(57)【要約】  本明細書中には、1又は複数の治療剤との組み合わせにおける約50kD 〜約200kD分子量を有する化学可溶性分岐多糖類を示す。そしてまた、悪性がんを治療及び予防するために少なくとも1つの抗がん薬との組み合わせにおいて当該多糖類を使用する方法を開示する。更に、血管新生を治療及び予防するために当該組成物使用するための方法が開示されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多糖類と化学治療剤の組み合わせを含んで成る医薬組成物であって、当該多糖類は、複数の反復する炭水化物単位を有する骨格を有し、ここで、各反復単位は、少なくとも1つの酸性及び少なくとも1つの天然炭水化物を有し、ここで当該骨格は、それらに依存する少なくとも1つの分岐する側鎖を有する医薬組成物。
【請求項２】
前記多糖類は、約50kDa〜約200kDaの分子量を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記骨格が20の酸性炭水化物ごとに1つの天然の炭水化物を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記天然の炭水化物がラムノースである、請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記酸性炭水化物がウロン酸である、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ウロン酸がガラクツロン酸である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ウロン酸がカルボン酸成分を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記カルボン酸成分が、アルキル化されているかあるいはエステル化されている、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記カルボン酸成分が、メチル、アセチル、デシル、ベンジルなどから選択される、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記分岐側鎖が天然炭水化物を介して前記骨格へ連結している、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記多糖類が更に、1又は複数の疎水性炭水化物成分を含んで成る、請求項１に記載の組成物。
【請求項１２】
前記多糖類が、ポリガラクツロン酸及びラムノース骨格を含んで成り、ここで少なくとも1つの分岐する側鎖は少なくとも1つのラムノースに依存する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
前記化学治療剤が、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、BCG、ビカルタミド、ブレオマイシン、ブセレリン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シクロフォスファミド、シプロテロン、シタラビン、デカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フィルグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマタニブ、インターフェロンα、イリノテカン、レトロゾール、ルーコボリン、ループロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトタン、マイトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトルキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモシキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トラスツマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンなどからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記分岐する側鎖は第二の側鎖を有する請求項１に記載の組成物。
【請求項１５】
前記分岐する側鎖が、ガラクトース、グルコース、アラビノース、及びその誘導体からなる群から選択される炭水化物で終わる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１６】
前記骨格が実質上、脱エステル化されている、請求項１に記載の組成物。
【請求項１７】
前記骨格が脱エステル化されて約1%未満になる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記骨格が脱エステル化されて約0.5%未満になる、請求項１に記載の組成物。
【請求項１９】
前記骨格が脱エステル化されて約0.25%未満になる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記骨格が脱エステル化されて約0.1%未満になる、請求項１に記載の組成物。
【請求項２１】
更に、第二の枝を含んで成り、ここで当該第二の枝は疎水性環境を生み出す、請求項１に記載の組成物。
【請求項２２】
前記多糖類が、ガレクチンレセプターへ結合する、請求項１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ガレクチンレセプターがガレクチン-3である、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
対象者におけるがんを治療する方法であって、有効な量の医薬組成物をそれを必要とする対象者へ投与することを含んで成り、ここで当該医薬組成物は、多糖類及び化学治療剤を含んで成り、当該多糖類は、複数の反復する炭水化物単位を有する骨格を有し、各反復する単位は、少なくとも１つの酸性炭水化物及び少なくとも1つの天然炭水化物を含み、そして当該骨格はそれらに依存する少なくとも１つの枝分かれする側鎖を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記がんが、腎細胞がん、カポジ肉腫、慢性白血病、乳がん、肉腫、卵巣がん、直腸がん、喉頭がん、メラノーマ、結腸がん、膀胱がん、肥満細胞腫、肺がん、乳腺腺がん、喉頭扁平上皮細胞がん、消化管がん、胃がんなどからなる群から選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
対象者の血管新生を治療する方法であって、有効な量の医薬組成物を、それを必要とする対象者へ投与することを含んで成り、ここで当該医薬組成物が多糖類及び抗血管新生剤を含んで成り、ここで当該多糖類は、骨格は複数の反復する炭水化物単位を有し、各反復する単位は、少なくとも1つの酸性炭水化物及び少なくとも１つの中性炭水化物を含み、ここで当該骨格は、それらに依存する少なくとも1つの枝分かれする側鎖を有する、方法。
【請求項２７】
前記抗血管新生剤が、アンジオゲニン(ANG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮増殖因子(EGF)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、腫瘍増殖因子-α(TGF-α)、及び腫瘍増殖因子-β(TGF-β)、血小板誘導増殖因子(PDGF)、血小板誘導内皮細胞増殖因子(PD-ECGF)、胎盤増殖因子(PIGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、血小板活性化因子(PAF)、インスリン様増殖因子(IGF)、インターロイキン-8(IL-8)、顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)などからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記医薬組成物が更に腫瘍溶解剤を含んで成る、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
前記腫瘍溶解剤が、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、BCG、ビカルタミド、ブレオマシン、ブセレリン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シクロフォスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルビシン、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フリグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン-α、イリノテカン、レトロゾール、ルーコボリン、ループロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトタン、マイトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トラスツマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビンなどから選択される、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2004年7月22日に提出された米国仮出願60/581,958号の優先権及び利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、悪性のがん及び血管形成を治療するための方法及び組成物に関連する。詳細に、本発明は、1又は複数の公知の化学治療剤を多糖類と共に投与することに関する。
【０００３】
本発明の背景
多くのがんの形態の発生率は、集団の年齢が上がるにつれて増加すると予測される。例えば、前立腺がんは、アメリカ人男性で最も良く診断され並びに男性においてがんの死亡の原因をもたらす共通のがんである。前立腺がんを有する診断がなされた患者の約50%が、単独では前立腺に影響を与えない疾患の形態を有する。前立腺がんは骨格系へ転移し、そして患者は典型的に重篤な骨転移疾患で死亡する。更に、有効な治療法がなく且つ骨転移疾患を有する患者のための緩和療法もほとんどない。
【０００４】
腫瘍細胞転移の過程には、細胞が一次腫瘍から分離し、基底膜へ侵入し、腫瘍細胞血栓からの血流を通じて移動し、標的器官の血管内皮細胞を相互作用し、そして増殖して2次腫瘍コロニーを形成することが必要となる。
【０００５】
転移カスケードの多くのステージには、ガラクトシド結合レクチン(ガラクチン)を含む、炭水化物結合タンパク質などの細胞表層成分が介在する細胞間相互作用が関連する。B16メラノーマ及びuv-2237上皮肉腫細胞をin vitroにおいて、抗ガレクチンモノクローナル抗体により、同系マウスの尻尾の血管へ注射(i.v.)する前に処理することで、腫瘍肺コロニー進行の著しい阻害がもたらされた。低転移性、低ガレクチン3発現性uv-2237-c115上皮肉腫細胞をガレクチン-3cDNAでトランスフェクションさせることで、トランスフェクションした細胞の転移性表現型の増加がもたらされた。更に、ヒト甲状腺乳頭がんのガレクチン-3発現のレベルと腫瘍段階ヒト結腸直腸及び胃がんの間での相関関係が確立された。単糖のメチル-α-D-ラクトシド及びラクト-N-テトロースもB16メラノーマ細胞の転移を阻害することを示し、他方、D-ガラクトース及びアラビノガラクトースはL-1肉腫細胞の肝転移を阻害した。
【０００６】
しかし、多くの推定上の抗がん薬は、正常な組織に対して毒性の副作用をもたらす、薬物の非特異的デリバリーが理由により細胞毒性がある。従って、がんを治療する際に、それらの不都合な毒性を下げつつ、推定上の抗がん物質の確立された治療上の質を増加することができる治療方法に対する要請がある。
【発明の開示】
【０００７】
本発明は、1又は複数の治療剤との組合せにおいて約50kD〜約200kDの分子量を有する化学的に可溶性のリガンド分岐多糖類に関連する。1つの観点において、本発明は悪性のがんを治療及び予防するために上記物を1以上の抗がん薬との組合せにおいて使用する方法に関連する。更に他の観点において、本発明は、血管形成を治療及び予防するために、本発明の組成物を使用する方法に関する。
【０００８】
本発明によれば、複数の炭水化物単位からなる生理学的可溶性ポリマーを含んで成る、リガンド分岐多糖類が提供されており、ここで、各炭水化物単位は炭水化物骨格を含む。当該炭水化物単位は複数の繰返単位を含み、ここで各繰返単位は、1以上の酸性分子及び1以上の天然炭水化物分子を有する。炭水化物の1以上の分岐鎖が骨格に結合でき、例えば、複数の天然の炭水化物及び又は炭水化物誘導体を含む。
【０００９】
このリガンド分岐多糖類は、約50kD〜約200kD、又は約250〜約1000の単糖類の範囲の平均分子量を有する。この骨格は、20〜25酸性分子ごとに約1つの天然炭水化物分子を含む。分岐鎖は、1又は複数の天然炭水化物分子によって連結されている。更に、多糖類は、1又は複数の推定治療剤と反応し、有効にこれらの治療剤を転移性がん(ここでそれらが活性を発揮する)へデリバリーすることができる疎水性且つわずかに負に帯電した成分(例えば、ウロン酸)の組み合わせを有する。1つの観点において、前記多糖類構造は、がん細胞の表層上に分散した複数の多価レクチンレセプターと反応する拡張された炭水化物リガンドを有することができる。これらのリガンドは腫瘍表層及び化学療法剤の潜在性、更に腫瘍細胞内へのデリバリーの増強を混乱させる。従って、可溶性分岐リガンド多糖類との共投与により、推定抗がん剤は、影響を受けた疾患細胞へ一層効率的にデリバリーされ、そしてより健常さが少ない細胞は悪影響を受ける。
【００１０】
1つの観点において、前記酸性分子は、様々な形態、例えば、カリウム、ナトリウム又はマグネシウムの塩形態であるウロン酸である。他の観点において、ウロン酸はカルボキシル単位を含み、且つ全単位の最大10%をアルキル化又はエステル化されている。例えば、メチル、アセチル、デシル、又はベンジルがカルボキシル単位へ結合できうる。
【００１１】
本発明の1つの実施態様において、多糖類が記載されており、ここでは酸性分子が含まれており且つそれはガラクツロン酸であり、そして天然の炭水化物が含まれており且つそれはラムノースである。本発明の1つの観点は、1以上の分鎖ガラムノース分子を介して炭水化物骨格へ連結している多糖類を提供する。
【００１２】
本発明の他の実施態様は、多糖類であって、酸性分子が含まれており且つそれは最大で100単位含むポリガラクツロン酸でありそして天然炭水化物分子が各末端に存在し且つそれはラムノースである多糖類に関する。1つの観点は、多糖類であって、1以上の分鎖が炭水化物骨格へポリガラクツロン酸分子及び/又はラムノース分子のいずれかを介して結合している多糖類を提供する。
【００１３】
他の実施態様は、がんを有すると診断された患者を治療するため又はがんを有する危険性が高いと診断された患者におけるがんを治療する方法であって:治療上有効な量の1以上の推定抗がん薬と本発明の多糖類を組み合わせて、併用療法を開発し;そしてこの組合せを患者へデリバリーする段階を含んで成る方法に関する。
【００１４】
他の実施態様は、腫瘍血管形成を有すると診断された患者を治療するため又は腫瘍血管形成を有する危険性が高いと診断された患者における腫瘍血管形成を治療する方法であって:治療上有効な量の1以上の推定抗腫瘍形成薬と本発明の可溶性分岐多糖類を組み合わせて、併用療法を開発し;そしてこの組合せを患者へデリバリーする段階を含んで成る方法に関する。本発明の1つの観点は更に、推定上抗がん薬と前記組合せを、当該組合せを患者へデリバリーする前記組合せることを含んで成る。
【００１５】
更に他の実施態様は、がんを有する患者における腫瘍血管形成を予防する方法であって、当該方法は:治療上有効な量の1以上の推定抗がん薬、治療上有効な量の1以上の推定血管新生薬と本発明の可溶性分岐リガンドを組み合わせ併用療法を開発し;そして当該組合せを患者へデリバリーする段階を含んで成る方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
発明の詳細な説明
本発明は、約50kD〜約200kDの分子量を有する化学可溶性分岐多糖類に関連する。本発明は、本発明の多糖類を、1以上の推定抗がん薬との組合せにおいて、悪性のがんを治療及び予防するために使用する方法にも関連する。本発明は更に、本発明の多糖類を、血管新生を治療及び予防するために1以上の推定上抗血管新生薬との組合せにおいて使用する方法に関連する。
【００１７】
本明細書中で使用される略記は:PS、多糖類;EHSはEaglebreth-Holm Swarm;DMEMはDulbecco's Soluble branched Eagle最小必須培地;CMF-PBSは、Ca2+-及びMg2+-遊離リン酸干渉塩類溶液、pH7.2;BSA、ウシ血清アルブミン;galUAは、ガラクトピラノシルウロン酸、そしてまたガラクツロン酸ともいう;及びgalはガラクトース;manはマンノース;glcはグルコース;allはアロース;altはアルトロース;idoはイドース;talはタロース;gulはグルコース;及びaraはアラビノース、ribはリボース;lyxはリキソース;xylはキシロース;及びfruはフルクトース;psiはプシコース;sorはソルボース;tagはタガロース;及びrhaはラムノース;fucはフコース;quinはキノボース;2-d-ribは2-デオキシリボースである。本記載及び付随のクレームにおいて使用された場合、以下の用語は、示された意味を、特に他で必要ない限り、有する。
【００１８】
「投与」とは、経口、又は非経口の例えば、静脈内、皮下、局所、経皮、経粘膜、静脈内、及び筋肉投与が挙げられる。
【００１９】
「対象者」とは、動物の、例えば人を意味する。当該用語は患者をも含む。
【００２０】
「がんの治療」とは、がんが進行する危険性の高い対象者並びに腫瘍が既に進行した対象者の予後診断を意味する。用語「治療」とは、異常な細胞増殖、細胞集合及び第2の部位への分散(転移)の減少又は予防へ適用されて良い。
【００２１】
「がん」とは、任意の新生物疾患の例えば細胞性疾患の、腎細胞がん、カポジ肉腫、慢性白血病、乳がん、肉腫、卵巣がん、咽頭がん、メラノーマ、結腸がん、腎がん、肥満細胞腫、肺がん、乳腺腺がん、咽頭扁平上皮細胞がん、及び胃腸管又は胃がんを意味する。
【００２２】
「脱ポリマー化」とは、多糖類が化学的に処理された場合に、本来の多糖類に比べてサイズの下がった断片を生ずる、多糖類骨格の部分的又は完全な加水分解を意味する。
【００２３】
「有効な投与薬」とは、がんを患う対象者の症状を改善する又はがんを患うもしくは患う危険性の高い対象者の寿命を伸ばす剤の投与量を意味する。
【００２４】
「サッカリド」とは、任意の単純な炭水化物の、例えば、単糖類、単糖類の誘導体、単糖類類似物、糖の例えば、オリゴ糖又は多糖類中の個々の単位を形成するものを意味する。
【００２５】
「単糖」とは、単一の炭水化物単位を意味し;ポリヒドロキシアルデヒド(アルドース)又はポリヒドロキシケトン(ケトース)並びに誘導体及びその類似物はその例である。
【００２６】
「オリゴ糖」とは、グリコシド結合を介して結合した最大約40のサッカリド単位を含む、単糖類の直鎖又は分鎖を意味する。
【００２７】
「多糖類」とは、ヘミアセタール又はグリコシド結合によって互いに結合した約40〜約100,000のサッカリド単位から形成されたポリマーを意味する。多糖類は、直鎖、単一の分鎖又は複数の分鎖のいずれかであって良く、ここで各枝は、第2の更なる枝を有することができ、そして単糖類は、それぞれD-フルクトース及びD-ガラクトースなどピラノース(6員環)又はフラノース(5員環)における標準的なD-又はL-環状糖であって良いかあるいは、それらは、環状糖誘導体の例えばD-グルコサミンなどのアミノ糖、D-フコース又はL-ラムノースなどのデオキシ糖、D-リボース-5-リン酸などの糖リン酸、D-ガラクツロン酸などの糖酸、又は多誘導糖の例えば、N-アセチル-D-グルコサミン、N-アセチルニュラミン酸(サリチル酸)、又は-N-スルフェート-D-グルコサミンなどを意味する。
【００２８】
骨格とは、多糖類の主要な鎖、又はαもしくはβグリコシド結合のいずれかによって連続的に結合した糖成分を有する、出発多糖類の主要な鎖から生ずる鎖を意味する。骨格は、連続する鎖に沿って様々な位置でその連結した更なる単糖類成分を含んで成ることができる。
【００２９】
「エステル化」とは、サッカリドのウロン酸成分のカルボン酸位におけるメチルエステル又は他のエステル基の存在を意味する。
【００３０】
「単等類及びそれらの誘導体」とは、本発明の背景において、単糖類(糖)の任意の標準的且つ可能な誘導体を意味し、それは、限定されないが、デオキシモノサッカリド、ジデオキシモノサッカリンド、糖アルコール、糖酸、糖エステル、糖エーテル、糖ハロゲン化物、アミノ糖、糖リン酸、ピラノース及びフラノース環形態、開環形態、糖のスルホンエステル、グリコシジル誘導体、グリコール、グリコレン、ケト糖、ジケト糖、保護糖、アセタールの例えば、ベンジリデン及びケタールの例えば、イソプロピリデン、ニトロ糖、N-アセチル糖、N-アセチルムラミン酸、及び抗生物質糖の例えば、ノジリマイシン及びジヒドロノジリマイシンが挙げられる。
【００３１】
「抗がん薬」とは、本発明の背景において、がん性腫瘍又は腫瘍細胞のサイズ、出現、転移、増殖、発生、又は再発生を減らす効果を示す任意の様々な化合物であり、限定されないが:アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、アスパラギナーゼ、BCG、ビカルタミド、ブレオマシン、ブセレリン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロドロネート、シクロフォスファミド、シプロテロン、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ジエチルスチルベストロール、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピルブシン、エストラムスチン、エトポシド、エキセメスタン、フリグラスチム、フルダラビン、フルドロコルチゾン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲムシタビン、ゴセレリン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イフォスファミド、イマチニブ、インターフェロン-α、イリノテカン、レトロゾール、ルーコボリン、ループロリド、レバミゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メドロキシプロゲステロン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキセート、マイトマイシン、マイトタン、マイトキサントロン、ニルタミド、オクトレオチド、オキサリプラチン、パクリタキセル、パミドロネート、ペントスタチン、プリカマイシン、ポルフィマー、プロカルバジン、ラルチトレキセド、リツキシマブ、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、テストステロン、チオグアニン、チオテパ、トポテカン、トラスツマブ、トレチノイン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンが挙げられる。
【００３２】
「抗血管新生薬」とは、本発明の意味において、腫瘍血管新生を有する対象者において抗血管新生効果を示す化合物であり、限定されないが: アンジオゲニン(ANG)、血管内皮増殖因子(VEGF)、塩基性繊維芽細胞増殖因子(bFGF)、酸性繊維芽細胞増殖因子(aFGF)、上皮増殖因子(EGF)、腫瘍壊死因子α(TNF-α)、腫瘍増殖因子-α(TGF-α)、及び腫瘍増殖因子-β(TGF-β)、血小板誘導増殖因子(PDGF)、血小板誘導内皮細胞増殖因子(PD-ECGF)、胎盤増殖因子(PIGF)、肝細胞増殖因子(HGF)、血小板活性化因子(PAF)、インスリン様増殖因子(IGF)、インターロイキン-8(IL-8)、及び顆粒球コロニー刺激因子(GCSF)が挙げられる。
本発明の1つの実施態様において、可溶性分岐多糖類は、平均して骨格単位約2あたり1個〜25あたり1個で骨格に連結した天然の単糖を伴う、ウロン酸サッカリド骨格又はウロン酸エステルサッカリド骨格を有する記載がなされている。生ずる多糖類は、骨格単位、約2〜25あたり1の天然の単糖類を介して骨格へ連結した最も天然のサッカリド及びサッカリド誘導体からなる1以上の側鎖を有する。本発明のいくつかの多糖類は、実質上、第二のサッカリド枝を有さず、ガラクトース、グルコース、アラビノース又はその誘導体を含んで成る末端サッカリドを伴う1以上の側鎖を有する。1つの観点において、可溶性分岐多糖類は、反復する単位あたり約1〜2個未満第2の枝を平均して有しうる。他の観点は、可溶性リガンド分岐多糖類部分を含み、ここで第2の分岐は平均して、反復する単位あたり約0.5〜1未満である。更に他の観点において、可溶性分岐多糖類は、反復する単位あたり第2の分岐が平均して約0.25〜0.5未満である。特に、可溶性分岐多糖類は、反復する単位あたり第2の分岐が平均して約0〜0.25未満である。本発明の他の多糖類は、フェルロイル基によるサッカリド可溶性分岐で終わるサッカリドの側鎖を1以上有しうる。
【００３３】
本発明の他の実施態様において、可溶性分岐多糖類骨格は、実質上、負に帯電した物体を生じさせる脱エステル化されている。一つの観点において、可溶性分岐多糖類骨格は、脱エステル化され約1%未満になる。他の観点において、可溶性分岐多糖類骨格は、脱エステル化され約0.5%未満になる。 更に他の観点において、可溶性分岐多糖類骨格は、脱エステル化され約0.25%未満になる。そして更に他の観点において、可溶性分岐多糖類骨格は脱エステル化され、約0.1 %未満になる。
【００３４】
本発明の他の実施態様において、可溶性分岐多糖類は、天然に生ずるポリマーを化学修飾することによって調製されて良い。天然多糖類は、化学修飾前、約40,000〜1,000,000の分子量を、サッカリドの複数の分岐、例えば、1〜20の単糖の例えば、グルコース、アラビノース、ガラクトースからなる分岐を伴って有する。これらの枝は、天然の単糖類の例えば、ラムノースを介して骨格へ結合している。これらの分子は更に、約2％程度〜最大約30％エステル化できうる1つの骨格又はウロン酸サッカリド骨格の鎖を有する。複数の分岐はそれら自身、サッカリドの複数の分岐、天然のサッカリド及び天然のサッカリド誘導体など第二の複数の分岐を有することができ、それによって主に疎水性の実体を生ずることができる。
【００３５】
多糖類及及び抗がん/抗血管新生薬の有効な投与量及び投与計画は、対象者の年齢、体重、病歴の関数及び他の関連あるとみなされる変数の関数である。投与量及び投与計画は、可溶性分岐多糖類成分(消化可能な担体を無視すれば)及び抗がん/抗血管新生薬物の分子量に基づく。典型的な計画は、対象者の体重あたり約10〜約1000gの日々の投与量からなる。可溶性分岐多糖類及び抗がん/抗血管新生薬物の投与量は更に、治療される疾患状態又は症状並びに他の臨床上の因子の例えば、患者の体重及び生理状態並びに投与の手段に依存する。可溶性分岐多糖類及び特定の対象者の抗がん/抗血管新生薬の半減期に依存して、片方又は両方の剤が数回/日〜1回/週で投与されて良い(本発明は、ヒト及び獣医使用のための用途を有することを理解されたい)。本発明の方法は、単一並びに複数の共投与(同時に又は長期、24時間ごとに約10〜約1000g/kg〜6時間ごとに約2.5〜250g/kgに渡り投与される)を熟考する。
【００３６】
化学可溶性分岐多糖類及び公知の抗がん/抗血管新生薬物は、経口投与のために、単独で又は一緒に処方されて良い。投与の他の方法としては、眼科的(例えば、ガラス体内又はカメラ内(intracameral))、鼻腔、局所(例えば、頬及び舌下)、皮内、器官内、及び硬膜外、経皮、腹腔内、頭蓋内、脳室内、膣内、子宮内、腎内又は非経口(例えば、静脈内、髄腔内、舌下又は筋内)手段が挙げられる。代替的に、可溶性分岐多糖類及び抗がん/抗血管新生薬は、化合物の持続放出を可能にする移植された生分解性ポリマー中に組み込まれて良い(Bremら、J.Neurosurg,(1991),vol.74,pp.441-446, その内容は本明細書中参照によって組み込まれている)。ポリマーは、薬物デリバリーが所望されている部分の近傍、例えば、腫瘍の部位に移植される、又は可溶性分岐多糖類が緩やかに全身的に放出されるように移植されることが望ましい。浸透圧ミニポンプも、高濃度の可溶性分岐多糖類がカニューレを通じて注目の部位へ直接、例えば、転移増殖へ又は腫瘍の血管供給へコントロールされたデリバリーを供するために使用できうる。
【００３７】
製剤は、単位投与形態中で都合よく存在していて良く且つ常用の医薬技術により調製されて良い。かかる技術は、活性成分と1もしくは複数の医薬担体又は1もしくは複数の賦形剤を結びつける段階を含む。一般に、製剤は、均一且つ親密に活性成分と、液状担体もしくは微細に分割した固体担体もしくはその両方を結びつけ、そしてもし必要なら当該産物を成形することによって調製される。
【００３８】
適切な消化可能医薬担体としてはゼラチンカプセルが挙げられ、その中で多糖類は、乾燥形態で封入されている、又は担体としては錠剤が挙げられその中で多糖類は、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶性セルロース、 プロピレングリコール、ステアリン酸亜鉛及び二酸化チタン及び他の適切な結合剤及び添加剤との混合されている。組成物は、蒸留水、調味剤ある種の糖又は甘味剤を、対象者が消費する場合に喜ばしい風味の組成物を調製する消化可能担体として使用することで液体として処方されて良い。
【００３９】
持続放出マトリクスとは、本明細書中で使用された場合、通常、酵素もしくは酸性/塩基性加水分解によって又は溶解によって分解可能であるポリマー物質からできているマトリクスである。酵素及び生体流体は、体内に一度入れられれば、当該マトリクスに良い作用する。持続放出マトリクスは望ましくは、生体適合性物質の例えば、リポソーム、ポリラクチド(ポリ乳酸)、ポリグリコライド(グリコール酸のポリマー)、ポリラクチドコグリコライド(乳酸とグリコール酸のコポリマー)ポリ無水物、ポリ(オルト)エステル、ポリペプチド、ヒアルロン酸、コラーゲン、硫酸コンドロイチン、カルボン酸、脂肪酸、リン酸、多糖類、核酸、ポリアミノ酸、アミノ酸の例えば、フェニルアラニン、チロシン、イソロイシン、ポリヌクレオチド、ポリビニルプロピレン、ポリビニルピロリドン及びシリコーンから選択される。生分解性マトリクスは、ポリラクチド、ポリグリコライド、又はポリラクチドコグリコライド(乳酸とグリコール酸のコポリマー)のうちの一つのマトリクスであるである。
【００４０】
本発明の転移調節治療組成物は、固体、液体又はエアロゾルであって良く且つ任意の公知の投与経路によって投与されて良い。固体治療組成物の例としては、ピル、クリーム、及び移植可能投与形態が挙げられる。ピルは、経口的に投与されて良く;治療クリームは、局所的に投与されて良い。移植可能投与単位は、局所的に投与されて良く、例えば、腫瘍の部位へ、又は治療血管新生調節組成物の全身放出のために、例えば舌下に移植されて良い。液体組成物の例としては、舌下注射、静脈内注射、動脈内注射に適合させた製剤、及び局所及び眼内投与に適した製剤が挙げられる。エアロゾル製剤の例としては、肺へ投与するための吸入製剤が挙げられる。
【００４１】
非経口投与のための適切な製剤としては、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤及び 製剤を目的とする受容者の血液と等張にせしめる溶質を含むことができる水性及び非水性無菌注射溶液;並びに懸濁剤及び増粘剤を含むことができる水性及び非水性無菌懸濁が挙げられる。製剤は、単回位投与又は多回投与容器の例えば、封止アンプル及びバイアル中に存在して良く、そして無菌液状担体の添加のみ例えば、注射のために水の添加が使用直前に必要になるフリーズドライ(凍結乾燥)状態で保存されて良い。即席注射溶液及び懸濁が、先に記載のような無菌粉末、顆粒及び錠剤から調製されて良い。
【００４２】
許容できる単位投与製剤は、投与される成分の毎日の投与量もしくは単位、毎日のサブ投与量、又はその適切な一部を含むものである(成分、特に上記成分に加えて、本発明の製剤は、件の製剤の型を有する他の常用の製剤を含むことを理解されたい)。 任意に、細胞障害剤は、患者に対して二元的な治療を提供するためにアンジオスタチンタンパク質、又は生物学的に機能するその断片へ組み込まれるかあるいは組み合わされて良い。
【００４３】
当業界で周知である治療剤を投与するための他の処方も使用されて良い。
【００４４】
一つの観点において、本発明の多糖類調製物は、公知の抗がん薬と、がんに対して有効であると当業界で知られている抗がん薬の治療投与量で共投与されて良い。例えば、5-FUは、100〜1000mg/m/日で又はTaxolは50〜300mg/m/日の投与量で投与されて良い。腫瘍を有する動物における最良の腫瘍が、抗がん薬の、例えば、5-FU及びTaxolが多糖類と投与量20〜300mg/mで組合された場合に確認された。特に、結腸腫瘍を有するげっ歯類において、治療を伴わないコントロールに対して併用療法の形態において最大で80%の改善が確認された。
【００４５】
可溶性分岐多糖類炭水化物構造体は、抗血管新生活性であって、血管新生因子-誘導血管新生を阻害する活性を有することが、CAMアッセイ、角膜血管新生アッセイ(Gimbroneら, 1974, J. Natl. Cancer Inst. 52:413-427,その全体は参照によって本明細書中に組み込まれている)、並びに当業界で公知の他の類似するアッセイを使用することで特定した場合に確認された。抗血管新生因子を有する可溶性分岐多糖類と抗がん薬の共投与は、相乗効果を有する。
【００４６】
詳細に、本方法は、腎がん、肉腫、カポジ肉腫、慢性白血病、乳がん、乳腺腺がん、卵巣がん、直腸がん、結腸がん、膀胱がん、前立腺がん、メラノーマ、肥満細胞腫、肺がん、喉頭がん、喉頭扁平上皮細胞がん、消化管がん又は胃がんに向けられている。
【００４７】
当業者には本発明が他のがんのためにも使用されて良いことが理解されるだろう。
【００４８】
本明細書中、所望の多糖類を生み出すための、時間、温度及び緩衝剤の条件を制御することを使用する化学修飾手順が記載されている。手順には、ポリマー骨格中のグリコシド結合のペルオキシド/アスコルビン酸塩切断(実施例1を参照のこと)、アルカリ還元脱ポリマー化(実施例2を参照のこと)、又はより小さい分子、分岐多糖類分子への制御された脱ポリマー化多糖類分子(実施例3)を含む。第一の精製手順は、タンパク質、色素及び他の不純物を除去するためのアルカリ及び又はキレート溶液による多糖類の抽出である。
【００４９】
推定抗がん薬との組み合わせにおいて投与される化学可溶性分岐多糖類の効果を証明するために、多くのin vitro(実施例5を参照のこと)及びin vivo(実施例6を参照のこと)アッセイを行った。転移の阻害は、培養物中で通常に集合するがん細胞系統を使用することで転移が示されたが、即席多糖類の存在下では分散が維持される。転移の阻害は、転移アッセイによって示され、当該アッセイにおいて、MLL細胞は、それらの細胞表層上でガレクチン-3のレベルが増加した。その理由は、ガレクチン-3は、腫瘍内皮細胞接着に関連するからだ。
【００５０】
脊椎動物ガラクトシド結合レクチンは、様々な組織及び細胞中で生じる。レクチンは、それらのサイズに依存して十分に多い2種類に分けられる。約14kDの分子量を有するレクチンは、ガレクチン-1と命名され、そして約30kDの分子量を有するものはガレクチン-3と命名されている。ガレクチン-3は、マウス34kD(mL-34)及びヒト31kD(hL-31)腫瘍関連ガラクトシド-結合レクチン、35kD繊維芽細胞炭水化物-結合タンパク質(CBP35)、IgE-結合タンパク質(cBP)、32kDマクロファージ非インテグリンラミニン結合タンパク質(Mac-2)、並びに29kDガラクトシド-結合レクチン(L-29)のラット、マウス、及びヒト形態を含む広い範囲の分子を意味する。分子クローニング技術は、ポリペプチドが同一であることを明らかにした。
【００５１】
ガレクチン-3は、活性化マクロファージ及び転移性細胞においてがん遺伝子形質転換させたものによって非常によく発現している。多くのがん細胞、例えばMLL細胞は、ガレクチン-3をそれら細胞表層上で発現し、そしてその発現は、腫瘍細胞における転移過程において複雑化されている。ポリペプチドの発現上昇は、足場依存性増殖、同型凝集及び腫瘍細胞肺コロニー化のため能力の増加と関連しており、それはガレクチン-3が循環にて腫瘍細胞塞栓を促すこと及び転移を増強することを示唆する。腫瘍-内皮細胞接着は、転移過程におけるキー事象であると考えられる。ポリ-N-アセチルグルコサミン配列を含むオリゴ糖へ高い親和性で結合するガレクチンは、特異的糖依存性態様において、ラミニンの炭水化物側鎖へも結合する。ラミニン(基底膜の主要な非コラーゲン性成分）は、ポリ-N-アセチルグルコサミン配列を担持するN結合糖タンパク質であり、細胞接着、移動、増殖、分化、侵襲及び転移と複合している。
【００５２】
腫瘍細胞は、細胞表層ガレクチン-3を介して糖タンパク質の炭水化物残基と反応し且つこれは、それらが、アガロースのガラクトース残基(D-ガラクトース及びL-無水ガラクトースのポリマー)と反応する能力、そして半-固体培地における細胞増殖のために必要な最小限の支持を提供する能力と相関する。抗-ガレクチン-3モノクローナル抗体は、アガロースにおける腫瘍細胞の増殖を阻害することができる。更に、正常マウス繊維芽細胞のマウスガレクチン-3cDNAによるトランスフェクションにより、足場依存性増殖の獲得がもたらされる。実施例1を参照すれば、本明細書中、多糖類によるin vivo結果は、ガレクチン-3を使用するヒト前立腺がん組織に対して行った先の研究(米国特許 No. 5,895,784,その全体は本願明細書中参照によって組み込まれている)と一環している。
【００５３】
本明細書中に記載の多糖類は、共投与のために抗がん薬と組み合わされた場合、ヒトにおける抗転移効果をデリバリー、ターゲッティング、及び抗転移効果の全体的なの正の改善を提供する。
【実施例】
【００５４】
実施例
実施例1:ペルオキシド/アスコルビン酸塩分離による天然に生ずる多糖類を修飾すること
最初の多糖類をU.V.放射で処理する又は70%アルコール処理中で約48時間に渡り懸濁させて、微生物コンタミネーションを減らす。残りの全ての段階を半滅菌条件下で行った。放射照射後、多糖類を蒸留水へ序々に溶かして炭水化物の総量をフェノールスルホン酸法(Fidlerら, Cancer Res.,(1973),vol.41,pp.3642-3956, その開示内容は、本願明細書中、参照によって組み込まれている)により測定した。
【００５５】
溶液を20g/Lの多糖類の例えば、USPペクチン(Pelco)、を使用して蒸留水中で調製し、そしてpHを1Mコハク酸ナトリウムにより5.5に調節した。次いで、多糖類溶液を固定した温度で、例えば、20℃でインキュベートし、そしてペルオキシド及び/又はアスコルビン酸塩を一緒に(図1)又は順次加えた。
【００５６】
H202は、USPペクチンの遅い分離をpH5.5、10mMで促す。特異的流動性を二倍にするために必要な半分の時間は15±72時間(図1)であった。L-アスコルビン酸塩は同じ条件及び濃度で、より早い分離を誘導した。最も劇的な効果は、しかしながら、5 mMのアスコルビン酸塩と5 mMのH202組み合わせによって生み出され、それは一層速い分離を生じさせた。アスコルビン酸塩を多糖類溶液(1mMのH202を含んでいる)へ対する逐次添加することにより、分離の更なる刺激が生じた。分離の速度及び程度を、加えたアスコルビン酸塩の投与量、H202添加後の時間、pH、及び温度によって特定した。これらの因子は、初期反応により分離過程を進んだことを示した。pH4.5が、最大遅延及び最大分離速度が得られた。従って、アスコルビン酸塩の増強効果は、以下の反応によって生産されたH202又はデヒドロアスコルビン酸塩に依存する: 
AH2+O2→A+H2O2
又は
AH2+H2O2→A+2H20
(式中、AH2はアスコルビン酸塩であり; Aはデヒドロアスコルビン酸塩である)
。
【００５７】
この方法は、Ca++、Cu++又はFe++など遷移金属イオンの存在下で更に増強されている。解裂の最もありえる源は、フェントン反応(Halliwell, B.及びGutteridge, J. M. C. (1990) Methods Enzymol. 186,1-85, その全体は本明細書中参照によって組み込まれている)であり、その反応はイオン化されたOHを生じさせ、そしてH202及び遷移金属イオンの還元形態を必要とする。Cu+はFe2+よりも60倍有効であると報じられている。
Cu++H2O2→・OH+OH-+Cu2+
【００５８】
多糖類サンプルが測定可能な微量のFe、Cu及びZnをppmレベルで最も含んでいた。Cu及びFe含有量は、いくつかの市販の多糖類(それらのAのCで報じられている)で類似しており、そして類似する分析等級のアスコルビン酸は微量低ppmのCu及びFeを含んでいた。従って、遷移金属が故意に加えられていない場合、フェントン反応はさらに実行可能であろう。
【００５９】
実施例2:アルカリ還元脱ポリマー化により天然に生ずる多糖類を修飾すること
多糖類溶液のpHをpH10へ、例えば、3NのNaOHにより上昇させた。5〜50℃で30〜60分における短時間のインキュベーション後、10〜20%エタノールを加えて精製した多糖類を沈殿させた。これにより多糖類と結合したタンパク質及び色素を除去した。次いで、多糖類を溶かして20g/Lにしそして酸を加えた。例えば、0.01〜1.0Mの最終濃度におけるトリフルオロ酢酸は、制御された脱ポリマー化を生じることが示された。他の酸又はその組み合わせ、例えば、硫酸、HCl、酢酸塩、プロピオン酸、又はメタンスルホン酸が、加水分解時間を短縮し且つ酸化をせずに分岐した多糖類の所望の構造を獲得するために使用される。
【００６０】
適切な時間間隔、例えば、10分〜48時間後、15℃〜121の範囲の温度において、溶液をpH3〜5へ中和し、4℃に冷却して任意の不溶性物質を除去する。次いで、上清を、1NのNaOHで中和して約6.0〜8.0の最終pHにし、そして20%エタノールを、可溶性多糖類を回収するために加えた。多糖類対酸の比、酸の型、濃度、pH、温度及び時間間隔は、50kD、60kD、75kD、90kD、105kD、125kD、150kD、175kD、及び最大で200kDの分子量を有する可溶性分岐多糖類を生ずるために選択される。
【００６１】
生ずる可溶性分岐多糖類産物は、更に最終乾燥粉末を提供するために、70％エタノールで又は100％アセトンで洗浄されて良い。それにより、可溶性分岐多糖類は、分析同定、効率、及び/又は毒物学的研究のために約5〜15重量％の最終濃度へ水中で再溶解されている。可溶性分岐多糖類は、所望の可溶性分岐多糖類組成物及び分子量に依存して、0.01〜10％の濃度が細胞へ提供されうる本発明の実施態様に従い使用するために更に希釈されて良い。
【００６２】
実施例3:制御した脱ポリマー化によって天然に生ずる多糖類を修飾すること
多糖類溶液のpHを、例えば、3NのNaOHでpH9へ増加させた。30〜60分に渡る、5〜50℃での短時間のインキュベーション後、10%エタノールを加えて精製した多糖類を沈殿させた。これにより多糖類と結合したタンパク質及び色素を除去する。次いで、還元剤の例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、シアノホウ素化水素ナトリウム、トリアセトキシホウ素化水素ナトリウム又は他のホウ素化水素塩を加え、グリコシド結合のアルカリ還元機構による切断を生じさせた。これは、反復するサブユニットに対応するサイズの断片を形成する(米国特許第5,554,386号、その全体は本明細書中、参照によって組み込まれている)。
【００６３】
温度及び時間を変えることで多糖類の加水分解時間を短縮し且つ収率を向上させることができる。適当な時間間隔、例えば、25℃〜75℃の温度で30分〜24時間後、溶液を4℃に冷却し且つ遠心して不溶性物質を除去した。次いで、上清を1NのHClで約6.0のpHへ中和し、そして20%エタノールを加えて可溶性多糖類を回収する。還元剤に対する多糖類の比、剤の型、濃度、pH、温度及び時間間隔は、50kD、60kD、75kD、90kD、105kD、125kD、150kD、175kD、及び最大で200kDの分子量を有する可溶性分岐多糖類を生じさせるために選択される。
【００６４】
生ずる可溶性分岐多糖類産物は更に、20〜70%エタノールで、そして最後に100%アセトンで画分されて最終乾燥粉末を提供する。それにより、可溶性分岐多糖類は、水中で再度溶解して約5〜15重量%の最終濃度へ、分析同定、有効性又は毒性研究のために再度溶かされる。可溶性分岐多糖類は、約0.01〜10%の濃度が細胞へ供される本発明の実施態様に従い更に希釈されて良い。所望の可溶性分岐多糖類組成物及び分子量に依存する。
【００６５】
温度(又はpH)が増加するにつれ、いわゆるβ除去が始まる(図2)。アルカリ性ホウ化水素のβ-除去は、反応をモニタリングするために使用される、粘度及びゲル化特性の減少に関連した鎖解裂の制御された方法をもたらす。
【００６６】
実施例4:HPLC/IR-MALLSによる定量及び分子量 
多糖類のHPLC溶出特性の二重モニタリングの使用は、多角レーザー光分散(MALLS)検出器によって測定される多糖類の重要な2つの化学的特性の屈折率シグナル及び絶対分子量を提供する。図3は、比較目的のための2つのクロマトグラムを示す。「ブランクa」は、コントロールであり、そして「スタンダードB3a」は、注目の多糖類を示す。30μLを8mg/mLで注入し、そして使用したシステムは次のとおり:カラム: Phenomenex, Polysep GFC及び1mL/分の流速における50mMの酢酸塩、pH5.0、0.1MのNaClの流動相である。更に、これらのクロマトグラムは、多糖類の分子安定性及び分解誘導体に関するデータを供しうる。
【００６７】
ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)分離技術(サイズ排除クロマトグラフィー-SECとしても使用する)を使用する高性能液体クロマトグラフィー(HPLC)は、ポリマーの特性を決定するための十分に確立された技術である。多角レーザー光散乱(MALLS)及び屈折率(RI)検出との組み合わせにおけるCPGは、ポリマー炭水化物の絶対分子量の特定するための強力な道具である。光散乱検出の適用は、時間がかかるGPCシステムの構造依存性校正の必要性を取り除く。GPC-MALLSの、古典的なGPCを超える他の利点とは、分子量に加えて、溶液における影響ある範囲及び構造に関する更なる情報が後に続きうることである。
【００６８】
GPC-MALLS法の原理は、光が小さな分子よりも大きな分子によって一層強力に散乱される事実に基づく。クロマトグラフィー操作の間、MALLS検出器は、15の異なる角度に配置された検出器によりレーザー光線の散乱の程度を測定する。光散乱検出器の出力は、マクロ分子の濃度及び分子量の増加に比例している。従って、光散乱ピークの形状は、非対象である。更に、それはRIピークと一致せず、何故なら、RI検出器シグナルは、濃度にのみ比例するからである(図3)。任意の溶出時間において、カラムから溶出するポリマーの分子量は、MALLS及びRIシグナルの指数から計算されて良い。分子量対溶出体積のグラフを獲得し、そして(平均)分子量及び分子量分布が計算できうる。
【００６９】
プロ医薬及びそれらの有するGMP機能は、薬物物質を定量化するためにGPC/IR-MALLS技術に適用され且つ分子量平均及び分布をR&Dにより特性決定し且つ相をスケールアップし且つ最後にそれを、分析明細書の一部としての構造の薬物証明へと組み込む適合がなされている。
【００７０】
多糖類を分析するためにMALLS分析を使用することにより、「古典的GPC」によるMW積算に干渉する多くの因子が取り除かれる。GPF分離は、分子量の違いに代えて水力学的体積の違いに基づいている。分子構造の違い、例えば、デキストランにおける分岐は、水力学的体積に強力な影響を与えることができる。第二に、正又は負に電荷を帯びたポリマーのGPC溶出は、固定相による解裂又は誘引が理由により理想的ではない。反対に、GPC-MALLS結果は、これらクロマトグラフィー的な欠陥に影響は受けず、そして絶対分子量が獲得されて良い。多糖類を様々な濃度において複数の測定をすることで、絶対分子量は、たとえポリマーが凝集する傾向にあるとしても、測定されて良い。図4は、市販のラムノガラクタン分子量に関するMALLS結果である。図5は、ラムノガラクタンのZimmプロットである。
【００７１】
実施例5: in vitroアッセイ-抗がん薬と又は更に抗血管新生薬との組み合わせにおける多糖類
特に断らない限り、下のアッセイを本発明の可溶性分岐多糖類を使用することで行っている。異なるサイズの分子、50kD、60kD、75kD、90kD、105kD、125kD、150kD、175kD、及び最大で200kDの範囲に渡る分子を試験した。生理学的溶媒中、可溶性分岐多糖類の量(w/v)を0.01%〜1%で変えた。コントロールには、更なる剤、非可溶性分岐多糖類を伴わない多糖類単独; gal-、ara-又はフェルロイル置換単糖類;及び抗がん薬単独、抗血管新生薬単独;可溶性分岐多糖類を伴う抗がん薬;可溶性分岐多糖類を伴う抗血管新生薬;及び可溶性分岐多糖類の存在下で抗血管新生薬を伴う抗がん薬を含んだ。CAMアッセイ、角膜血管新生アッセイ、及び当業者に公知の適切なアッセイ(Gimbroneら,1974,J.Natl.Cancer Inst.52:413-427、その開示内容の全体は本願明細書中、参照によって組み込まれている)を行った。
【００７２】
ラミニン接着アッセイ 
相関関係が、腫瘍細胞で同型凝集をする腫瘍細胞の性質とin vivoでのそれらの転移傾向で確立された。B16メラノーマ細胞塊は、一層の肺コロニーを、i.v.注射後、単一の細胞よりも生成する。更に、抗ガレクチン-3抗体は、アシアロフェツイン誘導同型凝集を阻害していることを示し(Fidler,I.J.,(1970).J.Natl.Cancer Inst.,45:77, それらの開示内容は全体に渡り本明細書中に組み込まれている)、細胞表層ガレクチン-3 ポリペプチドは、それらが糖タンパク質の側鎖との反応後に同型凝集の形成をもたらすことを示唆する。 
【００７３】
可溶性分岐多糖類を、抗がん薬の存在下、細胞-細胞及び細胞-マトリクス反応をコントロールする能力についてB16-F1マウスメラノーマ細胞接着アッセイにおいて試験し、そのアッセイは、ラミニンコーティング基質に対する細胞の接着における変化及びガレクチン-3を伴うアシアロフェツイン誘導同型凝集の阻害における変化を測定することを含む。B16-F1系統(肺転移の発生率が低い) は、B16メラノーマ細胞の静脈内注射によって生産された肺転移から導かれる(Lotan,Rら,Int.J.Cancer,(1994),vol.56,pp.1-20, 開示内容の全ては本願明細書中参照によって組み込まれている)。試験できうる他の細胞系統には、UV-2237-10-3マウス繊維芽細胞肉腫細胞、HT 1080ヒト繊維芽細胞肉腫細胞、及びA375ヒトメラノーマ細胞が挙げられる。
【００７４】
細胞を、Dulbeccoの可溶性分岐Eagleの最小必須培地(DMEM)(グルタミン、必須アミノ酸、ビタミン、抗生物質、及び10%不活性化ウシ血清(FCS10%)を補捉した）で行った。細胞を、7%CO2、93%空気の湿気雰囲気中、37℃で維持した。再現性を確保するために、全実験を、株の回収後6月以内に渡り増殖させて行うべきである。
【００７５】
ラミニン(EHSラミニン)は、Sigma, St. Louis, Missouriから購入することができ、そして本発明の可溶性分岐多糖類は上記手順に従い調製される。アシアロフェツインは、Gibco Laboratories から入手可能なフェツインから調製できうる。フェツインを、Spire; Grand Island Biological Co.,Grand Island. N.Yの方法に従って、80℃で1時間に渡り0.05N、H2SO4を使用することで弱い加水分解に委ねた。次いで、放出されたシアル酸を透析によってフェツインから除去した。
【００７６】
96-ウェルプレートの組織培養ウェルを、4℃で一晩に渡りEHSラミニン(2g/ウェル)(Ca2+-及びMg2+-フリーリン酸干渉溶液、pH7.2(CMF-PBS)中）で予めコーティングし、そして残りのタンパク質結合部位をCMF-PBS中の1％ウシ血清アルブミン(BSA)により室温で2時間に渡りブロッキングした。細胞を、0.02%EDTA(CMF-PBS中)により収穫し、そして血清フリーDMEMで懸濁させた。合計5×104個の細胞を、DMEM中各ウェルへ:1)可溶性分岐多糖類及び抗がん薬; 2)抗がん薬の投与量を変化させず濃度を変えた可溶性分岐多糖類;又は3)抗がん薬の投与量を変化させ濃度を変えない可溶性分岐多糖類、の有無で加えた。37℃で2時間15分に渡るインキュベーション後、細胞をCMF-PBSで洗浄し、そして吸着細胞をメタノールで固定化して写真を撮り、吸着細胞の相対数を標準的な手法により特定した(Zollner, Tら, Anti-cancer Research, (1993), vol.13, pp.923-930, 開示内容の全ては本明細書中参照によって組み込まれている)。細胞をメチレンブルーで染色し、しかる後にHCl-エタノールを添加し、色素を放出させて、光学密度(650 m)をプレートリーダーによって測定した。
【００７７】
細胞をCMF-BPS中、0.02%EDTAで剥がし、そしてCMF-PBS中、1×106細胞/mLの濃度で、20 g/mLのアシアロフェツイン及び0%〜0.5%の可溶性分岐多糖類もしくは0%〜0.5%可溶性分岐多糖類の有無で懸濁させた。0.5mLの細胞懸濁の当量を含むアリコートを、シリコンガラス管へ配置し、そして37℃において80rpmで60分に渡り攪拌した。次いで、凝集を、CMF-BPS中、細胞を1％ホルムアルデヒドで固定化することによって終了させた。サンプルを、単一の細胞の数を計測するために使用し、そして生ずる凝集を以下の等式を使用することで計算した:(1-Nt/Nc)×100(式中、Nt及びNcはそれぞれ試験した化合物の存在下且つコントロールバッファー(CMF-PBS)中での単一の細胞の数を示す）。
【００７８】
ガレクチン-3へ結合する多糖類
組換えガレクチン-3はまた、アシアロフェツイン親和性カラムを介する単一の精製段階によって細菌細胞から抽出することができうる。ラクトースによって溶出させた組換えガレクチン-3を、使用前に、CMF-PBSに対して過剰に透析した。セイヨウワサペルオキダーゼ(HRP)-結合ウサギ抗ラットIgG+IgM及び2,2'-アジノ-ジ(3-エチルベンゾチアゾリンスルホン酸)(ABTS)基質キットをZymed, South San Francisco,CAから購入できうる。B16-F1マウスメラノーマ細胞を、上記のとおりDulbeccoの可溶性分岐Eagleの最小基本培地(DMEM)で増殖させた。
【００７９】
96ウェルプレートの組織培養ウェルを0.5%MCP及び1%BSAを含むCMF-PBSでコーティングし且つ一晩乾燥させた。CMF-PBS(0.5%BSA及び0.05%Tween-20(溶液A)を含む)中、50 mMのラクトースの存在又は不在下で連続的に希釈した組換えガレクチン-3を加えて120分に渡り希釈し、その後、細胞を排出してCMF-PBS(0.1% BSA及び0.05% Tween-20を含む）(溶液 B)で洗浄した。溶液A中の抗ガレクチン-3を加えて60分に渡りインキュベートし、しかる後に、溶液Bで洗浄して溶液A中HRP-結合ウサギ抗ラットIgG+IgMとで30分に渡りインキュベートした。洗浄後、各ウェルにおける結合した酵素の相対量をABTSの添加によって確認した。加水分解の程度を、405nmで測定する。
【００８０】
細胞をCMF-PBS中0.02%EDTAで剥がして1×103細胞/mLにおいて完全DMEM中:1)可溶性分岐多糖類及び抗がん薬;2)抗がん薬の投与量を変化させずに濃度を変化させる可溶性分岐多糖類;又は3)抗がん薬の投与量を変化させ濃度を変化させない可溶性分岐多糖類の有無で懸濁させた。細胞を、30分に渡り、37℃でインキュベートし、次いで、45℃で予め暖めておいた蒸留水-完全DMEM中の1％アガロース溶液(1:4,v/v)と混合1:1(v/v)した。その後、2Lアリコートの当該混合物を、直径6cmの皿における1%アガロースのプレキャスト層の上部へ配置した。細胞を37℃で14日に渡りインキュベートし、そして形成されたコロニーの数を、2.6%グルタルアルデヒド(CMF-PBS中)の添加による固定化後、倒立相顕微鏡を使用することで特定した。
【００８１】
可溶性組換えガレクチン-3及び抗Mac-2モノクローナル抗体を使用する競合結合アッセイも行い、ラミニンに対する細胞接着による効果(又はそれらを欠く)を確認するために行い、それによって、可溶性分岐多糖類が抗がん薬との組み合わせにおいてどのようにして作用するのかのいくつかの考察を解明する。
【００８２】
ガレクチン-3 異型凝集転移アッセイ
MAT-LyLu(MLL)亜系統が、急速に増殖する、分化に乏しいアデノカルシノーマ細胞系統である。可溶性分岐多糖類の存在又は不在下で、ラット大動脈内皮(RAE)細胞のコンフルエント単層に対するCr-標識MLL細胞の接着を調べた。最初に、MLL及びRAE細胞をRPMI1640培地(10%胎児ウシ血清を補捉した)中で増殖させた。RAE細胞を組織培養ウェル中でコンフルエントに増殖させた。合計2.4×106MLL細胞を30分に渡り5CiのNa5CrO4と37℃で、2mLの血清フリー培地(0.5%のウシ血清アルブミン(BSA)を伴う)でインキュベートした。十分な洗浄後、4連において1×103個のMLL細胞/ウェルをRAE細胞単層へ加えた。
【００８３】
MLL細胞の接着を、独立して様々な濃度の可溶性分岐多糖類と抗がん薬の組み合わせにおける存在又は不在下での、4℃、90分に渡り以下のように評価した。細胞を、未結合の細胞を除去するために冷リン酸干渉塩類溶液中で3回アッセイし、次いで、0.1NのNaOHで30分に渡り37℃で溶解させ、その点において、各ウェルにおける放射活性をβカウンターにおいて測定した。抗がん薬との組み合わせにおける独立して濃度を変えた可溶性分岐多糖類の存在又は不在下でのRAE細胞のコンフルエント単層に対するMLL細胞の接着に関する時間経過をモニタリングした。
【００８４】
代替的に、このアッセイの他の変形において、MLL細胞のRAE細胞への接着を、蛍光法によりモニタリングした。最初に、1×105個のMLL細胞を、当該細胞を蛍光標識するために0.1% FITC中で30分に渡りインキュベートした。細胞を過剰に洗浄後、RAE細胞単層（0.5%BSA中)へ加えた。独立して、様々な濃度の可溶性分岐多糖類と抗がん薬組み合わせを、30又は60分に渡り加えた。次いで、培養物を、非接着細胞を除去するために洗浄し、そして接着のレベル、又は非接着のレベルを蛍光測定に基づいて評価した。
【００８５】
可溶性分岐多糖類のガレクチン-3への結合を解決するために、酵素結合免疫吸着剤アッセイを使用した。これにより、組換えガレクチン-3が、投与量依存態様で固定化した可溶性分岐多糖類へ結合できるか、そしてもし結合が生ずれば、それをラクトースにより遮断できるかどうかが特定された。かかるアッセイの結果により、本発明により、抗がん薬との組み合わせにおいて共投与した可溶性分岐多糖類の同型凝集に対する阻害効果の評価が可能になる。
【００８６】
0.5%アガロース上でのMLLコロニー形成に対する抗がん薬との組み合わせにおける可溶性分岐多糖類の効果を特定するために、最初、MLL細胞を0.02% EDTA(Ca2+及びMg2+フリー(CMF)-PBS中）により培養した単層から剥がし、そして4×103細胞/mLの濃度で完全RPMI中、可溶性分岐多糖類を様々な濃度で伴い又は伴わずにインキュベートした。細胞を30分に渡り、37℃でインキュベートし、次いで、予め45℃へ加熱した1％アガロースの溶液(RPMI中1:4(v/v))中1:1 (v/v)で混合した。次いで、混合物の2mLアリコートを、直径6cmの皿における1％アガロースのプレキャスト層へ配置した。細胞を、8日に渡り、37℃で固定化し、計測して写真を撮った。相コントラスト顕微鏡写真を、抗がん薬との組み合わせにおける0.1%(w/v)可溶性分岐多糖類を伴い又は伴わずに、MLL細胞の増殖を示すために準備した。
【００８７】
類似する実験を、in vitroで培養した単層のMLL細胞増殖の速度に対する抗がん薬との組み合わせにおける可溶性分岐多糖類の効果を調べるために行うことができ、そして結果をin vivo実験で獲得された結果と比較することができうる。このようにして、可溶性分岐多糖類/抗がん薬による共治療が細胞傷害性をもたらすかどうかについても情報を得られうる。可溶性分岐多糖類と抗がん薬の存在下で、軟アガー中、コロニーを形成する他の腫瘍細胞の例えば、B16-Fメラノーマ、UV-2237繊維芽肉腫、HT1080ヒト繊維芽肉腫、及びA375ヒトメラノーマの能力をも調べることができうる。実験は、MLL細胞について上記に類似して行われるだろう。
【００８８】
実施例6:In vivoアッセイ-抗がん薬又は更に抗血管新生薬との組合わせにおける多糖類
前立腺がんのDunning(R3327)ラット前立腺がんモデルは、オスのラットにいて発見した偶然生じた腺がんからDunningによって開発された(Dunning, W., Natl. Cancer Inst. Mono., (1963), vol. 12, pp. 351-369, その開示内容は本明細書中参照によって組み込まれている)。いくつかの亜系統は一次腫瘍から開発され、一次腫瘍は、多彩な分化及び転移特性を有する(Isaacs, J.ら, CancerRes.,(1978),vol.38,pp.4353-4359,その開示内容は本明細書中参照によって組み込まれている)。1×106個のMLL細胞を、ラットの大腿部への注射することにより、重篤な一次腫瘍負荷に次いで、約25日で動物の死がもたらされる(Isaacs,J.ら.,The Prostate,(1986),vol.9,pp.261-281;及びPienta,K.ら, The Prostate,(1992),vol.20,pp.233-241、その開示内容は本明細書中参照によって組み込まれている)。一次MLL腫瘍は、腫瘍細胞接種の12日後に転移を開始し、そしてこの時間の前の手肢切断による一次腫瘍の除去が動物へ治癒をもたらす。もし、切断が12日後に行われれば、大部分の動物は40日以内に肺及びリンパ節転移により死ぬ(Isaacs,J.ら., The Prostate,(1986),vol.9,pp.261-281、その開示内容は本明細書中参照によって組み込まれている)。
【００８９】
抗がん薬との組み合わせにおける可溶性分岐多糖類を、これらの腫瘍における偶然の転移に対する効果を調べるために、抗がん薬を基本的に習慣的にラットへ飲料水中で与えた。ラットを、0日目に後肢において1×106 MLL細胞を注射した。4日目に、一次腫瘍がサイズ1cmに到達した場合、0.01 %、0.1%、又は1.0%(w:v)の可溶性分岐多糖類及び抗がん薬を、基本的に連続的にラットの飲料水へ加えた。14目に、ラットを麻酔して後肢を切断することによって一次腫瘍を除去した。次いで30日後、ラットを犠牲にして解剖した。コントロール及び処理した動物を観察できる毒性についてモニタリングした。
【００９０】
30日目に、肺を除去し、水中で洗浄して一晩Bouin溶液中で固定化した。肺転移を患う多くのラットをコントロールのものと比較して記録した。MLL腫瘍コロニーの数を、解剖顕微鏡下での計測によって特定した。可溶性分岐多糖類/抗がん薬の共治療による効果を、飲料水における濃度の関数としてモニタリングした。
【００９１】
研究全体を通じて、処理した動物を明らかな毒性及び体重増加についてモニタリングし、そして結果を、多糖類を与えていないコントロール集団と比較した。日々の水接種を、コントロール及び処理集団の両方において30±4mL/ラットに維持した。処理期間全体を通じて髪の毛の質感、全体的な挙動、及び便色もモニタリングし且つ処理した動物及びコントロール動物について記録した。
【００９２】
コントロール及び処理された動物は、適切に体重増加し、そして、可溶性分岐多糖類/抗がん薬処理した動物において、抗がん薬単独でのコントロール治療に比較して確認できるほどの更なる毒性は確認されなかった。肺転移を患うラットの数は、上記のように、抗がん薬と組み合わせて可溶性分岐多糖類を与えた動物では、抗がん薬単独、多糖類単独、個々の単糖類残基を与えた、又は多糖類もしくは抗がん薬を与えなかった場合に比べて減っていた。効果の類似のパターンがリンパ節疾患において確認された。
【００９３】
類似の実験において、ラットに経口的に、抗がん薬、抗血管新生薬、及び可溶性分岐多糖類の組み合わせをそれらの飲料水において与えた。プロトコル及び手順は、更なるコントロール(例えば、抗がん薬を伴う可溶性分岐多糖類;抗血管新生薬を伴う可溶性分岐多糖類; 可溶性分岐多糖類の存在下で抗がん薬及び抗血管新生薬;抗がん薬単独;抗血管新生薬単独;並びに可溶性分岐多糖類単独)が必要であったことを除けば、多糖類を伴う抗がん薬のみの投与について記載したものと類似する。
【００９４】
コントロール及び共に処理された動物は、適切に体重増加し、そして、抗がん薬単独又は抗血管新生薬単独でのコントロール治療に比較して、確認できるほどの更なる毒性は、可溶性分岐多糖類/抗血管新生薬処理した動物において確認されなかった。肺転移を患うラット及び血管新生の徴候を示した動物の数は、上記のように、公知の抗がん薬及び抗血管新生薬との組み合わせにおいて可溶性分岐多糖類を与えた動物では、抗血管新生薬単独、多糖類単独、個々の単糖類残基を与えた、又は多糖類もしくは抗がん薬を全く与えなかった動物に比べて減っていた。効果の類似のパターンがリンパ節疾患において確認された。
【００９５】
この実験処理は、無毒性経口投与可溶性分岐多糖類を推定抗がん薬との組み合わせにおいて、又は抗がん薬と推定抗血管新生薬との組み合わせにおいて使用し、偶発的ながん転移及び関連する血管新生を治療する改良された方法を示すために設計されている。
【図面の簡単な説明】
【００９６】
【図１】20g/LのUSPペクチンの、10mM H2O2、10mMアスコルビン酸塩、及びその5mMずつの組合せによる消化を示し、消化時間と粘度計測定の直線関係を示す。
【図２】アルカリ性ホウ化水素酸塩(borohydrate)中でのβ除去により、粘度の減少及びゲル化特性の低下を伴う、鎖解裂のコントロールされた過程がもたらされる。
【図３】aは、コントロール「ブランク」のクロマトグラムを示し、そしてbは、注目の多糖類「標準B 3a」のクロマトグラムを示す。
【図４】市販のラムノガラクタン分子量のMALLS結果を示す。
【図５】ラムノガラクタンのZimmプロットを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【国際調査報告】
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