(57)【要約】  動物の画像化のための組成物および方法が記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物またはヒトにおける細胞を可視化する方法であって、ａ）結合ドメインリガンドを動物に経口投与、腹腔内投与、静脈内投与、または髄腔内投与することであって、前記結合ドメインリガンドが標識を含み、前記細胞が可視化分子を含み、前記可視化分子が膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含み、前記結合ドメインリガンドが前記結合ドメインと相互作用し、およびｂ）前記結合ドメインリガンドの標識を可視化すること、を含んでなる方法。
【請求項２】
前記可視化分子が、分泌のまたは細胞膜輸送のシグナルドメインをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記可視化分子が、内因性プロテアーゼにより認識されるヒンジドメインをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記可視化分子が、開裂可能なヒンジドメインをさらに含んでなる請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記標識の可視化により、大部分が分解速度に依存する薬物動態学的定常状態が可能になる請求項３に記載の方法。
【請求項６】
ヒンジ領域が、膜貫通ドメインと結合ドメインとの間にある請求項３に記載の方法。
【請求項７】
ヒンジが、前記結合した結合ドメインリガンドが除去される薬物動態学的速度の制御を可能にする請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記ヒンジドメインが、補体部位またはＩＸ因子部位を含んでなる請求項７に記載の方法。
【請求項９】
膜貫通ドメインが、一回通過型または複数回通過型膜貫通ドメインを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記結合ドメインが、マルトース結合タンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはｃｄ−４４を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記結合ドメインリガンドが、マルトースまたはその誘導体、ビオチン、グルタチオン、またはヒアルランポリマーを含んでなる請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標識が、ｃｙ５．５またはｆｉｔｃなどの蛍光プローブ、ヨウ素または任意の他の稠密金属、安定な同位元素、またはガドリジウム（ｇａｄｏｌｉｄｉｕｍ）を含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記可視化分子が、複数結合ドメインをさらに含んでなる請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記可視化分子が、同定ドメインをさらに含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記同定ドメインが、エピトープを含んでなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記エピトープが、赤血球凝集素Ａエピトープ、ＦＬＡＧタグ、またはｍｙｃエピトープを含んでなる請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第２の同定ドメインをさらに含んでなる請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記標識の可視化が、非侵襲的画像法、コンピュータトモグラフィ、生物発光画像法、プレーナーガンマカメラ画像法、単一光子三次元（３−Ｄ）放射型コンピュータトモグラフィ（ＳＰＥＣＴ）画像法、連続波長または時間領域光ベース画像法、磁気共鳴画像法、蛍光画像法、拡散光トモグラフィ、超音波検査法、ポジトロン放射型トポグラフィ（ＰＥＴ）画像法、蛍光相関分光法、インビボ２光子顕微鏡法、光干渉トモグラフィ、スペックル顕微鏡法、ナノ結晶標識法、または第二高調波画像法を実施することを含んでなる請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記動物が、疾患モデルとして使用できる動物である請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記疾患が、過誤腫または新形成、変性または神経変性疾患、自己免疫疾患、または感染症である請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記標識の可視化により、腫瘍が同定される請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記可視化標識が、疾患処置をモニタリングできる請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記可視化方法が、移植された細胞または形質移入された患部細胞または非患部細胞をモニタリングできる請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
移植された多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ）、多分化能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）、または単能性幹細胞または分化細胞が、造血細胞、筋細胞のような間葉細胞、膵細胞または神経細胞を含んでなる請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記可視化分子が、動物細胞に存在する請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記可視化分子が、新生物発生前細胞、新生物発生細胞または正常な内胚葉細胞、外胚葉細胞、または間葉細胞などの特定の組織に生じる請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
前記可視化分子が、細胞内に生じるように誘導される請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
前記可視化分子が、構成的に細胞内に生じる請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
可視化分子をコードする遺伝子構築体を動物細胞またはヒト細胞あるいは患部細胞に形質移入することを含んでなる動物を作製する方法。
【請求項３０】
可視化分子をコードする遺伝子構築体を細胞に形質移入することを含んでなる細胞を作製する方法。
【請求項３１】
可視化分子を含んでなる細胞。
【請求項３２】
可視化分子を含んでなる動物。
【請求項３３】
前記可視化分子の発現が、リコンビナーゼにより制御される請求項３２に記載の動物。
【請求項３４】
前記リコンビナーゼが、Ｃｒｅである請求項３３に記載の動物。
【請求項３５】
ａ）膜貫通領域および結合ドメインをコードする配列を含んでなる可視化構築体を細胞に形質移入すること、ｂ）標識を含んでなる結合ドメインリガンドを注入すること、およびｃ）前記結合ドメインリガンドの標識を可視化すること、を含んでなる細胞を可視化する方法。
【請求項３６】
患部組織または正常組織を有するヒト患者が、患部標的組織または正常標的組織に可視化分子を形質移入する外科的またはインターベンショナルラジオロジー法を受けるシステムであって、前記可視化分子の発現が、あるクラスの薬物の作用に重要なシグナル伝達経路に応答性の外因性レポーターにより制御され、患部組織または標的組織においてその薬物の有効性をリアルタイムで可視化することにより、可能性のある療法または処置に対する患者応答の代理的な基準を直ちに得られるシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２００５年９月１７日出願の米国仮特許出願第６０／６１０，６８１号明細書に対する優先権を主張し、該出願は、参照として、その全体が本明細書に組み込まれている。
【背景技術】
【０００２】
先行の画像化技法は、疾患の原因となる特異的分子事象（例えば遺伝子発現）を同定するのではなく、正常組織から病的組織を識別する非特異的で巨視的な身体的、生理学的、または代謝的変化に、主として基づいていた。しかし、分子画像法は、画像コントラスト源として、特異的分子プローブを利用する。非特異的アプローチから特異的アプローチに重点がおかれるこの変化は重要なパラダイムシフトとなり、その影響から、今では画像化によって、統合生物学、疾患の早期検出および特性化、ならびに治療の評価についての理解可能性が提供できる（マスード（Ｍａｓｓｏｕｄ）、２００３年）。
【０００３】
分子画像化法の出現は、主に、分子生物学的および細胞生物学的手法の進歩、遺伝子導入動物モデルの利用、高特異的な新規画像化剤およびプローブの入手可能性、ならびに小動物画像計測化の開発成功によるものである。現在のポストゲノム期における科学的地平の継続的な拡張と共に、これらの因子は、インビトロで確立されたアッセイおよび細胞培養実験的アッセイと生きている対象内の画像化試験との結合を可能にする新たな基準に向けての駆動力の要となっている。
【０００４】
分子画像法は、生物医学研究において、いくつかの重要な目標、すなわち、（１）特異的な細胞過程および分子過程、例えば、遺伝子発現、またはタンパク質−タンパク質相互作用などのより複雑な分子相互作用を反映する非侵襲的インビボ画像化法の開発；（２）複数の分子事象をほぼ同時にモニターすること；（３）細胞の輸送および標的化の追跡；（４）薬物療法および遺伝子療法の最適化；（５）分子レベルおよび細胞レベルでの薬剤作用の画像化；（６）分子病理学的レベルでの疾患進行の評価；および（７）同じ動物または患者の遺伝子産物に対する時間依存性の実験的、発生的、環境的、および治療的影響をモニターできるような、迅速で再現性があり、定量的様式において、上記の画像化目標を全て達成する可能性を生じさせること、を達成する可能性を生み出している（マスード（Ｍａｓｓｏｕｄ）、２００３年）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
当業界で必要とされているものは、タグ化粒子と結合するための細胞外、膜結合タンパク質を用いた画像化レポーターである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
導入遺伝子の発現の画像化に関する方法および組成物が開示される。
【０００７】
図面の簡単な説明
本明細書に組み込まれており、その一部を構成している添付の図面は、いくつかの実施形態を例示し、開示された組成物および方法を説明と共に例示している。
【０００８】
当該化合物、組成物、製品、装置、および／または方法が開示され説明される前に、それらは、別に明記されない限り、特定の合成法、または特定の組換えバイオテクノロジー法に限定されず、別に明記されない限り、特定の試薬に限定されず、したがって、当然変わり得ることを認識すべきである。また、本明細書に用いられる用語は、特定の実施形態の説明のみを目的としており、限定の意図はないことも当然である。
【０００９】
Ａ．定義
本明細書および添付の請求項に用いられる単数形の「１つの」、「ある」および「該」は、文脈から明らかに別に示されない限り、複数形の指示物を含む。したがって、例えば、「製薬的担体」は、このような担体の２種以上の混合物などを含む。
【００１０】
本明細書において、範囲は、「約」ある特定値からとして、および／または「約」他の特定値までとして表現し得る。このような範囲が表現されている場合、他の実施形態は、ある特定の値から、および／または他の特定値までを含む。同様に、先行の「約」の使用によって値が近似で表現されている場合、当然のことながら、その特定の値は他の実施形態を形成する。また、当然、各範囲の終点は他方の終点に関連していること、および他方の終点とは独立していることの双方を意味する。また、本明細書には多数の値が開示されており、各値は、本明細書においては、その値自体に加えて、その「約」特定値として開示されていることも当然である。例えば、「１０」の値が開示されている場合は、「約１０」もまた開示されている。また、当業者に適切に認識されるように、ある値が、その値「以下」、「その値以上」と開示されている場合、その値の間の可能な範囲もまた開示されている。例えば、「１０」の値が開示されている場合、「１０以下」ならびに「１０以上」もまた開示されている。また、当然のことながら、本出願を通じて、データは多数の異なるフォーマットで提供され、このデータは、終点および開始点、ならびにデータ点の任意の組み合わせの範囲を表す。例えば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点「１５」が開示されているならば、１０ならびに１５超、以上、未満、以下、および等しいもの、ならびに１０と１５の間のものが開示されていると考えられることは当然である。
【００１１】
本出願およびそれに続く請求項においては、以下の意味を有すると定義される多数の用語が参照されるであろう：
【００１２】
「任意の」または「任意に」は、引き続き記述された事象または状況が生じることもあり得るし、生じないこともあり得ること、およびこの記述には、前記事象または状況が生じる場合も生じない場合も含まれることを意味する。
【００１３】
「プライマー」は、いくつかのタイプの酵素処理を助けることのできる、また、酵素処理が実施できるように標的核酸にハイブリダイズできるプローブのサブセットである。プライマーは、酵素処理を妨害しない、当業界で入手できるヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体または類縁体の任意の組み合わせから作製できる。
【００１４】
「プローブ」は、典型的には配列特異的様式で、例えばハイブリダイゼーションによって、標的核酸と相互作用できる分子である。核酸のハイブリダイゼーションは当業界で十分に認識されており、本明細書で検討されている。典型的に、プローブは、ヌクレオチドもしくはヌクレオチド誘導体または類縁体の任意の組み合わせから作製できる。
【００１５】
用語の「より高い」、「増加する」、「上昇する」、または「上昇」とは、例えば、対照または基本レベルに比較して、基本レベル以上の増加を言う。用語の「低い」、「より低い」、「減少する」、または「減少」とは、例えば、対照または基本レベルに比較して、基本レベル以下の低下を言う。
【００１６】
「標識」とは、直接的に（例えば、ポリペプチドまたは核酸内へ組み込まれた蛍光分子）または間接的に（例えば、活性化可能な基質、ペプチド、受容体融合タンパク質、一次抗体、または組み込まれたタグを有する二次抗体を含む発現遺伝子レポーターとの結合または活性化により）、対象となっている分子に結合できる任意の検出可能なタグを意味する。「標識」は、画像化法によって可視化できる任意のタグである。検出可能なタグは、放射線不透過物質、放射標識、蛍光標識、発光タンパク質または発光物質、磁気標識、またはミクロ気泡（循環系に残留し、本明細書にその全体が組み込まれている、エレガ（Ｅｌｌｅｇａ）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、１０８：３３６−３４１頁、２００３年に記載されている超音波検査法によって検出可能な均一なサイズの空気充填気泡）であり得る。検出可能なタグは、例えば、位置決めに好適なガンマ放射体、ベータ放射体、およびアルファ放射体、ポジトロン放射体、Ｘ線放射体、超音波反射板（ミクロ気泡）、および蛍光放射体であり得る。好適な蛍光化合物としては、フルオレセインナトリウム、フルオレセインイソチオシアネート、フィコエリスリン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、テキサスレッドスルホニルクロリド（デベルダー（ｄｅ  Ｂｅｌｄｅｒ）  ＆  ウィク（Ｗｉｋ）、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．４４（２）：２５１−５７頁（１９７５年））、ならびにＣｙ５．５、Ｃｙ７などの近赤外線で蛍光性である化合物および他のものが挙げられる。また、ｈＳＳＴｒ２チミジンキナーゼ（ヘルペスウィルス、ヒトミトコンドリア、または他のものからの）およびＮＩＳ（ヨウ素共輸送体）などの放射性トレーサーの投与後に検出可能な遺伝子レポーターが挙げられる。発光タンパク質としては、種々のタイプのルシフェラーゼが挙げられる。
【００１７】
「操作可能に結合した」とは、プロモーターが所定の核酸の発現を制御するというような所定のプロモーター配列の制御下での核酸の発現として定義される。所定の核酸は、限定はしないが、レポーター核酸であり得る。
【００１８】
用語の「プロモーター」は、細胞内のＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流の（３’方向）コード配列の転写を開始することのできるＤＮＡ調節領域として定義される。
【００１９】
全体を通して使用される「対象」は、個体を意味する。したがって、「対象」には、ネコ、イヌなどの家庭的動物、家畜（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギなど）、実験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモットなど）および鳥類を含めることができる。対象は、霊長類などの哺乳動物であることが好ましく、ヒトであることがより好ましい。
【００２０】
本出願を通して種々の刊行物が引用されている。これらの刊行物の開示は、これが関連する当業界の状態をより十分に説明するために、本出願の参照として、本明細書にそれらの全体が組み込まれている。また、開示された参考文献は、該参考文献に基づいている文章において検討されている本明細書に含有された材料に関して、参照として本明細書に、個々に、および特に組み込まれている。
【００２１】
Ｂ．方法
１．全般
分子画像法は、遺伝病の治療法評価において重要である。分子画像法は、遺伝子療法などの新規な分子療法の評価に利点を提供する。画像化により、インビボ標的化を確認できるか、または画像化を、療法に誘発された分子応答をモニターするために使用できる。遺伝子療法のアプローチに関して、遺伝子の移入および発現双方の程度および大きさが分子画像法により判定できる。さらに、遺伝子インビボ発現のリアルタイム画像化により、非侵襲的手段を用いた遺伝子発現のモニタリングが可能となる。
【００２２】
遺伝子構築体の形体における導入遺伝子由来の細胞外、膜結合タンパク質を用いた交差プラットホームインビボ画像化レポーターが、本明細書に開示されている。この遺伝子構築体は、細胞または組織に送達され、該レポーターの発現は、インビボ画像化によって検出され、画像化シグナルの強度は、発現されているレポーターの量に関連している。この膜結合タンパク質は、受容体または抗原のいずれかであり得、リガンド（タグ化粒子）との結合に使用できる。このようなリガンドとしては、抗体、タンパク質、ペプチド、炭水化物、化学化合物、多糖類、脂質、または脂質高分子（例えばリポソーム）を挙げることができる。細胞外、膜結合タンパク質は、膜貫通ドメイン、開裂可能ヒンジ、例えば、補体またはＩＸ因子開裂部位、およびリガンドまたは、例えば、マルトース結合タンパク質、アビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはｃｄ−４４などの抗体結合タンパク質から構成され得る。
【００２３】
このシステムの適用としては、限定はしないが、癌などのマウス疾患モデル（腫瘍画像化、追跡および治療）、アルツハイマー病およびプリオン病などの他の非腫瘍疾患モデル（神経組織状態のモニタリング）の研究、マウスにおける基礎インビボ生理学（例えば、ドーパミン作動性ニューロンなどの任意の興味ある細胞サブセットの存在／健全性および遺伝子発現のモニタリング）、または移植細胞（例えば、ヒト患者への造血／膵性／脳幹細胞および特殊細胞（例えば膵島細胞））のモニタリングなどの臨床適用、ならびに組織増殖および再生のモニタリング（麻痺に関する研究など）が挙げられる（図１）。
【００２４】
この技法は以下の利点を有する：以前、最良のレポーター技法は、三重融合タンパク質を用いた３つの異なるモダリティーのみにおける遺伝子発現を可視化することができた（Ｒａｙら）。現時点で、該基質の薬物動態を制御できる技法はない。本明細書に開示された方法および組成物は、少なくとも５つの異なるモダリティーにおけるリアルタイムで定常状態のレポーティングを実施する能力を提供する一方、同時に利用される基質の薬物動態を制御する能力を提供する。
【００２５】
２．細胞の標的化修飾
キメラ受容体は、受容体によってマークされる細胞の標的化修飾にも使用できる。リガンド−受容体相互作用の特異性は、リポソームおよびＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質などの膜貫通標的ペプチドを含めた他の膜貫通送達媒体を、特定の細胞の細胞膜近くに運ぶことによって細胞の取り込みを促進させるために使用できる。
【００２６】
ａ）特定の細胞における標的化離解または遺伝子発現活性化
特定の高周波（例えば超音波）または磁気放射線（例えばマイクロウェーブまたはＸ線）の特定の周波数によって励起する分子を用いてリガンドを標識することにより、細胞を離解することが可能である。これは、キメラ受容体を有する細胞を患者に移植し、その後有害になる（例えば癌性）療法に、または細胞もしくは組織特異的で標的化された離解が所望される（例えば、腫瘍、患部組織など）研究に使用できる。この技法は、低用量の高周波／放射線を用いることによって、改変熱ショック遺伝子を活性化するためにも使用できる。特定の高周波または磁気放射線の特定の周波数によって励起する分子を用いてリガンドを標識することにより、また、細胞を死滅させずに低用量の放射線（短時間および／または強度）を用いることにより、熱ショック遺伝子の活性化のため、十分に温度を上げることができる（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗｍｇｓ．ｂｉｏｎｅｔ．ｎｓｃ．ｒｕ／ｍｇｓ／ｐａｐｅｒｓ／ｓｔｅｐａｎｅｎｋｏ／ｈｓ−ｔｒｒｄ／を参照）。
【００２７】
例えば、１ステップまたは２ステップ破壊のための細胞標識化に、これらの同じ受容体が使用できる。１ステップ破壊は、ジフテリア毒素、ＤＮアーゼまたはバーナーゼなどの何らかの毒素または抗細胞剤のリガンド媒介送達によって達成できる（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００１年８月１５日；２９（１６）：Ｅ７６頁）。２ステップ破壊では、細胞表面への酸化鉄粒子の送達によって媒介され、これを高周波またはマイクロウェーブ放射線に曝露することによって酸化鉄粒子の振動およびタグ化細胞の熱媒介破壊が導かれる。例えば、チミジンキナーゼの送達は、内在化されると、ガンシクロビル投与の存在下で細胞死を導く。
【００２８】
ａ）動物への結合ドメインリガンドの経口、腹腔内、静脈内、または髄腔内投与であって、該結合ドメインリガンドは、標識を含んでなり、該細胞は、可視化分子を含んでなり、該可視化分子は、膜貫通ドメインおよび細胞外結合ドメインを含んでなり、該結合ドメインリガンドは、該結合ドメインと相互作用する投与、およびｂ）該結合ドメインリガンド標識の可視化、を含んでなる動物またはヒトの細胞を可視化する方法が開示される。
【００２９】
また、可視化分子が、分泌の、または細胞膜輸送のシグナルドメインをさらに含んでなる方法が開示される。実際、いずれの膜貫通タンパク質も分泌の、または膜貫通の標的化配列を有する。Ｉｇ−ｋは、分泌リーダー配列を有するタンパク質の一例である。ＨＬＡ−Ｂ７、ＰＤＧＦＲ、ＥＧＦＲ、およびＩＧＦＲは、膜貫通標的化配列を有するタンパク質の例である。
【００３０】
また、可視化分子がさらに、内因性プロテアーゼによって認識されるヒンジドメインを含んでなるか、または可視化分子がさらに、開裂可能なヒンジドメインを含んでなる方法が開示される。
【００３１】
また、標識の可視化により、おおよそは分解速度に依存する薬物動態学的定常状態が可能になる方法が開示される。したがって、細胞の健全性の定常状態マーカーとして働くか、または転写および翻訳の速度に基づいたリアルタイムレポーティングを迅速に可能にする（したがって、可視化分子を駆動させるプロモーターの分子レポーターとして働き、このレポーターは、一定の対象となっているシグナル経路、すなわち、一定のクラスの薬剤によって影響を受けることが知られている経路によってのみ特異的に活性化され得る）。その受容体に結合したリガンドのみを可視化できるため、徐々に開裂するヒンジを用いて、またはヒンジを全く用いずに、定常状態における細胞を可視化することができる。速やかに開裂するヒンジを用いることにより、リガンドの可視化は、受容体が生じる速度に依存し、したがって、本質的に、受容体の生成を駆動するプロモーターの速度を追跡するリアルタイムの画像化を実施することができる。ヒンジ不使用は、受容体の消失を提供せず、定常状態の画像化に用いられ、一方、ＩＸ因子などの速やかに開裂するヒンジを使用することにより、リアルタイムで受容体の生成を可視化することができる。
【００３２】
また、ヒンジ領域が膜貫通ドメインと結合ドメインの間にあるか、結合した結合ドメインリガンドの除去される薬物動態学的速度の制御が、該ヒンジによって可能になるか、またはヒンジドメインが補体部位またはＩＸ因子部位を含んでなる、方法が開示される。
【００３３】
また、膜貫通ドメインが、一回通過型または複数回通過型の膜貫通ドメインを含んでなる方法が開示される。一回通過型膜貫通ドメインのいくつかの例は、受容体チロシンキナーゼ、例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）または血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）である。
【００３４】
また、結合ドメインがマルトース結合タンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはｃｄ−４４を含んでなり、結合ドメインリガンドがマルトースまたはその誘導体、ビオチン、グルタチオン、またはヒアルランポリマーを含んでなり、標識がｃｙ５．５またはｆｉｔｃなどの蛍光プローブ、ヨウ素または他の任意の稠密金属、安定同位元素、またはガドリジウムを含んでなり、可視化分子がさらに複数の結合ドメインを含んでなり、可視化分子がさらに同定ドメインを含んでなり、同定ドメインがエピトープを含んでなり、エピトープが赤血球凝集素Ａエピトープ、ＦＬＡＧタグ、またはｍｙｃエピトープを含んでなり、さらに第２の同定ドメインを含んでなり、標識の可視化が非侵襲的画像法、コンピュータトモグラフィ、生物発光画像法、プレーナーガンマカメラ画像法、単一光子三次元（３−Ｄ）放射型コンピュータトモグラフィ（ＳＰＥＣＴ）画像法、連続波長または時間領域光ベース画像法、磁気共鳴画像法、蛍光画像法、拡散光トモグラフィ、超音波検査法、ポジトロン放出トモグラフィ（ＰＥＴ）画像法、蛍光関連分光法、インビボ２光子顕微鏡法、光干渉トモグラフィ、スペックル顕微鏡法、ナノ結晶標識法、または第二高調波画像法、の実施を含んでなり、動物が疾患モデルとして使用することのできる動物であり、疾患が、過誤腫もしくは新形成、変性疾患もしくは神経変性疾患、自己免疫疾患、または感染性疾患であり、標識の可視化により腫瘍が同定され、標識の可視化により疾患治療のモニタリングが可能になり、可視化法により移植細胞または形質移入された疾患細胞もしくは非疾患細胞のモニタリングが可能になり、移植した多能性、多分化能性、もしくは単能性幹細胞または分化細胞が、造血細胞、筋肉細胞のような間葉細胞、膵細胞、または神経細胞を含んでなり、可視化分子が動物細胞のサブセットニ存在し、可視化分子が、新生物発生前細胞、新生物発生細胞または正常な内胚葉細胞、外胚葉細胞、もしくは間葉細胞などの特定組織に生じ、可視化分子が細胞内に生じるように誘導され、可視化分子が構成的に細胞内に生じる、方法が開示される。
【００３５】
動物細胞もしくはヒト細胞または患部組織に可視化分子をコードする遺伝子構築体を形質移入することを含んでなる動物の作製方法が開示される。
【００３６】
細胞に可視化分子をコードする遺伝子構築体を有する細胞を形質移入することを含んでなる細胞の作製方法が開示される。
【００３７】
可視化分子を含んでなる細胞が開示される。
【００３８】
また、可視化分子を含んでなる動物が開示される。
【００３９】
また、可視化分子の発現がリコンビナーゼによって制御され、該リコンビナーゼがＣｒｅである動物が開示される。
【００４０】
また、ａ）細胞に、膜貫通領域および結合ドメインをコードする配列を含んでなる可視化構築体を形質移入すること、ｂ）標識を含んでなる結合ドメインリガンドを注入すること、およびｃ）該結合ドメインリガンドの標識を可視化すること、を含んでなる細胞可視化の方法が開示される。
【００４１】
開示された組成物および方法を用いて疾患または細胞または動物の状態に及ぼす種々の化合物の効果がモニターされる方法が開示される。また、組成物は活性に関してスクリーニングでき、開示された方法および組成物は細胞または動物に対する所望の効果を有する化合物をモニターするか、または同定するために使用できる。
【００４２】
また、あるクラスの薬剤の作用に重要なシグナル伝達経路に応答性の外来レポーターによって発現が制御される可視化分子を、患部の、または正常な標的組織に形質移入して、患部の、または正常な組織を有するヒト患者が、外科手術的、または介入的放射線操作を受けるシステムが開示される。患部または標的組織におけるその薬剤の有効性をリアルタイムに可視化することによって、可能性のある療法または治療に対する患者応答の代理的な基準が直ちに得られることになる。
【００４３】
３.画像化および癌
種々のタイプの癌に関与する分子機構を理解することは、治療的介入に関し、癌進行における同定および標的化の種々のステップの要点である。これらの機構が解明されることにより、これらの特定の機構およびシグナル伝達経路に関連する有効性に関して治療処置をモニターできる。この問題を克服するために、複雑なマウスモデルを作製することができる。必要とされるものは、微小侵襲および微小転移をモニタリングする手段である。開示された方法には、マウス癌モデルにおける癌の進行の早期検出を可能にするインビボ複数モダリティーレポーターが含まれる。
【００４４】
癌細胞上に、複数のモダリティーにわたる画像化（例えば、ＣＴ／ＭＲＩ／ＰＥＴ／光学的）を促進するキメラ受容体を条件付け発現できるマウスが作製される（図５）。このキメラ受容体は、一回通過型膜貫通ドメインおよび細胞外マルトース結合ドメインからなる。前癌細胞におけるこの受容体の活性化により、増殖、微小侵襲および微小転移の早期検出が可能になる。キメラ受容体のリガンド、マルトースは、ガドリジウム、ヨウ素、放射標識基質、赤色蛍光タンパク質またはｃｙ５．５などの種々の異なる基質で標識できる。次いで、これらの種々に標識化されたマルトースプローブを、遺伝子操作したマウスに静脈内注入する。次いで、標識マルトースを、腫瘍細胞特異的キメラ受容体に結合させる。その結果、この結合活性により、ＭＲＩ、ＣＴ、ＰＥＴ、蛍光または光学的画像法（注入されたマルトースに結合した標識に依り）を用いたリアルタイム複数モダリティーインビボ画像法が可能になる。
【００４５】
解剖学的高分解能（ＣＴ／ＭＲＩ）および分子感受性（ＰＥＴ／光学的）画像法を用いたインビボ定常状態腫瘍細胞レポーティング（特異的遺伝子発現の可視化）の技法の探索が多くなされている。現在、最もよく利用できる技法は、三融合タンパク質を用いた３つの異なる非高分解能モダリティー（ＰＥＴ／発光／蛍光）に限られている。標識リガンドの使用により、コントラスト増強複数モダル画像の時間的制御を達成することができる。これによってより大きな適用性が提供され、最小の侵襲的手段で、生きている遺伝子導入動物における細胞集団の可視化が可能になる。組織の定常状態を試験するためにこれらの手段が拡張されれば、疾患動物モデルにおける特定組織の健康状態をモニターすることができる。
【００４６】
この技法は、腫瘍形成および癌の進行（例えば転移）に関与する分子機構の詳細な研究が促進される。薬剤の有効性をモニターするためにこの技法を適用することを通して得られた知識によって、より良い治療が導かれ、その結果、癌の進行阻止および最終的には癌の退縮がもたらされる。この技法は、生理学的モデルおよび疾患モデルに関するリアルタイムインビボ遺伝子発現分析などの他の種々の適用にも使用できる。
【００４７】
４．画像化レポーター
画像化レポーターはインビボで組織または細胞の可視化を可能にできる分子である。画像化レポーターは、例えば、本明細書に開示された方法のいずれかに使用できる。可視化とは、可視化レポーターがそれ自体、例えば、蛍光標識または放射性標識を介して同定できることを意味し、画像化レポーターは特定の細胞または組織に関係していることから、その細胞または組織が同定または可視化されることを可能にする。画像化レポーターは、本明細書で検討した膜貫通ドメインおよび結合ドメインから典型的に作製される。画像化レポーターはまた、開裂可能なヒンジドメインを有することが多い。しかし、画像化レポーターは、例えば、レポーター結合部位、抗体認識部位、特異的細胞追跡シグナル、または精製に使用できるドメインなどの他の多くの部分を有し得る。
【００４８】
ａ）膜貫通ドメイン
任意の膜貫通領域または配列が使用できる。膜貫通ドメインの例としては、チロシンキナーゼの膜貫通受容体、チロシンファミリー（上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）および血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ））などの一回通過型膜貫通ドメイン、ｇタンパク質受容体、Ｇタンパク質の膜貫通ドメインなどの複数回通過型膜貫通ドメイン、または他のこのような膜貫通ドメインが挙げられる。例えば、表７における領域は膜貫通ドメインを含有する。
【００４９】
【表１】
2008513020.tif 000002
【００５０】
ｂ）結合ドメイン
任意の結合ドメインを使用できる。結合ドメインによって、例えば、マルトース（マルトース結合タンパク質との結合に用いられる）、ビオチン（アビジンと共に用いられる）、グルタチオン（ＧＳＴと共に用いられる）、またはヒアルランポリマー（任意の長さであり得、ｃｄ−４４またはＲＨＡＭＭタンパク質の認識に使用できる、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ、２００４年７月；４（７）：５２８−３９頁）などの基質の結合が可能になる。これらの基質は、蛍光もしくは放射線撮影などによって、または、例えば、小動物などの非侵襲的動物画像化に対してｃｙ５．５、小動物などの動物コンピュータ断層撮影に対してヨウ素、ＳＰＥＣＴまたはＰＥＴ画像法に対して安定な同位元素、または磁気共鳴画像法に対してガドリジウムなどの他の任意の方法によって、同定され得る任意の分子である種々の画像化タグによって個々に標識化できる。複数タグに結合する単一基質をデザインすることによって、シグナルの検出を著しく増強することができる。
【００５１】
（１）結合タンパク質のクラス
したがって、結合ドメインの１つのタイプは、該結合ドメインの基質が哺乳動物などの動物に存在しないものである。結合ドメインの他のタイプは、基質は存在し得るが、遍在的ではないもの、例えば、１種、２種、３種、４種、５種、６種、７種、８種、９種、１０種、１１種、１２種、１３種、１４種、または１５種の組織または細胞型にのみ存在するものである。本明細書に検討された他のものとの任意の組み合わせで使用できる他のタイプの結合ドメインは、該動物にとって非毒性である基質に結合する結合ドメイン、もしくは、動物内に存在する間は毒性であり得ても、その動物から除去された場合はもはや有害ではない基質に結合する結合ドメイン、または該動物にとって毒性であり得ても、死を引き起こさない基質に結合する結合ドメインである。
【００５２】
（２）マルトース結合タンパク質
マルトース結合タンパク質（配列番号：１５）は、そのリガンド、マルトースが哺乳動物の胃腸管腔以外には存在せず、その天然リガンドと特異的に結合するが、哺乳動物内で非毒性であることから、有用な結合ドメインの１つのタイプである。マルトース結合タンパク質は、１．２ｋｂ遺伝子によってコードされるペリプラズム細菌タンパク質である。これは、２つから少なくとも７つのアルファ１，４結合グルコシル単位、例えば、マルトース、マルトトリオース、およびマルトヘキソースの線状マルトデキストリン、ならびに例えば、シクロマルトヘキソースおよびシクロマルトヘプタオースなどの環状マルトデキストリンなどのいくつかの基質と、高親和性（Ｋｄ＝１．６−４０×１０−７Ｍ）で結合することが知られている（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、キオチョー（Ｑｕｉｏｃｈｏ）ら、ホーラシャー（Ｈｏｒｌａｃｈｅｒ）ら）。変異体のマルトース結合タンパク質は、さらに高い親和性でこれらの基質の多くと結合することができる（テルマー（Ｔｅｌｍｅｒ）ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８（３６）：３４５５５−６７頁）。Ｍｅｔ（Ｍ）（配列番号：１の３４７位）およびＧｌｎ（Ｑ）（配列番号：１の３５１位）をＡｌａ（Ａ）へと変換した最後の２つの塩基対変更の変異により、マルトースに対する親和性が、ＫＤ＝７０ｎｍ（１２００ｎｍから）に増加し、一方、最初の４つのアミノ酸（Ｇｌｕ（Ｅ）（配列番号：１の１９８位）、Ａｓｎ（Ｎ）（配列番号：１の１９９位）、Ｌｙｓ（Ｋ）（配列番号：１の２０１位）、およびＴｙｒ（Ｙ）（配列番号：１の２０２位）の欠失により、マルトースに対する親和性が、ＫＤ＝１１０ｎｍに増加し、また、これらの変異の組み合わせでは、マルトデキストリン類に対する親和性が増加し、特に、マルトトリオースに対する親和性が、ＫＤ＝６ｎｍに増加する。
【００５３】
このタンパク質とその基質との結合に関するモデルが提案されている（シルトン（Ｓｈｉｌｔｏｎ）ら）。このタンパク質の三次元構造がいくつかのグループによって決定されており（スパーリノ（Ｓｐｕｒｌｉｎｏ）ら、キオチョー（Ｑｕｉｏｃｈｏ）ら、シャルフ（Ｓｈａｒｆｆ）ら）、かれらは、基質のマルトース、マルトトリオースおよびマルトデキストロースとマルトース結合タンパク質との間の重要な結合および分子相互作用についての視点を提供している。これにより、複数モダル画像化に関して、適切な基質によるマルトースの標識化のための基質結合部位の位置に適切なデザインが可能になった。
【００５４】
マルトース結合タンパク質は、上記に挙げた基質に対して特異性が高く、グルコースに結合しないこと（スパーリノ（Ｓｐｕｒｌｉｎｏ）ら、ハルスマン（Ｈｕｌｓｍａｎｎ）ら）、また、トレハロース、ラクトースおよびスクロースに結合しないこと（ハルスマン（Ｈｕｌｓｍａｎｎ）ら）が知られている。線状マルトデキストリンおよびシクロデキストリンは、哺乳動物の腸内酵素により、単量体に分解され、したがって、腸管外の血中または細胞中には存在しないため、標識マルトースは血液中への注入剤の優れた候補になる。また、マルトースは、腎臓内でマルターゼによりさらに分解される。マルトースは、静脈内注入にとって安全であることが示されている（ヤング（Ｙｏｕｎｇ）ら、フィンケ（Ｆｉｎｋｅ）ら）。また、注入されたマルトースとオリゴ糖は細胞外の空間に分散されることが示されている（フィンケ（Ｆｉｎｋｅ）ら）。また、注入されたマルトースとオリゴ糖は、腎臓により身体から速やかに除去される（フィンケ（Ｆｉｎｋｅ）ら、スプランデル（Ｓｐｒａｎｄｅｌ）ら）。これにより、標識マルトースは、細胞へと分散され、引き続き、細胞内で特異的結合が生じ、キメラタンパク質を発現することが可能になるが、標識マルトースの非特異的分散は、速やかに除去される。これまでに、マルトースは、放射性同位元素（１４Ｃ、１３Ｃ、１５Ｏ）、ＡＮＤＳ（Ｆｌｕｘ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｓｐｉｎ（シン（Ｓｈｉｎ）ら）およびアミノ芳香族化合物（ナカジマ（Ｎａｋａｊｉｍａ）ら）によって標識されている。
【００５５】
薬物動態を制御する他の方法は、肝臓の胆汁経路にマルターゼを発現させ、肝臓の胆管にマルトースの異化作用を生じさせることであり得る。
【００５６】
（３）ペリプラズム結合タンパク質
他の細胞外結合タンパク質としては、約５×１０−７Ｍの親和性で、それらの基質に対し種々の程度の特異性で結合する５０超の種々の基質結合タンパク質のファミリーを含むグラム陰性細菌のペリプラズム結合タンパク質が挙げられる（スパーリノ（Ｓｐｕｒｌｉｎｏ）ら）。これらのペリプラズム結合タンパク質は、種々の炭水化物、ペプチド、アミノ酸、金属またはビタミン類に結合し、一般に小型タンパク質である（デウォルフ（Ｄｅ  Ｗｏｌｆ）ら）。表１は、細胞外表面受容体のクラスに関する典型的な親和性の要約を含んでいる。表２は、ペリプラズム結合タンパク質遺伝子、他の結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびリガンドの一覧を含んでいる。結合ドメインの一定のクラスは、１．６〜４０×１０−７、５．０×１０−７、６×１０−１６  ＆  ４×１０−１４、または２０×１０−９以下の解離定数でそれらの基質に結合することが認識される。
【００５７】
【表２】
2008513020.tif 000003
【００５８】
【表３】
2008513020.tif 000004
【００５９】
【表４】
2008513020.tif 000005
【００６０】
（４）アビジンおよびストレプトアビジン
アビジンおよびストレプトアビジンは、特別高い親和性で（アビジンはＫｄ＝６×１０−１６、ストレプトアビジンは４×１０−１４（ウィルチェック（Ｗｉｌｃｈｅｋ）ら））ビオチンに結合する能力でよく知られているタンパク質である。これらのタンパク質は、それらの高い結合親和性のため、タンパク質の精製から薬物標的化に及ぶ多数の適用に使用されている。ビオチンは多数の基質に結合している。アビジン／ストレプトアビジンは、４つのビオチン単量体に結合し、より高いシグナル潜在力を可能にしている（パーグリース（Ｐｕｒｇｌｉｅｓｅ）ら）。
【００６１】
（５）ｃｄ−４４
Ｃｄ−４４は、広範囲に発現し、種々の異性体に見られるヒアルロナン結合受容体である（バジョラス（Ｂａｊｏｒａｔｈ）ら）。ヒアルロナンは、反復二糖単位、β−（１，３）−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンおよびβ−（１，４）−Ｄ−グルクロン酸からなる大型の（ｍ．ｗ．＝１０×１０６まで、ダ・ベストウェーバー（Ｄａ  Ｖｅｓｔｗｅｂｅｒ）ら）ポリアニオン性グリコサミノグリカンである。このポリマーは十分に特徴づけされており、種々の基質に対するこのポリマーの理想的な結合を可能にしている。Ｃｄ−４４受容体もまた十分に特徴づけられている（ベストウェーバー（Ｖｓｔｗｅｂｅｒ）ら）。修飾リガンドに対して高特異性であるこの受容体の異性体もまた使用できる。
【００６２】
（６）抗体
特異的抗体によって認識される多数のタンパク質を使用することができる。抗体は十分に特性化されており、きわめて特異的なリガンドに高親和性で（Ｋｄ＝１０〜２０×１０−９Ｍまで（シアー（Ｓｃｈｉｅｒ）ら、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、ヤング（Ｙａｎｇ）ら））結合するそれらの能力が知られている。ミニボディおよびダイアボディは、抗体の特異的結合領域（可変領域）を含有する抗体の断片であり、ＰＥＴ用の放射性標識などの特定の目的で修飾できる（サンダレサン（Ｓｕｎｄａｒｅｓａｎ）ら）。
【００６３】
本明細書に開示された方法によって使用できる抗体、ミニボディまたはダイアボディに結合するタンパク質は、毒性および免疫原性が低く、遍在的に発現しないものである。抗体は多数の基質に結合されてきている。
【００６４】
抗体、ミニボディ、またはダイアボディは、結合ドメインかまたは基質のいずれかであり得る。例えば、本明細書で検討されたように使用し得る、何らかの基質に結合する抗体、ミニボディまたはダイアボディを産生できるため、抗体、ミニボディ、またはダイアボディは結合ドメインであり得る。抗体、ミニボディ、ダイアボディの配列を決定することができ、それらが膜貫通部および／または開裂可能なヒンジに結合され得るように、それらを生み出すｃＤＮＡを単離することができるか、または該抗体、ミニボディ、またはダイアボディをコードするＤＮＡ分子を作出することができる。
【００６５】
同様に、抗体、ミニボディ、またはダイアボディが結合するタンパク質またはペプチドは、結合ドメインであり得、抗体、ミニボディ、またはダイアボディは本明細書で検討された基質として使用し得る。
【００６６】
ｃ）開裂可能ヒンジ
任意の開裂可能ヒンジを含む任意のヒンジ領域を使用することができる。キメラタンパク質の膜貫通ドメインと受容体との間の開裂可能な細胞外「ヒンジ」は、カスタマイズ薬物動態のならびにリアルタイムに対する定常状態の遺伝子レポーティングを可能にする。ヒンジの作出により、リガンドで飽和した細胞を、ヒンジ開裂速度によって規定された予測可能でカスタマイズ可能な速度で除去することができる。キメラタンパク質の制御が関心対象となっている特定のプロモーターの制御下にある場合、キメラタンパク質レポーターに関して検出されたシグナルは、ヒンジがゆっくりと開裂する場合は、長期の遺伝子発現を反映できるか、ヒンジが速やかに開裂する場合は、リアルタイムの遺伝子発現を反映することができる。言い換えると、開裂可能なヒンジによって、結合基質が除去される速度に薬物動態速度を制御する能力が可能になる。
【００６７】
補体カスケードは、広範囲の開裂可能因子を提供する。例えば、タン（Ｔａｎ）ら（ＰＮＡＳ  ８７：１６２−１６６頁、１９９０年）は、抗体結合部位は同じでヒンジ領域アミノ酸組成の異なる、一連の遺伝子操作したキメラヒトＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗ダンシル（ＤＮＳ）抗体を特性化し、Ｆａｂ断片セグメントの可撓性、Ｃ１ｑ結合、および補体活性化に、ヒンジ領域がどのように影響を及ぼしているかを判定した。ヒンジ領域はＣ１ｑ結合および補体活性化に必須である。ＩｇＧ１〜ＩｇＧ４は全て、開示された方法によって有用なヒンジを有している。
【００６８】
ヒンジの他の例は、ＶＩＩ因子、ＩＸ因子、およびＸ因子など多くのセリンプロテアーゼを含むセリンプロテアーゼなどの、共凝集カスケードに見られるものである。研究の大きな部分が共凝集カスケードに関与する機構の解明に捧げられてきており、したがって、これらのタンパク質開裂の背後にある動態および機構は十分に特徴づけられている。（表３を参照）。これらの酵素のうちのいくつかの循環濃度は低いが、活性化プロトロンビンおよび活性化ＶＩＩａ因子の製剤を注入することは可能であろう。また、開裂を増強させるために、ＩＩａ因子およびＶＩＩａ因子を開裂標的下流に静脈内投与することが可能であろう。参考文献：ＰＭＩＤ：１１４８７０１８、ＰＭＩＤ：１５２６０８２０、ＰＭＩＤ：１２８２３８７１  ＰＭＩＤ：１１９７９７５０、ＰＭＩＤ：１１５０３９６８、ＰＭＩＤ：１１０９２２１３、ＰＭＩＤ：１５１７５７９４）を参照されたい。表４に、受容体の膜貫通部、ヒンジおよび結合領域に使用できる可能な組み合わせを示す。
【００６９】
【表５】
2008513020.tif 000006
【００７０】
開示された組成物および方法によって使用できる開裂部位は、例えば、カム（Ｋａｍ）ら、「Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｄ，Ｃ２，ａｎｄ  Ｂ，」  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６２（８）：３４４４−３４５１頁（１９８７）；ブジョークマン，Ｓ．（Ｂｊｏｒｋｍａｎ，Ｓ．）およびＥ．バーントープ（Ｅ．Ｂｅｒｎｔｏｒｐ）（２００１）、「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｌｅｖａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｈａｅｍｏｐｈｉｌｉａ．」  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ  ４０（１１）：８１５−３２頁、イシイ，Ｋ．（Ｉｓｈｉｉ，Ｋ．）、Ｌ．ヘイン（Ｌ．Ｈｅｉｎ）ら、（１９９３）、「Ｋｉｎｅｔｉｃｓ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｏｎ  ｉｎｔａｃｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．」Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６８（１３）：９７８０−６頁、ジャコブセン，Ｊ．（Ｊａｃｏｂｓｅｎ，Ｊ．）およびＫ．ポールセン（Ｋ．Ｐｏｕｌｓｅｎ）（１９９０）、「Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｒａｔ．」Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １７（６）：４４５−５１頁、ラッピン，Ｄ．（Ｌａｐｐｉｎ，Ｄ．）、Ａ．Ｄ．ハミルトン（Ａ．Ｄ．Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら（１９８６）、「Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（Ｃ３，Ｃ２，Ｂ  ａｎｄ  Ｃ１−ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）ａｎｄ  ｌｙｓｏｚｙｍｅ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ．」、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０（３）：１０１−５頁、ピーケ，Ｐ．Ｗ．（Ｐｅａｋｅ，Ｐ．Ｗ）．、Ｊ．Ａ．チャールズワース（Ｊ．Ａ．Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ）ら、（１９９１）、「Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｂｂｉｔ  Ｃ３：  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｈｅｉｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．」Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｉｎｆｌａｍｍ  ８（５−６）：２６１−７０頁、ランド，Ｍ．Ｄ．（Ｒａｎｄ，Ｍ．Ｄ．）、Ｓ．Ｒ．ハンソン（Ｓ．Ｒ．Ｈａｎｓｏｎ）ら（１９９５）、「Ｆａｃｔｏｒ  Ｖ  ｔｕｒｎｏｖｅｒ  ｉｎ  ａ  ｐｒｉｍａｔｅ  ｍｏｄｅｌ．」Ｂｌｏｏｄ  ８６（７）：２６１６−２３頁、タケウチ，Ｔ．（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，Ｔ．）、Ｊ．Ｌ．ハリス（Ｊ．Ｌ．Ｈａｒｒｉｓ）ら（２０００）、「Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｔｙｐｅ  ｓｅｒｉｎｅ  ｐｒｏｔｅａｓｅ  １  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅａｓｅ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−２  ａｎｄ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｕｒｏｋｉｎａｓｅ−ｔｙｐｅ  ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｓ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５（３４）：２６３３３−４２頁、ファン・ジエイジェン，Ｇ．（ｖａｎ  Ｄｉｅｉｊｅｎ，Ｇ．）、Ｇ．タンス（Ｇ．Ｔａｎｓ）ら、（１９８１）、「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄ  ａｎｄ  ｆａｃｔｏｒ  ＶＩＩＩａ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｏｖｉｎｅ  ｆａｃｔｏｒ  Ｘ．」、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５６（７）：３４３３−４２頁に見ることができ、これらは全て、少なくともヒンジ領域に関連した材料に関しては、それらの配列を含めて、参照として本明細書に組み込まれている。
【００７１】
図３は、種々の同定されたタンパク質に関する開裂部位を示しており、それらは全て、本明細書に開示された組成物および方法においてヒンジ領域として使用することができる。この図は、Ｈｅｍｏｓｔａｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ：  Ｂａｓｉｃ  Ｐｒｉｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、第４版、コールマン  ＲＷ（Ｃｏｌｍａｎ  ＲＷ）、ヒルシュ  Ｊ（Ｈｉｒｓｈ  Ｊ）、マーダー  ＶＪ（Ｍａｒｄｅｒ  ＶＪ）、クローズ  ＡＷ（Ｃｌｏｗｅｓ  ＡＷ）、ジョージ  ＪＮ（Ｇｅｏｒｇｅ  ＪＮ）（編）Ｊ．Ｂ．リッピンコット社（Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、フィラデルフィア、２０００年から入手した開裂部位配列から取り入れており、開裂部位およびそれらを開裂する酵素に関連した材料に関しては少なくとも本明細書に組み込まれている。
【００７２】
図４は、配列番号：８８および８９に示されたＣ２およびＣ３補体の開裂部位を示す。これらの開裂部位はまた、開示された組成物および方法におけるヒンジとしても使用できる。
【００７３】
１５分、３０分、４５分、６０分、１時間、２時間、４時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１５時間、２０時間、３０時間、４０時間、５０時間、７５時間、１００時間、１５０時間、２００時間以内に、またはそれ以上で開裂可能なヒンジ領域が開示される。
【００７４】
表４は、膜貫通ドメイン、ヒンジ領域、および結合ドメインの種々の組み合わせのいくつかを示す。これらは任意の可能な組み合わせで組み合わせることができ、また、これらは単に代表例であって、当然、他のものも同様に使用できる。
【００７５】
【表６】
2008513020.tif 000007
【００７６】
５．画像化レポーター発現
開示された画像化レポーターは、一種または複数種の細胞に対する画像化レポーターをコードする核酸を送達する任意のベクター系によって作製することができる。例えば、画像化レポーターは、画像化レポーターをコードする核酸のプロモーターのリプレッサー（ポリアデニル化シグナル／転写終結シグナル）がｌｏｘ部位によってフランクされているｃｒｅ−ｌｏｘベクター系に結合させることができる。Ｃｒｅが不在の場合は、画像化レポーターは発現されない。例えば、マウスなどの動物を、ｃｒｅ−ｌｏｘリプレッサーベクターを用いて作製することができる。これらの動物は、各細胞に存在する画像化レポーターをコードする構築体を有するが、画像化レポーターを発現する細胞はない。ついでこれらのマウスを、細胞特異的または組織特異的なプロモーター下で発現するＣｒｅを有するマウスと交配させて、所望のサブセットの細胞または組織に画像化レポーターを発現するマウスを作製することができる（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｓｈｒｉ．ｏｎ．ｃａ／ｎａｇｙ／Ｃｒｅ−ｐｕｂ．ｈｔｍｌを参照)。本明細書に開示された構築体を用いたこれらの動物の作製方法、ならびに該動物自体が本明細書に開示されている。
【００７７】
膜貫通領域（ＰＤＧＦＲ）および結合領域（マルトース結合タンパク質またはＭＢＰ）から構成されるキメラ受容体は、Ｒｏｓａ２６プロモーターなどの遍在的プロモーターから発現させることができる。Ｃｒｅ／Ｌｏｘ技法を用いて、該受容体が発現する時間および場所を制御することが可能である。上記で検討したように、Ｃｒｅは、ＬｏｘＰ部位として知られているＤＮＡの特定の３４塩基対配列を認識する酵素である。これらの部位の２つがＤＮＡ配列内に存在する場合、Ｃｒｅタンパク質はＬｏｘＰ部位の間のＤＮＡを再結合し、したがって、これらの部位の間のＤＮＡを切除する。キメラ受容体が、Ｒｏｓａ２６座から発現するようにデザインされ、マウスの任意の場所にあるキメラ受容体の発現が可能になる。Ｒｏｓａ２６プロモーターの後には、強力な停止シグナル（４つのポリアデニル化配列（図５）からなる）があり、次いでキメラ受容体の配列がある。この停止シグナルの挿入により、該シグナルが除去されるまで、キメラ受容体の発現が防止される。Ｃｒｅを添加する（細胞／組織特異的プロモーターから独立して発現させることができるか、またはタンパク質として注入できる）と、停止配列が除去され、したがって、Ｃｒｅに曝露された細胞からのキメラ受容体発現が可能になる。Ｃｒｅ系の例は、「Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｄｅｌｓ  ｏｆ  Ｓｐｏｒａｄｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ」、ジョス・ジョンカース（Ｊｏｓ  Ｊｏｎｋｅｒｓ）およびアントン・バーンズ（Ａｎｔｏｎ  Ｂｅｒｎｓ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｃａｎｃｅｒ、第２巻、２００２年４月、および「Ｃｒｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ｓｔｒａｉｎｓ  Ｐｒｏｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＹＦＰ  ａｎｄ  ＥＣＦＰ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  Ｒｏｓａ２６  Ｌｏｃｕｓ」、シャンカー・スリニバス（Ｓｈａｎｋａｒ  Ｓｒｉｎｉｖａｓ）ら、ＢＭＣ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １：４頁、２００１年に見ることができ、これらは双方とも、参照として、画像化レポーターおよび発現系に関するかれらの教示に関して、それらの全体が本明細書に組み込まれている。
【００７８】
６．誘導性発現
本発明により、複数の画像化モダリティーにわたって、遺伝子導入動物の遺伝子修飾した組織および細胞の非侵襲的または侵襲性の最少なリアルタイムおよび定常状態の画像化（薬物動態の制御により）が可能になる。画像化レポーターを生み出すこの導入遺伝子にコードされたレポーター系は、任意の組織特異的プロモーターまたは遺伝子座によって駆動できる。一例は、遍在的に存在し、Ｃｒｅ−ＬｏｘＰ媒介切除を用いて発現が誘導され、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現に基づき（Ｃｒｅに関する空間的に限定され、時間的に誘導可能なプロモーター要素を用いて（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｚｍｇ．ｕｎｉ−ｍａｉｎｚ．ｄｅ／ｔｅｔｍｏｕｓｅ／ｔｅｔ．ｈｔｍを参照）またはＣｒｅ酵素の直接注入などにより）所望の時間および場所でこのキメラタンパク質の発現を可能にするまでは沈黙状態（タンパク質として発現しない）にあるキメラ受容体であり得る。
【００７９】
プロモーター調節の人為的タイプは、Ｃｒｅ／ｌｏｘ系によって達成できる。一例において、遍在プロモーターを有する遺伝子導入生物を制御すべき遺伝子に結合させる。該プロモーターと該遺伝子との間にｌｏｘＰ部位に囲まれた「停止」配列を挿入する。停止配列は、遺伝子がタンパク質を産生することを防ぐいくつかの転写停止コドンを有する短い配列である。あるいは、この配列はＣｒｅを用いて切除されるリプレッサーをコードし、それによって所望の遺伝子産物の抑制を中止する。Ｃｒｅ＋細胞および遺伝子導入動物は当業界に十分知られており、容易に入手できる。
【００８０】
ｃｒｅ／ｌｏｘＰ系は部位特異的ＤＮＡリコンビナーゼＣｒｅをコードするｃｒｅ（環化組換え）遺伝子を利用する。これらの部位はｌｏｘＰ（Ｘ〜Ｐ１にわたる座）として知られており、３４塩基対の長さである。ゲノムにｌｏｘＰ部位を有する細胞がＣｒｅも発現する場合、該タンパク質はｌｏｘＰ部位間の相互的組換え事象を触媒する。ｌｏｘＰ配列は、動物や植物に人為的に挿入でき、ＤＮＡの正確な切除に利用できる。
【００８１】
７．モニタリング／画像化
インビボモニタリングは、例えば、生物発光画像法、プレーナーガンマカメラ画像法、ＳＰＥＣＴ画像法、光ベース画像法、磁気共鳴画像法および分光法、蛍光画像法（特に近赤外線）、拡散光トモグラフィ、超音波検査法（非標識ミクロバブル造影、および標識ミクロバブル造影を含む）、ＰＥＴ画像法、蛍光相関分光法、インビボ２光子顕微鏡法、光干渉トモグラフィ、スペックル顕微鏡法、小型分子レポーター、ナノ結晶標識法および第二高調波画像法ならびに他の方法を用いて実施できる。マソード（Ｍａｓｓｏｕｄ）らは、分子画像化技法の詳細なレビューを提供しており（Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１７：５４５−５８０頁、２００３年）、これは、分子画像法についての教示に関し、その全体が本明細書に組み込まれている。
【００８２】
ａ）放射性ヌクレオチド画像法
ポジトロン放出トモグラフィ（ＰＥＴ）により、対象内から放出される高エネルギーγ線が記録される。天然の生体分子を、その核からポジトロンを放出し、最後には、近傍の電子によって消滅して、約１８０度離れた２種の５１１，０００−ｅＶのγ線を生成させることによって、２種のγ線を生成することができるポジトロン放出同位元素によって標識できる。よく使用されるポジトロン放出同位元素としては、１５Ｏ、１３Ｎ、１１Ｃ、および１８Ｆが挙げられ、後者は水素の代替として用いられる。それよりは使用されることの少ない他のポジトロン放出物質としては、１４Ｏ、６４Ｃｕ、６２Ｃｕ，１２４Ｉ、７６Ｂｒ、８２Ｒｂ、および６８Ｇａが挙げられる。これらの同位元素の多くは、サイクロトロン（ストリジックマンズ（Ｓｔｒｉｊｃｋｍａｎｓ）、２００１年）において生成させるが、いくつかは、ジェネレーターを用いて生成させることができる（例えば、６８Ｇａ、８２Ｒｂ）。標識分子プローブ（下記参照）またはトレーサーを対象内に導入し、次いで注入分子の分散および濃縮後、ＰＥＴ画像法を用いることができる。使用されるポジトロン放出同位元素の多くは、比較的半減期が短い（例えば、１８Ｆのｔ１／２＝１１０分）ため、親分子内への同位元素の組み込みに至る化学反応およびその後の対象内への導入は、比較的速やかに生じる。
【００８３】
γ放出同位元素（例えば、９９ｍＴｃ、１１１Ｉｎ、１２３Ｉ、１３１Ｉ）もまた、生きている対象に使用でき、対象の周囲で回転させた際に（単一光子放出コンピュータトモグラフィ、ＳＰＥＣＴ）トモグラフィ画像の作製をもたらすことのできるガンマカメラを必要とする（ローゼンタール（Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ）ら、１９９５年）。
【００８４】
γ線の検出は、γ線のエネルギーを可視光に変換するシンチレーション結晶のアレイ、好適な光センサー、読取りエレクトロニクス、および画像処理ユニット（ジーグラー（Ｚｉｅｇｌｅｒ）２０００年）から構成されるシンチグラフィック機器によって達成される。互いにナノ秒内のＰＥＴにおける双方のγ線の同時検出により、空間における応答のラインが決まり、したがって、飛行の方向が決まる。ＳＰＥＣＴとは対照的に、ＰＥＴにおける放出された放射線の減衰（組織による吸収または散乱による検出器の表面に存在する事象の定量化可能な減少）は、正確に補正することができる。身体を通る合計した長さが同時ラインに沿った減衰因子を決定するからである。これを行うことによって、トレーサー分散についての定量的な情報を得ることができる。次いで、再構成ソフトウェアが、全ての角度および直線位置で測定された同時事象を用いて、走査された臓器の平面内におけるポジトロン放出放射性同位元素の所在および濃度を示す画像を再構成する。単一光子エミッターが用いられる場合、飛行の方向は幾何的コリメーションによって決定されなければならない。対象からのγ線の放出は等方性であるため、一定の予め決められた方向のγ線にデータを制限するようなコリメーションが必要である。ＳＰＥＣＴ測定とＰＥＴ測定との主な違いは、ＰＥＴの場合の電気的コリメーションに比較して、投射角度を限定するために鉛コリメーターが必要なことである。
【００８５】
ＰＥＴの感度は、１０−１１〜１０−１２モル／Ｌの範囲にあり、対象となっているレポータープローブの位置の深さとは無関係である。典型的には、レポータープローブを蓄えている数百万の細胞を、ＰＥＴスキャナーが背景に対する明確な対象物としてそれらを記録するために、比較的近接させなければならない。ＳＰＥＣＴでは、コリメーターのデザインは常に、空間分解能と感度との妥協である。すなわち、ホールのサイズの減少またはより長い中隔の使用によって空間分解能は改善するが、同時に感度は低下する。ＳＰＥＣＴにおいてコリメーターを使用すると、放射されたγ線の数の約１０−４倍のきわめて低い検出効率となる。したがって、ＰＥＴはＳＰＥＣＴよりも少なくとも対数オーダーでより高感度である。例えば、ＳＰＥＣＴとＰＥＴの双方のシステムにおいて、１ｃｍの分解能を仮定すると、ヒトの脳における９９ｍＴｃ標識トレーサーを画像化するためにデザインされたトリプルヘッドＳＰＥＣＴシステムであっても、ＰＥＴより感度が１５倍低い（ブジンガー（Ｂｕｄｉｎｇｅｒ）、１９９６年）。感度の限界を克服することが意図され、また、利用できる臨床システムに適合させることもできるＰＥＴの一代替物は、報告によると、１．７ｍｍという高さの空間分解能を有する、小動物画像化用の「ピンホールＳＰＥＣＴ」である。マイクロピンホールアパーチャーおよび１２５ＩＳＰＥＣＴ画像化によって、さらに高い分解能（２００μｍ）が可能である（ビークマン（Ｂｅｅｋｍａｎ）ら、２００２年）。
【００８６】
ＰＥＴスキャナーからの画像は、色で示されることが多いが、同一エネルギーγ線事象を反映し、色スケールは通常、身体の種々の場所における同位元素の濃度を反映している。たいていの臨床ＰＥＴスキャナーの空間分解能は、〜（６〜８）３ｍｍ３であるが、〜３３ｍｍ３の分解能に近づいているより高い分解能の臨床的脳スキャナーが開発されている。
【００８７】
小動物マイクロＰＥＴスキャナーもまた開発されている。これらのシステムは、典型的に、〜１３ｍｍ３の空間分解能を有する（チェリー（Ｃｈｅｒｒｙ）およびガンビール（Ｇａｍｂｈｉｒ）、２００１年）。ＰＥＴによる分子画像化アッセイは、世界中の確立された臨床ＰＥＴセンターで同じレポータープローブを用いる前に、細胞培養および小動物モデルにおいてそれらを検証することができるため、その開発は特に有益である。前臨床動物モデルを設定した細胞培養から臨床適用への翻訳的研究を実施できることは、ＰＥＴ技法の最もユニークで強力な特徴の１つである（チェリー（Ｃｈｅｒｒｙ）およびガンビール（Ｇａｍｂｈｉｒ）（２００１）、ルーカー（Ｌｕｋｅｒ）およびピューニカ−ウォームズ（Ｐｉｗｎｉｃａ−Ｗｏｒｍｓ）（２００１）、プライス（Ｐｒｉｃｅ）（２００１）、リーダーおよびツワイト（Ｒｅａｄｅｒ  ａｎｄ  Ｚｗｅｉｔ）（２００１）、およびチャトジーオノウ（Ｃｈａｔｚｉｉｏａｎｎｏｕ）（２００２））。
【００８８】
ｂ）光学的画像化法
光学的画像化法は、分子生物学および細胞生物学におけるインビトロおよびエクスビボ適用を目的に開発されている（例えば、蛍光顕微鏡および生物発光用の市販の基質キットを用いたベンチトップ発光法）。光子による非侵襲的インビボ画像法へ向けてのこのコンセプトの拡張により、生きている対象から関連した生物学的情報を引き出すことが可能になる（ワイスレーダー（Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ）、２００１年）。
【００８９】
生きている対象の光学的画像化法における基本的問題は、身体から放出される光をいかに検出するかということであり、これは生物発光画像法と蛍光画像法の双方に関連する。これに関して、きわめて低レベルの可視光を画像化しるためのいくつかの技術的進歩が見られており、生きている対象における高感度の、また、細胞培養物および透過小動物に限定されない検出器の使用を可能にしている。荷電結合素子（ＣＣＤ）検出器はコンピュータのシリコンチップ作製に用いられる技法と同様な技法を用いて集積回路組立て用に薄いシートにスライスされたシリコン結晶から作製される（スピベイ（Ｓｐｉｂｅｙ）ら、（２００１））。シリコンベース検出器の特性の１つは、それらが光に対して高感度であり、可視光から近赤外線の範囲の光を検出することを可能にしていることである。ＣＣＤカメラは、ＣＣＤ画素に当たる４００ｎｍから１０００ｎｍの間の波長の光子をほんの２〜３ｅＶのエネルギーで（容易にＣＣＤチップを横断すると考えられるＰＥＴでの５１１ｅＶの高エネルギーγ線に対して）電子に変換することにより作動する。ＣＣＤは、１つのアウトプットが隣のインプットとして働くように接続されている半導体を含む。この方法で、入光子の強度に相当する電荷パターンがＣＣＤに読み取られ、ＣＣＤ端部のアウトプット記録装置および増幅器に入ってデジタル化される。生物発光画像法では、ＣＣＤカメラは遮光検体チャンバーに据え付け、低温冷蔵ユニット（１２０℃から１５０℃にカメラを冷却するため）に取り付けることができる。データの捕捉および解析のために、コンピュータシステムに連結させたカメラ制御器が用いられる。生物発光画像は、オーバーレイおよび画像解析のソフトウェアを用いて、小動物の灰色スケール写真画像上に重ね合わせたカラー画像として示すことができる。対象となっている領域は、シグナル強度の領域上を手動で選択し、最大強度または平均強度は、１ステラジアン当り、１平方センチメートル当り、１秒当りの光子として記録される（ステラジアンは、立体角の単位である；ウー（Ｗｕ）ら、２００１年）。
【００９０】
光学的生物発光画像法の主な利点は、放出された光は実際に背景フリーであるため、きわめて低レベルのシグナルの検出に使用できることである（下記を参照）。それは迅速容易に実施され、生きている実験モデルにおける生物学的仮説の試験および原理の証明を迅速に行うことを可能にする。また、その操作の容易さ、捕捉時間の短さ（典型的には１０〜６０秒）、および６匹以上の生きている麻酔マウスの同時測定の可能性のため、ハイスループット画像化にとってユニークな好適性を有している（ヴーイジス（Ｖｏｏｉｊｓ）ら、２００２年）。
【００９１】
蛍光画像法では、ある波長の励起光（３９５ｎｍ〜６００ｎｍの可視光領域の）が生きている対象を照射し、ＣＣＤカメラ（ゴールデンおよびリグラー（Ｇｏｌｄｅｎ  ａｎｄ  Ｌｉｇｌｅｒ）、２００２年）がシフトした波長の放射光を集める。この方法に引き続き、細胞を、蛍光標識された抗体でタグ化するか、または緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子（またはその変異体；リッピンコット−シュワルツ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ−Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ら、２００１年；レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）、２００２年）の発現が導入される。ＧＦＰはクラゲ、Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａのタンパク質である。野生型ＧＦＰは、紫（３９５ｎｍ）光によって励起されると緑色（５０９ｎｍ）を放射する。変異体ＥＧＦＰは、長波長へシフトした励起スペクトルを有し、増強した（３５倍）輝度を有する。マウスの腹膜腔における１０００から１０，０００の蛍光標識細胞をその外部表面上に画像化できる（カネコ（Ｋａｎｅｋｏ）ら、２００１年）。蛍光画像法の２つの主な利点は、生きた、および固定された細胞／組織双方においてレポーターとして使用でき、その可視化に基質を必要としないことである（スパーゲル（Ｓｐｅｒｇｅｌ）、２００１年）。この単純な反射タイプの蛍光画像法は、これらのアプローチの実行可能性の試験および開発に広く用いられている（カミヤマ（Ｋａｍｉｙａｍａ）ら、２００２年；Ｘ．リー（Ｘ．Ｌｉ）ら、２００２年）。
【００９２】
可視光領域の蛍光画像法とは対照的に、７００〜９００ｎｍ領域の近赤外（ＮＩＲ）スペクトルの使用により、組織透過性が最大化され、非標的組織からの自己蛍光が最少化される（ワイスレーダー（Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ）、２００２年）。これは、可視光および赤外光それぞれのおもな吸収物質であるヘモグロビンと水がＮＩＲ領域で最低の吸収係数を有するからである。親和性分子（ペプチド、抗体）に結合させることができるか、または活性化させることのできるいくつかのＮＩＲ蛍光色素が入手できる（リン（Ｌｉｎ）ら、２００２年）。
【００９３】
より深部の構造の蛍光画像法への他のアプローチでは、蛍光媒介トモグラフィが用いられる（ニジアクリストスおよびワイスレーダー（Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ）、２００２年；ニジアクリストス（Ｎｔｚｉａｃｈｒｉｓｔｏｓ）ら、２００２年）。対象を異なる光源からの連続波またはパルス波に曝露し、画像化チャンバー内に空間的に規定された順序で配置された検出器が放出光を捕捉する。この情報の数学的処理によって、再構成されたトモグラフィ画像が生じる。生じた画像は、１〜２ｍｍの分解能を有し、蛍光色素の検出閾値はナノモルの領域にある。
【００９４】
ｃ）磁気共鳴画像法
ＭＲＩの基礎をなす基本的な原理は、磁気双極子と呼ばれる不対核スピン（水および有機化合物中の水素原子など）が、磁場に置かれるとそれ自体で整列することである。ＭＲＩスキャナーには、調査下の対象の周囲に磁場を生み出す強力な磁石がある。また、磁石の中には、Ｘ、Ｙ、およびＺ方向に磁場の勾配を生じさせる「コイル」も存在する。また磁石は、スピンの整列を変化させる一時的な高周波パルスを生じさせることのできる高周波コイルも含む。パルスの後に、磁気双極子はそれらのベースライン配向に戻り、それが（やはり高周波コイルによって）電磁気束（１〜１００ＭＨｚ領域の高周波）の変化として検出される。このスキャナーの機能は、これらの双極子がそれらのベースライン配向に弛緩する速度を測定することであり、この測定値はＭＲシグナルに翻訳される。異なる物理化学的環境にある双極子は異なる弛緩時間を有し、したがって、異なるＭＲシグナルを生じる（ジャコブスおよびチェリー（Ｊａｃｏｂｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｒｙ）、２００１年）。例えば、脂肪または炭水化物に富んだ環境にある双極子は、水性環境にある双極子よりも著しく短い（２０×まで）弛緩時間を有する（ホルナック（Ｈｏｒｎａｃｋ）、２００２年）。これはＭＲＩで画像コントラストが得られる主要な方法の１つである。パルス励起のタイミングパラメーターおよび記録は、中央コンピュータによって変化させることができ、種々のタイプの磁気コントラストを有する画像が生じる。タイミングパラメーターに最も多く用いられる２つは、Ｔ１およびＴ２強調として知られている。ＭＲＩは軟組織の違いおよび異常にきわめて高感度である（レーウィン（Ｌｅｗｉｎ）ら、１９９９年；シャハラバニー（Ｓｈａｈａｒａｂａｎｙ）ら、２００１年；ソング（Ｓｏｎｇ）ら、２００２年）。シグナルの違いを増強するために、また、異常をさらに強調するために、これらの異常近辺のＭＲシグナル強度を変化させる化学的試剤の添加もまた使用できる。特に、キレート化したガドリニウムまたはジスプロシウムなどの常磁性金属カチオン、または超常磁性ナノ粒子（ムーア（Ｍｏｏｒｅ）ら、１９９７年、２０００年；ワイスレーダー（Ｗｅｉｓｓｌｅｄｅｒ）ら、１９９７年ａ；ツレシェク（Ｔｕｒｅｔｓｃｈｅｋ）ら、２００１年）を、この方法において、区画化、標的化、またはスマート化されたプローブとして使用できる。新規造影剤の開発は、臨床研究と基礎研究の双方において活発な領域である。
【００９５】
マウス画像化のＭＲＩ法の新たな展開は、磁気共鳴顕微鏡のものである。これによって、１１０μｍ（１×１０−３ｍｍ３）の小ささの等方的な三次元空間分解能および２５μｍ（１．６×１０−５ｍｍ３）の小ささの単離臓器中空間分解能で、潅流固定死マウス全体の非破壊的画像が可能になる（「可視化マウス」アトラスプロジェクト；ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）ら、２００２年）。
【００９６】
より大きな機能的解析のための標準的ＭＲＩ法の変型としては、組織の顕微鏡的挙動（高分子の存在、膜の存在と膜透過性、細胞内水−細胞外水の平衡）についての情報を得るために水分子の翻訳移動性を利用する拡散強調ＭＲＩ；それらの血液動態をモニタリングするための内在性および外来性レポータープローブを利用する灌流強調ＭＲＩが挙げられる。
【００９７】
画像化に磁気共鳴を使用する他の例は、少量のサンプルまたは組織によって吸収される特定の共鳴周波数からなる特徴的な画像スペクトルが磁気共鳴に供した組織から得られる磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）である。これらのスペクトルは、サンプルまたは組織の化学組成または「分子」組成に依存する。ＭＲＳ用に最も有用な核は、水素、リン、ナトリウム、および使用範囲はそれより少ないが炭素である。水素ＭＲＳは、シグナル対ノイズ比がより大きく、リンの分光法よりも良好な空間分解能を有する。生きている対象における最も興味深いＭＲスペクトル成分は、代謝物およびアミノ酸のものであり、例えば、コリン、クレアチン、Ｎ−アセチルアスパルテート（ＮＡＡ）、ラクテート、ミオイノシトール、グルタミンおよびグルタメート、脂質、ロイシン、およびアラニンである（カスチロ（Ｃａｓｔｉｌｌｏ）ら、１９９６年）。たいていの代謝物の濃度は典型的に、組織内の水または脂肪のシグナルの濃度未満の大きさのオーダーである。したがって、代謝物の１Ｈ分光法を実施した際、水および脂肪の１Ｈ  ＭＲＩシグナルは抑制されなければならない。分子画像法におけるＭＲＳの新たな適用がある。例えば、ステグマン（Ｓｔｅｇｍａｎ）ら（１９９９年）は、腫瘍におけるシトシンデアミナーゼ導入遺伝子の発現をモニタリングする実行可能性を実証するために、マウスにＭＲＳを用いている。神経筋疾患のマウスモデルにおける遺伝子療法をモニターするためにＭＲＳを用いたマウス筋肉における遺伝子発現の非侵襲的測定もまた開発されている（フレイテス（Ｆｒａｉｔｅｓ）ら、２００２年）。
【００９８】
ｄ）コンピュータトモグラフィ画像法
Ｘ線が身体を通過する際に、成分組織のＸ線吸収が異なる場合、コンピュータトモグラフィー（ＣＴ）で画像が得られる（デンディおよびヒートン（Ｄｅｎｄｙ  ａｎｄ  Ｈｅａｔｏｎ）、１９９９年）。３０〜５０ｋＶｐの低エネルギー（すなわち、臨床用ＣＴスキャナーよりかなり低エネルギーの）Ｘ線源および検出器が動物の周囲を回転し、容積データを獲得する。画像の質を最適化するために、大抵のマウスＣＴ画像は、高分解能蛍光体スクリーン／ＣＣＤ検出器によって集められる。１００μｍの分解能でマウス全体のスキャンに約１５分かかる。より長いスキャニング時間によってより高い分解能（５０μｍ）の画像を得ることができる。当該使用では、コンピュータトモグラフィはそれ自体が「分子」画像化法ではなく、その代わり、小動物の解剖学的画像化に専用高分解能マイクロＣＴスキャナーが利用でき（ポーラス（Ｐａｕｌｕｓ）ら、２００１年；バーガー（Ｂｅｒｇｅｒ）ら、２００２年；ホールズワースおよびソーントン（Ｈｏｌｄｓｗｏｒｔｈ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ）、２００２年）、それゆえ、上記で検討した他のモダリティーによって得られた機能情報が補足される。
【００９９】
ｅ）他の画像化モダリティー
超音波検査法では、超音波画像は、皮膚に対して置かれたトランスデューサーから高周波（＞２０ｋＨｚ）音波が放出され、その超音波が検査下の内部臓器から反射される際に超音波画像が得られる。得られる画像のコントラストは、使用される画像化演算法、後方散乱、音波の減衰、および音波速度に依存する。７．５〜１５ＭＨｚの周波数範囲で作動される診断用超音波計測を用いた超音波検査法が、種々のマウスモデルに首尾よく適用されており（ターンブルおよびフォスター（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ）、２００２年）、３００〜５００μｍの空間分解能で画像が得られている。マウスのマイクロ画像化および表現型解析に利用できるモダリティーのスペクトルにおける超音波検査の役割は、臨床的画像化における現在の役割と密接に並行している。心臓、産科、血管、および腹部の画像化における超音波の強度は、高分解能および現在の臨床用超音波システムで得られるものと同様の実用性／機能性のレベルを達成するためにこの技法をスケールダウンすれば、マウスに拡張される可能性が高いと思われる。超音波のリアルタイム性は、画像誘導注入操作におけるその適用もまた促進しており、正常な、および障害のある発生を研究する場合にマウス胎仔を子宮内で直接操作することを可能にしている。胎仔期および出生後早期における小さな解剖学的構造のこの可視化は、「超音波生体顕微鏡」：近顕微鏡分解能（５０〜１００μｍ；ターンブルおよびフォスター（Ｔｕｒｎｂｕｌｌ  ａｎｄ  Ｆｏｓｔｅｒ）、２００２年）を有する、生きている生体組織を画像化するための高周波（２０〜１００ＭＨｚ）パルス−エコー超音波法を用いて可能である。また、この方法により、非侵襲的血液速度測定および微小循環マッピングのためのカラードップラー画像化が可能になる。
【０１００】
他の実施形態は、特定の細胞表面受容体、特に血管コンパートメント内の分子画像法のために標的化超音波造影剤を使用するものである（ランザおよびウィックリン（Ｌａｎｚａ  ａｎｄ  Ｗｉｃｋｌｉｎｅ）、２００１年）。例えば、ブタの頚動脈内の平滑筋細胞による組織因子の血管形成誘導発現を、リガンド標的化音波ナノ粒子系によって確認できる。組織因子標的化乳剤は、オーバーストレッチ平滑筋細胞に結合し、それらのエコー促進性およびグレースケールレベルを増加させることが判明している（ランザ（Ｌａｎｚａ）ら、２０００年）。
【０１０１】
全身オートラジオグラフィーは、同様に小動物画像化などの動物画像化のタイプの１つである。それは、殺処置後のげっ歯類モデルにおける放射性核種トレーサーの定量化および分散試験に対して、重要な補足的役割を演じている。オートラジオグラフィーは、Ｘ線フィルムまたはデジタルプレート上での放射性同位元素の検出であり、検体が照射源である。同位元素放出により、フィルム上に潜在的画像が形成され、現像すると最終的な画像が生じる。これはマイクロＰＥＴ試験の最後に実施されることが多く、ＰＥＴ画像やデータを比較する基準を提供する（ガンビール（Ｇａｍｂｈｉｒ）ら、１９９８年）。殺処置した動物をカルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）中で凍結させ、マイクロトームを用いて全身の切片（２０〜４５μｍ）を得る。切片を−２０℃で凍結乾燥し、曝露用Ｘ線フィルム上に置く。異なる放射性核種は曝露効率が変わるため、異なる曝露が必要である。オートラジオグラフィーは、広範囲の空間分解能を有し、マイクロオートラジオグラフィーは、分解能が０．０５μｍまでを有し、細胞内または細胞間のトレーサーの位置決めをするために使用される。マクロオートラジオグラフィー（全身オートラジオグラフィー）は、約５０μｍの分解能を有し、組織中のトレーサー濃度を判定するために使用される。定量的データは、参照として同位元素スケールを用い、デンシトメトリーによって得ることができる。
【０１０２】
ｆ）複数モダリティー画像化法
コンピュータソフトウェアにより、ＣＴまたはＭＲＩからの高分解能解剖学的画像は、同じ対象の生理学的／機能的に報知的なＰＥＴ画像に数学的に登録して、二重モダリティー画像を生じさせることができる。（タウンゼント（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）、２００１年；タウンゼントおよびチェリー（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｒｙ）、２００１年）。また、臨床用ＣＴ／ＰＥＴスキャナーと同じ様式で、同一のスキャナーに異なるモダリティーを組み込み、したがって集積された小動物計測も考慮されている（タウンゼント（Ｔｏｗｎｓｅｎｄ）、２００１年）。例えば、放射性核種と磁気プローブの組み合わせにより、ＭＲＩとＰＥＴの同時に近い画像化が可能になる（実施例９）。光学的方法、放射性核種法、ＭＲＩ法、およびＣＴ法、ならびに特にデザインされた二重目的プローブ（ボグダノフ（Ｂｏｇｄａｎｏｖ）ら、１９９８年；ジョセフソン（Ｊｏｓｅｐｈｓｏｎ）ら、２００２年）の他の組み合わせによっても複数モダル画像が生じる。
【０１０３】
Ｃ．組成物
開示された組成物の調製に使用される成分、ならびに本明細書に開示された方法の範囲内で使用される組成物自体が開示される。これらおよび他の材料が本明細書に開示され、当然のことながら、これらの化合物の種々の各個物ならびに集合的組み合わせおよび置換の特定の記述が特に開示されていなくても、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群などが開示されている場合は、各々が具体的に考慮され、本明細書に記載されることが認識される。例えば、ある特定の核酸が開示され、検討され、ヌクレオチドなどの多くの分子になし得る多くの修飾が検討されている場合は、ヌクレオチドの各々の組み合わせおよび置換ならびに可能な修飾が、特に反対に指示されない限り、具体的に考慮されている。したがって、Ａ、Ｂ、およびＣの分子のクラスが開示され、ならびにＤ、Ｅ、Ｆの分子のクラスおよび分子の組み合わせの一例、Ａ−Ｄが開示されている場合、たとえ各々が個々に記述されていなくても、各々が個々におよび集合的に考慮されており、Ａ−Ｅ、Ａ−Ｆ、Ｂ−Ｄ、Ｂ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、Ｃ−Ｄ、Ｃ−Ｅ、およびＣ−Ｆの組み合わせが開示されていることを意味している。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた開示されている。したがって、例えば、Ａ−Ｅ、Ｂ−Ｆ、およびＣ−Ｅのサブ群が開示されていると考えられる。このコンセプトは、限定はしないが、開示された組成物の作製法および使用法におけるステップなどの本適用の全ての態様に適用される。したがって、実施できる種々の追加のステップが存在する場合、これらの追加ステップの各々が、開示された方法の任意の特定の実施形態または実施形態の組み合わせによって実施できることが認識される。
【０１０４】
１．相同性／同一性
任意の公知の変異体および誘導体または本明細書に開示された遺伝子およびタンパク質から生じたものを確定する１つの方法は、特定の公知の配列に対する相同性に関する確定によることが認識される。例えば、配列番号：１は、特定の標的化ベクターの特定の配列を記載している。公表された配列に対して、少なくとも７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９パーセントの相同性を有する、これらの変異体ならびに本明細書に開示された他の遺伝子およびタンパク質が具体的に開示される。ベクターなどの２種のタンパク質または核酸の相同性の判定法は、当業者によって容易に認識される。例えば、相同性が最高レベルになるように２つの配列のアラインメントをした後に相同性を算出できる。
【０１０５】
相同性算出の他の方法は、公開された演算法によって実施できる。比較のための配列の最適なアラインメントは、スミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、ニードルマンおよびウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ピアソンおよびリップマン（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性方法の探索によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ実施により（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、ジェネティックス・コンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、マジソン、ウィスコンシン州）または検定により実施できる。
【０１０６】
核酸に関して同じタイプの相同性が、例えば、ズーカー，Ｍ．（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２頁、１９８９、イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０頁、１９８９年、イェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６頁、１９８９年、に開示された演算法によって得ることができ、これらは少なくとも核酸アラインメントに関する材料に関して、参照として本明細書に組み込まれている。
【０１０７】
２．ハイブリダイゼーション／選択的ハイブリダイゼーション
用語のハイブリダイゼーションとは、典型的には、プライマーまたはプローブおよび遺伝子などの少なくとも２種の核酸分子の間の配列駆動相互作用を意味する。配列駆動相互作用とは、ヌクレオチド特異的様式で２種のヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体またはヌクレオチド誘導体の間に生じる相互作用を意味する。例えば、Ｃと相互作用するＧ、またはＴと相互作用するＡは配列駆動相互作用である。典型的に、配列駆動相互作用は、ヌクレオチドのワトソン−クリック面またはフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）面に生じる。２種の核酸のハイブリダイゼーションは、当業者に公知の多数の条件およびパラメーターに影響される。例えば、反応の塩濃度、ｐＨ、および温度は全て、２種の核酸がハイブリダイズするかどうかに影響を及ぼす。
【０１０８】
２種の核酸分子間の選択的ハイブリダイゼーションに関するパラメーターは、当業者に十分知られている。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーション条件はストリンジェントなハイブリダイゼーション条件として規定することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、ハイブリダイゼーションステップと洗浄ステップのいずれかまたは双方の温度と塩濃度双方によって制御される。例えば、選択的ハイブリダイゼーションを達成するハイブリダイゼーションの条件は、Ｔｍ（分子の半分がそれらのハイブリダイゼーション相手から解離する融解温度）から約１２〜２５℃低い温度での高イオン強度溶液（６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ）におけるハイブリダイゼーション、それに引き続き、洗浄温度がＴｍより約５℃から２０℃低くなるように選択された温度と塩濃度の組合せにおける洗浄を含み得る。温度および塩条件は、フィルター上に固定された参照ＤＮＡのサンプルを、対象となっている標識核酸にハイブリダイズし、次いで種々のストリンジェンシーの条件下で洗浄する予備的実験において、実験的に容易に決定される。ハイブリダイゼーション温度は、ＤＮＡ−ＲＮＡおよびＲＮＡ−ＲＮＡのハイブリダイゼーションでは典型的により高い。ストリンジェンシーを達成するには、上記の条件を使用できるか、または当業界に公知である。（サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールドスプリングハーバー・ラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、コールドスプリングハーバー、ニューヨーク、１９８９年；クンケル（Ｋｕｎｋｅｌ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１９８７年：１５４：３６７頁、１９８７年。これらは、少なくとも核酸のハイブリダイゼーションに関する材料については、参照として本明細書に組み込まれている）。ＤＮＡ：ＤＮＡのハイブリダイゼーションに関する好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、６×ＳＳＣまたは６×ＳＳＰＥ中、約６８℃で（水性溶液中）行った後、６８℃で洗浄する。ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の場合、所望の相補性の程度が低下するにつれ、さらに、変動性が探索されるいずれかの領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依って減少させることができる。同様に、ハイブリダイゼーションおよび洗浄のストリンジェンシーは、所望の場合、所望の相同性が増加するにつれ、さらに、高い相同性が所望されるいずれかの領域のＧ−ＣまたはＡ−Ｔの豊富さに依って増加させることができ、当業界で全て知られている通りである。
【０１０９】
選択的ハイブリダイゼーションを確定する他の方法は、核酸の１つが他の核酸に結合した量（パーセンテージ）を調べることによる。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントの限定的核酸が非限定的核酸に結合する場合のものとなる。典型的に、非限定的プライマーは、例えば、１０倍または１００倍または１０００倍過剰である。このタイプのアッセイは、限定的および非限定的プライマー双方が例えば、それらのｋｄより１０倍または１００倍または１０００倍低いか、または核酸分子の１つだけが、それらのｋｄより１０倍または１００倍または１０００倍高いか、または核酸分子の１つまたは双方がそれらのｋｄより高い条件下で実施できる。
【０１１０】
選択的ハイブリダイゼーションを確定する他の方法は、所望の酵素操作を促進するためにハイブリダイゼーションが必要とされる条件下で、酵素操作されるプライマーのパーセンテージを調べることによる。例えば、いくつかの実施形態において、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントのプライマーが酵素操作を促進する条件下で酵素操作される場合のものとなり、例えば、酵素操作がＤＮＡの伸長の場合、選択的ハイブリダイゼーションの条件は、少なくとも約６０、６５、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００パーセントのプライマー分子が伸長されるものとなる。好ましい条件はまた、操作を行う酵素にとって適切であるとして製造元により提案されたもの、または当業界で指示されたものを含む。
【０１１１】
相同性のみに関しては、２種の核酸間のハイブリダイゼーションのレベルを判定するための、本明細書に開示された種々の方法があることが認識される。これらの方法および条件によって、２種の核酸間に異なるパーセンテージのハイブリダイゼーションを提供できることは当然であるが、別に指示しない限り、いずれかの方法のパラメーターに合致させることで十分であると考えられる。例えば、８０％のハイブリダイゼーションが必要とされ、ハイブリダイゼーションがこれらの方法のいずれか１つにおいて必要とされるパラメーターの範囲内で生じる限り、本明細書に開示されていると考えられる。
【０１１２】
当然のことながら、ある組成物または方法が集合的にまたは単独に、ハイブリダイゼーションを判定するためのこれらの基準のいずれかに合致するならば、本明細書に開示された組成物または方法であることは当業者によって認識される。
【０１１３】
３．核酸
例えばベクターなど、核酸ベースの種々の分子が本明細書に開示されている。開示された核酸は、例えば、ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、またはヌクレオチド代替物から構成される。これらおよび他の分子の非限定的例が本明細書で検討されている。例えば、ベクターが細胞内で発現する場合、発現したｍＲＮＡは典型的に、Ａ、Ｃ、Ｇ、およびＵから構成されることが認識される。同様に、例えば、アンチセンス分子が、例えば外来性送達によって細胞または細胞環境に導入される場合、このアンチセンス分子は、細胞環境におけるアンチセンス分子の分解を減少させるヌクレオチド類縁体から構成されることが有利である。
【０１１４】
ａ）ヌクレオチドおよび関連分子
ヌクレオチドは、塩基部分、糖部分およびリン酸部分を含有する分子である。ヌクレオチドは、それらのリン酸部分および糖部分を介して共に結合することができ、ヌクレオシド間結合を作り出す。ヌクレオチドの塩基部分は、アデニン−９−イル（Ａ）、シトシン−１−イル（Ｃ）、グアニン−９−イル（Ｇ）、ウラシル−１−イル（Ｕ）、およびチミン−１−イル（Ｔ）であり得る。ヌクレオチドの糖部分は、リボースまたはデオキシリボースである。ヌクレオチドのリン酸部分は５価のリン酸である。ヌクレオチドの非限定例は、３’−ＡＭＰ（３’−アデノシン一リン酸）または５’−ＧＭＰ（５’−グアノシン一リン酸）である。
【０１１５】
ヌクレオチド類縁体は、塩基、糖、またはリン酸部分のいずれかに何らかのタイプの修飾を含むヌクレオチドである。ヌクレオチドに対する修飾は当業界に十分知られており、例えば、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、および２−アミノアデニンならびに糖またはリン酸部分における修飾が挙げられる。
【０１１６】
ヌクレオチド代替物は、ヌクレオチドと類似した機能特性を有するが、リン酸部分を含有しない、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などの分子である。ヌクレオチド代替物は、ワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）またはフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）様式で核酸を認識するが、リン酸部分以外の部分を介して共に結合される分子である。ヌクレオチド代替物は、適切な標的核酸と相互作用すると、二重らせん型構造になることができる。
【０１１７】
また、例えば、細胞への取り込みを増強させるために、他のタイプの分子（結合体）をヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体に結合させることも可能である。結合体は、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体に化学的に結合させることができる。このような結合体としては、限定はしないが、コレステロール部分などの脂質部分が挙げられる（レッツィンガー（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、１９８９年、８６、６５５３−６５５６頁）。
【０１１８】
ワトソン−クリック相互作用は、ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、またはヌクレオチド代替物のワトソン−クリック面との少なくとも１つの相互作用である。ヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、またはヌクレオチド代替物のワトソン−クリック面は、プリンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、またはヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ１、およびＣ６位、およびピリミジンベースのヌクレオチド、ヌクレオチド類縁体、またはヌクレオチド代替物のＣ２、Ｎ３、およびＣ４位を含む。
【０１１９】
フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）相互作用は、二重鎖ＤＮＡの大きい溝に曝露されている、ヌクレオチドまたはヌクレオチド類縁体のフーグスティーン面に生じる相互作用である。フーグスティーン面は、プリンヌクレオチドのＣ６位にＮ７位および反応性基（ＮＨ２またはＯ）を含む。
【０１２０】
ｂ）配列
例えば、配列番号：１に関する種々の配列、ならびにジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）に開示され、本明細書に開示された他の任意のタンパク質が存在し、これらの配列および他の配列は、それらに含有される個々の部分配列と同様に、参照として、それらの全体が本明細書に組み込まれている。
【０１２１】
種々の配列が本明細書に提供されており、これらおよび他のものは、ｗｗｗ．ｐｕｂｍｅｄ．ｇｏｖ．で、ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）において見ることができる。当業者は、配列の不一致および差異の分析方法およびある特定の配列に関する組成物および方法を、他の関連配列に対して調整する方法を認識している。本明細書に開示され、当業界で公知の情報が与えられている任意の配列に関するプライマーおよび／またはプローブをデザインすることができる。
【０１２２】
ｃ）プライマーおよびプローブ
本明細書に開示された遺伝子と相互作用することができるプライマーおよびプローブなどの組成物が開示される。一定の実施形態において、プライマーは、ＤＮＡ増幅反応を助けるために使用される。典型的には、プライマーは、配列特異的様式で伸長できる。配列特異的様式におけるプライマーの伸長は、該プライマーがハイブリダイズされるか、または結合される核酸分子の配列および／または組成物が、該プライマーの伸長によって生じる生成物の組成物または配列を指示するか影響を及ぼす任意の方法を含む。したがって、配列特異的様式におけるプライマーの伸長は、限定はしないが、ＰＣＲ、ＤＮＡシークエンシング、ＤＮＡ伸長、ＤＮＡポリメリゼーション、ＲＮＡの転写または逆転写を含む。配列特異的様式でプライマーを増幅する方法および条件が好ましい。一定の実施形態において、プライマーは、ＰＣＲまたは直接的シークエンシングなどのＤＮＡ増幅反応に使用される。一定の実施形態において、例えば、プライマーの伸長に用いられるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが化学反応して、配列特異的様式で該プライマーを伸長させるように、ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドが修飾される非酵素的方法を用いてプライマーを伸長させることもできることが認識される。典型的には、開示されたプライマーは、核酸または核酸の領域にハイブリダイズするか、またはそれらは核酸の相補体または核酸の領域の相補体とハイブリダイズする。
【０１２３】
ｄ）機能性核酸
機能性核酸は、標的分子との結合または特定反応の触媒などの特定の機能を有する核酸分子である。機能性核酸分子は、限定の意図はないが、以下のカテゴリーに分けることができる。例えば、機能性核酸としては、アンチセンス分子、アプタマー、リボザイム、三重体形成分子、および外部ガイド配列（ＥＧＳ）が挙げられる。機能性核酸分子は、標的分子が有する特定活性のアフェクター、阻害物質、モジュレーター、および刺激物質として作用できるか、または機能性核酸分子は、他の任意の分子に依存しないデノボ活性を有し得る。
【０１２４】
カノニカルまたは非カノニカル塩基対のいずれかにより標的核酸分子と相互作用するアンチセンス分子をデザインできる。例えば、ＲＮａｓｅＨに媒介されたＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッド分解による標的分子の破壊を促進するために、アンチセンス分子と標的分子との相互作用がデザインされる。あるいは、標的分子上に通常生じる転写または複製などの処理機能を妨害するためにアンチセンス分子がデザインされる。アンチセンス分子は、標的分子の配列に基づいてデザインできる。標的分子が最も接近できる領域を見出すことによるアンチセンス効率の最適化を目的とする多数の方法が存在する。典型的方法は、インビトロ選択実験およびＤＭＳおよびＤＥＰＣを用いたＤＮＡ修飾試験が考えられる。アンチセンス分子は、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２以下の解離定数（ｋｄ）で標的分子に結合することが好ましい。アンチセンス分子のデザインおよび使用を助ける方法および技法の代表的な実例は、以下の米国特許明細書：米国特許第５，１３５，９１７号明細書、米国特許第５，２９４，５３３号明細書、米国特許第５，６２７，１５８号明細書、米国特許第５，６４１，７５４号明細書、米国特許第５，６９１，３１７号明細書、米国特許第５，７８０，６０７号明細書、米国特許第５，７８６，１３８号明細書、米国特許第５，８４９，９０３号明細書、米国特許第５，８５６，１０３号明細書、米国特許第５，９１９，７７２号明細書、米国特許第５，９５５，５９０号明細書、米国特許第５，９９０，０８８号明細書、米国特許第５，９９４，３２０号明細書、米国特許第５，９９８，６０２号明細書、米国特許第６，００５，０９５号明細書、米国特許第６，００７，９９５号明細書、米国特許第６，０１３，５２２号明細書、米国特許第６，０１７，８９８号明細書、米国特許第６，０１８，０４２号明細書、米国特許第６，０２５，１９８号明細書、米国特許第６，０３３，９１０号明細書、米国特許第６，０４０，２９６号明細書、米国特許第６，０４６，００４号明細書、米国特許第６，０４６，３１９号明細書、および米国特許第６，０５７，４３７号明細書の非限定的リストに見ることができる。
【０１２５】
アプタマーは、標的分子と、好ましくは特異的方法で相互作用する分子である。典型的に、アプタマーは、ステム−ループまたはＧカルテットなどの規定された二次および三次構造に折りたたまれる、１５〜５０塩基長の範囲の小型核酸である。アプタマーは、ＡＴＰ（米国特許第５，６３１，１４６号明細書）およびテオフィリン（米国特許第５，５８０，７３７号明細書）などの小型分子、ならびに逆転写酵素（米国特許第５，７８６，４６２号明細書）およびトロンビン（米国特許第５，５４３，２９３号明細書）などの大型分子と結合することができる。アプタマーは、１０−１２Ｍ未満のｋｄで標的分子ときわめて緊密に結合することができる。アプタマーは、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のｋｄで標的分子と結合することが好ましい。アプタマーは、きわめて高い程度の特異性で標的分子と結合することができる。例えば標的分子と他の分子との間の結合親和性の１００００倍超の違いを有する、分子上の位置が単に１つだけ異なるアプタマーが単離されている（米国特許第５，５４３，２９３号明細書）。アプタマーは、背景結合分子とのｋｄより少なくとも１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍または１０００００倍低い標的分子とのｋｄを有することが好ましい。例えば、ポリペプチドについて比較を行う場合、背景分子は異なるポリペプチドであることが好ましい。例えば、マルトース結合タンパク質アプタマーの特異性を判定する場合、背景タンパク質は血清アルブミンであり得る。種々の異なる標的分子と結合させるアプタマーの作製法および使用法の代表例は、以下の米国特許明細書：米国特許第５，４７６，７６６号、米国特許第５，５０３，９７８号明細書、米国特許第５，６３１，１４６号明細書、米国特許第５，７３１，４２４号明細書、米国特許第５，７８０，２２８号明細書、米国特許第５，７９２，６１３号明細書、米国特許第５，７９５，７２１号明細書、米国特許第５，８４６，７１３号明細書、米国特許第５，８５８，６６０号明細書、米国特許第５，８６１，２５４号明細書、米国特許第５，８６４，０２６号明細書、米国特許第５，８６９，６４１号明細書、米国特許第５，９５８，６９１号明細書、米国特許第６，００１，９８８号明細書、米国特許第６，０１１，０２０号明細書、米国特許第６，０１３，４４３号明細書、米国特許第６，０２０，１３０号明細書、米国特許第６，０２８，１８６号明細書、米国特許第６，０３０，７７６号明細書、および米国特許第６，０５１，６９８号明細書の非限定的リストに見ることができる。
【０１２６】
リボザイムは、分子内または分子間化学反応を触媒する核酸分子である。したがって、リボザイムは、触媒的核酸である。リボザイムは、分子間反応を触媒することが好ましい。ハンマーヘッドリボザイム（例えば、限定はしないが、以下の米国特許明細書：米国特許第５，３３４，７１１号明細書、米国特許第５，４３６，３３０号明細書、米国特許第５，６１６，４６６号明細書、米国特許第５，６３３，１３３号明細書、米国特許第５，６４６，０２０号明細書、米国特許第５，６５２，０９４号明細書、米国特許第５，７１２，３８４号明細書、米国特許第５，７７０，７１５号明細書、米国特許第５，８５６，４６３号明細書、米国特許第５，８６１，２８８号明細書、米国特許第５，８９１，６８３号明細書、米国特許第５，８９１，６８４号明細書、米国特許第５，９８５，６２１号明細書、米国特許第５，９８９，９０８号明細書、米国特許第５，９９８，１９３号明細書、米国特許第５，９９８，２０３号明細書、ルドウィッヒおよびスプロート（Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  Ｓｐｒｏａｔ）による国際公開第９８５８０５８号パンフレット、ルドウィッヒおよびスプロート（Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  Ｓｐｒｏａｔ）による国際公開第９８５８０５７号パンフレット、ルドウィッヒおよびスプロート（Ｌｕｄｗｉｇ  ａｎｄ  Ｓｐｒｏａｔ）による国際公開第９７１８３１２号パンフレット）、ヘアピンリボザイム（例えば、限定はしないが、以下の米国特許明細書：米国特許第５，６３１，１１５号明細書、米国特許第５，６４６，０３１号明細書、米国特許第５，６８３，９０２号明細書、米国特許第５，７１２，３８４号明細書、米国特許第５，８５６，１８８号明細書、米国特許第５，８６６，７０１号明細書、米国特許第５，８６９，３３９号明細書、および米国特許第６，０２２，９６２号明細書）、およびテトラヒメナリボザイム（例えば、限定はしないが、以下の米国特許明細書：米国特許第５，５９５，８７３号明細書および米国特許第５，６５２，１０７号明細書）などの天然系に見られるリボザイムに基づくヌクレアーゼまたは核酸ポリメラーゼタイプ反応を触媒する多数の種々のタイプのリボザイムが存在する。また、天然系に見られないが、デノボ特異的反応を触媒するために設計される多数のリボザイムが存在する（例えば、限定はしないが、以下の米国特許明細書：米国特許第５，５８０，９６７号明細書、米国特許第５，６８８，６７０号明細書、米国特許第５，８０７，７１８号明細書、および米国特許第５，９１０，４０８号明細書）。好ましいリボザイムは、ＲＮＡまたはＤＮＡ基質を開裂し、より好ましくは、ＲＮＡ基質を開裂する。リボザイムは典型的に、引き続く開裂と共に標的基質の認識および結合を介して核酸基質を開裂する。この認識は、主としてカノニカルまたは非カノニカル塩基対相互作用に基づくことが多い。標的基質の認識が標的基質配列に基づくので、この性質により、核酸の標的特異的開裂にとってリボザイムは特に良好な候補物になる。種々の異なる反応を触媒するためのリボザイムの作製方法、および使用方法についての代表的な例としては、以下の米国特許明細書：米国特許第５，６４６，０４２号明細書、米国特許第５，６９３，５３５号明細書、米国特許第５，７３１，２９５号明細書、米国特許第５，８１１，３００号明細書、米国特許第５，８３７，８５５号明細書、米国特許第５，８６９，２５３号明細書、米国特許第５，８７７，０２１号明細書、米国特許第５，８７７，０２２号明細書、米国特許第５，９７２，６９９号明細書、米国特許第５，９７２，７０４号明細書、米国特許第５，９８９，９０６号明細書、および米国特許第６，０１７，７５６号明細書の非限定的リストに見ることができる。
【０１２７】
トリプレックス形成機能性核酸分子は、二本鎖または一本鎖核酸のいずれかと相互作用できる分子である。トリプレックス分子が標的領域と相互作用する場合、トリプレックスと呼ばれる構造が形成され、それにはワトソン−クリック（Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ）およびフーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ）双方の塩基対に依存する複合体を形成する３本鎖のＤＮＡがある。トリプレックス分子は、高親和性および特異性の標的分子を結合できるので好ましい。トリプレックス形成分子は、１０−６、１０−８、１０−１０、または１０−１２未満のｋｄで標的分子を結合することが好ましい。種々の異なる標的分子結合するためのトリプレックス形成分子を作製し、使用する方法についての代表的な例としては、以下の米国特許明細書：米国特許第５，１７６，９９６号明細書、米国特許第５，６４５，９８５号明細書、米国特許第５，６５０，３１６号明細書、米国特許第５，６８３，８７４号明細書、米国特許第５，６９３，７７３号明細書、米国特許第５，８３４，１８５号明細書、米国特許第５，８６９，２４６号明細書、米国特許第５，８７４，５６６号明細書、および米国特許第５，９６２，４２６号明細書の非限定的リストに見ることができる。
【０１２８】
外部ガイド配列（ＥＧＳｓ）は、複合体を形成する標的核酸分子を結合する分子である。この複合体は、標的分子を開裂するＲＮａｓｅ  Ｐにより認識される。ＥＧＳｓは、選択したＲＮＡ分子を特異的に標的化するためにデザインできる。ＲＮａｓｅ  Ｐは、細胞内で転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）のプロセッシングを促進する。細菌ＲＮａｓｅ  Ｐは、標的ＲＮＡ：ＥＧＳ複合体に天然のｔＲＮＡ基質を模倣させるＥＧＳを用いることにより、実質的に任意のＲＮＡ配列を開裂させるために動員できる（エール（Ｙａｌｅ）およびフォルスター（Ｆｏｒｓｔｅｒ）による国際公開第９２／０３５６６号パンフレット、およびアルトマン（Ａｌｔｍａｎ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３８：４０７−４０９頁（１９９０））。
【０１２９】
同様に、ＲＮＡの真核生物ＥＧＳ／ＲＮａｓｅ  Ｐ−特異的開裂は、真核細胞内の望ましい標的を開裂させるために利用できる（ユアン（Ｙｕａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：８００６−８０１０頁（１９９２）；エール（Ｙａｌｅ）による国際公開第９３／２２４３４号パンフレット；エール（Ｙａｌｅ）による国際公開第９５／２４４８９号パンフレット；ユアンおよびアルトマン（Ｙｕａｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｍａｎ）、  ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：１５９−１６８頁（１９９５）、およびカラーラ（Ｃａｒｒａｒａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．（ＵＳＡ）９２：２６２７−２６３１頁（１９９５））。種々の異なる標的分子の開裂を促進するためにＥＧＳ分子を作製し、使用する方法についての代表的な例としては、以下の非限定的米国特許明細書のリスト：米国特許第５，１６８，０５３号明細書、米国特許第５，６２４，８２４号明細書、米国特許第５，６８３，８７３号明細書、米国特許第５，７２８，５２１号明細書、米国特許第５，８６９，２４８号明細書、および米国特許第５，８７７，１６２号明細書に見ることができる。
【０１３０】
４．核酸送達
外因性ＤＮＡの対象の細胞への投与および取込み（すなわち、遺伝子トランスダクションまたはトランスフェクション）を含む上記の方法において開示された核酸は、裸のＤＮＡまたはＲＮＡの形態であり得るか、または核酸は、核酸を細胞に送達するためにベクター内にあり得、それによって抗体をコードするＤＮＡ断片は、通常の当業者によってよく理解されているように、プロモーターの転写調節下にある。該ベクターは、アデノウィルスベクター（カンタムバイオテクノロジーズ（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）社（Ｌａｖａｌ、Ｑｕｅｂｅｃ、カナダ国）など、市販の製剤であり得る。核酸またはベクターの細胞への送達は、種々のメカニズムを介してあり得る。一例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社Ｈｉｌｄｅｎ、独国）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（プロメガバイオテック（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ）社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）などの市販のリポソーム製剤ならびに当業界で標準的な手法に従って開発された他のリポソームを用いる、リポソームを介したものであり得る。さらに、開示された核酸またはベクターは、電気穿孔によるインビボで、ジェネトロニックス（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）から入手できるテクノロジーならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ器械（ＩｍａＲｘファーマシューティカル（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）社、Ｔｕｃｓｏｎ、アリゾナ州）の手段により送達できる。
【０１３１】
一例として、ベクター送達は、組換えレトロウィルスゲノムをパッケージできるレトロウィルスベクターシステムなど、ウィルスシステムを介してあり得る（例えば、パスタン（Ｐａｓｔａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：４４８６頁、１９８８年；ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８９５頁、１９８６年を参照）。したがって、組換えレトロウィルスは、感染させるために使用でき、それによって、広範な中和抗体（またはその活性断片）をコードする核酸を感染細胞に送達できる。変化させた核酸を哺乳動物細胞に導入する正確な方法は、もちろんレトロウィルスベクターの使用に限定されない。他の技術は、アデノウィルスベクター類（ミタニ（Ｍｉｔａｎｉ）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：９４１−９４８頁、１９９４年）、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）ベクター類（グッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）ら、Ｂｌｏｏｄ  ８４：１４９２−１５００頁、１９９４年）、レンチウィルスベクター類（ナイディーニ（Ｎａｉｄｉｎｉ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：２６３−２６７頁、１９９６年）、シュードタイプレトロウィルスベクター類（アグローアル（Ａｇｒａｗａｌ）ら、Ｅｘｐｅｒ．Ｈｅｍａｔｏｌ．２４：７３８−７４７頁、１９９６年）の使用など、本法に広く利用できる。物理的トランスダクション技術には、リポソーム送達および受容体媒介ならびに他のエンドサイトーシスメカニズムなども使用できる（例えば、シュワルツェンバーガー（Ｓｃｈｗａｒｔｚｅｎｂｅｒｇｅｒ）ら、Ｂｌｏｏｄ  ８７：４７２−４７８頁、１９９６年を参照）。この開示された組成物および方法は、任意のこれらまたは他の一般的に使用される遺伝子導入法と連結して使用できる。
【０１３２】
一例として、抗体をコードする核酸が、アデノウィルスベクターにおいて対象の細胞に送達される場合、ヒトに対するアデノウィルスの投与量は、１回の注射当り 約１０７から１０９の範囲のプラーク形成単位（ｐｆｕ）であるが、１回の注射当り１０１２と高いこともあり得る（クリスタル（Ｃｒｙｓｔａｌ）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：９８５−１００１頁、１９９７年；アルバレス（Ａｌｖａｒｅｚ）およびクリエル（Ｃｕｒｉｅｌ）、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．８：５９７−６１３頁、１９９７年）。対象に、単回注射を投与できるか、またはさらに注射が必要な場合、不定の期間および／または治療効果が確立されるまで６ヵ月間隔（または熟練医師により判定される他の適切な時間間隔）で反復できる。
【０１３３】
核酸またはベクターが必要な場合の非経口投与は、一般に注射を特徴とする。注射剤は、溶解液体または懸濁液として、注入前に液体中の懸濁溶液に好適な固体形態、または乳濁液として従来の形態で調製できる。非経口投与に関するごく最近の改定アプローチは、一定投与量が維持されるような緩効性または徐放性システムの使用を含む。例えば、本明細書に参照として組み込まれている米国特許第３，６１０，７９５号明細書を参照されたい。治療化合物の好適な製剤および投与経路についてのさらなる考察に関して、例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第１９版）、編集者Ａ．Ｒ．ゲンナロー（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）、マックパブリッシング（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ）社、Ｅａｓｔｏｎ、ペンシルバニア州、１９９５年、を参照されたい。
【０１３４】
５．組成物の細胞への送達
インビトロまたはインビボのいずれかで、核酸の細胞への送達に使用できる多数の組成物および方法がある。これらの方法および組成物は、大きく２つのクラス：ウィルスベースの送達系および非ウィルスベースの送達系に分類できる。例えば、核酸類は、電気穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム沈殿、プラスミド、ウィルスベクター、ウィルス核酸、ファージ核酸、ファージ、コスミドを介して、あるいは細胞またはカチオン性リポソームなどの担体における遺伝子材料の導入を介してなど、多数の直接送達系を介して送達できる。ウィルスベクター、化学トランスフェクタント、または電気穿孔およびＤＮＡの直接拡散などの物理機械的方法など、トランスフェクション用の適切な手段は、例えば、ウォルフ，Ｊ．Ａ．（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４７、１４６５−１４６８頁（１９９０）；およびウォルフ，Ｊ．Ａ．（Ｗｏｌｆｆ，Ｊ．Ａ．）Ｎａｔｕｒｅ、３５２、８１５−８１８頁（１９９１）により記載されている。このような方法は、当業界に周知であり、本明細書に記載されている組成物および方法による使用に容易に適応できる。ある一定の場合において、これらの方法は、大型ＤＮＡ分子を特異的に機能させるために変更される。さらに、これらの方法は、担体のターゲティング特性を使用することにより一定の疾患および細胞集団を標的にするために使用できる。
【０１３５】
開示された組成物および方法が、直接適用できると考えられる疾患例は、重度に衰弱性の疾患、またはその予後が死に至る、例えば、アルツハイマー病、癌、グレーブス病、パーキンソン病、嚢胞性線維症、筋ジストロフィおよび糖尿病の疾患が考えられる。これら疾患のいずれの場合においても、受容体を対象の細胞に組み込むために遺伝子送達技術（例えば、腫瘍中心への送達または組織の悪化領域への送達）が使用されると考えられる。これらの技術としては、ウィルス（例えば、レトロウィルス、レンチウィルスまたはアデノウィルス）、プラスミド・裸ＤＮＡの形態、またはＴＡＴペプチドに結合したＤＮＡまたはプラスミドの形態でのＤＮＡの送達を挙げることができよう。ＤＮＡの送達は、カテーテルベースの注入、シリンジを用いる注入により、遺伝子ガンまたは疾患組織／細胞に直接ＤＮＡが送達されると思われる任意の他の方法を用いて実施できるであろう。次にＤＮＡが取り込まれるための翻訳のため、また細胞膜への受容体の取込みが生じるための十分な時間が与えられるであろう。適切な造影剤が投与されてから、受容体を発現している患部組織を可視化する適切なモダリティーが使用されるであろう。リアルタイム画像を可能にする適切なヒンジを、受容体に関して選択すれば、特定の処置薬剤組成物を、疾患処置の有効性に関してモニターでき、患者に対する適切な薬物処方が投与できるであろう。
【０１３６】
例えば、ヒト癌患者の治療前薬物スクリーニングは、以下のとおり実施できる。治療を必要とする自然発症腫瘍、例えば、脳腫瘍を持つヒトは、一定のシグナル伝達経路、例えば、上皮成長因子シグナル伝達経路が活性である場合のみ活性である非構成的プロモーターからのキメラ受容体を発現したプラスミド、ウィルスまたはレトロウィルスを用いて彼または彼女の腫瘍のコア領域のカテーテル媒介トランスフェクションを受けることができる。リサイクル促進開裂可能なヒンジをキメラ受容体に加えて受容体の生存を数分に限定することにより、受容体のシグナルに、その発現を駆動するプロモーターの分刻みの活性を直接反映させる。対象の細胞シグナル伝達経路を特異的に阻害するためにデザインされた種々の薬物の連続試験用量の有効性は、キメラ受容体の連続リアルタイムモニタリングによりモニターできる。この副次的治療の非毒性「試験用量」に対する腫瘍およびその転移の迅速な「分子応答」は、腫瘍退化の代理として役立つ。したがって、１〜４日の期間内に最良の応答機会を有する最も適切な処置を、患者に対して予め選択することができる。
【０１３７】
ａ）核酸ベースの送達系
転移ベクターは、遺伝子を細胞に送達するために、または遺伝子を送達するために一般的な方法の一部として、例えば、組換えレトロウィルスまたはアデノウィルスとして用いられる任意のヌクレオチド構造であり得る（例えば、プラスミド）（ラム（Ｒａｍ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８頁（１９９３））。
【０１３８】
本明細書に用いられるプラスミドまたはウィルスベクターは、膜結合タンパク質などの開示された核酸を分解することなく細胞に輸送する物質であり、送達先の細胞内の遺伝子発現をもたらすプロモーターを含む。幾つかの実施形態において、ベクターはウィルスまたはレトロウィルスに由来する。ウィルスベクターは、例えば、アデノウィルス、アデノ関連ウィルス、ヘルペスウィルス、ワクシニアウィルス、ポリオウィルス、ＡＩＤＳウィルス、神経栄養性ウィルス、シンドビスおよび他のＲＮＡウィルスであり、ＨＩＶバックボーンを持つこれらのウィルスを含む。また、ベクターとしての使用に好適なこれらのウィルスの性質を共有する任意のウィルスファミリーであることが好ましい。レトロウィルスとしては、マウスマロニー白血病ウィルス、ＭＭＬＶ、およびベクターとしては、ＭＭＬＶの望ましい性質を発現するレトロウィルス類が挙げられる。レトロウィルスベクターは、他のウィルスベクターよりも大きな遺伝子ペイロード、すなわち、導入遺伝子またはマーカー遺伝子を担持することができ、この理由のため、一般的に使用されるベクターである。しかしながら、それらは、非増殖細胞においては、それほど有用ではない。アデノウィルスベクターは、比較的安定であり、作業が容易で高力価であり、エーロゾル製剤で送達でき、非分裂細胞に形質移入できる。ポックスウィルスベクターは大型であり、遺伝子挿入のために幾つかの部位を有し、それらは、熱安定性であり、室温で保存できる。好ましい実施形態は、ウィルス抗原により誘発される宿主生物の免疫応答を抑制するように操作されるウィルスベクターである。このタイプの好ましいベクターは、インターロイキン８または１０のコード領域を担持する。
【０１３９】
ウィルスベクターは、遺伝子を細胞に導入するための化学的または物理的方法よりも高度の処理能力（遺伝子を導入する能力）を有することができる。典型的には、ウィルスベクター類は、非構造的早期遺伝子、構造的後期遺伝子、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ転写物、複製およびキャプシド形成に必要な反転末端反復、およびウィルスゲノムの転写および複製を制御するプロモーターを含有する。ベクターとして操作する場合、ウィルスは典型的に、取り出された１種以上の早期遺伝子を有し、取り出されたウィルスＤＮＡの代わりに、遺伝子または遺伝子／プロモーターカセットをウィルスゲノム内に挿入する。このタイプの構築体は、約８ｋｂまでの外来性遺伝子材料を担持できる。取り出された早期遺伝子の必要な機能は、トランス中の早期遺伝子の遺伝子産物を発現させるために操作された細胞系により典型的に供給される。
【０１４０】
（１）レトロウィルスベクター
レトロウィルスは、任意のタイプのサブファミリー、属、または向性など、レトロウィルス科のウィルスファミリーに属する動物ウィルスである。レトロウィルスベクターは一般に、遺伝子形質移入に関するレトロウィルスベクターにベルマ，Ｉ．Ｍ．（Ｖｅｒｍａ，Ｉ．Ｍ．）により記載されている。Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ−１９８５年、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２２９−２３２頁、ワシントン（１９８５）において参照として本明細書に組み込まれている。遺伝子療法に関するレトロウィルスベクターを用いる方法例は、米国特許第４，８６８，１１６号明細書および米国特許第４，９８０，２８６号明細書；ＰＣＴ出願国際公開第９０／０２８０６号パンフレットおよび国際公開第８９／０７１３６号パンフレット；およびムリガン（Ｍｕｌｌｉｇａｎ）（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２頁（１９９３））に記載されており；その教示は、参照として本明細書に組み込まれている。
【０１４１】
レトロウィルスは、本質的に核酸カーゴにパッケージされているパッケージ体である。核酸カーゴはそれと共に、複製娘分子が、パッケージコート内に効率的にパッケージされていることを確認するパッケージング用シグナルを担持する。パッケージ用シグナルに加えて、複製ウィルスの複製およびパッケージングにシスで必要な多数の分子がある。典型的に、レトロウィルスゲノムは、タンパク質コートの作製に関与するｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を含有する。それは、典型的に標的細胞に移すべき外来性ＤＮＡにより置き換えられるｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子である。レトロウィルスベクターは典型的に、パッケージコートへの取込み用のパッケージングシグナル、ｇａｇ転写ユニットの開始を知らせる配列、逆転写のｔＲＮＡプライマーを結合するためのプライマー結合部位、ＤＮＡ合成時のＲＮＡ鎖のスイッチをガイドする末端反復配列、ＤＮＡ合成の第二鎖合成用の始動部位として役立つプリンに富む配列５’から３’ＬＴＲ、および宿主ゲノムに挿入するためにレトロウィルスのＤＮＡ状態を挿入できるＬＴＲｓの末端近くの特定の配列など、逆転写に必要な要素を含有する。ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ遺伝子を取り出すことにより、約８ｋｂの外来性配列がウィルスゲノムに挿入されること、逆転写されること、および複製の際に新規なレトロウィルス粒子にパッケージされることを可能にする。この核酸量は、各転写物のサイズに依って１つから多数の遺伝子の送達に十分である。挿入体中には、他の遺伝子と共に陽性または陰性選択性マーカーのいずれかを含むことが好ましい。
【０１４２】
大部分のレトロウィルスベクターでは複製機構部分およびパッケージングタンパク質（ｇａｇ、ｐｏｌ、およびｅｎｖ）が除去されているため、典型的に、ベクターをパッケージング細胞系に入れることによりベクターを生成させる。パッケージング用細胞系は、複製およびパッケージング機構を含有するが、何らかのパッケージングシグナルを欠失したレトロウィルスを形質移入されたか、または形質転換された細胞系である。選択されたＤＮＡを担持するベクターは、これらの細胞系に形質移入されると、対象の遺伝子を含有するベクターが複製され、ヘルパー細胞にシスで提供された機構により新しいレトロウィルス粒子内にパッケージされる。機構用ゲノムは、必要なシグナルを欠失しているのでパッケージされない。
【０１４３】
（２）アデノウィルスベクター
複製欠損アデノウィルスの構築は、（バークナー（Ｂｅｒｋｎｅｒ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２１３−１２２０頁（１９８７）；マッシー（Ｍａｓｓｉｅ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：２８７２−２８８３頁（１９８６）；ハジャマド（Ｈａｊ−Ａｈｍａｄ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５７：２６７−２７４頁（１９８６）；ダビッドソン（Ｄａｖｉｄｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６１：１２２６−１２３９頁（１９８７）；ツアング（Ｚｈａｎｇ）「Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｂｙ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＰＣＲ  ａｎａｌｙｓｉｓ」ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  １５：８６８−８７２頁（１９９３））に記載されている。ベクターとしてのこれらウィルスの使用の利点は、最初の感染細胞内で複製できるが、新たな感染ウィルス粒子を形成できないので、他の細胞タイプに拡大できる範囲に限定されることである。組換えアデノウィルスは、気道上皮、肝細胞、血管内皮、ＣＮＳ実質組織および多数の他の組織部位へのインビボ直接送達後、高効率の遺伝子移入を達成することが示されている（モーシイ（Ｍｏｒｓｙ）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１５８０−１５８６頁（１９９３）；カーシェンバウム（Ｋｉｒｓｈｅｎｂａｕｍ）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：３８１−３８７頁（１９９３）；レースラー（Ｒｏｅｓｓｌｅｒ）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９２：１０８５−１０９２頁（１９９３）；モウリア（Ｍｏｕｌｌｉｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４：１５４−１５９頁（１９９３）；ラサレ（Ｌａ  Ｓａｌｌｅ）、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５９：９８８−９９０頁（１９９３）；ゴメツ−フォイクス（Ｇｏｍｅｚ−Ｆｏｉｘ）、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６７：２５１２９−２５１３４頁（１９９２）；リッチ（Ｒｉｃｈ）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ４：４６１−４７６頁（１９９３）；ザブナー（Ｚａｂｎｅｒ）、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６：７５−８３頁（１９９４）；グズマン（Ｇｕｚｍａｎ）、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３：１２０１−１２０７頁（１９９３）；バウト（Ｂｏｕｔ）、Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：３−１０頁（１９９４）；ザブナー（Ｚａｂｎｅｒ）、Ｃｅｌｌ  ７５：２０７−２１６頁（１９９３）；ケイラウド（Ｃａｉｌｌａｕｄ）、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ５：１２８７−１２９１頁（１９９３）；およびラゴート（Ｒａｇｏｔ）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７４：５０１−５０７頁（１９９３））。組換えアデノウィルスは、特定の細胞表面受容体への結合により遺伝子トランスダクションを達成し、その後、野生型または複製欠損アデノウィルスと同じ様式で、受容体媒介エンドサイトーシスによりウィルスが内部移行する（チャードネットおよびデールズ（Ｃｈａｒｄｏｎｎｅｔ  ａｎｄ  Ｄａｌｅｓ）、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ４０：４６２−４７７頁（１９７０）；ブラウンおよびバーリンガム（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｂｕｒｌｉｎｇｈａｍ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １２：３８６−��９６頁（１９７３）；スベンソンおよびパーソン（Ｓｖｅｎｓｓｏｎ  ａｎｄ  Ｐｅｒｓｓｏｎ）、Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５５：４４２−４４９頁（１９８５）；セス（Ｓｅｔｈ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．５１：６５０−６５５頁（１９８４）；セス（Ｓｅｔｈ）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：１５２８−１５３３頁（１９８４）；バーガ（Ｖａｒｇａ）ら、Ｊ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ６５：６０６１−６０７０頁（１９９１）；ウィッカム（Ｗｉｃｋｈａｍ）ら、Ｃｅｌｌ  ７３：３０９−３１９頁（１９９３））。
【０１４４】
ウィルスベクターは、取り出されたＥ１遺伝子を有したアデノウィルスに基づくものであってもよく、これらのビロン（ｖｉｒｏｎ）は、ヒト２９３細胞系などの細胞系において生じる。別の好ましい実施形態において、Ｅ１およびＥ３遺伝子の双方が、アデノウィルスゲノムから取り出される。
【０１４５】
（３）アデノ関連ウィルスベクター
別のタイプのウィルスベクターは、アデノ関連ウィルス（ＡＡＶ）に基づいている。この欠陥パルボウィルスは、多くの細胞型に感染でき、ヒトに対して非病原性であることから好ましいベクターである。ＡＡＶ型ベクターは、約４ｋｂから５Ｋｂを輸送でき、野生型ＡＡＶは、染色体１９に安定に挿入されることが知られている。この部位特異的な組込み特性を含有するベクターが好ましい。このタイプのベクターの特に好ましい実施形態は、アビゲン（Ａｖｉｇｅｎ）社（サンフランシスコ、カリフォルニア州）により製造されたＰ４．１Ｃベクターであり、これは、単純ヘルペスウィルスチミジンキナーゼ遺伝子、ＨＳＶ−ｔｋ、および／または緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰをコードする遺伝子などのマーカー遺伝子を含有できる。
【０１４６】
別のタイプのＡＡＶウィルスにおいて、ＡＡＶは、異種遺伝子に操作可能で結合した細胞特異性発現を方向付けるプロモーターを含有する少なくとも１つのカセットをフランクする１対の反転末端反復（ＩＴＲ）を含有する。本文脈において異種とは、ＡＡＶまたはＢ１９パルボウィルスに備わっていない任意のヌクレオチドまたは遺伝子を称す。
【０１４７】
典型的に、ＡＡＶおよびＢ１９のコード領域を削除して、安全な非細胞毒性ベクターを得る。ＡＡＶ  ＩＴＲ類またはその修飾物は、感染性および部位特異的組込みを付与するが、細胞毒性はなく、該プロモーターは、細胞特異的発現を方向付ける。ＡＡＶベクターに関連する物質に関する米国特許第６，２６１，８３４号明細書は、参照として本明細書に組み込まれている。
【０１４８】
このように開示されたベクターは、哺乳動物の染色体に組み込むことのできる、実質的に毒性のないＤＮＡ分子を提供する。
【０１４９】
ウィルスおよびレトロウィルスに挿入された遺伝子は、通常、プロモーター、および／または所望の遺伝子産物の発現調節を助けるエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定化された位置にある場合に機能する配列またはＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用に必要なコア要素を含有し、上流要素および応答要素を含有できる。
【０１５０】
（４）大型ペイロードウィルスベクター
大型ヒトヘルペスウィルスとの分子遺伝学実験により、大型異種ＤＮＡ断片を、クローン化し、増殖させ、ヘルペスウィルスの感染を許容する細胞において確立できる手段を提供している（サン（Ｓｕｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ８：３３−４１頁、１９９４年；コッターおよびロバートソン（Ｃｏｔｔｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ）、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ５：６３３−６４４頁、１９９９年）。これらの大型ＤＮＡウィルス（単純ヘルペスウィルス（ＨＳＶ）およびエプスタインバルウィルス（ＥＢＶ）は、ヒト異種のＤＮＡ＞１５０ｋｂの断片を特定の細胞に送達する可能性がある。ＥＢＶ組換え体は、エピソームＤＮＡとして感染Ｂ細胞中に大型ＤＮＡ片を維持できる。３３０ｋｂまでのヒトゲノム挿入体を担持した個々のクローンは、遺伝子的に安定であると考えられる。これらのエピソームの維持には、特定のＥＢＶ核タンパク質、ＥＢＶとの感染時に構成的に発現するＥＢＮＡ１を必要とする。さらにこれらのベクターは、トランスフェクションに使用することができ、大量のタンパク質を、インビトロで一時的に生成することができる。ヘルペスウィルスアンプリコン系はまた、ＤＮＡ＞２２０ｋｂ片をパッケージし、エピソームとしてＤＮＡを維持できる細胞を感染させるために使用される。
【０１５１】
他の有用なシステムは、例えば、複製性および宿主制限非複製性のワクシニアウィルスベクターを含む。
【０１５２】
ｂ）非核酸ベースシステム
開示された組成物は、種々の方法で標的細胞に送達できる。例えば、該組成物は、電気穿孔、またはリポフェクション、あるいはリン酸カルシウム沈殿により送達できる。選択される送達メカニズムは、ある程度標的細胞型に依り、送達が、例えば、インンビボまたはインビトロで生じるかどうかに依る。
【０１５３】
したがって、該組成物は、開示されたベクターに加えて、カチオン性リポソーム（例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ、ＤＣ−コレステロール）またはアニオン性リポソームなどのリポソームのような脂質を含むことができる。 さらにリポソームは、所望ならば特定の細胞の標的化を促進させるタンパク質をさらに含むことができる。化合物およびカチオン性リポソームを含んでなる組成物の投与は、標的臓器に求心性の血液に投与できるか、または気道の細胞を標的にして気道内に吸入できる。リポソームに関しては、例えば、ブリガム（Ｂｒｉｇｈａｍ）ら、Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１：９５−１００頁（１９８９）；フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７頁（１９８７）；米国特許第４，８９７，３５５号明細書を参照されたい。さらに、該化合物を、マクロファージなど、特定の細胞型に標的化できるミクロカプセルの成分として、あるいはミクロカプセルからの該化合物の拡散または化合物の送達が、特定の速度または投与量に関してデザインされているものとして投与できる。
【０１５４】
外因性ＤＮＡの対象の細胞への投与および取込み（すなわち、遺伝子トランスダクションまたはトランスフェクション）を含む上記の方法において、該組成物の細胞への送達は、種々のメカニズムによることができる。一例として、送達は、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬ社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）、ＳＵＰＥＲＦＥＣＴ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）社、Ｈｉｌｄｅｎ、独国）およびＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（プロメガバイオテック（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｂｉｏｔｅｃ）社、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）などの市販のリポソーム製剤、ならびに当業界において標準的な方法に従って開発された他のリポソーム類を用いたリポソームによることができる。さらに、開示された核酸またはベクターは、電気穿孔により、ジェネトロニクス（Ｇｅｎｅｔｒｏｎｉｃｓ）社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州）から入手できる技術、ならびにＳＯＮＯＰＯＲＡＴＩＯＮ器械（ＩｍａＲｘファーマシューティカル（ＩｍａＲｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）社、Ｔｕｃｓｏｎ、アリゾナ州）の手段によりインビボで送達できる。
【０１５５】
材料は、溶液、懸濁液においてあり得る（例えば、ミクロ粒子、リポソーム、または細胞に取り込まれる）。これらは、抗体、受容体、または受容体リガンドにより特定の細胞型を標的にできる。以下の引用文献は、腫瘍組織に特異的なタンパク質を標的にするこの技術の使用例である（センター（Ｓｅｎｔｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、２：４４７−４５１頁（１９９１）；バグスヘーウェ，Ｋ．Ｄ．（Ｂａｇｓｈａｗｅ，Ｋ．Ｄ．）、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ、６０：２７５−２８１頁（１９８９）；バグスヘーウェ（Ｂａｇｓｈａｗｅ）ら、Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，５８：７００−７０３頁（１９８８）；センター（Ｓｅｎｔｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．、４：３−９頁（１９９３）；バッテリ（Ｂａｔｔｅｌｌｉ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．、３５：４２１−４２５頁（１９９２）；ピーターズおよびマッケンジー（Ｐｉｅｔｅｒｓｚ  ａｎｄ  ＭｃＫｅｎｚｉｅ）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇ．Ｒｅｖｉｅｗｓ、１２９：５７−８０頁（１９９２）；およびロフラー（Ｒｏｆｆｌｅｒ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ、４２：２０６２−２０６５頁（１９９１））。これらの技術は、種々の他の特定の細胞型に使用できる。「ステルス」および他の抗体結合リポソームなどの媒体（大腸癌を標的にする脂質媒介薬物を含む）、細胞特異的リガンドを介するＤＮＡの受容体媒介標的化、リンパ球特異的腫瘍標的化、およびマウス膠腫細胞のインビボ高特異的治療用レトロウィルスの標的化。以下の引用文献は、腫瘍組織に特異的なタンパク質を標的にするこの技術の使用例である（ヒューズ（Ｈｕｇｈｅｓ）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、４９：６２１４−６２２０頁（１９８９）；およびリッツィンガーおよびヒュアング（Ｌｉｔｚｉｎｇｅｒ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ）、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ、１１０４：１７９−１８７頁（１９９２））。一般に、受容体は、エンドサイトーシス、構成的またはリガンド誘導の経路に関与する。 これらの受容体は、クラトリン被覆ピットに密集し、クラトリン被覆小胞によって細胞に入り、受容体が選別される酸性エンドソームを通過してから、細胞表面にリサイクルし、細胞内に保存されるか、またはリソソーム中で分解される。この内在化経路により、栄養物の取込み、活性タンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウィルスおよび毒素の日和見侵入、リガンドの解離と分解、受容体レベルの調節など、種々の機能が供給される。多くの受容体は、細胞型、受容体濃度、リガンドタイプ、リガンド結合価、およびリガンド濃度に依って２つ以上の細胞内経路をたどる。受容体媒介エンドサイトーシスの分子および細胞機構は、（ブラウンおよびグリーン（Ｂｒｏｗｎ  ａｎｄ  Ｇｒｅｅｎｅ）、ＤＮＡ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １０：６、３９９−４０９頁（１９９１））にレビューされている。
【０１５６】
宿主細胞ゲノムに組込まれる細胞に送達される核酸は、典型的に組込み配列を含有する。これらの配列は、特にウィルスベースシステムが使用される場合にウィルス関連配列であることが多い。これらのウィルス組込みシステムは、リポソームなどの非核酸ベース送達系を用いて送達される核酸に取り込むこともでき、その結果、送達系に含まれた核酸は宿主ゲノムに組み込まれ得る。
【０１５７】
他の一般的な宿主ゲノムへの組込み技術としては、例えば、宿主ゲノムとの相同的組換えを促進するためにデザインされたシステムが挙げられる。これらのシステムは典型的に、ベクター核酸と標的核酸との間の組換えが生じる宿主細胞ゲノム内の標的配列と十分な相同性を有し、送達された核酸を宿主ゲノムに組み込ませる、発現させる核酸をフランキングする配列に依存する。相同的組換えを促進させるために必要なこれらのシステムおよび方法は、当業者に公知である。
【０１５８】
ｃ）インビボ／エキソビボ
上記のとおり、該組成物は、製薬的に許容できる担体中で投与でき、当業界に周知の種々のメカニズム（例えば、裸ＤＮＡの取込み、リポソーム融合、遺伝子ガンを介してＤＮＡの筋内注射、エンドサイトーシスなど）により、インビボおよび／またはエキソビボで対象の細胞に送達できる。
【０１５９】
エキソビボ法が使用される場合、細胞または組織を取り出し、当業界に周知の標準的プロトコルに従って身体外に維持できる。該組成物は、例えば、リン酸カルシウム媒介遺伝子送達、電気穿孔、微量注入またはタンパクリポソームなど、任意の遺伝子導入メカニズムを経て細胞に導入できる。次に形質導入細胞を注入できるか（例えば、製薬的に許容できる担体中）、または細胞または組織タイプに対する標準法により対象内の同位置に戻し移植できる。種々の細胞の対象内への移植または注入に関する標準的な方法が知られている。
【０１６０】
６．発現系
細胞に送達される核酸は、典型的に発現制御システムを含有する。例えば、ウィルスおよびレトロウィルスシステムに導入された遺伝子は、通常、所望の遺伝子産物の発現制御を助長するためにプロモーター、および／またはエンハンサーを含有する。プロモーターは、一般に、転写開始部位に関して比較的固定化された位置にあると機能する配列またはＤＮＡ配列である。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子との基本的な相互作用に必要なコア要素を含有し、上流要素および応答要素を含有する。
【０１６１】
ａ）ウィルスプロモーターおよびエンハンサー
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの転写を制御する好ましいプロモーターは、種々の供給源、例えば：ポリオーマ、シミアンウィルス４０（ＳＶ４０）、アデノウィルス、レトロウィルス、Ｂ型肝炎ウィルス、最も好ましくはサイトメガロウィルスなどのウィルスゲノム、または異種哺乳動物プロモーター、例えば、ベータアクチンプロモーターから入手できる。ＳＶ４０ウィルスの早期および後期プロモーターは、ＳＶ４０ウィルスの複製源をも含有するＳＶ４０制限断片として好適に得られる（ファイアーズ（Ｆｉｅｒｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、２７３：１１３頁（１９７８））。ヒトサイトメガロウィルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として好適に得られる（グリーンウェイ，Ｐ．Ｊ．（Ｇｒｅｅｎｗａｙ，Ｐ．Ｊ．）ら、Ｇｅｎｅ  １８：３５５−３６０頁（１９８２））。もちろん、宿主細胞または関連種からのプロモーターもまた、本明細書において有用である。
【０１６２】
エンハンサーは一般に、転写開始部位から固定されていない距離で機能するＤＮＡ配列を言い、転写単位に対して５’（レイミンズ，Ｌ．（Ｌａｉｍｉｎｓ，Ｌ．）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．７８：９９３頁（１９８１））または３’（ラスキー，Ｍ．Ｌ．（Ｌｕｓｋｙ，Ｍ．Ｌ．）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．  ３：１１０８頁（１９８３））であり得る。さらに、エンハンサーは、イントロン内（バネルジー，Ｊ．Ｌ．（Ｂａｎｅｒｊｉ，Ｊ．Ｌ．）ら、Ｃｅｌｌ  ３３：７２９頁（１９８３））ならびにコード配列それ自体内（オスボーン，Ｔ．Ｆ．（Ｏｓｂｏｒｎｅ，Ｔ．Ｆ．）ら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏ．４：１２９３頁（１９８４））にあり得る。それらは、通常、１０ｂｐから３００ｂｐの間の長さであり、シスで機能する。エンハンサーは、プロモーター近辺からの転写を増加させる機能がある。エンハンサーはまた、転写調節を媒介する応答要素を含むことが多い。プロモーターもまた、転写調節を媒介する応答要素を含むことができる。 エンハンサーは、しばしば遺伝子の発現調節を決定する。多くのエンハンサー配列は、現在、哺乳動物の遺伝子（グロブリン、エラスターゼ、アルブミン、フェトプロテインおよびインスリン）から知られているが、典型的には、一般的発現に関して真核細胞ウィルスからのエンハンサーを使用する。好ましい例としては、複製源の遅発側上のＳＶ４０エンハンサー（ｂｐ１００〜２７０）であり、サイトメガロウィルスの早期プロモーターエンハンサー、複製源の遅発側上のポリオーマエンハンサー、およびアデノウィルスエンハンサーである。
【０１６３】
該プロモーターおよび／またはエンハンサーは、それらの機能を起動させる光または特異的な化学事象により特に活性化できる。テトラサイクリンおよびデキサメタゾンなどの試剤によりシステムを調節できる。また、ガンマ線照射などの照射に対する曝露、またはアルキル化化学療法薬によりウィルスベクター遺伝子発現を増強させる方法がある。
【０１６４】
一定の実施形態において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、転写される転写単位の領域発現を最大にする構成的プロモーターおよび／またはエンハンサーとして作用できる。一定の構築体において、プロモーターおよび／またはエンハンサー領域は、特定の時間で特定のタイプの細胞でのみ発現される場合でも、全ての真核細胞タイプにおいて活性となるであろう。このタイプの好ましいプロモーターは、ＣＭＶプロモーター（６５０塩基）である。他の好ましいプロモーターは、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウィルス（完全長プロモーター）、およびレトロウィルスベクターＬＴＦである。
【０１６５】
全て特異的な調節要素は、クローン化でき、黒色腫細胞などの特定の細胞型において選択的に発現される発現ベクターを構築するために使用できることが示されている。グリア原線維酢酸タンパク質（ＧＦＡＰ）プロモーターは、グリア源の細胞に遺伝子を選択的に発現させるために用いられている。
【０１６６】
真核宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒトまたは有核細胞）において使用される発現ベクターもまた、ｍＲＮＡ発現に影響を及ぼし得る転写終了に必要な配列を含有できる。これらの領域は、組織因子タンパク質をコードするｍＲＮＡの未翻訳部分においてポリアデニル化セグメントとして転写される。３’未翻訳領域はまた、転写終了部位を含む。該転写単位はまた、ポリアデニル化領域を含むことが好ましい。この領域の１つの利点は、転写された単位が処理され、ｍＲＮＡのように輸送される可能性を増加させることである。発現構築体におけるポリアデニル化シグナルの同定および使用は十分に確立されている。同種ポリアデニル化シグナルが、導入遺伝子構築体に使用されることが好ましい。一定の転写単位において、ポリアデニル化領域は、ＳＶ４０早期ポリアデニル化シグナルに由来し、約４００塩基からなる。転写された単位は、他の標準的な配列を単独で、または上記配列との組合せにおいて含有し、該構築体からの発現または安定性を改善することも好ましい。
【０１６７】
ｂ）マーカー
ウィルスベクターは、マーカー産物をコードする核酸配列を含むことができる。このマーカー産物は、遺伝子が細胞に送達されたかどうか、送達されたら発現しているかどうかを判定するために使用される。好ましいマーカー遺伝子は、β−ガラクトシダーゼおよび緑色蛍光タンパク質をコードする大腸菌ｌａｃＺ遺伝子である。
【０１６８】
幾つかの実施形態において、マーカーは、選択マーカーであり得る。哺乳動物細胞にとって好適な選択マーカーの例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシン類縁体Ｇ４１８、ヒドロマイシン、およびプロマイシンである。このような選択マーカー は、哺乳動物宿主細胞内に首尾よく移入されたら、形質転換哺乳動物宿主細胞は、選択圧下に置かれた場合に生存できる。選択的措置の中で２つの広く使用される明確なカテゴリーがある。第一のカテゴリーは、細胞の代謝および補足培地と独立して増殖する能力を欠く変異細胞系の使用に基づいている。２つの例は：ＣＨＯ  ＤＨＦＲ−細胞およびマウスＬＴＫ−細胞である。これらの細胞は、チミジンまたはヒポキサンチンなどの栄養物の添加なしでは増殖能力を欠く。これらの細胞は、完全ヌクレオチド合成に必要な一定の遺伝子を欠いているので、それらは、欠落ヌクレオチドを補足培地に用意しない限り生存できない。培地を補足する代替法は、無処置のＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子を、それぞれの遺伝子を欠く細胞に導入し、その結果増殖要件を変更させることである。ＤＨＦＲまたはＴＫ遺伝子により形質転換されなかった個々の細胞は、非補足培地中で生存できないであろう。
【０１６９】
第二のカテゴリーは、任意の細胞型に使用される選抜スキームと称し、変異細胞系を使用する必要のない優性選抜である。これらのスキームは、典型的に宿主細胞の増殖を阻止するために薬物を使用する。新規遺伝子を持つこれらの細胞は、薬物耐性を導くタンパク質を発現し、その選抜に生き残ることであろう。このような優性選抜の例では、薬物ネオマイシン（サザン  Ｐ．およびバーグ  Ｐ．（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｐ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．）、Ｊ．Ｍｏｌｅｃ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎｅｔ．１：３２７頁（１９８２））、ミコフェノール酸（マリガン，Ｒ．Ｃ．およびバーグ，Ｐ．（Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｒ．Ｃ．ａｎｄ  Ｂｅｒｇ，Ｐ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０９：１４２２頁（１９８０））またはヒグロマイシン（スグデン，Ｂ．（Ｓｕｇｄｅｎ，Ｂ．）ら、  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：４１０−４１３頁（１９８５））を使用する。前記３つの例は、それぞれ適切な薬物、Ｇ４１８またはネオマイシン（ジェネテシン）、ｘｇｐｔ（ミコフェノール酸）またはヒグロマイシンに対して耐性を導くために真核遺伝子対照下で細菌遺伝子を使用する。他には、ネオマイシン類縁体Ｇ４１８およびプラマイシンが挙げられる。
【０１７０】
７．ペプチド
ａ）タンパク質変異体
本明細書に考察されたように、例えば、公知であり、本明細書に包含されるマルトース結合タンパク質の多数の変異体がある。さらに、公知の機能性マルトース結合タンパク質株の変異体に対し、開示された方法および組成物においても機能するこれらのタンパク質の誘導体がある。タンパク質変異体および誘導体は、当業者によく理解されており、アミノ酸配列修飾を含み得る。例えば、アミノ酸配列修飾は、典型的に１つ以上の３つのクラス：置換変異体、挿入変異体または削除変異体に入る。挿入は、アミノ末端融合および／またはカルボキシル末端融合ならびに単一または複数アミノ酸残基の配列内融合を含む。挿入は、通常、１つから４つの残基の程度でアミノ末端融合またはカルボキシル末端融合のものよりも小さな挿入となる。実施例に記載されるものなど、免疫原性融合タンパク質誘導体は、標的配列に免疫原性を付与するためにインビトロ架橋により十分に大きなポリペプチドを融合することにより、または融合をコードするＤＮＡにより形質転換された組換え細胞培養により作製される。欠失は、タンパク質配列から１つ以上のアミノ酸残基の削除を特徴とする。典型的には、約２つから６つ以下の残基が、タンパク質分子内の任意の１つの部位で削除される。これらの変異体は、通常、タンパク質をコードするＤＮＡの部位特異的なヌクレオチドの変異誘発により調製され、それによって変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後組換え細胞培養物中にＤＮＡを発現する。公知の配列を有するＤＮＡ内の予め決定された部位で置換変異体を作製する技術は、例えば、Ｍ１３プライマー変異誘発およびＰＣＲ変異誘発が周知である。アミノ酸置換は、単一残基が典型的であるが、多数の種々の位置で同時に生じることができ；通常、挿入は、約１つから１０のアミノ酸残基の程度であり；削除は、約１つから３０の残基の範囲である。削除または挿入は、隣接対、すなわち、２つの残基の削除または２つの残基の挿入で成されることが好ましい。置換、削除、挿入またはそれら任意の組合せを組合わせて、最終構築体に到達できる。変異は、リーディングフレーム外に配列を置いてはならず、二次的ｍＲＮＡ構造を産生できる相補的領域を創製しないことが好ましい。置換変異体は、少なくとも１つの残基が除去され、その位置に異なる残基が挿入されるものである。このような置換は、一般に以下の表６および表７に従って作製され、保存的置換と称される。
【０１７１】
【表７】
2008513020.tif 000008
【０１７２】
【表８】
2008513020.tif 000009
【０１７３】
機能または免疫学的同一性の実質的変更は、表６のものよりも保存性が少ない置換体を選択することによりなされ、（ａ）例えば、シート状またはらせん状コンフォメーションとして置換領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さ、を維持する際の効果がより有意に異なる残基を選択する。一般に、タンパク質の性質が最も大きく変化すると予想される置換体は、（ａ）親水性残基、例えば、セリルまたはトレオニルは、疎水性残基に、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリルまたアラニルに（または逆）置換され；（ｂ）システインまたはプロリンを、他の任意の残基に（または逆）置換され；（ｃ）陽電性側鎖を有する残基、例えば、リジル、アルギニル、またはヒスチジルは、陰電性残基、例えば、グルタミルまたはアスパルチルに（または逆）置換され；または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンは、側鎖を有さないもの、例えば、この場合グリシンに（または逆）置換され、（ｅ）硫酸化および／またはグリコシル化用の部位数を増加させるものである。
【０１７４】
例えば、１つのアミノ酸残基を、生物学的および／または化学的に同様である別のものとの置換は、保存置換として当業者に公知である。例えば、保存置換は、１つの疎水性残基を別のものに、または１つの極性残基を別のものに置換するものと考えられる。この置換体としては、例えば、Ｇｌｙ、Ａｌａ；Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ；Ａｓｐ、Ｇｌｕ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ｌｙｓ、Ａｒｇ；およびＰｈｅ、Ｔｙｒなどの組合せが挙げられる。各々明示して開示された配列のこのような保存置換の変異体は、本明細書に提供されたモザイク状ポリペプチド内に含まれる。
【０１７５】
置換または削除変異誘発は、Ｎ−グリコシル化（Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ／Ｓｅｒ）またはＯ−グリコシル化（ＳｅｒまたはＴｈｒ）部位を挿入するために使用できる。システインまたは他の不安定な残基の削除もまた、所望できる。潜在的なタンパク質分解部位、例えばＡｒｇの削除または置換は、例えば、塩基残基の１つを削除するか、あるいはグルタミニル残基またはヒスチジル残基により１つの残基を置換することにより達成される。
【０１７６】
一定の翻訳後誘導体化は、発現ポリペプチドに及ぼす組換え宿主細胞の作用の結果生じる。グルタミニル残基およびアスパラギニル残基を、しばしば翻訳後に、対応するグルタミル残基およびアスパリル残基に脱アミド化する。あるいは、これらの残基を緩和な酸性条件下で脱アミド化する。他の翻訳後の修飾としては、プロリンおよびリジンの水酸化、セリル残基またはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニンおよびヒスチジン側鎖のｏ−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．クレイトン（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ）、Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ、Ｗ．Ｈ．フリーマン（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ）社、サンフランシスコ、７９−８６頁［１９８３］）、Ｎ末端アミンのアセチル化、幾つかの場合、Ｃ末端カルボキシルのアミド化が挙げられる。
【０１７７】
当然のことながら、本明細書に開示されたタンパク質の変異体および誘導体を確定する１つの方法は、特定の公知の配列に対する相同性／同一性の点から変異体および誘導体を確定することによる。例えば、配列番号：１は、マルトース結合タンパク質の特定の配列を記載しており、配列番号：１５は、別のマルトース結合タンパク質の特定の配列を記載している。これらの変異体は具体的に開示されおり、記述された配列に対して少なくとも７０％または７５％または８０％または８５％または９０％または９５％相同性を有する他のタンパク質が本明細書に開示されている。当業者は、２つのタンパク質の相同性を判定する方法を容易に理解できる。例えば、相同性がその最高レベルになるように２つの配列の位置合わせを行った後に相同性を算出できる。
【０１７８】
別の相同性算出方法は、公表されたアルゴリズムにより実施できる。配列比較のための最適なアラインメントは、スミスおよびウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムにより、ニードルマンおよびウンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムにより、ピアソンおよびリップマン（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４頁（１９８８）の類似性方法の探索により、これらのアルゴリズムのコンピュータ実施（ウィスコンシン・ジェネティックソフトウェアパッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、ジェネティックス・コンピュータグループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）により、または検定により実施できる。
【０１７９】
同じタイプの相同性は、例えば、ズーカー，Ｍ．（Ｚｕｋｅｒ，Ｍ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８−５２頁、１９８９年、ジェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６−７７１０頁１９８９年、ジェーガー（Ｊａｅｇｅｒ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１−３０６頁、１９８９年に開示されているアルゴリズムにより核酸に対して得ることができ、少なくとも核酸アラインメントに関連する物質に関して参照として本明細書に組み込まれている
【０１８０】
当然のことながら、変異体が保存変異である特定の配列に対して少なくとも７０％相同性を有する実施形態など、保存変異および相同性の記載は任意の組合せにおいて共に組合わせることができることが認識される。
【０１８１】
本明細書は、種々のタンパク質およびタンパク質配列を考察しているので、当然のことながら、これらのタンパク質配列をコードできる核酸もまた開示されていることが認識される。これは、特定のタンパク質配列に関連する全ての縮重配列、すなわち、１つの特定のタンパク質配列をコードする配列を持つ全ての核酸ならびにそのタンパク質配列の開示された変異体および誘導体をコードする縮重核酸を含む全ての核酸を含むことになる。このように、特定の核酸配列各々を、本明細書に完全に記載していないとしても、当然のことながら、各々どの配列も開示されたタンパク質配列によって実際に開示され、本明細書に記載されることが認識される。例えば、配列番号：２に記載されたタンパク質配列をコードできる多数の核酸配列のうちの１つが、配列番号：２に記載されている。また、当然のことながら、開示されたタンパク質の特定の変異体が本明細書に開示されている場合、アミノ酸配列は、特定のＤＮＡ配列が生物内のそのタンパク質をコードするかは示さないが、そのタンパク質が生じる特定の経路においてそのタンパク質をコードする公知の核酸配列もまた知られており、本明細書に開示され、記載される。
【０１８２】
当然のことながら、開示された組成物に組み込むことができる多数のアミノ酸およびペプチド類縁体がある。例えば、異なる機能的置換を有し、表５および表６に示されるアミノ酸である、多数のＤアミノ酸またはアミノ酸がある。天然ペプチドの反対の立体異性体、ならびにペプチド類縁体の立体異性体が開示さている。類縁アミノ酸を部位特異的な方法でペプチド鎖に挿入するために、これらのアミノ酸を、選択アミノ酸を有するｔＲＮＡ分子をチャージすることにより、また例えば、アンバーコドンを利用する遺伝子構築体を操作することによりポリペプチド鎖に容易に組み込むことができる（トーソン（Ｔｈｏｒｓｏｎ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃ．Ｂｉｏｌ．７７：４３−７３頁（１９９１）、ゾーラー（Ｚｏｌｌｅｒ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、３：３４８−３５４頁（１９９２）；  イッバ（Ｉｂｂａ）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＆  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｒｒｉｎｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  １３：１９７−２１６頁（１９９５）、キャヒル（Ｃａｈｉｌｌ）ら、ＴＩＢＳ、１４（１０）：４００−４０３頁（１９８９）；ベンナー（Ｂｅｎｎｅｒ）、ＴＩＢ  Ｔｅｃｈ、１２：１５８−１６３頁（１９９４）；イッバおよびヘンネッケ（Ｉｂｂａ  ａｎｄ  Ｈｅｎｎｅｃｋｅ）、Ｂｉｏ／ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、１２：６７８−６８２頁（１９９４）、これらは全て、アミノ酸類縁体に関連する物質に関して参照として本明細書に組み込まれている）。
【０１８３】
ペプチドに似ているが、天然ペプチド結合を介して結合していない分子を製造できる。例えば、アミノ酸またはアミノ酸類縁体に関する結合としては、ＣＨ２ＮＨ−、−ＣＨ２Ｓ−、−ＣＨ２−ＣＨ２−、−ＣＨ＝ＣＨ−（シスおよびトランス）、−ＣＯＣＨ２−、−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−、および−ＣＨＨ２ＳＯ−を挙げることができる。これらおよびその他は、スパトラ，Ａ．Ｆ．（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄｓ，Ｐｅｐｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｂ．ウェインスタイン（Ｂ．Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）編集、マーセルデッカー（Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ）、ニューヨーク、２６７頁（１９８３）；スパトラ，Ａ．Ｆ．（Ｓｐａｔｏｌａ，Ａ．Ｆ．）、ベガデータ（Ｖｅｇａ  Ｄａｔａ）（１９８３年３月）、１巻、３号、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂａｃｋｂｏｎｅ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ（一般レビュー）；モーリイ（Ｍｏｒｌｅｙ）、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ（１９８０）４６３−４６８頁；ハドソン，Ｄ．（Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．）ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｅｐｔ  Ｐｒｏｔ  Ｒｅｓ  １４：１７７−１８５頁（１９７９）（−ＣＨ２ＮＨ−、ＣＨ２ＣＨ２−）；スパトラ（Ｓｐａｔｏｌａ）ら、Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３８：１２４３−１２４９（１９８６）（−ＣＨ  Ｈ２−Ｓ）；ハンＪ．（Ｈａｎｎ  Ｊ．）Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ  Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．Ｉ  ３０７−３１４頁（１９８２）（−ＣＨ−ＣＨ−、シスおよびトランス）；アルムキスト（Ａｌｍｑｕｉｓｔ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２３：１３９２−１３９８頁（１９８０）（−ＣＯＣＨ２−）；ジェニングス−ホワイト（Ｊｅｎｎｉｎｇｓ−Ｗｈｉｔｅ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ  ２３：２５３３頁（１９８２）（−ＣＯＣＨ２−）；スゼルケ（Ｓｚｅｌｋｅ）ら、欧州特許出願ＥＰ第４５６６５ＣＡ号明細書（１９８２）：９７：３９４０５（１９８２）（−ＣＨ（ＯＨ）ＣＨ２−）；ホラディ（Ｈｏｌｌａｄａｙ）ら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ．Ｌｅｔｔ  ２４：４４０１−４４０４頁（１９８３）（−Ｃ（ＯＨ）ＣＨ２−）；およびフルビイ（Ｈｒｕｂｙ）  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ  ３１：１８９−１９９頁（１９８２）（−ＣＨ２−Ｓ−）；  に見ることができ、それらの各々は、参照として本明細書に組み込まれている。特に好ましい非ペプチド結合は−ＣＨ２ＮＨ−である。当然のことながら、ペプチド類縁体は、β−アラニン、γ−アミノ酪酸などの結合原子間で２個以上の原子を有することができる。
【０１８４】
アミノ酸類縁体および類縁体ならびにペプチド類縁体は、より経済的な製造、より大きな化学的安定性、増強された薬物動態学的性質（半減期、吸収、効力、有効性など）、特異性の変化（例えば、広範囲なスペクトルの生物活性）、抗原性の減少、その他増強された性質または所望の性質を持つことが多い。
【０１８５】
Ｄ−アミノ酸は、ペプチダーゼなどにより認識されないので、Ｄ−アミノ酸は、より安定なペプチドを作出するために使用できる。コンセンサス配列の１つ以上のアミノ酸の同じタイプのＤ−アミノ酸（例えば、Ｌ−リジンの代わりにＤ−リジン）による系統的な置換が、より安定なペプチドを作出するために使用できる。システイン残基は、２つ以上のペプチドを一緒に環化するか、または結合させるために使用できる。これは、ペプチドを特定のコンフォメーションに拘束する有利な点があり得る。（リゾおよびギーラッシュ（Ｒｉｚｏ  ａｎｄ  Ｇｉｅｒａｓｃｈ）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６１：３８７頁（１９９２）、参照として本明細書に組み込まれている)。
【０１８６】
ｂ）定方向進化
定方向進化（Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ）は、新規遺伝子を作成するために遺伝子の一ファミリーをとり上げて、これら遺伝子の異なる領域を無作為に組合わせる方法である。次にこれら新規遺伝子産物を、所望の機能増加（または減少）について、または新規な所望の機能についてスクリーニングする。ハルト  Ｋ（Ｈｕｌｔ  Ｋ）、Ｂｅｒｇｌｕｎｄ  Ｐ：Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｆｏｒ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００３年、１４：３９５−４００頁を参照。この技術は、膜におけるヒンジ発現の増加、受容体と基質との間の結合親和力の増加またはより良好なヒンジ薬物動態を生じるヒンジの種々の領域に適用できるであろう。
【０１８７】
ｃ）コドンの最適化
アミノ酸は、ｇｇｃまたはｃｇｔなど、コドンと呼ばれるＤＮＡ配列の三つ組によりコードされる。これらアミノ酸の多くは、幾つかの異なるコドンによりコードされる。これらコドンの各々は、アミノ酸に結合するコドン配列に対応する特異的アミノ酸を認識し、有する特異的なｔＲＮＡを有する。種々の生物は、種々の程度に対してこれらのコドンを使用する。例えば、一生物は、特定のアミノ酸をコードする上で他よりも頻繁に特定のコドンを使用する。例えば、アラニンは、コドンｇｃｔ、ｇｃｃ、ｇｃａおよびｇｃｇによりコードされるが、この生物は、殆どの場合ｇｃｔによりアラニンをコードすることが好ましいと思われる。別の生物は、同じアミノ酸のアラニンをコードする異なるコドンを使用すると考えられ、例えば、ｇｃａを用いる。全てのコドンにわたるこの適用により、どのコドンが、より頻繁に使用されるかについて、生物間で大きな程度の可変性が存在し得る状態を見ることができる。使用程度の高いコドンに相当するｔＲＮＡを用いている生物は、これらのｔＲＮＡをより多く産生し、使用程度が低いコドンに相当するｔＲＮＡの産生が少ない。これは、極めて異なる生物からの遺伝子を、別の生物において発現させる場合、例えば、哺乳動物において細菌遺伝子を発現させる場合、発現効率が問題となり得る。コドンの最適化は、この問題を最少にし、対象の生物（該コドンの利用され方が極めて異なる）の遺伝子配列を、依然として同じアミノ酸配列をコードするが、該遺伝子を発現する生物がコドンを使用する方法と同様にコドンを使用する種々の遺伝子配列に変換することによって遺伝子発現を最適にする。これは、生物間のコドン使用の相違に関連する問題を最小にし、タンパク質発現を増強する。
【０１８８】
８）抗体
（１）一般的な抗体
特定の抗体により認識される本明細書に開示された方法により使用できる多数のタンパク質がある。抗体は十分に特徴づけられ、極めて特定のリガンドに対して高親和性（Ｋｄ＝１０〜２０ｘ１０９まで）で結合する能力が公知である。「ミニボディ」および「ダイアボディ」もまた該用語に含まれる（サンダラサン（Ｓｕｎｄａｒａｓａｎ）、Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ．２００３年１２月；４４（１２）：１９６２−９頁、分子画像に関連するミニボディおよびダイアボディの教示に関してその全体が本明細書に含まれている)。用語の「抗体」は、広義で本明細書に使用され、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の双方を含む。無処置の免疫グロブリン分子に加えて、マルトースが、マルトース結合タンパク質との相互作用を阻止されるように、抗体が、例えば、マルトース結合タンパク質と相互作用する能力に関して選択される限り、用語の「抗体」は、これらの免疫グロブリン分子の断片またはポリマー、免疫グロブリン分子またはその断片のヒトまたはヒト化版を含む。抗体は、本明細書に記載されたインビトロアッセイを用いるか、または類似の方法により所望の活性を試験でき、その後、それらのインビボ治療活性および／または予防活性を、公知の臨床試験法に従って試験する。
【０１８９】
本明細書に用いられる用語の「モノクローナル抗体」とは、本質的に相同的抗体集団から得られた抗体を称し、すなわち、その集団内の個々の抗体は、抗体分子の小さなサブセット内に存在し得る可能な天然変異体を除いて同一である。本明細書のモノクローナル抗体は、特に重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、あるいは特定の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一か、または相同的であり、一方、該鎖の残りが、別の種に由来するか、あるいは別の抗体クラスまたはサブクラスに属する抗体における対応する配列と同一か、または相同的である「キメラ」抗体、ならびにそれらが所望のアンタゴニスト活性を示す限り、このような抗体の断片を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書およびモリソン（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８１：６８５１−６８５５頁（１９８４）を参照）。
【０１９０】
開示されたモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手法を用いて作製できる。例えば、開示されたモノクローナル抗体は、コーラーおよびミルスタイン（Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）、Ｎａｔｕｒｅ、２５６：４９５頁（１９７５）により記載されたものなど、ハイブリドーマ法を用いて調製できる。ハイブリドーマ法において、マウスまたは他の適切な宿主動物は、免疫化剤に特異的に結合する抗体を産生するか、または産生できるリンパ球を誘発する免疫化剤により典型的に免疫化される。あるいは、リンパ球は、例えば、本明細書に記載されたＨＩＶ  Ｅｎｖ−ＣＤ４−ｃｏ−受容体複合体を用いてインビトロで免疫化できる。
【０１９１】
モノクローナル抗体はまた、米国特許第４，８１６，５６７号明細書（キャビリー（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら）に記載されるものなど、組換えＤＮＡ法により作製できる。開示されたモノクローナル抗体をコードするＤＮＡを容易に単離でき、従来の手法を用いて配列決定できる（例えば、マウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより）。例えば、バートン（Ｂｕｒｔｏｎ）らに対する米国特許第５，８０４，４４０号明細書およびバーバス（Ｂａｒｂａｓ）らに対する米国特許第６，０９６，４４１号明細書に記載されているように、 抗体のライブラリーまたは活性抗体の断片もまた作出でき、ファージディスプレイ技法を用いてスクリーニングできる。
【０１９２】
インビトロ方法はまた、一価抗体を調製するために好適である。 抗体の消化によりその断片、特にＦａｂ断片を製造するために、当業界に公知のルーチン技術を用いて達成できる。例えば、消化はパパインを用いて実施できる。パパイン消化の例は、１９９４年１２月２２日に公開された国際公開第９４／２９３４８号パンフレットおよび米国特許第４，３４２，５６６号明細書に記載されている。抗体のパパイン消化により、典型的にＦａｂ断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が産生され、各々が単一の抗原結合部位、および残りのＦｃ断片を有する。ペプシン処理により、２つの抗原組合せ部位を有し、依然として抗原を架橋できる断片を生成する。
【０１９３】
該断片としては、他の配列に結合していてもしていなくても、抗体または抗体断片の活性が、非修飾抗体または抗体断片と比較して有意に変化していないか、または損なわれていないという条件で、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入体、削除体、置換体、または特定の領域または特定のアミノ酸残基の他の選択的修飾体を挙げることができる。これらの修飾は、ジスルフィド結合できるアミノ酸を除去／付加するため、その生物寿命を増加させるため、その分泌特性を変更するなど、幾つかの追加性質を提供できる。いずれの場合においても、抗体や抗体断片は、その同属抗原に対する特異的結合などの生物活性を有さなければならない。抗体または抗体断片の機能性または活性領域は、タンパク質の特定領域の変異誘発、次いで発現、発現ポリペプチドの試験により同定できる。このような方法は、当業熟練医師にとって容易に明らかであり、抗体または抗体断片をコードする核酸の部位特異的変異誘発を含むことができる。（ゾーラー，Ｍ．Ｊ．（Ｚｏｌｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．３：３４８−３５４頁、１９９２年）。
【０１９４】
本明細書に用いられる用語の「抗体」または「抗体類」はまた、ヒト抗体および／またはヒト化抗体を称することができる。多くの非ヒト抗体類（例えば、マウス、ラット、またはウサギに由来するもの）は、ヒトにおいて当然抗原性であり、したがってヒトに投与された場合、望ましくない免疫応答を生じ得る。したがってこの方法にけるヒト抗体またはヒト化抗体の使用は、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を誘発する機会を減らすために役立つ。
【０１９５】
（２）ヒト抗体類
開示されたヒト抗体類は、任意の技術を用いて調製できる。ヒトモノクローナル抗体生産に関する技術例としては、コール（Ｃｏｌｅ）ら（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、アラン・Ｒ・リス（Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ）、７７頁、１９８５年）により、またベールナー（Ｂｏｅｒｎｅｒ）ら（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７（１）：８６−９５頁、１９９１年）により記載されたものが挙げられる。ヒト抗体類（およびそれらの断片）は、ファージディスプレイライブラリー（フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２７：３８１頁、１９９１年；マークス（Ｍａｒｋｓ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．、２２２：５８１頁、１９９１年）を用いても生産できる。 
【０１９６】
開示されたヒト抗体類は、遺伝子導入動物からも得ることができる。例えば、免疫化に応答するヒト抗体類の完全レパートリーを産生できる形質導入変異マウスが記載されている（例えば、ジャコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：２５５１−２５５頁（１９９３）；ジャコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８頁（１９９３）；ブルッガーマン（Ｂｒｕｇｇｅｒｍａｎｎ）ら、Ｙｅａｒ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、７：３３頁（１９９３）を参照）。つまり、これらのキメラおよび生殖系列変異マウスにおける抗体重鎖結合領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子の同型接合的削除により、内因性抗体産生の完全阻止が生じ、このような生殖系列マウスへのヒト生殖系列抗体遺伝子アレイに好結果を与える移入により、抗原誘発の際にヒト抗体の産生がもたらされる。所望の活性を有する抗体類は、本明細書に記載されるＥｎｖ−ＣＤ４−ｃｏ−受容体複合体を用いて選択される。
【０１９７】
（３）ヒト化抗体類
抗体のヒト化技術は、一般に抗体分子の１本以上のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作するための組換えＤＮＡテクノロジーの使用を含む。したがって、非ヒト抗体（またはその断片）のヒト化形態は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに組み込まれた非ヒト（ドナー）抗体からの抗原結合部位の一部を含有するキメラ抗体または抗体鎖（またはＦｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’などの断片、あるいは抗体の他の抗原結合部分）である。
【０１９８】
ヒト化抗体を作出するために、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の抗原結合特性（例えば、標的抗原に対するある一定のレベルの特異性および親和性）を有することが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１つ以上のＣＤＲからの残基により置換される。幾つかの場合において、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体はまた、レシピエント抗体または移入ＣＤＲ、あるいはフレームワーク配列のいずれにも見られない残基を含有できる。一般に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からそれに導入される１つ以上のアミノ酸残基を有する。実際、ヒト化抗体は、幾つかのＣＤＲ残基および場合によっては幾つかのＦＲ残基は、げっ歯類抗体において類似部位からの残基により置換されているヒト抗体である。ヒト化抗体は、一般に抗体の定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト抗体の定常領域の少なくとも一部を含有する（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５頁（１９８６）、ライヒマン（Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７頁（１９８８）、およびプレスタ（Ｐｒｅｓｔａ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．、２：５９３−５９６頁（１９９２））。
【０１９９】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当業界に周知である。例えば、ヒト化抗体は、ウィンター（Ｗｉｎｔｅｒ）および協力者 （ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３２１：５２２−５２５頁（１９８６）、ライヒマン（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ、３３２：３２３−３２７頁（１９８８）、バーホーエン（Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９：１５３４−１５３６頁（１９８８））の方法に従って、げっ歯類ＣＤＲｓまたはＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより作出できる。ヒト化抗体を生産するために使用できる方法は、米国特許第４，８１６，５６７号明細書（キャビリイ（Ｃａｂｉｌｌｙ）ら）、米国特許第５，５６５，３３２号明細書（フーゲンブーム（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ）ら）、米国特許第５，７２１，３６７号明細書（ケイ（Ｋａｙ）ら）、米国特許第５，８３７，２４３号明細書（デオ（Ｄｅｏ）ら）、米国特許第５，９３９，５９８号明細書（クチャーラパチ（Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ）ら）、米国特許第６，１３０，３６４号明細書（ジャコボビッツ（Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ）ら）、および米国特許第６，１８０，３７７号明細書（モーガン（Ｍｏｒｇａｎ）ら）にも記載されている。
【０２００】
（４）ミニボディおよびダイアボディ
ミニボディおよびダイアボディは、抗体の認識領域（可変領域）を含有する抗体部分である。これらの部分は、抗体のこの認識領域を含有することから、それらにタグをつけることができ、正規の抗体と同じものを事実上使用できる。
【０２０１】
（５）抗体の投与
抗体の投与は、本明細書に開示されているように行うことができる。抗体送達に関する核酸のアプローチもまた存在する。マルトース結合タンパク質の抗体および抗体断片の広範な中和抗体は、中和抗体または中和抗体断片をコードする核酸製剤（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）として患者または対象に投与でき、患者または対象自体の細胞が、該核酸を取り込み、コード化された抗体または抗体断片を産生し、分泌するようにすることができる。核酸の送達は、例えば、本明細書に開示された任意の手段によって行うことができる。
【０２０２】
９．キット類
本明細書に開示された方法を実施する際に使用できる試薬を含めたキットが本明細書に開示されている。該キットは、本明細書に考察されたか、あるいは開示された方法の実施の際に必要であるか、または有利となることが解されると考えられる任意の試薬または試薬の組合せを含むことができる。例えば、該キットは、ベクターならびにレポーターを含むことができるであろう。例えば、配列番号：１で示されたベクターを含んでなる、前立腺癌を獲得する対象の危険性を評価するためのキットが開示されている。
【０２０３】
Ｄ．組成物を作製する方法
本明細書に開示された組成物および開示された方法を実施するために必要な組成物は、別に特に記載されない限り、その特定の試薬または化合物に関して当業者に公知の任意の方法を用いて作製できる。
【０２０４】
１．核酸合成
例えば、ベクターとして使用されるベクターなどの核酸は、標準的な化学合成法を用いて作製できるか、または酵素的方法あるいは任意の他の公知の方法を用いて製造できる。このような方法は、標準的な酵素消化、次いでヌクレオチド断片の単離できるものから（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版（コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク州、１９８９年）５章、６章を参照）から、例えば、ミリゲンまたはベックマン（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ  ｏｒ  Ｂｅｃｋｍａｎ）システム１プラスＤＮＡシンセサイザー（例えば、ミリガン−バイオサーチのモデル８７００自動化シンセサイザー（Ｍｉｌｌｉｇｅｎ−Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ）、Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ、マサチューセッツ州またはＡＢＩモデル３８０Ｂ）を用いるシアノエチルホスホルアミダイト法による純粋な合成法までの範囲に及び得る。オリゴヌクレオチド類を作製するのに有用な合成法はまた、イクタＩｋｕｔａ）ら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３−３５６頁（１９８４）（ホスホトリエステル法およびホスファイト−トリエステル法）、およびナラング（Ｎａｒａｎｇ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．、６５：６１０−６２０頁（１９８０）（ホスホトリエステル法）により記載されている。タンパク質核酸分子は、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．５：３−７頁（１９９４）により記載されているものなどの公知の方法を用いて作製できる。
【０２０５】
２．遺伝子修飾および遺伝子破壊方法
開示された組成物および方法は、これらの事象を受けることができる任意の動物における標的遺伝子の破壊および修飾に使用できる。遺伝子飾および遺伝子破壊は、哺乳動物の生殖系列を介して修飾を伝播させる様式で、哺乳動物などの動物における染色体の遺伝子または伸長物の選択的除去または変更に係わる方法、技術、および組成物を言う。一般に、細胞は、例えば、本明細書に記載された細胞内に含まれている特定の染色体の領域と相同的に組換わるようにデザインされるベクターにより形質転換される。この相同的組換え事象は、周囲のＤＮＡと共に、例えば、フレーム内に導入された外因性ＤＮＡを有する染色体を産生できる。このタイプのプロトコルにより、細胞内に含まれるゲノムに導入するために点変異などの極めて特異的な変異を可能にする。このタイプの相同的組換えを実施する方法は、本明細書に開示されている。
【０２０６】
哺乳動物細胞における相同的組換えを実施する際の１つの好ましい特徴は、所望の組換え事象が、低頻度で生じるので該細胞を培養できることである。
【０２０７】
細胞を本明細書に記載された方法により作製したら、幹細胞テクノロジーまたはクローニングテクノロジーのいずれかによりこの細胞から動物を作出することができる。例えば、核酸が形質移入された細胞が、生物の幹細胞であった場合、トランスフェクションおよび培養後、この細胞は、生殖細胞系における遺伝子修飾または破壊を含有する生物を作出するために使用でき、次にその全ての細胞における遺伝子修飾または破壊を有する別の動物を作出するために使用できる。その全ての細胞における遺伝子修飾または破壊を含有する動物の作出に関する他の方法において、クローニングテクノロジーが使用できる。これらのテクノロジーは、一般に形質移入された細胞の核を取り出し、融合または置換のいずれかにより、形質移入核と卵母細胞とを融合し、次いで動物を作出するために操作できる。ＥＳテクノロジーの代わりにクローニングを使用する手法の利点は、ＥＳ細胞以外の細胞を形質移入できることである。例えば、培養するのが極めて容易である線維芽細胞は、形質移入され、遺伝子修飾または遺伝子破壊事象を行うことができる細胞として使用でき、次にこの細胞から誘導した細胞は、動物全体をクローン化するために使用できる。
【実施例】
【０２０８】
Ｅ．実施例
本明細書に請求された化合物、組成物、物品、装置および／または方法が作製され評価される方法について、通常の当業者に完全な開示および説明を提供するために、以下の実施例が示されるが、純粋に例示的なものとして意図されており、本開示を決して限定するものではない。数値（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証する努力が成されているが、何らかの誤差および偏差は考慮される必要がある。別に指定されない限り、部は重量部であり、温度は℃であるか、または周囲温度であり、圧は大気圧またはそれに近い。
【０２０９】
１．実施例１：標的ベクター
以下の特徴を含む標的ベクターをクローン化した：キメラタンパク質は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）社（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）からのｐＤｉｓｐｌａｙベクター を用いて作出され、以下のものから構成された： 分泌経路に対するタンパク質の標的化を介して細胞の細胞外側で対象のタンパク質発現を可能にするＩｇ−ｋリーダー配列シグナルペプチド、抗体標識用の血球凝集素Ａエピトープ、マルトース結合タンパク質の発現用マルトース結合タンパク質（ＭａｌＥ）ｃＤＮＡ（ｐＭａｌを用いてＰＣＲ反応によりニューイングランドバイオラブス（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（Ｂｅｖｅｒｌｙ、マサチューセッツ州）から入手した）、追加の抗体標識用ｍｙｃエピトープ 、マルトース結合タンパク質の細胞膜への固着用ＰＤＧＦＲ膜貫通ドメイン、およびタンパク質翻訳を中止させるためのウシ成長ホルモンポリアデニル化配列。ＲＯＳＡ２６座（ｃｒｅ−媒介組換えよる使用のために）からこのレポーター遺伝子導入の条件付の強い発現は、この導入遺伝子を、以前に記載されたスリニバス（Ｓｒｉｎｉｖａｓ）らによるＲｏｓａ２６ｐＡ  ＢｉｇＴシステムを用いてＲＯＳＡ２６レポーターへ挿入することにより達成された。これにより、任意の遺伝子またはプロモーターにより駆動されるＣｒｅの発現により規定される位置と時間でレポーター導入遺伝子の発現を可能にした。図２は、この標的ベクターのマップを示す。
【０２１０】
２．実施例２：マウス胚性幹細胞
実施例１のベクターは線形化され、マウス胚性幹細胞に電気穿孔された。これらの細胞を培養し、正確な標的化事象のためにスクリーニングする。正確な標的（ＲＯＳＡ２６座を、キメラタンパク質の条件付発現を可能にする新規ＤＮＡにより置換）を含有する細胞を胚盤胞に注入してキメラマウスを得、これをスクリーニングして適切な子孫を選択する。次に画像レポーティング導入遺伝子を含有するマウスを分析し、肺胞性横紋筋肉腫および髄芽腫に関するものなどの既存のマウス癌モデルと関連づけて使用する。種々の開裂性ヒンジもまた使用でき、ならびに上記のものなどマルトース結合タンパク質に加えて他の結合たんぱく質を使用でき、Ｒｐｏ２座などの異なる座を標的にし、より高い受容体密度を得るためにより強いプロモーターを使用する。
【０２１１】
３．実施例３： 異種移植腫瘍マウスモデル：腫瘍増殖および転移の検出
培養におけるヒト腫瘍細胞に、電気穿孔、リポフェクション、またはｔａｔ−タンパク質担体を介して構成的で非可変性転写プロモーターからキメラ受容体を発現するプラスミド、ウィルスまたはレトロウィルスを形質移入する。リサイクル促進開裂性ヒンジは、キメラ受容体に加えない。この細胞を、免疫無防備状態（例えば、ヌード）マウスの皮下フランク組織に注入する。腫瘍細胞は増殖するので、腫瘍細胞表面上のキメラ受容体の比率は、存在する腫瘍細胞数に比例して指数関数的に増加する。生じた腫瘍のその元の移植位置での増殖を、ＰＥＴ、ＣＴ、超音波、またはＭＲＩなど、多くの様式により定量化でき、その転移は、転移標的臓器の正確な分布プロフィルによって高感度で検出できる。ＤＮＡ損傷化学療法剤など、例えば、シクロホスファミド、または、例えば、レチノイン酸のような生物学的修飾因子などの試験化合物の投与後に腫瘍およびその転移応答をモニターできる。
【０２１２】
４．実施例４：異種移植腫瘍マウスモデル：薬物に対する腫瘍感受性の検出
培養におけるヒト腫瘍細胞に、電気穿孔、リポフェクション、またはｔａｔ−タンパク質担体により一定の細胞シグナル伝達経路、例えば、上皮成長因子シグナル伝達経路が活性である場合のみ活性である非構成的プロモーターからキメラ受容体を発現するプラスミド、ウィルスまたはレトロウィルスを形質移入する。受容体の生存を数分に限定するために、リサイクル促進開裂性ヒンジをキメラ受容体に加え、それによって受容体のシグナルが、その発現を駆動するプロモーターの分ごとの活性を直接反映するようにする。次にこの細胞を、免疫無防備状態（例えば、ヌード）マウスの皮下フランク組織に注入する。腫瘍細胞は増殖するので、腫瘍細胞表面上のキメラ受容体の比率は、存在する腫瘍細胞数および対象の細胞シグナル伝達経路の相対的活性に比例して指数関数的に増加する。対象の細胞シグナル伝達経路を特異的に阻害するようにデザインされた処置の有効性は、キメラ受容体の連続的リアルタイムのモニタリングによりモニターできる。この処置に対する腫瘍およびその転移の迅速な「分子応答」は、腫瘍または転移退化の代理法として役立つ。したがって、生物学的修飾因子のスクリーニングは、より迅速かつより特異的である。
【０２１３】
５．実施例５：非異種移植条件付マウス腫瘍モデル
「活性可能なレポーター」としてキメラ受容体を発現するマウス系を、活性可能な形質転換変異（例えば、Ｔｒｐ５３変異）を有する別のマウス系と交配させ、ｌｏｘＰに媒介される活性可能なレポーターおよびｌｏｘＰ媒介形質転換変異を活性化させる組織特異的および／または一時的誘導性の「トリガー」、例えば、Ｃｒｅ発現を有する第３のマウス系と交配させる。腫瘍は、対応するヒト腫瘍（血管、リンパ管、免疫サーベイランス）により経験される全て正常な構造を有する異種移植モデル、例えば、乳房の乳癌、脳の脳腫瘍、筋肉の筋肉癌よりも「真正な」様式で生じる。処置は、この条件付マウスモデルに施すことができ、腫瘍の応答は、１つ以上の装置／スキャナーによるキメラ受容体検出によりモニターできる。
【０２１４】
６．実施例６：ヒト癌患者の治療前薬物スクリーニング
治療を必要とする自然発生腫瘍、例えば、脳腫瘍を有するヒトは、腫瘍コア領域のカテーテル媒介で一定の細胞シグナル伝達経路、例えば、上皮成長因子シグナル伝達経路が活性な場合のみ活性である非構成的プロモーターからキメラ受容体を発現するプラスミド、ウィルスまたはレトロウィルスのトランスフェクションを受ける。受容体の生存を数分に限定させるために、リサイクル促進開裂性ヒンジをキメラ受容体に加えることができ、それによって受容体のシグナルを、その発現を駆動するプロモーターの分ごとの活性に直接反映させるようにする。対象の細胞シグナル伝達経路を特異的に阻害するようにデザインされた種々の薬物の連続的試験用量の有効性は、キメラ受容体の連続的リアルタイムのモニタリングによりモニターできる。これらの治療下、非毒性的「試験用量」に対する腫瘍およびその転移の迅速な「分子応答」は、腫瘍退化の代理法として役立つ。したがって、１〜４日間で、最良の応答機会を有する最も適切な治療が、患者にとって予め選択できる。
【０２１５】
７．実施例７：ヒト移植幹細胞のインサイチュモニタリング
培養における幹細胞は、電気穿孔、リポフェクション、またはｔａｔ−タンパク質担体により連続的非可変性転写プロモーターからキメラ受容体を発現するプラスミド、ウィルスまたはレトロウィルスを形質移入する。ゲノムへの無作為組込みに対する代替として、キメラレポーターおよびそのプロモーターは、遺伝子標的化により、ヒトＲｏｓａ２６座などのゲノムにおいて「安全な」位置に標的化できる。リサイクル促進開裂性ヒンジは、キメラ受容体に加えない。該細胞を、ヒトレシピエント（例えば、パーキンソン病患者）に外科的に移植する。幹細胞は増殖するので、幹細胞表面上のキメラ受容体の比率は、存在する幹細胞数および幹細胞誘導体数に比例して指数関数的に増加する。移植位置からの幹細胞の拡大は、多くのモダリティー（ＰＥＴ、ＣＴ、超音波、またはＭＲＩなど）により定量化できる。
【０２１６】
８．実施例８：ヒト移植幹細胞機能のインサイチュモニタリング 
培養の幹細胞に、電気穿孔、リポフェクション、またはｔａｔ−タンパク質担体により一定の細胞シグナル伝達経路、例えば、ドーパミン合成が活性である場合のみ活性である非構成的プロモーターからキメラ受容体を発現するプラスミド、ウィルスまたはレトロウィルスを形質移入する。受容体の生存を数分に限定させるために、リサイクル促進開裂性ヒンジをキメラ受容体に加えることができ、それによって受容体のシグナルに、その発現を駆動するプロモーターの分ごとの活性を直接反映させる。該細胞を、例えば、パーキンソン病患者などのヒトレシピエントに外科的に移植できる。幹細胞は分化するので、幹細胞表面上のキメラ受容体の比率は、対象のシグナル伝達経路を活性化することにより適切に機能する幹細胞誘導体数に比例して増加する。対象のシグナル伝達経路の活性、および全身的に投与された薬物治療により調節されるその能力は、キメラ受容体によってリアルタイムでモニターできる（ＰＥＴ、ＣＴ、超音波、またはＭＲＩなど）。
【０２１７】
９．実施例９：ＭｕｌｔｉＰｌａｔシステム
ｐＤｉｓｐｌａｙ  ＭＢＰ構成要素は、首尾よくクローン化された。最終ベクター（図６）は、キメラ受容体（Ｍｕｌｔｉ−ＰｌａｔｆｏｒｍまたはＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体としても知られている）の遍在性発現を可能にするＲｏｓａ２６座の遺伝子標的化を示している。 ＬｏｘＰ部位は、Ｒｏｓａ２６プロモーター後に強力な終止配列を直接フランクする。これは、Ｃｒｅの存在が終止配列を除去して、ＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体の発現を活性化するまでＲｏｓａ２６座からＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体発現の抑制を可能にする。これは、Ｃｒｅ発現の位置により媒介されるＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体の組織／細胞特異的活性を可能にする。配列決定は、全ての主要な成分が無傷で誤差が無いことを確かめるために実施した。最終ベクターを線形化し、マウス胚性幹細胞内に電気穿孔した。１４４のクローンを選択し、正しく標的化されたクローンについてサザンブロット解析によりスクリーニングした。１４４のクローンのうち２６（１８％）が正しく標的にされたことが判明した。これらのクローンの１つを、マウス胚細胞に注入して標的挿入体を含有するキメラマウスを作出した。何匹かの高パーセンテージのキメラマウスを作出し、生殖系列マウスを得るためにさらに交尾させた。
【０２１８】
キメラ受容体を発現する能力を持つ正しく標的化された胚性幹細胞を増殖した。ＨＩＶ−Ｔａｔモチーフ（Ｃｒｅタンパク質を細胞核内へと通過させるために）を含有するＣｒｅタンパク質を、それらの細胞培養の２日目と３日目にこれらの細胞に適用した（細胞を増殖させるために胚性幹細胞を支持細胞層に接着させる時間が必要であった）。これらの細胞を、ガラスカバースリップ上で５日間培養し、その時間後、ＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体が発現するかどうかを判定するために免疫組織化学を実施した。一次抗体は、マルトース結合タンパク質に対するマウスモノクローナル抗体であり、二次抗体は、ＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス二次抗体であった。ＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体が、実際に発現することが判明し、これらの結果は図７に示している。
【０２１９】
ＰＣＲ法は、ＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体を発現する能力を可能にするような遺伝子変更を含んでいる生殖系列マウスの遺伝子型を判定するために創製された。このＰＣＲ法を使用することにより、遺伝子変更がマウス生殖系列にあることが判明した。サザンブロット分析は、これらのマウスにおける遺伝子変更の存在を確認するために使用できる。
【０２２０】
ＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体（遺伝子型ＭＰ／ＷＴ）を発現する能力を含有するマウスを、ＨＰＲＴ  Ｃｒｅマウス（遍在性Ｃｒｅ発現を有するマウス）と交尾させた。マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、この交尾によるマウス胎仔から作出した。これら線維芽細胞系の生じた遺伝子型は、以下のとおりであった：ＨＰＲＴ−Ｃｒｅ（Ｃｒｅ／ＷＴ）、非活性化ＭｕｌｔｉＰｌａｔ（ＭＰ／ＷＴ）、野生型（ＷＴ／ＷＴ）および活性化ＭｕｌｔｉＰｌａｔ（ＭＰＡ／ＷＴ）。活性化ＭｕｌｔｉＰｌａｔ（ＭＰＡ／ＷＴ）のマウス線維芽細胞のみが、ＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体を発現し得ることが予想された。上記の細胞系は、１００ｍｍの細胞培養皿中で集密に達するまで培養した。次いでＲＮＡをこれらの細胞から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲは、ｃＤＮＡを創製するために抽出ＲＮＡ上で実施した。次にこのｃＤＮＡをＰＣＲ反応に用いて、ＭＥＦからＲＮＡの適切な発現を判定した。活性化ＭｕｌｔｉＰｌａｔＭＥＦのみがＭｕｌｔｉＰｌａｔｍＲＮＡを発現し、ＲＮＡ断片は適切なサイズであることが判明した（図８）。
【０２２１】
上記の遺伝子型のＭＥＦを、集密になるまで１００ｍｍ細胞培養プレート内で培養し、その後、総タンパク質をこれらの細胞から抽出した。ＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体が発現したかどうか、また予測された適切なサイズ（５６  ｋＤａ）であったかどうかを判定するためにこれらの総タンパク質抽出物に対してウェスタンブロット解析を実施した。同じ一次抗体を、上記の免疫組織化学実験に使用し、アルカリホスファターゼ複合化ヤギ抗マウス二次抗体をこの実験に用いた。活性化ＭｕｌｔｉＰｌａｔ細胞のみが、ＭｕｌｔｉＰｌａｔタンパク質を発現し、このタンパク質は、実際に予測されたサイズであったことが判明した（図９）。
【０２２２】
２種の光学的造影剤であるＦＩＴＣ標識マルトースおよびＣｙ５．５標識マルトースが誘導された。これらの試剤の検出限界が測定されており、それらは、細胞培養ベース試験およびインビボマウス試験双方に有用である。マルトース−ｃｙ５．５およびマルトース−ｆｉｔｃは双方ともは、いずれのプローブの蛍光も減衰させずに溶液中１０ｎＭまで検出できることが首尾よく示された。
【０２２３】
非発現細胞と共にＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体を発現するＭＥＦｓが、対照として使用できる。蛍光標識マルトース（上記の光学的造影剤）を、非発現および発現細胞の集密プレートに適用し、結合させる時間をおいた。次にこれらの細胞をリンスし、引き続きＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体が光学的造影剤と特異的に結合するかどうかを判定するために画像化した。
【０２２４】
マウスにおける光学的造影剤の薬物動態試験を着手できる。これらの試剤を、濃度を変えて尾静脈を介してマウスの静脈系に注入する。これらの試剤の分布およびシグナルを、経時的に光学画像機を用いて測定する。この時間中、組織／細胞特異的様式でＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体を発現するマウスが作出される。該光学的造影剤の適切な用量を、ＭｕｌｔｉＰｌａｔ発現マウスに注入し、その後、組織／細胞特異的画像化が可能であるかどうかを判定するために経時的にマウスを画像化する。
【０２２５】
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【図面の簡単な説明】
【０２２６】
【図１】神経組織の画像化における本技法の適用の図を示す。この例では、受容体の転写が中枢神経系に特異的に誘導されている。この受容体は、膜貫通ドメイン、開裂可能なヒンジおよびマルトース結合タンパク質から構成されている。マルトース結合タンパク質は、細胞外空間に発現する。マルトースは、所望の画像化モダリティーに特異的な分子で標識化され、マウスに静脈内投与される。引き続きこのモダリティーを用いてマウスを画像化し、受容体の発現している組織（この例では神経）を可視化する。
【図２】マウス胚性幹細胞への電気穿孔法に用いられる最終的な標的ベクター構築体を示す図である。このベクターの正しい標的化および引き続き、マウスへのクローン化ＤＮＡの組込みにより、Ｃｒｅ発現の位置決めによって決定される細胞または組織における細胞膜の細胞外部分上のマルトース結合タンパク質の条件付き発現が可能になる。
【図３】ヒンジ領域として使用できる開裂部位を示す図である。９８番から１２０番の番号で最後の列に引用されている文献は、以下のとおりである：98. Blomback G: The N terminal disulfide knot of human fibrinogen. Br J Haematol 17:145, 1969; 99. Iwanaga S, Wallen P, Grandahl NY et al:  On the primary structure of human fibrinogen, isolation and characterization of N terminal fragments from plasmic digests. Eur J Biochem 8:189, 1964; 100. Takagi T, Doolittle RF:  Amino acid sequence studies on Factor XIII and the peptide released during its activation by thrombin.  Biochemistry 13:750, 1974; 101. Eaton D, Rodriguez H, Vehar GA:  Proteolytic processing of human Factor VIII.  Biochemistry 25:505, 1986; 102. Mann KG, Jenny RJ, Krishnaswamy S: Cofactor proteins in the assembly and expression of blood clotting enzyme complexes.  Ann Rev Biochem 57:915, 1988; 103.  Hagen FS, Gray CL, O’Hara P et al: Characterization of a cDNA coding for human Factor VII.  Proc Natl Acad Sci USA 83:2412, 1986; 104. Radcliffe R, Nemersen Y: Bovine Factor VII. Methods Enzymol 45:49, 1976; 105. Elion J, Butkowski RJ, Downing MR, Mann KG: Primary structure of human fragment 2. Circulation 54:118, 1976; 106.  Walz DA, Hewett-Emmett D, Seegers WH: Amino acid sequence of human prothrombin fragment 1 and 2. Proc Natl Acad Sci USA 74:1963, 1977; 107.        Downing MR, Butkowski RJ, Clark MM, Mann KG: Human prothrombin activation.  J Biol Chem 250:8897, 1975; 108  Heldebrant CM, Noyes C, Kingdon HS, Mann KG: The activation of prothrombin III. Biochem Biophys Res Comm 54:155, 1973; 109 Magnusson S, Petersen TE, Sottrup-Jensen L, Claeys H: Complete primary structure of prothrombin.  In Reich, Rifkin, Shaw (eds): Proteases and Biological Control. Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory, 1975; 110 D, Davie EW: Characterization of a cDNA coding for human protein C. Proc Natl Acad Sci USA 81:4766, 1984; 111 Long GL, Belagaje RM, MacGillivray RTA: Cloning and sequencing of liver cDNA coding for bovine protein C. Proc Natl Acad Sci USA, 1984; 112 Mutt V, Magnusson S, Jorpes JE, Dahi E: Structure of procine secretin. Biochemistry 4:2358, 1965; 113 Morgan RJ, Birken S, Canfield RE: The amino acid sequence of human chorionic gonadotropin, J Biol Chem 250:5247, 1975; 114 Engel A, Alexander B: Activation of chymotrypsinogen A by thrombin preparations.  Biochemistry 3:3590, 1966; 115 Luncblad RI, Kingdon HS, Mann KG: Thrombin.  Methods Enzymol 45:156, 1976; 116 Mutt V, Jorpes JE: Structure of procine cholecystorinin pancreozymin.  Eur J Biochem 6:156, 1968; 117 Graf L, Barat E, Borvendeg J et al: Action of thrombin on ovine, bovine and human pituitary growth hormones. Eur J Biochem 64:333, 1976; 118 Muzbek L, Gladner JA, Laki K: The fragmentation of actin by thrombin.  Arch Biochem Biophys 167:99, 1975; 119 Sparrow JT, Pownall HJ, Hsu F et al: Lipid binding by fragment of apolipoprotein C-III-1 obtained by thrombin cleavage.  Biochemistry 16:5427, 1977; 120 Leavis PC, Rosenfeld S, Lu RC: Cleavage of a specific bond in troponin C by thrombin.  Biochim Biophys Acta 535:281, 1978; 121 Vu TKH, Hung DT, Wheaton VI, Coughlin SR: Molecular cloning of a functional thrombin receptor reveals a novel proteolytic mechanism of receptor activation.  Cell 64:1057, 1991 これらは、少なくとも開裂部位に関する材料に関して、参照として本明細書に組み込まれている。
【図４】ヒンジ領域として使用できる開裂部位を示す図である。これらは、少なくとも開裂部位に関する材料に関して、参照として本明細書に組み込まれているカム（Ｋａｍ）ら、「Ｈｕｍａｎ  Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  Ｄ、Ｃ２、およびＢ、」Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（８）：３４４４−３４５１頁（１９８７年）から使用された。
【図５】マウス小脳に発現する結合ドメイン（ＭＢＰ）を示す図である。リガンド（マルトース）に結合したモダリティー特異性造影剤をマウス血流（ａ）に注入する。造影剤結合リガンドは、細胞外空間に拡散し、そこで結合ドメイン（ｂ）に結合する。次いで、造影剤に適切なモダリティーを用いてマウスを画像化し（ｃ＆ｄ）、小脳を増強させる（ｅ＆ｆ）。
【図６】ＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体が結合領域（ＭＢＰ）および膜貫通ドメイン（ＰＤＧＦＲ）から構成されていることを示す図である。将来、受容体の検出および特性化を助けるための２種のタグ（ＨＡ、Ｍｙｃ）、ならびにＭＢＰ領域が細胞膜の細胞外部分に発現するように方向づけるＩｇｋリーダー配列がある。該受容体は、Ｒｏｓａ２６座から発現し、強力な停止シグナルおよびＬｏｘＰ配列にフランクされた選択（ＰＧＫ  Ｎｅｏ  ４ｘ  ＰＡ）に先行され、Ｃｒｅの発現による条件付き発現が可能となる。
【図７】マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）受容体を有する培養物中の胚性幹（ＥＳ）細胞の免疫組織化学的分析を示す図である。上に示されているのは、キメラマルトース結合受容体をコードするＤＮＡを含有するクローンのエピ蛍光顕微鏡写真である。キメラ受容体発現を示す目的で、細胞核および抗ＭＢＰ  ＦＩＴＣを示すために、細胞をＤＡＰＩで標識化した。左（Ａ）の細胞は、ｃｒｅによる処理はしておらず、対照として働き、一方、右（Ｂ）の細胞は、Ｃｒｅタンパク質による処置で、個々のクローンを、非発現状態からＭＢＰ発現状態へと変換した。右（Ｂ）のクローンは、部分的にＭＢＰ発現状態（発現細胞）に変換したＥＳ細胞のモザイククローンであり、表面ＭＢＰを発現しない細胞は、内部対照として働く。
【図８】集密化まで培養したマウス胚線維芽細胞から抽出したＲＮＡのＲＴ−ＰＣＲを示す図である。予想通り、ＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体（遺伝子型ＭＰＡ／ＷＴ）に陽性の細胞がＭｕｌｔｉＰｌａｔ  ＲＮＡに対して陽性の唯一の細胞である。ＤＮＡが存在しなかったことを検証するために、対照サンプルは、逆転写酵素なしでＭｕｌｔｉＰｌａｔ発現細胞サンプルと共に操作した（レーン６）。バンド陽性バンドはまた予想されたサイズであった（１２３２ｂｐ）。
【図９】マウス胚線維芽細胞から抽出したタンパク質のウェスタンブロットを示す図である。Ｃｒｅ活性化細胞は、ＭｕｌｔｉＰｌａｔ受容体（およそ５６ｋＤａと予想）を発現することが示されている。２５マイクログラムの総タンパク質を含有させた６２１１Ｎ２−５以外、全てのレーンに５０マイクログラムの総タンパク質抽出物を入れた。対照は、非活性化細胞（ＭＰ／ＷＴ）、野生型細胞（ＷＴ／ＷＴ）およびＣｒｅ発現野生型細胞（ＷＴＣ／ＷＴ）から構成された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2008513020.tif 000014
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図５】
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【図８】
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【図９】
2008513020.tif 000021
【図６】
2008513020.tif 000022
【図７】
2008513020.tif 000023
【配列表】
2008513020000001.app
【国際調査報告】
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