(57)【要約】  インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）変異体とポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）からなるコンジュゲートであって、該ＩＧＦ−Ｉ変異体は、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列の３つまでのアミノ酸位置２７、３７、６５、６８において、該アミノ酸１つまたは２つがリシン（Ｋ）であり、アミノ酸２７が極性アミノ酸であるがリシンではないように、アミノ酸変化を有し、該ＰＥＧは該リシンの第一のアミノ基を介してコンジュゲーションされておりそして該ポリ（エチレングリコール）基は２０〜１００kDaの全体の分子量を有することを特徴とするコンジュゲートが開示される。このコンジュゲートは、アルツハイマー病のような神経変性障害の処置のために有用である。
2008524296.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
インスリン様増殖因子−１（ＩＧＦ−Ｉ）変異体とポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）からなるコンジュゲートであって、該ＩＧＦ−Ｉ変異体は、アミノ酸３７、６５、６８の１つ以上がリシン（Ｋ）であり、アミノ酸２７が極性アミノ酸であるがリシンではないように、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸位置２７、３７、６５、６８においてアミノ酸変化を有し、そして該ＰＥＧは第一のアミノ基を介して該ＩＧＦ−Ｉ変異体にコンジュゲーションされていることを特徴とするコンジュゲート。
【請求項２】
該ＰＥＧが２０〜１００kDaの全体の分子量を有することを特徴とする、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
該ＩＧＦ−Ｉ変異体が、Ｎ末端アミノ酸において更にＰＥＧ化されていることを特徴とする、請求項１または２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
Ｋ６５、Ｋ６８またはＫ３７においてモノＰＥＧ化されているかまたはＫ６５およびＫ６８においてジＰＥＧ化されていることを特徴とする、請求項１または３に記載のコンジュゲート。
【請求項５】
該ＩＧＦ−Ｉ変異体が、Ｒ２７、Ｒ３７、Ｋ６５、Ｋ６８（ＲＲＫＫ）、Ｒ２７、Ｒ３７、Ｒ６５、Ｋ６８（ＲＲＲＫ）、Ｒ２７、Ｒ３７、Ｋ６５、Ｒ６８（ＲＲＫＲ）、Ｒ２７、Ｋ３７、Ｒ６５、Ｒ６８（ＲＫＲＲ）であることを特徴とする、請求項１〜４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
ＩＧＦ−Ｉ変異体において、Ｎ末端の３個までのアミノ酸がトランケーションされていることを特徴とする、請求項１〜５に記載のコンジュゲートまたは請求項５に記載のＩＧＦ−Ｉ変異体。
【請求項７】
ポリ（エチレングリコール）基が分岐状ポリ（エチレングリコール）基であることを特徴とする、請求項１〜６に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
ポリ（エチレングリコール）基が、２０〜１００kDaの全体の分子量を有することを特徴する、請求項１〜７に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
アミノ酸３７、６５、６８の１つ以上がリシン（Ｋ）でありそしてアミノ酸２７が極性アミノ酸であるがリシンではないように、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸位置２７、３７、６５、６８においてアミノ酸変化を有することを特徴とするＩＧＦ−Ｉ変異体。
【請求項１０】
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の製造用の中間体としての、請求項９に記載のＩＧＦ−Ｉ変異体の使用。
【請求項１１】
ＩＧＦ−Ｉ変異体および１つまたは２つのポリ（エチレングリコール）基を含み、該ポリ（エチレングリコール）基が約２０〜約１００kDaの全体の分子量を有する、コンジュゲートの製造方法であって、活性化されたポリ（エチレングリコール）がＩＧＦ−Ｉ変異体の第一のリシンアミノ基を介して請求項９に記載のＩＧＦ−Ｉ中間体に化学的に結合するような条件下に、請求項９に記載のＩＧＦ中間体を活性化されたポリ（エチレングリコール）と反応させることを含む方法。
【請求項１２】
該（ポリエチレングリコール）がＩＧＦ−Ｉ変異体のＮ末端アミノ基を介して該ＩＧＦ−Ｉ中間体に更に化学的に結合することを特徴する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜８に記載のコンジュゲートと薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１４】
アルツハイマー病の処置用の医薬を調製するための、請求項１〜８に記載のコンジュゲートの使用。
【請求項１５】
アルツハイマー病の処置を必用としている患者に、治療的に有効量の請求項１〜８に記載のコンジュゲートを投与することを含む、アルツハイマー病を処置するための方法。
【請求項１６】
リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体であって、アミノ酸３７、６５、６８の１つ以上がリシン（Ｋ）であり、アミノ酸２７が極性アミノ酸であるがリシンではないように、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸位置２７、３７、６５、６８においてアミノ酸変化を有し、そして該ＰＥＧが第一のアミノ基を介して該ＩＧＦ−Ｉ変異体にコンジュゲーションされている、リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体と、Ｎ末端でＰＥＧ化されているＩＧＦ−Ｉ変異体との組成物。
【請求項１７】
リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体であって、アミノ酸３７、６５、６８の１つ以上がリシン（Ｋ）であり、アミノ酸２７が極性アミノ酸であるがリシンではないように、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸位置２７、３７、６５、６８においてアミノ酸変化を有し、そして該ＰＥＧが第一のアミノ基を介して該ＩＧＦ−Ｉ変異体にコンジュゲーションされている、リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体と、Ｎ末端でＰＥＧ化されているＩＧＦ−Ｉ変異体と、薬学的に許容され得る担体を含む医薬組成物。
【請求項１８】
リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体であって、アミノ酸３７、６５、６８の１つ以上がリシン（Ｋ）であり、アミノ酸２７が極性アミノ酸であるがリシンではないように、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸位置２７、３７、６５、６８においてアミノ酸変化を有し、そして該ＰＥＧが第一のアミノ基を介して該ＩＧＦ−Ｉ変異体にコンジュゲーションされている、リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体と、Ｎ末端でＰＥＧ化されているＩＧＦ−Ｉ変異体との組成物の、アルツハイマー病の処置用の医薬を調製するための使用。
【請求項１９】
アルツハイマー病の処置を必用としている患者に、治療的に有効量の請求項１６または１７に記載の組成物を投与することを含む、アルツハイマー病を処置するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インスリン様増殖因子−Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）とポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）のコンジュゲート、このようなコンジュゲートを含有する医薬組成物およびこのようなコンジュゲートの製造方法および使用方法に関する。
【０００２】
発明の背景
アルツハイマー病（ＡＤ）は、６５歳以上のヒトの痴呆の全症例の約５０％〜６０％の割合を占める次第に進行する形態の神経変性である。それは、現在では全世界で１５００万人と見積もられる人々に影響を及ぼし、そして人口における老人の相対的増加により、その有病率は次の２０〜３０年にわたり増加する可能性がある。ＡＤは、臨床的症状の開始と死亡との間に約８．５年の平均期間を有する進行性の疾患である。より高度の精神的機能と関連した脳領域における錐体細胞の死およびニューロンシナプスの損失は、認知機能の全体的および進行性の悪化により特徴付けられた典型的な症状をもたらす(Francis, P.T., et al., J. Neurol. Neurosurg: Psychiatry 66(1999)137-147)。ＡＤは、世界における老人痴呆および初老期の痴呆の両方の最も普通の形態であり、そして記憶、知的機能の増加していく損質および言語傷害を与える容赦なく進行性の痴呆として臨床的に認識される(Merritt,A Textbook of Neurology, 6th edition, Lea & Febiger, Philadelphia, pp. 489-489, 1979)、神経病理学的には、ＡＤの主要な特徴は、２つの特徴的な損傷：アミロイド老人班および神経原線維変化(neurofibrillary tangle)（ＮＦＴ）の存在である。班はニューロンの外側に沈着しているが、上記変化は、死後の脳においてニューロン内に観察される。アミロイド班コアの主要な成分の１つは、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）からセクレターゼにより開裂される病理的に沈着した小さなアミロイド−β−ペプチド（Ａβ）である(Selkoe, D. J., Physiol. Rev. 81(2001) 741-766; Harday, J., and Selkoe, D. J., Science 297(2002)353-356; Bush, A.I., and Tanzi, R. E., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99(2002)7317-7319)。Ａβ、３９〜４３残基（ＭＷ〜４kDa）の自己凝集性ペプチドは、より大きいＡＰＰ（１１０〜１２０kDa）の一部として合成される。ＡＰＰはより大きなＮ末端細胞外ドメイン、単一の膜貫通ドメインおよび短い細胞質尾部を有するＩ型内在性膜糖タンパク質である。Ａβ領域は、ＡＰＰの細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの部分に及ぶ。ＡＤにおける神経細胞死へのＡＰＰの関与の最も一般的な仮説は、アミロイド仮説である。この仮説は、班アミロイド沈着または部分的に凝集した可溶性Ａβが、神経毒性カスケードをトリガーし、それによりＡＤ病理学に類似した神経変性を引き起こすことを仮定している(Selkoe, D. J., Physiol. Rev. 81(2001)741-766; Hardy, J., and Selkoe, D. J., Science 297(2002)353-356)。
【０００３】
インスリン様増殖因子Ｉ（ＩＧＦ−Ｉ）は、インスリンに構造的に関連した循環性ホルモンである。ＩＧＦ−Ｉは、末梢組織に対する成長ホルモンの作用の主要なメディエーターであると従来考えられていた。ＩＧＦ−Ｉは７０アミノ酸からなりそしてソマトメディンＣとも呼ばれそしてSwiss Prot. No. P01343により定義されている。使用、活性および製造は、例えば、le Bouc, Y., et al., FEBS Lett. 196(1986)108-184; de Pagter-Holthuizen, P., et al., FEBS Lett. 195(1986) 179-184; Sandberg Nordqvist, A. C., et al., Brain Res. Mol. Brain Res. 12(1992)275-277; Steenbergh, P.H., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 175(1991) 507-514; Tanner, J. M., etr al., Acta Endocrinol. (Copenh.) 84(1977)681-696; Uthne, K., et al., J.Clin. Endocrinol. Metab. 39(1974)548-554; EP 0123228、EP0128733; US5,861,373; US5,714,460; EP0597033; WO02/32449; WO93/02695に述べられている。
【０００４】
ＩＧＦ−Ｉ機能の調節は極めて複雑である。循環においては、ＩＧＦ−Ｉの０．２％のみが遊離形態で存在し、これに対して大部分はＩＧＦ結合タンパク質（ＩＧＦＢＰ’ｓ）に結合しており、該タンパク質は、ＩＧＦ’ｓへの非常に高いアフィニティーを有しそしてＩＧＦ−Ｉ機能をモデュレーションする。この因子は、プロテアーゼによるＩＧＦＢＰｓのプロテオリシスなどのＩＧＦ−Ｉを放出する機構により局所的に放出されうる。
【０００５】
ＩＧＦ−Ｉは、発達中の脳および成熟した脳においてパラクリン性の役割(paeacrine role)を演じる(Werther, G. A., et al., Mol. Endocrinol. 4(1990)773-778)。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究は、ＩＧＦ−Ｉが、ドーパミン作動性ニューロン(Knusel, B., et al., J.Neurosci. 10(1990)558-570)およびオリゴデンドロサイト(McMorris, F.A., and Dubois-Dalcq, M., J. Neurosci. Res. 21(1988)199-209; . McMorris, F.A., et Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83(1986)822-826; Mozell.,R. L., and McMorris, F.A., J.Neurosci. Res. 30(1991)382-390))を含む、ＣＮＳにおけるいくつかのタイプのニューロンに対する効力のある非選択性栄養剤(non-selective trophic agent)である(Knusel, B., et al., J.Neurosci. 10(1990)558-570) ; Svrzic, D., and Schubert, D., Biochem. Byophys. Res. Commun. 172(1990)54-60)ことを示す。ＵＳ5,093,317は、コリン作動性神経細胞の生存がＩＧＦ−Ｉの投与により高められることを記載している。ＩＧＦ−Ｉは、末梢神経再生を刺激し(Kanje, M., et al., Brain Res.486(1989)396-398)そしてオルニチンデカルボキシラーゼ活性を高める(US5,093,317)ことは更に知られている。US5,861,373およびWO93/02695は、患者の中枢神経系におけるＩＧＦ−Ｉおよび／またはそのアナログの活性濃度を増加させることにより、中枢神経系のグリア細胞および／または非コリン作動性神経細胞に主として影響を与える中枢神経系への損傷 または中枢神経系の疾患を処置する方法を記載している。WO0232449は、治療的に有効量のＩＧＦ−Ｉまたは生物学的に活性なその変異体を含む医薬組成物を哺乳動物の鼻腔に投与することにより、哺乳動物の中枢神経系の虚血性損傷を減少または防止する方法を指向する。ＩＧＦ−Ｉまたはその変異体は、鼻腔を通じて吸収されそして虚血性事象と関連した虚血性損傷を減少または防止するのに有効な量で哺乳動物の中枢神経系に輸送される。EP0874641は、ＡＩＤＳ関連痴呆、ＡＤ、パーキンソン病、ピック病、ハンチントン病、肝性脳症(hepatic encephalopathy)、皮質−基底神経節症候群、進行性痴呆、痙性パラパブレシス(spastic parapavresis)を伴う家族性痴呆、進行性核上性麻痺(progressive supranuclear palsy)、多発性硬化症、シルダーの脳硬化症(cerebral sclerosis of Schilder)または急性壊死出血性脳脊髄炎による、中枢神経系の神経損傷を処置または防止するための医薬であって、該医薬は血液脳関門または血液脊髄関門の外側で有効量のＩＧＦを非経口投与するための形態にある、医薬を製造するためのＩＧＦ−ＩまたはＩＧＦ−ＩＩの使用を請求している。
【０００６】
遊離ＩＧＦ−Ｉの脳レベルおよび血清レベルの減少は、散発性(sporadic)および家族性形態のＡＤの病原性に関係している。更に、ＩＧＦ−Ｉは、Ａβで誘導される神経毒性に対してニューロンを保護する(Niikura, et al., J. Neurosci. 21(2001)1902-1910; Dore,S., et al., Ann. NY Acad. Sci. 890(1999) 356-364)。最近、末梢に投与されたＩＧＦ−Ｉがラットおよびマウスにおける脳Ａβレベルを減少させることができることが示された(Carro, E., et al., Nat. Med. 8(2002)1390-1397)。更に、トランスジェニックＡＤマウスモデルにおいて長期のＩＧＦ−Ｉ処置は脳アミロイド班ロードを減少させることを研究は示している。これらのデータは、ＩＧＦ−Ｉが脳からＡβを清掃する(clearing)ことにより脳Ａβレベルおよび班関連脳痴呆（plaque-associated brain dementia）を減少させることができるという考えを強く支持する。
【０００７】
ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）によるタンパク質の共有結合改変は、身体におけるタンパク質の循環半減期を延ばすのに有用な方法であることが証明された。(Hershfield, M. S., et al., N. Engl. J. Med. 316(1987)589-596; Meyers, F. J., et al., Clin. Pharmacol. Ther. 49(1991)307-313; Delgado, C., et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 9(1992)249-304; Katre, Advanced Drug Delivery Systems 10(1993)91; EP-A0400472; Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6(1995)62-69; Satake-Ishikawa, R., et al., Cell Struct. Funct. 17(1992)157-160; Katre, N.V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84(1987)1487-1491; Tsutsumi, Y., et al., Jpn. J. Cancer Res. 85(1994)9-12; Inoue, H., et al., J.Lab. Clin. Med. 124(1994)529-536; Chamow, S. M., et al., Bioconjugate Chem. 5(1994)133-140)。
【０００８】
ＰＥＧ化(PEGylation)の他の利点は、溶解度の増加およびタンパク質免疫原性の減少である(Katre, N.V., J. Immunol. 144(1990)209-213)。タンパク質のＰＥＧ化のためのありふれた方法は、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）のようなアミノ反応性試薬で活性化されたポリ（エチレングリコール）の使用である。このような試薬によって、ポリ（エチレングリコール）は、リシン残基のＮ末端α−アミノ基およびε−アミノ基などの遊離第一のアミノ基においてタンパク質に結合される。しかしながら、このアプローチの主要な限界は、タンパク質が典型的には相当な量のリシン残基を含有しており、したがって、ポリ（エチレングリコール）基は、遊離ε−アミノ基のすべてにおいて非特異的な方式でタンパク質に結合され、ランダムなＰＥＧ化タンパク質の異種産物混合物が得られるということである。それゆえ、多くのＮＨＳ−ＰＥＧ化タンパク質は低い特異的活性のゆえに商業的使用には不適当である。不活性化は、生物学的活性のために必要な１つ以上のリシン残基もしくはＮ末端アミノ基の共有結合改変から生じるかまたはタンパク質の活性部位に近いもしくは活性部位におけるポリ（エチレングリコール）残基の共有結合から生じる。例えば、ＮＨＳ−ＰＥＧ化試薬を使用するヒト成長ホルモンの改変は、タンパク質の生物学的活性を１０倍より多く減少させることが見出された(Clark, R.，et al., J. Biol. Chem. 271 (1996)21967-21977)。ヒト成長ホルモンは、Ｎ末端アミノ酸にの外に９個のリシンを含有する。これらのリシンのあるものは、レセプター結合のために重要であることが知られているタンパク質の領域に位置している(Cunningham, B. C., et al., Science 254(1991)821-825)。更に、アミノ反応性ポリ（エチレングリコール）試薬の使用によるエリスロポエチンの改変は、生物学的活性の殆ど完全な損失ももたらす(Wojchowski, D. M., et al., Biochim. Biophys. Acta 910(1987)224-232)。アミノ反応性ＰＥＧ化試薬によるインターフェロン−α２の共有結合改変は、生物活性の４０〜７５％の損失をもたらす(US Patent No. 5,382,657)。Ｇ−ＣＳＦの同様な改変は、活性の６０％より多くの損失をもたらし(Tanaka, H., et al., Cancer Res. 51(1991)3710-37146)そしてインターロイキン−２の同様な改変は生物活性の９０％より多くの損失をもたらす(Goodson, R. J., and Katre, N. V., Bio Technology 8(1990)343-346)。
【０００９】
WO94/12219およびWO95/32003は、ＰＥＧとＩＧＦもしくはシステイン突然変異したＩＧＦを含むポリエチレングリコールコンジュゲートであって、該ＰＥＧは、該突然変異タンパク質のＮ末端領域における遊離システインにおいて該突然変異タンパク質に結合している、ポリエチレングリコールコンジュゲートを請求している。WO2004/60300は、Ｎ末端でＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉを記載している。
【００１０】
発明の要約
本発明は、アミノ酸３７、６５、６８の１つ以上がリシン（Ｋ）でありそしてアミノ酸２７が極性アミノ酸であるがリシンではないように、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸位置２７、３７、６５および／または６８においてアミノ酸変化を有することを特徴とするＩＧＦ−Ｉ変異体を含む。
【００１１】
好ましくは、アミノ酸２７はアルギニンである。
【００１２】
このようなＩＧＦ−Ｉ変異体は、リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉの製造のための中間体（ＩＧＦ−Ｉ中間体）として有用である。
【００１３】
驚くべきことに、リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体（アミノ反応性ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体）、好ましくは２０〜１００kDaＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体、特に好ましくはモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、治療的適用可能性に関して優れた性質を有することが見出された。
【００１４】
本発明の更なる態様は、本発明に従うリシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体と、Ｎ末端でＰＥＧ化されているＩＧＦ−Ｉ変異体との組成物である。好ましくは、分子比は、９：１〜１：９である。更に好ましいのは、モル比が少なくとも１：１（Ｎ末端でＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体１部当たりリシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体少なくとも１部）、好ましくは少なくとも６：４（Ｎ末端でＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体４部当たりリシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体少なくとも６部）である組成物である。好ましくは、リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体およびＮ末端でＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体の両方共モノＰＥＧ化されている。好ましくは、この組成物において、変異体はリシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体およびＮ末端でＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体の両方において同じである。変異体は、好ましくは、ＲＲＫＫ、ＲＲＫＲ、ＲＲＲＫ、ＲＫＲＲからなる群より選ばれる。ＰＥＧは、好ましくは３０〜４５kDa、特に３０kDaまたは４０kDaの平均分子量を有する。リシン−ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体およびＮ末端でＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体は、ＩＧＦ結合タンパク質（例えば、ＢＰ４およびＢＰ５）の結合において匹敵するアフィニティーを示すが、ＩＧＦ−ＩＲリン酸化に関して異なる活性を示す。
【００１５】
本発明は、ＩＧＦ−Ｉ変異体（ＩＧＦ−Ｉコンジュゲートすなわちコンジュゲート）およびポリ（エチレングリコール）基からなるコンジュゲートであって、該ＩＧＦ−Ｉ変異体は、アミノ酸３７、６５、６８の１つ以上がリシン（Ｋ）であり、アミノ酸２７が極性アミノ酸であるがリシンではないように、野生型ＩＧＦ−Ｉアミノ酸配列のアミノ酸位置２７、３７、６５および／または６８においてアミノ酸変化を有し、そして該ＰＥＧは第一のアミノ基を介して、好ましくはリシンの第一のアミノ基を介して該ＩＧＦ−Ｉ変異体にコンジュゲーションされていることを特徴とする、コンジュゲートを提供する。
【００１６】
好ましくは、ポリ（エチレングリコール）基は、少なくとも２０kDa、更に好ましくは約２０〜１００kDa、特に好ましくは２０〜８０kDaの全体の分子量(overall molecular weight)を有する。
【００１７】
ポリ（エチレングリコール）基は、１つ以上のアミノ酸位置３７、６５、６８においてリシンの第一のアミノ基を介してＩＧＦ−Ｉ変異体にコンジュゲーションされ（アミノ反応性ＰＥＧ化）、そして場合によりＮ末端アミノ酸においてＰＥＧ化される。コンジュゲートは、好ましくは、１つ以上のアミノ酸位置３７、６５、６８のリシン残基においてモノＰＥＧ化またはジＰＥＧ化されており、そして場合によりＮ末端アミノ酸においてＰＥＧ化されている。コンジュゲートは、Ｋ６５、Ｋ６８またはＫ３７においてモノＰＥＧ化されているかまたはＫ６５およびＫ６８においてジＰＥＧ化されておりそして場合によりＮ末端アミノ酸においてＰＥＧ化されていることは更に好ましい。好ましくはＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の２０％以下が更にＮ末端ＰＥＧ化されている。
【００１８】
ＩＧＦ−Ｉ変異体は下記のとおり命名される：Ｋ６５は、アミノ酸６５がリシンであることを意味し、Ｒ２７は、アミノ酸２７がアルギニンであること等を意味する。アミノ酸Ｒ２７、Ｋ３７、Ｋ６５、Ｋ６８を有するＩＧＦ−Ｉ変異体は、ＲＫＫＫと命名される。ＩＧＦ−Ｉ野生型は、ＫＲＫＫと命名される。
【００１９】
特に好ましいＩＧＦ−Ｉ変異体およびコンジュゲートにおける変異体は、ＲＲＫＫ、ＲＲＫＲ、ＲＲＲＫ、ＲＫＲＲである。
【００２０】
本発明に従う（ＰＥＧ化）ＩＧＦ−Ｉ変異体が、Ｎ末端における３個までの（好ましくは３個のすべての）アミノ酸がトランケーションされている変異体であることが更に好ましい。それぞれの野生型突然変異体はＤｅｓ（Ｉ−３）−ＩＧＦ−Ｉと名づけられそしてＮ末端からアミノ酸残基ｇｌｙ、ｐｒｏおよびｇｌｕを欠いている(Kummer, A., et al., Int. J.Exp. Diabesiry Res. 4(2003)45-57)。
【００２１】
ポリ（エチレングリコール）基は線状であるかまたは分岐状である。
【００２２】
本発明は、更にＩＧＦ−Ｉ中間体を使用して本発明に従うコンジュゲートの製造方法を含む。本方法は、ＩＧＦ−Ｉ変異体と１つまたは２つのポリ（エチレングリコール）基を含み、該ポリ（エチレングリコール）基は、好ましくは少なくとも２０kDa、更に好ましくは２０〜１００kDa、特に好ましくは２０〜８０kDaの全体の分子量を有する、コンジュゲートの製造であって、活性化されたポリ（エチレングリコール）がＩＧＦ−Ｉ変異体の第一のリシンアミノ基を介してＩＧＦ−Ｉ中間体に化学的に結合するような条件下に、ＩＧＦ−Ｉ中間体を活性化されたポリ（エチレングリコール）と反応させることによる製造を含む。
【００２３】
本発明は、好ましくは薬学的に許容される担体と共に、本発明に従うコンジュゲートを含有する医薬組成物を更に含む。
【００２４】
本発明は、本発明に従うコンジュゲートを含有する医薬組成物の製造方法を更に含む。
【００２５】
本発明は、ＡＤの処置用の医薬の調製のための本発明に従うコンジュゲートの使用を更に含む。
【００２６】
本発明は、ＡＤの処置を必要としている患者に、好ましくは週当たり１〜２回の適用で、薬学的に有効量のアミノ反応性ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を投与することを特徴とするＡＤの処置のための方法を更に含む。
【００２７】
発明の詳細な説明
本明細書で使用された「ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体」または「アミノ反応性ＰＥＧ化」は、ＩＧＦ−Ｉ変異体が１つまたは２つのポリ（エチレングリコール）基に、ＩＧＦ−Ｉ変異体分子の１つまたは２つのリシンへのアミノ反応性カップリングにより共有結合していることを意味する。ＰＥＧ基は、リシン側鎖の第一のε−アミノ基であるＩＧＦ−Ｉ変異体分子の部位に結合される。ＰＥＧ化は、Ｎ末端α−アミノ基で更に行うことが更に可能である。使用される合成方法および変異体により、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、Ｎ末端ＰＥＧ化を伴うかもしくは伴わないＫ６５、Ｋ６８および／またはＫ３７においてＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体の混合物からなることができ、その際ＰＥＧ化の部位は異なる分子で異なることができ、または分子当たりのポリ（エチレングリコール）側鎖の量および／または分子におけるＰＥＧ化の部位に関して実質的に均一であることができる。好ましくは、ＩＧＦ−Ｉ変異体はモノ−および／またはジＰＥＧ化されており、特にＮ末端ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体から精製される。
【００２８】
本明細書で使用されたアミノ反応性ＰＥＧ化は、反応性（活性化された）ポリ（エチレングリコール）の使用、好ましくは、好ましくはメトキシポリ（エチレングリコール）のＮ−ヒドロキシスクシンイミジルエステルの使用により、ＩＧＦ−Ｉ変異体の第一のリシンアミノ基にポリ（エチレングリコール）をランダムに結合させる方法を意味する。カップリング反応は、リシン残基の反応性第一のε−アミノ基および場合によりＩＧＦ−ＩのＮ末端アミノ酸のα−アミノ基にポリ（エチレングリコール）を結合させる。タンパク質へのＰＥＧのこのようなアミノ基コンジュゲーションは、当技術分野でよく知られている。例えば、このような方法の概説は、Veronese, F. M., Biomaterials 22(2001)405-417により与えられる。Veroneseに従えば、タンパク質の第一のアミノ基へのＰＥＧのコンジュゲーションは、該第一のアミノ基のアルキル化を行う活性化されたＰＥＧｓを使用することにより行うことができる。このような反応のために、活性化されたアルキル化性ＰＥＧｓ、例えばＰＥＧアルデヒド、ＰＥＧ−トレシルクロリド(PEG-tresyl chloride)またはＰＥＧエポキシドを使用することができる。更なる有用な試薬は、アシル化性ＰＥＧｓ、例えば、カルボキシル化されたＰＥＧｓのヒドロキシスクシンイミジルエステル、または末端ヒドロキシ基がクロロホルメートまたはカルボニルイミダゾールにより活性化されているＰＥＧｓである。更なる有用なＰＥＧ試薬は、アミノ酸アームを有するＰＥＧｓである。このような試薬は、いわゆる分岐状ＰＥＧｓを含有することができ、その際少なくとも２つの同一のもしくは異なるＰＥＧ分子がペプチドスペーサー（好ましくはリシン）により一緒に連結され、そして例えばリシンスペーサーの活性化されたカルボキシレートとしてＩＧＦ−Ｉ変異体に結合される。モノ−Ｎ末端カップリングもKinster, O., et al., Adv. Drug Deliv. Rev. 54(2002)477-485によって記載されている。
【００２９】
本明細書で使用された「ＰＥＧまたはポリ（エチレングリコール）」は、市販のまたは当技術分野で周知の方法に従うエチレングリコールの開環重合により製造することができる水溶性ポリマーを意味する(Kodera, Y., et al., Progress in Polymer Science 23(1998)1233-127; Francis, G. E., et al., Int. J. Hematol. 68(1998)1-18)。用語「ＰＥＧ」は、エチレングリコール単位の数が少なくとも４６０、好ましくは４６０へ２３００、特に好ましくは４６０〜１８４０（２３０ＰＥＧ単位は約１０kDaの分子量に相当する）である任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広く使用される。ＰＥＧ単位の上限の数はコンジュゲートの溶解度によってのみ限定される。通常２３００単位を含有するＰＥＧｓより大きいＰＥＧｓは使用されない。好ましくは、本発明で使用されるＰＥＧは、一端でヒドロキシまたはメトキシで終わっており（メトキシＰＥＧ、ｍＰＥＧ）そして他端でエーテル酸素結合を介してリンカー部分に共有結合している。ポリマーは線状または分岐状である。分岐状ＰＥＧｓは、例えば、Veronese, F.M., et al., Journal of Bioactive and Compatible Polymers 12(1997)196-207に記載されている。有用なＰＥＧ試薬は、例えば、Nektar Therapeutics(www.nektar.com)から入手可能である。
【００３０】
ＰＥＧの任意の分子質量を、実際に所望されるとおりに使用することができ、例えば、２０kダルトン（Da）〜１００kDa（ｎは４６０〜２３００である）を使用することができる。ＰＥＧにおける反復単位の数「ｎ」が、ダルトンで表された分子質量に代わって近似される。例えば、２個のＰＥＧ分子がリンカーに結合しているならば、各ＰＥＧ分子が１０kDaの同じ分子質量を有する（各ｎは約２３０である）場合に、リンカー上のＰＥＧの総分子質量は約２０kDaである。リンカーに結合したＰＥＧの分子質量は異なっていてもよく、例えば、リンカー上の２つの分子のうち、１つのＰＥＧ分子は５kDaであることができ、そしてもう１つのＰＥＧ分子は１５kDaであることができる。分子質量は、常に平均分子質量を意味する。
【００３１】
下記実施例において、アミノ反応性ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の製造のためのいくらかの好ましい試薬が記載される。例えば、Veronese, F. M., Biomaterials 22(2001)405-417により記載された方法に基づいた改変が、その方法が本発明に従うコンジュゲートをもたらす限りは、その技法においてなされうることは理解される。
【００３２】
標的タンパク質における３個までの潜在的に反応性の第一のアミノ基の存在は（２個までのリシンおよび１個の末端アミノ酸）、ポリ（エチレングリコール）鎖の結合点が異なる一連のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体異性体をもたらす。
【００３３】
本発明は、改良された性質を有するＩＧＦ−Ｉ変異体のＰＥＧ化された形態を提供する。このようなＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体コンジュゲートは、線状または分岐状の且つそれにランダムに結合した１個または２個のＰＥＧ基を含有し、その際コンジュゲートにおけるすべてのＰＥＧ基の全分子量は、好ましくは約２０〜８０kDaである。分子量のこの範囲からの少しの逸脱は、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体が脳においてＡβペプチドレベルを低下させることにおける活性を示す限りは可能であるということは、当業者には明らかである。また、８０kDaより高い分子量を有するＰＥＧによるＩＧＦ−Ｉ変異体のＰＥＧ化は、より高いバイオアベイラビリティーをもたらす。しかしながら、このような活性は、分子量が増加するにつれて、減少したＩＧＦ−Ｉレセプター活性化および血液脳関門輸送により、減少することが予想される。ゆえに、ＰＥＧの分子量として２０〜８０kDaの範囲が、ＡＤに罹患している患者の有効な処置のために有用なＰＥＧとＩＧＦ−Ｉ変異体のコンジュゲートのための最適化された範囲であると理解されるべきである。
【００３４】
本明細書で使用された「分子量」は、ＰＥＧの平均分子量を意味する。
【００３５】
下記のＰＥＧ化された形態のＩＧＦ−Ｉ変異体は、本発明コンジュゲートの例でありそして意図される態様である：
−ＰＥＧ基が２０〜８０kDa（４６０〜１８４０ＰＥＧ単位）の分子量を有する、モノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体；
−ＰＥＧ基が各々約１０〜５０kDa（２３０〜１１５０ＰＥＧ単位）の分子量を有する、ジＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体
およびその混合物。
【００３６】
特に好ましいのは、分岐状ＰＥＧ基は、３０〜４５、好ましくは４０〜４５kDa（約９２０ＰＥＧ単位）の分子量を有する、ＲＲＫＫ、ＲＲＫＲ、ＲＲＲＫおよびＲＫＲＲからなる群より選ばれるモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉである。例えば、ＰＥＧの４４kDaの平均分子量およびＩＧＦ−Ｉの７．６kDaの分子量に基づいて、このようなモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの計算された平均分子量は約５１．６kDaである。ＰＥＧが３０または４０kDaの平均分子量を有する、ＲＲＫＫ、ＲＲＫＲ、ＲＲＲＫおよびＲＫＲＲからなる群より選ばれるモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉも好ましい。
【００３７】
本発明に従う「ＰＥＧまたはＰＥＧ基」が、必須の部分としてポリ（エチレングリコール）を含有する残基を意味する。このようなＰＥＧは、結合反応のために必要な更なる化学基；分子の化学的合成から生じる更なる化学基；または分子の部分のお互いからの最適距離のためのスペーサーである更なる化学基を含有することができる。更に、このようなＰＥＧは、互いに連結されている１個以上のＰＥＧ側鎖からなることができる。１個より多くのＰＥＧ鎖を有するＰＥＧ基は、多重アームＰＥＧまたは分岐状ＰＥＧと呼ばれる。分岐状ＰＥＧは、例えば、グリセロール、ペンタエリトリオールおよびソルビトールを含む種々のポリオールへのポリエチレンオキシドの付加により製造することができる。例えば、４アーム分岐状ＰＥＧｓは、ペンタエリトリオールとエチレンオキシドから製造することができる。分岐状ＰＥＧｓは、通常２〜８アームを有し、そして例えばEP-A0473084およびUS Patent No.5,932,462に記載されている。特に好ましいのは、リシンの第一のアミノ基を介して連結された２つのＰＥＧ側鎖（ＰＥＧ２）を有するＰＥＧｓである(Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6(1995)62-69)。
【００３８】
本明細書で使用された「実質的に均一な」は、製造され、含有されまたは使用された唯一のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体分子が１つまたは２つのＰＥＧ基を結合されているＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体分子であることを意味する。調製物は、少量の未反応（即ち、ＰＥＧ基を欠いている）タンパク質を含有することができる。ペプチドマッピングおよびＮ末端配列決定により確められたとおり、下記の１つの例は、少なくとも９０％のＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ変異体コンジュゲートおよび多くても５％の未反応タンパク質である調製物を提供する。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体のこのような均一な調製物の単離および精製は、通常の精製方法、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィーにより行うことができる。
【００３９】
本明細書で使用された「モノＰＥＧ化された」は、ＩＧＦ−Ｉ変異体が、ＩＧＦ−Ｉ変異体分子当たり１個のみのリシンにおいてＰＥＧ化され、その際１個のみのＰＥＧ基がこの部位で共有結合されていることを意味する。このようなモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉは、ある程度までＮ末端においてさらにＰＥＧ化されていてもよい。純粋なモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体（Ｎ末端ＰＥＧ化を伴わない）は、調製物の少なくとも８０％、好ましくは９０％であり、最も好ましくはモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は調製物の９２％以上であり、残りは例えば未反応（ＰＥＧ化されていない）ＩＧＦ−Ｉおよび／またはＮ末端でＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体である。したがって、本発明に従うモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体調製物は、例えば薬学的用途において均質な調製物の利点を示すのに十分に均一である。同じことがジＰＥＧ化された種に当てはまる。
【００４０】
「活性化されたＰＥＧｓまたは活性化されたＰＥＧ試薬」は、当技術分野の状態で周知である。好ましくは、ポリ（エチレングリコール）のアルコキシ酪酸スクシンイミジルエステル（「低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＢＡ」）またはポリ（エチレングリコール）のアルコキシプロピオン酸スクシンイミジルエステル（「低級アルコキシ−ＰＥＧ−ＳＰＡ」）またはＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性化ＰＥＧｓなどの求電子的に活性化されたＰＥＧｓが使用される。活性化されたエステルをアミンと反応させてアミドを形成する任意の慣用の方法を利用することができる。ＩＧＦ−Ｉと活性化されたＰＥＧとの反応において、例示されたスクシンイミジルエステルは、アミド形成を引き起こす離脱基である。タンパク質とのコンジュゲートを製造するためのスクシンイミジルエステルの使用は、US Patent No.5,672,662に開示されている。
【００４１】
使用される反応条件は、異なってＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉ変異体の相対的量に影響を与える。反応条件（例えば、試薬の割合、ｐＨ、温度、タンパク質濃度、反応時間等）を操作することにより、異なるＰＥＧ化種の相対的量を変えることができる。好ましくは、５〜１５％（容積／容積）のエタノールおよび０．５〜４％（容積／容積）のエチレングリコールを含有するｐＨ８〜１０の緩衝化された水性溶液中で反応を行う。モノＰＥＧ化変異体を製造する場合には、タンパク質：ＰＥＧ比は好ましくは１：０．５〜１：２であり、ジＰＥＧ化変異体を製造する場合には、１：２．２〜１：５である。反応温度および反応時間は、当業者の知見に従って変えることができ、その際高い温度および長い反応時間は、増加したＰＥＧ化をもたらす。したがって、モノＰＥＧ化変異体を製造する場合には、４℃で３０分以下の間操作することが好ましい。好ましくは５０mMホウ酸ナトリウム、１０％エタノールおよび１％ジ（エチレングリコール）（ＤＥＧ）からなる反応バッファー中で約９．０のｐＨ、約１：１．５のタンパク質：ＰＥＧ比および４℃からの反応温度で、ＰＥＧ化試薬をＩＧＦ−Ｉ変異体と一緒にすると、モノＰＥＧ化種、ジＰＥＧ化種および痕跡量のトリＰＥＧ化種の混合物が生成される。タンパク質：ＰＥＧ比が約１：３であるならば、主としてジＰＥＧ化種およびオリゴＰＥＧ化種が生成される。
【００４２】
本発明に従うＩＧＦ−Ｉ変異体コンジュゲートは、ＩＧＦ−Ｉ変異体の第一のリシンアミノ基を二官能性試薬と共有結合的に反応させて、アミド結合を有する中間体を形成し、アミド結合を有する該中間体を活性化されたポリ（エチレングリコール）誘導体と共有結合的に反応させて、ＩＧＦ−Ｉ変異体コンジュゲートを形成することにより、調製することができる。前記方法において、二官能性試薬は、好ましくはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオプロピオネートまたはＮ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテートであり、そして活性化されたポリ（エチレングリコール）誘導体は、好ましくは、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧ、メトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンおよびメトキシ−ＰＥＧ−マレイミドからなる群より選ばれる。
【００４３】
特に好ましいのは、４０kDaの分子量のＮ−ヒドロキシスクシンイミジル活性化分岐状ＰＥＧエステル（ｍＰＥＧ２−ＮＨＳ）の使用である((Monfardini, C., et al., Bioconjugate Chem. 6(1995)62-69; Veronese, F. M., et al., J. Bioactive Compatible Polymers 12(1997)197-207; US Patent 5,932,462)。
【００４４】
ＩＧＦ−Ｉ変異体コンジュゲートは、ＩＧＦ−Ｉ変異体へのチオール基のアミノ反応性共有結合（「活性化」）および得られる活性化されたＩＧＦ−Ｉ変異体をポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体とカップリングさせることにより調製されうる。第１工程は、ＩＧＦ−Ｉ変異体のリシンＮＨ２基を介するチオール基の共有結合連結を含む。ＩＧＦ−Ｉ変異体のこの活性化は、保護されたチオール基と、追加の反応性基、例えば活性エステル（例えばスクシンイミジルエステル）、無水物、スルホン酸のエステル、それぞれカルボン酸およびスルホン酸のハロゲン化物を有する二官能性試薬により行われる。チオール基は、当技術分野で知られている基、例えばアセチル基により保護される。これらの二官能性試薬は、リシンアミノ酸のε−アミノ基と、アミド基を形成することにより反応することができる。二官能性試薬の調製は当技術分野で知られている。二官能性ＮＨＳエステルの前駆体はDE3924705に記載されており、アセチルチオ化合物への誘導体化は、March, J., Advanced Organic Chemistry (1977)375-376により記載されている。二官能性試薬ＳＡＴＡは市販されており(Molecular probes, Eugene, OR, USA and Pierce, Rockford, IL)そしてDuncan, R. J., Anal. Biochem. 132(1983)68-73に記載されている。
【００４５】
反応は、例えば、水性バッファー溶液、ｐＨ６．５〜８．０中で、例えば１０mMリン酸カリウム、３００mM  ＮａＣｌ、ｐＨ７．３中で行われる。二官能性試薬はＤＭＳＯ中に加えることができる。反応の完了後、好ましくは３０分の後、反応をリシンの添加により停止させる。過剰の二官能性試薬は、当技術分野で知られている方法、例えば透析またはカラム濾過により分離することができる。ＩＧＦ−Ｉ変異体に付加されたチオール基の平均数は、例えば、Grasetti, D.R., and Murray, J. F., in Arch. Biochem. Byophys. 119(1967)41-49に記載された測光法により決定されうる。上記の反応に続いて、活性化されたポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）誘導体の共有結合カップリングを行う。
【００４６】
活性化されたＰＥＧ誘導体は、当技術分野で知られておりそして、例えば、ＰＥＧ−ビニルスルホンについてはMorpurgo, M., et al., J. Bioconjugate Chem. 7(1996)363-368 に記載されている。線状鎖および分岐状鎖ＰＥＧ種は、式Ｉの化合物の調製のために適当である。反応性ＰＥＧ試薬の例は、ヨード−アセチル−メトキシ−ＰＥＧおよびメトキシ−ＰＥＧ−ビニルスルホンである。これらのヨードで活性化された物質の使用は当技術分野で知られておりそして、例えば、Hermanson, G. T.,により Bioconjugate Techniques, Academic Press, San Diego(1996)pp. 147-148に記載されている。
【００４７】
モノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体および／またはジＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の分離および好ましくはＮ末端でＰＥＧ化された形態からの分離を含む、本発明に従う化合物の更なる精製は、当技術分野で知られている方法、例えばカラムクロマトグラフィー、好ましくはイオン交換クロマトグラフィー、特にカチオン交換クロマトグラフィーにより行うことができる。
【００４８】
モノＰＥＧコンジュゲートの百分率およびモノＰＥＧ種とジＰＥＧ種の比は、溶離ピークの辺りのより広い画分をプールして、モノＰＥＧまたはより狭い画分の百分率を減少させて、組成物におけるモノＰＥＧの百分率を増加させることによりコントロールすることができる。約９０％モノＰＥＧコンジュゲートは、収率と活性の良好なバランスである。ときには、例えばコンジュゲートの少なくとも９５％または少なくとも９８％がモノＰＥＧ種である組成物が所望されうる。本発明の態様では、モノＰＥＧ化コンジュゲートの百分率は、９０〜９８％である。
【００４９】
本明細書で使用された「極性アミノ酸」は、システイン（Ｃ）、アスパラギン酸（Ｄ）
、グルタミン酸（Ｅ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、アルギリン（Ｒ）、セリン（Ｓ）およびトレオニン（Ｔ）からなる群より選ばれるアミノ酸を指す。リシンもまた極性アミノ酸であるが、リシンは本発明に従って置換されるので排除される。アルギニンが好ましくは極性アミノ酸として使用される。
【００５０】
医薬処方
本発明に従うＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉは、循環において改良された安定性を与えて、低い適用間隔で、身体全体にわたるＩＧＦ−Ｉレセプターへの持続したアクセスを可能とする。
【００５１】
ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、混合物として、またはイオン交換クロマトグラフィーもしくはサイズ排除クロマトグラフィーで分離された異なるＰＥＧ化種として投与することができる。本発明の化合物は、当業者に知られている医薬組成物の調製方法に従って処方されうる。このような組成物の製造のために、本発明に従うＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体は、好ましくは医薬組成物の所望の成分を含有する水性溶液に対する透析により、薬学的に許容される担体との混合物において組み合わされる。このような許容される担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, 1990, Mack Publishing Company, edited by Oslo et al.（例えば、１４３５〜１７１２頁）に記載されている。典型的な組成物は、適当な量の担体と共に、有効量の、例えば約０．１〜１００mg/mlの本発明に従う物質を含有する。組成物は、非経口的に投与することができる。本発明に従うＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉは、好ましくは腹腔内、皮下、静脈内または鼻腔内適用により投与される。
【００５２】
本発明に従う医薬処方は、当技術分野で知られている方法に従って調製されうる。通常、ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体の溶液を医薬組成物で使用することを意図するバッファーに対して透析し、そして濃縮または希釈により最終の所望のタンパク質濃度を調節する。
【００５３】
このような医薬組成物は、好ましくは腹腔内、皮下、静脈内または鼻腔内適用により注射または注入(infusin)するための投与に使用することができ、そして薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、佐剤および／または担体と共に有効量のＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体を含有することができる。このような組成物は、種々のバッファー内容物（例えばアルギニン、アセテート、ホスフェート）の希釈剤、ｐＨおよびイオン強度、添加剤、例えば洗剤および可溶化剤（例えばTween（商標）80／ポリソルベート(polysorbate)、プルロニック（商標）Ｆ６８）、酸化防止剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（Timersol（商標）、ベンジルアルコール）および増量物質（例えばサッカロース、マンニトール）を含み、ポリマー化合物、例えば、ポリ乳酸、ポリグリコール酸等の特定の調製物へのまたはリポソームへの前記物質の配合を含む。このような組成物は、本発明従うモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉの物理的状態、安定性、放出およびクリアランスの速度に影響を与えることができる。
【００５４】
投薬量および薬物濃度
典型的には、標準処置計画では、患者は１日から約３０日までまたはそれより長く続くある期間にわたり１日当たりＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体０．００１〜３mg、好ましくは０．０１〜３mgの範囲の投薬量で処置される。薬物は、０．１〜１００mgＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ／mlを含有する医薬処方剤の１日１回の皮下または静脈内または腹腔内ボーラス注射または注入として適用される。この処置は、標準処置の前、標準処置中または標準処置の後にＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉを適用することにより、任意の標準（例えば化学療法）処置と組み合わせることができる。これは標準処置単独と比較して改良された結果をもたらす。
【００５５】
本発明に従うＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉは、成功する処置のために週当たり１回または２回だけ投与すればよいことが見出された。ゆえに、本発明の更なる態様は、アルツハイマー病の処置を必要としている患者に、治療的に有効量の本発明に従うＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉを、各々kg当たりそして３〜８日当たり好ましくは７日当たりＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体０．００１〜３mg、好ましくは０．０１〜３mgの範囲において１回の投薬量で投与することを含むアルツハイマー病の処置のための方法である。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉとして、好ましくはモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉが、好ましくはモル比が少なくとも１：１である本発明に従うリシンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体およびＮ末端でＰＥＧ化されているＩＧＦ−Ｉ変異体の組成物として使用される。
【００５６】
本発明の更なる態様は、アルツハイマー病の処置を必用としている患者に、治療的に有効量で且つkg当たりそして６〜８日当たり好ましくは７日当たりＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体０．００１〜３mg、好ましくは０．０１〜３mgの範囲において１回または２回の投薬量で投与される、アルツハイマー病の処置用の医薬の調製のための本発明に従うＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉの使用である。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉとして、好ましくはモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉが、好ましくはモル比が少なくとも１：１である本発明に従うリシンＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ変異体およびＮ末端でＰＥＧ化されているＩＧＦ−Ｉ変異体の組成物として使用される。
【００５７】
下記の実施例、参考文献および図は、その真の範囲が特許請求の範囲に記載されている本発明の理解を助けるために与えられる。本発明の精神から逸脱することなく示された方法において改変がなされうることは理解される。
【００５８】
配列リスティング
ヒトＩＧＦ−Ｉの配列番号１アミノ酸配列（アミノ酸１〜７０  ＩＧＦ−Ｉ；SwissProt P01343に従うアミノ酸７１〜１０５プロペプチド）。
【００５９】
実施例
物質および方法
リコンビナントヒトインスリン様増殖因子（ｒｈＩＧＦ−Ｉ）はCell Concepts(Umkirch, Germany)を介してPeproTech(Rocky Hill, NJ, USA)から購入されそしてＤｅｓ（１〜３）−ＩＧＦ−Ｉは、GroPep(Adelaide, Austria)から得られた。ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）試薬は、Nektar Ltd(San Carlos, CA, USA)から送られた。この研究のためのすべての他の化学品および溶媒は、入手可能な最も高い純度であった。ＩＧＦ−Ｉ変異体は、例えば、好ましくはUS 6,509,443またはUS6,403,764に記載されたとおりＥ．ｃｏｌｉにおける発現方法と組み合わせて部位特異的突然変異誘発を使用することにより、当技術分野の状態に従ってリコンビナントに製造されうる。
【００６０】
ＩＧＦ−ＩのＰＥＧ化
単一の部位におけるＰＥＧ化を有するＩＧＦ−Ｉ異性体（モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ）を製造した。モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉは、ＩＧＦ−Ｉ分子の表面またはＮ末端のリシンε−アミノ基の、４０kDa分子量の活性化された分岐状ＰＥＧ部分とのコンジュゲーションにより調製された。ＰＥＧ化反応混合物は、５０mMホウ酸ナトリウムバッファー（１０％エタノールおよび１％ＤＥＧ）、ｐＨ９．０中に１：１．５モル比においてｒｈＩＧＦ−Ｉおよび４０kDaＰＥＧ−ＮＨＳ試薬を含有していた。反応を４℃で３０分間行った。使用したＰＥＧ部分の４４kDaの平均分子量およびＩＧＦ−Ｉの７．６kDaの分子量に基づいて、モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの計算された平均分子量は、ほぼ５１．６kDaと予測された。
【００６１】
イオン交換クロマトグラフィーによるＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ位置異性体の分離
分取強カチオン交換カラム（TOSOH-BIOSEP, SP-5PW、３０mm内径および７５mm長さ）による精製スキームを使用して、純粋なモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体を調製した。バッファー系は、ｐＨ４．５に調節された７．５mM酢酸ナトリウム、１０％エタノールおよび１％ジエチレングリコール（バッファーＡ）およびｐＨ６．５に調節された２０mMリン酸カリウム、１０％エタノールおよび１％ジエチレングリコール（バッファーＢ）からなっていた。
【００６２】
カラムを２５％バッファーＢと予備平衡化した。ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉサンプルをローディングした後、カラムを３５％バッファーＢで洗浄し、続いて６５％に上昇していく線状勾配で洗浄して異性体を分離した。ＰＥＧ化されていないＩＧＦ−Ｉの溶離のために、系をｐＨ８．０を有する改変されたバッファーＢに切り替えた。流速は８ml／分でありそして検出を２１８ｎｍで行った。得られるタンパク質サンプルを手動で集めそして−２０℃でアリクォートにして貯蔵して、種々の化学的および生物学的タンパク質アッセイにより分析した（下記参照）。
【００６３】
分析用強カチオン交換カラム（TOSOH-BIOSEP, SP-NPR、２．５μm粒経、４．６mm直径、３．５cm長さ）を使用して分離された位置異性体の純度を調べた。この分析カラムのために、我々は、分取カラムの場合と同じ移動相を、しかし減少した流速および運転時間で、使用した。モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体のタンパク質濃度は、モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのタンパク質部分の２８０nm吸収（Ｅ＝０．５８４）に基づいて分光側光により決定した。
【００６４】
モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ純度の分析
個々のモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体は、非還元条件または還元条件下に４〜１２％トリス−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。タンパク質を固定しそしてSimple Blue SaveStatin(Invitrogen, Basel, Switzerland)を使用して染色した。
【００６５】
モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体の質量分析法同定
精製したモノＰＥＧ−ＩＧＦ異性体をＡｓｐ−Ｎで開裂してＮ末端、Ｋ２７、Ｋ６５またはＫ６８における４つの可能なＰＥＧ化部位を同定した。開裂バッファーは、０．０４μg/μlＡｓｐ−Ｎを伴う１００mMトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０からなっていた（Roche Diagnostics GmbH, DE）。２０μgモノＰＥＧ−ＩＧＦを、１μgＡｓｐ−Ｎと共に開裂バッファー中で３７℃で１６時間インキュベーションした。１６時間後に反応混合物をＴＣＥＰ（１０mM）の添加により３７℃で１．５時間還元した。次いで、反応溶液を１／２０容積の１０％ＴＦＡの添加によりクエンチして開裂反応を終わらせた。得られたペプチド混合物をオンラインＨＰＬＣ  ＥＳＩ質量分析法、ＨＰＬＣにより直接分析するかまたは−８０℃で貯蔵した。
【００６６】
ＥＳＩ−ＬＣ−ＭＳＤ分析のために、ペプチド混合物をPhenomenex Jupiter C18逆相カラム（１×２５０mm、５μm、３００Å）を備えたAgilent 1100 HPLCシステムで、４０μl/分の流速で分離した。ＵＶシグナルも２２０nmで記録された。Ｑ−ＴｏＦＩＩまたはＬＣＴ質量分析計(Micromass)を、ＨＰＬＣシステムに直接カップリングした。ＥＳＩ−ＴｏＦスペクトルを、２００〜２０００m/zの質量範囲で１スキャン／秒で記録した。ＵＶおよびＴＩＣスペクトルを評価しそして各ペプチドをクロマトグラの単一のピークに帰属させることができた。
【００６７】
ＨＰＬＣ分析では、ペプチド混合物をPhenomenox Jupiter C18逆相カラム（１×２５０mm、５μm、３００Å）を備えたAgilent 1100 HPLCシステムで、４０μl/分の流速で分離した。ＵＶシグナルも２２０nmで記録された。ＰＥＧペプチドをより高いアセトニトリル濃度に向けて保持時間においてシフトさせそしてＮ末端エドマン分解に供した。
【００６８】
ＨＰＬＣ運転のための条件（溶媒Ａ：水中の０．１％ＴＦＡ、溶媒Ｂ：アセトニトリル中の０．１％ＴＦＡ）を表１に示す。
【００６９】
【表１】
2008524296.tif 000003
【００７０】
Ｎ末端エドマン分解配列決定を、Applied Biosystens Procise システムで行った。Ｎ末端エドマン分解配列決定は、製造者の指示に従ってprociseシステムコントロールソフトウエアを有する Applied Biosystems Proteinsequencer Procise 492で行われた。ＨＰＬＣ運転から採集された画分２０μlを、ＢｉｏＢｒｅｎｅ  Ｐｌｕｓ（商標）で状態調節されたミクロＴＦＡフィルターに直接適用した。フィルターをカートリッジシールで覆われたアルゴン下に乾燥しそしてタンパク質シーケンサーに導入した。自動標準プログラムを使用してポリペプチドの逐次の分解を行った。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓデータ評価ソフトウエア６１０Ａによる各分解サイクルからのＨＰＬＣクロマトグラムの分析は、各アミノ酸の位置を示した。システインおよびペグ化リシンのような改変されたアミノ酸は、クロマトグラムにおいてギャップとして現れた。
【００７１】
オリゴヌクレオチドアレー転写分析
異なるモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写プロファイリングのために、ＩＧＦ−ＩＲで安定にトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、２時間血清飢餓状態にし、そして０．１または１μg/mlｒｈＩＧＦおよびそれぞれのモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体または分離しないで得られたすべての異性体の混合物１μg/mlと共に２４時間にわたり血清の不存在下にインキュベーションした。次いで培養した細胞を回収しそしてトータル細胞ＲＮＡをＲＮＡ−ＢｅｅＴＭで抽出した。各サンプルから１０μgＲＮＡを逆転写し、標識しそして供給者の指示(Invitrogen, Basel, Switzerland; Ambion, Huntingdon,UK)に従って市販のキットを使用することによりプロセッシングした。アルカリ性熱フラグメント化の方法およびＭＯＥ  ４３０Ａ  ＧｅｎｅＣｈｉｐアレーのためのハイブリダイゼーション条件は、製造者により与えられた標準手順であった(Affymetrix, US)。
【００７２】
アレーの蛍光（細胞強度）を共焦点レーザースキャナーで記録しそしてデータをＭＡＳ  ５．０ソフトウエア（Affymetrix, US）を使用して解析した。各遺伝子の発現レベルは、ミスマッチしたオリゴヌクレオチドへのハイブリダイゼーションと比較して蛍光強度の標準化された平均差として計算され、平均差（ＡＤ）として表された。各実験は生物学的変動を考慮するために三重で(in triplicate)行った。
【００７３】
下記の２つの基準がディファレンシャルに発現された遺伝子の選択のために選ばれた：ｉ）処置された細胞のｍＲＮＡレベル値は、非処置細胞と比較して少なくとも５倍高いかまたは５倍低くなければならない。ｉｉ）標準偏差は、平均差の絶対変化よりも有意に小さくなければならずそして遺伝子の計算された信頼水準は９７％より大きく設定された（ｐ＜０．０３）。
【００７４】
ＩＧＦ−ＩＲリン酸化アッセイ
ヒトＩＧＦ−ＩＲでトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、２〜４継代でこれらの実験のために使用した。細胞をコーティングされていない２４ウェルプレートまたは９６ウェルプレートにおいて培養しそして７０％のコンフルエンシーまで増殖させた。次いで、細胞を、一夜血清飢餓状態にし、次いでｒｈＩＧＦ−ＩまたはそれぞれのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉピーク（またはピーク混合物）と３０分間インキュベーションした。次いで細胞をウエスタンのためにＬａｅｍｍｌｉバッファー中で溶解するかまたはＩＧＦ−ＩＲリン酸化の細胞内分析(in-cell analysis)のために４％ホルムアルデヒドで３０分間固定した。ウエスタン分析のために、タンパク質抽出物を１０％Ｂｉｓ−ＴｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しそしてニトロセルロース膜上にブロットした。ブロットを、マウス抗ホスホチロシン（４Ｇ１０、１：１０００；Upstate）およびウサギ抗ＩＧＦ−ＩＲ（Ｃ−２０、１：１０００；Santa Cruz）一次抗体と共インキュベーションし、そして抗マウスＡｌｅｘａ６８０（１：１００００; Molecular Probes）および抗ウサギＩＲＤｙｅ８００二次抗体（１：１００００; Jackson）で標識した。細胞内分析のために、固定された細胞を、２％ヤギ血清およびＴｒｉｔｏｎＸ−１００（０．１％）でブロッキングしそして透過性を上げ、同じ一次および二次抗体と共にインキュベーションした。タンパク質バンドの蛍光検出は、Ｏｄｙｓｓａｙイメージングシステム（Licor Biosciences）により行った。デジタル像から、タンパク質バンドの画素強度を定量しそして用量応答曲線を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して解析した。ホスホチロシンレベルを、関心のある同じ領域から得られたＩＧＦ−ＩＲ値で標準化して、リアルＩＧＦ−ＩＲ活性化変化を得た。実験は二重で(in duplicate)行いそして３回反復して用量当たり６つの独立した調査を得た。データは平均±ＳＥＭとして表した。
【００７５】
ｒｈＩＧＦ−ＩおよびＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体によるｉｎ  ｖｉｖｏ実験
シングルトランスジェニックＡＡＰおよびダブルトランスジェニックＰＳ２ＡＡＰマウス（Richards, J. Neurosci. 23(2003)8989-9003)からなるアルツハイマー病のためのマウスモデルを使用して、他のマウスおよびラットモデルにおいて最近示された脳アミロイドシス(Carro, E., et al., Nat. Med. 8(2002)1390-1397)に対するｒｈＩＧＦ−Ｉ（およびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ）の効果を調べた。ＰＳ２ＡＰＰマウスモデルは、２ヶ月での測定可能なＡβレベルおよび８ヶ月齢での班沈着(plaque deposition)の発症を伴うアミロイドシスを発生することが示された(Richards, J. Neurosci. 23(2003)8979-9003)。シングルトランスジェニックＡＰＰマウスは、この若い年齢において非常に類似したＡβレベルを示し、従ってグループに含まれた。我々は、前班齢(pre-plaque age)（２〜３ヶ月）を分析して、可溶性脳Ａβレベルに対するｒｈＩＧＦ−ＩおよびＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体の効果を調べた。すべての実験は、スイス動物保護権に従って行いそして動物の苦しみは最小に保たれた。１０％グリセロールを伴う１mMＨＣｌ中の（ｒｈＩＧＦ−Ｉ）またはＰＢＳ中の（モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体）ストック溶液から、注射剤を１％より少ない溶媒を伴う０．９％ＮａＣｌ中に調製した。対照は０．９％ＮａＣｌを注射された。注射は、僅かなイソフルラン麻酔の下に腹腔内に行われた。注射後の異なる時点で（２時間、６時間、２４時間、４８時間または７２時間）、動物をイソフルラン麻酔の下で殺した。マウスを断頭しそして脳を終脳（海馬を含む皮質）の単離のために除去した。皮質タンパク質抽出物を、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル（両方ともＳｉｇｍａ）を伴う４mMＴｒｉｓｐＨ７．４および３２０mMスクロース（両方ともＦｌｕｋａ）を含有する低張溶解バッファー中で調製した。サンプルバッファーは、８M尿素を含有するＬａｅｍｍｌｉであった（Ｆｌｕｋａ）。タンパク質を４〜１２％Ｂｉｓ−ｔｒｉｓＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離しそしてニトロセルロース膜上にブロットした。ブロットを、ＡＰＰ、Ｃ９９フラグメントおよびＡβを検出するマウス抗アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）（ＷＯ−２クローン、１：５０００；Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ）およびヤギ抗アクチン（Ｃ−１１、１：５０００；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）一次抗体と共インキュベーションしそして抗マウスＡｌｅｘａ６８０（１：１００００、Molecular Probes）および抗ヤギＩＲＤｙｅ８００二次抗体（１：１００００; Jackson）で標識した。タンパク質バンドの蛍光検出は、Ｏｄｙｓｓａｙイメージングシステム（Licor Biosciences）により行った。デジタル像から、タンパク質バンドの画素強度を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウエアを使用して解析した。データは平均±ＳＥＭとして表された。
【００７６】
すべての値は、アクチン（または対照タンパク質としてアルブミン）に対して標準化しそして特異的比(specific ratios)（Ｃ９９／ＡＰＰ、Ａβ／ＡＰＰ、Ｃ９９／Ａβ）を計算した。Ｃ９９／ＡＰＰ比は、β−セクレターゼおよびγ−セクレターゼの活性状態に関する情報を与える。何故ならば、Ｃ９９はβ−セクレターゼの産物であり且つγ−セクレターゼの基質であるからであり；この目安の変化は、Ａβのその後の運命とは無関係にこれらのセクレターゼの１つに対するモデュレーション効果と示すであろう。特定の処置後の一定のＣ９９／ＡＰＰレベルで、Ｃ９９／Ａβ比は、Ａβの産生とは無関係にＡβのクリアランスを監視し、クリアランス速度の増加とともに高くなり、そしてクリアランス速度が減少すると低くなる。更に、Ａβは、ＡＰＰに対して標準化された。何故ならばその産生は個々のマウス間で変わるトランスジェニックＡＰＰ発現に依存するからである。比の計算は、個々の動物ごとに行った。すべての得られたデータは、すべての実験で含まれた非処置対照グループの％で表される。２〜５匹の動物／用量／時間間隔での個々の実験を２〜４回反復した。統計的差は、統計的に有意であると考えられるｐ＜０．０５でアンペアードｔ検定(unpaired t tests)により平均±ＳＥＭから評価された。
【００７７】
実施例１
モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ位置異性体のクロマトグラフィーによる分離
ＩＧＦ−Ｉは、潜在的ＰＥＧ化部位として４つのアミノ基を含有しそして４つの可能なモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ（モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ）異性体が予想された。更なる誘導体は、反応条件に依存してオリゴＰＥＧ化されることが予測された。強カチオン高速液体クロマトグラフィー法（ＩＥＣ−ＨＰＬＣ）は、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉまたは−Ｄｅｓ（１〜３）−ＩＧＦ−Ｉ異性体の局所的電荷差に基づくそれらの分離のために開発された。５mgＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの分取溶離プロフィルを図１に示す。この方法の結果は５つの主要なピークへの分離であり、３つはベースライン分離を伴い、２つは部分分離を伴う。クロマトグラムの端部に向けてのベースライン吸収の減少は、より高い保持時間で溶離する追加のモノＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉ種のないことを示唆する。追加のピークは、異なるｐＨを有する改変されたバッファーＢへの切り替えから生じる追加のピークがピーク３と４との間に現れる。分析的ＩＥＣ−ＨＰＬＣを使用して個々の異性体の純度およびにＩＥＣ画分における他の位置異性体による汚染を評価した。すべてのモノＰＥＧ化ピークは、＞９９％の純度を有していた。
【００７８】
実施例２
モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析
非還元条件および還元条件条件下にＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って、分子間ジスルフィド橋による異なるＩＧＦ−Ｉ分子の潜在的な望まれない架橋を評価した。両条件は、同様な結果を生じ、有意な量のタンパク質が異常に架橋されていないことを示す（図２）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、ピーク０が＞１００ｋＤａのみかけの分子量を有し、これに対して主要な検出されたバンドが〜７０ｋＤａにおけるピーク１〜３であり；更にピーク４は、ＰＥＧ化されていないＩＧＦ−Ｉについて予測されたサイズ、〜７ｋＤａで検出されたことを示した（図２）。このランニングプロフィルおよびＨＰＬＣで得られた保持時間から、我々は、ピーク０はおそらく間違いなくジＰＥＧ−ＩＧＦ−ＩおよびオリゴＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉからなると結論した。対照的に、ピーク１〜３は３つの異なるモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体として指名された。モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの予測された分子量（５１．６kDa）と〜７０kDaの見かけのサイズとの間に相違があったが、しかしながら、観察されたより高い見掛けの分子量は、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉの電気泳動移動度を相当遅くしそして見かけの分子量を増加させる水の結合による、ＰＥＧのより大きい流体力学的容積により説明されうる(Foser, S., et a;., Pharmacogenomic J. 3(2003)319)。ＩＥＣ−ＨＰＬＣとＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験は、一緒になって、ＩＥＣ画分の純度は更なる特徴付けのために十分に純粋であると考えられうることを示す。
【００７９】
ＰＥＧ化およびモノＰＥＧ−Ｄｅｓ（１〜３）−ＩＧＦ−Ｉの分離は、ｒｈＩＧＦ−Ｉに対応して行われそして同様に３つの主要なモノＰＥＧ−Ｄｅｓ（１〜３）−ＩＧＦ−Ｉピークを生じた。
【００８０】
実施例３
モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体の分析
Ａｓｐ−ＮによるｒｈＩＧＦ−Ｉの開裂は、３０〜４５分保持時間でＨＰＬＣにより分離された６つの独立したペプチドフラグメントを生じた（図３Ａ、上部パネル）。精製されたピーク１〜３の開裂後（図３Ａ、下部パネル）６つのフラグメントの異なる分布および〜７０分保持時間で溶離する追加のフラグメント（フラグメント７）の存在が観察された。ピーク１では、フラグメント７の付随する増加を伴って、ペプチドフラグメント４は明確に減少した。ピーク２では、我々は、フラグメント３の明らかな減少およびフラグメント５の僅かな減少ならびに主要なおよび少ないＰＥＧフラグメント（７および７’）の出現を観察した。同様に、ピーク３のＨＰＬＣ分析は、フラグメント７および７’の付随する出現を伴って、フラグメント３および５の明らかな減少を生じた。図１１Ｂは、ｒｈＩＧＦ−ＩのＡｓｐ−Ｎ開裂により得られたそれぞれのフラグメントのペプチド配列を示す。エドマン末端ペプチド分解を使用して、我々は、ＰＥＧ化ピーク１，２および３で得られた主要フラグメント７のペプチド配列を分析した。その際、システインおよびＰＥＧ化アミノ酸はペプチド配列においてあき(breaks)として示された。この分析を使用して、ピーク１は、Ｋ２７でＰＥＧ化されているｒｈＩＧＦ−Ｉとして明白にマッピングすることができた（図３Ｃ）。ピーク２では、主要フラグメント７（＞９０％）はＰＥＧ化されているＫ６５としてマッピングされた。何故ならばＫ６８はエドマン分解により改変されていないリシン（Ｋ）として確認されたからである。対照的に、ピーク３の画分は、Ｋ６８におけるＰＥＧ化を示し（配列におけるギャップ）、Ｋ６５はエドマン分解ＨＰＬＣクロマトグラムにおけるシグナルをもたらす（図３Ｃ）。小さいピーク７’は、エドマン分解により配列決定できなかったが、これは、多分ＰＥＧ化により、Ｎ末端が反応にアクセスできなかったことを示す。これらのデータは、一緒になってピーク１がＫ２７ＰＥＧ化異性体からなり、ピーク２はＫ６５においてＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉでありそしてピーク３は有意な量のＮ末端でＰＥＧ化されたＩＧＦ−Ｉを伴ってＫ６８ＰＥＧ化されていることを示す。
【００８１】
実施例４
ｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体の転写プロファイリング
ＤＮＡマイクロアレーを使用して、我々は、ヒトＩＧＦ−ＩＲで安定にトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞の転写応答をｒｈＩＧＦ−ＩまたはＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体による２４時間処置にわたって決定した。したがって、我々はＩＧＦ−Ｉ０．１および１μg/mlまたはＰＥＧ化反応から得られたモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉピークもしくはピーク混合物１μg/mlで細胞を刺激した。我々は、すべての既知のＩＧＦ−Ｉ応答遺伝子を含む約１４，０００マウス遺伝子のためのプローブ組を含有する市販のチップタイプ（ＭＯＥ  ４３０Ａ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｉｎｃ，）を使用して、刺激された細胞の全体的転写活性を対照培養物と比較した。ｍＲＮＡアバンダンス(mRNA abundance)は、完全マッチオリゴヌクレオチドプローブと中心位置にミスマッチを有する対応するプローブとの平均差（ＡＤ）として表された。我々は、５より大きい変化係数を有しそして３つの生物学的複製物内で９７％再現性（ｐ値＜０．０３）を有する遺伝子のみを考慮した。この分析は、全部で１６２遺伝子に生じ、８６はすべてのＩＧＦ−Ｉ変異体によりアップレギュレーションされそして７６はダウンレギュレーションされた。異なるモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体の転写活性についての一般的相関プロフィルは、図４でアップレギュレーションされた遺伝子およびダウンレギュレーションされた遺伝子の階層的クラスターの形態で例示される。ＩＧＦ−Ｉ０．１μg/mlおよび１．０μg/mlの個々の遺伝子の誘導レベルの検査は、選ばれたクラスターが非常に類似していることを示す。ピーク３は、同じ濃度でのＰＥＧ化されていないＩＧＦ−Ｉと同様な発現プロフィルを発生し、そしてそれはＰＥＧ−ＩＧＦ混合物および他のピークより高い効能がある。興味深いことに、ピーク２はＰＥＧ−ＩＧＦ混合物のような同様な転写応答をトリガーする。生物学的活性と合致して、ピーク１は最も弱い転写応答を示し、これはＰＥＧ化がレセプター相互作用を妨害することを示す。
【００８２】
実施例５および６
ｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉによるｉｎ  ｖｉｔｒｏＩＧＦ−ＩＲリン酸化
ＩＧＦ−ＩＲ活性化のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分析のために、ヒトＩＧＦ−ＩＲを安定に発現するＮＩＨ−３Ｔ３細胞を使用した。一夜血清飢餓状態にした後、細胞をｒｈＩＧＦ−ＩまたはそれぞれのＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体の増加していく用量（０．００３〜１０μg/ml）で処置した。リン酸化されたＩＧＦ−ＩＲのウエスタン分析は、上記に従って行われそして得られた用量応答曲線は、Ｈｉｌｌ係数（ｎＨ）を含む一部位結合速度論(one-site binding kinetics)に適合しており；会合曲線の定量的データは図６の表に示される。ｒｈＩＧＦ−Ｉの用量応答（図５Ａ）は、６．３mMのＥＣ５０を生じそして２．２７のｎＨでほぼすべてか無かの方式で起こった（図６）。対照的に、モノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉのピーク１は、明白な用量応答を示さず、飽和を伴わず、０．３４のｎＨおよび９１．５nMの評価されたＥＣ５０を示した（図５Ｂ、６）。ピーク２および３（図５Ｃおよび５Ｄ）は、それぞれ１３．４および２１．５nMのＥＣ５０値を有する同様な結合アフィニティーを示した（図６）。両場合に、ｎＨは、それぞれ１．２７および１．１９で普通であった。ピーク混合物は、２８．８nMのＥＣ５０および１．２８の普通のｎＨを有する僅かに低いアフィニティーを有する同様なＩＧＦ−ＩＲ活性化パターンを証明した（図５Ｆ，７）。最後に、ＰＥＧ−Ｄｅｓ（１〜３）−ＩＧＦ−Ｉピーク３は、１０．８nMのＥＣ５０および１．０８の普通のｎＨを有するすべてのＰＥＧ異性体の最も高いアフィニティーを有していた（図５Ｆ、７）。データは、ピーク１を除くすべてのピークはｒｈＩＧＦ−Ｉと比較して２〜５倍のアフィニティーの損失を伴ってヒトＩＧＦ−ＩＲを特異的に活性化したことを示す。
【００８３】
実施例７
ｒｈＩＧＦ−Ｉによる２ヶ月齢ＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下
ダブルトランスジェニックＰＳ２ＡＰＰマウスを使用して脳Ａβロードに対するｒｈＩＧＦ−Ｉの短期間効果を分析した。我々は、これらのマウスを５０μg/kgｒｈＩＧＦ−Ｉ腹腔内により処置しそして注射の２時間後に皮質Ａβを分析した。図７Ａは、２ヶ月齢マウスからの脳抽出物のウエスタンブロットを示す。ＡＰＰ、Ｃ９９および対照タンパク質（アルブミン）レベルはｒｈＩＧＦ−Ｉにより変化しないと思われるが、Ａβレベルは、ｒｈＩＧＦ−Ｉ注射の２時間後に減少した。定量的分析を行いそしてそれぞれの画素強度の比を計算してＡβ産生に対するｒｈＩＧＦ−Ｉの潜在的効果に関する情報を得た。この分析は、ＡＰＰ／対照タンパク質（対照の９７．５±５．７％）およびＣ９９／ＡＰＰ（対照の８７．２±９．８％）比は変化しなかったが、これはトランスジェニックＡＰＰ発現もＡＰＰプロセッシングもｒｈＩＧＦ−Ｉによる処置の２時間後変化しなかったことを示していることを示した（図７Ｂ）。対照的に、Ａβ／ＡＰＰは対照の６８．４±７．１％に有意に低下し（ｐ＜０．０１）そしてＣ９９／Ａβは、対照の１５７．９±１６．６％に増加し（ｐ＜０．０１）、これはｒｈＩＧＦ−ＩがＡβを低下させたことを示す。これらのデータは、一緒になって、若いＰＳ２ＡＰＰマウスのｒｈＩＧＦ−Ｉによる２時間の処置は、主として脳からのＡβクリアランスを増加させることを示唆する。
【００８４】
実施例８
ｒｈＩＧＦ−ＩによるＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下の時間的経過
可溶性脳Ａβに対するｒｈＩＧＦ−Ｉのこの短期効果の時間的経過を評価するために、脳班のない若いＰＳ２ＡＰＰマウス（２ヶ月齢）を５０μg/kgｒｈＩＧＦ−Ｉの腹腔内注射により処置し、そして皮質ＡＰＰ、Ｃ９９、Ａβおよびアクチンレベルを２、６、または２４時間後に検出した。ＡＰＰ／アルブミンおよびＣ９９／ＡＰＰ比は、調べたいかなる時点でもｒｈＩＧＦ−Ｉにより有意に変化しなかった。ｒｈＩＧＦ−ＩによるＡβ／ＡＰＰの低下は、注射の２時間後に観察されたが、効果は６時間および２４時間後にはなかった（図８Ａ）。同様に、Ｃ９９／Ａβ比により監視されたＡβ減少の増加は、２時間にのみ検出可能でありそして６時間および２４時間には消失した（図８Ｂ）。これは、Ａβクリアランスに対するｒｈＩＧＦ−Ｉ効果は、多分血液流における単離されたＩＧＦ−Ｉの短い半減期により短い期間であったことを示す。
【００８５】
実施例９
２ヶ月齢ＡＰＰおよびＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβクリアランス効能についてのピーク１〜３の比較解析
この実施例では、ＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉピーク１〜３のデータは、Ａβの低下およびＡβクリアランスの効能の直接比較のために一緒に示される。ｒｈＩＧＦ−Ｉと同様に、ＡＰＰ／アクチン（アクチンはここでは対照タンパク質として使用された）またはＣ９９／ＡＰＰ比は、いかなる濃度のピーク１、２または３によっても変化させられなかった。ピーク３は、腹腔内注射の６時間後のＡβ／ＡＰＰの減少において最も高い効能を有していた（図９Ａ）。対照的に、ピーク１は、試験された全濃度範囲にわたって活性がなく、そしてピーク２は、使用された最も高い濃度（５００μg/kg）でＡβ／ＡＰＰを低下させることに対する有意な効果を及ぼすのみである。同様に、図９Ｂに示されたとおり、ピーク３は、増加したＡβクリアランスを表すＣ９９／Ａβ比を増加させるのに低い用量（１５〜５０μg/kg）で活性な唯一の化合物であった。この評価においても、ピーク１は不活性でありそしてピーク２は、５００μg/kgでのみ有意な効果を及ぼした。これらのデータは、一緒になって、ピーク３は、このｉｎ  ｖｉｖｏ実験パラダイムにおいて最も活性なモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体であることを示唆する。図１１は、ダブルトランスジェニックＰＳ２ＡＰＰマウスモデルだけの結果を示す。
【００８６】
実施例１０
ピーク３によるＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下の時間的経過
腹腔内注射の６時間後に、５０μg/kgのピーク３は、脳Ａβレベルの減少に有意な効果を及ぼした。この効果がいかに長く維持されるかを試験するために、我々は、５０μg/kgのピーク３で２、６、２４、４８および７２時間処置されたＰＳ２ＡＰＰマウスからの脳抽出物を分析した。全時間の期間にわたり、ＡＰＰ／アクチンまたはＣ９９／ＡＰＰ比のいずれにおいても有意な変化は観察されなかった。対照的に、Ａβ／ＡＰＰレベルは、腹腔内注射の６、２４および４８時間後に有意に減少し（それぞれ、Ｐ＜０．０５、Ｐ＜０．００１、Ｐ＜０．０１）、これは少なくとも４８時間にわたるピーク３のＡβ低下効果を示している（図１０Ａ）。Ａβ産生とは無関係に（Ｃ９９／ＡＰＰは一定に維持されているので）Ａβクリアランスを表すＣ９９／Ａβ比は、注射後少なくとも２４時間にわたり十分に維持される極めて類似した時間的経過において有意に増加した（図１０Ｂ）。これらのデータは、一緒になって、ピーク３がＰＳ２ＡＰＰにおいて脳Ａβを減少させることができることを証明する。図１２は、ダブルトランスジェニックＰＳ２ＡＰＰマウスモデルだけの結果を示す。
【００８７】
実施例１１
ＩＧＦ結合タンパク質ＩＧＦＢＰ４（ＢＰ４）およびＩＧＦＢＰ５（ＢＰ５）への結合
ＩＧＦＢＰ４（SwissProt 22692）を同定しそしてShimasaki, S., Mol. Endocrinol. 4(1990) 1451-1458によりクローニングした。ＩＧＦＢＰ５（SwissProt 245932）を同定しそしてKiefer, M.C., Biochem. Byophys. Res. Commun. 176(1991) 219-225によりクローニングした。両結合タンパク質はＥ．ｃｏｌｉにおいてリコンビナントに産生された。
【００８８】
タンパク質相互作用の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析のために、Biacore ３００機器を使用した。ランニングバッファーおよび反応バッファーは、２５℃のＨＢＳ−Ｐ（１０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ、０．００５％ポリ界面活性剤、ｐＨ７．４）であった。すべてのサンプルを１２℃に予備冷却した。ＩＧＦＢＰ４およびＩＧＦＢＰを、５μg/mlの濃度でアミンカップリングさせた。ＣＭ５チップ上でのカップリングは、〜７００ＲＵｓのローディングシグナルをもたらした。ＰＥＧ化ＩＧＦ−Ｉサンプル（アナライト）を１．２３nM〜１００nMの５つの濃度で５分間注射し（会合相(association phase)）そして５０μl/分の流速で５分間ＨＢＳ−Ｐで洗浄した。チップ表面は、１分間１００mMＨＣｌの１回の注射により再生させた。
【００８９】
チップ、アッセイフォーマットおよび注射の順序は、表２の記載に対応する。データ評価は、１：１ラングミア結合モデルを使用することにより行った。
【００９０】
【表２】
2008524296.tif 000004
【００９１】
略号：
４０kDa：40kDa分岐状ＰＥＧ
４０kDa／ＮＴ−ＲＲＲＫ：Ｎ末端で４０kDaＰＥＧでＰＥＧ化されているＲＲＲＫ
４０kDa／ＲＲＲＫ：４０kDaＰＥＧでＫ６８においてリシンＰＥＧ化されているＲＲＲＫ
composition：４０kDa／ＮＴ−ＲＲＲＫおよび４０kDa／ＲＲＲＫ（１：１）の組成物
【００９２】
これらの結果は、すべてのＰＥＧ化ＩＧＦサンプルが同様な範囲でＩＧＦＢＰ４およびＩＧＦＢＰ５に活性に結合していることを示す。すべてのＰＥＧ化されたサンプルは、ＰＥＧ化されていないＩＧＦと比較して有意に減少した会合速度定数(association rate constant)を示した。
【００９３】
システム固有のベースラインドリフトの補正およびシグナルノイズ減少のために、ネガティブ対照データ（例えばバッファー曲線）をサンプル曲線から減じた。
【００９４】
実施例１２
リガンドによるＩＧＦ−ＩＲの自己リン酸化
本発明のポリペプチドのＩＧＦ−ＩＲを活性化しそしてＩＧＦ−ＩＲリン酸化を誘導するする能力を決定するために、ＩＧＦ−ＩＲ過発現細胞を本発明のポリペプチドにより刺激し、次いでＩＧＦ−ＩＲリン酸化状態をＥＬＩＳＡにより解析した。
【００９５】
ＥＬＩＳＡのために、９６ウェルのストレプトアビジンコーテッドポリスチレンプレート（Ｎｕｎｃ）を、３％ＢＳＡを有するＰＢＳＴ中で１：３５０に希釈されたヒトＩＧＦ−ＩＲαに対する１００μlモノクローナル抗体（０．５mg/ml）でコーティングした。プレートシェーカー上で室温で１時間インキュベーションした後、コーティング溶液を除去しそしてプレートをウェル当たり２００μlＰＢＳＴで３回洗浄した。
【００９６】
ＩＧＦ−ＩＲトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、２mM  Ｌ−グルタミン（Gibco, CatNo. 25030-024）および０．５％熱不活性化ＦＣＳ（ＰＡＡ，ＣａｔＮｏ．Ａ１５−７７１）を補充された高グルコース（ＰＡＡ，ＣａｔＮｏ．Ｅ１５−００９）を有するＭＥＭダルベッコ培地（ＤＭＥＭ）中でプレートした。ＥＣ５０値の決定のために、ウェル当たり１．３×１０４細胞とインキュベーションされた９６ウェルプレートを３７℃および５％ＣＯ２で２日間培養した。
【００９７】
低血清培地による４８時間の培養の後に、培地を注意深く除去しそしてそれぞれの培地５０μl中に希釈された異なる濃度の本発明のポリペプチドにより置き換えた。３７℃および５％ＣＯ２で１０分間のインキュベーション後に、培地を吸引により注意深く除去しそしウェル当たり冷リーシスバッファー１２０μl（５０mM  Ｔｒｉｓ  ｐＨ７．５、１mM  ＥＤＴＡ、１mMＥＧＴＡ、２０％グリセロール、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１００mMＮａＦ、１mMＮａＶＯ４、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ（商標）プロテアーゼ阻害剤）を加えた。プレートを、プレートシェーカー上で４℃で１５分間リーシスバッファーとインキュベーションし、そしてウェル内容物１００μlを、ヒトＩＧＦ−ＩＲαに対するモノクローナル抗体でコーティングされたＥＬＩＳＡプレートに後でトランスファーした。ライセートを、プレートシェーカー上で室温で１時間インキュベーションして、捕捉抗体へのＩＧＦ−ＩＲ結合を可能とし、そしてその後に注意深く吸引した。結合しなかった物質を２００μlＰＢＳＴ／各ウェルで３回の洗浄工程により除去した。
【００９８】
結合したリン酸化されたＩＧＦ−ＩＲを検出するために、３％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中に１：１２６５０に希釈されたヒトＩＧＦ−ＩＲαに対するポリクローナルＩｇＧウサギ抗体１００μlを各ウェルに加え、次いでプレートシェーカー上で室温で１時間更にインキュベーションした。ウェル内容物を再び注意深く除去しそしてウェルを２００μlＰＢＳＴ／ウェルで３回洗浄した。ポリクローナルウサギ抗体の検出のために、３％ＢＳＡ／ＰＢＳＴ中に１：６０００に希釈されたＨＲＰにカップリングしたウサギＩｇＧに対するポリクローナル抗体１００μl（Cell Spinaling Technology Inc.USA）を各ウェルに加えた。シェーカー上で室温で１時間インキュベーションした後、２００μlＰＢＳＴ／ウェルで６回プレートを洗浄することにより、結合しなかった検出抗体を除去した。抗体カップリングしたＨＲＰのための基質として、３，３’−５，５’−テトラメチルベンジジン１００μlを各ウェルに加え、次いでシェーカー上で室温で０．５時間更にインキュベーションした。
【００９９】
定量は、２５μl／ウェル１MＨ２ＳＯ４により反応を停止した後、４５０nmの波長での吸光度を測定することにより行った。
【０１００】
サンプルの得られたＯＤ４５０値を、１００％（最大値ｍａｘ）対照として１０nMＩＧＦ−Ｉを使用しそして０％（最小値）対照としてｗ／ｏＩＧＦ−Ｉを使用し、次いで下記式：
百分率活性化＝（サンプル−最小値）／（最大値−最小値）
により百分率活性化に転換した。得られるＥＣ５０（ＩＧＦ−ＩＲの最大値の半分の活性化におけるポリペプチド濃度）を表３に要約する。
【０１０１】
【表３】
2008524296.tif 000005
【０１０２】
略号は実施例１１参照。
【０１０３】
【表４】
2008524296.tif 000006
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2008524296.tif 000008
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】ＰＥＧ−ＩＧＦのＩＥＣ−ＨＰＬＣ。分取強カチオン交換カラム（ＴＯＳＯＨ−ＢＩＯＳＥＰ，ＳＰ−５ＰＷ）を使用して、ＰＥＧ化混合物から純粋な位置異性体を分離した。５つの異なるピーク画分（０〜５の番号を付けた）を単離しそして更なる分析のために処理した。
【図２Ａ】モノＰＥＧ−ＩＧＦ−ＩピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。５つの精製したピーク画分（０〜４の番号を付けた）を、非還元条件下に４〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、そしてゲルをタンパク質についてクーマシーブルーで染色した。ＭＷ、分子量マーカー。
【図２Ｂ】モノＰＥＧ−ＩＧＦ−ＩピークのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。５つの精製したピーク画分（０〜４の番号を付けた）を、および還元条件下に４〜１２％Ｔｒｉｓ−グリシンＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動し、そしてゲルをタンパク質についてクーマシーブルーで染色した。ＭＷ、分子量マーカー。
【図３Ａ】モノＰＥＧ化−ＩＧＦ−Ｉピーク１、２および３のペプチド分析。精製されたモノＰＥＧ化−ＩＧＦ−Ｉピーク１、２および３をＡｓｐ−Ｎで消化し、そしてペプチドフラグメントをＨＰＬＣにより分離した。ＰＥＧ化フラグメントのペプチド配列は、記載されたとおりのエドマンＮ末端ペプチド分解により得られた。Ａ．，ＨＰＬＣ分析は、保持時間３０〜４５分においてｒｈＩＧＦ−Ｉについての６つの異なるペプチドフラグメントおよび〜７０分保持時間においてＰＥＧ化されたピークの主要フラグメント７（および少ないフラグメント７’）を生じた。矢印は、ｒｈＩＧＦ−Ｉと比較して該異なるピークにおけるペプチドフラグメントの主要な相対的変化を示す。
【図３Ｂ】モノＰＥＧ化−ＩＧＦ−Ｉピーク１、２および３のペプチド分析。精製されたモノＰＥＧ化−ＩＧＦ−Ｉピーク１、２および３をＡｓｐ−Ｎで消化し、そしてペプチドフラグメントをＨＰＬＣにより分離した。ＰＥＧ化フラグメントのペプチド配列は、記載されたとおりのエドマンＮ末端ペプチド分解により得られた。Ｂ．，ｒｈＩＧＦ−ＩのＡｓｐ−Ｎ開裂から得られた６つのフラグメントのペプチド配列。リシン（Ｋ）は太字でマークされておりそしてフラグメント３および４に存在する。フラグメント５は、Ｎ末端ペプチドを示す。
【図３Ｃ】モノＰＥＧ化−ＩＧＦ−Ｉピーク１、２および３のペプチド分析。精製されたモノＰＥＧ化−ＩＧＦ−Ｉピーク１、２および３をＡｓｐ−Ｎで消化し、そしてペプチドフラグメントをＨＰＬＣにより分離した。ＰＥＧ化フラグメントのペプチド配列は、記載されたとおりのエドマンＮ末端ペプチド分解により得られた。Ｃ．，エドマン分解後のＰＥＧ化ペプチドフラグメント７のペプチド配列。システインおよびＰＥＧ化リシン残基はペプチド配列において省略符号（breaks）で示される。
【図４Ａ】ＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ化異性体からの異なる全体的発現プロフィルのＡＤの階層的クラスタリング。ＩＧＦ−ＩおよびＰＥＧ化変異体のインキュベーション時間は２４時間であり；マウス細胞系ＮＩＨ−３Ｔ３を使用した。データ解析のための条件は、本文に記載されている。ダウンレギュレーションされた遺伝子のクラスター。
【図４Ｂ】ＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ化異性体からの異なる全体的発現プロフィルのＡＤの階層的クラスタリング。ＩＧＦ−ＩおよびＰＥＧ化変異体のインキュベーション時間は２４時間であり；マウス細胞系ＮＩＨ−３Ｔ３を使用した。データ解析のための条件は、本文に記載されている。アップレギュレーションされた遺伝子のクラスター。
【図５Ａ】ｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−ＩによるＩＧＦ−ＩＲリン酸化。ヒトＩＧＦ−ＩＲで安定にトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、一夜血清飢餓状態にしそして増加する用量（０．０１〜１０μg/ml）のｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体（ピーク１、２、３、ピーク混合物、Ｄｅｓ（１〜３）ピーク３）と３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をウエスタンまたは方法で述べた細胞内分析のために処理した。ｒｈＩＧＦ−Ｉに関する用量応答曲線。リン酸化シグナルは、個々のウェルにおけるＩＧＦ−ＩＲレベルについて標準化された。データ点は３つの独立した培養物からの６つの測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｂ】ｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−ＩによるＩＧＦ−ＩＲリン酸化。ヒトＩＧＦ−ＩＲで安定にトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、一夜血清飢餓状態にしそして増加する用量（０．０１〜１０μg/ml）のｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体（ピーク１、２、３、ピーク混合物、Ｄｅｓ（１〜３）ピーク３）と３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をウエスタンまたは方法で述べた細胞内分析のために処理した。ピーク１に関する用量応答曲線。リン酸化シグナルは、個々のウェルにおけるＩＧＦ−ＩＲレベルについて標準化された。データ点は３つの独立した培養物からの６つの測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｃ】ｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−ＩによるＩＧＦ−ＩＲリン酸化。ヒトＩＧＦ−ＩＲで安定にトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、一夜血清飢餓状態にしそして増加する用量（０．０１〜１０μg/ml）のｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体（ピーク１、２、３、ピーク混合物、Ｄｅｓ（１〜３）ピーク３）と３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をウエスタンまたは方法で述べた細胞内分析のために処理した。ピーク２に関する用量応答曲線。リン酸化シグナルは、個々のウェルにおけるＩＧＦ−ＩＲレベルについて標準化された。データ点は３つの独立した培養物からの６つの測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｄ】ｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−ＩによるＩＧＦ−ＩＲリン酸化。ヒトＩＧＦ−ＩＲで安定にトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、一夜血清飢餓状態にしそして増加する用量（０．０１〜１０μg/ml）のｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体（ピーク１、２、３、ピーク混合物、Ｄｅｓ（１〜３）ピーク３）と３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をウエスタンまたは方法で述べた細胞内分析のために処理した。ピーク３に関する用量応答曲線。リン酸化シグナルは、個々のウェルにおけるＩＧＦ−ＩＲレベルについて標準化された。データ点は３つの独立した培養物からの６つの測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｅ】ｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−ＩによるＩＧＦ−ＩＲリン酸化。ヒトＩＧＦ−ＩＲで安定にトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、一夜血清飢餓状態にしそして増加する用量（０．０１〜１０μg/ml）のｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体（ピーク１、２、３、ピーク混合物、Ｄｅｓ（１〜３）ピーク３）と３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をウエスタンまたは方法で述べた細胞内分析のために処理した。ピーク混合物に関する用量応答曲線。リン酸化シグナルは、個々のウェルにおけるＩＧＦ−ＩＲレベルについて標準化された。データ点は３つの独立した培養物からの６つの測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図５Ｆ】ｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−ＩによるＩＧＦ−ＩＲリン酸化。ヒトＩＧＦ−ＩＲで安定にトランスフェクションされたＮＩＨ−３Ｔ３細胞を、一夜血清飢餓状態にしそして増加する用量（０．０１〜１０μg/ml）のｒｈＩＧＦ−ＩおよびモノＰＥＧ−ＩＧＦ−Ｉ異性体（ピーク１、２、３、ピーク混合物、Ｄｅｓ（１〜３）ピーク３）と３０分間インキュベーションした。次いで、細胞をウエスタンまたは方法で述べた細胞内分析のために処理した。Ｄｅｓ（１〜３）ピーク３に関する用量応答曲線。リン酸化シグナルは、個々のウェルにおけるＩＧＦ−ＩＲレベルについて標準化された。データ点は３つの独立した培養物からの６つの測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図６】ＮＩＨ−３Ｔ３細胞におけるＩＧＦ−ＩＲリン酸化の定量分析。実施例７の実験から得られた用量応答曲線は、一部位結合速度論と適合して、特異的結合（ＢＭａｘ）、最大値の半分の結合濃度（ＥＣ５０）およびＨｉｌｌ係数（ｎＨ）を得た。データは３つの独立した培養物からの６つの測定値の平均±ＳＥＭを示す。
【図７Ａ】ＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｒｈＩＧＦ−Ｉのｉｎ  ｖｉｖｏ脳Ａβ低下。２〜３か月のダブルトランスジェニックＰＳ２ＡＰＰマウス（ｎ＝１０）をｒｈＩＧＦ−Ｉ（５０μg/kg、腹腔内）で処置した。皮質抽出物を調製しそしてＡＰＰ、Ｃ９９、Ａβおよび対照タンパク質（アルブミン）レベルを方法で述べたとおりに評価した。比Ｃ９９／ＡＰＰ、Ａβ／ＡＰＰおよびＣ９９／Ａβは、アルブミン標準化された値から計算され、非処置対照の％として表され、そして平均±ＳＥＭを示す。Ａ、２ヶ月齢の皮質抽出物の代表的ウエスタンブロット。Ａβレベルの明らかな減少に留意すると共に、ｒｈＩＧＦ−Ｉ処置により他のレベルは変化しないことに留意されたい。。
【図７Ｂ】ＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｒｈＩＧＦ−Ｉのｉｎ  ｖｉｖｏ脳Ａβ低下。２〜３か月のダブルトランスジェニックＰＳ２ＡＰＰマウス（ｎ＝１０）をｒｈＩＧＦ−Ｉ（５０μg/kg、腹腔内）で処置した。皮質抽出物を調製しそしてＡＰＰ、Ｃ９９、Ａβおよび対照タンパク質（アルブミン）レベルを方法で述べたとおりに評価した。比Ｃ９９／ＡＰＰ、Ａβ／ＡＰＰおよびＣ９９／Ａβは、アルブミン標準化された値から計算され、非処置対照の％として表され、そして平均±ＳＥＭを示す。Ｂ、ＰＳ２ＡＰＰマウスからの皮質抽出物の定量分析（＊＊、非処置対照に対してｐ＜０．０１））。
【図８Ａ】ｒｈＩＧＦ−ＩによるＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下の時間的経過。２ヶ月齢のマウスをｒｈＩＧＦ−Ｉ（５０μg/kg、腹腔内）で２、６または２４時間処置した。次いで、Ａβ／ＡＰＰおよびＣ９９／Ａβレベルを評価しそして記載されたとおりに比を計算した。データは、非処置対照の％として表されそして平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝１０〜１３）。注射の２、６および２４時間後のＡβ／ＰＰ比（非処置対照に対して、＊＊、ｐ＜０．０１）。
【図８Ｂ】ｒｈＩＧＦ−ＩによるＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下の時間的経過。２ヶ月齢のマウスをｒｈＩＧＦ−Ｉ（５０μg/kg、腹腔内）で２、６または２４時間処置した。次いで、Ａβ／ＡＰＰおよびＣ９９／Ａβレベルを評価しそして記載されたとおりに比を計算した。データは、非処置対照の％として表されそして平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝１０〜１３）。注射の２、６および２４時間後のＣ９９／Ａβ比（非処置対照に対して、＊＊、ｐ＜０．０１）。
【図９Ａ】ピーク１〜３によるＡＡＰおよびＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下。シングルトランスジェニックＡＰＰおよびダブルトランスジェニックＰＳ２ＡＰＰマウスの混合集団において実験を行った。ピーク１、２および３、についてＡβ／ＡＰＰおよびＣ９９／Ａβ比は、Ａβ低下およびクリアランスに対するそれらの相対的効果の直接の比較のために一緒に示される（ｎ＝８〜１０）。脳Ａβロードに対するピーク１〜３の効果を示すＡβ／ＡＰＰ比（非処置対照に対して、＊、ｐ＜０．０５、；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図９Ｂ】ピーク１〜３によるＡＡＰおよびＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下。シングルトランスジェニックＡＰＰおよびダブルトランスジェニックＰＳ２ＡＰＰマウスの混合集団において実験を行った。ピーク１、２および３、についてＡβ／ＡＰＰおよびＣ９９／Ａβ比は、Ａβ低下およびクリアランスに対するそれらの相対的効果の直接の比較のために一緒に示される（ｎ＝８〜１０）。脳からのＡβのクリアランスを示すピーク１〜３のＣ９９／Ａβ比（非処置対照に対して、＊、ｐ＜０．０５、；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１０Ａ】ピーク３によるＡＡＰおよびＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下の時間的経過。２ヶ月齢のＡＰＰおよびＰＳ２ＡＰＰマウスの混合集団をピーク３（５０μg/kg、腹腔内）により２、６、２４、４８、または７２時間処置した。次いで、ＡＰＰ、Ｃ９９、Ａβおよびアクチンレベルを評価しそして記載されたとおりに比を計算した。データは非処置対照の％として表しそして平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝１０〜１５）。注射の６、２４および４８時間後のＡβ／ＡＰＰ比（非処置対照に対して、＊、ｐ＜０．０５、；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１０Ｂ】ピーク３によるＡＡＰおよびＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下の時間的経過。２ヶ月齢のＡＰＰおよびＰＳ２ＡＰＰマウスの混合集団をピーク３（５０μg/kg、腹腔内）により２、６、２４、４８、または７２時間処置した。次いで、ＡＰＰ、Ｃ９９、Ａβおよびアクチンレベルを評価しそして記載されたとおりに比を計算した。データは非処置対照の％として表しそして平均±ＳＥＭを示す（ｎ＝１０〜１５）。注射の６、２４および４８時間後のＣ９９／Ａβ比（非処置対照に対して、＊、ｐ＜０．０５、；＊＊、ｐ＜０．０１；＊＊＊、ｐ＜０．００１）。
【図１１】ＰＥＧ−ＩＧＦピーク１〜３によるＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下。ピーク１、２または３についてＡβ／ＡＰＰ比を、Ａβ低下およびクリアランスに対するそれらの相対的効果の直接比較のために一緒に示す。（ｎ＝３〜１３）；非処置対照に対して＊、ｐ＜０．０５））。
【図１２】ピーク３によるＰＳ２ＡＰＰマウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏＡβ低下の時間的経過。２ヶ月齢のＰＳ２ＡＰＰマウスを、ピーク３（５０μg/kg、腹腔内）の１回の注射により２、６、２４、４８または７２時間処置した。次いで、記載されたとおりにＡβ／ＡＰＰ比を計算した。データは、非処置対照の％として表されそして平均±ＳＥＭを示す（非処置対照に対して、＊、ｐ＜０．０５、；＊＊、ｐ＜０．０１）。
【図１】
2008524296.tif 000009
【図２Ａ】
2008524296.tif 000010
【図２Ｂ】
2008524296.tif 000011
【図３Ａ】
2008524296.tif 000012
【図３Ｂ】
2008524296.tif 000013
【図３Ｃ】
2008524296.tif 000014
【図４Ａ】
2008524296.tif 000015
【図４Ｂ】
2008524296.tif 000016
【図５Ａ】
2008524296.tif 000017
【図５Ｂ】
2008524296.tif 000018
【図５Ｃ】
2008524296.tif 000019
【図５Ｄ】
2008524296.tif 000020
【図５Ｅ】
2008524296.tif 000021
【図５Ｆ】
2008524296.tif 000022
【図６】
2008524296.tif 000023
【図７Ａ】
2008524296.tif 000024
【図７Ｂ】
2008524296.tif 000025
【図８Ａ】
2008524296.tif 000026
【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
2008524296.tif 000028
【図９Ｂ】
2008524296.tif 000029
【図１０Ａ】
2008524296.tif 000030
【図１０Ｂ】
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【図１１】
2008524296.tif 000032
【図１２】
2008524296.tif 000033
【配列表】
2008524296000001.app
【国際調査報告】
2008524296.tif 000034
2008524296.tif 000035
2008524296.tif 000036
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