(57)【要約】  多様なＨＩＶ分岐群に対する抗体を誘導する広範なＨＩＶ治療剤およびワクチンを誘導し、ＨＩＶｇｐ１２０によって誘導された短いペプチド配列免疫原を同定する能力に関する組成物、および、同定されたＣＣＲ５結合部位を構成するペプチドから作製される様々な治療用組成物を開示する。さらに、薬物候補となる可能性があるペプチド配列を選択する方法も開示し、これは、アルツハイマー病、乾癬、多発性硬化症およびその他のヒトの炎症性のカスケードに関連する病気、同様に、関連するレトロウイルス、例えばＨＴＬＶ−Ｉ、熱帯性痙性不全対麻痺の原因のような領域において有効な治療を提供すると予想される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト免疫不全ウィルスに対して有効な治療用組成物およびワクチンの免疫原であって、
構造：Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｃ
［式中、
Ａは、あらゆるアジュバントである、
Ｌは、あらゆる結合部分であり、
Ｐは、構造Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ５を有するペプチドであり、ここで：
Ｒ１は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ａ、または、Ｅからなる群より選択され、
Ｒ２は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、または、Ｅからなる群より選択され、
Ｒ３は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｋ、Ｉ、Ｑ、Ｈ、または、Ｅからなる群より選択され、
Ｒ４は、Ｙであり、
Ｒ５は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｍ、ＷもしくはＧ、またはそれらのアミド；および、その他のあらゆるアミノ酸からなる群より選択され、
Ｃは、あらゆる保護基である］
を含む、上記治療用組成物およびワクチンの免疫原。
【請求項２】
Ｌが、３個のアミノ酸部分からなり、Ｐが、５個のアミノ酸部分からなる、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
Ｌが、トリペプチド部分Ａ−Ｓ−Ｔである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
Ｒ２が、Ｔ、Ｓ、および、Ｎからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
Ｐが、ＥＹＩＹＴ、ＩＮＮＹＴ、ＩＳＮＹＳ、ＩＳＮＹＴ、ＩＳＹＲＬ、ＮＮＲＹＲ、ＮＮＳＹＲ、ＮＳＮＹＳ、ＮＳＳＹＲ、ＮＴＩＹＴ、ＮＴＳＹＧ、ＮＴＳＹＭ、ＮＴＳＹＲ、ＮＴＳＹＳ、ＳＳＥＹＲ、ＳＳＲＹＲ、ＳＳＴＹＲ、ＳＴＮＹＴ、ＳＴＳＹＲ、ＴＩＳＹＲ、ＴＳＮＹＳ、ＴＴＮＦＴ、ＴＴＮＹＴ、全てＤ型のＴＴＮＹＴ、ＴＴＳＹＲ、ＴＴＳＹＴ、および、ＹＴＳＹＲからなる群より選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
Ａが、ヒトにおいて許容できるあらゆるアジュバントである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
Ｃが、Ｃ末端のアミド基である、請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物が、２〜５種の成分のカクテルを含み、ここで、これらの成分は、Ｐ領域におけるアミノ酸部分の配列が異なる、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
Ｌ−Ｐ領域が、約７〜約１６個のアミノ酸残基の長さを有するペプチドを含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アミノ酸が、Ｄステレオ異性体である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
構造：Ｌ−Ｐ−Ｃ
［式中、
Ｌは、あらゆるトリ−ペプチド配列を含み、
Ｐは、構造Ｒ１Ｒ２Ｒ３Ｒ４Ｒ５を有するペプチドを含み、ここで：
Ｒ１は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｒ、Ｋ、Ａ、または、Ｅからなる群より選択され、
Ｒ２は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｇ、Ｉ、または、Ｅからなる群より選択され、
Ｒ３は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｄ、Ｇ、Ｒ、Ｋ、Ｉ、Ｑ、Ｈ、または、Ｅからなる群より選択され、
Ｒ４は、Ｙであり、
Ｒ５は、Ｎ、Ｓ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、Ａ、Ｍ、ＷもしくはＧ、またはそれらのアミド；および、その他のあらゆるアミノ酸からなる群より選択され、
Ｃは、あらゆる保護基である］
を有する治療用組成物。
【請求項１２】
Ｌが、３個のアミノ酸部分からなり、Ｐが、５個のアミノ酸部分からなる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
Ｌが、トリペプチド部分Ａ−Ｓ−Ｔである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１４】
Ｒ２が、Ｔ、Ｓ、および、Ｎからなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１５】
Ｐが、ＥＹＩＹＴ、ＩＮＮＹＴ、ＩＳＮＹＳ、ＩＳＮＹＴ、ＩＳＹＲＬ、ＮＮＲＹＲ、ＮＮＳＹＲ、ＮＳＮＹＳ、ＮＳＳＹＲ、ＮＴＩＹＴ、ＮＴＳＹＧ、ＮＴＳＹＭ、ＮＴＳＹＲ、ＮＴＳＹＳ、ＳＳＥＹＲ、ＳＳＲＹＲ、ＳＳＴＹＲ、ＳＴＮＹＴ、ＳＴＳＹＲ、ＴＩＳＹＲ、ＴＳＮＹＳ、ＴＴＮＦＴ、ＴＴＮＹＴ、全てＤ型のＴＴＮＹＴ、ＴＴＳＹＲ、ＴＴＳＹＴ、および、ＹＴＳＹＲからなる群より選択される、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１６】
Ａが、ヒトにおいて許容できるあらゆるアジュバントである、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１７】
Ｃが、Ｃ末端のアミド基である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１８】
前記組成物が、２〜５種の成分のカクテルを含み、ここで、これらの成分は、Ｐ領域におけるアミノ酸部分の配列が異なる、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１９】
Ｌ−Ｐ領域が、約７〜約１６個のアミノ酸残基の長さを有するペプチドを含む、請求項１１に記載の組成物。
【請求項２０】
前記アミノ酸が、Ｄステレオ異性体である、請求項１１に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
本願は、２００５年６月２３日付けで出願された仮出願番号６０／６９３，０８７；２００５年６月２３日付けで出願された仮出願番号６０／６９３，０８８、および、２００５年６月２３日付けで出願された仮出願番号６０／６９３，０８９に基づく優先権を主張する。本願はまた、２００６年６月２３日付けで出願された出願番号（発明の名称「Stabilizing Alkylglycoside Compositions and Methods Thereof」）にも関する（これらの内容は、この参照により開示に含まれる）。
【０００２】
発明の背景
一般的に、ＨＩＶ−１感染やＡＩＤＳを防御することができるワクチンは、それらの地理的な由来、サブタイプまたは遺伝子型の特異性に関わりなく、それらウイルスの一次的な単離物に対する有力な中和活性を有する高レベルの抗体を誘導する免疫原を必要とすると考えられており、これが、現行のワクチン候補では実現できていない目的の一つである。それゆえに、合理的なワクチン設計および開発には広範な中和をもたらすエピトープの同定が重要である。具体的に重要なのは、優勢な北米の分岐群Ｂサブタイプに対して発展途上国に存在し、世界的に関連を有する発生株を含む分岐群Ｃサブタイプに対するワクチン候補の抗体の開発である。
【０００３】
ＨＩＶに感染した個体において、中和抗体の優勢な標的はＨＩＶエンベロープである。ある種の中和エピトープのクラスターは、一次および／または単球親和性の単離物のｇｐ１２０ｅｎｖタンパク質に少なくとも部分的に晒されるようである。２０年にわたり大規模な研究が行われているにもかかわらず、広範なワクチンの中和を惹起することができる免疫原は見出されていない。その理由として、ＨＩＶ感染に対するワクチンは定義が難しいことがあった。
【０００４】
ある発明は、多様なＨＩＶ株に有力な中和活性を有する抗体を導くことができるペプチド、および、ＨＩＶ−１防御のための免疫化戦略の重要な成分であるペプチドを同定する補助受容体ＣＣＲ５に結合するｇｐ１２０の短い配列の同定に関与する。これらの結合配列に生産され、結合部位のペプチドの免疫原を含む抗体は、系統に関わりなくＨＩＶウイルス感染からの防御が付与されると期待され、さらに治療にも役立つと予想されている。すなわち、それらの受動的な投与は、ウイルスレベルを減少させ、すでにＨＩＶに感染した人間に臨床的な利点を提供すると予想される。
【０００５】
中和抗体は、ＨＩＶ−１感染に応答する。初感染後のウイルス血症から数ヶ月で、まずは抗ヒト免疫不全ウィルスタイプの中和抗体が出現する。初期に生じる中和抗体は、高度な型特異性を有する。感染中に、中和抗体反応はその後も広がる可能性があるが（１６）、通常わずかであり、長期間感染した個体を含む患者の大半において散発的に発生する。
【０００６】
中和抗体は、ＨＩＶ−１エンベロープの糖タンパク質を認識し、これはｇｐ１２０エクステリアとｇｐ４１膜貫通糖タンパク質とからなる。ｇｐ１２０糖タンパク質は、標的であるＣＤ４、ならびにケモカイン受容体ＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４に結合する。ｇｐ１２０がＣＤ４との複合体を形成した後にのみ発現されるｇｐ１２０のエピトープに対して抗体が発生する例はほとんどない。望ましいワクチン標的である実際の補助受容体結合部位は、ＣＤ４とｇｐ１２０との会合の際にのみ形成されると考えられる。これらのＣＤ４誘導性（ＣＤ４ｉ）抗体は、ｇｐ１２０−ｓＣＤ４複合体のＣＣＲ５およびＣＸＣＲ４結合をブロックする。ＨＩＶ−１に感染した人間から単離されたＣＤ４ｉ抗体の数は少ない。
【０００７】
最も初期のＨＩＶ−１ワクチンを用いた研究は、中和抗体を誘発するワクチンを開発することに向けられていた。これらの中和抗体は、それらの作用が限定的であり、動物モデルにおいて接種されたウイルスのほぼ全ての系統に対して特異的である。それゆえにこれらの抗体は広範な特異性を有しておらず、優れたワクチン候補を形成しないだろう。
【０００８】
最も成功したワクチンは、その受容体（ＨＩＶの場合、補助受容体ＣＸＣＲ４およびＣＣ５である）に結合するウイルスをブロックする（１，２）。過去２０年間にわたって懸命な調査の対象である補助受容体結合部位の同定は現在まで達成されておらず、従って、これらを同定することによって、望ましいワクチン用途に適した多様な系統の広範な中和を実現することができる免疫原が生産されることが期待される。
【０００９】
本願の目的の一つは、生物学的に活性な補助受容体結合部位に対する抗体である。インビトロでの研究において、この抗体はＣＣＲ５受容体に結合するｇｐ１２０−ｓＣＤ４複合体の有力な阻害を示し、さらに、適切なペプチドコンフォメーションに対して生じた抗体は中和抗体を広範に誘導することから、それによってＨＩＶ−１感染に対する防御免疫、すなわちワクチンを提供することが期待される。
【００１０】
１０年以上にわたり、ほとんどのＨＩＶ−１単離物の広範かつ有力な中和を仲介するヒトモノクローナル抗体はほんのわずかしか単離されていない。これらのモノクローナル抗体のうち２種は、ｇｐ１２０（モノクローナル抗体ｂ１２および２Ｇ１２）の表面に結合し（３，４）、１種は、ｇｐ４１の膜貫通ドメインの直近位に存在するエピトープに結合する。モノクローナル抗体ｂ１２は、ｇｐ１２０のＣ３−Ｖ４領域と炭水化物とを含む複雑な不連続エピトープを認識する。モノクローナル抗体２Ｆ５は、ｇｐ４１の細胞外ドメイン上にある直鎖状のエピトープに結合するが、このエピトープがシンプルかは疑わしく、恐らく６個の残基からなる直鎖状配列よりも複雑であり、モノクローナル抗体ｂ１２、２Ｇ１２および２Ｆ５は、インビトロで、多種多様の一次単離物に対して中和活性を示した。これまで、広範な中和を仲介するが一次単離物に対して有意な中和抗体を発生させないことがわかっているエピトープも含めてあらゆる組換えエンベロープベースのワクチン候補が臨床試験で試験された。ペプチドベースのワクチン候補も、十分な免疫反応を引き起こすことができない。
【００１１】
ペプチドＤＡＰＴＡに対する相同配列（デルタ１−ペプチドＴ−アミド（５））は、多数のＨＩＶ−１単離物のＶ２内に存在する（我々は４，０７８種の配列を試験した）。ペプチドＤＡＰＴＡに対するポリクローナルおよび精製ＩｇＧ抗体を用いた我々の結果によれば、一次および実験用に適合させた系統に対する有意な中和活性が示され、このことから、架橋を形成するシート近傍にあるＶ２ドメインのカルボキシル末端から８個の配列が、新しい中和エピトープの一つであるという見込みが得られた。
【００１２】
ポリクローナルペプチドＤＡＰＴＡ抗血清の生成
親和性によって精製した抗体を生成するために、以下を連続して皮下注射することによって６匹のウサギを免疫化した：１）フロイント完全アジュバントに懸濁した７５μｇのペプチドＤＡＰＴＡ（１日目）、２）フロイント不完全アジュバントに懸濁した７５μｇのＤＡＰＴＡ（２０日目）、および、３）アジュバントなしの１５０μｇのＤＡＰＴＡ（３５日目）。セロコンバージョンに関して試験するために、１日目と週１回にウサギの耳の静脈から採血し、その後、精製したペプチドＤＡＰＴＡ、および、ホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させたヤギ抗ウサギＩｇＧで被覆したマイクロタイタープレートを用いた酸素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）によって血清を試験した。その後、血清陽性のウサギから心臓穿刺によって採血した。抗血清中に存在するペプチドＤＡＰＴＡ抗体を、精製したペプチドＤＡＰＴＡとカップリングしたアフィニティーセファロースカラムを用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製した。
【００１３】
発明の簡単な要約
以下はいくつかの好ましい実施態様の要約であって、本発明の範囲を限定する意図は全くない。多様なＨＩＶ分岐群、すなわち有効なワクチンの主要な成分に対する中和抗体を広範に誘導する組成物を開示する。
【００１４】
いくつかの実施態様は、ＨＩＶｇｐ１２０によって誘導された短いペプチド配列の免疫原を同定する能力、および、同定されたＣＣＲ５結合部位を構成するペプチドから製造された様々な治療用組成物に関する。このようなペプチドは、多様なＨＩＶ株由来のペプチド配列、関連ウイルス株由来の配列、その他のウイルスエンベロープ由来の配列、および、選択された神経ペプチド由来の配列を解析することによって選択される。
【００１５】
さらに、その他の実施態様は、ＨＩＶ治療剤として作用する組成物、または、ヒトに投与すると、広範に活性な抗ＨＩＶワクチン抗体を誘導する免疫原として作用する組成物を提供する。
【００１６】
さらにその他の実施態様は、治療上有用な調合物において、安定化させ、凝集を減少させ、ペプチドの免疫原性を強化する能力に関する。より具体的には、本発明は、少なくとも１種の自己会合または自己凝集するペプチドまたはタンパク質薬物、および、少なくとも１種の界面活性剤を含む治療用組成物を提供し、ここで、界面活性剤はさらに、少なくとも１種のアルキルグリコシド、および／または、糖類とアルキルとのエステルで構成される。
【００１７】
さらにその他の実施態様は、アルツハイマー病、乾癬、多発性硬化症、および、その他のヒトの炎症のカスケードに関連する疾患、同様に、関連するレトロウイルス、例えばＨＴＬＶ−１、熱帯性痙性不全対麻痺の原因のような領域において有効な治療を提供すると予想される薬物候補になる可能性があるペプチド配列を選択する新規の方法に関する。
【００１８】
図面の簡単な説明
図１において、ＤＡＰＴＡは、ＣＣＲ５受容体とのｇｐ１２０−ＣＤ４複合体の共免疫沈降反応を防ぐ。
【００１９】
図２は、ｇｐ１２０のＣＣＲ５の結合分析である。
図３Ａ〜Ｂにおいて、蛍光標識したｇｐ１２０（ＦＩＴＣ−ｇｐ１２０）は、ｓＣＤ４が存在するときのみにＣｆ２Ｔｈ／ｓｙｎＣＣＲ５細胞に効率的に結合した。
【００２０】
図４Ａ〜Ｃにおいて、ＤＡＰＴＡは、ｇｐ１２０エンベロープタンパク質のＣＣＲ５への結合を阻害する。
図５Ａ〜Ｂは、抗ペプチドＤＡＰＴＡのｇｐ１２０一量体への結合を示す。
【００２１】
図６は、抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ血清のｇｐ１２０に対する結合親和性を示す。
図７は、抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ ＩｇＧのｇｐ１２０タンパク質への溶解性ＣＤ４依存性の結合を示す。
【００２２】
図８は、抗ペプチドＴＩｇＧおよびポリクローナル血清の、膜に固定されたウイルスおよび組換えｇｐ１２０タンパク質への親和性結合を示す。
発明の詳細な説明
以前の研究の生成物および方法に対して、本明細書において開示された生成物および方法は、有用な抗ＨＩＶ活性、およびその他の治療特性を示す予想外の特性を示す。以下の実施例において、様々な本発明の実施態様のいくつか（ただし全てではない）を説明する。
【００２３】
本明細書において、補助受容体結合をブロックする可変性だが相同な配列を有するｇｐ１２０のＶ２領域における生物活性を有するペンタペプチド群を説明する。以前の研究では、Ｖ２領域は、ｇｐ１２０の受容体への結合および感染力において重要な役割を有さないと考えられていた。Ｖ２が欠失した突然変異体は、感染力を有すると考えられていた（６，７）。Ｖ２ループに対して、Ｖ３ループは、ｇｐ１２０の受容体結合エピトープを含むことが一般的に提唱されてきた（７〜９）。なおこのような相同配列はさらに、それらが発生し得るＶ２以外のｇｐ１６０の領域から得られる場合がある。
【００２４】
本発明は、ＣＣＲ５において受容体活性を有するペプチドを１種またはそれより多く含む調合物を説明する。ペプチドＴに対する相同配列（ＳＦ−２単離物から誘導された）は、多数のＨＩＶ−１単離物のＶ２内の同様の位置に存在する。我々は、Ｅｎｔｒｅｚデータベースにおいて入手可能な４，０７８種のエンベロープ（ｇｐ１２０）Ｖ２配列を試験した。これらのうち、６０％がｘＴｘＹｘまたはｘＮｘＹｘの形態を取り、２３％がｘＳｘＹｘの形態を取っているが、残りの１７％は、普及率２〜７％の１０種程度のその他のマイナーなモチーフに割り当てられる。これらの多様なエンベロープから誘導されたペンタペプチド配列は、受容体活性を有するモチーフ、例えば利用可能な配列の８０％より多くを含む２種の主要なモチーフを定義するために重要であり、より十分に説明するためにいくつかの例を示す。このような構造の収集から、治療剤またはワクチン免疫原として外見的に多様なＨＩＶ株に対して広範な特異性を有するペプチドを、単独で、または、混合物として設計することができる。
【００２５】
我々が研究してきたＶ２配列は、全部ではないが多数のＨＩＶ単離物においてほぼ同じ位置（幹部近傍のＶ２）に発生しており、ペプチドＴＤＡＰＴＡの末端の５個のアミノ酸にいくらか相同である。このようなペプチドは、ＶＩＰ／ＰＡＣＡＰ／ＧＨＲＨペプチドに属するペプチドと相同性を有する。これらのウイルスによって誘導された神経ペプチドの多く（例えば表１に記載されたもの）が合成され、試験されており、さらに、ペプチドＴＤＡＰＴＡオクタペプチドと同等か、またはそれよりも有効な生物活性を有することが示されている。薬理学的に、このようなペンタペプチドは、ケモカインの走化性の部分アンタゴニストである（１０）。このようなＤＡＰＴＡのアンタゴニストの作用は、そのｇｐ１２０−ｓＣＤ４のＣＣＲ５への結合をブロックする能力（１１）、または、インビトロにおいてｇｐ１２０によって誘導されるニューロンの死滅（１２）をブロックする能力によるものである。
【００２６】
ｇｐ１２０からのＶ２関連ペンタペプチドの免疫原ライブラリーにおける治療剤およびワクチンの同定
以下の表１に、１９種の有用なペンタペプチドのライブラリーを示すが、これから治療用ペプチドおよびワクチン成分が選択されると予想される。
【００２７】
【表１】
2008546803.tif 000002
【００２８】
以下の表で、Ｖ２ペンタペプチド、および、それらに対応するＨＩＶ単離物を列挙する。
【００２９】
【表２】
2008546803.tif 000003
【００３０】
注釈：＊は、ペプチドＴの配列であり、末端ペンタペプチドが強調表示されており、＃は、４位にＤ−チロシンを有する不活性な類似体である（１２）。Ｖ２ペプチドに関するＨＩＶ単離物を列挙し、続いて実際のペプチド配列を列挙する。このようなペプチドは、チロシン（Ｙ）が同じ位置に存在し、セリン（Ｓ）とスレオニン（Ｔ）とはメチル基が一つ異なる構造的に関連するアミノ酸であるため、類似体として認識される。改変型がわずかながら知られており、これらの構造的な詳細がこれまでに考察されている（１８，５７）。興味深いことに、ペプチドＴは、実験用に適合させたウイルスＳＦ−２（以前はＡＲＶ，（１３））から誘導されるが、ＣＣＲ５に対して活性である。これは、これらのペプチドのうちいくつかは、関連するＣＸＣＲ４侵入の受容体、および、数種のＶＩＰ受容体において固有の活性を有することを示す（１４，１５）。わずかな改変によって、ＨＩＶ進行の後期におけるいわゆる「二重細胞指向性」ウイルス単離物の出現（これもＣＸＣＲ４侵入の受容体を利用する）に伴う受容体の利用度、インビボで生じる作用が広がると予想される。
【００３１】
脳のウイルス単離物は、低いレベルのＣＤ４およびＣＣＲ５を発現する脳の小グリア細胞およびマクロファージにおける複製に適応した別個のエンベロープタンパク質の表現型を示すようである（１６）。それゆえに、脳のウイルス単離物から誘導されたエンベロープタンパク質のペンタペプチドは、低いＣＤ５または補助受容体の発現に適応したＨＩＶ株（例えば脳に感染するＨＩＶ株）をブロックすることに関して特定の治療上の利点を提供する可能性がある。低いＣＤ４および／またはＣＣＲ５が細胞に感染する能力は、Ｔ細胞とマクロファージとの両方に関してより広範な親和性与えると予想され、それゆえに、脳に適応した株からのペンタペプチドは、これらに限定されないが、脳のマクロファージまたは小グリア細胞への、多様な組織および細胞における低い受容体の数に適応したＨＩＶ株感染を抑制する、または、ワクチンまたは治療抗体を生成させるための免疫原を作るのにも使用可能である。低い受容体数に適応したウイルス単離物の抑制は、ＨＩＶ治療剤開発における次世代の領域である可能性が高く、高い効力を有するリガンドが最も有効であると予想される。天然のウイルスから生じた配列を精査することによって、生物学的関連性と実際の有用性が最適化されると予想される。候補の治療用ペプチドの受容体の効力は容易に試験することが可能であり、安定性および生物学的利用率に関してさらなる改変を施すことによって、最も高度な活性を有するペンタペプチドが治験薬として開発され得る。
【００３２】
脳で同定されたＶ２受容体活性を有するペプチド治療剤および免疫原、ならびに、選択された神経ペプチドで同定されたワクチンのペンタペプチド
（１６）で説明されている５種の脳単離物から典型的な配列を同定し、それを以下の表に示す。
【００３３】
【表３】
2008546803.tif 000004
【００３４】
ｇｐ１２０のＶ２領域内のペンタペプチドに加えて、我々は、このペプチドのモチーフが、ｇｐ１２０のその他の部分、ｇｐ４１（膜結合した）、および、ＶＴＰ／ＰＡＣＡＰ／ＧＨＲＨに関連する神経ペプチドに存在することを特筆する（１７）。以下の表に、これらの例を列挙する。
【００３５】
【表４】
2008546803.tif 000005
【００３６】
従って、Ｖ２に関連するペプチドは生物学的に活性であることが示され、最も簡単な説明は、これらは、特異的なケモカイン受容体において薬理学的に活性であることである。
ＨＩＶエンベロープタンパク質ＧＰ４１において同定されたＶ２に関連するペンタペプチド
以下の表で、治療剤またはワクチン免疫原として使用可能なＧＰ４１のＨＩＶ配列を説明する。
【００３７】
【表５】
2008546803.tif 000006
【００３８】
我々は、Ｅｎｔｒｅｚデータベースからの７０２種のｇｐ４１配列を試験した。記録された全てのペンタペプチド配列は、これらのペプチド類似体が有する共通の結合機能に相当する同じ位置、すなわちｇｐ４１のおよそ１２６位に位置していた。本発明は、高濃度か低濃度かに関わらず少なくとも１種のペプチドまたはタンパク質を含む調合物を説明する。
【００３９】
ＣＣＲ５に結合して、ＨＩＶｇｐ１２０のＣＣＲ５への結合をブロックする多様なＶ２に関連するペンタペプチドの同定
上述した（１１）で詳述された方法、すなわち、競合的な小さいｇｐ１２０ペプチドを添加した場合、または添加しない場合のｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体のＣｈｆＴｈ−ＣＣＲ５発現細胞への結合を用いて、我々は、Ｖ２によって誘導されたＤＡＰＴＡに相同なペプチドも、ｇｐ１２０のＣＣＲ５への結合をブロックする有力な能力を有する一般的なケースを示す。構造と機能活性を示すが、これは特異性の指標であり、ペプチドＴＴＮＹＴにおいて、Ｌ型アミノ酸からＤ型アミノ酸への置換は効力を大きく減少させ、ペプチドＩＮＮＹＴにおいて、ＮからＤへの置換によってペプチドＩＤＮＹＴが形成されると、活性がより低くなる。驚くべきことに、ペプチドＴＴＮＹＴのＤ型アミノ酸の形態はいずれも高い活性を有しており、これは、これらのペンタペプチドのＤ型アミノ酸の形態はいずれも有用であることを示しており、それらの予想されるペプチダーゼ分解に対する安定性のために好ましい場合がある。
【００４０】
【表６】
2008546803.tif 000007
【００４１】
ペプチドＴＤＡＰＴＡは、ｇｐ１２０−ｓＣＤ４複合体のＣＣＲ５受容体への結合を防ぐ
図１に示したように、ＤＡＰＴＡは、ｇｐ１２０−ＣＤ４複合体とＣＣＲ５受容体との共免疫沈降反応を防ぐ。パネルＡで説明した研究において、ｈＣＣＲ５受容体を発現するＣｆ２Ｔｈ／ｓｙｎＲ５細胞が用いられた。可溶化したＣＣＲ５受容体を抗ｔａｇ抗体ＩＤ４と共に免疫沈降させ、タンパク質Ａ／Ｇアガロースで捕捉し、ＤＡＰＴＡの存在下または非存在下でｇｐ１２０Ｂａｌ−ｓＣＤ４複合体とインキュベートした。ヒトＨＩＶＩｇを用いたウェスタンブロッティングによって免疫沈降したｇｐ１２０を検出した。同じ膜を裂いて、ＣＣＲ５（ＮＴ）受容体に対するウサギポリクローナル抗血清を用いてハイブリダイズさせた（下部のパネルＡ）。パネルＢは、Ｃｆ２Ｔｈの親の胸腺細胞系からの細胞溶解産物を示す。免疫沈降したｇｐ１２０タンパク質は検出されなかった。パネルＣは、ｇｐ１２０ＣＭ２３５タンパク質とインキュベートする前にＤＡＰＴＡで処理したＨＯＳＣＤ４．ＣＣＲ５細胞を示す。約２×１．１０７からの膜に結合したＣＣＲ５が、ＣＣＲ５に対するモノクローナル抗体と免疫沈降した。ウェスタンブロットによって、共免疫沈降したｇｐ１２０タンパク質、および、膜に結合したＣＤ４受容体が検出された。
【００４２】
ＤＡＰＴＡは、ＣＤ４依存性のｇｐ１２０のＣＣＲ５への結合をブロックする
図２で説明したように、本発明者等は、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４複合体の、既知のＣＣＲ５リガンド、例えばＭＩＰ１−□またはＣＣＲ５「ブロッキング」抗体による阻害を受けやすいＣＣＲ５を発現する細胞への結合を分析した。抗ウイルス性の分析は従来技術で詳細に説明されており（Ruff等, 2001, Antiviral Res, 52, 63-75）、これは、参照により本発明に含め、本明細書においては簡単に説明するのみとする。
【００４３】
我々は、蛍光タンパク質標識キット（ロシュ・ダイアグノスティックス社（Roche Diagnostics GmBh））を用いて、可溶性ｇｐ１２０タンパク質（２５□ｇ／ｍｌ）から新規のＦＩＴＣ標識トレーサーを製造した。結合分析は、５０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））、ｐＨ＝７．４、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２．６Ｈ２Ｏ（シグマ（Sigma））、５％ＢＳＡ（シグマ）、および、０．１％ＮａＮ３を含み、最終容量１００□１の結合緩衝液中で行われた。指定された通りの数種のＣＣＲ５を発現する系統を用いて、９６ウェルのフィルタープレート（ミリポア（Millipore））中で３７℃で１時間結合させた。未結合の標識タンパク質を、９６−ウェルプレートマニホールドを用いた迅速な真空ろ過と洗浄によって除去した。蛍光プレートリーダー（ヒューレット・パッカード（Hewlett Packard））を４９５／５３０ｎｍで用いてフィルターを計数した。ｓＣＤ４の非存在下で非特異的な結合を決定し、それを１００ｎＭのｓＣＤ４（全ての結合）の存在下でのｇｐ１２０−ＦＩＴＣ結合から差し引いた。
【００４４】
蛍光標識したｇｐ１２０（ＦＩＴＣ−ｇｐ１２０）は、ｓＣＤ４の存在下のみでＣｆ２Ｔｈ／ｓｙｎＣＣＲ５細胞に効率的に結合した
分析中にｓＣＤ４が存在しない場合、結合はほぼ検出不可能であった。ＦＩＴＣ−ｇｐ１２０の最大の結合は、それに続いて用いられた１００ｎＭのｓＣＤ４で得られた。
【００４５】
図３で説明したように、ｇｐ１２０（Ｂａｌ、および、ＣＭ２３５）結合の特異性は、標識されていないＨＩＶ−１Ｂａｌ、または、ＭＩＰ−１□、既知のＣＣＲ５リガンドとの競合により示された（１８〜２２）（図２，上記）。標識したＦＩＴＣ−ｇｐ１２０Ｂａｌ（０．５ｎＭ）の結合は、等モル量（０．５ｎＭ）の標識されていないＨＩＶ−１Ｂａｌの存在下で８０％を超えて阻害されるか、または、２０倍過量の（１０ｎＭ）標識されていないＨＩＶ−１Ｂａｌを用いた場合バックグラウンドレベルまで減少した。ｇｐ１２０タンパク質ＢａｌおよびＣＭ２３５の両方の結合は、ＣＣＲ５特異的なリガンドＭＩＰ−１□（１０ｎＭ）を用いた場合に阻害され、これまでに述べられている通りである（２３〜２５）。また、ＦＩＴＣ−ｇｐ１２０ＣＭ２３５の結合も、イヌの胸腺細胞を、ｇｐ１２０結合をブロックするＣＣＲ５に対する２Ｄ７抗体（図１）とインキュベートすることによって阻害された（２６）。ＦＩＴＣ−ｇｐ１２０タンパク質は、１００ｎＭのｓＣＤ４の存在下で、親のＣＣＲ５陰性のイヌ胸腺細胞Ｃｆ２Ｔｈ細胞に感知できるほどに結合しなかった。これらの研究から、ｇｐ１２０−ＦＩＴＣのＣＣＲ５受容体への結合はＣＤ４依存性であることが示される（２６〜３０）。
【００４６】
２種のＣＣＲ５結合ｇｐ１２０タンパク質（Ｂａｌ、ＣＭ２３５）それぞれの飽和結合状態（図３）を、（Ｃｆ２Ｔｈ／ｓｙｎＲ５）細胞にＦＩＴＣ−で標識されたされたｇｐ１２０の量を高めて（０．２５〜２．５ｎＭ）添加することによって研究した（図２，右）。ｓＣＤ４の非存在下で非特異的な結合を決定し、それを１００ｎＭのｓＣＤ４存在下での結合から差し引いた。ｇｐ１２０Ｂａｌの飽和可能な結合および高親和性の結合は、Ｋｄが、０．４６＋０．１７ｎＭ（Ｐ＜０．０５）で生じ、ｇｐ１２０ＣＭ２３５１に関してはＫｄが、０．７７＋０．３５ｎＭ（Ｐ＜０．０５）で生じ、この結果は、その他にも一致する（２７，３１，３１，３２）。
【００４７】
ＤＡＰＴＡは、ｇｐ１２０エンベロープタンパク質のＣＣＲ５への結合を阻害する
ｇｐ１２０のＣＣＲ５受容体への結合のペプチド阻害剤の効力を定義するために、濃度を増加させたＣＣＲ５選択的なケモカインリガンドＭＩＰ−□、および、ＤＡＰＴＡの存在下で固定濃度のｓＣＤ４／ｇｐ１２０複合体を用いて阻害の研究を行った。これらの研究は図４で説明される。特異的な結合の総量は、ｓＣＤ４（１００ｎＭ）を添加した場合、または、それらを添加しない場合での、ＦＩＴＩＣ−ｇｐ１２０の結合の差として定義した。
【００４８】
ｇｐ１２０ＢａＬ／ｓＣＤ４のＣＣＲ５（Ｃｆ２Ｔｈ／ｓｙｎＲ５）細胞への結合は、ＭＩＰ−１□（ＩＣ５０＝１．５＋０．００２ｎＭ、Ｐ＜０．０５）、および、ＤＡＰＴＡ（ＩＣ５０＝５５＋０．０８ｐＭ、Ｐ＜０．０５）で完全に阻害された（図３Ａ）。ＤＡＰＴＡに関するヒル（Hill）の傾きは−１．０７であり、これは、１部位における競合結合モデルと一致した。同様に、我々はｇｐ１２０ＣＭＣＭ２３５／ｓＣＤ４の同じ細胞への結合阻害を研究したところ、再度、ＭＩＰ−１□（ＩＣ５０＝１．８＋０．００６ｎＭ、Ｐ＜０．０５）、および、ＤＡＰＴＡ（ＩＣ５０＝０．３２＋．０３ｎＭ、Ｐ＜０．０５）による特異的結合の実質的な（＞８０％）阻害が示された（図３Ｂ）。我々はさらに、ｇｐ１２０ＣＭ２３５／ｓＣＤ４の異なるＣＤ４を発現する細胞系（ＧＨＯＳＴ  ＣＤ４．ＣＣＲ５）への結合も、ＭＩＰ−１□（ＩＣ５０＝０．４３＋０．０７ｎＭ、Ｐ＜０．０５）、および、ＤＡＰＴＡ（ＩＣ５０＝５１＋０．０９ｐＭ、Ｐ＜０．０５）で阻害されたことも示した（図３Ｃ）。示されたデータ（パネルＡ〜Ｃ）は、３回の実験（それぞれ３連での決定）の平均およびＳＥＭである。ＰＲＩＳＭで解析を行った。
【００４９】
これらの臨床的および基礎的な調査の発見の関連性は、ｇｐ１２０のペプチドＴ領域が、ケモカイン補助受容体ＣＣＲ５に結合するエピトープと同定されたことを証明するものである（１１）。ほぼ２５年にわたる努力によっても、ＣＣＲ５の臨床的に有効な短いペプチド受容体の競合物は得られなかった。例えば、ｇｐ１２０分子全体を含むあらゆる包括的な２０ｍｅｒを２セット製造し、抗ウイルス活性に関して試験した。（第二のセットは、第一のセットに比べて１０個分の位置をフレームシフトさせた）。これらのサンプルはどれも、抗ウイルス活性をまったく示さなかった。加えて、１０年にわたる完全な失敗、有効なＨＩＶワクチンを同定しようとする３００億ドルもの連邦または個人的な努力は、ワクチン研究センター（Vaccine Research Center）、ＮＩＨにおける臨床研究局長（Director of Clinical Studies）であるBarney Graham博士による講演、「有効なＨＩＶは可能か（Is an Effective HIV Possible）」という表題の講演（２００６年２月１５日、メリーランド州ベセスダ）で認められているが、これは、広範な中和抗ＨＩＶ抗体を作製する能力が導かれる本発明のアプローチが自明ではないことを示す。実際に、このような抗体を誘導することができないことが、過去および現在のワクチンに関するあらゆる試みの失敗の元となっている。
【００５０】
ＣＣＲ５受容体に結合するＨＩＶエンベロープｇｐ１２０のペプチドは、ウイルスの受容体への結合をブロックする免疫原として用いることができる。ほぼ全ての有効な抗体ワクチンは、ウイルスの受容体結合または付着をブロックすることによって作用する。
【００５１】
近年、製剤化されたペプチドの特性の解析、および、詳細な構造的な研究（MacPhee，未発表）から、ＤＡＰＴＡは、水溶液に迅速に溶解させると、極めて強い凝集傾向を示し、それにより、生物学的利用率と抗ウイルス活性との両方の損失が起こることが解明されている。目下、このＤＡＰＴＡの特性は、準最適な臨床結果しか得られない場合があり（３３）、インビトロでの結果が不当に陰性になることさえあることが明らかである。例えば、ペプチドＴ溶液は、高濃度になり、「ゲル」になることが報告されており、それにより、粘膜（例えば鼻上皮）を介して輸送される活性および／または能力の見込みが失われると考えられている。調合物から塩化ナトリウムを除去し、濃度を５ｍｇ／ｍＬに低くすることが、問題を解決するようである。しかしながら分光偏光解析によれば、わずか１ｍｇ／ｍＬでも、室温で、それより低濃度の０．１ｍｇ／ｍｌの２０５．４ｎｍでの大きいピークから２３７．２ｎｍでの大きいピークにシフトすることが明らかになり、これは、ゲル化が起こり得る凝集工程において、ペプチドＴは、より高濃度の場合、それ自身と相互作用することを示す。電子顕微鏡法により、ペプチドＴは細線維を形成することが確認され、我々の知る限りの知識によれば、ペプチドＴは、すでに説明されているその他の小さいペプチドのどれよりも容易に細線維を形成する。
【００５２】
細線維の形成の決定
ペプチドＴまたはそれらの類似体の細線維の形成は、電子顕微鏡法を用いて測定することができる。ＤＡＰＴＡ水溶液の２μｌのアリコートを、フォームバー（ｆｏｒｍｖａｒ）／炭素で被覆されたニッケル製のＥＭグリッドに塗布した。このグリッドを１０μｌの蒸留水で３回リンスし、１０μｌの２％酢酸ウラニルで染色した。このサンプルをＬａＢ６フィラメント（１２０ｋｖ）を備えたＦＥＩ  ＴＥＭ  Ｔｅｃｎａｉ顕微鏡で試験し、メガビューＩＩ（Megaview II）ＣＣＤカメラでイメージ化した。
【００５３】
また、ペプチドＴまたはそれらの類似体の細線維の形成は、色素結合を用いて決定することもできる。コンゴレッドを、ＰＢＳ（５ｍＭのリン酸カリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４）に７μｇ／ｍＬの濃度に溶解させた。この溶液を４℃に冷却し、ＤＡＰＴＡを１０ｍｇ／ｍＬのストック水溶液として添加し、０．４８ｍｇ／ｍＬの色素溶液中で最終的なペプチド濃度にした。粉末を溶解させた直後のペプチド溶液を、凝集したペプチドを含む時間を置いたストック溶液と比較した。４℃で４００〜７００ｎｍでスペクトルを回収した。
【００５４】
またペプチドＴまたはそれらの類似体の細線維の形成は、円二色性（ＣＤ）分光分析を用いて決定することもできる。新たに製造されたペプチド、または、繊維性の凝集体を含むペプチドのいずれかの１０ｍｇ／ｍＬの水溶液を、４℃で蒸留水に５０μｇ／ｍＬの濃度まで添加した。ジャスコ（Ｊａｓｃｏ）のモデルＪ−８１０スペクトロメーターで、０．１ｃｍのパス長の石英キュベットを用いて、１９０〜２５０ｎｍの範囲で、１分間のインターバル、および、２秒の応答時間を用いてＣＤスペクトルを得た。
【００５５】
さらにその他のペプチドＴまたはそれらの類似体の細線維の形成の決定方法は、フーリエ変換赤外（ＦＴＩＲ）分光分析を用いて行われる。ＤＡＰＴＡを重水に１０ｍｇ／ｍｌの濃度まで溶解させ、細線維の形成を促進する温度および時間条件下でインキュベートした。次に、２５μｌのサンプルを、６μｍのスペーサーで仕切ったＮａＣｌウィンドウを備えた予め冷却した透過セル中に入れた。ＦＴＩＲスペクトルを、ＤＴＧＳ検出器を用いて、バイオ・ラッド（ＢｉｏＲａｄ）のＦＴＳ−１７５Ｃフーリエ変換スペクトロメーターで透過モードで回収した。２ｃｍ−１の解像度で２５０６枚の干渉写真を記録した。水蒸気を差し引いて、スペクトルの基線を修正した。
【００５６】
免疫原性の特性
抗ペプチドＤＡＰＴＡ抗体のｇｐ１２０単量体への結合
図５は、抗ペプチドＤＡＰＴＡ抗体のｇｐ１２０単量体への結合を説明する。パネルＡにおいて、ＩＩＩＢｇｐ１２０（●）；ｇｐ１２０ＡＤＡ（）、および、ｇｐ１２０Ｂａｌ（▲）は、マイクロプレートに直接被覆されている（被覆されたＥＬＩＳＡ）。そのウェルに２５倍まで連続的に希釈した抗ペプチドＤＡＰＴＡを添加した。結合した抗体を抗ウサギＩｇＧ−ＨＰＲ−ロバ（ＫＰ＆Ｌ）を１：１０００にしたもので検出し、４５０ｎｍにおける光学密度として測定した。バックグラウンドを一般的なウサギ血清コントロールによって推定した。試験された３種全てのｇｐ１２０タンパク質への最大限の結合の半分に到達するのに必要なＶ２抗体の濃度は、８〜２５ｎｇ／ｍｌの間であった。これらのデータは、代表的な実験から得られたものだが、各データポイントは、３連の実験からの平均値である。パネルＢは、ｓＣＤ４（■）の存在下、および、ｓＣＤ４なし（◇）でのｇｐ１２０ＩＩＩＢと抗ペプチドＤＡＰＴＡとの反応性を示す。これらの抗体は、ｓＣＤ４の存在下では高親和性で結合する。この結果は、２回繰り返した代表的な実験から得られたものである。各データポイントは、３連の実験からの平均値である。
【００５７】
抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ抗体の可溶化したｇｐ１２０ｓへの結合
抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ抗体、および、精製したＩｇＧ分子の、様々な実験用に適合させたウイルス株由来のｇｐ１２０組換えタンパク質への親和性をＥＬＩＳＡ分析によって測定した。ポリクローナル抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ血清は、可溶化したｇｐ１２０タンパク質に結合したが、ｇｐ１２０ＡＤＡ、および、ｇｐ１２０ＩＩＩＢには高親和性で結合し、ＳＦ１６２ｇｐ１２０には最も低い親和性で結合した。これは、図６で説明されている。捕捉ＥＬＩＳＡからの結果は、中和活性との優れた相関を示し、従って、我々が本明細書において開発したような単純なＥＬＩＳＡ試験によって、ワクチン候補抗体を選別することができることが示される。
【００５８】
ｇｐ１２０ｓ（１μｇ／ｍｌ）を、マイクロプレート上のポリクローナルヤギ抗ＨＩＶ−１ＳＦｇｐ１２０血清によって捕捉した（捕捉ＥＬＩＳＡ）。３倍まで連続的に希釈した抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ血清を加熱不活性化し、これをそのウェルに添加した。結合した抗体をロバ抗ウサギＩｇＧ−ＨＲＰで検出し、４５０ｎｍにおける光学密度として測定した。バックグラウンドを、結合したペプチドＴＤＡＰＴＡに対して免疫化する前のウサギ血清の量によって推定し、それを差し引いた。このラインは、３連で行われた２回の実験からのデータのうち代表的なものである。
【００５９】
抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ抗体の可溶化したｇｐ１２０ｓへの結合は、ＣＤ４依存性である
溶解性ＣＤ４（ｓＣＤ４）を添加した場合、および、それらを添加しない場合の精製した抗付着部位ＩｇＧのｇｐ１２０ｓへの親和性結合を、ペプチドＴをローディングした親和性ＥＬＩＳＡから精製した抗ペプチドＴＤＡＰＴＡウサギ抗血清全体から誘導された免疫グロブリンのトラクションを用いて研究した。
【００６０】
これは、図７で説明されている。可溶性ｇｐ１２０タンパク質を、抗ＨＩＶ−１ＳＦ２血清、または、ｓＣＤ４（１μｇ／ｍｌ）で被覆されたマイクロプレートウェル上で捕捉した。３倍まで連続的に希釈した抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ ＩｇＧを、各希釈率ごとに３連で添加した。結合した抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ ＩｇＧを、２％の一般的なヤギ血清を含むブロッキング緩衝液中のＨＰＲ−ロバ抗ウサギＩｇＧによって検出した。その結果は、３連で行われた２回の実験の平均である。エラーバーは、ＳＤ（ｐ＜０．０５）を示した。
【００６１】
ＣＤ４分子に結合するとおおむねｇｐ１２０を認識する抗体が特に興味深く、ワクチン関連性を有する。いわゆるＣＤ４誘導性（ＣＤ４ｉ）抗体は、ＣＣＲ５、および、ＣＸＣＲ４のｇｐ１２０−ＣＤ４複合体への結合を阻害することから（３４〜３６）、これら抗体は、ｇｐ１２０の補助受容体結合を許容するコンフォメーションに対して向けられていると認識される。しかしながら、ヒトから単離されたＣＤ４ｉ抗体の例は限定的であり、そのプロトタイプは、一次ＨＩＶ−１単離物に対して弱い中和活性しか示さない。これらの抗体が一見希少であることの原因は、ＣＤ４ｉエピトープが比較的入手困難であることにある（６，３７，３８）。
【００６２】
このようなｇｐ１２０のＣＤ４誘導性（ＣＤ４ｉ）部位が見出された抗体は、極めて限られた数しか存在しない。ＣＤ４によって引き起こされるｇｐ１２０のコンフォメーションを認識する抗体は、補助受容体結合エピトープに対して向けられている可能性が高い。抗ペプチドＴ抗体は、本明細書において、ＣＤ４誘導性エピトープを選択的に認識することが示されており、従って、補助受容体結合部位の近傍で、またはその場で結合すると推測される。
【００６３】
抗付着部位抗体は、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４のＣＣＲ５侵入の補助受容体への結合をブロックする
抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ抗血清、および、精製した抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ ＩｇＧのｇｐ１２０ｓへの親和性を、ウェスタンブロットでさらに研究した。２種のＨＩＶ−１ウイルス株ＪＲ−ＣＳＦ、および、ＳＦ１６２からのウイルス粒子を濃縮し、ＮＰ４０の存在下で溶解させ、４〜１２％のポリアクリルアミドゲルを用いたタンパク質を電気泳動で分離した。ｐ２４抗原に関して３種の異なる濃度を用いられ、スロットあたり１、２および３ｎｇの溶解産物で測定された。タンパク質をＮＥＭＰＶＤＦメンブレンに移し、精製した抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ ＩｇＧ（１：２００）とハイブリダイズさせた。これらの抗体は、用量依存性の方式でウイルスのｇｐ１２０タンパク質を認識した。
【００６４】
これは、図８で説明されている。パネルＡにおいて、ウイルス粒子を濃縮し、４〜１２回のＳＤＳＰＡＧＥで分離した。ＥＬＩＳＡによって測定したところ１、２および３ｎｇのｐ２４タンパク質を含むウイルスの溶解産物をローディングした。このメンブレンを、ペプチドＴＤＡＰＴＡ ＩｇＧ（１：２００）に対する親和性によって精製した抗ペプチドＴＤＡＰＴＡとハイブリダイズさせ、ＨＲＰ−ロバ抗ウサギＩｇＧ（１：２０００）で染色した。このフィルムをＥＣＬ溶液（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））で展開した。この実験を２回繰り返した。パネルＢにおいて、ＩＩＩＢＨＩＶ−１ウイルス株、および、可溶性ｇｐ１２０ＩＩＩＢ組換えタンパク質からの溶解産物全体（濃度２１μｇ／ｍｌ）を１０％ＳＤＳＰＡＧＥでの電気泳動で分離し、トランスファーさせた。このメンブレンを、ペプチドＴＤＡＰＴＡ（１０μＭ）の存在下での、抗ペプチドＴＤＡＰＴＡポリクローナル血清（＃１９５）、予め採血した血清および抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ血清とインキュベートした。抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ抗体のＨＩＶ−１ｇｐ１２０ＩＩＩＢエンベロープタンパク質に対する特異性が示された。ペプチドＴＤＡＰＴＡは、抗ペプチドＴＤＡＰＴＡのｇｐ１２０タンパク質への結合をブロックした（図８Ａ）。
【００６５】
Ｖ２ペプチドベースの抗体の抗ペプチドＤＡＰＴＡの中和特性
ＨＥＬＡＣＤ４＋ＣＸＣＲ４／ＣＣＲ５＋細胞（Ｐ７）において融合細胞をカウントする分析で、ＨＩＶ−１の中和を評価した。顕微鏡下で青色のフォーカスユニット（ＢＦＵ／ウェル）をカウントした。以下の表１にまとめたこのデータは、抗体の固定濃度０．１２５μｇ／ウェルを用いて得られた。さらに精製したＩｇＧの中和活性の滴定も行った。ＩｇＧ分画は、より低い親和性を有するペプチドＤＡＰＴＡに対するポリクローナル抗血清の滴定曲線に類似した滴定曲線に従っていた（データ示さず）。感染の阻害は３連の平均値であり、以下の式によって計算された：阻害（％）：１００−［（ＢＦＵ（抗体を含む）：  ＢＦＵ（抗体を含まない））×１００］。
【００６６】
【表７】
2008546803.tif 000008
【００６７】
数種の一般的に研究された分岐群Ｂ単離物に関するペプチドＴ／ＤＡＰＴＡに対する抗体の効力（５０％［ＩＣ５０］阻害を達成するのに必要な濃度）を比較するために、我々は、既定の補助受容体特異性を有する細胞系（ＨＥＬＡ  ＣＤ４−βガラクトシダーゼ、および、ＨＥＬＡ  ＣＤ４．ＣＣＲ５）を用いたフォーカス形成分析において一回のウイルス感染を用いた（３９）（表１）。
【００６８】
上記の実験において、感染分析は以下のように行われた。ＨｅＬａ細胞系（ＭＡＧＩ）が用いられ、この細胞系は、いずれも高レベルのＣＤ４を発現し、トランケーションされたヒト免疫不全ウィルス１型（ＨＩＶ−１）ロングターミナルリピート（ＬＴＲ）の制御下にあるベータ−ガラクトシダーゼ遺伝子の単一の統合されたコピー（４０）を含み、このＣＣＲ５遺伝子（ＭＡＧＩ−ＣＣＲ５）を有する細胞系（Pirounaki等, 2000）は、ＮＩＡＩＤ  ＡＩＤＳレポジトリー（NIAID AIDS Repository）から入手した。ペプチドＴのケモカイン受容体サブタイプの感受性を決定するために、ＭＡＧＩおよびＭＡＧＩ−ＣＣＲ５を、以下に説明されているようにして用い、以前のプロトコール（４０〜４３）を改変させた。簡単に言えば、１０，０００個のＭＡＧＩまたはＭＡＧＩ−ＣＣＲ５細胞／ウェルを９６ウェルプレートにシーディングした。１日後、培地を除去し、２０□ｇ／ｍｌのＤＥＡＥ−デキストリンを含むＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ギブコ・ＢＲＬ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ），ライフ・テクノロジーズ（Life Technologies））でのペプチドＴまたはＭＩＰ−１□の希釈液を添加した。このプレートを、６０分間、３７℃、５％ＣＯ２で培養し、次に、ウイルスの希釈液を添加し、さらに１．５時間培養した。接種されたウイルスを除去し、ウェルを０．２ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地で２回洗浄し、新しい培地（１５０□ｌ／ウェルのＤＭＥＭ）を添加した。さらに４６時間培養した後、細胞を、ＰＢＳ中の１％ホルムアルデヒド、０．２％グルタルアルデヒドで室温で５分間固定し、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中の４ｍＭのフェロシアン化カリウム、４ｍＭのフェリシアン化カリウム、２ｍＭのＭｇＣｌ、および、０．４ｍｇ／ｍｌの５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−□−Ｄ−ガラクトピラノシド（Ｘ−ｇａｌ染色、イナルコ・ファーマシューティカルズ（Inalco Pharmaceuticals），セントルイス・オビスポ，カリフォルニア州）で、３７℃で、５％ＣＯ２で、５０分間染色し、ＰＢＳで２回洗浄した。顕微鏡で青色のフォーカスを計数し、感染レベルを青色のフォーカスユニット（ＢＦＵ／ウェル）として記録した。全ての分析において、ＢＦＵ／ウェルのバックグラウンドレベルは概して３未満であった。
【００６９】
上述した感染分析におけるＣＣＲ５株ＳＦ１６２、および、ＪＲ−ＣＳＦの感染力の阻害に関して、未精製の抗血清、および、免疫化する前のコントロール血清を試験した。中和力価（ＩＣ５０）は、免疫血清において１：２０〜１：４０の希釈率の範囲であり、免疫化する前の血清における非特異的な中和はごくわずかであった（示さず）。
【００７０】
特異性および効力を強化するために、親和性によって精製した抗血清を、ペプチドＴ／ＤＡＰＴＡカラムを用いたさらなる研究のために製造した。ＣＣＲ５株ＳＦ１６２、および、ＪＲ−ＣＳＦに関する親和性によって精製した抗体分画の中和力価は、ＳＦ１６２は０．２５〜１２５μｇ／ｍｌの間であり、ＪＲ−ＣＳＦウイルス株は０．１２５および０．０６μｇ／ｍｌであった（示さず）。精製したＩｇＧ分画の中和活性の滴定は、ｇｐ１２０補助受容体の付着部位に対するポリクローナル血清の滴定曲線に類似した滴定曲線に従っており、ＳＦ１６２ワクチン株に関する親和性はより低かった。予め採血した血清を同じ解析で試験した。バックグラウンドの阻害は、１：２０に希釈した血清サンプルで２〜４パーセントの範囲であった。続いて、ｇｐ１２０補助受容体の付着部位の親和性によって精製したＩｇの活性を、様々な分岐群のなかからそれらの多様性および外見に関して選択されたより大規模なＨＩＶ単離物サンプルで評価した。
【００７１】
１９％のカットオフ値は、１：５の希釈率で試験された一般的なウサギ血清を用いて得られた９５％の信頼レベルに基づく（Laboratory of Antiviral Drug Mechanisms, Science Applications International Corporation at Frederick National Cancer Institute-Frederick Cancer Research and Development Center）。表Ｘに示した結果は、少なくとも２回の独立した実験（ウイルス株ごとに３連で行われた）から得られたものである。
【００７２】
ｇｐ１２０補助受容体の付着部位の親和性によって精製した免疫グロブリンは、２種の一次単離物、分岐群Ｂ／Ｆ由来の９３ＢＲ０１９、および、９３ＩＮ１０１分岐群Ｃのウイルス株に対して極めて高い中和活性、および、２株を除く全てに対する有意な中和活性を示した。Ｘ４ウイルス単離物に対する活性は予想外であり、これは、これらのペプチドは、Ｒ５、Ｘ４、および、二重細胞指向性ＨＩＶ株に対する免疫原または治療剤を作製するのに有用であり得ることを示す。
【００７３】
親和性によって純粋にした抗ペプチドＴによるＨＩＶの中和
ＩＣ５０が０．０４５μｇ／ｍｌの抗付着部位ＩｇＧの、ＨＩＶ−１分岐群Ｃ単離物（Ｄｕｌ２３、および、Ｄｕｌ５６）に対する中和活性を、デューク大学（Duke University）のＡＩＤＳワクチン研究所（AIDS Vaccine Lab）（David Montefiori、個人的な人脈）による一回のルシフェラーゼレポーター遺伝子分析によって確認した。そのデータは、以下の通りである：
【００７４】
【表８】
2008546803.tif 000009
【００７５】
値は、相対的な発光単位（ＲＬＵ）が、ＴＺＭ−ｂｌ細胞においてウイルスコントロールウェル（試験サンプルなし）と比較して５０％減少した時点の血清の希釈濃度である。活性を有するサンプルは、太字で示す。
【００７６】
反復配列
有用なペンタペプチド配列は、直線状のアレイで２〜５回の頻度で生じるそれらの反復モチーフによっても同定が可能であり、このようなモチーフは、分離されていないか、または、どこかで１〜数百個のアミノ酸で分離されているかのいずれかであり、すなわちエンベロープタンパク質のそれ以外のいずれか一部分を除きＶ２には存在しない。これらのペプチドの望ましくない凝集特性は、エンベロープ内の「ステープル様の」付着部位として役立つこれらのペンタペプチド配列を含むウイルスエンベロープの三次構造を構築することに有用な場合がある。どのような場合においても、いずれの所定のウイルス内におけるペンタペプチド配列の反復は、規則に従っていなくても、追加の有用な配列を示す可能性がある。例えば、ＥＹＩＹＴ反復配列は５回反復される。この反復は、コンセンサス配列の近傍に続いて存在しない。これらは反復しているが、活性な化合物のライブラリーに加えられる。
【００７７】
ＣＣＲ５受容体活性の存在
有用な候補は、ＣＣＲ５受容体への保存的な親和性を有すると予想される。従って、ＣＣＲ５受容体への相対的な親和性に関して、様々なペンタペプチド組成物（すなわち、それらの様々なリンカーおよび免疫原が結合している）の活性を分析すること（結合分析、抗ウイルス性またはその他のＣＣＲ５受容体の相対的な生物活性の分析）は、さらなる有用なスクリーニングであると予想される。ＣＣＲ５受容体への親和性が高ければ高いほど、最終産物が治療活性を有する可能性は高くなる。
【００７８】
有用な候補は、概して、免疫原として用いられる前に広範な抗ウイルス活性を示すと予想される。従って、これらのワクチンはそれ自身、治療剤であると期待される。
本発明の特に重要な形態は、これらのペプチドの混合型のアンタゴニストとしての薬理学的作用に関する。Nobelist Arvid Carlsson(Medicine/Physiology, 2000)によって述べられたように、薬物の混合型の（部分）アゴニストの形態は、受容体相互作用の臨床的に好ましいタイプである。混合型／部分アゴニスト薬物の場合、完全アンタゴニストの除感作、耐性および副作用を回避することが一般的であり、このタイプの成功した薬物が製薬会社によって作製されている。部分アゴニスト薬物は、受容体活性のバランスをとるように作用し（ＤＡＰＴＡ作用の混合型アゴニストの形態について示したRedwine, 1999を参照）、従ってこれらは好ましい治療剤である。我々は、本明細書で説明するような、これらのペプチドの固有の生物活性を決定する方法を開発し、予想通りにヒトへ投与してから６ヶ月後に受容体における耐性の誘導を示さない混合型アゴニスト（例えば表６に記載のペプチド）が得られることを見出した。
【００７９】
ＨＩＶ−１ｇｐ１２０は、最も広範囲にわたりグリコシル化されたタンパク質の１種である。これらは、２３または２４個のＮ結合型糖付加部位、および、タンパク質の総質量の約半分を占めるこれらの部位に結合したグリカンを含む。糖付加、および、グリコシダーゼ阻害剤を用いた多数の研究により、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質のコンフォメーションを決定することにおける炭水化物部分の重要性が解明されている。部位特異的変異誘発から、糖付加部位の多くはいずれも非必須であることが示された。２４部位のうち、いずれもｇｐ１２０のアミノ末端側の半分に位置する５部位のみ（アミノ酸８８、１４１、１９７、２６２および２７６）が、ウイルス感染力に影響を与えた。１９７部位は、Ｖ２の近傍に存在するか、または、我々が定義した結合部位のペプチドの多くの位置に存在する。例えば、ここで留意すべきは、本発明のペプチドに、糖付加モチーフＴ／ＳｘＮが存在することが多いことである。我々の結果によれば、Ｎ結合型糖付加部位が、本明細書に記載のペプチドの近傍、その場、またはその範囲内に存在することが多く、さらに、補助受容体様ＣＣＲ５へのウイルス結合エピトープを定義することが示される。糖付加が存在する場合、糖付加は、構造的な特異性に寄与するか、または、この重要なエピトープの免疫監視を回避する手段として天然の抗体による中和をマスクする可能性がある。
【００８０】
本発明の一実施態様は、免疫原性特性を有する組成物である。この組成物は、一般的に、Ａ−Ｌ−Ｐ−Ｃ部分の組み合わせとして説明され、ここで、Ａは、あらゆるアジュバントであり、Ｌは、あらゆる結合部分であり、Ｐは、ペプチド部分であり、Ｃは、保護基である。
【００８１】
開示された化合物において、あらゆるアジュバントが使用できる。ペプチドとリンカー領域とは、アジュバントとは独立して作用すると考えられるので、アジュバントの選択はまったく制限されない。いくつかの有用なアジュバントの例は、これらに限定されないが、ヒトにおいて許容できるあらゆるアジュバント、肝炎のコア抗原、ポリリジンなどである。この開示の後に開発されたアジュバントも作用すると考えられ、その前に開発されたアジュバントも同様である。
【００８２】
あるいは、アジュバントは、所定の環境に応じて調合してもよい。例えばペプチドを凝集するようにする場合である。
その他の本発明の実施態様は、治療特性を有する組成物である。この組成物は、一般的に、Ｌ−Ｐ−Ｃ部分の組み合わせとして説明され、ここで、Ｌは、あらゆる部分であり、ただし好ましくは短いペプチド部分であり、Ｐは、その他のペプチド部分であり、Ｃは、保護基である。
【００８３】
連結させたＬおよびＰ領域の長さに関して、いずれも特定の長さ（約７〜約１６個）のアミノ酸が機能すると考えられる。好ましい実施態様において、このような連結は、７〜１１個の範囲である。さらに好ましい実施態様において、このような連結は、７〜９個の範囲である。よりさらに好ましい実施態様において、８である。あるいは、天然の神経性のペプチドは２８個のアミノ酸からなることを示すため、開示された組成物のペプチド領域の長さは、約２８個のアミノ酸であると考えられる。（表４を参照）。
【００８４】
本明細書において開示された様々な化合物は、単独で、または、カクテルとして組み合わせて作用するように設計される。多種多様な化合物が使用でき、限定されない。最も有用なカクテルは、２〜７種の異なる化合物からなると考えられる。
【００８５】
Ｃ部分は、あらゆる保護基が可能である。好ましい実施態様は、アミドである。
本発明の開示はまた、以下の活性：ＨＩＶウイルスに感染したヒトにおける、単球によって誘導されたマクロファージ（ＭＤＭ）、小グリア細胞、または、Ｔ細胞におけるＲ５または二重細胞指向性（Ｒ５／Ｘ４）株におけるＨＩＶの抑制を示す化合物、および、その化合物に関してスクリーニングする方法も包含する。その他の活性としては、ＣＣＲ５受容体を調節することによって治療可能なあらゆるヒトの病気が挙げられ、例えば、これらに限定されないが、アルツハイマーを引き起こす神経炎症、多発性硬化症、乾癬、および、関節炎である。これらの病気は、抑制されるか、または、解消されると予想され、病気の経過は止まるか、または、回復すると予想され、および、臨床的な利点が生じると予想される。
【００８６】
最後に、本発明の開示は、組成物の安定性に関してスクリーニングする方法を包含する。これは、ウイルスの感染力、走化性、マップキナーゼ活性化、ｇｐ１２０結合、ＣＣＲ５活性化もしくは阻害、または、Ｇタンパク質シグナル伝達からなる群より選択される生物学的に特徴付ける方法によって決定される。
【００８７】
引用文献
【００８８】
【表９】
2008546803.tif 000010
【００８９】
【表１０】
2008546803.tif 000011
【００９０】
【表１１】
2008546803.tif 000012
【００９１】
【表１２】
2008546803.tif 000013
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ＤＡＰＴＡは、ＣＣＲ５受容体とのｇｐ１２０−ＣＤ４複合体の共免疫沈降反応を防ぐ。
【図２】ｇｐ１２０のＣＣＲ５の結合分析である。
【図３】蛍光標識したｇｐ１２０（ＦＩＴＣ−ｇｐ１２０）は、ｓＣＤ４が存在するときのみにＣｆ２Ｔｈ／ｓｙｎＣＣＲ５細胞に効率的に結合した。
【図４】ＤＡＰＴＡは、ｇｐ１２０エンベロープタンパク質のＣＣＲ５への結合を阻害する。
【図５】抗ペプチドＤＡＰＴＡのｇｐ１２０一量体への結合を示す。
【図６】抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ血清のｇｐ１２０に対する結合親和性を示す。
【図７】抗ペプチドＴＤＡＰＴＡ ＩｇＧのｇｐ１２０タンパク質への溶解性ＣＤ４依存性の結合を示す。
【図８】抗ペプチドＴＩｇＧおよびポリクローナル血清の、膜に固定されたウイルスおよび組換えｇｐ１２０タンパク質への親和性結合を示す。
【図１】
2008546803.tif 000014
【図２】
2008546803.tif 000015
【図３】
2008546803.tif 000016
【図４】
2008546803.tif 000017
【図５】
2008546803.tif 000018
【図６】
2008546803.tif 000019
【図７】
2008546803.tif 000020
【図８】
2008546803.tif 000021
【国際調査報告】
2008546803.tif 000022