(57)【要約】  高い生産力、生物活性、および長い血清中半減期を有するトランスフェリン部分、ＧＬＰ−１部分およびリンカー部分の改変された融合タンパク質を開示する。好ましい融合タンパク質としては、トランスフェリン部分が、グリコシル化を示さないか、または減少したグリコシル化を示すように改変された融合タンパク質が挙げられる。本発明の融合タンパク質は、ＩＩ型糖尿病、Ｉ型糖尿病、肥満、うっ血性心不全、および非脂肪性の肝疾患を治療するのに有用である。
2008531059.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＰ−１ペプチド、実質的にらせん状ではないポリペプチドリンカー、および、天然型のトランスフェリン分子と比較して低下したグリコシル化を示す改変トランスフェリン（ｍＴｆ）分子を含む融合タンパク質。
【請求項２】
リンカーは、ＰＥＡＰＴＤ、（ＰＥＡＰＴＤ）2、ＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせたＰＥＡＰＴＤ、およびＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせた（ＰＥＡＰＴＤ）2からなる群より選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
リンカーは、リジッドなリンカーを有さない融合タンパク質またはフレキシブルなポリペプチドリンカーを有する融合タンパク質と比較して、実質的に該融合タンパク質発現の生産力を増加させる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
リンカーは、リジッドなリンカーを有さない融合タンパク質またはフレキシブルなポリペプチドリンカーを有する融合タンパク質と比較して、実質的にＧＬＰ−１ペプチドの効力を増加させる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＧＬＰ−１ペプチドは、非融合状態のＧＬＰ−１分子と比較して長い血清中半減期を示す、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ＧＬＰ−１ペプチドは、非融合状態のＧＬＰ−１分子と比較して持続性の生物活性を示す、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ＧＬＰ−１ペプチドは、融合タンパク質のＮ末端、融合タンパク質のＣ末端、または融合タンパク質のＮおよびＣ末端の両方に存在する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
少なくとも２つのＧＬＰ−１ペプチドを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＧＬＰ−１ペプチドは、プロテアーゼによる切断が実質的に少なくなるように改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
切断の前に、融合タンパク質のＮ末端は分泌シグナル配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
シグナル配列は、血清トランスフェリン、ラクトフェリン、メラノトランスフェリン、またはそれらの変異体由来のシグナル配列である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
シグナル配列は、ＨＳＡ／ＭＦα−１ハイブリッドリーダー配列、またはＴｆシグナル配列である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
シグナル配列は、配列番号２のアミノ酸１〜１９を含むＴｆシグナル配列である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ＧＬＰ−１（７−３７）（配列番号６）は改変されている、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
ＧＬＰ−１（７−３７）は、Ａ８がＳ、ＧまたはＶに（配列番号６のＡ２がＳ、ＧまたはＶに）突然変異することによって改変されている、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
ＧＬＰ−１（７−３７）は、Ｋ３４がＱ、ＡまたはＮに（配列番号６のＫ２８がＱ、ＡまたはＮに）突然変異することによって改変されている、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
ＧＬＰ−１（７−３７）は、Ｖ３３〜Ｇ３７（配列番号６のＶ２７〜Ｇ３１）が欠失するように改変されている、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
ＧＬＰ−１は、Ａ３０〜Ｇ３７（配列番号６のＡ２４〜Ｇ３１）が欠失するように改変されている、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
改変されたＧＬＰ−１は、ＧＬＰ−１（７−３７；Ａ８Ｇ，Ｋ３４Ａ）である、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
ｍＴｆ分子は、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）への親和性が減少している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
ｍＴｆ分子は、実質的に血液脳関門を通過しない、請求項２０に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
ｍＴｆ分子は、改変されたラクトフェリン、または改変されたメラノトランスフェリンである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
ｍＴｆタンパク質は、鉄への親和性が減少している、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
ｍＴｆタンパク質は、鉄と結合しない、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
ｍＴｆタンパク質は、Ｎ結合グリコシル化を示さない、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
ｍＴｆタンパク質は、グリコシル化を示さない、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
ｍＴｆタンパク質は、グリコシル化を防止する少なくとも１つの突然変異を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
突然変異は、配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを含むＮ結合グリコシル化部位内であるか、またはそれらに隣接している、請求項２７に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ部位は、配列番号３のアミノ酸Ｎ４１３またはＮ６１１に相当する、請求項２８に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
突然変異は、配列番号３のＮ４１３およびＮ６１１の両方において、Ｎ結合グリコシル化部位内に存在する、請求項２９に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
融合タンパク質は、配列番号１２を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸分子。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３２に記載の核酸分子を含む宿主細胞。
【請求項３６】
請求項３４に記載の宿主細胞を、コードされた融合タンパク質が発現されるような条件下で培養することを含む、融合タンパク質の発現方法。
【請求項３７】
請求項３５に記載の宿主細胞を、コードされた融合タンパク質が発現されるような条件下で培養することを含む、融合タンパク質の発現方法。
【請求項３８】
細胞は、原核細胞または真核細胞である、請求項３４に記載の宿主細胞。
【請求項３９】
細胞は、原核細胞または真核細胞である、請求項３５に記載の宿主細胞。
【請求項４０】
細胞は、酵母細胞である、請求項３８に記載の宿主細胞。
【請求項４１】
細胞は、酵母細胞である、請求項３９に記載の宿主細胞。
【請求項４２】
請求項３２に記載の核酸分子を含む、非ヒトトランスジェニック動物。
【請求項４３】
請求項４２に記載のトランスジェニック動物から融合タンパク質を分離することを含む、融合タンパク質の生産方法。
【請求項４４】
請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、およびキャリアーを含む医薬組成物。
【請求項４５】
対象に、治療上有効な量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、対象の治療方法。
【請求項４６】
対象は、健康な対象と比較して血糖値が高い、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
高い血糖値は、糖尿病に関連する、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
糖尿病は、ＩＩ型糖尿病である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
対象に、治療上有効な量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、対象における血糖値を調節する方法。
【請求項５０】
融合タンパク質は、メトホルミン、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ＮＥＰ２４．１１阻害剤およびグリタゾンからなる群より選択される１種またはそれ以上の物質、またはそれらの誘導体と組み合わせて投与される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、動物の食物摂取を減少させる方法。
【請求項５２】
有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、患者のβ細胞増殖またはβ細胞の質量増加を誘導する方法。
【請求項５３】
有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、インスリン分泌を必要とする患者におけるインスリン分泌の誘導方法。
【請求項５４】
有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、Ｉ型糖尿病の患者の治療方法。
【請求項５５】
有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、動物における胃内容排出を減少させる方法。
【請求項５６】
有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、動物の体重減少の誘導方法。
【請求項５７】
有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、うっ血性心不全の患者の治療方法。
【請求項５８】
有効量の請求項１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質を投与することを含む、非アルコール性、非脂肪性の肝疾患の患者の治療方法。
【請求項５９】
ＧＬＰ−１ペプチド、実質的にらせん状ではないポリペプチドリンカー、およびトランスフェリン分子を含む、融合タンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００５年３月４日付けで出願された米国仮出願第６０／６５８,１４０号、および２００５年３月２２日付けで出願された第６０／６６３,７５７号による優先の利益を主張するもので、これら出願はいずれも参照によりその全体を本明細書に加入する。
【０００２】
ただし、本願は、優先の利益を主張するものではないが、２００３年８月２８日付けで出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／２６８１８（これは、２００３年３月４日付けで出願された米国特許出願第１０／３７８,０９４号の利益を主張するものである）および２００２年８月３０日付けで出願された米国特許出願第１０／２３１,４９４号（これは、２００１年８月３０日付けで出願された米国仮出願第６０／３１５,７４５号および２００１年１１月３０日付けで出願された米国仮出願第６０／３３４,０５９号の利益を主張するものである）に関連しており、これらはいずれも、参照によりその全体を本明細書に加入する。また本願は、優先の利益を主張するものではないが、２００２年８月３０日付けで出願された米国仮出願第６０／４０６,９７７号に関連し、これは参照によりその全体を本明細書に加入する。
【０００３】
本発明は、ＩＩ型糖尿病のような高い血清グルコースレベルに関連する疾患を治療するための、ＧＬＰ−１とトランスフェリンとの融合タンパク質、およびその使用に関する。また本発明の融合タンパク質は、肥満症、Ｉ型糖尿病、うっ血性心不全および非アルコール性、非脂肪性の肝疾患のようなＧＬＰ−１を用いた治療が有益であることがわかっているその他の病気を治療するのにも用いることができる。
【背景技術】
【０００４】
治療用タンパク質またはペプチドは、それらの天然状態では、または組換えによって生産された場合、一般的に、示される血清中での安定期間が短い、またはインビボにおける循環中の半減期が短い、不安定分子である。加えて、これらの分子は、製剤化されると、特に診断や治療のための水性液剤に製剤化されるとかなり不安定であることが多い。
【０００５】
タンパク質様の治療的分子のインビボまたはインビトロでの安定性を高めたり、または促進したりする実用的な液剤はほとんど存在しない。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、タンパク質に結合して、長時間作用型の持続的なタンパク質活性をもたらすことができる物質である。ＰＥＧとの結合によってタンパク質活性が長期間になる場合、必要なタンパク質投与の回数を低減させることができる。しかしながら、ＰＥＧ結合は、タンパク質の治療活性を減少させたり、または破壊したりすることが多い。ある例で、ＰＥＧ結合によってタンパク質の免疫原性を減少させることができる一方で、その他の例では、免疫原性を高める可能性もある。
【０００６】
また、治療用タンパク質またはペプチドは、治療用タンパク質のインビボでの循環中の半減期を長くすることができるタンパク質への融合によっても安定化されている。例えば、アルブミンまたは抗体フラグメントに融合した治療用タンパク質は、非融合状態の治療用タンパク質と比較して延長されたインビボでの循環中の半減期を示し得る。米国特許第５,８７６,９６９号、および、５,７６６,８８３号を参照。
【０００７】
また、その他の血清タンパク質、グリコシル化ヒトトランスフェリン（Ｔｆ）を用いて、治療用タンパク質との融合体を作成し、細胞の内部への送達を標的化したり、または物質を血液脳関門を通過して運搬したりすることもできる。これらのグリコシル化ヒトＴｆを含む融合タンパク質を用いて、このような物質に全長Ｔｆを融合させることによって神経成長因子（ＮＧＦ）または毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）を血液脳関門を通過して標的化することも行われている。米国特許第５,６７２,６８３号、および、５９７７,３０７号を参照。これらの融合タンパク質において、分子のＴｆ部分はグリコシル化され、２個の鉄原子に結合するが、この鉄原子は、Ｔｆがその細胞上の受容体に結合するのに必要であり、さらにこれらの特許の発明者等によれば、ＮＧＦまたはＣＮＴＦ部分を血液脳関門を通過して送達を標的化するのに必要である。また、トランスフェリン融合タンパク質は、グリコシル化トランスフェリンの表面に露出したループ内にＨＩＶ−１プロテアーゼ標的配列を挿入することによって生産されており、このような融合タンパク質は、Ｔｆ受容体を介する細胞の内部への標的化された送達のためのその他の形態のＴｆ融合体を生産する能力を調査することができる（Ａｌｉ等（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３）。
【０００８】
血清トランスフェリン（Ｔｆ）は、分子量８０,０００ダルトンを有する単量体の糖タンパク質であって、循環中に鉄と結合して、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）を介して鉄を様々な組織に輸送する（Ａｉｓｅｎ等（１９８０）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：３５７〜３９３；ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ等（１９８１）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：３５４３〜３５５３，米国特許第５,０２６,６５１号）。Ｔｆは、最も一般的な血清中の分子の１つであり、総血清タンパク質の最大約５〜１０％を構成する。糖鎖欠損トランスフェリンは、アルコール依存症の個体の血液で高値で生じ、グリコシル化トランスフェリンの半減期（約７〜１０日間）よりも長い半減期（約１４〜１７日間）を示す。ｖａｎ  Ｅｉｊｋ等（１９８３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ  １３２：１６７〜１７１，Ｓｔｉｂｌｅｒ（１９９１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３７：２０２９〜２０３７（１９９１），Ａｒｎｄｔ（２００１）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４７（１）：１３〜２７およびＳｔｉｂｌｅｒ等．ｉｎ  “Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｃｏｎｓｕｍｐｔｉｏｎ”，Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，（Ｅｄ  Ｎｏｒｄｍａｎｎ等），Ｐｅｒｇａｍｏｎ，１９８８，第７１巻，３５３〜３５７頁）を参照。
【０００９】
Ｔｆの構造はよく特徴付けられており、さらに、受容体結合、鉄結合および放出、ならびに炭酸イオン結合のメカニズムも解明されている（米国特許第５,０２６,６５１号、５,９８６,０６７号、および、ＭａｃＧｉｌｌｉｖｒａｙ等（１９８３）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８（６）：３５４３〜３５４６）。
【００１０】
また、トランスフェリンやトランスフェリン受容体に結合する抗体は、がん治療として毒物を腫瘍細胞に送達または運搬するのにも使用されており（ＢａｓｅｌｇａおよびＭｅｎｄｅｌｓｏｈｎ，１９９４）、さらにトランスフェリンは、非ウイルス遺伝子治療用ベクターとして細胞にＤＮＡを送達するのに用いられている（Ｆｒａｎｋ等，１９９４；Ｗａｇｎｅｒ等，１９９２）。入り口点としてトランスフェリン受容体を使用してタンパク質を中枢神経系（ＣＮＳ）に送達する能力は、ＣＤ４（Ｗａｌｕｓ等，１９９６）、脳由来神経栄養因子（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ等，１９９４）、グリア細胞由来神経栄養因子（Ａｌｂｅｃｋ等）、血管作用性小腸ペプチド（ｖａｓｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅ）類似体（Ｂｉｃｋｅｌ等，１９９３）、ベータ−アミロイドペプチド（Ｓａｉｔｏ等，１９９５）、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ等，１９９５）などの数種のタンパク質およびペプチドを用いて実証されている。
【００１１】
ＧＬＰ−１は、小腸分泌Ｌ細胞中プログルカゴン遺伝子産物の翻訳後プロセシングから誘導された３０／３１個のアミノ酸からなる治療用ペプチドである。ＩＩ型糖尿病に罹ったヒトにＧＬＰ−１を注入すると、インスリン分泌を刺激して、グルコース依存的に血糖を低下させる（Ｎａｕｃｋ，Ｍ．，２００４，Ｈｏｒｍ．Ｍｅｔａｂ．Ｒｅｓ．３６：８５２〜８５８；Ｖｉｌｓｂｏｌｌ等，２００４，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．４７：３５７〜３６６；および、Ｚａｎｄｅｒ等，２００２，Ｌａｎｃｅｔ．３５９：８２４〜８３０）。またＧＬＰ−１は満腹を促進し、胃内容排出を阻害することも見出されている（Ｚａｎｄｅｒ等，２００２，Ｌａｎｃｅｔ．３５９：８２４〜８３０；Ｇｕｔｚｗｉｌｌｅｒ等，１９９９，Ｇｕｔ．４４：８１〜８６；Ｍｅｉｅｒ等，２００２，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４４０：２６９〜２７９；およびＦｌｉｎｔ等，２００１，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．Ｒｅｌａｔ．Ｍｅｔａｂ．Ｄｉｓｏｒｄ．２５：７８１〜７９２）。ＧＬＰ−１の注入は、齧歯類のランゲルハンス島における、インスリン生合成の増加、ならびにβ細胞増殖およびβ細胞の質量増加を引き起こす（Ｐｅｒｆｅｔｔｉ等，２０００，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１４１：４６００〜４６０５；Ｗａｎｇ等，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２８８３〜２８８９；およびＳｔｏｆｆｅｒｓ等，２０００，Ｄｉａｂｅｔｅｓ．４９：７４１〜７４８）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
全長の活性ＧＬＰ−１は、ジペプチジルペプチダーゼＩＶ（ＤＰＰＩＶ）がペプチドのＮ末端におけるそれぞれ第二および第三の位置にあるアラニンとグルタミン酸との間を切断することによる迅速な酵素的不活化のために、循環中の半減期は１〜２分間と短い（Ｋｉｅｆｆｅｒ等，１９９５，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．１３６：３５８５〜３５９６）。２８／２９個のアミノ酸を含むＧＬＰ−１の残りのフラグメントは、インスリン分泌刺激性ではなく、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）によってさらに切断される（ＫｎｕｄｓｅｎおよびＰｒｉｄｅｌ，１９９６，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．３１８：４２９〜４３５、ならびにＰｌａｍｂｏｅｃｋ等，２００５，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ．４８：１８８２〜１８９０）。ＧＬＰ−１の単回非経口注射では数分以内に循環中から消失するため、長期間分解抵抗性のＧＬＰ−１の必要性が存在する。
【００１３】
最近、アメリカドクトカゲ（Ｇｉｌａ  ｍｏｎｓｔｅｒ）の唾液腺における体内産物の強力なＧＬＰ−１受容体アゴニストであるエキセンジン−４（ｅｘｅｎｄｉｎｅ−４）が、ＩＩ型糖尿病患者の治療に認可された（Ｐａｒｋｓ等，２００１，Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．５０：５８３〜５８９；ＡｚｉｚおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，２００２，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１３２：９９０〜９９５；およびＥｇａｎ等，２００２，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８７：１２８２〜１２９０）。エキセンジン−４は、ＧＬＰ−１と同様にインスリン分泌刺激性であり、食物摂取と胃内容排出を阻害し、齧歯類においてβ細胞に栄養を与える。さらに、エキセンジン−４は、そのＮ末端の位置２にグリシンが存在するために、ＤＰＰＩＶの基質ではない。エキセンジン−４の使用のマイナス面は、エキセンジン−４の半減期はわずか２〜４時間であるために、１日２回注射しなければならないことにある（Ｋｏｌｔｅｒｍａｎ等，２００３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．Ｍｅｔａｂ．８８：３０８２〜３０８９およびＦｉｎｅｍａｎ等，２００３，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｃａｒｅ．２６：２３７０〜２３７７）。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
従って、長期間分解抵抗性のＧＬＰ−１分子の必要性がなお存在する。本発明は、生物活性を維持または増加させつつ、ＧＬＰ−１タンパク質のインビボでの循環中の半減期を延長するトランスフェリンおよびＧＬＰ−１融合タンパク質を提供することによってこの必要性を満たす。
【００１５】
発明の要約
以下でより詳細に説明するように、本発明は、ＧＬＰ−１ペプチド、実質的にらせん状ではないポリペプチドリンカー、および改変（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）トランスフェリン（ｍＴｆ）分子を含む融合タンパク質を含む。一実施態様において、本融合タンパク質は、天然型のトランスフェリンタンパク質と比較して減少したグリコシル化を示す。
【００１６】
本発明のリンカー部分は、ＧＬＰ−１部分を、改変トランスフェリン部分に連結する。一実施態様において、本リンカーは、ＰＥＡＰＴＤ（配列番号１３）、ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号１０）、ＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせたＰＥＡＰＴＤ（配列番号１１８〜１２３および１２６〜１２９）およびＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせたＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤからなる群より選択される。
【００１７】
本発明のＧＬＰ−１部分は、改変されていてもよい。一実施態様において、ＧＬＰ−１部分は、プロテアーゼによる切断が阻害されるように改変されていてもよい。例えば、ＧＬＰ−１（７〜３６）または（７〜３６）部分は、Ａ８からＳ、ＧまたはＶへの突然変異（配列番号６のＡ２に相当する）および／またはＫ３４からＱ、ＡまたはＮへの突然変異（配列番号６のＫ２８に相当する）によって改変されていてもよい。
【００１８】
ＧＬＰ−１／実質的にらせん状ではないポリペプチドリンカー／本発明のｍＴｆ融合タンパク質は、実質的にらせん状ではないリンカーを有さない類似の融合タンパク質と比較して、高い発現の生産力を示す。さらに、ＧＬＰ−１／実質的にらせん状ではないポリペプチドリンカー／本発明のｍＴｆ融合タンパク質は、フレキシブルなポリペプチドリンカーを有する類似の融合タンパク質と比較して、高い発現の生産力を示す。
【００１９】
その他の実施態様において、ＧＬＰ−１／実質的にらせん状ではないポリペプチドリンカー／ｍＴｆ融合タンパク質は、このようなリンカーの結果として、リンカーを有さない類似のＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質と比較して、または、フレキシブルなリンカーを有する類似のＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質と比較して、少なくとも１種の活性において実質的な増加を示す。例えば、本発明の融合タンパク質は、リンカーを有さない、またはフレキシブルなリンカーを有する類似のＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質と比較して、実質的に血糖値を減少させ、さらに実質的にインスリン分泌を誘導することができる。
【００２０】
また、本発明の融合タンパク質は、非融合状態のＧＬＰ−１分子と比較して延長された半減期および持続性の生物活性も示す。
【００２１】
さらに考察すると、本発明の融合タンパク質は、さらなる改変を含んでいてもよい。例えば、切断の前に、本融合タンパク質のＮ末端は分泌シグナル配列を含んでいてもよい。Ｔｆ部分は、Ｔｆ部分が鉄と結合しないように改変されていてもよい。さらに、Ｔｆ部分は、Ｔｆ部分がＮ結合グリコシル化またはＯ結合グリコシル化を示さないように改変されていてもよい。例えば、ｍＴｆ部分は、配列Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔを含むＮ結合グリコシル化部位内に、またはそれらに隣接して突然変異を含んでいてもよい。一実施態様において、ｍＴｆ部分は、Ｎ４１３および／またはＮ６１１に、またはそれらに隣接するＳ／Ｔ残基に突然変異を含む。
【００２２】
本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子は、ベクターにクローニングして、宿主細胞で発現させてもよい。本発明の一実施態様において、宿主細胞を培養して融合タンパク質を発現させ、得られたタンパク質を分離する。例えば、本発明の融合タンパク質は、酵母で発現させ、次に単離し、精製することができる。また、本発明の融合タンパク質は、本発明の融合タンパク質をコードする核酸分子を用いて作出されたトランスジェニック動物からも単離することができる。
【００２３】
本発明は、ＧＬＰ−１／実質的にらせん状ではないポリペプチドリンカー／ｍＴｆ融合タンパク質の医薬組成物を含む。本発明は、ＧＬＰ−１／実質的にらせん状ではないポリペプチドリンカー／ｍＴｆ融合タンパク質を含む医薬組成物を投与することによる、ＩＩ型糖尿病、Ｉ型糖尿病、肥満症、うっ血性心不全、非脂肪性の肝疾患およびその他のふさわしい疾患に罹った患者の治療方法を含む。本融合タンパク質を投与すると血糖値を有効に減少させ、β細胞増殖およびβ細胞の質量増加を誘導し、インスリン分泌を誘導し、胃内容排出を減少させ、満腹感を高めることができる。
【００２４】
図面の簡単な説明
図１は、ヒト（Ｈｕ）トランスフェリン（Ｔｆ）のＮおよびＣドメインのアライメントを示し（配列番号３）、類似性と同一性は強調表示した。
図２Ａ〜２Ｂは、様々な種由来のトランスフェリン配列のアライメントを示す。明るい陰影：類似性；暗い陰影：同一性（配列番号８４〜９０）。
図３は、治療用タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに関するＴｆの表面に露出した多数の挿入部位の位置を示す。
図４は、様々なＧＬＰ−１／ＧＬＰ−２／ｍＴｆ融合タンパク質を構築するのに用いられた、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２リンカーおよびｍＴｆの様々な変異体を示す図である。変異体２〜１０において、ＧＬＰ−１（〜３７）（変異体１，配列番号７１）が、アミノ酸欠失、Ｎ末端アミノ酸付加、および／または、アミノ酸置換で改変されている。変異体２（配列番号７１のアミノ酸１〜３０）。変異体３（配列番号７１のアミノ酸１〜３０）。変異体４（配列番号７２）。変異体５〜８（配列番号７３）。変異体９（アミノ酸１〜２７）。変異体１０（配列番号７１のアミノ酸１〜２３）。変異体ｂ〜ｈにおいて、ＧＬＰ−２（ペプチドａ、配列番号７４）が改変されている。変異体ｂ（配列番号７４のアミノ酸２〜２４）。変異体ｃ〜ｆ（配列番号７５）。変異体ｇ（配列番号７４のアミノ酸１〜２９）。変異体ｈ（配列番号７４のアミノ酸９〜３４）。一例として、融合タンパク質ＨＧＬＰ−１（７−３６）Ｋ３４Ｑ−ＧＬＰ−２（２−３４）Ｋ３０Ａ−ｍＴｆのＮ末端部分を示す（配列番号７５）。この例において、ｍＴｆの二番目の残基もＰｒｏからＳｅｒに改変されている。
図５は、ＣＨＯ細胞にクローニングしたラットＧＬＰ−１受容体を用いたｃＡＭＰ分析における相対的な効力を示す。
図６は、ＥＬＩＳＡおよびインビトロでの生物検定によって測定された、サルにおけるＧＬＰ−１／ｍＴｆの血漿濃度の比較を示す。各ポイントは、３連での測定の平均である。用いられたＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質は、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ，Ｋ３４Ａ）−ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ−ｍＴｆであった。
図７は、ＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）をコードするｐＲＥＸ０５８５（配列番号１１）の制限地図である。
図８ａは、ＧＬＰ−１ＲでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞における様々なの濃度のＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）、ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４に関するｃＡＭＰの最大反応のパーセントを示す。
図８ｂは、ＲＩＮ１０４６．３８細胞における様々なの濃度のＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）に関するインスリンの最大分泌のパーセントを示す。
図８ｃは、分離したラット膵島における様々なの濃度のＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１−Ｔｆでのインスリンの最大の反応のパーセントを示す。
図８ｄは、ＧＬＰ−１−Ｔｆを皮下および静脈内の投与経路で用いて処置したカニクイザルにおける、経時的な血漿のＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）を示す。
図９ａおよびｂは、腹腔内（図９ａ）投与経路および皮下（図９ｂ）投与経路で、ｈＴｆ、１ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１−Ｔｆまたは１０ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１−Ｔｆで処置した非糖尿病マウスにおける経時的血糖を示す。
図１０ａ〜ｄは、ｈＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆで処置したｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖および血漿インスリン分泌量を示す（配列番号１２）。
図１１ａ〜ｄは、ｈＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）で処置した後、５日にわたり１日１回摂食させたｄｂ／ｄｂおよび非糖尿病マウスにおける血糖（図１１ａおよびｃ）と食物摂取（図１１ｂおよびｄ）を示す。図１１ａは、ｈＴｆまたはＧＬＰ−１で処置した正常なマウスにおける経時的な血糖を示す。図１１ｃは、ｈＴｆまたはＧＬＰ−１で処置したｄｂ／ｄｂマウスにおける経時的な血糖を示す。図１１ｂは、ｈＴｆ、または、ＧＬＰ−１−Ｔｆで処置した非糖尿病マウスにおける経時的な食物摂取を示す。図１１ｄは、ｈＴｆ、ＧＬＰ−１−Ｔｆまたはエキセンジン−４で処置したｄｂ／ｄｂマウスにおける経時的な食物摂取を示す。
図１２ａ〜ｃは、ｈＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）で処置したｄｂ／ｄｂマウスの膵臓におけるＢｒｄＵ＋核を示す。
図１３ａは、ＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）で処置したラット由来の血漿におけるＴｆおよびＧＬＰ−１−Ｔｆに相当するフラグメントを示すウェスタンブロットである。
図１３ｂ〜ｃは、腹腔内注入（図１３ｂ）および脳室内注入（図１３ｃ）によってｈＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）で処置したラットの最後野ニューロン、孤束核および視床下部室傍核におけるｃＦｏｓ活性化の画像である。
図１４は、ＧＬＰ−１−ＴｆまたはＴｆで処置したマウスの固定した膵臓からの膵島におけるＧＬＰ−１−Ｔｆで処置してから２４時間後の、免疫蛍光法および共焦点顕微鏡法を用いた画像を示す。
【００２５】
一般的な説明
本発明は、部分的に、ＧＬＰ−１治療用タンパク質が、血清中の治療用タンパク質の半減期を延長するするのに十分なトランスフェリン、改変トランスフェリン、またはトランスフェリンもしくは改変トランスフェリンの部分にＧＬＰ−１治療用タンパク質を遺伝学的に融合させることによって、それらの血清中半減期および／またはインビボでの活性が延長されるように安定化することができるという発明者等による発見に基づく。改変トランスフェリン融合タンパク質は、治療用タンパク質またはペプチドに共有結合したトランスフェリンタンパク質またはドメインを含み、ここにおいて、このトランスフェリン部分は、野生型トランスフェリン配列と比較して１個またはそれ以上のアミノ酸置換、挿入または欠失が含まれるように改変される。一実施態様において、Ｔｆ融合タンパク質は、ＴｆまたはＴｆドメイン内へのグリコシル化を低減または阻害するように操作される。その他の実施態様において、Ｔｆタンパク質またはＴｆドメインは、鉄または炭酸イオンへの結合が低減されるか、もしくはそのような結合が起こらないように、またはＴｆ受容体（ＴｆＲ）への親和性が低減されるか、もしくはそれらへの結合が起こらないように改変される。
【００２６】
また本発明は、ＧＬＰ−１とトランスフェリン分子との間にリンカーを挿入すると、ＧＬＰ−１分子がその受容体に結合するためのＧＬＰ−１分子の安定性と利用可能性を増加させるという発見にも基づく。具体的には、ＧＬＰ−１とｍＴｆとの間のリンカーとしてＧＬＰ−２またはそれらの誘導体を用いることによって、ＧＬＰ−１のその受容体への提示が改善されることが見出された。また、実質的にらせん状ではないリンカー、例えばこれらに限定されないが、ＰＥＡＰＴＤ、（ＰＥＡＰＴＤ）2、ＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせたＰＥＡＰＴＤ（配列番号１１８〜１２３および１２６〜１２９）、およびＩｇＧヒンジリンカーと組み合わせた（ＰＥＡＰＴＤ）2を用いると、実質的に、ＧＬＰ−１の血清中半減期、融合タンパク質発現の生産力、および／または活性を増加させることも見出された。本発明の一実施態様において、第二のＧＬＰ−１またはその誘導体を、ＧＬＰ−１治療用タンパク質とｍＴｆとの間のリンカーとして用いてもよい。
【００２７】
それゆえに、本発明は、トランスフェリン融合タンパク質、本融合タンパク質を含む治療用組成物を含み、さらにＧＬＰ−１とトランスフェリンとの融合タンパク質を投与することによる疾患または障害の治療、予防または改善方法を含む。本発明のＧＬＰ−１お
よびトランスフェリン融合タンパク質は、少なくともＧＬＰ−１治療用タンパク質のフラグメントまたは変異体、少なくとも改変トランスフェリンのフラグメントまたは変異体、およびリンカーを含み、これらは、互いに付随しており、好ましくは遺伝学的な融合（すなわち、このようなトランスフェリン融合タンパク質は、治療用タンパク質の全部または部分をコードするポリヌクレオチドが、フレーム内で改変トランスフェリンの全部または部分をコードするポリヌクレオチドと連結されている核酸を翻訳することによって生成する）、または相互の化学的な接合によって付随している。そのトランスフェリン融合タンパク質の一部のＧＬＰ−１治療用タンパク質について、そのトランスフェリン融合タンパク質のＧＬＰ−１「部分（ｐｏｒｔｉｏｎ）」、「領域」または「部分（ｍｏｉｅｔｙ）」ということがある（例えば、「ＧＬＰ−１治療用タンパク質部分」または「トランスフェリンタンパク質部分」）。同様に、そのトランスフェリン融合タンパク質の一部の実質的にらせん状ではないリンカーまたはＧＬＰ−２リンカーについて、そのトランスフェリン融合タンパク質の「リンカー」またはリンカー「部分」、「領域」または「部分」ということがある。
【００２８】
一実施態様において、本発明は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質、リンカータンパク質および改変された血清トランスフェリンタンパク質を含む、またはこれに代わるものとしてそれらからなる、トランスフェリン融合タンパク質、例えば配列番号１２に相当する融合タンパク質を提供する。その他の実施態様において、本発明は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療活性を有するフラグメント、リンカータンパク質および改変トランスフェリンタンパク質を含む、またはこれに代わるものとしてそれらからなる、トランスフェリン融合タンパク質を提供する。その他の実施態様において、本発明は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質、リンカータンパク質および改変トランスフェリンタンパク質の生物学的に活性なおよび／または治療活性を有する変異体を含む、またはこれに代わるものとしてそれらからなる、トランスフェリン融合タンパク質を提供する。さらなる実施態様において、本発明は、ＧＬＰ−１タンパク質、リンカータンパク質および改変トランスフェリンの生物学的に活性なおよび／または治療活性を有するフラグメントを含むトランスフェリン融合タンパク質を提供する。その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のＧＬＰ−１治療用タンパク質部分は、本治療用タンパク質の活性型である。
【００２９】
特に他の指定がない限り、本明細書で用いられる全ての専門用語や科学用語は、本発明が属する分野の当業者が一般的に理解している意味と同じ意味を有する。好ましい方法および材料を説明するが、本発明の実施または試験において、本明細書で説明されている方法および材料に類似しているか、またはそれらと同等のあらゆる方法および材料を用いることができる。
【００３０】
定義
本明細書で用いられる、トランスフェリン配列において「〜に相当するアミノ酸」または「等しいアミノ酸」は、第一のトランスフェリン配列と、少なくとも第二のトランスフェリン配列との同一性または類似性が最大化されるようにアラインメントすることによって同定される。第二のトランスフェリン配列において等しいアミノ酸を同定するのに用いられる番号は、第一のトランスフェリン配列においてそれに相当するアミノ酸を同定するのに用いられる番号に基づく。ある場合において、これらの語句は、ウサギ血清トランスフェリン中の所定の残基と比較してヒトトランスフェリン中のアミノ酸残基を説明するのに使用される場合がある。
【００３１】
本明細書で用いられる用語「生物活性」または「活性」は、生物学的な環境（すなわち、生体内、またはそれらのインビトロでの模擬環境）においてＧＬＰ−１治療用分子、タンパク質またはペプチドによって行われる機能または一連の活性を意味する。生物活性としては、これらに限定されないが、特許請求した融合タンパク質のＧＬＰ−１治療的分子部分の機能が挙げられ、例えば、これらに限定されないが、インスリン分泌の誘導、血糖降下、食物摂取の抑制、胃内容排出の抑制、β細胞増殖およびβ細胞の質量増加、および神経系におけるｃＦｏｓ活性化が挙げられる。本発明の融合タンパク質またはペプチドが、その治療用タンパク質の天然型の対応物、すなわち融合していない対応物の１種またはそれ以上の生物活性を示す場合、それらは生物学的に活性であるとされる。
【００３２】
ＧＬＰ−２および／または実質的にらせん状ではないリンカーを含む、または含まない融合タンパク質が、インビボまたはインビトロのいずれかで、１種またはそれ以上の生物活性を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、もしくは少なくとも約３００％、またはそれ以上の割合で、その治療用タンパク質の天然型の対応物における同一の１種またはそれ以上の生物活性よりも長い持続時間（すなわち長期間）で示す場合、上記融合タンパク質は実質的に長期間の生物活性を示す。その他の実施態様において、ＧＬＰ−２リンカーおよび／または実質的にらせん状ではないリンカーを有する融合タンパク質が、インビボまたはインビトロのいずれかで、１種またはそれ以上の生物活性を、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％、もしくは少なくとも約３００％、またはそれ以上の割合で、リンカー配列が欠失したＧＬＰ−１およびＴｆ融合タンパク質またはフレキシブルなリンカーを有するＧＬＰ−１およびＴｆ融合タンパク質の上記生物活性またはそれ以上の生物活性よりも長い持続時間（すなわち長期間）で示す場合、上記融合タンパク質は、実質的に長期間の活性を示す。
【００３３】
本明細書で用いられる「結合剤」は、粉末状の材料に粘着性を付与するために用いられる物質である。結合剤は、時には「顆粒化剤」として知られているが、これらは、錠剤の調合物に粘着性を付与するものであり、所望の硬度およびサイズの顆粒を調合することによって、錠剤を圧縮後も確実に無傷のままにし、加えて流動しやすさの性質を改善する。結合剤として一般的に使用される材料としては、スターチ；ゼラチン；糖類、例えばスクロース、グルコース、デキストロース、糖蜜、およびラクトース；天然および合成ゴム類、例えばアラビアゴム、アルギン酸ナトリウム、アイリッシュ・モスの抽出物、パンワールガム（ｐａｎｗａｒ  ｇｕｍ）、ガッティガム、イサポール（ｉｓａｐｏｌ）の殻の粘液、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ヴィーガム（Ｖｅｅｇｕｍ）、微結晶セルロース、微結晶デキストロース、アミロース、およびカラマツのアラボガラクタン（ｌａｒｃｈ  ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ）などが挙げられる。
【００３４】
本明細書で用いられる用語「キャリアー」は、これと共に組成物として投与される、希釈剤、アジュバント、賦形剤またはビヒクルを意味する。このような製薬用キャリアーは、滅菌液が可能であり、例えば、水および油、例えば石油系、動物性、植物性または合成の油、例えば落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油などが挙げられる。
【００３５】
本明細書で用いられる「着色剤」は、錠剤により心地よい外観を付与し、加えて、製造元にとって製造中における製品を制御しやすくし、使用者にとって製品を認識しやすくするための物質である。認可・認証された水溶性ＦＤ＆Ｃ色素、それらの混合物、またはそれらの対応するレーキのいずれも有色の錠剤に使用可能である。色素レーキは、水溶性色素を重金属の水和酸化物に吸着させ、色素の不溶性の形態を生成させることによる組み合わせ物質である。
【００３６】
本明細書で用いられる「希釈剤」は、調合物のかさを増量するために添加される不活性物質であり、錠剤を圧縮するのに実用的なサイズにすることができる。一般的に使用される希釈剤としては、リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、ラクトース、カオリン、マンニトール、塩化ナトリウム、ドライスターチ、粉糖、シリカなどが挙げられる。
【００３７】
本明細書で用いられる「分解させるもの」または「崩壊剤」は、投与後の錠剤の分解または崩壊を促進する物質である。崩壊剤として機能する物質は、スターチ類、クレー類、セルロース類、アルギン類またはゴム類に化学的に分類されている。その他の崩壊剤としては、ヴィーガムＨＶ（Ｖｅｅｇｕｍ  ＨＶ）、メチルセルロース、寒天、ベントナイト、セルロースおよび木材製品、天然スポンジ、カチオン交換樹脂、アルギン酸、グアーガム、シトラスパルプ、架橋ポリビニルピロリドン、カルボキシメチルセルロースなどが挙げられる。
【００３８】
用語「分散性」または「分散性の」は、含水量が、約１０質量％（％ｗ）未満、通常約５％ｗ未満および好ましくは約３％ｗ未満の水分であり；粒度が、約１.０〜５.０μｍの質量中位径（ＭＭＤ）、一般的には１.０〜４.０μｍのＭＭＤ、および好ましくは１.０〜３.０μｍのＭＭＤであり；送達される用量が、ほぼ＞３０％、一般的に＞４０％、好ましくは＞５０％、最も好ましくは＞６０％であり；およびエアロゾル粒子粒度分布が、１.０〜５.０μｍの空気力学的質量中位径（ＭＭＡＤ）、一般的に１.５〜４.５μｍのＭＭＡＤ、および好ましくは１.５〜４.０μｍのＭＭＡＤである乾燥粉末を意味する。
【００３９】
用語「乾燥（した）」とは、組成物が、吸入装置中で粒子が容易に分散してエアロゾルを形成することができるような含水量を有することを意味する。この含水量は、一般的には約１０質量％（％ｗ）未満の水であり、通常は約５％ｗ未満、好ましくは約３％ｗ未満である。
【００４０】
本明細書で用いられる「有効量」は、所望の局所的または全身性の効果および性能を、あらゆる薬物療法に伴う適度なベネフィット・リスク比で提供するのに十分な薬物または薬理活性物質の量を意味する。
【００４１】
本明細書で用いられる「着香料」は、単純なエステル、アルコールおよびアルデヒドから炭水化物および複合的な揮発性油に及び、それらの化学構造において極めて多様である。ほとんど全ての所望タイプの合成着香料が現在入手可能である。
【００４２】
本明細書で用いられる用語「Ｔｆタンパク質のフラグメント」または「Ｔｆタンパク質」または「Ｔｆタンパク質の部分」は、天然に存在するＴｆタンパク質、またはそれらの突然変異体の少なくとも約５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％を含むアミノ酸配列を意味する。
【００４３】
本明細書で用いられる用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連するＤＮＡのあらゆるセグメントを意味する。従って、遺伝子は、これらに限定されないが、それらの発現に必要なコード配列および／または調節配列を含む。また、遺伝子は、例えば他のタンパク質のための認識配列を形成するが発現されないＤＮＡセグメントを含んでいてもよい。遺伝子は、多様な源から得ることができ、例えば対象の源からクローニングしたり、または既知のもしくは予測の配列情報から合成して得ることができ、さらに所望のパラメーターを有するように設計された配列を含んでいてもよい。
【００４４】
本明細書で用いられる「異種ポリヌクレオチド」または「異種核酸」または「異種遺伝子」または「異種配列」または「外因性ＤＮＡセグメント」は、特定の宿主細胞とは異質の源が起源であるポリヌクレオチド、核酸もしくはＤＮＡセグメントを意味し、または同じ起源の場合は、その起源の形態から改変されたポリヌクレオチド、核酸またはＤＮＡセグメントを意味する。宿主細胞中の異種遺伝子は、特定の宿主細胞にとって内因性であるが、改変されている遺伝子を含む。従って、この用語は、細胞にとって外来または異種であるＤＮＡセグメントか、または細胞と同種だが、通常はその要素が見出されない宿主細胞の核酸内の位置に存在しているＤＮＡセグメントを意味する。一例として、酵母細胞にとって天然型であるが、ヒトＴｆ配列に結合したシグナル配列は、異種である。
【００４５】
本明細書で用いられる「分離した」核酸配列は、その他の核酸配列を実質的に含まない核酸配列を意味し、例えば、アガロースゲル電気泳動によって決定される場合、少なくとも約２０％純粋な、好ましくは少なくとも約４０％純粋な、より好ましくは約６０％純粋な、さらにより好ましくは約８０％純粋な、最も好ましくは約９０％純粋な、およびさらに最も好ましくは約９５％純粋な核酸配列を意味する。例えば、分離された核酸配列を遺伝子工学で用いられる標準的なクローニング方法により得て、核酸配列を、その天然の位置から、それらが再生産されると予想される異なる部位に移転させることができる。クローニング方法は、ポリペプチドをコードする核酸配列を含む所望の核酸フラグメントを切り出し、分離すること、そのフラグメントをベクター分子に挿入すること、その組換えベクターを、その核酸配列の複数のコピーまたはクローンが複製されると予想される宿主細胞に組み込むことを含み得る。このような核酸配列としては、ゲノム、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、半合成、合成由来の核酸配列、または、それらの任意の組み合わせが可能である。
【００４６】
本明細書で用いられるように、フレーム内で２種またはそれ以上のＤＮＡコード配列が融合した結果として、ＤＮＡコード配列が融合ポリペプチドに翻訳される場合、その２種またはそれ以上のＤＮＡコード配列は、「連結された」または「融合した」という。用語「融合」は、Ｔｆ融合体に関して用いられる場合、これらに限定されないが、少なくとも１つの治療用タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのＴｆのＮ末端への結合、ＴｆのＣ末端への結合、および／またはＴｆ内での任意の２個のアミノ酸の間への挿入が挙げられる。
【００４７】
本明細書で用いられる「滑沢剤」は、錠剤製造において、錠剤用顆粒の流速を改善すること、ダイスやパンチの表面への錠剤材料の付着を防ぐこと、粒子間摩擦を減少させること、およびダイスの空洞からの錠剤の排出を容易にすることのような多数の性能を発揮する物質である。一般的に使用される滑沢剤としては、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸、および硬化植物油が挙げられる。滑沢剤の典型的な量は、約０.１重量％〜約５質量％の範囲である。
【００４８】
本明細書で用いられる「改変トランスフェリン」は、本明細書で用いられるように、野生型トランスフェリンと比較して、そのアミノ酸配列の少なくとも１つの改変を示すトランスフェリン分子を意味する。
【００４９】
本明細書で用いられる「改変トランスフェリン融合タンパク質」は、本明細書で用いられるように、改変トランスフェリン（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子が、治療用タンパク質（またはそのフラグメントもしくは変異体）の少なくとも１つの分子に融合することによって形成されたタンパク質を意味する。
【００５０】
本明細書で用いられる用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびそれらのポリマーを意味する。特に限定されない限り、これらの用語には、その言及の核酸と類似の結合特性を有し、天然に存在するヌクレオチドに類似した様式で代謝される天然ヌクレオチドの類似体を含む核酸が包含される。特に他の指定がない限り、特定の核酸配列はまた、明示的に指定された配列と同様に明示されていなくとも保存的に改変されたそれらの変異体（例えば、縮重コドンの置換体）および相補配列をも包含する。特に、縮重コドンの置換体は、１またはそれ以上の選択された（または全ての）コドンの第三の位置が混合型の塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換されている配列を生じさせることによって達成することもできる（Ｂａｔｚｅｒ等（１９９１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１；Ｏｈｔｓｕｋａ等（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８；Ｃａｓｓｏｌ等（１９９２）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ等（１９９４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８）。核酸という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ、および遺伝子によってコードされたｍＲＮＡと同じ意味で用いられる。
【００５１】
本明細書で用いられるように、ＤＮＡセグメントがその他のＤＮＡセグメントと機能的に関連して置かれる場合、そのＤＮＡセグメントは、「機能するように連結した」と称される。例えば、シグナル配列のＤＮＡが、本融合タンパク質の分泌に関与する前駆タンパク質として発現する場合、それらは本発明の融合タンパク質をコードするＤＮＡに機能するように連結しており；プロモーターまたはエンハンサーが、配列の転写を刺激する場合、それはコード配列機能するように連結している。一般的に、機能するように連結しているＤＮＡ配列はコンティグであり、シグナル配列または融合タンパク質の場合、いずれもコンティグで、かつリーディング相内である。しかしながら、エンハンサーは、必しもそれらが転写を制御するコード配列とコンティグである必要はない。このような状況において、連結は、都合のよい制限部位、またはそれらの代わりに挿入されたアダプターもしくはリンカーでのライゲーションによって達成される。
【００５２】
本明細書で用いられる「製薬上許容できる」は、生理学的に許容でき、典型的には、ヒトに投与した際にアレルギー性または類似の不都合な反応（例えば胃の不快感、眩暈など）を起こさない物質および組成物を意味する。典型的には、本明細書で用いられる用語「製薬上許容できる」は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されていること、または動物、より具体的にはヒトに使用するために、米国薬局方またはその他の一般的に認定されている薬局方においてリストに載っていることを意味する。
【００５３】
本明細書で用いられる「生理学的に有効な量」は、対象に送達されて、所望の緩和効果または治療効果を与える量である。この量は、各薬物に、さらにそれらの認可された最終的な投与量レベルに、特有の量である。
【００５４】
本明細書で用いられる「効力」は、ＧＬＰ−１が１またはそれ以上の受容体を活性化する能力を意味する。例えば、本発明のＧＬＰ−１／実質的にらせん状ではないリンカー／ｍＴＦ融合タンパク質は、実質的にらせん状ではないリンカーを有さない融合タンパク質と比較してまたはフレキシブルなリンカーを有する融合タンパク質と比較して、少なくとも約１倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２０倍もしくは少なくとも約５０倍、またはそれを超える効力を示すことができる。
【００５５】
本明細書で用いられる用語「粉末」は、微細分散した固体粒子からなる組成物であって、吸入装置中で流動しやすく、容易に分散させることができ、その後、対象が吸入して、粒子が肺に到達して肺胞への浸透が可能になるようなものを意味する。従って、粉末は、「吸引に適した（ｒｅｓｐｉｒａｂｌｅ）」と称される。好ましくは、平均粒度は、直径が約１０ミクロン（μｍ）未満であり、比較的一様な球形形状の分布を有する。より好ましくは、直径が、約７.５μｍ未満、最も好ましくは約５.０μｍ未満である。通常は、このような粒子の粒度分布は、直径が約０.１μｍ〜約５μｍ、具体的には約０.３μｍ〜約５μｍである。
【００５６】
本明細書で用いられる、本融合タンパク質の発現の「生産力」は、宿主細胞系で発現されるタンパク質の能力を意味する。例えば、ＧＬＰ−２リンカーまたは実質的にらせん状ではないリンカーを有するＧＬＰ−１およびＴｆ融合タンパク質は、酵母細胞で発現させることができる。本明細書で用いられる「生産力を実質的に増加させる」とは、宿主中での本融合タンパク質の発現が、上記リンカーが欠失した類似の融合タンパク質またはフレキシブルなポリペプチドリンカーを有する類似の融合タンパク質の発現と比較して、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約２００％または少なくとも約３００％またはそれより高い割合で増加することを意味する。
【００５７】
本明細書で用いられる用語「プロモーター」は、転写を開始させるためのＲＮＡポリメラーゼ結合に関与するＤＮＡ領域を意味する。
【００５８】
本明細書で用いられる「プロテアーゼによる切断」は、プロテアーゼによるＧＬＰ−１の切断を意味する。例えば、ＤＰＰ−ＩＶは、自然状態でＧＬＰ−１を切断するプロテアーゼである。ＧＬＰ−１（７〜３７）のアミノ酸置換Ａ８Ｇは、ＤＰＰ−ＩＶによるこれらのアミノ酸におけるＧＬＰ−１タンパク質切断を阻害することができる。本明細書で用いられるように、「実質的にプロテアーゼによる切断を減少させる」ように改変されているＧＬＰ−１タンパク質とは、天然型のＧＬＰ−１タンパク質と比較して、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１１倍、少なくとも約１２倍、少なくとも約１３倍、少なくとも約１４倍または少なくとも約１５倍多く、またはそれより多くプロテアーゼによる切断を減少させる１またはそれ以上のアミノ酸置換を有するＧＬＰ−１タンパク質である。
【００５９】
本明細書で用いられる用語「組換え」は、遺伝子またはＤＮＡの新しい組み合わせを用いた形質転換を受けた細胞、組織または生物を意味する。
【００６０】
本明細書で用いられる用語「血清中半減期」または「血漿中半減期」は、インビボでの血清ＧＬＰ−１濃度が５０％低下するのに要する時間を意味する。ＧＬＰ−１の血清中半減期が短ければ短いほど、タンパク質が治療効果を発揮できる期間も短くなる。例えば、ＧＬＰ−１ならびにＧＬＰ−２リンカーおよび／もしくは実質的にらせん状ではないリンカーを含む、または含まないＴｆ融合体ペプチドが、測定可能な半減期の増加を示す場合、例えば、融合していないＧＬＰ−１分子と比較して、血清中の中半減期において、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２００倍、少なくとも約３００倍、少なくとも約４００倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約６００倍、少なくとも約７００倍、少なくとも約８００倍、少なくとも約９００倍、少なくとも約１,０００倍、少なくとも約５,０００倍、少なくとも約１０,０００、少なくとも約２５,０００倍、少なくとも約５０,０００倍、少なくとも約７５,０００倍もしくは少なくとも約１００,０００倍、またはそれを超える割合の増加を示す場合、それらは、延長された血清中半減期を示す。
【００６１】
本明細書で用いられる用語「対象」とは、ヒト、哺乳類または動物であり得る。治療される対象は、治療が必要な患者である。
【００６２】
本明細書で用いられる用語「実質的にらせん状ではないリンカー」または「リジッドなリンカー」は、融合タンパク質のＧＬＰ−１とトランスファー部分とを物理的に隔てるリンカーを意味する。「実質的にらせん状ではない」とは、リンカーペプチドが、らせん状（ｈｅｌｉｃａｌ）の形状もしくはらせん形（ｓｐｉｒａｌ）の形状または二次構造を、わずかしか示さないか、または示さないことを意味する。例えば、実質的に非らせんの構造は、約２０％未満のらせん状の形状もしくはらせん形の形状、または二次構造を含んでいてもよい。典型的なアルファヘリックス状のペプチドは右巻きであり（時計回り方向にねじれる）、へリックスの外側に伸長したアミノ酸Ｒ基を含み、このへリックスはアミノ酸３.６個毎に完全に１回転しており、各ペプチド結合のカルボニル基はへリックスの軸に平行して伸長し、へリックス内で、ペプチド結合のＮ−Ｈ基において、その下の４個のアミノ酸に直接向かっており、それらの間には水素結合が形成される。典型的には、らせん状ではないリンカーは、あらゆるアルファへリックス形成を崩壊させるアミノ酸（例えばポリペプチド鎖にキンクを誘導するアミノ酸）を、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％または約１００％含む。
【００６３】
キンクは、アミノ酸残基を改変することによって天然に存在するペプチドに導入することができる。ポリペプチド鎖にキンクを引き起こすアミノ酸としては、例えば、プロリンおよびグリシンアミノ酸残基が挙げられる。例えば、直鎖状のαへリックスのバレル中央における、またはそのほぼ中央におけるプロリンまたはグリシンの付加は、タンパク質を曲げる、すなわちキンクを生じさせると予想される。プロリン残基の導入は、一般的に、グリシン残基の導入よりも大きいキンクを引き起こす。当業者であれば当然ながら、プロリンまたはグリシン残基は、リンカーペプチドのどこに導入してもキンクを生じさせることができる。リンカーペプチドは、キンクを誘導するアミノ酸残基を１種またはそれ以上含んでいてもよい。例えば、実質的にらせん状ではないリンカーは、少なくとも約５％のプロリン含量、少なくとも約１０％のプロリン含量、少なくとも約２０％のプロリン含量、少なくとも約３０％のプロリン含量、少なくとも約４０％のプロリン含量、少なくとも約５０％のプロリン含量、少なくとも約６０％のプロリン含量、少なくとも約７０％のプロリン含量、少なくとも約８０％のプロリン含量、少なくとも約９０％のプロリン含量、少なくとも約９５％のプロリン含量または約１００％のプロリン含量を有していてもよい。
【００６４】
実質的にらせん状ではないリンカーとしては、これらに限定されないが、ＰＥＡＰＴＤ（配列番号１３）、ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号１０）、ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号１４）、ＩｇＧヒンジ（配列番号８８、８９および１１７）、ＰＥＡＰＴＤ＋ＩｇＧヒンジ（配列番号１１８〜１２３および１２６〜１２９）、ＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰＰ（配列番号１７）、ＧＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号１８）、ＰＥＡＧＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号１９）、ＰＥＡＰＴＤＧＥＡＰＴＤ（配列番号２０）、ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＧＴＤ（配列番号２１）、ＰＱＡＰＴＮＰＱＡＰＴＮ（配列番号２２）、およびＰＥＡＰＥＡＰＥＡＰＥＡ（配列番号２３）が挙げられる。典型的には、実質的にらせん状ではないリンカーは、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０または少なくとも約２１個のアミノ酸またはそれより多いアミノ酸を有する。しかしながら、リンカーの長さに上限はない。
【００６５】
本明細書で用いられる「錠剤」は、医薬物質を含む固形の医薬投与形態であり、適切な希釈剤を含んでもよいし、または含まなくてもよく、これは当技術分野でよく知られた圧縮または成形方法のいずれかによって製造される。錠剤は、１９世紀後半から広範に使用されており、それらの人気は未だ続いている。錠剤は、製造元（例えば、製造の簡便さや経済性、安定性、ならびに包装、運送および調剤の際の便利さ）および患者（例えば、投与量の正確性、コンパクトであること、携帯できること、口当たりがいいこと、および投与しやすいこと）の双方に利点を与えることから、投薬形態として依然人気である。錠剤は形状が最も高い頻度で円盤状であるが、円形、卵型、長方形、円柱形または三角形であってもよい。錠剤は、存在する医薬物質の量と目的とする投与方法に応じて、サイズおよび質量が大きく異なる場合もある。錠剤は、２種の一般的な種類に分類され、すなわち（１）圧縮錠剤、および（２）湿製錠剤または粉薬錠剤である。活性成分もしくは治療成分または成分群に加えて、錠剤は、多数の不活性物質または添加剤を含む。このような添加剤の第一の群としては、調合物に十分な圧縮特性を付与するのに役立つ材料であり、例えば、希釈剤、結合剤、および滑沢剤が挙げられる。このような添加剤の第二の群は、完成した錠剤に追加の望ましい物理特性を付与するのに役立つものであり、例えば、崩壊剤、着色料、着香料、および甘味剤である。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「治療上有効な量」は、それらを必要とする対象に投与した場合、治療をもたらすのに十分な、ＧＬＰ−１治療的分子を含むトランスフェリン融合タンパク質の量を意味する。「治療上有効な量」を構成するトランスフェリン融合タンパク質の量は、用いられる治療用タンパク質、身体状態または疾患の重症度、ならびに治療しようとする対象の年齢および体重に応じて様々であると予想されるが、当業者であれば、当業者自身の知識と本開示を考慮して型どおりに決定することができる。
【００６７】
本明細書で用いられる「治療用タンパク質」または「治療的分子」は、１種またはそれ以上の治療活性および／または生物活性を有するＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１フラグメントまたはそれらの変異体もしくは類似体を意味する。本明細書において、ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドという用語は互いに置き換え可能に用いられる。本明細書で用いられるように、「治療活性」を示すポリペプチドまたは「治療活性を有する」タンパク質は、本明細書で説明されているようなまたはそれ以外で当技術分野でよく知られているようなＧＬＰ−１に関連する１種またはそれ以上の既知の生物活性および／または治療活性を有するＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１フラグメントまたはそれらの変異体もしくは類似体である。「治療用タンパク質」は、疾患、身体状態または障害を治療、予防または改善するのに有用なＧＬＰ−１タンパク質または類似体である。このような疾患、身体状態または障害は、ヒトにおけるものでもよいし、またはヒト以外の動物におけるものでもよく、例えば獣医学的な使用におけるものでよい。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「形質転換」は、核酸（すなわち高分子ヌクレオチド）の細胞への導入を意味する。本明細書で用いられる用語「遺伝学的な形質転換」は、ＤＮＡ、特に組換えＤＮＡの細胞への導入および取り込みを意味する。
【００６９】
本明細書で用いられる用語「形質転換体」は、形質転換を受けた細胞、組織または生物を意味する。
【００７０】
本明細書で用いられる用語「導入遺伝子」は、それらが確実に機能するように生物、宿主細胞またはベクターに挿入される核酸を意味する。
【００７１】
本明細書で用いられる用語「トランスジェニック」は、様々な形質転換方法のいずれか１種で、外来または改変された遺伝子、特に改変されたＴｆ融合タンパク質をコードする遺伝子を受け入れた細胞、細胞培養物、生物、細菌、菌類、動物、植物、およびそれらの後代を意味し、ここにおいて、外来または改変された遺伝子は、外来または改変された遺伝子を受け入れた生物種と同一の種由来であってもよいし、またはそれらとは異なる種由来であってもよい。
【００７２】
「変異体群または変異体」は、参照核酸またはポリペプチドとは異なるが、それらの本質的な特性を保持するポリヌクレオチドまたは核酸を意味する。一般的に、変異体は、参照核酸またはポリペプチドと全体に極めて類似しており、多くの領域において同一である。本明細書で用いられる「ＧＬＰ−１変異体」または「ＧＬＰ−１類似体」は、配列が天然型の治療用タンパク質とは異なるが、本明細書の何処かで説明されているようなまたは当技術分野で既知のそれ以外のＧＬＰ−１ペプチドの機能的および／または治療特性を少なくとも１種保持する本発明のトランスフェリン融合タンパク質の、ＧＬＰ−１ペプチド部分を意味する。ＧＬＰ−１変異体および類似体としては、プロテアーゼによる切断を阻害する改変を１種またはそれ以上含むＧＬＰ−１（７〜３７）が挙げられ、このような改変としては、これらに限定されないが、アミノ酸の改変Ａ８ＧおよびＫ３４Ａが挙げられる。
【００７３】
本明細書で用いられる用語「ベクター」は、概して、外因性の核酸をコードするあらゆるプラスミド、ファージミドまたはウイルスを意味する。またこの用語は、ビリオンまたは細胞への核酸の導入を容易にする非プラスミド、非ファージミドおよび非ウイルス化合物、例えばポリリジン化合物などを包含するものと解すべきである。ベクターは、核酸、またはそれらの突然変異体を細胞に送達するための運搬手段として適したウイルスベクターでもよいし、またはベクターはそれと同じ目的に適した非ウイルスベクターでもよい。ＤＮＡを細胞および組織に送達するためのウイルスおよび非ウイルスベクターの例は当技術分野でよく知られており、例えば、Ｍａ等（１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：１２７４４〜１２７４６）に記載されている。ウイルスベクターの例としては、これらに限定されないが、組換えワクシニアウイルス、組換えアデノウイルス、組換えレトロウイルス、組換えアデノ随伴ウイルス、組換えトリポックスウイルス（ａｖｉａｎ  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ）などが挙げられる（Ｃｒａｎａｇｅ等，１９８６，ＥＭＢＯ  Ｊ．５：３０５７〜３０６３；国際特許出願公開ＷＯ９４／１７８１０、１９９４年８月１８日公開；国際特許出願公開ＷＯ９４／２３７４４、１９９４年１０月２７日公開）。非ウイルスベクターの例としては、これらに限定されないが、リポソーム、ＤＮＡのポリアミン誘導体などが挙げられる。
【００７４】
本明細書で用いられる用語「野生型」は、天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。
【００７５】
トランスフェリンおよびトランスフェリンの改変
本発明は、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１類似体、およびトランスフェリンまたは改変されたトランスフェリンを含む融合タンパク質を提供する。本発明の改変されたＴｆ融合タンパク質を作製するのに、あらゆるトランスフェリンが使用可能である。一実施態様において、Ｔｆ融合タンパク質はまた、ＧＬＰ−２および／または実質的にらせん状ではないリンカーをも含む。その他の実施態様において、Ｔｆ融合タンパク質は、治療的分子のＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１類似体に加えて、ＧＬＰ−１リンカーを含む。
【００７６】
本発明の改変されたＴｆ融合タンパク質を作製するのに、あらゆるトランスフェリンが使用可能である。一例として、野生型ヒトＴｆ（Ｔｆ）は、約７５ｋＤａの６７９個のアミノ酸からなるタンパク質（グリコシル化は考慮に入れない）であって、これは２つの主要なドメイン、Ｎ（約３３０個のアミノ酸）およびＣ（約３４０個のアミノ酸）を含み、これらは、遺伝子重複によって生じるようである。ＧｅｎＢａｎｋ登録番号ＮＭ＿００１０６３、ＸＭ＿００２７９３、Ｍ１２５３０、ＸＭ＿０３９８４５、ＸＭ＿０３９８４７、およびＳ９５９３６（www.ncbi.nlm.nih.gov/）（これらはいずれも、参照により配列番号１、２および３を加えてその全体が本明細書に加入される）。この２つのドメインは、経時的に分岐しているが、かなりの程度の同一性／類似性を保持している（図１）。
【００７７】
ＮおよびＣドメインはそれぞれ、さらに２つのサブドメイン、Ｎ１およびＮ２、Ｃ１およびＣ２に分けられる。Ｔｆの機能は、鉄を体の細胞に輸送することである。このプロセスは、Ｔｆ受容体（ＴｆＲ）が介在しており、Ｔｆ受容体は、全ての細胞で、特に活発に増殖する細胞で発現する。ＴｆＲが、Ｔｆの鉄結合型（受容体につき２つの分子が結合している）を認識し、次にエンドサイトーシスが起こり、それによってＴｆＲ／Ｔｆ複合体がエンドソームに輸送され、そのポイントで局所的なｐＨの低下により結合した鉄が放出され、ＴｆＲ／Ｔｆ複合体が細胞表面にリサイクルされ、Ｔｆを放出する（その鉄未結合型はアポＴｆとして知られている）。受容体結合は、ＴｆのＣドメインを介してなされる。グリコシル化されていない鉄結合型Ｔｆが受容体と結合することから、Ｃドメイン中の２つのグリコシル化部位は受容体結合には関与していないようである。
【００７８】
Ｔｆ分子はそれぞれ、２個の鉄イオン（Ｆｅ3+）を運搬することができる。これらは、Ｎ１とＮ２、Ｃ１とＣ２のサブドメインの間の空間で錯化しており、分子のコンフォメーション変化を引き起こす。Ｔｆは、Ｔｆ受容体を介して血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する。
【００７９】
ヒトトランスフェリンにおいて、鉄結合部位は、少なくとも、配列番号３のアミノ酸Ａｓｐ６３（配列番号２のＡｓｐ８２、これは、天然型のＴｆシグナル配列を含む）、Ａｓｐ３９２（配列番号２のＡｓｐ４１１）、Ｔｙｒ９５（配列番号２のＴｙｒ１１４）、Ｔｙｒ４２６（配列番号２のＴｙｒ４４５）、Ｔｙｒ１８８（配列番号２のＴｙｒ２０７）、Ｔｙｒ５１４または５１７（配列番号２のＴｙｒ５３３またはＴｙｒ５３６）、Ｈｉｓ２４９（配列番号２のＨｉｓ２６８）、およびＨｉｓ５８５（配列番号２のＨｉｓ６０４）を含む。ヒンジ領域は、少なくとも、配列番号３のＮドメインのアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７および／または３１６〜３１８、ならびにＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２および／または６５２〜６５８を含む。炭酸結合部位は、少なくとも配列番号３のアミノ酸Ｔｈｒ１２０（配列番号２のＴｈｒ１３９）、Ｔｈｒ４５２（配列番号２のＴｈｒ４７１）、Ａｒｇ１２４（配列番号２のＡｒｇ１４３）、Ａｒｇ４５６（配列番号２のＡｒｇ４７５）、Ａｌａ１２６（配列番号２のＡｌａ１４５）、Ａｌａ４５８（配列番号２のＡｌａ４７７）、Ｇｌｙ１２７（配列番号２のＧｌｙ１４６）、およびＧｌｙ４５９（配列番号２のＧｌｙ４７８）を含む。
【００８０】
本発明の一実施態様において、改変トランスフェリン融合タンパク質は、改変されたヒトトランスフェリンを含むが、あらゆる動物のＴｆ分子を用いてヒトＴｆ変異体を含む本発明の融合タンパク質を生産することができ、このような動物としては、ウシ、ブタ、ヒツジ、イヌ、ウサギ、ラット、マウス、ハムスター、ハリモグラ、カモノハシ、ニワトリ、カエル、イモムシ、サルが挙げられ、加えてその他のウシ科の、イヌ科のおよび鳥類の種も挙げられる。これらのＴｆ配列はいずれも、ＧｅｎＢａｎｋやその他の公開データベースで容易に入手可能である。ヒトＴｆヌクレオチド配列が利用可能であり（配列番号Ｓ１、２および３、ならびに上述の登録番号を参照、www.ncbi.nlm.nih.gov/で利用可能）、これらを用いて、ＴｆまたはＴｆのドメインと、選択された治療的分子との遺伝学的な融合体を作製することができる。また、融合体は、ラクトトランスフェリン（ラクトフェリン）ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿００２３４３）、または、メラノトランスフェリン（ＧｅｎＢａｎｋ登録番号：ＮＭ＿０１３９００、マウスのメラノトランスフェリン）のような関連分子から作製してもよい。
【００８１】
メラノトランスフェリンは、悪性黒色腫細胞において高レベルで見出されたグリコシル化タンパク質であり、最初はヒト黒色腫抗原ｐ９７と命名された（Ｂｒｏｗｎ等，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ，２９６：１７１〜１７３）。これは、ヒト血清トランスフェリン、ヒトラクトフェリンおよびニワトリトランスフェリンと高い配列相同性を有する（Ｂｒｏｗｎ等，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ，２９６：１７１〜１７３；Ｒｏｓｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８６，８３：１２６１〜１２６５）。しかしながら、これらの受容体とは異なり、メラノトランスフェリンに関する細胞受容体が同定されていない。メラノトランスフェリンは鉄と可逆的に結合し、２つの形態で存在するが、そのうちの１つは、グリコシルホスファチジルイノシトールのアンカーによって細胞膜に結合し、他方の形態は、可溶性であり、かつ活発に分泌される（Ｂａｋｅｒ等，１９９２，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，２９８：２１５〜２１８；Ａｌｅｍａｎｙ等，１９９３，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１０４：１１５５〜１１６２；Ｆｏｏｄ等，１９９４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７０１１〜７０１７）。
【００８２】
ラクトフェリン（Ｌｆ）は、防衛作用のある天然の鉄結合性タンパク質であり、抗菌性、抗真菌性、抗ウイルス性、抗腫瘍性および抗炎症性の活性を有することが見出されている。このタンパク質は、通常、正常なフローラに曝露される外分泌物：乳汁、涙、鼻の滲出液、唾液、気管支粘液、胃腸液、頚膣部の粘膜液、および精液に存在している。加えて、Ｌｆは、循環している多形核好中球（ＰＭＮ）の二次的な特殊顆粒の主成分である。そのアポタンパク質は、化膿した領域においてＰＭＮが脱顆粒する際に放出される。Ｌｆの主要な機能は、流体や炎症を起こしている領域中の遊離の鉄を捕捉することであり、それによりフリーラジカルが介在するダメージを抑制し、浸入してくる微生物および新生細胞に金属の利用可能性を減少させることができる。成人における125ＩＬｆの代謝回転速度を試験した研究において、Ｌｆは、肝臓と脾臓に迅速に取り込まれ、肝臓と脾臓において放射活性が数週間残存したことが示されてる（Ｂｅｎｎｅｔｔ等（１９７９），Ｃｌｉｎ．Ｓｃｉ．（Ｌｏｎｄ．）５７：４５３〜４６０）。
【００８３】
一実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンのスプライス変異体を含む。一例において、トランスフェリンのスプライス変異体は、ヒトトランスフェリンのスプライス変異体であり得る。特定の一実施態様において、ヒトトランスフェリンのスプライス変異体は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ６１１４０の変異体であり得る。
【００８４】
その他の実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ラクトフェリンスプライス変異体を含む。一例において、ヒト血清ラクトフェリンスプライス変異体は、好中球のラクトフェリンの新規なスプライス変異体であってもよい。特定の一実施態様において、好中球のラクトフェリンスプライス変異体は、Ｇｅｎｂａｎｋ登録番号ＡＡＡ５９４７９の変異体であり得る。その他の特定の実施態様において、好中球のラクトフェリンスプライス変異体は、以下のアミノ酸配列ＥＤＣＩＡＬＫＧＥＡＤＡ（配列番号５）を含んでいてもよく、この配列には、スプライス変異体（ｓｐｌｉｃｅ  ｖａｒｉａｎｃｅ）の新規の領域が含まれる。
【００８５】
その他の実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、メラノトランスフェリン変異体を含む。
【００８６】
改変されたＴｆ融合体は、どのようなＴｆタンパク質、フラグメント、ドメイン、または操作されたドメインを用いて作製してもよい。例えば、融合タンパク質は、天然型のＴｆシグナル配列を含んで、またはそれを含まないで全長Ｔｆ配列を用いて製造してもよい。また、Ｔｆ融合タンパク質は、単一のＴｆドメイン、例えば個々のＮもしくはＣドメイン、または２Ｎもしくは２Ｃドメインを含むＴｆの改変された形態、を用いて製造してもよい（２００２年８月３０日付けで出願された米国仮出願第６０／４０６,９７７号を参照、これは、参照によりその全体を本明細書に加入する）。いくつかの実施態様において、治療用タンパク質を単一のＣドメインに融合させた融合体を生産してもよく、ここにおいて、Ｃドメインは、グリコシル化を減少、抑制または妨止するように改変されている。その他の実施態様において、Ｔｆグリコシル化部位はＣドメインとＮドメインにそのままで存在するために、単一のＮドメインの使用が有利である。好ましい実施態様は、高レベルで発現される単一のＮドメインを有するＴｆ融合タンパク質である。
【００８７】
本明細書で用いられるように、Ｎ様ドメインとして機能するように改変されたＣ末端ドメインまたはローブは、実質的に天然型または野生型Ｎドメインまたはローブのグリコシル化パターンまたは鉄結合特性と類似したグリコシル化パターンまたは鉄結合特性を示すように改変される。好ましい実施態様において、Ｃドメインまたはローブは、関連するＣドメイン領域またはアミノ酸をそれに相当する天然型または野生型Ｎドメインの領域または部位に存在するＣドメイン領域またはアミノ酸で置換することによって、グリコシル化されず、鉄と結合しないように改変される。
【００８８】
本明細書で用いられるように、「２つのＮドメインまたはローブ」を含むＴｆ部分は、天然型Ｃドメインまたはローブを、天然型、もしくは野生型Ｎドメインもしくはローブ、または改変されたＮドメインもしくはローブ、で置換されるように改変されたＴｆ分子を含むか、または実質的に野生型または改変されたＮドメインと同様に機能するように改変されたＣドメインを含む。
【００８９】
２つのドメインを重ね合わせることによる（スイスＰＤＢビューワー（Ｓｗｉｓｓ  ＰＤＢ  Ｖｉｅｗｅｒ）３．７ｂ２，Ｉｔｅｒａｔｉｖｅ  Ｍａｇｉｃ  Ｆｉｔ）および直接のアミノ酸アライメント（ＣｌｕｓｔａｌＷ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）による２つのドメインの解析により、２つのドメインは経時的に分岐していることが明らかである。アミノ酸アライメントによれば、２つのドメイン間で４２％の同一性と、５９％の類似性が示される。しかしながら、構造的な等価性（ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｅｑｕｉｖａｌｅｎｃｅ）に関して、Ｎドメインの約８０％がＣドメインと合致する。またＣドメインは、Ｎドメインと比較して余分なジスルフィド結合もいくつか有する。
【００９０】
ＮおよびＣドメインに関する分子モデルのアライメントによれば、以下の構造的な等価性が明らかである：
【表１】
2008531059.tif 000003
【００９１】
２つのドメインのジスルフィド結合は、以下のように並べられる：
【表２】
2008531059.tif 000004
【００９２】
一実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブを含む。さらなる実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリンから誘導されたトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブを含む。
【００９３】
その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、およびＨｉｓ２４９からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＮ末端ローブを含む、それらを包含する、またはそれらからなる。
【００９４】
その他の実施態様において、改変トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有する、組換えヒト血清トランスフェリンのＮ末端ローブの突然変異体を含む。
【００９５】
その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、トランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含む、それらを包含する、またはそれらからなる。さらなる実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、ヒト血清トランスフェリンから誘導されたトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含む。
【００９６】
さらなる実施態様において、Ｃ末端ローブの突然変異体はさらに、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１のうち少なくとも１種の突然変異を含み、この突然変異はグリコシル化を不可能にする。
【００９７】
その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含み、ここにおいて、この突然
変異体は、金属に結合する能力を保持する。その代わりの実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＴｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含み、ここにおいて、この突然変異体は、金属に結合する能力が減少している。その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有するトランスフェリンの少なくとも２つのＣ末端ローブを含み、ここにおいて、この突然変異体は、金属に結合する能力を保持せず、実質的にＮドメインと同様に機能する。
【００９８】
いくつかの実施態様において、ＴｆまたはＴｆ部分は、非融合状態のＧＬＰ−１治療用タンパク質のインビボでの循環中の半減期、血清安定性、インビトロでの溶液安定性または生物学的利用率と比較して、ＧＬＰ−１治療用タンパク質のインビボでの循環中の半減期、血清中の安定性、インビトロでの溶液の安定性または生物学的利用率を増加させるのに十分な長さのものとなる。このような安定性、血清中半減期または生物学的利用率における増加は、約５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２００倍、３００倍、４００倍、５００倍、６００倍、７００倍、８００倍、９００倍、１,０００倍、５,０００倍、１０,０００倍、２５,０００倍、５０,０００倍、７５,０００倍または１００,０００倍またはそれ以上であり得る。いくつかの場合には、改変トランスフェリンおよびＧＬＰ−１、さらに任意にＧＬＰ−２および／または実質的にリジッドなリンカーを含むトランスフェリン融合タンパク質は、約１２〜２４時間、約１８〜２４時間、約１日、約３０時間、約３８時間、約４０時間、約４２時間、約４５時間、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、約１０〜２０日もしくはそれを超える日数、約１２〜１８日間または約１４〜１７日間の血清中半減期を示す。
【００９９】
ＴｆのＣドメインが本融合タンパク質の一部である場合、２つのＮ結合グリコシル化部位、配列番号３のＮ４１３およびＮ６１１に相当するアミノ酸残基は、酵母系で発現させるために突然変異していてもよく、それにより、グリコシル化または過剰なマンノシル化を防止し、本融合タンパク質および／または治療用タンパク質の血清中半減期を延長することができる（アシアロ−、または場合によってはモノシアロ−Ｔｆもしくはジシアロ−Ｔｆを生産するため）。Ｎ４１３およびＮ６１１に相当するＴｆアミノ酸に加えて、グリコシル化を防止するまたは実質的に減少させるために、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接する残基に突然変異があってもよい。Ｆｕｎｋ等の米国特許第５,９８６,０６７号を参照。また、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現されたＴｆのＮドメインが、Ｓ３２に単一のヘキソースを有するＯ結合グリコシル化になっていることも報告されており、これも、このようなグリコシル化を防止するように突然変異しているか、または改変されている可能性がある。
【０１００】
従って、本発明の一実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質は、改変トランスフェリン分子を含み、ここにおいて、トランスフェリンは、これらに限定されないが、Ｔｆのアシアロ−、モノシアロ−およびジシアロ形態などの減少したグリコシル化を示す。その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防止するように突然変異した組換えトランスフェリン突然変異体を含む。その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、完全にグリコシル化された組換えトランスフェリン突然変異体を含む。さらなる実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、Ｎ結合グリコシル化を防止するように突然変異した組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、配列番号３のＡｓｎ４１３およびＡｓｎ６１１のうち少なくとも一方が、グリコシル化が不可能なアミノ酸に突然変異している。その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、グリコシル化を防止するまたは実質的に減少させるように突然変異した組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、突然変異は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔグリコシル化部位内の隣接する残基にあってもよく、例えばＳ／Ｔ残基の突然変異であってよい。その上、上記セリンまたはスレオニン残基を突然変異させることによって、グリコシル化を減少させまたは防止することができる。さらに、グリコシル化を防止するために、Ｘをプロリンに変化させることが既知である。
【０１０１】
以下でより詳細に考察されるように、本発明の改変されたＴｆ融合タンパク質はまた、鉄と結合せず、および／またはＴｆ受容体と結合するように設計してもよい。本発明のその他の実施態様において、鉄の結合を保持し、Ｔｆの鉄結合能力を、上皮または内皮細胞膜を通過しておよび／または血液脳関門を通過して、細胞の内部に治療用タンパク質またはペプチドを送達するのに用いてもよい。鉄および／またはＴｆ受容体と結合させるこれらの実施態様は、グリコシル化を減少させまたは防止して治療用タンパク質の血清中半減期を延長させるために設計されることが多い。単独のＮドメインは、鉄が付加されてもＴｆＲに結合しないと予想され、鉄と結合したＣドメインは、ＴｆＲと結合すると予想されるが、完全な分子と同じ親和性は有さない。
【０１０２】
その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、金属イオンに結合する能力を保持しない。その代わりの実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりも弱い金属イオンに対する結合親和性を有する。その代わりの実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりも強い金属イオンに対する結合親和性を有する。
【０１０３】
その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、トランスフェリン受容体に結合する能力を保持しない。例えば、本発明の改変されたＧＬＰ−１およびＴｆ融合タンパク質は、細胞表面のＧＬＰ−１Ｒ受容体に結合する可能性があるが、Ｔｆ受容体には結合しない。このような融合タンパク質は、細胞表面で、すなわち細胞に侵入しなくても治療活性を有する可能性がある。
【０１０４】
その代わりの実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりも弱いトランスフェリン受容体に対する結合親和性を有する。その代わりの実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりも強いトランスフェリン受容体に対する結合親和性を有する。
【０１０５】
その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、炭酸イオンに結合する能力を保持しない。その代わりの実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりも弱い炭酸イオンに対する結合親和性を有する。その代わりの実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、突然変異を有する組換えトランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、野生型血清トランスフェリンよりも強い炭酸イオンに対する結合親和性を有する。
【０１０６】
その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、金属イオンに結合する能力を保持する。その代わりの実施態様において、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、減少した金属イオンに結合する能力を有する。その他の実施態様において、配列番号３のＡｓｐ６３、Ｇｌｙ６５、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９、Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５からなる群より選択される少なくとも１つのアミノ酸残基に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、金属イオンに結合する能力を保持しない。
【０１０７】
その他の実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも強い金属イオンに対する結合親和性を有する（米国特許第５,９８６,０６７号を参照，これは参照によりその全体を本明細書に加入する）。その代わりの実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、野生型ヒト血清トランスフェリンよりも弱い金属イオンに対する結合親和性を有する。さらなる実施態様において、本トランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分は、配列番号３のＬｙｓ２０６またはＨｉｓ２０７に突然変異を有する組換えヒト血清トランスフェリン突然変異体を含み、ここにおいて、この突然変異体は、金属イオンに結合しない。
【０１０８】
本発明のトランスフェリン融合タンパク質を生産するには、利用可能であればどのような技術を用いてもよく、このような技術としては、これらに限定されないが、一般的に利用可能な分子技術が挙げられ、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ等，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，第二版，コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ），１９８９に開示された技術である。当技術分野でよく知られている部位特異的突然変異誘発を行う技術を用いてヌクレオチド置換を行う場合、コードされたアミノ酸の変化が軽度のもの、すなわち保存的アミノ酸置換が好ましいが、特に、Ｔｆ融合タンパク質の改変トランスフェリン部分、例えば、減少したグリコシル化、減少した鉄の結合などを示す改変されたＴｆタンパク質を生産する場合、それ以外の非保存的な置換も同様に考慮される。具体的に考慮されるアミノ酸置換は、短い欠失または挿入、典型的には１〜約３０個のアミノ酸の欠失または挿入；トランスフェリンドメイン間のへの挿入；短いアミノまたはカルボキシル末端の伸長、例えばアミノ末端のメチオニン残基、またはトランスフェリンドメイン間への５０、４０、３０、２０または１０残基未満の短いリンカーペプチド、またはトランスフェリンタンパク質と、治療用タンパク質もしくはペプチド、もしくは精製を容易にする短い伸長、例えばポリヒスチジントラクト（ｐｏｌｙ−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔｒａｃｔ）、抗原エピトープ、もしくは結合ドメインとの連結である。
【０１０９】
保存的アミノ酸置換の例は、同種の群のなかでなされる置換であり、例えば、塩基性アミノ酸（例えば、アルギニン、リシン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（例えば、グルタミン酸およびアスパラギン酸）、極性アミノ酸（例えば、グルタミンおよびアスパラギン）、疎水性アミノ酸（例えば、ロイシン、イソロイシン、バリン）、芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、トリプトファン、チロシン）、および低分子量アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、セリン、スレオニン、メチオニン）の群のなかでなされる置換である。
【０１１０】
非保存的置換は、ある群に属するアミノ酸を、その他の群に属するアミノ酸で置換することを包含する。例えば、非保存的置換としては、極性アミノ酸の疎水性アミノ酸での置換が挙げられることになる。ヌクレオチド置換の一般的な説明については、例えばＦｏｒｄ等（１９９１），Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒ．２：９５〜１０７を参照。鉄との結合を示さないか、もしくはそれらが減少した、本融合タンパク質のＴｆ受容体への結合がないか、もしくはそれらが減少した、および／または、グリコシル化がないか、もしくはそれらが減少した本発明のＴｆ融合タンパク質を生産するには、非保存的な置換、欠失および挿入が特に有用である。
【０１１１】
鉄の結合、および／または受容体の結合は、突然変異によって減少または破壊されてもよく、このような突然変異としては、配列番号３のＴｆのＮドメイン残基Ａｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｈｉｓ２４９および／またはＣドメイン残基Ａｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１４および／またはＨｉｓ５８５の１またはそれ以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換またはそれらへの挿入が挙げられる。また、鉄の結合は、配列番号３のアミノ酸Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７またはＡｒｇ６３２への突然変異によって影響を受ける可能性がある。カーボネート結合は、突然変異によって減少または破壊されてもよく、このような突然変異としては、配列番号３のＴｆのＮドメイン残基Ｔｈｒ１２０、Ａｒｇ１２４、Ａｌａ１２６、Ｇｌｙ１２７および／またはＣドメイン残基Ｔｈｒ４５２、Ａｒｇ４５６、Ａｌａ４５８および／またはＧｌｙ４５９の１またはそれ以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換またはそれらへの挿入が挙げられる。カーボネート結合の減少または破壊は、鉄および／または受容体の結合に逆の影響を与える可能性がある。
【０１１２】
Ｔｆ受容体への結合は、突然変異によって減少または破壊されてもよく、このような突然変異としては、鉄の結合に関して上述されたＴｆのＮドメイン残基の１またはそれ以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換またはそれらへの挿入が挙げられる。
【０１１３】
上記で考察したように、グリコシル化は、Ｃドメイン残基Ｎ４１３および／またはＮ６１１に相当するＮ−Ｘ−Ｓ／Ｔ部位周辺のＴｆのＣドメイン残基の１またはそれ以上に対応するアミノ酸残基の欠失、置換またはそれらへの挿入などの突然変異によって減少するか、または防止される可能性がある（米国特許第５,９８６,０６７号を参照）。例えば、Ｎ４１３および／またはＮ６１１は、Ｇｌｕ残基に突然変異していてもよい。
【０１１４】
本発明のＴｆ融合タンパク質が、グリコシル化、鉄の結合、カーボネート結合および／または受容体の結合を防止するように改変されていない場合において、グリコシル化、鉄および／または炭酸イオンは、融合タンパク質から脱離されるか、または切断される可能性がある。例えば、利用可能なデグリコシラーゼ（ｄｅｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ）を用いて、融合タンパク質からグリコシル化残基、特にＴｆ部分に結合した糖残基を切断してもよいし、グリコシル化酵素が欠失した酵母を用いてグリコシル化を防止してもよいし、および／または組換え細胞をグリコシル化を防止する物質（例えばツニカマイシン）の存在下で増殖させてもよい。
【０１１５】
また、融合タンパク質上の糖質を減少させてもよいし、または融合タンパク質をデグリコシラーゼで処理することによって酵素的にそれを完全に除去してもよい。デグリコシラーゼは当技術分野でよく知られている。デグリコシラーゼの例としては、これらに限定されないが、ガラクトシダーゼ、ＰＮＧアーゼＡ、ＰＮＧアーゼＦ、グルコシダーゼ、マンノシダーゼ、フコシダーゼ、およびエンドＨデグリコシラーゼが挙げられる。
【０１１６】
それにもかかわらず、ある種の環境では、経口送達にとって、本融合タンパク質のＴｆ部分が完全にグリコシル化されることが好ましい場合がある。
【０１１７】
Ｔｆの３次元構造を変更するように、Ｔｆで追加の突然変異がなされてもよく、例えば、鉄への結合とＴｆ受容体認識に必要なコンフォメーション変化を妨げるためのヒンジ領域への改変である。例えば、突然変異は、Ｎドメインのアミノ酸残基９４〜９６、２４５〜２４７および／または３１６〜３１８、加えてＣドメインのアミノ酸残基４２５〜４２７、５８１〜５８２および／または６５２〜６５８に、またはそれらの周辺になされてもよい。加えて、突然変異は、Ｔｆの構造と機能を変更するためにこれらの部位のフランキング領域に、またはそれらの周辺になされてもよい。
【０１１８】
本発明の一形態において、トランスフェリン融合タンパク質は、治療用タンパク質の半減期または生物学的利用率を延長したり、加えて、場合によっては治療用タンパク質を、細胞内部におよび／または血液脳関門を通過して運搬したりするためのキャリアータンパク質として機能することができる。その代わりの実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質は、改変トランスフェリン分子を含み、ここにおいて、トランスフェリンは、血液脳関門を通過する能力を保持しない。
【０１１９】
その他の実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質は、改変トランスフェリン分子を含み、ここにおいて、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合する能力を保持し、細胞内部に治療用ペプチドを輸送する。その代わりの実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質は、改変トランスフェリン分子を含み、ここにおいて、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合する能力を保持せず、細胞内部に治療用ペプチドを輸送する。
【０１２０】
さらなる実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質は、改変トランスフェリン分子を含み、ここにおいて、トランスフェリン分子は、トランスフェリン受容体に結合する能力を保持し、細胞内部に治療用ペプチドを輸送し、血液脳関門を通過する能力を保持する。その代わりの実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質は、改変トランスフェリン分子を含み、ここにおいて、トランスフェリン分子は、血液脳関門を通過する能力を保持するが、トランスフェリン受容体に結合する能力を保持せず、細胞内部に治療用ペプチドを輸送する。
【０１２１】
改変トランスフェリン融合タンパク質
本発明のタンパク質の融合体は、Ｔｆタンパク質のＮ末端および／またはＣ末端に結合した、ＧＬＰ−１またはそれらの類似体のようなＧＬＰ−１治療用タンパク質の１またはそれ以上のコピーを含んでいてもよい。いくつかの実施態様において、ＧＬＰ−１治療用タンパク質は、Ｔｆタンパク質のＮおよびＣ末端の両方に結合しており、本融合タンパク質は、Ｔｆの末端のいずれか、またはそれらの両方にＧＬＰ−１治療用タンパク質またはポリペプチドの１またはそれ以上の等価体を含んでいてもよい。その他の実施態様において、ＧＬＰ−１治療用タンパク質またはポリペプチドは、Ｔｆタンパク質の既知のドメインに、例えば１またはそれ以上のＴｆのループに挿入される（Ａｌｉ等（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４（３４）：２４０６６〜２４０７３を参照）。実際に、ＧＬＰ−１治療用タンパク質またはポリペプチドは、トランスフェリンの５つのループ全てに挿入されていてもよく、それによりＧＬＰ−１受容体への高い親和性を有する五価の分子を作出することができる。その他の実施態様において、ＧＬＰ−１治療用タンパク質またはポリペプチドは、ＴｆのＮドメインとＣドメインとの間に挿入される。あるいは、ＧＬＰ−１治療用タンパク質またはポリペプチドは、トランスフェリン分子中のどこかに挿入される。
【０１２２】
本発明の融合タンパク質は、本タンパク質のトランスフェリンとＧＬＰ−１部分とを隔てるための、ＧＬＰ−２リンカーおよび／または実質的にらせん状ではないアミノ酸リンカーの使用を含む。例えば、一実施態様において、ＧＬＰ−１は、リンカーペプチドを介してＴｆのＮ末端に結合している。その他の実施態様において、ＧＬＰ−１は、リンカーペプチドを介してＴｆのＣ末端に結合している。当業者には当然と思われるが、本発明は、ＧＬＰ−１とトランスフェリンとを隔てるための、分子中に様々な方法で置かれているリンカーが想定される。
【０１２３】
一般的に、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、１つの改変トランスフェリンから誘導された領域と、１つのＧＬＰ−１治療用タンパク質領域とを有していてもよい。しかしながら、各タンパク質の複数の領域を用いて、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を作製してもよい。同様に、２以上のＧＬＰ−１治療用タンパク質を用いて、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を作製してもよく、それによって多機能の改変されたＴｆ融合タンパク質を生産することができる。
【０１２４】
一実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン分子、またはそれらの部分に融合したＧＬＰ−１治療用タンパク質を含む。その他の実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン分子のＮ末端に融合したＧＬＰ−１治療用タンパク質またはポリペプチドを含む。その代わりの実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン分子のＣ末端に融合したＧＬＰ−１治療用タンパク質またはポリペプチドを含む。さらなる実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に融合したトランスフェリン分子を含む。その代わりの実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質またはポリペプチドのＣ末端に融合したトランスフェリン分子を含む。
【０１２５】
その他の実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、改変トランスフェリンのＮ末端とＣ末端の両方に融合したＧＬＰ−１治療用タンパク質を含む。その代わりの実施態様において、このようなＮ末端およびＣ末端で融合した治療用タンパク質は、ＧＬＰ−１で治療可能であることが当技術分野で既知の疾患または障害を治療または予防するのに使用できる１種またはそれ以上のＧＬＰ−１治療用タンパク質および１種またはそれ以上の異なる治療用タンパク質を含む。その他の実施態様において、Ｎ末端およびＣ末端で融合した治療用タンパク質は、一般的に患者において同時に発症することが当技術分野で既知の疾患または障害を治療または予防するのに使用できる１種またはそれ以上のＧＬＰ−１治療用タンパク質および１種またはそれ以上の異なる治療用タンパク質である。
【０１２６】
改変トランスフェリンの部分がＧＬＰ−１治療用タンパク質の部分のＮ末端および／またはＣ末端に融合している本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質に加えて、本発明のトランスフェリン融合タンパク質はまた、対象のＧＬＰ−１治療用タンパク質またはペプチド（例えば、本明細書で開示された治療用タンパク質もしくはペプチド、またはそれらのフラグメントもしくは変異体）を改変トランスフェリンの内部領域に挿入することによって生産してもよい。改変トランスフェリンの内部領域としては、これらに限定されないが、鉄結合部位、ヒンジ領域、ビカーボネート結合部位、または受容体結合ドメインが挙げられる。
【０１２７】
改変トランスフェリン分子のタンパク質配列内に、多数のループまたはターンが存在しており、これらはジスルフィド結合で安定化されている。これらのループは、特定の生物活性を有する改変トランスフェリン分子を生成させるために、治療活性を有するペプチド、特に、機能的にするために２次構造を必要とするもの、または治療用タンパク質の挿入または内部融合に有用である。
【０１２８】
治療用タンパク質が、Ｔｆ分子の少なくとも１つのループに挿入されたり、またはそこで置換されたりする場合、挿入は、表面に露出したループ領域ならびにその他のＴｆの領域のいずれかで行うことができる。例えば、挿入は、Ｔｆアミノ酸３２〜３３、７４〜７５、２５６〜２５７、２７９〜２８０および２８８〜２８９を含むループ内になされてもよい（Ａｌｉ等，上記）（図３を参照）。上述したように、挿入はまた、Ｔｆのその他の領域内になされてもよく、例えば、以下でより詳細に説明されるように鉄およびビカーボネート結合、ヒンジ領域および受容体結合ドメインのための部位になされてもよい。また、ランダムペプチドインサートのスクリーニング可能なライブラリーを開発するために、タンパク質またはペプチドを挿入するための改変／置換を施すことができるＴｆタンパク質配列中のループを用いてもよい。Ｔｆドメインへのクローニング、および／または、Ｔｆ末端への融合の前に、利用可能なファージや細菌のディスプレイシステムを含むペプチドライブラリーを作製するために、核酸インサートを生産するあらゆる手法が使用可能である。
【０１２９】
ＴｆのＮ末端は遊離であり、分子本体から外に向いている。それゆえに、好ましい実施態様は、Ｎ末端におけるタンパク質またはペプチドの融合体であり得る。このような融合体は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質をＴｆから隔てるために、ＧＬＰ−２および／または実質的にらせん状ではないリンカーを含んでいてもよい。
【０１３０】
ＴｆのＣ末端は、Ｃ末端から６個のアミノ酸がジスルフィド結合によってより深く埋め込まれており保護されているように見える。ヒトＴｆにおいて、Ｃ末端のアミノ酸はプロリンであり、このプロリンが配向される仕方に応じて、融合体を外側に向けるか、または分子本体に向けるかのいずれかになる。また、Ｎ末端近傍にもプロリンが存在する。本発明の一形態において、Ｎおよび／またはＣ末端におけるプロリンを変えることもできる。本発明のその他の形態において、Ｃ末端のジスルフィド結合を除去して、Ｃ末端を開放してもよい。
【０１３１】
ＧＬＰ−１治療用タンパク質およびペプチド
哺乳動物において、グルカゴン遺伝子は、前駆体プログルカゴンをコードしており、組織特異的（ｔｉｓｓｕｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ）な様々なペプチド産物を生じるようにプロセシングされる。具体的には、プログルカゴンの組織特異的プロセシングにより、脳においてグルカゴンが生成し、さらに腸においてグリセンチン、オキシントモジュリン、およびグルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）およびグルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）が生成する。プログルカゴン前駆体におけるこれらのペプチドの構成は、ラット、ハムスターおよびウシ膵臓由来のｃＤＮＡの分子クローニンによって解明されている。プログルカゴン前駆体の解析によれば、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２ペプチドは、スペーサーまたは介在ペプチドによって互いに離れていることが示される。
【０１３２】
グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、いわゆるエンテロインスラールアキシス（ｅｎｔｅｒｏｉｎｓｕｌａｒ  ａｘｉｓ）に属するインスリン分泌を調節する消化管ホルモンである。エンテロインスラールアキシスは、消化管における栄養素の存在と吸収に応答して胃腸粘膜から放出される一群のホルモンをいい、これは初期の強化されたインスリン放出を促進する。インスリン分泌への増強作用であるインクレチン作用は、恐らく正常な耐糖能に必須である。ＧＬＰ−１はインクレチン作用に関与することから、ＧＬＰ−１は生理学的に重要なインスリン分泌刺激のホルモンである。
【０１３３】
ＧＬＰ−１は、プログルカゴンの産物である（Ｂｅｌｌ等，Ｎａｔｕｒｅ，１９８３，３０４：３６８〜３７１）。ＧＬＰ−１は、腸内分泌細胞で、２種の主要な分子形態に、ＧＬＰ−１（７〜３６）アミドおよびＧＬＰ−１（７〜３７）として合成される。１９８０年代初期に初めて、これらのペプチドが同定され、続いてプログルカゴンに関するｃＤＮＡと遺伝子がクローニングされた。
【０１３４】
全長ペプチドであるＧＬＰ−１（１〜３７）およびＧＬＰ−１（１〜３６アミド）に対して行われた初期の研究では、より大きなＧＬＰ−１分子は、生物活性を欠いていると結論付けられている。１９８７年には、３つの別個の研究グループが、最初の６個のアミノ酸を除去すると、生物活性が強化されたＧＬＰ−１分子が生じることを実証した。
【０１３５】
ＧＬＰ−１のアミノ酸配列は、Ｓｃｈｍｉｄｔ等によって開示された（１９８５  Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ  ２８  ７０４〜７０７）。ヒトＧＬＰ−１は、回腸末端部のＬ細胞、膵臓および脳において合成されるプレプログルカゴン由来の３７個のアミノ酸残基からなるペプチドである。プレプログルカゴンのＧＬＰ−１（７〜３６アミド）、ＧＬＰ−１（７〜３７）およびＧＬＰ−２へのプロセシングは、主としてＬ細胞で起こる。ＧＬＰ−１（７〜３６アミド）およびＧＬＰ−１（７〜３７）のアミノ酸配列は、以下の通りである（配列番号６）：
【化１】
2008531059.tif 000005
式中、ＸはＧＬＰ−１（７〜３６アミド）ではＮＨ2であり、ＸはＧＬＰ−１（７〜３７）ではＧｌｙである。従って、ＧＬＰ−１（７〜３６）および（７〜３７）のＡ８は、配列番号６のＡ２に相当し、ＧＬＰ−１（７〜３６）および（７〜３７）のＫ３４は、Ｋ２８に相当する、等々である。
【０１３６】
ＧＬＰ−１様分子は、ＩＩ型（インスリン非依存性糖尿病（ＮＩＤＤＭ））糖尿病に罹った、ある場合にはＩ型糖尿病に罹った、ヒト対象において抗糖尿病活性を有する。ＧＬＰ−１を用いた治療では、高い血糖値の場合にのみ、インスリン分泌および生合成の増加、グルカゴン分泌の減少、遅い胃内容排出のような活性が惹起されるため、インスリンまたはスルホニル尿素よりもずっと安全な治療を提供する可能性がある。適切なＧＬＰ−１治療によって、患者の食後の血糖値を正常なレベルに移行させることができる。また、ＧＬＰ−１様分子は、ＩＩ型患者の膵臓ベータ細胞の機能を温存し、さらには回復させる能力を有することを示唆する報告もある。
【０１３７】
あらゆるＧＬＰ−１配列を用いて、ＧＬＰ−１（７〜３５）、ＧＬＰ−１（７〜３６）、およびＧＬＰ−１（７〜３７）を含む本発明のＴｆ融合タンパク質を作製してもよい。またＧＬＰ−１は、消化管にも強力な作用を有する。ＧＬＰ−１は、生理学的な量で注入されると、ペンタガストリン誘導性の、および食事誘導性の胃酸分泌を強く阻害する（Ｓｃｈｊｏｌｄａｇｅｒ等，Ｄｉｇ．Ｄｉｓ．Ｓｃｉ．１９８９，３５：７０３〜７０８；Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎ等，Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  １９９３；３８：６６５〜６７３）。またＧＬＰ−１は、胃内容排出速度および膵臓の酵素分泌も抑える（Ｗｅｔｔｅｒｇｒｅｎ等，Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ１９９３；３８：６６５〜６７３）。ヒトにおいて、炭水化物または脂質を含む溶液を回腸に潅流させると、胃および膵臓での分泌や運動性に対する類似の阻害作用が惹起することがある（Ｌａｙｅｒ等，Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ１９９５，４０：１０７４〜１０８２；Ｌａｙｅｒ等，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  １９９３，５４：３８５〜３８）。付随してＧＬＰ−１分泌が著しく刺激されることから、ＧＬＰ−１は、このいわゆる「回腸ブレーキ（ｉｌｅａｌ−ｂｒａｋｅ）」作用に少なくとも部分的に関与している可能性があるという推測がなされている（Ｌａｙｅｒ等，Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  １９９３；５４：３８５〜３８）。実際に、近年の研究によれば、生理学的に、ＧＬＰ−１の回腸ブレーキ作用は、その膵島における作用よりも重要である可能性があることが示唆されている。従って、用量反応研究において、ＧＬＰ−１は、少なくとも膵島分泌に影響を与えるのに必要な最低限の速度での注入速度で胃内容排出速度に影響を与える（Ｎａｕｃｋ等，Ｇｕｔ  １９９５；３７（Ｓｕｐｐｌ．２）：Ａ１２４）。
【０１３８】
ＧＬＰ−１は、食物摂取に対して作用を有するようである。ラットにおいて、ＧＬＰ−１の脳室内投与は食物摂取を著しく抑える（Ｓｃｈｉｃｋ等  ｉｎ  Ｄｉｔｓｃｈｕｎｅｉｔ等（編），Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅ，Ｊｏｈｎ  Ｌｉｂｂｅｙ＆Ｃｏｍｐａｎｙ  ｌｔｄ，１９９４；３６３〜３６７頁；Ｔｕｒｔｏｎ等，Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３７９：６９〜７２）。この作用は、高度に特異的のようである。従って、Ｎ末端で伸長されたＧＬＰ−１（ＰＧ７２〜１０７）アミドは不活性であり、適切な用量のＧＬＰ−１アンタゴニストのエキセンジン９〜３９は、ＧＬＰ−１の作用を無効にする（Ｔａｎｇ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９６，２７１（４  Ｐｔ  ２）：Ｒ８４８〜５６）。ラットにおいて、ＧＬＰ−１の急性末梢投与は、食物摂取を迅速には抑えない（Ｔａｎｇ−Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ等，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９６，２７１（４Ｐｔ２）：Ｒ８４８〜５６；Ｔｕｒｔｏｎ等，Ｎａｔｕｒｅ  １９９６，３７９：６９〜７２）。しかしながら、腸のＬ細胞から分泌されたＧＬＰ−１は、満腹シグナルとして作用し得るという可能性は残されている。
【０１３９】
糖尿病患者において、ＧＬＰ−１のインスリン分泌刺激作用およびＧＬＰ−１の消化管に対する作用を維持して（Ｗｉｌｌｍｓ等，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ１９９４；３７，ｓｕｐｐｌ．１：Ａ１１８）、それにより、食事誘導性のグルコース急増を抑えるのを助けることができるが、より重要なことには、これにより食物摂取に影響を与え得ることである。ＧＬＰ−１を４ｎｇ／ｋｇ／分で１週間連続的に静脈内投与したところ、ＮＩＤＤＭ患者において著しい副作用を起こすことなく血糖の制御を劇的に改善することが実証されている（Ｌａｒｓｅｎ等，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９６；４５、ｓｕｐｐｌ．２：２３３Ａ）。
【０１４０】
Ｉ型およびＩＩ型糖尿病および肥満症の治療において、少なくとも１つの、ＧＬＰ−１類似体およびそれらのフラグメント、を含むＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質が有用である。
【０１４１】
また、ＧＬＰ−１およびそれらのフラグメントの投与は、うっ血性心不全、および非アルコール性、非脂肪性の肝疾患を治療するのにも有用な可能性がある。
【０１４２】
本明細書で用いられる用語「ＧＬＰ−１分子」は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体、またはＧＬＰ−１誘導体を意味する。
【０１４３】
本明細書で用いられる用語「ＧＬＰ−１類似体」は、ＧＬＰ−１と比較して１またはそれ以上のアミノ酸置換、欠失、転位（ｉｎｖｅｒｓｉｏｎ）、または付加を有する分子と定義される。多くのＧＬＰ−１類似体は当技術分野で既知であり、例えば、ＧＬＰ−１（７〜３４）、ＧＬＰ−１（７〜３５）、ＧＬＰ−１（７〜３６）、Ｖａｌ8−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｇｌｙ8−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｓｅｒ8−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｇｌｎ9−ＧＬＰ１（７〜３７）、Ｄ−Ｇｌｎ9−ＧＬＰ−１（７〜３７）、Ｔｈｒ16−Ｌｙｓ18−ＧＬＰ−１（７〜３７）、およびＬｙｓ18−ＧＬＰ−１（７〜３７）が挙げられる（配列番号９６を参照）。好ましい類似体は、ＧＬＰ−１（７〜３７；Ａ８Ｘ，Ｋ３４Ｘ）を含み、ここにおいて、Ｘは天然型のＧＬＰ−１配列またはＧＬＰ−１（７〜３７；Ａ８Ｇ，Ｋ３４Ａ）以外のあらゆるアミノ酸である。その他の類似体としては、ＧＬＰ−１のジペプチジル−ペプチダーゼ耐性型が挙げられ、ここにおいて、このペプチドのＮ末端は保護されている。このような類似体としては、これらに限定されないが、追加のアミノ酸を含むＧＬＰ−１が挙げられ、例えば、Ｎ末端に付加された、またはＮ末端のアミノ酸（ＧＬＰ−１（７〜３６）またはＧＬＰ−１（７〜３７）におけるアミノ酸７または８、これらは配列番号６のアミノ酸１または２に相当する）を置換したヒスチジン残基である。これらの類似体において、Ｎ末端は、以下の残基を含んでいてもよい：Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（それぞれ配列番号７７〜８２を参照）、Ｈｉｓ−Ｘ−Ａｌａ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｘ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ、Ｈｉｓ−Ｘ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（ここにおいて、Ｘはあらゆるアミノ酸である）。米国特許第５,１１８,６６６号は、ＧＬＰ−１類似体の例を記載しており、例えば、ＧＬＰ−１（７〜３４）およびＧＬＰ−１（７〜３５）である。
【０１４４】
その他の実施態様において、ＧＬＰ−１ペプチドは、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）による切断を受けにくくする突然変異を有する。本発明の発明者等は、ＢＲＸ０５８５（配列番号１２）は、融合していないＧＬＰ−１タンパク質と比較してＮＥＰ切断を受けにくいことを見出した。
【０１４５】
いくつかの突然変異が、ＧＬＰ−１のＮＥＰ切断を妨げる可能性を有する。例えば、疎水性アミノ酸のＮ末端側、またはその近傍の突然変異は、ＮＥＰのＧＬＰ−１切断能力を減少させることができる。ＧＬＰ−１（７〜３６）およびＧＬＰ−１（７〜３７）は、Ｅ２７〜Ｌ３２（配列番号６のＥ２１〜Ｌ２６に相当）において疎水性アミノ酸が豊富である。ＧＬＰ−１内の最もＮＥＰ切断を受けやすい部位は、Ｅ２７↓Ｆ２８（配列番号６のＥ２１Ｆ２２およびＷ２５↓Ｌ２６に相当）およびＷ３１↓Ｌ３２（配列番号６のＥ２１〜Ｌ２６に相当）である。
【０１４６】
しかしながら、注目すべきことに、残基Ｆ２８およびＬ３２は、受容体の結合に重要である可能性がある。ＧＬＰ−１の受容体活性化能力が維持される場合、受容体結合の消失は許容できる。例えば、Ａ３０Ｑは、受容体結合の消失を起こすようだが、受容体活性化は増加をもたらす。従って、本発明は、ＮＥＰ切断を妨げ、同時にＧＬＰ−１受容体活性化を維持するように、１またはそれ以上の疎水性アミノ酸および／またはＥ２７〜Ｌ３２領域のアミノ酸を突然変異させることを含む。本発明はまた、ＮＥＰ切断を妨げ、同時にＧＬＰ−１受容体活性化を維持するように、疎水性アミノ酸近傍（すなわち、好ましくは５個のアミノ酸以内）のアミノ酸中で、および／またはＥ２７〜Ｌ３２領域のアミノ酸中で突然変異させることも含む。例えば、ＮＥＰ切断を妨げるために、Ｅ２７Ｘ、Ｆ２８Ｘ、Ｉ２９Ｘ、Ａ３０Ｑ、Ｗ３１Ｘ、Ｌ３２Ｘ、および／またはＶ３３Ｘからなる群より選択される１またはそれ以上の突然変異を用いることができ、ここにおいて、Ｘは、グリシン（Ｇ）、プロリン（Ｐ）、またはシスチン（Ｃ）以外のあらゆるアミノ酸である。一実施態様において、このような突然変異は、Ａ３０Ｑである（配列番号６のＡ２４Ｑに相当）。Ｈｕｐｅ−Ｓｏｄｍａｎｎ等，１９９５，Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．５８：１４９〜１５６およびＨｕｐｅ−Ｓｏｄｍａｎｎ等，１９９７，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．１８：６２５〜６３２を参照。その他の実施態様において、本発明は、ＮＥＰに対する感受性を減少させるための、エキセンジン４またはその誘導体（ＣＥｘ；配列番号１５）のＣ末端の使用を含む。
【０１４７】
用語「ＧＬＰ−１誘導体」は、ＧＬＰ−１またはＧＬＰ−１類似体のアミノ酸配列を有するが、それに加えて１個またはそれ以上のそのアミノ酸側基、α−炭素原子、末端アミノ基、または末端カルボン酸基の化学修飾を有する分子と定義される。化学修飾としては、これらに限定されないが、化学部分を付加すること、新しい結合を形成すること、および化学部分を除去することが挙げられる。
【０１４８】
本明細書で用いられる用語「ＧＬＰ−１関連化合物」は、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体、または、ＧＬＰ−１誘導体の定義に当てはまるあらゆる化合物を意味する。
【０１４９】
ＷＯ９１／１１４５７は、活性なＧＬＰ−１ペプチド７〜３４、７〜３５、７〜３６、および７〜３７の類似体を記載しており、これらもＧＬＰ−１成分として有用な可能性がある。
【０１５０】
ＥＰ０７０８１７９−Ａ２（イーライリリー＆カンパニー（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏ．））は、Ｎ末端イミダゾール基を含み、場合により位置３４のリシン残基に結合した非分枝のＣ6〜Ｃ10アシル基を含むＧＬＰ−１類似体および誘導体を記載している。
【０１５１】
ＥＰ０６９９６８６−Ａ２（イーライリリー＆カンパニー）は、ＧＬＰ−１の特定のＮ末端がトランケーションされたフラグメントを記載しており、これは生物学的に活性であると報告されている。
【０１５２】
米国特許第５,５４５,６１８号は、実質的に、以下からなる群より選択される少なくとも１つの改変を有する、ＧＬＰ−１（７〜３４）、ＧＬＰ１（７〜３５）、ＧＬＰ−１（７〜３６）もしくはＧＬＰ−１（７〜３７）、またはそれらのアミド形態、およびそれらの製薬上許容できる塩からなるＧＬＰ−１分子を記載している：（ａ）位置２６および／または位置３４において、リシンの代わりに、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、アルギニン、またはＤ−リシンでの置換；または、位置３６において、アルギニンの代わりに、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、リシン、またはＤ−アルギニンでの置換；（ｂ）位置３１において、トリプトファンの代わりに、耐酸化性を有するアミノ酸での置換；（ｃ）以下の少なくとも１つの置換：位置１６において、バリンの代わりに、チロシン；位置１８において、セリンの代わりに、リシン；位置２１において、グルタミン酸の代わりに、アスパラギン酸；位置２２において、グリシンの代わりに、セリン；位置２３において、グルタミンの代わりに、アルギニン；位置２４において、アラニンの代わりに、アルギニン；および位置２６において、リシンの代わりに、グルタミン；および（ｄ）以下の少なくとも１つの置換：位置８において、アラニンの代わりに、グリシン、セリンまたはシステイン；位置９において、グルタミン酸の代わりに、アスパラギン酸、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニン；位置１０において、グリシンの代わりに、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニン；および位置１５において、アスパラギン酸の代わりに、グルタミン酸；および（ｅ）位置７においてヒスチジンの代わりに、グリシン、セリン、システイン、スレオニン、アスパラギン、グルタミン、チロシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、メチオニンまたはフェニルアラニン、またはヒスチジンのＤ−もしくはＮ−アシル化もしくはアルキル化された形態での置換（それぞれ配列番号８３〜８７を参照）；ここにおいて、置換が（ａ）、（ｂ）、（ｄ）および（ｅ）である場合、置換されたアミノ酸はＤ型であってもよく、７位において置換されたアミノ酸は、Ｎ−アシル化またはＮ−アルキル化された形態であってもよい。
【０１５３】
米国特許第５,１１８,６６６号は、インスリン分泌刺激活性を有するＧＬＰ−１分子を記載している。このような分子は、以下のアミノ酸配列を有するペプチドからなる群より選択される：Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ（配列番号７）またはＨｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ（配列番号８）；ならびに前記ペプチドの誘導体が記載されており、前記ペプチドは、以下からなる群より選択される：前記ペプチドの製薬上許容できる酸付加塩；前記ペプチドの製薬上許容できるカルボン酸塩；前記ペプチドの製薬上許容できる低級アルキルエステル；およびアミド、低級アルキルアミド、および低級ジアルキルアミドからなる群より選択される前記ペプチドの製薬上許容できるアミド。
【０１５４】
米国特許第６,２７７,８１９号は、心筋梗塞後の死亡率および罹患率を低下させる方法を教示しており、この方法は、患者にＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体、およびＧＬＰ−１誘導体を投与することを含む。ＧＬＰ−１類似体は、以下の構造式で示され（配列番号９）：Ｒ1−Ｘ1−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｘ2−Ｇｌｙ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｘ3−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｒ2、およびそれらの製薬上許容できる塩、ここにおいて：Ｒ1は、Ｌ−ヒスチジン、Ｄ−ヒスチジン、デスアミノ−ヒスチジン、２−アミノ−ヒスチジン、．ベータ−ヒドロキシ−ヒスチジン、ホモヒスチジン、アルファ−フルオロメチル−ヒスチジン、およびアルファ−メチル−ヒスチジンからなる群より選択され；Ｘ1は、Ａｌａ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ、Ｉｌｅ、およびアルファ−メチル−Ａｌａからなる群より選択され；Ｘ2は、Ｇｌｕ、Ｇｉｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、およびＧｌｙからなる群より選択され；Ｘ3は、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、およびＧｌｙからなる群より選択され；Ｒ2は、ＮＨ2、および、Ｇｌｙ−ＯＨからなる群より選択され；ただし、ＧＬＰ−１類似体は約６.０〜約９.０の範囲の等電点を有することを条件とし、さらに、Ｒ1がＨｉｓであり、Ｘ1がＡｌａであり、Ｘ2がＧｌｕであり、Ｘ3がＧｌｕである場合、Ｒ2はＮＨ2でなければならないことを条件とする。
【０１５５】
Ｒｉｔｚｅｌ等（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１９９８，１５９：９３〜１０２）は、ＧＬＰ−１類似体、［Ｓｅｒ8］ＧＬＰ−１を記載しており、ここにおいて、Ｎ末端の二番目のアミノ酸であるアラニンはセリンで置き換えられている。この改変により、そのペプチドのインスリン分泌刺激作用は損なわれなかったが、ＧＬＰ−１と比較して高い血漿安定性を有する類似体が生産された。
【０１５６】
米国特許第６,４２９,１９７号は、急性卒中または出血後のＧＬＰ−１での治療、好ましくは静脈内投与を教示しており、これは理想的な治療を可能にし、なぜならそれは、インスリン分泌を最適化し、脳での同化を増加させ、グルカゴンを抑制してインスリンの有効性を増強し、正常血糖、または重度の低血糖症もしくはその他の不都合な副作用を起こす危険性がない軽度低血糖を維持する手段を提供するためである。本発明は、インスリン分泌を最適化するため、グルカゴンの拮抗作用を抑制することによってインスリンの有効性を増強するるため、そして正常血糖、もしくは重度の低血糖症を起こす危険性がない軽度低血糖を維持するための、ＧＬＰ−１またはその生物学的に活性な類似体を用いた、急性脳梗塞または出血後の虚血性または再潅流性の脳の治療方法を提供する。
【０１５７】
米国特許第６,２７７,８１９号は、心筋梗塞後の死亡率および罹患率を減少させる方法を提供しており、この方法は、それを必要とする患者に、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−１類似体、ＧＬＰ−１誘導体、およびそれらの製薬上許容できる塩からなる群より選択される化合物を、血糖を正常化するのに有効な用量で投与することを含む。
【０１５８】
米国特許第６,１９１,１０２号および６,５８３,１１１号は、体重の減少が必要な患者の体重を減少させる方法を記載しており、この方法は、患者に、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、グルカゴン様ペプチド類似体（ＧＬＰ−１類似体）、グルカゴン様ペプチド誘導体（ＧＬＰ−１誘導体）、またはそれらの製薬上許容できる塩を含む組成物を、体重の減少を引き起こすのに十分な用量で、体重減少を起こすのに有効な期間投与することによってなされ、前記期間は少なくとも４週間である。
【０１５９】
ＧＬＰ−１は、皮下投与後十分な活性を有するが（Ｒｉｔｚｅｌ等，Ｄｉａｂｅｔｏｌｏｇｉａ１９９５；３８：７２０〜７２５）、主としてジペプチジルペプチダーゼＩＶ様酵素による分解のために迅速に分解される（Ｄｅａｃｏｎ等，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ１９９５，８０：９５２〜９５７；Ｄｅａｃｏｎ等，１９９５，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ４４：１１２６〜１１３１）。従って、あいにく、ＧＬＰ−１とその類似体の多くは、ヒトにおいて血漿中半減期が短い（Ｏｒｓｋｏｖ等，Ｄｉａｂｅｔｅｓ  １９９３；４２：６５８〜６６１）。従って、本発明の目的は、ＧＬＰ−１（７〜３７）に比べて作用の持続的プロファイルを有する、ＧＬＰ−１またはそれらの類似体を含むトランスフェリン融合タンパク質を提供することである。本発明のさらなる目的は、ＧＬＰ−１（７〜３７）よりも低いクリアランスを有するＧＬＰ−１の誘導体、およびそれらの類似体を提供することである。その上、本発明の目的は、改善された安定性を有するＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質、または、ＧＬＰ−１類似体／トランスフェリン融合タンパク質を含む医薬組成物を提供することである。加えて、本発明は、例えば、これらに限定されないが、ＩＩ型糖尿病、肥満症、代謝症候群、前糖尿病、非脂肪性の肝疾患またはうっ血性心不全などの疾患、および上述の疾患を治療するための、ＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質またはＧＬＰ−１類似体／トランスフェリン融合タンパク質の使用を含む。
【０１６０】
あらゆるＧＬＰ−１治療的分子が、本発明の方法および組成物に係るＴｆとの融合体パートナーとして使用可能である。本明細書で用いられる「治療的分子」は、インビトロまたはインビボにおいて有益な生物学的作用を発揮することができるＧＬＰ−１またはその変異体もしくは類似体である。例えば、病状に関連した有益な作用は、治療を受けた対象に有利なあらゆる作用を含み、例えば、治療を受けた対象に有益な作用を生じさせるための疾患の予防、疾患の安定化、病微の軽減もしくは緩和、または基礎的欠陥の調節、緩和もしくは治癒が挙げられる。
【０１６１】
本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質は、少なくとも治療用タンパク質のフラグメントまたは変異体、および、少なくとも改変された血清トランスフェリンのフラグメントまたは変異体を含み、これらは、好ましくは遺伝学的な融合によって互いに連結している。
【０１６２】
さらなる実施態様において、本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質は、少なくともＧＬＰ−１治療用タンパク質のフラグメントまたは変異体を含んでいてもよい。さらなる実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質は、タンパク質のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体を含んでいてもよく、ここにおいて、これら変異体またはフラグメントは、少なくとも１種の生物学的活性または治療活性を保持する。このトランスフェリン融合タンパク質は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質を含んでいてもよく、このＧＬＰ−１治療用タンパク質は、長さが少なくとも約４、少なくとも約５、少なくとも約６、少なくとも約７、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、少なくとも約１１、少なくとも約１２、少なくとも約１３、少なくとも約１４、少なくとも約１５、少なくとも約１６、少なくとも約１７、少なくとも約１８、少なくとも約１９、少なくとも約２０、少なくとも約２１、少なくとも約２２、少なくとも約２３、少なくとも約２４、少なくとも約２５、少なくとも約２６、少なくとも約２７、少なくとも約２８、少なくとも約２９、少なくとも約３０、または少なくとも約３１個のアミノ酸のペプチドフラグメントまたはペプチド変異体が可能であり、これらはＮおよび／もしくはＣ末端に融合、改変トランスフェリン内に挿入、また改変トランスフェリンのループに挿入される。
【０１６３】
本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質は、１つまたはそれ以上のペプチドを含んでいてもよい。ペプチドの数を増加させることは、トランスフェリンに融合したペプチドの機能およびトランスフェリン融合タンパク質全体の機能を増強する可能性がある。このペプチドを用いて二機能性または多機能性の融合タンパク質を製作してもよく、これは複数の機能を有するペプチドまたはタンパク質ドメインを含ませることによってなされる。例えば、多機能の融合タンパク質は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質と、本融合タンパク質を１種またはそれ以上の特異的な標的に標的化させる第二のタンパク質とを用いて作製できる。
【０１６４】
本発明のトランスフェリン融合体は、トランスフェリンをＧＬＰ−１治療用ペプチドに連結するリンカーを含ませることができる。好ましくは、リンカーは、ＧＬＰ−２または１もしくはそれ以上のコピーの配列ＰＥＡＰＴＤ（配列番号１３）である。本融合タンパク質のアミノ末端には、１個またはそれ以上のＧＬＰ−１ペプチドが存在する。
【０１６５】
その他の実施態様において、改変トランスフェリン融合体分子は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質部分を含み、この部分は、例えば、アミノ酸配列のアミノ末端から欠失した１個またはそれ以上の残基を有するポリペプチドばかりでなく、その全長タンパク質を含む、ＧＬＰ−１治療用タンパク質のフラグメントであってもよい。
【０１６６】
その他の実施態様において、改変トランスフェリン融合体分子は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質部分を含み、この部分は、例えばアミノ酸配列のカルボキシ末端から欠失した１個またはそれ以上の残基を有するポリペプチドばかりでなく、その全長タンパク質を含むＧＬＰ−１治療用タンパク質のフラグメントであってもよい。
【０１６７】
その他の実施態様において、改変トランスフェリン融合体分子は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質部分を含み、この部分は、アミノおよびカルボキシ末端の両方から欠失した１個またはそれ以上のアミノ酸を有していてもよい。
【０１６８】
その他の実施態様において、改変トランスフェリン融合体分子は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質部分を含み、この部分は、本明細書で示された参照ＧＬＰ−１治療用タンパク質またはそれらのフラグメントと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。さらなる実施態様において、トランスフェリン融合体分子は、ＧＬＰ−１治療用タンパク質部分を含み、この部分は、上述のようなＮおよびＣ末端に欠失があるアミノ酸配列を有する参照ポリペプチドと、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である。
【０１６９】
その他の実施態様において、改変トランスフェリン融合体分子は、治療用タンパク質部分を含み、この部分は、例えばＧＬＰ−１治療用タンパク質の天然型または野生型アミノ酸配列と、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％同一である。また、これらのポリペプチドのフラグメントも提供される。
【０１７０】
本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質のＧＬＰ−１治療用タンパク質部分に相当するＧＬＰ−１治療用タンパク質、例えば細胞表面および分泌タンパク質は、１個またはそれ以上の少糖類の基を結びつけることによって改変することができる。グリコシル化と称される改変は、タンパク質の物理特性に有意に影響を与えることができ、タンパク質の安定性、分泌および局在化に重要である可能性がある。グリコシル化は、ポリペプチド主鎖に沿った特異的な位置で起こる。一般的に、グリコシル化には以下の２種の主要な型がある：Ｏ連結少糖類を特徴とするグリコシル化、この場合、少糖類は、セリンまたはスレオニン残基に結合する；および、Ｎ連結少糖類を特徴とするグリコシル化、この場合、少糖類は、Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ配列中のアスパラギン残基に結合し、ここにおいてＸは、プロリン以外のアミノ酸が可能である。タンパク質構造や細胞型のような変動要素は、様々なグリコシル化部位における鎖内の糖質単位の数と性質に影響を与える。また、所定の細胞型内では、グリコシル化された異性体は同じ部位でよく生ずる。例えば、ヒトインターフェロンの数種のタイプでグリコシル化される。
【０１７１】
本発明のトランスフェリン融合タンパク質、ならびにその類似体および変異体の治療用タンパク質部分に対応する治療用タンパク質は、それらを発現する宿主細胞による核酸配列の操作の結果として、またはそれらの発現のその他の条件によって、１またはそれ以上の部位でグリコシル化が変化するように改変されていてもよい。例えば、グリコシル化された異性体は、グリコシル化部位を無効にしたり、もしくはグリコシル化部位を導入することによって、例えば、アミノ酸残基の置換もしくは欠失によって、例えばアスパラギンをグルタミンで置換することによって、生産することができ、またはグリコシル化されていない組換えタンパク質は、それらをグリコシル化しないと予想される宿主細胞（例えばグリコシル化欠損酵母）において上記タンパク質を発現することによって生産することができる。これらのアプローチは当技術分野で既知である。
【０１７２】
治療用タンパク質、およびそれらの核酸配列は当技術分野でよく知られており、ケミカル・アブストラクツ・サービスのデータベース（Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｂｓｔｒａｃｔｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅｓ；例えばＣＡＳレジストリ）、ＧｅｎＢａｎｋおよびＧｅｎＳｅｑのような公開データベースで利用可能である。以下に言及する登録番号および配列は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７３】
その他の実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、本願のどこかで説明されている治療用タンパク質の治療活性および／または生物学的活性に相当する治療活性および／または生物学的な活性を有するものであり得る。さらなる実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の治療活性を有するタンパク質部分は、本明細書で引用された参照配列のフラグメントまたは変異体である。
【０１７４】
本発明はさらに、本明細書で説明されているＧＬＰ−１治療用タンパク質のフラグメントを含む改変されたＴｆ融合タンパク質を対象にする。タンパク質のＮ末端から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失して、治療用タンパク質部分の生物学的機能の１種またはそれ以上が改変されたり消失したりする場合でも、その他の治療活性および／または機能的な活性（例えば、生物活性、多量体化する能力、リガンドと結合する能力）は、それでもなお保持される可能性がある。例えば、Ｎ末端に欠失があるポリペプチドの、完全なまたは成熟した形態のポリペプチドを認識する抗体を誘導する、および／またはそれに結合する能力は、一般的に、Ｎ末端から除去された残基が、完全ポリペプチドの残基の半分程度より少なければ保持されると予想される。完全ポリペプチドのＮ末端の残基が欠失した特定のポリペプチドが、このような免疫学的な活性を保持しているかどうかは、本明細書で説明されている型どおりの方法や、それ以外の当技術分野で既知の方法によって分析することができる。Ｎ末端のアミノ酸残基が多数欠失した突然変異体が、何らかの生物学的活性または免疫原性活性を保持する可能性がないとはいえない。実際には、６個もの少ないアミノ酸残基で構成されるペプチドでも、しばしば免疫反応を誘発する可能性がある。
【０１７５】
また、上述したように、治療用タンパク質のＮ末端またはＣ末端から１個またはそれ以上のアミノ酸が欠失して、上記タンパク質の生物学的機能の１種またはそれ以上が改変されたり消失したりする場合でも、その他の機能的な活性（例えば、生物活性、多量体化する能力、リガンドと結合する能力）および／または治療活性は、それでもなお保持される可能性がある。例えば、Ｃ末端に欠失があるポリペプチドの、完全なまたは成熟したポリペプチドの形態を認識する抗体を誘導する、および／またはそれに結合する能力は、一般的に、完全なまたは成熟したポリペプチドの半分程度より少ない残基がＣ末端から除去されている場合、保持されると予想される。参照ポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端の残基が欠失した特定のポリペプチドが、治療活性を保持しているかどうかは、本明細書で説明されている型どおりの方法および／または当技術分野で既知のその他の方法で容易に測定することができる。
【０１７６】
ＧＬＰ−１治療用タンパク質のペプチドフラグメントは、アミノ酸配列がフラグメントである治療用タンパク質のポリペプチド配列の、治療活性および／または機能的な活性（例えば生物活性）を示すアミノ酸配列を含む、あるいはそれらからなるフラグメントであってもよい。
【０１７７】
ＧＬＰ−１治療用タンパク質のペプチドフラグメントは、タンパク質のＮ末端およびＣ末端のみを含むものでもよく、すなわちこの場合、治療用タンパク質の中央部分は欠失している。あるいは、このようなペプチドフラグメントは、治療用タンパク質の中央部分と隣接していない部分を含んでいてもよいし、および／または治療用タンパク質の中央部分と隣接する部分を含んでいてもよい。
【０１７８】
その他のポリペプチドフラグメントは、生物学的に活性なフラグメントである。生物学的に活性なフラグメントは、本発明で用いられる治療用タンパク質の活性に類似しているが必ずしも同一ではない活性を示すフラグメントである。このようなフラグメントの生物活性は、改善された所望の活性を含んでいてもよいし、または低減された望ましくない活性を含んでいてもよい。
【０１７９】
一般的に、タンパク質の変異体は、本発明のトランスフェリン融合タンパク質のＧＬＰ−１治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質のアミノ酸配列と全体的に極めて類似しており、多くの領域において同一である。また、これらの変異体をコードする核酸も本発明に包含される。
【０１８０】
本発明で使用可能なさらなる治療用ポリペプチドは、当業者既知のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、ＧＬＰ−１治療用タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸分子の相補物にハイブリダイゼーションするポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドである。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．等編，１９８９  Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，グリーン・パブリッシング・アソシエイツ社（Ｇｒｅｅｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、およびジョン・ワイリー＆サンズ社（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ｉｎｃ．），ニューヨーク州を参照）。また、これらのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも本発明に包含される。
【０１８１】
あるポリペプチドが、本発明のクエリーアミノ酸配列と少なくとも例えば９５％「同一な」アミノ酸配列を有するという場合、その議題のポリペプチド配列はクエリーアミノ酸配列のアミノ酸１００個あたり５個以下のアミノ酸の変更を含む可能性があるが、それ以外はクエリー配列と同一であることを意味する。言い換えれば、クエリーアミノ酸配列に少なくとも９５％同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、その議題の配列中に許容されるその他のアミノ酸の挿入、欠失または置換は、アミノ酸残基の５％以下である。これらの参照配列の変更は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端の位置で発生していてもよいし、またはアミノまたはカルボキシ末端の位置の間のどこかで発生していてもよく、後者の場合、その位置は、参照配列中の残基間に個別に散在しているか、または参照配列内の１個またはそれ以上のコンティグ基に散在しているかのいずれかである。
【０１８２】
実際問題として、いずれかの特定のポリペプチドが、例えば、本発明のトランスフェリン融合タンパク質またはそのフラグメントのアミノ酸配列（例えば、トランスフェリン融合タンパク質またはトランスフェリン融合タンパク質のトランスフェリン部分の、治療用タンパク質部分）に、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータープログラムを用いて従来通り決定することができる。クエリー配列（本発明の配列）と議題の配列との間の最良の総合的なマッチングを決定する好ましい方法（また、グローバル配列アライメントともいう）は、Ｂｒｕｆｉａｇ等（Ｃｏｍｐ．Ａｐｐ．Ｂｉｏｓｃｉ  ２４５（１９９０））のアルゴリズムに基づくＦＡＳＴＤＢコンピュータープログラムを用いて決定することができる。
【０１８３】
本発明のポリヌクレオチド変異体は、コード領域、非コード領域、またはその両方に変更を含んでいてもよい。サイレント置換、付加または欠失を生じさせるが、コードされたポリペプチドの特性または活性を変更しないような変更を含むポリヌクレオチド変異体を用いて、改変されたＴｆ融合タンパク質を生産することもできる。遺伝子コードの縮重によるサイレント置換によって生産されたヌクレオチド変異体が利用可能である。さらに、約５０未満、４０未満、３０未満、２０未満、１０未満、または５〜５０、５〜２５、５〜１０、１〜５もしくは１〜２個のアミノ酸が、あらゆる組み合わせで置換、欠失または付加を有するポリペプチド変異体も利用可能である。ポリヌクレオチド変異体は、多種多様な理由、例えば、コドン発現を特定の宿主に最適化するため、生産することができる（ヒトｍＲＮＡにおけるコドンを、上記の酵母またはＥ．ｃｏｌｉのような宿主に好ましいコドンに変える）。
【０１８４】
その他の実施態様において、ＧＬＰ−１治療用タンパク質部分は、野生型配列と比較して保存的置換を有する。「保存的置換」とは、グループ内での交換を意味し、例えば、脂肪族または疎水性アミノ酸Ａｌａ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの交換；ヒドロキシル残基ＳｅｒおよびＴｈｒの交換；酸性残基ＡｓｐおよびＧｌｕの交換；アミド残基ＡｓｎおよびＧｌｎの交換；塩基性残基Ｌｙｓ、ＡｒｇおよびＨｉｓの交換；芳香族残基Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐの交換；ならびにサイズが小さいアミノ酸Ａｌａ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＭｅｔおよびＧｌｙの交換である。表現型がサイレントのアミノ酸置換の製作方法に関する指針は、例えば、Ｂｏｗｉｅ等の「Ｄｅｃｉｐｈｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｅｓｓａｇｅ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ：Ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｔｏ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ２４７：１３０６〜１３１０（１９９０）で提供されている。特定の実施態様において、本発明のポリペプチドは、本明細書で説明されている本発明の治療用タンパク質および／または血清トランスフェリンおよび／改変トランスフェリンタンパク質のアミノ酸配列のフラグメントまたは変異体を含み、あるいはそれらからなり、ここにおいて、上記フラグメントまたは変異体は、参照アミノ酸配列と比較して、１〜５個、５〜１０個、５〜２５個、５〜５０個、１０〜５０個または５０〜１５０個のアミノ酸残基の付加、置換および／または欠失を有する。さらなる実施態様において、このようなアミノ酸置換は保存的である。また、これらのポリペプチドをコードする核酸も本発明に包含される。
【０１８５】
本発明の改変された融合タンパク質は、互いにペプチド結合、または改変されたペプチド結合で連結しているアミノ酸で構成されていてもよく、２０種の遺伝子でコードされたアミノ酸以外のアミノ酸を含んでいてもよい。上記ポリペプチドは、翻訳後プロセシングのような天然のプロセス、または当技術分野でよく知られた化学修飾技術のいずれかによって改変が可能である。このような改変は、基礎的な教本で、より詳細な単行本で十分に記載されており、加えて膨大な研究文献でも記載されている。
【０１８６】
改変は、ポリペプチド中のどこでも起こる可能性があり、例えばペプチド主鎖、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端などで起こる。当然のことながら、同じタイプの改変が、所定のポリペプチド中のいくつかの部位において、同じ程度で存在していてもよいし、または様々な程度で存在していてもよい。また、多くのタイプの改変が所定のポリペプチドに含まれていてもよい。ポリペプチドは分岐状でもよいし（例えばユビキチン化の結果として）、環状でもよく、この場合、分岐を含んでいてもよいし、またはそれらを含まなくてもよい。環状ポリペプチド、分岐ポリペプチド、および分岐した環状ポリペプチドは、翻訳後の天然プロセスによって生成してもよいし、または、合成方法で製造してもよい。改変としては、アセチル化、アシル化、ＡＤＰ−リボシル化、アミド化、フラビンの共有結合、ヘム部分の共有結合、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体の共有結合、脂質もしくは脂質誘導体の共有結合、ホスファチジルイノシトール（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ）の共有結合、架橋、環化、ジスルフィド結合の形成、脱メチル、共有結合架橋の形成、システインの形成、グリコシル化、ＧＰＩアンカー形成、水酸化、ヨウ素化、メチル化、ミリスチル化、酸化、ペグ化、タンパク分解的プロセシング、リン酸化、プレニル化、ラセミ化、硫酸化、トランスファーＲＮＡ介在のタンパク質へのアミノ酸付加、例えばアルギニル化、およびユビキチン化が挙げられる。（例えば、ＰＲＯＴＥＩＮＳ−ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＰＲＯＰＥＲＴＩＥＳ，第二版，Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，ニューヨーク（１９９３）；ＰＯＳＴ−ＴＲＡＮＳＬＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＶＡＬＥＮＴ  ＭＯＤＩＦＩＣＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＲＯＴＥＩＮＳ，Ｂ．Ｃ．Ｊｏｈｎｓｏｎ編，アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク，１〜１２頁（１９８３）；Ｓｅｉｆｔｅｒ等（１９９０）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８２：６２６〜６４６；Ｒａｔｔａｎ等，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．６６３：４８〜６２を参照）。
【０１８７】
ＧＬＰ-２
ＧＬＰ−２は、組織特異的にグルカゴン遺伝子から発現される３３個のアミノ酸からなるペプチドである。ＧＬＰ−２は、以下の配列を有する：Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｐｈｅ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ、配列番号９６）。ＧＬＰ−２は、ＧＬＰ−１に関連する。しかしながら、ＧＬＰ−１とは異なり、ＧＬＰ−２の生理学的な役割はわかっていない。
【０１８８】
本発明において、ＧＬＰ−２は、ＧＬＰ−１をトランスフェリンまたは改変トランスフェリンに連結するためのリンカーとして用いられる。本発明者等は、ＧＬＰ−２をＧＬＰ／ｍＴｆ融合タンパク質中のリンカーとして用いると、融合タンパク質が安定化し、より強力なＧＬＰ−１ペプチドを産生することを見出したが、これは、ＧＬＰ−１ペプチドが、その受容体への結合により利用しやすいためと思われる。従って、本発明は、トランスフェリンまたは改変トランスフェリン分子に連結したＧＬＰ−２に連結したＧＬＰ−１を含むトランスフェリン融合タンパク質を提供する。このようなトランスフェリン分子としては、血清トランスフェリン、ラクトフェリン、またはメラノトランスフェリン分子が可能である。
【０１８９】
トランスフェリン融合タンパク質のＮ末端に、少なくとも１つのＧＬＰ−１分子が存在する。一実施態様において、２〜５個のＧＬＰ−１分子が存在する。その他の実施態様において、３または４個のＧＬＰ−１分子が存在する。
【０１９０】
好ましい実施態様において、ＧＬＰ−２リンカー配列は、ＧＬＰ−２のＮ末端のアミノ酸に相当するアミノ酸（すなわちヒスチジン）が存在しないか、またはその他のアミノ酸に変更されるかのいずれかになるように改変される。
【０１９１】
核酸
本発明はまた、ＧＬＰ−１治療用タンパク質に共有結合で連結されたまたは結合したトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の部分、好ましくは治療用タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸分子を提供する。以下でより詳細に説明されるように、あらゆる治療用タンパク質が使用可能である。本融合タンパク質は、リンカー領域をさらに含んでいてもよく、例えば約５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満または１０個未満のアミノ酸残基のリンカーをさらに含んでいてもよい。このリンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその部分に共有結合することができ、さらに、トランスフェリンタンパク質またはその部分と、治療用タンパク質、好ましくは治療用タンパク質との間を共有結合させることができる。本発明の核酸分子は精製されていてもよいし、または精製されていなくてもよい。
【０１９２】
また、核酸分子を複製し、コードされた融合タンパク質を発現させるための宿主細胞およびベクターも提供される。原核性か、または真核性かにかかわらずあらゆるベクターまたは宿主細胞が使用可能であるが、真核性の発現系、具体的には酵母発現系が好ましい場合がある。このような目的のための多くのベクターおよび宿主細胞が当技術分野で既知である。所望の適用に適した適切な組み合わせを選択することは十分に当技術分野の技術の範囲内である。
【０１９３】
トランスフェリン、トランスフェリンの部分およびＧＬＰ−１およびリンカーをコードするＤＮＡ配列は、当技術分野で既知の多種多様なゲノムまたはｃＤＮＡライブラリーからクローニングすることができる。プローブに基づく方法を用いてこのようなＤＮＡ配列を分離する技術の従来技術は、これは当業者によく知られている。このようなＤＮＡ配列を分離するためのプローブは、公開されたＤＮＡまたはタンパク質配列に基づくものでもよい（例えば、Ｂａｌｄｗｉｎ，Ｇ．Ｓ．（１９９３）Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｒｏｍ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｃｏｍｐ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０６Ｂ／１：２０３〜２１８を参照、およびそこで引用された文献はいずれも、参照によりその全体を本明細書に加入する）。あるいは、Ｍｕｌｌｉｓ等（米国特許第４,６８３,１９５号）およびＭｕｌｌｉｓ（米国特許第４,６８３,２０２号）で記載されたポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法（参照により本明細書に加入する）を用いてもよい。このようなＤＮＡ配列を分離するためのライブラリーの選択およびプローブの選択は、当技術分野における通常の技術レベルの範囲内である。
【０１９４】
当技術分野で既知のように、２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の「類似性」は、一つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドのヌクレオチドまたはアミノ酸配列、さらにその保存されたヌクレオチドまたはアミノ酸置換を、第二のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列と比較することによって決定される。また、当技術分野で既知であるが、「同一性」は、このような配列の２本のストリングス間のマッチの同一性によって決定して、２種のポリペプチド配列間、または、２種のポリヌクレオチド配列間の配列の関連性の程度を意味する。同一性も類似性も、容易に計算することができる（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．，ｅｄ．，オックスフォード・ユニバーシティ・プレス（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．，ｅｄ．，アカデミックプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．，編，ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ），ニュージャージー州，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，アカデミックプレス，１９８７；およびＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．，編，Ｍストックトンプレス（Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ），ニューヨーク州，１９９１）。
【０１９５】
２種のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列間の同一性および類似性を測定する多数の方法があるが、用語「同一性」および「類似性」は当業者によく知られている（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，Ｇ．，アカデミックプレス，１９８７；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍストックトンプレス，ニューヨーク，１９９１；および、Ｃａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）。２つの配列の同一性または類似性を決定するのに一般的に用いられる方法としては、これらに限定されないが、Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｈｕｇｅ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｊ．Ｂｉｓｈｏｐ，ｅｄ．，アカデミックプレス，サンディエゴ，１９９４、およびＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．４８：１０７３（１９８８）で記載された技術が挙げられる。
【０１９６】
同一性を決定する好ましい方法は、試験される２つの配列間の最大のマッチが得られるように設計される。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータープログラムに体系化されている。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法としては、これらに限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２（１）：３８７（１９８４））、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ，等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３（１９９０））が挙げられる。上述した類似性または同一性の程度は、２つの配列間の同一性の程度として決定されるが、第二の配列からの第一の配列の派生を示す場合が多い。２つの核酸配列間の同一性の程度は、当技術分野で既知のコンピュータープログラムによって決定してもよく、このようなプログラムとしては、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージに含まれているＧＡＰが挙げられる（ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３〜４５３（１９７０））。本発明に係る２つの核酸配列間の同一性の程度を決定するためには、ＧＡＰは、以下の設定：ＧＡＰクリエーションペナルティーは５.０、およびギャップ伸長ペナルティーは０.３で用いられる。
【０１９７】
コドン最適化
遺伝子コードの縮重により、関心あるトランスフェリンタンパク質および／または治療用タンパク質のヌクレオチドの配列の変異型が許容されるが、このような変異型はそれでもなお天然型のＤＮＡ配列によってコードされたポリペプチドと同一なアミノ酸配列を有するポリペプチドを生産する。このような手法は、「コドン最適化」（米国特許第５,５４７,８７１号で記載されており、これはその全体を参照により本明細書に加入する）として知られており、それにより、このような改変ＤＮＡ配列を設計する手段を備えた一つが提供される。コドンが最適化された遺伝子の設計は多種多様な要因を考慮すべきであり、このような要因としては、生物におけるコドン使用の頻度（ｎｅａｒｅｓｔ  ｎｅｉｇｈｂｏｒ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ）、最隣接の頻度、ＲＮＡの安定性、２次構造形成の可能性、合成経路およびその遺伝子の目的とするさらなるＤＮＡ操作が挙げられる。特に、酵母発現系が用いられる場合、所定の融合タンパク質をコードするコドンを最も容易に酵母によって認識されるコドンに変更するのに利用可能な方法を用いることができる。
【０１９８】
遺伝子コードの縮重は、同じアミノ酸配列を、多くの異なる方法でコードして、翻訳することを可能にする。例えば、ロイシン、セリンおよびアルギニンはそれぞれ、６種の異なるコドンによってコードされ、バリン、プロリン、スレオニン、アラニンおよびグリシンはそれぞれ、４種の異なるコドンによってコードされる。しかしながら、このような同義コドンの使用頻度は、真核生物や原核生物のなかのゲノムごとに様々である。例えば、哺乳動物間の同義のコドンの選択パターンは極めて類似しているが、進化的に遠い生物、例えば酵母（例えばＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、細菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）および昆虫（例えば、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）は、ゲノムのコドンの使用頻度において明らかに異なるパターンを示す（Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，８，４９〜６２（１９８０）；Ｇｒａｎｔｈａｍ，Ｒ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，９，４３〜７４（１９８１）；Ｍａｒｏｙａｍａ，Ｔ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１４，１５１〜１９７（１９８６）；Ａｏｔａ，Ｓ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１６，３１５〜４０２（１９８８）；Ｗａｄａ，Ｋ．等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９  Ｓｕｐｐ．，１９８１〜１９８５（１９９１）；Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２８５，１６５〜１６９（１９９１））。これらのコドン選択パターンの差は、ペプチド伸長速度を調節することによって、個々の遺伝子の総合的な発現レベルに寄与しているようである。（Ｋｕｒｌａｎｄ，Ｃ．Ｇ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２８５，１６５〜１６９（１９９１）；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｓ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，３，２８９５〜２８９８（１９８４）；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ，Ｍ．Ａ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０７，３６５〜３７７（１９８９）；Ｒａｎｄａｌｌ，Ｌ．Ｌ．，等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７，３７５〜３７９（１９８０）；Ｃｕｒｒａｎ，Ｊ．Ｆ．およびＹａｒｕｓ，Ｍ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２０９，６５〜７７（１９８９）；Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．，等，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１８０，５４９〜５７６（１９８４），Ｖａｒｅｎｎｅ，Ｓ．，等，Ｊ．Ｍｏｌ，Ｂｉｏｌ．，１８０，５４９〜５７６（１９８４）；Ｇａｒｅｌ，Ｊ．−Ｐ．，Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．，４３，２１１〜２２５（１９７４）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１４６，１〜２１（１９８１）；Ｉｋｅｍｕｒａ，Ｔ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５１，３８９〜４０９（１９８１））。
【０１９９】
合成遺伝子の場合の好ましいコドンの使用頻度は、組換えタンパク質発現での使用を目的とする細胞／生物の正確な（または可能な限り密接に関連した）ゲノム、特に酵母種のゲノムから誘導された核遺伝子のコドンの使用を反映すべきである。上記で考察したように、好ましい一実施態様において、ヒトＴｆ配列は、酵母発現に関して本明細書で説明されているように、治療用タンパク質のヌクレオチド配列と同様に、改変前または改変後にコドンが最適化される。
【０２００】
ベクター
本発明で使用するための発現単位は、一般的に、５’から３’方向に機能するように連結している以下の構成要素を含むことになる：転写プロモーター、分泌シグナル配列、リンカー、ＧＬＰ−１をコードするＤＮＡ配列に結合したトランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンタンパク質の部分を含む改変されたＴｆ融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列、および転写ターミネーター。上記で考察したように、Ｔｆ部分に融合したＧＬＰ−１およびリンカーのあらゆる配列が本発明のベクターで使用可能である。適切なプロモーター、シグナル配列およびターミネーターの選択は、選択された宿主細胞に応じて決定されることになり、それは当業者には明らかであり、より具体的には以下で考察する。
【０２０１】
本発明で使用するのに適切な酵母ベクターは米国特許第６,２９１,２１２号で記載されており、例えば、ＹＲｐ７（Ｓｔｒｕｈｌ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：１０３５〜１０３９，１９７８）、ＹＥｐ１３（Ｂｒｏａｃｈ等，Ｇｅｎｅ  ８：１２１〜１３３，１９７９）、ｐＪＤＢ２４９およびｐＪＤＢ２１９（Ｂｅｇｇｓ，Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：１０４〜１０８，１９７８）、ｐＰＰＣ０００５、ｐＳｅＣＨＳＡ、ｐＳｃＮＨＳＡ、ｐＣ４、およびそれらの誘導体が挙げられる。また、有用な酵母プラスミドベクターとしては、ｐＲＳ４０３〜４０６、ｐＲＳ４１３〜４１６およびピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ベクターも挙げられ、これは、ストラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ラ  ホーヤ，カリフォルニア州９２０３７，米国）より入手可能である。プラスミドｐＲＳ４０３、ｐＲＳ４０４、ｐＲＳ４０５およびｐＲＳ４０６は、酵母組込み型プラスミド（ＹＩｐ）であり、酵母選択マーカーＨＩＳ３、ＴＲＰ１、ＬＥＵ２およびＵＲＡ３を組み込む。プラスミドｐＲＳ４１３〜４１．６は、酵母セントロメアプラスミド（ＹＣｐ）である。
【０２０２】
このようなベクターは、一般的に選択マーカーを含むことになるが、これは、優性表現型を示す多数の遺伝子の１つであることができ、そのために表現型分析が存在し、形質転換株の選択を可能にする。好ましい選択マーカーは、宿主細胞の栄養要求性を補足するもの、抗生物質耐性を提するもの、または細胞の特異的な炭素源の利用を可能にするものであり、このような選択マーカーとしては、例えば、ＬＥＵ２（Ｂｒｏａｃｈ等，同書中）、ＵＲＡ３（Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等，Ｇｅｎｅ  ８：１７，１９７９）、ＨＩＳ３（Ｓｔｒｕｈｌ等，同書中）またはＰＯＴ１（ＫａｗａｓａｋｉおよびＢｅｌｌ，ＥＰ１７１，１４２）が挙げられる。その他の適切な選択マーカーとしては、酵母細胞にクロラムフェニコール耐性を付与するＣＡＴ遺伝子が挙げられる。酵母に使用するのに好ましいプロモーターとしては、酵母の解糖系遺伝子由来のプロモーター（Ｈｉｔｚｅｍａｎ等，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２２５：１２０７３〜１２０８０，１９８０；ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：４１９〜４３４，１９８２；Ｋａｗａｓａｋｉ，米国特許第４,５９９,３１１号）またはアルコールデヒドロゲナーゼの遺伝子（Ｙｏｕｎｇ等，ｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ｆｏｒ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｈｏｌｌａｅｎｄｅｒ等（編），ｐ．３５５，Ｐｌｅｎｕｍ，Ｎ．Ｙ．，１９８２；Ａｍｍｅｒｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１０１：１９２〜２０１，１９８３）が挙げられる。これに関して、特に好ましいプロモーターは、ＴＰＩ１プロモーター（Ｋａｗａｓａｋｉ、米国特許第４,５９９,３１１号）およびＡＤＨ２−４C（米国特許第６,２９１,２１２号参照）プロモーター（Ｒｕｓｓｅｌｌ等，Ｎａｔｕｒｅ３０４：６５２〜６５４，１９８３）である。また、発現単位には、転写ターミネーターが含まれていてもよい。好ましい転写ターミネーターは、ＴＰＩ１ターミネーター（ＡｌｂｅｒおよびＫａｗａｓａｋｉ，同書中）である。その他の好ましいベクターや好ましい成分、例えば酵母発現系のプロモーターやターミネーターは、欧州特許ＥＰ０２５８０６７、ＥＰ０２８６４２４、ＥＰ０３１７２５４、ＥＰ０３８７３１９、ＥＰ０３８６２２２、ＥＰ０４２４１１７、ＥＰ０４３１８８０、およびＥＰ１００２０９５；欧州特許出願公開  ＥＰ０８２８７５９、ＥＰ０７６４２０９、ＥＰ０７４９４７８、およびＥＰ０８８９９４９；ＰＣＴ公開ＷＯ００／４４７７２およびＷＯ９４／０４６８７；および米国特許第５,７３９,００７号；５,６３７,５０４；５,３０２,６９７；５,２６０,２０２；５,６６７,９８６；５,７２８,５５３；５,７８３,４２３；５,９６５,３８６；６１５０,１３３；６,３７９,９２４；および５,７１４,３７７で開示されており、これらはその全体を参照により本明細書に加入する。
【０２０３】
酵母に加えて、本発明の改変された融合タンパク質は、糸状菌、例えば菌類アスペルギルス属の菌株で発現させることができる。有用なプロモーターの例としては、アスペルギルス・ニダランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）の解糖系遺伝子から誘導されたもの、例えばａｄｈ３プロモーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．４：２０９３〜２０９９，１９８５）、および、ｔｐｉＡプロモーターが挙げられる。適切なターミネーターの例は、ａｄｈ３ターミネーター（ＭｃＫｎｉｇｈｔ等，同書中）である。このような成分を利用する発現単位は、例えば、アスペルギルスの染色体ＤＮＡに挿入できるベクターにクローニングしてもよい。
【０２０４】
本発明の実施に使用するための哺乳動物発現ベクターとしては、改変されたＴｆ融合タンパク質の転写に特異化することができるプロモーターが挙げられる。好ましいプロモーターとしては、ウイルス性プロモーターおよび細胞性プロモーターが挙げられる。好ましいウイルス性プロモーターとしては、アデノウイルス２由来の主要後期プロモーター（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．２：１３０４〜１３１９９，１９８２）およびＳＶ４０プロモーター（Ｓｕｂｒａｍａｎｉ等，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４〜８６４，１９８１）が挙げられる。好ましい細胞性プロモーターとしては、マウスのメタロチオネイン１プロモーター（Ｐａｌｍｉｔｅｒ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２２：８０９〜８１４，１９８３）、および、マウスＶ６（米国特許第６,２９１,２１２号を参照）プロモーター（Ｇｒａｎｔ等，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１５：５４９６、１９８７）が挙げられる。特に好ましいプロモーターは、マウスＶH（米国特許第６,２９１,２１２号を参照）プロモーター（Ｌｏｈ等，ｉｂｉｄ）である。また、このような発現ベクターは一連のＲＮＡスプライシング部位を含んでいてもよく、これらはプロモーター下流、かつトランスフェリン融合タンパク質をコードするＤＮＡ配列上流に位置する。好ましいＲＮＡスプライシング部位は、アデノウイルスおよび／または免疫グロブリン遺伝子から得ることができる。
【０２０５】
また、関心あるコード配列の下流に位置するポリアデニル化シグナルも発現ベクターに含まれる。ポリアデニル化シグナルとしては、ＳＶ４０由来の初期または後期ポリアデニル化シグナル（ＫａｕｆｍａｎおよびＳｈａｒｐ，同書中）、アデノウイルス５Ｅ１Ｂ領域およびヒト成長ホルモン遺伝子のターミネーター由来のポリアデニル化シグナル（ＤｅＮｏｔｏ等，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．９：３７１９〜３７３０，１９８１）が挙げられる。特に好ましいポリアデニル化シグナルは、ＶH（米国特許第６,２９１,２１２号を参照）遺伝子ターミネーター（Ｌｏｈ等，同書中）である。発現ベクターは、非コードウイルス性のリーダー配列を含んでいてもよく、例えば、プロモーターとＲＮＡスプライシング部位との間に位置するアデノウイルス２の三分節系のリーダーである。また、好ましいベクターは、エンハンサー配列を含んでいてもよく、例えばＳＶ４０エンハンサーおよびマウス（米国特許第６,２９１,２１２号を参照）エンハンサー（Ｇｉｌｌｉｅｓ，Ｃｅｌｌ  ３３：７１７〜７２８，１９８３）である。また、発現ベクターは、アデノウイルスＶＡのＲＮＡをコードする配列を含んでいてもよい。
【０２０６】
形質転換
菌類を形質転換する技術は文献においてよく知られており、例えば、Ｂｅｇｇｓ（同書中）、Ｈｉｎｎｅｎ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７５：１９２９〜１９３３，１９７８）、Ｙｅｌｔｏｎ等（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：１７４０〜１７４７，１９８４）、およびＲｕｓｓｅｌｌ（Ｎａｔｕｒｅ  ３０１：１６７〜１６９，１９８３）に記載されている。真菌細胞にクローニングしたＤＮＡ配列を導入するその他の技術、例えばエレクトロポレーション（ＢｅｃｋｅｒおよびＧｕａｒｅｎｔｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９４：１８２〜１８７，１９９１）を用いてもよい。宿主細胞の遺伝子型は、一般的に、発現ベクターに存在する選択マーカーによって補足される遺伝学的な欠陥を含むと予想される。特定の宿主および選択マーカーの選択は、十分に当技術分野における通常技術のレベルの範囲内である。
【０２０７】
クローニングした本発明の融合タンパク質を含むＤＮＡ配列は、培養した哺乳動物細胞に導入してもよく、これは例えば、リン酸カルシウムが媒介するトランスフェクションによってなされる（Ｗｉｇｌｅｒ等，Ｃｅｌｌ  １４：７２５、１９７８；ＣｏｒｓａｒｏおよびＰｅａｒｓｏｎ，Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：６０３，１９８１；ＧｒａｈａｍおよびＶａｎ  ｄｅｒ  Ｅｂ，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６，１９７３）。また、哺乳動物細胞にクローニングしたＤＮＡ配列を導入するその他の技術、例えばエレクトロポレーション（Ｎｅｕｍａｎｎ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．１：８４１〜８４５，１９８２）、またはリポフェクションも使用可能である。クローニングしたＤＮＡを組み込まれている細胞を同定するためには、一般的に、選択マーカーが、関心ある遺伝子またはｃＤＮＡと共に細胞に導入される。培養した哺乳動物細胞に使用するのに好ましい選択マーカーとしては、ネオマイシン、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートのような薬物耐性を付与する遺伝子が挙げられる。選択マーカーは、増幅可能な選択マーカーであり得る。好ましい増幅可能な選択マーカーは、ＤＨＦＲ遺伝子である。特に好ましい増幅可能なマーカーは、ＤＨＦＲr（米国特許第６,２９１,２１２号を参照）ｃＤＮＡ（ＳｉｍｏｎｓｅｎおよびＬｅｖｉｎｓｏｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８０：２４９５〜２４９９，１９８３）である。選択マーカーは、Ｔｈｉｌｌｙ（Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｔｏｎｅｈａｍ，Ｍａｓｓ．）によって概説されており、選択マーカーの選択は、十分当技術分野における通常の技術レベルの範囲内である。
【０２０８】
宿主細胞
本発明はまた、本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質を発現するように形質転換された細胞、好ましくは酵母細胞も含む。形質転換宿主細胞それ自身に加えて、本発明はまた、上記細胞の培養物、好ましくはモノクローナル（クローン的に均一な）培養物、または栄養培地中でモノクローナル培養物から誘導された培養物も含む。ポリペプチドが分泌されると、培地は、そのポリペプチドを細胞と共に含むことになり、または培地をろ過したり、または遠心分離した場合はそのポリペプチドを細胞なしで含むことになる。
【０２０９】
本発明の実施に使用するための宿主細胞としては、外因性ＤＮＡで形質転換またはトランスフェクションさせ、それらを培養物中で増殖させることができる真核細胞、場合によっては原核細胞が挙げられ、例えば、培養した哺乳動物、昆虫、真菌、植物および細菌細胞である。
【０２１０】
真菌細胞、例えば酵母種（例えば、サッカロミセス属エスピーピー、シゾサッカロミセス属エスピーピー、ピチア属エスピーピー）は、本発明の範囲内で宿主細胞として使用可能である。本発明の実施において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質を発現するための宿主として有用であると考えられる酵母などの菌類の例としては、ピチア属（そのうちいくつかの種は、以前はハンセヌラ属と分類されていた）、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、アスペルギルス属、カンジダ属、トルロプシス属、トルラスポラ属、シゾサッカロミセス属、シテロミセス属（Ｃｉｔｅｒｏｍｙｃｅｓ）、パチソレン属（Ｐａｃｈｙｓｏｌｅｎ）、チゴサッカロミセス属、デバリオミセス属（Ｄｅｂａｒｏｍｙｃｅｓ）、トリコデルマ属、セファロスポリウム属、フミコーラ属、ムコール属、アカパンカビ属、ヤロビア属（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、メチニコビア属（Ｍｅｔｓｃｈｕｎｉｋｏｗｉａ）、ロドスポリジウム属、ロイコスポリジウム属、ボトリオアスカス属（Ｂｏｔｒｙｏａｓｃｕｓ）、スポリジオボラス属（Ｓｐｏｒｉｄｉｏｂｏｌｕｓ）、エンドミコプシス属（Ｅｎｄｏｍｙｃｏｐｓｉｓ）などが挙げられる。サッカロミセス属エスピーピーの例は、Ｓ．セレビジエ、Ｓ．イタリカス（Ｓ．ｉｔａｌｉｃｕｓ）およびＳ．ルキシー（Ｓ．ｒｏｕｘｉｉ）である。クルイベロミセス属エスピーピーの例は、Ｋ．フラジリス（Ｋ．ｆｒａｇｉｌｉｓ）、Ｋ．ラクチス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）、およびＫ．マルキシアヌス（Ｋ．ｍａｒｘｉａｎｕｓ）である。適切なトルラスポラ属の種は、Ｔ．デルブルッキー（Ｔ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）である。ピチア属エスピーピーの例は、Ｐ．アングスタ（Ｐ．ａｎｇｕｓｔａ，以前はＨ．ポリモルファ）、Ｐ．アノマーラ（Ｐ．ａｎｏｍａｌａ）(以前はＨ．アノマーラ)、およびＰ．パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。
【０２１１】
本発明のＴｆ融合タンパク質を生産するのに特に有用な宿主細胞は、メチロトローフィックなピチア・パストリスである（Ｓｔｅｉｎｌｅｉｎ等（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ．Ｐｕｒｉｆ．６：６１９〜６２４）。ピチア・パストリスは、そのアルコールオキシダーゼプロモーターが分離され、クローニングされて以来、外来タンパク質生産のための優れた宿主として開発されてきた；その形質転換は１９８５年に初めて報告された。Ｐ．パストリスは、グルコースの非存在下で炭素源としてメタノールを利用することができる。Ｐ．パストリスの発現系は、メタノールによって誘導されたアルコールオキシダーゼ（ＡＯＸ１）プロモーターを使用でき、これは、メタノール代謝における第一の工程を触媒する酵素であるアルコールオキシダーゼの発現をコードする遺伝子を制御する。このプロモーターは特徴付けられており、一連のＰ．パストリスの発現ベクターに組み込まれている。Ｐ．パストリスで生産されたタンパク質は、典型的には、正確に折り畳まれ、培地に分泌されるため、遺伝子操作されたＰ．パストリスの発酵は、Ｅ．ｃｏｌｉの発現系に代る優れた手段を提供する。この系を用いて、破傷風毒素フラグメント、百日咳菌（Ｂｏｒｄａｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のペルタクチン、ヒト血清アルブミンおよびリゾチームなどの多数のタンパク質が生産されている。
【０２１２】
その他の好ましい宿主は、酵母サッカロミセス・セレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株である。好ましい実施態様において、酵母細胞、またはより具体的には、糖タンパク質のアスパラギン結合型グリコシル化に必要な遺伝子に遺伝学的な欠損を含むサッカロミセス・セレビジエ宿主細胞が用いられる。このような欠損を有するＳ．セレビジエ宿主細胞は、標準的な突然変異および選択の技術を用いて調製することができるが、多くの利用可能な酵母株は、グリコシル化または過剰なマンノシル化を防止または低減するように改変されている。Ｂａｌｌｏｕ等（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：５９８６〜５９９１，１９８０）は、アスパラギン結合型グリコシル化に影響を与える遺伝子を欠損したマンノプロテイン生合成突然変異体の分離を記載している。ＧｅｎｔｚｓｃｈおよびＴａｎｎｅｒ（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  ７：４８１〜４８６，１９９７）は、酵母におけるタンパク質のＯ−グリコシル化における第一の工程に関与する酵素をコードする少なくとも６種の遺伝子（ＰＭＴ１〜６）のファミリーを記載している。これらの遺伝子の１種またはそれ以上を欠損した突然変異体は、減少したＯ結合グリコシル化および／または変更されたＯ−グリコシル化特異性を示す。
【０２１３】
一実施態様において、宿主は、ＷＯ０５／０６１７１８（参照によりその全体を本明細書に加入する）に記載されているＳ．セレビジエ株である。例えば、宿主は、ＰＤＩ１またはその他のシャペロンがそれぞれノックアウトされた宿主バージョンを有する株において、ＰＤＩ１遺伝子または任意のその他のシャペロン遺伝子をのコピーを運ぶｐＳＡＣ３５ベースのプラスミドを含んでいてもよい。このようなコンストラクトは、増強された安定性を付与する。本明細書の実施例の章において、「コントロール株」および「株Ａ」と称される株は、ＷＯ０５／０６１７１８に記載されている同名の株のことである。
【０２１４】
異種タンパク質生産を最適化するためには、また、宿主株が突然変異を有することが好ましく、例えば、タンパク質分解活性の減少をもたらすＳ．セレビジエｐｅｐ４突然変異（Ｊｏｎｅｓ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８５：２３〜３３，１９７７）である。その他のプロテアーゼをコードした領域に突然変異を含む宿主株は、大量の本発明のＴｆ融合タンパク質を生産するのに特に有用である。
【０２１５】
本発明のＤＮＡコンストラクトを含む宿主細胞は、適切な増殖培地で増殖させる。本明細書で用いられる用語「適切な増殖培地」は、細胞増殖に必要な栄養素を含む培地を意味する。細胞増殖に必要な栄養素としては、炭素源、窒素源、必須アミノ酸、ビタミン、無機物質および増殖因子を含みうる。増殖培地は、一般的に、例えば薬物選択または必須栄養素の欠損によってＤＮＡコンストラクトを含む細胞を選択するが、これは、ＤＮＡコンストラクト上に存在する選択マーカーによって補足されるか、またはＤＮＡコンストラクトと共にトランスフェクションされる。例えば、酵母細胞は、好ましくは、炭素源、例えばスクロース、アミノ酸以外の窒素源、無機塩、ビタミン、および必須アミノ酸の補給剤を含む化学的に規定された培地で増殖させる。培地のｐＨは、好ましくは２より大きく８未満のｐＨに維持され、好ましくはｐＨ５.５〜６.５に維持される。安定なｐＨを維持する方法としては、緩衝化、および一定なｐＨへの制御が挙げられる。好ましい緩衝剤としては、コハク酸、およびビス−トリス（シグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．，セントルイス，ミズーリ州）が挙げられる。アスパラギン結合型グリコシル化に必要な遺伝子が欠損した酵母細胞は、好ましくは、浸透圧安定剤を含む培地中で増殖させる。好ましい浸透圧安定剤は、ソルビトールであり、これは、０.１Ｍ〜１.５Ｍの濃度、好ましくは０.５Ｍまたは１.０Ｍの濃度で培地に補給される。
【０２１６】
培養した哺乳動物細胞は、一般的に、市販の血清含有培地または無血清培地で増殖させる。用いられる特定の細胞系に適した培地の選択は、当技術分野における通常の技術レベルの範囲内である。トランスフェクションされた哺乳動物細胞は、関心のあるＤＮＡ配列の発現を開始させるために、一定期間、典型的には１〜２日間増殖するにまかせる。次に、薬物選択を行い、選択マーカーを安定して発現している細胞の増殖を選択する。増幅可能な選択マーカーでトランスフェクションされた細胞に対しては、クローニングした配列のコピー数が高く、従って発現レベルが高いものを選択するために、薬物濃度を段階的に増加させてもよい。
【０２１７】
また、バキュロウイルス／昆虫細胞発現系を用いて、本発明の改変されたＴｆ融合タンパク質を生産してもよい。ＢａｃＰＡＫTMバキュロウイルス発現系（ＢＤバイオサイエンス（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）））は、昆虫宿主細胞において組換えタンパク質を高レベルで発現する。標的遺伝子はトランスファーベクターに挿入され、これが、昆虫宿主細胞に、直線状にしたＢａｃＰＡＫ６ウイルスＤＮＡと共にトランスフェクションされる。ＢａｃＰＡＫ６のＤＮＡは、バキュロウイルスゲノムの必須部分を欠失している。上記ＤＮＡがベクターと再結合すると、必須の構成要素が復活し、標的遺伝子がバキュロウイルスゲノムに移される。組換えの後、２〜３個のウイルスプラークをピックアップし、精製し、組換え表現型を検証する。次に、新たに分離した組換えウイルスを増幅して、それを用いて昆虫細胞培養に感染させ、大量の所望のタンパク質を生産することができる。
【０２１８】
また、本発明のＴｆ融合タンパク質は、トランスジェニック植物および動物を用いて生産してもよい。例えば、ヒツジやヤギは、それらの乳汁中に治療用タンパク質を作ることができる。または、タバコ植物は、それらの葉中にタンパク質を含むことができる。トランスジェニック植物および動物でのタンパク質生産はいずれも、本融合タンパク質を新しいコードする遺伝子を生物のゲノムに付加することを含む。トランスジェニック生物は新しいタンパク質の生産が可能なだけでなく、この能力をその子孫に受け渡すこともできる。
【０２１９】
分泌シグナル配列
用語「分泌シグナル配列」または「シグナル配列」または「分泌リーダー配列」は、同じ意味で用いられ、さらに、例えば米国特許第６,２９１,２１２号および米国特許第５,５４７,８７１号（これらはいずれも、その全体を参照により本明細書に加入する）に記載されている。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は、分泌ペプチドをコードする。分泌ペプチドは、細胞からの成熟ポリペプチドまたはタンパク質の分泌を指示するように作用するアミノ酸配列である。分泌ペプチドは、一般的に、疎水性アミノ酸のコアを特徴とし、典型的には（ただしそうとは限らないが）、新たに合成されたタンパク質のアミノ末端で見出される。分泌ペプチドは、分泌の間に成熟タンパク質から切断されることが極めて多い。分泌ペプチドは、分泌経路を通過するとき、シグナルペプチドを成熟タンパク質の切断を可能にするプロセシング部位を含んでいてもよい。プロセシング部位は、シグナルペプチド内にコードされている場合もあるし、または例えばインビトロでの変異誘発によってシグナルペプチドに付加されている場合もある。
【０２２０】
分泌ペプチドを用いて、本発明のＧＬＰ−１／ｍＴｆおよびＧＬＰ−１／リンカー／ＧＬＰ−１融合タンパク質の分泌を指示してもよい。このような、その他の分泌ペプチドと組み合わせて使用可能な分泌ペプチドの一つは、アルファ接合因子リーダー配列である。分泌シグナル配列またはシグナル配列または分泌リーダー配列は、タンパク質の分泌を引き起こす複雑な一連の翻訳後プロセシング工程に必要である。無傷のシグナル配列が存在する場合、発現されているタンパク質は、粗面小胞体の内腔に入り、次にゴルジ体を介して分泌小胞に輸送され、最終的に細胞の外に輸送される。一般的に、シグナル配列は、開始コドンのすぐ後に存在し、分泌させるタンパク質のアミノ末端でシグナルペプチドをコードする。ほとんどの場合、このシグナル配列は、シグナルペプチダーゼと呼ばれる特異的なプロテアーゼによって切断される。好ましいシグナル配列は、ウイルス、哺乳動物または酵母発現ベクターを用いた組換えタンパク質のプロセシングおよび組換えタンパク質発現の輸送効率を改善する。
【０２２１】
一実施態様において、天然型のＴｆシグナル配列を用いて、本発明の融合タンパク質を発現させて、分泌させてもよい。トランスフェリン分子は血液、涙および乳汁のような様々なタイプの分泌物に存在するため、多くの異なるトランスフェリンシグナルペプチドが存在する。例えば、トランスフェリンシグナルペプチドは、血清トランスフェリン、ラクトトランスフェリン、またはメラノトランスフェリン由来のものでもよい。また、天然型のトランスフェリンシグナルペプチドは、昆虫、哺乳動物、魚類、カエル、アヒル、ニワトリのような様々な種由来のものでもよいし、またはその他の種由来のものでもよい。好ましくは、このようなシグナルペプチドは、哺乳動物トランスフェリン分子由来のものである。より好ましくは、このようなシグナルペプチドは、ヒト血清トランスフェリン由来のものである。以下の表に、様々な哺乳動物トランスフェリン分子由来のシグナルペプチド配列を要約する（www.chatham.edu/undergraduate/bio/lambert/transferrin/signal.htm）。
【０２２２】
【表３】
2008531059.tif 000006
【０２２３】
その他の実施態様において、シグナルペプチドは、機能的に活性なシグナルペプチドを有する変異体または改変トランスフェリン分子由来である。加えて、シグナルペプチドは、細胞膜を通過して本発明のトランスフェリン融合タンパク質を輸送させ、本融合タンパク質をプロセシングさせる能力を保持するトランスフェリンシグナルペプチドの変異体または改変された形態である。
【０２２４】
その他の実施態様において、移入により誘導されたシグナル配列を用いて、異種タンパク質を分泌してもよく、例えば、Ｔｆシグナル配列にとって異種のあらゆる関心のあるタンパク質を、Ｔｆシグナルを用いて発現して、分泌させることもできる。特に、Ｔｆシグナル配列を、組換え酵母からタンパク質を分泌させるのに用いてもよい。好ましくは、シグナルペプチドは、ヒト血清トランスフェリン（ｎＬ，配列番号２のアミノ酸１〜１９）由来である。
【０２２５】
確実にシグナル配列を効率的に除去するために、場合によっては、シグナル配列と成熟タンパク質との間に短いプロペプチド配列を含むことが好ましい場合があり、この場合、プロペプチドのＣ末端部分は、プロテアーゼ（例えば酵母ｋｅｘ２ｐプロテアーゼ）の認識部位を含む。好ましくは、プロペプチド配列は、長さが約２〜１２個のアミノ酸であり、より好ましくは長さが約４〜８個のアミノ酸である。このようなプロペプチドの例は、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１１３）、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号１１４）、Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ（配列番号１１５）、およびＡｒｇ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ａｒｇ−Ａｒｇ（配列番号１１６）である。
【０２２６】
リンカー
本発明の改変トランスフェリン融合タンパク質のＴｆ部分および治療用タンパク質は、様々な長さのリンカーペプチドを使用して、より大きい物理的な隔たりを提供し、融合したタンパク質間のより空間的に大きい移動を可能にするが、これはすなわち、例えばその同源の受容体へ結合するための治療用タンパク質の接近しやすさを最大化する。一実施態様において、上記で考察したように、ＧＬＰ−２、またはそれらのフラグメントがリンカーとして使用可能であり、これは、好ましくはＧＬＰ−１が治療用タンパク質部分の場合である。このようなリンカーは、約５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１０個未満、または５個未満のアミノ酸残基であり得る。このようなリンカーは、トランスフェリンタンパク質またはその部分に、ならびにそれと治療用タンパク質（例えばＧＬＰ−１）との間で共有結合することができる。これらのリンカーは、ＧＬＰ−１をトランスフェリンに連結させるのに用いてもよい。
【０２２７】
本発明の好ましい実施態様において、ＧＬＰ−１は、実質的にらせん状ではないリンカーを介してｍＴｆに連結している。このようなリジッドなリンカーの例としては、ＰＥ、ＰＥＡ、ＰＥＡＰＴＤ（配列番号１３）、（ＰＥＡＰＴＤ）2（配列番号１０）、（ＰＥＡＰＴＤ）3（配列番号１４）、または（ＰＥＡＰＴＤ）nが挙げられ、ここにおいてｎは整数である。本発明はまた、ＩｇＧヒンジリンカー、ＣＥｘリンカー（ＳＳＧＡＰＰＰＳ；配列番号１５（エキセンジン−４へのＣ末端伸長））、ＰＥＡＰＴＤリンカーと連結したＩｇＧヒンジリンカー、およびＣＥｘリンカーと連結したＩｇＧヒンジリンカーを提供する。
【０２２８】
ＧＬＰ−１／Ｔｆ融合タンパク質の検出
生物学的に活性な改変トランスフェリン−融合タンパク質を検出するための分析は、ウェスタントランスファー、タンパク質ブロットまたはコロニーフィルターを含んでいてもよく、加えて、トランスフェリンおよび治療用タンパク質を含む融合タンパク質を検出する活性に基づく分析を含んでいてもよい。ウェスタントランスファーフィルターは、Ｔｏｗｂｉｎ等が記載している方法を用いて調製してもよい（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７６：４３５０〜４３５４，１９７９）。簡単に言えば、サンプルをドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル中で電気泳動する。ゲル中のタンパク質は、電気泳動でニトロセルロース紙に移される。タンパク質ブロットフィルターは、例えばミニフォールド（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ）（シュライヒャー＆シュエル（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ），キーン，ニューハンプシャー州）を用いて、上清サンプルまたは濃縮物をニトロセルロースフィルターでろ過することによって調製できる。コロニーフィルターは、適切な増殖培地を敷いたニトロセルロースフィルター上でコロニーを増殖させることによって調製できる。この方法においては、固形培地が好ましい。細胞は、フィルター上で少なくとも１２時間増殖させる。フィルターに結合したタンパク質を除去しないような適切な緩衝液で洗浄することによってフィルターから細胞を除去する。好ましい緩衝液は、２５ｍＭのトリスベース、１９ｍＭのグリシン、ｐＨ８.３、２０％メタノールを含む。
【０２２９】
本発明の融合タンパク質は、放射線同位体またはその他の造影剤で標識されていてもよく、インビボでの診断目的で用いてもよい。好ましい放射線同位体の造影剤としては、ヨウ素−１２５およびテクネチウム−９９が挙げられ、テクネチウム−９９が特に好ましい。タンパク質−同位体接合を生産する方法は当技術分野ではよく知られており、例えばＥｃｋｅｌｍａｎ等（米国特許第４,６５２,４４０号）、Ｐａｒｋｅｒ等（ＷＯ８７／０５０３０）およびＷｉｌｂｅｒ等（ＥＰ２０３,７６４）によって説明されている。あるいは、トランスフェリン融合タンパク質は、スピンラベルのエンハンサーに結合していてもよいし、さらに、磁気共鳴（ＭＲ）映像法に用いてもよい。適切なスピンラベルのエンハンサーとしては、安定な立体的に込み合ったフリーラジカル化合物、例えば窒素酸化物が挙げられる。ＭＲ映像法用にリガンドを標識付ける方法は、例えばＣｏｆｆｍａｎ等（米国特許第４,６５６,０２６号）で記載されている。
【０２３０】
本発明の融合タンパク質の検出は、治療用タンパク質と、検出可能な物質とをカップリングすること（すなわち物理的に連結させること）によって促進することができる。検出可能な物質の例としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射活性物質が挙げられる。適切な酵素の例としては、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ；適切な補欠分子族複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ；適切な蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロリドまたはフィコエリトリンが挙げられ；発光物質の例としては、ルミノールが挙げられ；生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ；および適切な放射活性物質の例としては、125Ｉ、131Ｉ、35Ｓまたは3Ｈが挙げられる。
【０２３１】
一実施態様において、本発明のトランスフェリン融合タンパク質が抗体に結合する能力、または抗体への結合に関して抗原と競合する能力を分析する場合、当技術分野で既知の様々なイムノアッセイを用いることができ、このようなイムノアッセイとしては、これらに限定されないが、例えばラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）、サンドイッチイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散分析、インサイチュイムノアッセイ（例えばコロイド金、酵素または放射線同位体標識を使用）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集分析（例えばゲル凝集分析）、補体結合分析、免疫蛍光分析、プロテインＡ分析、および免疫電気泳動分析などの技術を用いた競合的および非競合的分析系が挙げられる。一実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質の結合は、トランスフェリン融合タンパク質上の標識を検出することによって検出される。その他の実施態様において、トランスフェリン融合タンパク質は、トランスフェリン融合タンパク質と相互作用する二次抗体または試薬の結合を検出することによって検出される。さらなる実施態様において、この二次抗体または試薬は、標識される。イムノアッセイにおける結合を検出する多くの手段が当技術分野で既知であり、それらは本発明の範囲内である。
【０２３２】
また、本発明の融合タンパク質は、治療用タンパク質部分の活性について分析することによって検出することもできる。具体的には、本発明のトランスフェリン融合タンパク質は、当技術分野で既知の分析を用いて、機能的な活性（例えば生物活性または治療活性）について分析してもよい。加えて、当業者は、よく知られた分析を用いて、本発明の融合タンパク質の治療用タンパク質部分に相当する治療用タンパク質のフラグメントを活性について、型どおりの手順で分析することができる。さらに、当業者は、慣例的手順で、当業界既知の分析を用いて、改変トランスフェリンタンパク質のフラグメントの活性について分析してもよい。
【０２３３】
例えば、一実施態様において、抗治療用ポリペプチド抗体および／または抗トランスフェリン抗体への結合に関して治療用タンパク質と結合または競合する、本発明のトランスフェリン融合タンパク質の能力を分析する場合、当技術分野で既知の様々なイムノアッセイが使用可能であり、このようなアッセイとしては、これらに限定されないが、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検査法）、サンドイッチイムノアッセイ、イムノラジオメトリックアッセイ、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散分析、インサイチュイムノアッセイ（例えばコロイド金、酵素または放射線同位体標識を使用）、ウェスタンブロット、沈降反応、凝集分析（例えばゲル凝集分析）、補体結合分析、免疫蛍光分析、プロテインＡ分析、および免疫電気泳動分析などの技術を用いた競合および非競合分析系が挙げられる。一実施態様において、抗体結合は、一次抗体上の標識を検出することによって検出される。その他の実施態様において、一次抗体は、二次抗体または試薬と一次抗体との結合を検出することによって検出される。さらなる実施態様において、二次抗体は、標識される。イムノアッセイにおける結合を検出する多くの手段が当技術分野で既知であり、それらは本発明の範囲内である。
【０２３４】
さらなる実施態様において、治療用タンパク質の結合パートナー（例えば、受容体またはリガンド）を同定する場合、上記結合パートナーへの、融合体の治療用タンパク質部分として上記治療用タンパク質を含むトランスフェリン融合タンパク質による結合を当技術分野でよく知られている手段によって分析することができ、例えば、還元および非還元ゲルクロマトグラフィー、タンパク質アフィニティークロマトグラフィー、およびアフィニティーブロッティングによって分析することができる。当業者であればその他の方法を知っているであろうし、それらは本発明の範囲内である。
【０２３５】
融合タンパク質の生産
本発明はさらに、本明細書で説明されている核酸分子を用いて改変された本発明の融合タンパク質を生産する方法を提供する。一般論として言えば、タンパク質の組換え型の生産は、典型的には、以下の工程を含む。
【０２３６】
まず、本発明のトランスフェリン融合タンパク質をコードする核酸分子を得る。次にこの核酸分子を、好ましくは、上述のように適切な制御配列と操作可能に連結して配置し、タンパク質のオープンリーディングフレームを含む発現単位を形成する。この発現単位を用いて適切な宿主を形質転換させ、形質転換した宿主を、組換えタンパク質を生産させるような条件下で培養する。場合により、培地または細胞から組換えタンパク質を分離してもよい；このタンパク質の回収および精製は、多少の不純物が許容され得るような場合においては必須ではない。
【０２３７】
前述の工程はそれぞれ、種々の方法で達成することができる。例えば、種々宿主において作動可能な発現ベクターの構築は、上記のような適切なレプリコンおよび制御配列を用いて達成される。制御配列、発現ベクターおよび形質転換方法は、遺伝子を発現させるのに用いられる宿主細胞のタイプに応じて様々であり、これまでに詳細に考察されているか、あるいは当業者既知である。通常、利用可能でない場合、これらのベクターに挿入するための切り出し可能な遺伝子が提供されるように、適切な制限部位をコード配列の末端に付加することができる。当業者であれば、所望の組換えタンパク質が生産されるように、当業界既知のあらゆる宿主／発現系を、本発明の核酸分子と使用するために容易に適合させることができる。
【０２３８】
上記で考察したように、あらゆる発現系が使用可能であり、例えば、酵母、細菌、動物、植物、真核性および原核性の系が挙げられる。いくつかの実施態様において、酵母、哺乳動物細胞培養、およびトランスジェニック動物または植物の生産系が好ましい。その他の実施態様において、天然型の酵母グリコシル化、過剰なグリコシル化またはタンパク質分解活性が減少するように改変されている酵母系を用いてもよい。
【０２３９】
改変トランスフェリン融合タンパク質の単離／精製
分泌された生物学的に活性な改変トランスフェリン融合タンパク質は、生物学的に活性な融合タンパク質を分泌させる条件下で宿主細胞を増殖した培地から分離することができる。培養した培地から細胞由来の物質を除去し、当技術分野で既知の分離技術を用いて生物学的に活性な融合タンパク質を分離する。適切な分離技術としては、沈殿、および多種多様なクロマトグラフィー法による分画化が挙げられ、このクロマトグラフィー法としては、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。
【０２４０】
特に好ましい精製法は、鉄結合に関するアフィニティークロマトグラフィー、または金属キレートカラム、またはポリペプチド融合体のトランスフェリンまたは治療用タンパク質に対して向けられた抗原を用いたイムノアフィニティークロマトグラフィーである。抗原は、好ましくは、固体支持体、または基質に固定されているか、またはそれらに結合している。特に好ましい基質は、ＣＮＢｒ活性化セファロース（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）（ファルマシアＬＫＢテクノロジーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  ＬＫＢ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．），ピスカタウェイ，ニュージャージー州）である。この方法によって、生じる結合を可能にする条件下で、培地を抗原／基質と混合する。複合体を洗浄して未結合の物質を除去してもよいし、さらに、複合体形成に不向きな条件の使用によって、トランスフェリン融合タンパク質を放出させるか、または溶離させることもできる。特に有用な溶離方法としては、ｐＨ変化、この場合、固定された抗原は、第一のｐＨではトランスフェリン融合タンパク質への高い親和性を有するが、第二の（第一より高い、または低い）ｐＨでは親和性が減少する；所定のカオトロピック試薬の濃度変化が挙げられ、または界面活性剤の使用による方法でもよい。
【０２４１】
細胞の内部および／または血液脳関門（ＢＢＢ）を通過する薬物または治療用タンパク質の送達
本発明の範囲内で、改変トランスフェリン融合タンパク質はキャリアーとして用いてもよく、このようなキャリアーによって、トランスフェリンの第二鉄イオンと錯化した分子または低分子治療剤を、細胞の内部に、または血液脳関門もしくはその他のバリアーを通過して、例えば自然に、または人工的にＴｆ受容体を発現するあらゆる細胞型の細胞膜を通過して、送達することができる。これらの実施態様において、Ｔｆ融合タンパク質は、典型的には、本融合タンパク質および／または治療用タンパク質部分の血清中半減期を延長するために、グリコシル化が抑制、防止または除去されるように設計または改変されることになる。標的ペプチドの添加は、さらにＴｆ融合タンパク質を特定の細胞型（例えば癌細胞）に標的化するように特に考慮される。
【０２４２】
一実施態様において、鉄を含む抗貧血薬である第二鉄−ソルビトール−クエン酸塩錯体が、改変された本発明のＴｆ融合タンパク質に装薬される。第二鉄−ソルビトール−クエン酸（ＦＳＣ）は、インビトロで様々なマウスの癌細胞の増殖を阻害し、インビボで腫瘍の退行を引き起こすが、非悪性の細胞の増殖にはまったく作用を有さないことが示されている（Ｐｏｌｊａｋ−Ｂｌａｚｉ等（２０００年６月）Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（米国），１５／３：２８５〜２９３）。
【０２４３】
その他の実施態様において、抗新生物薬のアドリアマイシン(R)（ドキソルビシン）および／または化学療法薬のブレオマイシン（これらはいずれも第二鉄イオンと錯体を形成することが知られている）が本発明のＴｆ融合タンパク質に装薬される。その他の実施態様において、薬物の塩（例えばクエン酸塩または炭酸塩）を製造して、第二鉄と錯化して、続いてＴｆに結合させてもよい。腫瘍細胞は、鉄のより高い代謝回転速度を示すことが多いため、少なくとも１種の抗腫瘍剤を運搬するように改変されたトランスフェリンは、薬物への曝露または腫瘍細胞への負荷を高める手段を提供する可能性がある。（Ｄｅｍａｎｔ，Ｅ．Ｊ．，（１９８３）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３７／（１〜２）：１１３〜１１８；Ｐａｄｂｕｒｙ等（１９８５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０／１３：７８２０〜７８２３）。
【０２４４】
医薬製剤および治療方法
本発明の一形態において、ＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆタンパク質を含む医薬組成物は、医薬組成物を製剤化する確立されたあらゆる方法で製剤化が可能であり、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１９８５で説明されているように製剤化してもよい。一実施態様において、本医薬組成物は、配列番号１２に記載の融合タンパク質を含む。本組成物は、全身的な注射または注入に適した形態のものが可能であり、そのようなものとして、滅菌水または等張食塩水またはグルコース溶液のような適切な液状のビヒクルを用いて、製剤化されてもよい。本組成物は、当技術分野でよく知られた従来の滅菌技術で滅菌することもできる。得られた水性液剤は、使用のためにパッケージングしてもよいし、または無菌条件下でろ過してもよく、さらに凍結乾燥してもよく、このような凍結乾燥製剤は、投与前に滅菌水溶液と混合される。本組成物は、生理学的条件に近づけるために必要に応じて製薬上許容できる補助剤を含んでいてもよく、このような補助剤としては、例えば緩衝剤、張度調節剤などが挙げられ、例えば酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウムなどである。
【０２４５】
本発明のＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質はまた、経口、経鼻、経皮、経肺または直腸投与にも適している（ＰＣＴ／ＵＳ０３／２６７７８を参照，これは参照によりその全体を本明細書に加入する）。本組成物で用いられる製薬上許容できるキャリアーまたは希釈剤は、従来のどのような固体キャリアーでもよい。固体キャリアーの例は、ラクトース、白土、スクロース、タルク、ゼラチン、寒天、ペクチン、アラビアゴム、ステアリン酸マグネシウムおよびステアリン酸である。同様に、キャリアーまたは希釈剤は、当技術分野で既知のあらゆる持続放出性の物質を含んでいてもよく、例えばモノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンであり、これらは単独でもよいし、またはワックスと混合してもよい。
【０２４６】
本発明の組成物を持続放出製剤の形態で提供することが、特に有利な場合がある。そのようなものとして、本組成物は、ポリ乳酸、ポリグリコール酸または乳酸／グリコール酸コポリマーのような適切な製薬上許容できる生分解性ポリマーによってカプセル封入された、またはそれらに分散されたＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆを含むマイクロカプセル剤または微粒子剤（ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）として製剤化してもよい。
【０２４７】
経鼻投与のためには、このような製剤は、液体キャリアー、特にエアゾールに適用するための水性キャリアーに、溶解または懸濁したＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆを含んでいてもよい。このようなキャリアーは、添加剤、例えば可溶化剤、例えばプロピレングリコール、界面活性剤、吸収促進剤、例えばレシチン（ホスファチジルコリン）もしくはシクロデキストリン、または保存剤、例えばパラベンを含んでいてもよい。
【０２４８】
一般的に、本発明の化合物は、単位投与形態に調剤され、単位投与形態は、単位投与量あたり、製薬上許容できるキャリアーと一緒に本融合タンパク質０.５〜５００ｍｇを含む。
【０２４９】
その上、本発明は、高い血糖値に関連する疾患、例えば上述の疾患（ただしこれらに限定されない）の治療で用いることができる医薬品を製造するためのＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆの使用を考慮する。具体的には、本発明は、糖尿病（ＩＩ型糖尿病など）、肥満、重度のやけど、および、心不全、例えばうっ血性心不全および急性冠症候群などを治療するためのＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質の使用を意図する。
【０２５０】
ＧＬＰ−１のＮ末端は通常アミド化される。酵母において、アミド化は起こらない。本発明の一形態において、酵母において起こらないＮ末端でのアミド化を補うために、ＧＬＰ−１のＮ末端に追加のアミノ酸が付加される。ＧＬＰ−１のＮ末端にアミノ酸が付
加されると、立体障害のために、ジペプチジルペプチダーゼがＧＬＰ−１の二番目のアミノ酸で切断することを妨げることができる。そのために、ＧＬＰ−１は、依然として機能的に活性である。ＧＬＰ−１のＮ末端には、２０個のアミノ酸のうちどれを付加してもよい。場合によっては、非荷電性の、または正電荷を有するアミノ酸を用いてもよく、好ましくはヒスチジンが付加される。次に、追加のアミノ酸を有するＧＬＰ−１は、トランスフェリンに融合させる。従って、アミノ酸が付加されたＧＬＰ−１は、トランスフェリン部分のＮ末端に融合することになり遊離のＧＬＰ−１Ｎ末端はそのままである。
【０２５１】
ＧＬＰ−１（７〜３６）またはＧＬＰ−１（７〜３７）ペプチドを、ジペプチジルペプチダーゼによる切断に対してより耐性にする一実施態様において、Ｈｉｓ残基は、ＧＬＰ−１のＮ末端に付加されるか、またはＧＬＰ−１のＮ末端がＨｉｓ−Ｈｉｓで始まるように、ＧＬＰ−１のＮ末端でＨｉｓ残基の後に挿入される。
【０２５２】
本発明のその他の実施態様において、ＧＬＰ−１（７〜３６）またはＧＬＰ−１（７〜３７）ペプチド（配列番号６）におけるＮ末端から二番目の残基が、その他のアミノ酸で置換される。例えば、ＧＬＰ−１（７〜３６）またはＧＬＰ−１（７〜３７）ペプチドで、Ｎ末端から二番目の残基において、Ａｌａ  残基が、Ｓｅｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、またはその他のアミノ酸で置換されていてもよい。
【０２５３】
本発明のＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質は、それを必要とする患者に、標準的な投与プロトコールを用いて投与することができる。例えば、本発明の融合タンパク質は、単独で与えてもよいし、または特定の病理学的過程を調節するその他の物質と組み合わせて、またはそれらと連続的に組み合わせて提供してもよい。本明細書で用いられるように、２種の薬物が、同時に投与される場合、または２種の薬物が同時にもしくはほぼ同時に作用するような様式で独立して投与される場合、２種の物質は組み合わせて投与されると言う。
【０２５４】
本発明の融合タンパク質は、非経口、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮、および口腔内経路によって投与することができる。例えば、薬物は、微量注入によって損傷部位に局所投与してもよい。その代わりに、またはそれと同時に、投与は、経口、吸入、経鼻または経肺ルートのいずれかによる非侵襲的な投与であってもよい。投与される用量は、レシピエントの年齢、健康状態および体重、併用療法の種類、必要に応じて治療頻度および所望の効果の性質に依存することになる。
【０２５５】
本発明の融合タンパク質を送達するためのあらゆる投与方法が使用可能であるが、所定のクラスの融合タンパク質にとって、または所定の身体状態を治療するためには、経口的な投与または送達が好ましい実施態様であり得る。
【０２５６】
本発明はさらに、１またはそれ以上の本発明の融合タンパク質を含む組成物を提供する。個体の必要性は多様であるが、各成分の最適な有効量範囲の決定は当技術分野の技術範囲内である。典型的な投与量においては、約１ｐｇ／ｋｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。一実施態様において、全身投与のための投与量においては、約１００ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。その他の実施態様において、用量は、３００μｇ／ｋｇ〜９００μｇ／ｋｇの範囲である。本発明はまた、約５０ｍｇ、１００ｍｇ、または１５０ｍｇ総投与量で週１回投与も含む。さらに、微量注入による部位に直接投与するための投与量においては、約１ｎｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ体重が含まれる。直接注射または微量注入によって投与される場合、本発明の改変された融合タンパク質は、限局性の鉄毒性を、一部、予防するために、減少した鉄との結合を示すか、または鉄との結合が起こらないように設計されてもよい。
【０２５７】
薬理学的に活性な融合タンパク質に加えて、本発明の組成物は、活性化合物の処理を容易にする賦形剤および助剤などの適切な製薬上許容できるキャリアーを、作用部位への送達のために製薬上使用可能な調製物に含ませてもよい。非経口投与に適した製剤としては、水溶性の形態の活性化合物（例えば水溶性の塩）の水性液剤が挙げられる。加えて、活性化合物の懸濁液、必要に応じて油性の懸濁注射液を投与してもよい。適切な親油性溶媒またはビヒクルとしては、脂肪油、例えばゴマ油、または合成脂肪酸エステル、例えばオレイン酸エチルまたはトリグリセリドが挙げられる。水性懸濁注射液は、懸濁液の粘度を高める物質を含んでいてもよく、このような物質としては、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールおよびデキストランが挙げられる。場合により、懸濁液は安定剤を含んでいてもよい。また、リポソームを用いて、細胞に送達するための薬物をカプセル封入することもできる。
【０２５８】
本発明に係る全身投与のための医薬製剤は、経腸、非経口、または局所投与用として製剤化されてもよい。実に、３種全てのタイプの製剤は、活性成分の全身投与を同時に達成するために使用することができる。経口投与に適した製剤としては、ハードまたはソフトゼラチンカプセル剤、丸剤、錠剤、例えばコーティング錠剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤、または吸入剤、およびそれらの放出制御形態が挙げられる。
【０２５９】
本発明の医薬組成物は、単位投与形態が可能であり、例えば錠剤またはカプセル剤である。このような形態において、本組成物は、適切な量の活性成分を含む単位用量にさらに分割される；単位投与形態は、パッケージ化された組成物であってもよく、例えばパック詰めされた、粉末、バイアル、アンプル、プレフィルドシリンジ、または液体を含む小容器（ｓａｃｈｅｔｓ）が挙げられる。単位投与形態は、例えばカプセルまたは錠そのものであってもよいし、または当該組成物が適切な数でパッケージ化されたものでもよい。治療で用いられる投与量は、医師によって主観的に決定されなければならない。
【０２６０】
本発明の方法の実施において、本発明の融合タンパク質は、単独で、または組み合わせて用いてもよく、またはその他の治療薬または診断薬と組み合わせて用いてもよい。好ましい特定の実施態様において、本発明の化合物は、典型的には、一般的に認められた医療に従ってこれらの身体状態に対して処方されるその他の化合物と一緒に共投与（ｃｏ−ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒ）してもよい。本発明の化合物は、インビボで、通常は哺乳動物、例えばヒト、ヒツジ、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ラットおよびマウスにおいて利用してもよいし、またはインビトロで利用してもよい。
【０２６１】
本発明において、融合タンパク質（これらに限定されないが、改変されたＴｆ融合タンパク質）は、経口送達用に製剤化することができる。特に、特定のクラスの疾患または病状を治療するのに用いられる本発明の特定の融合タンパク質は、特に経口製剤および送達に適している。このようなクラスの疾患または状態としては、これらに限定されないが、急性、慢性および再発性の疾患が挙げられる。慢性または再発性の疾患としては、これらに限定されないが、ウイルス性疾患または感染、がん、代謝性疾患、肥満、自己免疫疾患、炎症性疾患、アレルギー、移植片対宿主疾患、全身性の微生物感染、貧血、心臓血管疾患、精神病、遺伝病、神経変性疾患、造血細胞の障害、内分泌系または生殖系の疾患、胃腸疾患が挙げられる。これらのクラスの疾患の例としては、糖尿病、多発性硬化症、喘息、ＨＣＶまたはＨＩＶ感染、高血圧、高コレステロール血症、動脈硬化、関節炎、およびアルツハイマー病が挙げられる。多くの慢性疾患において、本発明のＴｆ融合タンパク質の経口製剤および投与方法が、注射による治療または薬物プロトコールに頼らずに、自宅での経口投与によって長期にわたる患者のケアや治療を可能にするために特に有用である。
【０２６２】
本発明の融合タンパク質を含む経口製剤および送達方法は、消化管（ＧＩ）上皮を通過するトランスフェリン受容体介在トランスサイトーシスを一部たくみに利用する。Ｔｆ受容体は、ヒトＧＩ上皮において極めて高い密度で見出されており、さらにトランスフェリンはトリプシンおよびキモトリプシン消化に対して高い抵抗性を有していることから、Ｔｆの化学的な接合体を用いて、タンパク質およびペプチドをＧＩ上皮を通過してうまく送達することができる（Ｘｉａ等（２０００）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒａｐ．，２９５：５９４〜６００；Ｘｉａ等（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．，１８（２）：１９１〜１９５；およびＳｈａｈ等（１９９６）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉ．，８５（１２）：１３０６〜１３１１，これらはいずれも、参照によりその全体を本明細書に加入する）。本発明の融合タンパク質は、一たびＧＩ上皮を通過して輸送されると、血清中で延長された半減期を示す、すなわち、Ｔｆに結合した、またはＴｆに挿入された治療用タンパク質またはペプチドは、融合していない状態のタンパク質またはペプチドと比較して延長された血清中半減期を示す。
【０２６３】
本発明の融合タンパク質の経口製剤は、ＧＩ上皮への輸送および胃における本融合タンパク質成分およびその他の活性成分の保護に適するように調製することができる。このような製剤はキャリアーおよび分散剤成分を含んでいてもよく、適切なあらゆる形態が可能であり、このような形態としては、例えば、エアゾール剤（経口または肺送達のため）、シロップ剤、エリキシル剤、錠剤（チュアブル錠剤を含む）、ハードまたはソフトカプセル剤、トローチ剤、ロゼンジ剤、水性または油性懸濁剤、エマルジョン剤、カシェ剤またはペレット剤  顆粒剤、および分散性散剤が挙げられる。好ましくは、融合タンパク質製剤は、正確な投与量の単純な投与、および好ましくは経口投与、に適した固形の投薬形態で用いられる。経口投与のための固形の投薬形態は、好ましくは、錠剤、カプセル剤などである。
【０２６４】
錠剤またはカプセルの形態での経口投与のためには、組成物が充分な活性成分をホストに吸収させて有効な反応を起こさせることを確実に可能にするように注意すべきである。従って、例えば、融合タンパク質の量を論理上必要な量より多くしてもよいし、またはコーティングまたはカプセル化のようなその他の既知の手段を用いて、胃での酵素作用からポリペプチドを保護してもよい。
【０２６５】
従来、ペプチドおよびタンパク質薬は、経口投与すると生物学的利用率が低いため、注射で投与されている。これらの薬物は、化学的およびコンホメーション的に不安定な傾向があり、胃での酸性条件によって、加えて胃および消化管における酵素によって分解されることが多い。これらの送達の問題に対して、ある種の経口送達技術が開発されており、例えば薬物キャリアーとして疎水性主鎖と親水性分岐とを含むポリマーで構成されるナノ粒子へのカプセル化、微粒子剤へのカプセル化、エマルジョン中でのリポソームへの挿入、およびその他の分子との接合体が挙げられる。これらはいずれも、本発明の融合体分子と共に使用可能である。
【０２６６】
ナノ粒子の例としては、キトサンやカーボポールでコーティングされた粘膜付着性のナノ粒子（Ｔａｋｅｕｃｈｉ等，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．４７（１）：３９〜５４，２００１）、および電荷を有する組み合わせのポリエステル、ポリ（２−スルホブチル−ビニルアルコール）およびポリ（Ｄ，Ｌ−乳酸−ｃｏ−グリコール酸）を含むナノ粒子（Ｊｕｎｇ等，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｐｈａｒｍ．５０（１）：１４７〜１６０，２０００）が挙げられる。ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミド領域およびカチオン性ポリ−ビニルアミン基を有する、表面にポリマーを含むナノ粒子は、ラットに経口投与したところ、サケのカルシトニンの吸収において改善を示した。
【０２６７】
ポリリジンで強化された、アルギン酸塩とペクチンとで構成される薬物送達用の粒子は、比較的酸および塩基抵抗性を有し、薬物用のキャリアーとして用いることができる。これらの粒子は、生体接着性、増強された吸収性および持続放出性の利点を兼ね備えている（Ｌｉｕ  Ｌｉｕ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．５１（２）：１４１〜１４９，１９９９）。
【０２６８】
加えて、合成ソマトスタチンのようなペプチドのＮ末端およびＣ末端に接合されたリポアミノ酸基やリポサッカライド基は、両親媒性界面活性剤を形成するが、これらは、生物活性を保持する組成物を生産することが示されている（Ｔｏｔｈ等，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．４２（１９）：４０１０〜４０１３，１９９９）。
【０２６９】
その他のペプチドを送達する技術の例としては、関心のあるペプチド、およびニトロソ−Ｎ−アセチル−Ｄ，Ｌ−ペニシラミンおよびカルボルポル（ｃａｒｂｏｌｐｏｌ）、またはタウロコーレートのいずれか、およびカーボポールを含む、カーボポールでコーティングした粘膜付着性のエマルジョンが挙げられる。これらは、ラットに経口投与したところ、血清カルシウム濃度を減少させたことから有効であることが示されている（Ｏｇｉｓｏ等，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２４（６）：６５６〜６６１，２００１）。ホスファチジルコリンから誘導されたホスファチジルエタノールを用いて、インスリンのキャリアーとしてホスファチジルエタノールを含むリポソームを調製した。これらのリポソームは、ラットに経口投与したところ、活性であることが示されてた（Ｋｉｓｅｌ等，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．２１６（１〜２）：１０５〜１１４，２００１）。
【０２７０】
また、インスリンは、インスリン、およびプロテアーゼ阻害剤、例えばアプロチニンまたはバシトラシンを含むポリ（ビニルアルコール）ゲルのスフェアに製剤化されている。これらのゲルスフェアのグルコース低下特性はラットで実証されており、この場合、インスリンの大部分は下部腸管で放出される（Ｋｉｍｕｒａ等，Ｂｉｏｌ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．１９（６）：８９７〜９００，１９９６）。
【０２７１】
また、界面活性剤を用いて油相中分散されたポリ（アルキルシアノアクリラート）で作製されたナノ粒子を用いたインスリンの経口送達（Ｄａｍｇｅ等，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．８６（１２）：１４０３〜１４０９，１９９７）、および、キトサンでコーティングされたアルギン酸カルシウムビーズを用いたインスリンの経口送達（Ｏｎａｌ等，Ａｒｔｉｆ．Ｃｅｌｌｓ  Ｂｌｏｏｄ  Ｓｕｂｓｔｉｔ．Ｉｍｍｏｂｉｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３０（３）：２２９〜２３７，２００２）も研究されている。
【０２７２】
その他の方法において、ペプチドのＮ末端およびＣ末端がポリエチレングリコールに連結され、続いてアリル鎖に連結されることによって、酵素分解に対する抵抗性が改善され、さらに消化管壁を介する拡散が改善された接合体が形成される（www.nobexcorp.com）。
【０２７３】
バイオポーター（ＢｉｏＰＯＲＴＥＲ(R)）は、カチオン脂質混合物であり、ペプチドと非共有結合によって相互作用して保護被膜または層を形成する。このペプチド−脂質複合体は、細胞の原形質膜に融合して、ペプチドを細胞内に取り込むことができる（www.genetherapysystems.com）。
【０２７４】
出発物質としてリポソームを用いたプロセスにおいて、製薬用のビヒクルとして渦巻型の粒子が開発されている。ペプチドは、主として負電荷を有する脂質を含むリポソームの懸濁液に添加される。カルシウムを添加すると、リポソームの崩壊と、脂質二重層で構成される大きいシートへの融合が起こり、続いて自発的に巻き上がるか、または渦巻型に重なる（米国特許第５,８４０,７０７号；www.biodeliverysciences.com）。
【０２７５】
経口での使用を目的とする融合タンパク質を含む組成物は、医薬組成物を製造する技術分野において既知のあらゆる方法に従って製造することができ、このような組成物は、製薬的に優美で口当たりのよい製剤を提供するために、甘味剤からなる群より選択される１種またはそれ以上の物質を含んでいてもよい。例えば、経口的に送達可能な錠剤を調製するためには、Ｔｆ融合タンパク質と少なくとも１種の医薬賦形剤とを混合し、この固体調合物を圧縮し、既知の方法に従って、消化管へ送達するための錠剤を形成する。錠剤用の組成物は、典型的には、添加剤、例えば糖類またはセルロースキャリアー、結合剤、例えばスターチペーストまたはメチルセルロース、充填剤、崩壊剤、または医薬製剤の製造で一般的に用いられるその他の添加剤を用いて製剤化される。経口送達可能なカプセル剤を調製するためには、ＤＨＥＡと、少なくとも１種の医薬賦形剤とを混合して、この固体の調合物を、消化管への送達に適したカプセル状の容器に入れる。融合タンパク質を含む組成物は、一般的に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，１９９０（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．１８０４２）の第８９章（参照により本明細書に加入する）に記載されているように製造してもよい。
【０２７６】
上述したように、本発明の経口製剤の多くは、胃の環境に対する保護を可能にし、腸内に生物学的に活性な物質を放出することができる不活性成分を含んでいてもよい。このような調合物または腸溶コーティング剤は当技術分野でよく知られている。例えば、錠剤の製造に適した非毒性の製薬上許容できる賦形剤が混合されたＴｆ融合タンパク質を含む錠剤を用いてもよい。これらの賦形剤としては、不活性希釈剤、例えば炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム；造粒剤および崩壊剤、例えばメイズスターチ、ゼラチンまたはアラビアゴム、および滑沢剤、例えばステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルクが挙げられる。
【０２７７】
錠剤は、コーティングされていなくてもよいし、または既知の技術でコーティングされていてもよく、それにより、消化管内での崩壊および吸収を遅延させて、長い期間にわたり持続的な作用を提供することが可能になる。例えば、モノステアリン酸グリセリンまたはジステアリン酸グリセリンのような時間を遅延させる物質を単独で用いてもよいし、またはワックスを併用してもよい。
【０２７８】
また、経口で使用するための製剤は、ハードゼラチンカプセルとして提供してもよく、その場合、活性成分は、不活性な固体希釈剤、例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウムもしくはカオリンと混合され、またはソフトゼラチンカプセルとして提供してもよく、その場合、活性成分は、水性もしくは油性媒体、例えばアラキス油、ラッカセイ油、流動パラフィン、またはオリーブ油と混合される。
【０２７９】
水性懸濁液は、水性懸濁剤の製造に適した賦形剤との混合物中に融合タンパク質を含んでいてもよい。このような賦形剤は、懸濁化剤、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントゴム、およびアラビアゴムであり；分散剤または湿潤剤としては、天然に存在するホスファチド、例えばレシチン、またはアルキレン酸化物と脂肪酸との縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンステアレート、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物、例えば、ヘプタデシルエチルオキシセタノール、またはエチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビトールモノオレエート、または、エチレンオキシドと、脂肪酸およびヘキシトール無水物から誘導された部分エステルとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが挙げられる。また、水性懸濁液は、１またはそれ以上の保存剤、例えばエチルまたはｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエート、１種またはそれ以上の着色剤、１種またはそれ以上の着香料、および１種またはそれ以上の甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリンを含んでいてもよい。
【０２８０】
油性懸濁液は、植物油、例えばラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはヤシ油に、または鉱油、例えば流動パラフィンに活性成分を懸濁することによって製剤化することができる。油性懸濁液は、増粘剤、例えば蜜蝋、固形パラフィン、またはセチルアルコールを含んでいてもよい。上述したもののような甘味剤や着香料を添加して、口当たりのよい経口製剤を提供してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸のような抗酸化剤の添加によって保存してもよい。
【０２８１】
水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性の散剤および顆粒剤は、活性成分、ならびに分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１種もしくはそれ以上の保存剤との混合物を提供する。適切な分散剤または湿潤剤、および懸濁化剤の例は、すでに上述したものである。また、追加の賦形剤、例えば甘味剤、着香料および着色剤が含まれていてもよい。
【０２８２】
また、融合タンパク質を含む医薬組成物は、水中油型エマルジョン剤の形態であってもよい。油相は、植物油、例えばオリーブ油もしくはラッカセイ油、または鉱油、例えばアラビアゴムもしくはトラガントゴム、天然に存在するホスファチド（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｅ）、例えばダイズレシチン、ならびに脂肪酸とヘキシトール無水物とから誘導されたエステルまたは部分エステル、例えばソルビタンモノオレエート、および同じ部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物、例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートが可能である。また、このようなエマルジョン剤は、甘味剤および着香料を含んでいてもよい。
【０２８３】
融合タンパク質を含むシロップ剤、およびエリキシル剤は、甘味剤、例えばグリセロール、ソルビトールまたはスクロースを用いて製剤化することができる。また、このような製剤は、粘滑薬、保存剤、および着香料、および着色剤を含んでいてもよい。本医薬組成物は、滅菌注射調合物の形態であってもよく、例えば、注射用の滅菌水性または油性懸濁液のような形態である。この懸濁液は、上述したような適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を用いて、既知の技術に従って製剤化することができる。また、滅菌注射製剤は、非毒性の非経口的に許容できる希釈剤または溶媒（例えば１，３−ブタンジオール溶液）中の滅菌注射用溶液または懸濁液であってもよい。使用可能な許容できるビヒクルおよび溶媒のなかでも、水、リンゲル溶液および等張塩化ナトリウム溶液が挙げられる。加えて、溶媒または懸濁媒として、滅菌した不揮発性油が従来通りに用いられる。この期間、刺激の少ない不揮発性油であればどのようなものでも使用可能であり、例えば合成モノまたはジグリセリドである。加えて、オレイン酸のような脂肪酸も注射剤の調製に使用可能である。
【０２８４】
また、経口送達用に、ポリエステルのマイクロスフェア、ゼインのマイクロスフェア、プロテノイドのマイクロスフェア、ポリシアノアクリラートマイクロスフェア、および脂質ベースの系を用いて医薬組成物を製剤化してもよい（例えば、ＤｉＢａｓｅおよびＭｏｒｒｅｌ，Ｏｒａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ：Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，ＳａｎｄｅｒｓおよびＨｅｎｄｒｅｎ（編集），２５５〜２８８頁（プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）１９９７）を参照）。
【０２８５】
医薬活性を有する融合タンパク質の、キャリアーおよび／またはその他の物質に対する比率は、約０.５〜約１００質量％（質量パーセント）の範囲で様々であってよい。経口で使用するために、医薬製剤は、一般的に、約５〜約１００質量％の活性物質を含むと予想される。その他の使用のためには、医薬製剤は、一般的に、約０.５〜約５０質量％の活性物質を含むと予想される。
【０２８６】
本発明で用いられる融合タンパク質製剤は、個体に投与されると有効量の融合タンパク質を与える。このような状況において用いられる場合、融合体の「有効量」は、疾患の症状を改善するのに有効な量である。
【０２８７】
本発明の融合タンパク質組成物は、必ずではないが、症状を改善することができる有効量で毎日投与してもよい。一般的に、１日の総投与量は、１日あたり少なくとも約５０ｍｇ、好ましくは少なくとも約１００ｍｇ、より好ましくは少なくとも約２００ｍｇと予想され、好ましくは例えばそれぞれＴｆ融合タンパク質５０ｍｇを含む４個のカプセル剤または錠剤で、１日あたり５００ｍｇ以下が経口投与される。経口送達用のカプセル剤または錠剤は、都合のよい形態としては、１日の全経口用量（例えば２００ｍｇまたはそれ以上）以下の用量を含んでいてもよい。
【０２８８】
特に好ましい実施態様において、融合タンパク質を含む経口用医薬組成物を緩衝化された液体の形態で製剤化し、次にこの液体をソフトまたはハードコーティングしたゼラチンカプセルにカプセル封入し、次に適切な腸溶コーティングでコーティングする。本発明の経口用医薬組成物について、放出位置は、小腸（十二指腸、空腸または回腸）または大腸など消化管系のどこでも可能である。
【０２８９】
その他の実施態様において、消化管系中で、本発明の経口用組成物は、本発明の融合タンパク質を含む活性成分が既知の遅延放出製剤を用いて徐放されるように製剤化される。
【０２９０】
経口送達のための本発明のＴｆ融合タンパク質は、ＧＩ上皮に存在する受容体と結合することができる。この結合と受容体が介在する輸送を促進するために、典型的には、鉄、さらに場合によってはカーボネートがその部分に結合した本発明の融合タンパク質が生産される。本発明の融合タンパク質組成物の部分に鉄やカーボネートを装填する工程および方法は当技術分野で既知である。
【０２９１】
本発明のいくつかの医薬製剤において、融合タンパク質の部分は、親和性または部分の鉄への親和性が増加するように改変されていてもよい。このような方法は、当技術分野で既知である。例えば、変異誘発を用いて、天然トランスフェリンよりも強力に鉄に結合する突然変異トランスフェリン部分を生産することができる。ヒト血清トランスフェリンにおいて、金属イオンキレート化のリガンドであるアミノ酸としては、これらに限定されないが、Ｎローブのアミノ酸である、Ａｓｐ６３、Ｔｙｒ９５、Ｔｙｒ１８８、Ｌｙｓ２０６、Ｈｉｓ２０７、および、Ｈｉｓ２４９；およびＣローブのアミノ酸である、配列番号３のＡｓｐ３９２、Ｔｙｒ４２６、Ｔｙｒ５１７およびＨｉｓ５８５が挙げられる（アミノ酸の隣の数字は、一次アミノ酸配列におけるアミノ酸残基の位置を示しており、ここにおいて、成熟タンパク質のバリンが１位と指定されている）。米国特許第５,９８６,０６７号を参照（参照により本明細書に加入する）。一実施態様において、Ｎローブ内のＬｙｓ２０６およびＨｉｓ２０７残基は、それぞれＧｌｎおよびＧｌｕで置換されている。
【０２９２】
本発明のいくつかの医薬製剤において、本融合タンパク質は、治療用タンパク質またはペプチドと部分との間に切断部位が含まれるように設計される。このような切断可能な部位またはリンカーは当技術分野で既知である。
【０２９３】
本発明の医薬組成物  および本発明の方法は、本融合タンパク質のＧＩ上皮を通過する移行を促進するために、トランスサイトーシスのエンハンサーの添加を含んでいてもよい。このようなエンハンサーは当技術分野で既知である。Ｘｉａ等（２０００）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．Ｔｈｅｒａｐ．，２９５：５９４〜６００；および、Ｘｉａ等（２００１）Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓ．，１８（２）：１９１〜１９５を参照。
【０２９４】
本発明の好ましい実施態様において、経口用医薬製剤は、上述のようにＮ末端でＧＬＰ−１タンパク質またはペプチドに融合した、減少したグリコシル化を示すまたはグリコシル化を示さない改変された部分を含む融合タンパク質を含む。このような医薬組成物を用いて、糖尿病のようなグルコースの不均衡による障害を、有効量の融合タンパク質を含む医薬組成物を経口投与することによって治療することもできる。
【０２９５】
融合タンパク質の有効量は、多くの方法で測定することができ、例えば、患者における特定の病状に関連する症状（例えば糖尿病の症状）を緩和するように計算された投与量である。その他の製剤において、投与量は、患者における血糖値の検出可能な変化を引き起こすのに有効な量の融合タンパク質が含まれるように計算される。このような血糖における検出可能な変化としては、約１％〜９０％の間、または約５％〜約８０％の間の血糖値の減少が挙げられる。このような血糖値の減少は治療されている疾患の状態に依存すると予想され、医薬組成物または投与方法は、患者それぞれにとって所望の結果が達成されるように調節することもできる。その他の例において、本医薬組成物を製剤化して、患者における治療用タンパク質またはペプチドの活性レベルの増加、例えばインスリンまたはＧＬＰ−１活性の検出可能な増加が検出されるように投与方法を調節する。このような製剤および方法によって、約１ｐｇ〜約１５０ｍｇ／ｋｇ体重の融合タンパク質、約１００ｎｇ〜約１００μｇ／ｋｇ体重の融合タンパク質、約１００μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の融合タンパク質、約１μｇ〜約１ｇの融合タンパク質、約１０μｇ〜約１００ｍｇの融合タンパク質または約１０ｍｇ〜約５０ｍｇの融合タンパク質を送達することが可能である。一実施態様において、有効量は、３００μｇ／ｋｇ〜９００μｇ／ｋｇである。その他の実施態様において、有効量は、週１回、総投与量約５０ｍｇ、１００ｍｇまたは１５０ｍｇで投与される。
【０２９６】
また有効量の処方も、治療用タンパク質活性の単位を測定することによって計算することができ、例えば、約５〜約５００単位のヒトインスリン、または約１０〜約１００単位のヒトインスリンと計算される。Ｔｆに融合した各治療用タンパク質またはペプチドに関して既知の標準を用いて、質量または活性による測定値を計算することができる。
【０２９７】
糖尿病を治療するのに本発明の融合タンパク質が用いられる場合、有効性は、長期投与における血糖コントロールの尺度である糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）の低下によって測定することができる。例えば、有効量は、当業界既知の方法によって測定された糖化ヘモグロビンが、少なくとも約１.５倍、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約１５倍、少なくとも約２０倍、少なくとも約３０倍、少なくとも約４０倍、少なくとも約５０倍、または、少なくとも約１００倍の減少、またはそれを超える減少を示す用量であり得る。
【０２９８】
本発明はまた、本発明の医薬組成物を経口投与する方法も含む。このような方法は、これらに限定されないが、患者または介護者によって本組成物を経口投与する工程を含んでいてもよい。このような投与工程は、融合タンパク質、疾患もしくは患者の身体状態、または個々の患者に応じて、間隔を置いて投与すること、例えば１日あたり１回または２回で投与することを含んでいてもよい。また、このような方法は、別種の融合タンパク質を様々な投与量で投与することを含んでいてもよい。例えば、医薬組成物の最初の投与量は、血糖値の減少のような所望の作用を誘導することができる比較的高レベルであってもよい。所望の効果に達したならば、その後投与量を減少させてもよい。このような投与プロトコールの変更または調節は、担当医または医療従事者によって行われ得る。場合によっては、投与プロトコールの変更は、例えば、患者が血糖値をモニターして、本発明のｍＴｆ−ＧＬＰ−１経口用組成物を投与する場合、個々の患者によってなされてもよい。
【０２９９】
本発明はまた、本発明の経口用組成物または医薬組成物の製造方法も含み、本方法は、本発明のＴｆ融合タンパク質を経口投与可能な形態に製剤化することを含む。その他の例において、本発明は、本発明の組成物または医薬組成物の製造方法を含み、本方法は、本発明のＴｆ融合タンパク質を経口投与に適した形態に製剤化することを含む。
【０３００】
その上、本発明は、Ｔｆ融合タンパク質製剤の肺送達を含む。肺送達は、その他の投与経路での送達が難しい高分子の送達に特に有望である。肺に送達された薬物は、容易に肺胞の領域を介して血液循環に直接吸収されるため、このような肺送達は、肺疾患を治療するための全身への送達と局所的な送達の両方に有効である可能性がある。
【０３０１】
本発明は、様々な身体状態または疾患を治療するための経口吸入（肺送達）のための薬物分散を形成するのに適した組成物を提供する。本融合タンパク質製剤は、様々なアプローチによって送達することができ、例えば液体噴霧器、エアゾールベースの定量吸入器（ＭＤＩ）、および乾燥粉末分散装置によってなされる。肺送達用の組成物の製剤化において、製薬上許容できるキャリアーとしては、表面活性剤または界面活性剤が挙げられ、増量キャリアー（ｂｕｌｋ  ｃａｒｒｉｅｒ）は、一般的に、対象への本組成物の一様な肺送達を増強するために安定性、分散性、粘稠度および／または増量特性を提供するために添加される。
【０３０２】
表面活性剤または界面活性剤は、ポリペプチドの粘膜や粘膜内層を通しての吸収を促進する。有用な表面活性剤または界面活性剤としては、脂肪酸およびそれらの塩、胆汁酸塩、リン脂質、またはアルキルサッカライドが挙げられる。脂肪酸およびそれらの塩の例としては、カプリル酸（Ｃ8）、カプリン酸塩（Ｃ10）、ラウリン酸塩（Ｃ12）およびミリスチン酸塩（Ｃ14）のナトリウム、カリウムおよびリシン塩が挙げられる。胆汁酸塩の例としては、コール酸、ケノデオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコケノデオキシコール酸、タウロケノデオキシコール酸、デオキシコール酸、グリコデオキシコール酸、タウロデオキシコール酸、リトコール酸、およびウルソデオキシコール酸が挙げられる。
【０３０３】
リン脂質の例としては、単鎖リン脂質、例えばリゾホスファチジルコリン、リゾホスファチジルグリセロール、リゾホスファチジルエタノールアミン、リゾホスファチジルイノシトールおよびリゾホスファチジルセリン；または、二重鎖のリン脂質、例えばジアシルホスファチジルコリン、ジアシルホスファチジルグリセロール、ジアシルホスファチジルエタノールアミン、ジアシルホスファチジルイノシトールおよびジアシルホスファチジルセリンが挙げられる。アルキルサッカライドの例としては、アルキルグルコシドまたはアルキルマルトシド、例えばデシルグルコシドおよびドデシルマルトシドが挙げられる。
【０３０４】
キャリアーとして有用な医薬賦形剤としては、安定剤、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）；増量剤、例えば糖質、アミノ酸およびポリペプチド；ｐＨ調整剤または緩衝液；塩、例えば塩化ナトリウム；などが挙げられる。これらのキャリアーは、結晶質の形態でもよいし、または、非晶質の形態でもよく、またはこれら二つの形態の混合物であってもよい。
【０３０５】
増量剤として使用するための糖質の例としては、単糖、例えばガラクトース、Ｄ−マンノース、ソルボースなど；二糖類、例えばラクトース、トレハロースなど；シクロデキストリン、例えば２−ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン；および多糖類、例えばラフィノース、マルトデキストリン、デキストランなど；アルジトール、例えばマンニトール、キシリトールなどが挙げられる。増量剤として使用するためのポリペプチドの例としては、アスパルテームが挙げられる。アミノ酸としては、アラニンおよびグリシンが挙げられ、好ましくはグリシンである。
【０３０６】
噴霧乾燥中のコンホメーション安定性のために、さらに粉末の分散性を改善するために、組成物の微量成分である添加剤が含まれていてもよい。これらの添加剤としては、疎水性アミノ酸、例えばトリプトファン、チロシン、ロイシン、フェニルアラニンなどが挙げられる。
【０３０７】
適切なｐＨ調整剤または緩衝剤としては、有機酸および塩基から製造された有機塩、例えばクエン酸ナトリウム、アスコルビン酸ナトリウムなどが挙げられ、好ましくはクエン酸ナトリウムである。
【０３０８】
肺送達のためのＴｆ融合体組成物は、単位投与剤としてパッケージ化されていてもよく、この場合、治療上有効な量の組成物が、一つの単位投与剤容器、例えばブリスターパック、ゼラチンカプセルなどに含まれる。ブリスターパックまたはゼラチンカプセルの製造は、典型的には、一般的にパッケージング技術分野においてよく知られた方法によって行われる。
【０３０９】
米国特許第６,５２４,５５７号は、（ａ）ＨＦＡ噴射剤；（ｂ）噴射剤に分散可能な医薬活性を有するポリペプチド；および（ｃ）界面活性剤を含むエアゾール医薬製剤を開示しており、このような界面活性剤は、Ｃ8〜Ｃ16脂肪酸またはそれらの塩、胆汁酸塩、リン脂質、またはアルキルサッカライドであり、このような界面活性剤は、下気道におけるポリペプチドの全身吸収を増強する。本発明はまた、このような製剤の製造方法、および患者の治療におけるこのような製剤の使用を提供する。
【０３１０】
ドライパウダー薬物を肺送達する１つのアプローチは、加圧ガス源を提供するための手動ポンプを備えたハンドヘルド装置を利用することである。加圧ガスは、ベンチュリノズルのような粉末分散装置を介して突発的に放出され、分散された粉末が患者の吸入に利用できるようになる。
【０３１１】
乾燥粉末分散装置は数々の特許で記載されている。米国特許第３,９２１,６３７号は、粉末化した薬物の単一のカプセルを突き刺すためのニードルを備えた手動式ポンプを記載している。投薬のための複数の容器を備えたディスクまたはストリップの使用が、欧州特許出願公開ＥＰ０４６７１７２；国際特許出願公開ＷＯ９１／０２５５８；およびＷＯ９３／０９８３２；米国特許第４,６２７,４３２号；４,８１１,７３１号；５,０３５,２３７号；５,０４８,５１４号；４,４４６,８６２号；５,０４８,５１４号、および４,４４６,８６２号に記載されている。
【０３１２】
タンパク質治療剤のエアゾール化は、欧州特許出願公開ＥＰ０２８９３３６に記載されている。エアゾール治療製剤は、国際特許出願公開ＷＯ９０／０９７８１に記載されている。
【０３１３】
本発明は、経口吸入のためにＴｆ融合タンパク質を製剤化することを提供する。このような製剤は、Ｔｆ融合タンパク質および肺送達に適した医薬賦形剤を含む。本発明はまた、経口吸入によってＴｆ融合タンパク質組成物を、それらを必要とする対象に投与することを提供する。
【０３１４】
ＩＩ型糖尿病を治療するためのＧＬＰ−１−ｍＴｆ融合タンパク質
上記で考察したように、ＧＬＰ−１は、体内の重要な内分泌ホルモン系を活性化し、調節するものであり、さらにグルコース代謝において重要な管理的な役割を果たす。市場のその他のあらゆる糖尿病治療とは異なり、ＧＬＰ−１での治療は、β細胞の増殖因子として作用させて膵臓のインスリン分泌能を改善することによって回復させたり、さらに感受性を改善し、血糖値をさらに安定させることによって、現存するインスリンレベルをより効率的に作用させたりする可能性を有する。これは、毎日血糖値をモニターする負荷を軽減し、さらに場合によっては糖尿病に起因する血糖の変動によって惹起する重篤な長期にわたる副次的悪影響を遅延させる可能性もある。その上、ＧＬＰ−１は、食欲を減少させ、体重を減らすことができる。肥満は、グルコース代謝の制御不良による固有の結果であり、これは、糖尿病の身体状態を悪化させる作用しか持たない。
【０３１５】
天然ＧＬＰ−１は循環中で迅速に分解されるため（半減期は数分である）、その臨床的な応用は限定される。循環中で治療的なレベルを維持するために、ポンプまたはパッチ装置を用いて高用量を一定して投与することが必要であるが、これは、治療コストを増大させる。これは、特に糖尿病を治療したり、血糖値をモニターしたりするその他のあらゆる薬物療法と併用させると、長期間の連続使用には不便である。ＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質は、ＧＬＰ−１の活性を保持するが、改変トランスフェリン（ｍＴｆ）の長い半減期、溶解性および生体内分布特性を有する。これらの特性によって、低コスト、小さい体積、月１回のｓ．ｃ．（皮下）注射を実現することができ、このタイプの製品は、長期間の長びく使用には絶対必要である。
【０３１６】
好ましくは、本発明のＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質は、糖尿病または肥満を治療するのに用いられる。本リンカーとして、実質的にらせん状ではないリンカー、すなわちリジッドなリンカーが使用可能であり、リンカーとしては、これらに限定されないが、ＰＥＡＰＴＤ（配列番号１３）、ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号１０）、ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号１４）、ＩｇＧヒンジ領域（配列番号８８、８９、および１１７）、ならびにＩｇＧヒンジ領域およびＰＥＡＰＴＤ（配列番号１１８〜１２３および１２６〜１２９）が挙げられる。一実施態様において、ＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質は、実施例４で説明されているＢＲＸ０５８５（配列番号１２）であり、これは、Ａ８ＧおよびＫ３４Ａの改変を含むＧＬＰ−１（７〜３７）、ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤリンカーならびに隣接するＳ／Ｔ残基の置換によって４１３位および６１１位においてＮ−グリコシル化が欠失したｍＴｆからなる。
【０３１７】
また、ＧＬＰ−２は、ＧＬＰ−１をｍＴｆに連結するリンカーとしても使用可能である。一実施態様において、本融合タンパク質におけるＧＬＰ−２ペプチドは、より安定な融合タンパク質を形成してより強力なＧＬＰ−１が生じるように改変されている。例えば、ＧＬＰ−２ペプチドは、実質的に減少したＧＬＰ−２活性を有するように改変することもあり得よう。ＧＬＰ−２ペプチドは、ＧＬＰ−２ペプチドのＨ１に相当するアミノ酸を欠失させることによって改変することもあり得よう。また、ＧＬＰ−２ペプチドは、プロテアーゼによる切断が実質的に少なくなるように改変することもあり得、ここにおいて、プロテアーゼによる切断は、Ｙａｐ３ｐが介在する。例えば、ＧＬＰ−２のＫ３０に相当するアミノ酸は、例えばＡに突然変異させることもあり得よう。あるいは、ＧＬＰ−２は、Ｋ３０〜Ｒ３４に相当するアミノ酸を欠失させることによって、またはＨ１〜Ｄ８に相当するアミノ酸を欠失させることによって改変することもあり得よう。
【０３１８】
その他の実施態様において、本融合タンパク質は、Ｎ末端に少なくとも２つのＧＬＰ−１ペプチドを含む。その上、ＧＬＰ−１は、例えばアミノ酸をＧＬＰ−１のＮ末端に付加することによって改変することもあり得よう。好ましくは、付加されたアミノ酸は、ＨまたはＧである。あるいは、ＧＬＰ−１は、Ａ８をＳに突然変異することによって改変することもあり得よう。ＧＬＰ−１は、Ｋ３４をＱ、ＡまたはＮに突然変異することによって改変することもあり得よう。また、ＧＬＰ−１も、Ｖ３３〜Ｒ３６を欠失させることによって改変することもあり得よう。
【０３１９】
その他の治療剤と組み合わせたＧＬＰ−１−ｍＴｆ融合タンパク質
本発明の一形態において、本発明のＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質、例えば配列番号１２に相当するタンパク質は、少なくとも一つの第二の治療的分子と組み合わせて用いてＩＩ型糖尿病、肥満、および異常な血糖値に関連するその他の疾患または身体状態を治療してもよく、ここにおいて、第二の治療的分子としては、例えば、ＤＰＰＩＶ阻害剤、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）２４．１１阻害剤またはグルコファージ(R)（Ｇｌｕｃｏｐｈａｇｅ(R)）（塩酸メトホルミン錠剤）またはグルコファージ(R)ＸＲ（塩酸メトホルミン徐放性錠）が挙げられる。
【０３２０】
グルコファージ(R)およびグルコファージ(R)ＸＲは、ＩＩ型糖尿病を管理するための経口血糖降下薬である。グルコファージ(R)ＸＲは、グルコファージの徐放性製剤である。従って、グルコファージ(R)ＸＲは、投薬形態から薬物が徐放されるため、１日１回の投与でよい。グルコファージ(R)は、肝臓からのグルコース体内生産の低減を促進する。従って、グルコファージ(R)は、患者の血糖値の制御に有効である。グルコファージ(R)は、体内でそれ以上インスリンを生産させないため、低血糖（低血糖症）を引き起こすことはめったにない。
【０３２１】
また、グルコファージ(R)は、ＩＩ型糖尿病を有する人々において高いことが多い血中の脂肪成分、トリグリセリドおよびコレステロールの低減も促進する。メトホルミンは、薬物摂取を開始する場合、食欲を減少させ、ヒトの体重を数ポンド減らすのに役立つことが示されている。
【０３２２】
メトホルミンは、スルホニル尿素またはインスリンとの併用療法、または単剤療法（そのものによる）が承認されている。メトホルミンは、インスリン抵抗性患者において高血圧（ＷＯ９１１２００３−アップジョン（Ｕｐｊｏｈｎ））、血餅の溶解用（ｔ−ＰＡ−誘導体と組み合わせて）（ＷＯ９１０８７６３、ＷＯ９１０８７６６、ＷＯ９１０８７６７およびＷＯ９１０８７６５−ベーリンガー・マンハイム（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ））、虚血や組織の酸素欠乏（ＥＰ２８３３６９−リファ（Ｌｉｐｈａ））、アテローム性動脈硬化症（ＤＥ１９３６２７４−ブルネングラーバー＆Ｃｏ．（Ｂｒｕｎｎｅｎｇｒａｂｅｒ＆Ｃｏ．）、ＤＥ２３５７８７５−フルカ（Ｈｕｒｋａ）、および米国特許第４,２０５,０８７号−ＩＣＩ）のような様々な心臓血管疾患の治療における使用が示唆されている。加えて、メトホルミンを、冠動脈拡張薬としてのプロスタグランジン類似シクロペンタン誘導体と組み合わせて使用して、血圧を低くすることが示唆されている（米国特許第４,１８２,７７２号  −ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ））。また、メトホルミンは、２−ヒドロキシ−３，３，３−トリフルオロプロピオン酸誘導体（米国特許第４,１０７,３２９号−ＩＣＩ）、１，２−ジアリールエチレン誘導体（米国特許第４,０６１,７７２号−ヘキスト）、置換アリールオキシ−３，３，３−トリフルオロ−２−プロピオン酸、エステルおよび塩（米国特許第４,０５５,５９５号−ＩＣＩ）、置換ヒドロキシフェニル−ピペリドン（米国特許第４,０２４,２６７号−ヘキスト）、および部分水素化された１Ｈ−インデノ−［１，２−Ｂ］−ピリジン誘導体（米国特許第３,９８０,６５６号−ヘキスト）と併用するときのコレステロール低下における使用も示唆されている。
【０３２３】
Ｍｏｎｔａｎａｒｉ等（Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，第２５巻，番号１，１９９２）は、メトホルミンを、１日２回（ｂ．ｉ．ｄ．）５００ｍｇの量で使用することによって、メトホルミン８５０ｍｇを１日３回（ｔ．ｉ．ｄ．）使用した場合と同様に虚血後の血流を増加させることを記載している。Ｓｉｒｔｏｒｉ等（Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓ．Ｐｈａｒｍ．，６：９１４〜９２３，１９８４）は、末梢血管疾患の患者において、１日３回（ｔ．ｉ．ｄ）の８５０ｍｇの量のメトホルミンは、動脈血流を増加させることを記載している。
【０３２４】
本発明は、ＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質と、１またはそれ以上の治療剤（例えばメトホルミン）とを併用することを含む、様々な病気の治療を提供する。一実施態様において、ＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質とメトホルミンとを併用して、異常な血糖値に関連する疾患および身体状態、例えば糖尿病を治療することができる。好ましくは、ＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質とメトホルミンとを併用して、ＩＩ型糖尿病または肥満を治療することができる。
【０３２５】
本発明は、本発明のＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質と、チアゾリジンジオン、例えばグリタゾン（ロシグリタゾンまたはピオグリタゾン）とを併用した、ＩＩ型糖尿病および／または肥満の治療を提供する。チアゾリジンジオンは、ＩＩ型糖尿病で見られるインスリン抵抗性を元に戻す。
【０３２６】
本発明のＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質と併用可能なその他の治療剤としては、これらに限定されないが、ＤＰＰＩＶ阻害剤、ＮＥＰ阻害剤、スルホニル尿素およびスルホニル尿素様の物質、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）ガンマモジュレーター、ＰＰＡＲアルファモジュレーター、タンパク質チロシンホスファターゼ−１Ｂ阻害剤、インスリン受容体チロシンキナーゼ活性化剤、１１ベータ−ヒドロキシステロイドデヒドロゲナーゼ阻害剤、グリコーゲンホスホリラーゼ阻害剤、グルコキナーゼ活性化剤、ベータ−３アドレナリン作動薬、およびグルカゴン受容体アゴニストが挙げられる。
【０３２７】
トランスジェニック動物
本発明の一実施態様において、本発明の長い血清中半減期、高い血清安定性または高い生物学的利用率を有する融合体のコンストラクトを含む非ヒトトランスジェニック動物の生産が意図されている。いくつかの実施態様において、本融合タンパク質のＴｆ部分としてラクトフェリンを用いて、融合タンパク質を生産させ乳汁に分泌させてもよい。
【０３２８】
多数の特許および刊行物で非ヒトトランスジェニック動物をうまく生産することが記載されており、例えば米国特許第６,２９１,７４０号（２００１年９月１８日に発行）；米国特許第６,２８１,４０８号（２００１年８月２８日に発行）；および米国特許第６,２７１,４３６号（２００１年８月７日に発行）で記載されており、これらの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０３２９】
動物、例えばウシ（ｃｏｗ）、ブタ、ヤギ、ウマ、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）およびヒツジなどの家畜哺乳類の遺伝学的構成を変更する能力は、多数の商業的な適用を可能にする。これらの適用としては、収穫が簡単な形態で外因性タンパク質を大量に発現する（例えば、乳汁または血液への発現）動物の生産、体重増加、飼料効率、屠体成分、乳生産または含量、耐病性および特定の微生物による感染への耐性を高めた動物の生産、ならびに成長速度または生殖能力が強化された動物の生産が挙げられる。ゲノムに外因性ＤＮＡ配列を含む動物は、トランスジェニック動物と称される。
【０３３０】
トランスジェニック動物の生産に最も広く用いられる方法は、受精胚の前核へのＤＮＡのマイクロインジェクションである（Ｗａｌｌ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．４９：１１３［１９９２］）。その他のトランスジェニック動物の製造方法としては、レトロウイルスまたはレトロウイルスベクターを用いた胚の感染が挙げられる。野生型または組換えレトロウイルスのいずれかによる、着床前マウス胚と着床後マウス胚の両方の感染が報告されている（Ｊａｎｅｎｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７３：１２６０［１９７６］；Ｊａｎｅｎｉｃｈ等，Ｃｅｌｌ  ２４：５１９［１９８１］；Ｓｔｕｈｌｍａｎｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：７１５１［１９８４］；Ｊａｈｎｅｒ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：６９２７［１９８５］；Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｐｕｔｔｅｎ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ８２：６１４８〜６１５２［１９８５］；Ｓｔｅｗａｒｔ等，ＥＭＢＯ  Ｊ．６：３８３〜３８８［１９８７］）。
【０３３１】
レトロウイルスで胚を感染させるための代替手段は、マウス胚の胞胚腔へのウイルスまたはウイルス産生細胞の注射である（Ｊａｈｎｅｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９８：６２３［１９８２］）。マウス妊娠中期胚の子宮内へのレトロウイルス感染を用いた、マウスの生殖細胞系への導入遺伝子の導入が報告されている（Ｊａｈｎｅｒ等，上記［１９８２］）。トランスジェニック動物を作出するためのレトロウイルスまたはレトロウイルスベクターによるウシおよびヒツジ胚の感染が報告されている。これらのプロトコールは、レトロウイルス粒子のマイクロインジェクションまたは受精卵または初期胚の囲卵腔にレトロウイルス粒子を入れる細胞の成長停止（すなわちマイトマイシンＣ処理）を含む（ＰＣＴ国際公開ＷＯ９０／０８８３２［１９９０］；およびＨａｓｋｅｌｌおよびＢｏｗｅｎ，Ｍｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．Ｄｅｖ．，４０：３８６［１９９５］。ＰＣＴ国際出願公開ＷＯ９０／０８８３２は、２〜８細胞期でのヒツジ胚の囲卵腔への野生型のネコ白血病ウイルスＢの注射を記載している。注射された胚から誘導された胎児は、複数の挿入部位を含むことが示された。
【０３３２】
米国特許第６,２９１,７４０号（２００１年９月１８日に発行）は、分裂細胞を形質導入するレトロウイルスベクター（例えば、マウスの白血病ウイルス［ＭＬＶ］から誘導されたベクター）を用いた、成熟前の卵母細胞および成熟した未受精の卵母細胞（すなわち受精前の卵母細胞）に外因性ＤＮＡを導入することによるトランスジェニック動物の生産を記載している。またこの特許は、サイトメガロウイルスプロモーターによって駆動する方法および組成物、ならびに様々な組換えタンパク質のマウス乳癌ＬＴＲ発現のための方法および組成物も記載している。
【０３３３】
米国特許第６,２８１,４０８号（２００１年８月２８日に発行）は、胚幹細胞を用いてトランスジェニック動物を生産する方法を記載している。簡単に言えば、胚幹細胞は、トランスジェニック動物を生成するための混合細胞と桑実胚との共培養で用いられる。共培養の前に、外来遺伝物質を、例えばエレクトロポレーション、マイクロインジェクションまたはレトロウイルス送達によって胚幹細胞に導入する。このようにしてトランスフェクションされたＥＳ細胞は、ネオマイシンのような選択マーカーを介する遺伝子の組込みのために選択される。
【０３３４】
米国特許第６,２７１,４３６号（２００１年８月７日に発行）は、以下の方法を用いたトランスジェニック動物の生産を説明しており、この方法は、始原生殖細胞を分離し、これらの細胞を培養して、始原生殖細胞から誘導された細胞系を生産し、始原生殖細胞と培養細胞系との両方を形質転換し、これらの形質転換細胞および細胞系を用いてトランスジェニック動物を生産することを含む。トランスジェニック動物の生産効率が極めて高くなるため、げっ歯類以外のトランスジェニック動物種の生産における相同組換えの利用が可能になる。
【０３３５】
遺伝子治療
本発明の一実施態様において、改変トランスフェリンタンパク質またはトランスフェリンドメインを、治療用タンパク質またはペプチドに結合させた、遺伝子治療のための改変トランスフェリン融合体のコンストラクトの使用が意図されている。本発明の長い血清中半減期または高い血清中の安定性を有する改変トランスフェリン融合体のコンストラクトは、遺伝子治療による処置に理想的に適合する。
【０３３６】
可溶性融合タンパク質を発現させるための遺伝子治療のうまい使用を説明する。簡単に言えば、細胞障害性リンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）およびヒト免疫グロブリンＧ１のＦｃ部分からなる可溶性融合タンパク質をコードする遺伝子を含むアデノウイルスベクターを注射ことによる遺伝子治療が、近年、Ｉｊｉｍａ等（２００１年６月１０日）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（米国）１２／９：１０６３〜７７により示された。この出願の遺伝子治療において、上記ベクターの関節内注射によってＩＩ型コラーゲン誘導関節炎のマウスモデルの治療が成功している。
【０３３７】
また遺伝子治療は、多数の米国特許にも記載されており、例えば、米国特許第６,２２５,２９０号（２００１日５月１日に発行）；米国特許第６,１８７,３０５号（２００１年２月１３日に発行）；および米国特許第６,１４０,１１１号（２０００年１０月３１日に発行）が挙げられる。
【０３３８】
米国特許第６,２２５,２９０号は、対象の哺乳動物の腸上皮細胞に、遺伝子操作によって改変して、所望の治療効果を有するタンパク質を発現する遺伝子を作動できるように組み込ませる方法およびコンストラクトを提供する。腸細胞の形質転換は、主として裸のＤＮＡで構成される調合物の投与によって達成され、このようなＤＮＡは経口投与が可能である。経口用またはその他の胃腸内投与経路は単純な投与方法を提供するが、裸の核酸の使用は、遺伝子治療を達成するためのウイルスベクターの使用に伴う合併症を回避する。発現されたタンパク質は消化管および／または血流に直接分泌され、タンパク質の治療域の血中濃度が得られ、それによってそのタンパク質を必要とする患者を治療することができる。形質転換された腸上皮細胞は、特定のタンパク質の欠乏に関連する疾患、またはタンパク質の過剰発現による治療で処置することができる疾患の短期間または長期間の治療法を提供する。
【０３３９】
米国特許第６,１８７,３０５号は、脊椎動物の細胞、特に哺乳動物由来の細胞において遺伝子またはＤＮＡを標的化する方法を提供する。簡単に言えば、ＤＮＡを、相同組換え、またはＤＮＡ標的化によって脊椎動物起源の一次または二次細胞に導入し、それを、一次または二次細胞のゲノムＤＮＡの予め選択された部位に導入する。
【０３４０】
米国特許第６,１４０,１１１号（２０００年１０月３１日に発行）は、レトロウイルスの遺伝子治療ベクターを記載している。記載されたレトロウイルスベクターは、関心ある遺伝子のための挿入部位を含み、これは、多種多様のトランスフェクションされた細胞型で関心ある遺伝子から誘導された高レベルのタンパク質を発現することができる。また、選択マーカーが欠失したレトロウイルスベクターも記載されており、このようなベクターによって、抗生物質のようなマーカー産物を共発現させないでそれらを多種多様な病態の治療におけるヒト遺伝子治療に適合させることができる。これらのレトロウイルスベクターは、特定のパッケージング細胞系で使用するのに特に適している。レトロウイルスベクターの哺乳動物細胞のゲノムに挿入する能力により、それらは、ヒトおよび動物の遺伝病の遺伝療法に使用するのに特に有望な候補となっている。典型的には、遺伝療法は、（１）インビボで新しい遺伝物質を患者の細胞に添加すること、または、（２）患者の細胞を体から採取して、その細胞に新しい遺伝物質を添加し、それらを体に再導入すること、すなわちインビトロでの遺伝子治療を含む。様々な細胞においてレトロウイルスベクターを用いた遺伝子治療を行う方法の考察は、例えば、１９８９年９月１９日に発行された米国特許第４,８６８,１１６号、および１９９０年１２月２５日に発行された４,９８０,２８６号（上皮細胞）、１９８９年８月１０日に公開されたＷＯ８９／０７１３６号（肝細胞）、１９９０年７月２５日に公開されたＥＰ３７８,５７６（線維芽細胞）、ならびに１９８９年６月１５日に公開されたＷＯ８９／０５３４５および１９９０年６月２８日に公開されたＷＯ／９０／０６９９７（内皮細胞）で見出すことができる（これらの開示は、参照により本明細書に加入する）。
【０３４１】
トランスフェリン融合タンパク質を含むキット
さらなる実施態様において、本発明は、ＧＬＰ−１／ｍＴｆ、またはＧＬＰ−１／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質を含むキットを提供し、本キットは、例えば治療用途に用いてもよいし、または、治療以外の用途に用いてもよい。本キットは、ラベルを備えた容器を含む。適切な容器としては、例えば、ボトル、バイアル、および試験管が挙げられる。このような容器は、ガラス、またはプラスチックのような多様な材料から形成することができる。このような容器は、上述のような治療用途、または治療以外の用途に効果的な融合タンパク質を含む組成物を収容できる。本組成物中の活性物質は、治療用タンパク質である。容器上のラベルは、上記組成物が、特定の治療用途、または治療以外の用途で用いられることを表示するものであり、さらに、インビボまたはインビトロのいずれかでの使用、例えば上述したような使用に関する説明を表示していてもよい。
【０３４２】
本発明のキットは、典型的には、上述の容器、および商業的観点および使用者の観点から望ましい物質を含む１個またはそれ以上のその他の容器を含むことになり、このような物質としては、緩衝液、希釈剤、フィルター、注射針、注射器、および使用説明書を含む添付文書が挙げられる。
【０３４３】
これ以上の説明がなくても、当業界における通常の技術を有する者であれば、以上の説明と以下の例示的実施例を用いて、本発明を作製し、それらを利用して、特許請求された方法を実施することが可能だと考えられる。例えば、当業者であれば容易にインビトロとインビボの両方において、本発明の融合タンパク質コンストラクトに関する生物活性を、それらの非融合状態における治療部分の相当する活性と比較して測定することができるはずである。同様に、当業者であれば、本発明に係るコンストラクトの血清中の半減期、および血清中の安定性を、容易に測定することができよう。それゆえに、以下の実施例で、本発明の好ましい実施態様を具体的に指摘するが、開示されていない残部をいかなる方法によっても制限するものとして解釈すべきものではない。
【実施例】
【０３４４】
実施例１：ＧＬＰ−１／トランスフェリン融合タンパク質
ＧＬＰ−１は、インスリン分泌を調節するペプチドである。ＧＬＰ−１は、糖尿病、特にＩＩ型糖尿病に罹ったヒト対象において抗糖尿病活性を有する。その他のペプチドと同様に、ＧＬＰ−１は、ヒトにおいて短い血漿中半減期を有する。本発明は、異常な血糖値に関連する疾患を治療するための、長い半減期を有するｍＴｆに融合したＧＬＰ−１を含む融合タンパク質、およびこのような融合タンパク質の医薬組成物を提供する。
【０３４５】
本発明はまた、ＧＬＰ−１類似体およびｍＴｆを含む融合タンパク質を提供する。本発明の一実施態様において、ＧＬＰ−１類似体は、Ｎ末端に追加のＨｉｓ残基を含む。このＨｉｓ残基は、ＧＬＰ−１のＮ末端に付加することもよいし、またはＧＬＰ−１のＮ末端でＨｉｓ残基の後に挿入することもできた。その他の実施態様において、ＧＬＰ−１類似体は、位置２にアミノ酸置換を含む。例えば、ＧＬＰ−１（７〜３６）またはＧＬＰ−１（７〜３７）ペプチドにおけるＡｌａは、その他のアミノ酸で置換される。
【０３４６】
この実施例において、ＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質を生産する工程を説明する。それと同じ工程は、ＧＬＰ−１ペプチド類似体を含むトランスフェリン融合タンパク質の製造に使用可能である。
【０３４７】
ＧＬＰ−１／ｍＴｆ融合タンパク質を生産するために、ＧＬＰ−１（７〜３６）およびＧＬＰ−１（７〜３７）のアミノ酸配列が使用可能である。
【０３４８】
【化２】
2008531059.tif 000007
【０３４９】
例えば、ＧＬＰ−１（７〜３６）のペプチド配列をＤＮＡに逆翻訳し（ｂａｃｋ  ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）、コドンを酵母に最適化してもよい：
【０３５０】
【化３】
2008531059.tif 000008
【０３５１】
アニーリング後に５’ＸｂａＩおよび３’ＫｐｎＩ付着末端が形成され、ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで切断したｐＲＥＸ００５２に、リーダー配列の末端のちょうど５’とｍＴｆのＮ末端で直接のライゲーションできるように、プライマーを具体的に設計した。あるいは、他方の付着末端がその他のベクターにライゲーションするように、それらを操作してもよい。
【０３５２】
【化４】
2008531059.tif 000009
【０３５３】
アニーリングとライゲーションの後に、クローンを配列解析して、正しい挿入を確認した。このベクターをｐＲＥＸ００９４と名付けた。ＮｏｔＩを用いてｐＲＥＸ００９４からカセットを切り出し、ＮｏｔＩで切断した酵母ベクター、ｐＳＡＣ３５にサブクローニングし、ｐＲＥＸ０１００を作製した。
【０３５４】
次に、このプラスミドを、宿主サッカロミセス・セレビジエ酵母株にエレクトロポレーションし、最小培地プレート上で、形質転換株をロイシンプロトトロフィー（ｐｒｏｔｏｔｒｏｈｙ）に関して選択した。発現を、液体最小培地中での増殖によって測定し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ウェスタンブロットおよびＥＬＩＳＡによって上清を分析した。
【０３５５】
実施例２：活性を改善するためのリンカーの付加
ｍＴｆキャリアーによる立体障害は、ＧＬＰ−１がその受容体に結合する能力を減少させる可能性があるという仮説に基づいた、ＧＬＰ−１ｍＴｆ融合体の活性を改善する方法としての、ＧＬＰ−１とｍＴｆとの間へのリンカーまたはスペーサーの付加を調査した。従って、立体障害を減少させることができ、リンカーを挿入してＧＬＰ−１とｍＴｆとの間の距離を長くすることにより、活性は回復すると推定した。３種の異なるタイプのリンカー：フレキシブルなリンカー、短いフレキシブルなリンカーおよびリジッドなリンカーを試験した。
【０３５６】
試験された長いフレキシブルなリンカーとしては、（ＳＧＧＧ）3のリピート、およびＧＬＰ−２配列をベースとしたリンカー（「ＧＬＰ−２リンカー」）であった。リンカーとして（ＳＧＧＧ）3のリピートとそれと類似した配列が用いられ、例えばＶｈおよびＶｌが一緒に連結した単鎖Ｆｖフラグメントにおいて用いられた。ＧＬＰ−２リンカーを試験したが、これは、自然状態で、プロセシングによってグルカゴン、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−２が生じるプロペプチドにおいてＧＬＰ−２はＧＬＰ−１に近接して存在するためである。切断されて２つのＧＬＰペプチドを生じる介在ペプチド配列はＧＬＰ−２におけるＮ末端残基であるため、これを除去して、何らかの手段でそれがリンカーから切断されるとＧＬＰ−２が不活性になるようにした。さらに、ＧＬＰ−２は天然の配列であるため、免疫原性が生じる可能性は低いと推測された。
【０３５７】
試験された短いフレキシブルなリンカーは、Ｓ、ＳＳおよびＳＳＧであった。このクラスのリンカーを試験して、ｍＴｆから空間的に離れたＧＬＰ−１の非存在下で、２つの部分の連結部におけるフレキシビリティーの作用を測定した。
【０３５８】
リジッドなリンカー、すなわち実質的にらせん状ではないリンカーを、それらは可動性ではないが、ＧＬＰ−１がその受容体を発見するのに必要な２つの部分をはっきりと隔てるという考えに基づいて設計した。ＴｆのＮとＣローブとの間に天然に存在する配列、すなわちＣｙｓ３３１〜Ｃｙｓ３３９に天然に存在する配列（ＰＥＡＰＴＤＥ）の使用は、循環系で高い発生量でみられる配列の利用となったが、そうすることによって、それらが免疫原性になり得る懸念を低くした。この配列中にプロリン残基があると、ｍＴｆの二番目の残基位置におけるプロリン残基と同様に、フレキシビリティーが低いペプチドが生じると予想された。作出されたリンカーは、ＰＥ、ＰＥＡ、ＰＥＡＰＴＤ、（ＰＥＡＰＴＤ）2、（ＰＥＡＰＴＤ）３および（ＰＥＡＰＴＤ）４であった。
【０３５９】
代替の高い発生量で天然に存在するリンカー配列として、ヒトＩｇＧ１由来のヒンジ領域を調査した。ＩｇＧヒンジは、ヒトＩｇＧ１重鎖の定常（Ｆｃ）と可変領域（Ｖｈ）とを連結させる配列の領域である。天然型のタンパク質において、このヒンジは、抗原結合の際にＩｇＧ分子を柔軟にする。この配列は、実際には、ペプチドまたはタンパク質をＦｃ融合体のＮ末端に連結させる際に用いられている。またこれは、組換えタンパク質において２つの別個のタンパク質ドメイン間でフレキシブルな領域を形成するのにも用いられてきた（Ｄｏｙｌｅ等，２００３  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，１１４，１５３〜１５８）。一般的にＩｇＧヒンジと言われる配列は、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（残基２２４〜２３８）（配列番号８８）であり、軽鎖とジスルフィド結合を形成するシステイン、および抗体の他方の重鎖Ｆｃ領域とジスルフィド結合を形成する２つのシステインを含む。
【０３６０】
リンカーを所望の長さにするために、この配列を２５残基：ＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号１２４）に延長した。このリンカーを、システイン残基をセリンに突然変異させて改変し、遊離のシステインのジスルフィド結合形成を防いだ（ＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号８９））。このシステイン残基を同様にアラニンで置換して、ＶＥＰＫＳＡＤＫＴＨＴＡＰＰＡＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号１１７）を作製することができる。さらに、このシステイン残基とセリン残基をアラニンで置換して、ＶＥＰＫＡＡＤＫＴＨＴＡＰＰＡＰＡＰＥＬＬＧＧＰＡ（配列番号１２５）を作製してもよい。配列番号１１７および１２５はいずれも、セリン残基を除去した結果としてＯ−グリコシル化が減少した。この段落で説明したヒンジ配列を単一のＰＥＡＰＴＤ配列、またはＰＥＡＰＴＤ多量体、例えば（ＰＥＡＰＴＤ）2と共に用いて、リンカーをさらに延長してもよい。
【０３６１】
エキセンジン−４のＣ末端配列は、ＧＬＰ−１受容体結合親和性において主要な役割を果たし、さらに、ＧＬＰ−１ペプチドに９個のアミノ酸からなるＣ末端配列：ＳＳＧＡＰＰＰＳ（配列番号１５）を付加して、それらのＧＬＰ−１受容体への親和性を高めた（Ｈｅｕｓｅｒ等，２００４  Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  １１０：３８６〜３９４）。この配列を、ＩｇＧヒンジと共にリンカーとして用いた。
【０３６２】
多数のリンカーを試験した。以下に結果を要約する。
【化５】
2008531059.tif 000010
【０３６３】
長いフレキシブルなリンカーの構築
（ＳＧＧＧ）3（配列番号１６）リンカーコンストラクトｐＲＥＸ０２１６［ΔＬ  ＧＬＰ−１（７−３６）（ＳＧＧＧ）3ｍＴｆ］を、一緒にアニールするとＸｂａＩ／ＫｐｎＩオーバーハングが生じるようなプライマー：Ｐ０２８１、Ｐ０２８２、Ｐ０２８３およびＰ０２８を設計することによって作製した。
【化６】
2008531059.tif 000011
【０３６４】
１０×ＰＣＲ緩衝液（ＭｇＣｌ2非含有）１０μＬを含む試験管中で各プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）１０μＬを混合することによって、これらをアニールした。この反応を、６８℃で５分間、３７℃で１０分間、および２０℃で１０分間で行った。アニールした産物を洗浄し（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のゲル抽出キット、ＰＣＲプロトコール）、産物を、ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで消化したｐＲＥＸ００９５にクローニングし、ｐＲＥＸ０２１６を作出した。クローンのＤＮＡを配列解析して、インサートが正しいかどうかを調べた。正しいクローンを得て、発現カセットを、ＮｏｔＩ／ＳｃａＩ消化によって抽出し、ＮｏｔＩで消化しＳＡＰ処理したｐＳＡＣ３５にクローニングし、ｐＲＥＸ０２１７を作出した。クローンを、ＸｂａＩ／ＳａｌＩ消化を用いてＬＥＵ２遺伝子と同じ方向のインサートに関してスクリーニングした。バイオ・ラッド・ジーン・パルサー（ＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  Ｐｕｌｓｅｒ）を２ｍｍのキュベットで用いたエレクトロポレーションによって、ｐＲＥＸ０２１７ＤＮＡを、サッカロミセス・セレビジエ株（コントロール株）に形質転換し（ＷＯ０５０６１７１８を参照）、ＢＭＭ／Ｓプレート上で平板培養した。このコンストラクトの酵母ストックを作製した：Ｙ０１６０。フラスコ振盪培養によって、５２ｎｇ／ｍＬまで培養した（ＥＬＩＳＡより）。
【０３６５】
（ＳＧＧＧ）3リンカーコンストラクトｐＲＥＸ０２１７を発酵させたところ（Ｆ００７９）、０.２１８μｇ／ｍＬ（ＥＬＩＳＡにより）しか生産されなかった（表１）。しかしながら、活性は大いに改善され、ＥＣ50が、ＧＬＰ−１ペプチドが約０.６ｎＭであるのに対し、２.２７４ｎＭであった（ｃＡＭＰ０６０２０４−１）。
【０３６６】
ΔＬ  ＧＬＰ−１（７〜３６）ＧＬＰ−２リンカーｍＴｆコンストラクトｐＲＥＸ０２１３を、一緒にアニールすることができるリンカー：Ｐ０２７３、Ｐ０２７４、Ｐ０２７５、Ｐ０２７６、Ｐ０２７７、Ｐ０２７８、Ｐ０２７９およびＰ０２８０を設計することによって作製し、それらをｐＲＥＸ００９５にクローニングした。
【化７】
2008531059.tif 000012
【０３６７】
基本的に、これらのプライマーは、ＧＬＰ−２リンカーが結合したＧＬＰ−１を再利用して、１０×ＰＣＲ緩衝液（ＭｇＣｌ2非含有）１０μＬを含む試験管中で各プライマー（２０ｐｍｏｌ／μＬ）１０μＬを混合することによってアニールした。この反応を、６８℃で５分間、３７℃で１０分間、および２０℃で１０分間で行った。アニーリングを完了させるために、この反応液にＴ４ＤＮＡリガーゼ５μＬを添加し、室温で２時間インキュベートした。Ｐ０２７３およびＰ０２８０を外側のプライマーとして用いてＰＣＲ反応を構築し、アニールした産物を増幅させた。ＰＣＲ反応条件は以下の通り：９４℃で１分を１サイクル、９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、および７２℃で１分を２５サイクル、それに続いて、最後の伸長を７２℃で７分間。得られたＰＣＲ産物を、ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで消化し、ＸｂａＩ／ＫｐｎＩで消化したｐＲＥＸ００９５にクローニングし、ｐＲＥＸ０２１３を作出した。クローンの２つの制限部位の間のＤＮＡを配列解析し、配列が正しいことを調べた。正しいクローンが得られたら、発現カセットを、ＮｏｔＩ／ＳｃａＩ消化によって抽出し、ＮｏｔＩで消化しＳＡＰ処理したｐＳＡＣ３５にクローニングし、ｐＲＥＸ０２１４を作出した。クローンを、ＸｂａＩ／ＳａｌＩ消化を用いてＬＥＵ２遺伝子と同じ方向のインサートに関してスクリーニングした。バイオ・ラッド・ジーン・パルサーを２ｍｍのキュベットで用いたエレクトロポレーションによって、ｐＲＥＸ０２１４ＤＮＡを、サッカロミセス・セレビジエコントロール株に形質転換し（ＷＯ０５／０６１７１８）、ＢＭＭ／Ｓプレート上で平板培養した。コロニーを形成して、ＢＭＭ／Ｓ振盪フラスコ培養（３０℃，２００ｒｐｍ）で増殖させたところ、生産量が５ｎｇ／ｍＬであることが測定された（抗Ｔｆ−ＥＬＩＳＡにより）。このコンストラクトの酵母ストック（Ｙ０１７２）を作製した。
【０３６８】
ＧＬＰ−２リンカーコンストラクトｐＲＥＸ０２１４を発酵した（Ｆ００８０）。これらの生産量は９μｇ／ｍＬであった（表１）。（ＳＧＧＧ）3リンカーコンストラクトと同様に、活性が大いに改善され、ＥＣ50は５.９であった。
【表４】
2008531059.tif 000013
【０３６９】
短いフレキシブルなリンカーの構築
短いフレキシブルなリンカーＳ、ＳＳおよびＳＳＧを様々なコンストラクトで作製した。
【表５】
2008531059.tif 000014
【０３７０】
短いフレキシブルなリンカー変異体の構築を、オーバーラップするＰＣＲプライマーを設計することによって達成した。
【化８】
2008531059.tif 000015
【０３７１】
Ｐ００２５をリバース突然変異誘発プライマーと組み合わせて、Ｐ００１２をフォワード突然変異誘発プライマーと組み合わせて用いたＰＣＲの１ラウンドによって、上記リンカーをＧＬＰ−１変異体とｍＴｆとの間に挿入し、それに続いて、２ラウンドを行い、２つの１ラウンドの産物を、Ｐ００２５およびＰ００１２と結合させた。１ラウンドの反応条件は、９４℃で１分、５０℃で１分、および７２℃で１分を１５サイクル、それに続いて、最後の伸長７２℃で１０分間であった。２ラウンドの反応条件は、９４℃で１分を１サイクル、９４℃で３０秒、５５℃で３０秒、および７２℃で１分を２５サイクル、それに続いて、最後の伸長を７２℃で７分間であった。次に、ＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＡｆｌＩＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＲＥＸ００５２にクローニングした。クローンの制限部位の間のＤＮＡを配列解析し、正しい挿入を確認した。正しいクローンを選択し、発現カセットをＮｏｔＩ／ＰｖｕＩ消化によって抽出した。発現カセットをＮｏｔＩで消化しＳＡＰ処理したｐＳＡＣ３５にクローニングした。このクローンを、ＸｂａＩ／ＳａｌＩ消化を用いてＬＥＵ２遺伝子と同じ方向のインサートに関してスクリーニングした。バイオ・ラッド・ジーン・パルサーを２ｍｍのキュベットで用いたエレクトロポレーションによって、ＤＮＡを、Ｓ．セレビジエ株Ａに形質転換した（ＷＯ０５／０６１７１８）。このコンストラクトからストックを作製し、ＤＮＡ配列解析し、同一性を確認した。
【０３７２】
コンストラクトｐＲＥＸ０４５６と同様に、単一のＳリンカーにより、発酵槽（Ｆ０１４０）から３７μｇ／ｍＬが生産された。発酵槽からのＳＳリンカー（ｐＲＥＸ０５０７）、およびＳＳＧリンカー（ｐＲＥＸ０５０９）の生産力は、１２００μｇ／ｍＬ（Ｆ１５１および１５８）であり、それぞれ平均１３４６μｇ／ｍＬであった（Ｆ１４９、１５２、１５３および１５６）（表３）。生産力は優れていたが、活性はリンカーを有さないコンストラクト（ｐＲＥＸ０５０５Ｆ１５０、１６３、１６４、１６９、１７０）の活性とほぼ同じであった。
【表６】
2008531059.tif 000016
【０３７３】
リジッドなリンカーの構築
以下に、ＴｆのＮおよびＣローブを連結した配列をベースとして作製されたリジッドなリンカーコンストラクトを示す。
【表７】
2008531059.tif 000017
【０３７４】
ＰＥＡＰＴＤベースのリンカーの挿入に加えて、ＧＬＰ−１コンストラクトに２つの変更をさらに加えた。ＤＰＰ  ＩＶ耐性のためにＡ８Ｇ突然変異を組み込んだ。エキセンジン−４のようなＧＬＰ−１類似体の活性を高める可能性があるＧＬＰ−１のα−へリックス主鎖におけるキンクが生じる可能性を除去するために、Ｇ２２Ｅ突然変異を組み込んだ。
【０３７５】
これらの変異体を、２ラウンドのＰＣＲにおいて突然変異誘発ＰＣＲプライマーを用いることによって作製した。
【化９】
2008531059.tif 000018
【０３７６】
【化１０】
2008531059.tif 000019
【０３７７】
ＰＣＲの１ラウンドにおいて、フォワード突然変異誘発プライマーを、Ｐ００１２と組み合わせ、リバース突然変異誘発プライマーを、Ｐ００２５と組み合わせた。ＰＣＲの２ラウンドにおいて、２種の生成物を、Ｐ００２５およびＰ００１２と結合させた。１ラウンドの反応条件は、９４℃で１分、５０℃で１分、および７２℃で１分を１５サイクル、それに続いて、最後の伸長７２℃で１０分間であった。２ラウンドの反応条件は、９４℃で１分を１サイクル、９４℃で３０秒、５０℃で３０秒、および７２℃で１分を２５サイクル、それに続いて、最後の伸長を７２℃で７分間であった。次に、ＰＣＲ産物をＡｆｌＩＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＡｆｌＩＩ／ＢａｍＨＩで切断したｐＲＥＸ００５２にクローニングした。クローンの制限部位の間のＤＮＡを配列解析し、正しい挿入を確認した。正しいクローンを選択し、発現カセットをＮｏｔＩ／ＰｖｕＩ消化によって抽出した。この発現カセットを、ｐＳＡＣ３５にクローニングした。このクローンを、ＸｂａＩ／ＳａｌＩ消化を用いてＬＥＵ２遺伝子と同じ方向のインサートに関してスクリーニングした。バイオ・ラッド・ジーン・パルサーを２ｍｍのキュベットで用いたエレクトロポレーションによって、ＤＮＡを、Ｓ．セレビジエ株Ａに形質転換した（ＷＯ０５／０６１７１８を参照）。このコンストラクトからストックを作製し、ＤＮＡ配列解析し、同一性を確認した。
【表８】
2008531059.tif 000020
【０３７８】
ＰＥＡまたはＰＥＡＰＴＤベースのリンカーコンストラクトを用いた発酵はいずれも、約１ｇ／Ｌ（ＥＬＩＳＡにより）の優れた生産力を示した（表６）。ＰＥＡリンカーコンストラクト、ｐＲＥＸ０５１８は、３７５ｎＭの効力を有しており、これは、リンカーを含まないコンストラクト（ｐＲＥＸ０５０５−２１６２ｎＭ）よりも数倍低い。（ＰＥＡＰＴＤ）2リンカーは、効力と生産力を高めた。Ａ８Ｇと（ＰＥＡＰＴＤ）2との組み合わせは、ｃＡＭＰ分析においてＧＬＰ−１ペプチドの生産力と効力に最も近い、最高の生産力と効力との組み合わせが生じる。
【０３７９】
単一のＰＥＡＰＴＤリンカーを含む変異体を作製し、発酵させた。２種のコンストラクト変異体を用いて（ＰＥＡＰＴＤ）2リンカーを作製した。その一方（ｐＲＥＸ０５８５）を発酵させたところ、１９００μｇ／ｍＬの生産力（ＥＬＩＳＡにより）と、３ｎＭの効力（表６）を得た。
【表９】
2008531059.tif 000021
【０３８０】
ＩｇＧヒンジおよびエキセンジン−４リンカーの構築
二段階工程のＰＣＲプロトコールを用いて、表７に記載のプライマーでｐＲＥＸ０５５６〜ｐＲＥＸ０５５９を産生した。
【表１０】
2008531059.tif 000022
【０３８１】
ｐＲＥＸ０５５６は、ＩｇＧヒンジリンカー（ＶＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ）でトランスフェリンのＮ末端に融合したＧＬＰ−１（７〜３７；Ａ８Ｇ；Ｇ２２Ｅ；Ｋ３４Ａ）を含む。第一の工程において、プライマーＰ０７２３およびＰ０６７６を用いてｐＲＥＸ０５５５から５’セグメントを増幅し、Ｐ０６７７、Ｐ０７２４およびＰ０７４５を用いてｐＲＥＸ０５２３から３’セグメントを増幅した。Ｐ０６７７は比較的長いプライマー（８７ｂｐ）であるため、増幅効率を改善するために、それより短いプライマーＰ０７４５を含めた。反応条件は、９４℃で１分間、９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、および７２℃で１分を１５サイクル、それに続いて、７２℃で７分の伸長であった。５’および３’セグメントを、上記の条件を１８サイクルで用いてＰ０７２３およびＰ０７２４を用いた増幅によって連結させた。４種全てのコンストラクトに同じＰＣＲ条件を用いた。産物をＡｆｌＩＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｐＲＥＸ０５４９のＡｆｌＩＩ／ＢａｍＨＩ部位にクローニングし、配列解析した。ＧＬＰ−１トランスフェリン融合体の発現カセットを、ｐＲＥＸ０５４９からＮｏｔＩ／ＰｖｕＩ消化で切り出し、ｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ＤＮＡ配列解析した。
【０３８２】
ｐＲＥＸ０５５７は、エキセンジン−４のＣ末端（ＣＥｘ，ＳＳＧＡＰＰＰＳ）およびリンカーとしてＩｇＧヒンジでトランスフェリンのＮ末端に融合したＧＬＰ−１（７〜３７；Ａ８Ｇ；Ｇ２２Ｅ；Ｋ３４Ａ）を含む。第一の工程において、５’セグメントを、プライマーＰ０７２３およびＰ０６７８を用いてｐＲＥＸ０５５５から増幅し、３’セグメントを、Ｐ０６７９、Ｐ０７２４およびＰ０７４５を用いてｐＲＥＸ０５２３から増幅した。５’および３’セグメントを、Ｐ０７２３およびＰ０７２４を用いた増幅によって連結させた。産物を、ｐＣＲ２．１にクローニングし、ＤＮＡ配列解析し、次に、ＡｆｌＩＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｐＲＥＸ０５４９にクローニングした。ＧＬＰ−１トランスフェリン融合体の発現カセットを、ＮｏｔＩ／ＰｖｕＩ消化でｐＲＥＸ０５４９から切り出し、ｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ＤＮＡ配列解析した。
【０３８３】
ｐＲＥＸ０５５８は、ＰＥＡＰＴＤおよびＩｇＧヒンジリンカーでトランスフェリンのＮ末端に融合したＧＬＰ−１（７〜３７；Ａ８Ｇ；Ｇ２２Ｅ；Ｋ３４Ａ）を含む。第一の工程において、５’セグメントを、プライマーＰ０７２３およびＰ０６８０を用いてｐＲＥＸ０５５５から増幅し、３’セグメントを、Ｐ０６８１、Ｐ０７２４およびＰ０７４５を用いてｐＲＥＸ０５２３から増幅した。５’および３’セグメントを、Ｐ０７２３およびＰ０７２４で増幅することによって連結した。産物を、ｐＣＲ２．１にクローニングし、ＤＮＡ配列解析し、ＡｆｌＩＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｐＲＥＸ０５４９にクローニングした。ＧＬＰ−１トランスフェリンの発現カセットを、ＮｏｔＩ／ＰｖｕＩ消化によってｐＲＥＸ０５４９から切り出し、ｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ＤＮＡ配列解析した。
【０３８４】
ｐＲＥＸ０５５９は、ＣＥｘリンカーでトランスフェリンのＮ末端に融合したＧＬＰ−１（７〜３７；Ａ８Ｇ；Ｇ２２Ｅ；Ｋ３４Ａ）を含む。第一の工程において、５’セグメントを、プライマーＰ０７２３およびＰ０７１９を用いてｐＲＥＸ０５５５から増幅し、３’セグメントを、Ｐ０７２０およびＰ０７２４を用いてｐＲＥＸ０５２３から増幅した。５’および３’セグメントを、Ｐ０７２３およびＰ０７２４で増幅することによって連結した。産物をＡｆｌＩＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ｐＲＥＸ０５４９にクローニングし、配列解析した。ＧＬＰ−１トランスフェリンの発現カセットを、ＮｏｔＩ／ＰｖｕＩ消化によってｐＲＥＸ０５４９から切り出し、ｐＳＡＣ３５のＮｏｔＩ部位にクローニングし、ＤＮＡ配列解析した。
【０３８５】
バイオ・ラッド・ジーン・パルサーを２ｍｍのキュベットで用いたエレクトロポレーションによって、コンストラクトを、サッカロミセス・セレビジエ株Ａに形質転換し（ＷＯ０５／０６１７１８を参照）、ＢＭＭ／Ｓ培地上で平板培養した。形質転換株をＢＭＭ／Ｓで４日増殖させ、次に、抗トランスフェリンポリクローナル血清（カルバイオケムカタログ番号６１６４２３）を含むＢＭＭ／Ｓ  プレート上に適用した。４日後、４種全てのコンストラクトについて、沈殿した抗体／トランスフェリン複合体の輪を可視化した。また、形質転換されたクローンもＢＭＭ／Ｓプレート上に筋状に塗布して、単一のコロニーを分離した。ＢＭＭ／Ｓ振盪フラスコ培養物をそのパッチから接種し、３０℃で３日間増殖させ、分泌されたトランスフェリン融合タンパク質を定量化するためにＥＬＩＳＡで分析した。全てのコンストラクトにおいて、ＩｇＧリンカーを付加すると振盪フラスコ中での生産力が増加し（表８）、ＰＥＡＰＴＤ  ＩｇＧリンカー（ｐＲＥＸ０５５８）では最大の生産力が観察された。このコンストラクトは、ＧＬＰ−１トランスフェリンにおいて、リンカーを含まないコンストラクト（ｐＲＥＸ０５０５）に比べて約７倍の増加を示した。ＣＥｘリンカーを単独で付加したところ（ｐＲＥＸ０５５９）、あまり生産力は増加しなかった（表８）。
【表１１】
2008531059.tif 000023
【０３８６】
コンストラクトｐＲＥＸ０５５６〜５５９（それぞれＹ０３８９、Ｙ０３８４、Ｙ０３８５およびＹ０３８０）について単一の細胞のストックを作製し、ＤＮＡ配列解析し、同一性を確認した。ＩｇＧコンストラクト（ｐＲＥＸ０５５６）について２種の発酵（Ｆ０１８７およびＦ０１９０）を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで濃度測定したところ、推定の収量は６７９および７１９μｇ／ｍＬであった。ＰＥＡＰＴＤ  ＩｇＧコンストラクト（ｐＲＥＸ０５５８）の発酵Ｆ０１９１では、濃度測定により９６０μｇ／ｍＬの収量が得られた。ＧＬＰ−１融合体の効力を、ｃＡＭＰ分析によって決定した。Ｆ０１８７およびＦ０１９０（ＩｇＧ）のＥＣ50値は、６.６ｎＭおよび８.６ｎＭであり、Ｆ０１９１（ＰＥＡＰＴＤ  ＩｇＧ）のＥＣ50は、５.９ｎＭであった。
【０３８７】
ＥＬＩＳＡデータ
以下の表９に、ＧＬＰ−１および様々なリンカーを含むコンストラクトを用いて得られたＥＬＩＳＡデータをまとめる。
【表１２】
2008531059.tif 000024
【０３８８】
結論
１．長いフレキシブルなリンカー、（ＳＧＧＧ）3およびＧＬＰ−２は生産力が低かったが、ＧＬＰ−２リンカーは極めて強力である。
２．短いフレキシブルなリンカー、Ｓ、ＳＳおよびＳＳＧは、効力で改善を示さなかったが、Ｓリンカーは生産力で劇的に低下したのに対して、ＳＳおよびＳＳＧリンカーは生産力のレベルを維持した。
３．実質的にらせん状ではないリンカーは、最も有利な結果を示した。ＰＥおよびＰＥＡリンカーは生産力または効力のいずれに関しても効果を示さなかったが、ＰＥＡＰＴＤリンカー、および特に二重のリンカー、（ＰＥＡＰＴＤ）2は、生産力を改善し、天然型のＧＬＰ−１ペプチドの約５〜１０倍の範囲内で効力をもたらした。効力に関して３または４回反復の効果を試験していないが、生産力で逆の結果を示すことはなかった。
４．ＩｇＧリンカーは、特にＰＥＡＰＴＤリンカーと組み合わせると、生産力に有意な改善をもたらした。また、インビトロで、Ｇ２２Ｅ突然変異と同等の天然型のＧＬＰ−１ペプチドの効力に近い融合体の効力をもたらすことも見出された。
５．コンストラクトｐＲＥＸ０５８５  ｎＬ  ＧＬＰ−１（７〜３７；Ａ８Ｇ；Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）2ｍＴｆは、天然の配列との差が最も少ないが、効力において最大の改善を示した。
【０３８９】
実施例３：ＧＬＰ−１類似体／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質の薬物動態学
この実施例において、ＧＬＰ−１類似体／リンカー／ｍＴｆ融合タンパク質を作製し、その薬物動態学を解析した。
本発明は、リンカーを介してｍＴｆに融合したＧＬＰ−１類似体を含む融合タンパク質を提供する。一実施態様において、ＧＬＰ−１（７〜３７）類似体は、位置８および３４（これは、配列番号６のアミノ酸２および２８に相当する）にアミノ酸置換を含む。例えば、ＧＬＰ−１（７〜３７）類似体は、位置８においてアラニンのグリシンへの置換および３４位においてリシンのアラニンへの置換を含む。これにより、ジペプチジルペプチダーゼＩＶによる切断が防止され（位置８の残基での置換）、第二の酵素による切断が防止されている（３４位の残基での置換）。
【化１１】
2008531059.tif 000025
【０３９０】
ＧＬＰ−１（７〜３７；Ａ８Ｇ，Ｋ３４Ａ）は、融合タンパク質の生産力を高めるための（ＰＥＡＰＴＤ）2のようなリンカーを介してｍＴｆに融合している。ＧＬＰ−１（７〜３７；Ａ８Ｇ，Ｋ３４Ａ）のアミノ末端は、ｎＬリーダー配列に融合している。
【化１２】
2008531059.tif 000026
【０３９１】
融合タンパク質ｎＬ  ＧＬＰ−１（７〜３７；Ａ８Ｇ，Ｋ３４Ａ）（ＰＥＡＰＴＤ）2ｍＴｆの完全な核酸およびアミノ酸配列（プラスミドｐＲＥＸ０５８４およびｐＲＥＸ０５８５を参照）を以下に示す（配列番号６５および６６）。
【化１３】
2008531059.tif 000027
【０３９２】
【化１４】
2008531059.tif 000028
【０３９３】
【化１５】
2008531059.tif 000029
【０３９４】
【化１６】
2008531059.tif 000030
【０３９５】
ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ，Ｋ３４Ａ）−ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ−ｍＴｆの薬物動態学
１グループあたり２匹のカニクイザルに、Ａ280により測定して２２５０μｇ／ｋｇのＧＬＰ−１−Ｔｆ融合タンパク質を皮下注射または静脈注射した。用いられた融合タンパク質は、ＧＬＰ−１（Ａ８Ｇ，Ｋ３４Ａ）−ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ−ｍＴｆであった。血漿サンプルの分析は、ＧＬＰ−１−Ｔｆに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、融合タンパク質を捕捉するためのＧＬＰ−１に対するモノクローナル抗体、および結合したタンパク質を検出するためのＴｆに対するポリクローナル抗体を用いて行われた。プレートをウサギ抗マウスＦａｂ（１μｇ／ウェル）でコーティングし、次に洗浄し、ＰＢＳ中の１％ＢＳＡでブロックした。その後、キャプチャー抗体としてマウス抗ＧＬＰ−１ＭＡｂを添加した。次に、このプレートを洗浄し、スタンダードカーブまたはＰＢＳ中の１％ＢＳＡで希釈したサンプルをプレートに添加した。インキュベート後、プレートを洗浄し、検出抗体としてビオチン化抗ヒトトランスフェリン抗体を添加した。各工程の間に洗浄するとともに、ＨＲＰ−ストレプトアビジンと蛍光性基質で結合した抗体を検出した。
【０３９６】
生物検定のために、サンプルを、ラットＧＬＰ−１受容体でトランスフェクションされたＣＨＯ細胞とインキュベートした。ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）は膜結合型Ｇタンパク質共役受容体であり、リガンドと結合すると、アデニリルシクラーゼが活性化され、細胞内ｃＡＭＰの濃度依存性の上昇が起こる。血漿中でＧＬＰ−１−Ｔｆに応答して細胞によって生産されたｃＡＭＰを、ｃＡＭＰ  ＥＬＩＳＡで測定した。サンプルによって生産されたｃＡＭＰを、既知の濃度のＧＬＰ−１−Ｔｆによって生産されたｃＡＭＰと比較した。ＰＫサミット（ＰＫ  Ｓｕｍｍｉｔ）ソフトウェアを用いてＰＫ解析を行った。
【０３９７】
図６に結果を示す。これらの研究におけるターミナル半減期は約３０時間と計算された。これは、ヒトにおいてＧＬＰ−１ペプチドの半減期が約９０秒であることに匹敵する。加えて、皮下または静脈経路についての濃度曲線下面積の比較から、皮下経路を介した高い生物学的利用率が示される。
【０３９８】
実施例４：糖尿病治療および体重減少のためのＢＲＸ０５８５の構築および使用
酵母におけるＢＲＸ０５８５の発現
ＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤリンカーペプチド（配列番号１０）を介して非グリコシル化ヒトトランスフェリンのＮ末端に結合したＧＬＰ−１（７〜３７）をコードする発現カセットを作出した。注目すべきことに、ＰＥＡＰＴＤ（配列番号１３）、ＩｇＧヒンジリンカー（配列番号８８、８９、および１１７）、ＩｇＧヒンジリンカーおよびＰＥＡＰＴＤ（配列番号１１８〜１２３）、ならびにＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤＰＥＡＰＴＤ（配列番号１４）のような代替の実質的にらせん状ではないリンカーも使用可能であった。
【０３９９】
このカセットは、ＤＰＰ−ＩＶのＧＬＰ−１部分に対する作用を防止するために、ＧＬＰ−１部分の二番目のアミノ酸が置換されるように設計された。トランスフェリン配列は、２つのＮ結合グリコシル化部位が除去されるように改変した。このカセットを、高コピー数プラスミドでクローニングし（図７；配列番号１１を参照）、サッカロミセス・セレビジエで高値で発現された。同様に、２つのＮ結合グリコシル化部位を除去するために用いた同じ改変を有するトランスフェリン配列を高コピー数プラスミドにクローニングし、Ｓ．セレビジエで発現させた。数種のクロマトグラフィー工程を用いて、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＳＥ−ＨＰＬＣで測定して純度が９９.９％より大きくなるまでタンパク質を精製し、Ｎ末端を配列解析した。得られたＴｆおよびＧＬＰ−１融合タンパク質は、配列番号１２のの配列に相当する。この実施例において、この配列番号１２の融合体ペプチドを、ＢＲＸ０５８５およびＧＬＰ−１−Ｔｆと同じ意味でいう。
【０４００】
ＧＬＰ−１−Ｔｆは、インビトロでＧＬＰ−１受容体を活性化した
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を、ＧＬＰ−１受容体で安定してトランスフェクションし（ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞）、前述のように（Ｍｏｎｔｒｏｓｅ−Ｒａｆｉｚａｄｅｈ等，１９９７，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２１２０１〜２１２０６）、５％ＣＯ2、３７℃で、ハムＦ−１２培地（セルグロ（Ｃｅｌｌｇｒｏ））中で培養した。ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞をクレブス−リンゲル緩衝液（ＫＲＢ，セルグロ）でリンスし、３７℃で１時間インキュベートし、内因性の細胞内ｃＡＭＰレベルを低下させた。それに続いて、これを４ｍＭのＩＢＭＸ（シグマ）を含むＫＲＢ中で短時間インキュベートし、ｃＡＭＰを分解する細胞内ホスホジエステラーゼを阻害した。セルの３連ウェルを、ＧＬＰ−１−Ｔｆ、ＧＬＰ−１（７〜３７）またはエキセンジン−４（後者の２つはベイケム（Ｂａｃｈｅｍ）製）の連続希釈液で３７℃で６０分間処理した。その後上清を除去し、０.１ＮのＨＣｌ中に細胞を溶解させた。細胞溶解産物を競合ベースの化学発光酵素免疫検査法（アッセイ・デザインズ社（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｉｎｃ．））を用いて分析して、細胞内ｃＡＭＰ濃度を測定した。
【０４０１】
ＧＬＰ−１受容体（ＧＬＰ−１Ｒ）は、膜結合型Ｇタンパク質共役受容体であり、リガンドと結合すると、アデニリルシクラーゼが活性化され、細胞内ｃＡＭＰの濃度依存性の上昇が起こる。ＧＬＰ−１−Ｔｆは、ＧＬＰ−１ＲでトランスフェクションされたＣＨＯ細胞（ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ）においてアデニリルシクラーゼを活性化することが見出された。それにより、細胞内ｃＡＭＰレベルの用量依存性の増加が起こり、活性は減少するが、効力は、天然型のＧＬＰ−１およびエキセンジン−４と比較して同様であった（ＥＣ50：ＧＬＰ−１−Ｔｆ、ＧＬＰ−１、エキセンジン−４それぞれにおいて、２.２８、０.１６および０.０５ｎＭ）（図８ａ）。
【０４０２】
ラットインスリノーマ細胞系、ＲＩＮ１０４６−３８細胞を、Ｓａｍｕｅｌ  Ａ．Ｃｌａｒｋ博士から入手し、前述されているように（Ｗａｎｇ等，２００１，Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，１４２：１８２０〜１８２７）、５％ＣＯ2、３７℃で、Ｍ１９９培地（セルグロ）中で培養した。１２ウェルプレートで増殖させ、５０〜６０％の集密度に達したＲＩＮ１０４６−３８細胞を、グルコース非含有インスリン分泌緩衝液（Ｂｉｏｆｌｕｉｄｓ）で洗浄し、細胞を、ＧＬＰ−１、およびＧＬＰ−１−Ｔｆの連続希釈液で３７℃で１時間インキュベートした。また、実験の１セットにエキセンジン−９〜３９（１μｍｏｌ／ｌ：ベイケム（Ｂａｃｈｅｍ））、ＧＬＰ−１Ｒの阻害剤も一晩添加した。次に、上清を捕集し、ＥＬＩＳＡ（クリスタル・ケム（Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｃｈｅｍ））によりインスリン含量を測定するために−８０℃で保存した。細胞を溶解させ、ブラッドフォード法を用いてタンパク質含量を定量した。
【０４０３】
我々が上述したように（ただしいくつかの変更を含む）（Ｗａｎｇ等，１９９７，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９９：２８８３〜２８８９）、スプラーグ−ドーリーラットから膵島を分離した。簡単に言えば、膵臓をＸＩ型コラゲナーゼ（シグマ）で消化し、フィコール・パックの濃度勾配（アマシャム・バイオサイエンス（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））によって膵島を分離した。分離した膵島を、０.２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ，シグマ）を含むハンクス平衡塩溶液（バイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ））を用いて数回洗浄し、手動でピックアップし、５％ＣＯ2、３７℃で、５ｍＭグルコースが補足されたＭ１９９培地中で一晩培養した。次に、ラット膵島を、上述のようにＲＩＮ細胞に同様に処理した（ウェルあたり３０〜４０個）。
【０４０４】
ＧＬＰ−１−Ｔｆは、ラットのインスリノーマ細胞と、分離したラット膵島の両方において、濃度依存性の様式でインスリン分泌を刺激することがわかった（図８ｂおよびｃ）。
【０４０５】
体液中のＧＬＰ−１−Ｔｆの測定
雄カニクイザル（Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ）（Ｎ＝４）に、ＧＬＰ−１−Ｔｆ（２.２５ｍｇ／ｋｇ）の静脈内（ＩＶ）および皮下（ＳＣ）ボーラスを投与し、図８ｄに指定した時間で血液を採取した。血液を遠心分離し、ＧＬＰ−１−Ｔｆ分析のために血清を−８０℃で保存した。全ての動物実験は、ＮＩＡの動物管理使用委員会（Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ＆Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）に従って認可されたプロトコールで行われた。
【０４０６】
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、体液中のＧＬＰ−１−Ｔｆの濃度を測定した。この分析のために、抗ＧＬＰ−１モノクローナル抗体（アンチボディ・ショップ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｈｏｐ））２００ｎｇを、抗マウスＩｇＧでコーティングされたマイクロタイタープレートに固定した。洗浄後、サンプルまたは標準をプレートに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。次にプレートを洗浄し、ビオチン化ニワトリ抗ヒトトランスフェリン抗体（フィッツジェラルド・ラボラトリーズ（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））とインキュベートした。洗浄を繰り返し、プレートを、ホースラディッシュ−ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）−ストレプトアビジンとインキュベートした。プレートを再度洗浄し、結合したＨＲＰを、ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）のＱｕａｎｔａ  Ｂｌｕ発蛍光基質を用いて測定した。測定は、スペクトラマックス・ジェミニ（Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｇｅｍｎｉ）蛍光プレートリーダーおよびソフトマックス・プロ（Ｓｏｆｔｍａｘ  Ｐｒｏ）ソフトウェアを用いて行われた。全ての工程で用いられた緩衝液は、１％ＢＳＡおよび０.０５％トゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０）を含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）であった。
【０４０７】
両方の投与経路で処理した後の、血清中のＧＬＰ−１−Ｔｆの半減期（ｔ1/2）は、約４４時間であり、皮下と静脈内プロファイルとを比較したところ、実質的に１００％の生物学的利用率が示された（図８ｄ）。さらに、ＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒを、その注射を受けたサル由来の血清で処理することによって、ＥＬＩＳＡによって測定されたＧＬＰ−１−Ｔｆは生物学的に活性であり、ＥＬＩＳＡにおいて、経時的に上記血清に反応して蓄積された細胞内ｃＡＭＰ崩壊の傾きは、ＧＬＰ−１−Ｔｆの傾きに類似していた（データ示さず）ことが見出された。
【０４０８】
非糖尿病および糖尿病マウスにおけるグルコースホメオスタシスと血漿インスリンの測定
機能するレプチン受容体が欠失した雄の糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ−Ｌｅｐｒdb／Ｌｅｐｒdb）、およびそれらの非糖尿病の異型接合の同腹子を、ジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（バーハーバー）から４週齢で購入した。それらを１ケージあたり２匹で飼育し、どのような試験の前でも少なくとも５日間は自由に摂食させた。実験期間中、同じマウスを一緒にケージに入れた。
【０４０９】
糖尿病のｄｂ／ｄｂマウスは、突然変異した機能しないレプチン受容体に関してホモ接合型であり、その結果としてそれらは、多食症に罹っており、１日２４時間ずっと（暗時間の間通常より摂食するというのではなく）食事をし、肥満になり、４〜６週齢までには、３００〜４００ｍｇ／ｄｌの範囲の高い血糖値を有する（正常な空腹時血糖値は、９０〜１２０ｍｇ／ｄｌである）。それらの異型接合の同腹子（非糖尿病マウス）は過食ではなく、痩せており、糖尿病を発症しない。
【０４１０】
非糖尿病マウスを一晩絶食した後に、腹腔内（ＩＰ）グルコース負荷試験（ＩＰＧＴＴ）（０.５ｇ／ｋｇ体重）を行った。グルコース注射の３０分前に、ＴｆおよびＧＬＰ−１−Ｔｆを、腹腔内投与した。０および３０および６０分で血糖値（グルコメーター・エリート（Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ），バイエル（Ｂａｙｅｒ））を測定し、さらに、ＩＰＧＴＴ後の０および３０分における血漿インスリンレベルを測定した。
【０４１１】
非糖尿病マウスにおいて、１および１０ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１−ＴｆをＩＰ投与すると、インスリン分泌が増強された。３０分の時点で、高いインスリンレベルと同時にピーク血糖が減少した（図９ａ）。
【０４１２】
ＴｆおよびＧＬＰ−１−Ｔｆを、非糖尿病および糖尿病マウスに皮下投与し、４８時間、持続性の作用に関して血糖を頻繁にチェックした。１時間と４時間で血漿インスリンレベルを測定した。また、絶食の開始時にＧＬＰ−１−ＴｆまたはＴｆが皮下投与された糖尿病マウスを一晩１２時間絶食した後に、ＩＰＧＴＴ（０.５ｇ／ｋｇ体重）も行った。
【０４１３】
自由に摂食させた非糖尿病マウスにおいて、ＧＬＰ−１−Ｔｆの皮下投与によって、血中グルコース濃度は用量依存的に減少し、インスリン分泌は増加した（図９ｂ）。投与の３時間以内に血糖値は７０ｍｇ／ｄｌまで落ち、２４時間以内に徐々に投与前のレベルに上がった。ＧＬＰ−１−Ｔｆをさらに多い用量（１０ｍｇ／ｋｇ）で投与すると、低い血糖は３６時間まで持続した。
【０４１４】
自由に摂食させた糖尿病マウスにおいて、ＧＬＰ−１−Ｔｆの皮下投与（１および１０ｍｇ／ｋｇの両方）によって、血糖値が正常なレベルまで低下し（３５８±２３から１１５±１８ｍｇ／ｄｌへ）、その作用は、注射の１時間後という早い時期に始まった（図１０ａ）。ＧＬＰ−１−Ｔｆを１および１０ｍｇ／ｋｇで投与後いずれも、増加した血漿インスリンレベルは少なくとも４時間まで持続した（図１０ｂ）。最大用量では、低血糖を引き起こすことなく血糖への作用を少なくとも１２時間持続させた。ＧＬＰ−１−Ｔｆの低い用量（０.１ｍｇ／ｋｇ）では、投与後１時間で血漿インスリンレベルが増加するが、それに付随して、投与後の４時間急性で非持続型の血糖低下作用が起こる（図１０ａおよびｂ）。
【０４１５】
糖尿病マウスグループに、ＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆを９ｐｍで皮下投与し、一晩絶食し、翌朝ＩＰＧＴＴを行った。絶食したＴｆ処置動物は、自由に摂食させた動物よりも低い空腹時血糖を示し（３５８±２３ｍｇ／ｄｌに対して、２３８±３９；図１０ｃの絶食した動物の０時間と、図１０ａの摂食させた動物の０時間とを比較した）、さらに、ＧＬＰ−１−Ｔｆを１または１０ｍｇ投与された動物は、Ｔｆを単独で投与された動物よりも低い空腹時血糖を有していた（１３２±２７ｍｇ／ｄｌ）。ＩＰＧＴＴ後、ＧＬＰ−１−Ｔｆを投与された動物は、ｈＴｆで処置した動物よりも低い血糖値と高い血漿インスリンレベルを有していた（図１０ｃおよびｄ）。
【０４１６】
非糖尿病およびｄｂ／ｄｂマウスにおけるＢＲＸ０５８５投与後の食物摂取と血糖測定
機能するレプチン受容体が欠失した雄の糖尿病のｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ−Ｌｅｐｒdb／Ｌｅｐｒdb）、およびそれらの非糖尿病の異型接合の同腹子を、ジャクソン・ラボラトリーズ（バーハーバー）から４週齢で購入した。
【０４１７】
マウス（Ｎ＝５／グループ）に、５日間１日１回給餌して（午前中９〜１０時）調整した。６日目の朝にそれらに、Ｔｆ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＧＬＰ−１−ＴＦ（０.１、１および１０ｍｇ／ｋｇ）、またはエキセンジン−４（１ｎｍｏｌ／ｋｇ）を腹腔内投与し、続いて自由に摂食させた。ペプチド投与の２、４、７および２４時間後に、食物摂取および血糖値を測定した。
【０４１８】
ｄｂ／ｄｂマウス（９９±９ｍｇ／ｄｌ）は、５日間中ずっと正常な空腹時血糖値を維持し、そのレベルは非糖尿病の動物と類似していた（８７±２ｍｇ／ｄｌ）（図１１ｃの０時間，図１１ａの０時間と比較して）。摂食時間中に、両方の動物群は餌ペレット約０.５グラムを食べた。６日目の朝に２匹の犠牲にし、胃または小腸に食物は存在しなかった。残りの動物に、餌を自由に摂取させる前に、ＧＬＰ−１−Ｔｆ（０.１、１および１０ｍｇ／ｋｇ）、Ｔｆ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはエキセンジン−４（１ｎｍｏｌ／ｋｇ，糖尿病マウスにのみ）を投与した。食物摂取を定量し、血糖値（食後のグルコース上昇を測定するために）を次の２４時間インターバルを置いて測定した。非糖尿病動物において、ＧＬＰ−１−Ｔｆ（１０ｍｇ／ｋｇ）では７時間までに、ＧＬＰ−１−Ｔｆ（１ｍｇ／ｋｇ）では２時間で食物摂取が約半分に減少し、Ｔｆのみを投与された動物と比較すると、３種全ての用量で食後の血糖値は濃度依存的に低くなり（図１１ａおよびｂ）、これは、食物摂取の減少とインスリン分泌の増加の両方を反映している（図１０ｂを参照）。注射後７〜２４時間の時間セグメントでは、ＧＬＰ−１−Ｔｆで処置した動物は、Ｔｆで処置した動物と類似した食物摂取を示した。また、ｄｂ／ｄｂ動物では、ＧＬＰ−１−Ｔｆ（１および１０ｍｇ／ｋｇ）を用いた場合、２時間で食物摂取は約半分に減少し、Ｔｆ処置と比較すると、３種全ての用量でやはり濃度依存的に食後の血糖値を低下させた。エキセンジン−４は、実質的に測定可能なあらゆる餌料消費を７時間妨げ、その後の１７時間食物摂取の減少を起こした。
【０４１９】
β−細胞増殖およびβ−細胞質量の分析
機能するレプチン受容体が欠失した雄の糖尿病ｄｂ／ｄｂマウス（Ｃ５７ＢＬＫＳ／Ｊ−Ｌｅｐｒdb／Ｌｅｐｒdb）を、ジャクソン・ラボラトリーズ（バーハーバー）から４週齢で購入した。これらをケージあたり２匹で飼育し、あらゆる試験前の少なくとも５日間は自由に摂食させた。実験期間中、同じマウスを一緒にケージに入れた。
【０４２０】
ｄｂ／ｄｂマウス（タイムポイントあたり６匹）に、Ｔｆ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはＧＬＰ−１−Ｔｆ（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内注射を１回投与し、１、２および３日後に、β−細胞増殖の測定のために犠牲にし、３、５、８および１０日後に、膵島質量の測定のために犠牲にした。犠牲にする６時間前に、６０ｍｇ／ｋｇの５−ブロモ−２−デオキシウリジン（ＢｒｄＵ，シグマ）を腹腔内注射した。ＢｒｄＵは、細胞の有糸分裂のＳ期中に取り込まれるチミジン類似体である。膵臓を取り出し、４％緩衝ホルマリン中で一晩固定し、パラフィンに包埋処理し、組織切片（４μｍ）をポリ−ｌ−リシンでコーティングしたスライドガラスにマウントした。ＢｒｄＵを、ＢｒｄＵ抗体（シグマ，１：５００，さらにＺｙｍｅｄ抗体，１：２５０でも確認した）とＢｒｄＵ染色キット（ザイムド・ラボラトリーズ社（Ｚｙｍｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ））で検出した。次に、各条件より５〜６００個の膵島を可視化し、ＢｒｄＵ＋細胞を含む膵島の数、加えて膵島細胞の総数あたりのＢｒｄＵ＋核のパーセントを定量した。インスリン染色とβ−細胞の質量の決定のために、組織切片を、モルモットインスリン抗体（リンコ（Ｌｉｎｃｏ））で処理した。抗体結合を３，３−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）で可視化し、切片を、ヘマトキシリン（ベクタステイン（Ｖｅｃｔａｓｔａｉｎ）ＡＢＣキット，ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ヤギ抗モルモットＩｇＧを使用）で対比染色した。イメージングソフトウェアを備えたコンピューターに連結されたビデオカメラを用いて、この切片を試験した。位相差光学顕微鏡（カール・ツァイス（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ））の２.５×の対物レンズによって切片化された組織画像を得て、ソニー（Ｓｏｎｙ）のパワーＨＡＤデジタルカメラによってデジタル化した（切片１つあたり平均２０〜３０枚の画像）。メタモルフ（ＭｅｔａＭｏｒｐｈ）４.６．３ソフトウェア（ユニバーサル・イメージング社（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｉｎｃ．），ウェストチェスター）を用いて、画像毎に全ての膵臓領域およびβ細胞陽性領域を定量した。
【０４２１】
ＧＬＰ−１−Ｔｆで処置した動物は、Ｔｆのみでの処置と比較して、ＧＬＰ−１−Ｔｆ注射の後２４時間もの早い時期に膵島におけるＢｒｄＵ＋核の数の明らかな増加を示した。活性処置後の３日目に、ＢｒｄＵ＋核は４.７倍の増加（ｐ＜０.０１）（図１２ａ）を示し、ＧＬＰ−１−Ｔｆ処置動物における全ての膵島が１またはそれを超えるＢｒｄＵ＋核を示し、それに対して、ｈＴｆで処置した動物の膵島は３５％（４００のうち１４０）であった。ＧＬＰ−１−Ｔｆで処置した動物において、５０％もの膵島細胞核においてＢｒｄＵ＋核が観察される膵島が生じることもあった（図１２ｂ）。ＢｒｄＵ＋核は主としてインスリンを含むβ細胞中に存在していた（図１２ｂ）。ＧＬＰ−１−Ｔｆ（１０ｍｇ／ｋｇ）を用いた処置の３日後には、β細胞の総質量はＴｆ処置と比較して１.７倍増加し、５、８および１０日目にはβ細胞の総質量はさらにそれぞれ２.２、４.１および４.３倍増加した（図１２ｃ）。免疫蛍光法と共焦点顕微鏡法を用いて、本発明者らは、Ｔｆ処置およびＧＬＰ−１−Ｔｆ処置したマウスから採取しておいた固定した膵臓からの膵島において、２４時間までにＧＬＰ−１−Ｔｆの存在を検出することができた（図１４）。
【０４２２】
ｈＴｆおよびＧＬＰ−１−Ｔｆの髄液（ＣＳＦ）におけるレベルの測定
雄スプラーグ・ドーリーラットを、ハーラン・スプラーグ・ドーリー（Ｈａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ，インディアナポリス）から６週齢で購入した。ラットに、ｈＴｆおよびＧＬＰ−１−Ｔｆを腹腔内注射した。血漿、ＣＳＦおよび脳中のタンパク質の存在を分析するために２および２４時間後に動物を犠牲にした。環椎と軸椎との間に取り付けた注射器と共に３０ゲージの注射針を挿入することによってＣＳＦを採取し、ＣＳＦを穏やかに吸引した。分析に用いられるＣＳＦに血液の汚染はなかった。この実験において、十分な量のＣＳＦを得るためにラットを用いた。脳を取り出し、スライスし、ＳＤＳ  溶解緩衝液中で超音波破砕し、ホモジネートを、その後ウェスタンブロット解析で処理するために−８０℃で保存した。
【０４２３】
血漿サンプル（０.１μＬ）またはＣＳＦサンプル（５μＬ）、および脳のホモジネートを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液１０μＬと混合し、供給元のプロトコールに従って１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ノヴェックス（Ｎｏｖｅｘ））で処理した。２５ｍＭトリス＋１９２ｍＭのグリシン中でタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（バイオ・ラッド）に移した。ろ紙を、２５ｍＭのホウ酸緩衝液（ｐＨ８.０）＋１５０ｍＭのＮａＣｌ＋５％の無脂肪ドライミルクで平衡化させた。ウサギ抗Ｔｆ（ロックランド・イムノケミカルズ（Ｒｏｃｋｌａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ））をブロットに添加し、室温で一晩インキュベートした。しっかり洗浄した後、二次抗体としてＨＲＰ結合ヤギ抗ウサギＩｇＧ（ピアース）を用いた。ＴｆおよびＧＬＰ−１−Ｔｆに結合した抗体のバンドを、スーパーシグナル・ウェスト・ピコ（ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ  Ｗｅｓｔ  Ｐｉｃｏ）化学発光検出キット（ピアース）によって検出した。
【０４２４】
抗Ｔｆを用いた血漿のウェスタンブロッティングにより、全長サイズを示す推定７７ｋＤａのサイズが示され、その他のフラグメントは観察されなかったことから、濃度依存性が明確になった（図１３ａ）。ＥＬＩＳＡと一致して、ウェスタンブロット解析でもＣＳＦにおいて免疫反応性のＴｆは観察されなかった。また本発明者らは、ＧＬＰ−１−Ｔｆで処置したラットから採取して２時間後に、ＣＳＦと共にＣＨＯ／ＧＬＰ−１Ｒ細胞もインキュベートしたところ、結果として細胞内ｃＡＭＰの何らかの増加を検出することができず、加えて、ウェスタンブロット解析によれば上記動物由来のホモジナイズした脳切片はＴｆを示さなかった。それゆえに、ＧＬＰ−１−Ｔｆは、血液脳関門を通過しないと結論付けた。
【０４２５】
脳におけるｃ−Ｆｏｓ活性化
マウス脳におけるｃ−Ｆｏｓの発現パターン（ニューロン活性化のマーカーとして用いられる）を試験して、末梢投与されたＧＬＰ−１−Ｔｆが中枢神経系を活性化することができるかどうかを測定し、その結果を、所定の脳領域を活性化することがわかっている腹腔内投与されたエキセンジン−４（１ｎｍｏｌ／ｋｇ＝４μｇ／ｋｇ）を末梢投与した場合に得られた結果と比較した（Ｂａｇｇｉｏ等，２００４，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．１２７：５４６〜５５８）。
【０４２６】
簡単に言えば、腹腔内注射を受けたマウスを２時間後にイソフルランで麻酔し、脳室内注射を受けたマウスを１.５および２４時間後に麻酔した。氷冷した４％パラホルムアルデヒドを用いた心臓内潅流を即座に行った。潅流の最後に脳を即座に取り出し、氷冷した４％パラホルムアルデヒド中で７２時間維持し、次に、４％パラホルムアルデヒドと２５％スクロースを含む溶液に、それらが浮くまで移した。それぞれの脳を、凍結させた台を備えたスライディングマイクロトームを使って３０μｍの切片に切断した。各動物からの脳切片を１２ウェルプレートに入れて、次に、免疫細胞化学用に処理した。まず各動物からの自由に浮漂する切片を、０.３％Ｈ2Ｏ2中で３０分間インキュベートし、次に、ＰＢＳ中で１回５分間のリンスを３回行って洗浄した。その後この切片を、ブロッキング血清（正常ヤギ血清／ＰＢＳ／０.１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ））中で室温で４５分間インキュベートした。この切片を、ウサギ抗ヒトｃ−Ｆｏｓ（カルバイオケム，１：３０，０００）中で、アミノ酸残基４〜１７に対して向けられた抗体でｃ−Ｆｏｓに関して４℃で４８時間染色した。次に、この切片を、ＰＢＳ／０.１％トリトンで、６回洗浄し、その後、ブロッキング血清（ベクター・ラボラトリーズ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ））中でビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（１：６００）と共に室温で１.５時間インキュベートした。その後この切片を、ＤＡＢ（ベクタステインＡＢＣキット）で可視化し、コントロール切片において色が必要な強度に達するまで展開した。スライドを蒸留水に浸漬することによって反応を止めた。染色が完了した後、切片をスーパーフロストスライド（フィッシャー・サイエンティフィック（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ））にマウントし、１〜２日間風乾させ、パーマウントと共にカバースリップをかけた。光学顕微鏡を用いて切片を試験し、ｃ−Ｆｏｓ陽性細胞を同定した。
【０４２７】
ＧＬＰ−１−Ｔｆの末梢投与（１０ｍｇ／ｋｇ用量）は、投与後の２時間、最後野ニューロン（ＡＰ）（４／６動物）、孤束核（ＮＴＳ）（６／６動物）、および視床下部の室傍核（ＰＶＨ）（６／６動物）においてｃ−Ｆｏｓを活性化した（図１３ｂ）。ＧＬＰ−１−Ｔｆ（１ｍｇ／ｋｇ）は、ＮＴＳ（６／６動物）およびＰＶＨ（６／６動物）を活性化したが、ＡＰ（０／６動物）は活性化されなかった（データ示さず）。エキセンジン−４は、全ての注射を受けた動物においてＧＬＰ−１−Ｔｆと類似の領域を活性化したが、ＡＰの反応はＧＬＰ−１−Ｔｆより相当強かった（図１３ｂ）。
【０４２８】
その他の一連の実験において、ＴｆおよびＧＬＰ−１−Ｔｆを脳室内（ＩＣＶ）投与し、１.５および２４時間後にｃ−Ｆｏｓ活性化を評価した。ＧＬＰ−１−Ｔｆを脳室内注射して９０分後、ＰＶＨおよびＮＴＳではｃ−Ｆｏｓ活性化が起こったが、ＡＰでは起こらなかった（図１３ｃ）。脳室内注射の２４時間後、ｃ−Ｆｏｓ活性化は、３種の脳領域のいずれにも起こらなかった（データ示さず）。
【０４２９】
統計方法
全ての結果は、平均±ＳＥとして示した。スチューデントのｔ検定は、２つの平均の等分散性を評価したＦ検定の結果に基づく。分散が統計学的に有意に異なる場合、ｔ検定は、不等分散に基づく。２以上のサンプル間の有意差を計算するためにＡＮＯＶＡ検定を用い、それに続いて、シェッフェ検定を用いた事後検定を行った。Ｐ値が０.０５より小さければ、統計学的に有意とした。
【０４３０】
本発明を上記の実施例を参照しながら詳細に説明したが、当然ながら、本発明の本質から逸脱することなく様々な改変を作製できる。従って、本発明は以下の請求項によってのみ限定される。本願において引用された全ての特許、特許出願および刊行物は、その全体が参照により本明細書に加入する。
【図面の簡単な説明】
【０４３１】
【図１】ヒト（Ｈｕ）トランスフェリン（Ｔｆ）のＮおよびＣドメインのアライメントを示す（配列番号３）。
【図２Ａ−１】様々な種由来のトランスフェリン配列のアライメントを示す。
【図２Ａ−２】様々な種由来のトランスフェリン配列のアライメントを示す。
【図２Ｂ−１】様々な種由来のトランスフェリン配列のアライメントを示す。
【図２Ｂ−２】様々な種由来のトランスフェリン配列のアライメントを示す。
【図３】治療用タンパク質、ポリペプチドまたはペプチドに関するＴｆの表面に露出した多数の挿入部位の位置を示す。
【図４】様々なＧＬＰ−１／ＧＬＰ−２／ｍＴｆ融合タンパク質を構築するのに用いられた、ＧＬＰ−１、ＧＬＰ−２リンカーおよびｍＴｆの様々な変異体を示す図である。
【図５】ＣＨＯ細胞にクローニングしたラットＧＬＰ−１受容体を用いたｃＡＭＰ分析における相対的な効力を示す。
【図６】ＥＬＩＳＡおよびインビトロでの生物検定によって測定された、サルにおけるＧＬＰ−１／ｍＴｆの血漿濃度の比較を示す。
【図７】ＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）をコードするｐＲＥＸ０５８５（配列番号１１）の制限地図である。
【図８】ａは、様々な濃度のＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）、ＧＬＰ−１およびエキセンジン−４に関するｃＡＭＰの最大反応のパーセントを示す。ｂはそれらのインスリンの最大分泌のパーセントを示す。ｃは、様々な濃度のＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１−Ｔｆでのインスリンの最大の反応のパーセントを示す。ｄは、経時的な血漿のＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）を示す。
【図９】腹腔内（ａ）投与経路および皮下（ｂ）投与経路で、ｈＴｆ、１ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１−Ｔｆまたは１０ｍｇ／ｋｇのＧＬＰ−１−Ｔｆで処置した非糖尿病マウスにおける経時的な血糖を示す。
【図１０】ａ〜ｄは、ｈＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆで処置したｄｂ／ｄｂマウスにおける血糖および血漿インスリン分泌量を示す（配列番号１２）。
【図１１】ｈＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）で処置した後、５日にわたり１日１回摂食させたｄｂ／ｄｂおよび非糖尿病マウスにおける血糖（ａおよびｃ）と食物摂取（ｂおよびｄ）を示す。
【図１２】ａ〜ｃは、ｈＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）で処置したｄｂ／ｄｂマウスの膵臓におけるＢｒｄＵ＋核を示す。
【図１３】ａは、ＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）で処置したラット由来の血漿におけるＴｆおよびＧＬＰ−１−Ｔｆに相当するフラグメントを示すウェスタンブロットである。ｂ〜ｃは、腹腔内注入（ｂ）および脳室内注入（ｃ）によってｈＴｆまたはＧＬＰ−１−Ｔｆ（配列番号１２）で処置したラットの最後野ニューロン、孤束核および視床下部の室傍核におけるｃＦｏｓ活性化の画像である。
【図１４】ＧＬＰ−１−ＴｆまたはＴｆで処置したマウスの固定した膵臓からの膵島における、ＧＬＰ−１−Ｔｆで処置してから２４時間後の、免疫蛍光法および共焦点顕微鏡法を用いた画像を示す。
【図１】
2008531059.tif 000031
【図２Ａ−１】
2008531059.tif 000032
【図２Ａ−２】
2008531059.tif 000033
【図２Ｂ−１】
2008531059.tif 000034
【図２Ｂ−２】
2008531059.tif 000035
【図３】
2008531059.tif 000036
【図４】
2008531059.tif 000037
【図５】
2008531059.tif 000038
【図６】
2008531059.tif 000039
【図７】
2008531059.tif 000040
【図８】
2008531059.tif 000041
【図９】
2008531059.tif 000042
【図１０】
2008531059.tif 000043
【図１１】
2008531059.tif 000044
【図１２】
2008531059.tif 000045
【図１３】
2008531059.tif 000046
【図１４】
2008531059.tif 000047
【配列表】
2008531059000001.app
【国際調査報告】
2008531059.tif 000048
2008531059.tif 000049
2008531059.tif 000050
2008531059.tif 000051