(57)【要約】  ４０タイプのＨＰＶを分析するためのオリゴヌクレオチドプローブは合成され、ＤＮＡチップは前記オリゴヌクレオチドプローブを用いて製造された。前記オリゴヌクレオチドプローブの合成は、米国および欧州のケースに基づく情報に加えて、韓国人成人女性４，８９８人の子宮頸部細胞標本から得られた３５タイプのＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子のクローン並びに６８個の子宮頸癌のケースの組織標本に基づく。前記ＤＮＡチップは、子宮頸部で発見された４０タイプのＨＰＶを解析でき、優れた診断感度、１００%近いＨＰＶ遺伝子型の特異性および再現性を有する。また、前記ＤＮＡチップは多くの標本を短時間で分析できるので、従来の解析方法より優れており、とても経済的である。従って、前記ＤＮＡチップは、子宮頸癌および前癌性病変の予測に有益である。【選択図】  なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号６〜配列番号５４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチド、および前記オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択され、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の核酸と相補的に結合することを特徴とするプローブ。
【請求項２】
配列番号２の塩基配列を含むことを特徴とするＨＰＶ  Ｌ１  ＤＮＡ増幅用プライマー。
【請求項３】
配列番号１および配列番号２の塩基配列を有するプライマーセットであることを特徴とするＨＰＶ  Ｌ１  ＤＮＡ増幅用プライマー。
【請求項４】
配列番号７〜配列番号５４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択された少なくても一つのプローブを含むことを特徴とするＨＰＶのプロービングおよび遺伝子型解析用ＤＮＡチップ。
【請求項５】
配列番号７〜配列番号１４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするＨＰＶのプロービング用および遺伝子型解析用ＤＮＡチップ。
【請求項６】
配列番号１５〜配列番号５４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするＨＰＶのプロービング用および遺伝子型解析用ＤＮＡチップ。
【請求項７】
配列番号７〜配列番号５４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むことを特徴とするＨＰＶのプロービング用および遺伝子型解析用ＤＮＡチップ。
【請求項８】
前記ＤＮＡチップは、βグロブリン、アクチンおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子からなる群から選択されたスタンダードマーカープローブを含むことを特徴とする請求項４記載のＤＮＡチップ。
【請求項９】
前記βグロブリンプローブは、配列番号５５の塩基配列を有することを特徴とする請求項８記載のＤＮＡチップ。
【請求項１０】
プローブＤＮＡの５’末端アミン基は、前記ＤＮＡチップの固体表面のアルデヒド基とシッフ塩基反応で固定されたことを特徴とする請求項４記載のＤＮＡチップ。
【請求項１１】
請求項４〜１０のいずれか一項に記載のＨＰＶのプロービングおよび遺伝子型解析用ＤＮＡチップは、ＰＣＲ法によってＨＰＶ  ＤＮＡサンプル増幅用プライマーセットおよび前記ＤＮＡチップでハイブリダイズされた増幅されたＤＮＡをプロービングするためのラベル化手段を含むことを特徴とするＨＰＣのプロービング用および遺伝子型解析用キット。
【請求項１２】
前記ラベル化手段は、Ｃｙ−５、Ｃｙ−３、ビオチン結合物質、５−２’−アミノエチルアミノ−１−ナフタレン硫酸（ＥＤＡＮＳ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、ｘ−ローダミンおよびＴＥＸＡＳ  ＲＥＤからなる群から選択されることを特徴とする請求項１１記載のキット。
【請求項１３】
前記プライマーセットは、配列番号１および配列番号２の塩基配列からなるＨＰＶ  Ｌ１  ＤＮＡ増幅用プライマーセットを含むことを特徴とする請求項１１記載のキット。
【請求項１４】
前記プライマーセットは、配列番号３および配列番号４の塩基配列を含むＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ＤＮＡ増幅用プライマーセットおよび配列番号５および配列番号６の塩基配列を含むβグロブリンＤＮＡ増幅用プライマーセットを更に含むことを特徴とする請求項１３記載のキット。
【請求項１５】
（ａ）ＨＰＶのＤＮＡ増幅用プライマーを用いたＤＮＡサンプル増幅マルチプレックスＰＣＲを行う工程；
（ｂ）配列番号７〜配列番号５４の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドと相補的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなる群から選択された少なくとも一つのプローブを含む前記ＤＮＡチップに増幅されたＤＮＡをハイブリダイゼーションする工程；
（ｃ）前記プローブにハイブリダイゼーションされた反応物を検出する工程；を含むことを特徴とするＨＰＶプロービング用またはＨＰＶの遺伝子型解析方法。
【請求項１６】
前記マルチプレックスＰＣＲ増幅は、配列番号２の塩基配列を有するＨＰＶ  Ｌ１  ＤＮＡ増幅用プライマーを用いることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
前記マルチプレックスＰＣＲ増幅は、配列番号１および配列番号２、配列番号３および配列番号４、並びに配列番号５および６の塩基配列を有するＨＰＶ  Ｌ１  ＤＮＡ増幅用プライマーセットを用いることを特徴とする請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記検出は、遺伝子がＣｙ−５でラベル化されている場合、共焦点レーザーで蛍光シグナルを解析することにより行われることを特徴とする請求項１５記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｃｙ−５蛍光物質は、リバースプライマーを含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
ハイブリダイゼーション反応後、ＳＳＰＥ溶液で洗浄する工程を更に含むことを特徴とする請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
ＨＰＶ  Ｌ１遺伝子およびＨＢＢ遺伝子のデュプレックスＰＣＲ増幅、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子のデュプレックスＰＣＲ増幅、並びにＨＰＶ  Ｌ１遺伝子、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子のトリプレックスＰＣＲ増幅は、
（ａ）１０□バッファー、ＭｇＣｌ２（１０ｍＭ）、ｄＮＴＰ（１０ｍＭ）およびＴａｑポリメラーゼを、５：７．５：１：１の体積比で混合する工程；
（ｂ）プライマーおよび鋳型ＤＮＡを該混合物に加える工程；
（ｃ）滅菌蒸留水で前記混合物を希釈し、反応液を準備する工程；および、
（ｄ）反応液を９５℃５分間で変性した後、９５℃１分間での再変性、４７℃１分間、および７２℃１分間を１０回、７２℃５分間で反応させる工程；を含む方法によって行われることを特徴とするＨＰＶプロービング用またはＨＰＶの遺伝子型解析用マルチプレックスＰＣＲ増幅方法。
【請求項２２】
前記ＤＮＡチップは、６〜８の区画を有し、各区画は一サンプルを平等にすることができることを特徴とする請求項４〜１０のいずれかに記載のＤＮＡチップ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、子宮頸癌の主な原因であり最も一般的な性交渉感染症であるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の核酸と相補的に結合するプローブ、前記プローブとそれを用いたＨＰＶの遺伝子型分析キットを含むＤＮＡチップまたはマイクロアレイ、並びにＨＰＶ感染の有無の検出およびＨＰＶの遺伝子型を分析する方法に関するものでる。
【背景技術】
【０００２】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）はキャプシドがゲノムの二本鎖ＤＮＡを囲むウイルスであり、その形状はゴルフボ−ルに似ている。ＨＰＶは、２つの観点から人間にとって重要である。第１に、ＨＰＶは、最も一般的な性交渉感染症（ＳＴＤ）である。すべての成人女性の５０％以上がその生涯の間、少なくとも一回、ＨＰＶに感染していると報告されている。第２に、ＨＰＶは、ヒト上皮細胞に感染し、過剰増殖を誘発する。主に、このような過剰増殖は、良性腫瘍（例えば単純な皮膚疣、外部の生殖器周辺または肛門などの尖圭コンジロ−マ）である。しかしながら、ＨＰＶは癌を誘発する原因になりえ、そして、実際に、ほとんど全ての子宮頸癌、頭頸部腫瘍の大多数および多数の肛門癌はＨＰＶにより誘発される(例えば、非特許文献１、非特許文献２参照)。
【０００３】
ＨＰＶは、次の２つのタイプに分類できる。一つは、皮膚に侵入するタイプであり、もう一方は、皮膚の境界線および外部の生殖器または肛門の粘膜に侵入する肛門性器タイプである。ゲノムの塩基配列（すなわち、系統樹または遺伝子型）に応じて、具体的にＨＰＶはほぼ１２０のタイプに分類できる。それらの中で、ＨＰＶタイプ１６（ＨＰＶ−１６），ＨＰＶ−３１，ＨＰＶ−３３，ＨＰＶ−３５，ＨＰＶ−５２，ＨＰＶ−５８，ＨＰＶ−６７，ＨＰＶ−４０，ＨＰＶ−４３，ＨＰＶ−７，ＨＰＶ−３２，ＨＰＶ−４２，ＨＰＶ−６，ＨＰＶ−１１，ＨＰＶ−７４，ＨＰＶ−４４，ＨＰＶ−５５，ＨＰＶ−１３，ＨＰＶ−６１，ＨＰＶ−７２，ＨＰＶ−６２，ＨＰＶ−２，ＨＰＶ−２７，ＨＰＶ−５７，ＨＰＶ−３，ＨＰＶ−２８，ＨＰＶ−２９，ＨＰＶ−１０，ＨＰＶ−５４，ＨＰＶ−１８，ＨＰＶ−３９，ＨＰＶ−４５，ＨＰＶ−５９，ＨＰＶ−６８，ＨＰＶ−７０，ＨＰＶ−２６，ＨＰＶ−６９，ＨＰＶ−５１，ＨＰＶ−３０，ＨＰＶ−５３，ＨＰＶ−５６，ＨＰＶ−６６，ＨＰＶ−３４，ＨＰＶ−６４，ＨＰＶ−７３を含むＨＰＶの４５種のタイプは、外部の生殖器および肛門に侵入する。ＨＰＶの肛門性器タイプは、子宮頸癌を誘発する能力に応じて、高リスクタイプおよび低リスクタイプおよび／または中リスクタイプに分類できる。高リスクタイプのＨＰＶは、ＨＰＶ−１６， ＨＰＶ−１８， ＨＰＶ−２６， ＨＰＶ−３０， ＨＰＶ−３１， ＨＰＶ−３３， ＨＰＶ−３５， ＨＰＶ−３９， ＨＰＶ−４５， ＨＰＶ−５１， ＨＰＶ−５２， ＨＰＶ−５３， ＨＰＶ−５６， ＨＰＶ−５７， ＨＰＶ−５８， ＨＰＶ−５９， ＨＰＶ−６１， ＨＰＶ−６７， ＨＰＶ−６８， ＨＰＶ−７０， ＨＰＶ−７３，及び ＨＰＶ−８２である２２種のＨＰＶを含む。それらの内、ＨＰＶで最も一般的な高リスクタイプはＨＰＶ−１６であって、次にＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−５２およびＨＰＶ−５８であるが、世界中では差がある。ＨＰＶの低リスクタイプは、ＨＰＶ−２ａ， ＨＰＶ−３， ＨＰＶ−６， ＨＰＶ−１０， ＨＰＶ−１１， ＨＰＶ−３２， ＨＰＶ−３４， ＨＰＶ−４０， ＨＰＶ−４２， ＨＰＶ−４３， ＨＰＶ−４４， ＨＰＶ−５４， ＨＰＶ−５５， ＨＰＶ−６１， ＨＰＶ−６６， ＨＰＶ−６９， ＨＰＶ−７０， ＨＰＶ−７２， ＨＰＶ−８１， 及び ＨＰＶ−ＣＰ６１０８のような約２０種類のＨＰＶを含む(例えば、非特許文献３、非特許文献４を参照)。
【０００４】
ＨＰＶのゲノム構造は、概略的に初期転写領域Ｅ（初期遺伝子領域）、後期転写領域Ｌ（後期遺伝子領域）および非発現領域ＬＣＲ（長い制御領域）に分けることができる。ＨＰＶのゲノム構造は、発症タイプ、危険性およびＨＰＶの予後に非常に影響を及ぼす。特に、Ｅ領域のＥ６およびＥ７遺伝子は、感染細胞のゲノムに統合、維持、発現され、これにより、癌を誘発するための重要な役割を演じる。ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８などのような高リスクタイプのＨＰＶは、ｐ５３、Ｅ６ＡＰ、網膜芽細胞腫（Ｒｂ、Ｐ１０５ＲＢ）Ｐ１０７およびＰ１３０などのような、人間において、最も重要な癌抑制遺伝子と反応し、癌抑制遺伝子を不活性化する。その結果、感染細胞は、細胞周期調節およびアポトーシス制御メカニズムの不全により、癌細胞に変わる。これに反して、低リスクタイプのＨＰＶは、ｐ５３またはＲｂ癌抑制遺伝子と反応し、癌抑制遺伝子を不活性化する能力が低いので、低リスクタイプのＨＰＶは子宮頸癌を誘発することは困難である。一方、ＨＰＶ遺伝子で最も大きな遺伝子は、Ｌ１である。Ｌ１は、大部分のＨＰＶタイプで類似の保存塩基配列に存在する。Ｌ１タンパク質は主にＨＰＶキャプシドタンパク質で構成され、その抗原性は最も高い(例えば、非特許文献５参照）。
【０００５】
いったんＨＰＶによって変化させられた頸部細胞は、前癌性病変または形成異常、頸部上皮内癌（ＣＩＮ）または扁平上皮内病変（ＳＩＬ）を経て、いわゆる上皮内癌へ進む。上皮内癌が上皮細胞の下の基層に侵入する場合、それはいわゆる癌または侵食癌になる。９０％以上のＨＰＶ感染女性は、自身で自然に免疫系によって、ＨＰＶを取り除く。しかしながら、１０％の高リスクタイプＨＰＶに感染した女性で、ＨＰＶは維持され、子宮頸癌を誘発する。約８％の前癌性病変は上皮内癌へ進行し、そして、約２０％の上皮内癌は癌に発展する。すなわち、ＨＰＶ感染患者のＨＰＶの高リスクタイプが１０〜２０年以上の間維持される場合、ＨＰＶの高リスクタイプは子宮頸癌を誘発し、その頻度は約０．１６％になると推定される。子宮頸癌の発症は、非常に長い時間を必要とし、そして、段階的に誘導されるので、発症の中間段階である前癌性病変を初期に検査することによって、子宮頸癌の治療または予防が可能となる。すなわち、保存の医療手術によって前癌性病変を取り除くことにより、発癌を防ぐことが可能である。最近、ＨＰＶの主要抗原であるＬ１に対するワクチンに関する臨床試験が進めれている。また、子宮頸癌を誘発する大きな原因であるＨＰＶのＥ６およびＥ７に対するワクチンを用いて頸部前癌性病変を治療する試みもまた、活発に進められている。しかしながら、ＨＰＶワクチンのためには、各ＨＰＶの遺伝子型を認識することで固定されたワクチンを調合する必要がある(例えば、非特許文献６、非特許文献７、非特許文献８参照)。
【０００６】
ＨＰＶを培養すること、及び免疫学的な検査または血清検査で診断することは非常に困難であるので、ＨＰＶに関する研究は、足を踏み出した状態である。しかしながら、過去２０年の間の遺伝子の検査方法の発展により、ＨＰＶの遺伝子型を検査する試み、それによるＨＰＶの診断、予防および治療用ワクチンの開発、並びに前記検査の結果を用いた子宮頸癌スクリーニングが、活発に進められている。ＨＰＶの遺伝子型を調査するという試みが、それにより、診断、予防および検査の結果を用いたＨＰＶおよびスクリーニング子宮頸癌の処理のためのワクチンの開発が、活発に進められている。
【０００７】
特に、遺伝子チップ（またはＤＮＡチップ若しくはＤＮＡマイクロアレイ）は、分子生物学および電子機器の組合せによって近年開発された、それは、たった１枚の顕微鏡スライドガラス上で、同時に数十から数万の遺伝子を調査することができる。このようなＤＮＡチップは、遺伝子発現、遺伝子診断法、遺伝子突然変異診断、薬スクリーニングおよび疾患スクリーニングの分析およびバクテリア若しくはウイルスなどの正確な診断に適用できる新規な分析システムである。したがって、迅速に、かつ、正確に子宮頸癌に関する高リスクタイプのＨＰＶを検出するＨＰＶ  ＤＮＡチップの開発は、世界中で試みられている。
【０００８】
子宮頸癌集団検診は、主に子宮頸癌およびその前病変をスクリーニングするために用いる従来の検査方法である。子宮頸癌集団検診は、器具の先端に取り付けられたブラシ、例えば綿棒のような道具で、頸部細胞をふき取り、または削り取ることにより行われ、その後、細胞の細胞学的タイプを検討する。子宮頸癌集団検診の読み出した情報は、正常、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）低リスクタイプまたは低悪性度の扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）、高リスクタイプまたは高悪性度の扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、上皮内癌または癌に分類される。子宮頸癌集団検診は、発明者によるパパニコロー塗抹試験（パップスメア）もまた言及される。パップスメア検査は、１９４０年代から使われ、子宮頸癌による死亡率を著しく低下させるために重要な役割を演じた。しかしながら、パップスメアには、偽陰性率が３０〜４０％で高いという不利点がある。この種の高い偽陰性率は、試料採取器の抽出誤差または検査官の読み出し誤差に起因する。従って、抽出誤差を回避して、読み出し誤差を減らすために、Ｔｈｉｎ  Ｐｒｅｐもまた言及される。近年、液体ベースの細胞学検査が試みられている。それにもかかわらず、偽陰性率は高いままである。それゆえに、最近の１０年で、ＨＰＶの高リスクタイプを認識して、ＨＰＶ感染の有無を調査することによる子宮頸癌およびその遺伝子型の発症危険度を予測する試みがなされている。ＨＰＶ検査がパップスメアのそれより高いスクリーニング精度を有すると考えられる。
【０００９】
近年、たった一回のＨＰＶ検査で、ほとんど全ての高リスクタイプの前病変を診断することができ、そして、一回のＨＰＶ検査で２つのパップスメアまたは膣鏡検査より高い精度を有し得ることが報告されている。加えて、組合せ検査はパパニコロー塗抹試験の問題を解決できるので、ＨＰＶ検査およびパップスメアの組合せは、スクリーニン感度および特異性を向上させることができる。また、組合せ検査は、スクリーニング検査の時間的間隔が（パップスメアだけの際の）１年から３〜４年に延長できる効果がある。それゆえに、ＦＤＡは、パップスメアおよびＨＰＶ検査の組合せの検査を推奨する(例えば、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２参照）。
【００１０】
現在、ＨＰＶ遺伝子の検査は、２つの方法に分けることができる。一つは、ＨＰＶ感染およびラフタイプ（ｒｏｕｇｈ  ｔｙｐｅ）のＨＰＶの有無を調査する方法である。もう一方は、ＨＰＶ感染およびラフタイプのＨＰＶの有無を調査する遺伝子型決定法である。
【００１１】
前の方法、すなわち、ＨＰＶ感染を診断できる代表的な方法は、ＰＣＲを基にした方法およびハイブリッド形成を基にした方法を含む。ＰＣＲを基にした方法は、外部の生殖器タイプＨＰＶのゲノムの塩基配列が最も保存される主なウイルス・キャプシドＬ１遺伝子またはコンセンサスプライマーを使用しているＥ６およびＥ７遺伝子を増幅し、泳動などによって結果を確認することで実施される。しかしながら、この方法は、ＨＰＶ感染の有無だけが確認でき、示されるＨＰＶの遺伝子型または高リスクタイプ若しくは低リスクタイプかどうかさえ調査することができない。加えて、増幅の間、偽陽性および汚染の危険がある。代表的なハイブリッド形成を基にした方法は、ハイブリッドキャプチャーＩＩ解析法（米国  Ｄｉｇｅｎｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）である。ハイブリッドキャプチャー法は、ＨＰＶ  ＤＮＡをハイブリッドキャプチャー技術で標本から抽出して、高リスクＨＰＶプローブカクテルおよび低リスクＨＰＶプローブカクテルでＨＰＶ  ＤＮＡをハイブリッドして、ＨＰＶ感染の有無を診断することで行われる。しかしながら、ハイブリッドキャプチャー法には、増幅しないので、ＨＰＶの正確な遺伝子型および低感度の検査で分析することが可能でないという不利点がある。類似の方法には、コンセンサスプライマーを用いたＰＣＲ、高リスクＨＰＶプローブカクテルによるハイブリダイゼーションおよび酵素免疫応答の観察により実施される方法を含む。この方法は、比較的単純で、ＨＰＶの高リスクタイプを認識することに役立つが、低リスクタイプのＨＰＶおよびＨＰＶの正確なタイプを認識することができない(例えば、非特許文献１３参照）。
【００１２】
遺伝子型と同様にＨＰＶ感染の有無を認識するために用いた最も標準的な方法は、ＰＣＲの後のシークエンシング法である。前記方法は、塩基配列は外部生殖器のＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子に保存され、そして塩基配列が各タイプに応じて異なる領域を増幅し、直接、または、クローニングの後、塩基配列を決定することで行われる。前記方法は、最も高品質な標準試験である。しかしながら、シークエンシング法は、１、２回の検査で一つの標本だけが調査できるので、多くの時間及びコストが必要であり、大きな労働力を要するという不利点がある。従って、シークエンシング法を臨床検査に適用することは困難である。また、クローニングがＨＰＶの少なくとも一つのタイプの複合感染を認識するのに必要であるにもかかわらず、実際には、このような手順は不可能である。それ故、以下の方法が、シークエンシング法の代わりに試みられている。
【００１３】
第１の方法は、各ＨＰＶタイプに従って遺伝子型に特有のプライマー用いる、いくつかのＰＣＲを実施する方法である。この方法は、各ＨＰＶ遺伝子型に対する電気泳動またはサザンブロット法によって、ＰＣＲ生成物のさまざまな大きさを認識するものである。前記方法は、単純であるが、多くの労働力を要し、非効率的である。また、前記方法には、少数のＨＰＶタイプを認識してしまうという不利点がある。
【００１４】
第２の方法は、ＰＣＲ−制限断片長多型（ＰＣＲ−ＲＦＬＰ）である。この方法は、コンセンサスプライマーを使用しているＰＣＲによって、Ｌ１遺伝子またはＥ６およびＥ７遺伝子を増幅し、制限酵素を用いたＰＣＲ生成物を消化し、そして、電気泳動によって、生成物の長さを決定することにより行われる。前記方法は、従来のものであり、多くの労働力を要する。また、前記方法は、少数のＨＰＶタイプを認識してしまうという不利点がある（例えば、非特許文献１４参照）。
【００１５】
第３の方法は、最近の６〜７年の間に使われている、リバースハイブリダイゼーションラインブロット検査法である。前記方法は、各タイプのＨＰＶのための遺伝子型特有のオリゴヌクレオチドプローブが取り付けられたナイロン膜ストリップを準備し、ＨＰＶのコンセンサスプライマーＰＣＲ生成物を配置し、そして、ハイブリダイゼーションによって、最も強い反応を示しているタイプを決定することで行われる。前記方法がＰＧＭＹ−ラインブロット分析、または、ＳＦＰ１０プローブ分析などの名において用いられる（例えば、非特許文献１５、非特許文献１６参照）。これらの方法が最大で２５〜２７タイプのＨＰＶを認識できると報告されている。しかしながら、これらの方法は、大きな労働力を要し、自動化することが困難で、ＨＰＶのすべての遺伝子型を認識できるというわけではない。加えて、決定のための標的領域がＬ１遺伝子の特定の領域の５０の塩基に局所化されるので、ＰＣＲ増幅は遺伝子内変異のため効率的に実施でない。また、前記方法は、遺伝子変異種を認識することが困難であり、子宮頸癌を誘発するために決定的役割を演じたＥ６およびＥ７遺伝子を認識することができない。
【００１６】
最後に、近年、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはＤＮＡチップが開発され用いられている。ＤＮＡチップは、顕微鏡ガラススライドがナイロン膜ストリップの代わりに使われることを除いて、上記のリバースハイブリダイゼーション法の手順で使用される(例えば、非特許文献１７参照)。ＤＮＡチップは、上記のリバースハイブリダイゼーション法と比較して容易に自動化できる。しかしながら、前記ＤＮＡチップには、リバースハイブリダイゼーション法と同じ不利点がある。すなわち、ＤＮＡチップは、外性器ＨＰＶのすべての遺伝子型を認識できるというわけではなく、２２のタイプだけを認識することができ、決定する標的領域がＬ１遺伝子の特定の領域の５０の塩基に局所化されているので、ＰＣＲ増幅を効率的に行うことができず、遺伝子異型を認識することが困難であり、Ｅ６およびＥ７遺伝子を分析することができない。
【００１７】
合理的なＨＰＶ遺伝子型検査方法において、要求される条件は、以下の通りである：
（１）外性器ＨＰＶの全ての種類のＨＰＶを含んでいる複合感染を診断することが可能でなければならない、
（２）感度、特異性および再現性の全ては、１００％に近づかなければならず、
（３）Ｅ６およびＥ７遺伝子と同様にＬ１遺伝子を分析することが可能でなければならず、
（４）遺伝子の正常型塩基配列および変異体塩基配列を分析することが可能でなければならず、
（５）検査結果の検査手順および分析は、容易でなければならず、
（６）短時間で多数の標本を分析するために、自動化されなければならない。
【００１８】
結果として、ＤＮＡチップが適切である。しかしながら、現在まで、上記の条件を満たすＤＮＡチップは、商業化されてこなかった。地域性を考慮すると、頸部細胞標本に存在するＨＰＶの遺伝子型および変異を認識している多くの韓国人女性から頸部細胞標本を得ることにより構築されたデータベースに基づいてＤＮＡチップを生産することが必要である。
【非特許文献１】Ｈｏｗｌｅｙ  ＰＭ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．  Ｖｏｌ  ２，  １９９６，  ２０４５−２１０９
【非特許文献２】Ｍｕｒｉｎｏｚ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ２００３，  ３４８：５１８−２７
【非特許文献３】Ｍｕｒｉｎｏｚ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ２００３，  ３４８：５１８−２７
【非特許文献４】Ｓｃｈｅｎｅｉｄｅｒ  Ａ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９３；  ２８１：２６３−５
【非特許文献５】ｚｕｒ  Ｈａｕｓｅｎ  Ｈ．  Ｓｅｍｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｂｉｏｌ  １９９９；  ９：４０５−１１
【非特許文献６】Ｂｏｓｃｈ  ＦＸ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐａｔｈｏｌ，  ２００２，  ５５：２４４−６５
【非特許文献７】Ｗａｌｌｉｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  １９９９，３４１：１６３３−８
【非特許文献８】Ｋｏｕｔｓｋｙ  ＬＡ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ２００２，３４７：１６４５−５１
【非特許文献９】Ｌｅｄｇｅｒ  ＷＪ  ｅｔ  ａｌ．,  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ，  ２０００；  １８２：  ８６０−５
【非特許文献１０】Ｗｒｉｇｈｔ  ＴＣ  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ．，  ＪＡＭＡ，  ２００１，  ２８７：２１２０−９
【非特許文献１１】Ｗｒｉｇｈｔ  ＴＣ  Ｊｒ  ｅｔ  ａｌ.，  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，  ２００３，  ３４８：６−７
【非特許文献１２】Ｓｈｅｒｍａｎ  ＭＥ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎａｔｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ，  ２００３，  ９５；  ４６−５２
【非特許文献１３】Ｋｏｒｎｅｇａｙ  ＪＲ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ２００１，  ３９：３５３０−６
【非特許文献１４】Ｖｅｒｍｏｎ  ＳＤ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ２０００，  ３８：６５１−５
【非特許文献１５】Ｇｒａｖｉｔｔ  ＰＥ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  １９９８，  ３６：３０２０−７
【非特許文献１６】ｖａｎ  Ｄｏｏｒｎ  Ｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，  ２００２，  ４０：９７９−９８３
【非特許文献１７】Ｃｈｏ  ＮＨ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ，  ２００３，  １８８：５６−６２
【非特許文献１８】Ｍｕｒｉｎｏｚ  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ，２００３，３４８：５１８−２７
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
本発明は、上記の問題を解決するために完成され、そして自動的に、そして、正確に、高い選択性及び感度を有する、子宮頸癌の主な原因であり、性交渉感染症で最も一般的な理由の一つである、性的なＨＰＶ感染の遺伝子型を診断できるプローブを提供することである。
【００２０】
本発明の態様は、性的なＨＰＶ感染を精査し、またはその遺伝子型を分析するためのオリゴヌクレオチドマイクロアレイチップ（ＤＮＡチップ）を提供することである。
【００２１】
本発明の別の態様は、上述したプローブ、ＨＰＶ  ＤＮＡチップに関する全ての試薬、コントロール標本等を備える性的なＨＰＶ感染を精査または遺伝子型を分析するための一体型キットを提供することである。
【００２２】
本発明の別の態様は、ＨＰＶの遺伝子型を分析するプローブ、及び、前記プローブを備えるオリゴヌクレオチドマイクロアレイ（オリゴＤＮＡチップ）を用いて性的ＨＰＶを精査または分析する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２３】
本発明は以下に添付の図を参照してより完全に記述され、本発明の好ましい実施形態が示される。しかしながら、本発明は、多くの異なる形で実施されることができ、本願明細書において、記載される実施形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態は、この開示が一貫かつ完結し、当業者に本発明の範囲を完全に伝えるために、提供される。
【００２４】
本発明のＨＰＶ、ＤＮＡ、キットおよび分析方法を分析するためのプローブは、以下の通りに９つのステップにより達成される：
１．スタンダードおよびコントロール標本の準備
韓国人女性からサンプルを採取した６８個の頸部癌組織および韓国人女性からサンプルを採取した４，８９８個の頸部細胞標本は、主なタイプのＨＰＶに感染しているヒト子宮頸癌株化細胞として準備された。ポジティブコントロールおよびネガティブコントロール標本は、そこから得られた（実施例１）。
【００２５】
２．ＤＮＡの隔離
ＤＮＡは、適切な技術を用いて、ステップ１において、得られた標本から分離された（実施例２）。
【００２６】
３．ＰＣＲ
Ｅ６／Ｅ７遺伝子を増幅するためのオリゴヌクレオチドプライマー、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびヒトβグロブリン遺伝子は選択、設計され、そして、適切なＰＣＲ条件が確立された。シングルＰＣＲ（ｓｉｎｇｌｅ  ＰＣＲ）、デュプレックスＰＣＲ（ｄｕｐｌｅｘ  ＰＣＲ）およびトリプレックスＰＣＲ（ｔｒｉｐｌｅｘ  ＰＣＲ）それぞれに対して、ＰＣＲ条件が確立された。加えて、Ｅ６／Ｅ７遺伝子のためのＰＣＲ、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびヒトβグロブリン遺伝子は、テンプレートとしてステップ２において、分離されたＤＮＡを用いて実施された（実施例３）。
【００２７】
４．配列解析およびクローンの確立
ＰＣＲの後、シークエンシング反応はＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７およびＨＰＶ  Ｌ１の塩基配列を分析するために行われた。そして、データベースは分析情報を整理することにより構築された。加えて、それらのＨＰＶタイプが確認されたＰＣＲ生成物は、プラスミドベクターでクローンがつくられた。その後、本発明のＤＮＡチップの反応条件を確立するときに、これらのクローンはスタンダードおよびコントロール標本として用いられた。臨床ＤＮＡ標本は、保存され、その後、本発明のＤＮＡチップの精度を分析するために使われた（実施例４および５）。
【００２８】
５．ＤＮＡチップのプローブ設計
ステップ４の中で韓国の女性から抽出された頸部細胞のＨＰＶ遺伝子型を分析するための臨床検査標本で補強されたＨＰＶのＥ６／Ｅ７およびＬ１のデータベース、および外国のＨＰＶに関するデータベースに基づいて、オリゴヌクレオチドプローブは、ハイブリダイゼーション反応によって、外性器ＨＰＶおよびヒトβグロブリンのＬ１およびＥ６／Ｅ６を、それぞれ、ＤＮＡチップ上で分析できる（実施例６）。
【００２９】
６．ＤＮＡチップの製造
格子は、ステップ５において、設計されたプローブを配列または観測するために考案された。その後、適切なバッファーと混ぜ合わせられたプローブは、顕微鏡のスライドガラスに配列または観測された。安定化および品質管理のための適切な処理の後、スライドガラスは、将来の解析のために保存された（実施例７）。
【００３０】
７．前記ＤＮＡチップ上の反応および分析条件の確立
ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７およびＨＰＶ  Ｌ１遺伝子およびβグロブリン遺伝子は、ステップ４で確立された各ＨＰＶタイプの一つ、二つまたは三つのクローンの様々な組合せおよび濃度で生成された標準標本を用いたマルチプレックスＰＣＲにより増幅された。適切な条件は、前記ＤＮＡチップ上へのＰＣＲ生成物の配置、数回のハイブリダイゼーション反応の実施、その後、蛍光スキャナによる分析により確立された（実施例８)。
【００３１】
８．ＤＮＡチップ上の臨床材料分析
マルチプレックスＰＣＲ増幅は、ＨＰＶが存在する、または存在しない臨床材料のＤＮＡに対して行われ、もし存在したならば、その遺伝子型が検出された。その後、ＰＣＲ生成物がステップ６のＤＮＡチップ生産物に配置されたあと、ハイブリダイゼーション反応はステップ７において、確立された条件で実施された。洗浄後、蛍光スキャナ解析が、実施された。ＤＮＡチップの感度、特異性および再現性は、このような手順により分析されることができる。また、ＨＰＶの遺伝子型を診断するための本発明のＤＮＡチップの最適条件が、再び確立された（実施例９）。
【００３２】
９．ＤＮＡチップ上の臨床分析の後の分析された臨床データによる相関の解析
相関、及び、ＤＮＡチップが子宮頸癌または前癌性病変を予測することに役立つどうか分析するために、子宮頸癌集団検診などによって、得られた臨床データと、ステップ８のＰＣＲの後、ＤＮＡチップを用いた解析によって、得られた結果を比較した。ＤＮＡチップが子宮頸癌スクリーニングと同様に、ＨＰＶの遺伝子型を分析するのに役立つことが判明した（実施例１０）。
【００３３】
本発明は、ＤＡＮチップを使用しており、以下を含んでいる診断キット（一体型キット）を提供する：１）頸部スワブのようなサンプリング臨床材料などのための用具およびＤＮＡを標本から抽出するための試薬、２）ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子およびＬ１遺伝子を増幅するＰＣＲのための試薬およびβグロブリン遺伝子、３）ＨＰＶ遺伝子の増幅におけるポジティブコントロールとして用いられるプラスミドＤＮＡクローン、４）ＨＰＶの遺伝子型を分析するためのオリゴＤＮＡチップ、５）ＤＮＡチップを使用したハイブリダイゼーション反応およびハイブリダイゼーション反応の後、使用される洗浄液のための反応液。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３４】
本発明上記およびの他の特徴と、有利な点とは、添付の図面を参照して詳細にその実施形態を説明することによって、より明らかになる。
【００３５】
図１は、２％アガロースゲルで行われた電気泳動により得た、ＨＰＶのＥ６およびＥ７遺伝子の電気泳動写真である。前記Ｅ６およびＥ７遺伝子は、以下のように得た：ゲノムＤＮＡをポジティブコントロール株化細胞から分離して、その後、鋳型として前記ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによってＥ６およびＥ７遺伝子を増幅した。（レーン１（Ｍ）：１００ｂｐ  ＤＮＡサイズマーカー、レーン２（Ｎ／Ｃ）：ネガティブコントロール、レーン３（ＨＰＶ−１６）：ポジティブコントロール株化細胞（Ｃａｓｋｉ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５０）に感染したＨＰＶ−１６、レーン４（ＨＰＶ−１８）：ポジティブコントロール株化細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に感染したＨＰＶ−１８、レーン５（ＨＰＶ−３５）：ポジティブコントロール株化細胞（ＡＴＣＣ  ４０３３１）に感染したＨＰＶ−３５）
図２は、２％のアガロースゲルで行われた電気泳動により得た、ＨＰＶのＬ１遺伝子の電気泳動写真である。前記Ｅ６およびＥ７遺伝子は、以下によって、得られた：ゲノムＤＮＡをポジティブコントロール株化細胞から分離し、その後、鋳型として前記ゲノムＤＮＡを用いたＰＣＲによってＬ１遺伝子を増幅した。（レーン１（Ｍ）：１００ｂｐ  ＤＮＡサイズマーカー、レーン２（Ｎ／Ｃ）：ネガティブコントロール、レーン３（ＨＰＶ−１６）：ポジティブコントロール株化細胞（Ｃａｓｋｉ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５０）に感染したＨＰＶ−１６、レーン４（ＨＰＶ−１８）：ポジティブコントロール株化細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に感染したＨＰＶ−１８、レーン５（ＨＰＶ−３５）：ポジティブコントロール株化細胞（ＡＴＣＣ  ４０３３１）に感染したＨＰＶ−３５）
図３は、２％のアガロースゲルで行われた電気泳動により得た、ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子およびヒトβグロブリン（ＨＢＢ）遺伝子の電気泳動写真である。前記Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、以下によって得られた：ゲノムＤＮＡをポジティブコントロール株化細胞から分離し、その後、鋳型として前記ゲノムＤＮＡを用いたデュプレックスＰＣＲによって、前記Ｅ６／Ｅ７およびＨＢＢ遺伝子を増幅した。（レーン１（Ｍ）：１００ｂｐ  ＤＮＡサイズマーカー、レーン２（Ｎ／Ｃ）：ネガティブコントロール、レーン３（ＨＰＶ−１６）：ポジティブコントロール株化細胞（Ｃａｓｋｉ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５０）に感染したＨＰＶ−１６、レーン４（ＨＰＶ−１８）：ポジティブコントロール株化細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に感染したＨＰＶ−１８、レーン５（ＨＰＶ−３５）：ポジティブコントロール株化細胞（ＡＴＣＣ  ４０３３１）に感染したＨＰＶ−３５）
図４は、２％のアガロースゲルで行われた電気泳動により得た、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびヒトβグロブリン（ＨＢＢ）遺伝子の電気泳動写真である。前記Ｌ１遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、以下によって得られた：ゲノムＤＮＡをポジティブコントロール株化細胞から分離し、その後、鋳型として前記ゲノムＤＮＡを用いたデュプレックスＰＣＲによって、Ｌ１およびＨＢＢ遺伝子を増幅すること。（レーン１（Ｍ）：１００ｂｐ  ＤＮＡサイズマーカー、レーン２（ＨＰＶ−１６）：ポジティブコントロール株化細胞（Ｃａｓｋｉ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５０）に感染したＨＰＶ−１６、レーン３（ＨＰＶ−１８）：ポジティブコントロール株化細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に感染したＨＰＶ−１８）
図５は、２％のアガロースゲルで行われた電気泳動により得た、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子の電気泳動写真である。前記Ｌ１およびＥ６／Ｅ７遺伝子並びにＨＢＢ遺伝子は、以下によって得られた：ゲノムＤＮＡをポジティブコントロール株化細胞から分離し、その後、鋳型として前記ゲノムＤＮＡを用いたトリプレックスＰＣＲにより前記Ｌ１、Ｅ６／Ｅ７およびＨＢＢ遺伝子を増幅した。（レーン１（Ｍ）：１００ｂｐ  ＤＮＡサイズマーカー、レーン２（ＨＰＶ−１６）：ポジティブコントロール株化細胞（Ｃａｓｋｉ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５５０）に感染したＨＰＶ−１６、レーン３（ＨＰＶ−１８）：ポジティブコントロール株化細胞（ＨｅＬａ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２）に感染したＨＰＶ−１８）
図６は、増幅されたＥ６／Ｅ７遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＥ６／Ｅ７遺伝子は、Ｃａｓｋｉ（すなわち、子宮頸癌株化細胞に感染したＨＰＶ−１６）から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにヒトβグロブリン（ＨＢＢ）遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図６に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−１６である。
【００３６】
図７は、増幅されたＥ６／Ｅ７遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＥ６／Ｅ７遺伝子は、Ｈｅｌａ（すなわち、子宮頸癌株化細胞に感染したＨＰＶ−１８）から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図７に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−１８である。
【００３７】
図８は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、Ｃａｓｋｉ（すなわち、子宮頸癌株化細胞に感染したＨＰＶ−１６）から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図８に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−１６である。
【００３８】
図９は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、Ｈｅｌａ（すなわち、子宮頸癌株化細胞に感染したＨＰＶ−１８）から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図９に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−１８である。
【００３９】
図１０は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図１０に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−３１である。
【００４０】
図１１は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図１１に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−３５である。
【００４１】
図１２は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図１２に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−３９である。
【００４２】
図１３は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図１３に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−６７である。
【００４３】
図１４は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図１４に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−５６である。
【００４４】
図１５は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、陽性反応の変化のみを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図１５に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、低リスクタイプの一種であるＨＰＶ−６ｂである。
【００４５】
図１６は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、陽性反応の変化のみを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図１６に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、低リスクタイプの一種であるＨＰＶ−１１である。
【００４６】
図１７は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）のみを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図１７に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−５８である。
【００４７】
図１８は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診および生検において、微小扁平上皮細胞癌を示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図１８に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−１６である。
【００４８】
図１９は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診および生検において、高度扁平上皮内病変を示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図１９に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−３１である。
【００４９】
図２０は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診および生検において、ＨＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図２０に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−１８である。
【００５０】
図２１は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診および生検において、ＨＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図２１に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−５８である。
【００５１】
図２２は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診および生検において、ＨＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図２２に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−３４である。
【００５２】
図２３は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸部生検において、上皮内癌を示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図２３に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−６８である。
【００５３】
図２４は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、低度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）を示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図２４に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−５６である。
【００５４】
図２５は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、ＬＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図２５に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−３５である。
【００５５】
図２６は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、ＨＳＩＬと、その後ＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−７０の複合感染とを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。
【００５６】
図２７は、増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターンである。増幅されたＬ１遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、微小扁平上皮細胞癌と、その後ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−５２の複合感染とを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。
【００５７】
図２８は、本発明の一実施形態によるＤＮＡチップに配置される形式および位置を示す概略図である。
【００５８】
図２９は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップの正面写真である。
【００５９】
図３０は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、Ｃａｓｋｉ（すなわち、子宮頸癌株化細胞）から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図３０に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−１６である。
【００６０】
図３１は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、Ｈｅｌａ（すなわち、子宮頸癌株化細胞）から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図３１に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、ＨＰＶ−１８である。
【００６１】
図３２は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、Ｋ５６２（すなわち、非感染ネガティブコントロール株化細胞）から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。
【００６２】
図３３は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図３３に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−１６である。
【００６３】
図３４は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図３４に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−１８である。
【００６４】
図３５は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図３５に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−３１である。
【００６５】
図３６は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図３６に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−３５である。
【００６６】
図３７は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図３７に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、一種の高リスクタイプであるＨＰＶ−３９である。
【００６７】
図３８は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図３８に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、の高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−６７である。
【００６８】
図３９は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、韓国人女性の子宮頸癌組織において、微細に解剖された頸部癌細胞から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図３９に示すように、ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−５６である。
【００６９】
図４０は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、陽性反応の変化のみを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図４０に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、低リスクタイプの一種であるＨＰＶ−６ｂである。
【００７０】
図４１は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、陽性反応の変化のみを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図４１に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、低リスクタイプの一種であるＨＰＶ−１１である。
【００７１】
図４２は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、意義不明異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）のみを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図４２に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−５８である。
【００７２】
図４３は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診および生検において、微小扁平上皮細胞癌を示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図４３に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−１６である。
【００７３】
図４４は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、高度扁平上皮内病変を示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図４４に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−３１である。
【００７４】
図４５は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、ＨＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図４５に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−１８である。
【００７５】
図４６は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、ＨＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図４６に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−５８である。
【００７６】
図４７は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、ＨＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図４７に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−３４である。
【００７７】
図４８は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、上皮内癌を示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図４８に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−６８である。
【００７８】
図４９は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、低度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）を示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図４９に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−５６である。
【００７９】
図５０は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、ＬＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図５０に示すように、前記ＨＰＶの遺伝子型は、高リスクタイプの一種であるＨＰＶ−３５である。
【００８０】
図５１は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、ＨＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図５１に示すように、ＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−７０の複合感染であることが分かる。
【００８１】
図５２は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、ＨＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図５２に示すように、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−５２の複合感染であることが分かる。
【００８２】
図５３は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真である。増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診において、正常評価を示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出したＤＮＡを用いて、Ｌ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子、並びにＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図５３に示すように、いかなるＨＰＶ感染もない。
【００８３】
以下に、本発明が、実施例により記述される。しかしながら、以下の実施例は本発明を例証しているだけであり、本発明は以下の実施例に限定されない。
【実施例１】
【００８４】
スタンダードおよびコントロール標本の準備
第１に、今後の遺伝子型検査および解析のスタンダードまたは参照およびコントロールとして使われる標本が準備された。
【００８５】
第１の標本は、その有無およびそのタイプが確認されたヒト子宮頸癌株化細胞であり、そして、ＨＰＶ遺伝子型の研究において、広く使用されている。ヒト子宮頸癌株化細胞はＡＴＣＣ（米国マナッサス社製、ＶＡ２０１０８）および韓国細胞株バンク（ＫＣＬＢ）（韓国ソウル大学メディカルセンター癌協会）で購入し、単層培養した後に使用した。株化細胞の詳細を、表１にまとめる。
【００８６】
第２に、標本は、間違いなく子宮頸癌または上皮内癌病変と診断された女性の頸部組織から得て、処理を施された。標本のホルマリン固定の後、パラフィン包埋された状況で保存された組織を、１０μｍの厚みで６〜１０の検鏡用薄切片に切り、顕微鏡スライドガラスに付着させ、癌細胞だけを顕微解剖した。６８個の子宮頸癌病変の内、６１ケースは頸部扁平上皮癌であり、７ケースは頸部上皮内癌（ＣＩＮ）であった。女性の平均年齢分布は、３２〜６９歳であり、平均年齢は４９歳であった。
【００８７】
第３に、４，８９８個の頸部標本は、２００３年からＨａｍｃｈｕｎ診療センター（韓国ソウル市）および韓国婦人科癌基金（韓国ソウル市）に行き、スワブおよび子宮頸癌集団検診を受診した４，８９８人の女性から得た。女性の平均年齢分布は、１６〜１９歳が０．２％を占め、２０代は、１８％を占め、３０代は、３８％を占め、４０代は、３２％を占め、５０代は、７％を占め、６０代は、１％その他が３％を占める。４，８９８ケースの内、４，７４１ケースにおいて、細胞学的および病理学的診断の結果は、子宮頸癌集団検診および／または生検と同様にＨＰＶ検査を行うことにより提供された。頸部細胞は、頸部にＰａｐブラシ（韓国ソウル市ソンパク（ｓｏｎｇｐａｋｕ）サンガメディカル社製）または綿棒を挿入することによって、試料採取し、十分に頸部細胞を集めるために、ブラシまたは棒を転がした。そして次に、Ｐａｐブラシまたは綿棒の先端は殺菌されたトランスファーバッファーを有し、スクリュー管に導かれ、保存された。３ｍｌのＣｙｔｏＬｙｔ溶液（米国ＣＹＴＹＣ社製、ＭＡ  ０１７１９）が、主にトランスファーバッファーとして用いられた。
【００８８】
【表１】
2008524983.tif 000003
【実施例２】
【００８９】
ＤＮＡの分離
ＤＮＡは、以下の通りに適切な方法で実施例において、試料採取されたさまざまな標本から分離される。
【００９０】
ＤＮＡを株化細胞から分離するために、単層培養された株化細胞は、５０ｍｌ遠心管に入れられて、３０分間、３，５００ｒｐｍで遠心分離し、上澄をデカンテ−ションして取り除き、５００μlのＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水)でペレットを懸濁し、１．５ｍｌ遠心管に移し、残ったメディウムの液分を取り除くために２分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、２００μｌのＰＢＳ液体および２０μｌのプロテイナーゼＫ（２０μｇ／μｌ）が、細胞ペレットに加えられ、マグネチックスターラで攪拌して混和した。２００μｌのＧＣ溶液を加え、混和し、２０分間の６０℃加熱ブロックで溶解した。反応終了後、サンプルに１００μｌのイソプロパノールを加え、完全に混和した。すべての溶液は、フィルタカラムに加えられ、１分間１０，０００ｒｐｍで遠心分離された。前記カラムを通過したろ液を廃棄した後、５００μｌのＷ１バッファーを加え、遠心分離した。そして次に、５００μｌのＷ２バッファーを、加え、再び遠心分離した。空のカラムは、完全にエタノールを取り除くために、２分間１２，０００ｒｐｍで遠心分離した。その後、６０μｌの滅菌蒸留水を添加し、１０分間立たせ、ＤＮＡを得るために２分間１，２００ｒｐｍで遠心分離した。
【００９１】
また、ＤＮＡをパラフィン包埋頸部組織から分離するために、唯一の癌細胞を、ピンポイントスライドＤＮＡ分離システム（米国カリフォルニア州Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）を使用して、１０μｍの厚みで顕微鏡スライドガラス上に付着された頸部組織から解離した。スライドガラスごとに、約１，０００〜２，０００の細胞が液体状態で得られ、すべての細胞を、マイクロ遠心チューブに移し、パラフィンを取り除くために２回１ｍｌのキシレンで処理し、乾燥エタノール過剰キシレンで処理し、１００μｌのＤＮＡ抽出および細胞融解バッファー（５０ｍＭ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  トリス−ＨＣｌ［ｐＨ  ８．３］、２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、ゼラチン、０．４５％  ＩＧＥＰＡＬ、０．４５％  トゥイーン２０、プロテイナーゼＫ［６０μｇ／ｍｌ］）で処理し、３時間、５５℃で反応させ、プロテイナーゼＫを不活性化するために、１０分間、９５℃で加熱した。遠心後、上澄をＰＣＲで用いた。
【００９２】
ＤＮＡを頸部スワブ標本から分離するために、ＤＮＡを、Ａｃｃｕｐｒｅｐ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＤＮＡ抽出キット（韓国Ｂｉｏｎｅｅｒ社製、カタログＮｏ．Ｋ−３０３２）で濃縮し、精製した。その手順は、以下の通りである：１．５ｍｌ頸部細胞の中で塗抹標本を、２分間、１２，０００ｒｐｍで遠心沈殿し、１．５ｍｌリン酸バッファー溶液を加え、洗浄し、適量のプロテイナーゼＫおよび細胞融解バッファーを加え、６０℃で２０分間培養した。反応終了後、反応液は、遠心機でＤＮＡ結合カラムを通過させ、ＤＮＡを集めるため、遠心機を使用して洗浄バッファー１および２で洗浄した。
【実施例３】
【００９３】
ＰＣＲ増幅
ＨＰＶの遺伝子型を調査するために、まず、ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子およびＬ１遺伝子を、ＰＣＲによって、増幅し、そして、ヒトβグロブリン遺伝子を内標として、ＰＣＲによって増幅した。
【００９４】
第１に、これらのＰＣＲ増幅のために、オリゴヌクレオチドプライマーが選択され、設計された。前記プライマーは、ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子を検出できるＨＰＣＦ／ＨＰＣＲプライマー、ヒトβグロブリン遺伝子のＬ１遺伝子およびＨＢＢＦ／ＨＢＢＲプライマーを検出できるＧＰ６−１プライマー（配列番号１）からなり、ＤＮＡ抽出およびＰＣＲの効率を確認するために用いられる。ＧＰ６−１プライマーは新しく設計され、そして、その他の２つのプライマーは周知のプライマーから選択される。ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子のＰＣＲは約２２５ｂｐ長の生成物を増幅し、ＨＰＶのＬ１遺伝子のＰＣＲは１８２ｂｐ長の生成物を増幅し、そして、βグロブリン遺伝子のＰＣＲは１８２ｂｐ長の生成物を増幅する。各遺伝子のためのＰＣＲプライマーの塩基配列は表２にまとめられ、ＰＣＲの条件は以下の通りである：
各適切なＰＣＲ条件は、シングルＰＣＲ、デュプレックスＰＣＲおよびトリプレックスＰＣＲに対して確立された。それ故に、ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子およびＨＰＶ  Ｌ１遺伝子並びにヒトβグロブリンのＰＣＲは、鋳型として実施例２において、分離されたＤＮＡを用いて行われた。
ＰＣＲの手順は、以下の通りである：
１．シングルＰＣＲ
表２に記述されるように、Ｓｕｐｅｒ  Ｂｉｏ社から購入されたプレミックス（１０Ｘバッファー  ２．５μｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２３．７５μｌ、１０ｍＭのｄＮＴＰ  ０．５μｌ、Ｔａｑ  ポリメラ−ゼ  ０．５μｌ）１５μｌに、ＭＹ１１／ＧＰ６−１、ＨＰＣＦ／ＨＰＣＲおよびＨＢＢＦ／ＨＢＢＲプライマーを各々１μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ)加え、更に前記標本の鋳型ＤＮＡ４．０μｌ（１５０ｎｇ／μｌ)を加え、最終的に総反応液の体積が３０μｌになるように蒸留水を加えた。
【００９５】
ヒトβグロブリンのＰＣＲは、９５℃５分間によりＨＢＢプライマーを含む反応液を前変性し、９５℃３０秒間、５０℃３０秒間、そして、７２℃３０秒間を４０サイクルを繰り返し、７２℃５分間で伸張させることにより行われた。
【００９６】
ＨＰＶのＥ６／Ｅ７のＰＣＲは、９５℃５分間によりＨＰＣＦ／ＨＰＣＲプライマーを含む反応液を前変性し、９５℃３０秒間、５６℃３０秒間、そして、７２℃３０秒間を４０サイクル繰り返し、７２℃５分間で伸張させることにより行われた。
【００９７】
ＨＰＶのＬ１のＰＣＲは、９５℃５分間によりＭＹ１１およびＧＰ６−１プライマーを含む反応液を前変性し、９５℃３０秒間、５６℃３０秒間、そして、７２℃３０秒間を４０サイクル繰り返し、７２℃５分間で伸張させることにより行われた。
【００９８】
２．デュプレックスＰＣＲ
ＨＰＶ感染を確認するためのデュプレックスＰＣＲのプライマー組合せは、（１）ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子を検出するＨＰＣＦ／ＨＰＣＲプライマーおよびβグロブリン遺伝子を検出するＨＢＢＦ／ＨＢＢＲプライマーの組合せ、および（２）ＨＰＶのＬ１遺伝子を検出するＭＹ１１／ＧＰ６−１プライマーおよびβグロブリンプライマーの組合せからなる。
【００９９】
ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７およびＨＢＢ遺伝子のデュプレックスＰＣＲは、以下の通りに行われた：ＨＰＶ感染を発見するためのＰＣＲ反応組成物は、１μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ)のＨＰＣＦ／ＨＰＣＲおよびＨＢＢＦ／ＨＢＢＲプライマー各々を、１５μｌのＳｕｐｅｒＴａｑ  ｐｌｕｓプレミックスに加え、更に４．０μｌ（１５０ｎｇ／μｌ）の標本の鋳型ＤＮＡを加え、最終的に総反応液の体積が３０μｌになるように蒸留水を加えた。ＰＣＲは、９５℃５分間で反応液を前変性し、９５℃１分間、７２℃１分間、そして、７２℃１分間を３０サイクル繰り返し、７２℃５分間で伸張させることにより行われた。
【０１００】
ＨＰＶ  Ｌ１およびＨＢＢ遺伝子のデュプレックスＰＣＲは、以下の通りに行われた：ＨＰＶ感染を発見するためのＰＣＲ反応組成物は、１μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ)のＭＹ１１／ＧＰＧ−１およびＨＢＢＦ／ＨＢＢＲプライマー各々を、１５μｌのＳｕｐｅｒＴａｑ  ｐｌｕｓプレミックスに加え、更に４．０μｌ（１５０ｎｇ／μｌ）の標本の鋳型ＤＮＡを加え、最終的に総反応液の体積が３０μｌになるように蒸留水を加えた。ＰＣＲは、９５℃５分間で反応液を前変性し、９５℃１分間、７２℃１分間、そして、７２℃１分間を１０サイクル繰り返し、再び９５℃１分間、５０℃１分間、そして、７２℃１分間を３０サイクルを繰り返し、７２℃５分間で伸張させることにより行われた。
【０１０１】
３．トリプレックスＰＣＲ
ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７、Ｌ１およびＨＢＢ遺伝子のトリプレックスＰＣＲは、以下の通りに行われた：
ＨＰＶ感染を発見するためのＰＣＲ反応組成物は、１μｌ（１０ｐｍｏｌ／μｌ)のＭＹ１１／ＧＰＧ−１、ＨＰＣＦ／ＨＰＣＲ、およびＨＢＢＦ／ＨＢＢＲプライマー各々を、１５μｌのＳｕｐｅｒＴａｑ  ｐｌｕｓプレミックスに加え、更に４．０μｌ（１５０ｎｇ／μｌ）の標本の鋳型ＤＮＡを加え、最終的に総反応液の体積が３０μｌになるように蒸留水を加えた。ＰＣＲは、９５℃５分間で反応液を前変性し、９５℃１分間、７２℃１分間、そして、７２℃１分間を１０サイクルを繰り返し、再び９５℃１分間、５０℃１分間、そして、７２℃１分間を３０サイクル繰り返し、７２℃５分間で伸張させることにより行われた。
【０１０２】
実験の結果を、図１〜図５に示す。図１〜５に示すように、ＨＰＶのシングル、デュプレックスおよび、トリプレックスＰＣＲの条件は最適化され、そしてまた、頸部スワブ標本およびパラフィン包埋頸部癌組織のＰＣＲは十分に行われた。
【０１０３】
ＨＰＶのＬ１およびＥ６／Ｅ７遺伝子の頸部細胞の４，８９８の臨床材料で行われたＰＣＲの結果を、表３に示す。１，４１４のケースの結果は、陽性であった。特に、それらの内、Ｌ１により検出されるケースは約５０％であり、Ｅ６／Ｅ７により検出されるケースは約６６％であり、そして、Ｌ１かＥ６／Ｅ７により検出されるケースは、それぞれ、５０．２％および３４．７％であった。臨床検査のＨＰＶ検出のための頸部細胞を調査するときに、そして、検査がＬ１だけを調査することになっている場合、商業化されたＨＰＶ逆線ハイブリダイゼーションキットおよび同等のＤＮＡチップなどでは、大多数のＨＰＶが見逃されることが大いに示唆される。また、Ｅ６／Ｅ７と同様にＬ１を増幅し、正確にＨＰＶを選別するためにそれらの塩基配列を確認することが必要であることが示された。これは、本発明の特徴的なＨＰＶ遺伝子型ＤＮＡチップを設計するための重要な基礎である。
【０１０４】
【表２】
2008524983.tif 000004
【０１０５】
【表３】
2008524983.tif 000005
【実施例４】
【０１０６】
シークエンシング解析および補強したデータベース
実施例３のＰＣＲの後、ＰＣＲ生成物の自動シークエンシング解析はＨＰＶ−Ｅ６／Ｅ７およびＨＰＶ  Ｌ１の塩基配列を分析するために行われ、そして、データベースは分析情報を整理することにより構築された。また、遺伝子型が確認された臨床ＤＮＡ標本は保存され、その後、本発明のＤＮＡチップの精度を分析するために用いられた。
【０１０７】
シークエンシング反応の手順は、以下の通りである：
ＰＣＲ生成物のシークエンシング反応がＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ＢｉｇＤｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｒｅａｄｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎキット（米国パーキンエルマーバイオシステムズ社製）により行われた後、塩基配列はＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ３７７オートシーケンサー（米国パーキンエルマー社製）により分析された。その手順は、以下の通りである：
（１）シークエンシング反応の鋳型として実施例４で各標本から得たＰＣＲ生成物を使用するために、ＰＣＲ生成物の濃度を、最適に調整する。例えば、長さが１００〜２００ｂｐであるならば、１〜３ｎｇ／μｌが必要であり、そして、長さが２００〜５００ｂｐであるならば、３〜１０ｎｇ／μｌが必要である。
【０１０８】
（２）薄壁マイクロ遠心チューブに、各ＰＣＲ生成物およびプライマー３．２ｐｍｏｌ、８μｌのターミネーターレディリアクションミックス（ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  ｒｅａｄｙ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘ）および滅菌蒸留水（２０μｌまで）を加え、軽く、かつ十分に混合した。
【０１０９】
（３）サイクルシークエンシングは、（２）で得られた混合物に、９６℃１０秒間、５０℃５秒間そして６０℃６分間で２５サイクルを、ＧｅｎｅＡｍｐ  ２７００（米国ＰＥバイオシステムズ社製)により行われる。
【０１１０】
（４）結果として生じる反応物はエタノールによって、沈殿させられ、遠心分離して遊離プライマーおよび前記ターミネーターレディリアクションミックス中の蛍光ラベル化ｄｄＮＴＰを取り除き、そして乾燥される。
【０１１１】
（５）（４）で得られたＤＮＡは、ホルムアミド、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ  ８．０）、ブルーデキストランおよびローディングバッファーと混合する。結果として生じる混合物を５分間の沸騰水で変性させた後、標本は冷蔵庫において、保存される。
【０１１２】
（６）変性ＤＮＡ標本は、あらかじめ成型された５．５％ロングレンジャーゲル（Ｌｏｎｇ  Ｒａｎｇｅｒ  ｇｅｌ）（米国ＭＢＡ社製、カタログＮｏ．５０６１１)のプレートの各ウェルに入れ、２〜４時間電気泳動し、シーケンサーで配列決定される。
【０１１３】
解析結果によれば、ＨＰＶは、全６８ケースの内、６８全てのケースで発見された。発見されたタイプは、すべて、いわゆる高リスクタイプであった。それらの内、ＨＰＶ−１６タイプは３３ケースであり、ＨＰＶ−５８タイプは１２ケースであり、ＨＰＶ−３１タイプは１１ケースであり、ＨＰＶ−１８タイプおよびＨＰＶ−３５タイプは、それぞれ、４ケースであり、ＨＰＶ−３３タイプは３ケースであり、そして、これらの７タイプで９９％を占める。複合感染は、ＰＣＲ−シークエンシングによって、見つけることができなかった。
【０１１４】
ＨＰＶのタイプおよび子宮頸癌の初期の健康診断のため産婦人科クリニックに行った韓国人の女性から試料採取された４，８９８個の頸部スワブ標本のＰＣＲの後、陽性反応を示す１，４１４個の頸部スワブ標本から得た塩基配列解析の結果は表４にまとめられ、それらに相当する実施例を、図７〜２７に示す。
【０１１５】
最後に、ＨＰＶ感染は韓国人の一般の成人女性から試料採取された頸部細胞標本の４，８９８ケースの内、１，０１３ケースにおいて発見され、そして、頻度は２０．６％であった。３５種のタイプを含む発見されたＨＰＶタイプの内、１５タイプは高リスクタイプであり、１１タイプは低リスクタイプであり、４タイプは中リスクタイプであり、そして、５ケースは、不明であった。発見された高リスクタイプは８３８ケース（８２．７％）であり、その頻度は全体として１７．１％であった。結果は、ＨＰＶの高リスクタイプである傾向があった。その理由は、なぜすべての女性が子宮頸癌の初期の健康診断のためのＨＰＶ検査を受けたかということであり、これらの女性の大多数は頸部病変を有する高リスクタイプであった。この状況は、高リスクタイプのＨＰＶを正確に認識することを主な目的とした研究であることと、よく対応すると考えられる。発見されたＨＰＶのタイプに関して、出現頻度は、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−５３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−１８の順であった。ＨＰＶ−１６は、最も一般的であった。この出現順序は、米国および欧州のものと、全く異なる。米国および欧州において、出現頻度は、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３およびＨＰＶ−５８の順序である（例えば、非特許文献１８参照）。
【０１１６】
また、他と異なる点として、前記研究で発見されるＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７の塩基配列中に、韓国において、これまで報告されておらず、米国および欧州のデータベースの正常型塩基配列と異なる多数の変異塩基配列がある。これらのタイプのＨＰＶは子宮頸癌の発症に重要な役割を演ずると考えられる。
【０１１７】
また、実施例３にて説明したように、ＰＣＲの後、シークエンシングによって、頸部細胞スワブ標本を分析するときに、ＨＰＶ  Ｌ１だけを用いた解析によって、ＨＰＶ感染を見つける可能性が５０％以下であったものと理解されることから、注意すべき場合には、ＨＰＶ  Ｌ１およびＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７の組合せ解析によって、ＨＰＶ感染を発見することができる。また、韓国人の女性に特有の塩基配列を、考慮しなければならない。韓国人の女性のＨＰＶ遺伝子型についての詳細な事前調査のこれらの結果は、（１）ＨＰＶのＬ１およびＥ６／Ｅ７の組合せの解析、（２）韓国人女性ＨＰＶの塩基配列を考慮している本発明のＤＮＡチップについての特有の考えの重要な基礎になる。
【０１１８】
【表４】
2008524983.tif 000006
図２６および２７では、電気泳動ピークパターンのピークが、重なっていた。それは、いくつかの異なる鋳型ＤＮＡを分析するとき、言い換えれば、様々なタイプのＨＰＶが混合されたときに現れる現象である。この場合、その部分だけは、ブラスト検索（ｂｌａｓｔ  ｓｅａｒｃｈ）によって確認できる。それはＰＣＲ生成物はクローニングされることを意味し、多数のクローンはシークエンシングにより分析されなければならない。この場合、複合ＨＰＶ感染を分析できるＤＮＡチップは、非常に有益である。実際に、上記のケースのために、ＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−７０（図５１を参照）の複合感染の存在およびＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−５２（図５２を参照）の複合感染は、本発明のＤＮＡチップにより検出された。
【実施例５】
【０１１９】
ＨＰＶ解析のためのクローンの確立
実施例４のＰＣＲの後、それらのＨＰＶタイプがシークエンシング法により確認されたＰＣＲ生成物は、プラスミドベクターおよびＥ．ｃｏｌｉ．を用いてクローンがつくられた。その後、本発明のＤＮＡチップの反応条件を確立するときに、これらのクローンはスタンダードおよびコントロール標本として用いられた。クローニング方法は、以下の通りである：
１）アガロースゲルにおいて、ゲルリカバリーキット（Ｇｅｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｋｉｔ）（米国Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ社製）でＰＣＲ増幅したＥ６／Ｅ７遺伝子およびＬ１遺伝子によって、得たＰＣＲ生成物を分離した後、それらの濃度は、分光計によって、または、アガロースゲル上で決定された。
【０１２０】
２）−２０℃で保存されていたｐＧＥＭＴＭ−Ｔ  イージーベクター（米国Ｐｒｏｍｅｇａ社製、Ａ１３６０）および２ｘラピッドライゲーションバッファー（Ｒａｐｉｄ  Ｌｉｇａｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ）を、指で軽くチューブを振盪することで溶解し、低速で遠心分離し、表５で説明する割合でクローニングするためにＤＮＡを加えて混合し、０．５ｍｌチューブに入れ、それによりライゲーション反応の準備をした。
【０１２１】
【表５】
2008524983.tif 000007
３）各反応液をピペットを用いて完全に混合した後、結合反応は室温で約１時間行われた。多数の生成物が必要とされる場合、結合反応は４℃で一晩行われる。
【０１２２】
４）このような結合されたサンプルは−７０℃で保存されたＪＭ１０９コンピテント細胞（≧１ｘ１０８  ｃｆｕ／μｇ  ＤＮＡ）５０μlに変えられた。
【０１２３】
５）第１に、１．５ｍｌのチューブに、２μｌの結合された生成物、および加える直前に氷浴で溶解されたコンピテント細胞５０μlが加えられた。混合物は完全に混合され、反応は２０分間氷中で行われた。
【０１２４】
６）前記チューブは、４５〜５０秒間、４２℃の水浴恒温槽による熱ショックの直後、２分間氷浴中に置かれた。
【０１２５】
７）前記チューブに室温に設定された９５０μｌのＳＯＣメディウムを加えた後に、それが３７℃で約１時間半振盪機でインキュベーションされた。
【０１２６】
８）培養物の約１００μｌは、ＬＢ／ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎ／ＩＰＴＧ／Ｘ−Ｇａｌプレートに注いだ。プレートを裏返して、１６〜２４時間３７℃で振盪機において、インキュベ−ションした後、コロニー計数が行われた。そして、白いコロニーだけが選択され、３ｍｌのＬＢ／アンピシリン培養液で培養された。プラスミドＤＮＡは、小型のものが準備された。加えたＤＮＡがベクターに正しく挿入されたことは、ＰＣＲまたは制限酵素により確認された。より正確な解析のために、このような手順によって、得られたすべてのクローンは、オートシーケンサーにより分析された。
【実施例６】
【０１２７】
ＤＮＡチップのプローブ設計
本実施例は、ＤＮＡチップに配置されるオリゴヌクレオチドプローブの設計方法を説明する。これは、本発明の要部である。
【０１２８】
韓国人の女性の良性および悪性頸部標本から、ＤＮＡの単離によって、得られた１，０１３個の臨床材料におけるＨＰＶのＥ６／Ｅ７およびＬ１の塩基配列に関する情報を有しており、実施例４および５にて説明したように、ＰＣＲにより確認された巨大なデータベース、および、米国のＨＰＶに関するデータベースを分析した後、各遺伝子において、存在する内部変異は、各人種において、ＨＰＶ遺伝子型およびその頻度に従って分析された。このような手順によって、頸部に侵入している４０種の生殖器タイプのＨＰＶが選択された。ＨＰＶタイプの遺伝子型を分析するためにオリゴヌクレオチドプローブ、および塩基配列を表５にまとめる。
【０１２９】
プローブは遺伝子型特異的なプローブとしてオリゴヌクレオチドプローブを作るように設計され、そして、それは、本発明の目的により、具体的にはＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子のＤＮＡと結合できる。
【０１３０】
第１に、（１）全米バイオテクノロジ−情報センター（ＮＣＢＩ）のＨＰＶデータベース、（２）米国ロスアラモス（ＬＯＳ  ＡＬＡＭＯＳ）のデータベース、そして（３）実施例４で韓国人女性の頸部で見つかった３５タイプのＨＰＶのデータベースである全てのデータベースを一緒にし、ＨＰＶ−１ａ、ＨＰＶ−２ａ、ＨＰＶ−３、ＨＰＶ−４、ＨＰＶ−５、ＨＰＶ−６ｂ、ＨＰＶ−７、ＨＰＶ−８、ＨＰＶ−９、ＨＰＶ−１０、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−１２、ＨＰＶ−１３、ＨＰＶ−１５、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１６ｒ、ＨＰＶ−１７、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−１９、ＨＰＶ−２０、ＨＰＶ−２１、ＨＰＶ−２２、ＨＰＶ−２３、ＨＰＶ−２４、ＨＰＶ−２５、ＨＰＶ−２６、ＨＰＶ−２７、ＨＰＶ−２８、ＨＰＶ−２９、ＨＰＶ−３０、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３２、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３４、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−３５ｈ、ＨＰＶ−３６、ＨＰＶ−３７、ＨＰＶ−３８、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４０、ＨＰＶ−４１、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−４７、ＨＰＶ−４８、ＨＰＶ−４９、ＨＰＶ−５０、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５３、ＨＰＶ−５４、ＨＰＶ−５５、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５７、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−５９、ＨＰＶ−６０、ＨＰＶ−６１、ＨＰＶ−６３、ＨＰＶ−６５、ＨＰＶ−６６、ＨＰＶ−６７、ＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−７０、ＨＰＶ−７２、ＨＰＶ−７３、ＨＰＶ−７５、ＨＰＶ−７６、ＨＰＶ−７７、ＨＰＶ−８０、ＨＰＶ−ＭＭ４、ＨＰＶ−ＭＭ７、ＨＰＶ−ＭＭ８およびＨＰＶ−ＣＰ８３０４を含む全７６タイプのＨＰＶから得られたゲノムＤＮＡの塩基配列が確立された。ＣｌｕｓｔａｌＷ方法で得られたＤＮＡ塩基配列（ペアワイズアライメントおよびマルチプルシーケンスアライメント：ｐａｉｒｗｉｓｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｐｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）にコンピュータプログラムＤＮＡＳＴＡＲ（ＭｅｇＡｌｉｇｎＴＭ  ５，ＤＮＡＳＴＡＲ社製）を実行した後に、系統樹を作成した。グループごとに遺伝子型特異的な塩基配列をスクリーニングした後に、遺伝子型特異プローブは、コンピュータプログラム（ｐｒｉｍｅｒ  ｐｒｅｍｉｅｒ  ５、ＰＲＥＭＩＥＲ  Ｂｉｏｓｏｆｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社製）により設計された。この場合、プローブ長の２０Ａｐおよび１８Ａｐ  ｂｂのオリゴヌクレオチドをセットして、１１０遺伝子型特異プローブを、主に設計した。ＤＮＡプローブの解析標的が、８種の高リスクＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７遺伝子、２０種の高リスクＨＰＶ  Ｌ１遺伝子、１７種の低リスクＨＰＶ  Ｌ１遺伝子および３種の中リスクＨＰＶ  Ｌ１遺伝子を含む全４０タイプのＬ１遺伝子で特徴づけられたＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップおよび診断キットにおいて、高リスクＨＰＶタイプは、ＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−１８、ＨＰＶ−３１、ＨＰＶ−３３、ＨＰＶ−３５、ＨＰＶ−５２、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−６７、ＨＰＶ−２６、ＨＰＶ−３０、ＨＰＶ−３４、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５３、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５７、ＨＰＶ−６６、ＨＰＶ−６８、およびＨＰＶ−７０を含み、低リスクＨＰＶタイプは、ＨＰＶ−６、Ｈ���Ｖ−７、ＨＰＶ−１０、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−２７、ＨＰＶ−３２、ＨＰＶ−４０、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−５４、ＨＰＶ−５５、ＨＰＶ−５９、ＨＰＶ−６１、ＨＰＶ−６２、ＨＰＶ−７２、ＨＰＶ−７３およびＨＰＶ−８３を含み、中リスクＨＰＶタイプは、ＨＰＶ−ＭＭ４／８２、ＨＰＶ−ＭＭ８／８４およびＨＰＶ−ＣＰ８３０４／８１を含む。
【０１３１】
全７６種の異なるタイプのＨＰＶを得るために上記手順により設計された全１１０のプローブの仮想結合能力は、コンピュータプログラムＡｍｐｌｉｆｙ  １．２（ウィスコンシン大学）により分析された。この実施例では、韓国人に共通で、子宮頸癌に密接に関連しているＨＰＶ−１６、ＨＰＶ−５８、ＨＰＶ−３１およびＨＰＶ−３３のプローブが、設計された。次に、プローブを、ＨＰＶ−３９、ＨＰＶ−４５、ＨＰＶ−５１、ＨＰＶ−５６、ＨＰＶ−５９、ＨＰＶ−６１、ＨＰＶ−６８、ＨＰＶ−７０、ＨＰＶ−７３、ＨＰＶ−７４、ＨＰＶ−６、ＨＰＶ−７、ＨＰＶ−１１、ＨＰＶ−３２、ＨＰＶ−３４、ＨＰＶ−４０、ＨＰＶ−４２、ＨＰＶ−４４、ＨＰＶ−５５およびＨＰＶ−６６に遺伝子型特異的結合する能力に従って選択した。名称、配列番号およびタイプは、表６および７にまとめられる。
【０１３２】
【表６】
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【０１３３】
【表７】
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【実施例７】
【０１３４】
ＤＮＡチップの製造
実施例６において、設計されるプローブに従って格子を設計した後に、適切なバッファーと混合されたプローブは、顕微鏡スライドガラスにスポットされた。その後、スライドは適切な処理によって、安定化され、試験まで品質を管理、保存された。
【０１３５】
ＤＮＡチップ作成のための方法は、以下の通りである：
１．ＤＮＡチップに配置されるオーダー（ｏｒｄｅｒ）格子の準備
本発明において、分析された遺伝子型が高リスクタイプか、中リスクタイプか低リスクタイプであるかどうか迅速に、そして、容易に決定するために、グループ化格子が製造された。前記格子のオーダーを、図２８に示す。図２８の通り、ＨＰＶ高リスクタイプの８タイプのＥ６／Ｅ７プローブおよびＨＰＶ高リスクタイプの２０タイプのＬ１プローブを左にスポットし、ＨＰＶ中リスクタイプのＬ１プローブを中心にスポットし、そして、ＨＰＶ低リスクタイプの１７タイプのＬ１プローブを右にスポットした。また、ＤＮＡ分離およびＰＣＲ増幅の適合性を確認するためのヒトβグロブリン遺伝子に特異的であるコーナーマーカー（ｃｏｒｎｅｒ  ｍａｒｋｅｒ）およびオリゴヌクレオチドプローブを、左上部（２プローブ）および中央の上部および下部（２プローブ）および右下部（１プローブ）にスポットした。
【０１３６】
前記ヒトβグロブリン遺伝子に加えて、アクチン、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ遺伝子をスタンダードマーカープローブとして用いることができる。
【０１３７】
各オリゴヌクレオチドプローブは、アレイヤー（ａｒｒａｙｅｒ）を用いてスポットされた。この場合、同じプローブは、ＨＰＶの各遺伝子型が、最低２回、最大４回示されるよう、二通り（ｄｕｐｌｉｃａｔｅ）にスポットされた。本発明において、８種のＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブが加えられた理由は、以下の通りである。第一に、前記８種の遺伝子型は、韓国を含む世界中で最も高い頻度で存在する。第二に、前記８タイプのＨＰＶは、代表的な高リスクタイプであり、子宮頸癌の発症に、密接に関連している。第三に、ＨＰＶの高リスクタイプに対するワクチンを投与する場合にＥ６／Ｅ７の正確な遺伝子型を認識することは、重要である。第四に、Ｌ１遺伝子が、ＰＣＲプロセスの間、遺伝子内変異のためＰＣＲによって、増幅することができないＨＰＶタイプの場合なので、このような問題に対処し、Ｅ６／Ｅ７遺伝子の増幅によって、結果を補償することが必要である。これらの観点は、本発明のＤＮＡチップの重要な基礎になり、本発明のＤＮＡチップのＨＰＶ遺伝子型の解析精度を向上させるために、重要な役割を演ずる。
【０１３８】
一つのＤＮＡチップ上を６〜８区画に分割している格子が反復的に存在していることは、本発明のＤＮＡチップの重要な特徴の一つである。したがって、前記ＤＮＡチップは、６〜８種の異なる標本を一つのチップのみで分析することができ、時間、労働力およびコストの節約に非常に有益である。
【０１３９】
２．マスタープレートへ合成されたオリゴヌクレオチドプローブおよび分配物をスポットすための溶液の準備
実施例に従って合成された、アミンがＣ６部分に結合したオリゴヌクレオチドは、ＨＰＬＣで精製され、第三蒸留水（ｔｈｉｒｄ  ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ  ｗａｔｅｒ）で溶解され、最終濃度が２００ｐｍｏｌ／μｌになるよう調整された。このように準備されたオリゴヌクレオチドプローブは、スポッティング溶液であるマイクロスポッティング溶液プラス（ｍｉｃｒｏ  ｓｐｏｔｔｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐｌｕｓ：米国Ｔｅｌｅｃｈｅｍ社製、ＴＣ−ＭＳＰ）と混合され、濃度が３８ｐｍｏｌ／μｌに調整された。すなわち、７．７μｌの２００ｐｍｏｌ／μｌオリゴヌクレオチドプローブは３２．４μｌのスポッティング溶液と混合され、最終体積４０μｌとした。結果として生じた混合物は、９６ウェルマスタープレートに順番に分配された。
【０１４０】
３．アレイヤーを用いたスライドガラス上へのオリゴヌクレオチドプローブのスポッティング
オリゴヌクレオチドプローブを含むスポッティング溶液は、アレイヤーを用いて特別なコーティングをされたスライドガラスに、前記９６ウェルマスタープレートから二通り（ダブルヒット：ｄｏｕｂｌｅ  ｈｉｔ）にスポット（配列）された。一スポットは、平均約０．００５μｌのプローブ溶液を含んでいた。ＤＮＡチップの基材であるスライドガラスは、スーパーアルデヒドがコーティングされているＢＭＴアルデヒドスライドガラス（韓国Ｂｉｏｔｒｉｘ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）のようなものが望ましい。アレイヤーは、例えばＧＭＳ  ４１７アレイヤー（米国ピン−リングタイプ、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ社製）ＭＧＩＩ（米国バイオロボティクス社製、ＭＡ０１８０１）または同等なものが、望ましい。
【０１４１】
４．スライドガラスのアルデヒド基によって、スポットされたオリゴヌクレオチドプローブのシッフ塩基反応の誘導および後処理
上記の通りにスライドガラスにプローブをスポットすることにより製造されたＤＮＡチップを、湿度が８０％で維持されるガラスジャーに入れて、１５分間、室温で反応させた。反応終了後、固定されたスライドを、乾燥オーブンに入れ、１２０℃で１時間および３０分間焼き、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）溶液で２分間２回洗浄し、９５℃第三蒸留水に３分間浸漬し、固定されたオリゴヌクレオチドプローブを変性し、そして再び第三蒸留水で１分間洗浄した。洗浄後、前記スライドガラスを、１５分間ブロッキング溶液（１ｇのＮａＢＨ４、３００ｍｌのリン酸塩緩衝溶液（ＰＢＳ）、１００ｍｌのエタノール）で低減し、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム溶液を用いて２分間で２回洗浄し、第三蒸留水で２分間２回洗浄し、１分および３０秒間８００ｒｐｍで遠心分離し、水分を除去し、スライドボックスに入れて、デシケータで保存した。
【０１４２】
本発明の結果として生じたＤＮＡチップは、以下の実施例８のような方法によって、品質を管理された。
【実施例８】
【０１４３】
前記ＤＮＡチップ上のハイブリダイゼーション反応および分析条件の確立
ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７およびＨＰＶ  Ｌ１遺伝子およびβグロブリン遺伝子は、実施例５で確立した各ＨＰＶタイプの一つ、二つまたは三つのクローンの様々な組合せ、および濃度で作成した１００種の代用標準物質標本を用いてマルチプレックスＰＣＲで増幅した。適切な条件は、ＰＣＲ生成物をＤＮＡチップに配置し、３回以上ハイブリダイゼーション反応を行い、その後、蛍光スキャナによって、分析することにより確立された。手順は、以下の通りである：
１．ＰＣＲ
ＨＰＶのＥ６／Ｅ７およびＬ１遺伝子およびヒトβグロブリン遺伝子のＰＣＲは、プライマー、すなわちＧＰ６−１、ＨＰＣＲおよびＨＢＢＲの組合せの内、リバースプライマーに、Ｃｙ−５蛍光が用いられてラベルされたオリゴヌクレオチドを供給して、実施例３で説明した手順により行われた。
【０１４４】
Ｃｙ−３、ビオチン結合物質、５−２’−（アミノエチル）アミノ−１−ナフタレン硫酸（ＥＤＡＮＳ）、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、テトラメチルローダミンイソシアネート（ＴＭＲＩＴＣ）、ｘ−ローダミンおよびＴＥＸＡＳ  ＲＥＤを、標識マーカーとして用いることができる。
【０１４５】
２．ハイブリダイゼーション反応
ハイブリダイゼーション反応は、その基板上に様々なオリゴヌクレオチドプローブが固定されたスライドガラス基板上に、ＰＣＲで増幅されたＨＰＶ  ＰＣＲ生成物が配置されることで行われた。１００μｌ灌流８ウェルチャンバー（独国Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ社製）が、ハイブリダイゼーション反応チャンバーとして用いられた。
【０１４６】
Ｅ６／Ｅ７遺伝子、ＨＢＢ遺伝子およびＬ１遺伝子の各増幅産物１０μｌを混合し、第三蒸留水を混合物に加えて最終体積を５０μｌとした。９５℃５分間で変性させた後に、混合物を直ちに３分間の氷中に置いた。その後、５０μｌのハイブリダイゼーション反応液（２ｍｌの２０ｘＳＳＣ、１．７ｍｌの９０％グリセロールおよび６．３ｍｌの５０ｍＭＰＢＳは混合され、最終体積が１０ｍｌに調整された。）を加えて最終体積を１００μｌとした後、スライドガラスに固定されたプローブと、４５℃で３０分間反応させた。
【０１４７】
３．洗浄
ハイブリダイゼーション反応後、前記ＤＮＡチップからウェルカバーを取り、スライドガラスを環境温度で２分間３ｘＳＳＰＥ溶液で洗浄し、再び環境温度で２分間１ｘＳＳＰＥ溶液で洗浄し、その後、環境温度で８００ｒｐｍで１分間および３０秒間スライドガラスを遠心分離し、それを乾燥させた。
【０１４８】
４．スキャン
ハイブリダイゼーションの後、非特異性シグナルを洗浄および遠心分離により取り除いたスライドガラスを、共焦点レーザー蛍光スキャナによってスキャンし、蛍光シグナルおよび画像を分析した。スキャンで使用されたスキャナは、アフィメトリックス４２８アレイスキャナ（米国アフィメトリクス社製）またはスキャンアレイライト（米国パッカードバイオサイエンス社製）またはその同等物を含む。
【実施例９】
【０１４９】
ＤＮＡチップマルチプレックスＰＣＲ増幅での臨床材料の解析は、臨床材料のＤＮＡにおけるＨＰＶの有無、もし存在した場合はＰＣＲ後のシークエンシングによるその遺伝子型の検出が行われた。そして、ＰＣＲ後、生成物は実施例６および７で製造されたＤＮＡチップ上に配置され、ハイブリダイゼーション反応が実施例８の手順で行われた。洗浄後、蛍光スキャナ解析が行われた。前記ＤＮＡチップの感度、特異性および再現性は、このような手順によって、分析できる。
また、ＨＰＶの遺伝子型を診断するための本発明のＤＮＡチップの最適条件は、再び確立された。その結果を図３０〜図５３に示す。
【０１５０】
図３０〜３２は、Ｃａｓｋｉ、ＨｅＬａおよびＫ−５６２各々で合成された３０対のＨＰＶタイププローブを用いたＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション反応結果の写真である。これらの図において、円は、プローブの種類に応じた位置を示す。これらの図に示すように、異なるプローブ間でクロスハイブリダイゼーションは起こらず、ハイブリダイゼーション反応は、具体的にはＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−１８のそれぞれで起こった。
【０１５１】
図３３〜５２は、それぞれ本発明のＤＮＡチップにスポットされた４８対のオリゴヌクレオチドプローブを用いたＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション反応結果の写真である。これらの図において、円は、プローブの種類に応じた位置を示す。これらの図に示すように、プラスミドＤＮＡ増幅生成物によって、生じたハイブリダイゼーションの結果は、クロスハイブリダイゼーションは起こらず、それぞれ固有のプローブでのみ、タイプに特異的な発現が起こったことを示す。
【０１５２】
すなわち、本発明で生成されたＤＮＡチップの４８対の各ＨＰＶタイププローブは、特定のタイプのＨＰＶ  ＤＮＡと特に結合し、クロスハイブリダイゼーションは起こらなかった。加えて、ＨＰＶの少なくとも一つのタイプと混合された複合感染標本は、正確に診断された。すなわち、単一または複合感染ＨＰＶの遺伝子型を診断するために、本発明のＤＮＡチップは、１００％の感度および１００％の特異性を呈した。また、時間をおいて異なる試験者により行われた３回以上の反復試験の同様の結果に関して、前記ＤＮＡチップの再現性は１００％であった。その結果に関して、本発明において、合成された４８対のプローブは、正確に多数のＨＰＶタイプの組合せを分析できると考えられ、ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション反応の例は考慮されなかった。
【０１５３】
特に、図５１は、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型診断のためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナで撮られた写真である。前記増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診でＨＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出されたＤＮＡを用いてＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって、得られた。図５１に示すように、ＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−７０の複合感染が、検出された。この場合、ＨＰＶ−７０だけが第一ダイレクトシークエンシングアッセイで検出され、そして、ＨＰＶ−１８はクローニング後、第二シークエンシングアッセイで更に検出された。しかしながら、本発明のＨＰＶの遺伝子型分析用ＤＮＡチップは、一回のアッセイのみで容易かつ迅速にＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−７０の複合感染を分析できる。
【０１５４】
また、図５２は、頸部上皮内癌の存在がその後生検により確認されたことを証明するケースであり、そして、本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型診断用ＤＮＡチップで増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子を分析した結果を示す蛍光スキャナで撮られた写真である。前記増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子は、子宮頸癌集団検診でＨＳＩＬを示す韓国人女性の頸部スワブ標本から抽出されたＤＮＡを用いてＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子を増幅するトリプレックスＰＣＲによって得られた。図５２に示すように、ＨＰＶ−１６およびＨＰＶ−５２の複合感染が検出された。この場合、ＨＰＶは第一ダイレクトシークエンシング分析において認識することができず、ＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−５２はクローニングの後、第二シークエンシング分析において一緒に検出された。しかしながら、本発明のＨＰＶの遺伝子型分析用ＤＮＡチップは、一回のアッセイのみで容易かつ迅速にＨＰＶ−１８およびＨＰＶ−７０の複合感染を分析できる。
【０１５５】
すなわち、本発明において、製造されたＤＮＡチップは、臨床検査において、頸部スワブ標本から各タイプのＨＰＶを正確に判別できると認識できる。各ＨＰＶタイププローブは特定のタイプのＨＰＶ  ＤＮＡと特に結合され、クロスハイブリダイゼーションは起こらなかった。また、ダイレクトシークエンシングによる診断が困難であり、クローニング後に多くのシークエンシングアッセイによって、認識できる少なくても一つのタイプのＨＰＶが混合された複合感染標本は、正確に診断された。すなわち、単一または複合感染ＨＰＶの遺伝子型を診断するために、本発明のＤＮＡチップは、１００％の感度および１００％の特異性を呈した。また、時間をおいて異なる試験者により行われた３回以上の反復試験の同様の結果に関して、前記ＤＮＡチップの再現性は１００％であった。
【実施例１０】
【０１５６】
ＤＮＡチップ上の臨床材料を分析した後の臨床データの相関分析
子宮頸癌集団検診などによって、得られた臨床データに関する実施例９のＰＣＲの後、ＤＮＡチップを用いた分析によって、得られた結果を比較し、その相関とＤＮＡチップが子宮頸癌または前癌性病変を予測するのに有益であるどうかを分析した。ＤＮＡチップが子宮頸癌スクリーニングと同様に、ＨＰＶの遺伝子型を分析するために有益であるということが証明された。手順は、次の通りである：
第１に、ＨＰＶタイプは、本発明のＤＮＡチップおよびパラフィン包埋６８個の頸部癌組織および４９個の正常頸部組織標本におけるシークエンシング法により分析された。その結果は、高リスクタイプのＨＰＶが全６８個の頸部癌組織において、検出されたことを示した。逆に、正常頸部組織においては、高リスクタイプのＨＰＶは存在せず、低い頻度（５ケース、１０．２％）で低リスクタイプのＨＰＶが存在した。このような結果は、ＤＮＡチップが子宮頸癌の状態を予測することができ、特に子宮頸癌および頸部上皮内癌の選択的な分析に役立つということを証明した。加えて、本発明のＤＮＡチップを用いた分析的研究（予想盲検試験）およびシークエンシング法は、韓国婦人科癌財団（Ｋｏｒｅａｎ  Ｇｙｎｅｃｏｌｏｇｉｃ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ：ＫＧＣＦ）の協力を経て家庭産科（ｄｏｍｅｓｔｉｃ  ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ）に行った成人女性２０人から得られた頸部スワブ標本についての頸部膣頸管検査、頸部スキャン、子宮頸部塗抹標本スクリーニングおよび頸部生検と同時に行われ、その研究の結果を分析した。子宮頸癌集団検診によって、得られた結果、並びにＨＰＶ  ＤＮＡチップ分析およびシークエンシング法によって、得られた結果によるボランティアの生検の相関を、表８に示す。
【０１５７】
その結果は、高リスクタイプのＨＰＶが前癌性病変（ＨＳＩＬおよびＬＳＩＬ両方）と同様に子宮頸癌の単一または複合感染の形で検出されることを示した。逆に、正常頸部組織においては高リスクタイプのＨＰＶは存在しなかった。このような結果もまた、ＤＮＡチップが子宮頸癌の状態を予測することができ、特に子宮頸癌および前癌性病変（ＨＳＩＬおよびＬＳＩＬ両方）の選択的な解析のために有益であるということを証明した。また、前記ＤＮＡチップアッセイが、シークエンシング法で認識することができない複合ＨＰＶ感染を認識できることを再確認された。
【０１５８】
本発明を特にその実施形態を参照して図と共に記述したが、さまざまな形の変更および詳細が以下の請求項に記載の本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく為されることが可能であることは当業者によって、よく理解されるだろう。
【０１５９】
【表８】
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【産業上利用可能性】
【０１６０】
オリゴヌクレオチドプローブ、ＤＮＡチップおよびそれらからなる診断キット、並びにそれらを用いたＨＰＶの遺伝子型分析方法は、頸部で発見され、子宮頸癌、陰部疣贅等の主な原因となる４０タイプのＨＰＶを正確に診断することができ、そのリスクを予測する。本発明の診断は、ＨＰＶのＬ１遺伝子のみを分析することにより引き起こされる問題に対応するため、ＨＰＶのＬ１遺伝子同様にＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子を分析することにより行われるので、その診断の正確さを著しく向上させることができる。また、様々なタイプのＨＰＶによる複合感染を分析できる本発明のＤＮＡチップおよび診断方法は、約１００％の診断感度、診断特異性および再現性を有する。最後に、試験の手順および結果の分析は、非常に容易であり、そして試験のコストは安価である。
【０１６１】
特に、ＨＰＶ遺伝子型診断ＤＮＡチップおよびそれを用いた診断キットは、ＨＰＶ感染の有無、およびその遺伝子型を、迅速、正確および大量に頸部細胞、尿などのような標本で自動的に分析できると考えられる。また、前記ＤＮＡチップは、単独、または従来のＨＰＶ試験を代替して頸部癌および前癌性病変を選別するパパニコロー頸部スクリーニングと一緒に使用することができ、試験時間、労働力、およびコストを節約できる。また、前記ＤＮＡチップは、ＨＰＶ感染したＥ６／Ｅ７の正確な遺伝子型を分析することによって、適切なタイプのワクチンを適用するために有益である。従って、本発明は、子宮頸癌の発生率および死亡率を低下させることによって、国民の健康および福祉を大いなる向上に寄与するため、非常に有益な産業的な有効性を有する。
【０１６２】
本発明は、その実施形態を参照して詳しく図と共に記述したが、さまざまな形の変更および詳細が以下の請求項に記載の本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく為されることが可能であることは当業者によって、よく理解されるだろう。
［シーケンス・リストのテキスト］
配列番号１〜６はＨＰＶまたはβグロブリンの核酸を増幅するためのプライマー塩基配列からなり、配列番号７〜５５はＨＰＶまたはβグロブリンのプローブ塩基配列からなる。シーケンス・リストは、本出願に添付される。
【図面の簡単な説明】
【０１６３】
【図１】２％アガロースゲルで行われた電気泳動により得た、ＨＰＶのＥ６およびＥ７遺伝子の電気泳動写真。
【図２】２％のアガロースゲルで行われた電気泳動により得た、ＨＰＶのＬ１遺伝子の電気泳動写真。
【図３】２％のアガロースゲルで行われた電気泳動により得た、ＨＰＶのＥ６／Ｅ７遺伝子およびヒトβグロブリン（ＨＢＢ）遺伝子の電気泳動写真。
【図４】２％のアガロースゲルで行われた電気泳動により得た、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびヒトβグロブリン（ＨＢＢ）遺伝子の電気泳動写真。
【図５】２％のアガロースゲルで行われた電気泳動により得た、ＨＰＶのＬ１遺伝子およびＥ６／Ｅ７遺伝子の電気泳動写真。
【図６】増幅されたＥ６／Ｅ７遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図７】増幅されたＥ６／Ｅ７遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図８】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図９】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図１０】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図１１】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図１２】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図１３】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図１４】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図１５】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図１６】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図１７】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図１８】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図１９】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図２０】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図２１】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図２２】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図２３】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図２４】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図２５】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図２６】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図２７】増幅されたＬ１遺伝子をＡＢＩプリズム３７７オートシーケンサーで分析した結果を示す電気泳動ピークパターン。
【図２８】本発明の一実施形態によるＤＮＡチップに配置される形式および位置を示す概略図。
【図２９】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップの正面写真。
【図３０】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図３１】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図３２】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す写真。
【図３３】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図３４】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図３５】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図３６】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図３７】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図３８】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図３９】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図４０】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図４１】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図４２】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図４３】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図４４】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図４５】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図４６】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図４７】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図４８】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図４９】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図５０】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図５１】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図５２】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図５３】本発明の一実施形態によるＨＰＶの遺伝子型を診断するためのＤＮＡチップで分析された増幅されたＬ１遺伝子、Ｅ６／Ｅ７遺伝子およびＨＢＢ遺伝子の結果を示す蛍光スキャナによって撮られた写真。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【国際調査報告】
2008524983.tif 000064
2008524983.tif 000065
2008524983.tif 000066