(57)【要約】  本発明は、血管内皮成長因子受容体に結合し血管新生反応を調節する化合物の使用に関する。受容体の認識に関与するＶＥＧＦアミノ酸領域１７−２５を模倣しそれにより血管新生プロセスを抑制または刺激する化合物を、ＶＥＧＦに依存する血管新生が過剰または不足していることを特徴とする疾患、例えば、慢性虚血、癌、増殖性網膜症およびリューマチ性関節炎、新しい血管の形成または再生の恩恵を受ける状況または状態の治療において、およびＶＥＧＦ受容体の過剰発現を呈する病変の診断において、またはＶＥＧＦ受容体活性化に依存する細胞経路を分析するための生化学的ツールとして用いることができる。
2008546821.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管の形成または再生の恩恵を受ける状況、疾患または状態を治療するための薬剤を調製するための、ＶＥＧＦ受容体を認識することができると共に内皮細胞の増殖と血管新生の両方を調節することができる、残基Ｐｈｅ１７〜Ｔｙｒ２５に及ぶＶＥＧＦヘリックスを模倣する化合物の使用。
【請求項２】
血管新生依存性疾患の治療のための、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記疾患が、慢性虚血、乾癬、癌、増殖性網膜症およびリューマチ性関節炎を含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
その表面にＶＥＧＦ受容体を発現している腫瘍および血管新生依存性腫瘍を治療するための、請求項３に記載の使用。
【請求項５】
肺腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、胃腸腫瘍、腎臓腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頸部腫瘍、上皮性悪性腫瘍、血管肉腫、胚細胞腫瘍および頭蓋内腫瘍を治療するための、請求項４に記載の使用。
【請求項６】
眼疾患を治療するための、請求項２に記載の使用。
【請求項７】
加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、硝子体出血、網膜剥離および血管新生緑内障を治療するための、請求項６に記載の使用。
【請求項８】
女性生殖器官疾患を治療するための、請求項２に記載の使用。
【請求項９】
卵巣過剰刺激症候群および子宮内膜症を治療するための、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
脳水腫、虚血性心臓血管疾患、神経細胞障害、骨疾患または障害、胃潰瘍、糖尿病性足壊疽、糖尿病性神経障害および創傷治癒を治療するための、請求項２に記載の使用。
【請求項１１】
ＶＥＧＦ受容体の過剰発現を特徴とする病変の診断のための診断用組成物の調製のための、ＶＥＧＦ受容体を認識することができると共に内皮細胞の増殖と血管新生の両方を調節することができる、残基Ｐｈｅ１７〜Ｔｙｒ２５に及ぶＶＥＧＦヘリックスを模倣する化合物の使用。
【請求項１２】
診断用組成物が血管新生脈管構造の画像化に適している、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
ＶＥＧＦ受容体の活性化に依存する細胞経路の研究のための生化学的ツールとしての、ＶＥＧＦ受容体を認識することができると共に内皮細胞の増殖と血管新生の両方を調節することができる、残基Ｐｈｅ１７〜Ｔｙｒ２５に及ぶＶＥＧＦヘリックスを模倣する化合物の使用。
【請求項１４】
前記化合物が配列番号１〜８から選択されるペプチドである、先の請求項のいずれかに記載の使用：
配列番号１：  ＫＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰ
配列番号２：  ＫＬＴＦＭＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
配列番号３：  ＫＬＴＷＭＥＬＹＱＬＡＹＫＧＩ
配列番号４：  ＫＬＴＷＫＥＬＹＱＬＡＹＫＧＩ
配列番号５：  ＫＬＴＷＭＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
配列番号６：  ＫＬＴＷＱＥＬＹＱＬＡＹＫＧＩ
配列番号７：  ＫＬＴＷＫＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
配列番号８：  ＫＬＴＷＱＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
【請求項１５】
血管新生依存性病変により影響を受けている被験者を治療する方法であって、その被験者に、ＶＥＧＦ受容体を認識することができると共に内皮細胞の増殖と血管新生の両方を調節することができる、残基Ｐｈｅ１７〜Ｔｙｒ２５に及ぶＶＥＧＦヘリックスを模倣する化合物の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１６】
前記化合物が配列番号１〜８から選択されるペプチドである、請求項１５に記載の方法：
配列番号１：  ＫＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰ
配列番号２：  ＫＬＴＦＭＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
配列番号３：  ＫＬＴＷＭＥＬＹＱＬＡＹＫＧＩ
配列番号４：  ＫＬＴＷＫＥＬＹＱＬＡＹＫＧＩ
配列番号５：  ＫＬＴＷＭＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
配列番号６：  ＫＬＴＷＱＥＬＹＱＬＡＹＫＧＩ
配列番号７：  ＫＬＴＷＫＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
配列番号８：  ＫＬＴＷＱＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＥＧＦ受容体と相互作用すると共にＶＥＧＦ依存性生物学的反応を調節（modulation)する化合物の使用に関する。これらの化合物は、受容体の結合に関与する特定の領域であるヘリックス領域１７−２５ＶＥＧＦに係わる。具体的には、本発明は、ＶＥＧＦ生物学的活性の制御に係わる病変の治療のため、ＶＥＧＦ受容体の過剰発現を呈する病変の診断のため、およびＶＥＧＦ受容体の活性化に依存する細胞経路の研究のための生化学的ツールとしての、これらの化合物の使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
血管新生は、予め存在する血管からの新しい血管の分岐を特徴とする、血管組織のリモデリングと呼ばれる生理学的プロセスである。これは、内皮細胞（ＥＣ）の移動および増殖に密接に関与する。胚の発生中にＥＣは特に活性であるが、成体期間には、ＥＣのターンオーバーは非常に低く特定の生理学的現象に限定されている（カルメリエト（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．）、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００３，９，６５３）。健常個体において、血管新生は、血管新生促進因子と血管新生阻害因子とにより進行が精巧に調節され、低酸素のような特定の刺激下におけるこの平衡からのシフト（血管新生スイッチ）は、複数のヒト疾患に関与する（病的血管新生）（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．）、フォルクマン（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．）、Ｃｅｌｌ  １９９６，８６，３５３）。血管新生促進因子の優勢（過剰血管新生）は、癌、増殖型網膜症、リューマチ性関節炎および乾癬に関係する。一方、不充分な血管新生が、冠状動脈疾患、虚血および低下した組織再生能の原因である（カルメリエト（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．）、ジェイン（Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．）、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０７，２４９）。
【０００３】
多くの臨床的研究により、血管新生が充実性腫瘍（固形腫瘍）の成長のための必須のプロセスであることが示された。血管新生のどこかの相を抑制すると、新しい血管の形成が阻害され、それにより、腫瘍の成長および転移の発生が影響を受ける。正常組織としての腫瘍細胞は、生き残るために酸素と代謝産物を受け取る必要がある。最初に、新生物病巣が小さい（直径２ｍｍ未満）ときは、腫瘍は、これらの物質を拡散（無血管相）により受け取ることができ、休眠を維持して増殖とアポトーシスとの間の静止状態を達成することができる。引き続いて（血管相）、腫瘍細胞が無差別に分裂し始めると、血管新生促進因子と血管新生阻害因子との間の平衡にシフトを誘発（血管新生スイッチ）し、血管網状組織の形成を促進して、酸素と栄養素の増加する需要を充たし、それにより、腫瘍の成長を急上昇させることができる（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．）、フォルクマン（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．）、Ｃｅｌｌ  １９９６，８６，３５３）。さらに、新しい血管は、腫瘍が転移の形成に至り得る経路の一つである。
【０００４】
血管新生スイッチは、腫瘍のタイプに依存して腫瘍進行の異なる相において起こり得るが、大部分の場合、それは、腫瘍の成長にとって必須条件である。
【０００５】
新しく形成された腫瘍血管は、正常のものと異なる特徴を示す。実際、これらの血管は構造的に乱れ、捻じれ、拡張しており、それらの膜表面上に特有のマーカーを発現しており、そのマーカーを腫瘍血管の選択的標的化に用いることができる（ベルガーズ（Ｂｅｒｇｅｒｓ，Ｇ．）、ベンジャミン（Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｌ．Ｅ．）、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００３，３，４０１；ルースラーチ（Ｒｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．）、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００２，２，８３）。
【０００６】
心臓血管疾患：虚血への主な生理学的反応は、毛細血管の局所的成長である。主要動脈が閉塞すると、狭窄後圧力が低下し、血液が存在する細動脈に再分配される。得られる引き伸ばしおよびせん断力により、内皮ケモカイン、接着分子および成長因子が発現される（ヘリシュ（Ｈｅｌｉｓｃｈ，Ａ．）、シェイパー（Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｗ．）、Ｚ  Ｋａｒｄｉｏｌ  ２０００，８９，２３９）。血管は巨大成長プロセスを示し、内皮細胞および血管平滑筋細胞の両方が活発に増殖する。冠状動脈疾患または末梢血管疾患の場合、この血管新生反応は、動脈新生を伴うことが多い。冠状動脈閉塞部位の周囲に、側副血管が発生し得る。動脈新生の正確な機構は明らかではないが、予め存在する血管をリモデリングして大量の血流を運ぶことができる部位を拡大することと、閉塞動脈の外膜表面上の後毛細血管細静脈から新規血管を進出させて次第に拡大し遠位動脈部分に結合することの、２つの異なる可能性がある。過剰の血管は、充分な流れが一旦達成されると、アポトーシスする（サイモンズ（Ｓｉｍｏｎｓ，Ｍ．）、ワレ（Ｗａｒｅ，Ｊ．Ａ．)、Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  ２００３，２，８６３）。
【０００７】
個体が、良好な側副循環を形成し、毛細血管床寸法を増加させて、虚血性傷害後の補償を行い、それにより損傷を制限する性能を有することが非常に重要である（シェイパー（Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｗ．）、イトー（Ｉｔｏ，Ｗ．Ｄ．）、Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  １９９６，７９，９１１；ヘリシュ（Ｈｅｌｉｓｃｈ，Ａ．）、シェイパー（Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｗ．）、Ｍｉｃｒｏｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ２００３，１０，８３）。末梢動脈疾患を有する個体が、広域の下肢動脈閉塞にも拘わらず、生来堅牢な側副網目故にほとんど無症候性のままであることは稀ではない（ヘリシュ（Ｈｅｌｉｓｃｈ，Ａ．）、シェイパー（Ｓｃｈａｐｅｒ，Ｗ．）、Ｚ  Ｋａｒｄｉｏｌ  ２０００，８９，２３９）。慢性虚血における側副血管形成の程度はある個体から他の個体に異なるので、血管新生反応の個体間相違の基礎を明らかにすることが重要である（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ．）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９９，１００，５４７）。複数の観察により、遺伝的背景が、少なくとも部分的に、慢性冠状動脈疾患中の側副発達を欠く原因であり得ることが示されている。
【０００８】
実験データは、側副発達に乏しい患者において、ＶＥＧＦの低酸素的誘発が著しく低下していることを示している（シュツル（Ｓｃｈｕｌｔｚ，Ａ．）ら、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  １９９９，１００，５４７）。内因性血管新生の可能性の個々の変化は、低酸素誘発因子−１（ＨＩＦ−１）媒介ＶＥＧＦ発現の上流側調整解除に限定されないことが見えてくる。組織メタロプロテイナーゼ、組織プラスミノーゲン活性化因子または、細胞内信号伝達の変化に係わる血管新生の原因となるカスケードの他の成分の不完全な発現は、結果に影響があると分かる（イズナー（Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０００，１０６，６１５）。
【０００９】
血管新生は、主に、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）により調整される。ＶＥＧＦは内皮細胞に特異的な有糸分裂促進物質であり、ここ数年、血管新生反応標的化ＶＥＧＦおよびその受容体を制御するための多くの努力が続けられた。
【００１０】
血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）は、有効な血管新生因子、すなわち血管内皮細胞に特異的な有糸分裂促進物質であり、血管新生において主要な役割を果たす。ＶＥＧＦおよびその受容体が、病的血管新生において過剰発現されて、この系を、治療的かつ診断的適用のための有効な標的にする（ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．）、フォルクマン（Ｆｏｌｋｍａｎ，Ｊ．）、Ｃｅｌｌ  １９９６，８６，３５３；カルメリエト（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．）、ジェイン（Ｊａｉｎ，Ｒ．Ｋ．）、Ｎａｔｕｒｅ  ２０００，４０７：２４９）。
【００１１】
ＶＥＧＦは、シスチンノット（cystine net）成長因子科に属するホモ二量体蛋白である。これは、異なるスプライシング事象故に４つの異なるアイソフォーム（ＶＥＧＦ121，ＶＥＧＦ165，ＶＥＧＦ189，ＶＥＧＦ205）において発現される単一遺伝子によりコードされる。最も豊富なアイソフォームであるＶＥＧＦ165は、４５ＫＤａ糖蛋白であり、高い親和性でヘパリンに結合する。ＶＥＧＦの生物学的機能は、２種のチロシンキナーゼ受容体、すなわちキナーゼ領域受容体（ＫＤＲ、ＦＩｋ−１またはＶＥＧＦＲ−２）およびＦｍｓ様チロシンキナーゼ（ＦＩｔ−１またはＶＥＧＦＲ−１）への結合により媒介される。ＶＥＧＦは、内皮細胞有糸分裂誘発を刺激する受容体二量化を誘発する。ＫＤＲおよびＦＩｔ−１は、種々の内皮細胞型の細胞表面上に局在化する（フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．）ら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ２００３，９，６６９）。これらの受容体の発現の増加が、幾つかの刺激に反応して起こり、内皮細胞に細胞増殖、移動および血管新生を起こさせることになる（ブロギ（Ｂｒｏｇｉ，Ｅ．）ら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９６，９７，４６９）。
【００１２】
異なる機構が、ＶＥＧＦ遺伝子発現の調整に関与していることが示された。これらのうち、酸素圧が主要な役割を果たす。種々の正常および形質転換された培養細胞型において低酸素圧に晒すことにより、ＶＥＧＦ  ｍＲＮＡの発現が迅速かつ可逆的に誘発される（アベディ（Ａｂｅｄｉ，Ｈ．）およびザチャリ（Ｚａｃｈａｒｙ，Ｉ．），Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９７，２７２，１５４４２）。
【００１３】
異なる病変におけるＶＥＧＦの役割が報告され、ＶＥＧＦとその受容体との相互作用を阻害することが幾つかの治療的用途を有することが示された。多くのレビューおよび特許が、病的血管新生におけるＶＥＧＦの役割と用法を記載しており、その治療的用途を検討している。全ての特許出願、特許および引用された公報を、ここで、参照としてその全体を援用する。
【００１４】
ＶＥＧＦとその受容体との相互作用の抑制に基づく治療から恩恵を受け得る疾患は癌である（ヒクリン（Ｄ．Ｊ．Ｈｉｃｋｌｉｎ）およびエリス（Ｌ．Ｍ．Ｅｌｌｉｓ  Ｊ．）、Ｃｌｉｎ．Ｏｎｅ．２００５，２３，１０１１；フェラーラ（Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ）ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００３，９，６６９；フェラーラ（Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ）およびディビス（Ｔ．Ｄａｖｉｓ）−Ｓｍｙｔｈ  Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１９９７，１８，４）。ＶＥＧＦは、幾つかの型の腫瘍において過剰発現される（肺腫瘍、甲状腺腫瘍、乳癌、胃腸腫瘍、腎臓腫瘍、卵巣腫瘍、子宮頸部腫瘍、上皮性悪性腫瘍、血管肉腫、胚細胞腫瘍および頭蓋内腫瘍）。ＶＥＧＦ受容体が、幾つかの型の腫瘍、例えば、非小細胞肺癌、黒色腫、前立腺癌、白血病、中皮腫および乳癌において（ヒクリン（Ｄ．Ｊ．Ｈｉｃｋｌｉｎ）およびエリス（Ｌ．Ｍ．Ｅｌｌｉｓ）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｅ．２００５，２３，１０１１）、および血管新生活性内皮細胞の表面上で過剰発現される。
【００１５】
硝子体出血、網膜剥離および血管新生緑内障につながり得る眼内血管新生において（フェラーラ（Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ）ら、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２００３，９，６６９；フェラーラ（Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ）、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２０００，１１，６１７）、および加齢性黄斑変性症および糖尿病性網膜症のような眼疾患において（ＵＳ２００６／００３０５２９）、ＶＥＧＦが関与すると見なされる。
【００１６】
卵巣過剰刺激症候群および子宮内膜症のような女性生殖器官の病変においても、ＶＥＧＦが関与すると見なされる。
【００１７】
乾癬、リューマチ性関節炎（テイラー（Ｐ．Ｃ．Ｔａｙｌｏｒ）、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  ２００２，４，Ｓ９９）において、および脳水腫の進行において、ＶＥＧＦが関与すると見なされた。
【００１８】
不完全血管新生により引き起こされる疾患を、新しい側副血管の成長を促進することができる薬剤で治療することができる（治療的血管新生）。ＶＥＧＦに誘発された血管新生は、幾つかの治療的用途を有する。もちろん、ＶＥＧＦ受容体に結合すると共にＶＥＧＦの生物学的活性を模倣する分子は、これらの疾患の治療に有用である。
【００１９】
虚血性心臓血管疾患を治療して、虚血領域における血管再生を刺激し、冠状動脈血流を増加させ、血管形成術後の再狭窄を防止するためにＶＥＧＦが用いられてきた（サイモンズ（Ｍ．Ｓｉｍｏｎｓ）およびワレ（Ｊ．Ａ．  Ｗａｒｅ）、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃ．２００３，２，１；フェラーラ（Ｎ．Ｆｅｒｒａｒａ）およびデイビス（Ｔ．Ｄａｖｉｓ）−Ｓｍｙｔｈ  Ｅｎｄｏｃｒ．Ｒｅｖ．１９９７，１８，４）。
【００２０】
脳卒中、脊髄虚血、虚血性および糖尿病性神経障害において、ＶＥＧＦおよびその受容体が関与すると見なされた。ＶＥＧＦは、神経細胞障害、例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、慢性虚血性脳疾患、筋萎縮性側索硬化症、筋萎縮性側索硬化症様疾患、および他の変性性神経細胞障害、特に、運動神経細胞障害を治療するための治療薬である（ＵＳ２００３／０１０５０１８；ストルケバウム（Ｅ．Ｓｔｏｒｋｅｂａｕｍ）およびカルメリエト（Ｐ．Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ）、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００４，１１３，１４）。
【００２１】
ＶＥＧＦは、骨血管新生および軟骨内骨形成において基本的役割を有する。これらの発見は、ＶＥＧＦが、骨形成を促進して血管再生を向上させるのに有用であり得ることを示している。ＶＥＧＦを用いた治療から恩恵を受けることができる状態は、骨折、椎骨または椎間板損傷／破壊、脊椎固定、損傷半月板、無血管性壊死、頭蓋顔面再建／再構築、軟骨破壊／損傷、変形性関節症、骨硬化症、骨粗鬆症、移植片固定、遺伝性または後天性骨障害または疾患における骨修復である（ＵＳ２００４／００３３９４９）。
【００２２】
ＶＥＧＦは、胃潰瘍（マ（Ｍａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ２００１，９８，６４７０）、創傷治癒、糖尿病性足壊疽および糖尿病性神経障害のプロセスにおいて関与すると見なされた。
【００２３】
ＶＥＧＦは、神経発生（ジン（Ｋ．Ｊｉｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００２，９９，１１９４６）において、および新しい血管の形成または再生から恩恵を受ける病的および自然状態の治療のために関与すると見なされた（ＵＳ２００５／００７５２８８）。
【００２４】
ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体に結合することができる分子は、ＶＥＧＦ受容体を過剰発現する病変の診断のため（リー（Ｌｉ）ら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２００３，１４，１２７４）、および新生脈管構造の画像化（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００５，９７，１７２）に有用であり得る。
【００２５】
血管新生を画像化するための分子剤は、ＶＥＧＦ受容体に高い特異性で結合すると共に低濃度で検出可能でなくてはならない。これらは、画像診断法であるＰＥＴおよびＳＰＥＣＴに従って、およびそれほどではないにせよ、超音波（マイクロバブル造影剤を使用）および光学的画増化（蛍光造影剤を使用）に従って標識すべきである。さらに、ＭＲＩの感度が低くても、血管新生の分子マーカーを結合する薬剤に結合したオリゴマー化常磁性物質を用いて、血管新生を分子的画像化することが可能である（ミラー（Ｍｉｌｌｅｒ）ら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．２００５，９７，１７２）。
【００２６】
今まで、幾つかのＶＥＧＦ構造が報告されている：ＶＥＧＦ  ｆｒｅｅ（ミューラー（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ）ら）  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９９７，５，１３２５；ミューラー（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９９７，９４，７１９２）、抗体との複合体（ミューラー（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ）ら、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  １９９８，６，１１５３）、ペプチド阻害剤との複合体（ウィースマン（Ｗｉｅｓｍａｎｎ，Ｃ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９８，３７，１７７６５；パン（Ｐａｎ，Ｂ．）ら、Ｊ  ＭｏＩ  Ｂｉｏｌ  ２００２，３１６，７６９）、およびＦＩｔ−１領域２との複合体（ウィースマン（Ｗｉｅｓｍａｎｎ，Ｃ．）ら、Ｃｅｌｌ  １９９７，９１，６９５）。ジスルフィド結合により結合された２つのＶＥＧＦモノマーが、ＶＥＧＦ逆平行ホモ二量体の極に局在化した２つの受容体分子に結合する。複合体の全体構造は、ほぼ２つ折りの対称である。構造および変異誘発データの分析により、受容体への結合に関与する残基を確認することができた。ＫＤＲとＦＩｔ−１はＶＥＧＦ結合領域を共有し、実際、７つの最も重要な結合残基のうちの５つが、両方のインターフェース中に存在する。ＦＩｔ−１D2と接触しているＶＥＧＦ8-109のセグメントは、一つのモノマーの、Ｎ−末端ヘリックス（１７−２５）、ループ結合性ストランドβ３−β４（６１−６６）およびストランドβ７（１０３−１０６）からの残基、および他のモノマーの、ストランドβ２（４６−４８）からのおよび結合性ターンを含むストランドβ５およびβ６（７９−９１）からの残基を含む。認識インターフェースは、Ａｒｇ２２４（ＦＩｔ−１）とＡｓｐ６３（ＶＥＧＦ）との間の極性相互作用を除いて、強度に疎水性である（ウィースマン（Ｗｉｅｓｍａｎｎ，Ｃ．）ら、Ｃｅｌｌ  １９９７，９１，６９５）。
【００２７】
ＶＥＧＦ−受容体相互作用を調節するために多くの手法が追及され、ペプチドとしての新規分子的実体（ケイト（Ｋｅｙｔ，Ｂ．Ａ．）ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  １９９６，２７１，５６３８；アン（Ａｎ，Ｐ．）ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４，１１１，１６５；シェイデガー（Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ，Ｐ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ２００１，３５３，５６９；ジア（Ｊｉａ，Ｈ．）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２００１，２８３，１６４；ビネトゥルイ−ターナー（Ｂｉｎｅｔｒｕｙ−Ｔｏｕｒｎａｉｒｅ，Ｒ．）ら、Ｅｍｂｏ  Ｊ  ２０００，１９，１５２５；ヘチアン（Ｈｅｔｉａｎ，Ｌ．）ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００２，２７７，４３１３７；ジルベルベルグ（Ｚｉｌｂｅｒｂｅｒｇ，Ｌ．）、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３，２７８，３５５６４；エル−ムサビ（Ｅｌ−Ｍｏｕｓａｗｉ，Ｍ．）ら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００３，２７８，４６６８１−４６６９１）、および抗体としての新規分子的実体（プレウェット（Ｐｒｅｗｅｔｔ，Ｍ．）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９９９，５９，５２０９；クッケ（Ｃｏｏｋｅ，Ｓ．Ｐ．）ら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００１，６１，３６５３）が、ＶＥＧＦ受容体の細胞外領域に結合することが報告された。それらの多数が拮抗活性を示し、作動薬として挙動するのは極僅かであった（アン（Ａｎ，Ｐ．）ら、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２００４，１１１，１６５）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２８】
本発明は、ＶＥＧＦ受容体を認識することができると共に、内皮細胞の増殖と血管新生または血管新生の傾向との両方を調節（制御）することができる、ＶＥＧＦ配列Ｐｈｅ１７〜Ｔｙｒ２５のＶＥＧＦヘリックス領域を模倣する化合物（以下、「ＶＥＧＦ−ヘリックス１７−２５模倣化合物」）、およびそれらの、血管の形成または再生から恩恵を受ける状況、疾患または状態の治療ための薬剤または組成物の調製における使用に関する。
【００２９】
好ましい態様において、前記化合物は、以下の表１による配列番号１〜配列番号８からなる群より選択されるペプチドである。
（表１）
配列番号１：  ＫＶＫＦＭＤＶＹＱＲＳＹＣＨＰ
配列番号２：  ＫＬＴＦＭＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
配列番号３：  ＫＬＴＷＭＥＬＹＱＬＡＹＫＧＩ
配列番号４：  ＫＬＴＷＫＥＬＹＱＬＡＹＫＧＩ
配列番号５：  ＫＬＴＷＭＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
配列番号６：  ＫＬＴＷＱＥＬＹＱＬＡＹＫＧＩ
配列番号７：  ＫＬＴＷＫＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
配列番号８：  ＫＬＴＷＱＥＬＹＱＬＫＹＫＧＩ
核磁気共鳴および円偏光二色性により水中で予め特徴付けすると、これらのペプチドのヘリックス立体構造を採ろうとする良好な特性（傾向）が示された。これらの化合物について、生物学的活性は報告されていなかった（アンドリア（Ｌ．Ｄ．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ）
ら、Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ２００２  Ｅｄｉｚｉｏｎｉ  Ｚｉｉｎｏ，Ｎａｐｏｌｉ，Ｉｔａｌｙ  （２００２），４５４）。
【００３０】
本発明者らは、試験管内および生体内において、これらのペプチドの生物学的挙動を特徴付けた。それらの一部がＶＥＧＦ受容体に結合して、ＶＥＧＦ様生物学的活性を示し、他のものがＶＥＧＦ受容体に結合して、ＶＥＧＦ拮抗薬として作用する。それらの生物学的特性に基づいて、これらの化合物を、ＶＥＧＦ生物学的活性の調節に係わる病変の治療のため、ＶＥＧＦ受容体の過剰発現を呈する病変の診断のため、およびＶＥＧＦ受容体の活性化に依存する細胞経路の研究のための生化学的ツールとして用いることができる。
【００３１】
好ましくは、これらの化合物は、慢性虚血、癌、増殖性網膜症およびリューマチ性関節炎のような血管新生に係わる病変の診断および治療のために用いられる。特に、血管の形成または再生から恩恵を受け得る状況、状態または疾患の治療のために、血管新生を刺激する化合物が用いられる。
【００３２】
一つの態様によれば、本発明は、癌の治療のための、好ましくは、その表面上にＶＥＧＦ受容体を発現している腫瘍、および肺腫瘍(lung tumor)、甲状腺腫瘍(thyroid tumor)、乳癌(breast cancer)、胃腸腫瘍(gastrointestinal tumor)、腎臓腫瘍(kidney tumor)、卵巣腫瘍(ovary tumor)、子宮頸部腫瘍(uterine cervix tumor)、上皮性悪性腫瘍(carcinoma)、血管肉腫(angiosarcoma)、胚細胞腫瘍(germ cell tumor)および頭蓋内腫瘍(intracranial tumor)のような血管新生に依存する腫瘍の治療のための治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００３３】
もう一つの態様において、本発明は、加齢性黄斑変性症age related macular degeneration)、糖尿病性網膜症(diabetic retinopathy)、硝子体出血(vitreous hemorrhage)、網膜剥離(retinal detachment)および血管新生緑内障(neovascular glaucoma)のような眼疾患を治療するための治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００３４】
もう一つの態様において、本発明は、卵巣過剰刺激症候群(ovarian hyperstimulation syndrome)および子宮内膜症(endometriosis)のような女性生殖器官の病変を治療するための治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００３５】
もう一つの態様において、本発明は、乾癬を治療するための治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００３６】
もう一つの態様において、本発明は、リューマチ性関節炎(rheumatoid arthritis)を治療するための治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００３７】
もう一つの態様において、本発明は、脳水腫(brain edema)を治療するための治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００３８】
もう一つの態様において、本発明は、虚血性心臓血管疾患を治療するための治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００３９】
もう一つの態様において、本発明は、神経細胞障害、特に、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、慢性虚血性脳疾患(chronic ischemic brain disease)、筋萎縮性側索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis)、筋萎縮性側索硬化症様疾患(amyotrophic lateral sclerosis-like disease)、および他の変性性神経細胞障害(degenerative neuronal)、特に、運動神経細胞障害(motor-neuron disorder)を治療するための治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００４０】
もう一つの態様において、本発明は、骨形成を誘発するため、および骨欠損、好ましくは、椎体または椎間板損傷／破壊(vertebral body or disc injury/destruction)、脊椎固定(spinal fusion)、損傷半月板(injured meniscus)、無血管性壊死(avascularnecrosis)、頭蓋顔面再建／再構築(cranio-facial repair/reconstruction)、軟骨破壊／損傷(cartilage destruction/damage)、変形性関節症(osteoarthritis)、骨硬化症(osteosclerosis)、骨粗鬆症(osteoporosis)、移植片固定(implant fixation)、遺伝性または後天性骨障害または疾患(inheritable or acquired bone disorder or disease)を治療するため治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００４１】
もう一つの態様において、本発明は、胃潰瘍(gastric ulcer)を治療するため治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００４２】
もう一つの態様において、本発明は、糖尿病性足壊疽(diabetic foot ulcer)を治療するため治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００４３】
もう一つの態様において、本発明は、糖尿病性神経障害(diabetic neuropathy)用の治療薬としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００４４】
もう一つの態様において、本発明は、神経血管新生を刺激するための薬剤としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００４５】
もう一つの態様において、本発明は、創傷治癒(wound healing)用の治療剤としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００４６】
もう一つの態様において、本発明は、血管の形成または再生の恩恵を受ける病的および自然状態を治療するための治療剤としての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００４７】
もう一つの態様において、本発明は、ＶＥＧＦ受容体の過剰発現を呈する病変の診断のための、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００４８】
もう一つの態様において、本発明は、新生脈管構造の画像化のための、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【００４９】
もう一つの態様において、本発明は、ＶＥＧＦ受容体の活性化に依存する細胞経路の研究のための生化学的ツールとしての、ＶＥＧＦヘリックス１７−２５模倣化合物、好ましくは配列番号１〜配列番号８から選択されるペプチドの使用を提供する。
【実施例】
【００５０】
（実施例１）
試験管内およびウシ大動脈内皮細胞（ＢＡＥＣ）上での生物学的アッセイは、表１の配列番号８のペプチド（すなわち「ＱＫ」）が、ＶＥＧＦ受容体に結合することができ、受容体上の同じ領域を標的している可能性のあるヨウ素化ＶＥＧＦ165と競合することができることを示した。天然ペプチド配列番号１（ＶＥＧＦ１５）は受容体に結合せず、これは、ヘリカル構造が生物学的活性に必要であることを意味している。さらに、ＱＫは、内皮細胞増殖を誘発し、ＶＥＧＦ165により誘発される信号伝達を活性化し、ＶＥＧＦ生物学的反応を増加させた。ＱＫは、マトリゲル基質上での試験管内アッセイにおける毛細血管の形成および組織化、および生体内での血管新生を誘発させることができた。
【００５１】
これらの結果は、ＶＥＧＦの１７−２５ヘリックス領域が、ＶＥＧＦ受容体活性化に関与している証拠を提供する。この領域に似るように設計されたペプチドは、ＶＥＧＦ165の多くの生物学的特性を共有し、従って、この領域が生物医学用途にとって興味深い可能性があり、この領域を模倣する分子が、治療的および診断的用途に有益であり得ることを示している。（アンドリー（Ｌ．Ｄ．Ｄ’Ａｎｄｒｅａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（２００５），１０２，１４２１５）。
【００５２】
ペプチド合成：
ペプチドを、標準的Ｆｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）化学を用いてＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）を使用して固相上で合成した。Ｎ−末端リシンをメチルトリチル基で保護して、選択的脱保護およびペプチド標識を行った。樹脂からの解離を、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシランおよび水（９５：２．５：２．５）で室温で３時間処理することにより達成した。ペプチドの純度および同一性を、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析により調べた。
【００５３】
細胞培養：
ＳＶ４０で不死化したウシ大動脈からのＥＣを、９５％空気−５％ＣＯ2中、１０％ＦＢＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）を補足したＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ製）中で３７℃で培養した。全ての実験において、ＶＥＧＦ165（Ａｌｅｘｉｓ製）を１００ｎｇ／ｍｌで用いた。
【００５４】
ＶＥＧＦ受容体結合アッセイ：
細胞を、溶解緩衝液（１２．５ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ６．８，５ｍＭ  ＥＤＴＡ，５ｍＭ  ＥＧＴＡ）中で均質化し、遠心分離によりサイトゾルフラクションから膜を分離した。膜を、結合緩衝液（７５ｍＭ  Ｔｒｉｓ，１２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ2，２ｍＭ  ＥＤＴＡ）中に懸濁し、等量の膜蛋白（１μｇ）を、９６ウエルプレートにおいて、ＱＫ（１０-13〜１０-8Ｍ）および［125Ｉ］−ＶＥＧＦ（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）と共に平板培養した。ＶＥＧＦ結合をγ−カウンターで評価した。
【００５５】
ウエスタンブロット：
細胞を、６ウエル皿上で平板培養し、血清を一晩欠乏させた。翌日、ＶＥＧＦ165の不存在または存在下に、細胞を異なる量のペプチドで３７℃で１５分間処理し、次に、ＲＩＰＡ−ＳＤＳ緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５），１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，１％ＮＰ−４０，０．２５％デオキシコール酸塩，９．４ｍｇ／５０ｍｌオルトバナジウム酸ナトリウム、２０％ドデシル硫酸ナトリウム）に溶解した。一部の実験において、全ＫＤＲおよびＦＩｔ−１を、全ＫＤＲまたはＦＩｔ−１に対する抗体に共役させた蛋白Ａ／Ｇアガロースビーズ（Ｒ＆Ｄ）を用いて、等量の全細胞蛋白抽出物から免疫沈降させた。全細胞抽出物からの蛋白または免疫複合体をＰＡＧＥにより溶解し、ニトロセルロースに移した。全細胞外信号調整キナーゼ１および２（ＥＲＫ１／２）、セリン−チロシンリン酸化ＥＲＫ１／２、リン酸化−チロシン（細胞信号伝達）およびリン酸化−ＲＢ（ｐ−ＲＢ）（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ製）を、特異抗体、抗ウサギＨＲＰ共役二次抗体（Ｓａｎｔａｃｒｕｚ製）および標準的化学的発光（Ｐｉｅｒｃｅ製）を用いて視覚化した。
【００５６】
［3Ｈ］−チミジン取り込み：細胞を２４時間血清欠乏させ、次に、ＤＭＥＭ中で、［3Ｈ］−チミジン（Ａｍｅｒｓｈａｍ製）およびＱＫ単独（１０-12〜１０-6Ｍ）またはＱＫとＶＥＧＦ165との組み合わせと共にインキュベーションした。２４時間後、細胞をトリクロル酢酸（０．０５％）で固定し、１Ｍ  ＮａＯＨに溶解した。シンチレーション液を加え、チミジン取り込みをβ−カウンターで評価した。
【００５７】
細胞増殖アッセイ：
６ウエルプレートにおいてウエル当たり１００００個の密度で播種し、血清を一晩欠乏させ、次に、ＶＥＧＦ165の不存在または存在下にＱＫ（１０-12〜１０-6Ｍ）で刺激した。細胞数を、刺激の２４時間後に決めた。ＱＫ（１０-6Ｍ）、ＶＥＧＦ165およびＶＥＧＦ１５（１０-6Ｍ）による刺激の１２および１８時間後に、ｐ−ＲＢをウエスタンブロットで評価した。
【００５８】
試験管内血管新生アッセイ：
ヒト内皮細胞を、２４ウエルプレートにおいて特別に設計された媒体（Ａｎｇｉｏｋｉｔ，ＴＣＳ  ＣｅｌｌＷｏｒｋｓ製）中、他のヒト細胞と共培養した。３日毎に、ＶＥＧＦ165の不存在または存在下にＱＫを培養物に添加した。ＶＥＧＦおよびスラミン（２０μＭ）を、それぞれ、陽性および陰性対照として用いた。続いて、細胞が増殖し始め、次に、移動相に入り、その間に、マトリクスを通過して移動して糸様小管構造を形成する。１１日目に、細胞を冷たい７０％エタノールで固定し、小管形成を、抗ヒトＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−１）について染色することにより視覚化した。結果を、画像分析ソフトウェアＡｎｇｉｏｓｙｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＴＣＳ  ＣｅｌｌＷｏｒｋｓ製）を用いて記録した。
【００５９】
生体内アッセイにおける血管新生：
動物および手術手順：フェデリコＩＩ大学のガイドラインに従って、動物研究を行った。血管内送達によるアデノウイルス媒介遺伝子伝達を、１５に既述されているように行った。チレタミン（５０ｍｇ／ｋｇ）とゾラゼパム（５０ｍｇ／ｋｇ）で麻酔した１２週齢正常血圧ＷＫＹにおいて、虚血性後肢モデル（β２−アドレナリン作用性受容体過剰発現により高められる虚血性血管新生：内皮アドレナリン作用性系のための新規役割、イアカリーノ（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ）ら、Ｃｉｒ  Ｒｅｓ  ２００５）を作り、その際に、ＱＫ（１０−７Ｍ）、ＶＥＧＦ（１０−７Ｍ）およびＶＥＧＦ１５（１０−７Ｍ）の長期大腿内動脈輸液を、前述の物質を含む溶液で満たされると共に腹膜内に配されたミニ浸透圧ポンプにより行なった（Ｃａｒｄｉａｃ  βＡＲＫ１  Ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｓａｌｔ  Ｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｒａｔｓ，イアカリーノ（Ｉａｃｃａｒｉｎｏ）ら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ  ２００１）。
【００６０】
デジタル血管造影写真および血流決定：１４日後、動物に麻酔し、右大腿動脈からカテーテルを除去し、巻いて層状にまとめた。次に、左総頚動脈を前述のように露出し、火炎伸長させたＰＥ５０カテーテルを、蛍光透視視覚化（Ａｄｖａｎｔｉｘ  ＬＣＸ，Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃｓ製）の状態で、腹大動脈に腸骨分岐の直前まで進めた。ニトログリセリン（２０μｇ、動脈内）により最大血管拡張を得た。電子制御注射器（ＡＣＩＳＴ，Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＩＮＣ製）を用いて、造影剤（Ｉｏｍｅｒｏｎ  ４００，Ｂｒａｃｃｏ製）０．２ｍｌを定圧（９００ｐｓｉ）で送達した。ＴＩＭＩフレーム計算評価のためのシネフレーム数を、前述のような適当なシネ−ビューワーモニター上でデジタルフレームカウンターを用いて測定した。全ての血管造影図を５フレーム／秒で造影し、２人の内容を知らない試験者により分析した（ＦＰ，ＧＧ）。ＴＩＭＩフレーム計算を第１のフレームから行い、造影剤を、最初の後肢動脈分岐が充分にフレームで視覚化されるまで腸骨動脈に入れた。血管造影後、０．９％ＮａＣｌの１ｍｌに希釈した１０８個のオレンジ染色ビーズ（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）を注入し、次に、動物を致死量のペントバルビタールで殺した。虚血性および非虚血性ＨＬの腓腹筋サンプルを集め、液体窒素で凍結させ、−８０℃で貯蔵した。次に、サンプルを均質化および消化し、ビーズを集め、ＤＭＴＦ中に懸濁させた。染料の放出を、４５０ｎｍでの光吸収により調べた。データを、虚血性筋肉と非虚血性筋肉との比として表した。
【００６１】
組織学：
組織標本を解剖し、直ちに、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、０．０１Ｍ、ｐＨ７．２−７．４）／ホルマリンに浸漬することにより少なくとも２４時間固定した。次に、これらを、三日月形アルコール濃厚物（ｃｒｅｓｃｅｎｔ  ａｌｃｏｈｏｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を通して脱水し、パラフィンに包埋した。厚さ５μｍのセクションを組織化学のために加工し：再脱水後、Ｂａｎｄｅｉｒａｅａ  ｓｉｍｐｌｉｃｉｆｏｌｉａ  Ｉ（ＢＳ−Ｉ）ビオチニル化レクチン（Ｓｉｇｍａ製，１：５０）と共に一晩インキュベーションした。ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役ストレプトアビジン（Ｄａｋｏ製，１：４００）と共に室温で１時間二次インキュベーションすることにより、毛細血管内皮へのＢＳ−Ｉ特異的接着が示され、これは、過酸化水素およびジアミノベンジジンの存在下に、褐色反応生成物を与える。Ｌｅｉｃａ
ＤＣ  ２００デジタルカメラを備えるＬｅｉｔｚ  Ｄｉａｐｌａｎ顕微鏡により、形態学的分析を行った。興味のある画像を、Ｉｍａｇｅ  Ｐｒｏ  Ｐｌｕｓソフトウェア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ製，ＭＤ，ＵＳＡ）で加工して、試験領域当たりの毛細血管数を数えた。この研究において、５〜１５μｍの毛細血管の直径を考慮した。５つの組織セクション／各動物／各実験群を試験した。処理について無知の二人の独立した担当者（ＶＣ；ＧＡ）により、各セクションにおいて２０領域当たりの毛細血管数を測定した。次に、５つのセクション／動物／実験群からの測定の平均値を計算し、プロットした。最終的値を、１０００μｍ2に相当する単位面積当たりの平均毛細血管数として表した。群間相違を分散分析（Ａｎｏｖａ）により評価した。遺伝子導入後のβ２ＡＲ免疫組織化学のために、厚さ６μｍの筋肉凍結セクションを切断し、ポリ−Ｌ−リシン被覆スライド上に乗せた。セクションを、使用するまで凍結保持する、または冷アセトン中に固定し乾燥した。組織セクション上の非特異的蛋白結合部位を、正常ヤギ血清と共にインキュベーションすることにより遮断した。この後に、さらに洗浄することなく、１：２５ウサギ抗−β２ＡＲ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ製，ＣＡ，ＵＳＡ）と共に４℃で一晩インキュベーションした。ビオチニル化二次抗体を用い、続いてアビジン共役アルカリホスファターゼ複合体（Ｄａｋｏ製）を用いて、酵素標識免疫反応を行った。０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．２）中のナフトールＡＳ−ＭＸリン酸塩および新しいフクシンを用いて、アルカリホスファターゼを現像して赤色反応生成物を得た。免疫染色対照は、一次抗体を非免疫血清に置き換えることからなっていた。
【００６２】
ラットにおける移植マトリゲルモデル：
各動物に、ＱＫ、ＶＥＧＦ１５、ＶＥＧＦ１６５（１０−６Ｍ）をまたは食塩溶液を含むＭａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｈｉｇｈ（１８−２２ｍｇ／ｍＬ；Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製，Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）１ｍＬを、背中に皮下注射した。１週間後、マトリゲル栓を除去し、Ｍａｓｓｏｎ三重染色を用いて組織学的分析のためにＰＢＳ中４％緩衝ホルムアルデヒド中で固定した。組織セクション中の１５〜２０個の領域の視野当たりの毛細血管占領面積を、コンピューター化デジタルカメラシステム（Ｏｌｙｍｐｕｓ製，Ｍｅｌｖｉｌｌｅ，ＮＹ）およびＮＩＨ  Ｉｍａｇｅ  １．６１（ＮＩＨ製，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）を用いて測定した。血管は、特許の内腔および陽性内皮細胞核を有する構造として定義される。
【００６３】
カスパーゼ３活性の分析：
Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ，ＤＴＴ  １ｍＭ，ＥＤＴＡ  ０．１ｍＭ，ＮＰ−４０  ０．１％，ＣＨＡＰＳ  ０．１％を含む緩衝液中に細胞（２×１０4）を溶解し、蛋白量を決めた。少量の蛋白（２０μｇ）を、Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ，ＤＴＴ  １ｍＭ，ＥＤＴＡ  ０．１ｍＭ，ＮＰ−４０  ０．１％，ＣＨＡＰＳ  ０．１％を含む緩衝液中で２０μＭ  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に３７℃で３時間インキュベーションした。カスパーゼ３活性を、細胞質抽出物中、Ｎ−アセチル−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（ソーンベリー（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ  ＮＡ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：７６８−７４）からの７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の放出を分析することにより決め；ＡＭＣの放出を、蛍光光度計にて励起波長を３８０ｎｍおよび発光波長を４４０ｎｍとしてモニターした。
【００６４】
結果：
ペプチド設計：ＶＥＧＦ／ＦＩｔ−１D2複合体（１ＦＬＴ）（１）のＸ線構造に基づき、アミノ酸配列Ｐｈｅ１７〜Ｔｙｒ２５に及ぶＶＥＧＦ結合領域を再生するペプチドを設計および合成した。この領域は、受容体から４．５Åより短い距離に位置する２１個の残基のうち５個（Ｐｈｅｌ７，Ｍｅｔｌ８，Ｔｙｒ２１，Ｇｌｎ２２，Ｔｙｒ２５）を含み、天然の蛋白におけるα−ヘリックス構造と推定される。採用した設計は、受容体と相互作用する残基の３次元配列を固定して保持し、二次構造モチーフを安定化することであった。突然変異データは、Ｐｈｅ１７をＡｌａに変異させると、ＫＤＲへの親和性が９０倍低下するが、他の４個の残基の突然変異は結合に僅かの影響しか与えない（２，３）ことを示している。５個の全ての相互作用性残基はヘリックスの上面を占め、それらが受容体との疎水性相互作用を生み出す。反対側面の残基は蛋白内側に向かって突出し、単離ペプチドにおいては、溶媒に晒される。ＱＫペプチドのヘリックス構造が安定化され、Ｎ−およびＣ−封止性配列（４）、固有のヘリックスとなろうとする傾向（ヘリックス傾向）と好ましい静電相互作用を有するアミノ酸（５）が導入される。封止性残基は各位置についての統計的選択に基づき選択した：Ｎ’（Ｌｅｕ）、Ｎcap（Ｔｈｒ）、Ｎ４（Ｌｅｕ）、Ｃ３（Ｌｅｕ）、Ｃcap（Ｌｙｓ）、Ｃ’（Ｇｌｙ）およびＣ’’（Ｉｌｅ）。分光プローブを導入しかつ疎水性表面を増やすためにＰｈｅ１７をＴｒｐに置き換え；ＦＩｔ−１の残基Ａｓｎ２１９に近いＭｅｔ１８を、好ましい水素結合相互作用の形成に一層適しているＶＥＧＦ相同蛋白である胎盤成長因子中に存在するＧｌｎ残基で置換した。Ａｓｐ１９を、高いヘリックス傾向故にＧｌｕに置き換え、Ｓｅｒ２４を、ヘリックス傾向および溶解性を増加させるためにＬｙｓで置換した。さらなるＬｙｓ残基をＮ−末端に付けて、選択的標識を提供した。ペプチド末端荷電とヘリックス双極子との間の静電反発力を避けるために、ペプチドをアセチル化およびアミド化した。この設計により以下のＱＫ配列が得られた：
Ａｃ−Ｋ1Ｌ2Ｔ3Ｑ4Ｋ5Ｅ6Ｌ7Ｙ8Ｑ9Ｌ10Ｋ11Ｙ12Ｋ13Ｇ14Ｉ15−ＣＯＮＨ2
ＶＥＧＦ受容体結合アッセイ：ＱＫペプチドの生物学的挙動を確かめるために、細胞膜上のＶＥＧＦの結合部位と競合するその性能を試験した（図１ａ）。単離ＢＡＥＣから得られた膜を、ヨウ素化ＶＥＧＦと、その次に、量を増加させているＱＫと競合させた。競合曲線は、推定見掛け解離定数１０-9.5ＭでのＱＫによるヨウ素化ＶＥＧＦの移動を示し、従って、粒状細胞フラクション（particulate cellular fraction)上に局在化された受容体との相互作用を示している。実際にＶＥＧＦ受容体がＱＫへの結合に関与していることを示し、本発明の化合物が信号伝達の初期事象を開始する性能を評価するために、ＢＡＥＣ全抽出物から全ＫＤＲおよびＦＩｔ−１を免疫沈降させ、ウエスタンブロットによりチロシンリン酸化を視覚化した。予想されるように、対照として用いられるＶＥＧＦ165に１５分間晒すことにより、膜におけるリン酸化ＫＤＲの水準が低下し、一方、ＦＩｔ−１リン酸化が増加した（図１ｂ，ｃ）（６）。ＱＫは、リン酸化ＫＤＲを非刺激細胞における水準より低下させ、一方、ＦＩｔ−１のリン酸化の水準を高めたので、これらの受容体に同様に効果を発揮した。配位子結合データと共に、これらの結果は、ＱＫが、ＶＥＧＦ受容体へのＶＥＧＦ165の効果を再現することを示している。
【００６５】
増殖性細胞内経路の活性化：
次に、ＱＫが、内皮細胞活性化の経路を開始できるかどうか検討した。ＶＥＧＦによる血管新生の調節が主にＥＲＫ１／２依存性であり、ＤＮＡ合成および細胞増殖（７）に至ることが達成された。従って、このキナーゼへのＱＫの効果を調べた。実際、ＱＫは、投与量依存的にＥＲＫ１／２活性化を導く。この反応はＶＥＧＦに付加的であり、ＱＫの低投与量がＶＥＧＦ信号伝達を容易にすることを示している（図２ａ）。その代わりに、天然ヘリックス（ＶＥＧＦ１５）を再生するペプチドは、細胞内信号伝達を開始できないのであれば、ＥＫＲ活性化に効果を有していない（図２ｂ）。ＱＫによるＥＲＫ１／２活性化が細胞増殖につながるかどうか確認するために、細胞数、ＤＮＡ合成およびサイクリン活性化のような細胞増殖指標を研究した。ＱＫは、どの投与量でもＤＮＡ合成を増加させ、効果は、ＶＥＧＦの存在により高められた（図３ａ）。細胞増殖研究は、同様に、ＱＫが細胞増殖自体を生み出し、ＶＥＧＦ反応を向上させることを示した（図３ｂ）。最後に、ＱＫおよびＶＥＧＦ165はサイクリンＲＢのリン酸化を向上させたが、ＶＥＧＦ１５は向上させず、Ｇ０からＧ１への細胞サイクルの進行を示している（図３ｃ）。
【００６６】
試験管内血管新生アッセイ：
ＱＫが、ＶＥＧＦの全血管新生特性を再現するかどうか調べるために、ペプチドが、マトリゲル基質上でＥＣネットワーク（網目）構造形成を誘発させる性能を研究した（図４）。白血球漏出に関与する細胞内接着分子であるＣＤ３１／ＰＥＣＡＭ−１についてのポジティブ染色により、小管形成を評価した。全小管長により補正される細胞間結合の数を決めた。陽性対照として、各内皮細胞が隣接細胞に延びる結合の数を増加（０．ｌ±０．ｌから２．１４±０．１７）させるＶＥＧＦを用いた。ＱＫは、新しい結合の形成を投与量依存的に誘発させ、ＶＥＧＦ165への反応を向上させた（図４ｅ）。
【００６７】
生体内血管新生アッセイ：
麻酔した１２週齢ＷＫＹラットにおいて、Ｍａｔｒｉｇｅｌ  Ｍａｔｒｉｘ  Ｈｉｇｈ（ＢＤ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）含有または対照ペプチド（ＶＥＧＦ１５  １０−７Ｍ）の皮下注射を用いて、生体内でのＱＫの血管新生促進効果を評価した。１週間後、栓を除去し、形態全体および、ＣＤ３１／ｖＷＦ免疫染色による毛細血管浸潤を分析した。血液顕微鏡的評価を含む巨視的観点でのＱＫによる栓は、ＶＥＧＦ１５栓におけるよりも、ＶＥＧＦおよびＱＫ栓において強度の末梢毛細血管浸潤を証明した（データは示さず）。ＷＫＹのもう一つの群において、ＱＫ（１０−７Ｍ）、ＶＥＧＦ（１０−７Ｍ）およびＶＥＧＦ１５（１０−７Ｍ）の長期大腿内動脈輸液を伴う虚血性後肢モデルを作った。１４日後、動物に麻酔をかけ、ＴＩＭＩフレームスコア（ＴＦＣ）を数えるデジタル血管造影により評価される後肢血流（ＢＦ)は、遠位肢動脈においてコントラストを得る必要がある（図５ａ）。ＢＦは、黄色ビーズの腹大動脈における注射による染色ビーズ希釈によっても評価した（３＊  １０５）（図５ｂ）。虚血性および非虚血性前脛骨筋上での組織学により、毛細血管密度を評価した。データを以下の表に示し、ＶＥＧＦに類似のＱＫの生体内血管新生促進特性を示し、これは、生体内においても、このペプチドが全蛋白に似ていることを示唆している。
【００６８】
【表１】
2008546821.tif 000003
【００６９】
ＨＵＶＥ細胞のアポトーシスからの救済：設計されたペプチドが、ＶＥＧＦ抗アポトーシス活性を模倣できるかどうか調べるために、ＦＢＳが除去されたヒト一次内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞におけるカスパーゼ３の活性化を分析した。ＶＥＧＦの添加は、予想される（イルマズ（Ｙｉｌｍａｚ  Ａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００３，３０６：７３０）ように、ＨＵＶＥＣを部分的にアポトーシスから救済した。ＱＫは、ＶＥＧＦに類似の生物学的効果を示し、ＨＵＶＥＣのＶＥＧＦへの反応を向上させた（図６）。
【００７０】
成体において血管新生の調節は関連病状に関与しているので、非常に魅力的な目的である。治療的血管新生は、代替法により治療することができない状態において慢性虚血を解決するための究極の介入手段として求められる。その逆である血管新生阻害治療は、腫瘍学における有望な治療である。血管新生反応はＶＥＧＦ活性に厳格に依存するので、この蛋白は、非常に魅力的な薬理学的標的であると見なされ、昨年における熱心な研究の対象であった。
【００７１】
複合体ＶＥＧＦ／ＦＩｔ−１D2のＸ線構造は、結合性インターフェースが、主に３つの領域に局在していることを示している（１）。それらの一つは、アミノ酸配列１７−２５に及ぶα−ヘリックスである。この領域は受容体の認識に関与するキー残基を含み、この領域を再生する受容体と相互作用する新しい分子は今まで開発されていないので、この領域に注意を集中させた。さらに、ヘリカルペプチドの折り畳みおよび安定性規則がこの数年に解明されたので、ヘリカルペプチドの設計は、ペプチド工学にとって御しやすい標的を表す（５）。天然蛋白のヘリックス、ターンおよびβ−ヘアピンに及ぶペプチドフラグメントは、極一部の例外を除いて、生理学的条件下に天然の二次構造を再生する傾向がほとんど無いことが良く知られている（５）。さらに、水溶液において適当な構造特性を安定化することが、設計されたペプチドのそれらの標的への結合を得るための条件である。
【００７２】
ヘリカル構造を安定化させるように天然配列に適当なツールを導入すると、受容体の結合に適した３次元配列中にキー残基が並べられると推論した。ＶＥＧＦ受容体と相互作用すべき線形ペプチドＱＫを設計するために、構造を利用した手法を採用した。水溶液中のＱＫペプチドの構造的選択性について集められた全てのデータは、それが主にヘリカル構造に折り畳まれることを強く示している。特に、ＣＤスペクトルから誘導される第１の兆候は、Ｈα化学シフト分析およびＮＭＲ構造決定により充分に確認される。これらの２つの後者の分析は、ＶＥＧＦヘリカル領域に相当すると共にＱＫ生物学的活性のための重要な必要条件を表す残基４と１２との間に含まれるものとして、ＱＫヘリカル領域を定義した。ＶＥＧＦ１５は溶液中でのランダムコイル構造が想定されるので、また、典型的には天然アミノ酸からなる短いペプチドは固有の熱力学的不安定性を主な原因として溶液中で滅多に螺旋形をとらないので、ＱＫヘリカル構造の安定化は取るに足りない結果ではない。ＱＫの螺旋形折り畳みの理由は、固有のヘリカル選択性を有するアミノ酸の存在と、ペプチドの反対面上における多くの中程度のイオン性、極性および疎水性相互作用を生じさせるヘリックスの両親媒性とにあると思われる。さらに、僅かに１５個の天然アミノ酸からなると共に、純水中でのその構造が良好な骨格を有して誘導されたＱＫペプチドは、さらなる折り畳み研究のためのモデルを表すことができる。
【００７３】
ＶＥＧＦの生物学的機能の大部分が、その受容体ＫＤＲおよびＦＩｔ−１（８−１０）により媒介される。ＶＥＧＦのＫＤＲまたはＦＩｔ−１との相互作用は、受容体の二量体化およびその後の活性化を誘発する。従って、ＶＥＧＦの二量体が唯一の活性形であると考えられる。この報告において、ペプチドＱＫがＶＥＧＦ受容体に結合する証拠を報告している。結合に関する研究は、ＱＫが、内皮細胞膜上の結合部位についてＶＥＧＦと競合することを示した。これらの細胞は、それらの作動薬に結合したときに自己リン酸化する２つのチロシン受容体であるＫＤＲとＦＩｔ−１との両方の受容体を発現する。ＱＫが、２つの受容体のうちの一方への選択性を有するかどうか評価するために、受容体を免疫沈降させ、ウエスタンブロットによりチロシンリン酸化を評価した。図１に報告されているデータは、ＱＫが、ＶＥＧＦと同様に、両方の受容体を結合し活性化することを示した。ＫＤＲリン酸化は、ＫＤＲは内在化および消化され、一方、ＦＩｔ−１は膜上に露出したままになるので、配位子結合後に低下する（６）。ＱＫの作動薬様挙動（agonist-like behavior)は、細胞増殖実験により、およびＶＥＧＦ依存性細胞内経路（ＥＲＫ１／２）の下流活性化により確認される。種々のＥＣ型（１１−１４）においてＶＥＧＦがＤＮＡの合成および増殖を刺激することが報告された。ＶＥＧＦは、ＥＲＫ１／２の活性を強度に誘発し、この経路の活性化は、おそらく、ＥＣ増殖の刺激において中心的役割を果たす（１５，１６）。我々のデータは、ＱＫが、投与量依存的にＥＲＫ１／２の活性化および細胞増殖を導き、両方の実験において、ＱＫが、ＶＥＧＦ活性を向上させることを示した。さらに、細胞周期のＧ１相における制限点を通過する進行を制御することにより増殖を調節するサイクリンであるＲＢのリン酸化を、細胞増殖のマーカーとして調べた。ＱＫおよびＶＥＧＦ165がＲＢリン酸化を向上させ、ＶＥＧＦ１５はリン酸化を向上させなかったことは、Ｇ０からＧ１への細胞周期の進行を示している（図３ｃ）。
【００７４】
マトリゲル基質を用いる試験管内血管新生アッセイを行う機能的アッセイにおいて、我々のペプチドの生物学的特性を試験した。ＶＥＧＦは、細胞増殖および細胞外マトリクスを介する移動を誘発することにより、結合して小管の網目構造を作る糸様小管構造を形成する、生体内における有効な血管新生因子である（１７，１８）。ＱＫは、図４に示すように、投与量依存的に新しい結合の形成を誘発し、ＶＥＧＦ応答を向上させた。この実験は、我々のペプチドＱＫが、ＶＥＧＦについて報告される信号伝達における特徴の多くを再現することを確認した。
【００７５】
最後に、ＱＫの血管新生促進特性（pro-angiogenic property)が、２つの異なるモデルを用いる生体内においても示された。両方の実験において、ペプチドＱＫは、ＶＥＧＦに類似の活性を示し、一方、対照ペプチドであるＶＥＧＦ１５は、いかなる生物学的活性も示さなかった。ペプチドＱＫは、生体内においてＶＥＧＦの生物学的効果を高める性能も示した。これらのデータは、ＶＥＧＦ受容体の活性化の機構および臨床的適用の両方において、新しい研究分野を開く。
【００７６】
ＱＫがＥＣをアポトーシスから救済してＶＥＧＦの生存機能を模倣し得ることも示した。
【００７７】
全体として、我々の結果は、ＱＫが試験管内でＶＥＧＦ受容体に結合することを示し、それが血管新生のための有効な作動薬であることを示している。ＱＫ領域のコア領域の安定な螺旋構造は、ＶＥＧＦ受容体を結合するその性能のための重要な条件であることが見えてくる。実際、予想されるように水中で構造化しない天然フラグメントＶＥＧＦ１５は、単独でまたはＶＥＧＦと組み合わせて、いかなる感知できる生物学的活性も示さなかった。
【００７８】
慢性虚血または心不全のような心臓血管状態における治療的血管新生は、最近のバイオテクノロジーの裏付けとして求められる。実際、ＶＥＧＦを投与するとヒトにおいて治療的に有意義な血管新生が起こるという仮説が、既に、イズナー（Ｉｓｎｅｒ）らによって重症肢虚血の患者における遺伝子治療試行において試験されている（１９）。ＶＥＧＦのような成長因子の使用への主な制限は、制御されない血管新生およびリンパ浮腫を促進する性能と関わる。近年の発見は、さらに、ＶＥＧＦを、喘息を促進する因子（２０）として、すなわち、大規模な虚血集団におけるこの分子の使用を排除する副作用を提案している。我々のデータは、ＱＫまたは改良された類似体が、より安全な血管新生促進薬への要求を満たすことを示唆している。
【００７９】
(実施例２)
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）についての生物学的アッセイは、配列番号３および５のペプチド（すなわち、それぞれ、「ＭＡ」および「ＭＫ」）がＶＥＧＦ拮抗薬であることを示した。両者が、ＶＥＧＦがＨＵＶＥＣをアポトーシスから救済することを損なう性能がある。ＭＡはＶＥＧＦ受容体に結合し、ＥＲＫ１／２キナーゼのＶＥＧＦによる活性化を阻害する。
【００８０】
ペプチド合成：
ペプチドを、標準的Ｆｍｏｃ（Ｎ−（９−フルオレニル）メトキシカルボニル）化学を用いてＲｉｎｋ  Ａｍｉｄｅ  ＭＢＨＡ樹脂（Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ製）を使用して固相上で合成した。Ｎ−末端リシンをメチルトリチル基で保護して、選択的脱保護およびペプチド標識を行った。樹脂からの解離を、トリフルオロ酢酸、トリイソプロピルシランおよび水（９５：２．５：２．５）で室温で３時間処理することにより達成した。ペプチドの純度および同一性を、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ質量分析により調べた。
【００８１】
細胞：
正常ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｐｒｏｍｏｃｅｌｌ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から得、ＥＧＭ−２  ＳｉｎｇｌｅＱｕｏｔｓ（Ｃａｍｂｒｅｘ，Ｃａｒｌｓｂａｎｄ，ＣＡ）において培養した。
【００８２】
カスパーゼ３活性の分析：
Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ，ＤＴＴ  １ｍＭ，ＥＤＴＡ  ０．１ｍＭ，ＮＰ−４０  ０．１％，ＣＨＡＰＳ  ０．１％を含む緩衝液中に細胞（２×１０4）を溶解し、蛋白量を決めた。少量の蛋白（２０μｇ）を、Ｈｅｐｅｓ  ５０ｍＭ，ＤＴＴ  １ｍＭ，ＥＤＴＡ  ０．１ｍＭ，ＮＰ−４０  ０．１％，ＣＨＡＰＳ  ０．１％を含む緩衝液中で２０μＭ  Ａｃ−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ製，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）と共に３７℃で３時間インキュベーションした。カスパーゼ３活性を、細胞質抽出物中、Ｎ−アセチル−ＤＥＶＤ−ＡＭＣ（ソーンベリー（Ｔｈｏｒｎｂｅｒｒｙ  ＮＡ）ら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９２；３５６：７６８−７４）からの７−アミノ−４−メチルクマリン（ＡＭＣ）の放出を分析することにより決め；ＡＭＣの放出を、蛍光光度計にて励起波長を３８０ｎｍおよび発光波長を４４０ｎｍとしてモニターした。
【００８３】
ヒト組み換えＶＥＧＦおよび他の試薬：
ヒト組み換えＶＥＧＦを、Ｒ＆Ｄ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）から得た。抗−リン酸化ＥＲＫポリクローナル抗体を、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）から得た。フィコエリスリン（ＰＥ）−共役抗−β１−インテグリンモノクローナル抗体（ｍＡｂ）を、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から得た。イソチオシアン酸フルオレセイン（ＦＩＴＣ）−共役アネキシンＶを、Ｂｅｎｄｅｒ  ＭｅｄＳｙｓｔｅｍｓ  ＧｍｂＨ（Ｖｉｅｎｎａ，Ａｕｓｔｒｉａ）から得た。抗−ヒトα−チューブリンｍＡｂを、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から得た。
【００８４】
蛍光：
細胞（３×１０5）を、飽和量のＦＩＴＣ−共役および他の提示された試薬と共に、暗所で４℃で５分間インキュベーションした。ＰＢＳで洗浄後、細胞をＰＢＳ中に再懸濁し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ製）フローサイトメーターで分析した。
【００８５】
ウエスタンブロット：
氷上のサンプル緩衝液（２％ドデシル硫酸ナトリウム，１０％グリセロール，２％メルカプトエタノールおよび６０  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ６．８、脱塩水中）中で、細胞全蛋白溶解物を調製した。溶解物（２５μｇ）を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上を走らせ、電気泳動によりニトロセルロースに移動させた。ニトロセルロースブロットを、Ｔｒｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  Ｓａｌｉｎｅ  Ｔｗｅｅｎ−２０（ＴＢＳＴ）緩衝液［２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４），５００ｍＭ  ＮａＣｌおよび０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０］中の５％ＢＳＡで遮断し、ＴＢＳＴ−５％ＢＳＡ中の一次抗体と共に４℃で一晩インキュベーションした。標準的プロトコール（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ製，ＵＫ）に従って、ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役二次抗体および強化化学発光試薬と共に連続的にインキュベーションすることにより免疫反応性を検出した。
【００８６】
統計的分析：
ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ製，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ．を用いて統計的分析を行った。
【００８７】
結果：
設計ペプチドによるＶＥＧＦ活性の抑制：
設計されたペプチドがＶＥＧＦ抗−アポトーシス活性と競合できるかどうか検討するために、ＦＢＳが除去されたヒト一次内皮（ＨＵＶＥＣ）細胞中でカスパーゼ３の活性化を分析した。ＦＢＳが除去された細胞からの細胞溶解物において、２０Ｕ／ｍｌを超える活性化カスパーゼ３が証明されたが、ＶＥＧＦを用いる培養からの細胞は、９Ｕ／ｍｌ未満の酵素活性を含むんでいることが見えてくる。従って、ＶＥＧＦの添加は、予想される（イルマズ（Ｙｉｌｍａｚ  Ａ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２００３，３０６：７３０−６）ように、ＨＵＶＥＣ細胞を部分的にアポトーシスから救済した。ＭＡペプチドを培養物に加えるとＶＥＧＦの効果が無くなり；ＭＫは成長因子の効果を部分的に抑制し、他の試験したペプチドはＶＥＧＦ活性を調節することができなかった（図７）。
【００８８】
ＭＡペプチドのＨＵＶＥＣ細胞への結合：
ＭＡペプチドのＨＵＶＥＣ細胞への結合を証明するために、ＭＡと共にまたはフルオレセインと共役した混合ペプチドと共に細胞をインキュベーションし、ＦＡＣＳにより結合を分析した。ＭＡは投与量依存的に細胞に特異的に結合（データは示されない）し、細胞に添加されたヒト組み換えＶＥＧＦはＭＡペプチドと競合することが見えてくる（図８）。
【００８９】
ＶＥＧＦにより誘導されるＭＡペプチドによるＥＲＫキナーゼの活性化の抑制：
ＨＵＶＥＣ細胞にＶＥＧＦが結合することは、ＥＲＫキナーゼの活性化を誘発し、それにより細胞アポトーシスが抑制されることが示された（サラメ（Ｓａｌａｍｅｈ  Ａ）ら、Ｂｌｏｏｄ．２００５，１０６：３４２３−３１）。従って、ＭＡペプチドが細胞に結合することが、ＶＥＧＦによるＥＲＫ活性化を阻害し得るかどうか調べた。図９ａに示されるように、ＶＥＧＦで３０分間刺激された細胞は、知覚し得る水準のリン酸化（活性化）ＥＲＫ１／２キナーゼを示したが、これらの水準は、ＭＡペプチドの存在下にＶＥＧＦと共にインキュベーションした細胞においては著しく低下した。
【００９０】
ＶＥＧＦを含む培養物中におけるアネキシンＶ＋細胞の外観へのＭＡペプチドの効果：
アポトーシス細胞が、アネキシンＶにより結合されたホスファチジルセリンを外面化する（スティーンスマ（Ｓｔｅｅｎｓｍａ  ＤＰ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２００３；８５：３２３−３２）。ＦＢＳを２４時間除去したＨＵＶＥＣ細胞は、２５％のアネキシンＶ＋細胞を示し、その百分率は、ＶＥＧＦを用いる培養物においては４０％を超えて低下した。ＶＥＧＦおよびＭＡペプチドと共に培養した細胞において、２２％を超えるアネキシンＶ＋細胞（図９ｂ）が観察され、これは、ペプチドが、成長因子の抗アポトーシス効果を著しく（ｐ＜０．０２）抑制したことを示している。
ことを示している。
【００９１】
参考文献
１．  ウィーズマン（Ｗｉｅｓｍａｎｎ，Ｃ），フー（Ｆｕｈ，Ｇ．），クリスティンガー（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ，Ｈ．Ｗ．），アイゲンブロット（Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ，Ｃ），ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．）およびデ・ホス（ｄｅ  Ｖｏｓ，Ａ．Ｍ．）（１９９７）  Ｃｅｌｌ  ９１  ，６９５−７０４．
２．  ミューラー（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｙ．Ａ．），リー（Ｌｉ，Ｂ．），クリスティンガー（Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ，Ｈ．  Ｗ．），ウェルズ（Ｗｅｌｌｓ，Ｊ．Ａ．），カニングハム（Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ，Ｂ．Ｃ．）およびデ・ホス（ｄｅ  Ｖｏｓ，Ａ．Ｍ．）（１９９７）  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  ９４，７１９２−７．
３．  ケイト（Ｋｅｙｔ，Ｂ．Ａ．），グエン（Ｎｇｕｙｅｎ，Ｈ．Ｖ．），バーリュー（Ｂｅｒｌｅａｕ，Ｌ．Ｔ．），ドゥアルテ（Ｄｕａｒｔｅ，ＣＭ．），パーク（Ｐａｒｋ，Ｊ．），チェン（Ｃｈｅｎ，Ｈ．）およびフェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．）（１９９６）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１，５６３８−４６．
４．  アウロラ（Ａｕｒｏｒａ，Ｒ．）およびローズ（Ｒｏｓｅ，Ｇ．Ｄ．）（１９９８）  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ  ７，２１−３８．
５．  デグラド（ＤｅＧｒａｄｏ，Ｗ．Ｆ．），スンマ（Ｓｕｍｍａ，ＣＭ．），ポボン（Ｐａｖｏｎｅ，Ｖ．），ナストリ（Ｎａｓｔｒｉ，Ｆ．）およびロンバルディ（Ｌｏｍｂａｒｄｉ，Ａ．）（１９９９）  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６８，７７９−８１９．
６．  デゥバル（Ｄｕｖａｌ，Ｍ．），ベダード−グレット（Ｂｅｄａｒｄ−Ｇｏｕｌｅｔ，Ｓ．），デリスレ（Ｄｅｌｉｓｌｅ，Ｃ．）およびグラットン（Ｇｒａｔｔｏｎ，Ｊ．Ｐ．）（２００３）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７８，２００９１−７．
７．  ベラ（Ｂｅｒｒａ，Ｅ．），ミラニニ（Ｍｉｌａｎｉｎｉ，Ｊ．），リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄ，Ｄ．Ｅ．），レ・ガル（Ｌｅ  Ｇａｌｌ，Ｍ．），ビナルズ（Ｖｉｎａｌｓ，Ｆ．），ゴシー（Ｇｏｔｈｉｅ，Ｅ．），ルー（Ｒｏｕｘ，Ｄ．），パゲス（Ｐａｇｅｓ，Ｇ．）およびピッセグル（Ｐｏｕｙｓｓｅｇｕｒ，Ｊ．）（２０００）  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，Ｖｏｌ．
６０，ｐｐ．１１７１−８．
８．  フェラーラ（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．）およびデイビス−スミス（Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ，Ｔ．）（１９９７）  Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｖ  １８，４−２５．
９．  シブヤ（Ｓｈｉｂｕｙａ，Ｍ．）（２００１）  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｆｕｎｃｔ  ２６，２５−３５．
１０．  ザチャリ（Ｚａｃｈａｒｙ，Ｉ．）およびグリキ（Ｇｌｉｋｉ，Ｇ．）（２００１）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ４９，５６８−８１．
１１．  タッカー（Ｔｈａｋｋｅｒ，Ｇ．Ｄ．），ハジャー（Ｈａｊｊａｒ，Ｄ．Ｐ．），ミューラー（Ｍｕｌｌｅｒ，Ｗ．Ａ．）およびロゼンガルト（Ｒｏｓｅｎｇａｒｔ，Ｔ．Ｋ．）（１９９９）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４，１０００２−７．
１２．  ペドラム（Ｐｅｄｒａｍ，Ａ．），ラザンジ（Ｒａｚａｎｄｉ，Ｍ．）およびレビン（Ｌｅｖｉｎ，Ｅ．Ｒ．）（１９９８）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３，２６７２２−８．
１３．  キシア（Ｘｉａ，Ｐ．），アイエロ（Ａｉｅｌｌｏ，Ｌ．Ｐ．），イシイ（Ｉｓｈｉｉ，Ｈ．），ジャング（Ｊｉａｎｇ，Ｚ．Ｙ．），パーク（Ｐａｒｋ，Ｄ．Ｊ．），ロビンソン（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，Ｇ．Ｓ．），タカギ（Ｔａｋａｇｉ，Ｈ．），ニューサム（Ｎｅｗｓｏｍｅ，Ｗ．Ｐ．），ジロウセク（Ｊｉｒｏｕｓｅｋ，Ｍ．Ｒ．）およびキング（Ｋｉｎｇ，Ｇ．Ｌ．）（１９９６）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ
９８，２０１８−２６．
１４．  ドアンス（Ｄｏａｎｅｓ，Ａ．Ｍ．），ヘグランド（Ｈｅｇｌａｎｄ，Ｄ．Ｄ．），セチ（Ｓｅｔｈｉ，Ｒ．），コベスジ（Ｋｏｖｅｓｄｉ，Ｉ．），ブルデル（Ｂｒｕｄｅｒ，Ｊ．Ｔ．）およびフィンケル（Ｆｉｎｋｅｌ，Ｔ．）（１９９９）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２５５，５４５−８．
１５．  フィーラー−ジョーンズ（Ｗｈｅｅｌｅｒ−Ｊｏｎｅｓ，Ｃ），アブ−ガラレ（Ａｂｕ−Ｇｈａｚａｌｅｈ，Ｒ．），コスペダル（Ｃｏｓｐｅｄａｌ，Ｒ．），ヒューリストン（Ｈｏｕｌｉｓｔｏｎ，Ｒ．Ａ．），マーチン（Ｍａｒｔｉｎ，Ｊ．）およびザチャリ（Ｚａｃｈａｒｙ，Ｉ．）（１９９７）  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  ４２０，２８−３２．
１６．  アベジ（Ａｂｅｄｉ，Ｈ．）およびザチャリ（Ｚａｃｈａｒｙ，Ｉ．）（１９９７）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２，１５４４２−５１．
１７．  コンウェイ（Ｃｏｎｗａｙ，Ｅ．Ｍ．），コレン（Ｃｏｌｌｅｎ，Ｄ．）およびカルメリエト（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ，Ｐ．）（２００１）  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｒｅｓ  ４９，５０７−２１．
１８．  フェララ（Ｆｅｒｒａｒａ，Ｎ．）（２００１）  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２８０，Ｃ  １３５８−６６．
１９．  イズナー（Ｉｓｎｅｒ，Ｊ．Ｍ．）およびアサハラ（Ａｓａｈａｒａ，Ｔ．）（１９９９）  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １０３，１２３１−６．
２０．  リー（Ｌｅｅ，Ｃ．Ｇ．），リンク（Ｌｉｎｋ，Ｈ．），バルク（Ｂａｌｕｋ，Ｐ．），ホーマー（Ｈｏｍｅｒ，ＲＪ．），チャポバル（Ｃｈａｐｏｖａｌ，Ｓ．），バンダリ（Ｂｈａｎｄａｒｉ，Ｖ．），カン（Ｋａｎｇ，Ｍ．Ｊ．），コーン（Ｃｏｈｎ，Ｌ．），キム（Ｋｉｍ，Ｙ．Ｋ．），マクドナルド（ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｍ．）およびエリアス（Ｅｌｉａｓ，Ｊ．Ａ．）（２００４）  ｉｎ  Ｎａｔ  Ｍｅｄ，Ｖｏｌ．  １０，ｐｐ．  １０９５−  １０３．
【図面の簡単な説明】
【００９２】
【図１】ＶＥＧＦ受容体の結合および活性化。ａ）ＢＡＥＣ上のＶＥＧＦ競合的結合。膜蛋白１μｇを、ＱＫおよび［125Ｉ］−ＶＥＧＦ（５０００００ｃｐｍ，１０-10Ｍ）と共に平板培養した。ｂ）ＫＤＲ活性化。刺激後、全ＫＤＲを、全細胞蛋白抽出物から免疫沈降し、リン酸化チロシンを特異抗体、抗ウサギＨＲＰ−共役二次抗体および標準的化学的発光により視覚化した。ｃ）ＦＩｔ−１活性化。刺激後、全ＦＩｔ−１を、全細胞蛋白抽出物から免疫沈降し、リン酸化チロシンを特異抗体、抗ウサギＨＲＰ−共役二次抗体および標準的化学的発光により視覚化した。
【図２】ＥＲＫ１／２活性化への、ＱＫおよびＶＥＧＦ１５の効果。血清誘導ＢＡＥＣを、ＶＥＧＦ165（１００ｎｇ／ｍｌ）の不存在または存在下に、ＱＫ（ａ）またはＶＥＧＦ１５（ｂ）により、３７℃で１５分間処理し、次に、ＲＩＰＡ−ＳＤＳ緩衝剤に溶解した。全ＥＲＫ１／２および、ＥＲＫ１／２のリン酸化型を、特異抗体で視覚化した。
【図３】細胞増殖への、ＱＫの効果。ａ）ＤＮＡ合成。ＢＡＥＣを、ＤＭＥＭ中で、ＶＥＧＦ165（１００ｎｇ／ｍｌ）の不存在または存在下に、［3Ｈ］−チミジンおよびＱＫと共にインキュベーションした。２４時間後、細胞を固定し溶解した。シンチレーション液を加え、［3Ｈ］−チミジンの取り込みを評価した。ｂ）細胞増殖。ＢＡＥＣを、ＶＥＧＦ165（１００ｎｇ／ｍｌ）の不存在または存在下に、提示量のＱＫで刺激した。細胞数を、刺激後２４時間で決めた。ｃ）ＲＢリン酸化。ＱＫ（１０-6Ｍ）、ＶＥＧＦ165（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＶＥＧＦ１５（１０-6Ｍ）で刺激後１２時間および１８時間でｐ−ＲＢを評価した。
【図４】ＱＫの試験管内血管新生特性。ヒト内皮細胞を、２４ウエルプレートにおいて特別に設計された媒体中、他のヒト細胞と共培養した。３日毎に、ＱＫ単独、またはＱＫとＶＥＧＦ165（１００ｎｇ／ｍｌ）との組み合わせを、培地に加えた。１１日目に、細胞を氷浴７０％エタノールで固定し、小管の形成を、抗ヒトＣＤ３１（ＰＥＣＡＭ−Ｉ）について染色することにより視覚化した。サンプル画像を挿入像ａ〜ｄに報告する。ａ）スラミン（２０μＭ）およびｂ）ＶＥＧＦ165を、それぞれ、陰性および陽性対照として用いた。ｅ）細胞結合の数および小管全長を、デジタル化後の画像を分析するソフトウェアを用いて決めた。
【図５】生体内血流評価。生体内慢性虚血中のＱＫおよびＶＥＧＦ動脈内慢性注入による増加した血管新生反応を評価した。（ａ）ＴＩＭＩフレームカウント（ＦＣ）。慢性虚血１５日後、対照として用いた擬処理ラットと比較して、ＱＫおよびＶＥＧＦで処理した虚血後肢におけるＴＩＭＩ  ＦＣの数の低下を、デジタル血管造影により証明した（＊：ｐ＜０．０５）。（ｂ）染色ビーズ希釈。同様に、ＱＫおよびＶＥＧＦは、対照と比較して、虚血後肢における血流を改善する（＊：ｐ＜０．０５）。
【図６】ＨＵＶＥ細胞（ｌ×１０4／ｃｍ2）を、ＦＢＳを含まない培地中、５％ＣＯ2雰囲気下、ＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＱＫ（５ｎｇ／ｍｌ）の不存在または存在下に３７℃でインキュベーションした。４時間後、カスパーゼ３活性を決めた。結果を、３回の平均値として表す。
【図７】ＨＵＶＥ細胞（ｌ×１０4／ｃｍ2）を、ＦＢＳを含まない培地中、５％ＣＯ2雰囲気下、ＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）および提示されたペプチド（２０ｎｇ／ｍｌ）の不存在または存在下に３７℃でインキュベーションした。４時間後、カスパーゼ３活性を決めた。結果を、３回の平均値として表す。
【図８】ＨＵＶＥ細胞（ｌ×１０4／ｃｍ2）を、フルオレセインと共役した５００ｎＭ  ＭＡペプチドと共にインキュベーションし、暗所にて４℃で３０分後に量を増やしつつあるＶＥＧＦと競合させた。次に、細胞蛍光をフローサイトメトリーにより分析した。
【図９】（ａ）ＨＵＶＥ細胞（ｌ×１０4／ｃｍ2）を、ＭＡペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ）の不存在または存在下、ＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に、３０分間２回インキュベーションした。次に、細胞溶解物を得、抗−ホスホ−ＥＲＫ抗体を用いてウエスタンブロットで分析した。（ｂ）ＨＵＶＥ細胞（ｌ×１０4／ｃｍ2）を、ＭＡペプチド（１００ｎｇ／ｍｌ）の不存在または存在下、ＶＥＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）と共に、５％ＣＯ2雰囲気中、３７℃で２４時間３回インキュベーションした。次に、ＦＩＴＣアネキシンＶ結合を、フローサイトメトリーにより分析した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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