(57)【要約】【課題】新規の立体選択的アルコール脱水素酵素及びこの組み換え調製に必要なＤＮＡを提供すること。【解決手段】ＮＡＤＰ依存型アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡ分子、該DNA分子の少なくとも１つのＤＮＡ配列のコピーを含有するベクター、及び該ＤＮＡ配列で形質転換又はトランスフェクトされた原核宿主細胞又は真核宿主細胞、ＮＡＤＰ依存型アルコール脱水素酵素、該アルコール脱水素酵素の製造方法及び用途、及び第２級アルコールを立体選択的に生成する方法である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＡＤＰ依存型アルコール脱水素酵素をコードし、かつ、下記（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の配列から選ばれるＤＮＡ配列を有するＤＮＡ分子。
【化１】
2008501351.tif 000012
又はその相補鎖
（ｂ）ストリンジェントな条件下で前記配列（ａ）又はそれらのフラグメントをハイブリッド化するＤＮＡ配列
（ｃ）遺伝子コードのために、（ａ）及び（ｂ）に従ってＤＮＡ配列に縮重し、かつ前記アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡ配列
【請求項２】
請求項１に記載のＤＮＡ配列の少なくとも１つのコピーを含有することを特徴とするベクター。
【請求項３】
下記宿主細胞が前記アルコール脱水素酵素を発現できるように、請求項１に記載のＤＮＡ配列で形質転換又トランスフェクションした原核宿主細胞又は真核宿主細胞。
【請求項４】
大腸菌（Escherichia coli）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、及び枯草菌（Bacillus subtilis）からなる群より選ばれることを特徴とする請求項３に記載の原核宿主細胞又は真核宿主細胞。
【請求項５】
請求項１に記載のＤＮＡ配列のうちの１つをコードし、かつ、複合タンパク質の一部を形成するアルコール脱水素酵素。
【請求項６】
以下のアミノ酸配列、
【化２】
2008501351.tif 000013
2008501351.tif 000014
又は該アミノ酸の１０％までの欠失、挿入及び／又は置換により誘導される配列を有することを特徴とする請求項５に記載のアルコール脱水素酵素。
【請求項７】
前記アルコール脱水素酵素を発現できるように、請求項１に記載のＤＮＡ配列で形質転換又はトランスフェクションした原核宿主細胞又は真核宿主細胞を、亜鉛イオンを０．１〜５ｎＭの濃度で含有する培地中で培養し、前記アルコール脱水素酵素を、前記ＤＮＡ配列の発現産物として単離することを特徴とする請求項５に記載のアルコール脱水素酵素の製造方法。
【請求項８】
前記アルコール脱水素酵素を単離するために、前記宿主細胞を、周期系の第１主族及び第２主族元素のイオン、アンモニウムイオン、および鉄イオンからなる群より選ばれるイオンを少なくとも０．２Ｍの濃度で含有する培地中で、ホモジナイズ及び／又は熱変性することを特徴とする請求項７に記載のアルコール脱水素酵素の製造方法。
【請求項９】
周期系の第１主族及び第２主族元素のイオン、アンモニウムイオン、および鉄イオンからなる群より選ばれるイオンを少なくとも０．２Ｍの濃度で含有する培地中で、前記アルコール脱水素酵素によりケト化合物を酵素還元して立体選択的にヒドロキシ化合物を生成させるための請求項５又は６に記載のアルコール脱水素酵素の用途。
【請求項１０】
周期系の第１主族及び第２主族元素のイオン、アンモニウムイオン、並びに鉄イオンからなる群より選ばれるイオンを少なくとも０．２Ｍの濃度で含有する培地中で、請求項５又は６に記載のアルコール脱水素酵素によってケト化合物を酵素還元することを特徴とする第２級アルコールの立体選択的製造方法。
【請求項１１】
前記ケト化合物が、脂肪族ケトン、芳香族ケトン類、２−ケトエステル類、３−ケトエステル類、およびジケトン類からなる群より選ばれることを特徴とする請求項１０に記載の第２級アルコールの立体選択的製造方法。
【請求項１２】
前記ケト化合物が、２−ブタノン、２−ヘキサノン、２−オクタノン、モノクロロアセトン、アセトアルデヒド、２−メチルブチルアルデヒド、ジアセチル、２，４−ペンタンジオン、２，５−ヘキサンジオン、アセト酢酸エチル、４−クロロアセト酢酸エチル、アセトフェノン、ｐ−クロロアセトフェノン、２−アセチルピリジン、３−ブチン−２−オン、１，２−シクロヘキサンジオン、ピルビン酸塩、２−オキソ酪酸、４−クロロ−２−ブタノン、４−ヒドロキシ−２−ブタノン、３−オクタノン及び塩化フェナシルからなる群より選ばれることを特徴とする請求項１０に記載の第２級アルコールの立体選択的製造方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＮＡＤＰ依存型アルコール脱水素酵素をコードするＤＮＡ分子、少なくとも１つのＤＮＡ配列のコピーを含有するベクター、及びそのＤＮＡ配列で形質転換又はトランスフェクションした原核宿主細胞又は真核宿主細胞に関する。また、本発明は、ＮＡＤＰ依存型アルコール脱水素酵素、その製造方法並びに用途、及び第２級アルコールの立体選択的製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アルコール脱水素酵素は、ケト化合物をアルコールに酵素還元する既知の種類の酵素である。
【０００３】
例えば、アルコール類及びアミン類などの光学活性化合物を、生物触媒を用いて製造する方法が、ますます重要となってきている。補酵素再生を伴う２種の脱水素酵素を組み合わせて使用する方法が、これらの化合物を大規模な工業的規模で合成する経路として知られている（ＤＥ１９７５３３５０  Ａ１）。
【０００４】
ＮＡＤＰ依存型グルコース脱水素酵素、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、又は他のＮＡＤＰ依存型酸化還元酵素を用いた、ＮＡＤＰＨのインシチュ(ｉｎ  ｓｉｔｕ)再生が現在行われている（Y. Yasohara, N. Kizaki, J. Hasegawa, M. Wada, M. Kataoka及びS. Shimizu、Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 1713-1718を参照のこと）。
【０００５】
このような関係の中で、アルコール脱水素酵素（ＡＤＨ）に関心が集まっている。実際には、とりわけ、平衡に(balanced)組み合わされた酵素系において、ケトン類のエナンチオ選択的還元又はラセミ体アルコールの動的ラセミ分割により一方のエナンチオマーに富んだアルコール類の製造が可能になる（技術水準における最新の包括的な概要として、DE10037101、W. Hummel Adv. Biochem. Engineering/Biotechnology 1997, 58, 145-184を参照のこと）。
【０００６】
第２の(second)脱水素酵素を用いないで、基質と結合した補酵素（cofactor）を再生する方法も多く用いられる。ここで、補酵素は、第２の基質を用いて、所望の変換率に必要なアルコール脱水素酵素によって、逆合成の方向で再生される。この第２の基質（例えばイソプロパノール又はエタノール等の任意のアルコール）は過剰に添加される（W. Stampfer, B. Kosjek, C. Moitzi, W. Kroutil及びK. Faber, Angew. Chem. Int.、Engl.編、２００２年３月１５日；41(6): 1014-7を参照のこと）。
ＡＤＨは、クラスＥ．Ｃ．１．１．１．１又はクラスＥ．Ｃ．１．１．１．２に分類されている。したがって、いわゆる酸化還元酵素の部類に属する。これらは、多数の微生物中に存在する（Enzyme Catalysis in Organic Synthesis、編集：K. Drauz及びH. Waldmann、1995、VCH、第ＩＩ巻、595ff）。
【０００７】
広範囲の基質を立体選択的に変換する「ブロードバンド酵素(broad band enzymes)」が重要である。
【０００８】
実験室規模における調製に使用するために市販されているＡＤＨは、例えば、酵母（ＹＡＤＨ）、ウマの肝臓（ＨＬＡＤＨ）、及び、サーモアナエロバクター  ブロッキイ（Thermoanaerobacter brockii）又はサーモアナエロビウム  ブロッキイ（Thermoanaerobium brockii）由来であり、これらはアルコール類の合成に使用される。しかし、これらとは別に、市販されている多数の他のＡＤＨが存在するが、これらのＡＤＨは、実際に名称が示すように、例えば多くのステロイド脱水素酵素等のような特定の基質を変換し、ステロイド構造又はグリセロール脱水素酵素におけるアルコール基を好ましく変換し、グリセリン、又は最終的に、既述のグルコース脱水素酵素等のような糖変換酵素を変換する。
【０００９】
文献においてこれまでに既知のほとんどのＡＤＨは「Ｓ−特異性」である。（Ｓ及びＲの名称は、命名法における形式的な理由から反対の場合もある）。他方、乳酸菌（Lactobacillus）株由来のＡＤＨは、Ｒ−特異性であると言われている（C. W. Bradshaw, W. Hummel, C. -H. Wong, J. Org. Chem. 1992, 57, 1532を参照のこと）。同様に、文献（P. Hildebrandt, T. Riermeier, J. Altenbuchner, U. T. Bornscheuer, Tetrahedron: Asymmetry 2001, 12, 1207）に開示されているシュードモナス（Pseudomonas）由来の別のＡＤＨもＲ−特異性であることが、最近、Altenbuchner及びBornscheuerのチームにより報告されている。
さらに、Keinan及びLamedを含む研究グループは、サーモアナエロビウム  ブロッキイ由来のＡＤＨを報告している（E. Keinan, E. K. Hafeli, K. K. Seth, R. Lamed, J. Am. Chem. Soc. 1986, 108, 162）。これらは、小さい基質に対して（Ｒ）−特異性であるが、一方で、より大きい基質に対しては（Ｓ）−特異性である。
【００１０】
本発明において述べるＡＤＨ  Ｔは、（Ｓ）選択性である。（Ｓ）特異性のアルコール脱水素酵素の多くの仲間が既に明らかに知られているが、それらの工業上の利用可能性はかなり制限されている。このことは、数多くのＡＤＨが既知であることとは対照的に、このような酵素を工業的に使用する方法がほとんどないことから特に実証される。酵母由来の（Ｓ）ＡＤＨは、確かに価値のあるＮＡＤＨ依存型酵素であるが、第１級アルコールを選択的に変換するため、キラルアルコールの製造に関してはあまり重要視されていない。
【００１１】
ウマの肝臓由来のＮＡＤＨ依存型（Ｓ）ＡＤＨ（ＨＬＡＤＨ）は、この酵素に関する数多くの刊行物によってはっきりと示されているように、間違いなく、学術分野において最も頻繁に使用されるアルコール脱水素酵素である（例えば、K. Faber,「有機化学の生体内変化(Biotransformations in Organic Chemistry)」、第四版、Springer-Verlag, 2000, 184fの概要を参照のこと）。残念なことに、この酵素は、入手がしにくいことから、産業上の使用にはあまり選択されない。ウマの肝臓由来の（Ｓ）ＡＤＨは、これまで組み換えにより入手することができないために、非常に高価である（一単位当たり約０．５ユーロ）。
【００１２】
また、その基質スペクトルは主として環状ケトンからなり、（アセトフェノン型の）芳香族側鎖を有するケトンを変換しない。しかし、産業上の観点から、この芳香族ケトンの基質群は、医薬分野における重要な中間産物としての数多くの用途があり、非常に重要である(例えば、ａ）R. A. Holt, S.R. Rigby (Zeneca Limited) ,US5580764, 1996；ｂ）T. J. Blacklock, P. Sohar, J.W. Butcher, T. Lamanec, E. J. J. Grabowski, J. Org. Chem. 1993, 58, 1672-1679；ｃ）R. A. Holt, Chimica Oggi, Chemistry Today 1996, 9, 17-20；ｄ）F. Bracher, T. Litz, Arch. Pharm. 1994, 327, ．591-593；ｅ）S. Y. Sit, R. A. Parker, I. Motoc, W. Han, N. Balasubramanian, J. Med. Chem. 1990, 33, 2982-2999；及びｆ）A. Zaks, D. R. Dodds, Drug Discovery Today 1997, 2, 513-530を参照のこと）。
【００１３】
サーモアナエロバクター  ブロッキイ又はサーモアナエロビウム  ブロッキイ由来のＮＡＤＰ依存型ＡＤＨ（ＴＢＡＤＨ）は、組み換えによって入手可能である。ＮＡＤＰの値段はＮＡＤの値段よりも約３〜４倍も高い。それでも、好適な再生機構を使用することができるので補酵素のコストは許容可能である。しかし、ＴＢＡＤＨの基質スペクトルは脂肪族ケトンに限定される。例えば、（アセトフェノン型の）芳香族側鎖を有するケトンは変換されない。
【００１４】
さらに容易に入手可能な（Ｓ）選択性ＡＤＨは、ロードコッカス・エリスロポリス（Rhodococcus  erythropolis）由来の酵素である（ＤＥ４２０９０２２．９、ＷＯ０３／０９１４２３）。広い基質スペクトルが認められる。しかし、このＡＤＨの産業上の利用に関する欠点は、酵素と結合した補酵素の再生が必要な点である。例えばイソプロパノール等の安価な第２の基質を使用することはできない。
【００１５】
対照的に、ロードコッカス・ルーバー（Rhodococcus ruber）由来の（Ｓ）ＡＤＨ（W. Stampfer, B. Kosjek, C. Moitzi, W. Kroutil及びK. Faber, Angew. Chem. Int. Ed. Engl.、2002年3月15日；41(6): 1014-7）は、補酵素再生のための基質結合経路にうまく適応する。産業的に利用するための本質的な欠点は、酵素の入手が限定されることである。すなわち、酵素は野生型から調製できるのみであり、これまで、クローニング及び過剰発現もこれまで成功していない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
したがって明らかなように、前述の欠点のない、産業的に有用なＡＤＨを提供することがなお望まれている。
【００１７】
本発明の目的は、新規な立体選択性アルコール脱水素酵素及びこの組み換え調製に必要なＤＮＡを提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
上記目的は、請求項１で請求されているＤＮＡ分子及び請求項５及び請求項６で請求されているアルコール脱水素酵素によって達成される。
【００１９】
本発明によるＤＮＡは、サーモアナエロバクター種由来である。
【００２０】
この配列を用いてＤＮＡを既知の方法で合成することができる。この目的のためには、不溶性マトリクスと結合している成長鎖に活性化されたモノマーを連続して付加する自動化された固相法が特に適している。合成中反応させない反応性基は保護基によってブロックされる。ＤＮＡ鎖の合成が完了した後、保護基を開裂し、ＤＮＡ鎖をマトリクスから脱離する。
【００２１】
また、所定の配列を有するＤＮＡ分子が市販されている。これらは、所望の配列の製品を専門に扱う企業によって製造される。したがって、ＤＮＡ分子を得るのに原料となる有機物を入手する必要はない。
【００２２】
請求項１で使用される「ストリンジェントな条件」は、ＤＮＡの加水分解及び洗浄に関する条件を意味する。ストリンジェントな条件は、当業者に既知であり、文献（例えば、「分子生物学の最近のプロトコル(Current Protocols in Molecular Biology)」, John Wiley & Sons, N.Y., 1989, 6.3.1-6.3.6）に記載されている。この参考文献には、水系及び非水系の方法が記載されている。好ましいストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、例えば、ＵＳ−Ａ６７４０５１４号にも記載されている。
【００２３】
本発明によるアルコール脱水素酵素は熱的に安定であり、また以下にＡＤＨ  Ｔと記載する。（Ｓ）選択性の酵素は、脂肪族アルコール類、脂肪族ケトン類及び脂肪族ジケトン類、さらに、（アセトフェノン型の）芳香族側鎖を有するケトン類を変換する。
【００２４】
熱安定性であるので、３０〜７０℃の広い温度範囲にわたって、変換が可能である。熱安定性のグルコース脱水素酵素を使用することによって、酵素にほとんど関係なく反応温度を選択することができる。また、ＡＤＨ  Ｔは耐溶剤性なので、基質と結合した補酵素の再生（例えば、イソプロパノールの使用を通じて）もまた可能である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明によるアルコール脱水素酵素の使用例は、図１に図示されている。
【００２６】
サーモアナエロバクター  エサノリカス（Thermoanaerobacter ethanolicus）３９Ｅ由来のアルコール脱水素酵素（ＡＤＨ−ＴＥ）が米国特許５９０８９２４Ａ１に記載されている。ＤＮＡ配列及びアミノ酸配列は、本発明によるＤＮＡ分子及びＡＤＨ  Ｔとある程度一致している。上記米国特許に記載及び特許請求されているＤＮＡ分子は本発明の対象ではなく、ＡＤＨ  Ｔは、サーモアナエロバクター  エサノリカス３９Ｅ由来のアルコール脱水素酵素と比べて、下記比較例から分かるように、極めて予測不可能な利点を示す。
【００２７】
本発明は、請求項１に記載のＤＮＡ配列の少なくとも１つのコピーを含むベクターに関し、また、宿主細胞が上記アルコール脱水素酵素を発現できるように、請求項１に記載のＤＮＡ配列で形質転換又はトランスフェクションした原核宿主細胞又は真核宿主細胞に関する。宿主細胞は、好ましくは大腸菌（Escherichia coli）、サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、及び枯草菌（Bacillus subtilis）から成る群から選択される。
【００２８】
本質的には、本発明のＡＤＨ  Ｔアルコール脱水素酵素を製造するための発酵及び発現は、当業者に既知の条件下で、例えば、M.I. Viitanen, A. Vasala, P. Neubauer及びT. AlatossavaがMicrobial Cell Factories 2003, 2:2に記載されているように実施することができる。しかし、この方法は、約２００Ｕ／ｇ（細胞湿重量）という低い活性収量をもたらすにすぎない。驚くべきことに、亜鉛イオンを培地に添加すると、活性収量がかなり増加することが見出された。すなわち、活性収量は１ｍＭの硫酸亜鉛の添加によって１０倍に増加した。したがって本発明は、アルコール脱水素酵素の製造方法に関する。該製造方法においては、宿主細胞がアルコール脱水素酵素を発現できるように請求項１に記載のＤＮＡ配列で形質転換又はトランスフェクトした原核宿主細胞又は真核宿主細胞を、０．１〜５ｍＭの濃度で亜鉛イオンを含む培地で培養し、ＤＮＡ配列の発現産物としてアルコール脱水素酵素を単離する。
【００２９】
活性収量が亜鉛濃度に依存することは以下の表１から分かる。
表１は、大腸菌のＡＤＨ  Ｔの異種発現を伴う高濃度の細胞発酵における異なる亜鉛濃度の影響を検討した結果である。ＯＤ600３０、０．４ｍＭのＩＰＴＧを使用して、１４時間、３０℃で誘導を行った。その活性は、誘導期間後の細胞湿重量１グラム当たりで示した。
【００３０】
【表１】
2008501351.tif 000002
【００３１】
熱安定性にもかかわらず、単離されたＡＤＨ  Ｔは標準的な条件下で長期間保存することはできない（５０ｍＭトリス−Ｃｌ、ｐＨ７．０）。半減期は、わずか約４日である。例えば、塩化ナトリウムを加えることによって、半減期は４０日超に増大する（表２）。表２に、４℃での異なる条件で保存した単離ＡＤＨ  Ｔの活性を示した。
【００３２】
【表２】
2008501351.tif 000003
【００３３】
しかし、調製された酵素に亜鉛イオンを添加すると、急速に不活性化する。
【００３４】
グリセリンを添加（特に５０％の濃度）すると、−２０℃で少なくとも３ヶ月間極めて安定に保存することができた。
【００３５】
グリコール、ポリエチレングリコール、トレハロース、スクロース等の糖類、及び、これらの物質そのものの組み合わせ又はこれらの物質とイオン強度上昇に適した物質との組み合わせも、本発明において酵素製剤の安定化剤として好適である。
【００３６】
組み換えＡＤＨ  Ｔの他の特徴については、ｐＨ７．０が最適であることが見出された（表３及び表４）。表３は、異なるｐＨ値での単離ＡＤＨ  Ｔの活性について示す。表４は、ｐＨ７．０により近いｐＨ値での活性を再び別々に検討した結果を示す。
【００３７】
【表３】
2008501351.tif 000004
【００３８】
【表４】
2008501351.tif 000005
【００３９】
熱的安定性もまた、非常に良好である。ＡＤＨ  Ｔの活性は、５０℃で１２時間処理後でさえ開始時の値の７５％であった。
【００４０】
本明細書中に述べる精製した状態において、ＡＤＨ  Ｔは、脂肪族ケトン類、芳香族ケトン類、アルデヒド類、２−又は３−ケトエステル類、及びジケトン類を変換する。基質スペクトルのさらなるデータを表５に示す。表５は、異なる基質（１０ｍＭ）の還元における、精製ＡＤＨ  Ｔの相対活性について示す。アセトンでの活性を１００％に設定した。
【００４１】
【表５】
2008501351.tif 000006
【００４２】
ジケトンの変換に関する、ＡＤＨ  Ｔとサーモアナエロバクター  エサノリカス３９Ｅ由来の第２級アルコールの脱水素酵素（ＵＳ−Ａ５９０８９２４）との活性の比較は興味深い（表６）。表６は、様々なジケトン類に対するＡＤＨ  Ｔの相対活性を示す。
【００４３】
対応するジオール類が、化学的な均一系触媒のキラル配位子の合成において主要な役割を果たすことから、エナンチオマー純度及びジアステレオマー純度は最も高くなくてはならない。
【００４４】
【表６】
2008501351.tif 000007
【００４５】
（Ｓ）−４−ヒドロキシ−２−ペンタノン及び（Ｓ，Ｓ）−２，４−ペンタンジオールの製造にはＡＤＨ  Ｔと２，４−ペンタンジオンとの反応が好適である。
【００４６】
この反応によって、エナンチオマー純度及びジアステレオマー純度が非常に高い両生成物を得ることができる（表７）。
表７は、５０ｍＭのトリス／塩酸（ｐＨ７．０）中、３０℃で４８時間インキュベーションした後の基質含量及び生成物含量を示す。
（Ｓ）−４−ヒドロキシ−２−ペンタノンの調製には、５Ｕ／ｍｌの酵素とイソプロパノール（１０％）を使用して再生した基質結合補酵素を使用し、（Ｓ，Ｓ）−２，４−ペンタンジオールの調製には、１０Ｕ／ｍｌの酵素とグルコース脱水素酵素を使用して再生した酵素結合補酵素を使用した。
この両者の場合、補酵素はＮＡＤＰである。
【００４７】
【表７】
2008501351.tif 000008
【００４８】
表から、ＡＤＨ  Ｔは、高い変換率レベルを達成するだけでなく、ＡＤＨ−ＴＥと比べて、２，４−ペンタンジオンの還元において、非常に良好なエナンチオ選択性及びジアステレオ選択性を有することも分かる。
【００４９】
ＡＤＨ  Ｔは、２，５−ヘキサンジオンもまた、非常に高い変換率、エナンチオ選択性及びジアステレオ選択性でジオール体に還元する（表８）。表８に、４８時間後の変換率及び（Ｓ，Ｓ）エナンチオマーのｅｅ／ｄｅを表６で使用された酵素と同じ量で示した。
【００５０】
【表８】
2008501351.tif 000009
【００５１】
ｅｅ／ｄｅ値が１００％であることは、調製したジオールがエナンチオマー及びジアステレオマーとして完全に純粋であることを表す。本明細書において開示されている方法によって、ＡＤＨ  Ｔを初めて十分量得ることができ、それにより、キログラム単位でジオールの純粋なエナンチオマーを生産することができる。
【００５２】
本願で開示されている単離された酵素の安定性を改善することによって、ＡＤＨ  Ｔ生体内形質転換（biotransformation）において、使用された酵素の量に対する、キラルアルコール類の生成物収量が顕著に増加する。
【００５３】
実際には、イソプロパノールを使用した基質と結合した補酵素の再生による２−ペンタノン又は２−ブタノン等の重要なケトン類の還元におけるエナンチオ選択性は、酵素と結合した補酵素の再生を利用する場合よりも非常に良好であることが分かる。
【００５４】
また、生成物の達成可能なエナンチオマー純度は、使用されるイソプロパノールの量によって変わる（表９）。表９に、基質と結合した補酵素の再生に関して、異なるイソプロパノール濃度で、２００ｍＭの２−ペンタノンを３Ｕ／ｍｌのＡＤＨ  Ｔ及び０．０５ｍＭのＮＡＤＰを含む１００ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．０）中で変換したときの変換率レベル及びエナンチオ過剰率（ｅｅ）を示す。
【００５５】
【表９】
2008501351.tif 000010
【００５６】
〔活性測定〕
活性は、補酵素の減少を光度測定することにより決定した。測定バッチ：１０ｍＭの基質及び０．２ｍＭのＮＡＤＰＨを含む５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．０）。ＡＤＨ−ＴＥの測定バッチは１ｍＭの塩化マグネシウムをさらに含む。
【００５７】
酵素添加後、１分間、３４０ｎｍにおいてＮＡＤＰＨの減少を追跡した。活性が０．５〜１．５Ｕ／ｍｌとなるように十分量の酵素を添加した。測定容量は１ｍｌであった。
【００５８】
１Ｕは、１分につき１μｍｏｌの基質を変換する酵素の量に対応する。
【００５９】
〔サーモアナエロバクター種由来のアルコール脱水素酵素のクローン化〕
サーモアナエロバクター種由来のアルコール脱水素酵素のクローン化のために、関連生物であるサーモアナエロバクター  エサノリカス（Th.ethanolicus）、サーモアナエロバクター  ブロッキイ（Th.brockii）及びサーモアナエロバクター  テングコンゲンシス（Th.tengcongensis）由来のアルコール脱水素酵素の対応する遺伝子配列が、これらの配列のプライマー対を誘導するのに十分相同性があると仮定した。
【００６０】
誘導されたプライマー配列は、以下のとおりである。
【００６１】
【化１】
2008501351.tif 000011
【００６２】
配列において太字で強調されているように、Ｎｄｅ Ｉ切断部位は、Ｎ末端のプライマーに付着し、Ｘｈｏ Ｉ切断部位は、Ｃ末端のプライマーに付着している。
【００６３】
１００ｐｍｏｌ／μｌに希釈後、ロシュ（Roche）のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いてプライマーをリン酸化した。
【００６４】
〔ゲノムＤＮＡ及びＰＣＲの調製〕
新たに発酵したサーモアナエロバクター種生物のバイオマス１００ｍｇを回収した。ゲノムＤＮＡは、キアゲン（QIAGEN）社のゲノムチップで単離した。
【００６５】
ＰＣＲ反応は、コア温度が約５５℃で、１０℃のアニーリング勾配を含むプログラムで実行した。
【００６６】
残りのパラメーターについては、約１，０００ｂｐのフラグメントに関するロシュ（Roche）のハイファイ(high fidelity)プロトコルに記載されているように選択した。
【００６７】
これに続くゲル電気泳動法によって、１２バッチ全てにおいて約１，０００ｂｐの予測したサイズであるＰＣＲ生成物が得られたことが分かった。
【００６８】
〔ｐＵＣ１８へのクローン化〕
ＤＮＡは、ロシュ（Roche）のＴ４リガーゼを使用して、Ｓｍａ  Ｉ切断部位及び脱リン酸化されたベクターｐＵＣ１８に結合した。
【００６９】
大腸菌（E.coli）ＤＨ５αへの構築物（construct）の形質転換、プラスミド単離及び制限分析後、挿入断片を含むベクターのいくつかのクローンを同定することができた。
【００７０】
構築物をｐＵＣ１８［ＡＤＨ  Ｔ］と名付け、その配列を決定した。
【００７１】
〔ｐＥＴ２４ａへのクローン化〕
アルコール脱水素酵素に関する遺伝子を、制限酵素であるＮｄｅ  Ｉ及びＸｈｏ  Ｉを使用してベクターｐＵＣ１８［ＡＤＨ  Ｔ］から切断し、同じ酵素で消化したベクターｐＥＴ２４ａに結合した。
【００７２】
予備試験において、このベクターの脱リン酸化は不要であることが見出された。
【００７３】
結合混合物は、再び大腸菌ＤＨ５αに形質転換した。
【００７４】
また、プラスミド単離及び制限分析後、正しい挿入部位を有するいくつかのクローンもここで単離することができた。
【００７５】
製造された構築物をｐＥＴ２４ａ［ＡＤＨ  Ｔ］と名付け、ノバゲン（Novagen）社の発現宿主株Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）ｐＬａｃＩに形質転換した。
【００７６】
〔発現試験〕
このようにして得られたＲｏｓｅｔｔａ［ＤＥ３］ｐＬａｃＩにおけるｐＥＴ２４ａ［ＡＤＨ  Ｔ］株を、ＬＢ培地で５時間培養し、０．５ｍＭのイソプロピルチオガラクシド（ＩＰＴＧ）で誘導して、さらに一晩培養した。
【００７７】
細胞を採取し、１００ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．５）で超音波崩壊して、細胞残屑を遠心分離によって除去した。
【００７８】
基質であるアセトンに対する、過剰に生産されたタンパク質の活性が、５，０００Ｕ／ｇ（細胞湿重量）であることが見出された。
【００７９】
〔配列分析〕
見出されたＤＮＡ配列は、「クローン」プログラムによってアミノ酸配列に翻訳され、サーモアナエロバクター  エサノリカス（Th.ethanolicus）由来の対応する配列と比較した。
【００８０】
〔大腸菌（E.coli）の高細胞濃度発酵〕
無機塩培地：
ＮａＨ2ＰＯ4×２Ｈ2Ｏ        ４．０ｇ／ｌ
Ｋ2ＨＰＯ4                  １４．６ｇ／ｌ
ＮＨ4Ｃｌ                    ０．５ｇ／ｌ
（ＮＨ4）2ＳＯ4              ２．５ｇ／ｌ
（ＮＨ4）2Ｈクエン酸塩      １．０ｇ／ｌ
Ｎａ2ＳＯ4                  ２．０ｇ／ｌ
【００８１】
培地は高温殺菌して、１ＭのＭｇＳＯ4、
ＣａＣｌ2×６Ｈ2Ｏ      ０．７４ｇ／ｌ
ＺｎＳＯ4×７Ｈ2Ｏ      ０．１８ｇ／ｌ
ＭｎＳＯ4×Ｈ2Ｏ        ０．１ｇ／ｌ
Ｎａ2ＥＤＴＡ            ２０．１ｇ／ｌ
ＦｅＣｌ3×６Ｈ2Ｏ      １６．７ｇ／ｌ
ＣｕＳＯ4                ０．１ｇ／ｌ
ＣｏＣｌ2                ０．１０４ｇ／ｌ
から成る微量元素溶液、及び３４ｍｇ／ｌのチアミンをそれぞれ２ｍｌ／Ｌずつ添加した。２０ｇ／ｌのグルコースを炭素源として使用した。
【００８２】
また、ＡＤＨ  Ｔを過剰生産できる細菌〔この場合は大腸菌（E.coli）〕の発酵のために、ＺｎＳＯ4を０ｍＭ〜３ｍＭの濃度で添加した。
【００８３】
培地に接種し、撹拌器の回転数及び通気速度を適宜調節して飽和酸素量を３０％超に維持した。炭素源の消費後、酸素濃度が３０％を越えないように、グルコースを供給容器から計量しながら供給した。
【００８４】
２ｍｌ／ｌの１Ｍ  ＭｇＳＯ4、２ｍｌ／ｌの微量元素溶液、３４ｍｇ／ｌのチアミン及び６６０ｇ／ｌのグルコースを含む前述の無機培地を供給した（M.I. Viitanen, A. Vasala, P. Neubauer及びT. Alatossava, Microbial Cell Factories 2003, 2:2）。
【００８５】
〔酵素調製〕
得られた細胞集団を１０％の１Ｍ  ＮａＣｌを含む５０ｍＭのトリス−Ｃｌ（ｐＨ７．０）中に再懸濁して、ホモゲナイザーで解砕した。次に、水槽中、７０℃で７．５分間熱変性した。変性したタンパク質及び細胞残屑を遠心分離した。
【００８６】
上清を１，０００Ｕ／ｍｌの活性濃度まで濃縮し、グリセリン濃度を５０％にして、−２０℃で保存した。
【００８７】
アルコール脱水素酵素の単離のために、本発明による方法では、宿主細胞を、周期系の第１主族元素及び第２主族元素のイオン、アンモニウムイオン、及び鉄イオンから成る群から選択されるイオンを少なくとも０．２Ｍの濃度で含有する培地中でホモジナイズ及び／又は熱変性する。
【００８８】
本発明はまた、周期系の第１主族及び第２主族元素のイオン、アンモニウムイオン、及び鉄イオンから成る群から選択されるイオンを少なくとも０．２Ｍの濃度で含有する培地中で、アルコール脱水素酵素を用いてケトン化合物を酵素還元してヒドロキシ化合物を立体選択的に生産するための、アルコール脱水素酵素であるＡＤＨ  Ｔの用途に関する。
【００８９】
本発明はさらに、ケト化合物を、周期系の主族元素の１族元素及び２族元素のイオン、アンモニウムイオン及び鉄イオンから成る群から選択されるイオンを少なくとも０．２Ｍの濃度で含有する培地中で、アルコール脱水素酵素であるＡＤＨ  Ｔによって酵素還元することを特徴とする第２級アルコール類の立体選択的製造方法に関する。
【００９０】
この方法の好ましい実施形態を請求項１１及び請求項１２に示す。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】再生した補酵素を利用するアルコール脱水素酵素の使用を示す概略図である。Ｒ2〔プロ立体中心側(prostereogenic sides)〕は、Ｒ1よりもかさ高い置換基なので、プロキラルケトンに対する攻撃はＳｉ側から起こる。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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