(57)【要約】  少なくとも１つの第１の制限エンドヌクレアーゼでゲノムを消化する工程と、少なくとも１つのアダプターを、第１のサブセットの制限フラグメントにライゲーションさせる工程と、第１のプライマーの組合せを使用してアダプターライゲーション制限フラグメントの第１の組を選択的に増幅させる工程であって、第１のプライマーは、プライマー配列の３’末端に第１の選択配列（１〜１０個の選択的ヌクレオチドを含む）を含有する、増幅させる工程と、少なくとも第２のプライマーの組合せを用いてこれらの工程を繰り返す工程であって、プライマーは、異なる第２の選択配列を含有する、繰り返す工程と、増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントのサブセットをそれぞれ断片化する工程であって、それによりシーケンシングライブラリーを生成する、断片化する工程と、フラグメントのヌクレオチド配列を確定する工程と、ライブラリーそれぞれにおけるフラグメントの配列をアラインする工程であって、それによりコンティグを生成する、アラインする工程と、１つの第２の制限エンドヌクレアーゼ及び／又はさらなる制限エンドヌクレアーゼに関してこれらの工程を繰り返す工程と、第２の制限エンドヌクレアーゼ及び／又はさらなる制限エンドヌクレアーゼそれぞれに関して得られるコンティグをアラインする工程であって、それによりゲノムの配列を提供する、アラインする工程とを含む、ゲノム配列を確定する方法。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノム配列を確定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの第１の制限エンドヌクレアーゼで前記ゲノムを消化することにより、該ゲノムの第１のサブセットを提供する工程であって、それにより制限フラグメントを提供する、提供する工程と
（ｂ）少なくとも１つのアダプターを、前記第１のサブセットの制限フラグメントにライゲーションさせる工程であって、それによりアダプターライゲーション制限フラグメントの第１の組を提供する、ライゲーションさせる工程と、
（ｃ）第１のプライマーの組合せを使用して、前記アダプターライゲーション制限フラグメントの第１の組を選択的に増幅させる工程であって、少なくとも第１のプライマーは、該アダプター及び前記制限エンドヌクレアーゼの認識配列の一部に相補的であり、且つ該プライマー配列の３’末端に第１の選択配列をさらに含有するセクションを含有し、該第１の選択配列は、１〜１０個の選択的ヌクレオチドを含み、それにより増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの第１のサブセットを提供する、選択的に増幅させる工程と、
（ｄ）少なくとも第２のプライマーの組合せ及び／又はさらなるプライマーの組合せを用いて前記工程（ｃ）を繰り返す工程であって、該プライマーは、同じ数の選択的ヌクレオチドを含有する、３’末端に異なる第２の選択配列及び／又はさらなる選択配列を含有し、それにより増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの第２のサブセット及び／又はさらなるサブセットを提供する、前記工程（ｃ）を繰り返す工程と、
（ｅ）前記増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの第１のサブセット、第２のサブセット及び／又はさらなるサブセットをそれぞれ断片化する工程であって、それにより第１のシーケンシングライブラリー、第２のシーケンシングライブラリー及び／又はさらなるシーケンシングライブラリーを生成し、続いて任意に該ライブラリーをプールする、断片化する工程と、
（ｆ）前記第１のライブラリー、前記第２のライブラリー及び／又は前記さらなるライブラリーそれぞれに含有される前記フラグメント（の少なくとも一部）のヌクレオチド配列（の少なくとも一部）を確定する工程と、
（ｇ）前記第１のライブラリー、前記第２のライブラリー及び／又は前記さらなるライブラリーそれぞれにおける前記フラグメントの配列をアラインする工程であって、それにより前記ゲノムの散在分画を表す増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメント由来のコンティグを生成する、アラインする工程と、
（ｈ）少なくとも１つの第２の制限エンドヌクレアーゼ及び／又はさらなる制限エンドヌクレアーゼに関して前記工程（ａ）〜前記工程（ｇ）を繰り返す工程と、
（ｉ）前記第２の制限エンドヌクレアーゼ及び／又はさらなる制限エンドヌクレアーゼそれぞれに関して前記工程（ｇ）及び前記工程（ｈ）で得られるコンティグをアラインする工程であって、それにより前記ゲノムの配列を提供する、アラインする工程と
を含むことを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項２】
請求項１に記載のゲノム配列を確定する方法において、前記第１の制限エンドヌクレアーゼ、前記第２の制限エンドヌクレアーゼ及び／又は前記さらなる制限エンドヌクレアーゼの少なくとも１つはレアカッターであることを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項３】
請求項１又は２に記載のゲノム配列を確定する方法において、前記第１の制限エンドヌクレアーゼ、前記第２のエンドヌクレアーゼ及び／又は前記さらなる制限エンドヌクレアーゼの少なくとも１つはフリークエントカッターであることを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、少なくとも２つのレアカッターが使用されることを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、１つのレアカッター及び１つのフリークエントカッターが使用されることを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、前記増幅方法は、ＰＣＲ、好ましくはロングレンジＰＣＲであることを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、前記プライマーの３’末端にある選択配列は、１〜８個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の選択ヌクレオチドを含有することを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、前記第１の選択配列、前記第２の選択配列及び前記さらなる選択配列は、同じ数のヌクレオチドを有するが、前記プライマーの３’末端に位置する前記選択的配列において互いにヌクレオチド配列が異なることを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、シーケンシングは、サンガーダイデオキシシーケンシングにより実施されることを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、シーケンシングは、ビーズのような固体支持体上で実施されることを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、前記シーケンシングは、ハイスループットシーケンシング、好ましくは合成によるシーケンシング(Sequencing-by-Synthesis)に基づくことを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、前記シーケンシングは、合成によるシーケンシング、好ましくはピロシーケンシングに基づくことを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項１３】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、シーケンシングは、
（ｆ１）シーケンシングアダプターを、前記フラグメントにライゲーションさせる工程と、
（ｆ２）シーケンシングアダプターライゲーションフラグメントをビーズへアニーリングさせる工程（各ビーズは、単一のフラグメントとアニーリングする）と、
（ｆ３）油中水型マイクロリアクター中で前記ビーズを乳化させる工程（各油中水型マイクロリアクターは、単一のビーズを含む）と、
（ｆ４）エマルジョンＰＣＲを実施する工程であって、それによりビーズの表面上でアダプターライゲーションフラグメントを増幅させる、エマルジョンＰＣＲを実施する工程と、
（ｆ５）増幅されたアダプターライゲーションフラグメントを含有するビーズを選択／濃縮する工程と、
（ｆ６）ウェル中に前記ビーズを負荷する工程（各ウェルは、単一のビーズを含む）と、
（ｆ７）ピロリン酸シグナルを生成する工程と
を含むことを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、コンティグ構築は、ＢＡＣ末端配列、ＢＡＣショットガン配列、ＥＳＴ配列又は全ゲノムショットガン配列（これらに限定されない）が挙げられる他の供給源に由来するヌクレオチド配列の使用によりさらに助長されることを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のゲノムを確定する方法において、ゲノムサブセットは、制限フラグメントを提供するように制限エンドヌクレアーゼで前記ゲノムを消化すること、続く非選択的増幅により調製されることを特徴とするゲノムを確定する方法。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のゲノム配列を確定する方法において、前記混合物の複雑性を低減させる方法は、インデキシングリンカー、ＣＨＩＰ又は保存モチーフに対するＰＣＲプライマーに基づくことを特徴とするゲノム配列を確定する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学及び遺伝学の分野に関する。本発明は、ハイスループットシーケンシング技術の使用に基づいて、好ましくは複雑な（即ち、大きな）ゲノムの配列を確定するための改善された戦略に関する。
【背景技術】
【０００２】
ドラフトゲノム配列に対する大きなゲノム（１００Ｍｂｐ以上）の全ゲノムショットガン配列のアセンブリは、複雑な問題である。多くの植物及び動物はさらに、多数の反復配列を含有し、それにより問題をさらに複雑にする。この計算問題は、ハイスループットシーケンシング技術の出現により、例えば454 Life Scienceの技術によりさらに拡大する。これらの技術は多くの場合、もはやサンガーダイデオキシシーケンシングに基づかず、固体表面上でより実施しやすい合成によるシーケンシング(sequencing by synthesis)（ピロシーケンシング）に主に基づく。合成によるシーケンシングは、大量の配列を提供するが、サンガーデオキシシーケンシングに関して一般的であるような５００〜１０００ｂｐの比較的長い長さと比較して、比較的短い長さ（約１００ｂｐ）の配列を提供する。
【０００３】
かかる短いフラグメントの不都合な点の１つは、ゲノム配列を確定するためのコンティグのアセンブリに巨大な計算能力を要することであり、現在のシーケンシング方法を比較的高価で且つ時間のかかる探索にしている。したがって、ときには「１０００＄ゲノム」と呼ばれるまでに技術を推進するための、複雑な、即ち大きなゲノムをシーケンシングする、安価で、信頼性が高く且つ迅速な方法、即ち１０００＄以下で複雑なゲノム（特にヒト）の完全配列の確定を可能にする方法が必要とされている。このことは、とりわけオーダーメイド（personalized）医療の発展を可能にする。
【０００４】
【特許文献１】欧州特許第０  ５３４  ８５８号明細書
【特許文献２】国際公開第ＷＯ０３／０１２１１８号パンフレット
【特許文献３】国際公開第ＷＯ００／２４９３９号パンフレット
【特許文献４】米国特許第６，０４５，９９４号明細書
【特許文献５】欧州特許第９７６８３５号明細書
【特許文献６】欧州特許第９７４６７２号明細書
【特許文献７】国際公開特許第ＷＯ０１／８８１８９号パンフレット
【特許文献８】国際公開特許第ＷＯ０３／００４６９０号パンフレット
【特許文献９】国際公開第ＷＯ０３／０５４１４２号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第ＷＯ２００４／０６９８４９号パンフレット
【特許文献１１】国際公開第ＷＯ２００４／０７０００５号パンフレット
【特許文献１２】国際公開第ＷＯ２００４／０７０００７号パンフレット
【特許文献１３】国際公開第ＷＯ２００５／００３３７５号パンフレット
【特許文献１４】国際公開特許第ＷＯ００４４９３７号パンフレット(Keygene N.V)
【非特許文献１】Albert L. Lehninger著「生化学の原理（Principles of Biochemistry）」,793-800(Worth Pub. 1982)
【非特許文献２】インデックスリンク（indexed linking）（Unrau et al.）
【非特許文献３】Unrau et al., 1994, Gene, 145:163-169
【非特許文献４】Vos et al. (1995)著「ＡＦＬＰ：ＤＮＡフィンガープリントのための新しい技法（AFLP: a new technique for DNA fingerprinting）」Nucleic Acids Research, vol. 23, no. 21, 4407-4414．
【非特許文献５】Vos et al. Nucleic Acids Research, 1995, 23, 4407-4414
【非特許文献６】Seo et al. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101:5488-93
【非特許文献７】www.biotagebio.com；www.pyrosequencing.com
【非特許文献８】Smith及びWaterman (1981) Adv. Appl. Math. 2:482
【非特許文献９】Needleman及びWunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443
【非特許文献１０】Pearson及びLipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444
【非特許文献１１】Higgins及びSharp (1988) Gene 73:237-244
【非特許文献１２】Higgins及びsharp (1989) CABIOS 5:151-153
【非特許文献１３】Corpet et al. (1988) Nucl. Acids Res. 16:10881-90
【非特許文献１４】Huang et al. (1992) Computer Appl. in the Biosci. 8:155-65
【非特許文献１５】Pearson et al. (1994) Meth. Mol. Biol. 24:307-31
【非特許文献１６】Altschul et al. (1994) Nature Genet. 6:119-29
【非特許文献１７】The NCBI Basic Local Alignment Search Tool（ＢＬＡＳＴ）（Altschul et al., 1990）
【非特許文献１８】Varshney et al. (2005) Trends in Biotechn. 23(1):48-55
【非特許文献１９】Zabeau & Vos（1993）：「選択的制限フラグメント増幅；ＤＮＡフィンガープリンティングに関する一般的な方法(Selective restriction fragment amplification; a general method for DNA fingerprinting)」
【非特許文献２０】Vos et al (Vos, P., Hogers, R., Bleeker, M., Reijands, M., van de Lee, T., Hornes, M., Frijters, A., Pot, J., Peleman, J., Kuiper, M. et al. (1995)「ＡＦＬＰ：ＤＮＡフィンガープリンティングに関する新たな技法(AFLP: a new technique for DNA fingerprinting)」、 Nucl. Acids Res., 21, 4407-4414)
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
今回、本発明者等は、異なる戦略によりこの問題を解決することができ、ハイスループットシーケンシング技術をゲノムアセンブリで効率的に使用することができることを見出した。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、制限フラグメントの組を生じるように１つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼでゲノムを制限すること、及び次に選択的増幅により制限フラグメントのサブセットを提供することにより、再現性よく且つ相補的な部分でゲノムを分割する技術を用いることを含む。サブセットはシーケンシングされて、コンティグへとアセンブリする。制限エンドヌクレアーゼの１つ又は複数の異なる組に関してこの工程を繰り返すことにより、種々のコンティグが得られる。これらの種々のコンティグを使用して、ドラフトゲノム配列をアセンブリする。本発明は、配列のいかなる知識も必要とせず、いかなるサイズ及び複雑性のゲノムにも適用させることができる。本発明は、ゲノムのいかなる型及びサイズに関しても拡大させることができる。本発明は、所定の任意のゲノムに対するより機敏で信頼性が高く且つ迅速なアクセスを提供し、それによりゲノムの解析の促進を提供する。
【０００７】
定義
以下の説明及び実施例において、多くの用語が使用される。そのような用語に与えられる範囲を含む、明細書及び請求項についての明確で一貫した理解を提供するために、以下の定義が提供される。本明細書において別途定義されない限り、使用される全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献の開示は、参照によりその全体が本明細書において援用される。
【０００８】
核酸：本発明に記載の核酸は、ピリミジン塩基及びプリン塩基の任意のポリマー又はオリゴマー、好ましくはシトシン、チミン及びウラシル、並びにアデニン及びグアニンをそれぞれ含んでもよい（非特許文献1を参照、これは全ての目的のためにその全体が参照により本明細書において援用される)。本発明は、下記の塩基のメチル化された形式、ヒドロキシメチル化された形式又は糖鎖が付加した形式等のような、任意のデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド又はペプチド核酸成分、及びそれら任意の化学的な変異型も検討する。ポリマー又はオリゴマーは、組成物中で不均質又は均質であってもよく、天然に存在するソースから単離するか又は人為的若しくは合成的に生成されてもよい。さらに核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ、又はそれらの混合物であってもよく、恒久的に又は一時的に、ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖、及びハイブリッド状態を含む、一本鎖型又は二本鎖型で存在してもよい。
【０００９】
複雑度の減少：用語「複雑度の減少」は、サンプルのサブセットの生成によって、ゲノムＤＮＡのような核酸サンプルの複雑度を減少させる方法を意味するために使用する。このサブセットはサンプル全体（即ち複雑である）の代表になることができ、好ましくは再現可能なサブセットである。本文脈において、再現可能は、同一の方法を使用して同一のサンプルの複雑度が減少される場合、同じか又は少なくとも同程度のサブセットが得られることを意味する。複雑度の減少のために使用される方法は、当該技術分野において既知である複雑度の減少のための任意の方法であってもよい。複雑度の減少のための方法の例は、例えば、ＡＦＬＰ（登録商標）（Keygene N.V．、オランダ；例えば、特許文献1を参照）、Dongにより記述された方法（例えば、特許文献２、特許文献３を参照）、非特許文献２等を含む。本発明で使用される複雑度の減少方法は、それらが再現可能であることが共通である。同一のサンプルが同一の様式で複雑度が減少される場合に、サンプルの同一のサブセットが得られるという意味における再現性は、顕微解剖、又は選択された組織で転写されたゲノムの一部を表わし、その再現性については、組織の選択、単離時期等へ依存するｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）の使用のような、より無作為な複雑度の減少に対立するものである。
【００１０】
タグ付け：用語「タグ付け」は、核酸サンプルを第２の核酸サンプル又はさらなる核酸サンプルと区別することを可能にするために、核酸サンプルへタグを追加することを指す。タグ付けは、例えば、複雑度の減少の間の配列識別子の追加により、又は当該技術分野において既知である任意の他の手段により行うことができる。そのような配列識別子は、特異的な核酸サンプルの同定のために独自に使用される、例えば一様でないが、定義された長さの特有な塩基配列であり得る。その代表例は、例えばＺＩＰ配列である。そのようなタグを使用して、その後の加工に際して、サンプルの起源を決定することができる。異なる核酸サンプルから生じる加工生成物を組み合わせる場合には、異なる核酸サンプルは異なるタグを使用して同定されるべきである。
【００１１】
タグ付けしたライブラリー：用語「タグ付けしたライブラリー」は、タグを付けた核酸のライブラリーを指す。
【００１２】
シーケンシング：用語「シーケンシング」は、核酸サンプル、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ中のヌクレオチド（塩基配列）の順番を決定することを指す。
【００１３】
アラインすること及びアラインメント：用語「アラインすること」及び「アラインメント」により、同一又は同様のヌクレオチドの、短い又は長い一続きのもの（stretches）の存在に基づいた、２つ以上のヌクレオチド配列の比較を意味する。さらに以下で説明されるように、ヌクレオチド配列のアラインメントのためのいくつかの方法は、当該技術分野において既知である。アセンブリすることを同義語として用いる場合もある。
【００１４】
ハイスループットスクリーニング：ＨＴＳとしばしば略されるハイスループットスクリーニングは、特に生物学分野及び化学分野に関連する、科学的な実験作業のための方法である。最新のロボット工学と他の特殊な研究室ハードウェアとの組合せによって、研究者が効果的に同時に大量のサンプルをスクリーニングすることを可能にする。
【００１５】
制限エンドヌクレアーゼ：制限エンドヌクレアーゼ又は制限酵素は、二本鎖ＤＮＡ分子中の特異的なヌクレオチド配列（標的部位）を認識し、標的部位ごとにＤＮＡ分子の両方の鎖を切断する酵素である。
【００１６】
制限フラグメント：制限エンドヌクレアーゼによる消化により生成されたＤＮＡ分子は制限フラグメントと呼ばれる。任意の所定のゲノム（又はその起源にかかわらず核酸）は、特定の制限エンドヌクレアーゼにより、制限フラグメントの不連続なセットへと消化される。制限エンドヌクレアーゼ切断に由来するＤＮＡフラグメントは、様々な技法の中でさらに使用することができ、例えばゲル電気泳動法により検出することができる。
【００１７】
ゲル電気泳動法：制限フラグメントを検出するために、サイズに基づいて二本鎖ＤＮＡ分子を分画するための分析方法が必要となり得る。そのような分画を達成するために、最も一般に用いられている技法は、（キャピラリー）ゲル電気泳動法である。ＤＮＡフラグメントのそのようなゲル中での移動率は、ＤＮＡフラグメントの分子量に依存する。したがって、フラグメント長が増加するにつれて、移動距離は減少する。ゲル電気泳動法により分画されたＤＮＡフラグメントは、染色手順、例えば、パターンの中に含まれたフラグメント数が十分に少ない場合には、銀染色法又はエチジウムブロマイドを使用する染色により直接可視化することができる。或いは、ＤＮＡフラグメントのさらなる処理では、蛍光色素分子又は放射性標識のような、フラグメントにおいて検出可能な標識を取り込んでもよい。
【００１８】
ライゲーション：２つの二本鎖ＤＮＡ分子を共有結合で共に結合させるリガーゼ酵素により触媒された酵素反応は、ライゲーションと呼ばれる。一般に、両方のＤＮＡ鎖は共有結合で共に結合されるが、鎖の末端の一方の化学的修飾又は酵素的修飾によって、２つの鎖のうちの１つの鎖のライゲーションを防ぐことも可能である。その場合には、共有結合が２つのＤＮＡ鎖のうちの１つのみにおいて起こる。
【００１９】
合成オリゴヌクレオチド：化学的に合成することができる、好ましくは約１０〜約５０の塩基を有する一本鎖ＤＮＡ分子は、合成オリゴヌクレオチドと呼ばれる。関連した配列を有する分子のファミリーを合成することは可能であり、それはヌクレオチド配列中の特異的な位置で異なるヌクレオチド組成を有しているが、一般に、これらの合成ＤＮＡ分子は、特有なヌクレオチド配列又は望ましいヌクレオチド配列を有するように設計される。用語「合成オリゴヌクレオチド」は、設計されたヌクレオチド配列又は望ましいヌクレオチド配列を有するＤＮＡ分子を指すために使用される。
【００２０】
アダプター：限られた数の塩基対、例えば約１０〜約３０の塩基対の長さを有する短い二本鎖ＤＮＡ分子は、制限フラグメントの末端にライゲーションすることができるように設計されている。アダプターは通常、互いに部分的に相補的なヌクレオチド配列を有する２つの合成オリゴヌクレオチドから成る。適切な条件下で溶液中で２つの合成オリゴヌクレオチドを混合した場合、それらはアニーリングして、互いに二本鎖構造を形成する。アニーリング後、アダプター分子の一方の末端は制限フラグメントの末端と適合し、末端でライゲーションすることができるように設計されている。アダプターのもう一方の末端は、ライゲーションできないように設計することができるが、そうである必要はない（二重にライゲーションされたアダプター）。
【００２１】
アダプターライゲーション制限フラグメント：ライゲーションの結果としてアダプターによりキャッピングされた制限フラグメント。
【００２２】
プライマー：一般に、用語「プライマー」は、ＤＮＡの合成をプライミングすることができるＤＮＡ鎖を指す。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーなしではＤＮＡをデノボ合成することができない：アセンブリされるヌクレオチドの順序を指定するために、鋳型として相補的な鎖が用いられるような反応において、ＤＮＡポリメラーゼは既存のＤＮＡ鎖のみを伸長することができる。本発明者等は、プライマーとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）において用いられる合成オリゴヌクレオチド分子を指す。
【００２３】
ＤＮＡの増幅：用語「ＤＮＡの増幅」は、一般的には、ＰＣＲを用いた二本鎖ＤＮＡ分子のｉｎ  ｖｉｔｒｏの合成を示すために用いられる。他の増幅方法が存在し、それらは主旨から外れずに、本発明において用いられてもよいことが留意される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
本発明は、ゲノム配列を確定する方法であって、
（ａ）少なくとも１つの第１の制限エンドヌクレアーゼでゲノムを消化することにより、ゲノムの第１のサブセットを提供する工程であって、それにより制限フラグメントを提供する、提供する工程と、
（ｂ）少なくとも１つのアダプターを、第１のサブセットの制限フラグメントにライゲーションさせる工程であって、それによりアダプターライゲーション制限フラグメントの第１の組を提供する、ライゲーションさせる工程と、
（ｃ）第１のプライマーの組合せを使用して、アダプターライゲーション制限フラグメントの第１の組を選択的に増幅させる工程であって、少なくとも第１のプライマーは、アダプター及び制限エンドヌクレアーゼの認識配列の一部に相補的であり、且つプライマー配列の３’末端に第１の選択配列をさらに含有するセクションを含有し、第１の選択配列は、１〜１０個の選択的ヌクレオチドを含み、それにより増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの第１のサブセットを提供する、選択的に増幅させる工程と、
（ｄ）少なくとも第２のプライマーの組合せ及び／又はさらなるプライマーの組合せ（複数可）を用いて工程（ｃ）を繰り返す工程であって、プライマーは、同じ数の選択的ヌクレオチドを含有する、３’末端に異なる第２の選択配列及び／又はさらなる選択配列を含有し、それにより増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの第２のサブセット及び／又はさらなるサブセットを提供する、工程（ｃ）を繰り返す工程と、
（ｅ）増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの第１のサブセット、第２のサブセット及び／又はさらなるサブセットをそれぞれ断片化する工程であって、それに続いて任意に最適なサイズ範囲内でフラグメントのサイズ選択を行い、それにより第１のシーケンシングライブラリー、第２のシーケンシングライブラリー及び／又はさらなるシーケンシングライブラリーを生成し、続いて任意にライブラリーをプールする、断片化する工程と、
（ｆ）第１のシーケンシングライブラリー、第２のシーケンシングライブラリー及び／又はさらなるシーケンシングライブラリーそれぞれに含有されるフラグメント（の少なくとも一部）のヌクレオチド配列（の少なくとも一部）を確定する工程と、
（ｇ）第１のライブラリー、第２のライブラリー及び／又はさらなるライブラリーそれぞれにおけるフラグメントの配列をアラインする工程であって、それによりゲノムのサブセット（複数可）に由来する増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントのコンティグを生成する、アラインする工程と、
（ｈ）少なくとも１つの第２の制限エンドヌクレアーゼ及び／又はさらなる制限エンドヌクレアーゼに関して工程（ａ）〜工程（ｇ）を繰り返す工程と、
（ｉ）第２の制限エンドヌクレアーゼ及び／又はさらなる制限エンドヌクレアーゼそれぞれに関して工程（ｇ）及び工程（ｈ）で得られるコンティグをアラインする工程であって、それによりゲノムの配列を提供する、アラインする工程と
を含む、ゲノム配列を確定する方法を提供する。
【００２５】
上記方法の工程（ａ）では、関連するゲノムが、１つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼに付される。或る特定の実施形態では、少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼが使用される。特に大きなゲノムを用いる或る特定の実施形態では、３つ以上の制限エンドヌクレアーゼが使用され得る。ゲノムの消化は、ゲノムの第１のサブセットを提供する。制限エンドヌクレアーゼは、フリークエントカッター（即ち、通常４カッター及び５カッター、即ちそれぞれ４個又は５個のヌクレオチドの認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼ）であってもよく、又はレアカッター（即ち、通常６個以上のカッター（７、８…等）、即ちそれぞれ６個以上のヌクレオチドの認識配列を有する制限エンドヌクレアーゼ）であってもよく、或いはそれらの組合せであってもよい。或る特定の実施形態では、レアカッター及びフリークエントカッターの組合せが使用される。或る特定の実施形態では、２つのレアカッターが使用され得る。制限エンドヌクレアーゼは、認識配列の片側及び両側のいずれかの上でそれらの認識配列の外側のＤＮＡを切断する、ＩＩｓ型並びにＩＩｓａ型を含む任意の型であり得る。
【００２６】
上記方法の工程（ｂ）では、少なくとも１つのアダプターが、工程（ａ）で得られる制限フラグメントにライゲーションされる。好ましくは、アダプターは、アダプターのライゲーション時に制限部位が修復されないようなものである。また、例えば２つ以上の制限エンドヌクレアーゼの場合、２つ以上の異なるアダプターを用いることも可能である。このライゲーション工程により、アダプターライゲーション制限フラグメントが生じる。アダプターは、制限エンドヌクレアーゼに応じて、平滑末端であり得るか、又はオーバーハングを含有してもよい。
【００２７】
或る特定の実施形態では、アダプターは、インデキシングリンカーとして既知のアダプターの組であり得る(非特許文献３)。
【００２８】
工程（ｃ）では、アダプターライゲーション制限フラグメントの第１の組は、第１のプライマーの組合せを使用して増幅される。プライマーの組合せは、アダプター（の少なくとも一部）及びゲノムの制限に使用される制限エンドヌクレアーゼの認識配列の一部に相補的であるセクションを含有する少なくとも第１のプライマーを含む。通常、認識配列の一部は、制限エンドヌクレアーゼによる配列の制限後に残存する部分である。その３’末端に、プライマーは第１の選択配列を含有する。第１の選択配列は、１〜１０個のヌクレオチド、好ましくは１〜８個、好ましくは１〜５個、より好ましくは１〜３個の選択ヌクレオチドの予め選択された組を含む。かかるプライマーは、以下の実例的な構造（２個の選択的ヌクレオチド（ＡＣ）に関する）「５’−アダプター特異的領域−制限配列特異的領域−ＡＣ−３’」を有し得る。したがって、この例示的な第１のプライマーは、２個の選択的ヌクレオチドＡＣを含有し、制限フラグメントの配列に由来する第１の２つのヌクレオチドとして相補的なＴＧを含有するアダプターライゲーションフラグメントを増幅するに過ぎない。これは、増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの第１のサブセットを提供する。
【００２９】
第１のプライマーの組合せはまた、それぞれがそれらの３’末端に選択配列を保有する２つの選択的プライマーを含み得る。プライマーは、プーリング戦略を可能にするようにタグ付けすることができる。
【００３０】
増幅は好ましくは、ＰＣＲを使用して実施される。或る特定の実施形態では、ロングレンジＰＣＲの使用が好ましい。
【００３１】
工程（ｄ）では、選択的増幅が、第２のプライマーの組合せ及びさらなるプライマーの組合せを用いて繰り返される。さらなるプライマーの組合せそれぞれにおけるプライマーの少なくとも１つは、その３’末端に異なる選択配列を含有する。選択配列の選択は、選択ヌクレオチドの数を仮定して、選択的ヌクレオチドの全ての考え得る順列が使用されるようなものである。上記例では、このことは、ＡＴ、ＡＧ、ＡＡ、ＣＡ、ＣＴ、ＣＧ、ＣＡ等を意味する。実際に、このことは、ゲノムのサブセット内（即ち、１つ又は複数の制限エンドヌクレアーゼを使用して得られる制限フラグメントの組内）の全てのアダプターライゲーション制限フラグメントが増幅されていることを意味する。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態において、選択的増幅によるゲノムの複雑度の減少は、ＡＦＬＰ（登録商標）（Keygene N.V．、オランダ；例えば、特許文献１及び非特許文献４を参照、これらは参照によってその全体が本明細書において援用される）によって行なわれる。
【００３３】
ＡＦＬＰは選択的制限フラグメント増幅のための方法である。ＡＦＬＰはいかなる事前配列情報も必要なく、任意の出発ＤＮＡで行うことができる。一般にＡＦＬＰは、
（ａ）核酸、特にＤＮＡを１つ又は複数の特異的な制限エンドヌクレアーゼで消化して、対応する一連の制限フラグメントへとＤＮＡを断片化する、消化する工程と、
（ｂ）このように得られた制限フラグメントを、１つの末端が１つ又は両方の制限フラグメントの末端と適合する二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターとライゲーションして、それによりアダプターでライゲーションされた（好ましくは、タグ付けされた）出発ＤＮＡの制限フラグメントを生成する、ライゲーションする工程と、
（ｃ）アダプターでライゲーションされた（好ましくは、タグ付けされた）制限フラグメントを、ハイブリダイズする条件下で、その３’末端で選択的なヌクレオチドを含む１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる工程と、
（ｄ）プライマーとハイブリダイズされた、アダプターでライゲーションされた（好ましくは、タグ付けされた）制限フラグメントを、プライマーがハイブリダイズする出発ＤＮＡの制限フラグメントに沿ってハイブリダイズされたプライマーのさらなる伸長を引き起こすように、ＰＣＲ又は同様の技法によって増幅する工程と、
（ｅ）このように得られた増幅又は伸長したＤＮＡフラグメントを、検出、同定、又は回収する工程と
を含む。
【００３４】
ＡＦＬＰは、このようにアダプターライゲーションフラグメントの再現可能なサブセットを提供する。１つのＡＦＬＰ技術の有用な変形は、非選択的なヌクレオチド（即ち＋０／＋０プライマー）を用い、これはしばしばリンカーＰＣＲと呼ばれる。これは、類似のゲノムに対して非常に適切な複雑度の減少も提供する。
【００３５】
ＡＦＬＰ、その利点、その実施形態、並びに技法、酵素、アダプター、プライマー及びさらなる化合物、及び本明細書で使用した道具のさらなる説明のために、特許文献４、特許文献１（Ｂ）、特許文献５及び特許文献６、特許文献７、及び非特許文献５が言及され、これらはそれら全体が本明細書に援用される。
【００３６】
したがって、本発明の方法の好ましい実施形態において、ゲノムは、
（ａ）少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼにより核酸サンプルを消化して、制限フラグメントへ断片化する、消化すること、
（ｂ）１つ又は両方の制限フラグメントの末端と合うような１つの末端を有する、少なくとも１つの二本鎖合成オリゴヌクレオチドアダプターで得られた制限フラグメントをライゲーションして、アダプターライゲーション制限フラグメントを生成する、ライゲーションすること、
（ｃ）ハイブリダイズする条件下で、上記アダプターライゲーション制限フラグメントを、１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させること、及び
（ｄ）１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの伸長によって、上記適合された制限フラグメントを増幅することにより複雑度が減少され、
（ｅ）ここで１つ又は複数のオリゴヌクレオチドプライマーの少なくとも１つが、上記制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドを含み、アダプターに存在するヌクレオチドの少なくとも一部を含む、上記適合された上記制限フラグメントの末端で鎖の端末部分と同じヌクレオチド配列を有するヌクレオチド配列を含み、ここで任意で、当該プライマーの少なくとも１つは、その３’末端で、当該制限エンドヌクレアーゼのための標的配列の形成に関与するヌクレオチドにすぐに隣接して位置する少なくとも１つのヌクレオチドを含む選択された配列を含む。
【００３７】
ＡＦＬＰは、複雑度の減少のための高度に再現可能な方法であり、したがって本発明に記載の方法に対して特に適している。
【００３８】
これまでシーケンシング技術の分野において、全ゲノムの、特に複雑なゲノムでの配列確定におけるこの選択的増幅の使用は、開示も示唆もされていない。ＡＦＬＰ技術は、フィンガープリンティング技術として当該技術分野で既知であるが、複雑なゲノムのシーケンシングを助長するための解決策としてはいまだ確認されてはいない。特に、所定数の選択的ヌクレオチドに関してヌクレオチドの順列の全て又は大部分を網羅するプライマーの組合せの組（例えば、２個の選択的ヌクレオチドの場合１６個のプライマーの組合せ）は、シーケンシングされ得るゲノムの相補的且つ再現性よいサブセットを提供する。或る特定の実施形態では、複雑性低減に使用されるプライマーは、１つ又は複数のチオエート結合を含有して、それらの選択性及び／又は性能を増大させる。
【００３９】
或る特定の代替的な実施形態では、複雑性低減は、ＣＨＩＰ法を含む。複雑性低減に関する他の適切な方法は、クロマチン免疫沈降（ＣｈｉＰ）である。このことは、核ＤＮＡが単離される一方で、転写因子のようなタンパク質がＤＮＡにライゲーションされることを意味する。ＣｈｉＰにより、最初にタンパク質に対する抗体が使用されて、Ａｂ−タンパク質−ＤＮＡ複合体を生じる。この複合体を精製して、それを沈降させることにより、このタンパク質が結合するＤＮＡが選択される。次に、ＤＮＡは、ライブラリー構築及びシーケンシングに使用することができる。即ち、これは、特異的な機能的領域、本実施例では特異的な転写因子に対して非ランダム様式で複雑性低減を実施するための方法である。代替的な実施形態は、ＳＳＲ、ＮＢＳ領域（ヌクレオチド結合領域）、プロモーター／エンハンサー配列、テロメアコンセンサス配列、ＭＡＤＳボックス遺伝子、ＡＴＰアーゼ遺伝子ファミリー及び他の遺伝子ファミリーのような保存モチーフに対するＰＣＲプライマーの設計を使用し得る。
【００４０】
工程（ｅ）では、第１のシーケンシングライブラリー、第２のシーケンシングライブラリー及びさらなるシーケンシングライブラリーは、増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの各サブセットに関して生成される。ライブラリーは通常、増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの断片化により生成される。断片化は、物理的な技法、即ちせん断、超音波処理又は他のランダム断片化方法により達成され得る。工程（ｆ）では、ライブラリーに含有されるフラグメントの少なくとも一部（但し、好ましくは全てのフラグメント）のヌクレオチド配列の少なくとも一部（但し、好ましくは完全ヌクレオチド配列）が確定される。
【００４１】
シーケンシングは、ダイデオキシ連鎖停止法のような、当該技術分野において既知である任意の手段によって、原則としては行われてもよい。しかしながら、シーケンシングは、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２及び特許文献１３（非特許文献６に（全て454 Life Sciencesの名で）開示された方法のようなハイスループットシーケンシング法、及びHelios、Solexa、US Genomics等の技術（これらは参照により本明細書において援用される）を用いて行なわれることが好ましい。シーケンシングは、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、及び特許文献１３に（全て454 Life Sciencesの名で）開示された装置及び／又は方法を用いて行なわれることが最も好ましく、それらは参照により本明細書において援用される。記述された技術は、一回の実行において４０００万塩基のシーケンシングを可能にし、競合技術よりも１００倍速く、より安価である。シーケンシング技術は、１）ＤＮＡの切断化及び一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）のライブラリーを形成するための特異的なアダプターのライゲーションと、２）ビーズに対するｓｓＤＮＡのアニーリング、油中水型マイクロリアクター中のビーズの乳化、及びビーズ上に個々のｓｓＤＮＡ分子を増幅させるための乳化ＰＣＲの実施と、３）ビーズ表面上に増幅したｓｓＤＮＡ分子を含むビーズに対する濃縮の選択と、４）ピコタイタープレート（登録商標）におけるＤＮＡを伴うビーズの沈着と、５）ピロリン酸光シグナルの生成による１００，０００ウェルの同時シーケンシングとのおおまかには５つの工程から成る。この方法はより詳細に以下で説明されるだろう。
【００４２】
好ましい実施形態において、シーケンシングは、
（ａ）各々のビーズが単一の適合されたフラグメントとアニーリングされるビーズに適合されたフラグメントをアニーリングする工程と、
（ｂ）各々の油中水型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水型マイクロリアクター中のビーズを乳化する工程と、
（ｃ）各々のウェルが単一のビーズを含む、ウェル中にビーズを充填すると共にピロリン酸シグナルを生成する工程と
を含む。
【００４３】
第１の工程（ａ）において、シーケンシングアダプターは、組合せライブラリー中のフラグメントにライゲーションされる。当該シーケンシングアダプターは、少なくとも、ビーズへのアニーリングのための「キー」領域、シーケンシングプライマー領域、及びＰＣＲプライマー領域を含む。それにより、適合されたフラグメントが得られる。
【００４４】
第１の工程において、適合されたフラグメントは、各々のビーズが単一の適合されたフラグメントにアニーリングする、ビーズにアニーリングされる。大多数のビーズについて、１つのビーズ当たり１つの単一の適合されたフラグメントのアニーリングを保証するように、適合されたフラグメントのプールに、ビーズが過剰に加えられる（ポアソン分布）。
【００４５】
次の工程において、各々の油中水型マイクロリアクターが単一のビーズを含む、油中水型マイクロリアクターでビーズが乳化される。ＰＣＲ試薬は、ＰＣＲ反応がマイクロリアクター中で起こることを可能にする油中水型マイクロリアクターに存在する。続いて、マイクロリアクターは破壊され、ＤＮＡを含むビーズ（ＤＮＡ陽性ビーズ）が濃縮される。
【００４６】
続く工程において、各々のウェルが単一のビーズを含む、ウェルにビーズが充填される。ウェルは、好ましくは、大量のフラグメントの同時シーケンシングを可能にするピコタイタープレート（商標）プレートの一部である。
【００４７】
酵素を伴うビーズの付加後、フラグメントの配列はピロシーケンシングを用いて決定される。引き続いての工程において、ピコタイター（商標）プレート及びビーズは、その中の酵素ビーズと同様に、従来のシーケンシング試薬の存在下で異なるデオキシリボヌクレオチドに曝され、デオキシリボヌクレオチドの取り込みの際、記録される光シグナルが生成される。正確なヌクレオチドの取り込みにより、検出可能なピロシーケンシングシグナルが生成される。
【００４８】
ピロシーケンシング自体は、当該技術分野において既知であり、とりわけ、非特許文献７のtechnologyセクションで記述される。技術は、例えば、特許文献８、特許文献９、特許文献１０、特許文献１１、特許文献１２、及び特許文献１３で（全て454 Life Sciencesの名で）、さらに適用され、それらは本明細書において参照により援用される。
【００４９】
本発明の方法の工程（ｇ）では、第１のライブラリー、第２のライブラリー及び／又はさらなるライブラリーのフラグメントの確定された配列がアラインされる。アラインメントは、増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントのサブセットにおけるフラグメントのコンティグを提供する。このようにして、各増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントに関して、コンティグは、シーケンシングされたフラグメントから生成され、即ち、１つの増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントのコンティグは、工程（ｅ）における断片化から得られる様々なフラグメントの配列のアラインメントから構築される。ゲノムのごく一部の散在する制限フラグメントを表す配列からコンティグを構築することにより、大量の反復配列に起因するコンティグ構築に関する問題は大いに低減されて、反復配列の偽結合に起因した誤差をあまり含有しない、より高品質のドラフトゲノム配列を導く。さらに、アセンブリプロセスは、計算上あまり複雑でなく、したがってより迅速に実施される。異なるライブラリーにおける配列をアラインすることにより、制限フラグメントの組の各制限フラグメントに関するコンティグは、各プライマーの組合せに関して構築され得る。このことは、それぞれが特定の制限フラグメントに対応するコンティグの組をもたらす。結果として、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼによるゲノムの制限から得られる各制限フラグメントはここで、確定された（コンティグ）配列を有する。本発明の方法を図１及び図２に示す。
【００５０】
比較目的のための配列のアラインメントの方法は、当該技術分野において既知である。様々なプログラム及びアラインメントアルゴリズムは、非特許文献８;非特許文献９;非特許文献１１;非特許文献１２;非特許文献１３; 非特許文献１４;及び非特許文献１５において記述され、これらは本明細書において参照により援用される。非特許文献１６（本明細書において参照により援用される）は、配列アラインメントの方法及び相同性の計算について詳細な考察を提供する。
【００５１】
ＮＣＢＩの基本的局所アラインメント検索ツール（非特許文献１７）は、配列解析プログラムのｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、及びｔｂｌａｓｔｘに関連する使用について、国立生体情報センター（National Center for Biological Information）（ＮＣＢＩ、メリーランド州ベテスダ）及びインターネット上を含むいくつかのソースから利用可能である。それは＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/＞でアクセスすることができる。このプログラムを用いて、配列同一性を決定する方法の説明は、＜http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html＞で利用可能である。さらなる適用は、マイクロサテライトの抽出において可能である（非特許文献１８を参照）。
【００５２】
一般的には、アダプター／プライマー及び／又は識別子に関して調整されている（trimmed）配列データに対してアラインメントが行われるが、制限酵素認識配列が再構築される（即ち、核酸に由来するフラグメントからの配列データのみを使用する）。一般的に、得られた配列データは、フラグメントの起源（即ち、どのサンプル由来であるか）を同定するのに使用され、アダプター及び／又は識別子に由来する配列がデータから取り除かれ、アラインメントがこの調節セットに対して行なわれる。
【００５３】
工程（ｈ）では、手順全体を、少なくとも１回、１つ又は複数の異なる制限エンドヌクレアーゼ、即ち好ましくは第１のエンドヌクレアーゼと異なる認識部位を含有する制限エンドヌクレアーゼを用いて繰り返して、続いてアダプターライゲーションされて、独立して選択される選択配列、即ち上記選択配列、つまり（ヌクレオチドの数又は型のいずれかにおいて）第１の制限エンドヌクレアーゼと同じ目的に使用されている配列と関係を持たない選択配列を有するプライマーの組合せを使用して選択的に増幅される制限フラグメントの第２の組又はさらにさらなる組を提供する。例えば、第１のサブセットは、ＭｓｅＩ／ＰｓｔＩによる制限により得ることができ、認識部位のＭｓｅＩ残部に関し、且つその３’末端に２個の選択的ヌクレオチドを保有する選択的プライマーを使用して選択的に増幅させることができる。第２のサブセットは、ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ消化及び１個の選択的ヌクレオチドを有する認識部位のＥｃｏＲＩ残部に関する選択的プライマーを用いた選択的増幅により得ることができる。
【００５４】
したがって、全ての制限フラグメントに関するコンティグの第２の（及び／又はさらなる）組は、このようにして本明細書中で先に開示するのと類似した様式で得ることができる。所定の制限エンドヌクレアーゼに関して、シーケンシングされるゲノムの分画が相補的であること、それらが重複しないことが必要である。異なる酵素の組合せを用いて得られるコンティグは重複せず、したがってそこからのコンティグの生成を可能にし、それにより（ドラフト）ゲノム配列の形成を可能にする。
【００５５】
上記方法の工程（ｉ）では、各フラグメントに関して上記方法の先の工程から得られるコンティグをアラインして、ゲノムの配列を形成する。
【００５６】
或る特定の実施形態では、制限フラグメント又はゲノム配列のいずれかのコンティグ構築は、ＢＡＣ末端配列、ＢＡＣショットガン配列、ＥＳＴ配列又は全ゲノムショットガン配列が挙げられる（これらに限定されない）他の供給源に由来するゲノムのヌクレオチド配列の使用により助長され得る。
【００５７】
本発明の方法は、ＤＮＡの供給源とは無関係であり、即ち、本発明の方法はいかなる以前の配列情報を必要としないため、全ての生物に適用可能である。酵素、アダプター、プライマー及び選択的ヌクレオチドの数の適切な選択により、ゲノムの全てのサイズ及び複雑性に適用可能である拡張可能な技術が提示される。さらに、異なるプライマーの組合せを用いて、及び／又は３’末端にある特異的な選択的ヌクレオチド配列が互いに異なる選択的プライマーを用いて得られるゲノム分画は相補的である。このことは、任意の所定数の選択的ヌクレオチドに関して、全ての順列が使用される（１個の選択的ヌクレオチド＝４個の変形体（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）、２個の選択的ヌクレオチド＝１６個の変形、３個の選択的ヌクレオチド＝６４個の変形等）場合、組み合わせた制限フラグメントは、制限されたゲノムを構成することを意味する。
【００５８】
本発明は以下の実施例を用いて説明することができるが、以下の実施例は、いかなる場合においても本発明を限定するものと意図されず、単に例示として有用である。
【００５９】
ロングレンジＰＣＲを使用した全ゲノムシーケンシング。
【００６０】
工程１：ＤＮＡを、２つの６カッターＡ及びＢ（例えば、ＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ）を使用して制限する。これにより、対象のゲノムのＧＣ含有量及び制限エンドヌクレアーゼの選択に応じて、約３〜４ｋｂの平均長を有する３つの型の制限フラグメント：Ａ−Ａ（２５％）、Ｂ−Ｂ（２５％）及びＡ−Ｂ（５０％）が生成される。アダプターのライゲーション後、プライマーの組合せ１つ当たり１Ｍｂの配列へと、＋Ｘ／＋Ｙプライマー（即ち、プライマーの一方がＸ選択的ヌクレオチドを含有し、他方がＹ選択的ヌクレオチドを含有する）を用いてロングレンジＰＣＲを実施する。Ｘ＝２及びＹ＝３である場合、１０２４個のプライマーの組合せ全てに関してこれを繰り返す。Ｘ＝１及びＹ＝２である場合、６４個のプライマーの組合せ全てに関してこれを繰り返す。
【００６１】
Ａ：ゲノムサイズが２７００Ｍｂｐのトウモロコシ：Ａ−Ｂ型フラグメント＝１３５０Ｍｂｐ。＋２／＋３選択的増幅（１０２４個のプライマーの組合せ）により、各プライマーの組合せの増幅生成物は、平均して１３５０／１０２４＝１．３２Ｍｂｐの配列を含有する。約３０００ｂｐのＡ−Ｂフラグメント１つ当たりの平均長を用いると、これにより１３２００００／３０００＝４４０のＡ−Ｂフラグメントが生じる。
【００６２】
Ｂ：１３０Ｍｂｐのシロイヌナズナ：Ａ−Ｂ型フラグメント＝６５Ｍｂｐ。Ｘ＝１及びＹ＝２を用いると、あらゆるプライマーの組合せ（ＰＣ）は、約１Ｍｂｐの配列を含有する。フラグメント１つ当たり３０００ｂｐの平均長を用いると、これは、１００００００／３０００＝３３０のＡ−Ｂフラグメントである。
【００６３】
工程２：各プライマーの組合せに関する、増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの各組のせん断及び本明細書中で他の箇所に記載するような454 Technologiesのピロシーケンシングと併用したエマルジョンＰＣＲを使用したシーケンシングによるライブラリーの構築（１０２４回又は６４回）。この技術を使用したシーケンシングは、ライブラリー１つ当たり４０Ｍｂｐの配列データを提供し、あらゆるライブラリーが４０倍冗長的にシーケンシングされることを意味する。ヌクレオチドの数の変動により、種々の量のＡ−Ｂフラグメントが増幅されて、種々の冗長性が達成される。これは、実際に確定することができる。
【００６４】
工程３：（ＰＣ１つ当たりの）配列ライブラリー１つ当たりの配列のアセンブリ
アセンブリを実施して、ＰＣ１つにつき増幅された全てのＡ−Ｂフラグメントのコンティグを生成する。このことは、ＰＣ１つ当たり約３００〜５００個のコンティグを導き、その平均長はＡ−Ｂフラグメントの平均長に相当する。全てのＰＣのシーケンシングは、数万から最大数十万に及ぶ多数のコンティグを生じる（シロイヌナズナ２１０００、トウモロコシ４５００００）。
【００６５】
工程４：少なくとも１つの他の酵素の組合せ（ＥＣ）（例えば、Ａ−Ｃ）に関して工程１〜工程３を繰り返す。ＥＣ  Ａ−Ｂ由来の全てのＰＣは相補的なコンティグを提供するに過ぎず、重複するコンティグを提供せず、これはゲノムのほんの５０％を網羅するため、このことが必須である。ゲノムの対象範囲は、同様に全てのＡ−Ａ及びＢ−Ｂフラグメントをプロセシングすることにより高めることができる。さらなるＥＣを使用することにより、ＡＢのコンティグとＡＣのコンティグとの間で重複が達成され、ゲノムの対象範囲が増大する。
【００６６】
工程５：（ドラフト）ゲノム配列に対してＡ−Ｂ（任意に、同様にＡ−Ａ、Ｂ−Ｂ）及びＡ−Ｃのプライマーの組合せの全てのコンティグをアセンブリする。
【００６７】
この方法の利点の１つは、ゲノムアセンブリの問題の１つである反復配列の多岐にわたる存在に起因する誤ったコンティグの形成の可能性は、全ゲノムに代わってゲノムの１〜５Ｍｂｐ分画内の１〜１０ｋｂの小さな散在（即ち、非隣接）コンティグの形成により最低限に抑えられる。はるかに大きな長さを有するコンティグは、偽結合の生成物であるとして初期段階に標識することができ、廃棄することができる。さらなる利点は、初期アセンブリ（工程３）で、ゲノム配列全体が１つの工程でアセンブリされる場合よりも小さな配列が包含されるため、アセンブリが計算上あまり複雑でないことである。さらなる利点は、選択的増幅プロセスがプロセス全体を任意のサイズのゲノムに拡張可能にし、選択的増幅プロセスが普遍的に適用可能であることである。
【００６８】
１つのレアカッター及び１つのフリークエントカッターを使用した全ゲノムシーケンシング
工程１：上記の通り、但し６カッター（ＥｃｏＲＩ）及び４カッター（ＭｓｅＩ）を用いる。平均フラグメント長は約２５０ｂｐである。Ａ−Ｂフラグメントは、ゲノムの約８〜１５％に相当する。２つの６カッター制限酵素を使用した制限酵素消化と比較して、約１〜５ＭｂｐのＰＣ１つ当たりの配列複雑性の量に達するのにより小さな平均約１個の選択的ヌクレオチドが必要とされる。
【００６９】
Ａ：ゲノムサイズが２７００Ｍｂｐのトウモロコシ：Ａ−Ｂ型フラグメント＝２７０Ｍｂｐ（１０％）。＋２／＋２選択的増幅（２５６個のプライマーの組合せ）により、各プライマーの組合せの増幅生成物は平均して２７０／２５６＝１．０５Ｍｂｐの配列を含有する。約２５０ｂｐのＡ−Ｂフラグメント１つ当たりの平均長を用いると、これにより１０５００００／２５０＝４２００のＡ−Ｂフラグメント／コンティグが生じる。
【００７０】
Ｂ：１３０Ｍｂｐのシロイヌナズナ：Ａ−Ｂ型フラグメント＝１３Ｍｂｐ（１０％）。Ｘ＝１及びＹ＝２を用いると、あらゆるプライマーの組合せ（ＰＣ）は、約１Ｍｂｐの配列を含有する。フラグメント１つ当たり２５０ｂｐの平均長を用いると、これは、１００００００／３０００＝４０００のＡ−Ｂフラグメントである。
【００７１】
工程２：上記の通り。短すぎるフラグメントへの傾向を回避するために、サイズ選択を使用して、１００〜１５０ｂｐ未満のフラグメントを除去することができる。
【００７２】
工程３：（ＰＣ１つ当たりの）配列ライブラリー１つ当たりの配列のアセンブリ
アセンブリを実施して、ＰＣ１つにつき増幅された全てのＡ−Ｂフラグメントのコンティグを生成する。このことは、ＰＣ１つ当たりの数千個のコンティグを導き、その平均長はＡ−Ｂフラグメントの長さ（２５０ｂｐ）に相当する。全てのＰＣのシーケンシングは、数万から最大約百万に及ぶ多数のコンティグを生じる（シロイヌナズナ６４０００、トウモロコシ１００００００）。
【００７３】
工程４：様々なＥＣ（Ａ−Ｃ、Ｂ−Ｃ、Ｃ−Ｃ、Ｃ−Ｄ、Ａ−Ｄ等）を用いて工程１〜工程３を繰り返す。酵素の組合せＡ−ＢのＰＣはゲノムの８〜１５％以下しか網羅せず、上記の通り、ＰＣのコンティグは重複しないため、このことが必要である。
【００７４】
工程５：上記の通り。
【００７５】
１つの制限エンドヌクレアーゼを使用した全ゲノムシーケンシング
工程１：１つの制限エンドヌクレアーゼＡ（例えば、ＥｃｏＲＩ）を使用してＤＮＡを消化する。ＧＣ含有量及び酵素の選択に応じて、約３〜４ｋｂの制限フラグメント。混合物にアダプターをライゲーションさせて、ＰＣ１つ当たりの配列の量を約１Ｍｂに低減させる選択的プライマーを用いたロングレンジＰＣＲ（上記を参照）を実施する。Ｘ＝２及びＹ＝３である場合、１０２４個のＰＣ全てに関して繰り返す。（Ｘ，Ｙ）＝（＋１／＋２）に関しては、６４個のＰＣ全てに関して繰り返す。
【００７６】
Ａ：ゲノムサイズが２７００Ｍｂｐのトウモロコシ：Ａ−Ａ型フラグメント＝２７００Ｍｂｐ。＋２／＋３選択的増幅（１０２４個のプライマーの組合せ）により、各プライマーの組合せの増幅生成物は、平均して２７００／１０２４＝２．６４Ｍｂの配列を含有する。約３０００ｂｐのＡ−Ａフラグメント１つ当たりの平均長を用いると、これにより２６４００００／３００＝８８０のＡ−Ａフラグメント／コンティグが生じる。
【００７７】
Ｂ：１３０Ｍｂｐのシロイヌナズナ：Ａ−Ａ型フラグメント＝１３０Ｍｂ。Ｘ＝１及びＹ＝２を用いると、あらゆるプライマーの組合せ（ＰＣ）は、約２Ｍｂｐの配列を含有する。フラグメント１つ当たり３０００ｂｐの平均長を用いると、これは、２００００００／３０００＝６６０のＡ−Ａフラグメントである。
【００７８】
工程２：各プライマーの組合せに関する、増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの各組のせん断及び本明細書中で他の箇所に記載するような454 Technologiesのピロシーケンシングと併用したエマルジョンＰＣＲを使用したシーケンシングによるライブラリーの構築（１０２４回又は６４回）。この技術を使用したシーケンシングは、ライブラリー１つ当たり４０Ｍｂｐの配列データを提供し、あらゆるライブラリーが２０倍冗長的にシーケンシングされることを意味する。
【００７９】
工程３：（ＰＣ１つ当たりの）配列ライブラリー１つ当たりの配列のアセンブリ
アセンブリを実施して、ＰＣ１つにつき増幅された全てのＡ−Ａフラグメントのコンティグを生成する。このことは理論上、ＰＣ１つ当たり６００〜９００個のコンティグを導き、その平均長はＡ−Ａフラグメントの長さ（３０００ｂｐ）に相当する。全てのＰＣのシーケンシングは、数万から最大約数十万に及ぶ多数のコンティグを生じる（シロイヌナズナ４２０００、トウモロコシ９０００００）。
【００８０】
工程４：少なくとも１つの他のＥＣ（Ｂ−Ｂ）に関して工程１〜工程３を繰り返す。酵素の組合せＡ−ＢのＰＣはゲノムの８〜１５％以下しか網羅せず、上記の通り、ＰＣのコンティグは重複しないため、このことが必要である。
【００８１】
工程５：上記の通り。
【実施例１】
【００８２】
この実施例は、複雑な植物ゲノムのゲノム配列を確定するために、２個の制限酵素の組合せに由来するＡＦＬＰフラグメントのハイスループットシーケンシングを使用することができることを記載する。
【００８３】
以下の工程がこの実施例で行われた：
Ａ）特許文献１４＝国際公開特許第ＷＯ００４４９３７号(Keygene N.V)に記載されるソフトウェアツールＲＥＣＯＭＢを使用したシロイヌナズナゲノム配列(Genbank)のＡＦＬＰ制限フラグメントのコンピュータ内での予測
シロイヌナズナゲノム（生態型コロンビア）のゲノム配列全体をGenbankからダウンロードした。それぞれ＋Ｃ及び＋Ｇ選択的ヌクレオチドを使用した制限酵素の組合せＢａｍＨＩ／ＸｂａＩに関するコンピュータ内でのＡＦＬＰ  ＋１／＋１フラグメントを、ＲＥＣＯＭＢを使用して予測した。同様に、選択的ヌクレオチド＋Ｃ及び＋ＣＴを使用した制限酵素の組合せＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩに関するＡＦＬＰ  ＋１／＋２フラグメントを予測した。２つのコンピュータ内での消化物に由来するＡＦＬＰフラグメントの回収は、酵素の組合せＢａｍＨＩ／ＸｂａＩとＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩとの間に様々な（およそ１４個の）重複するＡＦＬＰフラグメント配列を生じた。重複する制限フラグメントの１つは、コンティグ「６０６」で表示されるコンティグを形成し、これは、全長６６２ｂｐを有する。このコンティグの配列を図３に示す。
【００８４】
このコンティグにおける予測ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＡＦＬＰ  ＋Ｃ／＋ＣＴフラグメントは、２１８ｂｐ長であり、全コンティグ長６０６ｂｐの３２．９％を占める。予測ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ  ＡＦＬＰ  ＋Ｃ／＋Ｇフラグメントは、４８６ｂｐ長であり、全コンティグ長の７３．４％に等しい。両方のフラグメントは、図３で表されるように４２塩基対分重複する。
【００８５】
Ｂ）ＡＦＬＰ鋳型調製及び増幅
シロイヌナズナ（生態型コロンビア）のゲノムＤＮＡ、並びに制限酵素の組合せＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ／ＸｂａＩに関するＡＦＬＰ鋳型は、非特許文献１９、特許文献１（Ａ１、Ｂ１）；特許文献４、及び非特許文献２０に記載されるプロトコルに基づいて調製した。
【００８６】
以下のアダプター配列（５’−３’）を使用した：
【００８７】
【化１】
2008546405.tif 000002
【００８８】
選択的（＋１／＋１）増幅（Ｅ／Ｈ及びＢ／Ｘ）は、以下のホスホロチオエートプライマー（５’−３’）を使用して実施した：
【００８９】
【化２】
2008546405.tif 000003
【００９０】
「ｓ」により、オリゴヌクレオチド上のホスホロチオエート結合の位置を示している。
【００９１】
ＡＦＬＰ反応混合物は、以下の組成物を有していた：
ＭＱ中で１／１０に希釈したＡＦＬＰ鋳型  ５μｌ
５×ｈｅｒｃｕｌａｓｅ  ＩＩ  ＰＣＲ緩衝液  １０μｌ
ｄＮＴＰ（２０ｍＭ）  ０．５μｌ
ＡＦＬＰプライマー１（５０ｎｇ／μｌ）  １．５μｌ
ＡＦＬＰプライマー２（５０ｎｇ／μｌ）  １．５μｌ
Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（登録商標）ＩＩ融合ＤＮＡ−ポリメラーゼ  １μｌ
ＭＱ  ３０．５μｌ
ＰＣＲサイクリング条件は以下の通りであった：
初期変性          ９４℃  ２分
変性              ９４℃  １０秒
アニーリング      ５６℃  ３０秒      １０サイクル
伸長              ６８℃  ２分
変性              ９４℃  １５秒
アニーリング      ５６℃  ３０秒      ２０サイクル
伸長              ６８℃  ２分＊
＊変更：１サイクル当たり２０秒
ＡＦＬＰ増幅後、製造業者のプロトコルに従って、Ｑｉａｇｅｎカラムを使用して反応生成物を精製した。
【００９２】
Ｃ）４５４配列ライブラリー調製
２つの４５４配列ライブラリーは、精製されたＡＦＬＰ反応生成物のネブライゼーション(nebulization)（断片化）を始めとして、Margulies及び共同研究者等により記載されるように、それぞれ出発ＤＮＡとして精製されたＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ  ＡＦＬＰフラグメント及びＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＡＦＬＰフラグメントを使用して調製された。ＧＳ２０シーケンシング機器(Roche Molecular Diagnostics)を使用して、ＧＳ２０  ピコタイタープレートの半分に、２つのＡＦＬＰ酵素の組合せのフラグメントライブラリーそれぞれを適用させて、単一の４５４配列解析（run）を実施した。
【００９３】
Ｄ）データプロセシング
配列解析の完了後、ＧＳ２０のＲＵＮＡＳＳＥＭＢＬＹソフトウェアを使用して、生データをプロセシングした。ＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ  ＡＦＬＰフラグメントライブラリーに由来するデータは、個々に及び組み合わせてプロセシングされて、重複する配列読取のコンティグを生成した。
【００９４】
次に、コンティグ６０６に含有されるコンピュータ内での予測ＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ  ＋Ｃ／＋Ｇ及びＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＋Ｃ／＋ＣＴ  ＡＦＬＰフラグメントがどの程度シーケンシングされたかを確認するために、ＲＵＮＭＡＰＰＩＮＧを使用して、ＲＵＮＡＳＳＥＭＢＬＹから生じるコンティグを上記参照ゲノム（工程ａで予測されるコンティグ６０６）に対してマッピングした。各々のライブラリーから得られる網羅のパーセントを以下の表に示す。
【００９５】
【表１】
2008546405.tif 000004
【００９６】
得られる配列コンティグを図４に示す。
【００９７】
これらの結果は、複数のＡＦＬＰ制限酵素の組合せを用いて総ゲノムＤＮＡを消化すること、続くフラグメントライブラリー１つ当たりのコンティグアセンブリ及びその後の植物ゲノム配列へのコンティグのアセンブリにより、複雑な植物ゲノムのゲノム配列を確定するための実現可能性を実証している。
【図面の簡単な説明】
【００９８】
【図１】ゲノムＤＮＡから出発して、制限エンドヌクレアーゼの組合せ（酵素の組合せ１、ＥＣ１）による消化が実施されて、制限フラグメントの組を生じることを示す図である。制限フラグメントに、アダプターをライゲーションさせて、その後アダプターライゲーション制限フラグメントを、第１の選択的プライマーの組合せ（ＰＣ１）を用いて増幅させて、ｎ個のフラグメントを生じる。各フラグメントはハイスループットシーケンシング用に断片化して、シーケンシング及びアラインメントに付して、制限フラグメントのコンティグを生成する。このようにして、増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメント（ｎ）の全て又は大部分の配列が、１つのプライマーの組合せに関して確定される。
【図２】所定の酵素の組合せ（ＥＣ１）に関する考え得るプライマーの組合せそれぞれに関して、増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの断片化、シーケンシング、アラインメント及びコンティグ構築の工程を繰り返すことを示す図である。このことは、例えば選択的増幅が、それぞれそれの３’末端に選択的ヌクレオチドを保有するプライマー（即ち、＋１／＋１プライマー）を用いて実施される場合、１６個のプライマーの組合せ（ＰＣ１・・・ＰＣｍ）は、全ての順列を網羅し、１６個のプライマーの組合せを用いて、全てのアダプターライゲーション制限フラグメントが増幅され、続いてシーケンシングされていることを意味する。ＥＣ１を用いて生成されるコンティグから、即ちＥＣ１／ＰＣ１・・・ＥＣ１／ＰＣｍから、アセンブリはゲノムの大部分を網羅するが、ゲノム配列を提供するためには固着される必要がある。この目的で、第２の酵素の組合せ（及び必要であれば、第３の酵素の組合せ及び第４の酵素の組合せ等）が使用される。図１及び図２の工程、即ち制限、アダプターライゲーション等は、酵素の組合せ２（ＥＣ２）を用いて繰り返される。選択的増幅は、ＥＣ１とともに使用されるプライマーとは通常異なり得る（配列及び選択性）選択的プライマーの組を用いて実施される。アダプターライゲーション制限フラグメントは、選択的プライマーの組の全ての考え得る順列を用いて再び増幅されて、異なり且つ相補的なサブセットを生じる。選択的に増幅されたアダプターライゲーション制限フラグメントの各サブセットの断片化、及び続くハイスループットシーケンシング、コンティグ構築等は、再びゲノムの大部分を網羅する第２のアセンブリを導く。大面積に関して互いに重複しないこれらの２つのアセンブリ（及び任意の第３の酵素の組合せ、第４の酵素の組合せ等）から、研究されるゲノムのドラフト配列が生成される。
【図３】重複するＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＋Ｃ／＋ＣＴ及びＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ  ＋Ｃ＋Ｇ制限フラグメントを含有するコンティグ６０６のコンピュータ内で予測される６６２ｂｐの配列を示す図である。
【図４】シーケンシングＡＦＬＰフラグメントライブラリーＥｃｏＲＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ  ＋Ｃ／＋ＣＴ（ｒ１＿９＿３５９７４〜３６０８７）及びＢａｍＨＩ／ＸｂａＩ  ＋Ｃ／＋Ｇ（ｒ２＿９＿３６１３８〜３６２００）に基づくコンピュータ内で予測されるコンティグ６０６の観察される配列コンティグを示す図である。（ｒ１＿９＿３５９７４〜３６０８７）と（ｒ２＿９＿３６１３８〜３６２００）との間の４２ｂｐの重複は、両方のフラグメントライブラリーから得られる配列により完全に網羅されることに留意されたい。
【図１】
2008546405.tif 000005
【図２】
2008546405.tif 000006
【図３】
2008546405.tif 000007
【図４】
2008546405.tif 000008
【配列表】
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【国際調査報告】
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