(57)【要約】本発明は一般に、特定の薬剤に低い感受性を、および/または免疫学的試薬との低い相互作用力を示すウイルスのバリアントに関する。具体的には本発明は、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に完全な耐性もしくは部分的な耐性を、および/またはウイルスの表面成分に対する抗体との低い相互作用力を、それらの抗体に対する低い感受性を含めて示すB型肝炎ウイルス(HBV)のバリアントに向けられる。本発明はさらに、抗ウイルス治療レジメンのモニタリングに、およびウイルス性因子、特にHBVのバリアントに対する新規または修飾型のワクチンの開発に有用な、上記のウイルスのバリアントを検出するアッセイ法を企図している。本発明は、ウイルスの感染、複製、および/または放出を阻害可能な薬剤をスクリーニングするか、および/または開発もしくは設計するための、ウイルスのバリアントの使用も企図している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリアントにコードされたタンパク質にアミノ酸の付加、置換、および/または欠失をもたらすヌクレオチド変異を含み、およびHBVのバリアントがETVのみまたはETVおよびLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；ならびにADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択される1種類もしくは複数のヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体に低い感受性を示す、単離されたB型肝炎ウイルス(HBV)のバリアント。
【請求項２】
変異が、HBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中に存在する、請求項1記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項３】
変異が、表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項1記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項４】
変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される、請求項1または2記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項５】
変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項4記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項６】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項4記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項７】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項5記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項８】
変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異から選択される、請求項1または3記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項９】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mからなり、別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、およびsS210Rを含むリストから選択される、請求項8記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項１０】
DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびにHBVのバリアントがETVのみまたはETVおよびLMVのみには耐性を示さないことを条件として、HBVのヌクレオチド配列中の変異、ならびにADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに対する耐性もしくは低い感受性に関与する変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBVが、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに低い感受性を示す可能性を示すことを見極める方法。
【請求項１１】
変異が、HBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中に存在する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
変異が、表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される、請求項10または11記載の方法。
【請求項１４】
変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項13記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項１６】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210に存在する、請求項10または12記載の方法。
【請求項１８】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、およびsS210Rからなるリストより選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに耐性を示すバリアントHBV、ならびに1種類もしくは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む組成物。
【請求項２０】
バリアントHBVが、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
バリアントHBVが、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される変異を含む、請求項19または20記載の組成物。
【請求項２３】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項22記載の組成物。
【請求項２４】
変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異から選択される、請求項19記載の組成物。
【請求項２５】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、およびsS210Rからなるリストより選択される、請求項24記載の組成物。
【請求項２６】
B型肝炎ウイルス感染の治療用および/または予防用の薬物の製造において、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに低い感受性をもたらす、DNAポリメラーゼまたは表面抗原をコードする遺伝子中にヌクレオチド変異を含むバリアントHBVの使用。
【請求項２７】
変異が、HBVのDNAポリメラーゼ遺伝子、および/または表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項26記載の使用。
【請求項２８】
変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される、請求項26または27記載の使用。
【請求項２９】
変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項26または28記載の使用。
【請求項３０】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項28記載の使用。
【請求項３１】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項29記載の使用。
【請求項３２】
変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異から選択される、請求項26または27記載の使用。
【請求項３３】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される、請求項32記載の使用。
【請求項３４】
DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびにDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中の変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBV株がヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に低い感受性を示すか否かを判定する方法であって、コドンrtN53、rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、およびrtM250から選択されるrt領域における変異の存在が、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに低い感受性を示すバリアントであることを示す、方法。
【請求項３５】
変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異からなるリストより選択される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される請求項34記載の方法。
【請求項３７】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K 、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
エンベロープ遺伝子をコードするヌクレオチド配列中の変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBV株がヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に低い感受性を示すか否かを判定する方法であって、コドンsT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、およびsS210から選択される、s遺伝子中における変異の存在が、HBVのバリアントがETVのみまたはETVおよびLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに低い感受性を示すバリアントであることを示す、方法。
【請求項３９】
変異が、stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210からなるリストより選択される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
変異が、stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210からなるリストより選択される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択される、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または類似体の組合わせに曝露された対象からHBVを単離する段階を含み、該HBVを、表面抗原に対する1種類もしくは複数の抗体のパネルに接触させる段階、ならびにHBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、結合親和性または結合スペクトルにおける任意の変化に関するスクリーニングを行う段階を含む、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVを検出する方法。
【請求項４２】
変異が、HBVのDNAポリメラーゼ遺伝子中、または表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異体を含む、請求項41または42記載の方法。
【請求項４４】
コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項44または45記載の方法。
【請求項４７】
コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、SI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、もしくはsS210に変異を含む、請求項41または42記載の方法。
【請求項４８】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
血清試料を、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択されるヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体に曝露された対象から単離する段階、および続いて血清を、HBVの表面抗原、またはその抗体結合断片のパネルに接触させる段階、ならびにHBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、結合親和性または結合スペクトルにおける任意の変化に関するスクリーニングを行う段階を含む、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVを検出する方法。
【請求項５０】
変異が、HBVのDNAポリメラーゼ遺伝子中、または表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、もしくはrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項49または50記載の方法。
【請求項５２】
コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項49または50記載の方法。
【請求項５３】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項51または52記載の方法。
【請求項５４】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、SI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、もしくはsS210における変異である、請求項49または50記載の方法。
【請求項５６】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される、請求項55記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項５７】
プラスミドベクターに含まれる、HBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製する段階、次いで、細胞に該コンストラクトをトランスフェクトする段階、トランスフェクション前、トランスフェクション中、および/またはトランスフェクション後に、細胞に被験薬剤を接触させ、該薬剤に耐性を示す場合に、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階；ならびに細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階により、HBVに阻害活性を示す薬剤を検出する方法。
【請求項５８】
感染性のHBVゲノムが、2.2.15細胞系もしくはAD細胞系などを含むがそれらに限定されない連続細胞系中に安定に組入れられるように、HBVのゲノムの感染性コピーを複製可能な有効量で含む、連続細胞系を作製する段階、細胞に被験薬剤を接触させる段階、細胞を、薬剤に耐性を示す場合に、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階、ならびに続いて細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、ウイルスが薬剤の存在下で複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階を代替的に含む、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
HBV感染の治療用の薬物の製造における、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204Gを含むリストから選択される、HBV感染に対する治療用ワクチンの製造におけるHBVのバリアントの使用であって、ここで、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVにHBVが耐性を示す、使用。
【請求項６０】
HBVが、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；ならびにADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに耐性を示し、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択されるHBVワクチンを含む、HBV感染に対するワクチン。
【請求項６１】
HBVが、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項60記載のワクチン。
【請求項６２】
rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される変異を含むHBVのバリアント、ならびに1種類もしくは複数のワクチンに許容される担体および/または希釈剤を含む、請求項60記載のワクチン。
【請求項６３】
HBVがrtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Iから選択される変異を含む、請求項61記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は一般に、特定の薬剤に低い感受性を、および/または免疫学的試薬との低い相互作用力を示すウイルスのバリアントに関する。具体的には本発明は、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に完全な耐性もしくは部分的な耐性を、および/またはウイルスの表面成分に対する抗体との低い相互作用力(それらの抗体に対する低い感受性を含む)を示すB型肝炎ウイルス(HBV)のバリアントに向けられる。本発明はさらに、抗ウイルス治療レジメンのモニタリングに、およびウイルス性因子、特にHBVのバリアントに対する新規または修飾型のワクチンの開発に有用な、上記のウイルスのバリアントを検出するアッセイ法を企図している。本発明は、ウイルスの感染、複製、および/または放出を阻害可能な薬剤をスクリーニングするか、および/または開発もしくは設計するための、ウイルスのバリアントの使用も企図している。
【背景技術】
【０００２】
先行技術の説明
本明細書で言及された出版物の書誌的詳細は、本明細書の最後にもまとめて記載してある。
【０００３】
本明細書における任意の先行技術に関する言及は、先行技術が、あらゆる国における共通の知識の一部を形成していることの承認または任意の形での示唆ではなく、そのようにとられるべきではない。
【０００４】
B型肝炎ウイルス(HBV)は、消耗性の疾患条件を引き起こす恐れがあり、急性肝不全に至る恐れがある。HBVはRNA中間体を介して複製し、その複製戦略に逆転写を利用するDNAウイルスである(Summers and Mason, Cell 29: 403-415, 1982(非特許文献1))。HBVのゲノムは、表面遺伝子、コア遺伝子、ポリメラーゼ遺伝子、およびX遺伝子をコードする重複性オープンリーディングフレームを有する部分的に2本鎖のDNA構造を有する複雑な性質を有する。HBVゲノムの複雑な性質について図1に示す。ポリメラーゼは、末端タンパク質(TP)、スペーサー、逆転写酵素(rt)、およびリボヌクレアーゼ(RNAse)の4つの機能領域からなる）。
【０００５】
HBVのポリメラーゼ遺伝子はエンベロープ遺伝子と重複しており、ポリメラーゼ遺伝子の触媒ドメインにおける変異は、エンベロープタンパク質のヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列にも影響を及ぼし得、その逆もあり得る。特に、HBsAg内に存在し、およびアミノ酸99〜169に位置する「a」決定基として公知のHBVの中和ドメインの遺伝子配列は、ウイルスのポリメラーゼタンパク質の主要触媒領域、特にドメインAおよびドメインBと実際に重複している。
【０００６】
HBVのDNAポリメラーゼの存在から、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体が有効な抗ウイルス剤として作用する可能性があることが提案されている。現在検討中のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体の例には、ペンシクロビル、およびその経口型(FCV)[Vere Hodge, Antiviral Chem Chemother 4: 67-84, 1993(非特許文献2)；Boyd et al., Antiviral Chem Chemother. 32: 358-363, 1987(非特許文献3)；Kruger et al., Hepatology 22；219A, 1994(非特許文献4)；Main et al., J. Viral Hepatitis 3: 211-215, 1996(非特許文献5)]、ラミブジン[(-)-β-2'-デオキシ-3'-チアシチジン]；(3TCまたはLMV)[Severini et al., Antimicrobial Agents Chemother. 39: 430-435, 1995(非特許文献6)；Dienstag et al., New England J Med 333；1657-1661, 1995(非特許文献7)]などがある。既に臨床試験が進行中の新たなヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体には、ピリミジンであるエムトリシタビン、((-)-β-L-2'-3'-ジデオキシ-5-フルオロ-3'-チアシチジン；FTC)、3TCの5-フルオロ誘導体、およびクレブジン(Clevudine)(1-(2-フルオロ-5-メチル-β-L-アラビノ-フラノシル)ウラシル；L-FMAU)、チミジン類似体などがある。3TCと同様に、それらは、非天然の「L」型配置を有するピリミジン誘導体である。複数のプリン誘導体を対象に臨床試験が進められており；エンテカビル(Entecavir)(BMS-200, 475；ETV)、炭素環デオキシグアノシン類似体、ジアミノプリンジオキソラン(DAPD)、ジオキソラングアニン((-)-β-D-2-アミノプリンジオキソラン；DXG)の経口プロドラッグ、および非環状デオキシアデノシン一リン酸のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体であるアデフォビル(9-[ホスホニル-メトキシエチル]-アデニン；PMEA)の経口プロドラッグであるアデフォビルジピボキシルなどがある。前臨床試験および臨床試験が進行中の他のドラッグには、FLG[Medivir]、ACH-126,443(L-d4C)[Archillion Pharmaceuticals]、ICN 2001-3(ICN)、ならびにラシビール(Racivir)(RCV)[Pharmassett]などがある。
【０００７】
それらの薬剤は、HBVのDNA合成の阻害に極めて有効であるが、長期の抗ウイルス化学療法中に、HBVの耐性変異体が出現する可能性がある。長期LMV療法を受けている患者では、重要な耐性変異が、ポリメラーゼ中のrtドメイン中のrtM204I/V+/-rtL180M、ならびに他の変異中に選択される。ポリメラーゼの変異に使用される命名法は、Stuyver et al., 2001(前記)(非特許文献8)で提案されている命名法に準じる。LMVは、慢性HBV感染に対する使用が承認されているヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体である。LMVは、HBVの複製に対する特に強力な阻害剤であり、および同所性肝移植(OLT)後の慢性感染患者の血清中におけるHBVのDNA量を、ウイルスDNAの合成を阻害することで低下させる。LMVの単独療法は、HBVの複製を長期にわたって制御できる可能性は低いようである。これはHBVのLMV耐性株の出現が、単独療法中においてほぼ避けられないと考えられているためである。
【０００８】
アデフォビルジピボキシル(ADV：旧名bis-pom PMEA)は、非環状デオキシアデノシン一リン酸の類似体であるアデフォビル(旧名PMEA)の経口使用可能なプロドラッグである(図2)。ADVは、HBVの複製の強力な阻害剤でもあり、最近になって慢性HBV感染に対する使用に関してFDAから承認された。アデフォビルジピボキシルは、このクラスの他の薬剤とは、ヌクレオチド(ヌクレオシドではない)類似体であること、およびこのためにドラッグ活性化中における最初のリン酸化反応を迂回する点が異なる。この段階は、しばしば律速段階である。アデフォビルジピボキシルは、HBVの野生型株およびラミブジン耐性株の両方に対する臨床活性を有することが報告されており、現在、第III相臨床試験が進行中である(Gilson et al., J Viral Hepat 6: 387-395, 1999(非特許文献9)；Perrillo et al., Hepatology 32: 129-134, 2000(非特許文献10)；Peters et al., Transplantation 68: 1912-1914, 1999(非特許文献11)；Benhamou et al., Lancet 358: 718-723, 2001(非特許文献12))。第II相試験では、アデフォビルジピボキシルの毎日30 mgの12週間にわたる投与によって、ウイルス血症が平均4 log10減少することが報告されている(Heathcote et al., Hepatology 28: A620, 1998(非特許文献13))。
【０００９】
ADVは、置換型の非環状ヌクレオシドホスホン酸である。このクラスの化合物にはまた、フマル酸テノホビルジソプロキシル(テノホビルDF、またはテノホビルもしくは(TFV)、または9-R-(2-ホスホノメトキシプロピル)アデニン(PMPA)とも呼ばれ、VireadとしてGilead sciencesから販売されている)が含まれる。
【００１０】
TFVは、HBVとHIVの両方に対して抗ウイルス活性を有する(Ying et al., J Viral Hepat. 7(2): 161-165, 2000(非特許文献14)；Ying et al., J. Viral Hepat. 7(1): 79-83, 2000, 2000(非特許文献15)；Suo et al., J Biol Chem. 273(42): 27250-27258. 1998(非特許文献16))。
【００１１】
FTCは、HBVおよびHIVに対する活性を有する(Frick et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 2285-2292, 1993(非特許文献17))。
【００１２】
ヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体による療法は単独療法として、または2種類もしくは2種類以上のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体が投与され得る併用療法として実施可能である。ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体は、インターフェロンやB型肝炎免疫グロブリン(HBIG)などの他の抗ウイルス剤と組合わせて投与することもできる。
【００１３】
ヌクレオシド/ヌクレオチド類似体もしくは抗体に耐性を有するHBV株の出現をモニタリングし、そのような耐性ウイルスを検出するための診断プロトコルを開発し、および/またはそれらを使用して、抗ウイルス剤として有用なものとする特性を有する薬剤をスクリーニングしたり、および/または開発もしくは設計したりすることが求められている。このような欠損型の耐性株、またはこれに由来する抗原性成分も、ウイルスの表面成分に対する抗体と同様に、治療用ワクチン組成物の開発に有用であると考えられている。
【００１４】
【非特許文献１】Summers and Mason, Cell 29: 403-415, 1982
【非特許文献２】Vere Hodge, Antiviral Chem Chemother 4: 67-84, 1993
【非特許文献３】Boyd et al., Antiviral Chem Chemother. 32: 358-363, 1987
【非特許文献４】Kruger et al., Hepatology 22；219A, 1994
【非特許文献５】Main et al., J. Viral Hepatitis 3: 211-215, 1996
【非特許文献６】Severini et al., Antimicrobial Agents Chemother. 39: 430-435, 1995
【非特許文献７】Dienstag et al., New England J Med 333；1657-1661, 1995
【非特許文献８】Stuyver et al., 2001
【非特許文献９】Gilson et al., J Viral Hepat 6: 387-395, 1999
【非特許文献１０】Perrillo et al., Hepatology 32: 129-134, 2000
【非特許文献１１】Peters et al., Transplantation 68: 1912-1914, 1999
【非特許文献１２】Benhamou et al., Lancet 358: 718-723, 2001
【非特許文献１３】Heathcote et al., Hepatology 28: A620, 1998
【非特許文献１４】Ying et al., J Viral Hepat. 7(2): 161-165, 2000
【非特許文献１５】Ying et al., J. Viral Hepat. 7(1): 79-83, 2000, 2000
【非特許文献１６】Suo et al., J Biol Chem. 273(42): 27250-27258. 1998
【非特許文献１７】Frick et al., Antimicrob Agents Chemother 37: 2285-2292, 1993
【発明の開示】
【００１５】
発明の概要
本明細書の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、「〜を含む(comprise)」という表現、または「〜を含む(comprises)」または「〜を含む(comprising)」などの類似表現は、記載された要素もしくは整数、または要素群もしくは整数群が含まれるが、他の任意の要素もしくは整数、または要素群もしくは整数群が除外されないことを意味すると理解される。
【００１６】
ヌクレオチド配列およびアミノ酸配列は、配列識別番号(SEQ ID NO:)によって表記される。SEQ ID NO:は、配列識別子<400>1 (SEQ ID NO:1)や<400>2(SEQ ID NO:2)などに、数の上で対応する。配列識別子の要約を表1に示す。
【００１７】
アミノ酸配列中の特定の変異は、本明細書では「Xaa1nXaa2」と表記される。Xaa1は、変異前の当初のアミノ酸残基であり、nは残基番号であり、Xaa2は変異型アミノ酸である。省略形「Xaa」は3文字コードの場合もあれば1文字コード(すなわち「X」)の場合もある。「Xaa1nXaa2」の前方の「rt」は「逆転写酵素」を意味する。「s」はエンベロープ遺伝子を意味する。HBVのDNAポリメラーゼのアミノ酸残基には、モチーフTyr Met Asp Asp(YMDD)中のメチオニン残基に残基番号204が付されている(Stuyver et al., Hepatology 33: 751-757, 2001)。B型肝炎ウイルスの表面抗原のアミノ酸残基には、Norder et al.(J. Gen. Virol. 74: 341-1348, 1993)に従って番号が付されている。アミノ酸残基を指す場合には、1文字省略形も3文字省略形も使用され、それらは表2に要約する。
【００１８】
本発明では、HBVのバリアントの選択は、ADVおよび/またはLMVで治療された慢性HBV感染の患者で同定されている。したがって、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびLMV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに耐性を示すか、または低い感受性を示す、HBVのrtのバリアントが企図される。表面抗原中における、対応する変異も存在する。このようなHBVバリアントの同定は、ADV耐性、LMV耐性、FTC耐性、および/またはTFV耐性、および/またはLMVを除く任意のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体を組合わせたETVに対する耐性、および/または他のヌクレオシドもしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対する耐性をモニタリングするための、ならびに代替的な治療薬として有用な薬剤をスクリーニングするためのアッセイ法の開発に重要である。対象となるバリアントは、ETVのみまたはETVおよびLMVのみに耐性を示すとは提示されていない。
【００１９】
本明細書における「抗HBV剤」という表記は、ヌクレオシド類似体およびヌクレオチド類似体、ならびに免疫学的試薬(例えばHBVの表面成分に対する抗体)、ならびにウイルスの複製、維持、感染、組み立て、もしくは放出を阻害するか、または別の方法で干渉する化合物、タンパク性薬剤、および核酸性薬剤を含む。
【００２０】
このようなHBVのバリアントの検出は、HBV感染を治療するための適切な薬剤の選択を含む治療プロトコルの管理に特に重要である。本発明のこの局面の方法は部分的に、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせの存在下でHBV量が増加した対象における推移のモニタリングに基礎を置く。臨床医であれば、後に既存の治療プロトコルを変更したり、それに応じて適切な治療プロトコルを選択したりすることができる。
【００２１】
したがって本発明の1つの局面は、DNAポリメラーゼに対する少なくとも1つのアミノ酸の付加、置換、および/または欠失をもたらす、DNAポリメラーゼをコードする遺伝子中におけるヌクレオチド変異を含み、ならびにADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択される1種類もしくは複数のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示す、単離されたB型肝炎ウイルス(HBV)のバリアントに向けられる。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。バリアントHBVは、そのゲノム中の、HBVのDNAポリメラーゼのドメインFおよびG、ならびにドメインA〜Eの1つもしくは複数によって定義される領域中の、重複性オープンリーディングフレームに変異を含む。
【００２２】
本発明の別の局面は、表面抗原に少なくとも1つのアミノ酸の付加、置換、および/または欠失をもたらし、ならびにADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択される1種類もしくは複数のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示す、S遺伝子中にヌクレオチド変異を含む、単離されたHBVのバリアントを提供する。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００２３】
rt領域における有用な変異体は、1つの態様では、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異を含む。特定の変異体は、rtN53、rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、およびrtN236における変異を含み、別の態様では、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、およびrtH248を含み、またはさらに別の態様では、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、およびrtM250を含み、またはさらに別の態様では、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、rtM250、またはそれらの組合わせ、または同等の変異を含む。さらにより特定の変異体は、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236Tを含み、別の態様では、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、およびrtH248Nを含み、またはさらに別の態様では、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lを含み、またはさらに別の態様では、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異を含む。
【００２４】
特に有用な変異体は、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、またはrtM250Lなどの、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、またはrtM250における変異体である。
【００２５】
S遺伝子における有用な変異は、1つの態様では、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mなどの、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、もしくはsS210における変異を含み、別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mを含み、またはさらに別の態様では、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rを含み、ならびにまた別の態様では、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210Rを含む。
【００２６】
本発明はさらに、HBVが、DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離し、ならびにDNAポリメラーゼのドメインFおよびG、ならびにドメインA〜Eの任意の1つもしくは複数、またはこの近位の領域における少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、および/または付加をもたらし、ならびにADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVおよび/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対する耐性もしくは低い感受性に関連する、HBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中の変異に関するスクリーニングを行うことで、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示す可能性を見極める方法を企図している。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００２７】
このような変異の存在は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対する耐性を示す可能性があることの指標となる。
【００２８】
本発明は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、またはバリアントHBV、またはその組換え型もしくは誘導型、またはその化学的等価物に由来するHBVの表面抗原に耐性を示すバリアントHBV、ならびに1種類もしくは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む組成物も提供する。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００２９】
本発明のさらに別の局面は、B型肝炎ウイルス感染の治療用および/または予防用の薬物の製造における、上述の組成物、またはDNAポリメラーゼに少なくとも1つのアミノ酸の付加、置換、および/または欠失をもたらし、ならびにADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対する低い感受性をもたらすDNAポリメラーゼをコードする遺伝子中にヌクレオチド変異を含むバリアントHBVの使用を提供する。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００３０】
本発明は、以下の変異がrt領域に存在する、DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離し、およびDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中の変異に関するスクリーニングを行うことで、HBV株がヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤に低い感受性を示すか否かを判定する方法も企図している：1つの態様では、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異。
【００３１】
特定の変異体は、rtN53、rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、およびrtN236を含み、別の態様では、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、およびrtH248を含み、またはさらに別の態様では、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、およびrtM250を含み、またはさらに別の態様では、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、rtM250、またはそれらの組合わせ、または同等の変異を含む。さらにより特定の変異体は、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236Tを含み、別の態様では、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、およびrtH248Nを含み、またはさらに別の態様では、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lを含み、またはさらに別の態様では、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異を含む。変異は、それらの組合わせか、または変異が、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示すバリアントであることを意味する同等の変異の場合もある。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００３２】
さらに別の局面は、以下の変異がs遺伝子中に存在する、エンベロープ遺伝子をコードするヌクレオチド配列中の変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBV株がヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に低い感受性を示すか否かを判定する方法を提供する：1つの態様では、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mなどの、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異を含み、ならびに別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mを含み、またはさらに別の態様では、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rを含み、またはさらに別の態様では、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、またはそれらの組合わせ、または等価物を含み、1つもしくは複数の他の変異が、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示すバリアントであることの指標となる。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００３３】
好ましくはバリアントは、天然の体液から引き離される少なくとも1回の精製段階を受けた、単離された状態である。またはバリアントは、単離された体液中に維持される場合があるほか、DNAの状態の場合がある。本発明は、バリアントHBVに由来するゲノムまたはその一部を含む感染性分子クローンも企図している。細胞、細胞溶解物、培養上清液、および体液中のHBVまたはその成分の検出は、任意の核酸ベースの検出手段を含む任意の簡便な手段により、例えば核酸ハイブリダイゼーション法によるか、または1回もしくは複数回のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介する場合がある。「体液」という表現は、血液、リンパ液、組織や、または血清、全血、生検標本および生検液体、臓器移植片、ならびに肝臓懸濁液などの器官懸濁物を含む器官系に由来する任意の液体を含む。
【００３４】
本発明の別の局面は、標準型すなわち野生型のHBVに由来する表面抗原と比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびに標準型すなわち野生型の表面抗原に対して生じた抗体がHBVのバリアントに対して、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVに向けられる。1つの変化したプロファイルは、HBV中和能力の低下を含む。具体的には、バリアントHBVの表面抗原は、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示し、ここでバリアントHBVは、HBVのDNAポリメラーゼのヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤によって選択される。本発明のこの局面のバリアントHBVは、治療前のHBVと比較して、1つまたは複数のヌクレオチドの置換、付加、および/または欠失を含むヌクレオチド配列を含む場合もある。
【００３５】
本発明はさらに、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択されるヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または類似体の組合わせに、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに曝露された対象からHBVを単離する段階、および続いて該HBVを、表面抗原に対する1種類もしくは複数の抗体のパネルに接触させる段階、ならびに結合親和性または結合スペクトルにおける任意の変化に関するスクリーニングを行う段階を含む、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVを検出する方法を企図している。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００３６】
関連する発明では本発明は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択されるヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに曝露された対象から血清試料を単離する段階、および続いて血清を、HBVの表面抗原、またはその抗体結合断片のパネルに接触させる段階、ならびに結合親和性または結合スペクトルにおける任意の変化に関するスクリーニングを行う段階を含む、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVを検出する方法を提供する。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００３７】
本発明は、単離されたHBsAg、またはその組換え型、またはその誘導体もしくはバリアントHBVに対応する化学的等価物に拡張される。一般に、HBsAg、またはその組換え型、またはその誘導型、もしくはその化学的等価物は、標準型のHBVに由来するHBsAgと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有し、標準HBVに対する抗体が、該バリアントHBsAgを有するHBVに対して、変化した免疫学的プロファイルを示すアミノ酸配列を含む。1つの態様では、変化した免疫学的プロファイルは、バリアントHBVを中和する能力の低下を含む。
【００３８】
本発明の別の局面は、プラスミドベクターに含まれる、HBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製後に、細胞に該コンストラクトをトランスフェクトし、細胞に、トランスフェクション前、トランスフェクション中、および/またはトランスフェクション後に被験薬剤を接触させ、該薬剤に耐性を示す場合は、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養し；ならびに細胞、細胞溶解物、または培養上清液を対象に、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段を行うことで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定することで、HBVに阻害活性を示す薬剤を検出する方法を企図している。好ましい態様では、プラスミドベクターはバキュロウイルスベクターであり、ならびに方法は、細胞の感染に有効な一定量のバキュロウイルスゲノムに含まれるか、または融合された、HBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製する段階と、これに続く、該細胞に該コンストラクトを感染させる段階、細胞に、感染前、感染中、および/または感染後に、被験薬剤を接触させる段階、該薬剤に耐性を示す場合に、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階と、これに続く、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を対象に、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段を行うことで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階を含む。
【００３９】
それらの方法と関連して、プラスミドベクターは、バキュロウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターなどの他のウイルスベクターの一部または全体をコードする遺伝子を含む場合がある(Ren and Nassal, J. Virol. 75(3): 1104-1116, 2001を参照)。
【００４０】
別の態様では本方法は、2.2.15細胞系またはAD細胞系などであるが、それらに限定されない感染性HBVゲノムが連続細胞系中に安定に組み込まれるように、HBVのゲノムの感染性コピーを複製可能な有効量で含む連続細胞系を作製する段階、細胞に被験薬剤を接触させる段階、細胞を、薬剤に耐性を示す場合は、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階、ならびに続いて細胞、細胞溶解物、または培養上清液を対象に、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段を行うことで、薬剤の存在下でウイルスが複製したか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階を含む。
【００４１】
別の態様では本発明は、HBVのポリメラーゼに阻害活性を示す薬剤を、インビトロポリメラーゼアッセイ法で検出する方法も企図している。HBVのポリメラーゼの活性は、確立されたアッセイ法で検討することが可能である(Gaillard et al., Antimicrob Agents Chemother. 46(4): 1005-1013, 2002；Xiong et al., Hepatology. 28(6): 1669-73, 1998)。HBVのポリメラーゼは、野生型すなわち標準型のHBVのポリメラーゼの場合もあれば、変異型のHBVのポリメラーゼの場合もある。
【００４２】
ウイルスのバリアントの同定によって、ポリメラーゼ遺伝子や、Lタンパク質、Mタンパク質、Sタンパク質をコードするエンベロープ遺伝子であるPreS1、PreS2、Sなどの特定の組換え型ウイルス成分を含むワクチン、ならびに欠損型のHBVバリアントを含む治療用ワクチンの作製が可能となる。ポリメラーゼ遺伝子、またはLタンパク質、Mタンパク質、Sタンパク質をコードするエンベロープ遺伝子であるPreS1、PreS2、S、またはHBVの他の成分と相互作用可能な治療用分子を同定もしくは作製するためには、合理的なドラッグ設計も利用できる。このようなドラッグは、診断における可能性も有している。加えて、欠損型のHBVバリアントを、同じウイルス、類似のウイルス、または相同なウイルスに対する免疫応答を惹起させるための治療的組成物として使用することもできる。または、HBVバリアントまたはその表面成分に対して生じた抗体を、HBVのバリアント、または類似のウイルスもしくは相同なウイルスによる感染に対する対象の受動免疫に使用することができる。さらに、HBVの成分の活性をダウンレギュレートして複製、維持、感染、組み立て、もしくは放出を阻害する能力を有するヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体、RNAi分子またはsiRNA分子(DNA由来の分子もしくは合成分子の両方)、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはセンスオリゴヌクレオチド、化合物またはタンパク性分子などの薬剤が本発明で企図される。
【００４３】
上述したように本発明は、ETVのみまたはETVおよびLMVのみに耐性もしくは低い感受性を示すHBVのバリアントには拡張されない。
【００４４】
本明細書で使用される省略形の要約を表3に示す。
【００４５】
本明細書で使用される配列識別子の要約を表1に示す。
【００４６】
（表１）配列識別子の要約
2008534020.tif 000002
【００４７】
（表２）1文字および3文字のアミノ酸の省略形
2008534020.tif 000003
【００４８】
（表３）省略形
2008534020.tif 000004
【００４９】
発明の詳細な説明
本発明は部分的に、ADVもしくはLMVもしくはETV、または特にADVおよびLMVもしくはTFVおよびLMV、またはETV、ならびに任意で1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体、またはTFVやFTCなどの他の抗HBV剤のいずれかによる患者の治療後における、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に耐性のHBVのバリアントの同定および単離に基づいている。特に、ADVまたはADVおよびLMVまたはETVで治療された患者は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対して低下した感受性すなわち低い感受性を示すHBVのバリアントを生じる。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。本明細書において、ADVおよび/またはLMV、および/またはFTC、および/またはTFV、および/またはETVに対する感受性に関して「低下した」もしくは「低い」という場合は、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤に対する完全な耐性もしくは実質的な耐性、ならびに部分的な耐性を含みかつ包含し、ならびにヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤の存在下で野生型を上回る複製速度もしくは複製効率を含む。1つの局面では、これは、治療中におけるウイルス量の増加によって簡便に測定されるか、または治療中に、治療前のHBVのDNAレベルからHBVのDNAウイルス量の実質的な減少はない(すなわち治療に対する反応がない)。
【００５０】
したがって本発明の1つの局面は、バリアントにコードされたタンパク質にアミノ酸の付加、置換、および/または欠失をもたらすヌクレオチド変異を含み、ならびにADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；ならびにADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択される1種類もしくは複数のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に低い感受性を示す、単離されたB型肝炎ウイルス(HBV)のバリアントを提供する。
【００５１】
特に、変異はDNAポリメラーゼ中か、または表面抗原(S遺伝子産物)中に存在する。
【００５２】
したがって本発明の1つの局面は、DNAポリメラーゼをコードする遺伝子中に、該DNAポリメラーゼに少なくとも1つのアミノ酸の付加、置換、および/または欠失をもたらすヌクレオチド変異を含み、ならびにADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択される1種類もしくは複数のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示す、単離されたB型肝炎ウイルス(HBV)のバリアントを企図している。
【００５３】
本発明のさらなる局面は、DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、およびHBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列において、該DNAポリメラーゼのドメインFおよびA〜Eの任意の1つもしくは複数において、またはこれに近位の領域において少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、および/または付加をもたらし、かつADV、LMV、TFV、FTCの1種類もしくは複数に対する耐性もしくは感受性の低下に関連する変異に関するスクリーニングを行う段階を含み、ならびに/または、このような変異の存在が、ADV、LMV、TFV、および/もしくはFTC、および/もしくはETV、およびLMVを除く他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体の1種類もしくは複数に耐性を示す可能性があることの指標となる、ADV、LMV、TFVおよびFTC、またはETVから選択されるヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、およびLMVを除く別の類似体、またはそれらの組合わせ、または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に低い感受性をHBVが示す可能性を見極める方法を提供する。
【００５４】
本発明を詳細に説明する前に、特に明記した部分を除いて、本発明が、変動しうる成分の特定の剤形、製造法、投与レジメンなどに制限されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語が、特定の態様を述べているに過ぎず、制限する意図はないことを目的とすることも理解されたい。
【００５５】
本明細書で使用されているように、単数形の「1つの(a)」、「1つの(an)」、および「その(the)」は、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、複数の局面を含むことを理解する必要がある。したがって例えば、「ヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体」という表現は、1つの類似体、ならびに2つもしくはそれ以上の類似体を含み；「HBVのバリアント」という表現は、2つもしくはそれ以上のHBVのバリアントを含むことを意味する。他の表現についても同様である。
【００５６】
本発明を説明および主張するに際して、以下に記載された定義に準じて以下の用語を使用する。
【００５７】
「類似体」、「化合物」、「活性薬剤」、「薬学的に活性のある薬剤」、「薬物」、「活性因子」、および「ドラッグ」という表現は本明細書で、ウイルスの複製、感染、維持、組み立て、および/またはHBVのDNAポリメラーゼなどの酵素の機能の阻害などの所望の作用を誘導する化合物を意味するように互換的に使用される。この表現は、特に本明細書で言及され、塩、エステル、アミド、プロドラッグ、活性代謝物、類似体などを含むが、それらに限定されない、このような活性薬剤の、薬学的に許容され、および薬理学的に活性のある成分も含む。「類似体」、「化合物」、「活性薬剤」、「薬学的に活性のある薬剤」、「薬物」、「活性因子」、および「ドラッグ」という表現が使用される場合は、これが、活性薬剤そのもの、ならびに薬学的に許容され、薬学的に活性のある塩、エステル、アミド、プロドラッグ、代謝物、類似体などを含むことを理解されたい。
【００５８】
したがって本発明は、HBVの複製、感染、維持、組み立て、および/またはHBVのDNAポリメラーゼなどの酵素の機能を阻害するために有用な化合物を企図している。「類似体」、「化合物」、「活性薬剤」、「薬学的に活性のある薬剤」、「薬物」、「活性因子」、および「ドラッグ」という表現は、ADV、LMV、TFV、ETV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびLMV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせなどを含む。「組合わせ」という表現は、薬剤が個別に提供され、および個別に供与されるか、もしくは分配されるか、または分配前にひとまとめに混合される、多数の部分から構成される抗HBV治療的組成物などの、2つの部分またはそれ以上の部分も含む。
【００５９】
本明細書で用いる、薬剤の「有効量」および「治療的有効量」という表現は、HBVの複製、感染、維持、組み立て、および/またはHBVのDNAポリメラーゼなどの酵素の機能を阻害する、所望の治療的作用または生理的作用を提供するのに十分な量の薬剤を意味する。さらに、薬剤の「有効HBV阻害量」または「有効症状改善量」は、複製、感染、維持、組み立て、および/またはHBVのDNAポリメラーゼなどの酵素の機能を直接的または間接的に阻害するのに十分な量の薬剤である。望ましくない作用、例えば副作用は、所望の治療的作用とともに現われる場合があるので；施行者は、適切な「有効量」の決定に際して、潜在的な有益性と潜在的なリスクのバランスをとる。必要とされる正確な量は、個々の対象によって、対象の種、年齢および一般条件、投与様式などに依存して変動する。したがって、正確な「有効量」を挙げることはできない可能性がある。しかしながら、任意の個別の場合における適切な「有効量」は、当業者であれば常用の実験法だけで決定可能な場合がある。
【００６０】
「薬学的に許容される」担体、賦形剤、または希釈剤は、生物学的または他の様式で望ましくなくない材料を含む薬学的溶媒を意味し、すなわちこのような材料は、任意の、または実質的な有害反応を引き起こすことなく、選択された活性薬剤とともに対象に投与可能である。担体は、賦形剤、および希釈剤、界面活性剤、着色剤、湿潤剤、または乳化剤、pH緩衝剤、保存剤などの他の添加剤を含む場合がある。
【００６１】
同様に、本明細書で提供される化合物の「薬理学的に許容される」塩、エステル、アミド、プロドラッグ、もしくは誘導体は、生物学的または他の様式で望ましくなくない塩、エステル、アミド、プロドラッグ、もしくは誘導体である。
【００６２】
本明細書で用いる、「治療する」および「治療」という表現は、HBV感染と関連する症状の重症度および/または症状発生頻度の低減、症状および/または根本原因の除去、症状および/またはその根本原因の発生の予防、ならびに損傷の改善もしくは緩和を意味する。したがって例えば、患者を「治療する」とは、HBVの複製、感染、維持、組み立て、および/またはHBVのDNAポリメラーゼなどの酵素の機能を阻害することで、HBV感染を予防すること、ならびに臨床的にHBVの症状を示す個体を治療することを含む。したがって例えば、HBV感染患者か、または感染しやすい患者を「治療する」本発明の方法は、HBV感染の予防と、HBV感染またはその症状の治療の両方を含む。いずれにせよ本発明は、HBV感染の治療または予防を企図している。
【００６３】
本明細書で用いる「患者」は、動物、好ましくは哺乳動物、およびより好ましくは、低級霊長類を含む霊長類、ならびにさらにより好ましくは、本発明の製剤および方法によって利益を得る可能性のあるヒトを意味する。患者は、ヒトであれ非ヒト動物であれ、個体、対象、動物、宿主、またはレシピエントと呼ばれる場合がある。本発明の化合物および方法は、ヒトの医学、獣医学、ならびに広くは、家畜または野生動物の畜産に応用できる。便宜上、「動物」は、家禽(アヒル、ニワトリ、シチメンチョウ、およびガチョウを含む)、飼育鳥(aviary bird)、または狩猟鳥などの鳥類種を含む。非ヒト動物における状態は、天然のHBVの感染ではない場合があり、HBV様の感染が誘導される場合がある。
【００６４】
上述したように、好ましい動物は、ヒト、マーモセット、ヒヒ、オランウータンなどの非ヒト霊長類、ツピア(tupia)などの低級霊長類、家畜動物、実験動物、ペット動物、または捕獲野生動物である。最も好ましい標的はヒトである。しかしながら、非ヒト動物モデルを使用することができる。
【００６５】
実験動物の例には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、およびハムスターなどがある。ウサギ、およびラットやマウスなどの齧歯類動物は、霊長類および低級霊長類と同様に、使いやすい試験系または動物モデルとなっている。家畜動物は、ヒツジ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウマ、およびロバを含む。鳥類種などの非哺乳動物、ゼブラフィッシュ、両生類(オオヒキガエルを含む)、およびキイロショウジョウバエ(Drosophila melanogaster)などのショウジョウバエ種も企図されている。生きている動物モデルの代わりに、試験系は、組織培養系を含む場合もある。
【００６６】
「抗HBV剤」は、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、タンパク質、化合物、RNAもしくはDNA、またはRNAiオリゴヌクレオチドもしくはsiRNAオリゴヌクレオチド(DNA由来のものか、または合成されたもの)を含む。
【００６７】
好ましくは、低い感受性はETVに関する。または低い感受性はADVまたはLMVに関する。または、低い感受性はTFVに関する。または低い感受性はFTCに関する。または低い感受性はETV、および、LMVのみを除く、他のヌクレオチド類似体もしくはヌクレオシド類似体に関する。または低い感受性はADVおよびTFV、ならびに任意でETVに関する。または低い感受性はLMVおよびTFV、ならびに任意でETVに関する。または低い感受性はADVおよびFTC、ならびに任意でETVに関する。または低い感受性はFTCおよびTFV、ならびに任意でETVに関する。または低い感受性はFTCおよびLMV、ならびに任意でETVに関する。または低い感受性はADVおよびLMVおよびTFV、ならびに任意でETVに関する。または低い感受性はADVおよびTFVおよびFTC、ならびに任意でETVに関する。または低い感受性はLMVおよびTFVおよびFTC、ならびに任意でETVに関する。または低い感受性はADVおよびLMVおよびFTC、ならびに任意でETVに関する。または低い感受性はADVおよびFTCおよびTFVおよびLMV、ならびに任意でETVに関する。本発明は、ETVのみまたはETVおよびLMVのみには耐性もしくは低い感受性を示すHBVのバリアントに拡張されない。
【００６８】
本明細書における「抗HBV剤」は、ウイルスの複製、維持、感染、組み立て、もしくは放出を阻害するか、または干渉する、ヌクレオシド類似体およびヌクレオチド類似体、ならびに免疫学的試薬(例えばHBVの表面成分に対する抗体)、ならびに化合物、タンパク性薬剤、および核酸性薬剤を含む。本明細書における「核酸」は、センス分子またはアンチセンス分子、RNAまたはDNA、オリゴヌクレオチド、ならびにRNAi分子およびsiRNA分子、ならびにそれらを含む複合体を意味する。
【００６９】
DNAポリメラーゼをコードする遺伝子中の変異に加えて、HBVゲノムの重複性のために(図1)、対応する変異は、HBsAgに対する抗体や免疫細胞などの免疫学的試薬の相互作用力を低減させる、表面抗原(HBsAg)をコードするS遺伝子をコードする遺伝子中に生じる場合もある。ウイルスの表面成分に対する免疫学的試薬の相互作用力の低下は一般に、ウイルスの表面成分を認識するか、または実質的に認識する免疫記憶の不在を含む。したがって本発明は、バリアントが、ADVおよび/またはLMVの併用治療後に、または連続治療後に選択される、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示すか、またはHBsAgに対する免疫学的試薬の低い相互作用力を示すHBVのバリアントに拡張される。ここでいう「連続」という表現は、ADVと、これに続くLMVおよび/またはTFVおよび/またはETV、および/またはFTC、LMVと、これに続くADVおよび/またはTFVおよび/またはFTC、および/またはETVの投与、またはETVと、これに続くADV、FTC、LMV、および/またはTFVの1種類もしくは複数の投与、またはETV、ADV、LMV、および/またはTFV、および/またはFTCのそれぞれの複数の連続投与を意味する。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００７０】
したがって、ウイルスのバリアントは、DNAポリメラーゼ遺伝子中のみに、またはDNAポリメラーゼ遺伝子とS遺伝子の両方に変異を有する場合がある。「変異」という表現は、その最も広い文脈において解釈されるべきであり、および複数の変異を含む。
【００７１】
本発明は、変異がADVおよび/またはLMVおよび/またはTFVおよび/またはETVおよび/またはFTC、またはそれらの組合わせに対する感受性の低下に至るという条件で、HBVのDNAポリメラーゼの、特に領域FおよびG、ならびにドメインA〜Eの変異および任意のドメインに拡張される。
【００７２】
本明細書では、ドメインA〜Eとして定義されるDNAポリメラーゼの保存された領域に特に言及される。領域A〜Eは、オーストラリア特許第734831号のFormula IIに記載されたアミノ酸配列によって定義されている。
【００７３】
好ましくは変異は、HBVのDNAポリメラーゼのドメインFおよびG、ならびにドメインA〜E、またはこれに近位の領域の任意の1つもしくは複数に、アミノ酸配列の変化をもたらす。
【００７４】
本発明の別の局面は、変異が、HBVのDNAポリメラーゼのドメインFおよびG、ならびにドメインA〜Eの1つもしくは複数によって定義される領域中に存在し、ならびにバリアントが、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示す、そのゲノム中の重複性オープンリーディングフレームに変異を含むHBVのバリアントを提供する。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００７５】
本発明の別の好ましい局面は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示す、該HBsAgにアミノ酸の付加、置換、および/または欠失をもたらす、HBsAgをコードするヌクレオチド配列中に変異を含むHBVのバリアントを企図している。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００７６】
具体的には本発明は、標準型すなわち野生型のHBVに由来する表面抗原と比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含むバリアントHBVを提供し、標準型すなわち野生型の表面抗原に対して作製された抗体は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対する対象の曝露によって選択されるHBVのバリアントに対する低い中和能力を示す。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【００７７】
「併用療法」という表現は、ADV、LMV、FTC、TFV、および/またはETVのあらゆる組合わせが、同じ組成物中で同時に、または別個の組成物として同時に投与されることを意味する。「連続療法」という表現は、2種類の薬剤が、数秒以内、数分以内、数時間以内、数日以内、または数週間以内に相互に、およびいずれかの順序で投与されることを意味する。連続療法は、ADV、LMV、FTC、TFV、もしくはETVの1種類または他の薬剤による治療コースを完了後に、他のADV、LMV、FTC、TFV、もしくはETVによる第2もしくは第3の、または後続の治療コースを完了することも包含している。
【００７８】
したがって本発明の別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVがADV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００７９】
本発明の別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、LMV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００８０】
本発明のさらに別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、FTC療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００８１】
本発明のなお別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、TFV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００８２】
本発明のさらになお別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、ETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００８３】
本発明のまたさらに別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、ADVおよびLMV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００８４】
本発明のなおまた別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、ADVおよびTFV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００８５】
本発明のさらになお別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、ADVおよびETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００８６】
本発明の他の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、LMVおよびTFV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００８７】
本発明のさらに他の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、LMVおよびETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００８８】
本発明の別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、ADVおよびFTC療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００８９】
本発明のさらに別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、TFVおよびFTC療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００９０】
本発明のなお別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、TFVおよびETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００９１】
本発明のなお別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、FTCおよびLMV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００９２】
本発明のまた別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、FTCおよびETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００９３】
本発明のまたさらに別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、ADV、LMVおよびTFVおよび/またはETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００９４】
本発明のなおまた別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、ADV、LMVおよびTFVおよび/またはETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００９５】
本発明の他の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、ADV、LMVおよびFTCおよび/またはETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００９６】
本発明の別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、FTC、LMVおよびTFVおよび/またはETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００９７】
本発明のさらに別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、ADV、FTCおよびTFVおよび/またはETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００９８】
本発明のさらになお別の局面は、治療前のHBVと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を有する表面抗原を含み、ならびにバリアントHBVの表面抗原が、該バリアントHBVが、ADV、LMV、FTCおよびTFVおよび/またはETV療法、または1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤による療法への対象の曝露によって選択される場合に、治療前のHBVと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示すHBVのバリアントを企図している。
【００９９】
好ましくはバリアントは、天然の体液から分離される少なくとも1回の精製過程を受けた、単離された状態である。またはバリアントは、単離された体液中で維持され得るか、もしくはDNAの状態を取り得る。本発明は、バリアントHBVのゲノムまたはゲノムの一部を含む感染性分子クローンも企図している。さらに本発明は、単離されたHBsAgなどの場合があるが、それらに限定されない、バリアントHBVから単離された成分を提供する。したがって本発明は、ADV、LMV、FTC、TFV、および/またはETVの1種類もしくは複数、または任意で1種類もしくは複数のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤への対象の曝露によって選択されるバリアントHBVに由来する、単離されたHBsAg、またはその組換え型、またはその誘導体もしくは化学的等価物を提供する。
【０１００】
具体的には、本発明のさらに別の局面は、標準HBVに由来するHBsAgと比較して、変化した免疫学的プロファイルを示す、単離されたバリアントHBsAg、またはその組換え型、またはその誘導体もしくは化学的等価物に向けられ、HBsAgは、ADV、LMV、FTC、TFV、および/またはETVの1種類もしくは複数、または任意で1種類もしくは複数のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤への対象の曝露によって選択されるバリアントHBVに由来する。
【０１０１】
さらに具体的には本発明は、標準HBVに由来するHBsAgと比較して1か所もしくは複数のアミノ酸の置換、付加、および/または欠失、もしくは切断を有するアミノ酸配列を含む、単離されたバリアントHBsAg、またはその組換え型もしくは誘導型、またはその化学的等価物を提供し、かつここで標準HBVに対する中和抗体が、ADV、LMV、FTC、TFV、および/またはETVの1種類もしくは複数、または任意で1種類もしくは複数のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤への対象の曝露によって選択されるバリアントHBVに由来する、該バリアントHBsAgを有するHBVに対して中和活性を示さないか、または低い中和活性を示す。
【０１０２】
HBVのDNAポリメラーゼにおける好ましい変異は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせの後にHBVを再発した患者から選択されるバリアントを含む。ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤は、移植処置(例えば骨髄移植(BMT)もしくはOLT)中に、移植処置後に、もしくは移植処置前に、または肝炎と診断された患者の治療後に処方される場合がある。バリアントの選択後に、ウイルス量は、治療前のレベルと同等のレベルで得られるか、または治療中に増加する。
【０１０３】
rt領域における有用な変異体は、1つの態様では、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204VおよびrtN236Tなどの、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、もしくはrtM250における変異を含み、別の態様では、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、およびrtH248Nを含み、またはさらに別の態様では、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lを含み、またはさらに別の態様では、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異を含む。特に有用な変異体は、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、またはrtM250Lである。
【０１０４】
このようなHBVのバリアントは、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示すと考えられている。アミノ酸の位置に関する命名システムが、コドンrtM204と表記されるYMDDモチーフ中のメチオニン残基に基づくことに注意されたい。このナンバリングシステムは、ポリメラーゼ遺伝子内のYMDDモチーフ中のメチオニン残基がコドン550と指定される、オーストラリア特許第734831号に記載されたシステムとは異なる。この点に関して、rtL180MとrtM204Vは、オーストラリア特許第734831号では、それぞれL526MとM550Vに対応する。対応する変異は、PreS1、PreS2、およびSの1つもしくは複数のような、エンベロープ遺伝子中に存在する場合もある。
【０１０５】
ADVおよび他の非環状ヌクレオシドホスホン酸の別の潜在的な作用様式は、免疫の刺激である(Calio et al., Antiviral Res. 23: 77-89, 1994)。いくつかの変異が、免疫回避と関連する可能性のあるHBVバリアント中に検出されるエンベロープ遺伝子に変化をもたらしている。このような変化は、1つの態様では、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mなどの、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異を含み、ならびに別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mを含み、またはさらに別の態様では、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rを含み、またはさらに別の態様では、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、またはそれらの組合わせ、または同等の変異を含む。
【０１０６】
本発明のバリアントの同定によって、このようなバリアントを検出する多様なアッセイ法の作製が可能となる。このようなバリアントの検出は、耐性バリアントを同定して、化学療法の適切な様式を見極めるために、および/またはワクチン接種プロトコルをモニタリングするために、または新規もしくは改変型のワクチン調製物を開発するために重要な役割を果たす可能性がある。
【０１０７】
本発明のなお別の局面は、DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびにDNAポリメラーゼのドメインFおよびG、ならびにA〜Eドメイン、またはこれに近位の領域の任意の1つもしくは複数における少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、および/または付加をもたらす、HBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中に位置し、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対する耐性もしくは低い感受性と関連する変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤にHBVが低い感受性を示す可能性を見極める方法を企図している。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【０１０８】
したがって本発明の別の局面は、DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびにDNAポリメラーゼのドメインFおよびA〜E、またはこれに近位の領域の任意の1つもしくは複数において少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、および/または付加をもたらす、HBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中に位置し、ならびに、ADV、LMV、TFV、FTC、および/またはETVの1つもしくは複数に対する耐性もしくは低い感受性と関連する変異であって、そのような変異の存在が、ADV、LMV、TFV、および/またはFTC、および/またはETV、ならびにLMVのみを除く別の類似体の1種類もしくは複数に対する耐性の可能性の指標となる変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBVが、ADV、LMV、TFV、およびFTC、およびETVから選択されるヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、ならびにLMVのみの場合を除く他のヌクレオチド類似体もしくはヌクレオシド類似体、または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に低い感受性を示す可能性を見極める方法を提供する。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【０１０９】
好ましくは、アッセイ法は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示すバリアントの指標となる、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236Tなどの、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における1つもしくは複数の変異を、別の態様では、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、およびrtH248Nを含む変異を、またはさらに別の態様では、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lを含む変異を、またはさらに別の態様では、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異を含む変異を検出する。
【０１１０】
したがって本発明の別の局面は、DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびにDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中、および/またはS遺伝子の対応する領域中の変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤にHBV株が低い感受性を示すか否かを判定する方法を生成し、ここで1つの態様では、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mなどの、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異、および別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mの変異、またはさらに別の態様では、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rの変異、またはさらに別の態様では、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、さらに別の態様では、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236Tの変異、別の態様では、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、およびrtH248Nの変異、またはさらに別の態様では、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lの変異、またはさらに別の態様では、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、またはそれらの組合わせ、または等価物から選択される1つもしくは複数の他の変異の存在が、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびLMV；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対して、バリアントが低い感受性を示すバリアントを示すことを意味する。
【０１１１】
本発明の他の局面は、DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびに、DNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中、および/またはS遺伝子の対応領域中の変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤にHBV株が低い感受性を示すか否かを判定する方法を生成し、ここで1つの態様では、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mなどの、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異、ならびに別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mの変異、またはさらに別の態様では、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rの変異、またはさらに別の態様では、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、さらに別の態様では、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236Tの変異、別の態様では、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、およびrtH248Nの変異、またはさらに別の態様では、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lの変異、またはさらに別の態様では、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、それらの組合わせ、または等価物から選択される1つもしくは複数の他の変異の存在が、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに低い感受性を示すバリアントであることを意味する。
【０１１２】
細胞、細胞溶解物、培養上清液、および体液中のHBVまたはその成分の検出は、任意の核酸ベースの検出手段を含む任意の簡便な手段によって、例えば核酸ハイブリダイゼーション法によって、または1回もしくは複数回のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を介してもよい。「体液」は、血液、リンパ液、組織や、または血清、全血、生検標本および生検液体、臓器移植片、ならびに肝臓懸濁液などの器官懸濁物を含む器官系に由来する任意の液体を含む。本発明はさらに、制限酵素切断断片長多型(RFLP)、増幅断片長多型(AFLP)、1本鎖多型(SSCP)、増幅およびミスマッチ検出(AMD)、散在反復配列ポリメラーゼ連鎖反応(IRS-PCR)、逆ポリメラーゼ連鎖反応(iPCR)、および逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)などを含む、核酸ベースの検出手段のさまざまなアッセイ法のフォーマットの使用を含む。他の様式の検出は、ノーザンブロット、サザンブロット、PCR配列決定や、ELISA、ウェスタンブロット、および免疫組織化学的手法などの抗体法を含む。特に有用なアッセイ法は、固定化されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチドを介する検出系に必要な試薬および成分を含む。
【０１１３】
特に有用な1つの核酸検出系は、逆ハイブリダイゼーション法である。この手法では、HBV試料に由来するDNAを、ビオチンまたは他のリガンド標識プライマーを使用して増幅することで、標識された増幅産物(amplificon)を得る。続いて、ニトロセルロースフィルムなどの固相支持体に固定化されたオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーションによって増幅されたDNAを捕捉する。特異的な核酸断片が、ビオチンまたはリガンドを介して同定される。一般に、標識されたプライマーは、検出対象の特定のヌクレオチド変異に特異的である。増幅は、検出対象の変異が存在する場合にのみに生じる。逆ハイブリダイゼーションアッセイ法には多くの様式があり、いずれも本発明に含まれる。
【０１１４】
本発明で企図される別の局面は、ADV、LMV、TFV、ETV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびLMV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択されるヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに曝露された対象からHBVを単離する段階、ならびに続いて該HBVを、表面抗原に対する1種類もしくは複数の抗体のパネルに接触させる段階、ならびに結合親和性または結合スペクトルにおける任意の変化に関するスクリーニングを行う段階を含む、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVを検出する方法を提供する。
【０１１５】
関連する態様では本発明は、ADV、LMV、TFV、ETV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびLMV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択されるヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに曝露された対象から血清試料を単離する段階、ならびに続いて血清を、HBVの表面抗原、またはその抗体結合断片のパネルに接触させる段階、ならびに結合親和性または結合スペクトルにおける任意の変化に関するスクリーニングを行う段階を含む、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVを検出する方法を企図している。
【０１１６】
細胞培養物においてHBVの複製を検出することは、特に有用である。
【０１１７】
本発明のこの局面および他の局面は、HBVのゲノム配列または転写物をダウンレギュレートするセンス分子およびアンチセンス分子、RNAi分子もしくはsiRNA分子、またはDNA結合分子もしくはRNA結合分子を含むオリゴヌクレオチドを同定するといった、マイクロアレイ解析に特に適している。マイクロアレイ解析は、HBVのDNAポリメラーゼのコード領域中、またはHBsAgのコード領域中に存在する変異などの、HBVゲノム中における特定の変異の同定にも使用可能である。
【０１１８】
本発明の別の局面は、以下の段階を含む、HBVに阻害活性を示す薬剤を検出する方法を企図している：
プラスミドベクターに含まれる、HBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製し、次に、細胞に該コンストラクトをトランスフェクトする段階；
細胞に、トランスフェクション前、トランスフェクション中、および/またはトランスフェクション後に、被験薬剤を接触させる段階；
該薬剤に耐性を示す場合に、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階；ならびに
続いて、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階。
【０１１９】
好ましい態様では、プラスミドベクターは、バキュロウイルスやアデノウイルス(Ren and Nassal, 2001、前記)などの他のウイルスベクターの一部または全体をコードする遺伝子を含む場合があり、方法は、以下の段階を含む：
細胞感染に有効な量の、バキュロウイルスゲノムまたはアデノウイルスゲノムに含まれるか、または融合された、HBVに由来する、複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製し、次に、細胞に該コンストラクトを感染させる段階；
細胞に、感染前、感染中、および/または感染後に、被験薬剤を接触させる段階；
該薬剤に耐性を示す場合に、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階；ならびに
続いて、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階。
【０１２０】
代替の態様では、方法は、以下の段階を含む：
感染性HBVゲノムが、2.2.15またはADなどであるがそれらに限定されない連続細胞系中に安定に組込まれるように、複製可能な有効量のHBVのゲノムの感染性コピーを含む連続細胞系を作製する段階；
細胞に、被験薬剤を接触させる段階；
薬剤に耐性を示す場合に、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階；ならびに
続いて、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階。
【０１２１】
上記の方法は、1つの態様では、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、もしくはrtN236Tなどの、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、もしくはrtM250における変異、別の態様では、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、もしくはrtH248Nを含む変異、またはさらに別の態様では、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lを含む変異、またはさらに別の態様では、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250Lを含む変異、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、またはそれらの組合わせ、または等価変異；別の態様では、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mなどの、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、もしくはsS210における変異、ならびに別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mを含む変異、またはさらに別の態様では、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rを含む変異、またはさらに別の態様では、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210Rを含む変異、またはそれらの組合わせ、または同等の変異を有するバリアントなどの、HBVのバリアントに対する薬剤の同定もしくは開発に特に有用である。
【０１２２】
したがって本発明の別の局面は、DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびに1つの態様では、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236Tなどの、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、もしくはrtM250における変異、別の態様では、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、およびrtH248Nを含む変異、またはさらに別の態様では、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lを含む変異、またはさらに別の態様では、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250Lを含む変異、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、またはそれらの組合わせ、または等価変異；別の態様では、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mなどの、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、もしくはsS210における変異、および別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mを含む変異、またはさらに別の態様では、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rを含む変異、またはさらに別の態様では、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210Rを含む変異、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせから選択される、エンベロープ遺伝子またはDNAポリメラーゼ遺伝子のヌクレオチド配列中の変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の潜在的な抗HBV剤にHBV株が低い感受性を示すか否かを判定する方法を企図している。
【０１２３】
DNAポリメラーゼのアミノ酸のバリアントの検出は、さまざまなアミノ酸検出法で簡便に達成される。HBVのバリアントがアミノ酸の変化を含む場合、このような単離物は、DNAポリメラーゼ活性が変化した、HBVのバリアントであると推定される。
【０１２４】
本発明はさらに、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに耐性を示すHBVのバリアントを阻害する薬剤を企図している。このような薬剤は、ADV、LMV、FTC、TFV、および/またはETV、および/または任意で、TFVなどの他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体による長期治療の場合に特に有用であり、臨床医によって企図されている。薬剤は、DNAもしくはRNA、またはタンパク性もしくは非タンパク性の化合物の場合がある。植物、サンゴ、および微生物などに由来する天然物のスクリーニングも、コンビナトリアルライブラリーまたは化合物ライブラリーのスクリーニングと同様に、マスキング剤の有用な潜在的な供給源として企図されている。薬剤は、単離された状態か、または薬学的組成物すなわち製剤の状態の場合があり、および、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体と連続的に、または同時に投与することができる。さらに、例えばHBVのDNAポリメラーゼの結晶構造またはNMR構造の解明や、同酵素の活性部位に結合可能な薬剤の設計を含む合理的なドラッグ設計が企図される。このような方法は、HBVの他の成分にも適用可能である。
【０１２５】
したがって本発明の別の局面は、以下の段階を含む、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに耐性もしくは低い感受性を示す、HBVに阻害活性を示す薬剤を検出する方法を企図している：
プラスミドベクターに含まれる、HBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製し、次に、細胞に該コンストラクトをトランスフェクトする段階；
該細胞に、トランスフェクション前、トランスフェクション中、および/またはトランスフェクション後に、被験薬剤を接触させる段階；
該薬剤に耐性を示す場合に、該細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階；ならびに
細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、該薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階。
【０１２６】
本発明のさらに別の局面は、以下の段階を含む、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに耐性もしくは低い感受性を示すHBVに阻害活性を示す薬剤を検出する方法を提供する：
細胞への感染に有効な量のバキュロウイルスゲノムに含まれるか、または融合されたHBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製し、次に、該細胞に該コンストラクトを感染させる段階；
該細胞に、感染前、感染中、および/または感染後に、被験薬剤を接触させる段階；
該薬剤に耐性を示す場合に、該細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階；ならびに
細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、該薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階。
【０１２７】
好ましくは、HBVのゲノムは、細胞のゲノム中に安定に組込まれる。
【０１２８】
特に有用な細胞は、2.2.15細胞(Price et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(21): 8541-8544, 1989)、またはAD細胞(HepAD32細胞もしくはHepAD79細胞としても公知である)[Ying et al., 2000、前記]である。
【０１２９】
バキュロウイルスベクターは本発明の実施に特に有用であるが、本発明は、アデノウイルスベクターなどがあるがこれに限定されない、さまざまな他のベクターに拡張される。
【０１３０】
本発明はさらに、HBVのゲノムの全体もしくは一部、またはこれに由来する遺伝子もしくは遺伝子の一部を含む遺伝子コンストラクトを有する細胞系(例えば2.2.15細胞もしくはAD細胞)に拡張される。
【０１３１】
本発明は、抗ウイルス剤をスクリーニングするための本HBVのバリアントの使用も提供する。このような抗ウイルス剤は、ウイルスを阻害する。「阻害する」という表現は、感染、複製、組み立て、および/または放出、または任意の中間段階と拮抗するか、またはそれらの段階を妨げることを含む。好ましい抗ウイルス剤は、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または抗HBV剤を含むが、本発明は非ヌクレオシド分子に拡張される。
【０１３２】
加えて、薬剤の合理的な設計も、ヌクレオシドに似ている化合物か、または特定のヌクレオチド配列もしくは特定のヌクレオチドと相互作用する化合物を同定または作製するために企図される。コンビナトリアル化学、およびツーハイブリッドスクリーニングは、潜在的な治療薬または診断薬の同定に利用可能ないくつかの手法の一部である。
【０１３３】
1つの例では、ポリメラーゼまたは表面抗原の結晶構造またはNMR構造を用いて、機能および/または抗原性に必要な分子の重要な領域と相互作用する可能性の高い小型の化合物が合理的に設計される。このような薬剤は、ポリメラーゼ活性の阻害剤として有用な場合があり、および/または表面抗原上のエピトープを改変可能である。
【０１３４】
HBVのポリメラーゼの複数のモデルが、HIVの逆転写酵素との類似性のために作製されている(Das et al., J. Virol. 75(10): 4771-4779, 2001；Bartholomeusz et al., Intervirology 40(5-6): 337-342 1997；Allen et al., Hepatology 27(6): 1670-1677, 1998)。HBVのポリメラーゼのモデルは、耐性変異および野生型のウイルスをコードするHBVに対して有効な新規薬剤の合理的なドラッグ設計に使用することができる。設計される合理的なドラッグは、耐性に関連する変異をコードするHBVの選択に使用される薬剤などの既存の抗ウイルス剤の修飾に基づく場合がある。変異をコードするHBVのゲノム材料を発現するウイルスまたはクローンを、新しい抗ウイルス剤のスクリーニングに使用することもできる。
【０１３５】
代替の態様では本発明は、HBVのポリメラーゼに阻害活性を示す薬剤をインビトロポリメラーゼアッセイ法で検出する方法も企図している。HBVのポリメラーゼの活性は、確立されたアッセイ法で調べることができる(Gaillard et al., Antimicrob Agents Chemother. 46(4): 1005-1013, 2002；Xiong et al., Hepatology 28(6): 1669-1673, 1998)。
【０１３６】
上述したように、マイクロアレイ法も、HBVの定義済みの内部成分または外部成分と相互作用可能な薬剤を同定する有用な手段である。例えば、多様なアミノ酸バリアントを有するHBVのDNAポリメラーゼまたはそのペプチド断片のアレイを、このような分子と結合可能または相互作用可能な薬剤のスクリーニングに使用することができる。これは、薬剤とHBVバリアント間の結合パターンの差を見極める簡便な方法である。抗体のアレイを、改変型のHBsAg分子のスクリーニングに使用することもできる。マイクロアレイは、HBV成分と相互作用する能力を有する抗体、インターフェロン、またはサイトカインなどの分子を同定するプロテオミクス解析にも有用である。DNA分子およびRNA分子を対象としたマイクロアレイで、HBVのゲノム上の遺伝子領域、またはその転写物上に対応するセンス分子およびアンチセンス分子を同定することもできる。
【０１３７】
上記の方法は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに耐性もしくは低い感受性を示すHBVの阻害剤の同定に特に有用である。したがって本発明は、阻害剤の組成物に拡張される。阻害剤は、抗体や、またはリボザイム、アンチセンス分子、および/またはコサプレッション(co-suppression)もしくはRNAi誘導用のセンス分子などの遺伝的分子の形状をとり得るか、あるいは他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、または公知の類似体の誘導体である場合がある。RNAiへの言及は、短鎖の干渉性RNA(siRNA)への言及を含み、およびあらゆるRNAi型分子はDNA由来の分子か、または合成分子の場合がある。
【０１３８】
「組成物」という表現は、「薬学的組成物」または製剤を含む。
【０１３９】
阻害剤は以下では、「活性成分」または「活性化合物」と表記され、上記の阻害剤のリストから選択され得る。
【０１４０】
組成物は、天然物のスクリーニング、または合理的なドラッグ設計(コンビナトリアル化学的手法を含む)によって同定された、HBVの抗原性成分、欠損型のHBVのバリアント、または薬剤を含む場合がある。
【０１４１】
薬学的に許容される担体および/または希釈剤は、任意の、およびあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性のある物質に関する、このような溶媒および薬剤の使用は当技術分野で周知である。任意の従来の溶媒または薬剤が活性成分と不適合な場合を除いて、治療的組成物中におけるその使用が企図される。補助的な活性成分を組成物中に混合することも可能である。
【０１４２】
薬学的組成物は、ベクターがアスパルチルプロテアーゼ阻害剤をコード可能な核酸分子を有する場合に標的細胞をトランスフェクト可能なベクターなどの遺伝的分子を含む場合もある。ベクターは例えば、ウイルスベクターの場合がある。
【０１４３】
注射使用に適した薬学的形態には、無菌性の水溶液(水溶性の場合)、および無菌性注射液の即時調製用の無菌性粉末などがある。これは製造および保存の条件で安定でなければならず、かつ細菌や真菌などの微生物で汚染されないように保存されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、その適切な混合物、ならびに植物油を含む溶媒または希釈溶媒の場合がある。適切な流動性は例えば、界面活性剤を使用することで維持できる。微生物の作用の予防は、さまざまな抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによって達成可能である。多くの場合、等張剤、例えば糖や塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、例えばモノステアリン酸アルミニウムやゼラチンなどの薬剤遅延吸収用の組成物を使用することで達成できる。
【０１４４】
無菌性の注射溶液は、必要量の活性化合物を適切な溶媒中に、活性成分、および必要であれば任意で他の活性成分とともに混合した後に、濾過滅菌または他の適切な殺菌手段を行うことで調製される。無菌性注射液調製用の無菌性粉末の場合、適切な調製法には、活性成分に加えて所望の追加的な成分の粉末が得られる真空乾燥法および凍結乾燥法などがある。
【０１４５】
活性成分が適切に保護されたら、例えば不活性希釈剤とともに、または同化され得る食用担体とともに経口投与が可能なほか、硬シェルカプセルもしくは軟シェルゼラチンカプセルで被覆したり、錠剤に圧縮したりすることができる。経口治療投与の場合は、活性成分を賦形剤と混合して、摂取可能な錠剤、口内錠、トローチ、カプセル、エリキシル、懸濁液、シロップ、ウエハースなどの形状で使用できる。このような組成物および調製物は、重量比で少なくとも1%の活性化合物を含むべきである。組成物および調製物のパーセンテージが変動し得ること、好都合には重量比で約5〜約80%の範囲であり得ることは言うまでもない。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適切な用量が得られるようにする。本発明の好ましい組成物または調製物は、経口投与剤形が約0.1μg〜200 mgの活性化合物を含むように調製される。他の投与量は、約1μg〜約1000 mgおよび約10μg〜約500 mgを含む。投与量は、個体あたり、または体重1 kgあたりの場合がある。投与は、時間毎、日毎、週毎、年毎に行われる場合がある。
【０１４６】
錠剤、トローチ剤、丸剤、カプセル剤などに、以下に挙げる成分を含めることも可能である。ガム、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンなどの結合剤；第二リン酸カルシウムなどの添加剤；コーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；およびショ糖、乳糖、またはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント香料、冬緑油香料、もしくはチェリー香料などの着香料を添加することができる。単位投与剤形がカプセルの場合、上記のタイプの材料に加えて、液体の担体を含めることができる。他のさまざまな材料を、コーティング剤として、または単位投与剤形の物理的形状を修飾するために含めることができる。例えば、錠剤、丸剤、またはカプセル剤を、セラック、糖、またはその両方でコーティングすることができる。シロップまたはエリキシルには、活性化合物、甘味剤としてショ糖、ならびに保存剤としてメチルパラベンおよびプロピルパラベン、色素、および香味料を含めることができる。任意の単位投与剤形の調製に使用される任意の材料が薬学的に純粋であり、かつ使用量において実質的に毒性がないものであるべきことは言うまでもない。加えて活性化合物は、徐放型の調製物および製剤中に混合することができる。
【０１４７】
上述したように本発明はさらに、本明細書に記載されたHBVのバリアントに由来する、単離されたHBsAgに拡張される。具体的には本発明は、HBsAg、またはその組換え型、またはその誘導体、もしくは化学的等価物を提供する。単離された表面成分、具体的には、単離された表面抗原、またはその組換え型、誘導型、もしくは化学的等価物は、ワクチン製剤などの生物学的組成物の開発に有用である。
【０１４８】
本発明のさらに別の局面は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、または該バリアントHBV、またはその組換え型もしくは誘導型、または、その化学的等価物に由来するHBVの表面抗原に耐性を示すバリアントHBV、ならびに1種類もしくは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む組成物を提供する。このような組成物は、治療的組成物として見なすことが可能であり、液性応答を含む免疫応答の惹起に有用である。一般にHBVバリアントは「欠損型」であり、それだけでは対象に持続的な感染を引き起こすことができない。
【０１４９】
上述したように、抗体を変異体バリアントHBV剤に対して作製し、このようなウイルスによる感染に対する受動的または直接的なワクチン接種に使用することができる。抗体は、ヒトまたは非ヒト動物で産生され得る。後者の場合、非ヒト抗体を脱免疫化する、すなわち具体的には使用前にヒト化するとよい。脱免疫化は例えば、マウスまたは非ヒト動物の抗HBV抗体の可変領域に由来する相補性決定領域(CDR)の、ヒトのコンセンサス断片抗体結合(Fab)ポリペプチドへの移植を含む場合がある。または、抗体の可変領域中のエピトープを決定するアミノ酸に、エピトープがヒトMHC II複合体によって認識されなくなるように変異を導入することができる。
【０１５０】
リボザイム、アンチセンス、またはコサプレッション(RNAi)もしくはsiRNA、またはそれらの複合体の抑制が考慮される場合、これは好都合には、翻訳後遺伝子サイレンシングが標的とされる。DNAまたはRNAを投与することができるほか、HBVのmRNAに特異的なRNAiまたは化学的類似体を含む複合体を利用することができる。
【０１５１】
このような全ての分子を、薬学的組成物中に混合することが可能である。
【０１５２】
別の態様では本発明は、バリアントHBV、またはHBsAg、または該バリアントHBVに由来するLタンパク質、Mタンパク質、もしくはSタンパク質、またはその組換え型もしくは誘導型、またはその化学的等価物を含む生物学的組成物を提供する。
【０１５３】
一般に、HBVを使用する場合は最初に弱毒化される。本発明のこの局面による生物学的組成物は一般に、1種類もしくは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤をさらに含む。
【０１５４】
生物学的組成物は、1種類のHBVのバリアントに由来するHBsAgまたは同様の分子を含む場合があるほか、組成物は、さまざまなADV耐性および/またはLMV耐性および/またはFTC耐性および/またはTFV耐性のHBVバリアントに由来するHbsAg、またはLタンパク質、Mタンパク質、もしくはSタンパク質、または同様の分子のカクテルの場合がある。組成物がHBVを含む場合には、類似の内容物が適用される。
【０１５５】
本発明はさらに、特定のヌクレオチド配列を有するか、または特定のポリメラーゼ、または表面抗原、またはLタンパク質、Mタンパク質、もしくはSタンパク質コードするHBV株の感染に対するワクチンを個体に接種するための治療用ワクチンの製造における欠損型のHBVのバリアントの使用に向けられる。
【０１５６】
適切なワクチン候補の例は、1つの態様では、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236Tなどの、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、もしくはrtM250における変異、別の態様では、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、およびrtH248Nを含む変異、またはさらに別の態様では、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lを含む変異、またはさらに別の態様では、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250Lを含む変異、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、またはそれらの組合わせ、または等価変異；別の態様では、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mなどの、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、もしくはsS210における変異、ならびに別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mを含む変異、またはさらに別の態様では、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rを含む変異、またはさらに別の態様では、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R、またはそれらの組合わせ、または同等の変異を含む変異から選択される変異を含む、欠損型のHBVのバリアントである。
【０１５７】
1つの態様では、例えばHBVのバリアントは、そのポリメラーゼにおいて、耐性もしくは低い感受性をヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体にもたらす特定の変異を有することが同定され得る。このようなバリアントは次に、それを欠損型とするような、すなわち弱毒化させるか、感染を生じなくするような変異が導入され得る。このような欠損型のヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体に耐性を示すウイルスは後に、そのポリメラーゼ中に同じ変異を有する毒性ウイルスに対する治療用ワクチンとして使用することができる。
【０１５８】
本発明は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに耐性を示すバリアントHBVを対象としたアッセイ法用のキットに拡張される。このようなキットは例えば、PCRまたは他の核酸ハイブリダイゼーション法用の試薬、または免疫学ベースの検出法用の試薬を含む場合がある。特に有用なアッセイ法は、固定化されたオリゴヌクレオチドまたはオリゴペプチを介する検出系に必要な試薬および成分を含む。
【０１５９】
本発明のなお別の局面は、DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびにDNAポリメラーゼのドメインFおよびG、ならびにドメインA〜E、またはこれに近位の領域の任意の1つもしくは複数に少なくとも1つのアミノ酸の置換、欠失、および/または付加をもたらす、HBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中に位置し、ならびにADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対する耐性もしくは低い感受性と関連する変異に関するスクリーニングを行う段階を含み、このような変異の存在が、該ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対して耐性を示す可能性のあることの指標となる、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせ、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対してHBVが低い感受性を示す可能性を見極める方法を企図している。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。
【０１６０】
潜在的なウイルスのバリアントの評価は、適切な治療プロトコルの選択に重要である。このような評価は、とりわけウイルスのバリアントと関連する少なくとも2つの特性用の入力コードを加えるソフトウェアでプログラムされたコンピューターの支援によって適切に高められ、特定の化合物または免疫学的薬剤に対するウイルスのバリアントの耐性もしくは感受性に対応する値が得られる。このような値は、(a)特定の化合物もしくは免疫学的薬剤に対し低い感受性または耐性を示す能力；(b)野生型HBVからのDNAポリメラーゼの変化；(c)野生型HBVからの表面抗原の変化；または(d)患者の罹患率もしくは回復の可能性から選択され得る。したがって本発明では、このような特性を示す値は、データを処理して、特定のウイルスのバリアント、またはこれを含む生物学的標本に関する値を提供可能な、機械で読み取り可能な記憶媒体に保存される。
【０１６１】
したがって別の局面では本発明は、以下を含む、対象における適切な治療プロトコル(図15)であることの見極めるために、ウイルスのバリアント、またはそれを含む生物学的試料が、有用な可能性を評価するためのコンピュータプログラム製品を企図している：
(1)以下から選択される、ウイルス性因子、またはこれを含む生物学的試料と関連する少なくとも2つの特性に関する入力コードとして受信するコード：
(a)特定の化合物もしくは免疫学的薬剤に対する低い感受性に耐性を示す能力；
(b)野生型HBVからのDNAポリメラーゼの変化；
(c)野生型HBVからの表面抗原の変化；または
(d)患者の罹患率もしくは回復の可能性；
(2)該ウイルスのバリアントまたは生物学的試料に関する値に対応する合計値を提供するために該入力コードを加えるコード；および
(3)コードを保存する、コンピューター可読媒体。
【０１６２】
関連する局面では本発明は、以下を含む、対象におけるウイルスのバリアント、またはそれを含む生物学的試料が有用である可能性を評価するためのコンピュータに拡張される：
(1)機械可読データが、該ウイルスのバリアント、もしくは生物学的試料と関連する、以下から選択される少なくとも2つの特性に関する入力コードを含む、機械可読データでコード化されたデータ記憶媒体を含む機械可読データの記憶媒体：
(a)特定の化合物もしくは免疫学的薬剤に対する低い感受性に耐性を示す能力；
(b)野生型HBVからのDNAポリメラーゼの変化；
(c)野生型HBVからの表面抗原の変化；または
(d)患者の罹患率もしくは回復の可能性；
(2)機械可読データを処理するための指示を蓄積するための作業メモリ；
(3)該機械可読データを処理して、該化合物の値に対応する該入力コードの総和を提供するために、作業メモリに、および機械可読データ記憶媒体に接続された中央演算処理装置；ならびに
(4)該値を受信するために中央演算処理装置に接続された出力ハードウェア。
【０１６３】
本発明により企図されている任意の一般的な目的、または特別の目的を有するコンピューターシステムは、記憶媒体、およびターミナルなどの少なくとも1つの入力/出力装置の両方と電気的に接続されたプロセッサを含む。汎用のコンピュータシステムを図15に示す。このようなシステムは、パーソナルコンピュータ、ワークステーション、またはメインフレームを含む場合があるが、それらに限定されない。プロセッサは、RAMメモリー上に位置するプログラムを実行する汎用プロセッサもしくはマイクロプロセッサ、または専用プロセッサの場合がある。プログラムは、ディスクやプログラム済みのROMメモリーなどの記憶装置に由来するRAM上に置かれる場合がある。RAMメモリーは、1つの態様では、データの保存とプログラムの実行の両方に使用される。コンピュータシステムは、プロセッサおよびメモリーが異なる物理的実体に存在するが、ネットワークによって電気的に接続されているシステムも含む。
【０１６４】
別の態様では、プログラムによって、1つの態様では、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236Tなどの、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、もしくはrtM250における変異、別の態様では、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、およびrtH248Nを含む変異、またはさらに別の態様では、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lを含む変異、またはさらに別の態様では、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250Lを含む変異、またはそれらの組合わせ、または同等の変異、またはそれらの組合わせ、または等価変異；別の態様では、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mなどの、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異、ならびに別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mを含む変異、またはさらに別の態様では、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rを含む変異、またはさらに別の態様では、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R、またはそれらの組合わせ、または同等の変異を含む変異から選択される変異のスクリーニングが行われる。
【０１６５】
本発明をさらに、以下の非制限的な実施例によって説明する。
【０１６６】
実施例1
HBVの重複性のゲノム
HBVの重複性のゲノムを図1に示す。DNAポリメラーゼをコードする遺伝子(P)は、ウイルスのエンベロープ遺伝子であるPre-S1およびPre-S2と重複しており、X遺伝子およびコア(C)遺伝子と部分的に重複している。HBVのエンベロープは、小型、中型、および大型のタンパク質である、HBVの表面抗原を含む。大型タンパク質成分は、HBVの表面抗原(HBsAg)と呼ばれ、S遺伝子配列にコードされている。Pre-S1およびPre-S2の遺伝子配列は、他のエンベロープ成分をコードしている。
【０１６７】
実施例2
ADV療法を受ける患者、およびHBVのDNAの解析
患者A：
ADV療法中に、固有のHBV変異が、実施例4に記載された方法によるPCR増幅配列決定法で検出された(表4)。検出された準種に変化が認められた。ADV(試料A)に関して当初選択された変異プロファイルは、rtN53K、rtY54D、rtL180M、rtT184S、およびrtM204Vの固有の変異を含む。重要な固有の変異はrtT184Sである。次に、異なるADV耐性プロファイルが試料B中のrtN53K/N、rtL180M、rtT181A/V、およびrtN236Tで検出された。重要な固有の変異は、ADV耐性患者で過去に検出されたrtT181A/VおよびrtN236Tである(表4、図3、図4、図5、図6、図7、および図8)。
【０１６８】
HBsAgにおける変化は、試料AではsT45K、sL175F、sI195Mを含み、続く試料BではsT45KおよびsL173L/Fが検出された。それらの固有の変化を、8つの遺伝子型A〜Hのそれぞれに由来する標準配列と、ならびに治療前の試料に由来するコンセンサス配列と比較することで固有の変化が決定された。
【０１６９】
患者B：
ADV治療中におけるHBVの変異を、表5、ならびに図9、図10、および図11に挙げる。HBVのDNAポリメラーゼのrt領域における重要な固有の変化はrtS202CおよびrtH248Nを含む。ADV治療中におけるHBVのポリメラーゼ中の他の変化は、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、およびrtM204Vを含む。ADV治療中におけるHBsAgの変化は、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mを含む。
【０１７０】
患者C：
ADV治療中におけるHBVの変異を、表6、ならびに図12、図13、および図14に挙げる。HBVのDNAポリメラーゼのrt領域における重要な固有の変化はrtM250Lを含む。ADV治療中におけるHBVのポリメラーゼ中の他の固有の変化は、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、およびrtM204Vを含む。ADV治療中におけるHBsAgの変化は、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rを含む。
【０１７１】
患者D：
この患者は当初、rtN236TにおけるADV耐性変異を有するとして選択された(Angus et al., Gastroenterology, 125 (2):292-7. 2003)。この患者は後に、ADVおよびLMVによる治療を受けた。併用抗ウイルス療法中に、ウイルス学上のブレークスルーがあった(経時的な(第1の抗ウイルス療法の開始後の日の)HBVのDNAレベル(ウイルス量)の増加、およびALTのグラフ表示に関しては図15を参照)。ADVおよびLMV二重治療におけるHBV変異を、表7、ならびに図16、図17、および図18に挙げる。HBVのゲノムのPCRによる増幅、および直接的な配列決定によって、HBVのDNAポリメラーゼのrt領域における固有の変化は、rtD134V、rtN139E/K、rtI233V、rtM250Lを含むことが判明した。それらは、rtA181VおよびrtN236Tにおける既知のADV耐性変異と関連して存在していた。重要な固有の変異はrtI233VおよびrtM250Lを含む。ADVおよびLMV治療中におけるHBVのポリメラーゼにおける全ての固有の変化は、rtN53D、rtS116P、rtD134V、rtN139E、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250Lを含む。ウイルス学上のブレークスルーの時点で単離されたHBVに由来するポリメラーゼ遺伝子をコードするPCR増幅産物を対象にクローン解析を実施した(実施例15参照)。他の重要な変異が、このPCR増幅産物中でrtS85Aに検出され、他の変異もrtN139K/EおよびrtQ149Kにおいてマイナーな種として検出された(表7の脚注)。
【０１７２】
ADVおよびLMV治療中におけるHBsAgにおける変化は、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210Rを含む。
【０１７３】
実施例3
ウイルスマーカーの検出
B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、抗HBe、およびB型肝炎コア抗原(HBcAg)に特異的なIgGおよびIgMを市販の免疫アッセイ法で測定した(Abbott Laboratories, North Chicago, IL, USA)。B型肝炎ウイルスのDNAレベルを、キャプチャーハイブリダイゼーションアッセイ法で、製造業者の指示通りに測定した(Digene Hybrid Capture II, Digene Diagnostics Inc., Beltsville, MD)。製造業者は、臨床標本中のHBVウイルス血症の検出時のカットオフが0.7x106コピー/mlまたは2.5 pg/mlであると述べている[Hendricks et al., Am J Clin Pathol 104: 537-46, 1995]。HBVのDNAレベルは、Cobas増幅HBVモニターキット(Roche)などの他の市販のキットで定量可能でもある。
【０１７４】
実施例4
HBVのDNAの配列決定
HBVのDNAを100 μlの血清から、Aye et al., J. Hepatol. 26: 1148-1153, 1997に記載された手順で抽出した。オリゴヌクレオチドは、Geneworks(Adelaide, Australia)によって合成された。HBVのポリメラーゼ遺伝子、またはHBVゲノムの全体の増幅については、Aye et al., 1997、前記、およびAyres et al., Methods Mol. Med. 95:125-49, 2004に記載されている。
【０１７５】
特異的な増幅産物を、MO BIO Laboratories Inc (La Jolla, CA)のカラムなどのPCR精製カラムを使用して精製し、BigDye terminator Cycle sequencing Ready Reactionキット(Perkin Elmer, Cetus Norwalk, CT)を使用して配列を直接決定した。PCR産物の内部領域の配列決定には、PCRプライマーを配列決定用のプライマー、
2008534020.tif 000005
を使用した。
【０１７６】
実施例5
アデフォビルジピボキシル(ADV)
ADV(旧名Bis-pom PMEA)は、HBVの複製の強力な阻害剤である。ADVの構造を図2に示す。この合成については、Benzaria et al., J Med Chem. 39: 4958-4965, 1996に記載されている。
【０１７７】
実施例6
抗ウイルス耐性のインビトロ解析
アデフォビル、テノホビル、および他の抗ウイルス剤に対するHBV変異体の感受性/耐性プロファイルをインビトロで、組換え型のHBV/バキュロウイルスを使用して調べた。耐性プロファイルの解析手順については、以下の実施例7〜14で概説する。
【０１７８】
実施例7
細胞培養
Sf21昆虫細胞を、10% v/v熱不活性化ウシ胎児血清(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)をさらに補充した補充グレース培地中で、加湿インキュベーター内で28CでCO2を加えて維持した。HepG2細胞を、10% v/v熱不活性化ウシ胎児血清(MEM-FBS)を添加した最小必須培地で維持した。HepG2細胞を加湿インキュベーター内で37℃で5% v/v CO2の条件で成長させた。
【０１７９】
実施例8
特異的な点変異を有するHBV/バキュロウイルス輸送ベクターの調製
抗ウイルス性の検討に使用した組換え型HBV/バキュロウイルス系は、文献に記載されている(Delaney et al., Antimicrob Agents Chemother 45(6): 1705-1013, 2001)。簡単に説明すると、組換え型の輸送ベクターを、1.3x HBVゲノムコンストラクトを含む断片を切り出し、これをバキュロウイルスベクターpBlueBac4.5(Invitrogen, Carlsbad, CA)のマルチクローニング領域にクローニングすることで作製した。点変異は、製造業者(QuikChange, Stratagene)の仕様書に従って市販のキットを使用する部位特異的変異誘発法で作製した。プラスミド、および部位特異的変異誘発法で作製された点変異のヌクレオチド配列を、ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキットを、製造業者(Perkin Elmer, Cetus Norwalk, CT)の仕様書に従って使用した配列決定によって確認した。HBV変異体のパネルを、野生型(WT)の遺伝子型DのHBV単離物から部位特異的変異導入法で作製した。変異体は、WTのHBVのポリメラーゼ、またはHBeAg陰性(precore [PC] G1896A変異体)のバックグラウンドで、表8に挙げたアミノ酸置換を有するポリメラーゼいずれかをコードするものとした。他のHBV変異体を作製して、抗ウイルス感受性に関して同様の手順で検討することができる。
【０１８０】
実施例9
1.3 HBVコンストラクトを含む組換え型バキュロウイルスの作製
精製済みの組換え体輸送ベクターおよび直鎖状のAcMNPVバキュロウイルスのDNAを、Invitrogen(Carlsbad, CA)のBacNBlueトランスフェクションキットを使用してSf21細胞に同時にトランスフェクトし；組換え型ウイルスをプラークアッセイ法で製造業者の指示書に従って単離した。一連の組換え型ウイルスを、単離されたプラークから、Sf21細胞の100-mmのディッシュに感染させて増幅した。ウイルスDNAを、増幅後のウイルスから標準的な手順で抽出した。精製後のウイルスDNAを制限酵素で切断後に、1% v/vアガロースゲル電気泳動で分画した。サザンブロッティングを行って、どのウイルス単離物が、完全な1.3 HBVコンストラクトを含むかを判定した。Boehringer Mannheim Random Prime DNA Labelingキット(Indianapolis, IN)を使用して、[32P]-放射標識プローブを作製した。完全長の2本鎖のHBVゲノムを、全ての放射標識プローブのテンプレートとして使用した。ウイルスのDNA配列は、ポリメラーゼの触媒領域を対象としたPCR増幅および配列決定によって確認した。
【０１８１】
実施例10
バキュロウイルスの増幅および精製の準備
バキュロウイルスを、対数増殖期のSf21細胞の懸濁培養物に、0.5 pfu/細胞の感染多重度(moi)時に感染させることで増幅した。感染は、フラスコ内の細胞の大半が、明らかな感染の兆候を示すまで進めた(4〜5日)。ウイルス粒子を感染Sf21培地から、80,000×gで遠心分離し、20〜60%(w/v)のショ糖勾配で精製して濃縮した。精製後のウイルスの滴定をSf21細胞を対象にエンドポイント希釈法で4回行った。個々の高力価ストックのアリコートをDNAの抽出に使用した。ポリメラーゼ遺伝子を増幅し、配列を決定して、部位特異的変異導入の存在を確認した。
【０１８２】
実施例11
抗ウイルス剤によりバキュロウイルスを発現する組換え型HBVによるHepG2細胞の感染(すなわち形質導入)
HepG2細胞を約20〜40%のコンフルエンシーの時点で添加し、16〜24時間成長させてから感染させた。感染させる日に、細胞の3枚のプレートをトリプシン処理し、生きている細胞数を血球計数器でトリパンブルー排除法で決定した。平均細胞数を計算し、指定のmoiにおける細胞の感染に必要な高力価ウイルスストックの容積を決定した。HepG2細胞を無血清MEMで1回洗浄して微量の血清を除去した。バキュロウイルスを、血清を含まないMEMで希釈し、適切なmoiを、1.0 ml、0.5 ml、および0.25 mlの容積で、それぞれ100 mm、60 mm、および35 mmのディッシュに感染させて達成した。バキュロウイルスをHepG2細胞に1時間、37℃で、15分毎に穏やかに振盪しながら吸収させ、接種細胞が均一に分布するようにした。次に接種細胞を吸引し、HepG2細胞をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、さまざまな濃度の薬剤を含むか、または薬剤を含まないMEM-FBSに添加した。
【０１８３】
同型のHepG2細胞培養物を野生型または変異型のHBVで、バキュロウイルスベクターを使用して形質導入を行い、さまざまな濃度の各ドラッグに7日間、連続的に曝露させた。各アッセイ法では、5つの異なる濃度の各ドラッグについて2回の検討を行った。ヌクレオシド類似体(LMV、FTC、L-dT、およびETV)のドラッグ濃度は、1 nM、10 nM、100 nM、1,000 nM、および10,000 nMとした。使用したヌクレオチド類似体(ADVおよびTFV)の濃度は、100 nM、500 nM、1,000 nM、5,000 nM、および10,000 nMとした。2組の非処理培養物を対照として使用した。7日間の培養後にDNAを抽出して解析した。
【０１８４】
実施例12
分泌型HBV抗原の解析
B型肝炎e抗原(HBeAg)の検出を、ラジオイムノアッセイ法および微粒子酵素イムノアッセイ法で、Abbott Laboratories (Abbott Park, IL, USA)から購入したキットを使用して行った。HepG2細胞由来の培地を回収し、6,000 gで遠心分離して細胞破片を除去し、清浄なチューブに移し、解析を行うまで20℃で保存した。HBeAgの値を、正の対照に対する倍率で表す。培地試料を、ラジオイムノアッセイ法の結果がHBeAgに関して正の対照における値を下回るように適切に希釈した。
【０１８５】
実施例13
細胞内複製中間体の検出
HBVのコア粒子を、0.5% w/vのNP-40に溶解したHepG2細胞の細胞質フラクションから単離した。細胞質抽出物を、10 mmol/l McC 12となるように調整し、非保護状態のDNAを、500 g/ml Proteinase Kと37℃で1.5時間インキュベートして除去した。次に試料中のHBVのDNAを、Qiagen(DNA抽出用)などの市販のDNA抽出キットで、またはフェノールおよびクロロホルムによる連続抽出によるインハウスの方法で抽出して、核酸をエタノール沈殿法で回収した。核酸を50 μl/lのTE(10 mmol/l Tris、1 mmol/lエチレンジアミン四酢酸)に再懸濁し、OD260で標準化し、および100 g/mlのRNase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)で37℃で1時間かけて消化した後に、リアルタイムPCRまたは電気泳動、および完全長の[32P]標識HBVを使用するサザンブロッティングによる解析を行い、Bio-Radの蛍光体イメージング用スクリーンを使用してオートラジオグラフを得た。画像を記録し、「Quantity One」ソフトウェアを備えたBio-Rad Model FX Molecular Imagerで解析した。
【０１８６】
ドラッグ処理細胞中のHBVのDNAの量を、画像密度を元に、非処理対照におけるHBVのDNAの平均量(1.0と定義)に対する割合として表した。2回の実験で得られた2組の値を平均化して、平均および標準偏差を算出する個々の3回の独立したアッセイ法に関して1つの値を得た。得られたデータを、EC50、EC90、およびAUC(曲線下面積)を推定する用量反応プロットを作成するTableCurve2Dを使用して解析した。
【０１８７】
実施例14
野生型およびポリメラーゼ上の変異をコードするHBV/バキュロウイルスによって実施される抗ウイルス性の検討
変異体のパネルに対する抗ウイルス剤の影響を表9に示す。抗ウイルス性の検討の結果、ETVに関して、LMV耐性変異体と関連してコドン184およびコドン202において過去に選択された変異が、ADVおよびTDFに対する感受性にも影響を及ぼすことがわかった。184変異および202変異が、ADV治療のみを受けた患者によって選択された(患者Aおよび患者Bを参照)。他の変異をコードするHBVを類似の方法で検討する。
【０１８８】
実施例15
抗ウイルス療法中に選択されたHBVのポリメラーゼ変異体のクローン解析
LMV療法時およびADV療法時のウイルス学的ブレークスルーの時点でクローン解析を行い、患者Dにおいて複数のHBV変異が同じゲノム上に存在するか否かを判定した。逆転写酵素/ポリメラーゼの触媒ドメインを、文献(Ayres et al., 2004、前記)に記載の手順で配列が決定済みのプライマーOS1およびOS2(実施例4参照)を使用して個別に増幅した。それらの試料から得られたOS1/OS2 PCR産物をPCRScript Amp SK+(Stratagene)中に、製造業者の指示書に従ってクローニングした。PCR増幅を個々のクローンから直接実施し、上記の各試料に関してPCR産物の配列を、OS1/OS2 PCRプライマーを配列決定用プライマーとして使用して決定した。ADV単独療法の失敗時には、患者は事前にrtN236TおよびrtA181Tを選択していた。ADVおよびLMVの二重耐性の時点で、ゲノム全体の増幅および直接配列決定によって検出された変異プロファイルは、rtN53D、rtS116P、rtD134V、rtN139E、rtA181V、rtI233V、rtN236T、rtM250Lを含んでいた。rtN236TおよびrtA181Tは100%のクローンで検出された。55%のクローンにおけるrtN139E＋rtQ149K＋rtM250L＋rtI233Vと、45%のクローンにおけるrtS85A＋rtN139K＋rtN238Dについて2つの主なクローンプロファイルがそれぞれ検出された。rtS85Aにおける重要な変異、ならびにrtN139E/KおよびrtQ149Kにおける変異は、HBVゲノムの初期増幅における直接配列決定、およびPCR配列決定では検出されなかったが、クローンの直接配列決定によって検出され、PCR産物もまたクローン解析用に使用された。
【０１８９】
rtM250L変異は、コドンrt250における過去に明らかにされた別の変異がETV治療中に選択されたように、エンテカビルに対する感受性に影響を及ぼすと考えられた。rtI233Vは、HIVのコドン215に対するHIVの逆転写酵素との配列アラインメント中の同様の位置に位置する(Batholomeusz et al., Antivir Ther. 9(2): 149-6, 2004)。rtM204I/V±rtL180MのLMV耐性変異は、ADVとLMVの併用療法時のウイルス学的ブレークスルー時のクローン解析では検出されなかった。
【０１９０】
当業者であれば、本明細書に記載された本発明が、具体的に記載された事項以外に変更および変形の影響を受けやすいことを理解するであろう。本発明は、このような全ての変更および変形を含むことを理解されたい。本発明は、個別または集合的に本明細書において言及されたか、または指示された、あらゆる段階、特徴、組成物、および化合物、ならびに任意の2つか、または2つ以上の段階または特性の任意の、および全ての組合わせも含む。
【０１９１】
（表４）ADV療法中に検出された患者AにおけるHBVのポリメラーゼおよびエンベロープの変異
2008534020.tif 000006
【０１９２】
（表５）ADV療法中に検出された患者BにおけるRTおよびポリメラーゼの変異
2008534020.tif 000007
【０１９３】
（表６）ADV療法中に検出された患者CにおけるRTおよびポリメラーゼの変異
2008534020.tif 000008
【０１９４】
（表７）ADVおよびLMV療法中に直接PCR増幅配列決定によって検出された患者DにおけるRTおよびポリメラーゼの変異*
2008534020.tif 000009
*クローン解析では、rtS85Aにおいて重要な変異が、ならびにrtN139K/EおよびrtQ149Kにおいて他の変異もマイナーな種として検出された。
【０１９５】
（表８）HBVの変異体に関する記述
2008534020.tif 000010
【０１９６】
（表９）抗ウイルス性試験の結果の要約
2008534020.tif 000011
【０１９７】
参考文献
2008534020.tif 000012
2008534020.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【０１９８】
【図１】表面(S)、コア(C)、ポリメラーゼ(P)、およびXの遺伝子をコードする重複性オープンリーディングフレームを示す、部分的に2重鎖のDNAであるHBVのゲノムを示す図である。
【図２】ADVの化学構造の図である。
【図３】ADV治療中の患者Aに由来する連続試料(試料A)中のポリメラーゼ遺伝子の触媒領域をコードするHBVのヌクレオチド配列の比較を示す図である。
【図４】ADV療法中の患者Aに由来する連続試料(試料A)中のポリメラーゼ遺伝子の触媒領域の推定アミノ酸配列の比較を示す図である。
【図５】ADV療法中の患者Aに由来する連続試料(試料A)中のエンベロープ遺伝子の推定アミノ酸配列の比較を示す図である。
【図６】ADV治療中の患者Aに由来する連続試料(試料B)中のポリメラーゼ遺伝子の触媒領域をコードするHBVのヌクレオチド配列の比較を示す図である。
【図７】ADV療法中の患者Aに由来する連続試料(試料B)中のポリメラーゼ遺伝子の触媒領域の推定アミノ酸配列の比較を示す図である。
【図８】ADV療法中の患者Aに由来する連続試料(試料B)中のエンベロープ遺伝子の推定アミノ酸配列の比較を示す図である。
【図９】ADVおよびLMV治療中の患者Bに由来する連続試料中のポリメラーゼ遺伝子の触媒領域をコードするHBVのヌクレオチド配列の比較を示す図である。
【図１０】ADVおよびLMV療法中の患者Bに由来する連続試料中のポリメラーゼ遺伝子の触媒領域の推定アミノ酸配列の比較を示す図である。
【図１１】ADVおよびLMV療法中の患者Bに由来する連続試料中のエンベロープ遺伝子の推定アミノ酸配列の比較を示す図である。
【図１２】ADV治療中の患者Cに由来する試料中のポリメラーゼ遺伝子の触媒領域をコードするHBVのヌクレオチド配列を示す図である。
【図１３】ADV療法中の患者Cに由来する試料中のポリメラーゼ遺伝子の触媒領域の推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１４】ADV療法中の患者Cに由来する試料中のエンベロープ遺伝子の推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１５】経時的な(最初の抗ウイルス療法開始からの日数)HBVのDNAレベル(ウイルス量)およびALTの増加のグラフ表示である。
【図１６】ADVおよびLMV治療中の患者Dに由来する試料中のポリメラーゼ遺伝子の触媒領域をコードするHBVのヌクレオチド配列を示す図である。
【図１７】ADVおよびLMV療法中の患者Dに由来する試料中のポリメラーゼ遺伝子の触媒領域の推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１８】ADVおよびLMV療法中の患者Dに由来する試料中のエンベロープ遺伝子の推定アミノ酸配列を示す図である。
【図１】
2008534020.tif 000014
【図２】
2008534020.tif 000015
【図３】
2008534020.tif 000016
【図４】
2008534020.tif 000017
【図５】
2008534020.tif 000018
【図６】
2008534020.tif 000019
【図７】
2008534020.tif 000020
【図８】
2008534020.tif 000021
【図９】
2008534020.tif 000022
【図１０】
2008534020.tif 000023
【図１１】
2008534020.tif 000024
【図１２】
2008534020.tif 000025
【図１３】
2008534020.tif 000026
【図１４】
2008534020.tif 000027
【図１５】
2008534020.tif 000028
【図１６】
2008534020.tif 000029
【図１７】
2008534020.tif 000030
【図１８】
2008534020.tif 000031
【配列表】
2008534020000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年2月8日(2007.2.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
バリアントにコードされたタンパク質にアミノ酸の付加、置換、および/または欠失をもたらすヌクレオチド変異を含み、ADV、LMV、TFV、およびFTCからなるリストより選択される1種類もしくは複数のヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体に低い感受性を示し、DNAポリメラーゼをコードする遺伝子中にrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236もしくはrtM250からなるリストより選択されるコドンでの変異、および/または表面抗原をコードする遺伝子中にstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204もしくはsS210からなるリストより選択されるコドンでの変異から選択される変異を含む、単離されたB型肝炎ウイルス(HBV)のバリアント。
【請求項２】
変異が、HBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中に存在する、請求項1記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項３】
変異が、表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項1記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項４】
変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される、請求項1または2記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項５】
変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項4記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項６】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181T、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項4記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項７】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項5記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項８】
変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異から選択される、請求項1または3記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項９】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mからなり、別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、およびsS210Rを含むリストから選択される、請求項8記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項１０】
DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびにDNAポリメラーゼをコードする遺伝子中にrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236もしくはrtM250からなるリストより選択されるコドンでの変異、および/または表面抗原をコードする遺伝子中にstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204もしくはsS210からなるリストより選択されるコドンでの変異から選択される変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBVが、ADV、LMV、TFV、および/もしくはFTCに低い感受性を示す可能性を示すことを見極める方法。
【請求項１１】
変異が、HBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中に存在する、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
変異が、表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項10記載の方法。
【請求項１３】
変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される、請求項10または11記載の方法。
【請求項１４】
変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項12記載の方法。
【請求項１５】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181T、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項13記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項１６】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210に存在する、請求項10または12記載の方法。
【請求項１８】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、およびsS210Rからなるリストより選択される、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、請求項1記載のADV、LMV、TFV、および/もしくはFTCに耐性を示すバリアントHBV、ならびに1種類もしくは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む組成物。
【請求項２０】
バリアントHBVが、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項19記載の組成物。
【請求項２１】
変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項20記載の組成物。
【請求項２２】
バリアントHBVが、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181T、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される変異を含む、請求項19または20記載の組成物。
【請求項２３】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項22記載の組成物。
【請求項２４】
変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異から選択される、請求項19記載の組成物。
【請求項２５】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、およびsS210Rからなるリストより選択される、請求項24記載の組成物。
【請求項２６】
DNAポリメラーゼをコードする遺伝子中にrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236もしくはrtM250からなるリストより選択されるコドンでのヌクレオチド変異、および/または表面抗原をコードする遺伝子中にstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204もしくはsS210からなるリストより選択されるコドンでの変異から選択される変異を含むバリアントHBVの使用。
【請求項２７】
変異が、HBVのDNAポリメラーゼ遺伝子、および/または表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項26記載の使用。
【請求項２８】
変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される、請求項26または27記載の使用。
【請求項２９】
変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項26または28記載の使用。
【請求項３０】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項28記載の使用。
【請求項３１】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項29記載の使用。
【請求項３２】
変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異から選択される、請求項26または27記載の使用。
【請求項３３】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される、請求項32記載の使用。
【請求項３４】
DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびにDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中の変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBV株がヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に低い感受性を示すか否かを判定する方法であって、コドンrtN53、rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、およびrtM250から選択されるrt領域における変異の存在が、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに低い感受性を示すバリアントであることを示す、方法。
【請求項３５】
変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異からなるリストより選択される、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される請求項34記載の方法。
【請求項３７】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K 、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
エンベロープ遺伝子をコードするヌクレオチド配列中の変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBV株がヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に低い感受性を示すか否かを判定する方法であって、コドンsT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、およびsS210から選択される、s遺伝子中における変異の存在が、HBVのバリアントがETVのみまたはETVおよびLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに低い感受性を示すバリアントであることを示す、方法。
【請求項３９】
変異が、stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210からなるリストより選択される、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
変異が、stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210からなるリストより選択される、請求項39記載の方法。
【請求項４１】
ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択される、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または類似体の組合わせに曝露された対象からHBVを単離する段階を含み、該HBVを、表面抗原に対する1種類もしくは複数の抗体のパネルに接触させる段階、ならびにHBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、結合親和性または結合スペクトルにおける任意の変化に関するスクリーニングを行う段階を含む、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVを検出する方法。
【請求項４２】
変異が、HBVのDNAポリメラーゼ遺伝子中、または表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項41記載の方法。
【請求項４３】
コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異体を含む、請求項41または42記載の方法。
【請求項４４】
コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項43記載の方法。
【請求項４５】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項43記載の方法。
【請求項４６】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項44または45記載の方法。
【請求項４７】
コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、SI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、もしくはsS210に変異を含む、請求項41または42記載の方法。
【請求項４８】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される、請求項47記載の方法。
【請求項４９】
血清試料を、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択されるヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体に曝露された対象から単離する段階、および続いて血清を、HBVの表面抗原、またはその抗体結合断片のパネルに接触させる段階、ならびにHBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、結合親和性または結合スペクトルにおける任意の変化に関するスクリーニングを行う段階を含む、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVを検出する方法。
【請求項５０】
変異が、HBVのDNAポリメラーゼ遺伝子中、または表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項49記載の方法。
【請求項５１】
コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、もしくはrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項49または50記載の方法。
【請求項５２】
コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項49または50記載の方法。
【請求項５３】
変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項51または52記載の方法。
【請求項５４】
変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項52記載の方法。
【請求項５５】
変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、SI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、もしくはsS210における変異である、請求項49または50記載の方法。
【請求項５６】
変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される、請求項55記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項５７】
プラスミドベクターに含まれる、HBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製する段階、次いで、細胞に該コンストラクトをトランスフェクトする段階、トランスフェクション前、トランスフェクション中、および/またはトランスフェクション後に、細胞に被験薬剤を接触させ、該薬剤に耐性を示す場合に、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階；ならびに細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階により、HBVに阻害活性を示す薬剤を検出する方法。
【請求項５８】
感染性のHBVゲノムが、2.2.15細胞系もしくはAD細胞系などを含むがそれらに限定されない連続細胞系中に安定に組入れられるように、HBVのゲノムの感染性コピーを複製可能な有効量で含む、連続細胞系を作製する段階、細胞に被験薬剤を接触させる段階、細胞を、薬剤に耐性を示す場合に、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階、ならびに続いて細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、ウイルスが薬剤の存在下で複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階を代替的に含む、請求項57記載の方法。
【請求項５９】
HBV感染の治療用の薬物の製造における、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204Gを含むリストから選択される、HBV感染に対する治療用ワクチンの製造におけるHBVのバリアントの使用であって、ここで、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVにHBVが耐性を示す、使用。
【請求項６０】
HBVが、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC；ADVおよびLMV；ADVおよびTFV；LMVおよびTFV；FTCおよびADV；FTCおよびTFV；FTCおよびLMV；ETVおよびADV；ETVおよびFTC；ETVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびTFV；またはADVおよびFTCおよびTFV；TFVおよびFTCおよびLMV；ADVおよびLMVおよびETV；ADVおよびETVおよびTFV；ETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびLMVおよびFTC；ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV；ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV；ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV；ならびにADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに耐性を示し、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択されるHBVワクチンを含む、HBV感染に対するワクチン。
【請求項６１】
HBVが、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項60記載のワクチン。
【請求項６２】
rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される変異を含むHBVのバリアント、ならびに1種類もしくは複数のワクチンに許容される担体および/または希釈剤を含む、請求項60記載のワクチン。
【請求項６３】
HBVがrtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Iから選択される変異を含む、請求項61記載のワクチン。
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月7日(2007.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
DNAポリメラーゼの逆転写酵素(rt)のアミノ酸残基番号181におけるアラニン(A)(rtA181)、アミノ酸残基番号233におけるイソロイシン(I)(rtI233)、アミノ酸残基番号236におけるアスパラギン(N)(rtN236)、およびアミノ酸残基番号250におけるメチオニン(M)(rtM250)に対する、アミノ酸の置換、付加、または欠失を含み、少なくとも2つのヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体に対する耐性を付与する、アミノ酸の共変異(co-mutation)を、DNAポリメラーゼの逆転写酵素(rt)内に含む、単離されたB型肝炎ウイルス(HBV)のバリアント。
【請求項２】
アミノ酸残基番号53におけるアスパラギン(N)(rtN53)に対するアミノ酸の置換、付加、または欠失をさらに含む、請求項1記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項３】
アミノ酸残基番号116におけるセリン(S)(rtS116)に対するアミノ酸の置換、付加、または欠失をさらに含む、請求項1記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項４】
アミノ酸残基番号134におけるアスパラギン酸(D)(rtD134)に対するアミノ酸の置換、付加、または欠失をさらに含む、請求項1記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項５】
アミノ酸残基番号139におけるアスパラギン(N)(rtN139)に対するアミノ酸の置換、付加、または欠失をさらに含む、請求項1記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項６】
DNAポリメラーゼの逆転写酵素(rt)のアミノ酸残基番号181におけるアラニン(A)(rtA181)、アミノ酸残基番号233におけるイソロイシン(I)(rtI233)、アミノ酸残基番号236におけるアスパラギン(N)(rtN236)、アミノ酸残基番号250におけるメチオニン(M)(rtM250)、アミノ酸残基番号53におけるアスパラギン(N)(rtN53)、アミノ酸残基番号116におけるセリン(S)(rtS116)、アミノ酸残基番号134におけるアスパラギン酸(D)(rtD134)、およびアミノ酸残基番号139におけるアスパラギン(N)(rtN139)に対する、アミノ酸の置換、付加、または欠失を含み、少なくとも2つのヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に対する耐性を付与する、アミノ酸の共変異を、DNAポリメラーゼの逆転写酵素(rt)内に含む、単離されたHBVのバリアント。
【請求項７】
少なくとも1つのヌクレオシド類似体がラミブジン(LMV)である、請求項1または6記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項８】
少なくとも1つのヌクレオチド類似体がアデフォビル(ADV)である、請求項1または6記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項９】
少なくとも2つのヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体がLMVおよびADVである、請求項1または6記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項１０】
rtA181におけるバリン(V)での置換(rtA181V)、rtI233におけるバリン(V)での置換(rtI233V)、rtN236におけるトレオニン(T)での置換(rtN236T)、およびrtM250におけるロイシン(L)での置換(rtM250L)を含む、請求項1または6または9のいずれか一項記載の単離されたHBV。
【請求項１１】
rtN53におけるリジン(L)またはアスパラギン(N)での置換(rtN53D)をさらに含む、請求項10記載の単離されたHBV。
【請求項１２】
rtS116におけるプロリン(P)での置換(rtS116P)をさらに含む、請求項10記載の単離されたHBV。
【請求項１３】
rtD134におけるバリン(V)での置換(rtD134V)をさらに含む、請求項10記載の単離されたHBV。
【請求項１４】
rtN139におけるグルタミン酸(E)での置換(rtN139E)をさらに含む、請求項10記載の単離されたHBV。
【請求項１５】
置換変異rtA181V、rtI233V、rtN236T、rtM250L、rtN53D、rtS116P、rtD134V、およびrtN139Eを含む、請求項6または9記載の単離されたHBVのバリアント。
【請求項１６】
HBVのDNAもしくは対応するmRNAを対象に、DNAポリメラーゼのrtのrtA181、rtI233、rtN236、およびrtM250におけるアミノ酸の置換、付加、または欠失につながると考えられる共変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、2つまたはそれ以上のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に対してHBVが耐性を示す可能性が高いか否かを判定する診断法。
【請求項１７】
rtN53におけるアミノ酸の置換、付加、または欠失に関するスクリーニングを行う段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
rtI233におけるアミノ酸の置換、付加、または欠失に関するスクリーニングを行う段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
rtS116におけるアミノ酸の置換、付加、または欠失に関するスクリーニングを行う段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
rtD134におけるアミノ酸の置換、付加、または欠失に関するスクリーニングを行う段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２１】
rtN139におけるアミノ酸の置換、付加、または欠失に関するスクリーニングを行う段階をさらに含む、請求項16記載の方法。
【請求項２２】
HBVのDNAもしくは対応するmRNAを対象に、DNAポリメラーゼのrtのrtA181、rtI233、rtN236、rtM250、rtN53、rtS116、rtD134、およびrtN139におけるアミノ酸の置換、付加、または欠失につながると考えられる共変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、2つまたはそれ以上のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に対してHBVが耐性を示す可能性が高いか否かを判定する診断法。
【請求項２３】
少なくとも1つのヌクレオシド類似体がラミブジン(LMV)である、請求項16または21記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも1つのヌクレオチド類似体がアデフォビル(ADV)である、請求項16または121記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも2つのヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体がLMVおよびADVである、請求項16または22記載の方法。
【請求項２６】
rtA181におけるバリン(V)での置換(rtA181V)、rtI233におけるバリン(V)での置換(rtI233V)、rtN236におけるトレオニン(T)での置換(rtN236T)、およびrtM250におけるロイシン(L)での置換(rtM250L)に関するスクリーニングを行う段階を含む、請求項16または22または25のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
rtN53におけるアスパラギン酸Dでの置換(rtN53D)に関するスクリーニングを行う段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項２８】
rtS116におけるプロリン(P)での置換(rtS116P)に関するスクリーニングを行う段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項２９】
rtD134におけるバリン(V)での置換(rtD134V)に関するスクリーニングを行う段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項３０】
rtN139におけるグルタミン酸(E)での置換(rtN139E/)に関するスクリーニングを行う段階をさらに含む、請求項26記載の方法。
【請求項３１】
置換変異rtA181V、rtI233V、rtN236T、rtM250L、rtN53D、rtS116P、rtD134V、およびrtN139Eに関するスクリーニングを行う段階を含む、請求項21または25記載の方法。
【請求項３２】
HBVのDNAもしくは対応するmRNAを対象に、rtL180およびrtM204における、ならびにrtS202および/またはrtM250の1つまたは複数におけるアミノ酸の置換、付加、または欠失につながると考えられる共変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、2つまたはそれ以上のヌクレオシド類似体にHBVが耐性を示す可能性が高いか否かを判定する診断法。
【請求項３３】
共変異がrtL180、rtM204、およびrtS202である、請求項32記載の診断法。
【請求項３４】
共変異が、rtL180M、rtM204V、およびrtS202Cの置換につながる、請求項33記載の診断法。
【請求項３５】
共変異が、rtL180M、rtM204V、およびrtM250Lの置換につながる、請求項34記載の診断法。
【国際調査報告】
2008534020.tif 000032
2008534020.tif 000033
2008534020.tif 000034