(57)【要約】  ヒト胚幹細胞を培養するためのこれまでの方法は、線維芽細胞支持細胞又はならし培地のいずれかを必要とし、線維芽細胞支持細胞に露出され、該幹細胞を未分化状態に保持していた。ここで、高濃度の線維芽成長因子を、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及び脂質を有する培地に用いる場合、支持細胞又はならし培地を用いなくても、幹細胞が複数の継代中に無制限に未分化のままであることが見出された。ヒト蛋白質のヒト化基質は、細胞を培養するための基底基質として用いることができる。これらの培養条件、該培地及び該基質を用いて製造されたヒト胚幹細胞の新規系は、動物性細胞、動物性生成物、支持細胞又はならし培地には決して露出されない。【特許請求の範囲】
【請求項１】
支持細胞又はならし培地を使用しないヒト胚幹細胞の新規な培養系を開始するための、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及び脂質を、新規増殖幹細胞を未分化状態で生じる及び保持するのに十分な量で含む培地において胚盤胞から細胞をプレーティングする工程を含む、方法。
【請求項２】
培地が、少なくとも40ng/mLの濃度で線維芽細胞成長因子を含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
培地が、トランスフェリン及びインスリンも含む、請求項１記載の方法。
【請求項４】
ヒト胚幹細胞;
塩、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及び脂質を、複数回の培養継代中に該幹細胞を未分化状態で保持するのに十分な量で含む培養培地であって、支持細胞を含まず、且つ支持細胞に決して露出されない培地:及び
ヒトコラーゲン、及びフィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンからなる群から選択される少なくとも2種のヒト蛋白質からなるヒト化基質、
を培養容器内に含む、生体外細胞培養。
【請求項５】
基質が、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンの全てのを含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
培地が、少なくとも40ng/mLの濃度で線維芽細胞成長因子を含む、請求項４記載の方法。
【請求項７】
培地が、トランスフェリン及びインスリンも含む、請求項４記載の方法。
【請求項８】
ヒト胚幹細胞;
ヒトコラーゲン、及びコラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニンからなる群から選択される少なくとも2種のヒト蛋白質からなるヒト化基質、及び
ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、及び脂質を、複数回の培養継代中に該幹細胞を未分化状態で保持するのに十分な量で含む培養培地であって、支持細胞を含まず、且つ支持細胞に決して露出されない培地、
を培養容器内に含む、生体外細胞培養。
【請求項９】
(a)胚盤胞状態における胚の内細胞塊を単離する工程;
(b)工程(a)からの細胞を、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム及び脂質を、複数回の培養継代中に該幹細胞を未分化状態で保持するのに十分な量で含む培地で培養する工程:
(c)ヒト蛋白質の基質上で行われる培養工程;及び
(d)該培地上で増殖する細胞を連続的に広げる工程、
を含む、新規ヒト胚幹細胞を培養する方法。
【請求項１０】
培地におけるヒト蛋白質が、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、及びラミニンからなる群からの少なくとも3種の蛋白質を含む、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
ヒト蛋白質の基質上で成長するヒト胚幹細胞を含む細胞の培養であって、該幹細胞は動物性細胞、動物性蛋白質、支持細胞又はならし培地に決して露出されていない系統からのものであり、該細胞培養培地が、20回以上の継代で培養している該細胞を保持することができる一方で、該細胞を未分化のままにし、多分化能を保持し、及び通常の核型を保持する、培養。
【請求項１２】
シアル酸Neu5Gcを示さないヒト胚幹細胞を含む細胞の、培養。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔関連出願に対するクロスリファレンス〕
本出願は、2005年6月29日に提出された米国仮特許出願Ser. No. 60/695,100、及び2004年9月8日に提出された米国仮特許出願Ser. No. 60/608,040からの優先権を請求する。
【０００２】
〔連邦政府の援助を受けた研究又は開発に関する声明〕
本願明細書に記載されている研究の一部は、米国政府からの助成金によって支援され、及び一部はされていない。新規ヒト胚幹細胞系を得る方法に関する本願明細書に記載されている研究は、米国政府からの助成金で支援されてはいない。ある程度まで、本発明は、以下の機関:NIH RR017721によって授与された米国政府援助によってなされた。米国は本発明における一定の権利を有する。
【０００３】
〔背景技術〕
幹細胞は、多くの他の分化細胞タイプに分化することのできる細胞として定義される。胚幹細胞は、成熟体の、全てではないが、大部分の分化細胞タイプに分化することができる胚からの幹細胞である。幹細胞は多分化能と呼ばれ、これは多くの細胞タイプに分化するこの能力を表現している。研究団体が高い関心のある多分化能幹細胞の部類は、ヒト胚幹細胞、ここでは略してヒトES細胞であり、ヒト胚源由来の胚幹細胞である。ヒト胚幹細胞が非常に科学的関心が高いのは、それらが培養液中で無制限に増殖でき、及びそれによって、少なくとも原理的には、不備又は欠陥のあるヒト組織の代わりとなる細胞及び組織を供給することができるからである。ヒト胚幹細胞が培養液中に存在することは、ヒトの健康を補助する種々の治療プロトコル及び研究プログラムに使用するためのヒト細胞及び組織の無制限量の潜在能力を提供する。将来的には、ヒト胚幹細胞は増殖され、及び特定の系統に分化する方向に向かい、治療目的のために人体に移植することのできる分化細胞又は組織を開発することが想定される。
【０００４】
ヒト胚幹細胞を作成及び培養するための基本的な技術が説明されている。これまでに報告されている技術は正常に機能するが、ヒト胚幹細胞を培養するために現在用いられている手順の多くには制限及び欠点がある。一つの制限は特に懸念される。大部分の現存するヒト胚幹細胞系は、ある程度までマウス細胞又はマウス細胞が以前に培養された培地に直接露出される。現存する細胞系からの一部のES細胞が、通常はヒト細胞から作成されないシアル酸残渣Neu5Gcを示すことが見出された事実は、報道において多くの注目を受けた。ヒト胚幹細胞の生成及び培養のための従来技術は、ヒト胚幹細胞を培養することのできる支持層として、マウス胚線維芽細胞(MEF)支持細胞の使用を必要とした。線維芽細胞支持細胞が作用し、一部が今のところまだ完全には理解されていないメカニズムによって、幹細胞を未分化状態のままにすることを助長する。後に、幹細胞が“ならし培地”に露出された場合に同じ現象が達成され得ることが発見された。ならし培地は、支持細胞、例えばMEFsが予め培養されている幹細胞培地である。支持細胞は該培地にいくつかの因子を分け与えるか、又は該培地からいくつかの因子を除去したが、結果的にならし培地を用いて幹細胞を分化させることなく培養することができる。培養条件、マウス支持細胞上におけるヒトESの直接成長、又はならし培地の使用のいずれも、ウィルスなどの1種以上の病原体がマウス細胞からヒトES細胞に遺伝され得るという関心事を生じる。ヒト胚幹細胞培養の目的の一つが、究極的には人体に移植できる組織を作成することである場合、幹細胞を、別種の細胞又は別種の細胞を培養するのに用いた培地に決して露出しないことが非常に望ましい。従って、線維芽細胞支持層を用いずにヒト胚幹細胞の増殖及び培養を可能にする培養条件を定義することが、ヒト胚幹細胞の長期培養のための技術の継続的な発展に非常に重要である。
【０００５】
いくつかの培地処方は、ヒトES細胞を多少の時間未分化のままにすることができるが、この状態はしばしばそれ自体を保持することができない。特に、培養容器における最初の種培養物から同一の培養容器における集密までのヒトES細胞の成長を“継代”としての定義する。激しい分化をしない1回又は2回の継代のためのヒトES細胞の培養を可能にするが、続いて該細胞がその後の継代で迅速に分化するいくつかの培地処方を見出した。ならし培地又は線維芽細胞支持細胞を用いずに、分化させることなくヒトES細胞の無限増殖を正確に支持する培地のためには、該培地が少なくとも5回の継代のために実質的に均一且つ未分化状態でヒトES細胞の培養を支持することを実証しなければならないと考えるようになった。該培養物が、培養期間中に比較的均一且つ未分化のままであり、及びヒトES細胞の重要な特徴の全てを保持することも重要である。
【０００６】
培養中のヒト胚幹細胞の特徴的な形質は、条件が理想に満たない場合に、細胞が分化する傾向にあることである。ヒトES細胞の分化を誘起するのは容易であり、培養液中にヒトES細胞を未分化状態で保持させるのは厳しい要求である。大部分の培養条件は、特に成長しているES細胞コロニーの末梢周辺で、一定レベルの望ましくない分化を生じる。ES細胞は、ある程度の望ましくない分化を伴って培養され得るので、この目的は、該培養をできる限り未分化のまま、すなわち、できる限り少ない分化細胞のままで可能にする培養条件を定義することである。我々は、特に厳密な標準を用いて、未分化ES細胞培養物の無限の培養を支持する条件を定義することを考える。
【０００７】
幹細胞培養物の分化状態は、形態学的特徴によって評価することができる。未分化幹細胞は特徴的な形態、すなわち、明確に画定された細胞境界線を有する小さく且つ緻密な細胞を有し、顕微鏡下での幹細胞培養物の検査によって容易に判断することのできる形態である。それに反し、分化した細胞はより大きく且つより散在して見え、不明瞭な境界線を有する。ある種の未分化細胞は未分化細胞のコロニーの縁で見ることができ、及び通常は見え、最適な幹細胞培養物は、分化しているように見える該培養物の周辺において、培養容器中で最小数のみの細胞で増殖するものである。経験とともに、ヒトES細胞培養物の分化及び健康の状態を視覚的に良好な精度で判断することができる。
【０００８】
さらに、ヒトES細胞の新規な系の誘導を支持する培地の十分性は、幹細胞培養条件の十分性のためのさらに厳密な基準である。現存する幹細胞系の増殖及び成長を支持するある種の培養条件は、新規ヒトES細胞系の誘導に使用するには十分でないことが証明された。幹細胞の新規な系の開始を支持する能力は、全ての幹細胞培養条件を特徴付けるとは限らない能力であることが考えられる。
【０００９】
〔発明の開示〕
本発明は、支持細胞又はならし培地を必要としないヒト胚幹細胞を培養するための、塩、ビタミン、アミノ酸、グルコース、線維芽細胞成長因子、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム塩及び脂質を、全てが複数の培養継代中に該幹細胞を未分化状態に保持するのに十分な量で含む培地でヒト胚幹細胞を培養する工程を含む方法として要約される。
本発明は、幹細胞を線維芽細胞支持細胞又はならし培地を必要とせずに無制限に未分化状態で培養することのできる、高濃度の線維芽細胞成長因子、ガンマアミノ酪酸、ピペコリン酸、リチウム塩及び脂質を含む培地で培養されるヒト胚幹細胞の生体内細胞における培養も意図している。
本発明は、動物生成物、支持細胞、又はならし培地に露出されないヒト胚幹細胞の新規な系の製造としても要約される。
本発明の目的は、支持細胞又は幹細胞が培養されているならし培地のための、動物細胞の使用を回避するヒト胚幹細胞のための長期培養条件を定義することである。
本発明の別の目的は、動物細胞又は動物性蛋白質への露出をできる限り回避する上記のヒト胚幹細胞のための培養条件を定義することである。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の明細書から明らかとなる。
【００１０】
〔発明の詳細な説明〕
未分化状態且つさらに支持細胞及びならし培地の完全な不存在下でのヒト胚幹細胞の無限培養及び増殖を可能にする複数の培養条件及び培地を確認した。ここで記載される培養条件及び培地は、動物性生成物を全く含まず、全ての蛋白質がヒト由来である。これらの培地及び培養条件の開発が、任意の種類の動物細胞に直接的又は間接的に露出されることなく、定義され且つ制御された条件でのヒトES細胞系の誘導及び保持を可能にし、動物性細胞又は動物性細胞が培養された培地に決して露出されないヒトES細胞の新規な系の誘導も可能にする。該培地は、動物性生成物又は蛋白質を含まない。この培地は、未分化ES細胞の増殖を、それがそのような培養を無制限に支持することが確実に明らかである少なくとも25回の継代中に支持することが証明された。ここで、好ましい培地は、ヒトES細胞の新規な系の誘導を支持するのに十分であり、これらの新規系は培養中に10回以上の継代を通過することが証明された。
【００１１】
いずれ、“支持細胞を含まない”培養条件を製造するようなならし培地の使用が過去の慣習となる。このフレーズは、あるタイプの支持細胞が依然として“ならし培地”を調整する必要があるために誤りである。ここで、ヒトES細胞の“支持細胞非依存性”培養を可能にする培養条件が記載される。“支持細胞非依存性”によって意味されるのは、ヒト又は動物のいかなる種類の支持細胞も該方法では必要とされず、培養及び培地の調整のいずれも必要としない。支持細胞非依存性条件は、いかなる目的のためにも支持細胞を全く必要としない。
【００１２】
ヒトES細胞の培養及び増殖のために定義され且つヒト化された培地は、典型的には塩、ビタミン、グルコースなどのエネルギー源、ミネラル及びアミノ酸を含む。培地条件及び供給条件を補完して細胞成長を支持するために、最初の幹細胞は一つの供給源又は別の供給源からの血清を含んだ。以前にも、線維芽細胞成長因子及び血清置換添加剤の添加が、血清無しでヒトES細胞の増殖を可能にすることが報告された。血清置換剤は、そのために販売されている市場で入手可能な製品であり得るか、又は蛋白質、例えば血清アルブミン、ビタミン、塩、ミネラル、トランスフェリン又はトランスフェリン代用物、及びインスリン又はインスリン代用物の調合混合物であり得る。この血清置換成分はセレンで補完されてもよい。ここで好ましくは、定義された血清置換剤が、ヒトES細胞を培養する際に任意の供給源からの血清の代わりに用いられ、血清成分における変化の問題を回避し、且つできる限り上記の培地を使用する。培養培地に加えるのが有利であることが見出されている他の成長因子は、GABA、ピペコリン酸、塩化リチウム、及び形質転換成長因子ベータ(TGFβ)であるが、TGFβは培地に加えられるFGFの濃度を増加させるのに必要とされ得ない。
【００１３】
以前はヒトES細胞を未分化状態に保持するのに必要であると考えられていた線維芽細胞支持細胞層の必要性を回避するために、より高い濃度のFGF(10〜1000ng/mL)の使用と、ガンマアミノ酪酸(GABA)、ピペコリン酸、塩化リチウム及びTGFβの使用の組み合わせが、培地が未分化幹細胞成長を支持することを可能にすることをここで報告する。これらの添加剤の組み合わせは、支持細胞又はならし培地への露出無く、ヒトES細胞の培養を未分化状態で保持するのに十分であることが見出された。これらの添加剤は明らかに十分である。しかし、それらの全ては全ての培地処方に必要とはなり得ない。これらの添加剤の選択的な除外により、それらの1種以上が所定の培地のためにこの結果を達成するのに必要でないことが経験的に確認され得る。しかし、該組み合わせは、種々の培地が支持細胞又はならし培地を用いない無限回の継代中に、未分化ヒトES細胞の長期間培養及び増殖を支持することを可能にするのに十分であることは明らかである。
【００１４】
これらの成分をある種の変化に付す。例えば、LiClを培地に用いるのは、wnt経路を刺激するからである。この経路のwnts自体又は他の刺激物、例えばアクチビンは、LiClがおそらくこの目的のために最も経済的な試薬であるとしても、当量のLiClと置き換えることができる。同様に、GABAはGABA受容体と相互作用すると考えられ、及び科学文献は、同一の受容体の作用薬であり、且つ培地におけるGABAの同等物として置き換えられ得るいくつかの分子の同定を含む。PAは、GABA受容体とも相互作用すると考えられている。PA及びGABAの両方がここで用いられる濃度で培地に有用であることが見出され、1種以上の他のこれらの成分が濃度で劇的に上昇し、他の必要性を取り除くことも考えられる。
【００１５】
より高い濃度(40〜100ng/ml)の線維芽細胞成長因子は、支持細胞の必要性を除外するように見える。好ましいFGFは、bFGF及びFGF2とも呼ばれる塩基性FGFであるが、少なくともFGF4、FGF9、FGF17及びFGFl8を含む他のFGFsは、この目的のために同様に十分である。他のFGFsは、より高い濃度でも作用し得る。
【００１６】
ヒトES細胞の培養条件において、培養容器に生物学的基質を含むことも有用である。用いた1種の該物質はMatrigelTMであり、これはマウス細胞由来の人工的基底膜であり、マウス細胞を含まない市販の製品として供給される。しかし、Matrigelの使用は、該培養液内に、共に定義されておらず、且つマウス由来の物質を含む物質を導入する。ここで、Matrigelを完全に置換するヒト型蛋白質の生物学的基質を製造する方法も記載される。この基質は、4種のヒト型蛋白質:ヒトプラセンタから単離されたコラーゲン、ヒト血漿から単離されたフィブロネクチン、ヒト血漿から単離されたビトロネクチン及びヒトプラセンタから単離されたラミニンからなる。これら4種の蛋白質の組み合わせは十分であるが、4種全ての使用はヒトES細胞の成長及び培養を支持する必要はない。ビトロネクチン、フィブロネクチン又はラミニンの1種を用いないが他の3種の蛋白質を含む該基質の使用は、ES細胞培養物の分化状態の純度をある程度失いながらES細胞の培養を支持する。ES細胞成長のための基質を製造する方法が、以下の実施例に記載される。
【００１７】
上記培地添加剤の到達に続き、80種以上の個々の成長因子の方法論的な試験をした。一部の添加剤が、少なくともいくつかの継代で、培養中のヒトES細胞の成長を支持するように見える一方、多くがその後の継代において該ES細胞を未分化状態に保持することができなかった。以下の実施例に記載される培地添加剤の結果を与えたこれらの他の因子の組み合わせを確認していない。
【００１８】
線維芽細胞支持細胞の存在下又はならし培地において培養されるときに、ヒト胚幹(ES)細胞培養物を予め未分化状態のみで保持するという知見は、線維芽細胞がES細胞の分化を阻害するように作用する因子を該培地に放出するという推測を導いた。しかし、培地に対する線維芽細胞支持細胞によって媒介される効果が何であれ、以下に記載される培地が該効果の代わりとなることは明らかである。以下に定義される3種の培地を明確にし、動物性細胞を含まず、及び未分化状態での未分化ヒトES細胞の長期培養を可能にする。実施例は、“ヒト化”培地にするために培地における蛋白質が全てヒト型である培地、及び動物由来の細胞下生成物に関する全ての起こり得る問題を回避する培養条件も示す。
【００１９】
さらに以下に示されるのは、この培地を用いるヒト胚幹細胞の新規な系の誘導である。従って、ヒトES細胞のこれらの系は、支持細胞、ならし培地、動物性生成物又は動物性蛋白質に決して露出されない。これまでのヒトES系が、培養中又は人体におけるヒト細胞に本来は見出されないシアル酸形態(Neu5Gc)を示すことは以前に報告されている。これまでのヒトES系がマウス要素を含む培養条件からのNeu5Gcを取得したため、ここで記載される新規ヒトES細胞系は、Neu5Gcを全く含まない。
【００２０】
実施例
特に明記しない限り、ここに記載される全ての培養液に用いたTeSR1培地の成分を、以下の表１に述べる。我々の予備実験は、未分化ヒトES細胞増殖が7.2のpH、350mOsMolのモル浸透圧濃度、及び10%CO2/5%O2の気圧で最適であることを示した。これらの条件を、ここで記載される全てのその後の培養液に用いた。
【００２１】
上記成分の全てを有する培地が十分であり好ましいが、全ての成分がヒトES細胞の連続的な培養のために必要であるとは限らない。分化細胞の量に依存して容認される傾向にあり、特に培地が少しの継代にのみ用いられる場合は、培地の一部の成分を省略することができる。どの成分を省略してもよいかを探索するために、ヒトES細胞を上記の培地の変化に省略する成分を変えながら培養した。20万個の細胞を実験培地の処理済みの2つのウェルに蒔き、7日間成長させた。続いて、細胞を転写調節因子Oct4、分化細胞の認識マーカーの発現で分析した。この実験からのデータを図１のグラフに示し、各実験培地におけるOct4発現細胞の数は、好ましい培地TeSR1からの関数として示す。TGFβが、少なくとも短時間培養のための高濃度のFGFの存在下では、少なくとも必要な成分であるように見えることに注意する。省略された他の成分が、未分化細胞の割合を増加させるが、その差は定量的であり、該培地は、少なくともある程度の細胞継代を制限するまで、これらの成分無しで作用することにも注意する。
【００２２】
培地は、ヒト由来の新規基質物質を用いてヒトES細胞を培養するのにも用いられる。新規基質は、以下の4種の蛋白質からなる:
1.  10μg/100μL/cm2の最終濃度のコラーゲン(ヒトプラセンタから単離される)、
2.  5μg/100μL/cm2の最終濃度のフィブロネクチン(ヒト血漿から単離される)、
3.  0.2μg/100μL/cm2の最終濃度のビトロネクチン(ヒト血漿から単離される)、
4.  5μg/100μL/cm2の最終濃度のラミニン(ヒトプラセンタから単離される)。
【００２３】
この基質を構築するために、コラーゲンを6M GuHCl(グアニジンHCl)で変性させ、45μmの濾過器で濾過し、及びアリコットを凍結させる。解凍したら、変性コラーゲンをCa及びMgを含まないPBSに希釈して適切な最終濃度を達成し、培養皿に蒔いた。被覆したプレートは、さらなる基質成分を蒔く前に、室温で1時間以内に培養することを可能にする。この最初の培養に続き、さらなる基質成分(フィブロネクチン、ビトロネクチン及びラミニン)をCa及びMgを含まないPBSに希釈して適切な最終濃度を達成し、培養皿に蒔いた。被覆したプレートは、ヒトES細胞が蒔かれる前に、室温で1時間以内に培養することを可能にする。
【００２４】
新規基質物質を用いて、以前から存在する系のヒトES細胞を最小の10回の継代で培養し、未分化のままで増殖させた。
ヒト化基質の成分の厳密な必要性を試験するために、該基質における変化を、省略した1種以上の成分で処方した。該実験からのデータを図２に示す。各実験条件の文字は、基質における蛋白質を表す(C-コラーゲン、F-フィブロネクチン、V-ビトロネクチン、及びL-ラミニン)。CFV、CVL及びCFL膜が良く作用し、ES細胞を未分化状態に保持するが、簡単にはCVFL基質条件とほとんど同じように成長した細胞培養物に対して伝導性とはならない。
【００２５】
この培地は、ヒト胚幹細胞の新規な系の開始を支持できることも証明された。新規系のための誘導方法は、培地処方のために困難な試験になり得るが、定義された培地の使用は、動物性蛋白質又はマウスに露出されず、且つ支持細胞又は支持細胞が培養された培地に決して露出されないヒト胚幹細胞の新規系を製造することができる。これは、新規な成功であると考えられる。
【００２６】
この作業は、広く承認された公共的な再検討及びドナーからのインジョームドコンセントを得た後にだけ行った。生体外のヒト受精プロトコルのために製造されたが臨床的な必要性を超過した凍結ヒト胚嚢を供与した。胚嚢を解凍し、市場で入手可能な一連の胚細胞システム(Vitrolife-GUIシリーズ)を用いて胚盤胞状態まで培養した。透明帯の除去後、ヒト胚盤胞の内細胞塊(ICM)を免疫手術(Solter及びKnowles, 1975, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 72:5099-5102)によって単離するか、又は全量を培養して(Evans及びKaufman, 1981, Nature, 292154-156)、上記の定義されたヒト化基質(CVFL)を有する上記の培地TeSRl上の4つのウェルの培養プレートに蒔いた。培養の最初の48時間に続き、TeSR1培養培地を毎日置き換えた。14〜21日後、細胞の凝集塊を機械的に単離し、新鮮なCVFLプレート上で置き換えた。機械的単離をその後の2〜3回の継代で続け、その後にコロニーを酵素ディスパーゼを用いて継代させた。新規コロニーが、ヒト胚幹細胞の新規系であることを確認した。
【００２７】
上記の4種のヒト基質成分にTeSR1培地を用いると、5回培養された胚盤胞から2種の新規なヒトES細胞系が得られた。本記載のように、両方のヒトES細胞系が、6ヶ月間の連続的な継代中に連続的に培養された。該系は安定であり、形態学的に以前の幹細胞系と類似である。FACS分析及びRT-PCR、Western blottingは、これらの細胞がヒトES細胞の一連のマーカー特性を発現することを示した。これらの細胞系から生じる奇形腫体は、全ての3種の胚細胞層のマーカーを発現し、両細胞系はSCID-beigeマウスに注入されるときに奇形腫を形成した。培養して4ヶ月後、一つの細胞系がXXY(クラインフェルター症候群)であり、もう一つは核型的に通常であった。クラインフェルター症候群は、最も一般的なヒト染色体異常の1種であり、この異常は幹細胞培養を開示する方法によって導入される人工産物よりもそれ自体で胚に存在し得ることを示している。
【００２８】
表１  TeSRl培地の完全な処方
無機塩                                              mM
塩化カルシウム(無水物)                              0.8232
HEPES                                               11.76
塩化マグネシウム(無水物)                            0.2352
硫酸マグネシウム(MgSO4)                             0.319088
塩化カリウム(KCl)                                   3.26144
重炭酸ナトリウム(NaHCO3)                            11.2112
塩化ナトリウム(NaCl)                                94.55824
リン酸ナトリウム、二塩基(dibas)(無水物)             0.392
リン酸ナトリウム、モノ(NaH2PO4-H2O)                 0.355152
【００２９】
微量ミネラル                                        mM
硝酸鉄(Fe(NO3)3-9H2O)                               0.00009408
硫酸鉄(FeSO4-7H2O)                                  0.001176
硫酸銅(CuSO4-5H2O)                                  4.0768E-06
硫酸亜鉛(ZnSO4-7H2O)                                0.001176
メタバナジン酸アンモニウムNH4VO3                    0.000056
硫酸マンガンMnSO4 H2O                               1.00592E-05
モリブデン酸アンモニウム                            1.00404E-05
NiSO4 6H2O                                          4.94861E-06
メタケイ酸ナトリウムNa2SiO3 9H2O                    0.004926108
SnCl2                                               5.32544E-05
CdCl2                                               6.21931E-05
CrCl3                                               9.41176E-06
AgNO3                                               5.00293E-06
AlCl3 6H2O                                          2.4855E-05
Ba(C2H3O2)2                                         4.99217E-05
CoCl2 6H2O                                          5.0021E-05
GeO2                                                2.5337E-05
KBr                                                 5.04202E-06
KI                                                  5.12048E-06
NaF                                                 0.000500119
【００３０】
アミノ酸                                            mM
L-アラニン                                          0.1392
L-アルギニンヒドロクロライド                        0.5488
L-アスパラギン-H2O                                  0.1392
L-アスパラギン酸                                    0.1392
L-システイン-HCl-H2O                                0.0784
L-シスチン 2HCl                                     0.0784
L-グルタミン酸                                      0.1392
L-グルタミン                                        2.96
グリシン                                            0.296
L-ヒスチジン-HCl-H2O                                0.1176
L-イソロイシン                                      0.326144
L-ロイシン                                          0.353584
L-リシンヒドロクロライド                            0.391216
L-メチオニン                                        0.090944
L-フェニルアラニン                                  0.16856
L-プロリン                                          0.2176
L-セリン                                            0.296
L-トレオニン                                        0.352016
L-トリプトファン                                    0.0346528
L-チロシン 2Na 2H2O                                 0.167776
L-バリン                                            0.354368
【００３１】
ビタミン                                            mM
アスコルビン酸                                      0.375
ビオチン                                            1.12112E-05
塩化コリン                                          0.0502544
D-カルシウムパントテナート                          0.0036064
葉酸                                                0.004704
i-イノシトール                                      0.05488
ナイアシンアミド                                    0.012936
ピリドキシンヒドロクロライド                        0.0076048
RbCl                                                5.00414E-05
ZrOCl2 8H2O                                         9.03834E-05
リボフラビン                                        0.0004704
チアミンヒドロクロライド                            0.02460217
ビタミンB12                                         0.000392
【００３２】
成長因子                                            mM
GABA                                                0.979
ピペコリン酸                                        0.000984
bFGF                                                5.80E-06
LiCl                                                0.979
TGFベータ1                                          2.35E-08
【００３３】
脂質                                                mM
リノール酸                                          0.0070976
リポ酸                                              0.00039984
アラキドン酸                                        0.001312
コレステロール                                      0.0113798
DL-アルファトコフェロール-アセテート                0.02962
リノレン酸                                          0.007184
ミリスチン酸                                        0.008758
オレイン酸                                          0.00708
パルミトレイン酸                                    0.007862
ステアリン酸                                        0.00703
【００３４】
エネルギー基質                                      mM
D-グルコース                                        13.72784
ピルビン酸ナトリウム                                0.392
【００３５】
蛋白質                                              mM
ヒトインスリン                                      0.0034438
ヒトホロトランスフェリン                            0.14
ヒト血清アルブミン                                  199.7
【００３６】
他の成分                                            mM
グルタチオン(還元型)                                0.00592996
ヒポキサンチンNa                                    0.01176
フェノールレッド                                    0.0159936
プトレッシン-2HCl                                   0.000394352
チミジン                                            0.001176
2-メルカプトエタノール                              0.1
セレン                                              0.000177304
Pluronic F-68                                       0.238
Tween 80                                            0.3358
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】実施例からのデータの一部のグラフ説明。
【図２】実施例からのデータのさらなるグラフ説明。
【図１】
2008518585.tif 000002
【図２】
2008518585.tif 000003
【国際調査報告】
2008518585.tif 000004
2008518585.tif 000005
2008518585.tif 000006
2008518585.tif 000007