(57)【要約】それによって不可逆的エレクトロポレーションパルスが標的組織の領域全体に生成される方法、及び該方法を生成するためのシステムが開示される。医療用画像化装置を使用して、不可逆的エレクトロポレーションの画像をリアルタイムで作成し、それによってエレクトロポレーションの領域及び得られる結果の範囲を決定することができ、かつ、調べた画像に基づいて、必要に応じて電極の配置及び/又は電流を調整することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下において使用するために製造された装置又はシステム：
標的組織領域を同定すること；
標的組織領域が第一の電極と第二の電極の間に位置するように、第一の電極及び第二の電極を配置すること；
第一の電極と第二の電極の間へ電流パルスを印加すること；ならびに
第一の電極と第二の電極の間の標的組織の領域の画像を作成すること。
【請求項２】
画像の作成が、超音波を用いて行われる、請求項1記載の装置又はシステム。
【請求項３】
約1マイクロ秒〜約62秒の範囲の時間、パルスが印加されるように設計された、請求項1記載の装置又はシステム。
【請求項４】
約100マイクロ秒±約10マイクロ秒の期間に複数のパルスが印加されるように設計された、請求項1記載の装置又はシステム。
【請求項５】
約1回〜約15回のパルスが印加されるように設計された、請求項2記載の装置又はシステム。
【請求項６】
持続時間がそれぞれ約100マイクロ秒のパルスが約8回印加されるように設計された、請求項2記載の装置又はシステム。
【請求項７】
パルスが、約50ボルト/cm〜約8000ボルト/cmの範囲の電圧勾配を生成するように設計された、請求項4記載の装置又はシステム。
【請求項８】
第一の電極が第二の電極から約5mm〜10cmの位置に配置されかつ第一及び第二の電極が作成された標的領域画像を用いて配置されるように設計された、請求項1記載の装置又はシステム。
【請求項９】
標的組織領域が腫瘍である使用のために部分的に適合化された、請求項1記載の装置又はシステム。
【請求項１０】
画像に基づく電流対電圧比の調整のために設計された構成要素をさらに含む、請求項1記載の装置又はシステム。
【請求項１１】
標的組織領域の周辺の組織への損傷をもたらすことなく標的組織領域における細胞の不可逆的エレクトロポレーションを得るために、第一の電極と第二の電極の間の電流パルスが十分な電圧、電流、期間、及び回数で印加されるように設計された、請求項1記載の装置又はシステム。
【請求項１２】
以下において使用するための装置又はシステム：
(a) 破壊のための標的として、組織の領域を同定すること；
(b) 該領域のエレクトロポレーションを得るために電流を印加すること；
(c) エレクトロポレーションの程度の指標として領域を画像化すること；
(d) 破壊の標的として同定された領域の不可逆的エレクトロポレーションを達成するために、画像化に従って所定の大きさの印加電圧を調整すること。
【請求項１３】
以下において使用するための装置又はシステム：
(a) 生存している哺乳動物の組織内の生物細胞の群を癌細胞と同定すること、及び、細胞全体へ電圧を印加すること；
(b) 生物細胞のエレクトロポレーションの程度の指標として細胞を画像化すること；ならびに、
(c) 癌細胞として同定された細胞の不可逆的エレクトロポレーションを達成するために、画像に従って所定の大きさの印加電圧を調整すること。
【請求項１４】
生物細胞のエレクトロポレーションの開始の指標を得るための連続的画像化のために、及び、連続的に得られた画像に従った印加電圧の持続時間の調整のために設計された、請求項13記載の装置又はシステム。
【請求項１５】
以下において使用するために製造された装置又はシステム：
(a) 標的組織領域を同定すること；
(b) 同定された標的組織の領域において組織内へモニタリング装置を配置すること；
(c) 同定された標的組織領域が電極の間に位置するような様式で電極を配置すること；
(d) 不可逆的エレクトロポレーションを引き起こすには不十分である試験電流を印加すること；
(e) 標的組織に対する及び遠隔位置における試験電流の影響をモニタリングすること；
(f) 不可逆的エレクトロポレーションを達成するのに必要な電流の量を決定するために、試験電流の量に基づいて外挿すること；ならびに
(g) 不可逆的エレクトロポレーションを得るために電流を印加すること。
【請求項１６】
モニタリング装置が高インピーダンス針である、請求項15記載の装置又はシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は組織のエレクトロポレーションの分野に関し、具体的には、エレクトロポレーションのモニタリング及び制御のためにリアルタイムで適用される医療用画像化技術の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
エレクトロポレーションは、特定の電気パルスへの曝露によって細胞膜を透過性にする現象として定義される(Weaver, J.C. and Y.A. Chizmadzhev, Theory of electroporation: a review. Bioelectrochem. Bioenerg., 1996. 41: p. 135-60)。膜の透過性は、使用される電気的パラメータに応じて、可逆的又は不可逆的であることができる。可逆的エレクトロポレーションにおいて、細胞膜は、パルスの停止から一定時間後に再封し(reseal)、細胞は生存する。不可逆的エレクトロポレーションにおいて、細胞膜は再封せず、細胞は溶解する(Dev, S.B., Rabussay, D.P., Widera, G., Hofmann, G.A., Medical applications of electroporation, IEEE Transactions of Plasma Science, Vol28 No 1, Feb 2000, pp 206-223)。
【０００３】
誘導された電場による細胞膜の絶縁破壊である不可逆的エレクトロポレーションは、1970年代初期に最初に認められた(Neumann, E. and K. Rosenheck, Permeability changes induced by electric impulses in vesicular membranes. J. Membrane Biol, 1972. 10: p. 279-290; Crowley, J.M., Electrical breakdown of biomolecular lipid membranes as an electromechanical instability. Biophysical Journal, 1973. 13: p. 711-724; Zimmermann, U., J. Vienken, and G. Pilwat, Dielectric breakdown of cell membranes,. Biophysical Journal, 1974. 14(11): p. 881-899)。膜を再封する能力を有する可逆的エレクトロポレーションは、1970年代後半に別途発見された(Kinosita Jr, K. and T. Y. Tsong, Hemolysis of human erythrocytes by a transient electric field. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1977. 74(5): p. 1923-1927; Baker, P.F. and D.E. Knight, Calcium-dependent exocytosis in bovine adrenal medullary cells with leaky plasma membranes. Nature, 1978. 276: p. 620-622; Gauger, B. and F.W. Bentrup, A Study of Dielectric Membrane Breakdown in the Fucus Egg,. J. Membrane Biol., 1979. 48(3): p. 249-264)。
【０００４】
エレクトロポレーションの機構は、まだ完全には理解されていない。電場が、細胞膜周囲の電気化学的ポテンシャルを変化させ、分極された細胞膜脂質二重層における不安定性を誘導すると考えられている。その後、不安定な膜は、その形状を変化させ、該膜を貫通するナノスケール細孔でありうる水路を形成し、したがってこれは「エレクトロポレーション」と称される(Chang, D.C., et al., Guide to Electroporation and Electrofusion. 1992, San Diego, CA: Academic Press, Inc.)。そして、電気化学的制御下で、これらのチャネルを介して物質移動が起こりうる。細胞膜が透過化されるまでの機構が何であったとしても、エレクトロポレーションは、細胞膜を介する物質移動の増強のための重要な方法となっている。
【０００５】
エレクトロポレーションの細胞膜透過化特性の第一の重要な適用は、Neumannによるものである(Neumann, E., et al., Gene transfer into mouse lyoma cells by electroporation in high electric fields. J. EMBO, 1982. 1: p. 841-5)。Neumannは、可逆的エレクトロポレーションを細胞へ適用することにより、通常は細胞に侵入するには大きすぎる巨大分子である遺伝子がエレクトロポレーション後に細胞へ侵入できるように、細胞膜を十分に透過化することが可能であることを示した。この手法の目標は該遺伝子を組み入れた生存細胞を得ることであるので、可逆的エレクトロポレーションの電気的パラメータを用いることは、この手法が成功する上で重要である。
【０００６】
この発見の後、蛍光色素、薬物及び放射性トレーサーなどの低分子から、抗体、酵素、核酸、HMWデキストラン及びDNAなどの高分子量分子まで、通常は細胞膜を通過しないか通過が困難である化学種を細胞へ導入又は細胞から抽出するための医療及びバイオテクノロジーにおける様々な用途に関して、細胞膜を可逆的に透過化するためにエレクトロポレーションが一般的に使用されるようになった。
【０００７】
体外の細胞に対する研究に続いて、可逆的エレクトロポレーションは、組織中の細胞を透過化するために使用され始めた。Heller, R., R. Gilbert, and M.J. Jaroszeski, Clinical applications of electrochemotherapy. Advanced drug delivery reviews, 1999. 35: p. 119-129。組織のエレクトロポレーションは現在、体内の特定領域の細胞への小型薬物及び巨大分子の導入のための最小侵襲外科技術として、次第に一般的になり始めている。この技術は、薬物又は巨大分子を罹患領域に注入し、標的組織の内部又はその周囲に電極を配置して、可逆的透過化用電場を組織中に生じさせることによって実現され、それにより、薬物又は巨大分子を罹患領域の細胞内へ導入する(Mir, L.M., Therapeutic perspectives of in vivo cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry, 2001. 53: p. 1-10)。
【０００８】
望ましくない組織を焼灼（ablate）するためのエレクトロポレーションの使用が、1987年にOkino及びMohriにより、ならびに1991年にMirらにより導入された。彼らは、癌細胞のアブレーション（ablation）においては非常に有効であるが細胞膜を貫通するのが困難である、ブレオマイシン及びシスプラチンなどの癌治療のための薬物が存在することを認識した。さらに、ブレオマイシンなどのいくつかのこれらの薬物は、再生しない正常細胞に影響を及ぼすことなく、再生する癌性細胞へ選択的に影響を及ぼす能力を有する。Okino及びMori、ならびにMirらは、電気パルスと不透過性抗癌剤の併用によって、その薬物による治療の効果が大幅に増大することを、個別に発見した(Okino, M. and H. Mohri, Effects of a high-voltage electrical impulse and an anticancer drug on in vivo growing tumors. Japanese Journal of Cancer Research, 1987. 78(12): p. 1319-21; Mir, L.M., et al., Electrochemotherapy potentiation ofantitumour effect of bleomycin by local electric pulses. European Journal of Cancer, 1991. 27: p. 68-72)。Mirらはすぐに、有望な結果を示した臨床試験に従い、治療用の電気化学療法を作成した(Mir, L.M., et al., Electrochemotherapy, a novel antitumor treatment: first clinical trial. C. R. Acad. Sci., 1991. Ser. III 313(613-8))。
【０００９】
現在、エレクトロポレーションの主要な治療的インビボ用途は、細胞毒性非透過性薬物を透過化電気パルスと組み合わせた抗腫瘍電気化学療法(ECT)、及び、非ウイルス性遺伝子療法の形としての電気遺伝子療法(EGT)、及び、経皮的薬物送達である(Mir, L.M., Therapeutic perspectives of in vivo cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry, 2001. 53: p. 1-10)。最近、電気化学療法及び電気遺伝子療法に関する研究が、いくつかの刊行物において要約されている(Jaroszeski, M.J., et al., In vivo gene delivery by electroporation. Advanced applications of electrochemistry, 1999. 35: p. 131-137; Heller, R., R. Gilbert, and M.J. Jaroszeski, Clinical applications of electrochemotherapy. Advanced drug delivery reviews, 1999. 35: p. 119-129; Mir, L.M., Therapeutic perspectives of in vivo cell electropermeabilization. Bioelectrochemistry, 2001. 53: p. 1-10; Davalos, R.V., Real Time Imaging for Molecular Medicine through electrical Impedance Tomography of Electroporation, in Mechanical Engineering. 2002, University of California at Berkeley: Berkeley, p. 237)。最近の記事は、5箇所の癌研究センターにおいて実施された臨床試験の結果をまとめたものであった。合計291の腫瘍について、基底細胞癌、悪性メラノーマ、腺癌、及び頭頸部扁平細胞癌が治療された(Mir, L.M., et al., Effective treatment of cutaneous and subcutaneous malignant tumours by electrochemotherapy. British Journal of Cancer, 1998. 77(12): p. 2336-2342)。
【００１０】
電気化学療法は、組織を局所的に焼灼し、かつ、その組織学的型に関わりなく最小の副作用及び高い反応率で腫瘍を処置するための、有望な最小侵襲外科技術である(Dev, S.B., et al., Medical Applications of Electroporation. IEEE Transactions on Plasma Science, 2000. 28(1): p. 206-223; Heller, R., R. Gilbert, and M.J. Jaroszeski, Clinical applications of electrochemotherapy. Advanced drug delivery reviews, 1999. 35: p. 119-129)。望ましくない組織への電極の挿入、組織への細胞毒性薬物の注入、及び可逆的エレクトロポレーションパラメータの適用を通して実行される電気化学療法は、高温処置療法及び非選択的化学療法の両方の適用の容易さから恩恵を受け、かつ、高温処置療法及び非選択的化学療法の両方に匹敵する成果をもたらす。
【００１１】
細胞における不可逆的エレクトロポレーションを誘発する電気パルスの印加である不可逆的エレクトロポレーションも、組織アブレーションを考慮したものである(Davalos, R.V., Real Time Imaging for Molecular Medicine through electrical Impedance Tomography of Electroporation, in Mechanical Engineering. 2002, PhD Thesis, University of California at Berkeley: Berkeley, Davalos, R., L. Mir, Rubinsky B., "Tissue ablation with irreversible electroporation" in print Feb 2005 Annals of Biomedical Eng)。不可逆的エレクトロポレーションは、適切かつ重要な最小侵襲外科技術の可能性を有する。しかし、身体の外側表面又は外側表面近傍とは対照的に、体内深くで使用された場合、これは、綿密にモニタリング及び制御することができないという、体内深くで起こる全ての最小侵襲外科技術に典型的な欠点を有する。不可逆的エレクトロポレーションを組織アブレーションにおける日常的技術にするためには、速やかなフィードバックにより制御可能でなければならない。これは、周りの組織に影響を与えることなく標的化領域が適切に処置されていることを保証するために必要である。本発明は、医療用画像法の形で、この問題に対する解決策を提供するものである。
【００１２】
Onik及びRubinskyのグループによって1980年代初期に導入されて以来、医療用画像法は、最小かつ非侵襲的な手術の必須の局面となっている(G. Onik, C. Cooper, H.I. Goldenberg, A. A. Moss, B. Rubinsky, and M. Christianson, "Ultrasonic Characteristics of Frozen Liver," Cryobiology, 21, pp. 321-328, 1984, J.C. Gilbert, G.M. Onik, W. Haddick, and B. Rubinsky, "The Use of Ultrasound Imaging for Monitoring Cryosurgery," Proceedings 6th Annual Conference, IEEE Engineering in Medicine and Biology, 107-112, 1984 G. Onik, J. Gilbert, W.K. Haddick, R.A. Filly, P. W. Collen, B. Rubinsky, and L. Farrel, "Sonographic Monitoring of Hepatic Cryosurgery, Experimental Animal Model," American J. of Roentgenology, May 1985, pp.1043-1047)。医療用画像法は、組織の様々な物理的特性のマップの生成を伴うが、これは、画像化技術が分布を作成するために使用される。例えば、X線の使用においては様々な組織のX線吸収特性のマップが生成され、超音波においては組織の圧力波反射特性のマップが生成され、核磁気共鳴画像法においてはプロトン密度のマップが生成され、光画像法においては組織の光子散乱マップ又は吸収特性マップのいずれかが生成され、電気インピーダンストモグラフィー又は誘導インピーダンストモグラフィー又はマイクロ波トモグラフィーにおいては、電気インピーダンスのマップが生成される。
【００１３】
最小侵襲手術は、最小侵襲手段による組織内の望ましい変化の発生を伴う。最小侵襲手術はしばしば、様々な手段による特定の望ましくない組織のアブレーションに使用される。例えば、凍結手術においては望ましくない組織を凍結させ、超音波、電気、マイクロ波の焦点を合わせた放射性周波数アブレーションにおいては高熱療法組織を加熱し、アルコールアブレーションにおいてはタンパク質を変性させ、レーザーアブレーションにおいては光子を送達して電子のエネルギーを増大させる。画像法によって最小侵襲手術の効果を検出及びモニタリングするためには、画像化技術がモニタリングする物理的特性に変化が生成されなければならない。
【００１４】
本発明者らの最近の試験までは、組織における不可逆的エレクトロポレーションの主要な効果とは、細胞膜における可逆的又は不可逆的なナノスケールの孔の生成であると考えられていた。これらの変化はナノスケールであり、したがって、超音波、CT、MRI、光などの従来の画像化技術が違いを区別できないスケールである。細胞膜におけるナノポア（nanopore）の形成は、細胞の電気インピーダンス特性を変化させる効果を有する(Huang, Y, Rubinsky, B., "Micro-electroporation: improving the efficiency and understanding of electrical permeabilization of cells" Biomedical Microdevices, Vo 3, 145-150, 2000. (Discussed in "Nature Biotechnology" Vol 18. pp 368, April 2000), B. Rubinsky, Y Huang. "Controlled electroporation and mass transfer across cell membranes US patent #6300108, Oct 9, 2001)。
【００１５】
その後、組織の電気特性をマッピングする画像化技術である、電気インピーダンストモグラフィーが開発された。この概念は、実験的研究及び分析的研究によって証明された(Davalos, R.V., Rubinsky, B., Otten, D.M., "A feasibility study for electrical impedance tomography as a means to monitor tissue electroporation in molecular medicine" IEEE Trans of Biomedical Engineering. Vol. 49, No. 4 pp 400-404, 2002, B. Rubinsky, Y. Huang. "Electrical Impedance Tomography to control electroporation" US patent #6,387,671, May 14, 2002)。
【発明の開示】
【００１６】
発明の概要
不可逆的エレクトロポレーションパルスは、従来の医療用超音波上で、瞬時に明確な画像を生成する。この明確な画像は、分析的に予想される範囲の組織エレクトロポレーションに、及びその後の、エレクトロポレーションパルスによる組織アブレーションの組織学的測定に、十分に一致する。ここで本発明を、ブタ肝臓において市販の超音波を用いる分析的研究及び実験的研究によって説明する。従来の超音波を用いて、不可逆的エレクトロポレーションによる制御された処置計画をモニタリング及び開発することができることを、本発明は示す。さらに、本発明は、電気パルスの印加の結果として、エレクトロポレーションされた組織の画像化特性の変化がほとんど瞬間的（コンマ何分以内）であると思われることを示す。これによって、エレクトロポレーション及び組織に対するその効果のリアルタイムモニタリングが可能になる。不可逆的エレクトロポレーションと共に用いる場合、MRI、CT、又は光画像法などのその他の従来の画像化技術によって同様の画像を生成することが可能である。
【００１７】
本発明の局面は、パルス印加後に瞬間的に開始される、エレクトロポレーションされた組織の範囲のリアルタイム画像を生成するために、医療用超音波と共に従来の画像法を使用する。
【００１８】
本発明の別の局面とは、制御された組織アブレーション法であり、それによって、1つ又は複数の医療用画像化技術を用いて不可逆的エレクトロポレーションをリアルタイムでモニタリング及び制御する。
【００１９】
本発明の別の局面は、高インポテンス針及び/又は熱共役装置（thermal couple device）などの他の種類のモニタリング装置を組織内に設置すること、ならびに、単独で又は本明細書に記載の画像化技術と組み合わせて行われうるモニタリングを、エレクトロポレーションの前、間、及び/又は後に行うことを含む。
【００２０】
本発明の更に別の局面において、不可逆的エレクトロポレーションを得るためには不十分である試験電流パルスが印加され、該試験パルスの間にモニタリングが行われ、かつ、所望の範囲のエレクトロポレーションを得て標的組織における不可逆的エレクトロポレーションを得るための電圧、電流、及び持続時間を決定するために、測定値が外挿される。
【００２１】
本発明の更に別の局面とは、それによって、腫瘍などの特定の種類及び領域の組織を、超音波などの画像法を通じてリアルタイムで見ながら、エレクトロポレーションを通じて焼灼することができる方法である。
【００２２】
本発明のこれら及びその他の局面は、本開示を読むことにより、当業者には明らかであると考えられる。
【００２３】
発明の詳細な説明
本発明の方法、処置、及び装置を説明する前に、本発明は、説明される特定の態様に限定されず、よって当然変動し得ることが、理解されなければならない。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるので、本明細書において使用される用語は特定の態様の説明のみを目的としており、限定を意図しないことも、理解されなければならない。
【００２４】
値の範囲が提供される場合、文脈により別に明確に示されない限りは、その範囲の上限と下限の間における、下限の単位の1/10までの各介在値も、具体的に明らかにされていると理解される。任意の言及された値又は言及された範囲の介在値と、その言及された範囲における任意の他の言及された値又は介在値との間の、さらに小さな範囲の各々は、本発明に包含される。これらのより小さな範囲の上限及び下限は、独立してその範囲に含まれても除外されてもよく、かついずれかの限界値もしくは両方の限界値がこのより小さな範囲に含まれる場合の各範囲、又はどちらの限界値もこのより小さな範囲に含まれない場合の各範囲も、言及された範囲における任意の特に除外する限界に従い、本発明に包含される。言及された範囲がこれらの限界値の一方又は両方を含む場合、これらの限界値のいずれか又は両方を除外する範囲も本発明に含まれる。
【００２５】
特に定義されない限りは、本明細書において使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に通常理解されるものと同じ意味を有する。本発明の実施又は検証においては、本明細書に記載のものと類似又は同等のあらゆる方法及び物質が使用可能であるが、以下に好ましい方法及び物質を説明する。本明細書において言及された全ての刊行物は、該刊行物が関連して引用された方法及び／又は材料を開示及び説明するために、本明細書に参照として組入れられている。本開示は、任意の組込まれた刊行物と重複する程度まで制限している。
【００２６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用される、単数形「1つの（a）」「1つの（an）」及び「その（the）」は、文脈により別に明確に示されない限りは、複数の意味を含むことに留意されたい。従って例えば、「1つの（a）パルス」への言及は、複数のそのようなパルスを含み、「その（the）試料」への言及は、1つ又は複数の試料及び当業者に公知のその同等物などへの言及を含む。
【００２７】
本明細書において考察された刊行物は、本出願の出願日以前の開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなる記載も、本発明が先行発明によりそのような公開に先行する権利を有さないことの承認として解釈されるべきでない。さらに、提供された公開日は、実際の公開の日付と異なることがあり、これは個別に確認する必要がありうる。
【００２８】
定義
「可逆的エレクトロポレーション」という用語は、細胞全体にわたる電気パルスの印加を介した細胞膜の透過化を包含する。「可逆的エレクトロポレーション」において、細胞膜の透過化はパルスの印加後に途絶え、細胞膜透過性は、正常に又は少なくとも該細胞が生存可能なレベルまで戻る。したがって、細胞は「可逆的エレクトロポレーション」を生き延びる。これは、化学物質、DNA、又は他の物質を細胞へ導入する手段として使用されうる。
【００２９】
「不可逆的エレクトロポレーション」という用語も、細胞全体にわたる電気パルスの印加を介した細胞膜の透過化を包含する。しかし「不可逆的エレクトロポレーション」において、細胞膜の透過化はパルスの印加後に途絶えず、細胞膜透過性は正常に戻らず、よって細胞は生存可能ではない。したがって、細胞は「不可逆的エレクトロポレーション」を生き延びず、単に細胞成分の内部混乱によるだけではなく細胞膜の破壊によって、細胞死が引き起こされる。細胞膜に開口部が作製され、かつ／又はサイズが拡大されることによって、細胞膜を介する正常に制御された物質の流れの、致命的破壊がもたらされる。細胞膜は、細胞に残存するものと侵入するものを調節する能力において高度に特殊化されている。不可逆的エレクトロポレーションは、細胞が相殺できないような様式でその調節能力を破壊し、よって細胞は死滅する。
【００３０】
「超音波」とは、組織の画像化のために使用される方法であり、ここで、圧力波は圧電結晶を用いて組織内に送られる。組織反射によってもたらされる、結果として戻ってくる波は、画像に変換される。
【００３１】
「MRI」とは、放射線パルスにより引き起こされる水素分子の乱れを用いて画像を作成する画像化様式である。
【００３２】
「CT」とは、X線ビームの減衰を用いて画像を作成する画像化様式である。
【００３３】
「光画像法」とは、可視〜遠赤外の範囲の周波数の電磁波を組織に送って、組織の反射及び/又は吸収特性を再構築する、画像法である。
【００３４】
「電気インピーダンストモグラフィー」とは、組織全体にわたる電流の印加によって、ならびに、電流及び電位の測定によって、組織の電気インピーダンス特性が再構築される、画像化技術である。
【００３５】
発明全般
本発明によると、エレクトロポレーションパルスの影響を受ける組織の画像を作成するために、医薬分野で使用される特定の画像化技術が使用される。不可逆的エレクトロポレーションの実行プロセスの間に画像が作成されて、焼灼されるべき腫瘍などの組織にエレクトロポレーションの焦点を合わせるため、及び、神経などの組織の焼灼を回避するために使用される。本発明のプロセスは、画像化装置の画像化パス内に針電極などの電極を設置することによって行われうる。電極がONになると、画像装置は、エレクトロポレーションに供されている組織の画像を作成する。所与の領域の組織にわたるエレクトロポレーションの効果及び範囲は、画像技術を用いてリアルタイムで決定することができる。
【００３６】
可逆的エレクトロポレーションには、可逆的エレクトロポレーションのみを誘導する値の正確な範囲内の電気的パラメータが必要である。可逆的エレクトロポレーション装置を設計する時に、（エレクトロポレーションの開始と可逆的エレクトロポレーションの開始の間の）この正確かつ比較的狭い範囲の値を達成するために、これらは、2つ一組で、又は、特定の上方値及び下方値で制限されたこれらの正確なパルスの送達を可能にする正確に制御された構成で、通常は動作するように設計される。対照的に、不可逆的エレクトロポレーションにおいて、限界値はパルスの下方値により焦点が合わされ、これは、不可逆的エレクトロポレーションを誘発するために十分に高い。やけどを誘発しないという条件で、より高い値を用いることができる。したがって設計原理は、どれほど多くの電極が使用されていても、最も遠く離れた電極間の電気パラメータが少なくとも不可逆的エレクトロポレーションの値であるということにしか束縛されない、というようなものである。エレクトロポレーションされた領域内及び電極内により高い勾配がある場合、これはプローブの有効性を減少させない。これらの原理から、本発明者らは、接地電極によって該領域を取り囲み、かつ中央電極から電気パルスを与えることによって、焼灼されるべき任意の不規則な領域を処置できるという、非常に有効な設計を使用することができる。処置領域の周囲の接地電極の使用は、別の潜在的価値も有する；すなわちこれによって、処置が意図される領域の外側の組織が電流から保護されるが、このことは重要な安全性の指標である。原理上は、組織の領域を迷走電流からさらに保護するために、焼灼されるべき領域の周囲に二層の接地電極を配置することができると考えられる。概略的に、この設計は図1の断面図に示された形を取っている。電極は、無限に長くてよく、かつ、焼灼されるべき望ましくない領域により良好に沿った曲線でもよいことが、強調されるべきである。
【００３７】
それによって電気パルスが組織に印加される方法が、開示されている。電極間にパルスが印加され、これは、周辺の細胞を損傷することなく細胞の不可逆的エレクトロポレーションをもたらすように、電流と共に大量に印加される。エネルギー波は、電極間に位置する領域を画像化装置のエネルギー波が通過するように画像化装置から放射され、細胞の不可逆的エレクトロポレーションは、画像を作成するような様式で画像化装置のエネルギー波に作用する。
【００３８】
不可逆的エレクトロポレーションのパルス長の代表値は、約5マイクロ秒〜約62,000ミリ秒、又は約75マイクロ秒〜約20,000ミリ秒、又は約100マイクロ秒±10マイクロ秒の範囲内である。これは、細胞内（ナノ秒）電気的操作において一般に使用されるパルス長である1マイクロ秒以下よりも有意に長い−2002年1月24日に公開された米国特許出願第2002/0010491号を参照。パルス長は、リアルタイム画像法に基づいて調整することができる。
【００３９】
不可逆的エレクトロポレーションの場合、パルスの電圧は、約100V/cm〜7,000V/cm、又は200V/cm〜2000V/cm、又は300V/cm〜1000V/cm、又は約600V/cm±10％である。これは、細胞内電気操作において使用される約10,000V/cmよりも実質的に低い。2002年1月24日に公開された米国特許出願第2002/0010491号参照のこと。電圧は、単独で、又はパルス長と共に、リアルタイム画像法に基づいて調整することができる。
【００４０】
上記した電圧は、電圧勾配（cm当たりの電圧）である。電極は、形及びサイズが異なってよく、かつ互いに異なる距離に位置してよい。その形状は、円形、楕円形、正方形、長方形又は不規則な形などであってよい。電極の一方から他方までの距離は、0.5〜10cm、1〜5cm、又は2〜3cmであってよい。電極は、0.1〜5平方cm又は1〜2平方cmの表面積を有してよい。
【００４１】
電極のサイズ、形状及び距離を変動させることができ、そのため、使用される電圧及びパルス持続時間を変更することができかつ画像化情報に基づいて調整することができる。当業者は、望ましい範囲のエレクトロポレーションを得るため及び画像内で認められる周囲の細胞への熱損傷を避けるために、本開示及び画像法に従ってこれらのパラメータを調整すると考えられる。
【００４２】
熱作用には、不可逆的エレクトロポレーションにおいて使用されるものよりも実質的に長い電気パルスが必要である(Davalos, R.V., B. Rubinsky, and L.M. Mir, Theoretical analysis of the thermal effects during in vivo tissue electroporation. Bioelectrochemistry, 2003. Vol 61(1-2): p. 99-107)。組織アブレーションのために不可逆的エレクトロポレーションを使用する場合、不可逆的エレクトロポレーションパルスが周囲の組織への熱損傷作用を引き起こすくらい大きくなり、かつ不可逆的エレクトロポレーションにより焼灼される組織の範囲が、熱作用により焼灼される範囲に対して有意でなくなるという懸念が存在しうる。そのような状況下では、不可逆的エレクトロポレーションは熱アブレーションと重なりあって作用するので、これを有効な組織アブレーション様式と見なすことはできない。この問題は、ある程度は、画像化技術を用いる本発明によって対処されている。
【００４３】
本発明の1つの局面において、画像化装置は、超音波、X線技術、核磁気共鳴画像法（MRI）、光画像法、電気インピーダンストモグラフィー、電気誘導インピーダンストモグラフィー、及びマイクロ波トモグラフィーを含む、任意の医療用画像化装置である。本プロセスにおいて、異なる時点で異なる画像化技術を組み合わせて使用することが可能である。例えば、正確に腫瘍の位置を特定するためにあるタイプの画像化技術を使用し、腫瘍に対する電極の位置を確認するために別のタイプの画像化技術を使用することができる。また、リアルタイムで不可逆的エレクトロポレーションの電流の画像を作成するために、更に別のタイプの画像化技術を使用することができる。したがって、例えば、正確に腫瘍の位置を特定するためにMRI技術を用いることができる。X線画像化技術を用いて、電極を配置し、良好に配置されていると同定することができる。エレクトロポレーションパルスの影響を受ける組織の範囲を決定するために超音波技術を使用しながら、不可逆的エレクトロポレーションを行うために電流を印加することができる。計算値及び画像法の解決の範囲内で、超音波によって作成された画像の範囲は、不可逆的エレクトロポレーションされたと算出された領域に相当することが見出されている。組織学の解決の範囲内で、超音波画像によって作成された画像は、組織学的に実験された焼灼組織の範囲と一致する。
【００４４】
不可逆的エレクトロポレーションの有効性が画像法によって即座に確認可能であるので、周辺組織への望ましくない損傷の量を制限すること及び実施されるエレクトロポレーションの量を制限することが可能である。さらに、画像化技術を用いることによって、プロセスの間に電極の位置を変えることが可能である。電極の位置変えは、腫瘍などの所望の組織における不可逆的エレクトロポレーションの望ましい程度を得るために必要に応じて一回、二回、又は複数回行ってもよい。
【００４５】
本発明にしたがって、複数の段階を有する方法を行うことができる。第一の段階において、不可逆的エレクトロポレーションによって処置されるべき組織の領域を画像化する。次に、焼灼されるべき組織が電極の間に位置するように、電極を組織内に配置する。電極が正しく配置されたかを確認するためにこの時点で画像法を行うこともでき、所望の位置での配置を確実にするために、配置の前、間、及び/又は後に画像法を使用してもよい。電極を正しく配置した後、2つの電極間に電流のパルスを流し、周辺組織への損傷を最小限にしかつ腫瘍などの標的組織の望ましい不可逆的エレクトロポレーションを達成するように、パルス電流を設計する。不可逆的エレクトロポレーションが行われる間に画像化技術が使用され、該画像化技術によって、リアルタイムで生じる不可逆的エレクトロポレーションが画像化される。この実行中に、電流の量及びパルスの数を、所望の程度のエレクトロポレーションが達成されるように調整することができる。さらに、不可逆的エレクトロポレーションを標的化して望ましい標的組織を焼灼できるように、1つ又は複数の電極の位置を変えることができる。
【００４６】
上述のように、多様な画像化装置を用いて本発明を行うことができる。以下の例によって超音波技術の使用が明記されているが、CT、MRI、又は光などの技術を用いて動作する、その他従来の医療用画像化装置又はその他新規に開発された医療用画像化装置を使用することができる。これらの技術のいずれも、単独で又は別の画像化技術と併用して使用することができる。さらに、それ自体で望ましい結果を得るために本発明にしたがってこれらの画像化技術を使用することができる。本発明の別の局面において、他のモニタリング装置と組み合わせてこれらの技術を用いることができる。代替的に、熱電対又は高インピーダンス針の使用などのそのような他のモニタリング装置を用いて、更に後述する方法論に従い、標的組織の領域をモニタリングすることができる。
【００４７】
熱アブレーション法、特に凍結手術は、（組織の望ましくない凍結を予防することによって）合併症を予防するため、及び、（組織破壊を確実にする既知の標的温度に到達することによって）アブレーションの妥当性を確認するために、重大な領域において組織内部に配置された熱電対の測定値を頼りにすることが多い。アブレーションが続くようなゆっくりした性質によって、遠隔熱電対によるモニタリングが可能になり、これは、熱電対からのフィードバックに基づく焼灼プロセスの修正を可能にする。
【００４８】
不可逆的エレクトロポレーションは、それが起こる速度のために、固有の欠点を有する。計画されるアブレーションの予想モデルは理想的には正確であるが、組織における均一性の違い及び針の配置を考慮に入れていない。このアブレーション速度のために、合併症を予防するため及び重大な位置における組織破壊の妥当性を推定するためのアブレーションプロセスの修正は、完全アブレーションの前には不可能である。
【００４９】
本発明の別の局面によると、（モニタリング針への優先的な電流の流れを防止するための）高インピーダンス針モニタリング装置は、所望の位置において組織内に配置される（熱モニタリングにおいて熱電対が配置される場合と、概念及び配置が類似）。完全エレクトロポレーションパルスが送達される前に、「試験パルス」を送達するが、このパルスは、提唱される完全エレクトロポレーションパルスのほんの何分の一である。この試験パルスは、不可逆的エレクトロポレーションを引き起こさない範囲内である。モニタリング電極は、遠隔位置において試験電圧を測定する。次に、測定された電圧を、完全パルスの間にモニタリング電極によってみられるであろう電圧に外挿する（比例関係であるので、試験パルスが完全パルスの10％である場合は10をかける）。その位置における潜在的な合併症をモニタリングする場合、既知のレベルの不可逆的エレクトロポレーションに該当する電圧外挿によって、モニタリングを行っている部位が安全であることが示される。該位置においてエレクトロポレーションの妥当性をモニタリングする場合、外挿は、不可逆的組織エレクトロポレーションに適した既知レベルの電圧を上回らなければならない。
【００５０】
上記に基づくと、本発明の1つの局面は以下を含むと考えられる：(a) 標的組織領域の同定；(b) 同定された標的組織の領域中の組織内への、高インピーダンス針などのモニタリング装置の配置；(c) 同定された標的組織領域が電極の間に配置されるような様式での電極の配置；(d) 不可逆的エレクトロポレーションを引き起こすのには不十分な、試験電流の印加；(e) 遠隔位置における試験電流のモニタリング；(f) 不可逆的エレクトロポレーションを達成するのに必要な電流の量を決定するための、試験電流の量に基づく外挿；及び(g) 不可逆的エレクトロポレーションが得られるような電流の印加。
【００５１】
本方法によると、試験電流は、不可逆的エレクトロポレーションを得るのに必要な電流のほんの何分の一である。当業者は必要に応じて試験電流を調整する。例えば、試験電流は、完全電流を2以上の整数で割ったものであることができる。したがって、試験電流が、不可逆的エレクトロポレーションを得るために必要な完全電流の1/10であるように、整数が10であることができる。比例関係があるということなので、次に、外挿によって、完全パルスに必要な電流の量を、試験電流の10倍と決定することができる。
【００５２】
実施例
下記実施例は、本発明をいかに実施し使用するかの完全な開示及び説明を当業者に提供するために示されており、本発明者らが自身の発明とみなす範囲を限定することを意図するものでもなければ、下記実験が実施された実験の全てであるもしくは唯一の実験であると表すことを本発明者らが意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関する正確さを保証するように努力がなされているが、いくらかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別に記さない限りは、パーセントは重量パーセントであり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧又はその近傍である。
【００５３】
実施例1
分析的構成要素を用いて、ブタ肝臓において実験的研究を実施する。本試験を、21CFR Part 58に記載されたように、Good Laboratory Practice regulationsに従って行った。非臨床GLP文書を必要とする連邦政府及び/又はその他の機関への提出要件を満たす本試験について、完全QA監視（full QA oversight）、GLP文書、及びGLP報告が提供された。本試験は、Covance Research Products, Berkeley CAで実施された。
【００５４】
100 lbのブタ5頭を、本試験において用いた。典型的な手順において、一般的な麻酔法によってブタを麻酔した。開口開腹切開（open laparotomy incision）によって肝臓を露出させた。超音波モニタリング下で、2〜9本の電極針を肝臓の望ましい位置に導入した。対応する電位、医療用画像法、治療計画、及び組織アブレーションを目的とした様々な針の構成配置及びエレクトロポレーション電位を用いて、約20回の異なる実験を使用した。本明細書記載のエレクトロポレーションの例では、全試験の例となる4本針の構成を使用した。この特定の実験において、4本の1mm針を1.5cm四方の構成で配置した。固定関係で針を保持する鋳型を用いて、超音波モニタリング下で針を配置した。2.5kVの電気パルスを、各2本の隣接する針の間に、連続して1Hzで100ミリ秒間8回印加し、合計で4回適用した。パルスの印加からコンマ何分以内に、エレクトロポレーションされた領域が超音波で画像化された。
【００５５】
エレクトロポレーション直後、及び10分後に作成された画像を、図1に示す。エレクトロポレーションされていない周囲の肝臓と比較すると、画像は低エコー性であるように見える。低エコー領域内に、4つの高エコー性断続領域（hyperechoic punctuate area）が見られるが、これらはエレクトロポレーション針の位置を示すものである。興味深いことに、その後の1時間の間に、低エコー領域は徐々に高エコー性になり、1日後まで、エレクトロポレーションされていない肝臓に対して、病変は均一に高エコー性である。
【００５６】
図2は、エレクトロポレーションされた肝臓における、計算された電気的勾配を示す。エレクトロポレーションパルスによって改変された組織の画像が、不可逆的エレクトロポレーション勾配の範囲にほぼ対応していることが、超音波との比較によって示される。
【００５７】
同様に、図3は、エレクトロポレーションされた領域の組織学的肉眼的切片を示す。これは、エレクトロポレーションの超音波画像に十分に対応する。
【００５８】
不可逆的エレクトロポレーションのためのプローブの仕様
肝臓の後側右葉への深い複合アプローチにまで到達するのに必要な深度に及ぶ長さを有する必要性、及び、放射線科医が経皮的に設置するのに心理学的に許容可能である一方で不適切な場所に設置しても損傷の機会を最小限にするような直径を提供する必要性によって、IREプローブの仕様が決定される。さらに、プローブは、CTスキャナ内で使用可能なように構成されており、かつ最後に、停止されている止血薬の注射を収容するように設計されている。
【００５９】
プローブの仕様
1) プローブ幅 - 18ゲージ以下
2) アクティブプローブ長 - 15cm
3) 配置 - プローブに対して直角のケーブル
4) Leurロックハブを備えた、着脱可能な中央ダイヤモンドの尖頭部を有するトロカール
5) 可変長の絶縁体
【００６０】
プローブの骨格は、本質的には、様々な販売元より購入される約17cm長の18ゲージ針であることができる。可能性のある問題とは、プローブの遠位端における絶縁体とのインターフェースである。組織を通過してプローブを配置する際の困難を予防するために遷移は非常に滑らかでなければならない。
【００６１】
前記は、本発明の原理を単に例証するものである。本明細書には明確に説明されたり示されたりしていないが、本発明の原理を具体化しかつその意図及び範囲に含まれるような様々な変更が考案できることが、当業者には理解されると考えられる。さらに本明細書に引用された全ての実施例及び条件の表記は、本発明の原理及び当技術分野を促進するように本発明者らによりもたらされた概念の読者の理解を補助することが原則的に意図されており、かつそのような特に引用された実施例及び条件に限定されないとみなされるべきである。さらに本発明の原理、局面及び態様ならびにそれらの具体例を引用する全ての表明は、それらの構造的及び機能的の両方の同等物を包含することが意図されている。加えて、そのような同等物は、現在公知の同等物及び今後開発される同等物の両方を、すなわち構造に関わりなく同じ機能を実現する開発されたあらゆる要素を含むことが意図されている。従って本発明の範囲は、本明細書に示されかつ説明された例示的態様に限定されることは意図されない。むしろ本発明の範囲及び趣旨は、添付の特許請求の範囲により具体化される。
【図面の簡単な説明】
【００６２】
添付の図面と組合わせて詳細な説明を読むことによって、本発明は最も良好に理解される。一般的慣行に従い、図面の様々な特徴は一律の縮尺には従っていないことが強調される。対照的に、様々な特徴の寸法は、明確にするため任意に拡大縮小される。図面に含まれるのは以下の図である。
【図１】組織内部の腫瘍のエレクトロポレーション用に配置された電極の概略図である。
【図２】腫瘍アブレーションの際に神経損傷を制限するためにどのように電極を配置するかの概略図である。
【図３】不可逆的エレクトロポレーションされた肝臓組織を示す4枚の超音波画像A、B、C、及びDを含む。
【図４】エレクトロポレーションされた組織における、計算された電場の概略図を示す。
【図５】エレクトロポレーションされた組織の肉眼的画像の4枚の組織学的画像A、B、C、及びDを示す。
【図６】電極の概略図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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