(57)【要約】  本発明は、好ましくはグレリンに結合する核酸に関し、この場合、核酸は、第一のストレッチＢｏｘＡおよび第二のストレッチＢｏｘＢを含み、ここで、第一のストレッチＢｏｘＡは約２５個の連続ヌクレオチドを含み、第二のストレッチＢｏｘＢは約６〜８個の連続ヌクレオチドを含み、ここで、第一のストレッチＢｏｘＡのヌクレオチドの３’末端ストレッチは、第二のストレッチＢｏｘＢとハイブリダイズし、このハイブリダイゼーションでは、第一の二本鎖構造が形成され、そしてそのような第一の二本鎖構造がバルジを含む。
2008534024.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
選択的にグレリンに結合する核酸であって、
第一のストレッチＢｏｘＡおよび
第二のストレッチＢｏｘＢ
を含み、
ここで、
第一のストレッチＢｏｘＡは約２５個の連続ヌクレオチドを含み、
第二のストレッチＢｏｘＢは約６〜８個の連続ヌクレオチドを含み、
ここで、
第一のストレッチＢｏｘＡのヌクレオチドの３’末端ストレッチは、第二のストレッチＢｏｘＢとハイブリダイズし、このハイブリダイゼーションでは、第一の二本鎖構造が形成され、そしてそのような第一の二本鎖構造はバルジを含む、上記核酸。
【請求項２】
二本鎖構造が、第一のストレッチＢｏｘＡの５個の３’末端連続ヌクレオチドおよび第二のストレッチＢｏｘＢのヌクレオチドの一部または全部、好ましくは第二のストレッチＢｏｘＢの６〜８個の連続ヌクレオチドによって形成される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
バルジが、第一のストレッチＢｏｘＡの５個の３’末端連続ヌクレオチドと塩基対合しない、第二のストレッチＢｏｘＢの１〜３個のヌクレオチド、好ましくは第二のストレッチＢｏｘＢの１個のヌクレオチドによって形成される、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
バルジが非塩基対合プリンによって形成され、ここで、プリンは好ましくはグアノシンである、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸。
【請求項５】
非塩基対合プリンが、第二のストレッチＢｏｘＢによって提供される、請求項４に記載の核酸。
【請求項６】
核酸が、第三のストレッチＢｏｘＣ１および第四のストレッチＢｏｘＣ２をさらに含み、
ここで、第三のストレッチＢｏｘＣ１は少なくとも１個のヌクレオチドを含み、そして
第四のストレッチＢｏｘＣ２は少なくとも１個のヌクレオチドを含み、そして
ここで、第三のストレッチＢｏｘＣ１は、その３’末端によって第二のストレッチＢｏｘＢの５’末端に連結されており、そして第四のストレッチＢｏｘＣ２は、その５’末端によって第一のストレッチＢｏｘＡの３’末端に連結されている、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸。
【請求項７】
第三のストレッチＢｏｘＣ１および第四のストレッチＢｏｘＣ２はハイブリダイゼーション可能であり、ハイブリダイゼーションにより、第二の二本鎖構造が形成される、請求項６に記載の核酸。
【請求項８】
第一の二本鎖構造が第一のらせん構造を形成する、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸。
【請求項９】
第二の二本鎖構造が第二のらせん構造を形成する、請求項７に記載の核酸。
【請求項１０】
第二のらせん構造が、１〜１０個の塩基対、好ましくは１〜３個の塩基対、より好ましくは２〜３個の塩基対を含んでなる、ヘリックスまたはヘリックス様構造である、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
第一のらせん構造が第二のらせん構造によって延長されている、請求項９〜１０に記載の核酸。
【請求項１２】
第三のストレッチＢｏｘＣ１が、約１〜１０個の連続ヌクレオチド、好ましくは１〜３個の連続ヌクレオチド、より好ましくは２または３個の連続ヌクレオチドを含む、請求項６〜１１のいずれかに記載の核酸。
【請求項１３】
第四のストレッチＢｏｘＣ２が、約１〜１０個の連続ヌクレオチド、好ましくは１〜３個の連続ヌクレオチド、より好ましくは２または３個の連続ヌクレオチドを含む、請求項６〜１２のいずれかに記載の核酸。
【請求項１４】
核酸が第五のストレッチＢｏｘＤをさらに含み、ここで、第五のストレッチＢｏｘＤは少なくとも２個の連続ヌクレオチドを含む、請求項６〜１３のいずれかに記載の核酸。
【請求項１５】
第五のストレッチＢｏｘＤが配列５’−ＣＡを含む、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
第五のストレッチＢｏｘＤがいずれかの長さの連続ヌクレオチドを含み、ここで、長さは２、３、４、５および６個の連続ヌクレオチドからなる群から選ばれる、請求項１４または１５に記載の核酸。
【請求項１７】
第五のストレッチＢｏｘＤが、
５’ＣＡ（Ｘ）ｎ３’
［式中、Ｘは、好ましくはＡ，Ｇ，Ｔ，Ｃ，ＵおよびＩを含んでなる群から選ばれるいずれかのヌクレオチドであり、そしてｎは、０，１，２，３および４からなる群から選ばれるいずれかの整数である］
の配列を含む、請求項１３〜１６のいずれかに記載の核酸。
【請求項１８】
第五のストレッチＢｏｘＤが、配列
５’ＣＡ（Ｘ）ｎ３’
［式中、ｎ＝４］
からなる、請求項１７に記載の核酸。
【請求項１９】
第五のストレッチＢｏｘＤが、その５’末端によって第二のストレッチＢｏｘＢの３’末端に連結される、請求項１４〜１８のいずれかに記載の核酸。
【請求項２０】
核酸が第六のストレッチＢｏｘＥをさらに含み、ここで、第六のストレッチＢｏｘＥは少なくとも１個のヌクレオチドを含む、請求項１４〜１９のいずれかに記載の核酸。
【請求項２１】
第六のストレッチＢｏｘＥが、約１〜１０個の連続ヌクレオチド、好ましくは１〜４個の連続ヌクレオチド、より好ましくは３個の連続ヌクレオチドを含む、請求項２０に記載の核酸。
【請求項２２】
第六のストレッチＢｏｘＥの少なくとも１個のヌクレオチドが、ＵおよびＧからなる群から選ばれる、請求項２０または２１に記載の核酸。
【請求項２３】
ＵまたはＧヌクレオチドが、第一のストレッチＢｏｘＡの５’末端の直ぐ隣に配置されている、請求項２２に記載の核酸。
【請求項２４】
第六のストレッチＢｏｘＥが、その３’末端によって第一のストレッチＢｏｘＡの５’末端に連結されている、請求項２０〜２３のいずれかに記載の核酸。
【請求項２５】
第五のストレッチＢｏｘＤの３’末端が、第一のスペーサーによって第六のストレッチＢｏｘＥの５’末端に連結される、請求項２０〜２４のいずれかに記載の核酸。
【請求項２６】
第四のストレッチＢｏｘＣ２の３’末端が、第二のスペーサーによって第三のストレッチＢｏｘＣ１の５’末端に連結される、請求項２０〜２５のいずれかに記載の核酸。
【請求項２７】
第一および第二のスペーサーが、各々別々に、かつ独立して、親水性スペーサーを含んでなる群から選ばれている、請求項２５または２６に記載の核酸。
【請求項２８】
親水性スペーサーが、核酸スペーサーおよび非核酸スペーサーを含んでなる群から選ばれる、請求項２７に記載の核酸。
【請求項２９】
第一のスペーサーが、約１〜２０個の連続ヌクレオチド、好ましくは１〜５個の連続ヌクレオチド、より好ましくは２個の連続ヌクレオチドを含んでなる核酸スペーサーである、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３０】
第二のスペーサーが、約３〜２０個の連続ヌクレオチド、好ましくは３〜５個の連続ヌクレオチド、より好ましくは３個の連続ヌクレオチドを含んでなる核酸スペーサーである、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３１】
第二のスペーサーがＡＣＡまたはＣＡＡからなる、請求項３０に記載の核酸。
【請求項３２】
スペーサーが非核酸である、請求項２８に記載の核酸。
【請求項３３】
第一のスペーサーおよび／または第二のスペーサーが、少なくとも１個のエチレングリコール部分または複数個のそのようなエチレングリコール部分を含む、請求項３２に記載の核酸。
【請求項３４】
スペーサーが約１７２〜６８８Ｄａ、好ましくは３４４Ｄａの分子量を有する、請求項３３に記載の核酸。
【請求項３５】
核酸が環状核酸である、請求項１〜３４のいずれかに記載の核酸。
【請求項３６】
【化１】
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の構造または
【化２】
2008534024.tif 000017
の構造を有する、請求項１〜３５のいずれかに記載の核酸。
【請求項３７】
第一のストレッチＢｏｘＡが、
【化３】
2008534024.tif 000018
［式中、
Ｘ１＝ＧまたはＡ；
Ｘ２＝ＡまたはＵ；
Ｘ３＝ＧまたはＡ；
Ｘ４＝ＡまたはＣまたはＵ；および
Ｘ５＝ＧまたはＡ］
、好ましくは
【化４】
2008534024.tif 000019
の配列を含んでなる、請求項１〜３６のいずれかに記載の核酸。
【請求項３８】
第二のストレッチＢｏｘＢが５’ＧＵＧＡＧＧ３’の配列を含んでなる、請求項１〜３７、特に請求項３７のいずれかに記載の核酸。
【請求項３９】
核酸の配列が、
【表１】
2008534024.tif 000020
【表２】
2008534024.tif 000021
に記載の配列を含んでなる群から選ばれる、請求項１〜３８のいずれかに記載の核酸。
【請求項４０】
核酸が、
【表３】
2008534024.tif 000022
に記載の配列を含んでなる群から選ばれる、請求項１〜３８のいずれかに記載の核酸。
【請求項４１】
核酸の配列が、配列番号：２９、配列番号：３２、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０および配列番号：４１による配列を含んでなる群から選ばれる、請求項３９に記載の核酸。
【請求項４２】
核酸の配列が、配列番号：３０、配列番号：３３、配列番号：３６、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：５１および配列番号：５２による配列を含んでなる群から選ばれる、請求項３９又は４０に記載の核酸。
【請求項４３】
核酸が、グレリン、好ましくはヒト・グレリンを結合することができる、請求項１〜４２のいずれかに記載の核酸。
【請求項４４】
グレリンが配列番号：１によるアミノ酸配列を有する、請求項４３に記載の核酸。
【請求項４５】
核酸が修飾体（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含んでなる、請求項１〜４４のいずれかに記載の核酸。
【請求項４６】
修飾体が、ＨＥＳ部分およびＰＥＧ部分を含んでなる群から選ばれる、請求項４５に記載の核酸。
【請求項４７】
修飾体が直鎖または分枝状ＰＥＧからなるＰＥＧ部分であり、ここで、ＰＥＧ部分の分子量は、好ましくは約２０〜１２０ｋＤ、より好ましくは約３０〜８０ｋＤ、もっとも好ましくは約４０ｋＤである、請求項４６に記載の核酸。
【請求項４８】
修飾体がＨＥＳ部分であり、ここで、ＨＥＳ部分の分子量は、好ましくは約１０〜１３０ｋＤ、より好ましくは約３０〜８０ｋＤ、もっとも好ましくは約５０ｋＤである、請求項４６に記載の核酸。
【請求項４９】
核酸のヌクレオチドがＬ−ヌクレオチドである、請求項１〜４８のいずれかに記載の核酸。
【請求項５０】
核酸が完全にＬ−ヌクレオチドからなる、請求項１〜４８のいずれかに記載の核酸。
【請求項５１】
さらなる成分が製薬学的に許容できる添加物および製薬学的活性作用物を含んでなる群から選ばれる、請求項１〜５０のいずれかに記載の核酸および場合によってはさらなる成分を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項５２】
薬物の製造のための請求項１〜５０のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項５３】
診断手段の製造のための請求項１〜５０のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項５４】
薬物が、肥満、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝障害、腫瘍、血圧障害、心臓血管病、先端巨大症、およびエネルギーバランス、食欲、体重の調節を含んでなる群から選ばれる疾病または障害の処置および／または予防のために存在する、請求項５２に記載の使用。
【請求項５５】
薬物が、胃腸疾患を含んでなる群から選ばれる疾病または障害の処置および／または予防のために存在する、請求項５２に記載の使用。
【請求項５６】
グレリンおよび請求項１〜５０のいずれかに記載の核酸を含んでなる複合体であって、好ましくは結晶性複合体である上記複合体。
【請求項５７】
グレリンの検出のための請求項１〜５０のいずれかに記載の核酸の使用。
【請求項５８】
次の段階：
−  候補グレリンアンタゴニストおよび／または候補グレリンアゴニストを提供し、
−  請求項１〜５０のいずれかに記載の核酸を提供し、
−  グレリンアンタゴニストおよび／またはグレリンアゴニストの存在においてシグナルを提供する試験系を提供し、そして
−  候補グレリンアンタゴニストがグレリンアンタゴニストであるか否か、そして／または候補グレリンアゴニストがグレリンアゴニストであるか否かを決定すること、
を含んでなる、グレリンアンタゴニストまたはグレリンアゴニストのスクリーニング方法。
【請求項５９】
次の段階：
−  相、好ましくは固体相に固定化されたグレリンを提供し、
−  請求項１〜５０のいずれかに記載の核酸、好ましくは標識されている請求項１〜５０
のいずれかに記載の核酸を提供し、
−  候補グレリンアゴニストおよび／または候補グレリンアンタゴニストを添加し、そして
−  候補グレリンアゴニストがグレリンアゴニストであるか否か、そして／または候補グレリンアンタゴニストがグレリンアンタゴニストであるか否かを決定すること、
を含んでなる、グレリンアゴニストおよび／またはグレリンアンタゴニストのスクリーニングのための方法。
【請求項６０】
決定は、核酸が候補グレリンアゴニストによるか、または候補グレリンアンタゴニストによって置換されるか否かが調査されるように実施されることを特徴とする、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
請求項１〜５０のいずれかに記載の核酸を含んでなる、グレリンの検出のためのキット。
【請求項６２】
請求項５９および６０に記載の方法によって得ることができるグレリンアンタゴニスト。
【請求項６３】
請求項５９および６０に記載の方法によって得ることができるグレリンアゴニスト。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グレリン（ｇｈｒｅｌｉｎ）に結合する核酸、および薬物の製造におけるそれらの使用、および診断作用物の製造におけるそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グレリンは、成長ホルモン分泌促進物質受容体１ａ（ＧＨＳＲ１ａ）の天然のリガンドとして同定された。この受容体は、下垂体および脳の視床下部部分にもっとも豊富に存在するが、低濃度では他の組織においてもまた検出することができる。７０年代末期以来、分泌促進物質と命名された合成ペプチドおよび他の化合物は、成長ホルモンの放出を刺激することが示された。しかしながら、成長ホルモンの放出に関与する天然のリガンドは、１９９９年におけるグレリンの発見まで知られていなかった。グレリンは、そのＮ末端の３番目のアミノ酸（セリン３）においてオクタン酸（ｏｃｔａｎｏｙｌ  ａｃｉｄ）側鎖をもつ高度に塩基性の２８アミノ酸ペプチドホルモンである。この異例の修飾は、ＧＨＳ受容体における相互作用およびその活性のために必要とされる。しかしながら、生物サンプルにおいては、生物活性グレリンの形態物であるオクタノイルグレリン、および未修飾またはデス−オクタノイルグレリンの両方が存在している。精製されたラット・グレリンのアミノ酸配列は、ＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＫＡＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：２）であると決定され；対応するヒトの配列は、２つの位置においてのみ逸脱するが、アミノ酸位置セリン３において同じｎ−オクタノイル側鎖を保持し、そしてＧＳＳＦＬＳＰＥＨＱＲＶＱＱＲＫＥＳＫＫＰＰＡＫＬＱＰＲ（配列番号：１）であると決定された。
【０００３】
天然に存在するｎ−オクタノイル残基の他に、グレリンの位置３において導入された不飽和または分枝オクタノイル基およびより長い脂肪族鎖が同様に受容体認識を媒介する。受容体相互作用ドメインはグレリンのまさにＮ末端に置かれ；欠失研究では、アミノ酸１〜５の最小モチーフ（グレリン（１〜５）［ＧＳＳＦＬ］）がＧＨＳＲ１ａの刺激のためには十分であるが、ｎ−オクタノイル残基によるペプチド修飾に対する強力な必要性が観察されることが示された。
【０００４】
グレリンは嫌気状態に対して適切な生理学的機能を媒介することが示されている。それは下垂体からの成長ホルモン（ＧＨ）の放出を直接刺激し、したがって、先端巨大症の処置における適当な標的になり得る。また齧歯類における実験は、グレリンが視床下部ニューロンへの作用によってＧＨに依存しない様式で栄養補給（ｆｅｅｄｉｎｇ）を誘導することが示された。興味あることに、グレリン産生の一次部位は胃における酸分泌腺であり、それが、胃、下垂体および視床下部間のホルモン連鎖として働くことが示唆される。ラットにおけるグレリン投与がエネルギー獲得（ｉｎｔａｋｅ）および／または燃料利用における変化の結果として体重獲得をもたらすという観察は、そのような役割を支持することになる。さらに、ヒトでの全身的グレリン投与は、試験の被験者における空腹感を惹起し、過食を誘導する。これらの知見に基づいて、グレリンは、食欲および体重の調節において決定的な役割を有して、食物が十分与えられない状態の急性ならびに慢性的シグナルとして働くと考えられる。この仮説のさらなる支持は、グレリンのレベルならびに食欲が、胃バイパス後の個人において低下され、体重減少を実施する手法の効力に少なくとも一部は貢献するという観察からも得られる。また、Ｐｒａｄｅｒ−Ｗｉｌｌｉ症候群を有する患者からの臨床データは、この疾病に関係する過食および肥満が、大変な高グレリン血症（ｈｙｐｅｒｇｈｒｅｌｉｎｅｍｉａ）の結果であることを示唆する。さらに、グレリンは高血糖およびインスリン放出の抑制を誘導することが見出されて、グルコース代謝における関与が示された。エネルギー代謝におけるこれらの機能の他に、グレリンはまた、胃腸疾患の分野における多くの他のプロセス、例えば胃を空にしたり、腸の運動を調節することに関与している。さらに、グレリンはまた、多数の神経内分泌腫瘍において発現され、そして下垂体からのＧＨ放出の他に、ＡＣＴＨ、ＰＲＬおよびコルチソルの放出を刺激することが見出された。健康な個体へのグレリンの単一注射は、心拍出量を増加し、血圧を低下させることが見出された。かくして、グレリンの作用は種々の異なる仕事に関与していると考えられる。これらに関するさらなる背景情報は、非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０において見出すことができる。
【非特許文献１】Ｍ．Ｋｏｊｉｍａ，Ｈ．Ｈｏｓｏｄａ，Ｙ．Ｄａｔｅ，Ｍ．Ｎａｋａｚａｔｏ，Ｈ．Ｍａｔｓｕ，Ｋ．Ｋａｎｇａｗａ，“Ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｓ  ａ  ｇｒｏｗｔｈ−ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ａｃｙｌａｔｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒｏｍ  ｓｔｏｍａｃｈ”，Ｎａｔｕｒｅ  ４０２：６５６−６０，１９９９
【非特許文献２】Ｍ．Ｔｓｃｈ  ｐ，Ｄ．Ｌ．Ｓｍｉｌｅｙ，Ｍ．Ｌ．Ｈｅｉｍａｎ，“Ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  ４０７：９０８−１３、２０００
【非特許文献３】Ａ．Ｍ．Ｗｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，”Ｇｈｒｅｌｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ａｐｐｅｔｉｔｅ  ａｎｄ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｆｏｏｄ  ｉｎｔａｋｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ”，Ｊｏｕｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ８６：５９９２−６，２００１
【非特許文献４】Ｍ．Ｎａｋａｚａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，”Ａ  ｒｏｌｅ  ｆｏｒ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｅｅｄｉｎｇ”，Ｎａｔｕｒｅ  ４０９：１９４−８，２００１
【非特許文献５】Ｎ．Ｎａｇａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｇｕｌ  Ｉｎｔｅｇｒ  Ｃｏｍｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２００１  Ｍａｙ；２８０（５）：Ｒ１４８３−７；Ｈｅｍｏｄｙｎａｍｉｃ  ａｎｄ  ｈｏｒｍｏｎａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ
【非特許文献６】Ｖｏｌａｎｔｅ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００２  Ｍａｒ；８７（３）：１３００−８．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＧＨ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ｔｕｍｏｒｓ
【非特許文献７】Ｊｅｆｆｅｒｙ  ＰＬ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００２  Ｍａｒ；１７２（３）：Ｒ７−１１  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎ  ｐｒｏｓｔａｔｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ
【非特許文献８】Ｅｇｉｄｏ  ＥＭ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００２  Ｆｅｂ；１４６（２）：２４１−４  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｏｎ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ａｎｄ  ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｓｏｍａｔｏｓｔａｔｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ
【非特許文献９】Ｂｒｏｇｌｉｏ  Ｆ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．２００１  Ｏｃｔ；８６（１０）５０８３−６，Ｇｈｒｅｌｉｎ，  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ＧＨ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ  ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  ｓｔｏｍａｃｈ，ｉｎｄｕｃｅｓ  ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ  ａｎｄ  ｒｅｄｕｃｅｓ  ｉｎｓｕｌｉｎ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ
【非特許文献１０】Ｂｅｄｎａｒｅｋ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０００  Ｏｃｔ；４３：４３７０−６  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｎｅｗ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ，ｇｈｒｅｌｉｎ：ｍｉｎｉｍａｌ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｎｅｃｅｓｓａｒｙ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  １ａ．
【発明の開示】
【０００５】
本発明の基礎をなす課題は、グレリンに対する特異的アンタゴニストを提供することである。本発明の基礎をなす課題のさらなる態様は、成長ホルモン分泌促進物質受容体１ａ（ＧＨＳＲ１ａ）に対する特異的アンタゴニストを提供することである。本発明の基礎をなす課題のその他の態様は、グレリンおよびＧＨＳＲ１ａ受容体それぞれが関与する疾病および障害の処置のための化合物を提供することである。
【０００６】
本発明の基礎をなすさらなる課題は、生物活性グレリンの結合のための手段を提供すること、より具体的には生物活性グレリンによって媒介される疾病および障害の処置のための方法ならびに生物活性グレリンの特異的検出のための方法を提供することである。
【０００７】
本発明の基礎をなす課題は、好ましくはグレリンに結合する、核酸による第一の態様によって解決され、
こうして、核酸は、
第一のストレッチＢｏｘＡおよび
第二のストレッチＢｏｘＢ
を含み、
ここで、
第一のストレッチＢｏｘＡは約２５個の連続ヌクレオチドを含み、
第二のストレッチＢｏｘＢは約６〜８個の連続ヌクレオチドを含み、
ここで、
第一のストレッチＢｏｘＡのヌクレオチドの３’末端ストレッチは、第二のストレッチＢｏｘＢとハイブリダイズし、このハイブリダイゼーションでは、第一の二本鎖構造が形成され、そしてそのような第一の二本鎖構造はバルジを含む。
【０００８】
本発明の各々およびいずれかの態様の実施態様では、グレリンは、生物活性グレリン、より好ましくはオクタノイルグレリン、そしてもっとも好ましくはｎ−オクタノイルグレリンである。
【０００９】
１つの実施態様では、二本鎖構造は、第一のストレッチＢｏｘＡの５個の３’末端連続ヌクレオチドおよび第二のストレッチＢｏｘＢのヌクレオチドの一部または全部、好ましくは第二のストレッチＢｏｘＢの６〜８個の連続ヌクレオチドによって形成される。
【００１０】
１つの実施態様では、バルジは、第一のストレッチＢｏｘＡの５個の３’末端連続ヌクレオチドと塩基対合しない、第二のストレッチＢｏｘＢの１〜３個のヌクレオチド、好ましくは第二のストレッチＢｏｘＢの１個のヌクレオチドによって形成される。
【００１１】
１つの実施態様では、バルジは非塩基対合プリンによって形成され、ここで、プリンは好ましくはグアノシンである。
【００１２】
好適な実施態様では、非塩基対合プリンは、第二のストレッチＢｏｘＢによって提供される。
【００１３】
１つの実施態様では、核酸は、第三のストレッチＢｏｘＣ１および第四のストレッチＢｏｘＣ２をさらに含み、
ここで、第三のストレッチＢｏｘＣ１は少なくとも１個のヌクレオチドを含み、そして
第四のストレッチＢｏｘＣ２は少なくとも１個のヌクレオチドを含み、そして
ここで、第三のストレッチＢｏｘＣ１は、その３’末端によって第二のストレッチＢｏｘ
Ｂの５’末端に連結されており、そして第四のストレッチＢｏｘＣ２は、その５’末端によって第一のストレッチＢｏｘＡの３’末端に連結されている。
【００１４】
好適な実施態様では、第三のストレッチＢｏｘＣ１および第四のストレッチＢｏｘＣ２は、ハイブリダイゼーション可能であり、ここで、ハイブリダイゼーションでは、第二の二本鎖構造が形成される。
【００１５】
１つの実施態様では、第一の二本鎖構造は第一のらせん構造を形成する。
【００１６】
好適な実施態様では、第二の二本鎖構造は第二のらせん構造を形成する。
【００１７】
より好適な実施態様では、第二のらせん構造は、１〜１０個の塩基対、好ましくは１〜３個の塩基対、より好ましくは２〜３個の塩基対を含んでなる、ヘリックスまたはヘリックス様構造である。
【００１８】
好適な実施態様では、第一のらせん構造は第二のらせん構造によって延長される。
【００１９】
好適な実施態様では、第三のストレッチＢｏｘＣ１は約１〜１０個の連続ヌクレオチド、好ましくは１〜３個の連続ヌクレオチド、より好ましくは２または３個の連続ヌクレオチドを含む。
【００２０】
好適な実施態様では、第四のストレッチＢｏｘＣ２は約１〜１０個の連続ヌクレオチド、好ましくは１〜３個の連続ヌクレオチド、より好ましくは２または３個の連続ヌクレオチドを含む。
【００２１】
好適な実施態様では、核酸は、第五のストレッチＢｏｘＤをさらに含み、ここで、第五のストレッチＢｏｘＤは少なくとも２個の連続ヌクレオチドを含む。
【００２２】
より好適な実施態様では、第五のストレッチＢｏｘＤは配列５’−ＣＡを含む。
【００２３】
より好適な実施態様では、第五のストレッチＢｏｘＤは、いずれかの長さの連続ヌクレオチドを含み、ここで、長さは２、３、４、５および６個の連続ヌクレオチドからなる群から選ばれる。
【００２４】
好適な実施態様では、第五のストレッチＢｏｘＤは、
５’ＣＡ（Ｘ）ｎ３’
［式中、Ｘは、好ましくはＡ，Ｇ，Ｔ，Ｃ，ＵおよびＩを含んでなる群から選ばれるいずれかのヌクレオチドであり、そしてｎは、０，１，２，３および４からなる群から選ばれるいずれかの整数である］
の配列を含む。
【００２５】
より好適な実施態様では、第五のストレッチＢｏｘＤは、配列
５’ＣＡ（Ｘ）ｎ３’
［式中、ｎ＝４］
からなる。
【００２６】
好適な実施態様では、第五のストレッチＢｏｘＤは、その５’末端によって第二のストレッチＢｏｘＢの３’末端に連結されている。
【００２７】
好適な実施態様では、核酸は、第六のストレッチＢｏｘＥをさらに含み、ここで、第六
のストレッチＢｏｘＥは少なくとも１個のヌクレオチドを含む。
【００２８】
より好適な実施態様では、第六のストレッチＢｏｘＥは、約１〜１０個の連続ヌクレオチド、好ましくは１〜４個の連続ヌクレオチド、より好ましくは３個の連続ヌクレオチドを含む。
【００２９】
さらにより好適な実施態様では、第六のストレッチＢｏｘＥの少なくとも１個のヌクレオチドはＵおよびＧからなる群から選ばれる。
【００３０】
特に好適な実施態様では、ＵまたはＧヌクレオチドは、第一のストレッチＢｏｘＡの５’末端の直ぐ隣に配置されている。
【００３１】
好適な実施態様では、第六のストレッチＢｏｘＥは、その３’末端によって第一のストレッチＢｏｘＡの５’末端に連結されている。
【００３２】
好適な実施態様では、第五のストレッチＢｏｘＤの３’末端は、第一のスペーサーによって第六のストレッチＢｏｘＥの５’末端に連結されている。
【００３３】
好適な実施態様では、第四のストレッチＢｏｘＣ２の３’末端は、第二のスペーサーによって第三のストレッチＢｏｘＣ１の５’末端に連結されている。
【００３４】
好適な実施態様では、第一および第二のスペーサーは、各々別々に、独立して、親水性スペーサーを含んでなる群から選ばれる。
【００３５】
より好適な実施態様では、親水性スペーサーは、核酸スペーサーおよび非核酸スペーサーを含んでなる群から選ばれる。
【００３６】
より好適な実施態様では、第一のスペーサーは、約１〜２０個の連続ヌクレオチド、好ましくは１〜５個の連続ヌクレオチド、より好ましくは２個の連続ヌクレオチドを含んでなる核酸スペーサーである。
【００３７】
その他のより好適な実施態様では、第二のスペーサーは、約３〜２０個の連続ヌクレオチド、好ましくは３〜５個の連続ヌクレオチド、より好ましくは３個の連続ヌクレオチドを含んでなる核酸スペーサーである。なおより好適な実施態様では、第二のスペーサーはＡＣＡまたはＣＡＡからなる。
【００３８】
さらなるその他のより好適な実施態様では、スペーサーは非核酸である。その特に好適な実施態様では、第一のスペーサーおよび／または第二のスペーサーは、少なくとも１個のエチレングリコール部分または複数個のそのようなエチレングリコール部分を含む。
【００３９】
１つの実施態様では、スペーサーは約１７２〜６８８Ｄａ、好ましくは３４４Ｄａの分子量を有する。
【００４０】
１つの実施態様では、核酸は環状核酸である。
【００４１】
１つの実施態様では、核酸は、
【００４２】
【化１】
2008534024.tif 000003
【００４３】
の構造または
【００４４】
【化２】
2008534024.tif 000004
【００４５】
の構造を有する。
【００４６】
１つの実施態様では、第一のストレッチＢｏｘＡは、
【００４７】
【化３】
2008534024.tif 000005
【００４８】
［式中、
Ｘ１＝ＧまたはＡ；
Ｘ２＝ＡまたはＵ；
Ｘ３＝ＧまたはＡ；
Ｘ４＝ＡまたはＣまたはＵ；および
Ｘ５＝ＧまたはＡ］
、好ましくは
【００４９】
【化４】
2008534024.tif 000006
【００５０】
の配列を含んでなる。
【００５１】
１つの実施態様では、第二のストレッチＢｏｘＢは５’ＧＵＧＡＧＧ３’の配列を含む。
【００５２】
１つの実施態様では、核酸の配列は、次による配列を含んでなる群から選ばれる：
【００５３】
【表１】
2008534024.tif 000007
【００５４】
【表２】
2008534024.tif 000008
【００５５】
好適な実施態様では、核酸の配列は、配列番号：２９、配列番号：３０、配列番号：３３、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：３９、配列番号：４０、配列番号：４１、配列番号：４２、配列番号：４６、配列番号：４７、配列番号：５１および配列番号：５２による配列を含んでなる群から選ばれる。
【００５６】
１つの実施態様では、核酸はグレリン、好ましくはヒト・グレリンを結合することができる。
【００５７】
好適な実施態様では、グレリンは配列番号：１によるアミノ酸配列を有する。
【００５８】
１つの実施態様では、核酸は修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）を含む。
【００５９】
好適な実施態様では、修飾は、ＨＥＳ部分およびＰＥＧ部分を含んでなる群から選ばれ
る。
【００６０】
より好適な実施態様では、修飾体は直鎖または分枝状ＰＥＧからなるＰＥＧ部分であり、ここで、ＰＥＧ部分の分子量は、好ましくは約２０〜１２０ｋＤ、より好ましくは約３０〜８０ｋＤ、もっとも好ましくは約４０ｋＤである。
【００６１】
その他のより好適な実施態様では、修飾体はＨＥＳ部分であり、ここで、ＨＥＳ部分の分子量は、好ましくは約１０〜１３０ｋＤ、より好ましくは約３０〜８０ｋＤ、もっとも好ましくは約５０ｋＤである。
【００６２】
１つの実施態様では、核酸のヌクレオチドはＬ−ヌクレオチドである。
【００６３】
さらなる実施態様では、核酸は完全にＬ−ヌクレオチドからなる。
【００６４】
本発明の基礎をなす課題は、第一の態様による核酸および場合によってはさらなる成分を含んでなる製薬学的組成物によって第二の態様において解決され、この場合、さらなる成分は製薬学的に許容できる添加物および製薬学的活性作用物を含んでなる群から選ばれる。
【００６５】
本発明の基礎をなす課題は、薬物の製造のための第一の態様による核酸の使用によって第三の態様において解決される。
【００６６】
本発明の基礎をなす課題は、診断手段の製造のための第一の態様による核酸の使用によって第四の態様において解決される。
【００６７】
第三の態様の実施態様では、薬物は、肥満、摂食障害、糖尿病、グルコース代謝障害、腫瘍、血圧障害、心臓血管病、先端巨大症、およびエネルギーバランス、食欲、体重の調節、および胃腸疾患を含んでなる群から選ばれる疾病または障害の処置および／または予防のために存在する。
【００６８】
本発明の基礎をなす課題は、グレリンおよび第一の態様による核酸を含んでなる複合体によって第五の態様において解決され、ここで、好ましくは複合体は結晶性複合体である。
【００６９】
本発明の基礎をなす課題は、グレリンの検出のための第一の態様による核酸の使用によって第六の態様において解決される。
【００７０】
本発明の基礎をなす課題は、次の段階：
−  候補グレリンアンタゴニストおよび／または候補グレリンアゴニストを提供し、
−  第一の態様による核酸を提供し、
−  グレリンアンタゴニストおよび／またはグレリンアゴニストの存在においてシグナルを提供する試験系を提供し、そして
−  候補グレリンアンタゴニストがグレリンアンタゴニストであるか、そして／または候補グレリンアゴニストがグレリンアゴニストであるか否かを決定すること、
を含んでなる、グレリンアンタゴニストまたはグレリンアゴニストのスクリーニングのための方法によって第７の態様において解決される。
【００７１】
本発明の基礎をなす課題は、次の段階：
−  相、好ましくは固定相に固定化されたグレリンを提供し、
−  第一の態様による核酸、好ましくは標識されている第一の態様による核酸を提供し、
−  候補グレリンアゴニストおよび／または候補グレリンアンタゴニストを添加し、そして
−  候補グレリンアゴニストがグレリンアゴニストであるか、そして／または候補グレリンアンタゴニストがグレリンアンタゴニストであるか否かを決定すること、
を含んでなる、グレリンアゴニストおよび／またはグレリンアンタゴニストのスクリーニングのための方法によって第８の態様において解決される。
【００７２】
１つの実施態様では、決定は、核酸が候補グレリンアゴニストによるか、または候補グレリンアンタゴニストによって置換されるか否かが調査されるように実施される。
【００７３】
本発明の基礎をなす問題は、第一の態様による核酸を含んでなる、グレリンの検出のためのキットによって第９の態様において解決される。
【００７４】
本発明の基礎をなす問題は、第８の態様による方法によって得ることができるグレリンアンタゴニストによって第十の態様において解決される。
【００７５】
本発明の基礎をなす問題は、第８の態様による方法によって得ることができるグレリンアゴニストによって第十一の態様において解決される。
【００７６】
本発明は、グレリンに特異的に結合し、かつグレリンに対して高い親和力を有する核酸を生成することができるという驚くべき発見に基づいている。より具体的には、本発明者らは、驚くべきことに、生物活性のあるグレリン、より好ましくはオクタノイルグレリン、もっとも好ましくはｎ−オクタノイルグレリンに特異的に結合する核酸を生成することができた。
【００７７】
グレリンは配列番号：１によるアミノ酸配列を有する塩基性ペプチドであり、そして好ましくはオクタノイル側鎖、より好ましくはｎ−オクタノイル側鎖である脂肪酸側鎖により好ましくは修飾されている。グレリンの算出されたｐＩは、ヒト・グレリンについては１１，０７，およびラット・グレリンについては１０，５６である。好適な実施態様では、本発明による核酸が結合するグレリンは、脂肪酸側鎖により修飾されているグレリンである。その他の実施態様では、グレリンは、脂肪酸側鎖を有しないグレリンである。本明細書において使用されるような用語グレリンは、限定されるものではないが哺乳動物のグレリンを含むすべてのグレリンを指す。好ましくは、哺乳動物グレリンは、マウス、ラット、ウサギ、ハムスターおよびヒトのグレリンを含んでなる群から選ばれる。もっとも好ましくは、グレリンはヒト・グレリンである。
【００７８】
グレリンに核酸を結合する高い親和力が同定できたという発見は、塩基性タンパク質に対向されるアプタマー（ａｐｔａｍｅｒ）、すなわち標的分子に結合するＤ−核酸の生成は、この種の標的が高いが非特異的なシグナル対ノイズ比を生成するので、一般に非常に困難であることをＥａｔｏｎら（Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．；Ｇｏｌｄ，Ｌ．；Ｈｉｃｋｅ，Ｂ．Ｊ．；Ｊａｎｊｉｃ，Ｎ．；Ｊｕｃｋｅｒ，Ｆ．Ｍ．；Ｓｅｂｏｓｔａ，Ｄ．Ｐ．；Ｔａｒａｓｏｗ，Ｔ．Ｍ．；Ｗｉｌｌｉｓ，Ｍ．Ｃ．；Ｚｉｃｈｉ，Ｄ．Ａ．；Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ  ＆  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ  ５，Ｎｏ．６；ｐｐ１０８７−１０９６，１９９７）が観察した限りにおいて驚くべきことである。この高いシグナル対ノイズ比は、グレリンのような塩基性標的に対して核酸によって示される高い非特異的な親和力からもたらされる。
【００７９】
非常に塩基性の全体的なグレリンのｐＩおよび５．５という算出されたｐＩをもつむしろ酸性のドメインであるグレリンの受容体結合モチーフＧＳＳＦＬ［グレリン（１−５）］にも拘わらず、本発明者らが、酸性の受容体結合ドメインを認識するが、ペプチドの塩基性の中央およびカルボキシ末端ドメインを認識しない全長グレリンを用いて核酸を同定できたことは、なお一層驚くべき発見である。このことは、標的分子、すなわちグレリンの電荷および核酸の電荷の両方の静電効果に関して驚くべきことである。標的分子の塩基性ドメインに対する負電荷の核酸の結合は、標的分子の酸性ドメインに対する核酸の結合に較べてはるかに得策であるに違いない。かくして、当業者が、グレリンの塩基性部分に対して結合性ではないが、標的分子の酸性ドメインに結合性である核酸リガンドを成功裏に選択する合理的な期待を有しなかったことを指摘しなければならない。
【００８０】
アミノ末端の受容体結合モチーフＧＳＳＦＬを有する他に、本明細書で生物活性グレリンとも呼ばれる生物学的に活性なグレリンは、好ましくは、アミノ酸セリン３においてｎ−オクタノイル基によるそのアシル化を特徴とする。好ましくは本明細書で開示されるアミノ末端モチーフＧＳＳＦＬのリガンドである本発明による核酸分子は、好ましくは、グレリンの生物学的に不活性または生物活性のない形態と生物学的に活性な形態との区別を可能にする。結合は２つの部分、オクタノイル基とペプチドの存在に厳密に依存するので、このことは驚くべきことである：オクタノイル−グレリンへの核酸の結合は、デスオクタノイル−グレリンの１０００倍過剰量の存在下で、より好ましくはデスオクタノイル−グレリンの１００倍過剰量の存在下で、もっとも好ましくはデスオクタノイル−グレリンの１０倍過剰量の存在下で特異的である。
【００８１】
本明細書における好適な実施態様で使用されるように、生物活性グレリンは、天然に存在するグレリンの特徴のすべてを本質的に好適な実施態様において表すグレリンである。具体的には、好適な実施態様において本明細書で使用される生物活性グレリンは、より好ましくはＧＨＳ受容体との相互作用を介して、成長ホルモンの放出に関与するか、またはそれを惹起できるすべてのグレリンおよびグレリン誘導体である。好適な実施態様におけるこれとは反対に、非生物活性グレリンは、生物活性グレリンとは異なる、より好ましくは、より好ましくはＧＨＳ受容体との相互作用を介して、成長ホルモンの放出を惹起しないグレリンである。
【００８２】
好適な実施態様では、本発明者らは、驚くべきことに、グレリン結合核酸を生成することができたが、ここで、グレリンは生物活性グレリンまたは生物学的に活性なグレリンであり、これらは、そのＮ末端の３番目アミノ酸（セリン３）においてオクタン酸側鎖を有するグレリンを識別し、一方、それらは、そのようなオクタン酸側鎖を欠如するグレリンには結合しない。
【００８３】
本明細書で記述される本発明による核酸の特徴は、単独でも、またいかなる組み合わせ物においても、核酸が使用される本発明のいかなる態様においても実現することができる。
【００８４】
いかなる理論によっても拘束されることを願わずに、本発明は、本発明によるグレリン結合核酸の観察された特異性が、引用が図２０Ａに対してなされる次において議論されるであろう若干の構造的特徴を共有すると推測する。しかしながら、図２０Ａが、本発明による核酸の各々およびいずれかにおいて必ずしも実現されるとは限らない該構造的特徴のいくつかを組み入れていることを理解すべきである。
【００８５】
基本的な構造的特徴は、本明細書ではＢｏｘＡまたは第一のストレッチＢｏｘＡとして本明細書でまた言及される連続ヌクレオチドの第一のストレッチ、および本明細書ではＢｏｘＢまたは第二のストレッチＢｏｘＢとしてまた言及される連続ヌクレオチドの第二のストレッチである。第一のストレッチＢｏｘＡは約２５個の連続ヌクレオチドを含み、これに対して第二のストレッチＢｏｘＢは約６〜８個の連続ヌクレオチドを含む。第一のストレッチＢｏｘＡの３’末端ストレッチは、第二のストレッチＢｏｘＢとハイブリダイズ
し、このハイブリダイゼーションでは、第一の二本鎖構造が形成され、そのような第一の二本鎖構造はバルジを含む。二本鎖構造は、第一のストレッチＢｏｘＡの５個の３’末端連続ヌクレオチドおよび第二のストレッチＢｏｘＢの若干の６〜８個の連続ヌクレオチドによって形成される。バルジは、第一のストレッチＢｏｘＡの５個の３’末端連続ヌクレオチドと塩基対合しない１個位の少ないおよび３個位の多いヌクレオチドによって形成される。したがって、バルジは、好ましくは第二のストレッチＢｏｘＢによって提供される、１，２または３個の非塩基対合ヌクレオチドからなってもよい。このバルジのサイズに鑑みて、第二のストレッチＢｏｘＢは６〜８個の連続ヌクレオチドを含んでもよい。より好ましくは、バルジは、好ましくは６個の連続ヌクレオチドを含んでなる第二のストレッチＢｏｘＢによって、第二のストレッチＢｏｘＢの５’末端から見られる第二のストレッチＢｏｘＢ内の非塩基対合第三ヌクレオチドによって創成される。
【００８６】
好適な実施態様では、本発明による核酸は単一の核酸分子である。さらなる実施態様では、単一の核酸分子は、多数の単一の核酸分子として存在する。好ましくは、用語核酸および核酸分子は、それとは違って示されない限り本明細書では互換可能な様式で使用される。
【００８７】
本発明による核酸分子が、好ましくはホスホジエステル連結または結合をとおして、好ましくは、互いに共有結合されるヌクレオチドからなることは、当業者によって理解することができる。
【００８８】
さらなる重要な特色は、第二の二本鎖構造である。そのような第二の二本鎖構造は、ＢｏｘＣ１または第三のストレッチＢｏｘＣ１としてまた言及される連続ヌクレオチドの第三のストレッチ、およびＢｏｘＣ２または第四のストレッチＢｏｘＣ２としてまた言及される連続ヌクレオチドの第四のストレッチによって形成される。第三のストレッチＢｏｘＣ１は、第二のストレッチＢｏｘＢの５’末端にその３’末端により連結され、そして第四のストレッチＢｏｘＣ２は、第一のストレッチＢｏｘＡの３’末端にその５’末端により連結される。この第二の二本鎖構造は、典型的には、第二のらせん構造として本明細書でまた言及されるらせん構造を形成する。そのような第二のらせん構造は、好ましくは、第一の二本鎖構造によって典型的には形成されるらせん構造の伸長物である。好ましくは、第一のらせん構造として本明細書でまた言及されるらせん構造である該第一の二本鎖構造の長さは、第一のストレッチＢｏｘＡおよび第二のストレッチＢｏｘＢの長さによって、より正確には互いにハイブリダイズする該２種のＢｏｘのストレッチによって定義される。第二の二本鎖構造によって該第一のらせん構造に提供される伸長物は、本発明者らの現在の理解によれば、本発明者らはこの理論に束縛されることを願わないけれども、より安定化する種類のものである。第二のらせん構造は、１〜１０個の塩基対、好ましくは１〜３個の塩基対、より好ましくは２または３個の塩基対からなる。１〜３個位の少ない塩基対が、らせんを生成するのに必ずしも適当ではないことは当業者によって理解できる。この種の構造は、かくして、らせん様構造として本明細書でまた言及され、好ましくは、そのようならせん様構造は、１または数個の塩基対によって伸長される場合は、らせん構造をもたらすであろう構造物である。
【００８９】
さらなる重要な特色は、ＢｏｘＤまたは第五のストレッチＢｏｘＤとして本明細書でまた言及される連続ヌクレオチドの第五のストレッチである。このさらなるストレッチは、核酸の全体的結合において改良を与える。第五のストレッチは少なくともただ２個のヌクレオチドを含むけれども、グレリンの結合におけるその有益な劇的効果は、第五ストレッチの長さを好ましくは６個の連続ヌクレオチドまで増加することによってさらに改良することができる。また、第五のストレッチは、もし含有される場合は、好ましくはその５’末端ＣＡジヌクレオチドおよび
５’ＣＡ（Ｘ）ｎ３’
［式中、Ｘは、好ましくはＡ，Ｇ，Ｔ，Ｃ，ＵおよびＩを含んでなる群から選ばれるいずれかのヌクレオチドである］
の配列を有する第五ストレッチにおいて特に効果的であることがわかった。
【００９０】
本発明による核酸のさらなる特色は、ＢｏｘＥまたは第六のストレッチＢｏｘＥとして本明細書でまた言及される隣接ヌクレオチドの第六のストレッチである。好ましくは、第六のストレッチは少なくとも１個のヌクレオチドからなる。
【００９１】
種々のストレッチは図２０Ａから見られるように互いに連結される。そこに描かれるように、好ましくは、第三のストレッチＢｏｘＣ１および第四のストレッチＢｏｘＣ２の各々は、１または２個のヌクレオチド、より好ましくは２個のヌクレオチドを含み、第五のストレッチＢｏｘＤは少なくとも２個のヌクレオチド、好ましくは４個のヌクレオチド、もっとも好ましくは６個のヌクレオチドを含む。
【００９２】
第三のストレッチＢｏｘＣ１および第四のストレッチＢｏｘＣ２の長さが０である実施態様では、第一のストレッチＢｏｘＡおよび第二のストレッチＢｏｘＢは場合によっては、リンカーまたはスペーサーを介して連結されてもよく、ここで、そのようなスペーサーは本明細書で開示されるスペーサーのいずれであってもよい。本明細書で使用されるように用語「スペーサー」および「リンカー」は、他に指示されない場合は互換可能な様式で使用される。
【００９３】
本発明に関連して、第一のストレッチおよび第二のストレッチは、好ましくは共有結合を介して互いに連結される。好適な実施態様では、共有結合はホスホジエステル結合である。なおさらなる好適な実施態様では、第一のストレッチの３’末端は第二のストレッチの５’末端に連結される。
【００９４】
その他の実施態様では、第六のストレッチＢｏｘＥは１〜１０個の連続ヌクレオチド、好ましくは１〜４個の連続ヌクレオチド、もっとも好ましくは３個の連続ヌクレオチドを含む。
【００９５】
これらの種々の配置から分るように、第五のストレッチと第六のストレッチは互いに連結されるか、または連結されず、第三と第四ストレッチは互いに連結されるか、または連結されず、そして第一のストレッチと第二のストレッチは互いに連結されるか、または連結されないことが可能である。連結は好ましくは共有結合を介してなされることは認識できる。より好ましくは連結は、少なくとも１個の、好ましくは多数のエチレングリコール部分を含んでなる親水性スペーサーを介してなされる。種々のリンカーおよびスペーサーは、それぞれ当業者には既知であり、そして次の基準、例えば、ＰｉｌｓおよびＭｉｃｕｒａ（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０００），２８（９），１８５９−１８６３）によって記述されたような基準を用いて選択することができる。リンカーは塩基対自体を妨害してはならない。芳香族炭素環を含有するリンカーの種類は末端塩基対を攻撃するので、適当ではない（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９９），１２１，９９０５−９９０６；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９８），１２０，１１００４−１１００５）。しかしながら、エチレングリコールに基づくかエチレングリコールから誘導されるリンカーは、それらが良好な水溶解度と高いコンホメーションの柔軟性という利点を有するので、これらの要件に適合する（Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９３），１１５，８４８３−８４８４；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９３）、２１、５６００−５６０３；Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９３），３２，１７５１−１７５８；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（１９９０），１８,６３５３−６３５９；Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９７）,１１９，１１５９１−１１５９７）。好ましくは、スペーサーは、１または数個のエチレングリコール部分を含むか、またはそれからなり、ここで、酸素がＣＨ３、リン酸または硫黄によって置換されている。
【００９６】
これらの連結の選択に基づいて、次の構造物が実現できる。
【００９７】
【化５】
2008534024.tif 000009
【００９８】
最後に、本発明による核酸のための完全に閉ざされた、すなわち環状の構造物が図２０Ｄにおいて描かれるように実現されることも、また本発明内にはいる。
【００９９】
本発明による核酸は、また、本明細書に開示される特定の配列に本質的に相同である核酸を含まねばならない。用語「本質的に相同」は、相同性が少なくとも７５％、好ましくは８５％、より好ましくは９０％、もっとも好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％または９９％以上であるように理解されるべきである。
【０１００】
用語「本発明の核酸」または「本発明による核酸」は、好ましくは核酸または該一部がグレリンへの結合に関与するほどに、より好ましくは生物活性グレリンを非生物活性グレリンと区別する、すなわち、特にオクタノイル−グレリンをデスオクタノイル−グレリンと区別するほどに、本明細書に開示される核酸またはその一部を含むそれらの核酸を含むべきである。そのような核酸は、例えば、切り取り（ｔｒｕｎｃａｔｉｏｎ）によって本明細書に開示される核酸から誘導されてもよい。切り取りは、本明細書に開示される核酸の末端のいずれか、または両方に関してもよい。また、切り取りは、ヌクレオチドの内部配列に関してもよい、すなわち、それぞれ５’および３’末端ヌクレオチドの間のヌクレオチドに関してもよい。さらに、切り取りは、本明細書に開示される核酸の配列から単一ヌクレオチド位の短い欠失を含んでもよい。また、切り取りは、本発明の核酸の１個以上のストレッチに関してもよく、ここで、ストレッチは１個位の短いヌクレオチド長であってもよい。
【０１０１】
本発明による核酸は、Ｄ−核酸でも、またＬ−核酸であってもよい。好ましくは、本発明の核酸はＬ−核酸である。さらに、核酸の一部または数部分がＤ−核酸として存在するか、または核酸の少なくとも一部または数部分がＬ−核酸であることも可能である。用語核酸の「一部」は、１ヌクレオチド位の小さいものを意味すべきである。そのような核酸は、一般にＤ−およびＬ−核酸とそれぞれ本明細書では言及される。したがって、特に好適な実施態様では、本発明による核酸はＬ−ヌクレオチドからなり、そして少なくとも１個のＤ−ヌクレオチドを含む。そのようなＤ−ヌクレオチドは、好ましくは、本発明による核酸を定義するストレッチとは異なる部分、好ましくは核酸の他の部分との相互作用が必要であるそれらのその部分に連結される。好ましくは、そのようなＤ−ヌクレオチドは、いずれかのストレッチおよび本発明によるいずれかの核酸のそれぞれの末端に連結される。さらなる好適な実施態様では、そのようなＤ−ヌクレオチドは、スペーサーまたはリンカー、好ましくは本発明による核酸に対するＰＥＧおよびＨＥＳのような連結修飾体として働いてもよい。
【０１０２】
本発明による核酸がより長い核酸の一部であることもまた本発明の内にはいり、ここで
、このより長い核酸は、少なくとも一部分は、本発明による核酸またはその一部である数部分を含む。これらのより長い核酸の他の部分は、Ｄ−核酸でもＬ−核酸であってもよい。いずれの組み合わせ物が本発明に関して使用されてもよい。これらのより長い核酸の他の部分は、結合、好ましくはグレリンへの結合とは異なる機能を示すことができる。１つの可能性のある機能は、他の分子と相互作用させることであり、そのような他の分子は、例えば、固定化、架橋、検出または増幅のためのように、好ましくはグレリンとは異なる。
【０１０３】
本明細書で使用されるようなＬ−核酸は、Ｌ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＬ−ヌクレオチドからなる核酸である。
【０１０４】
本明細書で使用されるようなＤ−核酸は、Ｄ−ヌクレオチドからなる、好ましくは完全にＤ−ヌクレオチドからなる核酸である。
【０１０５】
本発明の核酸が、Ｄ−ヌクレオチド、Ｌ−ヌクレオチドあるいは例えば少なくとも１個のＬ−ヌクレオチドおよび少なくとも１個のＤ−ヌクレオチドからなるストレッチのランダム組み合わせ物または一定の配列である組み合わせによる両方の組み合わせ物からなるか否かに関係なく、核酸はデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはその組み合わせ物からなってもよい。
【０１０６】
本発明の核酸をＬ−核酸として設計することは、いくつかの理由で得策である。Ｌ−核酸は天然に存在する核酸の鏡像異性体である。しかしながら、Ｄ−核酸は、水溶液中、特に、ヌクレアーゼの広範な存在によって生物系または生物サンプルにおいて非常に不安定である。天然に存在するヌクレアーゼ、特に動物細胞からのヌクレアーゼはＬ−核酸を分解することはできない。このために、Ｌ−核酸の生物学的半減期は、動物およびヒトの身体を含む、そのような系では有意に増大する。Ｌ−核酸の分解性の欠如により、ヌクレアーゼ分解産物は生成されず、したがってそれから起きる副作用は観察されない。この態様は、グレリンの存在に係わる疾病および／または障害の治療において使用される実際にすべての他の化合物のＬ−核酸の限界を定める。ワトソン・クリック塩基対合とは異なるメカニズムにより標的分子に特異的に結合するＬ−核酸、あるいは特に、標的分子へのアプタマーの結合に関与するアプタマーのそれらの部分をもつ、Ｌ−ヌクレオチドから部分的または完全になるアプタマーは、またｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒと呼ばれる。
【０１０７】
本発明の核酸は、それらがＤ−核酸、Ｌ−核酸またはＤ，Ｌ−核酸として存在するか否か、あるいはそれらがＤＮＡまたはＲＮＡであるか否かに関係なく、一本鎖または二本鎖核酸として存在してもよいことは、また本発明内にはいる。典型的には、本発明の核酸は、一次配列により一定の二次構造を示す一本鎖核酸であり、したがってまた三次構造を形成してもよい。しかしながら、本発明の核酸は、互いに相補的または部分的に相補的である２本の鎖が互いにハイブリダイズされるという意味において二本鎖であってもよい。このことは、特に、核酸がＬ−型よりもむしろ天然に存在するＤ−型で存在する場合には有利であろう核酸への安定性を与える。
【０１０８】
本発明の核酸は修飾されてもよい。そのような修飾は核酸の単一ヌクレオチドに関してもよく、そして当該技術分野において周知である。そのような修飾の例は、なかんずく、Ｖｅｎｋａｔｅｓａｎ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．Ｏｃｔ；１０（１９）：１９７３−９１；Ｋｕｓｓｅｒ，Ｗ．（２０００）  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７４：２７−３８；Ａｕｒｕｐ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２２，２０−４；Ｃｕｍｍｉｎｓ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２３，２０１９−２４；Ｅａｔｏｎ，Ｂ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，２，６３３−８；Ｇｒｅｅ
ｎ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ，２，６８３−９５；Ｋａｗａｓａｋｉ，Ａ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ、３６,８３１−４１；Ｌｅｓｎｉｋ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２，７８３２−８；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ，４６９，２１３−４３において記述されている。そのような修飾は、核酸がなりたっている個々のヌクレオチドの２’位におけるＨ原子、Ｆ原子またはＯ−ＣＨ３基またはＮＨ２基であってもよい。また、本発明による核酸は少なくとも１個のＬＮＡヌクレオチドを含んでもよい。１つの実施態様では、本発明による核酸はＬＮＡヌクレオチドからなる。
【０１０９】
１つの実施態様では、本発明による核酸は多くの部分に分かれた核酸であってもよい。本明細書で使用される多くの部分に分かれた核酸は、少なくとも２本の核酸鎖からなる核酸である。これらの少なくとも２本の核酸鎖は機能的単位を形成し、ここでの機能的単位は標的分子に対するリガンドである。少なくとも２本の核酸鎖は、核酸を切断して２本の鎖を生成するか、あるいは本発明の、すなわち核酸全体の第一の部分に対応する１つの核酸および核酸全体の第二の部分に対応するその他の核酸を合成するか、いずれかによって本発明の核酸のいずれから誘導されてもよい。両、切断および合成が、先に例示された２本以上の鎖である多くの部分に分かれた核酸を生成するために応用できることは認識されるべきである。言い換えれば、少なくとも２本の核酸鎖は、典型的には、種々の核酸部分の間で、ある程度の相補性が存在するかも知れないが、互いに相補的であり、かつハイブリダイズする２本の鎖とは異なる。
【０１１０】
本発明は、本発明による核酸が非常に好ましいＫｄ値の範囲を示すことを発見した。より具体的には、完全なＢｏｘＡおよびＢｏｘＢの他に−最小２個のヌクレオチドを各々有するＢｏｘＣ１およびＣ２、最小６個のヌクレオチドを有するＢｏｘＤおよび最小３個のヌクレオチドを有するＢｏｘＥ−を含んでなるオリゴヌクレオチド（例えば、ＳＯＴ−Ｅ）は、ＳＯＴ−Ｃよりも６倍良好なグレリンに対する結合親和力（図１８）を示す。
【０１１１】
結合定数の決定を可能にするのは、所謂バイオコア（ｂｉａｃｏｒｅ）・デバイスの使用であり、これはまた当業者には既知である。本明細書で使用される親和力は、実施例において記述されるような「平衡アッセイ」の使用によってまた測定できた。本事例ではグレリンである標的による核酸間の結合の強度を表すための適当な測定値は、その決定方法が当業者において十分に知られている所謂Ｋｄ値である。
【０１１２】
本発明による核酸はあるＫｄ値を特徴とする。好ましくは、本発明による核酸によって示されるＫｄ値は１μＭ以下である。約１μＭのＫｄ値は、標的に対する核酸の非特異的結合について特徴的であると言われる。当業者によって認識できるように、本発明による核酸のような１群の化合物のＫｄ値は一定の範囲内にある。約１μＭという上記ＫｄはＫｄ値について好適な上限である。核酸を結合する標的のＫｄの好適な下限は約１０ピコモルまたはそれ以上であってもよい。グレリンに結合する個々の核酸のＫｄ値が、好ましくは、この範囲内であることは本発明の内にはいる。好適な範囲は、この範囲内のいずれか第一の数とこの範囲内のいずれか第二の数を選ぶことによって定められてもよい。好適な上限値は０．２５μＭ、０．１μＭおよび０．０１μＭであり、好適な下限値は１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭおよび０．０５ｎＭである。
【０１１３】
本発明による核酸分子は、なおそれらが標的分子に結合でき、かつ生物活性グレリンを非生物活性グレリンと区別できる、すなわち好ましくはオクタノイル−グレリンをデスオクタノイル−グレリンと区別できる場合には、いかなる長さを有してもよい。本発明による核酸の好適な長さが存在することは当該技術分野において認識できる。典型的には、この長さは１５〜１２０ヌクレオチドである。１５〜１２０間のいかなる整数も本発明によ
る核酸について可能な長さであることは当業者によって認識できる。本発明による核酸の長さのより好適な範囲は、約２０〜１００ヌクレオチド、約２０〜８０ヌクレオチド、約２０〜６０ヌクレオチド、約２０〜５０ヌクレオチドおよび約３０〜５０ヌクレオチドの長さである。
【０１１４】
本明細書で開示される核酸が、好ましくは高分子量部分であり、かつ／または、なかんずく、動物体内、好ましくはヒト体内における滞留時間という用語で好ましくは核酸の特徴を修飾させる部分を含むことは本発明内にはいる。そのような修飾の特に好適な実施態様は、本発明による核酸のＰＥＧ化およびＨＥＳ化である。本明細書で使用されるようなポリ（エチレングリコール）についてのＰＥＧ鎖およびヒドロキシエチル澱粉についてのＨＥＳ。好ましくは本明細書で使用されるＰＥＧ化は本発明による核酸の修飾であり、そのような修飾体は、本発明による核酸に連結されるＰＥＧ部分からなる。本明細書で使用されるＨＥＳ化は本発明による核酸の修飾であり、そのような修飾体は、本発明による核酸に連結されるＨＥＳ部分からなる。これらの修飾ならびにそのような修飾を用いる核酸の修飾方法は、欧州特許第一  ３０６  ３８２号に記述されており、これの開示は引用によって完全に本明細書に組み入れられている。
【０１１５】
好ましくは、高分子量部分からなる、またはそれを含んでなる修飾体の分子量は、特にそのような高分子量部分であるＰＥＧの場合には、約２，０００〜２００，０００Ｄａ、好ましくは４０，０００〜１２０，０００Ｄａであり、そして特にそのような高分子量部分であるＨＥＳの場合には、好ましくは約３，０００〜１００，０００Ｄａ、より好ましくは５，０００〜６０，０００Ｄａである。ＨＥＳ修飾の方法は、例えば、ドイツ特許出願第一  ２００４  ００６  ２４９．８号に記述されており、これの開示は引用によって完全に本明細書に組み入れられている。
【０１１６】
いかなる理論によっても束縛されないことを願えば、好ましくは生理学的に許容できるポリマー、より具体的には本明細書で開示されるポリマーのような高分子量部分を用いる本発明による核酸の修飾によって排出動態が変化されると考えられる。より具体的には、そのような修飾された本発明の核酸の分子量の増加により、そして特にＬ型における場合の被験者が代謝することのない核酸により、動物の身体、好ましくは哺乳動物の身体、より好ましくはヒトの身体からの排出が減少されると思われる。排出は、典型的には腎臓を介して起きるので、本発明は、このように修飾された核酸の糸球体濾過速度が、体内の滞留時間の増加をもたらすこの種の高分子量修飾を有しない核酸に較べて有意に減少されると推測する。これに関連して、そのような高分子量修飾にもかかわらず、本発明による核酸の特異性が有害な様式で影響されないことは特に注目される。その限りにおいて、本発明による核酸は、持続放出を与える製薬学的調合物が、持続放出を与えるために必ずしも必要とされないような−通常には製薬学的活性化合物から期待することができないー驚くべき特徴を有する。むしろ、高分子量部分を含んでなるそれらの修飾形態物における本発明による核酸は、既にそれ自体、持続放出調合物として使用することができる。
【０１１７】
しかしながら、本明細書に開示される核酸が、いかなる修飾も、特にＰＥＧ化またはＨＥＳ化のような高分子量修飾も含まないこともまた本発明の内にはいる。そのような実施態様は、投与後、身体からの核酸の速いクリアランスが所望される場合に特に好適である。そのような速いクリアランスは、本発明による核酸か、または同物質を含んでなる薬物を使用してインビボの想像性または一時的な食欲抑制の場合に望ましいであろう。
【０１１８】
本発明による核酸としてまた本明細書で言及される本発明の核酸および／または本発明によるアンタゴニストは、薬物の創成または製造のために使用されてもよい。そのような薬物は、少なくとも１種の本発明の核酸を、場合によってはさらなる製薬学的活性化合物とともに含有し、この場合、本発明の核酸は好ましくは製薬学的活性化合物自体として働
く。そのような薬物は好適な実施態様では少なくとも１種の製薬学的に許容できる担体を含む。そのような担体は、例えば、水、バッファー、ＰＢＳ、グルコース溶液、好ましくは５％グルコース塩均衡溶液、澱粉、糖、ゼラチンまたはいずれか他の許容できる担体物質であってもよい。そのような担体は一般に当業者には既知である。
【０１１９】
さらなる実施態様では、薬物はさらなる製薬学的活性作用物を含む。そのようなさらなる製薬学的活性化合物は、食欲を減退することが知られているそれらの化合物であってもよく、そして好ましくは、ＰＹＹ３−４５、ＣＣＫ、レプチンおよびインスリンを含んでなる群から選ばれる。あるいは、またはさらに、そのようなさらなる製薬学的活性作用物はさらなる本発明による核酸である。あるいはまた、薬物は、グレリンとは異なる標的分子に結合するか、または本発明による核酸の１種とは異なる機能を発揮する少なくとも１種以上の核酸を含む。１つの実施態様では、そのような核酸はオクタン酸部分を欠如するグレリンに結合している。
【０１２０】
そのような薬物が使用されてもよい処置および／または予防のための疾病および／または障害および／または疾病症状は、限定されるものではないが、肥満、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、胃腸疾患、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧、心臓血管病、先端巨大症、および他のＧＨインバランスを含む。当業者によって認識できるように、本発明の核酸は、事実上、グレリンに対するアンタゴニストがそのようなアンタゴニストを必要とする患者に投与でき、そしてそのようなアンタゴニストが疾病または障害の原因を除去できるか、または少なくとも疾病または障害からの影響を低下するために適当である、いかなる疾病において使用されてもよい。そのような影響は、限定されるものではないが、肥満、エネルギーバランス、食欲および体重の調節、摂食障害、胃腸疾患、糖尿病、グルコース代謝、腫瘍、血圧、心臓血管病、先端巨大症および他のＧＨインバランスを含む。これらおよび他の疾病または障害に関連する本発明による核酸の適応性は、なかんずく、本明細書の序論部分において概説されたようなグレリンの関与からもたらされる。本発明の目的では、エネルギーバランスの調節は疾病とみなされる。より具体的には、この使用は、エネルギーバランスの調節が直接にも間接にもグレリンによって影響され、グレリンの生物学的利用性の低下が望まれるすべての疾病の処置のためにある。同じことが、糖代謝、血圧および食欲と体重に適合する。本発明による核酸を用いて処置されてもよいさらなる疾病は、可能ならば全身的または局所的適用において、下垂体腫瘍、先端巨大症、中枢性Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、副腎性Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、腫瘍随伴性Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、異所性Ｃｕｓｈｉｎｇ症候群、副腎腫瘍、ストレス、副腎皮質亢進症、心不全、心筋梗塞、卒中、副腎皮質不全症、低血圧、大動脈狭窄、肺動脈緊張過度、梗塞性心外膜炎、感染疾患、感染毒性低血圧、血液量減少および低ナトリウム血症を含んでなる群から選択することができる疾病である。
【０１２１】
本明細書で使用されるように、用語、本発明による核酸を用いて処置できる胃腸疾患は、胃の疾病および障害、腸の疾病および障害、結腸の疾病および障害、および胃および結腸運動の調節を含む。好適な実施態様では、用語、腸の障害および腸の疾病は、炎症性腸疾患を含む。より好適な炎症性腸疾患は、潰瘍性大腸炎およびクローン病である。この種の疾病の処置のための本発明による核酸の適合性は、Ｋａｒｍｉｒｓら（Ｋａｒｍｉｒｓ  Ｋ，Ｋｏｕｔｒｏｕｂａｋｉｓ  ＩＥ，Ｘｉｄａｋｉｓ  Ｃ，Ｐｏｌｙｃｈｒｏｎａｋｉ  Ｍ，Ｖｏｕｄｏｕｒｉ  Ｔ，Ｋｏｕｒｏｕｍａｌｉｓ  ＥＡ，Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇｌｅｖｅｌｓ  ｏｆ  ｌｅｐｔｉｎ，ａｄｉｐｏｎｅｃｔｉｎ，ｒｅｓｉｓｔｉｎ，ａｎｄ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｎ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｂｏｗｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｉｎｆｌａｍｍ  Ｂｏｗｅｌ  Ｄｉｓ．２００６  Ｆｅｂ；１２（２）：１００−５）、Ｔｅｂｂｅ  ＪＪら（Ｔｅｂｂｅ  ＪＪ，Ｍｒｏｎｇａ  Ｓ，Ｔｅｂｂｅ  ＣＧ，Ｏｒｔｍａｎｎ  Ｅ，Ａｒｎｏｌｄ  Ｒ，Ｓｃｈａｆｅｒ  ＭＫ．Ｇｈｒｅｌｉｎ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｐｒｏｐｕｌｓｉｏｎ  ｉｓｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｏｎ  ｈｙｐｏｔｈａｌａｍｉｃ  ｎｅｕｒｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｙ１−  ａｎｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈｉｎ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｎｅｕｒｏｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．２００５  Ｓｅｐ；１７（９）：５７０−６）およびＦｕｋｕｄａ  Ｈ．ら（Ｆｕｋｕｄａ  Ｈ，Ｍｉｚｕｔａ  Ｙ，Ｉｓｏｍｏｔｏ  Ｈ，Ｔａｋｅｓｈｉｍａ  Ｆ，Ｏｈｎｉｔａ  Ｋ,  Ｏｈｂａ  Ｋ，Ｏｍａｇａｒｉ  Ｋ，Ｔａｎｉｙａｍａ  Ｋ，Ｋｏｈｎｏ  Ｓ．Ｇｈｒｅｌｉｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｇａｓｔｒｉｃ  ｍｏｔｉｌｉｔｙ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｄｉｒｅｃｔ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔｒｉｎｓｉｃ  ｎｅｕｒａｌ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ａｎｄ  ｃａｐｓａｉｃｉｎ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｆｆｅｒｅｎｔ  ｎｅｕｒｏｎｅｓ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｓｃａｎｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．２００４  Ｄｅｃ；３９（１２）：１２０９−１４）により記述されたようなグレリンの関与から生じる。
【０１２２】
Ｋｏｂｅｌｔらの公表（Ｋｏｂｅｌｔ  Ｐ，Ｈｅｌｍｌｉｎｇ  Ｓ，Ｓｔｅｎｇｅｌ  Ａ，Ｗｌｏｔｚｋａ  Ｂ，Ａｎｄｒｅｓｅｎ  Ｖ，Ｋｌａｐｐ  ＢＦ，Ｗｉｅｄｅｎｍａｎｎ  Ｂ，Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ  Ｓ，Ｍｏｎｎｉｋｅｓ  Ｈ．Ａｎｔｉ−ｇｈｒｅｌｉｎ
ＳＰＩＥＧＥＬＭＥＲ  ＮＯＸ−Ｂ１１  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｎｅｕｒｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｏｒｅｘｉｇｅｎｉｃ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｇｈｒｅｌｉｎ  ｉｎ  ｒａｔｓ．Ｇｕｔ．２００５  Ｊｕｎ  ３０，Ｅｐｕｂ  ａｈｅａｄ  ｏｆ  ｐｒｉｎｔ）は、抗グレリンＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ  ＮＯＸ−Ｂ１１の投与において末梢グレリンにより誘発された短期間の食物摂取の用量依存性減退を報告している。より具体的には、ＰＢＳおよび３ｎｍｏｌグレリンによるポジティブ対照群（媒質／グレリン群）処置では、媒質／媒質群（１．１３±０．５９ｇ／ｋｇ−ＢＷ，ｐ＜０．０００２）に較べて腹腔内注射後初めの半時間内に食物摂取が有意に増加した（４．９４±０．６３ｇ／ｋｇ−ＢＷ）（Ｋｏｂｅｌｔら、前出の図２Ａ）。Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ  ＮＯＸ−Ｂ１１（＝ＳＯＴ−Ｃ＝Ｂ１１ｔｒｃ）の３０ｎｍｏｌによる前処置は食物摂取に及ぼすグレリンの促進効果を阻止した（０．５８±０．５８ｇ／ｋｇ−ＢＷ，ｐ＜０．０００１）（Ｋｏｂｅｌｔら、前出の図２Ａ）。これに対して、ランダム配列からなる対照Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒの投与は、そのような抑制効果を有せず、食物摂取におけるグレリン誘導の促進は元のままであった（４．７７±０．６６ｇ／ｋｇ−ＢＷ；ｐ＞０．８６４）（Ｋｏｂｅｌｔら、前出の図２Ａ）。
【０１２３】
食物摂取に及ぼすＮＯＸ−Ｂ１１（＝ＳＯＴ−Ｃ＝Ｂ１１ｔｒｃ）の抑制効果は、厳密に用量依存性であることが証明された。Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ  ＮＯＸ−Ｂ１１（＝ＳＯＴ−Ｃ＝Ｂ１１ｔｒｃ）の１ｎｍｏｌの用量は、食物摂取のグレリン刺激には効果を有しなかった（Ｋｏｂｅｌｔら、前出の図２Ａ）。中間的効果はＮＯＸ−Ｂ１１（＝ＳＯＴ−Ｃ＝Ｂ１１ｔｒｃ）の１０ｎｍｏｌの用量について観察された：この用量レベルでは、最初の３０分間における３ｎｍｏｌグレリンの刺激効果は緩和された（３．５１±０．６６ｇ／ｋｇ−ＢＷ対４．９４±０．６３ｇ／ｋｇ−ＢＷ；ｐ＞０．１５９対グレリン単独）（Ｋｏｂｅｌｔら、前出の図２Ａ）。
【０１２４】
Ｓｈｅａｒｍａｎらの公表（Ｓｈｅａｒｍａｎ  ＬＰ，Ｗａｎｇ  ＳＰ，Ｈｅｌｍｌｉｎｇ  Ｓ，Ｓｔｒｉｂｌｉｎｇ  ＤＳ，Ｍａｚｕｒ  Ｐ，Ｇｅ  Ｌ，Ｗａｎｇ  Ｌ，Ｋｌｕｓｓｍａｎｎ  Ｓ，Ｍａｃｉｎｔｙｒｅ  ＤＥ，Ｈｏｗａｒｄ  ＡＤ，Ｓｔｒａｃｋ  ＡＭ．Ｇｈｒｅｌｉｎ  Ｎｅｕｔｒａｌｉｓａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａ  Ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ−ＳＰＭ  Ａｍｅｌｉｏｒａｔｅｓ  Ｏｂｅｓｉｔｙ  ｉｎ  Ｄｉｅｔ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｏｂｅｓｅ  Ｍｉｃ．；Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．２００６  Ｍａｒ；１４７（３）：１５１７−２６．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｄｅｃ  ８）は、食餌誘導の肥満（ＤＩＯ）マウスにおける抗グレリンＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ  ＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）の投与において、体重の低下および食物摂取の減少を報告している。より具体的には、ＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）注入は、対照に較べて体重喪失を惹起した（Ｓｈｅａｒｍａｎら、前出の図４Ａ、参照）。有意な体重喪失は、媒質処置のマウスに較べて１〜１０日目および１２日目において；対照Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（対照ＳＰＭ）注入群に較べて１〜１３日目において、ＮＯＸ−Ｂ１１−１１（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）注入により観察された（Ｐ＜０．０５ｖｓ．媒質または対照ＳＰＭ）。１３日目では、ＮＯＸ−Ｂ１１−２注入マウスは、体重の平均０．３２ｇを増加したが、対照Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒを注入されたマウスは、平均１．８５ｇを増加し、そして媒質を注入されたマウスは平均０．９１ｇ増加した。また、ＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）注入は有意に食物摂取を減退させた（Ｓｈｅａｒｍａｎら、前出の図４Ｂ、参照）。累積の食物摂取に及ぼす有意な効果は、媒質群に較べて１〜８日目に、対照Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ群に較べて１〜１３日目に観察された（１３日目に３９．３３ｇ対４２．６１ｇ；ｐ＜０．０５）（Ｓｈｅａｒｍａｎら、前出の図４Ｃ）。さらに、食物エネルギーが体質量の増大のためにいかに効率的に使用されたかを指示する摂食効率（消化された１ｋｃａｌ当たりの重量増加）が１〜５日目および６〜１３日目から計算された（Ｓｈｅａｒｍａｎら、前出の図４Ｄ，参照）。摂食効率は１〜５日目のＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）注入によって低下され、そしてこの効果は６〜１３日目からは観察されず、このことは重量増加における一過性低下が、単に食物摂取における減退によるものではなかったことを示唆する。さらに、ＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）による処置はＤＩＯマウスの体組成を変えた（Ｓｈｅａｒｍａｎら、前出の図４Ｅ）。赤身量含量（ｌｅａｎ  ｍａｓｓ  ｃｏｎｔｅｎｔ）では変化がなかったのに対して、ＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）注入されたマウスの脂肪量含量は、総体重についての校正後でさえ減少されなかった（Ｓｈｅａｒｍａｎら、前出の図４Ｆ）。白色脂肪組織貯蔵物重量はＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）注入によって変わらず、対照Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ注入は体組成または白色脂肪組織重量を変えなかった。
【０１２５】
ＤＩＯグレリン欠乏および野生型の両マウスを使用するＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）による常習的注入研究において、有意な体重喪失が、１〜６日目の野生型マウスにおけるＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）注入において観察された（Ｓｈｅａｒｍａｎら、前出の図５Ａ，参照）。これに対して、ＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）は、Ｇｈｒｌ−ｌ−マウスでは体重を変えなかった（Ｓｈｅａｒｍａｎら、前出の図５Ｂ、参照）。さらに、ＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）注入は、野生型マウスでは１日目に一日の食物摂取を減退した（Ｓｈｅａｒｍａｎら、前出の図５Ｃ，参照）。ＮＯＸ−Ｂ１１−２（ＳＯＴ−Ｄ−１０９）注入は、Ｇｈｒｌ−ｌ−マウスの食物摂取は変えなかった（Ｓｈｅａｒｍａｎら、前出の図５Ｄ、参照）。
【０１２６】
薬物が、原則として、疾病の処置のための薬物の使用に関連して開示された該疾病のすべての予防のために代替的または追加的に使用されることは、本発明の内にはいる。したがって、それぞれのマーカーは、心臓血管の危険因子、例えば、コレステロールおよび低い好気的活性ならびに体重管理を必要とする一般因子を含んでなる群から選ばれる。
【０１２７】
本発明による薬物は、原則として、当業者には既知のいかなる形態物において投与されてもよい。好適な投与経路は全身的投与、より好ましくは注射による投与である。あるいはまた、薬物は局所的に投与されてもよい。他の投与経路は、筋肉内、腹腔内、および皮下、好ましくはもっとも侵入性が少ないが有効性が確保される投与経路であるｐｅｒ  ｏｒｕｍまたは鼻内を含む。
【０１２８】
さらなる態様では、本発明は製薬学的組成物に関する。そのような製薬学的組成物は、少なくとも１種の本発明による核酸および好ましくは製薬学的に許容できる結合剤を含む。そのような結合剤は当該技術分野において使用され、そして／または既知であるいかなる結合剤であってもよい。より具体的には、そのような結合剤は、本明細書で開示される薬物の製造に関連して議論されるすべての結合剤である。さらなる実施態様では、製薬学的組成物はさらなる製薬学的活性作用物を含む。
【０１２９】
本明細書で記述されるような薬物が本明細書で開示される製薬学的組成物を構成することは本発明内にはいる。
【０１３０】
さらなる態様では、本発明は、方法が少なくとも１種の本発明による核酸の製薬学的に活性な量の投与を含む、そのような処置を必要としている被験者の処置方法に関する。１つの実施態様では、被験者は、疾病を蒙っているか、またはそのような疾病を発生する危険性にあり、ここで、疾病は本明細書で開示されるすべての疾病、特に薬物の製造のためのすべての本発明による核酸の使用に関連して開示されるすべてのそれらの疾病である。
【０１３１】
本発明による核酸ならびにアンタゴニストが、特に肥満におけるグレリンの関与に関して、薬物としてまたは薬物の製造のためだけでなく、また化粧目的のために使用できることを理解すべきである。同じ目的および／または同じ理由のために、本発明による核酸ならびにアンタゴニストは、食品添加物、体重制御の手段、食欲制御の手段としておよび／または診断剤として使用することができる。本発明による核酸ならびにアンタゴニストを含んでなる組成物はすべての上記目的のために使用することができる。
【０１３２】
好ましくは本明細書で使用されるように、診断剤または診断作用物または診断手段は、直接的にもまた間接的にも、グレリン、好ましくは本明細書で記述されるグレリン、より好ましくは本明細書に記述される種々の障害および疾病に関連して本明細書で記述されるグレリンを検出するために適当である。診断剤は、本明細書に記述される障害および疾病それぞれすべての検出および／または追跡のために適当である。そのような検出はグレリンに対する本発明による核酸の結合をとおして可能である。そのような結合は直接的にも間接的にも検出することができる。各方法および手段は当業者には既知である。なかんずく、本発明による核酸は、本発明による核酸、好ましくはグレリンに結合される核酸の検出を可能にする標識を含む。そのような標識は、好ましくは放射能、酵素および蛍光標識を含んでなる群から選ばれる。原則として、抗体のために開発されたすべての既知アッセイが、本発明による核酸のために採用されてもよく、それにより、標的結合抗体が標的結合性核酸に置換される。無標識の標的結合抗体を用いる抗体アッセイでは、検出は、好ましくは、放射能、酵素および蛍光標識により修飾され、そしてそのＦｃフラグメントにおいて標的結合抗体に結合する二次抗体によって実施される。核酸、好ましくは本発明による核酸の場合には、核酸がそのような標識により修飾されるが、好ましくはそのような標識は、ビオチン、Ｃｙ−３およびＣｙ−５を含んでなる群から選ばれ、そしてそのような標識は、そのような標識に対向される抗体、例えば、抗ビオチン抗体、抗Ｃｙ−３抗体または抗Ｃｙ−５抗体によって検出されるか、または−標識がビオチンの場合にはー標識は、ビオチンに自然に結合するストレプトアビジンまたはアビジンによって検出される。そのような抗体、ストレプトアビジンまたはアビジンは、順に、好ましくは、それぞれの標識、例えば放射能、酵素または蛍光標識により修飾される（二次抗体のように）。
【０１３３】
さらなる実施態様では、本発明による核酸は、検出手段が分子ビーコン（ｂｅａｃｏｎ）である第二の検出手段によって検出または分析される。分子ビーコンの方法は当業者には既知である。簡単に言えば、分子ビーコンとも呼ばれる核酸プローブは、検出されるべき核酸サンプルに対する逆相補物であり、このために、検出される核酸サンプルの一部にハイブリダイズする。核酸サンプルへの結合により、分子ビーコンの蛍光団基が分離されて、蛍光シグナルの変化、好ましくは強度における変化をもたらす。この変化は存在する核酸サンプルの量と相関する。
【０１３４】
本発明による生物活性および非生物活性グレリンの識別のためのアッセイは当業者には
既知の標準技術を用いて実施されてもよい。そのようなアッセイがまた、次に概説されるようなグレリン、好ましくは生物活性グレリンの検出のために使用できることは理解されるにちがいない。
【０１３５】
本発明による核酸を用いるグレリンの検出が、特に、本明細書で定義される生物活性グレリンの検出を可能にすることは認識できる。さらに、生物活性グレリンは、なかんずく、他の操作も当業者には明であるが、次の操作によってデスオクタノイルグレリンを別々に検出でき、したがって区別することができる。
【０１３６】
生物活性グレリンの検出に関連して、好適な方法は、次の段階：
（ａ）生物活性グレリンの存在について試験されるべきサンプルを提供し、
（ｂ）本発明による核酸を提供し、
（ｃ）好ましくは反応容器中で、サンプルを核酸と反応させること、
を含み、この場合、段階（ａ）は段階（ｂ）の前に実施されてもよく、または段階（ｂ）は段階（ａ）の前に実施されてもよい。
【０１３７】
好適な実施態様では、サンプルと核酸との反応の検出にある、さらなる段階ｄ）が提供される。好ましくは、段階ｂ）の核酸は、表面に固定化される。表面は、反応チューブ、プレートのウェルのような反応容器の表面、またはそのような反応容器中に含有されるデバイス、例えばビーズの表面であってもよい。表面への核酸の固定化は、限定されるものではないが、非共有または共有結合を含む、当業者には既知のいかなる手段によってなされてもよい。好ましくは、連結は、表面と核酸との間の共有化学結合により確立される。しかしながら、核酸が間接的に表面に固定化され、そのような間接的固定化がさらなる成分または相互作用パートナーのペアの使用を伴うことも本発明の内にはいる。そのようなさらなる成分は、好ましくは、相互作用パートナーとも呼ばれる、固定化される核酸と特異的に相互作用し、その結果表面への核酸の付着を媒介する化合物である。相互作用パートナーは、好ましくは、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含んでなる群から選ばれる。好ましくは、相互作用パートナーは抗体、より好ましくはモノクローナル抗体である。あるいはまた、相互作用パートナーは、核酸、好ましくは機能的核酸である。より好ましくは、そのような機能的核酸は、アプタマー、ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ、および核酸に対して少なくとも部分的に相補的である核酸を含んでなる群から選ばれる。さらなるその他の実施態様では、表面への核酸の結合は多分離した（ｍｕｌｔｉ−ｐａｒｔｉｔｅ）相互作用パートナーによって媒介される。そのような多分離相互作用パートナーは、好ましくは、相互作用パートナーのペアまたは第一のメンバーと第二のメンバーからなる相互作用パートナーであり、ここでは、第一のメンバーは核酸によって含まれるか、または核酸に連結され、そして第二のメンバーは表面に付着されるか、または表面によって含まれる。多分離相互作用パートナーは、好ましくは、ビオチンとアビジン、ビオチンとストレプトアビジン、およびビオチンとノイトラビジン（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）を含んでなる相互作用パートナーのペアの群から選ばれる。好ましくは、相互作用パートナーのペアの第一のメンバーはビオチンである。
【０１３８】
そのような方法の好適な結果は、生物活性グレリンおよび核酸の非固定化複合体の形成であり、この場合、より好ましくは、該複合体が検出される。この複合体から生物活性グレリンが検出されることは実施態様内にはいる。より好ましくは、生物活性グレリンは、生物活性グレリンに特異的である検出手段によって検出される。特に好適な実施態様では、生物活性グレリンは、両、生物活性グレリンおよび非生物活性グレリンを検出する検出手段によって検出される。
【０１３９】
この要件に従うそれぞれの検出手段は、例えば、両、生物活性グレリンおよびデス−オクタノイルグレリンにおいて同一であるグレリンの、その／それらの部分に対して特異的
であるすべての検出手段である。好ましくは、そのような検出手段は、かくしてグレリンのＣ末端に結合するか、あるいは少なくとも、Ｎ末端およびｎ−オクタノイル側鎖によって形成されるドメインに結合することはない。特に好適な検出手段は、核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含んでなる群から選ばれる検出手段であり、これらの生成は当業者には既知である。
【０１４０】
グレリンの検出方法はまた、サンプルが、好ましくは段階ｃ）を実施するために使用された反応容器から除去されることを含む。
【０１４１】
さらなる実施態様では、方法はまた、生物活性および／またはデス−オクタノイルグレリンの相互作用パートナーを表面、好ましくは先に定義された表面上に固定化する段階を含み、ここでの相互作用パートナーは、本明細書、好ましくはそれぞれの方法に関連して先のように定義されており、より好ましくは、それらの種々の実施態様における核酸、ポリペプチド、タンパク質および抗体を含む。この実施態様では、特に好適な検出手段は、本発明による核酸であり、そのような核酸は、好ましくは標識されても、または標識されていなくてもよい。そのような核酸が標識される場合には、それが、直接的にまたは間接的に検出できる。そのような検出はまた、好ましくは、核酸、ポリペプチド、タンパク質および本明細書で記述される種々の実施態様における実施態様を含んでなる群からまた選ばれる第二の検出手段の使用を伴ってもよい。そのような検出手段は、好ましくは、本発明による核酸に特異的である。より好適な実施態様では、第二の検出手段は分子ビーコンである。核酸または第二の検出手段または両方のいずれも、好適な実施態様では、検出標識を含んでもよい。検出標識は、好ましくは、ビオチン、ブロモ−デオキシウリジン標識、ジゴキシゲニン標識、蛍光標識、ＵＶ−標識、放射能標識およびキレーター分子を含んでなる群から選ばれる。あるいはまた、第二の検出手段は、好ましくは、核酸によって含有されるか、またはそれによって含まれるか、またはそれに連結される検出標識と相互作用する。特に好適な組み合わせは、次のとおりである：
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がビオチンに対向された抗体であるか、あるいは
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がアビジンまたはアビジン保持分子であるか、あるいは
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がストレプトアビジンまたはストレプトアビジン担持分子であるか、あるいは
検出標識がビオチンであり、そして第二の検出手段がノイトラビジンまたはノイトラビジン担持分子であるか、あるいは
検出標識がブロモ−デオキシウリジンであり、そして第二の検出手段がブロモ−デオキシウリジンに対向された抗体であるか、あるいは
検出標識がジゴキシゲニンであり、そして第二の検出手段がジゴキシゲニンに対向された抗体であるか、あるいは
検出標識がキレーターであり、そして第二の検出手段が放射性核種であり、
これらの場合、該検出標識は核酸に連結されていることが好ましい。この種の組み合わせがまた核酸が表面に付着される実施態様にも応用できることが理解されるべきである。そのような実施態様では、検出標識が相互作用パートナーに連結されることが好ましい。
【０１４２】
最後に、第二の検出手段が第三の検出手段を用いて検出される、好ましくは第三の検出手段が酵素、より好ましくは第二の検出手段の検出において酵素反応を示す酵素であるか、あるいは第三の検出手段が放射線、より好ましくは放射性核種によって放出される放射線を検出する手段であることは、また本発明内にはいる。好ましくは、第三の検出手段は具体的には第二の検出手段を検出することおよび／または第二の検出手段と相互作用することである。
【０１４３】
また、表面に固定されている生物活性および／またはデスーオクタノイルグレリンの相互作用パートナーおよび本発明による核種が、好ましくは相互作用パートナーとグレリン間に形成される複合体に付加される実施態様では、サンプルは、反応から、より好ましくは段階ｃ）および／またはｄ）が実施される反応容器から除去されてもよい。
【０１４４】
１つの実施態様では、本発明による核種は蛍光部分を含み、ここで、蛍光部分の蛍光は、核種と生物活性グレリン間の複合体形成および遊離の生物活性グレリンにおいて異なる。
【０１４５】
さらなる実施態様では、核酸は本発明による核酸の誘導体であり、ここで、核酸の誘導体は、アデノシン置換アデノシンの少なくとも１種の蛍光誘導体を含む。好適な実施態様では、アデノシンの蛍光誘導体はエテノアデノシンである。
【０１４６】
さらなる実施態様では、本発明による核酸の誘導体および生物活性グレリンからなる複合体は蛍光を用いて検出される。
【０１４７】
本方法の実施態様では、シグナルは段階（ｃ）または段階（ｄ）において生成され、好ましくはシグナルはサンプル中の生物活性グレリンの濃度と相関される。
【０１４８】
好適な態様では、アッセイは９６穴プレートにおいて実施されてもよく、ここでの成分は前述の反応容器および反応容器として働くウェル中に固定化される。
【０１４９】
反応段階の上記系列およびそれらに関連して記述される種々の実施態様は、原則として、両生物活性グレリン、すなわち、オクタノイルグレリン、より好ましくはｎ−オクタノイルグレリン、およびデス−オクタノイルグレリンを検出するために適当である。このことは、生物活性グレリンの検出について、少なくとも１種の相互作用パートナーおよび本発明による核酸が生物活性グレリンを特異的に検出するのに適当である場合には可能である。原則として、生物活性グレリンに特異的である本発明による核酸が使用されることが十分である。サンプル中に含有されるグレリン量を特定するこの種の方法の読み取りは、生物活性グレリンについての分析の結果としてそれ自体使用することができる。しかしながら、また結果は、グレリン、好ましくは両生物活性グレリンおよびデス−オクタノイルグレリンの総含量を決定する方法において使用されてもよい。そのような目的では、デス−オクタノイルグレリンに特異的な、あるいは両生物活性およびデス−オクタノイルグレリン、すなわち総グレリン含量またはその量を検出するのに適当な検出手段または相互作用パートナーのいずれかを使用する、上記と好ましくは同一な方法が実施される。該相互作用パートナーまたは手段が、生物活性グレリンであるか、またデス−オクタノイルグレリンであるかに拘わらず、いずれかのグレリンを検出するのに適当である場合は、サンプル中に含有されるグレリンの総量は、生物活性グレリンについて得られる値および総グレリン含量の商形成によってサンプル中の生物活性グレリンのパーセンテージを決定することを可能なような方法の読み取りによって計算することができる。さらなる実施態様では、方法はデス−オクタノイルグレリンを特異的に検出するために使用される。そのようなデス−オクタノイルグレリンは、例えば、ｎ−オクタノイル部分を欠如しているグレリンのＣ末端またはＮ末端に対向されることによるような、デス−オクタノイルグレリンに特異的である手段または相互作用パートナーの検出によって検出することができる。かくして検出されるグレリンの量、すなわちデスーオクタノイルグレリンの量は、次いで、サンプル中の総含量を与える生物活性グレリンの量に加えることができる。
【０１５０】
本発明の核酸は、薬物設計のための出発材料としてさらに使用されてもよい。１つのアプローチは化合物ライブラリーのスクリーニングであり、そのような化合物ライブラリーは、好ましくは低分子量化合物ライブラリーである。１つの実施態様では、スクリーニン
グは高処理スクリーニングである。好ましくは、高処理スクリーニングは、標的に基づくアッセイにおける化合物の迅速、効率的、試行錯誤評価である。最良の場合には、分析は比色（ｃｏｌｏｒｍａｔｉｃ）測定によって実施される。これに関連して使用されるライブラリーは当業者には既知である。
【０１５１】
あるいはまた、本発明による核酸は薬物の合理的設計のために使用されてもよい。好ましくは、合理的薬物設計は製薬学的先導（ｌｅａｄ）構造の設計である。Ｘ線結晶学または核磁気共鳴分光法のような方法によって典型的には同定される標的の三次元構造から出発して、コンピュータープログラムが、多くの異なる化学化合物の構造を含有しているデータベースをとおして検索するために使用される。選択はコンピューターによって実施され、同定された化合物が続いて実験室において試験できる。
【０１５２】
薬物の合理的設計は、本発明による核酸のいずれから出発してもよく、そして本発明の核酸の構造に類似しているか、または本発明の核酸の構造の結合媒介部分に同一である構造、好ましくは三次元構造を必要とする。薬物の合理的設計におけるさらなる段階でもまた代替的段階においても、神経伝達物質に結合する核酸のそれらの部分の好ましくは三次元構造は、ヌクレオチドおよび核酸とは異なる化学基によって模倣される。この模倣によって、核酸とは異なる化合物が設計できる。そのような化合物は、好ましくは低分子またはペプチドである。
【０１５３】
当業者には既知である競合アッセイを使用するような、化合物ライブラリーのスクリーニングの場合では、適当なグレリン類似体、グレリンアゴニストまたはグレリンアンタゴニストが発見することができる。そのような競合アッセイは次のように設定されてもよい。本発明の核酸、好ましくは標的結合Ｌ−核酸であるｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒが固相に結合される。グレリン類似体を同定するために、標識されたグレリンがアッセイに添加されてもよい。潜在的な類似体は、それぞれの標識によって得られるシグナルにおける減少とともに進行するｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒに結合するグレリン分子と競合する。アゴニストまたはアンタゴニストのスクリーニングは、当業者には既知の細胞培養アッセイの使用を伴ってもよい。
【０１５４】
本発明によるキットは、少なくとも１種または数種の本発明の核酸を含んでもよい。さらに、キットは少なくとも１種または数種のポジティブまたはネガティブ対照を含んでもよい。ポジティブ対照は、例えば、グレリン、特にこれに対して本発明の核酸が選ばれるか、またはこれに対して、好ましくは液体形態においてそれが結合するものであってもよい。ネガティブ対照は、例えば、グレリンに類似する生物物理学的性質の見地から定義されるが、本発明の核酸によって認識されないペプチドであってもよい。さらにまた、該キットは１種以上のバッファーを含んでもよい。種々の成分は、乾燥または凍結乾燥形態においてキット中に含有されても、または液体に溶解されてもよい。キットは、キットの１種以上の成分を含有してもよい１種以上の容器を含んでもよい。さらなる実施態様では、キットは、キットおよびその種々の成分を使用する方法に関する情報を使用者に与える指示または指示紙片を含む。
【０１５５】
好ましくは本明細書で使用されるように、用語「処置」は、好適な実施態様では、追加的または代替的に予防および／または追跡処置を含む。
【０１５６】
好ましくは本明細書で使用されるように、用語「疾病および障害」は、改めて指示されない限り、互換可能な様式で使用されるべきである。
【０１５７】
本明細書で使用されるように、用語「含む」は、好ましくは、そのような用語によって追跡または記述される主題を限定することを意図していない。しかしながら、その他の実
施態様では、用語「含む」は、含有するという意味において理解されるべきであり、かくして、そのような用語によって追跡または記述される主題を限定するとして理解されるべきである。
【０１５８】
種々の配列番号、本発明による核酸分子の化学的性質および本明細書で使用される標的分子グレリン、その実際の配列および内部参照番号が、次の表において総括される。
【０１５９】
【表３】
2008534024.tif 000010
【０１６０】
【表４】
2008534024.tif 000011
【０１６１】
【表５】
2008534024.tif 000012
【０１６２】
【表６】
2008534024.tif 000013
【０１６３】
本発明は、図面、実施例および配列リストによってさらに具体的に説明され、これらからさらに、特徴、実施態様および利点が取り上げられてもよい。
【実施例】
【０１６４】
例１：グレリン結合配列
明確に別に指示されない限り、これらの実施例をとおして使用されるグレリンは、そのオクタノイル化形態におけるグレリンであった。
【０１６５】
ドイツ特許第一０３４９４４．３号に記述される技術から得られる技術を用いて、ビオチン化ヒト・Ｄ−グレリンに対向されるＲＮＡインビトロ選択が実施された。ｄｓＤＮＡ分子の富有化集団がクローン化され、配列決定された。配列分析の結果は図１において見ることができる。
【０１６６】
全配列は、既知のグレリン結合配列ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１ｔｒｃ；特許出願ＷＯ２００４／０１３２７４Ａ２，参照）のグレリン結合モチーフＡ（２５ヌクレオチド）を含む。これらの２３クローンからの４個のみにおいてモチーフＡが、配列の３’末端に置かれている。１９配列内では、モチーフＡはクローンの５’−末端に置かれている。モチーフＤと呼ばれるさらなるモチーフはモチーフＡの３’末端に置かれている。
【０１６７】
配列の結合特性
異なる位置において変異を示す１５クローン（図１）が、実施例２に記述される「競合アッセイ」を用いる３７℃での格付け実験のために選ばれた。参考として、放射能標識アプタマーＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１ｔｒｃ）が使用された。数種の候補がＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１ｔｒｃ）よりも強くＤ−グレリンに結合し、より低いＫＤまたは「競合アッセイ」では分別できない活性コンホメーションのより高い量を示した。クローンＭＳ−Ｐ２−Ｇ２、ＭＳ−Ｐ２−Ｄ２、ＭＳ−Ｐ２−Ａ２、ＭＳ−Ｐ２−Ｈ３は対照クローンＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１ｔｒｃ）よりも良好な結合を有するように見え、クローンＭＳ−Ｐ２−Ｅ１、ＭＳ−Ｐ２−Ｂ１、ＭＳ−Ｐ２−Ｆ１、ＭＳ−Ｐ２−Ｃ３、ＭＳ−Ｐ２−Ｃ２，ＭＳ−Ｐ２−Ａ４およびＭＳ−Ｐ２−Ｂ２はさらに良好な結合を示した。ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１ｔｒｃ）に較べて類似の結合結果は、クローンＭＳ−Ｐ２−Ｅ３、ＭＳ−Ｐ２−Ａ３、ＭＳ−Ｐ２−Ｈ２およびＭＳ−Ｐ２−Ｄ１について決定できた（図２；評価は図１参照）。したがって、最良クローンが、平衡アッセイにおいてアプタマーとして、そして３７℃における細胞培養アッセイにおいてＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒとしてそれらの活性について試験された（プロトコルは実施例２参照）。結果は図１において総括されている。クローンＭＳ−Ｐ２−Ｄ２、ＭＳ−Ｐ２−Ｆ１、ＭＳ−Ｐ２−Ｃ２、ＭＳ−Ｐ２−Ａ４およびＭＳ−Ｐ２−Ｂ２は、平衡アッセイにおいて３７℃で２２〜３４ｎＭのＫＤ（約６０％活性分子）と測定され、そして３，０〜８，０ｎＭのＩＣ５０値が３７℃の細胞培養実験において検出できた。これに較べて、ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１ｔｒｃ）のＩＣ５０は３７℃で２０ｎＭと検出され、そしてＫＤは３７℃で１００ｎＭ（４７％活性分子）と決定された（特許出願ＷＯ２００４／０１３２７４Ａ２に記述されるように、室温におけるＳＯＴ−ＣのＩＣ５０は約５ｎＭである）。結果は、ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＭＳ−Ｐ２−Ｆ１、ＭＳ−Ｐ２−Ｃ２およびＭＳ−Ｐ２−Ｄ２の生物学的活性は、３７℃においてＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１ｔｒｃ）よりも約５倍も良好であり得ることを示している。連続的な先端切り取り実験では、クローンＭＳ−Ｐ２−Ｆ１（４，０ｎＭのＩＣ５０）が選択された（二次構造予想、図１２参照）。
【０１６８】
図１に示される配列のいずれもが、その先端を切り取られた形態物を含む本発明による核酸であるが、それらはなお標的に結合することができる。
【０１６９】
例２：  配列の結合特性
２．１  「平衡結合アッセイ」の使用による放射能標識アプタマーの格付け
本明細書で開示され、そしてより具体的には図１において列挙されるほとんどのクローンが、「平衡結合アッセイ」の使用によって、ビオチン化ヒト・Ｄ−グレリンに対するそれらの結合挙動に関して放射能標識アプタマー（Ｄ−ＲＮＡ）として格付けされた。
【０１７０】
ヒト・Ｄ−グレリンに対する分子の結合挙動の格付けが実施された。この目的のために、本明細書で記述される標準プロトコルを用いて、同定されたアプタマーが図１に描かれるような先端を切り取られたアプタマー（プライマー結合部位なし）として合成された。
【０１７１】
次に示すように、アプタマー配列が次のプロトコルを用いてγ−Ｐ３２−ＡＴＰにより５’末端において放射能標識された。
成分                                                        ［最終］
オリゴヌクレオチド                                          ５μＭ
Ｔ４  Ｆｏｒｗａｒｄ反応バッファー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  １ｘ
Ｔ４  ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）  １０Ｕ／１０μｌ反応容量［γ−３２Ｐ］−ＡＴＰ                                  １μｌ／１０μｌ反応容量
【０１７２】
反応は３７℃で１時間インキュベートされた。次いで、放射能標識アプタマーはゲル精製された。
【０１７３】
放射能標識ＲＮＡの２〜５ｐｍｏｌｅが、Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含有しない選択バッファー（ヒト血液における生理学的条件にしたがう：２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭＮａＣｌ、５ｍＭＫＣｌ，ｐＨ７．４は３７℃で調節された）において９５℃で３分間変性され、３７℃において１ｍＭの最終濃度までのこれらのイオンの添加によって折り畳まれ、そして０，４〜３０００ｎＭの範囲の濃度のビオチン化ヒトＤ−グレリンとともに３７℃で１時間インキュベートされた。続いて、ＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎアガロースの一定量がマトリックスとして添加され、そしてＲＮＡ：ペプチド複合体が３０分以上３７℃で振盪された。次いで、結合されたペプチドをもつマトリックスおよびチューブが沈降され、上澄液が除去され、マトリックスが１００μｌ選択バッファーにより洗浄され、そして結合ＲＮＡと非結合ＲＮＡとの差異がＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒを使用する放射能の測定によって決定された。算出された数から、対照（０ｎＭビオチン化ヒトＤ−グレリン）がバックグラウンドとして差し引かれた。平衡定数はソフトウエアプログラム「ＧｒａＦＩＴ」（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０．１０．，Ｅｒｉｔｈａｃｕｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｌｔｄ．，Ｓｕｒｒｅｙ，ＵＫ）を使用して計算された。
【０１７４】
２．２  競合アッセイの使用によるアプタマーの格付け
既知のグレリン結合配列ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１ｔｒｃ；特許出願ＷＯ２００４／０１３２７４Ａ２参照）に対してクローンを比較するために、ＳＯＴ−Ｃが、本明細書で記述される標準プロトコル（実施例４）を用いてアプタマー（Ｄ−ＲＮＡ）として合成された。アプタマー配列は本明細書で記述される標準プロトコルを用いてγ−Ｐ３２−ＡＴＰにより５’末端において放射能標識された。
【０１７５】
放射能標識ＳＯＴ−Ｃおよび同定されたクローン（Ｄ−ＲＮＡ）が平衡アッセイのために前述のように調製された。アッセイは２０ｎＭのペプチド濃度（ビオチン化ヒトＤ−グレリン）において実施された。その後、等モル量の放射能標識ＳＯＴ−Ｃおよび２つの異なる濃度（４０ｎＭおよび２００ｎＭ）のアプタマーが試験された（結果は図２に示される）。アッセイは平衡アッセイと同様に実施された。
【０１７６】
２．３  グレリン結合Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒによるグレリン誘導カルシウム放出の抑制
グレリン結合Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒの機能的特性決定が、ヒト（Ｌ−）グレリンとヒト
成長ホルモン分泌促進物質受容体（ＧＨＳ−Ｒ）との相互作用を追跡する細胞アッセイ系において実施された。受容体−リガンド相互作用からもたらされる細胞内カルシウム放出は、蛍光カルシウム指示薬の手段によって可視化される。
【０１７７】
ヒト・グレリン受容体（ＧＨＳ−Ｒ１ａ）を発現する安定なトランスフェクトされたＣＨＯ細胞（Ｅｕｒｏｓｃｒｅｅｎ，Ｇｏｓｓｅｌｉｅｓ，Ｂｅｌｇｉｕｍから得られた）が、透明な底を有する黒色の９６穴プレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ）において５〜７ｘ１０４細胞／ウェルを接種され、そして１００単位／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４００μｇ／ｍｌゲネチシンおよび２．５μｇ／ｍｌフンギゾン（ｆｕｎｇｉｚｏｎｅ）をさらに含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地（Ｃａｍｂｒｅｘ）において３７℃および５％ＣＯ２下で一夜培養された。
【０１７８】
カルシウム指示薬染料ｆｌｕｏ−４を負荷する前に、細胞は２００μｌのＣＨＯ−Ｕ＋により一回洗浄される。次いで、指示薬染料溶液（ＣＨＯ−Ｕ＋中、１０μＭｆｌｕｏ−４（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、０．０８％ｐｌｕｒｏｎｉｃ１２７（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ））の５０μｌが添加され、そして細胞は３７℃で６０分間培養される。その後、細胞は１８０μｌのＣＨＯ−Ｕ＋により３回洗浄される。最後に、９０μｌのＣＨＯ−Ｕ＋が各ウェルに添加される。
【０１７９】
種々の量のＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒが、０．２ｍｌの低プロフィル（ｌｏｗ  ｐｒｏｆｉｌｅ）９６穴プレートにおいて室温または３７℃で１５〜６０分間、５ｍＭｐｒｏｂｅｎｅｃｉｄおよび２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ＣＨＯ−Ｕ＋）を含有するＵｌｔｒａＣＨＯ培地において、ヒト（Ｌ−）グレリン（Ｂａｃｈｅｍから購入）とともにインキュベートされる。対照として、ペプチドのみを含有するサンプル（最大カルシウム放出）およびペプチドを含有しないサンプル（最小カルシウム放出）が分析される。これらの刺激溶液においては、ペプチドおよびＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（添加される場合）は、このアッセイに較べて１０倍濃縮されている。
【０１８０】
カルシウム放出の検出では、刺激溶液が細胞に添加され（１０μｌ／ウェル）、そして蛍光シグナルの変化がモニターされる。蛍光シグナルの測定は、注入ポンプを備えたＦｌｕｏｓｔａｒ  Ｏｐｔｉｍａ多検出プレートリーダー（ＢＭＧ）において４８５ｎｍの励起波長および５２０ｎｍの発光波長において実施される。
【０１８１】
数個のサンプルの並行測定では、９６穴プレートの１つの（垂直の）列のウェルが一緒に記録される。４秒のタイムラグをもつ最初の３回の読み取りが、ベースラインの決定のために実施される。次いで、読み取りが中断され、プレートが装置から除かれる。多チャンネルピペットを用いて、刺激溶液の１０μｌがウェルに添加され、次いで、プレートが装置中に再び移動され、そして測定が継続される。４秒間隔での全２０回の読み取りにおいて実施される。
【０１８２】
各ウェルでは、最大蛍光とベースライン値との間の差異が決定され、そしてヒト（Ｌ−）グレリン（オクタノイル化された）濃度に対してプロットされるか、あるいはＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒによるカルシウム放出の抑制における実験では、半最大抑制定数（ＩＣ５０）の決定を可能にするＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒの濃度に対してプロットされる。
【０１８３】
２．４  表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）測定
ビオチン化ヒトＤ−グレリンに結合するアプタマーの特性決定が、前記ＢＩＡｃｏｒｅ２０００装置（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を用いるＳＰＲ即時速度分析によって決定された。Ｃ末端ビオチン化ペプチドの１００ＲＵ（フローセル２）および３００ＲＵ（フローセル３）が、Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ共役センサーチッ
プ（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に固定化され、そして０，１μＭ〜１μＭの濃度範囲におけるサンプルが、会合時間３６０（ｓ）および解離時間３６０（ｓ）を定めるＫｉｎｊｅｃｔ指令を用いて注入された。フローセル１はバッファーおよびデキストラン基質対照（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＡ−Ｃｈｉｐ  ｓｕｒｆａｃｅ）として使用され、フローセル４には、非特異的Ｄ−ペプチドが固定化されてアプタマーの非特異的結合を決定した。反応は３７℃で実施された。ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ３．０  ソフトウエア（ＢＩＡｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によるデータ解析では、本研究者らはＬａｎｇｍｕｉｒ１：１化学量論的フィッティング・アルゴリズムを使用した。
【０１８４】
例３：  グレリン結合Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒモチーフの定義
３．１  ＳＯＴ−Ｄ−０００の切り取り
３．１．１  予め選ばれたＳＯＴ−Ｄ−０００の末端切り取り
図３に示されたグレリン結合Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、特許出願ＷＯ２００４／０１３２７４Ａ２において既に示されるように予め得られた。二次構造の予測（最小自由エネルギーコンホメーション［Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ  １２５：１６７−１８８］）では、５’−および３’末端の間の標準的分子内塩基対合が全Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒについて明白になる（図４−７；図３において下線を付した塩基）。Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒにおけるそのような構造的要素の存在は、活性のある三次元構造の正確な折り畳みのためには極めて重要であろうが、経済的なＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒの合成のためには、分子は可能な限り短くあるべきである。ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｄ−０００（別名、プライマー結合部位を含まないＳＯＴ−Ｒ０４−ＤＲ１４−Ｆ７の先端切り取り物）は、それが、最長の末端らせんを形成する可能性を有する最短の選ばれたＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒであるので、末端切り取りのための基本として選ばれた。
【０１８５】
１０個の代わりに８個（ＳＯＴ−Ｄ−１０８）、７個（ＳＯＴ−Ｄ−１００）および６個（ＳＯＴ−Ｄ−１０４）の塩基対のらせんの長さをもつＳＯＴ−Ｄ−０００の先端切り取り変異体が合成され（図８）、そして実施例２における記述のように細胞培養において試験された（図９）。ＳＯＴ−Ｄ−１０４（３９量体）は有意に結合活性を喪失したが、ＳＯＴ−Ｄ−１００（４１量体）および−１０８（４３量体）は完全なグレリン・アンタゴニスト性能を維持した。変異体ＳＯＴ−Ｄ−１０６、Ｇ４が除去されたＳＯＴ−Ｄ−１０４のさらなる先端切り取り物は実質的に不活性であった。驚くべきことに、この不適合Ｇ−全選択グレリンＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒのらせんに存在する−は容易には除去されないであろう。むしろ、グレリン結合のためには必須であると思われる。
【０１８６】
３．１．２  ＳＯＴ−Ｄ−１００および−１０８の内部欠失変異体
図３における選ばれたグレリン結合物（ｂｉｎｄｅｒ）の整列を考慮する場合、強度に可変性の領域は、５’末端における末端らせんに直接隣接するすべての整列された分子において存在すると思われる。グレリン結合物のさらなる先端切り取りについてのこの明白な可変性を精査するために、最小の完全活性ＳＯＴ−Ｄ変異体ＳＯＴ−Ｄ−１００およびー１０８がさらなる切り取りのための基礎として使用された。内部のＳＯＴ−Ｄ−１００変異体の場合は、それぞれの塩基が単純に除かれたが、ＳＯＴ−Ｄ−１０８変異体では、それらが、合成中に柔軟性の親水性スペーサーによって置換された。次に、ＳＯＴ−Ｄ−１００およびその誘導体ＳＯＴ−Ｄ−１０１および−１０２ならびにＳＯＴ−Ｄ−１０８誘導体ＳＯＴ−Ｄー１０９、ＳＯＴ−Ｄ−１１０およびー１１１が、実施例２における記述のように細胞培養において試験された（図９）。図８に示されるように、３個ではないが２個の内部ヌクレオチドの欠失は、活性喪失なしに可能であった（ＳＯＴ−Ｄ−１０１；−１０２）。これに対して、スペーサーによって置換された場合（ＳＯＴ−Ｄ−１０９、−１１０、−１１１）には、３個のヌクレオチドが除くことができた。スペーサーの最適位置はＳＯＴ−Ｄ−１０９において実現される（図１０）。
【０１８７】
４０ｋＤａ部分による５’末端におけるＳＯＴ−Ｄ−１０９の修飾はグレリン結合活性の喪失なしに可能であった（図１１）。
【０１８８】
３．２  ＳＯＴ−Ｅの切り取り
次のように、先導配列として選ばれたグレリン結合配列ＭＳ−Ｐ２−Ｆ１（図１および図１２）はＳＯＴ−Ｅと呼ばれる。
【０１８９】
二次構造の予測（最小自由エネルギーコンホメーション［Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ  １２５：１６７−１８８］）では、Ｃ３０およびＧ５０の間の標準的分子内塩基対合の可能性が、ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅについて明白になる（図１２）。ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅの切り取りをもたらす次の実験が記述される。ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅのすべての切り取り型が細胞培養においてそれらの活性に関して試験された（実施例２、参照）。
【０１９０】
３．２．１  ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅの末端切り取り
３’末端における５個のヌクレオチドは分子の他の部分にはハイブリダイズされないと思われる。反対に、５’末端では、ヌクレオチドは部分的に対合できる。驚くべきことに、３’末端は結合の低下なしには切り取りすることができない（ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−０１２）が、一方ＳＯＴ−Ｅ−０１４（５’末端における６個のヌクレオチドの切り取り）は完全なグレリン・アンタゴニスト性能を維持した（図１３）。
【０１９１】
３．２．２  ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅの内部欠失変異体
図１における選ばれたグレリン結合物ＭＳ−Ｐ２−Ｅ３、ＭＳ−Ｐ２−Ｇ２、ＭＳ−Ｐ２−Ｄ２、ＭＳ−Ｐ２−Ａ３、ＭＳ−Ｐ２−Ｅ１、ＭＳ−Ｐ２−Ｂ１、ＭＳ−Ｐ２−Ｃ３、ＭＳ−Ｐ２−Ｃ２、ＭＳ−Ｐ２−Ｈ２、ＭＳ−Ｐ２−Ａ４、およびＳＯＴ−Ｅ（配列ファミリーＩ）の整列を考慮する場合、可変性の領域は、末端において、かつ、らせんに直接隣接するすべての整列された分子において存在すると思われる（ＳＯＴ−ＥにおけるＧ３６−Ｃ４３）。ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅの二次構造予測は、４個のヌクレオチドのループを示す（Ａ３８−Ｕ４１；図１２）。グレリン結合物のさらなる切り取りのためにこの明白な可変性を探査するために、最初に、ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅのそれぞれの塩基が、合成中に柔軟性の親水性スペーサーによって置換された。８個のヌクレオチド（Ｇ３６−Ｃ４３；ＳＯＴ−Ｅ−００８）ではない６個（Ｕ３７−Ａ４２；ＳＯＴ−Ｅ−０１１）の欠失が、活性の喪失なしに可能であった。５’末端における切り取り（Ｇ１−Ａ６）の結果および柔軟性の親水性スペーサーによる６個のヌクレオチド（Ｕ３７−Ａ４２）の置換の組み合わせは、５６−ヌクレオチドＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ（図１２）として細胞培養において同一のＩＣ５０を示す４４−ヌクレオチドのＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−０１９（図１４）をもたらす。
【０１９２】
３．２．３  ＳＯＴ−Ｅ−０１９内の配列セグメントの転位
配列ＭＳ−Ｐ２−Ａ２、ＭＳ−Ｐ２−Ｈ３、ＭＳ−Ｐ２−Ｄ１（図１）によって表される配列ファミリーＩＩは配列ファミリーＩ（ＳＯＴ−Ｅを含む）に対して類似性を担持する。これらの配列相同性は図１におけるｂｏｘＡ（ＵＡＡＧＡＣＣＧＡＡＧＧＵＡＡＣＣＡＡＵＣＣＵＡＣ）として強調される。配列ファミリーＩＩでは、ｂｏｘＡは、むしろ３’末端に置かれるが、配列ファミリーＩでは、ｂｏｘＡは５’末端に接近している。ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅのインビトロの選択および二次構造予測のこの結果により、ｂｏｘＡが５’末端に置かれるＳＯＴ−Ｅ−０１９の変異体が計画された。その目的のために、ＳＯＴ−Ｅ−０１９の本来の５’末端および３’末端が、柔軟性の親水性スペーサーと連結され、そしてループが除去されて、新しい５’末端および３’末端を生成した（ＳＯＴ−Ｅ−０２１；図１５および２１）。驚くべきことに、ＳＯＴ−Ｅ−０２１では、活性の喪失は観察できなかった。ＳＯＴ−Ｅ−０１９およびＳＯＴ−Ｅ−０２１（ＳＯＴ−Ｅ−３３（図１６および２１）およびＳＯＴ−Ｅ−２５（図１７および２１））に基づくさらなる切り取り物は、グレリン・アンタゴニスト機能の低下なしには可能ではなかった（図１３）。
【０１９３】
３．３  ＳＯＴ−Ｃ、ＳＯＴ−Ｄ−１０９およびＳＯＴ−Ｅの比較
ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅが、ＳＯＴ−Ｃに比較して表面プラズモン共鳴（実施例２）によって測定され、６倍良好なＫＤが決定できた（図１８）。同じ改良された結合性（５倍良好）が、Ｄ−１０９に較べてＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅを用いる細胞培養実験（実施例２）において検出することができた（図１９）。動物体内での滞留時間を改良するために、ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−１９が、４０ｋＤａ−ＰＥＧ部分によってその５’末端において修飾された（ＳＯＴ−Ｅ１９−５’−ＰＥＧ）。ＳＯＴ−Ｅ１９−５’−ＰＥＧは、細胞培養実験においてＳＯＴ−Ｅに較べて類似の結果を示し（図１９）、さらに、インビボ活性を例証した（実施例５；図２２）。
【０１９４】
３．４  グレリン結合Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒモチーフの定義
グレリン、特に本明細書で定義されるオクタン酸側鎖を有するグレリンを結合させるすべての分子は、第一に、グレリン結合のために必須である２５個のヌクレオチド（「ＢｏｘＡ」）のモチーフの存在を特徴とする。「ＢｏｘＡ」内の２５個のヌクレオチドのあるものは他の塩基と相互に交換可能であると思われる（図２０Ａ）。
【０１９５】
グレリン結合Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒの「ＢｏｘＡ」の機能のための必須要件は、非対合の中央に置かれたグアノシンを含んでらせん構造を形成する配列５’−ＧＵＧＡＧＧ（ＢｏｘＢ）の相補鎖と、「ＢｏｘＡの」３’末端の５個のヌクレオチド（５’−ＣＣＵＡＣ）とのハイブリダイゼーションである。ＢｏｘＢにおけるこの中央のグアノシンの欠失は、有意な結合の喪失をもたらす（「ＢｏｘＡにより定義されるらせん」、非対合Ｇ；図２０Ａ）。「ＢｏｘＡ」、「ＢｏｘＡにより定義されるらせん」に対する３’−隣接物は、１個、優先的には２個以上のさらなる定まっていない塩基対（「ＢｏｘＣ１」および「ＢｏｘＣ２」、図２０Ａ）によって最小に伸長されるべきである。
【０１９６】
「ＢｏｘＢ」の３’末端では、さらなるヌクレオチドが結合のために必須である。少なくとも２個のさらなるヌクレオチド（優先的には５’−ＣＡ）が結合のために必要である。結合性の有意な改良は、この位置において（「ＢｏｘＤ」、図２０Ａ）、さらなる２個、場合によっては４個のヌクレオチドを付加して２、３、４、５または６個のヌクレオチドを含んでなるＢｏｘＤをもたらすことによって達成できる。
【０１９７】
「ＢｏｘＡ」の５’末端では、さらなるヌクレオチドが結合のために必須である。少なくとも１個のさらなるヌクレオチド（特にＵまたはＧ）が結合のために必要である。結合性の有意な改良は、この位置において（「ＢｏｘＥ」、図２０Ａ）、さらなる２個のヌクレオチドを付加して１、２、３または４個のヌクレオチドを含んでなるＢｏｘＥをもたらすことによって達成できる。
【０１９８】
ＢｏｘＤおよびＥが柔軟性の親水性スペーサーを介して連結される場合、該スペーサーはまた、種々の位置に挿入することができる（参照、図８；ＳＯＴ−Ｄ−１０９、ＳＯＴ−Ｄ−１１０およびＳＯＴ−Ｄ−１１１）。
【０１９９】
驚くべきことに、ＢｏｘＤおよびＥの代わりに「ＢｏｘＣ１」および「ＢｏｘＣ２」が柔軟性の親水性スペーサーに連結した場合に、一定の配列要素が機能する。
【０２００】
変異体１：
【０２０１】
【化６】
2008534024.tif 000014
【０２０２】
変異体２：
【０２０３】
【化７】
2008534024.tif 000015
【０２０４】
本明細書、請求項および／または図面において開示される本発明の特徴は、別々に、およびいずれかのその組み合わせにおいて、その種々の形態において本発明を実現するための材料となり得る。
【０２０５】
例４：  アプタマーおよびＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒの化学的合成
化学的固相合成
小規模合成
アプタマーは、２’ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡホスホルアミダイト化学を使用してＡＢＩ  ３９４シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）による固相合成によって製造された（Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ，Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｖｉｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｓ，ｅｄ．Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，ｐ．８１−１１４，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．１９９３）。Ｄ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｄ−ｒＣ（Ａｃ）−、Ｄ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、Ｄ−ｒＵ−およびヘキサエチレングリコールホスホルアミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから購入された。アプタマーはゲル電気泳動によって精製された。
【０２０６】
未修飾（ＰＥＧ化のない）Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、２’ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡホスホルアミダイト化学を使用してＡＢＩ  ３９４シンセサイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）による固相合成によって製造された（Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ，Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｖｉｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｓ，ｅｄ．Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，ｐ．８１−１１４，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．１９９３）。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｌ−ｒＣ（Ａｃ）−、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、Ｌ−ｒＵ−およびヘキサエチレングリコールホスホルアミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから購入された。アプタマーはゲル電気泳動によって精製された。
【０２０７】
大規模合成および修飾
修飾ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−１９は、２’ＴＢＤＭＳ  ＲＮＡホスホルアミダイト化学を使用して  ｋｔａＰｉｌｏｔ１００シンセサイザー（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）による固相合成によって製造された（Ｍ．Ｊ．Ｄａｍｈａ，Ｋ．Ｋ．Ｏｇｉｌｖｉｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２０  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ａｎａｌｏｇｓ，ｅｄ．Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，ｐ．８１−１１４，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．１９９３）。Ｌ−ｒＡ（Ｎ−Ｂｚ）−、Ｌ−ｒＣ（Ａｃ）−、Ｌ−ｒＧ（Ｎ−ｉｂｕ）−、Ｌ−ｒＵ−およびヘキサエチレングリコールホスホルアミダイトは、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＭＡから購入された。合成は、Ｌ−ｒｉｂｏＣ修飾されたＣＰＧ孔径１０００（Ｌｉｎｋ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＵＫ）において開始された。カップリング（１サイクルについて１５分）では、アセトニトリル中０．３Ｍベンジルチオテトラゾール（ＣＭＳ−Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）、およびアセトニトリル中それぞれ０．１Ｍホスホルアミダイト溶液の３．５当量が使用された。Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒの５’末端におけるアミノ基は、アミノヘキシルホスホルアミダイト（ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ）をカップリングすることによって連結された。酸化−キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）サイクルが使用された。オリゴヌクレオチド合成のためのさらなる標準溶媒および試薬はＢｉｏｓｏｌｖｅ（Ｖａｌｋｅｎｓｗａａｒｄ，ＮＬ）から購入された。ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒはＤＭＴ−ＯＮ合成された；脱保護の後、それは、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて調製用ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｗｉｎｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ  １９９５  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２６７７）により精製された。５’ＤＭＴ−基は８０％酢酸を用いて除去された（ＲＴで３０分）。続いて、２ＭＮａＯＡｃ水溶液が添加され、そしてＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒが、５Ｋ再生セルロース膜（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いる接線流動濾過によって脱塩された。
【０２０８】
ＰＥＧ化
インビボの腎臓クリアランスを低下させるために、ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−１９は５’末端において４０ｋＤａポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分に共有結合された。そのような増加された分子質量をもつＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒを用いることは、血漿における保持を有意に延長させ、そのために、より長い有効性が達成できた。
【０２０９】
ＰＥＧ化（欧州特許出願第一  ３０６  ３８２号）では、精製された５’−アミノ修飾Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、Ｈ２Ｏ（２．５ｍｌ）、ＤＭＦ（５ｍｌ）およびバッファーＡ（５ｍｌ；クエン酸・Ｈ２Ｏ［７ｇ］、ホウ酸［３．５４ｇ］、リン酸［２．２６ｍｌ］および１ＭＮａＯＨ［３４３ｍｌ］を混合し、そして最終容量１  ｌまでＨ２Ｏを添加することによって調製された；ｐＨ＝８．４は１ＭＨＣｌにより調節された）の混合液中に溶解された。
【０２１０】
Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ溶液のｐＨは１ＭＮａＯＨにより８．４にもたらされた。次いで、４０ｋＤａのＰＥＧ−ＮＨＳエステル（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬ）が、７５〜８５％の最大収率が達成されるまで、０．６当量の４分量において３０分毎に３７℃で添加された。反応混合液のｐＨは、ＰＥＧ−ＮＨＳエステルの添加中１ＭＮａＯＨにより８〜８．５に維持された。
【０２１１】
反応混合液は、４ｍｌ尿素溶液（８Ｍ）、４ｍｌバッファーＡ、および４ｍｌバッファーＢ（Ｈ２Ｏ中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）と混合され、９５℃に１５分間加熱された。ＰＥＧ化Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは次に、アセトニトリル濃度勾配（バッファーＢ；バッファーＣ：アセトニトリル中０．１Ｍ酢酸トリエチルアンモニウム）を用いて、Ｓｏｕｒｃｅ１５ＲＰＣ媒質（Ａｍｅｒｓｈａｍ）によりＲＰ−ＨＰＬＣによって精製された。過剰のＰＥＧは５％バッファーＣにおいて、ＰＥＧ化Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは１０〜１５％バッファーＣにおいて溶出した。＞９５％の純度（ＨＰＬＣによって調査）をもつ生成物画分が合わされ、４０ｍｌの３Ｍ  ＮａＯＡｃと混合された。ＰＥＧ化Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、接線流動濾過（５Ｋ再生セルロース膜、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）によって脱塩された。
【０２１２】
例５：  抗グレリン−ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ１９−５’−ＰＥＧによる外因性グレリン投与後の成長ホルモン放出の抑制
外因性グレリンの投与は、ラットにおける成長ホルモン（ＧＨ）の放出を惹起することが知られている。グレリン結合Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒの前以ての投与は、ＧＨのグレリン誘導放出を抑制する。
【０２１３】
Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットが、７日間それらの新しい環境に適応された。実験の設定は、各々５匹の動物をもつ５群からなった：１つのポジティブ対照群および４つの異なる用量のＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ１９−５’−ＰＥＧ群。全動物は、実験期間中Ｋｅｔａｍｉｎｅ／Ｘｙｌａｚｉｎｅで麻酔され、尾静脈中に２回の静脈注射を受けた。第一回の注射は第二回注射の３０分前に与えられ、そしてＰＢＳ（ポジティブ対照群）または図２２に指示されるＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ１９−５’−ＰＥＧの用量からなった。第二回の投与は全動物に対して３ｎｍｏｌラット・グレリンからなり、そして実験について時間０とマークされた。第二回の投与前に、最初の血液サンプルが眼窩の血脈洞から抜き取られた。さらなるサンプルは、ラット・グレリン投与後の５、１５、３０および４５分に採取された。得られる血漿サンプルは、製造者の指示にしたがって市販の酵素免役アッセイ（Ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎ，Ｒａｔ，Ｂｉｏｔｒａｋ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ，ＲＰＮ２５６１，Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ）により成長ホルモン濃度について分析された。
【０２１４】
図２２において分るように、ＧＨの放出はラット・グレリンの注射によって強力に刺激されるが、ＳＯＴ−Ｅ１９−５’−ＰＥＧの前以ての投与によって抑制することができた。最大の抑制は７５ｎｍｏｌＳＯＴ−Ｅ１９−５’−ＰＥＧ／ｋｇ体重において達成される。１５０ｎｍｏｌＳＯＴ−Ｅ１９−５’−ＰＥＧ／ｋｇ体重までの投与用量におけるさらなる増加は、それ以上のＧＨ放出を抑制しない。この結果は、抗グレリンＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ１９−５’−ＰＥＧのインビボ活性を例証している。
【０２１５】
例６：  内部リンカーを含まないＳＯＴ−Ｅ−１９の誘導体
実施例３に記述されたように、抗グレリンＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−１９は、Ｌ−ヌクレオチド、および６個のヌクレオチドを置換するために元の分子ＳＯＴ−Ｅに組み入れられた内部リンカーからなる。６個のヌクレオチドからの４個はＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅにおいてループを形成し、残りの２ヌクレオチド（６ヌクレオチドからの）は互いにハイブリダイズできる（ＳＯＴ−Ｅ、参照図２３、第一列、ハイブリダイズされるヌクレオチドは下線を付される）。
【０２１６】
内部リンカーを含まないＳＯＴ−Ｅ−１９の可能な限り短い誘導体を実現するために、リンカーは３個のヌクレオチドの種々の建造ブロックによって置換された。全誘導体がＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（プロトコル、実施例４参照）として合成され、そして細胞培養実験（プロトコル、実施例２参照）において分析された。結合および抑制効力（ＩＣ５０）の喪失のないＳＯＴ−Ｅ−１９の内部リンカーの置換は、次の建造ブロックについて成功裏に示された：ＡＣＡ（ＳＯＴ−Ｅ−１９−Ｌ３）およびＣＡＡ（ＳＯＴ−Ｅ−１９−Ｌ４）。ＳＯＴ−Ｅ−１９の種々の誘導体が図２３に示される。
【０２１７】
例７：  グレリン結合Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒによるオクタノイル−グレリンおよびデスオクタノイル−グレリンの識別
グレリンに対するＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−１９の結合の特徴は、さらに、実施例２に記述された方法に基づいて、競合アッセイにおいて分析された。これらのアッセイにおいて、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒは、細胞の刺激前の刺激溶液においてグレリンペプチド（オクタノイル−およびデスオクタノイル−グレリン）の種々の組み合わせ物とともにインキュベートされた。
【０２１８】
ペプチド組み合わせ物のスキームおよび全長オクタノイル−グレリン（ヒト・グレリン
＝ｈｕグレリン）が図２４（左から右へ数えられるバー）において総括される：いずれのオクタノイル−グレリン（ヒト・グレリン＝ｈｕグレリン）も含まないか、または３００ｎＭの最終濃度においてデスオクタノイル−グレリンを含む場合は、細胞の刺激は検出できない（バー１および２）が、一方、１３ｎＭの濃度におけるオクタノイル−グレリン（ヒト・グレリン＝ｈｕグレリン）は既にカルシウム放出を媒介するために十分であり（バー３）；３００ｎＭデスオクタノイル−グレリン（バー４）のさらなる添加は細胞刺激を妨げず、これは、生物学的に不活性なデスオクタノイル−グレリンが受容体アンタゴニストではないことを示している。３ｎＭオクタノイル−グレリン（ヒト・グレリン＝ｈｕグレリン）によって媒介されるカルシウム放出はＳＯＴ−Ｅ−１９の１０倍過剰量によって抑制でき（バー５）、オクタノイル−グレリン（ヒト・グレリン＝ｈｕグレリン）を超える１００倍過剰量（３００ｎＭ）でのデスオクタノイル−グレリンの存在でさえ抑制に対して競合しない（バー６）。これに対して、３００ｎＭオクタノイル−グレリンおよび３０ｎＭＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒのアッセイ濃度はカルシウム放出の増加を示し（バー７）、アッセイ条件下で、オクタノイル−グレリン（ヒト・グレリン＝ｈｕグレリン）による刺激増進が達成できるという証拠を与える。この実験は、ＳＯＴ−Ｅ−１９がオクタノイル形態とデスオクタノイル形態におけるグレリン間を特異的に識別することを例証する。
【０２１９】
グレリンに対するＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＮＯＸ−Ｂ１１の結合特性（オクタノイル−グレリンには結合するが、デスオクタノイル−グレリンには結合しないか、または弱く結合する）は、ＳＯＴ−Ｅ−１９に類似している（同じ実験が既にＷＯ２００５／０４９８２８に記述されるように実施された）。
【０２２０】
両分子は、主としてｂｏｘＡに基づく高い構造的相関関係（実施例３、参照）を有するので、この結果は、モチーフＡが、グレリンのオクタノイル化形態に関して、特にオクタノイル基を含むＮ末端における５個のアミノ酸に関して、本発明による核酸分子の高い特異性のために必須であるという仮説を支持する。
【０２２１】
例８：  グレリン結合ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＮＯＸ−Ｂ１１を使用するオクタノイル−グレリンの定量
グレリン結合ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＮＯＸ−Ｂ１１は、オクタノイル化されたヒトおよびラットのグレリンの非放射能定量のために、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）のアッセイ形式に類似する形式で使用することができる。
【０２２２】
原理
このアッセイでは、標準、対照および未知の処理血漿が、グレリン結合Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ、例えば、そのＮ末端においてオクタノイル−グレリンを認識するＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＮＯＸ−Ｂ１１によりコートされた９６穴ミクロタイター・プレートにおいてインキュベートされる。インキュベーションおよび洗浄後、ウェルが、抗グレリン抗体（第一の抗体）またはグレリンのＣ末端においてグレリンに結合する核酸により処理される。この抗体または核酸は標識されても、されなくてもよいが、核酸は好ましくは標識される。（第一の）抗体が標識されない場合、（第一の）抗グレリン抗体を除去するインキュベーションおよび数回の洗浄段階後、第二の抗体（抗体は第一の抗体のＦｃフラグメントに対向され、そして標識されている）が添加される。第二の抗体の標識は、酵素セイヨウワサビ・ペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）であってもよい。第二の抗体とともにウェルをインキュベートし、未結合フラクションを除去した後、ウェルはＨＲＰ基質テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）とともにインキュベートされる。次いで、酸性停止液が添加され、そして基質の酵素的ターンオーバーの度合が４５０ｎｍにおける吸光度測定によって決定される。測定された吸光度はサンプル中に存在するオクタノイル−グレリンの濃度に直接比例している。１セットのグレリン標準が使用されて、グレリン濃度に対する吸光度の標準曲線がプロットされ、これから未知のグレリンが計算できる。
【０２２３】
プロトコル
最初に、ストレプトアビジンでコートされた９６穴プレート（Ｒｅａｃｔｉ−Ｂｉｎｄ
Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｃｏａｔｅｄ  Ｈｉｇｈ  Ｂｉｎｄ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  Ｂｌａｃｋ  ９６−ｗｅｌｌ  Ｐｌａｔｅｓ，Ｐｅｒｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｏｎｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）が、０．１％Ｔｗｅｅｎを含むＰＢＳ−Ｄｕｌｂｅｃｃｏ（Ｍｇ２＋およびＣａ２＋を含む、Ｂｉｏｃｈｒｏｍ  ＡＧ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により３回洗浄された。各ウェルは、室温で１時間、１００μｌの５０μＭビオチン化ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＮＯＸ−Ｂ１１（ＰＢＳに溶解；配列番号：７２）とともにインキュベートされた。ビオチン化ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＮＯＸ−Ｂ１１の固定化の後、未結合のＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒが１回の洗浄段階（１００μｌ  ＰＢＳ）によって除去された。これは図２６Ａに図示される。
【０２２４】
洗浄バッファーを除去後、一定濃度のオクタノイル−グレリンを含む保存液が添加され、そして室温で１時間インキュベートされた。上澄液が除去され、ウェルが１回（１００μｌ  ＰＢＳ）洗浄された。これは図２６Ｂに図示される。
【０２２５】
抗グレリン抗体（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ；１０ａｂ）がブロッキング溶液（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ）において１時間インキュベートされ、未結合の抗体が３回の洗浄段階（各１００μｌ  ＰＢＳ）によって除去された。これは図２６Ｃに図示される。
【０２２６】
結合された抗グレリン抗体を検出するために、抗グレリン抗体（１０ａｂ）のＦｃフラグメントを特異的に認識し、そしてセイヨウワサビ・ペルオキシダーゼにより修飾されている第二の抗体（Ｐｈｏｅｎｉｘ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＣＡ，ＵＳＡ；２０ａｂ−ＨＲＰ）が使用された。第二の抗体（２０ａｂ−ＨＲＰ）の未結合フラクションは５回の洗浄段階（１００μｌ  ＰＢＳ）によって除去された。これは図２６Ｄに図示される。
【０２２７】
定量では、ＴＭＢ基質（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｈａｌｆｏｎｔ，ＵＫ）の１００μｌが添加され、プレートが密封され、そして３０分間暗室においてインキュベートされた。定義５０μｌが添加された。基質の酵素的ターンオーバーの度合が４５０ｎｍにおける吸光度測定によって決定され、そして吸光度単位の差異が記録された。
【０２２８】
図２５に示されるように、１セットのグレリン標準品が使用されて、グレリン濃度に対する吸光度の標準曲線をプロットした。
【０２２９】
結果
原則として、実験データは、ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＮＯＸ−Ｂ１１が濃度依存方式でオクタノイル−グレリンを固定化するために使用でき、したがって、ＥＩＡ型検出アッセイにおいて試薬としての潜在力を有することを例証する。
【０２３０】
本明細書、請求項および／または図面において開示される本発明の特徴は、別々に、およびいずれかのその組み合わせにおいて、その種々の形態において本発明を実現するための材料となり得る。
【図面の簡単な説明】
【０２３１】
【図１】図１は、ヒト・グレリンに結合するＲＮＡリガンドの配列の整列を示す；
【図２】図２は、先端を切り取られたアプタマー対既知の配列ＳＯＴ−Ｃ（Ｂ１１ｔｒｃ）によるグレリンへの結合の競合アッセイを示す；
【図３】図３は、ＲＮＡリガンドの選ばれた配列の整列を示し、これらは特許出願ＷＯ２００４／０１３２７４Ａ２において公表された；
【図４】図４は、グレリン結合ＲＮＡｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒクローンＳＯＴ−Ｃの計算された二次構造を示し、二次構造はプログラム「ＲＮＡフォールド（ｆｏｌｄ）」（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ  １２５：１６７−１８８）を用いて計算された；
【図５】図５は、グレリン結合ＲＮＡｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒクローンＳＯＴ−Ｄ−０００の計算された二次構造を示し、二次構造はプログラム「ＲＮＡフォールド」（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ  １２５：１６７−１８８）を用いて計算された；
【図６】図６は、グレリン結合ＲＮＡｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒクローンＳＯＴ−Ｄの計算された二次構造を示し、二次構造はプログラム「ＲＮＡフォールド」（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ  １２５：１６７−１８８）を用いて計算された；
【図７】図７は，グレリン結合ＲＮＡｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒクローンＦ−１２の計算された二次構造を示し、二次構造はプログラム「ＲＮＡフォールド」（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ  １２５：１６７−１８８）を用いて計算された；
【図８】図８は、ＳＯＴ−Ｄ−０００誘導体の整列を示し、これらは先端切り取りおよび合理的設計実験の結果である；
【図９】図９は、室温におけるＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｃ、ＳＯＴ−Ｄ−０００およびそれらの変異体によるグレリン誘導Ｃａ＋＋−放出の抑制についてのワンポイント測定を示し；細胞は、種々の量のＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｃ、ＳＯＴ−Ｄ−０００またはＤ−０００の変異体とともに室温でプレインキュベートされた５ｎＭグレリンにより刺激され、結果はＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒを無しで得られたシグナルに対して標準化された蛍光シグナルのパーセンテージを示す；
【図１０】図１０は、グレリン結合ＲＮＡｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒクローンＳＯＴ−Ｄ−１０９の推定二次構造を示す；
【図１１】図１１は、室温におけるＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＤ−１０９および５’−ＰＥＧ化Ｄ−１０９によるグレリン誘導Ｃａ＋＋−放出の抑制についての用量−応答曲線を示し；細胞は、種々の量のＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＤ−１０９および５’−ＰＥＧ化Ｄ−１０９とともに室温でプレインキュベートされた５ｎＭグレリンにより刺激され；結果はＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒを無しで得られたシグナルに対して標準化された蛍光シグナルのパーセンテージを示し；ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＤ−１０９およびその修飾体は、同じＩＣ５０をもってグレリン誘導Ｃａ＋＋−放出を抑制することが見出された；
【図１２】図１２は，グレリン結合ＲＮＡＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒクローンＳＯＴ−Ｅの計算された二次構造を示し、二次構造はプログラム「ＲＮＡフォールド」（Ｈｏｆａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｍｏｎａｔｓｈ．Ｃｈｅｍ  １２５：１６７−１８８）を用いて計算された；
【図１３】図１３は、細胞培養実験によって試験されたＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅの先端を切り取られた変異体の結合分析を示す；
【図１４】図１４は、グレリン結合ＲＮＡＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−１９の推定二次構造を示す；
【図１５】図１５は、グレリン結合ＲＮＡｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒクローンＳＯＴ−Ｅ−２１の推定二次構造を示す；
【図１６】図１６は、グレリン結合ＲＮＡｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒクローンＳＯＴ−Ｅ−３３の推定二次構造を示す；
【図１７】図１７は、グレリン結合ＲＮＡｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒクローンＳＯＴ−Ｅ−２５の推定二次構造を示す；
【図１８】図１８は、Ｄ−グレリン結合ＲＮＡクローンＳＯＴ−ＣおよびＳＯＴ−ＥのＫＤ値を指示するＢｉｏｃｏｒｅ２０００センサーグラム（ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍ）を示す；
【図１９】図１９は、３７℃におけるＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ、ＳＯＴ−Ｅ−１９−５’−アミノ、ＳＯＴ−Ｅ−１９−５’−ＰＥＧまたはＳＯＴ−Ｄ−１０９によるグレリン誘導Ｃａ＋＋−放出の抑制についての用量−応答曲線を示し；細胞は、種々の量のＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ、ＳＯＴ−Ｅ−１９−５’−アミノ、ＳＯＴ−Ｅ−１９−５’−ＰＥＧまたはＳＯＴ−Ｄ−１０９とともに３７℃でプレインキュベートされた２ｎＭヒト・グレリンにより刺激され；結果はＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒを無しで得られたシグナルに対して標準化された蛍光シグナルのパーセンテージを示し；ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−１９およびその修飾体は、約４ｎＭのＩＣ５０をもってグレリン誘導Ｃａ＋＋−放出を抑制することが見出された；
【図２０Ａ】図２０Ａは、グレリン結合Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒについて特徴的である配列ｂｏｘの定義を示す；
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、図２０Ａの１変異体；
【図２０Ｃ】図２０Ｃは、図２０Ａの１変異体；
【図２０Ｄ】図２０Ｄは、図２０Ａの１変異体；
【図２１】図２１は、ＳＯＴ−Ｄ−１０９、ＳＯＴ−Ｅ、ＳＯＴ−Ｅ−１９、ＳＯＴ−Ｅ−２１、ＳＯＴ−Ｅ−３３およびＳＯＴ−Ｅ−２５の配列を示す；
【図２２】図２２は、抗グレリンＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−１９−５’−ＰＥＧによる外因性グレリンの投与後の成長ホルモン放出の抑制を示す；
【図２３】図２３は、内部リンカーの代わりにさらなるヌクレオチドを含むＳＯＴ−Ｅ−１９の異なる誘導体の概観、およびｎＭで表される観察されたＩＣ５０値を示す；
【図２４】図２４は、線の下に総括される成分の組み合わせおよび濃度をもつ、オクタノイルグレリン、デス−オクタノイルグレリンおよびＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＳＯＴ−Ｅ−１９による細胞競合アッセイの結果を示す；
【図２５】図２５は、ＥＩＡ型検出アッセイによって記録されたヒト・グレリン（オクタノイル化）濃度に対する吸光度の標準曲線を示し、ここで、グレリン結合ＳｐｉｅｇｅｌｍｅｒＮＯＸ−Ｂ１１はヒト・グレリン（オクタノイル化）を固定化するために使用されて、ヒト・グレリン（オクタノイル化）の定量を可能にした；
【図２６Ａ−Ｄ】図２６Ａ〜Ｄは、本発明によるグレリン結合核酸を用いるオクタノイルグレリンの定量方法の種々の段階を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2008534024.tif 000055
2008534024.tif 000056
2008534024.tif 000057
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