(57)【要約】本発明は、ミトコンドリア遺伝病、もしくはミトコンドリア遺伝病に関連する疾病あるいは症状の治療、予防、もしくは発症リスクの軽減のため、スピロステノール誘導体の使用を含む方法、および組成に関するものである。【選択図】図1
2008534623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
中枢神経系の神経病理ではないミトコンドリア障害を罹患した、もしくは罹患の兆候のある哺乳類に施されることを含む治療の方法であって、前記哺乳類に有効量の構造式Iの化合物もしくは薬学的に許容されるそれらの塩を投与することを含む方法であって、
【化１】
2008534623.tif 000006
式中のR1、R2、R4、R7、R11、R12、およびR15のそれぞれは個別に、水素原子、任意に-NR'-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR'-もしくは-NR'-C(O)-を挿入した(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシル基、N(R')2、カルボキシル基、オキソ基、もしくはスルホン酸であり、
R3はヒドロキシル基、(C1-C8)アルコキシ基、(C1-C22)アルキルCO2、もしくはR'O2C(CH2)2-8CO2-であって、
ここで、(C1-C22)アルキル基もしくは(CH2)2-8は任意に1〜2個のCH=CH単位、1〜2個のOH、および／もしくは1〜2個のエポキシ置換基を含むことができ、
R3はトルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、
R6、R8、R9、R10、R13、R14、R16およびR17のそれぞれは個別に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)ヒドロキシルアルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシル基であり、
XはO、S、S(O)、N(R')、N(Ac)もしくはN(トルエン-4-スルホニルオキシ)基であり、
ここで各R'は、個別にH、(C1-C8)アルキル基、フェニル基もしくはベンジル基である
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
R10およびR13がCH3であることを特徴とする、請求項１の治療方法。
【請求項３】
R16およびR17の一つもしくは両方がCH3であることを特徴とする、請求項１もしくは請求項２の治療方法。
【請求項４】
R1、R2もしくはR12がHあるいはOHであることを特徴とする、請求項１から請求項３のいずれか一項の治療方法。
【請求項５】
R1、R2、R4、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14およびR15がHであることを特徴とする、請求項１から請求項４のいずれか一項の治療方法。
【請求項６】
R3が(C1-C22)アルキルCO2-、(C1-C6)アルキルCO2-、もしくはOHであることを特徴とする、請求項１から請求項５のいずれか一項の治療方法。
【請求項７】
XがOであることを特徴とする、請求項１から請求項６のいずれか一項の治療方法。
【請求項８】
XがNHであることを特徴とする、請求項１から請求項６のいずれか一項の治療方法。
【請求項９】
ミトコンドリア障害を、前記障害に罹患した、あるいは罹患の兆候の或る患者において治療するための治療方法であり、
ここで前記障害は中枢神経系の神経病理ではなく、
有効量の構造式IIの化合物もしくは薬学的に許容されるそれらの塩を前記患者に投与することを含み、
【化２】
2008534623.tif 000007
式中のR1、R2、R4、R7、R11、R12、およびR15はそれぞれ個別に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、スルホン酸、もしくは、任意に-NH-、-N((C1-C8)アルキル基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR'-、もしくは-NR'-C(O)-を挿入した(C1-C8)アルキル基であって、
ここでR'はHもしくは(C1-C8)アルキル基であり、
R3はヒドロキシル基、(C1-C6)アルキルCO2、HO2C(CH2)2CO2-、トルエン-4-スルホニルオキシ基もしくはベンゾイルオキシ基であり、
R6、R8、R9、R10、R13、およびR14はそれぞれ個別に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)ヒドロキシルアルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシル基であり、
XはO、N(H)、N(Ac)もしくはN(トルエン-4-スルホニルオキシ)基である
ことを特徴とする方法。
【請求項１０】
R3がOHもしくは(C1-C6)アルキルCO2-であることを特徴とする、請求項９の方法。
【請求項１１】
XがOであることを特徴とする、請求項９もしくは請求項１０の方法。
【請求項１２】
XがNHであることを特徴とする、請求項９もしくは請求項１０の方法。
【請求項１３】
R10およびR13がCH3であることを特徴とする、請求項９から請求項１２のいずれか一項の方法。
【請求項１４】
R1、R2もしくはR12がOHであることを特徴とする、請求項９から請求項１３のいずれか一項の方法。
【請求項１５】
R1、R2、R4、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14およびR15がHであることを特徴とする、請求項９から請求項１５のいずれか一項の方法。
【請求項１６】
請求項１もしくは請求項９のいずれか一項の方法であって、
前記化合物が、(20α)-25ξ-メチル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-オー
ル、(20ξ)-25ξ-メチル-N-アセチル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-オール、(22R,25ξ)-(20α)-スピロスタ-5-エン-(2α,3ξ)-ジオール、パラトルエンスルホン酸=(20α)-25ξ-メチル-N-パラトルエンスルホニル-(22R,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3ξ-イル、(22R,25ξ)-(20α)-(14α,20α)-スピロスタ-5-エン-(3β,12β)-ジオール、(22R,25S)-(20ξ)-スピロスタ-5-エン-3ξ-オール、安息香酸=(22R,25ξ)-(20α)-スピロスタ-5-エン-3β-イル、ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イル、(22R,25ξ)-(20α)-スピロスタ-5-エン-(1ξ,3ξ)-ジオール、(22R,25S)-(20α)-スピロスタ-5-エン-3β-オール、琥珀酸=(22R,25S)-(20α)-スピロスタ-5-エン-3β-イル、およびプロパン酸=(20α)-25S-メチル-N-アセチル-(22S,26)-アザシクロフロスタ-5-エン-3β-イル、から成る群から選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項１７】
前記化合物がヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イルであることを特徴とする、請求項１６の方法。
【請求項１８】
請求項１もしくは請求項９の方法であって、前記化合物の治療的な有効量を含む剤型で前記化合物が投与されることを特徴とする方法。
【請求項１９】
請求項１８の方法であって、
前記剤型が、錠剤、ソフトゼラチンカプセル、ハードゼラチンカプセル、懸濁錠剤、発泡錠剤、粉末剤、発泡粉末剤、チュアブル剤、液剤、懸濁液、乳剤、クリーム、ゲル、パッチ、および坐薬から成る群から選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項２０】
前記剤型が薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことを特徴とする、請求項１９の方法。
【請求項２１】
請求項２０の方法であって、
前記薬学的に許容される賦形剤が、結合剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定剤、滑剤、湿潤剤、希釈剤、固結防止剤、流動促進剤、もしくは薬学的に適合する担体を含む
ことを特徴とする方法。
【請求項２２】
前記ミトコンドリア障害がミトコンドリア病であることを特徴とする、請求項１から請求項２１のいずれか一項の方法。
【請求項２３】
前記ミトコンドリア障害が筋疾患であることを特徴とする、請求項１から請求項２１のいずれか一項の方法。
【請求項２４】
前記筋疾患が心筋症であることを特徴とする、請求項２３の方法。
【請求項２５】
前記ミトコンドリア障害が細管炎であることを特徴とする、請求項１から請求項２３のいずれか一項の方法。
【請求項２６】
前記ミトコンドリア障害が、コンパートメント症候群もしくは筋圧挫症候群に起因することを特徴とする、請求項１から請求項２１のいずれか一項の方法。
【請求項２７】
請求項１から請求項２１のいずれか一項の方法であって、
前記中枢神経系の神経病理が、全虚血と局所虚血、もしくは出血性卒中、頭部外傷、脊髄損傷、低酸素誘導神経細胞損傷、心停止もしくは新生児困難に起因する神経細胞損傷
、てんかん、不安症、脊髄障害、ALS、アルツハイマー病、ハンチントン病、およびパーキンソン病から成る群から選択される
ことを特徴とする方法。
【請求項２８】
薬学的な化合物であり、治療に有効な量の構造式IもしくはIIの化合物の少なくとも一方
を、薬学的に許容される賦形剤と併用して含む化合物。
【請求項２９】
構造式（I）の化合物もしくは薬学的に許容されるそれらの塩の使用方法であり、
【化３】
2008534623.tif 000008
式中のR1、R2、R4、R7、R11、R12、およびR15のそれぞれは個別に、水素原子、任意に-NR'-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR'-もしくは-NR'-C(O)-を挿入した(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシル基、N(R')2、カルボキシル基、オキソ基、もしくはスルホン酸であり、
R3はヒドロキシル基、(C1-C8)アルコキシ基、(C1-C22)アルキルCO2、もしくはR'O2C(CH2)2-8CO2-であって、
ここで、(C1-C22)アルキル基もしくは(CH2)2-8は任意に1〜2個のCH=CH単位、1〜2個のOH、および／もしくは1〜2個のエポキシ置換基を含むことができ、
R3はトルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、
R6、R8、R9、R10、R13、R14、R16およびR17のそれぞれは個別に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)ヒドロキシルアルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシル基であり、
XはO、S、S(O)、N(R')、N(Ac)もしくはN(トルエン-4-スルホニルオキシ)基であり、
ここで各R'は、個別にH、(C1-C8)アルキル基、フェニル基もしくはベンジル基であり、
前記中枢神経系の神経病理ではないミトコンドリア病もしくは障害を治療するための薬剤を調製することを含む、
構造式（I）の化合物もしくは薬学的に許容されるそれらの塩の使用方法。
【請求項３０】
構造式（II）の化合物もしくは薬学的に許容されるそれらの塩の使用方法であり、
【化４】
2008534623.tif 000009
式中のR1、R2、R4、R7、R11、R12、およびR15はそれぞれ個別に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、スルホン酸、もしくは、任意に-NH-、-N((C1-C8)アルキル基)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-、SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR'-、もしくは-NR'-C(O)-を挿入した(C1-C8)アルキル基であって、
ここでR'はHもしくは(C1-C8)アルキル基であり、
R3はヒドロキシル基、(C1-C6)アルキルCO2、HO2C(CH2)2CO2-、トルエン-4-スルホニルオキシ基もしくはベンゾイルオキシ基であり、
R6、R8、R9、R10、R13、およびR14はそれぞれ個別に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)ヒドロキシルアルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシル基であり、
XはO、N(H)、N(Ac)もしくはN(トルエン-4-スルホニルオキシ)基であり、
前記中枢神経系の神経病理ではないミトコンドリア病もしくは障害を治療するための薬剤を調製することを含む、
構造式（II）の化合物もしくは薬学的に許容されるそれらの塩の使用方法。
【請求項３１】
前記薬剤が生理学的に許容される担体を含むことを特徴とする、請求項２９もしくは請求項３０の使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、2005年4月1日に出願された米国仮特許出願第60/667,229号、および2005年7月8日に出願された米国仮特許出願第60/697,518号に基づく優先権を主張し、両出願を参照として本明細書に引用する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、赤血球を除く体の全細胞に存在する分化した小器官であり、酸化的リン酸化によって、生命と成長の維持に体が必要なエネルギーの90%以上を生産する役目を担っている。ミトコンドリア呼吸鎖がはたらかなくなると、細胞のエネルギーレベルは急速に下がり、細胞死と器官機能障害につながる。器官によって異なるが、ミトコンドリアの生理機能の障害は、神経変性の疾病と疾患に関連する。これらは、アルツハイマー病やパーキンソン病などの中枢神経系の疾病と疾患、および、筋疾患（筋障害）や、種々の腎臓、肝臓ならびに呼吸の疾患などの、末梢神経系に影響を及ぼす疾病と疾患を含む。
【０００３】
ミトコンドリア障害の重症度によるが、疾患は軽症から致死の重症度にまで及ぶ。ミトコンドリアの障害が、罹患した疾病の原因であろうと結果であろうと、障害を負った生理機能を回復させるのに、呼吸機能の保護は必須である。さらに、ミトコンドリアの呼吸機能の保護は、成功する移植のために必要な組織の保存のためにも必須である。
【０００４】
遺伝的要因を持つミトコンドリア病の治療法は存在しないが、しかし治療によって症状を和らげること、または疾病の進行を遅らせる、もしくは阻止することを助けることは可能である(M. Zeviani et al., Brain; 127: 2153 (2004))。体質と疾患の重症度によって、治療は各患者個々に区別されるものの、これらの緩和治療は、既に起こった損傷を取り消すことはできない。しかし、遺伝子治療や薬物療法を含む多数の実験方法が、現在評価されている。
【０００５】
一つの方法は、タンパク質導入装置を用いて、修飾遺伝子もしくは遺伝子産物をミトコンドリア内に導入すること(G. Manfredi et al., Natur. Genet., 30:394 (2002))、および、配列特異的な、抗遺伝子ペプチド核酸によって、変異mtDNAの複製を妨げること(R.W.
Taylor et al., Natur. Genet., 15:212 (1997))を含む。これらの取り組みは、まだ臨床では用いられていない。
【０００６】
特定の特殊な筋疾患の症例では、ヘテロプラズミックな（異なる型のmtDNAが混在している）変異体の荷重の減少が、筋毒性薬を用いて、制御された筋線維損傷、および、変異体を持たないサテライト細胞による再生によって得られる(W. Irwin et al., J. Biol. Chem., 277:2221 (2002))。しかし、この治療は進行性外眼筋麻痺症候群(PEO)の5人の患者における下垂の改善には効果がなかった。
【０００７】
クレアチンは、クレアチンリン酸の合成の基質であり、筋、心臓および脳における、最も豊富なエネルギー貯蔵化合物である。種々の神経筋疾患を持つ81患者（17人のミトコンドリア病患者を含む）における非盲検試験は、虚血性等尺性握力、および非虚血性等尺性背屈トルクの著しい改善を示した。しかし、慢性PEOもしくはミトコンドリア筋疾患の16患者における別の無作為二重盲検プラセボ対照交差試験では、運動成績、眼球運動、もしくは日常生活動作において著しい効果は見られなかった(P. F. Chinnery et al., Am. J.
Med. Genet., 106:94 (2001))。あわせて考えると、これらのデータは、クレアチンが、全てではないがいくつかのミトコンドリア病においては効果的であることを示している。
【０００８】
コエンザイムQ10はmtDNAに関連するミトコンドリア病においては効果がないが (N. Bresolin et al., J. Neurol. Sci., 100:70 (1990))、‘原発性’CoQ10欠乏症において顕著な改善につながる。コエンザイムQ10の短鎖類似体であるイデベノンは、フリードライヒ失調症における肥大性心筋症の改善に効果があると思われる(P. Rustin et al., Lancet,
354: 477 (1999); C. Mariotti et al., Neurology, 60:1676 (2003))。
【０００９】
このように、ミトコンドリア病を含むミトコンドリア障害の治療法が依然として必要とされている。
【発明の開示】
【００１０】
本発明は、中枢神経系の神経病理ではないミトコンドリア障害に罹患した、もしくは罹患の兆候のある、ヒトなどの哺乳類への投薬を含む治療法を提供する。これは、哺乳類に有効量の構造式（I）の化合物、または薬学的に許容されるそれらの塩を投与することを含む。
【００１１】
【化５】
2008534623.tif 000003
【００１２】
式中のR1、R2、R4、R7、R11、R12およびR15のそれぞれは、個別に、水素原子、任意に-NR'-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR'-、もしくは-NR'-C(O)-を挿入した(C1-C8)アルキル基、または、ヒドロキシル基、N(R')2、カルボキシル基、オキソ基、もしくはスルホン酸である。R3はヒドロキシル基、(C1-C8)アルコキシ基、(C1-C22)アルキルCO2、R'O2C(CH2)2-8CO2-、トルエン-4-スルホニルオキシ基、もしくはベンゾイルオキシ基であり、ここで(C1-C22)アルキル基もしくは(CH2)2-8は任意に1〜2個のCH=CH単位、1〜2個のOH、および／もしくは1〜2個のエポキシ置換基を含むことができる。R6、R8、R9、R10、R13、R14、R16およびR17のそれぞれは、個別に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシル(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシル基であり、XはO、S、S(O)、N(R')、N(Ac)もしくはN(トルエン-4-スルホニルオキシ基)である。
【００１３】
ここで各R'は、個別にH、(C1-C8)アルキル基、フェニル基もしくはベンジル基である。
R16および／もしくはR17はCH3であることが好ましい。
アルキル基は(C2-C8)アルキル基であることが好ましい。
【００１４】
従って、本発明は、中枢神経系の神経病理ではない疾患に罹患した、もしくは罹患の兆候のある患者において、ミトコンドリア障害を治療するための治療法を含み、これは、有効量の構造式（II）の化合物、もしくは薬学的に許容されるそれらの塩を患者に投与することを含む。
【００１５】
【化６】
2008534623.tif 000004
【００１６】
ここで式中のR1、R2、R4、R7、R11、R12、およびR15のそれぞれは、個別に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、ヒドロキシル基、アミノ基、カルボキシル基、オキソ基、スルホン酸、または、任意に-NH-、-N((C1-C8)アルキル)-、-O-、-S-、-SO-、-SO2-、-O-SO2-、-SO2-O-、-C(O)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-C(O)-NR'-、もしくは-NR'-C(O)-を挿入した(C1-C8)アルキル基で、ここでR'はHもしくは(C1-C8)アルキル基である。R3はヒドロキシル基、(C1-C6)アルキルCO2、HO2C(CH2)2CO2-、トルエン-4-スルホニルオキシ基もしくはベンゾイルオキシ基である。R6、R8、R9、R10、R13、およびR14のそれぞれは、個別に、水素原子、(C1-C8)アルキル基、(C1-C8)ヒドロキシルアルキル基、(C1-C8)アルコキシ基、もしくはヒドロキシル基である。XはO、N(H)、N(Ac)もしくはN(トルエン-4-スルホニルオキシ)基である。
【００１７】
下記に詳細に示すように、スピロステノール、特に、ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イルなどの5,6不飽和スピロステノール、サンシチソウ（キク科）に天然に存在する22R-ヒドロキシコレステロール誘導体は、ミトコンドリアに有毒なAβに作用するだけでなく、ミトコンドリア呼吸鎖に直接作用することで効果を発揮する、新しい治療法を提供することができる。ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イルは、さらに、誘発された酸化的リン酸化の脱共役を止め、ミトコンドリア膜透過性遷移孔の有力なブロッカーであるシクロスポリンAの効果を増幅させる。これはミトコンドリア膜透過性遷移孔における効果を意味する。
【００１８】
CNS神経病理とはみなされないミトコンドリア病を含むミトコンドリア障害、および本方法で治療され得るミトコンドリア障害は、次のものを含む。
眼球：網膜色素変性症、視神経萎縮
筋：外眼筋の疾患（下垂、後天性斜視、眼筋麻痺）、圧挫筋症候群（コンパートメント症候群）
薬物副作用の結果としてのミトコンドリア機能不全（高活性抗レトロウイルス剤療法、HAARTなど）
筋疾患
心臓：心発作、心臓発作、心臓病、心疾患、心筋症、および、薬物副作用の結果としての任意の心臓のミトコンドリア機能不全（HAART、メガHAART、アントラサイクリンのような抗ガン剤など）
肝臓：肝細胞性の機能不全
腎臓および内分泌系：細管炎、糖尿病
呼吸障害
本発明は、薬学的に許容される担体と結合した、有効量の構造式Iおよび／もしくはIIの化合物を含む医薬合成物のような、構造式IもしくはIIの新しい化合物および合成物をさらに提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
下記に述べるように、ミトコンドリア呼吸鎖の障害は、アルツハイマー病（AD）と関連して詳細に述べられてきた。また、Aβ1-42はミトコンドリア呼吸鎖を脱共役させ、ミトコンドリア膜透過性遷移孔（MPT）の開放を促進し、細胞死につながることが報告されてきた。スピロステノール、ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イル（SP-233）は、ペプチドに結合し不活性化することで、Aβ1-42毒性に対して神経細胞を守ると報告されている。本発明は、SP-233の保護効果がミトコンドリア機能の保護にも帰するという発見に基づくものである。ラット前脳から単離したミトコンドリアにおいて、SP-233によって部分的に打ち消された保護効果により、ピコモル濃度のAβ1-42がミトコンドリア呼吸率を減少させるということがわかっている。このSP-233の保護効果は、おそらく、SP-233がAβ1-42はもちろん、呼吸鎖をも直接標的とすることに由来する。
【００２０】
SP-233はさらに、カルボニルシアニド=3-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）に誘導される酸化的リン酸化の脱共役を停止させる。また、シクロスポリンA（ミトコンドリアMPT孔の有力なブロッカー）の効果を増幅させ、これはMPTへの効果を意味する。呼吸鎖の脱共役およびミトコンドリアMPT孔の開放は、Aβ1-42によって引き起こされる心身に有害な二つの現象であるため、これらのSP-233の特性がその神経保護効果に寄与すると考えられる。
【００２１】
さらにヒトSK-N-AS神経芽細胞腫を用いて、Aβ1-42はミトコンドリアマトリクスに累積し、SP-233はAβ1-42を完全にマトリクスから排除するということが、共焦点顕微鏡法を用いて観察された。これらの結果は、Aβ1-42およびSP-233はヒト神経細胞のミトコンドリア機能に直接的な影響を及ぼし、またSP-233（アミロイドペプチドと共に培養混合液に存在するとき）はAβ誘導毒性に対してこれらの細胞を保護することができる、ということを示す。まとめると、これらの所見は、Aβ1-42がミトコンドリア機能に直接的な毒性効果を及ぼすということを示し、また、SP-233が、Aβを直接標的とすること、従って呼吸鎖を保護し、ADおよび他のCNS神経病理以外のミトコンドリアの疾病および障害の治療に有効な化合物ファミリーを提供することで、神経保護効果を発揮するということ、を示す。
【００２２】
本明細書で用いられるように、ミトコンドリア障害という言葉は、当分野で認められるミトコンドリア病だけでなく、ミトコンドリア障害もしくは機能不全が、兆候症状、進行および／もしくは予後において役割を担うような状態をも含む。後者の状態は、アルツハイマー病、パーキンソン病、多発性硬化症、もしくは筋萎縮性側索硬化症などの神経変性疾患を含み、さらに、卒中、脳虚血および他の脳および脊髄損傷によって引き起こされる神経細胞死を含む。ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3-イルを含むスピロステノールの、A誘導神経毒性に対する保護効果、およびAD治療における潜在的効果は報告されており(L. Lecanu et al., Steroids, 69:1 (2004))、また、公開されたPCT出願WO/03/077869の主題にもなっている。ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3-イルの、種々のストレッサーに対するミトコンドリア保護効果、および種々のミトコンドリア病の治療における効果は、これまでにわかっていない。
【００２３】
ミトコンドリア病もしくはミトコンドリア筋疾患は、ミトコンドリアに影響する疾病群であり、また筋機能にも干渉する。疾病群は、キーンズ‐セイアー症候群、リー症候群、ミトコンドリアDNA減少症候群（MDS）、ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシスおよび卒中様発作症状（MELAS）、ラゲット・レッド線維を伴うミオクローヌスてんかん（MERFF）、ミトコンドリアneurogastrointestinal脳筋症（MNGIE）、神経障害、運動失調および色素性網膜炎（NARP）、および進行性外眼筋麻痺症候群（PEO）を含む。
【００２４】
ミトコンドリア筋疾患の症状は、筋力低下もしくは運動不耐性、心障害（心筋症）もし
くは律動障害、痴呆、運動障害、卒中様発作症状、難聴、失明、眼瞼下垂症、眼球運動制限、嘔吐、および発作を含む。これらの障害の予後は、進行性の衰弱から死に至る重症度にまで及ぶ。このように、ミトコンドリア障害は、視神経萎縮、下垂、後天性斜視、および眼筋麻痺などの眼の障害を含み得る。ミトコンドリア機能不全は、筋圧挫症候群（コンパートメント症候群）、HAARTならびに心臓を損傷させる薬物（アントラサイクリンなど）を含む抗ガン治療のような、薬物療法の副作用、肝細胞機能不全、内分泌細管症、および呼吸障害によって引き起こされ得る。
【００２５】
ミトコンドリア筋疾患のほとんどは20歳より前に発症し、しばしば運動不耐性もしくは筋力低下と共に発症する。身体活動において、筋は簡単に疲労もしくは衰弱してしまう。まれではあるが筋痙攣が起こる。吐き気、頭痛、および無呼吸もまたこれらの障害に伴う。
【００２６】
本明細書で用いられる“治療する”もしくは“治療”という言葉は、患者においてミトコンドリアに関する疾病もしくは障害に関連する疾病もしくは障害の任意の治療を意味し、また、疾病もしくは障害に罹りやすいと思われるが、まだ疾病もしくは障害に罹患したとは診断されていない患者において、疾病もしくは障害の発症を予防すること、疾病もしくは障害を抑制すること（例えば疾病もしくは障害の進行の阻止）、疾病もしくは障害を軽減すること（例えば疾病もしくは障害の症候の緩解）、もしくは、疾病もしくは障害に起因する状態を軽減すること（例えば疾病もしくは障害の症状の抑止）、とを含むが、それらに限定されない。本明細書で用いられるように、“ミトコンドリア障害”もしくは“ミトコンドリア病”とは、本明細書で開示する全ての障害を含むことを意味する。
【００２７】
本方法は、移植されるもしくは移植する器官もしくは組織において、ミトコンドリア障害の予防もしくは軽減に、in vitroでも用いられる。
“予防する”もしくは“予防”という言葉は、ミトコンドリアに関する疾病もしくは障害に関連して、患者において、何も起きていない場合には疾病もしくは障害が進行しないこと、あるいは、既に障害もしくは疾病が進行している場合にはさらに障害もしくは疾病が進行しないこと、あるいは、論理的に観察可能な疾病の兆候を示す症状がないこと、を意味する。
【００２８】
好ましい立体異性体は、3S、10Rと13S、および20S、炭素骨格がスピロステン-3-オールの番号付けに一致して番号付けられる22Sと25Sである。従って、好ましい構造式（IもしくはII）の化合物は、ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イル（SP233）である。構造式（I）もしくは（II）に示される炭素原子は、他に示されない限り、水素原子で飽和していることに注目されたい。
【００２９】
他に定められない限り、“アルキル基”、接頭辞“alk”（アルコキシ基におけるように）、および接尾辞“−アルキル”（ヒドロキシアルキル基におけるように）という言葉は、それぞれC1-8炭化水素の直鎖（ブチル基など）もしくは分鎖（イソブチル基など）をあらわす。アルキレン、アルケニレン、およびアルキニレンは、それぞれ二価のC1-8アルキル（エチレンなど）、アルケン、およびアルキンラジカルをあらわす。アルキル基は、ブチル基、ヘキシル基、メチル基、エチル基、プロピル基、もしくはイソプロピル基などの(C1-C6)アルキル基であることが好ましい。“アルキル基”という言葉は、シクロアキル基、（シクロアルキル）アルキル基、およびアルキル（シクロアルキル）アルキル基を含む。“アルケニル”という言葉も同様に、1〜2個のCH=CH単位を含むアルキル基だけでなく、付随するシクロアルケニル残基を含む。
【００３０】
特に、(C1-C8)アルキル基はメチル基、エチル基、プロピル基、イソプロピル基、ブチル基、イソブチル基、sec-ブチル基、ペンチル基、3-ペンチル基、へプチル基、もしくは
オクチル基であり得る。(C3-C8)シクロアルキル基は単環、二環、もしくは三環とすることもでき、さらにシクロプロピル基、シクロブチル基、シクロペンチル基、シクロヘキシル基、ビシクロ[2.2.2]オクタニル基もしくはノルボルニル基を含み、さらに種々のテルペンおよびテルペノイド構造を含む。(C3-C6)シクロアルキル(C1-C2)アルキル基は、前記のシクロアルキル基を含み、シクロプロピルメチル基、シクロブチルメチル基、シクロペンチルメチル基、シクロヘキシルメチル基、2-シクロプロピルエチル基、2-シクロブチルエチル基、2-シクロペンチルエチル基、もしくは2-シクロヘキシルエチル基とすることができる。ヘテロシクロアルキル基は、シクロアルキル基を含み、ここでそのシクロアルキル環系は、単環、二環、もしくは三環であり、且つ、任意に1〜2個のS、過酸化物ではないO、もしくはN(R')と、4〜8個の環員炭素原子を含むようなものであって、例えば、モルホリニル基、ピペリジニル基、ピペラジニル基、インダニル基、1,3-ジチアン-2-イル基、などである。全てのシクロアルキル環系もしくはヘテロシクロアルキル環系は、任意に、1〜3個の二重結合もしくはエポキシ残基を含み、且つ、任意に、1〜3個のOH、(C1-C6)アルカノイルオキシ基、(CO)、(C1-C6)アルキル基、もしくは(C2-C6)アルキニル基で置換される。(C1-C8)アルコキシ基には、メトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、イソプロポキシ基、ブトキシ基、iso-ブトキシ基、sec-ブトキシ基、ペントキシ基、3-ペントキシ基、もしくはヘキシルオキシ基を含めることができる。(C2-C6)アルケニル基は、ビニル基、アリル基、1-プロペニル基、2-プロペニル基、1-ブテニル基、2-ブテニル基、3-ブテニル基、1-ペンテニル基、2-ペンテニル基、3-ペンテニル基、4-ペンテニル基、1-ヘキセニル基、2-ヘキセニル基、3-ヘキセニル基、4-ヘキセニル基、もしくは5-ヘキセニル基とすることができる。ヒドロキシ(C1-C8)アルキル基もしくはヒドロキシ(C1-C8)アルコキシ基は、1もしくは2個のOH基で置換したアルキル基とすることができ、こうした1もしくは2個のOH基で置換したアルキル基としては、例えばヒドロキシメチル基、1-ヒドロキシエチル基、2-ヒドロキシエチル基、1-ヒドロキシプロピル基、2-ヒドロキシプロピル基、3-ヒドロキシプロピル基、1-ヒドロキシブチル基、4-ヒドロキシブチル基、3,4-ジヒドロキシブチル基、1-ヒドロキシペンチル基、5-ヒドロキシペンチル基、1-ヒドロキシヘキシル基、もしくは6-ヒドロキシヘキシル基である。(C1-C22)アルキルCO2-は、アセトキシ基、プロパノイルオキシ基、ブタノイルオキシ基、イソブタノイルオキシ基、ペンタノイルオキシ基、もしくはヘキサノイルオキシ基とすることができ、もしくは(C8-C22)CO2-は天然脂肪酸の残基を表すこともできる。
【００３１】
本発明のある実施形態において、R10および／もしくはR12はCH3である。
本発明の別の実施形態において、R16およびR17はCH3である。
本発明の更なる実施形態において、R1、R2および／もしくはR12はHもしくはOHとなり得る。
【００３２】
別の実施形態において、R1、R2、R4、R6、R7、R8、R9、R11、R12、R14およびR15はHである。
R2は、(C8-C22)アルキルCO2-もしくは(C1-C6)アルキルCO2-を含む(C1-C22)アルキルCO2-であることができ、またはOHもしくはO(C1-C8)アルキル基、またはHO2C(CH2)2CO2-であることができる。
【００３３】
XはO、あるいは、NHもしくはNAcを含むNR'となり得る。
R3はOR23でもよく、ここでR23は、脱離可能なヒドロキシ保護基であって、例えば、トシル基、メシル基、トリ(C1-C4)アルキルシリル基、THP、Eto(Et)、ベンジル基、ベンゾイルオキシカルボニル基、などとすることができる。C3がヒドロキシ置換された、化合物のC3-(C8-C22)脂肪酸エステルも本発明に包含され、脂肪酸は天然のものが好ましい。
【００３４】
本発明の実施に用いられる、上記構造式（I）および（II）の種々の化合物を下の表1に示す。
【００３５】
【表１】
2008534623.tif 000005
【００３６】
効能のある本発明の化合物の有効量は、障害を負ったミトコンドリア機能に関連する疾病の治療のために認可される前に、医薬組成物となるために薬学的に許容される担体と共に処方され得る。“有効量”もしくは“薬学的有効量”とは、治療された患者に治療効果を与えるために必要とされる化合物の量をあらわす。動物とヒトへの投薬量の相関（mg/m2体表面積に基づく）は、Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50, 219 (1966)に記載されている。体表面積は患者の身長と体重から概算できる。例えばScientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, New York, 1970, 537を参照のこと。有効投与量は、Aβ毒性の阻害、もしくは、そうでなければミトコンドリアの保護に有効であると判明した、本化合物のin vitro濃度に基づくものである。モデル神経細胞株の治療に有効な本化合物の投与量は、下記に開示する。また、有効投与量は、当業者によって認められる
とおり、投与経路、賦形剤使用、および他の治療薬との同時投与によって異なる。
【００３７】
有効成分の毒性および効力は、例えばLD50（50%致死量）およびED50（50%有効量）を定めるための、標準的な薬学的手順によって定められる。毒性効果と治療効果との投与量の比率が治療係数であり、LD50/ED50の比率であらわされる。大きな治療係数を示す化合物が好ましい。毒性の副作用を示す化合物でも使用できるが、そのような化合物を病変組織部位へ導く送達系を設計するには、未感染細胞への潜在ダメージを最小限にする、すなわち副作用を軽減するために、注意が必要である。
【００３８】
本発明の方法、キット、化合物および医薬組成物には、記載の化合物および薬学的に許容されるそれらの塩の結晶体（多形体など）、鏡像体、異性体、および互変体が含まれる。実例となる薬学的に許容される塩は、蟻酸、酢酸、プロピオン酸、琥珀酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、メシル酸、ステアリン酸、サリチル酸、p-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、トルエンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、アルギン酸、b-ヒドロキシ酪酸、ガラクタル酸、およびガラクツロン酸から調製される。
【００３９】
“プロドラッグ”という言葉は、体内の代謝過程による転換の結果として、薬学的活性を生じるような薬物、もしくは化合物（活性成分）をあらわす。プロドラッグは、一般に薬物の前駆物質とみなされ、患者への投与およびその後の吸収に引き続いて、代謝過程などのいくつかの過程を経て、活性種もしくはより強い活性種に転換される。転換過程からの生じる他の産物は、身体で簡単に処理される。一般にプロドラッグはその上に、活性を下げる、および／もしくは、可溶性あるいはいくつか他の特性を薬物に与えるような、例えばエステル基もしくはアシル基などの、化学官能基を持つ。化学官能基がプロドラッグから解離すると、より活性の高い薬物が生まれる。プロドラッグは可逆性の薬物誘導体として設計され、薬物の部位特異的な組織への運搬を促進する修飾因子として利用される。現在のところ、プロドラッグの目的は、水が主な溶媒である部位を標的とするために、治療化合物の実効水溶性を高めることである。例えば、Fedorak, et al., Am. J. Physiol., 269, G210-218 (1995)はデキサメタゾン- β-D-グルクロニドについて記載している。McLoed, et al., Gastroenterol., 106, 405-413 (1994)は琥珀酸デキサメタゾン=デキストランについて記載している。Hochhaus, et al., Biomed. Chrom., 6, 283-286 (1992)は、21-スルホ安息香酸デキサメタゾンナトリウム、および21-イソニコチン酸デキサメタゾンについて記載している。加えて、J. Larsen and H. Bundgaard, Int. J. Pharmaceutics, 37, 87 (1987)によれば、N-アシルスルホンアミドはプロドラッグ誘導体の可能性があると評価されている。J. Larsen et al., Int. J. Pharmaceutics, 47, 103 (1988)によれば、N-メチルスルホンアミドはプロドラッグ誘導体の可能性があると評価されている。また、プロドラッグは、例えば、Sinkula et al., J. Pharm. Sci., 64, 181-210 (1975)などにも記載されている。プロドラッグはさらに、当該技術分野で周知の合成相互変換により、構造式（I）もしくは（II）の他の化合物の調製における合成中間体としても有用である。例えば、スピロステノール置換基の相互変換に有用な方法は、I.T. Harrison,
Compendium of Organic Synthetic Methods, Wiley-Interscience (1971)を参照のこと。
【００４０】
“誘導体”という言葉は、類似した構造の別の化合物から、そのうちの或る原子、分子もしくは基を、他のものに交換、あるいは置換することによって作られる化合物をあらわす。例えば、化合物中の水素原子はアルキル基、アシル基、アミノ基などで置換され、その化合物の誘導体を作る。
【００４１】
“血中濃度”とは、血漿もしくは血清中の基質濃度をあらわす。
“薬物吸収”もしくは“吸収”とは、薬物の投与部位から、例えば患者の血流などの全身循環への、移動過程をあらわす。
【００４２】
“生物学的利用率”とは、有効成分（薬物もしくは代謝物）が全身循環に吸収され、体内の薬効部位で有効となるまでの程度をあらわす。“代謝”とは、体内での薬物の化学変換の過程をあらわす。
【００４３】
“薬物ダイナミクス”とは、薬効部位で薬物濃度に応じて観察される生物反応を決定する因子をあらわす。
“薬物キネティクス”とは、薬効部位での薬物の適切な濃度の達成および維持を決定する因子をあらわす。
【００４４】
“血中半減期”とは、薬物の血中濃度が、最高濃度の50%まで減少するためにかかる時間をあらわす。
“約”という言葉は、本開示において“およそ”という意味であり、関連技術の実施の際に起こり得るパラメータの変量を包含するものである。例示的に、“約”という言葉の使用は、例示範囲から外れた用量も有用且つ安全であり得ることを示し、またそのような用量は本請求項の範囲に包含される。
【００４５】
“測定可能な血清濃度”という言葉は、投与後に血流に吸収された治療薬の血清濃度（典型的には、ml、dl、もしくはl血清あたりのmg、μg、もしくはng治療薬量で測定される）を意味する。
【００４６】
“薬学的に許容される”という言葉は、本明細書では形容詞的に用いられ、それで修飾された名詞が薬学的製品における使用に適することを意味する。薬学的に許容される塩には、金属イオンと有機イオンが含まれる。より好ましい金属イオンは、適切なアルカリ金属（Ia族）塩、アルカリ土類金属（IIa族）塩、および他の生理学的に許容される金属イオンを含むが、これらに限定はされない。イオンの例としては、通常の価数であるアルミニウム、カルシウム、リチウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、および亜鉛が含まれる。好ましい有機イオンとしては、プロトン化三級アミンおよび四級アンモニウムカチオン類が含まれ、その一部を挙げれば、トリメチルアミン、ジエチルアミン、N,N'-ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミン）、およびプロカインがある。薬学的に許容される酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、リン酸、硫酸、メタンスルホン酸、酢酸、蟻酸、酒石酸、マレイン酸、リンゴ酸、クエン酸、イソクエン酸、琥珀酸、乳酸、グルコン酸、グルクロン酸、ピルビン酸、オキサロ酢酸、フマル酸、プロピオン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、などが含まれるが、これらに限定はされない。
【００４７】
本発明の組成物は、通常は、薬学的組成物の形態で投与される。こうした組成物は任意の適切な経路、例えば、経口、経鼻胃、直腸、経皮、非経口（例えば皮下、筋肉内、静脈内、脊髄内、および皮内の、注射法または注入法による投与）、鼻腔内、経粘膜、移殖、膣、局所、頬側、ならびに舌下、を含むような経路で投与できるが、これらに限定はされない。その調製は、緩衝剤、保存料、浸透促進剤、適合性担体、ならびに、他の治療成分もしくは非治療成分を含めるのが普通である。
【００４８】
また本発明は、一つもしくはそれ以上の、構造式（I）あるいは（II）の化合物を含む医薬組成物を、薬学的に許容される担体もしくは賦形剤と併せて使う方法も含む。本明細書で用いられるように、“薬学的に許容される担体”もしくは“薬学的に許容される賦形
剤”という言葉は、任意且つすべての溶媒、分散媒体、外被物、抗真菌剤および抗菌剤、ならびに、等張剤および吸収遅緩剤、などを含む。基質の摂取のための、こうした媒体および試薬の使用については、当該技術分野において周知である。本発明の組成物と不適合である場合を除き、従来技術に係る任意の媒体もしくは試薬の使用が想定される。また、付加的な活性成分もこの組成物に組み込むことができる。本発明の組成物の製造にあたっては、（ひとつもしくは複数の）組成物を、薬学的に許容される賦形剤と併せて混合することができ、この賦形剤で希釈する、もしくは、カプセル、包、もしくは他の容器の形態をとる担体の中に包含させることもできる。本発明の組成物の製造に際して使用できる担体物質は、製薬で常用されている賦形剤のうちの任意のものであるが、こうした担体は、活性薬剤との適合性と、所望の投与形態における放出プロファイル特性とに基づいて選択すべきである。
【００４９】
例示的に、薬学的な賦形剤は以下にあげる例から選択される。
（ａ）アラビアゴム、アルギニン酸およびその塩、セルロース誘導体、メチルセルロース、ヒドロキシエチル-セルロース、ヒドロキシプロピル-セルロース、珪酸マグネシウムアルミニウム、ポリエチレングリコール、ゴム類、多糖類の酸、ベントナイト類、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー、クロスポビドン、ポビドン、ポリメタクリラート類、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、澱粉、アルファ化澱粉、エチルセルロース、トラガカントゴム、デキストリン、シクロデキストリン、微細結晶セルロース、スクロース、もしくはグルコースなどの、結合剤。
【００５０】
（ｂ）澱粉、アルファ化コーンスターチ、アルファ化澱粉、セルロース類、架橋カルボキシメチルセルロース、澱粉グリコール酸ナトリウム、クロスポビドン、架橋ポリビニルピロリドン、クロスカルメロースナトリウム、微細結晶セルロース、カルシウム、アルギニン酸ナトリウム錯体、粘土類、アルギニン酸塩類、ゴム類、もしくは澱粉グリコール酸ナトリウム、ならびに、錠剤調製において用いられる任意の崩壊剤、といった崩壊剤。
【００５１】
（ｃ）ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、硫酸カルシウム、微細結晶セルロース、粉末セルロース、デキストロース、デキストラン塩類、デキストラン、澱粉類、アルファ化澱粉、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコール、などの充填剤。
【００５２】
（ｄ）ラウリル硫酸ナトリウム、モノオレイン酸ソルビタン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリソルベート類、ポロクサマー類、胆汁酸塩類、モノステアリン酸グリセリル、PluronicTM系列（BASF）、などの界面活性剤。
【００５３】
（ｅ）クエン酸、琥珀酸、フマル酸、リンゴ酸、酒石酸、マレイン酸、グルタル酸炭酸水素ナトリウム、およびグルタル酸炭酸ナトリウム、などの可溶化剤。
（ｆ）任意の抗酸化剤、緩衝剤、もしくは酸、などの安定剤も使用できる。
【００５４】
（ｇ）ステアリン酸マグネシウム、水酸化カルシウム、滑石、ステアリルフマル酸ナトリウム、硬化植物油、ステアリン酸、ベハピン酸グリセリン、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸、滑石、蝋類、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、DL-ロイシン、ポリエチレングリコール類、オレイン酸ナトリウム、もしくはラウリル硫酸ナトリウム、などの滑沢剤。
【００５５】
（ｈ）オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、モノオレイン酸ソルビタン、ソルビ
タンモノラウラート、オレイン酸トリエタノールアミン、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレアート、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウラート、オレイン酸ナトリウム、もしくはラウリル硫酸ナトリウム、などの湿潤剤。
【００５６】
（ｉ）ラクトース、澱粉、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、微細結晶セルロース、リン酸水素カルシウム、スクロースに基づく賦形剤、粉砂糖、硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物、乳酸カルシウム三水和物、デキストラン塩類、イノシトール、加水分解された穀物固形物、アミロース、粉末セルロース、炭酸カルシウム、グリシン、もしくはベントナイト、などの希釈剤。
【００５７】
（ｊ）滑石、コーンスターチ、DL-ロイシン、ラウリル硫酸ナトリウム、およびステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸ナトリウム、などの固結防止剤あるいは流動促進剤。
【００５８】
（ｋ）アラビアゴム、ゼラチン、コロイド二酸化珪素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、珪酸マグネシウム、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、ステアリル乳酸カルシウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、もしくはアルファ化澱粉、などの、薬学的に適合する担体。
【００５９】
加えて、薬剤処方については、例えばRemington's The Science and Practice of Pharmacy (2000)で考察されている。薬剤処方の別の考察については、Liberman, H. A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980に見つけることができる。本発明の組成物を含む錠剤もしくは顆粒は、被膜することもでき、または腸溶剤皮で包むこともできる。
【００６０】
ヒトの治療用として有用であることに加えて、本発明は、獣医学上の動物、爬虫類、鳥類、外来動物、ならびに畜獣を含む他の被験者に対しても有用であって、こうした被験者には、哺乳類、齧歯類なども含まれる。哺乳類には、例えばサル、もしくはキツネザル、ウマ、イヌ、ブタ、またはネコが含まれる。齧歯類には、ラット、マウス、リス、もしくはモルモットが含まれる。
【００６１】
本発明の薬学的組成物は、ミトコンドリア毒性の阻害剤の投与が必要である場合に有用である。これらの組成物は、ミトコンドリア病の治療において特に有用であると考えられる。
【００６２】
神経変性障害／ミトコンドリア障害の治療のために、本発明の組成物を使用して、例えば薬物に起因するミトコンドリア毒性の軽減などの治療反応を引き出すのに十分な量で、本発明の化合物の用量を提供することができる。例えばその用量は、約5 ng〜約1000 mg、または約100 ng〜約600 mg、または約1 mg〜約500 mg、または約20 mg〜約400 mgである。通常は、体重に対しての有効な用量は、約0.0001mg/kgから1500mg/kg、より好ましくは1から1000 mg/kg、より好ましくは約1から150 mg/kgの範囲であり、最も好ましくは体重に対して約50から100 mg/kgの範囲である。一回分の用量を、一日にあたり一回から約四回の服用に分割して投与することもでき、また、治療効果を引き出すために、複数回分の用量を一日で投与することもできる。例示的には、本発明の組成物の投薬単位は、例えば本発明の化合物を約5 ng、50 ng、100 ng、500 ng、1 mg、10 mg、20 mg、40 mg、80 mg、100 mg、125 mg、150 mg、200 mg、250 mg、300 mg、350 mg、400 mg、450 mg、500 mg、550 mg、600 mg、700 mg、800 mg、900 mg、もしくは1000 mg含むのが典型的である。投薬形式は、特定の用量を実現するために用いられる所望の頻度での投与に適合するように、選択することができる。投与する組成物の投薬形式単位の量と、症状もしくは障害を
治療するための投薬療法とは、種々の因子（被験者の年齢、体重、性別、および症状、ならびに、症状もしくは障害の重症度、ならびに、投与の経路および頻度を含む）に依存し、これは周知の通り広汎に変更可能である。
【００６３】
本発明の或る実施形態においては、組成物は患者に有効量で投与される。これはつまり、本発明の化合物の治療効果を示すような用量が、所望の治療効果を引き出すための或る期間内において患者の血清中に存在できるように、組成物を投与する、ということである。例示的に、絶食している成人（一般に少なくとも10時間の絶食）においては、組成物の投与より約5分後の時点から、患者の血清中において、本発明の化合物の治療上有効量が得られるように、組成物が投与される。本発明の別の実施形態においては、患者への組成物の投与より約10分後の時点から、患者の血清中において本発明の化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明の別の実施形態においては、患者への組成物の投与より約20分後の時点から、患者の血清中において本発明の化合物の治療上有効量が得られるようになる。
【００６４】
本発明のなおも別の実施形態においては、患者への組成物の投与より約30分後の時点から、患者の血清中において本発明の化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明のさらに別の実施形態においては、患者への組成物の投与より約40分後の時点から、患者の血清中において本発明の化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明の或る実施形態においては、患者への組成物の投与より約20分から約12時間の間に、患者の血清中において本発明の化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明の別の実施形態においては、患者への組成物の投与より約20分から約6時間の間に、患者の血清中において本発明の化合物の治療上有効量が得られるようになる。本発明のなおも別の実施形態においては、患者への組成物の投与より約20分から約2時間の間に、患者の血清中において本発明の化合物の治療上有効量が得られるようになる。
【００６５】
本発明のさらに別の実施形態においては、患者への組成物の投与より約40分から約2時間の間に、患者の血清中において本発明の化合物の治療上有効量が得られるようになる。また、本発明のなおも別の実施形態においては、患者への組成物の投与より約40分から約1時間の間に、患者の血清中において本発明の化合物の治療上有効量が得られるようになる。
【００６６】
本発明の或る実施形態においては、本発明の組成物は、血清濃度が本発明の化合物の最大半量となるのに適した用量で投与される。例示的に、本発明の組成物の投与後、約0.01から約1000 nM、もしくは約0.1から約750 nM、もしくは約1から約500 nM、もしくは約20から約1000 nM、もしくは約100から約500 nM、もしくは約200から約400 nMの血清濃度が患者において得られる。
【００６７】
本発明において想定される組成物では、投与後に約5分間から約24時間の間隔をおいて投薬することで、治療効果が得られ、望むならば一日一度もしくは二日に一度の投与とすることも可能である。本発明の或る実施形態では、患者へ組成物を投与後約10分、20分、30分、もしくは40分後に、患者において、本発明の化合物の最大半量が、約1 μg/ml以上、もしくは約5 μg/ml以上、もしくは約10 μg/ml以上、もしくは約50 μg/ml以上、もしくは約100 μg/ml以上、もしくは約500 μg/ml以上、もしくは約1000 μg/ml以上の平均血清中濃度となるよう、適した一投与量で組成物が投与される。
【００６８】
治療効果を引き出すために必要な治療薬の量は、例えば、血清中への試薬の吸収率、試薬の生物学的利用率、および障害の治療に関する効能、といったことに基づいて実験的に定量することができる。しかしながら、本発明の治療薬の、任意の特定患者への特定の投薬量は、種々の要因に依存しており、そのような要因としては、使用する特定の化合物の
活性、患者の年齢、体重、総合的な健康状態、性別、食餌（例えば患者が絶食しているか、もしくは食後かといったことを含む）、投与時間、排出率、薬剤の配合、ならびに治療される特定の障害の重症度、ならびに投与の形態、が含まれる、ということがわかる。一般に治療用量は、安全性および有効性を最適化するために用量設定することができる。典型的には、in vitroおよび／もしくはin vivoでの初期実験から得られる用量-効果の相関が、患者への投与に適した用量を導き出す上で有用となる。一般的に、本発明に関する胃腸の障害もしくは疾病の治療のために有用な用量を評価するための手引きとして、実験動物による研究が用いられる。治療プロトコルの観点から言うと、投与される用量が、投与される特定の試薬、投与経路、特定の患者の状態などを含む種々の因子に依存する、ということを正しく認識するべきである。一般的に言って、治療効果を引き出すために有用な期間においてin vitroで有効であるとされた濃度と、同一基準の血清中レベルを得るのに効果的な量で、化合物を投与することが望ましい。従って、化合物がin vitro活性を示す用量、例えば200 nMの最大半量など、例えばβ-アミロイドに起因する高い神経毒性、および、当業者による適切な基準として選択される他の指標に関連した障害の治療といった、所望の治療効果を引き出せる期間において、in vivo濃度200 nMの概算最大半量を得るために有効である量の薬剤を投与するのが望ましいだろう。これらのパラメータの定量については当該技術分野において周知である。これらの考慮事項は当該技術分野において周知であり、標準的教科書に記載されている。
【００６９】
患者に送達される、本発明の化合物の有効量を測定および定量するために、標準的アッセイ法を用いて、本発明の化合物の血清中濃度を測定することができる。
本発明で想定される組成物は、患者への投与後、約30分から約24時間の間隔をおいて治療効果を呈する。或る実施形態においては、組成物はこうした治療効果を約30分間で呈する。別の実施形態においては、組成物は、治療効果を約24時間にわたって呈し、一日一度の投与を可能にし、患者の服薬遵守を改善する。
【００７０】
また、本発明の方法、キット、および組成物は、ミトコンドリア病の治療もしくは予防を目的とした別の治療薬（例えばクレアチニンなど）と併せて使用すること（“併用療法”）も可能である。本発明と連携して用いる場合、即ち併用療法においては、望まざる副作用のうちの全てではないにせよ多くを、軽減または除去できるような付加作用もしくは相乗作用を得ることができる。これらの薬剤から副作用が軽減されると、例えば、投与された配合物の治療効果を得るために必要な用量が軽減されることなどに一般につながる。
【００７１】
“併用療法”という言葉は、患者のミトコンドリア障害を治療もしくは予防するための別の薬剤と、本発明の組成物とを連携して投与することを、神経変性障害および／もしくはミトコンドリア障害の治療のためのこれらの治療薬の補助活性から、有益な作用効果を得ることを意図した特定の治療法の一部として、包含する。併用による有益な作用効果としては、治療薬の併用から生じる薬物キネティックもしくは薬物ダイナミックな補助活性が含まれるが、これに限定はされない。これらの治療薬の併用投与は、典型的には所定の時間（常に実質上同時に、選択した配合に応じて、分単位、時間単位、日単位、週単位、月単位、もしくは年単位）をおいて行われる。“併用療法”は、一般的には、本発明と併用したときに付随的且つ恣意的な結果を与えるような別々の単独の治療法の一部として、二種もしくはそれ以上のこれらの治療薬を投与することを包含する、という意味ではない。“併用療法”は、これらの治療薬の連続的な投与、即ち、それぞれの治療薬を異なる時刻に投与すること、さらに、これらの治療薬、もしくは二種以上の治療薬を実質的に実質的に同時に投与することを含むという意味である。実質的に同時である投与は、例えば、患者に、それぞれの治療薬を固定比で含んでいる単独の錠剤もしくはカプセルを患者に投与すること、あるいは、それぞれの治療薬の単独のカプセルもしくは錠剤を複数組み合わせて患者に投与することによって行うことができる。それぞれの治療薬の連続投与、もしくは実質的な同時投与は、任意の適切な経路で行うことができる。本発明の組成物は、経
口的もしくは経鼻胃的に投与することができ、その一方で併用する他の試薬を、その特定試薬に適切な任意の経路で投与することができる。こうした経路としては、口腔経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、もしくは粘膜組織からの直接の吸収、が含まれるが、これらに限定はされない。例えば、本発明の組成物は、経口的もしくは経鼻胃的に投与することができ、且つ、併用する治療薬を経口的もしくは経皮的に投与することができる。連続的に治療薬を投与することは、狭義においては危険なことではない。“併用療法”は、さらに、例えば鎮痛薬であるがそれに限定はされないような他の生理活性成分、また、例えば外科手術であるがそれに限定はされないような非投薬療法、とをさらに組み合わせた、上述の治療薬の投与のことをも包含する。
【００７２】
併用療法を構成する治療化合物は、配合して一体とした剤型、もしくは、実質的な同時投与を目的とした別々の剤型とすることができる。また、併用療法を構成する治療薬は、二段階の投与を要する療法において投与されるいずれかの治療化合物と共に、連続的に投与することもできる。従って、或る療法は、別々の有効薬を間隔をおいて投与しながら、複数の治療化合物を連続的に投与することを必要とする。複数の投与ステップの時間間隔は、それぞれの治療化合物の効能、可溶性、生物学的利用率、血中半減期、およびキネティック特性といったそれぞれの治療薬の特性に応じて、さらに摂食の影響、ならびに患者の年齢および状態に応じて、例えば数分間から数時間から数日間の範囲をとることができる。また、目標分子の濃度の概日変化から、最適な投薬間隔を決定することもできる。
【００７３】
同時に、実質的に同時に、もしくは連続的に投与されるような併用療法の治療化合物には、例えば口腔経路による一つの治療化合物と、口腔経路、皮下経路、静脈内経路、筋肉内経路、もしくは粘膜組織からの直接の吸収などによる別の治療薬の投与を必要とする療法が含まれる。併用療法の治療化合物を、経口投与、吸入スプレーによる投与、直腸投与、局所投与、口内投与、舌下投与、または非経口的投与（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、および皮内への注射）のいずれかによって別々に、あるいは共に投与する場合のいずれにおいても、それぞれの治療化合物は、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤、もしくは他の処方成分を含んだ適切な薬学的処方に包含されるだろう。
【００７４】
経口投与のために、本発明の薬学的組成物には、所望の量の構造式（I）もしくは（II）の化合物を含めることができ、例えば、錠剤、ハードカプセルもしくはソフトカプセル、薬用ドロップ、包、トローチ、分配粉末、細粒、懸濁液、エリキシル剤、液体、または、経口投与にあたって妥当である任意の他の形態といった形態で投与される。例示的に、このような薬学的組成物は、所定の量の有効化合物を含んだ、錠剤もしくはカプセルのような個別の剤型単位の形で調製することができる。このような経口投与形態は、例えば緩衝剤をさらに含む。錠剤、ピルなどは、腸溶外被を付加して調製することもできる。
【００７５】
口内投与もしくは舌下投与に適した薬学的組成物には、例えば、スクロースおよびアラビアゴム、もしくはトラガカントゴムのようなフレーバーベース中に活性化合物を含む薬用ドロップ、ならびに、ゼラチンおよびグリセリン、または、スクロースおよびアラビアゴムといった不活性ベース中に活性化合物を含む錠剤、が含まれる。
【００７６】
経口投与のための液状調剤には、当該技術分野で通常使用される不活性な希釈剤（例えば水）を含んだ薬学的に許容される乳剤、溶液、懸濁液、シロップ、およびエリキシル剤が含まれる。このような組成物には、例えば、湿潤剤、乳化剤、および懸濁剤、ならびに、甘味料、フレーバー、香料を含めることもできる。
【００７７】
適切な液状調剤には、活性化合物、ならびにβ-シクロデキストリン、または、水溶性のβ-シクロデキストリン誘導体（例えばβ-シクロデキストリン=スルホブチルエーテル、ヘプタキス-2,6-ジ-O-メチル-β-シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル-β-シクロ
デキストリン、およびジメチル-β-シクロデキストリンなど）を含む水溶液が含まれるが、これらに限定はされない。
【００７８】
また、本発明の薬学的組成物は、注射（静脈内、筋肉内、皮下）によって投与することもできる。このような注射可能な組成物には、適切な担体物質として、例えば、生理食塩水、デキストロース、もしくは水を使用できる。必要であれば、適切な酸、塩基、もしくは緩衝剤を用いて、組成物のpH値を調節することもできる。また、適切な充填剤、分散剤、湿潤剤、もしくは懸濁剤（マンニトール、およびポリエチレングリコール（PEG 400など）を含む）を、組成物に含めることもできる。また、適切な非経口的組成物には、注射バイアル内に凍結乾燥された活性化合物を含めることもできる。注射に先立ち、水溶液を加えて組成物を溶解することもできる。
【００７９】
薬学的組成物は、坐薬などの形態でも投与できる。このような直腸処方には、活性化合物を、総量にして例えば約0.075〜約75% w/w、もしくは約0.2〜約40% w/w、もしくは約0.4〜約15% w/wで含めるのが好ましい。ココアバター、カカオオイル、および他の油脂といった担体物質、ならびにポリエチレングリコール系坐薬基剤を、これらの組成物に用いることができる。外被（例えば、ヒドロキシプロピル-メチルセルロース被膜）、および崩壊剤（例えば、クロスカルメロースナトリウム、および架橋ポビドン）といった他の担体物質を、所望であれば用いることもできる。
【００８０】
被験化合物は、遊離形態であってもよいし、あるいは、マイクロカプセルや、コロイド性薬剤送達系（リポソーム、マイクロエマルジョン、およびマクロエマルジョンなど）に内包してもよい。
【００８１】
これらの薬学的組成物は、本発明の活性化合物と、一つもしくは複数の担体物質とを配合させるステップを含むような、任意の適切な薬学的方法を用いて調製できる。一般的には、組成物は、液体もしくは細粒状固体担体、またはその両方と、活性化合物とを均一且つ充分に混合し、必要であればその後に製品を成形する。例えば、化合物の粉末もしくは顆粒に、任意に一つもしくは複数の添加成分を加えて圧縮するかもしくは成形することで、錠剤を調製できる。圧縮錠剤は、粉末もしくは顆粒といった流動体である化合物に、任意に結合剤、滑沢剤、不活性な希釈剤、および／もしくは界面活性／分散剤を混合して、適切な機械を用いて圧縮することによって調製することができる。成形錠剤は、不活性な希釈液で湿らせた化合物粉末を、適切な機械を用いて成形して調製することができる。
【００８２】
本発明の錠剤は、OpadryTM White YS-1-18027A（もしくは別の色）のような従来の外被物質でコーティングすることもでき、コーティングされた錠剤の総重量のうちの約3%程度を外被物の重量とすることができる。本発明の組成物は、患者に投与された後に、当該技術分野で周知の方法によって、組成物が、即座に、持続して、もしくは遅れて放出するように処方することができる。
【００８３】
賦形剤に希釈剤としての役割も持たせる場合には、賦形剤を固体、半固体、もしくは液体の物質とすることができ、これらはまた、活性成分のための溶媒、担体、もしくは媒体としても機能する。従って組成物を、錠剤、咀嚼錠、ピル、粉末、薬用ドロップ、包、オブラート包、エリキシル剤、懸濁液、乳濁液、溶液、シロップ、エアロゾル（固体として、もしくは液体媒体中に溶かして）、ソフトゼラチンカプセル、ハードゼラチンカプセル、および滅菌パッケージ済み粉末といった形態とすることができる。
【００８４】
本発明の或る実施形態においては、製造プロセスとして、以下の方法のうちの一つあるいはそれらの組み合わせを用いることができる。即ち、（１）空練り、（２）直接圧縮、（３）粉砕、（４）乾燥造粒もしくは無加水造粒、（５）加水造粒、または（６）溶融。
Lachman et al., The Theory and Practice of Industrial Pharmacy (1986)。
【００８５】
本発明の別の実施形態においては、本発明の治療薬を薬学的賦形剤と混合して、治療薬と賦形剤との均一な混合物を含んだ固形の前製剤組成物を作成することによって、錠剤のような固形組成物を調製することができる。（一つもしくは複数の）これらの前製剤組成物を均一であると称する場合には、治療薬が組成物全体に亘ってむらなく分散し、この組成物を、同等に有用な剤型単位（錠剤、ピル、およびカプセルなど）へと容易に再分割できる、ということを意味している。こうした固形の前処方物は、本明細書中で記載したような類の剤型単位へと再分割される。
【００８６】
圧縮錠剤とは、活性成分と、加工を助け且つ製品の特性を改善するように選択された賦形剤とを含む処方を、凝縮することによって調製される固体の剤型のことである。“圧縮錠剤”という語は、一般的には、単味の、被覆されていない経口投与のための錠剤であって、一回の圧縮で調剤されるような錠剤、または、予備圧縮とそれに続く最終的な圧縮とで調剤されるような錠剤のことを指す。
【００８７】
本発明の錠剤もしくはピルは、被覆することもでき、または、長期間の活性の利点が得られるような剤形に調製されることもできる。例えば、錠剤もしくはピルは内剤および外剤を含むことができ、この後者が前者を被覆するように構成することができる。腸溶層もしくは腸溶外被を使用するためには、数多のポリマーの酸、ならびに、ポリマーの酸と、セラック、セチルアルコール、および酢酸セルロースなどの物質との混合物、を含むような種々の物質を用いることができる。
【００８８】
本発明の組成物の継続投与を必要とする患者の、ミトコンドリア障害の治療にあたっては、長期持続放出インプラントの使用が適している。本明細書中で用いる“長期”放出とは、活性成分の治癒力のある量を、少なくとも30日間、好ましくは60日間にわたり送達することができるようにインプラントが組立・構成されていることを意味する。長期持続放出インプラントは、当業者には周知のものであって、上述の放出系のいくつかを含む。
【００８９】
本発明の別の実施形態においては、ミトコンドリア障害を治療するための化合物を、一つもしくは複数の本発明の治療化合物を含んだキットまたはパッケージの形状に収める。これら本発明の治療化合物は、連続的もしくは同時の投与に適するように、時間毎、日毎、週毎、もしくは月毎（または他の周期毎）の用量を収めた、キットあるいはパッケージの形状で包装されることができる。本発明では、連日の投与のための複数の別々にパッケージされた剤型単位を含み、それぞれの剤型単位が本発明の治療化合物のうちの少なくとも一つを含んでいるようなキットもしくはパッケージもさらに提供する。この薬剤送達系を用いることによって、本発明の治療化合物の種々の実施形態全ての投与を容易にすることができる。或る実施形態では、系は、日毎もしくは週毎に投与されるべき用量を複数含んでいる。キットもしくはパッケージには、剤形の適切な投与を容易にするために併用療法で利用できる他の治療薬を含めることもできる。キットもしくはパッケージには、患者への説明書のセットも含まれる。
【００９０】
本発明について、次の略語を用いて、後述する詳細な例を参照してさらに記述する。
（AChEI）アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、（Aβ）β-アミロイドペプチド、（ADDLs）可溶性アミロイドオリゴマー、（ANT）アデニンヌクレオチド転移酵素、（APP）アミロイド前駆体タンパク質、（CCCP）カルボニルシアニド3-クロロフェニルヒドラゾン、（FCCP）カルボニルシアニドp-トリフルオロメトキシ-フェニルヒドラゾン、（CsA）シクロスポリンA、（MPT）膜透過性遷移、（MRC）ミトコンドリア呼吸率、（PAO）フェニルアルシンオキシド、（SP-233）ヘキサン酸＝(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イル、（SP-233）ヘキサン酸=(22R,25R)-(20α)-スピロスタ-5-エン-3β-イル。
【００９１】
さらにミトコンドリア膜透過性遷移（MPT）は、悪条件下（ミトコンドリアマトリクスのミトコンドリアCa+2量の増加、あるいは酸化ストレスなど）で起こるミトコンドリア内膜の透過性の非特異的増加と定義され、ミトコンドリア内膜の非特異的ポア集合体（孔）（“メガチャネル”）の原因となり、ミトコンドリアの膜電位の減少、ミトコンドリア呼吸の脱共役、および細胞エネルギーの減退を引き起こし、それら全てが細胞死の一因となる。
【実施例】
【００９２】
〔実施例１〕ミトコンドリア機能の保護のためのSP-233の使用
A：材料と方法
１．材料
Αβ1-42ペプチドはAmerican Peptide Company (Sunnyvale, CA, USA)から購入し、-80°Cで保存した。抗複合体II抗体はMolecular Probes (Eugene, OR, USA)から、また、抗Ab1-42抗体はSignet Laboratories (Dedham, MA, USA)から購入した。スピロステノール、ヘキサン酸=(22S,25S)-(20S)-スピロスタ-5-エン-3β-イル（SP-233）は、Interbioscreen (Moscow, Russia)から購入した。Cyclosporin A （CsA）、および、カルボニルシアニド3-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）はSigma (St. Louis, MO, USA)から購入した。ダルベッコ最小基礎培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）、およびSK-N-ASヒト神経芽腫細胞はATCC (Manassas, VA, USA)から購入した。
２．ミトコンドリア単離手順
体重230〜280 gのオスLong-Evansラットを用いた。断頭後、すぐに脳を取り出し、6 mlの単離バッファー（TRIS 20 mM、スクロース 250 mM、KCl 40 mM、EGTA 2 mM、ウシ血清アルブミン 1 mg/ml、pH 7.2、4°C）でPotter-Elvejhem homogenizer (Eurostar, IKA-Verke, Staufen, Germany)を用いて氷上でホモジェナイズした。懸濁液を2000×gで8分間遠心し、細胞片と核を除去した。ミトコンドリア含有上清は、12000×gで10分間遠心した。得られたペレットを300 μlの呼吸バッファー（D-マンニトール 300 mM、KCl 10 mM、KH2PO4 10 mM、MgCl2 5 mM、pH 7.2、37°C）で再懸濁させた。このペレットはミトコンドリアに非常に豊富である(Zini et al. 1996)。ミトコンドリア懸濁液のタンパク質濃度はLowry et al. 1951の方法により測定した。
３．別の溶液の調製
Αβ1-42溶液を、500 μM濃度となるように新鮮な蒸留水で再調製した。Αβ1-42は新鮮に再調製されたものか、あるいは溶液を4°Cで48時間培養して古くなった後の凝集体を用いた。両溶液は、使用前に呼吸バッファー（上記参照）で希釈し、その後望ましい濃度でミトコンドリアに直接加えた。神経芽腫細胞を用いた実験（下記参照）においては、新鮮に再調製したΑβ1-42溶液のみを用いた。SP-233、CCCPおよびCsAは、最初にN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し、それから新鮮な蒸留水に希釈した。
４．ミトコンドリア呼吸のモニタリング
ミトコンドリア機能は、PC (Compaq, PIII 400 MHz)につないだOxytherm (Hansatech, Norfolk, UK)を用いて調べた。O2を検出するため、37°CのOxytherm恒温培養槽を白金‐銀Clarck電極につないだ。O2消費量は、ミトコンドリア機能、およびADP（ATPの前駆体）の存在下、CCCP（酸化的リン酸化の脱共役剤）もしくはCsA（MPT孔の阻害剤）の存在下あるいは非存在下における生存力のマーカーとして測定した。O2消費量の測定により、ミトコンドリア呼吸率（MRC）が計算でき、V3/V4であらわされる。V4は基底O2消費量、V3はADPを加えた後のO2消費量（ATP生産量）である。SP-233(1 pMから1 nM)の濃度増加がミトコンドリア呼吸鎖に与える影響は、MRCの漸進的変化のモニタリングによって評価した。ミトコンドリア濃度は、呼吸バッファーを用いて0.4 mgタンパク質量/mlに調製した。ミト
コンドリアは、呼吸鎖の複合体Iの基質として、リンゴ酸／グルタミン酸を加えることで活性化させた。State 2はミトコンドリアの酸素消費の基底速度である。ADPの付加によってATP合成が始まると、酸素消費速度は劇的に増加しState 3に達した。ADPの供給が枯渇すると、O2消費速度は基線（State 2）に戻り、これはState 4と呼ばれる(Chance and Williams 1956)。各実験のコントロールは、ADPの存在下での基底呼吸量に応じた。
５．SP-233が酸化的リン酸化のCCCP誘導脱共役に与える影響
CCCP（1 μM）を加えることで、呼吸鎖反応の脱共役が起こり、O2消費量が増加する。SP-233がCCCP誘導脱共役に与える影響を評価するため、リンゴ酸／グルタミン酸を加える前に、ミトコンドリア画分をSP-233の存在下で37°Cで3分間培養し、その1分後にCCCPを加えた。
６．SP-233がCsA誘導低酸素に与える影響の評価
低酸素は、CsA（1 μM）をミトコンドリア培養溶媒に加えることで誘導された(Zini et
al. 1996)。この実験は、CsAの存在下かつSP-233の非存在下においてADPを加えることで、コントロールとした。上記のように、SP-233もしくはその溶媒を最初に加え、培養はCsAを加える前に1.5分間行った。それから、基質であるリンゴ酸／グルタミン酸を1.5分後に加え、ADPを2.5分後に加えた。
７．Αβ1-42誘導ミトコンドリア機能不全に対するSP-233の保護効果の評価
SP-233を培養混合液中で3分間培養し、基質であるリンゴ酸、グルタミン酸を加える前に、Αβ1-42を37°Cで1.5分間培養した。ADPはリンゴ酸／グルタミン酸を加えた1分後に加えた。SP-233のΑβ1-42に対する効果のコントロールは、ADP非存在下で行った実験のものと同じとした。
８．ヒト神経芽腫細胞における、Aβ1-42誘導毒性に対するSP-233の保護効果の評価
ヒト神経芽腫SK-N-AS細胞を、96ウェルプレート（7x104 細胞数/ウェル）の10% FBSを含むDMEM培地に播種し、5% CO2、95%湿度で培養した。その後Αβ1-42（0.1、1および10 μM）もしくはその溶媒を加え、SP-233（1 μM）の存在下もしくは非存在下で、培養を72時間続けた。Aβの細胞毒性は、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル  テトラゾリウム（MTT）アッセイ(Trevigen, Gaithersburg, MD)を用いて評価した。
９．ヒト神経芽腫細胞のミトコンドリアにおけるΑβ1-42取り込みの免疫細胞化学分析
ヒト神経芽腫SK-N-AS細胞を直径13-mmのカバーガラス（20,000 細胞数／カバーガラス）に播種し、10% FBSを含むDMEM培地で37°C、5% CO2で一晩培養した。その後Αβ1-42（10 μM）もしくはその溶媒を加え、SP-233（1 μM）の存在下もしくは非存在下で、3時間培養を続けた。ミトコンドリアのΑβ1-42取り込みを評価するため、ミトコンドリア呼吸鎖複合体IIに対して作製したマウスモノクローナル抗体、抗OxPhos複合体II 70-kDaサブユニット(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)、および、Αβ1-42の33-42アミノ酸残基に対して作製したウサギポリクローナル抗体(Signet Laboratories, Dedham, MA, USA)を用いて、共局在分析を行った。神経芽腫細胞は1Xリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、-20°Cでメタノール固定し、1X PBSでリンスした。続いて細胞を10%ロバ血清を含む1X PBSで30分間ブロッキングし、その後、1.5%ロバ血清と0.01%Triton X100を含む1X PBS内で、複合体IIに対して作製した一次抗体（1/200）と共に4°Cで24時間培養した。標本を1X PBSで三回洗浄した後、ロバ抗マウスローダミンラベル二次抗体(Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, USA)を1/200希釈で加え、室温で2時間培養を続けた。さらに、Αβ1-42の33-42アミノ酸残基に対して作製した一次抗体を、同じプロトコルに従って1/500希釈で用いた。蛍光マーカーAlexa FluorR 488 (Molecular Probes, Eugene, OR, USA)でラベルしたロバ抗ウサギ二次抗体を用いて、特異的な染色を示した。その後カバーガラスを、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール-2-塩酸塩（DAPI）を含む水溶性のマウント剤(Vect
or Laboratories. Burlingame, CA, USA)でマウントした。共焦点画像をOlympus Fluoview BX61 Laser Scanning microscopeを用いて撮影した。
１０．統計分析
各実験において、結果は平均値±標準偏差であらわす。群間比較はダネット検定に従ってANOVAによって行った。
B：結果
１．ミトコンドリア呼吸の調節にSP-233が与える影響
SP-233は10、30、および100 pMの濃度で分析した。10 pMという低濃度においても、SP-233はラット脳ミトコンドリアのMRCを、コントロール群と比べて有意に50%減少させた（p<0.001）（図１）。SP-233の種々の濃度によって引き起こされた効果の違いに有意差はなかったものの、MRCは濃度10〜100 pMの範囲にわたって漸進的に減少したことから、結果は濃度と効果との相関をあらわす傾向を示した。
２．CCCPもしくはCsAに起因するミトコンドリア呼吸率の変化にSP-233が与える影響
1 μMの脱共役剤CCCPは、ラット脳ミトコンドリアのO2消費量を基底値の150%まで増加させた（p<0.01）（図２a）。SP-233の全ての実験濃度（1-1000 pM）において、CCCPのこの代謝効果は完全に阻害された（p<0.001）。SP-233によるCCCP誘導脱共役の阻害は、O2消費量が基底レベルの60〜65%まで減少したことに関連し、濃度非依存的であった。SP-233はCsAに起因するMRCの減少は打ち消さなかったが、反対に、濃度依存的にCsAの効果を増幅させた（図２b）。
３．新鮮なAβ1-42、および古いAβ1-42がミトコンドリア呼吸率に与える影響
Aβ1-42は0.1 pMという低濃度においても、ラット脳ミトコンドリアのMRCを著しく減少させた（図３）。この効果は、古いものよりも新鮮なアミロイドペプチドの方が明白であり、それぞれの阻害効果は55〜63%、および43〜53%であった。この違いは、非凝集体のAβ1-42の方が、古い、凝集体のペプチドよりも、大いにミトコンドリア内に浸透することをあらわすと思われる。
４．新鮮なAβ1-42、および古いAβ1-42によって誘導される、ミトコンドリア呼吸率の変化にSP-233が与える影響
新鮮なAβ1-42は、コントロールに比べて71%MRCを減少させ、この効果はSP-233によって部分的に阻害された（図４a）。SP-233の最低実験濃度（1 pM）において、MRCはコントロール値の約40%まで戻り、MRCはAβ1-42のみで得られた値に比べ有意に増加した（38.56
± 0.34 vs. 28.93 ± 1.75、p<0.001）。古いAβ1-42はコントロールに比べて51%MRCを減少させたが、SP-233はこの効果を有意に阻害しなかった（図４b）。
５．SK-N-ASヒト神経芽腫細胞におけるAβ1-42誘導毒性にSP-233が及ぼす影響
図５は、Aβ1-42誘導のSK-N-AS細胞生存力の減少に対して、SP-233が及ぼす影響を示す。1 μMのSP-233は、三つの実験濃度のAβ1-42によって誘導された神経毒性を、それぞれ19%、26%、および28%阻害した（p<0.01）。
６．SK-N-ASヒト神経芽腫細胞のミトコンドリアへのAβ1-42取り込みにSP-233が与える影響
Aβ1-42処理された神経芽腫細胞は、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体IIと共局在する、強い免疫反応を示し、これは、Aβ1-42がミトコンドリアに入り、その内部に存在することを証明する。
SP-233で処理するとAβ1-42免疫反応は打ち消され、このことは、SP-233が細胞およびミトコンドリアへのAβ1-42の取り込みをブロックすることを示す。
C：考察
周知の通り、ADは、臨床的には進行性の認知過程障害および記憶の喪失を特徴とする。初期の頃から、この疾病の“記憶”という見方は、アセチルコリン（ACh）のシナプス濃度の減少を反映した、中枢のコリン作用性の経路の衰退に関連付けられてきた。従って、創薬研究は脳でのAChレベルの回復に主に集中し、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（AChEIs）、この種の化合物の原型であるタクリンの開発につながった。しかし、有望な臨床データにもかかわらず、タクリンの有益な効果はわずかで、また、リバスチグミン、ガランタミン、ドネペジルに代表される、AChEIsの新たな生産の開発にもかかわらず、タクリンに比べAD患者の発症の遅延は短縮されなかった。AD症状のさらなる進行におけるこの短い（一〜二年）遅延(Tariot and Winblad, 2001; Waldemar et al. 2001; Grossberg et al. 2004)は、患者とその親類にとっては貴重であるものの、おそらくコリン作用性ニューロンの進行性の衰退のためであり、AChEIsの使用の限界ということである。さらに、565人の軽度から中程度のADを罹患する地域住民患者に実施された最近の研究では、ドネペジルは費用効果がなく、関連閾値の最小限を下回る効果しかなかった(Courtney et al.
2004)。従って、ADの創薬においては主だった進歩がなく、メマンチン、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体拮抗物質が近年重度のADを中程度に治療すると認可されたものの(Livingston and Katona 2004)、AChEIsよりも効果のある薬剤の開発が依然として緊急に必要とされている。
【００９３】
ADの病因論は、この疾病の家族性の早期発症型に限ってよく考証されており、APP、プレセニリン-1もしくはプレセニリン-2遺伝子の突然変異が含まれる。対照的に、全AD症例の約95%をあらわす晩期発症型の孤発性ADの原因は、依然として確立されていない。数多くの仮説が現れ、それらにおいて、ミトコンドリア機能障害に由来するエネルギー性機能不全、および酸化ダメージが、ADの原因であるという可能性が提案されている(Schulz et
al. 1997; Beal, 2000)。
【００９４】
ミトコンドリア機能障害がADの病因論に関連するという証拠は、SP-233（天然スピロステノール）がニューロンのPC12細胞をAβ1-42誘導神経毒性から保護する(Lecanu et al. 2004)という近年の発見と共に、Aβ1-42への暴露によって損傷した、単離ミトコンドリアの機能を回復するSP-233の潜在能力を研究するきっかけとなった。総合すると、本研究は、Aβと関係し、またADの発症機序に関連する基本的機構に対して、SP-233が影響する可能性を持つことを示唆している。
【００９５】
Aβがミトコンドリア機能に与える影響は、過去10年間広範に研究されてきており、これらの研究によって作られたデータは、ミトコンドリア機能障害につながり得る、ペプチドの種々の影響を示唆している。Aβ1-42とAβ25-35断片は、神経細胞ミトコンドリアにおいて、呼吸、および、コハク酸脱水素酵素、α-ケトグルタル酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、ならびにシトクロム酸化酵素などの鍵酵素の活性を阻害することがわかっている(Kaneko et al. 1995; Casley et al. 2002a)。呼吸鎖の別の複合体の阻害も、Aβ25-35に暴露した神経細胞ミトコンドリアにおいて起こることが報告されており(Pereira et al. 1998; Canevari et al. 1999;Casley et al. 2002b)、さらにこの同じペプチド断片は、MPTに関連する孔開口を促進する(Moreira et al. 2001; Moreira et al. 2002; Bachurin et al. 2003)。
【００９６】
上記の本明細書中の結果は、MRCの減少から明らかなように、Aβ1-42がラット脳ミトコンドリアにおいてミトコンドリア呼吸を阻害することをさらに示す。また、この阻害は、新鮮に用意されたペプチドおよび古いペプチドの両方において、Aβ1-42が0.1 pMという低濃度でも起こる（図３を参照）。阻害効果は、新鮮な形態でより明白であり、これはおそらく、Aβ1-42の重合体の方が、単量体もしくはADDLsなどの低重合体よりも、ミトコン
ドリア膜をより横切りにくいためである。従ってこれら後者の形態は、より呼吸鎖に有害な影響を及ぼしやすく、事実上、より有毒である。また、古い／凝集体のAβ1-42を受容したミトコンドリアにおけるSP-233による保護の欠如は（図４参照）、SP-233が、アミロイドペプチドの凝集体には、単量体に結合するのと同様には結合することができないためであると思われる。
【００９７】
Aβ1-42に暴露されたPC12細胞のATP合成に対する、SP-233の回復効果を示す過去のデータ(Lecanu et al. 2004)を確かめると、SP-233は、新鮮に用意されたAβ1-42によって誘導されたMRCの減少を部分的に阻害することができ、さらにミトコンドリア機能を保護することができる。SP-233は非常に低濃度（ピコモル範囲）で活性化するため、その作用機構は比較的特異的であると思われる。本発明におけるデータはさらに、SP-233が、ペプチドの単量体に結合し、神経毒性のある低重合体ADDLsの形成を阻害することで、Aβ1-42神経毒性に対して神経細胞を保護したということを示す、近年の結果を裏付ける(Lecanu et
al. 2004)。
【００９８】
Aβ1-42が呼吸鎖複合体IIと共局在することを示すために、ヒト神経芽腫細胞において実施した共焦点顕微鏡分析は、Aβ1-42が細胞とミトコンドリア膜両方を横断できることを示唆している。SP-233とAβ1-42が共に培養溶媒に存在する場合、アミロイドペプチドに対応する免疫細胞化学染色は完全に抑制され、またこのSP-233の“除去”効果は、MRCの部分的な回復に伴って見られた。加えて、SP-233は、部分的ではあるものの、同じヒト神経芽腫細胞へのAβ1-42の神経毒性作用を抑制した。この結果は、死後のAD脳の皮質錐体神経細胞のミトコンドリアに、アミロイド沈殿物が存在することを示す近年の結果(Fernandez-Vizarra et al. 2004)を考えると、特に興味深い。これらの組織学的特長は、疾病の経過における非常に初期の現象として記述されてきており、対らせん状のフィラメントの形成の前に現れ、神経細胞死につながる。
【００９９】
Aβ1-42へのSP-233の結合、および“除去”効果が証明された後、SP-233がミトコンドリアへ直接影響することで、Aβ1-42に対する加算性の保護効果がもたらされるという可能性が研究された。この点について、Aβは脳ミトコンドリアのMPT孔の開放を促進し、機能障害を引き起こし、さらにこの影響はCsAによって打ち消される、ということが以前に証明されている(Moreira et al. 2001; Bachurin et al. 2003; Abramov et al. 2004)。本研究は、SP-233がCsAのように、MRCを減少させることを示す。また、SP-233はCsAの効果を増幅させ、このことはSP-233がCsA様の性質を持ち、それによってMPT孔開放を阻害することを示唆するものであり、それによってAβ1-42誘導ミトコンドリア機能不全に対する保護効果が得られる。
【０１００】
SP-233はさらに、CCCPによって誘導される酸化的リン酸化の脱共役を打ち消すことができた（図２a参照）。Aβ1-42はミトコンドリア膜構造を分裂させ(Kremer et al. 2001; Rodrigues et al. 2001)、AD脳ではミトコンドリアの膜流動性が変わる(Mecocci et al, 1996)ということが示されており、両現象はミトコンドリアの脱共役を引き起こす。従って、SP-233の“再共役”効果はまだ完全には明らかにされていないものの、このことが本明細書記載のミトコンドリア機能の回復に寄与していると考えられる。さらに、SP-233の除去効果（おそらくMPT孔の調節を含む）と、再共役効果の組み合わせによって、SP-233が1
pMという低濃度でAβ1-42の影響を打ち消す原因が明らかになると考えられる。
〔実施例２〕スピロステノール、ヘキサン酸=(22R,25R)-20a-スピロスタ-5-エン-3β-イルによる、神経細胞におけるミトコンドリアのAβ取り込みの阻害、およびAβ誘導ミトコンドリア機能障害の抑制
A：材料と方法
１．材料
Aβ1-42ペプチドはAmerican Peptide Company (Sunnyvale, CA)から購入した。抗複合体II抗体はMolecular Probes (Eugene, OR)から、抗Aβ1-42抗体はSignet Laboratories (Dedham, MA)から購入した。スピロステノール（SP-233）はInterbioscreen (Moscow, Russia)から購入した。Cyclosporin A（CsA）、カルボニルシアニド3-クロロフェニルヒドラゾン（CCCP）、カルボニルシアニドp-トリフルオロメトキシ-フェニルヒドラゾン（FCCP）、ロテノン、マロン酸、ミソチアゾール、シアン化カリウム（KCN）、オリゴマイシン、およびフェニルアルシンオキシド（PAO）はSigma (St Louis, MO)から入手した。ダルベッコ最小基礎培地（DMEM）、ウシ胎児血清（FBS）、およびSK-N-ASヒト神経芽腫細胞はATCC (Manassas, VA)から購入した。
２．ミトコンドリア画分の単離
ミトコンドリア画分を単離するため、体重230-350 gのラットを断頭し、脳をすぐに取り出し、6 mlの氷冷単離バッファー（TRIS 20 mM、スクロース 250 mM、KCl 40 mM、EGTA
2 mM、ウシ血清アルブミン 1 mg/ml、pH 7.2）を含むPotter-Elvejhem homogenizer (Eurostar, IKA-Verke, Staufen, Germany)を用いて氷上でホモジェナイズした。懸濁液を2000×gで8分間4°Cで遠心し、細胞片と核を除去した。ミトコンドリア含有上清を12000×gで10分間4°Cで遠心した。沈殿物を300 μlの呼吸バッファー（D-マンニトール 300 mM、KCl 10 mM、KH2PO4 10 mM、MgCl2 5 mM、pH 7.2、37°C）で再懸濁した。この沈殿物はミトコンドリアにおいて非常に豊富である（Zini et al. 1996）。ミトコンドリア懸濁液のタンパク質濃度はLowry法によって測定した。
３．ミトコンドリア呼吸の測定
ミトコンドリア呼吸はPC (Compaq, PIII 400 MHz)につないだOxytherm (Hansatech, Norfolk, UK)を用いて測定した。O2を検出するため、Oxythermの37°C培養槽を白金‐銀Clarck電極につないだ。O2消費量は、ADP（ATPの前駆体）の存在下、ならびに次の物質の存在下もしくは非存在下におけるミトコンドリア呼吸のマーカーとして用いた：CCCP（酸化的リン酸化の脱共役剤）、CsA（膜透過性遷移孔の阻害剤）、もしくはAβ1-42。O2消費量の測定により、V3/V4で定義されるミトコンドリア呼吸率（MRC）を算出することができ、ここでV4は基底O2消費量、V3はADPを加えた後のO2消費量（ATP産出量）である。ミトコンドリアの終濃度は、呼吸バッファーを用いて0.4 mgタンパク質/mLに調製した。ミトコンドリアは呼吸鎖の複合体Iの基質であるリンゴ酸／グルタミン酸を加えることで活性化する。State 2はミトコンドリア酸素消費の基底速度と定義される。ADPを加えることでATP合成が始まると、酸素消費は劇的に増加し、State 3に達する。ADP供給が枯渇すると、O2消費速度は基線（State 2）に戻り、これはState 4と呼ばれる(Chance and Williams 1956)。呼吸における全実験処置の影響は、基準呼吸、あるいはADPのみの存在下におけるミトコンドリア呼吸と比較した。
【０１０１】
CCCPに誘導されるミトコンドリア機能不全に対するSP-233の効果を調べるため、単離したミトコンドリアを、リンゴ酸／グルタミン酸を加える前に、SP-233内で3分間37°Cで培養した。1分後、CCCPを加えた。CsAに誘導されるミトコンドリア機能不全に対するSP-233の効果を調べるため、単離したミトコンドリアを、CsAを加える前にSP-233内で1.5分間培養した。1.5分後にリンゴ酸／グルタミン酸を加え、2.5分後にADPを加えた。最後に、Aβ1-42に誘導されるミトコンドリア機能不全に対するSP-233の効果を調べるため、ミトコンドリア画分を、リンゴ酸／グルタミン酸を加える前に、SP-233内で3分間、さらにAβ1-42内で1.5分間、37°Cで培養した。リンゴ酸／グルタミン酸を加えた1分後に、ADPを加えた。全実験において、SP-233、CCCP、およびCsAは最初にN,N-ジメチルホルムアミド（DMF）に溶解し、それから新鮮な蒸留水に希釈した。これらの実験で用いたAβ1-42は、新鮮な蒸留水で500 μMの濃度まで再調製した。Aβ1-42は新鮮に再調製されたものか、もしくは、溶液を4°Cで48時間培養して古くなった後に凝集したものを用いた。両溶液は使用前に呼吸バッファーで希釈し、それから所望の濃度になるよう、ミトコンドリアに直接加えた
。
４．細胞培養
ヒト神経芽腫SK-N-AS細胞を、96ウェルプレート（7x104 細胞数/ウェル）の10% FBSを含むDMEM培地に播種し、5% CO2、95%湿度で培養した。培養は種々の濃度のSP-233存在下もしくは非存在下で、次の物質と共に処理した。：Αβ1-42（0.1、1および10 μM）、ロテノン（50 nM）、マロン酸（100 mM）、ミソチアゾール（0.3 μM）、KCN（12 mM）、オリゴマイシン（0.5 μg/ml）、FCCP（3 μM）、およびPAO（0.25 μM）。細胞生存力は、臭化3-(4,5-ジメチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニル テトラゾリウム（MTT）アッセイを用いて、製造者の説明書に従って測定した(Trevigen, Gaithersburg, MD)。Aβ1-42を含む実験においては、細胞生存力は、1 μM Aβ1-42の存在下もしくは非存在下において、侵襲の72時間後に測定した。新鮮に再調製されたAβ1-42溶液のみを用いた。ミトコンドリア毒（ロテノン、マロン酸、ミソチアゾール、KCN、およびオリゴマイシン）を含む実験においては、細胞生存力は、1、3、10、30、あるいは100 μMのAβ1-42の存在下もしくは非存在下において、侵襲の6時間後または24時間後に測定した。SP-233はミトコンドリア毒を加える1時間前に培養に加えた。FCCPおよびPAOを含む実験においては、FCCPまたはPAOを加える1時間前に、同時並行の細胞培養を、1〜100 μMの範囲で濃度増加するSP-233の存在下もしくは非存在下で行った。細胞生存率は24時間後に評価した。FCCP、ロテノン、マロン酸、ミソチアゾール、KCN、オリゴマイシン、およびPAOは、保存液として全て最初にエタノールに溶解し、その後所望の終濃度になるまで培養溶媒に希釈した。培養溶媒中のエタノールの割合は0.09%とした。
５．Aβ1-42の免疫細胞化学分析
ヒト神経芽腫SK-N-AS細胞を直径13-mmのカバーガラス（20,000 細胞数／カバーガラス）に播種し、10% FBSを含むDMEM培地で37°C、5% CO2で一晩培養した。その後Αβ1-42（10 μM）もしくはその溶媒と共に、SP-233（1 μM）の存在下もしくは非存在下で、3時間培養した。ミトコンドリアのΑβ1-42取り込みを評価するため、ミトコンドリア呼吸鎖複合体IIに対して作製した、抗OxPhos複合体II 70-kDaサブユニットマウスモノクローナル抗体(Molecular Probes, Eugene, OR)、および、Αβ1-42の33-42アミノ酸残基に対して作製したウサギポリクローナル抗体(Signet Laboratories, Dedham, MA)を用いて、共局在分析を行った。神経芽腫細胞はリン酸緩衝食塩水（PBS）で洗浄し、-20°Cでメタノール固定し、さらにPBSでリンスした。続いて細胞を10%ロバ血清を含むPBSで30分間ブロッキングし、その後、複合体IIに対して作製した抗体と共に4°Cで24時間培養した（1.5%ロバ血清と0.01%Triton X100を含むPBS内、1:200）。さらに細胞をPBSで洗浄し、ロバ抗マウスローダミンラベル二次抗体(1:200、Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA)と共に室温で2時間培養した。さらに、Αβ1-42の33-42アミノ酸残基に対して作製した抗体（1:500）、および蛍光マーカーAlexa FluorR 488 (Molecular Probes, Eugene, OR)でラベルしたロバ抗ウサギ二次抗体を用いて、同じ連続ステップを続けて行った。カバーガラスを、4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール-2-塩酸塩(DAPI; Vector Laboratories, Burlingame, CA)を含む水溶性のマウント剤でマウントした。共焦点画像をOlympus Fluoview
BX61 Laser Scanning microscopeを用いて撮影した。
６．統計分析
全結果は平均値±標準偏差であらわす。群間比較はダネット検定に従って分散分析（ANOVA）を用いて行った。P値 < 0.05を有意差とした。
B：結果
１．CCCPもしくはCsAに誘導されるミトコンドリア呼吸の変化にSP-233が及ぼす影響
最初に、濃度1 fM〜100 pMの範囲においてSP-233がミトコンドリア呼吸に与える影響は、MRCの漸進変化を分析することで評価した（図６）。SP-233濃度が増加すると、MRCは漸
進的に減少した。1 nMという低濃度においても、SP-233はラット脳ミトコンドリアのMRCをコントロール群に比べて有意に減少させた（p<0.001、図６b）。10 pMもしくは10 pM以上のSP-233濃度においては、MRCは50%減少した。
【０１０２】
CCCPは酸化的リン酸化を脱共役し、O2消費量を増加する。図７aに示すように、1 μMのCCCPはラット脳ミトコンドリアのO2消費量を基底量の150%まで増加した（p<0.01）。1〜1000 pMの濃度範囲のSP-233はこの効果を完全に打ち消し（全てにおいてp<0.001）、これらの濃度のSP-233存在下でのCCCP誘導脱共役の阻害は、O2消費量が基底量の60〜65%まで減少したことに関連していた。
【０１０３】
低酸素は1 μMのCsAをミトコンドリア培養溶媒に加えることで誘導される(Zini et al.
1996)。SP-233はCsAに誘導されるMRCの減少は打ち消さなかった。反対に、SP-233はこの効果を濃度依存的に増幅させた（図７b）。
２．新鮮なAβ1-42、および古いAβ1-42に誘導されるミトコンドリア呼吸の変化にSP-233が及ぼす影響
Aβ1-42を単離したミトコンドリアに加えると、0.1 pMという濃度においてさえ、MRCは著しく減少した（図８）。この効果は、古いものよりも新鮮なアミロイドペプチドの方が明白であり、前者の阻害効果はおよそ10%大きかった。非凝集体のAβ1-42の方が、古い、凝集体のペプチドよりも、大いにミトコンドリア内に浸透すると考えられる。図９aに示すように、新鮮なAβ1-42を単離したミトコンドリアに加えると、MRCはコントロール値の71%まで減少し、この減少はSP-233によって部分的に取り消された。SP-233の最低実験濃度（1 pM）において、MRCはコントロール値のおよそ39%にまで回復した。MRCはAβ1-42のみで得られた値に比べ、有意に増加した（38.56 ± 0.34 vs. 28.93 ± 1.75、p<0.001）。古いAβ1-42はMRCをコントロールに比べて51%減少させたが、SP-233はこの古いAβ1-42に誘導されたMRCの変化に対しては有意な影響を及ぼさなかった（図９b）。
３．SK-N-ASヒト神経芽腫細胞におけるAβ1-42誘導毒性にSP-233が及ぼす影響
図１０は、SK-N-AS細胞におけるAβ1-42誘導神経毒性に対してSP-233が及ぼす影響を示す。三つの全実験濃度のAβ1-42存在下において、1 μMのSP-233を加えることで、細胞生存力は著しく増加した。
SP-233は0.1、1、および10μMのAβ1-42によって誘導される神経毒性を、それぞれ19%（p<0.01、Aβ1-42のみと比較して）、26%（p<0.01）、および28%（p<0.01）減少させた。
４．SK-N-ASヒト神経芽腫細胞のミトコンドリアへのAβ1-42取り込みにSP-233が及ぼす影響
図１１は、SK-N-ASヒト神経芽腫細胞における、DAPI染色（a1、b1およびc1）、Aβ1-42の免疫蛍光ラベル（a2、b2およびc2）、ならびに複合体II 70-kDaサブユニットの免疫蛍光ラベル（a3、b3およびc3）の代表イメージを示す。合併イメージを図a4、b4およびc4に示す。Aβ1-42処理した神経芽腫細胞は、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体IIのラベルと共局在する（図１１b4）、強いAβ1-42免疫反応を示した（図１１b2）。これは、Aβ1-42がミトコンドリアに入り、その内部に存在することを証明する。Aβ1-42免疫反応はSP-233の存在下では打ち消され（図１１c2）、これはSP-233が細胞およびミトコンドリアへのAβ1-42の取り込みをブロックすることを示す。
５．SK-N-AS細胞におけるミトコンドリア複合体の阻害剤に対するSP-233の神経保護効果
SP-233は、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体I、II、およびIIIの阻害剤に対する神経保護効果は何も示さなかった（図１２a、b、およびc）。1 μMの濃度において、SP-233はロテノンに対して有意な保護効果を示し、100 μMのSP-233はミソチアゾールに対して有意な保護効果を示した（共にp<0.05）。この保護効果は有意ではあったものの、両ケースにお
いて効果の規模は小さかった。対照的に、SP-233は、複合体IV阻害剤であるKCN、および複合体V阻害剤であるオリゴマイシンによって誘導される毒性に対して、顕著な有益効果を発揮した（図１２dおよび１２e）。低濃度のSP-233（1、3、および10 μM）はKCNに対して活性があり、一方、高用量（30および100 μM）は有益効果を示さない。SP-233のオリゴマイシンに対する保護効果は、10 μMのSP-233は統計的に有意な神経保護効果を示さなかったものの、用量依存的であった。これらのデータは、SP-233が複合体IVおよびVの阻害に対してSK-N-AS細胞を保護することを示す。
６．SK-N-AS細胞におけるPAOおよびFCCPに対するSP-233の神経保護効果
アデニンヌクレオチド転位酵素（ANT）はミトコンドリア内膜に局在するチャネルタンパク質であり、生理的状態において、1:1の割合でATPを搬出しADPを搬入する。PAOによるANTの阻害は、透過性遷移孔の開放を促進し、アポトーシスを誘導する。1 μMのSP-233はSK-N-AS神経細胞におけるPAOの毒性効果を25%軽減した（図１３、p<0.01）。1 μM以上の濃度のSP-233は、神経保護効果と関連しなかった。加えて、SP-233は100 μMの濃度において、FCCPに誘導される呼吸鎖の脱共役に対して、わずかだが有意な効果（p<0.01）を発揮した（図１４）。
C：考察
ADは、臨床的には進行性の認知過程障害および記憶の喪失を特徴とする。早くから、この疾病の“記憶”という見方は、アセチルコリン（ACh）のシナプス濃度の減少を反映した、中枢のコリン作用性の経路の衰退に関連付けられてきた。従って、創薬研究は脳でのAChレベルの回復に主に集中し、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤（AChEIs）の開発につながった。しかし、これらの薬剤はAD患者とその介護者にとっては貴重であるものの、AChEIsは、疾病の進行を止めるのではなく、ただ限られた期間遅らせるだけの対症薬剤である(Tariot and Winblad, 2001; Waldemar et al. 2001; Grossberg et al. 2004)。メマンチン、N-メチル-D-アスパラギン酸（NMDA）受容体拮抗物質が近年重度のADを中程度に治療すると認可されたものの(Livingston and Katona 2004)、ADの病因を標的とする新薬および新治療法法が依然として緊急に必要とされている。
【０１０４】
ADの病因論は、この疾病の家族性の早期発症型においてよく考証されており、APP（プレセニリン-1もしくはプレセニリン-2）遺伝子の突然変異が含まれる。対照的に、全AD症例の約95%をあらわす晩期発症型の孤発性ADの原因は、依然として確立されていない。数多くの仮説が現れ、それらにおいて、ミトコンドリア機能障害に由来するエネルギー性機能不全、および酸化ダメージが、ADの原因であるという可能性が提案されている(Schulz et al. 1997; Beal, 2000)。このミトコンドリア機能障害仮説は、スピロステノール誘導体SP-233がニューロンのPC12細胞をAβ1-42誘導神経毒性から保護する(Lecanu et al. 2004)という近年の発見と共に、SP-233がAβ1-42に暴露された単離ミトコンドリアの機能を回復させることができるか、ということについて研究するきっかけとなった。本明細書中の結果は、単離されたラット脳ミトコンドリア、およびヒト神経芽腫細胞の両方において、SP-233がAβ1-42の毒性効果からミトコンドリア機能を保護することを示している。これらの知見は、Aβ誘導神経毒性と関係し、またADの発症機序に関連する基本的機構に対して、SP-233が影響する可能性を持つことを示唆している。
【０１０５】
Aβがミトコンドリア機能に与える影響は、過去10年間広範に研究されてきており、これらの研究によって作られたデータは、ペプチドの種々の影響が、ミトコンドリア機能障害を引き起こす可能性を示唆している。Aβ1-42とAβ25-35断片は、神経細胞ミトコンドリアにおいて、呼吸、および、コハク酸脱水素酵素、α-ケトグルタル酸脱水素酵素、ピルビン酸脱水素酵素、ならびにシトクロム酸化酵素などの鍵酵素の活性を阻害することがわかっている(Kaneko et al. 1995; Casley et al. 2002a)。呼吸鎖複合体の阻害についても、Aβ25-35に暴露した神経細胞ミトコンドリアにおいて報告されており(Pereira et 
al. 1998; Canevari et al. 1999;Casley et al. 2002b)、さらにこの同じペプチド断片は、MPTに関連する孔開口を促進する(Moreira et al. 2001; Moreira et al. 2002; Bachurin et al. 2003)。
【０１０６】
加えて、本明細書中の結果は、MRCの減少から明らかなように、Aβ1-42がラット脳ミトコンドリアにおいてミトコンドリア呼吸を阻害することを示す。さらに、この阻害は、新鮮に用意されたペプチドおよび古いペプチドの両方において、Aβ1-42が0.1 pMという低濃度でも起こった。Aβ1-42の重合体の方が、単量体もしくはADDLsなどの低重合体よりも、ミトコンドリア膜をより横切りにくいため、この阻害効果は新鮮な形態の方が明白であったと思われる。これら後者の形態は、より呼吸鎖に有害な影響を及ぼしやすく、事実上、より有毒である。また、古い／凝集体のAβ1-42に暴露されたミトコンドリアにおけるSP-233による保護の欠如は、SP-233が、アミロイドペプチドの凝集体には、単量体に結合するのと同様には結合することができないためであると思われる。
【０１０７】
興味深いことに、Aβ1-42に暴露されたPC12細胞のATP合成に対する、SP-233の回復効果を示す過去のデータ(Lecanu et al. 2004)を確かめると、SP-233は、新鮮に用意されたAβ1-42によって誘導されたMRCの減少を部分的に阻害することができる。SP-233が非常に低濃度で活性化するという結果は、その作用機構が比較的特異的であることを示唆する。本明細書記載のデータはさらに、SP-233が、ペプチドの単量体に結合し、神経毒性のある低重合体ADDLsの形成を阻害することで、Aβ1-42神経毒性に対して神経細胞を保護するということを示す、近年の結果を裏付ける(Lecanu et al. 2004)。
【０１０８】
Aβ1-42が呼吸鎖複合体IIと共局在することを示すにあたり、ヒト神経芽腫細胞において実施した共焦点顕微鏡分析は、Aβ1-42が細胞外膜とミトコンドリア膜両方を横断できることを示唆している。SP-233とAβ1-42が共に培養溶媒に存在する場合、アミロイドペプチドラベルは完全に抑制され、またこのSP-233の“除去”効果は、MRCの部分的な回復に伴って見られた。加えてSP-233は、同じヒト神経芽腫細胞へのAβ1-42の神経毒性作用を部分的に抑制した。この結果は、死後のAD脳の皮質錐体神経細胞のミトコンドリアに、アミロイド沈殿物が存在することを示す近年の結果(Fernandez-Vizarra et al. 2004)を考えると、特に興味深い。これらの組織学的特長は、疾病の経過における非常に初期の現象として記述されてきており、対らせん状のフィラメントの形成の前に現れ、神経細胞死につながる。この論拠のもと、SP-233によるAβ1-42の不活性化は、本明細書記載の通り、AD治療においてSP-233の使用を正当化する(Lecanu et al. 2004)。
【０１０９】
Aβ1-42へのSP-233の結合、および“除去”効果が証明された後、SP-233がミトコンドリアへ直接影響することで、Aβ1-42に対する加算性の保護効果がもたらされるという可能性が研究された。この点について、Aβは脳ミトコンドリアのMPT孔の開放を促進し、機能障害を引き起こし、さらにこの影響はCsAによって打ち消される、ということが以前に証明されている(Moreira et al. 2001; Bachurin et al. 2003; Abramov et al. 2004)。本研究は、SP-233がCsAのように、MRCを減少させることを示す。また、SP-233はCsAの効果を増幅させ、このことはSP-233がCsA様の性質を持つことを示唆する。つまり、SP-233はMPT孔開放を阻害し、それによってAβ1-42誘導ミトコンドリア機能不全に対する保護効果が得られる。この仮説は、MPTを促進することが知られている、PAO（チロシン脱リン酸化酵素阻害剤であるタンパク質）に対するSP-233の保護効果によって裏付けられる(Korge
et al., 2001)。このように、SP-233は1 μMの濃度で神経細胞生存力を25%回復させ、一方、より高濃度のSP-233は保護効果を伴わなかった。MPT結合孔の開放に対するSP-233の効果は、直接的および／もしくは間接的な作用を介して起こると思われる（例えば、ミトコンドリア膜への挿入後のアロステリック修飾によって）。
【０１１０】
SP-233はさらに、単離ミトコンドリアおよび神経芽腫細胞において、CCCPによって誘導
された酸化的リン酸化の脱共役を打ち消すことができた。Aβ1-42はミトコンドリア膜構造を分裂させ(Kremer et al. 2001; Rodrigues et al. 2001)、AD脳ではミトコンドリアの膜流動性が変わる(Mecocci et al, 1996)ということが示されており、両現象はミトコンドリアの脱共役を引き起こす。従って、SP-233の“再共役”効果はまだ完全には明らかにされていないものの、このことが本明細書記載のミトコンドリア機能の回復に寄与していると考えられる。さらに、SP-233の除去効果（おそらくMPT孔の調節を含む）と、再共役効果の組み合わせによって、1 pMという低濃度でAβ1-42の影響を打ち消すことができるSP-233の能力を説明することができると思われる。
【０１１１】
ミトコンドリア呼吸鎖におけるSP-233の別の標的を特定しようとする試みにおいて、SP-233は、複合体I、III、IV、およびVの阻害剤に対しては神経芽腫細胞を保護することができるが、複合体IIの阻害剤に対しては神経芽腫細胞を保護することができないことが示された（図１５）。最も明白な効果は複合体IIIとIVで観察されたが、SP-233は1 μMおよび100 μMの濃度においても、ロテノンならびにミソチアゾール誘導毒性に対して、それぞれわずかだが有意な神経保護効果を発揮した。Aβ1-42に対する細胞生存力救出と比較して、KCNおよびオリゴマイシンに対する細胞生存力救出の重要性は、複合体IVおよびVが、アミロイドペプチドに誘導されるミトコンドリア機能障害の主要な標的であることを示唆する。これらの結果は、単離脳ミトコンドリアにおいて、Aβ25-35断片が複合体IVを阻害することを示す先行結果を裏付ける(Canevari et al., 1999)。しかし、このデータと対照的に、同じ筆者はAβ25-35が呼吸鎖の他の複合体には影響しないことを報告している。この明白な相違は、用いられたアミロイドペプチド種の違いによって説明でき、神経病理学におけるAβ25-35およびAβ1-42の役割について問題提起している。
【０１１２】
ADは不治の神経変性障害であり、そのほとんどがAChEの阻害のみに基づく現存する治療法は重大な制限を持つことから、より有効な治療薬の開発が緊急に必要とされている。微小分子であるSP-233は、ADDLsの形成をブロックすることでAβ1-42誘導神経毒性を阻害することが以前から示されているが、脳ミトコンドリアをAβ1-42暴露による有害効果から保護することを本明細書において報告する。SP-233の神経保護効果の基礎を成す分子機構は、少なくとも部分的に、Aβ1-42の“除去”、“抗脱共役”効果、ミトコンドリア複合体IVおよびVに対する保護効果、ならびにMPT孔の開放を阻害する能力によるものと思われる。結論として、本明細書中のデータは、SP-233が抗アミロイドペプチド特性を持つことを示す先行結果を裏付け、また拡大し、さらに、ミトコンドリアおよび呼吸鎖をAβ1-42ならびにSP-233の直接的な標的として特定するものである。
〔文献目録〕
下記リストの出版物は、本明細書において全文が記載されるのと同様に参照として組み込まれる。
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全ての出版物、特許および特許出願は、参照によって本明細書に組み込まれる。上記明細書において、本発明について特定の好ましい実施形態を参照して説明し、多くの細部について例示の目的で述べたが、当業者にとっては、本発明に追加の実施形態をとらせることも可能であり、また本明細書記載の細部のいくつかは、本発明の基本原理から逸脱することなく大幅に変更されうることが明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１１３】
【図１】図１は、SP-233の濃度増加（10から100 pM）がミトコンドリア呼吸鎖へ与える影響を、ラット脳のミトコンドリアの呼吸率の漸進的変化を測定して評価したものである。このミトコンドリア呼吸率（MRC）はV3/V4である。V4は基底O2消費量である。V3はADPを加えた後のO2消費量である（ATP生産量）。ミトコンドリア濃度は0.4 mgタンパク質量/mlに調製した。注目すべきは、10 pMという低いSP-233濃度でも、コントロールに比べMRCが50%減少した（p<0.001）ことである。結果は平均値±標準偏差であらわす。群間比較はダネット検定に従ってANOVAによって行った。
【図２Ａ】図２aは、ラット脳のミトコンドリアにおいて、SP-233が酸化的リン酸化のCCCP誘導脱共役に与える影響を示す。SP-233が酸化的リン酸化のCCCP誘導脱共役に与える影響を評価するために、リンゴ酸／グルタミン酸を加える前に、ミトコンドリア画分をSP-233に37℃で3分間培養し、その後1分後にCCCPを加えた。脱共役剤CCCP（1 μM）への暴露により、O2消費量は基底値の150%まで増加した（p<0.01）。この変化は酸素消費量の増加を反映している。全ての実験濃度において（1 pMにおいてさえ）、SP-233はCCCPの代謝効果を打ち消した（p<0.001）。このSP-233の脱共役阻害効果は、O2消費量が基底レベルの60〜65%まで減少することに関連し、濃度非依存的なものである。
【図２Ｂ】図２bは、CsA誘導低酸素にSP-233が与える影響を示す。低酸素はCsA（1 μM）をミトコンドリアを培養する培養液に加えることによって引き起こされる。この実験は、ADPをCsAの存在下かつSP-233の非存在下に加えることでコントロールとした。SP-233、もしくはその溶媒を最初に加え、CsAを穏やかに加える前まで、1.5分間培養を続けた。それから、基質であるリンゴ酸／グルタミン酸を1.5分後に、ADPを2.5分後に加えた。SP-233への暴露は、CsAによって誘導されたMRCの減少は阻害しなかった。しかし反対に、CsAの効果は濃度依存的に増幅された。結果は平均値±標準偏差であらわす。群間比較はダネット検定に従ってANOVAによって行った。
【図３】図３は、新鮮なAβ1-42、および古いAβ1-42がラット脳のミトコンドリアにおけるミトコンドリア呼吸率に与える影響を示す。ミトコンドリアは、基質であるリンゴ酸／グルタミン酸を加える前に、Αβ1-42の存在下で37℃で1.5分間培養した。リンゴ酸／グルタミン酸を加えた1分後、ADPを加えた。この実験はADPを除去することでコントロールとした。Αβ1-42は、0.1 pMの低い濃度においても、MRCを著しく減少させた。新鮮なアミロイドペプチドがMCRに与える影響は、古いものが与える影響よりも明白であり、それぞれMRCの減少は55〜63%と43〜53%であった。結果は平均値±標準偏差であらわす。群間比較はダネット検定に従ってANOVAによって行った。
【図４Ａ】図４は、ラット脳のミトコンドリアにおいて、新鮮なAβ1-42、および古いAβ1-42によって誘導されるミトコンドリア呼吸率の変化に、SP-233が与える影響を示す。ミトコンドリアをSP-233の存在下で3分間培養し、リンゴ酸／グルタミン酸を加える前に、新鮮に用意されたΑβ1-42（a）もしくは古いΑβ1-42（b）の存在下で37℃で1.5分間培養した。基質であるリンゴ酸／グルタミン酸の1分後にADPを加えた。Αβ1-42に対するSP-233の影響のコントロールは、ADPなしの実験と同様にした。（a）では、新鮮なΑβ1-42がコントロールに比べてMRCを71%減少させ、この効果はSP-233によって部分的に阻害された。最も有力な効果は、SP-233の最低濃度で観察され、これはMRCをコントロール値の39%まで戻した（38.56 ± 0.34 vs. 28.93 ± 1.75、p<0.001）。（b）では、古いΑβ1-42がコントロール値に比べてMRCを51%減少させたが、SP-233はこの効果を阻害しなかった。結果は平均値±標準偏差であらわす。群間比較はダネット検定に従ってANOVAによって行った。
【図４Ｂ】図４は、ラット脳のミトコンドリアにおいて、新鮮なAβ1-42、および古いAβ1-42によって誘導されるミトコンドリア呼吸率の変化に、SP-233が与える影響を示す。ミトコンドリアをSP-233の存在下で3分間培養し、リンゴ酸／グルタミン酸を加える前に、新鮮に用意されたΑβ1-42（a）もしくは古いΑβ1-42（b）の存在下で37℃で1.5分間培養した。基質であるリンゴ酸／グルタミン酸の1分後にADPを加えた。Αβ1-42に対するSP-233の影響のコントロールは、ADPなしの実験と同様にした。（a）では、新鮮なΑβ1-42がコントロールに比べてMRCを71%減少させ、この効果はSP-233によって部分的に阻害された。最も有力な効果は、SP-233の最低濃度で観察され、これはMRCをコントロール値の39%まで戻した（38.56 ± 0.34 vs. 28.93 ± 1.75、p<0.001）。（b）では、古いΑβ1-42がコントロール値に比べてMRCを51%減少させたが、SP-233はこの効果を阻害しなかった。結果は平均値±標準偏差であらわす。群間比較はダネット検定に従ってANOVAによって行った。
【図５】図５は、ヒトの神経芽細胞腫における、Αβ1-42誘導毒性に対するSP-233の保護効果を評価したものである。Αβの細胞毒性は、SK-N-AS神経芽細胞腫を、MTTアッセイを用いて、SP-233（1 μM）の存在下もしくは非存在下におき、Αβ1-42（0.1、1および10 μM）もしくは溶媒で72時間培養した後に評価した。SP-233（1 μM）は、Αβ1-42の三種の濃度によって誘導された神経毒性を阻害した。結果は平均値±標準偏差であらわす。群間比較はダネット検定に従ってANOVAによって行った。
【０１１４】
Αβ1-42で処理された神経芽細胞腫は、強い免疫活性を示した（これはミトコンドリア呼吸鎖の複合体IIと共存し、Αβ1-42がミトコンドリア内部に存在することを示す）。
SP-233処理は、Αβ1-42の免疫活性を打ち消し、これはΑβ1-42がミトコンドリア内に入るのを妨げる能力がSP-233にあることを示す。
【図６Ａ】図６は、SP-233がミトコンドリア呼吸に与える影響を示す。スピロステノール誘導体ヘキサン酸=(22R,25R)-20α-スピロスタ-5-エン-3β-イル（SP-233）の構造式は（a）に示す。SP-233濃度の増加（1 aM 〜 100 pM）がミトコンドリア呼吸鎖に与える影響は、単離されたラット脳のミトコンドリアにおける呼吸率の漸進的変化を測定することで評価され、（b）に示す。ミトコンドリア呼吸率（MRC）はV3/V4と定められ、V4は基底O2消費量であり、V3はADPを加えた後のO2消費量（ATP生産量）である。ミトコンドリア濃度は0.4 mgタンパク質量/mlに調製した。注目すべきは、1 fMという低いSP-233濃度においても、コントロールに比べてMRCが40%減少したことである（p<0.001）。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。
【図６Ｂ】図６は、SP-233がミトコンドリア呼吸に与える影響を示す。スピロステノール誘導体ヘキサン酸=(22R,25R)-20α-スピロスタ-5-エン-3β-イル（SP-233）の構造式は（a）に示す。SP-233濃度の増加（1 aM 〜 100 pM）がミトコンドリア呼吸鎖に与える影響は、単離されたラット脳のミトコンドリアにおける呼吸率の漸進的変化を測定することで評価され、（b）に示す。ミトコンドリア呼吸率（MRC）はV3/V4と定められ、V4は基底O2消費量であり、V3はADPを加えた後のO2消費量（ATP生産量）である。ミトコンドリア濃度は0.4 mgタンパク質量/mlに調製した。注目すべきは、1 fMという低いSP-233濃度においても、コントロールに比べてMRCが40%減少したことである（p<0.001）。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。
【図７Ａ】図７は、酸化的リン酸化のCCCP誘導脱共役と、CsA誘導低酸素にSP-233が与える影響を示す。（a）では、SP-233が酸化的リン酸化のCCCP誘導脱共役に与える影響を評価するために、ミトコンドリア画分を、リンゴ酸／グルタミン酸を加える前にSP-233の存在下で37℃で3分間培養した。CCCPは1分後に加えた。脱共役剤である1 μM CCCPへの暴露は、O2消費量を基底値の150%にまで増加させた（p<0.01）。全ての実験濃度において、SP-233はCCCPの代謝効果を打ち消した（p<0.001）。SP-233の脱共役阻害効果は、O2消費量が基底レベルの60〜65%まで減少したことに関連し、濃度非依存的であった。（b）では、ミトコンドリアを培養する培養液に1μM CsAを加えることで低酸素が誘導された。コントロールとして、CsAの存在下、およびSP-233の非存在下においてADPを加えた。SP-233もしくはその溶媒を最初に加え、CsAを穏やかに加える前に1.5分間培養を続けた。基質であるリンゴ酸／グルタミン酸を1.5分後に加え、ADPは2.5分後に加えた。SP-233への暴露は、CsAに誘導されるMRCの減少を阻害しなかった。反対に、CsAの効果は濃度依存的に増幅された。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。
【図７Ｂ】図７は、酸化的リン酸化のCCCP誘導脱共役と、CsA誘導低酸素にSP-233が与える影響を示す。（a）では、SP-233が酸化的リン酸化のCCCP誘導脱共役に与える影響を評価するために、ミトコンドリア画分を、リンゴ酸／グルタミン酸を加える前にSP-233の存在下で37℃で3分間培養した。CCCPは1分後に加えた。脱共役剤である1 μM CCCPへの暴露は、O2消費量を基底値の150%にまで増加させた（p<0.01）。全ての実験濃度において、SP-233はCCCPの代謝効果を打ち消した（p<0.001）。SP-233の脱共役阻害効果は、O2消費量が基底レベルの60〜65%まで減少したことに関連し、濃度非依存的であった。（b）では、ミトコンドリアを培養する培養液に1μM CsAを加えることで低酸素が誘導された。コントロールとして、CsAの存在下、およびSP-233の非存在下においてADPを加えた。SP-233もしくはその溶媒を最初に加え、CsAを穏やかに加える前に1.5分間培養を続けた。基質であるリンゴ酸／グルタミン酸を1.5分後に加え、ADPは2.5分後に加えた。SP-233への暴露は、CsAに誘導されるMRCの減少を阻害しなかった。反対に、CsAの効果は濃度依存的に増幅された。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。
【図８】図８は、新鮮な、および古いΑβ1-42が、ラット脳のミトコンドリアにおけるミトコンドリア呼吸率に与える影響を示す。ミトコンドリアは、基質であるリンゴ酸／グルタミン酸を加える前に、Αβ1-42の存在下で37℃で1.5分間培養した。リンゴ酸／グルタミン酸の1分後にADPを加えた。これらの実験では、ADPを培養混合液から取り除いた。Αβ1-42は、0.1 pMの濃度においてさえ、MRCを著しく減少させた。新鮮なアミロイドペプチドがMCRに与える影響は、古いものが与える影響よりも明白であり、それぞれMRCの減少は55〜63%と43〜53%であった。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。
【図９Ａ】図９は、新鮮な、および古いAβ1-42に誘導されたMRCの変化にSP-233が与える影響を示す。ミトコンドリアは、リンゴ酸／グルタミン酸を加える前に、SP-233の存在下で3分間、さらに、新鮮に用意されたAβ1-42（a）もしくは古いAβ1-42（b）の存在下で1.5分間、37℃で培養した。ADPは、リンゴ酸／グルタミン酸を加えた1分後に加えた。コントロール反応は、ADPの非存在下で実施した。新鮮なAβ1-42は、コントロールに比べてMRCを71%減少させ、この効果はSP-233によって部分的に阻害された。
【０１１５】
もっとも有力な効果は、SP-233の最低濃度で観察され、MRCをコントロール値の39%まで戻した（38.56 ± 0.34 vs. 28.93 ± 1.75、 p<0.001）。古いAβ1-42は、コントロールに比べてMRCを51%減少させたが、SP-233はこの効果を阻害しなかった。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。
【図９Ｂ】図９は、新鮮な、および古いAβ1-42に誘導されたMRCの変化にSP-233が与える影響を示す。ミトコンドリアは、リンゴ酸／グルタミン酸を加える前に、SP-233の存在下で3分間、さらに、新鮮に用意されたAβ1-42（a）もしくは古いAβ1-42（b）の存在下で1.5分間、37℃で培養した。ADPは、リンゴ酸／グルタミン酸を加えた1分後に加えた。コントロール反応は、ADPの非存在下で実施した。新鮮なAβ1-42は、コントロールに比べてMRCを71%減少させ、この効果はSP-233によって部分的に阻害された。
【０１１６】
もっとも有力な効果は、SP-233の最低濃度で観察され、MRCをコントロール値の39%まで戻した（38.56 ± 0.34 vs. 28.93 ± 1.75、 p<0.001）。古いAβ1-42は、コントロールに比べてMRCを51%減少させたが、SP-233はこの効果を阻害しなかった。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。
【図１０】図１０は、ヒトの神経芽細胞腫におけるAβ1-42誘導毒性に対するSP-233の保護効果を評価したものである。Aβの細胞毒性は、SK-N-AS培養液を、MTTアッセイを用いて、SP-233（1 μM）の存在下もしくは非存在下におき、Αβ1-42（0.1、1および10 μM）もしくは溶媒で72時間培養した後に評価した。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。
【図１１Ａ】図１１は、SK-N-ASヒト神経芽細胞腫における、ミトコンドリアのΑβ1-42取り込みにSP-233が与える影響の、共焦点顕微鏡法分析を示す。健康な、損傷のない（コントロール）細胞からとられた代表イメージを（a1-4）に示す。これらの培養液はAβ1-42もしくは SP-233を受容しない。10 μMのAβ1-42で3時間処理したSK-N-AS細胞からとられた代表イメージを（b1-4）に示す。10 μMのAβ1-42および1 μMのSP-233で3時間処理したSK-N-AS細胞からとられた代表イメージを（c1-4）に示す。細胞はDAPI核対比染色で染色し（a1、b1、およびc1）、Aβ1-42（FITC；a2、b2、およびc2）および複合体II 70-kDaサブユニット（Texas red； a3、 b3、 およびc3）でラベルした。混合イメージはa4、b4、およびc4に示す。Aβ1-42処理した神経芽細胞腫は、強い抗体活性を示し（b2）、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体IIと共存した（b4）。また、SP-233処理によってAβ1-42抗体活性は打ち消された（c2）。
【図１１Ｂ】図１１は、SK-N-ASヒト神経芽細胞腫における、ミトコンドリアのΑβ1-42取り込みにSP-233が与える影響の、共焦点顕微鏡法分析を示す。健康な、損傷のない（コントロール）細胞からとられた代表イメージを（a1-4）に示す。これらの培養液はAβ1-42もしくはSP-233を受容しない。10 μMのAβ1-42で3時間処理したSK-N-AS細胞からとられた代表イメージを（b1-4）に示す。10 μMのAβ1-42および1 μMのSP-233で3時間処理したSK-N-AS細胞からとられた代表イメージを（c1-4）に示す。細胞はDAPI核対比染色で染色し（a1、b1、およびc1）、Aβ1-42（FITC；a2、b2、およびc2）および複合体II 70-kDaサブユニット（Texas red；a3、 b3、 およびc3）でラベルした。混合イメージはa4、b4、およびc4に示す。Aβ1-42処理した神経芽細胞腫は、強い抗体活性を示し（b2）、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体IIと共存した（b4）。また、SP-233処理によってAβ1-42抗体活性は打ち消された（c2）。
【図１１Ｃ】図１１は、SK-N-ASヒト神経芽細胞腫における、ミトコンドリアのΑβ1-42取り込みにSP-233が与える影響の、共焦点顕微鏡法分析を示す。健康な、損傷のない（コントロール）細胞からとられた代表イメージを（a1-4）に示す。これらの培養液はAβ1-42もしくはSP-233を受容しない。10 μMのAβ1-42で3時間処理したSK-N-AS細胞からとられた代表イメージを（b1-4）に示す。10 μMのAβ1-42および1 μMのSP-233で3時間処理したSK-N-AS細胞からとられた代表イメージを（c1-4）に示す。細胞はDAPI核対比染色で染色し（a1、b1、およびc1）、Aβ1-42（FITC；a2、b2、およびc2）および複合体II 70-kDaサブユニット（Texas red；a3、 b3、 およびc3）でラベルした。混合イメージはa4、b4、およびc4に示す。Aβ1-42処理した神経芽細胞腫は、強い抗体活性を示し（b2）、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体IIと共存した（b4）。また、SP-233処理によってAβ1-42抗体活性は打ち消された（c2）。
【図１２Ａ】図１２は、SK-N-AS細胞におけるミトコンドリア複合体阻害剤に対するSP-233の神経保護効果を示す。SK-N-AS培養細胞に、SP-233もしくはその溶媒を加えた１時間後、５つの異なるミトコンドリア毒素を加えた。ロテノン、マロン酸、およびミソチアゾールを、SP-233の非存在下もしくは存在下で24時間培養した後、細胞生存率を測定した。KCNおよびオリゴマイシンの培養時間は6時間であった。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。SP-233処理していない培養細胞との有意差は* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001であらわす。
【図１２Ｂ】図１２は、SK-N-AS細胞におけるミトコンドリア複合体阻害剤に対するSP-233の神経保護効果を示す。SK-N-AS培養細胞に、SP-233もしくはその溶媒を加えた１時間後、５つの異なるミトコンドリア毒素を加えた。ロテノン、マロン酸、およびミソチアゾールを、SP-233の非存在下もしくは存在下で24時間培養した後、細胞生存率を測定した。KCNおよびオリゴマイシンの培養時間は6時間であった。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。SP-233処理していない培養細胞との有意差は* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001であらわす。
【図１２Ｃ】図１２は、SK-N-AS細胞におけるミトコンドリア複合体阻害剤に対するSP-233の神経保護効果を示す。SK-N-AS培養細胞に、SP-233もしくはその溶媒を加えた１時間後、５つの異なるミトコンドリア毒素を加えた。ロテノン、マロン酸、およびミソチアゾールを、SP-233の非存在下もしくは存在下で24時間培養した後、細胞生存率を測定した。KCNおよびオリゴマイシンの培養時間は6時間であった。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。SP-233処理していない培養細胞との有意差は* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001であらわす。
【図１２Ｄ】図１２は、SK-N-AS細胞におけるミトコンドリア複合体阻害剤に対するSP-233の神経保護効果を示す。SK-N-AS培養細胞に、SP-233もしくはその溶媒を加えた１時間後、５つの異なるミトコンドリア毒素を加えた。ロテノン、マロン酸、およびミソチアゾールを、SP-233の非存在下もしくは存在下で24時間培養した後、細胞生存率を測定した。KCNおよびオリゴマイシンの培養時間は6時間であった。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。SP-233処理していない培養細胞との有意差は* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001であらわす。
【図１２Ｅ】図１２は、SK-N-AS細胞におけるミトコンドリア複合体阻害剤に対するSP-233の神経保護効果を示す。SK-N-AS培養細胞に、SP-233もしくはその溶媒を加えた１時間後、５つの異なるミトコンドリア毒素を加えた。ロテノン、マロン酸、およびミソチアゾールを、SP-233の非存在下もしくは存在下で24時間培養した後、細胞生存率を測定した。KCNおよびオリゴマイシンの培養時間は6時間であった。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。SP-233処理していない培養細胞との有意差は* p<0.05、** p<0.01、*** p<0.001であらわす。
【図１３】図１３は、PAOに対するSK-N-AS細胞へのSP-233の神経保護効果を示す。SP-233もしくはその溶媒を加えた１時間後にPAOを培養細胞に加えた。培養細胞を、SP-233の非存在下もしくは存在下で、PAO内で24時間培養した後、細胞生存率を測定した。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。SP-233処理していない細胞との有意差は** p<0.01であらわす。
【図１４】図１４は、SK-N-AS細胞において、ミトコンドリア呼吸鎖のFCCP誘導脱共役にSP-233が与える影響を示す。SP-233もしくはその溶媒を加えた１時間後、SK-N-AS培養細胞にFCCPを加えた。培養細胞をSP-233の非存在下もしくは存在下で、FCCP内で２４時間培養した後、細胞生存率を測定した。結果は、三通りに実施された三つの個別の実験より、平均値±標準偏差であらわす。SP-233処理していない細胞との有意差は** p<0.01であらわす。
【図１５】図１５は、ミトコンドリアのSP-233ターゲット部位の概略図である。呼吸鎖におけるSP-233のターゲット要素は緑矢印で示される。点線矢印は弱い神経保護効果を示し、緑の塗りつぶし矢印は強い保護効果を示す。最も明白な効果は、複合体IVの阻害剤であるKCN、複合体Vの阻害剤であるオリゴマイシン、およびMPTのプロモーターであるPAOに対して観察された。
【図６Ａ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１２Ｅ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【国際調査報告】
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