(57)【要約】  本発明は、拡張された動的範囲において、被分析物の検出及び定量について競合アッセイを行う方法を提供する。この方法は、複数ステップのサンプル添加方法により達成され、様々な濃度のサンプルをアッセイ中の異なる時点で添加することにより、複数の検出ウィンドウを有する用量応答曲線を生じさせる。この複数ステップのサンプル添加方法は、複合アッセイの用量応答曲線を拡げ、劇的にアッセイ動的範囲を増大させる。【選択図】図３
2008532018.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある濃度で標的被分析物を含むかもしれないサンプル中の標的被分析物についてアッセイを行う方法であって、以下のステップ：
ａ）容器中で、第１の量のサンプルと第１の量の希釈緩衝液を含む第１のサンプル容量、物質と結合した既知の濃度の標的被分析物を含む第１の試薬容量、及び標的被分析物に対して高親和性を有するレセプターを含む第２の試薬容量を混合し;
ｂ）該容器を第１の期間、加熱してインキュベートし;
ｃ）第２の量のサンプルと第２の量の希釈緩衝液を含む第２のサンプル容量を、該容器に加え、ここで、該第２のサンプル容量中のサンプルの量の、該第１のサンプル容量中のサンプルの量に対する比は規定した希釈倍率と等しく；
ｄ）該容器を第２の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した該物質の存在により生じたシグナルを測定し；さらに
ｅ）予め決定した用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の該標的被分析物の濃度とを関連付けることを含む、前記方法。
【請求項２】
第２の量の希釈緩衝液がゼロである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の量及び第２の量の希釈緩衝液がゼロであり、第１の量のサンプルと第２の量のサンプルとの差を用いて、規定した希釈倍率を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アッセイが均一系アッセイである、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
標的被分析物と結合した物質が酵素であり、第２の試薬容量が該酵素が作用する１以上の基質を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
アッセイが、固相上に固定されたレセプターを用いる不均一系アッセイである、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項７】
標的被分析物と結合した物質が酵素であり、第２のインキュベーション期間の後に得た上澄液を、１以上の基質を該分離した上澄液に加えてシグナル生成させる前に、該固相から分離する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第２の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第１の試薬容量を容器に加える、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１のサンプル容量を加える前に、第１の試薬容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の加熱インキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第２の加熱インキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
規定した希釈倍率を、広範囲の標的被分析物濃度において線形応答を有する用量応答曲線が得られるように選択する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
規定した希釈倍率を、２つの異なる範囲の標的被分析物濃度において２つの別個の線形応答を有する用量応答曲線が得られるように選択する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
第１の期間の間又は後、及びステップｃ）の前に、最初のアッセイシグナルを測定すること、並びに、該最初のアッセイシグナルについて予め決定した用量応答曲線を用いて、該最初のアッセイシグナルと、サンプル中の標的被分析物の濃度とを関連付けることを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ある濃度で標的被分析物を含むかもしれないサンプル中の標的被分析物についてアッセイを行う方法であって、以下のステップ：
ａ）容器中で、第１の量のサンプル及び第１の量の希釈緩衝液を含む第１のサンプル容量、物質と結合した既知の濃度の標的被分析物を含む第１の試薬容量、並びに標的被分析物に対して高親和性を有するレセプターを含む第２の試薬容量を混合することを含む、第１のサンプル添加ステップを行い；
ｂ）該容器を第１の期間、加熱してインキュベートし；
ｃ）追加量のサンプルと追加量の希釈緩衝液を含む追加のサンプル容量を該容器に加えることを含む追加のサンプル添加ステップを行い、ここで、該追加のサンプル容量中のサンプルの量の、その直前のサンプル添加ステップで使用されるサンプルの量に対する比は、規定した希釈倍率と等しく；
ｄ）該容器を追加の期間、加熱してインキュベートし；
ｅ）最終量のサンプル及び最終量の希釈緩衝液を含む最終サンプル容量を該容器へ加えることを含む最終のサンプル添加ステップを行い、ここで、該最終サンプル容量中のサンプルの量の、その直前のサンプル添加ステップで使用されるサンプルの量に対する比は、規定した希釈倍率と等しく；
ｆ）該容器を最終の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した該物質の存在により生じたシグナルを測定し；さらに
ｇ）予め決定した用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の該標的被分析物とを関連付けることを含む、前記方法。
【請求項１７】
ステップｃ）及びｄ）の最初の実施の直後に、ステップｃ）及びｄ）を１回以上繰り返えす、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アッセイが均一系アッセイである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
標的被分析物と結合した物質が酵素であり、第２の試薬容量が該酵素が作用する１以上の基質を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アッセイが、固相上に固定されたレセプターを用いる不均一系アッセイである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２１】
標的被分析物と結合した物質が酵素であり、最終のインキュベーション期間の後に得た上澄液を、１以上の基質を該分離した上澄液に加えてシグナル生成させる前に、該固相から分離する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第２の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第１の試薬容量を容器に加える、請求項１６、１７、１８、１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
第１の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項１６、１７、１８、１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
第１のサンプル容量を加える前に、第１の試薬容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項１６、１７、１８、１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２５】
第１の加熱インキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
追加の加熱インキュベーション期間及び最終のインキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
追加の加熱インキュベーション期間及び最終のインキュベーション期間の各々の前に、容器を撹拌する、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
希釈緩衝液へのサンプルの添加を用いてサンプルを希釈し、規定した希釈倍率を得る、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
第１のサンプル容量、追加のサンプル容量、及び最終のサンプル容量間の容量の差を用いて、規定した希釈倍率を得る、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
規定した希釈倍率を、広範囲の標的被分析物濃度において線形応答を有する用量応答曲線が得られるように選択する、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
規定した希釈倍率を、３つの異なる範囲の標的被分析物濃度において３つの別個の線形応答を有する用量応答曲線が得られるように選択する、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
規定した係数を、複数の異なる範囲の標的分析濃度において複数の別個の線形応答を有する用量応答曲線が得られるように選択する、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
第１の期間の間又は後及びステップｃ）の前に、最初のアッセイシグナルを測定すること、並びに、該最初のアッセイシグナルについて予め決定した用量応答曲線を用いて、該最初のアッセイシグナルと、サンプル中の標的被分析物の濃度とを関連付けることを含む、請求項１６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ある濃度で標的被分析物を含むかもしれないサンプル中の標的被分析物についてアッセイを行う方法であって、以下のステップ：
ａ）容器中で、第１の量のサンプルと第１の量の希釈緩衝液を含む第１のサンプル容量、物質と結合した既知の濃度の標的被分析物を含む第１の試薬容量、及び標的被分析物に対して高親和性を有するレセプターを含む第２の試薬容量を混合し;
ｂ）該容器を第１の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した該物質の存在により生じたシグナルを測定し；
ｃ）予め決定した用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の該標的被分析物の濃度とを関連付けることにより、該サンプル中の該標的被分析物の濃度を推定し；
ｄ）該予め決定した用量応答曲線が最大の傾きとなる時の濃度を、該サンプル中の該標的被分析物の推定濃度で割ることにより、最適な希釈倍率を算出し；
ｅ）第２の量のサンプルと第２の量の希釈緩衝液を含む第２のサンプル容量を、該容器に加え、ここで、該第２のサンプル容量中のサンプルの量の、該第１のサンプル容量中のサンプルの量に対する比は、規定した希釈倍率と等しく；
ｆ）該容器を第２の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した該物質の存在により生じたシグナルを測定し；さらに
ｇ）用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の該標的被分析物の濃度とを関連付けることを含む、前記方法。
【請求項３５】
ステップｃ）で得た標的被分析物の推定濃度が、該測定でのシグナル-ノイズ比の結果としてゼロ又はゼロと区別できない程度である事象において、最適な希釈倍率を、固定値と等しくなるように選択する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
アッセイが均一系アッセイである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
標的被分析物と結合した物質が酵素であり、第２の試薬容量が、該酵素が作用する１以上の基質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
アッセイが、固相上に固定されたレセプターを用いる不均一系アッセイである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３９】
標的被分析物と結合した物質が酵素であり、第２のインキュベーション期間の後に得た上澄液を、１以上の基質を該分離した上澄液に加えてシグナル生成させる前に、該固相から分離する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第２の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第１の試薬容量が容器に加えられる、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
第１の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
第１のサンプル容量を加える前に、第１の試薬容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
第１の加熱インキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
第２の加熱インキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
希釈緩衝液へのサンプルの添加を用いてサンプルを希釈し、規定の希釈倍率を得る、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
第１のサンプル容量と第２のサンプル容量との間の容量の差を用いて規定した希釈倍率を得る、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
特定範囲の標的被分析物濃度に及ぶ動的範囲を与えるように選択された固定の希釈倍率にて、予め規定した用量応答曲線を得て、ここで未知のサンプル中の標的被分析物の濃度は該特定範囲内にあると予測されるものであり、そして、既知の用量応答のセットから得たシグナルをその濃度に対しプロットし、該シグナルと濃度を次式：
【数１】
2008532018.tif 000008
[式中、yはアッセイシグナルであり、xは被分析物濃度であり、さらにa0-a6は適合するパラメーターである]
で表される数学関数に当てはめ、パラメーターa5を式a2/f（ここでfは最適な希釈倍率と等しい）で置換することにより該予め決定した用量応答曲線から用量応答曲線を求める、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
標的被分析物についてのアッセイを改良する方法であって、該アッセイはS字型用量応答曲線により特徴付けられ、拡張された検出ウィンドウをもたらすものであり、以下のステップ：
ａ）既知の量の標的被分析物を、ある濃度で該標的被分析物を含むかもしれないサンプル又は該アッセイで使用される試薬のいずれかに加え；さらに
ｂ）該サンプル上でアッセイを行うこと；
を含み、ステップａ）は拡張された検出ウィンドウをもたらし、低い標的被分析物濃度での実施を改良する、前記方法。
【請求項４９】
アッセイが均一系アッセイである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
アッセイが、標的被分析物を結合した固相上に固定されたレセプターを用いる不均一系アッセイである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
既知の量の標的被分析物を、該標的被分析物と結合も反応もしない試薬に加える、請求項４８、４９又は５０に記載の方法。
【請求項５２】
標的被分析物を含む場合に得られるアッセイシグナルと、含まない場合、すなわち標的被分析物の濃度が０であるサンプルの場合に得られるアッセイシグナルの差が、可能な全ての標的被分析物濃度にわたって該アッセイで得られる最大シグナルの25％に等しいか又はそれ以下である、請求項４８、４９、５０又は５１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連する米国特許出願の相互参照
本出願は、米国実用特許出願第11/070,282号（2005年3月3日出願）「動的範囲が拡張されたイムノアッセイ」の英語出願に関するものであり、参照によりその全体が本明細書に含まれているものとする。
【０００２】
発明の分野
本発明は、動的範囲が拡張されたイムノアッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
親和性に基づいたイムノアッセイは、その感度を理由に、サンプル中の被分析物(analyte)の存在や濃度を検出及び測定するためにごく一般的に使用される。被分析物は、薬剤、汚染物質、化学物質、混入物質等のような多種多様な物質のうち任意のものであり得る。低分子量（1000未満）を有する被分析物の検出及び定量を行うための最も一般的なアプローチは、競合的イムノアッセイである。このアッセイには複数の形式が存在し、標的被分析物、該被分析物と結合する特異的なレセプター、及び酵素のような検出可能な標識と結合した標的被分析物（又は該標的被分析物の誘導体）からなる対応する被分析物-コンジュゲートが関与する。
【０００４】
競合アッセイは、非線形用量応答曲線、質量作用の法則により影響を受ける形状、及び被分析物と被分析物-コンジュゲートに対するレセプターの親和性を示すことが知られている。かかるアッセイによりもたらされる動的範囲(dynamic range)は、モノクローナル抗体をレセプターとして使用する場合には、多くの場合、約１オーダーに制限される。残念ながら、数多くの重要な被分析物の濃度のうち臨床的に意義のある範囲は１オーダーよりもずっと大きいことがあり、殆どの競合アッセイの測定可能な範囲を超えている。
【０００５】
アッセイの動的範囲を拡張する直接的な技術のほとんどは、サンプルを希釈しアッセイに戻すことによるものである。この方法は、精度(accuracy)を維持し、動的範囲を増大させる。かかる方策は、被分析物濃度が通常、非常に限られた範囲の濃度に分布する場合において、医療機関がスクリーニングを行うのに適し得る。かかるケースでは、希釈を必要とする可能性は極めて低く、よって稀である。ハイスループットスクリーニングを行うクリニックでは、サンプル希釈に伴う時間と費用は比較的大した問題とならないので、アッセイ動的範囲を拡張する手段として希釈が特に適している。
【０００６】
しかしながら、サンプルが非常に広分布の被分析物濃度で存在し得、サンプルを頻繁に希釈することが必須となるような非スクリーニング医療機関が他に数多くある。例えば、（薬物中毒に対する治療下の薬物中毒者のコンプライアンスをモニターする）メタドン(methadone)維持療法クリニックでは、広範囲の薬物濃度をもつ患者集団を頻繁かつ精確に試験する必要がある。希釈を利用して必要とされるアッセイ動的範囲を得る場合、かなりの費用がかかることがある；これは、追加試薬の費用の面と、結果を得るまでにより長い時間がかかるということ、の両方が要因である。小規模なクリニックは、ハイスループットクリニックが享受するのと同じ規模の節約から恩恵を受けることができないので、希釈に付随する費用の増加には特に影響を受けやすい。
【０００７】
米国特許第5,585,241号及びWO8911101は、異なるタイプの単分散粒子の上にそれぞれ被覆された高親和性レセプター及び低親和性レセプターを利用するアッセイ技術を記載する。しかしながら、これらの方法は、被分析物に対する２つの異なるタイプのレセプターの生産及び長い開発時間を要する作業を必要とする。さらに、複数バッチの試薬において、高度に制御されたレセプター親和性という要件を満たすことは困難である。米国特許第6,551,788号は、独立して測定可能なクラスのレセプターで被覆されたサイズが互いに異なる２以上の粒子と共に、サンプルを同時にインキュベートすることによって、広範囲の動的範囲を有するアッセイを提供する。その半面、この方法は、高度に制御された専用の試薬を調製するのに、高額で面倒な作業を必要とする。
【特許文献１】米国実用特許出願第11/070,282号
【特許文献２】米国特許第5,585,241号
【特許文献３】WO8911101
【特許文献４】米国特許第6,551,788号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、必要とされるのは、簡便で、費用効率がよく、かつ実用的で分離アッセイや追加試薬の消費を必要としない手法により拡張された動的範囲をもたらすアッセイ方法である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の要約
よって、新規の複合アッセイを行う方法であって、複数ステップのサンプル添加プロセスを適用し、様々な濃度のサンプルをアッセイ中の異なる時点で加える前記方法が提供される。複数ステップのサンプル添加方法は、複合アッセイの用量応答曲線を拡げ、劇的にアッセイ動的範囲を増大させる。
【００１０】
本発明のアッセイは、以下のとおり行われる。標的被分析物についてアッセイする最初のサンプル容量及び、標識と結合した被分析物を含む試薬を、容器に分配する。被分析物に対して高親和性を有するレセプターを含む第２の試薬をその後、同一の容器に分配し、この時点で反応を開始させる。混合物をその後、最初の期間インキュベートする。最初のサンプルよりも多くのサンプルを含む第２のサンプル容量をその後、該容器へと分配する。第２のサンプルの容量（volume）及び濃度を選択することにより、第２のサンプル添加ステップに対する第１のサンプル添加ステップの好ましい希釈倍率(dilution factor)が得られる。そして、新しい混合物を第２の期間インキュベートした後、結合された又は非結合の被分析物の量と関連するシグナルを測定する。その後、予め確立した用量応答曲線を利用して、測定したシグナルから被分析物濃度を推定する。複合アッセイの用量応答曲線は、サンプル希釈倍率と２つのインキュベーション時間を制御することにより、最適化し得る。
【００１１】
したがって、本発明は、ある濃度で標的被分析物を含むかもしれないサンプル上の標的被分析物についてアッセイを行う方法であって、以下のステップ：
ａ）容器中で、第１の量のサンプルと第１の量の希釈緩衝液を含む第１のサンプル容量、物質と結合した既知の濃度の標的被分析物を含む第１の試薬容量、及び標的被分析物に対して高親和性を有するレセプターを含む第２の試薬容量を混合し;
ｂ）該容器を第１の期間、加熱してインキュベートし;
ｃ）第２の量のサンプルと第２の量の希釈緩衝液を含む第２のサンプル容量を該容器に加え、ここで、該第２のサンプル容量中のサンプルの量の、該第１のサンプル容量中のサンプルの量に対する比は規定した希釈倍率と等しく；
ｄ）該容器を第２の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した物質の存在により生じたシグナルを測定し；さらに
ｅ）予め決定した用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の該標的被分析物の濃度とを関連付けることを含む、前記方法を提供する。
【００１２】
本発明の別の態様では、複合アッセイ方法を改良することにより、広い検出ウィンドウにおいて高感度を得ることができる。これは、次の方法により達成され、最適な精度での測定をもたらすように希釈倍率はアッセイ法ごとに変更される。希釈したサンプルの固定容量を、最初に反応容器へと加える。第１のインキュベーション時間の後に、シグナルを測定して利用することにより、予め決定した用量応答曲線から被分析物濃度の推定値を得る。そして、第１のサンプルの第２のサンプルに対する最適な希釈倍率を、用量応答曲線が最大の傾きとなる時の被分析物濃度の、推定した被分析物濃度に対する比から算出する。算出した希釈倍率に一致する容量及び濃度の第２のサンプルを、その後容器へと加える。第２の期間インキュベートした後に、シグナルを再度測定する。その後、最適な希釈倍率での複合アッセイに関して予め確立した用量応答曲線をもとに、被分析物濃度を精確に推定する。
【００１３】
したがって、本発明の別の態様には、ある濃度で標的被分析物を含むかもしれないサンプル上の標的被分析物についてアッセイを行う方法であって、以下のステップ：
ａ）容器中で、第１の量のサンプルと第１の量の希釈緩衝液を含む第１のサンプル容量、物質と結合した既知の濃度の標的被分析物を含む第１の試薬容量、及び標的被分析物に対して高親和性を有するレセプターを含む第２の試薬容量を混合し;
ｂ）該容器を第１の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した物質の存在により生じたシグナルを測定し；
ｃ）予め決定した用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の標的被分析物の濃度とを関連付けることにより、該サンプル中の標的被分析物の濃度を推定し；
ｄ）予め決定した用量応答曲線が最大の傾きとなる時の濃度を、該サンプル中の標的被分析物の推定濃度で割ることにより、最適な希釈倍率を算出し；
ｅ）第２の量のサンプルと第２の量の希釈緩衝液を含む第２のサンプル容量を、該容器に加え、ここで、該第２のサンプル容量中のサンプルの量の、該第１のサンプル容量中のサンプルの量に対する比は、最適な希釈倍率と等しく；
ｆ）該容器を第２の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した物質の存在により生じたシグナルを測定し；さらに
ｇ）用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の標的被分析物の濃度とを関連付けることを含む、前記方法がある。
【００１４】
本発明の最終的な態様では、従来のアッセイを改良することにより、拡張された検出ウィンドウを得る方法が開示される。この方法では、アッセイ技術に関係なく、S字型用量応答曲線を示す任意のアッセイを適用する。改良されたアッセイ方法は、ある量の純粋な被分析物をアッセイ試薬又はサンプルのいずれかに加え、その後、公知の一般的なプロトコールを用いてアッセイを行う。純粋な被分析物の添加により、アッセイ精度の最大値は低下するが、検出ウィンドウが増大する。
【００１５】
したがって、本発明の別の態様には、標的被分析物についてアッセイを行う方法であって、該アッセイはS字型用量応答曲線により特徴付けられ、拡張された検出ウィンドウをもたらすものであり、以下のステップ：
ａ）既知の量の標的被分析物を、ある濃度で標的被分析物を含むかもしれないサンプル又は該アッセイで使用される試薬のいずれかに加え；さらに
ｂ）サンプル上でアッセイを行うこと；
を含み、ステップａ）は拡張された検出ウィンドウをもたらし、低い標的被分析物濃度での実施を改良する前記方法がある。
【００１６】
本発明の機能的かつ有利な態様は、以下の詳細な説明及び図面を参照することにより、さらに理解することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
図面の簡単な説明
後述の「図面の簡単な説明」の項を参照のこと。
【００１８】
本発明は、本出願の一部を構成する添付の図面と関連付けた発明の詳細な説明から、さらに十分に理解されるであろう。
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、サンプル中の１つの被分析物をアッセイする方法に関する。より具体的には、拡張された動的範囲をもたらすことができ、複数の検出ウィンドウを有する改良された競合アッセイを提供する。
【００２０】
本明細書で使用される用語「レセプター」は、抗体、DNA、RNA、アプタマー、分子インプリントポリマー(molecularly imprinted polymer)、又は被分析物に対し特異的な結合親和性を示すことができる任意の他の種(species)を意味する。
【００２１】
本明細書で使用される用語「被分析物」又は「標的被分析物」は、サンプル中でその存在又は濃度が探索される任意の種を意味する。
【００２２】
本明細書で使用される用語「検出ウィンドウ」は、変動係数(CV)が所望の値より低い場合における被分析物濃度の連続範囲を意味する。
【００２３】
本明細書で使用される用語「動的範囲」は、検出ウィンドウ内での最大の被分析物濃度の、該検出ウィンドウ内での最小の被分析物濃度に対する比を意味する。
【００２４】
先行技術の競合アッセイは、(標的被分析物を含むかもしれない)ある容量のサンプルを、既知の量の被分析物-コンジュゲートと共に、被分析物と被分析物-コンジュゲートに特異的な既知の量のレセプターの存在下で、インキュベートすることにより行われる。サンプル中の被分析物と被分析物-コンジュゲートは、レセプターの結合部位に対して競合し、ホモジニアス形式で存在するか又は固相とヘテロジニアス形式で結合するか、いずれかをとり得る。インキュベーション期間の後に、結合された又は非結合の被分析物-コンジュゲートの数と関連するシグナルを測定する。これは、先行技術として知られる多くの形式のうちの１つ、例えば競合的均一系酵素イムノアッセイ(EIA)を利用して、実現される。競合的均一系EIA形式では、被分析物と結合した酵素は発色基質上で作用し、光学吸光度として測定される色を生じさせる。被分析物-コンジュゲートとレセプターとの結合は酵素の活性を低下させるので、より低い光学吸光度が生じる。そのため、測定した吸光度は、予め決定した用量応答曲線を用いて被分析物濃度と関連付けられる。かかる競合アッセイは、通常、１オーダーよりも低い動的範囲を示す。
【００２５】
本発明は、劇的にアッセイ動的範囲を増大させることにより、従来の競合アッセイを改良する。これは、複数ステップのサンプル添加プロセスを含む新規の複合アッセイを用いて達成され、該添加ステップでは、アッセイインキュベーションのプロセスで、正確なサンプル容量を反応容器へと加える。かかるアッセイ内サンプル添加スキームは、競合アッセイの動的範囲を拡げるという有利な結果をもたらすことが観察されている。
【００２６】
本明細書で開示の新規の複合アッセイは、先行技術と本発明の競合アッセイを行う方法とを対比することにより、広く理解することができる。先行技術の競合アッセイの用量応答は図１に示される通りで、測定したシグナルは非結合の被分析物-コンジュゲートの数と直線的に相関する。希釈していないサンプルでは、実線の算定(logistic)曲線が得られる。そして、サンプルが希釈されると、破線の算定曲線で示されるとおり、用量応答曲線はより高いサンプル濃度へとシフトする。
【００２７】
ここで、希釈したサンプルと希釈してないサンプルの両方をアッセイの間に添加する複合アッセイにおいて、競合アッセイの用量応答曲線について検討する。希釈したサンプルを最初に加え、被分析物-コンジュゲートと共にインキュベートすると、反応は図１の破線の用量応答曲線を生じさせるように進行する。インキュベーション時間の後に、希釈していないサンプルを加え、この新しい混合物をインキュベートする。すると、反応は図１の実線の用量応答曲線を生じさせる方にシフトする。そのため、化学平衡に達するのに十分な時間が与えられる場合には、最終的な用量応答曲線は、理論上、図１の実線の曲線とほぼ同一のもの（希釈したサンプル中の少量の被分析物の存在により僅かにシフトしたもの）になるであろう。というのは、反応容器中に存在する被分析物の量は、希釈していないサンプルの量にほぼ等しいからである。
【００２８】
しかしながら、もし希釈していないサンプルの添加後に化学平衡に達しなければ、測定した用量応答曲線は図１の曲線のいずれにもならないであろう。代わりに、被分析物-コンジュゲートの最終的な数は、単一の競合する希釈したサンプル及び希釈してないサンプルで得られた値の間になるであろうことが理解できる。換言すると、用量応答曲線は、図１の実線及び破線の曲線の間に位置することになるであろう。かかる中間に位置する平衡でない用量応答曲線は、図２において太い実線の曲線として示される。本発明の複合アッセイを行うことにより得られたこの中間の曲線は、従来の先行技術のアッセイよりも、ずっと広い動的範囲におよぶ。複合アッセイ曲線の正確な形状は、２つのステップで加えられるサンプルの相対量とインキュベーションのタイミングにより決まる。
【００２９】
上記アッセイ方法は、均一系競合アッセイの場合を示す図３のフローチャートで、模式的に示される。第１のステップにおいて、標的被分析物についてアッセイする最初のサンプル容量と、被分析物-コンジュゲートを含む試薬とを、容器へと分配する。その後、被分析物に特異的なレセプターを含む第２の試薬を同一の容器へと分配し、この時点で反応を開始させる。あるいは、単一の固相を利用する不均一系アッセイでは、サンプル容量と被分析物-コンジュゲートを、固相と結合したレセプターを含む第２の容器中に分配する。その後、混合物を最初の期間インキュベートする。最初のサンプルよりも大きなサンプル容量をもつ第２のサンプル容量を、その後、容器中に分配する。そして、新しい混合物を第２の期間インキュベートした後、アッセイを完了する。
【００３０】
アッセイの完了後、その結果を適切な検出スキームを用いて読み取る。例えば、発色基質上で作用する酵素が被分析物と結合する均一系アッセイでは、光度吸光度を測定する。本発明の好ましい実施形態では、該検出方法により、結合された又は非結合の被分析物-コンジュゲートの総数を測定することができる。上記のうち、酵素が結合した被分析物に関しては、正味の吸光度シグナルではなく、吸光度の変化速度を測定することにより該検出方法が達成される。別の例において、蛍光シグナルが使用される場合には、結合された又は非結合の被分析物-コンジュゲートの総数の測定値として、直接的な蛍光シグナルが利用される。
【実施例】
【００３１】
本発明のアッセイ方法は、これに限定されないが、尿中のEDDPの定量について均一系競合アッセイを行う実施例を検討することにより、さらに説明され得る。EDDPはメタドンの代謝産物であり、薬物中毒に対する治療処置下にある薬物中毒者に対して一般に投与される代替薬である。市販の酵素イムノアッセイ(EIA)を適用して、先行技術の方法の実施は立証される。このアッセイにおいて、被分析物-コンジュゲートは酵素で標識したEDDPのことであり、このコンジュゲートは、限られた数の抗体結合部位に対して、サンプル（被分析物）中のEDDPと競合する。サンプル中の被分析物の量が増加すると、抗体と結合した被分析物-コンジュゲートの量が減少し、その結果、酵素活性が増大する。これは、酵素-被分析物-コンジュゲートと抗体との結合が酵素活性を阻害するからである。結合された(又は非結合の)酵素コンジュゲートの数と直線的に関連する基質産生の変化速度は、波長340 nmにおける光学吸光度から測定される。
【００３２】
市販のEIAは２つの試薬を有し、以降R1及びR2と呼ぶ。試薬R1には、EDDPに対するモノクローナル抗体を含むレセプターと、グルコース-6-ホスフェート(G6P)とニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NAD)を含む基質とが含まれる。第２の試薬R2には、酵素グルコース-6-ホスフェートデヒドロゲナーゼ(G6PDH)で標識されたEDDPである被分析物-コンジュゲートが含まれる。光学吸光度の変化は、基質G6P及びNAD上での酵素G6PDHの作用、すなわちNADをNADHへ変化させる作用により生じる。
【００３３】
上記のEIA試薬は本発明の根本的な原理を説明するために利用したものであり、本発明の複合アッセイ方法は、希釈したサンプルと希釈していないサンプルをそれぞれ用いて行った２つのアッセイの用量応答曲線の間に位置する用量応答曲線を生じさせる。この実験では、競合的均一系アッセイを、96-ウェルマイクロプレート形式の３つのウェルで行った。第１のウェルでは、1000 ng/mlのEDDPを含む20μLのサンプルを、30μLのR2と混合した。その後、80μLのR1をこのウェルへと加えた。第２及び第３のウェルでは、1000 ng/mlのEDDPを含むわずか2μLのサンプルを、30μLのR2と混合した。その後、80μLのR1も第２及び第３のウェルに加えた。そして、マイクロプレートを30秒間撹拌し、各ウェルの吸光度を波長340 nmにおいて、30秒の測定間隔で5分間測定した。光学測定中は、マイクロプレートを室温に維持した。5分間の光学測定及び2分間の更なるインキュベーション時間の後、1000 ng/ml(のEDDP)を含む18μLのサンプルを、第３のウェルに加えた。そして、マイクロプレートを撹拌し、各ウェルの吸光度をその後、再び30秒の測定間隔で30分間読み取った。
【００３４】
したがって、上記実験における第１のウェルは希釈していないサンプルで行った先行技術のアッセイを示し、第２のウェルは希釈したサンプルで行った先行技術のアッセイを示すものとして理解することができる。しかしながら、2μLのサンプルを最初に加え、そして18μLをその後加えた第３のウェルは、本発明の複合アッセイ方法を示す。その結果を図４に示し、ここでは測定した吸光度を、データから最初の吸光度値を差し引いた上で時間の関数としてプロットする。この図から、(30分の時点で)吸光度の変化速度を計算すると、第１、第２、及び第３のウェルについて、それぞれ20.2、39.5、及び31.1 mAU/分であった。図４の曲線及び測定した吸光度の変化速度は、吸光度と本発明のアッセイの吸光度の変化速度がいずれも、先行技術の希釈したアッセイ及び希釈していないアッセイで得られた値の間に入ることを示す。この結果は、本発明の新規の態様を明示的に確認するものであり、中間の用量応答曲線を上記規定の方法により得ることができる。
【００３５】
この結果は、先行技術の希釈していないアッセイの完全な用量応答曲線を、EDDPについての本発明のアッセイの用量応答曲線と比較することにより、より詳細に検討することができる。その場合、幾つかの異なる被分析物濃度を使用することにより、正確に数学関数に当てはめる。最初に、EDDPについての先行技術の競合アッセイを96-ウェルマイクロプレート形式で行った。マイクロプレート内の8個のウェルのそれぞれにおいて、既知の濃度のEDDPを含む20μLのサンプルを、30μLのR2と混合した。マイクロプレートウェルへと加えた8個のEDDPサンプルの濃度は、0、75、150、300、500、1000、2300及び9000 ng/mlであった。その後、80μLのR1をそれぞれのマイクロプレートウェルへと加えた。そして、マイクロプレートを30秒間撹拌した後、340 nmにおける吸光度を30秒の間隔で35分間測定した。吸光度を測定する間、マイクロプレートは室温に維持した。
【００３６】
8個のサンプルについて測定した吸光度値を、図５にプロットする。あらゆるサンプル依存性のバックグラウンド吸光度を除くために、最初の吸光度値をデータから差し引いている。アッセイ結果は吸光度の変化速度から推定し、該変化速度は図６においてアッセイ開始から30分が経過した時点のものとしてプロットされる。図に示すとおり、測定した吸光度の変化速度をロジスティック関数に正確に当てはめることにより、先行技術のアッセイについてなめらかな用量応答曲線が得られる。アッセイの検出ウィンドウは、この場合、(固定のオフセットを差し引いた後の)最大のシグナルの10％〜90％の範囲内に収まる被分析物濃度の範囲として規定され、約58-580 ng/mlである。また、動的範囲は約10である。
【００３７】
次に、本発明の複合アッセイを、分離マイクロプレートを用いて行った。マイクロプレート内の8個のウェルのそれぞれにおいて、既知の濃度のEDDPを含む2μLのサンプルを、30μLのR2と混合した。マイクロプレートウェルに加えた8個のEDDPサンプルの濃度は、上記の先行技術の競合アッセイの場合と同一とした。
【００３８】
その後、80μLのR1をそれぞれのマイクロプレートウェルへと加えた。その後、マイクロプレートを30秒間撹拌し、マイクロプレートを室温に維持し、30秒の間隔で5分間吸光度を読み取った。そして、マイクロプレートを再び撹拌する前に、サンプル容量18μLを加えた(各ウェルには、最初の2μLのサンプル容量中のサンプル濃度と同じサンプル濃度を加える）。そして、再びマイクロプレートを室温に維持し、吸光度を30秒の間隔で30分間読み取った。
【００３９】
８個のサンプルの時間依存性の吸光度を、図７にプロットする。濃度150 ng/mlの曲線のみが、他の濃度曲線と明瞭に分離している図５の濃度曲線とは異なり、図７ではほとんど全ての曲線が、明瞭な相互分離を示す。しかしながら、２ステップの逆希釈プロセスであるため、吸光度値のみから正確な解釈をすることはできない。その代わりに、吸光度の変化速度が、測定したデータの明瞭で意味のある提示を与える。（30分後に測定した）吸光度の変化速度を図８に示す。図８は該アッセイの新しい用量応答曲線を明確に示している。特に、(先行技術のアッセイと同じ方法で算出した)検出ウィンドウは、先行技術の範囲である約58-580 ng/mlから、より広い範囲である75-2250 ng/mlへと拡張する。また、動的範囲は30であり、先行技術の値の3倍へと劇的に増加する。
【００４０】
新しい用量応答曲線は、先行技術の希釈していないアッセイ曲線と共に図９でも示されるように、先行技術の希釈した用量応答曲線及び希釈していない用量応答曲線の数値平均値に近似することが明らかである。複合アッセイの傾きは、全ての場所において先行技術のアッセイの最大の傾きよりも低いので、拡張した動的範囲は複合アッセイの変動係数が全体的に高くなる代償として、得られるのだと理解することができる。新しい曲線を、２つの算定曲線を併せたものに正確に当てはめる。単純で公知な関数へのこの正確な当てはめにより、予め決定した較正曲線から未知のサンプル濃度を容易に決定することができる。特に、単純な二次方程式を解くことによって、より複雑な数値方法を要することなく、この逆算をすることができる。
【００４１】
一般的に均一系酵素アッセイに関しては、図１０で模式的に説明されるように、次のプロトコールに従いアッセイが行われ得る。T＝0の時点で、２つの試薬R1及びR2を容量V1のサンプルと混合する。そして、その混合物を撹拌し、Taの期間、一定の温度でインキュベートする。それから、容量V2のサンプルを加え、その混合物を再び撹拌して十分な混合を確保する。混合物をTRの時点までインキュベートし、その後、TSの時点まで吸光度を読み取る。そして、間隔[TR-TS]の途中のTCの時点で吸光度の変化速度を算出する。被分析物濃度は、予め決定した用量応答曲線をもとに算出する。
【００４２】
均一系酵素アッセイに関する上記実施例のように、エンドポイントアッセイよりもダイナミックな特別の場合には、本発明の別の実施形態により、特定範囲に及ぶ被分析物の濃度をより正確に測定することができる。これは、第１のインキュベーション時間の間又は後であるが第２のサンプル容量の添加よりも前に得たシグナルに基づいて、被分析物濃度を測定することにより実現される。被分析物濃度は、この方法を用いて予め決定した用量応答曲線から得られる。該アッセイシグナルは、（図２に見られるとおり）複合アッセイよりも大きな傾きを持つ用量応答曲線を特徴とするので、より誤差の少ない測定をもたらす。しかしながら、この改良された精度は限定的な範囲の濃度でしか得られないので、被分析物濃度がこの範囲よりも低い場合には、複合アッセイの第２の部分を実施することにより、低い被分析物濃度でも正確な測定が行われ得る。
【００４３】
EDDPについて本発明の複合アッセイの測定精度及び正確性も実験により調べた。上記の方法を用いて、測定した吸光度の変化速度を２つのロジスティック関数を併せたものに当てはめることにより、まず較正曲線を得た。そして、EDDP濃度が100 ng/mlである同一サンプルについて、新たに8回を１セットとした複合アッセイを上記の方法を再び用いて行った。較正関数の二次方程式を用いて、測定した吸光度の変化速度を推定されるサンプル濃度に変換した。得られたサンプル濃度を、表１、また図８に示す。この結果は、典型的なアッセイを2％の確度(accuracy)と1.5％の測定精度(precision)で行うことができることを示す。
【００４４】
表１：EDDPの正確な濃度が100 ng/mlである場合における、8回を１セットとした複合アッセイでのEDDPの推定濃度。
【表１】
2008532018.tif 000003
【００４５】
複合アッセイ方法の好ましい実施形態では、サンプル希釈を適用することにより第１及び第２のサンプル添加ステップの正確な希釈倍率を得るが、様々なサンプル容量を使用することにより有効な希釈倍率を得ることも可能である。例えば、上記のEDDPについての複合アッセイでは、2μLのサンプル容量を希釈したサンプルとして適用した。その後、容量18μLを事実上希釈していないサンプルとして選択した。2μL容量及び18μL容量の被分析物濃度はいずれも同一であったが、18μLを2μLのサンプルと同一の反応容器に分配することは、正味の結果としては10倍の逆希釈をしたことになる。
【００４６】
複合EDDPアッセイのために得た用量応答曲線は、特別な場合における曲線の一般的なセットであって、特定のアッセイの要件に適合するように調整され得ることを理解することが重要である。実際に、該複合アッセイの用量応答曲線は、アッセイのパラメーターを変更することにより、改変され得る。例えば、検出ウィンドウの幅は、希釈したサンプル及び希釈していないサンプルの希釈倍率を変更することにより、最適化することができる。また、曲線の形状は、２つのインキュベーション時間(すなわち、第２のサンプル容量の添加前の期間、及び第２のサンプル容量の添加とシグナルの測定の間の期間)の選択により決まる。
【００４７】
この調節により、所定の用途のために最適化された形状を有する用量応答曲線をとるアッセイを当業者は設計することができる。検出ウィンドウの中心域内の濃度範囲において、曲線の傾きは大きな傾きからより小さな傾きへと変化し、その後再び大きな傾きへと変化することが、図８より観察できる。これは、用量応答曲線の２つの線形範囲間の移行において生じる。対応するアッセイの変動係数は、ほとんどの場合、この傾きと同じ傾向となるであろう。多くの診断アッセイでは、検出ウィンドウの中心域で変動係数が悪くなるのは望ましくないかもしれない。しかし、幸いにも、本アッセイのパラメーターで用量応答曲線を調節することにより、検出ウィンドウの中心域内で単一の線形範囲を作成することが可能である。これは、複合アッセイの用量応答曲線を含む２つのロジスティック関数に十分に重なる量に希釈倍率を狭めることにより達成される。
【００４８】
かかるスキームを図１１に図示し、小さい希釈倍率を用いてシュミレーションしたEDDP複合アッセイに関する用量応答曲線を、上記の複合EDDPアッセイで測定した用量応答曲線とともにプロットする。該シュミレーションは、希釈倍率を表す双対のロジスティック関数のパラメーターの比を変更することにより達成される。双対のロジスティック関数は一般式:
【数１】
2008532018.tif 000004
【００４９】
[式中、yはアッセイシグナルであり、xは被分析物濃度であり、さらにa0-a6は当てはめパラメーターであり、希釈倍率はa2/a5の比とおおよそ等しい]
で表される。図８に示した当てはめた用量応答曲線では、この比は10.9と等しく、希釈倍率が10であるのと殆ど等しい(較差は、ピペッティングエラーのみによって説明され得る)。図１１のシュミレーションした曲線は、a2の値を1150 ng/mlから550 ng/mlへと変更すること、すなわち希釈倍率を5.2に下げることにより得ることができる。この希釈倍率の低下は、広範囲の被分析物濃度において線形の用量応答を生じさせる効果を有し、第１のロジスティック関数の上方への湾曲は、第２のロジスティック関数の下方への湾曲によって均衡が保たれる。このシュミレーションした用量応答曲線の動的範囲は、実際に測定した複合アッセイの動的範囲よりも狭いが、シュミレーションした曲線は、有利には、全てのオーダーの被分析物濃度に関して一定の傾きを維持する。ほとんどの場合、この挙動により、診断アッセイの望ましい特性である一定の変動係数がもたらされるであろう。
【００５０】
また、アッセイは、好ましくは２つの分離した線形範囲（すなわち、低濃度のカットオフ値で被分析物の存在を測定するための線形範囲及び治療に関連する濃度範囲内にある被分析物濃度を正確に定量するための線形範囲）で行われ得る。かかる用量応答曲線は、上記の実施例のように、希釈倍率を調節することにより設計し得る。大きな希釈倍率(例えば、10を超える)を選択する場合には、２つのロジスティック関数が用量応答曲線において分離し、２つの分離した線形（かつ、感受性の高い）検出ウィンドウをもたらすであろう。
【００５１】
本発明の別の実施形態では、本発明の複合アッセイ方法を改良することにより、広い検出ウィンドウで最適な感度が得られ得る。希釈したサンプルの固定容量を最初に加える。第１のインキュベーション時間の後でかつ、第２の(希釈していない)変動するサンプル容量の添加の前に、シグナル(例えば、酵素アッセイにおける吸光度の変化速度)を測定する。その後、測定したシグナルを用いて、予め決定した較正曲線を利用し、先行技術のアッセイ方法と全く同じ方法で被分析物濃度の推定値を得る。一方で、改良された複合方法では、推定した被分析物濃度を用いることにより、最大の感度を有する複合アッセイのための最適な希釈倍率を計算することができる。
【００５２】
直接的なサンプル希釈を使用することにより適切なサンプル希釈倍率を得て、該適切な希釈倍率をもつ第２のサンプルを使用することができる。あるいは、サンプル希釈の代わりにサンプル容量を使用する場合には、希釈倍率を使用して第２のサンプル容量を算出する。例えば、推定した被分析物濃度が、希釈した用量応答曲線が最大の傾きとなるポイントよりも10倍低い場合には、希釈倍率は10を選択する。よって、逆希釈をするためにサンプル容量を得るのであれば、10倍以上のサンプルを第２のステップで加えることになる。この選択では、低濃度の(希釈していないサンプルにより生じた)算定曲線において最大の傾きとなるポイントを、推定サンプル濃度とする。このアッセイ方法の好適な較正曲線を作成するためには、用量応答曲線を希釈倍率の中間値で作成する。この曲線は、１つの特定の希釈倍率に対してのみ有効とも考えられるが、これは式１の値a5を変更することにより、任意の希釈倍率に当てはめるように改変することができる。特に、a5は、a2を最適な希釈曲線で割ることにより得られた値に置き換えることができる。この変更により、最適な希釈倍率のために必要な用量応答曲線が得られるような方法で、特定の希釈倍率で得られる用量応答曲線の形状は改変される。
【００５３】
本発明は、２ステップの複合アッセイに関連付けて記載されているが、該方法を複数ステップのプロセスへと一般化することにより、複数の検出ウィンドウを得ることができる。例えば、第１及び第２のサンプル添加ステップの場合よりも多くの被分析物を加える第３の逆希釈ステップを追加することができる。この第３の追加ステップを使用することにより、第３の検出ウィンドウを追加し、はじめの２つの検出ウィンドウのうちの１つの線形範囲を拡げ、又は単一の広い線形用量応答曲線を拡げることができる。
【００５４】
本発明の最終的な実施形態では、単一のワンステップアッセイ方法を適用することにより、改良された動的範囲が得られる。本発明のアッセイ方法を任意のアッセイに適用することにより、用量応答曲線をロジスティック関数のようなS字型関数に当てはめる。本発明のアッセイは、ある量の純粋な標的被分析物を、アッセイ試薬のうちの１つ又はサンプル自体に加えるといった方法で、既知のアッセイを改良することにより達成される。好ましい実施形態では、純粋な被分析物を、被分析物が結合も反応もしないアッセイ試薬に加える。被分析物の添加により用量応答曲線を改変し、観察されるシグナル範囲を狭める。例えば、算定曲線については、次の関数式で表される。
【数２】
2008532018.tif 000005
【００５５】
上記式中、yはアッセイシグナルであり、xはサンプル中の被分析物濃度であり、さらにa0-a3は当てはめパラメーターであり、被分析物濃度x'に相当するサンプルを添加する場合には、用量応答曲線は新しい次式で表される。
【数３】
2008532018.tif 000006
【００５６】
ロジスティックな用量応答曲線をとる仮想アッセイについて、新しい関数式による計算結果を図１２に示す。ここで、濃度50 ng/mlに相当するサンプルの添加の有無に関わらず、用量応答曲線におけるパラメーターはa0=0、a1=10、a2=150、a3=2.71で表される。図１２の検討により、純粋なサンプルの添加によって、どのように用量応答曲線が拡がり、低い被分析物濃度での用量応答曲線の傾きが増加するのかが明確に説明される。この傾きの増加は、低い被分析物濃度でのアッセイ精度の向上、すなわちより広い動的範囲にそのまま反映される。
【００５７】
精度の実質的な向上については、両方のアッセイのCVを算出することにより、定量的に調べることができる。式y=y(x)で表される用量応答曲線をとるアッセイのCVは、次式
【数４】
2008532018.tif 000007
【００５８】
[式中、Δyはアッセイシグナルyでの誤差である]
と等しい。ただし、実際には、誤差Δyは被分析物濃度に依存しないと見なすことができる。定誤差Δyで割ったCVは、サンプル添加の有無に関わらず、両方のアッセイともに図１３で示される。実線の曲線は、被分析物を添加していない場合のアッセイシグナルの微分を示し、破線の曲線は被分析物を添加した場合のアッセイシグナルの微分を示す。
【００５９】
通常、検出ウィンドウは濃度範囲によって定まり、CVは最大のアッセイシグナルの10％及び90％で測定したその値よりも低い又は等しい。サンプル添加をしないアッセイでは、このCV/Δy値は図１３において太い横実線で示される(最大シグナルの10％及び90％でのCV/Δy値は、算定曲線では等しい）。矢印のついた横線からわかるように、ここで規定した両方のアッセイにおける検出ウィンドウは、横にずれはするが、距離は殆ど等しい。しかしながら、検出ウィンドウの規定を変更することにより、CV/Δyが最大のアッセイシグナルの5%又は95％で測定した測定した値よりも低い又は等しい濃度範囲を示す場合には、サンプル添加をしないアッセイのCV/Δyとして、太い破線が得られる。この場合には、矢印のついた横線でも示されるとおり、サンプル添加をするアッセイの検出ウィンドウは、サンプル添加をしないアッセイの検出ウィンドウよりも、著しく大きい。
【００６０】
既述の考察は、本発明のこの実施形態が、いかにして拡張した動的範囲を有するアッセイ方法を得るために使用され得るかを示している。しかしながら、動的範囲における当該拡張は、検出ウィンドウ内の広い濃度範囲ではアッセイ精度の低下を伴う。このことは、図１３において、サンプルを添加しないアッセイと比べ、サンプルを添加するアッセイで得られるCV/Δyの最小値がより小さいことから明らかである。多くの用途では、この精度の低下は、動的範囲の増加を伴えば認容されるであろう。
【００６１】
当業者であれば、複合アッセイを行う上記の方法は均一系アッセイに限定されず、通常、サンプル中の被分析物と被分析物-コンジュゲート間の競合が関与する全てのアッセイプラットフォームに適用可能であることを容易に理解するであろうことに留意されたい。特に、用語「競合」アッセイは、同時競合アッセイ、阻害アッセイ、さらに置換アッセイを含むことが意図される。
【００６２】
本明細書で使用される用語「含む(comprises、comprising、including及びincludes)」は、包括的でオープンエンドであり、排他的でないものとして解釈されるべきである。特に、特許請求の範囲を含めこの明細書で使用される場合、用語「含む(comprises、comprising、including及びincludes)」及びその変形した用語は、特定の特徴、ステップ又は構成要素が含まれることを意味する。これらの用語は、他の特徴、ステップ又は構成要素の存在を排除して解釈されるべきではない。
【００６３】
本発明の好ましい実施形態に関する前述の説明は、本発明の原理を説明するために提示されているのであって、本発明を例示した特定の実施形態に限定するものではない。本発明の範囲は、特許発明の範囲及びそれと同等の範囲内に包含される全ての実施形態により規定されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【００６４】
【図１】先行技術の競合アッセイのための用量応答曲線の典型的なセットの図示。
【図２】本発明の複合アッセイにより示される中間の平衡でない用量応答曲線の図示。
【図３】均一系競合アッセイの場合の複合アッセイを実施する方法を示す。
【図４】EDDP(メタドンの代謝産物)の均一系競合アッセイのための、吸光度をインキュベーション時間の関数として表す曲線のセット。該アッセイは、従来の方法及び複合方法で実施する。サンプル中のEDDPの濃度は、1000 ng/mlである。
【図５】被分析物がEDDPである場合の先行技術の競合アッセイのための、吸光度をインキュベーション時間の関数として表す曲線のセット。
【図６】図４の曲線について、３０分間のインキュベーションの後の吸光度の変化速度を示す。測定したデータに当てはめた算定曲線は、用量応答曲線を示す。
【図７】複合アッセイのための、吸光度をインキュベーション時間の関数として示す曲線のセット。
【図８】図５の曲線について、３０分間のインキュベーションの後の吸光度の変化速度を示す。測定したポイントで当てはめた算定曲線を２つ併せたものが用量応答曲線を表す。
【図９】従来の方法と複合方法で行ったアッセイの用量応答曲線の比較。
【図１０】複合均一系イムノアッセイについて、時系列プロトコールを図式化して示す。
【図１１】EDDP複合アッセイで測定したデータの用量応答曲線をプロットする。より幅広い線形応答範囲を有するシュミレーションした用量応答曲線を含む。
【図１２】ロジスティック関数式を示す仮想アッセイの用量応答曲線をプロットする。点線及び実線はそれぞれ、純粋な被分析物を試薬のうちの１つに加えた場合又は加えない場合の結果を示す。
【図１３】ロジスティック関数式を示す仮想アッセイについて、アッセイシグナルエラーで割った変動係数をプロットする。点線及び実線はそれぞれ、純粋な被分析物を試薬のうちの１つに加えた場合及び加えない場合の結果を示す。
【図１】
2008532018.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月4日(2006.8.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある濃度で標的被分析物を含むかもしれないサンプル中の標的被分析物についてアッセイを行う方法であって、以下のステップ：
ａ）容器中で、第１の量のサンプルと第１の量の希釈緩衝液を含む第１のサンプル容量、検出可能な標識と結合した既知の濃度の標的被分析物を含む第１の試薬容量、及び標的被分析物に対して高親和性を有するレセプターを含む第２の試薬容量を混合し;
ｂ）該容器を第１の期間、加熱してインキュベートし;
ｃ）第２の量のサンプルと第２の量の希釈緩衝液を含む第２のサンプル容量を、該容器に加え、ここで、該第２のサンプル容量中のサンプルの量の、該第１のサンプル容量中のサンプルの量に対する比は規定した希釈倍率と等しく；
ｄ）該容器を第２の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した該検出可能な標識の存在により生じたシグナルを測定し；さらに
ｅ）予め決定した用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の該標的被分析物の濃度とを関連付けることを含む、前記方法。
【請求項２】
第２の量の希釈緩衝液がゼロである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
第１の量及び第２の量の希釈緩衝液がゼロであり、第１の量のサンプルと第２の量のサンプルとの差を用いて、規定した希釈倍率を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
アッセイが均一系アッセイである、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項５】
標的被分析物と結合した検出可能な標識が酵素であり、第２の試薬容量が該酵素が結合する１以上の基質をさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
アッセイが、固相上に固定されたレセプターを用いる不均一系アッセイである、請求項１、２又は３に記載の方法。
【請求項７】
標的被分析物と結合した検出可能な標識が酵素であり、第２のインキュベーション期間の後に得た上澄液を、１以上の基質を該分離した上澄液に加えてシグナル生成させる前に、該固相から分離する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
第２の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第１の試薬容量を容器に加える、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
第１の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
第１のサンプル容量を加える前に、第１の試薬容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
第１の加熱インキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
第２の加熱インキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
規定した希釈倍率を、広範囲の標的被分析物濃度において線形応答を有する用量応答曲線が得られるように選択する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
規定した希釈倍率を、２つの異なる範囲の標的被分析物濃度において２つの別個の線形応答を有する用量応答曲線が得られるように選択する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
第１の期間の間又は後、及びステップｃ）の前に、最初のアッセイシグナルを測定すること、並びに、該最初のアッセイシグナルについて予め決定した用量応答曲線を用いて、該最初のアッセイシグナルと、サンプル中の標的被分析物の濃度とを関連付けることを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
ある濃度で標的被分析物を含むかもしれないサンプル中の標的被分析物についてアッセイを行う方法であって、以下のステップ：
ａ）容器中で、第１の量のサンプル及び第１の量の希釈緩衝液を含む第１のサンプル容量、検出可能な標識と結合した既知の濃度の標的被分析物を含む第１の試薬容量、並びに標的被分析物に対して高親和性を有するレセプターを含む第２の試薬容量を混合することを含む、第１のサンプル添加ステップを行い；
ｂ）該容器を第１の期間、加熱してインキュベートし；
ｃ）追加量のサンプルと追加量の希釈緩衝液を含む追加のサンプル容量を該容器に加えることを含む追加のサンプル添加ステップを行い、ここで、該追加のサンプル容量中のサンプルの量の、その直前のサンプル添加ステップで使用されるサンプルの量に対する比は、規定した希釈倍率と等しく；
ｄ）該容器を追加の期間、加熱してインキュベートし；
ｅ）最終量のサンプル及び最終量の希釈緩衝液を含む最終サンプル容量を該容器へ加えることを含む最終のサンプル添加ステップを行い、ここで、該最終サンプル容量中のサンプルの量の、その直前のサンプル添加ステップで使用されるサンプルの量に対する比は、規定した希釈倍率と等しく；
ｆ）該容器を最終の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した該検出可能な標識の存在により生じたシグナルを測定し；さらに
ｇ）予め決定した用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の該標的被分析物とを関連付けることを含む、前記方法。
【請求項１７】
ステップｃ）及びｄ）の最初の実施の直後に、ステップｃ）及びｄ）を１回以上繰り返えす、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
アッセイが均一系アッセイである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項１９】
標的被分析物と結合した検出可能な標識が酵素であり、第２の試薬容量が該酵素が結合する１以上の基質をさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
アッセイが、固相上に固定されたレセプターを用いる不均一系アッセイである、請求項１６又は１７に記載の方法。
【請求項２１】
標的被分析物と結合した検出可能な標識が酵素であり、最終のインキュベーション期間の後に得た上澄液を、１以上の基質を該分離した上澄液に加えてシグナル生成させる前に、該固相から分離する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
第２の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第１の試薬容量を容器に加える、請求項１６、１７、１８、１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２３】
第１の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項１６、１７、１８、１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
第１のサンプル容量を加える前に、第１の試薬容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項１６、１７、１８、１９、２０又は２１に記載の方法。
【請求項２５】
第１の加熱インキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
追加の加熱インキュベーション期間及び最終のインキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
追加の加熱インキュベーション期間及び最終のインキュベーション期間の各々の前に、容器を撹拌する、請求項１６〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
希釈緩衝液へのサンプルの添加を用いてサンプルを希釈し、規定した希釈倍率を得る、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
第１のサンプル容量、追加のサンプル容量、及び最終のサンプル容量間の容量の差を用いて、規定した希釈倍率を得る、請求項１６〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
規定した希釈倍率を、広範囲の標的被分析物濃度において線形応答を有する用量応答曲線が得られるように選択する、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
規定した希釈倍率を、３つの異なる範囲の標的被分析物濃度において３つの別個の線形応答を有する用量応答曲線が得られるように選択する、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
規定した係数を、複数の異なる範囲の標的分析濃度において複数の別個の線形応答を有する用量応答曲線が得られるように選択する、請求項１６〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
第１の期間の間又は後及びステップｃ）の前に、最初のアッセイシグナルを測定すること、並びに、該最初のアッセイシグナルについて予め決定した用量応答曲線を用いて、該最初のアッセイシグナルと、サンプル中の標的被分析物の濃度とを関連付けることを含む、請求項１６〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ある濃度で標的被分析物を含むかもしれないサンプル中の標的被分析物についてアッセイを行う方法であって、以下のステップ：
ａ）容器中で、第１の量のサンプルと第１の量の希釈緩衝液を含む第１のサンプル容量、検出可能な標識と結合した既知の濃度の標的被分析物を含む第１の試薬容量、及び標的被分析物に対して高親和性を有するレセプターを含む第２の試薬容量を混合し;
ｂ）該容器を第１の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した該検出可能な標識の存在により生じたシグナルを測定し；
ｃ）予め決定した用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の該標的被分析物の濃度とを関連付けることにより、該サンプル中の該標的被分析物の濃度を推定し；
ｄ）該予め決定した用量応答曲線が最大の傾きとなる時の濃度を、該サンプル中の該標的被分析物の推定濃度で割ることにより、最適な希釈倍率を算出し；
ｅ）第２の量のサンプルと第２の量の希釈緩衝液を含む第２のサンプル容量を、該容器に加え、ここで、該第２のサンプル容量中のサンプルの量の、該第１のサンプル容量中のサンプルの量に対する比は、規定した希釈倍率と等しく；
ｆ）該容器を第２の期間、加熱してインキュベートし、この間に、該標的被分析物と結合した該検出可能な標識の存在により生じたシグナルを測定し；さらに
ｇ）用量応答曲線を用いて、該測定したシグナルと、該サンプル中の該標的被分析物の濃度とを関連付けることを含む、前記方法。
【請求項３５】
ステップｃ）で得た標的被分析物の推定濃度が、該測定でのシグナル-ノイズ比の結果としてゼロ又はゼロと区別できない程度である事象において、最適な希釈倍率を、固定値と等しくなるように選択する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
アッセイが均一系アッセイである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３７】
標的被分析物と結合した検出可能な標識が酵素であり、第２の試薬容量が、該酵素が作用する１以上の基質を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
アッセイが、固相上に固定されたレセプターを用いる不均一系アッセイである、請求項３４又は３５に記載の方法。
【請求項３９】
標的被分析物と結合した検出可能な標識が酵素であり、第２のインキュベーション期間の後に得た上澄液を、１以上の基質を該分離した上澄液に加えてシグナル生成させる前に、該固相から分離する、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
第２の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第１の試薬容量が容器に加えられる、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
第１の試薬容量を加える前に、第１のサンプル容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
第１のサンプル容量を加える前に、第１の試薬容量及び第２の試薬容量を容器に加える、請求項３４〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
第１の加熱インキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
第２の加熱インキュベーション期間の前に、容器を撹拌する、請求項３４〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
希釈緩衝液へのサンプルの添加を用いてサンプルを希釈し、規定の希釈倍率を得る、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
第１のサンプル容量と第２のサンプル容量との間の容量の差を用いて規定した希釈倍率を得る、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
特定範囲の標的被分析物濃度に及ぶ動的範囲を与えるように選択された固定の希釈倍率にて、予め規定した用量応答曲線を得て、ここで未知のサンプル中の標的被分析物の濃度は該特定範囲内にあると予測されるものであり、そして、既知の用量応答のセットから得たシグナルをその濃度に対しプロットし、該シグナルと濃度を次式：
【数１】
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[式中、yはアッセイシグナルであり、xは被分析物濃度であり、さらにa0-a6は適合するパラメーターである]
で表される数学関数に当てはめ、パラメーターa5を式a2/f（ここでfは最適な希釈倍率と等しい）で置換することにより該予め決定した用量応答曲線から用量応答曲線を求める、請求項３４〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【国際調査報告】
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