(57)【要約】【課題】オリゴヌクレオチドのプローブ／プライマー組成物を提供する。【解決手段】（ａ）第１の部分及び第２の部分を備える核酸プライマーであって、第１の部分がターゲット核酸に相補的であり、第２の部分が核酸プローブには相補的であるがターゲット核酸には相補的でない核酸プライマーと、（ｂ）核酸プライマーの第２の部分に相補的な部分を備えるが、核酸プライマーの第１の部分に相補的な部分は備えない核酸プローブと、（ｃ）相互作用するラベルの対であって、相互作用するラベルの対の第１の要素は核酸プライマーに結合しており、相互作用するラベルの対の第２の要素は核酸プローブに結合しており、プライマー及びプローブがハイブリッドを形成している場合には相互作用し、プライマー及びプローブが乖離している時には相互作用しないラベルの対とを備える。【選択図】図1
2008539730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）第１の部分及び第２の部分を備える核酸プライマーであって、前記第１の部分がターゲット核酸に相補的であり、前記第２の部分が核酸プローブには相補的であるが前記ターゲット核酸には相補的でない前記核酸プライマーと、
（ｂ）前記核酸プライマーの前記第２の部分に相補的な部分を備えるが、前記核酸プライマーの前記第１の部分に相補的な部分は備えない前記核酸プローブと、
（ｃ）相互作用するラベルの対であって、前記相互作用するラベルの対の第１の要素は前記核酸プライマーに結合しており、前記相互作用するラベルの対の第２の要素は前記核酸プローブに結合しており、前記プライマー及び前記プローブがハイブリッドを形成している場合には相互作用し、前記プライマー及び前記プローブが乖離している時には相互作用しない前記ラベルの対
とを備えるラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項２】
前記相互作用するラベルの対が蛍光分子と消光剤を備える、請求項１のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項３】
前記蛍光分子又は前記消光剤のいずれかが前記核酸プローブの3’ヌクレオチドに結合している、請求項２のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項４】
前記蛍光分子が前記3’ヌクレオチドに結合している、請求項３のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項５】
前記消光剤が前記3’ヌクレオチドに結合している、請求項３のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項６】
前記蛍光分子又は前記消光剤のいずれかが前記核酸プライマーの5’ヌクレオチドに結合している、請求項２のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項７】
前記蛍光分子が前記5’ヌクレオチドに結合している、請求項６のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項８】
前記消光剤が前記5’ヌクレオチドに結合している、請求項６のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項９】
前記蛍光分子が前記核酸プローブの3’末端ヌクレオチドに結合しており、前記消光剤が前記核酸プライマーの5’末端ヌクレオチドに結合している、請求項６のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項１０】
前記蛍光分子が、FAM、R110、TAMRA、R6G、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Gold 540、CAL Fluor Orange 560、及びQUASAR-670からなるグループから選択される、請求項２のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項１１】
前記消光剤が、DABCYL、BHQ-I、BHQ-2、及びBHQ-3からなるグループから選択される、請求項２のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項１２】
前記核酸プローブの切断により前記蛍光が少なくとも3倍上昇する、請求項２のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項１３】
前記核酸プローブの切断により前記蛍光が少なくとも4倍上昇する、請求項２のラベルされたオリゴヌクレオチドの対。
【請求項１４】
前記請求項１のラベルされたオリゴヌクレオチドの対と、その包装部材とを備え、前記核酸プライマーと前記核酸プローブが別個のコンテナにあるキット。
【請求項１５】
前記請求項１のラベルされたオリゴヌクレオチドの対と、その包装部材とを備え、前記核酸プライマーと前記核酸プローブが同じコンテナにあるキット。
【請求項１６】
核酸ポリメラーゼを更に備える、請求項１４又は１５のキット。
【請求項１７】
前記核酸ポリメラーゼが5’から3’へのヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、請求項１６のキット。
【請求項１８】
ヌクレアーゼを更に備える、請求項１７のキット。
【請求項１９】
前記ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項１８のキット。
【請求項２０】
前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項１８のキット。
【請求項２１】
前記ヌクレアーゼがFENヌクレアーゼである、請求項１８のキット。
【請求項２２】
（ａ）前記請求項１のラベルされたオリゴヌクレオチドの対を、PCR混合物に加えることと、
（ｂ）前記核酸プライマーが前記ターゲット核酸にハイブリダイズする時に検出可能なシグナルを生成するために、前記核酸プローブを切断させること
とを含み、
前記シグナルが核酸サンプル中の前記ターゲット核酸の存在を示す、サンプル中のターゲット核酸の検出方法。
【請求項２３】
核酸ポリメラーゼを加えることを更に含む、請求項２２の方法。
【請求項２４】
前記核酸ポリメラーゼが5’から3’へのヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている、請求項２３の方法。
【請求項２５】
ヌクレアーゼを更に備える、請求項２４の方法。
【請求項２６】
前記ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項２５の方法。
【請求項２７】
前記ヌクレアーゼがFENヌクレアーゼである、請求項２５の方法。
【請求項２８】
（ａ）PCR増幅反応を実施すること、ここで前記PCR増幅反応の混合物がターゲット核酸、前記請求項１のラベルされたオリゴヌクレオチドの対、及び前記ターゲット核酸に相補的な第２のプライマーを備え、
（ｂ）ヌクレアーゼ切断反応を実施すること、及び
（ｃ）前記相互作用するラベルの対の要素によって生じるシグナルを検出することを含み、前記シグナルが前記ターゲット核酸の存在を示す、サンプル中のターゲット核酸を検出する方法。
【請求項２９】
請求項１のプローブを備える、反応混合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は核酸検出のための技術に関し、特にオリゴヌクレオチドのプローブ／プライマー組成物、及びポリヌクレオチドの検出方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ポリヌクレオチド検出のための技術は、基礎研究、診断及び法医学において確立された広範な有用性を有する。ポリヌクレオチド検出は多くの方法によってなされることができる。ほとんどの方法は、ターゲットDNAの量を増幅するためのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)の使用に依存している。
【０００３】
タックマン（登録商標）アッセイは、ポリヌクレオチドを検出するためのホモジニアスなアッセイである(例えば、特許文献1参照。)。このアッセイでは、二つのPCRプライマーが中央のプローブ・オリゴヌクレオチドを側面攻撃する。プローブ・オリゴヌクレオチドは蛍光色素と消光剤を含む。PCR工程の重合ステップの間、ポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性がプローブ・オリゴヌクレオチドを切断し、消光剤から蛍光色素を物理的に分離し始め、それが蛍光放射を増大させる。より多くのPCR産物が産生されるほど、新たな波長における放射強度が増大する。しかしプローブ・オリゴヌクレオチド中において要求される蛍光色素と消光剤の分離のために、この方法ではバックグランドの放射もかなり高くなりうる。
【０００４】
ポリヌクレオチドを検出するために、分子標識(Molecular beacons)がTaqManの代替手段になる(例えば、特許文献2、3、4参照。)。分子標識とはオリゴヌクレオチドのヘアピンであり、完全にマッチするテンプレートに結合によって構造変化する。オリゴヌクレオチドの構造変化は、オリゴヌクレオチド上に存在する蛍光色素と消光剤の間の物理的な距離を長くする。この物理的距離の増加は消光剤の影響を減少させるので、蛍光色素からのシグナルが上昇する。
【０００５】
隣接プローブ法(adjacent probes method)は、ターゲット配列の隣り合う領域にハイブリダイズする二つの核酸プローブの存在下、ターゲット配列をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する。プローブの一つはアクセプタ蛍光色素でラベルされており、他のプローブは蛍光エネルギー移動ペアのドナー蛍光色素でラベルされている。二つのプローブとターゲット配列のハイブリダイゼーションの際に、ドナー蛍光色素はアクセプタ蛍光色素と相互作用し、検出可能なシグナルが生成される。そしてドナー蛍光色素によって吸収される波長の光でサンプルは励起され、蛍光エネルギー移動ペアからの蛍光放射が、ターゲットの量を判断するために検出される(例えば、特許文献5参照。)。特許文献5はそのような方法を開示している。
【０００６】
サンライズ・プライマー(Sunrise primers)は、分子標識と同様にヘアピン構造を利用するが、プライマーとして機能するターゲット結合配列に結合している。プライマーの相補鎖が合成された時、ヘアピン構造が崩壊して消光作用が失われる。これらのプライマーは増幅産物を検出し、5’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼの使用を必要としない。サンライズ・プライマーはナザレンコ(Nazarenko)らによって説明されている(例えば、特許文献6、7参照。)。
【０００７】
スコーピオン・プローブ(Scorpion probes)は、プライマーと、サンライズ・プライマーと同様の加えられたヘアピン構造とを結合する。しかしスコーピオン・プローブのヘアピン構造は相補鎖の合成によっては開裂されず、ヘアピン構造の一部と、プライマーにハイブリダイズする部分から下流のターゲット部分とのハイブリダイゼーションによって開裂される。
【０００８】
DzyNA-PCRは、DNAzymeのアンチセンス配列を含むプライマーと、特定のRNAホスホジエステル結合を切断可能なオリゴヌクレオチドとを含む。プライマーはターゲット配列に結合し、活性DNAzymeを含む増幅産物(amplicon)を産生する増幅反応を促進する。そして活性DNAzymeは、反応混合物中のいわゆるレポーター基質を切断する。レポーター基質は蛍光色素と消光剤の対を含み、ターゲット配列の増幅と共に上昇する蛍光シグナルを基質の切断は発生させる(例えば、特許文献8、9参照。)。Dzy-PCRは、特許文献8、9に記載されている。
【０００９】
フィアンダカ（Fiandaca）らは、消光剤でラベルされたペプチド核酸(Q-PNA)プローブと、蛍光色素でラベルされたオリゴヌクレオチド・プライマーとを用いるPCR分析用蛍光方法について述べている（例えば、特許文献10参照。)。Q-PNAは、プライマーの5’末端のタグ配列にハイブリダイズする。
【００１０】
リー（Li）らは、対立するオリゴヌクレオチド鎖上に消光剤と蛍光色素を有する二本鎖プローブについて記載している（例えば、特許文献11参照。）。ターゲットに結合していない時、鎖は互いにハイブリダイズし、プローブは消光されている。しかしターゲットが存在する時、少なくとも一つの鎖がターゲットにハイブリダイズし、結果として蛍光シグナルが生じる。
【特許文献１】米国特許第5,723,591号明細書
【特許文献２】米国特許第6,277,607号明細書
【特許文献３】米国特許第6,150,097号明細書
【特許文献４】米国特許第6,037,130号明細書
【特許文献５】米国特許第6,174,670B1号明細書
【特許文献６】ナザレンコ(Nazarenko)著、「Nucleic Acids Res.」、1997年、25:2516-21
【特許文献７】米国特許第5,866,336号明細書
【特許文献８】トッドら(Todd et al.)著、「Clin. Chem.」、2000年、46:625-30
【特許文献９】米国特許第6,140,055号明細書
【特許文献１０】フィアンダカら（Fiandaca et al.）著、「Genome Research.」、2001年、11:609-613
【特許文献１１】リーら(Li et al.)著、「Nucleic Acids Research.」、30 (2e5); 1-9
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明は、オリゴヌクレオチドのプローブ／プライマー組成物、及びポリヌクレオチドの検出方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明は、核酸検出のための新規な化合物及び方法に関する。ある態様において、本発明は、ターゲット核酸配列を検出するための、ラベルされたオリゴヌクレオチドの対を提供する。ラベルされたオリゴヌクレオチドの対は、核酸プライマーと核酸プローブを有する複合体を形成する。核酸プライマーは、第1の部分と第2の部分を有する。第1の部分はターゲット核酸と相補的であり、第2の部分は核酸プローブと相補的である。しかし第2の部分はターゲット核酸と相補的でない。核酸プローブは核酸プライマーの第2の部分と相補的である。しかし核酸プローブは核酸プライマーの第1の部分と相補的でない。またオリゴヌクレオチド・プローブ複合体は、相互作用するラベルの対を含む。相互作用するラベルの対の第1の要素は核酸プライマーに結合されており、第2の要素は核酸プローブに結合されている。プローブとプライマーが複合体を形成した時、ラベルは相互作用し、プライマーとプローブが乖離した時、ラベルは相互作用しない。
【００１３】
その他の態様において、本発明はサンプル中のターゲット核酸配列の検出方法を提供する。本方法は、PCR増幅反応混合物に、本発明のラベルされたオリゴヌクレオチドの対を加えることを含む。ターゲット核酸が存在する時、核酸プローブが切断されるような反応条件がPCR増幅反応に適用される。増幅産物(amplicon)に組み込まれたプライマー核酸の第2の部分にハイブリダイズしているプローブに切断酵素が接触した時に、プローブは切断される。切断により検出可能なシグナルが発生し、それはサンプル中のターゲット核酸の存在を示す。
【００１４】
関連する態様において、サンプル中のターゲット核酸配列の検出方法は、PCR増幅反応及びヌクレアーゼ切断反応を実施することを要する。PCR増幅反応混合物は、ターゲット核酸と、ラベルされたオリゴヌクレオチドの対と、ターゲット核酸に相補的な第2のプライマーを含む。増幅反応の間、又は後、相互作用するラベルの対の分離により発生するシグナルが検出される。シグナルは、サンプル中のターゲット核酸配列の存在及び／又は量を示す。
【００１５】
本発明のさらなる態様において、ラベルされたオリゴヌクレオチドの対はキットに含まれている。ラベルされたオリゴヌクレオチドの対に加えて、キットは核酸ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、第2のプライマー、及びそれらの包装材料を含みうる。ラベルされたオリゴヌクレオチドの対の核酸プローブ及び核酸プライマーは、キット内の同じか、あるいは別々のコンテナに入れられて供給されうる。
【００１６】
本発明の最後の態様は、ラベルされたオリゴヌクレオチドの対が、サンプル中のターゲット核酸配列の存在を示すことができるシグナルを発生させるための反応混合物中に存在する。また反応混合物は、核酸ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、及び第2のプライマーを含みうる。
【発明の効果】
【００１７】
本発明によれば、オリゴヌクレオチドのプローブ／プライマー組成物、及びポリヌクレオチドの検出方法を提供可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
（定義）
本明細書において、「ポリヌクレオチド」はヌクレオチド（つまりRNAではリボヌクレオチド、DNAではデオキシリボヌクレオチド）の共有結合により連結された配列を意味し、あるヌクレオチドのペントース(pentose)の3’部位は、ホスホジエステル結合により、隣のヌクレオチドのペントースの5’部位に結合されている。「ポリヌクレオチド」という語は、1本鎖及び2本鎖ポリヌクレオチドを含む。ここで使用される「ポリヌクレオチド」という語は、化学的、酵素的、又は代謝的に修飾されたポリヌクレオチドの形態も包含する。また「ポリヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチド（例えば、プライマー又はプローブ）としばしば呼ばれる短いポリヌクレオチドも包含する。ポリヌクレオチドのホスホジエステル結合が置換基モノヌクレオチドのペントース環の5’炭素及び3’炭素の間で生じるため、ポリヌクレオチドは「5’末端」及び「3’末端」を有する。5’炭素に新しい結合が生じうるポリヌクレオチドの末端が、5’末端ヌクレオチドである。3’炭素に新しい結合が生じうるポリヌクレオチドの末端が、3’末端ヌクレオチドである。ここで用いられる「末端ヌクレオチド」は、3’又は5’末端の最後に位置するヌクレオチドである。本明細書において、ポリヌクレオチド配列は、例えより大きいポリヌクレオチドの内部であっても（つまり、ポリペプチド内の配列部分）、5’及び3’末端を有すると述べられてもよいこととする。
【００１９】
本明細書において、「オリゴヌクレオチド」という語は、短いポリヌクレオチドを意味し、典型的には150ヌクレオチド長未満又は以下である（例えば、5乃至150、好適には10乃至100、さらに好適には15乃至50ヌクレオチド長である。）。しかし本明細書において、この語はより長いか、又はより短いポリヌクレオチド鎖を包含することも意図される。「オリゴヌクレオチド」は、他のポリヌクレオチドやターゲット核酸とハイブリダイズしうる。そのため、ポリヌクレオチド検出用プローブや、ポリヌクレオチド鎖伸長用プライマーとして機能する。
【００２０】
本明細書において、「核酸プライマー」は、上で定義されたような「オリゴヌクレオチド」の長さ制限を有するか、又は含むオリゴヌクレオチドを意味し、ターゲット核酸に相補的な配列を有するか、又は含み、塩基対合によってターゲット・ポリヌクレオチドにハイブリダイズし、伸長（延長）反応を開始し、ヌクレオチドをオリゴヌクレオチド・プライマーに組み込む。核酸プライマーは第1及び第2の部分を含み、第1の部分は3’から前記の第2の部分までである。第1の部分はターゲット核酸に相補的であり、ハイブリダイズする。そして第2の部分は核酸プローブに相補的であり、ハイブリダイズする。核酸プライマーは、核酸プライマーの伸長によって、増幅産物(amplicon)に組み込まれる。開始及び伸長のための条件は、適切な緩衝液（「緩衝液」は例えば補因子であるか、あるいはpHやイオン強度に液用を与える置換基を含みうる。）中、適切な温度での、4つの異なるデオキシリボヌクレオシド三リン酸塩と、DNAポリメラーゼや逆転写酵素のような重合誘導試薬の存在を含む。本発明で有効な核酸プライマーは、一般的に10乃至100ヌクレオチド長であり、好ましくは17乃至50ヌクレオチド長であり、最も好ましくは17乃至45ヌクレオチド長である。
【００２１】
本明細書において、「核酸プローブ」はオリゴヌクレオチドを意味し、プローブの配列と核酸プライマーの第2の部分の配列との相補性により、核酸プライマーの第2の部分にハイブリダイズする。核酸プローブはターゲット核酸にハイブリダイズしない。しかし核酸プローブは、増幅されたターゲット核酸、又は少なくとも1回の増幅サイクルの後の増幅産物(amplicon)にハイブリダイズする。核酸プローブは、ペプチド核酸(PNA)プローブではない。通常、プローブは8乃至100ヌクレオチドを含み、好ましくは15乃至50ヌクレオチドを含み、さらに好ましくは15乃至35ヌクレオチドを含む。
【００２２】
本明細書において、「ラベルされたオリゴヌクレオチドの対」は、二つのオリゴヌクレオチド、つまり(1)核酸プライマー及び（2）核酸プローブの複合体を意味する。複合体は、核酸プローブが核酸プライマーの第2の部分にハイブリダイズする時に形成される。またラベルされたオリゴヌクレオチドの対は、相互作用するラベルの対を含む。相互作用するラベルの対の一つの要素は核酸プライマーに結合し、相互作用するラベルの対の第2の要素は核酸プローブに結合する。
【００２３】
本明細書において、「相互作用可能なラベルの対」は、検出シグナルによってそれらの近接を検出可能にするような、物理的、光学的、あるいはその他の方法によって相互作用する分子の対を意味する。「相互作用可能なラベルの対」の例としては、これらに限定されないが、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET: fluorescence resonance energy transfer)（Stryer, L. Ann. Rev. Biochem. 47, 819-846, 1978)、シンチレーション近接アッセイ(SPA: scintillation proximity assays) (Hart及びGreenwald, Molecular Immunology 16:265-267, 1979; U.S. Pat. No. 4,658,649)、発光共鳴エネルギー転移(LRET: luminescence resonance energy transfer) (Mathis, G. Clin. Chem. 41, 1391-1397, 1995)、ダイレクト・クエンチング(direct quenching) (Tyagiら, Nature Biotechnology 16, 49-53, 1998)、化学発光エネルギー転移(CRET: chemiluminescence energy transfer) (Campbell, A. K., 及びPatel, A. Biochem. J. 216, 185-194, 1983)、バイオ発光共鳴エネルギー転移(BRET: bioluminescence resonance energy transfer) (Xu, Y., Piston D. W., Johnson, Proc. Natl. Acad. Sc, 96, 151-156, 1999)、あるいはエキシマ生成(Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Press, New York, 1999)での使用に適切なラベルを含む。
【００２４】
本明細書において、「相補的」とは、二つのポリヌクレオチド鎖の領域の間の配列の相補性の概念を意味する。第1のポリヌクレオチド領域のアデニン塩基は、もし塩基がチミンかウラシルであれば、第1の領域と逆平行の第2のポリヌクレオチドの領域の塩基と、特異的な水素結合（「塩基対」）を形成できることは知られている。同様に、第1のポリヌクレオチド鎖のシトシン塩基は、塩基がグアニンであれば、第1の鎖と逆平行な第2のポリヌクレオチド鎖の塩基と塩基対を形成できることも知られている。二つの領域が逆平行な様式で配列され、第1の領域の少なくとも一つのヌクレオチドが第2の領域の塩基と塩基対を形成可能であれば、ポリヌクレオチドの第1の領域は、異なるポリヌクレオチドの第2の領域に相補的である。したがって、総てのヌクレオチドの位置で、二つの相補的なポリヌクレオチドが塩基対を形成する必要はない。「相補的」とは、第2のポリヌクレオチドと100%あるいは「完全に」相補的な第1のポリヌクレオチドを指してもよく、この場合、総てのヌクレオチドの位置で塩基対が形成される。また「相補的」とは、少なくとも一つのヌクレオチドの位置でミスマッチなヌクレオチドを含む、100%相補的でない（例えば90%、80%、70%、あるいはそれ未満の相補性）第1のポリヌクレオチドを意味してもよい。
【００２５】
本明細書において、「ハイブリダイゼーション」あるいは「結合」の語は、相補的な（部分的に相補的であることを含む。）ポリヌクレオチド鎖、つまり、核酸プライマーの第2の領域と核酸プローブの対合を記載するために用いられる。ハイブリダイゼーションとハイブリダイゼーション強度（例えば、ポリヌクレオチド鎖の間の結合強度）は、当該技術分野で広く知られた多くの要因に影響される。要因は、ポリヌクレオチドどうしの相補性の程度、関係する条件の厳密性(stringency)、形成されたハイブリッドの融解温度(Tm)、他の分子の存在（例えば、ポリエチレン・グリコールの存在又は非存在）、ハイブリダイズする鎖のモル濃度、及びポリヌクレオチド鎖のGC含有量などを含む。
【００２６】
本明細書において、あるポリヌクレオチドがその他のポリヌクレオチドに「ハイブリダイズ」すると述べる時は、それは二つのポリヌクレオチド間にある相補性があること、あるいは二つのポリヌクレオチドがハイブリッドを形成することを意味する。あるポリヌクレオチドがその他のポリヌクレオチドにハイブリダイズしないと述べる時は、それは二つのポリヌクレオチド間に相補的な配列が実質的にないこと、あるいは二つのポリヌクレオチド間でハイブリッドが形成されなかったことを意味する。ある態様において、二つの相補的なポリヌクレオチドは、高度に厳密なハイブリダイゼーション条件下で、互いにハイブリダイズすることが可能である。厳密な条件下でのハイブリダイゼーションは、65℃で5X SSC、5X Denhardt's溶液、1% SDS中の放射標識プローブとのインキュベーションとして定義される、高度に厳密なハイブリダイゼーション条件下の膜ハイブリダイゼーション（例えば、ノーザン・ハイブリダイゼーション）によって通常確認される。膜ハイブリダイゼーションの厳密な洗浄は、以下のように実施される。膜は、室温で2X SSC/0.1%SDS中で洗浄され、65℃で0.2XSSC/0.1%SDS中で、1回の洗浄あたり10分間洗浄され、フィルムに露出される。
【００２７】
本明細書において、「ターゲット核酸」は、伸長、複製、増幅及び検出のために選択された対象のポリヌクレオチドの領域を意味する。ターゲット核酸は、増幅前のサンプル中に存在する。ターゲット核酸の増幅は、さらなる核酸配列を、増幅産物(amplicon)、つまり核酸プライマーの第2の部分に組み込むことを導く。これら付加された核酸配列はターゲット核酸とはみなされないが、増幅産物(amplicon)の一部である。
【００２８】
本明細書において、「核酸ポリメラーゼ」は、ヌクレオチドの重合を触媒する酵素を意味する。通常この酵素は、核酸テンプレート配列にアニールされたプライマーの3’末端から合成を開始させ、テンプレート鎖の5’末端に向けて進行させる。「DNAポリメラーゼ」はデオキシリボ核酸の重合を触媒する。例えば既知のDNAポリメラーゼは、好熱性古細菌(Pfu: Pyrococcus furiosus) DNAポリメラーゼ(Lundbergら, 1991, Gene, 108:1)、E. coli DNAポリメラーゼ I (Lecomte及びDoubleday, 1983, Nucleic Acids Res. 11:7505)、T7 DNAポリメラーゼ(Nordstromら, 1981, J. Biol. Chem. 256:3112)、高度好熱菌(Tth: Thermus thermophilus) DNAポリメラーゼ(Myers及びGelfand 1991, Biochemistry 30:7661)、好熱性細菌(Bacillus stearothermophilus) DNAポリメラーゼ(Stenesh及びMcGowan, 1977, Biochim Biophys Acta 475:32)、高度好熱性古細菌(Tli: Thermococcus litoralis) DNAポリメラーゼ(Vent DNAポリメラーゼとも呼ばれる、Carielloら, 1991, Nucleic Acids Res, 19: 4193)、9°Nm DNAポリメラーゼ(New England Biolabsの製造中止品)、好熱性細菌(Tma: Thermotoga maritima) DNAポリメラーゼ(Diaz及びSabino, 1998 Braz J. Med. Res, 31:1239)、好熱菌(Taq: Thermus aquaticus) DNAポリメラーゼ(Chienら, 1976, J. Bacteoriol, 127: 1550)、超好熱始原菌(Pyrococcus kodakaraensis) KOD DNAポリメラーゼ(Takagiら, 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63:4504)、JDF-3 DNAポリメラーゼ(特許出願WO 0132887)、及びPyrococcus GB-D (PGB-D) DNAポリメラーゼ(Juncosa-Ginestaら, 1994, Biotechniques, 16:820)を含む。 上記の酵素のいずれのポリメラーゼ活性も、当該技術分野でよく知られた手段により判定可能である。本発明に係るDNAポリメラーゼ活性の一つの単位は、最適化された温度（例えばPfu DNAポリメラーゼでは72℃）で30分の間に、10ナノ・モーラの全dNTPをポリマー状に組み込むことを触媒する酵素の量として定義される。
【００２９】
本明細書において、「ポリメラーゼ連鎖反応」、「PCR」、あるいは「PCRアッセイ」は、特定のポリヌクレオチドのテンプレート配列をin vitroで増幅するための方法を意味する。PCR反応は繰り返される一連の温度サイクルを含み、通常50乃至100μlの体積で実施される。反応混合物は、dNTPs（4つのデオキシリボ核酸であるdATP、dCTP、dGTP、及びdTTPのそれぞれ）、プライマー、緩衝液、DNAポリメラーゼ、及びポリヌクレオチドのテンプレートを備える。一つのPCR反応は、5乃至100回のポリヌクレオチド分子の変性及び合成の「サイクル」からなりうる。PCR工程は、米国特許番号4,683,195及び4,683,202に記載されており、それぞれの開示は参考文献としてここに取り込まれる。
【００３０】
本明細書において、「ヌクレアーゼ」又は「切断試薬」は、つまり、本発明に係るいわゆる「開裂構造」を切断するという点で特異的な酵素であり、ターゲット核酸にハイブリダイズしていないプローブを実質的に切断しないという点で特異的でない。ヌクレアーゼ又は切断試薬との語は、例えばDNAポリメラーゼ、つまりはE.coli由来のDNAポリメラーゼ、Thermus aquaticus (Taq)、Thermus thermophilics (Tth)、Pyrococcus furiosus (Pfu)、及びThermus flavus (TfI)由来のDNAポリメラーゼのような、5’エンドヌクレアーゼ活性を有する酵素を含む。またヌクレアーゼ又は切断試薬との語は、FENヌクレアーゼを包含する。またヌクレアーゼ又は切断試薬との語は、エキソヌクレアーゼ活性を有する酵素を含む。
【００３１】
本明細書において、「開裂構造」は、二重構造を形成するために、核酸プローブとターゲット核酸の相互作用により形成された構造を意味する。そして二重構造は切断試薬で切断される。
【００３２】
本明細書において、「開裂反応」は、オリゴヌクレオチド（なお、他の断片や核酸にホスホジエステル結合によって物理的につながれていないもの）を、断片又はヌクレオチド、及びオリゴヌクレオチドから生じる断片に、酵素的に分解することを意味する。例えば、ラベルされた開裂構造を切断することは、本発明に係るラベルされた開裂構造を、例えば核酸プライマーの第2の部分のようなターゲットに特異的にハイブリダイズする核酸プローブのようなオリゴヌクレオチド由来の断片を含む個々の断片に分解することを意味する。ここで個々の断片の一つは、例えば核酸プライマーの第2の部分のようなターゲットに特異的にハイブリダイズする核酸プローブのようなオリゴヌクレオチド由来のラベルされた核酸断片であり、ラベルされた断片上に存在するラベルされた成分の検出に適している当該技術分野でよく知られた方法で、検出及び／又は測定されることが可能である。開裂反応は、エキソヌクレアーゼ活性又はエンドヌクレアーゼ活性によって実施される。エンドヌクレアーゼ活性を利用する開裂反応は米国特許番号6,548,250、5,210,015及び6,528,254に記載されており、その総てが参考文献として本願に組み込まれる。本願方法で包含される開裂反応アッセイも、米国特許番号5,723,591に記載されたTaqManアッセイのようなエキソヌクレアーゼ活性を利用するアッセイを含み、その総てが参考文献として本願に組み込まれる。これらのアプローチは、蛍光試薬と消光剤の対を含むプローブを採用しており、プローブは増幅の間に切断されて蛍光分子を放出し、その濃度が存在する二本鎖DNAの量に比例する。増幅の間、ポリメラーゼのヌクレアーゼ活性、又はターゲット配列にハイブリダイズしている時は別のヌクレアーゼで、プローブは分解される。切断により蛍光分子は消光剤から分離され、それによりレポーター分子からの蛍光が現れる。
【００３３】
本明細書において、「エンドヌクレアーゼ」は核酸分子内の結合、好ましくはホスホジエステル結合を切断する酵素を意味する。エンドヌクレアーゼは、一本鎖又は二本鎖DNA又はRNAに特異的であることができる。エンドヌクレアーゼ酵素は、例えばDNAポリメラーゼ、具体的にはE. coli由来のDNAポリメラーゼI、並びにThermus aquaticus (Taq)、Thermus thermophilus (Tth)、及びThermus flavus (TfI)由来のDNAポリメラーゼ含む。またエンドヌクレアーゼの語は、FENヌクレアーゼも包含する。
【００３４】
本明細書において、「エキソヌクレアーゼ」は、ポリヌクレオチドの末端から一つずつヌクレオチド間の結合、好ましくはホスホジエステル結合を切断する酵素を意味する。エキソヌクレアーゼはDNA又はRNA分子の5’又は3’末端に特異的であり、ここでは5’エキソヌクレアーゼ又は3’エキソヌクレアーゼと呼ばれる。
【００３５】
本明細書において、「5’から3’エキソヌクレアーゼ活性」又は「5’->3’エキソヌクレアーゼ活性」は、例えばあるDNAポリメラーゼに本来的に相関する5’->3’エキソヌクレアーゼ活性のような、テンプレート特異的核酸ポリメラーゼの活性を意味する。一方、モノヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドは、ポリヌクレオチドの5’末端から連続的に取り去られる（例えば、E.coli DNAポリメラーゼIはこの活性を持つ一方、クレノウ (Klenowら, 1970, Proc. Natl. Acad. Sd., USA, 65:168)断片はそうでない, (Klenowら, 1971, [Epsilon]ur. J. Biochem., 22:371)）。あるいはポリヌクレオチドは、5'から3'エキソヌクレアーゼ活性に本来的に存在しうるエンドヌクレアーゼ活性によって、5’末端から除去される。 
本明細書において、「実質的に5’から3’エキソヌクレアーゼ活性を失う」あるいは「実質的に5’->3’エキソヌクレアーゼ活性を失う」との句は、野生型酵素の活性の10%、5%、1%、0.5%、あるいは0.1%以下の活性を有することを意味する。「5’から3’エキソヌクレアーゼ活性を失う」あるいは「5’→3’エキソヌクレアーゼ活性を失う」との句は、検出不可能な5’から3’エキソヌクレアーゼ活性、又は野生型酵素の活性の1%、0.5%、又は0.1%以下の活性を有することを意味する。5’から3’エキソヌクレアーゼ活性は、エキソヌクレアーゼ・アッセイで計測されうる。そしてそれは、例えば60℃で30分の間、10 mM Tris-HCl (pH 8.0)、10 mM MgCl2、及び50μg/ml ウシ血清アルブミンを含む適切な緩衝液中でニック(nicked)された基質を切断するステップと、 10 mMのEDTAと1mg/mlの bromoplienol blueを含む95%ホルムアミドを加えることにより切断反応を終わらせるステップと、ニック(nicked)された、又はニック(nicked)されていない産物を検出するステップを含む。
【００３６】
本発明の所定の実施の形態で有益な核酸ポリメラーゼは、5’から3’へのエキソヌクレアーゼ活性及び／又は3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠いており、exo- Pfu DNAポリメラーゼ(3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くPfu DNAポリメラーゼの変異体、Clineら, 1996, Nucleic Acids Research, 24: 3546; 米国特許番号5,556,772参照、Stratagene, La Jolla, Calif. カタログ番号600163から市場で入手可能)、exo- Tma DNAポリメラーゼ(3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くTma DNAポリメラーゼの変異体)、exo- TIi DNAポリメラーゼ(3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くTIi DNAポリメラーゼの変異体、New England Biolabs、(カタログ番号257))、exo- E. coli DNAポリメラーゼ(3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くE. coli DNAポリメラーゼの変異体)、E. coli DNAポリメラーゼIのexo- Klenow断片(Stratagene, カタログ番号600069)、exo- T7 DNAポリメラーゼ(3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くT7 DNAポリメラーゼの変異体)、exo- KOD DNAポリメラーゼ(3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くKOD DNAポリメラーゼの変異体)、exo- JDF-3 DNAポリメラーゼ（3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くJDF-3 DNAポリメラーゼの変異体）、exo- PGB-D DNAポリメラーゼ（3’から5’へのエキソヌクレアーゼ活性を実質的に欠くPGB-D DNAポリメラーゼの変異体、New England Biolabs, カタログ番号259）、Tth DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ (例えばカタログ番号600131, 600132, 600139, Stratagene)；UlTma (N-truncated) Thermatoga martima DNAポリメラーゼ；  DNAポリメラーゼIのKlenow断片、9°Nm DNAポリメラーゼ (New England Biolabsの製造中止品, Beverly, MA)、「3'-5' exo reduced」変異体 (Southworthら, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci 93:5281)、及びSequenase (USB, Cleveland, OH)を含むが、これらに限定されない。上記酵素のいずれのポリメラーゼ活性も、当該技術分野でよく知られた手段によって定義されることができる。 本願発明に係るDNAポリメラーゼ活性の1ユニットは、最適化された温度で、30分の間に、10ナノモーラの全dNTPsを重合体に組み込むことを触媒する酵素の量として定義される。
【００３７】
本願発明において、「実質的にエンドヌクレアーゼ活性を欠く」との句は、野生型酵素の10%、5%、1%、0.5%、又は0.1%未満の活性を有することを意味する。エンドヌクレアーゼ活性は、当該技術分野で知られた多様なエンドヌクレアーゼ・アッセイによって測定されうる。それは米国特許番号6,548,250に記載されたものを含み、参考文献として本願に取り込まれる。
【００３８】
（説明）
発明者は、例えばリアルタイムPCR分析におけるターゲット核酸配列の検出に非常に有効な、ラベルされたオリゴヌクレオチド複合体を発見した。ある態様において本発明は、ターゲット核酸配列を検出するためのラベルされたオリゴヌクレオチドの対を提供する。ラベルされたオリゴヌクレオチドの対は、核酸プライマー及び核酸プローブを有する複合体を形成している。核酸プライマーは第1の部分と第2の部分に分割される。第1の部分はターゲット核酸に相補的であり、第2の部分は核酸プローブに相補的である。しかし第2の部分はターゲット核酸に相補的ではない。核酸プローブは、核酸プライマーの第2の部分に相補的である。しかし核酸プローブは核酸プライマーの第1の部分に相補的でない。またオリゴヌクレオチドのプローブの複合体は、相互作用するラベルの対を含む。相互作用するラベルの対の第1の要素は、核酸プライマーに結合しており、第2の要素は核酸プローブに結合している。プローブとプライマーが複合体を形成している時、ラベルは相互作用し、プライマーとプローブが乖離している時、ラベルは相互作用しない。ある実施の形態において、相互作用するラベルの対は、蛍光色素と消光剤である。核酸プローブと核酸プライマーが互いにハイブリダイズされた時、ラベルは充分に近接し、ラベルは相互作用する。好ましくは、ラベルの相互作用対の第1の要素は核酸プローブの3’末端に結合されており、その他の要素は核酸プライマーの5’末端に結合されている。さらに好ましい実施の形態において、ラベルの相互作用対の第1の要素は3’末端ヌクレオチドのヒドロキシル基に結合されている。ある実施の形態において、蛍光色素は核酸プローブの3’末端に結合されており、消光剤は核酸プライマーの5’末端に結合されている。本発明で有効な蛍光色素は、FAM、Rl 10、TAMRA、R6G、CAL Fluor Red 610、CAL Fluor Gold 540、及びCAL Fluor Orange 560、Quasar 670を含む。本発明で有効な消光剤は、DABCYL、BHQ-I、BHQ-2、及びBHQ-3を含む。ある実施の形態において、核酸プローブの切断によって、蛍光シグナルが少なくとも3倍上昇する。他の実施の形態において、核酸プローブの切断によって、蛍光シグナルが少なくとも4倍上昇する。
【００３９】
その他の態様において、本発明はサンプル中のターゲット核酸の配列の検出方法を提供する。本方法は、本発明のラベルされたオリゴヌクレオチドの対をPCR増幅反応混合物に添加することを含む。ターゲット核酸が存在する時に、核酸プローブの切断を可能にするような反応条件が、PCR増幅反応混合物に適用される。増幅産物(amplicon)に組み込まれた核酸プライマーの第2の部分にハイブリダイズしたプローブに切断酵素が接触した時、プローブは切断される。切断により検出可能なシグナルが発生し、それはサンプル中にターゲット核酸が存在することを示す。ある実施の形態において、本方法は核酸ポリメラーゼを提供することも含む。ポリメラーゼは、5’から3’へのエキソヌクレアーゼ及び／またはエンドヌクレアーゼ活性を実質的に欠いている。その他の実施の形態において、本方法はヌクレアーゼを提供することも含む。ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼであり得る。ある実施の形態において、ヌクレアーゼはFENである。好ましい実施の形態において、Pfu DNAポリメラーゼは5’から3’へのヌクレアーゼ活性を実質的に欠いており、FENヌクレアーゼは反応混合物に添加される。
【００４０】
関連する態様において、サンプル中のターゲット核酸の配列を検出する方法は、PCR増幅反応及びヌクレアーゼ切断反応を実施することを要する。PCR増幅反応混合物は、ターゲット核酸、ラベルされたオリゴヌクレオチドの対、及びターゲット核酸に相補的な第2のプライマーを含む。増幅反応の間または後に、相互作用するラベルの対の分離によって発生するシグナルが検出される。シグナルは、サンプル中に存在するターゲット核酸の存在及び／又は量を示す。ある実施の形態において、本方法は核酸ポリメラーゼを提供することをさらに含む。ポリメラーゼは、5’から3’へのエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ活性を実質的に欠いていてもよい。その他の実施の形態において、本方法はヌクレアーゼを提供することをさらに含む。ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼであり得る。ある実施の形態において、ヌクレアーゼはFENである。好ましい実施の形態において、5’から3’へのヌクレアーゼ活性を実質的に欠いているPfu DNAポリメラーゼ及びFENヌクレアーゼが反応混合物に添加される。ある実施の形態において、ヌクレアーゼ切断反応は、エキソヌクレアーゼによって実施される。その他の実施の形態において、ヌクレアーゼ切断反応は、エンドヌクレアーゼによって実施される。さらにその他の実施の形態において、ヌクレアーゼ切断反応は、DNAポリメラーゼによる伸長反応によって、ハイブリダイズしている核酸プローブを取り除くステップと、取り除かれた鎖をエンドヌクレアーゼで切断するステップを含む。さらにその他の実施の形態において、核酸プローブは、エキソヌクレアーゼ活性を有するDNAポリメラーゼによるプライマーの伸長によって切断される。
【００４１】
本発明のさらなる態様において、ラベルされたオリゴヌクレオチドの対は、キットに含まれている。またラベルされたオリゴヌクレオチドの対に加えて、キットは、核酸ポリメラーゼ、エンドヌクレアーゼ、第2のプライマー、及びそれらの包装材をも含みうる。ラベルされたオリゴヌクレオチドの対の核酸プローブと核酸プライマーは、キットで、同じか別個のコンテナに入れられて供給される。また他の実施の形態において、キットは核酸ポリメラーゼをさらに含む。ポリメラーゼは、5’から3’へのエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ活性を実質的に欠いていてもよい。また、その他の実施の形態において、キットはヌクレアーゼを含む。ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼであり得る。さらにまた別の実施の形態において、ヌクレアーゼはFENである。好ましい実施の形態において、5’から3’へのヌクレアーゼ活性を実質的に欠くPfu DNAポリメラーゼとFENヌクレアーゼがキットに含まれている。
【００４２】
本発明の最後の態様において、オリゴヌクレオチド複合体は、サンプル中のターゲット核酸配列の存在を示すシグナルを生成するための反応混合物の一部である。また反応混合物は、核酸ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ、及び第2のプライマーを含んでいてもよい。ある実施の形態において、ポリメラーゼは5’から3’へのエキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼ活性を実質的に欠く。その他の実施の形態において、反応混合物はさらにヌクレアーゼを含む。ヌクレアーゼは、エキソヌクレアーゼ又はエンドヌクレアーゼであり得る。ある実施の形態において、ヌクレアーゼはFENである。さらにまたその他の実施の形態において、DNAポリメラーゼは、5’から3’へのヌクレアーゼ活性を実質的に欠くPfu DNAポリメラーゼであり、ヌクレアーゼはFENヌクレアーゼである。
【００４３】
（プライマーとプローブの準備）
プローブとプライマーは、後述する方法のいずれか、及び当該技術分野で知られたその他の方法によって合成可能である。プローブとプライマーは、典型的には生物学的又は化学的な合成によって準備される。しかしそれらは、例えばエンドヌクレアーゼ消化のような、生物学的精製又は分解によって準備されてもよい。本発明で用いられる核酸プローブやプライマーのような短い配列の場合は、生物学的合成と比べて、化学合成のほうが経済的であることが多い。メッシング（Messing）の論文(1983, Methods Enzymol. 101: 20 - 78)に記載されているように、一本鎖DNAにはM13を用いるように、長い配列の場合には、分子生物学で採用されている一般的な複製方法が採用可能である。ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド合成のための化学的な方法は、ホスホトリエステル及びホスホジエステル法(Narangら, Meth. Enzymol. (1979) 68:90)、及びsynthesis on a support (Beaucageら, Tetrahedron Letters. (1981) 22:1859 - 1862)を含み、ホスホロアミダート(phosphoramidate)技術(Caruthers, M. H.,ら, Methods in Enzymology (1988)154:287 - 314 (1988))、及び「Synthesis and Applications of DNA and RNA」(S. A. Narang, editor, Academic Press, New York, 1987)、及びそれらに含まれた引用文献に記載されているその他の方法を含む。
【００４４】
本発明の核酸プローブとプライマーは、一本鎖から形成されることができる。核酸プローブ及び核酸プライマーの複合体を含むラベルされたオリゴヌクレオチドの対は、例えば核酸プローブ及び核酸プライマーのような二本鎖から形成されることができる。二本鎖は、例えば相補的な塩基のハイブリダイゼーションによって、複合体を形成するよう連係する。図1参照。核酸プローブとプライマーは、増幅反応の前か間に、複合体を形成するように提供されることができる。例えば核酸プローブと核酸プライマーは、増幅の前に、同一の反応チューブ中で結合されることができる。そして核酸プローブとプライマーを変性するために、熱が反応チューブに加えられることができる。そして反応混合物は冷却され、複合体が形成されるように、核酸プローブとプライマーの相補的な部分のアニーリングが進められる。あるいは核酸プローブとプライマーは、温度サイクル反応中に、増幅反応混合物と、それらの中に形成される複合体に加えられることができる。
【００４５】
ラベルは任意の鎖の任意の位置に付加されることができ、核酸プローブが核酸プライマーの第2の部分にハイブリダイズした時に、検出可能なシグナルが消光され、プローブが切断反応で切断された時に、シグナルが生成される。
【００４６】
本発明において、核酸プライマーは、天然又は非天然ヌクレオチド、及び類似体を備えることができる。核酸プライマーは、核酸の類似体、又は2-アミノエチルグリシン(2- aminoethylglycine)のような、核酸と核酸類似体モノマー・ユニットを備えるキメラであってもよい。例えば核酸プライマーの一部又は総てが、PNA又はPNA/DNAキメラであってもよい。マイナーグルーブバインダー(MGBs: minor groove binders)を有するオリゴヌクレオチド、架橋型人工核酸(LNA: locked nucleic acids)、及びその他の修飾されたヌクレオチドが使用可能である。合成ヌクレオチドを用いるこれらのオリゴヌクレオチドは高い融解温度を保ちつつ、長さを短くできるという利点を有することができる。
【００４７】
核酸プライマーは、第1の部分(B)及び第2の部分(A)を含み、第1の部分は第2の部分に対して3’側である。図1参照。第1の部分はターゲット核酸に相補的であり、ハイブリダイズする。第2の部分は核酸プローブ(A’)に相補的であり、ハイブリダイズする。核酸プライマーの伸長により、核酸プライマーは増幅産物(amplicon)に組み込まれる。核酸プライマーの第2の部分は、ターゲット核酸にハイブリダイズしてはならない。総ての核酸プライマーにとって一般的な、例えばGBS核酸配列のようなタグ配列を第2の部分は備えていてもよい。本発明に係る核酸プライマーは、通常約10乃至100ヌクレオチド長であり、好ましくは17乃至50ヌクレオチド長であり、さらに好ましくは17乃至45ヌクレオチド長である。
【００４８】
一つの実施の形態において、核酸プライマーの第1及び第2の部分は隣接している。その他の実施の形態においては、核酸プライマーの第1の部分及び第2の部分の間に、介在核酸配列が存在する。介在配列は、ターゲット核酸に非相補的であり核酸プローブにも非相補的である核酸配列を備えていてもよい。介在配列は、通常、約1乃至20ヌクレオチド長であり、好ましくは2乃至15ヌクレオチド長であり、最も好ましくは3乃至10ヌクレオチド長である。
【００４９】
本発明において核酸プローブは、天然、非天然ヌクレオチド、及び類似体を備えることができる。核酸プローブは、核酸類似体又は2-アミノエチルグリシン(2- aminoethylglycine)のような、核酸及び核酸類似体モノマーユニットを備えるキメラであってもよい。しかし核酸プローブは、PNAでもPNA/DNAでもない。マイナーグルーブバインダー(MGBs: minor groove binders)を有するオリゴヌクレオチド、架橋型人工核酸(LNA: locked nucleic acids)、及びその他の修飾されたヌクレオチドも使用可能である。
【００５０】
核酸プローブは、核酸プライマーの第2の部分にハイブリダイズする。核酸プローブはターゲット核酸にはハイブリダイズしない。しかし少なくとも1回の増幅サイクルの後、核酸プローブは増幅されたターゲット核酸又は増幅産物(amplicon)にハイブリダイズする。核酸プローブは、核酸プライマーの第2の部分に対して普遍的に相補的な配列を含んでいてもよい。これにより複数の異なるターゲット核酸を検出するために、同じプローブを使用することができる。通常、プローブは8乃至100ヌクレオチドを備え、好ましくは15乃至50ヌクレオチドを備え、さらに好ましくは15乃至35ヌクレオチドを備える。
【００５１】
（ラベル）
本願明細書において、「ラベルの相互作用対」との句、「相互作用ラベルの対」との句、及び「第1の要素及び第2の要素」との句は、物理的、光学的、あるいは検出シグナルによってそれらの近接を検出可能にするその他の様式で相互作用する分子対を意味する。「相互作用ラベルの対」の例は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET) (Stryer, L. Ann. Rev. Biochem. 47, 819-846, 1978)、シンチレーション近接アッセイ(SPA: scintillation proximity assays) (Hart及びGreenwald, Molecular Immunology 16:265- 267, 1979; 米国特許番号4,658,649)、発光共鳴エネルギー移動(LRET: luminescence resonance energy transfer) (Mathis, G. Clin. Chem. 41, 1391-1397, 1995)、ダイレクト・クエンチング(direct quenching) (Tyagiら, Nature Biotechnology 16, 49-53, 1998)、化学発光エネルギー移動(CRET: chemiluminescence energy transfer) (Campbell, A. K., 及びPatel, A. Biochem. J. 216, 185-194, 1983)、バイオ発光共鳴エネルギー移動(BRET: bioluminescence resonance energy transfer)( Xu, Y., Piston D. W., Johnson, Proc. Natl. Acad. Sc, 96, 151-156, 1999)、あるいはエキシマ生成(excimer formation) (Lakowicz, J. R. Principles of Fluorescence Spectroscopy, Kluwer Academic/Plenum Press, New York, 1999)等の使用に適したラベルを含むが、これらに限定されない。
【００５２】
ラベルの対は、本発明のオリゴヌクレオチド・プローブに、共有結合又は非共有結合によって結合されることができる。好ましくは、ラベルはプローブの5’及び3’末端、又はそれらの近くに共有結合で結合される。
【００５３】
ある実施の形態において、ラベルの相互作用対の一つの要素は核酸プローブの3’末端に結合され、他の要素は核酸プライマーの5’末端に結合されている。その他の実施の形態において、蛍光色素は核酸プローブの3’末端に結合されており、消光剤は核酸プライマーの5’末端に結合されている。さらにその他の実施の形態では、蛍光色素又は消光剤が、核酸プローブ又はプライマーの内部に結合されている。またさらにその他の実施の形態においては、蛍光色素及び消光剤が両方ともプローブに結合されている。
【００５４】
本願明細書において「蛍光」、「蛍光基」あるいは「蛍光色素」との語は、それぞれ発光及び発光基を含む。
【００５５】
本願明細書において「蛍光の上昇」は、蛍光色素によって放射される検出可能な蛍光の上昇を意味する。例えば消光作用が減少するように、ヌクレアーゼでプローブが切断されることにより、例えば蛍光色素と消光剤の間の距離が増加した時、蛍光の上昇が生じうる。蛍光色素により放射される蛍光が少なくとも2倍、例えば2、2.5、3、4、5、6、7、8、10倍又はそれ以上上昇した時、「蛍光の上昇」があることとする。例えば5 '-flap エンドヌクレアーゼ(FEN)又はその他のヌクレアーゼによる切断が、第1及び第2のラベルを分離させ、ターゲットへの結合により発生するシグナルを強化するために利用されることができる。
【００５６】
（蛍光色素）
本発明で有用な相互作用ラベルの対は、FRET互換染料の対、又は消光剤と染料の対を備えることができる。ある実施の形態において、対は蛍光色素と消光剤の対を備える。
【００５７】
本発明のオリゴヌクレオチドの対の複合体は、蛍光による増幅反応の検出を可能にする。手つかずの複合体の蛍光色素から放射される蛍光は実質的に消光される一方、核酸プローブが切断された複合体における蛍光は消光されないよう、オリゴヌクレオチドの対の複合体は蛍光色素と消光剤でラベルされることができ、プローブの切断により、全体の蛍光の上昇がもたらされる。さらに増幅産物のリアルタイム検出の間の蛍光シグナルの発生は、サンプル中の最初のターゲット配列の数の正確な定量を可能にする。
【００５８】
多用な蛍光色素が使用可能であり、5 - FAM (5 - carboxyfluoresceinとも呼ばれ、Spiro(isobenzofuran - 1(3H), 9' - (9H)xanthene) - 5 - carboxylic acid,3',6' - dihydroxy - 3 - oxo - 6 - carboxyfluoresceinとも呼ばれる)、5 - Hexachloro - Fluorescein ([4,7,2',4',5',V - hexachloro - (3',6' - dipivaloyl - fluoresceinyl) - 6 - carboxylic acid ])、6 - Hexachloro - Fluorescein ([4,7,2',4',5',7' - hexachloro - (3',6' - dipivaloylfluoresceinyl) - 5 - carboxylic acid ])、5 - Tetrachloro - Fluorescein ([457,2',7' - tetra - chloro - (3',6' - dipivaloylfluoresceinyl) - 5 - carboxylic acid])、6 - Tetrachloro - Fluorescein ([4,7,2',7' - tetrachloro - (3',6' - dipivaloylfluoresceinyl) - 6 - carboxylic acid])、5 - TAMRA (5 - carboxytetramethylrhodamine; Xanthylium, 9 - (2,4 - dicarboxyphenyl) - 3,6 - bis(dimethyl - amino)、6 - TAMRA (6 - carboxytetramethylrhodamine; Xanthylium, 9 - (2,5- dicarboxyphenyl) - 3, 6 - bis(dimethylamino)、EDANS (5 - ((2 - aminoethyl) amino)naphthalene - 1 - sulfonic acid)、1,5 - IAEDANS (5 - ((((2 - iodoacetyl)amino)ethyl) amino)naphthalene - 1 - sulfonic acid)、DABCYL (4 - ((4 - (dimethylamino)phenyl) azo)benzoic acid) Cy5 (Indodicarbocyanine - 5) Cy3 (Indo - dicarbocyanine - 3)、及びBODIPY FL (2,6 - dibromo - 4,4 - difluoro - 5,7 - dimethyl - 4 - bora - 3a,4a - diaza - s - indacene - 3 - proprionic acid)、Quasar-670 (Biosearch Technologies)、CalOrange (Biosearch Technologies)、Rox、並びにこれらの適当な誘導体を含むが、これらに限定されない。
【００５９】
（消光剤）
本願明細書において、「消光剤(quencher)」の語は、色素体の分子又は化成物の一部を意味し、供与体に接触又は近接した時に、蛍光供与体からの放射を減少させることができる。消光作用は、蛍光共鳴エネルギー移動、光誘起電子移動、項間交差(intersystem crossing)の常磁性増強(paramagnetic enhancement)、Dexter交換カップリング、及びダーク・コンプレックス(dark complexes)の形成のような励起子カップリング(exciton coupling)を含むいくつかのメカニズムのいずれかによって生じうる。蛍光色素により放射される蛍光が、消光剤がない場合の蛍光と比較して、少なくとも10%、例えば、15%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、99.9%、又はそれ以上減少した時、蛍光は「消光された」という。
【００６０】
消光剤は、アッセイで使用される励起された蛍光色素から放射された少なくとも一つの蛍光を消光可能な任意の物質である。特定のプローブのために、適切なレポーターと消光剤の対を選択するために、文献中に見いだすことができる実用的なガイダンスが多数ある。例えば、以下のような参考文献がある。Clegg (1993, Proc. Natl. Acad. Sci., 90:2994-2998)、Wuら(1994, Anal. Biochem., 218:1-13)、Pesceら, editors, Fluorescence Spectroscopy (1971, Marcel Dekker, New York)、Whiteら, Fluorescence Analysis: A Practical Approach (1970, Marcel Dekker, New York)など。また文献は、蛍光及び発色分子の余すところのないリストと、レポーターと消光剤の対の選択のためのそれらの適切な光学特性を提供する参考文献を含む。例えば、Berlman, Handbook of Fluorescence Spectra of Aromatic Molecules, 2nd Edition (1971, Academic Press, New York)、Griffiths, Colour and Constitution of Organic Molecules (1976, Academic Press, New York)、Bishop, editor, Indicators (1972, Pergamon Press, Oxford)、Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1992 Molecular Probes, Eugene) Pringsheim, Fluorescence and Phosphorescence (1949, Interscience Publishers, New York)があり、これらは参考文献として本願に取り込まれる。さらに、オリゴヌクレオチドに加えられる一般的な反応基を介して共有結合するためのレポーターと消光剤分子の誘導体化のための多数のガイダンスが、以下に例示されるような文献中に見いだすことができる。例えば、前出のHaugland、Ullmanらの米国特許番号No. 3,996,345、Khannaらの米国特許番号4,351,760など。これらは総て、参考文献として本願に取り込まれる。
【００６１】
多数の化学的に利用可能な消光剤が当該技術分野で知られており、DABCYL、BHQ-I、BHQ-2、及びBHQ-3を含むが、これらに限定されない。BHQ（「ブラックホール・クエンチャー(Black Hole Quenchers)」消光剤は、新しい種類のダーク・クエンチャーであり、ハイブリダイゼーションが始まるまで蛍光を阻害する。加えて、これらの新しい消光剤は生来の蛍光を有さず、他の消光剤で見られるバックグランドの問題をほとんど解消する。BHQ消光剤はほとんど総てのレポーター染色体を消光するために使用されることができ、例えばBiosearch Technologies, Inc (Novato, CA)から市場で入手可能である。
【００６２】
（蛍光色素及び消光剤の結合）
本発明のある実施の形態において、蛍光色素又は消光剤は、核酸プローブ又は核酸プライマーの3’ヌクレオチドに結合されている。本発明のその他の実施の形態において、蛍光色素又は消光剤は、5’ヌクレオチドに結合されている。さらにその他の実施の形態において、蛍光色素又は消光剤は、核酸プローブ又はプライマーの内部に結合されている。またさらにその他の実施の形態において、蛍光色素と消光剤の両方が核酸プローブに結合されている。その他の実施の形態において、前記蛍光色素又は消光剤の一つが、核酸プローブ又は核酸プライマーのいずれかの5’ヌクレオチドに結合されており、前記蛍光色素又は消光剤のその他が他方の3’ヌクレオチドに結合されている。好ましい実施の形態において、蛍光色素が核酸プローブの3’ヌクレオチドに結合されており、消光剤が核酸プライマーの5’ヌクレオチドに結合されている。結合は、直接的なカップリングを介するか、あるいは1乃至5原子長のスペーサー分子を用いてなされる。
【００６３】
蛍光色素又は消光剤の内部結合において、結合は当該技術分野で知られた任意の手段を用いてなされる。多くの染色剤をオリゴヌクレオチドに結合するための適切な連結方法が、多くの文献に記載されている。例えばMarshall,  Histochemical J., 7: 299-303 (1975)、Menchenらの米国特許番号5,188,934、Menchenらのヨーロッパ特許出願87310256.0、及びBergotらの国際特許出願PCT/US90/05565など。これら総ては参考文献として本願に取り込まれる。
【００６４】
蛍光色素／消光剤の対の各々の要素は、核酸プローブ又はプライマー内の任意の位置、好ましくは、核酸プローブとプライマーがハイブリダイズしている時に、充分な消光作用が生じるよう、対のその他から離れたところに結合されることができる。
【００６５】
ラベルされたオリゴヌクレオチドの対が複合体を形成する時、蛍光色素／消光剤の分子どうしは近接しており、消光する関係にある。最大限消光するために、理想的には二つの分子は互いに近接している。一つの実施の形態において消光剤及び蛍光色素は、お互いから30又はそれ以下のヌクレオチド長のところに配置されている。
【００６６】
好ましくは、ラベルされたオリゴヌクレオチドの対は、核酸増幅反応中のターゲットDNAの存在をモニター又は検出するために用いられる。本発明に係る方法は、一般的なポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のための典型的な反応条件を用いて実施される。1サイクルあたり、二つの温度に達せられる。まず高温での変性ステップ（通常、90℃から96℃の範囲）であって、通常1乃至30秒間のステップである。そして組み合わされたアニーリング／伸長ステップ（50℃乃至65℃の間の任意、プローブとプライマーのアニーリング温度に依存する）であって、通常10乃至90秒間のステップである。反応混合物は「PCR反応混合物」又は「PCR混合物」ともいうが、核酸、上述したような核酸ポリメラーゼ、本発明に係るラベルされたオリゴヌクレオチドの対、第2のプライマー、適切な緩衝液、及び塩を含んでいてもよい。反応はPCRで一般的に用いられる任意の温度サイクラー中で実施されることができる。しかしTaq Man 7700 AB (Applied Biosystems, Foster City, CA)、Rotorgene 2000 (Corbett Research, Sydney, Australia)、LightCycler (Roche Diagnostics Corp, Indianapolis, IN)、iCycler (Biorad Laboratories, Hercules, CA)、Mx3000PリアルタイムPCRシステム、Mx3005P リアルタイムPCRシステム(Stratagene, La Jolla, CA)、及びMx4000 Multi-Plex 定量PCRシステム(Stratagene, La Jolla, CA)を含むリアルタイム測定能を有する機器を含む、リアルタイム蛍光測定能を有するサイクラーが好ましい。
【００６７】
例えばPCR等によるターゲット・ポリヌクレオチドの増幅と共に、ラベルされたプローブの一般的な使用は、多くの参考文献、例えばInnisら, editors, PCR Protocols (Academic Press, New York, 1989)、Sambrookら, Molecular Cloning, Second Edition (Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1989)に記載されており、これらの総ては参考文献として本願に取り込まれる。
【００６８】
本発明において、核酸プライマーと核酸プローブは、別個に、あるいは複合体としてPCR反応混合物に添加される。複合体として添加された場合、消光剤は蛍光シグナルを阻害する。図2A参照。変性ステップの間、プローブとプライマーは分離する。図2A参照。最初のアニーリングステップで、核酸プライマーは核酸プローブに再アニールするか、プライマーの第1の部分を介してターゲット核酸にアニールする。一方、第2のプライマーはターゲット核酸の相補体にアニールする。伸長ステップの間、核酸プライマーはDNAポリメラーゼによって伸長される。このようにしてターゲット核酸に相補的な増幅産物(amplicon)が合成され、プライマー核酸の第2の部分が組み込まれる。第2のプライマーも伸長される。反応はさらなるサイクルの間繰り返される。
【００６９】
それ以降のサイクルで、オリゴヌクレオチド複合体は再び変性され、再アニールされうる。あるいはプライマー核酸はその第1の部分を介してターゲットにアニールしうる。あるいは核酸プライマーの第1の部分及び第2の部分の両方が、核酸プライマーの第2の部分を組み込んだ増幅産物(amplicon)にアニールされうる。図2B参照。第2のプライマーは、組み込まれた核酸プライマーを有する増幅産物(amplicon)にアニールされうる。一方、核酸プローブは、増幅産物(amplicon)に組み込まれた核酸プライマーの第2の部分にハイブリダイズする。DNAポリメラーゼは、第2のプライマーを、アニール及びラベルされた核酸プローブで占められる領域まで伸長する。図2C参照。そしてプローブはポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって直接切断され、それによって核酸プローブから蛍光ラベルが放出され、蛍光シグナルが生成される。
【００７０】
あるいはヌクレアーゼ活性を欠くDNAポリメラーゼによる第2のプライマーの伸長によっても、蛍光シグナルは発生する。DNAポリメラーゼは、核酸プローブを部分的にずらす。プローブの5’末端の部分的な移動は、例えばFENヌクレアーゼのような5’flapを認識するヌクレアーゼによって切断されることができる開裂構造を作り出す。
【００７１】
好ましくはPfu DNAポリメラーゼ、Taq DNAポリメラーゼ、あるいは等価な熱安定性DNAポリメラーゼなどのDNAポリメラーゼを用いて、PCRは実施される。ただし、どの切断反応が用いられるかに応じて、どのポリメラーゼが最も適切かが決定される。PCRのアニーリング温度は、ラベルされたオリゴヌクレオチドの対の融解温度よりも約5℃乃至10℃低い。
【００７２】
核酸プライマーの第1の部分の配列（ターゲット結合配列）は、ターゲットDNAへのハイブリダイゼーションがPCR反応のアニーリング／伸長温度で生じるよう、設計されている。それ故、プローブの第1の部分の配列は、ターゲットDNAに相同性をもつ。一方、核酸プローブの第2の領域は、ターゲット配列に相同性を持たない。核酸プライマーの第2の部分の配列（核酸プローブ結合配列）は、核酸プローブへのハイブリダイゼーションが、PCR反応のアニーリング／伸長温度で生じるよう、設計されている。
【００７３】
ラベルされたオリゴヌクレオチドの対は、高温、低イオン濃度、及び／又はホルムアミド又はDMSOのような過激な化学薬品の存在を含む適切な条件下で変性される。本発明に係る核酸プローブとプライマーは、好適には、アニーリング／伸長温度で複合体を形成し、それは通常55乃至65℃である。そのためTmがアニーリング／伸長温度より高いラベルされたオリゴヌクレオチドの対が好ましく、Tm ≧ 55℃を有することができ、通常Tm ≧ 60℃、 Tm ≧ 62℃、あるいはTm ≧ 65℃のものが使用可能である。しかし通常、Tmはアニーリング／伸長温度より約15℃以上高くあるべきでない。最も好ましいのは、ラベルされたオリゴヌクレオチドの対が、おおよそアニーリング／伸長温度からアニーリング／伸長温度より約10乃至15℃高い範囲内のTmを有することである。
【００７４】
（キット）
本発明はこれまで述べたように、PCRのための新しい試薬と方法を提供することを意図する。またここで本発明は、主題に係る少なくとも一つの試薬のコンテナを有し、ある実施の形態においてPCRにおける合成を含むポリヌクレオチド合成に用いられる多用な試薬のコンテナを含む包装ユニットを備えたキット形式をも意図している。またキットは、以下の重合酵素（例えばDNAポリメラーゼ、特に熱安定性DNAポリメラーゼ等の少なくとも一つの核酸ポリメラーゼ）、ポリヌクレオチド、前駆体（例えばヌクレオチド三リン酸塩）、プライマー、緩衝液、指示書、及びコントロールの少なくとも一つを備えていてもよい。キットは、本発明に係る方法を実施するために適切な比率で混合された試薬のコンテナを含んでいてもよい。好ましくは試薬コンテナは、主題に係る方法を実施する時に、測定ステップを不要にする単位質量で試薬を含む。また本発明に係るあるキットは、染色ゲルから生じるPCR産物の定量のための基準をもたらすDNAを含んでいる。
【００７５】
（実施例）
以下に述べる実施例は限定的なものではなく、本発明の多様な態様及び特徴の単なる例示に過ぎない。
【００７６】
（第1の実施例）  
（CFTRターゲットDNAを定量するためのラベルされたオリゴヌクレオチドの対の使用）
CFTR PCR産物の100fGが、総ての試験のテンプレートとして使用された。5'-BHQ-2で消光された100nM又は200nMの核酸プライマーが、400nMのCFTRフォワードプライマーと、200nMの3’-FAMでラベルされた核酸プローブを含むFull Velocity（登録商標）PCR反応物に加えられた。Full Velocity（登録商標）QPCRマスター・ミックスはStratageneのカタログ番号600561であり、米国特許番号6,528,254 及び6,548,250に記載されている（それぞれの総ては本願に参考文献として取り込まれる。）。
【００７７】
ラベルされたオリゴヌクレオチドの複合体は、図1に示される。核酸プライマーの核酸配列は以下のとおりであり、下線部で示されたタグ特異的配列（第2の部分）を有していた。
【００７８】
5'-AGGGTTGCGATGGTTCTGTTGTAGGTAGGTTTGGTTGACTTGGTAGG-3' 
(配列番号1)
核酸プライマーのタグ（第2の部分）にホモジニアスな核酸プローブの核酸配列は、以下のとおりであった。
【００７９】
5'-TACCTACAACAGAACCATCGCAACCCT-3'
(配列番号2)
フォワードプライマーの核酸配列は、以下のとおりであった。
【００８０】
5'-GCAGTGGGCTGTAAACTCC-3' 
(配列番号3)
実験は、以下のサイクリング・パラメータを用いて、Mx3000pリアルタイムPCR装置(Stratagene)上で制御された。95℃で2分。引き続き95℃で30秒と、60℃で30秒を50サイクル。データを図3に示す。データはサイクル数に対するdRn（FAM蛍光の変化、参照染料で規格化されている。）として表されている。結果は100nM及び200nMの核酸プライマーの両方で強い蛍光シグナルを示した。しかし最終的な蛍光シグナルは、核酸プライマーの濃度が200nMのほうが高かった。両方の反応とも同じCt値を有する。
【００８１】
本願明細書で引用された総ての特許、特許出願、及び刊行物の総てが、参考文献としてここに取り込まれる。この発明は、その好ましい実施の形態を参照して詳細に示され、説明されてきたが、当該分野の技術を有する者は、様式や細部の様々な変更が、添付された請求項によって包含される本発明の範囲から逸脱することなく、なされることを理解されるであろう。
【００８２】
（関連出願）
本願は、2005年5月2日に出願された米国特許出願番号60/676,766の継続出願である。上記出願の総ての教示が、参考文献として本願に取り込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図1は、本発明の二重プライマー／プローブ構造を示す。
【図２Ａ】図2Aは、二重プライマー／プローブを用いるターゲットの検出方法を示す。
【図２Ｂ】図2Bは、二重プライマー／プローブを用いるターゲットの検出方法を示す。
【図２Ｃ】図2Cは、二重プライマー／プローブを用いるターゲットの検出方法を示す。
【図３】図3は、100nM又は200nMの核酸プライマーと200nMの核酸プローブを用いた検出アッセイのQ-PCR増幅プロットを示す。
【符号の説明】
【００８４】
A…第2の部分
B…第1の部分
【図１】
2008539730.tif 000003
【図２Ａ】
2008539730.tif 000004
【図２Ｂ】
2008539730.tif 000005
【図２Ｃ】
2008539730.tif 000006
【図３】
2008539730.tif 000007
【配列表】
2008539730000001.xml
【国際調査報告】
2008539730.tif 000009