(57)【要約】  本発明は、リン脂質補因子タンパク質に対する抗体を検出するための方法及び試薬を提供する。リン脂質としてはカルジオリピンが挙げられる。補因子タンパク質としては、ベータ−２−グリコプロテインＩ（即ちアポリポタンパク質Ｈ）又はプロトロンビンタンパク質が挙げられる。検出はフローサイトメトリー（例えば、蛍光励起細胞分取装置（fluorescence-activated cell sorting：ｆａｃｓ））により行なうことができる。【選択図】図３
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
リン脂質部分と、補因子タンパク質（cofactor protein）と、担体とを含んでなる、抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬（anti-phospholipid-cofactor protein-antibody detection reagent）であって、
前記リン脂質部分が前記補因子タンパク質に共有結合し、前記補因子タンパク質が前記担体に結合してなる、抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬。
【請求項２】
前記リン脂質部分が、カルジオリピン部分、ホスファチジルセリン部分、ホスファチジルコリン部分、ホスファチジルエタノールアミン部分、ホスファチジルグリセロール部分、ホスファチジルイノシトール部分、及びホスファチジン酸部分から選択される、請求項１記載の抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬。
【請求項３】
前記リン脂質部分が、ベータ−２−グリコプロテインＩ（beta-2-glycoprotein I：β２ＧＰＩ）タンパク質及びプロトロンビンタンパク質から選択される、請求項１記載の抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬。
【請求項４】
前記担体が微小粒子（microparticle）及びマイクロタイタープレートから選択される、請求項１記載の抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬。
【請求項５】
前記補因子タンパク質が前記担体に共有結合してなる、請求項１記載の抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬。
【請求項６】
生体サンプル中の抗リン脂質補因子タンパク質抗体（anti-phospholipid-cofactor protein-antibody）を検出する方法であって、
前記抗体が、リン脂質部分、補因子タンパク質、及びリン脂質補因子タンパク質複合体（phospholipid-cofactor protein complex）からなる群より選択される抗原に特異的と結合するとともに、
前記方法が：
（ａ）前記生体サンプルを、請求項１記載の抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬と接触させる工程；並びに
（ｂ）前記抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬と、前記抗リン脂質補因子タンパク質抗体とを含んでなる、抗原抗体複合体を検出する工程を含んでなり、
前記抗原抗体複合体の検出により、前記生体サンプル中の前記抗リン脂質補因子タンパク質抗体の存在が示される、方法。
【請求項７】
前記担体が、微小粒子及びマイクロタイタープレートから選択される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
工程（ｂ）がフローサイトメトリーにより行なわれる、請求項６記載の方法。
【請求項９】
少なくとも１つの工程が、界面活性剤（detergent）を含んでなる緩衝液中で行なわれる、請求項６記載の方法。
【請求項１０】
患者の抗リン脂質症候群（anti-phospholipid syndrome：ＡＰＳ）を診断する方法であって：
（ａ）前記患者から生体サンプルを単離する工程；
（ｂ）前記生体サンプルを、請求項１記載の抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬と接触させる工程；並びに
（ｃ）前記抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬と、生体サンプル由来の抗リン脂質補因子タンパク質抗体とを含んでなる、抗原抗体複合体のレベルを決定する工程を含んでなり、
前記患者由来の生体サンプルと正常対照由来の生体サンプルとの間で、前記抗原抗体複合体のレベルに差があることにより、前記患者がＡＰＳを有することが示される、方法。
【請求項１１】
前記担体が微小粒子及びマイクロタイタープレートから選択される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記生体サンプルが血液又は血液産物である、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）がフローサイトメトリーにより行なわれる、請求項１０記載の方法。
【請求項１４】
前記リン脂質がカルジオリピン及びホスファチジルセリンから選択され、前記補因子タンパク質がベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）である、請求項１０記載の方法。
【請求項１５】
患者が抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）を発症する可能性を決定する方法であって：
ａ）カルジオリピン部分と、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質と、カルジオリピン部分がβ２ＧＰＩタンパク質に共有結合してなる、カルジオリピンβ２ＧＰＩタンパク質複合体とからなる群より選択される、ＡＰＳ用抗原（antigen for APS）と結合する抗体のレベルを決定する工程；及び
ｂ）工程ａ）で決定された抗体のレベルを、正常対照における前記抗体のレベルと比較する工程を含んでなり、
（ｉ）前記患者における前記抗体のレベルが、前記正常対照における前記抗体のレベルよりも低いか、又は実質的に同程度であることにより、ＡＰＳを発症する可能性が低いか、又は可能性がないことが示され；
（ii）前記患者における前記抗体のレベルが、前記正常対照における前記抗体のレベルよりも高いことにより、ＡＰＳを発症する可能性が高まっていることが示される、方法。
【請求項１６】
ホスファチジルセリン部分がβ２ＧＰＩタンパク質に共有結合してなる、ホスファチジルセリンβ２ＧＰＩタンパク質複合体と結合する抗体のレベルを決定する工程、並びに、前記レベルを正常対照における前記抗体のレベルと比較する工程を更に含んでなる、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
患者が抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）を発症する可能性を決定する方法であって：
ａ）カルジオリピン部分；ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質；カルジオリピン部分がβ２ＧＰＩタンパク質に共有結合してなるカルジオリピン−β２ＧＰＩタンパク質複合体；ホスファチジルセリン部分；ホスファチジルセリンβ２ＧＰＩタンパク質複合体；及びプロトロンビンタンパク質からなる群より選択される、ＡＰＳ用抗原（antigen for APS）と結合する抗体のレベルを決定する工程；及び
ｂ）工程ａ）で決定された抗体のレベルを、正常対照における前記抗体のレベルと比較する工程を含んでなり、
（ｉ）前記患者における前記抗体のレベルが、前記正常対照における前記抗体のレベルよりも低いか、又は実質的に同程度であることにより、ＡＰＳを発症する可能性が低いか、又は可能性がないことが示され；
（ii）前記患者における前記抗体のレベルが、前記正常対照における前記抗体のレベルよりも高いことにより、ＡＰＳを発症する可能性が高まっていることが示される、方法。
【請求項１８】
カルジオリピン部分、ベータ−２−糖タンパク質Ｉ（β２ＧＰＩ）タンパク質、及び担体を含んでなる、抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬（anti-cardiolipin-cofactor protein-antibody detection reagent）であって、
前記カルジオリピン部分が前記β２ＧＰＩタンパク質に共有結合し、前記β２ＧＰＩタンパク質が前記担体に結合してなる、抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年４月１８日に出願された、米国仮出願第６０／６７２，７４５号の利益を主張する。本仮出願の内容は、引用により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
抗リン脂質症候群（anti-phospholipid syndrome：ＡＰＳ）は１９８３年に始めて報告され、現在では主要な血栓性症候群（thrombotic syndrome）の１つとして認識されている。その臨床的特徴は、深部静脈血栓症（deep vein thrombosis：ＤＶＴ）、慢性下腿潰瘍、反復性流産、頭痛、心臓発作、腎静脈及び動脈血栓症から、肺塞栓症、更には抗リン脂質抗体（例えばカルジオリピン）に関連する肺高血圧症にまで及んでいる。リン脂質は、親水性環境に不溶の脂質又は脂肪である。現在のイムノアッセイ技術は疎水性引力を用いて、リン脂質をマイクロタイタープレートの疎水表面に結合させている。抗カルジオリピン抗体のための従来の酵素免疫吸着アッセイ（enzyme-linked immunosorbent assay：ＥＬＩＳＡ）では、固相をカルジオリピンで受動的に被覆し、その上に各種の補因子タンパク質を吸着させている。この方式の構成によれば、補因子に依存する抗体と依存しない抗体とが混在する、抗カルジオリピン抗体の混成群について、検出は可能であるものの、識別には有効ではない。更に、この受動的な構成は、再現性よく作製することは困難であり、また、水性環境では不安定であった。これらの抗カルジオリピン抗体の検出は、ウシ血清の量及び質、並びに、アッセイに加えられる補因子タンパク質レベルのその後の変動に影響される。加えて、補因子タンパク質リン脂質複合体の受動的な構成は、Ｔｗｅｅｎ２０やＣＨＡＰＳ等の界面活性剤（detergent）の存在に弱い。界面活性剤は通常、非特異結合を低減し、感度や特異性を向上させるために、アッセイに加えられる。界面活性剤は固相に結合した脂質を溶解させ、シグナル消失を引き起こすことにより、抗リン脂質イムノアッセイの妨げとなってしまう（ＷＯ９１１００１３８及びＵＳ２００４０９６９０３参照）。このため、抗カルジオリピン抗体のアッセイの変動性がしばしば報告されてきた。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
本発明は上記の要求やその他の要求を解決するものである。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一態様によれば、本発明は、リン脂質部分と、補因子タンパク質と、担体とを含んでなる、抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬を提供する。リン脂質部分は補因子タンパク質に共有結合し、補因子タンパク質は担体に結合してなる。リン脂質部分としては、例えば、カルジオリピン部分、ホスファチジルセリン部分、ホスファチジルコリン部分、ホスファチジルエタノールアミン部分、ホスファチジルグリセロール部分、ホスファチジルイノシトール部分、又はホスファチジン酸部分が挙げられる。補因子タンパク質の例としては、ベータ−２−グリコプロテインＩ（beta-2-glycoprotein I：β２ＧＰＩ）タンパク質及びプロトロンビンタンパク質が挙げられる。担体の例としては、微小粒子及びマイクロタイタープレートが挙げられる。一実施形態によれば、補因子タンパク質は担体に共有結合してなる。
【０００５】
別の態様によれば、本発明は、生体サンプル中の抗リン脂質補因子タンパク質抗体を検出する方法を提供する。本方法は、上述の抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬に生体サンプルを接触させた後、抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬と抗リン脂質補因子タンパク質抗体とを含んでなる、抗原抗体複合体を検出することにより行なわれる。抗原抗体複合体の検出により、生体サンプル中に抗リン脂質補因子タンパク質抗体が存在することが示される。抗体は、例えばリン脂質部分、補因子タンパク質、又はリン脂質補因子タンパク質複合体等に特異的に結合する。上述のように、担体の例としては、微小粒子及びマイクロタイタープレートが挙げられる。一実施形態によれば、検出はフローサイトメトリーによって行なわれる。別の実施形態によれば、少なくとも１つの工程、例えば保温又は洗浄工程を、界面活性剤を含んでなる緩衝液中で行なう。
【０００６】
別の態様によれば、上述の抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬を用いて、患者の抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）を診断する。これは、患者の生体サンプルを取得し、その生体サンプルを抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬と接触させた後、抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬と生体サンプル中の抗リン脂質補因子タンパク質抗体とを含んでなる、抗原抗体複合体のレベルを決定することにより行なわれる。抗原抗体複合体のレベルを正常対照と比較し、生体サンプルの抗原抗体複合体レベルの正常対照との間に差があることにより、患者がＡＰＳを有することが示される。一実施形態によれば、ＡＰＳであると診断される患者の抗原抗体複合体レベルは、正常対照のレベルよりも高い。担体の例としては、微小粒子及びマイクロタイタープレートが挙げられる。好ましい実施形態によれば、生体サンプルは血液又は血液産物である。別の好ましい実施形態によれば、検出はフローサイトメトリーを用いて行なわれる。更なる実施形態によれば、リン脂質はカルジオリピン又はホスファチジルセリンであり、補因子タンパク質はベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）である。別の実施形態によれば、本方法は更に、ホスファチジルセリン部分がβ２ＧＰＩタンパク質に共有結合してなるホスファチジルセリンβ２ＧＰＩタンパク質複合体と結合する抗体のレベルを決定する工程と、このレベルを正常対照における抗体レベルと比較する工程を含んでなる。
【０００７】
別の態様によれば、本発明は、患者が抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）を発症する可能性を決定する方法を提供する。本方法ではまず、ＡＰＳ用抗原（antigen for APS）、例えばカルジオリピン部分、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質、又はカルジオリピンがβ２ＧＰＩタンパク質抗体に共有結合してなる複合体等に対し、結合する抗体のレベルを決定する。患者の抗体レベルを正常対照における抗体レベルと比較する。患者の抗体レベルが正常対照の抗体レベルよりも低いか、又は実質的に同程度であることにより、ＡＰＳを発症する可能性が低いか、又は可能性がないことが示される。患者の抗体レベルが正常対照の抗体レベルよりも高いことにより、ＡＰＳを発症する可能性が高まっていることが示される。一実施形態によれば、ホスファチジルセリンβ２ＧＰＩタンパク質複合体に結合する抗体のレベルを決定し、正常対照のレベルと比較する。更なる実施形態によれば、ホスファチジルセリン部分は、β２ＧＰＩタンパク質に共有結合してなる。
【０００８】
別の態様によれば、本発明は生体サンプル中における、リン脂質、補因子タンパク質、及びリン脂質補因子タンパク質に対する抗体のファミリーを検出する方法を提供する。検出される抗体は、カルジオリピン部分、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質、カルジオリピン−β２ＧＰＩタンパク質複合体、ホスファチジルセリン部分、ホスファチジルセリン−β２ＧＰＩタンパク質複合体、及びプロトロンビンタンパク質からなる群より選択される抗原に、特異的に結合するものである。これらの抗体のうち何れか一種、又はこれらの抗体の何れかの組合せを、本方法で検出することができる。本方法は、カルジオリピン部分、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質、カルジオリピンβ２ＧＰＩタンパク質複合体、ホスファチジルセリンβ２ＧＰＩタンパク質複合体、又はプロトロンビンタンパク質の何れかによって被覆された、識別可能な常磁性ラテックス粒子に生体サンプルを接触させた後、本試薬に結合する抗原抗体複合体を検出することにより行なわれる。抗原抗体複合体の検出によって、生体サンプル中の抗体の存在が示されるものとする。一実施形態によれば、担体は識別可能な常磁性ラテックス粒子である。別の実施形態によれば、検出及び識別はフローサイトメトリーにより行なわれる。
【０００９】
一態様によれば、本発明は、カルジオリピン部分と、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質と、担体とを含む抗カルジオリピン−補因子タンパク質抗体検出試薬を提供する。カルジオリピン部分はβ２ＧＰＩタンパク質に共有結合し、β２ＧＰＩタンパク質は担体に結合してなる。一実施形態によれば、β２ＧＰＩタンパク質は担体に共有結合してなる。一部の実施形態によれば、担体は、例えばマイクロスフェアやマイクロタイタープレートであってもよい。
【００１０】
別の態様によれば、本発明は、生体サンプル中の抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体を検出する方法を提供する。検出される抗体は、カルジオリピン部分と、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質と、カルジオリピン−β２ＧＰＩタンパク質複合体とからなる群より選択される抗原に、特異的に結合するものである。本方法は、上述の抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬に生体サンプルを接触させた後、抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬と抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体とを含んでなる、抗原抗体複合体を検出することにより行なわれる。抗原抗体複合体の検出により、生体サンプル中に抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体が存在することが示される。一部の実施形態によれば、担体は例えば微小粒子やマイクロタイタープレートであってもよい。別の実施形態によれば、検出はフローサイトメトリーによって行なわれる。
【００１１】
更に別の態様によれば、本発明は、患者の抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）を診断する方法を提供する。まず、患者から生体サンプルを単離する。次いでこの生体サンプルを、上述の抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬と接触させる。その後、抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬と、生体サンプル由来の抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体とを含んでなる、抗原抗体複合体のレベルを決定する。抗原抗体複合体の検出によって、生体サンプル中に抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体が存在することが示される。患者の抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体のレベルを正常対照におけるレベルと比較し、患者と正常対照との間でレベルに差があることにより、患者がＡＰＳを有することが示される。また、患者と正常対照との間のレベルの差を、患者がＡＰＳの症状を有することの指標としてもよい。一部の実施形態によれば、担体は例えば微小粒子やマイクロタイタープレートであってもよい。別の実施形態によれば、検出はフローサイトメトリーによって行なわれる。更に別の実施形態によれば、生体サンプルは血液又は血液産物である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１２】
Ｉ．導入：
本発明は、生体サンプル中のいわゆる抗カルジオリピン抗体を検出する試薬及び方法に関する。この試薬はビーズ又は他の固体支持体であり、まず、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質に共有結合してなるカルジオリピンを含んでなる。更に、このβ２ＧＰＩタンパク質は、イムノアッセイにおける本試薬の使用を容易にするべく、固体支持体又は担体に結合されてなる。
【００１３】
また、本発明はこれらの試薬を用いて抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体を検出する方法と、これらの試薬を用いて抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）を診断する方法に関する。
【００１４】
II．定義
本明細書において使用される「抗リン脂質補因子タンパク質抗体（an anti-phospholipid-cofactor protein-antibody）」という語は、リン脂質部分、リン脂質補因子タンパク質、又はリン脂質部分とリン脂質補因子タンパク質との複合体に対して、特異的に結合する抗体を指す。一実施形態によれば、この抗リン脂質補因子タンパク質抗体は、カルジオリピン部分、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質、又は、カルジオリピン部分とβ２ＧＰＩタンパク質若しくは他の補因子タンパク質との複合体に対して、特異的に結合する。別の実施形態によれば、この抗リン脂質補因子タンパク質抗体は、ホスファチジルセリン部分、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質、又は、ホスファチジルセリン部分とβ２ＧＰＩタンパク質若しくは他の補因子タンパク質との複合体に対して、特異的に結合する。
【００１５】
本明細書において使用される「抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬（an anti-phospholipid-cofactor protein-antibody detection reagent）」という語は、リン脂質部分を含んでなるとともに、このリン脂質部分がリン脂質補因子タンパク質に共有結合し、続いてこのリン脂質補因子タンパク質が担体に結合してなる検出試薬を指す。一実施形態によれば、この抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬はカルジオリピン部分を含んでなり、このカルジオリピン部分がβ２ＧＰＩタンパク質に共有結合し、更にこのβ２ＧＰＩタンパク質が担体に結合してなる。別の実施形態によれば、このカルジオリピン部分はスクシニル基を有し、これによってβ２ＧＰＩタンパク質又は補因子タンパク質への共有結合が容易になっている。更に別の実施形態によれば、この抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬はホスファチジルセリン部分を含んでなり、このホスファチジルセリン部分がβ２ＧＰＩタンパク質に共有結合し、更にこのβ２ＧＰＩタンパク質が担体に結合してなる。別の実施形態によれば、このホスファチジルセリン部分はスクシニル基を有し、これによってβ２ＧＰＩタンパク質又は補因子タンパク質への共有結合が容易になっている。
【００１６】
本明細書において使用される「抗リン脂質抗体（anti-phospholipid antibody）」という語は、他の補因子タンパク質の不在下で、生体サンプル中のリン脂質部分に特異的に結合する抗体を指す。
【００１７】
本明細書において使用される「抗リン脂質抗体検出試薬（anti-phospholipid antibody detection reagent）」という語は、担体に共有結合するリン脂質部分を含んでなる検出試薬を指す。好ましい実施形態によれば、このリン脂質部分はスクシニル基を有し、これにより担体への共有結合が容易となっている。
【００１８】
本明細書において使用される,「リン脂質部分」という語は、例えば、カルジオリピン、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジン酸を指す。リン脂質はよく知られており、例えばAvanti Polar Lipids, Inc. やSigma-Aldrich Co. 等から市販されている。リン脂質部分が有するアシル基の鎖長や飽和量は任意である。また、リン脂質部分には、反応性カルボキシル基を有するように修飾されたリン脂質も含まれる。好ましい一実施形態によれば、リン脂質部分にはスクシニル基が導入される。
【００１９】
本明細書において使用される「リン脂質補因子タンパク質（phospholipid cofactor protein）」という語は、リン脂質部分に特異的に結合するタンパク質を指す。リン脂質補因子タンパク質の例としてはβ２ＧＰＩタンパク質及びプロトロンビンが挙げられる。
【００２０】
本明細書において使用される「抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体（anti-cardiolipin-cofactor protein-antibody）」という語は、カルジオリピン部分、カルジオリピン補因子タンパク質、又はカルジオリピン部分とカルジオリピン補因子タンパク質との複合体に対して、特異的に結合する抗体を指す。一実施形態によれば、この抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体は、カルジオリピン部分、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質、又はカルジオリピン部分とβ２ＧＰＩタンパク質との複合体に対して、特異的に結合する。
【００２１】
本明細書において使用される「抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬（anti-cardiolipin-cofactor protein-antibody detection reagent）」という語は、カルジオリピン部分を含んでなる検出試薬であって、このカルジオリピン部分がカルジオリピン補因子タンパク質、β２ＧＰＩタンパク質に共有結合し、更にこれが担体に結合してなる検出試薬を指す。一実施形態によれば、この抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬が、β２ＧＰＩタンパク質に共有結合するカルジオリピン部分を含んでなり、更にこのβ２ＧＰＩタンパク質が、担体に結合してなる。別の実施形態によれば、このカルジオリピン部分はスクシニル基を有し、これによってβ２ＧＰＩタンパク質又は他の補因子タンパク質に対する共有結合が容易になっている。
【００２２】
本明細書において使用される「抗カルジオリピン抗体（anti-cardiolipin antibody）」という語は、他のβ２ＧＰＩタンパク質の不在下で、生体サンプル中のカルジオリピン部分に特異的に結合する抗体を指す。
【００２３】
本明細書において使用される「抗カルジオリピン抗体検出試薬（anti-cardiolipin antibody detection reagent）」という語は、担体に共有結合したカルジオリピン部分を含んでなる検出試薬を指す。好ましい実施形態によれば、このカルジオリピン部分はスクシニル基を有し、これによって担体への共有結合が容易となる。
【００２４】
本明細書において使用される「カルジオリピン部分（cardiolipin moiety）」という語は、リン脂質のカルジオリピンを指す。カルジオリピン はよく知られており、例えば、Avanti Polar Lipids, Inc. や Sigma-Aldrich Co. 等から市販されている。カルジオリピンは四つのアシル基を有する。カルジオリピン部分のアシル基の鎖長や飽和量は任意である。また、カルジオリピン部分には、反応性カルボキシル基を有するように修飾されたカルジオリピンも含まれる。好ましい実施形態によれば、カルジオリピン部分にはスクシニル基が導入される。より好ましい実施形態によれば、このスクシニル修飾は、カルジオリピンの極性頭部基のＣ２位に対して行なわれる。
【００２５】
本明細書において使用される「カルジオリピン補因子タンパク質（cardiolipin cofactor protein）」という語は、カルジオリピンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。好ましい実施形態によれば、カルジオリピン補因子タンパク質はβ２ＧＰＩタンパク質である。
【００２６】
本明細書において使用される「抗ホスファチジルセリン補因子タンパク質抗体（anti-phosphatidylserine-cofactor protein-antibody）」という語は、ホスファチジルセリン部分、ホスファチジルセリン補因子タンパク質、又はホスファチジルセリン部分とホスファチジルセリン補因子タンパク質との複合体に対して、特異的に結合する抗体を指す。一実施形態によれば、この抗ホスファチジルセリン補因子タンパク質抗体は、ホスファチジルセリン部分、ベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質、又はホスファチジルセリン部分とβ２ＧＰＩタンパク質との複合体に対して特異的に結合する。別の実施形態によれば、この抗ホスファチジルセリン補因子タンパク質抗体は、ホスファチジルセリン部分、プロトロンビンタンパク質、又はホスファチジルセリン部分とプロトロンビンタンパク質との複合体に対して特異的に結合する。
【００２７】
ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジン酸
【００２８】
また、本発明は、他の抗リン脂質補因子タンパク質抗体も包含する。例として、抗ホスファチジルコリン補因子タンパク質抗体、抗ホスファチジルエタノールアミン補因子タンパク質抗体、抗ホスファチジルグリセロール補因子タンパク質抗体、抗ホスファチジルイノシトール補因子タンパク質抗体、及び抗ホスファチジン酸補因子タンパク質抗体が挙げられる。
【００２９】
本明細書において使用される「抗ホスファチジルセリン補因子タンパク質抗体検出試薬（anti-phosphatidylserine-cofactor protein-antibody detection reagent）」は、ホスファチジルセリン部分を含んでなる検出試薬であって、このホスファチジルセリン部分がホスファチジルセリン補因子タンパク質に共有結合し、更にこのホスファチジルセリン補因子タンパク質が担体に結合してなる検出試薬を指す。一実施形態によれば、この抗ホスファチジルセリン補因子タンパク質抗体検出試薬は、β２ＧＰＩタンパク質又はプロトロンビンタンパク質に共有結合したホスファチジルセリン部分を含んでなり、これらが担体に結合してなる。別の実施形態によれば、このホスファチジルセリン部分がスクシニル基を有し、これによって補因子タンパク質への共有結合が容易となる。
【００３０】
また、本発明は、他の抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬も包含する。例としては、抗ホスファチジルコリン補因子タンパク質抗体検出試薬、抗ホスファチジルエタノールアミン補因子タンパク質抗体検出試薬、抗ホスファチジルグリセロール補因子タンパク質抗体検出試薬、抗ホスファチジルイノシトール補因子タンパク質抗体検出試薬、及び抗ホスファチジン酸補因子タンパク質抗体検出試薬が挙げられる。
【００３１】
本明細書において使用される「抗ホスファチジルセリン抗体（anti-phosphatidylserine antibody）」という語は、β２ＧＰＩタンパク質の不在下で、生体サンプル中のホスファチジルセリン部分と特異的に結合する抗体を指す。
【００３２】
また、本発明は、他の抗リン脂質抗体も包含する。例としては、抗ホスファチジルコリン抗体、抗ホスファチジルエタノールアミン抗体、抗ホスファチジルグリセロール抗体、抗ホスファチジルイノシトール抗体、及び抗ホスファチジン酸抗体が挙げられる。
【００３３】
本明細書において使用される「抗ホスファチジルセリン抗体検出試薬（anti-phosphatidylserine antibody detection reagent）」という語は、担体に共有結合したホスファチジルセリン部分を含んでなる検出試薬を指す。好ましい実施形態によれば、このホスファチジルセリン部分はスクシニル基を有し、担体への共有結合が容易となっている。
【００３４】
また、本発明は、他の抗リン脂質抗体検出試薬も包含する。例としては、抗ホスファチジルコリン抗体検出試薬、抗ホスファチジルエタノールアミン抗体検出試薬、抗ホスファチジルグリセロール抗体検出試薬、抗ホスファチジルイノシトール抗体検出試薬、及び抗ホスファチジン酸抗体検出試薬が挙げられる。
【００３５】
本明細書において使用される「ホスファチジルセリン部分（phosphatidylserine moiety）」という語は、リン脂質であるホスファチジルセリンを指す。ホスファチジルセリンはよく知られており、例えば Avanti Polar Lipids, Inc. や Sigma−Aldrich Co. 等から市販されている。ホスファチジルセリン部分が有するアシル基の鎖長や飽和量は任意である。また、ホスファチジルセリン部分には、反応性カルボキシル基を有するように修飾されたホスファチジルセリンも含まれる。好ましい実施形態によれば、ホスファチジルセリン部分にはスクシニル基が導入される。
【００３６】
また、本発明は他のリン脂質部分も包含する。例としては、ホスファチジルコリン部分、ホスファチジルエタノールアミン部分、ホスファチジルグリセロール部分、ホスファチジルイノシトール部分、及びホスファチジン酸部分が挙げられる。
【００３７】
本明細書において使用される「ホスファチジルセリン補因子タンパク質（phosphatidylserine cofactor protein）」という語は、ホスファチジルセリンに対して特異的に結合するタンパク質を指す。好ましい実施形態によれば、ホスファチジルセリン補因子タンパク質は、β２ＧＰＩタンパク質又はプロトロンビンタンパク質である。
【００３８】
また、本発明は、他のリン脂質補因子タンパク質も包含する。例としては、ホスファチジルコリン補因子タンパク質、ホスファチジルエタノールアミン補因子タンパク質、ホスファチジルグリセロール補因子タンパク質、ホスファチジルイノシトール補因子タンパク質、及びホスファチジン酸補因子タンパク質が挙げられる。
【００３９】
本明細書において使用される「ベータ−２−グリコプロテインＩ（beta-2-glycoprotein I）」又は「β２ＧＰＩ」という語は、アポリポタンパク質Ｈとしても知られる、アニオン性表面に結合する血漿タンパク質を指し、例としてはカルジオリピンが挙げられる。好ましい実施形態によれば、β２ＧＰＩはヒト由来のものである。ヒトβ２ＧＰＩは受入番号Ｐ０２７４９として知られており、例えば Haematologic Technologies, Inc. 等から市販されている。
【００４０】
本明細書において使用される「プロトロンビン（prothrombin）」又は「プロトロンビンタンパク質」という語は、血液凝固時にトロンビンに変換される血漿タンパク質を指す。好ましい実施形態によれば、プロトロンビンはヒト由来のものである。プロトロンビンのアミノ酸配列は、例えば受入番号ＮＰ＿０００４９７に登録されており、例えば Haematologic Technologies, Inc. 等から市販されている。
【００４１】
本明細書において使用される「担体（carrier）」という語は、不活性の固体支持体であって、ガラスやコラーゲン等の天然材料や、以下の合成材料からなるものを指す。合成材料としては、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、シリコーンゴム、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリケイ酸、ポリエチレンオキシド、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フッ化炭素、ナイロン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸が挙げられる。多くの場合、担体の表面には一部の官能基、例えばカルボン酸（−ＣＯＯＨ）、遊離アミン（−ＮＨ2）、及びスルフヒドリル（−ＳＨ）基等が元から存在するので、これらを例えばカルジオリピン部分やβ２ＧＰＩ等のタンパク質に対する結合に使用してもよい。こうした天然由来の官能基を利用できない場合には、例えばカルボン酸基等の所望の官能基や、結合相互作用のパートナーとして知られている部分（例えばビオチンを結合可能なアビジン等）を、こうした固体支持体に結合させてもよい。本発明において好ましい担体としては、例えば、ＥＬＩＳＡプレート、マイクロタイタープレート、又はカルボキシル化ラテックス、又は磁性マイクロスフェア、又は微小粒子が挙げられる。
【００４２】
本明細書において使用される「正常対照（normal control）」という語は、例えば血液、血清、又は血漿等の生体サンプルであって、健常個体、即ちＡＰＳを有していない個体における抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体レベルの範囲を表わすサンプルを指す。また、正常対照は、抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体の基準範囲、即ち、ＡＰＳを有していない個体において測定される抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体レベルの範囲としても用いることができる。
【００４３】
本明細書において使用される「特異的検出（specific detection）」という語は、多くの場合は他の抗体やタンパク質を含む不均一集団内において、本発明の抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬に対する任意の抗体の結合を検出することにより、抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体の存在が決定できることを指す。指定のイムノアッセイ条件下において検出可能なシグナルは、バックグラウンドシグナルの少なくとも２倍のシグナルである。従って、特異的抗体ペプチド結合は、バックグラウンドの少なくとも２倍、好ましくは１０倍超、より好ましくは１００倍のシグナルを生じることが望まれる。
【００４４】
「生体サンプル」という語は、生検や剖検サンプル等の組織の切片、及び、組織学用途で採取された凍結切片を指す。こうしたサンプルには、全血、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、組織、培養細胞、例えば初代培養物、外植片、形質転換細胞、大便、尿、精嚢液、粘液、及び他の体分泌液や、スワブ器具を用いて採取された組織も含まれる。好ましい実施形態によれば、生体サンプルは血液又は血液産物、例えば、全血、血清、乾燥血斑、又は血漿である。生体サンプルは通常、ＡＰＳの患者、又はＡＰＳの疑いのある患者から採取される。
【００４５】
本明細書において「接触（contact）」又は「接触させる（contacting）」という語は、合わせる（combine with）、加える（add to）、混合する（mix with）、通過させる（pass over）、一緒に保温する（incubate with）、流通させる（flow over）等の語と同義に使用される。
【００４６】
「抗体」という語は、免疫グロブリンファミリーのタンパク質、又は、対応する抗原に対して非共有結合により可逆的且つ特異的に結合し得る免疫グロブリン断片を含むポリペプチドを指す。抗体の構造単位の例は四量体である。各四量体は同一の２対のポリペプチド鎖から構成され、各対は一本の「軽（light）」鎖（約２５ｋＤ）と一本の「重（heavy）」鎖（約５０〜７０ｋＤ）とが１又は２以上のジスルフィド結合で結合してなる。認められている免疫グロブリン遺伝子としては、κ、λ、α、γ、δ、ε、及びμの定常領域遺伝子に加えて、無数の免疫グロブリン可変領域遺伝子がある。軽鎖はκ鎖とλ鎖とに分類される。重鎖はγ、μ、α、δ及びεに分類され、これらの種類に応じて、それぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥという免疫グロブリンのクラスが定義される。各鎖のＮ末端は、約１００から１１０以上のアミノ酸からなる可変領域であり、抗原認識において主要な役割を果たしている。可変軽鎖（ＶL）及び可変重鎖（ＶH）という語は、っそれぞれ軽鎖及び重鎖におけるこれらの領域を指す。抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体及び抗カルジオリピン抗体は、何れの免疫グロブリンクラスのものであってもよい。
【００４７】
「相補性決定領域（complementarity-determining domains）」又は「ＣＤＲ」という語は、ＶL及びＶHの超可変領域を指す。ＣＤＲは、抗体鎖が有する標的タンパク質結合部位であって、その標的タンパク質に対する特異性を保有している。ヒトのＶL及びＶHは各々３つのＣＤＲを有し（Ｎ末端から順にＣＤＲ１〜３と呼ばれている）、可変領域の約１５〜２０％を構成している。ＣＤＲは標的タンパク質のエピトープと相補的な構造を有し、これが結合特異性を生み出す直接の原因となっている。ＶL又はＶHの他の領域はフレームワーク領域と呼ばれ、アミノ酸配列の変異が比較的少ない（Kuby, Immunology, 4th ed., Chapter 4, W.H. Freeman & Co., New York, 2000）。
【００４８】
ＣＤＲ及びフレームワーク領域の位置は、当該技術分野で周知の定義法によって決定することができる。例としては、Kabat, Chothia, International ImMunoGeneTics database（ＩＭＧＴ）及びＡｂＭ（例えば Johnson et al., Nucleic Acids Res., 29:205-206 (2001)；Chothia and Lesk, J. MoI. Biol, 196:901-917 (1987) ；Chothia et al., Nature, 342:877-883 (1989) ；Chothia et al., J. MoI. Biol, 227:799-817 (1992) ；Al-Lazikani et al., J.Mol.Biol, 273:927-748 (1997) 等を参照のこと）。また、抗原結合部位の定義法は、以下の文献にも記載されている。Ruiz et al., Nucleic Acids Res., 28:219-221 (2000)；Lefranc, M.P., Nucleic Acids Res., 29:207-209 (2001)；MacCallum et al., J. MoI Biol, 262:732-745 (1996)；Martin et al, Proc. Natl. Acad. Sd. USA, 86:9268-9272 (1989); Martin et al., Methods Enzymol, 203:121-153 (1991)；Rees et al., In Sternberg M.J.E. (ed.), Protein Structure Prediction, Oxford University Press, Oxford, 141-172 (1996)。
【００４９】
「抗体軽鎖（antibody light chain）」及び「抗体重鎖（antibody heavy chain）」という語は、それぞれＶL及びＶHを指す。ＶLは遺伝子断片Ｖ（variable）及びＪ（junctional）によってコード化され、ＶHはＶ、Ｄ（diversity）及びＪによってコード化される。ＶL及びＶHは各々、フレームワーク領域に加えてＣＤＲを有している。
【００５０】
抗体は、無傷の免疫グロブリンとして、或いは各種ペプチダーゼで消化して得られる特性化済み（well−characterized）断片として存在する。即ち、例えばペプシンは抗体をヒンジ領域のジスルフィド結合の下で消化し、Ｆ（ab）’2を生成する。これはＦab’の二量体であり、軽鎖がＶH−ＣH１にジスルフィド結合で結合してなるものである。Ｆ（ab）’2は穏和な条件下でも還元され、ヒンジ領域のジスルフィド結合が切断され得る。これによってＦ（ab）’2二量体はＦab’単量体に変換される。このＦab’単量体は基本的にＦabからなるが、ヒンジ領域の一部を有している（Paul, Fundamental Immunology 3d ed. 1993）。無傷抗体の消化に基づいて様々な抗体断片が定義されているが、当業者には周知のように、こうした断片は化学的に、或いは組み換えＤＮＡ方法論を用いて、新規に（de novo）合成することが可能である。即ち、本明細書において使用される抗体という語には、全長抗体の修飾によって得られる抗体断片、又は組み換えＤＮＡ方法論（例えば単鎖ＦV）を用いて新規に（de novo）合成されたもの、又はファージ・ディスプレイ・ライブラリを用いて同定されたもの（ファージ・ディスプレイ libraries：例えば McCafferty et al., Nature, 348:552-554 (1990) を参照のこと）も含まれる。
【００５１】
モノクローナル又はポリクローナル抗体の調製は、本技術分野で公知の任意の手法を用いて行なうことができる（例えば Kohler & Milstein, Nature, 256:495-497 (1975)；Kozbor et al., Immunology Today, 4:72 (1983)；Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96. Alan R. Liss, Inc. 1985 等を参照のこと）。単鎖抗体を作製する技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を応用して、本発明のポリペプチドに対する抗体を作製することも可能である。また、遺伝子組み換えマウスや他の哺乳類等の生物を用いて、ヒト化抗体を発現させることも可能である。或いはファージ・ディスプレイ技術を用いて、選択された抗原に特異的に結合する抗体、異種結合（heteromeric）Ｆab断片、又はｓｃＦｖ断片を同定することも可能である（例えば McCafferty et al., supra; Marks et al., Biotechnology, 10:779-783, (1992) 参照）。
【００５２】
III．リン脂質の補因子タンパク質及び／又は担体への結合
本発明の検出試薬に使用するために、リン脂質を補因子タンパク質及び／又は担体に結合させてもよい。リン脂質の多くは当初から反応性基を有するため、他の分子上の官能基に従来法を用いて複合化させることができる。一部の実施形態によれば、天然の反応性基を有するリン脂質を修飾して、第二の反応性基を導入する。
【００５３】
多くの他のリン脂質とは異なり、カルジオリピンは本来、カルボキシル基等の反応基を有していない。従って、カルジオリピンをβ２ＧＰＩタンパク質等の補因子タンパク質、又は担体に結合させるためには、修飾して反応性基を導入しなければならない。一実施形態によれば、カルジオリピンを無水コハク酸で誘導体化し、スクシニル化カルジオリピンを得る。カルジオリピンをスクシニル化する方法は公知である。例えば、米国特許出願公開公報第２００４/００９６９０３号及び国際公開公報ＷＯ９１/１０１３８等を参照のこと。好ましい実施形態によれば、この修飾は、カルジオリピンの極性頭部基のＣ２位に対して行なう。
【００５４】
反応性基の導入後、修飾カルジオリピンを別の分子上の官能基と複合化させる。これらの反応は従来法で実施でき、本技術分野では公知である。例えば、修飾カルジオリピンを担体に直接結合させてもよい。担体について以下、より詳しく説明する。多くの場合、担体は例えばアミン、カルボン酸、及びスルフヒドリル基等の官能基を有するので、これらと修飾カルジオリピン分子の官能基とを反応させれば容易に共有結合を形成し、カルジオリピンを担体と複合化させることができる。本目的に適した担体が、本体こうした官能基を有さないものである場合には、複合化に先立ってこの担体を誘導体化することにより、新たな反応性官能基を露出させ、又はこうした官能基を付加すればよい。誘導体化は、多数の分子のうち任意のものを接触させて行なうことができる。こうした分子としては、例えばSigma-Aldrich Chemical Company（セントルイス、ミズーリ）から入手されるものが挙げられる。例としては、１，６−ジアミノヘキサン、ＢＳＡ、ポリリジン、ポリ（エチレングリコール）ビス（３−アミノプロピル）終端化物、ポリ（エチレンオキシド）、４アーム（four-arm）、アミン終端化物、及びアミノデキストラン（Invitrogen Corporation（カールズバッド、カリフォルニア）製）が挙げられる。
【００５５】
また、修飾カルジオリピンを、β２ＧＰＩタンパク質等の補因子タンパク質に複合化させてもよい。更に、このβ２ＧＰＩタンパク質等の補因子タンパク質を担体に結合させる。結合は非共有結合でもよく、共有結合でもよい。共有結合は、担体と補因子タンパク質の末端アミノ酸残基との間でも、担体と補因子タンパク質の中間アミノ酸残基との間でもよい。必要であれば、補因子タンパク質への複合化に先立ち、この担体を誘導体化することにより、新たな反応性官能基を露出させ、又はこうした官能基を付加してもよい。これらの反応は従来法で実施でき、本技術分野では公知である。図２は、修飾カルジオリピンをβ２ＧＰＩタンパク質に共有結合させ、これを更に担体、即ちビーズに共有結合させる場合を示す概略図である。補因子タンパク質（例えばβ２ＧＰＩタンパク質）の担体への結合は、修飾カルジオリピンの補因子タンパク質への結合の前及び後の何れに行なってもよい。好ましい実施形態によれば、スクシニル化カルジオリピンをβ２ＧＰＩタンパク質に複合化させる。別の好ましい実施形態によれば、β２ＧＰＩタンパク質を担体に共有結合させる。
【００５６】
同様の方法を用いて、他のリン脂質をタンパク質や担体に結合させることもできる。他のリン脂質としては、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、及びホスファチジン酸が挙げられる。これらのリン脂質のうち反応性基を有するものは、未就職の状態でタンパク質又は担体に複合化させることができる。しかしながら、ユーザの必要や所望に応じて、上述した反応性基、例えばスクシニル基を、複合化に先立ちリン脂質に結合させてもよい。
【００５７】
担体の多くは合成ポリマー材料であるが、天然材料であってもよい。担体材料の例としては、アクリルアミド、セルロース、ニトロセルロース、ガラス、ポリスチレン、ポリエチレン酢酸ビニル、ポリプロピレン、ポリメタクリレート、ポリエチレン、ポリケイ酸、ポリエチレンオキシド、ポリカーボネート、テフロン（登録商標）、フッ化炭素、ナイロン、シリコーンゴム、コラーゲン、ポリ無水物、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、ポリプロピルフマレート、グリコサミノグリカン、及びポリアミノ酸が挙げられる。担体としては、多数の有用な形態のうち何れかであればよい。例としては薄層又は薄膜、ビーズ、ボトル、ディッシュ、繊維、繊維織物、成形ポリマー、粒子、及びマイクロスフェア等の微小粒子が挙げられる。好ましい支持体の形態はプレート及びビーズである。最も好ましい形態のビーズは、磁性ビーズ又はラテックスビーズである。
【００５８】
補因子タンパク質（例えばβ２ＧＰＩタンパク質）の担体への共有結合については上述したが、補因子タンパク質を担体に非共有結合させてもよい。一部の実施形態によれば、補因子タンパク質、又はカルジオリピンに共有結合している補因子タンパク質を、マイクロタイタープレートの壁面に被覆して、その表面に結合させることにより、補因子タンパク質を非共有結合でマイクロタイターウェルに結合させることができる。更なる実施形態によてば、β２ＧＰＩタンパク質、又はカルジオリピンに共有結合しているβ２ＧＰＩタンパク質を、マイクロタイタープレートの壁面に被覆して、その表面に結合させることにより、β２ＧＰＩタンパク質を非共有結合でマイクロタイターウェルに結合させることができる。
【００５９】
或いは、公知のタグとタグバインダーとの結合相互作用により、β２ＧＰＩ等の補因子タンパク質を担体に結合させてもよい。この結合相互作用の協働因子の一方、例えばタグを、補因子タンパク質に対して、例えば組み換え技術により結合させるとともに、他方の因子、例えばタグバインダーを担体に結合させればよい。使用可能なタグ及びタグバインダーとしては、公知の分子結合相互作用に基づくものが多数、文献に記載されている。例えば、タグが天然のバインダー、例えばビオチンを有する場合には、適切なタグバインダー（アビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン等）との組合せで使用すればよい。また、受容体リガンド結合相互作用も、タグ及びタグバインダー対として好適である。例としては、細胞膜受容体のアゴニスト及びアンタゴニスト（例えば、トランスフェリン、ｃ−キット、ウイルス受容体リガンド、サイトカイン受容体、ケモカイン受容体、インターロイキン受容体、カドヘリンファミリー、インテグリンファミリー、セレクチンファミリー等の細胞受容体リガンド結合相互作用が挙げられる（例えば Pigott & Power, The Adhesion Molecule Facts Book I (1993) を参照）。同様に、毒素（toxins）や毒液（venoms）、ウイルス性エピトープ、ホルモン（例えばオピエート、ステロイド等）、細胞内受容体（例えば、各種の小型リガンド、例えばステロイド、甲状腺ホルモン、レチノイド及びビタミンＤ；ペプチド等の作用を媒介するもの）、薬物、レクチン、糖、核酸（単鎖及び環状多量体の何れの構成も含む）、オリゴ糖、タンパク質、リン脂質、及び抗体は、何れも様々な細胞受容体と相互作用し得る。加えて、一部の合成ポリマー、例えばポリウレタン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリウレア、ポリアミド、ポリエチレンイミン、ポリ硫化アリーレン、ポリシロキサン、ポリイミド、及びポリアセテート等も、同様に適切なタグ又はタグバインダーを形成し得る。
【００６０】
タグの補因子タンパク質への結合には、多数の手法を用いることができる。また、タグバインダーの固体基体（即ち、担体）への固定化には、現在使用可能な様々な方法のうち、任意の方法を用いることができる。固体基体の誘導体化又は官能基化は、通常は基体の全体又は一部を化学試薬に暴露して、化学基を表面に固定化させ、次いでその化学基をタグバインダーの一部と反応させることによって行なわれる。例えば、長鎖部分に対する結合に適した基としては、アミン、ヒドロキシル、チオール、及びカルボキシル基が挙げられる。アミノアルキルシラン及びヒドロキシアルキルシランを用いれば、様々な表面、例えばガラス表面等を官能基化することができる。こうした固相バイオポリマーアレイの構造については文献に詳しく述べられている。例えば、Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154 (1963) （ペプチド等の固相合成に関する記載）；Geysen et al., J. Immun. Meth. 102:259-274 (1987) （ピン上での固相成分の合成に関する記載); Frank & Doring, Tetrahedron 44:6031-6040 (1988) （セルロースディスク上での様々なペプチド配列の合成に関する記載）；Fodor et al., Science, 251:767-777 (1991) ；Sheldon et al., Clinical Chemistry 39(4):718-719 (1993) ；及び Kozal et al., Nature Medicine 2(7):753759 (1996) (何れも固体基体に固定化されたバイオポリマーアレイに関する記載）を参照のこと。タグバインダーを基体に固定化する化学的手法以外の手法としては、他の一般的な方法、例えば熱、紫外線照射による架橋等の方法が挙げられる。
【００６１】
検出試薬の例は図１に記載されている。ＦＩＧ．１Ｂは、担体に結合した補因子タンパク質を含んでなる検出試薬を示している。補因子タンパク質の担体に対する結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。また、ユーザーの所望に応じて、まず補因子タンパク質をリンカーに結合させ、次いでこれを担体に結合させてもよい。
【００６２】
ＦＩＧ．１Ｃは、担体に結合したリン脂質を含んでなる検出試薬を示している。ユーザーの所望に応じて、まずリン脂質を共有結合によってリンカーに結合させ、次いでこれを共有結合又は非共有結合により、担体に結合させてもよい。
【００６３】
ＦＩＧ．１Ｄは、リン脂質と補因子タンパク質との複合体を担体に結合させてなる検出試薬を示している。補因子タンパク質の担体への結合は、共有結合でも非共有結合でもよい。ユーザーの所望に応じて、リン脂質をリンカーに結合させ、更にこれを補因子タンパク質に結合させてもよい。同様に、ユーザーの所望に応じて、補因子タンパク質をリンカーに結合させ、更にこれを担体に結合させてもよい。
【００６４】
Ｖ．抗リン脂質補因子タンパク質抗体又は抗リン脂質抗体の検出用アッセイ
Ａ．本発明の検出試薬を用いた抗リン脂質補因子タンパク質抗体の検出
本発明の検出試薬を抗リン脂質補因子タンパク質抗体の検出に有用なものとするには、まず、抗リン脂質補因子タンパク質抗体に特異性をもって結合できるようにしなければならない。こうした特異結合の試験には、多数の周知の免疫学的結合アッセイを用いることができる。例えば、米国特許第４，３６６，２４１号；第４，３７６，１１０号；第４，５１７，２８８号；及び第４，８３７，１６８号を参照のこと。また、イムノアッセイ法の概説としては、Asai, Methods in Cell Biology, Volume 37: Antibodies in Cell Biology, Academic Press, Inc. NY (1993) を参照のこと。
【００６５】
本発明の検出試薬は、通常は担体に固定化され、抗リン脂質補因子タンパク質抗体のいわゆる「捕捉剤（capture agent）」として用いられる。抗リン脂質補因子タンパク質抗体を含有することが既知のサンプルを用いて結合アッセイを行なうことにより、組み換えβ２ＧＰＩタンパク質等の組み換えタンパク質を含む補因子タンパク質の中から、抗リン脂質補因子タンパク質抗体に特異性をもって結合可能なものを選別することができる。適切な結合条件を決定する手法は周知であり、こうした結合アッセイの実施に関する概説は、多数の科学出版物に記載されている。例えば Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988) を参照のこと。抗体と抗原（即ち検出試薬）との複合体を形成する際に、標識剤を使用することにより、こうした複合体の存在を表示することができる。この場合において、この目的に標識剤を使用する手法としては、幾つかの手法が挙げられる。例えば、標識剤として、抗体抗原複合体を認識可能であって、且つ、標識を有する第二抗体を用いることができる。或いは、標識を有さない第二抗体に、第二抗体が由来する抗体種に対して特異的な、標識化された第三抗体を結合させてもよい。また、第二抗体をビオチン等の検出可能な部分によって修飾し、次いでこれに特異性をもって結合可能な第三の標識分子、例えばストレプトアビジン等を結合させてもよい。更に、タンパク質Ａやタンパク質Ｇ等の、免疫グロブリンの定常領域に特異的に結合可能な他のタンパク質も、標識剤として使用することができる。これらのタンパク質は連鎖球菌の細胞壁の一般的な構成要素であり、様々な種の免疫グロブリンの定常領域に対して非免疫原性の強い反応性を示す。概要については、Kronval et al., J Immunol, 111:1401-1406 (1973) ；及び Akerstrom et al., J Immunol, 135:2589-2592 (1985) 等を参照のこと。ヒト患者において抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体のアッセイを行なう場合は、いわゆる抗ヒト抗体を用いて抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体を検出することができる。
【００６６】
アッセイ時には、試薬の組合せ毎に保温及び／又は洗浄工程が必要となる場合がある。保温工程は約５秒から数時間まで様々であるが、好ましくは約５分から約２４時間までの範囲である。保温時間は、アッセイの方式、ペプチドの種類、溶液の体積、濃度等に応じて様々である。アッセイは多くの場合は環境温度で行なわれるが、広範な温度範囲、例えば約１０℃から約４０℃までの範囲で行なうことができる。
【００６７】
好ましい実施形態によれば、保温及び／又は洗浄工程に使用される緩衝液は、界面活性剤を含んでいてもよい。界面活性剤としては、例えばＴｗｅｅｎ２０、ＣＨＡＰＳ、ＮＰ−４０、又はイムノアッセイに一般的に使用される他の界面活性剤が挙げられる。
【００６８】
抗体抗原複合体の検出には、異なる標識化の手法を用いることができる。標識化部分としては、例えば、蛍光分子（例えば、フルオレセイン、ローダミン、テキサスレッド、及びフィコエリトリン等）又は酵素分子（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びβ−ガラクトシダーゼ等）を、第二抗体又は第三抗体に結合させれば、蛍光発光に基づく検出や、酵素によって触媒される化学反応の産物に基づく検出が可能となる。また、種々の同位体（例えば3Ｈ、125Ｉ、35Ｓ、14Ｃ、又は32Ｐ等）を有する放射性標識を適切な分子に結合させれば、放射能を記録するための任意の適切な方法（例えばオートラジオグラフィー等）によって、抗体ペプチド複合体の検出を行なうことが可能となる。例えば Tijssen, "Practice and Theory of Enzyme Immunoassays", Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Burdon and van Knippenberg Eds., Elsevier (1985), pp. 9-20 を参照のこと。また、標識、標識化手順、及び標識の検出の紹介としては、Polak and Van Noorden, Introduction to Immunocytochemistry, 2d Ed., Springer Verlag, NY (1997) ；及び Haugland, Handbook of Fluoroscent Probes and Research Chemicals（Molecular Probes, Inc. 発行のハンドブックとカタログの組合せ）(1996) も挙げることができる。
【００６９】
Ｂ．フローサイトメトリー
フローサイトメトリーは、抗リン脂質補因子タンパク質抗体の存在を検出するための、好ましい方法の１つである。本手法によれば、複合化された本発明の補因子タンパク質（例えばβ２ＧＰＩタンパク質）を好適な粒子と複合化することにより、蛍光等で標識した第三の分子の結合を通じて、抗リン脂質補因子タンパク質抗体の特異的な結合が検出される。フローサイトメトリーの方法や器具類は本技術分野では公知であり、本発明の実施にもそれらを用いることができる。通常、フローサイトメトリーは、レーザービーム近傍に微小粒子の懸濁液流を通過させ、各粒子からの蛍光発光を光電管で検出することによって行なう。フローサイトメトリーの器具類や方法に関する詳細な説明は文献に記載されている。例としては、McHugh, "Flow Microsphare Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes", Methods in Cell Biology 42, Part B (Academic Press, 1994)；McHugh et al., "Microsphare-Based Fluorescence Immunoassays Using Flow Cytophotometry Instrumentation", Clinical Flow Cytophotometry, Bauer, K.D., et al., eds. (Baltimore, Maryland, USA: Williams and Williams, 1993), pp. 535-544；Lindmo et al., "Immunometric Assay Using Mixtures of Two Particle Types of Different Affinity", J. Immunol. Meth. 126: 183-189 (1990)；McHugh, " Flow Cytophotometry and the Application of Microsphare-Based Fluorescence Immunoassays", Immunochemica 5: 116 (1991)；Horan et al, "Fluid Phase Particle Fluorescence Analysis: Rheumatoid Factor Specificity Evaluated by Laser Flow Cytophotometry", Immunoassays in the Clinical Laboratory, 185-189 (Liss 1979)；Wilson et al, "A New Microsphare-Based Immunofluorescence Assay Using Flow Cytometry", J. Immunol. Meth. 107: 225-230 (1988)；Fulwyler et al, "Flow Microsphare Immunoassay for the Quantitative and Simultaneous Detection of Multiple Soluble Analytes", Meth. Cell Biol. 33: 613-629 (1990)；Coulter Electronics Inc., United Kingdom Patent No. 1,561,042 (published February 13, 1980)；及び Stemkamp et al, Review of Scientific Instruments 44(9): 1301-1310 (1973) が挙げられる。また、フローサイトメトリーアッセイについては、米国特許第６，２８０，６１８号及び第６，８７２，５７８にも開示されている。これらは何れも引用によって本明細書に組み込まれる。
【００７０】
本発明の実施に使用される粒子は、顕微鏡サイズであって、ポリマー材料からなることが好ましい。微小粒子のポリマーとしては、微小粒子表面に添着された結合用部材となる塗膜を除いて、生体サンプル成分やアッセイ試薬よりも化学的に不活性のポリマーであることが好ましい。また、好適な微小粒子材料は、自己蛍光が最小限であり、固体であり、アッセイに使用されるサンプルや緩衝液、溶媒、担体、希釈剤、又は懸濁化剤の何れにも溶解せず、且つ、適切な塗膜材料を好ましくは共有結合によって添着可能なものである。好適なポリマーの例としては、ポリエステル、ポリエーテル、ポリオレフィン、ポリアルキレンオキシド、ポリアミド、ポリウレタン、多糖類、セルロース、及びポリイソプレンが挙げられる。ポリマーの多くは、架橋によって微小粒子の構造が統合され、剛性が付与されるので、架橋は有用である。微小粒子のサイズの範囲は様々であり、本発明では必ずしもサイズ範囲を特定する必要はない。多くの場合、微小粒子の径は、約０.５マイクロメートルから約１００マイクロメートルの範囲であるが、約０.３マイクロメートルから約４０マイクロメートルの範囲が好ましい。
【００７１】
粒子の回収やアッセイの洗浄工程を容易にするために、粒子は、磁気反応性材料（magnetically responsive material）、即ち、磁場に対して反応する任意の材料を含有することが好ましい。固相と液相との分離は、保温工程又は洗浄工程の何れかの後に、懸濁液を保温する反応器に磁場を印加し、粒子を反応器の壁面に付着させてから、液体をデカンテーション又は吸引によって除去することにより行なう。本発明において対象となる磁気反応性材料としては、常磁性材料、強磁性材料、フェリ磁性材料、及びメタ磁性材料が挙げられるが、常磁性材料が好ましい。例としては、鉄、ニッケル、及びコバルトが挙げられる。また、例えばＦｅ3Ｏ4、ＢａＦｅ12Ｏ19、ＣｏＯ、ＮｉＯ、Ｍｎ2Ｏ3、Ｃｒ2Ｏ3、及びＣｏＭｎＰ等の金属酸化物も挙げられる。
【００７２】
磁気反応性材料は、ポリマーによく分散させてもよく、ポリマー表面に塗膜として、若しくはポリマー表面の複数の塗膜のうちの１つとして設けてもよく、又は、材料を粒子に固定するための他の任意の方法によって導入若しくは添着してもよい。粒子中の磁気反応性材料の量は重要ではなく、広範な値を取り得る。但し、液相と固相との接触面を最大とし、フローサイトメトリーを容易にする目的においては、この量は微小粒子の密度に影響を与える場合があり、また、量及び粒子サイズはともに、微小粒子の懸濁液中における安定性に影響を与える場合がある。微小粒子中における磁気反応性材料の量が多過ぎると、それによって生じる自己蛍光のレベルが高くなり過ぎて、アッセイ結果と干渉してしまう場合がある。従って、磁気反応性材料の濃度をできるだけ低く抑えて、材料が発する自己蛍光を最小限にすることが好ましい。以上の点を考慮すると、本発明に係る粒子の磁気反応性材料は、全体として、粒子の約０.０５重量％から約７５重量％の範囲であることが好ましい。より好ましい重量パーセント範囲は約１％から約５０％であり、更に好ましい重量パーセント範囲は約２％から約２５％であり、より一層好ましい重量パーセント範囲は約２％から約８％である。
【００７３】
粒子表面を適切なアッセイ試薬で被覆するためには、静電気引力、特異親和結合相互作用、疎水結合相互作用、共有結合等を用いることができるが、共有結合が好ましい。アッセイ試薬の共有結合用官能基によるポリマーの誘導体化は、従来の手法で行なうことが可能であるが、特にそうした官能基を有する単量体の使用が挙げられる。このような単量体は、単独で使用される単量体であってもよく、他の単量体と併用される単量体であってもよい。好適な官能基の例としては、アミン基（−ＮＨ2）、アンモニウム基（−ＮＨ3+又は−ＮＲ3+）、ヒドロキシル基（−ＯＨ）、カルボン酸基（−ＣＯＯＨ）、及びイソシアネート基（−ＮＣＯ）が挙げられる。カルボン酸基をポリオレフィンに導入するのに有用な単量体としては、例えば、アクリル酸及びメタクリル酸が挙げられる。
【００７４】
粒子表面における抗体認識用エピトープの密度を増加させ、立体障害を低減する手段として、リンカーを使用することもできる。これにより、アッセイの範囲及び感度を向上させることができる。また、本発明の特定の被覆材料を安定化させる必要がある場合には、特異型の反応性基を固相表面に付与する手段として、リンカーを使用することもできる。好適且つ有用な官能基としては、１,６−ジアミノヘキサン、ポリリジン、ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸、及びポリアルギニンが挙げられる。
【００７５】
一部の実施例では、高い自己蛍光を示す粒子の使用を避けるように注意が必要な場合がある。一般に、多種多様な出発単量体から従来の乳化重合技術を用いて形成した粒子は、自己蛍光を生じても低レベルであるので好適である。逆に、修飾によって孔隙率が、ひいては表面積が高められた粒子、即ち、文献において「マクロポーラス（macroporous）」粒子と呼ばれる粒子は、高い自己蛍光を示す傾向があるのであまり好ましくない。更に、サイズの増大やジビニルベンゼン単量体のパーセンテージの増加に伴って自己蛍光が強まる点にも留意すべきである。
【００７６】
結合用部材の標識化に使用される標識は、検出可能なシグナルを発し得る標識であれば任意である。こうした標識の中でも、フルオロフォアが好ましい。膨大な種類のフルオロフォアが文献に報告されて当業者に周知となっており、その多くはバイオテクノロジー分野の販売業者から容易に入手可能である。フルオロフォアに関する文献としては、Cardullo et al, Proc. Natl. Acad. ScL USA 85: 8790-8794 (1988) ；Dexter, D.L., J. of Chemical Physics 21: 836-850 (1953) ；Hochstrasser et al, Biophysical Chemistry 45: 133-141 (1992) ；Selvin, P., Methods in Enzymology 246: 300-334 (1995) ；Steinberg, I. Ann. Rev. Biochem., 40: 83-114 (1971) ；Stryer, L. Ann. Rev. Biochem., 47: 819-846 (1978) ；Wang et al, Tetrahedron Letters 31: 6493-6496 (1990) ；Wang et al., Anal. Chem. 67: 1197-1203 (1995) 等が挙げられる。
【００７７】
フルオロフォアの例を以下に列挙する。ＢＯＤＩＰＹ；クマリン；シアニン染料；フルオレセイン；フルオレセインイソチオシアネート；フィコビリタンパク質（Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン等）；量子ドット；ローダミンＢ；ローダミン１２３；ローダミンＸイソチオシアネート；スルホローダミンＢ；スルホローダミン１０１；スルホローダミン１０１のスルホニルクロリド誘導体（テキサスレッド）；Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）；テトラメチルローダミン；及び、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）。
【００７８】
これらのフルオロフォアの何れかを上述した結合用分子に結合させて、本発明の実施に使用されるアッセイ試薬を形成する手法としては、フルオロフォア及び結合用部材上の適切な官能基を用いて、従来法で共有結合させる手法が挙げられる。こうした基や、結合を形成するための反応は、当業者には容易に認識されるであろう。
【００７９】
同様に、アッセイを自動化する場合に、磁場を印加及び除去する方法や器具等についても、当業者には公知であり、文献に報告されている。こうした文献報告の例としては、Forrest et al.、米国特許第４，１４１，６８７号（Technicon Instruments Corporation、１９７９年２月２７日）；Ithakissios、米国特許第４，１１５，５３４号（Minnesota Mining and Manufacturing Company、１９７８年９月１９日）；Vlieger, A.M., et al., Analytical Biochemistry 205:1-7 (1992)； Dudley, Journal of Clinical Immunoassay 14:77-82 (1991) ；及び、Smart, Journal of Clinical Immunoassay 15:246- 251 (1992) 等が挙げられる。本段落及び以降の段落で引用される全文献が、引用により本明細書に組み込まれる。
【００８０】
フローサイトメトリーによるアッセイの例をＦＩＧ．２Ａに示す。この例では、患者由来のサンプルを分析するのに、二種以上の検出試薬を用いている。これらの検出試薬としては、例えば、抗リン脂質補因子タンパク質抗体検出試薬、抗リン脂質抗体検出試薬、及び、抗補因子タンパク質検出試薬が挙げられる。検出試薬は微小粒子を含有し、この例では各微小粒子が互いに他と識別できるようになっている。フローサイトメトリーは、微小粒子を例えば粒子サイズによって識別することができる。粒子を識別するための他の方法としては、（Tripatzos L、ＥＰ ０ １２６ ４５０）蛍光、有色染料、サイズ等が挙げられる。別の実施形態によれば、微小粒子は識別可能ではないが、患者由来サンプルのアッセイに個別に用いられる。例えば、３種の異なる検出試薬を含有する３つのチューブに、サンプルを等分して加える場合が考えられる。
【００８１】
サンプルを（一種又は二種以上の）検出試薬に加えた後、混合物を保温することにより、適切な抗体を適切な検出試薬に結合させて、抗原抗体複合体を形成させる。この複合体を洗浄して、結合していない非特異的抗体を除去する。アッセイ用抗体に対して特異的な標識化抗体、即ち、ヒト患者由来サンプル用の抗ヒト抗体を、この抗原抗体複合体に加え、十分な時間保温して、標識化抗体の特異結合を生じさせる。複合体を再度洗浄して、結合していない標識化抗体を除去する。サンプル中の標識の量を、フローサイトメトリーを用いて測定する。
【００８２】
VI．抗リン脂質症候群の診断
抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）は、例えば、発作、深部静脈血栓症、再発性流産、皮斑、痙攣、舞踏病、腎静脈及び環状脈血栓症、血小板減少、並びに肺高血圧症等に関連する疾病である。
【００８３】
診断方法の一例としては、ＡＰＳの疑いのある患者について、いわゆる抗リン脂質抗体を測定する方法が挙げられる。これらのいわゆる抗リン脂質抗体を測定する方法として現在利用できる方法は変動が大きいのに対して、本発明は、共有結合リン脂質、例えば共有結合カルジオリピンを有する検出試薬を提供することにより、これらの方法を改善することが可能となる。他の方法としては、抗ホスファチジルセリン抗体又はホスファチジルセリン補因子タンパク質複合体に対する抗体のレベルを測定する方法が挙げられる。ホスファチジルセリン補因子タンパク質複合体は、β２ＧＰＩタンパク質を含むことが好ましい。
【００８４】
ＡＰＳの診断は、ＡＰＳの疑いのある患者について、抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体のレベルを決定することにより行なう。診断用に測定可能な他の抗体としては、例えば、抗カルジオリピン抗体、抗ホスファチジルセリン、抗エタノールアミン抗体、及び抗補因子タンパク質抗体、例えば抗β２ＧＰＩタンパク質や抗プロトロンビン抗体、及び抗ホスファチジルセリン補因子タンパク質複合体抗体が挙げられる。前記の決定は、生体サンプルを本発明の検出試薬（例えば本発明の抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬）と接触させ、例えば抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬と、生体サンプル由来の抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体とを含んでなる、抗原抗体複合体のレベルを決定することにより行なう。抗原抗体複合体、即ち、抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬と抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体との複合体のレベルは、サンプル中の抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体の量と関連している。
【００８５】
好ましい実施形態によれば、診断は、カルジオリピン部分がβ２ＧＰＩタンパク質に共有結合し、このβ２ＧＰＩタンパク質が担体に結合してなる抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体検出試薬に、特異的に結合する抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体のレベルを決定することにより行なう。更に好ましい実施形態によれば、β２ＧＰＩタンパク質は担体に共有結合してなる。
【００８６】
患者のサンプル中における抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体、又は標的となる他の抗体のレベルを、正常対照と比較することが好ましい。正常対照とは、例えばヒトの血液、血清、又は血漿等の生体サンプルであって、健常個体、即ち、ＡＰＳを有しない個体における抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体レベルの範囲を表わすサンプルを指す。また、正常対照は、抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体の基準範囲、即ち、ＡＰＳを有しない個体において決定される抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体レベルの範囲であってもよい。ＡＰＳの診断は、抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体のレベルが正常対照レベルよりも有意に高いことが、例えば少なくとも２回、或いは、一部の実施形態では１０回よりも多く、或いは、別の実施形態では１００回よりも多く示された場合に、支持されることになる。正常対照値の決定は本技術分野では公知であり、例えば Sasse E. A., Reference Intervals and Clinical Decision Limits, in Clinical Chemistry: Theory, Analysis and Correlation 365-398 (Lawrence A. Kaplan et al. eds., 3rd ed. 1996) に開示されている。
【００８７】
抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体の検出は、従来のイムノアッセイ方式、例えばＥＬＩＳＡやフローサイトメトリーによって行なうことができる。
【００８８】
好ましい実施形態によれば、患者はヒトである。より好ましい実施形態によれば、患者は、本明細書記載の試薬により高レベルの抗体が検出されるとともに、他のＡＰＳの症状のうち少なくとも１つが観察される者である。他のＡＰＳの症状としては、血管血栓症、妊娠不全、及び血漿中におけるループス抗凝固因子の存在が挙げられる。例えば Wilson et al., Arthr. & Rheum. 422:1309-1311 (1999) を参照のこと。
【００８９】
本明細書及び上述の特許請求の範囲において使用される「ある」、「その」等の単数形（the singular forms "a", "an", and "the"）には、文脈上明らかに単数である場合を除いて、複数の指示対象も含まれることに留意すべきである。即ち、例えば「１の核酸（a nucleic acid）」と言う場合には、こうした核酸が複数ある場合も含まれるものとし、「そのポリペプチド（the polypeptide）」と言う場合には、一又は二以上のポリペプチド、及び当業者に公知のその等価物も含まれるものとする。
【００９０】
本明細書で言及した刊行物は、本出願の出願日前の開示内容のためにのみ供されるものである。本明細書の如何なる記載についても、本発明が先の発明の存在によって、こうした刊行物に先行する権利を有しないものと解釈してはならない。更に、記載された刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があるので、個別に確認する必要があると思われる。引用文献は援用により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００９１】
実施例１：
カルジオリピンβ２ＧＰＩタンパク質ビーズの合成
１.８ｍＬの微小遠心管に１０ｍｇの８μｍカルボキシル化修飾常磁性マイクロスフェアを入れた。約１ｍＬの１６７ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ約６．１）によって一回（磁気分離を用いて）洗浄した。６６８ｍＭスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳＳ）の１６７ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ約６．１）中溶液約３００μＬと、１４４ｍＭ Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）のエタノール中溶液７００μＬとを加えた。混合（例えば回転等）しながら約３０分間室温で放置した。磁気分離して上清を廃棄した。約１ｍＬの５０ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）（ｐＨ約８．１）で一回洗浄した。６３４μＬの脱イオン水、２００μＬの２５０ｍＭ ＥＰＰＳ（ｐＨ約８．１）、及び１６６μＬの１．５１ｍｇ／ｍＬβ２ＧＰＩ溶液を加えた。混合（例えば回転等）しながら約６０分間室温で放置した。ビーズを約４回、約１ｍＬの５０ｍＭ ＰＢＳ／０．１％ＣＨＡＰＳで洗浄し、結合しないβ２ＧＰＩを除去した。その後、ビーズを１ｍＬの５０ｍＭ ＰＢＳ／０．１％ＣＨＡＰＳ、保存緩衝液中で、必要時まで約２〜８℃で保存した。
【００９２】
約３００μＬのスクシニル化カルジオリピン（４．５ｍｇ、エタノール中１５ｍｇ／ｍＬ）を１．８ｍＬの微小遠心管に入れ、この溶液に、約９μＬの３３４ｍＭ Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）のエタノール溶液と、１９．５μＬの１６８ｍＭ ＣＭＣのエタノール溶液を加えた。サンプルを室温で３０分、穏やかに混合した。保存緩衝液をβ２ＧＰＩ被覆ビーズから除去し、約１ｍＬのエタノールで２回洗浄した。
【００９３】
スクシニル化カルジオリピンとＮＨＳとの反応が完了した後、その溶液約２２０μＬを、洗浄したβ２ＧＰＩ被覆ビーズに移し、室温で約１時間混合した。このビーズを、約１ｍＬのビーズ希釈剤で約４回洗浄した。ビーズ希釈剤は、０．５％ ゼラチン；６ｍＭ塩化ナトリウム；５０ｍＭ ３−（Ｎ−モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）；０．１％３−［（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニオ］−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）；０．００５％ ２−（ｐ−メトキシフェノキシ）プロピオン酸（ＰＭＰ）；２０％グリセロール；３．３ＴＩＵ／Ｌアプロチニン；及び２ｍＭ 塩化マグネシウムを含んでなる（ｐＨ７．４）。このビーズを約１ｍＬのビーズ希釈剤中、必要時まで約２〜８℃で保存した。カルジオリピンβ２ＧＰＩビーズの調製法を表わす略図を図３に示す。
【００９４】
このカルジオリピンβ２ＧＰＩタンパク質ビーズにより、Luminex 100 プラットフォームを用いて、選択された患者サンプルから抗カルジオリピン補因子タンパク質抗体を首尾よく検出することができた。表１に、本発明のアッセイBioPlex FCIAと、市販の酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）との比較試験の結果を示す。この結果は、本発明のアッセイが市販のＥＩＡと同等であることを示している。
【００９５】
【表１】
2008537121.tif 000003
【００９６】
実施例２：
ホスファチジルセリンβ２ＧＰＩビーズの合成
１.８ｍＬの微小遠心管に、約１０ｍｇの８μｍカルボキシル化修飾常磁性マイクロスフェアを入れた。約１ｍＬの１６７ｍＭ ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（ｐＨ約６．１）により１回（磁気分離を用いて）洗浄した。６６８ｍＭ スルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳS）の１６７ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ約６．１）溶液約３００μＬと、１４４ｍＭ Ｎ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネート（ＣＭＣ）のエタノール溶液約７００μＬとを加えた。このサンプルを混合（例えば回転等）しながら約３０分間室温で放置した。ビーズを上清から磁気分離し、上清を廃棄した。ビーズを約１ｍＬの５０ｍＭ ４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸（ＥＰＰＳ）（ｐＨ約８．１）で１回洗浄した。このビーズに対して、約６３４μＬの脱イオン水、約２００μＬの２５０ｍＭ ＥＰＰＳ（ｐＨ８．１）、及び約１６６μＬの１．５１ｍｇ／ｍＬβ２ＧＰＩ溶液を加え、混合（例えば回転等）しながら約６０分間室温で放置した。このビーズを４回洗浄し、約１ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ約７．４）を加えた。その後、このビーズを約０．６ｍＬの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）、保存緩衝液中、約２〜８℃で使用時まで保存した。
【００９７】
８．１ｍｇ／ｍＬホスファチジルセリンの１０ｍＭ ＰＢＳ（ｐＨ７．４）／１．５％ ＣＨＡＰＳ中に有する液を約４００μＬ、１．８ｍＬの微小遠心管に入れ、溶液とした。この溶液に、３３４ｍＭスルホ−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳＳ）の５０ｍＭ ＭＥＳ（ｐＨ６．１）中溶液約１２μＬと、１６８ｍＭ ＣＭＣエタノール溶液約２６μＬとを加えた。サンプルを室温で約３０分間、穏やかに混合した。
【００９８】
溶液の放置後、１０ｍＭ ＰＢＳ／１．５％ＣＨＡＰＳ約３５９μＬと、上記ホスファチジルセリン溶液４１μＬを、ビーズ懸濁液に加えた。混合（例えば回転等）しながら約１時間室温で放置した。このビーズを上述したビーズ希釈剤約１ｍＬで６回洗浄した。このビーズを約１ｍＬのビーズ希釈剤中、約２〜８℃で使用時まで保存した。ホスファチジルセリンβ２ＧＰＩビーズの調製法を表わす略図を図４に示す。
【００９９】
上述のホスファチジルセリンβ２ＧＰＩビーズを用いた本発明のアッセイと、市販の酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）との比較試験の結果を表２に示す。この結果は、本発明のアッセイが市販のＥＩＡと同等であることを示している。
【０１００】
【表２】
2008537121.tif 000004
【０１０１】
実施例３：
カルジオリピン又はホスファチジルセリンβ２ＧＰＩビーズを用いたＡＰＳの診断 
表３に示すように、健全な血液提供者９７人と、以前に一次又は二次の抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）と診断されたことがある患者１０６人から、血液サンプルを採取した。１）β２ＧＰＩのみ、２）スクシニル化カルジオリピンのみ、３）スクシニル化カルジオリピン及びβ２ＧＰＩ、並びに４）ホスファチジルセリン及びβ２ＧＰＩを用いて被覆（即ち、これらと共有結合させた）識別可能な粒子の多重化パネルを作製した。３及び４については、スクシニル化カルジオリピン及びホスファチジルセリンの何れも、β２ＧＰＩタンパク質に対して共有結合させた。洗浄は界面活性剤を含有する緩衝液中で実施した。これらの血液サンプルを、４種の識別可能な粒子に基づいて、フローサイトメトリーによりアッセイした。健全提供者由来のサンプルには、４種の試験粒子のうち何れかと結合を示したものはなかった。これに対して、ＡＰＳ患者のうち６１人のサンプル（５８％）は、４種の試験粒子のうち少なくとも１種と結合を示した。従来のＡＰＳ診断試験によれば、β２ＧＰＩビーズ又はβ２ＧＰＩカルジオリピンビーズに結合する抗体が検出される。以下のＡＰＳ患者のうち７人は、従来法による診断はできないものと思われる。６人がカルジオリピンのみのビーズに結合を示し、１人はホスファチジルセリンのみのビーズに結合を示した（表示せず）。
【０１０２】
【表３】
2008537121.tif 000005
【０１０３】
以上、理解の明確化のために、本発明について例示を加えながら詳細に説明したが、本発明の教示に基づいて、添付の請求項の要旨及び範囲を逸脱しない限りにおいて、任意の変更や修正を加えてもよいことは、当業者であれば明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】リン脂質補因子タンパク質検出試薬の構造を示す図である。ＦＩＧ．１Ａは、試薬の成分に使用する記号を説明する図である。ＦＩＧ．１Ｂは、リン脂質補因子タンパク質に結合する抗体を検出する試薬の構造を表わす図である。ＦＩＧ．１Ｃは、リン脂質部分に結合する抗体を検出する試薬の構造を表わす図である。ＦＩＧ．１Ｄは、リン脂質−補因子タンパク質複合体に結合する抗体を検出する試薬の構造を表わす図である。
【図２】リン脂質部分、補因子タンパク質、及びリン脂質補因子タンパク質複合体にそれぞれ結合する抗体を識別するために使用される、フローサイトメトリーによるアッセイを表わす図である。ＦＩＧ．２Ａはアッセイを示す図であり、ＦＩＧ．２Ｂはアッセイの成分に使用する記号を説明する図である。
【図３】カルジオリピンβ２ＧＰＩ微小粒子の合成法を示す図である。微小粒子を大きな円で示す。ＣＭＣはＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートを表わす。β２ＧＰＩはベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質を表わす。
【図４】ホスファチジルセリンβ２ＧＰＩ微小粒子の合成法を示す図である。微小粒子を大きな円で示す。ＣＭＣはＮ−シクロヘキシル−Ｎ’−（２−モルホリノエチル）カルボジイミドメト−ｐ−トルエンスルホネートを表わす。β２ＧＰＩはベータ−２−グリコプロテインＩ（β２ＧＰＩ）タンパク質を表わす。
【図１】
2008537121.tif 000006
【図２】
2008537121.tif 000007
【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
2008537121.tif 000010