(57)【要約】本発明は、タンパク質デアセチラーゼについての酵素アッセイに関する。より特定的には、本発明は、ホールセルを利用する、かかるアッセイに関する。本発明は、哺乳動物の体から直接的に採取されたホールセルにおける、タンパク質デアセチラーゼ活性のレベルの評価を可能にする、アッセイを提供する。
2008532561.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
エキソビボで、ホールセルにおける、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、全タンパク質デアセチラーゼ活性を評価するための以下を含む方法：
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、細胞透過性の、該タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するpan-基質またはアイソタイプ特異的基質とを、接触させる工程であって、ここで、該タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる該基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；および、
該検出可能なレポーター分子を定量する工程
【請求項２】
検出可能なレポーター分子の量が、タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
エキソビボで、ホールセル由来の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類または２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的活性を評価するための方法であって、
ここで、該タンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類または２種類以上のアイソタイプは、全デアセチラーゼ活性の大部分を提供し、
以下を含む方法：
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、細胞透過性の、該タンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、または、細胞透過性の、該タンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的阻害剤とを接触させる工程であって、ここで、該タンパク質デアセチラーゼによる該基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該細胞の第１のアリコートと、全デアセチラーゼ活性の大部分を提供する１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼのアイソタイプ特異的阻害剤とを接触させる工程；
該全デアセチラーゼ活性の大部分を提供する１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼのアイソタイプ特異的阻害剤と接触させられない、該ホールセルの第２のアリコートを提供する工程；
該第１のアリコートおよび第２のアリコート中の、該検出可能なレポーター分子を定量する工程；ならびに、
該第１のアリコートおよび第２のアリコート中の、該検出可能なレポーター分子を比較する工程
【請求項６】
検出可能なレポーター分子の量が、タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類若しくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
ホールセルが、検出可能なレポーター分子を定量する前に、１種類もしくは２種類以上のアイソタイプを発現する遺伝子もしくは遺伝子群によって形質移入されている、請求項５に記載の方法
【請求項１０】
エキソビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的活性を評価するための以下を含む方法：
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルを、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質と接触させる工程であって、ここで、該１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼによる該基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；および、
該検出可能なレポーター分子を定量する工程
【請求項１１】
検出可能なレポーター分子の量が、タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
エキソビボで、ホールセルにおける、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan−阻害剤候補の活性を評価するための以下を含む方法：
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、細胞透過性の、該タンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質またはアイソタイプ特異的基質とを接触させる工程であって、ここで、該タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる該基質の脱アセチル化が、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該細胞の第１のアリコートと、該タンパク質デアセチラーゼファミリーのpan−阻害剤候補とを接触させる工程；
該タンパク質デアセチラーゼファミリーのpan−阻害剤候補と接触させられない、該細胞の第２のアリコートを提供する工程； 
該第１のアリコートおよび該第２のアリコート中の、該検出可能なレポーター分子を定量する工程；および、
該第１のアリコートおよび該第２のアリコート中の、検出可能なレポーター分子の量を比較する工程
を包含する、方法。
【請求項１５】
検出可能なレポーター分子の量が、タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１７】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１８】
エキソビボで、ホールセル由来の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、阻害剤候補のアイソタイプ特異的活性を評価するための方法であって、ここで、該タンパク質デアセチラーゼファミリーの該１種類もしくは２種類以上のアイソタイプは、全デアセチラーゼ活性の大部分を提供し；
以下を含む方法：
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、細胞透過性の該タンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、または、細胞透過性の該タンパク質デアセチラーゼファミリーの該１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的阻害剤とを接触させる工程であって、ここで、該タンパク質デアセチラーゼによる該基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該ホールセルの第１のアリコートと、全デアセチラーゼ活性の大部分を提供する該１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼのアイソタイプ特異的阻害剤候補とを、接触させる工程；
全デアセチラーゼ活性の大部分を提供する該１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼのアイソタイプ特異的阻害剤候補と接触させられない、該細胞の第２のアリコートを提供する工程；
該第１のアリコートおよび第２のアリコート中の、該検出可能なレポーター分子を定量する工程；ならびに、
各々のアリコートについての、該検出可能なレポーター分子の量を比較する工程
【請求項１９】
検出可能なレポーター分子の量が、タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-阻害剤の効力を評価するための以下を含む方法：
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、該タンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質とを接触させる工程であって、ここで、該タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる該基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該レポーター分子を定量する工程；
該哺乳動物に、該pan-阻害剤を投与する工程；
該哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、該pan-基質またはアイソタイプ特異的基質とを接触させる工程；
該レポーター分子を定量する工程；および、
該pan-阻害剤の投与前の該哺乳動物由来の該ホールセル中の該レポーター分子の量と、該pan-阻害剤の投与後の該ホールセル中の該レポーター分子の量とを比較する工程
を包含する、方法。
【請求項２３】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの、アイソタイプ特異的阻害剤の、効力を評価するための以下を含む方法；
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質とを接触させる工程であって、ここで、該１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼによる該基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該レポーター分子を定量する工程；
該哺乳動物に、該アイソタイプ特異的阻害剤を投与する工程；
該哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、アイソタイプ特異的基質とを接触させる工程；
該レポーター分子を定量する工程；および、
該アイソタイプ特異的阻害剤の投与後の該ホールセル由来の該レポーター分子の量と、該アイソタイプ特異的阻害剤の投与前の該哺乳動物由来の該ホールセル中の該レポーター分子の量とを、比較する工程
【請求項２６】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-アクチベーターの効力を評価するための以下を含む：
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、該タンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質またはアイソタイプ特異的基質とを接触させる工程であって、ここで、該タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる該基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該レポーター分子を定量する工程；
該哺乳動物に、該pan-アクチベーターを投与する工程；
該哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、該pan-基質またはアイソタイプ特異的基質とを接触させる工程；
該レポーター分子を定量する工程；および
該pan-アクチベーターの投与前の該哺乳動物由来のホールセル中の該レポーター分子の量と、該pan-アクチベーターの投与後の該ホールセル中の該レポーター分子の量とを、比較する工程
【請求項２９】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの、アイソタイプ特異的アクチベーターの効力を評価するための以下を含む方法であって：
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、タンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質とを接触させる工程であって、ここで、該１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼによる、該基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該レポーター分子を定量する工程；
該哺乳動物に、該アイソタイプ特異的アクチベーターを投与する工程；
該哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと該アイソタイプ特異的基質とを接触させる工程；
該レポーター分子を定量する工程；および
該アイソタイプ特異的アクチベーターの投与後の該ホールセル中由来の該レポーター分子の量と、該アイソタイプ特異的アクチベーターの投与前の、該哺乳動物由来のホールセル中の該レポーター分子の量とを比較する工程
【請求項３２】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求３０に記載の方法。
【請求項３４】
インビボで、哺乳動物の全タンパク質デアセチラーゼまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-阻害剤の効力を評価するための以下を含む方法：
該哺乳動物に、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質を投与する工程であって、ここで、該pan-基質またはアイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該哺乳動物から体液を得る工程；
該体液中の、該検出可能なレポーター分子の量を決定する工程；
該哺乳動物に、該タンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-阻害剤を投与する工程；
該哺乳動物に、該pan-基質またはアイソタイプ特異的基質を投与する工程；
該哺乳動物から体液を得る工程；
該体液中の、該検出可能なレポーター分子の量を決定する工程；および、
該pan-阻害剤の投与前に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の量と、該pan-阻害剤の投与後の体液中の該検出可能なレポーター分子の量とを、比較する工程
【請求項３５】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求３３に記載の方法。
【請求項３７】
インビボで、哺乳動物における、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的阻害剤の効力を評価するための以下を含む方法：
哺乳動物に、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質を投与する工程であって、ここで、該アイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該哺乳動物から体液を得る工程；
該体液中の、該検出可能なレポーター分子の量を決定する工程；
該哺乳動物に、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの該１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的阻害剤を投与する工程；
該哺乳動物に、該アイソタイプ特異的基質を投与する工程；
該哺乳動物から体液を得る工程；
該体液中の検出可能なレポーター分子の量を決定する工程；および、
該アイソタイプ特異的阻害剤の投与前に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の量と、該アイソタイプ特異的阻害剤の投与後の体液中の該検出可能なレポーター分子の量とを比較する工程
を包含する、方法。
【請求項３８】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求３６に記載の方法。
【請求項４０】
インビボで、哺乳動物における、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、全活性のpan-アクチベーターの効力を評価するための以下を含む方法：
該哺乳動物に、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質またはアイソタイプ特異的基質を投与する工程であって、ここで、該pan-基質またはアイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該哺乳動物から体液を得る工程；
該体液中の該検出可能なレポーター分子の量を決定する工程；
該哺乳動物に、該タンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-アクチベーターを投与する工程；
該哺乳動物に、該pan-基質または該アイソタイプ特異的基質を投与する工程；
該哺乳動物から体液を得る工程；
該体液中の、該検出可能なレポーター分子の量を決定する工程；および
該pan-アクチベーターの投与前に得られた体液中の該検出可能なレポーター分子の量と、該pan-アクチベーターの投与後の体液中の該検出可能なレポーター分子の量とを、比較する工程
【請求項４１】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４２】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求３９に記載の方法。
【請求項４３】
インビボで、哺乳動物における、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的アクチベーターの効力を評価するための以下を含む方法：
該哺乳動物に、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質を投与する工程であって、ここで、該アイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該哺乳動物から体液を得る工程；
該体液中の該検出可能なレポーター分子の量を決定する工程；
該哺乳動物に、該タンパク質デアセチラーゼファミリーの該１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的アクチベーターを、投与する工程；
該哺乳動物に、該アイソタイプ特異的基質を投与する工程；
該哺乳動物から体液を得る工程；
該体液中の、該検出可能なレポーター分子の量を決定する工程；および、
該アイソタイプ特異的アクチベーターの投与前に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の量と、該アイソタイプ特異的アクチベーターの投与後の体液中の検出可能なレポーター分子の量とを比較する工程
を包含する、方法。
【請求項４４】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
タンパク質デアセチラーゼファミリーが、Ｓｉｒ−２ファミリーである、請求４２に記載の方法。
【請求項４６】
エキソビボで、ホールセル中の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-アクチベーター候補の活性を評価するための以下を含む方法：
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、細胞透過性の該タンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソザイム特異的基質とを接触させる工程であって、ここで、該タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる該基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該細胞の第１のアリコートと、該タンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-アクチベーター候補とを接触させる工程；
該タンパク質デアセチラーゼファミリーの該pan-アクチベーター候補と接触させられない、該細胞の第２のアリコートを提供する工程；
該第１のアリコートおよび第２のアリコート中の該検出可能なレポーター分子を定量する工程；ならびに、
該第１のアリコートおよび第２のアリコート中の該検出可能なレポーター分子の量を比較する工程
【請求項４７】
エキソビボで、ホールセル中の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的アクチベーター候補の活性を評価するための以下を含む方法：
哺乳動物由来のホールセルを提供する工程；
該ホールセルと、細胞透過性の、該タンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質またはアイソタイプ特異的基質とを接触させる工程であって、ここで、該タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる該基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する、工程；
該細胞の第１のアリコートと、該タンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的アクチベーター候補とを接触させる工程；
該タンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、該アイソタイプ特異的アクチベーター候補と接触させられない、該細胞の第２のアリコートを、提供する工程；
該第１のアリコートおよび第２のアリコート中の、該検出可能なレポーター分子を定量する工程；ならびに、
該第１のアリコートおよび第２のアリコート中の、該検出可能なレポーター分子の量を比較する工程
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
関連出願
本願は、２００４年９月２２日に出願された、米国仮出願第６０／６１１，９６４号の利益を主張し、この米国仮出願第６０／６１１，９６４号は、本明細書において、その全体が参考として援用される。
【０００２】
本発明の分野
本発明は、タンパク質デアセチラーゼについての酵素アッセイに関する。より具体的には、本発明は、初代（primary）の、無処置の、ホールセル（whole cell）を利用するようなアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
関連技術の要約
ヒストンデアセチラーゼは、哺乳動物細胞の遺伝子調節において、重要な役割を果たす。以下の文献：GrayおよびEkstrom、Expr. Cell. Res. 262: 75-83 (2001); Zhouら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10572-10577 (2001); Kaoら、J. Biol. Chem. 277: 187-193 (2002)、ならびに、Gaoら、J. Biol. Chem. 277: 25748-25755 (2002)は、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーに、１１のメンバーが存在することを教示する。遺伝子発現に関与するデアセチラーゼの別のファミリーは、Ｓｉｒ−２ファミリーである。上記のGrayおよびEkstromは、ヒトのＳｉｒ−２ファミリーに、７個のメンバーが存在することを教示する。
【０００４】
転写におけるＨＤＡＣの役割、およびその疾患（癌など）への関連は、最近になって探求されてきている。以下の文献：Minnucciら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 11295-11300 (1997); Hassigら、Chem. Biol. 4: 783-789 (1998); Grignaniら、Nature 391: 815-818 (1998)およびSiddiqueら、Oncogene 16: 2283-2285 (1998)は、ＨＤＡＣの阻害剤が、種々のヒトの疾患における転写治療のために、有用であり得ることを示唆する。
【０００５】
治療的処置のための、ＨＤＡＣ阻害剤の開発の試みが進むにつれて、かかる阻害剤の活性を決定するためのアッセイが必要となる。Lechnerら（Biochim. Biophys. Acta 1296: 181-188 (1996)）は、トリチル化され、アセチル化された、ヒストンの、基質としての使用を教示する。Tauntonら（Science 272: 408-411 (1996)）は、トリチル化され、アセチル化された、ヒストンに由来する合成ペプチドの、基質としての使用を教示する。これらのアッセイは、標準化することが困難であることが判明した。
【０００６】
より最近になって、非アイソトープのアッセイが、開発されてきた。HeltwegおよびJung（Journal of Biomolecular Screening 8: 89-95 (2003)）は、ＨＤＡＣ阻害剤であるトリコスタチンＡの存在下または非存在下において、蛍光化合物ＭＡＬ（Boc-LysAc-AMC）、および部分的に精製されたラット肝臓ＨＤＡＣを使用する、アッセイを記載する。また、Heltweg Bら（Analytical Biochemistry (2003)）は、いくつかの組み替えＨＤＡＣアイソタイプのための同じ低分子基質およびその誘導体の、インビトロでの使用を開示する。Wegenerら（Chemistry & Biology 10: 61-68 (2003)）は、脱アセチル化された場合、トリプシンのための基質となり、次いで、発色団を放出する、アセチル化されたリシンを有する蛍光発生ＨＤＡＣ基質の使用を開示する。同様に、Biomol（Plymouth Meeting, Philadelphia）は、インビトロでのＨＤＡＣ活性をモニタリングできる、いくつかの蛍光活性キット（「HDAC Fluorescent Activity/Drug Discovery Kit」）、または、インビトロでのＳｉｒＴ１、ＳｉｒＴ２、もしくはＳｉｒＴ３の活性を、特にモニタリング出来るキットを開示する。インビトロで、組み替え酵素を使用することによって、スラミンの阻害活性、ならびにリスベラトロール（resverstrol）のアクチベーター活性を、サーチュイン類に対してモニタリングすることが出来、ＴＳＡの阻害活性を、抽出物中のＨＤＡＣ類または組み替えＨＤＡＣアイソタイプに対して、モニタリングすることが出来る。不都合なことに、これらのアッセイ、および同様のアッセイは全て、細胞抽出物の形成を必要とし、細胞抽出物の形成は、時間を要し、抽出手順からアーチファクトを生じ得る。
【０００７】
「HDAC Fluorescent Activity/Drug Discovery Kit」（Biomol）は、培養ＨｅＬａ完全細胞または培養ジャーカット完全細胞を使用するアッセイを開示し、このアッセイは、蛍光レポーター分子を生成する未開示のアセチル化ＨＤＡＣ（クラスＩ／ＩＩ）pan-基質を使用し、細胞が培養されるウェル中で、蛍光ＨＤＡＣ切断生成物を測定する。しかし、方法は、以下を測定できない：１）ホールセルの成分における、所与のクラスＩ／ＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤の効力およびアイソタイプ特異性；２）ホールセルの成分におけるサーチュイン阻害剤の効力およびアイソタイプ特異性；ならびに、３）哺乳動物、またはＨＤＡＣクラスＩ／ＩＩ阻害剤もしくはサーチュイン阻害剤で処置される哺乳動物から採取される初代細胞由来のＨＤＡＣ活性。特に、後者のシナリオの場合、哺乳動物から採取される初代のホールセルは、培養に感受性でないかもしれず、かかる培養細胞は、その哺乳動物の体内における細胞中のＨＤＡＣの実際の活性を、反映していないかもしれない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
従って、以下：１）ホールセルの成分におけるＨＤＡＣ阻害剤またはサーチュイン阻害剤のアイソタイプ選択性、および２）哺乳動物の体から直接的に採取されたホールセルにおけるタンパク質デアセチラーゼ活性のレベルの評価を可能にする、アッセイの必要性が存在する。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の簡単な要約
本発明は、哺乳動物の体から直接的に採取されたか、または体液から採取された、初代の未処置のホールセルにおける、タンパク質デアセチラーゼ活性のレベルの評価を可能とする、アッセイを提供する。
【００１０】
第一の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセルにおける、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、全タンパク質デアセチラーゼ活性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、この細胞を、細胞透過性の、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と、接触させる。ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。次いで、この検出可能なレポーター分子の量を測定する。好ましい態様において、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して、この検出可能なレポーター分子の量を測定する。
【００１１】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００１２】
第二の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセル由来の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的活性を評価するための方法を提供し、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のアイソタイプは、全デアセチラーゼ活性の大部分を提供する。本発明のこの局面による方法において、哺乳動物由来のホールセルを提供し、この細胞を、細胞透過性の、このタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するpan-基質、または、細胞透過性の、このタンパク質デアセチラーゼファミリーファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、この１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。この細胞の第１のアリコートを、全デアセチラーゼ活性の大部分を提供する１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼの、アイソタイプ特異的阻害剤と、さらに接触させ、その細胞の第２のアリコートは、接触させない。次いで、上記の検出可能なレポーター分子の量を、第１および第２のアリコートについて測定し、各々のアリコートについてのタンパク質デアセチラーゼ活性の量を測定する。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量は、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定する。
【００１３】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００１４】
第３の局面において、本発明は、エキソビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、特定のアイソタイプの活性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上の特定のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼによるこの基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成し、この検出可能なレポーター分子の量の測定をもたらす。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量は、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定する。
【００１５】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００１６】
第４の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセルにおける、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-阻害剤候補の活性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、これらの細胞を、細胞透過性の、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。この細胞の第１のアリコートを、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-阻害剤候補と、さらに接触させ、この細胞の第２のアリコートは、接触させない。次いで、この検出可能なレポーター分子の量を、この第１および第２のアリコートについて測定し、各々のアリコートについてのタンパク質デアセチラーゼ活性の量を比較する。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量は、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定する。
【００１７】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００１８】
第５の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセル由来の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの阻害剤候補のアイソタイプ特異的活性を評価するための方法を提供し、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のアイソタイプは、全デアセチラーゼ活性の大部分を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、細胞透過性の、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、または、細胞透過性の、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼによるこの基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。これらの細胞の第１のアリコートを、全デアセチラーゼ活性の大部分を提供するこのタンパク質デアセチラーゼのアイソタイプ特異的阻害剤候補と、さらに接触させ、これらの細胞の第２のアリコートは、接触させない。次いで、この検出可能なレポーター分子の量を、この第１および第１のアリコートについて測定し、各々のアリコートについてのこの検出可能なレポーター分子の量を比較する。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量は、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定する。
【００１９】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００２０】
第６の局面において、本発明は、インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーのpan-阻害剤の効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供する。これらの細胞を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。次いで、このレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、既知の活性に対して標準化する。次に、この哺乳動物に、このpan-阻害剤を投与する。好適な期間の後で、再び、この哺乳動物からホールセルを採取し、これらの細胞を、上記のpan-基質と接触させる。次に、上記のレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、既知の活性に対して標準化する。次いで、このpan-阻害剤投与後のレポーター分子の量と、このpan-阻害剤投与前のレポーター分子の量とを、比較する。このpan-阻害剤の投与後の、このレポーター分子の量の有意な減少を、効力の尺度として取り入れる。
【００２１】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００２２】
第７の局面において、本発明は、インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーのメンバーの、アイソタイプ特異的阻害剤の効力および特異性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供する。これらの細胞を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼによるこの基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。次いで、この検出可能なレポーター分子の量を、決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのメンバーの既知の活性に対して、標準化する。次に、この哺乳動物に、このアイソタイプ特異的阻害剤を投与する。好適な期間の後で、再び、この哺乳動物からホールセルを採取し、これらの細胞を、上記のアイソタイプ特異的基質と接触させる。次に、上記のレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの既知の活性に対して、標準化する。次いで、このアイソタイプ特異的阻害剤の投与後のレポーター分子の量と、このアイソタイプ特異的阻害剤の投与前のレポーター分子の量とを比較する。このアイソタイプ特異的阻害剤の投与後の、レポーター分子の量の有意な減少を、効力の尺度として取り入れる。
【００２３】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００２４】
第８の局面において、本発明は、体液中の検出可能なレポーター分子の量を測定することによって、インビボで、哺乳動物の全タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-阻害剤の効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、この哺乳動物に、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質を投与し、ここで、このpan-基質またはアイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。この哺乳動物由来の体液を得、この体液中の上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、この哺乳動物に、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-阻害剤を投与し、好適な期間の後で、この哺乳動物に、上記のpan-基質を投与する。この哺乳動物由来の体液を得、この体液中の上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、このpan-阻害剤の投与の前に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の量と、このpan-阻害剤投与後の体液中のこの検出可能なレポーター分子の量とを、比較する。このpan-阻害剤の投与後の、このレポーター分子の量の有意な減少を、効力の尺度として取り入れる。
【００２５】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００２６】
第９の局面において、本発明は、体液中の検出可能なレポーター分子の量を測定することによる、インビボでの、哺乳動物における、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的阻害剤の効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法において、この哺乳動物に、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質を投与し、ここで、このアイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。この哺乳動物由来の体液を得、この体液中の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、この哺乳動物に、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的阻害剤を投与し、好適な期間の後で、この哺乳動物に、上記のアイソタイプ特異的基質を投与する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、このアイソタイプ特異的阻害剤の投与の前に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の量と、このアイソタイプ特異的阻害剤の投与後の体液中のこの検出可能なレポーター分子の量とを、比較する。このアイソタイプ特異的阻害剤の投与後の、このレポーター分子の量の有意な減少を、効力の尺度として取り入れる。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００２７】
第１０の局面において、本発明は、インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-アクチベーターの効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供する。これらの細胞を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。次いで、このレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、既知の活性に対して標準化する。次に、この哺乳動物に、このpan-アクチベーターを投与する。好適な期間の後で、再び、この哺乳動物からホールセルを採取し、上記のpan-基質と接触させる。次に、上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、既知の活性に対して標準化する。次いで、このpan-アクチベーターの投与後の上記のレポーター分子の量と、このpan-アクチベーターの投与前のこのレポーター分子の量とを比較する。このpan-アクチベーターの投与後の、このレポーター分子の量の有意な増加を、効力の尺度として取り入れる。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００２８】
第１１の局面において、本発明は、インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的アクチベーターの、効力および特異性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供する。これらの細胞を、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼによるこの基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。次いで、このレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのメンバーの既知の活性に対して、標準化する。次に、この哺乳動物に、このアイソタイプ特異的アクチベーターを投与する。好適な期間の後に、再び、この哺乳動物から、ホールセルを採取し、これらの細胞を、上記のアイソタイプ特異的基質と接触させる。次に、検出可能なレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのメンバーの既知の活性に対して、標準化する。次いで、このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与後のこのレポーター分子の量と、このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与前のこのレポーター分子の量とを、比較する。このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与後の、このレポーター分子の量の有意な増加を、効力の尺度として取り入れる。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００２９】
第１２の局面において、本発明は、体液中の検出可能なレポーター分子の量を測定することによって、インビボで、哺乳動物の全タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-アクチベーターの、効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法において、この哺乳動物に、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するpan-基質、あるいはアイソタイプ特異的基質を投与し、ここで、このpan-基質あるいはアイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、この哺乳動物に、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-アクチベーターを投与し、好適な期間の後で、この哺乳動物に、上記のpan-基質またはアイソタイプ特異的基質を投与する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、このpan-アクチベーターの投与前に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の量と、このpan-アクチベーターの投与後の体液中の検出可能なレポーター分子の量とを、比較する。このpan-アクチベーターの投与後の、このレポーター分子の量の有意な増加を、効力の尺度として取り入れる。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００３０】
第１３の局面において、本発明は、体液中の検出可能なレポーター分子の量を測定することによって、インビボで、哺乳動物における、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的アクチベーターの、効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、この哺乳動物に、細胞透過性の、タンパク質デアセチラーゼに対するアイソタイプ特異的基質を投与し、ここで、このアイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、この哺乳動物に、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的アクチベーターを投与し、好適な期間の後で、この哺乳動物に、上記のアイソタイプ特異的基質を投与する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与の前に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の量と、このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与後の体液中の検出可能なレポーター分子の量とを、比較する。このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与後の、このレポーター分子の量の有意な増加を、効力の尺度として取り入れる。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００３１】
第１４の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセルにおける、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-アクチベーター候補の活性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、これらの細胞を、細胞透過性の、このタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。これらの細胞の第１のアリコートを、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-アクチベーター候補とさらに接触させ、これらの細胞の第２のアリコートは、接触させない。次いで、これら第１および第２のアリコートについて、検出可能なレポーター分子の量を測定し、各々のアリコートについてのタンパク質デアセチラーゼ活性の量を比較する。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定する。
【００３２】
特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００３３】
第１５の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセルにおいて、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的アクチベーター候補の活性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、これらの細胞を、細胞透過性の、このタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。これらの細胞の第１のアリコートを、このタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的アクチベーター候補と、さらに接触させ、これらの細胞の第２のアリコートは、接触させない。次いで、これら第１および第２のアリコートについて、上記の検出可能なレポーター分子の量を測定し、各々のアリコートについてのタンパク質デアセチラーゼ活性の量を比較する。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定する。
【００３４】
特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
好ましい態様の詳細な説明
本発明は、タンパク質デアセチラーゼについての酵素アッセイに関する。より具体的には、本発明は、ホールセル（whole cell）を利用する、かかるアッセイに関する。本発明は、哺乳動物の体内から直接的に採取されたホールセル、または体液中のホールセルにおける、タンパク質デアセチラーゼ活性のレベルの評価を可能とするアッセイを提供する。
【００３６】
第１の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセルにおける、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、全タンパク質デアセチラーゼ活性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、これらの細胞を、細胞透過性の、このタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と、接触させる。ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。次いで、この検出可能なレポーター分子の量を、測定する。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して、測定する。
【００３７】
特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００３８】
「タンパク質デアセチラーゼファミリー」とは、タンパク質のアミノ酸残基の塩基性側鎖から、アセチル基を取り除く能力を有する、関連するタンパク質の群である。用語「哺乳動物」とは、特に、ヒトを含む。「ホールセル（whole cell）」とは、独立して存在するか、または組織もしくは腫瘍の一部として存在する、未処置の細胞である。「細胞透過性のpan-基質」とは、細胞に浸透する分子であり、それらのネイティブな形態においては、検出可能なレポーター分子を生成しないが、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーのメンバーによる切断後に、検出可能なレポーター分子を生成する分子である。「細胞透過性のアイソタイプ特異的阻害剤」とは、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーであるが、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの全てのメンバーよりは少ないメンバーを阻害する、タンパク質デアセチラーゼ阻害剤、またはその塩である。例えば、例において記載される、化合物２、およびその塩（本明細書において化合物６として言及される）は、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、およびＨＤＡＣ−３に特異的である。「検出可能なレポーター分子」とは、アッセイにおいて測定可能なシグナルを生じる分子である。この分子の性質は、この分子が測定可能である限りは、重要でない。好ましい検出可能なレポーター分子として、比色分子（colorometric molecule）、蛍光分子、ＦＲＥＴ検出可能分子、酵素、放射性標識、および化学発光分子が挙げられるが、これらに限定されない。「タンパク質デアセチラーゼコントロール標準物質」とは、既知レベルのタンパク質デアセチラーゼ活性を有するサンプルである。ＨＤＡＣファミリーおよびＳｉｒ２ファミリーは、このようなことが文献において公知であるファミリーである。
【００３９】
上記のホールセルを、細胞透過性の、pan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と、単独で接触させても、薬学的に受容可能なキャリアと組み合わせて接触させてもよい。本明細書において使用される場合、用語「薬学的に受容可能」とは、そのアッセイの有効性を妨げず、生物学的な系（細胞、組織、または生物など）と適合性である物質を指す。本明細書において使用される場合、用語「キャリア」とは、任意の賦形剤、希釈剤、充填剤、塩、緩衝剤、安定化剤、可溶化剤、脂質、または薬学的処方物における用途について当該分野において周知の他の物質を包含する。これらのキャリア、賦形剤、希釈剤などの特徴は、特定の適用のための投与の経路に依存することが、理解される。これらの物質を含有する、薬学的に受容可能な処方物の調製は、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、第１８版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990において記載される。
【００４０】
第２の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセル由来の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的活性を評価するための方法を提供し、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のアイソタイプは、全タンパク質デアセチラーゼ活性の大部分を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、これらの細胞を、細胞透過性の、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーについてのpan-基質、または細胞透過性の、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質と、接触させ、ここで、これら１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。これらの細胞の第１のアリコートを、全デアセチラーゼ活性の大部分を提供する１種類もしくは２種類以上のタンパク質デアセチラーゼの、アイソタイプ特異的阻害剤と、さらに接触させ、これらの細胞の第２のアリコートは、この阻害剤と接触させない。次いで、これら第１および第２のアリコートについて、上記の検出可能なレポーター分子の量を測定し、各々のアリコートについてのタンパク質デアセチラーゼ活性の量を比較する。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量を、タンパク質デアセチラーゼのコントロール標準物質に対して測定する。
【００４１】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００４２】
「アイソタイプ特異的活性」とは、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーであるが、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの全てのメンバーよりは少ないメンバーを阻害する、タンパク質デアセチラーゼ活性である。例えば、例において記載される化合物２または化合物６は、ＨＤＡＣ−１、ＨＤＡＣ−２、およびＨＤＡＣ−３に特異的である。特定の他のアイソタイプ特異的活性として、あるタンパク質デアセチラーゼ活性の単一のメンバー（例えば、ＨＤＡＣ−１）に特異的な阻害剤が挙げられる。天然に、または、これらの細胞が１種類もしくは２種類以上のアイソタイプによって形質移入されており、そのアイソタイプを過剰発現するために、その１種類もしくは２種類以上のアイソタイプが、全タンパク質デアセチラーゼの大部分を提供する。用語「第１のアリコート」および「第２のアリコート」は、便宜上使用され、どのアリコートが、時間的に最初に調製されるかは、意味しない。全ての他の定義は、上記の通りである。
【００４３】
第３の局面において、本発明は、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーのメンバーの、１種類もしくは２種類以上の特定のアイソタイプの活性を、評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、これらの細胞を、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質と、接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成し、この検出可能なレポーター分子の量の測定をもたらす。
【００４４】
好ましい態様において、上記の検出可能なレポーター分子の量を、タンパク質デアセチラーゼのコントロール標準物質に対して測定する。
【００４５】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００４６】
「アイソタイプ特異的基質」とは、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーであるが、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの全てのメンバーよりは少ないメンバーに対する、基質である。特定の他のアイソタイプ特異的基質として、あるタンパク質デアセチラーゼ活性の単一のメンバー（例えば、ＨＤＡＣ−１）に特異的な基質が挙げられる。全ての他の定義は、上記の通りである。
【００４７】
第４の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセルにおいて、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-阻害剤候補の活性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、これらの細胞を、細胞透過性の、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。これらの細胞の第１のアリコートを、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-阻害剤候補と、さらに接触させ、これらの細胞の第２のアリコートは、このpan-阻害剤候補とは接触させない。次いで、これら第１および第２のアリコートについて、上記の検出可能なレポーター分子の量を測定し、各々のアリコートについてのこの検出可能なレポーター分子の量を比較する。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量を、このタンパク質デアセチラーゼまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについてのコントロール標準物質に対して測定する。
【００４８】
特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００４９】
「pan-阻害剤候補」とは、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの全てのメンバーを阻害する能力について試験されるべき、タンパク質デアセチラーゼの阻害剤である。「pan-基質」とは、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの全てのメンバーについての基質である。全ての他の定義は、上記の通りである。
【００５０】
第５の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセル由来の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの阻害剤候補の、アイソタイプ特異的活性を評価するための方法を提供し、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のアイソタイプは、全タンパク質デアセチラーゼ活性の大部分を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、これらの細胞を、細胞透過性の、このタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-阻害剤、または細胞透過性の、このタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するアイソタイプ特異的基質と、接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼによるこの基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。これらの細胞の第１のアリコートを、全タンパク質デアセチラーゼ活性の大部分を提供するこのタンパク質デアセチラーゼのアイソタイプ特異的阻害剤候補と、さらに接触させ、これらの細胞の第２のアリコートは、この阻害剤候補と接触させない。次いで、これら第１および第２のアリコートについて、上記の検出可能なレポーター分子の量を測定し、各々のアリコートについてのこの検出可能なレポーター分子の量を比較する。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量を、タンパク質デアセチラーゼコントロール標準物質に対して測定する。
【００５１】
特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００５２】
「阻害剤候補のアイソタイプ特異的活性」とは、あるタンパク質脱アセチル化の阻害剤が、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーであるが、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの全てのメンバーより少ないメンバーについて、特異的であるか否かの決定である。全ての他の定義は、上記の通りである。
【００５３】
第６の局面において、本発明は、インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-阻害剤の効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供する。これらの細胞を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。次いで、このレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、既知の活性に対して、標準化する。次に、この哺乳動物に、上記のpan-阻害剤を投与する。好適な期間の後で、再び、ホールセルをこの哺乳動物から採取し、これらの細胞を、上記のpan-基質またはアイソタイプ特異的基質と接触させる。次に、上記のレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、既知の活性に対して、標準化する。次いで、このpan-阻害剤の投与後のこのレポーター分子の量と、このpan-阻害剤の投与前のこのレポーター分子の量とを、比較する。このpan-阻害剤の投与後での、このレポーター分子の量の有意な減少を、効力の尺度として取り入れる。特定の好ましい態様において、この阻害剤の投与の前にこの哺乳動物から採取されたホールセルを、貯蔵し、この検出可能なレポーター分子の処理前および処理後のレベルについてのアッセイを、同時に、またはほぼ同時に行う。
【００５４】
特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００５５】
pan-阻害剤の投与は、任意の受容可能な経路によるものであってよく、そのような経路として、経口経路、非経口経路、舌下経路、静脈内経路、眼内経路、局所経路、鼻内経路、脳室内経路、小胞内経路、および直腸内経路が挙げられるが、これらに限定されない。体液として、血液、血漿、痰、尿、および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい態様において、上記の検出可能なレポーター分子の各々の定量化を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの既知の活性に対して、標準化する。特定の好ましい態様において、上記のpan-阻害剤の投与の前に得られた体液を、保存し、投与の前後に得られた体液中の上記の検出可能なレポーター分子の定量化を、同時に行っても、またはほぼ同時に行ってもよい。全ての他の定義は、上記の通りである。
【００５６】
第７の局面において、本発明は、インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的阻害剤の効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供する。これらの細胞を、上記のタンパク質デアセチラーゼファミリーのメンバーに対するアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。次いで、このレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのこのメンバーの既知の活性に対して、標準化する。次に、この哺乳動物に、上記のアイソタイプ特異的阻害剤を投与する。好適な期間の後で、再び、この哺乳動物からホールセルを取得し、上記のアイソタイプ特異的基質と接触させる。次に、上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのこのメンバーの既知の活性に対して、標準化する。次いで、このアイソタイプ特異的阻害剤の投与後のこのレポーター分子の量と、このアイソタイプ特異的阻害剤の投与前のこのレポーター分子の量とを、比較する。このアイソタイプ特異的阻害剤の投与後での、このレポーター分子の量の有意な減少を、効力の尺度として取り入れる。
【００５７】
特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーである。特定の好ましい態様において、上記のタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーである。
【００５８】
アイソタイプ特異的阻害剤の投与は、任意の受容可能な経路によるものであってよく、そのような経路として、経口経路、非経口経路、舌下経路、静脈内経路、眼内経路、局所経路、鼻内経路、脳室内経路、小胞内経路、および直腸内経路が挙げられるが、これらに限定されない。体液として、血液、血漿、痰、尿、および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい態様において、上記の検出可能なレポーター分子の各々の定量化を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの既知の活性に対して、標準化する。特定の好ましい態様において、上記のアイソタイプ特異的阻害剤の投与の前に得られた体液を、保存し、投与の前後に得られた体液中の上記の検出可能なレポーター分子の定量化を、同時に行っても、またはほぼ同時に行ってもよい。
【００５９】
全ての他の定義は、上記の通りである。
【００６０】
第８の局面において、本発明は、体液中の検出可能なレポーター分子の量を測定することによって、インビボで、哺乳動物における、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの全活性の、pan-阻害剤の効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法において、上記の哺乳動物に、細胞透過性の、このタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質を投与し、ここで、このpan-基質またはアイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。この哺乳動物から体液を得、この体液中のこの検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、この哺乳動物に、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-阻害剤を投与し、好適な期間の後で、この哺乳動物に、上記のpan-基質またはアイソタイプ特異的基質を投与する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、このpan-阻害剤の投与の前に得られた体液中の、この検出可能なレポーター分子の量と、このpan-阻害剤の投与後の体液中の、この検出可能なレポーター分子の量とを、比較する。このpan-阻害剤の投与後での、この検出可能なレポーター分子の量の有意な減少を、効力の尺度として取り入れる。
【００６１】
特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００６２】
pan-基質またはアイソタイプ特異的基質およびpan-阻害剤の投与は、任意の受容可能な経路によるものであってよく、そのような経路として、経口経路、非経口経路、舌下経路、静脈内経路、眼内経路、局所経路、鼻内経路、脳室内経路、小胞内経路、および直腸内経路が挙げられるが、これらに限定されない。体液として、血液、血漿、痰、尿、および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい態様において、上記の検出可能なレポーター分子の各々の定量化を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの既知の活性に対して、標準化する。特定の好ましい態様において、上記のpan-阻害剤の投与の前に得られた体液を、保存し、投与の前後に得られた体液中の上記の検出可能なレポーター分子の定量化を、同時に行っても、またはほぼ同時に行ってもよい。
【００６３】
全ての他の定義は、上記の通りである。
【００６４】
第９の局面において、本発明は、体液中の検出可能なレポーター分子の量を測定することによって、インビボで、哺乳動物における、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的阻害剤の効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法において、哺乳動物に、細胞透過性の、このタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質を投与し、ここで、このアイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、この哺乳動物に、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的阻害剤を投与し、好適な期間の後で、この哺乳動物に、上記のアイソタイプ特異的基質を投与する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、このアイソタイプ特異的阻害剤の投与の前に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の量と、このアイソタイプ特異的阻害剤の投与後の体液中の検出可能なレポーター分子の量とを、比較する。このアイソタイプ特異的阻害剤の投与後での、このレポーター分子の量の有意な減少を、効力の尺度として取り入れる。
【００６５】
特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００６６】
上記のアイソタイプ特異的基質およびアイソタイプ特異的阻害剤の投与は、任意の受容可能な経路によるものであってよく、そのような経路として、経口経路、非経口経路、舌下経路、静脈内経路、眼内経路、局所経路、鼻内経路、脳室内経路、小胞内経路、および直腸内経路が挙げられるが、これらに限定されない。体液として、血液、血漿、痰、尿、および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい態様において、上記の検出可能なレポーター分子の各々の定量化を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの既知の活性に対して、標準化する。特定の好ましい態様において、アイソタイプ特異的阻害剤の投与の前に得られた体液を保存し、投与の前後に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の定量化を、同時に行っても、またはほぼ同時に行ってもよい。この検出可能なレポーター分子は、細胞から体液中へと拡散することが出来る。
【００６７】
全ての他の定義は、上記の通りである。
【００６８】
第１０の局面において、本発明は、インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-アクチベーターの効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法において、哺乳動物由来のホールセルを提供する。これらの細胞を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質に接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。次いで、このレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、既知の活性に対して、標準化する。次に、この哺乳動物に、上記のpan-アクチベーターを投与する。好適な期間の後で、再び、この哺乳動物からホールセルを採取し、これらの細胞を、上記のpan-基質またはアイソタイプ特異的基質と接触させる。次に、上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、既知の活性に対して、標準化する。次いで、このpan-アクチベーターの投与後のこのレポーター分子の量と、このpan-阻害剤の投与前のこのレポーター分子の量とを、比較する。このpan-アクチベーターの投与後での、このレポーター分子の量の有意な増加を、効力の尺度として取り入れる。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。あるタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-アクチベーターとは、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの全てのメンバーを活性化する分子である。
【００６９】
上記のpan-アクチベーターの投与は、任意の受容可能な経路によるものであってよく、そのような経路として、経口経路、非経口経路、舌下経路、静脈内経路、眼内経路、局所経路、鼻内経路、脳室内経路、小胞内経路、および直腸内経路が挙げられるが、これらに限定されない。体液として、血液、血漿、痰、尿、および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい態様において、上記の検出可能なレポーター分子の各々の定量化を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの既知の活性に対して、標準化する。特定の好ましい態様において、上記のpan-アクチベーターの投与の前に得られた体液を保存し、投与の前後に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の定量化を、同時に行っても、またはほぼ同時に行ってもよい。この検出可能なレポーター分子は、細胞から体液中へと拡散することが出来る。
【００７０】
全ての他の定義は、上記の通りである。
【００７１】
第１１の局面において、本発明は、インビボで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーについてのアイソタイプ特異的アクチベーターの効力および特異性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供する。これらの細胞を、細胞透過性の、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーに対するアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼによるこの基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。次いで、このレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーのメンバーの、既知の活性に対して標準化する。次に、この哺乳動物に、上記のアイソタイプ特異的アクチベーターを投与する。好適な期間の後で、再び、この哺乳動物からホールセルを採取し、上記のアイソタイプ特異的基質と接触させる。次に、上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。好ましい態様において、この量を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、既知の活性に対して標準化する。次いで、このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与後のこのレポーター分子の量と、このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与前のこのレポーター分子の量とを、比較する。このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与後での、このレポーター分子の量の有意な増加を、効力の尺度として取り入れる。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００７２】
あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的アクチベーターとは、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの、１種類もしくは２種類以上のメンバーであるが、全てのメンバーではないメンバーの、活性および／または量を増大させる分子である。全ての他の定義は、上記の通りである。
【００７３】
上記のアイソタイプ特異的アクチベーターの投与は、任意の受容可能な経路によるものであってよく、そのような経路として、経口経路、非経口経路、舌下経路、静脈内経路、眼内経路、局所経路、鼻内経路、脳室内経路、小胞内経路、および直腸内経路が挙げられるが、これらに限定されない。体液として、血液、血漿、痰、尿、および脳脊髄液が挙げられるが、これらに限定されない。特定の好ましい態様において、上記の検出可能なレポーター分子の各々の定量化を、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーの既知の活性に対して、標準化する。特定の好ましい態様において、アイソタイプ特異的アクチベーターの投与の前に得られた体液を保存し、投与の前後に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の定量化を、同時に行っても、またはほぼ同時に行ってもよい。この検出可能なレポーター分子は、細胞から体液中へと拡散することが出来る。
【００７４】
すべての他の定義は、上記のとおりである。
【００７５】
第１２の局面において、本発明は、体液中の検出可能なレポーター分子の量を測定することによって、インビボで、哺乳動物の、全タンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、pan-アクチベーターの効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物に、細胞透過性の、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質を投与し、ここで、このpan-基質またはアイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、この哺乳動物に、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-アクチベーターを投与し、好適な期間の後で、この哺乳動物に、上記のpan-基質またはアイソタイプ特異的基質を投与する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、このpan-アクチベーターの投与の前に得られた体液中の検出可能なレポーター分子の量と、このpan-アクチベーター投与後の体液中のこの検出可能なレポーター分子の量とを、比較する。このpan-アクチベーターの投与後での、このレポーター分子の量の有意な増加を、効力の尺度として取り入れる。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００７６】
全ての定義は、上記の通りである。
【００７７】
第１３の局面において、本発明は、体液中の検出可能なレオポーター分子の量を測定することによって、インビボで、哺乳動物における、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的アクチベーターの効力を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物に、細胞透過性の、タンパク質デアセチラーゼに対するアイソタイプ特異的基質を投与し、ここで、このアイソタイプ特異的基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、この哺乳動物に、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的アクチベーターを投与し、好適な期間の後で、この哺乳動物に、上記のアイソタイプ特異的基質を投与する。この哺乳動物から体液を得、この体液中の上記の検出可能なレポーター分子の量を決定する。次いで、このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与の前に得られた体液中の、検出可能なレポーター分子の量と、このアイソタイプ特異的アクチベーター投与後の体液中の、この検出可能なレポーター分子の量とを、比較する。このアイソタイプ特異的アクチベーターの投与後での、このレポーター分子の量の有意な増加を、効力の尺度として取り入れる。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼファミリーは、Ｓｉｒ２ファミリーである。
【００７８】
全ての定義は、上記の通りである。
【００７９】
第１４の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセルにおける、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-アクチベーター候補の活性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、これらの細胞を、細胞透過性の、そのタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。これらの細胞の第１のアリコートを、このタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-アクチベーター候補と、さらに接触させ、これらの細胞の第２のアリコートは、このpan-アクチベーター候補と接触させない。次いで、これら第１および第２のアリコートについて、上記の検出可能なレポーター分子の量を測定し、各々のアリコートについてのタンパク質デアセチラーゼ活性の量を比較する。
【００８０】
特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定する。
【００８１】
全ての定義は、上記の通りである。
【００８２】
第１５の局面において、本発明は、エキソビボで、ホールセルにおける、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーの、アイソタイプ特異的アクチベーター候補の活性を評価するための方法を提供する。本発明のこの局面による方法においては、哺乳動物由来のホールセルを提供し、これらの細胞を、細胞透過性の、このタンパク質デアセチラーゼファミリーに対するpan-基質、またはアイソタイプ特異的基質と接触させ、ここで、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーによる、この基質の脱アセチル化は、検出可能なレポーター分子を生成する。これらの細胞の第１のアリコートを、このタンパク質デアセチラーゼファミリーの１種類もしくは２種類以上のメンバーのアイソタイプ特異的アクチベーター候補と、さらに接触させ、これらの細胞の第２のアリコートは、このアクチベーター候補と接触させない。次いで、これら第１および第２のアリコートについて、上記の検出なレポーター分子の量を測定し、各々のアリコートについての、タンパク質デアセチラーゼ活性の量を比較する。好ましい態様において、この検出可能なレポーター分子の量を、このタンパク質デアセチラーゼファミリーまたはその１種類もしくは２種類以上のメンバーについての、コントロール標準物質に対して測定する。
【００８３】
特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）ファミリーのメンバーである。特定の好ましい態様において、このタンパク質デアセチラーゼは、Ｓｉｒ２ファミリーのメンバーである。
【００８４】
全ての定義は、上記の通りである。
【００８５】
以下の例は、本発明の特定の特に好ましい態様を、さらに説明することを意図され、本発明の範囲を限定することは、決して意図されない。
【実施例】
【００８６】
例１：Boc-Lys(Ac)-AMCを基質として使用する、ヒト２９３Ｔ細胞の細胞内および細胞外のデアセチラーゼ活性
新たにトリプシン処理された細胞（２９３Ｔ）を、９６ウェルの黒色のCoster E1A/RIAプレート（Corning Inc., Corning, New York）中へ分注した。低分子基質であるBoc-Lys(Ac)-AMC（Bachem Biosciences Inc., King of Prussia, Philadelphia）を、３００μＭの最終濃度で、細胞懸濁液に加えた。細胞を、３７℃のインキュベーター内に、５％ＣＯ２下で、示された時間にわたって静置した。必要であれば、上清を回収し、スピニング（spinning）に供した。新たに調製したFluor-de-Lys（登録商標）発色液（developer）（Biomol, Plymouth Meeting, Philadelphia）、ならびに、アッセイ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中１μＭのＴＳＡ（Biomol, Plymouth Meeting, Philadelphia）および１％のＮＰ−４０を、上清または細胞ペレットに添加することによって、反応を停止した。蛍光を、１５分間３７℃で発色させ、蛍光光度計（SPECTRAMAX GeminiXS, Molecular Devices, Sunnylvale, California）において、３６０ｎｍの励起波長、４７０ｎｍの発光、および４３５ｎｍのカットオフで、読み取った。図１に示すように、有意な細胞内および細胞外のデアセチラーゼ活性が検出され得た。このことは、Boc-Lys(Ac)-AMCが、細胞を透過し得、生成された生成物（Boc-Lys-AMC）は、培養培地中へと拡散し得、その後に蛍光を発色することによって検出され得たことを示す。対照的に、添加される基質が存在しない場合、培養細胞からの上清または細胞ペレットのいずれも、ＨＤＡＣ活性を有さない。このアッセイのフローチャートを、図２に示す。
【００８７】
例２：基質Boc-LysAc-AMCは、インビトロでのサーチュイン類に対する好ましい基質ではない
ヒトＳｉｒＴ１、２、３の組み替え酵素を、Biomol（Biomol, Plymouth Meeting, Philadelphia）から購入した。Biomolの使用者の手引きにおいて示されるように、または例１において記載するように、各々のサーチュイン類の５単位を、アッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ，ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍｇ／ｍｌ  ＢＳＡ、５００μＭ  ＮＡＤ＋）中で、Fluor-de-Lys-SirT1基質（６０μＭ）、Fluor-de-Lys-SirT2基質（ＳｉｒＴ２については２００μＭ、ＳｉｒＴ３については３０μＭ）、またはBoc-Lys(Ac)-AMC基質（２００μＭ）とともに、４５分間インキュベートし、その後、反応を停止させて読み取った。図３に示すように、組み替えＳｉｒｔ１酵素に対しては、Fluor-de-Lys-SirT1基質が、Boc-Lys(Ac)-AMCより好ましい基質であるが、一方、Ｓｉｒｔ２酵素およびＳｉｒＴ３酵素の両方に対しては、Fluor-de-Lys-SirT2基質がより好ましい基質である。
【００８８】
例３：Boc-Lys(Ac)-AMCを使用しての、ヒトの癌細胞および正常細胞における、ホールセル活性
新たにトリプシン処理された細胞を、９６ウェルの黒色のCoster E1A/RIAプレート（Corning Inc., Corning, New York）中へ分配した。低分子基質であるBoc-Lys(Ac)-AMC（Bachem Biosciences Inc., King of Prussia, Philadelphia）を、３００μＭの最終濃度で、細胞懸濁液に加えた。細胞を、３７℃のインキュベーター内に、５％ＣＯ２下で、９０分間静置した。新たに調製したFluor-de-Lys（登録商標）発色液（Biomol, Plymouth Meeting, Philadelphia）、ならびにアッセイ緩衝液（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ＨＣｌ  ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）中１μＭのＴＳＡ（Biomol, Plymouth Meeting, Philadelphia）および１％のＮＰ−４０を添加することによって、反応を停止させた。１％のＮＰ−４０の存在下において、細胞外ＨＤＡＣ活性および細胞内ＨＤＡＣ活性の両方を、培養細胞中で一緒に測定した。蛍光を、３７℃で１５分間発色させ、蛍光光度計（SPECTRAMAX GeminiXS, Molecular Devices, Sunnylvale, California）において、３６０ｎｍの励起波長、４７０ｎｍの発光、および４３５ｎｍのカットオフで、読み取った。本発明者らが試験した細胞株（ＨＣＴ１１６、Ａ５４９、Ｄｕ１４５、ＨＭＥＣ、２９３Ｔなど）において、全ＨＤＡＣ活性は、細胞数の関数であった（図４を参照のこと）。
【００８９】
例４：ヒト癌細胞株におけるデアセチラーゼ活性に対する、Boc-LysAc-AMC基質濃度の効果
細胞を、トリプシン処理し、トリパンブルー除去によって計数した。生きている細胞（４×１０４個のＡ５４９細胞、または１×１０５個のＨＣＴ１１６細胞、または５×１０４個のＤｕ１４５細胞）を、９６ウェルプレートの各々のウェルに分注した。ＨＤＡＣの低分子基質であるBoc-Lys(Ac)-AMCを、広範囲の最終濃度で、細胞懸濁液中へ添加し、細胞とともに、９０分間３７℃でインキュベートし、その後反応を停止させ、蛍光を発色させて読み取った。図５に示すように、ホールセルデアセチラーゼ活性に対する基質濃度の効果を測定した。Boc-Lys(Ac)-AMCのＫｍは、１５０μＭ〜２２０μＭの範囲にわたった。
【００９０】
例５：Boc-Lys(Ac)-AMCを基質として使用しての、未処置の癌細胞における、ＨＤＡＣのpan-阻害剤またはアイソタイプ特異的阻害剤の活性
ヒト癌細胞株（Ａ５４９、Ｄｕ１４５およびＨＣＴ１１６、２９３Ｔ、Ｊｕｒｋａｔ−Ｔ、Ｐａｎｃ１）を、種々の濃度のＨＤＡＣ阻害剤を用いて、示された期間にわたって処置し、その後、酵素の基質であるBoc-Lys(Ac)-AMCを、培養細胞中へ添加した。阻害剤は、pan-クラスＩ／ＩＩ阻害剤（ＳＡＨＡ、ＬＡＱ−８２４）、または、ＭＳ−２７５もしくは化合物２などの、アイソタイプ特異的クラスＩ阻害剤（ＨＤ１、２、３に対するもの）であり得た。未処置の細胞におけるＨＤＡＣ酵素アッセイを、例３において記載するように行った。図６および表１に示すように、酵素阻害の用量−応答曲線を分析することによって、ホールセルにおいて全ＨＤＡＣ活性の５０％を阻害する濃度（ＩＣ５０）を決定した。しかし、以下の表１においてまた示すように、２９３Ｔ細胞において、化合物２は、用量依存的な様式においてＨＤＡＣ活性を阻害するが、一方で、ＣＤＫ阻害剤（Kim KSら、J Med Chem. 45(18): 3905-3927 (2002)において記載される化合物４）またはタキソールは、このアッセイを使用する場合、ホールセルにおけるＨＤＡＣ活性に対して効果を有さなかった。
【００９１】
【表１】
2008532561.tif 000003
【００９２】
例６：サーチュイン特異的基質を使用しての、ヒト癌細胞における、基質濃度の関数としての、ホールセルでのサーチュインデアセチラーゼ活性
培養細胞（ＨＣＴ１１６）を、トリプシン処理し、トリパンブルー除去法によって計数した。生きている細胞（２×１０５個）を、９６ウェルプレートの各々のウェルへ分注する。サーチュインの低分子基質であるFluor-de-Lys-SirT1基質またはFluor-de-Lys-SirT2基質（Biomol, Plymouth Meeting, Philadelphia）を、種々の濃度において、培養細胞に添加し、示される期間にわたってインキュベートし、その後、Biomolの使用者の手引きに示されるように、反応を停止させ、読み取った。本発明者らは、Fluor-de-Lys-SirT1基質またはFluor-de-Lys-SirT2基質の両方（Biomol, Plymouth Meeting, Philadelphia）が、サーチュインに対する細胞透過性の基質として使用され得ることを見出した。ＨＣＴ１１６細胞において、Fluor-de-Lys-SirT1基質またはFluor-de-Lys-SirT2のＫｍが、各々、１３９．０μＭまたは１９５．５μＭとなることを決定した（図７ａ）。別個に、本発明者らは、ホールセル中でのFluor-de-Lys-SirT1基質またはFluor-de-Lys-SirT2のいずれかの濃度を固定し、ホールセルサーチュイン活性に対する、外因性のＮＡＤ＋濃度の効果を分析した（図７ｂ）。本発明者らは、外因性のＮＡＤ＋は、ホールセルサーチュイン活性に対して効果を有さないことを見出した。このことは、細胞内のＮＡＤ＋が、ホールセルのサーチュイン活性がその最大値に到達するために充分であることを示唆する。組み替えサーチュインを使用するインビトロでの反応と異なり、ニコチンアミドは、反応を失活（quench）させるには無効であり、蛍光シグナルは、インキュベーション中に、細胞の要因によって発色する。従って、読み取りは、停止後速やかに行った。
【００９３】
例７：ＴＳＡではなくスラミンによる、インビトロでのサーチュイン酵素活性の用量依存的特異的阻害
スラミンを、種々の濃度において、組み替えサーチュイン１〜３（Biomol, Plymouth Meeting, Philadelphia）ならびにサーチュインの基質（Fluor-de-Lys-SirT1またはFluor-de-Lys-SirT2）とともに、例２において記載する設定において、４５分間インキュベートした。Biomolの使用者の手引きにおいて示されるように、反応を読み取った。表２に示すように、スラミンは、Ｓｉｒｔ１、ＳｉｒＴ２、およびＳｉｒＴ３酵素を、インビトロで、用量依存的な様式において、阻害する。しかし、１０μＭの用量までのＴＳＡは、インビトロで、１０μＭまでのＳｉｒｔ１またはＳｉｒｔ２のいずれの活性も阻害しなかった。
【００９４】
【表２】
2008532561.tif 000004
【００９５】
例８：ＴＳＡではなくスラミンが、ホールセルでのサーチュイン活性を、用量依存的様式において阻害し得た
培養ＨＣＴ１１６細胞を、計数し、９６ウェルプレートの各々のウェルへ分注した。スラミンまたはＴＳＡを、種々の濃度で、細胞とともに１．５時間インキュベートし、その後、Biomol（Plymouth Meeting, Philadelphia）製のサーチュインの基質（Fluor-de-Lys-SirT1、５００μＭ）を添加した。サーチュインの基質（Fluor-de-Lys-SirT1、５００μＭ）またはＨＤＡＣの基質であるBoc-Lys(Ac)-AMC（３００μＭ）の添加後、細胞を追加の２時間さらにインキュベートした。例３および例６において記載するように、反応を停止させ、読み取った。図８に示すように、スラミンはホールセルでのＳｉｒＴ１活性を用量依存的な様式において阻害するが、ＴＳＡは阻害しなかった。しかし、ホールセルでBoc-Lys(AC)-AMCが基質として使用される場合、ＴＳＡは、ホールセルでのＨＤＡＣ活性を阻害することが出来た。この観察は、ＴＳＡがインビトロでクラスＩＩＩ（サーチュイン類）を阻害できないという、例７における本発明者らの知見と一致した。また、本発明者らの例３における知見と一致して、本発明者らは、Boc-Lys(Ac)-AMCが、ホールセルにおけるクラスＩおよびクラスＩＩのＨＤＡＣ活性をモニターするために使用され得ることを示す。
【００９６】
例９：リスベラトロールによる、インビトロでの、サーチュイン酵素活性の用量依存的な特異的活性化
リスベラトロールを、組み替えサーチュイン１〜３（Biomol, Plymouth Meeting, Philadelphia）ならびにサーチュインの基質（Fluor-de-Lys-SirT1またはFluor-de-Lys-SirT2）とともに、４５分間インキュベートした。例３において記載するように、反応を読み取る。表３に示すように、リスベラトロールは、インビトロで、用量依存的な様式において、Ｓｉｒｔ１酵素を活性化し得る。
【００９７】
【表３】
2008532561.tif 000005
【００９８】
例１０：リスベラトロールによる、ヒトＨＣＴ１１６細胞における、サーチュイン酵素活性の用量依存的な特異的活性化
ヒトＨＣＴ１１６細胞を、種々の濃度でのリスベラトロールとともに、１．５時間プレインキュベートし、その後、サーチュイン基質（Fluor-de-Lys-SirT1）を添加し、次いで追加の２時間さらにインキュベートした。反応を読み取り、結果を図９に示す。本発明者らは、リスベラトロールが、ホールセルでのサーチュイン（ＳｉｒＴ１）活性を、用量依存的な様式において活性化し得ることを示す。
【００９９】
例１１：Boc-Lys(Ac)-AMCを基質として使用しての、白血球細胞のホールセルＨＤＡＣ活性
全血（ヒトまたはマウス）を、２５００ｒｐｍで、１０分間、外界温度で、Sorvall RT-7遠心機（Mandel Scientific Co., Guelph, Ontario）において遠心した。血漿を除去し、バフィーコート（buffy coat）を回収した。５倍容積の赤血球溶解緩衝液（ＥＬ：Qiagen Canada Inc., Mississauga, Ontario）を、バフィーコートに添加した。バフィーコートを、氷上で２０分間インキュベートし、その後、４００ｇで１０分間４℃で遠心した。上清を除去し、バフィーコートをＥＬ緩衝液で２回洗浄し、再遠心した。バフィーコートを、ＲＰＭＩ培地中に再懸濁し、細胞（白血球細胞）をトリパンブルー除去法によって計数した。白血球細胞を、１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ中で、９６ウェルディッシュ中に播種した。ＨＤＡＣの低分子基質であるBoc-Lys(ac)-AMCを、細胞懸濁液に添加し、細胞とともに、９０分間３７℃でインキュベートし、その後、反応を停止させ、蛍光を発色させて読み取った。図１０に示すように、ヒト白血球細胞のホールセルでのＨＤＡＣ活性は、細胞数の関数であった。
【０１００】
例１２：Boc-LyAc-AMCを基質として使用する、ヒト白血球細胞における、ホールセルでのＨＤＡＣ活性（クラスＩまたはクラスＩＩ）のエキソビボでの阻害
ヒトのドナーから単離されたヒト白血球細胞（バフィーコート）を、１０％ウシ胎児血清添加ＲＰＭＩ中で、９６ウェルディッシュ中に播種した。広範囲の希釈率でのＨＤＡＣ阻害剤を、細胞とともに、１６時間、３７℃で、５％ＣＯ２下でインキュベートした。ＨＤＡＣの低分子基質であるBoc-Lys(Ac)-AMCを、細胞懸濁液中に添加して、細胞とともに９０分間インキュベートし、その後、反応を停止させ、蛍光を発色させて読み取った。pan-阻害剤（図１１ａ；ＬＡＱ−８２４）と、ＨＤＡＣ１〜３に対するアイソタイプ特異的阻害剤（図１１ｂ；化合物２）との両方が、用量依存的阻害を示した。図１１ｃは、インビトロで同じ低分子基質Boc-Lys(Ac)-AMCを使用する場合の、組み替えＨＤＡＣ酵素に対する、これらの阻害剤のＩＣ５０（μＭにおいて）を示す。全ＨＤＡＣ活性の７０％が、このアイソタイプ特異的阻害剤によって阻害され、このことは、ＨＤＡＣ１〜３が、ヒト由来の白血球細胞におけるこの活性のほとんどを提供することを示す。
【０１０１】
例１３：白血球細胞を使用しての、ホールセルでのサーチュイン活性
ｄｂ／ｄｂマウス（Jackson Laboratories, Bar Harbor, Maine）由来の血液を、ヘパリン処置試験管（heparin tube）中に回収した。５倍容積の赤血球溶解緩衝液（EL, Qiagen Canada Inc, Mississauga, Ontario）を用いて、赤血球を溶解した。遠心（４００×ｇ、５分間）によって白血球細胞を回収し、洗浄し、ＲＰＭＩ（＋１０％  ＦＢＳ）中に再懸濁し、次いで計数した。４×１０５個の細胞を、２００μＭのFluor-de-Lys Sirt1（BioMol, Plymouth Meeting, Philadelphia）とともに、９６ウェルディッシュの各々のウェルに分注し、９０分間インキュベートした。１×Developer II（BioMol, Plymouth Meeting, Philadelphia）および１％のＮＰ４０を補充した、１倍容積のアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を用いて、反応を停止させた。先の実験において、本発明者らは、ニコチンアミドがこの反応を失活させるのに無効であること、および、アッセイのインキュベーション中に細胞の要因によって蛍光が発色することを見出しており、従って、読み取りは、停止後速やかに行った。結果を、図１２に示す。
【０１０２】
例１４：サーチュイン特異的基質を使用しての、白血球細胞におけるホールセルでのサーチュイン活性のエキソビボ調節
マウスの血液を、ヘパリン処理試験管中に回収した。５倍容積の赤血球溶解緩衝液（EL, Qiagen Canada Inc, Mississauga, Ontario）を用いて、赤血球を溶解した。遠心（４００×ｇ、５分間）によって白血球細胞を回収し、洗浄し、ＲＰＭＩ（＋１０％  ＦＢＳ）中に再懸濁し、次いで計数した。４×１０５個の細胞を、９６ウェルディッシュの各々のウェルに分注し、種々の用量のスラミン、および２００μＭのFluor-de-Lys Sirt1（BioMol, Plymouth Meeting, Philadelphia）とともに、インキュベートした。９０分間のインキュベーションの後に、１×Developer II（BioMol, Plymouth Meeting, Philadelphia）および１％のＮＰ４０を補充した、１倍容積のアッセイ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０、１３７ｍＭ  ＮａＣｌ、２．７ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２）を用いて反応を停止させた。図１３に示すように、スラミンは、ホールセルの（whole）白血球細胞において、ＳｉｒＴ１酵素を阻害した。
【０１０３】
例１５：インビボでの、化合物２を用いて処置された動物の白血球細胞におけるＨＤＡＣ活性の時間依存的阻害
ＣＤ−１マウス（各群につき５個体）を、ビヒクル（生理食塩水中、４０：６０の比での、ＰＥＧ４００：０．２Ｎ  ＨＣｌ）または化合物２のいずれかを、９０ｍｇ／ｋｇでの経口投与による、示された期間についての単一用量で用いて、処置した。各々の群の動物についての血液を、同じ時点で採取するように計画し、４℃で一晩保存した。個々の動物由来の白血球細胞を単離した。例１１において記載するように、Boc-Lys (Ac)-AMCを使用して、ＨＤＡＣ酵素アッセイを行った。結果を、図１４に示す。
【０１０４】
例１６：マウスおよびヒトにおける、ＨＤＡＣ阻害剤の血漿濃度
ＣＤ−１マウス（各群につき３〜４個体）を、化合物２の９０ｍｇ／ｋｇでの単一用量で、経口で処置した。血液を、用量後の示された時点で回収した。マウスの血液中の化合物２の血漿濃度を、ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して決定した。API2000質量分析機（Applied Biosystems /MDS Sciex Concord, ON, Canada）と組み合わせたAgilent 1100  ＨＰＬＣシステム（Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA）で、アッセイを行った。ThermoHypersilの、50×2.1 mm、3mの、AQUASIL C18カラム（Thermo Electron, WALTHAM, MA, USA）を使用した。均一溶媒比４５：５５での、移動相Ａ（水および０．１％のギ酸）ならびにＢ（メタノールおよび０．１％のギ酸）を、３００ｍＬ／分の流速で流した。サンプル注入は、５μｌであった。正の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）スキャンモードを利用した。Analyst（登録商標）プログラム（Applied Biosystems /MDS Sciex Concord, ON, Canada）を使用して、データを分析した。マウスの血漿中のタンパク質を沈殿させ、その後、乾燥するまで蒸発させ、０．１％のギ酸水溶液で再構成した。表４に示すように、マウスにおいて、化合物２の血漿蓄積の時間経過は、化合物２によるＨＤＡＣ酵素阻害の時間経過と相関する（図１３において示す）。同様の方法を使用して、医薬品開発業務委託機関における、ＧＬＰ条件下での第１期研究における患者において、化合物６の血漿濃度を検出した（図１９）。
【０１０５】
【表４】
2008532561.tif 000006
【０１０６】
例１７：インビボでの、ホールセルでのＨＤＡＣ活性の用量依存的阻害
ＣＤ−１マウス（各群につき５個体）を、ビヒクル（生理食塩水中、４０：６０の比での、ＰＥＧ４００：０．２Ｎ  ＨＣｌ）、または化合物２、または化合物２の不活性なアナログ（類似の分子量を有する）のいずれかで処置した。化合物を、経口で、示される単一用量で、マウスに投与した。各々の群の動物についての血液を収集し、４℃で一晩保存した。個々の動物由来の白血球細胞を単離した。Boc-Lys (Ac)-AMCを使用して、ＨＤＡＣ酵素アッセイを行った。化合物２は、マウス白血球細胞におけるＨＤＡＣ活性を、用量依存的な様式において阻害したが、化合物２の不活性なアナログは阻害しなかった（図１５ａ）。
【０１０７】
例１８：用量および時間に依存的な、インビボでのヒストンアセチル化の誘導
ＣＤ−１ヌードマウス（各群につき３個体）を、ビヒクル（生理食塩水中、４０：６０の比での、ＰＥＧ４００：０．２Ｎ  ＨＣｌ）または化合物２（６０ｍｇ／ｋｇもしくは９０ｍｇ／ｋｇでの遊離塩基）のいずれかを用いて、経口投与により４時間にわたって処置した。各々の群由来の血液をプールし、白血球細胞を単離した。白血球細胞（少なくとも２×１０７個）を、氷冷溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５ｍＭ  ＫＣｌ、０．５％  ＮＰ−４０、１２ｕＭ  ＤＴＴ、５ｍＭ  酪酸ナトリウム、および新たに調製されたプロテアーゼ阻害剤）中で溶解した。細胞を、氷上で１０分間インキュベートし、IEC Micromax遠心機（Fisher Scientific Ltd., Nepean, Ontario）において、２０００ｒｐｍで１５分間４℃で遠心した。ペレットを、冷たい溶解緩衝液で１回洗浄し、冷たい濃硫酸（最終濃度０．４Ｍ）を細胞ペレットに加え、再懸濁されたペレットを、氷上で、少なくとも１時間インキュベートし、その後、１５０００ｒｐｍで５分間４℃で遠心した。上清を、１５ｍｌのポリプロピレンのＦａｌｃｏｎチューブ（Becton Dickinson Laboratories, Franklin Lakes, New Jersey）に移し、アセトン（１０×上清の容積）を加えた。アセトンを加えた上清を、−２０℃で一晩インキュベートし、２０００ｒｐｍで５分間４℃での遠心によって、ヒストンを回収した。酸抽出したヒストンを、空気乾燥し、水中に再懸濁し、BioRadタンパク質アッセイ（Bio-Rad Laboratories (Canada) Ltd., Mississauga, Ontario）を使用することによって、タンパク質濃度を決定した。
【０１０８】
白血球細胞由来のヒストンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、その後の抗アセチル化Ｈ４ヒストン抗体および抗ヒストンＨ４抗体を使用するウェスタンブロッティングとによって、分析した。各々の群についてのＨ４ヒストンのアセチル化を、ビヒクル処理された群のＨ４ヒストンのアセチル化に対して正規化した。血中の化合物２によるＨＤＡＣ活性の酵素阻害は、そのヒストンアセチル化の誘導と相関した（図１５ｂ）。重要なことに、化合物２が白血球細胞における酵素活性の５０％を阻害し得る用量（６０ｍｇ／ｋｇ）は、インビボで有意な抗腫瘍活性をもたらす用量とほぼ同じであった（図１６）。マウスにおいて、化合物２によるＨＤＡＣの酵素阻害は、その抗腫瘍活性と相関した（以下を参照のこと）。
【０１０９】
例１９：ヌードマウスのＡ４３１ヒト類表皮癌異種移植モデルにおける、化合物２の用量依存的抗腫瘍活性
ヒトＡ４３１腫瘍を有するＣＤ−１ヌードマウス（各群につき８個体）を、生理食塩水のみ、または食塩水中４０：６０の比でのＰＥＧ４００：０．２Ｎ  ＨＣｌ中の化合物２の種々の用量のいずれかを用いて、毎日、経口投与によって処理した。簡単に述べると、Ａ４３１細胞（２００万個）を、動物の側腹部において皮下注射し、固形腫瘍を形成させた。腫瘍フラグメントを、ヌードマウスにおいて、それらの使用の前に最低３回継代した。腫瘍フラグメント（約３０ｍｇ）を、ＣＤ１のメスのヌードマウス（６〜８週齢、Charles River Laboratories, Wilmington, MAより）に、全身麻酔下で、小さい外科切開を通して皮下移植した。腫瘍の大きさが約１００ｍｍ３に達した場合、レシピエント動物を、生理食塩水またはＨＤＡＣ阻害剤を用いて、経口投与によって処置した。腫瘍の容積および動物の総体重を、２週間まで、週２回モニタリングした。各々の実験群は、少なくとも８個体の動物を含んだ。StudentＴ検定を使用して、データセットにおける数値の間の統計学的有意差を分析した。腫瘍の容積を、２週間にわたりモニタリングした。これらの結果を、図１６に示す。
【０１１０】
例２０：健常志願者由来の白血球細胞におけるホールセルＨＤＡＣ活性
３個体の志願者から新たに抽出（draw）されたヒト血液を分析した。単離された白血球細胞（８００，０００個の細胞）におけるＨＤＡＣ活性を、例１１において記載するように、Boc-Lys(AC)-AMCを使用して分析した。志願者番号３由来の白血球細胞を使用して、２回の独立した分析を行い、この方法の処理上の誤差を示した。この処理上の誤差は、非常に小さかった（図１７）。
【０１１１】
例２１：化合物６を用いて処置された患者からの、ホールセルＨＤＡＣ活性およびヒストンアセチル化の時間経過
０時間の時点で、３個体の患者を化合物６（１２ｍｇ／ｍ２）を用いて処置し、処置後の示された時点で、患者から血液サンプルを回収した。単離された白血球細胞（８００，０００個の細胞）のホールセルＨＤＡＣ活性を、例１１において記載するように、Boc-Lys(AC)-AMCを使用して分析した。図１８において、３個体の個々の患者の白血球細胞における、ＨＤＡＣ酵素阻害の時間経過を示す。これらの患者の血液において、化合物６によるＨＤＡＣ酵素阻害は、化合物６の薬物動態と相関していた。これら３個体の患者における化合物６の血漿濃度の時間依存を、図１９に示す。処置後の最初の２４時間で血中における薬物暴露がより著しく蓄積された患者番号００１および患者番号００３は、同じ期間中にはるかに低い程度の薬物暴露を有した患者番号００２よりも、白血球細胞におけるＨＤＡＣ酵素活性のより劇的な低下を示した。本発明者らはさらに、患者由来の白血球における酵素阻害が、化合物６によるヒストンアセチル化の誘導と、著しく相関することを示した。
【０１１２】
図２０において、患者のヒストンアセチル化の誘導の時間依存を分析した。０時間の時点で、患者を、化合物６（１２ｍｇ／ｍ２）を用いて処置し、処置後の示された時点で、患者から血液サンプルを回収した。白血球細胞を単離し、ヒストンを、例１８において示すように抽出した。単離されたヒストンに対してＥＬＩＳＡを使用して、ヒストンＨ３アセチル化を分析した（以下を参照のこと）。インビボで化合物６を用いて処置された患者由来の白血球細胞における、化合物６によるホールセル酵素活性の阻害（図１８）は、ヒストンアセチル化の誘導（図２０）、および化合物６の血漿蓄積（図１９）と、著しく相関していた。
【０１１３】
例２２：精製されたヒストンに対するサンドウィッチＥＬＩＳＡによる、ヒストンアセチル化の検出
（例１８において記載されるように）インビボで化合物６を用いて処置された患者の白血球細胞から単離されたヒストン（６μｇ）を使用して、ヒストンアセチル化を分析した。簡単に述べると、１μｇ／ｍｌでの抗ヒストン（Ｈ１１−４）抗体（Roche, Laval, Quebec）を使用して、黒色プレート（Nunc437111プレート、VWR, Ville Mont-Royal, Quebec）を、２２℃で２時間にわたって被覆した。被覆されたプレートを、ＰＢＳで２回洗浄し、（ＰＢＳ中０．１％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００および１％のウシ血清アルブミン）を用いて、２２℃で４０分間ブロッキングした。一次抗体は、１：５００希釈でのウサギのポリクローナル抗アセチル−Ｈ３（Upstate, Waltham, MA）抗体、または、１：２５００希釈でのウサギのポリクローナル抗Ｈ３抗体（Abcam, Cambridge, MA）のいずれかを、単離されたヒストン（ブロッキング溶液中に６μｇ）とともに使用した。プレートを、一次抗体およびヒストンとともに、２２℃で４５分間インキュベートし、その後ブロッキング溶液（上記を参照のこと）を使用して３回洗浄した。二次抗体は、ブロッキング溶液中１：８０００希釈におけるヤギのポリクローナル抗ウサギＨＲＰ抗体（Sigma, St-Louis, MO）を使用し、２２℃で４５分間インキュベートした。その後、プレートを、ブロッキング緩衝液を用いて２回洗浄し、ＰＢＳを用いて２回洗浄した。５０μＭのAmplex-Red（Invitrogen Canada Inc., Burlington, Ontario）と２００μＭのＨ２Ｏ２を加えることによって、反応を発色させ、３０分間暗所でインキュベートした。蛍光光度計（SpectraMax GeminiXS, Molecular Devices）で、５５０ｎｍの励起波長、および６１０ｎｍの発光波長、ならびに５９０ｎｍのカットオフで、蛍光を読み取った。化合物６を用いて処置された３個体の患者から単離されたヒストンのヒストンアセチル化を、図２０に示す。
【０１１４】
例２３：細胞透過性基質を使用する比色アッセイによって測定される、ヒト癌細胞におけるホールセルＨＤＡＣ活性
ＨＣＴ１１６細胞を、トリプシン処理し、計数した。細胞を、９６ウェルのCostar黒色プレート（E1A/RIA）において、それらの培養培地中に播種し、Biovision（Mountain View, California）製の「比色ＨＤＡＣ活性アッセイキット」を使用して、ホールセルＨＤＡＣ酵素アッセイを行った。ＨＤＡＣ比色基質（Boc-Lys(Ac)-pNA）を、細胞懸濁液中に、３００μＭの最終濃度で添加した。プレートを、９０分間、３７℃で、５％ＣＯ２下でインキュベートした。反応を停止させる前に、４０５ｎＭでのＯＤを読み取ってバックグラウンドを得た。「リジン発色液（Lysine developer）」（キット中）を添加することによって反応を停止させ、プレートを、３７℃で３０分間インキュベートし、その後、SpectraMax 190（Molecular Devices, Sunnylvale, California）で、４０５ｎｍでのＯ．Ｄ．を読み取った。図２１において、本発明者らは、Boc-Lys(Ac)-pNAを基質として使用した場合のホールセルＨＤＡＣ活性を、細胞数の関数として示す。従って、ＨＤＡＣ酵素によって基質からどのような種類の受容体分子が生成されるかに関わりなく、細胞透過性の基質を使用して、ホールセルＨＤＡＣ活性を測定することが出来る。
【０１１５】
例２４：ＨＤＡＣ−１アイソタイプまたはＨＤＡＣ−６アイソタイプを優位に過剰発現する細胞における、ＨＤＡＣ阻害剤のアイソタイプ特異性および効力をモニタリングする
２９３Ｔ細胞に、ヒトＨＤＡＣ−１またはＨＤＡＣ−６をコードするレンチウイルスを感染させた。ピューロマイシンに対して細胞を選択し、抗生物質耐性の集団を得た。細胞を、９６ウェルプレートに播種し、低分子基質（Boc-Lys(Ac)-AMC）とともにインキュベートし、その後、反応を停止させて読み取った。これらの細胞におけるＨＤＡＣ−１またはＨＤＡＣ−６の発現レベルを、免疫ブロッティングによって分析した。図２２ａに示すように、２９３Ｔ細胞におけるＨＤＡＣ−１またはＨＤＡＣ−６の過剰発現は、全体のＨＤＡＣ活性を有意に増大させ、２９３Ｔ細胞におけるＨＤＡＣ−１またはＨＤＡＣ−６の過剰発現を、ウェスタンブロットによって確認した（図２２ｂ）。表５に示すように、本発明者らは、これらの細胞株を使用して、いくつかのＨＤＡＣ阻害剤のアイソタイプ選択性および効力をプロファイルする。インビトロでの酵素選択性と、細胞における選択性との間に、一般的な相関関係が存在する。例えば、化合物２またはＭＳ−２７５は、どちらもインビトロでクラスＩのＨＤＡＣ阻害剤であり、また、ＨＤＡＣ１を過剰発現する細胞においても強力な阻害剤であるが、ＨＤＡＣ−６を過剰発現する細胞においては阻害剤でない。しかし、クラスＩ／ＩＩのＨＤＡＣのpan-阻害剤であるＳＡＨＡは、細胞において、ＨＤＡＣ−１およびＨＤＡＣ−６の両方を阻害することが出来る。本発明者らはまた、インビトロでＨＤＡＣ−６選択性を示す化合物５が、ホールセルにおいてもＨＤＡＣ−６選択性を示すことを例証する。従って、本発明者らは、クラスＩ／ＩＩの酵素に対するpan-基質を使用して、１種類または数種類のＨＤＡＣアイソタイプが豊富に存在する細胞集団において、pan-阻害剤またはアイソタイプ選択的阻害剤の効力およびアイソタイプ特異的阻害活性を分析することが出来た。
【０１１６】
【表５】
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【０１１７】
例２５：体液を使用するデアセチラーゼ活性の評価
ＣＤ−１マウスの血液を、ヘパリン処理試験管に回収し、Coulterカウンター（Beckman Coulter, Ville St.Laurent, Quebec）によって細胞を計数した。１．６×１０６個の白血球細胞を含有する全血の量を一定分割（aliquot）し、容積を、ＲＰＭＩ（＋１０％ＦＢＳ）で２００μｌまで増量（bring up）した。Boc-Ac-Lys-AMCを、３００μＭの最終濃度で添加した。種々の長さの時間（amount of time）の後で、この混合物をスピンし（４００×ｇで５分間）、その上清（血清）のうち５０μｌを、９６ウェルプレートに移した。等量の発色液混合物を添加し、１５分間のインキュベーション後に読み取ることによって（例３において記載するように）、上清中に存在する脱アセチル化産物Boc-Lys-AMCの量を検出した。その結果を、図２３に示す。この知見は、基質Boc-Lys(Ac)-AMCが透過性であり細胞内へ入るのみならず、その脱アセチル化産物であるBoc-Lys-AMCもまた、透過性であり細胞から出てくるという、例１における本発明者らの観察と一致した。従って、初代細胞における全ＨＤＡＣ活性は、動物がＨＤＡＣ基質とエキソビボで接触させられた場合、体液中において容易にモニタリング出来た。
【０１１８】
例１６：体液を使用する、インビボでの、タンパク質デアセチラーゼ活性の評価
ＣＤ−１マウス（各群につき６個体）またはラット（各群につき６個体）を、細胞透過性のpan-基質を１〜１００ｍｇ／ｋｇで用いて、単一の静脈内投与によって処置する。マウス（またはラット）のうち３個体を、次いで、あるタンパク質デアセチラーゼファミリーのpan-阻害剤を用いて処置する。その後の時点で、血液を採取し、血漿を分離し、検出可能なレポーター分子の量について分析する。阻害剤によって処置されたマウス由来の血漿中のレポーター分子の量と、未処置のマウスの血漿中の量とを比較する。
【０１１９】
等価物
当業者は、本明細書において記載される本発明の特定の態様の、多数の等価物を、理解するか、または慣用的な実験のみを用いて確認することができる。かかる等価物は、付随する特許請求の範囲によって、包含されることを意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１】培養２９３Ｔ細胞における細胞内ＨＤＡＣ活性および細胞外ＨＤＡＣ活性を示す。
【図２】代表的な細胞透過性基質に対する検出可能なレポーター分子の生成についてのスキームを示す。
【図３】３種類の基質に対する、組み替えＳｉｒｔ１、Ｓｉｒｔ２、およびＳｉｒｔ３の基質優先度を示す。
【図４】培養ヒト癌細胞および培養正常細胞における細胞数の関数としての、ホールセルＨＤＡＣ活性を示す。
【図５】ヒト癌細胞株におけるＨＤＡＣのホールセル活性に対する、基質濃度の効果を示す。
【図６】ＳＡＨＡ、化合物２、およびＬＡＱ−８２４による、ヒト癌細胞におけるホールセルＨＤＡＣ活性の阻害を示す。
【図７】図７ａは、サーチュイン特異的基質が細胞透過性であること、およびヒト癌細胞におけるサーチュインホールセル活性に対する基質の濃度の効果を示す。図７ｂは、外因性ＮＡＤ＋が、ヒト癌細胞におけるホールセルサーチュイン活性に対して効果を及ぼさないことを示す。
【０１２１】
【図８】スラミンはヒト癌細胞におけるＳｉｒＴ１活性を阻害し得るが、ＴＳＡは阻害し得ないことを示す。
【図９】リスベラトロールが、ヒト癌細胞におけるＳｉｒＴ１活性を活性化し得ることを示す。
【図１０】ヒト白血球細胞の細胞数の関数としてのホールセルＨＤＡＣ活性を示す。
【図１１】ヒト白血球細胞におけるホールセルＨＤＡＣ活性の、ＨＤＡＣ阻害剤（化合物２およびＬＡＱ−８２４）による用量依存的阻害；ならびに、これらのアイソタイプ酵素の阻害活性を示す。
【図１２】ＳｉｒＴ１特異的基質を使用しての、糖尿病マウス由来のマウスの血液中での、ホールセルＳｉｒＴ１活性を示す。
【図１３】サーチュイン阻害剤であるスラミンによる、マウス白血球細胞におけるホールセルＳｉｒＴ１活性の、用量依存的阻害を示す。
【図１４】化合物２を用いて処置されたマウス由来の白血球細胞におけるＨＤＡＣ酵素活性の、時間依存的阻害を示す。
【図１５】化合物２を用いて処置されたマウス由来の白血球細胞における、ホールセルＨＤＡＣ活性およびヒストンアセチル化の、用量依存的阻害を示す。
【０１２２】
【図１６】図１６は、マウスのＡ４３１異種移植モデルにおける、化合物２の用量依存的な抗腫瘍活性を示す。
【図１７】３個体の健常ヒト志願者由来の白血球細胞におけるホールセルＨＤＡＣ活性、およびこのアッセイの処理上の誤差を示す。
【図１８】化合物６を用いて経口で処置された３個体の癌患者由来の、ホールセルＨＤＡＣ活性の時間経過を示す。
【図１９】ＨＤＡＣ阻害剤を用いて経口で処置された３個体の癌患者由来の血液における、化合物６の血漿蓄積の時間経過を示す。
【図２０】化合物６を用いて経口で処置された３個体の癌患者由来の白血球細胞における、ヒストンアセチル化の誘導の時間経過を示す。
【図２１】比色アッセイを使用した、細胞数の関数としての、ＨＣＴ１１６細胞のホールセルＨＤＡＣ活性を示す。
【図２２】ＨＤＡＣ−１またはＨＤＡＣ−６のいずれかを過剰発現する２９３Ｔ細胞におけるホールセルＨＤＡＣ活性、および、これらの細胞における、ＨＤＡＣ−１またはＨＤＡＣ−６の発現レベルを示す。
【図２３】ＨＤＡＣ基質と接触させられたマウス全血から単離された血清由来のＨＤＡＣ活性の検出を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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