(57)【要約】  本発明は、ヒトを含む哺乳類における疾病または病態と関連している中枢神経系（ＣＮＳ）の慢性炎症の予防的および／または治療的処置に使用できるＫＡＴＰチャネル開口薬（ＫＣＯ）に関する。ベンゾピラン、シアノグアニジン、チオホルムアミド、ベンゾチアジジン、ピリジル硝酸塩、ピリミジン硫酸塩、シクロブテンジオン、ＤＨＰ関連化合物、第三カルビノール、６−スルホニル−クロメン、１，２，３−トリアゾール、ピリドチアジアジン、ベンゾチアジン、ハロゲノキナゾリンおよびフェニルベンゾイミダゾールを含んでなる群などのＫＣＯ、特に、ジアゾキシド化合物を投与することにより、種々のＣＮＳ病変、例えば、軸索損傷、脳腫瘍、外傷性障害、神経変性、脊髄損傷、ならびに自己免疫疾患および感染症における反応性小膠細胞の応答が低減する。さらに、同位体修飾したＫＣＯも、ＣＮＳの慢性炎症の検出およびモニタリング用診断薬の製造に使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトを含む哺乳類における疾病または病態と関連しているＣＮＳの慢性炎症の予防、治療および／または診断薬の製造のためのＫＡＴＰチャネル開口薬（ＫＣＯ）またはその同位体修飾物の使用。
【請求項２】
前記ＫＡＴＰチャネル開口薬が、ベンゾピラン、シアノグアニジン、チオホルムアミド、ベンゾチアジジン、ピリジル硝酸塩、ピリミジン硫酸塩、シクロブテンジオン、ＤＨＰ関連化合物、第三カルビノール、６−スルホニル−クロメン、１，２，３−トリアゾール、ピリドチアジアジン、ベンゾチアジン、ハロゲノキナゾリンおよびフェニルベンゾイミダゾールからなる群から選択される、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記ＫＡＴＰチャネル開口薬が、ジアゾキシド、クロマカリム、レブクロマカリム、エマカリム、ビマカリム、セリカリム、Ｕ９６５０１、ＲＯ  ３１−６９３０、ＳＤＺ  ＰＣＯ  ４００、ＫＣ−３９９、ＫＣ−５１５、ＢＲＬ  ４９３８１、ＪＴＶ−５０６、ＮＩＰ−１２１、リルマカリム、ピナシジル、アプリカリム、ニコランジル、硫酸ミノキシジル、ＷＡＹ−１５１６１６、ＺＭ−２４４０８５、ＺＤ−６１６９）およびベンゾオキサジンからなる群から選択される、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記疾患がＣＮＳの損傷および／または障害である、請求項２に記載の使用。
【請求項５】
前記ＣＮＳの損傷および／または障害が、脳損傷、脊髄損傷、全虚血、局所虚血、低酸素症、発作、ＣＮＳの血管疾患、神経性眼疾患ならびに外傷性障害からなる群から選択される、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
前記疾患がＣＮＳの腫瘍である、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
前記ＣＮＳの腫瘍が、神経膠腫および神経節膠腫からなる群から選択される、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
前記疾患がＣＮＳ変性疾患である、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
前記ＣＮＳ変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、老年性認知症、タウパシー、アミロイド血管症、黄斑変性、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、脳障害、副腎白質ジストロフィー、クロイツフェルト・ヤコブ病、プリオン関連海綿状脳症、その他のプリオン関連疾患からなる群から選択される、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
前記疾患がＣＮＳの感染症である、請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
前記ＣＮＳの感染症が、ウイルス感染症、寄生虫による感染症、細菌感染症、マイコプラズマ感染症ならびに真菌感染症からなる群から選択される、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記疾患が自己免疫疾患である、請求項２に記載の使用。
【請求項１３】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症およびフェニルケトン尿症からなる群から選択される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記疾患が、栄養、代謝または毒性障害である、請求項２に記載の使用。
【請求項１５】
前記障害が、肝性脳症および鉛中毒からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記病態が脳老化である、請求項２に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＫＡＴＰチャンネル開口薬がジアゾキシドである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１８】
疾病または病態と関連しているＣＮＳの慢性炎症に罹患しているか、または罹患しやすいヒトを含む哺乳類の予防、治療および／または診断方法であって、有効量のＫＡＴＰチャネル開口薬（ＫＣＯ）またはその同位体修飾物を、適量の許容される希釈剤または担体とともに投与することを含む方法。
【請求項１９】
前記ＫＡＴＰチャネル開口薬が、ベンゾピラン、シアノグアニジン、チオホルムアミド、ベンゾチアジジン、ピリジル硝酸塩、ピリミジン硫酸塩、シクロブテンジオン、ＤＨＰ関連化合物、第三カルビノール、６−スルホニル−クロメン、１，２，３−トリアゾール、ピリドチアジアジン、ベンゾチアジン、ハロゲノキナゾリンおよびフェニルベンゾイミダゾールからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＫＡＴＰチャネル開口薬が、ジアゾキシド、クロマカリム、レブクロマカリム、エマカリム、ビマカリム、セリカリム、Ｕ９６５０１、ＲＯ  ３１−６９３０、ＳＤＺ  ＰＣＯ  ４００、ＫＣ−３９９、ＫＣ−５１５、ＢＲＬ  ４９３８１、ＪＴＶ−５０６、ＮＩＰ−１２１、リルマカリム、ピナシジル、アプリカリム、ニコランジル、硫酸ミノキシジル、ＷＡＹ−１５１６１６、ＺＭ−２４４０８５、ＺＤ−６１６９）およびベンゾオキサジンからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記疾患がＣＮＳの損傷および／または障害である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＣＮＳの損傷および／または障害が、脳損傷、脊髄損傷、全虚血、局所虚血、低酸素症、発作、ＣＮＳの血管疾患、神経性眼疾患ならびに外傷性障害からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記疾患がＣＮＳの腫瘍である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＮＳの腫瘍が、神経膠腫および神経節膠腫からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記疾患がＣＮＳ変性疾患である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＮＳ変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、老年性認知症、タウパシー、アミロイド血管症、黄斑変性、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、脳障害、副腎白質ジストロフィー、クロイツフェルト・ヤコブ病、プリオン関連海綿状脳症、その他のプリオン関連疾患からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記疾患がＣＮＳの感染症である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＣＮＳの感染症が、ウイルス感染症、寄生虫による感染症、細菌感染症、マイコプラズマ感染症ならびに真菌感染症からなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記疾患が自己免疫疾患である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記自己免疫疾患が、多発性硬化症およびフェニルケトン尿症からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記疾患が、栄養、代謝または毒性障害である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
前記障害が、肝性脳症および鉛中毒からなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記病態が脳老化である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＫＡＴＰチャンネル開口薬がジアゾキシドである、請求項１８〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、ヒトおよび動物医薬品の分野、具体的には、疾患、特に、中枢神経系の炎症に関連する疾患の治療および診断のための化合物に関する。
【０００２】
背景技術
小膠細胞は、中枢神経系（ＣＮＳ）全域の非重複領域に分布する。小膠細胞とは、機能に関する用語として、脳、脊髄および眼神経構造全域の免疫補助細胞のネットワークを表し、脅威の内在性センサーとしての役割を果たす。小膠細胞は、そのＣＮＳ微小環境の変化に対する感受性が高いことから、前哨としての働きもする(G.W. Kreutzberg, Trends Neurosci. 1996, vol. 19, pp. 312-8参照)。
【０００３】
ニューロン損傷により、それらの遺伝子発現が迅速に変化し、近くの小膠細胞を支援のために活性化させる。その後、活性化された小膠細胞は、星状細胞、乏突起神経膠細胞およびニューロンに影響を及ぼす前炎症性サイトカインを放出し(F. Gonzalez-Scarano et al., Annu. Rev. Neurosci. 1999, vol. 22, pp. 219-40参照)、さらに直接的および間接的（すなわち、小膠細胞によってもたらされる）損傷を増加させるオートクライン回路を形成して、脳損傷を直接促す可能性がある。このように、ＣＮＳにおける小膠細胞の作用は、本来、炎症的様相を呈し、幅広い種類のＣＮＳの慢性（脳、脊髄および神経眼科）障害の発症機序や進行の中心的なものとなっている。慢性炎症は、神経の死や寿命の短縮をもたらす可能性のある数多くのメディエーターの放出を伴う。加齢性ＣＮＳ変性疾患（例えば、多発性硬化症、外傷、発生、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症、ＡＩＤＳ脳炎、副腎白質ジストロフィーおよび脊髄損傷）ならびにＣＮＳの感染症は、慢性炎症の徴候と関係している。
【０００４】
現在のところ、ＣＮＳの慢性炎症の治療には、それらの非特異的な作用と重大な望ましくない副作用の特徴がある。現在の抗炎症薬は、一般に、ＮＳＡＩＤ（非ステロイド系抗炎症薬）とコルチコステロイド、主にグルココルチコイドの２種類に分けられる。
【０００５】
ＮＳＡＩＤは、サリチル酸誘導体（例えば、アスピリン）、インドールおよびインデン酢酸（例えば、インドメタシン）、ヘテロアリール酢酸（例えば、ジクロフェナク）、アリールプロピオン酸（例えば、イブプロフェン）、ならびにエノール酸（例えば、ピロキシカム）などのいくつかの化学的分類に分けられる。ＮＳＡＩＤの抗炎症活性は、主にプロスタグランジン生合成の阻害を介するものである。それらは、小膠細胞の前炎症性サイトカイン（インターロイキン類またはＴＮＦα（腫瘍壊死因子−α）など）の直接的な放出抑制を行わない。ＮＳＡＩＤは、治療活性を共通に持つが、いくつかの望ましくない重篤な副作用も共通に持ち、最も一般的には、胃または腸潰瘍形成（軽度の消化不良および胃酸過多症から潰瘍形成まで）を誘導する傾向があり、時には致命的な結果を伴う。長期にわたってＮＳＡＩＤを使用している患者は、非使用者と比べて、胃腸の重篤有害事象の相対危険率がおよそ３倍高い。これらの薬剤の他の副作用としては、血小板機能障害、妊娠または自然分娩の延長および腎機能の変化等が挙げられる。特定の個体では、血管運動神経性鼻炎、血管神経性浮腫、蕁麻疹および気管支喘息から喉頭浮腫および気管支収縮、低血圧症ならびにショックまでのさまざまな症状を呈する過敏反応が表れる。
【０００６】
コルチコステロイド、主にグルココルチコイド（例えば、プレドニゾン）はまた、遺伝子発現の改変を介しても強力な抗炎症作用を有する。しかし、それらは、病気の根底にある原因に対して対処するものではない。それらは、抗炎症作用を与えるが、炭水化物、タンパク質および脂質代謝の変化、体液および電解質異常、高血圧症、感染に対する感受性の増加、筋疾患、行動障害および白内障、成長停止、ならびに脂肪再分布、線条、斑状出血、座瘡および多毛症などのステロイドの過剰投与特有の影響ももたらす。骨の異化作用は、クッシング症候群における骨粗鬆症の原因でもある。よって、長期にわたるコルチコステロイドによる治療に関連する副作用が生命にかかわる恐れがあり、それらを長期治療に使用する上での重要な制限となっている。
【０００７】
要するに、ＣＮＳの慢性炎症の徴候に関係する疾患の治療のための新規治療薬を提供することが極めて望ましい。
【０００８】
発明の概要
本発明者らは、驚くべきことに、ヒトおよび齧歯類活性化小膠細胞が、心臓および筋組織、ニューロンならびに膵臓β細胞において知られているＫＡＴＰチャネルと類似したＫＡＴＰチャネルを強く発現するということを見出した。この知見により、本発明者らは、小膠細胞の活性化を直接低減し、従って、その前炎症性効果を阻害するという作用を有する新規治療薬を提供する。
【０００９】
活性化小膠細胞がＫＡＴＰチャネルを発現するという事実から、ＫＡＴＰチャネル開口薬（ＫＣＯ）がＣＮＳの炎症性疾患および自己免疫疾患を治療するための治療標的となる。ＫＣＯは、これまで高血圧症、狭心症、冠動脈性心疾患、喘息、尿失禁および脱毛症に対して使用されてきた。本発明者らは、ＫＣＯ、特にジアゾキシドが、種々のＣＮＳ病変、例えば、軸索損傷、脳腫瘍、外傷性障害、神経変性、脊髄損傷、感染症および自己免疫疾患における反応性小膠細胞応答を低減するということを見出した。
【００１０】
よって、本発明は、ヒトを含む哺乳類における疾病または病態と関連しているＣＮＳの慢性炎症の予防、治療および／または診断薬の製造のためのＫＣＯまたはその同位体修飾物の使用に関する。本発明はまた、疾病または病態と関連しているＣＮＳの慢性炎症に罹患しているか、または罹患しやすいヒトを含む哺乳類の予防、治療および／または診断法も提供し、この方法は、有効量のＫＣＯまたはその同位体修飾物を、適量の許容される希釈剤または担体とともに投与することを含む。
【００１１】
ＫＣＯは、著しい化学的多様性を示し、数多くの異なる構造種を含む。それらの構造と活性との関係については、最近、一部分において総説されている(R. Mannhold, Med. Res. Rev. 2004, vol. 24, pp. 213-66参照)。本発明の特定の実施形態では、ＫＣＯは、ベンゾピラン（例えば、クロマカリム、レブクロマカリム、エマカリム、ビマカリム、セリカリム、Ｕ９６５０１、ＲＯ  ３１−６９３０、ＳＤＺ  ＰＣＯ  ４００、ＫＣ−３９９、ＫＣ−５１５、ＢＲＬ  ４９３８１、ＪＴＶ−５０６、ＮＩＰ−１２１およびリルマカリム）、シアノグアニジン（例えば、ピナシジル）、チオホルムアミド（例えば、アプリカリム）、ベンゾチアジジン（例えば、ジアゾキシド）、ピリジル硝酸塩（例えば、ニコランジル）、ピリミジン硫酸塩（例えば、硫酸ミノキシジル）、シクロブテンジオン（例えば、ＷＡＹ−１５１６１６）、ＤＨＰ関連化合物（例えば、ＺＭ−２４４０８５）、第三カルビノール（例えば、ＺＤ−６１６９）、６−スルホニル−クロメン、１，２，３−トリアゾール、ピリドチアジアジン、ベンゾチアジン、ハロゲノキナゾリン、フェニルベンゾイミダゾールおよびベンゾオキサジンからなる群から選択される。より詳細な実施形態では、ＫＣＯは、ベンゾチアジアジン類に属するジアゾキシドである。
【００１２】
本発明の特定の実施形態では、ＣＮＳの慢性炎症は、ＣＮＳの損傷および／または障害、特に、脳損傷、脊髄損傷、全虚血、局所虚血、低酸素症、発作、ＣＮＳの血管疾患、眼神経疾患（例えば、炎症性視神経症および網膜炎）、ならびに外傷性障害と関係する。もう１つの実施形態では、ＣＮＳの慢性炎症は、ＣＮＳの腫瘍、特に、神経膠腫および神経節膠腫と関係する。もう１つの実施形態では、ＣＮＳの慢性炎症は、ＣＮＳ変性疾患と関係する。さらに詳しくは、ＣＮＳ変性疾患は、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、老年性認知症、タウパシー（例えば、ダウン症侯群およびニーマン−ピック病）、アミロイド血管症、黄斑変性、筋萎縮性側索硬化症、多発性硬化症、脳障害、副腎白質ジストロフィー、クロイツフェルト・ヤコブ病、プリオン関連海綿状脳症、その他のあらゆるプリオン関連疾患である。もう１つの実施形態では、ＣＮＳの慢性炎症は、ＣＮＳの感染症、特に、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ脳炎）、寄生虫による感染症（原生動物および後生動物による感染症）、細菌感染症（例えば、化膿性軟膜炎および脳膿瘍）、マイコプラズマ感染症ならびに真菌感染症と関係する。もう１つの実施形態では、ＣＮＳの慢性炎症は、自己免疫疾患、特に、脱髄疾患、例えば、多発性硬化症およびフェニルケトン尿症と関係する。もう１つの実施形態では、ＣＮＳの慢性炎症は、栄養、代謝または毒性障害、特に、肝性脳症および鉛中毒と関係する。もう１つの実施形態では、ＣＮＳの慢性炎症は、脳老化と関係する。
【００１３】
当然のことではあるが、「治療」とは、予防および確立された症状の緩和を含むことを意図している。
【００１４】
当業者ならば、ジアゾキシドなどのＫＣＯについての、経口投与、頬側投与、非経口投与、デポー投与もしくは直腸投与によるか、吸入もしくは通気（口または鼻のいずれかを介する）によるなどの適切な投与を選択するであろう。経口および非経口製剤が好ましい。
【００１５】
ＫＣＯは、経口投与用に、例えば、従来の方法によって薬学上許容される賦形剤を用いて調製される錠剤またはカプセル剤の形態をとってよい。経口投与用の液体製剤は、例えば、液剤、シロップ剤または懸濁剤の形態をとってよいし、あるいは使用前に水もしくは他の好適なビヒクルで構成する乾燥品として提供してもよい。このような液体製剤は、従来の方法によって医薬上許容される添加剤を用いて調製することができる。経口投与用の製剤は、活性化合物が制御放出されるように適切に調剤することができる。
【００１６】
脳、脊髄および眼科処置などの術中のＣＮＳの外科処置用の液体製剤は、例えば、液剤または懸濁剤の形態をとってよいし、あるいは直接塗布する（例えば、散剤、ゲル剤もしくは固相支持体に含浸させたもの）か、または使用前に水もしくは他の好適なビヒクル（例えば、滅菌パイロジェンフリー水）で構成する乾燥品として提供してもよい。このような液体製剤は、従来の方法によって、乳化剤（例えば、レシチンまたはアラビアゴム）；非水性ビヒクル（例えば、扁桃油、油性エステル、エチルアルコールまたは分別植物油）および防腐剤（例えば、メチルもしくはプロピル−ｐ−ヒドロキシ安息香酸塩またはソルビン酸）などの医薬上許容される添加剤を用いて調製することができる。この製剤には、バッファー塩と、場合によって、必要に応じて、生理学的担体（例えば、生理食塩水または乳酸加リンガー液）中の複数の活性物質（例えば、抗生物質）も含めてよい。液剤は、これらの薬剤の大量の経口、静脈（ｉ．ｖ．）、皮下（ｓ．ｃ．）または筋肉（ｉ．ｍ．）投与による望ましくない副作用を回避しながら、ＣＮＳの慢性炎症を予防抑制するために、外科的および診断的処置中の創傷の連続洗浄に使用される。
【００１７】
ＫＣＯは、ボーラス注射または連続注入による非経口投与用に調剤することができる。注射用の処方物は、防腐剤を加えた単位投与形（例えば、アンプルまたは複数回投与用容器で）で提供することができる。組成物は、懸濁液、溶液または油性もしくは水性ビヒクル中のエマルジョンのような形態をとってよく、安定剤または分散剤のような薬剤を含めてもよい。また、有効成分は、使用前に好適なビヒクル（例えば、滅菌パイロジェンフリー水）で構成する散剤形態であってよい。
【００１８】
ＫＣＯは、坐剤または保持浣腸剤（例えば、ココアバターまたは他のグリセリドのような従来の坐剤基剤を含有する）などの直腸用組成物としても調剤することができる。
【００１９】
ＫＣＯは、デポー製剤としても調剤することができる。このような長時間作用性の処方物は、埋植（例えば、ｓ．ｃ．もしくはｉ．ｍ．）によるか、または筋肉注射により投与することができる。そのため、例えば、本発明の化合物は、好適な高分子もしくは疎水性材料を用いて（例えば、許容される油中のエマルションとして）か、またはイオン交換樹脂を用いて、あるいは難溶性誘導体として（例えば、難溶性塩として）調剤される。
【００２０】
ＫＣＯは、経鼻および経眼投与や脳室内注入用に、好適な定量もしくは単位用量装置を介する投与用の液剤として、あるいは好適な送達装置を用いた投与に適した担体を含む混合散剤として調剤することができる。
【００２１】
好適な用量範囲については、当業者ならば一般的に分かるであろう。よって、本発明の条件に用いるために、ＫＣＯが有効であることが分かっている他の条件に適した用量でも化合物を使用することができる。患者の年齢および状態に応じて、日常的に用量を変更することが必要であり、正確な用量は、最終的には医師または獣医の判断によるものとする。また、投与の経路や選択する特定の化合物によっても用量は異なる。好適な用量範囲は、例えば、１日当たり０．０１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは、０．１〜約２００ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは、０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇである。
【００２２】
本発明において有用なＫＣＯは、他のＫＣＯと組み合わせて、かつ／または他の治療薬と組み合わせて投与することができ、便宜な方法によるあらゆる便宜な経路での投与用に調剤することができる。適当な用量については、当業者ならば一般的に分かるであろう。
【００２３】
本発明はまた、ＣＮＳの慢性炎症の診断薬の製造のための同位体修飾したＫＣＯの使用についても言及する。当業者ならば、同位体と技術を適切に選択して、小膠細胞の反応を検出かつ追跡し、そうすることによってＣＮＳの炎症を有する患者の漸進的変化を理解するであろう。機能的脳画像法、例えば、陽電子放射型断層撮影法（ＰＥＴ）、単光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）および核磁気共鳴法（ＮＭＲ）では、ＣＮＳにおける小膠細胞の反応の分布を示す画像を得ることができる。一度活性化すると、小膠細胞は、疾患過程において、特定領域で非常に制限された関与を示す。このことにより、任意の活動性疾患過程の正確な空間位置確認のための診断価値がそれらに与えられる。ＫＣＯは、例えば、１１Ｃ、１３Ｃ、１７Ｆ、３１Ｐ、１Ｈまたは１７Ｏで標識することができる。
【００２４】
説明および特許請求の範囲を通じて、用語「含む」およびその用語の変化形、例えば、「含んでなる」とは、他の技術的特徴、添加剤、成分または工程を排除することを意図したものではない。本願の要約は、引用することにより本明細書の一部とされる。本発明のさらなる目的、利点および特徴は、記載の検討により当業者には明らかになり、本発明の実施によっても分かる。以下の実施例および図面を例として示すが、本発明を限定することを意図するものではない。
【００２５】
特定の実施形態の具体的説明
ジアゾキシドはラット海馬損傷における小膠細胞の反応を低減する
【００２６】
このモデルでは、星状膠細胞および小膠細胞の反応を伴うニューロン欠損を特徴とする神経変性過程を引き起こすラット海馬のグルタミン酸受容体の急性定位過剰活性化を利用する(F. Bernal et al., Hippocampus 2000, vol. 10, pp. 296-304; F. Bernal et al., Exp. Neurol. 2000, vol. 161, pp. 686-95参照)。この神経変性モデルでは、エキセシン（抱水クロラールとペントバルビタールナトリウムの混合物；０．３ｍｌ／１００ｇ体重、ｉ．ｐ．）を用いてラットを麻酔し、Kopf定位フレームに設置し、切歯棒を−３．３ｍｍに設定した。背側海馬を狙って脳内注射をブレグマ後方３．３ｍｍ、外側２．２ｍｍ、硬膜から腹側２．９ｍｍにて行った(G. Paxinos et al., “The rat brain in stereotaxic coordinates”, Sydney: Academic Press 1986参照)。０．５μｌの量を５分間かけて注入した。
【００２７】
異なる４群のラットに、以下のように、２時間の間隔をおいて２回の注射を行った：ａ）シャムラット（ｎ＝４）は、ＰＢＳの注射を２回行った；ｂ）ＡＭＰＡラット（α−アミノ−３−ヒドロキシ−５−メチルイソキサゾール−４−プロピオン酸）（ｎ＝４）は、最初に５．４ｍＭ  ＡＭＰＡの注射を行い、次にＰＢＳの注射を行った；ｃ）ジアゾキシドラット（ｎ＝４）は、５０μＭジアゾキシドの注射を２回行った；ｄ）ＡＭＰＡ＋ジアゾラット（ｎ＝４）は、最初に５．４ｍＭ  ＡＭＰＡ＋５０μＭジアゾキシドの注射を行い、次に５０μＭジアゾキシドの注射を行った。損傷の２４時間後、総てのラットを犠牲にした。
【００２８】
ラットを０．１Ｍリン酸バッファー（ＰＢ，ｐＨ７．４）３００ｍｌ、続いて氷冷固定液３００ｍｌ（流速２０ｍｌ／分）で心臓灌流した。固定液の構成は、ＰＢ中４％（ｗ／ｖ）パラホルムアルデヒドであった。脳を摘出し、ＰＢ中１５％（ｗ／ｖ）スクロースで凍結保護した後、ドライアイスで凍結した。クリオスタット切片（１２μｍ）を背側海馬の位置（ブレグマ−３．３ｍｍ）で得た。イソレクチンＢ４（ＩＢ４）組織化学を行って、小膠細胞の反応を確認した(C.A. Colton et al., J. Histochem. Cytochem. 1992, vol. 40, pp. 505-12参照)。
【００２９】
小膠細胞症領域の評価をＩＢ４陽性に染色された切片で行い、それをコンピューターを使った画像解析システム（ＯＰＴＩＭＡＳ（登録商標），BioScan Inc., Washington, USA）により解析した。ＩＢ４染色された反応性微小細胞を、透過型光学顕微鏡(Axiolab, Zeiss, Gottingen, Germany)に取り付けられた接眼レンズのグリッドを使って倍率×１００で計数した。一元配置分散分析(ANOVA)により群間の差を比較した後、ＬＳＤ事後的検定を行った。結果は、平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表した。総ての解析をコンピュータープログラム  ＳＴＡＴＧＲＡＰＨＩＣＳ(STSC Inc., Rockville, MD, USA)で実施した。
【００３０】
シャム群およびジアゾキシド群において認められた小膠細胞の反応は、類似しており、その範囲はそれぞれ、０．１７±０．０４ｍｍ２および０．１９±０．０３ｍｍ２に達していた。ＡＭＰＡラットでは、強い小膠細胞症がはっきりと表れ、アメーバ様微小細胞が０．４４±０．０７ｍｍ２の範囲に広がっていた。ＡＭＰＡ＋ジアゾ群では、この小膠細胞症の領域は、シャム群やジアゾキシド群と同様の０．１６±０．０２ｍｍ２（ＡＭＰＡ群の３７％）に縮小した（一元配置分散分析による検定結果：Ｆ３，１２＝８．１９；ｐ＝０．００３１）（図１参照）。４つの総ての群で認められた反応性微小細胞の密度は類似であり、シャム群では５０４±８２細胞／ｍｍ２、ジアゾキシド群では５５５±９１細胞／ｍｍ２、ＡＭＰＡ群では６４５±５９細胞／ｍｍ２、ＡＭＰＡ＋ジアゾ群では６０３±５６細胞／ｍｍ２であった。
これらの結果から、ジアゾキシドがシャム群の値に対して小膠細胞の活性化を低減することは明らかである。ジアゾキシドで処置した動物では、ＡＭＰＡで処置した動物と比べて低い小膠細胞の反応が観察された。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】ラット海馬損傷における小膠細胞の反応の低減におけるジアゾキシドの効果を示す図である。ＰＢＳ（シャム(sham)、Ｓ）、ジアゾキシド（ジアゾ）、ＡＭＰＡおよびＡＭＰＡ＋ジアゾの２定位マイクロインジェクションによって誘導された海馬小膠細胞症領域（Ａ、単位ｍｍ２）を表す。２個のアスタリスクは、シャムとｐ＜０．０１において差があることを示している（ＬＳＤ事後的(post-hoc)検定）。
【図１】
2008503548.tif 000002
【国際調査報告】
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