(57)【要約】本発明は、サンプルから標的分子を単離する方法を提供する。ある実施態様では、その方法は、サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子が標的分子を結合して標的分子捕捉因子錯体を形成する能力があり、そして標的分子がリン酸化分子、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子より構成される群から選択される条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを含むこと、そしてサンプルから標的分子―捕捉因子錯体を分離すること、それによりサンプルから標的分子を単離することを含む。さらに提供されるのは、サンプルを捕捉因子と接触させ、その因子がシデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含することを含む、サンプル中の標的分子の存在を測定する方法である。
2008506971.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そして因子が、標的分子を結合して、標的分子−捕捉因子錯体を形成する能力があり、そして標的分子がリン酸化分子、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子より構成される群から選択される条件下で、その因子が、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および
（ｂ）サンプルから標的分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルから標的分子を単離すること
を含む、サンプルから標的分子を単離する方法。
【請求項２】
さらに、標的分子−捕捉因子錯体から標的分子を分離することを包含する請求項１の方法。
【請求項３】
サンプルが溶液を包含する請求項１の方法。
【請求項４】
サンプルが支持体を包含する請求項１の方法。
【請求項５】
支持体が、粒子、ビーズ、ゲル、マトリックス、膜、フィルター、および表面から選択される請求項４の方法。
【請求項６】
シデロホアが、原核生物のシデロホアおよび真菌のシデロホアの群から選択される請求項１の方法。
【請求項７】
シデロホアが、ヒドロキサメート・シデロホア、カテコレート・シデロホア、フェノレート・シデロホア、および混合カテコレート−ヒドロキサメート・シデロホアの群から選択される請求項１の方法。
【請求項８】
シデロホアが、混合カテコレート−ヒドロキサメート・シデロホアである請求項７の方法。
【請求項９】
混合カテコレート−ヒドロキサメート・シデロホアが、ピロベルジン・ファミリーのシデロホアである請求項８の方法。
【請求項１０】
ピロベルジン・ファミリーのシデロホアが、アゾトバクチン、ミコバクチン、ピロベンジンＰａＡ、シュードバクチンＢ１０、アゾベルジン、ピロベルジンＧＭ−ＩＩ、ピロベルジンＧ４Ａ、ピロベルジンＧ４Ｒ、およびスクシノピロベルジンの群から選択される請求項９の方法。
【請求項１１】
シデロホアが、ヒドロキサメート・シデロホアである請求項７の方法。
【請求項１２】
ヒドロキサメート・シデロホアが、デスフェリオキサミン・ファミリーのシデロホアである請求項１１の方法。
【請求項１３】
シデロホアが、デスフェリオキサミンである請求項１２の方法。
【請求項１４】
シデロホアが、タグ付デスフェリオキサミンである請求項１３の方法。
【請求項１５】
タグ付デスフェリオキサミンが、フルオレッセン、ロダミン、７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル、Ｎ−メチルアントラニルおよび２−シアノナフト［２，３−ｃ］−２Ｈ−ピロリルから選択される部分を含有する請求項１４の方法。
【請求項１６】
ヒドロキサメート・シデロホアが、フェリクロム・ファミリーのシデロホアである請求項１１の方法。
【請求項１７】
シデロホアが、フェリクロムである請求項１６の方法。
【請求項１８】
シデロホアが、タグ付フェリクロムである請求項１６の方法。
【請求項１９】
タグ付フェリクロムが、フルオレッセン、ロダミン、および７−（９’−アントラセニル）−５−オキソ−２−オキサ−６−アザヘプチルの群から選択される部分を包含する請求項１８の方法。
【請求項２０】
シデロホアが、脂質溶解性である請求項１の方法。
【請求項２１】
脂質溶解性のシデロホアは、エクソケリン・シデロホアである請求項２０の方法。
【請求項２２】
シデロホアが、フェリクロム、フェリルビン、シゾキネン、ロドトルリック酸、トリアセチルフサリニン、フェリクロシン、エクソケリン、ビシバクチンダイマー酸、アセチルダイマー酸、アルカルギンＥ、ピオケリン、コプロゲンＢ、メチルコプロゲンＢ、フサリニン、アシネトフェリン、オルニバクチン、アンフィバクチン、マリノバクチン、アクアケリン、ミコバクチン、クリソバクチン、セパバクチン、ピロベルジン、エンテロバクチン、カルバセファロスポリンＪＡＭ−２−２６３、カルバセファロスポリンＥＫＤ−３−８８およびアゾトバクチンの群から選択される請求項１の方法。
【請求項２３】
シデロホアが、タグ付けされる請求項１の方法。
【請求項２４】
タグが、ハプテンである請求項２３の方法。
【請求項２５】
ハプテンが、ビオチン、デスチオビオチン、ジグオキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−エトキシメチレン−２−フェニル−２−オキサゾリン−５−オン、および５−ベンズイミダゾールカルボン酸の群から選択される請求項２４の方法。
【請求項２６】
タグが、ポリペプチドである請求項２４の方法。
【請求項２７】
ポリペプチドが、酵素である請求項２６の方法。
【請求項２８】
酵素が、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびベータ−グルクロニダーゼの群から選択される請求項２７の方法。
【請求項２９】
ポリペプチドが、光タンパク質である請求項２６の方法。
【請求項３０】
ポリペプチドが、蛍光ポリペプチドである請求項１９の方法。
【請求項３１】
蛍光ポリペプチドが、フィコビリタンパク質、緑色蛍光タンパク質、および赤色蛍光タンパク質の群から選択される請求項２６の方法。
【請求項３２】
蛍光ポリペプチドが、緑色蛍光タンパク質である請求項３１の方法。
【請求項３３】
タグが、検出可能な部分である請求項２３の方法。
【請求項３４】
検出可能な部分が、蛍光部分である請求項３３の方法。
【請求項３５】
遷移金属陽イオンが、鉄（ＩＩＩ）、ガリウム（ＩＩＩ）、インジウム（ＩＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、セリウム（ＩＩＩ）、イットリウム（ＩＩＩ）、ジルコニウム（ＩＶ）、チタン（ＩＶ）、銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）およびタンタルム（Ｖ）の群から選択される請求項１の方法。
【請求項３６】
遷移金属陽イオンが、ガリウム（ＩＩＩ）である請求項３５の方法。
【請求項３７】
遷移金属陽イオンが、不安定化アクオリガンドにより占められる１つまたはそれより多くの配位部位を有する請求項１の方法。
【請求項３８】
捕捉因子が、支持体に付着される請求項１の方法。
【請求項３９】
支持体が、粒子、ビーズ、ゲル、マトリックス、膜、フィルターおよび表面から選択される請求項３８の方法。
【請求項４０】
表面が、マイクロウエル平板、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的平板、アレイ、マイクロアレイ基質、キャピラリーおよび顕微鏡スライドから選択される請求項３９の方法。
【請求項４１】
粒子が、ガラス、プラスチックおよび金属から選択される材料を包含する請求項４０の方法。
【請求項４２】
粒子が、コロイド状金およびコロイド状銀から選択される金属を包含する請求項４１の方法。
【請求項４３】
接触が、塩の不在下で行われる請求項１の方法。
【請求項４４】
接触が、酸の不在下で行われる請求項１の方法。
【請求項４５】
（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子が標的分子を結合して、標的分子−捕捉因子錯体を形成する能力があり、そして標的分子が、リン酸化分子、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子より構成される群から選択される条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および、
（ｂ）標的分子−捕捉因子錯体の形成を検出し、それによりサンプル中の標的分子の存在を測定することを含む、サンプル中の標的分子の存在を測定する方法。
【請求項４６】
検出が、捕捉因子と標的分子の間の結合を測定することによって行われる請求項４５の方法。
【請求項４７】
測定が、吸光度、透過、分子量測定、蛍光強度、蛍光偏光、時間決定蛍光、共鳴光散乱、表面増強ラマン散乱、誘導結合プラズマ質量分光測定法、電子常磁性共鳴、屈折率吸収、核磁性共鳴、微量熱量計測法、フーリエ変換赤外線分光測定法、原子分光測定法、表面プラズモン共鳴、屈折率変化、分光偏光測定法および偏光解析法の群から選択される状態を含む請求項４６の方法。
【請求項４８】
標的分子−捕捉因子錯体のシデロホア部分を検出する請求項４５の方法。
【請求項４９】
標的分子−捕捉因子錯体の遷移金属部分を検出する請求項４５の方法。
【請求項５０】
標的分子−捕捉因子錯体のリン酸化分子部分を検出する請求項４５の方法。
【請求項５１】
さらに、標的分子−捕捉因子錯体中に存在しない捕捉因子を除去することを包含する請求項４５の方法。
【請求項５２】
（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子がリン酸化分子を結合して、リン酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および
（ｂ）サンプルからリン酸化分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルからリン酸化分子を単離することを含む、サンプルからリン酸化分子を単離する方法。
【請求項５３】
（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子がリン酸化分子を結合して、リン酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および
（ｂ）リン酸化分子−捕捉因子錯体の形成を検出し、それによりサンプル中のリン酸化分子の存在を測定することを含む、サンプル中のリン酸化分子の存在を測定する方法。
【請求項５４】
（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子がリン酸化分子を結合して、ニトロチロシン含有分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および
（ｂ）サンプルからニトロチロシン含有分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルからニトロチロシン含有分子を単離すること含む、サンプルからニトロチロシン含有分子を単離する方法。
【請求項５５】
（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子がリン酸化分子を結合して、ニトロチロシン含有分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および
（ｂ）ニトロチロシン含有分子−捕捉因子錯体の形成を検出し、それによりサンプル中のニトロチロシン含有分子の存在を測定することを含む、サンプル中のニトロチロシン含有分子の存在を測定する方法。
【請求項５６】
（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子がリン酸化分子を結合して、硫酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および
（ｂ）サンプルから硫酸化分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルから硫酸化分子を単離することを含む、サンプルから硫酸化分子を単離する方法。
【請求項５７】
（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子が硫酸化分子を結合して、硫酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および
（ｂ）硫酸化分子−捕捉因子錯体の形成を検出し、それによりサンプル中の硫酸化分子の存在を測定することを含む、サンプル中の硫酸化分子の存在を測定する方法。
【請求項５８】
（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子がリン酸化分子を結合して、リン酸化ヒスチジン含有分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび銅（ＩＩ）陽イオンを包含すること、および
（ｂ）サンプルからリン酸化ヒスチジン含有分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルからリン酸化ヒスチジン含有分子を単離することを含む、サンプルからリン酸化ヒスチジン含有分子を単離する方法。
【請求項５９】
単離シデロホアおよび遷移金属塩を包含する市販用パッケージ。
【請求項６０】
シデロホアが、支持体に付着される請求項５９の市販用パッケージ。
【請求項６１】
単離シデロホアおよび遷移金属溶液を包含する市販用パッケージ。
【請求項６２】
シデロホアが、支持体に付着される請求項６１の市販用パッケージ。
【請求項６３】
（ａ）シデロホア−遷移金属陽イオン錯体をリン酸化部分と接触させ、そして
（ｂ）リン酸化部分に結合するその錯体の能力を測定し、それにより捕捉因子を同定することを含む、捕捉因子を同定する方法。
【請求項６４】
シデロホア−遷移金属陽イオン−錯体が、
（ａ）シデロホアを遷移金属陽イオンと接触させ、そして
（ｂ）遷移金属陽イオンに結合するシデロホアが、シデロホア−遷移金属陽イオン錯体として同定されるものである遷移金属陽イオンに結合するシデロホアの能力を測定することを含む方法によって同定される請求項６３の方法。
【請求項６５】
シデロホアは、検出可能な遷移金属陽イオン−結合物質の存在下で、遷移金属陽イオンと接触され、そして検出可能な遷移金属陽イオン−結合物質を置換してシデロホア−遷移金属陽イオン錯体を形成するシデロホアの能力を測定する請求項６３の方法。
【請求項６６】
シデロホア−遷移金属陽イオン錯体を、検出可能なリン酸化部分と接触させる請求項６５の方法。
【請求項６７】
検出可能な部分の加水分解を検出することによって、リン酸化部分に結合する錯体の能力を測定する請求項６１の方法。
【請求項６８】
検出可能なリン酸化部分が、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルおよび４−ニトロフェニルホスホの群から選択される請求項６１の方法。
【請求項６９】
（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、その因子がリン酸化分子を結合して疎水性相中に含有されるリン酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子が脂質溶解性シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、そして；
（ｂ）リン酸化分子−捕捉因子錯体を親油性リン酸化コンペティター化合物と接触させて、親油性リン酸化コンペティター−捕捉因子錯体を形成すること；および
（ｃ）親水性相を収集し、それによりサンプルからリン酸化分子を単離することを含む、疎水性相および親水性相を含むサンプルからリン酸化分子を単離する方法。
【請求項７０】
親水性相は、水性相である請求項６９の方法。
【請求項７１】
シデロホアは、エクソケリン・シデロホアである請求項６９の方法。
【請求項７２】
コンペティター化合物が、フェニルおよび２−（チオフェン−３−イルエチル）ホスホン酸から選択される請求項６９の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、標的分子を検出および単離すること、そしてさらに詳細には、リン分子、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子を検出および単離することに関する。
【背景技術】
【０００２】
体内の細胞は、機能、サイズ、寿命、および膨大な他の特徴において変化する多くの型の分子を含有する。これらの分子の内のいくつかは、体内でそれらの寿命の間に変化しない一方で、他の分子は、化学反応を通して修飾される。修飾は、正常な状態、並びに外傷、感染および疾患により引き起される異常な状態を含めた特定の細胞状態を示しうる。
【０００３】
特に、多くのタンパク質が、体内でそれらの寿命の間に化学的に修飾される。したがって、タンパク質としては、細胞内でのその合成の間およびその後に起こる多数の修飾が挙げられる。これらの修飾は、タンパク質のサイズおよび構造を変化し、それにより、細胞でのタンパク質の機能または作用をしばしば変化させる。タンパク質の可能な修飾の例は、小型の産物を産生するプロテアーゼによる当初のポリペプチドの酵素的切断である。他の修飾としては、タンパク質中での所定のアミノ酸への糖分子の付加（グリコシル化）、リン酸基の付加（リン酸化）、硫酸基の付加（硫酸化）およびチロシン残基上へのニトロ基の付加（チロシンニトロシル化）が挙げられる。
【０００４】
キナーゼ（リン酸化物を付加する）およびホスファターゼ（リン酸を除去する）と呼ばれる酵素によるトレオニン、セリンおよびチロシン残基の可逆リン酸化は、成長および細胞周期制御のような多くの細胞プロセスを調節する上で重要な役割を果たす。リン酸化は、互いのタンパク質から連続して起こり、そして「リン酸化カスケード」と呼ばれる一連の活性化を生じうる。リン酸化カスケードは、細胞の成長、死滅および分化を導く信号発生ネットワーク、すなわち体内で正常な細胞を維持するための重要な信号として識別される。成果は、種々の細胞型のリン酸化タンパク質を同定する研究集団内で進行中であり、そしてリン酸化タンパク質の集団は、「リン酸プロテオーム」と称される。タンパク質リン酸化の理解が増大されるのは、ヘルセプチン（登録商標）およびエルビタックス（登録商標）のような有効な癌療法の開発に先導されてきた。
【０００５】
ニトロチロシンは、ヒト冠状動脈の硬化病巣、後期虚血性心臓、および子かん前症の間の臍帯、炎症性疾患、および萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）のような神経性疾患を含めた多様な臨床条件から得られるタンパク質中に存在することが示されてきた。研究者らは、ニトロチロシンのレベルが、一般に使用される分類のコレステロール低下薬であるスタチンで処置した患者の間で減少されることを報告し、そしてニトロチロシンがスタチンの抗炎症効果を監視する優れた測定法として役割を果たすことを示した。これらの理由により、中でも、体の正常な、および罹患した状態でのチロシンニトロシ化の役割をよりよく理解することは、科学および医療集団に興味があるものである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
硫酸化は、薬剤代謝および化学的防御における十分に確立された役割を示す。この点で、我々がさらされる多くの化合物は、さらに生物学的に活性な順流の代謝をさせ、そしてこの生物活性化は、食物中のものを含めて膨大な癌起因因子の作用の機構に重要である。硫酸化は、膨大な癌起因因子の生物活性化における最終段階である。体内での異常な硫酸化を理解するために、研究者らは、最近、硫酸化酵素についてのヒト遺伝子を研究している。例として、研究は、所定の硫酸化酵素遺伝子突然変異が、硫酸により活性化される癌起因因子について標的組織を表す膀胱および結腸の癌における危険因子として役割を果たしうる可能性に焦点を当てた。体内での正常な硫酸化の例として、カテコラミンのような所定のホルモンが、それらの硫酸化接合体（９５％より多くの循環中のドーパミンは、硫酸ドーパミンの形態にある）として優先的に循環する。正常な、および罹患した状態で起こる硫酸化の理解が増大したことは、薬剤代謝および化合物防御への、並びに体の正常な、および罹患した状態へのさらなる見通しを供すると思われる。
【０００７】
したがって、タンパク質のような修飾形態の分子を検出および単離することは、体の細胞および系の正常および異常な状態を理解するために研究するものに、並びにタンパク質修飾に関連する異常な状態の診断および予後のための試験を開発するものに興味深い。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、サンプルから標的分子を単離する方法を提供する。実施態様では、その方法は、サンプルを捕捉因子と接触させることを包含し、そしてその因子が標的分子を結合して、標的分子−捕捉因子錯体を形成する能力があり、そして標的分子がリン酸化分子、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子より構成される群から選択される条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること；そしてサンプルから標的分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルから標的分子を単離することを包含する。
【０００９】
１つの実施態様では、その方法は、サンプルからリン酸化分子を単離するために使用されうる。別の実施態様では、その方法は、サンプルからニトロチロシン含有分子を単離するために使用されうる。さらに別の実施態様では、その方法は、サンプルから硫酸化分子を単離するために使用されうる。その方法は、標的分子−捕捉因子錯体から標的分子を分離することも含みうる。サンプルは溶液で使用される。
【００１０】
本発明は、サンプル中の標的分子の存在を測定する方法を提供する。実施態様では、その方法は、サンプルを捕捉因子と接触させること、因子が標的分子を結合して、標的分子−捕捉因子錯体を形成する能力があり、そして標的分子がリン酸化分子、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子より構成される群から選択される条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること；そして標的分子−捕捉因子錯体の形成を検出し、それによりサンプル中の標的分子の存在を測定する。
【００１１】
１つの実施態様では、その方法は、サンプル中のリン酸化分子の存在を測定するために使用されうる。別の実施態様では、その方法は、サンプル中のニトロチロシン含有分子の存在を測定するために使用されうる。さらに別の実施態様では、その方法は、サンプル中の硫酸化分子の存在を測定するために使用されうる。
【００１２】
検出は、例えば、捕捉因子と標的分子との間の結合を測定することによって行われうる。測定は、吸光度、透過、分子量測定、蛍光強度、蛍光偏光、時間決定蛍光、共鳴光散乱、表面増強ラマン散乱、誘導結合プラズマ質量分光測定法、電子常磁性共鳴、屈折率吸収、核磁性共鳴、微量熱量測定法、フーリエ変換赤外線分光測定法、原子分光測定法、表面プラズモン共鳴、屈折率変化、分光偏光測定法および偏光解析法の群から選択される状態を含みうる。実施態様では、標的分子−捕捉因子錯体のシデロホア部分を検出する。別の実施態様では、標的分子−捕捉因子錯体の遷移金属部分を検出する。別の実施態様では、標的分子−捕捉因子錯体のリン酸化分子部分を検出する。
【００１３】
特定の実施態様では、本発明の方法は、サンプルからリン酸化分子を単離する方法である。方法は、サンプルを捕捉因子と接触させ；そしてその因子がリン酸化分子を結合してリン酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含し、そしてサンプルからリン酸化分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルからリン酸化分子を単離する。
【００１４】
本発明は、市販用パッケージを提供する。１つの実施態様では、市販用パッケージは、単離シデロホアおよび遷移金属塩を含有しうる。別の実施態様では、市販用パッケージは、単離シデロホアおよび遷移金属溶液を含有しうる。さらなる実施態様では、シデロホアは、支持体に付着されうる。
【００１５】
本発明は、捕捉因子を同定する方法を提供する。その方法は、シデロホア−遷移金属陽イオン錯体をリン酸化部分と接触させ、そしてリン酸化部分に結合するその錯体の能力を測定し、それにより捕捉因子を同定することを含む。実施態様では、方法は、さらに、シデロホアを遷移金属陽イオンと接触させ、そして遷移金属陽イオンに結合するシデロホアが、シデロホア−遷移金属陽イオン錯体として同定されるものである遷移金属陽イオンに結合するシデロホアの能力を測定することを含みうる。
【００１６】
別の実施態様では、シデロホアを、検出可能な遷移金属陽イオン−結合物質の存在下で、遷移金属陽イオンと接触させ、そして検出可能な遷移金属陽イオン−結合物質を置換してシデロホア−遷移金属陽イオン錯体を形成するシデロホアの能力を測定しうる。所望の場合、シデロホア−遷移金属陽イオン錯体を、検出可能なリン酸化部分と接触させる。さらに、検出可能な部分の加水分解を検出することによって、リン酸化部分に結合する錯体の能力を測定しうる。典型的な検出可能なリン酸化部分としては、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルおよび４−ニトロフェニルホスホが挙げられる。
【００１７】
サンプルからリン酸化分子を単離するための本発明の方法の実施態様では、サンプルは、疎水性相および親水性相を含むことができ、そしてその方法は、サンプルを捕捉因子と接触させること、その因子がリン酸化分子を結合して疎水性相中に含有されるリン酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子が脂質溶解性シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること；リン酸化分子−捕捉因子錯体を親油性リン酸化コンペティター化合物と接触させて、親油性リン酸化コンペティター−捕捉因子錯体を形成すること；および親水性相を収集し、それによりサンプルからリン酸化分子を単離することを含む。親水性相は、例えば、水性相でありうる。シデロホアは、例えば、エクソケリン・シデロホアでありうる。
【００１８】
本発明は、サンプルから標的分子を単離する方法の別の実施態様を提供する。その方法は、サンプルを捕捉因子と接触させること、そして因子が、標的分子を結合して標的分子−捕捉因子錯体を形成する能力があり、そして標的分子は、リン酸化分子、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子より構成される群から選択される条件下で、その因子は、デスフェロキサミン・シデロホアおよびガリウム（ＩＩＩ）陽イオンを包含し、そしてサンプルから標的分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルから標的分子を単離することを含む。
【００１９】
さらに、提供されるのは、サンプル中の標的分子の存在を測定する方法の別の実施態様である。その方法は、サンプルを捕捉因子と接触させること、そして因子が標的分子を結合して標的分子−補足因子錯体を形成する能力があり、そして標的分子がリン酸化分子、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子より構成される群から選択される条件下で、その因子は、デスフェロキサミン・シデロホアおよびガリウム（ＩＩＩ）陽イオンを包含し、そして標的分子−捕捉因子錯体の形成を検出し、それによりサンプル中の標的分子の存在を測定することを含む。実施態様では、サンプルは、粒子、ビーズ、ゲル、マトリックス、膜、フィルターまたは表面のような支持体を含みうる。表面の例としては、マイクロウエル平板、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標的板、アレイ、マイクロアレイ気質、キャピラリーおよび顕微鏡スライドが挙げられる。捕捉因子は、同様に、表面に付着されうる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
ここに示される技術は、リン酸化分子、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子のような標的分子を単離および／または検出するための方法、組成物および市販用パッケージに関する。
【００２１】
実施態様では、本発明は、１つまたはそれより多くのリン酸化部分、ニトロチロシン部分および硫酸化部分を含有するもの、またはそれの組合せのような、標的分子を単離する方法に向けられる。サンプルから標的分子の単離は、捕捉因子に標的分子を結合し、そしてサンプルから標的分子−捕捉因子錯体を分離することによって、達成されうる。捕捉因子は、１つまたはそれより多くの遷移金属イオンと配位結合したシデロホアを含有し、そしてシデロホア−遷移金属イオン錯体は、標的分子に選択的に結合することを提供する。下に示されるとおり、多様なシデロホア−遷移金属イオン錯体は、標的分子に結合するのに適切である。実施例６には、ホスホペプチド、ホスホイノシチド、硫酸化分子およびニトロチロシン含有分子に選択的に結合するためのデスフェリオキサミド−ガリウム（ＩＩＩ）錯体を含有する捕捉因子の用途が記載されている。いったん標的分子−捕捉因子錯体が形成されると、それは、使用者により選択されたフォーマットによって、多様な手段によりサンプルから除去されうる。例えば、捕捉因子が、支持体に付着されるとき、サンプル（液相）から支持体（固形または半固形相）を分離すること、またはその逆によって、分離が行われうる。別の例として、捕捉因子は、抗体または他の結合相手によって識別されるエピトープのような単離タグを含有する場合、単離タグに標的分子−捕捉因子錯体の捕捉因子部分を結合させ、そして単離タグ結合錯体を収集することによって、分離が行われうる。分子錯体を収集する多様な周知手段は、ここに示される方法の内容の内で使用されうる。
【００２２】
別の実施態様では、本発明は、１つまたはそれより多くのリン酸化部分、ニトロチロシン部分または硫酸化部分またはそれの組合せを含有する標的分子のような標的分子を検出するための方法に向けられる。サンプル中の標的分子の検出は、捕捉因子に標的分子を結合させ、そして標的分子−捕捉因子錯体、またはその錯体の一部を検出することによって達成されうる。下にここで示されるとおり、膨大で、そして多様な分析的方法を、このような錯体またはその錯体の一部を検出するために使用しうる。例えば、その錯体の１つの成分を、検出可能なタグで標識でき、そして単離錯体中のタグの存在を検出しうる。別の例として、質量のようなそれの成分に関する錯体の物理化学的特性を、検出しうる。別の例として、蛍光共鳴エネルギー移動のような錯体を形成されたときの標的分子と捕捉因子との間の近傍から生じる特性を、検出しうる。実施例６は、近接アッセイフォーマット中にデスフェリオキサミン−ガリウム（ＩＩＩ）錯体を含有する捕捉因子を使用してフェムトモル量のホスホペプチド、ホスホイノシチド、硫酸化分子およびニトロチロシン含有分子を検出することを示す。
【００２３】
ここに示される技術は、遷移金属陽イオンと配位結合されるシデロホアを含有する捕捉因子への標的分子の結合を含む。標的分子は、一般に、捕捉因子の遷移金属陽イオン部分に結合するが、しかし関与する特定の捕捉因子および標的分子によって、シデロホアおよび遷移金属陽イオンの両方にも結合しうる。先の研究は、リンタンパク質が金属イオンに結合しうることを示した。そのようなものとして、リンタンパク質検出および精製製品は、ＩＭＡＣ（固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー）アッセイ（モレキュラー・デバイシズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、カリフォルニア州サニーベール（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ））、プロ−Ｑダイアモンド・リンタンパク質ゲル染色（モレキュラー・プローブズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）、オレゴン州ユージーン（Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ））およびＺｉｐＴｉｐＭＣピペット・チップス（ミリポア・コーポレーション（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、マサチューセッツ州ビレリカ（Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ））を含めて市販で入手可能である。これらの製品は、イミノジアセテート、ニトリロトリアセテート、１，４，７−トリアゾシクロノナンまたは１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラ酢酸（ＢＡＰＴＡ）のような合成の小型分子有機キレートと配位結合した三価遷移金属陽イオンの使用に関与する。これらの技術を使用したリン酸化分子の単離は、一般に３から６までの酸性ｐＨ値で行われる。ＧａｂｒｅｉｃｅｖｉｃおよびＣｒｕｍｂｌｉｓｓは、小型分子有機キレート剤が、これらの高いｐＨ値で遷移金属陽イオンを結合するそれらの許容量が減少されることにより中性ｐＨでリン酸化分子を結合することができないので、このような低いｐＨが必要とされることを仮定する（ＧａｂｒｅｉｃｅｖｉｃおよびＣｒｕｍｂｌｉｓｓ、２００３年）。対照的に、標的分子を検出および単離するためにここに示される方法は、所望であれば、中性ｐＨで、またはその付近で行われうる。
【００２４】
ここで使用される場合、用語「標的分子」は、所定のシデロホア−遷移金属陽イオン錯体に選択的に結合する能力のある分子を意味する。用語「標的分子」は、共有結合で結合または非共有結合で結合したリン酸化部分、ニトロチロシン部分、硫酸化部分を含有するあらゆる型の分子を包含する。リン酸化部分を含有しうる分子の限定なしの例としては、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質および炭化水素が挙げられる。硫酸化されうる分子の限定なしの例としては、サッカライド、糖脂質、グルコサミングルカンなどのような炭化水素が挙げられる。ニトロチロシンを含有しうる分子の限定なしの例としては、アミノ酸チロシン、チロシン残基を含有するポリペプチドまたはペプチド、およびチロシン残基を組み込むあらゆる融合または人工的分子が挙げられる。標的分子は、１つまたはそれより多くの他の分子に結合されうるか、または単独の分子でありうる。選択的結合は、捕捉因子が１つまたはそれより多くのリン分子、ニトロチロシン含有分子、および／または硫酸化分子に結合するが、しかし非リン分子、非ニトロチロシン含有分子または非硫酸化分子、あるいは他の非関連分子には実質的に結合しないことを意味する。本発明の方法または市販用パッケージに使用される特定の捕捉因子が、リン分子に選択的に、ニトロチロシン含有分子に選択的に、そして硫酸化分子に選択的に特異的結合することを含めて、同時にリン分子、ニトロチロシン含有分子、および硫酸化分子に、またはこれらの型の分子の副集合に特異的に結合する能力がありうることが分かる。実施例６は、リン分子、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子に特異的結合を有するデスフェリオキサミン−ガリウム（ＩＩＩ）陽イオン捕捉因子を示す。
【００２５】
ここで使用される場合、用語「捕捉因子」は、標的分子に選択的に結合する能力のある実体を意味する。捕捉因子としては、１つまたはそれより多くの遷移金属陽イオンと配位結合したシデロホアを含む。捕捉因子のシデロホア部分を、所望の場合、遷移金属陽イオンに加えて、リガンドと錯体化させうる。捕捉因子は、捕捉因子のシデロホア部分または遷移金属陽イオン部分に付着されるか、または固有に存在しうるタグも含有しうる。
【００２６】
ここで使用される場合、用語「シデロホア」は、遷移金属陽イオンを配位結合する能力のある有機分子を意味する。シデロホアは、原核生物および真菌のような微生物、植物および高等生物を含めた多様な生物によって産生される天然に生じる分子を含む。シデロホアは、シデロホアが遷移金属陽イオンを配位結合する能力を保持する限り、タグ付形態の天然に生じるシデロホアのような修飾、人工的または人造分子も含む。シデロホアは、周知シデロホア構造分類内にカテゴリー化された化学的構造を有しうる。シデロホアの典型的な構造分類は、ヒドロキサメート・シデロホア、カテコール・シデロホア、およびフェノレート基本のシデロホアを含む。ヒドロキシメート・シデロホアの非限定の例は、フェリクロム、フェリルビン、ロドトルリック酸（ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ）、トリアセチルフサリニン、フェリクロシン、エクソケリン、ビシバクチン、ダイマー酸、アセチルダイマー酸、シゾキネン、コプロゲンＢ、メチルコプロゲンＢ、フサリニン、アシネトフェリン、オルニバクチン、アンフィバクチン、マリノバクチン、アクアケリン、ミコバクチンおよびデスフェリオキサミンが挙げられる。カテコレート・シデロホアの限定なしの例としては、クリソバクチン、エンテロバクチン、スペルミジン基本のカテコール・シデロホア−カルバセファロスポリン（ＪＡＭ−２−２６３）、Ｎ５−アセチル−Ｎ５−ヒドロキシ−Ｌ−オルニチン・トリペプチドヒドロキサメートシデロホア−カルバセファロスポリン（ＥＫＤ−３−８８）、アゾトバクチン・デルタ、発色団内にカテコレート型基を含有し、そしてペプチド鎖と末端ヒドロキサメート基との中間にアルファ−ヒドロキシカルボン酸基を含有する天然の蛍光シデロホア、ＩＣ２０２Ａ（Ｉｉｊｉｍａら（１９９９年）Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）５２（１）巻：２５−８頁、およびＩｉｊｉｍａら（１９９９年）Ｊ  Ａｎｔｉｂｉｏｔ（Ｔｏｋｙｏ）５２（１）巻：２０−４頁に示されるとおりのブチリジンＮ−オキシド官能基を含有するフェリオキサミン関連化合物）、およびエクソケリンが挙げられる。フェノレート基本のシデロホアの限定なしの例としては、ピオケリン、およびアルカリジンＥが挙げられる。
【００２７】
シデロホアは、周知シデロホア構造分類と異なる化学構造も有しうる。この型の典型的なシデロホアは、イオン結合についてエチレンジアミンジカルボニルおよびα−ヒドロキシカルボニル官能基を含有するリゾブルム・メリオチ（Ｒｈｉｚｏｂｌｕｍ  ｍｅｌｉｏｔｉ）から単離されるシデロホアを含む（Ｓｍｉｔｈ  ＭＪ．およびＮｅｉｌａｎｄｓＪＢ．（１９８４年）Ｊ．Ｐｌａｎｔ  Ｎｕｔｒ．７巻：４４９−４５８頁）。人造の、または人工のシデロホアは、一般に、既知シデロホアのもの、およびシデロホアの組合せに基づいた化学構造を有する。典型的な人工ヒドロキサメートおよびカテコール分類のシデロホアは、例えば、Ｈｅｇｇｅｍａｎｎら（２００３年）、Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ、１６（４）巻：５３９−５１頁およびＳｌｏｍｅｚｙｎｓｋａら（２０００年）、Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ｓｃｉ．２３（３）巻：２６５−６頁で示され、そしてそれは参照してここに組み込まれる。人工的混合モノ−またはビスカテコレートヒドロキサメートは、例えば、Ｓｚａｒａｐｉｎｓｋａ−Ｋｗａｓｚｅｗｓｋａら、（２００３年）Ａｃｔａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｐｏｌ．５２（３）巻：２６１−９頁に示され、そしてそれは参照してここに組み込まれる。
【００２８】
シデロホアは、天然に発光するか、または化学的に修飾されて発光しうる。特に、ここに示される技術の種々の実施態様で有用なシデロホアは、蛍光シデロホアである。典型的な天然の蛍光シデロホアとしては、アゾトバクチン、ミコバクチン、アゾベルジン、ピロベルジンＰａＡ、シュードバクチンＢ１０、ピロベルジンＧＭ−ＩＩ、ピロベルジンＧ４Ａ、ピロベルジンＧ４Ｒまたはスクシノピロベルジンが挙げられる。典型的な化学的に修飾されたシデロホアとしては、７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル、Ｎ−メチルアントラニルまたは２−シアノナフト［２，３−ｃ］−２Ｈ−ピロリルデスフェリオキサミン、並びに７−（９’−アントラセニル）−５−オキソ−２−オキサ−６−アザヘプチル・フェリクロムが挙げられる。
【００２９】
シデロホアは、鉄（ＩＩＩ）、ガリウム（ＩＩＩ）、インジウム（ＩＩＩ）、アルミニウム（ＩＩＩ）、セリウム（ＩＩＩ）、イットリウム（ＩＩＩ）、ジルコニウム（ＩＶ）、チタン（ＩＶ）、および銅（ＩＩ）、亜鉛（ＩＩ）、タンタルム（Ｖ）のような１つまたはそれより多くの遷移金属陽イオンと配位結合する能力がありうる。ガリウムイオンについてのシデロホアの親和性は、一般に高い一方で、一価および二価陽イオンについてのそれらの親和性は、比較的低い（Ｆｏｌｓｃｈｗｅｉｌｌｅｒ  Ｎ、Ｇａｌｌａｙ  Ｊ、Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ｍ、Ａｂｄａｌｌａｈ  ＭＡ、Ｐａｔｔｕｓ  Ｆ、Ｓｃｈａｌｋ  ＩＪ．（２００２年）１２月１０日；４１（４９）巻；１４５９１−６０１頁；Ｗａｓｉｅｌｅｗｓｋｉら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００２年１０月１５日；４１（４１）巻；１２４８８−９７頁；Ｍｏｂｅｒｇら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００４年Ｃａｎ  １；７６（９）巻：２６１８−２２頁）。しかし、下にここで示されるとおり、銅（ＩＩ）遷移金属陽イオンと配位結合したシデロホアは、リン酸化ヒスチジンを含有する標的分子を検出および／または単離するのに有用でありうる。特定の遷移金属イオンと配位結合するシデロホアの能力を測定する方法は、当業者に周知であり、そして下にここで例示される。このような方法は、上に列挙されたもののような遷移金属陽イオン、並びにクロム、鉛、マンガン、カドミウム、スカンジウム、バナジウム、ルテニウム（ＩＩＩ）およびユーロピウム（ＩＩＩ）のような、選択シデロホアと配位結合する他の陽イオンの能力を測定するために使用されうる。
【００３０】
ここに示される特定の型のシデロホアは、デスフェリオキサミンである。デスフェリオキサミンは、患者の体から鉄を除去するために臨床で使用された。このような用途の間に、デスフェリオキサミンが体からアルミニウムも除去しうることが観察された。多様なデスフェリオキサミン形態が、例えば、デスフェラル（商標）、デスフェリオキサミン・メシレート塩、デフェロキサミン・メタンスルホン酸塩、７−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール・デスフェリオキサミンＢ、Ｎ−ヒドロキシデスフェリオキサミンＢを含めて市販で入手可能である。多様な修飾形態のデスフェリオキサミンが同定された。非アミド類似体、Ｃ末端修飾類似体、逆アミド類似体、およびハイブリット類似体を含めた人工的デスフェリオキサミンの作製は、例えば、Ｐｏｒｅｄｄｙら、Ｊ  Ｃｏｍｂ  Ｃｈｅｍ、（２００４年）６（２）巻：２３９−５４頁で記述され、そしてそれは、参照してここに組み込まれる。デスフェリオキサミン・ファミリー構成要素は、非常に関連した化学構造を有する場合、適切な遷移金属イオンと錯体形成されたあらゆるデスフェリオキサミン・ファミリー構成要素は、標的分子に選択的に結合する能力があることが認識される。ここで使用される場合、用語「デスフェリオキサミン」および「デスフェリオキサミン・ファミリー構成要素」は、そして上にここで示されるもののいずれか、および修飾形態がガリウム（ＩＩＩ）のような遷移金属陽イオンと配位結合する能力を保有する限り、既知デスフェリオキサミン分子のいずれかの修飾形態を含めた既知デスフェリオキサミン分子を意味する。
【００３１】
ここで使用される場合、用語「標的分子」は、捕捉因子が選択的に結合する分子を意味する。標的分子は、リン酸化部分、ニトロチロシン部分、硫酸部分またはそれの組合せを含有する。標的分子は、１つまたはそれより多くの他の分子に結合されうるか、または単独分子でありうる。選択的に結合することは、捕捉因子が１つまたはそれより多くのリン分子、ニトロチロシン含有分子、および／または硫酸化分子に結合するが、しかし非リン分子、非ニトロチロシン含有分子、または非硫酸化分子、または他の非関連分子に実質的に結合しないことを意味する。本発明の方法または市販用パッケージで使用される特定の捕捉因子が、同時にリン分子、ニトロチロシン含有分子、および硫酸化分子に、またはリン分子に選択的に、ニトロチロシン含有分子に選択的に、そして硫酸化分子に選択的に結合することを含めて、これらの型の分子のサブセットに選択的に結合する能力がありうることが分かる。実施例６は、リン分子、ニトロチロシン含有分子、および硫酸化分子に対して選択的結合を示すデスフェリオキサミン−ガリウム（ＩＩＩ）陽イオン捕捉因子を示す。
【００３２】
ここで使用される場合、用語「支持体」は、捕捉因子を含むために、捕捉因子を付着させうるか、または官能化されうる固形または半固形材料を意味する。例えば、支持体は、天然または合成の重合体、樹脂、金属またはシリケートでありうる。支持体は、ウイルス；ウイスル様粒子、例えばバクテリオファージ；細菌、例えばイー．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）；真核生物の細胞、例えば酵母、昆虫または哺乳類細胞のような生物学的材料でもありうる。
【００３３】
適切な支持体は、当業界で知られており、そして市販で入手可能であるセファロースのようなアガロース；例示的にカルボキシメチルセルロースを含めたセルロース；セファデックスのような市販で入手可能であるようなデキストラン；ポリアクリルアミド；ポリスチレン；ポリエチレングリコール；樹脂；シリケート；ジビニルベンゼン；メタクリレート；ポリメタクリレート；ガラス；セラミックス；紙；金属；メタロイド；ポリアクリロイルモルホリド；ポリアミド；ポリ（テトラフルオロエチレン）；ポリエチレン；ポリプロピレン；ポリ（４−メチルブテン）；ポリ（エチレン・テレフタレート）；レーヨン；ナイロン；ポリ（ビニルブチラート）；ポリビニリデンジフルオリド（ＰＶＤＦ）；シリコーン；ポリホルムアルデヒド；セルロースアセテート；ニトロセルロース；その混合物などが例示的に挙げられる。
【００３４】
本発明の方法に有用な支持体は、多様な物理的フォーマットを有することができ、そしてそれは、例えば、膜、カラム；ビーズ、ゲル、光ファイバー材料を含めた繊維、マトリックスおよびサンプル容器のような中空の固形、半固形の多孔または空隙含有粒子が挙げられうる。サンプル容器の限定なしの例としては、サンプルウエル、管、キャピラリー、バイアルおよびサンプルを保持する能力のある他のあらゆる器、溝または窪みが挙げられる。サンプル容器は、マイクロプレート、スライド、マイクロ流動体デバイスなどのような複数のサンプルプラットホーム上に含有されうる。捕捉因子が付着される粒子は、所望の粘度の溶液中に懸濁されたままである粒子、並びに所望の粘度の溶液中で十分に沈殿する粒子を含めて多様なサイズを示しうる。所望の場合、支持体は、検出および／または精製のために有用なタグのようなタグを含みうる。
【００３５】
ここで使用される場合、標的分子に関して使用される場合に用語「単離する」は、サンプル中の他の分子、物質または材料から標的分子を分離する作用を意味する。本発明の方法または市販用パッケージに有用な標的分子、捕捉因子、シデロホアまたは他の成分に関して使用される場合に用語「単離」は、成分が、ヒトの手によって作用されて、成分がサンプルまたは製品中でそれと結合されている他の分子、物質または材料を除去することを意味する。用語「単離」は、完全な純度を必要としないが、むしろ相対的語句として意図される。
【００３６】
ここで使用される場合、捕捉因子またはシデロホア−遷移金属イオン錯体と標的分子との間の相互作用または結合に関して使用される場合に、用語「選択的」は、非標的分子が捕捉因子またはシデロホア−遷移金属イオン錯体に実質的に結合しないことを意味する。
【００３７】
ここで示される場合、遷移金属陽イオンと配位結合したシデロホアを含有する捕捉因子は、標的分子に選択的に結合でき、そしてしたがって、標的分子を単離するのに有用でありうる。したがって、本発明は、サンプルから標的分子を単離する方法を提供する。その方法は、（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること；その因子が標的分子を結合して、標的分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および（ｂ）サンプルから標的分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルから標的分子を単離することを含む。標的分子は、例えばリン酸化分子、ニトロチロシン含有分子、硫酸化分子、またはリン酸化分子、ニトロチロシン含有分子および／または硫酸化分子の組合せを有する分子でありうる。サンプルは、溶液中にあるか、または支持体上に含まれうる。実施態様では、シデロホアは、原核生物のシデロホアおよび真菌のシデロホアのような天然に生じるシデロホアであり得て、そしてこのようなシデロホアのタグ付形態でありうる。
【００３８】
実施態様では、本発明の方法に使用される捕捉因子は、リン酸化分子に選択性がありうる。したがって、特定の実施態様では、本発明は、（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子がリン酸化分子と結合して、リン酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、（ｂ）サンプルからリン酸化分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルからリン酸化分子を単離することを含む、サンプルからリン酸化分子を単離する方法を提供する。
【００３９】
別の実施態様では、本発明の方法で使用される捕捉因子は、ニトロチロシン含有分子に選択性がありうる。したがって、別の特定の実施態様では、本発明は、（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子がニトロチロシン含有分子と結合して、ニトロチロシン含有分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、（ｂ）サンプルからニトロチロシン含有分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルからニトロチロシン含有分子を単離することを包含する、サンプルからニトロチロシン含有分子を単離する方法を提供する。
【００４０】
別の実施態様では、本発明の方法で使用される捕捉因子は、硫酸化分子に選択性がありうる。したがって、別の特定の実施態様では、本発明は、（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子が硫酸化分子と結合して、硫酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、（ｂ）サンプルから硫酸化分子−捕捉因子錯体を分離し、それによりサンプルから硫酸化分子を単離することを含む、サンプルから硫酸化分子を単離する方法を提供する。
【００４１】
ここで示される場合、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを含有する捕捉因子は、リン酸化分子、ニトロチロシン含有分子、および硫酸化分子のような標的分子を検出するために有用でありうる。したがって、本発明は、サンプル中の標的分子の存在を測定する方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子が標的分子を結合して、標的分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、（ｂ）標的分子−捕捉因子錯体を形成を検出し、それによりサンプル中の標的分子の存在を測定することを含む。
【００４２】
特定の実施態様では、本発明は、サンプル中のリン酸化分子の存在を測定する方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子がリン酸化分子を結合して、リン酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および（ｂ）リン酸化分子−捕捉因子錯体の形成を検出し、それによりサンプル中のリン酸化分子の存在を測定することを含む。
【００４３】
別の特定の実施態様では、本発明は、サンプル中のニトロチロシン含有分子の存在を測定する方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子がニトロチロシン含有分子を結合して、ニトロチロシン含有分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および（ｂ）ニトロチロシン含有分子−捕捉因子錯体の形成を検出し、それによりサンプル中のニトロチロシン含有分子の存在を測定することを含む。
【００４４】
別の特定の実施態様では、本発明は、サンプル中の硫酸化分子の存在を測定する方法を提供する。本発明の方法は、（ａ）サンプルを捕捉因子と接触させること、そしてその因子が硫酸化分子を結合して、硫酸化分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、その因子は、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含すること、および（ｂ）硫酸化分子−捕捉因子錯体の形成を検出し、それによりサンプル中の硫酸化分子の存在を測定することを含む。
【００４５】
標的分子は、ここに示される技術を使用して、多様な型のサンプルから単離および／または検出されうる。ここで使用される場合、用語「サンプル」は、標的分子を含むか、または含むことが推測される物質を意味する。標的分子を単離および／または検出するための本発明の方法に有用なサンプルは、液体または固体であり得て、液体中に溶解または懸濁され得て、エマルジョンまたはゲル中にあり得て、そして材料に結合されるか、またはその上に吸着されうる。サンプルは、生物学的サンプル、環境用サンプル、実験用サンプル、診断用サンプル、または標的分子を含むか、または含むことが推測される他のいずれかの型のサンプルでありうる。そのようなものとして、サンプルは、生物、臓器、組織、細胞、体液、生検サンプルまたはその分画でありうるか、または含みうる。
【００４６】
サンプルを、標的分子を保存または安定化させるために加工しうる。サンプル中の分子の完全性を保存する方法は、当業者に周知である。このような方法は、適切な緩衝液、および／またはサンプル中の分子における変化を保存または最小限にするヌクレアーゼ、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤を含めた阻害剤の使用を含む。このような阻害剤としては、例えば、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレングリコールビス（Ｐ−アミノエチルエーテル）Ｎ，Ｎ，Ｎ１，Ｎ１−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）のようなキレート剤、フッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ）、アプロチニン、リューペプチン、アンチペインなどのプロテアーゼ阻害剤、およびホスフェート、フッ化ナトリウム、バナデートなどのようなホスファターゼ阻害剤が挙げられる。分子の間の選択的相互作用を可能にするための適切な緩衝液および条件としては、当業界で周知であり、そして例えば、特徴付けられるべきサンプル中の分子の型に基づいて、変えられうる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（補追４７）、ジョン・ウイリー・アンド・サンズ、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９９年）；ＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅ、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・プレス（１９９９年）；Ｔｌｅｔｚ、Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３版、ＢｕｒｔｉｓおよびＡｓｈｗｏｏｄ編、ダブリュ．ビー．サウンダーズ（Ｗ．Ｂ．Ｓａｕｎｄｅｒｓ）、フィラデルフィア（Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ）（１９９９年）を参照）。サンプルは、干渉物質の存在を減少させ、および／または捕捉因子へのサンプル成分の非選択的結合を減少させるためにも加工しうる。例えば、非選択的に捕捉因子に結合する酸性ポリペプチドの傾向は、ポリペプチドサンプルのメチルエステル化により減少されうる（Ｆｉｃａｒｒｏら、２００２年；Ｂｒｉｌｌら、２００４年）。
【００４７】
流動体サンプルまたは細胞抽出物を分画する種々の方法は、当業者に周知であり、そして、イオン交換、疎水性および逆相、サイズ排出、親和性、疎水性充満誘電クロマトグラフィーなどのような細胞下画分またはクロマトグラフィー技術が挙げられる（Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、１９９９年；Ｓｃｏｐｅｓ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ、３版、シュプリンガー−ベルラーグ、ニューヨーク（１９９３年）；ＢｕｒｔｏｎおよびＨａｒｄｉｎｇ、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ、Ａ８１４巻：７１−８１頁（１９９８年））。
【００４８】
本発明の方法によって検出、単離または別の方法では作用された標的分子は、その分子がここに示されるとおり捕捉因子に結合する能力のある限り、多様な構造上および物理化学的特性を有しうる。標的分子としては、リン酸化分子、ニトロチロシン含有分子、硫酸化分子、および類似、擬態または修飾形態のリン酸化部分、ニトロチロシン部分および硫酸化部分を有する分子が挙げられる。
【００４９】
実施態様では、本発明の方法および組成物は、リン酸化分子を検出および単離するのに有用である。分子上のリン酸化部分は、その分子自身の共有結合修飾であり得て、そして標的分子に非共有結合で結合される分子上のリン酸化部分でありうる。標的分子上のリン酸化部分は、天然に生じるか、または非生理学的でありうる。多様な分子を、天然および／または非生理学的条件下でリン酸化されうる。このような分子の限定なしの例としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、脂質および炭水化物が挙げられる。
【００５０】
特定の実施態様では、本発明の方法を使用して検出および／または単離されるリン酸化分子は、リン酸化ポリペプチドである。ポリペプチドに非共有結合で結合し、そしてリン酸化部分を有する分子の例としては、ヌクレオチド３リン酸、ヌクレオチド２リン酸およびホスホイノシチドが挙げられる。リン酸化分子の例としては、セリン、トレオニン、チロシン、１−ホスホヒスチジン、３−ホスホヒスチジン、ホスホアスパラギン酸、ホスホグルタミン酸、Ｎイプシロン−ホスホリジン、デルタ−Ｏ−ホスホヒドロキシリジン、Ｎオメガ−ホスホアルギニンおよびホスホシステインのようなリン酸化アミノ酸が挙げられる。非生理学的リン酸化部分の例としては、チオリン酸化部分、Ｏ−ボラノリン酸化部分、Ｏ−ジチオリン酸化部分、並びにホスホアミド、Ｈ−ホスホネート、アルキルホスホネート、ホスホロチオレート、ホスホジチオレート、ホスホロフルオリデートなどが挙げられる。
【００５１】
実施態様では、本発明の方法および組成物は、ニトロチロシン含有分子を検出および単離するのに有用である。標的分子上のニトロチロシン部分は、その分子自身の共有結合修飾であり得て、そして標的分子に非共有結合で結合される分子上のニトロチロシン部分でありうる。いずれの標的分子上のニトロチロシン部分も、天然に生じるか、または非生理学的でありうる。実施態様では、本発明の方法は、ニトロチロシン含有ポリペプチドを検出するために使用されうる。その方法は、特定の細胞条件下でニトロチロシンを含有することが知られているか、または推測されるもののような特定のニトロチロシン含有ポリペプチドを検出するために、並びに特徴付けられていないニトロチロシン含有ペプチドを検出するために使用されうる。
【００５２】
実施態様では、本発明の方法および組成物は、硫酸化分子を検出および単離するのに有用である。分子上の硫酸化部分は、その分子自身の共有結合修飾であり得て、そして標的分子に非共有結合で結合される分子上の硫酸化部分でありうる。硫酸化グルコサミニグルカンを含めた膨大な非常に荷電された硫酸化分子は、自然に存在することが知られており、そして興味深い生理学上の役割を保有することが分かっている。ヒト病原性ミコバクテリアを含めた数種のミコバクテリアは、細菌性病原体発生で役割を有することが推測される、糖脂質およびグルコペプチド脂質のような硫酸化化合物を産生することが知られている。硫酸化サッカライド、細菌性代謝産物および真核生物の分子を含めた他の硫酸化分子は、ここで記述される方法によって検出および単離されうる。
【００５３】
いずれかの標的分子上の硫酸化部分は、天然に生じうるか、または非生理学的でありうる。実施態様では、本発明の方法は、硫酸化グリコサミノグルカン、硫酸化脂質、硫酸化グリコペプチド脂質、硫酸化サッカライドおよび硫酸化ポリペプチドを検出するために使用されうる。グリコサミノグルカンの特定の例は、ヘパリンである。
【００５４】
本発明の方法および組成物に有用な捕捉因子は、１つまたはそれより多くの遷移金属陽イオンと配位結合で結合したシデロホアを含有する。捕捉因子は、所望の場合、同じ型のシデロホアの１つより多くおよび２つまたはそれより多くの異なるシデロホアを含めた１つより多くのシデロホアを含有しうる。捕捉因子は、支持体、タグ、または望ましい手段で捕捉タグの物理的特性を変える他の構成要素も含みうる。例えば、捕捉因子は、それを単離または検出させ、それの疎水性または溶解性特徴を変え、それの安定性を改善し、それの荷電または質量を変える構成要素などを含みうる。
【００５５】
捕捉因子中に存在するシデロホアは、特定の条件下で１つまたはそれより多くの特定の型の標的分子に結合するそれの能力に基づいて選択されうる。実施例６に示されるとおり、ガリウム（ＩＩＩ）陽イオンと配位結合したデスフェリオキサミン・シデロホアは、リン酸化標的分子、ニトロチロシン含有標的分子および硫酸化標的分子を検出または単離するのに有用でありうる。したがって、実施態様では、捕捉因子は、デスフェリオキサミンのようなデスフェリオキサミン・ファミリーのシデロホアを含有する。特定の実施態様では、デスフェリオキサミンは、ガリウム（ＩＩＩ）陽イオンと錯体を形成させる。別の実施態様では、捕捉因子は、ピロベルジン・ファミリーのシデロホアのような混合カテコレート−ヒドロキサメート・シデロホアを含有する。特定の実施態様では、ピロベルジン・ファミリーのシデロホアは、アゾトバクチン、ミコバクチン、ピロベルジンＰａＡ、シュードバクチンＢ１０、アゾベルジン、ピロベルジンＧＭ−ＩＩ、ピロベルジンＧ４Ａ、ピロベルジンＧ４Ｒ、およびスクシノピロベルジンから選択されうる。Ａ１２。実施態様では、シデロホアは、デスフェリオキサミン・ファミリーのシデロホアおよびフェリクロム・ファミリーのシデロホアのようなヒドロキサメート・シデロホアである。特定のフェリクロム・ファミリーのシデロホアは、フェリクロムである。実施態様では、シデロホアは、脂質溶解性である。特定の実施態様では、脂質溶解性のシデロホアは、エクソケリンのシデロホアである。さらに別の実施態様では、シデロホアは、フェリクロム、フェリルビン、シゾキネン、ロドトルリック酸（ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌｉｃ  ａｃｉｄ）、トリアセチルフサリニン、フェリクロシン、エクソケリン、ビシバクチンダイマー酸、アセチルダイマー酸、アルカルギンＥ、ピオケリン、コプロゲンＢ、メチルコプロゲンＢ、フサリニン、アシネトフェリン、オルニバクチン、アンフィバクチン、マリノバクチン、アクアケリン、ミコバクチン、クリソバクチン、セパバクチン、ピロベルジン、エンテロバクチン、カルバセファロスポリンＪＡＭ−２−２６３、カルバセファロスポリンＥＫＤ−３−８８およびアゾトバクチンの群から選択される。
【００５６】
錯体銅（ＩＩ）イオンと配位結合したシデロホアを含む捕捉因子は、リン酸化ヒスチジン残基を含有する分子の選択的検出および／または単離のために使用されうる。この目的のために有用な典型的なシデロホアとしては、銅（ＩＩ）陽イオンをキレート化するシゾキネンおよびフェリオキサミンＢが挙げられる（ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＭｏｒｅｌ、Ｌｉｍｉｎｏｌ．Ｏｃｅａｎｏｇｒ、１９７９年、２４巻；８２３−８３７頁；ＭｃＫｎｉｇｈｔら、Ｌｉｍｉｎｏｌ．Ｏｃｅａｎｏｇｒ．１９８０年、２５巻：６２−７１１１９８０；Ａｒｃｅｎｅａｕｘら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８４年Ｃａｎ；２５（５）巻：６５０−２頁；Ｃｌａｒｋｅら、Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９８７年Ｃａｎ；５３（５）巻：９１７−２２頁）。Ｎａｐｐｅｒら、Ａｎａｌ  Ｃｈｅｍ．２００３年４月１日；７５（７）巻：１７４１−７頁で示されるとおり、ＺｉｐＴｉｐＭＣピペットチップを用いて、リン酸化ヒスチジン含有ペプチドを単離しうる。ホスフェート−ヒスチジン連結は、酸不安定性であり、したがって、実験条件下で保存するのが困難である可能性があるので、中性ｐＨ値での配位金属イオンは、ＩＭＡＣ手段で利用される従来の有機キレート剤に比べて、ヒスチジン−リン酸化ペプチドおよびタンパク質の単離および検出について有利なものである。銅（ＩＩ）で配位結合された蛍光部分−標識シデロホアのための手段の例として、マイクロアレイ上のホスホヒスチジン含有およびホスホモノエステル含有ペプチドの間を区別するために、ガリウム（ＩＩＩ）で配位結合されたシアニン５染料標識シデロホアとの組合せで使用されうる。タンパク質またはペプチド一次アミン残基に対する結合を通して、非特異的標識化を最小限にするために、シアニン染料の未スルホン化版を、この用途に使用しうる。銅（ＩＩ）は、所定のシデロホアを急冷できるが、この急冷は、一般に、鉄（ＩＩＩ）自身によって発生されるものより小さな規模の次元である。したがって、本発明の実施態様では、銅（ＩＩ）陽イオンで配位結合したシデロホアは、リン酸化ヒスチジン含有分子を検出または単離するために使用されうる。
【００５７】
実施態様では、本発明の方法は、エクソケリン・シデロホアを含有する捕捉因子を使用する。エクソケリンは、脂質溶解性であり、したがって細胞に入ることができるミコバクテリウム・ツーバキローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のヒドロキサメート分類のシデロホアである（ＤｏｎｇおよびＭｉｌｌｅｒ、２００２年、Ｊ  Ｏｒｇ  Ｃｈｅｍ．７月１２日；６７（１４）巻：４７５９−７０頁）。脂質溶解性エクソケリンは、相−分画手段によって、親水性ホスホペプチドの単離に適切なシデロホアである。ホスホペプチドが、陽イオン荷電シデロホアに錯体形成されるとき、生じる錯体の疎水性は、ホスホペプチド単独、並びに未結合非リン酸化ペプチドのものより大きい。疎水性に基づいた２相抽出系では、これは、いっそう疎水性の相にさせ、そしてその系における原料ペプチドから離れさせるべきホスホペプチドを生じる。連続して、疎水性相を取り出し、そして新鮮な水相と混合する。その後、エクソケリンからホスホペプチドを溶出させ、そして水相でのそれらの連続的回収を有効にするために、フェニルホスフェートまたは２−（チオフェン−３−イルエチル）ホスホン酸のような親油性リン酸化化合物を添加しうる。ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子を検出および／または単離する類似の方法を行いうる。
【００５８】
本発明の方法、組成物または市販用パッケージに有用な捕捉因子をタグ付けしうる。タグは、捕捉因子のシデロホア部分、捕捉因子の遷移金属陽イオン部分、または両方の部分に存在しうる。捕捉因子は、所望の場合、１つより多くのタグを含有しうる。１つの型のタグは、ビオチン、ジグオキシゲニン、２，４−ジニトロフェノール、２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、４−エトキシメチレン−２−フェニル−２−オキサゾリン−５−オン、および５−ベンズイミダゾールカルボン酸のようなハプテンである。例えば、ビオチン標識捕捉因子の場合には、標的分子−ビオチン−標識捕捉因子の形成を、検出可能なアビジンまたはストレプトアビジンを使用して検出しうる。実施態様では、捕捉因子のシデロホア部分をタグ付にする。特定の実施態様では、タグは、上に列挙されるハプテンのようなハプテンである。別の型のタグは、蛍光、ルミネッセンスおよびリン光のような物理化学的特性により検出可能であるか、または例えば、酵素のようなそれの官能性活性により検出可能にされうるポリペプチドである。特定の型のポリペプチド・タグは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、およびベータ−グルクロニダーゼのような酵素である。例として、捕捉因子を、西洋ワサビペルオキシダーゼでタグ付けしうる。標的分子−捕捉因子錯体の形成により、その後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基本の色素原法、３，３’−ジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド（ＤＡＢ）基本の色素原法、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）基本の色素原法、アムプレックス・レッド染料基本の蛍光体法、増強ルミノール基本のケムルミネッセンス反応、遊離チロシルラジカルの電子常磁性共鳴基本の検出、ルミネッセンスの半導体結晶（クアンタム・ドット）またはチラミド信号増幅を含めて、西洋ワサビペルオキシダーゼを検出する広範な周知方法のいずれかを使用して、検出を行いうる。このような検出方法は、既知および検出可能な基質を有するいずれかの酵素に適している。別の特定の型のポリペプチド・タグは、光タンパク質である。ここで使用される場合、用語「光タンパク質」は、光を発散する能力のあるポリペプチドを意味する。本発明の方法で有用な光タンパク質タグは、天然に生じるか、または人造でありうる。典型的な光タンパク質は、蛍光ポリペプチドである。フィコビリタンパク質、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、オベリン、アクオリンおよびホチナ（Ｐｈｏｔｉｎａ）（商標）、およびそれの変異体のような蛍光ポリペプチドは、標的分子−捕捉因子錯体中に存在するときに検出されうる。捕捉因子に対する光タンパク質の付着を、化学的に、非共有結合で、および標準分子生物学融合タグ付けアプローチ法により行いうる。
【００５９】
ここに示される方法で使用されうる別の型のタグは、発光部分、蛍光部分、放射活性部分などのような検出可能な部分；ポリヒスチジン、フラグ、ｍｙｃおよびＧＳＴタグのような精製タグ；ポリヌクレオチドタグ、アプタマー、タンパク質核酸；ファージのような生物学的タグ；抗体および抗体様タグ；定義されたサイズの粒子、例えば、金属ビーズおよびナノ粒子タグなどのような大量タグが挙げられる。実施態様では、標的分子を単離する本発明の方法、および標的分子を検出するための本発明の方法は、検出可能な部分でタグ付けされたシデロホアを使用できる。検出可能な部分は、例えば、蛍光部分でありうる。特定の実施態様では、シデロホアは、デスフェリオキサミンである。デスフェリオキサミンは、フルオレッセン、ロダミン、７−ニトロ−２，１，３−ベンゾキサジアゾール−４−イル、Ｎ−メチルアントラニルおよび２−シアノナフト［２，３−ｃ］−２Ｈ−ピロリルのような部分を含有できる。別の特定の実施態様では、シデロホアは、フェリクロムである。フェリクロムは、フルオレッセン、ロダミン、および７−（９’−アントラセニル）−５−オキソ−２−オキサ−６−アザヘプチルのような部分を含有できる。
【００６０】
タグは、多様な周知化学的および生合成法を使用して、捕捉因子、サンプルまたはそれの一部または成分に付着されうる。使用される特定の手段は、タグが付着される捕捉因子またはサンプルの一部、および選択されるタグの物理化学的特性による。捕捉因子に関する例としては、タグに捕捉因子を付着させるために連続して使用されうるＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、インドアセタミドおよびマレイミドのような反応性基を作り出すために、二官能性架橋因子を、例えば、捕捉因子のシデロホア部分で、捕捉因子に組み込みうる。
【００６１】
本発明の方法、組成物および市販用パッケージの実施態様では、捕捉因子は、支持体に付着させつつ、標的分子に現れされうる。代わりに、支持体が、捕捉因子に選択的に付着する能力がある限り、支持体は、捕捉因子が標的分子に表される間または後に供されうる。したがって、捕捉因子を付着する支持体は、本発明の方法を実施しつつ、あらゆる従来の点で供給されうる。
【００６２】
標的分子を結合する利用可能な遷移金属陽イオンを遊離させつつ、それを支持体に付着させるために、捕捉因子またはそれの部分と相互に作用する能力のある多様な周知の官能基を使用して、捕捉因子を、支持体に付着させうる。所定の場合には、標的分子は、遷移金属陽イオンとシデロホアの両方に結合して、標的分子−捕捉因子錯体を形成することが分かる。サンプルは、このような周知官能基を使用して、支持体にも付着されうる。官能基の例示的な例としては、アルキル、Ｓｉ−ＯＨ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシル、アミド、アミン、アミノ、エーテル、エステル、エポキシド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、スルフヒドリル、ジスルフィド、オキシド、ジアゾ、ヨウ素、スルホン酸または化学的または強力な化学的反応性を有する類似の基が挙げられる。
【００６３】
本発明の方法または市販用パッケージに有用なシデロホア遷移金属陽イオン錯体を、所望の特徴を有する錯体を得るために、多様な条件下で製造しうる。１つの特徴は、選択された特定の金属陽イオンである。シデロホアと錯体を形成する特定の金属陽イオンの能力を測定する方法は、当業者に周知であり、そして下にここで具体化される。別の特徴は、シデロホア−遷移金属陽イオン化学量論である。シデロホア／金属陽イオン化学量論での変動の例は、以下のとおりである。アルカリギンおよびビスカベリンは、酸性ｐＨ値で１対１第二鉄イオン／シデロホア錯体を形成することが知られているが、しかし中性よりわずかに上のｐＨ値では２対３の錯体を形成することが知られている（Ｈｏｕら、Ｉｎｏｒｇ  Ｃｈｅｍ、１９９８年１２月２８日；３７（２６）巻：６６３０−６６３７頁）。均等に高いｐＨ値では、２対２の錯体が形成する。クリソバクチンは、第二鉄イオンの１対１未満の配位を示し、そして水性溶液中の化学量論も、溶液ｐＨによって変化する（ＰｅｒｓｍａｒｋおよびＮｅｉｌａｎｄｓ、Ｂｉｏｍｅｔａｌｓ、１９９２年春号；５（１）巻：２９−３６頁）。実施態様では、シデロホア−遷移金属陽イオン。
【００６４】
シデロホア遷移金属陽イオン錯体の別の特徴は、遷移金属陽イオン上の配位部位で存在する１つまたはそれより多くのリガンドの不在の存在（ｐｒｅｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｂｓｅｎｃｅ）である。例として、遷移金属陽イオンは、不安定なアコリガンドによって占められ、そしてリン酸化分子のリン酸部分のような、標的分子の一部による置換が容易にできる１つまたはそれより多くの部位を有することができる。
【００６５】
リン酸化分子、ニトロチロシン含有分子、硫酸化分子、またはこれらの広範なカテゴリーの標的分子の内の種のような、特定の型の標的分子と共に使用するためのシデロホア遷移金属陽イオン錯体の選択は、一般に、ここに開示される手段を使用して、並びに慣例的な方法を使用することによって、経験的に決定されうる。
【００６６】
ここに示される方法は、捕捉因子を標的分子に結合させて、標的分子−捕捉因子錯体を形成できる条件下で行われる。捕捉因子は、一般に、典型的なタンパク質相互作用アッセイ条件下で標的分子に結合する。このような条件は、当業者に周知であり、そして一般に、おおよそ生理学的に塩濃度、緩衝剤、および４−３７℃の範囲内にある温度を含む。選択された捕捉因子については、サンプルを、特化されたｐＨまたは塩濃度のような特化された特徴を示す溶液または環境に調節または置かれうる。所望の場合、標的分子に選択的に結合する捕捉因子の能力を、無機塩、アルコール、洗剤および界面活性剤のようなサンプル成分の存在下で改善、増強および／または安定化しうる。本発明の方法の実施態様では、捕捉因子を、遷移金属塩の陰イオン成分の不在下、または塩化ナトリウムまたは緩衝イオン強度を増大させる目的のために添加される他の塩の不在下のような、塩の不在下でサンプルと接触させる。別の実施態様では、捕捉因子を、約ｐＨ７のような、約６から８までの中性ｐＨでのような、酸の不在下でサンプルと接触させる。本発明の所定の実施態様では、本発明の方法を使用して単離および／または検出される標的分子は、サンプル溶液中に含まれる。本発明の他の実施態様では、標的分子は、支持体を含む。所望の場合、１つまたはそれより多くの型の標的分子は、支持体上に存在しうる一方で、他の型は、溶液中に存在する。標的分子を支持体に付着させる方法は、下にここで示される。
【００６７】
ここに示される方法は、サンプルから標的分子−捕捉因子錯体を分離すること、それによりサンプルから標的分子を単離することを含みうる。標的分子−捕捉因子錯体の分離は、多様な周知方法によって達成されうる。所定の実施態様では、捕捉因子および／またはサンプル（すなわち、サンプル中に含まれる標的分子）を、支持体に付着しうる。標的分子−捕捉因子錯体の一部を支持体に付着させた場合、分離は、支持体から液相を除去することによって、および／または支持体を洗浄して、支持体から液相、ゲル、コロイドまたは他の型の非液相を除去することによって行われうる。代わりに、分離は、抗体、リガンド、受容体、抗原、相補的配列などのような、標的分子−捕捉因子錯体内のエピトープに選択的に結合する結合相手を使用して、標的分子−捕捉因子錯体またはその一部を収集することによって行われる。
【００６８】
ここに示される方法は、サンプル中の標的分子の存在を検出するために、標的分子−捕捉因子錯体の形成を検出することを含みうる。分子実体の間の相互作用を検出するための手段は、当業者に周知である。このような検出手段は、一般に、相互作用実体の内の少なくとも１つで物理化学的変化を検出すること、または他の実体の存在が知られているときに相互作用実体の内の１つの存在を検出することを含む。標的分子−捕捉因子錯体またはその一部は、物理化学的特性を観察することによって、並びに官能活性を観察することによって検出されうる。所望の場合、質量、蛍光吸収、放出、エネルギー移動、偏光、異方性などのような物理化学的特性が、標的分子−捕捉因子錯体の化学的修飾なしに観察されうる。代わりに、錯体またはその一部を、物理化学的特性の検出を促進するある種の型の化学的修飾にかけうる。相互作用許容性、酵素的活性などのような官能特性は、標的分子−捕捉因子錯体またはその一部を、抗体、抗原、受容体、リガンド、コファクター、サブユニット、相補的配列、基質などのような適切な結合相手と接触させることによって観察されうる。
【００６９】
分子錯体およびその成分を検出する典型的な周知方法としては、吸収、伝達、質量、荷電対質量比、蛍光強度、蛍光偏光、時間決定蛍光、共鳴光散乱、表面増強ラマン散乱、電子常磁性共鳴、屈折率吸収、核磁性共鳴、微量熱量測定法、表面プラズモン共鳴、屈折率変動、分光偏光測定法、偏光解析法；および誘導結合プラズマ質量分光測定法、フーリエ変換赤外線分光測定法、および原子吸着分光測定法によって測定可能なもののような多様な分光特徴の測定が挙げられる。
【００７０】
標的分子−捕捉因子錯体中に含まれる（またはそれから連続的に分離される）捕捉因子または標的分子が、発光または染料成分を含有する場合、検出は、ＵＶトランスイルミネータ上での目視観察により、またはＵＶ基本ＣＣＤカメラ検出システム、レーザー基本ゲルスキャナー、キセノン−アーク基本ＣＣＤカメラ検出システム、ＵＶトランスイルミネータと合わせたポラロイドカメラ、並びにルミネッセンスを検出ために使用される多様な他のデバイスを使用することによって可能である。
【００７１】
標的分子−捕捉因子錯体に付着した捕捉因子を検出する限定なしの例として、共鳴光散乱（ＲＬＳ）粒子を、検出可能なタグとして使用しうる（例えば、ＹｇｕｅｒａｂｉｄｅおよびＹｇｕｅｒａｂｉｄｅ、２００１年、Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｕｐｐｌ．補追３７巻：７１−８１頁を参照）。例えば、およそ４０と１２０ｎｍ直径の間の範囲に入る均質寸法の球状金および銀ＲＬＳナノ粒子は、例えば、細口ビームの白色光で照らされたときに、単色の分散光を発生する。単独ＲＬＳナノ粒子によって発生される分散光信号は、従来の小型分子発蛍光団について得られる信号よりおよそ１０4から１０8倍大きく、そして暗視野照明によって比較的容易に検出される。個々のＲＬＳ粒子によって発生される分散光の強度および色は、光安定性であり、そして粒子の組成および直径に依存する。ＲＬＳ粒子の表面は、分析的アッセイでの特別の結合を誘導する多様な官能性で誘導されうる。マイクロアレイ、免疫細胞学／組織学、インサイチューハイブリダイゼーション、マイクロタイター・ウエルアッセイについての感受性ＲＬＳ試薬および計器測定システム、およびＲＬＳ技術によるマイクロアレイにおけるポリペプチドまたはペプチド、金または銀ナノ粒子を、シデロホアで被覆し、そしてその後、適切な遷移金属陽イオンで荷電する。粒子を、マイクロアレイ表面上でインキュベートし、そして過剰の粒子を洗い流す。結合粒子を、共鳴光散乱によって検出し、したがって、リン酸化標的を、アレイ上の信号の配位に基づいて同定する。
【００７２】
質量分光測定法を含めた検出手段を、標的分子−捕捉因子錯体を検出するために使用しうる。例えば、オンラインキャピラリー液体クロマトグラフィー−電子スプレー質量分光測定法およびタンデム質量分光測定法は、プロフェリオキサミンＤ２、Ｅ、Ｇ１、Ｇ２、Ｘ１およびＸ２を含めた、火傷病病原体エルウィニア・アミロボラ（Ｅｒｗｉｎｉａ  ａｍｙｌｏｖｏｒａ）のシデロホアを同定および特徴付けするために使用されてきた（Ｇｏｔｔｆｒｉｅｄら、（２００５年）Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ２８（３）巻：１６３−１７５頁）。当業者は、標的分子−捕捉因子錯体中に存在するか、そこから放出されるシデロホアを検出する類似の手段を行うことができる。
【００７３】
種々の型の近接アッセイを、標的分子−捕捉因子錯体を検出するために使用しうる。このような近接アッセイとしては、例えば、シンチレーション近接アッセイ、アルファスクリーン（商標）アッセイ、イータグ（商標）アッセイ（アシアラ・バイオサイエンシズ（Ａｃｉａｒａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、カリフォルニア州マウンテン・ビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ））などが挙げられる。アッセイ設計の当業者は、標的分子−捕捉因子錯体の形成を検出する近接アッセイを使用することが十分にできる。
【００７４】
本発明は、その因子が、標的分子を結合して、標的分子−捕捉因子錯体を形成する能力がある条件下で、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含する捕捉因子、（ｉｉ）一重状態に酸素を活性化させる能力のある光増感剤に連結した標的分子結合相手、および（ｉｉｉ）一重状態の酸素と反応する能力のある化学発光化合物と接触させること；サンプルに光をあてて、それにより光増感剤が励起状態になること；および発光が、サンプル中に標的分子の存在または不在を示すものであるサンプルから発光を検出することを含む方法を提供する。実施態様では、標的分子結合相手は、抗体である。捕捉因子は、標的分子に結合する一方で、捕捉因子結合相手は、その標的分子の異なる部分に結合する。
【００７５】
標的分子−捕捉因子錯体を検出する手段の別の例は、下にここで示される。実施例１は、標的分子の蛍光検出を示す。実施例２は、標的分子の蛍光共鳴エネルギー移動検出を示す。実施例３は、捕捉因子中に含まれるシデロホアと結合した遷移金属イオンを検出することに基づいて、標的分子の元素分析検出を示す。この実施例は、ＩＣＰ−ＭＳに焦点を置くが、多様な元素分析アプローチが、捕捉因子またはその捕捉因子の一部に含まれる遷移金属イオンを検出するために使用されうることが分かる。
【００７６】
先の研究は、リンタンパク質を、セリンまたはトレオニンのリン酸エステルのアルカリ加水分解、カルシウムを用いた放出無機リン酸化物の沈殿、不溶性ホスホモリブデート錯体の形成、およびその後、メチル緑色、マラカイト緑色またはロダミンＢのような染料を用いた錯体の可視化を通して、ゲル中で選択的に検出しうることを示した（ＣｕｔｔｉｎｇおよびＲｏｔｈ、１９７３年、Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９７３年８月号；５４（２）巻：３８６−９４頁；Ｄｅｂｒｕｙｎｅ、１９８３年、Ａｎａｌ  ＢｉｏＣｈｅｍ．８月号；１３３（１）巻：１１０−５頁）。この染色手段は、明らかに複雑であり（７つの異なる試薬を含む）、そしてアルカリ加水分解は、ゲルを摂氏６５度まで加熱することを要求し、そしてそれは、ゲルマトリックスを相当に加水分解および膨張させる。ホスホチロシン残基は、アルカリ処理によって加水分解されず、このアミノ酸残基でリン酸化されたタンパク質は、その方法による検出を逃れる。実施例４で示される方法およびそれの変法を、リン酸化チロシン残基を有するリン酸化分子を検出するために使用しうる。
【００７７】
実施例４は、ポリアクリルアミドマトリックス内の標的分子を検出するための本発明の捕捉因子の使用を示す。この実施例は、シデロホアを支持体に付着させ、そしてその後、遷移金属陽イオンを導入することによって捕捉因子を作製することを示す。遷移金属陽イオンと配位結合したシデロホアも、支持体に付着されうることが分かる。さらに、当業者によって容易に決定されるとおり、類似の手段は、アガロースおよび他の型のゲル、膜、紙、プラスチック製粒子、繊維などのような多様なマトリックスを有する標的分子を検出するために使用されうることが分かる。
【００７８】
本発明は、ここに示される技術による方法を行うのに有用な市販用パッケージを提供する。本発明の市販用パッケージは、シデロホアおよび遷移金属陽イオンを包含する捕捉因子、またはそのような捕捉因子を形成するために有用な試薬を含有する。捕捉因子を形成するのに有用な試薬の例としては、遷移金属塩を含有する溶液または遷移金属塩のような１つまたはそれより多くの遷移金属陽イオン源と共に、実質的な金属陽イオン配位を欠くシデロホアが挙げられる。市販用パッケージは、所望の場合、２つまたはそれより多くのシデロホアおよび／または２つまたはそれより多くの遷移金属陽イオン源を含みうる。
【００７９】
本発明の市販用パッケージは、捕捉因子；シデロホアと遷移金属陽イオン；またはシデロホアと遷移金属塩に加えて、多様な成分を含有しうる。そのパッケージは、例えば、標的分子を単離するために捕捉因子を使用するための；標的分子を検出する捕捉因子を使用するための捕捉因子を作製するための１組の指示、または指示の組合せを含みうる。指示は、都合により、特定の用途で使用するためのシデロホアの濃度、またはサンプルに対するシデロホアまたは捕捉因子の比を考慮した推奨、並びに温度、緩衝液条件およびキンキュベーション期間に関する手引きを含みうる。本発明の市販用パッケージは、都合により、１つまたはそれより多くのタンパク質またはペプチド分画デバイス、標識ポリペプチド、蛍光染料、結合緩衝液、洗浄緩衝液、分子量基準、導電点基準、リン酸化基準、固定剤、染色、抗体、レクチン、アプタマー、ホスファターゼ基質、キナーゼ基質などのような他の構成要素を含みうる。当業者は、アッセイプロトコール、検出または単離のために使用される特定の捕捉因子、いったんアッセイが行われると使用されるべき測定の方法、消費者価格の点、配送および取扱い最適性などの設計としてこのような典型的因子に基づいて、本発明の市販用パッケージで含むための適切な構成要素を選択することができる。
【００８０】
本発明は、種々の市販用パッケージを提供する。ある市販用パッケージは、単離シデロホアおよび遷移金属塩を含有する。別の市販用パッケージは、単離シデロホアおよび遷移金属溶液を含有する。多様な単離シデロホアおよび遷移金属塩または溶液は、本発明の市販用パッケージ中に含まれうる。ある実施態様では、シデロホアを、支持体に付着させる。
【００８１】
本発明は、ここに示される方法を行うために有用な組成物を提供する。本発明の組成物は、例えば、ガリウム（ＩＩＩ）と錯体を形成したデスフェリオキサミンのような、１つまたはそれより多くの遷移金属陽イオンと配位結合したシデロホアを含みうる。このようなシデロホア−遷移金属陽イオン錯体を、支持体に付着させ、そしてシデロホアに加えて、リガンドを含有でき、そして所望の場合、タグを含みうる。
【００８２】
本発明は、ここに示されるとおり、標的分子を検出または単離するときに、使用するのに適した捕捉因子を同定する方法を提供する。その方法は、シデロホア−遷移金属陽イオン−錯体を、リン酸化部分と接触させること、そしてリン酸化部分に結合するその錯体の能力を測定し、それにより捕捉因子を同定することを含む。その方法は、さらに、シデロホアを、遷移金属陽イオンと接触させ、そして遷移金属陽イオンに結合するシデロホアが、シデロホア−遷移金属陽イオン−錯体として同定されるものである、遷移金属陽イオンに結合するシデロホアの能力を測定することを含む。
【００８３】
ある実施態様では、シデロホアを、検出可能な遷移金属陽イオン−結合物質の存在下で遷移金属陽イオンと接触させ、そして検出可能な遷移金属陽イオン−結合物質を置換して、シデロホア−遷移金属陽イオン錯体を形成するシデロホアの能力を測定する。シデロホア−遷移金属陽イオン−錯体を、例えば、検出可能なリン酸化部分と接触させうる。別の実施態様では、検出可能な部分の加水分解を検出することによって、リン酸化部分に結合する錯体の能力を測定する。特定の実施態様では、検出可能なリン酸化部分は、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルおよび４−ニトロフェニルホスホの群から選択される。
【００８４】
蛍光シデロホアが、第二鉄イオンと錯体を形成する場合、発光種の蛍光強度または最低収量が減少される（Ｐａｌａｎｃｈｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ  Ｉｎｏｒｇ  Ｃｈｅｍ、１９９９年４月；４（２）巻：１８８−９８頁）。例えば、未キレート化ピロベルジンの蛍光は、キノリン発色団から生じ、そしてそれは、ペプチド鎖に、そしてジカルボン酸またはジカルボン酸アミドに結合されるが、しかしＦｅ（ＩＩＩ）キレート化ピロベルジンは蛍光を発しない。急冷は、発蛍光団と第二鉄金属イオンとの間の基底状態の錯体の形成の間に起こると考えられる。憶測に捕らわれることを望むことなく、第二陽鉄イオンの常磁性特性が、システム間交差プロセスの増強による非放射性プロセスにおける励起状態エネルギーの消散を促進する傾向にあることは明らかである。遷移元素における常磁性は、ｄサブ軌道での不対電子の存在によって引き起される。他方、反磁性は、電子が全てｄ軌道で対になっている化合物の特徴である。反磁性ガリウム（ＩＩＩ）イオンは、しばしば、鉄含有生物分子中の第二鉄原子の機能性類似体として役割を果たし得て、そしてこの型の錯体は、それらの蛍光特性を保持する。
【００８５】
リン酸化分子に結合するシデロホア−遷移金属陽イオン錯体の能力を測定する典型的手段は、６，８−ジフルオロ−４−メチルウンベリフェリルホスフェート（ＤＩＦＭＵＰ）または４−ニトロフェニルホスフェート（４−ＮＰＰ）のような、蛍光性または発色性リン酸モノエステルまたはリン酸ジエステル含有基質の加水分解を監視することを含む（ＺｈａｎおよびＳｉｔｒｉｎ、２００１年）。金属陽イオンが、リガンド交換を通して、このようなリン酸化基質に密着して結合する場合、ホスホリル基は、ヒドロキシドイオンが活性化水分子であるような強力な吸核試薬とごく近傍になり、そしてホスフェート−酸素結合の金属イオンで触媒された切断、および検出可能な信号の発生に至る。このような基質は、発蛍光団および発色団遊離基の比較的低いｐＫａ値のため容易に切断されうる。多様な他の手段は、この型の情報を提供し、そして核磁性共鳴分光学および質量分光測定法基本のアプローチのような様々の基質または計器測定法を使用しうる（ＭｏｓｓおよびＲａｇｕｎａｔｈａｎ、１９９８年、Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８年、１８７１−１８７２頁）。
【００８６】
実質的に本発明の種々の実施態様の活性に影響しない修飾も、ここに供される本発明の定義内に含まれることが分かる。したがって、以下の実施例は、例示であって、本発明を限定しないことが意図される。
【実施例】
【００８７】
実施例１
捕捉因子を使用したリン酸化分子のプロファイル
本実施例は、マイクロアレイ・フォーマットにおける捕捉因子を用いてリン酸化分子をプロファイル化する手段を示す。
【００８８】
マイクロアレイに分配されるサンプル中に含まれるリン酸化分子を同定するために、リン酸化分子に選択性のある捕捉因子を使用する。本実施例で使用される捕捉因子は、検出可能な蛍光を示す。
【００８９】
アッセイは以下のとおり行われる。リン酸化分子についての結合相手を、マイクロアレイの表面にスポットとして固定する。結合相手は、例えば、抗体、ペプチド、アプタマーなどでありうる。スポットは、様々な結合相手を含みうるか、またはレプリケートスポットでありうる。結合相手に結合する能力のあるリン酸化分子を含むことが推測されるサンプルを、マイクロアレイ表面に塗布し、そしてマイクロアレイをインキュベートする。従来のマイクロアレイと同様に、インキュベーションは、カバーガラス下で、またはインキュベーション装置中で開放で行われうる。インキュベーション後、サンプルを、マイクロアレイから洗浄して、過剰および非選択的に結合した捕捉因子および他の分子を除去する。ホスフェートが、シデロホアの結合について競合し、そしてリン酸化標的分子に結合されるシデロホアの量を減少させうるので、リン酸緩衝生理食塩水のような無機ホスフェートを含有する緩衝液は、一般に避けられる。
【００９０】
結果のスポットは、リン酸化分子がサンプルとのインキュベーションの間に選択的にそれらに結合されたものであればなんでもと共に、結合相手を含有する。その後、中性の蛍光捕捉因子を含有する溶液を、マイクロアレイに塗布し、そしてマイクロアレイのスポットに存在する分子のリン酸化部分に選択的に与える。
【００９１】
従来の蛍光で標識されたマイクロアレイの検出のために典型的に使用される方法および器機を使用して、捕捉分子の蛍光検出を行う。例としては、蛍光部分の励起バンドを重複する波長を示す励起光のビームを、ビームスプリッター要素に向け、そしてそれは、対物レンズに励起ビームを向ける。レンズは、マイクロアレイ表面の小さな領域にビームの焦点を当てる。蛍光シデロホアが焦点に存在する場合、それらは、長波長で蛍光光を発光する。発光された蛍光灯の光の分画を、レンズによって捕捉し、ビームに形成する。ビームスプリッター装置は、光電子増倍管またはＣＣＤアレイのような検出器に蛍光灯の光の一部を通過させる。典型的には、発光フィルターを、検出器の前に置いて、シデロホア蛍光によって発生されないいずれの波長も遮断する。蛍光信号は、シデロホアの局所領域濃度、したがって、リン酸化残基の局所濃度に比例する。ある種の場合には、ｎ−オクタノールのような有機溶媒、または有機溶媒を含有する溶液を用いた洗浄段階の後にマイクロアレイを浴につける水性媒体の交換は、約１０倍またはそれより多くまで信号の蛍光強度を増大させうる。
【００９２】
要約すると、蛍光捕捉因子を、マイクロアレイ・フォーマットでリン酸化分子を検出するために使用しうる。
実施例２
捕捉因子を用いた酵素アッセイ
本実施例は、捕捉因子を用いて酵素活性を測定する手段を示す。
【００９３】
捕捉因子を、タンパク質キナーゼ、ホスファターゼおよびホスホジエステラーゼの活性のような酵素活性を検出するためのアッセイで使用しうる。例としては、タンパク質キナーゼによってリン酸化される場合、ペプチド基質は、それのリン酸化部分を通して蛍光捕捉因子に結合しうる。捕捉因子に対するリン酸化ペプチド基質のこの結合は、基質の可動性を減少させ、そして増大した蛍光偏光信号を生じる。代わりに、蛍光で標識されたペプチド基質を、類似の結果を得るために非蛍光捕捉因子と共に使用しうる。
【００９４】
別の型のアッセイでは、蛍光捕捉因子および特定のキナーゼについての蛍光標識ペプチド基質を、キナーゼを含有することが推測されるサンプルに添加する。キナーゼによってリン酸化されるペプチドは、捕捉因子に結合しうる。捕捉因子は、アゾバクチンのような蛍光シデロホアを含有し、そしてそれは、約３６５ｎｍで特に吸着し、そして約４５０ｎｍで発光する典型的な天然の蛍光シデロホアである。しかし、ペプチドそれ自身が、テキサス赤色染料で標識される場合、３６５ｎｍでのシデロホアの励起は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）のプロセスを通して６１３ｎｍの長波長に発光シフトを導く。発光シフトを検出することによって、捕捉因子に結合したリン酸化ペプチドの存在を検出しうる。類推によって、均一時間決定蛍光基本アッセイも作り出され、それによって、例えば、ユーロピウム基本のキレートを、キナーゼ基質ペプチドに固定させ、そして捕捉因子を、アロフィコシアニンのような蛍光タンパク質に付着させうる。ユーロピウムキレートは、３５０ｎｍで吸収し、そして捕捉因子で標識される蛍光タンパク質が、シデロホア上の遷移金属陽イオンとの、ペプチド上のリン酸化部分の相互作用を通して、ペプチドに密着して近接している場合、発光波長は、約６２０ｎｍから６６５ｎｍまで移行する。エネルギー移動は、供与体染料の発光と受容体染料の吸収との間の重複により、引用される実施例の各々で２つの蛍光部分の間に生じる。標識シデロホアは、ＦＲＥＴアッセイでの供与体または受容体のいずれかとして役割を果たしうる。ペプチドが累進的に脱リン酸化するとき、捕捉因子との標的ペプチド相互作用の損失を示すであろう発光長波長での信号の損失を監視することによって、キナーゼアッセイについて示されるのと同じ基本原理を使用して、ホスファターゼアッセイを行いうる。
【００９５】
要約すると、リン酸化分子の形成または破壊を、捕捉因子を使用して検出しうる。検出は、蛍光共鳴エネルギー移動、蛍光偏光などのような多様な蛍光方法を使用しうる。この一般的方法論は、ニトロチロシン含有分子および硫酸化分子のような他の型の標的分子に使用できることが分かる。
実施例３
元素分析アプローチと共に捕捉因子を使用した標的分子の検出
本実施例は、それらのシデロホアと結合した遷移金属イオンを検出することにより、捕捉因子に結合する標的分子を検出することを示す。
【００９６】
本実施例は、元素分析、すなわち電気誘導で結合したプラズマ質量分光学（ＩＣＰ−ＭＳ）についての１つの型の分析的アプローチを示す。ＩＣＰ−ＭＳを使用して、１０億当たり１部（ｐｐｂ）程度の少ない金属イオンを検出しうる。５，９８６エレクトロンボルトの第一イオン化電位を示すアルミニウムのイオン化交換は、ＷｉｌｂｕｒおよびＭｃＣｕｒｄｙ、２００１年でリンについて記述されているのと同一の稼動条件下で、９９％である。したがって、リンの代わりにＡｌ（ＩＩＩ）を検出するためのＷｉｌｂｕｒおよびＭｃＣｕｒｄｙ、２００１年で概説される手段に続いて、検出を１６倍改善する。さらに、金属の特定の検出は、検出窓を、サンプルバックグランドの信号から移動しうる。
【００９７】
バックグランドのために、電気誘導で結合したプラズマ質量分光測定法（ＩＣＰ−ＭＳ）は、環境的、生物学的、および医薬サンプルの微量元素分析に有用である。レーザーアブレーションＩＣＰ−ＭＳは、紫外線レーザビームの空間分解能を、近頃のＩＣＰ−ＭＳの質量分解能および元素感度と合わせることによって、微量元素分析を可能にする。１９３−２６６ｎｍの波長で通常に生成されるＵＶレーザー光を、サンプル表面上に焦点を合わせ、そしてサンプル除去を引き起す。１５−２０ミクロンの除去クレーターは、計器測定によりごく通常に発生される。特別のサンプル作製で、その手段を要求されるものはない。除去された材料を、高温誘導結合プラズマに直接的にアルゴン担体ガスで輸送し、そして得られたイオンを、その後、検出および計数のために質量分析器に引き込む。質量フィルターは、それらの荷電／質量比に基づいて粒子を選択し、その結果、特定のアイソトープのみがフィルターを通ることを許され、そして質量分析器（四重の磁性セクターまたは飛行時間型の計測手段）の末端に積載された電子増倍管検出器に入ることができる。個々のアイソトープの検出信号を、アイソトープ比に、または基準が未知のものと一緒に測定されるときには、実際の元素濃度に変換させうる。
【００９８】
標的分子−捕捉因子錯体のＩＣＰ−ＭＳ基本の検出を、以下の典型的手段によって行いうる。第一に、標的分子を、マイクロアレイに含まれる固定化結合相手（例えば、抗体、アプタマー、または標的に選択性のある他のいずれかの親和性分子）のスポットに結合させる。その後、アレイを、１つまたはそれより多くの捕捉因子とインキュベートする。次に、アレイを、５０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、５０ｍＭ塩化マグネシウムのような緩衝液で洗浄して、過剰の捕捉因子を除去する。アレイ上の個々のスポットを、例えば、（リンの信号よりむしろ）関連の金属信号を定量することを除いて、Ｍａｒｓｈａｌｌら、２００２年およびＷｉｎｄら、２００３年に記述されるものに類似の方法により、レーザーアブレーションＩＣＰ−ＭＳにかける。レーザーアブレーションＩＣＰ質量分析装置を用いた検出は、一般に、紫外線レーザーアブレーションビームを、通常には照準ビームの形態で、焦点レンズに向けることによって行いうる。レンズは、特定のマイクロアレイスポットでの高流動密度にビームを当てて、局所アブレーションを引き起しうる。それらがマイクロアレイから離れた担体ガスの流れによって運ばれるＩＣＰサンプル採取管中に除去分子を捕捉する。担体ガスは、一般に、除去にかけられるその領域の付近を満たす手段で提供される。担体ガスおよび除去分子を、分子がプラズマでイオン化され、続いて分光器で質量同定されるＩＣＰ質量分析器装置に運搬する。単独または多重スポット分析、直線走査またはラスタによって、サンプル採取を行いうる。
【００９９】
要約すると、標的分子−捕捉因子錯体またはそれのシデロホア−遷移金属陽イオン部分での元素分析を行うことによって、サンプル中の標的分子を、検出しうる。
実施例４
マトリックス中に存在する標的分子の検出
本実施例は、ポリアクリルアミドマトリックス内の標的分子を検出するための本発明の捕捉因子の用途を示す。
【０１００】
ポリアクリルアミドマトリックス中の標的ポリペプチドを検出するために、ポリペプチドサンプルを、標準手段によるＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳導により分離する。電気泳動の後、ゲルを、５０％メタノール、１０％酢酸のような酸およびアルコールを含有する固定剤溶液中でインキュベートする。その後、ゲルを脱イオン水で洗浄して、固定剤溶液を除去する。次に、ゲルを、温和に振とうさせながら（例えば、軌道振とう装置で〜５０ＲＰＭ）、少なくとも約２時間、蛍光捕捉因子を含有する溶液中でインキュベートする。蛍光捕捉因子を含有する溶液は、標的ポリペプチドとの相互作用を促進し、そしてサンプル内のゲルマトリックスまたは他の陰イオン巨大分子に対する非選択的結合を減少させるために、単独のアルコール、緩衝液、塩、酸およびそれの組合せを含有しうる。その後、ゲルを、脱イオン水または緩衝液で洗浄する。蛍光信号を観察するのに適した多様な方法を使用して、リンタンパク質のような標的ポリペプチドを、その後、検出しうる。ニトロセルロースまたはポリビニリデン２フッ化物膜のような重合体膜上の電気ブロットされた標的ポリペプチドを検出するときに、類似のアプローチを使用する。一般に、インキュベーション時間は、検出試薬に対するポリペプチドの優れた利用可能性により、移行膜についてはより短い。
【０１０１】
要約すると、捕捉因子は、ポリアクリルアミドゲルのようなマトリックスでの標的分子検出のために使用されうる。
実施例５
支持体に付着した捕捉因子の作製
本実施例は、プラスチック製ビーズ支持体に付着したデスフェリオキサミン捕捉因子の作製を示す。
【０１０２】
ガリウム（ＩＩＩ）陽イオンと錯体を形成したデスフェリオキサミンおよび鉄（ＩＩＩ）と錯体を形成したデスフェリオキサミンを作製するために、プラスチック製ビーズ支持体に付着した捕捉因子として、デスフェリオキサミンを、最初に、以下のとおりプラスチック製ビーズに付着させた：５ｍｇのデスフェリオキサミン、２５０μｌの原料アルファスクリーン（商標）受容体ビーズ（２０ｍｇ／ｍｌで）、６μｌのツイーン（商標）２０洗剤（水中で１０％で）、５０μｌのシアノ硼化水素ナトリウム（水中で２５ｍｇ／ｍｌで）および６９５μｌのＭＥＳ０．１Ｍ（ｐＨ６．０）を混合した。混合物を、曝気水浴中で、３７℃で一夜インキュベートした。翌朝、５０μｌのカルボキシメトキシアミン（水中で６５ｍｇ／ｍｌ（ｐＨ５）で）を添加し、そして混合物を、３７℃で１時間、インキュベートした。その後、ビーズを、遠心分離（１３，０００ｒｐｍで３０分）し、トリス緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８．０）で二回洗浄した。
【０１０３】
遷移金属陽イオンとのデスフェリオキサミンの錯体を形成するために、ビーズを、１００ｍＭガリウム（ＩＩＩ）または塩化鉄（ＩＩＩ）を含有するヘペス緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）中に再懸濁させた。インキュベーションの１時間後、ビーズを遠心分離し、ヘペス緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）で二回洗浄し、そしてヘペス緩衝液に再懸濁させた。超音波は、都合により、ビーズの凝集物を排除するために使用されうる。原料アルファスクリーン受容体ビーズは、パーキンエルマー（登録商標）（マサチューセッツ州ボストン（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ））から得られた。デスフェリオキサミン、シアノ硼化水素ナトリウム、カルボキシメトキシアミン、塩化ガリウム（ＩＩＩ）、塩化ナトリウムおよびツイーン（商標）２０は、シグマ−アルドリッチ（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））から得られた。ＭＥＳ，ＴＲＩＳおよびＨＥＰＥＳ緩衝塩は、ＩＣＮ（エムピー・バイオメディカルズ（ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）、カリフォルニア州アービン（Ｉｒｖｉｎｅ，ＣＡ））から得た。
実施例６
デスフェリオキサミン捕捉因子を使用した標的分子の単離および検出
本実施例は、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）−ガリウム（ＩＩＩ）陽イオン捕捉因子を使用してホスホペプチド、リン脂質、ニトロチロシン含有ペプチドおよび硫酸化ポリペプチドを単離および検出することを示す。
【０１０４】
標的分子に結合するデフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）−ガリウム（ＩＩＩ）陽イオン捕捉因子の能力を、アルファスクリーン（商標）アッセイを使用して確認した。これらのアッセイは、ビーズ基本の非放射活性の均一近接アッセイである。アルファスクリーン（商標）アッセイ法の説明について、例えば、Ｕｌｌｍａｎ  ＥＦら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ、９１巻：５４２６−５４３０頁（１９９４年）、米国第６，２５１，５８１号；第６，１６０，３５４号およびアルファスクリーン実施ガイト、パーキンエルマー，インク．（２００３年）を参照し、そしてその各々は、参照してここに組み込まれる。簡潔には、アッセイは、２つの型のビーズ、供与体ビーズおよび受容体ビーズを使用する。各ビーズ型は、化合物の様々の混合物を含有する。供与体ビーズは、周囲の酸素を、６８０ｎｍでの照射による一重状態の酸素である励起状態のＯ２に変換する光増感器を含有する。それの４マイクロ秒の半減期内で、一重状態の酸素は、溶液中でおよそ２００ｎｍ拡散しうる。受容体ビーズが、その近傍にあれば、エネルギーは、一重状態の酸素から、受容体ビーズとのチオキセン誘導体に移動され、連続して、５２０−６２０ｎｍでの光生成で頂点に達する。受容体ビーズの不在下で、一重状態の酸素は、基底状態に陥り、そして信号で生成されるものはない。供与体ビーズに対する受容体ビーズの近接は、それらに結合した分子の相互作用による。最も一般的なアルファスクリーンアッセイは、標的分子のような一方の結合相手を供与体ビーズ上に、そして標的分子結合相手のような他方の相手を受容体ビーズ上に捕捉することによって構築される。相手が相互作用するとき、化学的エネルギーを、供与体から受容体ビーズに移動させ、そして信号を生じる。代わりに、競合または切断アッセイは、信号減少として読み取られうる。供与体および受容体ビーズは、抗リン分子抗体のような抗体との接合体のような接合体として、そして非接合体形態でパーキンエルマー・エルエイエス・インク．（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  ＬＡＳ，Ｉｎｃ．）（マサチューセッツ州ボストン）から市販で入手可能である。未接合体ビーズは、簡単な還元性アミン化プロトコールを介して結合相手に直接的に被覆されうる。
【０１０５】
種々のビオチン化標的分子を使用して、アルファスクリーン（商標）アッセイを、以下のとおりに行った：白色３８４ウエル平板中に、ヘペス２５ｍＭ中に希釈された（１０μＭから１０ｐＭまで）図５で「プローブ」と称される５μｌのビオチン化標的分子、１００ｍＭ  ＮａＣｌ０．０１％ツイーン２０、およびヘペス緩衝液中で５０μｇ／ｍｌで１０μｌのデフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）−ガリウム（ＩＩＩ）陽イオン受容体ビーズの順で添加した。ＲＴ（室温）で３０分のインキュベーション後、ビオチン化標的分子に選択的に結合する１０μｌのストレプトアビジン供与体ビーズ（ヘペス緩衝液中の５０ｕｇ／ｍｌ）を添加し、そしてその平板を、室温で１時間インキュベートした。最後に、その平板を、アルファクエスト（商標）読取装置で読み取った。全アッセイは、三重で行われた。ビオチン化ホスホチロシン標的分子およびストレプトビオチンのアルファスクリーン（商標）供与体ビーズを、パーキンエルマー（登録商標）（マサチューセッツ州ボストン）から得た。
【０１０６】
図１で示されるとおり、９．７の信号−対−バックグランドで３００ｐＭあたりのホスホペプチド濃度で出発して、単離されたビオチン−ホスホ−ｌｃｋを検出した。最大限の信号−対−バックグランドは、３０ｎＭホスホペプチドで８００あたりであることが分かった。図２で示されるとおり、３００ｐＭあたりのビオチン−ＰＩＰ３で出発して、ビオチン−ホスホイノシチド−３，４，５−トリスホスフェート（ＰＩＰ３）を検出した。最大限の信号は、まだ１Ｍに達していなかった。図３で示されるとおり、３０ｐＭあたりのビオチン−ヘパリンで出発して、ビオチン−ヘパリンを検出した。信号は、約３ｎＭで最大であり、そして１４５の信号対ノイズ比であった。図４で示されるとおり、１００ｐＭあたりのビオチン−ニトロチロシン−ＢＳＡで出発して、ビオチン−ニトロチロシン−ＢＳＡを検出した。信号は、３ｎＭで最大であり、そして１０．８の信号対ノイズ比であった。図５で示されるとおり、酸性ポリペプチドもヒスチジン富化ペプチドもデフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）−ガリウム錯体に結合されるものはなかった。
【０１０７】
要約すると、ホスホペプチド、リン脂質、ニトロチロシン含有ペプチドおよび硫酸化ポリペプチドを検出する上で、本実施例は、デフェロキサミン（ｄｅｆｅｒｏｘａｍｉｎｅ）−ガリウム（ＩＩＩ）陽イオン捕捉因子の用途を示す。
【０１０８】
本出願を通して、種々の出版物が、括弧内で参照された。それらの実体でこれらの出版物の開示は、本発明が関与する当業界の状態をより十分に示すために、本出願で参照してここに組み込まれる。
【０１０９】
本発明は、開示された実施態様に関して示されたが、当業者は、詳説された特定の実験が、本発明の例示のみであることを容易に予測する。種々の修飾が、本発明の概念から逸脱することなく行われることを理解すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１１０】
【図１】遷移金属陽イオンと配位結合したシデロホアを含む捕捉因子を使用したホスホペプチドの検出を示す。
【図２】遷移金属陽イオンと配位結合したシデロホアを含む捕捉因子を使用したホスホイノシチドの検出を示す。
【図３】遷移金属陽イオンと配位結合したシデロホアを含む捕捉因子を使用した硫酸化分子の検出を示す。
【図４】遷移金属陽イオンと配位結合したシデロホアを含む捕捉因子を使用したニトロチロシン含有分子の検出を示す。
【図５】遷移金属陽イオンと配位結合したシデロホアを含む捕捉因子に結合するビオチン酸性タンパク質およびヒスチジン富化ペプチドの無能力を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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