(57)【要約】本発明は、被験者のＤＮＡまたはＲＮＡサンプルにおける三つの特定のＳＮＰを含むハプロタイプの存在および／または血清ＥＮＰＰ１タンパク質濃度の上昇の判定によって、肥満または肥満関連病理の発症に対する被験者のリスク増加を判定する方法を対象とする。本発明はキットにも、および前記ＥＮＰＰ１遺伝子ハプロタイプを含む単離された核酸配列、ベクターまたは組換え細胞にも関するものである。本発明はさらに、肥満または肥満関連病理の治療または予防のための化合物を選択する方法、および患者の肥満または肥満関連病理のリスクを減らす医薬品の有効性を判定する方法も含んでいる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含む被験者の生体サンプルから、被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法であって、
ａ）タンパク質ＥＮＰＰ１をコードする少なくとも一つの対立遺伝子またはＲＮＡ配列において、前記配列またはその断片が、三つの次のＳＮＰ、
・Ｋ１２１Ｑ、
・ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および
・３’ＵＴＲドメイン配列内に位置するＳＮＰ
を有するハプロタイプを含んでいるかを判定する過程と、
ｂ）前記ハプロタイプの存在は被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いことを示すので、前記配列またはその断片が前記ハプロタイプを含んでいるかを観察することによって前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いか否かを観察する過程
とから成る方法。
【請求項２】
肥満関連病理が２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症および高脂質血症から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
肥満関連病理が２型糖尿病であることを特徴とする、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
３’ＵＴＲドメイン内に位置する前記ＳＮＰが、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、Ａ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡ、およびＣ＞Ｔ＋１１５７ＴＧＡから成るＳＮＰ群から選択されることを特徴とする、請求項１から３のいずれか一つに記載の方法。
【請求項５】
３’ＵＴＲドメイン内に位置する前記ＳＮＰが、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡおよびＡ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡから成るＳＮＰ群から選択されることを特徴とする、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
３’ＵＴＲドメイン内に位置する前記ＳＮＰがＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
請求項１から６のいずれか一つに記載の方法の過程ａ）とｂ）から成ることを特徴とする、被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法であって、
過程ａ）で、被験者が前記三つのＳＮＰを含む前記ハプロタイプについて同型接合であるか否かが判定され、
過程ｂ）で、同型接合は被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いことを示すので、前記被験者が前記ハプロタイプについて同型接合であるかを観察することによって被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いか否かを観察する
方法。
【請求項８】
前記三つの対立遺伝子がリスクであるハプロタイプの有無を判別する過程ａ）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記ハプロタイプＳＮＰを含む可能性のあるゲノムＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列、またはその断片を増幅する過程を含む方法によって実施されることを特徴とする、請求項１から７のいずれか一つに記載の方法。
【請求項９】
ＰＣＲ過程が、次のプライマーセット、
ａ）「Ｋ１２１Ｑ」ＳＮＰに対して、５’−ＴＣＡＴＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）と５’−ＣＡＡＴＡＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣＴＡＡ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）、
ｂ）ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１のＳＮＰに対して、５’−ＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＧＴＴ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と５’−ＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）、および
ｃ）Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡのＳＮＰに対して、５’−ＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＣＴ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）と５’−ＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＴＡＧＧＣＣＧ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）
を用いて、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは逆転写過程の結果得られたｃＤＮＡ、またはその断片から実施されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ハプロタイプの存在がＲＮＡ配列またはその断片において判別されるときに、前記生体サンプルが肝臓、脂肪細胞または膵臓ベータ細胞のサンプルであることを特徴とする、請求項１から９のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１１】
被験者の血漿または血清サンプルから、前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法であって、
ａ）血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度を測定する過程と、
ｂ）有意に高い濃度の存在は被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いことを示すので、前記濃度が通常レベルより有意に高いかを観察することによって前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いか否かを観察する過程
とから成ることを特徴とする方法。
【請求項１２】
血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質の有意に高い濃度が、正常な血清または血漿の濃度より少なくとも１０％高い、好適には１５％以上高い濃度に対応することを特徴とする、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度が、ＥＮＰＰ１タンパク質を特異的に認識することができる抗体を用いて測定されることを特徴とする、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＥＮＰＰ１タンパク質と前記抗体の間で特定の免疫複合体の形成を可能にする条件下で前記抗体を試験対象の血清または血漿と接触させ、形成された免疫複合体を定量することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１１から１４のいずれか一つに記載の方法を含み、さらに請求項１および４から６に定義された三つのＳＮＰを含むハプロタイプの存在の判定を含むことを特徴とする、被験者の血漿または血清サンプルから前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法。
【請求項１６】
肥満関連病理が２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症および高脂質血症から成る群から選択されることを特徴とする、請求項１１から１５のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１７】
肥満関連病理が２型糖尿病であることを特徴とする、請求項１１から１６のいずれか一つに記載の方法。
【請求項１８】
被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定するためのキットであって、タンパク質ＥＮＰＰ１をコードし、三つの次のＳＮＰ、
・Ｋ１２１Ｑ、
・ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および
・３’ＵＴＲドメイン配列内に位置するＳＮＰ
を有するハプロタイプを含む可能性のあるゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの断片を増幅することのできる、少なくとも一つのプライマー対またはセットのプライマー対から成ることを特徴とするキット。
【請求項１９】
前記少なくとも一つのプライマー対またはセットのプライマー対が、タンパク質ＥＮＰＰ１をコードし、三つの次のＳＮＰ、
・Ｋ１２１Ｑ、
・ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、ならびに
Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、Ａ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡ、およびＣ＞Ｔ＋１１５７ＴＧＡから成るＳＮＰ群から選択された３’ＵＴＲドメイン内に位置するＳＮＰ
を有するハプロタイプを含む可能性のあるゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの断片を増幅することが可能であることを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
【請求項２０】
前記少なくとも一つのプライマー対またはセットのプライマー対が、タンパク質ＥＮＰＰ１をコードし、三つの次のＳＮＰ、
・Ｋ１２１Ｑ、
・ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および
・３’ＵＴＲドメイン内に位置する、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡまたはＡ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡのＳＮＰ
を有するハプロタイプを含む可能性のあるゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの断片を増幅することが可能であることを特徴とする、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
前記少なくとも一つのプライマー対またはセットのプライマー対が、タンパク質ＥＮＰＰ１をコードし、三つの次のＳＮＰ、
・Ｋ１２１Ｑ、
・ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および
・３’ＵＴＲドメイン内に位置するＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ
を有するハプロタイプを含む可能性のあるゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの断片を増幅することが可能であることを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
前記少なくともセットのプライマー対が、
ａ）「Ｋ１２１Ｑ」ＳＮＰに対して、５’−ＴＣＡＴＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）と５’−ＣＡＡＴＡＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣＴＡＡ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）、
ｂ）ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１のＳＮＰに対して、５’−ＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＧＴＴ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と５’−ＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）、および
ｃ）Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡのＳＮＰに対して、５’−ＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＣＴ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）と５’−ＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＴＡＧＧＣＣＧ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）
であることを特徴とする請求項１８から２１のいずれか一つに記載のキット。
【請求項２３】
請求項１および４から６に定義された三つのＳＮＰから成るハプロタイプの存在を少なくとも含んでいることを特徴とする、哺乳類、好適にはヒトの、ＥＮＰＰ１タンパク質をコードする遺伝子のゲノムＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の単離された変異核酸配列またはその相補的配列。
【請求項２４】
請求項２３に記載の核酸配列を含んでいるクローニングベクターおよび／または発現ベクター。
【請求項２５】
請求項２４に記載のベクターによって形質転換された宿主細胞。
【請求項２６】
請求項２５に記載の形質転換細胞を含有するか、または請求項１および４から６に定義された三つのＳＮＰを含む少なくともハプロタイプを有する機能的な組換えＥＮＰＰ１遺伝子を含んでいる細胞を含有することを特徴とする、ヒト以外のトランスジェニック哺乳類。
【請求項２７】
肥満または肥満関連病理の治療または予防のための化学化合物または生化学化合物をスクリーニングするための、請求項２５に記載の細胞または請求項２６に記載のトランスジェニック哺乳類の使用方法。
【請求項２８】
肥満または肥満関連病理の治療または予防のための化学化合物または生化学化合物を選択するための方法であって、
ａ）請求項２５に記載の細胞または請求項２６に記載のトランスジェニック哺乳類を試験対象の前記化学化合物または生化学化合物と接触させる過程と、
ｂ）ＥＮＰＰ１遺伝子の発現産物が前記細胞または前記哺乳類において減少したか否かを観察する過程
とから成ることを特徴とする方法。
【請求項２９】
請求項２８に記載の肥満または肥満関連病理の治療または予防のための化学化合物または生化学化合物を選択するための方法において、
・過程ａ）において、試験対象の前記化学化合物または生化学化合物を請求項２６に記載のトランスジェニック哺乳類またはＥＮＰＰ１タンパク質を過剰発現するトランスジェニック哺乳類に投与し、さらに
・過程ｂ）において、血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度が基準と比較して減少したかを観察し、
前記濃度の減少が認められたときに前記化学化合物または生化学化合物を選択することを特徴とする方法。
【請求項３０】
患者における肥満または肥満関連病理のリスクを減らすための医薬品の有効性を判定する方法であって、
（ａ）前記患者への前記医薬品の投与の前後に前記患者から血清または血漿サンプルを採取する過程と、
（ｂ）前記治療後の血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度の低下は肥満または肥満関連病理のリスクを低下する治療の指標であるため、前記採取したサンプルにおける血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度を測定する過程
とから成る方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は被験者のＤＮＡもしくはＲＮＡサンプルにおける三つの特定のＳＮＰを含むハプロタイプの存在および／または血清ＥＮＰＰ１タンパク質濃度の上昇の判定によって、肥満または肥満関連病理の発症に対する被験者のリスクの増加を判定する方法を対象とする。本発明はキットにも、また、前記ＥＮＰＰ１遺伝子のハプロタイプを含む単離された核酸配列、ベクターまたは組換え細胞にも関するものである。本発明はさらに、肥満または肥満関連病理の治療または予防のための化合物の選択方法、および患者の肥満または肥満関連病理のリスクを減らす医薬品の有効性を判定する方法も含んでいる。
【背景技術】
【０００２】
肥満は深刻な疾患である。肉体的健康を損なうことに加えて、肥満は自尊心に影響を与えるので精神的健康にも大きな打撃を与えることがあり、それが最終的には人が他者と社会的に交流する能力を損なわせることがある。不幸なことに、肥満は十分理解されているとは言えず、肥満に対する社会的固定観念と推測はこの疾患の心理的影響を深刻化させる傾向にあるだけである。個人と社会に対する肥満の影響が大きいため、肥満治療の方法を発見するために多くの努力がなされたが、肥満の長期治療および／または予防に対してはほとんど成果が得られていない。
【０００３】
肥満は体重障害の中で最も一般的なものであり、西欧諸国において最も重要な栄養障害であり、中年層では３０％から５０％に蔓延していると推定されている。除脂肪体重に対する体脂肪の過剰と定義される肥満は、他の疾患の一因にもなっている。例えば、この障害は冠動脈疾患、高血圧、脳卒中、糖尿病、高脂血症、および一部のガンなどの発症率も増加させる。肥満は単なる生活習慣の問題、すなわち自発的な過食の結果ではない。むしろ、肥満者と健常者の間に見られる身体組成の差は、代謝および神経／代謝相互作用の両方における差の結果である。これらの差は、ある程度、遺伝子発現の差、および／または遺伝子産物レベルもしくは遺伝子活性レベルの差に起因すると思われる。肥満の疫学研究はこの障害が遺伝する特性を呈することを強く示している。
【非特許文献１】Ｍｅｙｒｅ，  Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｃａｎ  ｆｏｒ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｔｒａｉｔｓ  ｉｎ  Ｆｒｅｎｃｈ  ｆａｍｉｌｉｅｓ  ｓｈｏｗｓ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  ６ｑ２２．３１−ｑ２３．２．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３，  ８０３−１１  （２００４）．
【非特許文献２】Ａｔｗｏｏｄ，  Ｌ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｏｍｅｗｉｄｅ  Ｌｉｎｋａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｂｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ  ａｃｒｏｓｓ  ２８  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｓｔｕｄｙ．  Ａｍ．  Ｊ．  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅｔ．  ７１，  １０４４−５０  （２００２）．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
したがって、要するに、大きな、世界的な健康問題を引き起こしている肥満は、複雑で、高度に遺伝される形質である。かかる障害の重篤性、蔓延および潜在的不均一性に鑑み、とくに、この病理または肥満関連病理の発症のリスクを予見し、および／またはより標的を絞った薬剤を開発することができるように、肥満の制御に関与する遺伝子を識別することが強く必要とされている。それが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
以前の研究は、小児肥満の遺伝子座を、２．４Ｍｂの２型糖尿病・肥満に連鎖した領域を含む、染色体６ｑ１６．３−ｑ２４．２上に識別しており（ロッドスコア＝４．０６）１、前記遺伝子座は、この領域における連鎖を報告している八つの公開されたゲノムスキャン全てに共通である１−８。
【０００６】
本発明者は、３１４７人のフランス系白人の被験者と６０００人を超える欧州人の被験者において、５８０ｋｂのＥＮＰＰ１領域における遺伝子型・表現型の関連研究とＥＮＰＰ１のｍＲＮＡの発現研究を実施した。
【０００７】
ＥＮＰＰ１遺伝子は、エクト型ヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ（ＥＮＰＰ）ファミリーのメンバーであるエクト型ヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼ１（ＥＮＰＰ１）をコードする。コードされたタンパク質はジスルフィド結合で連結した二つの同一のサブユニットからなるＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。このタンパク質は広い特異性を有し、ヌクレオチドや糖ヌクレオチドのホスホジエステル結合、およびヌクレオチドや糖ヌクレオチドのピロリン酸結合を含む、多種多様な基質を切断する。このタンパク質はヌクレオシド５’三リン酸をその対応する一リン酸塩に加水分解する機能を有し得、またジアデノシンポリリン酸を加水分解し得る。この遺伝子の突然変異は、とくに、「突発性」乳児動脈石灰化（ＧＬＵ８９３ＴＥＲ、ＡＲＧ７７４ＣＹＳ、またはＬＥＵ５７９ＰＨＥ）、脊椎の後縦靭帯骨化症（ＯＰＬＬ）（ＩＶＳ２０ＡＳ、１−ＢＰ  ＤＥＬ、Ｔ、−１１）およびインスリン抵抗性（ＬＹＳ１２１ＧＬＮ、「Ｋ１２１Ｑ」突然変異）に関連づけられてきた。
【０００８】
発明者は、このＥＮＰＰ１遺伝子の変異体、特に三つの対立遺伝子がリスクであるハプロタイプ（Ｋ１２１Ｑ、ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および３’ＵＴＲドメイン配列内に位置するＳＮＰ（特にＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、ＱｄｅｌＴＧ））と、小児肥満および病的肥満の大人との間に最も強い関連があることを実証した。発明者は、リスクハプロタイプの少なくとも一つの対立遺伝子の存在が、高いＥＮＰＰ１発現をさらに示唆する、小児における可溶性ＥＮＰＰ１タンパク質の血清レベルの増加と関連づけられることも実証した。くわえて、肥満に関連するＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡのＳＮＰを含む長いＥＮＰＰ１のｍＲＮＡアイソフォームの発現が、グルコース恒常性に主として重要な三つの組織、すなわち、膵島β細胞、脂肪細胞および肝臓に特異的であることが見出された。これらの所見は、肥満と２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の両方の発症においてＥＮＰＰ１のいくつかの変異体がインスリン抵抗性の成立に主要な役割を果たすことを初めて実証するものであり、蔓延している両疾患に共通する分子機構を提案するものである。
【０００９】
発明者は、肥満および／または肥満関連病理を発症するリスクを診断することならびに治療処置のための分子を識別することに用いることができるスクリーニングアッセイも提供している。
【００１０】
したがって、第一の態様において、本発明は、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含む被験者の生体サンプルから、前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法であって、
ａ）タンパク質ＥＮＰＰ１をコードする少なくとも一つの対立遺伝子またはＲＮＡ配列において、前記核酸配列またはその断片が、表３に示されたＳＮＰで変異対立遺伝子の頻度が５％を超えるＳＮＰから成るＳＮＰ群から選択された、少なくとも一つのＳＮＰを含んでいるかを判定する過程と、
ｂ）前記ＳＮＰの存在は被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いことを示すので、前記配列またはその断片が前記少なくとも一つのＳＮＰを含んでいるかを観察することによって、前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いか否かを観察する過程
とから成る方法を対象とする。
【００１１】
好ましい実施態様において、本発明は、ゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含む被験者の生体サンプルから、前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法であって、
ａ）タンパク質ＥＮＰＰ１をコードする少なくとも一つの対立遺伝子またはＲＮＡ配列において、前記核酸配列またはその断片が、ＩＶＳ２  ｄｅｌＧ＋８、Ｋ１２１Ｑ、ＩＶＳ８  Ｔ＞Ｇ＋２７、ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、およびＴ＞Ｇ＋５９５４ＴＧＡから成るＳＮＰ群から選択された少なくとも一つのＳＮＰを含んでいるかを判定する過程と、
ｂ）前記ＳＮＰの存在は被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いことを示すので、前記配列またはその断片が前記少なくとも一つのＳＮＰを含んでいるかを観察することによって、前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いか否かを観察する過程
とから成る方法を含んでいる。
【００１２】
第二の態様において、本発明はゲノムＤＮＡまたはＲＮＡを含む被験者の生体サンプルから、前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法であって、
ａ）タンパク質ＥＮＰＰ１をコードする少なくとも一つの対立遺伝子またはＲＮＡ配列において、前記核酸配列またはその断片が、次の三つのＳＮＰ、
・Ｋ１２１Ｑ（ｒｓ１０４４４９８）、
・ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および
・３’ＵＴＲドメイン配列内に位置するＳＮＰ
を有するハプロタイプを含んでいるかを判定する過程と、
ｂ）前記ハプロタイプの存在は被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いことを示すので、前記配列またはその断片が前記ハプロタイプを含んでいるかを観察することによって、前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いか否かを観察する過程
とから成る方法を対象とする。
【００１３】
本明細書において、例えば「ｒｓ１０４４４９８」という表現の中の「ｒｓ」という用語は、データバンクｄｂＳＮＰにおけるＳＮＰの名称に対応する。
【００１４】
ＳＮＰ「Ｋ１２１Ｑ（ｒｓ１０４４４９８）」は、ＥＮＰＰ１変異体「Ｋ１２１Ｑ」に対応するＳＮＰであるｒｓ１０４４４９８を示すものである（１２１は寄託番号（Ａ．Ｎ．）ＮＰ＿００６１９９を有するＥＮＰＰ１アミノ酸配列（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１４）におけるアミノ酸の位置であり、寄託番号ＡＡＨ５９３７５を有するＥＮＰＰ１アミノ酸配列においては１７３位に対応する。寄託番号ＢＣ０５９３７５はＡ．Ｎ．ＡＡＨ５９３７５で表される配列を有するヒトＥＮＰＰ１タンパク質をコードするｍＲＮＡのヌクレオチド配列に対応する）。
【００１５】
ＳＮＰ「ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１」は下に示したようにＥＮＰＰ１のエクソン２１の前の−１１位に対応する。
ＡａａａａｔｔａｇｃｃａｇｇｃｇｔｇｇｔｇｇｇｔｃａｃａｃｃｔｇｔａａｔｃｃｃａｇｃａｃｔｔｔｇａｇｇｇｇｇｃｔｇｃａｇｃｇｇａｔｇｇａｔｃａｃｃｔｇａｇｇｔｃａｇｇａｇｃｔｃａａｇａｃｃａｇｃｃｔｔｇｃｃａａｃａｔｇｇｔｇａａａｃｃｃｃａｔｃｔｃｔａｃｃａａａａａｃａｃａａａａａｔｔａｇｃｃａｇｇｃｇｔｇｇｔｇｇｃａｇａｔｇｃｃｔｇｔａｇｔｃｃｃａｇｃｔａｃｔｃｇｇｇａａｇｃｔｇａｇｇｃａｇｇａｇａａｔｃｇｃｔｔｇａａｃｃｔｇｇｇｇｇｇｃａｇａｇｔｔｇｃｇｇｔｇａｇｃｃｇａｇａｔｔｇｃｇｃｃｇｃｔｇｃｃｃｔｃｔａｇｔｃｔｇｇｇｔｇａｃａｇａｇｔｇａｇａｃｔｃｃａｔｃｔｔａａａａａａａｔａａｔａａｔａａｔａａａｔａａａｔａａａｔａａａｔａａａｔａａａｔａｔｔｔａａａａｔｔｇｔｇｔａｇａｔａａａａｔｃａｔｔｃｔａａａｃａｔｔａｔｔｔｃａｔａｔｔａｇｃａｔａｇｃａｇａａｔｃｔｇａａａａｔａｔｔｔｇｃａｔａａａｔａｔｇａｃａａｔｔａａｔａｔｃｔｔｔａａｔａｔｔｇｔａａａｇｃａｔｔｔｔｔａｃａｃｔｔｔａｇｔｔａｇａａａａａａａｇａｔｇａａｔａｔａｃｔａｇｔａｇｇａａａａｔａｇｇｇａａｇｇａｃａｔｇａｇｃｔｇａｃａｇｃｔａｇａｇｃｔｔｃａｔａａｔｔｔｔａｔｇａｔｇｔａｇｔｔｃａｃｃｔｔｔａａａｔａｔｔａａｔａａａｇｃａＡｔｔｔｔｃｔｔｃｔｃｔｇｔｇｃｃｔｇａｔａｔｃｔｇａｇａｇｔｔｃｔｔｃｔｃａｔｔｔｔ（ｄｅｌＴ）ｃｇｔｔｃｔｔｃａｇＧＡＣＡＧＴＴＴＣＴＣＴＡＣＧＧＡＡＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＣＴＧＴＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＣＴＴＴＡＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＴＡＧＴＣＣＴＧＴＣＣＡＴＡＡＡＴＧＴＴＣＡＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＡＴＡＡＣＡＣＣＡＡＡＧＴＧＡＧＴＴＡＣＧＧＧＴＴＣＣＴＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＣｇｔａａｇｔｔｔｔｔｔｃｃｔｃｔｃｃｔｇａｃｃｔｔｃｃｃｔｔｔｔｃｔｃｃｔｔｔｔｔｇｔｔｔｔｃｔｔｔｃｔｔｇｔｔｔａｔａａａｔｃｃｔａｃｃａｔａｃａｔｔａｔａｇｇｇｔａａｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ：１）
【００１６】
「ハプロタイプ」という用語は個体またはサンプル内に存在する対立遺伝子の組合せを意味する。本発明において、ハプロタイプは、所与の個体に見出される、表現型に関連すると考えられる多型対立遺伝子の組合せを特に指している。
【００１７】
本書における「多型」という用語は、異なるゲノムまたは個体の間で二つ以上の代替的なゲノム配列または対立遺伝子が生じることを意味する。「多型性」は特定のゲノム配列の二つ以上の変異体が個体群の中に見出される状況を意味する。「多型部位」は変異が生じている遺伝子座である。「一塩基多型」（ＳＮＰ）は一塩基対の変化である。典型的には、一塩基多型は多型部位における一つのヌクレオチドの別のヌクレオチドによる置換である。単一のヌクレオチドの欠失または単一のヌクレオチドの挿入も、一塩基多型を生じさせる。
【００１８】
変異核酸は、特に人間において自然に存在する、とりわけヌクレオチドの欠失、置換および／または付加に対応する、全ての代替的な核酸配列を意味するものと理解される。本願の場合、変異核酸配列はとりわけ、肥満または肥満関連病理を発症するリスクの増加に部分的に関連する。
【００１９】
本書で交換可能に使用される用語「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」には、一本鎖または二本鎖のいずれかの、二つ以上のヌクレオチドからなるＲＮＡ配列、ＤＮＡ配列またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド配列が含まれる。
【００２０】
本書で用いられる用語「核酸」および「核酸分子」は、ＤＮＡ分子（例えばｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（例えばｍＲＮＡ）、ならびにヌクレオチド類似体を用いて生成したＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むものとする。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好適には二本鎖ＤＮＡである。本明細書を通して、「ヌクレオチド配列」という表現は、ポリヌクレオチドまたは核酸を区別なく指すために用いられることがある。より正確には、「ヌクレオチド配列」は核酸物質自体を包含し、したがって、特定のＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子を生化学的に特徴づける配列情報（すなわち四つの塩基の文字から選択された文字の連続）に限定されない。また、本書において、用語「核酸」、「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は交換可能に使用される。
【００２１】
好ましい実施態様において、前記肥満関連病理は、２型糖尿病、心臓疾患、冠動脈疾患、心筋梗塞、高血圧、および脂質に関連する代謝異常、例えば高コレステロール血症、高脂質血症などから成る群から選択される。
【００２２】
より好ましい実施態様において、前記肥満関連病理は２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）である。
【００２３】
３’ＵＴＲドメイン配列内に位置する前記ＳＮＰに関して、好適にはこのＳＮＰは、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ（ｒｓ７７５４５６１）、Ａ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡ（ｒｓ７７５４５８６）、Ｃ＞Ｔ＋１１５７ＴＧＡ（ｒｓ７７５４８５９）、Ｇ＞Ｔ＋１１０１ＴＧＡ、Ｔ＞Ｃ＋１１３７ＴＧＡ、Ｃ＞Ｔ＋１１５７ＴＧＡ、Ｇ＞Ｔ＋１２３６ＴＧＡ、Ｔ＞Ｃ＋１３４８ＴＧＡ、Ｇ＞Ａ＋１３５０ＴＧＡ、Ａ＞Ｇ＋１５３９ＴＧＡおよびＴ＞Ｃ＋１６７０ＴＧＡから成るＳＮＰ群から選択される。より好適には、ＳＮＰはＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、Ａ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡおよびＣ＞Ｔ＋１１５７ＴＧＡから成る群から選択され、３’ＵＴＲドメイン内に位置するＳＮＰであるＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡが最も好適である。
【００２４】
同様に好適なのは、本発明による上述の方法の過程ａ）とｂ）から成ることを特徴とする、被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法であって、
過程ａ）で、被験者が前記三つのＳＮＰを含む前記ハプロタイプについて同型接合であるか否かが判定され、
過程ｂ）で、同型接合は被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いことを示すので、前記被験者が前記ハプロタイプについて同型接合であるかを観察することによって被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いか否かを観察する
方法である。
【００２５】
天然の遺伝子と比較して遺伝子内の変異を検出することを可能にする方法は、もちろん、きわめて数多くある。それらの方法は本質的に二つの大きな部類に分けることができる。第一のタイプの方法は、変異の存在が、代替的配列を対応する正常な配列と比較することによって検出されるものであり、第二のタイプは、変異の存在が間接的に、例えば、変異の存在によるミスマッチの存在によって検出されるものである。
【００２６】
対立遺伝子の変異性の判別方法の中で、本発明によるヌクレオチド配列のプライマー対を用いた、本発明による、三つの対立遺伝子がリスクであるハプロタイプから成る標的配列のいわゆるＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）あるいはＰＣＲ様増幅のための少なくとも一つの段階を含む方法が好適である。増幅産物を適切な制限酵素で処理してから、標的生成物の検出またはアッセイを実施してもよい。
【００２７】
ＰＣＲ様増幅は、核酸配列の直接的または間接的な複製を用いるか、あるいは標識系が増幅されている、全ての方法を意味するものと理解され、これらの技術はもちろん既知であり、一般的に、ポリメラーゼによるＤＮＡ増幅を含む。元のサンプルがＲＮＡであるとき、あらかじめ逆転写を実施することが望ましい。現在この増幅を可能にする方法は数多くあり、例えば、いわゆるＮＡＳＢＡ「核酸配列に基づく増幅（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」、ＴＡＳ「転写に基づく増幅システム（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂａｓｅｄ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）」、ＬＣＲ「リガーゼ連鎖反応（Ｌｉｇａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」、「エンドラン増幅（Ｅｎｄｏ  Ｒｕｎ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」（ＥＲＡ）、「サイクリングプローブ反応（Ｃｙｃｌｉｎｇ  Ｐｒｏｂｅ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ）」（ＣＰＲ）、およびＳＤＡ「鎖置換増幅（Ｓｔｒａｎｄ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」などの方法が当業者には周知である。
【００２８】
したがって、本発明に従って被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが（高度に）増加しているかを判定する方法において、前記三つの対立遺伝子がリスクであるハプロタイプの有無を判別する過程ａ）が、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって前記ハプロタイプＳＮＰを含む可能性のあるゲノムＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列、好適にはＤＮＡ配列、またはその断片を増幅する過程を含む方法によって実施されることを特徴とする方法も、本発明の一部を形成する。
【００２９】
三つの対立遺伝子がリスクであるハプロタイプの有無を判別する過程ａ）が、増幅ＰＣＲ過程を含む方法によって実施されることを特徴とする前記方法において、使用されるプライマーは、ＥＮＰＰ１遺伝子のヌクレオチド配列から推定され、Ｋ１２１Ｑ、ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および３’ＵＴＲドメイン配列（配列ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１５を有する、最初の１１７０ｂｐの３’ＵＴＲドメインの野生型配列（ＴＧＡコドンを含む））内に位置するＳＮＰという三つのＳＮＰを含む、あるいはそれらから成る前記ハプロタイプの存在を検出することを可能にする、全てのプライマーとすることができる。
【００３０】
「プライマー」という用語は、標的ヌクレオチド配列に対して相補的で、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズさせるために用いられる特定のオリゴヌクレオチド配列を意味する。プライマーはＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素によって触媒されるヌクレオチド重合の開始点の役割を果たす。
【００３１】
本発明の方法に使用できるプライマーは、当該分野で既知の任意の方法のために、開示された配列から設計することができる。プライマーの好ましいセットは、標的配列と同一の隣接範囲の３’末端がプライマーの３’末端に存在するように構成される。このような構造は、プライマーの３’末端が選択された核酸配列とハイブリダイズすることを可能にする。
【００３２】
対立遺伝子特異的プライマーは、多型が隣接範囲の３’末端に存在し、隣接範囲がプライマーの３’末端に存在するように設計される。かかる対立遺伝子特異的プライマーは、多型で見られる二つの対立遺伝子のうちの一つを含む核酸サンプルと共に使用される限りにおいて、増幅または配列決定反応を選択的に引き起こす傾向がある。
【００３３】
好ましい実施態様において、本発明に従った、被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが（高度に）増加しているかを判定する前記方法は、ＰＣＲ過程が次のプライマーセット、
ａ）「Ｋ１２１Ｑ」ＳＮＰに対して、５’−ＴＣＡＴＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）と５’−ＣＡＡＴＡＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣＴＡＡ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）、
ｂ）ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１のＳＮＰに対して、５’−ＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＧＴＴ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と５’−ＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）、および
ｃ）Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡのＳＮＰに対して、５’−ＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＣＴ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）と５’−ＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＴＡＧＧＣＣＧ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）
を用いて、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは逆転写過程の結果得られたｃＤＮＡ、またはその断片から実施されることを特徴とする。
【００３４】
特定の実施態様において、本発明に従った、被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが（高度に）増加しているかを判定する前記方法は、ＰＣＲ過程が次の二つのプライマーセット、
ａ）−５’−ＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＧＣＡＴＴＧＴＣＡ−３’（フォワードプライマー  エクソン７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）と
−５’−ＴＴＴＣＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＡＣ−３’（リバースプライマー  エクソン１２、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）、
および３’ＵＴＲのＳＮＰについて
ｂ）−５’−ＧＴＣＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＡ−３’（フォワードプライマー  エクソン２３、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）と
−５’−ＣＣＣＴＴＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＡ−３’（リバースプライマー  ３’ＵＴＲ、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）
を用いて、ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは逆転写過程の結果得られたｃＤＮＡ、またはその断片から実施されることを特徴とする。
【００３５】
また、さらに別の好ましい実施態様において、本発明に従った、被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが（高度に）増加しているかを判定する前記方法は、前記ハプロタイプの存在がＲＮＡ配列またはその断片において判別されるときに、前記生体サンプルが肝臓、脂肪細胞または膵臓ベータ細胞のサンプルであることを特徴とする。
【００３６】
本発明のさらに別の実施態様は、被験者の血漿または血清サンプルから、前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法であって、
ａ）血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度を測定する過程と、
ｂ）有意に高い前記濃度の存在は被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いことを示すので、前記濃度が通常レベルより有意に高いかを観察することによって前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが高いか否かを観察する過程
とから成る方法に関するものである。
【００３７】
好ましい実施態様において、血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質の有意に高い濃度は正常な血清または血漿の濃度より少なくとも１０％高い、好適には１５％以上高い濃度に対応する。
【００３８】
本発明はさらに、本発明に従った、被験者の血漿または血清サンプルから前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法であって、前記血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度が、ＥＮＰＰ１タンパク質またはその特定のエピトープ断片を特異的に認識することができる抗体を用いて測定されることを特徴とする方法にも関するものである。
【００３９】
好ましい実施態様において、前記方法は、ＥＮＰＰ１タンパク質と前記抗体の間で特定の免疫複合体の形成を可能にする条件下で前記抗体を試験対象の血清または血漿と接触させ、形成された免疫複合体を定量することを特徴とする。
【００４０】
他の態様には、被験者の血漿または血清サンプルから、およびＥＮＰＰ１遺伝子の三つの対立遺伝子がリスクであるハプロタイプを含んでいる可能性のあるゲノムＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列またはその断片を含む生体サンプルから、前記被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定する方法であって、血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度を測定すること、そして前記血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度が正常レベルより有意に高いか否か、および前記ＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が三つの対立遺伝子がリスクであるハプロタイプを有するか否かを観察することから成る方法も含まれる。
【００４１】
被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが（高度に）増加しているかを判定するこれらの方法のための好ましい実施態様において、肥満関連病理は２型糖尿病、高血圧、高コレステロール血症および高脂質血症から成る群から選択され、とりわけ２型糖尿病である。
【００４２】
別の態様において、本発明は、被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定するためのキットであって、ＥＮＰＰ１領域の次の三つのＳＮＰ、
・Ｋ１２１Ｑ、
・ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および
・３’ＵＴＲドメイン配列内に位置するＳＮＰ
におけるヌクレオチドの同一性を判定することによって被験者の遺伝子型を決定するための一つ以上のプライマーもしくはプライマーのセットまたはプローブから成り、必要な試薬と指示の一部または全てを随意に備えたキットも含んでいる。
【００４３】
前記キットのプライマーまたはプローブは随意に固体担体に取り付けられるか、ポリヌクレオチドのアレイまたはアドレス可能アレイの一部とすることができる。このキットは、シーケンシングアッセイ法、マイクロシーケンシングアッセイ法、ハイブリダイゼーションアッセイ法、対立遺伝子特異的増幅法、またはポリメラーゼ連鎖反応および／もしくはリガーゼ連鎖反応に基づくミスマッチ検出アッセイを始めとするがそれらに限定されない既知のいずれかの方法による、ＥＮＰＰ１領域位置のこれら三つのＳＮＰにおけるヌクレオチドの同一性の判定で利用することができる。
【００４４】
好ましい実施態様において、被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定するための前記キットは、タンパク質ＥＮＰＰ１をコードし、三つの次のＳＮＰ、
・Ｋ１２１Ｑ、
・ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および
・３’ＵＴＲドメイン配列内に位置するＳＮＰ
を有するハプロタイプを含む可能性のあるゲノムＤＮＡまたはＲＮＡの断片を増幅することのできる、少なくとも一つのプライマー対またはセットのプライマー対から成ることを特徴とする。
【００４５】
前記キットのためのより好ましい実施態様において、３’ＵＴＲドメイン内に位置するＳＮＰは、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、Ａ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡ、Ｇ＞Ｔ＋１１０１ＴＧＡ、Ｔ＞Ｃ＋１１３７ＴＧＡ、Ｃ＞Ｔ＋１１５７ＴＧＡ、Ｇ＞Ｔ＋１２３６ＴＧＡ、Ｔ＞Ｃ＋１３４８ＴＧＡ、Ｇ＞Ａ＋１３５０ＴＧＡ、Ａ＞Ｇ＋１５３９ＴＧＡ、およびＴ＞Ｃ＋１６７０ＴＧＡから成るＳＮＰ群から選択される。前記キットにさらにより好ましいのは、３’ＵＴＲドメイン内に位置するＳＮＰが、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、Ａ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡ、およびＣ＞Ｔ＋１１５７ＴＧＡから成るＳＮＰ群から選択されることであり、なかでもＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡとＡ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡからなるＳＮＰ群が好ましく、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡが最も好ましい。
【００４６】
特定の実施態様において、本発明は、本発明に従った、被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定するためのキットであって、前記少なくともセットのプライマー対が、
ａ）「Ｋ１２１Ｑ」ＳＮＰに対して、５’−ＴＣＡＴＡＣＴＣＡＧＧＡＡＧＡＣＡＧＣＡＡ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．２）と５’−ＣＡＡＴＡＧＣＣＡＴＧＡＣＴＣＣＴＡＡ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．３）、
ｂ）ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１のＳＮＰに対して、５’−ＡＧＣＡＴＴＴＴＴＡＣＡＣＴＴＴＡＧＴＴ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．４）と５’−ＡＴＡＡＴＧＴＡＴＧＧＴＡＧＧＡＴＴＴ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．５）、および
ｃ）Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡのＳＮＰに対して、５’−ＡＴＡＴＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＴＣＡＣＴ−３’（フォワードプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．６）と５’−ＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＣＣＴＴＡＧＧＣＣＧ−３’（リバースプライマー  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．７）
であることを特徴とするキットを含んでいる。
【００４７】
別の特定の実施態様において、本発明は、本発明に従った、被験者が肥満または肥満関連病理を発症するリスクが増加しているかを判定するためのキットであって、前記少なくともセットのプライマー対が、
ａ）−５’−ＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＧＣＡＴＴＧＴＣＡ−３’（フォワードプライマー  エクソン７、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）と
−５’−ＴＴＴＣＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＡＣ−３’（リバースプライマー  エクソン１２  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）、および３’ＵＴＲのＳＮＰについて
ｂ）−５’−ＧＴＣＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＡ−３’（フォワードプライマー  エクソン２３  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０）と
−５’−ＣＣＣＴＴＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＡ−３’（リバースプライマー  ３’ＵＴＲ  ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１）
であることを特徴とするキットを含んでいる。
【００４８】
別の態様において、本発明は、哺乳類、好適にはヒトの、ＥＮＰＰ１タンパク質をコードする遺伝子のゲノムＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列の単離された変異核酸配列、あるいは単離された核酸分子、またはその相補的配列を対象とするものであり、前記単離された変異核酸配列が、先に定義された三つのＳＮＰであるＫ１２１Ｑ、ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、ならびに、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、Ａ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡ、Ｇ＞Ｔ＋１１０１ＴＧＡ、Ｔ＞Ｃ＋１１３７ＴＧＡ、Ｃ＞Ｔ＋１１５７ＴＧＡ、Ｇ＞Ｔ＋１２３６ＴＧＡ、Ｔ＞Ｃ＋１３４８ＴＧＡ、Ｇ＞Ａ＋１３５０ＴＧＡ、Ａ＞Ｇ＋１５３９ＴＧＡおよびＴ＞Ｃ＋１６７０ＴＧＡから成るＳＮＰ群から選択されたＳＮＰの一つのような３’ＵＴＲドメイン配列内に位置するＳＮＰを含むハプロタイプを含んでいることを特徴とする。Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡまたはＡ＞Ｃ＋１０９２ＴＧＡのＳＮＰが３’ＵＴＲドメイン配列内に位置するＳＮＰとしてより好ましく、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡのＳＮＰが最も好ましい。
【００４９】
「単離された」核酸配列または核酸分子は、核酸の天然源内に存在する他の核酸配列または核酸分子から分離されたものである。好適には「単離された」核酸には、核酸が由来する被験者のゲノムＤＮＡ内の核酸に自然に隣接している配列（すなわち、核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）がない。例えば、様々な実施態様において、本発明の単離された変異核酸配列は、核酸が由来する細胞のゲノムＤＮＡ内の核酸分子に自然に隣接している約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含むことができる。さらに、ｃＤＮＡ分子のような「単離された」核酸分子は、組換え技術によって生成されたときに他の細胞の物質または培養培地をほとんど含まないか、あるいは化学合成したときに化学前駆物質またはその他の化学物質をほとんど含まないものであり得る。本発明の核酸分子は標準的な分子生物学技術と本書に提供した配列情報を用いて単離することができる。先に定義した三つのＳＮＰであるＫ１２１Ｑ、ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および３’ＵＴＲ内に位置するＳＮＰを含むハプロタイプを含むＥＮＰＰ１変異核酸配列の全部または一部を用いて、本発明の単離された核酸分子は標準的なハイブリダイゼーション技術およびクローニング技術を用いて単離することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  Ｊ．，  Ｆｒｉｔｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，  Ｔ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ．  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．，  ２ｎｄ，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９に記載）。
【００５０】
本発明のもう一つの態様は、本発明のＥＮＰＰ１の単離された変異核酸配列をコードする核酸を有するベクター、好適には発現ベクターに関するものである。
【００５１】
本書で用いられる「ベクター」という用語は、自身が結合している別の核酸を運ぶことができる核酸分子を意味する。ベクターの一つのタイプは「プラスミド」であり、これは環状の二本鎖ＤＮＡループを意味し、その中に追加のＤＮＡ断片をライゲーションすることができる。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、これにおいて追加のＤＮＡ断片をウイルスのゲノム内にライゲーションすることができる。いくつかのベクターはそれが導入される宿主細胞内で自己複製が可能である（例えば、細菌由来の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム型の哺乳類ベクター）。その他のベクター（例えば非エピソーム型の哺乳類ベクター）は宿主細胞に導入されると宿主細胞のゲノム内に組み込まれ、それによって宿主のゲノムと共に複製される。さらに、いくつかのベクターはそれらが作用可能に連結している遺伝子の発現を指示することができる。かかるベクターは本書において「発現ベクター」と称する。一般的に、組換えＤＮＡ技術において有益な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」と「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に用いられるベクターの形であるため交換可能に使用できる。しかしながら、本発明は、同等の役割を果たすウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの、発現ベクターの他の形も含むものとする。
【００５２】
本発明の組換え発現ベクターは宿主細胞内での核酸の発現に適した形で、本発明のＥＮＰＰ１タンパク質をコードする遺伝子の単離された変異核酸配列を含むことができるが、それは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作用可能に連結している、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択された一つ以上の調節配列を含んでいることを意味する。組換え発現ベクターにおいて、「作用可能に連結した」とは、関心のあるヌクレオチド配列が（例えば、インビトロでの転写／翻訳システム内、またはベクターが宿主細胞内に導入されるときは宿主細胞内で）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節配列に連結していることを意味するものとする。用語「調節配列」はプロモーター、エンハンサーおよびその他の発現調節エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）を含むものとする。酵母発現ベクターまたはバキュロウイルス発現ベクターなどの本発明の発現ベクターは、タンパク質またはペプチドを生成するために、原核細胞または真核細胞である宿主細胞内に導入することができる。別の実施態様において、本発明の発現ベクターは哺乳類細胞または特定の細胞タイプにおいて選択的に核酸の発現を指示することができる（例えば、核酸の発現のために組織特異的な調節エレメントが用いられる）。
【００５３】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターが導入された宿主細胞に関するものである。用語「宿主細胞」と「組換え宿主細胞」は本書では交換自在に用いられる。かかる用語は特定の被験者の細胞だけでなく、かかる細胞の後代または潜在的な後代も意味するものとする。突然変異または環境の影響によって後続の世代で特定の変化が発生することがあるので、かかる後代は、実際には、親細胞と同一でないこともあるが、それでも本書に使用される用語の範囲に含まれるものとする。
【００５４】
宿主細胞は任意の原核細胞または真核細胞とすることができる。例えば、本発明の単離されたＥＮＰＰ１変異核酸配列は、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母細胞または哺乳類細胞（例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞またはヒトの細胞）内で発現させることができる。その他の適切な宿主細胞は当業者には周知であり、アフリカツメガエル卵母細胞が含まれる。
【００５５】
ベクターＤＮＡは、通常の形質転換またはトランスフェクション技術を介して原核細胞または真核細胞内に導入することができる。本書に使用される用語「形質転換」または「トランスフェクション」は外来核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞内に導入するための当技術分野で知られている様々な技術を意味するものとし、リン酸カルシウム共沈または塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストランを用いたトランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞の形質転換またはトランスフェクションに適した方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．  ２ｎｄ，  ｅｄ．，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．，  １９８９）およびその他の実験マニュアルに見出すことができる。
【００５６】
哺乳類細胞の安定したトランスフェクションについては、使用する発現ベクターまたはトランスフェクション技術に応じて、ごく一部の細胞だけが外来ＤＮＡをそのゲノム内に組み込むことが知られている。これらの組み込み体を識別し選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が一般的に、関心のある遺伝子と共に宿主細胞内に導入される。好ましい選択可能なマーカーには医薬品に対する耐性を付与するものが含まれる。
【００５７】
本発明の宿主細胞は、ヒト以外のトランスジェニック動物の生産にも使用できる。例えば、一つの実施態様において、本発明の宿主細胞は、その中に本発明による単離されたＥＮＰＰ１変異核酸配列が導入される受精卵母細胞または胚性幹細胞である。これによって、かかる宿主細胞を、ゲノム内に本発明の外因性のＥＮＰＰ１変異核酸配列が導入されたヒト以外のトランスジェニック動物、または本発明のハプロタイプの変異体を挿入するために内因性のＥＮＰＰ１核酸配列が改変された相同組換え動物の作成に用いることができる。かかる動物は、ＥＮＰＰ１ポリペプチドまたはその断片の機能および／または活性を研究するために、またＥＮＰＰ１のモジュレーターを識別および／または評価するために有益である。本書で用いられる「トランスジェニック動物」は、その一つ以上の細胞が導入遺伝子を含むヒト以外の動物、好適には哺乳類、より好適にはラットやマウスなどの齧歯類である。トランスジェニック動物のその他の例には、ヒト以外の霊長類、ヒツジ、イヌ、ウシ、ヤギ、ニワトリ、両生類などが含まれる。導入遺伝子はトランスジェニック動物が発生する元となる細胞のゲノム内に組み込まれる外因性ＤＮＡであり、該外因性ＤＮＡが成熟動物のゲノム内に残存することで、トランスジェニック動物の一つ以上の細胞タイプまたは細胞組織におけるコードされた遺伝子産物の発現を指示する。本書で用いられる「相同組換え動物」は、動物の発生に先立って、内因性ＥＮＰＰ１遺伝子が、内因性遺伝子と、動物の細胞内、例えば動物の胚細胞内に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって改変された、ヒト以外の動物、好適には哺乳類、より好適にはマウスである。
【００５８】
本発明のトランスジェニック動物は、例えばマイクロインジェクションまたはレトロウイルス感染によって本発明のＥＮＰＰ１変異核酸を受精卵母細胞の雄性前核内に導入し、卵母細胞を擬妊娠した雌の代理母動物内で発生させることにより作成することができる。あるいは、マウスまたはラットのＥＮＰＰ１遺伝子の変異体などの、本発明によるヒトＥＮＰＰ１遺伝子の変異体のヒト以外の相同体を導入遺伝子として用いることができる。胚操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を作成する方法は当技術分野において一般的となっており、多く報告されている。
【００５９】
相同組換えを介してゲノム内に所望の核酸が導入された動物を作成するために、本発明のハプロタイプの少なくとも三つの突然変異が導入され、それによって改変されたＥＮＰＰ１遺伝子の少なくとも一部を有するベクターが準備される。
【００６０】
したがって、本発明は、本発明による形質転換細胞を含むか、先に定義した三つのＳＮＰ（Ｋ１２１Ｑ、ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、および３’ＵＴＲドメイン配列内に位置するＳＮＰ）を含むハプロタイプを少なくとも含む機能的な組換えＥＮＰＰ１遺伝子を有する細胞を含む、ヒトを除くトランスジェニック哺乳類に関するものである。
【００６１】
別の態様において、本発明は肥満または肥満関連病理の治療または予防のための化学化合物または生化学化合物をスクリーニングするのための、本発明による細胞またはトランスジェニック哺乳類の使用を含んでいる。
【００６２】
好ましい実施態様において、肥満または肥満関連病理の治療または予防のための化学化合物または生化学化合物を選択するための前記方法は、
ａ）本発明による形質転換細胞またはトランスジェニック哺乳類を試験対象の前記化学化合物または生化学化合物と接触させる過程と、
ｂ）ＥＮＰＰ１遺伝子の発現産物が前記細胞または前記哺乳類において減少したか否かを観察する過程
とから成ることを特徴とする。
【００６３】
より好適な実施態様において、本発明による肥満または肥満関連病理の治療または予防のための化学化合物または生化学化合物を選択するための前記方法は、
・過程ａ）において、試験対象の前記化学化合物または生化学化合物を本発明によるトランスジェニック哺乳類またはＥＮＰＰ１タンパク質を過剰発現するトランスジェニック哺乳類に投与し、
・過程ｂ）において、血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度が基準と比較して減少したかを観察し、
前記濃度の減少が認められたときに前記化学化合物または生化学化合物を選択することを特徴とする。
【００６４】
別の態様において、本発明は患者における肥満または肥満関連病理のリスクを減らすための医薬品の有効性を判定する方法であって、
（ａ）前記患者への前記医薬品の投与の前後に前記患者から血清または血漿サンプルを採取する過程と、
（ｂ）前記治療後の血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度の低下は肥満または肥満関連病理のリスクを低下させる治療の指標であるため、前記採取したサンプルにおける血清または血漿のＥＮＰＰ１タンパク質濃度を測定する過程
とから成る方法も対象とする。
【００６５】
実施例
本発明の方法のいくつかを下記の実施例において説明するが、それらは例示のために提供されるものであり、いっさい制限するものではない。本書に規定した本発明には、本発明の趣旨と範囲を逸脱することなく数多くのその他の変更と変型を行うことが可能である。
【００６６】
図面の簡単な説明
図１．４２１人の肥満児と２９８人の対照個体における、ＥＮＰＰ１遺伝子を含む５８０ｋｂ領域内の５３のＳＮＰ間のペアワイズＬＤ。高いＬＤおよび低いＬＤ（デルタ）の領域はそれぞれ赤と青の影で示されている。グラフは物理地図の縮尺のものである。
図２．ＡＲＧ１、ＣＲＳＰ３、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１およびＣＴＧＦ遺伝子を含む５８０ｋｂ領域内の５３のＳＮＰの対立遺伝子の関連。青い円は４２１人の肥満児と２９８人の対照個体の間の対立遺伝子分布の比較についての−ｌｏｇ１０（ｐ値）に対応する。赤い円は６２の「６ｑ−ｅｖｉｄｅｎｃｅ」家族の肥満児と２９８人の対照個体の間の対立遺伝子分布の比較についての−ｌｏｇ１０（ｐ値）に対応する。この図は物理地図位置に従った縮尺ではない。実際には、ＳＮＰは関連の試験結果を容易に視覚表示できるように等距離になっている。
図３．２７９人の小児におけるＥＮＰＰ１タンパク質の血清レベルとＢＭＩのＺスコアとの間の相関。
図４．リスクハプロタイプの存在に照らした、８９人の痩せた小児のＥＮＰＰ１の血清レベル。
図５Ａおよび５Ｂ．ヒトの組織におけるＰＣ−１／ＥＮＰＰ１のｍＲＮＡの発現。β−アクチンとＥＮＰＰ１を検出するためにＰＣＲを実施した。レーン１：心臓、２：脳、３：胎盤、４：肺、５：肝臓、６：骨格筋、７：腎臓、８：膵臓（ＭＴＣパネル）、９：ヒトβ−細胞、１０：皮下脂肪細胞、および１１：大網脂肪細胞。五つのＥＮＰＰ１アイソフォームがデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＩＥＢ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ａｃｅｍｂｌｙ／ａｖ．ｃｇｉ？ｄｂ＝ｈｕｍａｎ＆１＝ＥＮＰＰ１）に記載されていることを考慮して、少なくとも３つの転写産物に共通のエクソン７と１２の間のコード領域を増幅するプライマーを最初に設計し、普遍的に発現されることを見出した（図５Ａ）。つぎに、より大きな３’ＵＴＲ（肥満に関連するＳＮＰであるＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡを含む、ＴＧＡの下流の１１７０の塩基）に特徴を有する長いｍＲＮＡアイソフォームに特異的なプライマーを設計し、膵臓とベータ細胞、皮下脂肪細胞および大綱脂肪細胞および肝臓に特異的な発現を見出した（図５Ｂ）。
【実施例１】
【００６７】
方法
ａ）被験者
それぞれのサンプルについて、表現型の特徴と実施した研究のタイプを表１にまとめた。
【００６８】
【表１】
2008546380.tif 000002
【００６９】
５２９人の血縁関係のない肥満児を研究した。リールのＣＮＲＳ−パスツール研究所ユニットとジャンヌ・ドゥ・フランドル病院で、少なくとも一人の肥満児を有する３３６の家系を収集した。１０６人の追加の肥満児はトゥールーズの小児病院で集められ、８７人はパリのトゥルーソー病院で集められた。ＢＭＩがＲｏｌｌａｎｄ−Ｃａｃｈｅｒａら１２の表に報告された年齢と性別についてのＢＭＩ（フランスの一般的個体群）の９７分位数より大きい子供たちは、欧州小児肥満グループ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  Ｇｒｏｕｐｅ、ＥＣＯＧ）４２の勧告に従って肥満と診断した。６９６人の血縁関係のない病的肥満（ＢＭＩ≧４０ｋｇ／ｍ２）および７１７人の血縁関係のない中程度肥満（ＢＭＩが３０〜４０ｋｇ／ｍ２）の成人患者の組を使用した。ＴＤＴには、成人肥満を有する８７の家系（ＢＭＩが４０ｋｇ／ｍ２を超える一人の発端者、ＢＭＩが２７ｋｇ／ｍ２を超える少なくとも一人の兄弟姉妹、および少なくとも一人の親）も使用した。これらの個体はパリのオテル・ディウ病院の栄養科とリールのＣＮＲＳ−パスツール研究所ユニットで収集した。７５２人のＴ２Ｄ被験者はコルベイユ＝エソンヌのシュド・フランシリアン病院またはリールのＣＮＲＳ−パスツール研究所ユニットで収集した。耐糖能異常および２型糖尿病の状態はＷＨＯの１９９９年の基準に従って定義した。５５６人の対照被験者の第一の組はＳＵＶＩＭＡＸ個体群から得られた４３。６４９人の対照個体の第二の組はリールのＣＮＲＳ−パスツール研究所ユニットと「フルルベ＝ラヴァンチ市保健所」研究４４を通じて収集した。１２６１人の血縁関係のないオーストリア人被験者の組は前述の個体群の無作為な小集団である４５。年齢を適合させていない対照の使用を正当化し、ＳＮＰとハプロタイプの頻度に対する年齢コホートの影響がないことを確認するために、「フルルベ＝ラヴァンチ市保健所」研究４４から得た１９８人の対照小児においてＫ１２１Ｑ、ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１およびＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡの多型の遺伝子型を決定して、対照成人と比較してＱ対立遺伝子（１３．８％）およびリスクハプロタイプ（７．８％）の頻度がきわめて一致していることを見出した。４５８組の対照トリオ（両親と一人の痩せた子供）は「フルルベ＝ラヴァンチ市保健所」のコホートに由来する。書面によるインフォームド・コンセントを参加の前に全ての被験者から得た。遺伝学的研究はパリのオテル・ディウとリールのＣＨＲＵの倫理委員会によって承認された。ＢＭＩのＺスコアはＣｏｌｅの方法に従って得られた４６。経口ブドウ糖負荷試験（ＯＧＴＴ）の際、被験者は１２時間の一晩の断食の後に、１）被験者の体重が５０ｋｇ未満のときは１ｇグルコース／ｋｇを、２）被験者の体重が５０ｋｇを超えるときは７５ｇのグルコースを与えられた。血漿のグルコースとインスリンの濃度を測定するために０分、３０分、６０分、９０分および１２０分に血液サンプルを採取した。血漿インスリンの定量的測定は二抗体ラジオイムノアッセイを用いて実施した。血清グルコース濃度はグルコースオキシダーゼ法を用いて測定した。インスリン分泌指数はＳｅｌｔｚｅｒらに従って計算した���７。
【００７０】
ｂ）連鎖解析
３０６人の個体を含む６８の核家族において、最初のゲノムワイドな研究１の連鎖区間をカバーする五つの多型マーカー（Ｄ６Ｓ１７２０、Ｄ６Ｓ４３４、Ｄ６Ｓ２８７、Ｄ６Ｓ１６５６、Ｄ６Ｓ２９２）を遺伝子型決定に用いた。２点解析および多点解析をＧｅｎｅＨｕｎｔｅｒソフトウェア４９により実行されるＭＬＳ試験４８を用いて実施した。
【００７１】
ｃ）突然変異のスクリーニング
染色体６ｑ１６−ｑ２４遺伝子座での連鎖が見られる家族の中から無作為に選択された４８人の血縁関係のない肥満児と、フランス人の家系から選択された２４人の血縁関係のない肥満ではない正常血糖の対照被験者とにおいて、ＤＨＰＬＣ（Ｔｒａｎｓｇｅｎｏｍｉｃ，  Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，  Ｃａｌｉｆ．，  ＵＳＡ）を用いて２５のエクソンとＵＴＲ（上流５’ＵＴＲと下流３’ＵＴＲ）をスクリーニングした。変異体のプロフィールは、自動ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７００  ＤＮＡシーケンサーとＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア、ＵＳＡ）を組み合わせて用いて配列決定した。
【００７２】
ｄ）遺伝子型決定
マイクロサテライトマーカーの遺伝子型決定を自動ＤＮＡ配列決定機（ＡＢＩ  ３７７、ＰＥ  ＡＢＩ）で蛍光に基づいた半自動の技術を用いて実施した。プライマーはＭＷＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈによって合成されたものである。ＳＮＰはＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）、ＬｉｇｈｔＴｙｐｅｒ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ、バーゼル、スイス）で、ＴａｑＭａｎ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、フォスターシティ、カリフォルニア、ＵＳＡ）で、あるいは直接の配列決定によって遺伝子型決定した。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）とＬｉｇｈｔＴｙｐｅｒ（登録商標）のためのプローブはドイツのＴＩＢ  Ｍｏｌｂｉｏｌ（登録商標）  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｌａｂｏｒによって合成されたものである。５８０ｋｂの領域をカバーするために、白人において対立遺伝子頻度が＞１０％のＳＮＰを、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ  ＳＮＰ  Ｖｉｅｗｅｒ  ＩＩソフトウェアを用いて選択した。ＳＮＰの遺伝子型決定のミスを防止するために、さらなる検証のためＤＮＡサンプルの１０％を体系的に再び遺伝子型決定した。全てのＳＮＰについて一致率は１００％であった。
【００７３】
ｅ）統計分析
症例と対照の間の対立遺伝子頻度の比較をχ２検定を用いて実施し、ｐ値はプログラムＣＬＵＭＰ５０を用いて経験的に計算した。ハプロタイプの頻度はＵＮＰＨＡＳＥＤソフトウェア（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｂｓｕ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｐｅｒｓｏｎａｌ／ｆｒａｎｋ／）５１によって決定し、群間で比較した。質的形質または量的形質の変異に対するハプロタイプの影響はＵＮＰＨＡＳＥＤソフトウェアのサブプログラムｃｏｃａｐｈａｓｅおよびｑｔ−ｐｈａｓｅを用いて評価した５１。関連の独立性はソフトウェアＴＨＥＳＩＡＳ３２で試験した。ＴＨＥＳＩＡＳはＥＭアルゴリズムも実行し、線形フレームワークにおけるハプロタイプの影響のモデルの尤度試験を可能にする。このプログラムを使用して、肥満の状態に対するそれぞれのＳＮＰの影響がＫ１２１Ｑ単独の影響から独立しているかを試験した。ハプロタイプ分析は、これらのＳＮＰが部分的にＬＤであるので、多重ロジスティック回帰よりも好ましい。ＳＮＰとハプロタイプに対するＴＤＴ分析はＵＮＰＨＡＳＥＤソフトウェア５１で実行されるＴＤＴ法によって実施した。リスクハプロタイプの三つのＳＮＰの間のＬＤが低いので、個体群の層別化に対して強固な、真のＴＤＴを得るために、明白なハプロタイプのみを使用した。連鎖に対するリスクハプロタイプの影響を評価するために、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ＩＢＤ  Ｓｈａｒｉｎｇ  Ｔｅｓｔ（ＧＩＳＴ）手順２３を使用した。これは家族のＮＰＬスコアと家族内のリスクハプロタイプ頻度の指数との間の相関を試験するものである。
【００７４】
ｆ）連鎖不均衡分析
２４の識別されたＥＮＰＰ１のＳＮＰの間、および５８０ｋｂのＥＮＰＰ１領域における５３のＳＮＰの間のＬＤ（連鎖不均衡）を調査した。ペアワイズのデルタ（ＳＮＰの間の相関係数）を遺伝子型から推定し、結果をＧＯＬＤプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｐｈ．ｕｍｉｃｈ．ｅｄｕ／ｃｓｇ／ａｂｅｃａｓｉｓ／ＧＯＬＤ／）によって視覚化した。
【００７５】
ｇ）ＥＮＰＰ１のｍＲＮＡの発現
ＭＴＣパネル（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏｎｔｅｃｈ）、皮下脂肪細胞および大綱脂肪細胞（提供：Ｇ  Ｆｒｕｈｂｅｋ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎａｖａｒｒａ、パンプロナ、スペイン）およびＦＡＣＳで精製した膵臓ベータ細胞（提供：Ｈｕｍａｎ  Ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ、リール、フランス５２）から得たヒトｃＤＮＡをｍＲＮＡ発現の分析に使用した。ベータ細胞の純度は免疫化学（９８％インスリン陽性細胞）とＰＣＲ（外分泌細胞に特徴的な、キモトリプシンプライマーによる増幅の不存在）によって確認した。ＰＣＲは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの各ｄＮＴＰ、２．５ＵのＴａｑポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、フォワードプライマーとリバースプライマーの両方を３０ｍＭ、および３μｌの一本鎖ｃＤＮＡを含む、２５μｌの混合溶液内で実施した。ＥＮＰＰ１のためのフォワードプライマーは（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．８）５’−ＣＴＴＴＣＣＣＣＡＡＴＣＡＣＴＡＣＡＧＣＡＴＴＧＴＣＡ−３’（エクソン７）であり、リバースプライマーは（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．９）５’−ＴＴＴＣＡＧＡＣＣＡＴＣＣＡＴＣＡＧＣＡＴＡＣＣＡＡＣ―３’（エクソン１２）であった。またベータアクチンについて、フォワードプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１２：５’−ＣＧＴＣＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＣＡＴＣＴＧＣ―３’）およびリバースプライマー（ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１３：５’−ＡＴＣＴＧＧＣＡＣＣＡＣＡＣＣＴＴＣＴＡＣＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＧ−３’）が使用された。より大きな３’ＵＴＲ（ＴＧＡ終止コドンの下流の１１７０の塩基）を特徴とするＥＮＰＰ１アイソフォームは、ＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１０の５’−ＧＴＣＣＴＧＴＧＴＴＴＧＡＣＴＴＴＧＡＴＴＡＴＧＡ―３’（エクソン２３）とＳＥＱ  ＩＤ  Ｎｏ．１１の５’−ＣＣＣＴＴＡＧＧＣＣＧＴＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＴＣＡ―３’（３’ＵＴＲ）を用いて増幅した。混合物を９５℃で２分間加熱して、９５℃で３０秒、６８℃で２分、７２℃で２分、ついで７２℃で１０分の４５サイクルの増幅にかけた。ＰＣＲ産物は２％（ｗ／ｖ）アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドとＵＶ透過照明によって視覚化した。
【００７６】
ｈ）ＥＮＰＰ１タンパク質の血清のアッセイ
ＥＮＰＰ１の血清レベルをＲｕｔｓｃｈらが記載しているＥＬＩＳＡを用いて測定した２４。
【実施例２】
【００７７】
染色体６ｑ１６．３−ｑ２４．２上の位置的候補遺伝子の探索
【００７８】
６２の「６ｑ−ｅｖｉｄｅｎｃｅ」家族（マイクロサテライトマーカーＤ６Ｓ４３４とｄ６Ｓ１７０４が隣接する２−ＬＯＤドロップの区間において、個別の家系のＧｅｎｅ  ＨｕｎｔｅｒのＺスコアが＞１．０であることによって規定される）の表現型の特徴を、発明者が以前に公表した小児肥満についてのゲノムスキャンに全て由来する、残りの３５の家族と最初に比較した１。
【００７９】
【表２】
2008546380.tif 000003
【００８０】
表２に示したごとく、「６ｑ−ｅｖｉｄｅｎｃｅ」の肥満児は、有意に高いＢＭＩのＺスコア（フランス人の基準個体群と比較したボディマス指数の偏差１２）を有する。性別、年齢およびＢＭＩのパラメーターの調整の後、グルコース投与後の彼らの血中グルコースレベルは高く、第一相のインスリン分泌を評価する彼らのインスリン分泌指数は他の家族の子供たちより有意に低い。くわえて、「６ｑ−ｅｖｉｄｅｎｃｅ」肥満児の３．１％は、グルコース不耐性または糖尿病のいずれかである。対照的に、他の家族の肥満児は誰もグルコース不耐性ではない。さらに前の世代も調査したところ、他の家族における親の３．２％と比較して、６ｑが連鎖した親の１３．８％が２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）を有することが分かった（ｐ＝０．０２）。これらのデータから、染色体６ｑ上の肥満感受性遺伝子がグルコース恒常性にも関与しているのではないかと結論した。
【００８１】
小児肥満についての発明者のゲノムスキャン１に基づくと、６ｑ１６．３−ｑ２４．２の連鎖ピークについての２−ＬＯＤドロップの区間は４１．４Ｍｂにわたり、１６６の参照された遺伝子を含んでいる。肥満感受性遺伝子の調査をより制限された染色体領域に絞るために、全て成人について実施された、７件の公開された報告による、肥満２、インスリン分泌３、４またはＴ２Ｄ５−８のいずれかの、染色体６ｑ１６．１−ｑ２７での連鎖のピークを分析した。ゲノムスキャンの全てで、マーカーＤ６Ｓ１６５６とＤ６Ｓ２７０の間の領域にわたる２．４Ｍｂの区間が共通であると識別された。この区間内に位置する２２の遺伝子の中で、最良の生理学的な候補はエクト型ヌクレオチドピロホスファターゼ／ホスホジエステラーゼＥＮＰＰ１（形質細胞の糖タンパク質−１、ＰＣ−１としても知られている）（ＯＭＩＭ参照番号１７３３３５）であった。ＥＮＰＰ１はインスリン誘導性のインスリン受容体の立体構造の変化を直接阻害し、それによってその活性化と下流のシグナル伝達に作用すると思料される９、１３。この点に関して、インスリンのシグナル伝達をより効果的に阻害するとされる１１機能的ミスセンス変異（Ｋ１２１Ｑ）が、様々な民族集団においてインスリン抵抗性またはＴ２Ｄと関連づけられた１４−１８。
【００８２】
発明者の最初のゲノムスキャンにおいて小児肥満と連鎖していた、ＥＮＰＰ１遺伝子のイントロン１内のマイクロサテライトマーカーＤ６Ｓ１６５６を、ＢＭＩ＞９５分位数（性別と年齢について補正）である少なくとも二人の同胞を有する６８家族の第二の追試の組において分析したところ、連鎖のわずかな存在（ＭＬＳ＝０．８３、ｐ＝０．０４）が観察された。対照的に、追試の組ではこの領域の４つの他のマイクロサテライトマーカーに肥満との連鎖は見出されなかった（データは示されていない）。Ｄ６Ｓ１６５６の対立遺伝子１０も、最初のおよび追試の組の両方において、罹患した小児に対して有意な非伝達を示した（４４の伝達対６９の非伝達、ｐ＝０．０２、データは示されていない）。これらの結果は部分的に連鎖不均衡（ＬＤ）である機能的多型が近傍に位置している可能性があることを示唆している。
【実施例３】
【００８３】
ＥＮＰＰ１遺伝子内の配列の変異とＥＮＰＰ１のＳＮＰによる肥満との関連
【００８４】
ＥＮＰＰ１は２５のエクソンを有し、８３．２Ｋｂにわたっている。遺伝子内の配列の変異の特徴を明らかにするために、全てのコード領域、ならびに１．３ＫｂのＡＴＧ開始コドンの上流とＴＧＡ終止コドンの下流の配列決定を「６ｑ−ｅｖｉｄｅｎｃｅ」家族の４８人の肥満児および２４人の肥満でない成人で実施した。８つの一塩基多型（ＳＮＰ）が上流配列内に、６つがイントロン／エクソンジャンクション内に識別され、４つはミスセンス変異で、３つは同義変異であり、また２０が下流配列内に識別された（表３参照）。
【００８５】
【表３】
2008546380.tif 000004
【００８６】
これらの４１の多型の中で、２４は公的なデータベース内に存在し、変異体のうちの２２は５％より高いマイナー対立遺伝子頻度（ＭＡＦ）を有していた。１９の頻度が低い多型について、それらの伝達を家系内で検査した。罹患していない同胞内に希な対立遺伝子が存在するとき、変異体はそれ以上調査しなかった（ｎ＝１４）。残りの五つの希なＳＮＰは症例対照分析において、肥満との有意の関連を示さなかった（データは示されていない）。２２のもっとも共通のＳＮＰと、さらに他の二つ、すなわち、ｍＲＮＡの安定性に影響する１９ものとして先に記載したＳＮＰ２３（３．５％）および１３ｂｐのインサート（ＳＮＰ３１、Ｉｎｓ１３ｂｐ＋８２８ＴＧＡ、保有率４．２％）におけるペアワイズＬＤを、サンプル組全体においてタイプ決定される１０の「ハプロタイプ・タギング」ＳＮＰからなる組を選択するために使用した。
【００８７】
機能性ＳＮＰの識別の確率をさらに向上させるために、長さが１００ｂｐを超え、トラフグ（Ｆｕｇｕ  ｒｕｂｒｉｐｅｓ）、ラットおよびヒトのゲノムを通じて高い相同性（＞７０％）を示しており、またＥＮＰＰ１遺伝子の１９８Ｋｂのイントロン領域ならびに５’および３’遺伝子間領域内に存在する、２５の断片を識別した。これらの断片は配列決定され、さらに１１のＭＡＦ＞５％のＳＮＰが識別された。これらのＳＮＰは４２１人の肥満児と２９８の対照個体からなる試験組の遺伝子型決定に最初に使用された。小児肥満との関連の傾向（ｐ＜０．１）を示したＥＮＰＰ１の３’領域内の一つのＳＮＰ（Ｔ＞Ｇ＋５９５４ＴＧＡ）を、サンプル組全体において分析されるＳＮＰの組に加えた。
【００８８】
結局のところ、５２９人の血縁関係のない肥満児、６９６人の血縁関係のない病的肥満の成人、および１２０５人の痩せた正常血糖の成人で構成される２４３０人の個体において１１のＳＮＰが遺伝子型決定された。痩せた大人は、肥満に対して長期の耐性を示したので、症例の両方の組に対する対照として使用した。表４に見るごとく、重篤な肥満と６つのＳＮＰ、すなわちＩＶＳ２  ｄｅｌＧ＋８、Ｋ１２１Ｑ、ＩＶＳ８  Ｔ＞Ｇ＋２７、ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１、Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、およびＴ＞Ｇ＋５９５４ＴＧＡとの間に関連が認められた（表４参照、０．００００８＜ｐ＜０．０３、１．２１＜ＯＲ＜１．３７）。個体間の肥満の状態の１０５の並べ替えで評価した全体的なｐ値は０．００１であった。蓄積したデータの分析により、Ｋ１２１ＱのＳＮＰの、重篤な肥満との最大の関連が識別された（ＯＲ＝１．３７、９５％信頼区間［１．１７−１．６１］、ｐ＝０．００００８）。劣性モデルにおけるオッズ比は３．２９［１．８３−５．９３］（ｐ＝０．００００３）に増加し、付加的なモデルから有意の逸脱を示した（ｐ＝０．０２）。
【００８９】
この関連をさらに試験するために、１８４の多重家族をこのＳＮＰについて遺伝子型決定した。この組は小児肥満についてゲノムスキャンした９７の家族と成人の重篤な肥満を有する８７の核家族から成り、血清レプチンレベルの染色体６ｑ２４に対する連鎖が示されている２０。伝達不均衡テスト（ＴＤＴ）を用いると、１２１Ｑ対立遺伝子は肥満の子に有意に過剰伝達されており（伝達：７６、非伝達：４８、ｐ＝０．０１）、症例対照研究の結果を裏付けている。
【００９０】
これらの関連に対するＥＮＰＰ１の特異性を確認するために、５８０ｋｂにわたる、ＡＲＧ１、ＣＲＳＰ３、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１およびＣＴＧＦ遺伝子を含む染色体６ｑ領域内の合計５３のＳＮＰを、先に使用した４２１人の肥満児と２９８人の対照個体からなる最初の組においてタイプ決定した（平均密度：１ＳＮＰ／１０．９ｋｂ）。ＧＯＬＤソフトウェアを用いて、三つの別個の連鎖不均衡（ＬＤ）な領域を見出した。第一のものはＡＲＧ１、ＣＲＳＰ３およびＥＮＰＰ３遺伝子を、第二のものはＥＮＰＰ１遺伝子だけを、第三のものはＣＴＧＦ遺伝子と１７６Ｋｂの非コード領域とを含んでいた（図１）。肥満児と対照の間の、また６２人の「６ｑ−ｅｖｉｄｅｎｃｅ」肥満児と対照の間の、５３のＳＮＰの対立遺伝子分布の比較により、八つのＳＮＰが小児肥満と「６ｑ−ｅｖｉｄｅｎｃｅ」小児肥満の両方に関連していることが明らかになった（ｐ＜０．０５）。八つのＳＮＰのうちの七つ（Ｋ１２１Ｑ、Ｃｅｌｅｒａ  ｄｂＳＮＰ  ｈｃＶ１２０７９８９、Ｃ＞Ｔ＋１６４  ＴＧＡ、Ｃｅｌｅｒａ  ｄｂＳＮＰ  ｈｃＶ１２０７９７４、Ａ＞Ｇ＋１０４４  ＴＧＡ、Ｇ＞Ｔ＋１１０１  ＴＧＡ、Ｃ＞Ｔ＋１１５７  ＴＧＡ）はＥＮＰＰ１内にマッピングされた（図２）。第八の関連ＳＮＰは遺伝子間領域、ＣＴＧＦの６９ｋｂの３’領域内に位置し、トラフグ、齧歯類およびヒトのゲノムを通じて高い相同性を示す、既知の転写因子結合部位がない断片内には位置していなかった。これらのデータは小児肥満との観察された関連がＥＮＰＰ１のＳＮＰによるものであるという仮説を裏付けている。
【００９１】
【表４】
2008546380.tif 000005
【表５】
2008546380.tif 000006
【表６】
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【実施例４】
【００９２】
重篤な肥満と強く関連している三つの対立遺伝子がリスクであるハプロタイプの解析
【００９３】
Ｋ１２１Ｑ多型と６つの他の肥満関連ＳＮＰとの間の、二つのＳＮＰの分析を用いて、これらのＳＮＰが肥満リスクに対して独立した影響を有するかを評価した。尤度比試験はＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１とＧ＋１０４４ＴＧＡのＳＮＰだけがＫ１２１Ｑの影響を有意に変化させることを示した（それぞれｐ＝０．０３とｐ＝０．０４）。指摘に値するのは、これら二つのＳＮＰについて、最も適合したモデルもやはり劣性のものであったということである。このことは、遺伝子型決定のエラーが再配列決定によって除外されているので、これらのＳＮＰについてのハーディ・ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）でわずかに見られた偏差の原因となっている（データは示されていない）。このような偏差は、遺伝モデルが厳密には付加的でないときに、罹患した「極端な」個体で予想される２１。
【００９４】
肥満リスクに対する三つのＳＮＰの組合せの潜在的な累積的影響を評価するために、２４３０人のフランス系白人の被験者の組の全体から得たＫ１２１Ｑ、ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１およびＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡのＳＮＰのデータを用いてハプロタイプ分析を実施した。八つのハプロタイプが予測され、その中の五つはＭＡＦ＞５％である。表５に示したごとく、三つの対立遺伝子が野生型であるハプロタイプ（Ｋ１２１Ｑ／ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１／Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、ＫＴＡ）は、対照よりも肥満被験者において頻度が低かった（６４．０％対６０．３％、ｐ＝０．００２）。対照的に、三つの対立遺伝子がリスクであるハプロタイプ（Ｋ１２１Ｑ／ＩＶＳ２０  ｄｅｌＴ−１１／Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ、ＱｄｅｌＴＧ）は重篤な肥満と強く関連していた（１１．２％対７．５％、ＯＲ＝１．５８、ｐ＝０．００００１、１０５のシミュレーションについての経験的なｐ値＜０．０００１）。興味深いことに、リスクハプロタイプの影響は病的肥満の成人と小児肥満の両方において同程度であった（それぞれ、１０．８％対７．９％、ＯＲ＝１．５０、ｐ＝０．００６、および１１．７％対７．１％、ＯＲ＝１．６９、ｐ＝０．００６）。この関連は１８４の家族のＴＤＴ分析でも裏付けられた（カイ二乗検定＝５．６８、ｐ＝０．０１、表５）。
【００９５】
【表７】
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【００９６】
４５８組のフランス系白人の対照トリオ（両親と１人の痩せた子供）のＴＤＴ分析は、リスクハプロタイプの伝達過剰を示さず（カイ二乗検定＝０．５３、ｐ＝０．４６、データは示されていない）、また罹患していない子供におけるリスクハプロタイプの伝達率の歪みを排除した２２。最後に、肥満の重篤度が低い（ＢＭＩが３０〜４０ｋｇ／ｍ２）７１７人の成人被験者からなる追加の組においてハプロタイプの影響を評価し、先に使用した６４９人の肥満でない正常血糖の対照被験者と比較した。ここでも、リスクハプロタイプは肥満と関連していた（１０．３％対７．９％、ＯＲ＝１．３７、ｐ＝０．０２）。
【００９７】
ゲノムスキャンで観察された小児肥満との連鎖に対するＥＮＰＰ１のリスクハプロタイプの影響を試験するためにいくつかの手法を使用した。まず、「６ｑ−ｅｖｉｄｅｎｃｅ」家族の個体におけるリスクハプロタイプ（１６．２％対７．１％、ＯＲ＝２．３７、ｐ＝０．００４）の頻度が他の家族（１２．２％対７．１％、ＯＲ＝１．６５、ｐ＝０．１６）と比較して高いことを検出した。肥満に関連するリスクハプロタイプを共有する罹患同胞対（合計１３５のうち１５）は、別個に分析すると、最初の最大連鎖の位置（マーカーＤ６Ｓ２８７）において、３．４９の最大多点ＭＬＳ  ＬＯＤスコアを示した。逆に、これら１５の罹患同胞対を除いた後、多点ＭＬＳ  ＬＯＤスコアは、マーカーＤ６Ｓ２８７において４．０６から１．６に減少し、２．６３の新たな最大ＭＬＳ  ＬＯＤスコアが、マーカーＤ６Ｓ３０１において、元の連鎖ピークに対して１６Ｍｂ動原体側に出現した。これらの変異の有意性を評価するために、Ｇｅｎｏｔｙｐｅ  ＩＢＤ  Ｓｈａｒｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  （ＧＩＳＴ）を使用した２３。この試験は、劣性モデルで有意になった（ｐ＝０．０３）ハプロタイプの影響の可能性が、付加的なモデルにおいてもある程度見られることを示唆している（ｐ＝０．０７）が、それはハプロタイプの二つのコピーを共有している三つの罹患同胞対のみに基づいている。結局のところ、これらのデータが示唆しているのは、染色体６ｑ上の小児肥満との観察された連鎖に対する、ＥＮＰＰ１の肥満リスクハプロタイプのある程度の寄与であるが、ＧＩＳＴの結果はそれが比較的わずかであることを実証している。
【００９８】
これらのデータによれば、少なくとも三つのＥＮＰＰ１のＳＮＰが肥満との関連に関与している。Ｑ１２１変異体は野生型のものより効果的にインスリンのシグナル伝達１１を阻害すると思われるが、リスクハプロタイプの機能的作用は未知である。
【実施例５】
【００９９】
Ｋ１２１Ｑ、ＩＶＳ２０ｄｅｌＴ−１１およびＧ＋１０４４ＴＧＡ対立遺伝子に関連したＥＮＰＰ１レベルの高度に有意な増加
【０１００】
ＥＮＰＰ１タンパク質はタンパク質分解性の切断部位を有し、細胞の表面で切断され、循環内に存在することが知られている２４。したがって、このタンパク質の血清レベルはその組織発現の優れた評価に当たる２４。広い体重範囲を含む２７９人の小児で測定した血清ＥＮＰＰ１タンパク質レベルは、ＢＭＩのＺスコアと正の相関を示した（ピアソンの相関係数＝０．１、ｐ＝０．０５、図３）。交絡因子であるＢＭＩを固定するために、つぎに８９人の痩せた小児を選定し（平均ＢＭＩ、１８．４±２．５ｋｇ／ｍ２、平均年齢、１３．３±２．６歳、ｎ＝５０／３９  女子／男子）、そしてＥＮＰＰ１レベルに対する三つのＳＮＰの影響を分析した。Ｑ１２１、ＩＶＳ２０ｄｅｌＴ−１１およびＧ＋１０４４ＴＧＡ対立遺伝子の少なくとも一つのコピーの存在がＥＮＰＰ１レベルの高度に有意な増加と関連づけられ（２８．６ｎｇ／ｍｌ対２４．１ｎｇ／ｍｌ、ｐ＝０．００８）（図４）、このことは、肥満に関連するハプロタイプがインスリン結合を阻害するだけでなく、ＥＮＰＰ１の発現レベルを向上させることを示唆している。
【０１０１】
発明者はつぎに、データが入手可能な４７４人の肥満児において、肥満に関連する表現型の変異に対するリスクハプロタイプの寄与を評価した。肥満に関連するリスクハプロタイプを有する肥満児は、空腹時血糖の０．１７ｍｍｏｌ／ｌの上昇（ｐ＝０．００２）を示し、グルコース不耐性／Ｔ２Ｄの高い有病率（ＯＲ＝３．４３、ｐ＝０．０２）を伴っていた。リスクハプロタイプを有する親はＴ２Ｄを発症するリスクの増加が２．３５倍であった（ｐ＝０．００５）。さらに、肥満の親の小集団ではそのリスクはより高かった（ＯＲ＝３．２６、ｐ＝０．０００５）が、リスクハプロタイプを有する肥満でない親ではＴ２Ｄリスクの増加は認められなかった（ＯＲ＝０．８６、ｐ＝０．９）。ＥＮＰＰ１のＳＮＰとＴ２Ｄとの関連を確認するために、その疾患の家族歴をもつ７５２人の血縁関係のないＴ２Ｄのフランス系白人の被験者の追加の重複していないコホートを、先に使用した５５６人の中年の肥満でない正常血糖の被験者（平均年齢：５５±６歳）と比較した。Ｔ２Ｄ群に有意に過剰なリスクハプロタイプが識別され（１０．７％対７．１％、ＯＲ＝１．４４、ｐ＝０．００５）、フランス系白人のグルコース恒常性に対するＥＮＰＰ１のＳＮＰの影響の可能性がさらに裏付けられた。つぎにこの所見は、５０３人のＴ２Ｄ被験者と７５８人の肥満でない正常血糖の被験者から成る、１２６１人の血縁関係のないオーストリア人被験者を用いて反復された（９．８％対６．３％、ＯＲ＝１．６８、ｐ＝０．００１）。フランス人コホートとオーストリア人コホートとの間で対立遺伝子頻度と影響の大きさに潜在的な差があるので、固定効果モデルにおいて、Ｍａｎｔｅｌ  Ｈａｅｎｓｚｅｌ調整オッズ比を用いて、プールしたコホートにおけるＴ２Ｄのリスクを評価した。欧州人系の２５６９の個体のプールしたデータにより、Ｔ２Ｄとのリスクハプロタイプの関連が強化された（１０．４％対６．６％、組合せＯＲ＝１．５６、ｐ＝０．００００２）。要約すると、これらの所見は、肥満とＴ２Ｄの両方が、とくに肥満被験者において、ＥＮＰＰ１の遺伝的変異性と、またとくに三つの対立遺伝子がリスクである一つのハプロタイプと関連していることを示している。これは、最近報告された小児肥満と十代および成年初期におけるＴ２Ｄの高いリスクとの間の連鎖２５に遺伝学的証拠を提供して、この有害な関連についての最初の共通の分子機構を提供するものである。
【０１０２】
つぎにＥＮＰＰ１転写産物の組織分布を検査した。脳、筋肉、肝臓、脂肪細胞（皮下および大網）ならびに精製膵島ベータ細胞を含む広範囲のヒト組織のｃＤＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを実施した。五つのＥＮＰＰ１アイソフォームが既知であることを考慮して（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＩＥＢ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／Ａｃｅｍｂｌｙ／ａｖ．ｃｇｉ？ｄｂ＝ｈｕｍａｎ＆１＝ＥＮＰＰ１）、少なくとも３つの転写産物に共通なエクソン７と１２の間の領域を増幅するためのプライマーを設計し、普遍的な発現を見出した（図５参照）。つぎに、ＴＧＡ終止コドンの下流の１１７０塩基を有するより大きな３’ＵＴＲを特徴とし、肥満に関連するＳＮＰであるＡ＞Ｇ＋１０４４ＴＡＧを含む長いｍＲＮＡアイソフォームに特異的なプライマーを設計した。長い形態のものは、膵臓β細胞、脂肪細胞および肝臓という、グルコース恒常性にとっての三つの鍵となる組織にだけ発現したことが分かった（補足の図１参照）。
【０１０３】
本研究は、小児と成人の両方の病的な肥満およびあまり重篤でない肥満の発症におけるＥＮＰＰ１遺伝子変異体の変異体の主たる役割の最初の証拠を、そして肥満が同時に存在することによって増大するかも知れないＴ２Ｄとの関連の強い証拠を提供する。代謝疾患の枠内における全ＥＮＰＰ１遺伝子座のこの広範な分析は、この作用が主として、全ての研究された個体群において個別のＳＮＰよりも有力な予測因子であった、新規に報告された三つの対立遺伝子がリスクであるハプロタイプの結果であることを明らかにした。
【０１０４】
発明者が観察した６ｑ上での小児肥満との連鎖に対する、肥満に関連するＥＮＰＰ１のリスクハプロタイプの予想される寄与を、最近報告されたＧｅｎｏｔｙｐｅ  ＩＢＤ  Ｓｈａｒｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  （ＧＩＳＴ）手順２３を始めとするいくつかの方法で評価した。ＧＩＳ試験において、ハプロタイプに固有の指数とＮＰＬスコアとの間の有意な相関と共に、リスクハプロタイプの有意に高い頻度が「６ｑ−ｅｖｉｄｅｎｃｅ」家族の罹患した個体に認められた。この点に関して、Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎらは、メキシコ系アメリカ人に観察された、空腹時インスリンレベルへの連鎖に対するＥＮＰＰ１のＳＮＰの寄与を裏付ける予備データを最近報告した３。発明者も、ＥＮＰＰ１のＳＮＰとＴ２Ｄの間の関連の証拠を発見したので、この遺伝子は他の個体群で見出されたＴ２Ｄやそれに関連する形質との連鎖ピークにも寄与しているかも知れない３−８。しかしながら、フランス系白人の個体群における重篤な肥満との三つの対立遺伝子を有するハプロタイプの強い関連（ＯＲ＝１．５８、ｐ＝０．００００１）と、６ｑ連鎖シグナルへのその寄与の証拠にもかかわらず、ＴＤＴによって測定したところ、罹患した子に対するこのハプロタイプの伝達の過剰は中程度のものであることが分かった（ｐ＝０．０１）。これは、リスクハプロタイプは連鎖に必要であり、それゆえ「連鎖した」個体において高い頻度を示すが、そのことを完全に説明するには充分ではないということを示唆している。このことは６ｑ連鎖領域における他の寄与配列を示唆している。
【０１０５】
ＥＮＰＰ１遺伝子座の非コード領域内のさらなるＳＮＰが、観察された連鎖の一端を担うことが考えられる。例えば、トラフグ、ラットおよびヒトのゲノムを通じて高度に保存された領域内に含まれるＳＮＰであるＴ＞Ｇ＋５９５４ＴＧＡは、重篤な肥満との関連を示した。Ｇｅｎｏｍａｔｉｘ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍａｔｉｘ．ｄｅ／）を用いて、この多型がインスリンプロモーター因子ＩＰＦ１２７によって認識される配列（ａａａａａａｔｔｃＴＴ（＞Ｇ）ＡＴｇａｃａｃｃｔａ）の一部であることを見出した。ＴからＧへの置換は結合ＩＰＦ１の喪失を予測し、このことは、このＳＮＰが機能性であるかも知れないことを示唆している。あるいは、二つ以上の遺伝子が６ｑ上での肥満とＴ２Ｄとの連鎖を説明するかも知れない。このような状況はクローン病について１６番染色体ですでに報告されている２８、２９。この点に関して、ＥＮＰＰ１の肥満に関連するリスクハプロタイプの保有者が排除されたときの連鎖ピークの１６Ｍｂ動原体側への変位は、もう一つの肥満候補遺伝子であるＳｉｎｇｌｅ−ｍｉｎｄｅｄ  １（ＳＩＭ１）の位置と一致する３０、３１。
【０１０６】
肥満に関連する三つのＳＮＰの推定される機能性を、ＴＨＥＳＩＡＳソフトウェア３２を用いて、ハプロタイプの影響の尤度比試験を含む統計的手段で主として評価した。これらのＳＮＰの中で、ＥＮＰＰ１のＫ１２１Ｑのエクソン４のミスセンス変異は、シチリア島、スカンジナビアおよびインド１４−１７の比較的小さなサイズのサンプルにおけるインスリン抵抗性、ならびにドミニカ人のＴ２Ｄ１８と既に関連づけられていたが、大規模な研究で確認されたことはなかった。本研究は全てが欧州系の合計６１４７人を被験者とし、Ｔ２Ｄについての調査結果を裏付け、それらを拡張して肥満を包含するものである。他の二つの強く肥満に関連するＳＮＰはエクソン２１境界（ＩＶＳ２０ｄｅｌＴ−１１）と３’ＵＴＲ（Ａ＞Ｇ＋１０４４ＴＧＡ）内に位置する。興味深いことに、後者は、Ｔ２Ｄの病態生理に大きな役割を果たすと考えられる三つの高度にインスリン応答性のヒト組織（膵島β細胞、脂肪細胞および肝臓）内で特異的に発現するアイソフォームに属している。肝細胞内でＥＮＰＰ１遺伝子を過剰発現するアデノウィルス発現構築物を導入されたマウスは、インスリン抵抗性とグルコース不耐性を示し、肝臓におけるＥＮＰＰ１作用の重要性を浮き彫りにした１０。非酵素的機構によってインスリン受容体を直接阻害するためにエクソン１２１Ｑのアミノ酸置換が提案されたが１１、他の非コードＳＮＰも、遺伝子発現、タンパク質生成またはスプライシングを変化させることによって効果を有するかも知れず、ともにインスリンシグナル伝達に対するタンパク質の推定される有害作用を増強する。この仮説は、ＥＮＰＰ１の肥満リスクハプロタイプを有する小児における血清タンパク質レベルの増大によって、また脂肪過多症によるＥＮＰＰ１レベルの上昇によっても裏付けられる。この作用がハプロタイプ固有のものであるか、あるいは遺伝相と無関係であるかについては、より大きな家族コホートで確認する必要がある。
【０１０７】
我々の研究が明らかにしたところでは、ＥＮＰＰ１のｍＲＮＡはインスリンに応答する細胞タイプ内に存在し、高いタンパク質発現は、インスリンが効果的な食欲抑制作用を有する脳３３、あるいは骨格筋における、インスリン受容体の不活性化の作用をある程度模倣する可能性があり、この不活性化は脂肪量の増加につながる３４、３５。加えて、肝臓３６またはβ細胞３７のインスリン受容体をノックアウトしたマウスはグルコース不耐性である。逆に、Ｕｍらは、Ｓ６Ｋ１欠損マウスにおいて、年齢および食餌に誘発される肥満に対する防護がインスリン感受性の増強と関連していることを最近実証した３８。最近の研究によれば、ＥＮＰＰ１のリスクハプロタイプを有する肥満児はＴ２Ｄの強い家族歴を有し、グルコース負荷に対して不耐性であることがより多い。このことは、肝臓、筋肉および脂肪組織（そして可能性としては脳と膵島β細胞）における、遺伝した増加したＥＮＰＰ１発現によって付与された過剰なインスリン抵抗性が、きわめて強い西洋化した肥満環境という脈絡において、栄養分配を変化させ、過剰な脂肪の蓄積に寄与するかも知れないということを示唆する。この点に関して、Ｂａｒｒｏｓｏらは、ＥＮＰＰ１のＱ１２１対立遺伝子が英国の一般的な個体群におけるＢＭＩの増加と関連があることを最近示した３９。ここに紹介したデータは、「前糖尿病」状態と見ることができる小児肥満に対する原発性のインスリン抵抗性の因果作用の見解を裏付けている２５。この仮説に従って、インスリン抵抗性に誘発される空腹時高インスリン血症が各種の民族集団の子供たちにおけるその後の肥満発症の強力な予測因子になることが証明された４０、４１。
【０１０８】
結論として、この研究は、ＥＮＰＰ１遺伝子の変異体と、染色体６ｑに連鎖した小児の多遺伝子性の肥満との間の遺伝的関連、また成人肥満やＴ２Ｄとの間の遺伝的関連を強力に裏付けるものである。発明者のデータはインスリン抵抗性と肥満との間の生理学的関連についての分子レベルの根拠に対する洞察を提供し、それ故にこれらの疾患の予防と治療に新しい見通しを開くものである。
【０１０９】
参考文献
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９．  Ｍａｄｄｕｘ，  Ｂ．  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＣ−１  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｎｏｎ−ｉｎｓｕｌｉｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ３７３，  ４４８−５１  （１９９５）．
１０．  Ｄｏｎｇ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｈｅｐａｔｉｃ  Ｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ，  ＰＣ−１／ＮＰＰｌ，  Ｉｎｄｕｃｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  Ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５４，  ３６７−７２  （２００５）．  
１１．  Ｃｏｓｔａｎｚｏ，  Ｂ．Ｖ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  Ｑ  ａｌｌｅｌｅ  ｖａｒｉａｎｔ  （ＧＬＮ１２１）  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＣ−１  ｉｎｔｅｒａｃｔｓ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｍｏｒｅ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｔｈａｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  Ｋ  ａｌｌｅｌｅ  ｖａｒｉａｎｔ  （ＬＹＳ１２１）．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０，  ８３１−６  （２００１）．
１２．  Ｒｏｌｌａｎｄ−Ｃａｃｈｅｒａ，  Ｍ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｂｏｄｙ  Ｍａｓｓ  Ｉｎｄｅｘ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ：  ｃｅｎｔｉｌｅｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｒｔｈ  ｔｏ  ８７  ｙｅａｒｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ４５，  １３−２１  （１９９１）．
１３．  Ｍａｄｄｕｘ，  Ｂ．  Ａ．  ＆  Ｇｏｌｄｆｉｎｅ，  Ｉ．Ｄ．  Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＣ−１  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｃｃｕｒｓ  ｖｉａ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｌｐｈａ−ｓｕｂｕｎｉｔ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９，  １３−１９  （２０００）．
１４．  Ｐｉｚｚｕｔｉ，  Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  （Ｋ１２１Ｑ）  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＣ−１  ｇｅｎｅ  ｃｏｄｉｎｇ  ｒｅｇｉｏｎ  ｉｓ  ｓｔｒｏｎｇｌｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４８，  １８８１−４  （１９９９）．
１５．  Ｇｕ，  Ｈ．Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＣ−１  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｅｌｅｖａｔｅｄ  ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｌｅｖｅｌｓ  ｉｎ  ａ  ｐａｉｒｅｄ−ｓｉｂｌｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４９，  １６０１−３  （２０００）．
１６．  Ｋｕｂａｓｚｅｋ，  Ａ．，  Ｐｉｈｌａｊａｍａｋｉ，  Ｊ．，  Ｋａｒｈａｐａａ，  Ｐ．，  Ｖａｕｈｋｏｎｅｎ，  Ｉ．  ＆  Ｌａａｋｓｏ，  Ｍ．  Ｔｈｅ  Ｋ１２１Ｑ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＣ−１  ｇｅｎｅ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｗｉｔｈ  ｄｙｓｌｉｐｉｄｅｍｉａ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ  ２６，  ４６４−７  （２００３）．
１７．  Ａｂａｔｅ，  Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ  ＰＣ−１  Ｋ１２１Ｑ  ａｎｄ  ｅｔｈｎｉｃ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８８，  ５９２７−３４  （２００３）．
１８．  Ｈａｍａｇｕｃｈｉ，  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ＰＣ−１  Ｑ１２１  ａｌｌｅｌｅ  ｉｓ  ｅｘｃｅｐｔｉｏｎａｌｌｙ  ｐｒｅｖａｌｅｎｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｏｍｉｎｉｃａｎ  Ｒｅｐｕｂｌｉｃ  ａｎｄ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８９，  １３５９−６４  （２００４）．
１９．  Ｆｒｉｔｔｉｔｔａ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｔｈｒｅｅ  ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ３’−  ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＰＣ−１  ｇｅｎｅ  ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ  ＰＣ−１  ｍＲＮＡ  ａｎｄ  ｉｓ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ＰＣ−１  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５０，  １９５２−５  （２００１）．  
２０．  Ｈａｇｅｒ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｓｃａｎ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｇｅｎｅｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ｍａｊｏｒ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｏｃｕｓ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １０．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２０，  ３０４−８  （１９９８）．
２１．  Ｄｅｎｇ，  Ｈ．  Ｗ．，  Ｃｈｅｎ，  Ｗ．Ｍ．  ＆  Ｒｅｃｋｅｒ，  Ｒ．Ｒ．  ＱＴＬ  ｆｉｎｅ  ｍａｐｐｉｎｇ  ｂｙ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｆｏｒ  Ｈａｒｄｙ−Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ａｔ  ａ  ｓｅｒｉｅｓ  ｏｆ  ｌｉｎｋｅｄ  ｍａｒｋｅｒ  ｌｏｃｉ  ｉｎ  ｅｘｔｒｅｍｅ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｏｆ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６６，  １０２７−４５  （２０００）．  
２２．  Ｅａｖｅｓ，  Ｉ．Ａ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｒａｔｉｏ  ｄｉｓｔｏｒｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ＩＮＳ−ＩＧＦ２  ＶＮＴＲ．  Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ２２，  ３２４−５  （１９９９）．  
２３．  Ｌｉ，  Ｃ．，  Ｓｃｏｔｔ，  Ｌ．Ｊ．  ＆  Ｂｏｅｈｎｋｅ，  Ｍ．  Ａｓｓｅｓｓｉｎｇ  ｗｈｅｔｈｅｒ  ａｎ  ａｌｌｅｌｅ  ｃａｎ  ａｃｃｏｕｎｔ  ｉｎ  ｐａｒｔ  ｆｏｒ  ａ  ｌｉｎｋａｇｅ  ｓｉｇｎａｌ：  ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｔｙｐｅ−ＩＢＤ  Ｓｈａｒｉｎｇ  Ｔｅｓｔ  （ＧＩＳＴ）．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ７４，  ４１８−３１  （２００４）．
２４．  Ｒｕｔｓｃｈ，  Ｆ．  ｅｔ  ａｌ．  ＰＣ−１  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｃａｌｃｉｆｉｃａｔｉｏｎ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １５８，  ５４３−５４  （２００１）．
２５．  Ｗｅｉｌｌ，  Ｊ．，  Ｖａｎｄｅｒｂｅｃｋｅｎ，  Ｓ．  ＆  Ｆｒｏｇｕｅｌ，  Ｐ．  Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｉｓｉｎｇ  ｉｎｃｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｉｎ  ａｄｏｌｅｓｃｅｎｃｅ．  Ａｒｃｈ  Ｄｉｓ  Ｃｈｉｌｄ  ８９，  ５０２−４  （２００４）．
２６．  Ｊｅｎｋｉｎｓｏｎ，  Ｃ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｓｎｐｓ  ｉｎ  ＥＮＰＰ１：  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｄｉａｂｅｓｉｔｙ．  ＡＳＨＧ  ａｂｓｔｒａｃｔ  （２００４）．
２７．  Ｏｈｌｓｓｏｎ，  Ｈ．，  Ｋａｒｌｓｓｏｎ，  Ｋ．  ＆  Ｅｄｌｕｎｄ，  Ｔ．  ＩＰＦ１，  ａ  ｈｏｍｅｏｄｏｍａｉｎ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｒａｎｓａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｇｅｎｅ．  Ｅｍｂｏ  Ｊ  １２，  ４２５１−９  （１９９３）．
２８．  Ｈｕｇｏｔ，  Ｊ．Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＮＯＤ２  ｌｅｕｃｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｖａｒｉａｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｏ  Ｃｒｏｈｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４１１，  ５９９−６０３  （２００１）．
２９．  Ｈａｍｐｅ，  Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ＮＯＤ２−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｌｏｃｕｓ  ｆｏｒ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｅｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ  １６ｐ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９９，  ３２１−６（２００２）．
３０．  Ｈｏｌｄｅｒ，  Ｊ．Ｌ．，  Ｊｒ．，  Ｂｕｔｔｅ，  Ｎ．Ｆ．  ＆  Ｚｉｎｎ，  Ａ．Ｒ．  Ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ  ｔｈａｔ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｔｈｅ  ＳＩＭ１  ｇｅｎｅ．  Ｈｕｍ  ＭｏＩ  Ｇｅｎｅｔ  ９，  １０１−８．  （２０００）．
３１．  Ｍｉｃｈａｕｄ，  Ｊ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｓｉｍ１  ｈａｐｌｏｉｎｓｕｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｃａｕｓｅｓ  ｈｙｐｅｒｐｈａｇｉａ，  ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐａｒａｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｎｕｃｌｅｕｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｕｓ．  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １０，１４６５−７３  （２００１）．
３２．  Ｔｒｅｇｏｕｅｔ，  Ｄ．Ａ．，  Ｅｓｃｏｌａｎｏ，  Ｓ．，  Ｔｉｒｅｔ，  Ｌ．，  Ｍａｌｌｅｔ，  Ａ．  ＆  Ｇｏｌｍａｒｄ，  Ｊ．Ｌ．  Ａ  ｎｅｗ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅ−ｂａｓｅｄ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ：  ｔｈｅ  Ｓｔｏｃｈａｓｔｉｃ−ＥＭ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ．  Ａｎｎ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６８，  １６５−７７  （２００４）．
３３．  Ｓｃｈｗａｒｔｚ，  Ｍ．  Ｗ．  Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｃｏｕｐｌｉｎｇ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｔｏ  ｏｂｅｓｉｔｙ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０８，  ９６３−４  （２００１）．
３４．  Ｂｒｕｎｉｎｇ，  Ｊ．Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ａｎｄ  ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８９，  ２１２２−５  （２０００）．
３５．  Ｋｉｍ，  Ｊ．  Ｋ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ  ｔｏ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  ｍｉｃｅ  ｗｉｔｈ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０５，  １７９１−７  （２０００）．
３６．  Ｍｉｃｈａｅｌ，  Ｍ．Ｄ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｏｓｓ  ｏｆ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｌｅａｄｓ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ．  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ６，  ８７−９７  （２０００）．
３７．  Ｋｕｌｋａｒｎｉ，  Ｒ．Ｎ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｓｓｕｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｔａ  ｃｅｌｌｓ  ｃｒｅａｔｅｓ  ａｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｏｒｙ  ｄｅｆｅｃｔ  ｓｉｍｉｌａｒ  ｔｏ  ｔｈａｔ  ｉｎ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｃｅｌｌ  ９６，  ３２９−３９  （１９９９）．
３８．  Ｕｍ，  Ｓ．Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａｂｓｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｓ６Ｋ１  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ａｇｅ−  ａｎｄ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｗｈｉｌｅ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４３１，  ２００−２０５  （２００４）．
３９．  Ｂａｒｒｏｓｏ，  Ｉ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃａｎｄｉｄａｔｅ  Ｇｅｎｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  Ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  Ｔｙｐｅ  ２  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｉｎｄｉｃａｔｅｓ  ａ  Ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｂｅｔａ−Ｃｅｌｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｓ  Ｗｅｌｌ  ａｓ  Ｉｎｓｕｌｉｎ  Ａｃｔｉｏｎ．  ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  １，  Ｅ２０  （２００３）．
４０．  Ｏｄｅｌｅｙｅ，  Ｏ．Ｅ．，  ｄｅ  Ｃｏｕｒｔｅｎ，  Ｍ．，  Ｐｅｔｔｉｔｔ，  Ｄ．Ｊ．  ＆  Ｒａｖｕｓｓｉｎ，  Ｅ．  Ｆａｓｔｉｎｇ  ｈｙｐｅｒｉｎｓｕｌｉｎｅｍｉａ  ｉｓ  ａ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｏｆ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔ  ｇａｉｎ  ａｎｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｐｉｍａ  Ｉｎｄｉａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４６，  １３４１−５  （１９９７）．
４１．  Ｊｏｈｎｓｏｎ，  Ｍ．Ｓ．，  Ｆｉｇｕｅｒｏａ−Ｃｏｌｏｎ，  Ｒ．，  Ｈｕａｎｇ，  Ｔ．Ｔ．，  Ｄｗｙｅｒ，  Ｊ．Ｈ．  ＆  Ｇｏｒａｎ，  Ｍ．Ｉ．  Ｌｏｎｇｉｔｕｄｉｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｂｏｄｙ  ｆａｔ  ｉｎ  Ａｆｒｉｃａｎ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ａｎｄ  Ｃａｕｃａｓｉａｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ：  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｆａｓｔｉｎｇ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ８６，  ３１８２−７  （２００１）．
４２．  Ｐｏｓｋｉｔｔ，  Ｅ．Ｍ．  Ｄｅｆｉｎｉｎｇ  ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ：  ｔｈｅ  ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｂｏｄｙ  ｍａｓｓ  ｉｎｄｅｘ  （ＢＭＩ）．  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｈｉｌｄｈｏｏｄ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｇｒｏｕｐ．  Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒ  ８４，  ９６１−３  （１９９５）．  
４３．  Ｈｅｒｃｂｅｒｇ，  Ｓ．  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ  ｕｓｉｎｇ  ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  ｄｏｓｅｓ  ｏｆ  ａｎｔｉｏｘｉｄａｎｔ  ｖｉｔａｍｉｎｓ  ａｎｄ  ｍｉｎｅｒａｌｓ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｓｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒｓ  ｉｎ  ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  ＳＵ．ＶＩ．ＭＡＸ  ｓｔｕｄｙ−ｄｅｓｉｇｎ，  ｍｅｔｈｏｄｓ，  ａｎｄ  ｐａｒｔｉｃｉｐａｎｔ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ．  ＳＵｐｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｅｎ  ＶＩｔａｍｉｎｅｓ  ｅｔ  Ｍｉｎｅｒａｕｘ  ＡｎｔｉｏＸｙｄａｎｔｓ．  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｃｌｉｎ  Ｔｒｉａｌｓ  １９，  ３３６−５１  （１９９８）．  
４４．  Ｌａｆａｙ，  Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ａｎｄ  ｎａｔｕｒｅ  ｏｆ  ｄｉｅｔａｒｙ  ｕｎｄｅｒｒｅｐｏｒｔｉｎｇ  ｉｎ  ａ  ｆｒｅｅ−ｌｉｖｉｎｇ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ：  ｔｈｅ  Ｆｌｅｕｒｂａｉｘ  Ｌａｖｅｎｔｉｅ  Ｖｉｌｌｅ  Ｓａｎｔｅ  （ＦＬＶＳ）  Ｓｔｕｄｙ．  Ｉｎｔ  Ｊ  Ｏｂｅｓ  Ｒｅｌａｔ  Ｍｅｔａｂ  Ｄｉｓｏｒｄ  ２１，  ５６７−７３  （１９９７）．  
４５．  Ｏｂｅｒｋｏｆｌｅｒ，  Ｈ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＰＧＣ−１  ａｌｐｈａ  ｇｅｎｅ  ａｒｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｎｄ  ｔｙｐｅ  ２  ｄｉａｂｅｔｅｓ．  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５３，  １３８５−９３  （２００４）．
４６．  Ｃｏｌｅ，  Ｔ．Ｊ．  Ｔｈｅ  ＬＭＳ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｎｏｒｍａｌｉｚｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｓｔａｎｄａｒｄｓ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ  ４４，  ４５−６０  （１９９０）．
４７．  Ｓｅｌｔｚｅｒ，  Ｈ．Ｓ．，  Ａｌｌｅｎ，  Ｅ．Ｗ．，  Ｈｅｒｒｏｎ，  Ａ．Ｌ．，  Ｊｒ．  ＆  Ｂｒｅｎｎａｎ，  Ｍ．Ｔ．  Ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｔｏ  ｇｌｙｃｅｍｉｃ  ｓｔｉｍｕｌｕｓ：  ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｅｌａｙｅｄ  ｉｎｉｔｉａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｔｏ  ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  ｉｎｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｉｌｄ  ｄｉａｂｅｔｅｓ  ｍｅｌｌｉｔｕｓ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ４６，  ３２３−３５  （１９６７）．  
４８．  Ｒｉｓｃｈ，  Ｎ．  Ｌｉｎｋａｇｅ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｒａｉｔｓ．  Ｉ．  Ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｍｏｄｅｌｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ４６，  ２２２−２２８  （１９９０）．
４９．  Ｋｒｕｇｌｙａｋ，  Ｌ．  ＆  Ｌａｎｄｅｒ，  Ｅ．Ｓ．  Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｍｕｌｔｉｐｏｉｎｔ  ｓｉｂ−ｐａｉｒ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｔｒａｉｔｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ５７，  ４３９−５４  （１９９５）．  
５０．  Ｓｈａｍ，  Ｐ．Ｃ．  ＆  Ｃｕｒｔｉｓ，  Ｄ．  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ  ｔｅｓｔｓ  ｆｏｒ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  ａｌｌｅｌｅｓ  ａｔ  ｈｉｇｈｌｙ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｌｏｃｉ．  Ａｎｎ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ５９  （Ｐｔ  １），  ９７−１０５  （１９９５）．
５１．  Ｄｕｄｂｒｉｄｇｅ，  Ｆ．，  Ｋｏｅｌｅｍａｎ，  Ｂ．Ｐ．，  Ｔｏｄｄ，  Ｊ．Ａ．  ＆  Ｃｌａｙｔｏｎ，  Ｄ．Ｇ．  Ｕｎｂｉａｓｅｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ／ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  ｔｅｓｔ  ｔｏ  ｍｕｌｔｉｌｏｃｕｓ  ｈａｐｌｏｔｙｐｅｓ．  Ａｍ  Ｊ  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ  ６６，  ２００９−１２  （２０００）．
５２．  Ｌｕｋｏｗｉａｋ，  Ｂ．  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｈｕｍａｎ  ｂｅｔａ−ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｎｅｗ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｚｉｎｃ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｐｒｏｂｅ．  Ｊ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｙｔｏｃｈｅｍ  ４９，  ５１９−２８  （２００１）．  
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】４２１人の肥満児と２９８人の対照個体における、ＥＮＰＰ１遺伝子を含む５８０ｋｂ領域内の５３のＳＮＰ間のペアワイズＬＤを示す図。
【図２】ＡＲＧ１、ＣＲＳＰ３、ＥＮＰＰ３、ＥＮＰＰ１およびＣＴＧＦ遺伝子を含む５８０ｋｂ領域内の５３のＳＮＰの対立遺伝子の関連を示すグラフ。
【図３】２７９人の小児におけるＥＮＰＰ１タンパク質の血清レベルとＢＭＩのＺスコアとの間の相関を示すグラフ。
【図４】リスクハプロタイプの存在に照らした、８９人の痩せた小児のＥＮＰＰ１の血清レベルを示すグラフ。
【図５】ヒトの組織におけるＰＣ−１／ＥＮＰＰ１のｍＲＮＡの発現を示す図。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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