(57)【要約】  ＯｓＫ１は３つのジスルフィドブリッジを持つ３８−残基のペプチドであって、サソリオーソキラス  スクロビキュローサス（Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ）の毒液に見出される。それは電圧−ゲーテッドＫ+チャネルＫｖ１．１、Ｋｖ１．２及びＫｖ１．３で優れて活性であり、タイプ１の中程度のコンダクタンスのＣａ2+−活性化チャネルＫCa３．１で中程度に活性である。特に切形又は点突然変異を含むＯｓＫ１の誘導体は、Ｋｖ１．３チャネルに対する活性、及びそれに対する選択性を増強するように開発された。これは、該誘導体を、多発性硬化症を含めた自己免疫疾患の治療のための候補とするようである。そのような使用は、単独、又はもう１つのサソリトキシンであるモーロトキシンとで組合せ療法とすることができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
７つ以下のＮ−末端アミノ酸残基が削除された、及び／又は４つ以下のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基によって置換されたＯｓＫ１誘導体。
【請求項２】
上記アミノ酸残基の置換は、８番目〜３８番目の位置におけるものであって、別の第３グループの短鎖サソリトキシン又はモーロトキシンにおける対応する位置で起こっている請求項１記載のＯｓＫ１誘導体。
【請求項３】
ＯｓＫ１中の１６番目の位置におけるグルタミン酸残基がリシン残基で置換されている請求項１又は２記載のＯｓＫ１誘導体。
【請求項４】
ＯｓＫ１中の２０番目の位置におけるリシン残基がアスパラギン酸残基で置換されている前記請求項いずれかに記載のＯｓＫ１誘導体。
【請求項５】
以下のＯｓＫ１誘導体のいずれか１つ；
・［Δ1］−ＯｓＫ１
・［Ａ34］−ＯｓＫ１
・［Ｋ16］−ＯｓＫ１
・［Ｄ20］−ＯｓＫ１
・［Ｋ16，Ｄ20］−ＯｓＫ１
・［Δ1，Ｋ16，Ｄ20］−ＯｓＫ１
・［Δ1，Ｔ2，Ｋ16，Ｄ20］−ＯｓＫ１
・［Δ1-4，Ｋ16，Ｄ20］−ＯｓＫ１
・［Δ1-6，Ｋ16，Ｄ20］−ＯｓＫ１
・［Δ1-7，Ｋ16，Ｄ20］−ＯｓＫ１
・［Ｋ3，Ｋ16，Ｄ20］−ＯｓＫ１
・［Ｐ12，Ｋ16，Ｄ20］−ＯｓＫ１
・［Ｋ16，Ｄ20，Ｎ25］−ＯｓＫ１
・［Ｋ16，Ｄ20，Ｒ31］−ＯｓＫ１
・［Ｋ16，Ｄ20，Ｙ36］−ＯｓＫ１
・［Ｋ12，Ｋ16，Ｒ19，Ｄ20］−ＯｓＫ１。
【請求項６】
Ｎ末端がアセチル基で終了しているか、又はＣ末端がアミド化されている前記請求項いずれかに記載のＯｓＫ１誘導体。
【請求項７】
４〜１０個の炭素原子及び０〜２個の炭素−炭素二重結合を有するω−アミノ脂肪酸で終了している請求項１ないし５いずれかに記載のＯｓＫ１誘導体。
【請求項８】
医薬上許容される希釈剤又は担体と混合された前記請求項いずれかに記載のＯｓＫ１誘導体を含む医薬組成物。
【請求項９】
多発性硬化症を含むがこれに限定されない自己免疫疾患の治療用の医薬の調製のための、ＯｓＫ１、Ｎ末端がアセチル基で終了するＯｓＫ１、Ｃ末端がアミド化されたＯｓＫ１、４〜１０個の炭素原子及び０〜２個の炭素−炭素二重結合を有するω−アミノ−脂肪酸で終了するＯｓＫ１、又は請求項１〜７のいずれかに記載のＯｓＫ１誘導体の使用。
【請求項１０】
モーロトキシンの前投与、同時投与又は後投与と組み合わされた、多発性硬化症を含むがこれに限定されない自己免疫疾患の治療用の医薬の調製のための、ＯｓＫ１、Ｎ末端がアセチル基で終了するＯｓＫ１、Ｃ末端がアミド化されたＯｓＫ１、４〜１０個の炭素原子及び０〜２個の炭素−炭素二重結合を有するω−アミノ−脂肪酸で終了するＯｓＫ１、又は請求項１〜７のいずれかに記載のＯｓＫ１誘導体の使用。
【請求項１１】
モーロトキシンの前投与、同時投与又は後投与と組み合わされた、多発性硬化症を含むがこれに限定されない自己免疫疾患の治療用の医薬の調製のための［Ｋ１６，Ｄ２０］−ＯｓＫ１の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＯｓＫ１誘導体、及び該ＯｓＫ誘導体を含有する医薬組成物に関する。上記の誘導体は、多発性硬化症を含めた神経疾患の治療で有用である。
【背景技術】
【０００２】
ＯｓＫ１は３つのジスルフィド架橋を有する３８残基のペプチドであって、サソリのオーソキラス  スクロビキュローサス（Ｏｒｔｈｏｃｈｉｒｕｓ  ｓｃｒｏｂｉｃｕｌｏｓｕｓ）の毒液中で見出されている。それは、多数ある短鎖サソリトキシンのうちの１種である。短鎖サソリトキシンは、２９〜３９個のアミノ酸残基を含有し、３つ又は４つのジスルフィド結合によって架橋され、電位依存型及びカルシウム活性型の両方のカリウムチャネルサブタイプに活性がある。これらの短鎖サソリトキシンは、テイトガット等（Ｔｙｔｇａｔ  ｅｔ  ａｌ．）、トレンド  ファーマコル  サイエンス（Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｓｃｉ．）,２０（１１）、４４４−４４７、１９９９によって分類されている。ＯｓＫ１は、第３グループのトキシンであり、他の第３グループのトキシン及び１つの第６グループのトキシンであるモーロトキシン（ＭＴｘ）と共に、下記の表１に示される。
【０００３】
【表１】
2008503539.tif 000002
【０００４】
哺乳動物の電位依存型Ｋ+チャネルであるＫｖ１．３、及び１型のインターミディエイトコンダクタンスＣａ2+活性型チャネルであるＫCa３．１（ＩＫ１ともいう）は、いずれも免疫系のＴ細胞で発現している。Ｔ細胞表面におけるそれらの相対的な発現量は、リンパ球の活性化状態及び分化状態に依存する。カリウムチャネルの表現型は、休止状態のＴ細胞から活性化状態のＴ細胞へ進行する間、及びナイーブＴ細胞からエフェクター記憶型Ｔ細胞へ進行する間に変化する。従って、これらのチャネルタイプのブロッカーは、多発性硬化症のようなヒト病気の治療において有益であり得る優れた免疫調節特性を保有する。多発性硬化症は、中枢神経系の慢性炎症性自己免疫疾患であり、反応性自己免疫リンパ球によって引き起こされる進行性脱髄及び軸索損傷によって特徴付けられる。これらの細胞（エフェクター記憶型Ｔ細胞）の活性化及び増殖は、Ｋｖ１．３チャネル（及び恐らくはＩＫ１チャネル）に依拠し、Ｋｖ１．３チャネルブロッカーによってブロックされ得る。脱髄もまたＫｖ１．１及びＫｖ１．２のサブタイプの露出に関連しており、これは、（活動電位を変化させることによって）リーク電流及び神経伝達の減少を引き起こす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
我々は、短鎖サソリトキシンの中でもＯｓＫ１だけが、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２及びＫｖ１．３チャネルに対して高い活性があり、ＩＫ１に対して中程度の活性があることを見出した。この特性又はこの特性の一部を保持するか増強し、及び／又はＩＫ１サブタイプをより強力にブロックする合成ペプチドを見出すことが強く望まれるであろう。
【０００６】
そのような誘導体は、移植片拒絶、関節リウマチ、骨分解、及び癌（異常な細胞増殖）等の他のヒトの疾患に対しても有用であり得る。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、７個以下のＮ末端アミノ酸残基が削除され、及び／又は４個以下のアミノ酸残基が点変異しているＯｓＫ１誘導体を提供する。好ましくは、アミノ酸残基の置換が８番目から３８番目の位置に存在し、別の第３グループの短鎖サソリトキシン又はモーロトキシンに一致する位置で起こる。
【０００８】
表２に、本発明者らが研究したＯｓＫ１誘導体のリストを示す。それらの全てが本発明の範囲内に入るわけではない。ＯｓＫ１からの差を太文字で示す。Δｎは、ＯｓＫ１におけるｎ番目の位置に存在するペプチドが削除されていることを示し、Ｘｎは、ＯｓＫ１におけるｎ番目の位置に存在するペプチドがペプチドＸで置き換えられていることを示すことは理解されるであろう。Ａｃはアセチルを表し、Ｖａｌはバレリルを表す。
【０００９】
好ましいペプチドは［Ｋ１６，Ｄ２０］−ＯｓＫ１であり、これはＡＯｓＫ１と略されている。ＯｓＫ１中の１６番目の位置におけるグルタミン酸に代えてのリシンでの置換、及びＯｓＫ１中の２０番目の位置におけるリシンに代えてのアスパラギン酸での置換は、カリオトキシン−１及び−２、アジトキシン−１、−２及び３、及びビュ−サス・マーテンシ（Ｂｕｔｈｕｓ  ｍａｒｔｅｎｓｉ）のカリオトキシンにおけるそれらの位置の基準に従う。ＡＯｓＫ１は、ＯｓＫ１自体よりもＫｖ１．３チャネルに約５倍以上よく効き、これまで特徴付けられた最も効果の高いＫｖ１．３チャネルブロッカーである。ＡＯｓＫ１はＩＫ１についても同一の活性を有するため、この誘導体はＯｓＫ１よりも良好なリード化合物となっている。
【００１０】
【表２】
2008503539.tif 000003
【００１１】
ＯｓＫ１又はその誘導体のＮ末端を切断すると、得られるペプチドのＫｖ１．２チャネルに対する活性が低下し、程度は低いがＫｖ１．１チャネルに対する活性も低下し、したがって、Ｋｖ１．３チャネルに対するペプチドの選択性が増強する。さらに、ＯｓＫ１又はその誘導体のＮ末端を切形すると、恐らくＫｖ１．１及びＫｖ１．２チャネルに対する親和性の低下のため、得られたペプチドの毒性が低下する。対照的に、Ｃ末端を切形すると、測定された全てのチャネルに対する活性の明らかな喪失を引き起こした。
【００１２】
ＡＯｓＫ１の２番目の位置における点変異は、１番目の位置におけるペプチドの削除と組み合わると、Ｋｖ１．３チャネルに強い活性を有する２つのサソリトキシンであるマーガトキシン及びノキシウストキシンのものと同一のＮ末端ドメイン（すなわち、ＴＩＩＮＶＫ）を有するペプチド［Δ1、Ｔ2］−ＡＯｓＫ１を生じた。Ｎ末端において切断されたペプチドは、２番目の位置において変異しているか否かにかかわらず、Ｋｖ３．２チャネルに対して良好な活性を示した。
【００１３】
ドッキング研究によれば、ＯｓＫ１の３４番目の位置におけるＨｉｓがＫｖ１．２及びＫｖ１．３ドッキングに関与しているように見え、このペプチドを例えばＡｌａ等によって置換することが望ましく、Ｋｖ１．３に対してより高い選択性に導くことを示した。このような研究においても、３番目の位置においてＩｌｅの代わりにＬｙｓの含有を示唆していた。
【００１４】
２５番目の位置におけるアスパラギンはトキシンとＫｖ１．３チャネルとの親和性において重要であると報告されており、３１番目の位置におけるアルギニンはＫｖ１．３チャネルについて活性な他のトキシン群と相同性がある。実際に、３１番目の位置におけるＲは、Ｋｖ１．１、Ｋｖ１．２及びＫｖ１．３チャネルの全てに対して強い親和性を有するＡＯｓＫ１誘導体を提供する。
【００１５】
本発明のＯｓＫ１誘導体は、慣用的な方法で、Ｎ末端をアセチル化したり、あるいはＣ末端をアミド化したりすることができる。もう１つのアプローチは、４〜１０個の炭素原子及び０〜２個の炭素−炭素二重結合を有する脂肪酸でＯｓＫ１誘導体を終了させるか、あるいはω−アミノ−脂肪酸のようなその誘導体でＯｓＫ１誘導体を終了させることである。Ｎ末端又はＣ末端のいずれかをこのように終了させることができる。この結果、誘導体について水溶性及び生物学的活性が増強されるはずである。好ましい脂肪酸は吉草酸（あるいは、Ｃ末端では、ω−アミノ−吉草酸）である。
【００１６】
本発明は、さらに、医薬上許容される希釈剤又は担体と混合された前記ＯｓＫ１誘導体を含む医薬組成物を提供する。
【００１７】
さらに、本発明は、多発性硬化症を含むがこれに限定されるわけではない自己免疫疾患の治療用の医薬の調製のための、前記したＯｓＫ１又はＯｓＫ１誘導体の使用も提供する。
【００１８】
モーロトキシンは、カルシウム活性型カリウムチャネルサブタイプＩＫ１の短鎖サソリトキシンの中でも最も強力な阻害剤である。モーロトキシンにおいて対応する位置に現れるアミノ酸残基を置換すると、ＩＫ１に対する活性が増強された誘導体を導くことができるが、３６番目の位置におけるスレオニンをチロシンで置換しても、これを達成することは示されていない。Ｋｖ１．３についての高い活性をＩＫ１での改良された活性と組み合わせる単一化合物の不存在下において、我々は、本発明のＯｓＫ１誘導体とＭｔｘとを用いた組合せ療法の可能性を調べた。以下に示すように、ＡＯｓＫ１及びＭＴｘを一緒に用いると、いずれか単独の使用よりも良好であるように見える。そのような組合せ療法は、かくして、本発明に含まれる。
【００１９】
実験
表２にリストされたＯｓＫ１及びＯｓＫ１誘導体は、ペプチド合成機（モデル４３３Ａ、アプライド  バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）株式会社）を用いる化学合成によって調製した。ペプチド鎖は、１ミリモルのＮα−（９−フルオレニル）メチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）Ｌ−アミノ酸誘導体を用いて０．２５ミリモルのＨＭＰ樹脂（１％架橋；０．６５ミリモルのアミノ基／ｇ）にて段階的に組み立てた。３官能性残基に対する側鎖保護基は：システイン、アスパラギン、ヒスチジン及びグルタミンについてはトリチル；セリン、スレオニン、チロシン、アスパルテート及びグルタメートについてはｔ−ブチル；アルギニンについては２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−スルホニル；及びリシンについてはｔ−ブチルオキシカルボニルであった。Ｎα−アミノ基は、１８％と２０％（ｖ／ｖ）のピペリジン／Ｎ−メチルピロリドンでそれぞれ３分間及び８分間連続的に処理することによって脱保護した。Ｎ−メチルピロリドンで三回洗浄した後、Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体をＮ−メチルピロリドン（四倍過剰）中でそれらのヒドロキシベンゾトリアゾール活性エステルとしてカップリングさせた（２０分）。ペプチドを組立て、Ｎ末端Ｆｍｏｃ基を除去した後、ペプチド樹脂（約１．５ｇ）を、グラムあたり３０ｍｌの最終容量中で、結晶性フェノール（２．１ｇ）の存在下でトリフルオロ酢酸／Ｈ2Ｏ／チオアニソール／エタンジチオール（７３：１１：１１：５，ｖ／ｖ）の混合物で２５℃で３時間攪拌下で処理した。ペプチド混合物を濾過し、沈殿させ、冷ジエチルオキサイドで二回洗浄した。粗ペプチドを遠心（３，２００×ｇ；８分）によってペレット化した。次いで、粗ペプチドをＨ2Ｏに溶解させ、凍結乾燥した。還元されたＡＯｓＫ１のアナログを、酸化的折畳みのために０．２Ｍ  トリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．３）中に約０．６ｍＭの濃度にて溶解させた（ペプチドに応じて４０〜１２０時間、２０℃）。折り畳まれた／酸化されたペプチドを、６ｍｌ／分の液速にて（λ＝２３０ｎｍ）、０〜４０％の０．１％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸／アセトニトリル（緩衝液Ｂ）を含む０．０８％（ｖ／ｖ）トリフルオロ酢酸／Ｈ2Ｏ（緩衝液Ａ）の６０分の線形グラジエントによる逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）（Ｃ18  Ａｑｕａｐｏｒｅ  ＯＤＳ，２０μｍ，２５０×１０ｍｍ；パーキンエルマー  ライフ  サイエンシーズ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））によって均一となるまで精製した。各ペプチドの純度及び同定は、（i）１ｍｌ／分の液速にて、０〜６０％の緩衝液Ｂを含む緩衝液Ａの６０分の線形グラジエントを用いる分析Ｃ18逆相ＨＰＬＣ（Ｃ18  リクロスファー（Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ）  ５μｍ、４×２００ｍｍ；Ｍｅｒｃｋ）；（ii）ペプチドアシドリシス［６Ｍ  ＨＣｌ／２％（ｗ／ｖ）フェノール，２０時間，１２０℃  Ｎ2雰囲気］後のアミノ酸分析；及び（iii）マトリックス−補助レーザー脱着イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）スペクトロメトリーによる分子質量測定によって評価した。ＭＳ結果のいくつかを以下の表３に示し、ＨＰＬＣプロファイルのいくつかを添付の図面に示す��
【００２０】
【表３】
2008503539.tif 000004
【００２１】
電気生理学的実験は、パッチ−クランプ全細胞記録モードを用いて２２〜２４℃で行った。細胞を、２９０〜３２０ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度を持つ哺乳動物リンゲル液（ｍＭで表す）：１６０ＮａＣｌ、４．５ＫＣｌ、２ＣａＣｌ2、１ＭｇＣｌ2、及び１０ＨＥＰＥＳ（ＮａＯＨでｐＨ７．４）で浴させた。ＡＯｓＫ１誘導体を適用した場合、０．１％ウシ血清アルブミンをリンゲル液に加えた。シリンジ駆動灌流デバイスを用いて、外部記録浴溶液を交換した。２つの内部ピペット溶液を用い、１つは電位依存型Ｋ+電流を測定するためのものであり、２９０〜３２０ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度を持ち、１５５ＫＦ、２ＭｇＣｌ2、１０ＨＥＰＥＳ、及び１０ＥＧＴＡ（ＫＯＨでｐＨ７．２）を含有する（ｍＭで表す）、もう１つはＣａ2+活性型Ｋ+電流を測定するためのものであり、２９０〜３２０ｍＯｓｍの浸透圧モル濃度を持ち、１３５Ｋ−アスパルテート、８．７ＣａＣｌ2、２ＭｇＣｌ2、１０ＥＧＴＡ、１０ＨＥＰＥＳ（ＫＯＨでｐＨ７．２）を含有する（ｍＭで表す）。１μＭの遊離[Ｃａ2+]iを計算した。電位依存型Ｋ+チャネルを通る全ての電流は、−８０〜＋４０ｍＶの２００ｍｓの脱分極電圧段差によって誘導した。ＫCa１．１、ＫCa２．１及びＫCa３．１を通るカリウム電流は、１μＭの内部［Ｃａ2+］iならびに−１２０〜０ｍＶの（ＫCa３．１チャネル及びＫCa１．１チャネル用）及び１２０ないし＋４０ｍＶの（ＫCa２．１チャネル用）４００ｍｓの電圧ランプによって誘導した。
【００２２】
電極はガラス毛細管（サイエンス  プロダクツ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、  ドイツ国）から引き出し、火炎で磨いて２．５〜５ＭΩの抵抗とした。膜の電流を、収集及び分析ソフトウエア（パルス  アンド  パルスフィット（Ｐａｌｓｅ  ａｎｄ  ＰａｌｓｅＦｉｔ））が動くマッキントッシュ（Ｍａｃｉｎｔｏｓｈ）コンピューターに接続したＥＰＣ−９又はＥＰＣ−１０パッチ−クランプ増幅器（ヘカ  エレクトロニク（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ），ランブレヒト（Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ），ドイツ国）で測定した。電位依存型Ｋ+電流を測定する場合、Ｐ／１０手法を用いて容量的及び漏洩電流を差し引いた。シリーズ抵抗補正（＞８０％）を２ｎＡを超える電流に用いた。保持電位は全ての実験において−８０ｍＶであった。データ分析をイガープロ（ＩｇｏｒＰｒｏ）（ウェイブメトリクス（ＷａｖｅＭｅｔｒｉｃｓ），オレゴン（Ｏｒｅｇｏｎ），ＵＳＡ）で行い、変形したヒル方程式を、４つの異なるＡＯｓＫ１アナログ濃度で得られた正規化されたデータ点に対するデータ（Ｉトキシン／Ｉコントロール＝１／［１＋（［ＡＯｓＫ１アナログ］／ＩＣ50）］）に当てはめることによってＩＣ50値を推定した。ここで、Ｉはピーク電流（電位依存型Ｋ+チャネル）、又はランプ電流の傾き、すなわち、−１００〜−６０ｍＶの間（Ｃａ2+活性型Ｋ+チャネル用）で測定されたコンダクタンスである。結果を表４に示す。
【００２３】
【表４】
2008503539.tif 000005
【００２４】
電位依存型チャネルであるｈＫｖ１．４、Ｋｖ１．５、ｈＫｖ１．６、ｍＫｖ１．７、ｍＫｖ３．１及びｈＫｖ１１．ｘ（ＨＥＲＧ、ヒトエーテル−ａ−ｇｏ−ｇｏ関連遺伝子ともいう）、又はＣａ2+活性型Ｋ+チャネルであるｈＫCa１．１（ＢＫともいう）及びｈＫCa２．１（ＳＫ１ともいう）については、合成されたペプチドのいずれもがマイクロモラー濃度では活性は検出されなかった。
【００２５】
２０ｇのＣ５７／ＢＬ６マウスへの脳室内注射後に５０％致死用量（ＬＤ50）を測定することによって、ペプチドの毒性をイン・ビボで評価した。用量当たり６〜８匹の群に、０．１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン及び０．９％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌを含有する５μｌのペプチド溶液を注射した。ＬＤ50値を表５に記載する。
【００２６】
【表５】
2008503539.tif 000006
【００２７】
ＡＯｓＫ１とＭＴｘとを共投与する効果が、フロイントの完全アジュバントで乳化させた脊髄ホモジェネートで免疫化したルイス（Ｌｅｗｉｓ）ラットでテストされている。各ラットに、０日目にて、後肉趾に分割して、２００μｌのエマルジョンを皮下で受領させた。８日後、それらの体重が減少するにつれ、これは臨床ＥＡＥの前駆的兆候であるが、浸透圧ポンプを腹腔内移植した。ポンプは１μｌ／時間にて８日間薬物を送達した。ビヒクルとして、２％ルイス（Ｌｅｗｉｓ）血清を含有するＮａＣｌ  ０．１５Ｍに溶解させたペプチドブロッカーをそれらに満たした。
【００２８】
免疫化していないラットの２つのさらなる群を同一条件にてブロッカーで処理した。連続投与の４日後に血液試料を集めて、パッチ−クランプ技術を用いて血清中のブロッカー濃度を測定した。
【００２９】
臨床的評価
病気の酷さを０〜６のスケールでスコア取りし、中程度の臨床的知見については０．５ポイントを与えた（０：臨床的兆候なし；１．０：力のない尾；２．０：軽い不全対麻痺及び運動失調；３．０：中程度の不全対麻痺；４．０：完全な後足の麻痺；５．０：麻痺＋失禁；５．５：四肢麻痺；６．０：瀕死又は死亡）。ラットは毎日体重を量った。ＥＡＥの臨床的兆候及び体重喪失を示さなかったラットを実験から除外した。ＥＡＥに対するＫ+ブロッカーの有用な効果は、ビヒクルのみ、０．１５Ｍ  ＮａＣｌで処理したラットそれと比較した、臨床的重症度、及び病気の持続、及び再発の数の低下によって評価した。
【００３０】
データの解析
統計学的解析は、マン−ホイットニー（Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ）Ｕ検定を用いて行った。グループ間の平均差は、Ｐ＜０．０５の値において有意と考えた。
【００３１】
結果を表６に示す。５０ｎＭのＭＴｘと５０ｎＭのＡＯｓＫ１との組合せは、５０ｎＭのＭＴ単独よりも効果的であることが判明した。
【００３２】
【表６】
2008503539.tif 000007
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】ＨＰＬＣプロファイルを示す説明図。
【図１】
2008503539.tif 000008
【配列表】
2008503539000001.xml
【国際調査報告】
2008503539.tif 000018
2008503539.tif 000019
2008503539.tif 000020