(57)【要約】【課題】熟地黄と五加皮の混合生薬材抽出物及びそれを有効成分とする骨粗鬆症予防及び治療用組成物の提供。【解決手段】本発明は、熟地黄（Ｒｅｈｍａｎｎｉａｅ  Ｒａｄｉｘ  Ｐｒｅｐａｒａｔａ）と五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ  Ｃｏｒｔｅｘ）の混合生薬材抽出物及びそれを有効成分とする骨粗鬆症予防及び治療用組成物に関するものである。本発明の混合生薬材抽出物は、造骨細胞を増殖させて、破骨細胞の形成及び活性を効果的に抑制するので、骨粗鬆症予防及び治療に有用に使用することができる。【選択図】図１
2008531552.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
造骨細胞からのオステオプロテゲリン分泌促進及び破骨細胞増殖抑制活性を有する熟地黄及び五加皮の混合生薬材抽出物。
【請求項２】
前記混合生薬材抽出物が、熟地黄抽出物：五加皮抽出物の重量比が１５．０：０．５〜０．１５：５．０であることを特徴とする、請求項１に記載の混合生薬材抽出物。
【請求項３】
前記混合生薬材抽出物が、熟地黄抽出物：五加皮抽出物の重量比が８：１〜１：４であることを特徴とする、請求項１に記載の混合生薬材抽出物。
【請求項４】
前記混合生薬材抽出物が、熟地黄抽出物：五加皮抽出物の重量比が４：１〜１：１であることを特徴とする、請求項１に記載の混合生薬材抽出物。
【請求項５】
前記熟地黄抽出物が、熟地黄を、水、Ｃ１〜Ｃ４アルコールまたは水とＣ１〜Ｃ４アルコールの混合溶液で抽出したものであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項に記載の混合生薬材抽出物。
【請求項６】
前記五加皮抽出物が、五加皮を、水、Ｃ１〜Ｃ４アルコールまたは水とＣ１〜Ｃ４アルコールの混合溶液で抽出したものであることを特徴とする、請求項２〜４のいずれか一項に記載の混合生薬材抽出物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか一項の混合生薬材抽出物を有効成分として含む、造骨細胞によるオステオプロテゲリン発現促進剤。
【請求項８】
請求項１〜４のいずれか一項の混合生薬材抽出物を有効成分として含む、破骨細胞増殖抑制剤。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項の混合生薬材抽出物を有効成分として含む、骨粗鬆症予防及び治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、熟地黄（Ｒｅｈｍａｎｎｉａｅ  Ｒａｄｉｘ  Ｐｒｅｐａｒａｔａ）と五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ  Ｃｏｒｔｅｘ）の混合生薬材抽出物、及びそれを有効成分とする骨粗鬆症予防及び治療用組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
骨は、筋肉と連合している石灰化した結体組織で、表面は厚くて堅い石灰化組織であり、身体均衡を成す支柱の役割をして、臓器を保護している。骨の内側には、骨髄組織があり、  カルシウム代謝の中心になる部位である。骨は、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）、オステオカルシン（ｏｓｔｅｏｃａｌｃｉｎ）、オステオネクチン（ｏｓｔｅｏｎｅｃｔｉｎ）など有機質（ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）と、カルシウム、リン、フッ素などの無機質（ｉｎｏｒｇａｎｉｃ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）及び水分で構成されている。生体ではいつも、骨形成（ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ）と骨吸収（ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ）が起きている。骨形成は、少量の副甲状線ホルモンやアンドロゲン、エストロゲン、フッ素、リンなどによって促進され、骨吸収は、物理的減圧、無重力状態、多量の副甲状線ホルモン、副腎皮質ステロイドなどによって促進される。したがって、骨代謝には、これらの間の均衡が重要である。
【０００３】
骨粗鬆症（ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）は、骨吸収と骨形成の均衡が崩れて発生するもので、骨形成より骨吸収が過多に進行することに起因した疾患である。骨粗鬆症は、骨組織の石灰が減少して骨の緻密質が薄くなって、それによって骨髄腔が広くなって、症状が進むにつれて骨が弱くなるため、小さな衝撃にも骨折しやすくなる。骨組織は、造骨細胞によって形成され、破骨細胞によって破壊吸収が絶えず繰り返される動的な組織である。
【０００４】
骨吸収は、破骨細胞によって起き、破骨細胞の生成及び活性には、ＮＦ−κＢ受容体の受容体活性剤（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ＲＡＮＫＬ）が必ず必要である。ＲＡＮＫＬは、造骨細胞及び肝葉細胞に存在して、破骨細胞前駆細胞及び破骨細胞のＮＦ−κＢの受容体活性剤（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ｏｆ  ＮＦ−κＢ，ＲＡＮＫ）に結合する（非特許文献１）。造骨細胞で生産されるタンパク質であるオステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｉｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ，ＯＰＧ）は、ＲＡＮＫＬの誘引基（ｄｅｃｏｙ）受容基としてＲＡＮＫＬとＲＡＮＫの結合を邪魔することで、破骨細胞前駆細胞が破骨細胞に分化することを抑制して、破骨細胞の活性も抑制する（非特許文献２）。
【０００５】
骨粗鬆症の原因は、原発性（ｐｒｉｍａｒｙ）と続発性（ｓｅｃｏｎｄａｒｙ）に分けられ、原発性骨粗鬆症は主に、老年期骨粗鬆症と閉経期後の骨粗鬆症で、続発性骨粗鬆症は、甲状腺機能亢進、副甲状線機能亢進、副腎皮質機能亢進、妊娠、長期間の固定（例、石膏包帯固定など）、栄養不足、薬物、腫瘍とその外の慢性疾患の合併症として発生し得る。
【０００６】
原発性骨粗鬆症は、その原因が明らかではないが、多くの因子が関与すると認識されてきた。老化による骨代謝の平衡の崩壊と共にカルシウム不足、副甲状線ホルモンの過剰、カルシトニン（ｃａｌｃｉｔｏｎｉｎｅ）の欠乏、活性型ビタミンＤの不足、女性ホルモンの欠乏、運動不足などの様々な要因が複合的に関与して発生すると考えられている。カルシウム代謝に強い影響を及ぼす因子としては、副甲状線ホルモン（ＰＴＨ）、カルシトニン（ＣＴ）、１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３等がある。カルシウムの代謝に関与する副甲状線ホルモンと甲状腺の傍濾胞上皮細胞とも呼ばれるＣ細胞で分泌するカルシトニンは、お互いに拮抗的に作用する。カルシトニンは、ポリペプチドで分子量が３５００〜４０００程度で骨に作用してカルシウム塩が骨に沈着するのを手伝う作用をする。その結果、血中カルシウムとマグネシウムが減少して、小便内のリン酸とハイドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）も減少する。副甲状線ホルモン（Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ；ＰＴＨ）もポリペプチドで、分子量は８４４７程度である。副甲状線ホルモンは、骨に作用して破骨細胞（Ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）を活性化して骨吸収を増加させ、小腸粘膜でビタミンＤ３の作用を上昇させる。したがって、血中カルシウムとマグネシウムが増加して、小便内のハイドロキシプロリン（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ）とリン酸（ＰＯ４３−）も増加する。卵巣で分泌するステロイドであるエストラジオールは、骨で造骨細胞（Ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔ）を活性化させて骨吸収を防ぐ。
【０００７】
女性の閉経期以後には、エストロゲンの分泌が低下してその結果、血中カルシトニンが減少して腎臓での１，２５−（ＯＨ）２Ｄ３合成が減少して、副甲状線ホルモンの分泌が増加する。それによって、インターロイキン６（ＩＬ−６）とプロスタグランジン（Ｐｒｏｓｔａｇｌａｎｄｉｎ）の生成が増加し、小腸内でのカルシウム吸収率が低下して、破骨細胞が活性化することにより骨吸収が増加して、骨消失率が亢進されるので、骨粗鬆症の発生率が高くなる。一般的に骨吸収が骨形成より活発になると、関節機能に障害が生じて、脊椎が漸進的に奇形になって、脊椎とその他の部位に微細な骨折が誘発され、痛症（特に腰背痛）がひどくなって運動性が低下し、脊椎後湾が起きて腎臓が小さくなる。
【０００８】
骨粗鬆症は、その症状自体よりは、骨の弱化によって容易に招来される各種骨折、特に大腿骨骨折または脊椎骨折などが、長期間活動を制限して健康な生活を営むことができなくして、結果的に、老人層死亡の１５％にあたる原因提供をすると知られている。骨の量は、遺伝的要因、栄養摂取、ホルモンの変化、運動及び生活習慣の差など様々な要因によって影響を受け、骨粗鬆症の原因としては、老齢、運動不足、低体重、喫煙、低カルシウム食餌、閉経、卵巣切除などが知られている。
【０００９】
一方、個人差はあるけれど、白人よりは黒人が骨再吸収水準（ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ）が低くて骨量がもっと高く、たいてい骨量は、１４〜１８歳のときに一番高くて老後には、１年に約１％ずつ減少する。特に、女性の場合、３０歳以後から骨減少が持続的に進行して、閉経期に至るとホルモン変化によって骨減少が急激に進行する。
【００１０】
このように、骨粗鬆症は程度の差はあるが、老年層、特に閉経期以後の女性においては避けることができない症状で、先進国では人口が老令化するにつれて骨粗鬆症及びその治療剤に対する関心が徐徐に増加している。
【００１１】
また、全世界的に骨疾患治療と関連して、約１，３００億ドルの市場が形成されていることが知られていて、これからさらに増加することが予想されるため、世界的な各研究機関や製薬会社では、骨疾患治療剤開発に多額の投資をしていて、現在、骨吸収抑制剤の開発が活発に進行されている。
【００１２】
骨粗鬆症と関連して過去には主に、骨の無機質、すなわちカルシウムとリンの代謝異常を中心にその研究が進行されてきたが、その発病機序解明には大きな進展が見られなかった。
【００１３】
現在、骨粗鬆症治療剤として使用されている物質としては、ビスホスホネート製剤（アレンドロネート、エチドロネート）、ホルモン製剤（ラロキシフェン）、ビタミンＤ製剤、カルシトニン製剤、カルシウム製剤などがある。しかし、ビスホスホネート製剤は、吸収率が落ちて服用方法が複雑で食道炎を誘発し、ホルモン製剤は一生服用しなければならないので長期投与する場合、乳房癌、子宮癌、胆石及び血栓症などの副作用が現われ、ビタミンＤ製剤は高価で効果が確かではなく、カルシトニン製剤は高価で投与方法が難しく、カルシウム製剤は副作用が少ないけれど治療よりは予防効果に限られる短所がある。
【００１４】
骨粗鬆症は、薬物の短期投与だけでは治療することができないので、薬物の長期投与が必須である。したがって、薬物を長期投与する時に前記のような副作用がなく、優秀な薬効を有する新しい物質が求められている。
【００１５】
以上のことに鑑みて、本発明者等は、熟地黄と五加皮の多様な生理活性研究を進行中、熟地黄と五加皮の混合生薬材抽出物が、毒性がないだけではなく、造骨細胞から破骨細胞の生成と活性化を防ぐタンパク質であるオステオプロテゲリンの発現を増殖させて、破骨細胞の増殖を抑制する活性を示し、副作用なしに骨粗鬆症を予防して治療するのに効果的であることを明らかにすることにより本発明を完成した。
【非特許文献１】Ｈｏｆｂａｕｅｒ  Ｌ．  Ｃ．，Ｋｈｏｓｌａ  Ｓ．，Ｄｕｎｓｔａｎ  Ｃ．Ｒ．，Ｌａｃｅｙ  Ｄ．Ｌ．，Ｂｏｙｌｅ  Ｗ．Ｊ．，Ｒｉｇｇｓ  Ｂ．Ｌ．，Ｔｈｅ  ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  ａｎｄ  ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｒａｃｒｉｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ．Ｊ  Ｂｏｎｅ  Ｍｉｎｅｒ  Ｒｅｓ．，２０００年，第１５（１）巻，２−１２頁
【非特許文献２】Ｋｏｎｇ  Ｙ．Ｙ．，Ｆｅｉｇｅ  Ｕ．，Ｓａｒｏｓｉ  Ｉ．，Ｂｏｌｏｎ  Ｂ．，Ｔａｆｕｒｉ  Ａ．，Ｍｏｒｏｎｙ  Ｓ．，Ｃａｐｐａｒｅｌｌｉ  Ｃ．，Ｌｉ  Ｊ．，Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｒ．，ＭｃＣａｂｅ  Ｓ．，Ｗｏｎｇ  Ｔ．，Ｃａｍｐａｇｎｕｏｌｏ  Ｇ．，Ｍｏｒａｎ  Ｅ．，Ｂｏｇｏｃｈ  Ｅ．Ｒ．，Ｖａｎ  Ｇ．，Ｎｇｕｙｅｎ  Ｌ．Ｔ．，Ｏｈａｓｈｉ  Ｐ．Ｓ．，Ｌａｃｅｙ  Ｄ．Ｌ．，Ｆｉｓｈ  Ｅ．，Ｂｏｙｌｅ  Ｗ．Ｊ．，Ｐｅｎｎｉｎｇｅｒ  Ｊ．Ｍ．：Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｂｏｎｅ  ｌｏｓｓ  ａｎｄ  ｊｏｉｎｔ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ａｄｊｕｖａｎｔ  ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  ｌｉｇａｎｄ．Ｎａｔｕｒｅ，１９９９年，第４０２巻，３０４−３０９頁
【非特許文献３】Ｙａｓｕｄａ  Ｈ．，Ｓｈｉｍａ  Ｎ．，Ｎａｋａｇａｗａ  Ｎ．，Ｙａｍａｇｕｃｈｉ  Ｋ．，Ｋｉｎｏｓａｋｉ  Ｍ．，Ｇｏｔｏ  Ｍ．，Ｍｏｃｈｉｚｕｋｉ  Ｓ．Ｉ．，Ｔｓｕｄａ  Ｅ．，Ｍｏｒｉｎａｇａ  Ｔ．，Ｕｄａｇａｗａ  Ｎ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ．，Ｓｕｄａ  Ｔ．，Ｈｉｇａｓｈｉｏ  Ｋ．：Ａ  ｎｏｖｅｌ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ．，Ｂｏｎｅ，１９９９年，第２５（１）巻，１０９−１１３頁
【非特許文献４】Ｓｕｄａ  Ｔ．，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｎ．，Ｕｄａｇａｗａ  Ｎ．，Ｊｉｍｉ  Ｅ．，Ｇｉｌｌｅｓｐｉｅ  Ｍ．Ｔ．，Ｍａｒｔｉｎ  Ｔ．Ｊ．：Ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｍｅｍｂｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｄ  ｌｉｇａｎｄ  ｆａｍｉｌｉｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ，１９９９年，第２０（３）巻，３４５−３５７頁
【非特許文献５】Ａｕｂｉｎ  Ｊ．Ｅ．，Ｂｏｎｎｅｌｙｅ  Ｅ．：Ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｌｉｇａｎｄ：ａ  ｎｅｗ  ｐａｒａｄｉｇｍ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｏｎｅ  ｒｅｓｏｒｐｔｉｏｎ．，Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓ  Ｉｎｔ，２０００年，第１１（１１）巻，９０５−９１３頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、造骨細胞からオステオプロテゲリン発現増殖及び破骨細胞増殖抑制活性を有する熟地黄（Ｒｅｈｍａｎｎｉａｅ  Ｒａｄｉｘ  Ｐｒｅｐａｒａｔａ）と五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ  Ｃｏｒｔｅｘ）の混合生薬材抽出物を提供する。
【００１７】
また本発明は、前記混合生薬材抽出物を有効成分とする、骨粗鬆症予防及び治療用組成物を提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記の目的を達成するために、本発明は造骨細胞からオステオプロテゲリン（ｏｓｔｅｏｐｒｏｔｅｇｅｒｉｎ；ＯＰＧ）発現増殖及び破骨細胞増殖抑制活性を有する熟地黄（Ｒｅｈｍａｎｎｉａｅ  Ｒａｄｉｘ  Ｐｒｅｐａｒａｔａ）と五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ  Ｃｏｒｔｅｘ）の混合生薬材抽出物を提供する。
【００１９】
熟地黄（Ｒｅｈｍａｎｎｉａｅ  Ｒａｄｉｘ  Ｐｒｅｐａｒａｔａ）は、ゴマノハグサ科に属する薬用植物の根を蒸して乾かしたもので、漢方で薬剤に使用している。生のものを生地黄、乾かしたものを乾地黄と言って、熟地黄の中で特にお酒に浸してから蒸して乾かすことを９回繰り返して作ったものは、九地黄と言ってその薬効は最高を示す。味は甘いながらも苦みがあり、暖かい性質があり、血液を補い、精（生命が発生して活動するのに基本になる物質）を補い、腰や膝が冷えて痛い症状や月経異常、目眩などを治療し、髪を黒くする効能がある。熟地黄は、四物湯の主要薬剤で各種慢性病の中で体が虚弱のため現われる内熱、咽喉乾燥、喉の渇きなどの症状に使用される。民間療法では、豚肉を煮た汁とともに服用すれば習慣性便秘に効果があると知られている。
【００２０】
五加皮（Ａｃａｎｔｈｏｐａｎａｃｉｓ  Ｃｏｒｔｅｘ）は、ウコギ科（Ａｒａｌｉａｃｅａｅ）に属する潅木植物で、北半球の極東アジアにのみ分布し、韓国南部では絶滅危機にある野生保護植物である。五加皮の種類には、刺五加皮、一般五加皮および香五加皮があって、漢方では毒性も副作用もない上薬に分類され、根と皮を薬剤に使用する。葉には、チイサノサイド（Ｃｈｉｉｓａｎｏｓｉｄｅ）が含まれていて、薬理的機能を有し、根には五加皮配糖体だけではなく、シリンギン（Ｓｙｒｉｎｇｉｎ）、クマリン配糖体などが含まれている。五加皮には、五加皮配糖体であるアカントサイド（Ａｃａｎｔｈｏｓｉｄｅ）Ｂ、Ｄと免疫性を高める水溶性多糖体とがある。五加皮は、味は辛くて苦く、暖かい性質を持っていて、肝経、神経に作用して風湿を無くし、益気昇精を助けると知られている。また、五労（五臓が虚弱で生ずる虚労病）と七傷（男性が虚弱のために生じる七種の症状）を補い、足が不自由な場合に使用され、これを長く服用すると、身体の気を高め、胃を保護し、精力を増強し、精神をすっきりさせ、意志力を高めて身を軽くし、老化を防止して、体内の汚れた血を清くきれいにしてくれると知られている、腰や脊椎の痛症、男性陰萎症、嚢湿および女性の陰痒症などの様々な症状を治療すると知られている。
【００２１】
本発明の混合生薬材抽出物は、熟地黄及び五加皮を、水、Ｃ１〜Ｃ４アルコールまたは水とＣ１〜Ｃ４アルコールの混合溶液で抽出したもの、より好ましくは水で抽出したものを意味し、前記混合生薬材抽出物は、下記のように製造することができる。
【００２２】
熟地黄及び五加皮各々を水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥する。それらを抽出容器に入れて、溶媒を加えて抽出する。抽出物を室温で冷やした後、ろ紙でろ過する。前記抽出液を真空回転蒸発器を使用して減圧濃縮して、凍結乾燥して粉末状態の熟地黄抽出物及び五加皮抽出物を各々製造する。前記の過程で得た熟地黄抽出物及び五加皮抽出物を混合して、混合生薬材抽出物を製造する。
【００２３】
抽出方法は、前記溶媒を使用して冷浸、温浸、加熱など通常の抽出方法が可能であり、熱水抽出の場合、１００℃で４時間抽出することが好ましい。
【００２４】
また、前記熟地黄抽出物と五加皮抽出物の混合抽出物は、熟地黄抽出物：五加皮抽出物の重量比が、１５．０：０．５〜０．１５：５．０で混合することが好ましく、８：１〜１：４で混合することがより好ましく、熟地黄抽出物：五加皮抽出物の重量比を４：１〜１：１で混合することが最も好ましい。
【００２５】
本発明の混合生薬材抽出物は、造骨細胞から破骨細胞の生成及び活性を抑制するオステオプロテゲリンタンパク質の発現を促進させる（図１）。
【００２６】
また、本発明の混合生薬材抽出物は、破骨細胞の増殖を抑制する効果を有する（図２）。
【００２７】
特に、熟地黄抽出物：五加皮抽出物の重量比を、８：１〜１：４で混合した場合、より好ましくは熟地黄抽出物：五加皮抽出物の重量比を４：１〜１：１で混合した場合に、造骨細胞からオステオプロテゲリンタンパク質発現を促進する効果及び破骨細胞の増殖を抑制する効果が、全て顕著に現われて、各々の生薬抽出物を単独で使用する場合より、二成分の相乗作用によって、効果が顕著に向上する。
【００２８】
したがって、本発明の混合生薬材抽出物は、造骨細胞から破骨細胞の生成及び活性を抑制するオステオプロテゲリンタンパク質の発現を促進させて、破骨細胞の増殖を抑制するので、骨粗鬆症予防及び治療に効果的で、骨粗鬆症予防及び治療用組成物で有用に使用することができる。
【００２９】
本発明の混合生薬材抽出物をラットに経口投与して毒性実験を行った結果、経口投与毒性試験による５０％致死量（ＬＤ５０）は、少なくとも１ｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断される。
【００３０】
また、本発明は、前記混合生薬材抽出物を有効成分とする、骨粗鬆症予防及び治療用組成物を提供する。
【００３１】
本発明の組成物は、前記混合生薬材抽出物に同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上さらに含むことができる。
【００３２】
前記混合生薬材抽出物は、臨床投与時に経口または非経口で投与が可能で、一般的な医薬品製剤の形態で使用することができる。
【００３３】
すなわち、本発明の混合生薬材抽出物は、実際臨床投与時に経口及び非経口のさまざまな剤形で投与することができ、製剤化する場合には普通に使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩解剤、界面活性剤などの希釈剤または賦形剤を使用して調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸薬、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが挙げられ、このような固形製剤は、三七根抽出物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム（Ｃａｌｃｉｕｍ  ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（Ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（Ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調剤される。また、単純な賦形剤以外にステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使用される。経口のための液状製剤では、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤などが該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外にさまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味料、芳香剤、保存料などを含むことができる。非経口投与のための製剤には、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤では、プロピレングリコール（Ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステルなどを使用することができる。座薬の基材では、ハードファット（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴ−ル、ツイーン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロゼラチンなどを使用することができる。また、関節炎予防または治療剤としての効能増進のためにカルシウムやビタミンＤ３を添加することができる。
【００３４】
本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食餌、投与時間、投与方法、排泄率及び疾患の重症度によってその範囲が多様であり、一日投与量は、混合生薬材抽出物の量を基準に１〜１０００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは３００〜７００ｍｇ／ｋｇで、さらに好ましくは１５０〜４５０ｍｇ／ｋｇであり、一日に１〜６回投与することができる。
【００３５】
本発明の組成物は、骨粗鬆症の予防及び治療のために単独で、または手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。
【００３６】
本発明の組成物は、骨粗鬆症改善を目的に健康食品に添加することができる。本発明の混合生薬材抽出物を食品添加物に使用する場合、前記混合生薬材抽出物をそのまま添加したり他の食品または食品成分とともに使用したりすることができ、通常的な方法によって適切に使用することができる。有効成分の混合量は、その使用目的（予防、健康または治療的処置）によって適合するように決定することができる。しかし、健康及び衛生を目的にしたりまたは健康調節を目的にしたりする長期間摂取の場合には、前記量は前記範囲以下があり得るが、安全性面で何らの問題がないので有効成分は、前記範囲以上の量でも使用することができることは明確である。
【００３７】
前記食品の種類には、特別な制限はない。前記物質を添加することができる食品の例としては、肉類、ソーセージ、パン、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲料水、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などが挙げられ、通常的な意味での健康食品をすべて含む。
【００３８】
本発明の健康飲料組成物は、通常の飲料のようにさまざまな香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、ブドウ糖、果糖のようなモノサッカライド、マルトース、スクロースのようなジサッカライド、及びデキストリン、サイクロデキストリンのようなポリサッカライド、キリシトール、ソルビトール、エリスリトールなどの糖アルコールである。甘味料としては、タウマチン、ステビア抽出物のような天然甘味料や、サッカリン、アスパルテームのような合成甘味料などを使用することができる。前記天然炭水化物の割合は、本発明の組成物１００ｍｌ当り一般的に約０．０１〜０．０４ｇ、好ましくは約０．０２〜０．０３ｇである。
【００３９】
前記の外に本発明の組成物は、さまざまな栄養剤、ビタミン、電解質、風味剤、着色料、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などを含むことができる。その他に本発明の組成物は、天然果物ジュース、果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は、独立的にまたは混合して使用することができる。このような添加剤の割合は、それほど重要ではないが本発明の組成物１００重量部当り０．０１〜０．１重量部の範囲で選択されるのが一般的である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例及び実験例を提示する。しかし、下記の実施例及び実験例は、本発明をより易しく理解するために提供するだけのものであって、実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【００４１】
実施例１：混合生薬材抽出物の製造
熟地黄及び五加皮は、漢方薬材の卸商から購入して使用した。
【００４２】
＜１−１＞熟地黄抽出物の製造
熟地黄を水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥した。乾燥した熟地黄１００ｇを３ｌ抽出容器に入れて蒸留水１ｌを加えて１００℃で４時間熱水抽出した。前記過程を３回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やした後、ろ紙でろ過した。前記抽出液は、真空回転蒸発器を使用して４０℃以下で減圧濃縮して熟地黄抽出物を得た（収率：４２％）。
【００４３】
＜１−２＞五加皮抽出物の製造
五加皮を水できれいに洗浄した後、日陰で乾燥した。乾燥した五加皮１００ｇを３ｌ抽出容器に入れて蒸留水１ｌを加えて１００℃で４時間熱水抽出した。前記過程を３回繰り返した後、得られた溶液を室温で冷やした後、ろ紙でろ過した。前記抽出液は、真空回転蒸発器を使用して４０℃以下で減圧濃縮し、凍結乾燥して粉末状の五加皮抽出物を得た（収率：５．８％）。
【００４４】
＜１−３＞混合生薬材抽出物の製造
前記１−１で得た熟地黄抽出物０．１５〜１５．０重量部と、前記１−２で得た五加皮抽出物０．５〜５．０重量部を適切な組成比で混合し、混合生薬材抽出物を細胞培養液に希釈して、下記実験に使用した。
【００４５】
実験例１：本発明の混合生薬材抽出物による造骨細胞からオステオプロテゲリン分泌に及ぼす影響分析
本発明の混合生薬材抽出物が造骨細胞からオステオプロテゲリン分泌に及ぼす影響を調べるために、下記のような実験を遂行した。
【００４６】
＜１−１＞造骨細胞の培養
本発明の混合生薬材抽出物が、造骨細胞のオステオプロテゲリンの発現に及ぼす影響を評価するために、ヒト骨肉腫由来の細胞株であるＭＧ−６３細胞株とＨＯＳ細胞株を、ＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，米国）から購入して使用し、１０％ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）培地で３７℃、湿度９５％、ＣＯ２  ５％の培養器で培養して使用した。
【００４７】
＜１−２＞破骨細胞生成を抑制するオステオプロテゲリンの発現測定
本発明では、造骨細胞を培養しながら実施例１で得た抽出物を処理して、ＯＰＧの分泌量が増加することを観察しようとした。
前記実験例１−１で記述したＭＧ−６３細胞株を９６ウェルプレートに飽和状態になるように培養した後、色々な濃度の生薬材抽出物が含まれた血清不在（ｓｅｒｕｍ  ｆｒｅｅ）ＤＭＥＭ培養液２ｍｌを添加して、１６時間培養した後、上澄み液を回収した。ＯＰＧ酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を使用して、ＯＰＧが遊離した量を測定した。酵素免疫測定時の吸光度は、ダイナテックＭＲ−７０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅ社）機器を使用して、４５０ｎｍで測定し、下記数式１を使って、培地のみ添加した対照群に対する百分率でＯＰＧ遊離量を計算した。
【００４８】
（数１）
＜数式１＞
ＯＰＧ遊離増加率（％）＝（１−実験群のＯ．Ｄ．４５０／対照群のＯ．Ｄ．４５０）×１００
（前記式中、Ｏ．Ｄ．４５０は、４５０ｎｍでの吸光度）
【００４９】
その結果、下記表１に示したように、本発明の実施例１を添加した場合、造骨細胞で破骨細胞の生成を抑制する物質であるＯＰＧタンパク質の発現を、実施例１の熟地黄抽出物の３及び６ｍｇ／ｍｌの濃度で各々２００％及び２２１％まで増加させ、五加皮抽出物の１．２５ｍｇ／ｍｌの濃度で１９４％まで増加させ、二つの生薬材抽出物は、濃度依存的にＯＰＧ発現を増加させる。抽出物を混合した場合、単独で処理した場合に比べて、約１２０〜１３０％以上のオステオプロテゲリンタンパク質発現増殖効果を示した（表１、図１）。特に、熟地黄抽出物を６ｍｇ／ｍｌ入れた場合より、熟地黄抽出物３ｍｇ／ｍｌと五加皮抽出物を１．２５ｍｇ／ｍｌを混合した時、相乗作用によりＯＰＧ発現増加効果がさらに顕著に現われた。したがって、生薬材抽出物製造時、熟地黄抽出物に対する五加皮抽出物の適切な混合重量比が、ＯＰＧ発現増加効果に重要な影響を及ぼすことが分かった。
【００５０】
【表１】
2008531552.tif 000003
【００５１】
前記結果から、発明の混合生薬材抽出物が、造骨細胞で破骨細胞の生成を抑制するＯＰＧ発現を増加させて破骨細胞の生成を抑制する機能をすることを確認した。
【００５２】
実験例２：本発明の混合生薬材抽出物による破骨細胞（ｏｓｔｅｏｃｌａｓｔ）の増殖抑制作用
本発明の混合生薬材抽出物が破骨細胞の成長及び活性にどのような影響を及ぼすのかを調べるために、カルシウムホスファートで被膜されたプレート（ＯＡＡＳ、ＯＣＴ  Ｉｎｃ．）に破骨細胞前駆細胞を培養して、破骨細胞の標識酵素であるＴＲＡＰ（Ｔａｒｔｒａｔｅ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ａｃｉｄ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ，ＴＲＡＰ）活性を分析した。
【００５３】
＜２−１＞破骨細胞前駆細胞の純粋分離及び成熟した破骨細胞への分化誘導
マウス骨髄細胞を分離するために７〜９週になった雄のマウスを頚部捻転で犠牲にした後、大腿骨と頚骨を無菌的に摘出して軟組織を除去して腸骨の両端を切断した後、２６Ｇ注射針を使用して一方の端の骨髄腔に、０．１％コラゲナーゼ（Ｇｉｂｃｏ）、０．０５％トリプシン及び０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ）が含まれた酵素溶液１ｍｌを注射した。骨髄を取り出した後、３０分間撹拌して骨髄細胞を集めて、１０％ＦＢＳが含まれたα−ＭＥＭ（α−ｍｉｎｉｍｕｍ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）で２４時間前全培養した後、未付着細胞を集めた。破骨細胞の前駆細胞になる未付着細胞をウェル当り２×１０５個の細胞になるように分注して培養した。８日間培養する間、２０ｎｇ／ｍｌ大食細胞集落刺激因子（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｃｏｌｏｎｙ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ，Ｍ−ＣＳＦ，Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，米国）と３０ｎｇ／ｍｌ  ＲＡＮＫＬ（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，米国）を含んだα−ＭＥＭに前記実施例の混合生薬材抽出物を処理しながら培養した。培養が終わった後、破骨細胞の生成を検査するために、細胞を固定してＴＲＡＰ染色を行った。
【００５４】
＜２−２＞ＴＲＡＰ（＋）である多核細胞形成測定
破骨細胞の形成測定は、破骨細胞前駆細胞をカルシウムホスファートでコーティングされたプレート上で培養した後、ＴＲＡＰ（＋）を示す多核細胞の数で観察した。具体的に、細胞培養後、付着細胞をＰＢＳで洗浄した後、シトレートアセテートホルムアルデヒド（ｃｉｔｒａｔｅ−ａｃｅｔａｔｅ−ｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で５分間固定させてナフトール（ｎａｐｈｔｈｏｌ）ＡＳ−ＢＩホスファート（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ファーストガーネット（ｆａｓｔ  Ｇａｒｎｅｔ）ＧＢＣ溶液と７ｍＭタルトレート緩衝溶液（ｔａｒｔｒａｔｅ  ｂｕｆｆｅｒ，ｐＨ５）を含む、３７℃アセテート緩衝溶液（ｐＨ５．０）に１時間培養して、ＴＲＡＰ染色をした。３個以上の核を持つＴＲＡＰ（＋）多核細胞を破骨細胞と見なした。実施例１で製造した混合生薬材抽出物及び単一抽出物を処理して、８日間培養した後、ＴＲＡＰ陽性多核細胞の数の変化を測定して下の数式２で生成の抑制率を表記した。
【００５５】
（数２）
＜数式２＞
ＴＲＡＰ（＋）である多核細胞生成抑制率（％）＝１００−｛（実験群多核細胞数／対照群多核細胞数）×１００｝
【００５６】
【表２】
2008531552.tif 000004
【００５７】
表２及び図２に示されたように、熟地黄抽出物を単独で処理した時、抽出物を何も処理していない対照群の抑制の割合を０にして、対照群に比べてＴＲＡＰ陽性多核細胞数の抑制割合が、各々０．１２５、０．２５、０．５、１、２ｍｇ／ｍｌの濃度で、１２．４３、１２．６８、４０．１０、４９．０１、８１．７５％で、破骨細胞の生成及び活性を抑制した。また、五加皮抽出物を単独で処理した場合、各々０．１２５、０．２５、０．５、１ｍｇ／ｍｌの濃度で、１２．７７、１９．２８、６１．６１、９９．７４％で、破骨細胞の形成及び活性を抑制し、濃度依存的にＴＲＡＰ（＋）である多核細胞生成を抑制することが示された。
【００５８】
特に熟地黄抽出物は、単独で処理した場合には濃度を高めても０．５ｍｇ／ｍｌの濃度までは５０％の抑制効果を越えない活性を示すだけであるが、五加皮抽出物とともに処理した場合には、低い濃度でも最大１００％の抑制効果という大きな活性を示すことが分かる。また、熟地黄抽出物及び五加皮抽出物の濃度を各々０．２５ｍｇ／ｍｌ以上で混合した場合、特に熟地黄抽出物を約２０重量％以上含みかつ五加皮抽出物を約１０重量％以上含む場合、好ましくは、熟地黄５０重量％以上と五加皮抽出物２５重量％以上を含む場合に、それ以下の重量％を有する場合に比べて、破骨細胞の生成が顕著に抑制されることが分かった。
【００５９】
したがって、本発明の混合生薬材抽出物は、熟地黄抽出物と五加皮抽出物を各々単独で処理した場合に比べて、破骨細胞の形成及び活性を相乗作用によって顕著に抑制することが分かる。
【００６０】
実験例３：ラットに対する経口投与急性毒性実験
本発明の混合生薬材抽出物の急性毒性を調べるために、下記のような方法で急性毒性実験を行った。
【００６１】
実験動物に６週齢の特定病原体不在（ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｐａｔｈｏｇｅｎ−ｆｒｅｅ，ＳＰＦ）ＳＤ系ラットを使用して、急性毒性実験を実施した。各群２匹ずつの動物に、本発明の混合生薬材抽出物を各々０．５％メチルセルロース溶液に懸濁して１ｇ／ｋｇ／ｍｌの用量で１回単回経口投与した。試験物質投与後、動物の斃死の有無、臨床症状、体重変化を観察して血液学的検査と血液生化学的検査を実施し、部検して肉眼で腹腔臓器と胸腔臓器の異常の有無を観察した。
【００６２】
その結果、試験物質を投与したすべての動物で特記するに値する臨床症状や斃死した動物はなく、体重変化、血液検査、血液生化学検査、剖検所見などでも毒性変化は観察されなかった。
【００６３】
したがって、本発明の混合生薬材抽出物は、全てのラットで１ｇ／ｋｇまで毒性変化を示さなかったので、経口投与最小致死量（ＬＤ５０）は、抽出物１ｇ／ｋｇ以上の安全な物質であると判断された。
【００６４】
下記に本発明の組成物のための製剤例を例示する。
【００６５】
製剤例１：製薬製剤の製造
＜１−１＞散剤の製造
混合生薬材抽出物                                                            ２ｇ
乳糖                                                                        １ｇ
前記の成分を混合して気密包に充填して散剤を製造した。
【００６６】
＜１−２＞錠剤の製造
混合生薬材抽出物                                                      １００ｍｇ
とうもろこし澱粉                                                      １００ｍｇ
乳糖                                                                  １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                                  ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常の錠剤の製造方法にしたがって打錠して錠剤を製造した。
【００６７】
＜１−３＞カプセル剤の製造
混合生薬材抽出物                                                      １００ｍｇ
とうもろこし澱粉                                                      １００ｍｇ
乳糖                                                                  １００ｍｇ
ステアリン酸マグネシウム                                                  ２ｍｇ
前記の成分を混合した後、通常のカプセル剤の製造方法にしたがってゼラチンカプセルに充填してカプセル剤を製造した。
【００６８】
製剤例２：食品の製造
本発明の混合生薬材抽出物を含む食品を下記のように製造した。
【００６９】
＜２−１＞小麦粉食品の製造
本発明の混合生薬材抽出物０．５〜５．０重量％を小麦粉に添加して、その混合物を使用してパン、ケーキ、クッキー、クラッカー及び麺類を製造して健康増進用食品を製造した。
【００７０】
＜２−２＞乳製品（ｄａｉｒｙ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ）の製造
本発明の混合生薬材抽出物５〜１０重量％を牛乳に添加して、該牛乳を使用してバター及びアイスクリームのような多様な乳製品を製造した。
【００７１】
＜２−３＞禅食の製造
玄米、麦、もち米、ハト麦を公知の方法でアルファ化させて乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【００７２】
黒豆、黒胡麻、荏胡麻も公知の方法で蒸して乾燥させたものを焙煎した後、粉砕機で粒度６０メッシュの粉末に製造した。
【００７３】
本発明の混合生薬材抽出物を真空濃縮器で減圧濃縮して、噴霧、熱風乾燥器で乾燥して得た乾燥物を粉砕機で粒度６０メッシュに粉砕して乾燥粉末を得た。
【００７４】
前記で製造した穀物類、種実類及び混合生薬材抽出物の乾燥粉末を次の割合で配合して製造した。
【００７５】
穀物類（玄米３０重量％、ハト麦１５重量％、麦２０重量％）、
種実類（荏胡麻７重量％、黒豆８重量％、黒胡麻７重量％）、
混合生薬材抽出物の乾燥粉末（３重量％）、
霊芝（０．５重量％）、
地黄（０．５重量％）
【００７６】
製剤例３：飲料の製造
＜３−１＞炭酸飲料の製造
砂糖５〜１０％、クエン酸０．０５〜０．３％、カラメル０．００５〜０．０２％、ビタミンＣ０．１〜１％の添加物を混合して、そこに７９〜９４％の精製水を混ぜてシロップを作る。前記シロップを８５〜９８℃で２０〜１８０秒間殺菌して、冷却水と１：４の割合で混合した後、０．５〜０．８２％の炭酸ガスを注入して、本発明の混合生薬材抽出物を含む炭酸飲料を製造した。
【００７７】
＜３−２＞健康飲料の製造
液状果糖０．５％、オリゴ糖２％、砂糖２％、食塩０．５％、水７５％のような副材料と混合生薬材抽出物を均質に配合して瞬間殺菌をした後、それをガラス瓶、ＰＥＴ瓶など小容器に包装して健康飲料を製造した。
【００７８】
＜３−３＞野菜ジュースの製造
本発明の混合生薬材抽出物５ｇをトマトまたはにんじんジュース１，０００ｍｌに加えて健康増進用野菜ジュースを製造した。
【００７９】
＜３−４＞果物ジュースの製造
本発明の混合生薬材抽出物１ｇをリンゴまたはぶどうジュース１，０００ｍｌに加えて健康増進用果物ジュースを製造した。
【産業上の利用可能性】
【００８０】
前記で詳しくみたように、本発明による熟地黄及び五加皮の混合生薬材抽出物は、造骨細胞からオステオプロテゲリンの発現を増加させて、破骨細胞の生成及び活性を効果的に抑制する効果と、破骨細胞の増殖を抑制する効果を同時に示す複合効果を示す。特に、熟地黄抽出物を２０重量％以上含み、かつ五加皮抽出物を１０重量％以上含む場合、さらに好ましくは、熟地黄５０重量％以上と五加皮抽出物２５重量％以上とを含む場合、各々の生薬抽出物を単独で使用した場合より、相乗作用によって前記効果が顕著に向上するので、骨粗鬆症予防及び治療に有用な医薬品及び健康食品に広く使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】本発明の混合生薬材抽出物を骨肉腫細胞株ＭＧ６３細胞に処理した時、ＯＰＧタンパク質の発現をエライザ（ＥＬＩＳＡ）分析した図である。
【図２】本発明の混合生薬材抽出物による破骨細胞増殖抑制を示した図である。
【図１】
2008531552.tif 000005
【図２】
2008531552.tif 000006
【国際調査報告】
2008531552.tif 000007
2008531552.tif 000008