(57)【要約】  本発明は、動物細胞に対する増殖阻害活性または細胞死誘導活性を有するポリペプチドの使用に関する。本発明はさらに、前記ポリペプチドを使用する手段および方法、並びに前記ポリペプチドのコード領域を含有する対応する核酸配列を提供する。本発明はさらに、前記ポリペプチドを発現するベクター、癌のような増殖性障害または疾患を治療するための医薬組成物および治療法に関する。最後に重要な点として、本発明は、動物細胞における増殖阻害活性または細胞死誘導活性を有する前記ポリペプチドを使用する遺伝子治療法の方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
増殖性疾患または障害の治療のための薬剤としての単離されたバクテリオファージ由来タンパク質の使用であって、前記バクテリオファージ由来タンパク質が真核細胞において細胞増殖阻害活性または細胞殺傷効果を誘導する使用。
【請求項２】
前記バクテリオファージ由来タンパク質が、αへリックス型チャネル形成タンパク質または少なくともその機能的部分または類似体である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記バクテリオファージ由来タンパク質がホリンである、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記バクテリオファージ由来タンパク質が、ラムダＳ１０５およびラムダＳ１０７タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０３７０５）、Ｐｈｉ２９ＧＰ１４タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ１１１８８）、ファージＴ４免疫タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０８９８６）、ファージＰ２２タンパク質１３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０９９６２）、ファージＰ２ＴＭタンパク質Ｙ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ５１７７３）、ファージＰＲＤ１のＭタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２７３８９）、ファージＡ１１８のホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ３７９７５）、ファージＡ５００ホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ３７９７７）、ファージＤｐ−１のＤＰＨホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｏ０３９７８）、ファージＨＰ１のホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ５１７２７）、ファージｒｌｔのホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ３８１３４）、ファージＴ７（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０３８０２）およびＴ３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ１０３０７）の溶解タンパク質１７．５、ファージＰ２ＯｇｒのＮｕｃＥホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ５４４１８）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）から単離されたホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ４８２８１）、ファージＰｈｉ−６のＰ１０タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ１１１２７）、ファージＴ４のタンパク質ｒＶ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０６８０８）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＰｈｉ−１１ホリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ３８０２０）、およびラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＴｕｃ２００９ホリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ３８６１３）からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
前記真核細胞が哺乳類および／またはヒト細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項６】
前記バクテリオファージ由来タンパク質が真核発現ベクターによって真核細胞へ形質導入される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項７】
前記真核発現ベクターがウイルスベクター、詳しくはレトロウイルスベクター、より詳しくは複製可能なレトロウイルスベクター、ＰｒｏＣｏｎまたはＲｅＣｏｎベクターである、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
作動可能に連結された調節エレメントから、真核細胞における細胞増殖阻害活性または細胞殺傷効果を誘導するバクテリオファージ由来タンパク質をコードする核酸配列を含み、かつこれを発現する請求項６または７に記載の有用な真核発現ベクター。
【請求項９】
作動可能に連結された調節エレメントから、真核細胞における細胞増殖阻害活性または細胞殺傷効果を誘導するバクテリオファージ由来タンパク質との融合タンパク質を含み、かつこれを発現する真核発現ベクター。
【請求項１０】
前記ベクターがウイルスベクター、詳しくはレトロウイルスベクター、より詳しくは複製可能なレトロウイルスベクター、ＰｒｏＣｏｎまたはＲｅＣｏｎベクターである、請求項８または９に記載の真核発現ベクター。
【請求項１１】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の真核発現ベクターをコードする配列を含む核酸配列。
【請求項１２】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の真核発現ベクターを含有するウイルス粒子。 
【請求項１３】
請求項１１に記載の核酸配列を含む真核細胞。 
【請求項１４】
請求項１２に記載のウイルス粒子を産生する能力を有する請求項１３に記載の真核細胞。
【請求項１５】
請求項１１に記載の核酸配列を真核細胞へ導入するための方法であって、前記方法が、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の発現ベクターを真核細胞に形質導入する工程、または請求項１２に記載のウイルス粒子を真核細胞に感染させる工程、を含む方法。
【請求項１６】
治療有効量の、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の発現ベクター、請求項１１に記載の核酸配列、請求項１２に記載のウイルス粒子、請求項１４に記載の真核細胞、細胞阻害活性または細胞殺傷効果を誘導する単離されたバクテリオファージ由来タンパク質、および／またはバクテリオファージ由来タンパク質との融合タンパク質、並びに薬剤として許容可能な担体、を含む組成物。
【請求項１７】
多孔質膜にカプセル化された、請求項８〜１０のいずれか一項に記載の発現ベクター、請求項１１に記載の核酸配列、請求項１２に記載のウイルス粒子、請求項１４に記載の真核細胞、単離されたバクテリオファージ由来タンパク質および／またはバクテリオファージ由来タンパク質との融合タンパク質、を含み、
患者への投与後に、治療有効量の、前記発現ベクター、前記核酸配列、前記ウイルス粒子、前記真核細胞、前記バクテリオファージ由来タンパク質および／またはバクテリオファージ由来タンパク質との前記融合タンパク質を、前記カプセルおよび薬理学的に許容可能な担体から遊離可能にする組成物。
【請求項１８】
請求項８〜１０のいずれか一項に記載の発現ベクター、請求項１１に記載の核酸配列、請求項１２に記載のウイルス粒子、請求項１４に記載の真核細胞、単離されたバクテリオファージ由来タンパク質、細胞増殖阻害活性または細胞殺傷効果を誘導するバクテリオファージ由来タンパク質との融合タンパク質、および／または請求項１６または１７に記載の組成物の、癌疾患の治療用の薬剤としての、または癌疾患の治療用の薬剤の製造のための使用。
【請求項１９】
治療有効量の請求項１６または１７に記載の組成物を対象に投与する工程を含む癌を治療するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、動物細胞において増殖阻害活性または細胞死誘導活性を有するポリペプチドの使用に関する。本発明はさらに、前記ポリペプチドを使用する手段および方法、並びに前記ポリペプチドのコード領域を含有する対応する核酸配列に関する。本発明はさらに、前記ポリペプチドを発現するベクター、癌のような増殖性障害または疾患を治療するための医薬組成物および治療方法に関する。最後に、特に本発明は、動物細胞において増殖阻害活性または細胞死誘導活性を有する前記ポリペプチドを使用する遺伝子治療法の方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
死亡原因としての癌の発達は、良質なヘルスケアおよび高い割合の高齢者を有する集団においてますます大きな問題となっている。今までのところ、手術または化学および放射線療法のような限定された選択肢のみが癌を治療し、または患者を癒すために存在している。これは遺伝子治療法が主に癌の治療に集中して発展した１つの理由である。
【０００３】
遺伝子治療法の一つではいわゆる自殺遺伝子が使用される。自殺遺伝子とはその細胞における発現がその細胞にとって致死的である遺伝子である。
【０００４】
大部分の自殺遺伝子は、低い固有毒性を有する化学物質を細胞毒性化合物へ変換するウイルス、細菌、真菌、植物、またはヒト酵素をコードすることによって細胞殺傷効果を仲介する［１］。この方法は、遺伝子指向性酵素プロドラッグ療法（ＧＤＥＰＴ）、または遺伝子を送達するためにウイルスベクターが使用される場合は、ウイルス指向性酵素プロドラッグ療法（ＶＤＥＰＴ）とも呼ばれる。
【０００５】
このようにプロドラッグを変換する、または所定の条件下で毒性を有する自殺遺伝子によってコードされる大部分の酵素は、ＤＮＡ複製の破壊により毒性を仲介するが、一方で、自殺遺伝子の発現産物はプロドラッグをその毒性代謝産物に変換し、これは次いで複製ＤＮＡに作用する［１、６］。もっとも良く研究された酵素の一部は、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）−１チミジンキナーゼ［２］、細菌または酵母からのシトシンデアミナーゼ［３］、細菌のニトロ還元酵素［５６］、および哺乳類の肝酵素シトクロムＰ４５０［４、５］である。これらの酵素が標的細胞において発現されると、それぞれのプロドラッグ（それぞれ、ガンシクロビル、フルオロシトシン、ＣＢ１９５４、およびシクロホスファミド、またはイソファミド）を全身に投与することができ、それぞれの自殺遺伝子を有しかつ発現する細胞においてのみ活性化される。
【０００６】
別の方法において、植物遺伝子リナマラーゼ（ｌｉｓ）は青酸グリコシド基質、リナマリン（ｌｉｎ）をグルコースおよび細胞毒性シアン化物へ加水分解する［５７］。
【０００７】
これらの方法の欠点は、高用量に関係するプロドラッグの全身送達であり、これは特に、肝臓の細胞において主に生理的に発現されるシトクロムＰ４５０の場合に副作用を誘発しうる。
【０００８】
別の欠点は、プロドラッグまたは細胞殺傷のいずれかに対する癌細胞耐性の発達において確認されるが、かかる細胞殺傷は、この種の療法においては通常、アポトーシス［７、８］によるものであり、したがってそれぞれの自殺遺伝子を有する細胞の除去に対する耐性である。
【０００９】
別の方法では、水泡性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）糖タンパク質またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）エンベロープタンパク質のような融合膜タンパク質など細胞に対する直接致死効果を有する細胞毒性タンパク質をコードする遺伝子が使用される［９−１１］。融合膜タンパク質は、標的細胞において発現されると、隣接細胞の膜融合を引き起こし、大きな多核合胞体の形成をもたらすが、これは最終的にアポトーシスまたは壊死のいずれかによって死ぬ［１２−１４］。直接細胞殺傷に使用されている他の毒素は、例えば、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ）毒素Ａ［１５−１８］、コレラ（Ｃｈｏｌｅｒａ）毒素Ｂ［１９、２０］、炭疽（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）毒素［２１−２４］、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）毒素［５８］、またはリシン（Ｒｉｃｉｎｕｓ  ｃｏｍｍｕｎｉｓ）［５８］である。
【００１０】
さらに別の方法では、アポトーシス経路を活性化し、細胞死を誘導するアポトーシス誘導因子が使用される。これらの研究で使用される遺伝子は、例えば、カスパーゼ−１／インターロイキン−１［β］−変換酵素（ＩＣＥ）［５９］、カスパーゼ−３／ＣＰＰ３２β［６０］、カスパーゼ−６［６１］、カスパーゼ−８［６２］、デスドメインとのＦａｓ関連タンパク質（ＦＡＤＤ）［６３］、およびＢａｘ［６４］である。
【００１１】
自殺遺伝子は、可能な限り多くの標的細胞によるその取込みおよび発現を確実にすると同時に、非標的細胞によるその発現を制限するやり方で細胞へ導入されなければならない。癌の自殺遺伝子療法は理想的には標的細胞と非標的細胞を区別する能力を有するベクターを必要とする。
【００１２】
ウイルスベクター（検討には［２５］を参照）を考慮すると、毒性遺伝子がコードされ、それぞれのパッケージング細胞［２６］を早期殺傷から保護する場合には厳重に抑制された生産システムが必要である。
【００１３】
一部の細胞毒性自殺遺伝子はすでに周知であるが、有利な特徴を有する、特に標的細胞、特に患者における癌細胞を殺傷し、または根絶する能力を有する追加のかつ別の自殺遺伝子が依然として必要である。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
したがって、本発明の目的は、ヒト細胞を含む真核細胞、特に動物または哺乳類細胞における活性を誘導する細胞増殖阻害および／または細胞死を有する、新しい一連の細胞毒性自殺遺伝子およびその対応する細胞毒性タンパク質またはポリペプチドを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の詳細な説明
ここで発明者らは、バクテリオファージおよびプロファージ由来αへリックス型チャネル形成タンパク質、具体的には、細胞膜における孔形成による原核細胞の溶解を自然に引き起こすホリンタンパク質が、真核細胞、特に動物またはヒト細胞において導入および／または発現されると、重大な細胞増殖阻害活性さらには細胞死誘導活性も引き起こすことを示す。
【００１６】
本発明との関連で「動物」または「動物細胞」という語は、動物界、植物界、原生生物界、菌類界、およびモネラ界（原核バクテリアおよびシアノバクテリアを含む）を含む現在の分類の５界（マルグリス（Ｍａｒｇｕｌｉｓ）とシュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）、１９９８年、Ｆｉｖｅ  Ｋｉｎｇｄｏｍ．Ａｎ  Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｐｈｙｌａ  ｏｆ  Ｌｉｆｅ  ｏｎ  Ｅａｒｔｈ．、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｆｒｅｅｍａｎ）、ニューヨーク）による動物界に属する生物または生物の細胞に使用される。したがって、「動物細胞」という語は「ヒト」細胞をも含む。しかし、本願では一部の場合において、強調するためにヒト細胞が追加的に言及される。本発明との関連で「動物またはヒトの細胞」は組織内もしくは動物またはヒト体内（「ｉｎ  ｖｉｖｏ」）に位置してもよく、またはその自然環境、例えば、細胞系、一次細胞（「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」）から単離されてもよい。
【００１７】
細胞の異常な増殖によって特徴づけられる「増殖性疾患」または「増殖性障害」という語は、本明細書では、細胞周期の制御を必要とする、例えば、癌および白血病だけではなく再狭窄や心筋症などの心血管障害、糸球体腎炎や関節リウマチなどの自己免疫疾患、乾癬などの皮膚科疾患、マラリア、気腫、脱毛症などの抗炎症、抗真菌、抗寄生虫障害を含む広義で使用される。これらの障害において、バクテリオファージ由来タンパク質、好ましくは、本発明のホリンは細胞死を誘導し、標的細胞集団内の均衡状態を維持するために使用されうる。
【００１８】
バクテリオファージ由来「ホリン」は、共通の構造的および機能的特徴を示す少なくとも１６の異なるタンパク質ファミリーで構成される機能的スーパーファミリーに属する。より具体的には、バクテリオファージにコードされるホリンはα−へリックス型のチャネル形成タンパク質のメンバーであり、感染細菌細胞の溶解、かつ結果として、バクテリオファージ粒子の放出に必要である。しかし、そのファミリーのメンバーは統計的に有意な配列類似性または相同性を示すことはない。
【００１９】
本発明との関連で、「バクテリオファージ」という語は、バクテリオファージそれ自体、および休止状態におけるバクテリオファージであり、または不完全でもあるプロファージを含む。そのゲノムは、宿主細菌のゲノムへ組込まれ、または自己複製される。
【００２０】
ホリンは、グラム陽性およびグラム陰性細菌のプロファージおよびこれらの生物と関連したバクテリオファージの遺伝子によってコードされる［２８］。ホリンの主な機能は、細胞膜を通過して細胞壁へムレイン加水分解酵素を輸送することであると思われるが、ここで当該酵素は細胞溶解への準備としてペプチドグリカン細胞壁における結合を加水分解する。したがって、染色体にコードされている場合は、これらの酵素は自己溶菌酵素である。ホリンは、細胞質からの電解質および栄養素の漏出をも促進し、それによって細胞死を推進しうる。ムレイン加水分解酵素はＮ末端シグナル配列を欠き、したがって一般の分泌経路によって輸送されるとは考えられない。ホリンは明らかに、細胞膜における孔を生成するオリゴマー錯体を形成する。これらの孔はその基質タンパク質の受動輸送経路を提供すると考えられている。
【００２１】
発明者にとって、このようなホリンが、ヒトまたは動物細胞において発現された場合に、細胞殺傷を誘導し、またはこれらの細胞における細胞増殖を阻害することを見出したのはきわめて驚くべきことであった。特に、真核細胞代謝は細菌系の代謝と完全に異なるため、これらの結果は驚くべきことであった。さらに、真核細胞の構造および機構も基本的に細菌細胞と異なる上に、真核細胞はバクテリオファージの宿主ではない。したがって、ホリンが動物細胞またはヒト細胞において発現されるのか、どんな経路が使用されるのか、したがって、細胞内コンパートメントのどこにかかるタンパク質が位置するのか、それらの機能性が保存または修飾されるのか、細胞代謝が影響され、または活性化されるのか、そして最後に特に重要なことであるが、真核細胞においてかかるホリンの導入および発現がどんな効果を有するのかは、予測不可能であった。
【００２２】
これらのこと、およびさらに基礎研究的な疑問に答えると同時に、発明者は、増殖性疾患および癌を治療するためにバクテリオファージ由来ホリンを使用するアプローチおよび方法を提供することができた。具体的には、発明者は、癌を治療するための遺伝子治療法のアプローチおよび方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
本発明の好ましい実施形態において、バクテリオファージ由来タンパク質はαへリックス型チャネル形成タンパク質である。これらのタンパク質は、二本鎖ＤＮＡバクテリオファージ、一本鎖ＤＮＡバクテリオファージ、または一本鎖ＲＮＡバクテリオファージに限定されずに選択され、より好ましくは、それらはラムダＳ１０５およびラムダＳ１０７タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０３７０５）、Ｐｈｉ２９ＧＰ１４タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ１１１８８）、ファージＴ４免疫タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０８９８６）、ファージＰ２２タンパク質１３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０９９６２）、ファージＰ２ＴＭタンパク質Ｙ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ５１７７３）、ファージＰＲＤ１のＭタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ２７３８９）、ファージＡ１１８のホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ３７９７５）、ファージＡ５００ホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ３７９７７）、ファージＤｐ−１のＤＰＨホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｏ０３９７８）、ファージＨＰ１のホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ５１７２７）、ファージｒｌｔのホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ３８１３４）、ファージＴ７（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０３８０２）およびＴ３（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ１０３０７）の溶解タンパク質１７．５、ファージＰ２ＯｇｒのＮｕｃＥホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ５４４１８）、ヘモフィルス・ソムナス（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｓｏｍｎｕｓ）から単離されたホリンタンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ４８２８１）、ファージＰｈｉ−６のＰ１０タンパク質（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ１１１２７）、ファージＴ４のタンパク質ｒＶ（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｐ０６８０８）、スタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＰｈｉ−１１ホリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ３８０２０）、およびラクトコッカス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ）ファージＴｕｃ２００９ホリン（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ登録番号Ｑ３８６１３）からなる群から選択される。
【００２４】
最も好ましくは、それらは配列番号７、配列番号８、および配列番号９を有する群から選択される。
【００２５】
ホリンタンパク質の「類似体」も含まれる。実質的にホリンに対応する類似体は、保存的な変化を有するか、または、ホリンのアミノ酸配列の１つもしくはそれ以上のアミノ酸が別のアミノ酸で置換、削除、および／または挿入されているポリペプチドであるが、結果として生じるタンパク質が、対応するホリンと実質的に同等またはさらに高い生物活性を示すことを条件とする。
【００２６】
「保存的」変化とは、タンパク質の活性、電荷、または構成を変えると予想されず、したがってその生物特性を変えると考えられない変化である。保存性置換には、ポリペプチドにおける少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるアミノ酸によって保存的に置換されている「類似体」が含まれる。適切な置換は、合成化ポリペプチドの修飾された構造的および機能的特性を提供すると同時に、ホリンタンパク質の生物活性を維持するルーチンの実験によって決定されうる。１つもしくはそれ以上の置換は、好ましくは、以下のリストに従って生じうる：
Ａｌａ（ＧＩｙ、Ｓｅｒ）、Ａｒｇ（Ｌｙｓ）、Ａｓｎ（ＧＩｎ、Ｈｉｓ）、Ａｓｐ（ＧＩｕ）、Ｃｙｓ（Ｓｅｒ）、ＧＩｎ（Ａｓｎ）、ＧＩｕ（Ａｓｐ）、ＧＩｙ（Ａｌａ、Ｐｒｏ）、Ｈｉｓ（Ａｓｎ、ＧＩｎ）、Ｎｅ（Ｌｅｕ、ＶａＩ）、Ｌｅｕ（ｌｉｅ、ＶａＩ）、Ｌｙｓ（Ａｒｇ、ＧＩｎ、ＧＩｕ）、Ｍｅｔ（Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、ｌｉｅ）、Ｐｈｅ（Ｍｅｔ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ）、Ｓｅｒ（Ｔｈｒ）、Ｔｈｒ（Ｓｅｒ）、Ｔｒｐ（Ｔｈｒ）、Ｔｙｒ（Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）、およびＶａＩ（ｌｉｅ、Ｌｅｕ）。
【００２７】
遺伝子レベルでは、これら類似体は一般に、例えば、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ＣＳＨラボラトリー（Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）、１９８９年に記載されているように、ホリンタンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異によって調製される。
【００２８】
ファージラムダなどの二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）バクテリオファージでは、（ｉ）ペプチドグリカンのグリコシド、アミド、またはペプチド結合に対する酵素活性を有する壁分解酵素またはエンドライシン（ｅｎｄｏｌｙｓｉｎ）および（ｉｉ）分泌シグナル配列を欠き、細胞質に蓄積するエンドライシンが、時宜を得てペプチドグリカンに接近し、最終的に細胞の死をもたらすことを可能にする孔形成ホリンからなる宿主細胞溶解の二重系が使用される［２８、２９］。ホリン機能は、異なるバクテリオファージに由来するホリンおよびエンドライシンからなる人工溶解系が溶解可能であることが証明されているため、エンドライシンに対して非特異的である［２９］。これにより相異なるアミノ酸配列を有し、したがってＤＮＡまたはアミノ酸レベルで相同を示さない異なるホリンタンパク質の機能的相同も明らかにされる。ｄｓＤＮＡバクテリオファージによってコードされるホリンは相違しているが、それらは一般に共通の特徴を示す。すなわち、（ｉ）小さいサイズ（６０−１４５個のアミノ酸）、（ｉｉ）２、３、もしくは４個の膜貫通ドメイン、（ｉｉｉ）親水性Ｎ末端、および（ｉｖ）高極性、電荷豊富なＣ末端ドメイン。ＮおよびＣ末端親水性ドメインは、ホリン介在チャネル形成のタイミングにおいて機能することが知られている［３０、３１］。これら共通の特徴にもかかわらず、ｄｓＤＮＡバクテリオファージのホリンは一般的クラスへグループ化されうる。クラスＩホリンは、そのうちバクテリオファージλ（ラムダ）のＳ（Ｓλ）が原型であり、一般にサイズが９５個もしくはそれ以上のアミノ酸残基であり、３つの潜在的な膜貫通ドメインを有する。ファージ２１のＳ２１などのクラスＩＩホリンは通常、より小さく、サイズが６５〜９５個のアミノ酸残基であり、膜貫通ドメインを２つのみ含有する。
【００２９】
ｄｓＤＮＡバクテリオファージのホリンはオリゴマー錯体を形成する［３２、３３］。ほんのわずかなホリン分子のみが細菌細胞を溶解する必要がある。Ｓλについては、ホリンが細胞当り１−３×１０３分子の濃度で大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対して致死的であることが証明されている［３４］。通常、溶原性細菌培養は溶解の開始後数分以内に溶解を受ける。この正確な時間の制御は、シアン化物またはジニトロフェノールなどのエネルギー毒を感染周期の十分に後期に添加することにより、バクテリオファージλまたは他のバクテリオファージ感染細胞の早期溶解を即座に誘導するため、膜のエネルギー状態に関連すると思われる［２９］。バクテリオファージλについては、宿主細胞溶解の正確なタイミングは、実際のホリンとホリン阻害剤とのモル比（通常、約２：１）によって制御される［３５］。両方のタンパク質は、同じオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）によってコードされる。実際のホリン（Ｓ１０５）はコドン番号３での翻訳開始に由来する。ホリン阻害剤（Ｓ１０７）はアミノ酸残基２個分のみ長く、コドン番号１での翻訳開始の産物である。この二重開始モチーフ（すなわち、その少なくとも１つがプラス帯電している１つもしくは２つのコドンによって分離される２つのフレーム内ＡＴＧ開始コドン）［３５］は、ＳλＯＲＦだけではなく、多くの他のホリン遺伝子においても見られる。ホリン／ホリン阻害剤のペアの存在は、Ｓλだけではなく他のファージコード溶解系についても実験的に明らかにされており［３０、３６、３７］、これらは参照により本明細書で援用される。
【００３０】
細菌細胞溶解に関して、最も魅力的なモデルにおいて［３８］、ホリンは細胞膜の２つのコンフォメーション状態に存在する。すなわち、ホリンが膜に蓄積する「プレ・ホール」状態、および実際の穴が形成される「ホール」状態である。膜におけるホリンタンパク質の数が増加するにつれて、より高位のオリゴマーの構築材料となるホリン二量体が蓄積し、最終的に融合して小さなホリン・アイランドとなる。これらホリンのアレイは膜における不安定領域を表し、ある時点で、熱変動がホリンアレイ内に穴を開け、膜の局所脱分極をもたらすと考えられている。次いで、この局所脱分極は、プレ・ホール状態からホール状態への周囲のホリンタンパク質のコンフォメーション変化を誘導し、結果として大きな穴および膜電位の完全な崩壊をもたらす。連鎖反応において、膜電位の機能停止は、ますますホリンタンパク質の活性コンフォメーションへのコンフォメーション変化を誘導し、最終的に細胞膜における大きな穴の生成をもたらす。穴自体は不規則なサイズであることが証明されているが、少なくともエンドライシンが通過できるために十分に大きい必要がある。ワング（Ｗａｎｇ）らは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細胞膜におけるＳλ穴が、４８０ｋＤａのエンドライシン／ＬａｃＺ融合タンパク質の放出を可能にするのにさらに大きいことを証明した［３９］。
【００３１】
ｄｓＤＮＡバクテリオファージとは対照的に、ｓｓＤＮＡバクテリオファージ（φＸ１７４、α３、Ｇ４、Ｓ１３によって表される）およびｓｓＲＮＡバクテリオファージ（ＭＳ２、ＧＡ、Ｑβ、ＳＰによって表される）などの単純溶解バクテリオファージは、小さな内在性膜タンパク質をコードする唯一の溶解遺伝子を有する。これらのバクテリオファージの溶解物は、壁分解酵素活性を有しないことが証明されており、これらのバクテリオファージからの既知のホリンのアミノ酸配列は、かかる機能のいずれも示すことがない。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドコードφＸ１７４溶解遺伝子の発現だけで有効な細胞溶解に十分である［４０−４２］。しかし、この場合、細胞溶解は活発に成長する細胞に依存する［４３、４４］。さらに、ペプジル−プロリルｃｉｓ−ｔｒａｎｓイソメラーゼ（ＰＰｌａｓｅ）をコードする細菌宿主遺伝子ｓｌｙＤは、野生型タンパク質Ｅによる細胞溶解に完全に必要とされることが証明されている［４５］。ＳｌｙＤはおそらくタンパク質の正確な折りたたみおよび安定化、またはその細胞膜への送達におそらく関与している［４６］。
【００３２】
本発明には、例示的に、動物細胞、具体的にはヒト細胞、例えば、ヒト頸癌細胞系（ＨｅＬａ）、乳腺腺癌細胞系（ＭＣＦ７）、ヒト胚腎細胞系（ＨＥＫ２９３）、およびマウス乳腺腺癌細胞（ＴＳ／Ａ）において発現される場合、ファージλコードＳ１０５タンパク質を使用して、バクテリオファージホリンタンパク質の毒性効果が記載されている［７２］。したがって、本発明は、Ｓ１０５発現の誘導後の細胞の形態変化を記載することによってＳ１０５の細胞毒性効果、膜完全性に対する細胞毒性効果（すなわち、トリパンブルー染色、アネキシンＶ−ＰＥ／７ＡＡＤ染色によって）、および細胞代謝に対する細胞毒性効果（すなわち、デヒドロゲナーゼまたはミトコンドリアの膜電位によって生成されるＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨレベルを測定）を示す。特異的細胞分画法、蛍光免疫細胞化学、および透過電子顕微鏡を用いて、ラムダＳ１０５タンパク質は好ましくはミトコンドリアおよび小胞体細網（ＥＲ）において蓄積し、これがミトコンドリアの超微細構造の崩壊および細胞死の誘導をもたらすことが明らかにされている。バクテリオファージホリンタンパク質の発現は、腫瘍細胞由来異種移植片を使用する動物試験で示されているように、動物、特にｉｎ  ｖｉｔｒｏだけではなくｉｎ  ｖｉｖｏでのヒト細胞における細胞増殖阻害活性および細胞殺傷効果を誘導することが証明された。この細胞増殖阻害活性および細胞殺傷効果は、癌細胞の増殖活性を制限するために、または患者における癌細胞を根絶するために、したがって癌および他の増殖性疾患の治療のために特に有用である。
【００３３】
本発明に記載の使用のために、バクテリオファージ由来タンパク質、例えば、ホリンは、真核細胞、特に動物またはヒト細胞において発現される必要がある。このために、核酸配列、例えば、ファージ由来タンパク質またはその機能的断片のＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその発現産物は、細胞へ移動される必要がある。あるいは、核酸配列、例えば、ホリンをコードするＲＮＡまたはｍＲＮＡは、細胞内で直接合成される必要がある。別の方法において、バクテリオファージ由来タンパク質またはその生物活性部分およびシャトルタンパク質からなるバクテリオファージ由来タンパク質または融合タンパク質は、標的細胞へ移動されうる。
【００３４】
本発明に記載の「核酸配列」として、例えば、ホリン、またはその生物活性部分など、ホリン様機能を有するバクテリオファージ由来タンパク質またはポリペプチドをコードするすべての核酸配列―例えば、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡ―が挙げられる。この定義は、同じポリペプチドまたはタンパク質をコードするが、遺伝子コードの既知の縮退によって許容される変化による自然の配列と異なる核酸配列をも包含する。またこの定義は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下に、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、およびその機能的断片を含む、クレームされた核酸配列にハイブリダイズする能力を有する核酸をも含む。特に、ホリンまたはその生物活性部分およびシャトルタンパク質（例えば、ＨＩＶ−１−Ｔａｔ、ＨＢＶ−ＰｒｅＳ２−ＴＬＭ、Ｓｏｘ１０、ＶＰ２２）からなる融合タンパク質をコードする核酸配列も定義に含まれる。
【００３５】
本発明に記載の「産生細胞」は、バクテリオファージ由来タンパク質、例えば、ホリン、その「類似体」、その機能的断片、または「核酸配列」によってコードされる「融合タンパク質」のいずれかを発現するように修飾されている組換え細胞であると定義される。
【００３６】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という語は、ヌクレオチド配列が通常、互いにハイブリダイズされたままであるハイブリダイゼーションおよび洗浄のための条件を指す。かかるストリンジェントな条件は、当業者には周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、ジョン・ワイリー（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ）アンド（＆）サンズ（Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク（Ｎ．Ｙ．）（１９８９年）、６．３．１．ｆｆ．において確認されうる。さまざまな修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに行われうるが、したがって、「核酸」という語は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態をも包含する。ｃＤＮＡの３’末端ポリＡ＋経路のようなポリＡ＋配列、またはＴ（またはＵ）残基の相補的ストレッチのみにハイブリダイズする「核酸」が「核酸」の定義に含まれないことは自明であるが、それはかかる核酸がポリ（Ａ）ストレッチまたはその相補体を含有する核酸分子にハイブリダイズするためである。
【００３７】
細胞への核酸配列の移動にはいくつかの既知のベクター系、ウイルスベクター、または裸のＤＮＡも使用されうる。一般に、本発明に記載のベクターは、所望の核酸配列に加えて調節配列、場合により選択的マーカー遺伝子、および場合によりベクターの自己複製を可能にするレプリコンを含有する、プラスミド、コスミド、または人工染色体など、線状化もしくは環状構造のＤＮＡビヒクルである。
【００３８】
一時的または安定してトランスフェクトされた細胞の生成のために標的細胞への核酸配列の移動のためには、いくつかの方法が周知であり適用されうる。これらの方法としては、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、微粒子銃、抗体またはリガンド、デキストラン、リポソーム、ウイルスソーム、リン酸カルシウム、帯電ポリマーまたは帯電脂質介在ＤＮＡ移動など物理的および化学的方法が挙げられる。化学的修飾、例えば、親油性構造を有するペプチド、タンパク質、およびオリゴヌクレオチドの誘導化をも使用し、標的細胞への取込みを強化することができる。例えば、既知の膜刺激ペプチドの配列は、上記のように核酸配列に融合され、または、ラウロイル誘導体の添加、またはメチオニン残基の酸化によりスルホキシド基を生成し、またはそのケトメチレンイソエステルによってペプチド結合を置換して膜透過性を強化するなど、ホリンに対する当業者に周知の化学的修飾が行われうる。あるいは、細胞表面受容体に結合することが周知である分子が、かかるポリペプチド、タンパク質、または核酸配列に抱合されうる。有用な例は、参照により本明細書で援用される、米国特許第５，１０８，９２１号明細書に記載されているように、糖、ビタミン、ホルモン、サイトカイン、トランスフェリン、アジア糖タンパク質（ａｓｉａｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ）である。
【００３９】
好ましい実施形態によれば、本発明は、ファージ由来ホリンまたはその生物活性断片の真核細胞へのコード情報の伝達のためのウイルスベクター系を使用し、これを提供する。一般に、核酸配列の移動およびその後の発現を可能にするすべてのウイルスベクターを本発明に従って使用されうる。特に有用なのは、ポックスウイルス発現ベクター、アデノウイルス発現ベクター、ヘルペスウイルス発現系、アデノ関連性ウイルスベクター、アルファウイルスベクター、ＳＶ４０ベクター、水泡性口内炎ウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、シンドビスウイルスベクター、狂犬病ウイルスベクターのほか、レンチウイルスおよびレトロウイルスベクター系である。
【００４０】
さらに好ましい実施形態ではレトロウイルスベクター系が使用される。かかるレトロウイルスベクター系は、複製可能（例えば、国際公開第０１８２４０号パンフレットに記載）または複製不全レトロウイルスベクター系のいずれかに基づく。複製可能レトロウイルスベクター系は高い変換速度の利点を有するが、これは非特異的変換のリスクも有する。したがって、遺伝子発現の特異性は、細胞特異的プロモーターなどの特異的調節エレメントによって制御される必要がある。
【００４１】
これと比較して、複製不全レトロウイルスベクター系は、欧州特許第０７７９９２９号明細書に記載されているプロモーター変換ベクター（ＰｒｏＣｏｎ）または国際公開第９９／３５２８０号パンフレットに記載されている再構成ウイルス（ＲｅＣｏｎ）ベクター（いずれも参照により本明細書で援用）のように、高い細胞特異性を示すが、あまり有効に細胞を形質導入しない。さまざまなレトロウイルスベクター系が当技術分野で十分に記載されているため、当業者が適切なベクターを選択するのは容易である。
【００４２】
一般に、レトロウイルスベクター系は２つの成分からなり、第１の成分であるレトロウイルスベクター自体は、修飾されたレトロウイルス（ベクタープラスミド）であり、ここでウイルスタンパク質をコードする遺伝子は、場合により真核細胞に移動されるマーカー遺伝子を含む目的とする核酸配列によって置換されている。ウイルスタンパク質をコードする遺伝子の置換はウイルスを効果的に無能にするため、欠けているウイルスタンパク質をコードする、系の第２の成分によって救助されなければならない。第２の成分は、大量のウイルス構造的および酵素的タンパク質を生成するが、複製可能なウイルスを生成する能力を欠く細胞系である。この細胞系はパッケージング細胞系として知られ、修飾レトロウイルスベクターがパッケージされることを可能にする遺伝子を有する１つもしくはそれ以上のプラスミドで、一時的または安定してトランスフェクトされた細胞系からなる。これらのプラスミドは、ビリオン生成に要求される必要なウイルスタンパク質の合成を指図する。ウイルス粒子またはパッケージベクターを生成するために、第１の成分またはベクタープラスミドはパッケージング細胞系へ移動される。これらの条件下、挿入された治療用および場合によりマーカー遺伝子がベクタープラスミドから転写され、修飾レトロウイルス粒子（組換えウイルス粒子）へパッケージされる。かかる組換えウイルス粒子に感染した細胞は、ウイルスタンパク質がこれらの細胞には存在しないため新しいベクターウイルスを生成することができない。しかし、治療用およびマーカー遺伝子を持つベクターは存在し、これらは現在、感染細胞において発現されうる。
【００４３】
別の好ましい実施形態において、参照により本明細書で援用される国際公開第９９／３５２８０号パンフレットに記載されている再構成レトロウイルスベクターが使用されうる。このベクター系ではウイルスライフサイクル中の転換が使用され、形質導入標的細胞のみで分離された要素から機能的発現カセットの再構成を可能にする［５２］。このために、異種調節エレメントまたはプロモーターが逆方向でレトロウイルスベクターの長い末端反復の独自の５’領域（Ｕ５）（５’ＬＴＲ）へ挿入される。治療用毒性遺伝子は逆方向で３’長末端反復（３’ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ；３’ＬＴＲ）の独自の３’領域（３Ｕ）へ挿入される。逆転写後、両方の独自の領域は複製され、２つの機能的および活性発現カセットを各々のレトロウイルスＬＴＲ内に再構成する。組織特異的プロモーターの使用は、それぞれの標的細胞または特定の組織の細胞のみもしくは優先的に形質導入遺伝子の発現を確実にしうる。すべてのプロモーターはさらに構造的または条件付きで活性であり、ウイルスまたは非ウイルス起源でありうる。
【００４４】
本発明で使用される「調節エレメント」という語は、プロモーターとして使用される、すなわち、プロモーターに作動可能に連結された核酸配列の発現を調節する核酸配列を意味する。かかる「調節エレメント」または「プロモーター」は、構造的または誘導的に連結された核酸配列の発現を制御しうる。誘導的プロモーターの例は、テトラサイクリン依存調節系（検討には［６６］を参照）、熱ショック（例えば、エキジソン、ドキソサイクリン、リファンピシン）、または金属イオン調節系である。多くの系は有意水準の基礎発現を示す。この「漏出性」は細胞毒性遺伝子の発現のためのそれらの使用を困難にする。本発明に記載の「漏出プロモーター」は、誘導なしに連結された核酸の基礎発現を示す誘導的調節エレメントである。「組織特異的プロモーター」（ＴＳＰ）という語は、特異的細胞または組織の特異的細胞においてのみまたは主として活性である調節エレメントを意味する（例えば、プロバシンプロモーター、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素プロモーター、ヒトサーファクタントタンパク質Ａ１プロモーター、Ｋｓｐ−カドヘリン（Ｃａｄｈｅｒｉｎ１６）プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）、乳性酸性タンパク質プロモーター（ＷＡＰ））。
【００４５】
別の好ましい実施形態において、欧州特許第０７７９９２９号明細書に記載され、参照により本明細書で援用されるプロモーター変換ベクター（ＰｒｏＣｏｎ）が使用されうる。ＰｒｏＣｏｎの原理によれば、３’Ｕ３領域は変化しているが、正常な５’Ｕ３構造は維持されているレトロウイルスベクターが構成されており、ベクターは５’Ｕ３領域内に位置した正常なレトロウイルスプロモーターを利用するＲＮＡへ転写されうる。しかし、生成されたＲＮＡは変化した３’Ｕ３構造のみを含有する。感染標的細胞において、逆転写後、この変化したＵ３構造はレトロウイルス構造の両端に配置される。
【００４６】
変化した領域が、例えば、Ｕ３領域の代わりにポリリンカーを持つ場合には、組織特異的発現を方向づけるものを含むすべてのプロモーターが容易に挿入されうる。次いで、このプロモーターは、レトロウイルスベクターによって運ばれる連結された遺伝子の発現のための標的細胞においてのみ利用される。それが望まれる場合は、そのプロモーターはベクターにおける唯一のプロモーターでありうる。１つもしくはそれ以上の細胞配列と相同の追加のＤＮＡ部分を遺伝子標的のためにポリリンカーへ挿入されうる。
【００４７】
パッケージング細胞系では、レトロウイルスベクターの発現は正常な非選択的活性レトロウイルスプロモーターによって調節される。しかし、ベクターが標的細胞に入り次第、プロモーター変化が起こり、治療用遺伝子はポリリンカーへ導入される最適な組織特異的プロモーターから発現される。実質的にすべての組織特異的プロモーターが系に含まれ、多種多様の異なる細胞型の選択的標的を提供するだけではなく、さらに、変換イベント後、レトロウイルスベクターの構造および特性はもはやウイルスのそれに似ていない。これはもちろん、レトロウイルスがパッケージングベクターによる遺伝子組換えを容易に受け、当技術の普通の状態のレトロウイルスベクターは潜在的に病原性のウイルスを生成するため、安全性の観点からきわめて重要な結果を有する。プロモーター変換（ＰｒｏＣｏｎ）ベクターは、変換後にはＵ３レトロウイルスプロモーターをもはや持たず、したがって遺伝子組換えの可能性を削減するため、レトロウイルスと似ていない。また、ＰｒｏＣｏｎベクターは、当技術の普通の状態のベクターとは対照的に、融合部位の近くで細胞遺伝子を活性化する可能性が少ないとみられる。
【００４８】
本発明の内容において、また発現遺伝子の潜在的な毒性効果の評価を可能にするため、厳重に制御された遺伝子発現系が使用される。毒性遺伝子の発現の厳重な制御は、ウイルスベクター系を使用する場合に特に重要であるが、ここでウイルスベクターはパッケージング細胞によってパッケージされる必要があり、もちろん、パッケージング細胞における毒性遺伝子の発現は当該細胞を殺傷する。ウイルスベクターがウイルス粒子へパッケージングされた後にのみ、およびウイルス粒子がその宿主、好ましくは、真核細胞、より好ましくは動物細胞、特に哺乳類またはヒト細胞に感染した後にのみ、毒性遺伝子は宿主才能において発現される。
【００４９】
これは、例えば、細胞毒性遺伝子に作動可能に連結された厳重に制御された誘導的プロモーターを使用することによって達成されうる。厳重に制御された系では遺伝子発現は誘導因子を添加することによって誘導されうる。誘導因子なしでは系はサイレントであり、遺伝子発現は起こらない。したがって、ウイルス粒子が宿主細胞に感染した後のみに誘導因子を添加することによって、毒性遺伝子の発現が宿主細胞においてのみ起こることが確保されうる。誘導的プロモーターの例は、Ｌａｃリプレッサー／オペレーター、ＦＫ５０６／ラパマイシン、エクジソン誘導性、ＲＵ４８６／ミフェプリストン、およびテトラサイクリン（Ｔｃ）誘導性系［６８、６９］、またはマウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ）。
【００５０】
本発明は、別の実施形態において、（ｉ）グルココルチコイドによって活性化されうるマウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーターを使用するレトロウイルスベクターに基づくホルモン誘導的遺伝子発現系［６５］、および（ｉｉ）２つの異なるプラスミドベクターに基づくテトラサイクリン／ドキシサイクリン誘導的遺伝子発現系［６７、６８］を使用して癌遺伝子療法のための毒性タンパク質としてλ−Ｓ１０５、λ−Ｓ１０７、およびΦ２９−ＧＰ１４の価値を確認する。誘導のためのこれら誘導的遺伝子発現系を使用することにより、Ｓ１０５発現の顕著な効果が、ＨｅＬａ細胞、ＭＣＦ−７細胞、またはＨＥＫ２９３細胞のいずれかの形態、膜完全性（すなわち、トリパンブルー染色、アネキシンＶ−ＰＥ／７ＡＡＤ染色によって）、および細胞代謝（すなわちデヒドロゲナーゼによって生成されるＮＡＤＰＨまたはＮＡＤＨレベルを測定し、または膜電位を測定することによって）に対して例示的に明らかにされうる（実施例を参照）。さらに、λ−Ｓ１０５、λ−Ｓ１０７、およびΦ２９−ＧＰ１４は、細胞内で発現されると、好ましくは、細胞のミトコンドリアおよび小胞体細網において蓄積され、結果としてミトコンドリア膜電位の迅速な破壊がもたらされることが、蛍光免疫細胞化学および特異的細胞分画によって証明された。動物異種移植片モデルを使用することによって、バクテリオファージ由来タンパク質の発現が結果として、治療バクテリオファージ由来ホリンを発現しない非処置対照群と比べ、腫瘍の増殖速度の大幅な減少がもたらされることが明らかにされた。したがって、ヒト細胞におけるバクテリオファージ由来ホリンの発現が細胞増殖の削減をもたらし、特異的に真核細胞、特に動物細胞もしくはより特異的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでヒト細胞を含む哺乳類細胞をも殺傷することが意外にも証明された。
【００５１】
別の実施形態によれば、従来の調節エレメントをも使用されうる。漏出調節エレメントからの基礎転写が、パッケージング系内で細胞毒性遺伝子（アンチセンスＲＮＡ）の転写と少なくとも部分的に相補的である核酸配列を発現することによってサイレンス化されうるが、依然として細胞毒性遺伝子の転写に有効に結合する能力があり、したがって、少なくともパッケージング系の活力が延長し、十分なウイルスベクター粒子が生成されるやり方で細胞毒性遺伝子の翻訳を阻害する。
【００５２】
本発明−別の実施形態による−は、真核細胞において、細胞増殖阻害活性もしくは細胞殺傷効果を誘導するバクテリオファージ由来タンパク質または融合タンパク質、または少なくともその機能的部分を導入し発現する方法を提供する。このために、バクテリオファージ由来タンパク質もしくは融合タンパク質、その機能的部分もしくはその類似体、および作動可能に連結された調節エレメントをコードする核酸配列が真核細胞へ導入され、ここでその後に適切に連結された調節エレメントの制御下に発現されうる。取込みのために前記核酸配列は裸のＤＮＡとして真核細胞に提示されうるが、これにより、ある程度まで核酸配列が摂取され、コードタンパク質を発現する。効率を増大させるには、プラスミドまたは他のＤＮＡベクターが、例えば、リン酸カルシウムなど公知のトランスフェクション系を使用して細胞へトランスフェクトされうる。組換えウイルスまたはウイルス粒子のいずれかでありうるウイルスベクターを使用して真核細胞に感染させ、それによって核酸配列を前記細胞へ移動させる。
【００５３】
本発明に記載の「融合タンパク質」は、第１および少なくとも第２のポリペプチドからなり、そのすべてが互いに作動可能に連結されているが、各々のポリペプチドがその特異的機能を保存している。
【００５４】
融合タンパク質が細胞外培地から、例えば、組成物またはカプセルから放出されて標的細胞に入るようにデザインされている実施形態では、バクテリオファージ由来タンパク質がタンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）、または言い換えれば、シャトルタンパク質に連結されうるが、これにより細胞による摂取が容易になる。かかる伝達ドメインの例は、単純ヘルペスウイルスのＶＰ２２、アンテナペディアタンパク質のＰＴＤドメイン、ＰＤＸ−１のＰＴＤ、またはヒト免疫不全ウイルスタンパク質Ｔａｔのタンパク質伝達ドメインである。
【００５５】
好ましい実施形態では、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質のタンパク質伝達ドメインを構成する１１アミノ酸残基は、バクテリオファージ由来タンパク質またはホリン、もしくは好ましくは、ファージラムダＳ１０５タンパク質、ファージラムダＳ１０７タンパク質、またはファージＰｈｉ２９ＧＰ１４タンパク質のいずれかのＮＨ２末端に連結されている。
【００５６】
融合タンパク質が産生細胞から細胞外媒体へ分泌される実施形態では、タンパク質伝達ドメインおよびバクテリオファージ由来ホリンからなるバクテリオファージ由来タンパク質または融合タンパク質のいずれかをコードするポリヌクレオチド配列は、開裂可能なシグナルペプチド配列をコードするポリヌクレオチド配列に連結されている。融合タンパク質のシグナル配列は、細胞膜を通じて融合タンパク質の転位を方向づける。異なるタンパク質の一部の自然に発生するシグナルペプチドは配列が相同ではないが、それらは一般にいくつかの、好ましくは４〜１２の疎水性残基を含むが、これらは小胞体細網を交差させ、したがってタンパク質がゴルジ体または細胞外放出体へ輸送されることを可能にするために重要である。一般に、塩基性残基がさらにシグナルペプチドの疎水性配列前の数個の残基に配置されている。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態では、シグナルペプチドは、バクテリオファージ由来タンパク質のＮ末端、より好ましくは、タンパク質伝達ドメインおよびバクテリオファージ由来ホリンからなる融合タンパク質に作動可能に連結されており、かつさらに好ましくは、タンパク質伝達ドメインはＨＩＶ  Ｔａｔの１１アミノ酸残基からなり、ホリンはファージラムダＳ１０５、ファージラムダＳ１０７、またはＰｈｉ２９  ＧＰ１４タンパク質から選択される。本発明に従って使用されうる開裂可能なシグナルペプチドの例は、例えば、プレプロアルブミン、プレ−Ｐｒｇ軽鎖、プレリゾチーム、プレプロラクチン、プレペニシリナーゼ、前水疱性口内炎ウイルス糖タンパク質、またはプレリポタンパク質から選択されうる。さらに好ましくは、オステオネクチン／ＳＰＡＲＣ／ＢＭ４０シグナルペプチドが使用される。
【００５８】
本発明に記載の「融合タンパク質」は、当業界ですでに周知の方法によって製造されうる。これらの方法としては、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組換えＤＮＡ技術、化学技術、およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え／遺伝子組換えが挙げられる。ＤＮＡおよびＲＮＡ合成は、さらに、例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９年）に記載されている自動合成装置を使用して実行される。
【００５９】
かかる融合タンパク質の調製は、第１および第２のＤＮＡコード領域、およびフレームにおけるかかる領域の機能的ライゲーションまたは連結、調製を一般に必要とし、所望の融合タンパク質をコードする単一コード領域を調製する。本文脈では、バクテリオファージ由来タンパク質、好ましくは、ホリン、さらに好ましくは、ラムダＳ１０５タンパク質が、シャトルタンパク質（例えば、ＨＩＶ−１−Ｔａｔ、ＨＢＶ−ＰｒｅＳ２−ＴＬＭ、Ｓｏｘ１０、またはＶＰ２２）をコードするＤＮＡ配列とフレームで連結されている。治療薬標的剤のどの部分がＮ末端領域として、またはＣ末端領域として調製されるか特に重要であるとは一般に考えられていない。融合タンパク質の部分として使用されるシャトルタンパク質によって、融合タンパク質の２つ部分の連結のためのペプチドスペーサーを提供することが必要でありうる。これらのペプチドスペーサーは、開裂可能または非開裂可能のいずれかでありうる。かかる組換え生成融合タンパク質は精製され、ヒト投与用に形成されうる。あるいは、融合タンパク質をコードする核酸は、遺伝子療法によって送達される。裸の組換えＤＮＡまたはプラスミドが使用されうるが、リポソームまたはベクターの使用が好ましい。
【００６０】
あるいは、架橋試薬を使用し、２つの異なる分子の官能基を化学的に結合する分子架橋を形成しうる。段階的に２つの異なるタンパク質を連結するには、望ましくないホモポリマー形成を除去するヘテロ二官能性架橋剤が好ましい。ヘテロ二官能性架橋剤は、２つの反応基を含有する。すなわち、１つは１級アミン基（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ））ともう１つは一般にチオール基（例えば、ピリジルジスルフィド、マレイミド、ハロゲン等）と反応する。１級アミン反応基により、架橋剤はタンパク質のリシン残基と反応し、チオール反応基により、すでに第１のタンパク質に固定されている架橋剤は他のタンパク質のシステイン残基（遊離スルフヒドリル基）と反応する。
【００６１】
したがって、ポリペプチドまたはタンパク質は一般に、架橋目的に利用可能な官能基を有し、または有するように誘導化されている。この要件は、多種多様の基がこのようにして使用されうるという点で限定的であるとは考えられていない。例えば、１級または２級アミン基、ヒドラジド基またはヒドラジン基、カルボキシルアルコール、リン酸、またはアルキル化基が結合または架橋結合のために使用されうる。
【００６２】
架橋剤の２つの反応基間のスペーサーアームはさまざまな長さおよび化学組成物を有しうる。長いスペーサーアームは抱合成分のより良い柔軟性を可能にするが、架橋における特定の成分（例えば、ベンゼン基）は反応基に追加の安定性またはさまざまな態様の作用との化学的連結の抵抗性の増大（例えば、還元剤に対するジスフィルド結合抵抗性）をもたらしうる。Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａ−Ｌ−Ｌｅｕ−Ｌ−Ａｌａなどのペプチドスペーサーの使用も意図されている。
【００６３】
血液または他の体液中で十分な安定性を有する架橋剤が使用されることが好ましい。有効に使用されうるリンカーを含有する多くの種類のジスルフィド結合が周知である。例示的なヘテロ二官能性架橋剤は、ＳＭＰＴ、ＳＰＤＰ、ＬＣ−ＳＰＤＰ、Ｓｕｌｆｏ−ＬＣ−ＳＰＤＰ、ＳＭＣＣ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳ、ＳＩＡＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＩＡＢ、ＳＭＰＢ、Ｓｕｌｆｏ−ＳＭＰＢ、ＥＤＣ／Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ、またはＡＢＨである。立体障害であるジスフィルド結合を含有するリンカーがｉｎ  ｖｉｖｏでより大きな安定性を示し、作用部位での結合前の薬剤の放出を防ぐことを証明しうる。したがって、これらのリンカーが連結剤の１つの好ましい群である。
【００６４】
使用されるさらに好ましい架橋試薬の１つがＳＭＰＴであり、これは隣接ベンゼン環およびメチル基によって「立体障害」であるジスフィルド結合を含有する二官能性架橋剤である。ジスフィルド結合の立体障害は、組織および血液中に存在しうるグルタチオンなどチオラートアニオンによる攻撃から結合を保護する機能を果たし、それによって、標的部位、例えば、腫瘍との付着剤の送達前に抱合体の分離を防ぐのに役立つと考えられている。
【００６５】
ＳＭＰＴ架橋試薬は、多くの既知の架橋試薬と同様に、システインまたは１級アミン（例えば、リシンのイプシロンアミの基）のＳＨなど官能基を架橋する能力をもたらす。架橋剤の別の可能な種類としては、スルホスクシンイミジル−２−（ｐ−アジド  サリチルアミド（ｓａｌｉｃｙｌａｍｉｄｏ））エチル−１，３’−ジチオプロピオン酸塩など開裂可能なジスルフィド結合を含有するヘテロ二官能性光反応性フェニルアジドが挙げられる。Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基は１級アミノ基と反応し、フェニルアジドは（光分解時に）非選択的にアミノ酸残基と反応する。
【００６６】
障害架橋剤に加えて、非障害リンカーもこれに従って使用されうる。保護ジスルフィドを含有または生成するとみなされない他の有用な架橋剤としては、ＳＡＴＡ、ＳＰＤＰ、および２−イミノチオレンが挙げられる。かかる架橋剤の使用は当業界で十分に理解されている。
【００６７】
抱合されると、抱合体は非抱合成分から、かつ他の混入物質から分離される。それらを臨床的に有用にさせる十分な程度の純度の抱合体の提供用に多数の精製法が利用可能である。ゲルろ過、ゲル透過、または高速液体クロマトグラフィーなどサイズ分離に基づく精製方法が一般に最も使用されている。ブルーセファロース分離など他のクロマトグラフィー法も使用されうる。
【００６８】
本発明に記載の「医薬組成物」は、治療有効量の発現ベクター以外に、核酸配列、ウイルス粒子、真核パッケージング細胞、産生細胞、バクテリオファージ由来タンパク質、例えば、ホリン、および／または融合タンパク質、一般に、１つもしくはそれ以上の薬剤として許容可能なおよび／または薬理的に許容可能な担体、添加剤、抗菌剤、保存剤、補助剤、希釈剤、および／または安定剤を含みうる。
【００６９】
「薬剤としてまたは薬理的に許容可能な」という語句は、必要に応じて、動物、またはヒトに投与されると、有害な、アレルギー性の、または他の厄介な反応を生じることがない分子エンティティおよび組成物を指す。
【００７０】
本明細書で使用される「薬剤として許容可能な担体」としては、任意のかつすべての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張性および吸収遅延剤などが挙げられる。ささにかかる補助物質は、水、生理食塩水、グリセロール、エタノール、湿潤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質、または同様のものでありうる。適切な担体は通常、タンパク質、ポリ単糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマーアミノ酸、アミノ酸コポリマー、脂質凝集体、または同様のものなど大きな、ゆっくり代謝される分子である。薬剤活性物質用のかかる媒体および薬剤の使用は当業界で公知である。ヒト投与のために、調製は、ＦＤＡ生物製剤基準局によって要求され、または欧州連合における医療品を規制するＥｕｄｒａＬｅｘ規則に記載の滅菌、発熱、一般的安全性、純度の基準を満たすべきである。
【００７１】
別の実施形態では、治療有効量の発現ベクター、核酸配列、ウイルス粒子、真核生成またはパッケージング細胞、および／またはバクテリオファージ由来タンパク質、または融合タンパク質が透過膜または半透膜にカプセル化されうる。
【００７２】
「カプセル化される」という語は、生体材料が、内容物を周囲環境から免疫隔離し、発現ベクター、核酸配列、ウイルス粒子、および／またはバクテリオファージ由来タンパク質、例えば、ホリンをカプセルから放出させる生体適合性デバイスまたは「カプセル」に含まれていることを意味する。カプセル化に使用される生体適合性材料の主な特徴は、したがって、以下の通りである。すなわち（ｉ）補体系を著しく活性化することがなく、（ｉｉ）カプセル中かつ／またはカプセル外の酸素、栄養素、および廃棄物など小さな分子の通過を可能にし、（ｉｉｉ）生成物（発現ベクター、核酸配列、ウイルス粒子、および／またはバクテリオファージ由来タンパク質、例えばホリンのカプセルからの放出を可能にし、（ｉｖ）宿主免疫系の成分のカプセルへの侵入を著しく防ぐ。
【００７３】
さまざまな生体適合性人工ポリマー（またはコポリマー）、例えば、セルロース、デキシトラン、ポリアミド、ポリウレタン、アクリルオニトリル、ナイロン、アルギン酸ポリ−Ｌ−リシン、ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、ＡＮ６９（ポリアクリル−メタリルスルホン酸塩）、ヒドロキシエチルメタクリル酸メチルメタクリレート（ＨＥＭＡ−ＭＭＡ）、ポリアミド、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、硫酸キトサン、ＰＡＮ／ＰＶＣ、またはアガロースポリスチレンアルギン酸塩が、カプセル化に使用されうる。好ましくは、半透膜は、電解質錯体、最も好ましくは、硫酸セルロースおよび塩化ポリジメチルジアリルアンモニウムによって形成される。
【００７４】
生体適合性デバイスは、異なる形態、例えば、中空糸、シート、またはクッションを示しうる。本発明の特定の実施形態において、カプセルは球形であり、０．０１〜５ｍｍ、好ましくは、０．１〜２ｍｍの可変の直径を有しうる。一例として、欧州特許第０８３５１３７号明細書または欧州特許第０８９２８５２号明細書に記載され、参照により本明細書で援用されるマイクロカプセルが使用されうる。
【００７５】
キャプシド形成のために、発現ベクター、核酸配列、核酸配列、ウイルス粒子、産生細胞、パッケージング細胞、および／またはバクテリオファージ由来タンパク質、例えば、ホリンが、適切な培地中でポリアニオン成分（例えば、硫酸セルロース）と混合される。次いで、混合物は、ポリカチオン成分（例えば、塩化ポリジアリルジメチルアンモニウム、塩化ポリビニルベンジルトリメチルアンモニウム）を含有する重合浴へ滴下され、結果として電解質錯体によって形成される安定した膜を示し、非重合ポリアニオンの流体核を取囲むカプセルが生じる。
【００７６】
かかるマイクロカプセルの調製のために幾つかの製造方法が周知である（例えば、エアジェット（Ａｉｒｊｅｔ）法、振動法、ジェットカッター（ＪｅｔＣｕｔｔｅｒ）法）。
【００７７】
カプセルの形成後、生体材料はカプセル核内に封入される。医薬組成物の調製のために追加の洗浄および／またはろ過工程を使用して重合媒体からカプセルを分離することが必要である。
【００７８】
カプセルを含有する組成物は、好ましくは、非経口投与、例えば、静脈内、動脈内、筋内、または、それを必要とする動物またはヒトの腫瘍もしくは疾患部位への直接滴下（腔内投与）を含む、他のかかる経路による注射用に形成される。
【００７９】
注射用に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液または分散液、ごま油、ピーナッツ油、もしくは水性プロピレングリコールを含む製剤、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。ヒトにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ使用の要件を満たす媒質は、例えば、ＮａＣｌ溶液またはリンガー乳酸溶液である。すべての場合に、剤形は滅菌され、注入可能性が存在する程度に流体であるべきである。製造および貯蔵の条件下に安定であり、細菌および真菌など微生物の汚染作用に対して保存されるべきである。カプセルはガラスバイアルまたは注射器のような適切な容器中で形成されうる。カプセル化された細胞を含有する製剤はさらに抗凍結剤（例えば、ＤＭＳＯ、グリセロール）および／または別の添加剤を含有しうる。抗凍結剤の濃度は、患者に投与する前に希釈または追加の洗浄工程のいずれかによって削減されうる。
【００８０】
さらに、本発明の別の実施形態によれば、バクテリオファージ由来タンパク質、ホリン、または融合タンパク質は、他の薬剤として許容可能な製剤とキットで混合されうる。かかる他の製剤は、診断／画像用または複合療法用でありうる。例えば、かかるキットは、１つもしくはそれ以上の範囲の化学療法または放射線療法剤、抗血管新生剤、抗腫瘍細胞抗体、および／または抗腫瘍血管もしくは細胞毒素を含有しうる。
【００８１】
本発明のバクテリオファージ由来タンパク質または融合タンパク質は、非経口投与用に形成され、例えば、静脈内、筋内、皮下、経皮、または、蠕動投与および腫瘍もしくは疾患部位への直接滴下（腔内投与）を含む、かかる経路による注射用に形成される可能性が最も高くなる。
【００８２】
注射用に適切な医薬形態としては、滅菌水溶液または分散液、ごま油、ピーナッツ油、もしくは水性プロピレングリコールを含む製剤、および滅菌注射溶液または分散液の即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。すべての場合に、剤形は滅菌され、注入可能性が存在する程度に流体であるべきである。製造および貯蔵の条件下に安定であり、細菌および真菌など微生物の汚染作用に対して保存されるべきである。
【００８３】
医薬組成物は、中性または塩形態で滅菌水性組成物へ形成されうる。遊離塩基または薬理的に許容可能な塩としての治療薬標的剤の溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースなど界面活性剤と適切に混合された水中で調製されうる。薬剤として許容可能な塩としては、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基で形成）、および、例えば、塩酸またはリン酸など無機酸、もしくは酢酸、トリフルオロ酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など有機酸中で形成されるものが挙げられる。遊離カルボキシル基で形成される塩は、例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、または水酸化第二鉄など無機塩基由来、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど有機塩基由来でもありうる。
【００８４】
適切な担体としては、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、その適切な混合物、および植物油を含有する溶媒および分散媒が挙げられる。多くの場合に、等張性剤、例えば、糖、または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散の場合に必要な粒径の維持によって、かつ／またはサーファクタントの使用によって維持されうる。
【００８５】
別の実施形態では、バクテリオファージ由来タンパク質、例えば、ホリンまたは融合タンパク質がリポソームおよび／またはナノ粒子および／または他の被覆体に封入されうる。リポソームの形成および使用は一般に当業者に周知である。一般に、リポソームは、水性媒質中に分散され、多重膜同心二層小胞（多重膜小胞（ＭＬＶとも呼ばれる）を自然発生的に形成するリン脂質で形成される。ＭＬＶは一般に２５ｎｍ〜４μｍの直径を有する。ＭＬＶの超音波処理は結果として、核に水溶液を含有する直径２００〜５００オングストロームの小さな単層小胞（ＳＵＶ）の形成をもたらす。リポソームは異なる機序、例えば、ファガサイトーシスによるエンドサイトーシス、またはリポソームの脂質２層の血漿膜への挿入による血漿細胞膜との融合によって細胞と相互作用し、同時に標的細胞の細胞質へリポソームの内容物を放出する。
【００８６】
本発明のこの部に記載のナノカプセルまたは他の被覆体は一般に安定した再現可能なやり方で化合物を封入しうる。細胞内ポリマーの過負荷による副作用を回避するには、かかるカプセルは、好ましくは、例えば、生体分解性ポリアルキルシアノアクリレートを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで分解されることが可能なポリマー使用してデザインされるべきである。
【００８７】
治療有効量のバクテリオファージ由来タンパク質または融合タンパク質は、約５−１００ｍｇｓ、約１０−８０ｍｇｓ、約２０−７０ｍｇｓ、好ましくは約２５−６０ｍｇｓ、もしくはさらに好ましくは約３０−５０ｍｇｓの範囲でありうる。低量は他の薬剤との併用でより適切であり、１００ｍｇｓ以上の高量は依然として忍容されうることが理解されるであろう。
【００８８】
本発明の他の態様内では、感染性ウイルス粒子または組換えウイルスを含有し、これを保存する組成物を調製するための方法が提供される。手短に言えば、精製され、または濃縮されている感染性ウイルス粒子または組換えウイルスが、最初に十分な量の製剤緩衝剤を、水性懸濁液を形成するために、組換えウイルスを含有する媒質に添加することによって保存されうる。製剤緩衝剤はポリ単糖類、高分子量の構造的添加剤、および緩衝成分を水中に含有する水溶液である。本発明との関連で使用される「緩衝化合物」または「緩衝成分」は、所望のｐＨで水性懸濁液を維持するように機能する物質を指すことが理解されるべきである。水溶液は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸および／または場合により細胞増殖因子をも含有しうる。
【００８９】
感染性ウイルス粒子または組換えウイルスは、精製形態でも保存されうる。より具体的には、製剤緩衝剤の添加前に、クルード・ストックは、それをフィルタに通すことによって浄化され、次いで、クロスフロー濃縮システム（フィルトン・テクノロジー社（Ｆｉｌｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏｒｐ．）、Ｎｏｒｔｂｏｒｏｕｇｈ、マサチューセッツ州（ＭＡ））などによって濃縮される。１つの実施形態の範囲内では、ＤＮＡｓｅが濃縮物に添加され、外来ＤＮＡを消化する。次いで、消化物は透析ろ過され過剰な媒質成分を除去し、より望ましい緩衝液中で感染性ウイルス粒子または組換えウイルスを確立する。次いで、透析ろ過液をセファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）Ｓ−５００ゲルカラム上に通し、精製粒子またはウイルスが溶出される。十分な量の製剤緩衝剤がこの溶出物に添加され、構成物質の所望の最終濃度に達し、組換えウイルスを最小限に希釈し、次いで水性懸濁液は、好ましくは、−７０℃下に保存され、または直ちに乾燥される。上記の通り、製剤緩衝剤はポリ単糖類、高分子量の構造的添加剤、および緩衝成分を水中に含有する水溶液である。水溶液は、１つもしくはそれ以上のアミノ酸および／または場合により細胞増殖因子をも含有しうる。
【００９０】
感染性ウイルス粒子または組換え粒子のクルード・ストックもショ糖密度勾配による超遠心分離工程によって精製されうる。この方法はウイルス精製の標準方法として周知である。一般に、クルード・ストックは、さまざま密度（例えば、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ  ｐＨ９．５中２０％−６０％ｗ／ｖショ糖）の溶液中で遠心分離された特定の密度の分子は、分子の密度および溶液の密度が正確に等しいゾーンでのバンド中に集まる傾向があるという事実を活用することによって精製されうる。遠心分離後、異なる画分が遠心分離管の底の穴を通じて収集される。余分なショ糖は緩衝液中で遠心分離によって洗い流され、感染性ウイルス粒子または組換えウイルスは所望の緩衝液中に再懸濁される。次いで、十分な量の製剤緩衝剤が、上記の通り、精製組換えウイルスに添加され、水性懸濁液は直ちに乾燥され、または好ましくは、−７０℃下に保存される。
【００９１】
粗また精製形態での水性懸濁液は凍結乾燥または周囲温度での蒸発によって乾燥されうる。具体的には、凍結乾燥は水性懸濁液をガラス転移温度以下または水性懸濁液の共融点温度以下に冷却し、昇華によって冷却懸濁液から水を除去し、凍結乾燥ウイルスを形成する工程を含む。手短に言えば、形成組換えウイルスのアリコートを凍結乾燥機（Ｓｕｐｅｒｍｏｄｕｌｙｏ  １２Ｋ）に取付けたエドワード冷凍室（Ｅｄｗａｒｄｓ  Ｒｅｆｒｉｇｅｒａｔｅｄ  Ｃｈａｍｂｅｒ）（３シェルフＲＣ３Ｓユニット）へ配置する。フィリップス（Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）ら（Ｃｒｙｏｂｉｏｌｏｇｙ  １８：４１４、１９８１年）によって記載された多重工程凍結乾燥法を使用し、形成された組換えウイルスを、好ましくは、−４０℃〜−４５℃の温度に凍結する。結果として生じる組成物は、凍結乾燥ウイルスの１０重量％未満の水を含有する。凍結乾燥されると、以下で詳細に述べられるように、組換えウイルスは安定し、−２０℃〜２５℃に保存されうる。
【００９２】
以前に記載された製剤に使用される水溶液は、単糖類、高分子量の構造的添加剤、緩衝成分、および水で構成される。溶液は１つもしくはそれ以上のアミノ酸をも含みうる。これらの成分の組合せは、凍結および凍結乾燥、または蒸発による乾燥時に感染性ウイルス粒子または組換えウイルスの活性を保存するように作用する。好ましい単糖類が乳糖ではあるが、ショ糖、マニトール、グルコース、トレハロース、イノシトール、フラクトース、マルトース、またはガラクトースなど他の単糖類が使用されうる。また、例えば、乳糖とマニトール、またはショ糖とマニトールの単糖類の組合せが使用されうる。乳糖の特に好ましい濃度は３−４重量％である。好ましくは、単糖類の濃度は、１〜１２重量％である。
【００９３】
アミノ酸は、存在する場合には、水性懸濁液の冷却および解凍時にウイルス感染性をさらに保存するように機能する。また、アミノ酸は、冷却水性懸濁液の昇華中、および凍結乾燥状態での間にウイルス感染力をさらに保存するように機能する。好ましいアミノ酸がアルギニンであるが、リシン、オルニチン、セリン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、グルタミン酸、またはアスパラギン酸など他のアミノ酸も使用されうる。特に好ましいアルギニン濃度が０．１重量％である。好ましくは、アミノ酸濃度は、０．１重量％〜１０重量％である。
【００９４】
また、感染される細胞の活性を強化することが周知の成分を含有する水溶液を使用することが有利でありうる。増殖因子または増殖因子の組合せは、医薬組成物に存在する場合には、細胞の生理的過程を調節することが可能であり、したがって、本発明との関連で、組換レトロウイルスベクターの取込みおよびさらなる融合を促進する。代表的な例としては、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、メラニン細胞刺激ホルモン（ＭＳＨ）、インスリン様増殖因子（ＩＧＦ）、および、インターロイキン−２、−４、または１０、インタフェロンアルファまたはガンマのようなさまざまなサイトカインが挙げられる。
【００９５】
緩衝成分は、比較的一定のｐＨを維持することによって溶液を緩衝するように作用する。所望のｐＨ範囲、好ましくは、７．０〜７．８によってさまざまな緩衝剤が使用されうる。適切な緩衝剤としてはリン酸緩衝剤およびクエン酸緩衝剤が挙げられる。組換えウイルス製剤の特に好ましいｐＨが７．４であり、好ましい緩衝剤がトロメタミンである。
【００９６】
また、水溶液は、最終形成ウイルスを適切な等浸透圧塩濃度に調節するために使用される中性塩を含有することが好ましい。適切な中性塩としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、または塩化マグネシウムが挙げられる。好ましい塩が塩化ナトリウムである。
【００９７】
上記の所望の濃度の成分を含有する水溶液は、濃縮ストック溶液として調製されうる。
【００９８】
その後の再構成用に凍結乾燥状態で組換えウイルスを保存するための特に好ましい方法は、（ａ）感染性組換えウイルスを水溶液と混合し水性懸濁液を形成するが、この水性懸濁液は４重量％の乳糖、０．１重量％のヒト血清アルブミン、０．０３重量％以下のＮａＣｌ、０．１重量％のアルギニン、および約７．４の水性懸濁液のｐＨを提供し、それによって感染性組換えウイルスを安定化させるのに有効な量のトロメタミン緩衝剤を含む工程と、（ｂ）懸濁液を−４０℃〜−４５℃の温度に冷却し、凍結懸濁液を形成する工程と、（ｃ）昇華によって凍結懸濁液から水を除去し、凍結乾燥組成物の２重量％未満の水を有する凍結乾燥組成物を形成するが、組成物は再構成時に哺乳類細胞に感染することが可能である工程を含む。組換えウイルスは複製可能であることが好ましく、組換えウイルスが複製欠損であり、再構成時にヒトへの投与に適切であることがさらに好ましい。
【００９９】
本明細書で提供された開示を前提して、凍結乾燥ウイルスが室温下で貯蔵用に意図されている場合、水溶液内で特定の単糖類を利用することが好ましい場合があることは当業者には明らかであろう。より具体的には、乳糖またはトレハロースなど単糖類を、特に室温下での貯蔵用に利用することが好ましい。
【０１００】
本発明の凍結乾燥または乾燥ウイルスは、さまざまな物質を使用して再構成されうるが、好ましくは、水を使用して再構成される。場合によっては、最終製剤を等張性にする希釈塩溶液も使用されうる。また、再構成ウイルスの活性を強化することが周知の成分を含有する水溶液を使用することが有利でありうる。かかる成分としては、ＩＬ−２などのサイトカイン、硫酸プロタミンなどのポリカチオン、または、再構成ウイルスの伝達効率を強化する他の成分が挙げられる。凍結乾燥または乾燥組換えウイルスは、凍結乾燥または乾燥試料の実質的かつ好ましくは全溶解を可能にする都合の良い量の水または上記の再構成剤で再構成されうる。
【０１０１】
本発明によれば、上記の組成物は、それを必要とする患者における癌を治療するために特に有用である。このために、本発明の組成物は、腫瘍に、または、例えば、脳脊髄液、骨髄、関節、動脈内皮細胞、直腸、口腔／舌下、膣、リンパ系などの部位を含む多種多様の位置に、肺、肝、膵、脾、皮膚、血液、および脳からなる群から選択される臓器に、または腫瘍および間質腔からなる群から選択される部位に直接投与されうる。他の実施形態の範囲内で、組成物は眼内、鼻内、舌下、経口、局所、膀胱内、髄腔内、静脈内、動脈内、例えば、肺内動脈内、腹腔内、頭蓋内、筋内、関節内、または皮下に投与されうる。投与の他の代表的経路としては、完全な手術法および入院を必要としないが、医療従事者の存在を必要とする胃鏡検査法、ＥＣＲＰ、および大腸内視鏡検査法が挙げられる。
【０１０２】
本発明の組成物を投与するための配慮としては以下が挙げられる。
【０１０３】
経口投与は容易かつ便利、経済的（滅菌が不要）、安全（過量で多くの場合に処置されうる）、かつ組成物（組換えウイルス）の活性成分の制御放出を可能にする。反対に、悪心、嘔吐、または下痢、難溶性薬剤に対する異常な吸収など局所刺激がありうるとともに、組換えウイルスは、肝代謝や胃酸および酵素分解によって「初回通過効果」にかけられる。さらに、作用が遅れて開始する場合があり、有効な血漿レベルが達成されない場合があり、患者の協力が必要とされ、食事が吸収に影響を及ぼす場合がある。
【０１０４】
口腔／舌下投与は、組成物の活性成分の作用の迅速な開始を提供し、初回通過代謝を回避する便利な投与方法である。したがって、胃酸または酵素分解がなく、組換えウイルスの吸収は実行可能である。高いバイオアベイラビリティがあり、実質的に即時の治療の中止が可能である。反対に、かかる投与は比較的低い投与量（通常、約１０−１５ｍｇ）に限定されており、同時の飲食または嚥下はありえない。
【０１０５】
直腸投与は、わずかな初回通過代謝効果を提供し（十分な血液／リンパ管供給、および吸収物質の下大静脈への直接排出が得られる）、この方法は小児、嘔吐を有し、意識を欠く患者に適切である。この方法は胃酸および酵素分解を回避し、組成物のイオン化は直腸液が緩衝能を有さないため変化しない（ｐＨ６．８、帯電組成物が最も良く吸収する）。反対に、ゆっくり、不良、または異常な吸収、刺激、細菌叢による分解がありうるとともに、小さな吸収表面（約０．０５ｍ２）がある。さらに、親脂質性および水溶性化合物が直腸粘膜による吸収には好ましく、吸収増強剤（例えば、塩、ＥＤＴＡ、ＮＳＡＩＤ）が必要でありうる。
【０１０６】
本明細書に記載された投与の経路（例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）内、骨髄内、静脈内、動脈内、頭蓋内、筋内、皮下、さまざまな臓器内、腫瘍内、間質腔内、腹腔内、リンパ管内、または毛細血管床内）の多くは、針、カテーテル、または関連デバイスを使用して直接投与することによって簡単に行われうる。具体液には、本発明の特定の実施形態の範囲内で、１つもしくはそれ以上の投与量が直接、以下の指示された方法で投与されうる。
【０１０７】
１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で脳脊髄液内、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で骨髄内、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で関節内、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で静脈内、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で動脈内、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で頭蓋内、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で筋内、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で眼内、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で経肺、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で経鼻、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で舌下、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で経直腸、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で経口、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で局所、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で経膣、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で皮下、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で膀胱内、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で肺、肝、脾、皮膚、血液、脳などの臓器内、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で腫瘍内、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で腹腔内、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で間質腔、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量でリンパ管内、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で毛細血管床内、または１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、または１０１１ｃｆｕ以上の投与量で鞘内。
【０１０８】
組換えウイルスは、体の外側から標的へ（外来処置として）または外科処置として送達されうるが、ここでベクターは他の目的の処置の一部として、またはベクターを投与するように明確にデザインされた処置として投与される。投与のための他の経路および方法としては、経口経路および複数の部位を介した投与が挙げられる。
【０１０９】
あるいは、ウイルス、ウイルスベクター粒子、またはパッケージング細胞を生体適合性デバイス、例えば、上記のカプセルへカプセル化することができる。かかる生体適合性デバイスは、前記生体適合性デバイスを含有する組成物の形で適用され、好ましくは、それを必要とするヒトを含む動物への非経口経路のために形成されうる。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は、本発明の一部の態様を説明するために役立つ。
実施例
実施例１
ファージラムダ（λ）Ｓ１０５タンパク質を発現するベクターの機能性
本実施例において、ＨｅＬａ細胞におけるλ−Ｓ１０５を発現するために使用されるベクターの機能性が検査される。λ−Ｓ１０５Ｓ対立遺伝子（コドン３〜１０７、バクテリオファージλゲノムのヌクレオチド４５１９２〜４５５０９［ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＣ００１４１６］）をコードするλオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の部分をプライマーＶ１３およびＷ１３を使用してプラスミドｐＶＩＩＩ−Ｓ１０５［５３］からＰＣＲによって増幅し（表１）、ＸｂａｌおよびＳａｃｌｌで制限し、やはりＸｂａｌおよびＳａｃｌｌで制限されていたベクターｐＭＭＴＶＧＦＰでライゲートし（表１）、結果としてベクターｐＭＭＴＶ−ホリンを得た（図１）。
【０１１１】
ｐＭＭＴＶ−ホリンの親ベクターであるｐＭＭＴＶＧＦＰを以下の通り構成した。すなわち、ｐｃＤＮＡ３のＣＭＶプロモーター含有Ｎｒｕｌ−ＢａｍＨｌ断片（表１）を、マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端反復（ＭＭＴＶ  ＬＴＲ）を含有するベクターｐＬＴＲ．ｓｔｐのＮｒｕｌ−ＢａｍＨｌ断片によって置換し（表１）、結果としてベクターｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲを得た（表１）。ｅＧＦＰ遺伝子をＥｃｏＲｌ−Ｎｏｔｌ断片としてｐＥＧＦＰ−１から切断し（表１）、ＥｃｏＲｌおよびＮｏｔｌで制限されていたｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲでライゲートし、ｐＭＭＴＶＧＦＰを得た。
【０１１２】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ１０Ｂ細胞（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をｐＭＭＴＶ−ホリンで変換し、アンピシリン抵抗性クローンを単離した。ベクターｐＭＭＴＶ−ホリンの正しい構成を調製されたプラスミドＤＮＡの制限酵素分析によって確認し、λ−Ｓ１０５遺伝子の完全性をプライマーＳｅｑ−ＲＣ−ＭＭＴＶ−１−Ｒを使用してＤＮＡ配列決定によって証明した（表１）。
【０１１３】
ＨｅＬａ細胞をメーカー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））の指示に従ってリン酸カルシウム共沈殿法を使用して安定してトランスフェクトし、Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ  Ｇ４１８（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に対して抵抗性の個々のクローンをλ−Ｓ１０５コードホリンタンパク質のＣ末端部分に位置したペプチドに対して生じた抗血清を使用するウェスタンブロット法によってλ−Ｓ１０５発現について分析した。ｐＭＭＴＶ−ホリンは、ＭＭＴＶ  ＬＴＲのＵ３領域に位置したＭＭＴＶプロモーターからのλ−Ｓ１０５のグルココルチコイド誘導性発現を可能にする。ｐＭＭＴＶ−ホリントランスフェクト細胞のスクリーニングのために、１μＭデキサメタゾン（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア（Ａｕｓｔｒｉａ））を細胞の回収４８時間前に培養培地に添加することによって誘導した。デキサメタゾン処理後のλ−Ｓ１０５タンパク質の誘導的合成を示す細胞クローン（クローン１２）をさらに調査した。
【０１１４】
したがって、１×１０５細胞のクローン１２、または、対照として、ｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞を６ウェルプレートへ接種し、１２０時間培養した。異なる時点で、１μＭデキサメタゾンを培養培地に添加し、細胞をさらにホルモンの存在下に２４、４８、７２、９６、および１２０時間インキュベートした。４８時間以上デキサメタゾン処理した細胞については、新しいデキサメタゾンを１日おきに添加した。１２０時間の時点で、すべての細胞を同時に回収し、ＳＤＳ−レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）試料緩衝剤（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ダイゼンホーフェン（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）ドイツ）中に再懸濁し、同等量のタンパク質を標準法を使用するウェスタンブロット法によって分析した。λ−Ｓ１０５コードホリンタンパク質合成が最初にデキサメタゾンによるインキュベーションの２４時間後に検出された（図２）。発現レベルはその後に多少なりとも９６時間一定のままであった。対照として、λ−Ｓ１０５を誘導的に発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の溶解物（図２、細菌溶解物）を使用した。
【０１１５】
安定してトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の染色体ＤＮＡへ組込まれたλ−Ｓ１０５遺伝子の完全性を、λ−Ｓ１０５  ＯＲＦの、それぞれ、上流および下流で結合するオリゴヌクレオチドプライマーホリン−Ｆ２およびホリン−Ｒ１（表１）を使用するＰＣＲによってコード配列を増幅し（表１）、かつプライマーホリン−Ｆ２およびホリン−Ｒ２による断片のその後の配列決定（表１）によって確認した。
【０１１６】
実施例２
デキサメタゾン誘導λ−Ｓ１０５発現後のＨｅＬａ細胞の形態変化
本実施例では、デキサメタゾン誘導λ−Ｓ１０５発現後のＨｅＬａ細胞の形態変化を検査する。手短に言えば、ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトした１×１０４ＨｅＬａ細胞、または、対照として、ｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲを８ウェルチャンバースライドに接種し、１２０時間培養した。異なる所定の時点で、１μＭデキサメタゾンを培養培地に添加し、細胞をさらにホルモンの存在下に２４、４８、７２、９６、および１２０時間インキュベートした。４８時間以上デキサメタゾン処理した細胞については、新しいデキサメタゾンを１日おきに培養培地に添加した。細胞を緩衝ホルマリン中に固定し、ヘマウム（ｈｅｍａｌｕｍ）溶液（フルカ（Ｆｌｕｋａ）、ゼールツェ（Ｓｅｅｌｚｅ）、ドイツ）中で２分間対比染色した。標準光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ、カール・ツァイス有限合資会社（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＧｍｂＨ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア）によって分析し、写真撮影した。ｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲトランスフェクト細胞は、デキサメタゾン処理後のその形態に顕著な変化を示さなかった（図３Ａ）が、時間とともにｐＭＭＴＶ−ホリン−トランスフェクトＨｅＬａ細胞におけるλ−Ｓ１０５のデキサメタゾン誘導発現はある種の「腫脹」を誘導し、最終的に巨大な、しばしば多核細胞をもたらした（図３Ｂ、矢印）。また、ｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトしたそれぞれの対照と比べ（図３Ａ）、細胞数はλ−Ｓ１０５の発現の誘導後４８時間からｐＭＭＴＶ−ホリン−トランスフェクト細胞が継続的に減少した（図３Ｂ、４８時間＋ｄｅｘ、７２時間＋ｄｅｘ、９６時間＋ｄｅｘ、１２０時間＋ｄｅｘ）。
【０１１７】
実施例３
デキサメタゾン誘導λ−Ｓ１０５発現の細胞代謝に対する効果
本実施例では、ＭＴＴアッセイ（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア）を使用する相対ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨレベルの測定によって判定されるＨｅＬａ細胞におけるデキサメタゾン誘導λ−Ｓ１０５発現の細胞代謝に対する効果が記載されている。手短に言えば、ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトした１×１０５ＨｅＬａ細胞、または、陰性対照として、ｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲを６ウェル−プレートに接種し、１２０時間培養した。異なる所定の時点で、１μＭデキサメタゾンを培養培地に添加し、細胞をさらにホルモンの存在下に２４、４８、７２、９６、および１２０時間インキュベートした。４８時間以上デキサメタゾン処理した細胞については、新しいデキサメタゾンを１日おきに添加した。１２０時間の時点で、すべての細胞を同時に回収し、細胞代謝の指標として、同時に、細胞生存率の指標として、ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの相対量を判定するためにＭＴＴアッセイにかけた。ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞については、１２０時間のデキサメタゾンによるインキュベーションにより、デキサメタゾンで処理されなかった細胞と比べ７４％の生細胞の顕著な減少が生じた（図４、黒丸）。デキサメタゾン自体の細胞増殖および生存率の好ましくない効果を排除するために、領域をコードするλ−Ｓ１０５を欠くｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞も１２０時間デキサメタゾンでインキュベートした（図４、白丸）。ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトし、１２０時間増殖させたが、デキサメタゾンでインキュベートしなかったＨｅＬａ細胞（図４の０時間の時点での黒丸）の生細胞数を１００％に設定し、ｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトしたが、その他の点では同じやり方で処理したＨｅＬａ細胞（図４の１２０時間の時点での白丸）と比べると、デキサメタゾンが細胞増殖に対して好ましくない効果を有さなかったことは明らかである。対照的に、λ−Ｓ１０５遺伝子を欠くＨｅＬａ細胞は、遺伝子を有する細胞（１００％）と比べ高い数の生細胞（１１０％）を示した。この効果は、ＭＭＴＶプロモーター系の漏出性、およびデキサメタゾンの非存在下または細胞培養培地に存在する低レベルのグルココルチコイドによってもｐＭＭＴＶ−ホリンでトランスフェクトした細胞におけるλ−Ｓ１０５の低レベル発現によって説明されうる。総合すれば、これらの結果は、λ−Ｓ１０５発現が、細胞代謝の減少によって示されるように細胞生存率に対する顕著に好ましくない効果を有することを明らかに示す。
【０１１８】
実施例４
デキサメタゾン誘導λ−Ｓ１０５発現の膜完全性に対する効果
本実施例では、トリパンブルー排除アッセイを適用することによって判定されるＨｅＬａ細胞におけるデキサメタゾン誘導λ−Ｓ１０５発現の膜完全性に対する効果が記載されている。細胞膜の漏出性はアポトーシスまたは壊死による細胞死の公知の指標である。ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトした１×１０５ＨｅＬａ細胞、または、陰性対照として、ｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲを６ウェル−プレートに接種し、１２０時間培養した。異なる所定の時点で、１μＭデキサメタゾンを培養培地に添加し、細胞をさらにホルモンの存在下に２４、４８、７２、９６、および１２０時間インキュベートした。４８時間以上デキサメタゾン処理した細胞については、新しいデキサメタゾンを１日おきに添加した。１２０時間の時点で、すべての細胞を同時に回収し、トリパンブルー染色にかけ、無傷膜の生細胞の量を測定した。トリパンブルー排除アッセイをメーカー（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア）の指示に従って行った。ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞については、デキサメタゾンによる１２０時間のインキュベーションにより、デキサメタゾンで処理されず、１００％に設定された細胞（図４、黒三角）と比べると、無傷（トリパンブルー排除）膜（３０％）の顕著に低い数の細胞が生じた。膜完全性に対するデキサメタゾン自体の好ましくない効果を排除するために、λ−Ｓ１０５を欠くｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞もデキサメタゾンで１２０時間インキュベートした。１２０時間増殖されていたが、デキサメタゾンでインキュベートされていなかったｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトした非損傷ＨｅＬａ細胞の数（１００％、図４の０時間の時点で黒三角）を、ｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトしたが、その他の点では同じやり方で処理したＨｅＬａ細胞（図４の１２０時間の時点での白三角）と比べると、デキサメタゾン自体は膜損傷を引き起こさなかったことは明らかである。対照的に、λ−Ｓ１０５遺伝子を欠くＨｅＬａ細胞は、遺伝子を有する細胞（１００％）と比べると、無傷細胞膜の高い数の生細胞（１０６％）を示した。実施例３でも言及されているように、この効果はＭＭＴＶプロモー系の漏出性による可能性がきわめて高い。総合すれば、本実施例に記載された結果も、細胞完全性の喪失によって示される通り、λ−Ｓ１０５コードホリンタンパク質の細胞生存率に対する有害な効果を明らかに示す。
【０１１９】
実施例５
デキサメタゾン誘導λ−Ｓ１０５の細胞膜に対する効果
本実施例では、アネキシンＶ−ＰＥ／７ＡＡＤ染色によって判定されるλ−Ｓ１０５タンパク質のデキサメタゾン誘導発現の細胞膜に対する効果が記載されている。アネキシンＶは、サイトゾルに直面する内膜小葉に位置したホスファチジルセリン（ＰＳ）の天然の結合パートナーである。しかし、細胞のアポトーシス中、ＰＳは細胞表面に曝露され、したがって、外側から付加されたアネキシンによって検出されうる。アネキシンＶの細胞への結合は、損傷膜の細胞はアネキシンＶを侵入させ、ＰＳを内側から結合するためアポトーシスだけではなく壊死の指標である（５５）。７ＡＡＤ（７−アミノ−アクチノマイシンＤ）は二本鎖核酸へ挿入する。これは無傷膜の生細胞によって排除されるが、後期アポトーシスおよび／または壊死細胞の細胞膜に侵入する。
【０１２０】
領域をコードするλ−Ｓ１０５を欠くｐＭＭＴＶ−ホリンまたはｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトした１×１０５ＨｅＬａ細胞を６ウェル−プレートに接種し、１２０時間培養した。異なる所定の時点で、１μＭデキサメタゾンを培養培地に添加し、細胞をさらにホルモンの存在下に２４、４８、７２、９６、および１２０時間インキュベートした。４８時間以上デキサメタゾン処理した細胞については、新しいデキサメタゾンを１日おきに添加した。１２０時間の時点で、すべての細胞を同時に回収し、メーカー（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ドイツ）の指示に従ってアネキシンＶ−ＰＥ／７ＡＡＤ染色にかけた。デキサメタゾンで処理されており、アネキシンＶ−ＰＥ／７ＡＡＤ染色を示すことがなかった（したがって、生細胞とみなされた）細胞の数を１００％に設定し、デキサメタゾンで１２０時間処理されていた細胞のプールのアネキシンＶ−ＰＥ／７ＡＡＤ陰性細胞の数と比べると、はるかに少ない細胞（３２％）が生きていることが明らかになる（図４）。デキサメタゾン自体の膜完全性に対する考えうる効果を調査するために、λ−Ｓ１０５遺伝子を欠くｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞もデキサメタゾンで１２０時間インキュベートした。１２０時間増殖されていたが、デキサメタゾンでインキュベートされていなかったｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞の数（１００％、図４の０時間の時点で黒四角）を、ｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトしたが、その他の点では同じやり方で処理したＨｅＬａ細胞（図４の１２０時間の時点での白四角）と比べると、デキサメタゾン自体は膜損傷を引き起こさなかったことは明らかである。対照的に、λ−Ｓ１０５遺伝子を欠くＨｅＬａ細胞は、遺伝子を有する細胞（１００％）と比べると、無傷細胞膜の高い数の生細胞（１０５％）を示した。実施例３および４でも指摘されている通り、λ−Ｓ１０５遺伝子を欠くＨｅＬａ細胞は、遺伝子を有する細胞（１００％）と比べデキサメタゾン処理の１２０時間後の生細胞の高い数（１１１％）を示した。また、この効果は、ＭＭＴＶプロモーター系の漏出性による可能性がきわめて高い（実施例３）。総合すれば、本実施例は、ＨｅＬａ細胞で発現されるとλ−Ｓ１０５の有力な細胞殺傷効果を明らかに示す。
【０１２１】
実施例６
ドキシサイクリン誘導ベクター 系の評価
本実施例では、ドキシサイクリン誘導性Ｔｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系（ＢＤバイオサイエンス社（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ハイデルベルク（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）、ドイツ）を使用するＨｅＬａおよび２９３細胞のλ−Ｓ１０５発現の効果が記載されている。このために、細胞をｐＴｅｔ−Ｏｎで安定してトランスフェクトした後、Ｔｅｔ反応ベクターｐＵＨＤ１０．３−ホリンＨｙｇｒまたは親ベクターｐＵＨＤ１０．３−Ｈｙｇｒをコードするそれぞれのλ−Ｓ１０５でトランスフェクトした（図５）。テトラサイクリン反応プラスミドｐＵＨＤ−１０．３−ホリンは、領域（ＮＣＢＩ−Ｇｅｎｅ  ｂａｎｋ登録番号Ｊ０２４５９、ヌクレオチド４５１９２−４５５０９）をコードするλ−Ｓ１０５を含有する長さが３１８ｂｐの増幅ＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＨＤ−１０．３  ［ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ２．ｃｂｍ．ｕａｍ．ｅｓ／ｂｃ−０１５／ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ／ｐＵＨＤ１０−３．ｈｔｍｌ．］へ挿入することによって構成された。増幅に使用されるプライマー（Ｖ１３およびＷ１３［表１］）は、ｐＵＨＤ−１０．３のｐ３．１５ｋｂベクター断片のＸｂａｌおよびＳｃａｌｌ部位を有する得られた断片の酵素消化およびライゲーションのＳｃａｌｌおよびＸｂａｌ部位を含む。ハイグロマイシン抵抗性遺伝子発現カセット（２．３ｋｂ）は、Ｐｖｕｌｌでの制限酵素消化によってｐｃＤＮＡ３−Ｈｙｇｒ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＬＴ、ローファー（Ｌｏｆｅｒ）オーストリア）から得られた。２．３ｋｂ断片は、Ｐｖｕｌｌ−線状化ベクターｐＵＨＤ−１０．３−ホリンおよびｐＵＨＤ−１０．３でそれぞれライゲートされ、ベクターｐＵＨＤ−１０．３−ホリン−ＨｙｇｒおよびｐＵＨＤ−１０．３−Ｈｙｇｒが得られた（図５）。
【０１２２】
安定してトランスフェクトした細胞クローンを、λ−Ｓ１０５コードホリンタンパク質のＣ末端部分に位置したペプチドに対して生じた抗血清を使用するウェスタンブロット法によってドキシサイクリン誘導性λ−Ｓ１０５発現について分析した。λ−Ｓ１０５発現クローンの中で、きわめて高い発現レベルを示す３つのクローンをさらに分析した。ＨｅＬａ細胞を５μｇ／ｍｌドキシサイクリンの存在下に２４、４８、７２、および９６時間培養した。２９３細胞は、すべての細胞がインキュベーション期間後に死亡したため２４および４８時間のみ培養した。ＨｅＬａ細胞クローン２４、３５、３６および２９３細胞クローン１、３、および６におけるλ−Ｓ１０５が、それぞれ、図６ＡおよびＢに示されている。非（図６、レーン５、１５、２７、３０）または低（図６、レーン１０、２５）背景発現が、ドキシサイクリンでインキュベートされていなかったＨｅＬａおよび２９３対照細胞で確認され、きわめて高い発現が培養培地へのドキシサイクリンの添加後すでに２４時間で確認された（図６レーン６、１１、１６、２６、２８、３１）。対照として、実施例１に記載されたλ−Ｓ１０５を発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の同じ細胞溶解物（図６レーン１および２０）およびベクターｐＭＭＴＶ−ホリンからのλ−Ｓ１０５を安定して発現するＨｅＬａ細胞の細胞抽出物（図６レーン２および２２、実施例１を参照）を使用した。ベクターｐＭＭＴＶ−ホリンからのλ−Ｓ１０５を発現するデキソメタゾン誘導ＨｅＬａ細胞と比べ（図６Ｂ、レーン２２）、発現レベルがＴｅｔ−Ｏｎベクター系でλ−Ｓ１０５を発現させることよって劇的に増強された。ウェスタンブロット法によってドキシサイクリンによる４８時間のインキュベーション後に２９３細胞クローン３の抽出物において検出された低量のλ−Ｓ１０５ホリンタンパク質（図６Ｂ、レーン３２）は、細胞の大部分はこの時点ですでに死亡していたという事実による。細菌溶解物を含有するレーン２０（図６Ｂ）における大きなタンパク質バンド染色はほぼ確実にλ−Ｓ１０５のオリゴマー形態を表すが、染色λ−ホリンタンパク質（矢印でマーク）を越えて検出された小さいタンパク質（図６Ｂ、レーン２４、２５、２６、２８）は、２９３細胞におけるλ−Ｓ１０５ホリンタンパク質の部分的分解を示すとみられる。
【０１２３】
実施例７
ドキシサイクリン誘導λ−Ｓ１０５発現の細胞代謝に対する効果
本実施例は、ＭＴＴアッセイを使用する細胞生存率の指標として相対ＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨの測定によって判定されるＨｅＬａおよび２９３細胞におけるドキシサイクリン誘導Ｔｅｔ調節λ−Ｓ１０５の細胞代謝に対する効果を記載する。Ｔｅｔ調節発現ベクターｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒを含有するλ−Ｓ１０５を有する安定してトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞クローン２４、３５、３６、および２９３細胞クローン１、３、および６を５μｇ／ｍｌドキシサイクリンの存在下に２４、４８、７２、および９６時間（ＨｅＬａ細胞クローン）または２４および４８時間（２９３細胞クローン）培養し、λ−Ｓ１０５発現を誘導した。λ−Ｓ１０５コードホリン合成をウェスタンブロット法によって検証した（実施例６を参照）。細胞をＭＴＴアッセイにかけ（実施例３を参照）細胞生存率を判定した（図７）。ベクターを欠く（図７、黒ダイア）非トランスフェクトＨｅＬａ（図７Ａ）および２９３（図７Ｂ）細胞の生存率は損なわれておらず、ドキシサイクリン自体が細胞に対して好ましくない効果を有さなかったことを明らかに示す。しかし、ｐＵＨＤ−１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒトランスフェクト２９３およびＨｅＬａおよび細胞クローンにおけるλ−Ｓ１０５の発現（図７、黒四角、三角、十字）は結果として、ドキシサイクリンによるインキュベーションの４８時間〜９６時間に９４％〜９８％の実質的な細胞殺傷をもたらした。
【０１２４】
実施例８
ドキシサイクリン誘導λ−Ｓ１０５発現の細胞膜完全性に対する効果
本実施例では、トリパンブルー染色によって判定される細胞生存率の指標として細胞膜完全性に対するＨｅＬａおよび２９３細胞におけるドキシサイクリン誘導λ−Ｓ１０５発現の効果を記載する。λ−Ｓ１０５タンパク質をドキシサイクリン誘導Ｔｅｔ−Ｏｎ遺伝子発現系を使用して発現させた（実施例７を参照）。Ｔｅｔ調節発現ベクターｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒを有するＨｅＬａ細胞クローン２４、３５、３６、および２９３細胞クローン１、３、および６を検査した。５μＭドキシサイクリンを添加することによってλ−Ｓ１０５発現を誘導し、ドキシサイクリンの存在下に細胞を２４、４８、７２、および９６時間（ＨｅＬａ細胞クローン）または２４および４８時間（２９３細胞クローン）培養した。λ−Ｓ１０５タンパク質発現をウェスタンブロット法によって検証した（実施例６を参照）。トリパンブルー染色（実施例４を参照）をメーカー（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア）の指示に従って行った。ｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒで安定してトランスフェクトしたＨｅＬａ（図８Ａ）および２９３細胞（図８Ｂ）について、９６時間のドキシサイクリンによるインキュベーションにより、９７％〜１００％の生細胞の減少が生じた（図８、黒四角、三角、十字）が、ベクターを欠くＨｅＬａおよび２９３細胞（図８、黒ダイア）はドキシサイクリン処理後の生存率の喪失を示さなかった。トリパンブルー排除における不良によって示される細胞膜の明らかな損傷は、λ−Ｓ１０５発現によって介在されるアポトーシスまたは壊死性細胞死のいずれかによるとみられる。
【０１２５】
実施例９
真核癌細胞系の細胞生存率に対するλ−Ｓ１０５のＴｅｔオン／オフ調節発現の評価
真核癌細胞におけるλ−Ｓ１０５タンパク質の合成のための完全に厳重に調節された発現系を得るために、Ｔｅｔオン／オフベクター系を確立した。このために、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に基づく、レトロウイルスベクターｐＬｉｂ−ｒｔＴＡ−Ｍ２−ＩＲＥＳ−ＴＲＳＩＤ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏｒ（図９）を［６８］に記載されている通り構成した。手短に言えば、逆Ｔｅｔ調節転写活性化因子（ｒｔＴＡ）高親和性変形ｒｔＴＡ２−Ｍ２を、さらにヒストン−デアセチラーゼ−リクルーティングＴｅｔ−リプレッサータンパク質（ＴＲＳＩＤ）およびピューロマイシン抵抗性遺伝子（Ｐｕｒｏｒ）をコードする修飾ｐＬＬＢレトロウイルスベクター（ＢＤバイオサイエンス社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ハイデルベルク（Ｈｅｄｅｋｂｅｒｇ））へクローン化した。各々のコード領域が、５’長末端反復（ＬＴＲ）で配置されたレトロウイルスプロモーターから推進される１つのｍＲＮＡからの３つのすべてのタンパク質の同時の翻訳を可能にする内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）によって分離される。高親和性ｒｔＴＡ変形（ｒｔＴＡ２−Ｍ２）をＴＲＳＩＤと結合するベクターは大きく減少した漏出性を示したが、これはそれらを特に細胞毒性遺伝子の厳重に制御された発現のために有用にしている。ヒト頸（ＨｅＬａ）および乳腺癌（ＭＣＦ−７）細胞系ならびに胚腎細胞（２９３）を、２９３由来両種性パッケージング細胞系から生成された組換えベクターウイルスに感染させた［７１］。選択細胞集団をさらにｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒでトランスフェクトし（図５）、ドキシサイクリンによる刺激でλ−Ｓ１０５を発現する単一クローンをさらに調査した。
【０１２６】
したがって、３×１０５ＭＣＦ−７または１×１０５ＨｅＬａまたは２×１０５２９３細胞／ウェルを６ウェルプレートへ接種した。翌日、５μｇ／ｍｌドキシサイクリンを細胞培養培地に添加した。２４時間以上ドキシサイクリンで処理した細胞については、新しいドキシサイクリンを細胞培養培地に毎日、添加し、細胞をさらに２４、４８、７２、９６、および１２０時間インキュベートした。１４４時間の時点で、すべての細胞を同時に回収した。各々の試料からの浮遊および付着細胞をプールし、いっしょに回収した。総細胞数（細胞／ウェル）をＣａｓｙＴＴ（登録商標）細胞計数器（シェルフェ・システム有限合資会社（Ｓｃｈａｅｒｆｅ  Ｓｙｓｔｅｍ  ＧｍｂＨ）、ロイトリンゲン（Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ）、ドイツ）によって判定した。誘導λ−ホリンタンパク質合成の細胞生存率に対する効果の評価については、ＭＴＴ（図１０、上パネル）およびトリパンブルー排除アッセイ（図１０、下パネル）を行った（実施例７および８を参照）。細胞殺傷率（％生存率）をドキシサイクリン誘導細胞と非誘導細胞との比と定義した。両方のアッセイは、３つのすべての系におけるドキシサイクリンによって発現されるλ−Ｓ１０５遺伝子の刺激により細胞生存率の大きな減少を示した（図１０）。非トランスフェクト細胞をドキシサイクリで処理すると細胞毒性効果が注目されなかった（図１０、開放記号）。細胞系によって、ドキシサイクリ誘導λ−Ｓ１０５発現の４８〜９６時間に９０％の細胞死が確認された。
【０１２７】
実施例１０
免疫インコンピテントＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウスにおけるヒト乳腺腫瘍細胞異種移植片の増殖に対するλ−Ｓ１０５遺伝子発現の評価
ｉｎ  ｖｉｖｏでのλ−Ｓ１０５コードホリンタンパク質の細胞毒性活性の評価のために、ｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒまたはそれぞれの基礎ベクターｐＵＨＤ１０．３−ＨｙｇｒをコードするＴｅｔ調節λ−ホリンを安定して有するでプラスミド５×１０６ＭＣＦ−７細胞を皮下的に雌ＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウス（Ｃ．Ｂ−１７／ｌｃｒＨｓｄ−  Ｐｒｋｃｄｓｃｉｄ  Ｌｙｓｔｂｇ、ハーラン・ヴィンケルマン（Ｈａｒｌａｎ−Ｗｉｎｋｅｌｍａｎｎ）、ボーヒェン（Ｂｏｃｈｅｎ）、ドイツ）の乳腺脂肪体へ注射した。腫瘍サイズを週２回２次元でキャリパーにより測定し、腫瘍容積を式［１×ｗ×ｗ／２］に従って計算した。注入後３７日、腫瘍が約５０ｍｍ３に増殖したところで、１７β−エストラジオール（Ｅ２）９０日緩徐放出ペレット（イノバティーブ・リサーチ（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、フロリダ州（ＦＬ）、米国）１．７ｍｇを各マウスに注入し、さらに腫瘍の増殖を強化した。腫瘍が触診可能なサイズ（約２００ｍｍ３）に増殖した後、動物を２群に分けた。１群には２ｍｇ／ｍｌの最終濃度まで５％ショ糖を含有する飲料水中に溶解したドキシサイクリを経口投与し、もう１群にはドキシサイクリンを欠くショ糖富化飲料水を与えた。動物をドキシサイクリンで３２日間処理した。実験の終了時または腫瘍が１８００ｍｍ３を超えた場合、マウスを犠死させ解剖した。腫瘍増殖率を個々の動物の腫瘍増殖曲線の平均勾配として計算した（図１１）。腫瘍増殖の有意な減少が、ｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒ−トランスフェクトＭＣＦ−７細胞を有するドキシサイクリン処理マウスをドキシサイクリンを投与しなかった動物と比べて確認された（図１１Ａ、ｐ＝０．０４２４）。対照的に、ドキシサイクリン処理に応じて親ベクターｐＵＨＤ１０．３−ホリン−ＨｙｇｒでトランスフェクトしたＭＣＦ−７細胞を有する動物では腫瘍増殖の差は得られなかった（図１１Ｂ）。
【０１２８】
実施例１１
同系の乳腺腺癌マウスモデルにおける腫瘍増殖に対するドキシサイクリン誘導λ−Ｓ１０５遺伝子発現の効果
免疫可能モデルにおけるλ−Ｓ１０５コードホリンタンパク質の抗腫瘍形成能の評価のために、Ｔｅｔオン／オフ調節発現ベクターｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒ発現系または親ベクターｐＵＨＤ１０．３−Ｈｙｇｒを含有するマウス乳腺腺癌細胞（ＴＳＡ）を確立した。１×１０６細胞をＢａｌｂ／ｃマウスの同系の乳腺脂肪体へ皮下注射した。７日後にマウスを毎日ドキシサイクリン（５０ｍｇ／ｋｇ体重、ｉ．ｐ．）を接種した。無作為選択されたマウスからなる対照群はドキシサイクリンを得なかった。全動物の腫瘍増殖を週２回モニタリングし、腫瘍体積を式［１×ｗ×ｗ／２］に従って計算した（図１２Ａ）。図１２Ｂに示されているように、きわめて顕著に削減された腫瘍増殖（ｐ＝０．００１２）が、ＴＳＡ細胞を発現するλ−Ｓ１０５を有するドキシサイクリン処置動物（白色棒）をｐＵＨＤ１０．３−Ｈｙｇｒトランスフェクト細胞（黒色棒）と比較した場合に確認された。
【０１２９】
実施例１２
細胞下分画による真核細胞におけるλ−Ｓ１０５コードホリンタンパク質の細胞内局在の測定
λ−ホリンタンパク質の細胞内局在の調査のために、Ｔｅｔオン／オフ調節発現ベクターｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒを安定して有した１×１０７ＨｅＬａ細胞を２４時間で５μｇ／ｍｌドキシサイクリンでインキュベートした。処理後、細胞を培養フラスコから静かにこすり落とし、２５０ｘｇで５分間、遠心分離によって回収した。細胞内分画をわずかに変更して［７０］に記載されているように実行した。手短に言えば、２０ｍＭＨｅｐｅｓ−ＫＯＨ、ｐＨ７．５、１０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、１ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ）、プロテアーゼ阻害剤カクテル（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ダイゼンホーフェン（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）ドイツ）および２５０ｍＭショ糖を含有する５ｖｏｌ．の氷冷緩衝剤Ａ中に再懸濁した。細胞を１０分間膨張させた後、それらを１５−２０回２５ゲージ針に通過させて溶解し、ホモジネートを５回氷冷緩衝剤Ａにより１０００ｘｇで１０分間４℃下に遠心分離によって洗浄し、核（画分Ｎ）を単離した。上清を１００００ｘｇで１５分間４℃下に遠心分離した。結果として生じるミトコンドリア富化ペレット（画分Ｍ）を５回氷冷緩衝剤Ａで洗浄した。結果として生じる上清を細胞画分（Ｃ）として使用した。１０％β−メルカプトエタノール（シグマ・アルドリッチ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、ダイゼンホーフェン（Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ）ドイツ）を含有するレムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）サンプル緩衝剤中１５−３０μｇのタンパク質―総細胞抽出物（Ｔ）および細胞内画分―をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ウェスタンブロット法によって分析した（図１３）。ポリクローナルウサギ抗ホリン抗血清またはシトクロムｃオキシダーゼ（ＣｏｘＩＶ）（１：５０）（オイビオ（Ｅｕｂｉｏ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア）、カルネキシン（１：５０）（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア），ヌクレオポリン（１：５０）（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア）、およびインテグリンα２（１：２５）（べクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア）などオルガネラ特異的マーカータンパク質を検出する抗体のいずれかで膜をプローブした。最後に、強化化学発光（アマシャム・バイオサイエンス社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））によってタンパク質を検出した。λ−ホリンタンパク質（図１３Ａ）は、ＣｏｘＩＶ（図１３Ｂ）およびカルネキシン（図１３Ｃ）を含有する細胞内画分中に共局在化し、それぞれ、ミトコンドリアおよび小胞体細網中にその存在を示すことが証明された。ホリンタンパク質が、それぞれ、ヌクレオポリン（図１３Ｄ）およびインテグリンα２（図１３Ｅ）によって測定されるように核または細胞膜を含有する画分中で検出された。
【０１３０】
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【０１３１】
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【表１】
2008506411.tif 000002
【図面の簡単な説明】
【０１３２】
図面の簡単な説明
【図１】発現ベクターｐＭＭＴＶ−ホリンおよびｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲを示す概略図である。ｂｌａはβーラクタマーゼ遺伝子を示し；ＭＭＴＶ  ＬＴＲはマウス乳腺腫瘍ウイルスの３’ＬＴＲを示し；λ−Ｓ１０５はλ−ホリンタンパク質をコードするバクテリオファージλ遺伝子Ｓ（コドン３〜１０７）を示し；ＳＶ４０  ｏｒｉはＳＶ４０の複製起点を示し；ｐＳＶ４０はＳＶ４０  プロモーターを示し；ｎｅｏはネオマイシン耐性遺伝子を示し；ｐＵＣ１９  ｏｒｉはプラスミドｐＵＣ１９からの複製起点を示す。
【図２】ウェスタンブロット法によって測定された、デキサメタゾンによる刺激後２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、および１２０時間の、ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるλ−Ｓ１０５の発現を示す図である。染色されたλ−Ｓ１０５によりコードされるホリンタンパク質は矢印で指示されている。分子量標準のサイズは左に示されており（ｋＤａ）；−ｄｅｘはデキサメタゾン処理されていないことを示し；細菌溶解物はλ−１０５を誘導的に発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の溶解物を示す。
【図３】ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞の、デキサメタゾン誘導λ−Ｓ１０５発現後の形態変化を示す図である。（Ａ）ｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定的にトランスフェクトされ、デキサメタゾンで示された時間にわたってインキュベートされたＨｅＬａ細胞。（Ｂ）ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定的にトランスフェクトされ、デキサメタゾン（＋ｄｅｘ）で示された時間にわたってインキュベートされたＨｅＬａ細胞を示し、−ｄｅｘはデキサメタゾン処理されていないことを示す。矢印は多核細胞の核を示す。
【図４】ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定的にトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞（●）および対照としてｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定的にてトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞（○）におけるＭＴＴ試験を使用した代謝活性の測定、または（σ）ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞および（Δ）対照としてｐＭＭＴＶ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞におけるトリパンブルー排除アッセイによって、または（ν）ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞および（ｏ）対照としてｐＭＭＴＶｂ．ＬＴＲで安定してトランスフェクトされたＨｅＬａ細胞のアネキシンＶ／７ＡＡＤ染色によって決定された、ＨｅＬａ細胞の生存率に対するデキサメタゾン誘導λ−Ｓ１０５発現の効果を示す図である。
【図５】Ｔｅｔ調節発現ベクターｐＵＨＤ１０．３−ホリン−ＨｙｇｒおよびｐＵＨＤ１０．３−Ｈｙｇｒを示す概略図である。ＳＶ４０ポリ（Ａ）はシミアンウイルス４０のポリアデニル化シグナルを示し；ＳＶ４０プロモーターはシミアンウイルス４０プロモーターを示し；ＣｏｌＥ１  ｏｒｉは複製起点を示し；ａｍｐｒはアンピシリン耐性遺伝子を示し；ハイグロｒはハイグオマイシン耐性遺伝子を示し；ＭＣＳは多重クローニング部位を示し；７ｔｅｔＯ＋ｍＣＭＶはヒトサイトメガロスウイルスの最小プロモーターに結合されたテトラサイクリンオペレーターエレメントの７反復を示し；λ−Ｓ１０５はバクテリオファージλ−ホリンタンパク質コード遺伝子を示し；Ｐｖｕｌｌ、Ｓａｃｌｌ、Ｘｂａｌは制限酵素結合部位を示す。
【図６】（Ａ）ＨｅＬａ細胞クローンＣＩ２４（レーン５−９）、クローンＣＩ３５（レーン１０−１４）、クローンＣＩ３６（レーン１５−１９）、および（Ｂ）ｐＴｅｔ−Ｏｎ（ＢＤバイオサイエンス・クローンテック（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）と発現ベクターｐＵＨＤ１０.３−ホリン−Ｈｙｇｒとで安定してトランスフェクトされた２９３細胞クローンＣＩ１（レーン  ２４−２６）、クローンＣＩ６（レーン２７−２９）、クローンＣＩ３（レーン３０−３２）における、ウェスタンブロット方によって測定された、ドキシサイクリンによる刺激後のλ−Ｓ１０５の発現を示す図である。染色されたλ−Ｓ１０５にコードされるホリンタンパク質は、矢印で示されている。分子量標準のサイズ（ｋＤａ）は左に示されている。レーンの番号は（１、２０）λ−Ｓ１０５タンパク質を誘導的に発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の溶解物、（２、２２）ｐＭＭＴＶ−ホリンで安定してトランスフェクトされ、対照としてデキサメタゾンで処理されたＨｅＬａ細胞の抽出物、（３、２１）タンパク質分子量標準、（４、２３）非トランスフェクトＨｅＬａ細胞の抽出物、（５、１０、１５、２５、２７、３０）ドキシサイクリンでインキュベートされていないｐＴｅｔ−Ｏｎ／ｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒ−トランスフェクト細胞、（６、１１、１６、２６、２８、３１）、ドキシサイクリンで２４時間（７、１２、１７、２４、２９、３２）４８時間、（８、１３、１８）７２時間、および（９、１４、１９）９６時間インキュベートされた二重トランスフェクト細胞。
【図７】ｐＴｅｔ−Ｏｎ及び発現ベクターｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒで安定してトランスフェクトされた（Ａ）ＨｅＬａおよび（Ｂ）２９３細胞クローンにおいて、ＭＴＴアッセイを用いた代謝活性の測定によって、細胞生存率に対するドキシサイクリン誘導λ−Ｓ１０５発現の効果を判定した結果を示す。（Ａ）◆非トランスフェクトＨｅＬａ細胞、■ＨｅＬａ細胞クローン２４、ｓ  ＨｅＬａ細胞クローン３５、６  ＨｅＬａ細胞クローン３６。（Ｂ）◆非トランスフェクト２９３細胞、■２９３細胞クローン３、ｓ  ２９３細胞クローン６、６  ２９３細胞クローン１。
【図８】ｐＴｅｔ−ＯｎおよびｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒで安定してトランスフェクトされた（Ａ）ＨｅＬａおよび（Ｂ）２９３細胞クローンのトリパンブルー排除アッセイによって測定された細胞生存率に対するドキシサイクリン誘導λ−Ｓ１０５発現の効果を示す図である。（Ａ）◆非トランスフェクトＨｅＬａ細胞、■ＨｅＬａ細胞クローン２４、ｓ  ＨｅＬａ細胞クローン３５、６  ＨｅＬａ細胞クローン３６。（Ｂ）◆非トランスフェクト２９３細胞、■２９３細胞クローン３、ｓ  ２９３細胞クローン６、６  ２９３細胞クローン１。
【図９】複合Ｔｅｔオン／Ｔｅｔオフ調節系のコンポーネントをコードするレトロウイルスベクターを示す図である［６８］。ベクターｐＬｉｂ−ｒｔＴＡ−Ｍ２−ＩＲＥＳ−ＴＲＳＩＤ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏｒは、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）をベースにしている。ＬＴＲはＭＬＶ長末端反復を示し；ＩＲＥＳは内部リボゾーム進入部位を示し；Ｐｕｒｏｒはピューロマイシン耐性遺伝子を示し；Ψ＋はＭＬＶパッケージングシグナルを示し；ｒｔＴＡ−Ｍ２は逆Ｔｅｔ−調節転写活性化因子（ｒｔＴＡ）の高アフィニティー変異型を示し；ＴＲＳＩＤはヒストン−デアセチラーゼ−リクルーティングＴｅｔ−リプレッサータンパク質を示す。
【図１０】ｐＬｉｂ−ｒｔＴＡ−Ｍ２−ＩＲＥＳ−ＴＲＳＩＤ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏｒで安定して感染され、ｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒで安定してトランスフェクトされたＨｅＬａ、２９３、およびＭＣＦ−７細胞における、ＭＴＴおよびトリパンブルー排除アッセイを使用する細胞生存率の測定によって判定されたλ−Ｓ１０５のドキシサイクリン誘導発現の効果を示す図である。ｏは非トランスフェクトＭＣＦ−７細胞を示し；ｍは非トランスフェクトＨｅＬａ細胞を示し、◇は非トランスフェクト２９３細胞を示し；ｓはλ−Ｓ１０５を発現するトランスフェクト／感染ＭＣＦ−７細胞を示し；６はλ−Ｓ１０５を発現するトランスフェクト／感染ＨｅＬａ細胞を示し；＋はλ−Ｓ１０５を発現するトランスフェクト／感染２９３細胞を示す。
【図１１】免疫不全ＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウスにおけるヒト乳腺腫瘍細胞由来異種移植片に対するλ−Ｓ１０５ホリンタンパク質の効果を示す図である。テトラサイクリン調節系を有し、ｐＵＨＤ１０．３−ホリン−ＨｙｇｒまたはｐＵＨＤ１０．３−ＨｙｇｒでトランスフェクトされたＭＣＦ−７細胞を、ＳＣＩＤ／ｂｅｉｇｅマウスへ皮下注射した。腫瘍が触診可能なサイズに成長したとき、マウスに２ｍｇ／ｍｌの濃度でドキシサイクリンを与えるか（処置群）または通常の飲料水（非処置群）を与えた。ドキシサイクリン処置動物および非処置動物の腫瘍増殖速度を比較した。ｐ＜０．０５の場合に差を統計的に有意とみなした。（Ａ）ｐＵＨＤ１０．３−ホリン−ＨｙｇｒトランスフェクトＭＣＦ−７細胞で得られた腫瘍増殖速度の分析。統計的評価により、処置マウス（＋ｄｏｘ）と非処置マウス（−ｄｏｘ）の腫瘍増殖速度に有意差（ｐ＝０．０４２４）を示した。（Ｂ）ｐＵＨＤ１０．３−ＨｙｇｒトランスフェクトＭＣＦ−７細胞で得られた腫瘍の増殖速度の比較。処置動物（ｏ＋ｄｏｘ）と非処置動物（ｎ−ｄｏｘ）との間に有意差（ｐ＝０．９０１４）は確認されなかった。
【図１２】同系の免疫可能マウスモデルにおけるマウス乳腺癌細胞由来異種移植片腫瘍の増殖に対するλ−Ｓ１０５発現の効果を示す図である。マウス乳腺腺癌細胞（ＴＳ／Ａ）にｐＬｉｂ−ｒｔＴＡ−Ｍ２−ＩＲＥＳ−ＴＲＳＩＤ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏｒを感染させた後、ｐＵＨＤ１０．３−Ｈｙｇｒでトランスフェクションした。選択クローンの混合物を同系のＢａｌｂ／ｃマウスにおける皮下異種移植片腫瘍の確立に使用した。ｐＵＨＤ１０．３−Ｈｙｇｒでトランスフェクトした感染細胞も注射した。各群をそれぞれマウス２０匹に分け、ドキシサイクリンで処置し（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）または処置しなかった。腫瘍増殖をモニタリングし、増殖速度を統計的に評価した。（Ａ）非ドキシサイクリン処置マウス（ｏ）およびドキシサイクリン処置マウス（Δ）におけるｐＵＨＤ１０．３−ＨｙｇｒでトランスフェクトしたＴＳＡ細胞、および非ドキシサイクリン処置マウス（●）およびドキシサイクリン処置マウス（τ）におけるｐＵＨＤ１０．３−ＨｙｇｒでトランスフェクトしたＴＳＡ細胞由来の異種移植片の腫瘍増殖。（Ｂ）ドキシサイクリン処置マウスにおけるｐＵＨＤ１０．３−ホリン−Ｈｙｇｒトランスフェクト（ｏ）またはｐＵＨＤ１０．３−Ｈｙｇｒトランスフェクト（ν）ＴＳＡ細胞由来の異種移植片の平均腫瘍増殖速度の比較および統計的評価（対応のないスチューデントｔ検定）。差はきわめて有意（ｐ＝０．００１２）であることがわかった。
【図１３】ｐＬｉｂ−ｒｔＴＡ−Ｍ２−ＩＲＥＳ−ＴＲＳＩＤ−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏｒを感染させ、ｐＵＨＤ１０．３−ホリン−ＨｙｇｒでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞から調製された細胞抽出物の細胞内画分のウェスタンブロット分析を示す図である。細胞をドキシサイクリンで４８時間インキュベートし、λ−Ｓ１０５遺伝子発現を誘導した。総細胞溶解物（Ｔ）を調製し、分画遠心法により、細胞質（Ｃ）、核（Ｎ）、およびミトコンドリア（Ｍ）に分画した。分画タンパク質をシトクロムｃオキシダーゼ（Ｂ）、カルネキシン（Ｃ）、ヌクレオポリン（Ｄ）、およびインテグリン（Ｅ）などのオルガネラ特異的マーカータンパク質の存在をウェスタンブロット法によって分析した。λ−Ｓ１０５タンパク質（Ａ）の存在は、シトクロムｃオキシダーゼおよびカルネキシンとの共局在化によって示されるようにミトコンドリアおよび小胞体において検出された。分子量標準のサイズは左に示されている（ｋＤａ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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