(57)【要約】  生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法は、固相結合材料を使用し、いかなる溶解溶液又は被覆の使用を避けることを開示している。固相結合材料の使用は、細胞の核酸内容物が遊離され、直接的におよび１つの工程で捕捉されることを予想外にも可能とする。新規な方法は、現存の方法を越えて、重要な簡易さを表現する。核酸は、５分以内の下流プロセスのために、適切な形態で捕捉および解離されうる。本発明の方法と組成物で使用する好適な固相材料は、４級オニウム核酸結合部分を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を捕捉する方法において、
ａ）固相結合材料を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程と、
を含む、サンプルからの核酸の捕捉方法。
【請求項２】
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
ａ）固相結合材料を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程と、
ｃ）前記固相結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）随意に前記固相結合材料を洗浄する工程と、
ｅ）前記固相結合材料から結合核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。
【請求項３】
前記生物学材料または細胞材料が、細胞外の核酸、動物、植物または細菌起源の無傷細胞、および動物、植物または細菌起源の無傷細胞を含んでいる組織からなる群から選択される請求項１記載の捕捉方法。
【請求項４】
５分以内で行なわれる請求項２記載の単離方法。
【請求項５】
生物の全血から核酸を捕捉する方法において、
ａ）固相結合材料を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、全血サンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程と、
を含む、全血からの核酸の捕捉方法。
【請求項６】
ｃ）前記固相結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）随意に前記固相結合材料を洗浄する工程と、
ｅ）前記固相結合材料から結合核酸を解離する工程と、
を含む請求項５記載の捕捉方法。
【請求項７】
前記核酸が、前記全血中の白血球内に含まれる請求項５記載の捕捉方法。
【請求項８】
５分以内で行なわれる請求項６記載の捕捉方法。
【請求項９】
前記核酸が、ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択される請求項１記載の捕捉方法。
【請求項１０】
前記核酸が、有機体のゲノムＤＮＡである請求項１記載の捕捉方法。
【請求項１１】
前記固相結合材料が、シリカ、ガラス、焼結ガラス、制御ポアガラス、アルミナ、ジルコニア、チタニア、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、並びに、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される金属材料、から選択される請求項１記載の捕捉方法。
【請求項１２】
前記固相結合材料が磁性反応部分を含む請求項１記載の捕捉方法。
【請求項１３】
前記固相結合材料が共有結合した核酸結合部分を含む請求項１記載の捕捉方法。
【請求項１４】
前記固相結合材料が非共有結合した核酸結合部分を含む請求項１記載の捕捉方法。
【請求項１５】
前記固相結合材料が、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、３級スルホニウム基、４級アンモニウム基および４級ホスホニウム基からなる群から選択される基を含む請求項１記載の捕捉方法。
【請求項１６】
前記共有結合した核酸結合部分が、４級ホスホニウム基を含む請求項１３記載の捕捉方法。
【請求項１７】
前記共有結合した核酸結合部分が、カルボキシル基を含む請求項１３記載の捕捉方法。
【請求項１８】
前記核酸結合部分が、選択的に開裂されうる結合を介して、前記固相結合材料に結合される請求項１３記載の捕捉方法。
【請求項１９】
前記結合核酸が、強アルカリ溶液中で前記固相結合材料から解離される請求項１記載の捕捉方法。
【請求項２０】
前記結合核酸が、下流の分子生物学プロセスで直接使用されうる溶液中で、前記固相結合材料から解離される請求項１記載の捕捉方法。
【請求項２１】
前記結合核酸が、下流の分子生物学プロセスで直接使用されうる溶液中で、前記固相結合材料から解離される請求項１９記載の捕捉方法。
【請求項２２】
前記下流の分子生物学プロセスが、核酸増幅反応である請求項２０記載の捕捉方法。
【請求項２３】
前記下流の分子生物学プロセスが、核酸増幅反応である請求項２１記載の捕捉方法。
【請求項２４】
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を捕捉する方法において、
ａ）核酸結合部分と結合される基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
を含む、サンプルからの核酸の捕捉方法。
【請求項２５】
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
ａ）核酸結合部分と結合される基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
ｃ）前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）随意に固相結合材料を洗浄する工程と、
ｅ）前記固相から結合核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。
【請求項２６】
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を捕捉する方法において、
ａ）選択的に開裂可能な結合を介して、核酸結合部分と結合される基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
を含む、サンプルからの核酸の捕捉方法。
【請求項２７】
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
ａ）選択的に開裂可能な結合を介して、核酸結合部分と結合される基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
ｃ）前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）随意に固相結合材料を洗浄する工程と、
ｅ）結合部分を選択的に開裂させることにより前記固相から結合核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。
【請求項２８】
前記固相が、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類から選択される基質、並びに、式ＱＲ２＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される３級スルホニウム基、式ＮＲ３＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される４級アンモニウム基（４級オニウム基）および式ＰＲ３＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される４級ホスホニウム基から選択される、前記基質の表面に結合されたオニウム基を含む請求項２４記載の捕捉方法。
【請求項２９】
前記固相が、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類から選択される基質、並びに、式ＱＲ２＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される３級スルホニウム基、式ＮＲ３＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される４級アンモニウム基（４級オニウム基）および式ＰＲ３＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される４級ホスホニウム基から選択される、前記基質の表面に結合されたオニウム基を含む請求項２６記載の捕捉方法。
【請求項３０】
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を捕捉する方法において、
ａ）粒子結合材料を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記粒子結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記粒子結合材料を一緒にする工程と、
を含む、サンプルからの核酸の捕捉方法。
【請求項３１】
前記核酸が３分以内に捕捉される請求項３０記載の捕捉方法。
【請求項３２】
前記核酸が３０秒以内に捕捉される請求項３０記載の捕捉方法。
【請求項３３】
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
ａ）粒子結合材料を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記粒子結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記粒子結合材料を一緒にする工程と、
ｃ）前記粒子結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）随意に前記粒子結合材料を洗浄する工程と、
ｅ）前記粒子結合材料から結合核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。
【請求項３４】
５分以内で行なわれる請求項３３記載の単離方法。
【請求項３５】
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を捕捉する方法において、
ａ）粒子結合材料を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記粒子結合材料に結合するために、３分を超えない時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記粒子結合材料を一緒にする工程と、
を含む、サンプルからの核酸の捕捉方法。
【請求項３６】
生物学材料または細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
ａ）粒子結合材料を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記粒子結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記粒子結合材料を一緒にする工程と、
ｃ）前記粒子結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）随意に前記粒子結合材料を洗浄する工程と、
ｅ）前記粒子結合材料から結合核酸を解離する工程と、
を含み、５分以内で行なわれるサンプルからの核酸の単離方法。
【請求項３７】
ａ）溶解溶液の使用または溶解試薬のコーティングなしで、生物学材料または細胞材料から直接核酸を捕捉する能力を有し、生物学材料または細胞材料から直接核酸を捕捉するための固相結合材料と、
ｂ）前記固相結合材料から核酸を解離するための試薬と、
を含むキット。
【請求項３８】
前記固相結合材料が粒子材料である請求項３７記載のキット。
【請求項３９】
前記粒子材料が磁性的に反応する請求項３８記載のキット。
【請求項４０】
前記固相結合材料が、シリカ、ガラス、焼結ガラス、制御ポアガラス、アルミナ、ジルコニア、チタニア、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、並びに、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される金属材料、から選択される請求項３７記載のキット。
【請求項４１】
前記固相結合材料が共有結合した核酸結合部分を含む請求項３７記載のキット。
【請求項４２】
前記核酸結合部分が、選択的に開裂されうる結合を介して、前記固相結合材料に結合する請求項４１記載のキット。
【請求項４３】
前記固相結合材料から核酸を解離するための試薬が、強アルカリ溶液である請求項４１記載のキット。
【請求項４４】
前記固相結合材料が、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、３級スルホニウム基、４級アンモニウム基および４級ホスホニウム基からなる群から選択される基を含む請求項３７記載のキット。
【請求項４５】
前記共有結合した核酸結合部分が、４級ホスホニウム基を含む請求項４１記載のキット。
【請求項４６】
前記共有結合した核酸結合部分が４級ホスホニウム基を含み、前記固相から核酸を解離するための試薬が、強アルカリ溶液である請求項４２記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、特に、生物学起源の材料でとりわけ血液および細胞の培養組織からの全体ゲノム核酸、を捕捉および単離するための簡易な方法に関する。さらに、本発明は、これらの方法で有用な固相結合材料を含んでいるキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
分子診断（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）および分子生物学における最新の技術（逆転写、クローニング、制限分析、増幅、および配列解析を含む）においては、核酸の抽出が要求される。核酸を得ることは、標的核酸が見出されるのが基質（ｍａｔｒｉｘ）サンプルの複合物中であるために、複雑である。かかるサンプルには、例えば、組織（ｔｉｓｓｕｅｓ）からの細胞、体液からの細胞、血液、培養組織中の細菌細胞、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、または標的核酸の増幅から得られる溶液が含まれる。基質サンプルはしばしば顕著な量の汚染物質を含み、関心のある核酸を分子生物学的または診断技術において使用する前に、これらをその核酸から除去しなければならない。
【０００３】
上述のような細胞や組織より生成される混合物から標的核酸を得るための慣用の技術には、フェノール、クロロホルム、および臭化エチジウム等の有害な化学薬品の使用が必要となる。フェノール／クロロホルム抽出は、標的核酸と様々な汚染物質との混合物から汚染物質を抽出するためのかかる手法において用いられる。あるいはまた、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配が、公知技術の方法として使用される。例えば、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」，サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著（１９８９），コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ），１．４２〜１．５０頁を参照。後者の方法は、一般に、エタノールまたは２−プロパノールを水相に添加して核酸を沈殿させることにより、抽出された水相中に残留する核酸材料を沈殿することによる。沈殿物は、通常は遠心分離により溶液から除去され、結果として得られる沈殿物のペレットは、さらなる使用のために水または緩衝液中に再懸濁される前に、乾燥される。
【０００４】
様々なタイプの固相を使用する単純かつ迅速な方法が、細胞溶解物または核酸と汚染物質との他の混合物から核酸を分離するために、開発されている。かかる固相には、クロマトグラフィ樹脂、ポリマーおよびシリカ、または、繊維、フィルターおよび被覆された容器などの様々な外形および形態でのガラスベース材料が含まれる。小さな微粒子の形態である場合には、磁性コアが時に分離の実行において助けを与える。
【０００５】
全血からのＤＮＡ抽出ＤＮＡは、血液中の白血球から抽出される。血液は、通常、赤血球を選択的に溶解するために処理され、沈殿または遠心分離工程の後に、無傷白血球が、核酸内容物を露出させるために分離して溶解される。タンパク質は蒸解され、得られたＤＮＡは固相で分離され、次いで配列多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の決定、配列解析、ＲＦＬＰ分析、突然変異検出または他のタイプの診断分析のために使用される。欧州特許ＥＰ０７９６３２７Ｂ１号公報に開示された方法は、粒子の固体支持体の存在下で、細菌の培養組織あるいは全血等の細胞−含有サンプルと溶解洗浄剤を混合することを含む。対照的に本方法では、いかなる洗浄剤または溶解溶液の使用をも排除される。他の方法は、抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）で被覆された粒子で全血から白血球を選択的に捕捉し、次いで捕捉した白血球を溶解する工程を含み、固体支持体上の解離した核酸を捕捉することを含む（米国特許出願２００３／０１８０７５４Ａ１号明細書）。
【０００６】
細菌からの核酸抽出、米国特許５，９９０，３０１号明細書には、溶解とそれに続くアニオン交換体上で遊離した核酸の単離、制御されたイオン強度の溶液での溶離、およびその後のエンドトキシン（ｅｎｄｏｔｏｘｉｎｓ）を除去するための洗浄剤またはクロマトグラフィの支持体での処理による細菌またはウイルスからの核酸の単離方法が開示されている。固体結合支持体材料を含んでいるキットが開発されており、これは細菌の培養組織から、またヒト全血からゲノムを単離する方法に使用するために市場で入手可能である。製品によって供給される手順には、常に、核酸の除去と精製を始める前に細胞が溶解されなければならないことが明記されている。付加的な沈殿工程もまた、固体支持体の使用の前に時々使用される（例えば、Ｋ．スミス（Ｋ．Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１（６），２４４０−３（２００３）；Ｐ．レビソン（Ｐ．Ｌｅｖｉｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，８２７、３３７−４４（１９９８））。
【０００７】
固相材料
核酸の単離に使用される１つのタイプの固相には、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）での使用のために設計された多孔質シリカゲル粒子が含まれる。多孔質シリカゲル粒子の表面は、一定の塩およびｐＨ条件下でプラスミドＤＮＡと交換されるアニオン交換体で官能化されている。例えば、米国特許４，６９９，７１７号および５，０５７，４２６号明細書を参照。これらの固相材料に結合したプラスミドＤＮＡは、高濃度の塩を含んでいる水溶液中で溶離される。そこで溶離された核酸溶液は、下流のプロセスで使用される前に、塩を除去するためにさらに処理されなければならない。
【０００８】
他のシリカベース固相材料には、制御ポアガラス（ＣＰＧ）、シリカ粒子で取り囲まれたフィルター、シリカゲル粒子、珪藻土、ガラス繊維または上記の混合物が含まれる。各シリカベース固相材料は、核酸を含んでいるサンプル中で、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）チオシアネートまたは塩化グアニジニウムなどのカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤の存在下で、可逆的に核酸と結合する。例えば、米国特許５，２３４，８０９号および６，５８２，９２２号明細書を参照。かかる固相は、核酸材料と結合してこれを保持し、残留しているサンプル成分から、基質とそれに結合した核酸材料とを分離するために、固相の遠心分離または減圧ろ過が行われる。核酸材料はその後、水または低塩溶離緩衝液で溶離することにより固相から遊離される。市場で入手可能な核酸単離用のシリカベース固相材料には、例えば、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＤＮＡ精製システム製品（プロメガ（株），マディソン，ＷＩ）、ｔｈｅ  ＱｉａＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ単離システム（（株）キアゲン，サンタクラリタ，ＣＡ）、ハイピュア（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））、およびＧＦＸマイクロプラスミドキット（Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ）（アマルシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））が含まれる。
【０００９】
粒子の形態での重合樹脂も、核酸の単離および精製のために広範に使用されている。カルボキシレート変性重合粒子（バーンズ，エージェンコート（Ｂａｎｇｓ，Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ））は、公知である。４級アンモニウム先端基を有するポリマーは、欧州特許出願公開番号ＥＰ１２４３６４９Ａ１号明細書中に開示されている。このポリマーは共有結合された線状非架橋ポリマーを有する不活性担体粒子である。このタイプの重合固相は一般に、触手（テンタクル）樹脂と呼ばれる。この線状ポリマーは、４級テトラアルキルアンモニウム基を包含する。アルキル基は、メチル基またはエチル基として明示されている（４欄、５２〜５５行）。より長いアルキル基は、望ましくないと考えられる。
【００１０】
アニオン交換則に基づいて核酸と結合するための他の固相材料が、現在使用されている。これらには、ＤＥＡＥ先端基を有するシリカベース材料（（株）キアゲン）および欧州特許ＥＰ０４９６８２２Ｂ１号明細書に記載されたクロマトグラフィ支持体に基づくシリカ−ヌクレオボンドＡＸ（ベクトン  ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），ロシュ−ゲノピュア（Ｒｏｃｈｅ−Ｇｅｎｏｐｕｒｅ））が含まれる。重合トリアルキルアンモニウム基をもつポリマー樹脂が、欧州特許ＥＰ１２４３６４９号明細書中に開示されている（ゲネスキャン（ＧｅｎｅＳｃａｎ））。ＤＮＡ単離用のカルボキシ変性ポリマーは、非常に多くの供給先から入手可能である。核酸は、高塩条件下で引き寄せられて、低イオン強度条件下で解離される。
【００１１】
細胞を溶解するための洗浄剤、弱塩基およびキレート試薬を含んでいる組成物で被覆されたろ紙またはメンブラン（ｍｅｍｂｒａｎｅ）等の固体基質あるいは基材を含んでいる材料は、米国特許５，４９６，５６２号、５，７５６，１２６号、６，６４５，７１７号および６，７４６，８４１号明細書に開示されている。コーティングは、溶液として塗布され、次いで基質上で乾燥される。このコーティングは、分離した追加の層であり、材料の一体化した部分ではない。更に、核酸は、次の加熱工程によって基質に固定される。
【００１２】
カチオン性のトリメチルアミンを外側に有する重合マイクロキャリアビーズは、米国特許６，２１４，６１８号明細書に開示されている。このビーズは、比較的大きな径（７５〜２２５μｍ）を有し、細胞の結合と培養組織中での成長のための支持体として有用である。これらのビーズについて、核酸を捕捉すること、または核酸と結合することは報告されていない。
【００１３】
磁性反応粒子もまた、核酸を単離する際に固相として使用するために開発されている。核酸単離用に設計された幾つかの異なるタイプの磁性反応粒子は公知技術であり、かつ、いくつかの出所から市場で入手可能である。可逆的に核酸材料と結合する磁性粒子には、まさにマグネシル（Ｍａｇｎｅｓｉｌ）（登録商標）粒子（プロメガ（株））が含まれる。磁性粒子は、ｍＲＮＡのポリＡ末端とのハイブリッド形成のために結びついたオリゴｄＴ末端を有する共有結合されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して、可逆的にｍＲＮＡと結合することも知られている。
【００１４】
種々のタイプの磁性反応シリカベース粒子を、核酸結合単離法において固相として使用することは公知である。かかるタイプの１つは、磁性反応ガラスビーズであり、好ましくは、ＣＰＧ社（リンカーンパーク，ＮＪ）から磁性ポアガラス（ＭＰＧ）粒子として入手可能な制御ポア径を有するもの、または、米国特許４，３９５，２７１号，４，２３３，１６９号，４，２９７，３３７号、もしくは６，２５５，４７７号明細書に記載された磁性ポアガラス粒子である。核酸の結合および単離のために有用な他のタイプの磁性粒子は、重合二酸化シリコン化合物の基質中に磁性材料を混合することにより製造される。例えば、ドイツ特許ＤＥ４３０７２６２Ａ１号、米国特許５，９４５，５２５号、６，０２７，９４５号および６，２９６，９３７号明細書参照。４級アンモニウム基を有するセルロース基質に固定された酸化鉄ナノ粒子を含んでいる磁性粒子は、ＭａｇａＣｅｌｌ−Ｑ（登録商標）としてコルテックスバイオケム（Ｃｏｒｔｅｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）により市場で製造されている。
【００１５】
誘導可能な磁性特性を有する粒子またはビーズは、磁石の存在下で一時的に磁性特性を発現しうる金属酸化物を形成するための遷移金属、例えば、鉄、ニッケル、銅、コバルトおよびマンガンの小粒子を含む。これらの粒子は、常磁性体または超常磁性体と呼ばれる。常磁性体または超常磁性体ビーズを形成するために、金属酸化物は、水中で比較的安定なポリマーで被覆される。米国特許４，５５４，０８８号明細書には、重合シランの層により被包された金属酸化物コアを含んでいる常磁性体粒子が開示されている。米国特許５，３５６，７１３号明細書には、疎水性ビニル芳香族モノマーの殻で被包された磁化しうる粒子のコアを含む、磁化しうるミクロスフェアが開示されている。米国特許５，３９５，６８８号明細書には、混合された常磁性体金属酸化物−ポリマー層で被覆されたポリマーコアが開示されている。他の方法は、ポリマーコアを、例えば米国特許４，７７４，２６５号明細書中におけるように、金属酸化物を吸着するために利用する。常磁性体金属酸化物層で被覆された重合コアを含んでいる磁性粒子は、米国特許５，０９１，２０６号明細書中に開示されている。この粒子は、その後さらに、金属酸化物層を遮蔽するとともに反応性コーティングを与えるために、付加的な重合層で被覆される。米国特許５，８６６，０９９号明細書には、タンパク質の存在下で２つの金属塩の混合物を共沈させて、金属塩を配位結合させるとともに、混合された金属酸化物を捕捉する磁性粒子の調製が開示されている。非常に多くの典型的な金属塩対が記載されている。米国特許５，４１１，７３０号明細書には、沈殿された混合金属酸化物をデキストラン、オリゴ糖類中で捕捉する、類似の方法が記載されている。
【００１６】
ＤＮＡおよびＲＮＡを不可逆的に捕捉するためのアルミナ（酸化アルミニウム）粒子が、米国特許６，２９１，１６６号明細書に開示されている。結合核酸は、ＰＣＲなどの固相増幅法での使用に、利用できる。
【００１７】
これらの固相材料に結合したＤＮＡは、高濃度の塩を含んでいる水溶液中で溶離される。これらから溶離された核酸溶液は、下流のプロセスで使用される前に、塩を除去するためにさらに処理されなければならない。対称的に、シリカベース材料に結合した核酸は、水または低塩溶離緩衝液での溶離により、固相から遊離される。米国特許５，７９２，６５１号明細書には、細胞内のトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）での核酸の能力を増大させ、核酸のクロマトグラフィ単離のための組成物が開示されている。この組成物は、２−プロパノールと任意の塩と緩衝材料を含んでいる水溶液を含む。
【００１８】
さらに、磁性マイクロコアを含むアガロースまたはセルロース粒子を含んでいる他の磁性固相材料は、高濃度の塩とポリアルキレングリコールを含んでいる組成物での処理により、核酸に結合して核酸を保持することが報告されている（例えば、米国特許５，８９８，０７１号明細書およびＰＣＴ公報ＷＯ０２０６６９９３号）。核酸は、水または低イオン強度緩衝液での処理により、続いて解離される。
【００１９】
本出願人により出願中の、米国出願番号１０／７１４，７６３号、１０／７１５，２８４号および１０／８９１，８８０号、１０／９４２，４９１号および６０／６３８，６３１号明細書は、ここで参照として受け入れられ、開裂可能な材料と核酸の結合および解離の方法を含めて、新規な固相核酸結合材料を開示する。
【００２０】
トリブチルホスホニウム先端基を有する重合ビーズは、３相システムでの相転写触媒としての使用について開示されている。このビーズは、架橋ポリスチレンから調製される（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  ＩＩ，１８２７−１８３０，（１９８３））。アルキレン鎖およびアルキレンエーテル鎖を介して架橋ポリスチレン樹脂に結合されたペンダント型のトリアルキルホスホニウム基を有するポリマービーズも開示されている（トモイ（Ｔｏｍｏｉ）ら，Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，１８７（２），３５７−６５（１９８６）；トモイ（Ｔｏｍｏｉ）ら，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ，Ｓｏｒｂｅｎｔｓ，３（４），３４１−９（１９８５））。架橋ポリスチレン樹脂をベースとする混合された４級アンモニウム／ホスホニウム不溶性ポリマーは、触媒および殺生物剤として開示されている（ダビデシュー（Ｄａｖｉｄｅｓｃｕ）ら，Ｃｈｅｍ．Ｂｕｌｌ．Ｔｅｃｈｎ．Ｕｎｉｖ．Ｔｉｍｉｓｏａｒａ，４０（５４），６３−７２（１９９５）；パルベルシュー（Ｐａｒｖｕｌｅｓｃｕ）ら，Ｒｅａｃｔｉｖｅ＆Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，３３（２，３），３２９−３６（１９９７））。
【発明の開示】
【００２１】
本発明の第１の目的は、生物学材料および細胞材料から核酸を捕捉するための簡易で迅速な方法を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、生物学材料および細胞材料から核酸を単離するための簡易で迅速な方法を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、有機体の血液画分または全血から核酸を捕捉および単離するための方法を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、細胞培養組織（ｃｕｌｔｕｒｅｓ）から核酸を捕捉および単離するための方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、５分以内に生物学材料および細胞材料から核酸を捕捉および単離するための方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
図１は、本発明による血液サンプルからの核酸の単離を概略的に示す。
【００２７】
図２Ａは、実施例２の粒子を使用して、ヒト血液サンプルから単離したＤＮＡを表すゲル像である。図２Ｂは、図２Ａで単離したゲノムＤＮＡの範囲の増幅を表すゲル像である。
【００２８】
図３は、実施例２または実施例７の粒子と様々な添加剤を使用して本方法により単離したゲノムＤＮＡの範囲の増幅を表すゲル像である。
【００２９】
図４は、本発明の様々な粒子を使用して、ヒト血液サンプルから単離したＤＮＡを表すゲル像である。
【００３０】
図５Ａは、実施例２または４の粒子を使用し、様々なＮａＯＨ濃度で溶離してヒト血液サンプルから単離したＤＮＡを表すゲル像である。図５Ｂは、図５Ａに示した単離したゲノムＤＮＡの範囲の増幅を表すゲル像である。
【００３１】
図６は、本発明の様々な粒子を使用して、ヒト血液サンプルから単離したＤＮＡを表すゲル像である。
【００３２】
発明の詳細な説明
定義
アルキル基−１〜２０個の炭素原子を含む分岐、直鎖または環状炭化水素基であり、水素原子以外の１またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。ここで使用されるような低級アルキル基は、炭素原子を８個まで含むアルキル基に当てはまる。
【００３３】
アラルキル基−アリール基で置換されたアルキル基である。
【００３４】
アリール基−１〜５個の炭素環式芳香環を含む芳香環含有基であり、水素原子以外の１またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００３５】
生物学材料−全血、凝固を阻止した全血、組織（ｔｉｓｓｕｅ）、細胞、細胞内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）、細胞外の核酸、ウイルスを含む。
【００３６】
細胞材料−無傷細胞または材料であり、動物、植物または細菌起源の無傷細胞を含有する組織を含む。
【００３７】
細胞の核酸内容物−細胞材料中に見られる核酸に関連し、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよび、ウイルスやプラスミドを含む感染要因由来のもの等の他の核酸である。
【００３８】
磁性粒子−外部磁場に対し反応する粒子、微粒子またはビーズである。この粒子はそれ自体が磁性体、常磁性体または超常磁性体であってよい。強磁性材料を用いる場合のように、外部磁石かまたは適用された磁場に引き付けられてもよい。粒子は、磁性的に反応し、１またはそれ以上の非磁性的に反応する層により被包された固体コア部分を有してもよい。あるいはまた、磁性的に反応する部分は周囲の層であってもよく、または、非磁性的に反応するコア内に配置された粒子であってもよい。
【００３９】
オリゴマー、オリゴヌクレオチド−ここに使用されるものとして、ホスホジエステルヌクレオチド間結合および５’−末端モノホスフェート基を含む化合物が当てはまる。ヌクレオチドは、通常生ずるリボヌクレオチドＡ，Ｃ，ＧおよびＵまたはデオキシリボヌクレオチドｄＡ，ｄＣ，ｄＧおよびｄＴであってよい。
【００４０】
核酸−ポリヌクレオチドはＤＮＡ，ＲＮＡまたはＰＮＡ等の合成ＤＮＡ類似体であってよい。これら３つのいかなるタイプの鎖の一本鎖化合物および二本鎖ハイブリッドもまた、この用語の範囲内である。
【００４１】
解離、溶離−溶液または組成物と接触させることにより、固相材料の表面またはポアに結合した材料の実質的な部分を除去すること。
【００４２】
サンプル−核酸を含むかまたは含んでいる可能性のある流体である。本発明の方法において使用可能である代表的なサンプルは、集められた血液検体に通常見られるように凝固を阻止したものでもよい血液、血漿、漿液、尿、精液、唾液等の体液、細胞培養組織、組織抽出物等を含む。他のタイプのサンプルには、溶剤、海水、工業用水サンプル、食品サンプル、ならびに、土壌または水、植物材料、原核生物、真核生物、細菌、プラスミド、およびウイルス由来の細胞等の環境サンプルが含まれる。
【００４３】
固相材料−核酸分子を引き寄せ得る表面を有する材料である。この材料は、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態を有してよい。
【００４４】
置換−１つの基内における少なくとも１個の水素原子の、非水素基による置換に当てはまる。置換基に関しては、明確に他のことを示している場合を除き、置換基が複数となる点が存在し得ることを意味することに留意すべきである。
【００４５】
慣例的に、核酸は、種々のサンプルタイプから様々な技術によって抽出、単離され、その他の方法で精製される。これらの技術の多くは、核酸に対するいくらかの親和力による材料の表面への選択的吸着による。他の強固でない結合成分を除去するための洗浄工程後、固相は、結合核酸を除去するか、または溶離するために溶液で処理される。
【００４６】
細胞材料の一部からゲノム核酸を抽出して単離することは、しばしば必要である。そうして得られた核酸は、増幅、診断テスト、突然変異の分析、遺伝子の表現プロファイリング（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）およびクローニングを含む次のプロセスで使用される。本発明の方法により単離されうる核酸からのサンプルには、細菌の培養組織、体液、全血と血液成分、組織抽出物、植物材料および細胞材料を含む環境サンプルが含まれる。
【００４７】
公知の方法による細胞の核酸内容物の除去は、内部にアクセスするために細胞膜または細胞壁の破裂あるいは浸透を必要とする。この目的のために、従来の方法では細胞溶解工程を使用していた。これらの方法の１つは、溶解するために試薬を使用する。溶解溶液には、使用される溶解の方法に依存して２つのタイプがある。１つのタイプは、アルカリ溶解用の高ｐＨ水溶液である。もう１つのタイプは、細胞膜を粉砕するために１つまたはそれ以上の界面活性剤あるいは洗浄剤を使用する。溶解溶液は、また細胞の核酸内容物の遊離を助けるために、プロテイナーゼ酵素等の消化酵素を含んでもよい。他の方法は、捕捉工程の前に、完全な細胞を粉砕するために、硬い粒子とともに超音波あるいは制御された振動をもって細胞を機械的に破壊する、予備的工程を採用する。
【００４８】
本出願人は、新規な方法および新規な固相結合材料を開発し、これらは、ウイルス、プラスミド、細胞外のＤＮＡまたはＲＮＡ、全血、凝固を阻止した血液、あるいは細菌等の、生物学および細胞材料のサンプルからの核酸の迅速な捕捉および単離に使用され、いかなる予備的な溶解工程をも必要としない。固相結合材料は、細胞の核酸内容物を一工程で捕捉することを、予想外にも可能とした。新規な方法は、溶解溶液の使用を排除したことから、迅速性、簡易性、利便性及び自動化の容易性において著しい改善を示している。
【００４９】
本発明の１つの側面は、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の捕捉方法を提供する。
ａ）固相結合材料を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程。
【００５０】
本発明の他の側面は、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の単離方法を提供する。
ａ）固相結合材料を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる細胞材料のサンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程と、
ｃ）前記固相結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）随意に前記固相結合材料を洗浄する工程と、
ｅ）前記固相結合材料から結合核酸を解離する工程。
【００５１】
生物学サンプルから核酸を捕捉または単離する従来の方法と異なって、細胞を溶解する予備的工程はない。さらに、溶解試薬、洗浄剤、界面活性剤またはカオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅ）は、固相結合材料とサンプルを接触する前、それと同時、またはその後にも使用されず、あるいは必要とされない。必要とされるのは、短い時間で固相と細胞材料のサンプルを接触させることだけである。以下の実施例に示すように、接触時間は３分あるいはそれより短く、若干の場合には、３０秒程の短い時間でかなりの量の核酸を捕捉することができる。捕捉された量は、ゲル電気泳動、蛍光染色、ＰＣＲ増幅等の通常の技術により、固相から解離された後、容易に検出することができる。
【００５２】
便宜のため、固相結合材料は、水、または溶解もしくは細胞の分解を起こすことが知られていない溶液もしくは緩衝液中のサンプルに加えることができる。一方で、固相結合材料は、乾燥した固体として直接サンプルに加えることもできる。
【００５３】
本発明の好適な側面は、次の工程を含む生物の全血からの核酸の捕捉方法を提供する。
ａ）固相結合材料を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、全血サンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程。
【００５４】
本発明の他の好適な側面は、次の工程を含む有機体の全血中の白血球内に含まれる核酸の捕捉方法を提供する。
ａ）固相結合材料を与える工程と、
ｂ）前記白血球からの前記核酸を前記固相結合材料に結合させるに十分な時間、全血サンプルと前記固相結合材料を一緒にする工程。
【００５５】
上記方法は、次の追加工程を行なうことにより、捕捉した核酸を単離するために使用することができる。
ｃ）前記固相結合材料から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）随意に前記固相結合材料を洗浄する工程と、
ｅ）前記固相結合材料から結合核酸を解離する工程。
【００５６】
本発明の方法で使用する核酸を結合するための固相材料は、そのサイズ、形、多孔性、および物理学的特性を規定する基質を含み、粒子、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態とすることができる。任意の特別な操作理論により洗浄せず結合されたままとする一方、本方法において有効な固相支持体の表面が、サンプルから直接核酸を固定する役割を果たすことができる場合がある。ここで使用されるように核酸捕捉の用語は、通常、その使用の条件下で固相と核酸を結合させるための操作でのいかなる方式をも含んでおり、固相が無傷細胞と結合する場合も同様に予期している。
【００５７】
固相材料は、全血、細菌培養組織等の細胞材料のサンプルから直接核酸と結合する所望特性を有する任意の適切な物質とすることができる。好適な固相材料には、シリカ、ガラス、焼結ガラス、制御ポアガラス、アルミナ、ジルコニア、チタニア、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、並びに、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される金属材料、同様にシリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーまたは不溶性多糖類で被覆された磁性反応材料が含まれる。典型的な材料には、細胞を粉砕して核酸を誘引する役割を有する共有結合した表面官能基で官能化され、あるいは被覆されたシリカベース材料が含まれる。また、好適に表面を官能化された炭水化物ベース材料、およびこの表面官能性をもつ重合材料も含まれる。非常に多くの特有の材料およびそれらの調製が、本出願人により出願中の、米国出願番号１０／７１４，７６３号、１０／７１５，２８４号、１０／８９１，８８０号、１０／９４２，４９１号、もしくは６０／６３８，６３１号明細書に記載されている。
【００５８】
１つの実施形態として、さらにこの材料は、様々な長さの核酸分子の捕捉および結合を可能とする表面、またはその近傍において、共有結合した核酸結合部分を含む。ここで、表面は、固相材料の外表面だけでなく、固相材料内の利用できるいかなる多孔質領域の表面をも意味する。非常に多くの特別な材料とそれらの調製が、本出願人により出願中の、米国出願番号１０／７１４，７６３号、１０／７１５，２８４号、１０／８９１，８８０号、１０／９４２，４９１号および６０／６３８，６３１号明細書に記載されている。
【００５９】
本発明の他の側面は、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の捕捉方法を提供する。
ａ）核酸結合部分と結合させる基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程。
【００６０】
本発明の他の側面は、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の単離方法を提供する。
ａ）核酸結合部分と結合させる基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
ｃ）前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）随意に前記固相を洗浄する工程と、
ｅ）前記固相から結合核酸を解離する工程。
【００６１】
他の実施形態として、さらにこの材料は、様々な長さの核酸分子の捕捉および結合を可能とする表面、またはその近傍において、非共有結合した核酸結合部分を含む。非共有結合した核酸結合部分は、その表面上の、反対に荷電された残基への静電的誘引により固体基質と結合されるか、または、その表面との疎水性引力により結合される。
【００６２】
共有または非共有結合した核酸結合基を有するこれらの材料の基質材料は、いかなる適切な物質であってもよい。好適な基質材料は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、不溶性多糖類、および、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される金属材料、並びに、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーまたは不溶性多糖類で被覆された磁性反応材料から選択される。典型的な材料には、細胞を粉砕して核酸を誘引するために利用する共有結合した表面官能基で官能化され、あるいは被覆されたシリカベース材料が含まれる。また、好適に表面を官能化された炭水化物ベース材料、およびこの表面官能性をもつ重合材料も含まれる。非常に多くの特有の材料およびそれらの調製は、本出願人により出願中の、米国出願番号１０／７１４，７６３号、１０／７１５，２８４号、１０／８９１，８８０、１０／９４２，４９１号および６０／６３８，６３１号明細書に記載されている。核酸結合基として利用される表面官能基には、細胞の構造的な完全性を粉砕し、かつ、固体支持体に核酸を誘引させることのできるいかなる基も含まれる。かかる基には、限定はされないが、ヒドロキシル基、シラノール基、カルボキシル基、アミノ基、アンモニウム基、４級アンモニウムおよびホスホニウム塩並びに以下に記載される３級スルホニウム塩タイプの材料が含まれる。結合のために最初の低ｐＨでプロトン化され、かつ、結合核酸の解離の間に次の高ｐＨで脱プロトン化されるアミノ基を組み込んでいる固相材料、例えば、欧州特許ＥＰ０１０３６０８２Ｂ１号明細書に開示されている材料は、本発明において有用な固相材料の範囲内である。
【００６３】
多くの用途のために、固相材料は粒子の形態であることが好ましい。好ましくは粒子は、約５０μｍより小さい粒子であり、より好ましくは約１０μｍより小さい粒子である。小さい粒子は、溶液中により迅速に分散され、高い表面／体積比を有する。大きな粒子およびビーズもまた、重力沈殿または遠心分離が使用される方法で有用である。さらに、固相は、好ましくは磁性反応部分を含んでいてもよく、この部分は通常、磁性微粒子の形態であり、粒子は磁場により誘引され、操作することができる。かかる磁性微粒子は、磁性金属酸化物または金属硫化物のコアを含み、これは一般に、核酸結合基が共有結合される層であって、吸着結合または共有結合された当該層により囲まれ、これにより表面が被覆されている。磁性金属酸化物コアは、好ましくは鉄酸化物または鉄硫化物であり、ここで鉄は、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋またはその両方である。磁性粒子はまた、米国特許４，６５４，２６７号明細書に開示されているように、多孔ポリマーの存在下で金属粒子を沈殿させて、磁性反応性金属粒子を捕捉することにより形成することができる。これにより調製されうる磁性金属酸化物には、Ｆｅ３Ｏ４，Ｆｅ２Ｏ３，ＭｎＦｅ２Ｏ４，ＮｉＦｅ２Ｏ４，およびＣｏＦｅ２Ｏ４が含まれる。他の磁性粒子はまた、米国特許５，４１１，７３０号明細書に開示されているように、多糖類デキストランの存在下で金属酸化物粒子を沈殿させて、磁性反応性金属粒子を捕捉することにより形成することができる。さらに、他の種類の磁性粒子は、前述の米国特許５，０９１，２０６号明細書中に開示されている。この粒子は、金属酸化物層を遮蔽するとともに反応性コーティングを与えるために、常磁性金属酸化物層および付加的な重合層で被覆された重合コアを含む。クロロメチル化メリーフィールド樹脂を含んでいるマグネタイトの調製は、出版物（テトラへドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４０（１９９９），８１３７−８１４０））中に記載されている。
【００６４】
市場で入手可能な磁性シリカまたは磁性重合粒子は、本発明において有用な磁性固相結合材料の調製における出発材料として使用することができる。表面カルボキシル基を有する好適なタイプの重合粒子は、商品名セラマグ（ＳｅｒａＭａｇ，登録商標）（セラダイン社，Ｓｅｒａｄｙｎ）およびビオマグ（ＢｉｏＭａｇ，登録商標）（ポリサイエンスアンドバーンズラボラトリーズ）により公知である。好適なタイプのシリカ磁性粒子は、商品名マグネシル（ＭａｇｎｅＳｉｌ，登録商標）（プロメガ（株））により公知である。表面にカルボキシル基またはアミノ基を有するシリカ磁性粒子は、ケミセル（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ）ＧｍｂＨ社（ベルリン）から入手可能である。
【００６５】
本出願人は、核酸結合（ＮＡＢ）部分と結合される有機結合基と、被覆なしか、または被覆された金属コアを結合させることで、本発明による磁性反応粒子の結合材料を調製した。被覆された金属コアを使用する場合、便利な被覆コアには、シリカ−被覆磁性コアまたはガラス−被覆磁性コアがある。好適な磁性反応金属コアは、マグネタイト、Ｆｅ３Ｏ４により得られる。マグネタイトは市場において入手可能であり、または、通常知られている方法で、塩基性の溶液中で鉄（ＩＩ）および鉄（ＩＩＩ）塩の反応によって調製することができる。
【００６６】
１つの末端にトリアルコキシシラン基を含んでいる結合基は、シリカまたはガラス−被覆磁性粒子等の被覆金属材料または金属材料の表面に結合されうる。好適なトリアルコキシシラン化合物は、構造式Ｒ１−Ｓｉ（ＯＲ）３を有し、ここでＲは低級アルキル基であり、また、Ｒ１は、直鎖、分岐鎖および環から選択される有機基であって、１〜１００個の原子を含む。この原子は、好ましくは、Ｃ，Ｈ，Ｂ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｓｉ，Ｐ、ハロゲンおよびアルカリ金属から選択される。典型的なＲ１基は、３−アミノプロピル、２−シアノエチルおよび２−カルボキシエチル、並びに、以下により詳細に記載したような開裂可能な部分を有する基である。好適な実施形態として、トリアルコキシシラン化合物は、開裂可能な中央部分と反応基末端部分を含み、ここで反応基は１つの工程で、３級アミン、３級ホスフィンまたは有機硫化物との反応により、４級または３級オニウム塩に転化されうる。
【００６７】
かかる結合基は、フッ化物イオンを用いるプロセスで、金属粒子およびガラスまたはシリカ−被覆金属粒子の表面に付着しうることが見出された。この反応は、低級アルコールおよびトルエン等の芳香族溶剤を含む有機溶媒中で行うことができる。好適なフッ化物源は、かかる有機溶剤中でかなりの溶解性を有し、セシウムフルオライドおよびテトラアルキルアンモニウムフルオライド塩等がある。
【００６８】
本発明の方法で有用な固相結合材料中に含まれるＮＡＢ基は、２つの目的に利用できることが明らかである。ＮＡＢ基は、種々の長さおよび塩基組成または配列をもつオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸を引き寄せて、これらと結合する。これらはまた、細胞の外被から核酸を遊離させるための役割を果す多少の能力を発揮することができる。核酸結合基には、例えば、カルボキシル基、アミン基および３級または４級オニウム基、またはこれらの基の１つ以上の混合が含まれる。アミン基は、ＮＨ２、アルキルアミンおよびジアルキルアミン基であってよい。好適なＮＡＢ基は、４級トリアルキルアンモニウム基（−ＱＲ３＋）、トリアルキルホスホニウム若しくはトリアリールホスホニウムまたは混合アルキルアリールホスホニウム基を含むホスホニウム基（−ＱＲ３＋）、および３級スルホニウム基（−ＱＲ２＋）を含む３級または４級オニウム基である。固相は、ここに記載されているような核酸結合基を一種を超えて含んでもよい。Ｒ基が少なくとも４個の炭素原子をもつアルキル基である３級または４級オニウム基−ＱＲ２＋または−ＱＲ３＋を含んでいる固相材料は、核酸との結合において特に有効であるが、１個程度の少ない炭素原子を有するアルキル基もまた、アリール基と同様に有用である。かかる固相材料は、結合核酸を強固に保持し、かつ、従来技術において公知の溶離のために使用される大抵の条件下で、核酸の除去または溶離を阻害する。低および高イオン強度の両方の大抵の公知の溶離条件は、結合核酸の除去において効果を有しない。ＤＥＡＥおよびＰＥＩ基を含む慣用のアニオン交換樹脂とは異なり、３級または４級オニウム固相材料は、反応媒体のｐＨに関わらず、プラスに荷電されたままである。
【００６９】
ある好適な実施形態では、選択的に切断されうる結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を介してＮＡＢ基が基質に結合する固相結合材料が用いられる。この結合の切断は、固相からいかなる結合核酸をも効果的に分離する。この結合は、明確に開裂可能な結合部分（ｌｉｎｋｅｒ）で結合を切断するが、関心のある核酸を破壊することのない、いかなる化学的、酵素的、光化学的または他の方法によっても開裂させることができる。かかる開裂可能な固相材料は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類、並びに、金属、金属酸化物および金属硫化物から選択される金属材料から選択される基質を含む固体支持体部分を含む。核酸を引きよせて結合するための核酸結合（ＮＡＢ）部分は、開裂可能な結合部分により、固体支持体表面に結合されている。
【００７０】
2008513007.tif 000002
【００７１】
好適な実施形態において、ＮＡＢは、上述したように一般式ＱＲ２＋Ｘ−で示される３級オニウム基または４級オニウム基ＱＲ３＋Ｘ−である。
【００７２】
2008513007.tif 000003
【００７３】
開裂可能な結合部分は、好ましくは、直鎖、分岐鎖および環から選択される有機基であり、１〜１００個の原子を含む。この原子は、好ましくは、Ｃ，Ｈ，Ｂ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｓｉ，Ｐ、ハロゲンおよびアルカリ金属から選択される。典型的な結合基は、加水分解的に開裂可能な基であり、これは加水分解により開裂する。カルボキシエステルおよび無水物、チオエステル、カーボネートエステル、チオカーボネートエステル、ウレタン、イミド、スルホンアミド、およびスルホンイミドは、スルホネートエステルのように、典型的である。好適な実施形態において、開裂可能な結合はアルカリ水溶液で処理される。他の典型的な結合基の種類は、エタンチオール、メルカプトエタノール、およびＤＴＴなどのチオールにより開裂されるジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合などの還元開裂を受ける基である。他の典型的な基は、過酸化（Ｏ−Ｏ）結合を含んでいる有機基である。過酸化結合は、チオール、アミンおよびホスフィンにより開裂可能である。
【００７４】
他の典型的な基は、次式のニトロで置換された芳香族のエーテル及びエステル等の光化学的に開裂可能な結合基である。
【００７５】
2008513007.tif 000004
【００７６】
ここで、Ｒｄは、Ｈ、アルキル基またはフェニル基である。オルト−ニトロベンジルエステルは、以下のよく知られた反応として紫外光により開裂する。
【００７７】
2008513007.tif 000005
【００７８】
他の典型的な開裂可能な基は、酵素的に開裂可能な結合基である。典型的な基には、エステラーゼおよび加水分解酵素により開裂可能なエステル、プロテアーゼおよびペプチダーゼにより開裂可能なアミドおよびペプチド、グリコシダーゼにより開裂可能なグリコシド基が含まれる。
【００７９】
他の典型的な開裂可能な基は、開裂可能な１，２−ジオキセタン部分である。かかる材料は、熱により分解されうるか、または化学反応もしくは酵素剤により断片化を開始されうるジオキセタン部分を含む。オキシアニオンを生成するための保護基の除去は、ジオキセタン環の分解を促進する。断片化（フラグメンテーション）は、過酸化Ｏ−Ｏ結合の開裂により、Ｃ−Ｃ結合と同様に、よく知られたプロセスに従って生ずる。開裂可能なジオキセタンは、非常に多くの特許および出版物に記載されている。典型的な例には、米国特許４，９５２，７０７号、５，７０７，５５９号、５，５７８，２５３号、６，０３６，８９２号、６，２２８，６５３号および６，４６１，８７６号明細書が含まれる。
【００８０】
2008513007.tif 000006
【００８１】
あるいはまた、結合したオニウム基は、アリール基Ａｒに対してか、または、開裂可能な基Ｙに対して、結合可能である。さらにあるいはまた、固相および３級または４級オニウム基に対する結合は、示された方向とは逆である。
【００８２】
他の開裂可能な結合基は、不安定な１，２−ジオキセタン部分に転化されうるエレクトロンリッチＣ−Ｃ二重結合である。二重結合における少なくとも１個の置換基は、Ｏ，ＳまたはＮ原子を用いて二重結合と結合する。エレクトロンリッチ二重結合の一重項酸素との反応により、不安定な１，２−ジオキセタン環基が生成され、このジオキセタン環基は、周囲温度にて自然に断片化して、２つのカルボニル断片を生成する。エレクトロンリッチ二重結合から構成される不安定なジオキセタンは、Ａ．Ｐ．シャップ（Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ）およびＳ．Ｄ．ガグノン（Ｓ．Ｄ．Ｇａｇｎｏｎ），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｍ．Ｓｃｏ．，１０４，３５０４−６（１９８２）；Ｗ．アダム（Ｗ．Ａｄａｍ），Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１１６，８３９−４６，（１９８３）；米国特許５，７８０，６４６号明細書によって例示される非常に多くの特許および出版物に記載されている。
【００８３】
2008513007.tif 000007
【００８４】
開裂可能な結合基を有する固相材料の他の基は、ＰＣＴ公報ＷＯ０３／０５３９３４号に開示されているように、開裂可能な部分としてケテンジチオアセタールを有する。ケテンジチオアセタールは、ペルオキシダーゼ酵素および過酸化水素を用いた酵素の酸化により、酸化開裂を受ける。
【００８５】
2008513007.tif 000008
【００８６】
開裂可能な部分は示された構造を有し、アクリダン環において置換基をもつ類似体を含み、ここでＲａ、ＲｂおよびＲＣはそれぞれ、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜約５０個の非水素原子を含んでいる有機基であり、ここでＲａおよびＲｂは互いに結合して環を形成してもよい。非常に多くの他の開裂可能な基は、熟練した技術者には明らかだろう。
【００８７】
本発明の他の側面は、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の捕捉方法を提供する。
ａ）選択的に開裂可能な結合（ｌｉｎｋａｇｅ）を介して、核酸結合部分に結合される基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程。
【００８８】
さらに、次の工程を含む生物学材料または細胞材料のサンプルからの核酸の単離方法を提供する。
ａ）選択的に開裂可能な結合を介して、核酸結合部分に結合される基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
ｃ）前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）随意に前記固相を洗浄する工程と、
ｅ）結合部分を選択的に開裂することにより前記固相から結合核酸を解離する工程。
【００８９】
好適な実施形態において、固相は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類から選択される基質、並びに、式ＱＲ２＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される３級スルホニウム基、式ＮＲ３＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される４級アンモニウム基および式ＰＲ３＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される４級ホスホニウム基から選択される基質の表面に結合されたオニウム基を含む。
【００９０】
核酸を含んでいる生物学材料または細胞材料のサンプルと固相を一緒にする工程は、サンプル材料と固相結合材料を混合することを伴い、随意に混合物を機械的に攪拌して、細胞材料を粉砕し固相に核酸を結合させるに有効な時間、サンプルの容積内で固相を均一に分散させる。サンプルの核酸内容物のすべてを固相に結合させる必要はないが、可能な限り多く結合させることが有利である。サンプル／固相混合物の攪拌は、振盪、機械的な振動子あるいはロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）、ボルテキシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）、超音波攪拌などを含む任意便宜形態とすることができる。この工程で核酸を結合させるために必要とされる時間は、通常数秒から２，３分のオーダーであるが、日常の実験によって、実験的に立証されうる。
【００９１】
固相からサンプルを分離する工程は、例えば、ろ過、重力沈殿、傾瀉、磁力分離、遠心分離、減圧吸引、および多孔膜またはフィルターマットに液体を強制的に通すための空気または他のガスによる過圧により実施することができる。核酸以外のサンプルの成分は、この工程において除去される。他の成分の除去が完全でない限り、１またはそれ以上の洗浄を行って、それらの完全な除去を助けることができる。塩、生物または細胞の残渣、タンパク質およびヘモグロビンなどのサンプル成分を除去するための洗浄試薬には、水および緩衝剤水溶液があり、界面活性剤を含んでもよい。
【００９２】
固相から結合核酸を解離する工程は、固相から結合核酸を解離させるために溶液と固相材料を接触させることを必要とする。この溶液は、解離した核酸を溶解して、かつ、十分に保護する必要がある。溶液は、ｐＨ約７〜９である緩衝剤水溶液を含む試薬組成物であり、随意に０．１〜３Ｍの緩衝塩、金属ハライドあるいは酢酸塩を含んでいてもよく、随意に０．１〜５０％の有機補助溶剤または界面活性剤を含んでいてもよい。
【００９３】
あるいはまた、開裂後の固相から核酸を解離するための試薬は、強アルカリ水溶液でもよい。少なくとも１０−４Ｍの濃度のアルカリ金属水酸化物または水酸化アンモニウムの溶液は、開裂および開裂した固相からの核酸の溶離に効果的である。強アルカリ溶液は、共役結合の切断により開裂または分断されうる基を介して、核酸結合部分が基質に結合する固相結合材料と共に有用である。かかる材料は、以下および前述の出願中の、米国出願番号１０／７１４，７６３号、１０／７１５，２８４号および１０／８９１，８８０号明細書に記載されている。解離工程は室温で実施することができるが、都合のよいいかなる温度も使用することができる。溶離温度は、核酸を単離する本方法の成功に対し重要ではない。周囲温度が好ましいが、若干の場合には、高温により溶離速度を増大させることができる。
【００９４】
固相核酸の捕捉方法は、非常に多くの用途に用いることができる。以下特有の個々の実施例に示すように、一本鎖と二本鎖の核酸の両方が捕捉され、解離されうる。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡは捕捉および解離されうる。
【００９５】
本方法の好適な用途は、全血からのＤＮＡの単離である。背景技術の欄で上述したように、全血中の白血球からのＤＮＡ抽出も、典型的に扱いにくい多工程プロセスであり、このプロセスは溶液溶解条件下で固体支持体の使用またはオートメーション化を困難にしている。本発明の方法は、従来の方法の限界を克服する。この方法は、操作上簡易であり、固相材料上で核酸内容物を捕捉するための短い時間、固相結合材料と血液サンプルとを混合することのみを必要としている。全体のプロセスは、５分以内に手動で実施することができる。この方法は、固体材料が粒子または微粒子の形態である場合に、特に効果的で迅速である。簡易であり必要とされる時間が短いにもかかわらず、かなりの量の核酸が捕捉される。
【００９６】
これらの方法の重要な利点は、多くの下流の分子生物学プロセスと両立できることである。本方法により単離された核酸は、多くの場合、さらなるプロセスで直接的に使用することができる。ＰＣＲ、米国特許５，９９８，１７５号明細書に記載された多重オリゴマーの連結反応（ＬＭＯ）およびＬＣＲなどの増幅反応には、かかる核酸の溶離剤を使用することができる。慣用技術による核酸の単離、特に細菌細胞の培養組織から、または血液サンプルからの核酸の単離は、低分子量アルコールを高容積パーセントで加えることによる沈殿を必要とする。次いで、沈殿した材料は、使用する前に、分離され、収集され、かつ、好適な溶媒中に再溶解させなければならない。これらの工程は、本方法を使用する本発明の固相結合材料からの核酸の溶離によって不要にすることができる。解離された核酸を含んでいる溶液を直接的に核酸増幅反応において使用して、核酸またはそれのセグメントの量をポリメラーゼまたはリガーゼ仲介反応を用いて増幅させることは、好ましい実施である。
【００９７】
固相結合材料の広い多様性は、前述の欄に記載されており、非常に多くの特有の典型的な材料が、次の特有の実施例における本方法に示されている。当業者ならば、ここに記載された方法の日常的な応用により、適切な材料を決定することができるであろう。
【００９８】
さらに、本発明は、上述の方法に有用な固相結合材料を有するキットに関する。キットは、固相結合材料と、固相から核酸を解離するための試薬とを含む。キットはまた、他の構成要素、例えば、洗浄緩衝液、希釈液または使用説明書を含む。
【００９９】
固相材料は、溶解溶液の使用または溶解試薬の被覆なしで、生物学材料または細胞材料から直接核酸を捕捉する能力を有する。核酸捕捉のためのその使用は、いかなる予備的な溶解工程をも必要とせず、一工程で生物学材料または細胞材料の核酸内容物を捕捉することを可能にする。一実施形態においては、固相材料は、粒子材料または磁性反応粒子材料である。
【０１００】
実施例：
下記実施例に示された構造式の図は、固相材料の開裂可能な結合部分のみを図示することを意図したものである。図は、固相材料の完全な規定を示すものではない。
【０１０１】
実施例１
４’−ヒドロキシフェニル４−クロロメチル−チオベンゾエートの合成
３Ｌのフラスコに１００．９ｇの４−クロロメチル−安息香酸と１．２Ｌの塩化チオニルを入れた。反応では４時間還流し、その後、塩化チオニルを減圧下で除去した。塩化チオニル残留物を、ＣＨ２Ｃｌ２の添加、および減圧下での蒸発により除去した。
【０１０２】
１１３．１ｇの４−クロロメチル安息香酸クロライドの入った３Ｌフラスコに、９８．１７ｇの４−ヒドロキシ−チオフェノールと１．５ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加えた。アルゴンでパージし、６７．７５ｍＬのピリジンを加えた。一晩攪拌後、反応混合物を１ＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、全量５Ｌの水で抽出した。水相はＣＨ２Ｃｌ２で逆抽出した。混合したＣＨ２Ｃｌ２溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、固形物になるまで濃縮した。固形物を５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、ろ過し、風乾した。１Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）：δ４．８０９（ｓ，２Ｈ），６．９４６−６．９６８（ｄ，２Ｈ），７．３２３−７．３４６（ｄ，２Ｈ），７．６４３−７．６６４（ｄ，２Ｈ），８．００４−８．０２５（ｄ，２Ｈ）。
【０１０３】
実施例２
トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有し、ポリメタクリレート結合部分により官能化された磁性シリカ粒子の合成
【０１０４】
2008513007.tif 000009
【０１０５】
磁性カルボン酸により官能化されたシリカ粒子（ケミセル社，ＳｉＭＡＧ−ＴＣＬ，１．０ｍｅｑ／ｇ，１．５ｇ）を２０ｍＬの塩化チオニル中にいれ、４時間還流した。過剰の塩化チオニルを減圧下で除去した。樹脂を２５ｍＬのＣＨＣｌ３に再懸濁し、懸濁液を超音波により分散させた。溶媒を蒸発させ、超音波洗浄処理を繰り返した。粒子をさらなる使用のため、減圧下で乾燥させた。
【０１０６】
酸塩化物により官能化された粒子を３８８ｍｇのジイソプロピルエチルアミンと共に３８ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中で懸濁した。４’−ヒドロキシフェニル４−クロロメチルチオベンゾエート（５２４ｍｇ）を加え、密閉反応フラスコ中で一晩振盪機にて振盪した。粒子を５０ｍＬのプラスチック製試験管に移し、磁性分離にて、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨ３ＯＨ、１：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、次いでＣＨ２Ｃｌ２で繰り返し洗浄した。未反応の可溶性出発材料の除去のため、洗浄液をＴＬＣにてモニターした。さらなる使用の前に、固形物を風乾した。
【０１０７】
アルゴン雰囲気中で、樹脂（１．２３３ｇ）を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁した。トリブチルホスフィン（３９５ｍｇ）を加え、スラリーを７日間振盪した。粒子を５０ｍＬのプラスチック製試験管に移し、４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、次いで４０ｍＬのＭｅＯＨで４回、４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、洗浄した。次いで、樹脂を風乾し、１．１７ｇのライトブラウンの固形物を得た。
【０１０８】
実施例３
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により官能化されたシリケート結合部分の合成
【０１０９】
2008513007.tif 000010
【０１１０】
１３ｍＬのエタノールと７５ｍＬのヘプタン中の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（１３．２ｍＬ）の溶液をアルゴン雰囲気中に置き、５．５ｇの無水コハク酸と共に攪拌した。反応は４．５時間還流し、その後、一晩室温で冷却した。溶媒を除去し、透明のオイルとしてアミド生成物を得た。
【０１１１】
５．５ｇの４’−ヒドロキシ−フェニル４−クロロメチルベンゾエート（実施例１）を加える前に、１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中のＥＤＣ塩酸塩（４．０ｇ）と上記生成物２．８６ｇの溶液をアルゴン雰囲気下に置き、１時間攪拌した。反応は一晩攪拌することにより行った。反応混合物を１５０ｇのシリカを用いクロマトグラフにかけて、１〜２％のＥｔＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶離し、白色の固形物としてカップリングした生成物１．８４ｇを得た。
【０１１２】
実施例４
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により官能化されたシリカ粒子の合成
【０１１３】
2008513007.tif 000011
【０１１４】
アルゴン雰囲気下で、５０ｍＬの乾燥トルエン中の実施例３の生成物（１．８４ｇ）を、オーブンで乾燥させた３．８３ｇのシリカの入ったフラスコにカニューレを介して加えた。反応は、一晩還流した。室温に冷却した後、シリカをろ過し、５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、４時間減圧乾燥させた。
【０１１５】
５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中のクロロベンジル末端基を有する誘導体化されたシリカ（２．０ｇ）を８．０ｇのトリブチルホスフィンと混合した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で２日間攪拌した。シリカをろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２とヘキサンで洗浄し数時間減圧乾燥した。
【０１１６】
実施例５
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により被覆された磁性粒子の合成
【０１１７】
2008513007.tif 000012
【０１１８】
実施例３のシリケート結合部分（０．２５ｇ）を０．５ｇのＦｅ３Ｏ４粒子と、還流トルエン中、アルゴン雰囲気下で一晩攪拌して反応させた。冷却後、固形物とトルエン溶液を５０ｍＬの遠心管に移した。固形物を外部磁石で誘引し、トルエンをデカントし、固形物をトルエンで３回、ＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄した。
【０１１９】
前工程の粒子（０．４０ｇ）を２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に懸濁した。トリブチルホスフィン（１．６ｇ）をこの懸濁液に加え、１．５日間オービタルシェーカー（ｏｒｂｉｔａｌ  ｓｈａｋｅｒ）にかける前に、容器を密栓した。固形物につき上述の磁性洗浄を行い、黒色の粉体を得た。
【０１２０】
実施例６
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により被覆された磁性シリカ粒子の合成
開裂可能な核酸結合基をシリカ粒子の表面上に受動的に吸着させることで、核酸結合材料を調製した。
【０１２１】
ステアリン酸（１．３３ｇ）を１０ｍＬのＳＯＣｌ２中で２時間還流した。過剰のＳＯＣｌ２を減圧下で除去し、褐色の液体としてステアロイルクロライドを生成した。
【０１２２】
ステアロイルクロライドを１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、３０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の、実施例１に記載のように調製された４’−ヒドロキシフェニル４−クロロメチルチオベンゾエート１．０ｇおよび１．５６ｍＬのジイソプロピルエチルアミンの溶液に加え、混合物を一晩攪拌した。溶媒を除去し、残留物を、１：１のヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２を溶離剤として用いて、カラムクロマトグラフィーに供した。ステアロイルエステル（１．４３ｇ）を、白色の固形物として単離した。
【０１２３】
３０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の上記生成物（１．４３ｇ）およびトリブチルホスフィン（１．２７ｍＬ）の溶液をアルゴン雰囲気下で２日間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２除去後、残留物を６×５０ｍＬのエーテルで洗浄し、ＣＨ２Ｃｌ２に再溶解し、エーテルで沈殿して、１．６９ｇのホスホニウム塩生成物を生成した。この材料は水に不溶であることがわかった。
【０１２４】
2008513007.tif 000013
【０１２５】
このホスホニウム塩（０．６ｇ）を６ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、６．０ｇのシリカゲルに攪拌しながら加えた。溶媒を蒸発させ、核酸結合材料を得た。
【０１２６】
実施例７
ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム基を含有する重合層を有する磁性粒子の合成
【０１２７】
2008513007.tif 000014
【０１２８】
磁性メリフィールドペプチド樹脂（ケミセル社  ＳｉＭａｇ  クロロメチル，１００ｍｇ）をガラスバイアル中で２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に加えた。トリブチルホスフィン（８０μＬ）を加え、そのスラリーを室温で３日間振盪した。バイアルの下に磁石を設置し、ピペットで、上澄みを除去した。固形物を２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄した（洗浄液もまた磁石／ピペットの手順で除去した）。樹脂を風乾した（９３ｍｇ）。
【０１２９】
実施例８
トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマー粒子の合成
【０１３０】
2008513007.tif 000015
【０１３１】
ポリ（メタクリロイルクロライド）粒子（１．０ｍｅｑ／ｇ，１．５ｇ）を２．４５ｇのジイソプロピルエチルアミンを含む７５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に加えた。トリエチルアミン（１．２ｇ）を加えた。４’−ヒドロキシフェニル４−クロロメチルチオベンゾエート（４．５ｇ）を加え、密閉した反応混合物を室温で一晩攪拌した。そのスラリーをろ過し、樹脂を１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、２００ｍＬのアセトン、２００ｍＬのＭｅＯＨ、２×１００ｍＬの１：１のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２、２５０ｍＬのＴＨＦ、２５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、２５０ｍＬのヘキサンで洗浄した。樹脂はさらなる使用のため風乾した。
【０１３２】
樹脂（１．５２５ｇ）をアルゴン雰囲気下で２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中で懸濁した。トリブチルホスフィン（１．７ｇ）を加え、そのスラリーを４日間攪拌した。樹脂をろ過して、２２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、続いて１７５ｍＬのヘキサンで洗浄した。樹脂をその後風乾し、１．６８ｇの固形物を得た。
【０１３３】
実施例９
トリブチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
【０１３４】
2008513007.tif 000016
【０１３５】
架橋結合したクロロメチル化ポリスチレンであるメリフィールドペプチド樹脂（シグマ社，１．１ｍｅｑ／ｇ，２０．０ｇ）をアルゴン雰囲気下で２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（５０／５０）中で攪拌した。過剰のトリブチルホスフィン（４８．１ｇ，１０当量）を加え、そのスラリーを７日間室温で攪拌した。そのスラリーをろ過し、得られた固形物を２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で２回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（２１．５ｇ）。元素分析：実測値Ｐ  ２．５２％，Ｃｌ  ３．０８％，期待値  Ｐ  ２．７９％，Ｃｌ  ３．１９％：Ｐ／Ｃｌ比は０．９４
【０１３６】
実施例１０
トリブチルアンモニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
【０１３７】
2008513007.tif 000017
【０１３８】
メリフィールドペプチド樹脂（オールドリッチ社、１．４３ｍｅｑ／ｇ，２５．１ｇ）をアルゴン雰囲気下で１５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中で攪拌した。過剰のトリブチルアミン（２５．６ｇ，４当量）を加え、そのスラリーを室温で、８日間攪拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物を２５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で２回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（２８．９ｇ）。元素分析：実測値  Ｎ  １．１８％  Ｃｌ  ３．４０％；期待値  Ｎ  １．５８％  Ｃｌ  ４．０１％：Ｎ／Ｃｌ比  ０．８８
【０１３９】
実施例１１
トリブチルホスホニウム基により官能化されたシリカ粒子の合成
【０１４０】
2008513007.tif 000018
【０１４１】
１時間、１１０℃でアルゴン雰囲気下にて乾燥させたシリカゲル（４．８２ｇ）を２．７９ｇのＥｔ３Ｎと共に５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に加えた。混合物を２０分間攪拌し、その後、２．５６ｇの３−ブロモプロピルトリクロロシランを加え、発熱を生じさせた。混合物を２４時間攪拌し、ろ過し、固形物を３×４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、４×４０ｍＬのＭｅＯＨおよび２×４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で順次洗浄した。固形物を一晩風乾し、６．１３ｇを得た。
【０１４２】
５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の上記により調製した官能化されたシリカ（５．８ｇ）を５．３３ｍＬのトリブチルホスフィンと１０日間攪拌した。混合物をろ過し、固形物を７×５０ｍＬのアセトンで洗浄した。風乾して、５．８８ｇの生成物を得た。
【０１４３】
実施例１２
実施例６のＮＡＢ材料中の結合部分の制御された開裂
実施例６の被覆されたシリカ材料（７０ｍｇ）を１．０ｍＬのＤ２Ｏに懸濁させ、３分間ボルテクシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）により混合した。１Ｈ  ＮＭＲによる水溶液の分析では、溶液中への材料の解離は見られなかった。
【０１４４】
４０μＬの４０％ＮａＯＤにてシリカ懸濁液を処理し、３分間ボルテックスし、上澄みをＮＭＲにて分析すると、結合部分の開裂とシリカから溶液中への解離がみられた。
【０１４５】
実施例１３
シロキサン被覆されたマグネタイトの合成
１００ｍＬの無水エタノール中の１．００ｇのマグネタイト（アルファ  アエサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ））を、３．２ｍＬのＴＥＯＳ、３．３２ｇのＣｓＦおよび１．０ｍＬの水とアルゴン雰囲気下で２時間還流で反応させた。冷却した反応混合物をデカントし、固形物をエタノールで４回、ＣＨ２Ｃｌ２で５回磁性的に洗浄した。アルゴン雰囲気下で固形物を乾燥させ、３．１４ｇの固形物を得た。この材料１．０ｇを５×５０ｍＬの脱イオン水および５×５０ｍＬのメタノールで順次洗浄した。乾燥させて０．６７ｇの固形物を得た。
【０１４６】
実施例１４
ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム基を含有する磁性粒子の合成
１．０ｇの酸化鉄を１００ｍＬのエタノール中に超音波浴を用いて分散した。反応容器に１．５０ｍＬのＴＥＯＳ、１．６５ｇのｐ−（クロロメチル）フェニルトリメトキシシラン（Ｇｅｌｅｓｔ）、３．３２ｇのフッ化セシウムおよび１．０ｍＬの脱イオン水を加えた。反応混合物をアルゴン雰囲気下で２時間、還流中攪拌した。混合物を室温に冷却し、溶媒をデカントし、固形物を磁性的にエタノールで５回、ＣＨ２Ｃｌ２で５回洗浄した。固形物をアルゴン気流で乾燥させ、２．９６ｇの生成物を得た。
【０１４７】
前工程の粒子（０．５０ｇ）を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁した。トリブチルホスフィン（０．５ｍＬ）を懸濁液に加え、オービタルシェーカーで一晩振盪する前に容器を密閉した。固形物をＣＨ２Ｃｌ２で５回、磁性的に洗浄した。アルゴン気流にて固形物を乾燥し、０．４８ｇの生成物を得た。
【０１４８】
実施例１５
官能化されたシロキサン−被覆マグネタイトの合成
２００ｍＬの無水エタノール中のマグネタイト（アルファ  アエサー）１．００ｇを３．０ｍＬの３−（トリエトキシシリル）−ピロピオニトリル、３．３２ｇのＣｓＦおよび１．０ｍＬの水とアルゴン雰囲気下で２時間還流にて反応させた。冷却した混合反応物をデカントし、固形物をエタノールで４回、ＣＨ２Ｃｌ２で５回、磁性的に洗浄した。アルゴン雰囲気下で固形物を乾燥し、２．４６ｇの固形物を得た。
【０１４９】
実施例１６
官能化されたシロキサン−被覆、制御ポアガラスの合成
アルゴン雰囲気下、５０ｍＬの乾燥トルエン中の実施例２のシリケート結合部分（１．８４ｇ）をカニューレを介して、３．８３ｇのオーブンで乾燥させた制御ポアガラス（プライム  シンセシス  ネイティブ（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｎａｔｉｖｅ））ＣＰＧ（０．５ｇ）が入ったフラスコに加えた。反応は一晩還流させた。室温に冷却した後、ガラスをろ過し、５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、４時間減圧乾燥した。
【０１５０】
５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中のクロロベンジル末端基を有する誘導体化したガラス（２．０ｇ）を８．０ｇのトリブチルホスフィンと混合した。反応混合物を２日間アルゴン雰囲気下で攪拌した。ガラスをろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２、およびヘキサンで洗浄し、数時間減圧乾燥した。
【０１５１】
実施例１７Ａ
官能化された磁性ポリスチレンの合成
【０１５２】
2008513007.tif 000019
【０１５３】
アミン官能化された磁性ポリスチレンビーズ（スフェロテック（Ｓｐｈｅｒｏｔｅｃｈ））の懸濁水溶液（４×１ｍＬで１ｍＬあたり２５ｍｇを含む）をとり、２本の１．５ｍＬの試験管に加えた。上澄みを除きビーズを３×１ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．０、で洗浄した。それぞれの試験管に６００μＬのＭＥＳ緩衝液、２８ｍｇのＥＤＣ（０．１４７ｍｍｏｌ）および３００μＬのＤＭＦ中の５０ｍｇの４−クロロメチル安息香酸（０．１７４ｍｍｏｌ）の溶液を加えた。１日攪拌後、試験管を１時間、超音波処理して、磁気ラック（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｒａｃｋ）に保管した。反応混合物を２本の５０ｍＬの試験管に移し、Ｈ２Ｏで４０ｍＬに希釈した。ビーズを水（４×４０ｍＬ）、１：１ＣＨ３ＯＨ：Ｈ２Ｏ（４０ｍＬ）およびＣＨ３ＯＨ（３×４０ｍＬ）で磁性的に洗浄し、試験管内で乾燥した。
【０１５４】
上記固形物（９０ｍｇ）を１．５ｍＬ試験管に入れ、８００μＬのＣＨ３ＯＨを加えた。２００μＬのＣＨ３ＯＨ中の３０ｍｇのＰＢｕ３の溶液をこの懸濁液に加えた。反応混合物を３０分間超音波処理し、室温で攪拌した。９日間攪拌後、磁石上に保持して上澄みを除去した。ビーズを水（４×１ｍＬ）、ＣＨ３ＯＨ（４×１ｍＬ）、および水（１×１ｍＬ）で、磁性的に洗浄した。ついで、１ｍＬの水をビーズに加え、１０ｍｇ／ｍＬの保存懸濁液を作製した。
【０１５５】
実施例１７Ｂ
官能化された磁性ポリスチレンの別の合成
３０ｍＬのアセトン中の３．００ｍＬのトリブチルホスフィン（１２．０ｍｍｏｌ）と１．００ｇの４−クロロメチル安息香酸（５．８６ｍｍｏｌ）の溶液をアルゴン雰囲気下で一晩攪拌し、１Ｈ  ＮＭＲにより４−カルボキシ−ベンジルトリブチルホスホニウムクロライドと同定される白色の沈殿物を生成した。固形物をろ過収集し、アセトンで洗浄し、その後へキサンで洗浄した。収量２．１９ｇ，８９％であった。
【０１５６】
アミン官能化された磁性ポリスチレンビーズ（スフェロテック）の懸濁水溶液（２×１ｍＬで１ｍＬあたり２５ｍｇを含む）をとり、２本の１．５ｍＬの試験管に加えた。上澄みを除き、ビーズを３×１ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．０で洗浄した。それぞれの試験管に、６００μＬのＭＥＳ緩衝液と、２００μＬのＤＭＦ／２００μＬのＭＥＳ緩衝液中の３０ｍｇの４−カルボキシ−ベンジルトリブチルホスホニウムクロライド（８０μｍｏｌ）の溶液およびＥＤＣ（１５ｍｇ、７８μｍｏｌ）を加えた。試験管を３０分間超音波処理し、１日振盪した。磁石上に保持して上澄みを除去した。ビーズを水（４×１ｍＬ）、ＣＨ３ＯＨ（４×１ｍＬ）、および水（１ｍＬ）で磁性的に洗浄し、ついで、水を加え、１００ｍｇ／ｍＬの保存懸濁液を作製した。
【０１５７】
実施例１８
官能化された磁性ポリスチレンの合成
【０１５８】
2008513007.tif 000020
【０１５９】
３０ｍＬのアセトン中の１．０ｇの４’−アミノフェニル４−クロロメチル−ベンゼンチオカルボキシレート（４−クロロメチル安息香酸と４−アミノチオフェノールのＥＤＣカップリングにより調製）の溶液と２．０ｇのトリブチルホスフィンをアルゴン雰囲気下で一晩攪拌した。生成した沈殿物をろ過し、アセトンおよびヘキサンで洗浄した。ホスホニウム塩の収量は１．４１ｇ，８２％であった。
【０１６０】
2008513007.tif 000021
【０１６１】
１００ｍｇ／ｍＬの懸濁液からの１ｍＬの磁性カルボキシル化ポリスチレン樹脂をデカントし、固形物を３×１．０ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．０、で洗浄した。前工程の生成物（５０ｍｇ）を４００μＬのＤＭＦと４００μＬのＭＥＳ緩衝液に溶解した。この溶液を２００μＬのＭＥＳ緩衝液中のビーズの懸濁液に加えた。次いで、２８ｍｇのＥＤＣを加え、懸濁液を３０分間超音波処理し、振盪した。１日攪拌の後、反応混合物を除去した。ビーズを４×１ｍＬのＨ２Ｏ、４×１ｍＬのＣＨ３ＯＨ、１×１ｍＬのＨ２Ｏで磁性的に洗浄した。ビーズをＨ２Ｏに懸濁させた（１００ｍｇ／ｍＬ）。
【０１６２】
実施例１９
官能化された磁性ポリスチレンの合成
【０１６３】
2008513007.tif 000022
【０１６４】
１００ｍｇ／ｍＬの磁性カルボキル化ポリスチレン樹脂の懸濁液の１ｍＬから上澄みを除き、固形物を３×１ｍＬの０．１Ｍ  ＭＥＳ緩衝液、ｐＨ４．０、で洗浄した。ビーズを８００μＬのＭＥＳに懸濁させ、２００μＬのＭＥＳ緩衝液中の６３ｍｇの１，４−ジアミノブタンの溶液を加えた。ＥＤＣ（２８ｍｇ，０．１４７ｍｍｏｌ）を加え、ビーズを３０分間超音波処理し、次いで、室温で攪拌した。反応混合物を磁性的にビーズから分離した。ビーズをその後、４×１ｍＬの水および４×１ｍＬのＭＥＳ緩衝液で、磁性的に洗浄した。
【０１６５】
５０ｍｇの４−カルボキシベンジルトリブチルホスホニウムクロライド（０．１３４ｍｍｏｌ）を４００μＬのＤＭＦ／ＭＥＳ緩衝液１：１混合物に溶解し、６００μＬのＭＥＳ緩衝液中の上記ビーズの懸濁液に加えた。試験管を３０分間超音波処理し、振盪した。１日攪拌の後、溶液をデカントし、ビーズを水（４×１ｍＬ）で、ＣＨ３ＯＨ（４×１ｍＬ）で、水（１ｍＬ）で磁性的に洗浄し、水を加えて１００ｍｇ／ｍＬの保存懸濁液を調製した。
【０１６６】
実施例２０
静電気的に結合したホスホニウム基を有する磁性ポリマーの合成
【０１６７】
2008513007.tif 000023
【０１６８】
１００ｍｇ／ｍＬの磁性カルボキル化ポリスチレン樹脂の懸濁液の１ｍＬから上澄みを除いた。ビーズを１ｍＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨで５分間攪拌した。溶液をデカントした後、ビーズを１ｍＬの水で洗浄した。４００μＬの水中の２０ｍｇのプラスエンハンサー（Ｐｌｕｓ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ）（登録商標）（米国特許５，４５１，４３７号明細書の記載に基づき調製）の溶液をビーズに加え、混合物を５分間振盪した。上澄みを除いた後、ビーズを３×１ｍＬの水で洗浄し、水を加えて１００ｍｇ／ｍＬの保存懸濁液を調製した。
【０１６９】
実施例２１
官能化された磁性ポリマーの合成
【０１７０】
2008513007.tif 000024
【０１７１】
２５ｍｇの固形物を含むビーズ（ダイナル（Ｄｙｎａｌ）マグネチック  ＣＯＯＨ  ビーズ，Ｃａｔ．Ｎｏ  Ｇ０３８１０）のアリコートを、磁石を用いてデカントした。次いで、一晩乾燥させる前に、ビーズを３×１ｍＬの水、および３×１ｍＬのＣＨ３ＣＮで洗浄した。ビーズを８００μＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁し、１５ｍｇのＥＤＣ（７８μｍｏｌ）に加えた。２００μＬのＤＭＦ中の実施例１の化合物（３０ｍｇ）の溶液を混合物に加えた。３０分間試験管を超音波処理し、一晩振盪した。上澄みを除き、ビーズを４×１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、１ｍＬの１：１のＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２、３×１ｍＬのＭｅＯＨ、および４×１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で、磁性的に洗浄した。ビーズを一晩風乾した。
【０１７２】
ビーズを１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に懸濁させ、３０μＬのトリブチルホスフィンを加えた。反応混合物を３０分間超音波処理し、合計で５日間振盪した。磁石上に保持して溶媒をデカントした。ビーズを４×１ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、３×１ｍＬのＣＨ３ＯＨ、および２×１ｍＬの水で、磁性的に洗浄した。１ｍＬの水を加えて、ビーズの保存溶液（２５ｍｇ／ｍＬ）を調製した。
【０１７３】
実施例２２
官能化された磁性ポリマーの合成
【０１７４】
2008513007.tif 000025
【０１７５】
ダイナルトシル活性化ビーズ（Ｄｙｎａｌ  ｔｏｓｙｌ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｅａｄｓ）のアリコート（１ｍＬの９７．５ｍｇ／ｍＬ保存溶液、ＣＡＴ．Ｎｏ．Ｆ６８７１０）を１．５ｍＬの試験管にいれ、磁気ラックを用いて、溶媒を除去した。ビーズを２×１ｍＬの水、および５×１ｍＬのＣＨ３ＯＨで洗浄した。トリブチルホスフィン（１００μＬ）を１ｍＬのＣＨ３ＯＨ懸濁液中のビーズに加えた。試験管を室温で振盪した。９日後、上澄みを、磁石を用いて除いた。ビーズを４×１ｍＬの水、４×１ｍＬのＣＨ３ＯＨ、および１ｍＬの水で洗浄した。次いで、１ｍＬの水をビーズに加えて、１００ｍｇ／ｍＬの保存溶液を調製した。
【０１７６】
実施例２３
粒子に非共有結合したトリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分を有する磁性ポリマー粒子の合成
【０１７７】
2008513007.tif 000026
【０１７８】
磁性カルボキル化ポリスチレン粒子の保存溶液（１００ｍｇ／ｍＬ）から、ラック上の１．５ｍＬの試験管に５００μＬとり、上澄みを除去した。ビーズを３×５００μＬの水および４×５００μＬのＭｅＯＨで洗浄した。上述した化合物１０ｍｇを１００μＬのＣＨ３ＯＨに溶解し、ビーズに加え、溶媒を大気中に蒸発させた。
【０１７９】
実施例２４
ポリメタクリレート結合部分により官能化され、トリス（カルボキシエチル）ホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有する磁性シリカ粒子の合成
【０１８０】
2008513007.tif 000027
【０１８１】
磁性カルボン酸により官能化されたシリカ粒子（ケミセル社，ＳｉＭＡＧ−ＴＣＬ，１．０ｍｅｑ／ｇ，１．５ｇ）を、最終工程を除いて実施例２に記載されているように官能化した。この材料（１１６．５ｍｇ）を１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に３分間超音波処理により懸濁した。トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（６６．８ｍｇ）と３２μＬのトリエチルアミンを加え、スラリーを７日間振盪した。粒子をフラスコに移し、２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で３回洗浄し、次いで、２０ｍＬのＭｅＯＨで４回洗浄し、２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で２回洗浄した。固形物をその後風乾し、１０９ｍｇの材料を得た。
【０１８２】
実施例２５
官能化された磁性ポリメタクリレート粒子の合成
【０１８３】
2008513007.tif 000028
【０１８４】
４０ｍＬのＳｅｒａ−Ｍａｇ  磁性カルボキシレート−変性微粒子懸濁液（セラディン（Ｓｅｒａｄｙｎ））からの磁性粒子を磁性的に収集し、上澄みをデカントした。粒子を４×５０ｍＬのタイプＩの水、次いで４×５０ｍＬのアセトニトリルで、磁性的に洗浄した。最終洗浄後、粒子を乾燥させ、１．９３ｇの褐色の固形物を得た。
【０１８５】
１００ｍＬの丸底フラスコに１．０２ｇの粒子、０．２８９９ｇ（１．５ｍｍｏｌ）のＥＤＣ、０．５０５８ｇ（１．８ｍｍｏｌ）の実施例１の結合部分、および５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を加えた。混合物を１０分間超音波処理し、均質性を確保するために定期的に５分間超音波処理を行って、オービタルシェーカーで１１日間攪拌した（１７０ｒｐｍ）。生成物を磁性的に収集し、固形物を４×５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、５０ｍＬの１：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、４×５０ｍＬのＭｅＯＨ、５０ｍＬの１：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、および４×５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で磁性的に洗浄した。固形物を乾燥し、０．９５１ｇの褐色の固形物を得た。
【０１８６】
５０ｍＬの丸底フラスコに０．８９９３ｇの上記材料と２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を加えた。混合物を５分間超音波処理し、０．２４ｇ（１．２ｍｍｏｌ）のトリブチルホスフィンを加えた。この添加の後、混合物を更に１５分間超音波処理して、定期的に超音波処理を行いながら７日間オービタルシェーカーにて攪拌した。その後、生成物を磁性的に収集し、４×５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、５０ｍＬの１：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、４×５０ｍＬのＭｅＯＨ、５０ｍＬの１：１  ＣＨ２Ｃｌ２／ＭｅＯＨ、および４×５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。この固形物を乾燥し、褐色の固形物０．８８０１ｇを得た。
【０１８７】
実施例２６
予め生成したポリマーへの酸化鉄の包含による磁性官能化させたポリマーの合成
１．００ｇの実施例９のポリマー生成物と０．２ｇの酸化鉄の混合物を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２を加える前に均質になるよう混合した。混合物を１５分超音波処理し、１００ｍＬのヘキサンで希釈し、ろ過した。収集した固形物を２００ｍＬのアセトンおよび４００ｍＬの水で色落ちがなくなるまで洗浄し、次いで、２００ｍＬのアセトンで洗浄した。固形物を４×４０ｍＬのアセトンで、磁性的に洗浄した。固形物をろ過により収集し、アセトンで洗浄し、乾燥した。顕微鏡で観察した際に、非常に少量の遊離マグネタイトのみが観察される固形物０．７ｇを得た。
【０１８８】
実施例２７
官能化された制御ポアガラスの調製
０．５ｇのｎａｔｉｖｅ制御ポアガラス（プライム  シンセシス  アストン（Ｐｒｉｍｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ａｓｔｏｎ），ＰＡ  １８−５０メッシュ，５００Åポアサイズ）を実施例３のトリエトキシシラン結合部分（０．２５ｇ、０．４３ｍｍｏｌ）と５０ｍＬの無水トルエンと一緒にした。混合物を１８時間アルゴン雰囲気下で還流した。室温に冷却後、ガラス粒子を吸引ろ過にて単離し、０．２Ｌのトルエンおよび０．２ＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄した。一晩風乾後、０．５２ｇのガラス粒子を得た。
【０１８９】
上記ガラス粒子０．４５０ｇと、１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２と、ＰＢｕ３（０．９１ｇ，４．５ｍｍｏｌ）を一緒にした。混合物を室温にてロータリーオービタルシェーカーに設置し、３日間振盪した。ガラス粒子を吸引ろ過により単離し、０．２ＬのＣＨ２Ｃｌ２、０．２ＬのＭｅＯＨ、および０．３ＬのＣＨ２Ｃｌ２で順次洗浄した。一晩風乾後、０．４５４ｇのガラス粒子を得た。
【０１９０】
同様な手順で、１２０〜２００メッシュ、ポアサイズ５００または１０００Åを有するＣＰＧについて行った。
【０１９１】
実施例２８
官能化された焼結ガラスの調製
４つの小さな焼結ガラスフィルター（ｃａ．３５ｍｇ  ｅａ，Ｒ＆Ｈ  Ｆｉｌｔｅｒ  Ｃｏ．）を２０％ＮａＯＨ水溶液，１Ｎ  ＨＣｌ，水，およびＭｅＯＨで順次前処理した。乾燥後、フリット（ｆｒｉｔ）を実施例３のトリエトキシシラン（０．３２ｇ，０．５５ｍｍｏｌ）、１０ｍＬのトルエン、および１０μＬのＨ２Ｏと一緒にした。混合物をアルゴン雰囲気下で１６時間還流した。室温に冷却後、フリットを除き、ＣＨ２Ｃｌ２、ＭｅＯＨ、およびＣＨ２Ｃｌ２で順次洗浄した。
【０１９２】
上記ガラスフィルターを１０ｍｌのＣＨ２Ｃｌ２およびＰＢｕ３（０．２０ｇ，０．９９ｍｍｏｌ）と一緒にした。混合物を室温にてロータリーオービタルシェーカーに設置し、７日間振盪した。フィルターを除き、ＣＨ２Ｃｌ２、ＭｅＯＨ、およびＣＨ２Ｃｌ２で順次洗浄した。
【０１９３】
実施例２９
アクリジニウムアミドにより官能化されたシリカゲルの調製
【０１９４】
2008513007.tif 000029
【０１９５】
３−アミノプロピルシリカゲルは、市場で得られ（シリサイクル，キュービック（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ，Ｑｕｅｂｅｃ），カナダ）、または、トルエン中で過剰の３−アミノプロピルトリエトキシシランと“シリカゲル（ｓｉｌｉｃａ  ｇｅｌ）６０”を一晩還流することによっても得られる。３−アミノプロピル誘導体化シリカゲル（１．００ｇ，ｌｏａｄｉｎｇ  ｃａ．１ｍｍｏｌ／ｇ）をアルゴン雰囲気下でＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）に懸濁した。Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１．５ｍＬ，８．６１ｍｍｏｌ）をシリンジを介して加え、次いで、アクリジン９−アシッドクロライド（３６０ｍｇ，１．４９ｍｍｏｌ）を加えた。混合物をロータリーオービタルシェーカーに設置し、室温で２時間振盪した。暗褐色の反応生成物を焼結ガラス漏斗（ｆｕｎｎｅｌ）にて吸引ろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（０．２Ｌ）、２０％（ｖ／ｖ）のＭｅＯＨ：ＣＨ２Ｃｌ２（０．２Ｌ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（０．２５Ｌ）で順次洗浄した。風乾後、粉末状の固形物１．１６ｇを得た。
【０１９６】
上記により調製した材料（１．００ｇ）をＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）中に懸濁し、かき混ぜて固形物を分散した。メチルトリフレート（Ｍｅｔｈｙｌｔｒｉｆｌａｔｅ）（０．１７ｍＬ，１．５ｍｍｏｌ）を加え、ゴム隔膜（ｓｅｐｔｕｍ）で栓をして反応させた。混合物をロータリーオービタルシェーカーに設置し、室温で１６時間振盪した。得られた混合物を焼結ガラス漏斗で吸引ろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（０．２Ｌ）、ＭｅＯＨ（０．２Ｌ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（０．２５Ｌ）で順次洗浄した。風乾後、１．０２ｇの粉末状の固形物を得た。
【０１９７】
実施例３０
官能化されたシリカゲルの調製
【０１９８】
2008513007.tif 000030
【０１９９】
３０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の２．００ｇの２−（３−トリエトキシシリルプロピル）無水コハク酸と１．８２ｇの４’−アミノフェニル４−クロロメチル−ベンゼンチオカルボキシレートの溶液を室温で一晩攪拌した。溶媒を蒸発させ、３．８ｇのワックス状の固形物を得た。この固形物を１７０ｍＬのトルエン中で、１．０ｇのシリカと混合し、７０℃に加熱し、１６時間攪拌した。冷却後、黄色の固形物をろ過し、アセトン（５×５０ｍＬ）、ＣＨ２Ｃｌ２（５×５０ｍＬ）、ＭｅＯＨ（５×５０ｍＬ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（２×５０ｍＬ）で順次洗浄した。風乾後、３．０２ｇの黄色の固形物を得た。
【０２００】
１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の２．００ｇの上記材料の懸濁液を５分間超音波処理し、アルゴン雰囲気下に置き、１．４０ｍＬのトリブチルホスフィンで処理した。この混合物を７日間攪拌し、ろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２（４×５０ｍＬ）、ＭｅＯＨ（４×５０ｍＬ）、およびＣＨ２Ｃｌ２（４×５０ｍＬ）で順次洗浄した。風乾後、２．０４ｇの黄色の固形物を得た。
【０２０１】
実施例３１
ヒト全血からのＤＮＡの捕捉
１０ｍｇの粒子を試験管中で、７０μＬのヒトの全血と混合した。試験管を１５秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘ）し、室温で５分置き、再び１５秒間ボルテックスした。混合物を３００μＬの１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、で希釈し、液体を粒子から、磁性反応粒子を用いた場合は磁石を用いて除去した。磁性分離は、Ｄｙｎａｌ  ＭＰＣ−５  磁気ラックを用いて行った。
【０２０２】
実施例３２
ヒト全血からのＤＮＡの単離
前述の実施例の手順により固相結合材料上に捕捉された核酸を、５００μＬの１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、で３回洗浄し、その都度上澄みを廃棄した。１００μＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨを用いて、３７℃、５分間で溶離することにより核酸を粒子から除いた。その他のＮａＯＨ濃度もまた有効であった。
【０２０３】
実施例３３
迅速な単離プロトコール
１ｍｇの粒子を１００μＬのヒト全血と試験管中で混合した。試験管を３０秒間ボルテックスした。混合物を３００μＬの１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、で希釈し、粒子から液体を、磁性反応粒子を用いた場合は磁石を用いて除去した。前述の実施例の手順により固相結合材料上に捕捉された核酸を、５００μＬの１０ｍＭトリス緩衝液、ｐＨ８．０、で３回洗浄し、その都度上澄みを廃棄した。核酸を５０μＬの０．０５Ｍ  ＮａＯＨを用いて、室温、３０秒間で溶離させることにより粒子から除いた。
【０２０４】
実施例３４
蛍光アッセイプロトコール
上澄み液と溶離剤を、ＤＮＡ含量について、ＤＮＡを染色するためにピコグリーン（ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ）（登録商標）を使用する蛍光アッセイで分析した。簡潔にいえば、ＤＮＡを含むか、もしくは含むと思われる溶液を１０μＬとり、１９０μＬの蛍光ＤＮＡ染色溶液でインキュベートした。蛍光染色液（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｓｔａｉｎ）は０．１Ｍトリス，ｐＨ７．５，１ｍＭのＥＤＴＡで１：４００に希釈したピコグリーン（モレキュラー  プローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））であった。少なくとも５分間サンプルをインキュベートした後、蛍光をマイクロプレートフルオロメーター（ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ）（フルオロスカン  ラブシステムズ（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ））にて測定した。使用したフィルターセットは４８０ｎｍおよび５３５ｎｍであった。既知量の同じＤＮＡを含むポジティブコントロールと、ネガティブコントロールを同時に実験した。核酸を１００μＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨ中に溶離させた実験では、１０μＬアリコートを用いた。核酸を５０μＬの０．０５Ｍ  ＮａＯＨ中に溶離させた実験では、５μＬアリコートを用いた。
【０２０５】
実施例３５
ゲル電気泳動プロトコール
０．７５％、または１．５％のアガロースゲルを核酸溶離剤の分析のために調製した。適切な量のアガロースを、２分間煮沸させることにより、１０ｍＬのＴＡＥ緩衝液に溶解させた。５０〜６０℃に冷却後直ちに、１ｍｇ／ｍＬの臭化エチジウム溶液（２０μＬ）を加え、ゲルを注いだ。それぞれのサンプル（ｃａ．１２μＬ）を、０．２５％のブロモフェノールブルー、０．２５％のキシレンシアノールおよび３０％のグリセロールを含有する２μＬの６×充填（ｌｏａｄｉｎｇ）緩衝液と混合した。ゲル電気泳動は７０Ｖで実験した。
【０２０６】
実施例３６
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅
本発明の方法を０．０５Ｍまたは０．１Ｍ  ＮａＯＨ中における、実施例２，４〜１１および１３〜３０（１または２μＬ）のそれぞれの固相材料で全血に適用して溶出したＤＮＡを、２４塩基対のプライマーとともにＰＣＲ増幅に供し、２００ｂｐアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を生成した。ＰＣＲ反応混合物は、以下の表に記載されている成分を含んでいた。
【０２０７】
2008513007.tif 000031
【０２０８】
ネガティブコントロールでは反応混合物中のテンプレートを１μＬの水と置き換えた。さらなる反応には、１：１０に水で希釈した１μＬのテンプレートを用いた。反応混合物を９４℃で３０秒、６０℃で３０秒、７２℃で３０秒の３０サイクルに供した。反応生成物を１．５％アガロースゲルで分析した結果、期待したアンプリコンを示した。
【０２０９】
別の実験では、実施例２の粒子を用いて単離されたＤＮＡを、以下のリストのように、いくつかの異なった染色体の部位の増幅反応に用いた。結果は、単離手順により得られたＤＮＡが無傷のゲノムの典型であることを示した。
【０２１０】
2008513007.tif 000032
【０２１１】
実施例３７
異なった量の粒子による全血からの核酸の捕捉と単離
７０μＬのヒト全血からのＤＮＡを様々な量の実施例２の粒子と結合し、実施例３３の迅速なプロトコールにより単離した。溶離剤中の様々なＮａＯＨ濃度の効果もまた試験した。溶離したＤＮＡの量を蛍光分析（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）により定量し、ＤＮＡの標準参照サンプルと比較した。
【０２１２】
2008513007.tif 000033
【０２１３】
実施例３８
異なった量の粒子による全血からの核酸の捕捉と単離
７０μＬのヒト全血からのＤＮＡを様々な量の種々の粒子に結合し、実施例３１および３２のプロトコールにより単離した。溶離剤を、図４に示すようにゲル電気泳動により分析した。比較として、５００ｂｐから４０，０００ｂｐのサイズ範囲のサイズ標識のラダー（ｌａｄｄｅｒ）を示す。
【０２１４】
追加サンプルを図６に示す。
【０２１５】
実施例３９
異なった量の粒子による異なった量の全血からの核酸の捕捉と単離
１ｍＬのヒトの全血からのＤＮＡを実施例２の粒子５ｍｇと結合し、実施例３１および３３のプロトコールにより単離した。蛍光分析による複製サンプルの溶離剤（１００μＬ）の分析は、１７〜２４μｇのＤＮＡ収量を示した。１０ｍｇの同タイプの粒子を用いた７０μＬの血液からのＤＮＡの単離からの溶離剤の同様な分析では、１００μＬの０．１Ｍ  ＮａＯＨを用い、３０秒または１分で溶離され、それぞれ、収量は６．５μｇと７．３μｇであった。プロトコール３１，３２による実施例５の粒子の使用により、７０μＬの血液から２．８μｇのＤＮＡを得た。
【０２１６】
実施例４０
異なった固相材料による全血からの核酸の捕捉と単離
１００μＬのヒト全血からのＤＮＡを、本発明の方法に従い実施例３３の迅速なプロトコールにより１ｍｇの様々な固相材料に結合させ、５０μＬの５０ｍＭ  ＮａＯＨ溶液を用いて溶離した。溶離したＤＮＡの量を蛍光分析により定量し、ＤＮＡの標準参照サンプルと比較した。
【０２１７】
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【０２１８】
実施例２７の非磁性制御ポアガラス粒子（１０ｍｇ）と実施例２８の焼結ガラスフリット（１０ｍｇ）を、磁性分離よりもむしろ遠心分離により固形物から液体を除去したことを除いて、上記のように試験に用いた。
【０２１９】
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２７−Ａ＝１８〜５０メッシュ，５００Åポアサイズ
２７−Ｂ＝１００〜２００メッシュ，１０００Åポアサイズ
２７−Ｃ＝１００〜２００メッシュ，５００Åポアサイズ
【国際調査報告】
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