(57)【要約】本発明は、一般に、その後の少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質を含むサンプルの調製方法、処理方法、または分析方法のためのサンプルの調整方法であって、以下の工程：Ａ）少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質を含むサンプルを準備する工程と、Ｂ）前記サンプルを液体または固体の組成物と接触させて液体サンプル調製物を産生する工程と、ここで、前記組成物が、以下：ａ）ポリアミン、ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、ｃ）これらの窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、ｅ）カルボン酸アミン、ｆ）無機アンモニウム塩、ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、ｈ）核酸に結合する抗生物質、ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、および２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含むことを含む方法を提供する。本発明は、特に、生体サンプルの溶解方法、生体分子の安定化方法、生体分子を含むサンプルの阻害効果を減少させる方法、および差分マスキング方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質を含むサンプルのその後に続く調製、処理、または分析方法のためのサンプルの調製方法であって、以下の工程：
Ａ）少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質を含むサンプルを準備する工程と、
Ｂ）前記サンプルを液体または固体の組成物と接触させて液体サンプル調製物を産生する工程と、ここで、前記液体サンプル調製物が、ｐＨ７．１とｐＨ１４との間、好ましくは、ｐＨ７．１とｐＨ１２との間、特に好ましくは、ｐＨ７．４とｐＨ１０との間であること、ここで、前記組成物が、以下：
ａ）ポリアミン、
ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、
ｃ）窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、
ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、
ｅ）カルボン酸アミン、
ｆ）無機アンモニウム塩、
ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、
ｈ）核酸に結合する抗生物質、
ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、および
２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物
からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含むこと
を含む、方法。
【請求項２】
少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質をケーシング中に含む生体サンプルの溶解方法であって、前記サンプルをライセート産生のための液体または固体の組成物と接触させ、前記組成物が、以下：
ａ）ポリアミン、
ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、
ｃ）これらの窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、
ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、
ｅ）カルボン酸アミン、
ｆ）無機アンモニウム塩、
ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、
ｈ）核酸に結合する抗生物質、
ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、および
２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物
からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含み、
ここで、このような様式で産生された前記液体サンプル調製物が、ｐＨ７．１とｐＨ１４との間、好ましくは、ｐＨ７．１とｐＨ１２との間、特に好ましくは、ｐＨ７．４とｐＨ１０との間である、溶解方法。
【請求項３】
前記溶解を、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を産生されたライセート中に溶解または懸濁するような様式で行う、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが、核酸およびタンパク質からなる群由来の少なくとも２つの種を含み、前記溶解を、いくつかの所定の種の核酸および／またはタンパク質を産生されたライセート中に溶解または懸濁するような様式で行う、請求項２または請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが、核酸およびタンパク質からなる群由来の少なくとも２つの種を含み、前記溶解を、前記生体サンプル中に含まれる本質的に全種の核酸および／またはタンパク質を産生されたライセート中に溶解または懸濁するような様式で行う、請求項２〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
少なくとも１種の核酸またはタンパク質の固定のためのキャリア材料を溶解中に前記サンプル中に添加する、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１種の核酸、特に、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡが前記ライセート中に含まれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記１種またはそれを超える種のタンパク質が前記ライセート中に含まれる、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記組成物が、さらなる溶解試薬として錯化剤、界面活性剤、容積制限物質、および／または溶媒の群の少なくとも１つの試薬を含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記溶解が、機械的影響下および／または酵素的様式で起こる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記サンプルを、前記溶解前に、洗浄緩衝液、特に、低張洗浄緩衝液で洗浄する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
産生された前記ライセート中の窒素化合物の濃度が、０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、０．００１〜１００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜３０ｍＭ、特に、０．００１〜１９ｍＭおよび０．００１〜１５ｍＭである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの核酸種が、ＤＮＡ種またはＲＮＡ種である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）前記ポリアミンが、２〜６個のアミノ基を有する開鎖および環状のポリアミドを含む群から選択され、
ｂ）前記アミノ酸が、αアミノ酸、特に、タンパク新生無極性および極性αアミノ酸からなる群、特に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、グリシン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸、およびトリプトファンからなる群から選択され、
ｃ）前記複素環式化合物が、５員環もしくは６員環、またはアネレーテッド（anellated）５員環を有する６員環の群から選択され、ここで、前記５員環、６員環、および／またはアネレーテッド（anellated）５員環が、１〜３個の窒素原子を含み、各環員が、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、＝Ｏ、−ＯＨ、＝Ｓ、−ＳＨ、＝ＮＨ、−ＮＨ2、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｏ−、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノからなる群から選択され、ここで、前記アルキル基が、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基であり、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、またはＪを含むことができ、前記複素環が、各５員環または６員環の基中にさらなるヘテロ原子として１つまたは複数のＯ原子またはＳ原子を含むことができ、前記複素環式化合物が、好ましくは、イミダゾール、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ピリミジン、ピリジン、２，３−ジメチルピラジン、チアゾール、２−アミノチアゾール、インダゾール、およびベンズイミダゾールからなる群から選択され、
ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、残りのＲ1、Ｒ2、およびＲ3が、ＨおよびＣ1〜Ｃ3アルキル基からなる群から互いに独立して選択され、
ｅ）前記カルボン酸アミンが、構造Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2を含み、ここで、Ｘは、−ＮＨ2、Ｃ1〜Ｃ5アルキル、Ｃ2〜Ｃ5アルケニル、Ｃ2〜Ｃ5アルキニル、またはアリール、好ましくは、フェニル、またはアミノ置換アリール、Ｈ2ＮＣ（＝Ｏ）−Ｙ−からなる群から選択され、ここで、Ｙは、−（ＣＨ2）n型のアルキレン基であってよく、ここで、ｎは、０〜１０、好ましくは、０〜５の範囲の整数であるか、Ｙは、Ｃ1〜Ｃ10アルケニレン基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ6アルケニレン基、またはアリール基であり、ここで、Ｘは、好ましくは、−ＮＨ2または２−アミノフェニルであり、
ｆ）無機アンモニウム塩は、硫酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、および炭酸アンモニウムからなる群から選択され、
ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩は、ベタイン、エクトイン、およびトリメチルアミンオキシドから選択され、
ｈ）前記核酸に結合する抗生物質は、ジスタマイシン、特に、ジスタマイシンＤ、マイトマイシン、ノルフロキサシン、ストレプトゾシン、ドゥオカルマシン、アクチノマイシン、およびアミノグリコシドからなる群から選択され、
ｉ）前記ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物は、チアゾトロプシン、トリイミダゾール、およびクロモマイシンからなる群から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記窒素化合物が、
ａ）好ましくは、２〜６個のアミノ基を有する非分岐ポリアミン、特に、スペルミジンを含む群から選択されるポリアミン、
ｂ）極性、アルカリ性、および酸性のアミノ酸、特に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、または
ｃ）イミダゾールおよび２，３−ジメチルピラジン、ピリミジン、およびグアニンから選択される複素環式化合物
の群から選択される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
サンプル中の少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質を検出するための分析方法であって、
Ａ）請求項１〜１５に記載の溶解方法によるライセートの産生、
Ｂ）少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質の検出に適切な反応または反応系列でのライセートの使用
を含む、分析方法。
【請求項１７】
サンプル調製物中に含まれる核酸種および／またはタンパク質種数の減少および／またはサンプル調製物からの分解させる物質の除去もしくは不活化のための検出反応前に、さらなる方法工程を行うことなく前記ライセートを直接使用する、請求項１６に記載の分析方法。
【請求項１８】
少なくとも１つの核酸の検出に適切な前記反応または反応系列が、核酸結合反応、特に、核酸ハイブリッド形成、特に、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、またはオリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリッド形成の群、核酸の酵素的修飾または重合、特に、配列決定反応、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写、制限エンドヌクレアーゼ分断の群、増幅反応、特に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、３ＳＲ（配列持続自己複製）、２ＳＲ、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＭＤＡ（多置換増幅）、ローリングサークル増幅、およびローリング転写増幅の群から選択される、請求項１６または１７に記載の分析方法。
【請求項１９】
少なくとも１つのタンパク質の検出に適切な前記反応または反応系列が、タンパク質結合反応、特に、タンパク質認識、特に、他のタンパク質によるタンパク質の認識、タンパク質、抗体、アプタマー、リガンド、核酸（特に、ウェスタンブロッティング）、または他の物質（グルタチオンおよびＮＡＤなど）の酵素活性に基づいた反応の群から選択されるか、タンパク質の修飾またはプロセシング、特に、（脱）リン酸化、（脱）グリコシル化、およびプロテアーゼによる分断の群から選択される、請求項１６または１７に記載の分析方法。
【請求項２０】
核酸および／またはタンパク質を安定化する方法であって、
Ａ）少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質を含むサンプルを準備する工程と、
Ｂ）前記サンプルを液体または固体の組成物と接触させて液体サンプル調製物を産生する工程と、ここで、前記液体サンプル調製物が、ｐＨ７．１とｐＨ１４との間、好ましくは、ｐＨ７．１とｐＨ１２との間、特に好ましくは、ｐＨ７．４とｐＨ１０との間であること、ここで、前記組成物が、以下：
ａ）ポリアミン、
ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、
ｃ）窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、
ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、
ｅ）カルボン酸アミン、
ｆ）無機アンモニウム塩、
ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、
ｈ）核酸に結合する抗生物質、
ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、および
２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物
からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含むこと
を含む、安定化する方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１種の核酸またはタンパク質を、窒素結合前、窒素結合中、または窒素結合後にキャリア材料に固定化する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を液体サンプル調製物中に溶解および／または懸濁するような様式で前記サンプル調製物を生成する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記サンプルは、液体サンプル調製物の産生のために組成物と接触させる前に溶解に供し、場合により、さらなる精製工程に供する生体サンプルである、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルは、ケーシング中に少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質を含む生体サンプルであり、前記サンプルを、液体または固体の組成物と接触させてライセートを産生する、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルは核酸およびタンパク質からなる群由来の少なくとも２つの種を含み、前記サンプル調製物の生成または溶解を、いくつかの所定の種の核酸および／またはタンパク質を産生されたライセート中に溶解または懸濁するような様式で行う、請求項２０〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプルは核酸およびタンパク質からなる群由来の少なくとも２つの種を含み、前記サンプル調製物の生成または溶解を、前記サンプル中に含まれる本質的に全種の核酸および／またはタンパク質をライセート中に溶解および／または懸濁または固定するような様式で行う、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、前記サンプル調製物またはライセート中に溶解および／または懸濁または固定する、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記少なくとも１種のタンパク質を、前記サンプル調製物またはライセート中に溶解および／または懸濁または固定する、請求項２０〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組成物が、さらなる溶解試薬として錯化剤、界面活性剤、容積制限物質、および／または溶媒の群の少なくとも１つの試薬を含む、請求項２０〜２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
記溶解が、機械的影響下および／または酵素的様式で起こる、請求項２０〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプルを、前記溶解前に、洗浄緩衝液、好ましくは、低張洗浄緩衝液で洗浄する、請求項２０〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
産生されたサンプル調製物またはライセート中の前記窒素化合物の濃度が、０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、０．００１〜１００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜３０ｍＭ、特に、０．００１〜１９ｍＭまたは０．００１〜１５ｍＭである、請求項２０〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ａ）前記ポリアミンが、２〜６個のアミノ基を有する開鎖および環状のポリアミンを含む群から選択され、
ｂ）前記アミノ酸が、αアミノ酸、特に、タンパク新生無極性および極性αアミノ酸からなる群、特に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、グリシン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸、およびトリプトファンからなる群から選択され、
ｃ）前記複素環式化合物が、５員環もしくは６員環、またはアネレーテッド（anellated）５員環を有する６員環の群から選択され、ここで、前記５員環、６員環、および／またはアネレーテッド（anellated）５員環が、１〜３個の窒素原子を含み、各環員が、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、＝Ｏ、−ＯＨ、＝Ｓ、−ＳＨ、＝ＮＨ、−ＮＨ2、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｏ−、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノからなる群から選択され置換基であり、ここで、前記アルキル基が、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基であり、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、またはＪを含むことができ、前記複素環が、各５員環または６員環の基中にさらなるヘテロ原子として１つまたは複数のＯ原子またはＳ原子を含むことができ、前記複素環式化合物が、好ましくは、イミダゾール、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ピリミジン、ピリジン、２，３−ジメチルピラジン、チアゾール、２−アミノチアゾール、インダゾール、およびベンズイミダゾールからなる群から選択され、
ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミン中の残りのＲ1、Ｒ2、およびＲ3が、ＨおよびＣ1〜Ｃ3アルキル基からなる群から互いに独立して選択され、
ｅ）前記カルボン酸アミンが、構造Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2を含み、ここで、Ｘは、−ＮＨ2、Ｃ1〜Ｃ5アルキル、Ｃ2〜Ｃ5アルケニル、Ｃ2〜Ｃ5アルキニル、またはアリール、好ましくは、フェニル、またはアミノ置換アリール、Ｈ2ＮＣ（＝Ｏ）−Ｙ−からなる群から選択され、ここで、Ｙは、−（ＣＨ2）n型のアルキレン基であってよく、ここで、ｎは、０〜１０、好ましくは、０〜５の範囲の整数であるか、Ｙは、Ｃ1〜Ｃ10アルケニレン基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ6アルケニレン基、またはアリール基であり、ここで、Ｘは、好ましくは、−ＮＨ2または２−アミノフェニルであり、
ｆ）無機アンモニウム塩は、硫酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、および炭酸アンモニウムからなる群から選択され、
ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩は、ベタイン、エクトイン、およびトリメチルアミンオキシドから選択され、
ｈ）前記核酸に結合する抗生物質は、ジスタマイシン、特に、ジスタマイシンＤ、マイトマイシン、ノルフロキサシン、ストレプトゾシン、ドゥオカルマシン、アクチノマイシン、およびアミノグリコシドからなる群から選択され、
ｉ）前記ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物は、チアゾトロプシン、トリイミダゾール、およびクロモマイシンからなる群から選択される、請求項２０〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記窒素化合物が、
ａ）好ましくは、２〜６個のアミノ基を有する非分岐ポリアミン、特に、スペルミジンを含む群から選択されるポリアミン、
ｂ）極性、アルカリ性、および酸性のアミノ酸、特に、リジン、ヒスチジン、グルタミン酸、
ｃ）イミダゾールおよび２，３−ジメチルピラジン、ピリミジン、およびグアニンから選択される複素環式化合物
の群から選択される、請求項２０〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
サンプル中の１種または複数の種の核酸および／またはタンパク質を検出するための分析方法であって、
ａ）少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質を含むサンプル調製物またはライセートを準備する工程と、前記少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を、請求項２０〜３４のいずれか１項に記載の方法を使用して安定化すること、および
ｂ）少なくとも１つの核酸および／または少なくとも１つのタンパク質の検出のための反応または反応系列でサンプル調製物またはライセートを使用する工程と
を含む、分析方法。
【請求項３６】
サンプル調製物中に含まれる核酸種および／またはタンパク質種数の減少および／またはサンプル調製物からの核酸および／またはタンパク質を分解する物質の除去もしくは不活化のために、さらなる方法工程を行うことなく前記サンプル調製物またはライセートを直接使用する、請求項３５に記載の分析方法。
【請求項３７】
少なくとも１つの核酸の検出に適切な前記反応または反応系列が、核酸結合反応、特に、核酸ハイブリッド形成、特に、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、またはオリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリッド形成の群、核酸の酵素的修飾または重合、特に、配列決定反応、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写、制限エンドヌクレアーゼ分断の群、増幅反応、特に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、リアルタイムＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ鎖反応）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、３ＳＲ（配列持続自己複製）、２ＳＲ、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＭＤＡ（多置換増幅）、ローリングサークル増幅、およびローリング転写増幅の群から選択される、請求項３５または３６に記載の分析方法。
【請求項３８】
前記サンプル調製物またはライセート中に含まれる核酸種がＲＮＡであり、工程ｂ）では、前記反応または反応系列は、ＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲである、請求項３５〜３７のいずれか１項に記載の分析方法。
【請求項３９】
少なくとも１つのタンパク質の検出に適切な前記反応または反応系列が、タンパク質結合反応、特に、タンパク質認識、特に、他のタンパク質によるタンパク質の認識、タンパク質、抗体、アプタマー、リガンド、核酸（特に、ウェスタンブロッティング）、または他の物質（グルタチオンおよびＮＡＤなど）の酵素活性に基づいた反応の群から選択されるか、タンパク質の修飾またはプロセシング、特に、（脱）リン酸化、（脱）グリコシル化、およびプロテアーゼによる分断の群から選択される、請求項３５または３６に記載の分析方法。
【請求項４０】
前記タンパク質を、抗体および／またはアプタマーによって認識する、請求項３９に記載の分析方法。
【請求項４１】
少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質ならびに少なくとも１つの阻害物質を含むサンプルの阻害効果を減少させる方法であって、以下の工程：
Ａ）少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質および少なくとも１つの阻害物質を含むサンプルを準備する工程と、
Ｂ）前記サンプルを液体または固体の組成物と接触させて液体サンプル調製物を産生する工程と、ここで、前記液体サンプル調製物が、ｐＨ７．１とｐＨ１４との間、好ましくは、ｐＨ７．１とｐＨ１２との間、特に好ましくは、ｐＨ７．４とｐＨ１０との間であること、ここで、前記組成物が、以下：
ａ）ポリアミン、
ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、
ｃ）これらの窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、
ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、
ｅ）カルボン酸アミン、
ｆ）無機アンモニウム塩、
ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、
ｈ）核酸に結合する抗生物質、
ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、および
２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物
からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含むこと
を含み、ここで、液体サンプル調製物中の阻害物質の阻害効果を減少させるように前記サンプルに添加する窒素化合物の量を選択する、阻害効果を減少させる方法。
【請求項４２】
前記サンプルは、液体サンプル調製物の組成物との接触前に溶解に供し、場合により、さらなる精製工程に供する生体サンプルである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１種の核酸またはタンパク質を、窒素化合物の添加前または添加中にキャリア材料に固定化する、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４４】
少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を液体サンプル調製物中に溶解および／または懸濁するような様式で前記サンプル調製物を生成する、請求項４１または４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記サンプルは、ケーシング中に少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質を含む生体サンプルであり、ライセート生成のための前記サンプルを、ライセート生成のための液体または固体の組成物と接触させる、請求項４１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記サンプルは核酸およびタンパク質からなる群由来の少なくとも２つの種を含み、前記溶解を、いくつかの所定の種の核酸および／またはタンパク質を産生されたライセート中に溶解または懸濁するような様式で行う、請求項４１または４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記サンプルは核酸およびタンパク質からなる群由来の少なくとも２つの種を含み、前記サンプル調製物の生成または溶解を、前記サンプル調製物またはライセート中に含まれる本質的に全種の核酸および／またはタンパク質を前記サンプル調製物またはライセート中に溶解および／または懸濁または固定するような様式で行う、請求項４１〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記少なくとも１種のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、前記サンプル調製物またはライセート中に溶解および／または懸濁または固定する、請求項４１または４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記少なくとも１種のタンパク質を、前記サンプル調製物またはライセート中に溶解および／または懸濁または固定する、請求項４１または４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記組成物が、さらなる溶解試薬として錯化剤、界面活性剤、容積制限物質、および／または溶媒の群の少なくとも１つの試薬を含む、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
前記溶解が、機械的影響下または酵素的様式で起こる、請求項４１〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５２】
前記サンプルを、前記溶解前に、洗浄緩衝液、好ましくは、低張洗浄緩衝液で洗浄する、請求項４１〜５１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５３】
産生されたサンプル調製物またはライセート中の前記窒素化合物の濃度が、０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、０．００１〜１００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜３０ｍＭ、特に、０．００１〜１９ｍＭまたは０．００１〜１５ｍＭである、請求項４１〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記少なくとも１つの核酸種が、ＤＮＡ種、特に、ｇＤＮＡ種および／またはＲＮＡ種である、請求項４１〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
ａ）前記ポリアミンが、２〜６個のアミノ基を有する開鎖および環状のポリアミドを含む群から選択され、
ｂ）前記アミノ酸が、αアミノ酸、特に、タンパク新生無極性および極性αアミノ酸からなる群、特に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、グリシン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸、およびトリプトファンからなる群から選択され、
ｃ）前記複素環式化合物が、５員環もしくは６員環、またはアネレーテッド（anellated）５員環を有する６員環の群から選択され、ここで、前記５員環、６員環、および／またはアネレーテッド（anellated）５員環が、１〜３個の窒素原子を含み、各環員が、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、＝Ｏ、−ＯＨ、＝Ｓ、−ＳＨ、＝ＮＨ、−ＮＨ2、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｏ−、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノからなる群から選択され、ここで、前記アルキル基が、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基であり、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、またはＪを含むことができ、前記複素環が、各５員環または６員環の基中にさらなるヘテロ原子として１つまたは複数のＯ原子またはＳ原子を含むことができ、前記複素環式化合物が、好ましくは、イミダゾール、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ピリミジン、ピリジン、２，３−ジメチルピラジン、チアゾール、２−アミノチアゾール、インダゾール、およびベンズイミダゾールからなる群から選択され、
ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミン中の残りのＲ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択され、同時にＨではないこと、
ｅ）前記カルボン酸アミンが、構造Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2を含み、ここで、Ｘは、−ＮＨ2、Ｃ1〜Ｃ5アルキル、Ｃ2〜Ｃ5アルケニル、Ｃ2〜Ｃ5アルキニル、またはアリール、好ましくは、フェニル、またはアミノ置換アリール、Ｈ2ＮＣ（＝Ｏ）−Ｙ−からなる群から選択され、ここで、Ｙは、−（ＣＨ2）n型のアルキレン基であってよく、ここで、ｎは、０〜１０、好ましくは、０〜５の範囲の整数であるか、Ｙは、Ｃ1〜Ｃ10アルケニレン基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ6アルケニレン基、またはアリール基であり、ここで、Ｘは、好ましくは、−ＮＨ2または２−アミノフェニルであり、
ｆ）無機アンモニウム塩は、硫酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、および炭酸アンモニウムからなる群から選択され、
ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩は、ベタイン、エクトイン、およびトリメチルアミンオキシドから選択され、
ｈ）前記核酸に結合する抗生物質は、ジスタマイシン、特に、ジスタマイシンＤ、マイトマイシン、ノルフロキサシン、ストレプトゾシン、ドゥオカルマシン、アクチノマイシン、およびアミノグリコシドからなる群から選択され、
ｉ）前記ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物は、チアゾトロプシン、トリイミダゾール、およびクロモマイシンからなる群から選択される、請求項４１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記窒素化合物が、
ａ）好ましくは、２〜６個のアミノ基を有する非分岐ポリアミン、特に、スペルミジンを含む群から選択されるポリアミン、
ｂ）極性、アルカリ性、および酸性のアミノ酸、特に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、
ｃ）イミダゾールおよび２，３−ジメチルピラジン、ピリミジン、およびグアニンの群から選択される複素環式化合物、または
ｈ）ジスタマイシン、特に、ジスタマイシンＤ、マイトマイシン、ノルフロキサシン、ストレプトゾシン、ドゥオカルマシン、アクチノマイシン、およびアミノグリコシドからなる群から選択される核酸に結合する抗生物質
の群から選択される、請求項４１〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
サンプル中の１種または複数の種の核酸および／またはタンパク質を検出するための分析方法であって、
ａ）少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質を含むサンプル調製物またはライセートを準備する工程と、前記サンプル調製物またはライセートの阻害効果を、請求項４１〜５６のいずれか１項に記載の方法を使用して減少させること、
ｂ）少なくとも１つの核酸または少なくとも１つのタンパク質の検出に適切な反応または反応系列で前記サンプル調製物を使用する工程と
を含む、分析方法。
【請求項５８】
サンプル調製物中に含まれる核酸種および／またはタンパク質種数の減少またはサンプル調製物からの核酸および／またはタンパク質材料の分解の不活化のために、さらなる方法工程を行うことなく前記工程ｂ）において前記サンプル調製物またはライセートを直接使用する、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
少なくとも１つの核酸または少なくとも１つのタンパク質の検出に適切な前記反応または反応系列が、核酸結合反応、特に、核酸ハイブリッド形成、特に、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、またはオリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリッド形成の群、核酸の酵素的修飾または重合、特に、配列決定反応、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写、制限エンドヌクレアーゼ分断の群、増幅反応、特に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、３ＳＲ（配列持続自己複製）、２ＳＲ、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＭＤＡ（多置換増幅）、ローリングサークル増幅、およびローリング転写増幅の群から選択される、請求項５７または５８に記載の分析方法。
【請求項６０】
少なくとも１つのタンパク質の検出に適切な前記反応または反応系列が、タンパク質結合反応、特に、タンパク質認識、特に、他のタンパク質によるタンパク質の認識、タンパク質、抗体、アプタマー、リガンド、核酸（特に、ウェスタンブロッティング）、または他の物質（グルタチオンおよびＮＡＤなど）の酵素活性に基づいた反応の群から選択されるか、タンパク質の修飾またはプロセシング、特に、（脱）リン酸化、（脱）グリコシル化、およびプロテアーゼによる分断の群から選択される、請求項５７または５８に記載の分析方法。
【請求項６１】
前記サンプル調製物またはライセートが、ｇＤＮＡに加えてＲＮＡを含み、工程ｂ）で、酵素を使用した核酸の反応系列を含む、請求項５７〜５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記工程ｂ）中の反応系列が、以下の工程：
ｂ１）任意選択的なｇＤＮＡの酵素分解、およびそれに次ぐ
ｂ２）ＲＮＡ検出のための逆転写またはＲＴ−ＰＣＲ、特に、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ
を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記サンプル調製物またはライセートが、少なくとも１つの種のタンパク質を含み、前記工程ｂ）中の反応または反応系列が、工程ｂ１）少なくとも１つの抗体またはアプタマーによる結合を含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６４】
少なくとも１つの第１の核酸種および第１の種と異なる第２の核酸種を含むサンプル中の少なくとも１種の核酸の選択的マスキング方法であって、以下の工程：
Ａ）少なくとも２つの異なる種の核酸を含むサンプルを準備する工程と、
Ｂ）前記サンプルを液体または固体の組成物と接触させて液体サンプル調製物を産生する工程と、ここで、前記液体サンプル調製物が、ｐＨ７．１とｐＨ１４との間、好ましくは、ｐＨ７．１とｐＨ１２との間、特に好ましくは、ｐＨ７．４とｐＨ１０との間であること、ここで、前記組成物が、以下：
ａ）ポリアミン、
ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、
ｃ）これらの窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、
ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、
ｅ）カルボン酸アミン、
ｆ）無機アンモニウム塩、
ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、
ｈ）核酸に結合する抗生物質、
ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、および
２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物
からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含むこと
を含み、ここで、前記サンプル調製物を、前記第１および第２の核酸種を前記液体サンプル調製物中に溶解および／または懸濁するような様式で生成し、
ここで、前記窒素化合物の量を、同一の検出方法と比較して、前記第１の核酸種を、前記窒素化合物を前記サンプルに添加しない核酸の検出方法の改善された様式で検出することができる様式で前記第２の核酸種をマスキングするように選択する、方法。
【請求項６５】
前記サンプルは、組成物との接触前に溶解に供し、場合により、さらなる精製工程に供する生体サンプルである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記サンプルは、ケーシング中に核酸種を含む生体サンプルであり、前記サンプルを、液体または固体の組成物と接触させてライセートを産生する、請求項６４または６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記サンプルは核酸およびタンパク質からなる群由来の少なくとも２つの種を含み、前記溶解を、いくつかの所定の種の核酸および／またはタンパク質を産生されたライセート中に溶解または懸濁するような様式で行う、請求項６４または６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記サンプルは核酸およびタンパク質からなる群由来の少なくとも２つの種を含み、前記溶解を、前記サンプル中に含まれる本質的に全種の核酸および／またはタンパク質をサンプル調製物またはライセート中に溶解および／または懸濁または固定するような様式で行う、請求項６４〜６７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６９】
ａ）前記第１の核酸種がＤＮＡ種であり、前記第２の核酸種がＲＮＡ種またはＰＮＡ種であるか、
ｂ）前記第１の核酸種がＲＮＡ種であり、前記第２の核酸種がＤＮＡ種またはＰＮＡ種であるか、
ｃ）前記第１の核酸種がＰＮＡ種であり、前記第２の核酸種がＤＮＡ種またはＲＮＡ種であるか、
ｄ）前記第１の核酸種および第２の核酸種がＤＮＡ種であるか、
ｅ）前記第１の核酸種および第２の核酸種がＲＮＡ種であるか、
ｆ）前記第１の核酸種および第２の核酸種がＰＮＡ種である、請求項６４〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記組成物が、さらなる溶解試薬として錯化剤、界面活性剤、容積制限物質、および／または溶媒の群の少なくとも１つの試薬を含む、請求項６４〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
前記溶解が、機械的影響下または酵素的様式で起こる、請求項６４〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記サンプルを、前記溶解前に、洗浄緩衝液、特に、低張洗浄緩衝液で洗浄する、請求項６４〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
生成されたサンプル調製物またはライセート中の前記窒素化合物の濃度が、０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、０．００１〜１００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜３０ｍＭ、特に、０．００１〜１９ｍＭまたは０．００１〜１５ｍＭである、請求項６４〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
ａ）前記ポリアミンが、２〜６個のアミノ基を有する開鎖および環状のポリアミドを含む群から選択され、
ｂ）前記アミノ酸が、αアミノ酸、特に、タンパク新生無極性および極性αアミノ酸からなる群、特に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、プロリン、グリシン、アラニン、グルタミン、グルタミン酸、およびトリプトファンからなる群から選択され、
ｃ）前記複素環式化合物が、５員環もしくは６員環、またはアネレーテッド（anellated）５員環を有する６員環の群から選択され、ここで、前記５員環、６員環、および／またはアネレーテッド（anellated）５員環が、１〜３個の窒素原子を含み、各環員が、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、Ｃ（Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、＝Ｏ、−ＯＨ、＝Ｓ、−ＳＨ、＝ＮＨ、−ＮＨ2、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｏ−、Ｃ1〜Ｃ6−アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノからなる群から選択され、ここで、前記アルキル基が、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基であり、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、またはＪを含むことができ、前記複素環が、各５員環または６員環の基中にさらなるヘテロ原子として１つまたは複数のＯ原子またはＳ原子を含むことができ、前記複素環式化合物が、好ましくは、イミダゾール、アデニン、グアニン、チミン、シトシン、ピリミジン、ピリジン、２，３−ジメチルピラジン、チアゾール、２−アミノチアゾール、インダゾール、およびベンズイミダゾールからなる群から選択され、
ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、残りのＲ1、Ｒ2、およびＲ3が、ＨおよびＣ1〜Ｃ3アルキル基からなる群から互いに独立して選択され、
ｅ）前記カルボン酸アミンが、構造Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2を含み、ここで、Ｘは、−ＮＨ2、Ｃ1〜Ｃ5アルキル、Ｃ2〜Ｃ5アルケニル、Ｃ2〜Ｃ5アルキニル、またはアリール、好ましくは、フェニル、またはアミノ置換アリール、Ｈ2ＮＣ（＝Ｏ）−Ｙ−からなる群から選択され、ここで、Ｙは、−（ＣＨ2）n型のアルキレン基であってよく、ここで、ｎは、０〜１０、好ましくは、０〜５の範囲の整数であるか、Ｙは、Ｃ1〜Ｃ10アルケニレン基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ6アルケニレン基、またはアリール基であり、ここで、Ｘは、好ましくは、−ＮＨ2または２−アミノフェニルであり、
ｆ）無機アンモニウム塩は、硫酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、および炭酸アンモニウムからなる群から選択され、
ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩は、ベタイン、エクトイン、およびトリメチルアミンオキシドから選択され、
ｈ）前記核酸に結合する抗生物質は、ジスタマイシン、特に、ジスタマイシンＤ、マイトマイシン、ノルフロキサシン、ストレプトゾシン、ドゥオカルマシン、アクチノマイシン、およびアミノグリコシドからなる群から選択され、
ｉ）前記ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物は、チアゾトロプシン、トリイミダゾール、およびクロモマイシンからなる群から選択される、請求項６４〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
前記窒素化合物が、
ａ）好ましくは、２〜６個のアミノ基を有する非分岐ポリアミン、特に、スペルミジンを含む群から選択されるポリアミン、
ｂ）極性、アルカリ性、および酸性のアミノ酸、特に、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、
ｃ）イミダゾールおよび２，３−ジメチルピラジン、ピリミジン、およびグアニンから選択される複素環式化合物、または
ｈ）ジスタマイシン、特に、ジスタマイシンＤ、マイトマイシン、ノルフロキサシン、ストレプトゾシン、ドゥオカルマシン、アクチノマイシン、およびアミノグリコシドからなる群から選択される核酸に結合する抗生物質
からなる群から選択される、請求項６４〜７４のいずれか１項に記載の差分分析方法。
【請求項７６】
サンプル中の少なくとも１種または複数の種の核酸を検出するための差分分析方法であって、
ａ）少なくとも１種の核酸および第２の核酸種を含むサンプル調製物を準備する工程と、ここで、前記第１の核酸種が前記第２の核酸種と異なること、前記第１の核酸種を、請求項６４〜７５のいずれか１項に記載の方法を使用してマスキングすること、および
ｂ）前記第２の核酸の検出に適切な反応または反応系列中で前記サンプル調製物またはライセートを使用する工程と
を含む、分析方法。
【請求項７７】
サンプル調製物中に含まれる核酸種数の減少および／または核酸分解する材料の除去または不活化のために、さらなる方法工程を行うことなく工程ｂ）を行う、請求項７６に記載の差分分析方法。
【請求項７８】
さらなる調製工程を使用することなく第２の核酸を検出するために、反応または反応系列で前記サンプル調製物またはライセートを直接使用する、請求項７６または７７に記載の差分分析方法。
【請求項７９】
少なくとも第２の核酸の検出に適切な前記反応または反応系列が、核酸結合反応、特に、核酸ハイブリッド形成、特に、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、またはオリゴヌクレオチドとプローブとのハイブリッド形成の群、核酸の酵素的修飾または重合、特に、配列決定反応、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写、制限エンドヌクレアーゼ分断の群、増幅反応、特に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、３ＳＲ（配列持続自己複製）、２ＳＲ、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＭＤＡ（多置換増幅）、ローリングサークル増幅、およびローリング転写増幅の群から選択される、請求項７６〜７８のいずれか１項に記載の差分分析方法。
【請求項８０】
前記第２の核酸種の検出のために工程ｂ）で使用される反応または反応系列は、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである、請求項７６〜７９のいずれか１項に記載の差分分析方法。
【請求項８１】
サンプル調製物またはライセート中で、前記第１の核酸種がｇＤＮＡであり、前記第２の核酸種がＲＮＡであり、工程ｂ）では、前記反応または反応系列は、ＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲである、請求項７６〜８０のいずれか１項に記載の差分分析方法。
【請求項８２】
前記窒素化合物は、請求項６３、７３、および７４で定義したポリアミン、複素環、アミノ酸、カルボン酸アミド、およびアンモニウム化合物の群から選択され、好ましくは、スペルミジン、硫酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、グリシン、２，３−ジメチルピラジン、ベンズイミダゾール、イミダゾール、アルギニン、ヒスチジン、および尿素からなる群から選択される、請求項８１に記載の差分分析方法。
【請求項８３】
サンプル調製物またはライセート中で、前記第１の核酸種がＲＮＡであり、前記第２の核酸種がＤＮＡ、好ましくはｇＤＮＡであり、工程ｂ）では、前記反応または反応系列は、ＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＰＣＲである、請求項７６〜８０のいずれか１項に記載の差分分析方法。
【請求項８４】
前記窒素化合物が、請求項１、１０、および１１で定義した複素環、アミノ酸、およびアンモニウム化合物の群から選択され、好ましくは、プロリン、インダゾール、および硫酸アンモニウムからなる群から選択される、請求項８３に記載の差分分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生体分子を含むサンプルの処理方法に関する。本発明は、さらに、生体サンプルの溶解方法、核酸および／またはタンパク質の安定化方法、核酸および／またはタンパク質を含むサンプルの阻害効果を減少させる方法、核酸の差分マスキング方法、ならびに前記方法を基礎する、またはこれらの方法を取り入れた分析方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
細胞の遺伝的原因および機能活性を、例えば、その核酸またはタンパク質としての生体分子の研究によって決定し、説明することができることが長年にわたって知られている。これらの分子の分析により、細胞活性の起源に直接利用することができる。したがって、これらは、例えば、代謝産物の検出などの従来の間接的方法よりも優れている。これにより、以前の核酸およびタンパク質分析が広く使用されるようになった。したがって、生体分子分析は、既に多くの領域（例えば、医学的および臨床的診断、薬物の開発および評価における薬創学、食品分析および食糧生産の管理、農作物および家畜の育種における農学、環境分析、ならびに多数の研究領域）で使用されている。
【０００３】
遺伝子の活性を、例えば、細胞中のＲＮＡ、特に、ｍＲＮＡの分析によって直接決定することができる。最新の分子生物学的方法（例えば、リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（「リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ」）または遺伝子発現チップ分析）による細胞中の転写サンプル（ｍＲＮＡサンプル）の定量的分析により、例えば、誤って発現した遺伝子を認識し、それにより、例えば、代謝障害、感染症、または癌の形成を認識することができる。分生成物学的方法（例えば、ＰＣＲ、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、または配列決定）による、例えば、細胞由来のＤＮＡの分析により、例えば、遺伝的欠陥を裏付け、ＨＬＡ型および他の遺伝子マーカーを決定することができる。
【０００４】
ゲノムＤＮＡおよびＲＮＡの分析を、病原菌（ウイルス、細菌など）の直接的検出のためにも使用する。
【０００５】
これは、これらの生体分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質）を対応する分析方法に利用させる生体サンプル由来の生体分子の全分析方法のための条件である。細胞または生物の成分を、通常、内容物が分析媒質中に存在する（例えば、細胞または生物から分析媒質に移行する）場合に限って分析することができる。内容物が生物または細胞の内側ではなく外側に存在し、生物または細胞の内容物が分析のために自由に利用できるように、この目的のために細胞／生物を分解する。生物または生物の一部（例えば、細胞）の分解は溶解とも呼ばれ、分解された生物はライセートとも呼ばれる。
【０００６】
サンプル（生物）の分解は、以下の２つの論点のために、できるだけ完全に行うべきである：（１）例えば、恐らく生物の全ての部分の内容物がサンプル中に放出されるように、生物サンプルの全領域を分解すべきである。（２）例えば、生物サンプルの分解は、内容物が分析に利用可能となる場合に限って完了する。生物を分解したが、例えば、細胞区画によって依然として覆われている場合、定量的様式で内容物を分析することができない。
【０００７】
現在、いくつかの溶解方法が公知である。分析すべき内容物の清浄化は、分析に反作用する全物質から内容物を遊離するためのほとんどの溶解方法に従う。いくつかの例を以下に記載する。
【０００８】
（Ａ）界面活性剤での溶解：界面活性剤は、疎水性細胞膜を溶解し、その結果、細胞の内容物を環境に流出させる両親媒性分子である。例えば、非イオン性界面活性剤およびイオン性界面活性剤がこれに属する。界面活性剤であるｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ドデシル硫酸ナトリウム（ドデシル硫酸ナトリウム、ＳＤＳ）、または陽イオン性界面活性剤（例えば、Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ））は、特に、生物の分解のためにされに使用されている。陽イオン性界面活性剤を使用した多くの方法が記載されており、生物の溶解および核酸（ＮＡ）の単離について特許を受けている。核酸を、例えば、その保護および清浄化のために、陽イオン性界面活性剤によって複合体化することができる。以下の米国特許および米国特許出願に記載の方法は、これらの方法の一部である：米国特許第６，６０２，７１８、米国特許第６，６１７，１７０号、米国特許第５，０１０，１８３号、米国特許第５，９８５，５７２号、米国特許第５，３００，６３５号、米国特許第５，７２８，８２２号、ならびに米国特許出願２００２／０１４６６７７Ａ１号、米国特許出願２００４／００４８３８４Ａ１号、米国特許出願２００４／０１１５６８９Ａ１号、米国特許出願２００４／００１４７０３号。アンモニウム塩（例えば、Ｎ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ，−トリメチル−アンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ））を使用した溶解方法は、少なくとも６個のＣ原子のより長い炭化水素鎖を含む両親媒性アンモニウム塩を使用する。
【０００９】
Ｂ）水での溶解：水での溶解時に、これらを包む細胞の半透膜の性質を使用する。これらの膜は、透水性を示すが、塩またはより大きな分子を透過させない。塩および他のより大きな分子のその内容物内の細胞が細胞内よりも塩濃度が低い液体に移動した場合、細胞内外の塩濃度が釣り合うまで、細胞は水を吸収する。細胞内液と細胞外液との間の濃度の相違が十分に大きい場合、細胞は、破裂するまで水を吸収する。
【００１０】
Ｃ）有機溶媒での溶解：疎水性細胞膜を、有機溶媒によって破壊することができる。膜の脂質および膜の親油性タンパク質成分は、有機相に吸収される。細胞内容物のほとんどが親水性相または親油性相と親水性相との間の境界層に留まる。しばしば、この溶解型と共にフェノールを使用する。
【００１１】
Ｄ）カオトロピック塩での溶解：カオトロピック塩は、水素結合の形成に基づいて水の構造を破壊し、その結果、膜の二重層構造をもはや維持できない。それにより、これらの膜が溶解されて溶解が起こり、それにより、細胞内容物がカオトロピック環境に流れ込む。この方法を、多数の核酸およびタンパク質の単離方法（例えば、市販のＲＮｅａｓｙ（登録商標）、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）、またはタンパク質清浄化のための細胞の変性分解方法）と共に使用する。
【００１２】
所与の量の生体分子（ＤＮＡまたはＲＮＡなど）の検出または単離に必要な量をさらに減少させることができるので、関連する細胞の内容物ができるだけ完全にライセートに移行した得られたライセートを使用して実施する以下の清浄化工程または検出反応が望ましい。
【００１３】
生体分子（例えば、核酸およびタンパク質）の定量分析および定性分析に関して、その完全性の保存は非常に重要である。特に、ＤＮＡなどの核酸、より広い範囲では、ＲＮＡは、その天然の環境からの生体サンプルの除去後に異なる影響を受け、ＤＮＡまたはＲＮＡが変化または分解し得る。例えば、溶解時にサンプル中で起こる剪断力の影響下でのこれらの核酸の酵素的分解またはＤＮＡの分解が言及されている。
【００１４】
核酸およびタンパク質の完全性の保存を、（Ａ）ＮＡまたはタンパク質の清浄、（Ｂ）脱水、（Ｃ）分解酵素からの防御、または（Ｄ）複合体化によって達成することができることが知られている。これを以下に手短に記載する。
【００１５】
（Ａ）核酸またはタンパク質の清浄化：清浄時に、核酸またはタンパク質を、生体サンプル中に含まれ、且つ核酸またはタンパク質の完全性を恒久的に損ない得る全ての物質または分子から遊離する。これらの清浄化方法は、例えば、アフィニティクロマトグラフィ、タンパク質塩析法、固相での核酸またはタンパク質の清浄化である。固相は、例えば、米国特許第５，９９０，３０１号および米国特許第６，０２０，１８６号に記載のイオン交換体であり得る。あるいは、多孔質マトリックスの使用は、例えば、米国特許第６，１８０，７７８号または米国特許第５，４９６，５６２号に記載されている。
【００１６】
（Ｂ）脱水：核酸またはタンパク質の脱水により、核酸またはタンパク質を有するサンプルを水に溶解した場合に起こり得る損傷過程が遮断または防止される。これらの損傷過程は、例えば、プロテアーゼまたはヌクレアーゼによる酵素分解である。したがって、単離された核酸を、例えば、塩およびアルコールを用いた沈殿（沈殿）によって脱水することができる（Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅ．ｇ．ｐ．１．６．１．Ａｌｋａｌｉｎｅ  ｌｙｓｉｓ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ）。脱水によって生体サンプル（例えば、組織の一部または顕微鏡用切片）の分解から核酸を保護することもできる。これは、例えば、米国特許第６，５２８，６４１号に記載されている。試薬を、米国特許に記載の方法においてインタクトなサンプルに浸透させ、それにより、脱水するだけでなく、タンパク質が沈殿し（例えば、ヌクレアーゼが影響する）、タンパク質が不活性様式で脱水サンプル中に存在する。脱水剤としての硫酸アンモニウムの使用は、米国特許に特に記載されている。米国特許出願番号２００２／１９７６３７号に記載のＤＮＡの清浄化でＤＮＡが沈殿する。この清浄化は、清浄化のためにポリアミンを使用し、このポリアミンによってＤＮＡが濃縮され、機械的崩壊を使用して剪断によるＤＮＡの損傷を回避する。
【００１７】
（Ｃ）分解酵素からの防御：プロテアーゼおよびヌクレアーゼ（核酸を崩壊させる酵素）が特に阻害され得ることが知られている。したがって、ＤＮアーゼＩを、例えば、Ｍｇ2+またはＣａ2+錯化剤によって阻害することができる。ＲＮアーゼを、例えば、特異的ＲＮアーゼインヒビターまたは還元剤によって阻害することができる。これらのインヒビターは、米国特許第５，５５２，３０２号および米国特許第６，７７７，２１０号に記載されている。
【００１８】
（Ｄ）複合体化：別の種類の清浄化によって第四級アミン塩と複合体化し、核酸防御のためのミセルが形成される。したがって、核酸の複合体化により、ヌクレアーゼから防御される。陽イオン性界面活性剤として機能する第四級アンモニウム塩を使用し、ミセルを形成する。これについて、第四級アンモニウム塩が置換基として少なくとも１つの長鎖炭素鎖を有することが必要である。米国特許第６，６０２，７１８号、米国特許第６，６１７，１７０号、米国特許第５，０１０，１８３号、米国特許第５，９８５，５７２号、米国特許第５，３００，６３５号、米国特許第５，７２８，８２２号、米国特許出願２００２／０１４６６７７Ａ１号、米国特許出願２００４／００４８３８４Ａｌ号、米国特許出願２００４／０１１５６８９号、および米国特許出願２００４／００１４７０３Ａ１号は、これらの方法または類似の方法に属すると見なされる。
【００１９】
米国特許第６，８２１，７５２号は、両親媒性アミン、すわなち、類似の様式において界面活性剤として作用する化合物の存在下でのタンパク質の清浄化および抽出を記載している。
【００２０】
核酸またはタンパク質の分離または複合体化のために提供された化合物は、その後に行われる単離方法または分析方法に関してできるだけ不活性で挙動すべきである（すなわち、その後の単離または分析に不利な影響を及ぼすべきではない）という点で制限される。そうでなければ、化合物は、さらなる再生工程で脱複合体化されなければならない。
【００２１】
上記技術は、生体サンプル由来の核酸およびタンパク質の十分な安定化には、通常、サンプルが分裂されるさらなる認識工程が必要であることを示す。したがって、これらのさらなる認識工程を不必要にし、できるだけ多目的に使用することができる安定化試薬を使用する安定化方法が有利である。
【００２２】
核酸またはタンパク質を含むサンプルなどの生体分子の分析で起こり得るさらなる問題は、第１の生体分子型がこのようなサンプル中の第２の生体分子型によって損なわれ得るという事実である。時折、第２の生体分子型も分析すべきであり、それにより、第１または別の型の生体分子が分析時に破壊するように作用する。これを明白にするために、多くの例のうちの一例を本明細書中に記載する。サンプルは、一定の生物の細胞を含む。核酸に結合するタンパク質の存在下でのオリゴヌクレオチドによるこれらの細胞の核酸の検出は、例えば、不利な様式で影響を及ぼし得る。この例において一定のＤＮＡ種を検出すると仮定すると、ＤＮＡに結合するタンパク質は阻害物質である。別の例（例えば、ＤＮＡに結合するタンパク質の分析）では、ＤＮＡに結合するタンパク質に結合することができるＤＮＡは、この場合では核酸が阻害物質として作用し、分析結果を歪曲し得るので、分析結果に悪影響を及ぼし得る。
【００２３】
異なる生体分子間のこれらの不利な相互作用を排除するための有用な方法は、妨害を回避するために互いに影響を及ぼす生体分子を分離することである。したがって、これらの方法は、しばしば、一定の生体分子種をサンプルから除去する清浄化工程を提供する。含有する生体分子の濃度は分離方法によって変化するので、所望の生体分子が富化されるが、他の生体分子の濃度が減少する。生体分子の公知の分離方法には、以下の方法が含まれる。
（Ａ）塩析法による生体分子の分離。塩析法を使用して、一定量の塩によってサンプルから沈殿し得る生体サンプルの一部を分離する。一方では、これらの方法を使用して、塩を使用して清浄化されるべき部分を沈殿させることができる。タンパク質の硫酸アンモニウム沈殿は、このような公知の方法である。他方では、この方法を逆方向で使用して、清浄化すべき材料を複数の夾雑分子から遊離することができるが、材料自体は沈殿しない。これの例は、ＤＮＡ単離時の酢酸カリウムによるタンパク質沈殿である。
【００２４】
（Ｂ）クロマトグラフィによる生体分子の分離：生体分子を、その性質によって、いくつかのクロマトグラフィ法によって清浄化および分離することができる。これらの性質は、一例を挙げると、そのサイズ、電荷、疎水性、または一定の表面またはハプテンに対する親和性を考慮することができる。クロマトグラフィを、イオン交換クロマトグラフィを例として説明する。イオン交換クロマトグラフィによって清浄化すべき一連の化学的生体分子には２つの可能性がある。単離すべき生体分子は一方でイオン交換クロマトグラフィ材料に結合するのに対して、夾雑物質は結合せず、このような様式（例えば、負電荷の核酸の清浄化のための陰イオン交換クロマトグラフィ）で単離すべき生体分子を分離することができる。他方では、夾雑物質をクロマトグラフィ材料に結合させ、単離すべき生体分子を通過させるか、洗浄緩衝液によって洗浄することもできる（例えば、負電荷の核酸の清浄化のための陽イオン交換クロマトグラフィ）。このような方法の例は、米国特許５，９９０，３０１号およびＷＯ０２４８１６４号に記載されている。
【００２５】
（Ｃ）固相での生体分子の分離：多数の表面は、所定の結合環境下で一定の生体分子に結合することができる性質を有する。これらの結合特性を、生体分子の清浄化に使用することができる。これを、本明細書中で、シリカ表面での核酸の清浄化の例を用いて説明する。シリカ表面（微粒子または膜）は、高濃度のカオトロピック塩の存在下で核酸に結合することができる。しかし、他の分子（例えば、タンパク質）はこれらの表面に結合せず、それにより分離される。核酸を、シリカ表面の洗浄後に純粋な形態で得ることができる。この例は、米国特許第５，９９０，３０１号、米国特許第６，０２０，１８６号、および米個６，１８０，７７８号に記載されている。
【００２６】
（Ｄ）選択的複合体化による生体分子の分離：いくつかの分離方法は、生体分子を選択的に複合体化し、その結果、これらを、遠心分離工程または濾過工程によってサンプルの他の成分から分離することができる。これについての例は、米国特許第５，７２８，８２２号および米国特許第５，９８５，５７２号に記載されている。
【００２７】
ＲＮＡを含むサンプルにおいて阻害効果を中和するための硫酸アンモニウムの使用は、米国特許出願２００２／０１１５８５１号に記載されている。これらのサンプルは、精製されたＲＮＡを含む。しかし、無機アンモニウム塩（例えば、硫酸アンモニウム）がポリメラーゼ活性（例えば、３’−５’エクソヌクレアーゼ活性）の一部を変化させ、それにより、硫酸アンモニウムの存在がその後の分析のために行われるポリメラーゼ反応に不利な影響を及ぼし得ると文献に記載されている（Ｔｓｕｒｕｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，’’Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏＦ  ｔｈｅ  Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃａｔａｌｙｔｉｃ  Ｓｕｂｕｎｉｔ’’，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ  ６７，Ｎｏ．８，１９９３，ｐ．４６５１−４６５８）。
【００２８】
記載の方法には事前の生体分子の分離が必要であり、この分離は不利な様式で検出反応に影響を及ぼし、この影響はサンプルに由来するかサンプルに由来すると推定される。したがって、サンプルを使用して信頼できる検出反応を行うことができるような手段で、サンプル中の一定の生体分子の阻害効果を除去することができる簡潔な方法が必要である。
【００２９】
核酸分離中にしばしば起こるさらなる問題は、リボ核酸（ＲＮＡ）およびデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）がその化学的性質が非常に類似する生体分子であるという事実において見出される。したがって、しばしば、これらを互いに分離することは困難である。それにもかかわらず、複数の適用のために、ＤＮＡを含まないＲＮＡまたはＲＮＡを含まないＤＮＡを産生することは最も重要である。ＲＮＡ調製物中のゲノムＤＮＡの夾雑は、例えば、ＲＴ−ＰＣＲ実験において定量的に誤った結果を生じ得る。
【００３０】
現在、ＤＮＡまたはＤＮＡを個別に富化することを可能にする多数の方法が存在する。異なる方法を原理によって区別することができる。一方では、ＤＮＡまたはＲＮＡを特異的に分解する酵素を使用することができる。これらの酵素は、ヌクレアーゼと呼ばれている。ＲＮＡ分解酵素はこれらのヌクレアーゼ（ＲＮアーゼ）に属し、ＤＮＡ分解酵素はＤＮアーゼに属する。例えば、ＤＮＡを清浄化する場合、清浄化方法において、ＲＮＡ分子を分解して小片にするＲＮアーゼを使用することができる。これらの方法を、一般に、例えば、プラスミドの単離またはゲノムＤＮＡの清浄化のために使用する。あるいは、ＲＮＡ調製物中のＤＮＡ夾雑物を、ＤＮアーゼＩを使用して加水分解する。この方法も一般に知られている。
他方では、ＲＮＡまたはＤＮＡの化学的性質の相違を利用する化学的方法を使用することができる。多数の固相清浄方法がこれらに属するものと見なされる。固相は、例えば、米国特許第５，９９０，３０１号および米国特許第６，０２０，１８６号に記載のイオン交換体または米国特許第６，１８０，７７８号および米国特許第５，４９６，５６２号に記載の多孔質マトリックスであり得る。
他の清浄化方法は、ＲＮＡまたはＤＮＡの異なる溶解挙動に関する。カオトロピック塩および酸性フェノールを含む水溶液の存在下でのＲＮＡの清浄化は、これらに属するものと見なされ、この清浄化により、ゲノムＤＮＡは境界相に富化され、ＲＮＡは水溶液中に残存する（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ  Ｐ．＆  Ｓａｃｃｈｉ  Ｎ．，１９８７，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９８７  Ａｐｒｉｌ；１６２（１）：１５６−９，’’Ｓｉｎｇｌｅ  ｓｔｅｐ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｂｙ  ａｃｉｄ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ  ｐｈｅｎｏｌ  ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ  ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ’’）。
他の方法は、ＲＮＡまたはＤＮＡの選択的沈殿に基づく。この例は、生体分子の阻害または生体分子の安定化のための脱複合体化と組み合わせて上に既に記載している。
【００３１】
これらの方法には、異なる生体分子の相対的組成物、特に、異なる核酸またはタンパク質を所望の効果を得るために非常に変化させる分離方法も含まれる。方法の実行可能性は、分離のために使用した試薬が所望の検出反応に負の影響を及ぼすかどうかに依存し得、それにより、例えば、分析方法のための一定のサンプル調製に利用可能な試薬数は制限される。各方法のサンプルの分離工程はまた、さらなる費用に加えて夾雑リスクを有し、それにより、極度に清潔で制御された操作が必要となる。
【００３２】
異なる態様によれば、生体分子を含むサンプルのサンプル調製のさらなる改良、生体分子の処理、調製、および分析方法の改良が必要である。
【発明の開示】
【００３３】
本発明は、請求項１に記載のその後に続く調製、処理、または分析方法のためのサンプル調整方法、請求項２に記載の生体サンプルの溶解方法、請求項１６に記載の分析方法、請求項２０に記載の核酸および／またはタンパク質の安定化方法、請求項３５に記載の分析方法、請求項４１に記載のサンプルの阻害効果の減少方法、請求項５７に記載の分析方法、請求項６４に記載の選択的マスキング方法、および請求項７６に記載の差分分析方法を使用してこの目的を解決する。
本発明のさらなる有利な態様、詳細、および特徴は、従属クレーム、説明、実施例、および図面によってもたらされる。
【００３４】
本発明の個別の態様を記載する前に、本発明が理解されるように、以下の用語を説明する。
【００３５】
生物：生物を、核酸および／またはタンパク質を含む任意の形態のケーシングと定義する。これらには、例えば、ウイルス、ファージ、細胞、細胞形式、または生物全体が含まれる。これらの生物を、生きた状態、死んだ状態、またはその静止状態で使用することができる。これらの生物は溶液またはペレットであり得るか、固相に会合するか結合することもできる。「生物」を本発明の範囲内で言及する場合、同型のいくつかの生物、異なる型のいくつかの生物であり得るか、１つの生物であり得る。生物は、始原細菌、原核生物、または真核生物で見出され得る。生物は、動物、植物、または内部共生体（例えば、ミトコンドリアまたはプラスミド）を起源とし得る。そのうちで、本発明という意味での生物は、例えば、個別の細胞、細胞アセンブリ、組織、または動物全体または生物全体、培養細胞、排泄物または分泌物(例えば、安定化および非安定化血液、血清、血漿、組織液、精子、標本、痰、唾液、涙、尿、便、毛髪または毛根、フケ、頬側標本、軟膜など）である。
【００３６】
細胞物質：本発明の範囲内の細胞物質は、生物内で生じるか環境に送達され得る外因性物質の混合物（例えば、組織液、血漿、唾液、精子、分泌物など）である。細胞物質は、全ての成分（例えば、核酸、タンパク質、ならびに他のポリマーおよび代謝産物）を含む。生物のケーシングに割り当てられるべき物質（例えば、ケーシング、特に膜、キャプシド、細胞壁、細胞基質など）もこれらに属する。
【００３７】
生体分子：生体分子は、検出方法（例えば、増幅）によって得られた生物またはその変換産物に由来する分子である。生体分子は、例えば、核酸もしくはタンパク質または生物由来の他の分子である。生体分子を、例えば、生物の溶解によって得ることができる。
【００３８】
核酸：核酸（ＮＡ）は、本発明の範囲内で、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ）、またはペプチド核酸（ＰＮＡ）が考えられる。デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）は生物中に天然に存在するが、これは生物外で発生するか、これらに付加することもできる。核酸の長さは異なり得る。核酸を、変化によって修飾することができる。例えば、核酸の１つまたは複数の核酸塩基を修飾することができる。核酸中の糖単位を、修飾するか（例えば、メトキシ基による）、例えば、ＰＮＡ中でさらに置換することができる。核酸は、類似物（例えば、非プリンもしくは非ピリミジン類似物またはヌクレオチド類似物（例えば、ＰＮＡ））を含み得る。ＤＮＡおよび／またはＲＮＡは、追加物（例えば、タンパク質またはアミノ酸）を含み得る。
用語「ＤＮＡ」は、本発明で理解されているように、天然型および非天然型にさらに分類することができ、それにより、天然に存在しない型（例えば、トランスフェクションまたは形質転換による）も生物に含めることができる。ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）は、生物のデザインを含む配列情報を含む。本発明の全配列に対応しない部分的領域を（この配列由来の非常に小さな部分的領域も）ゲノムＤＮＡと呼ぶ。本発明で理解されるように、ゲノムＤＮＡはまた、その修飾形態である。用語「ＤＮＡ」には、プラスミドＤＮＡも含まれる。プラスミドＤＮＡは、その「複製起源」を有する染色体外ＤＮＡである。本発明で理解されるように、プラスミドＤＮＡは、その修飾形態でもある。本明細書中で理解される、用語「ＤＮＡ」には、ｍｔＤＮＡまたはｐｔＤＮＡも含まれる。ｍｔＤＮＡまたはｐｔＤＮＡは、ミトコンドリアまたはプラスミド由来のゲノムＤＮＡである。ｍｔＤＮＡまたはｐｔＤＮＡは、本明細書中で理解されるように、その修飾形態でもある。
【００３９】
本明細書中で理解される、用語「ＲＮＡ」には、天然型および非天然型が含まれ、それにより、非天然型を生物に含めることができる（例えば、トランスフェクションによる）。ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、およびｒＲＮＡは、巨大なＲＮＡ分子（５０ｎｔ〜高ｋｂ）であり、これらを、コードされた起源由来のコピーとして産生することができる。本発明で理解されるように、ｍＲＮＡまたはｒＲＮＡは、その修飾形態でもある。
ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡなどは、翻訳中に有効な小さなＲＮＡ分子である。直鎖または分岐鎖の配置でのペプチド結合を介してさらなるアミノ酸に連結した各核酸（ＡＳ）をタンパク質と呼ぶ。タンパク質は、単量体、二量体、または多量体として存在することができ、それにより、ホモマーまたはヘテロマーを形成することができる。タンパク質は、天然に存在するタンパク質または合成タンパク質であり得る。タンパク質は、修飾形態で存在することができる。これらのタンパク質は、例えば、酵素、構造タンパク質、受容体、イオンチャネルおよび他の輸送体、細胞外基質タンパク質、転写調節因子、タンパク質結合核酸、ケーシングおよび保護タンパク質、貯蔵タンパク質などであり得る。
【００４０】
溶解：用語「溶解」は、核酸および／またはタンパク質が生物から環境に送られる本発明の過程である。それにより、生物の構造は破壊され得る（例えば、生物のケーシングを溶解することができる）。用語「溶解」は、本発明で、生物の構造を破壊することなく、細胞物質が小開口部（例えば、孔）を介して生物から流出し得る。孔を、例えば、溶解試薬によって作製することができる。さらに、本発明の用語「溶解」は、既に構造的に破壊されているようであるか小開口部を有する生物の核酸および／またはタンパク質を、添加物の使用によって流出することができることを意味する。ライセートは、溶解によって産生される。溶解過程は、酵素的、化学的、または物理的溶解方法を使用して行うことができる。
【００４１】
酵素的、化学的、または物理的溶解方法：本発明の用語「酵素的溶解方法」は、酵素を使用した生物の溶解または生体分子の放出を支持する過程である。すなわち、酵素溶解方法のための酵素は、生物の溶解または生体分子の放出を支持するという点で特徴づけられる。このような酵素は、例えば、プロテアーゼ、リゾチーム、グルカナーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、ヒアルロニダーゼ、コラゲナーゼ、ヌクレアーゼ、アミラーゼ、加水分解酵素、ペクチナーゼなどである。当業者は、本発明の生物の溶解または生体分子の放出を支持するさらなる酵素について理解している。これらの酵素を、生物から古典的様式またはバイオテクノロジー法によって得ることができる。これらの酵素は、遺伝的または化学的に変化した酵素および熱不安定性または熱安定性酵素である。
本発明の用語「化学的溶解方法」は、化学物質を用いて生物の溶解または生体分子の放出を支持する過程である。これらは、例えば、界面活性剤、酸、塩基、有機溶媒、カオトロピック物質などである。
本発明の用語「物理的溶解方法」は、物理的方法を用いて生物の溶解または生体分子の放出を支持する過程である。これらは、機械的および温度方法であるが、波長および圧力の相違効果に基づいた方法でもある。機械的溶解方法は、例えば、剪断または粉砕する方法（例えば、ミル、ナイフ、小カニューレ、篩、モルタル、または粒子を使用した衝撃）またはサンプルを均一にすることができる方法である。温度的溶解方法では、温度変化によって生物の溶解または生体分子の放出を引き起こす。これらは、例えば、加熱または（例えば、凝固点以下での）冷却に基づき得る。波長の効果に基づいた方法は、例えば、音波または電磁波を使用した処理である。圧力変化も溶解を支持することができる（例えば、圧潰または突然の圧力変化（例えば、フレンチプレス）の形態）。
当業者は、さらなる酵素的、化学的、または物理的溶解方法を理解しており、これらの方法を異なる組み合わせで使用することができることも公知である。
【００４２】
溶解緩衝液：用語「溶解緩衝液」は、一般に、本発明の溶解のために使用される。この液体は、異なる溶解試薬の溶液であり得る。溶解緩衝液は、ｐＨの調製のための緩衝液系を含むことができるが、含む必要はない。本発明の方法で使用される液体組成物は、例えば、「溶解緩衝液」であえる。
【００４３】
反応系：本発明の反応系は、サンプル中に含まれる成分を、生物学的、化学的、または物理的反応において修飾、同定、または変化させることができる全ての形態の系と理解すべきである。反応系は、少なくとも検出可能な量の分析すべき成分（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）を含む。
【００４４】
差分分析：差分分析は、少なくとも２つの異なる成分（例えば、核酸ＤＮＡおよびＲＮＡ）を含み、成分のうちの少なくとも１つ（例えば、上記核酸のうちの１つ）が分析されないサンプルが使用される反応系である。
【００４５】
核酸調製物またはタンパク質調製物：核酸調製物は、核酸を含むサンプルまたは核酸を含む材料の混合物の調製によって得られた核酸であり、調製は、核酸の１つまたは複数の所定の種が核酸調製物中で富化されるようにサンプルまたは材料の混合物中に含まれる異なる核酸またはタンパク質種の相対濃度が影響を受ける方法である。とりわけ、調製方法は、精製方法（例えば、シリカ膜（例えば、ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ．Ｇｅｒｍａｎｙから入手したＲｎｅａｓｙまたはＤＩＡａｍｐ（登録商標））によるサンプルからの核酸の清浄化であり、それにより、調製方法の前に材料混合物のサンプルと比較した核酸に関するタンパク質濃度が顕著に減少する。類似物は、タンパク質調製に適用する。
【００４６】
以下に、本発明の分析方法で使用することができる異なる核酸のハイブリッド形成または配列決定および合成方法を記載している。これらの方法は標準的な方法であり、ＴＡＡと絵羽、出願ＷＯ０１／４９８８０２号または米国特許第２００２／０１１５８５１号に記載されている。
【００４７】
結合反応：結合反応は、少なくとも２つの結合パートナー（例えば、ハイブリッド形成における２つの核酸分子または抗体抗原相互作用における２つのタンパク質、または結合反応におけるタンパク質および核酸）が相互作用する反応である。検出反応または定量を実施するためかこれを調製するために結合反応を行う。
サンプルがプローブによって結合することができるようにサンプルをプローブに接触させる。プローブを、簡潔なプローブ検出が可能な様式で修飾することができる。これらの修飾は、例えば、フルオロフォア、放射性物質、または酵素のカップリングであり得る。
【００４８】
核酸の第１の鎖は、酵素（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ、リガーゼなど）によるプライマー依存性核酸合成中に形成され、標的核酸と相補的な核酸鎖である。核酸の第２の鎖は、酵素によってプライマー依存性核酸合成中に形成され、第１の鎖の配列と相補的な核酸鎖である。
【００４９】
反応系で反応する（例えば、定義したプライマーまたはオリゴヌクレオチドに特異的に結合する）（すなわち、これとハイブリッド形成することができる）核酸は、標的核酸と見なされる。標的核酸は、この例では、酵素によるプライマー依存性核酸合成（例えば、ＤＮＡ−またはＲＮＡ依存性ＤＮＡ重合）を使用したプライマー結合後に合成されるべき核酸鎖のマトリックスとして役立ち、合成されるべき核酸鎖の配列は、標的核酸配列と相補的である。それにより、特異的結合は、標的核酸とプライマーまたはオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成部分が１００％相補的であることを意味しない。有用な結果を得るために、プライマーと標的核酸との間のハイブリッド形成領域中の最大で５０％までの塩基が相補的でなくてよい。プライマーと標的核酸とのハイブリッド形成部分の３０％未満の塩基が相補的でない場合、良好から非常に良好までの結果を達成することができる。プライマーと標的核酸とのハイブリッド形成部分の相補性がより高いほど、プライマーはより特異的且つ有効である。
【００５０】
一方では、標的配列は、プライマー結合位置を含む配列であり、他方では、プライマー結合位置の３’方向（下流）に存在する配列である。核酸配列は、プライマー依存性核酸合成時に形成され、標的配列に相補的である。
【００５１】
プライマーは、核酸合成のための出発物質である。これらは、主に、１つの一本鎖核酸分子の領域に相補的であり（上記を参照のこと）、これと反応して二本鎖を形成することができる短鎖の一本鎖オリゴリボヌクレオチドまたはオリゴデオキシリボヌクレオチドである。この二本鎖中の遊離３’ヒドロキシ末端は、核酸ポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の基質および全一本鎖の二本鎖への重合のための出発点として役立つ。プライマーは、一般に、標的核酸に連続的に結合することができるオリゴマーの出発分子と定義される。プライマーに結合する標的核酸の配列を、プライマー結合位置と呼ぶ。それにより、プライマーはまた、これら全てがプライマー結合位と同一または類似の配列を含む場合、異なる標的核酸と結合することができる。第１プライマーまたは一次プライマー（Ｐ１）を、「アンチセンスプライマー」と定義し、第２プライマーまたは二次プライマー（Ｐ２）を「センスプライマー」と定義する。
【００５２】
外側由来の反応に添加した二次プライマーＰ２または核酸の第１の鎖の逆折り畳みによって形成されたプライマー（いわゆる「ヘアピンループ」）のいずれかである「センスプライマー」は、二次鎖合成プライマーであると理解される。プライマー結合位置は、ハイブリッド形成によってプライマーに結合することができる標的核酸の配列である。プライマー結合位置の配列は、プライマー配列と、少なくとも３０％まで、好ましくは、少なくとも５０％、特に好ましくは、１００％相補的である。
【００５３】
プライマーのハイブリッド形成対は、プライマー標的とハイブリッド形成し、プライマー標的分子のプライマー結合位置の配列と少なくとも５０％の塩基が相補的なプライマーの配列部分である。プライマー標的分子は、酵素反応に導入される核酸分子である。これは、この反応の産物ではない。
【００５４】
酵素によって触媒されるプライマー依存性核酸合成（特に、ＤＮＡおよびＲＮＡ依存性）は、ｃＤＮＡ合成、ＤＮＡ配列決定、および適用方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）／ＲＴ−ＰＣＲまたは等温増幅方法であるＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、３ＳＲ（配列持続自己複製）、２ＳＲ（自己持続配列複製；３ＳＲに類似しているが、ＲＮアーゼＨを使用しない）、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＳＤＡ（鎖置換増幅）、ＬＣＲ（リガーゼ連鎖反応）、および関連する方法）との重要な反応である。プライマー依存性核酸合成の効率は、核酸重合酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）の活性、標的核酸、ならびにプライマーハイブリッド形成の効率および特異性に影響を受ける。以下に、プライマー依存性核酸合成過程についてのいくつかの適用例をより詳細に記載する。
【００５５】
プライマー依存性核酸合成反応は、例えば、一次および二次鎖ｃＤＮＡ合成、ＤＮＡ配列決定、プライマー結合に基づいた変異誘発過程、および他の方法で見出され得る。配列特異的に出発した核酸合成反応を、酵素（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ポリメラーゼ）を使用して行い、それにより、配列特異的に開始したＤＮＡ合成反応は、以下の工程を含む。
【００５６】
１．第１のプライマーＰ１のこれに相補的な標的核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の１つの配列への配列特異的ハイブリッド形成および２．酵素（例えば、ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）を使用して伸長すべきプライマーＰ１の遊離３’ＯＨ末端へのデオキシリボヌクレオチドの触媒的挿入によるプライマーＰ１の伸長であって、ここで、標的核酸がマトリックスとして役立ち、プライマーＰ１が標的核酸の一定の配列に相補的であり、且つ特異的様式でこの標的配列とハイブリッド形成することができる配列の全体または少なくとも３’領域を含み、ここで、プライマーＰ１は標的核酸に相補的ではなく、且つ標的核酸とハイブリッド形成できない配列の５’領域を含むことができ、さらなる機能を含むことができる。合成は、標的核酸（マトリックス）の末端に達するか、末端までに妨害され得、それにより、第１の鎖の核酸合成が終了する。
３．核酸の第２の鎖合成は、第２の鎖合成プライマー（ＺＰ）の配列特異的ハイブリッド形成によって開始される。第２の鎖合成プライマーは、反応に導入された個別のプライマーＰ２、標的核酸の分解産物、または核酸の第１の鎖の逆折り畳みによって形成されたプライマー（ヘアピンループ）であり得る。
４．酵素を使用して伸長されるべきＺＰの遊離３’−ＯＨ末端へのヌクレオチドの触媒組み込みによるＺＰの伸長であって、ここで、標的核酸の第１の鎖がマトリックスとして役立ち、ＺＰが標的核酸の一定の配列に相補的であり、且つ配列特異的様式でこれとハイブリッド形成することができる配列の全体または少なくとも３’領域を含み、ＺＰは標的核酸に相補的ではなく、その結果として標的核酸とハイブリッド形成することができない配列の５’領域を含むことができるか、プライマーP１と異なる配列を含むことができる。
【００５７】
プライマー依存性合成反応は、配列決定と同様に重要な反応である。核酸配列決定方法は、本質的に、以前に記載されているプライマー依存性核酸合成反応下での方法に従い、工程（１）および（２）に制限される。ＤＮＡ合成の場合、デオキシリボヌクレオチドとジデオキシリボヌクレオチドとの混合物を、酵素（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ポリメラーゼ）による触媒的組み込みのために使用する。
【００５８】
したがって、配列特異的に開始される核酸合成反応を、酵素（例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ポリメラーゼ）による配列決定のために行い、配列特異的に開始されるＤＮＡ配列反応は、以下の工程を含む。
１．プライマーＰ１のこれに相補的な標的核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ）の配列への配列特異的ハイブリッド形成。
２．酵素（例えば、ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ）によって伸長すべきプライマーＰ１の遊離３’ＯＨ末端へのデオキシリボヌクレオチドよびジデオキシリボヌクレオチドの触媒的導入によるプライマーＰ１の伸長であって、ここで、標的核酸がマトリックスとして役立ち、プライマーＰ１が標的核酸の一定の配列に相補的であり、且つ特異的様式でこの標的配列とハイブリッド形成することができる配列の全体または少なくとも３’領域を含み、ここで、プライマーＰ１は標的核酸に相補的ではなく、且つ標的核酸とハイブリッド形成できない配列の５’領域を含むことができ、さらなる機能を含むことができる。
【００５９】
プライマー依存性核酸合成反応は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）の第１および第２の鎖のＤＮＡ合成でも見出される。したがって、配列特異的に開始されるＤＮＡ合成反応を、熱安定性ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ依存性ポリメラーゼによって行い、ここで、配列特異的に開始されるＤＮＡ配列反応は、以下の工程を含む。
１．標的核酸の最初の熱変性。
２．２つのプライマーＰ１およびＰ２のこれらに相補的な標的核酸配列への配列特異的ハイブリッド形成。
３．熱安定性ＲＮＡ依存性またはＤＮＡ依存性ポリメラーゼによって伸長されるべきプライマーＰ１およびＰ２の３’−ＯＨ末端へのデオキシリボヌクレオチドの触媒組み込みによるＰ１およびＰ２の伸長であって、ここで、標的核酸がマトリックスとして役立つ。
４．工程（１）に入った後に、プライマー伸長産物の一部がプライマーＰ１およびＰ２のプライマーハイブリッド形成のためのマトリックスとして再度役立つ。
５．工程（１）〜（４）を、任意に反復することができ、したがって、所望の性質を有する核酸を合成することができ、ここで、プライマーＰ１およびＰ２が、標的核酸の一定の配列に相補的であり、且つ特異的様式でこの標的配列とハイブリッド形成することができる配列の全体または少なくとも３’領域を含み、ここで、プライマーＰ１およびＰ２は標的核酸に相補的ではなく、且つ標的核酸とハイブリッド形成できない配列の５’領域を含むことができ、さらなる機能を含むことができる。
【００６０】
配列特異的に開始される核酸合成反応は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に基づいた等温の指数関数的核酸増幅方法（例えば、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、３ＳＲ（配列持続自己複製）、２ＳＲ（自己持続配列複製；３ＳＲに類似しているが、ＲＮアーゼＨを使用しない）、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、および類似の方法）のさらなる構成要素である。これらの方法と共に、プライマー、ＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、および適切な反応条件を使用し、ここで、指数関数的核酸増幅方法は、以下の工程を含む。
１．標的核酸、第１のプライマーＰ１、第２のＺＰ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド、およびデオキシリボヌクレオチドを含む１つの反応媒体の産生。
２．増幅サイクルを維持することができるような反応条件の設定。
３．相補的標的配列へのプライマーＰ１のハイブリッド形成によって標的核酸に相補的な第１の鎖の合成を行い、その後、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用したデオキシリボヌクレオチドによってプライマーＰ１を伸長し、ここで、標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る。
４．第１のＤＮＡ鎖の標的核酸の酵素的、温度的、または化学的変性または分解、相補的な第１のＤＮＡ鎖へのＺＰのハイブリッド形成、その後のＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用したデオキシリボヌクレオチドによるＺＰの伸長によって第１のＤＮＡ鎖に相補的な第２のＤＮＡ鎖の合成を行い、ここで、プライマーＰ１およびＺＰが、標的核酸の一定の配列に相補的であり、且つ特異的様式でこの標的配列とハイブリッド形成することができる配列の３’領域を含み、ここで、プライマーＰ１もしくはＺＰの少なくとも１つまたは両プライマーは標的核酸に相補的ではなく、且つ標的核酸とハイブリッド形成できない配列の５’領域を含むことができ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むことができる。
５．ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを使用して工程（１）〜（４）で合成したＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行うことができ、ここで、生成されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写物は、マトリックスとして再度役立ち、プライマーＰ１およびＺＰの配列特異的ハイブリッド形成下での第１および第２のＤＮＡ合成に入り、その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に入る。核酸の指数関数的増殖を、この様式で行う。
【００６１】
配列特異的に開始される核酸合成反応は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に基づいた洗浄等温核酸増幅方法のさらなる構成要素である。これらの方法を、適切な反応条件と共に配列特異的結合プライマー、ＲＮＡおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＮＡポリメラーゼを使用して行い、ここで、等温洗浄核酸増幅方法は、以下の工程を含む。
１．標的核酸、第１のプライマーＰ１、第２のＺＰ、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ、リボヌクレオチド、およびデオキシリボヌクレオチドを含む１つの反応媒体の産生。
２．相補的標的配列へのプライマーＰ１のハイブリッド形成によって標的核酸に相補的な第１の鎖の合成を行い、その後、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用したデオキシリボヌクレオチドによってプライマーＰ１を伸長し、ここで、標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得る。
３．第１のＤＮＡ鎖からの標的核酸の酵素的、温度的、または化学的除去によって第１のＤＮＡに相補的な第２のＤＮＡ鎖を合成し、第１の鎖の相補ＤＮＡにＺＰをハイブリッド形成する。核酸の第２の合成を、第２のＺＰ（標的核酸の分解産物）の配列特異的ハイブリッド形成または第１の核酸鎖に相補的な標的核酸の第１の核酸鎖配列への第１の核酸鎖の逆折り畳みによって開始する。デオキシリボヌクレオチドによるＺＰの伸長は、ＲＮＡまたはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して継続し、ここで、プライマーＰ１およびＺＰが、標的核酸の一定の配列に相補的であり、且つ特異的様式でこの標的配列とハイブリッド形成することができる配列の３’領域を含み、ここで、プライマーＰ１もしくはＺＰの少なくとも１つまたは両プライマーは標的核酸に相補的ではなく、且つ標的核酸とハイブリッド形成できない配列の５’領域を含むことができ、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼプロモーター配列を含むことができ、それにより、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼおよびリボヌクレオチドを使用して工程（１）〜（３）で合成したＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を行うことができる。核酸の一次関数的増殖を、この様式で行う。
【００６２】
鎖置換増幅（ＳＤＡ）：ＳＤＡは、核酸を増幅させる多数の方法の一般名である。反応は、少なくとも、増幅すべき核酸、適切な緩衝液、プライマー、ｄＮＴＰ、およびポリメラーゼを含む。反応により、核酸が合成され、ここで、二本鎖が遊離が遊離し、このような様式で生成された一本鎖をマトリックスとして使用することができる。ポリメラーゼ自体（元のＳＤＡ）によって遊離することができる。あるいは、ヘリカーゼ（ヘリカーゼ依存性増幅）を用いて二本鎖を遊離することができる。チャンス配列を含むプライマーを使用する場合、反応は、多置換増幅と呼ばれる。この方法は、ＶａｎＮｅｓｓによって開発され、プライマーが増幅すべき標的核酸の第１の鎖の分化異物に由来する（米国特許出願２００３／１３８８００号、「ニッキング剤を使用した核酸の指数関数的増幅」）。この方法は、ＮＵＧｅｎ社（ＵＳＡ）によって開発され、ＲＮＤ／ＤＮＡ融合プライマーを使用する。別のＳＤＡ反応は、増幅に環状ＤＮＡを使用する（ローリングサークル増幅）。この結果、ＤＮＡが合成される。類似の方法は、ＲＮＡを増幅する（ローリング転写増幅）。
【００６３】
プライマー非依存性合成反応：プライマー非依存性合成反応は、プライマーを必要としない反応である。プライマー非依存性合成反応の例は、転写反応である。転写反応によって転写物が合成され、これは、ヌクレオチド、適切な反応環境、およびＲＮＡポリメラーゼの存在下で、ＲＮＡポリメラーゼに適切なプロモーターを含む遺伝子から開始される。これは、プライマーを使用せずに起こる。多数の転写物が遺伝子から読み取られ、合成される。
【００６４】
プライマー非依存生合成反応のさらなる例は、翻訳反応である。ここに、ＲＮＡ転写物を、翻訳装置と接触させる。これは、リボゾームおよびタンパク質またはポリペプチドの産生に必要な全てのさらなる成分からなる。特に、これらは、例えば、ｔＲＮＡ、アミノアシル−ｔＲＮＡ−シンテターゼなどである。転写物をこの反応溶液と接触させる場合、このプライマー非依存生合成反応を用いてタンパク質を産生することができる。
【００６５】
以下に、本発明の分析方法にしたがって使用することができるさらなる反応系を記載する。
【００６６】
酵素試験は、触媒的に有効な生体分子をその触媒活性を活用して測定することができる反応系である。特に、これらは、例えば、酵素（デヒドロゲナーゼ、加水分解酵素、ポリメラーゼ、ホスホリラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼなど）の試験である。
【００６７】
生体分子表面の使用：これは、その表面の特定の特徴を使用した生体分子の定量、検出、富化、または検出であると理解される。特に、これらは、例えば、抗体、アプタマー、または結合パートナー、補因子、多酵素複合体のタンパク質、または核酸タンパク質相互作用の検出のためのタンパク質もしくは核酸を活用した生体分子の検出である。
【００６８】
生体分子の分解：これは、生体分子の少なくとも１つの性質の破壊であると理解される。酵素は、例えば、酵素が標的分子の構造を認識する場合、生体分子のサイズのみを減少させることができる。本発明の窒素化合物もこれに寄与することができる。
【００６９】
一般に、本発明は、少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質を含むサンプルのその後に続く調製、処理、または分析方法のためのサンプルの調整方法であって、以下の工程：
Ａ）少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質を含むサンプルを準備する工程と、
Ｂ）前記サンプルを液体または固体の組成物と接触させて液体サンプル調製物を産生する工程と、ここで、前記組成物が、以下：ａ）ポリアミン、ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、ｃ）これらの窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、ｅ）カルボン酸アミン、ｆ）無機アンモニウム塩、ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、ｈ）核酸に結合する抗生物質、ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、ｊ）さらに誘導されたａ−ｉ群から選択される窒素化合物、および２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含むことを含む方法に関する。
【００７０】
したがって、サンプルは、生物または核酸および／もしくはタンパク質を含む材料の混合物であり得る。本発明の方法の全ての実施形態では、工程Ｂ）で産生された液体サンプル調製物は、ｐＨ７．１とｐＨ１４との間、好ましくは、ｐＨ７．１とｐＨ１２との間、特に好ましくは、ｐＨ７．４とｐＨ１０との間である。
【００７１】
処理方法は、サンプル中に存在する生体分子の各酵素的、化学的、または物理的変換と理解すべきである。本方法の特定の態様を、本発明のさらなる態様として特定の実施形態を参照して以下に説明する。これらの特定の実施形態は、以下に説明するように、生体サンプルの溶解方法、核酸および／またはタンパク質の安定化方法、核酸および／またはタンパク質を含むサンプルの阻害効果の減少、サンプル中の核酸の選択的マスキング方法、ならびにこれらの方法にそれぞれ基づいた分析方法に関する。
【００７２】
したがって、本発明の１つの態様は、少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質をケーシング中に含む生体サンプルの溶解方法に関する。特に、生体ケーシング（例えば、膜、キャプシド、または細胞壁）をケーシングとして使用することができるが、ケーシングはこれらに限定されない。サンプルを、ライセート産生のための液体または固体の組成物と接触させ、前記組成物が、以下：ａ）ポリアミン、ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、ｃ）これらの窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、ｅ）カルボン酸アミン、ｆ）無機アンモニウム塩、ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、ｈ）核酸に結合する抗生物質、ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、ｊ）さらに誘導されたａ−ｉ群から選択される窒素化合物、および２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含む。特に、「少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質をケーシング中に含む生体サンプル」は、本発明で理解される生物である。サンプルが液体または固体のいずれの組成物と接触するかどうかは、サンプルが十分な液体を含み、それにより、さらに使用するために溶解によって十分に液体のライセートが得られるかどうかに依存する。組成物は、好ましくは、液体である。したがって、窒素化合物を溶媒に溶解することができるか、懸濁様式で存在することができる。
【００７３】
本発明の溶解方法を使用して、標準的な溶解方法と比較してより大量の核酸および／またはタンパク質をライセート中に移行させることが可能である。窒素化合物により、サンプル中に含まれる生物のケーシングがより有効に溶解し、それにより、より大量の細胞内容物をライセートに到達させることができると予想される。
【００７４】
この方法の好ましい実施形態では、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を産生されたライセート中に溶解または懸濁するような様式で溶解する。少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を産生されたライセート中に溶解または懸濁させるために、少なくとも１つの核酸および／またはタンパク質が沈殿しないような様式で溶解条件を選択しなければならない。本発明の用語「溶解」および「懸濁」は、少なくとも１種の核酸またはタンパク質がサンプル調製物（例えば、ライセート）の液相に残存し、それにより、対応する検出方法または分析方法によるその後に続く分析が利用可能であることを意味する。これは、検出方法または分析方法に直接移行できないが、対応する方法の工程によって最初に液相に移行させなければならないライセートの沈殿成分と対照的である。溶解されるサンプル型を、これによって考慮しなければならない。窒素化合物を含む組成物中の見込まれるさらなる構成要素もここで考慮しなければならず、場合により、一定のサンプル系および組成物系に適切な条件を、簡潔な日常的試験を用いて決定しなければならない。例えば、溶解に付随して沈殿が起こることが認められた場合にこれを行うことができる。これが真である場合、特に、沈殿が溶解／沈殿すべき核酸種および／またはタンパク質種を含む場合、初期値によって使用される分析方法および手順を使用して、その組成物の沈殿物をチェックすることができる。特に、この実施形態では、組成物中の窒素化合物の濃度を、核酸がライセート中に溶解または懸濁したままであり、それにより、窒素化合物がライセート中の核酸種および／またはタンパク質種の沈殿に影響を及ぼさないような様式で選択しなければならない。
例えば、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質がライセート中に溶解および／または懸濁したままであるという点で、ライセートを反応系における核酸種および／またはタンパク質種のその後に続く分析位に供することが可能である。分析されない他の細胞成分を溶解中に沈殿させ、それにより、液体サンプルから除去することができる。それによって、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質は、その後に続く調製方法、処理方法、または分析方法のために提供される種である。
【００７５】
さらなる実施形態では、少なくとも１種の核酸の固定化のためのキャリア材料の存在下で溶解する。それにより、核酸またはタンパク質の分析で通常使用される有用なキャリア材料（例えば、マイクロアレイまたはいわゆる「ビーズ」）を使用することができる。「ビーズ」は、分子が結合することができる表面を有する微粒子である。このような表面を、例えば、対応する表面処理によって得ることができる。このような材料の例は、ＱＩＡＧＥＮ社（Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から入手されるＯｌｉｇｏｔｅｘ（登録商標）およびＬｉｑｕｉｃｈｉｐ（登録商標）である。
【００７６】
本発明の方法のさらなる実施形態では、サンプルは、核酸およびタンパク質からなる群の少なくとも２種を含む。２種またはそれを超える核酸および／またはタンパク質が産生されたライセート中に含まれ、特に、これらがライセート中に溶解または懸濁されるような様式で溶解する。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸、特に、ｇＤＮＡおよびＲＮＡを、本方法のライセート中に含めることができる。あるいは、タンパク質を、溶液／懸濁液中に選択的に保持することができる。上記のように、サンプルおよび異なる溶解試薬の型、特に、窒素化合物の使用量を考慮しなければならない。
【００７７】
本発明のさらなる実施形態では、サンプルは核酸および／またはタンパク質からなる群由来の少なくとも２種を含み、サンプル調製物の生成または溶解を、いくつかの所定の核酸種および／またはタンパク質種を産生されたライセート中に溶解および／または懸濁するような様式で行う。それにより、サンプル中に含まれる核酸種または溶液中に含まれる全タンパク質種を、溶解および／または懸濁することができる。これは、例えば、ライセートからの核酸またはタンパク質の除去のために使用する場合、本質的に溶解中に沈殿が生じないことを意味する。サンプルがいくつかの種の核酸および／またはタンパク質を含む場合、これらの種のうちの２種、数種、または全種が溶解後にライセート中に溶解および／または懸濁したままであり、これらの異なる種の核酸および／またはタンパク質の相対濃度が溶解によって互いに変化せず、それにより、ライセート中のこれらの種の相対濃度がサンプル中のこの種の相対濃度に関して本質的に不変であることが特に好ましい。上記で既に開示しているように、溶解時のサンプルの型、使用可能な異なる溶解試薬、使用される窒素化合物型を考慮するために再度適用し、所与のサンプル型に適切な条件を決定するために、適切な日常的試験を行う必要がある。
【００７８】
上記溶解方法により、少なくとも２種の核酸および／またはタンパク質を、ライセート中に溶解および／または懸濁する場合、その後に続く分析方法および検出方法においてこれらの種の全てを分析または検出するためにこれらの種を含むライセートを使用することが可能である。
したがって、窒素化合物は、ライセート中に所望の核酸種および／またはタンパク質種の濃度を増加させるより有効な溶解に加えて、ライセート中に溶解および／または懸濁した核酸種および／またはタンパク質種を安定化する効果も有する。さらに、ライセートにおける阻害相互作用および効果を、溶解のために使用された組成物中での窒素化合物の使用によって減少または抑制することができる。さらに、窒素化合物の使用によって、ライセート中の一定の核酸種をマスキングすることが可能であり、その結果、この核酸種は、ライセート中に含まれるさらなる種の分析方法または検出方法にいかなる不利な影響も及ぼさない。これらの特定のさらなる態様を、以下でより詳細に考察する。
【００７９】
方法のさらに好ましい実施形態では、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、核酸種としてライセート中に溶解および／または懸濁する。別の実施形態では、１種または数種のタンパク質を、ライセート中に溶解および／または懸濁する。
【００８０】
本発明の溶解方法のさらに好ましい実施形態では、溶解のために使用される組成物は、窒素化合物に加えて、さらなる溶解試薬（錯化剤、界面活性剤、容積制限物質、および／または溶媒の群由来の少なくとも１つの試薬）を含む。特に、ＲＧＴＡ（エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸）およびＥＤＴＡ（エチレンジニトリロ四酢酸）が錯化剤と見なされる。可能な界面活性剤は、特に、ｔｒｉｔｏｎｘ１０（ポリエチレングリコール−ｔｅｒｔ−オクチルフェニルエーテル）、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０（ノニルフェニル−ポリエチレングリコール）、ｎ−オクチルグルコシド、およびＮ−セチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−アンモニウムブロミドである。容積制限物質として、特に、異なる鎖長のポリエチレングリコールが見なされる。Ｈ2Ｏ、フェノール、またはその混合物を、溶媒として使用することが好ましい。錯化剤を、好ましくは、これらがそれぞれサンプル調製物中に存在するような量（例えば、ライセート中に０．１〜１０ｍＭの濃度）で使用する。溶解のために使用される組成物として液体組成物（すなわち、溶解緩衝液）を使用する場合、錯化剤は、好ましくは、０．１〜１０ｍＭの濃度でそれぞれ存在する。界面活性剤を、好ましくは、サンプル調製物中にそれぞれ存在するような量（例えば、ライセート中に０．０１〜１０体積％の濃度）で使用する。溶解緩衝液を使用する場合、界面活性剤は、好ましくは、溶解緩衝液の０．０１〜１０体積％である。容積制限試薬を、好ましくは、サンプル調製物中にそれぞれ存在するような量（例えば、ライセート中に０．０１〜５体積％の濃度）で使用する。溶解緩衝液を使用する場合、好ましくは、０．０１体積％と５体積％との間の容積制限試薬を含む。溶解試薬は溶液が好ましいが、例えば、固体物質の形態で別で投与することもできる。本発明のために、溶解緩衝液を、特に、溶媒としてのＨ2Ｏ、添加物としての少なくとも１つの上記窒素化合物、最適な錯化剤、界面活性剤、および／または容積制限物質からなる組成物として使用する。
【００８１】
特に、これら全ての成分を含む溶解緩衝液を使用することができる。したがって、本発明のさらなる態様は、上記の本発明の溶解方法と組み合わせた、生体サンプルの溶解のための組成物であって、サンプルが本発明の異なる方法で使用される少なくとも１つの窒素化合物を含む組成物に関する。
機械的影響下または酵素支持の下でさらに溶解することができる。モルタル、高圧の印可、細い毛細管、およびフィルターユニットの使用が機械的支持手段として見なされる。溶解の酵素支持を、例えば、プロテアーゼ、リゾチーム、セルロース、ペクチナーゼによって支持することができ、それにより、サンプル中の生物の構造の分解がさらに支持される。
この支持によって溶解をより効率的にデザインすることができる。すなわち、ライセート中の核酸および／またはタンパク質の収量を、増加するか加速させることができる。サンプルを、溶解前に、洗浄緩衝液、特に、低張洗浄緩衝液で洗浄することがさらに可能である。
【００８２】
本発明の溶解方法の好ましい実施形態では、窒素化合物の使用量を、生成されたライセート中の窒素化合物の濃度が、０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、０．００１〜１００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜３０ｍＭ、０．００１〜２０ｍＭ、特に、０．００１〜１９ｍＭおよび０．００１〜１５ｍＭであるような様式で選択する。窒素化合物としての複素環式化合物（特に、イミダゾール）の使用時に、０．０１〜２０ｍＭのイミダゾール濃度、特に好ましくは、０．０１〜１５ｍＭに調整されるように、化合物の量を選択することができる。アミノ官能基を含む化合物について、通常、窒素化合物濃度をより低くでき、核酸またはタンパク質と相互作用できるアミノ官能基がより多く窒素化合物中に含まれるように適用する。
【００８３】
本発明の溶解方法のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１つの核酸種は、ＤＮＡ種である。本発明の溶解方法のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１つの核酸種は、ＲＮＡ種である。本発明の溶解方法のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１つの生体分子種は、タンパク質種である。
【００８４】
本発明の溶解方法のさらに好ましい実施形態では、窒素化合物を、以下からなる群から選択する：
ａ）好ましくは、２、３、４、５、または６個のアミノ基を有する開鎖および環状のポリアミンからなる群から選択されるポリアミン。用語「ポリアミン」は、本発明で、アミノ基末端を有する飽和炭素鎖を含む化合物と理解すべきである。アミノ基末端は、第一級アミノ基（Ｈ2Ｎ−）、第二級アミノ基（Ｒ1ＮＨ−）、または第三級アミノ基（Ｒ1Ｒ2Ｎ−）であり得、環状基の一部であり得る。残りのＲ1およびＲ2は、本明細書中で、互いに独立したＣ1〜Ｃ5アルキル基であり得る。アミノ基末端は、好ましくは、第一級または第二級アミノ基である。飽和炭素鎖を、第二級（−ＮＨ−）または第三級（−ＮＲ1−）、好ましくは、第二級アミノ基の数の変化によって妨害することができる。Ｒ1は、さらに、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基であり得る。飽和炭素鎖は、例えば、開鎖、非分岐、または環状であり得る。異なるアミノ基を連結する炭素鎖または１つの炭素鎖は、好ましくは、アルキレン基（ＣＨ2）n−（式中、ｎは、１〜６の整数、好ましくは、２または３である）である。環状炭素鎖は、純粋な炭素環および飽和窒素含有環の基（例えば、ピペリジンまたはピペラジン）であり得る。したがって、環は、４〜６個の環原子を含む。窒素含有環の基を、環中に含まれる少なくとも１つの窒素原子をアミノ基末端を有する飽和炭素鎖に置換することができる。この炭素鎖に、再度、第二級または第三級、好ましくは、第二級アミノ基を挿入することができる。炭素鎖はまた、好ましくは、アルキレン基（ＣＨ2）n−（式中、ｎは、２〜６の整数であってよく、好ましくは、２または３である）である。２〜６個のアミノ基を有するポリアミンが好ましいにもかかわらず、ポリアミンは、より多数のアミノ基を含むこともできる。特に、用語「ポリアミン」は、高分子直鎖または分岐ポリアミン（例えば、ポリエチレンイミンまたはビニルアミン）であることも意味する。
ポリアミンとして、特に、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、プトレッシン、スペルミジン、カダベリン、ジエチレントリアミン、スペルミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミン、１，４−ビス（３−アミノプロピル）−ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペラジン、１−（２−アミノエチル）ピペリジン、１，４，１０，１３−テトラオキサ−７，１６−ジアザシクロオクタデカン、ポリ（１−ビニルピロリドン−コ−２−ジメチルアミノエチルメタクリレート）、およびトリス（２−アミノエチル）アミン）などを使用することができる。２〜６個のアミノ基を有する非分岐ポリアミン、特に、エチレンジアミン、トリメチレンジアミン、プトレッシン、スペルミジン、ジエチレントリアミン、スペルミン、トリエチレンテトラミン、テトラエチレンペンタミン、ペンタエチレンヘキサミンの使用が特に好ましく、スペルミジンの使用が特に好ましい。
ｂ）アミノ酸、特に、α−アミノ酸。したがって、アミノ酸は、Ｄ型、Ｌ型、またはラセミ体として存在し得る。タンパク質性および非タンパク質性、特に、タンパク質性のアミノ酸を使用することができる。極性および無極性のアミノ酸を使用することができる。したがって、無極性アミノ酸は、脂肪族アミノ酸（例えば、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン）および芳香族アミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン）を含む。極性アミノ酸は、中性、塩基性、および酸性アミノ酸、または酸性アミノ酸のアミドを含み得る。中性アミノ酸を、例えば、プロリンなどのイミノ酸、水酸基を有するアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）、または硫黄含有アミノ酸（例えば、システインおよびメチオニン）から選択することができる。さらに、アミノ酸を、アルカリ性アミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）から選択することができる。アミノ酸を、酸性アミノ酸（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）またはそのアミド（例えば、アスパラギンまたはグルタミン）から選択することもできる。
アルギニン、プロリン、トリプトファン、およびグルタミン酸などのアミノ酸を、窒素化合物として使用することが好ましい。さらなる実施形態では、還元チオ基を含まないアミノ酸を窒素化合物として使用する。
ｃ）５員環もしくは６員環、またはアネレーテッド（anellated）５員環を有する６員環の群から選択される複素環式化合物であって、５員環、６員環、および／またはアネレーテッド（anellated）５員環は、１〜３個の窒素原子を含む、複素環式化合物。５員環または６員環およびアネレーテッド（anellated）環は、不飽和であるか、部分的に不飽和であるか、芳香族であり得る。各環員は、環化合物中に、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、＝Ｏ、−ＯＨ、＝Ｓ、−ＳＨ、＝ＮＨ、−ＮＨ2、アルキル−Ｏ−、アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノ基からなる群から選択される置換基を含み得、ここで、これらのアルキル基（すなわち、アルキル−Ｏ−、アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノ基中のアルキル基）は、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基である。環員を、Ｆ−、Ｃｌ−、Ｂｒ−、またはＪとさらに置換することができる。複素環式化合物は、それぞれ、５員環または６員環の基中にさらなるヘテロ原子として１つまたは複数のＯ原子またはＳ原子を含むことができる。好ましい複素環式化合物は、一般式Ｉ：
【化１】
2008537677.tif 000002
一般式Ｉ
（式中、Ｘは、ＮＨまたはＳから選択され、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は、−Ｈ、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｊ、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ2、アルキル−Ｏ−、アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノ基からなる群から互いに独立して選択され、ここで、これらのアルキル基は、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基である）の５員環の芳香族窒素化合物である。化合物イミダゾール、チアゾール、およびアミノチアゾールが特に好ましく、２−アミノチアゾールが特に好ましい。
さらに好ましい複素環式化合物は、一般式ＩＩ：
【化２】
2008537677.tif 000003
一般式ＩＩ
（式中、Ｘ1は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＲ4からなる群から選択され、Ｘ2は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＲ5からなる群から選択され、Ｘ3は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＲ6からなる群から選択され、ここで、Ｘ1基、Ｘ2基、またはＸ3の少なくとも１つがＮを示し、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｒ5、およびＲ6は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、アルキル−Ｏ−、アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノ基からなる群から互いに独立して選択され、ここで、これらのアルキル基（すなわち、アルキル−Ｏ−、アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノ基中のアルキル基）は、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基である）の６員環の芳香族化合物である。Ｘ1、Ｘ2、および／またはＸ3は、好ましくは、Ｎを示す。Ｘ1のみがＮであるか、Ｘ1およびＸ2またはＸ1およびＸ3がＮであることがさらに好ましい。Ｒ1〜Ｒ5は、好ましくは、Ｈおよび、Ｃ1〜Ｃ3アルキルからなる群から選択され、このましくは、Ｈまたはメチルである。化合物２，３−ジメチルピラジン、ピリジン、およびピリミジンが特に好ましい。
【００８５】
以下の一般式ＩＩＩの化合物がさらに好ましい。
【化３】
2008537677.tif 000004
一般式ＩＩＩ
（式中、Ｘ1は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＲ3からなる群から選択され、Ｘ2は、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＣＲ4からなる群から選択され、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4は、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、アルキル−Ｏ−、アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノ基からなる群から互いに独立して選択され、ここで、これらのアルキル基（すなわち、アルキル−Ｏ−、アルキル−Ｓ−、アルキルアミノ、およびジアルキルアミノ基中のアルキル基）は、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ3アルキル基である）。Ｘ1またはＸ2は、好ましくは、Ｎを示す。さらに、Ｘ1がＣＲ4である場合、Ｘ2はＣＲ4であり得る。Ｒ1、ＣＲ2、ＣＲ3、およびＲ4は、好ましくは、Ｈである。
特に好ましい化合物は、インダゾールおよびベンズイミダゾールである。
核酸塩基の群から選択された複素環式化合物は、窒素化合物としてさらに好ましい。これらは、特に、化合物アデニン、シトシン、グアニン、イノシン、ヒポキサンチン、チミン、ウラシル、およびキサンチン、またはアナログまたは誘導体として核酸に構築することができる化合物を含み、ここで、これらの化合物の構造はまた、環が異なり得る。化合物アデニン、シトシン、グアニン、およびチミンは、本明細書中で特に好ましい。
化合物イミダゾールおよび２，３−ジメチルピラジン、ピリミジン、グアニン、およびグアノシンは、本発明で特に好ましい有効性を示す。
さらに、複素環式窒素化合物は、これらの窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーである。
ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、残りのＲ1、Ｒ2、およびＲ3が、ＨおよびＣ1〜Ｃ5アルキル基からなる群から互いに独立して選択され、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3は同時にＨではない。メチルアミン、エチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ジ（ｎ−プロピル）アミン、ジ（イソプロピル）アミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、トリ（ｎ−プロピル）アミン、およびトリ（イソプロピル）アミンの使用が特に好ましい。
ｅ）構造Ｘ−Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ2を含むカルボン酸アミン。Ｘは、−ＮＨ2、Ｃ1〜Ｃ5アルキル、Ｃ2〜Ｃ5アルケニル、Ｃ2〜Ｃ5アルキニル、またはアリール、好ましくは、フェニル、またはアミノ置換アリール、Ｈ2ＮＣ（＝Ｏ）−Ｙ−からなる群から選択され、ここで、Ｙは、−（ＣＨ2）n型のアルキレン基であってよく、ここで、ｎは、０〜１０、好ましくは、０〜５の範囲の整数であるか、Ｙは、Ｃ1〜Ｃ10アルケニレン基、好ましくは、Ｃ1〜Ｃ6アルケニレン基、またはアリール基である。ＹがＣ1〜Ｃ10アルケニレン基である場合、この基は、１つまたは複数のオレフィン結合を含むことができ、ここで、オレフィン結合は、単離様式または結合様式で炭素鎖中に存在し得る。Ｙがアリールである場合、残りはフェニルまたはビフェニル基が特に考慮される。Ｘ−ＮＨ2は、好ましくは、−ＮＨ2または２アミノフェニルを示す。
ｆ）硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、およびリン酸水素アンモニウムからなる群から選択される無機アンモニウム塩。
ｇ）ベタイン、エクトイン、およびトリメチルアミンオキシドから選択されるアンモニウム基を含む分子内塩。
ｈ）ジスタマイシン、特に、ジスタマイシンＤ、マイトマイシン、ノルフロキサシン、ストレプトゾシン、ドゥオカルマシン（ｄｕｏｃａｒｍｙｃｉｎｅ）、アクチノマイシン、およびアミノグリコシド（ａｍｉｎｏｇｌｙｃｉｓｉｄｅ）からなる群から選択される核酸に結合する抗生物質。
ｉ）チアゾトロプシン、トリイミダゾール、およびクロモマイシンからなる群から選択されるＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物。
ｊ）さらに誘導されたａ−ｉ群から選択される窒素化合物。例えば、窒素化合物と無機または有機の残存物（糖、リン酸塩、アルコール、硫酸塩、グルタチオン、脂質など）との組み合わせによって誘導体化することができる。化合物グアノシン、アデノシン、シトシン、およびチミジンまたは抗生物質が本明細書中で特に好ましい。
【００８６】
上記の好ましい窒素化合物を、以下に説明する本発明のさらなる全ての態様で使用することができる。本発明で使用される窒素化合物は、一般に、遊離形態または適切な塩形態で存在し得る。化合物を遊離化合物または塩として使用するかどうかは、化合物が液体または固体のいずれで存在するのかに依存し得る。
【００８７】
Ｃ1〜Ｃ6アルキル基は、本発明では、特に以下の基である：メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、１−メチルプロピル、２−メチルプロピル、１，１−ジメチルエチル、ｎ−ペンチル、１−メチルブチル、２−メチルブチル、３−メチルブチル、１，１−ジメチルプロピル、１，２−ジメチルプロピル、２，２−ジメチルプロピル、１−エチルプロピル、ヘキシル、１−メチルペンチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、４−メチルペンチル、１，１−ジメチルブチル、１，２−ジメチルブチル、１，３−ジメチルブチル、２，２−ジメチルブチル、２，３−ジメチルブチル、３，３−ジメチルブチル、１−エチルブチル、２−エチルブチル、１，１，２−トリメチルプロピル、１，２，２−トリメチルプロピル、１−エチル−１メチルプロピル、および／または１−エチル−２−メチル−プロピル。
【００８８】
本発明のＣ1〜Ｃ5アルケニル基は、特に、以下の基である：エテニル（ビニル）、２−プロペニル（アリル）、２−ブテニル、３−ブテニル、１−メチル−２−プロペニル、２−メチル−２−プロペニル、２−ペンチル、３−ペンチル、４−ペンチル、１−メチル−２−ブテニル、２−メチル−３−ブテニル、３−メチル−３−ブテニル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、１，２−ジメチル−２−プロペニル、および１−エチル−２プロペニル。
【００８９】
本発明のＣ2〜Ｃ5アルキニル基は、特に、エチニル、２−プロピニル（プロパルギル）、２−ブチニル、３−ブチニル、２−ペンチニル、３−ペンチニル、４−ペンチニル、３−およびメチル−２−ブチニルである。
【００９０】
溶解に使用される窒素化合物の選択を、溶解緩衝液に使用さる溶媒に合わせて調整することが好ましい。したがって、それぞれの領域中において望ましい溶媒中の化合物濃度が可能な様式で窒素化合物を溶媒に溶解できることが好ましい。
【００９１】
さらなる態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質を検出するための分析方法であって、
Ａ）本発明の溶解方法によるライセートの産生、
Ｂ）少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質の検出に適切な反応または反応系列でのライセートの使用
を含む、分析方法に関する。
【００９２】
分析方法の検出精度を、通常の分析方法と比較して、サンプル中でより高い濃度の各核酸および／またはタンパク質が得られる溶解の改良によって改良する。
【００９３】
サンプル調製物中に含まれる核酸種および／もしくはタンパク質種数の減少のためのさらなる方法工程または核酸および／もしくはタンパク質を分解する材料のサンプル調製物からの除去またはこのような材料の不活化のためのさらなる工程を行うことなく、ライセートと直接使用することが好ましい。したがって、ライセートを、いかなるさらなる再馴化工程を行うことなく反応溶液の分析または産生のために直接使用することが好ましい。
【００９４】
他の場合では、物理的、化学的、または酵素的溶解のために、上記方法によって溶解を支持することができる。ライセートの加熱または均質化による物理的支持、界面活性剤の使用による化学的支持、またはプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＫ（タンパク質の場合検出されない））、リゾチーム、もしくはヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ、この場合ＤＮＡを検出できない）の使用による酵素的支持を使用した溶解方法が適切である。
【００９５】
したがって、少なくとも１つの核酸の検出に適切な反応または反応系列を、核酸結合反応、特に、核酸ハイブリッド形成、特に、ノーザンブロッティング、サザンブロッティング、またはオリゴヌクレオチドとプローブ、特にＤＮＡプローブとのハイブリッド形成の群、核酸の酵素的修飾または重合、特に、配列決定反応、ｉｎ−ｖｉｔｒｏ転写、制限エンドヌクレアーゼ分断の群、増幅反応、特に、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、リアルタイムＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（プローブに基づいた方法および配列非特異的結合検出分子（例えば、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）に依存する方法）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（プローブに基づいた方法および配列非特異的結合検出分子（例えば、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）に依存する方法）、マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ、プローブベースの方法であるリアルタイムマルチプレックスＰＣＲ、およびリアルタイムマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、３ＳＲ（配列持続自己複製）、２ＳＲ、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＭＤＡ（多置換増幅）、ローリングサークル増幅、全トランスクリプトーム増幅、全ゲノム増幅、およびローリング転写増幅、またはループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）の群から選択することができる。
少なくとも１つのタンパク質の検出に適切な反応または反応系列を、タンパク質結合反応、特に、タンパク質認識、特に、他のタンパク質によるタンパク質の認識、タンパク質、抗体、アプタマー、リガンド、核酸（特に、ウェスタンブロッティング）、または他の物質（グルタチオンおよびＮＡＤなど）の酵素活性に基づいた反応の群から選択されるか、タンパク質の修飾またはプロセシング、特に、（脱）リン酸化、（脱）グリコシル化、およびプロテアーゼによる分断の群から選択することができる。
上記の全ての方法を、溶液、懸濁液、固相中で行うことができる。
【００９６】
さらなる態様では、本発明は、核酸および／またはタンパク質を安定化する方法であって、以下の工程：
Ａ）少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質を含むサンプルを準備する工程と、
Ｂ）前記サンプルを液体または固体の組成物と接触させて液体サンプル調製物を産生する工程と、ここで、前記組成物が、ａ）ポリアミン、ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、ｃ）これらの窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに異なって選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、ｅ）カルボン酸アミン、ｆ）無機アンモニウム塩、ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、ｈ）核酸に結合する抗生物質、ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、ｊ）さらに誘導されたａ−ｉ群から選択される窒素化合物、および２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含むこと
を含む、安定化する方法に関する。
本方法のさらなる実施形態では、好ましくは、界面活性剤およびプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を使用して、酵素的、物理的、または化学的溶解の前、間、または後に１つまたは複数の特許請求の範囲に記載の物質によって核酸を安定化させる。したがって、濃度０．００５〜１０％の界面活性剤を使用する。プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）は、安定化されたサンプル中に、０．５×１０-4ｍＡＵ／μｌ〜５０×１０-4ｍＡＵ／μｌの濃度で含むことができる。
【００９７】
この方法のさらなる実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ）による酵素分解後の１つまたは複数の特許請求の範囲に記載の物質によってＲＮＡを安定化させる。したがって、ＤＮアーゼＩは、安定化されたサンプル中に、０．００３Ｕ／μｌ〜０．５Ｕ／μｌの濃度で含むことができる。
【００９８】
この方法のさらなる実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、ベンゾナーゼなど）による酵素分解後の１つまたは複数の特許請求の範囲に記載の物質によってタンパク質を安定化させる。
【００９９】
この方法のさらなる実施形態では、例えば、選択された１つまたはいくつかの特許請求の範囲に記載の化学物質によってサンプル中の生体分子（例えば、核酸またはタンパク質）を安定化する。例えば、アルギニン、イミダゾール、プロリン、リジン、スペルミン、スペルミジン、グルタミン酸、インダゾール、チミン、チミジン、グアニン、グアノシン、アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、硫酸アンモニウム、またはこれらの混合物から選択される物質によってサンプル中の少なくとも２種の生体分子を処理する。
【０１００】
この方法のさらなる実施形態では、少なくとも１種の核酸またはタンパク質を、窒素化合物の添加前、添加中、または添加後にキャリア材料に固定化する。既に上に記載されている材料を、本発明の溶解と組み合わせてキャリア材料として使用することができる。
本発明の安定化方法の別の実施形態では、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を液体サンプル調製物中に溶解および／または懸濁するような様式でサンプルを調製する。これを、特に、サンプルへの適量の窒素化合物の添加によって行うことができる。組成物の添加によって生体サンプルを溶解する場合、これに対して、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を液体サンプル調製物中に溶解および／または懸濁するような様式で溶解することができる。
【０１０１】
生物に加えて、分解するために溶解に供するサンプルは、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を含む材料の全混合物である。これは、材料の混合物または純粋な核酸もしくはタンパク質のみであり得る。これらの材料の混合物を、例えば、核酸またはタンパク質調製物によって得ることができる。少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を固定化したキャリア材料もサンプルとして使用することができる。したがって、サンプルは、固体または溶液として存在することができるか、純粋な生物または液体培地中の生物（例えば、細胞培養物）であり得る。サンプルの組成物を、サンプル型に応じて、液体（例えば、緩衝液）としてか固体として添加することができる。少なくとも１つの液相を含むサンプル調製物は、液体サンプル調製物である。サンプル調製物を、例えば、完全に溶解することができるか、懸濁成分および固体成分を含むこともできる。細胞成分を、例えば、サンプル調製物中に懸濁するか、溶解せずに存在することができる。サンプル調製物はまた、核酸および／またはタンパク質の固定化のためのキャリア材料を含むことができる。
少なくとも１種の核酸またはタンパク質を、サンプル調製物中のこの種の成分の直接分離（窒素化合物による安定化を行うことなくこの種を崩壊または分解するであろう）が必要ないか、通常よりも後に起こり得るようにサンプル調製物中に窒素化合物またはタンパク質を添加することによって安定化することができる。サンプル調製物の連続的精製を完全に先に行い、分析方法または検出方法でサンプル調製物を直接使用することができる場合、特に好ましい。一方では、この種が安定化した様式で分析溶液中に存在し、窒素化合物を使用しない比較系よりもこの分析溶液中でその濃度が減少しないかわずかしか減少しない場合、核酸種またはタンパク質種の検出が改良されており、分析中により多数の物質を利用可能である。他方では、多大な時間を要し、高額で夾雑する傾向がある精製工程をより容易に先に行うことができる。細胞物質に加えて核酸種および／またはタンパク質種が存在するサンプル中で、これらが特に細胞ライセート中に存在する場合、おそらくさらに安定化することができるとさらに判断された。
【０１０２】
本発明の安定化方法の好ましい実施形態では、サンプルは、液体サンプル調製物の生成のために組成物との接触前に溶解に供し、場合により、さらなる精製工程に供する生体サンプルである。通常の溶解方法を使用して溶解することができ、さらなる精製工程は、例えば、核酸またはタンパク質調製物の調製方法または固定化方法であり得る。
【０１０３】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、サンプルは、少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質をケーシング、好ましくは、生体ケーシング中に含む生体サンプルであり、ここで、サンプルが液体または固体組成物と接触してライセートが産生される。サンプルはまた、生物を含み得る。好ましくは、上記の本発明の方法にしたがって、生体サンプルの溶解のためにライセートを生成する。
【０１０４】
本発明の方法のさらなる実施形態では、サンプルは、核酸およびタンパク質からなる群の少なくとも２種を含む。サンプル調製物をこのような様式で生成するか、産生されたサンプル調製物または産生されたライセート中に２種またはそれを超える一定の種の核酸および／またはタンパク質を溶解または懸濁するか、キャリア材料に固定化するような様式で溶解する。例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸、特に、ｇＤＮＡおよびＲＮＡを、サンプル調製物またはライセート中に溶解または懸濁することができる。あるいは、タンパク質を、選択的に溶液中に保持することができる。上記のように、サンプル調製物の生成または溶解と共に使用しなければならない条件の選択時に、サンプル調製物の生成のために使用される組成物中に含まれるサンプルおよび異なる成分の型、特に、使用される窒素化合物の量を考慮しなければならない。
【０１０５】
本発明の安定化方法のさらに好ましい実施形態では、サンプルは、核酸およびタンパク質からなる群由来の少なくとも２種を含み、サンプルの調製または溶解を、サンプル中に含まれる核酸種および／またはタンパク質種が生成されたサンプル調製物またはライセート中にその大部分が溶解および／または懸濁または固定されるような様式で行う。好ましくは、全種は、本質的に、溶解および／または懸濁されているか、固定されている。したがって、サンプル中に含まれる全核酸種またはサンプル中に含まれる全タンパク質種のいずれかを、溶解および／または懸濁することができる。例えば、ライセートからの核酸またはタンパク質の除去のために使用する場合、これは、サンプル調製または溶解中に本質的に沈殿が起こらないことを意味する。サンプルが数種の核酸および／またはタンパク質を含む場合、窒素化合物との接触後にこれらの種の２種、数種、および全種がライセート中に溶解および／または懸濁されたままであるべきであり、これらの異なる種の核酸および／またはタンパク質の相対濃度が窒素化合物を含む組成物の添加または溶解によって互いに変化しないことが特に好ましい。すなわち、未処理サンプル中のこの種の相対濃度と比較したサンプル調製物またはライセート中のこの種の相対濃度は、本質的に変化しないままである。上記で既に開示のように、サンプルおよび場合によって使用される異なる溶解試薬の型ならびに溶解の実施時に使用される窒素化合物の型ならびに溶解中に使用される窒素化合物の型を考慮するために再度適用し、場合によって適切な日常的試験をおこなって所与のサンプル型に適切な条件を決定しなければならない。
【０１０６】
本発明の安定化方法のさらに好ましい実施形態では、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを、サンプル調製物またはライセート中に溶解および／または懸濁または固定する。さらにまたはあるいは、少なくとも１種のタンパク質を、サンプル調製物またはライセート中に溶解および／または懸濁または固定することができる。
【０１０７】
本発明の生体サンプルの溶解方法と組み合わせて上に既に記載されているように、溶解のために使用される組成物は、さらなる溶解試薬として錯化剤、界面活性剤、容積制限物質、および／または溶媒の群の少なくとも１つの試薬を含み得る。機械的作用および／または酵素的様式で溶解するか、サンプルを低張洗浄緩衝液で溶解前に洗浄することもできる。したがって、溶解を、上記の物理的、化学的、または酵素的な溶解方法によって支持することができる。ライセートの加熱または均質化による物理的支持、界面活性剤の使用による化学的支持、またはプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＫ（タンパク質の場合検出されない））、リゾチーム、もしくはヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ、この場合ＤＮＡを検出できない）の使用による酵素的支持を使用した溶解方法が特に適切であることが判明した。本発明の溶解方法と組み合わせた上記の実施項目を同一の様式でここに適用する。
【０１０８】
本発明の安定化方法では、サンプルへの窒素化合物の添加量を、好ましくは、産生されたサンプル調製物またはライセート中の窒素化合物の濃度が０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、０．００１〜１００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜３０ｍＭ、特に、０．００１〜１９ｍＭまたは０．００１〜１５ｍＭであるような様式で選択する。ポリアミン（ａ）を使用する場合、濃度は、好ましくは、０．００１ｍＭと１５ｍＭとの間であり、好ましくは、０．００１ｍＭと１ｍＭとの間である。驚いたことに、これらの非常に低濃度のポリアミン、特に、スペルミジンを使用した場合でさえ、例えば、ＲＮＡの本質的な安定化が認められる。アミノ酸（ｂ）の使用時に、この濃度は、好ましくは、０．００１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲、特に、１〜１５ｍＭの範囲であり得る。窒素複素環（ｃ）の使用時に、この濃度は、好ましくは、０．００１〜２０ｍＭ、好ましくは、０．００１〜１５ｍＭであり得る。カルボン酸アミン（ｅ）の使用時に、この濃度は、好ましくは、０．００１〜１５ｍＭであり得る。無機アンモニウム化合物を使用する場合、この濃度は、好ましくは、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜１５ｍＭであり得る。アンモニウム基を含む分子内塩の使用時に、この濃度は、好ましくは、０．００１〜３００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜２００ｍＭである。
【０１０９】
好ましくは、本発明の安定化方法で使用することができる窒素化合物の型に関して、本発明の溶解方法に関する上記実施項目を同一の様式で適用する。
【０１１０】
さらなる態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を検出するための分析方法であって、
ａ）少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質を含むサンプル調製物またはライセートを準備する工程と、前記少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を、本発明の安定化方法を使用して安定化すること、および
ｂ）少なくとも１つの核酸および／または少なくとも１つのタンパク質の検出のための反応または反応系列でサンプル調製物またはライセートを使用する工程と
を含む、分析方法に関する。サンプル調製物中に含まれる核酸種および／またはタンパク質種数の減少および／またはサンプル調製物からの核酸および／またはタンパク質を分解する物質の除去もしくは不活化のために、さらなる方法工程を行うことなくサンプル調製物またはライセートを直接使用する。
【０１１１】
検出すべき核酸種および／またはタンパク質種の安定化によって本方法によって改良された方法を行うことができ、これにより、検出反応物に先行するサンプル再馴化を、好ましくは、先に行うことができる。検出すべき核酸種またはタンパク質種を安定化するので、少量のサンプルを使用して検出することができる。
【０１１２】
対応する核酸種および／またはタンパク質種の検出のために使用した反応または反応系列の型に関して、本発明の溶解に関する上記実施項目を適用する。
【０１１３】
安定化に加えて、サンプル調製物またはライセートの生成時の窒素化合物の使用により、サンプル中に含まれる一定のさらなる核酸種をマスキングすることもできる。サンプルを溶解に供する場合、溶解を改良することもでき、特に、ライセート中の所望の核酸種および／またはタンパク質種の濃度を増加させることができる。安定化に加えて、場合により、サンプル中の一定の核酸種をマスキングすることができる。生成されたサンプル調製物またはライセートにおける阻害効果を、場合により、窒素化合物の使用によって減少させることもできる。
【０１１４】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質ならびに少なくとも１つの阻害物質を含むサンプルの阻害効果を減少させる方法を提供する。この方法は、以下の工程：
Ａ）少なくとも１種の核酸および／または１種のタンパク質ならびに少なくとも１つの阻害物質を含むサンプルを準備する工程と、
Ｂ）前記サンプルを液体または固体の組成物と接触させて液体サンプル調製物を産生する工程と、ここで、前記組成物が、ａ）ポリアミン、ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、ｃ）これらの窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、ｅ）カルボン酸アミン、ｆ）無機アンモニウム塩、ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、ｈ）核酸に結合する抗生物質、ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、ｊ）さらに誘導されたａ−ｉ群から選択される窒素化合物、および２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含むことを含み、ここで、液体サンプル調製物中の阻害物質の阻害効果を減少させる様式で前記サンプルに添加する窒素化合物の量を選択する。
【０１１５】
用語「阻害物質」は、サンプル調製物またはさらなる再馴化工程によって得られたサンプルを使用して実施するその後の分析または検出方法で阻害様式にて作用する（すなわち、検出反応に不利である）全ての物質と理解すべきである。核酸が検出すべきサンプル中に存在する場合、例えば、タンパク質はこのような阻害物質であり得る。サンプル中でタンパク質を検出すべきである場合、核酸は、例えば、このような阻害物質であり得る。タンパク質と核酸との相互阻害効果は、例えば、核タンパク質複合体の形成に基づき得る。本発明の好ましい実施形態では、阻害物質は、タンパク質、特に、核酸結合タンパク質、またはタンパク質結合核酸である。
核酸種および／またはタンパク質種と阻害物質との間に相互作用が起こり、これは、サンプル調製物を使用して行った分析または検出反応に悪影響を及ぼし、ここでは阻害効果であると理解される。阻害物質の存在により、反応の結果は、阻害物質を含まない同一物質と比較して悪影響を受ける。阻害効果の減少を、例えば、本発明で使用される窒素化合物の１つを添加したサンプルを使用して行う以下の一定の核酸種またはタンパク質種の分析または検出が窒素化合物を使用しない同一のサンプルを使用して行った同一の分析または検出反応と比較して改良されたという点で決定することができる。
【０１１６】
生物に加えて、分解するために溶解に供するサンプルは、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を含む材料の各混合物である。これは、材料の混合物または純粋な核酸もしくはタンパク質のみであり得る。これらの材料の混合物を、例えば、核酸またはタンパク質調製物によって得ることができる。したがって、サンプルは、固体または溶液として存在することができるか、純粋な生物または液体培地中の生物（例えば、細胞培養物）であり得る。サンプルの組成物を、サンプル型に応じて、液体（例えば、緩衝液）としてか固体として添加することができる。
【０１１７】
本発明の好ましい実施形態では、サンプルは、液体サンプル調製物の生成のために組成物との接触前に溶解に供し、場合により、さらなる精製工程に供する生体サンプルである。通常の溶解方法を使用して溶解することができ、さらなる精製工程は、例えば、核酸またはタンパク質調製物の調製方法または固定化方法であり得る。したがって、溶解を、上記の物理的、化学的、または酵素的な溶解方法によって支持することができる。ライセートの加熱または均質化による物理的支持、界面活性剤の使用による化学的支持、またはプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＫ（タンパク質の場合検出されない））、リゾチーム、もしくはヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ、この場合ＤＮＡを検出できない）の使用による酵素的支持を使用した溶解方法が適切であることが判明した。
【０１１８】
この方法の実施形態では、特に好ましくは、界面活性剤およびプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を使用して、酵素的、物理的、または化学的溶解後に選択した１つの物質によって核酸を安定化させる。したがって、例えば、濃度０．００５〜１０％の界面活性剤を使用する。プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）は、安定化されたサンプル中に、０．５×１０-4ｍＡＵ／μｌ〜５０×１０-4ｍＡＵ／μｌの濃度で含むことができる。
【０１１９】
この方法のさらなる実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ）による酵素分解後の１つまたは複数の特許請求の範囲に記載の物質によってＲＮＡを安定化させる。したがって、ＤＮアーゼＩは、安定化されたサンプル中に、０．００３Ｕ／μｌ〜０．５Ｕ／μｌの濃度で含むことができる。
【０１２０】
この方法のさらなる実施形態では、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ、ＤＮアーゼ、ベンゾナーゼなど）による酵素分解後の１つまたは複数の特許請求の範囲に記載の物質によってタンパク質を安定化させる。
【０１２１】
この方法のさらなる実施形態では、例えば、アルギニン、イミダゾール、プロリン、リジン、スペルミン、スペルミジン、グルタミン酸、インダゾール、チミン、チミジン、グアニン、グアノシン、アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、硫酸アンモニウム、またはこれらの混合物から選択される１つまたはいくつかの特許請求の範囲に記載の物質によって、サンプル中の生体分子（例えば、核酸またはタンパク質）を安定化する。
【０１２２】
本発明のこの態様のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１種の核酸またはタンパク質を、窒素化合物の添加前または添加中にキャリア材料に固定化する。したがって、既に上に記載されているキャリア材料を、本発明の他の態様と組み合わせて再度使用することができる。
【０１２３】
本発明のこの方法のさらに好ましい実施形態では、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を液体サンプル調製物中に溶解および／または懸濁するような様式でサンプルを調製する。これを、特に、サンプルへの適量の窒素化合物の添加によって行うことができる。組成物の添加によって生体サンプルを溶解する場合、これに対して、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を液体サンプル調製物中に溶解および／または懸濁するような様式で溶解することができる。
【０１２４】
本発明の方法のさらに好ましい実施形態では、サンプルは、少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質をケーシング（例えば、生体ケーシング）中に含む生体サンプルであり、ここで、サンプルが液体または固体組成物と接触してライセートが産生される。サンプルはまた、生物を含み得る。好ましくは、上記の本発明の方法にしたがって、生体サンプルの溶解のためにライセートを生成する。
【０１２５】
本発明の安定化方法において上に既に記載しているように、サンプルは、本発明の方法の好ましい実施形態では、阻害効果を減少させるための核酸およびタンパク質からなる群由来の少なくとも２種を含み、サンプル調製物の生成または溶解を、サンプル中に含まれる複数の核酸種および／またはタンパク質種がサンプル調製物またはライセート中に溶解および／または懸濁または固定化されるような様式で行う。好ましくは、これらの種の本質的に全てを、この方法の変形形態で溶解および／または懸濁または固定化する。それにより、サンプル中に含まれる全核酸種または溶液中に含まれる全タンパク質種を、溶解および／または懸濁または固定化することができる。溶解方法の類似の実施形態と組み合わせた上記の実施項目を同一の様式でここに適用する。
【０１２６】
これは、例えば、ライセートからの核酸またはタンパク質の除去のために使用する場合、本質的にサンプル調製または溶解中に沈殿が生じないことを意味する。サンプルがいくつかの種の核酸および／またはタンパク質を含む場合、これらの種のうちの２種、数種、または全種が溶解後にライセート中に溶解および／または懸濁したままであり、これらの異なる種の核酸および／またはタンパク質の相対濃度が溶解によって互いに変化せず、それにより、ライセート中のこれらの種の相対濃度がサンプル中のこの種の相対濃度に関して本質的に不変であることが特に好ましい。上記で既に開示しているように、溶解時のサンプルの型、使用可能な異なる溶解試薬、使用される窒素化合物型を考慮するために再度適用し、所与のサンプル型に適切な条件を決定するために、適切な日常的試験を行う必要がある。必要に応じて、所与のサンプル型に適切な条件を決定するために、適切な日常的試験を行う必要がある。
【０１２７】
本発明の阻害効果を減少させる方法では、好ましい実施形態により、特に、溶解および／または懸濁したＤＮＡおよび／またはＲＮＡがライセート中に含まれる。さらにまたはあるいは、特に、溶解または懸濁した少なくとも１種のタンパク質をライセート中に含めることができる。
【０１２８】
本発明の生体サンプルの溶解方法と組み合わせて上に既に記載されているように、溶解のために使用される組成物は、さらなる溶解試薬として錯化剤、界面活性剤、容積制限物質、および／または溶媒の群の少なくとも１つの試薬を含み得る。機械的作用下および／または酵素的様式で溶解することもできるか、溶解前にサンプルを低張洗浄緩衝液で洗浄することができる。本発明の溶解方法と組み合わせた上記の実施項目を同一の様式でここに適用する。
【０１２９】
本発明の安定化方法では、サンプルへの窒素化合物の添加量を、好ましくは、産生されたサンプル調製物またはライセート中の窒素化合物の濃度が０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、０．００１〜１００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜５０ｍＭまたは０．００１〜３０ｍＭ、特に、０．００１〜１０ｍＭであるような様式で選択する。ポリアミン（ａ）を使用する場合、濃度は、好ましくは、０．００１ｍＭと１５ｍＭとの間であり、好ましくは、０．００１ｍＭと１ｍＭとの間である。アミノ酸（ｂ）の使用時に、この濃度は、好ましくは、０．００１ｍＭ〜２０ｍＭの範囲、特に、１〜１５ｍＭの範囲であり得る。窒素複素環（ｃ）の使用時に、この濃度は、好ましくは、０．００１〜５０ｍＭ、好ましくは、０．００１〜３０ｍＭであり得る。カルボン酸アミン（ｅ）の使用時に、この濃度は、好ましくは、０．００１〜２０ｍＭであり得る。無機アンモニウム化合物を使用する場合、この濃度は、好ましくは、０．００１ｍＭ〜１００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜５０ｍＭであり得る。核酸に結合する抗生物質の使用時に、この濃度は、好ましくは、０．００１〜１５ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜１ｍＭであり得る。
【０１３０】
本発明の阻害効果の減少方法の特に好ましい実施形態では、少なくとも１つの核酸種は、ＤＮＡ種、特に、ｇＤＮＡ種および／またはＲＮＡ種である。
【０１３１】
好ましくは、本発明の阻害効果の減少方法で使用することができる窒素化合物の型に関して、本発明の溶解方法または本発明の安定化方法に関する上記実施項目を同一の様式で適用する。
【０１３２】
さらなる態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を検出するための分析方法であって、以下の工程：ａ）少なくとも１種の核酸および／または少なくとも１種のタンパク質を含む本発明のサンプル調製物またはライセートを準備する工程と、本発明の阻害効果の減少方法を使用して、サンプル調製物またはライセートの少なくとも１つの阻害効果が減少すること、および
ｂ）少なくとも１つの核酸および／または少なくとも１つのタンパク質の検出に適切な反応または反応系列でサンプル調製物を使用する工程と
を含む、分析方法に関する。
【０１３３】
この方法により、サンプル調製物またはライセートの阻害効果の減少によって、分析すべき種の検出を改良することができ、これにより、阻害物質の分離のために検出反応物に先行するサンプル再馴化を、先に行うことができる。
【０１３４】
本発明のこの分析方法の好ましい実施形態では、サンプル調製物中に含まれる核酸種および／もしくはタンパク質種数の減少のためのさらなる方法工程または核酸および／もしくはタンパク質を分解する物質のサンプル調製物からの除去またはこのような材料の不活化のためのさらなる工程を行うことなく、工程ｂ）において前記サンプル調製物またはライセートを同様に直接使用する。したがって、サンプル調製物またはライセートを、いかなるさらなる再馴化工程を行うことなく、分析に適切な反応溶液の分析または産生のために直接使用することが好ましい。
【０１３５】
さらなる実施形態では、溶解を、上記の物理的、化学的、または酵素的な溶解方法によって支持することができる。特に、ライセートの加熱または均質化による物理的支持、界面活性剤の使用による化学的支持、またはプロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＫ（タンパク質の場合検出されない））、リゾチーム、もしくはヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ、この場合ＤＮＡを検出できない）の使用による酵素的支持を使用した溶解方法が適切であることが判明した。
【０１３６】
この方法の実施形態では、特に好ましくは、界面活性剤およびプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を使用して、酵素的、物理的、または化学的溶解後に選択した１つの物質によって核酸を安定化させる。したがって、例えば、濃度０．００５〜１０％の界面活性剤を使用する。プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）は、安定化されたサンプル中に、０．５×１０-4ｍＡＵ／μｌ〜５０×１０-4ｍＡＵ／μｌの濃度で含むことができる。
【０１３７】
この方法のさらなる実施形態では、１つまたは複数の特許請求の範囲に記載の物質によって阻害効果を減少させる。核酸分解を、特に、この物質の１つによって改良することができる。したがって、ＤＮアーゼＩは、サンプル中に、０．００３Ｕ／μｌ〜０．５Ｕ／μｌの濃度でＤＮＡを分解することができる。
【０１３８】
この方法のさらなる実施形態では、例えば、選択された１つまたはいくつかの特許請求の範囲に記載の化学物質によってサンプル中の生体分子（例えば、核酸またはタンパク質）を安定化する。例えば、アルギニン、イミダゾール、プロリン、リジン、スペルミン、スペルミジン、グルタミン酸、インダゾール、チミン、チミジン、グアニン、グアノシン、アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、硫酸アンモニウム、またはこれらの混合物から選択される物質によってサンプル中の少なくとも２種の生体分子を処理する。
【０１３９】
対応する核酸種および／またはタンパク質種の検出のために使用した反応または反応系列の型に関して、本発明の溶解に関する上記実施項目をここに適用する。
【０１４０】
本発明のこの分析方法の特に好ましい実施形態では、サンプル調製物またはライセートは、ｇＤＮＡに加えて、ＲＮＡを含み、工程ｂ）中の反応系列は、任意選択的に、核酸の酵素との反応を含む。これらの反応は、特に、ｂ１）任意選択的なｇＤＮＡの酵素分解、およびそれに次ぐｂ２）ＲＮＡ検出のためのＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲであり得る。あるいは、ライセートは、ｇＤＮＡに加えて、ＲＮＡを含み、工程ｂ）中の反応系列は、以下の工程を含む：ｂ１）ｇＤＮＡ検出のためのＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲまたはｂ２）ＲＮＡ検出のためのＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ。したがって、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲは、任意選択的に、終点、多重、および／または実時間反応として進行する。
【０１４１】
本発明の方法の１つの実施形態では、分析方法を使用して、選択された核酸の第１の変換産物（例えば、ＲＮＡ由来の第１のｃＤＮＡ鎖）が得られる。
【０１４２】
上記で説明したサンプルにおける阻害効果の減少方法に関して、サンプル調製物またはライセート中に含まれる窒素化合物により、溶解をさらに改良し、一定の核酸種および／またはタンパク質種を安定化し、一定の核酸をマスキングすることもできる。
【０１４３】
さらなる態様では、本発明は、少なくとも１つの第１の核酸種および第１の種と異なる第２の核酸種を含むサンプル中の少なくとも１種の核酸の選択的マスキング方法に関する。この方法は、以下の工程：
Ａ）少なくとも２つの異なる種の核酸を含むサンプルを準備する工程と、
Ｂ）前記サンプルを液体または固体の組成物と接触させて液体サンプル調製物を産生する工程と、ここで、前記組成物が、以下：ａ）ポリアミン、ｂ）アミノ酸、オリゴペプチド、およびポリペプチド、ｃ）これらの窒素化合物を含むホモポリマーまたはヘテロポリマーが含まれる窒素複素環化合物、ｄ）Ｒ1Ｒ2ＮＲ3型のアミンであって、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が、Ｈ、Ｃ1〜Ｃ5アルキル基、およびアリール基からなる群から互いに独立して選択されること、ここで、Ｒ1、Ｒ2、およびＲ3が同時にＨではないこと、ｅ）カルボン酸アミン、ｆ）無機アンモニウム塩、ｇ）アンモニウム基を含む分子内塩化合物、ｈ）核酸に結合する抗生物質、ｉ）ＤＮＡの小さな空洞に結合する化合物、ｊ）さらに誘導されたａ−ｉ群から選択される窒素化合物、および２つまたはそれを超えるこれらの化合物の混合物からなる群から選択される少なくとも１つの窒素化合物を含むことを含み、ここで、前記サンプル調製物を、前記第１および第２の核酸種を前記液体サンプル調製物中に溶解および／または懸濁するような様式で生成し、ここで、前記窒素化合物の量を、同一の検出方法と比較して、前記第１の核酸種を、前記窒素化合物を前記サンプルに添加しない核酸の検出方法の改善された様式で検出することができる様式で前記第２の核酸種マスキングするように選択する。
サンプル中の第２の核酸種の簡潔な差分分析が本方法によって可能である。この方法では、差分分析で分析することができないが、第２の種の検出反応を潜在的に破壊または歪曲し得る第１の核酸種を、サンプル中で体系的にマスキングすることができる。したがって、サンプル由来の第１および第２の核酸種の分離を先に行うことができる。
言い換えると、ＤＮＡおよびＲＮＡの差分分析により、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡが差分マスキングされ、その結果、マスキングされた核酸を分析内で検出することができないか低効率で検出されるか、第２の種の分析結果に悪影響を及ぼさない。
【０１４４】
本発明のマスキング方法の好ましい実施形態では、サンプルは、溶解の液体サンプル調製物の生成のために組成物との接触前に溶解に供し、場合により、さらなる精製工程に供する生体サンプルである。さらに好ましい実施形態では、サンプルは、核酸種をケーシング、好ましくは、生体ケーシング中に含む生体サンプルであり、ここで、サンプルが液体または固体組成物と接触してライセートが産生される。さらに好ましい実施形態では、サンプルは少なくとも２種の核酸を含み、サンプル調製物またはライセートを、いくつかの一定の種の核酸および／またはタンパク質が生成されたライセート中に溶解または懸濁するような様式で生成する。サンプルが少なくとも２種の核酸を含み、サンプル調製物またはライセートをサンプル中に含まれる本質的に全てまたは複数の種の核酸がサンプル調製物またはライセート中に溶解および／または懸濁するような様式で生成することがさらに好ましい。窒素化合物を含む組成物が、さらなる溶解試薬として錯化剤、界面活性剤、容積制限物質、および／または溶媒の群の少なくとも１つの試薬を含むことがさらに好ましい。機械的作用下および／または酵素的様式で溶解することもできるか、溶解前にサンプルを低張洗浄緩衝液で洗浄することができる。これらの全ての好ましい実施形態に関して、本発明の溶解方法および本発明の安定化方法、または本発明の阻害効果の減少方法と組み合わせた上記の実施形態を適用する。
【０１４５】
本発明の選択的マスキング方法のさらに好ましい実施形態は、
ａ）第１の核酸種および第２の核酸種がＲＮＡ種またはＰＮＡ種であるか、
ｂ）第１の核酸種がＲＮＡ種であり、第２の核酸種がＤＮＡ種であるか、
ｃ）第１の核酸種がＰＮＡ種であり、第２の核酸種がＤＮＡ種またはＲＮＡ種であるか、
ｃ）第１の核酸種および第２の核酸種がＤＮＡ種であるか、
ｃ）第１の核酸種および第２の核酸種がＲＮＡ種であるか、
ｅ）第１の核酸種および第２の核酸種が核酸ＰＮＡである。
【０１４６】
本発明の選択的マスキング方法の好ましい実施形態では、サンプル調製物またはライセートの生成における窒素化合物の量を、生成されたサンプル調製物またはライセート中の窒素化合物の濃度が、０．００１ｍＭ〜１Ｍ、好ましくは、０．００１〜１００ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜３０ｍＭ、特に、０．００１〜１９ｍＭまたは０．００１〜１５ｍＭであるような様式で選択する。好ましくは、ＲＮＡと比較したＤＮＡ（例えば、ｇＤＮＡ）の選択的マスキングのためのポリアミン（ａ）（特に、スペルミジン）の使用時の濃度は、好ましくは、０．００１〜１０ｍＭ、好ましくは、０．００１〜１ｍＭである。好ましくは、ＲＮＡと比較したＤＮＡ（例えば、ｇＤＮＡ）の選択的マスキングのためのアミノ酸（ｂ）の使用時の濃度は、好ましくは、０．００１〜５０ｍＭ、特に好ましくは、０．００１〜３０ｍＭである。好ましくは、ＲＮＡと比較したＤＮＡ（例えば、ｇＤＮＡ）のマスキングのための複素環式窒素化合物の使用時の濃度は、好ましくは、０．００１〜３０ｍＭ、好ましくは、０．００１〜２０ｍＭである。好ましくは、ＲＮＡと比較したＤＮＡ（例えば、ｇＤＮＡ）のマスキングのための有機アンモニウム化合物の使用時の濃度は、好ましくは、０．００１〜５０ｍＭ、好ましくは、０．００１〜３０ｍＭである。好ましくは、ＲＮＡと比較したＤＮＡ（例えば、ｇＤＮＡ）のマスキングのためのカルボン酸アミドの使用時の濃度は、好ましくは、０．００１〜２０ｍＭ、好ましくは、０．００１〜１０ｍＭである。選択すべき濃度は、サンプル型に影響を受け得るので、場合により、同様に考慮すべきである。
【０１４７】
好ましくは、本発明の阻害効果の減少方法で使用することができる窒素化合物型に関して、溶解方法に関する上記の実施項目を同一の様式で適用する。
【０１４８】
さらなる態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を検出するための分析方法であって、以下の工程：
ａ）少なくとも第１の核酸種および第２の核酸種を含むサンプル調製物を準備する工程と、第１の核酸種が第２の核酸種と異なること、第１の核酸種を、本発明の選択的マスキング方法を使用してマスキングすること、
ｂ）第２の核酸種の検出に適切な反応または反応系列中でサンプル調製物またはライセートを使用する工程と
を含む、分析方法に関する。
【０１４９】
本発明の分析方法を、第１の核酸種の分析に悪影響を及ぼす可能性のある第２の核酸種の事前の分離を行わない選択的マスキングによって行うことができる。分析方法は、改良よび簡素化され、それにより、分析前に実施すべき複雑な分離工程を省略することができる。
【０１５０】
本発明の分析方法の好ましい実施形態では、サンプル調製物中に含まれる核酸種数の減少のためのさらなる方法工程および／または核酸を分解する材料のサンプル調製物からの除去、またはサンプル調製物中のこれらの物質の不活化のためのさらなる方法工程を行うことなく工程ｂ）を行う。第２の核酸種の検出または分析に適切な反応溶液の産生のための反応または反応系列でさらなる再馴化工程を行うことなく、サンプル調製物またはライセートを直接使用する。したがって、一定の核酸種の検出のためのサンプル調製が非常に簡素化され、それにより、時間および費用の消費ならびに分析方法のエラー感受性を軽減することができる。
【０１５１】
対応する核酸種の検出のために使用される反応または反応系列型に関して、本発明の前述の態様（例えば、本発明の溶解）と組み合わせた上記の実施項目を同一の様式で適用する。
【０１５２】
差分分析方法の特に好ましい実施形態では、第２の核酸種の検出のために工程ｂ）で使用した反応または反応系列は、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲである。好ましくは、サンプル調製物またはライセート中の第１の核酸種はｇＤＮＡであり、第２の核酸種はＲＮＡであり、工程ｂ）における反応または反応系列はＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲである。窒素化合物は、本発明の溶解方法に関する上記のポリアミン、複素環、アミノ酸、カルボン酸アミン、およびアンモニウム化合物の群から選択され、好ましくは、化合物は、スペルミジン、硫酸アンモニウム、リン酸水素アンモニウム、グリシン、２，３−ジメチルピラジン、ベンズイミダゾール、イミダゾール、アルギニン、ヒスチジン、尿素、およびジスタマイシン、特に、ジスタマイシンＤからなる群から選択される。
【０１５３】
本発明の差分分析方法のさらに好ましい実施形態では、サンプル調製物またはライセート中の第１の核酸ＲＮＡ種および第２の核酸種は、ＤＡＮＮ、好ましくは、ｇＤＮＡである。工程ｂ）では、反応または反応系列は、ＲＴ−ＰＣＲ、好ましくは、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲである。好ましくは、複素環、アミノ酸、およびアンモニウム化合物の群から選択される本発明の溶解方法と組み合わせた本明細書中に記載の化合物をここで使用し、この化合物は、特に、プロリン、イミダゾール、および硫酸アンモニウムからなる群から選択される。
【０１５４】
本発明を、以下の選択された実施例および対応する図面で詳細に説明する。実施例は、本発明を明らかにする目的を果たし、本発明を制限すると見なされない。
【０１５５】
さらなる態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも１種のＤＮＡを検出するための分析方法であって、
ａ）サンプル調製物またはライセートを準備する工程と、少なくとも１種のＲＮＡを、本発明のサンプル調製物中の少なくとも１つの物質で処理すること、および
ｂ）少なくとも１種のＲＮＡの検出に適切な反応または反応系列でサンプル調製物を使用する工程とを含む、分析方法に関する。サンプル調製物中に含まれる核酸種および／またはタンパク質種数の減少および／または核酸および／またはタンパク質を分解する物質のサンプル調製物からの除去または不活化のためのさらなる方法工程を行うことなく、サンプル調製物を、好ましくは、直接使用する。
【０１５６】
この方法の１つの実施形態では、少なくとも１種のＲＮＡの処理を、１つの選択された物質（生物中にＲＮＡが含まれる場合、特に、単細胞、細胞集合体、組織、動物または植物全体、培養細胞、排泄物または分泌物（例えば、安定化および非安定化血液、血漿、血清、組織液、精子、標本、痰、唾液、涙、尿、便、毛髪、鱗屑、細菌、ウイルスなど））によって行う。
【０１５７】
本発明の方法の１つの実施形態では、上記生物を、本発明の物質での処理前に洗浄液で前処理することができる。夾雑物を除去し、そして／または別の様式での本発明の物質での処理のためのサンプルを調製する洗浄液を使用することが特に好ましい。
【０１５８】
この方法により、検出すべきＲＮＡ種の処理によって、検出および／または反応を改良することができる。
【０１５９】
対応するＲＮＡ種の検出のために使用される反応または反応系列の型に関して、本発明の溶解と組み合わせた上記実施項目を適用する。
【０１６０】
本発明の方法のさらなる実施形態では、生物を、溶解緩衝液と、好ましくは、１〜１２０分間インキュベートする。本発明の方法のさらなる実施形態では、生物を、溶解緩衝液と、室温と比較して高い温度（好ましくは、３０〜９０℃、特に好ましくは、５０〜８５℃）でインキュベートする。
【０１６１】
この方法のさらなる実施形態では、酵素的、物理的、または化学的溶解中または溶解後に選択された物質の１つによって、特に好ましくは、界面活性剤およびプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）を使用して、少なくとも１種のＲＮＡを処理する。したがって、例えば、濃度０．００５〜１０％の界面活性剤を使用する。プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を、０．５×１０-4ｍＡＵ／μｌ〜５０×１０-4ｍＡＵ／μｌの濃度で安定化サンプル中に含めることができる。
【０１６２】
この方法のさらなる実施形態では、少なくとも１種のＲＮＡを、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＤＮアーゼ）によるＤＮＡの酵素分解中または酵素分解後に選択された物質の１つによって処理する。したがって、ＤＮアーゼＩを、０．００３Ｕ／μｌ〜０．５Ｕ／μｌの濃度で安定化サンプル中に含めることができる。
【０１６３】
本発明の方法のさらなる実施形態では、酵素処理後、温度上昇（例えば、６０〜９５℃）によって酵素を不活化させる。
【０１６４】
この方法のさらなる実施形態では、少なくとも１種のＲＮＡを、選択された物質の１つおよび物理的処理工程、特に好ましくは、剪断力、圧力差、または温度作用によって処理する。
【０１６５】
この方法のさらなる実施形態では、少なくとも１種のＲＮＡを、例えば、アルギニン、イミダゾール、プロリン、リジン、スペルミン、スペルミジン、グルタミン酸、インダゾール、チミン、チミジン、グアニン、グアノシン、アデニン、ヒスチジン、トリプトファン、硫酸アンモニウム、またはこれらの混合物から選択される１つまたは複数の特許請求の範囲に記載の物質によってサンプル中で処理する。
【０１６６】
この方法のさらなる実施形態では、少なくとも１種のＲＮＡを、少なくとも１つの上記物質を含む溶液中で処理し、この溶液は、ｐＨ７．１とｐＨ１４との間、好ましくは、ｐＨ７．１とｐＨ１２との間、特に好ましくは、ｐＨ７．４とｐＨ１０との間である。
【０１６７】
したがって、少なくとも１種のＲＮＡの検出に適切な配列または配列系列を、例えば、核酸結合反応、特に、核酸ハイブリッド形成、特に、核酸の重合の群、特に、増幅反応の群から選択することができる。この方法の特定の実施形態では、少なくとも１種のＲＮＡの検出方法は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、リアルタイムＰＣＲ（プローブベースの方法および配列非特異的結合分子（例えば、ＳｙｂｒＧｅｅｎ）に依存する方法）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（プローブに基づいた方法および配列非特異的結合検出分子（例えば、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）に依存する方法）、マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲおよびリアルタイムマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲのプローブに基づいた方法である。記載の用語「ＲＴ−ＰＣＲ」は、以下のように理解すべきである。ＲＴ−ＰＣＲの反応は、逆転写およびＰＣＲからなり、両反応は、２つの個別の容器中で互いに独立しておこるか、１つの容器中で共に起こり得る。両反応は、１つまたは複数の酵素によって起こり得る。ＲＴ−ＰＣＲに加えて、少なくとも１種のＲＮＡを使用して他の反応を起こすこともできる（例えば、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、３ＳＲ（配列持続自己複製）、２ＳＲ、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＭＤＡ（多置換増幅）、ローリングサークル増幅、全トランスクリプトーム増幅、全ゲノム増幅、およびローリング転写増幅、またはループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ））。
【０１６８】
さらなる態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも１種のＤＮＡを検出するための分析方法であって、
ａ）少なくとも１種のＤＮＡを含むサンプル調製物またはライセートを準備する工程と、少なくとも１種のＤＮＡを、サンプル調製物中の本発明の少なくとも１つの物質で処理すること、および
ｂ）少なくとも１種のＤＮＡの検出に適切な反応または反応系列でサンプル調製物を使用する工程とを含む、分析方法に関する。検出反応前にサンプル調製物中に含まれる核酸種および／またはタンパク質種数の減少および／または核酸および／またはタンパク質を分解する物質のサンプル調製物からの除去または不活化のためのさらなる方法工程を行うことなく、サンプル調製物を、好ましくは、直接使用する。
【０１６９】
この方法の１つの実施形態では、少なくとも１種のＤＮＡの処理を、１つの選択された物質（生物中にＤＮＡが含まれる場合、特に、単細胞、細胞集合体、組織、動物または植物全体、培養細胞、排泄物または分泌物（例えば、安定化および非安定化血液、血漿、血清、組織液、精子、標本、痰、唾液、涙、尿、便、毛髪、鱗屑、細菌、ウイルスなど））によって行う。
【０１７０】
本発明の方法の１つの実施形態では、上記生物を、本発明の物質での処理前に洗浄液で前処理することができる。夾雑物を除去し、そして／または別の様式での本発明の物質での処理のためのサンプルを調製する洗浄液を使用することが特に好ましい。
【０１７１】
この方法により、検出すべきＤＮＡ種の処理によって、検出および／または反応を改良することができる。
【０１７２】
対応するＤＮＡ種の検出のために使用される反応または反応系列の型に関して、本発明の溶解と組み合わせた上記実施項目を適用する。
【０１７３】
本発明の方法のさらなる実施形態では、生物を、溶解緩衝液と、好ましくは、１〜１２０分間インキュベートする。本発明の方法のさらなる実施形態では、生物を、溶解緩衝液と、室温と比較して高い温度（好ましくは、３０〜１００℃、特に好ましくは、５０〜８５℃）でインキュベートする。
【０１７４】
この方法のさらなる実施形態では、酵素的、物理的、または化学的溶解前、溶解中、または溶解後に選択された物質の１つによって、特に好ましくは、界面活性剤およびプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）を使用して、少なくとも１種のＲＮＡを処理する。したがって、濃度０．００５〜１０％の界面活性剤を使用する。プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を、０．５×１０-4ｍＡＵ／μｌ〜５０×１０-4ｍＡＵ／μｌの濃度で安定化サンプル中に含めることができる。
この方法のさらなる実施形態では、少なくとも１種のＲＮＡを、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＲＮアーゼ）によるＲＮＡの酵素分解後に選択された物質の１つによって処理する。
【０１７５】
本発明の方法のさらなる実施形態では、酵素処理後、例えば、温度上昇（例えば、６０〜１００℃）によって酵素を不活化させる。
【０１７６】
この方法のさらなる実施形態では、少なくとも１種のＤＮＡを、例えば、トリプトファン、プロリン、ヒスチジン、グアニン、またはこれらの混合物から選択される物質によってサンプル中で処理する。
【０１７７】
この方法のさらなる実施形態では、少なくとも１種のＤＮＡを、少なくとも１つの上記物質を含む溶液中で処理し、この溶液は、ｐＨ７．１とｐＨ１４との間、好ましくは、ｐＨ７．１とｐＨ１２との間、特に好ましくは、ｐＨ７．４とｐＨ１０との間である。
【０１７８】
この方法のさらなる実施形態では、少なくとも１種のＤＮＡを、選択された物質の１つおよび物理的処理工程、特に好ましくは、温度作用によって処理する。
【０１７９】
したがって、少なくとも１種のＤＮＡの検出に適切な配列または配列系列を、例えば、核酸結合反応、特に、核酸ハイブリッド形成、特に、核酸の重合の群、特に、増幅反応の群から選択することができる。この方法の特定の実施形態では、少なくとも１種のＲＮＡの検出方法は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、リアルタイムＰＣＲ（プローブに基づいた方法および配列非特異的結合分子（例えば、ＳｙｂｒＧｅｅｎ）に依存する方法）、マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ、リアルタイムマルチプレックスＰＣＲおよびリアルタイムマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲのプローブに基づいた方法である。ＰＣＲに加えて、少なくとも１種のＤＮＡを使用して他の反応を起こすこともできる（例えば、ＭＤＡ（多置換増幅）、ローリングサークル増幅、全トランスクリプトーム増幅、全ゲノム増幅、およびローリング転写増幅、またはループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ））。
【０１８０】
さらなる態様では、本発明は、サンプル中の少なくとも２種の生体分子（例えば、少なくとも１種の核酸および少なくとも１種のタンパク質）を検出するための分析方法であって、
ａ）少なくとも２種の生体分子（例えば、少なくとも１種の核酸および少なくとも１種のタンパク質）を含むサンプル調製物またはライセートを準備する工程と、少なくとも１種の核酸および／またはタンパク質を、本発明の少なくとも１つの物質で処理すること、および
ｂ）少なくとも２種の生体分子（例えば、少なくとも１種の核酸および１種のタンパク質）の検出に適切な反応または反応系列でサンプル調製物を使用する工程とを含む、分析方法に関する。サンプル調製物中に含まれる核酸種および／またはタンパク質種数の減少および／または核酸および／またはタンパク質を分解する物質のサンプル調製物からの除去または不活化のためのさらなる方法工程を行うことなく、サンプル調製物を、好ましくは、直接使用する。
【０１８１】
この方法の１つの実施形態では、核酸および／またはタンパク質の処理を、１つの選択された物質（生物中に核酸および／またはタンパク質が含まれる場合、特に、単細胞、細胞集合体、組織、動物または植物全体、培養細胞、排泄物または分泌物（例えば、安定化および非安定化血液、血漿、血清、組織液、精子、標本、痰、唾液、涙、尿、便、毛髪、鱗屑、細菌、ウイルスなど））によって行う。
【０１８２】
本発明の方法の１つの実施形態では、上記生物を、本発明の物質での処理前に洗浄液で前処理することができる。夾雑物を除去し、そして／または別の様式での本発明の物質での処理のためのサンプルを調製する洗浄液を使用することが特に好ましい。
【０１８３】
この方法により、核酸および／またはタンパク質を、処理サンプル中の処理に起因する反応において同様に検出することができる。
この方法により、ＲＮＡおよびＤＮＡ、ＲＮＡおよびタンパク質、またはＤＮＡおよびタンパク質を、処理サンプルの処理によって検出することができる。
対応する核酸種および／またはタンパク質種の検出のために使用される反応または反応系列の型に関して、本発明の溶解と組み合わせた上記実施項目を適用する。
【０１８４】
処理サンプル中のＲＮＡおよびＤＮＡの検出のためのこの方法の１つの実施形態では、酵素的、物理的、または化学的溶解前、溶解中、または溶解後に選択された物質の１つによって、特に好ましくは、界面活性剤およびプロテアーゼ（プロテイナーゼＫ）を使用して、核酸を処理する。したがって、例えば、濃度０．００５〜１０％の界面活性剤を使用する。プロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）を、０．５×１０-4ｍＡＵ／μｌ〜５０×１０-4ｍＡＵ／μｌの濃度で安定化サンプル中に含めることができる。
【０１８５】
処理サンプル中のＲＮＡおよびタンパク質の検出のためのこの方法の１つの実施形態では、酵素的、物理的、または化学的溶解前、溶解中、または溶解後に選択された物質の１つによって、特に好ましくは、界面活性剤および／またはＤＮＡ特異的ヌクレアーゼを使用して、核酸を処理する。したがって、例えば、ＤＮアーゼＩを、０．００３Ｕ／μｌ〜０．５Ｕ／μｌの濃度で安定化サンプル中に含めることができる。
【０１８６】
処理サンプル中のＤＮＡおよびタンパク質の検出のためのこの方法の１つの実施形態では、酵素的、物理的、または化学的溶解前、溶解中、または溶解後に選択された物質の１つによって、特に好ましくは、界面活性剤および／またはＲＮＡ特異的ヌクレアーゼを使用して、核酸を処理する。
【０１８７】
本発明の方法のさらなる実施形態では、生物を、溶解緩衝液と、好ましくは、１〜１２０分間インキュベートする。本発明の方法のさらなる実施形態では、生物を、溶解緩衝液と、室温と比較して高い温度（好ましくは、３０〜８５℃、特に好ましくは、５０〜８０℃）でインキュベートする。
【０１８８】
この方法のさらなる実施形態では、少なくとも２種の生体分子を、例えば、アルギニン、プロリン、イミダゾール、またはこれらの混合物から選択される物質によってサンプル中で処理する。
【０１８９】
この方法のさらなる実施形態では、サンプルを、少なくとも１つの上記物質を含む溶液中で処理し、この溶液は、ｐＨ７．１とｐＨ１４との間、好ましくは、ｐＨ７．１とｐＨ１２との間、特に好ましくは、ｐＨ７．４とｐＨ１０との間である。
【０１９０】
したがって、少なくとも１種の核酸の検出に適切な配列または配列系列を、核酸結合反応、特に、核酸ハイブリッド形成、特に、核酸の重合、特に、増幅反応の群から選択することができる。この方法の特定の実施形態では、少なくとも１種のＲＮＡの検出方法は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、リアルタイムＰＣＲ（プローブに基づいた方法および配列非特異的結合分子（例えば、ＳｙｂｒＧｅｅｎ）に依存する方法）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写ポリメラーゼ連鎖反応法）、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（プローブに基づいた方法および配列非特異的結合検出分子（例えば、ＳｙｂｒＧｒｅｅｎ）に依存する方法）、マルチプレックスＰＣＲ、マルチプレックスＲＴ−ＰＣＲ、プローブに基づいた方法であるリアルタイムマルチプレックスＰＣＲおよびリアルタイムマルチプレックスＲＴ−ＰＣＲのプローブに基づいた方法である。用語「ＲＴ−ＰＣＲ」は、以下に記載のように理解すべきである。ＲＴ−ＰＣＲの反応は、逆転写およびＰＣＲからなり、両反応は、２つの個別の容器中で互いに独立しておこるか、１つの容器中で共に起こり得る。両反応は、１つまたは複数の酵素によって起こり得る。ＲＴ−ＰＣＲに加えて、少なくとも１種のＲＮＡを使用して他の反応を起こすこともできる（例えば、ＮＡＳＢＡ（核酸配列ベースの増幅）、３ＳＲ（配列持続自己複製）、２ＳＲ、ＴＭＡ（転写媒介増幅）、ＭＤＡ（多置換増幅）、ローリングサークル増幅、全トランスクリプトーム増幅、全ゲノム増幅、およびローリング転写増幅、またはループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ））。
少なくとも１つのタンパク質の検出に適切な反応または反応系列は、タンパク質結合反応、特に、タンパク質認識、特に、他のタンパク質によるタンパク質の認識、タンパク質、抗体、アプタマー、リガンド、核酸（特に、ウェスタンブロッティング）、または他の物質（グルタチオンおよびＮＡＤなど）の酵素活性に基づいた反応の群から選択されるか、タンパク質の修飾またはプロセシング、特に、（脱）リン酸化、（脱）グリコシル化、およびプロテアーゼによる分断の群から選択することができる。
上記の全ての方法を、溶液、懸濁液、固相中で行うことができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【０１９１】
以下の実施例では、特許請求の範囲に記載の本発明で定義されている窒素化合物を添加物と呼ぶ。
以下の他で記載されない限り、本実施例で以下の材料を使用した。
【０１９２】
親溶液
（１）５００ｍＭ  ＥＧＴＡ（ｐＨ８）
（２）５００ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ８）
（３）ＴＥ緩衝液、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）
（４）ＥＰＥ：０．０６体積％ＮｏｎｉｄｅｔＰ４０、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＥＧＴＡ、０．１体積％ポリエチレングリコールＭＧ６０００（ＰＥＧ）
【０１９３】
デバイス：
（１）ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ７７００（ＡＢＩ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）（リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ）
（２）ＰＣＲ  ＴｈｅｒｍｏＣｙｃｌｅｒ（Ｂｉｏｍｅｔｒａ  ＧｍｂＨ，Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
（３）ＤＮＡまたはＲＮＡ濃度の決定のための分光計（Ｂｅｃｋｍａｎ  ＤＵ  ７４００，Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｎｃ．，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ  ＵＳＡ）
（４）Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ，ＵＳＡ）（変性ゲル分析）
【０１９４】
細胞培養：
（Ｉ）ＨｅＬａ細胞
（２）２９３細胞
（３）ＨＵＨ７細胞
（４）ＮＩＮ３Ｔ３細胞
（５）ＨｅｐＧ２細胞
（６）ＭＣＦ７細胞
【０１９５】
培地：
（１）Ｄ−ＭＥＭ（ＢＲＬ；ＵＳＡ）（１０％ＦＣＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐｔおよび／または１％の非必須アミノ酸を部分的に含む）（ＨｅＬａ、ＨＵＨ７、２９３、ＮＩＨ３Ｔ３用）
（２）ＲＰＭＩ１６４０（ＢＲＬ；ＵＳＡ）（１０％ＦＣＳ、１％グルタミン、および／または１％ＰＥＮ／Ｓｔｒｅｐｔを部分的に含む）（ＨｅｐＧ２細胞用）
（３）ＲＰＭＩ１６４０（ＢＲＬ；ＵＳＡ）（１０％ＦＣＳ、１％ピルビン酸ナトリウム、１％グルタミン、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐｔ、１％非必須ＡＳ、および／または０．２５％ウシインシュリンを部分的に含む）（ＭＣＦ７細胞用）
【０１９６】
キットおよび酵素：
（１）ＲＮｅａｓｙ（登録商標）：ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，ＧｅｒｍａｎｙのＲＮＡ調製方法
（２）ＲＮｅａｓｙ  ９６（登録商標）：ＲＮＡ  ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，ＧｅｒｍａｎｙのＲＮＡ調製方法
（３）Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ−Ｋｉｔ：ＲＮＡの逆転写酵素反応キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
（４）Ｓｅｎｓｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）ＲＴ−Ｋｉｔ：ＲＮＡの逆転写酵素反応キット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
（５）ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）ＳｙｂｒＧｅｅｎＰＣＲキット：ＳｙｂｒＧｒｅｅｎを使用したリアルタイムＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
（６）ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ（登録商標）サンプルＰＣＲキット：標識プローブを使用したリアルタイムＰＣＲキット（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
（７）ＤＮアーゼＩ：（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）
【０１９７】
リアルタイムＲＴ−ＰＣＲまたはＰＣＲで試験した転写物およびゲノム−遺伝子座
（１）転写部物およびゲノム遺伝子座としてのβ−アクチン
（２）転写物および遺伝子座としてのＧＡＰＤＨ
（３）転写物としてのβ−チューブリン
【０１９８】
ＤＮアーゼＩ消化（実施例１０および１１）
実施例１０および１１では、以下のようにＤＮアーゼＩ消化を行った。ＤＮアーゼＩ消化物はライセートであり、リアルタイムＰＣＲの前に消化した。これのために、２μｌのライセートを、２単位（単位）のＤＮアーゼＩと共に１５０μＭ  ＣａＣｌ2、４ｍＭ  ＭｇＣｌ2、および５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．４）を含む２０μｌの適切な緩衝液中で消化した。ＥＤＴＡ／ＥＧＴＡ溶液の添加によって反応を停止させた。次いで、２μｌの反応溶液を、ｇＤＮＡの残存量を測定するためのリアルタイムＰＣＲに取り掛かった。
【０１９９】
Ｉ．溶解
実施例１
異なる添加物の存在下での細胞の溶解
本実験を使用して、添加物の添加によってより効率的に細胞を溶解することができることを示す。これのために、細胞を、第１の実験の添加物として濃度１５ｍＭのイミダゾール水溶液を含む溶解溶液中で溶解した。第２の実験では、細胞を、イミダゾール（１５ｍＭ）を添加したＮｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液Ｂ中に溶解した。比較例として、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液Ｃ中に溶解した。溶解効率の決定のために、比較リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにおいて各細胞転写物のＣＴ値を決定した。Ｃｔ値は、ＰＣＲサイクルであり、これは、最初にＰＲＣシグナルが検出される（すなわち、視覚可能になる）。この実験では、添加物なしの溶解後のＣｔ値と添加物イミダゾールを使用した溶解でのＣｔ値との相違からΔＣｔ値を計算する。負のΔＣｔ値は、添加物を使用しない比較系と比較して改善された値を示す。正のΔＣｔ値は、添加物を使用しない比較系と比較して、溶解効率が低いことを示す。
【０２００】
実施：４００００個の２９３細胞を、適切な培地中で３日間インキュベートした。第１の実験では、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含むが、添加物を含まない溶解緩衝液中に溶解した。第２の実験では、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、および添加物として１５ｍＭイミダゾールを含む溶解緩衝液中に溶解した。第３の実験では、細胞を、Ｈ2Ｏに溶解したイミダゾールを含む溶解緩衝液中に溶解した。
２μｌのこの様式で得たＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手したＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）で標準的な逆転写酵素反応に変換した。この反応の終了後、２μｌのＲＴ反応溶液を、一定の転写物の検出のために、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに移した。
【０２０１】
結果：図１は、各実験のそれぞれ決定したΔＣｔ値を比較した図を示す。これらの結果は、細胞ＲＮＡが、添加物としてイミダゾール含む各溶解緩衝液の存在下でΔＣｔ値を示すことを示し、イミダゾールを含まない通常の溶解緩衝液を使用した分析よりも約１．５〜３．５Ｃｔ低かった（すなわち、より大きな負の値）。これは、溶解においてかなり向上した程度を示す。
【０２０２】
実施例２
添加物として異なる窒素化合物を使用したＨ2Ｏ中での細胞の溶解
本実施例では、異なる添加物の存在下および非存在下での水中での溶解によるＲＮＡ収率を比較した（リジン（１ｍＭ）、２，３−ジメチルピラジン（１５ｍＭ）、イミダゾール（１５ｍＭ）、尿素（５ｍＭ）、スペルミジン（１ｍＭ））。ＲＮＡ収率の増加は、より効率の高い溶解を示す。二次的影響の可能性を排除するために、各ライセートのＲＮＡを、溶解後にＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手したＲＮｅａｓｙ９６（登録商標）によって清浄化し、２６０ｎｍでの濃度測定によって定量した。
【０２０３】
実施：２００００個のＭＣＦ細胞を、適切な培地を含む９６ウェルのマルチタイター培養ポッド中でインキュベートした。細胞を、Ｈ2Ｏまたは異なる添加物を含むＨ2Ｏで溶解した。ライセートを、ＲＮｅａｓｙ９６（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから利用可能）で清浄化し、２６０ｎｍの波長で濃度測定を行った。添加物を含まないＨ2Ｏでの溶解を使用したＲＮＡの収率を、１００％に正規化した。
【０２０４】
結果：図２は、異なる添加物を使用してＲＮＡ収率を比較した図を示す。これらの結果から各添加物の使用によってより良好なＲＮＡ収率が得られることが示され、このことは、添加物の使用によってより効率の良い溶解が得られることを示している。
【０２０５】
実施例３
溶解緩衝液および異なる添加物を使用した細胞の溶解
本実施例では、異なる添加物の存在下および非存在下での溶解緩衝液を使用した溶解におけるＲＮＡ収率を比較した。ＲＮＡ収率の増加は、より効率の高い溶解を示す。二次的影響の可能性を排除するために、各ライセートのＲＮＡを、溶解後にＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから利用可能なＲＮｅａｓｙ９６によって清浄化し、２６０ｎｍでの濃度測定によって定量した。
【０２０６】
実施：２００００個のＭＣＦ細胞を、適切な培地を含む９６ウェルのマルチタイター培養ポッド中でインキュベートする。細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液中で清浄化するか、上記試薬に加えて、アルギニン（５ｍＭ）、リジン（１ｍＭ）、２，３−ジメチルピラジン（１５ｍＭ）、イミダゾール（１５ｍＭ）、スペルミジン（１ｍＭ）、ピリミジン（１５ｍＭ）、グアニン（１５ｍＭ）を含む溶解緩衝液中に溶解する。ライセートを、ＲＮｅａｓｙ９６（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから利用可能）で清浄化し、その後、２６０ｎｍの波長で濃度測定を行った。添加物を含まない溶解緩衝液での溶解時のＲＮＡの収率を、１００％に正規化した。
【０２０７】
結果：図３は、異なる実験のＲＮＡ収率を比較した図を示す。使用した全ての添加物で収率を増加することができることがこの図から認められる。添加物としてのグアニンの使用によって収率を特に多く増加させることができる（９４％）。
【０２０８】
ＩＩ．安定化
実施例４
異なる添加物による細胞ライセート中の細胞ＲＮＡの安定化
細胞を、添加物を含むか含まない溶解緩衝液中に溶解した。ＲＮＡ安定化度を決定するために、細胞転写物のＣＴ値を、比較リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで決定した。Ｃｔ値は、ＰＣＲサイクルであり、これは、最初にＰＲＣシグナルが検出される（すなわち、視覚可能になる）。この実験では、添加物を使用した溶解サンプルのＣｔ値と添加物を使用しない溶解サンプルのＣｔ値との相違からΔＣｔ値を計算する。低い（すなわち、ΔＣｔ値がより負である）ほど、安定化効果は高くなり、これは、ライセートへの添加物の添加によって起こる。
【０２０９】
実施：４００００個のＨｅｐＧ２細胞を、適切な培地中で３日間インキュベートした。第１の実験では、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含むが、添加物を含まない溶解緩衝液中に溶解した。さらなる実験では、細胞を、上記溶解試薬に加えて、添加剤として、イミダゾール（１５ｍＭ）、プロリン（１５ｍＭ）、グルタミン酸（１５ｍＭ）、ヒスチジン（１５ｍＭ）、アルギニン（５ｍＭ）、トリプトファン（１５ｍＭ）、グリシン（１５ｍＭ）、ピリミジン（１５ｍＭ）、グアニン（１５ｍＭ）、シトシン（３０ｍＭ）、ベタイン（１００ｍＭ）、エクトイン（２００ｍＭ）、２，３−ジメチルピラジン（３０ｍＭ）、２−アミノチアゾール（１５ｍＭ）、インダゾール（１５ｍＭ）、ベンズイミダゾール（１５ｍＭ）、尿素（５ｍＭ）、または硫酸アンモニウム（１３０ｍＭ）を含む溶解緩衝液中に溶解した。２μｌのこの様式で得たＲＮＡを、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で標準的な逆転写酵素反応に変換した。逆転写反応の終了後、２μｌのＲＴ反応溶液を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに移した。
【０２１０】
結果：図４は、細胞ＲＮＡの安定化をΔＣｔ値を用いて異なる添加物によって明らかにした図を示す。図から、０．５〜８Ｃｔ領域中のΔＣｔ値が異なる濃度の添加物の存在下で達成される。これにより、添加物を含む溶解緩衝液中のＲＮＡの安定性を、これらに添加物を添加していない溶解緩衝液の使用と比較すると非常により高いことが明らかである。
【０２１１】
実施例５
添加物の存在下での細胞ライセート中の細胞ＲＮＡの安定化
添加物を含むまたは含まない溶解緩衝液中に細胞を溶解した。ＲＮＡ安定化度を決定するために、比較リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて細胞転写物のＣＴ値を決定した。Ｃｔ値は、ＰＣＲサイクルであり、これは、最初にＰＲＣシグナルが検出される（すなわち、視覚可能になる）。この実験では、添加物なしの溶解後のＣｔ値と添加物イミダゾールを使用した溶解でのＣｔ値との相違からΔＣｔ値を計算する。低い（すなわち、ΔＣｔ値がより負である）ほど、安定化効果は高くなり、これは、ライセートへの添加物の添加によって起こる。
【０２１２】
実施：４００００個のＨｅＬａ細胞、ＨＵＨ７細胞、２９２９３−Ｚｅｌｌｅｎ細胞を、適切な培地中で３日間インキュベートした。第１の実験では、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液中に溶解した。さらなる実験では、細胞を、上記溶解反応に加えて、添加物であるイミダゾール、リジン、またはスペルミンも含む溶解緩衝液中に溶解した。２μｌのこの様式で得たＲＮＡを、ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙから入手したＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）で標準的な逆転写酵素反応に変換した。この反応の終了後、２μｌのＲＴ反応溶液を、一定の転写物の検出のためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに移した。
【０２１３】
結果：図５は、異なるサンプルのΔＣｔ値を比較した図を示す。これは、添加物を含まない標準的な溶解緩衝液を使用して得られたサンプルと対照的に、異なる細胞培養物の細胞ＲＮＡサンプルが、異なる濃度の添加物の存在下で約−２〜−５．５の領域の負のＣｔ値を示したことを示す。これは、添加物を含むサンプルのＲＮＡの安定性が非常に改良されたことを示す。
【０２１４】
実施例６
添加物の存在下での細胞ライセート中の細胞ＲＮＡの安定化
細胞を、潜在的な安定化添加物を含むまたは含まない溶解緩衝液中に溶解した。ＲＡＮ安定性の決定のために、変性ゲルにてＲＮＡを分析した。しかし、ＲＮＡが細胞物質と複合体化しているので、変性ゲルでの分析が可能になるように、これを最初にＲｎｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって清浄化しなければならない。ＲＮＡの完全性を、１８Ｓおよび２８Ｓ  ｒＲＮＡバンドを用いて決定することができる。
【０２１５】
実施：４００００個のＨｅｐＧ２細胞を、適切な培地中で３日間インキュベートした。細胞を、以下の溶解緩衝液中にそれぞれ溶解した。
１：カラム１：Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液
２：カラム２：２ｍＭ  ＥＧＴＡをさらに含む１
３：カラム３：２ｍＭ  ＥＤＴＡをさらに含む１
４：カラム４：Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液
５：カラム５：１ｍＭリジンをさらに含む１
６：カラム６：０．２ｍＭスペルミンをさらに含む１
７：カラム７：１０ｍＭイミダゾールをさらに含む１
【０２１６】
記載の溶解緩衝液での溶解後、ライセート中に得られたＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙによって清浄化し、変性ゲル（Ａｇｉｌｅｎｔ  ＢｉｏＡｎａｌｙｚｅｒ）にて分解をチェックした。
【０２１７】
結果：図６は、ゲル分析の結果を示す。ＰＥＧを含むか含まない簡潔な溶解緩衝液中の細胞ＲＮＡの分解（カラム１および４）が明らかに認められる。対照的に、添加剤であるリジン、スペルミジン、またはイミダゾールの存在下でのＲＮＡ（カラム５、６、および７）は、いかなる分解徴候も認められなかった。ヌクレアーゼインヒビターである高濃度のＥＧＴａＡまたはＥＤＴＡの存在下で、改良されているが十分ではない安定化が認められた（カラム２および３）。
【０２１８】
実施例７
室温での添加物による細胞ライセートの細胞ＲＮＡの安定化
細胞を、イミダゾールを含む溶解緩衝液中に溶解した。比較するために、細胞ＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙによって清浄化した。ライセートを、さらなる精製工程に供させず、それにより、依然として全ＲＮアーゼが含まれている。添加物イミダゾールおよび場合によってサンプル中に含まれるさらなる細胞物質を用いて行ったＲＮＡの安定化により、ライセート中のＲＮＡの分解は、室温のインキュベーション中でさえも、ライセート中のＲＮＡの分解は減少するか消失するはずである。
ＲＮＡ安定化を決定するために、比較リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて細胞転写物のＣｔ値を決定した。Ｃｔ値は、ＰＣＲサイクルであり、これは、最初にＰＲＣシグナルが検出される（すなわち、視覚可能になる）。ΔＣｔ値を、本実施例において、差Ｃｔ−Ｗｅｒｔ（ｔ＝０）（式中、「ｔ」は時間を意味する）およびＣｔ値（ｔ＝ｘ）から計算する。測定されたΔＣｔ値が測定期間にわたって０付近に留まる場合、測定期間にわたってＲＮＡの有意に分解されないことを示すので、これは高い安定化度を示す。
【０２１９】
実施：１６０００個の２９３細胞を、適切な培地中で３日間インキュベートした。一方では、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、およびイミダゾールを含む溶解培地中に溶解し、他方では、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってＲＮＡを調製した。ライセートまたは溶出液を、室温で最大２時間インキュベートした。２μｌのインキュベートしたＲＮＡを、異なる時間でＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で標準的な逆転写反応に変換した。ＲＴ反応の終了後、２μｌの反応溶液を、リアルタイムＰＣＲに移した。
【０２２０】
結果：図７は、インキュベーション時間に対するΔＣｔ値の依存性を示す図を示す。ライセートから直接測定したサンプルのΔＣｔ値およびＲＮｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて清浄化したＲＮＡのΔＣｔ値は、０付近に留まった。これは、ライセートのＲＮＡがＲＮｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって清浄化されたＲＮＡ調製物に類似の安定性を有することを示す。
【０２２１】
実施例８
異なる細胞数を有する細胞ＲＮＡの安定化
少数の細胞を有するサンプルから得た核酸を細胞物質のみによって安定化することができる一方で、多数の細胞から得たサンプルは、場合によって細胞物質による核酸の安定化を支持するさらなる薬剤が依然として必要である。異なる細胞数の培養物由来のサンプルを使用する実験では、溶解後のＲＮＡの安定性を、安定化添加物を使用するか使用しないで決定すべきである。
【０２２２】
実施：１０２４〜１０００００個の細胞を、適切な培地中で３日間インキュベートした。実験では、このような様式で得られた細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ、および安定化添加物としてイミダゾールを含む溶解緩衝液中に溶解した。イミダゾールの添加により、既に存在する可能性のある安定性を、細胞物質によって改良すべきである。さらなる実験では、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含むが、イミダゾールを含まない溶解緩衝液中に溶解した。上記の各実験で、細胞ＲＮＡを、比較のためにＲＮｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で清浄化した。それぞれ２μｌのライセートまたは溶出液を、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で標準的な逆転写酵素反応に変換した。ＲＴ反応の完了後、２μｌの反応溶液を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに移した。
ＲＮＡ安定化度を決定するために、細胞転写物のＣＴ値を、比較リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで決定した。Ｃｔ値は、ＰＣＲサイクルであり、これは、最初にＰＲＣシグナルが検出される（すなわち、視覚可能になる）。本実施例で、細胞数Ｘを用いたＣＴ値と細胞数１０００００を用いたＣｔ値との相違からΔＣｔ値を計算する。高い安定化の測定値に到達する場合、ΔＣｔ値は、細胞数の増加に伴って増加する。
【０２２３】
結果：図８は、添加物としてイミダゾールを含むライセート由来のサンプルおよび添加物を含まないサンプルのＲＮｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって清浄化されたサンプルの細胞数に対するΔＣｔ値の依存性を示す図を示す。ＲＮｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって清浄化したについて、ΔＣｔ値が全細胞数範囲にわたって細胞数に対応して挙動し、すなわち、細胞数の減少に伴ってΔＣｔ値が増加することを明確に示す。細胞をイミダゾールも含む溶解緩衝液を用いて溶解した場合、細胞数に対応したΔＣｔ値の増加は、４００００以下の細胞数のみで認められた。しかし、細胞をイミダゾールを含まない溶解緩衝液で溶解した場合、細胞集に対応するΔＣｔ値は、６４００個未満でも認められた。６４００個を超えると、より高いΔＣｔ値が測定され、６４００個を超えて導入された場合、ＲＮＡの明らかな分解を示す。これは、一定の細胞数（ここでは、６４００個）未満のタンパク質などの細胞物質のみによって、添加物を使用しないで十分な安定化が可能であることを示す。添加物は、この細胞数をさらに超えた安定化を補助しなければならない。
【０２２４】
ＩＩＩ．阻害効果の減少
実施例９
核タンパク質由来のｇＤＮＡの検出性
細胞を、添加物を含むか含まない溶解緩衝液中に溶解した。細胞の溶解により、ここで選択した溶解条件下で核タンパク質複合体を形成することができ、その結果、ライセートから得たサンプル中でｇＤＮＡのみが不十分に検出され得る。ｇＤＮＡの決定のために、比較リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでＣＴ値を決定した。Ｃｔ値は、ＰＣＲサイクルであり、これは、最初にＰＲＣシグナルが検出される（すなわち、視覚可能になる）。本実施例で、添加物を含む溶解後のＣｔと分離添加物を含まない溶解でのＣｔ値との相違からΔＣｔ値を計算する。ΔＣｔ値が低いほど、ｇＤＮＡの検出性がより良好になり、添加物によって核タンパク質複合体からより良好なｇＤＮＡを分離することができる。
【０２２５】
実施：ＨｅｐＧ２細胞を、適切な培地中で３日間インキュベートした。比較例として、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液Ｃに溶解した。さらに、細胞を、上記試薬に加えて、添加物であるアルギニン（１５ｍＭ）、２，３−ジメチルピラジン（３０ｍＭ）、トリプトファン（１５ｍＭ）、ヒスチジン（１５ｍＭ）、インダゾール（１０ｍＭ）、またはイミダゾール（１５ｍＭ）も所与の濃度で含むさらなる実験で溶解した。
ライセートを含む２μｌの核タンパク質複合体を、それぞれ、ｇＤＮＡを検出するためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに移した。
【０２２６】
結果：図９は、それぞれ決定した個別の実験のΔＣｔ値を比較した図を示す。全ての添加物を使用して、添加物を含まないサンプルと比較して、負のΔＣｔ値の増加が認められた。これらから、上記アミンによる細胞核酸タンパク質複合体からの分離後の核タンパク質によって複合体化したｇＤＮＡよりも良好に細胞ｇＤＮＡを検出することができると結論づけることができる。約０．３〜３．５より良好なΔＣｔ値を得ることができる。これは、添加物に起因する分離によるｇＤＮＡの検出性の改良（係数１．２〜１０）に対応すし、これは、細胞核タンパク質複合体の脱複合体化のために添加物を使用することに依存する。
【０２２７】
実施例１０
細胞核タンパク質複合体からのｇＤＮＡの酵素分解（ＤＮアーゼＩ）の改良
細胞を、添加物を含むか含まない溶解緩衝液中に溶解した。細胞の溶解により、核タンパク質複合体形成のためにここで選択した溶解条件下で核タンパク質複合体を形成することができ、その結果、ｇＤＮＡは、ＤＮアーゼＩに不十分にしか接近できない。ｇＤＮＡのＤＮアーゼＩ消化は、ｇＤＮＡの核タンパク質複合体からの距離の基準として役立つ。添加物によって核タンパク質からｇＤＮＡが脱複合体化する場合、ｇＤＮＡは、ＤＮアーゼＩによって容易に消化されるはずである。リアルタイムアッセイを用いたｇＤＮＡの検出は、ＤＮアーゼＩによる酵素分解の決定のために役立つ。Ｃｔ値は、ＰＣＲサイクルであり、これは、最初にＰＲＣシグナルが検出される（すなわち、視覚可能になる）。本実施例で、添加物を添加するがＤＮアーゼＩを添加しないサンプル中のＣｔ値と添加物およびＤＮアーゼＩを添加したサンプルのＣｔ値との相違からΔＣｔ値を計算する。本実施例で、添加物およびＤＮアーゼＩを添加しないサンプルのＣｔ値とＤＮアーゼＩを添加するが添加物を添加しないサンプルのＣｔ値との相違からΔＣｔ2値を計算する。本実施例で、以下の差：ΔＣｔ1値−ΔＣｔ2からΔＣｔ値を計算する。ΔＣｔ値が低い（すなわち、ΔＣｔ値がより負である）ほど、ＤＮアーゼＩによってｇＤＮＡをより良好に分解することができ、これはｇＤＮＡのＤＮアーゼＩへのより良い接近性の徴候である。
【０２２８】
実施：ＨｅｐＧ２−Ｚｅｌｌｅｎ  ＨｅｐＧ２細胞を、適切な培地中で３日間インキュベートした。比較例として、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液Ｃ中に溶解した。一方では、細胞を、上記物質に加えて、以下の添加物のうちのそれぞれ１つもそれぞれ所与の濃度で含む溶解緩衝液中に溶解した：アルギニン（１ｍＭ）、２，３−ジメチルピラジン（３０ｍＭ）、アミノチアゾール（１５ｍＭ）、インダゾール（３０ｍＭ）、ベンズイミダゾール（１５ｍＭ）、イミダゾール（１５ｍＭ）、トリプトファン（１５ｍＭ）、ヒスチジン（１５ｍＭ）、プロリン（５ｍＭ）、または硫酸アンモニウム（３０ｍＭ）。その後、上記のようにＤＮアーゼＩ消化を行い、このようにして得られたそれぞれ２μｌの反応溶液を、ｇＤＮＡを検出するためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに移した。
【０２２９】
結果：図１０は、異なるサンプルの異なるΔＣｔ値を比較した図を示す。
使用した全ての添加物により、より負の値のΔＣｔ値が得られ、これは、細胞核タンパク質複合体の細胞ｇＤＮＡをＤＮアーゼＩによって強化された上記の添加物を使用した脱複合体化によって分解することができることを示した。添加物に依存して、０．３〜１０サイクルのより良好なΔＣｔ値が得られた。これは、ＤＮアーゼＩによるｇＤＮＡの酵素分解性の改良に対応し、これは、約１．２〜約１００の係数内の添加物の添加によって達成される。
【０２３０】
Ｃｔの２サイクルの相違は、例えば、ＰＣＲに利用可能な出発材料（サンプル中のｇＤＮＡ）の量の係数４までの変化に対応する。この様式で、係数は、ｇＤＮＡの接近性の改良に相関し得る。この状況は、いかなる実験からも得られない理想的仮定値（図１０．ａ．１および１０．ａ．２）を用いて説明される。
【０２３１】
実施例１１
細胞核タンパク質複合体の酵素分解（ＤＮアーゼＩ）の改良の濃度依存
上記の実施例１０で行った一連の実験を、添加物として異なる濃度のイミダゾールを使用する類似の様式で行った。
【０２３２】
実施：ＨｅｐＧ２−Ｚｅｌｌｅｎ  ２９細胞を、適切な培地中で３日間インキュベートした。比較例として、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液Ｃ中に溶解した。その後、上記のようにＤＮアーゼＩ消化を行い、このようにして得られたそれぞれ２μｌの反応溶液を、ｇＤＮＡを検出するためにリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに移した。
【０２３３】
結果：図１１は、ライセートに添加したイミダゾール濃度由来のΔＣｔの濃度依存性を示す。ＤＮアーゼＩによるｇＤＮＡの酵素分解を、２０ｍＭイミダゾールを添加した場合に係数４０で改良することができる。
【０２３４】
実施例１２：
添加物の存在下でのｇＤＮＡ／ＲＮＡ混合物中のｇＤＮＡのより良いＤＮアーゼＩ消化
【０２３５】
核酸がシリカ膜（Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ））によって清浄化されたＲＮＡとＤＮＡとの核酸混合物で試験する場合、生体分子による阻害の減少のための添加物の使用により、ＤＮアーゼＩによる酵素分解が改良される。これのために、清浄化ｇＤＮＡおよび清浄化ＲＮＡを、添加物を含むか含まない溶解緩衝液中に入れることができる。ｇＤＮＡのＤＮアーゼＩへの接近性を、ＤＮアーゼＩを用いた酵素分解によって決定し、その後、リアルタイムＰＣＲによってｇＤＮＡ成分を決定する。リアルタイムＰＣＲでは、Ｃｔ値はＰＣＲサイクルであり、これは、最初にＰＲＣシグナルが検出される（すなわち、視覚可能になる）。本実施例で、添加物での溶解後のＣｔ値と添加物を含まない溶解でのＣｔ値との相違からデータＣｔ値を計算する。
低い（すなわち、ΔＣｔ値がより負である）ほど、酵素分解の効率が高く、ｇＤＮＡのＤＮアーゼＩへの接近性の改良をさらに示す。
【０２３６】
実施：ＲＮＡを、Ｒｎｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって清浄化した。ｇＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によって清浄化した。２０ｎｇのｇＤＮＡおよび２０ｎｇのＲＮＡをサンプルと組み合わせた。
ＤＮアーゼＩによる酵素分解
１５０μＭ（最終濃度）のＣａＣｌ2を添加したＱｉａｎｔｉＴｅｓｔ（登録商標）リアルタイム緩衝液（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）にてライセートのＤＮアーゼ消化を行った。反応物は、２０ｎｇ  ＲＮＡおよび２０ｎｇ  ｇＤＮＡ、０．５Ｕ  ＤＮアーゼ（Ａｍｂｉｏｎ，ＵＳＡ）、プライマー、ヌクレオチド、ＨｏｔｓｔａｒＴａｑポリメラーゼ、および上記の添加物をそれぞれ含んでいた。ＰＣＲでの熱活性化によって反応を停止させた。残存ｇＤＮＡの決定のために、リアルタイムＰＣＲを行う。
【０２３７】
結果：図１２は、それぞれ得られたΔＣｔ値の比較を示す。図は、使用した添加物の存在下で清浄化されたｇＤＮＡ／ＲＮＡ混合物中のｇＤＮＡが明らかに良好な様式でＤＮアーゼＩによって分解されたことを示す。２〜１３サイクル改良されたΔＣｔ値が認められた。これは、ＤＮアーゼＩによるｇＤＮＡ分解の約４〜１０００超の係数の改良（使用した添加物に依存する）に対応する。
【０２３８】
実施例１３
細胞ライセート由来のｇＤＮＡおよびＲＮＡの検出時の阻害効果の減少
細胞を、ジスタマイシンＤを含むか含まない溶解緩衝液中に溶解した。細胞の溶解により、核タンパク質複合体が形成され、その結果、ＲＮＡは、不十分にしか検出できなかった。ｇＤＮＡまたはＲＮＡの脱複合体化のために、小さな空洞中の二本鎖に主に結合するジスタマイシンＤを使用した。ｇＤＮＡの決定のために、比較リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでＣＴ値を決定した。比較リアルタイムＲＴ−ＰＣＲでＲＮＡを決定した。Ｃｔ値は、Ｃｔ値はＰＣＲサイクルであり、これは、最初にＰＲＣシグナルが検出される（すなわち、視覚可能になる）。本実施例で、添加物を使用した溶解後のＣｔ値と添加物を使用しない溶解でのＣｔ値との相違からΔＣｔ値を計算する。低い（すなわち、ΔＣｔ値がより負である）ほど、ｇＤＮＡまたはＲＮＡの検出性が良好であり、ｇＤＮＡまたはＲＮＡが添加物によって核タンパク質複合体からより良好に脱複合体化することができる。
【０２３９】
実施：懸濁液中で成長するＨｅＬａ細胞を、適切な培地中でインキュベートした。一方では、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液中に溶解した。他方では、細胞を、上記物質に加えて、添加物として異なる濃度のジスタマイシンＤも含む溶解緩衝液中に溶解した。
このようにしてそれぞれ得られた２μｌのライセートを、ｇＤＮＡまたはＲＮＡを検出するためのリアルタイムＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに移した。
【０２４０】
結果：図１３は、各実験のそれぞれ決定したΔＣｔ値を比較した図を示す。ジスタマイシンＤによる細胞核タンパク質複合体の脱複合体化後に、ジスタマイシンＤを含まないサンプルよりも細胞ｇＤＮＡおよびＲＮＡを容易に検出することができることが図中に認められる。改良度は、ジスタマイシン濃度に依存する。ｇＤＮＡについて、低濃度（７０ｐＭ）でさえも４サイクルを超えるＣｔの改良を行うことができる。これは、係数１０超の改良に対応する。
添加物としてのジスタマイシンの使用時のＲＮＡの検出時のＣｔ値の改良はここではより小さい。これは、ジスタマイシンが主にＤＮＡに結合することに起因し得る。したがって、達成された効果は、本質的にタンパク質ＤＮＡ複合体の脱複合体化に基づき、ＲＮＡは複合体内に織り込まれ、放出もされる。したがって、ＲＮＡの検出性に対する効果は、本質的に間接的である。
【０２４１】
実施例１４
ＤＮＡの検出性に正規化したＲＮＡに対する阻害効果の減少
細胞を、添加物を含むか含まない溶解緩衝液中に溶解した。細胞の溶解により、核タンパク質複合体が形成され、その結果、ＲＮＡは、不十分にしか検出できなかった。ＲＮＡの検出のために、ＣＴ値を比較２管（ｔｗｏ−ｔｕｂｅ）リアルタイムＲＴ−ＰＣＲで決定した。Ｃｔ値はＰＣＲサイクルであり、これは、最初にＰＲＣシグナルが検出される（すなわち、視覚可能になる）。本実施例で、添加物を使用した溶解後のＣｔ値と添加物を使用しない溶解でのＣｔ値との相違からΔＣｔ値を計算する。ＲＮＡのＣｔ値を、ｇＤＮＡのＣｔ値に対して正規化した。Ｃｔの相違（例えば、２サイクル）は、逆転写酵素によるＲＮＡの接近性の変化（係数４）に対応する。係数を、核タンパク質複合体由来のＲＮＡの接近性を各添加物による核タンパク質複合体由来のｇＤＮＡの接近性と比較する様式で決定することができる。
【０２４２】
実施：ＨｅｐＧ２細胞を、適切な培地中で３日間インキュベートした。一方では、細胞を、Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡを含む溶解緩衝液中に溶解した。他方では、細胞を、上記物質に加えて、以下の添加物のうちのそれぞれ１つもそれぞれ所与の濃度で含む溶解緩衝液中に溶解した：アルギニン（１ｍＭ）、２，３−ジメチルピラジン（３０ｍＭ）、アミノチアゾール（１５ｍＭ）、インダゾール（３０ｍＭ）、ベンズイミダゾール（１５ｍＭ）、ヒスチジン（１０ｍＭ）、プロリン（５ｍＭ）、トリプトファン（１０ｍＭ）、インダゾール（３０ｍＭ）、硫酸アンモニウム（３０ｍＭ）、またはイミダゾール（１５ｍＭ）。このようにして得られたそれぞれ２μｌのライセートを、ＯｍｎｉｓｃｒｉｐｔＲＴ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した逆転写反応で使用する。ＲＴ反応の終了後１μｌの反応溶液を、それぞれ、対応するｃＤＮＡを検出するためのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲに移した。
【０２４３】
結果：図１４は、細胞ＲＮＡの検出性のそれぞれの改良を比較した図を示す。図は、上記添加物による細胞核タンパク質複合体の脱複合体化後に、添加物を添加していないライセートサンプル由来のＲＮＡよりも細胞ＲＮＡを容易に検出することができることを示す。係数２−１０００による改良を、測定することができた。これは、核タンパク質複合体からのＲＮＡの明確な脱複合体化が各添加物の使用に起因することを示す。
【０２４４】
ＩＶ．マスキング
実施例１５
清浄化ゲノムＤＮＡおよび清浄化ＲＮＡの混合物中のＤＮＡの差分マスキング
マスキングしたＤＮＡは、ＲＮＡよりも増幅がより困難なはずである。ＤＮＡおよびＲＮＡのリアルタイムＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲは、ｇＤＮＡのマスキングのために添加物を使用する場合にＲＮＡと比較したＤＮＡの差分マスキングの測定を示し得る。
ΔＣｔ値を、添加物を添加したサンプルのＣｔ値といかなる添加物も添加していないサンプルのＣｔ値との相違と定義する。この値が高いと、ＲＮＡと比較してＤＮＡがマスキングされていることを示した。
【０２４５】
実施：ヒトｇＤＮＡおよびＲＮＡをＱＩＡａｍｐ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）またはＲｎｅａｓｙ（登録商標）（ＱＩＡＧＥＮ  ＧｍｂＨ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）によってそれぞれ清浄化し、２０ｎｇのｇＤＮＡおよび２０ｎｇのＲＮＡをサンプルに組み合わせた。最終濃度５または２０μＭまでのスペルミンを、いくつかのサンプルに添加した。遠心分離後の２μｌの残存物を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲまたは２管リアルタイムＲＴ−ＰＣＲに移した。
【０２４６】
結果：図１５は、各実験のそれぞれ決定したΔＣｔ値を比較した図を示す。２０μＭスペルミンの場合は両核酸（ｇＤＮＡおよびＲＮＡ）がマスキングされ、５μＭスペルミンを使用した場合はｇＤＮＡを選択的にマスキングすることができることが図中に認められる。５μＭスペルミンを使用して、ΔＣｔの６サイクル置換を測定することができ、ｇＤＮＡが約５００の係数でマスキングされる。対照的に、ＲＮＡにはΔＣｔ置換は認められなかった。
【０２４７】
実施例１６
異なる添加物による細胞ライセート中のＲＮＡマスキング
マスキングされたＲＮＡは、同一の調製物または同一のライセート由来のｇＤＮＡよりも増幅が劣るはずである。ｇＤＮＡのリアルタイムＰＣＲに調整したマスキングされたＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡと比較したＤＮＡの差分マスキング範囲を示すはずである。
ΔＣｔ値を、本実験の添加物を使用した溶解によって得たサンプルのＣｔ値と本発明の添加物を使用しない溶解によって得られたサンプルのＣｔ値の相違と定義する。ΔＣｔ値を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ中でＲＮＡによって達成されたＣｔに対して正規化した。
値の高さは、ＲＮＡと比較したＤＮＡマスキングを示した。
【０２４８】
実施：一方では、界面活性剤含有溶解緩衝液（Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡ）を使用して、ヒトｇＤＮＡおよびＲＮＡをＨｅｐＧ２から得た。他方では、ｇＤＮＡの差分マスキングのための添加剤である濃度３０ｍＭの硫酸アンモニウム、グリシン、またはリン酸水素アンモニウム、濃度５ｍＭの尿素。
ＲＮＡと比較したＤＮＡの差分マスキングを、その後、リアルタイムＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。
【０２４９】
結果：図１６は、各実験のそれぞれ決定したΔＣｔ値を比較した図を示す。上記の添加物を含む溶解緩衝液中のゲノムＤＮＡにより、ＲＮＡのＣｔ値に対して正規化されたより高いΔＣｔ値が得られることが図中に認められる。これは、ＲＮＡと比較したＤＮＡのマスキングを示す。インダゾールの場合、約７Ｃｔのマスキングが達成され、これは、マスキングによってこの溶液中で約１／１００のＲＮＡが検出されることを示す。
【０２５０】
実施例１７
異なる添加物による細胞ライセート中のゲノムＤＮＡのマスキング
マスキングされたＤＮＡは、同一の調製物由来のＲＮＡよりも増幅が劣るはずである。ｇＤＮＡのリアルタイムＰＣＲに調整したマスキングされたＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡと比較してＤＮＡの差分マスキング範囲を示すはずである。
本実験では、ΔＣｔ値を、Ｃｔ値（ＤＮＡ）とＣｔ−Ｗｅｒｔ（ＲＮＡ）との相違と定義する。負のΔCＴ値は、ＤＮＡと比較したＲＮＡのマスキングを示した。
【０２５１】
実施：一方では、界面活性剤含有溶解緩衝液（Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡ）を使用して、ヒトｇＤＮＡおよびＲＮＡを４０，０００細胞から得た。他方では、以下の添加物の１つを、ＲＮＡを差分マスキングするために所与の濃度で添加した：グルタミン酸（１５ｍＭ）、アルギニン（５ｍＭ）、２，３−ジメチルピラジン（１５ｍＭ）、ベンズイミダゾール（１５ｍＭ）、イミダゾール（１５ｍＭ）、またはヒスチジン（１５ｍＭ）。濃度はそれぞれ最終濃度である。ＲＮＡと比較したＤＮＡの差分マスキングを、その後、リアルタイムＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。
【０２５２】
結果：図１７は、それぞれ得たΔＣｔ値を示す。添加物を含む溶解緩衝液中のＲＮＡにより、負のΔＣｔ値が得られることが図中に認められる。これは、ＲＮＡと比較したＤＮＡのマスキングを示す。グルタミン酸およびアルギニン、２，３−ジメチルピラジンおよびイミダゾール場合、４Ｃｔのマスキングが行われ、これは、マスキングによってこの溶液中で約１／１０のＤＮＡが検出されることを示す。
【０２５３】
実施例１８
細胞ライセート中のゲノムＤＮＡのマスキングの濃度依存性
マスキングされたＤＮＡは、同一の調製物由来のＲＮＡよりも増幅が劣るはずである。ｇＤＮＡのリアルタイムＰＣＲに調整したマスキングされたＲＮＡのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＲＮＡと比較したＤＮＡの差分マスキング範囲を示すはずである。
本実験では、ΔＣｔ値を、Ｃｔ値（ＲＮＡ）とＣｔ値（ｇＤＮＡ）との相違と定義する。負のΔCＴ値は、ＤＮＡと比較したＲＮＡのマスキングを示した。
【０２５４】
実施：一方では、界面活性剤含有溶解緩衝液（Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡ）を使用して、ヒトｇＤＮＡおよびＲＮＡをＨｅｐＧ２細胞から得た。他方では、差分マスキングを行うために、添加物であるアルギニンを溶解緩衝液に異なる濃度でそれぞれ添加した。示した濃度はそれぞれライセート中のアルギニンの最終濃度である。ＲＮＡと比較したＤＮＡの差分マスキングを、その後、リアルタイムＰＣＲおよびリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって決定した。
【０２５５】
結果：図１８は、各実験のそれぞれ決定したΔＣｔ値を比較した図を示す。ΔＣｔ値が負になると、緩衝液中のアルギニンの最終濃度が高くなることが図よりわかる。これは、ＲＮＡと比較したＤＮＡのマスキングを示す。６ｍＭアルギニンを使用したこの一連の実験では、最大マスキングが得られた。ΔＣｔ値の「−６」は、約１／５００のｇＤＮＡの検出に対応する。
【０２５６】
実施例１９
異なる添加物による細胞ライセート中のＲＮＡのマスキング
マスキングされたＲＮＡは、同一の調製物または同一のライセート由来のｇＤＮＡよりも増幅が劣るはずである。ｇＤＮＡのリアルタイムＰＣＲに調整したマスキングされたＲＮＡの２管リアルタイムＲＴ−ＰＣＲは、ＤＮＡと比較したＲＮＡの差分マスキング範囲を示すはずである。
本実験では、ΔＣｔ値を、Ｃｔ値（DＮＡ）とＣｔ−Ｗｅｒｔ（ＲＮＡ）との相違と定義する。負のΔCＴ値は、ＤＮＡと比較したＲＮＡのマスキングを示した。
【０２５７】
実施：一方では、界面活性剤含有溶解緩衝液（Ｎｏｎｉｄｅｔ−Ｐ４０、ポリエチレングリコール、ＥＧＴＡ、およびＥＤＴＡ）を使用して、ヒトｇＤＮＡおよびＲＮＡをＨｅｐＧ２細胞から得た。他方では、ＲＮＡを差分マスキングするために、以下の添加物の１つを所与の濃度でそれぞれ添加した：プロリン（２０ｍＭ）、インダゾール（２０ｍＭ）、または硫酸アンモニウム（３０ｍＭ）。濃度はそれぞれ最終濃度である。その後、ＲＮＡを、ライセートを使用した２０μｌ逆転写酵素中で使用した。このようにして得た２μｌの反応溶液を、リアルタイムＰＣＲに移した。比較として、事前の転写酵素反応を行わずにリアルタイムＰＣＲを行った。
【０２５８】
図１９は、各実験のそれぞれ決定したΔＣｔ値を比較した図を示す。添加物を含む溶解緩衝液中のＲＮＡにより、負のΔＣｔ値が得られることが図中に認められる。これは、ｇＤＮＡと比較したＲＮＡのマスキングを示す。イミダゾールの場合、ほぼ６Ｃｔのマスキングが行われ、これは、マスキングによってこの溶液中で約１／４００のＲＮＡが検出されることを示す。
【０２５９】
実施例２０
生体サンプルまたは生物の治療およびｐＨ値の測定のための本発明の物質の使用
実施：一方では、界面活性剤含有溶解緩衝液を使用して、ヒトｇＤＮＡおよびＲＮＡをＨｅｐＧ２細胞から得た。あるいは、ａ）アルギニン（５ｍＭ）、ｂ）アルギニンおよびプロリン（それぞれ５ｍＭ）、ｃ）イミダゾール（１５ｍＭ）、またはｄ）グアノシン（２０ｍＭ）をこの溶解緩衝液に添加した。細胞への溶液の添加後、この様式で得たライセートのｐＨ値を決定した。
【０２６０】
結果：ｐＨ値を以下のように決定した。
ａ）アルギニン含有溶液で処理したサンプル：ｐＨ７．５〜８
ｂ）アルギニン−プロリン含有溶液で処理したサンプル：ｐＨ７．４〜８
ｃ）イミダゾール含有溶液で処理したサンプル：ｐＨ７．５〜８
ｄ）グアノシン含有溶液で処理したサンプル：ｐＨ＞９
【図面の簡単な説明】
【０２６１】
【図１】窒素化合物（添加物）を用いるか用いないで溶解した異なるサンプルのΔＣＴ値を比較した図である。
【図２】本発明の溶解方法の１つの実施形態で促進したＲＮＡ収率の増加を明確にするための図である。
【図３】これも本発明の溶解方法の１つの実施形態で促進したＲＮＡ収率の増加を明確にするための図である。
【図４】本発明の安定化方法の１つの実施形態の異なる添加物の安定化効果を示す図である。
【図５】本発明の安定化方法の１つの実施形態の異なる細胞培養物の安定化効果を示す図である。
【図６】異なる細胞ライセートのゲル分析の結果を示す図である。
【図７】インキュベーション時間に対するΔＣＴ値の依存性を示す図である。
【図８】細胞数に対するΔＣＴ値の依存性を示す図である。
【図９】阻害効果の減少のための本発明の方法の実施形態によって得られるライセート中の異なる添加物の使用によるｇＤＮＡの接近可能性の改良を示す図である。
【図１０−１】阻害効果の減少のための本発明の方法の実施形態によって得られるライセート中の異なる添加物の使用によるＤＮアーゼＩについてのｇＤＮＡの接近可能性の改良を示す図である。
【図１０−２】理想的な仮説的値を用いたＣｔ値と因子との間の関係を示す図である。
【図１１】ΔＣｔ測定値の濃度依存性を示す図である。
【図１２】阻害効果の減少のための本発明の方法の実施形態における清浄化ＤＮＡの使用時のΔＣｔ測定値を示す図である。
【図１３】本発明のジスタマイシンＤの存在下でのｇＤＮＡおよびＲＮＡの接近可能性の改良を示す図である。
【図１４】本発明の異なる添加物を使用して細胞ライセート中のＤＮＡと比較したＲＮＡの接近可能性の改良を示す図である。
【図１５】ΔＣｔ測定値を用いた異なる濃度のスペルミンを使用した本発明の細胞ライセート中のＲＮＡと比較したｇＤＮＡの差分マスキングの効果を示す図である。
【図１６】異なる添加物を使用した本発明の細胞ライセート中のｇＤＮＡの差分マスキングの効果を示す図である。
【図１７】ＲＮｅａｓｙ調製物に正規化した本発明のｇＤＮＡの差分マスキングの効果を示す図である。
【図１８】本発明の細胞ライセートにおけるｇＤＮＡのマスキング効果の濃度依存性を示す図である。
【図１９】本発明のＲＮＡのマスキング効果を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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