(57)【要約】  本発明は、胸腺ストローマ細胞、又は胸腺内リンパ球又はリンパ球前駆体のゲノムに安定にインテグレートすることのできるウイルスベクターの使用であって、遺伝性免疫不全、後天性免疫不全の予防又は治療のフレームの胸腺内投与用、又は自己又は非自己の遺伝子産物、細胞、又は組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用、又は自己免疫疾患の予防又は治療用医薬の製造のための使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
胸腺ストローマ細胞、又は、胸腺内リンパ球若しくはリンパ球前駆体のゲノムへ安定して組み込むことが可能であるウイルスベクターであって、
遺伝性免疫不全、後天性免疫不全の予防又は治療用か、あるいは、自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用か、あるいは、自己免疫疾患の予防又は治療用である医薬の製造のための前記ウイルスベクターの使用。
【請求項２】
レトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス、又はアデノ随伴ウイルスから選択される、請求項１に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項３】
ヒト免疫不全ウイルスＩ型由来の配列に相当するレンチウイルスベクターである、請求項１又は２に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項４】
自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用か、あるいは、遺伝性免疫不全、後天性免疫不全、又は、自己免疫疾患の予防又は治療用である所定の組換えヌクレオチド配列を含むウイルスベクターであって、
前記所定の組換えヌクレオチド配列が、真核細胞におけるその発現を導くエレメントの制御下にある、請求項１〜４のいずれか一項に記載の前記ウイルスベクターの使用。
【請求項５】
自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導のフレームの胸腺ストローマ細胞の形質転換用、及び自己免疫疾患の予防又は治療用、及び／又は、遺伝性免疫不全又は後天性免疫不全を予防又は治療のフレームの胸腺内リンパ球又はリンパ球前駆体の形質転換用である、医薬の製造のための、請求項１〜４のいずれ一項に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項６】
胸腺内投与用である医薬の製造のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項７】
自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導のフレームの胸腺ストローマ細胞を形質転換する胸腺内投与用、及び自己免疫疾患の予防又は治療用の、医薬の製造のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のウイルスベクターの使用。
【請求項８】
自己免疫疾患、例えば、重症筋無力症、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、狼瘡、大腸炎、炎症性筋疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性眼疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｏｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、又はＩ型糖尿病の予防又は治療用の、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項９】
組換えヌクレオチド配列が、ミエリン自己抗原コード配列、アセチルコリンレセプタコード配列、又はインスリンコード配列から選択される、請求項７又は８に記載の使用。
【請求項１０】
移植拒絶、例えば、固形器官、細胞もしくは組織の同種移植拒絶、造血幹細胞移植拒絶、又は治療用導入遺伝子もしくは遺伝子修正産物の拒絶の予防又は治療用である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１１】
組換えヌクレオチド配列が、例えば、ヒト主要組織適合性複合体（例えば、白血球抗原Ａ２）、ヒト因子ＶＩＩＩ、ヒト因子ＩＸ、ジストロフィン、又はエリトロポイエチンからの分子のアロ抗原コード配列から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
免疫不全、例えば、遺伝性免疫不全及び後天性免疫不全の治療のフレームの胸腺内リンパ球又はリンパ球前駆体を形質転換する胸腺内投与用の医薬の製造のための、請求項１〜６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１３】
重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、例えば、ＡＤＡ−不全（アデノシンデアミナーゼ）、Ｘ−ＳＣＩＤ（Ｘ  ｌｉｎｋｅｄ  ＳＣＩＤ）、ＺＡＰ−７０不全、Ｒａｇ１／２不全、Ｊａｋ３不全、ＩＬ７ＲＡ不全又はＣＤ３不全から選択される遺伝性免疫不全の治療用である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
組換えヌクレオチド配列が、ＡＤＡコード配列、ＩＬ２ＲＧコード配列、ＺＡＰ−７０コード配列、Ｒａｇ１／２コード配列、Ｊａｋ３コード配列、ＩＬ７ＲＡコード配列、ＣＤ３デルタ配列、又はＣＤ３イプシロン配列から選択される、請求項１２又は１３に記載の使用。
【請求項１５】
ＨＩＶ感染から生じる後天性免疫不全の治療用である、請求項１２に記載の使用。
【請求項１６】
組換えヌクレオチド配列が、膜−結合ｇｐ４１−由来のフュージョンインヒビターなどの抑制ペプチド、優性ネガティブＴａｔ、Ｒｅｖ、Ｅｎｖ配列、又はリボザイム、アンチセンスＨＩＶＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡから選択される、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
Ｔ−細胞特異レンチウイルスベクター、すなわち、特に、Ｔリンパ球で治療用導入遺伝子を発現する性質を有するレンチウイルスベクターの、請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
注入による胸腺内投与に適当な医薬組成物の製造用であって、ベクターの用量が、ミリリットル当たり１０５〜１０１１の間の感染性粒子を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の前記ウイルスベクターの使用。
【請求項１９】
遺伝性免疫不全、後天性免疫不全の予防又は治療用か、あるいは、自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用、及び、自己免疫疾患の予防又は治療用に有用な所定の配列で形質転換するレンチウイルスベクターであって、
以下：
−哺乳類ＺＡＰ−７０コード配列、例えば、ｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ｃｐｐｔ．ＣＤ４ｐｍＥ．ｈＺＡＰ−７０．ＩＲＥＳ．ｅＧＦＰ．ｐｒｅ（配列番号２）を含むＴ−細胞特異的レンチウイルスベクター、
−ウイルス性ＨＡコード配列、例えば、ｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ｃｐｐｔ．ＰＧＫ．ＨＡ．ｐｒｅ（配列番号４）を含むユビキタスレンチウイルスベクター、
−哺乳類インスリンコード配列、例えば、ｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ｃｐｐｔ．ＰＧＫ．Ｉｎｓ２．ＧＴＸ．ｅＧＦＰ．ｐｒｅ（配列番号１）を含む、ユビキタスレンチウイルスベクター、
から選択される、前記レンチウイルスベクター。
【請求項２０】
自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用か、あるいは、遺伝性免疫不全、後天性免疫不全の予防又は治療用である所定の組換えヌクレオチド配列を含むウイルスベクター（例えば、それらのゲノムへ安定して組み込まれる請求項１９のレンチウイルスベクター）を含むことを特徴とする、形質転換された胸腺ストローマ細胞。
【請求項２１】
自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用か、あるいは、遺伝性免疫不全、後天性免疫不全の予防又は治療用である所定の組換えヌクレオチド配列を含むウイルスベクター、例えば、それらのゲノムへ安定して組み込まれる請求項１９のレンチウイルスベクターを含むことを特徴とする、Ｔ−細胞系列の形質転換された細胞。
【請求項２２】
適当な医薬担体と関連する、請求項１９に記載のレンチウイルスベクターか、あるいは、請求項２０又は２１に記載の形質転換された細胞を含む医薬組成物。
【請求項２３】
注入による胸腺内投与に適当な、請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記レンチウイルスベクターの用量が、ミリリットルあたり１０５〜１０１１の感染性粒子を含む、請求項２２又は２３に記載の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、遺伝性免疫不全、後天性免疫不全、自己免疫疾患の予防又は治療用か、あるいは、自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用の医薬の調製のためのウイルスベクターの使用に関する。
【発明の分野】
【０００２】
胸腺は、胚性内胚葉（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｅｎｄｏｄｅｒｍ）及び中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ）分化由来の二葉器官（ｂｉｌｏｂａｔｅ  ｏｒｇａｎ）であり、心臓のすぐ上に位置する（［１ａ］で検討されている）。前記胸腺は、Ｔ細胞の成熟のための一次器官である。前記プロセスは、発生する胸腺細胞と胸腺ストローマ細胞との間の相互作用に関する。胸腺構造を形成する胸腺ストローマ細胞は、それらの解剖上の局在によって分類されてきた。これらは、皮質及び髄質上皮細胞、繊維芽細胞、マクロファージ、ならびに樹状細胞を含む極めて多様で多数の細胞タイプを包含する（［２ａ］で検討される）。ストローマ細胞は、肝臓又は骨髄由来の造血前駆体のＴリンパ球への分化を制御する：Ｔ細胞分化は、胸腺ストローマ細胞を有する未熟胸腺細胞の反応性を調整する成熟マーカー（例えば、ＣＤ４，ＣＤ８）の獲得及びＴ細胞レセプター複合体（ＴＣＲ）によって定義される。胸腺に入る初期胸腺細胞前駆体は、Ｔ細胞特異的分子（Ｔ−ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ；例えば、ＣＤ３，ＴＣＲのアルファ又はベータ鎖、又はＣＤ４及びＣＤ８分子）を発現しない。これらのＣＤ４−ＣＤ８−細胞（ダブルネガティブ（ＤＮ）細胞と称される）は、次に、いわゆるダブルポジティブ（ＤＰ）段階であるＣＤ４＋ＣＤ８＋となり、そして、ＴＣＲ分子を徐々に獲得する。Ｔ細胞の最終成熟は、細胞傷害性／サプレッサーかヘルパー／調節機能かを有する完全な成熟シングルポジティブ（ＳＰ）細胞を発生させるための、ＣＤ４又はＣＤ８分子の選択的欠失に関する。
【０００３】
前記プロセスの間で、Ｔ細胞のＴＣＲ−介在ポジティブ及びネガティブ選択は、自己主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子により提示される外来ペプチド（ｆｏｒｅｉｇｎ  ｐｅｐｔｉｄｅ）に反応することができるが、自己抗原に寛容な多様なＴＣＲレパトアの選択を保障する。前記性質によって、胸腺はＴ細胞寛容の操作のための魅力的な部位となる。現在まで、胸腺の直接操作による寛容誘導についての結果は少ない（［３ａ］で検討される）。しかしながら、膵島細胞［４ａ］、可溶性抗原［５ａ］、又はアデノウイルスベクター［６ａ，７ａ］の胸腺内（ＩＴ）注入を使用した以前の研究は、非免疫抑制動物における外来抗原に対する寛容の誘導が実現可能であることを示してきた。胸腺細胞の産出及び成熟は一生のプロセスであることができるので、可溶性抗原又はアデノウイルスの利用に対する主要な欠点は、胸腺におけるそれらの短期発現である［８ａ］。実際には、選択プロセスの調節は抗原の消失で停止することが好ましく、このことは長期寛容誘導によって問題となる。
【０００４】
静止細胞に感染し、そして、ゲノムへ安定して導入するそれらの能力のために、レンチウイルスベクターは、インビボでの任意の導入遺伝子の長期発現用の強力な新しい道具となる［９ａ］。造血及び筋細胞［１０ａ］、抗原提示細胞（ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）［１１ａ，１２ａ］、同様に、中枢神経系の細胞［１３ａ］を感染させるために、レンチウイルスベクターがインビボでうまく使用されてきた。
【０００５】
本発明者らは、外来遺伝子の長期ＩＴ発現用には、アデノウイルスベクターよりもレンチウイルスベクターのほうがより好ましいということを仮定した。したがって、本発明者らは、ＩＴ注入後のユビキタスレンチウイルスベクターの感染のパターンを調べた。
【０００６】
ユビキタスホスホグリセリン酸キナーゼプロモータの制御下のｅＧＦＰ、又はインフルエンザウイルスのヘマグルチニンを発現するレンチウイルスベクターを、ヤングアダルトマウスの胸腺内へ注入した。胸腺は、直接に、紫外線顕微鏡の下で、及びフローサイメトリーによってその後５〜９０日で試験された。レンチウイルスベクターの胸腺内注入は、主に、少なくとも３ヶ月間検出することのできるストローマ細胞の感染をもたらす。重要なことに、胸腺ストローマ細胞によるヘマグルチニン発現は同起源（ｃｏｇｎａｔｅ）のＴ細胞レセプター（ｃｏｇｎａｔｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を発現する胸腺細胞のネガティブ選択を調節する。感染の多様性に加えて、そして、感染の多様性にもかかわらず、注入後の３０日であっても形質導入された胸腺細胞を検出することもできる。
【０００７】
従って、本発明は、胸腺ストローマ細胞が大規模的及び持続的に感染し、そして、発生した胸腺細胞が感染のかなりの水準を示すという、本発明者らによってなされた証明に基づいている。更に、ＴＣＲ−遺伝子移植（Ｔｇ）マウスにおける同種抗原をコードするレンチウイルスベクターのＩＴ注入が、発生した胸腺細胞のネガティブな選択を導くことが、本発明者らによって示されている。
【０００８】
これらの結果は、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の胸腺内送出が胸腺における外来遺伝子の安定的な発現のために効果的な手段であることを実証している。
【０００９】
従って、本発明の主な目的は、胸腺内投与による遺伝子送出を用いて、特異抗原に対する寛容の誘導、及び、重症複合免疫不全（ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ）の遺伝子治療のための新しいツールを提供することである。
【００１０】
本発明は、胸腺ストローマ細胞、又は、胸腺内リンパ球若しくはリンパ球前駆体のゲノムへ安定して組み込むことが可能であるウイルスベクターであって、遺伝性免疫不全、後天性免疫不全の予防又は治療用か、あるいは、自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用か、あるいは、自己免疫疾患の予防又は治療用である医薬の製造のための前記ウイルスベクターの使用に関する。
【００１１】
本発明は、より詳しくは、レトロウイルス、レンチウイルス、スプマウイルス又はアデノ随伴ウイルスから選択されることを特徴とする、前記のウイルスベクターの使用に関する。
【００１２】
本発明は、より詳しくは、ヒト免疫不全ウイルスＩ型由来の配列に相当するレンチウイルスベクターであることを特徴とする、前記のウイルスベクターの使用に関する。
【００１３】
本発明において使用することのできるレンチウイルスベクターは、例えば、Ｃ．Ｄｅｌｅｎｄａ，ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２００４；６：Ｓ１２５−Ｓ１３８の総論におけるレンチウイルスベクターに由来する。
【００１４】
本発明は、特に、ラウス肉腫ウイルスのＵ３領域、３’ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）のＲ−Ｕ５領域、ｇａｇの一部、セントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）、ＨＩＶＩ型からの５’ＬＴＲのＲ−Ｕ５領域を含むが、３’ＬＴＲのＵ３領域、ｇａｇ，ｐｏｌ，ｎｅｆ，ｖｐｒ，ｖｐｕ，ｅｎｖの半分、前記ＨＩＶＩ型からの５’ＬＴＲのＵ３領域を含まない、レンチウイルスの前記定義された使用に関する。
【００１５】
本発明は、自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用か、あるいは遺伝性免疫不全、後天性免疫不全、若しくは自己免疫疾患の予防又は治療用の所定の組換えヌクレオチド配列を含むウイルスベクターの、前記定義された使用に関するものであって、ここで、前記所定の組換えヌクレオチド配列は、真核細胞におけるその発現を導くエレメントの制御下にある。
【００１６】
本発明は、特に、所定の組換えヌクレオチド配列が、セントラルポリプリントラクトと３’ＬＴＲとの間に挿入されるレンチウイルスベクターの、前記定義される使用に関する。
【００１７】
本発明は、自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導のフレームの胸腺ストローマ細胞の形質転換用、自己免疫疾患の予防又は治療用、及び／又は、遺伝性免疫不全又は後天性免疫不全の予防又は治療のフレームの胸腺内リンパ球又はリンパ球前駆体の形質転換用の医薬の製造のための、前記定義されるウイルスベクターの使用に関する。
【００１８】
本発明は、特に、胸腺内投与用の医薬の製造のための、前記定義されるウイルスベクターの使用に関する。
【００１９】
本発明は、特に、自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導のフレームの胸腺ストローマ細胞を形質転換する胸腺内投与用、及び自己免疫疾患の予防又は治療用の、医薬の製造のための、前記定義されるウイルスベクターの使用に関する。
【００２０】
この点において、本発明は、特に、自己免疫疾患（例えば、重症筋無力症、多発性硬化症、慢性関節リウマチ、狼瘡、大腸炎、炎症性筋疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｍｕｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、炎症性眼疾患（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｏｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅ）、又はＩ型糖尿病）の予防又は治療のフレームの胸腺ストローマ細胞を形質転換する胸腺内投与用の医薬の製造のための、前記定義されるウイルスベクターの使用に関する。
【００２１】
本発明は、特に、胸腺ストローマ細胞を形質転換する胸腺内投与用の医薬の製造のためのウイルスベクターが：
−重症筋無力症の予防又は治療のフレームのミエリン自己抗原コード配列、
−多発性硬化症の予防又は治療のフレームのアセチルコリンレセプタコード配列、又は
−Ｉ型糖尿病の予防又は治療のフレームのインスリンコード配列、
から選択される所定の組換えヌクレオチド配列を含む、前記定義されるウイルスベクターの使用に関する。
【００２２】
本発明は、特に、哺乳類インスリンコード配列（例えば、配列番号１に相当するベクターｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ｃｐｐｔ．ＰＧＫ．Ｉｎｓ２．ＧＴＸ．ｅＧＦＰ．ｐｒｅ）を含むユビキタスレンチウイルスベクターの前記定義される使用にも関する。
【００２３】
本発明は、特に、移植拒絶（例えば、固形器官、細胞もしくは組織同種移植拒絶、造血幹細胞移植拒絶、又は治療用導入遺伝子もしくは遺伝子修正産物の拒絶）の予防又は治療のフレームの胸腺ストローマ細胞を形質転換する胸腺内投与用の医薬の製造のための、前記定義されるウイルスベクターの使用にも関する。
【００２４】
この点において、本発明は、特に、前記拒絶の予防又は治療のフレームの胸腺ストローマ細胞を形質転換する胸腺内投与用の医薬の製造のためのウイルスベクターであって、前記ウイルスベクターが、例えば、ヒト主要組織適合性複合体からの分子（例えば、白血球抗原Ａ２）、ヒト因子ＶＩＩＩ、ヒト因子ＩＸ、ジストロフィン、又はエリトロポイエチンのアロ抗原コード配列から選択される所定の組換えヌクレオチド配列を含む、前記定義されるウイルスベクターの使用に関する。
【００２５】
本発明は、特に、免疫不全（例えば、遺伝性免疫不全又は後天性免疫不全）の予防又は治療のフレームの胸腺内リンパ球又はリンパ球前駆体を形質転換する胸腺内投与用の医薬の製造のための、前記定義されるウイルスベクターの使用にも関する。
【００２６】
本発明は、特に、重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）、例えば、ＡＤＡ−不全（アデノシンデアミナーゼ）、Ｘ−ＳＣＩＤ（Ｘ  ｌｉｎｋｅｄ  ＳＣＩＤ）、ＺＡＰ−７０不全、Ｒａｇ１／２不全、Ｊａｋ３不全、ＩＬ７ＲＡ不全又はＣＤ３不全から選択される遺伝性免疫不全の治療用の、前記定義されるウイルスベクターの使用にも関する。
【００２７】
胸腺内リンパ球又はリンパ球前駆体を形質転換する胸腺内投与用の医薬の製造のためのウイルスベクターであって、前記ウイルスベクターが：
−ＡＤＡ不全の予防又は治療のフレームのＡＤＡコード配列、
−Ｘ−ＳＣＩＤの予防又は治療のフレームのＩＬ２ＲＧコード配列、
−ＺＡＰ−７０不全の予防又は治療のフレームのＺＡＰ−７０コード配列、
−Ｒａｇ１／２不全の予防又は治療のフレームのＲａｇ１／２コード配列、
−Ｊａｋ３不全の予防又は治療のフレームのＪａｋ３コード配列、
−ＩＬ７ＲＡ不全の予防又は治療のフレームのＩＬ７ＲＡコード配列、
−ＣＤ３不全の予防又は治療のフレームのＣＤ３デルタ配列、又はＣＤ３イプシロン配列、から選択される所定の組換えヌクレオチド配列を含む、前記定義されるウイルスベクターの使用に関する。
【００２８】
本発明は、特に、哺乳類ＺＡＰ−７０コード配列（例えば、配列番号２に相当するベクターｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ｃｐｐｔ．ＣＤ４ｐｍＥ．ｈＺＡＰ−７０．ＩＲＥＳ．ｅＧＦＰ．ｐｒｅ）を含むＴ細胞特異的レンチウイルスベクターの前記定義される使用にも関する。
【００２９】
本発明は、特に、ＨＩＶ感染から生じる後天性免疫不全の治療用の、前記定義されるウイルスベクターの使用にも関する。
【００３０】
本発明は、特に、ＨＩＶ感染から生じる後天性免疫不全の治療のフレームの胸腺内リンパ球又はリンパ球前駆体を形質転換する胸腺内投与用の医薬の製造のためのウイルスベクターであって、前記ウイルスベクターが、ペプチドインヒビター（例えば、膜−結合ｇｐ４１−由来のフュージョンインヒビター）、優性ネガティブＴａｔ、Ｒｅｖ、Ｅｎｖ配列、又はリボザイム、アンチセンスＨＩＶＲＮＡ若しくはｓｉＲＮＡから選択される組換えヌクレオチド配列を含む、前記定義されるウイルスベクターの使用に関する。
【００３１】
本発明は、特に、胸腺内リンパ球を形質転換する胸腺内投与用の医薬の製造のためのウイルスベクターであって、前記ウイルスベクターが、Ｔ細胞特異的レンチウイルスベクター（すなわち、特に、Ｔリンパ球で治療用導入遺伝子を発現する性質を有するレンチウイルスベクター）である、前記定義されるウイルスベクターの使用に関する。
【００３２】
この点において、本発明は、特に、レンチウイルスベクターのＴ細胞特異性に関与するＴ細胞特異的ＤＮＡ配列が導入される、前記レンチウイルスベクターに相当するＴ細胞特異的レンチウイルスベクターの前記使用に関するものであって、前記Ｔ細胞特異的ＤＮＡ配列が、例えば：
−ミニマルプロキシマル（ｍｉｎｉｍａｌ  ｐｒｏｘｉｍａｌ）ＣＤ４プロモーター及びマウスエンハンサー（ｍｕｒｉｎｅ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、並びに、配列番号３を有する：ＣＤ４ｐｍＥ（マウスエンハンサーミニマルＣＤ４プロモーター）；
−又はミニマルプロキシマルＣＤ４プロモーター、マウスエンハンサー及びヒトサイレンサー（Ｓｉｌｅｎｃｅｒ）、
に相当するＣＤ４遺伝子調節配列のヒト又はマウスＣＤ４遺伝子からの配列から有利に選択される。
【００３３】
本発明は、特に、Ｔ細胞特異的ＤＮＡ配列がセントラルポリプリントラクトと３’ＬＴＲとの間に挿入される、前記定義されるＴ細胞特異的レンチウイルスベクターの使用に関する。
【００３４】
本発明は、例えば：
−配列番号４に相当する、ｅＧＦＰコード配列を奪われている（ｄｅｐｒｉｖｅｄ）ｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ＰＰＴ．ＣＤ４ｐｍＥ．ｅＧＦＰ．ｐｒｅ、
−配列番号５に相当する、ｅＧＦＰコード配列を奪われている（ｄｅｐｒｉｖｅｄ）ＲＲＬ．ｓｉｎ．ＰＰＴ．ＣＤ４ｐｍＥ．Ｓｉｌ．ｅＧＦＰ．ｐｒｅ、
の、前記定義されるＴ細胞特異的レンチウイルスベクターの使用に関する。
【００３５】
本発明は、注入による胸腺内投与用に適当な医薬組成物の製造のためのウイルスベクターであって、前記ベクターの用量がミリリットル当たり１０５〜１０１１の感染性粒子を含む、前記定義されるウイルスベクターの使用にも関する。
【００３６】
本発明は、遺伝性免疫不全、後天性免疫不全の予防又は治療用か、あるいは、自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の導入用、並びに、自己免疫疾患の予防又は治療用に有用な所定の配列で形質転換された、前記定義されるレンチウイルスベクターにも関する。
【００３７】
この点において、本発明は、特に、以下の：
−哺乳類ＺＡＰ−７０コード配列（例えば、ｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ｃｐｐｔ．ＣＤ４ｐｍＥ．ｈＺＡＰ−７０．ＩＲＥＳ．ｅＧＦＰ．ｐｒｅ（配列番号２））を含むＴ細胞特異的レンチウイルスベクター、
−ウイルス性ＨＡコード配列（例えば、ｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ｃｐｐｔ．ＰＧＫ．ＨＡ．ｐｒｅ（配列番号６））を含むユビキタスレンチウイルスベクター、
−哺乳類インスリンコード配列（例えば、ｐＲＲＬ．ｓｉｎ．ｃｐｐｔ．ＰＧＫ．Ｉｎｓ２．ＧＴＸ．ｅＧＦＰ．ｐｒｅ（配列番号１））を含むユビキタスレンチウイルスベクター、から選ばれる、前記定義されるレンチウイルスベクターに関する。
【００３８】
本発明は、自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用、又は自己免疫性疾患、遺伝性免疫不全、後天性免疫不全の予防又は治療用の所定の組換えヌクレオチド配列を含むウイルスベクター（例えば、前記定義されるレンチウイルスベクターであり、胸腺ストローマ細胞のゲノムへ安定的にインテグレートされる）を含むことを特徴とする、形質転換された胸腺ストローマ細胞に関する。
【００３９】
本発明は、自己又は非自己遺伝子産物、細胞、若しくは組織に対する生物体の免疫寛容の誘導用か、又は自己免疫性疾患、遺伝性免疫不全、後天性免疫不全の予防又は治療用の所定の組換えヌクレオチド配列を含むウイルスベクター（例えば、Ｔ細胞系列のゲノムへ安定的に導入される前記定義されるレンチウイルス）を含むことを特徴とする、Ｔ細胞系列の形質転換された細胞にも関する。
【００４０】
本発明は、適当な医薬担体に関連して、前記定義されるレンチウイルスベクター、又は、前記定義される形質転換された細胞を含む医薬組成物に関する。
【００４１】
本発明は、特に、注入による胸腺内投与に適当な前記定義される医薬組成物に関する。
【００４２】
本発明は、特に、前記レンチウイルスベクターの用量がミリリットル当たり１０５〜１０１１の感染性粒子を含む、前記定義される医薬組成物に関する。
【００４３】
本発明は、遺伝性免疫不全、後天性免疫不全の予防又は治療か、あるいは、自己又は非自己遺伝子産物への生物体の免疫寛容の誘導か、あるいは、前記の自己免疫の予防又は治療のフレームの、真核細胞でのその発現を導くエレメントの制御下での所定の組換えヌクレオチド配列を含む前記定義されるウイルスベクターの胸腺内経路を介する投与を含む遺伝子治療方法にも関する。
【００４４】
本発明は、本発明の前記ベクターと共に、胸腺ストローマ細胞又は胸腺内リンパ球又はリンパ球前駆体の形質転換の以下の実施例によって更に示されるであろう。
【００４５】
Ｉ）胸腺内遺伝子導入によるＺＡＰ−７０免疫不全のインビボ修正
重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）患者は、エクスビボの遺伝子修正幹細胞の投与によって、うまく治療されてきた。しかしながら、その立証された効果にもかかわらず、前記治療は特定のリスク及び困難を伴う。本発明者らは、胸腺におけるＴリンパ球前駆体のインサイチューでの遺伝子修正によって、これらの欠点のいくつかを克服できることを仮定した。実際には、形質導入された前胸腺細胞に選択的優位性を与える遺伝子のインビボでの胸腺内転移は、長期の免疫再構成を可能にする機能的Ｔリンパ球前駆体の発生を招くことが好ましい。本発明者らは、マウスモデルのＺＡＰ−７０不全ＳＣＩＤにおいて前記アプローチの実現可能性を評価した。Ｔ細胞特異的ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターを、事前の調製無しで、アダルトＺＡＰ−７０−／−マウスの胸腺内へ注入した。このことは、ベクターが前駆体細胞へ導入されたことを示す、成熟ＴＣＲαβ＋胸腺細胞の長期の分化を引き起こした。更に、末梢ＺＡＰ−７０発現Ｔ細胞が部分的に多様化したレセプターレパトアを実証し、そして、インビボ及びインビトロで同種抗原に応答した。胸腺がより大きく、そして、より高いパーセンテージの前胸腺細胞がサイクル中にある改良された治療効果が幼若（ｉｎｆａｎｔ）ＺＡＰ−７０−／−マウスにおいて達成された。従って、レンチウイルスベクターの胸腺内注入は、Ｔ細胞免疫不全の遺伝子治療用のエクスビボでの遺伝子修飾造血幹細胞移植に対する単純化され、そして、潜在的により安全な代替案を示す。
【００４６】
本明細書中に使用される略語は以下の通りである：アデノシンデアミナーゼ、ＡＤＡ；骨髄移植、ＢＭＴ；ヒト白血球抗原、ＨＬＡ；造血幹細胞、ＨＳＣ；胸腺内、ＩＴ；マウス白血病ウイルス、ＭＬＶ；重症複合免疫不全症、ＳＣＩＤ；形質導入ユニット、ＴＵ；野生型、ＷＴ。
【００４７】
２）序論
重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）は、日和見感染が出現すると、幼児期においてはほとんど一般に致命的である遺伝性疾患のヘテロジーナスな群である。ＳＣＩＤは同種抗原幹細胞移植によって治療が可能であるが、大多数の患者が組織適合ドナーを持たない。組織適合ドナーがいない場合、ＳＣＩＤ患者はＨＬＡ−ハプロアイデンティカルな（ｈａｐｌｏｉｄｅｎｔｉｃａｌ）ドナーからのＨＳＣ移植を受ける場合がある。このプロトコルの最近の修正は、生存率を７５％に達するまで増加させたが、かなりの短期及び長期合併症があり、そして、かなりの数の循環ｎａiｖｅＴ細胞出現には、１５０日以上を必要とする（１−３）。代わりに、ＳＣＩＤは、遺伝子修正リンパ球選択的利点を有することが好ましいので、遺伝子治療戦略に対するユニークな好ましい設定を示している。実際、前記アプローチが、いくつかのＡＤＡ不全及びγＣ不全ＳＣＩＤ患者において、効果的であることが示されている（４−７）。大規模な増大を経験するＴ前駆体の広範囲な能力は、“自然実験”により強調されているように、少数の修正された前駆体細胞のみがＴ細胞コンパートメントを再構成することができるという可能性に変える。特に、ＳＣＩＤ（Ｘ−ＳＣＩＤ及びＡＤＡ不全）となることが公知である遺伝性突然変異を有するいくらかの個々の患者が、比較的正常なＴ細胞数を有して、比較的健康であることが分っている（８−１１）。これらの患者の個々においては、前記イベントは統計学的に予測不可能であるため、おそらく単一の（ｓｉｎｇｌｅ）造血前駆体／幹細胞での復帰突然変異のためである（８−１０）。これらの「天然遺伝子治療実験（ｎａｔｕｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ）」は、増殖、分化、移行（ｉｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が可能である場合に、単一の前駆体細胞の遺伝子修正がＳＣＩＤに関連する致命的な症状を潜在的に除去できることを示唆している。
【００４８】
これらの前提に基づいて、ＳＣＩＤ疾患用の臨床遺伝子治療の試みは、非特異的レトロウイルスベクターを用いた造血幹（ＨＳＣ）／前駆体細胞（ＣＤ３４＋）へのエクスビボでの遺伝子導入に大きく頼ってきた。その実証された効果（４，６，７，１２，１３）にもかかわらず、前記アプローチは、特定のリスク及び困難を伴う（１４）。最初に、有糸分裂がない場合にはネズミ白血病ウイルス（ＭＬＶ）系レトロウイルスベクターによる遺伝子導入が起きることができないので、前記アプローチは、サイトカインのカクテルの存在下におけるＣＤ３４＋細胞のエクスビボ培養を必要とする。これは、前記細胞の長期的機能性に影響を及ぼすことのある扱いにくい操作である。次に、特に、導入遺伝子全ての幹細胞前駆体における治療遺伝子の異所性発現が、特に、導入遺伝子がシグナル伝達経路と関係する（ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ  ｉｎ）場合に、深刻な副作用を発生させることがある。最後に、細胞遺伝子の発現を修正することによって、オンコレトロウイルス挿入それ自体が白血病発生と関係させる（ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｅ  ｔｏ）ことができる（１４，１５）。
【００４９】
本発明者らは、Ｔ細胞特異的レンチウイルスベクターを用いて胸腺内におけるＴリンパ球前駆体のインサイチュー遺伝子修正によって、これらの欠点のいくつかを克服できるという仮説を立てた。前記仮説は以下の所見によって支持される：（ｉ）肝細胞、抗原提示細胞、筋細胞、及び中枢神経系細胞における効果的なインビボ遺伝子導入をもたらした（１６−２１）；（ｉｉ）胸腺中の初期Ｔリンパ球前駆体（ＥＴＰ）は、ＢＭにおいて発見される共通リンパ球前駆細胞（ＣＬＰ）よりも長い期間で、Ｔ細胞系列の子孫（ｐｒｏｇｅｎｙ）の生産を持続させる（２３）。従って、本発明者らは、形質導入された前胸腺細胞のための選択的優位（ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｄｖａｎｔａｇｅ）を提供する遺伝子をコードするＴ細胞特異的レンチウイルスベクターのＩＴ注入が、その後の長期免疫再構成を有する機能的Ｔリンパ球の子孫の生産に帰するということを結論付けた。
【００５０】
前記アプローチの実現可能性がＺＡＰ−７０不全のマウスモデルにおいて評価された。ＺＡＰ−７０は、その刺激の後でＴ細胞レセプタ（ＴＣＲ）を補強する７０Ｋｄプロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）である（２４）。前記ＺＡＰ−７０は、胸腺細胞、成熟Ｔ細胞、及びＫＮ細胞において、およそ同等のレベルで発現する（２５）。その欠乏は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞のステージで、Ｔ細胞発生におけるブロックを有するＳＣＩＤ表現型をもたらす（２６−２８）。ＺＡＰ−７０のユビキタス発現に関する潜在的な障害／リスクを未然に防ぐために、ｗｔ遺伝子をＴ細胞特異的レンチウイルスベクターへ導入した（２９）。ここで、本発明者らは、前記ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターの直接胸腺内注入がポリクローナルな、そして機能的なＴ細胞の再構成をもたらすことを実証した。
【００５１】
３）結果
ａ）ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターにより胸腺内投与されるマウスにおける胸腺細胞発生
インサイチュー遺伝子導入を介したＴ系列細胞を再構成する試みにおいて、本発明者らは、ヒトＺＡＰ−７０をコードするＴ細胞特異的レンチウイルスベクター（ｐＴ−ＺＡＰ）を、生後８〜１２週のＺＡＰ−７０不全マウスの胸腺へ直接注入した。ｐＴ−ＺＡＰにおいて、ＺＡＰ−７０／ＩＲＥＳ／ｅＧＦＰカセットは、ＣＤ４遺伝子由来のＴ細胞特異的調節配列の転写制御下にある（図１）。前記レンチウイルスベクターに関連して、ＺＡＰ−７０及びｅＧＦＰ発現は一致している（オンライン図１）。胸部外科処置の後で、本発明者らは、ｐＴ−ＺＡＰの形質導入ユニット（ＴＵ）２−４Ｘ１０７を含むべクター調製物１０〜２０μｌを胸腺内注入（ＩＴ）した。これは、胸腺における胸腺細胞とストローマ細胞の全体の合計数に対する感染性粒子の割合によって決定される極めて低い全体の感染の多重度（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ：ＭＯＩ＜０．１）へ翻訳することを注目されたい。更に、ＩＴ注入が胸腺ストローマ細胞の優先的な感染を導くことを本発明者らは本明細書のこれ以降に示しているため、胸腺細胞に対するＭＯＩは更に低い。
【００５２】
ＺＡＰ−７０の不在は、ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ胸腺細胞ステージで、Ｔ細胞分化における比較的遅いブロックと関連する（２６−２８）（図２）。使用される極めて低いＭＯＩから予想されるように、形質導入された胸腺細胞の実際のパーセンテージは極端に低く（０．３％、図２ｂ）、そして、従って、ｐＴ−ＺＡＰのＩＴ注入は、不全動物と比較すると、ＳＰ胸腺細胞の全体のパーセンテージを劇的に変化させることは予想されなかった（図２ａ）。しかしながら、ＺＡＰ−７０不全マウスにおいてＴＣＲβのアップレギュレーションがブロックされるのに対し、ＩＴ注入されたマウスはＴＣＲβ＋ＣＤ４  ＳＰ胸腺細胞におけるかなりの増加が観察された。更にｅＧＦＰ＋ＴＣＲβ＋細胞の分析は、成熟ＣＤ４及びＣＤ８シングルポジティブ胸腺細胞のパーセンテージが、細胞の８０％を超えていることを示している野生型マウスにおいて検出されたパーセンテージと類似していたことを示した（図２ｂ）。顕著な対比において、ｐＴ−ＺＡＰ注入マウスのｅＧＦＰ−ＴＣＲβ＋の母集団での胸腺細胞の表現型は、主に未熟ＤＰ細胞であった（７１％、図２ｂ）。これらの結果は、ｐＴ−ＺＡＰより生じるＺＡＰ−７０発現がＺＡＰ−７０不全における分化のブロックを修正することができることを示唆している。
【００５３】
分化する胸腺細胞は寿命が限られている（例えば、ＤＮ細胞は１５日間で分化し、そして、皮質にわたって移動することができる；（３０））ため、遺伝子導入後７〜５２週の形質導入された胸腺細胞の検出は、ＺＡＰ−７０レンチウイルスベクターが前駆細胞中へうまく導入されたことを強く示唆する（図２ｂ）。驚くべきことに、胸腺細胞分化における前記調節は：
ｉ）コントロールｅＧＦＰレンチウイルスベクターの注入後１４週で成熟胸腺細胞が検出されなかった（オンライン図２）、そして、
ｉｉ）ｅＧＦＰ注入及びＺＡＰ−７０レンチウイルスベクター注入のどちらも、用いられた用量で、ＩＴ注入の後、すぐに（７２時間）胸腺細胞分化を調節しなかった（オンライン図３）、
注入されたビリオンの非特異的効果のためではなかった。
【００５４】
ｂ）ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターを胸腺内投与されるマウスにおけるＴ細胞発生
胸腺におけるインビボ遺伝子導入は末梢の成熟Ｔ細胞の出現をもたらすことを調べるために、末梢血サンプルを、胸腺注入後４週間で始まった、末梢血のＣＤ３＋リンパ球の出現を分析した（図３ａ）。発本明者は、確かに処置されたアダルトマウスの６／２６において、そのような細胞を検出できた。本発明者らが、以前ＺＡＰ−７０発現レトロウイルスベクターを形質導入された野生型前駆体細胞又はＺＡＰ−７０−／−前駆体細胞の以下の移植で観察したものと同様に、ＣＤ３＋の末梢血リンパ球のパーセンテージは４週間で４−５％に達した（３１）。驚くべきことに、再構成マウスにおいて、ＣＤ３＋の末梢血リンパ球のパーセンテージは、時間とともに増加し、６週の末梢血において１５％のＣＤ４＋又はＣＤ８＋リンパ球となった（図３ａ）。それにもかかわらず、それらのレベルは、野生型のマウスで検出されるレベルよりかなり低い。図３ｂに示すように、ｅＧＦＰ＋の区画中の細胞の広大な大部分は、ＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞表現型であった。胸腺内注入されたマウスにおけるＴ細胞数の増加は継続し、ＩＴ注入後８週における、リンパ節及び脾臓のＴリンパ球の高いパーセンテージを伴っていた（図４ａ）。これらのデータは、ＩＴ遺伝子導入によってＺＡＰ−７０発現の修正が、末梢における成熟Ｔ細胞の出現をもたらしたことを示している。
【００５５】
前記Ｔリンパ球の活性化状態は、ＣＤ２５及びＣＤ６９活性化マーカーの発現を評価することによって測定された。ｐＴ−ＺＡＰを胸腺内注入されたＺＡＰ−７０−／−マウスからのＴ細胞はＣＤ２５活性化マーカーを、ＷＴマウスにおいて見られるよりかなり高い比率で発現していた（４４±１１．７％（ｎ＝５）ｖｓ．２２±４．６％（ｎ＝５），ｐ＝０．００１；図４ｂ）。ＷＴマウスのＴ細胞と比較して、ＺＡＰ−７０形質導入Ｔ細胞において、Ｔ細胞活性化を示すＣＤ６９活性化マーカーの発現も上昇していた。ナイーブ（ｎａiｖｅ）及びメモリー表現型（“ｍｅｍｏｒｙ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ”）（３２）の両方のＴ細胞集団が再構成マウスで観察されたとはいえ、ｐＴ−ＺＡＰを胸腺内注入されたマウスにおけるナイーブ（ｎａiｖｅ）Ｔ細胞のパーセンテージは低かった（図４ｂ）。実際にｐＴ−ＺＡＰ注入マウスにおいて認められた末梢Ｔ細胞の全体的なパーセンテージは、ＷＴ動物で見られるパーセンテージより常に低かった（表１）。ｐＴ−ＺＡＰ注入マウスのＣＤ３＋リンパ節Ｔ細胞は２６％に達し、一方、ＷＴマウスのＣＤ３＋リンパ節Ｔ細胞は平均しておよそ６０％となる（表１）。注目すべきことに、ＣＤ３＋Ｔ細胞におけるｅＧＦＰの発現レベルは、１４から６６％まで幅広く、様々であった。ＺＡＰ−７０−／−マウスのＴ細胞レベルは一般に４％を超えないため、ｐＴ−ＺＡＰ注入マウスで検出されるＴ細胞の広大な大部分は、ＺＡＰ−７０遺伝子導入の存在によって分化したことが極めてありうることである。従って、全てのＴ細胞においてｅＧＦＰを検出することができないことは、上流のＩＲＥＳと関連するｉｎ  ｖｉｖｏでのＺＡＰ−７０及びｅＧＦＰの発現の間におけるなんらかの不一致によるものか（図１、表１）、又はＦＡＣＳによって検出されないダウンレギュレートされたｅＧＦＰの低いレベルによるものである。
【００５６】
ｃ）ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターの胸腺内注入されたマウスにおいて発生したＴ細胞のＺＡＰ−７０発現及び多様性
本発明者らは、次に、末梢Ｔリンパ球における発現したＺＡＰ−７０のレベル及びそれらのＴＣＲレパトアの多様性を評価した（図５）。レンチウイルスにコードされたＺＡＰ−７０のレベルは、ＷＴマウスのエンドジーナスタンパク質のレベルと同じようであった。ＺＡＰ−７０遺伝子導入の異所性での発現は、野生型マウス及びｐＴ−ＺＡＰの胸腺内注入によって再構築されたＺＡＰ−７０−／−マウスからのＣＤ３＋細胞及びＣＤ３−細胞のソーティングによって調べた。重要なことには、異所性でのＺＡＰ−７０発現は、ｐＴ−ＺＡＰレンチウイルスベクターからのその発現の後、ＣＤ３＋Ｔ細胞区画においてほとんど独占的に見られることである（図５ａ）。従って、ＣＤ４プロモーターは、Ｔ細胞においてＺＡＰ−７０の発現をエンドジーナスプロモーターのレベルと同じようなレベルまで、推進するように思われる。
【００５７】
本発明者らは、その次に、全体のＴ細胞集団内のそれぞれのＴ細胞レセプター鎖超可変領域（ＴＣＲＢＶ）の相対的な利用を、フローサイトメトリー及びイムノスコープ／スペクトラタイプ（ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ／ｓｐｅｃｔｒａｔｙｐｅ）法によって調べた（３３、３４）。前記２つの方法を組み合わせて使用することによって、本発明者らは、ＢＶ発現細胞の頻度及びＢＶ発現細胞レパトア多様性の両方を証明した。イムノスコープ法は、分析されるＴＣＲのそれぞれの鎖をコードするｍＲＮＡの長さを許容する、超可変相補決定領域３（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ３：ＣＤＲ３）のＲＴ−ＰＣＲに基づく方法である。通常のセッティングにおいて、それぞれのシングルピークは、多数の再配列された様々な配列から構成される。従って、ＣＤＲ３の長さのガウス分布は、極度の多様性とバイアスのないＴ細胞集団とを示している。
【００５８】
ＺＡＰ−７０−ＩＴ再構成マウスからのＴ細胞のＣＤＲ３の長さのプロファイルは、モノクローナル又はオリゴクローナルを示した残りのＢＶファミリーとともに、分析された１４ＢＶファミリーの平均２６％のガウス分布（０〜７５％の範囲の）を有していた。このことは、ガウス分布が分析された全てのＴＣＲＢＶで観察された、ＷＴマウスとは対照的である（図５ｂ）。６匹の再構成マウスのＴＣＲＢＶ発現のフローサイトメトリー解析もまた、それぞれのＺＡＰ−７０−ＩＴ再構成マウスにおいて異なったＢＶ表現を伴った、ＣＤ４及びＣＤ８両方のＴ細胞集団において、通常のレパトアでないが多様性を示した。本発明者らは、平均して、フローサイトメトリーで分析された１１のＢＶファミリーの６０％（３０〜１００％の範囲）、及びイムノスコープ法で分析された７７％（５０〜１００％の範囲）を検出した。この違いは、フローサイトメトリーと比較して、イムノスコープ法のより高い感度によるものであるらしい。従って、前記の結果は、ｐＴ−ＺＡＰ注入マウスのＴ細胞レパトアがＢＶの利用の観点において極めて多様であるが、頻度とクローナリティーの両方に関してかき乱されたことを示している。
【００５９】
ｄ）ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターの胸腺内注入マウスにおいて発生したＴ細胞の機能
ＩＴ注入ＺＡＰ−７０−／−マウスで発生したＴリンパ球の機能性は、エクスビボでのＴ細胞レセプター刺激に反応するそれらの能力によることを含むいくつかの方法で評価される（図６ａ）。注目すべきことに、ＺＡＰ−７０は、成熟Ｔ細胞の活性化に重大な役割を果たしている。ＷＴタンパク質の非存在下では、後期の生物学的反応と同様に初期の反応、例えば、増殖が欠けている（３５）。刺激の非存在下では、ＷＴのＴ細胞もｐＴ−ＺＡＰ形質導入Ｔ細胞も顕著に増殖しなかったことは、異所性でのＺＡＰ−７０の発現が修正されたＴ細胞の基本的な増殖状況を調節しなかったことを示す。コンカナバリンＡ又はα−ＣＤ３／ＩＬ−２どちらかの刺激３日後に、ＷＴ及びｐＴ−ＺＡＰ形質導入Ｔ細胞の両方のかなりのパーセンテージが、４つの分画を経験した。対照的に、コントロールのＺＡＰ−７０欠損マウスから分離された脾細胞では分画は誘導されなかった。従って、ＷＴのＴ細胞と同様の、ｐＴ−ＺＡＰ形質導入Ｔ細胞は、ＴＣＲ特異的刺激に対して反応することができる。
【００６０】
前記ｐＴ−ＺＡＰ形質導入Ｔ細胞がインビボでの免疫刺激に対して応答することができたかを評価するために、マウスは、同系（Ｃ５７ＢＬ／６）及び完全にミスマッチの異系（ＢＡＬＢ／ｃ）両方の皮膚移植片を、背中の両側に移植された。未処置のＺＡＰ−７０不全マウス（ｎ＝３）及び野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ｎ＝２）を含むコントロールマウスは、同じ皮膚移植片を移植された。予想通り、Ｔ細胞が発生していない未処置のＺＡＰ−７０不全マウスは、同系及び異系の移植片も拒絶しなかった。コントロールのＣ５７ＢＬ／６マウスにおいては、同系の移植片は維持されたが、異系移植片は、１２日から後に示した壊死の徴候を伴って急性の拒絶があった。ｐＴ−ＺＡＰ注入マウスにおいては、２１日から３０日の間に、３匹のうちの２匹マウスにおいて拒絶の徴候が見られた。重要なことに、異系移植片の紅斑及び肥厚を示した２匹のマウスは、拒絶の証拠のないマウス（７％）より、ＣＤ３＋末梢Ｔ細胞のより高いパーセンテージ（それぞれ１６％及び１９％の脾臓Ｔ細胞）を有していた。移植辺をより正確に分析するために、マウスは３０〜４０日の間に生検を行い、パラフィン切片で組織学的分析を行なった。ｐＴ−ＺＡＰ注入マウスに移植された同系及び異系の切片においては、繊維芽細胞の過形成の徴候があった。しかしながら、異系の切片においてのみ、真皮表面及び表皮生の層において、リンパ球の浸潤が広く見られた（拒絶の臨床的徴候を伴った３匹のうちの２匹のマウスにおいて；図６ｂ）。更に、ＩＴ注入マウスからのＴリンパ球は、混合リンパ球反応において観察されたように、前記アロ抗原に応答して増殖した。野生型（Ｃ５７ＢＬ／６）及び皮膚移植されたｐＴ−ＺＡＰ再構成マウスからのリンパ節Ｔ細胞は、異系ＢＡＬＢ／ｃ抗原に応答して増殖した（図６ｃ）。従って、ｐＴ−ＺＡＰ形質導入Ｔ細胞の異系免疫刺激は、ミスマッチの皮膚移植の存在によって誘導される。
【００６１】
ｅ）Ｔ細胞再構成の有効性は、幼若（ｉｎｆａｎｔ）マウスへのＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターの胸腺内注入で顕著に増強される。
前記で示されたデータの全体は、ＺＡＰ−７０をコードするレンチウイルスベクターの胸腺内注入が、ＺＡＰ−７０不全マウスの胸腺及び末梢でのＴ細胞分化の回復もたらすことができることを証明している。それにも係わらず、本発明者らは、ｐＴ−ＺＡＰベクターを胸腺内に注入されたアダルトＺＡＰ−７０−／−マウスの２６匹中の６匹（２３％）において、顕著なＴ細胞再構成を検出することができたのみである。本発明者らは、前記の比較的低い有効性は、大部分は、（ｉ）アダルトマウスの小さな胸腺へのウイルス懸濁液の注入に関連する技術的な問題、及び（ｉｉ）使用された低いＭＯＩによるものであると信じる。更に、胸腺における不十分なＺＡＰ−７０導入遺伝子の発現、及び／又はレンチウイルスに感受性である胸腺細胞前駆体の十分でない母集団数も、またその原因を担っている。
【００６２】
前記の問題を避けるための試みとして、本発明者らは、若齢（ｙｏｕｎｇ）マウス（１０〜１４日齢）の胸腺へ、ｐＴ−ＺＡＰレンチウイルスベクターを注入した。ヒトの幼児におけるように、ＺＡＰ−７０不全幼若（ｉｎｆａｎｔ）マウスの胸腺は、アダルトの胸腺より顕著に大きい。更に、本発明者は、ＺＡＰ−７０不全幼若マウス（ｉｎｆａｎｔｓ）の胸腺における前胸腺細胞のより高いパーセンテージが、アダルトの対照物と比較して、それらのＦＳＣ／ＳＳＣプロファイル及び周期内（（Ｋｉ−６７＋）で評価される“芽球様（ｂｌａｓｔ−ｌｉｋｅ）“であることを見出した（図７ａ）。本発明者ら及びその他は、静止期の集団より、周期中のＴ細胞が、レンチウイルス形質導入に対して、より顕著に感受性であることを示してきたので、若齢（ｙｏｕｎｇ）マウスの前胸腺細胞もまた、遺伝子導入により感受性であることが期待される。この仮定と一致して、本発明者らは、幼若マウス（ｉｎｆａｎｔｓ）におけるＫｉ−６７＋胸腺細胞のより高いパーセンテージが、未熟ＤＮ表現型によるものであることを見出した（２５％ｖｓ．１４％、図７ｂ）。
【００６３】
１０〜１４日齢マウスで行なった胸部の外科処置は、技術的に挑戦的だったので、本発明者らは、ウイルス懸濁液を肋骨のすぐ上から皮膚を通して胸腔内へ直接注入することによる「ブラインド（ｂｌｉｎｄ）」アプローチを開発した。注入染料を使用した評価の場合、前記アプローチは、およそ、目的の胸腺内注入をもたらした（未発表の所見）。前記幼若マウス胸腺へのｐＴ−ＺＡＰの胸腺内注入の後、うまく処置されたアダルトマウスにおいて観察されたパーセンテージと同様の、リンパ節及び脾細胞におけるＴ細胞のパーセンテージを伴ったＴ細胞再構成が、注入動物の７５％（１５／２０）において観察された（図５Ｃ及び表１）。従って、幼若マウス胸腺への、ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターの直接インビボ注入は、Ｔ細胞再構成の顕著に改善された成功率をもたらす。
【００６４】
４）ディスカッション
すなわち、前記のデータは、ＺＡＰ−７０不全マウスの胸腺へのＴ細胞特異的レンチウイルスベクターの直接注入が、長期のＴ細胞再構成及び末梢Ｔ細胞での導入遺伝子発現を可能にすることを証明している。前記治療の有効性は、大部分は、導入遺伝子が強い選択的優位性を与えているＳＣＩＤの背景によるものである（４−７）。重要なことは、本発明者が、ｐＴ−ＺＡＰベクターのＩＶ注入でのＴ細胞再構成を観察することができなかったので、前記選択的優位性は、胸腺内注入によって完全に引き出されていることである。
【００６５】
ａ）胸腺内レンチウイルスベクター注入による初期Ｔ細胞前駆体の形質導入
胸腺内遺伝子導入において、ｐＴ−ＺＡＰ処置マウスの末梢Ｔリンパ球は、β鎖の再配列後の形質導入されたＤＰ胸腺細胞由来の成熟胸腺細胞の単一又はオリゴクローナルな集団の増大に起因することを可能とするであろう。前記の結果は、前記の仮定に対して討論する。確かに、本発明者らは、以前、未成熟のＴ細胞前駆体を含む形質導入ＤＮ細胞が、非特異的（２１）又はＴ細胞特異的なレンチウイルスベクターのＩＴレンチウイルス注入直後に検出されることができることを報告した（オンライン図３）。更に、遺伝子修飾胸腺細胞が、少数の数で、そして低いパーセンテージの動物（＜２５％）にもかかわらず、かなりの期間検出された。１年間維持された１匹のｐＴ−ＺＡＰ注入動物において、ｅＧＦＰを発現している未成熟のＤＮ及びＤＰ胸腺細胞（０．５％）が、いまだに検出されている（オンライン図４）。それにもかかわらず、これが胸腺の前駆体細胞の維持によるものであるか、又はより確からしいが、胸腺へ形質転換された前駆体の再循環によるものであるかは、明らかではない。前記の２番目の仮定は、形質導入された系列陰性の前駆体細胞が胸腺へのｐＴ−ＺＡＰの注入後８週より後の骨髄において検出されることができるという、発明者の発見によって支持される（未発表所見）。従って、胸腺前駆体の「歴史（ｈｉｓｔｏｒｙ）」を評価すること、及び前記細胞の亜集団が胸腺から移動し、そして、後期の時点のポイントにおいて再度入ることができるかどうかを決定することは、重要なことであろう。
【００６６】
ｂ）Ｔ細胞多様性及び機能
前記イムノスコープ法は、分析されるＴＣＲのそれぞれの鎖をコードするｍＲＮＡの長さを許す、超可変相補決定領域３（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ３：ＣＤＲ３）のＲＴ−ＰＣＲに基づく方法である。通常の設定において、それぞれのシングルピークは、多数の再配列された様々な配列から構成される。いくつかのＢＶファミリーのシングルピークの検出は、ＰＣＲによって優先的に増幅される単一のクローンの増大を示し、そして、そのこと自体は、存在しているであろうにも係わらず、ＣＤＲ３産物の検出を妨害するであろう。
【００６７】
ｐＴ−ＺＡＰ再構成末梢Ｔ細胞のレベル及び多様性は、インビトロでの分裂促進刺激に応答する機能的Ｔ細胞を有するＺＡＰ−７０免疫不全マウスを提供するのに十分であり、そしてインビボで異種皮膚移植に対する免疫反応を上昇させる。方法論の改良によって、名目上の抗原、及び／又は感染性のチャレンジに対する免疫反応の評価が重要になるであろう。しかしながら、ＩＴ処置ＺＡＰ−／−動物において検出されるＴＣＲＢＶプロファイルが、Ｘ−ＳＣＩＤ患者のプロファイルを連想させることに注意することが重要であり、Ｘ−ＳＣＩＤ患者のＴ細胞は単一のＴ細胞前駆体の復帰変異から発生し（９）、かなりよい臨床上の状態をもたらす。従って、わずかな前駆体／幹細胞の救出は、感染からの防御及び良好な臨床上の予後を、患者に提供するのに十分であり、部分的に多様化したＴＣＲレパトアを有するＴ細胞の分化を促進することができる。
【００６８】
ｃ）ＳＣＩＤに対するインサイチューでの遺伝子治療の潜在的な安全性の利点
この明細書で使用されたｅＧＦＰが最小のＣＤ４プロモーターでドライブされるベクターを注入されたマウスにおいて、ユビキタスレンチウイルスベクターを使用したＩＴ注入後の主な形質導入されるターゲットである胸腺ストローマ又は肝臓で、ｅＧＦＰ発現が検出されないことは、注目に値する。一般に、このことが、系統特異性が得られるレンチウイルスベクターの主要な利点であり、前記のアプローチの全体的な安全性に貢献している。我々のアプローチの他の利点は、遺伝子導入が事前の調製なしに得ることができることである。実際、マウスＳＣＩＤモデルへの遺伝子修飾ＨＳＣの移植研究のかなりの主要な部分は、致命的な放射線照射マウスで行なわれていた（３１、３８、３９）。更に、ＡＤＡ不全を伴ったヒトの患者では、エクスビボでの遺伝子修正ＨＳＣの注入後の高いレベルの免疫再構成には、移植前の化学療法が必要であった（６）。重要なことには、ＺＡＰ−７０不全マウスにおいては、エクスビボのＺＡＰ−７０レトロウイルスベクターを伴った修正ＨＳＣによるＴ細胞再構成は調製無しでは、起こらないことである。要するに、事前の調製無しのＴ細胞特異的レンチウイルスベクターのＩＴ注入は、ＳＣＩＤ遺伝子治療用の安全な改良を示している。
【００６９】
ＺＡＰ−７０不全の子供における、我々のアプローチの関心を更に強調することだが、本発明者は、アダルトマウスと比較して幼若マウスで、再構成のより高い頻度が得られることを示している。可能性のある臨床の適用を考慮して、本発明者は最近、マカクにおいて、超音波の誘導下で直接胸腺内注入を行なう、前記アプローチを評価し、そして容易で実現可能な技術的やり方を決定した。前記アプローチの全体の有効性は臨床背景において改良されるであろう。レンチウイルスベクターの胸腺内遺伝子導入は、マウスに提供する場合は、最適ではなく、
（ｉ）同様のＭＯＩｓ及び活性化の同一のレベルにおいて、ヒトＴ細胞よりマウスＴ細胞はレンチウイルス感染に対する感受性が低く（未発表所見、３７参照）、そして、
（ｉｉ）マウス胸腺の小さなサイズは、ベクターの大量の注入も、繰り返しの注入もできない。
同様に、マウスから大動物又は同等のヒトへの遺伝子導入の置き換えは、減少した有効性をもたらすけれども、これは、前記の背景の場合ではない。
【００７０】
５）方法
レンチウイルス構築及びウイルス産生
ｅＧＦＰ発現Ｔ細胞特異的なレンチウイルスベクターをコードしている、プラスミドｐＧＭ１は、以前に記載した（２９）。ＺＡＰ−７０及びｅＧＦＰをコードしたＴ細胞特異的レンチウイルスベクターを得るために、ＺＡＰ−７０−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰカセット（４０）を、オリジナルのｅＧＦＰをコードする配列を欠如させたｐＧＭ１プラスミドに挿入した。確認したＴ細胞特異的レンチウイルスベクターｐＲＲＬＳＩＮ．ＰＰＴ．ＣＤ４ｐｍＥ．ＺＡＰ−７０−ＩＲＥＳ−ｅＧＦＰｐｒｅは、以下、ｐＴ−ＺＡＰと称する。正確なクローニングの詳説は、要望により利用可能である。ウイルスは、２９３Ｔ細胞への、Ｖｉｆ，Ｖｐｒ，Ｖｐｕ及びＮｅｆアクセサリーＨＩＶ−１タンパク質（ｐ８、９１）を欠如しているエンキャプシデーション・プラスミドであるベクタープラスミド、及び水疱性口内炎ウイルスのＧタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）エンベロープ発現プラスミド（ｐＨＣＭＶ−Ｇ）（４１）のカルシウムリン酸の一過性の共ランスフェクション（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）により産生した。形質転換ユニット（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  ｕｎｉｔｓ：ＴＵ）として示されたウイルス量は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞への調製されたウイルスの段階希釈の形質転換を評価することによって測定した。前記カセットからのＺＡＰ−７０及びｅＧＦＰの発現は、ジャーカット（Ｊｕｒｋａｔ）Ｔ細胞を使用したインビトロでの評価に比例している。
【００７１】
マウス及び胸腺内注入
ＺＡＰ−７０−／−マウスは、病原体フリーの状態で交配され、維持されていた。胸腺内注入は、２〜３週齢（幼若マウス）又は６〜９週齢（アダルトマウス）のいずれかに行なわれた。前者の場合、１０μｌの総量のウイルスを、０．３ｍｌ、２８ゲージ、８ｍｍのインシュリンシリンジを用いて、肋骨のすぐ上の胸腔内に皮膚を通して、直接注入された。アダルトマウスは、４０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタールで麻酔した。気管へのアクセスを確保するため、より下部の首の中切開を行なった。肋骨の切開は最初の２つの肋骨で行ない、ウイルスを可視下の胸腺に注入した。すべての実験は、ローカル・アニマル・ファシリティー・インスティテューショナル・レビュー・ボード（ｌｏｃａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｆａｃｉｌｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ）によって、承認された。
【００７２】
免疫表現型の検査、増殖、及びフローサイトメトリー
ＺＡＰ−７０−／−マウスは、感染後６週〜１８週で安楽死され、解剖された。コントロールは、週齢の一致した１２９／Ｓｖマウスから得た。リンパ節、脾臓又は胸腺からの細胞は、示された標識抗体（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）で染色された。増殖分析のため、（４２）に記載のように、脾細胞は２．５Ｘ１０６細胞／ｍｌの濃度に再懸濁され、フルオロクロム・５−カルボキシフルオロセイン・ジアセテート・サクシニミジル・エステル（ｆｌｕｏｒｏｃｈｒｏｍｅ  ５−ｃａｒｂｏｘｙｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｄｉａｃｅｔａｔｅ  ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｅｓｔｅｒ：ＣＦＳＥ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で標識した。細胞は、示したように、１０％ＦＣＳ及び１０μＭのβ−メルカプトエタノールを添加したＲＰＭＩで、可溶性αＣＤ３ｍＡｂ（１μｇ／ｍｌ，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、又はコンカナバリンＡの存在下で、培養した。あるいは、混合リンパ球反応は、異系Ｂａｌｂ／ｃ脾細胞（５Ｘ１０５／ｗｅｌｌ）の存在下、又は非存在下で、ＩＬ−２添加培地（５０Ｕ／ｍｌ）中、リンパ節細胞（５Ｘ１０５／ｗｅｌｌ）を培養することによって行なった。すべての捕捉は、ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で行ない、分析は、セルクエスト（ＣｅｌｌＱｕｅｓｔ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）又はフロージョー（ＦｌｏｗＪｏ；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）ソフトウエアで行なった。
【００７３】
皮膚移植
皮膚移植は、ｐＴ−ＺＡＰ−７０のＩＴ注入後３カ月の、Ｔ細胞が再構成された、麻酔下のＺＡＰ−７０不全マウスに加え、野生型（Ｃ５７／Ｂｌ６）及びＺＡＰ−７０不全マウスに行なわれた。完全な厚さの皮膚移植片（０．５ｃｍ２）は、同系のＣ５７／Ｂｌ６及び異系のＢａｌｂＣ両方のドナーの尾の付け根から調製した。移植ベットはレシピエントマウスの背中の側面の右と左に準備した。Ｃ５７／Ｂｌ６及びＢａｌｂＣ両方からの皮膚移植片は、絹糸の中断した縫合糸でそれぞれの背中に付着され、移植の外観は１週間に３回モニターされた。パラフィン切片は、生検された移植片のホルマリン固定後に準備された。切片はヘマトキシリン及びエオシンで染色された。
【００７４】
ＴＣＲ  ＣＤＲ３サイズ分析
総ＲＮＡは、ＲＮＡｂｌｅ（Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｌｅｓ  Ｕｌｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて調製した。５μｇのＲＮＡがオリゴ（ｄＴ）プライマー（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びＭ−ＭＬＶリバーストランスクリプターゼ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を用いて逆転写された。ｃＤＮＡは、２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を用いて、１４のＴＣＲＢＶサブファミリー特異的プライマーの１つ及びコンスタント領域（ＴＣＲのβ鎖のＣβ１及びＣβ２）を認識するＣβプライマーとともに、５０μＬの反応混合液中で増幅された（サイクル  １ｍｉｎ．９４°Ｃ，１ｍｉｎ．６０°Ｃ，２ｍｉｎ．７２°Ｃ）。最終的な濃度は、１ＸＰＣＲ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｒｏｃｈｅ）中に、それぞれのプライマー０．５μＭ、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、２ｍＭ  ＭｇＣｌ２である。２μＬのそれぞれのＰＣＲは、ランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）反応で、０．２μＭのＲＯＸ標識Ｃβプライマー（Ｐｒｏｌｉｇｏ  Ｆｒａｎｃｅ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）、及び２．５ＵのＡｍｐｌｉＴａｑ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）で、更に処理された（１０サイクル  １ｍｉｎ．９４°Ｃ，１ｍｉｎ．６０°Ｃ，２ｍｉｎ．７２°Ｃ）。それぞれのランオフ（ｒｕｎ−ｏｆｆ）産物は、変性し、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ３７７シークエンサー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いた蛍光分析のためにゲルに泳動された。ＣＤＲ３の長さのプロファイルを得るために、生のデータをＩｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｌｏｇｉｎｓｅｒｍ，Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を使用して解析した。この研究において使用されているＴＣＲＢＶの用語は、Ａｒｄｅｎらによって提唱されている（４３）。
【表１】
2008501661.tif 000002
【００７５】
以下のインサイチューでのＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターの胸腺中注入ＺＡＰ−７０−／−マウスにおけるＣＤ３＋リンパ球のパーセンテージ
ＺＡＰ−７０−／−マウスは、示した年齢で、ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターを注入され、そして、前記注入後１２〜５２週間で分析された。解剖された動物のリンパ節におけるＣＤ３＋Ｔ細胞のパーセンテージと同様に、ＣＤ３＋母集団におけるｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージもフローサイメトリーによって決定された。ＩＴ注入されたマウスの提示された分析は、リンパ節分析が行なわれたもののためのＴ細胞再構成を示すマウスに限定されていることを注意されたい。コントロールＺＡＰ−７０−／−及びＷＴマウスのＴ細胞のパーセンテージが示されている。
【００７６】
６）参照文献
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４．   Ｋｏｈｎ，  Ｄ．Ｂ．，  Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｃａｒｂｏｎａｒｏ，  Ｄ．，  Ｓｈｉｇｅｏｋａ，  Ａ．，  Ｂｒｏｏｋｓ，  Ｊ．，  Ｓｍｏｇｏｒｚｅｗｓｋａ，  Ｅ．Ｍ．，  Ｂａｒｓｋｙ，  Ｌ．Ｗ．，  Ｃｈａｎ，  Ｒ．，  Ｂｕｒｏｔｔｏ，  Ｆ．，  Ａｎｎｅｔｔ，  Ｇ．，  ｅｔ  ａｌ．  １９９８．  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｎｏｒｍａｌ  ＡＤＡ  ｇｅｎｅ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ  ｕｍｂｉｌｉｃａｌ  ｃｏｒｄ  ｂｌｏｏｄ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ＡＤＡ−  ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ＳＣＩＤ  ｎｅｏｎａｔｅｓ．  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ４：７７５−７８０．
５．   Ｃａｖａｚｚａｎａ−Ｃａｌｖｏ，  Ｍ．，  Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ，  Ｓ．，  ｄｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｂａｓｉｌｅ，  Ｇ．，  Ｇｒｏｓｓ，  Ｆ．，  Ｙｖｏｎ，  Ｅ．，  Ｎｕｓｂａｕｍ，  Ｐ．，  Ｓｅｌｚ，  Ｆ．，  Ｈｕｅ，  Ｃ．，  Ｃｅｒｔａｉｎ，  Ｓ．，  Ｃａｓａｎｏｖａ，  Ｊ．Ｌ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２０００．  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  （ＳＣＩＤ）−Ｘ１  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８８：６６９−６７２．
６．   Ａｉｕｔｉ，  Ａ．，  Ｓｌａｖｉｎ，  Ｓ．，  Ａｋｅｒ，  Ｍ．，  Ｆｉｃａｒａ，  Ｆ．，  Ｄｅｏｌａ，  Ｓ．，  Ｍｏｒｔｅｌｌａｒｏ，  Ａ．，  Ｍｏｒｅｃｋｉ，  Ｓ．，  Ａｎｄｏｌｆｉ，  Ｇ．，  Ｔａｂｕｃｃｈｉ，  Ａ．，  Ｃａｒｌｕｃｃｉ，  Ｆ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＤＡ−ＳＣＩＤ  ｂｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｗｉｔｈ  ｎｏｎｍｙｅｌｏａｂｌａｔｉｖｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：２４１０−２４１３．
７．   Ｇａｓｐａｒ，  Ｈ．Ｂ．，  Ｐａｒｓｌｅｙ，  Ｋ．Ｌ．，  Ｈｏｗｅ，  Ｓ．，  Ｋｉｎｇ，  Ｄ．，  Ｇｉｌｍｏｕｒ，  Ｋ．Ｃ．，  Ｓｉｎｃｌａｉｒ，  Ｊ．，  Ｂｒｏｕｎｓ，  Ｇ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｍ．，  Ｖｏｎ  Ｋａｌｌｅ，  Ｃ．，  Ｂａｒｉｎｇｔｏｎ，  Ｔ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００４．  Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｂｙ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａ  ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｇａｍｍａｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｌａｎｃｅｔ  ３６４：２１８１−２１８７．
８．   Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，  Ｒ．，  Ｙａｎｇ，  Ｄ．Ｒ．，  Ｐｕｃｋ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｈｕｉｅ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｊｉａｎｇ，  Ｃ．Ｋ．，  ａｎｄ  Ｋｕｒｌａｎｄｓｋｙ，  Ｌ．Ｅ．  １９９６．  Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  ｎｏｒｍａｌ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ａ  ｐａｔｉｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  １３：２９０−２９５．
９．   Ｂｏｕｓｓｏ，  Ｐ．，  Ｗａｈｎ，  Ｖ．，  Ｄｏｕａｇｉ，  Ｉ．，  Ｈｏｒｎｅｆｆ，  Ｇ．，  Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ，  Ｃ．，  Ｌｅ  Ｄｅｉｓｔ，  Ｆ．，  Ｚｅｐｐ，  Ｆ．，  Ｎｉｅｈｕｅｓ，  Ｔ．，  Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ，  Ｐ．，  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ａ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２０００．  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９７：２７４−２７８．
１０． Ｓｔｅｐｈａｎ，  Ｖ．，  Ｗａｈｎ，  Ｖ．，  Ｌｅ  Ｄｅｉｓｔ，  Ｆ．，  Ｄｉｒｋｓｅｎ，  Ｕ．，  Ｂｒｏｋｅｒ，  Ｂ．，  Ｍｕｌｌｅｒ−Ｆｌｅｃｋｅｎｓｔｅｉｎ，  Ｉ．，  Ｈｏｒｎｅｆｆ，  Ｇ．，  Ｓｃｈｒｏｔｅｎ，  Ｈ．，  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ａ．，  ａｎｄ  ｄｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｂａｓｉｌｅ，  Ｇ．  １９９６．  Ａｔｙｐｉｃａｌ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｄｕｅ  ｔｏ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｅｆｅｃｔ  ｉｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３３５：１５６３−１５６７．
１１． Ａｒｉｇａ，  Ｔ．，  Ｏｄａ，  Ｎ．，  Ｙａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｋ．，  Ｋａｗａｍｕｒａ，  Ｎ．，  Ｋｉｋｕｔａ，  Ｈ．，  Ｔａｎｉｕｃｈｉ，  Ｓ．，  Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，  Ｙ．，  Ｔｅｒａｄａ，  Ｋ．，  Ｉｋｅｄａ，  Ｈ．，  Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ，  Ｍ．Ｓ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｒｏｍ  ２  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  ｄｅａｍｉｎａｓｅ  （ＡＤＡ）  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｓｈｏｗｅｄ  ｔｈｅ  ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＤＡ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｅｓｕｌｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎ．  Ｂｌｏｏｄ  ９７：２８９６−２８９９．
１２． Ｃａｖａｚｚａｎａ−ｃａｌｖｏ，  Ｍ．，  Ｈａｃｅｉｎ−Ｂｅｙ，  Ｓ．，  Ｄｅ  Ｓａｉｎｔ  Ｂａｓｉｌｅ，  Ｇ．，  Ｇｒｏｓｓ，  Ｆ．，  Ｎｕｓｂａｕｍ，  Ｐ．，  Ｙｖｏｎ，  Ｅ．，  Ｃａｓａｎｏｖａ，  Ｇ．Ｌ．，  Ｌｅ  Ｄｅｉｓｔ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｆｉｓｈｅｒ，  Ａ．  １９９９．  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＳＣＩＤ−ＸＩ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｇｃ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ａ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｔｏ  ＣＤ３４＋  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．  Ａｂｓｔｒａｃｔ  ｉｎ  Ｂｌｏｏｄ，  Ａ．  Ｓ．  Ｈ．  ９４  ｓｕｐ  １：３６７ａ．
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１５． Ｌｉ，  Ｚ．，  Ｄｕｌｌｍａｎｎ，  Ｊ．，  Ｓｃｈｉｅｄｌｍｅｉｅｒ，  Ｂ．，  Ｓｃｈｍｉｄｔ，  Ｍ．，  ｖｏｎ  Ｋａｌｌｅ，  Ｃ．，  Ｍｅｙｅｒ，  Ｊ．，  Ｆｏｒｓｔｅｒ，  Ｍ．，  Ｓｔｏｃｋｉｎｇ，  Ｃ．，  Ｗａｈｌｅｒｓ，  Ａ．，  Ｆｒａｎｋ，  Ｏ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００２．  Ｍｕｒｉｎｅ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｍａｒｋｉｎｇ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６：４９７．
１６． Ｅｓｓｌｉｎｇｅｒ，  Ｃ．，  Ｃｈａｐａｔｔｅ，  Ｌ．，  Ｆｉｎｋｅ，  Ｄ．，  Ｍｉｃｏｎｎｅｔ，  Ｉ．，  Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ，  Ｐ．，  Ｌｅｖｙ，  Ｆ．，  ａｎｄ  ＭａｃＤｏｎａｌｄ，  Ｈ．Ｒ．  ２００３．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ＤＣｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＣＤ８（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１１：１６７３−１６８１．
１７． ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ，  Ｔ．，  Ｔｈｏｒｒｅｚ，  Ｌ．，  Ｎａｌｄｉｎｉ，  Ｌ．，  Ｆｏｌｌｅｎｚｉ，  Ａ．，  Ｍｏｏｎｓ，  Ｌ．，  Ｂｅｒｎｅｍａｎ，  Ｚ．，  Ｃｏｌｌｅｎ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｃｈｕａｈ，  Ｍ．Ｋ．  ２００２．  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ−１  ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｃａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅ  ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｂｌｏｏｄ  １００：８１３−８２２．
１８． Ｙａｎａｙ，  Ｏ．，  Ｂａｒｒｙ，  Ｓ．Ｃ．，  Ｋａｔｅｎ，  Ｌ．Ｊ．，  Ｂｒｚｅｚｉｎｓｋｉ，  Ｍ．，  Ｆｌｉｎｔ，  Ｌ．Ｙ．，  Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ，  Ｊ．，  Ｌｉｇｇｉｔｔ，  Ｄ．，  Ｄａｌｅ，  Ｄ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｏｓｂｏｒｎｅ，  Ｗ．Ｒ．  ２００３．  Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｃｙｃｌｉｃ  ｎｅｕｔｒｏｐｅｎｉａ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｇ−ＣＳＦ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．  Ｂｌｏｏｄ  １０２：２０４６−２０５２．  Ｅｐｕｂ  ２００３  Ｍａｙ  ２０１５．
１９． Ｐａｌｍｏｗｓｋｉ，  Ｍ．，  Ｓａｌｉｏ，  Ｍ．，  Ｄｕｎｂａｒ，  Ｒ．Ｐ．，  ａｎｄ  Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏ，  Ｖ．  ２００２．  Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ＨＬＡ  ｃｌａｓｓ  Ｉ  ｔｅｔｒａｍｅｒｓ  ｔｏ  ｄｅｓｉｇｎ  ａ  ｖａｃｃｉｎａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｍｅｌａｎｏｍａ  ｐａｔｉｅｎｔｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  １８８：１５５−１６３．
２０． Ｋｏｂｉｎｇｅｒ，  Ｇ．Ｐ．，  Ｌｏｕｂｏｕｔｉｎ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｂａｒｔｏｎ，  Ｅ．Ｒ．，  Ｓｗｅｅｎｅｙ，  Ｈ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｊ．Ｍ．  ２００３．  Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｃ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｂｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １４：１４４１−１４４９．
２１． Ｂａｅｋｅｌａｎｄｔ，  Ｖ．，  Ｅｇｇｅｒｍｏｎｔ，  Ｋ．，  Ｍｉｃｈｉｅｌｓ，  Ｍ．，  Ｎｕｔｔｉｎ，  Ｂ．，  ａｎｄ  Ｄｅｂｙｓｅｒ，  Ｚ．  ２００３．  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｐｒｅｖｅｎｔｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ａｆｔｅｒ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｕｓｅ  ｂｒａｉｎ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：１９３３−１９４０．
２３． Ａｌｌｍａｎ，  Ｄ．，  Ｓａｍｂａｎｄａｍ，  Ａ．，  Ｋｉｍ，  Ｓ．，  Ｍｉｌｌｅｒ，  Ｊ．Ｐ．，  Ｐａｇａｎ，  Ａ．，  Ｗｅｌｌ，  Ｄ．，  Ｍｅｒａｚ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ｂｈａｎｄｏｏｌａ，  Ａ．  ２００３．  Ｔｈｙｍｏｐｏｉｅｓｉｓ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒｓ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：１６８−１７４．
２４． Ｃｈａｎ，  Ａ．Ｃ．，  Ｉｗａｓｈｉｍａ，  Ｍ．，  Ｔｕｒｃｋ，  Ｃ．Ｗ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ａ．  １９９２．  ＺＡＰ−７０：  ａ  ７０  ｋｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｔｈａｔ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ＴＣＲ  ｚｅｔａ  ｃｈａｉｎ．  Ｃｅｌｌ  ７１：６４９−６６２．
２５． Ｃｈａｎ，  Ａ．Ｃ．，  ｖａｎ  Ｏｅｒｓ，  Ｎ．Ｓ．，  Ｔｒａｎ，  Ａ．，  Ｔｕｒｋａ，  Ｌ．，  Ｌａｗ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｒｙａｎ，  Ｊ．Ｃ．，  Ｃｌａｒｋ，  Ｅ．Ａ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ａ．  １９９４．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ＺＡＰ−７０  ａｎｄ  Ｓｙｋ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ，  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｈｉｓ  ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｉｎ  ＴＣＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２：４７５８−４７６６．
２６． Ｎｅｇｉｓｈｉ，  Ｉ．，  Ｍｏｔｏｙａｍａ，  Ｎ．，  Ｎａｋａｙａｍａ，  Ｋ．，  Ｓｅｎｊｕ，  Ｓ．，  Ｈａｔａｋｅｙａｍａ，  Ｓ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｑ．，  Ｃｈａｎ，  Ａ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｌｏｈ，  Ｄ．Ｙ．  １９９５．  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ＺＡＰ−７０  ｉｎ  ｂｏｔｈ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３７６：４３５−４３８．
２７． Ｗｉｅｓｔ，  Ｄ．Ｌ．，  Ａｓｈｅ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｈｏｗｃｒｏｆｔ，  Ｔ．Ｋ．，  Ｌｅｅ，  Ｈ．Ｍ．，  Ｋｅｍｐｅｒ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｎｅｇｉｓｈｉ，  Ｉ．，  Ｓｉｎｇｅｒ，  Ｄ．Ｓ．，  Ｓｉｎｇｅｒ，  Ａ．，  ａｎｄ  Ａｂｅ，  Ｒ．  １９９７．  Ａ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ａｒｉｓｉｎｇ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＤＬＡＡＲＮ  ｍｏｔｉｆ  ｏｆ  ｍｕｒｉｎｅ  ＺＡＰ−７０  ａｂｒｏｇａｔｅｓ  ｋｉｎａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ａｒｒｅｓｔｓ  ｔｈｙｍｏｃｙｔｅ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６：６６３−６７１．
２８． Ｋａｄｌｅｃｅｋ，  Ｔ．Ａ．，  ｖａｎ  Ｏｅｒｓ，  Ｎ．Ｓ．，  Ｌｅｆｒａｎｃｏｉｓ，  Ｌ．，  Ｏｌｓｏｎ，  Ｓ．，  Ｆｉｎｌａｙ，  Ｄ．，  Ｃｈｕ，  Ｄ．Ｈ．，  Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，  Ｋ．，  Ｋｉｌｌｅｅｎ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓ，  Ａ．  １９９８．  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ＺＡＰ−７０  ｉｎ  ＴＣＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６１：４６８８−４６９４．
２９． Ｍａｒｏｄｏｎ，  Ｇ．，  Ｍｏｕｌｙ，  Ｅ．，  Ｂｌａｉｒ，  Ｅ．Ｊ．，  Ｆｒｉｓｅｎ，  Ｃ．，  Ｌｅｍｏｉｎｅ，  Ｆ．Ｍ．，  ａｎｄ  Ｋｌａｔｚｍａｎｎ，  Ｄ．  ２００３．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４＋  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＣＤ４  ｇｅｎｅ．  Ｂｌｏｏｄ  １０１：３４１６−３４２３．
３０． Ｐｏｒｒｉｔｔ，  Ｈ．Ｅ．，  Ｇｏｒｄｏｎ，  Ｋ．，  ａｎｄ  Ｐｅｔｒｉｅ，  Ｈ．Ｔ．  ２００３．  Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｓｔｅａｄｙ−ｓｔａｔｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔｓ  ｂｙ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｏｎｉｒｒａｄｉａｔｅｄ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８：９５７−９６２．
３１． Ｏｔｓｕ，  Ｍ．，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｍ．，  Ｆｅｒｒａｎｄ，  Ｃ．，  Ｍｅｒｉｄａ，  Ｐ．，  Ｒｅｂｏｕｉｓｓｏｕ，  Ｃ．，  Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ，  Ｐ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｎ．，  Ｃａｎｄｏｔｔｉ，  Ｆ．，  ａｎｄ  Ｎｏｒａｚ，  Ｎ．  ２００２．  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ＺＡＰ−７０−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ  ｃｅｌｌｓ．  Ｂｌｏｏｄ  １００：１２４８−１２５６．
３２． Ｂｅｌｌｉｅｒ，  Ｂ．，  Ｔｈｏｍａｓ−Ｖａｓｌｉｎ，  Ｖ．，  Ｓａｒｏｎ，  Ｍ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｋｌａｔｚｍａｎｎ，  Ｄ．  ２００３．  Ｔｕｒｎｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｍｏｒｙ  ｉｎｔｏ  ａｍｎｅｓｉａ  ｂｙ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｖｉｄｉｎｇ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １００：１５０１７−１５０２２．  Ｅｐｕｂ  １２００３  Ｎｏｖ  １５０２１．
３３． Ｐｕｉｓｉｅｕｘ，  Ｉ．，  Ｂａｉｎ，  Ｃ．，  Ｍｅｒｒｏｕｃｈｅ，  Ｙ．，  Ｍａｌａｃｈｅｒ，  Ｐ．，  Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ，  Ｐ．，  Ｅｖｅｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｆａｖｒｏｔ，  Ｍ．  １９９６．  Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｉｎ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｎｉｎｅ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｎａｌ−ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤＲ３  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｃｌｏｎａｌ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ６６：２０１−２０８．
３４． Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ，  Ｃ．，  Ｅｖｅｎ，  Ｊ．，  ａｎｄ  Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ，  Ｐ．  １９９５．  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｃｌｏｎａｌ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｎｏｒｍａｌ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｍｐｌｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １６：１７６−１８１．
３５． Ｗｉｌｌｉａｍｓ，  Ｂ．Ｌ．，  Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ，  Ｋ．Ｌ．，  Ｚｈａｎｇ，  Ｗ．，  Ｗａｎｇｅ，  Ｒ．Ｌ．，  Ｓａｍｅｌｓｏｎ，  Ｌ．Ｅ．，  Ｌｅｉｂｓｏｎ，  Ｐ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ａｂｒａｈａｍ，  Ｒ．Ｔ．  １９９８．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｙｋ  ｆａｍｉｌｙ  ｋｉｎａｓｅｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：  ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ａ  ＺＡＰ−７０−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ−  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １８：１３８８−１３９９．
３６． Ｕｎｕｔｍａｚ，  Ｄ．，  ＫｅｗａｌＲａｍａｎｉ，  Ｖ．Ｎ．，  Ｍａｒｍｏｎ，  Ｓ．，  ａｎｄ  Ｌｉｔｔｍａｎ，  Ｄ．Ｒ．  １９９９．  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｒｅ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８９：１７３５−１７４６．
３７． Ｈｉｒｓｃｈｈｏｒｎ，  Ｒ．  ２００３．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｖｅｒｓｉｏｎ  ｔｏ  ｎｏｒｍａｌ  ｏｆ  ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｇｅｎｅｔ  ４０：７２１−７２８．
３８． Ｌｏ，  Ｍ．，  Ｂｌｏｏｍ，  Ｍ．Ｌ．，  Ｉｍａｄａ，  Ｋ．，  Ｂｅｒｇ，  Ｍ．，  Ｂｏｌｌｅｎｂａｃｈｅｒ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｂｌｏｏｍ，  Ｅ．Ｔ．，  Ｋｅｌｓａｌｌ，  Ｂ．Ｌ．，  ａｎｄ  Ｌｅｏｎａｒｄ，  Ｗ．Ｊ．  １９９９．  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｂｙ  ａ  ｇｅｎｅ−ｔｈｅｒａｐｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ．  Ｂｌｏｏｄ  ９４：３０２７−３０３６．
３９． Ｏｔｓｕ，  Ｍ．，  Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  Ｓ．Ｍ．，  Ｂｏｄｉｎｅ，  Ｄ．Ｍ．，  Ｐｕｃｋ，  Ｊ．Ｍ．，  Ｏ’Ｓｈｅａ，  Ｊ．Ｊ．，  ａｎｄ  Ｃａｎｄｏｔｔｉ，  Ｆ．  ２０００．  Ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｍｉｃｅ  ａｆｔｅｒ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １：１４５−１５３．
４０． Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｍ．，  Ｓｗａｉｎｓｏｎ，  Ｌ．，  Ｓｃｈｗａｒｚ，  Ｋ．，  Ｂｏｙｅｒ，  Ｍ．，  Ｆｒｉｅｄｒｉｃｈ，  Ｗ．，  Ｙｓｓｅｌ，  Ｈ．，  Ｔａｙｌｏｒ，  Ｎ．，  ａｎｄ  Ｎｏｒａｚ，  Ｎ．  ２０００．  Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ＺＡＰ−７０−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｄｖａｎｔａｇｅ  ｏｆ  ｇｅｎｅ−ｃｏｒｒｅｃｔｅｄ  ｃｅｌｌｓ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ７：１３９２−１４００．
４１． Ｙｅｅ，  Ｊ．Ｋ．，  Ｍｉｙａｎｏｈａｒａ，  Ａ．，  ＬａＰｏｒｔｅ，  Ｐ．，  Ｂｏｕｉｃ，  Ｋ．，  Ｂｕｒｎｓ，  Ｊ．Ｃ．，  ａｎｄ  Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ，  Ｔ．  １９９４．  Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｉｇｈ−ｔｉｔｅｒ，  ｐａｎｔｒｏｐｉｃ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９１：９５６４−９５６８．
４２． Ｄａｒｄａｌｈｏｎ，  Ｖ．，  Ｊａｌｅｃｏ，  Ｓ．，  Ｋｉｎｅｔ，  Ｓ．，  Ｈｅｒｐｅｒｓ，  Ｂ．，  Ｓｔｅｉｎｂｅｒｇ，  Ｍ．，  Ｆｅｒｒａｎｄ，  Ｃ．，  Ｆｒｏｇｅｒ，  Ｄ．，  Ｌｅｖｅａｕ，  Ｃ．，  Ｔｉｂｅｒｇｈｉｅｎ，  Ｐ．，  Ｃｈａｒｎｅａｕ，  Ｐ．，  ｅｔ  ａｌ．  ２００１．  ＩＬ−７  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ＨＩＶ−１−ｂａｓｅｄ  ｖｅｃｔｏｒ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ＣＤ４＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９８：９２７７−９２８２．
４３． Ａｒｄｅｎ，  Ｂ．，  Ｃｌａｒｋ，  Ｓ．Ｐ．，  Ｋａｂｅｌｉｔｚ，  Ｄ．，  ａｎｄ  Ｍａｋ，  Ｔ．Ｗ．  １９９５．  Ｈｕｍａｎ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｓｅｇｍｅｎｔ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４２：４５５−５００．
【図面の簡単な説明】
【００７７】
７）図面の説明
図１は、野生型ＺＡＰ−７０をコードしたｐＣＤ４レンチウイルスベクターの模式図を示す。ｐＣＤ４レンチウイルスベクター中に組まれるエレメントの相対的なポジションが示されている。５’ＬＴＲ，ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）；ＳＤ，スプライスドナー；ＳＡ，スプライスアクセプター；Ψ，パッキングシグナル；ＧＡ−ＲＲＥ，ｒｅｖ応答エレメントを有するトランケーティッドｇａｇ配列；ｃｐｐＴ，ＨＩＶのセントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）；ＣＤ４ｐｍＥ，ヒトＣＤ４最小プロモーター／マウスエンハンサー・カセット（５９０  ｂｐ）；ＺＡＰ−７０ｃＤＮＡ；ＩＲＥＳ，インターナル・リボソーム・エントリー・サイト（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｒｉｂｏｓｏｍｅ  ｅｎｔｒｙ  ｓｉｔｅ）；ｅＧＦＰ，エンハンスドグリーン蛍光タンパク質ｃＤＮＡ（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｇｒｅｅｎ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃＤＮＡ）；ＷＰＲＥ，ウッドチャック肝炎ウイルスのポスト・トランスクリプショナル・シス−アクティング・レギュラトリー・エレメント（ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）（５８７ｂｐ）；及び、ＬＴＲ−ＳＩＮ，自己不活性化３‘ＵＴＲ（ｓｅｌｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ３’ＬＴＲ）（３’領域において４００ｂｐ欠失）。
【００７８】
図２は、ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターの以下のインサイチューでの注入後ＺＡＰ−７０−／−マウスにおける胸腺分化を示す。ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクター（ｐＴ−ＺＡＰ）を、８〜１２週のＺＡＰ−７０−／−マウス中へ胸腺内で注入し、そして、７〜１３週間後に安楽死させた動物から胸腺を回収した。（Ａ）全ての胸腺細胞をＣｙ標識αＣＤ８とＡＰＣ標識αＣＤ４ｍＡｂｓとで染色した。ＷＴ（Ｃ５７／Ｂｌ６）、ＺＡＰ−７０−／−、及び、インビボ再構成マウスにおける、ダブルポジティブ並びにＣＤ４＋及びＣＤ８＋シングルポジティブ（ＳＰ）胸腺のパーセンテージを、各々のドットプロットで表示した。（Ｂ）ＴＣＲβがアップレギュレート（ｕｐｒｅｇｕｌａｔｅ）されている胸腺細胞サブセット内と、胸腺全体内とでのｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージが示されている。ＺＡＰ−７０−／−及びＷＴマウスのＥＧＦＰ−母集団内でのＴＣＲβがアップレギュレートした胸腺細胞のＣＤ４／ＣＤ８分布が示されている。更に、ｐＴ−ＺＡＰレンチベクターを注入されたＺＡＰ−７０−／−マウスにおける、ＥＧＦＰ−とＥＧＦＰ＋とのＴＣＲβがアップレギュレートした母集団内でのＣＤ４／ＣＤ８分布が比較されている。ＩＴ注入されたマウスを処理後８週間で解剖し、そして、結果は、６匹のマウスから得られるデータの代表である。
【００７９】
図３は、ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターのインサイチュー胸腺注入後の末梢Ｔリンパ球移動のカイネティクスを示す。（Ａ）ｐＴ−ＺＡＰレンチウイルスベクターの胸腺内注入後の第４週及び第６週で、ＺＡＰ−７０−／−マウスの末梢血におけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔリンパ球の存在をフローサイメトリーによってモニターした。これらの時点での末梢血内でのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の全体のパーセンテージを表示する。代表ＺＡＰ−７０−／−及びＷＴマウスの分析も示されている。（Ｂ）すべての動物の末梢血におけるｅＧＦＰ＋細胞のパーセンテージが示される。前記母集団を特にゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）することによって、第４週及び第６週でｐＴ−ＺＡＰ注入マウスから単離したｅＧＦＰ＋細胞のＣＤ４／ＣＤ８表現型を評価した。
【００８０】
図４は、ＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターのインサイチュー注入後のＺＡＰ−７０−／−マウスにおけるＴリンパ球の再構成を示す。ＷＴ、ＺＡＰ−７０−／−、及びｐＴ−ＺＡＰレンチウイルスベクター（ＺＡＰ−７０−／−ＩＴ）を胸腺内に投与されたＺＡＰ−７０−／−マウスから、リンパ球が収集された。（Ａ）ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ３及びＣＤ１９細胞のパーセンテージが示されている。（Ｂ）ＰＥ標識αＣＤ２５及びαＣＤ６９ｍＡｂｓを使用してＴ細胞母集団の活性化状態を決定し、そして、ナイーブ（ｎａiｖｅ）及びメモリーＴ細胞の相対的なパーセンテージを、ｍＡｂ認識ＣＤ６２Ｌ（それぞれ、ＣＤ６２Ｌ＋及びＣＤ６２Ｌ−）とともにモニターした。陽性に染色された細胞のパーセンテージが、各々のヒストグラムにおいて示されている。本明細書中に提示されるＩＴ再構成されたマウスの代表を、注入後第８週で解剖した。
【００８１】
図５は、ｐＴ−ＺＡＰレンチウイルスベクターの胸腺内投与によって再構成されたＴリンパ球におけるＺＡＰ−７０発現及び多様性を示す。（Ａ）ソートされたＣＤ３＋及びＣＤ３−においてと同様に、ＷＴ及びＩＴ再構成されたＺＡＰ−７０マウスからの総脾細胞におけるＺＡＰ−７０レベルが、αＺＡＰ−７０ｍＡｂを使用するウエスタンブロットにおいて評価された。（Ｂ）ＷＴ及びＩＴ再構成されたアダルトＺＡＰ−７０−／−マウスから得られる、リンパ節細胞のＴ細胞レセプターＣＤＲ３サイズ分布（イムノスコーププロファイル（Ｉｍｍｕｎｏｓｃｏｐｅ  ｐｒｏｆｉｌｅｓ））の比較によって、ＴＣＲＢＶレパトアを評価した。蛍光Ｃβプライマーでのランオフ反応に先立つ、異なるＴＣＲＢＶサブファミリー特異的プライマー及び１定数βコンセンサスプライマー（Ｃβ）での逆転写によって、ＰＣＲ産物を産出した。グラフは、ＣＤＲ３サイズ（Ｘ軸）に対してプロットされる任意の（ａｒｂｉｔｒａｒｙ）ユニット（Ｙ軸）における蛍光強度を示す。１４ＴＣＲＢＶファミリー内でのサイズ分布を示す代表結果が示される。
【００８２】
図６は、ｐＴ−ＺＡＰの胸腺内注入により再構成されるＴ細胞のインビトロ及びインビボ応答性を示す。（Ａ）ＺＡＰ−７０−／−、ＷＴ及びＩＴ再構成されたＺＡＰ−７０−／−マウスからの脾細胞を、蛍光色素ＣＦＳＥでラベルし、コンカナバリンＡまたはαＣＤ３／ＩＬ−２の存在下で、３日間インビトロ培養し、そして、フローサイメトリーによって細胞をＣＦＳＥ強度で分析した。ピークの上に示される数字は、細胞分裂の数を示している。ＩＴ再構成されたＺＡＰ−７０マウスを、注入後第８週で解剖した。（Ｂ）同一のＩＴ再構成されたＺＡＰ−７０マウス上に移植された、同系（Ｃ５７／Ｂｌ６）及び異系（ＢａｌｂＣ）皮膚切片の組織切片をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。皮質中へ浸透するリンパ球（濃い紫染色として検出される）の存在が、拡大された差込図（ｉｎｓｅｔ）中に示される。ＩＴ再構成されたマウスは皮膚移植の１４週前に注入され、そして、３０日後に皮膚組織を実施した。２０Ｘの倍率が示される。（Ｃ）ＷＴ（Ｃ５７／Ｂｌ６）及びＩＴ再構成されたＺＡＰ−７０マウス（前記のように前移植される；移植後第６週で安楽死される）からのリンパ節細胞をＣＦＳＥでラベルし、そして、異系ＢａｌｂＣ脾細胞（ＭＬＲ；混合リンパ球反応）の存在下（＋）又は非存在下（−）で培養した。３日後に、αＣＤ４  ｍＡｂで細胞を染色し、そして、分割し、ＣＦＳＥ強度の損失によって評価されるＣＤ４＋細胞のパーセンテージが、各々のドットブロットで示される。
【００８３】
図７は、幼若マウスにおけるＺＡＰ−７０発現レンチウイルスベクターの胸腺内注入後の強化されたＴ細胞再構成効果を示す。（Ａ）生後２週（幼若）と、アダルトＺＡＰ−７０ＫＯマウスとからの胸腺の前方アングル（ＦＳＣ）及び側面アングル（ＳＳＣ）光散乱プロファイルが示される。フルオロクロム標識ｍＡｂを使用してＫｉ−６７抗原の細胞内発現を評価することによって、幼若及びアダルトＺＡＰ−７０ＫＯマウスからのトータル胸腺細胞の細胞周期エントリーをモニターした。Ｋｉ６７＋胸腺細胞の分画内でのＣＤ４／ＣＤ８分布が示される。（Ｂ）ｐＴ−ＺＡＰレンチウイルスベクターを胸腺内で注入されるＺＡＰ−７０  ＫＯ幼若マウスのリンパ節におけるＴ細胞再構成を、フローサイメトリーによってモニターし、そして、９／１０ＩＴ処理した幼若マウスの代表とする。
【００８４】
ＩＩ）レンチウイルスベクターの胸腺内注入についてのストローマ細胞及び胸腺細胞のインサイチューでの形質導入
１）結果
ａ）レンチウイルスベクターの胸腺内注入は、効果的及び持続的な胸腺ストローマ細胞の感染をもたらした。
本発明者らは、ＬｖＰＧＫ−ＧＦＰベクター（２．１０９ＴＵ１４３Ｂ／ｍｌ）の濃縮されたウイルスストックを使用し、７ｘ１０７〜１．２ｘ１０８の間の感染性ユニット（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｕｎｉｔｓ）で、正常なＣ５７Ｂｌ／６マウスの胸腺中に注入した。ＵＶ顕微鏡下での胸腺の直接検査によって、感染細胞は注入後５日で直ちに検出することができた（図８）。注目すべきことに、形質導入された細胞を、注入後１ヶ月（図８）及び３ヶ月（データは図示せず）で、依然として観察することができた。形質導入された細胞の多くが、繊維芽細胞形態を有していた。血流（ｂｌｏｏｄｓｔｒｅａｍ）へのベクターの見込まれる通過をモニターするために、本発明者らは、レンチウイルスベクターの静脈注入後の一次標的器官である肝臓における形質導入された細胞の存在を調査した［１４ａ］。本発明者らは、ベクター３０μｌまでのＩＴ注入について、循環中へのかなりの漏れが示唆される肝臓における多数のｅＧＦＰ＋（図８）を観察した。それにもかかわらず、前記の結果はレンチウイルスベクターのＩＴ注入についての胸腺ストローマ細胞への効果的及び持続的感染を実証した。
【００８５】
ｂ）レンチウイルスベクターの胸腺内注入後のネガティブ選択の誘導
本発明者らは、次に、レンチウイルスベクターの感染した胸腺ストローマ細胞が胸腺細胞のネガティブ選択を仲介できるかを調べたかった。従って、本発明者は、インフルエンザウイルスのＨＡ、又はコントロールとしてｅＧＦＰをコードしたレンチウイルスベクターをＨＡタンパク質ペプチド、及びクロノタイプの抗体認識導入遺伝子ＴＣＲ（ｃｌｏｎｅ６．５）が利用可能な、特異的なＴＣＲを発現しているＳＦＥ−Ｔｇマウスの胸腺に注入した［１５ａ］。感染６日後、本発明者らは、胸腺の引き裂き後、フローサイトメトリーで胸腺細胞を解析した。ＣＤ４ＳＰ及びＣＤ８ＳＰ胸腺細胞中の、６．５＋細胞の頻度を、代表的な実験として図９Ａに示した。ＬｖＰＧＫ−ＨＡベクターの胸腺内注入は、ＣＤ４ＳＰ中の６．５＋細胞の２倍の減少をもたらし、及び後者のサブセット中の６．５＋細胞のほとんど完全な消失を伴った、ＣＤ８ＳＰ中の５倍の６．５＋細胞の減少をもたらした。注目すべきことは、ＣＤ４ＳＰ細胞中のＴＣＲ導入遺伝子発現の強さは、減少していたことである（図９Ａ）。全体として、本発明者らは、ＬｖＰＧＫ−ＧＦＰベクターと比較して、ＬｖＰＧＫ−ＨＡベクターが注入されたマウスにおける特定のＴＣＲを発現した胸腺細胞の総数の３．５倍の減少を観察した（図９Ｂ）。我々の結果は、要するに、ＬｖＰＧＫ−ＨＡベクターの胸腺内注入の後、一週間以内に、感染胸腺ストローマ細胞が効果的にＨＡ―特異的胸腺細胞のネガティブ選択を仲介することを示した。
【００８６】
ｃ）レンチウイルスベクターの胸腺内注入は、未熟胸腺細胞の低レベル感染をもたらす。
本発明者は、次に、発生したＴ細胞がレンチウイルスベクターのＩＴ注入で感染したかを調べた。ノーマルマウスの胸腺へのＬｖＰＧＫ−ＧＦＰベクターの注入後５日に、切り裂いた胸腺から得られた胸腺細胞中において、極めて少数のｅＧＦＰ＋細胞がフローサイトメトリーで検出することができた（図１０）。これらの細胞の多くは、ＣＤ３−細胞であり、感染細胞がほとんど未成熟であることを示すＤＮ及びＤＰサブセットに属していた。興味深いことに、注入後３０日で、本発明者は、ＣＤ３を発現し、それらの半分より多いＣＤ４ＳＰ及びＣＤ８ＳＰのサブセットに属する、より成熟したｅＧＦＰ＋細胞を観察した。前記の結果は、感染自体はＴ細胞発生の通常の過程を干渉しなかったことを示している。更に、本発明者は、非感染ｅＧＦＰ−細胞において、ＣＤ４／ＣＤ８発現細胞の同様の再配分を観察した。まとめると、これらの結果は、未熟胸腺細胞がインサイチューでのレンチウイルス感染によって感染できることを示している。しかしながら、形質導入された胸腺細胞の選択的優位性がない場合には、成熟リンパ球のプール中における、それらの少ない発現量のためと思われるが、本発明者らは、注入されたマウスの脾臓において感染Ｔ細胞を明確には検出することができなかった。
【００８７】
２）議論
本発明者は、本明細書で、レンチウイルスベクターのＩＴ注入が、胸腺ストローマ細胞の優勢な感染、及び対する胸腺細胞前駆体の低いレベルの感染をもたらすことを報告する。肝臓細胞の顕著な感染もまた検出される。前記の知見は、アデノウイルスについてＤｅＭａｔｔｅｏらにより観察されたことを思い出させる［７ａ］。肝臓細胞がＩＶ注入レンチウイルス又はアデノウイルスベクターの主な標的であるという事実と共に、このことは、ウイルスベクターのＩＴ注入において、循環中へのかなりの漏れが起きていることを示唆している。我々のインサイチューでの分析は、胸腺の上皮の細胞が感染細胞の広大な大部分であることを示している。形質転換された皮質、髄質の上皮細胞、又は胸腺樹状細胞の割合が何であっても、発明者は、本明細書で特異的胸腺細胞のネガティブ選択効果的に仲介する抗原提示をもたらすことを示す。このことは、Ｔ細胞分化に非特異的に影響することのできる、天然の（ｃｒｕｄｅ）ウイルス上清の調製物の注入によるものではない。確かに、本発明者は、ＨＡ特異的胸腺細胞のネガティブ選択が胸腺ストローマ細胞によるＨＡ発現の直接の影響であることを示唆されているＬｖＰＧＫ−ＧＦＰベクターより、ＬｖＰＧＫ−ＨＡベクターからの１０倍低い量のｐ２４を注入した。このことは、ＴＣＲトランスジェニックマウスにおけるＭＨＣクラスＩＩに制限された、ＣＤ８ＳＰ細胞中の６．５ｈｉ細胞の欠損を示す、６．５＋胸腺細胞の頻度の解析によってさらに支持される［１５ａ］。導入遺伝子ＴＣＲの下方への転調及び欠失は、ＣＤ４ＳＰ細胞において見られた。このことは、Ｔｒａｎｉらにより最近、得られた結果、ＳＦＥ  ＴＣＲ―Ｔｇマウスにおける、ＨＡペプチドの増加した量の胸腺内輸送が導入遺伝子ＴＣＲのダウンレギュレーションをもたらすという結果を連想させる［１６ａ］。従って、欠失及び／又はリセプターのダウンレギュレーションは、ＳＦＥトランスジェニックマウスにおけるＨＡ特異的ＣＤ４ＳＰ細胞のネガティブ選択と一致して作用するかもしれない。
【００８８】
発生した胸腺細胞の極めて低い感染が検出された。このことは驚くべきことではなく、
（ｉ）感染の多重度（胸腺における総細胞数に対する感染ユニットの数の割合）が０．４より低いと推定され、そして
（ｉｉ）マウスＴ細胞のレンチウイルス形質導入の効率が、ヒトＴ細胞よりずっと少ないためである［１７ａ］。しかしながら、マウスの胸腺中に注入することのできる正確な量は限られており、本発明者は、濃縮ベクターで達成できる最も高いＭＯＩを使用した。そうではあるが、感染細胞が感染後５日において、ＣＤ３分子を発現していない未熟な胸腺細胞であることは強調することができる。後期の時点のポイントにおいて、感染はより成熟した胸腺細胞で検出される。この結果は、Ｔ細胞発生に影響する重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）のインビボでの遺伝子治療に対して重要な密接な関係を持つことができる［１８ａ参照］。確かに、これらの疾患の多くは、一遺伝子変異によるものであり、例えば、通常のサイトカインレセプターガンマ−ｃ［１９ａ］、又はＺＡＰ−７０タンパク質チロシンカイネース［２０ａ］にリンクしているＴ−Ｂ＋ＮＫ−不全における未熟な胸腺細胞に関係するものである。これらの結果は、機能分子を発現しているレンチウイルスベクターのＩＴ送出（ｄｅｌｉｖｅｒｙ）を通して、前記の発生のブロックを修正する可能性を開くものである。この特定の適用のためには、胸腺ストローマにおける導入遺伝子の発現を回避することが重要であろう。最近報告されたＴ細胞特異的なレンチウイルスベクターの使用は、この目的に向かう魅力ある可能性を示している［２１ａ］。Ｔ細胞の多大な増殖潜在能力、及び導入遺伝子によって提供されるであろう選択優位性を与え、少数の数の形質導入細胞でさえ、かなりのＴ細胞再構成をもたらすことができる。これは、単一の初期Ｔ細胞前駆体で起こった復帰突然変異である、Ｘリンク重症複合免疫不全の独自のケースによって最もよく例示された。少なくとも１，０００個の独自のＴ細胞レセプターβ配列を有するＴ細胞クローンがこの前駆体から生み出され、そしてこの多様性は安定のようであり、インビボでの感染からの防御を提供することが調べられた［２２ａ］。更に、前記の結果は、ＺＡＰ−７０不全マウスにおけるＴ細胞特異的レンチウイルスベクターを用いた、ＺＡＰ−７０遺伝子の胸腺内送出が、Ｔ細胞発生の回復をもたらすことを示している（前記参照）。ここで記載したアプローチは、インビボでの自家輸液の前に、エクスビボでの扱いにくい造血幹細胞の操作を用いた遺伝子治療のプロトコルに対する代替案を示している。
【００８９】
３）結論
本明細書で示された結果は、実験的な又は治療的な免疫システムの操作、及び注目すべきＳＣＩＤの寛容誘導並びに修正に対する、重要で密接な関係を有している。
【００９０】
４）方法
マウス及び胸腺内外科処置
６週齢のＣ５７Ｂｌ／６を８〜１０週齢時に使用した。ＳＦＥ  ＴＣＲ−Ｔｇマウス［１５ａ］は、我々の動物施設で繁殖し、６〜１０週齢で使用した。胸腺内外科処置は、４０ｍｇ／ｋｇのペントバルビタール（Ｓａｎｏｆｉ−Ｓｙｎｔｈｅｌａｂｏ，Ｇｅｎｔｉｌｌｙ，Ｆｒａｎｃｅ）による動物の麻酔処置の後に行なった。気管へのアクセスを確保するため、より下部の首の中切開を行なった。肋骨の切開は最初の２つの肋骨で行ない、胸腺を確認するため、丁寧に脇に引いた。１０〜３０μＬの一回の注入は、テルモ・インシュリン・シリンジ（Ｔｅｒｕｍｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｙｒｉｎｇｅｓ；ＶＷＲ，Ｆｏｎｔｅｎａｙ−ｓｏｕｓ−ｂｏｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて行なった。
【００９１】
レンチウイルスベクターの構築、産生、濃縮及び定量化
レンチウイルスベクターｐＲＲＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ｈＰＧＫ．ＧＦＰｐｒｅ（ＬｖＰＧＫ−ＧＦＰ）をコードするプラスミドは、他に記載されている［２３ａ］。インフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質をコードするプラスミドを構築するため、ｐＣＩｎｅｏＨＡプラスミド（ｐｒｏｖｉｄｅｄ  ｂｙ  Ｇｅｎｅｔｈｏｎ，Ｅｖｒｙ，Ｆｒａｎｃｅ）のインフルエンザウイルスのＨＡタンパク質（Ｈ１Ｎ１）のｃＤＮＡの５‘及び３’端に、それぞれＢａｍＨＩ及びＳａｌＩ制限酵素サイトを、Ｔａｑポリメレース（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｅｒｇｙ−Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、追加した。全体のＰＣＲ産物は、ＴＡベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングし、配列が完全であることをチェックし、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩで消化した。プラスミドｐＲＲＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ｈＰＧＫ．ＧＦＰｐｒｅは、ＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｓ，ＵＳＡ）で消化し、ｅＧＦＰを除いた。ライゲーションの後、プラスミドｐＲＲＬｓｉｎ．ＰＰＴ．ｈＰＧＫ．ＨＡｐｒｅ（以下、ＬｖＰＧＫ−ＨＡと称する）を得た。レンチウイルスベクターを産生するため、血清及び抗生物質（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍａｒｙｌａｎｄ，ＵＳＡ）を添加したＤＭＥＭ中、１０ｃｍのディシュで、［２１ａ］に記載のカルシウムホスフェート法を用いて、合計４．１０６の２９３Ｔ細胞を、転移ベクター、パッケージング並びにエンベローブプラスミドで、コトランスフェクションした。、抗生物質及びＬ−グルタミンを添加した血清フリーのＤＭＥＭ中で、コトランスフェクション後、レンチウイルス上清を１８、４２、及び６６時間で回収し、そしてＵｌｔｒａｆｒｅｅ−１５又はＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−８０  ｆｉｌｔｅｒ  ｄｅｖｉｃｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，Ｍａｓｓａｃｈｕｓｓｅｔｓ，ＵＳＡ）のいずれかを用いて、メーカーの取扱説明書に従い、限外ろ過によって濃縮した。簡単には、上清をフィルターデバイスに注ぎ、２０℃、２０分間、２０００ｇで遠心した。濃縮された上清は、分注され、使用まで−８０℃で保存された。ＬｖＰＧＫ−ＧＦＰレンチウイルスベクターのウイルスストックは、以前［２１ａ］の記載のように、１４３Ｂ細胞でタイターを測定した。また、ＬｖＰＧＫ−ＧＦＰ及びＬｖＰＧＫ−ＨＡベクターのウイルスストックも、ｇａｇ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡ（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ，Ｂｕｆｆａｌｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）を用いて定量した。
【００９２】
顕微鏡検査及び画像処理
全部の胸腺、又は肝臓は、注入マウスから取り出し、６−ウェルプレート、１ＸＰＢＳ中に入れた。器官全部の画像は水銀ランプの装備されたＣＫ−４０倒立顕微鏡に連結したＤＰ−１１数字（ｎｕｍｅｒｉｃ）カメラ（Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｆｒａｎｃｅ  Ｓ．Ａ，Ｒｕｎｇｉｓ  Ｆｒａｎｃｅ）を用いて、得られた。画像はアドビフォトショップ（Ａｄｏｂｅ  Ｐｈｏｔｏｓｈｏｐ；Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）を用いて処理した。
【００９３】
フローサイトメトリー
胸腺は、３％ウシ胎児血清（Ｌｉｆｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加した１ｘＰＢＳ中で、２つの凍結スライドに分離した。細胞懸濁液を計数し、１０６の細胞を以下のモノクローナル抗体（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｌｅ  Ｐｏｎｔ  ｄｅ  Ｃｌａｉｘ，Ｆｒａｎｃｅ）；ＣＤ４−ＡＰＣ（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ），ＣＤ８−ＣｙＣｒ（Ｃｙｃｈｒｏｍｅ）、及びＴＣＲ−ＰＥのＣＤ３又は汎β鎖（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｒｉｎ）、あるいはビオチン化抗ラットＩｇＧ２ｂ及びストレプトアビジンーＦＩＴＣを付随させるＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｉ−Ｅｄによって提示されるＨＡペプチドＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫ（ｃｌｏｎｅ６．５）（［１５ａ］）に対する精製された抗クロノタイプＴＣＲのいずれかで染色した。データは、ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で回収し、フロージョーソフトウエア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ａｓｈｌａｎｄ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）で解析した。
【００９４】
使用した略語は、以下のとおりである：ＤＮ：ダブルネガティブ、ＤＰ：ダブルポジティブ、ＳＰ：シングルポジティブ、ＩＴ：胸腺内、ＩＶ：血管内、ＨＡ：ヘマグルチニン、ＭＯＩ：感染の多重度、ＳＣＩＤ：重症複合免疫不全
【００９５】
５）参考文献
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４ａ． Ｐｏｓｓｅｌｔ，  ＡＭ，  Ｂａｒｋｅｒ，  ＣＦ，  Ｔｏｍａｓｚｅｗｓｋｉ，  ＪＥ，  Ｍａｒｋｍａｎｎ，  ＪＦ，  Ｃｈｏｔｉ，  ＭＡ，  Ｎａｊｉ，  Ａ：  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｎｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９０，  ２４９：１２９３−１２９５．
５ａ． Ｋｈｏｕｒｙ，  ＳＪ，  Ｇａｌｌｏｎ，  Ｌ，  Ｃｈｅｎ，  Ｗ，  Ｂｅｔｒｅｓ，  Ｋ，  Ｒｕｓｓｅｌｌ，  ＭＥ，  Ｈａｎｃｏｃｋ，  ＷＷ，  Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ，  ＣＢ，  Ｓａｙｅｇｈ，  ＭＨ，  Ｗｅｉｎｅｒ，  ＨＬ：  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｔｈｙｍｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ：  ｔｈｙｍｉｃ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｕｎｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｎｅｓｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９９５，  １８２：３５７−３６６．
６ａ． Ｉｌａｎ，  Ｙ，  Ａｔｔａｖａｒ，  Ｐ，  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｍ，  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，  Ａ，  Ｈｏｒｗｉｔｚ，  ＭＳ，  Ｇｕｉｄａ，  Ｊ，  Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，  ＮＲ，  Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，  ＪＲ：  Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ  ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ａｎｔｉｇｅｎｓ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｈｏｓｔ  ｔｈｙｍｕｓ  ｐｅｒｍｉｔｓ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｇｕｎｎ  ｒａｔｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １９９６，  ９８：２６４０−２６４７．
７ａ． ＤｅＭａｔｔｅｏ，  ＲＰ，  Ｃｈｕ，  Ｇ，  Ａｈｎ，  Ｍ，  Ｃｈａｎｇ，  Ｅ，  Ｂａｒｋｅｒ，  ＣＦ，  Ｍａｒｋｍａｎｎ，  ＪＦ：  Ｌｏｎｇ−ｌａｓｔｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  １９９７，  ７１：５３３０−５３３５．
８ａ． Ｒｏｏｋｅ，  Ｒ，  Ｗａｌｔｚｉｎｇｅｒ，  Ｃ，  Ｂｅｎｏｉｓｔ，  Ｃ，  Ｍａｔｈｉｓ，  Ｄ：  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｂｙ  ｉｎｔｒａｔｈｙｍｉｃ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １９９７，  ７：１２３−１３４．
９ａ． Ｖｉｇｎａ，  Ｅ，  Ｎａｌｄｉｎｉ，  Ｌ：  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ：  ｅｘｃｅｌｌｅｎｔ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ｃａｎｄｉｄａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ  ２０００，  ２：３０８−３１６．
１０ａ．      Ｋａｆｒｉ，  Ｔ，  Ｂｌｏｍｅｒ，  Ｕ，  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，  ＤＡ，  Ｇａｇｅ，  ＦＨ，  Ｖｅｒｍａ，  ＩＭ：  Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  ｄｉｒｅｃｔｌｙ  ｉｎｔｏ  ｌｉｖｅｒ  ａｎｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｎａｔ．  Ｇｅｎｅｔ．  １９９７，  １７：３１４−３１７．
１１ａ．      Ｅｓｓｌｉｎｇｅｒ，  Ｃ，  Ｃｈａｐａｔｔｅ，  Ｌ，  Ｆｉｎｋｅ，  Ｄ，  Ｍｉｃｏｎｎｅｔ，  Ｉ，  Ｇｕｉｌｌａｕｍｅ，  Ｐ，  Ｌｅｖｙ，  Ｆ，  ＭａｃＤｏｎａｌｄ，  ＨＲ：  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔａｒｇｅｔｓ  ＤＣｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ＣＤ８（＋）  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００３，  １１１：１６７３−１６８１．
１２ａ．      ＶａｎｄｅｎＤｒｉｅｓｓｃｈｅ，  Ｔ，  Ｔｈｏｒｒｅｚ，  Ｌ，  Ｎａｌｄｉｎｉ，  Ｌ，  Ｆｏｌｌｅｎｚｉ，  Ａ，  Ｍｏｏｎｓ，  Ｌ，  Ｂｅｒｎｅｍａｎ，  Ｚ，  Ｃｏｌｌｅｎ，  Ｄ，  Ｃｈｕａｈ，  ＭＫ：  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｖｉｒｕｓ  ｔｙｐｅ−１  ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ  ｃａｎ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅ  ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００２，  １００：８１３−８２２．
１３ａ．      Ｎａｌｄｉｎｉ，  Ｌ，  Ｂｌoｍｅｒ，  Ｕ，  Ｇａｌｌａｙ，  Ｐ，  Ｏｒｙ，  Ｄ，  Ｍｕｌｌｉｇａｎ，  Ｒ，  Ｇａｇｅ，  ＦＨ，  Ｖｅｒｍａ，  ＩＭ，  Ｔｒｏｎｏ，  Ｄ：  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｎｄｉｖｉｄｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９６，  ２７２：２６３−２６７．
１４ａ．      Ｐａｎ，  Ｄ，  Ｇｕｎｔｈｅｒ，  Ｒ，  Ｄｕａｎ，  Ｗ，  Ｗｅｎｄｅｌｌ，  Ｓ，  Ｋａｅｍｍｅｒｅｒ，  Ｗ，  Ｋａｆｒｉ，  Ｔ，  Ｖｅｒｍａ，  ＩＭ，  Ｗｈｉｔｌｅｙ，  ＣＢ：  Ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ＶＳＶＧ−ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ａｆｔｅｒ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｍａｒｒｏｗ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２００２，  ６：１９−２９．
１５ａ．      Ｋｉｒｂｅｒｇ，  Ｊ，  Ｂａｒｏｎ，  Ａ，  Ｊａｋｏｂ，  Ｓ，  Ｒｏｌｉｎｋ，  Ａ，  Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ，  Ｋ，  ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ，  Ｈ：  Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８＋  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９４，  １８０：２５−３４．
１６ａ．      Ｔｒａｎｉ，  Ｊ，  Ｍｏｏｒｅ，  ＤＪ，  Ｊａｒｒｅｔｔ，  ＢＰ，  Ｍａｒｋｍａｎｎ，  ＪＷ，  Ｌｅｅ，  ＭＫ，  Ｓｉｎｇｅｒ，  Ａ，  Ｌｉａｎ，  Ｍ−Ｍ，  Ｔｒａｎ，  Ｂ，  Ｃａｔｏｎ，  ＡＪ，  Ｍａｒｋｍａｎｎ，  ＪＦ：  ＣＤ２５＋  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ＣＤ４  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｅｄｉａｔｅ  Ａｃｑｕｉｒｅｄ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３，  １７０：２７９−２８６．
１７ａ．      Ｕｎｕｍａｔｚ，  Ｄ，  ＫｅｗａｌＲａｍａｎｉ，  ＶＮ，  Ｍａｒｍｏｎ，  Ｓ，  Ｌｉｔｔｍａｎ，  ＤＲ：  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｓ  ａｒｅ  ｓｕｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｆｏｒ  ＨＩＶ−１  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｉｎｇ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９９，  １８９：１７３５−１７４６．
１８ａ．      Ｂｕｃｋｌｅｙ，  ＲＨ：  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｖｅｒｅ  Ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ．  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００４，  ２２：６２５−６５５．
１９ａ．      Ｎｏｇｕｃｈｉ，  Ｍ，  Ｙｉ，  Ｈ，  Ｒｏｓｅｎｂｌａｔｔ，  ＨＭ，  Ｆｉｌｉｐｏｖｉｃｈ，  ＡＨ，  Ａｄｅｌｓｔｅｉｎ，  Ｓ，  Ｍｏｄｉ，  ＷＳ，  ＭｃＢｒｉｄｅ，  ＯＷ，  Ｌｅｏｎａｒｄ，  ＷＪ：  Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇａｍｍａ  ｃｈａｉｎ  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｅｖｅｒｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｃｅｌｌ  １９９３，  ７３：１４７−１５７．
２０ａ．      Ａｒｐａｉａ，  Ｅ，  Ｓｈａｈａｒ，  Ｍ，  Ｄａｄｉ，  Ｈ，  Ｃｏｈｅｎ，  Ａ，  Ｒｏｉｆｍａｎ，  Ｃ：  Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ＣＤ８＋  ｔｈｙｍｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ  ｌａｃｋｉｎｇ  ＺＡＰ−７０  ｋｉｎａｓｅ．  Ｃｅｌｌ  １９９４，  ７６：９４７−９５８．
２１ａ．      Ｍａｒｏｄｏｎ，  Ｇ，  Ｍｏｕｌｙ，  Ｅ，  Ｂｌａｉｒ，  ＥＪ，  Ｆｒｉｓｅｎ，  Ｃ，  Ｌｅｍｏｉｎｅ，  ＦＭ，  Ｋｌａｔｚｍａｎｎ，  Ｄ：  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４＋  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＣＤ４  ｇｅｎｅ．  Ｂｌｏｏｄ  ２００３，  １０１：３４１６−３４２３．
２２ａ．      Ｂｏｕｓｓｏ，  Ｐ，  Ｗａｈｎ，  Ｖ，  Ｄｏｕａｇｉ，  Ｉ，  Ｈｏｒｎｅｆｆ，  Ｇ，  Ｐａｎｎｅｔｉｅｒ，  Ｃ，  Ｌｅ  Ｄｅｉｓｔ，  Ｆ，  Ｚｅｐｐ，  Ｆ，  Ｎｉｅｈｕｅｓ，  Ｔ，  Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙ，  Ｐ，  Ｆｉｓｃｈｅｒ，  Ａ，  ｅｔ  ａｌ：  Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ，  ａｎｄ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｆｒｏｍ  ａ  ｓｉｎｇｌｅ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ２０００，  ９７：２７４−２７８．
２３ａ．      Ｆｏｌｌｅｎｚｉ，  Ａ，  Ａｉｌｌｅｓ，  ＬＥ，  Ｂａｋｏｖｉｃ，  Ｓ，  Ｇｅｕｎａ，  Ｍ，  Ｎａｌｄｉｎｉ，  Ｌ：  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｃｕｅｄ  ｂｙ  ＨＩＶ−１  ｐｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０００，  ２５：２１７−２２２．
【００９６】
６）図面の説明
図８は、ＬｖＰＧＫ−ＧＦＰベクターの胸腺内注入後のｅＧＦＰのインビボ発現を示している。Ｄ５：可視下及び紫外線下での、注入後５日の注入部位（矢印）の周辺における、形質転換された細胞の局在性（上部写真）。繊維芽細胞の形態の細胞が優勢に形質転換された（紫外線のみ）（下部パネル）。Ｄ３０：注入後３０日の胸腺（可視化及び紫外線：上部パネル）及び肝臓（紫外線のみ：下部パネル）におけるｅＧＦＰの発現。ＣＴＲＴ：可視下及び紫外線下での、バックグラウンドの蛍光を調べられた、ＰＢＳをＩＴに注入したコントロールマウスからの胸腺（上部パネル）及び肝臓（下部パネル）の写真。倍率は、それぞれの写真の右下隅に示されている。
【００９７】
図９は、発生した胸腺細胞のネガティブ選択を示す。（Ａ）ＬｖＰＧＫ−ＧＦＰレンチウイルスベクター（ｎ＝２）のｐ２４の４０〜６０ｎｇ、又はＬｖＰＧＫ−ＧＦＰ  レンチウイルスベクター（ｎ＝３）のｐ２４の３．５〜６ｎｇのＩＴ注入６日後のＳＦＥ−Ｔｇマウスにおける、抗クロノタイプモノクローナル抗体６．５によって確認される、胸腺内のＣＤ８ＳＰ（白）及びＣＤ４ＳＰ（灰色）細胞のＴＣＲ導入遺伝子発現。２つの独立した実験結果の代表的なプロファイルを示した。数値は、６．５＋細胞の頻度を示している。（Ｂ）ＬｖＰＧＫ−ＧＦＰ又はＬｖＰＧＫ−ＨＡレンチウイルスベクターの胸腺内注入６日後のＨＡ特異的胸腺細胞の絶対数。これらの図は、（Ａ）に示したフローサイトメトリーによって決定した６．５＋胸腺細胞のパーセンテージに基づいて得られた。統計的解析は、ステューデントｔ検定を用いて行なった。
【００９８】
図１０は、発生した胸腺細胞でのｅＧＦＰ発現。
全部の胸腺細胞は、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、及び抗ＣＤ３モノクローナル抗体で染色した。上部パネル：注入後の２つの異なる時間のポイント（Ｄ５及びＤ３）における食塩水注入コントロールマウス（ＣＲＴＬ）及びＬｖＰＧＫ−ＧＦＰ注入マウスを示している。下部パネル：ゲートされた細胞中のＣＤ４／ＣＤ８発現のプロファイルを示している。
【００９９】
ＩＩＩ）同起源の抗原の胸腺内発現によるレギュラトリー対エフェクターＴ細胞のバランスの移動。
本明細書で使用した略語は、以下のとおりである：ＨＡ、ヘマグルチニン、；ＨＥＬ、鶏卵ライソゾーム（ｈｅｎ  ｅｇｇ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ）；Ｔｒｅｇ、レギュラトリーＴ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）；ｍＴＥＣ、胸腺髄質上皮細胞（ｍｅｄｕｌｌａｒ  ｔｈｙｍｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ）；ＰＧＫ、ホスホグリセレート・カイネース（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ）。
【０１００】
１）要約
多様な表現型及び機能を有するレギュラトリー／サプレッサーＴ細胞が免疫システムに共存している。それらの中で、必然的に表れるＣＤ４＋ＣＤ２５＋レギュラトリーＴ細胞の独特な亜集団が胸腺内で発生する。そのようなレギュラトリーＴ細胞が、胸腺内で発現している自己抗原の認識を通して発生するか否かは、議論の余地がある。この疑問を解決するために、本発明者らは、ＨＡ―トランスジェニックマウスでインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質に特異的なＴ細胞の胸腺分化、又はＨＡ発現レンチウイルスベクターの胸腺内注入の結果としてのＴ細胞の胸腺分化を解析した。コントロールマウスと比較して、ＨＡ特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋胸腺細胞の絶対数において、胸腺内のＨＡ発現は、際だって１０倍の濃縮を引き起こしていた。更に、末梢において、それは機能的な抗原特異的レギュラトリーＴ細胞の濃縮をもたらした。従って、前記の結果は、レギュラトリーＴ細胞分化が、同起源の抗原の胸腺発現によって導かれる活性化プロセスであることを示している。また、それらは、抗原発現を仲介するレンチウイルスベクターが、研究及び治療の目的の、抗原特異的レギュラトリーＴ細胞のインビボ発生のための、新規で容易な手段であることを示している。
【０１０１】
２）導入
調節／抑制機能を有するいくつかのＴ細胞の集団が、免疫システム中に共存している。それらの中で、インターロイキン−２レセプター（ＣＤ２５）のα鎖を発現しているレギュラトリーＣＤ４＋Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、特定の興味を引きつける。なぜなら、それらは、マウスにおける多様な自己免疫疾患を防御、遅延、又は治療することを示して来た（１ｂ参照）。更に、ヒトのいくつかの自己免疫疾患は、質的、及び／又は量的なＴｒｅｇの欠損に関連してきていた。代表的な例は、Ｔｒｅｇ分化のための最上位の遺伝子と考えられている、ｆｏｘｐ３転写因子の遺伝的な欠損を原因とする致死的な疾患である、ＩＰＥＸ症候群である（２ｂ、３ｂ）。従って、Ｔｒｅｇは、一般の免疫疾患、特には自己免疫疾患の治療用の大きな期待を有している。
【０１０２】
胸腺におけるＴｒｅｇの産生はヒトにおいては、胎児の期間の間に始まっており（４ｂ）、マウスにおいては、周産期（ｐｅｒｉｎａｔａｌ  ｐｅｒｉｏｄ）に始まっている（５ｂ）。Ｔｒｅｇの調節機能は、リンパ球の増殖を抑制する分離ＣＤ４＋ＣＤ２５＋リンパ球の能力によって示されるように、胸腺での選択の間に獲得される（６ｂ）。本発明者らは、以前、胸腺における同起源の抗原の認識が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の出現を導くことを示唆していた（７ｂ）。より最近、胸腺におけるＨＡ発現は、Ｔ細胞レセプター（ＴＣＲ）トランスジェニックマウスにおけるＨＡ特異的Ｔｒｅｇの頻度、及び／又は数の増加を導くことを証明してきた（８ｂ−１１ｂ）。また、同様の観察が、オボアルブミン（ｏｖａｌｂｕｍｉｎ）（１２ｂ〜１４ｂ）及びグルコース−６−ホスフェート−イソメラーゼ（ｇｌｕｃｏｓｅ−６−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｉｓｏｍｅｒａｓｅ）（１５ｂ）特異的ＴＣＲトランスジェニックマウスで報告されてきた。しかしながら、蛾のチトクロームｃ（ｍｏｔｈ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  ｃ）又は鶏卵ライソゾーム（ｈｅｎ  ｅｇｇ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ；ＨＥＬ）抗原特異的ＴＣＲトランスジェニックマウスにおいては、ネガティブ選択の間にＴｒｅｇのより良好な生存を示唆している、それらの頻度の増大にもかかわらず、胸腺の同起源の抗原発現のもとで、特異的Ｔｒｅｇの数は増加しなかった（１６ｂ、１７ｂ）。従って、Ｔｒｅｇ選択における、胸腺の同起源の抗原発現の影響は、議論の余地を残している。
【０１０３】
胸腺のＴｒｅｇ細胞選択の再評価のために、本発明者らは、胸腺髄質上皮細胞（ｍＴＥＣ）による胸腺内のインスリンの生理的な発現（１９ｂ）を模倣したインシュリンプロモーターの制御下のインフルエンザウイルスのヘマグルチニン（ＨＡ）タンパク質を発現しているトランスジェニックマウス（Ｉｎｓ−ＨＡ）（１８ｂ）を使用した。本発明者らは、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｉ−Ｅｄ分子（ＴＣＲ−ＨＡ）（２０ｂ）によって提示されるＨＡ１１１−１１９ペプチドに特異的なＴＣＲトランスジェニックマウスで、これらのマウスを交雑することによってＴｒｅｇ選択における胸腺でのＨＡ発現の影響を研究した。これらのマウスにおいて、ＨＡ特異的Ｔ細胞は、６．５クロノタイプｍＡＢで同定することが可能である。ＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡトランスジェニックマウスにおいて、ＨＡ特異的ＴＣＲ−αβ鎖発現はＣＤ４＋Ｔ細胞のわずか１０〜２０％に限られているように（２１ｂ）、ＴＣＲ−β鎖は、しばしば内生のＴＣＲ−α鎖とペアを組んでいる。これは、ＴＣＲ導入遺伝子Ｔ細胞が９０％以上を示すことのできる他のモデルとは際だって対照的である。また、本発明者らは、ＴＣＲ−ＨＡトランスジェニックマウスにおいて、前記のＨＡをコードしているレンチウイルスベクターの胸腺内注入を使用して、ＨＡを発現した。これらの結果は、同起源の抗原がＴｒｅｇ分化を指示することができることを示している。
【０１０４】
３）結果及び議論
以前の報告のように、ＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡのダブルトランスジェニックマウスの２０〜３０％は、５週齢までに糖尿病を発症したが、一方、その他は、膵臓のβ細胞におけるリンパ球浸潤を得られた（２１ｂ）。何故これらのマウスがＨＡに対する完全な免疫寛容を産み出すことに失敗したかを理解するため、本発明者らは、最初に、非糖尿病ＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡマウスにおいて、ＨＡ特異的Ｔ細胞の胸腺分化を調べた。週齢を合わせたＴＣＲ−ＨＡマウスと比較して、ＨＡ特異的６．５＋リンパ球の平均数は６又は１４週齢において、それぞれ変化しないか、又は２倍未満の減少であった（図１１Ａ）。従って、ＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡマウスのＨＡ―特異的胸腺細胞の欠失は、様々な組織特異的なプロモーターの下での同起源の抗原を発現するトランスジェニックマウスの同じようなモデル、例えば、ＤＯ１１−１０  ＴＣＲトランスジェニックマウスにおけるインシュリンプロモーター駆動オボアルブミン発現で見られた欠失よりも、なおさら顕著ではなかった（１１ｂ、１３ｂ）。マウスにおける部分的だが顕著な糖尿病の制御を伴うＨＡ特異的胸腺細胞の持続は、この設定でのＴｒｅｇの発生を我々に調査させた。従って、本発明者らは、未熟なダブルポジティブ（ＣＤ４＋ＣＤ８＋，ＤＰ）から、ＣＤ４＋ＣＤ８ｌｏ（ＣＤ４ｉｎｔ）のステージを経て、成熟したＣＤ４＋ＣＤ８−（ＣＤ４ＳＰ）へのそれらの推移の間のＣＤ２５＋及びＣＤ２５−６．５＋胸腺細胞の分化を解析した（図１１Ｂ）。ＴＣＲ−ＨＡトランスジェニックマウスと比較すると、ＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡマウスでは、ＣＤ２５−サブセット中の６．５＋細胞の頻度は、ＣＤ４ＳＰ及びＣＤ４ｉｎｔステージの両方で減少した（図１１Ｄ）。明らかに対照的に、ＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡマウスのＤＰ、ＣＤ４ｉｎｔ及びＣＤ４ＳＰサブセットにおける、ＣＤ２５＋胸腺細胞中の６．５＋細胞の頻度は、それぞれ３、４、及びほとんど１０倍に増幅していた（図１１Ｃ及び１１Ｄ）。増幅した頻度を、増加した細胞数に変換した（図１２）。ＴＣＲ−ＨＡマウスと比較して、６．５＋ＣＤ２５＋細胞数の増加は、すでにＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡマウスのＤＰサブセットで検出され、そして、ＣＤ４ｉｎｔ及びＣＤ４ＳＰ胸腺細胞では１０倍であった。重要なことには、そのような増加は、６．５−ＣＤ２５＋Ｔ細胞では検出されず、それは確かにＨＡ駆動であることを示していた（図１２）。本発明者ら及び他の研究者は、ＣＤ４ＳＰ  ＣＤ２５＋胸腺細胞の大部分は、ｆｏｘｐ３のｍＲＮＡを発現し、そして末梢Ｔｒｅｇと同様の抑制活性を持つことを示してきた（４ｂ、８ｂ、１６ｂ）。ＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡマウスにおいて、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋胸腺細胞もまたｆｏｘｐ３のｍＲＮＡを発現していた（図１４）。従って、この結果は、胸腺におけるＨＡの発現が、結果としてＨＡ特異的Ｔｒｅｇの増加した数の発生を導くことを示している。
【０１０５】
本発明者らは、胸腺ストローマ細胞を、レンチウイルスベクターの胸腺内注入の後、効果的に形質導入することができることを、前記で報告した。従って、Ｔｒｅｇ分化における胸腺の同起源の抗原発現の役割を更に解決するために、本発明者らは、ＴＣＲ−ＨＡマウスの胸腺にＨＡコードレンチウイルスベクター（図１３Ａ）を注入した。このことは、６．５＋ＣＤ２５−胸腺細胞の欠失をもたらしたが、この欠失は注入後１週間で検出され、１ヶ月又は２ヶ月では検出されなかった（表２）。対照的に、ＣＤ２５＋ＣＤ４ＳＰ胸腺細胞中のＨＡ特異的細胞の頻度は注入後１週、そして１〜２カ月でも、２〜１０倍に増幅していた（表１）。増幅したＣＤ４ＳＰサブセットの６．５＋ＣＤ２５＋細胞の頻度は、その数においては１０倍の増加であった（図１３Ｂ）。注目すべきは、ＨＡ発現ベクターを注入されたマウスのＨＡ特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の数値は、非処置のマウスにおける総ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の絶対数に達し（図１３Ｂ）、同起源の抗原が、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞のポジティブ選択上の主要な影響を有していたことを示している。このことは、ＨＡ発現ベクターの６．５−ＣＤ２５＋細胞の平均数の中程度であるが顕著な増加であった（図１２Ｂ）。まとめると、これらの結果は、同起源の抗原の胸腺内発現は、予め全く抗原に暴露されていないマウスにおいて、ＨＡ特異的Ｔｒｅｇの頻度と数の増加を導いた。
【０１０６】
前記の効果を仲介する胸腺の細胞の特徴を明らかにすることが残っている。本発明者は、放射線照射され、ＨＡ発現ベクターを注入されたＴＣＲ−ＨＡトランスジェニックマウスへの、ＴＣＲ−ＨＡトランスジェニックマウスからの骨髄移植後に、同様のＨＡ特異的Ｔｒｅｇのポジティブ選択を入手し、これは、これらの細胞が放射線耐性であることを示している。胸腺の皮質上皮細胞は、胸腺におけるＴｒｅｇ分化に関与していると考えられ（２３Ｂ）るため、本発明者は、レンチウイルス介在抗原発現上のＴｒｅｇ発生にも関与していると推測する。
【０１０７】
ｅＧＦＰ発現ベクターを注入されたコントロールマウスと比較して、ＨＡ発現ベクターを注入したマウスのリンパ節においても６．５＋ＣＤ２５＋の頻度は増加していた（表１）。ＣＤ２５＋細胞は総ＣＤ４＋細胞の５〜６％のみであるので、６．５＋ＣＤ２５＋頻度の増大は、６．５＋ＣＤ２５−細胞の活性化ＣＤ２５＋細胞への転換に起因しうるものである。胸腺内注入後に、ウイルスベクターは漏れるので、前記の転換は末梢におけるＨＡ発現細胞の認識により起こることができたものである。従って、本発明者らは、Ｉｎｓ−ＨＡトランスジェニックマウスの糖尿病を防御又は遅延させるそれらの能力によってレンチウイルス処置マウスからの精製ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の抑制活性を分析した（図１３Ｃ）。糖尿病を誘導するため、本発明者は、亜致死性の放射線照射したＩｎｓ−ＨＡトランスジェニックマウスに、ＴＣＲ−ＨＡマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５−Ｔ細胞を注入し、そして次に、ＨＡで刺激した樹状細胞で免疫した。本発明者らは、ＨＡ発現ベクターを注入されたマウスからの末梢ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞が、コントロールマウスからのＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞と比較して糖尿病を防御する能力を著しく増加させていた（図１３Ｃ）ことを見出した。まとめると、これらの結果は、ＨＡ特異的ＴＣＲトランスジェニックマウスにおける、ＨＡコードレンチウイルスベクターの胸腺内注入は、胸腺及び末梢でのＨＡ特異的Ｔｒｅｇの濃縮をもたらす。
【０１０８】
同起源の抗原の胸腺発現での増加したＴｒｅｇの頻度が、ネガティブ選択に対するＴｒｅｇの増加した耐性によるものか、又は真のポジティブ選択によるものかは、議論の余地を残している。インシュリンプロモーターの制御下で、抗原が発現した場合（従っておそらくｍＴＥＣにおいてであるが）、増加した抗原特異的Ｔｒｅｇの絶対数がＨＡ（本明細書）及びＯＶＡ（１４ｂ）で観察され、一方、ＨＥＬでは見られなかった（１７ｂ）。後者の場合における増加した抗原特異的ＣＤ４＋ＣＤ２５＋の頻度は、ネガティブ選択に対するＴｒｅｇのより良好な耐性を証拠として説明される。しかしながら、ＨＥＬモデルにおける同起源の抗原の存在下でのネガティブ選択は、更に一層顕著であり（ＨＥＬ特異的及びＨＡ特異的胸腺細胞の減少は、それぞれ４０倍対２倍）、そしてポジティブ選択は隠されてしまうだろう。確かに、高いレベルの同起源抗原に応答する場合は、Ｔｒｅｇもネガティブ選択に対して感受性である（１６ｂ、２３ｂ）。本発明者らは、自己反応性Ｔ細胞（２４ｂ）のネガティブ選択、及びｍＴＥＣと発生した胸腺細胞との相互作用の親和性に依存しているＴｒｅｇの関与の両方を、ｍＴＥＣが実際に仲介できることを示唆した。本発明者らは、胸腺のＨＡ発現上のＨＡ特異的なＴｒｅｇの濃縮がＤＰステージで始まることを見出したので、Ｔｒｅｇ系列に対する未熟胸腺細胞の初期の関与に影響することができる。全体として、これらの結果は、自己ペプチドとＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ分子複合体のＴＣＲ認識によるシグナル伝達が、中立の前駆体をＴｒｅｇ系列への分化を指示することを裏付けている。
【０１０９】
末梢におけるｎａｉｖｅ  ＣＤ２５−細胞のｆｏｘｐ３発現ＣＤ２５＋レギュラトリーＴ細胞への転換は、継続的な抗原刺激（２５ｂ）又は胸腺の欠如下での恒常性増殖（２６ｂ）上で可能であるが、これらの末梢で誘導されたＴｒｅｇが治療の環境での通常のＴｒｅｇと同様に効果的であるか否かは、まだ明らかではない。自己免疫の関係する限りでは、抗原特異的なＴｒｅｇは自己免疫反応の有害な効果を防いだり、又は遅らせたりするためにたいへん効果的であることが、次第に認識されている。抗原特異的Ｔｒｅｇのインビトロでの拡大は、ＮＯＤ（２７ｂ、２８ｂ）又はＩｎｓ−ＨＡマウスにおいて糖尿病の予防、及び／又は治療することのできる多数の機能的なＴｒｅｇを得るための効果的な手段であることを示してきている。前記結果は、胸腺の単純な介入は、増加したＴｒｅｇ発生に対するＴ細胞の分化のバランスを変動することが十分であることを示しており、従って、治療の診療用の新しい展開を開くものである。
【０１１０】
４）材料及び方法
マウス
６〜１４週齢のヘマグルチニン抗原（ＨＡ）及びインシュリンプロモーター（Ｉｎｓ−ＨＡ）（１８ｂ）ヘテロ接合体のトランスジェニックマウス、又はＩ−Ｅｄ分子によって提示されるＨＡの１１１−１１９エピトープ（ＳＦＥＲＦＥＩＦＰＫ）に特異的なＴＣＲホモ接合体（２０ｂ）を、Ｂａｌｂ／ｃ背景に１０代より多く戻し交配し、ヨーロッパユニオンガイドライン（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ）に従い、特定病原体フリーの状態で繁殖した。
【０１１１】
胸腺内注入
マウスをケタミン３０ｍｇ／ｋｇ（Ｋｅｔａｍｉｎｅ；Ｉｍａｌｇｅｎｅ，Ｍｅｒｉａｌ）及びキシラジン２４ｍｇ／ｋｇ（Ｒｏｍｐｕｎ，Ｂａｙｅｒ）で麻酔した。外科的処置は、前記に記載した。簡単には、胸郭を開いた後に、胸腺を可視化に置き、そして３００μＬのシリンジ（Ｔｅｒｕｍｏ）を用いて１０〜２０μＬのレンチウイルスストックを注入した。
【０１１２】
レンチウイルスベクター
ＬｖＰＧＫ−ＨＡベクターの構築は、前記に詳細に記載し、そしてＬｖＰＧＫ−ＧＦＰベクターから由来したものである（２９ｂ）。簡潔には、［３０ｂ］に記載のように、ｅＧＦＰ、又はＨＡ発現ベクター、水疱性口内炎ウイルスエンベロープ及びパッケージングタンパク質をコードした、３つのプラスミドを２９３Ｔ細胞に、カルシウムホスフェートトランスフェクション（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）することにより、レンチウイルスベクターストックを調製した。上清は、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ−ｐｌｕｓ  ｃｏｌｕｍｎｓ（Ａｍｉｃｏｎ）を用いる限外ろ過によって濃縮し、ｅＧＦＰ発現ベクターのために１４３Ｂ細胞で異なった希釈でウイルス量を測定し、両方のベクターのために、ｐ２４  ＥＬＩＳＡ（Ｚｅｐｔｏｍｅｔｒｉｘ，Ｂｕｆｆａｌｏ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）で測定した。１ｍＬ当たり１０７感染粒子（ｐ２４は、＞１００ｎｇ／ｍｌ）を超える量のウイルスストックのみを、胸腺内注入のために使用した。
【０１１３】
フローサイトメトリー解析
ティースされた（ｔｅａｓｅｄ）器官からの細胞は、３％ウシ胎児血清含むＰＢＳ中、室温で１５〜３０分間、遮光し、持続的に撹拌しながら標識した。表現型の解析のために、以下のモノクローナル抗体を使用した：アロフィコシアニン（ａｌｌｏｐｈｙｃｏｃｙａｎｉｎ）標識抗ＣＤ４（ＲＭ４−５）、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）標識抗ＣＤ８（ｃｌｏｎｅ５３．６．７）、フィコエリトリン（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｒｉｎ）標識抗ＣＤ２５（すべてＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。ＴＣＲ―ＨＡに対する特異的な抗クロノタイプｍＡｂ（ｃｌｏｎｅ６．５）の標識は、ビオチン化抗ラットＩｇＧ２ｂ及びストレプトアビジン−シクローム（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ−ＣｙＣｈｒｏｍｅ；Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、又は直接ＰＥ標識ヤギ抗ラットＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）。アイソタイプの異なる（Ｉｓｏｔｙｐｅ−ｉｒｒｅｌｅｖａｎｔ）ｍＡｂｓ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）をコントロールとして使用した。少なくとも３０．０００イベント（ｅｖｅｎｔｓ）が、ＦＡＣＳキャリバー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）で収集された。データは、フロージョー（ＦｌｏｗＪｏ；Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）ソフトウエアを用いて解析した。
【０１１４】
細胞増殖
機械的な解離の後に、脾臓及び末梢ＬＮからの細胞は、引き続き、飽和量のビオチン標識抗ＣＤ２５ｍＡｂ（７Ｄ４，Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）及びストレプトアビジンマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，  Ｂｅｒｇｉｓｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、３０分間、氷中でインキュベートし、メーカーの取扱説明書に従い、磁性細胞分離用ＬＳカラム（（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）の２回の繰り返しを続いて行なった。すべてのステップは、３％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ中で行なった。ソートされたＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の精製度は７５−８５％であった。樹状細胞の精製のために、Ｂａｌｂ／ｃマウスからの脾細胞を、ＬＰＳ−ｌｏｗ  ＲＰＭＩ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃｅｒｇｙ  Ｐｏｎｔｏｉｓｅ，Ｆｒａｎｃｅ）で希釈した、リブレース（ｌｉｂｅｒａｓｅ；１．６７  Ｗuｎｓｈ  Ｕ／ｍｌ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）及びＤＮａｓｅ（０．１ｍｇ／ｍｌ，Ｂｏｅｒｈｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で、３７℃、５％ＣＯ２インキュベーター中で、３０分〜１時間消化した。分離した脾細胞は、フィルター処理し、そしてＬＰＳフリーの１ＸＰＢＳ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）で洗浄した。細胞は、抗ＣＤ１１ｃマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）で３０分間、氷中でインキュベートし、ＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いる磁性分離を続いて行なった。ＣＤ１１ｃ＋細胞の精製度は９５％であった。
【０１１５】
糖尿病の誘導及びモニタリング
ＴＣＲ−ＨＡトランス下ニックマウスの脾臓及びＬＮからの７．５．１０５のＣＤ２５−細胞は、３−Ｇｙの放射線照射されたトランスジェニックマウスへ、５．１０５の精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞と共に、又はそれを伴わずに、血管内に注入された。その後、マウスは一昼夜培養後に成熟し、そしてＨＡ１１１−１１９ペプチドで刺激された脾臓のＤＣの血管内注入により免疫された。血液のグルコースレベルは、グルコメーター（ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ；ＬｉｆｅＳｃａｎ  Ｉｎｃ．）を用いて、一日おきにモニターされた。マウスは、
２つの連続した測定値が２５０ｍｇ／ｄｌを超えた場合、糖尿病と見なされた。
【０１１６】
統計的な分析。
９５％信頼区間の両側不対ｔ検定（Ｔｗｏ−ｔａｉｌｅｄ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｔ−ｔｅｓｔ）を、マッキントッシュ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ４．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて行なった。ｐ値が０．０５に対して下である場合、平均値は、統計的に異なると見なされる。
【０１１７】
オンラインの補足の材料
１４週齢のＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡマウスからのＣＤ４ＳＰ胸腺細胞は、ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙａｎｉｎ５、ＣＤ８−ＦＩＴＣ  及びＣＤ２５−ＰＥ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）での３色染色の後、ＦＡＣｓｏｒｔ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）でＣＤ２５＋又はＣＤ２５−分画に分類した。総ｍＲＮＡは、５．１０４のＣＤ２５＋及び１０６のＣＤ２５−細胞から、ＲＮＡｂｌｅ（Ｅｕｒｏｂｉｏ，Ｆｒａｎｃｅ）を用いて抽出し、マウスモロニー白血病ウイルス逆転写酵素（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｍｏｌｏｎｅｙ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ；ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、メーカーの取扱説明書に従い、ｃＤＮＡに逆転写した。サイクロフィリン（ｃｙｃｌｏｐｈｙｌｉｎ）ｃＤＮＡは希釈したＣＤ２５−検体から増幅し、ＣＤ２５＋分画におけるのと同様の強度のバンドが得られた。次に、ｆｏｘｐ３及びサイクロフィリンのｃＤＮＡｓは、同じＰＣＲ反応で増幅した。アガロースゲルの泳動の後、公的なドメインにあるＮＩＨイメージプログラム（アメリカインスティテュートオブヘルス（Ｕ．Ｓ．  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）が開発し、インターネット上のhttp://rsb.info.nih.gov/nih-image/で利用可能である）を用いて、バンドの強度を測定した。
【０１１８】
５）参照文献
１ｂ． Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  Ｓ．  ２００４．  Ｎａｔｕｒａｌｌｙ  Ａｒｉｓｉｎｇ  ＣＤ４＋  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  Ｓｅｌｆ−Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｎｅｇａｔｉｖｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ．  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２２：５３１−５６２．
２ｂ． Ｂｅｎｎｅｔｔ，  Ｃ．Ｌ．，  Ｊ．  Ｃｈｒｉｓｔｉｅ，  Ｆ．  Ｒａｍｓｄｅｌｌ，  Ｍ．Ｅ．  Ｂｒｕｎｋｏｗ，  Ｐ．Ｊ．  Ｆｅｒｇｕｓｏｎ，  Ｌ．  Ｗｈｉｔｅｓｅｌｌ，  Ｔ．Ｅ．  Ｋｅｌｌｙ，  Ｆ．Ｔ．  Ｓａｕｌｓｂｕｒｙ，  Ｐ．Ｆ．  Ｃｈａｎｃｅ，  ａｎｄ  Ｈ．Ｄ．  Ｏｃｈｓ．  ２００１．  Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ，  ｐｏｌｙｅｎｄｏｃｒｉｎｏｐａｔｈｙ，  ｅｎｔｅｒｏｐａｔｈｙ，  Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＩＰＥＸ）  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＦＯＸＰ３．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２７：２０−２１．
３ｂ． Ｈｏｒｉ，  Ｓ．，  Ｔ．  Ｎｏｍｕｒａ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ．  ２００３．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｆｏｘｐ３．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９９：１０５７−１０６１．
４ｂ． Ｄａｒｒａｓｓｅ−Ｊeｚｅ，  Ｇ．，  Ｇ．  Ｍａｒｏｄｏｎ，  Ｍ．  Ｃａｔａｌａ，  Ｂ．  Ｓａｌｏｍｏｎ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｋｌａｔｚｍａｎｎ．  ２００４．  Ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ／ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｆｅｔｕｓ．  Ｂｌｏｏｄ  Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ．
５ｂ． Ａｓａｎｏ，  Ｍ．，  Ｍ．  Ｔｏｄａ，  Ｎ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ．  １９９６．  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓ  ａ  ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｙ  ｏｆ  ａ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８４：３８７−３９６．
６ｂ． Ｉｔｏｈ，  Ｍ．，  Ｔ．  Ｔａｋａｈａｓｈｉ，  Ｎ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ，  Ｙ．  Ｋｕｎｉｙａｓｕ，  Ｊ．  Ｓｈｉｍｉｚｕ，  Ｆ．  Ｏｔｓｕｋａ，  ａｎｄ  Ｓ．  Ｓａｋａｇｕｃｈｉ．  １９９９．  Ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ：  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ２５＋ＣＤ４＋  ｎａｔｕｒａｌｌｙ  ａｎｅｒｇｉｃ  ａｎｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｓ  ａ  ｋｅｙ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｕｓ  ｉｎ  ｍａｉｎｔａｉｎｉｎｇ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃ  ｓｅｌｆ−ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６２：５３１７−５３２６．
７ｂ． Ｍａｒｏｄｏｎ，  Ｇ．，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｒｏｃｈａ．  １９９４．  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ”ｄｅｌｅｔｉｏｎ”  ｏｆ  ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｍａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍｍａｔｕｒｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｏｎｔｏｇｅｎｙ  ｏｆ  Ｍｌｓ−１ａ  ｍｉｃｅ：  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｉｎｔ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ６：１８９９−１９０４．
８ｂ． Ｊｏｒｄａｎ，  Ｍ．Ｓ．，  Ａ．  Ｂｏｅｓｔｅａｎｕ，  Ａ．Ｊ．  Ｒｅｅｄ，  Ａ．Ｌ．  Ｐｅｔｒｏｎｅ，  Ａ．Ｅ．  Ｈｏｌｅｎｂｅｃｋ，  Ｍ．Ａ．  Ｌｅｒｍａｎ，  Ａ．  Ｎａｊｉ，  ａｎｄ  Ａ．Ｊ．  Ｃａｔｏｎ．  ２００１．  Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ａｎ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｓｅｌｆ−ｐｅｐｔｉｄｅ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：３０１−３０６．
９ｂ． Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ，  Ｉ．，  Ａ．  Ｓａｒｕｋｈａｎ，  Ｌ．  Ｋｌｅｉｎ，  ａｎｄ  Ｈ．  ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ．  ２００２．  Ｏｒｉｇｉｎ  ｏｆ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｋｎｏｗｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３：７５６−７６３．
１０ｂ．      Ｋｌｅｉｎ，  Ｌ．，  Ｋ．  Ｋｈａｚａｉｅ，  ａｎｄ  Ｈ．  ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ．  ２００３．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｎｏｔ  ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｂｅｈａｖｉｏｒ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．  ＰＮＡＳ  １００：８８８６−８８９１．
１１ｂ．      Ｌｅｒｍａｎ，  Ｍ．Ａ．，  Ｊ．  Ｌａｒｋｉｎ，  ＩＩＩ，  Ｃ．  Ｃｏｚｚｏ，  Ｍ．Ｓ．  Ｊｏｒｄａｎ，  ａｎｄ  Ａ．Ｊ．  Ｃａｔｏｎ．  ２００４．  ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ  Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  Ｖａｒｙｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｎｅｏ−Ｓｅｌｆ−Ａｎｔｉｇｅｎ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：２３６−２４４．
１２ｂ．      Ｋａｗａｈａｔａ，  Ｋ．，  Ｙ．  Ｍｉｓａｋｉ，  Ｍ．  Ｙａｍａｕｃｈｉ，  Ｓ．  Ｔｓｕｎｅｋａｗａ，  Ｋ．  Ｓｅｔｏｇｕｃｈｉ，  Ｊ．  Ｍｉｙａｚａｋｉ，  ａｎｄ  Ｋ．  Ｙａｍａｍｏｔｏ．  ２００２．  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４（＋）ＣＤ２５（＋）  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅｉｒ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ｆｒｏｍ  ｎｏｎａｕｔｏｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＴＣＲ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６８：４３９９−４４０５．
１３ｂ．      Ｗａｌｋｅｒ，  Ｌ．Ｓ．Ｋ．，  Ａ．  Ｃｈｏｄｏｓ，  Ｍ．  Ｅｇｇｅｎａ，  Ｈ．  Ｄｏｏｍｓ，  ａｎｄ  Ａ．Ｋ．  Ａｂｂａｓ．  ２００３．  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９８：２４９−２５８．
１４ｂ．      Ｌｏｈｒ，  Ｊ．，  Ｂ．  Ｋｎｏｅｃｈｅｌ，  Ｅ．Ｃ．  Ｋａｈｎ，  ａｎｄ  Ａ．Ｋ．  Ａｂｂａｓ．  ２００４．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｂ７  ｉｎ  Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  １７３：５０２８−５０３５．
１５ｂ．      Ｓｈｉｈ，  Ｆ．Ｆ．，  Ｌ．  Ｍａｎｄｉｋ−Ｎａｙａｋ，  Ｂ．Ｔ．  Ｗｉｐｋｅ，  ａｎｄ  Ｐ．Ｍ．  Ａｌｌｅｎ．  ２００４．  Ｍａｓｓｉｖｅ  Ｔｈｙｍｉｃ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  ｉｎ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  Ｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９：３２３−３３５．
１６ｂ．      ｖａｎ  Ｓａｎｔｅｎ，  Ｈ．−Ｍ．，  Ｃ．  Ｂｅｎｏｉｓｔ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｍａｔｈｉｓ．  ２００４．  Ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  Ｔ  Ｒｅｇ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｈａｔ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  Ｄｏｅｓ  Ｎｏｔ  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｕｐｏｎ  Ｅｎｃｏｕｎｔｅｒ  ｏｆ  Ａｇｏｎｉｓｔ  Ｌｉｇａｎｄ  ｏｎ  Ｔｈｙｍｉｃ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２００：１２２１−１２３０．
１７ｂ．      Ｌｉｓｔｏｎ，  Ａ．，  Ｄ．Ｈ．Ｄ．  Ｇｒａｙ，  Ｓ．  Ｌｅｓａｇｅ，  Ａ．Ｌ．  Ｆｌｅｔｃｈｅｒ，  Ｊ．  Ｗｉｌｓｏｎ，  Ｋ．Ｅ．  Ｗｅｂｓｔｅｒ，  Ｈ．Ｓ．  Ｓｃｏｔｔ，  Ｒ．Ｌ．  Ｂｏｙｄ，  Ｌ．  Ｐｅｌｔｏｎｅｎ，  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．  Ｇｏｏｄｎｏｗ．  ２００４．  Ｇｅｎｅ  Ｄｏｓａｇｅ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ａｉｒｅ  ｉｎ  Ｔｈｙｍｉｃ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，  Ｃｌｏｎａｌ  Ｄｅｌｅｔｉｏｎ，  ａｎｄ  Ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２００：１０１５−１０２６．
１８ｂ．      Ｌｏ，  Ｄ．，  Ｊ．  Ｆｒｅｅｄｍａｎ，  Ｓ．  Ｈｅｓｓｅ，  Ｒ．Ｄ．  Ｐａｌｍｉｔｅｒ，  Ｒ．Ｌ．  Ｂｒｉｎｓｔｅｒ，  ａｎｄ  Ｌ．Ａ．  Ｓｈｅｒｍａｎ．  １９９２．  Ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ａｎ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｂｏｔｈ  ＣＤ４＋  ａｎｄ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２２：１０１３−１０２２．
１９ｂ．      Ｄｅｒｂｉｎｓｋｉ，  Ｊ．，  Ａ．  Ｓｃｈｕｌｔｅ，  Ｂ．  Ｋｙｅｗｓｋｉ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｋｌｅｉｎ．  ２００１．  Ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｔｈｙｍｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ｍｉｒｒｏｒｓ  ｔｈｅ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｓｅｌｆ．  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：１０３２−１０３９．
２０ｂ．      Ｋｉｒｂｅｒｇ，  Ｊ．，  Ａ．  Ｂａｒｏｎ，  Ｓ．  Ｊａｋｏｂ，  Ａ．  Ｒｏｌｉｎｋ，  Ｋ．  Ｋａｒｊａｌａｉｎｅｎ，  ａｎｄ  Ｈ．  ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ．  １９９４．  Ｔｈｙｍｉｃ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ８＋  ｓｉｎｇｌｅ  ｐｏｓｉｔｉｖｅ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １８０：２５−３４．
２１ｂ．      Ｓａｒｕｋｈａｎ，  Ａ．，  Ａ．  Ｌａｎｏｕｅ，  Ａ．  Ｆｒａｎｚｋｅ，  Ｎ．  Ｂｒｏｕｓｓｅ，  Ｊ．  Ｂｕｅｒ，  ａｎｄ  Ｈ．  ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ．  １９９８．  Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｔｏｗａｒｄｓ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ａ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｍｏｄｅｌ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ  １７：７１−８０．
２３ｂ．      Ｂｅｎｓｉｎｇｅｒ，  Ｓ．Ｊ．，  Ａ．  Ｂａｎｄｅｉｒａ，  Ｍ．Ｓ．  Ｊｏｒｄａｎ，  Ａ．Ｊ．  Ｃａｔｏｎ，  ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．  Ｌａｕｆｅｒ．  ２００１．  Ｍａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｃｏｒｔｉｃａｌ  Ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ  Ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｔｈｅ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋２５＋  Ｉｍｍｕｎｏｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９４：４２７−４３８．
２４ｂ．      Ｋｌｅｉｎ，  Ｌ．，  Ｔ．  Ｋｌｅｉｎ，  Ｕ．  Ｒｕｔｈｅｒ，  ａｎｄ  Ｂ．  Ｋｙｅｗｓｋｉ．  １９９８．  ＣＤ４  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  ｈｕｍａｎ  Ｃ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ａｎ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｓｅｒｕｍ  ｐｒｏｔｅｉｎ，  ｉｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｅｄｕｌｌａｒｙ  ｔｈｙｍｉｃ  ｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８８：５−１６．
２５ｂ．      Ａｐｏｓｔｏｌｏｕ，  Ｉ．，  ａｎｄ  Ｈ．  ｖｏｎ  Ｂｏｅｈｍｅｒ．  ２００４．  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｃｏｍｍｉｔｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｎａｉｖｅ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９：１４０１−１４０８．
２６ｂ．      Ｌｉａｎｇ，  Ｓ．，  Ｐ．  Ａｌａｒｄ，  Ｙ．  Ｚｈａｏ，  Ｓ．  Ｐａｒｎｅｌｌ，  Ｓ．Ｌ．  Ｃｌａｒｋ，  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．  Ｋｏｓｉｅｗｉｃｚ．  ２００５．  Ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ  ｏｆ  ＣＤ４＋  ＣＤ２５−  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｔｏ  ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  Ｂ７  ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｔｈｅ  ｔｈｙｍｕｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  ２０１：１２７−１３７．
２７ｂ．      Ｔａｎｇ，  Ｑ．，  Ｋ．Ｊ．  Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ，  Ｍ．  Ｂｉ，  Ｅ．Ｂ．  Ｆｉｎｇｅｒ，  Ｇ．  Ｓｚｏｔ，  Ｊ．  Ｙｅ，  Ｅ．Ｌ．  Ｍａｓｔｅｌｌｅｒ，  Ｈ．  ＭｃＤｅｖｉｔｔ，  Ｍ．  Ｂｏｎｙｈａｄｉ，  ａｎｄ  Ｊ．Ａ．  Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ．  ２００４．  Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ−ｅｘｐａｎｄｅｄ  Ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９：１４５５−１４６５．
２８ｂ．      Ｔａｒｂｅｌｌ，  Ｋ．Ｖ．，  Ｓ．  Ｙａｍａｚａｋｉ，  Ｋ．  Ｏｌｓｏｎ，  Ｐ．  Ｔｏｙ，  ａｎｄ  Ｒ．Ｍ．  Ｓｔｅｉｎｍａｎ．  ２００４．  ＣＤ２５＋  ＣＤ４＋  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ，  Ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  Ｃｅｌｌｓ  Ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ａｕｔｏａｎｔｉｇｅｎｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅ，  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｊ．  Ｅｘｐ．  Ｍｅｄ．  １９９：１４６７−１４７７．
２９ｂ．      Ｆｏｌｌｅｎｚｉ，  Ａ．，  Ｌ．Ｅ．  Ａｉｌｌｅｓ，  Ｓ．  Ｂａｋｏｖｉｃ，  Ｍ．  Ｇｅｕｎａ，  ａｎｄ  Ｌ．  Ｎａｌｄｉｎｉ．  ２０００．  Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｂｙ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｉｓ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｂｙ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｒｅｓｃｕｅｄ  ｂｙ  ＨＩＶ−１  ｐｏｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２５：２１７−２２２．
３０ｂ．      Ｍａｒｏｄｏｎ，  Ｇ．，  Ｅ．  Ｍｏｕｌｙ，  Ｅ．Ｊ．  Ｂｌａｉｒ，  Ｃ．  Ｆｒｉｓｅｎ，  Ｆ．Ｍ．  Ｌｅｍｏｉｎｅ，  ａｎｄ  Ｄ．  Ｋｌａｔｚｍａｎｎ．  ２００３．  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ａｎｄ  ｍｏｕｓｅ  ＣＤ４＋  ｃｅｌｌｓ  ｕｓｉｎｇ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＣＤ４  ｇｅｎｅ．  Ｂｌｏｏｄ  １０１：３４１６−３４２３．
【０１１９】
６）図面の説明
図１１は、ＴＣＲ−ＨＡ及びＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡトランスジェニックマウスにおける、ＨＡ特異的な胸腺細胞分化を示している。（Ａ）１４週齢のＴＣＲ−ＨＡ（ν）及びＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡ（τ）トランスジェニックマウスの胸腺中のＨＡ特異的（６．５＋）細胞の絶対数。それぞれのドットは、一匹のマウスを示している。二つの平均値は、統計学的に異なる（ｐ＜０．０５）。（Ｂ）ＴＣＲ−ＨＡトランスジェニックマウスのＣＤ４及びＣＤ発現を基礎とした胸腺細胞サブセットのゲーティング（ｇａｔｉｎｇ）。表示は、総胸腺細胞のパーセンテージにおけるそれぞれの集団の頻度である。（Ｃ）ＴＣＲ−ＨＡ（灰色の線）及びＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡ（黒い線）のトランスジェニックマウスの胸腺における示した表現型のＣＤ２５＋細胞中の導入遺伝子ＴＣＲ（６．５＋）の発現の重ね合わせた表示。（Ｄ）１Ｂで定義されたサブセット（ＤＰ＝ＣＤ４＋ＣＤ８＋；ＣＤ４ｉｎｔ＝ＣＤ４＋ＣＤ８ｌｏ；ＣＤ４ＳＰ＝ＣＤ４＋ＣＤ８−細胞）内におけるＣＤ２５＋及びＣＤ２５−細胞中の６．５＋細胞の頻度（パーセンテージ±Ｓ．Ｄ）
【０１２０】
図１２は、ＴＣＲ−ＨＡ及びＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡトランスジェニックマウスの胸腺細胞サブセット中のＣＤ２５＋細胞の絶対数を示す。細胞の絶対数は、それぞれの継続した目的の集団において、トリパンブルー排除によって決定されたすべての生存細胞カウントを掛け合わせて計算した。それぞれのドットは、一匹のマウスを示している。上部パネル：示したサブセットのＴＣＲ−ＨＡ（λ）及びＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡ（σ）トランスジェニックマウス中の６．５＋ＣＤ２５＋細胞の絶対数。ＤＰサブセット中の６．５＋ＣＤ２５＋の絶対数において、平均値は統計的に異なった（ｐ＜０．０１）。ｐ値は、他のサブセットにおいてすべて０．００２より下であった。下部パネル：示したサブセットのＴＣＲ−ＨＡ（μ）及びＴＣＲ−ＨＡｘＩｎｓ−ＨＡ（Δ）トランスジェニックマウスの６．５−ＣＤ２５＋細胞の絶対数。平均値は分析した３つのサブセットにおいて統計的な差はなかった。
【０１２１】
図１３は、ＴＣＲ−ＨＡトランスジェニックマウスのＨＡコードレンチウイルスベクターの胸腺内注入上のレギュラトリーＴ細胞の新規な発生を示す。（Ａ）ＨＡコードレンチウイルスベクターの配置図。ＲＳＶ−Ｕ３：ラウス肉腫ウイルスのＵ３プロモーター／エンハンサー；ＳＤ：スプライスドナー（ｓｐｌｉｃｅ  ｄｏｎｏｒ）；ＳＡ：スプライスアクセプター（ｓｐｌｉｃｅ  ａｃｃｅｐｔｏｒ）；ｐｓｉ：パッケージングシグナル配列（ｐａｃｋａｇｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）；ｇａ−ＲＲＥ：反応性エレメントを有するトランケーティドｇａｇ遺伝子（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｇａｇ  ｇｅｎｅ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｒｅｖ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）；ｃｐｐＴ：  セントラルポリプリントラクト（ｃｅｎｔｒａｌ  ｐｏｌｙｐｕｒｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）；ＰＧＫ：ホスホグリセレートカイネースプロモーター（ｐｈｏｓｐｈｏ−ｇｌｙｃｅｒａｔｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ）；ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス調節エレメント（ｗｏｏｄｃｈｕｃｋ  ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）；ＬＴＲ−ＳＩＮ：自己非活性ロングターミナルリピート（ｓｅｌｆ−ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）。（Ｂ）ＧＦＰ発現（ＴＣＲ−ＨＡ）又はＨＡ−コードレンチウイルスベクターを注入したＴＣＲ−ＨＡトランスジェニックマウスの、（ＴＣＲ−ＨＡ  ＬｖＨＡ）６．５＋ＣＤ２５＋（クローズシンボル）及び６．５−ＣＤ２５＋（オープンシンボル）のＣＤ４ＳＰ胸腺細胞の絶対数。（Ｃ）１０日前にＧＦＰ発現（黒い線）又はＨＡ発現（破線）レンチウイルスベクターを胸腺に注入されたＴＣＲ−ＨＡトランスジェニックマウスからの、精製したＣＤ２５＋末梢Ｔ細胞の共移入の糖尿病Ｉｎｓ−ＨＡマウスのパーセンテージ。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の共移入がない場合、１００％のマウスは、糖尿病になる（未発表の結果）。データは、２つの別の実験において処置された１群当たり６匹のマウスからの結果をまとめたものである。
【０１２２】
図１４は、ＴＣＲ−ＨａｘＩｎｓ−ＨＡマウスからの分類されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋及びＣＤ４＋ＣＤ２５−胸腺細胞におけるｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡの半定量評価。（Ａ）セルソーティング後の分類したＣＤ４＋ＣＤ２５＋（上部パネル）及びＣＤ４＋ＣＤ２５−胸腺細胞（下部パネル）の精製度。（Ｂ）表示した胸腺細胞サブセット中のイメージソフトウエア（ＮＩＨ）を用いて、ＰＣＲバンドの光学強度を測定した。それらの任意のユニットにおける、ｆｏｘｐ３  ｍＲＮＡに対するのハウスキーピングシクロフィリンｍＲＮＡの割合を示した。
【０１２３】
表１．胸腺にレンチウイルスベクターを注入されたＴＣＲ−ＨＡトランスジェニックマウスの胸腺及びリンパ節からのＨＡ特異的ＣＤ４ＳＰのＴ細胞の頻度。
【表１】
2008501661.tif 000003
【０１２４】
ＧＦＰ発現レンチウイルスベクター（ＴＣＲ−ＨＡ  ＬｖＧＦＰ）、又はＨＡ発現レンチウイルスベクター（ＴＣＲ−ＨＡ  ＬｖＨＡ）を注入されたトランスジェニックマウスの胸腺又はリンパ節のＣＤ４ＳＰ  Ｔ細胞におけるＣＤ２５＋及びＣＤ２５−細胞の６．５＋細胞の頻度（パーセンテージ）±Ｓ．Ｄ．を示している。７〜１０週齢のマウスは、１５〜２５ｎｇのレンチウイルスベクターを胸腺に注入され、注入後１週（短期の効果）又は１カ月又は２カ月（長期の効果）のいずれかに、フローサイトメトリーのため、安楽死された。胸腺中のＣＤ４ＳＰ細胞中の６．５＋ＣＤ２５＋の頻度が最低２倍であったＴＣＲ−ＨＡ  ＬｖＨＡマウスが解析に含まれた（１０匹の注入中８匹）。ＮＤ：ｎｏｔ  ｄｏｎｅ．
【図１】
2008501661.tif 000004
【図２】
2008501661.tif 000005
【図３】
2008501661.tif 000006
【図４】
2008501661.tif 000007
【図５】
2008501661.tif 000008
【図６】
2008501661.tif 000009
【図７】
2008501661.tif 000010
【図８】
2008501661.tif 000011
【図９】
2008501661.tif 000012
【図１０】
2008501661.tif 000013
【図１１】
2008501661.tif 000014
【図１２】
2008501661.tif 000015
【図１３】
2008501661.tif 000016
【図１４】
2008501661.tif 000017
【配列表】
2008501661000001.app
【国際調査報告】
2008501661.tif 000018
2008501661.tif 000019
2008501661.tif 000020