん、追加のステップが、上述のステップの前、途中、または後に含まれてもよい。
【０１２４】
特定の好ましい実施例において、処理されたＤＮＡの少なくとも１本の鎖は、オリゴヌクレオチドまたはキメラオリゴマーの連結によって伸長される。キメラオリゴマーは、少なくとも１つのヌクレオチドがこのキメラオリゴマーの５’または３’側に位置する、ヌクレオチドおよびＰＮＡ−モノマーを含むことを特徴とする。
【０１２５】
特定の好ましい実施例において、処理されたＤＮＡの少なくとも１本の鎖は、第２のＤＮＡ鎖の連結によって伸長される。この第２のＤＮＡ鎖は、提供されたサンプルに由来してもよいし、または本発明の方法中において追加されてもよい。この第２のＤＮＡ鎖は、既知のまたは未知の配列であることができる。これはさらに、内因性（ゲノムの配列は、例えば、しかしこれに限定されないが、ヒトゲノム）であってもよく、または人工であってもよい。好ましくは、上述の第２のＤＮＡ鎖は、第１のバイサルファイト処理した１本のＤＮＡ鎖として、提供された核酸サンプルに由来するバイサルファイト処理した１本のＤＮＡ鎖である。
【０１２６】
好ましい１つの実施例において、少なくとも１つの処理された単鎖ＤＮＡ分子の伸長は、単鎖ＤＮＡリガーゼを含む。
【０１２７】
好ましい１つの実施例によれば、伸長反応は、単鎖ＤＮＡリガーゼを使用して行われる。これは、伸長反応がバイサルファイト処理した単鎖末端が別の末端との連結反応である場合に特に好ましい。好ましくは、単鎖ＤＮＡリガーゼはＣｉｒｃＬｉｇａｓｅTM  ｓｓＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）である。しかし、もちろん、本発明にしたがって、バイサルファイト処理したＤＮＡを連結することができるものに限り、他のリガーゼが使用されてもよい。
【０１２８】
好ましい１つの実施例において、上述のＤＮＡ分子の増幅は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーが、少なくとも部分的に、処理された単鎖ＤＮＡ分子の伸長された部分にハイブリッド形成することを特徴とする。
【０１２９】
特定の好ましい実施例において、伸長されたバイサルファイト処理した単鎖ＤＮＡ分子は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはＰＮＡ−オリゴマーを使用して増幅される。したがって、上述のオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、全体的にまたは部分的に、伸長されたバイサルファイト処理した単鎖ＤＮＡ分子の伸長された部分にハイブリッド形成する。特定の好ましい実施例において、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、伸長された部分に全体的にハイブリッド形成する。したがって、核酸サンプルとともに提供された全ゲノムの増幅が達成される。その他の特定の好ましい実施例によれば、オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、伸長された部分に、部分的にのみハイブリッド形成する。したがって、該当する箇所の特異的な増幅が達成される。特異性は、使用されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴマー、および増幅条件によって、次に決定される。
【０１３０】
好ましい１つの実施例によれば、増幅のための少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーは、バイサルファイト処理した一本のＤＮＡ鎖に全体的にハイブリッド形成する。これは、バイサルファイト処理した単一ＤＮＡ鎖の５’末端側がその３’末端側に連結され、分子内縮合をもたらす実施例に特に好ましい。オリゴヌクレオチドまたはオリゴマーの雑種細胞形成は、したがって、バイサルファイト処理した環状の一本のＤＮＡ鎖内のいかなる場所においても起こる。
【０１３１】
好ましい１つの実施例において、処理された単鎖ＤＮＡ分子は、伸長ステップ中に分子内で連結し、増幅は、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドまたはオリゴマーが、環状の処理された単鎖ＤＮＡ分子の任意の場所においてハイブリッド形成することを特徴とする。本実施例は、核酸サンプル内に提供された全ゲノムの代表的な増幅が、大量に増幅されることを特徴とする
【０１３２】
全ゲノム増幅の調査表は、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．：Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｄｖａｎｃｅｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００２  Ｆｅｂ；１３（１）：６５−７；から得ることができ、これは参照されることで本明細に全体として組み込まれる）。これらの方法によれば、断片はＤＮＡポリメラーゼおよびプライマーを使用して増幅される。このプライマーは、リンカー指定プライマー、ランダムプライマーまたは変性プライマーであってもよい。今までに、異なるＷＧＡ法が説明されている。いわゆるプライマー伸長前増幅（ＰＥＰ）において、増幅は、約１５ヌクレオチドの長さを持つ、オリゴヌクレオチドプライマーのランダムな混合物によって実施される（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．：Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｅｌｌ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：５８４７−５１，１９９２；参照されることで本明細に全体として組み込まれる）。しかし、ＤＯＰ−ＰＣＲ（縮重オリゴヌクレオチドに感作されたポリメラーゼ連鎖反応）においては、縮重プライマーのみが使用される（ｃｆ：Ｔｅｌｅｎｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ−ｐｒｉｍｅｄ  ＰＣＲ：ｇｅｎｅｒａｌ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔ  ＤＮＡ  ｂｙ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｒｉｍｅｒ；Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １３：７１８−２５，１９９２，参照されることで本明細に全体として組み込まれる）。その他のＷＧＡ方法は、いわゆるｌｉｎｋｅｒ／ａｄａｐｔｏｒ−ＰＣＲである。ここで、リンカーは断片に連結される。続く増幅において、プライマーが使用され、これは特異的にリンカーに結合する（ｓｕｒｖｅｙ  ｉｎ：Ｃｈｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｎｅｌｓｏｎ：Ｗｈｏｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｒｉｍｅｒ  ａｌｌｏｗｓ  ｈｕｎｄｒｅｄｓ  ｏｆ  ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ  ｔｏ  ｂｅ  ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ  ｏｎ  ｌｅｓｓ  ｔｈａｎ  ｏｎｅ  ｎａｎｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９３：１４６７６−９，１９９６，参照されることで本明細に全体として組み込まれる）。ＰＣＲに基づく上記のＷＧＡ法は、しかし、いくつかの欠点を持つ。例えば、多数の非特異増幅アーチファクトが起こることがある。さらに、全ゲノム領域の不完全な被服がしばしば発生する。さらに、部分的に、未満の長さを持つ短いＤＮＡ断片のみが生成される。（ｃｆ：Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．：Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９９：５２６１−６，２００２，参照されることで本明細に全体として組み込まれる）。全ゲノム増幅のもっとも強力な方法は、したがって、現在においては、等温''Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ''（ＭＤＡ、ｃｆ：Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００２  ａｓ  ａｂｏｖｅ；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ６，１２４，１２０）である。ＤＮＡは、ランダムプライマーおよびＤＮＡポリメラーゼと反応する。ここで、増幅中にＤＮＡ二本鎖の非テンプレート鎖に取って代わることのできるポリメラーゼが使用される（例：φ２９ポリメラーゼ）。置換された鎖は、かわりに更なるプライマーの伸長のマトリクスとして機能する。この方法を用いることにより、５，０００以上の増幅が可能である。生成物の長さの平均は１０ｋＢ以上であり、増幅は、断片の完全なプールにわたり、ある程度均一に割り当てられる。ＭＤＡの市販キットは、現在において、２つの供給業者から入手可能である（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製「ＧｅｎｏｍｉＰｈｉ」、ｗｗｗ４．ａｍｅｒｓｈａｍｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ．ｃｏｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔａｇｉｎｇ社製「Ｒｅｐｌｉ−ｇ」、ｗｗｗ．ｍｏｌｅｃｕｌａｒｓｔａｇｉｎｇ．ｃｏｍ）。
【０１３３】
特定の好ましい実施例において、全ゲノム増幅はリンカー／アダプターＰＣＲを使用することによって達成される。その他の特定の好ましい実施例によれば、全ゲノム増幅は多置換増幅を使用することによって達成される。
【０１３４】
本明細に記載の実施例は、バイサルファイト処理後のＤＮＡの全ゲノム増幅が可能であるという利点を有する。潜在的な問題は、バイサルファイト処理が、穏やかなものであっても、処理されたＤＮＡの完全性に負の効果を与えるということである。言い換えれば、バイサルファイトで処理されたＤＮＡ分子はサブフラグメントに断片化される。これらのサブフラグメントは、寸法が小さいことと、通常、遠い距離においてのみ、ゲノムＤＮＡに結合するために全ゲノム増幅に使用される、ランダムプライマー（オリゴヌクレオチドまたはオリゴマー）の特性のために、増幅することが困難である。さらに代表的であることと、さらに多量の増幅されたＤＮＡをもたらすことを特徴とする、これまでよりずっとよい全ゲノム増幅は、２つの特定の好ましい実施例によって達成される。第１の特定の好ましい実施例によれば、バイサルファイト処理の前に、二重鎖ＤＮＡ分子の単鎖の１つまたは両方に、好ましくは末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）活性を使用して、ヌクレオチドが加えられる。バイサルファイト処理後、ＤＮＡは加えられたヌクレオチドに特異的なプライマーを使用して増幅される。例えば、ポリｄＡ−テイルが加えられるときは、ポリｄＴプライマーが使用される。第２の特定の実施例によれば、二重鎖ＤＮＡ分子のバイサルファイト処理によって、単鎖バイサルファイト変換されたＤＮＡ分子が提供される。この１本のＤＮＡ鎖は次に、ａ）分子内で別の（少なくとも１つの）同じ手段で提供された一本のバイサルファイト処理したＤＮＡ鎖と連結して、伸長された１本のＤＮＡ鎖をもたらす、ｂ）その５’側をその３’側と連結することにより分子内で連結し、環状の単鎖ＤＮＡ分子をもたらす、またはｃ）伸長された１本のＤＮＡ鎖が環状である、ａ）とｂ）の組み合わせである。連結後、単鎖ＤＮＡ分子はランダムプライマーによって増幅される。単鎖ＤＮＡ分子の引き伸ばしのため、ポリメラーゼはもはやバイサルファイト処理したＤＮＡに結合および増幅することができない。言い換えれば、ポリメラーゼは単にバイサルファイト処理した非伸長ＤＮＡに比べ、より高いプロセッシビティを有する。また、分子間の鎖への連結も、断片が効果的に増幅され、雑種細胞となるランダムプライマーはごくわずか、またはなくなる点において利点である。
【０１３５】
１つの実施例において、本発明の方法は、遠隔サンプルのＤＮＡ内において、少なくとも１つのシトシンのメチル化状態、メチル化パターン、またはその両方を決定する、上記に記載の方法であって、
遠隔サンプルのＤＮＡ内において、各シトシンが限定されたところに位置する、少なくとも１つのシトシンのメチル化状態を決定することと、
遠隔サンプルのＤＮＡ内において、メチル化パターンを決定することとのうち、少なくとも１つを含む方法である。
【０１３６】
１つの実施例によれば、上記に記載の実施例のうち少なくとも１つが、遠隔サンプルのＤＮＡ内における少なくとも１つのＣｐＧの位置のメチル化状態、遠隔サンプルのＤＮＡ内におけるメチル化パターン、またはその両方の決定に使用され、
遠隔サンプルのＤＮＡ内において、各ＣｐＧの位置が限定されたところに位置する、少なくとも１つのＣｐＧの位置のメチル化状態を決定することと、
遠隔サンプルのＤＮＡ内において、メチル化パターンを決定することのうち、少なくとも１つをさらに含む。
【０１３７】
１つの実施例において、本発明の方法は、メチル化状態、メチル化パターン、またはその両方をを決定する方法であって、メチル化状態、メチル化パターン、またはその両方の決定は、増幅法、ＰＣＲ法、等温増幅法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、メチル化特異的増幅法、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）法、ネステッドＭＳＰ法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法、検出法、アガロースゲル、アガロースゲルの染色、メチル化特異的検出法、バイサルファイトシークエンス法、ＤＮＡアレーを使用した検出、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用した検出、ＣｐＧ島マイクロアレイを用いた検出、制限酵素を用いた検出、同時メチル化特異的増幅および検出法、ＣＯＢＲＡ法、リアルタイムＰＣＲ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTMリアルタイムＰＣＲ法、ＭＳＰ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM  ＡｌｇｏTM法、ＱＭ法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、ＭＳＰ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、メチル感受性プライマー伸長法、およびＭｓ−ＳＮｕＰＥ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法を含む群から選択された、少なくとも１つの方法の使用を含む。
【０１３８】
１つの実施例によれば、少なくとも１つのＣｐＧの位置のメチル化状態の決定、少なくとも１つのメチル化パターンの決定、またはその両方は、増幅法、ＰＣＲ法、等温増幅法、ＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、メチル化特異的増幅法、ＭＳＰ（メチル化特異的ＰＣＲ）法、ネステッドＭＳＰ法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法、検出法、アガロースゲル、アガロースゲルの染色、メチル化特異的検出法、バイサルファイトシークエンス法、ＤＮＡアレーを使用した検出、オリゴヌクレオチドマイクロアレイを使用した検出、ＣｐＧ島マイクロアレイを用いた検出、制限酵素を用いた検出、同時メチル化特異的増幅および検出法、ＣＯＢＲＡ法、リアルタイムＰＣＲ、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTMリアルタイムＰＣＲ法、ＭＳＰ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM  ＡｌｇｏTM法、ＱＭ法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、ＭＳＰ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法、メチル感受性プライマー伸長法、およびＭｓ−ＳＮｕＰＥ（Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法のうち、少なくとも１つの方法またはその組み合わせの使用を含む。
【０１３９】
１つの実施例によれば、増幅法はどのような増幅法でもよい。当業者であれば、適切な増幅法に精通している。好ましい１つの実施例によれば、増幅法はＰＣＲ法である。当業者であれば、本発明にしたがって使用することのできる適切なＰＣＲ法を知っている。好ましい１つの実施例によれば、増幅法は等温増幅である。本発明による適切な増幅法の使用は、当技術分野で周知である。かかる方法は、例えば、しかしこれに限定されないが、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ法である。好ましい１つの実施例によれば、増幅法はＮＡＳＢＡ法である。ＮＡＳＢＡ法は、逆転写酵素、ＲＮＡポリメラーゼおよびＲＮａｓｅの使用を含むＲＮＡ−ＤＮＡベースの増幅法である。当業者であれば、本発明にしたがって使用することのできるＮＡＳＢＡ法を心得ている。好ましい１つの実施例によれば、増幅法はＬｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ法である。概して、これらはリガーゼの使用に基づく増幅法である。当業者であれば、本発明にしたがって使用することのできる適切なＬＣＲを知っている。
【０１４０】
１つの実施例によれば、増幅法はメチル化特異的増幅である。適切なメチル化特異的増幅法は、同業者に周知である。好ましい１つの実施例によれば、メチル化特異的な増幅法は、Ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＰＣＲ（ＭＳＰ）法である。ＭＳＰ法は、ＣｐＧ島内の実質的にあらゆるＣｐＧ部位群のメチル化状態を、メチル化感受性制限酵素の使用に関わらず（Ｈｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：９８２１−９８２６、１９９６；ＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｎｏ．５，７８６，１４６；これらの参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）評価することを可能にする方法である。つまり、ＤＮＡは、メチル化シトシンを除き、すべての非メチル化シトシンをウラシルに変換する亜硫酸水素ナトリウムによって修飾され、続いてメチル化対非メチル化ＤＮＡに特異的なプライマーで増幅される。ＭＳＰプライマー対は、バイサルファイト処理したＣｐＧ  ジヌクレオチドにハイブリッド形成する少なくとも１つのプライマーを含む。したがって、上述のプライマーの配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドを含む。非メチル化ＤＮＡに特異的なＭＳＰプライマーは、ＣｐＧ内のＣ位置の３’位置に「Ｔ」を含む。したがって、好ましくは、上述のプライマーの塩基配列は、バイサルファイト変換された核酸配列にハイブリッド形成する、少なくとも９ヌクレオチドの長さを持つ配列を含むことが必要とされ、上述のオリゴマーの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド含む。ＭＳＰは少量のＤＮＡのみを必要とし、得られたＣｐＧ島遺伝子座の０．１％メチル化対立遺伝子に対し高感度である。本明細に記載のバイサルファイト処理および増幅法は、この検出法と組み合わせて使用されることができる。
【０１４１】
好ましい１つの実施例によれば、増幅はネステッドＭＳＰ法である。ネステッドＭＳＰ法は、原則的にＷＯ  ０２／１８６４９およびＵＳ  ２００４００３８２４５（これらの参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）の記述にしたがって行われる。このＭＳＰ法は、ＣＧおよびＴＧ位置を十分に区別するためにＭＳＰプライマーの高い特異性を必要とすることと、独自の制限酵素認識部位を作るために、不一致を許容する、明らかな矛盾を考察する。
これは、該当する遺伝領域の複製回数を拡大することを含む。したがって、ポリメラーゼ連鎖反応は、該当するメチル化が存在する、上述の領域の一部分を増幅するために使用される。これにより、増幅生成物が生成される。メチル化の存在を検出するため、上述の生成物の１アリコートが、第２のメチル化特異的、ポリメラーゼ連鎖反応に使用される。言い換えれば、メチル化特異的なＰＣＲに先立って非メチル化特異的ＰＣＲが実施される。
【０１４２】
好ましい１つの実施例によれば、増幅法はＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法である。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法は、原則的にＷＯ  ０２／０７２８８０およびＣｏｔｔｒｅｌｌ  ＳＥ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４  Ｊａｎ  １３；３２（１）：ｅ１０（これらの参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）の記述にしたがって行われる。この方法は、ＰＣＲプライマーと同時にバイサルファイト処理したテンプレート核酸にハイブリッド形成される、阻害するプローブオリゴヌクレオチドの使用を含む。好ましくは、阻害するオリゴヌクレオチドは、塩基配列が化学処理した核酸配列にハイブリッド形成する、少なくとも９ヌクレオチドの長さを持つ配列を含むことを特徴とする。これにより、上述の阻害オリゴヌクレオチドの塩基配列は、少なくとも１つのＣｐＧ、ＴｐＧまたはＣｐＡジヌクレオチドを含む。テンプレート核酸の増幅は、阻害プローブの相補的配列がテンプレート内に存在する場合、抑圧される。かかる場合、増幅は阻害プローブの５’位置において終了する。阻害プローブは、メチル化状態に特異的な手段において、バイサルファイト処理した核酸にハイブリッド形成するように意図されてもよい。例えば、非メチル化核酸のポピュレーション内のメチル化核酸は、問題となっている位置において非メチル化される核酸の増幅を抑制することによって検出されることができる。したがって、メチル化核酸の増幅が望まれる場合、阻害プローブは問題となっている位置において、「ＣｐＧ」ではなく「ＣｐＡ」または「ＴｐＡ」を含む。阻害オリゴヌクレオチドの使用には、ポリメラーゼ媒介による増幅の有効な阻害が必要となり、阻害オリゴヌクレオチドはポリメラーゼによって引き伸ばされることはできない。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法によれば、これは、「遊離」ヒドロキシル基以外とともに、３’−デオキシオリゴヌクレオチド、または３’位置で誘導体化したオリゴヌクレオチドであるブロッカーを使用することによって達成される。例えば、しかしこれに限定されないが、３’−Ｏ−アセチルオリゴヌクレオチドは、阻害分子の代表的な好ましいクラスである。
さらに、ポリメラーゼ媒介による阻害オリゴヌクレオチドの分解は除外されねばならない。好ましくは、かかる除外は、ｉ）５’−３’エクソヌクレアーゼ活性の欠乏するポリメラーゼの使用、またはｉｉ）変性阻害オリゴヌクレオチドの使用のうち、いずれかを含む。これらの変性阻害オリゴヌクレオチドは、５’末端において、例えば、チオアート橋を有することを特徴とする。これは、阻害分子をヌクレアーゼ耐性にする。特定の応用は、かかる阻害オリゴヌクレオチドの５’変性を必要としない。例えば、阻害オリゴヌクレオチドの分解は、ブロッカーおよびプライマー結合部位が重複する場合、実質的に除外される。これにより、プライマーの結合は除外される（例：過剰阻害オリゴヌクレオチドの場合）。したがって、ポリメラーゼはプライマーに結合することができず、引き伸ばされる。プライマーを伸長するポリメラーゼがないため、阻害オリゴヌクレオチドは分解される。本発明および本明細に記載の目的のためのＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法の特に好ましい実施例は、阻害オリゴヌクレオチドとして、ペプチド核酸（ＰＮＡ）オリゴマーの使用を含む。かかるＰＮＡ阻害オリゴマーは、ポリメラーゼによって分解も伸長もされないため、理想的には適している。
【０１４３】
１つの実施例によれば、検出法はどのような検出法であってもよい。当業者は、適切な検出法を知っている。好ましくは、検出法は、蛍光染料、非蛍光染料、質量ラベル、寸法による分離、または重量による分離の使用を含むどのような検出法であってもよい。例えば、しかしこれに限定されないが、検出法は、アガロースゲル内での寸法による分離、続いて蛍光染料を使用したＤＮＡの染色である。好ましい１つの実施例によれば、検出法はメチル化特異的検出である。当業者は、適切なメチル化特異的検出法を知っている。好ましい１つの実施例によれば、メチル化特異的検出法はバイサルファイトシークエンス法である。バイサルファイトシークエンス法は、原則的にＦｒｏｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１８２７−１８３１，１９９２の記述にしたがって行われる。バイサルファイトシークエンス法は、バイサルファイト処理したゲノムＤＮＡの事前に増幅された断片のシークエンシングが行われる方法である。バイサルファイト処理したＤＮＡはシークエンシングの前に増幅されるため、本明細に記述の増幅法がこの検出法と組み合わせて使用されてもよい。バイサルファイトシークエンシングの結果は、ＥＰ  ０２０９０２０３．７（本引用参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）の記載にしたがって原則的に分析されることがさらにとりわけ好ましい。すなわち、この方法によれば、１つ以上の塩基のエレクトロフェログラムを使用することにより、シトシンのメチル化の度合いが決定される。これにより、検出された塩基のエレクトロフェログラムの下部が算出される。メチル化の度合いは、この値を非メチル化シトシンのために得られた値と分析されるシトシン位置の値と比較することにより、次に推定される。よりよい結果のために、バイサルファイト処理のシトシンからウラシルへの転換率および／またはエレクトロフェログラム信号の標準化の決定および考慮が好都合である。
【０１４４】
好ましい１つの実施例によれば、検出法はＤＮＡアレーを用いた検出法である。当業者であれば、多くの適したＤＮＡアレーを知っている。好ましくは、ＤＮＡアレーは結合するか、別の方法で固相と関連するＤＮＡ分子を含む。アレーは、例えば、しかしこれに限定されないが、ＤＮＡ分子が、長方形または六方格子の形状で固相上に配列されることを特徴とすることができる。これにより、固相は、シリコン、ガラス、ポリスチレン、アルミニウム、鋼、鉄、銅、ニッケル、銀、金、ニトロセルロース、または、例えば、しかしこれに限定されないが、ナイロンなどのプラスチックを含む群から選択される少なくとも１つの位相である。しかし、上述の材料の組み合わせも考えられる。検出には、アレー上にハイブリッド形成されたＤＮＡが、好ましくは蛍光染料で標識化される。かかる標識化は、例えば、しかしこれに限定されないが、Ｃｙ３およびＣｙ５染料のＤＮＡ断片の５’−ＯＨへの単純な付着である。ハイブリッド形成されたＤＮＡの蛍光の検出は、例えば、しかしこれに限定されないが、共焦点顕微鏡を介して行われてもよい。
【０１４５】
特定の好ましい実施例において、検出法はオリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いた検出法である。オリゴマーアレーの製造に関する従来技術の概要は、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓの特別版（Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ，  Ｖｏｌｕｍｅ  ２１，Ｊａｎｕａｒｙ  １９９９，およびそれに引用される参考文献、この参照はその全体およびそれに引用される参照によって組み込まれる）から集めることができる。
【０１４６】
特定の好ましい実施例において、検出法は、ＣｐＧ−ｉｓｌａｎｄ−マイクロアレイを用いた検出法である。これにより、固定化した、または関連するアレーのＤＮＡは、ＣｐＧ島に由来する配列を含む。
【０１４７】
特定の好ましい実施例において、検出法は、ＷＯ  ９９／２８４９８、ＷＯ  ０１／３８５６５、またはＷＯ  ０２／１８６３２（これらの参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）に原則的に記載のＤＮＡアレーを用いた検出法である。
【０１４８】
好ましい１つの実施例によれば、検出法は制限酵素を用いた検出法である。当業者は適切な方法に精通している。
【０１４９】
好ましい１つの実施例によれば、メチル化特異的な増幅および検出は、同時に行われる。適切な方法は、当業者に知られている。特定の好ましい実施例において、同時メチル化特異的増幅および検出の方法は、ＣＯＢＲＡ法である。ＣＯＢＲＡ法は、少量のゲノムＤＮＡにおける特異的な遺伝子座のＤＮＡメチル化レベルの決定に有用な量的メチル化法である。（Ｘｉｏｎｇ＆Ｌａｉｒｄ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：２５３２−２５３４，１９９７，本参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）。ＣＯＢＲＡ法によれば、バイサルファイト処理されたＤＮＡのＰＣＲ生成物中におけるメチル化依存の配列の違いを明らかにするために、制限酵素での消化が使用される。メチル化依存配列の違いは、まずバイサルファイト処理によってゲノムＤＮＡに導入される。メチル化非特異プライマーを使用した、バイサルファイト変換されたＤＮＡのＰＣＲ増幅が次に実施され、続いて制限エンドヌクレアーゼ消化、ゲル電気泳動、および特異的な標識化された雑種細胞形成プローブを使用した検出が行われる。元のＤＮＡサンプルのメチル化レベルは、ＤＮＡメチル化レベルの広範囲にわたり、線形量的な方法で、消化された、および消化されていないＰＣＲ生成物の相対量で表される。さらに、バイサルファイト転換されたＤＮＡから増幅されたＰＣＲ生成物の制限酵素での消化もまた、Ｓａｄｒｉ＆Ｈｏｒｎｓｂｙ（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：５０５８−５０５９，１９９６，本参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）によって説明される方法で使用される。本明細に記載のバイサルファイト処理および増幅法は、この検出法と組み合わせて使用されることができる。
【０１５０】
特定の好ましい実施例において、同時メチル化特異的増幅および検出の方法は、リアルタイムＰＣＲ法である。当業者は、適切なリアルタイムＰＣＲ法を知っている。特定の好ましい実施例において、リアルタイムＰＣＲ法は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法である。ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法は、これにより、上記に記載のとおり、リアルタイムＰＣＲ設備を使用して実施される。
【０１５１】
特定の好ましい実施例において、リアルタイムＰＣＲ法はＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法である。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法は、ＰＣＲステップ後にそれ以上の操作を必要としない、蛍光ベースのリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎTM）技術を利用したハイスループット数量メチル化法である（Ｅａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５９：２３０２−２３０６，１９９９）。つまり、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMプロセスは、バイサルファイト反応において、標準的な手順によるメチル化依存配列の違いの混合プールに変換された、ゲノムＤＮＡの混合サンプルから開始される。続いて蛍光ベースのＰＣＲが、「非バイアス」（既知のＣｐＧメチル化部位と重複しないプライマーと）ＰＣＲ反応、または「バイアス」（既知のＣｐＧジヌクレオチドと重複するＰＣＲプライマーと）反応のいずれかにおいて実施される。配列の識別は、増幅プロセスのレベル、または蛍光検出プロセスのレベル、またはその両方において発生する。
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法は、ゲノムＤＮＡサンプル中のメチル化パターンの定量試験として使用されてもよく、配列の識別はプローブ雑種細胞形成のレベルにおいて発生する。この定量のバージョンにおいて、ＰＣＲ反応は、蛍光プローブの存在下において、特定の推定メチル化部位に重複する非バイアス増幅を提供する。投入されたＤＮＡの量の非バイアス制御は、いかなるＣｐＧジヌクレオチドの上にも、プライマー、プローブのいずれも覆いかぶさらない反応によって提供される。あるいは、ゲノムのメチル化の定量試験は、バイアスＰＣＲプールを、既知のメチル化部位を「覆わ」ない対照オリゴヌクレオチド（ＭＳＰ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法とも称する蛍光ベース版「ＭＳＰ」技法）、または潜在的なメチル化部位を覆うオリゴヌクレオチドのいずれかとプローブすることによって達成される。
【０１５２】
ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMプロセスは、増幅プロセスにおいて、「ＴａｑＭａｎ(登録商標)」プローブとともに使用されることができる。例えば、二本鎖ゲノムＤＮＡは、バイサルファイトで処理され、ＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブを使用した２回のうち１回のＰＣＲ反応、例えば、バイアスプライマーおよびＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブ、または非プライマーおよびＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブのいずれかにしたがう。ＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブは、ＰＣＲ周期において、フォワードまたはリバースプライマーよりも約１０℃高い温度で溶解するよう、蛍光「レポーター」および「消光剤」分子で二重に標識され、比較的高いＧＣ含量領域に特異的に意図される。これは、ＰＣＲアニーリング／伸長ステップ中にＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブが完全にハイブリッド形成されたままとなることを可能にする。Ｔａｑポリメラーゼは、ＰＣＲ中に新規の鎖を酵素的に合成するため、やがてはアニールしたＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブに到達する。次に、Ｔａｑポリメラーゼ５’から３’エンドヌクレアーゼ活性は、ＴａｑＭａｎ(登録商標)プローブを消化することによってこれに取って代わり、その今消されていない信号の定量的検出のために、リアルタイム蛍光検出システムを使用して、蛍光レポーター分子を放出する。
【０１５３】
同様に適切であるＴａｑＭａｎ(登録商標)検出技法のバリエーションには、二重プローブ技法（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒTM）、蛍光増幅プライマー（ＳｕｎｒｉｓｅTM技法）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ（Ｔｙａｇｉ  Ｓ．，ａｎｄ  Ｋｒａｍｅｒ  Ｆ．Ｒ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４，３０３−３０８，１９９６）、Ｓｏｒｐｉｏｎプライマー（Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１７，８０４−８０７，１９９９）、またはＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ  Ｎｕｃｌｅｉｄ  Ａｃｉｄ）Ｄｏｕｂｌｅ−Ｄｙｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅプローブ（Ｅｘｉｑｏｎ  Ａ／Ｓ）の使用がある。これらすべての技法は、バイサルファイト処理したＤＮＡ、およびさらにＣｐＧジヌクレオチド中におけるメチル化分析に適した方法で適応されることができる。
【０１５４】
本明細に記載のバイサルファイト処理および増幅法は、ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法またはその変形と組み合わせて使用されることができる。
【０１５５】
特定の好ましい実施例において、リアルタイムＰＣＲ法はＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMＡＬＧＯTM法である。ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTMＡＬＧＯTM法は、原則的にＥＰ０４０９０２５５．３（本参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）に記載されたＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法の改良法である。この改良法によれば、メチル化の度合いは、異なるアルゴリズムを用いたプローブの信号強度から算出される。
【０１５６】
特定の好ましい実施例において、リアルタイムＰＣＲ法はＱＭ（定量メチル化）アッセイである。このアッセイはメチル化非特異であり、したがって非バイアスリアルタイムＰＣＲ増幅である。これには、１つはメチル化増幅、２番目は非メチル化増幅のための、２つのメチル化特異的プローブ（ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM）の使用が付随する。この方法により、ａ）メチル化（ＣＧ）から非メチル化（ＴＧ）核酸への割合を決定する、および同時に、ｂ）メチル化核酸の絶対量を決定するために使用することのできる２つの信号が発生する。後のため、既知の量の対照ＤＮＡによるアッセイの較正が必要である。
【０１５７】
好ましい実施例によれば、同時メチル化特異的増幅および検出の方法は、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＰＣＲ法である。Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＰＣＲ法は、抑圧ＰＣＲ法である。これは、原則的にＲａｎｄ  Ｋ．Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，３３（１４），ｅ１２７（本参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）の記述にしたがって行われる。これは、増幅の選択性が単位複製配列の配列に依存する、関連する配列を見分けるＰＣＲ法である。５′の伸長は、関連する単位複製配列の１つにおける、配列に符合する１つの（または両方の）プライマーに含まれる。複製と増幅への取り込み後、この配列は、次に、内部配列へアニールし、ヘアピン構造を形成する用意をする、ループバックをすることができる。この構造は、次に、更なる増幅を妨げる。ゆえに、不一致または配列の不足を含む配列の増幅が影響を受けない一方で、５′の伸長との完全な一致を含む配列の増幅が抑制される。
【０１５８】
特定の好ましい実施例において、同時メチル化特異的増幅と検出の方法は、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＰＣＲ法およびＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法の組み合わせであり、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法とも呼ばれる。
【０１５９】
好ましい実施例によれば、同時メチル化特異的増幅と検出の方法は、ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法である。この方法は、Ｗｈｉｔｃｏｍｂｅ  ｅｔ  ａｌ．：Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＰＣＲ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  ｓｅｌｆ−ｐｒｏｂｉｎｇ  ａｍｐｌｉｃｏｎｓ  ａｎｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９９；１７（８）：８０４−７；Ｔｈｅｌｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．：Ｍｏｄｅ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｔｏ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０００  Ｏｃｔ  １；２８（１９）：３７５２−６１；ＵＳ  ６，３２６，１４５；ＵＳ  ６，３６５，７２９；ＵＳ  ２００３００８７２４０  Ａ１；これらの参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）によって最初に説明された。この方法の数々の実施例は、当業者に周知である。これらすべての方法は、共通して分子内プロービングを有する。いわゆるＨａｉｒｌｏｏｐ変異体によれば、ＳｃｏｒｐｉｏｎTMプライマーは、５’末端において特異的なプローブ配列を保有する。この配列は、ヘアループ様の構造に存在する。蛍光染料および消光剤は、プロービング配列末端の空間的近接に位置する。増幅周期に続く変性後、プローブは同一の鎖の引き伸ばされたプライマー配列上に分子内ハイブリッド形成する。これにより、ヘアループが開き、染料および消光剤は別々になり、よって染料の信号が検出される。
【０１６０】
別のＳｃｏｒｐｉｏｎTM法の変形は、例えば、Ｄｕｐｌｅｘ変形（Ｓｏｌｉｎａｓ  ｅｔ  ａｌ．：Ｄｕｐｌｅｘ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM  ｐｒｉｍｅｒ  ｉｎ  ＳＮＰ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ＦＲＥＴ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１  Ｏｃｔ  １５；２９（２０）：Ｅ９６）であり、またはＵＳ  ６，３２６，１４５およびＵＳ  ２００３００８７２４０（すべての参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）に記載の変形である。
【０１６１】
特定の好ましい実施例において、ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法は、原則的にＷＯ  ０５／０２４０５６（この参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）に記載される方法である。
【０１６２】
特定の好ましい実施例において、同時メチル化特異的増幅と検出の方法は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法およびＳｃｏｒｐｉｏｎTM法の組み合わせであり、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTMＳｃｏｒｐｉｏｎTM法とも呼ばれる。
【０１６３】
特定の好ましい実施例において、同時メチル化特異的増幅と検出の方法は、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTM法とＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法の組み合わせであり、ＨｅａｖｙＭｅｔｈｙｌTMＭｅｔｈｙＬｉｇｈｔTM法とも呼ばれる。
【０１６４】
特定の好ましい実施例において、同時メチル化特異的増幅と検出の方法は、ＭＳＰ法とＳｃｏｒｐｉｏｎTM法の組み合わせであり、ＭＳＰ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法とも呼ばれる。
【０１６５】
特定の好ましい実施例において、同時メチル化特異的増幅と検出の方法は、Ｈｅａｄｌｏｏｐ法とＳｃｏｒｐｉｏｎTM法の組み合わせであり、Ｈｅａｄｌｏｏｐ  ＳｃｏｒｐｉｏｎTM法とも呼ばれる。
【０１６６】
好ましい１つの実施例によれば、同時メチル化特異的増幅と検出の方法は、メチル化特異的プライマー伸長の方法である。当業者は、本発明にしたがって使用することのできる数々の方法を知っている。
【０１６７】
特定の好ましい実施例において、メチル化特異的プライマー伸長の方法はＭｓ−ＳＮｕＰＥ（ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ）法である。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法は、原則的にＧｏｎｚａｌｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（１２），２５２９−２５３１，１９９７およびＵＳ  Ｐａｔｅｎｔ  ６，２５１，５９４（これらの参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）の記述にしたがって行われる方法である。Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ法によれば、該当する領域は、バイサルファイト処理されたＤＮＡからのＰＣＲによって増幅される。ＰＣＲ生成物の精製後、プライマーは分析される位置の前で近接してハイブリッド形成される。プライマーはそして、標識化されたｄＣＴＰまたは異なって標識化されたｄＴＴＰのいずれかとともに、単一ヌクレオチドによって引き伸ばされる。元のＤＮＡ内のシトシンがメチル化された場合、バイサルファイト処理中においてメチル化シトシンがそのままとなるため、ｄＣＴＰは組み込まれる。元のＤＮＡ内のシトシンがメチル化されない別の場合、非メチル化シトシンがバイサルファイト処理によってウラシルに変換され、続くＰＣＲがウラシルをチミンで置換するため、ｄＴＴＰは組み込まれる。異なる標識を検出することにより、ＣｐＧの位置のシトシンがメチル化であるか、または非メチル化であるか見分けられることができる。ＭＳ−ＳＮｕＰＥ法は、定量の態様で実施されることもできる。
【０１６８】
特定の好ましい実施例において、メチル化特異的プライマー伸長の方法は、ＷＯ  ０１／０６２９６０、ＷＯ  ０１／０６２０６４、またはＷＯ  ０１／６２９６１（これらの参照は、参照されることにより全体として組み込まれる）に原則的に記載の方法である。これらのすべての方法は、定量の態様で実施されることができる。ＷＯ  ０１／０６２９６０によれば、伸長されるプライマーは、完全にまたは一部分のみ、該当する位置に、その３’端末とハイブリッド形成する。少なくとも１つのヌクレオチドの伸長は、プライマーが完全にハイブリッド形成する場合においてのみ起こる。ＷＯ  ０１／０６２０６４は、伸長されるプライマーが近接して隣接する、または分析される位置から上限１０個の塩基の距離でハイブリッド形成する方法を開示している。プライマーは次に、少なくとも単一のヌクレオチドによって伸長される。第３の方法は、ＷＯ  ０１／６２９６１に記載されている。この方法によれば、バイサルファイト処理後、２組のオリゴヌクレオチドが増幅されたＤＮＡにハイブリッド形成する。第１の種類のオリゴヌクレオチドは、近接して隣接する、または分析される位置から上限１０個の塩基の距離で５’にハイブリッド形成する。第２の種類のオリゴヌクレオチドは、その５’末端が上述の分析される位置に近接して隣接して３’にハイブリッド形成するよう、増幅されたＤＮＡにハイブリッド形成する。これにより、この２つのオリゴヌクレオチドは、１から１０の範囲のヌクレオチドの溝によって別々にされる。第１の種類のオリゴヌクレオチドは次に、ポリメラーゼを使用して伸長され、２つのオリゴヌクレオチドの間にあるヌクレオチドの数まで追加される。ここで、異なって標識化されたｄＣＴＰおよび／またはｄＴＴＰ含むヌクレオチドが使用される。この２つのオリゴヌクレオチドは、次にリガーゼ酵素を使用して連結される。元のＤＮＡ中のシトシンがメチル化された場合、ｄＣＴＰが組み込まれる。元のＤＮＡ中のシトシンがメチル化されない場合、ｄＴＴＰが組み込まれる。
【０１６９】
もちろん、名前の挙がった方法をさらに発展させた方法、またはその組み合わせである他の類似の方法は、本発明に基づいて使用することができる。
【０１７０】
１つの実施例において、本発明の方法は、上記に記載のマーカーの同定方法であって、
ＣｐＧの位置は１つのＤＮＡ断片に含まれ、シス内で特定され、細胞、細胞群、組織、器官または状態Ａによって特徴付けられる個体に由来するＤＮＡと、細胞、細胞群、組織、器官または状態Ｂによって特徴付けられる個体に由来するＤＮＡ間で異なるメチル化パターンである、少なくとも２つのＣｐＧの位置のメチル化状態を含む、少なくとも１つのメチル化パターンの同定と、
パーセント値がカットオフ値と同等またはそれより大きい場合は状態Ａを示し、パーセント値がカットオフ値より小さい場合は状態Ｂを示し、またはパーセント値がカットオフ値より小さい場合は状態Ａを示し、およびパーセント値がカットオフ値と同等またはそれより大きい場合は状態Ｂを示す、ＤＮＡ断片の混合物内で同定されたメチル化パターンによって特徴付けられたＤＮＡ断片の割合のカットオフ値を選択することをさらに含む方法である。
【０１７１】
１つの実施例によると、マーカーが同定され、それによって本明細書に記載の実施例の少なくとも１つが構成される。マーカー同定は、少なくとも以下の追加ステップを含む。ｉ）少なくとも１つのメチル化パターンを同定するステップ、およびii）ＤＮＡ断片の群内にあるすべてのＤＮＡ断片と比較して、前記の少なくとも１つのメチル化パターンを含むＤＮＡ断片の画分の値域を選択するステップである。したがって、ステップｉ）は、２つの態様において特徴付けられる。まず、メチル化パターンは、少なくとも２つのＣｐＧの位置のメチル化状態を含み、前記ＣｐＧの位置は１つのＤＮＡ断片によって構成され、シスに集中する。当業者が周知のように、シスでの局所化とは対応するＣＧジヌクレオチドが、同じＤＮＡ鎖上で同じ方向性を有することを意味する。２つ目の態様は、Ａによって特徴付けられる細胞、細胞集団、組織、器官または個体から得られるＤＮＡが、状態Ｂによって特徴付けられる細胞、細胞集団、組織、器官または個体から得られるＤＮＡと前記メチル化パターンの１つまたはそれらの組み合わせによって区別可能である点において、前記の少なくとも１つのメチル化パターンを言及する。
【０１７２】
好ましい実施例によると、ステップｉ）は、マーカーが事前に同定したメチル化パターンであることによって特徴付けれらる。したがって、前記パターンは、該当する状態と同様の状態を示すことで知られているかもしれない。
【０１７３】
好ましい実施例によると、ステップii）は、ａ）ＤＮＡ断片の群内にあるすべてのＤＮＡ断片と比較して、前記の少なくとも１つのメチル化パターンを含むＤＮＡ断片の画分を示す値は、値域が状態Ａを示す値と同等またはそれ以上である、およびｂ）前記のＤＮＡ断片の画分を示す値は、値域が状態Ｂを示す値未満であるという点において実現される。
【０１７４】
好ましい実施例によると、ステップii）は、ａ）ＤＮＡ断片の群内にあるすべてのＤＮＡ断片と比較して、前記の少なくとも１つのメチル化パターンを含むＤＮＡ断片の画分を示す値は、値域が状態Ａを示す値より大きい、およびｂ）前記のＤＮＡ断片の画分を示す値は、値域が状態Ｂを示す値未満であるという点において実現される。
【０１７５】
好ましい実施例によると、ステップii）は、ａ）ＤＮＡ断片の群内にあるすべてのＤＮＡ断片と比較して、前記の少なくとも１つのメチル化パターンを含むＤＮＡ断片の画分を示す値は、値域が状態Ａを示す値未満である、およびｂ）前記のＤＮＡ断片の画分を示す値は、値域が状態Ｂを示す値と同等またはそれ以上であるという点において実現される。
【０１７６】
好ましい実施例によると、ステップii）は、ａ）ＤＮＡ断片の群内にあるすべてのＤＮＡ断片と比較して、前記の少なくとも１つのメチル化パターンを含むＤＮＡ断片の画分を示す値は、値域が状態Ａを示す値と同等またはそれ以下である、およびｂ）前記のＤＮＡ断片の画分を示す値は、値域が状態Ｂを示す値より大きいであるという点において実現される。
【０１７７】
ステップii）のこれらの実施例によると、状態Ａ、状態Ｂ、またはその両方は、本明細書に記載の任意の状態となり得る。
【０１７８】
好ましい実施例によると、マーカーを同定するための本明細書に記載の実施例は、約２０％以上の感受性、約３０％以上の感受性、約３５％以上の感受性、約４０％以上の感受性、約５０％以上の感受性、約６０％以上の感受性、約７０％以上の感受性、約８０％以上の感受性、約９０％以上の感受性、約９５％以上の感受性、約９９％以上の感受性、約４０％以上の特異性、約５０％以上の特異性、約６０％以上の特異性、約７０％以上の特異性、約８０％以上の特異性、約８５％以上の特異性、約９０％以上の特異性、約９５％以上の特異性、または約９９％以上の特異性を含む群から選択される少なくとも１つの基準によってマーカーの同定を可能にすることによって特徴付けられる。
【０１７９】
好ましい実施例において、本発明の方法はマーカーを同定する方法であり、前記マーカーの同定は、
約２０％、約３０％、約３５％、約４０％  ％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の感受性、および
約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の特異性のうち、少なくとも１つによって可能となる。
【０１８０】
前記の特に好ましい実施例は、マーカーを同定するいくつかの研究において出願者によって適用された。これらの研究の１つは結腸癌マーカーを同定し、米国６０／６７２，２４２号、米国６０／６７６，９９７号、米国６０／６９７，５２１号および米国６０／７２３，６０２号の題目となった。前記マーカーは、健康な個体から得られた２３３サンプルと結腸直腸癌患者から得られた１２７サンプルのセットにおいて５７％の感受性、９６％の特異性によって、または健康な個体から得られた８３サンプルと結腸直腸癌患者から得られた２０９サンプルのセットにおいて５０％の感受性、９５％の特異性によって特定される。詳細は、米国６０／７２３，６０２号に記載され、参照することにより本明細書と一体となる。米国６０／７２３，６０２号は、前記の発明の特に好ましい実施例が少なくとも、約２０％、約３０％、約３５％、約４０％  ％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の感受性および約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の特異性、またはその両方でマーカーの同定を可能にすることを証明する。当業者が周知のように、感受性および特異性の値は、実施された研究に特異的である。また、互いに独立していて、一方の値を下げることによって他方の値を上げることが可能である。
好ましい実施例によると、本発明の方法は、マーカーを同定する方法であり、マーカーの同定は、
約２０％、約３０％、約３５％、約４０％  ％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の感受性、および
約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の特異性によって可能となる。
【０１８１】
好ましい実施例によると、マーカーを同定するための本明細書に記載の実施例は、約２０％、約３０％、約３５％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の感受性、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の特異性によってマーカーの同定を可能にするということによって特徴付けられる。
【０１８２】
特に好ましい実施例において、本発明の方法はマーカーの同定方法であり、結腸癌マーカーは、
少なくとも約２５％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の感受性、および
少なくとも  約６５％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の特異性のうち、少なくとも１つによって特徴付けられ、同定される。
【０１８３】
好ましい実施例によると、結腸癌マーカーは同定され、前記マーカーは、少なくとも約２５％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の感受性、および
少なくとも  約６５％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の特異性のうち、少なくとも１つの特性を有する。
【０１８４】
特に好ましい実施例において、本発明の方法はマーカーの同定方法であり、結腸癌マーカーは、
少なくとも  約２５％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の感受性、および
少なくとも  約６５％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の特異性によって特徴付けられ、同定される。
【０１８５】
好ましい実施例によると、結腸癌マーカーは同定され、前記マーカーは、少なくとも  約２５％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の感受性、少なくとも  約６５％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％の特異性を有する。
【０１８６】
好ましい実施例において、本発明の方法はカットオフ値を選択することによって特徴付けられるマーカーの同定方法であり、前記カットオフ値は、
約１５％、約２５％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％以上の感受性、および
約２０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の特異性のうち、少なくとも１つの基準によって選択される。
【０１８７】
好ましい実施例によると、マーカーは、
約１５％、約２５％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％以上の感受性、および
約２０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の特異性のうち、少なくとも１つによって値域を選択することによって同定される。
【０１８８】
好ましい実施例によると、マーカーは、約１５％、約２５％、約３５％、約４０％、約５０％、約５５％、約６０％、約７０％、約８０％、約８５％、約９０％、または約９５％以上の感受性、約２０％、約４０％、約５０％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、または約９９％以上の特異性によって閾値を選択することによって同定される。
【０１８９】
好ましい実施例において、本発明の方法は、状態を診断する、状態の予後を提供する、状態の治療反応を予測する、状態の素因を決定する、状態の素因を予測する、状態の進行を決定する、状態の進行を予測する、状態を等級分けする、状態を病期分類する、状態の区分、状態の特性化、またはそれらの組み合わせのうち、少なくとも１つのためのマーカーの同定方法であり、前記状態とは健全な状態または有害事象であり、前記の１つは、ＤＮＡ断片の混合物内で事前に同定したメチル化パターンによって特徴付けられたＤＮＡ断片に対するパーセント値から推定され、前記ＣｐＧの位置の対応するメチル化状態は、本明細書に記載される実施例によって測定され、
パーセント値が選択されたカットオフ値と同等またはそれ以上の場合の状態Ａに対する前記の１つを推定する、
パーセント値が選択されたカットオフ値未満の場合の状態Ｂに対する前記の１つを推定する、
パーセント値が選択されたカットオフ値より大きいの場合の状態Ｂに対する前記の１つを推定する、
パーセント値が選択されたカットオフ値と同等またはそれ以下の場合の状態Ａに対する前記の１つを推定することのうち、少なくとも１つをさらに含む。
【０１９０】
好ましい実施例によると、マーカーは、状態を診断する、状態の予後を提供する、状態の治療反応を予測する、状態の素因を決定する、状態の素因を予測する、状態の進行を決定する、状態の進行を予測する、状態を等級分けする、状態を病期分類する、状態の区分、状態の特性化、またはそれらの組み合わせを含む群から選択される少なくとも１つの適用または使用に対して同定される。本実施例は、
ｉ）前記状態は健全な状態または有害事象である、
ii）前記少なくとも１つの事前に同定したメチル化パターンのＣｐＧの位置のメチル化状態は個体由来のＤＮＡサンプルに対して決定しているため、決定は好ましくは、本明細書に記載の実施例にしたがって実行される、
iii）ＤＮＡ断片の割合を決定し、前記断片は事前に同定したメチル化パターンを含むという点において特徴付けられる、
iv）前記事前に選択した閾値で決定したＤＮＡ断片の割合を比較することによって、状態を診断する、状態の予後を提供する、状態の治療反応を予測する、状態の素因を決定する、状態の素因を予測する、状態の進行を決定する、状態の進行を予測する、状態を等級分けする、状態を病期分類する、状態の区分、状態の特性化、またはそれらの組み合わせを行うことによって特徴付けられる。特に好ましい実施例によると、状態を診断する、状態の予後を提供する、状態の治療反応を予測する、状態の素因を決定する、状態の素因を予測する、状態の進行を決定する、状態の進行を予測する、状態を等級分けする、状態を病期分類する、状態の区分、状態の特性化、またはそれらの組み合わせは、前記ＤＮＡ断片の割合が事前に選択して値域以上、同等またはそれ以上、同等、同等またはそれ以下、またはそれ未満であるという決定によって決定される。
【０１９１】
好ましい実施例において、本発明の方法はマーカーの同定方法であり、状態Ａ、状態Ｂ、またはその両方は健全な状態または少なくとも１つの有害事象であり、前記有害事象は、望ましくない薬物間相互作用、癌、増殖性疾患またはそれに伴う関連疾患、ＣＮＳ機能不良、損傷または疾患、攻撃性の症状または行動障害、脳障害の臨床的、心理的および社会的因果関係、精神障害および人格障害、認知症および／または関連症候群、消化管機能不全の循環器疾患、呼吸器系の機能不良、損傷または疾患、病変、炎症、感染、免疫および／または回復、発育過程異常としての体の機能不良、損傷または疾患、皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能不良、損傷または疾患、内分泌および代謝の機能不良、損傷または疾患、および頭痛または性的機能不良を含む群から選択される少なくとも１つのカテゴリーを含む。
【０１９２】
マーカーの同定の好ましい実施例によると、状態Ａ、状態Ｂ、またはその両方または一般の状態は、健全な状態または少なくとも１つの有害事象である。したがって、前記有害事象は、望ましくない薬物間相互作用、癌、増殖性疾患またはそれに伴う関連疾患、ＣＮＳ機能不良、損傷または疾患、攻撃性の症状または行動障害、脳障害の臨床的、心理的および社会的因果関係、精神障害および人格障害、認知症および／または関連症候群、消化管機能不全の循環器疾患、呼吸器系の機能不良、損傷または疾患、病変、炎症、感染、免疫および／または回復、発育過程異常としての体の機能不良、損傷または疾患、皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能不良、損傷または疾患、内分泌および代謝の機能不良、損傷または疾患、および頭痛または性的機能不良を含む群から選択される少なくとも１つのカテゴリーを含む。
【０１９３】
好ましい実施例によると、本発明の方法は対照を含む。
【０１９４】
特に好ましい実施例によると、遠隔サンプルの収集は、対照基準の選択および事前決定を含む。好ましくは、対照基準の少なくとも１つは、
１．サンプル選択基準：定義された疾患を有する患者から選択されたサンプル、健康な個体から選択されたサンプル、定義された疾患と類似の疾患を有する患者から選択されたサンプル、および定義された疾患と類似しない疾患を有する患者から選択されたサンプル。
２．定義された疾患を有する患者由来のサンプルをさらに特定する基準。当該基準は、例えば、これらに限定されないが、等級分け、病期分類、分類、区分、特性、症状、過去の治療、病歴の有無、組織学的分析の有用性である。
３．一般的基準：ａ）サンプルは、例えばこれらに限定されないがＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎）またはＨＣＶ（Ｃ型肝炎）などの感染症にかかっている患者あるいは個体由来のサンプルである場合、除外される。Ｂ）サンプルは、
所定の最低年齢である個体由来である場合、
医療記録が得られる患者由来である場合、
またはその両方、
の場合のみ対象となる。
４．健康な個体由来のサンプルをさらに特定する基準：
器官の組織学的異常がない、または定義された疾患が通常影響を与える、
未定の期間内に定義された疾患の病歴がない、
個体由来のサンプルのみが対象となる。
５．定義された疾患と類似の疾患を有する患者から選択されたサンプルをさらに特定する基準：本明細書によって、何が類似の疾患かを設定する。例えば、これらに限定されないが、等級分け、病期分類、分類、区分、特性、症状、過去の治療、病歴の有無、組織学的分析の有用性などの所定の基準によって特徴付けられる患者のサンプルのみが対象となる。
６．定義された疾患と類似しない疾患を有する患者から選択されたサンプルをさらに特定する基準：
疾患が分析時に活性している、
所定の期間内に定義された疾患の病歴がない、
患者のサンプルのみが対象となる。類似しない疾患が定義された疾患と同じ組織、または器官に影響を与えている場合、例えば、これらに限定されないが、等級分け、病期分類、分類、区分、特性、症状、過去の治療、病歴の有無、組織学的分析の有用性などの所定の基準によると、サンプルの更なる選択が好ましい。
【０１９５】
特に好ましい実施例によると、遠隔サンプルのＤＮＡ単離、バイサルファイト処理およびメチル化分析は、対照基準の選択および事前決定を含む。好ましくは、表１に挙げられる対照基準の少なくとも１つを使用する。
【０１９６】
表１：本発明の方法に適する対照
2008537888.tif 000004
【０１９７】
バッチ対照という用語は、これにより、表１に特定されるように、任意の対照を言及することがあり、一連の遠隔サンプルに含まれ、前記一連のサンプルは本発明によって同時に処理される。
【０１９８】
当業者は、上記実施例の特定の対照の適用方法を周知である。
【０１９９】
キット
本発明の目的は、
容器と、
尿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
血漿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
ＤＮＡ単離のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
ＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
メチル化状態またはメチル化パターン決定のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
本発明の実施例を実行するための説明と、
を含む、キットでもある。
【０２００】
好ましいキットは、
容器と、
ＤＮＡ単離のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
ＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
メチル化状態またはメチル化パターン決定のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
発明の実施例を実行するための説明と、
を含む。
特定の好ましいキットは、ｉ）尿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせ、ii）血漿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせ、およびiii）バイサルファイト変換したＤＮＡの増幅のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせのうち、少なくとも１つをさらに含む。
【０２０１】
特定の好ましいキットは、容器、血漿含有サンプルまたは尿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせ、ＤＮＡ単離のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせ、ＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせ、バイサルファイト変換したＤＮＡの増幅のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせ、メチル化状態またはメチル化パターン決定のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせ、発明の実施例を実行するための説明を含む。
【０２０２】
もう１つの特定の好ましいキットは、容器およびバイサルファイト変換したＤＮＡの増幅のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせを含む。したがって、バイサルファイト変換したＤＮＡは、単にバイサルファイト処理したまたはバイサルファイト処理し、かつ精製した（脱スルホン化）ＤＮＡであり得る。
【０２０３】
本明細書に記載の特定のキットによると、バイサルファイト変換したＤＮＡの増幅のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせは、ｉ）リガーゼ活性、末端トランスフェラーゼ活性、またはその両方、ii）ポリメラーゼ活性、iii）少なくとも１つのプライマー、およびiv）少なくとも１つのヌクレオチド、少なくとも１つのオリゴマー、またはその両方を含む。
【０２０４】
好ましくは、本明細書に記載の特定のキットによると、ｉ）リガーゼ活性は、本明細書で特定される任意のリガーゼ、特に単鎖ＤＮＡリガーゼであり、ii）末端トランスフェラーゼ活性は、本明細書で特定される任意のトランスフェラーゼ活性、特に末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼであり、iii）ポリメラーゼ活性は、増幅に有用な酵素、特にＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ転写酵素、追加酵素としてＲＮＡｓｅと結合してのＲＮＡ転写酵素、またはリガーゼであり、iv）１つまたは複数のプライマーは、本明細書で特定されるプライマー、特にランダムなプライマー、グアニン欠乏のランダムなプライマー、特異的プライマー、遺伝子特異的プライマー、または伸長特異的プライマーであり、ｖ）オリゴマーは、本明細書で特定されるオリゴマー、特にオリゴヌクレオチドまたは少なくとも１つのＰＮＡ‐モノマーおよび５’または３’末端ヌクレオチドのキメラオリゴマーである。遺伝子特異的プライマーは、厳しいまたは適度に厳しい状態で、最初に提供されるＤＮＡサンプル由来のＤＮＡ分子上にハイブリッド形成が可能な任意のプライマーである。それとは対照的に、伸長特異的プライマーは、厳しいまたは適度に厳しい状態で、ＤＮＡ分子の伸長した部分上にハイブリッド形成が可能な任意のプライマーであり、それによって伸長は、本明細書に記載されるように実現される。もちろん、一部分は伸長した部分に特異的で、一部分は提供されるバイサルファイト処理したＤＮＡ分子に特異的なプライマーも含まれる。もちろん、好ましいキットは、すべてではないが、前記成分の１つ以上を含むだけでよい。
【０２０５】
好ましいキットにおいて、
リガーゼ活性は、単鎖ＤＮＡリガーゼである、
末端トランスフェラーゼ活性は、末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼである、
ポリメラーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ転写酵素、追加酵素としてＲＮＡｓｅと結合してのＲＮＡ転写酵素、またはリガーゼである、
１つまたは複数のプライマーは、ランダムなプライマー、グアニン欠乏のランダムなプライマー、特異的プライマー、遺伝子特異的プライマー、または伸長特異的プライマーである、
オリゴマーは、オリゴヌクレオチドまたは少なくとも１つのＰＮＡ‐モノマーおよび５’または３’末端ヌクレオチドのキメラオリゴマーである、のいずれか、または
それらの組み合わせである。
【０２０６】
特定の好ましいキットは、本明細書に記載の方法によって、バイサルファイト処理したＤＮＡの増幅を実行するための説明またはマニュアルも含む。
【０２０７】
容器およびバイサルファイト変換したＤＮＡの増幅のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせを含む好ましいキットは、ＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせをさらに含む。好ましくは、これは、特にバイサルファイト処理したＤＮＡの脱スルホンのために精製するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせも含む。
【０２０８】
特定の好ましいキットによると、当該のＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせは、本明細書で特定されるバイサルファイト試薬を含み、本明細書で特定されるラジカルスカベンジャーまたはラジカルスカベンジャー溶液を含む。好ましくは、特定の好ましいキットは、例えば、ＭｉｃｒｏｃｏｎTMろ過装置、塩基性試薬または本明細書で特定される水酸化ナトリウムなどの溶液、またはその両方など、本明細書で特定されるろ過装置をさらに含む。
【０２０９】
発明の好ましいキットは、
血漿サンプルを提供するための本発明の方法を実行するための説明と、
尿サンプルを提供するための本発明の方法を実行するための説明の１つ以上をさらに含む。
【０２１０】
血漿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせを含む本発明の好ましいキットは、
ＥＤＴＡを含む容器と、
陰圧を含む容器と、
シリンジと、
遠心分離に適する１つ以上の容器と、
１つ以上のピペットと、
血漿含有サンプルを冷却、凍結、保管、移動、またはそれらの組み合わせに適する１つ以上の容器と、
症例報告書と、
過程チェックリストのうち、少なくとも１つをさらに含む。
【０２１１】
尿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせを含む本発明の好ましいキットは、
尿収集カップと、
ピペットと、
尿含有サンプルを冷却、凍結、保管、移動、またはそれらの組み合わせに適するＥＤＴＡを含む１つ以上の容器と、
症例報告書と、
過程チェックリストのうち、少なくとも１つをさらに含む。
【０２１２】
さらに、本発明の目的は、
遠隔サンプルまたは遠隔サンプルの少なくとも１つの成分を濃縮するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
遠隔サンプルの単離したＤＮＡを濃縮するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせ、または
バイサルファイト処理したＤＮＡを精製するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせのうち、少なくとも１つをさらに含む、上記で特定されるキットである。
【０２１３】
本発明によると、
Ａ）容器と、
Ｂ）例えば、これらに限定されないが、少なくとも１つの尿収集カップ、少なくとも１つのピペット、冷却、凍結、保管、移動、またはそれらの組み合わせに適するＥＤＴＡを含む少なくとも１つの容器、少なくとも１つの症例報告書、少なくとも１つの過程チェックリストなどの、尿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
Ｃ）例えば、これらに限定されないが、ＥＤＴＡを含む少なくとも１つの容器、好ましくは陰圧を含む、または例えばシリンジなどの陰圧をかけることができる容器、遠心分離に適する少なくとも１つの容器、少なくとも１つのピペット、冷却、凍結、保管、移動、またはそれらの組み合わせに適するＥＤＴＡを含む少なくとも１つの容器、少なくとも１つの症例報告書、少なくとも１つの過程チェックリストなどの、血漿含有サンプルを収集するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
Ｄ）遠隔サンプルまたは本明細書に記載の遠隔サンプルの少なくとも１つの成分を濃縮するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
Ｅ）本明細書で特定されるＤＮＡ単離のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
Ｆ）本明細書に記載の遠隔サンプルの単離したＤＮＡを濃縮するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
Ｇ）本明細書で特定されるＤＮＡのバイサルファイト処理のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
Ｈ）バイサルファイト処理したＤＮＡを精製するための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
Ｉ）本明細書で特定されるメチル化状態またはメチル化パターン決定のための１つ以上の溶液、物質、装置またはそれらの組み合わせと、
Ｊ）本明細書に記載の少なくとも１つの実施例を実行するための説明のうち、１つ以上を含むキットが好ましい。
【０２１４】
本発明の方法およびキットの使用
本明細書で開示される方法およびキットは、好ましくは、少なくとも１つのＤＮＡのメチル化状態、少なくとも１つのＤＮＡのメチル化レベル、または少なくとも１つのＤＮＡメチル化パターンの分析に使用される。もちろん、前記の組み合わせも好ましい。
【０２１５】
好ましくは、本明細書に記載の実施例およびキットは、ＤＮＡメチル化分析に使用される。特に当該の分析は、少なくとも１つのＣｐＧの位置のメチル化または非メチル化の検出および定量化を含む。また、少なくとも１つのＣｐＧの位置の同定、前記位置または本明細書に記載の状態を示す位置のメチル化を含む。好ましくは、当該の分析は、メチル化状態、メチル化レベル、またはメチル化パターンの同定を含む。特に好ましくは、当該の分析は、本発明に記載の状態を示す少なくとも１つのメチル化パターンの同定を含む。好ましくは、当該の分析は、ＣｐＧの位置でのメチル化状態の決定、ＣｐＧの位置でのメチル化レベルの決定、メチル化パターンの定量化、またはそれらの組み合わせを含む。特に好ましくは、当該の分析は、メチル化パターンの定量化を含む。
【０２１６】
本明細書で開示される方法およびテストキットは、さらに好ましくは、
ａ）病変した細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡ断片の混合物内にある限定されたメチル化パターンによって特徴付けられるＤＮＡ断片の割合を検出することと、
ｂ）健康な細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡ断片の混合物内にある限定されたメチル化パターンによって特徴付けられるＤＮＡ断片の割合を検出することと、
ｃ）健康な細胞、細胞集団、組織、または器官と病変した細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡの割合と健康な細胞、細胞集団、組織、または器官由来のＤＮＡの差異に基づいて指標特異的対象を明確にすることと、
を含む、指標特異的対象を同定するために使用される。
【０２１７】
好ましくは、本明細書に記載の実施例およびキットは、指標特異的対象の同定に使用される。本実施例は、ＤＮＡ断片の群内にあるＤＮＡ断片の画分の検出および定量化を含む。したがって、ＤＮＡ断片の群は、病変した細胞、細胞集団、組織、または器官から得られることによって特徴付けられる。したがって、ＤＮＡ断片の画分は、各ＤＮＡ断片が細胞、細胞集団、組織、または器官に関連する疾患に特異的またはそれを示す少なくとも１つのメチル化パターンを含むことによって特徴付けられる。本実施例は、ＤＮＡ断片の群内にあるＤＮＡ断片の画分の第２の検出および定量化も含む。したがって、ＤＮＡ断片の群は、健康な細胞、細胞集団、組織、または器官から得られることによって特徴付けられる。したがって、ＤＮＡ断片の画分は、前記疾患に特異的またはそれを示す少なくとも１つのメチル化パターンを含むことによって特徴付けられる。また、本実施例は指標特異的対象の同定を含む。したがって、同定は、病変した細胞、細胞集団、組織、または器官から得られる、および健康な細胞、細胞集団、組織、または器官から得られるＤＮＡ断片の前記画分の量的な差によって決定される。
【０２１８】
本明細書に記載の方法およびキットの使用は、特に指標特異的対象を同定するためであるのが好ましく、前記指標特異的対象はＤＮＡ切片、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチドまたは代謝化合物である。
【０２１９】
特に好ましくは、指標特異的対象の同定のための本明細書に記載の実施例およびキットである。本実施例によると、前記指標特異的対象は、ＤＮＡ切片、ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチドまたは代謝化合物である。
【０２２０】
本明細書に記載の方法およびキットの使用は、前記ＤＮＡ切片、前記ＲＮＡ分子、前記タンパク質、前記ペプチドまたは前記代謝化合物のそれ自体が周知であるモジュレータが、病変した細胞、細胞集団または組織の特異的な適応に割り当てられる場合、さらに特に好ましい。
【０２２１】
特に、本明細書に記載の実施例またはキットの使用は、前記ＤＮＡ切片、前記ＲＮＡ分子、前記タンパク質、前記ペプチドまたは前記代謝化合物のそれ自体が周知であるモジュレータが、病変した細胞、細胞集団または組織の特異的な適応に割り当てられる場合、好ましい。
【０２２２】
好ましくは、前記の割り当てられたモジュレータの使用は、特異的な適応、または特異的な癌の適応の場合、医薬用組成物を調製するためであるのが好ましい。これは、適応が癌の適応である場合、特に好ましい。
【０２２３】
本明細書に記載の方法およびキットの使用は、患者または個体に関して、状態を診断する、状態を予知する、治療反応を予測する、状態の素因を診断する、状態の進行を診断する、状態を等級分けする、状態を病期分類する、状態の区分、状態の特性化、またはそれらの組み合わせのうち、少なくとも１つに対してさらに特に好ましく、前記状態は、健全な状態または有害事象であり、前記有害事象は、望ましくない薬物間相互作用、癌、増殖性疾患またはそれに伴う関連疾患、ＣＮＳ機能不良、損傷または疾患、攻撃性の症状または行動障害、脳障害の臨床的、心理的および社会的因果関係、精神障害および人格障害、認知症および／または関連症候群、消化管機能不全の循環器疾患、呼吸器系の機能不良、損傷または疾患、病変、炎症、感染、免疫および／または回復、発育過程異常としての体の機能不良、損傷または疾患、皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能不良、損傷または疾患、内分泌および代謝の機能不良、損傷または疾患、および頭痛または性的機能不良を含む群から選択される少なくとも１つのカテゴリーを含む。
【０２２４】
特に好ましくは、状態を診断する、状態を予知する、治療反応を予測する、状態の素因を診断する、状態の進行を診断する、状態を等級分けする、状態を病期分類する、状態の区分、状態の特性化、またはそれらの組み合わせを含む群から選択される適用または使用の少なくとも１つのための、本明細書で開示される実施例またはキットの使用である。本実施例によると、前記状態は健全な状態または有害事象である。前記有害事象は、望ましくない薬物間相互作用、癌、増殖性疾患またはそれに伴う関連疾患、ＣＮＳ機能不良、損傷または疾患、攻撃性の症状または行動障害、脳障害の臨床的、心理的および社会的因果関係、精神障害および人格障害、認知症および／または関連症候群、消化管機能不全の循環器疾患、呼吸器系の機能不良、損傷または疾患、病変、炎症、感染、免疫および／または回復、発育過程異常としての体の機能不良、損傷または疾患、皮膚、筋肉、結合組織または骨の機能不良、損傷または疾患、内分泌および代謝の機能不良、損傷または疾患、および頭痛または性的機能不良を含む群から選択される少なくとも１つのカテゴリーを含む。
【０２２５】
本明細書に記載の方法およびキットの使用は、状態Ａと状態Ｂが異なる細胞状態を特徴とする、細胞または組織を区別し、細胞分化を研究するためであるのがさらに特に好ましい。
【０２２６】
本明細書で開示される実施例およびキットは、好ましくは、細胞型、組織を区別する、または細胞分化を研究するためにも使用される。これは、患者の薬物治療に対する反応を分析するために特に好ましい方法で役立つ。
【０２２７】
本明細書に挙げられるすべての文献は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
【０２２８】
定義
特定の態様において、「メチル化状態」という用語は、これに限定されないが、単一ＤＮＡ分子にある単一ヌクレオチドのメチル化の有無を言及し、前記ヌクレオチドはメチル化が可能である。
【０２２９】
特定の態様において、「メチル化レベル」という用語は、これに限定されないが、複数のＤＮＡ分子の単一ヌクレオチドでの平均メチル化占拠を言及し、前記ヌクレオチドはメチル化が可能である。
【０２３０】
特定の態様において、「メチル化パターン」という用語は、これに限定されないが、単一ＤＮＡ分子上のシスに位置する一連のヌクレオチドのメチル化状態を言及し、前記ヌクレオチドはメチル化が可能である。
【０２３１】
特定の態様において、「遠隔サンプル」という用語は、これに限定されないが、ゲノムＤＮＡを有するサンプルを含み、サンプルは、前記ゲノムＤＮＡが由来する細胞、細胞集団、組織、または器官の部位とは異なる部位（例えば、器官、組織、体液、細胞集団、細胞など）から得られる。
【０２３２】
特定の態様において、治療という用語は、これらに限定されないが、予防および追跡治療（例えば、それ以上検出できない癌または不変の癌の）も含む。予防という用語は、検出とともに健康診断も含む。特定の態様において、検出または診断および／または治療または癌治療という用語は、これらに限定されないが、選択肢として、他の組織にある原発腫瘍の転移の検出および／または治療も含む。
特定の態様において、予後という用語は、これらに限定されないが、療法の成功または治療の成功の可能性に関する記述、および／または疾患の悪性度に関する記述、および／または更なる病徴または転移の発症のない想定される人生、および／または追加治療の必要性の可能性、および／または望ましくない副作用の適合性に関する記述を本明細書に含む。
特定の態様において、ＤＮＡマイクロアレイという用語は、これに限定されないが、基質またはキャリアを有する不定の構造であり、その上またはそこに遺伝子、遺伝子断片または他のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドなどの異なる核酸種が、それぞれの核酸種に割り当てられた異なる限定された場所でそれぞれ配置される。それぞれの位置で１つの核酸種は配置されるが、そこで異なる核酸種の限定された混合物もそれぞれの場所に配置されてよく、すべての場所は異なる混合物を持つ。核酸は固定化してよいが、使用される気質またはキャリアによっては必ずしも必要ではない。マイクロアレイに関する実施例に限定しなければ、核酸  マイクロアレイ、遺伝子マイクロアレイ、ウェルにある核酸溶液を有するマイクロタイタープレート、固定化された、または固定化されていない核酸、それに固定化された核酸を有する膜、および２００ｂｐ以下までの長さを有するオリゴヌクレオチドが表面に固定化されたオリゴヌクレオチドアレイ、マイクロアレイまたはチップがある。
【０２３３】
特定の態様において、対象のモジュレータという用語は、これに限定されないが、対象の生成を抑制または誘導のどちらかを行う、または生成された対象の活性、物質の非存在下で前記の体外または体内の活性を減少または増加させる化合物または物質のことである。これまでにおいて、モジュレータは、一方において、対象の進行カスケードを調節するように作用する物質でよい。他方では、モジュレータは生成された対象との結合を形成する物質でよく、そのため、更なる内因性物質との生理学的相互作用は少なくとも減少または増加する。モジュレータは分子でもよく、標的遺伝子の転写に影響を与え、それを抑制または活性化する。当該の分子は、例えば、ポリアミドまたは亜鉛フィンガータンパク質でよく、基底転写機構のＤＮＡ領域との結合によって転写を防止する。転写は、転写因子の抑制によっても間接的に行われ、それは標的遺伝子の転写に不可欠である。当該の転写因子の抑制は、いわゆるデコイアプタマーとの結合によって保証されてよい。
モジュレータは、特異的に対象または対象の先駆または対象の後継に結合する天然または合成分子でよい。それらは、例えば、ヒト、ヒト化および非ヒト化ポリクローナルまたはモノクローナル抗体などの対象特異的抗体でもよい。抗体という用語は、ファージ提示法抗体、リボザイム提示法抗体（ＲＮＡとタンパク質間の共有融合）およびＲＮＡ提示法抗体（体外で生産される）をさらに含む。その用語は、キメラ化、ヒト型化または免疫除去によって修飾される抗体、および上記の型の基礎抗体の可変領域の軽鎖および／または重鎖の特異的断片も含む。既知の免疫遺伝子を有する当該抗体の生産または抽出は当業者によく周知であるため、詳細に説明する必要はない。さらに、一方では免疫効果細胞（例えば、ＣＤ３、ＣＤ１６、ＣＤ６４）の引き金分子と結合し、他方では癌対象細胞の抗原と結合する二重特異性抗体が含まれる。これは、結合する場合、例えば癌細胞を死滅させる。モジュレータは、例えば、抗体を模倣する対象特異的アンチカリンおよびアフィボディにも適してよい。
【０２３４】
特定の態様において、癌は、これらに限定されないが、肺癌、  卵巣癌、陰嚢癌、前立腺癌、膵臓癌、乳癌、消化管の器官の癌などの器官特異的癌である。本発明のすべての態様に関する適切な配列は、例えば、ＤＥ２０１２１９７９Ｕ１、ＤＥ２０１２１９７８Ｕ１、ＤＥ２０１２１９７７Ｕ１、ＤＥ２０１２１９７５Ｕ１、ＤＥ２０１２１９７４Ｕ１、ＤＥ２０１２１９７３Ｕ１、ＤＥ２０１２１９７２Ｕ１、ＤＥ２０１２１９７１Ｕ１、ＤＥ２０１２１９７０Ｕ１、ＤＥ２０１２１９６９Ｕ１、ＤＥ２０１２１９６８Ｕ１、ＤＥ２０１２１９６７Ｕ１、ＤＥ２０１２１９６６Ｕ１、ＤＥ２０１２１９６５Ｕ１、ＤＥ２０１２１９６４Ｕ１、ＤＥ２０１２１９６３Ｕ１、ＤＥ２０１２１９６１Ｕ１、ＤＥ２０１２１９６０Ｕ１、ＤＥ１００１９１７３Ａｌ、ＤＥ１００１９０５８Ａｌ、ＤＥ１００１３８４７Ａｌ、ＤＥ１００３２５２９Ａｌ、ＤＥ１００５４９７４Ａｌ、ＤＥ１００４３８２６Ａｌ、ＤＥ１００５４９７２Ａｌ、ＤＥ１００３７７６９Ａｌ、ＤＥ１００６１３３８Ａｌ、ＤＥ１０２４５７７９Ａｌ、ＤＥ１０１６４５０１Ａｌ、ＤＥ１０１６１６２５Ａｌ、ＤＥ１０２３０６９２、ＤＥ１０２５５１０４、ＥＰ１２６８８５５、ＥＰ１２８３９０５、ＥＰ１２６８８５７、ＥＰ１２９４９４７、ＥＰ１３７０６８５、ＥＰ１３９５６８６、ＥＰ１４２１２２０、ＥＰ１４５１３５４、ＥＰ１４５８８９３、ＥＰ１３４０８１８、ＥＰ１３９９５８９、ＥＰ１４７８７８４、ＷＯ２００４／０３５８０３、およびＷＯ２００５／００１１４１の文書に記載され、これにより明確に記述される。
【０２３５】
特定の態様において、本発明による医薬用組成物は、これらに限定されないが、通常の方法で実施されてよい。イオン化合物に対する対イオンとして、キャリア物質、火薬、結合剤、コーティング剤、膨張剤、潤滑剤または平滑剤、調味料、甘味料および液体メディエーターなどの通常の方法が使用される製品に対して、例えば、ＮＡ+、Ｋ+、Ｌｉ+またはシクロヘキシルアンモニウムを使用することができる。適切な固形または液体の生薬型は、例えば、顆粒、粉、糖衣錠、錠剤、（マイクロ）カプセル、坐剤、シロップ、ジュース、懸濁、乳剤、ドロップまたは注射剤（ＩＶ、ＩＰ、ＩＭ、ＳＣ）または微細分散（エアロゾル）、経皮システム、および有効成分を持続放出する製剤がある。補助剤として、炭酸マグネシウム、二酸化チタン、乳糖、マンニトールおよび他の糖類、タルカムパウダー、乳タンパク質、ゼラチン、でんぷん、セルロースおよび誘導体、肝油、ひまわり油、ピーナッツ油またはごま油などの動物性または植物性油、滅菌水などのポリエチレングリコールおよび溶媒、および例えばグリセリンなどの一価または多価アルコールが挙げられる。本発明による医薬用組成物は、本発明によって使用される少なくとも１つのモジュレータで、医薬的に適した生理学的に耐容性良好なキャリアの限定された用量および限定された抑制量のさらに適するかもしれない有効成分、追加剤または補助剤で混合することによって生産し、望ましい投与型に調製することができる。
【０２３６】
特定の態様において、反応マーカーは、これらに限定されないが、タンパク質またはＲＮＡ分子または核酸の修飾（ＳＮＰまたはメチル化など）であり、それらは細胞の外因性物質、特に治療剤に対する細胞反応に相関する。患者によって特異的療法に対する反応は異なる。これは治療剤に対する患者‐個体間の細胞反応に基づく。同じ疾患を患い同じ療法を受けているがその療法に対して異なる反応をみせる（例えば、異なる速さの治癒過程または副作用などの悪影響による）異なる人達の同一組織の微分解析により、当該の反応マーカーは同定される一方、タンパク質または酵素または核酸の修飾の（区別を示す）存在、または非存在は、それを反応マーカーとして限定する。
【０２３７】
特定の態様において、「信頼区間」という用語は、これらに限定されないが、測定における不確定性の定量化を言及する。通常、信頼区間の割合として報告され、それは確実に母集団の真の値が置かれる尤度の一定の割合内にある値の幅である。
【０２３８】
実施例
実施例１．サンプル収集
実施例１ａ．血漿サンプルの収集
血漿サンプルは、以下の明細書によって、米国、ロシア、ハンガリーおよびドイツの複数のプロバイダーから収集した。
以下の群によって、結腸直腸癌のＩ〜III期（ＡＪＣＣ）の患者からのサンプルおよび対照を収集した。
・ＣＲＣ群：結腸直腸癌患者（病理学的に確かめられた）
・健康な対照：大腸内視鏡検査での病理学的所見がなく、急性または悪化した慢性疾患の兆候がない患者
・癌対照：結腸直腸癌以外の癌患者、例えば乳癌または前立腺癌
・非癌対照：非癌性疾患患者
【０２３９】
表２および３は２つの収集サンプルセットの要約である。
【０２４０】
2008537888.tif 000005
表２：サンプルセットの要約
【０２４１】
2008537888.tif 000006
表３：第２のサンプルセットの要約
【０２４２】
サンプルの対象／除外基準：
最低３０サンプルで、同数のサンプルを各群に対して収集した。血漿遠隔サンプルを登録するには、以下の基準を満たさなければならない。（表４〜８）
【０２４３】
2008537888.tif 000007
表４：血漿サンプルの登録の一般的基準
【０２４４】
2008537888.tif 000008
表５：結腸直腸癌群における血漿サンプルの登録基準
【０２４５】
2008537888.tif 000009
表６：癌対照群における血漿サンプルの登録基準
【０２４６】
2008537888.tif 000010
表７：健康な対照群における血漿サンプルの登録基準基準
【０２４７】
2008537888.tif 000011
表８：非癌対照群における血漿サンプルの登録基準基準基準
【０２４８】
各治験責任医師は、各患者に提供されたサンプル収集キットに含まれる症例報告書で特定される臨床患者情報を提供した。これは、これらに限定されないが、以下を含む。
・一般的患者データ：年齢、性別、人種
・症状
・診断情報：病理学的報告の詳細を含む現疾患
・治療情報
【０２４９】
また、各提供者は、採血、血漿の抽出およびサンプル保管のための道具の使用を確認するため、収集過程およびサンプル収集キットの説明が含まれる治験実施計画書を渡された。
【０２５０】
各患者に対して、前もってラベルが付いた管および印刷された用紙が含まれるサンプル収集キットを使用する。大きいバッグには、臨床情報のための症例報告書（ＣＲＦ）および過程ステップを記録するための過程チェックリストが入っている。採血（針および血液容器）、血漿の抽出（ファルコンチューブおよびピペット）およびサンプルの保管（クライオバイアル）に必要な道具は、小さいバッグにまとめる。
【０２５１】
治験責任医師が患者を登録することを決定した後、採血を行い、ＣＲＦを終了した。採血管は、サンプル中の正確なＥＤＴＡ濃度を確実にするため、ラベルに印刷された印の上まで満たされなければならなかった。
血液管は、直ちに処理するか、実験室に輸送する必要がある場合は、最長３時間まで冷湿布上で保存した。
【０２５２】
血漿は、２ステップの遠心分離プロセスによって採血された血液から抽出した。両ステップは、１，５００×ｇ、４℃で実施した。血液容器は、初回の回転に使用した。浮遊物は、その後、４〜５本の採血管から２本の１５ｍｌのファルコンチューブへ注意深くピペットで取り、軟膜の上５ｍｍで停止した。
２回目の回転後、小さいファルコンチューブからの血漿は、４〜５本の４．５ｍｌのクライオバイアルへ等分する前に、プーリング用の大きい５０ｍｌのファルコンチューブへ移動した。このステップで、浮遊物から白血球の最適分離を確実にするために、０．５〜１ｍｌの残留量を各小さいファルコンチューブに残した。
【０２５３】
クライオバイアルは、直ちに、採血から四時間以内に直立状態で凍結した。凍結および保管は、−７０〜−８０℃で行った。
各ステップは、収集キットに含まれる過程チェックリストに記録した。
【０２５４】
サンプルは、要求に応じて、ドライアイスにのせて輸送した。
【０２５５】
記録した情報は、電子スプレッドシートに入力し、血漿サンプルの次の分析のために、ＣＲＦおよび過程チェックリストとして提供した。電子スプレッドシートで提供した臨床データは、以下を確認するために再検討した。
・妥当性
・完全性
・偽名
・対象および除外基準の順守
【０２５６】
実施例１ｂ．尿サンプルの収集：
尿サンプルは、米国およびドイツのいくつかの提供者から収集した。
【０２５７】
各提供者は、尿収集およびサンプル保管のための道具の使用を確認するため、収集過程およびサンプル収集キットの説明が含まれる治験実施計画書を提供した。
【０２５８】
収集を開始する前に、対象／除外基準を決めた。
【０２５９】
各患者に対して、前もってラベルが付いた管および印刷された用紙が含まれるサンプル収集キットが使用する。大きいバッグには、臨床情報のための症例報告書（ＣＲＦ）および過程ステップを記録するための過程チェックリストが入っている。尿収集に必要な道具（尿容器、ピペットなど）およびサンプルの保管（クライオバイアル）に必要な道具は、小さいバッグにまとめる。
【０２６０】
治験責任医師が患者を登録することを決定した後、患者の前立腺をマッサージし、最初の２０ｍｌの尿を収集し、ＣＲＦを終了した。尿収集カップは、サンプル中の正確なＥＤＴＡ濃度を確実にするため、収集容器の印まで満たされなければならなかった。
尿は、２本の１０ｍｌのクライオバイアルにピペットで取り、収集後１時間以内に−７０〜−８０℃で凍結した。
【０２６１】
各ステップは、各ステップは、収集キットに含まれる過程チェックリストに記録した。
【０２６２】
サンプルは、要求に応じて、ドライアイスにのせて輸送した。
【０２６３】
記録した情報は、電子スプレッドシートに入力し、尿サンプルの次の分析のために、ＣＲＦおよび過程チェックリストとして提供した。
【０２６４】
実施例２．プロセス対照
以下のプロセス対照を調製し使用した。
【０２６５】
ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ負の対照：１ｘリン酸緩衝生理食塩水（１０ｘＰＢＳ緩衝液ｐＨ７．４（アンビオンＩｎｃ．Ｃａｔ＃９６２５）で希釈した５％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン画分Ｖ（ロシュＣａｔ＃０３  １１７  ３７５  ００１）。
【０２６６】
ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ正の対照：５％ＢＳＡ溶液にスパイクしたメチル化ＤＮＡ（ケミコンＣａｔ＃Ｓ７８２１）、最終濃度２５ｎｇ／ｍｌ。
【０２６７】
前記対照は、各研究の前に大量に調製し、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ機器（ロシュ）の１回の実行に十分な体積である、４ｍｌの分割量で保管した。
【０２６８】
実施例３．血漿サンプルからのＤＮＡ単離
８９５血漿サンプルからのＤＢＮＡ単離は、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ（ロシュ）を使用して実施した。血漿サンプルは解凍した。ＤＮＡは、各血漿サンプルの１ｍｌの分割量８つから同時に抽出した。サンプルおよび対照は、マイクロタイタープレートに満たし、図２にしたがって取り扱い、プールした。ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ機器の各実行は、１ｍｌの分割量に分けられた各８ｍｌの３サンプルを３回含んだ。１ｍｌの分割量に分けられた４ｍｌの負の対照および１ｍｌの分割量に分けられた４ｍｌの正の対照である。負と正の対照のマイクロタイタープレート上での位置は、研究の初めでは、各実行でランダムに割り当てた。１ウェルにつき１００μｌの溶出体積を選択した。４ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ機器を使用して、実行を設定し対で終了した。溶出緩衝液中の提供されるＤＮＡは、その後、プーリングおよび濃縮ステップに使用する。
【０２６９】
実施例４．プーリングおよび濃縮
本ステップの目的は、各遠隔サンプルのために同時に実施した８つのＤＮＡ抽出をプールすること、および８００μｌの溶出液を１００μｌの体積に濃縮することである（図２参照）。ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎプロトコルにしたがって、各１ｍｌの分割量に対して１００μｌの溶出液を得た。遠隔サンプル１つにつき２つのＭｉｃｒｏｃｏｎＹＭ‐３０カラム（ミリポア）を使用した。すなわち、４００μｌの体積となった４つの溶出液を各フィルターにプールした。次に、フィルターは、体積が５０μｌとなるまで微小遠心で遠心分離した。２つの５０μｌの濃縮をプールし、８ｍｌの血漿サンプルから抽出したＤＮＡを含む１００μｌのサンプルを提供した。
【０２７０】
１つのＭｉｃｒｏｃｏｎ  ＹＭ‐３０カラム（ミリポア）を正と負の対照に使用した。得られたそれぞれ５０μｌの対照は、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅに含まれるＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ溶出緩衝液を加えることによって、１００μｌとした。
【０２７１】
実施例５．ＤＮＡ抽出の品質管理
各１００μｌの濃縮サンプルである正の対照および負の対照から５μｌを除去し、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  Ｃｏｍｐａｃｔ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（Ｉ）Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅに含まれるＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ溶出緩衝液４５μｌで希釈した。１２．５μｌの希釈ＤＮＡは、総ＤＮＡの濃度の決定のためのＣＦＦ１ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡアッセイに使用した。正の対照サンプルの回収されたＤＮＡの濃度は、ＤＮＡ抽出ステップを較正するための品質管理の尺度として使用した。正の対照の平均ＤＮＡ回収は、２．８ｎｇ／ｍｌであった。８９５血漿サンプルからの平均ＤＮＡ回収は、０〜１０８６ｎｇ／ｍｌの範囲で３．８６ｎｇ／ｍｌであった。
【０２７２】
ＣＦＦ１ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡアッセイ
【０２７３】
ＣＦＦ１フォワードプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１
５’ＴＡＡＧＡＧＴＡＡＴＡＡＴＧＧＡＴＧＧＡＴＧＡＴＧ３’
【０２７４】
ＣＦＦ１リバースプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２
５’ＣＣＴＣＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＴＣＣ３’
【０２７５】
ＣＦＦ１ＴａｑＭａｎプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３
５’‐６ＦＡＭ‐ＡＴＧＧＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＡＡＧＧＡＴＧＡＧＴ‐ＢＨＱ‐１‐３’
【０２７６】
以下の溶液はともにピペットで取り、表９にしたがって混合した。
【０２７７】
2008537888.tif 000012
表９：ＣＦＦ１ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡアッセイのＰＣＲ混合調製
（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ（ロシュＣａｔ＃２  ２３９  ２７２）を表す。）
【０２７８】
ＰＣＲは、表１０で特定される条件にしたがって、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０ＰＣＲ機（ロシュ）で実行した。
【０２７９】
2008537888.tif 000013
表１０：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０ＰＣＲ機（ロシュ）でのＣＦＦ１ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡアッセイのＰＣＲ循環条件
【０２８０】
実施例６．バイサルファイト処理およびバイサルファイト処理したＤＮＡの精製
装置の調製：５０℃の水槽、６０℃の熱ミキサー、沸騰した水槽
試薬の調製：研究開始前に、すべての乾燥したバイサルファイトおよびラジカルスカベンジャー試薬を量り、７５セットの等分したバイサルファイト処理の試薬を提供するために各例において７５の管に等分した。各７５セットは、バイサルファイト処理のバッチに使用する。
ジオキサン‐ラジカルスカベンジャー溶液と同様に、バイサルファイト溶液は各手順ごとに調製した。バイサルファイト溶液に関して、１０．３６ｇの重亜硫酸ナトリウムおよび２．４９ｇの亜硫酸ナトリウムは、２２ｍｌのヌクレアーゼが入っていない水を加えることによって溶解した。溶液は厳密に繰り返し混合され、すべてのバイサルファイト粒子が溶解するまで５０度で培養した。ジオキサン‐ラジカルスカベンジャー溶液に関して、３２３ｍｇの６‐ヒドロキシ‐２，５，７，８‐テトラメチル‐クロマン‐２カルボン酸（ラジカルスカベンジャー）は、８．２ｍｌの１，４‐ジオキサンを加えることによって溶解した。溶液は、すべての粒子が溶解するまで厳密に混合した。また、５００ｍｌの０．１ｍｏｌ／ｌトリス‐（ヒドロキシメチル）‐アミノメタン０．１ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡの溶液、５０ｍｌの０．２ｍｏｌ／ｌＮａＯＨ溶液および５０ｍｌの０．１ｍｏｌ／ｌＮａＯＨ溶液を調製した。
サンプル保管：すべてのサンプルは４℃で保管した。
【０２８１】
使用した道具および機器：
エッペンドルフ熱ミキサー５３５５（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ＃０２２６７０１０７）
エッペンドルフ熱ミキサー２．０ｍｌブロック（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ＃０２２６７０５４９）
ＶＷＲ水槽１２２５（ＶＷＲ＃１３３０９‐３７５）
ＶＷＲ撹拌つきホットプレート６２０、７”ｘ７”（ＶＷＲ＃１２３６５‐３８２）
エッペンドルフ微小遠心５４１７ｃ
メトラートレド化学天秤ＡＧ６４
ミリポアＹ‐３０Ｍｉｃｒｏｃｏｎろ過装置（ミリポア＃４２４１１）
コーニング４Ｌガラスビーカー（コーニング＃１００３‐４Ｌ）
ナルゲンメスシリンダー、５００ｍｌ（ＮＮＩ＃３６６３‐０５００）
ナルゲン殺菌０．２μＭフィルターユニット、５００ｍｌ（ナルゲン＃１６６‐００２０）
ナルゲン遊動ミクロ管ラック、１６位置（ＶＷＲ＃６０９８６‐０９８）
ナルゲン遊動ミクロ管ラック、８位置（ＶＷＲ＃６０９８６‐０９９）
５０ｍｌファルコン円錐管（ファルコン３５２０７０）
１５ｍｌファルコン円錐管（ファルコン３５２０９６）
ヌクレアーゼが入っていない水（アンビオン  ＃９９３２）
重亜硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ＃Ｓ‐９０００）
亜硫酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ＃４６７２）
１，４‐安定化ジオキサン（Ｓｉｇｍａ＃３３１４７）
ラジカルスカベンジャー‐６‐ヒドロキシ‐２，５，７，８‐テトラメチル‐クロマン‐２カルボン酸（Ｓｉｇｍａ＃２３８８１３‐５Ｇ）
０．５ｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ（アンビオン＃９２６０Ｇ）
０．２ｍｏｌ／ｌＮａＯＨ（フィッシャー＃ＡＣ３４９６８５０００）
１ｍｏｌ／ｌトリス‐（ヒドロキシメチル）‐アミノメタン（アンビオン＃９８５５Ｇ）
管キャップロック（ＩＳＣバイオエクスプレス＃ｃ‐３２７１‐２）
エッペンドルフセーフロック２．０ｍｌ管（エッペンドルフ＃２２  ６０  ００４‐４）
カラム収集管（ミリポア＃１０６５６０１）
クイックスピン小遠心（ＩＳＣバイオエクスプレス＃ｃ‐１３０１‐ｐ）
携帯用ピペットエイド（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ＃４‐０００‐１００）
１．７ｍｌ低残渣微小遠心管（ＩＳＣバイオエクスプレス＃ｃ‐３２２８‐１）
０．６５ｍｌ低残渣微小遠心管（ＩＳＣバイオエクスプレス＃ｃ‐３２２６‐１）
【０２８２】
ａ）単離したＤＮＡのバイサルファイト処理
サンプル調製：実施例４の単離したＤＮＡの溶液を含む２ｍｌの管は、４℃から外した。単離したＤＮＡの２０サンプルとともに、プロセス対照であるバイサルファイト処理のための１つの正の対照および１つの負の対照は、バイサルファイト処理の各バッチに含んだ。バイサルファイトの負の対照は、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ溶出緩衝液であるが、バイサルファイトの正の対照は、ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ溶出緩衝液１ｍｌにつき０．１μｇのケミコンのメチル化ＤＮＡおよび０．９μｇのロシュのヒトゲノムＤＮＡを含んだ。
【０２８３】
管は６，０００ｒｐｍで簡単に遠心分離した。３５４μｌのバイサルファイト溶液および１４６μｌのジオキサン溶液を連続して各管へ加えた。管は１０秒間厳密に混合し、６，０００ｒｐｍで簡単に遠心分離した。
【０２８４】
バイサルファイト反応：
管は、ＤＮＡを変性させるために、３分間沸騰した水槽に置き固定した。その後、管を予熱した熱ミキサーへ移動し、１，０００ｒｐｍで３０分間混合しながら６０℃で培養した。この後、管は、熱ミキサーで６０℃、１，０００ｒｐｍで１．５時間再培養する前に、沸騰した水槽へ３分間戻した。次に、管は３分間沸騰した水槽に戻し、熱ミキサーで６０℃、１，０００ｒｐｍで３時間再培養した。
【０２８５】
バイサルファイト反応混合物の脱塩：
バイサルファイト反応の管は混合し、６，０００ｒｐｍで簡単に遠心分離した。加熱の間に形成された沈殿物は、繰り返しの混合および２００μｌの水を加えることによって溶解した。次に、管を１０秒間簡単に遠心分離した。４００μｌの溶液は各管から取り除き、対応する適切にラベルが付けられたＭｉｃｒｏｎ  ＹＭ‐３０Ｍｉｃｒｏｃｏｎカラムに移動した。１カラムは、収集管に入った各元の遠隔サンプルに使用した。カラムアセンブリは、１４，０００×ｇで２０分間遠心分離した。遠心分離後、カラムは新しい収集管に移動し、バイサルファイト反応の約４００μｌの残余は、対応する  Ｍｉｃｒｏｎ  ＹＭ‐３０Ｍｉｃｒｏｃｏｎカラムに移動した。再度、カラムアセンブリは１４，０００×ｇで２０分間遠心分離し、カラムは新しい管に移動した。この２回目の遠心分離の後、カラムのフィルター膜は湿ったように見えるはずであるが、目に見える体積の液体は存在しないはずである。残った液体を含むカラムは、フィルターがちょうど湿るまで１４，０００×ｇで５分間繰り返し遠心分離した。最後に、カラムは新しい管に移動した。
【０２８６】
ｂ）バイサルファイト処理したＤＮＡの精製
バイサルファイト処理したＤＮＡの洗浄および脱スルホン：
４００μｌの０．２ｍｏｌ／ｌＮａＯＨは、バイサルファイト処理したＤＮＡを含む各ちょうど湿ったＹＭ‐３０Ｍｉｃｒｏｃｏｎカラムに移動した。カラムは、１４，０００×ｇで１２分間遠心分離し、その後、新しい管に置いた。４００μｌの０．１ｍｏｌ／ｌＮａＯＨは各カラムに移動し、再度、１４，０００×ｇで１２分間遠心分離した。この２回目の遠心分離の後、カラムのフィルター膜は湿ったように見えるはずであるが、目に見える体積の液体は存在しないはずである。残った液体を含むカラムは、フィルターがちょうど湿るまで１４，０００×ｇで５分間繰り返し遠心分離した。最後に、カラムは新しい管に移動した。この脱スルホンステップ後、カラムは４００μｌの水で２回洗浄し、その後、１４，０００×ｇで１２分間遠心分離した。流れが収集のために通る新しい管は、２回目の洗浄ステップに使用した。２回目の洗浄後、カラムのフィルター膜は、湿ったように見えるはずであるが、目に見える体積の液体は存在しないはずである。残った液体を含むカラムは、フィルターがちょうど湿るまで１４，０００×ｇで５分間繰り返し遠心分離した。ちょうど湿ったカラムは、溶出のために新しい管に置いた。
【０２８７】
バイサルファイト処理したＤＮＡの溶出：
５０〜６５μｌの５０℃に予熱した０．１ｍｏｌ／ｌトリス０．１ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡは、脱スルホン化ＤＮＡを含む各カラムに移動した。次に、カラムアセンブリは熱ミキサーに置き、１，０００ｒｐｍで撹拌しながら５０℃で１０分培養した。その後、カラムは新しいラベルが付いた管に反転させて入れた。ＤＮＡは、１，０００×ｇで７分間の遠心分離によってそれぞれのカラムから溶出した。５０μｌより少ない体積の溶出したバイサルファイト処理したＤＮＡのサンプルは、適切な量の０．１ｍｏｌ／ｌトリス０．１ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡの追加によって５０μｌに調節した。
【０２８８】
対照のため、５０μｌの溶出したＤＮＡうち５μｌを４５μｌの水で希釈した。その１２．５μｌを、バイサルファイト変換したＤＮＡの量を決定するために、ＨＢ１４アッセイに使用し、２０μｌをサルファイト分析に使用した。８８７血漿サンプルの平均ＤＮＡ回収は３．３２ｎｇ／ｍｌであり、０〜１１０９ｎｇ／ｍｌに及んだ。
【０２８９】
ＨＢ１４アッセイ（バイサルファイト変換したＤＮＡの量の決定）：
【０２９０】
ＨＢ１４フォワードプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４
５’‐ＴＧＧＴＧＡＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＴＴＡＧＴＡＡＧＴ‐３’
【０２９１】
ＨＢ１４リバースプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５
５’‐ＡＡＣＣＡＡＴＡＡＡＡＣＣＴＡＣＴＣＣＴＣＣＣＴＴＡＡ‐３’
【０２９２】
ＨＢ１４ＴａｑＭａｎプローブＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６
５’‐ＦＡＭ‐ＡＣＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＣＡＣＡＣＡＡＴＡＡＣＡＡＡＣＡＣＡ‐ＢＨＱ１ａ‐３’
【０２９３】
以下の溶液はともにピペットで取り、表１１にしたがって混合した。
【０２９４】
2008537888.tif 000014
表１１：ＨＢ１４アッセイのＰＣＲ混合調製
（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ（ロシュＣａｔ＃２  ２３９  ２７２）を表す。）
【０２９５】
ＰＣＲは、表１２で特定される条件にしたがって、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０ＰＣＲ機（ロシュ）で実行した。
【０２９６】
2008537888.tif 000015
表１２：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０ＰＣＲ機（ロシュ）でのＨＢ１４アッセイのＰＣＲ循環条件
【０２９７】
サルファイト分析：
残留サルファイトは、Ｓｕｌｆｉｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｓｔ（メルクＣａｔ＃１．１４３９４．０００１）を使用して、希釈したバイサルファイト変換したＤＮＡサンプルにおいて測定した。サルファイトの検量線は、０．１ｍｏｌ／ｌトリス０．１ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ中の１００ｍｇ／ｌ〜０．７８ｍｇ／ｌ無水亜硫酸ナトリウム（Ｎａ2ＳＯ3、Ｍ＝１２６．０４ｇ／ｍｏｌ）の範囲で調製した。探知剤は、灰色のミクロスプーン（ＳＯ３‐１Ｋ瓶のカップにある）ですりきり一杯分の（ＳＯ３‐１Ｋ瓶のカップにある）試薬を反応細胞に置くことによって調製し、試薬が完全に溶解するまでしっかりと閉じ、試薬が完全に溶解するまで激しく撹拌した（または穏やかに５秒間３回ボルテックスした）。
【０２９８】
サルファイトの測定は、９６ウェルプレートで行った。最終体積は１００μｌであった。底が透明のプレートのウェルにある３０μｌの水に、２０μｌの希釈したバイサルファイト変換したＤＮＡの分割量を加えた。標準として、５０μｌのサルファイト標準液を、底が透明のプレートにピペットで取った。その後、５０μｌのメルクサルファイト試薬を各ウェルに加えた。空試料として、５０μｌの水を５０μｌメルクサルファイト試薬に加えた。プレートは、Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｐｌｕｓ  Ｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して４１２ｎｍで読み取った。データは、ＳＯＦＴＭａｘ  ＰＲＯ４．０のソフトウェアで分析した。
【０２９９】
実施例７．バイサルファイトＤＮＡの全ゲノム増幅
実施例７ａ．ＣｉｒｃリガーゼｓｓＤＮＡリガーゼを使用してのバイサルファイトＤＮＡの全ゲノム増幅
実施例６の１５μｌのバイサルファイト処理し精製したＤＮＡを、２μｌのＣｉｒｃリガーゼ１０ｘ反応緩衝液（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ(登録商標)バイオテクノロジーズ）、１μｌの１ｍｍｏｌ／ｌＡＴＰ溶液および２μｌの５Ｕ／μｌＣｉｒｃリガーゼｓｓＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｅｒ(登録商標)バイオテクノロジーズ）と混合する。連結反応混合物は、リガーゼ酵素を不活性化にするために８０度で１０分間加熱する前に、６０度で１時間培養する。９５度で３分間加熱した後、氷上で保管する。
増幅に関して、ＴｅｍｐｌｉＰＨｉTM  ＤＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｔｅｍｐｌａｔｅ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ／ＴｅｍｐｌｉＰＨｉTM  １００／５００Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケア）の１０μｌのサンプル緩衝液およびＴｅｍｐｌｉＰＨｉTM  Ｋｉｔの１８μｌの反応緩衝液とＴｅｍｐｌｉＰＨｉTM  Ｋｉｔの２μｌのＰＨｉ２９ＤＮＡポリメラーゼを新しく調製した混合物を、１０μｌの連結反応混合物に加える。３０度で１６時間培養した後、ＰＨｉ２９ＤＮＡポリメラーゼは、６５度で１０分間加熱することによって不活性化する。
【０３００】
増幅したバイサルファイト変換したＤＮＡの量は、実施例６ｂに記載されるようにＨＢ１４アッセイにしたがって決定することができる。したがって、１０μｌの不活性化した増幅反応混合物は、２．５μｌの水と混合する。この混合物は、その後、ＨＢ１４アッセイに適用する。バイサルファイト処理したＤＮＡの全ゲノム増幅の効率は、全ゲノム増幅前のバイサルファイト変換したＤＮＡの決定した濃度の１５倍に対する全ゲノム増幅後のバイサルファイト変換したＤＮＡの決定した濃度の比率を計算することによって決定する（実施例６ｂ参照）。したがって、因数１５は、全ゲノム増幅前のＨＢ１４アッセイに適用した溶出したバイサルファイト変換したＤＮＡの同量と全ゲノム増幅後のＨＢ１４アッセイに適用した溶出したバイサルファイト変換したＤＮＡの同量によって決定する。他の体積を使用する場合、当業者は対応する因数の計算法を周知である。
【０３０１】
総ＤＮＡの量は、適宜に決定される。ＨＢ１４アッセイの代わりに、実施例５のＣＦＦ１ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡアッセイが使用される。当業者は、ＣＦＦ１ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡアッセイのためのバイサルファイト変換したＤＮＡの決定方法の調節の仕方を周知である。
【０３０２】
非メチル化ＤＮＡに対するメチル化ＤＮＡの比率が変化していないことを実証するには、限定されたメチル化パターンに特異的なアッセイを実施する。当該のアッセイは、例えば、実施例８のＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイである。したがって、同量の増幅前後のバイサルファイト変換したＤＮＡを、前記アッセイに使用する。ここで再度、当業者は、全ゲノム増幅前後の限定されたメチル化パターンを示すＤＮＡの比率を決定するための増幅前後のバイサルファイト変換したＤＮＡの比率を決定するための上記で特定した方法を適宜に調節する方法を周知である。
【０３０３】
実施例７ｂ．末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼの使用によるバイサルファイトＤＮＡの全ゲノム増幅
【０３０４】
概説：
バイサルファイト変換したＤＮＡの全ゲノム増幅に関して、以下のステップを実行した。
１．ＤＮＡ制限酵素を使用する人ＤＮＡの断片化
２．末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）によるＤＮＡ断片の３’末端の尾行（ポリｄＡ配列を追加する）
３．バイサルファイトによる処理およびその後の精製（脱スルホンを含む）による全非メチル化シトシンのウラシルへの変換
４．付着した尾（ポリｄＴプライマー）を補完するプライマーでのプライマー伸長反応を用いたバイサルファイト変換したＤＮＡの線形増幅
５．リアルタイムＰＣＲ（ＣＦＦ１アッセイの総量ＤＮＡ、バイサルファイト変換したＤＮＡのＨＢ１４アッセイの量）を用いた得られたＤＮＡの量の定量化
【０３０５】
実現：
詳細な実験構成を表１３に示す。２つの異なるＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼであるＳｔｕＩおよびＢｓｅＲＩおよびそれぞれの対照の使用を含む、６つの異なる反応を実施する。
【０３０６】
2008537888.tif 000016
表１３：実験構成
【０３０７】
ステップは、以下の条件にしたがって単独で実施する。
【０３０８】
１．断片化：
ヒトゲノムＤＮＡ（ロシュ）の酵素的制限は、１μｌのＤＮＡ、４μｌの１０ｘＮＥ緩衝液２（ニューイングランドバイオラボ）および制限酵素であるＳｔｕＩまたはＢｓｅＲＩそれぞれ５ユニットを含む総体積４０μｌで行う。負の対照（反応ＶおよびVI）は制限酵素を含有しない。反応は、３７℃で２時間培養する。
【０３０９】
２．尾行：
ポリｄＡ配列を有する断片化ＤＮＡの尾行は、ｄＡＴＰの存在下で末端ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ、ニューイングランドバイオラボ）を使用して遂行する。負の対照は、ＴｄＴで処理しない。反応は、４０μｌの断片化反応、１μｌの１０ｘＮＥ緩衝液４（ニューイングランドバイオラボ）、０．２５ｍｍｏｌ／ｌのＣｏＣｌ2、５０μｍｏｌ／ｌのｄＡＴＰ（フェルメンタス）および２ユニットのＴｄＴ（それぞれ負の対照において省略（反応II、IVおよびVI））を含む体積５０μｌにおいて行う。混合物は３７度で３０分培養し、最終的に１０分間で７０度に加熱することによって不活性化する。
【０３１０】
３．ＤＮＡのバイサルファイト変換：
非メチル化シトシンは、本明細書に記載の実施例および方法にしたがって、ウラシルに変換する。尾行反応の全反応混合物（各５０μｌ）は、バイサルファイト処理および精製（脱スルホンを含む）に使用する。バイサルファイト変換後、ＤＮＡは５０μｌの体積において回収する。
【０３１１】
４．線形増幅：
プライマー伸長反応によるバイサルファイトＤＮＡの全ゲノム増幅は、２５μｌのバイサルファイト変換したＤＮＡ（ステップ３に記載）、２Ｕ  Ｈｏｔｓｔａｒ  Ｔａｑポリメラーゼ（キアゲン）、２５ｐｍｏｌのプライマー（ｄＴ25）、１ｘＰＣＲ緩衝液（キアゲン）、０．２ｍｍｏｌ／ｌの各ｄＮＴＰ（フェルメンタス）を含む、５０μｌの体積において実行する。循環は、９５℃で１５分および９６℃、１分間で１５サイクル、４５℃で１分および７２℃で５分という条件で、Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（エッペンドルフ）を使用して行う。
【０３１２】
５．リアルタイムＰＣＲ定量化：
増幅したバイサルファイト変換したＤＮＡ（各１μｌ）は、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０ＰＣＲ機（ロシュ）を使用して、定量的リアルタイムＰＣＲ（ＧＳＴＰ１遺伝子アッセイ）に使用する。反応は、４ｍｍｏｌ／ｌのＭｇＣｌ2、０．１５μｍｏｌ／ｌの各検出プローブ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７  ５’‐ＧＴＴＴＡＡＧＧＴＴＡＡＧＴＴＴＧＧＧＴＧＴＴＴＧＴＡ‐Ｆｌｕｏ‐３’およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８  ５’‐Ｒｅｄ６４０‐ＴＴＴＴＧＴＴＴＴＧＴＧＴＴＡＧＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＡＧＧ‐ｐｈｏｓｐｈａｔｅ‐３’および０．３μｍｏｌ／ｌの各（フォワードプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９  ５’‐ＧＧＡＧＴＧＧＡＧＧＡＡＡＴＴＧＡＧＡＴ‐３’、リバースプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０  ５’ＣＣＡＣＡＣＡＡＣＡＡＡＴＡＣＴＣＡＡＡＡＣ‐３’））を含むＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ロシュ）を使用して、２０μｌの体積において実施する。９５℃で１０秒、５６℃で３０秒、７２℃で１０秒での４０サイクルを、９５℃で１０分の初回培養後に実施する。定量化は３回行う。
【０３１３】
結果：
ＴｄＴ（反応II、IVおよびVI）のない全反応は、プライマー結合部位の役割をする尾が存在しないため顕著なバイサルファイト変換したＤＮＡの増幅を示さないと予期される。バイサルファイト処理およびその後の精製の間の約２０％の損失のため、これらの反応は、０．８μｇのバイサルファイト変換したＤＮＡを産出する。わずかな増幅は、制限エンドヌクレアーゼではなく末端トランスフェラーゼを含む反応混合物Ｖ中にあると予期される。これは、使用したヒトゲノムＤＮＡのランダムな断片化のためである。これらの断片は、ＴｄＴのテンプレートとしての役割もし、その後、増幅される。バイサルファイト変換の間の２０％の損失および各増幅サイクルにおける線形増幅の９０％の効率を仮定すると、反応混合物ＩおよびIIIは、１０．８μｇの増幅したバイサルファイト変換したＤＮＡを産出すると予期される。
【０３１４】
考察：
末端トランスフェラーゼを用いる全ゲノム増幅の方法は、最高で約１０倍もバイサルファイト変換したＤＮＡを増幅する上で有益であると予期される。高い増幅は、プライマー伸長反応の間の増幅サイクルを増加させることによって遂行される。ポリｄＴプライマーを使用すると、これは、ヒトバイサルファイトゲノム内のいくつかのポリｄＡおよびポリｄＴ部位の存在によって制限される。これらの部位は、幾何学級数的な方法（ＰＣＲ）で増幅されることがあるため、線形増幅を妨害する。この制限は、尾行反応における５’‐メチル化ｄＣＴＰ（ｄ５ｍｅＣＴＰ）および増幅反応におけるポリＧプライマーを適用することによって回避することができる。得られたポリ５ｍｅＣ尾はバイサルファイト反応によって影響を受けないため、これらの尾は、ヒトバイサルファイトゲノムにおけるポリＧプライマーに対する唯一の可能なプライマー結合部位を示す。したがって、ＰＣＲ増幅は回避可能である。本方法のもう１つの改善は、制限エンドヌクレアーゼ認識部位の残留塩基を含むプライマーを使用して遂行することができる。これによってプライマーの特異性が増加し、再度、不要なＰＣＲ増幅を回避することができる。
【０３１５】
実施例８．ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイによって限定されたメチル化パターンの定量化
限定されたメチル化パターンの定量化に関して、前記メチル化パターンの測定に適するアッセイを使用した。例えば、当該のアッセイは、ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイである。
【０３１６】
したがって、実施例６の１２．５μｌの溶出したバイサルファイト変換したＤＮＡは、ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイに使用した。実施例６の１２．５μｌの溶出したＤＮＡは、実施例２に使用された１．９ｍｌの元の遠隔サンプル均等物に相当する。あるいは、実施例７の増幅したバイサルファイト変換したＤＮＡの同等量も使用可能である。アッセイは３回行った。
【０３１７】
ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイ
ＨＭ１７３７８．７１ＬＣ  ＴａｑＭａｎ  Ｆｌｏｕｒ  ＬＣ  Ｐｒｏｂｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１
５’‐ＧＴｔＣＧＡＡＡＴＧＡＴｔｔｔＡＴｔｔＡＧｔＴＧＣ‐ＦＬ‐３’
【０３１８】
ＨＭ１７３７８．７１ＬＣ  ＴａｑＭａｎ  ＬＣ６４０Ｒｅｄ  Ｐｒｏｂｅ  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２
５’‐ＬＣｒｅｄ６４０‐ＣＧＴＴＧＡｔＣＧＣＧＧＧＧＴｔＣ‐ＰＨ‐３’
【０３１９】
ＨＭ１７３７８．７１ＬＣフォワードプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３
５’‐ＧｔＡＧｔＡＧｔｔＡＧｔｔｔＡＧｔＡｔｔｔＡｔｔＴＴ‐３’
【０３２０】
ＨＭ１７３７８．７１ＬＣリバースプライマーＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４
５’‐ＣＣＣＡＣＣＡａＣＣＡＴＣＡＴａＴ‐３’
【０３２１】
ＨＭ１７３７８．７１ＬＣブロッカーオリゴヌクレオチドＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５
５’‐ＣＡＴＣＡＴａＴＣＡａＡＣＣＣＣＡＣＡａＴＣＡＡＣＡＣＡＣＡａＣ‐ＩＮＶ‐３’
（ＩＮＶは、逆３’末端を示す）
【０３２２】
小文字は、指名したプライマー、プローブおよびブロッカーオリゴヌクレオチドの配列におけるバイサルファイト変換したシトシンを示す。
【０３２３】
以下の溶液はともにピペットで取り、表１４にしたがって混合した。
【０３２４】
2008537888.tif 000017
表１４：ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイのＰＣＲ混合調製
（Ｈｙｂｐｒｏｂｅ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘは、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅｓ（ロシュＣａｔ＃２  ２３９  ２７２）を表す。）
【０３２５】
ＰＣＲは、表１５で特定される条件にしたがって、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０ＰＣＲ機（ロシュ）で実行した。
【０３２６】
2008537888.tif 000018
表１５：ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ２．０ＰＣＲ機（ロシュ）でのＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイのＰＣＲ循環条件
【０３２７】
実施例９．研究の実現
概要：
８９５血漿サンプルは、実施例１ａにしたがって収集し、以下の手順にしたがって分析した：実施例２〜６および実施例８の作業の流れは、２つの研究において実施した。ＤＮＡは、バイサルファイト処理および精製する前に血漿サンプルから単離し、プールして、濃縮した。次に、バイサルファイト変換したＤＮＡは、実施例６に記載されるＨＢ１４アッセイにしたがって定量化した。ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイによって限定されたメチル化パターンを定量化した（実施例７参照）。ＨＭ１７２７８．７１ＬＣアッセイの検出の９０％制限は、５０ｎｇの血液ＤＮＡ（ロシュ、ヒトゲノムＤＮＡ）の背景において、メチル化（ＳＳＳ１処理した）ＤＮＡの希釈系列によって２１ｐｇとして予測した。第１の研究では、１．６ｍｌのＤＮＡの血漿均等物はＰＣＲ反応ごとに加え、各血漿サンプルは２回実行した。第２の研究では、１．９ｍｌのＤＮＡの血漿均等物はＰＣＲ反応ごとに加え、２回実行した。全部の作業の流れは、バッチ形式で同時に実行した。正および負の対照サンプルは、プロセスバッチごとの変動を決定するために各過程ステップにおいて実行した。プロセス較正段階に基づき、ＭａｇＮＡＰｕｒｅ抽出ステップおよびバイサルファイト処理ステップは較正し、対象ＤＮＡ濃度が標準偏差３つの範囲外にあったバッチは、分析から除外した。
【０３２８】
実現：
各遠隔サンプルは３日以内に処理した。初日、ＤＮＡを単離し、濃縮した。２日目、ＤＮＡをバイサルファイト処理し、精製した。最後３日目に、ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイを３回、ＣＦＦ１ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡアッセイ、およびＨＢ１４アッセイをそれぞれのサンプルに対して実行した。毎日、ｉ）１２のＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ機器の作動は、同時に３回作動させた４つの機器とともに実行し、溶出したＤＮＡを有するプレートは対で濃縮した、ii）３バッチのサンプルは、バイサルファイト処理およびバイサルファイト処理後の精製に使用し、各バッチは１つの追加の正の対照および１つの追加の負の対照（対照を含み合計６６サンプル）を有するＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＤＮＡ単離の２０サンプルを含み、iii）５セットのリアルタイムＰＣＲ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒの作動を実施した（１セットのＣＦＦ１ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡアッセイ、１セットのＨＢ１４アッセイ、および３セットのＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイ）。
【０３２９】
統計分析：
例示的に、初日には、正の対照の平均ＤＮＡ回収は、ＤＮＡ単離に対して２．８ｎｇ／ｍｌであった。８９５血漿サンプルの対応する平均ＤＮＡ回収は３．８６ｎｇ／ｍｌであり、０〜１０８６ｎｇ／ｍｌの範囲に及んだ。バイサルファイト処理および精製に関して、８８７血漿サンプルの平均ＤＮＡ回収は、３．３２ｎｇ／ｍｌで０〜１１０９ｎｇ／ｍｌに及んだ。
【０３３０】
第１の研究は、反復した凝集の最適方法および正／負の分類に対する閾値（カットオフ値）を決定することを目的とした。第２の研究は、単独のサンプルセットと使用して、アッセイおよび分類の規則を実証することを目的とした。サンプル番号は、基準に合った信頼区間を提供するため、あらかじめ決定した。第１の研究において、ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイによって限定されたメチル化パターンの二重の分析を、各血漿サンプルに関して実施した。サンプルは、両方の複製が正の場合、正とみなした。第２の研究で得られたデータの感受性および特異性は、第１の研究で決定した閾値（カットオフ値）を適用することによって計算した。第１の研究で見られたマーカー（ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイの閾値またはカットオフ値）の高い特異性のため、ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイによって限定されたメチル化パターンを含む０ｐｇのＤＮＡの質的閾値が決定した。第２の研究において、三重の分析を各患者の血漿サンプルで実施した。サンプルは、３つの複製のうち少なくとも２つが正である場合、正とみなした。増幅曲線は自動的に分析し、本当の曲線を実証するため２人の単独の調査員によっても分析した。相違は、３人目の独立した調査員によって解決した。
【０３３１】
結果：
まず、感受性を第１の研究で決定し、その後、第２の研究で決定した。２つの研究結果を表１６および１７にまとめた。両研究の感受性は、結腸直腸癌の検出に対して、５０〜５７％の範囲であった。この結果は、ＨＭ１７３７８．７１ＬＣアッセイおよび選択された閾値（カットオフ値）によって限定されたマーカーは、５０歳以上の無症状の個体においても非常に特異的（９４〜９５％）であることを示す。特異性も、胃炎、関節炎、呼吸器感染および結腸直腸癌以外の早期癌などの状態の患者が関与する場合、高かった（９２％）。マーカーは、基部に近い結腸直腸癌および早期癌の両方に対する感受性が低いと示されているＦＯＢＴおよびｉＦＯＢＴなどの糞便検査とは異なり、進行段階や結腸にある病変の位置に関わらず、類似の感受性を有する結腸直腸癌を検出すると見られた。
【０３３２】
患者のコンプライアンスおよび現在のスクリーニング法の能力は、今日市場で利用可能なテストの有効性を制限する。大腸内視鏡検査の前に行う、結腸直腸癌を早期検出するための実施が容易な血液をベースにしたテストは、この疾患による死亡率を減少させる非常に効果的な方法になる可能性がある。
【０３３３】
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表１６：第１の研究の結果
【０３３４】
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表１７：第２の研究の結果
【図面の簡単な説明】
【０３３５】
【図１】図１は、本発明の１つの実施例の概観を示す。
【図２】図２は、例示的なプーリングおよび濃縮法の概観を示す。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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