(57)【要約】  構造[I]の接合型成長ホルモンが、該接合体を製造する方法と共に提供される。該接合体は治療において有用である。【化１】2008531482.tif 000238【選択図】なし
2008531482.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(I)に従う化合物、並びにその医薬的に許容可能な塩、プロドラッグおよび溶媒和化合物：
【化１】
2008531482.tif 000207
ここで、
GHは、成長ホルモン化合物を表し；
Gは、R-A-Eを表し、ここでのRおよびEは各々独立に結合またはリンカーを表し、またAは何れかの化学部分のビラジカルを表し；
PEGは、ポリエチレングリコール基を表し；
XXは、ヒスチジン、アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、チロシン、スレオニン、イソロイシン、トリプトファン、プロリン、およびバリンから選択されるアミノ酸残基を表す。
【請求項２】
請求項１に記載の化合物であって、次式Iaに従う構造を持った化合物：
【化２】
2008531482.tif 000208
【請求項３】
請求項２に記載の化合物であって、次式Ibに従う構造を持った化合物：
【化３】
2008531482.tif 000209
【請求項４】
請求項３に記載の化合物であって、次式Icに従う構造を持った化合物：
【化４】
2008531482.tif 000210
【請求項５】
請求項２に記載の化合物であって、次式Id、Ie、またはIfに従う構造を持った化合物：
【化５】
2008531482.tif 000211
ここで、PEGLは、2 kDa〜5 kDaの分子量を有するPEGのビラジカルである。
【請求項６】
請求項５に記載の化合物であって、次式Ig、Ih、またはIiに従う構造を持った化合物：
【化６】
2008531482.tif 000212
【請求項７】
請求項１〜６の何れか１項に記載の化合物であって、GHがヒト成長ホルモン（hGH）のアミノ酸配列（配列番号１）に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を含んでなる成長ホルモン化合物を表す化合物。
【請求項８】
請求項７に記載の化合物であって、GHが、hGHのアミノ酸配列（配列番号１）を含んでなる化合物。
【請求項９】
請求項１〜８の何れか１項に記載の化合物であって、Aが、オキシム結合、ヒドラゾン結合、フェニルヒドラゾン結合、セミカルバゾン部分、トリアゾール結合、イソオキサゾリジン結合、アミド結合、またはアラルキン結合を表す化合物。
【請求項１０】
請求項１〜９の何れか１項に記載の化合物であって、Gが下記から選択される化合物：
【化７】
2008531482.tif 000213
【化８】
2008531482.tif 000214
【請求項１１】
請求項３〜１０の何れか１項に記載の化合物であって、mPEGが、約5 kDa〜約60 kDaの分子量をもったメトキシポリエチレングリコールを表す化合物。
【請求項１２】
請求項１１に記載の化合物であって、前記mPEGが、約10 kDa、約20 kDa、約30 kDa、または約40 kDaの分子量をもったメトキシポリエチレングリコールを表す化合物。
【請求項１３】
請求項１に記載の化合物であって、下記から選択される化合物：
【化９】
2008531482.tif 000215
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化１０】
2008531482.tif 000216
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化１１】
2008531482.tif 000217
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化１２】
2008531482.tif 000218
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化１３】
2008531482.tif 000219
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化１４】
2008531482.tif 000220
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化１５】
2008531482.tif 000221
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化１６】
2008531482.tif 000222
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化１７】
2008531482.tif 000223
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化１８】
2008531482.tif 000224
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化１９】
2008531482.tif 000225
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化２０】
2008531482.tif 000226
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する。
【請求項１４】
治療に使用するための、請求項１〜１３の何れか１項に記載の化合物。
【請求項１５】
任意に医薬的賦形剤と組み合わせて、請求項１〜１３の何れか１項に記載の化合物を含有してなる医薬組成物。
【請求項１６】
成長ホルモン欠乏症（GHD）を治療する方法であって、それを必要としている患者に対して、治療的有効量の請求項１〜１３の何れか１項に記載の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項１７】
ターナー症候群；プラーダー・ヴィリ症候群(PWS)；ヌーナン（Noonan）症候群；ダウン症；慢性腎疾患；若年性関節リウマチ；嚢胞性繊維症；HAART治療を受けている小児でのHIV感染症（HIV/HALS小児）；妊娠期間の短い(SGA)低身長出生児；出産時体重が非常に低い(VLBW)がSGAでない低身長出生児；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨発育不全症；特発性低身長症（ISS）；成人におけるGHD；脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨、中足骨および指骨のような長骨における、または該長骨の骨折；頭蓋、手の基部および足の基部のような海綿質骨における、または該海綿質骨の骨折；例えば手、膝もしくは肩における腱もしくは靭帯手術後の患者；伸延性骨形成（distraction oteogenesis）を有するか、またはこれを経過中の患者；股関節置換もしくは円板置換、半月板修復、脊椎固定術、または膝、腰、肩、肘、手首もしくは顎における補綴物定着の後の患者；釘、螺子およびプレートのような骨接合術材料が固定されている患者；骨折が非癒合または癒合不良である患者；例えば脛骨または足親指からの骨切除後の患者；移植後の患者；外傷または関節炎により引き起こされた膝の関節軟骨退化；ターナー症候群を伴う患者での骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症；慢性透析（APCD）における成人患者；APCDにおける栄養失調関連の心血管系疾患；APCDにおける悪液質の反転；癌においるAPCD；APCDにおける慢性閉塞性肺疾患；APCD におけるHIV；APCDを伴った高齢者；APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；HIV感染症の男性；短腸症候群；中心性肥満；HIV関連リポジストロフィー症候群（HALS）；男性不妊；選択的大手術、アルコール/薬解毒、または神経学的外傷の後の患者；老化；要介護老人；骨-関節炎；外相的損傷を受けた軟骨；勃起障害；線維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；蜘蛛膜下出血；出産時超低体重；代謝症候群；グルココルチコイド筋疾患；小児におけるグルココルチコイド治療、筋組織神経組織もしくは創傷の治癒促進に起因した低身長；損傷を受けた組織への血流の促進もしくは改善；または損傷を受けた組織における感染率の減少を治療するための方法であって、それを必要として
いる患者に対して、治療的有効量の請求項１〜１３の何れか１項に記載の化合物を投与することを含んでなる方法。
【請求項１８】
成長ホルモン欠乏症（GDH）の治療のための医薬の製造における、請求項１〜１３の何れか１項に記載の化合物の使用。
【請求項１９】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の化合物の使用であって、ターナー症候群；プラーダー・ヴィリ症候群(PWS)；ヌーナン（Noonan）症候群；ダウン症；慢性腎疾患；若年性関節リウマチ；嚢胞性繊維症；HAART治療を受けている小児でのHIV感染症（HIV/HALS小児）；妊娠期間(SGA)の短い低身長出生児；出産時体重が非常に低い(VLBW)がSGAを伴う低身長出生児；骨格形成異常；軟骨低形成症；軟骨発育不全症；特発性低身長症（ISS）；成人におけるGHD；脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨、中足骨および指骨のような長骨における、または該長骨の骨折；頭蓋、手の基部および足の基部のような海綿質骨における、または該海綿質骨の骨折；例えば手、膝もしくは肩における腱もしくは靭帯手術後の患者；伸延性骨形成（distraction oteogenesis）を有するか、またはこれを経過中の患者；股関節置換もしくは円板置換、半月板修復、脊椎固定術、または膝、腰、肩、肘、手首もしくは顎における補綴物定着の後の患者；釘、螺子およびプレートのような骨接合術材料が固定されている患者；骨折が非癒合または癒合不良である患者；例えば脛骨または足親指からの骨切除後の患者；移植後の患者；外傷または関節炎により引き起こされた膝の関節軟骨退化；ターナー症候群を伴う患者での骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症；慢性透析（APCD）における成人患者；APCDにおける栄養失調関連の心血管系疾患；APCDにおける悪疫質の反転；癌においるAPCD；APCDにおける慢性のアブストラクト肺疾患；APCD におけるHIV；APCDを伴った高齢者；APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；HIV感染症の男性；短腸症候群；中心性肥満；HIV関連リポジストロフィー症候群（HALS）；男性不妊；選択的大手術、アルコール/薬解毒、または神経学的外傷の後の患者；老化；要介護老人；骨-関節炎；外相的損傷を受けた軟骨；勃起障害；線維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；蜘蛛膜下出血；出産時超低体重；代謝症候群；グルココルチコイド筋疾患；小児におけるグルココルチコイド治療、筋組織神経組織もしくは創傷の治癒促進に起因した低身長；損傷を受けた組織への血流の促進もしくは改善；または損傷を受けた組織
における感染率の減少を治療するための医薬の製造における使用。
【請求項２０】
請求項１〜１３の何れか１項に記載の化合物を調製する方法であって、GH-XX-Alaを、カルボキシペプチダーゼY(CPY)の存在下に、次式で表されるα-アミノ酸である第一の化合物と反応させて、
【化２１】
2008531482.tif 000227
次式のトランスアシル化された化合物を形成することを含んでなり、
【化２２】
2008531482.tif 000228
該トランスアシル化されたペプチドは更に、1以上のステップで、式Y-E-PEGの第二の化合物と反応されて、次式の共役GHが形成される方法：
【化２３】
2008531482.tif 000229
ここで、
Gは、R-A-Eを表し、ここでのRはリンカーまたは結合を表し；Eはリンカーまたは結合を表し；AはXおよびYに含まれる官能基間の反応により形成された部分を表し；
GHは、成長ホルモン化合物を表し；
Xは、GHを構成するアミノ酸残基の中のアクセス可能でない官能基を含む基を表し；
Yは、Xの中に存在する官能基と反応し且つGH中のアクセス可能な官能基と反応しない1以上の官能基を含んでなる基を表し；
PEGは、ポリエチレングリコール部分を表し；
XXは、ヒスチジン、アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、チロシン、スレオニン、イソロイシン、トリプトファン、プロリンおよびバリンから選択されるアミノ酸残基を表す。
【請求項２１】
請求項２０に記載の化合物であって、XXがLeuを表す方法。
【請求項２２】
請求項２０または２１の何れか１項に記載の方法であって、前記アミノ酸アミドが、2-アミノ-3-オキソ-ブチルアミド、2-アミノ-6-(4-オキソ-ペンタノイルアミノ)-ヘキサン酸アミド、2-アミノ-3-(2-オキソ-2-フェニル-エチルスルファニル)-プロピオンアミド、2-アミノ-5-オキソ-ヘキサン酸アミド、2-アミノ-3-オキソ-プロピオンアミド、2-アミノ-6-(4-アセチルベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド、(2S)-2-アミノ-3-[4-(2-オキソプロポキシ)フェニル]プロピオンアミド、(2S)-2-アミノ-3-[4-(2-オキソブトキシ)フェニル]プロピオンアミド、(2S)-2-アミノ-3-[4-(2-オキソペントキシ)フェニル]プロピオンアミド、(2S)-2-アミノ-3-[4-(4-オキソペントキシ)フェニル]プロピオンアミド、(2S)-2-アミノ-6-(4-オキソ-4-フェニルブチリルアミノ)ヘキサン酸アミド、(2S)-2-アミノ-6-(4-オキソ-4-(4-クロロフェニルブチリルアミノ)ヘキサン酸アミド、3-アセチル-N-((5S)-5-アミノ-5-カルバモイルペンチル)ベンズアミド、2-アセチル-N-((5S)-5-アミノ-5-カルバモイルペンチル)ベンズアミド、(2S)-2-アミノ-3-(4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド、(S)-2-アミノペンタ-4-イン酸アミド、(2S)-2-アミノ-6-(3-(プロパ-2-イニル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド、(2S)-2-アミノ-6-(4-(プロパ-2-イニル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド、(2S)-2-アミノ-6-(2-(プロパ-2-イニル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド、(2S)-2-アミノ-3-[4-(1-オキソエチオキシ)フェニル)プロピオンアミド、(S)-2-アミノ-6-(3-(アジオドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド、(S)-2-アミノ-6-(3-(アミノキシメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド、およびS-フェニルアシルシステインアミドから選択される方法。
【請求項２３】
請求項２０または２２の何れかに記載の方法であって、Y-E-PEGが下記のものを表す方法：
【化２４】
2008531482.tif 000230
ここで、mPEGは20 kDまたは30 kDの分子量を有する；
【化２５】
2008531482.tif 000231
ここで、mPEGは20 kDまたは30 kDの分子量を有する；
【化２６】
2008531482.tif 000232
ここで、mPEGは20 kDまたは30 kDの分子量を有する；
【化２７】
2008531482.tif 000233
ここで、mPEGは20 kDまたは30 kDの分子量を有する；
【化２８】
2008531482.tif 000234
ここで、mPEGは20 kDまたは30 kDの分子量を有する；
【化２９】
2008531482.tif 000235
ここで、mPEGは20 kDまたは30 kDの分子量を有する；
【化３０】
2008531482.tif 000236
ここで、mPEGは20 kDまたは30 kDの分子量を有し、PEGは2〜5 kDの分子量を有する；
【化３１】
2008531482.tif 000237
ここで、mPEGは20 kDまたは30 kDの分子量を有し、PEGは2〜5 kDの分子量を有する。
【請求項２４】
式GH-XX-Alaの化合物であって、GHはhGHのアミノ酸配列（配列番号１）に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列のペプチドを含んでなり、またXXはヒスチジン、アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、チロシン、スレオニン、イソロイシン、トリプトファン、プロリンおよびバリンから選択されるアミノ酸残基を表す化合物。
【請求項２５】
GHがhGHである、請求項２４に記載の化合物。
【請求項２６】
hGH-Leu-Alaである、請求項２５に記載の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｃ末端がPEG化されている成長ホルモン化合物、並びに該化合物を調製および使用する方法に関する。これらの化合物は治療において有用である。
【背景技術】
【０００２】
ペプチドの性質を適切に変化させる化学基を結合させることによって、該ペプチドの性質および特性を修飾することは周知である。そのような結合には、一般に、結合基の官能基と反応する官能基が当該ペプチド中に存在することが必要である。典型的には、リジンのN末端アミノ基もしくはε-アミノ基のようなアミノ基が、適切なアシル化試薬と組み合せて使用されてきた。或いは、ポリエチレングリコール（PEG）またはその誘導体が、タンパク質に結合されてよい。検討のために、Exp.Opion.Ther.Patent., 14, 859-894, 2004を参照されたい。成長ホルモンに対するPEGの結合は、成長ホルモンの血漿半減期に対して積極的な影響を有しえることが示されている（WO 03/044056）。
【０００３】
しばしば、特定の部位で結合することが、望まれまたさらには要求されることがあり、このことは、位置選択性結合(regioselective conjugation)と呼ばれる。しかしながら、ヒト成長ホルモン(hGH)といった成長ホルモンの位置選択性アシル化は困難である。というのも、このタンパク質が、同様の反応性を示すリジン残基を９つ含んでおり、通常生成物の混合物が得られるためである。これらの混合物の単一の構成成分は単離するのが難しく、通常、低い収率および純度でしか得られないだろう。
【０００４】
カルボキシペプチダーゼを使用してペプチドのＣ末端を修飾することが、先に記載されている。WO 92/05271は、Ｃ末端カルボキシ基をアミド化するためのカルボキシペプチダーゼおよび救核性化合物の使用を開示しており、またWO 98/38285は、この目的に特に適したかカルボキシペプチダーゼＹの変異体を開示している。
【０００５】
EP 243 929は、タンパク質もしくはポリペプチドのＣ末端にポリペプチド、レポータ基または細胞障害剤を組み込むための、カルボキシペプチダーゼの使用を開示している。
【０００６】
WO 2005/035553は、ペプチドのＣ末端に官能基を酵素的に組み込むことによる、ペプチドの選択的結合のための方法を記載している。
【０００７】
成長ホルモンは、肉体的成長の調節だけでなく、タンパク質、炭水化物および脂質の代謝調節にも関与する重要なホルモンである。成長ホルモンの主要な効果は、成長を促進することである。ヒトの成長ホルモンは191アミノ酸残基のタンパク質であり、下記の配列を有している：
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF（配列番号１）。
【０００８】
ヒト成長ホルモンおよびこれに密接に関連した変異体の投与は、成長ホルモン結合に関連した疾患を治療するために使用される。ペプチドであるため、成長ホルモンは非経腸的に、即ち、注射針によって投与される。更に、成長ホルモンは比較的短い半減期を特徴とするものであり、従って頻繁な投与が必要とされ、患者にとっては対応する痛みおよび不便が伴う。従って、例えば延長された半減期のような、改善された薬理学的性質を備えた成長ホルモン化合物を提供することが未だ必要とされている。
【０００９】
本発明は、改善された薬理学的性質を備えた新規な成長ホルモン接合体、並びにその製造方法を提供するものである。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者等は、驚くべきことに、Ｃ末端に-XX-Ala配列を有する成長ホルモン化合物は、改善された薬理学的性質を備えたGH接合体を得るためにPEG化され得ることを見出した。従って、一つの実施形態において、本発明は次式Iに従う化合物、並びにその医薬的に許容可能な塩、プロドラッグおよび溶媒和化合物に関する：
【化３２】
2008531482.tif 000003
【００１１】
ここで、GHは成長ホルモン化合物を表し；GはR-A-Eを表し、ここでのRおよびEは各々独立に結合またはリンカーを表し、またAは何れかの化学部分のビラジカルを表し；PEGはポリエチレングリコール基を表し；XXはヒスチジン、アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、チロシン、スレオニン、イソロイシン、トリプトファン、プロリン、およびバリンから選択されるアミノ酸残基を表す。
【００１２】
一実施形態において、本発明は、治療に使用するための式Iに従う化合物を提供する。
【００１３】
一実施形態において、本発明は、式Iの化合異物を含有する医薬組成物を提供する。
【００１４】
一実施形態において、本発明は、治療的有効量の式Iの化合物を、それを必要としている患者に対して投与することを含んでなる治療方法を提供する。
【００１５】
一実施形態において、本発明は、医薬の製造における式Iの化合物の使用を提供する。
【００１６】
一実施形態において、本発明は、式Iの化合物を製造するための方法であって、
ｉ）１以上のステップにおいて、GH-XX-Alaと、該GH-XX-Alaを構成するアミノ酸の何れにおいてもアクセス可能でない１以上の官能基を有する第一の化合物とを、前記GH-XX-AlaのＣ末端への前記第一の化合物の組み込みを触媒できるカルボキシペプチダーゼY(CPY)の存在下で反応させて、トランスアシル化された化合物を形成する工程と；
ｉｉ）１以上のステップにおいて、前記トランスアシル化された化合物と、PEG部分および１以上の官能基を含んでなる第二の化合物とを反応させ、前記官能基は前記GH-XX-Alaを構成するアミノ酸残基中におけるアクセス可能な官能基とは反応せず、かつ前記第二の化合物における官能基は前記第一の化合物における官能基と反応することができて、前記トランスアシル化された化合物および前記第二の化合物の間に共有結合が形成されるようになっている工程と
を含んでなる方法を提供する。
【００１７】
本発明の更なる目的は、-XX-Ala配列によってＣ末端を延長された成長ホルモン化合物、即ち、式GH-XX-Alaの化合物を提供異することである。
【００１８】
本発明の更なる目的は、本発明の方法に従って前記ペプチドを接合することによって、GHの性質を改善する方法を提供することである。
【定義】
【００１９】
本願の文脈において、「トランスアシル化」の用語は、脱離基が求核試薬と交換される反応を示すことを意図しており、ここでの救核試薬は炭素核を攻撃する傾向をもった電子に富む試薬であると理解される。トランスペプチド化は、トランスアシル化の一例である。
【００２０】
本願の文脈において、「アクセス可能でない」の用語は、それが到達できないという意味において何かが存在しないか、または事実上存在しないことを示すことを意図している。接合されるべきペプチドにおいて官能基がアクセス可能でないと述べるときは、前記ペプチドに前記官能基が存在しないか、または存在したとしても、何らかの理由で反応に関与することを妨げられていることを示すものである。一例として、前記官能基は、ペプチド構造の中に深く埋没されて、反応への関与から遮蔽されている可能性がある。官能基がアクセス可能であるか否かは、反応条件に依存することが理解される。例えば、変性剤の存在または上昇温度においては、当該ペプチドの折り畳みが解かれて、さもなければアクセス可能でない官能基を露出させる可能性が考えられる。「アクセス可能でない」は、「興味ある特定の反応について選択された反応条件においてアクセス可能でない」ことを意味することが理解されるべきである。
【００２１】
本願の文脈において、「オキシム結合」の用語は、式-C=N-O-の部分を示すことを意図している。
【００２２】
本願の文脈において、「ヒドラゾン結合」の用語は、式-C=N-N-の部分を示すことを意図している。
【００２３】
本願の文脈において、「フェニルヒドラゾン結合」の用語は、次式
【化３３】
2008531482.tif 000004
【００２４】
の部分を示すことを意図している。
【００２５】
本願の文脈において、「セミカルバゾン結合」の用語は、式-C=N-N-C(O)-N-の部分を示すことを意図している。
【００２６】
「アルカン」の用語は、飽和の直鎖、分岐鎖および／または環式の炭化水素を示すことを意図したものである。別の炭素原子数で特定しない限り、この用語は、1〜30（両者を含む）の炭素原子、例えば1〜20（両者を含む）、例えば1〜10（両者を含む）、例えば1〜5（両者を含む）の炭素原子をもった炭化水素を示すことを意図したものである。アルキルおよびアルキレンの用語は、それぞれ、対応する基およびビラジカルを意味する。
【００２７】
「アルケン」の用語は、少なくとも一つの炭素-炭素二重結合を含む直鎖、分岐鎖および／または環式の炭化水素を示すことを意図している。別の炭素原子数で特定しない限り、この用語は、2〜30（両者を含む）の炭素原子、例えば2〜20（両者を含む）、例えば2〜10（両者を含む）、例えば2〜5（両者を含む）の炭素原子をもった炭化水素を示すことを意図したものである。アルケニルおよびアルケニレンの用語は、それぞれ、対応する基およびビラジカルを意味する。
【００２８】
「アルキン」の用語は、少なくとも一つの炭素-炭素三重結合を含み、且つ任意に1以上の炭素-炭素二重結合を含んでより直鎖、分岐鎖および／または環式の炭化水素を示すことを意図している。別の炭素原子数で特定しない限り、この用語は、2〜30（両者を含む）の炭素原子、例えば2〜20（両者を含む）、例えば2〜10（両者を含む）、例えば2〜5（両者を含む）の炭素原子をもった炭化水素を示すことを意図したものである。アルキニルおよびアルキニレンの用語は、それぞれ、対応する基およびビラジカルを意味する。
【００２９】
「ホモ環式芳香族化合物」の用語は、ベンゼンおよびナフタレンのような方位後続炭化水素を意味することを意図している。
【００３０】
「ヘテロ環式化合物」の用語は、5、６または7個の環原子を含んでなり、そのうちの1、2、3または4個がN、Oおよび／またはSから選択されるヘテロ原子である環式化合物を示すものである。その例には、チオフェン、フラン、ピラン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、イソチアゾール、イソオキサゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジンのようなヘテロ環芳香族化合物、並びにそれらの部分的または完全に水素化等価物、例えばピペリジン、ピラゾリジン、ピロリジン、ピロリン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペラジンおよびモルホリンが含まれる。
【００３１】
「ヘテロアルカン」、「ヘテロアルケン」および「ヘテロアルキン」の用語は、上記で定義したアルカン、アルケンおよびアルキンであって、該部分の構造中に1以上のヘテロ原子または基が挿入されているものを示すことを意図している。ヘテロ基およびヘテロ原子の例には、-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-C(O)-、-C(S)-および-N(R＊)-が含まれ、ここでのR＊は水素またはC1-C6-アルキルを表す。ヘテロアルカンの例には下記のものが含まれる。
【化３４】
2008531482.tif 000005
【００３２】
「ラジカル」または「ビラジカル」の用語は、それぞれ一つまたは二つの水素原子が除去された化合物を示すものである。特に述べるときは、ラジカルはまた、より大きな原子群、例えばヒドロキシルを化合物から形式的に除去することにより形成される部分を示すものであり得る。
【００３３】
「ハロゲン」の用語は、周期律表第VII族の構成員、例えばF、Cl、BrおよびIを示すものである。
【００３４】
「Peg」の用語は、分子量が約100〜約1,000,000 Daのポリエチレングリコール（その類似体を含む）であって、例えばその末端OH基がアルコキシ基、例えばメトキシ基、エトキシ基またはプロポキシ基で置換されているものを示すものである。特に、末端-OH基がメトキシで置換されているPEGは、mPEGと称される。
【００３５】
「mPEG」（またはより正しくは「mPEGyl」）の用語は、下記構造の多分散または単分散のラジカルを意味し、
【化３５】
2008531482.tif 000006
【００３６】
ここでのmは、１より大きい整数である。従って、mが90であるmPEGは、3991 Daの分子量、すなわち約4 kDaの分子量を有する。同様に、平均分子量20 kDaのmPEGは、mの平均が454である。mPEGを製造するプロセスに起因して、これらの分子は屡々、分子量分布を有する。この分布は多分散指数により記述される。
【００３７】
ここで使用される「多分散指数」の用語は、重量平均分子量と数平均分子量の比を意味し、ポリマー化学の分野において既知である（例えば、“Polymer Synthesis and Characterization”、J.A. Nairn、University of Utah、2003参照）。多分散指数は、1以上の数であり、ゲル浸透クロマトグラフィーのデータから推定してよい。多分散指数が１の場合の生成物は単分散であり、従って単一の分子量の化合物からできている。多分散指数が１より大きい場合、これは該ポリマーの多分散の尺度となる。即ち、異なる分子量をもったポリマーの分布がどれだけ広いかが表される。
【００３８】
式、化合物名、または分子構造において、例えば「mPEG20000」の使用は、多分散で且つ約20 kDaの分子量を有するmPEG残基であることを示す。
【００３９】
多分散指数は、典型的には、PEGまたはmPEGの分子量に伴って増大する。5 kDa PEGおよび特に5 kDa mPEGと言う場合、これは多分散指数が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02〜1.03の値をとる化合物（または実際には化合物の混合物）を示すことを意図するものである。10 kDa PEGおよび特に10 kDa mPEGと言う場合、これは多分散指数が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02〜1.03の値をとる化合物（または実際には化合物の混合物）を示すことを意図するものである。15 kDa PEGおよび特に15 kDa mPEGと言う場合、これは多分散指数が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02〜1.03の値をとる化合物（または実際には化合物の混合物）を示すことを意図するものである。20 kDa PEGおよび特に20 kDa mPEGと言及された場合、これは、多分散指数が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02から1.03の間の値をとる化合物（または実際には化合物の混合物）を表すことを意図するものである。30 kDa PEGおよび特に30 kDa mPEGと言う場合、これは多分散指数が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02〜1.03の値をとる化合物（または実際には化合物の混合物）を表すことを意図している。40 kDa PEGおよび特に40 kDa mPEGと言う場合、これは多分散指数が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02〜1.03の値をとる化合物（または実際には化合物の混合物）を表すことを意図している。60 kDa PEGおよび特に60 kDa mPEGと言う場合、これは多分散指数が1.06未満、例えば1.05未満、例えば1.04未満、例えば1.03未満、例えば1.02〜1.03の値をとる化合物（または実際には化合物の混合物）を表すことを意図している。
【００４０】
本発明の文脈において、「ペプチド」および「タンパク質」の用語は、互換的に使用され且つ同じことを示すことを意図している。「ペプチド」の用語は、2以上のアミノ酸残基がペプチド結合で結合された化合物を示すことを意図している。該アミノ酸は、天然または非天然のものであってよい。この用語はまた、他のペプチド、糖、脂質または他の有機化合物で置換された前記化合物、並びに1以上のアミノ酸残基が化学修飾され、またペプチドが補欠分子団を含む化合物を含むことを意図している。
【００４１】
本発明の文脈において、「アリール」の用語は、炭素環式芳香族ラジカル、または少なくとも一つの環が芳香族である融合芳香族環系ラジカルを示すことを意図している。典型的なアリール基には、フェニル、ビフェニル、ナフチル等が含まれる。
【００４２】
ここで用いる「ヘテロアリール」の用語は、単独または組合せにおいて、例えば5〜7員の芳香環ラジカル、または例えば7〜18員の融合芳香環系ラジカルを意味し、ここでは少なくとも一つの環が芳香族であり、窒素、酸素または硫黄ヘテロ原子から選択される1以上のヘテロ原子を環原子として含んでおり、またN-オキシド、硫黄モノオキシドおよび硫黄ジオキシドが許容可能なヘテロ芳香族置換基である。その例には、フラニル、チエニル、チオフェニル、ピロリル、イミダゾリル、ピラゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、チアゾリル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、イソチアゾリル、ピリジニル、ピリダジニル、ピラジニル、ピリミジニル、キノリニル、イソキノリニル、ベンゾフラニル、ベンゾチオフェニル、インドリル、およびインダゾリル等が含まれる。
【００４３】
名詞としての「接合体」の用語は、修飾されたペプチド、即ち、当該ペプチドの性質を修飾するためにこれに結合された部分を備えたペプチドを示すことを意図している。動詞としてのこの用語は、ペプチドに対して該ペプチドの性質を修飾する部分を結合させるプロセスを示すことを意図している。
【００４４】
ここで使用される「プロドラッグ」の用語は、生体内加水分解性アミドおよび生体内加水分解性エステルを示し、また、ａ）そのようなプロドラッグの生体内加水分解性官能基が本発明による化合物に包含される化合物、およびｂ）所定の官能基が生物学的に酸化または還元されることにより本発明による薬剤物質が生じる化合物を包含する。これらの官能基の例には、1,4-ジヒドロピリジン、N-アルキルカルボニル-1,4-ジヒドロピリジン、1,4-シクロヘキサジエン、tert-ブチル等が含まれる。
【００４５】
本出願で使用される「生体内加水分解性エステル」の用語は、薬剤物質（この場合、本発明による化合物）のエステルであって、ａ）親物質の生物活性を妨害しないが、該物質に対して、作用期間、作用の開始等のようなin vivoでの有利な性質を付与するエステル、またはｂ）生物学的に不活性であるが、in vivoで患者により容易に生物学的有効成分に変換されるエステルの何れかである。この利点は、例えば可溶性が増大すること、または、生体内加水分解性エステルが経口投与で腸から吸収され、血漿中で本発明による化合物に変換されるということである。そのような多くの例が当該技術において知られており、例えば、低級アルキルエステル（例えば、C1-C4）、低級アシルオキシアルキルエステル、低級アルコキシアシルオキシアルキルエステル、アルコキシアシルオキシエステル、アルキルアシルアミノアルキルエステルまたはコリンエステルが含まれる。
【００４６】
本出願で使用される「生体内加水分解性アミド」の用語は、薬剤物質（この場合、本発明による化合物）のアミドであって、ａ）親物質の生物活性を妨害しないが、該物質に対して作用期間、作用の開始等といったin vivoでの有利な性質を付与するエステル、またはｂ)生物学的に不活性であるが、in vivoで患者により容易に生物学的有効成分に変換されるエステルの何れかである。この利点は、例えば可溶性が増大すること、または、生体内加水分解性エステルが経口投与で腸から吸収され、血漿中で本発明による化合物に変換されるということである。そのような多くの例が当該技術において知られており、例えば、低級アルキルアミド、α-アミノ酸アミド、アルコキシアシルアミド、およびアルキルアミノアルキルカルボニルアミドが含まれる。
【００４７】
本発明の文脈において、「医薬的に許容可能な塩」の用語は、患者に対して有害でない塩を示すことを意図している。そのような塩には、医薬的に許容可能な酸付加塩、医薬的に許容可能な金属塩、アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩が含まれる。酸付加塩は、無機酸ならびに有機酸の塩を含む。適切な無機酸の典型例にはは、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硫酸、硝酸等が含まれる。適切な有機酸の典型例には、ギ酸、酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、プロピオン酸、安息香酸、ケイ皮酸、クエン酸、フマル酸、グリコール酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、シュウ酸、ピクリン酸、ピルビン酸、サリチル酸、コハク酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、酒石酸、アスコルビン酸、パモ酸(pamoic acid)、ビスメチレンサリチル酸、エタンジスルホン酸、グルコン酸、シトラコン酸、アスパラギン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、EDTA、グリコール酸、p-アミノ安息香酸、グルタミン酸、ベンゼンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸等が含まれる。医薬的に許容可能な無機もしくは有機の酸付加塩の更なる例には、本明細書の一部として援用するJ. Pharm. Sci. 1977、66、2に列挙された医薬的に許容可能な塩が含まれる。金属塩の例には、リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩等が含まれる。アンモニウムおよびアルキル化アンモニウム塩の例には、アンモニウム塩、メチルアンモニウム塩、ジメチルアンモニウム塩、トリメチルアンモニウム塩、エチルアンモニウム塩、ヒドロキシエチルアンモニウム塩、ジエチルアンモニウム塩、ブチルアンモニウム塩、テトラメチルアンモニウム塩等が含まれる。
【００４８】
本出願にて使用される化合物の「治療的有効量」とは、所定の疾患およびその合併症の臨床症状を、治癒、緩和、または部分的に阻止するのに十分な量を意味する。これを達成するために適した量が「治療的有効量」として定義される。それぞれの目的のための有効量は、例えば、疾患または傷害の重篤度、ならびに患者の体重、性別、年齢および一般状態に依存するであろう。適切な投与量の決定は、数値の行列(matrix of values)を構築し、この行列における種々の点で試験を行うことによる日常的な実験を用いて達成してよく、そのような実験は、全て、熟練した医師または獣医師の通常の技術の中に含まれるものである。
【００４９】
ここで使用される「治療」または「治療する」の用語は、疾患または障害等の条件と闘うことを目的として、患者を管理およびケアすることを意味する。この用語は、患者が罹患している所定の症状に対する全範囲の治療を含むことを意図しており、例えば、病徴または合併症を緩和するために、疾患、障害または症状の進行を遅延させるために、病徴および合併症を緩和または軽減するために、および／または、疾患、障害または症状を治癒または除去するために、ならびに症状を予防するために活性化合物を投与することが含まれ、ここでの予防は、疾患、症状、または障害と闘う目的で患者を管理およびケアすることと解される、また病徴または合併症の発症を予防するために活性化合物を投与することが含まれる。治療される患者は、好ましくは哺乳類、特にヒトであるが、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジおよびブタといった動物が含まれてもよい。
【発明の詳細な説明】
【００５０】
本発明の一実施形態において、XXはLeuを表す。即ち、それは次式Iaの構造を備えた式Iに従う化合物に関する。
【化３６】
2008531482.tif 000007
【００５１】
一実施形態において、本発明は、次式Ibの構造を備えた式Iaに従う化合物、およびその医薬的に許容可能な塩、溶媒和物およびプロドラッグに関する。
【化３７】
2008531482.tif 000008
【００５２】
ここで、
GHは成長ホルモン化合物を表し；
mPEGは、分子量が0.1 kD〜1000 kDの、何れかの直鎖もしくは分岐鎖のメトキシポリエチレングリコール部分を表し；
Gは、R-A-Eを表し、ここでのRおよびEは各々独立に結合またはリンカーを表し、またAはビラジカルを表す。
【００５３】
特定の実施形態において、式Ibの化合物は、次式Icに従う構造を有する：
【化３８】
2008531482.tif 000009
【００５４】
一実施形態において、本発明は、式Id、IeまたはIfの構造を備えた式Iaに従う化合物、およびその医薬的に許容可能な塩、溶媒和物およびプロドラッグに関する：
【化３９】
2008531482.tif 000010
【００５５】
ここで、
GHは成長ホルモン化合物を表し；
mPEGは、分子量が0.1 kD〜1000 kDの、何れかの直鎖もしくは分岐鎖のメトキシポリエチレングリコール部分を表し；PEGLは、2 kD〜5 kDの分子量を有するPEGのビラジカルであり；
Gは、R-A-Eを表し、ここでのRおよびEは各々独立に結合またはリンカーを表し、またAは何ビラジカルを表す。
【００５６】
特定の実施形態において、式Id、Ie、およびIfの化合物は、それぞれ式Ig、IhおよびIiに従う構造を有する：
【化４０】
2008531482.tif 000011
【００５７】
ここでのPEGLは、2 kD〜5 kDの分子量を有するポリエチレングリコール部分のビラジカルである。
【００５８】
一実施形態において、GHはヒト成長ホルモン、hGHを表す。
【００５９】
一実施形態において、GHは、hGH配列における1以上のアミノ酸を化学的に修飾することによって得られるhGHの誘導体である。例示的なGH誘導体には、1以上の他の部分に共有結合されたhGHが含まれるが、これに限定されない。
【００６０】
一実施形態において、GHは、hGHの変種(variant)であり、該変種は、hGH配列の1以上のアミノ酸残基を別の天然または非天然アミノ酸に置換することによって；および／または1以上の天然または非天然アミノ酸をhGH配列に付加することによって；および／またはhGH配列から1以上のアミノ酸を欠失させることによって得られる化合物であると理解され、これらの工程は何れも、任意にその後に1以上のアミノ酸残基の誘導体化を伴ってよい。特に、このような置換は、1つのアミノ酸が同じグループの別のアミノ酸残基、即ち、同様の性質を有する別のアミノ酸残基で置換されるという意味において保存的である。アミノ酸は、好都合には、その性質に基づいて以下の群に分類されてよい：即ち、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えば、グルタミン、システインおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、プロリン、メチオニンおよびバリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、並びに小アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリンおよびスレオニン）である。
【００６１】
一実施形態において、GHは、hGHに対して少なくとも80％、例えば少なくとも85％、例えば少なくとも90％、例えば少なくとも95％の同一性を有する。一実施形態において、そのようなhGHとの同一性は、本出願による試験Ｉで決定される、hGHの成長ホルモン活性の少なくとも20％、例えば少なくとも40％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも80％に連関する。
【００６２】
当該分野で知られた「同一性」の用語は、配列の比較から決定される、2以上のタンパク質の配列の間の関係を意味する。当該分野において、「同一性」とはまた、2以上のアミノ酸残基のストリング間での一致数にて決定される、タンパク質間の配列の関連性の度合いを意味する。「同一性」は、特定の数学的モデルまたはコンピュータープログラム（即ち、「アルゴリズム」）によりアドレスされるギャップ・アラインメント（もし存在すれば）で、2以上の配列のより小さな部分間の一致のパーセントが測定される。関連タンパク質の同一性は、既知の方法によって容易に計算することができる。そのような方法には、Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988；Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W.、ed., Academic Press, New York, 1993；Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M.、and Griffin、H. G.、eds.、Humana Press、New Jersey、1994；Sequence Analysis in Molecular Biology、von Heinje、G.、Academic Press、1987；Sequence Analysis Primer、Gribskov、M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991；およびCarillo et al., SIAM J. Applied Math., 48:1073 (1988)に記載された方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００６３】
同一性を決定する好ましい方法は、試験する配列間で最大の一致が得られるように設計される。同一性を決定する方法は、公に入手可能なコンピュータープログラムに記載されている。2つの配列間の同一性を決定するための、好ましいコンピュータープログラム法には、GAPを含むGCGプログラムパッケージ（Devereux et al., Nucl. Acid. Res., 12:387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.）、BLASTP、BLASTN、およびFASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990))が含まれる。BLASTXプログラムは、国立バイオテクノロジー情報センター(NCBI)およびその他の供給元から提供され(BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra)、公的に入手可能である。周知のスミス・ウォーターマン(Smith Waterman)アルゴリズムもまた、同一性の決定のために使用してよい。
【００６４】
例えば、コンピューターアルゴリズムGAP（Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison、Wis.）を使用する場合、配列の同一性のパーセントを決定しようとする2つのタンパク質は、それぞれのアミノ酸が最適に一致するよう並べられる（アルゴリズムにより決定される「一致距離(matched span)」）。ギャップ開始ペナルティ(gap opening penalty)［３×平均対角(average diagonal)によって計算される；「平均対角」とは、使用される比較行列(comparison matrix)の対角の平均である；「対角」とは、特定の比較行列により、それぞれのアミノ酸完全一致に割り当てられるスコアまたは数である］およびギャップ伸長ペナルティ(gap opening penalty)［通常、{割合(fraction)(1/10)}×ギャップ開始ペナルティ］、ならびにPAM 250またはBLOSUM 62といった比較行列は、当該アルゴリズムと組み合わせて使用される。標準的な比較行列［PAM 250比較行列については、Dayhoff et al.、Atlas of Protein Sequence and Structure、vol. 5、supp.3 (1978)；BLOSUM 62比較行列についてはHenikoff et al.、Proc. Natl. Acad. Sci USA、89:10915-10919 (1992)を参照］もまた、アルゴリズムに使用される。
【００６５】
タンパク質配列比較に好ましいパラメーターは、以下を含む：
アルゴリズム：Needleman et al., J. Mol. Biol, 48:443-453 (1970)；比較行列：BLOSUM 62 (Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:10915-10919 (1992))；ギャップペナルティ：12、ギャップ長ペナルティ(Gap Length Penalty)：4、類似性の閾値：0。
【００６６】
GAPプログラムは、上記のパラメーターを用いた場合に有用である。上記のパラメーターは、GAPアルゴリズムを用いたタンパク質比較（終了ギャップに対してペナルティを伴わない）におけるデフォルトパラメーターである。
【００６７】
RおよびEの両者は独立に、結合またはリンカーを表す。これらリンカーは存在しないか（即ち、Rおよび／またはEは結合を表す）、またはアルカン、アルケンもしくはアルキンビラジカル、並びにヘテロアルカン、ヘテロアルケンおよびヘテロアルキンビラジカルの中から選択されてよく、ここでは1以上の任意に置換された芳香族ホモ環式ビラジカルまたはヘテロ環式化合物のビラジカル、例えばフェニレンもしくはピペリジンビラジカルが、上記のビラジカルの中に挿入されてよい。前記リンカーはまた、ヒドロキシ、ハロゲン、ニトロ、シアノ、カルボキシ、アリール、アルキルおよびヘテロアリールから選択される基による置換を含んでよいことが理解されるべきである。
【００６８】
EおよびRの典型例には、直鎖、分岐鎖および／または環式のC1-10アルカン、C2-10アルケン、C2-10アルキン、C1-10ヘテロアルカン、C2-10ヘテロアルケン、C2-10ヘテロアルキンのビラジカルが含まれ、ここでは1以上のホモ環式芳香族化合物ビラジカル、またはヘテロ環式化合物ビラジカルが挿入されてもよい。EおよびRの特別の例には下記のものが含まれる：
【化４１】
2008531482.tif 000012
【化４２】
2008531482.tif 000013
【００６９】
Aは、以下で述べるXおよびYの間の反応で形成されるビラジカルを表す。Aの異例には、オキシム結合、ヒドラゾン結合、フェニルヒドラゾン結合、セミカルバゾン結合、トリアゾール結合、イソオキサゾリジン結合、アミド結合またはアラルキン結合が含まれる。
【００７０】
一実施形態において、G、即ち、R-A-Eは下記のものを表す：
【化４３】
2008531482.tif 000014
【００７１】
例えば
【化４４】
2008531482.tif 000015
【００７２】
一実施形態において、G、即ち、R-A-Eは下記のものを表す：
【化４５】
2008531482.tif 000016
【００７３】
例えば
【化４６】
2008531482.tif 000017
【００７４】
一実施形態において、G、即ち、R-A-Eは下記のものを表す：
【化４７】
2008531482.tif 000018
【００７５】
一実施形態において、G、即ち、R-A-Eは下記のものを表す：
【化４８】
2008531482.tif 000019
【００７６】
一実施形態において、mPEGは、約0.5 kDa〜約100 kDa、例えば約5 kDa〜約80 kDa、例えば約10 kDa〜約60 kDa、例えば約10 kDa〜約40 kDaの分子量をもったmPEGを表す。特に、該mPEGは約10 kDa〜約30 kDa、例えば約10 kDa〜約20 kDaの分子量を有する。約5 kDa、約10 kDa、約15 kDa、約20 kDa、約30 kDa、約40 kDa、および約60 kDaの分子量をもったmPEGが、特に言及される。前記mPEGは、当該部分が１以上のmPEGアーム、典型的には２または３のアームを含む意味において、分岐している。一例として、約40 kDaの分子量を有するmPEGは、単鎖分子として調製するのは困難であるが、各々が約20 kDaの分子量をもった二つのmPEGアームを具備する分岐mPEGとして調製してよい。
【００７７】
式Iの化合物の特定の例には、下記のものが含まれる：
【化４９】
2008531482.tif 000020
【００７８】
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化５０】
2008531482.tif 000021
【００７９】
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化５１】
2008531482.tif 000022
【００８０】
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化５２】
2008531482.tif 000023
【００８１】
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化５３】
2008531482.tif 000024
【００８２】
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化５４】
2008531482.tif 000025
【００８３】
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化５５】
2008531482.tif 000026
【００８４】
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化５６】
2008531482.tif 000027
【００８５】
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化５７】
2008531482.tif 000028
【００８６】
ここで、各mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化５８】
2008531482.tif 000029
【００８７】
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化５９】
2008531482.tif 000030
【００８８】
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する；
【化６０】
2008531482.tif 000031
【００８９】
ここで、mPEGは約5 kDa、10 kDa、15 kDa、20 kDa、30 kDa、40 kDa、または60 kDaの分子量を有する。
【００９０】
本発明の化合物は、親化合物とも呼ばれる対応の非接合型GHと比較して、改善された薬理学的性質を有している。この点において、非接合型GHは、GHおよびGH-XX-Alaの両方を表す。そのような薬理学的性質の例には、機能的in vivo半減期(functional in vivo half-life)、免疫原性、腎濾過、プロテアーゼ保護およびアルブミン結合が含まれる。
【００９１】
「機能的in vivo半減期」の用語は、通常の意味で使用される。即ち、GHまたは接合型GHの50％の生物活性が、なお体内／標的組織に存在している時間であり、またはGHもしくはGH接合体(conjugates)の活性が、その最初の値の50％となった時間を意味する。機能的in vivo半減期を決定する代わりに、「in vivo血漿半減期」、即ち、GHまたはGH接合体の50％が、除去される前に血漿または血流中で循環している時間である。血漿半減期の決定は、しばしば機能的半減期の決定よりも単純であり、血漿半減期の大きさは、通常は機能的in vivo半減期の大きさの良い指標である。血漿半減期の別称には、血清半減期(serum half-life)、循環半減期(circulating half-life)、循環性半減期(circulatory half-life)、血清クリアランス(serum clearance)、血漿クリアランス(plasma clearance)、およびクリアランス半減期(clearance half-life)が含まれる。
【００９２】
機能的in vivo半減期または血漿半減期と関連して使用される「増加する」の用語は、GH接合体の関連半減期が、比較可能な条件下において、親GHのそれと比較して統計的に有意に増加することを示すように使用される。例えば、関連半減期は、少なくとも約25％まで、例えば少なくとも約50％まで、例えば少なくとも100％、150％、200％、250％、または500％まで増加してよい。一実施形態において、本発明による化合物は、親GHの半減期と比較して、少なくとも5時間、好ましくは少なくとも約24時間、より好ましくは少なくとも約72時間、および最も好ましくは少なくとも約7日間の半減期の増大を示す。
【００９３】
in vivo血漿半減期の測定は、文献に記載された多数の方法で行うことができる。in vivo血漿半減期における増大は、クリアランス(CL)の減少として、または平均滞留時間(MRT)の増加として定量してよい。本発明による接合型GHが、親GHのＣＬの70％未満、例えば50％未満、例えば20％未満、例えば10％未満に減少していると適切な試験にて決定された場合、in vivo血漿半減期が増加したといえる。適切な試験において、本発明による接合型GHのMRTが、親GHのMRTの130％超、例えば150％超、例えば200％超、例えば500％超まで増加した場合、in vivo血漿半減期は増加したといえる。クリアランスおよび平均滞留時間は、適切な実験動物を用いた標準的な薬物動態学的実験において評価することができる。所定のタンパク質に適した実験動物を選択することは、当業者の能力の範囲内である。勿論、ヒトにおける試験は最終的な試験に相当する。適当な実験動物には、正常な雄スプラーグ-ドーリー(Sprague-Dawley)ラット、マウスおよびカニクイザルが含まれる。典型的には、マウスおよびラットは1回の皮下大量瞬時投与(bolus)で注射され、一方サルは、１回の皮下大量瞬時投与(bolus)、または１回の静脈投与で注射してよい。注射する量は実験動物に依存する。続いて、CLおよびMRTの評価に適するように、１〜5日間に亘って血液サンプルが採取される。血液サンプルは、ELISA技術により便宜に分析される。
【００９４】
化合物の「免疫原性」の用語は、ヒトに投与されたときに、液性、細胞性またはその両方により有害な免疫反応を誘発する化合物の能力を意味する。何れかのヒトの部分母集団において、特定の投与されたタンパク質に対して感受性を示す個人が存在する可能性がある。免疫原性は、当該分野で既知の通常の技術を用い、感受性を示す個人において、成長ホルモンに対する抗体および／または成長ホルモンに応答するT細胞の存在を定量することにより測定してよい。一実施形態において、本発明による接合型GHは、感受性を示す個人において、親GHの免疫原性と比較して少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約40％、および最も好ましくは少なくとも約50％の免疫原性の減少を示す。
【００９５】
本出願で使用される「プロテアーゼ保護作用」または「プロテアーゼ保護された」の用語は、本発明による接合型GHが、血漿ペプチダーゼまたはプロテアーゼに対して、親GHよりも抵抗性を示すことを意図するものである。血漿中に存在するプロテアーゼおよびペプチダーゼ酵素は、循環するタンパク質、例えば、成長ホルモンのような循環するペプチドホルモンの分解に関与する。
【００９６】
成長ホルモンは、例えばトロンビン、プラスミン、サブチリシン、およびキモトリプシン様セリンプロティナーゼによる分解を受け易い。これらプロテアーゼの分解を測定するための試験は、J. Biotech., 65, 183, 1998に記載されている。一つの実施形態において、GH接合体の加水分解速度は、親GHの場合の70％未満、例えば40％未満、例えば10％未満である。
【００９７】
哺乳類種の循環血液中の最も豊富なタンパク質成分は血清アルブミンであり、これは正常な状態において、全血100 /mL当り約3〜4.5グラムの濃度で存在している。血清アルブミンは約70,000ダルトンの血液タンパク質であり、循環系において幾つかの重要な機能を有している。これは、血液中に存在する種々の有機分子のトランスポーターとして、また脂肪酸およびビリルビンのような様々な代謝産物の主要なトランスポーターとして機能し、更にその存在量に起因して循環血液の浸透圧調節因子として機能する。血清アルブミンは1週間を越える半減期を有しており、このタンパク質の血漿半減期を増加させる1つの方法は、血清アルブミンに結合する化学基をタンパク質に結合させることである。アルブミン結合特性は、本明細書の一部として援用するJ.Med.Chem, 43, 2000, 1986-1992に記載されるようにして決定してよい。
【００９８】
式(I)の化合物は、成長ホルモン活性を働かせ、それ自体で、成長ホルモン循環量の増加により利益を得るであろう疾患または状態の治療に使用してよい。特に、本発明は成長ホルモン欠乏症（GHD）；ターナー症候群；プラーダー-ヴィリ症候群(PWS)；ヌーナン症候群；ダウン症候群；慢性腎臓病、若年性関節リウマチ；嚢胞性線維症、HAART治療を受けた小児におけるHIV感染(HIV/HALS小児)；在胎期間の短い低身長出生児(short children born short for gestational age)(SGA)；超低出生時体重(VLBW)であるがSGAでない小児における低身長状態；骨格形成異常；低軟骨形成症；軟骨形成不全；特発性低身長(ISS)；成人におけるGHD；脛骨、腓骨、大腿骨、上腕骨、橈骨、尺骨、鎖骨、中手骨(matacarpea)、中足骨(matatarsea)、および指のような長骨の骨折またはその内部での骨折；頭蓋骨、手の基部(base of hand)、および足の基部(base of food)等の海綿状骨の骨折またはその内部での骨折；例えば手、膝、または肩における、腱または靭帯の手術後の患者；骨延長法(distraction oteogenesis)を行っているまたは経験している患者；臀部もしくは円盤置換術、半月板修復、脊椎固定術、または、膝、臀部、肩、肘、手首または顎における人工関節固定後の患者；釘、螺子およびプレート等の骨接合材料が固定された患者；骨折が非癒合または癒合不良の状態である患者；例えば、脛骨または足親指(1st toe)からの骨切除(osteatomia)後の患者；移植片移植後の患者；外傷または関節炎によって生じる膝における関節軟骨変性症；ターナー症候群の患者における骨粗鬆症；男性における骨粗鬆症；長期透析が必要な成人患者(adult patients in chronic dialysis)(APCD)；APCDにおける栄養失調関連循環器病；APCDにおける悪液質の反転(reversal of cachexia)；APCDにおける慢性閉塞性肺疾患(chronic abstractive pulmonal disease)；APCD におけるHIV；APCDの高齢者；APCDにおける慢性肝疾患、APCDにおける疲労症候群；クローン病；肝機能障害；HIV感染した男性；短腸症候群(short bowel syndrome)；中心性肥満；HIV関連性脂肪異栄養症候群(HALS)；男性不妊症；選択的大手術(major elective surgery)、アルコール/薬物解毒または神経学的外傷後の患者；加齢；虚弱な高齢者；骨関節炎；外傷的に損傷した軟骨；勃起障害；線維筋痛；記憶障害；鬱病；外傷性脳損傷；外傷性脊椎損傷；蜘蛛膜下出血；超低出生時体重；代謝症候群；グルココルチコイド筋障害；または小児におけるグルココルチコイド治療が原因の低身長の治療のための方法であって、それを必要とする患者に対して式(I)に従う化合物の治療的有効量を投与する方法を提供する。
【００９９】
一つの側面において、本発明は、筋組織、神経組織または傷の治癒の促進；損傷を受けた組織への血流の促進または改善；または損傷を受けた組織における感染率の低下のための方法であって、それを必要とする患者に対して、式Iの化合物の治療的有効量を投与することを含む方法を提供する。
【０１００】
一実施形態において、本発明は、上述した疾患のように、成長ホルモンの血漿レベルが増加することで利益を得る疾患のための治療薬の製造における、式Iに従う化合物の使用に関する。
【０１０１】
典型的な非経腸的投与量は、1回の投与当り10-9 mg/kg体重〜約100 mg/kg体重の範囲である。典型的な投与量は、1回の投与当り約0.0000001 mg/kg体重〜約10 mg/kg体重の範囲である。正確な投与量は、例えば、徴候、薬物、投与の頻度および様式、治療する患者の性別、年齢および一般的体調、治療する疾患または症状の性質および重症度、治療の望ましい効果および当業者にとって明らかなその他の因子に依存するであろう。
【０１０２】
典型的な投与頻度は、1日2回、1日1回、1日おき、週に2回、週に1回またはより長い投与間隔である。本発明による融合タンパク質の延長された半減期により、週に2回、週に1回またはより長い投与間隔といった、長い投与間隔による投与計画が、本発明の特別な実施形態である。
【０１０３】
多くの疾患は、その治療において、同時または連続的に投与される２以上の薬剤を用いて治療される。それゆえ、上記の疾患の1つの治療のための治療的方法において、式(I)の化合物を、前記疾患の治療において通常使用される1以上の他の治療活性を有する化合物と組み合わせて使用することは、本発明の範囲内である。同様に、式(I)の化合物を、上記の疾患の1つの治療において通常使用されるその他の治療的活性を有する化合物と組み合わせて、前記疾患のための薬物の製造に使用することも本発明の範囲内である。
【０１０４】
式Iの化合物は、有利には、２段階酵素触媒反応において調製されてよい。驚くべきことに、本発明者等は、GHにおいてアクセス可能でない１以上の官能基を含む第一の化合物を、-XX-Ala配列によりＣ末端を延長された成長ホルモン化合物（GH）のＣ末端の中に組み込んでトランスアシル化された化合物を形成するために、カルボキシペプチダーゼY（CPY）が特に適していること、並びに、該トランスアシル化された化合物は引き続き、PEG部分および前記第一の化合物の官能基とは反応するがGH中のアクセス可能な他の官能基とは反応しない１以上の官能基を含んでなるもう一つの化合物と反応され得ることを発見した。斯かる方法は、CPYのみがＣ末端における組み込みを触媒し、また二つの官能基は、それらが相互にのみ反応し且つGHにおいてアクセス可能な他の官能基とは反応しないように選択される点において、高度の特異性を提供する。この方法においては、PEG部分はＣ末端で結合するのみであり、官能基を選択することによってPEG部分の数を制御することができる。
【０１０５】
成長ホルモンの上記定義から、上記方法は、それ自身がＣ末端-XX-Ala配列を有するGHに対しても使用され得ることは明らかである。或いは、上記方法は、GHのC末端に-XX-Ala配列が結合される最初の工程を含む。これは、標準のタンパク質化学技術、例えばデノボ合成をし用意して行うことができる。或いは、標準の遺伝子加工技術を使用してGH-XX-Alaを製造してもよく、この場合、GH-XX-Alaをコードする核酸配列が適切なベクターの中に挿入され、該ベクターが適切なホスト細胞の中に導入され、該ホスト細胞が発酵されて、例えば該細胞の溶解の後に、発酵ブロスからのGH-XX-Alaの単離を可能にする。
【０１０６】
カルボキシペプチダーゼYは、分類群E.C.3.4.16.5に属する。該酵素により触媒されるインビボ反応は、Ｃ末端アミノ酸残基の加水分解である。該触媒サイクルの際には、酵素-基質複合体が形成され、これが正常なインビボ条件下で水分子による求核攻撃を受け、最終的にはペプチド結合の加水分解が導かれる。しかし、本発明の方法では求核試薬が添加され、これが求核体としての水と競合する。更に、反応を溶媒中または水性溶媒中で実行することによって、水活性は低下する。本発明の方法において、前記求核体は酵素-基質複合体を攻撃して、最終的にはトランスアシル化された化合物を形成する。求核剤であることに加えて、前記試薬はまた、接合されるべきペプチドにおいてアクセス可能でない１以上の官能基を具備しなければならない。
【０１０７】
CPYは、Ｃ末端の中に求核体を組み込むことができるために、ペプチドのアミノ酸配列に対する特別な要件を有する。CPYおよびGH-XX-Ala、特にGH-Leu-Alaの特定の組合せは、例えばCPYとGH-Alaの間の対応する反応において、GHに対する密接な関係を維持しながらより高い収率が得られる点において有利である。この側面は、GHがhGHを表すときに重要である可能性がある。天然のペプチドに対する密接な関係は、一般には、如何なる望ましくない後退発生のリスクをも最小化するので、天然ペプチドの変異体もしくは類似体の投与を含んでなる治療的介入についての利点と看做される。
【０１０８】
本発明の方法に従ってペプチドの中に組み込むことができる多くの求核性化合物が知られており、αアミノ酸は、このようなタイプの求核性化合物の一つである。しかし、本発明の目的にとっては、形成されるトランスアシル化された化合物がそれ自身では適用される酵素の基質ではないように、求核性化合物を選択するのが好ましい。別の言い方をすれば、何らかの更なる酵素反応を効果的に阻止する求核性化合物を適用するのが好ましい。カルボキシアミド化されたペプチドはカルボキシペプチダーゼの基質ではないので、このような化合物の一例は、αアミノ酸のアミドである。
【０１０９】
或る化合物が所定の酵素の基質であるか否かは、原理的に、その反応が生じる条件（例えば時間フレーム）に依存する。多くの化合物は、充分な時間が与えられれば実際には酵素の基質であるが、通常の条件ではそのようには看做されない。上記のように、トランスアシル化された化合物自身は酵素の基質であるべきでないと言うとき、それは、トランスアシル化された化合物自身は、本発明の方法におけるその後の反応が乱される範囲において該酵素の基質でないことを示すものである。トランスアシル化された化合物が実際に当該酵素のための基質であれば、該酵素は、例えば酵素阻害剤によって除去または不活性化され得る。
【０１１０】
一実施形態において、本発明はGH-XX-Alaを接合する方法であって、GH-XX-Alaを、カルボキシペプチダーゼY(CPY)の存在下に、次式で表されるα-アミノ酸である第一の化合物と反応させて、
【化６１】
2008531482.tif 000032
【０１１１】
次式のトランスアシル化された化合物を形成することを含んでなり、
【化６２】
2008531482.tif 000033
【０１１２】
該トランスアシル化されたペプチドは更に、1以上のステップで、式Y-E-PEGの第二の化合物と反応されて、次式の共役GHが形成される方法に関する：
【化６３】
2008531482.tif 000034
【０１１３】
ここで、
Gは、R-A-Eを表し、ここでのRはリンカーまたは結合を表し；Eはリンカーまたは結合を表し；AはXおよびYに含まれる官能基間の反応により形成された部分を表し；
GHは、成長ホルモン化合物を表し；
Xは、GHを構成するアミノ酸残基の中のアクセス可能でない官能基を含む基を表し；
Yは、Xの中に存在する官能基と反応し且つGH中のアクセス可能な官能基と反応しない1以上の官能基を含んでなる基を表し；
PEGは、ポリエチレングリコール部分を表し；
XXは、ヒスチジン、アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、チロシン、スレオニン、イソロイシン、トリプトファン、プロリンおよびバリンから選択されるアミノ酸残基を表す。
【０１１４】
更なる実施形態において、本発明は、上記で開示したようなGH-XX-Alaを接合する方法であって、更に、得られた接合体ペプチドを医薬組成物に製剤化する工程を含んでなる方法に関する。
【０１１５】
接合の後、該接合されたGH-XX-Alaは、当該技術において周知の技術により単離および精製されてよい。該接合されたペプチドは、適切であれば、医薬的に許容可能な塩またはプロドラッグに変換されてよい。
【０１１６】
一実施形態において、XXはLeuを表す。
【０１１７】
XおよびYの官能基間での反応において形成された部分Aは、原理的には、接合された最終ペプチドの如何なる性質が望ましいかに応じて、如何なる種類のものであってもよい。幾つかの状況においては、幾つかの後の段階で、例えば或る酵素作用によって、または光分解によって開裂され得る不安定な結合を有することが望ましいかもしれない。他の状況においては、安定な接合体ペプチドが得られるように、安定な結合を有するのが望ましいかもしれない。アミン誘導体およびカルボニル器の間の反応により形成された部分の種類、例えばオキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾンおよびセミカルバゾン部分が特に言及される。
【０１１８】
一実施形態において、官能基XおよびYは、カルボニル基、例えばケト基およびアルデヒド基）、並びにアミノ誘導体、例えば
ヒドラジン誘導体                        -NH-NH2、
カルボン酸ヒドラジン誘導体              -O-C(O)-NH-NH2、
セミカルバジド誘導体                    -NH-C(O)-NH-NH2、
チオセミカルバジド誘導体                -NH-C(S)-NH-NH2、
カルボン酸ジヒドラジド誘導体            -NHC(O)-NH-NH-C(O)-NH-NH2、
カルバジド誘導体                        -NH-NH-C(O)-NH-NH2、
チオカルバジド誘導体                    -NH-NH-C(S)-NH-NH2、
アリールヒドラジン誘導体                -NH-C(O)-C6H4-NH-NH2、および
ヒドラジド誘導体                        -C(O)-NH-NH2；
オキシルアミン誘導体、例えば-O-NH2、-C(O)-O-NH2、-NH-C(O)-O-NH2および-NH-C(S)-O-NH2である。
【０１１９】
もし、Xに含まれる官能基がカルボニル基であれば、Yに含まれる官能基はアミン誘導体であり、逆も同様である。殆どのペプチドにおける-NH2基の存在に起因して、Xがケト官能基またはアルデヒド官能基を含んでいれば、より良好な選択性が得られると思われる。
【０１２０】
XおよびYの適切な対のもう一つの例は、アジド誘導体（-N3）およびアルキンであり（逆も同様）、これらは反応してトリアゾール部分を形成する。
【０１２１】
XおよびYの適切な対のもう一つの例は、アルキンおよびニトロオキシドであり（逆も同様）、これらは反応してイソオキサゾリジン部分を形成する。
【０１２２】
XおよびYの適切な対のもう一つの例は、アルキンおよびハロアリールであり（逆も同様）、これらは反応してアラルキン部分を形成する。
【０１２３】
XおよびYの適切な対のもう一つの例は、アルキンおよびトリフルオロスルホン酸アリールであり（逆も同様）、これらは反応してアラルキン部分を形成する。
【０１２４】
特に、トランスアシル化されるべき基
【化６４】
2008531482.tif 000035
【０１２５】
は、2-アミノ-3-オキソ-ブチルアミド、2-アミノ-6-(4-オキソ-ペンタノイルアミノ)-ヘキサン酸アミド、2-アミノ-3-(2-オキソ-2-フェニル-エチルスルファニル)-プロピオンアミド、2-アミノ-5-オキソ-ヘキサン酸アミド、2-アミノ-3-オキソ-プロピオンアミド、2-アミノ-6-(4-アセチルベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド、(2S)-2-アミノ-3-[4-(2-オキソプロポキシ)フェニル]プロピオンアミド、(2S)-2-アミノ-3-[4-(2-オキソブトキシ)フェニル]プロピオンアミド、(2S)-2-アミノ-3-[4-(2-オキソペントキシ)フェニル]プロピオンアミド、(2S)-2-アミノ-3-[4-(4-オキソペントキシ)フェニル]プロピオンアミド、(2S)-2-アミノ-6-(4-オキソ-4-フェニルブチリルアミノ)ヘキサン酸アミド、(2S)-2-アミノ-6-(4-オキソ-4-(4-クロロフェニルブチリルアミノ)ヘキサン酸アミド、3-アセチル-N-((5S)-5-アミノ-5-カルバモイルペンチル)ベンズアミド、2-アセチル-N-((5S)-5-アミノ-5-カルバモイルペンチル)ベンズアミド、(2S)-2-アミノ-3-(4-(プロパ-2-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド、(S)-2-アミノペンタ-4-イン酸アミド、(2S)-2-アミノ-6-(3-(プロパ-2-イニル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド、(2S)-2-アミノ-6-(4-(プロパ-2-イニル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド、(2S)-2-アミノ-6-(2-(プロパ-2-イニル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド、(2S)-2-アミノ-3-[4-(1-オキソエチオキシ)フェニル)プロピオンアミド、およびS-フェニルアシルシステインアミドから選択されてよい。
【０１２６】
Y-E-PEGの特別の例には、下記のものが含まれる：
【化６５】
2008531482.tif 000036
【０１２７】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化６６】
2008531482.tif 000037
【０１２８】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化６７】
2008531482.tif 000038
【０１２９】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化６８】
2008531482.tif 000039
【０１３０】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化６９】
2008531482.tif 000040
【０１３１】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化７０】
2008531482.tif 000041
【０１３２】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化７１】
2008531482.tif 000042
【０１３３】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化７２】
2008531482.tif 000043
【０１３４】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化７３】
2008531482.tif 000044
【０１３５】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化７４】
2008531482.tif 000045
【０１３６】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化７５】
2008531482.tif 000046
【０１３７】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化７６】
2008531482.tif 000047
【０１３８】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化７７】
2008531482.tif 000048
【０１３９】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化７８】
2008531482.tif 000049
【０１４０】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化７９】
2008531482.tif 000050
【０１４１】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化８０】
2008531482.tif 000051
【０１４２】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化８１】
2008531482.tif 000052
【０１４３】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化８２】
2008531482.tif 000053
【０１４４】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化８３】
2008531482.tif 000054
【０１４５】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化８４】
2008531482.tif 000055
【０１４６】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化８５】
2008531482.tif 000056
【０１４７】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化８６】
2008531482.tif 000057
【０１４８】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化８７】
2008531482.tif 000058
【０１４９】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化８８】
2008531482.tif 000059
【０１５０】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化８９】
2008531482.tif 000060
【０１５１】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化９０】
2008531482.tif 000061
【０１５２】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化９１】
2008531482.tif 000062
【０１５３】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化９２】
2008531482.tif 000063
【０１５４】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化９３】
2008531482.tif 000064
【０１５５】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化９４】
2008531482.tif 000065
【０１５６】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化９５】
2008531482.tif 000066
【０１５７】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化９６】
2008531482.tif 000067
【０１５８】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化９７】
2008531482.tif 000068
【０１５９】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化９８】
2008531482.tif 000069
【０１６０】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化９９】
2008531482.tif 000070
【０１６１】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１００】
2008531482.tif 000071
【０１６２】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１０１】
2008531482.tif 000072
【０１６３】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１０２】
2008531482.tif 000073
【０１６４】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１０３】
2008531482.tif 000074
【０１６５】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１０４】
2008531482.tif 000075
【０１６６】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１０５】
2008531482.tif 000076
【０１６７】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１０６】
2008531482.tif 000077
【０１６８】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１０７】
2008531482.tif 000078
【０１６９】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１０８】
2008531482.tif 000079
【０１７０】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１０９】
2008531482.tif 000080
【０１７１】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１１０】
2008531482.tif 000081
【０１７２】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１１１】
2008531482.tif 000082
【０１７３】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１１２】
2008531482.tif 000083
【０１７４】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１１３】
2008531482.tif 000084
【０１７５】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１１４】
2008531482.tif 000085
【０１７６】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１１５】
2008531482.tif 000086
【０１７７】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１１６】
2008531482.tif 000087
【０１７８】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１１７】
2008531482.tif 000088
【０１７９】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１１８】
2008531482.tif 000089
【０１８０】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１１９】
2008531482.tif 000090
【０１８１】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１２０】
2008531482.tif 000091
【０１８２】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１２１】
2008531482.tif 000092
【０１８３】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
【化１２２】
2008531482.tif 000093
【０１８４】
ここで、mPEGは約10 kDa、約20 kDa、約30 kDaまたは約40 kDaの分子量を有する；
一実施形態において、本発明は、本発明の方法に従う接合に適した成長ホルモン化合物、即ち、式GH-XX-Alaの化合物であって、XXがヒスチジン、アスパラギン酸、アルギニン、フェニルアラニン、アラニン、グリシン、グルタミン、グルタミン酸、リジン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、セリン、チロシン、スレオニン、イソロイシン、トリプトファン、プロリンおよびバリンから選択されるアミノ酸残基を表す化合物に関する。特に、hGH-Leu-Alaが言及される。
【０１８５】
＜医薬組成物＞
別の目的は、本発明による接合型GHを含む医薬組成物を提供することであり、該接合型GHは、10-15 mg/mLから200 mg/mL、例えば10-10 mg/mLから5 mg/mLの濃度で存在し、前記組成物は、2.0から10.0のpHを有している。該組成物は更に、緩衝系、防腐剤、張性剤(tonicity agent)、キレート剤、安定剤および界面活性剤を含んでよい。本発明による一実施形態において、当該医薬組成物は水性組成物、即ち、水を含む組成物である。そのような組成物は、典型的には溶液または懸濁液である。本発明の更なる実施形態において、当該医薬組成物は水溶液である。「水性組成物」の用語は、少なくとも50％w/wの水を含む組成物として定義される。同様に、「水溶液」とは、少なくとも50％w/wの水を含む溶液と定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも50％w/wの水を含む懸濁液と定義される。
【０１８６】
もう一つの実施形態において、当該医薬組成物は凍結乾燥組成物であり、使用に先立って、医師または患者がこれに溶剤および/または希釈剤を加える。
【０１８７】
もう一つの実施形態において、当該医薬組成物は、予め溶解する必要がなく直ちに使用できる乾燥組成物（例えば凍結乾燥または噴霧乾燥されたもの）である。
【０１８８】
更なる側面において、本発明は、GH接合体の水溶液および緩衝剤を含む医薬組成物に関し、該GH接合体は、0.1〜100 mg/mLまたはそれを超える濃度で存在し、該組成物は、約2.0から約10.0のpHを有する。
【０１８９】
本発明のもう一つの実施形態において、当該処方剤のpHは、2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.1、5.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9.0、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9および10.0からなる群から選択される値を有する。
【０１９０】
更なる実施形態において、本発明の緩衝された医薬組成物における緩衝剤は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム、トリス（ヒドロキシメチル）-アミノメタン（TRIS）、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、およびアスパラギン酸からなる群から選択される１以上の緩衝剤を含有してよい。これらの特定の緩衝剤の各々が、本発明の代替的実施形態を構成する。
【０１９１】
本発明のもう一つの実施形態において、本発明の医薬組成物は、医薬的に許容され得る保存剤、例えば、フェノール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸メチル、p-ヒドロキシ安息香酸プロピル、2-フェノキシエタノール、p-ヒドロキシ安息香酸ブチル、2-フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チメロサール、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、p-ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、およびクロロフェネシン（3p-クロロフェノキシプロパン-1,2-ジオール）からなる群から選択される1以上の保存剤を含有してよい。これらの特定保存剤の各々が、本発明の代替的実施形態を構成する。本発明の更なる実施形態において、保存剤は、0.1 mg/mL〜20 mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる実施形態において、保存剤は0.1〜5 mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる実施形態において、保存剤は5〜10 mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる実施形態において、保存剤は10 mg/mL〜20 mg/mLの濃度で存在する。医薬組成物中に保存剤を使用することは当業者に周知である。便宜のために、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版（2000年発行）が参照される。
【０１９２】
本発明の更なる実施形態において、当該処方剤は更に等張化剤を含有する。本発明の更に或る実施形態において、この等張化剤は、塩（例えば、塩化ナトリウム）、糖または糖アルコール、アミノ酸（例えば、L-グリシン、L-ヒスチジン、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニン）、アルジトール（例えば、グリセロール（グリセリン）、1,2-プロパンジオール（プロピレングリコール）、1,3-プロパンジオール、1,3-ブタンジオール）、ポリエチレングリコール（例えば、PEG400）、またはそれらの混合物からなる群から選択される。単糖、二糖または多糖のような糖または水溶性グルカン、例えばフルクトース、グルコース、マンノース、ソルボース、キシロース、マルトース、ラクトース、スクロース、トレハロース、デキストラン、プルラン、デキストリン、シクロデキストリン、可溶性デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、またはカルボキシメチルセルロース-Naを用いてよい。一実施形態において、糖添加剤はスクロースである。糖アルコールは、少なくとも一つの-OH基を有するC4〜C8炭化水素として定義され、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシトール、ガラクシトール、ズルシトール、キシリトール、およびアラビトールが含まれる。一実施形態において、用いられる糖アルコーはマンニトールである。上記で述べた糖または糖アルコールは、個別にまたは組み合わせて使用してよい。糖または糖アルコールが液体組成物（処方剤）中に可溶性であり、また本発明の方法により達成される安定化効果に悪影響を与えない限り、使用される量に固定的な限界は存在しない。一つの実施形態において、糖または糖アルコールの濃度は約1 mg/mL〜約150 mg/mLである。
【０１９３】
更なる実施形態において、等張剤の濃度は、1 mg/mL〜150 mg/mLの濃度である。本発明の更なる実施形態において、等張剤は1 mg/mL〜50 mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる実施形態において、等張剤は1 mg/mL〜7 mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる実施形態において、等張剤は8 mg/mL〜24 mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる実施形態において、等張剤は25 mg/mL〜50 mg/mLの濃度で存在する。これら特定の等張剤の各々が、本発明の代替的実施形態を構成する。医薬組成物中における等張剤の使用は、当業者に周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版（20000年発行）が参照される。
【０１９４】
本発明の更なる実施形態において、当該組成物は更にキレート化剤を含有する。本発明の更なる実施形態において、該キレート化剤は、エチレンジアミン四酢酸（EDTA）、クエン酸、アスパラギン酸の塩、およびそれらの混合物から選択される。本発明の更なる実施形態において、キレート化剤は0.1 mg/mL〜5 mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる実施形態において、キレート化剤は0.1 mg/mL〜2 mg/mLの濃度で存在する。本発明の更なる実施形態において、キレート化剤は2 mg/mL〜5 mg/mLの濃度で存在する。これら特定のキレート化剤の各々が本発明の代替的実施形態を構成する。医薬組成物中におけるキレート化剤の使用は当業者に周知である。便宜のために、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版（2000年発行）が参照される。
【０１９５】
本発明の更なる実施形態において、本発明の組成物（処方剤）は更に安定化剤を含有する。医薬組成物中における安定化剤の使用は、当業者に周知である。便宜のために、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版（2000年発行）が参照される。
【０１９６】
本発明の更なる実施形態において、当該組成物は更に安定化剤を含有する。医薬組成物における安定化剤の使用は当業者に周知である。便宜のために、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版（2000年発行）が参照される。
【０１９７】
特に、本発明の組成物は、安定化された液体医薬組成物であり、その治療的活性成分には、液体医薬処方剤中での保存の際に凝集物形成を示す可能性のあるポリペプチドが含まれる。「凝集物形成」とは、オリゴペプチドまたはポリペプチド分子の間の物理的相互作用による、可溶性のまま残り得るオリゴマー、または溶液から沈殿する目にみえる大きな凝集物の形成を意味する。「保存の際」の用語は、調製された液体医薬組成物または組成物が、直ちに患者に投与されないことを言うものである。むしろ、調製された後、保存のために、液体形態、凍結状態、または後で患者に投与するのに適した液体形態または他の形態に再構成するための乾燥粉末の形態で包装される。「乾燥形態」とは、液体医薬組成物または組成物が、凍結乾燥（例えば、WilliamsおよびPolli, J. Parenteral Sci. Technol., 38:48-59(1984)参照）、噴霧乾燥（Masters, Spray-Drying Handbook, 第5版, pp. 491-676, 英国Essezに所在のLongman Scientific and Technical(1991年)発行；Broadheadら, Drug Devel. Ind. Pharm., 18:1169-1206(1992)；Mumenthalerら，Pharm. Res., 11:12-20(1994)参照））、または風乾（CarpenterおよびCrowe, Cryobiology, 25:459-470(1988)；Roser, Biopharm., 4:47-53(1991)）によって乾燥されることを意図する。液体医薬組成物の保存の際のタンパク質による凝集物形成は、当該タンパク質の生物学的活性に悪影響を及ぼし、医薬組成物の治療効果の低下をもたらす可能性がある。更に、凝集物形成は、注入システムを用いて当該タンパク質含有医薬組成物を投与するときに、管、膜またはポンプの閉塞のような他の問題を引き起こすことがある。
【０１９８】
本発明の医薬組成物は更に、当該組成物の保存中に、タンパク質による凝集物形成を低下させるのに十分な量のアミノ酸塩基を含み得る。「アミノ酸塩基」は、所定のアミノ酸が遊離塩基または塩の形態で存在する、アミノ酸またはその組合せを意味する。アミノ酸の組合せを使用するとき、全てのアミノ酸が遊離塩基状態で存在していても、全てが塩の形態で存在していても、一部が遊離塩基の形態で存在し且つ他が塩の形態で存在していてもよい。一つの実施形態において、本発明の組成物を製造する際に使用されるアミノ酸は帯電した側鎖を有するもの、例えばアルギニン、リシン、アスパラギン酸およびグルタミン酸である。特定アミノ酸（例えば、グリシン、メチオニン、ヒスチジン、イミダゾール、アルギニン、リシン、イソロイシン、アスパラギン酸、トリプトファン、スレオニンおよびその混合物）が遊離塩基または塩の形態で存在している限り、本発明の医薬組成物中には、前記特定アミノ酸の立体異性体（すなわち、L、DまたはDL異性体）および前記異性体の組合せが存在していてもよい。一つの実施形態では、アミノ酸のL-立体異性体が使用される。本発明の組成物は、これらアミノ酸のアナログを用いて調製されてもよい。「アミノ酸アナログ」とは、本発明の液体医薬組成物の保存の際に、ポリペプチドによる凝集物形成を低下させる望ましい効果をもたらす天然アミノ酸の誘導体を意味する。適当なアルギニンアナログには、例えばアミノグアニジン、オルニチンおよびN-モノエチル-L-アルギニンが含まれる。適当なメチオニンアナログには、エチオニンおよびブチオニンが含まれ、また適当なシステインアナログには、S-メチル-L-システインが含まれる。他のアミノ酸の場合と同様に、該アミノ酸アナログは、遊離塩基または塩の形態で組成物中に配合される。本発明の更なる実施形態において、アミノ酸またはアミノ酸アナログは、タンパク質の凝集を防止または遅延させるのに十分な濃度で使用される。
【０１９９】
本発明の更なる実施形態において、治療薬として作用するタンパク質がメチオニンスルホキシドへの酸化を受けやすいメチオニン残基を少なくとも１個含むポリペプチドのときには、前記メチオニン残基のメチオニンスルホキシドへの酸化を抑制するために、メチオニン（または、他の硫黄含有アミノ酸またはアミノ酸アナログ）を添加してもよい。この文脈における「抑制」の用語は、メチオニン酸化種の経時的蓄積を最小化することを意味する。メチオニン酸化を抑制すると、適正な分子形態で保持されるタンパク質の増大をもたらす。メチオニンの全ての立体異性体（L、DまたはDL異性体）またはその組合せを使用することができる。添加量は、メチオニンスルホキシドの量が規制当局に許容され得るように、メチオニン残基の酸化を抑制するのに十分な量でなければならない。典型的には、これは、当該組成物が約10％〜約30％以下のメチオニンスルホキシドしか含有しないことを意味する。これは一般に、添加されるメチオニン：メチオニン残基の比が約1：1〜約1000：1（例えば、約10：1〜約100：1）であるように、メチオニンを添加することによって達成することができる。
【０２００】
本発明の更なる実施形態において、当該組成物は更に、高分子量ポリマーまたは低分子量化合物からなる群から選択される安定化剤を含有する。本発明の更なる実施形態において、該安定化剤は、ポリエチレングリコール（例えば、PEG3350）、ポリビニルアルコール（PVA）、ポリビニルピロリドン、カルボキシ／ヒドロキシセルロースまたはその誘導体（例えば、HPC、HPC-SL、HPC-LおよびHPMC）、シクロデキストリン、硫黄含有物質（例えば、モノチオグリセロール、チオグリコール酸および2-メチルチオエタノール）および種々の塩（例えば、塩化ナトリウム）のような物質から選択される。これら特定の安定剤の各々が、本発明の実施形態を構成する。
【０２０１】
本発明の医薬組成物はまた、その中の治療的活性タンパク質の安定性を更に高める追加安定化剤を含有してもよい。本発明にとって特に興味深い安定化剤には、該タンパク質をメチオニン酸化から保護するメチオニンおよびEDTA、並びにタンパク質を凍結融解または機械的剪断に付随する凝集から保護する非イオン性界面活性剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２０２】
本発明の更なる実施形態において、当該組成物は更に、界面活性剤を含有する。本発明の更なる実施形態において、前記表面活性剤は、エトキシル化ヒマシ油、ポリグリコール化グリセリド、アセチル化モノグリセリド、ソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレンブロックポリマー（例えば、プルロニック（登録商標）F68、ポロキサマー188および407、トリトンX-100のようなポロキサマー）；ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ポリオキシエチレンおよびポリエチレン誘導体（例えば、アルキル化およびアルコキシル化誘導体（例：ツイーン-20、ツイーン-40、ツイーン-80およびBrij-35のようなツイーン）；モノグリセリドまたはそのエトキシル化誘導体、ジグリセリドまたはそのポリオキシエチレン誘導体、アルコール、グリセロール、レクチンおよびリン脂質（例えば、ホスファチジルセリン，ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロールおよびスフィングミエリン）；リン脂質誘導体（例えば、ジパルミトイルホスファチジン酸）およびリソホスホ脂質誘導体（例えば、パルミトイルリソホスファチジル-L-セリンおよびエタノールアミン、コリン、セリンまたはスレオニンの1-アシル-sn-グリセロ-3-ホスフェートエストル）；リソホスファチジルおよびホスファチジルコリンのアルキル、アルキルエステルおよびアルキルエーテル誘導体、例えば、リソファチジルコリンのラウロイルおよびミリストイル誘導体、ジパルミトイルホスファチジルコリン、並びにコリン、エタノールアミン、ホスファチジン酸、セリン、スレオニン、グリセロール、イノシトールである極性頭基の修飾物、正帯電したDODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、リソファチジルセリンおよびリソファチジルスレオニン；グリセロリン脂質（例えば、セファリン）；グリセロ糖脂質（例えば、ガラクトピラノシド）、スフィンゴ糖脂質（例えば、セラミド、ガングリオシド）；ドデシルホスホコリン；ニワトリ卵リソレシチン；フシジン酸誘導体（例えば、タウロ−ジヒドロフシジン酸ナトリウム等）；長鎖脂肪酸（例えば、オレイン酸およびカプリル酸）およびその塩；アシルカルニチンおよび誘導体；リシン、アルギニンまたはヒスチジンのNα-アシル化誘導体、リシンまたはアルギニンの側鎖アシル化誘導体；リシン、アルギニンまたはヒスチジンおよび中性または酸性アミノ酸の組合せからなるジペプチドのNα-アシル化誘導体；中性アミノ酸と２つの帯電アミノ酸の組合せからなるトリペプチドのNα-アシル化誘導体；DSS（ドクサートナトリウム、CAS登録番号[577-11-7]）、ドクサートカルシウム（CAS登録番号[128-49-4]）、ドクサートカリウム（CAS登録番号[7491-09-0]）；SDS（ドデシル硫酸ナトリウムまたはラウリル硫酸ナトリウム）；カプリル酸ナトリウム；コール酸またはその誘導体；胆汁酸およびその塩；並びにグリシンまたはタウリンコンジュゲート；ウルソデオキシコール酸、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、タウロコール酸ナトリウム、グリココール酸ナトリウム、N-ヘキサデシル-N,N-ジメチル-3-アンモニオ-1-プロパンスルホネート；アニオン性（アルキル-アリール-スルホネート）１価界面活性剤；双イオン性界面活性剤（例えば、N-アルキル-N,N-ジメルアンモニオ-1-プロパンスルホンネート、3-コールアミド-1-プロピルジメチルアンモニオ-1-プロパンスルホネート）；カチオン性界面活性剤（第４級アンモニウム塩基）（例えば、臭化セチルトリメチルアンモニウム、塩化セチルピリジニウム）；非イオン性界面活性剤（例えば、ドデシルβ-D-グルコピラノシド）；プロピレンオキシドおよびエチレンオキシドをエチレンジアミンに順次添加することにより誘導される四官能性ブロックコポリマーであるポロキサマー（例えば、Tetronic’s）から選択される。或いは、表面活性剤は、イミダゾリン誘導体類およびその混合物から選択されてもよい。これら特定の表面活性剤の各々が、本発明の代替的実施形態を構成する。
【０２０３】
医薬組成物中における界面活性剤の使用は当業者に周知である。便宜上、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 第20版（2000年発行）が参照される。
【０２０４】
本発明の医薬組成物の中には、他の成分を存在させてもよい。このような追加の成分には、例えば、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、増量剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチンまたは他のタンパク質）および双イオン種（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リシンおよびヒスチジンのようなアミノ酸）が含まれてよい。勿論、このような追加の成分は、本発明の医薬組成物の全体的な安定性に悪影響を及ぼしてはならない。
【０２０５】
本発明に従うGH接合体を含有する医薬組成物は、治療を要する患者に対して複数の部位に、例えば局所部位（例：皮膚および粘膜部位）、吸収をバイパスする部位（例えば動脈内、静脈内、心臓内）、および吸収を伴う部位（例えば、皮膚内、皮膚下、筋肉内または腹部内）に投与され得る。
【０２０６】
本発明の医薬組成物の投与は、幾つかの投与ルートを介して、例えば、舌、舌下、バッカル、口内、経口、胃および腸内、鼻、肺（例えば、細気管支および肺胞を介して）またはその組合せ、表皮、真皮、経皮、経膣、直腸、眼（例えば、結膜を介して）、尿管を介して、および非経腸的に、このような治療を必要としている患者に対してなされ得る。
【０２０７】
本発明の組成物は幾つかの剤形で、例えば溶液剤、懸濁液剤、エマルジョン剤、マイクロエマルジョン剤、複合エマルジョン剤、泡剤、膏薬、ペースト剤、硬膏剤、軟膏剤、錠剤、被覆錠剤、リンス剤、カプセル剤（例えば、硬カプセル剤および軟カプセル剤）、座剤、直腸カプセル剤、ドロップ、ゲル剤、スプレー剤、散剤、エアゾル剤、吸入剤、点眼剤、眼軟膏剤、眼リンス剤、膣ペッサリー、膣リング、膣軟膏、注射用溶液、現場変換（例えば、現場ゲル化、現場硬化、現場沈殿、現場結晶化）溶液、輸液溶液およびインプラントとして投与されてよい。
【０２０８】
本発明の組成物は、本発明の組成物の安定性を更に高めるため、生体利用性を向上させるため、溶解度を増加させるため、副作用を減らすため、当業者に既知の時間療法を達成するため、および患者のコンプライアンスを高めるため、またはその組合せのために、例えば共有結合、疎水性結合および静電的相互作用を介して、薬物担体、ドラッグデリバリーシステムおよび高度ドラッグデリバリーシステムに混合させるか、または結合させてもよい。担体、ドラッグデリバリーシステムおよび高度ドラッグデリバリーシステムの例には、ポリマー、例えばセルロースおよびその誘導体；多糖、例えば、デキストランおよびその誘導体、並びにデンプンおよびその誘導体；ポリ（ビニルアルコール）；アクリレートおよびメタクリレートポリマー；ポリ乳酸およびポリグリコール酸、並びにそれらのブロックコポリマー；ポリエチレングリコール；キャリアタンパク質、例えばアルブミン；ゲル、例えば当業者に公知のブロックコポリマー系のような熱ゲル化系；ミセル；リポソーム；ミクロスフェア；ナノ粒子；液晶およびその分散液；脂質−水系での相挙動の当業者に既知のＬ２相およびその分散液；ポリマーミセル；複合エマルジョン（自己乳化・自己ミクロ乳化）；シクロデキストリンおよびその誘導体；並びにデンドリマーが含まれるが、これらに限定されない。
【０２０９】
本発明の組成物は、例えば、全て当業者に既知のデバイスである計量吸入器、乾燥粉末吸入器およびネブライザーを用いてGH接合体を肺投与するための、固体、半固体、粉末および液体の組成物において有用である。
【０２１０】
本発明の組成物は、制御放出、持続放出、延長放出、遅延放出および徐放ドラッグデリバリーシステムの製剤において特に有用である。即ち、限定するものではないが、該組成物は、当業者に周知の非経腸的な制御放出系および持続放出系の組成物において有用である（両方の系は共に、必要な投与回数を何分の１かに減らすことができる）。特に有用なのは、皮下投与される制御放出系および徐放系である。本発明の範囲を限定するものではないが、有用な制御放出系および組成物の例は、ヒドロゲル、油性ゲル、液晶、ポリマーミセル、ミクロスフェア、またはナノ粒子である。
【０２１１】
本発明の組成物のために有用な制御放出系を製造する方法には、結晶化、凝縮、共結晶化、沈殿、共沈殿、乳化、分散、高圧均質化、カプセル化、噴霧乾燥、マイクロカプセル化、コアセルベーション、相分離、ミクロスフェアを生成するための溶媒蒸発、押し出しおよび超臨界流動プロセスが含まれるが、これらに限定されない。一般的には、Handbook of Pharmaceutical Controlled Release（Wise, D.L., ed. Marcel Dekker, New York, 2000）およびDrug and the Pharmaceutical Sciences, 99巻: Protein Formulation and Delivery（MacNally, E.J., ed. Marcel Dekker, New York, 2000）を参照されたい。
【０２１２】
非経腸的投与は、注射器、場合によってはペン様注射器を用いて皮下、筋肉内、腹腔内または静脈内投与により実施されてよい。或いは、非経腸的投与は輸液ポンプによって実施されてよい。更なるオプションは、鼻または肺スプレーの形態の液体（典型的には水）溶液または懸濁液である本発明の組成物の投与である。更なるオプションとして、本発明のGH接合体を含有する医薬組成物は、経皮投与（例えば無針注射によるか、またはイオン泳動パッチ等のパッチを介して）または経粘膜投与（例えば、バッカル投与）に適合させることができる。
【０２１３】
「安定化された組成物」の用語は、高い物理的安定性、高い化学的安定性または高い物理的／化学的安定性を有する処方剤を意味する。
【０２１４】
タンパク質組成物の「物理的安定性」の用語は、タンパク質を熱−機械的ストレスおよび／または不安定化させる界面および表面（例えば、疎水性表面および界面）に曝した結果として、前記ペプチドが生物学的に不活性および／または不溶性の凝集物を形成する傾向を意味する。水性タンパク質組成物の物理的安定性は、適切な容器（例えば、カートリッジまたはバイアル）に充填した組成物を異なる温度で異なる期間だけ機械的／物理的ストレス（例えば、撹拌）にかけた後に、目視検査および／または濁度の測定により評価される。組成物の目視検査は、暗背景で鮮明に焦点を合わせた光を用いて実施する。組成物の濁度は、濁度を例えば０〜３のスケールでランク付けする視覚スコアによって特徴付けられる（濁度を示さない処方剤は視覚スコア０に相当し、昼間光で濁りが見える処方剤は視覚スコア３に相当する）。昼間光で濁りが見えるときは、該処方剤は凝集に関して物理的に不安定と分類される。或いは、当業者に周知の簡単な濁度測定によって、処方剤の濁度を評価することができる。水性タンパク質組成物の物理的安定性は、該ペプチドの立体配座状態についての分光剤またはプローブを用いて評価することもできる。該プローブは、好ましくは、前記タンパク質の非天然コンフォーマーに優先的に結合する小分子である。このような小分子分光プローブの一例は、チオフラビンＴである。チオフラビンＴは、アミロイドフィブリルを検出するために広く使用されている蛍光染料である。フィブリルの存在下において、且つおそらくは他の構造の存在下において、チオフラビンＴは約450 nmでの新たな最大励起を生じ、フィブリル形態に結合しているときには約482 nmでの増大した発光を生ずる。非結合型のチオフラビンＴは、問題の波長において本質的に非蛍光性である。
【０２１５】
天然状態から非天然状態へのペプチド構造の変化のプローブとして、他の小分子を使用することができる。例えば、タンパク質の露出した疎水性パッチに優先的に結合する「疎水性パッチ」プローブである。この疎水性パッチは、通常は天然状態のタンパク質の３次構造内に埋まっているが、タンパク質が折畳み解除され、または変性し始めると露出されるようになる。このような小分子分光プローブの例は、芳香族疎水性染料、例えば、アントラセン、アクリジン、フェナントロリン等である。他の分光プローブは、金属-アミノ酸錯体、例えば疎水性アミノ酸（例：フェニルアラニン、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、バリン等）のコバルト錯体である。
【０２１６】
ここで使用されるタンパク質組成物の「化学的安定性」の用語は、タンパク質構造における化学的共有結合の変化を意味し、この変化により、元の分子に比較して潜在的に低い生物学的力価および／または潜在的に高い免疫原性を有する化学的分解産物が形成される。出発分子の種類および性質、並びに該分子が曝される環境に応じて種々の化学的分解産物が形成され得る。化学的分解の排除はおそらく完全には避けることができず、当業者に周知のように、タンパク質組成物の保存および使用の際に、徐々に増大する量の化学分解産物がしばしば見られる。殆どのタンパク質は脱アミド化、即ち、グルタミンまたはアスパラギン残基中の側鎖アミド基が加水分解されて遊離カルボン酸を形成するプロセスと受け易い。他の分解経路には、出発物質の２以上の分子がトランスアミド化および／またはジスルフィド相互作用により相互に共有結合して、共有結合したダイマー、オリゴマーおよびポリマー分解産物が形成される、より高分子量の変換生成物の形成が含まれる（Stability of Protein Pharmaceuticals, Ahern. T.J. & Manning M.C., Plenum Press, New York 1992参照）。化学分解のもう一つの変形例として、（例えば、メチオニン残基の）酸化が挙げられる。タンパク質組成物の化学安定性は、異なる環境条件に曝した後の異なる時点での化学分解産物の量を測定することによって評価され得る（分解産物の形成は、例えば温度を上昇させることにより加速され得る）。各分解産物の量は、屡々、各種クロマトグラフィー技術（例えば、SEC-HPLCおよび／またはRP-HPLC）を使用して、分子サイズおよび／または電荷に応じて分解産物を分離することにより決定される。
【０２１７】
従って、上記で概説したように、「安定化組成物」とは、増大した物理的安定性、増大した化学的安定性、または増大した物理的／化学的安定性を有する組成物を意味する。通常、組成物は有効期限が切れるまで、使用および保存（推奨される使用および保存条件に合致して）に際して安定でなければならない。
【０２１８】
本発明の一実施形態において、GH接合体を含有する医薬組成物は、６週間以上の使用、および３年間以上の保存において安定である。
【０２１９】
本発明のもう一つの実施形態において、GH接合体を含有する医薬組成物は、４週間以上の使用、および３年間以上の保存において安定である。
【０２２０】
本発明の更なる実施形態において、GH接合体を含有する医薬組成物は、４週間以上の使用および２年間以上の保存において安定である。
【０２２１】
本発明の更なる実施形態において、GH接合体を含有する医薬組成物は、２週間以上の使用および２年間以上の保存において安定である。
【０２２２】
ここに引用された刊行物、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、あたかも各参考文献が個別に且つ具体的にここで援用を指示され、且つその全体がここに記載されたかのように、（法により許容される最大範囲で）それらの全体が本明細書の一部として本願に援用される。
【０２２３】
見出しおよび副見出しは、ここでは便宜的にのみ使用されるもであり、如何なる意味でも本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【０２２４】
本明細書において、何れかおよび全ての例、または例示的文言（例えば「のような」）の使用は、単に本発明をより良く例示することを意図したものであり、特に指示しない限り、本発明の範囲に対して限定を課するものではない。本明細書中の文言は、特許請求の範囲に記載されていない如何なる要素も、本発明の実施に不可欠であることを示しているように解釈されるべきではない。
【０２２５】
ここでの特許文献の引用および援用は、便宜的にのみなされるものであり、このような特許書類の有効性、特許可能性および／または強制執行能力の如何なる側面をも反映するものではない。
【０２２６】
本発明は、適用可能な法が許容する限り、特許請求の範囲に記載された主題の全ての変形例および均等物を含むものである。
【実施例】
【０２２７】
HPLC-法：
方法02-B1-2：
RP-分析を、Waters 2487 デュアルバンド検出器を備えたAlliance Waters 2695系を用いて行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、Symmetry300 C18, 5um, 3.9mm x 150mmカラム、42℃で収集した。化合物は、0.05％トリフルオロ酢酸で緩衝される水中の0〜60％アセトニトリルの線状の勾配を用いて、15分に亘り流速1.0分／分で溶出される。
【０２２８】
方法02-B4-4：
RP-分析を、Waters 2487 デュアルバンド検出器を備えたAlliance Waters 2695系を用いて行った。214nmおよび254nmでのUV検出を、Symmetry300 C18, 5um, 3.9mm x 150mmカラム、42℃で収集した。化合物は、0.05％トリフルオロ酢酸で緩衝される水中の5〜95％アセトニトリルの線状の勾配を用いて、15分に亘り流速1.0分／分で溶出される。
【０２２９】
方法03-B1-1：
RP-分析を、Waters 996 ダイオードアレイを備えたAlliance Waters 2690系を用いて行った。UV検出を、42℃において1mL/分で溶出する218TP54 4.6mm x 250mm 5μ C-18シリカカラム(The Seperations Group, Hesperia)において、214, 254, 276, および301nmで収集した。カラムは、5％アセトニトリルを用いて均衡され、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液中の0.1％トリフルオロ酢酸で緩衝された。注入後、試料は、0.1％トリフルオロ酢酸水溶液中の0.1％トリフルオロ酢酸で緩衝される0％〜90％アセトニトリルの勾配により、50分に亘り溶出された。
【０２３０】
ペプチドについての質量スペクトルは、500〜1800Daの領域においてはAgilent 1100シリーズで、または500〜2000Daの領域においてはPerkin Elmer PE API 100で得られた。典型的には、m/zについて見出された信号は、z＝1, 2, 3, 4, 5, または6のいずれかのシリーズに対応する。MALDI-TOFスペクトルはBruker Daltonix autoflexで得られた。
【０２３１】
次の略語が用いられる：
【化１２３】
2008531482.tif 000094
DMSO：ジメチルスルホキシド
CHCA：4-ヒドロキシ-アルファ-シアノ桂皮酸
【化１２４】
2008531482.tif 000095
CPY：カルボキシペプチダーゼＹ
PMSF：フェニルメタンスルホニルフッ化物。
【０２３２】
トランスアシル化化合物、例えば式：
【化１２５】
2008531482.tif 000096
の化合物、およびその接合部分Y-E-PEGは、商業的に入手されるか、後述する一般方法において以下のガイドラインに従って合成されてよい。
【０２３３】
一般方法(A)：
一般式:
【化１２６】
2008531482.tif 000097
の化合物（式中、R'およびR''は独立にC1-15アルキレン、C2-15アルケニレン、C2-15アルキニレン、C1-15ヘテロアルキレン、C2-15ヘテロアルケニレン、C2-15ヘテロアルキニレンを表し、ここで１以上のホモ環式芳香族化合物ビラジカルまたはヘテロ環式化合物ビラジカルが挿入されてよい）は、
適切なアミノ酸メチルエステル：
【化１２７】
2008531482.tif 000098
（文献［例えばT. W. Greene, P. G. M. WutsZ, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York］に記載されるように適切な保護基PGによりα-アミノ基で保護化されたもの）
から、アシル化方法により調製され、
該アシル化方法では、適切な酸：
【化１２８】
2008531482.tif 000099
（例えば、文献(例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York)に記載されるように、Xが適切な保護基により保護されるか、または保護されずともよい）
と、例えばカルボジイミド（例えばジイソプロピルカルボジイミドまたは1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩）と組合わせたカップリング試薬（例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシベンゾトリアジン-4-オンまたは7-アザベンゾトリアゾール）とを、適切な塩基（例えばトリエチルアミンまたはエチルジイソプロピルアミン）の存在中で用いて、次式のタイプのエステルを形成する：
【化１２９】
2008531482.tif 000100
該エステルは、適切な溶媒または溶媒の混合物（例えば水またはN,N-ジメチルホルムアミド）の中で、例えばアンモニアとの反応により、対応するアミドに変換され得る：
【化１３０】
2008531482.tif 000101
全ての保護基の除去は、文献(例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York)に記載された方法により、１または複数の工程において行われ得る：
【化１３１】
2008531482.tif 000102
アミノ酸メチルエステルは一般的に商業的に入手可能であるか、よく知られた方法により合成されてよい。
【０２３４】
一般方法(B)：
一般式：
【化１３２】
2008531482.tif 000103
の化合物（式中、R'およびR''は上記で定義された通りである）は、
適切なアミノ酸メチルエステル：
【化１３３】
2008531482.tif 000104
（文献［例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protectivegroups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York］に記載の通り、α-アミノ基において適切な保護基 PGにより保護される）
から、適切なアルコール：
【化１３４】
2008531482.tif 000105
（式中Xは、文献［例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York］に記載の通りに適切な保護基により保護されてもよく、保護されなくてもよい）
を用いて芳香族ヒドロキシル基をアルキル化することにより調製してよく、
該アルキル化は文献に記載の通りに、例えばトリフェニルホスフィンおよびアゾジカルボン酸エチルのような例えばMitsunobu条件下で行われ、次式のタイプのエステルを形成する：
【化１３５】
2008531482.tif 000106
前記エステルは、例えば水もしくはN,N-ジメチルホルムアミドのような適切な溶媒、または溶媒混合物中において、例えばアンモニアとの反応により、対応するアミドに変換され得る：
【化１３６】
2008531482.tif 000107
全ての保護基の除去は、文献記載の方法による１又は複数のステップで行われ得る(例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York)。
【化１３７】
2008531482.tif 000108
一般方法(C)：
一般式の化合物：
【化１３８】
2008531482.tif 000109
（式中、R'およびR''は上記で定義された通りである）
は、適切なアミノ酸メチルエステル：
【化１３９】
2008531482.tif 000110
（α-アミノ基において、適切な保護基 PGにより、文献に記載の通りに保護される［例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York］）
から、適切なアルキル化剤：
【化１４０】
2008531482.tif 000111
（式中、LG’はハロゲン化物又はスルホン酸塩のような適切な脱離基であり、Xは適切な保護基により文献［例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York］に記載の通りに保護されても、されなくてもよい）
を用いて芳香族ヒドロキシル基をアルキル化することにより調製され得る。この反応は、例えば炭酸カリウム、ジアザビシクロ[5,4,0]undec-5-エンまたはtert-ブチルテトラメチルウアニジンのような塩基を適用する塩基性の条件下にて、適切な温度で、典型的には−78℃〜200℃の間で行われ得る： 
【化１４１】
2008531482.tif 000112
前記エステルは、例えば水又はN,N-ジメチルホルムアミドのような適切な溶媒または溶媒混合物中において、例えばアンモニアとの反応により、対応するアミドに変換され得る：
【化１４２】
2008531482.tif 000113
全ての保護基の除去は、文献記載の方法による１又は複数のステップで行われ得る(例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York)：
【化１４３】
2008531482.tif 000114
一般方法(D)：
一般式の化合物：
【化１４４】
2008531482.tif 000115
（式中、R'およびR''は上記で定義された通りである）
は、適切な酸：
【化１４５】
2008531482.tif 000116
（アルファ-アミノ基において、適切な保護基 PGにより、文献［例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protectivegroups in 有機syn-thesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York］に記載の通りに保護される）
から、適切な第一又は第二アルコール（式中Xは、適切な保護基により文献［例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York］に記載の通りに保護されても、されなくてもよい）との反応により調製され、
該反応では、例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシベンゾトリアジン-4-オン又は7-アザベンゾトリアゾールのような例えばカップリング試薬を、例えばジイソプロピルカルボジイミド又は1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩のようなカルボジイミドと組合わせ、例えばトリエチルアミン又はエチルジイソプロピルアミンのような適切な塩基の存在又は不存在中で用いるというような、当業者に知られたアシル化条件を用いてアミドを形成する：
【化１４６】
2008531482.tif 000117
全ての保護基の除去は、文献（T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York）に記載の通りに、１または複数の工程で行われてよい：
【化１４７】
2008531482.tif 000118
一般方法(E)：システインからの、ケト基を含んだアミノ酸アミドの合成
好適にN-保護されたシステイン誘導体(例えばエステル、N-(2,4-ジメトキシベンジル)アミドまたはN-bis(シクロプロピル)メチルアミド)、または好適にN-保護されたシステインアミドを、カルボニル基を含んだアルキル化剤（R50CO(CH2)nLG”（LG”＝求核置換反応のための脱離基であり、ハロゲン、スルホン酸塩(-O-SO2-R51)、ジアルキルスルホニウム、フェニルヨードニウム、またはヒドロキシから選択される）を用いて処理し、S-アルキル化システイン誘導体を得る（式中、R51はC1-6アルキル、部分的または完全にフッ素化されたC1-6アルキルまたはアリールを表し、任意にアルキル、ハロゲン、ニトロ、シアノ、またはアセトアミドで置換され、R50は水素、アルキル、アリール、またはヘテロアリールを表し、適切な反応条件下で、前記アリールまたはヘテロアリールは任意にC1-6アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アシル、アルキル、ニトロで１回または複数回置換される）。
【０２３５】
この誘導体は、酸誘導体のアミドへの変換およびα-アミノ基の脱保護とにより、アミノ酸に変換される。適切なN-保護基は例えばトリチル、フタロイル、またはtert-ブチルオキシカルボニルのようなアルコキシカルボニル基である：
【化１４８】
2008531482.tif 000119
（式中、nは1から10までの整数を表す）。
【０２３６】
一般方法(F)：アスパラギン酸またはグルタミン酸からの、ケト基を含んだアミノ酸アミドの合成
N-アルコキシカルボニル誘導体をホルムアルデヒドで用いて処理することにより、アスパラギン酸またはグルタミン酸を選択的に保護し、下記に示すような環状エステルを得ることができる：
【化１４９】
2008531482.tif 000120
これらの誘導体（式中、R60 はtert-ブチル、ベンジル、2-クロロベンジル、アリール、2-(トリメチルシリル)エチル、2,2,2-トリクロロエチル、またはベンズヒドリルである）は、カルボン酸の活性化(LvGはハロゲン、アリールオキシ、またはヘテロアリールオキシである)、および、求核性炭素(carbon nucleophile)R80-M1との反応（式中R80はアルキル、アリール、またはヘテロアリールを表し、前記アリールまたはヘテロアリールは任意にC1-6アルコキシ、ヒドロキシ、ハロゲン、シアノ、アシル、アルキル、またはニトロで１回または数回置換され；M1は、アルカリ金属、Mg、Zn、Ti、Zr、Mn、Cu、Ce、またはCaを表し、任意に適切な触媒の存在中にある）により、保護されたケトン含有アミノ酸誘導体に変換できる。アンモニアを用いた生成物の反応および脱保護により、所望のアミノ酸アミドを得るであろう：
【化１５０】
2008531482.tif 000121
同様に、N-アルコキシカルボニルピログルタミン酸エステル（ここでR70はtert-ブチル、ベンジル、2-クロロベンジル、アリール、2-(トリメチルシリル)エチル、2,2,2-トリクロロエチル、またはベンズヒドリルを表し、R80は下位アルキルを表す）を、求核炭素試薬（nucleophilic carbon reagents）と反応させることにより、保護されたケト基含有アミノ酸誘導体を得ることができる。生成物のアンモニアとの反応、および脱保護により、所望のアミノ酸アミドが得られるであろう：
【化１５１】
2008531482.tif 000122
同様に、下記に示す通り、適切にN-保護されたグルタミン酸ジエステル（式中、R90は下位アルキルを表す）を炭素において選択的にアシル化し、加水分解と脱炭酸化の後に、ケト基含有アミノ酸の保護化誘導体を得ることができ、これらは標準的な手順を用いてアミノ酸アミドに変換できる：
【化１５２】
2008531482.tif 000123
一般方法(G)
一般式：
【化１５３】
2008531482.tif 000124
の化合物（式中、R'''は、C1-15アルキレン、C2-15アルケニレン、C2-15アルキニレン、C1-15ヘテロアルキレン、C2-15ヘテロアルケニレン、C2-15ヘテロアルキニレンを表し；１個またはそれ以上のホモ環式芳香族化合物ビラジカルまたは複素環式化合物ビラジカルが挿入されてよく；式中、G3は結合部またはリンカーを表す）
は、適切な保護された一級または二級アミン：
【化１５４】
2008531482.tif 000125
（式中PGは適切な保護基であってよく；LG'''のアニオンは、例えばハロゲン化物又はスルホン酸塩のような脱離基である）
から、文献、例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New Yorkに記載の通りに調製されてよい。
【０２３７】
このアミンを、適切な保護化ヒドロキシルアミン：
【化１５５】
2008531482.tif 000126
（式中、PG’は、PG’をヒドロキシルアミンから除去することなくPGをアミンから除去できるように選択された保護基である）
を用いて反応させる。この例は文献、例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New York中に見出すことができる。
【０２３８】
上記２つの成分を、例えば水素化ナトリウムのような塩基性条件下で、例えば−78℃〜200℃のような適切な温度で反応させる：
【化１５６】
2008531482.tif 000127
アミンの保護基は、文献記載の方法で選択的に除去されてよい：
【化１５７】
2008531482.tif 000128
アミンを、適切な酸と、例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシベンゾトリアジン-4-オンまたは7-アザベンゾトリアゾールのようなカップリング試薬とを、例えばジイソプロピルカルボジイミドまたは1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩のようなカルボジイミドと組み合わせて、例えばトリエチルアミンまたはエチルジイソプロピルアミンのような適切な塩基の存在中または不存在中でアシル化するか、例えば2,5-ピロリジン-1-イル-エステルのような適切な酸の活性エステルを用いてアシル化して、アミドを得てよい：
【化１５８】
2008531482.tif 000129
最後に、ヒドロキシルアミンの保護基を、文献、例えばT. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New Yorkに記載の方法により除去してよい：
【化１５９】
2008531482.tif 000130
一般方法(H)
一般式：
【化１６０】
2008531482.tif 000131
の化合物（式中、G3は結合部またはリンカーである）を、適切なエステル（式中、RIV はC1-10アルキルである）から、エタノールのような適切な溶媒中でヒドラジン水和物を添加することにより調製してよい：
【化１６１】
2008531482.tif 000132
一般方法(J)  アシル基転移反応
例えば5〜50℃または室温のような適切な温度で、GH-XX-Ala(最終濃度0.01-10mM)および問題の求核剤(最終濃度10mM-2M)の溶液を、EDTAを低濃度で含んだ水中に懸濁させる。
【０２３９】
反応物質の溶解を促進させるために、有機溶媒が添加されてよい。この混合物は、例えばリン酸緩衝液またはHEPESのような適切な緩衝液を用いて、例えばpH 1とpH 14との間、例えばpH 3.5とpH 9との間、pH 6とpH 8.5との間のような適切なpH値に緩衝され得るか、塩基または酸を添加することによりpHを維持できる。カルボキシペプチダーゼＹを、ペプチドと求核剤との前記混合物に添加する。適切な時間、例えば5分〜10日の経過後に、温度またはpH値の変化、有機溶媒の添加、例えばフェニルメタンスルホニルフッ化物のようなCPYの阻害剤の添加、または、透析法もしくはゲル濾過により、反応を停止させ得る：
【化１６２】
2008531482.tif 000133
一般方法(K)  オキシム形成
オキシム部分は、トランスアシル化された問題のペプチドを水中に溶解させることにより形成され得る（式中、RVは、置換または非置換の芳香族環、置換または非置換のヘテロ環芳香族化合物、水素、またはC1-10アルキルであり得る）。溶解性を増すために、有機溶媒を添加してよい。溶液は、例えばpH 0〜pH 14、pH 3〜pH 6、またはpH 5のような適切なpH値で緩衝され、例えば0〜60℃のような適切な温度に維持される。問題のヒドロキシルアミンを添加し、以下の反応スキームに従ってオキシム部分が形成される：
【化１６３】
2008531482.tif 000134
一般方法(L)  ヒドラゾン形成
ヒドラゾン形成 (I)
ヒドラゾン部分は、問題のトランスアシル化されたペプチドを水中に溶解させることにより形成される［式中、RVI は、置換または非置換の芳香族環、置換または非置換のヘテロ環式芳香族化合物（ヘテロ芳香環）またはC1-10アルキルであり得る］。溶液を、例えばpH 2〜pH 14またはpH 0〜pH 4のような適切なpH-値に緩衝させ、例えば0〜60℃のような適切な温度で維持する。問題のヒドラジドを添加することにより、ヒドラゾンが形成される： 
【化１６４】
2008531482.tif 000135
一般方法(M)  イソオキサゾール形成
イソオキサゾールは、ニトリルオキシドと、アルキンとの間の反応により形成できる。ニトリルオキシドは、過剰な適切なオキシムに、例えば漂白剤のような適切な酸化剤を添加することにより形成される。過剰の新たに形成されたニトリルオキシドの溶液を、問題のペプチドに添加してよい：
【化１６５】
2008531482.tif 000136
一般方法(N)  トリアゾール形成
トリアゾールは、PEGに付加されるアジドと、問題の成長ホルモンに付加されるアルキンとを、Cu(I)イオンの存在下に、水、または、水と例えばアセトニトリルのような有機溶媒の混合物のような適切な溶媒中で反応させることにより形成できる。トリアゾールは２つの可能な位置異性体で形成され得る：
【化１６６】
2008531482.tif 000137
一般方法(O)  トリアゾール形成
トリアゾールは、PEGに付加されるアルキンと、当該(in question)成長ホルモンに付加されるアジドとを、Cu(I)イオンの存在中で、水、または、水および例えばアセトニトリルのような有機溶媒の混合物のような、適切な溶媒中で反応させることにより形成できる。トリアゾールは２つの可能な位置異性体で形成され得る：
【化１６７】
2008531482.tif 000138
一般方法(P)  アミド形成
アミドは、共有結合的に成長ホルモンに付加されるアジドを、トリフェニルホスフィン部分を含んだエステルと、例えばTetahedron Lett. 2003, 44, 4515-4518に記載されたようにして反応させることにより、位置選択的に形成できる：
【化１６８】
2008531482.tif 000139
一般方法(Q)  アミド形成
アミドは、共有結合的に成長ホルモンに付加されるアジドを、ジフェニルホスフィン部分を含んだチオエステルと、例えばJ. Org. Chem. 2002, 67, 4993-4996に記載されたようにして反応させることにより、位置選択的に形成できる：
【化１６９】
2008531482.tif 000140
一般方法(R)  アリールアルキン形成
アリールアルキンは、共有結合的に成長ホルモンに付加されるアルキンを、ハロアリール化合物と、水溶性のパラジウム触媒下において、例えばBioconjugate Chemistry, 2004, 15, 231-234に記載されたようにして反応させることにより形成できる。このハロアリール化合物は、対応のトリフルオロスルホン酸アリールと交換されてもよい：
【化１７０】
2008531482.tif 000141
一般方法(S)  アリールアルキン形成
アリールアルキンは、共有結合的に成長ホルモンに付加されるハロアリール部分と、アルキンとの間で、水溶性のパラジウム触媒の存在下において、例えばBioconjugate Chemistry, 2004, 15, 231-234に記載されたようにして反応させることにより形成されてもよい。ハロアリール部分の代わりに、ペプチドに付加されるトリフルオロスルホニルオキシアリール部分も同様に使用され得る：
【化１７１】
2008531482.tif 000142
一般方法(T)
一般式：
【化１７２】
2008531482.tif 000143
の化合物（式中、R'およびR''は上記で定義された通りである）は、適切なアミノ酸（α-アミノ基において、例えばBOC またはトリチルのような酸に不安定な保護基 PG1で保護化され；ω-アミノ基において、例えばFmocのような塩基に不安定な保護基 PG2で保護化される）から調製され得る。酸は、例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールまたは3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジンのような試薬の存在または不存在中において、および例えばトリエチルアミンまたはエチルジイソプロピルアミンのような塩基の存在または不存在中において、カルボジイミド、例えばジイソプロピルカルボジイミドを使用するというような、当業者に知られた標準的なカップリング条件を用いて、Rink-アミド樹脂に付加され得る。ω-アミンにおける保護基PG2は、例えば T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New Yorkのような文献に特定の保護基について記載された塩基性条件下で除去され得る：
【化１７３】
2008531482.tif 000144
例えばカルボジイミド（例えばジイソプロピルカルボジイミド）を、例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールまたは3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジンのような試薬の存在下または不存下において、および、例えばトリエチルアミンまたはエチルジイソプロピルアミンのような塩基の存在下または不存在下で使用するといった標準的なカップリング条件を用いて、ωアミノ部分に酸を付加できる。中間体を、例えばトリフルオロ酢酸、またはジクロロメタン中の20〜70％トリフルオロ酢酸溶液のような酸性条件下で、固相支持体から開裂させて、所望のアミンアミドを得ることができる：
【化１７４】
2008531482.tif 000145
一般方法(U)
一般式：
【化１７５】
2008531482.tif 000146
の化合物（式中、R'およびR''は上記で定義された通りである）は、例えばBOC またはトリチルのような酸に不安定な保護基 PG1で保護化される適切なアミノ酸から、カルボジイミド、例えばジイソプロピルカルボジイミドのようなカップリング試薬の存在下に、例えば1-ヒドロキシベンゾトリアゾール、1-ヒドロキシ-7-アザベンゾトリアゾールまたは3,4-ジヒドロ-3-ヒドロキシ-4-オキソ-1,2,3-ベンゾトリアジンのような試薬の存在または不存在においてで、過剰のアンモニアと反応させることにより調製され得る：
【化１７６】
2008531482.tif 000147
フェノール性水酸基を、例えば炭酸カリウムまたはテトラメチルグアニジンのような適切な塩基の存在下に、適切なハロゲン化物またはスルホン酸塩を用いてアルキル化すればよい（式中、Raはいずれかの適切な置換アルキルまたはアリールラジカルである）。保護基 PG1 を、酸性条件下でαアミノ酸から除去して（選択する特定の保護基については、例えば in T. W. Greene, P. G. M. Wuts, Protective groups in organic synthesis, 2nd ed., 1991 John Wiley & Sons, Inc. New Yorkに記載の通りである）、所望のアミノアミドを得ればよい。
【化１７７】
2008531482.tif 000148
一般方法(V)  PEG-試薬
一般式：
【化１７８】
2008531482.tif 000149
の試薬（式中、式：
【化１７９】
2008531482.tif 000150
はEであり、上記で定義した通りある）は、適切な酸（これは例えばN,N-ジメチルホルムアミドのような適切な溶媒中において、適切な試薬または試薬の組合せ、例えば2-スクシンイミド-1,1,3,3,-テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩(TSTU)との反応によって活性化され得る）から調製され得る。活性化された酸、例えば得られた前記酸の2,5-ジオキソピロジン-1イルエステルを、商業的に入手可能なPEG-試薬（これは、任意に例えばエチルジイソプロピルアミンまたはトリエチルアミンのような適切な塩基の存在下において、一次アミンを用いて官能化されてよい）と反応させればよい。
【化１８０】
2008531482.tif 000151
一般方法(W)  PEG-試薬
一般式：
【化１８１】
2008531482.tif 000152
の試薬（式中、式：
【化１８２】
2008531482.tif 000153
はEである)
は、商業的に入手可能なスクシンイミジルエステル： 
【化１８３】
2008531482.tif 000154
から、適切なアミン：
【化１８４】
2008531482.tif 000155
と、任意に例えばアミン-塩基、例えばトリエチルアミンまたはエチルジイソプロピルアミンのような塩基の存在下で反応させることにより調製されてよい。
【０２４０】
例１  N-(4-アミノキシブチル)-4-(mPEG20000イルオキシ)ブタノイルアミド
【化１８５】
2008531482.tif 000156
工程１：  2-(4-(tert-ブトキシカルボニルアミノキシ)ブチル)イソインドール-1,3-ジオン
【化１８６】
2008531482.tif 000157
商業的に入手可能なN-(4-ブロモブチル)フタルイミド(2.82g, 10mmol)およびN-Boc-ヒドロキシルアミン(2.08g, 15.6mmol)の混合物にアセトニトリル(2mL)を添加し、続けて1,8-ジアザビシクロ[5.4.0]undec-7-エン(2.25mL, 15mmol)を添加した。反応混合物を、室温で30分、次いで50℃で2日撹拌した。これを水(30mL)および1N 塩酸(20mL)の混合物で希釈した。これを酢酸エチルで抽出した(2 x 100mL)。有機相を塩水(50mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。粗成物を、ヘプタン／酢酸エチル 1：0〜0：1の勾配を溶出剤として用いるシリカ(60g)上のカラムクロマトグラフィーにより精製して、2.08gの2-(4-(tert-ブトキシカルボニルアミノキシ)ブチル)イソインドール-1,3-ジオンを得た。
【０２４１】
工程２：  N-(4-アミノブトキシ)カルバミン酸 tert-ブチルエステル
【化１８７】
2008531482.tif 000158
ヒドラジン水和物(1.0mL, 20mmol)を、エタノール(8.0mL)中の2-(4-(tert-ブトキシカルボニルアミノキシ)ブチル)イソインドール-1,3-ジオン(2.08g, 6.22mmol)の溶液に添加した。反応混合物を80℃で65h撹拌した。溶媒を真空下で除去した。残渣をトルエン(10mL)中に溶解させ、溶媒を真空下で除去した。残渣を1N 塩酸(10mL)中に懸濁させた。沈殿物を濾過により除去し、水(2mL)で洗浄した。濾液および洗浄液を合体させ、炭酸カリウムを用いて塩基性にした。溶液をジクロロメタンで抽出した(4 x 20mL)。有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、0.39gのN-(4-アミノブトキシ)カルバミン酸 tert-ブチルエステルを得た。炭酸カリウム(3g)を水相に添加し、これをジクロロメタンで抽出した(3 x 20mL)。これらの合体した有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、さらに0.39gのN-(4-アミノブトキシ)カルバミン酸 tert-ブチルエステルを得た。
【０２４２】
工程３：  N-(4-(4-(mPEG20000イルオキシ)ブタノイルアミノ)ブトキシ)カルバミン酸 tert-ブチルエステル
【化１８８】
2008531482.tif 000159
商業的に入手可能なmPEG2000イルオキシブタン酸のN-ヒドロキシスクシンイミドエステル(Nektar “mPEG-SBA”, # 2M450P01, 3g, 0.15mmol)を、ジクロロメタン(25mL)中に溶解させた。N-(4-アミノブトキシ)カルバミン酸 tert-ブチルエステル(0.12g, 0.59mmol)を添加した。反応混合物を室温で振盪した。ジエチルエーテルを、沈殿物が得られるまで添加した。沈殿物を濾過により分離した。この物質を真空下で乾燥させて、2.39gのN-(4-(4-(mPEG20000イル)ブタノイルアミノ)ブトキシ)カルバミン酸 tert-ブチルエステルを得た。
【０２４３】
工程４：  N-(4-アミノキシブチル)-4-(mPEG20000イルオキシ)ブタノイルアミド
【化１８９】
2008531482.tif 000160
トリフルオロ酢酸(20mL)を、ジクロロメタン(20mL)中のN-(4-(4-(mPEG20000イル)ブタノイルアミノ)ブトキシ)カルバミン酸 tert-ブチルエステル(2.39g, 0.12mmol)の溶液に添加した。反応混合物を30分振盪した。ジエチルエーテル(100mL)を添加した。形成された沈殿物を濾過により分離した。これをジエチルエーテルで洗浄し(2 x 100mL)、真空下で乾燥させて、1.96gのN-(4-アミノキシブチル)-4-(mPEG20000イル)ブタノイルアミドを得た。
【０２４４】
例２  (2S)-2-(N-(hGHイル)ロイシニルアミノ)-3-(4-((1-(10-(N-(mPEG20000イル)カルバモイル)デシル)トリアゾール-4-イル)メトキシ)フェニル)プロピオンアミド
【化１９０】
2008531482.tif 000161
工程１：  [(S)-1-カルバモイル-2-(4-ヒドロキシフェニル)エチル]-カルバミン酸 tert-ブチルエステル
【化１９１】
2008531482.tif 000162
ジカルボン酸ジ-tert-ブチル(15g, 69mmol)を、ジオキサン(140mL)および水酸化ナトリウム(140mL)の水溶液1N中の、チロシンアミドの塩酸塩の塩(15g, 69mmol)の溶液に添加した。反応混合物を16h室温で撹拌した。これを硫酸水素ナトリウム10％水溶液(200mL)で希釈し、酢酸エチルで抽出した(3 x 200mL)。合体した有機層を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(100mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去した。粗成物を、ジクロロメタン／メタノール(10：1)の混合物を用いるシリカ(400g)上のフラッシュクロマトグラフィにより精製して、8.17gの[(S)-1-カルバモイル-2-(4-ヒドロキシフェニル)エチル]-カルバミン酸 tert-ブチルエステルを得た。MS：m/z＝303(M+Na)+。
【０２４５】
1H-NMR(DMSO-d6)：δ 1.31(s 9H); 2.80(dd, 1H); 2.83(dd, 1H); 4.00(m, 1H); 6.62(d, 2H); 6.70(d, 1H); 6.97(br, 1H); 7.03(d, 2H); 7.31(br, 1H); 9.14(s, 1H)。
【０２４６】
工程２：  [(S)-1-カルバモイル-2-(4-(prop-2-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸 tert-ブチルエステル
【化１９２】
2008531482.tif 000163
[(S)-1-カルバモイル-2-(4-ヒドロキシフェニル)エチル]-カルバミン酸 tert-ブチルエステル(1.0g, 3.57mmol)、ヨウ化テトラブチルアンモニウム(65mg, 0.17mmol)、炭酸カリウム(3.94g, 29mmol)、臭化プロパルギル(0.38mL, 4.28mmol)およびN,N-ジメチルホルムアミド(15mL)の混合物を60℃にまで16h加熱した。これを室温にまで冷却し、水(30mL)で希釈し、硫酸水素ナトリウム10％水溶液を用いて酸性にした。混合物を酢酸エチルで抽出した(2 x 100mL)。合体した有機層を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(200mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去した。粗成物を、ジクロロメタン／メタノール(10：1)の混合物を溶出剤として用いるシリカ(100g)上のフラッシュクロマトグラフィにより精製して、998mgの[(S)-1-カルバモイル-2-(4-(prop-2-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸 tert-ブチルエステルを得た。MS：m/z＝341(M+Na)+。
【０２４７】
1H-NMR(DMSO-d6) δ 1.31(s, 9H); 2.50(s, 1H); 2.67(dd, 1H); 2.91(dd, 1H); 4.03(m, 1H); 4.74(s, 2H); 6.77(d, 1H); 6.86(d, 2H); 6.99(s, 1H), 7.17(d, 2H); 7.35(s, 1H)。
【０２４８】
工程３：  (2S)-2-アミノ-3-(4-(prop-2-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド
【化１９３】
2008531482.tif 000164
トリフルオロ酢酸(10mL)を、ジクロロメタン(10mL)中の [(S)-1-カルバモイル-2-(4-(prop-2-イニルオキシ)フェニル)エチル]カルバミン酸 tert-ブチルエステル(998mg, 3.13mmol)の溶液に添加した。反応混合物を1.5h室温で撹拌した。溶媒を除去した。残渣をジクロロメタン(30mL)中に溶解させた。溶媒を除去した。後者の手順を２回繰り返して、1.53gの(2S)-2-アミノ-3-(4-(prop-2-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミドのトリフルオロ酢酸塩の塩を得た。
【０２４９】
HPLC(方法02-B4-4)：Rf＝5.62分。MS：m/z＝219(M+1)+。
【０２５０】
1H-NMR(CDCl3) δ 2.51(s, 1H); 3.02(m, 2H); 3.90(m, 1H); 4.78(s, 2H); 6.95(d, 2H); 7.20(d, 2H); 7.56(s, 1H); 7.87(s, 1H); 8.10(br, 3H)。
【０２５１】
工程４：  11-アジドウンデカン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル
【化１９４】
2008531482.tif 000165
N,N,N',N'-テトラメチル-O-(N-スクシンイミジル)ウラニウムテトラフルオロ硼酸塩(1.32g, 4.40mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(10mL)中の11-アジドウンデカン酸(1.00g, 4.40mmol)およびトリエチルアミン(0.61mL, 4.40mmol)の溶液に添加した。反応混合物を2h室温で撹拌した。これを酢酸エチル(50mL)で希釈し、水で洗浄した(3 x 50mL)。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、1.40gの粗製の11-アジドウンデカン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステルを得、これをさらに精製せずに次の工程に用いた。MS：m/z＝347[M+Na+]。
【０２５２】
1H-NMR(CDCl3)：δ 1.35(m, 12H); 1.60(quintet) t, 2H); 1.75(quintett, 2H); 2.60(t, 2H); 1.85(m, 4H); 3.25(t, 2H)。
【０２５３】
工程５：  11-アジドウンデカノイルアミノmPEG20kDa
【化１９５】
2008531482.tif 000166
11-アジドウンデカン酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル(227mg, 0.7mmol)の溶液を、ジクロロメタン(50mL)中の商業的に入手可能なmPEG20000DA-アミン(Nektar 2M2U0P01, 5.00g, 0.25mmol)およびトリエチルアミン(0.174mL, 1.25mmol)の溶液に添加した。反応混合物を室温で16h撹拌した。エーテル(800mL)を添加した。形成された沈殿物を濾過により分離し、エーテルで洗浄した(2 x 100mL)。これを真空下で乾燥させて、4.58gの11-アジドウンデカノイルアミノmPEG20kDaを得た。
【０２５４】
工程６：  (S)-3-(4-(プロパルギルオキシ)フェニル)-2-((S)-2-hGHイルロイシニルアミノ)プロピオンアミド
【化１９６】
2008531482.tif 000167
室温で、CPY水溶液(200 U/mL, 1U, 0.005mL)を、0.25M HEPESおよび5mM EDTAを含み、1N 水酸化ナトリウム水溶液を用いてpH 8.02に調整された緩衝液(0.090mL)中のhGH-Leu-Ala(1mg, 45nmol)および、(2S)-2-アミノ-3-(4-(prop-2-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミドのトリフルオロ酢酸塩の塩(5.2mg, 0.157mmol)の溶液に添加した。4.5h後、反応混合物を水(0.800mL)で希釈した。新たに調製したイソプロパノール(0.900mL)中のフェニルメタンスルホニルフッ化物(0.32mg, 1808nmol)の溶液を添加した。MALDI-MS(CHCA)：11202(M2+)。
【０２５５】
３回の実行(three runs)で得た生成物を、1N 塩酸でpH 8.5に調整された50mM TRIS-緩衝液中に取り出した。これらを、1N 塩酸でpH 8.5に調整された50mM TRIS-緩衝液の緩衝液中の、2.0M 塩化ナトリウムおよび50mM TRISを含んだ緩衝液（1N 塩酸でpH 8.5に調整）0〜50％の勾配を流速0.5mL/分 で用いるmonoQ カラム(1mL)でのカラムクロマトグラフィーにより精製して、(S)-3-(4-(プロパルギルオキシ)フェニル)-2-((S)-2-hGHイルロイシニルアミノ)プロピオンアミドを得た。MALDI(CHCA)：22454(M+)；11238(M2+)。
【０２５６】
工程７：  水(0.125mL)中のL-(+)-アスコルビン酸(2mg, 0.008mmol)および2,6-ルチジン(0.003mL)の溶液を、水(0.125mL)中の硫酸銅五水和物 (0.55mg)の溶液に添加した。溶液を室温で５分維持した。この溶液0.25mLを、水(0.05mL)中の(S)-3-(4-(プロパルギルオキシ)フェニル)-2-((S)-2-hGHイルロイシニルアミノ)プロピオンアミド(0.5mg, 22nmol)および2,6-ルチジン(0.001mL)溶液と、水中の11-アジドウンデカノイルアミノmPEG20kDa (4.51mg, 223mmol)の溶液とを混合することにより予め調製された別の溶液に添加した。反応混合物を室温で21h維持した。SDS-ゲルは、PEG化された生成物についての期待値に基づき、実質的(virtual)分子量がおよそ65kDaである生成物の形成を示した。というのも、peg化された化合物は、SDS-ゲルにおいて、計算値よりも高い分子量を示すことが知られているからである。
【０２５７】
例３  (S)-2-((hGHロイシニル)アミノ)-6-(4-(1-(4-(4-(20kDa mPEGイル)ブタノイルアミノ)ブトキシイミノ)エチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド
工程１：  4-アセチル-N-((5S)-5-アミノ-5-カルバモイルペンチル)ベンズアミドを用いたhGH-Leu-AlaのCPY-触媒ペプチド転移
【化１９７】
2008531482.tif 000168
H2O：ジイソプロピルアミン(100：1 v/v, 0.6mL)中のhGH-Leu-Ala(20mg, 0.5mM 最終濃度)の溶液に、5mM EDTA(0.97mL)を含んだHEPES 緩衝液250mM pH8.5の溶液中の4-アセチル-N-((5S)-5-アミノ-5-カルバモイルペンチル)ベンズアミド(127mg, 175mM 最終濃度)を添加した。pHを、水酸化ナトリウム(水中に10M)を添加することにより8.2に調整する。反応体積を、5mM EDTAを含んだ HEPES 緩衝液250mM pH8.5を添加することにより1.77mLに調整した。水中の酵素(Fluka #21943)の溶液(10U/mL 最終濃度)を添加することにより反応が開始された。反応混合物を30℃でインキュベートした。
【０２５８】
反応はキャピラリー電気泳動法により観察された。
【０２５９】
CE分析方法：
キャピラリー電気泳動法は、ダイオードアレイ検出器を備えたHewlett Packard 3D CE 系を用いて行われた。
【０２６０】
用いられた石英ガラス製の毛細管(Agilent)は、全長64.5であり、有効長は56cmであり、IDは50μmであった。試料は、50mbarでの圧力により4s注入された。30℃で、電圧+25kVのもと、リン酸塩緩衝液50mM pH7を電解液として用い、分離を行った。分析は200nmで観察された。各実行の間で酸洗浄および塩基洗浄が行われた：毛細管は、水で2分、次いでリン酸0.1Mで2分、次いで水で2分洗浄した；続いて水酸化ナトリウム0.1M で3分、水で2分濯いだ後、毛細管を電解液で均衡させた。
【０２６１】
MALDI-TOF分析方法：
反応混合物中に現れる化合物は、アルファ-シアノ-4-ヒドロキシ-桂皮酸をマトリックスとして用いるMALDI-TOFにより同定された：
m/z= 11156 hGH-Leu-Ala(M+2H)2+
m/z= 11257(S)-2-((hGHロイシニル)アミノ)5-カルバモイルペンチル) 4-アセチル ベンズアミド(M+2H)2+
m/z= 11120 hGH-Leu(M+2H)2+。
【０２６２】
ペプチド転移された生成物の収率が＞80％に達したら、PMSF(乾燥イソプロパノール溶液中に100mM，最終濃度2mM)を用いて酵素をインキュベートすることにより、反応を停止させた。
【０２６３】
Tris，HCl 緩衝液50mM pH8.5中で希釈後、過剰な試薬を、超濾過(Millipore Amicon Ultra 10kD MW)につづき、Sephadex G25(Amersham)でゲル濾過することにより除去した。
【０２６４】
得られた溶液はさらに精製せずに次の工程で用いられた。
【０２６５】
工程２：  N-(4-アミノキシブチル)-4-(20kDa mPEGイルオキシ)ブタン酸アミドを用いたオキシム化：
【化１９８】
2008531482.tif 000169
16mgのペプチド転移生成物(約0.7μmole)を含んだ第１の工程で得られた１アリクォートの溶液(850μL)に、ニートの酢酸を添加してpHを４に調整した。次いで混合物を氷上に静置してNMP(750μL)を添加した(最終濃度 25％ v/v)。混合物を再び周囲温度で静置し、酢酸塩緩衝液50mM pH4(0.9mL)中の(4-アミノキシブチル)-4-(20kDa mPEGイルオキシ)ブタン酸アミド(425mg, 21μmoles)の溶液に添加した。反応混合物を、酢酸塩緩衝液50mM pH4を添加することによる希釈を２回行った。反応混合物を30℃で窒素下にて24h静置した。
【０２６６】
反応はHPLCにより観察された：
HPLC方法：
分析は、ダイオードアレイ検出器を備えたAgilent 1100 HPLC系を用いて行われた。用いられたカラムは逆相 Vydac C18(218TP53) 250x4.6であった。溶出は次の溶出剤を用いて行われた：Ａ：H2O/TFA 0.1％ およびＢ：ACN/TFA 0.1％，10〜91％Ｂの勾配を27分、流速1mL/分。分析は40℃で行われ、検出は214, 254, および280nmで行われた。
【０２６７】
(S)-2-((hGHロイシニル)アミノ)5-カルバモイルペンチル) 4-アセチル ベンズアミドのRt：19.6分
hGH-LeuのRt：19.6分
生成物(S)-2-((hGHロイシニル)アミノ)-6-(4-(1-(4-(4-(20kDa mPE-Gイル)ブタノイルアミノ)ブトキシイミノ)エチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミドのRt：18.6分。
【０２６８】
24h後のSDSゲルの実行（run）によれば、推測収率60％でのpegイル化誘導体の形成を示した。
【０２６９】
例４  4-アセチル-N-((5S)-5-アミノ-5-カルバモイルペンチル)ベンズアミド
【化１９９】
2008531482.tif 000170
Rink-アミド-樹脂(負荷：0.43mmol/g, 6.66g, 2.86mmol)をジクロロメタン(50mL)を用いて膨張させた。溶媒を除去した。N-メチルピロリジノン中のピペリジンの20％溶液を添加した(50mL)。反応器を20分振盪した。液体を除去した。樹脂をN-メチルピロリジノン(3 x 50mL)およびジクロロメタン(5 x 50mL)で洗浄した。N-メチルピロリジノン(50mL)中のBOC-Lys(FMOC)-OH(5.37g, 11.5mmol)の溶液と、N-メチルピロリジノン(20mL)中の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.75g, 11.5mmol)の溶液とを連続して添加した。ジイソプロピルカルボジイミド(1.79mL, 11.5mmol)およびエチルジイソプロピルアミン(1.96mL, 11.5mmol)を添加した。反応器を室温で16h振盪した。液体を除去した。樹脂をN-メチルピロリジノン(3 x 50mL)およびジクロロメタン(3 x 50mL)で洗浄した。N-メチルピロリジノン(50mL)中の4-アセチル安息香酸(2.82g, 11.5mmol)の溶液、およびN-メチルピロリジノン(20mL)中の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.75g, 11.5mmol)の溶液を連続して添加した。ジイソプロピルカルボジイミド(1.79mL, 11.5mmol)およびエチルジイソプロピルアミン(1.96mL, 11.5mmol)を添加した。反応器を室温で16h振盪した。樹脂をN-メチルピロリジノン(3 x 50mL)およびジクロロメタン(3 x 50mL)で洗浄した。ジクロロメタン(50mL)中の50％トリフルオロ酢酸および10％トリイソプロピルシランの溶液を樹脂に添加した。反応槽を1h室温で振盪した。液体を回収した。溶媒を真空下で除去した。残渣をトルエン(50mL)中に再び溶解させた。溶媒を真空下で除去した。
【０２７０】
６回の実行で得た粗生成物を合体させた。これらを、トリフルオロ酢酸0.1％ 緩衝液中で水中のアセトニトリル3〜23％の勾配を用いるC18逆相カラム上のHPLC-クロマトグラフィにより精製して、1.07gの4-アセチル-N-((5S)-5-アミノ-5-カルバモイルペンチル)ベンズアミドのトリフルオロ酢酸の塩を得た。
【０２７１】
MS：m/z＝292(M+1)+。HPLC(方法01-B1-2)：5.23分。
【０２７２】
例５：hGH-Leu-Alaのクローニング、発現、および精製
既にZbasic2mt-D4K-hGHを含むpET11a由来のベクターに基づくクローニング戦略が利用された。テンプレートとしてのpNNC13 並びにSac IIおよびBam HI制限部位に隣接するPCRプライマー組を使用して、hGHのＣ末端に追加の二つのアミノ酸（ロイシンおよびアラニン）をコードする628 bpのアンプリコンが作製された。次いで、このPCRアンプリコンを、存在するSac IIおよびBamHI部位を使用してpNNC13の中に戻しクローニングして、Zbasic2mt-D4K-hGH-Leu-AlaをコードするpNNC13.4を作製した。コーディング領域のdな配列決定により、得られたクローンの完全性を確認した。図１を参照されたい。
【０２７３】
E. coli BL21(DE3)に、pET11a-Zbasic2mt-D4K-Ser-hGHを形質転換した。シングルコロニーを、100μg/ml Ampを含む100 ml LB培地に接種し、OD600が0.6に達するまで37℃で培養した。細胞培養温度を30℃まで下げ、細胞を、1 mM IPTGと共に20℃で6時間誘導した。3000 gで15分間遠心することにより細胞を回収した。
【０２７４】
細胞ペレットを、細胞溶解緩衝液(25 mM Na2HPO4  25 mM NaH2PO4 pH 7、5 mM EDTA、 0.1%トリトンX-100)に再懸濁し、細胞を、30 kpsiの細胞破壊(cell disruption) (Constant Cell Disruption Systems)によって破壊した。10000 gで30分間遠心してライゼートを清浄化し、ペレットを処分し、上清は精製に使用した。
【０２７５】
Zbasic2mt-D4K-Ser-hGHを、段階的勾配溶出(緩衝液A: 25 mM Na2HPO4  25 mM NaH2PO4 pH 7; 緩衝液B: 25 mM Na2HPO4  25 mM NaH2PO4 pH 7、1 M NaCl)を用いて、SP-セファロース上で精製した。続いて、タンパク質を、エンテロペプチダーゼで切断し、Ser-hGHを放出させた。消化の後、Ser-hGHを更にブチルセファロース4FFカラムで精製し、Zbasic2mt-D4Kドメインおよびエンテロペプチダーゼから分離した(緩衝液A: 100 mM Hepes pH 7.5；緩衝液B: 100 mM Hepes pH 7.5、 2 M NaCl、直線的勾配を使用した)。
【０２７６】
消化が完全ではないので、残留するZbasic2mt-D4K-hGH-Leu-AlaをhGH-Leu-Alaから分離しなければならず、これは該タンパク質をSPセファロースFFカラムに再度ロードすることによって行われる。SPセファロースFFカラム上での精製の前に、25mM Na2HPO4、25mM NaH2PO4 pH 7への緩衝液の変更が、セファデックスG-25ミディアムカラム上で行われた。Zbasic2mt-D4K-hGH-Leu-AlaはSPセファロースFFに結合するのに対して、hGH-Leu-Alaは流去液中に見出された。
【０２７７】
最終生成物であるhGH-Leu-Alaは緩衝液交換され、50mM NH4HCO3, pH 7.8から凍結乾燥された。
【０２７８】
例６：4-アセチル-N-((5S)-5-アミノ-5-カルバモイルペンチル)ベンズアミド
【化２００】
2008531482.tif 000171
工程１：  ((S)-5-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-5-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸 ベンジルエステル
【化２０１】
2008531482.tif 000172
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル(S)-6-((ベンジルオキシカルボニル)アミノ)-2-((tert-ブトキシカルボニル)アミノ)ヘキサン酸塩(例えばFlukaまたはBachemで商業的に入手可能，15.g, 31mmol)をジクロロメタン(50mL)中に溶解させた。アンモニアの25％水溶液を添加した。反応混合物を勢いよく16h室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去して、21.27gの粗製((S)-5-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-5-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸 ベンジルエステルを得、これをさらに精製せずに次の工程で用いた。
【０２７９】
1H-NMR(DMSO-d6)：δ 1.2-1.6(m, 6H); 1.37(s, 9H); 2.95(q, 2H); 3.80(td, 1H); 5.00(s, 2H); 6.70(d, 1H); 6.90(s, 1H); 7.20-7.40(m, 7H)。MS：m/z＝280。
【０２８０】
工程２：  ((S)-5-アミノ-1-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸 tert-ブチルエステル
【化２０２】
2008531482.tif 000173
粗製((S)-5-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)-5-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸 ベンジルエステル(11.92g, 31.41mmol)をメタノール(250mL)中に懸濁させた。石炭上のパラジウム(50％湿潤)1.67gを添加した。混合物を圧力下での水素化に16h供した。これをセライトのプラグを介して濾過した。溶媒を真空下で除去して、13.13gの粗製((S)-5-アミノ-1-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸 tert-ブチルエステルを得、これをさらに精製せずに次の工程で用いた。
【０２８１】
1H-NMR(DMSO-d6)：δ 1.30-1.60(m, 6H); 1.37(s, 9H); 2.65(t, 2H); 3.80(dt, 1H); 5.70(br, 2H); 6.80(d, 1H); 6.95(s, 1H); 7.30(s, 1H)。
【０２８２】
工程３：  4-アセチル安息香酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル
【化２０３】
2008531482.tif 000174
2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロ硼酸塩(TSTU, 18.5g, 60.9mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(50mL)中の4-アセチル安息香酸(10.0g, 60.9mmol)およびトリエチルアミン(8.49mL, 60.9mmol)の溶液に添加した。反応混合物を2h室温で撹拌した。これを酢酸エチル(400mL)で希釈し、水で洗浄した(3 x 200mL)。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、13.38gの4-アセチル安息香酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステルを得た。
【０２８３】
1H-NMR(CDCl3)：δ 2.67(s, 3H); 2.93(s, 4H); 8.05(d, 2H); 8.20(d, 2H)。MS：m/z＝284(M+Na)+。
【０２８４】
工程４：  4-アセチル安息香酸 2,5-ジオキソピロリジン-1-イルエステル(8.21g, 31.4mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(200mL)中の粗製((S)-5-アミノ-1-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸 tert-ブチルエステル(7.71g, 31.4mmol)の懸濁物に添加した。エチルジイソプロピルアミン(16.14mL, 94.3mmol)を添加した。反応混合物を３日室温で撹拌した。溶媒を70℃で真空下で除去した。残渣をジクロロメタン(50mL)中に溶解させた。トリフルオロ酢酸(50mL)を添加した。反応混合物を1h室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去した。残渣をジクロロメタン(200mL)中に取り出した。10％硫酸水素ナトリウム水溶液(50mL)を添加した。混合物を水(200mL)で抽出した。水相を真空下で濃縮して約60mLにした。これを３つに分配した。各部を、0.1％トリフルオロ酢酸で緩衝された、水中のアセトニトリル0〜20％の勾配を用いるC18逆相カラム上のHPLC-クロマトグラフィにより精製して、合計で8.00gの4-アセチル-N-((5S)-5-アミノ-5-カルバモイルペンチル)ベンズアミドのトリフルオロ酢酸の塩を得た。
【０２８５】
1H-NMR(DMSO-d6)：δ 1.35(m, 2H), 1.55(m, 2H); 1.75(m, 2H); 2.62(s, 3H); 3.30(q, 2H); 3.70(m, 1H); 7.55(s, 1H); 7.80(s, 1H) 7.95(d, 2H); 8.00(d, 2H); 8.00(br, 3H); 8.65(t, 1H)。MS：m/z＝292。
【０２８６】
例７：(S)-2-アミノ-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド
【化２０４】
2008531482.tif 000175
工程１：  3-(アジドメチル)安息香酸メチル
【化２０５】
2008531482.tif 000176
アジ化ナトリウム(5.68g, 87mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(50mL)中の3-(ブロモメチル)安息香酸メチル(5.00g, 22mmol)の溶液に添加した。ヨウ化テトラブチルアンモニウム(81mg, 0.22mmol)を添加した。反応混合物を60℃にまで16h加熱した。これを室温にまで冷却し、水(200mL)に加えた。この混合物を酢酸エチル(400mL)で抽出した。有機層を水で洗浄し(3 x 200mL)、続けて硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、4.11gの粗製3-(アジドメチル)安息香酸メチルを得、これをさらに精製せずに次の工程で用いた。
【０２８７】
MS：m/z＝192。1H-NMR(CDCl3)：δ 3.92(s, 3H); 4.40(s, 2H); 7.50(m, 2H); 8.00(m, 2H)。
【０２８８】
工程２：  3-(アジドメチル)安息香酸
【化２０６】
2008531482.tif 000177
水(25mL)中の水酸化リチウム(3.81g, 21.5mmol)の溶液を、1,4-ジオキサン(25mL)中の粗製3-(アジドメチル)安息香酸メチル(4.11g, 21.5mmol)の溶液に添加した。透明な溶液が得られるまで、水および1,4-ジオキサンを添加した。反応混合物を16h室温で撹拌した。1N水酸化ナトリウム水溶液(100mL)を添加した。反応混合物をtert-ブチル メチルエーテルで洗浄した(2 x 100mL)。水相を、硫酸水素ナトリウム10％水溶液を用いて酸性にした。酢酸エチルで抽出した(2 x 200mL)。合体した酢酸エチル相を硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、3.68gの粗製3-(アジドメチル)安息香酸を得、これをさらに精製せずに用いた。MS：m/z＝150。
【０２８９】
1H-NMR(CDCl3)δ 4.57(s, 3H); 7.55(m, 2H); 8.00(m, 2H); 13.10(br, 1H)。
【０２９０】
工程３：  Rink アミド-樹脂(Novabiochem 01-64-0013, 負荷0.70mmol/g, 0.652g, 2.7mmol)をジクロロメタン(50mL)中で膨張させた。溶媒を除去した。N,N-ジメチルホルムアミド(50mL)中のピペリジンの20％溶液を添加した。混合物を20分室温で振盪した。溶媒を除去した。樹脂をN-メチルピロリジノン(3x 50mL)およびジクロロメタン(5 x 50mL)で洗浄した。N-メチルピロリジノン(12.5mL)中のBoc-Lys(FMOC)-OH(5.00g, 10.7mmol)の溶液、および1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.63g, 10.7mmol)の溶液を続けて樹脂に添加した。ジクロロメタン(25mL)中のジイソプロピルカルボジイミド(1.67mL, 10.7mmol)の溶液を添加した。エチルジイソプロピルアミン(1.83mL, 10.7mmol)を添加した。反応混合物を２日室温で振盪した。液体を除去した。樹脂をN-メチルピロリジノン(3x 50mL)およびジクロロメタン(5 x 50mL)で洗浄した。N,N-ジメチルホルムアミド(50mL)中のピペリジンの20％溶液を添加した。混合物を20分室温で振盪した。溶媒を除去した。樹脂をN-メチルピロリジノン(3x 50mL)およびジクロロメタン(5 x 50mL)で洗浄した。N-メチルピロリジノン(12.5mL) およびジクロロメタン(12.5mL)中の粗製3-(アジドメチル)安息香酸(1.89g, 10.7mmol)の溶液を添加し、続いてN-メチルピロリジノン(12.5mL)中の1-ヒドロキシベンゾトリアゾール(1.63g, 10.7mmol)の溶液を添加した。ジクロロメタン(12.5mL)中のジイソプロピルカルボジイミド(1.67mL, 10.7mmol)の溶液を添加した。エチルジイソプロピルアミン(1.83mL, 10.7mmol)を添加した。反応混合物を16h室温で振盪した。液体を除去した。樹脂をN-メチルピロリジノン(3x 50mL)およびジクロロメタン(5 x 50mL)で洗浄した。ジクロロメタン(20mL)中のトリフルオロ酢酸の50％溶液を樹脂に添加した。トリイソプロピルシラン(5mL)を添加した。反応混合物を1h室温で振盪した。液体を回収した。樹脂をジクロロメタン(30mL)で洗浄した。これら２つの後者の液体を合体させた。溶媒を真空下で除去した。粗成物を、0.1％トリフルオロ酢酸の添加により酸性にした、水中の13〜33％ アセトニトリルの勾配を用いるC18-逆相カラム上のHPLC-クロマトグラフィにより精製して、300mgの(S)-2-アミノ-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミドのトリフルオロ酢酸塩の塩を得た。
【０２９１】
MS：m/z＝305。1H-NMR(DMSO-d6, トリフルオロ酢酸塩の塩)δ 1.37(m, 2H); 1.55(m, 2H); 1.77(m, 2H); 3.28(m, 2H); 3.71(t, 1H); 4.53(s, 2H); 7.51(m, 3H); 7.84(m, 3H); 8.10(br, 3H); 8.54(t, 1H)。
【０２９２】
例８：N-((S)-5-アミノ-5-(カルバモイル)ペンチル)-3-(アミノオキシメチル)ベンズアミド
【化２０７】
2008531482.tif 000178
工程１：  3-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸メチル
【化２０８】
2008531482.tif 000179
3-ブロモメチル安息香酸メチル(10.0g, 43.7mmol)をアセトニトリル(50mL)中に溶解させた。N-ヒドロキシカルバミン酸tert-ブチル(8.72g, 65.5mmol)および1,8-ジアザビシクロundec-7-エン(DBU, 9.79mL, 65.48mmol)を連続して添加した。反応混合物を50℃で16h加熱した。これを室温にまで冷却し、水(200mL)および濃塩酸(25mL)で希釈した。これを酢酸エチルで抽出した(3 x 200mL)。合体した有機層を塩水(200mL)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、14.15gの3-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸メチルを得、これをさらに精製せずに用いた。
【０２９３】
1H-NMR(CDCl3)：δ 1.48(s, 9H); 3.91(s, 3H); 4.90(s, 2H); 7.45(m, 2H); 7.60(d, 1H); 8.00(d, 1H); 8.05(s, 1H)。MS：m/z＝183。
【０２９４】
工程２：  3-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸
【化２０９】
2008531482.tif 000180
粗製3-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸メチル(12.28g, 43.6mmol)をジオキサン(50mL)中に溶解させた。水(50mL)中の水酸化リチウム(1.26g, 52.4mmol)の溶液を添加した。透明な溶液が得られるまで、ジオキサンおよび水を添加した。反応混合物を室温で16h撹拌した。1N水酸化ナトリウム水溶液(200mL)を添加した。この水溶液をtert-ブチル メチルエーテルで洗浄した(2 x 200mL)。水相を、硫酸水素ナトリウム10％水溶液を添加することにより酸性にした。これを酢酸エチルで抽出した(2 x 200mL)。合体した酢酸エチル層を硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、12.28gの粗製3-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸を得、さらに精製せずに次の工程で用いた。
【０２９５】
1H-NMR(CDCl3)：δ 1.49(s, 9H); 4.92(s, 2H); 7.50(t, 1H); 7.65(br, 1H); 7.65(d, 1H); 8.07(d, 1H); 8.12(s, 1H)。MS：m/z＝169。
【０２９６】
工程３：  2,5-ジオキソピロリジンe-1yl 3-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸塩
【化２１０】
2008531482.tif 000181
2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロ硼酸塩(TSTU, 16.71g, 55.13mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(75mL)の粗製3-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸(12.28g, 45.94mmol)およびトリエチルアミン(7.68mL, 55.13mmol)の溶液に添加した。反応混合物を室温で16h撹拌した。これを酢酸エチル(300mL)で希釈し、水で洗浄した(3 x 150mL)。有機層を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(200mL)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、11.04gの粗製2,5-ジオキソピロリジン-1イル 3-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸塩を得、これをさらに精製せずに用いた。
【０２９７】
1H-NMR(CDCl3)：δ 1.47(s, 9H); 2.91(s, 4H); 4.92(s, 2H); 7.28(s, 1H); 7.53(t, 1H); 7.75(d, 1H); 8.10(d, 1H); 8.15(s, 1H)。MS：m/z＝265
工程４：  N,N-ジメチルホルムアミド(100mL)中の粗製2,5-ジオキソピロリジン-1イル 3-(((tert-ブトキシカルボニル)アミノキシ)メチル)安息香酸塩(11.45g, 31.41mmol)の溶液を、N,N-ジメチルホルムアミド(50mL)中の((S)-5-アミノ-1-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸 tert-ブチルエステル(7.71g, 31.41mmol)の溶液に添加した。エチルジイソプロピルアミン(16.13mL, 94.23mmol)を添加した。反応混合物を室温で16h撹拌した。溶媒を70℃で真空下で除去した。残渣をジクロロ-メタン(50mL)中に溶解させた。トリフルオロ酢酸(50mL)を添加した。混合物を1h室温で撹拌した。溶媒を真空下で除去した。残渣をジクロロメタン(100mL)中に溶解させた。水(200mL)中の硫酸水素ナトリウム(50mL)の10％水溶液を連続して添加した。水相を真空下で濃縮して約60mLにした。この溶液を４つに分配した。各部を、アセトニトリル0.1％トリフルオロ酢酸の緩衝液中における水中のアセトニトリル0〜20, 0〜11, 0〜9または0〜2％の勾配をそれぞれ用いて、C18逆相カラム上でのHPLC-クロマトグラフィに供した。合計で4.38gのN-((S)-5-アミノ-5-(カルバモイル)ペンチル)-3-(アミノオキシメチル)ベンズアミドを得た。
【０２９８】
HPLC：Rt＝3.24分(方法02-b1-2)。1H-NMR(DMSO-d6)：δ 1.35(m, 2H); 1.55(m, 2H); 1.75(m, 2H); 3.25(m, 2H); 3.72(m, 1H); 5.05(s, 2H); 7.54(m, 3H); 7.88(m, 3H); 8.12(br, 3H); 8.55(t, 1H)。MS：m/z＝295。
【０２９９】
例９：(S)-2-(hGH-Leu-アミノ)-3-(4-((1-(10-(4-(2-((20kDa mPEGイル)カルバモイルオキシ)-1-(((20kDa mPEGイル)カルバモイルオキシ)メチル)エトキシ)ブタノイルアミノ)デシル)1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ)フェニル)プロピオンアミド
【化２１１】
2008531482.tif 000182
工程１：  10-アジドデカノール
【化２１２】
2008531482.tif 000183
アジ化ナトリウム(4.39g, 67mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(12mL)中の商業的に入手可能な10-ブロモデカノール(4.0g, 17mmol)の溶液に添加した。反応混合物を60℃で16h撹拌した。これを室温にまで冷却し、水(100mL)および炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(50mL)で希釈した。これを酢酸エチルで抽出した(3 x 50mL)。合体した有機層を硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去した。粗成物を、酢酸エチル／ヘプタンの混合物(1：2)を溶出剤として用いるシリカ(100g)上のフラッシュクロマトグラフィにより精製して、3.25gの10-アジドデカノールを得た。
【０３００】
MS：172 [M-N2]+, 222 [M+Na]+。1H-NMR(CDCl3)：δ 1.55(m, 12H); 1.47(s, 1H); 1.60(m, 4H); 3.25(t, 2H); 3.65(t, 2H)。
【０３０１】
工程２：  10-アジドデシル 4-メチルベンゼンスルホン酸エステル
【化２１３】
2008531482.tif 000184
０℃で、塩化トルエンスルホン酸 (3.27g, 17.1mmol)を、ジクロロメタン(70mL)中の10-アジドデカノール(3.25g, 16.3mmol)およびトリエチルアミン(6.83mL, 49.0mmol)の溶液に添加した。反応混合物を４日間撹拌し、その間温度はゆっくりと室温にまで上昇した。これを酢酸エチル(300mL)で希釈し、硫酸水素ナトリウムの10％水溶液で洗浄した。水相を酢酸エチル(100mL)で抽出した。合体した有機層を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(200mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去した。粗成物を、酢酸エチル/ヘプタン(1：2)を溶出剤として用いるシリカ(100g)上のフラッシュクロマトグラフィにより精製して、1.85gの10-アジドデシル 4-メチルベンゼンスルホン酸エステルを得た。MS：376 [M+Na]+, 326 [M-N2]+。
【０３０２】
1H-NMR(CDCl3)：δ 1.15-1.45(m, 12H); 1.60(m, 4H); 2.45(s, 3H); 3.25(t, 2H); 4.00(t, 2H); 7.35(d, 2H); 7.80(d, 2H)。
【０３０３】
工程３：  2-(10-アジドデシル)イソインドール-1,3-ジオン
【化２１４】
2008531482.tif 000185
N,N-ジメチルホルムアミド(12mL)中の10-アジドデシル 4-メチルベンゼンスルホン酸エステル(1.85g, 5.23mmol)および商業的に入手可能なフタルイミドカリウム(1.45g, 7.84mmol)の混合物を100℃で4h加熱した。反応混合物を室温にまで冷却した。これを酢酸エチル(200mL)および硫酸水素ナトリウム10％水溶液(200mL)で希釈した。相が分離した。水相を酢酸エチル(100mL)で抽出した。合体した有機層を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(200mL)で洗浄し、硫酸マグネシウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去した。粗成物を、酢酸エチル/ヘプタン(1：2)を溶出剤として用いるシリカ(70g)上のフラッシュクロマトグラフィにより精製して、1.33gの2-(10-アジドデシル)イソインドール-1,3-ジオンを得た。MS：301 [M-N2]+, 351 [M+Na]+。
【０３０４】
1H-NMR(CDCl3)：δ 1.20-1.45(m, 12H); 1.50-1.75(m, 4H); 3.25(t, 2H); 3.70(t, 2H); 7.70(m, 2H); 7.85(m, 2H)。
【０３０５】
工程４：  10-アジドデシルアミン
【化２１５】
2008531482.tif 000186
エタノール(30mL)中の2-(10-アジドデシル)イソインドール-1,3-ジオン(1.33g, 4.05mmol)およびヒドラジン水和物(0.19mL, 4.85mmol)の溶液を85℃にまで3.25h加熱した。これを室温にまで冷却した。溶媒を真空下で除去した。粗成物を、ジクロロメタン／メタノール／アンモニア25％水溶液(100：20：2)の混合物を溶出剤として用いるシリカ(30g)上のフラッシュクロマトグラフィにより精製して物質を得、これをエタノール中に溶解させた。溶媒を真空下で除去して、440mgの10-アジドデシルアミンを得た。
【０３０６】
MS：199 [M+H]+。1H-NMR(CDCl3)：δ1.25-1.40(m, 12H); 1.45(m, 2H); 1.60(m, 2H); 2.00(br, 2H); 2.70(t, 2H); 3.25(t, 2H)。
【０３０７】
工程５：  N-(10-アジドデシル)-4-(2-((20kDa mPEGイル)カルバモイルオキシ)-1-(((20k Da mPE-Gイル)カルバモイルオキシ)メチル)エトキシ)ブタン酸アミド
【化２１６】
2008531482.tif 000187
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 4-(2-((20kDa mPEGイル)カルバモイルオキシ)-1-(((20kDa mPE-Gイル)カルバモイルオキシ)メチル)エトキシ)ブタン酸エステル(Nektar 2Z3Y0T01, バッチPT-09E-02, 1g, 0.025mmol)をジクロロメタン(50mL)中に溶解させた。ジクロロメタン(2mL)中の10-アジドデシルアミン(50mg, 0.25mmol)の溶液、およびトリエチルアミン(0.02 m. 0.12mmol)を連続して添加した。反応混合物を室温で16h撹拌した。エーテル(800mL)を添加した。形成された沈殿物を濾過により分離し、真空下で乾燥させた。これをジクロロメタン(50mL)中に溶解させた。Amberlyst 15(1.0g)を添加した。混合物を5分室温で撹拌した。固体を濾過により除去した。エーテル(800mL)を添加した。形成された沈殿物を濾過により分離し、真空下で乾燥させて、N-(10-アジドデシル)-4-(2-((20kDa mPEGイル)カルバモイルオキシ)-1-(((20kDa mPE-Gイル)カルバモイルオキシ)メチル)エトキシ)ブタン酸アミドを得た。
【０３０８】
工程６：  (S)-3-(4-(プロパルギルオキシ)フェニル)-2-((S)-2-hGHイルロイシニルアミノ)プロピオンアミド
【化２１７】
2008531482.tif 000188
室温で、CPY水溶液(200 U/mL, 1U, 0.005mL)を、0.25M HEPESおよび5mM EDTAからなり且つ1N水酸化ナトリウム水溶液でpH 7.97に調節された緩衝液(1.35mL)中の、hGH-Leu-Ala(15mg, 672nmol)および(2S)-2-アミノ-3-(4-(prop-2-イニルオキシ)フェニル)プロピオンアミド(78mg, 0.23mmol)のトリフルオロ酢酸塩の塩の溶液に添加した。2.75h後、フェニルメタンスルホニルフッ化物(174mg, 1.0mmol)をイソプロパノール(10mL)中に溶解することにより新たに調製された、フェニルメタンスルホニルフッ化物の貯蔵溶液0.013mL（調製）を添加した。反応混合物を、塩酸でpH 8.5に調整された50mM 2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)1,3-プロパンジオールの緩衝液(10mL)で希釈した。緩衝液を、カットオフフィルタ10kDaを用いた超遠心(RCF＝3600)により、塩酸でpH 8.5に調整した2-アミノ-2-(ヒドロキシメチル)1,3-プロパンジオールの5mM 緩衝液(5mL)と交換した。混合物を450nmフィルタを介して濾過した。MALDI-MS(CHCA)：11231(M2+)。
【０３０９】
この物質をMonoQカラム 10/100 GL(Amersham)上でのイオン交換クロマトグラフィにより精製した。その際、1N 塩酸でpH 8.5に調整された50mM TRIS-緩衝液からなる緩衝液中で、2.0M 塩化ナトリウムおよび50mM TRISからなり且つ1N 塩酸でpH 8.5に調節された60カラム体積の緩衝液に亘って、流速0.5mL/分で0〜100％の勾配を使用し、(S)-3-(4-(プロパルギルオキシ)フェニル)-2-((S)-2-hGHイルロイシニルアミノ)プロピオンアミドを得た。MALDI-MS(CHCA)：11230(M2+)。
【０３１０】
緩衝液を、10kDaのフィルタカットオフを用いた超遠心(RCF＝3600)により、50mM 炭酸水素アンモニウム-緩衝液(2.5mL)と交換した。この物質を凍結乾燥させた。
【０３１１】
工程７：  工程６で分離されたタンパク質(2.77mg, 123nmol)を部分的に、水(0.123mL)中の2％ 2,6-ルチジンからなる緩衝液中に溶解させた。N-(10-アジドデシル)-4-(2-((20kDa mPEGイル)カルバモイルオキシ)-1-(((20k Da mPEGイル)カルバモイルオキシ)メチル)エトキシ)ブタン酸アミド(49mg, 1230nmol)を、水(0.320mL)中の2％ 2,6-ルチジンからなる緩衝液中に溶解させた溶液を、前記タンパク質の溶液に添加した。水(6mL)中の硫酸銅(II)(60mg)の溶液。この銅溶液1mLを、水(6mL)およびルチジン(0.150mL)中のアスコルビン酸(220mg)から調製された溶液1mLに添加して、銅(I)-塩の溶液を得、これを5分室温で放置した。この銅(I)-塩の溶液0.062mLを、タンパク質とPEG-試薬との混合物に添加した。反応混合物を穏やかに4.5h振盪した。これを水(2.8mL)と、10mM TRIS-緩衝液からなる緩衝液(2.77mL)（1N 塩酸を用いてpH 8.0調整）とで希釈した。これを450nm フィルタを介して濾過した。これをMonoQカラム 10/100 GL(Amersham)上でのイオン交換クロマトグラフィにより精製した。その際、1N 塩酸でpH 8.5に調整された50mM TRIS-緩衝液からなる緩衝液中で、2.0M 塩化ナトリウムおよび10mM TRISからなり且つ1N 塩酸でpH 8.0に調節された20カラム体積の緩衝液に亘って、流速2mL/分で0〜100％の勾配を使用した。SDS-ゲルは、マーカー12(Invitrogen)に匹敵する分子量約116kDaの帯域を示した（双方ともsilver Quest 染色法(Invitrogen)およびPEG-感受性染色法(Kurfurst, M.M. Analytical Biochemsitry 1992, 200, 244-248)を用いて染色）、これらは全て、(S)-2-(hGH-Leu-アミノ)-3-(4-((1-(10-(4-(2-((20kDa mPEGイル)カルバモイルオキシ)-1-(((20kDa mPEGイル)カルバモイルオキシ)メチル)エトキシ)ブタノイルアミノ)デシル)1,2,3-トリアゾール-4-イル)メトキシ)フェニル)プロピオンアミドについて期待される領域内である。
【０３１２】
例10：(S)-2-((hGHイルロイシニル)アミノ)-6-(3-((4-((4-(bis(20kDa mPEGイルカルバモイルオキシメチル)メトキシ)ブチリルアミノ)メチル)トリアゾール-1-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド
【化２１８】
2008531482.tif 000189
工程１：  4-(bis(20kDa mPEGイルカルバモイルオキシメチル)メトキシ)-N-prop-2-イニル酪酸アミド
【化２１９】
2008531482.tif 000190
4-(bis(20kDa mPEGイルカルバモイルオキシメチル)メトキシ)酪酸(Nektarから購入, カタログ番号2Z3Y0T01, 2g, 0.05mmol)をジクロロメタン(25mL)中に溶解させた。エチルジイソプロピルアミン(0.042mL, 0.248mmol)およびプロパルギルアミン(0.014mL, 0.198mmol)を連続して添加した。反応混合物を3日撹拌した。沈殿が発生するまでジエチルエーテルを添加した。混合物を０℃にまで冷却し、P1-ガラスフィルタを介して濾過した。沈殿物を回収し、ジクロロメタン(18mL)および エタノール(2mL)中に溶解させた。Amberlyst 15(1.0g)をエタノールで洗浄し、添加した。混合物を穏やかに30分撹拌し、濾過した。溶媒を真空下で除去した。ジエチルエーテル(50mL)を添加した。沈殿物を濾過により分離し、２日間真空下で乾燥させて、1.36gの4-(bis(20kDa mPEGイルカルバモイルオキシメチル)メトキシ)-N-prop-2-イニル酪酸アミドを得た。
【０３１３】
工程２：  (S)-2-((hGHイルロイシニル)アミノ)-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド
【化２２０】
2008531482.tif 000191
hGH-Leu-Ala(15mg, 672nmol)を水(0.450mL)およびジイソプロピルエチルアミン(0.007mL)中に溶解させた。0.25M HEPESおよび5mM EDTAからなり1N水酸化ナトリウム溶液でpH 8に調整された緩衝液0.120mL中の、(S)-2-アミノ-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド(98mg, 0.235mmol)の溶液を添加した。溶液を濾過し、0.25M HEPESおよび5mM EDTAからなり1N 水酸化ナトリウム溶液でpH 8に調整された緩衝液と、水酸化ナトリウム溶液1Nとで希釈して、pH 7.8の溶液1.344mLを得た。CPYの溶液(200U/mL, 0.075mL, 15U)を添加した。反応混合物を穏やかに30℃で21h振盪した。100mM イソプロパノール中のフェニルメタン-スルホニルフッ化物(0.0135mL)の溶液100mMを新たに調製し添加した。反応混合物を1日室温で維持した。これを、水中の50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液を溶出剤として用いるHiPrep 26/10 脱塩カラム上でクロマトグラフィに供した。イソプロパノール中のフェニルメタンスルホニルフッ化物 (0.5mL画分体積ごとに0.0045mL)の溶液100mMを新たに調製して、タンパク質を含んだ画分に直ちに添加した。これらの画分を合体させ、10kDa フィルタのカットオフを備えたAmicon Ultra-15 バイアルを用いた超遠心に供した。これらを50mM の重炭酸アンモニウム溶液で希釈し、凍結乾燥させた。
【０３１４】
工程３：  水(9.17mL)中の硫酸銅(II)五水和物(41mg, 0.16mmol)の溶液を調製した。水(8.94mL)および2,6-ルチジン(0.229mL)中のアスコルビン酸(145mg, 0.82mmol)の溶液を調製した。両溶液の3.51mLを取り出して混合した。これらを室温で5分放置して銅(I)-塩溶液が形成され、これを5分経過後に直接用いた。
【０３１５】
水(0.862mL)および 2,6-ルチジン(0.18mL)の混合物中の(S)-2-((hGHイルロイシニル)アミノ)-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド(7.08mg, 314nmol)の溶液を、水(0.700mL)中の4-(bis(20kDa mPEGイルカルバモイルオキシメチル)メトキシ)-N-prop-2-イニル酪酸アミド(127mg, 0.003mmol)の溶液に添加した。前記銅(I)-塩溶液0.351mLを添加した。反応混合物を穏やかに20h振盪した。反応混合物を濾過し、TRIS の10mM 緩衝液で希釈して2mLにし、これを1N 塩酸でpH 8.0に調整した。これを、HiLoad 26/60 Superdex 200カラムを用いた、1N 塩酸でpH 8に調整した10mM Tris 緩衝液中でのゲルクロマトグラフィに供した。所望のタンパク質を含んだ画分を合体させ、10kDaのカットオフを備えたAmicon Ultra-15バイアルを用いた超遠心により濃縮した。これを、1N 塩酸でpH 8.5に調整した50mM Tris-緩衝液(20mL)で希釈した。これをMonoQ 10/100 GLカラム上でのイオン交換クロマトグラフィにより精製し、その際に、1N 塩酸でpH 8.5に調整された50mM Tris 緩衝液を緩衝液Ａとして、また1N 塩酸でpH 8.5に調整された50mM Tris/2M 塩化ナトリウム緩衝液を緩衝液Ｂとして用いた。所望のタンパク質を含んだ画分を合体させ、10kDaのカットオフを備えたAmicon Ultra-15バイアルを用いた超遠心により濃縮した。緩衝液を、10kDaのカットオフを備えたAmicon Ultra-15バイアルを用いた超遠心により50mM 重炭酸アンモニウム緩衝液と交換し、凍結乾燥させた。SDS-ゲルは、標題化合物の予期される特徴を有する化合物を示した。
【０３１６】
例11：(S)-2-(hGHイルロイシニルアミノ)-6-(3-((4-((4-(30kDa mPEGy-loxy)ブチリルアミノ)メチル)1,2,3-トリアゾール-1-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド
【化２２１】
2008531482.tif 000192
工程１：  4-(30kDa mPEGイル)-N-(prop-2-イニル)ブタン酸アミド 
【化２２２】
2008531482.tif 000193
2,5-ジオキソピロリジン-1-イル 4-(30kDa mPEGイル)ブタン酸エステル(Nektarで購入, 2.5g, 0.083mmol)を、ジクロロメタン(25mL)中に溶解させた。エチルジイソプロピルアミン(0.071mL, 0.413mmol)およびプロパルギルアミン(0.023mL, 0.33mmol)を連続して添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。沈殿物が形成されるまで、ジエチルエーテルを添加した。混合物を０℃にまで冷却し、沈殿物を、ガラス-フィルタ P1を介する濾過により分離した。分離した物質を、ジクロロメタン(15mL)中のエタノール10％溶液中に溶解させた。Amberlyst 15(2.0g)を使用前にエタノール10％溶液(20mL)で洗浄した後、添加した。混合物をゆっくりと30分撹拌した。Amberlyst-物質を濾過により除去し、ジクロロメタン(20mL)で洗浄した。溶液を真空下で濃縮した。沈殿が発生するまでエーテルを添加した。混合物を０℃にまで冷却した。沈殿物をガラス-フィルタ P1を介する濾過により分離し、真空下で乾燥させて、2.04gの4-(30kDa mPEGイル)-N-(prop-2-イニル)ブタン酸アミドを得た。
【０３１７】
工程２：  (S)-2-((hGHイルロイシニル)アミノ)-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド(11.0mg, 488nmol)の溶液を、水(1.328mL)および 2,6-ルチジン(0.028mL)の混合物中に溶解させた。この溶液を、水(1.00mL)中の4-(30kDa mPEGイル)-N-(prop-2-イニル)ブタン酸アミド(147mg, 4860nmol)の溶液中に濾過した。水(5.44mL)中の硫酸銅(II)五水和物(24.3mg, 0.097mmol)の溶液を、水(5.30mL)および 2,6-ルチジン(0.135mL)の混合物中のアスコルビン酸(85.0mg, 0.488mmol)の溶液に添加することにより、銅(I)-塩溶液を調製した。この銅(I)-塩溶液を5分室温で放置した。この銅(I)-塩溶液の一部(0.544mL)を、タンパク質を含んだ溶液に添加した。反応混合物を穏やかに22h振盪した。溶液を濾過した。フィルタを、水中の25mM Trisからなり1N 塩酸でpH 8.5に調整された緩衝液で洗浄した。水中の25mM Trisからなり1N 塩酸でpH 8.5に調整された緩衝液を流速20mL/分で用いるHiPrep26/10 脱塩カラムを用いたカラム上で、前記溶液を処理した。タンパク質を含んだ画分を回収し、合体させた。タンパク質を、MonoQ 10/100 GLカラム（水中の25mM Trisからなり且つ1N 塩酸でpH 8.5に調節された緩衝液を緩衝液Ａとして、および水中の0.2M 塩化ナトリウムおよび25mM Trisからなり且つ1N 塩酸でpH 8.5に調整された緩衝液を緩衝液Ｂとして用い、100カラム体積上で0〜100％ 緩衝液Ｂの勾配を流速0.50mL/分で適用する）を用いて、イオン交換クロマトグラフィにより精製した。所望のタンパク質を回収し、合体させ、10kDaのカットオフを備えたAmicon Ultra 遠心分離バイアルを用いた超遠心を介して濃縮した。濃縮後、緩衝液を、同様の超遠心バイアルにおいて50mM 炭酸水素アンモニウム 緩衝液と交換した。この物質を凍結乾燥させて、4.6mgの標題化合物を得た。SDSゲルは標題化合物についての予想にしたがう。当該化合物の特徴付けは、銀染色および、Kurfurst(Analytical Biochemistry 1992, 200, 244-248.)による記載にしたがう特定のPEG着色を用いてSDS-ゲルPAGEによりなされた。
【０３１８】
例12：(S)-6-(3-((4-((4-(N-(3-(オメガ-(2,3-bis(20kDa mPEgイルオキシ)プロポキシ)2-5kDa PEGイルオキシ)プロピル)カルバモイル)ブチリルアミノ)メチル)トリアゾール-1-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)2-((hGHイル)ロイシニルアミノ)ヘキサン酸アミド 
【化２２３】
2008531482.tif 000194
工程１：  4-(N-(3-(オメガ-(2,3-Bis(20kDa mPEGイルオキシ)プロポキシ)2-5kDa PEGイルオキシ)プロピル)カルバモイル)-N-(prop-2-イニル)酪酸アミド
【化２２４】
2008531482.tif 000195
2,3-Bis(20kDa PEGイルオキシ)-1-({3-[(1,5-ジオキソ-5-スクシンイミジルオキシペンチル)アミノ]プロポキシ} 2-5kDa PEGイルオキシ)プロパン(NOFから購入，注文番号：Sunbright GL3-400GS2, 1.00g, 0.023mmol)をジクロロメタン(10mL)中に溶解させた。エチルジイソプロピルアミン(0.019mL, 0.113mmol)およびプロパルギルアミン(0.006mL, 0.091mmol)を連続して添加した。反応混合物を16h室温で撹拌した。沈殿物が得られるまでジエチルエーテルを添加した。混合物を０℃に1h維持した。沈殿物を、濾過紙P1を介する濾過により分離した。
【０３１９】
Amberlyst 15 イオン交換物質(1.0g)をジクロロメタン(10mL)および エタノール(1mL)の混合物中に懸濁させた。混合物を穏やかに30分撹拌した。Amberlystを濾過により分離した。
【０３２０】
PEG-試薬の沈殿物をジクロロメタン(10mL)およびエタノール(1mL)の混合物中に溶解させた。Amberlyst 物質を添加した。混合物を穏やかに30分室温で撹拌した。Amberlystを濾過により除去し、ジクロロメタンで洗浄した。合体した溶液を真空下で濃縮しておよそ2mLにした。沈殿物が得られるまでジエチルエーテルを添加した。混合物を０℃に1h維持した。沈殿物を、フィルタ紙P1を介する濾過により分離し、真空下で乾燥させて、0.83gの4-(N-(3-(オメガ-(2,3-bis(20kDa mPEGイルオキシ)ポルポキシ)2-5kDa PEGイルオキシ)プロピル)カルバモイル)-N-(prop-2-イニル)酪酸アミドを得た。
【０３２１】
工程２：  (S)-2-((hGHイルロイシニル)アミノ)-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド(8.23mg, 365nmol)の溶液を、水(0.996mL)および2,6-ルチジン(0.021mL)の混合物中に溶解させた。この溶液を、水(0.75mL)中の4-(N-(3-(オメガ-(2,3-bis(20kDa mPEGイルオキシ)ポルポキシ)2-5kDa PEGイルオキシ)プロピル)カルバモイル)-N-(prop-2-イニル)酪酸アミド(161mg, 3650nmol)の溶液に添加した。水(4.08mL)中の硫酸銅(II)五水和物(18.23mg, 0.073mmol)の溶液を、水(3.98mL)および2,6-ルチジン(0.10mL)の混合物中のアスコルビン酸(64.52mg, 0.366mmol)の溶液と混合させることにより銅(I)塩溶液を調製した。この溶液を5分室温で振盪した。0.41mLのこの銅(I)溶液を取り出し、タンパク質およびPEG-試薬を含んだ溶液に添加した。反応混合物を穏やかに16h室温で振盪した。これを450nm フィルタを介して濾過した。HiPrep 26/10 脱塩カラム(Amersham)を用い、且つ1N 塩酸でpH 8.5に調整された25mM TRIS緩衝液を流速10mL/分で用いるゲル-クロマトグラフィを行った。所望の化合物を含んだ画分を、25mM TRISからなり且つ1N 塩酸(45mL)でpH 8.5に調整された緩衝液で希釈した。イオン交換クロマトグラフィを、MonoQ 10/100 GLカラム(Amersham)を用いて行い、その際、流速0.50mL/分および勾配0〜100％の、0.2M 塩化ナトリウムおよび25mM TRISからなり且つ1N 塩酸でpH 8.5に調節した緩衝液が、1N 塩酸でpH 8.5に調節した25mM TRISの緩衝液中で、25カラム体積に亘って使用された。所望の化合物を含んだ画分を合体させた。この溶液を２つに分配した。各部を、HiPrep 26/10 脱塩カラム(Amersham)と50mM 炭酸水素アンモニウムの溶液を流速10mL/分で用いるゲル-クロマトグラフィに供した。双方の処理から得た所望の生成物を含んだ画分を合体させ、凍結乾燥させて、2.6mgの所望の化合物を得た。この化合物の特徴づけは、銀着色およびKurfurst(Analytical Biochemistry 1992, 200, 244-248.)による記載どおりの特定のPEG 着色を用いたSDS-ゲルPAGEによりなされた。
【０３２２】
例13：(S)-2-((N1アルファ-(4-(2-(2-(2-(2-(4-(bis((20kDa mPEGイルアミノカルボニルオキシ)メチル)メトキシ)ブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)ブチル)hGHイル)ロイシルアミノ)-6-(3-((4-((4-(30kDa mPegイルオキシ)ブチリルアミノ)メチル)-1,2,3-トリアゾール-1-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド
【化２２５】
2008531482.tif 000196
工程１：  (S)-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)-2-((N1アルファ-(4-(2-(2-(2-(2-(4-(bis((20kDa mPEGイルアミノカルボニルオキシ)メチル)メトキシ)ブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)ブチル)hGHイル)ロイシルアミノ)ヘキサン酸アミド
【化２２６】
2008531482.tif 000197
(S)-2-((hGHイルロイシニル)アミノ)-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド(25.8mg, 0.001mmol)を25mM HEPES-緩衝液(0.500mL)（pH 7に調整）中に懸濁させた。エチルジイソプロピルアミン(0.004mL)を添加した。透明な溶液が得られた。25mM HEPES-緩衝液（pH7に調整）(2.050mL)を添加した。溶液を、1N 塩酸(0.040mL)を添加することによりpH 6.98に調整した。4-(2-(2-(2-(2-(4-(bis((20kDa mPEGイルアミノカルボニルオキシ)メチル)メトキシ)ブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)ブタノール(23.39mg, 0.0006mmol)を添加した。シアノホウ化水素ナトリウム(0.025mL, 0.025mmol)を新たに調製し、5h間にわたり添加した。反応混合物を室温で暗所にて16h穏やかに振盪し続けた。反応混合物を濾過した。緩衝液を、HiPrep26/10 脱塩カラム上のクロマトグラフィを介して25mM TRIS-緩衝液pH 8.5と交換した。この溶液を、MonoQ10/100 GLカラム上でのイオン交換クロマトグラフィに供した。試料をカラムに配する際の流速は0.5mL/分であった。溶出について、勾配は、30カラム体積にわたり25mM TRIS-緩衝液中の25mM TRIS/0.2M 塩化ナトリウム緩衝液（ともにpH 8.5に調整）を0〜75％で、続いて25mM TRIS-緩衝液中の25mM TRIS/0.2M 塩化ナトリウム緩衝液（ともにpH 8.5に調整）を75〜100％で、流速4.0mL/分で用いた。所望の化合物を含んだ画分をSDS-ゲル電気泳動法により識別した。これらをプールした。緩衝液をHiPerpe26/10 脱塩カラム上のクロマトグラフィに供することにより、これを50mM 炭酸水素アンモニウム 緩衝液と交換した。物質を凍結乾燥させて、3.8mgの(S)-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)-2-((N1アルファ-(4-(2-(2-(2-(2-(4-(bis((20kDa mPEGイルアミノカルボニルオキシ)メチル)メトキシ)ブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)ブチル)hGHイル)ロイシルアミノ)ヘキサン酸アミドを得た。
【０３２３】
工程２：  水(0.680mL)中の硫酸銅(II)(3.0mg)の溶液を、水(0.66mL)および 2,6-ルチジン(0.015mL)中のアスコルビン酸(10.7mg)の混合物に添加した。この溶液室温で5分放置した。0.068mLのこの溶液を、水(1.18mL)および 2,6-ルチジン(0.020mL)中の(S)-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)-2-((N1アルファ-(4-(2-(2-(2-(2-(4-(bis((20kDa mPE-Gイルアミノカルボニルオキシ)メチル)メトキシ)ブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)ブチル)hGHイル)ロイシルアミノ)ヘキサン酸アミド(3.8mg, 60nmol)および4-(30kDa mPEGイル)-N-(prop-2-イニル)ブタン酸アミド(18.1mg, 600nmol)の溶液に添加した。反応混合物を穏やかに室温で22h振盪した。緩衝液を、HiPrep26/10 脱塩カラム上のクロマトグラフィに供することにより、これを50mM 炭酸水素アンモニウム 緩衝液に変えた。緩衝液を、HiPrep26/10 脱塩カラム上のクロマトグラフィに供することにより、これをさらにpH 8.5に調整された25mM Tris-緩衝液に変えた。この溶液をMonoQ10/100 GLカラム上でのイオン交換クロマトグラフィに供した。サンプルをカラム内に配する際の流速は0.5mL/分であった。溶出について、勾配は、30カラム体積にわたり25mM TRIS-緩衝液中の25mM TRIS/0.2M 塩化ナトリウム緩衝液（ともにpH 8.5に調整）を0〜75％で、続いて25mM TRIS-緩衝液中の25mM TRIS/0.2M 塩化ナトリウム緩衝液（ともにpH 8.5に調整）を75〜100％で、流速4.0mL/分で用いた。所望の化合物を含んだ画分をSDS-ゲル電気泳動法により識別した。これらをプールした。緩衝液をHiPrep26/10 脱塩カラム上のクロマトグラフィに供することにより、これを50mM 炭酸水素アンモニウム 緩衝液と交換した。物質を凍結乾燥させて、0.42mgの(S)-2-((N1アルファ-(4-(2-(2-(2-(2-(4-(bis((20kDa mPEGイルアミノカルボニルオキシ)メチル)メトキシ)ブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)ブチル)hGHイル)ロイシルアミノ)-6-(3-((4-((4-(30kDa mPegイルオキシ)ブチリルアミノ)メチル)-1,2,3-トリアゾール-1-イル)メチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミドを得た。
【０３２４】
例14：(S)-2-{(hGHイルロイシニル)アミノ}-6-{4-(1-(4-(4-(2-(N-(20kDa mPE-Gイル)カルバモイルオキシ)-1-((N-(20kDa mPE-Gイル)カルバモイルオキシ)メチル)エトキシ)ブチリルアミノ)ブトキシイミノ)エチル)ベンゾイルアミノ}ヘキサン酸アミド
工程１：  例３の通りである。
【０３２５】
工程２：  N-(4-(アミノキシ)ブチル)4-(2-((20kDa mPEGイル)カルバモイルオキシ)-1-(((20kDa mPEGイル)カルバモイルオキシ)メチル)エトキシ)ブタン酸アミドを用いたオキシム化
【化２２７】
2008531482.tif 000198
第１の工程からのプールされた画分(3mg/mL, 6mL)を氷浴に供した。氷冷したDMFを添加した(1.32mL, 15％ 最終濃度)。PEG 試薬を添加した(281mg，3-メチルチオ-1プロパノール 0.14M(1mL) 溶液中に約10等量)。MES 緩衝液50mM pH6を添加することにより、体積を8.8mLに調整した。反応混合物の最終pH は6であった。
【０３２６】
反応の経過をAgilent 2100 バイオ分析器での実況(running)分析により追跡した。
【０３２７】
反応混合物を、窒素下にて10日30℃でインキュベートした。
【０３２８】
精製は、１アリクォートの反応混合物で、サイズ排除クロマトグラフィ(Amersham Superdex 200 26/26, 溶出：Tris, HCl 50mM pH8.5, 2.5mL/分)により、続いてイオン交換(MonoQ 10/100GL, Ａ緩衝液：Tris 50mM pH8.5, 緩衝液Ｂ：Ａ＋0.2M NaCl, 100カラム体積にわたり0〜100％Ｂ, 0.5mL/分)により行われた。
【０３２９】
収量：2mgの生成物が分離された(出発hGH-Leu-Ala タンパク質から3.5％)。
【０３３０】
例15：(S)-2-((hGHイルロイシニル)アミノ)-6-(4-(1-((3-((4-(2-(2-(2-(2-(4-(bis((20kDa mPegイルカルバモイルオキシ)メチル)メトキシ)ブチリルアミノ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)エトキシ)ブチリデン)アミノキシ)プロポキシ)イミノ)エチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド
工程１：  例３の通りである。
【０３３１】
工程２：  1,3-ジアミノキシ プロパンを用いたオキシム化：
【化２２８】
2008531482.tif 000199
0.14M 3-メチルチオ-1プロパノール水溶液(28mg, 0.37mM 最終濃度)(3mL)中の出発ケトンの溶液に、0.14M 3-メチルチオ-1プロパノール水溶液(0.4mL)中の1,3-ジアミノキシプロパン(TFA 塩)(68mg, 300等量, 111mM 最終濃度)の溶液を添加した。最終pHは４であった。
【０３３２】
反応をCEにより追跡した。CE分析方法：
キャピラリー電気泳動法を、ダイオードアレイ検出器を備えたHewlett Packard 3D CE系を用いて行った。
【０３３３】
用いた石英ガラス毛細管(Agilent)は、全長64.5、有効長56cmであり、ID 50μmであった。試料は、圧力50mbarで4s注入された。分離は30℃で、電圧+25kV下にて、リン酸塩緩衝液50mM pH2.5を電解液として用いて行われた。分析は200nmで観察された。各実験の間に(Between runs)、塩基性洗浄(basic wash)が行われた：毛細管を水で2分洗浄し、次いで水酸化ナトリウム0.1M で3分、水で2分で洗浄した後、毛細管を電解液で均衡させた。
【０３３４】
反応は1h後に完了した。生成物の識別はMALDI-TOF 分析により確認された。
【０３３５】
MALDI-TOF分析方法：例３，工程１の通りである。m/z= 11301(生成物)(M+2H)2+。
【０３３６】
トリエタノールアミン(45mM)を含んだ緩衝液と3-メチルチオ-1 プロパノール(0.14M)との反応混合物に添加した後、過剰の試薬を、Millipore Amicon Ultra カットオフ10kDでの超濾過（２回）により除去した。残ったタンパク質溶液を、3-メチルチオ-1 プロパノール(0.14M)を添加したのち再び超濾過した（２回）。
【０３３７】
最後に、得れらたタンパク質溶液を脱塩カラム(Amersham Hi-Prep  26/10 脱塩, 溶出剤：Tris 50mM pH8.5, 10mL/分)に供した。次いで3-メチルチオ-1 プロパノール(0.14M)への緩衝液の変更が行われた。最終タンパク質濃度は10mg/mLであった。
【０３３８】
工程３： mPEG2-ButyrALD-40Kを用いたオキシム化
【化２２９】
2008531482.tif 000200
工程２で得られたタンパク質溶液(28mg, 7mg/mL)に、0.14M 3-メチルチオ-1 プロパノール(0.4mL)中のmPEG2-ButyrALD-40K(Nektar #083Y0T01)(164mg, 4.1μモル, 3等量)の溶液を添加した。反応混合物を30℃で48hインキュベートした。
【０３３９】
生成物をイオン交換で精製した(Amersham MonoQ 10/100 GL, Ａ緩衝液：Tris 50mM pH8.5, 緩衝液Ｂ：Ａ＋0.2M NaCl, 0〜50％Ｂを20カラム体積で，50〜100％を3カラム体積で，4mL/分)。
【０３４０】
重炭酸アンモニウムへの緩衝の後に、プールした画分を凍結乾燥させた。
【０３４１】
収量：33mgの生成物を分離した(出発hGH-Leu-Ala タンパク質から33％)。
【０３４２】
例16：(S)-6-(4-(1-(3-((3-(オメガ-(2,3-bis(20kDa mPEGイルオキシ)プロピル)2-5kDa PE-Gイルオキシ) プロピリデン) アミノキシ) プロポキシイミノ) エチル) ベンゾイルアミノ)-2-(((hGHイル)ロイシニル)アミノ)ヘキサン酸アミド
工程１：  例３の通り
工程２：  1,3-ジアミノキシ プロパンを用いたオキシム化：例15の通りであり、例外として反応はpH6.5で行う。反応混合物を18h30℃でインキュベートする。
【０３４３】
ワークアップは例15の工程２に記載の通りであった。
【０３４４】
工程３：  “Sunbright GL3-400AL2”を用いたオキシム化：
【化２３０】
2008531482.tif 000201
0.14M 3-メチルチオ-1 プロパノール(1mL)中の“Sunbright GL3-400AL2”(NOF 生成物)(130mg, 3.2μモル，約3等量)の溶液に、工程２で得られたタンパク質溶液(3mL, 約10mg/mL))を添加した。
【０３４５】
反応混合物を30℃でインキュベートし、続いて反応をAgilent 2100 バイオ分析器で分析した。
【０３４６】
18h 反応時間後、バイオ分析器の統合的結果によれば収率は39％であった。
【０３４７】
生成物をイオン交換(Amersham MonoQ 10/100 GL, Ａ緩衝液：Tris 50mM pH8.5, 緩衝液Ｂ：Ａ＋0.2M NaCl, 0〜50％Ｂを20カラム体積で，50〜100％を3カラム体積で，4mL/分)で精製した。
【０３４８】
重炭酸アンモニウムへの緩衝シフトの後、プールした画分を凍結乾燥させた。
【０３４９】
収量：9mgの生成物を分離した(出発hGH-Leu-Ala タンパク質から10％)。
【０３５０】
例17：(S)-6-(3-(((3-(オメガ-(2,3-bis-(20kDa m-PEGイルオキシ)プロピル)2-5kDa PEGイルオキシ)プロピリジン)アミノキシ)メチル)ベンゾイルアミノ)-2-((hGHイル)ロイシニルアミノ)ヘキサン酸アミド
工程１：  hGH-Leu-Ala with N-((S)-5-アミノ-5-(カルバモイル)ペンチル)-3-(アミノキシメチル)ベンズアミドのPY-触媒によるトランスペプチド化
【化２３１】
2008531482.tif 000202
H2O：ジイソプロピルアミン(100：1 v/v, 0.6mL)中のhGH-Leu-Ala(15mg, 0.5mM 最終濃度)の溶液に、5mM EDTA(0.73mL)を含んだHEPES 緩衝液250mM pH8.5の溶液中のN-((S)-5-アミノ-5-(カルバモイル)ペンチル)-3-(アミノキシメチル)ベンズアミド(86.4mg, 159mM 最終濃度)を添加した。水酸化ナトリウム 10Mを添加することによりpHを8.2に調整した。5mM EDTAを含んだHEPES 緩衝液250mM pH8.5を添加することにより、反応体積を1.32mLに調整した。水(10U/mL 最終濃度)中の酵素(Fluka #21943)の溶液(15U添加)を添加することにより、反応を開始させた。反応混合物を30℃でインキュベートした。
【０３５１】
続いて反応をMALDI 分析により観察した。3h 反応時間後、痕跡量のみの出発物質を検出することができた。 
反応混合物に、トリエタノールアミン(45mM)、3-メチルチオ-1 プロパノール(0.14M)およびPMSF(2mM)を含んだ緩衝液を添加した後、過剰の試薬を、Millipore Amicon Ultra カットオフ10kDでの超濾過(２回)により除去した。残ったタンパク質溶液を、3-メチルチオ-1 プロパノール(0.14M) およびPMSF(2mM)を添加したのち再び超濾過した(２回)。
【０３５２】
最後に、得れらたタンパク質溶液を脱塩カラム(Amersham Hi-Prep  26/10 脱塩, 溶出剤：Tris 50mM pH8.5, 10mL/分)に供した。次いで3-メチルチオ-1 プロパノール(0.14M)への緩衝液の変更が行われた。最終タンパク質濃度は10mg/mLであった。このタンパク質 溶液を次の工程で直接用いた。
【０３５３】
工程２：  “Sunbright GL3-400AL2”を用いたオキシム化：
【化２３２】
2008531482.tif 000203
工程１で得られたタンパク質溶液(1.5mL, 約10mg/mL)を、0.14M 3-メチルチオ-1 プロパノール(0.5mL)中の“Sunbright GL3-400AL2”(NOF生成物)(71mg, 1.6μモル, 約3等量)の溶液に添加した。反応混合物を30℃でインキュベートした。
【０３５４】
24h反応時間後、生成物をイオン交換(Amersham MonoQ 10/100 GL, Ａ緩衝液：Tris 50mM pH8.5, 緩衝液Ｂ：Ａ＋0.2M NaCl, 0〜50％Ｂを20カラム体積で，50〜100％を3カラム体積で，4mL/分)で精製した。重炭酸アンモニウムへの緩衝液の変更の後、プールした画分を凍結乾燥させた。
【０３５５】
収量：4mgの生成物を分離した(出発hGH-Leu-Ala タンパク質から9％)。
【０３５６】
例18：(S)-2-アミノ-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミド
【化２３３】
2008531482.tif 000204
工程１：  ピロリジン-2,5-ジオン-1-イル 3-(アジドメチル)安息香酸エステル
【化２３４】
2008531482.tif 000205
2-スクシンイミド-1,1,3,3-テトラメチルウロニウムテトラフルオロ硼酸塩(TSTU, 32.52g, 107mmol)を、N,N-ジメチルホルムアミド(50mL)中の3-(アジドメチル)安息香酸(19.01g, 107mmol)およびトリエチルアミン(14.96mL, 107mmol)の溶液に添加した。反応混合物を16h室温で撹拌した。これを酢酸エチル(250mL)で希釈し、水で洗浄した(3 x 120mL)。有機層を炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(150mL)で洗浄し、硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、25.22gのピロリジン-2,5-ジオン-1-イル 3-(アジドメチル)安息香酸エステルを得た。
【０３５７】
1H-NMR(CDCl3) δ 2.92(m, 4H); 4,45(s, 2H); 7.55(t, 1H), 7.65(d, 2H); 8.10(m, 2H)。
【０３５８】
工程２：  (S)-6-(3-(アミノメチル)ベンゾイルアミノ)2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸アミド
【化２３５】
2008531482.tif 000206
粗製(S)-5-アミノ-1-(カルバモイル)ペンチル)カルバミン酸 tert-ブチルエステル(10.26g, 41.82mmol)をN,N-ジメチルホルムアミド(150mL)中に溶解させた。ピロリジン-2,5-ジオン-1-イル 3-(アジドメチル)安息香酸エステル(11.47g, 41.822mmol)およびエチルジイソプロピルアミン(21.48mL, 125.5mmol)を連続して添加した。反応混合物を16h室温で撹拌した。これを酢酸エチル(500mL)で希釈し、最初に10％硫酸水素ナトリウム水溶液(200mL)、水(3 x 250mL)、および炭酸水素ナトリウム飽和水溶液(200mL)で洗浄した。これを硫酸ナトリウム上で乾燥させた。溶媒を真空下で除去して、6.05gの(S)-6-(3-(アミノメチル)ベンゾイルアミノ)2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸アミドを得た。
【０３５９】
1H-NMR(CDCl3) δ 1.40(s, 9H); 1.63(m, 4H); 1.83(m, 2H); 3.43(q, 2H); 4.15(m, 1H); 4.37(s, 2H); 5.56(d, 1H); 6.08(s, 1H); 6.75(s, 1H); 7.00(s, 1H); 7.43(m, 2H); 7.77(m, 2H)。MS：m/z＝427(M+Na)+, 305(M-Boc)+。
【０３６０】
工程３：  気体の塩化水素を、酢酸エチル(75mL)中の(S)-6-(3-(アミノメチル)ベンゾイルアミノ)2-(tert-ブトキシカルボニルアミノ)ヘキサン酸アミド(6.05g, 14.96mmol)の懸濁物中で、それぞれ15分間、２回バブリングさせた。溶媒を真空下で除去した。粗成物を、0.1％トリフルオロ酢酸で緩衝された水中の8〜28％アセトニトリル勾配を用いるC18-逆相カラム上でのHPLC-クロマトグラフィに９回供して、(S)-2-アミノ-6-(3-(アジドメチル)ベンゾイルアミノ)ヘキサン酸アミドのトリフルオロ酢酸の塩とともに精製した。
【０３６１】
HPLC：6.53分(方法02-b1-2)。1H-NMR(DMSO-d6) δ 1.36(m, 2H); 1.55(m, 2H); 1.75(m, 2H); 3.26(q, 2H); 3.70(m, 1H); 4.53(s, 2H); 7.52(m, 3H); 7.84(m, 3H); 8.06(br, 3H); 8.54(t, 1H)。MS：m/z＝305(M+1)+。
【０３６２】
＜薬理学的方法＞
試験(I)  成長ホルモン活性を決定するためのBAF-3GHR試験
BAF-3細胞（骨髄由来のマウスプロ-Bリンパ細胞株）は、本来、生育および生存においてIL-3依存性であった。IL-3は、JAK-2およびSTATを活性化するが、これらは、GHにより刺激を受けて活性化される、同様の介在物質である。ヒト成長ホルモン受容体の形質移入の後、細胞株は、成長ホルモン依存型の細胞株となった。このクローンは、様々な成長ホルモンサンプルのBAF-3GHRの生存における効果を評価するために使用することができる。
【０３６３】
BAF-3GHR細胞株を、37℃、５％CO2下、飢餓培地(starvation medium)（成長ホルモンを含まない培地）で２４時間培養した。
【０３６４】
細胞を洗浄し、飢餓培地に再懸濁し、プレートにまいた。10μlの様々な濃度の成長ホルモン化合物もしくはヒト成長ホルモンまたは対照物を細胞に添加し、プレートを、37℃、５％CO2下で68時間培養した。
【０３６５】
AlamarBlue(登録商標)をそれぞれのウェルに加え、次に細胞を更に4時間培養した。AlamarBlue(登録商標)は、酸化還元の指標であり、生得的な細胞性代謝によって減少する。それゆえ、生存細胞数の間接的な尺度となる。
【０３６６】
最後に、細胞の代謝活性を、蛍光プレート測定器で測定した。サンプルの吸光度は、成長ホルモン化合物または対照物で刺激していない細胞を基準とした％で表した。濃度-応答曲線から、活性（50％を示した、細胞を刺激した化合物の量）を算出することができる。
【０３６７】
ここに引用された刊行物、特許出願および特許を含む全ての参考文献は、あたかも各参考文献が個別に且つ具体的にここで援用を指示され、且つその全体がここに記載されたかのように、（法により許容される最大範囲で）それらの全体が本明細書の一部として本願に援用される。
【０３６８】
見出しおよび副見出しは、ここでは便宜的にのみ使用されるもであり、如何なる意味でも本発明を限定するように解釈されるべきではない。
【０３６９】
上記要素の全ての可能な変形例における如何なる組合せも、ここで別途指示しない限り、或いは明らかに文脈に矛盾しない限り、本発明によって包含されるものである。
【０３７０】
本発明を説明する文脈において、「或る（不定冠詞：a）」および「或る（不定冠詞：an）」および「その（定冠詞：the）」の用語、並びに類似の指示語の使用は、ここで特に別途指示しない限り、または明瞭に文脈と矛盾しない限り、単数および複数の両方をカバーするように解釈されるべきである。
【０３７１】
ここで記載する数値の範囲は、該範囲内にある別個の値を個別的に言及する簡略法として働くことを意図したものに過ぎず、特に指示しない限り、それぞれの別個の値は、それぞれがここで個別に記載されたのと同じように本明細書に組み込まれる。特に別途言及しない限り、ここに与えられる全ての正確な値は、対応する概略値を代表するものである（例えば、特定の因子または測定に関して与えられる全ての正確な例示値は、適切な場合には「約」の語によって改変された対応の概略測定値をも提供するとみなすことができる）。
【０３７２】
ここに記載された全ての方法は、別途ここで支持しない限り、または明らかに文脈に矛盾しない限り、如何なる適切な順序でも実施することができる。
【０３７３】
本明細書において、何れかおよび全ての例、または例示的文言（例えば「のような」）の使用は、単に本発明をより良く例示することを意図したものであり、特に指示しない限り、本発明の範囲に対して限定を課するものではない。本明細書中の文言は、特許請求の範囲に記載されていない如何なる要素も、本発明の実施に不可欠であることを示しているように解釈されるべきではない。
【０３７４】
ここでの特許文献の引用および援用は、便宜的にのみなされるものであり、このような特許書類の有効性、特許可能性および／または強制執行能力の如何なる側面をも反映するものではない。
【０３７５】
一つの要素または複数の要素に関して、「含んでなる」、「有する」、「含んだ」または「含有する」のような用語を使用した、本発明の何れかの側面または実施形態のここでの説明は、特に別途言及しない限り、または文脈と明瞭に矛盾しない限り、当該特定の一つの要素または複数の要素「からなる」「実質的にからなる」、または「実質的に含んでなる」本発明の同様の側面または実施形態のための裏付けを提供するものである（例えば、特定の要素を含んでなるものとしてここに記載された組成物は、特に別途言及しない限り、または文脈と明確に矛盾しない限り、当該要素からなる組成物をも記載しているものとして理解されるべきである）。
【０３７６】
本発明は、適用可能な法が許容する最大範囲で、ここに提示された側面または特許請求の範囲に記載の主題の全ての変形例および均等物を含むものである。
【図面の簡単な説明】
【０３７７】
【図１】図１は、Zbasic2mt-D4K-hGH-Leu-AlaをコードするpNNC13.4のベクター地図である。PCR単位複製配列の挿入のために使用されるSac II部位およびBamHI部位を見ることができる。
【図１】
2008531482.tif 000239
【配列表】
2008531482000001.app
【国際調査報告】
2008531482.tif 000240
2008531482.tif 000241
2008531482.tif 000242
2008531482.tif 000243