(57)【要約】  以下の工程を含む、ホスフィチル化された化合物の調製方法：−ヒドロキシル含有化合物を、以下の式Ｉを有する活性剤の存在下において、ホスフィチル化剤と共に反応する工程：2008524163.tif 000016ここで、Ｒはアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、Ｒ1、Ｒ2は、Ｈか又は共に５から６員環を形成し、Ｘ1、Ｘ2は、独立にそれぞれＮ又はＣＨであり、Ｙは、Ｈ又はＳｉ（Ｒ4）3であって、Ｒ4はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、Ｂは、脱プロトン化された酸である。該ヒドロキシル含有化合物は、好ましくは糖部分又はヌクレオシド又はこれらから誘導されるオリゴマーである。【選択図】なし
2008524163.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、ホスフィチル化した化合物の調製方法：
−以下の式Ｉを有する活性剤の存在下において、ヒドロキシル含有化合物をホスフィチル化剤と共に反応させる工程：
【化１】
2008524163.tif 000009
ここで、
Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2は、Ｈか又は共に５から６員環を形成し、
Ｘ1、Ｘ2は、独立にそれぞれＮ又はＣＨであり、
Ｙは、Ｈ又はＳｉ（Ｒ4）3であって、Ｒ4はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｂは、脱プロトン化された酸である。
【請求項２】
該活性剤が、以下から成る群より選択される式を有する、請求項１に記載する方法：
【化２】
2008524163.tif 000010
ここで、
Ｙは、請求項１におけるものと同じように定義され、
Ｒは、メチル、フェニル又はベンジルである。
【請求項３】
該ヒドロキシル含有化合物が、糖部分を含む、請求項１又は２に記載する方法。
【請求項４】
該ヒドロキシル含有化合物が、ヌクレオシド又はこれから誘導されるオリゴマーである、請求項１から３のいずれか１項に記載する方法。
【請求項５】
該ヒドロキシル含有化合物が、３’−ヒドロキシル基を有する５’−Ｏ−保護されたヌクレオシド、又は５’−ヒドロキシル基を有する３’−Ｏ−保護されたヌクレオシドである、請求項１から４のいずれか１項に記載する方法。
【請求項６】
該活性剤が、インサイチューで調製され、及び精製を伴うことなく使用される、請求項１から５のいずれか１項に記載する方法。
【請求項７】
該反応が、式Ｉを有する活性剤及び以下の式ＶＩＩＩを有する対応する塩基の混合物の存在下におけるものである、請求項１から６のいずれか１項に記載する方法：
【化３】
2008524163.tif 000011
ここで、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ1、Ｘ2及びＲは、請求項１におけるものと同じように定義される。
【請求項８】
該対応する塩基を、ヒドロキシル含有化合物及びホスフィチル化剤と接触させ、次いで酸Ｈ+Ｂ-が添加される、請求項７に記載する方法。
【請求項９】
該ホスフィチル化剤が、以下の式ＩＩを有する、請求項１から８のいずれか１項に記載する方法：
【化４】
2008524163.tif 000012
ここで、Ｚは脱離基を表し、並びにＲ1及びＲ2は独立に２級アミノ基又はハロゲン原子である。
【請求項１０】
ホスフィチル化剤が、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトである、請求項１から９のいずれか１項に記載する方法。
【請求項１１】
該脱プロトン化した酸が、トリフルオロ酢酸、ジクロロ酢酸、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸（トリフレート）、ｏ−クロロフェノレート及びこれらの混合物から成る群より誘導される、請求項１から１０のいずれか１項に記載する方法。
【請求項１２】
該反応が、アセトンの存在下におけるものである、請求項１から１１のいずれか１項に記載する方法。
【請求項１３】
ホスフィチル化剤を用いた、ヒドロキシル含有化合物のホスフィチル化のための活性剤としての、以下の式Ｉを有する活性剤の使用：
【化５】
2008524163.tif 000013
ここで、
Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2は、Ｈか又は共に５から６−員環を形成し、
Ｘ1、Ｘ2は、独立にＮか又はＣＨであり、
Ｙは、Ｈ又はＳｉ（Ｒ4）3であって、Ｒ4はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｂは、脱プロトン化した酸である。
【請求項１４】
アデノシンホスホルアミダイト、シトシンホスホルアミダイト、グアノシンホスホルアミダイト及びウラシルホスホルアミダイト、デスオキシアデノシンホスホルアミダイト、デスオキシグアノシンホスホルアミダイト、デスオキシチミジンホスホルアミダイト、デスオキシシトシンホスホルアミダイト、加えて各ＸがＡ、ｄＡ、Ｃ、ｄＣ、Ｇ、ｄＧ、Ｕ、ｄＴから選択され及びｎ＝２から８、好ましくは２から６である式Ｘnを有するオリゴヌクレオチドホスホルアミデート、並びに保護基を含むこれらの誘導体の合成のための、請求項１３の使用。
【請求項１５】
以下の式Ｉを有する活性剤：
【化６】
2008524163.tif 000014
ここで、
Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2は、Ｈか又は共に５から６−員環を形成し、
Ｘ1、Ｘ2は、独立にＮか又はＣＨであり、
Ｙは、Ｈ又はＳｉ（Ｒ4）3であって、Ｒ4はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｂは、脱プロトン化した酸であり、
並びに、ピリジン又は以下の式ＶＩＩＩを有する添加剤との１：１から１：１０（モル：モル）のモル比率における混合物：
【化７】
2008524163.tif 000015
ここでＲ、Ｒ1、Ｒ2、Ｘ1、Ｘ2は式Ｉに対するものと同じように定義される。
【請求項１６】
アデノシンホスホルアミダイト、シトシンホスホルアミダイト、グアノシンホスホルアミダイト及びウラシルホスホルアミダイト、デスオキシアデノシンホスホルアミダイト、デスオキシグアノシンホスホルアミダイト、デスオキシチミジンホスホルアミダイト、デスオキシシトシンホスホルアミダイト、加えてＸがＡ、ｄＡ、Ｃ、ｄＣ、Ｇ、ｄＧ、Ｕ、ｄＴから選択され及びｎ＝２から８、好ましくは２から６である式Ｘnを有するオリゴヌクレオチドホスホルアミデート、並びに保護基を含むこれらの誘導体の合成のための、請求項１５の混合物の使用。
【請求項１７】
Ｒx及びＲyが独立にＣ1−Ｃ6アルキルであり、又は共にシクロアルキルを形成する、式Ｒx−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒyを有するケトンの、ホスホルアミダイトの合成における反応媒体又は共溶媒としての使用。
【請求項１８】
該ケトンが、アセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、シクロヘキサノン又はこれらの混合物である、請求項１７に記載する使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
（発明の背景）
本発明は、特定の活性剤を用いたホスフィチル化した（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｅｄ）化合物の調製方法、とりわけホスホルアミダイト（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）の合成に関する。
【０００２】
（発明の背景）
オリゴヌクレオチドは、種々の分野における重要な役割を有する、生命科学において鍵となる化合物である。オリゴヌクレオチドは、例えば、遺伝子発現解析の分野におけるプローブとして、ＰＣＲにおける又はＤＮＡシーケンシングに対するプライマーとして使用される。
さらに、換言すれば、アンチセンスオリゴヌクレオチドを含む潜在的な治療の適用も多く存在する。
多くの化学的な修飾が、オリゴヌクレオチドに対して導入され、診断における、検査薬として及び治療薬としてのそれらの有用性を向上し、例えばヌクレアーゼに対して安定にした。
オリゴヌクレオチドの合成は、液相法及び固相法の両方を用いて達成できる。近年好ましい方法は、固相を介した合成であり、該方法において、オリゴヌクレオチドは、固形物支持体上で調製され、及び該オリゴヌクレオチドはヌクレオチドの逐次的な付加により成長する。
【０００３】
適用件数の増大により、多量のオリゴヌクレオチドが必要となっている；従って、改良された合成方法の開発に対する継続的な必要性が存在する。
一般的な概観に関しては、例えば“Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ−Ｆｒｏｍ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｔｏ Ｔｈｅｒａｐｙ” Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｏｘｆｏｒｄ，１９９７）を参照されたい。
オリゴヌクレオチドの合成におけるビルディングブロックの有名な一の種類は、ホスホルアミダイトである；例えば、Ｓ．Ｌ． Ｂｅａｕｃａｇｅ， Ｍ．Ｈ． Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ １８５９（１９８１）２２を参照されたい。ヌクレオシド、デオキシリボヌクレオシド及び両方の誘導体のこれらホスホルアミダイトは、市場で入手可能である。通常の固相合成において、３’−Ｏ−ホスホルアミダイトが使用されるが、他の合成方法においては５’−Ｏ及び２’−Ｏ−ホスホルアミダイトも使用される。これらヌクレオシドホスホルアミダイトの調製における一の工程は、（保護された）ヌクレオシドのホスフィチル化（ｐｈｏｓｐｈｉｔｙｌａｔｉｎｇ）である。最も通常には、３’−、５’−又は２’−Ｏヒドロキシル基をホスフィチル化する前に、ヌクレオシドにおいて存在するこれら以外のヒドロキシル基及びアミノ基及び他の官能基が保護される。いくつかの経路が、モノマー（ヌクレオシド）及びポリマー（ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド）ホスホルアミダイトの調製に関して周知である。周知の方法は、非常に多くの場合、化学的又は安全性の問題に帰着する。大量のバッチ合成（１００ｋｇ−１０００ｋｇ）に対するこの化学反応の使用については、コスト有効度が向上しなければならない。
【０００４】
伝統的に、ヌクレオシドのホスフィチル化は、ホスフィチル化剤、例えば非常に反応性でかつ活性剤を必要としないクロロ−（２−シアノエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィン、又は活性剤を必要とする２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイト（ビス−ホス又はビス−アミダイト試薬）を用いて、保護されたヌクレオシドを処理することにより行われる。
ホスフィチル化反応において最も普通に用いられる活性剤は、１Ｈ−テトラゾールである。
とりわけラージスケールの合成を行う場合、１Ｈ−テトラゾールの使用での特有の問題が存在する。例えば、１Ｈ−テトラゾールは、爆発性及び毒性のものであるとして公知である。製品安全データシート（ＭＳＤＳ）によると、１Ｈ−テトラゾール（１Ｈ−テトラゾール、９８％）は、吸い込まれ、摂取され又は皮膚を介して吸収された場合、有害となり得る。
さらに、１Ｈ−テトラゾールは高価である。とりわけ、ラージスケールの合成において、１Ｈ−テトラゾールは、オリゴヌクレオチド類の合成コストにおいて、かなりの影響を有する。
【０００５】
該ＭＳＤＳは、１Ｈ−テトラゾールが、その融点である１５５℃より高く加熱された場合爆発し得、及び非常に感受性の高い爆発性の金属化合物を形成するかもしれない事を記載する。容器中におけるラージスケールの合成の場合において、１Ｈ−テトラゾールは、人間及び環境に関する多大な危険を含み得る。
加えて、１Ｈ−テトラゾールがその貯蔵、使用及び廃棄の間、特別な取扱を必要とすることが知られている。
１Ｈ−テトラゾール及び関連した誘導体、例えば５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾール、５−ベンジルチオ−１Ｈ−テトラゾールは、目的分子の分解に関する可能性も有する。従って、酸感受性保護基の開裂が、異なる出版物において報告された（Ｋｒｏｔｚ ｅｔ ａｌ， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ，  １９９７，３８，３８７５）。
酸に不安定な保護基の不注意な脱保護は、クロロ−（２−シアノエトキシ）−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノホスフィンの使用に関しても知られる。使用された保護基の開裂の傾向と無関係に、このホスフィチル化剤が、結果として大量の３’−３’アイソマーに帰着するであろう。結果得られるアミダイトは、時間及びコスト集約的なクロマトグラフィー工程により精製しなければならない。
【０００６】
とりわけ、オリゴマーのホスホルアミダイトのホスフィチル化に対する適用において、公知の方法は、ほとんどが分解又は目的分子及び副生成物の複雑な混合物に帰着した。
ある活性剤を用いたビス−ホスの使用は、モノマーのヌクレオシドアミダイトに関して一般的に知られているが、オリゴヌクレオチドの場合において、該低い反応性はこのアプローチを非常に複雑にした。
該低い反応性は、長い反応時間（２−６ｈ）にも帰着する。長い反応時間を避けることは、膨大に超過したホスフィチル化剤及び活性剤の使用を要求するであろう。最後には、この種の反応の取扱は、付加的な精製工程も要求するであろう。
ＥＰ０９０６９１７Ａ２及びＨａｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０（１９９８）１２３９５−１２４０１は、ホスホルアミダイトの合成のためのイミダゾリウムトリフレートの使用を開示する。該記載された合成の収量及び純度は、繰り返すことができなかった。
【０００７】
加えて、Ｈａｙａｋａｗａの方法は、活性剤の使用が適用され、該活性剤は、別々に調製、単離及び精製された。該水感受性の活性剤の精製後、この活性剤を完全に乾燥した条件下で貯蔵する必要がある。
この活性剤の感受性及び低い反応性は、複雑な取扱に帰着し、アミダイトのラージスケールの合成のためには扱いにくい。
Ｈａｙａｋａｗａのこの活性剤を用いた全ての実験において、結果得られたアミダイトは、コスト集約的なクロマトグラフィー工程により、精製されなければならない。
しかしながら、全ての場合において、ホスフィチル化反応の結果は、不完全かつ能率的ではなく、従って精製工程は常に主要な要件である。
感受性のオリゴヌクレオチドのホスフィチル化は、ほとんどが分解の結果となる。
記載した合成の収量及び純度は、繰り返すことができず、なぜならば使用されたイミダゾリウムトリフレートは、高い求核特性及び高い含水の傾向を有するためである。これら特性は、大量の分解及び加水分解で終わることであろう。該記載された活性剤は、単離され、及びその純粋な形態において使用された。
【０００８】
このアミダイトの合成方法は、目的化合物の精製のためにフラッシュクロマトグラフィーを必要とする。
加えて、Ｈａｙａｋａｗａは、ヌクレオチド間の結合の形成のための化合物を使用した（ヌクレオシドとアミダイトの縮合）。
Ｈｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６１（１９９６）７９９６−７９９７は、ヌクレオシドとホスホルアミダイトの縮合のための、ベンズイミダゾリウムトリフレートの使用を開示する。
Ｈａｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３（２００１）８１６５−８１７６は、ヌクレオシドとホスホルアミダイトの縮合のための、酸／アゾール複合体の使用を開示する。
Ａｒｎｏｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｌｅｃｔ．Ｃｚｅｃｈ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．５４（１９８９）５２３−５３２は、オリゴデオキシリボヌクレオチドの自動化したクロリダイト（ｃｈｌｏｒｉｄｉｔｅ）及びアミダイト合成を開示し、及びとりわけヌクレオシドとホスホルアミダイトの縮合における１−メチルイミダゾールの使用を開示した。
【０００９】
（本発明の概要）
本発明の目的は、少なくともいくつかの先行技術の欠点を克服する、ホスフィチル化された化合物の調製方法を提供することである。
本発明のさらなる目的は、先行技術の活性剤と比較した場合に、向上した特性を有する活性剤を提供することである。
【００１０】
本発明のさらなる目的は、先行技術の活性剤と比較した場合、向上した特性を有する活性剤／添加剤の混合物を提供することである。一側面において、本発明は以下の工程を含むホスフィチル化した化合物の調製方法を提供する：
−以下の式Iを有する活性剤の存在下において、ヒドロキシル含有化合物をホスフィチル化剤と反応させる工程；
【化１】
2008524163.tif 000003
ここで、
Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2は、Ｈか又は共に５から６−員の環を形成し、
Ｘ1、Ｘ2は、独立にＮか又はＣＨであり、
Ｙは、Ｈ又はＳｉ（Ｒ4）3であって、Ｒ4はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｂは、脱プロトン化された酸である。
該活性剤は、化学量論的に若しくは触媒的に（３から５０モル％、好ましくは１０から３０モル％）又は過剰に（最大で３００モル％）使用できる。
【００１１】
好ましい態様において、該活性剤は、以下から成る群より選択される式を有する：
【化２】
2008524163.tif 000004
ここで、
Ｙは、上と同じように定義され、
Ｒは、メチル、フェニル又はベンジルである。
これら活性剤の調製は、例えばＨａｙａｋａｗａ ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２３（２００１）８１６５−８１７６において記載されている。
【００１２】
一態様において、該活性剤は、添加剤との組み合わせにおいて使用される。添加剤は、式Ｉを有するプロトン化されていない形態の化合物、及び他のヘテロ環塩基、例えばピリジンから選択できる。活性剤と該添加剤の間の適切な比率は、１：１から１：１０である。
一の好ましい態様において、該活性剤は、“インサイチュー”方法に従って調製できる。この場合において、該活性剤は単離されず、これは反応の向上した結果に帰着する。目的分子の加水分解又は分解が抑制される。
オリゴヌクレオチド（ジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサ、ヘプタ及びオクタマー）の３’−及び／又は５’−位における高い収率のホスフィチル化のため、該活性剤のインサイチューでの調製及び添加剤を用いた組み合わせが好ましい。
【００１３】
上記のように、ホスフィチル化は、オリゴヌクレオチド及びビルディングブロックホスホルアミダイトの合成においてとりわけ有用である。従って、好ましい態様において、ヒドロキシル含有化合物は、糖部分を含み、例えばヌクレオシド又はこれらから誘導されるオリゴマーである。該ヌクレオシドは、例えば、任意で保護基を含む、アデノシン、シトシン、グアノシン及びウラシル、デスオキシアデノシン、デスオキシグアノシン、デスオキシチミジン、デスオキシシトシン及びこれらの誘導体である。
本発明の方法は、オリゴヌクレオチド（ジ、トリ、テトラ、ペンタ、ヘキサ、ヘプタ及びオクタマー）のホスフィチル化に対して特に有用である。該ホスフィチル化されたオリゴヌクレオチドは、例えば、フラグメント縮合の概念を介した大きいオリゴヌクレオチドの合成に対して使用される。
普通は、該オリゴヌクレオチドは、これらのヘテロ環官能基において、及びホスフィチル化されるべき基を除いたこれらヒドロキシルを有する基において適切に保護されるであろう。典型的には、ジメトキシトリチル、モノメトキシトリチル又はシリル含有保護基（例えばＴＢＤＭＳ）が、５’ＯＨ基に対する保護基として使用され、３’−ＯＨ基のホスフィチル化を許容する。
【００１４】
さらに、該３’−ＯＨ基は、保護基（ＬＥＶ、ＴＢＤＭＳ等）を用いて保護でき、及び脱保護された５’−ＯＨはヌクレオシド又はヌクレオチドの５’−Ｏ−ホスフィチル化を許容するであろう。
該ホスフィチル化の方法は、同一の結果を伴って３’−又は５’−ホスホルアミダイトの合成に対して使用できる。
ホスフィチル化反応の結果として得られる目的分子は、一態様において、ホスホルアミダイトであり、以下の構造を有する：
【化３】
2008524163.tif 000005
Ｚは、脱離基、例えばＣＨ3、Ｃ2Ｈ5、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＮ、パラ−ＣＨ2Ｃ6Ｈ4ＣＨ2ＣＮ、−（ＣＨ2）2-5Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＦ3、−ＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（Ｃ6Ｈ5）2ＣＨ3又は−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）ＣＯＣＦ3を表し、及びここでＲ3は１から約６の炭素を有するアルキルであり；又はＲ3は４から７原子を含み及び窒素、硫黄及び酸素から選択される最大で３つのヘテロ原子を有するヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニル環であり、並びに“化合物”は、ヒドロキシ含有化合物の残部、例えばヌクレオシド、ヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドである。
【００１５】
この場合において、Ｐ（ＩＩＩ）原子は、２つの酸素原子（又は２つのＰ−Ｏ結合を形成し）及び一の窒素原子（一のＰ−Ｎ結合を形成し）と結合し、これらはアミノ基、優先的にジイソプロピルアミン、ジエチルアミン又は他の２級アミンに属する。
【００１６】
他の分子（化合物Ａ）の他のヒドロキシル基とホスホルアミダイトとの縮合反応は、以下の構造を有するホスファイトトリエステルに帰着するであろう：
【化４】
2008524163.tif 000006
この場合において、Ｐ（ＩＩＩ）原子は、３つの酸素原子（３つのＰ−Ｏ結合を形成し）に対する結合を有し、窒素に対しては結合しない。
【００１７】
一般的には、ホスフィチル化剤は、１Ｈ−テトラゾールを用いたホスフィチル化反応におけるものと同じものであることができる。
好ましい態様において、ホスフィチル化剤は以下の式を有する：
【化５】
2008524163.tif 000007
ここで、Ｚは脱離基、例えばＣＨ3、Ｃ2Ｈ5、ＣＨ2Ｃ6Ｈ5、−ＣＨ2ＣＨ2ＣＮ、−ＣＨ2ＣＨ＝ＣＨＣＨ2ＣＮ、パラ−ＣＨ2Ｃ6Ｈ4ＣＨ2ＣＮ、−（ＣＨ2）2-5Ｎ（Ｈ）ＣＯＣＦ3、−ＣＨ2ＣＨ2Ｓｉ（Ｃ6Ｈ5）2ＣＨ3又は−ＣＨ2ＣＨ2Ｎ（ＣＨ3）ＣＯＣＦ3を意味し、並びにＲ1及びＲ2はそれぞれ独立に、２級アミノ基Ｎ（Ｒ3）2を意味し；ここでＲ3は、１から約６の炭素を有するアルキルであり；又はＲ3は４から７原子を含み、及び窒素、硫黄及び酸素から選択される最大で３つのヘテロ原子を有する、ヘテロシクロアルキル又はヘテロシクロアルケニル環である。
【００１８】
典型的なホスフィチル化剤は、２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホロジアミダイトである。
他の好ましいホスフィチル化剤は、参照により取り込まれるＮ．Ｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００３，１２５，８３０７から８３１７において記載されているような、オキサザホスホリジン（ｏｘａｚａｐｈｏｓｐｈｏｌｉｄｉｎｅ）誘導体である。このホスフィチル化剤はオリゴヌクレオチドの合成を許容し、該ヌクレオチド間の結合は、立体選択的な方法においてホスホチオエート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏａｔｅ）に転換する事ができる。該ジアステレオ選択的に合成されたヌクレオチド間のホスホチオエート架橋は、アンチセンス薬品としてのホスホチオエートの使用における有望な効果を有する。
脱プロトン化された酸Ｂ-の適切な例は、トリフレート、トリフルオロアセテート、ジクロロアセテート、メシル、トシル、ｏ−クロロフェノラートである。４．５より低いｐＫａを有する酸が好ましい。好ましくは、これらは低い求核性を有する。
【００１９】
一態様において、該反応は、モレキュラーシーブ又は他の水結合剤の存在下において行われる。一般的には、水は、該反応の間選択された乾燥媒体により排除され又は固定されなければならない。
本発明の活性剤とホスフィチル化剤を組み合わせ、後でヒドロキシル成分を添加することも可能である。該活性剤とヒドロキシル含有化合物を合わせ、及びその後にホスフィチル化剤を添加することも可能である。
添加剤を使用する場合において、該活性剤は、該ホスフィチル化剤が添加される前に、ヒドロキシ化合物と混合される。
該活性剤のインサイチューでの発生のため、制御された反応温度の下における添加剤の添加の後に、該選択された酸が好ましく添加される。
該選択された酸の添加前又は添加後に、該ホスフィチル化剤を添加することができる。
酸及びホスフィチル化剤の添加に関して、該ヌクレオシド成分は、最後又は最初に添加することができる。
【００２０】
好ましい態様において、該活性剤、ヒドロキシル含有化合物及びホスフィチル化剤の対応する塩基が合わせられ、及び該酸が添加されて反応を開始する。
本発明のさらなる目的は、以下の式Ｉを有する活性剤の、ホスフィチル化剤を用いた、ヒドロキシル含有化合物のホスフィチル化のための活性剤としての使用である：
【化６】
2008524163.tif 000008
ここで、
Ｒは、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｒ1、Ｒ2は、Ｈか又は５から６−員環を共に形成し、
Ｘ1、Ｘ2は、独立にＮか又はＣＨであり、
Ｙは、Ｈ又はＳｉ（Ｒ4）3であり、Ｒ4はアルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアルキル、ヘテロアリールであり、
Ｂは、脱プロトン化された酸である。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、活性剤及びプロトン化されていない塩基（添加剤）の組み合わせであり、これらは両方の種の間で平衡物を形成する。結果得られる平衡物は、先行技術の活性剤と比較した場合、向上した特性を示す。
とりわけ、アセトンの使用と合わせて、該活性剤／触媒は、公知の副反応（分解又は３’−３’若しくは５’−５’同族体の形成）を示さないであろう。アセトンは、抽出物及び試薬を溶解する能力も有する。
先行技術に従って、より長い反応時間の場合において、ジイソプロピルアミンの単体分離及び活性化したＢｉｓ−Ｐｈｏｓの存在は、目的化合物の分解に帰着する（脱トリチル化、ＣＥ−開裂、脱プリン化又は他の保護基の開裂）。アセトン及び特定の式の活性剤の存在は、これらの傾向を低下させる。
アセトンの存在は、ホスフィチル化方法の間に遊離する、いかなる量のジイソプロピルアミン（ＤＩＰＡ）の活性を抑える。これは、同じ結果（分解しない）を伴って、より短い及びより長いオリゴヌクレオチドのホスフィチル化に対して使用できる。Ｒx及びＲyが独立にＣ1−Ｃ6アルキルであり又は共にシクロアルキルを形成する、式Ｒx−Ｃ（＝Ｏ）−Ｒyを有する他のケトン化合物も、それらが、例えばα位においてＣＨ2−基を有するアミンの存在下において、エノラートを形成することができる限りは使用できる。
【００２２】
加えて、アセトンの使用は、５’−Ｏ−保護基の開裂を伴うことなく、より長い反応時間を許容する。両方の場合において、アセトンの使用は、異なる保護基を保護して、及び脱プリン化の公知の傾向を避けるであろう。
アセトンは、例えばアセトニトリルと比較して、毒性のよりよい特性及び向上した環境特性も有し、並びに安価である。
従って、さらなる目的は、ホスホルアミダイトの合成における反応媒体又は共溶媒としてのアセトンの使用である。
ある量の添加剤と活性剤の組み合わせは、より長く及び感受性のオリゴヌクレオチド（３’又は５’脱保護された）のホスフィチル化方法のより高い効率を補助する。
典型的には、該試薬の反応性が増加し、２−５分の後に合成を終わらせる。
本発明の方法を用いることにより、付加的な精製工程は必要とされれないであろう。
結果得られたモノマー及びオリゴマーのアミダイトは、オリゴヌクレオチドの固相及び液相合成に対して使用できる。
【００２３】
該活性剤又は活性剤／添加剤の組み合わせは、とりわけ、アデノシンホスホルアミダイト、シトシンホスホルアミダイト、グアノシンホスホルアミダイト及びウラシルホスホルアミダイト、デスオキシアデノシンホスホルアミダイト、デスオキシグアノシンホスホルアミダイト、デスオキシチミジンホスホルアミダイト、デスオキシシトシンホスホルアミダイト、加えて、各XがＡ、ｄＡ、Ｃ、ｄＣ、Ｇ、ｄＧ、Ｕ、ｄＴから選択され、ｎが２から３０、好ましくは２から１２、より好ましくは２から８又は２から６である式Ｘnを有したオリゴヌクレオチドホスホルアミデート、並びに保護基を含むこれらの誘導体の合成において有用である。
本明細書において使用するものとして、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオシド群、オリゴヌクレオチド類似体、修飾したオリゴヌクレオチド、ヌクレオチド模倣薬並びにＲＮＡ及びＤＮＡの形態にある同様のものも含む。一般的に、これら化合物は、架橋したモノマーのサブユニットの骨格を含み、各架橋したモノマーのサブユニットは、直接的又は間接的に、ヘテロ環塩基部分に対して結合する。モノマーのサブユニット群を合わせる架橋、モノマーのサブユニット及びヘテロ環塩基部分は、結果得られる化合物に対する多数の目的に関する原因を与える構造において可変であることができる。
【００２４】
本技術における公知の修飾は、ヘテロ環塩基、糖又はモノマーのサブユニット群をつなぐ結合の修飾である。ヌクレオチド間の結合の変化は、例えばＷＯ２００４／０１１４７４のページ１１の下から記載されており、これは参照により取り込まれる。
典型的な誘導体は、ホスホルチオエート、ホスホロジチオエート、メチル及びアルキルホスホネート及びホスホノアセト誘導体である。
さらに典型的な修飾は、糖部分でのものである。リボースが異なる糖により置換されるか、又は１以上の位置が、他の基、例えばＦ、Ｏ−アルキル、Ｓ−アルキル、Ｎ−アルキルで置換される。好ましい態様は、２’−メチル及び２’−メトキシエトキシである。全てのこれら修飾は、本技術において公知である。
ヘテロ環塩基部分について、本技術において使用される多くの他の合成塩基、例えば５−メチル−シトシン、５−ヒドロキシ−メチル−シトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−又は２−アルキル誘導体、２−チオウラシルが存在する。該修飾は、ＷＯ２００４／０１１４７４の２１ページから記載されている。
【００２５】
合成において使用された場合、これら塩基は、通常、保護基、例えばＮ−６−ベンジルアデニン、Ｎ−４−ベンジルシトシン又はＮ−２−イソブチリルグアニンを有する。一般的には、さらなる反応において反応することを意図しない全ての反応基、とりわけ糖のヒドロキシル基が保護されなければならない。
オリゴヌクレオチドホスホルアミダイトの合成に関する態様において、反応媒体か又は他の溶媒に対する共溶媒として使用することができる、アセトン又は他のケトン類、例えばアセトン、ブタノン、ペンタノン、ヘキサノン、シクロヘキサノンの存在下において反応を行うことが有用である。
本発明は、以下の制限されない例により、さらに説明される。
【００２６】
（例１）
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｔ−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
５．０ｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｔ−３’−ＯＨ（９．２ｍｍｏｌ、１．０当量）及び２．３４ｇのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（１１．９ｍｍｏｌ、１．３当量）を、１００ｍｌジクロロメタン中に溶解し、次いで３ｇのモレキュラーシーブ３Åを添加し、該混合物を１０分攪拌した。３．８ｍｌの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１１．９ｍｍｏｌ、１．３当量）を添加する。該反応を、２時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：９５％。
（例２）
ベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
３２２ｍｇのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（１．６４ｍｍｏｌ、１．０５当量）及び１．０ｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−３’−ＯＨ（１．５６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、１０ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、及び５００ｍｇのモレキュラーシーブ３Åを添加する。３０分後、０．５２ｍｌの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１．６４ｍｍｏｌ、１．０５当量）及び０．１ｍｌのアセトンを、攪拌した該溶液に対して添加する。反応を３０分後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：７４％。
【００２７】
（例３）
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＣBz−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
９．５１ｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＣBz−３’−ＯＨ（１５ｍｍｏｌ、１．０当量）を、８０ｍｌアセトン及び８０ｍｌアセトニトリル中に溶解する。６．１７ｇのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（３２ｍｍｏｌ、２．１当量）及び９．６４ｇの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（３２ｍｍｏｌ、２．１当量）を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を３０分後完結する。５００ｍｌの酢酸エチルを添加し、該溶液を２５０ｍｌのＮａＨＣＯ3−溶液で２回、及び２５０ｍｌの食塩水で抽出する。該有機層をＭｇＳＯ4を用いて乾燥し、乾燥するまで蒸発させる。該残渣を４０ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、２５０ｍｌのペンタンを添加し、上澄みをデカンテーションし、及び該残渣を減圧下で乾燥して、無色の泡を形成する。収率（１２．０ｇ、１４．４ｍｍｏｌ）：９６％、純度（ＨＰＬＣにより決定）：９３％。
（例４）
ベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＡBz−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
３８ｍｇのベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（０．１４ｍｍｏｌ、１．５当量）を、５ｍｌのアセトニトリルに溶解し、次いで３００ｍｇのモレキュラーシーブ３Åを添加する。１４５μｌの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．４６ｍｍｏｌ、５．０当量）を添加する。３０分後、６１ｍｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＡBz−３’−ＯＨ（０．０９ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、次いで該溶液を一晩攪拌する。該反応を１７時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：９１％。
【００２８】
（例５）
触媒量のメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＣBz−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
５００ｍｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＣBz−３’−ＯＨ（０．７９ｍｍｏｌ、１．０当量）を、１８ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、及び１ｍｌのＤＭＦ、３ｇのモレキュラーシーブ３Åを添加する。５０ｍｇのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（０．１７ｍｍｏｌ、０．２当量）及び２７６μｌの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．８７ｍｍｏｌ、１．１当量）を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を、２４時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：８９％。
（例６）
触媒量のベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
５ｍｇのベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（０．０２ｍｍｏｌ、０．２当量）を、５ｍｌのアセトニトリル中に溶解し、次いで３００ｍｇのモレキュラーシーブ３Åを添加する。１４５μｌの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．４６ｍｍｏｌ、５．０当量）を、攪拌した該溶液に対して添加する。１時間後、６０ｍｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−３’−ＯＨ（０．０９ｍｍｏｌ、１．０当量）を添加し、該溶液を一晩攪拌する。該反応を４８時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：９０％。
【００２９】
（例７）
触媒量のベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｔ−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
５０ｍｇのベンジル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（０．１８ｍｍｏｌ、０．１８当量）及び５００ｍｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｔ−３’−ＯＨ（０．９２ｍｍｏｌ、１．０当量）を２８ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、３ｇのモレキュラーシーブ３Åを添加する。３５０μｌの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１．０ｍｍｏｌ、１．１当量）を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を２５時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：９０％。
（例８）
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｔ−Ｐ（Ｓ）−ｄＣBz−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
１００ｍｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｔ−Ｐ（Ｓ）−ｄＣBz−３’−ＯＨ（０．１０ｍｍｏｌ、１．０当量）及び２４．４ｍｇのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（０．１１ｍｍｏｌ、１．１当量）を１０ｍｌのジクロロメタン中に溶解し、２００ｍｇのモレキュラーシーブ４Åを添加する。３２μｌの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．１０ｍｍｏｌ、１．０当量）を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を２４時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：６０％。
【００３０】
（例９）
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＣBz−Ｐ（Ｓ）−ｄＧiBu−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
１００ｍｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＣBz−Ｐ（Ｓ）−ｄＧiBu−３’−ＯＨ（０．０９ｍｍｏｌ、１．０当量）、及び１７．８ｍｇのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（０．０９ｍｍｏｌ、１．０当量）を１０ｍｌジクロロメタン中に溶解し、２００ｍｇのモレキュラーシーブ４Åを添加する。２８μｌの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．０９ｍｍｏｌ、１．０当量）を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を３時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：５６％。
（例１０）
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−Ｐ（Ｏ）−ｄＧiBu−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
１０６ｍｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−Ｐ（Ｏ）−ｄＧiBu−３’−ＯＨ（０．１０ｍｍｏｌ、１．０当量）及び３０ｍｇのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（０．１５ｍｍｏｌ、１．５当量）を１０ｍｌのアセトン中に溶解し、５００ｍｇのモレキュラーシーブ３Åを添加する。３０分後、３４μｌの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（０．１１ｍｍｏｌ、１．１当量）を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を４時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：５５％。
【００３１】
（例１１）
メチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテートを用いた、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｔ−Ｐ（Ｓ）−ｄＣBz−Ｐ（Ｓ）−Ｔ−Ｐ（Ｓ）−ｄＣBz−Ｐ（Ｓ）−ｄＣBz−Ｐ（Ｓ）−ｄＣBz−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
１０ｍｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−Ｔ−Ｐ（Ｓ）−ｄＣBz−Ｐ（Ｓ）−Ｔ−Ｐ（Ｓ）−ｄＣBz−Ｐ（Ｓ）−ｄＣBz−Ｐ（Ｓ）−ｄＣBz−３’−ＯＨ（３．６μｍｏｌ、１．０当量）及び１．４ｍｇのメチル−イミダゾリウム−トリフルオロアセテート（７．２μｍｏｌ、２．０当量）を、０．５ｍｌのアセトン及び０．５ｍｌのアセトニトリル中に溶解し、５０ｍｇのモレキュラーシーブ３Åを添加する。３０分後、５．８μｌの２−シアノエチルＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１８．１μｍｏｌ、５．０当量）を、攪拌した該溶液に対して添加する。該反応を５時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：７１％。
（例１２）
Ｎ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートのインサイチューでの発生を介した５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＴ−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
１．００ｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＴ−３’−ＯＨ（１．８４ｍｍｏｌ、１．０当量）を、２ｍｌのジクロロメタン及び２ｍｌのアセトン中に溶解する。３００ｍｇのＮ−メチルイミダゾール（３．６８ｍｍｏｌ、２９１μｌ、２．０当量）及び６６５ｍｇの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（２．２１ｍｍｏｌ、７００μｌ、１．２当量）を、続いて１．００ｇのモレキュラーシーブ３Åを添加する。この攪拌した懸濁液に対して、１ｍｌジクロロメタン中の２３０ｍｇのトリフルオロ酢酸（２．０２ｍｍｏｌ、１５９μｌ、１．１当量）を滴下して添加する。該反応を３時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：９９％。
【００３２】
（例１３）
Ｎ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートのインサイチューでの発生を介した、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
１．００ｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−３’−ＯＨ（１．５６ｍｍｏｌ、１．０当量）を２ｍｌジクロロメタン及び２ｍｌアセトン中に溶解する。２５５ｍｇのＮ−メチルイミダゾール（３．１１ｍｍｏｌ、２４７μｌ、２．０当量）及び５６３ｍｇの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１．８７ｍｍｏｌ、５９３μｌ、１．２当量）を、次いで１．００ｇのモレキュラーシーブ３Åを添加する。この攪拌した懸濁液に対して、１ｍｌジクロロメタン中の１９５ｍｇのトリフルオロ酢酸（１．７２ｍｍｏｌ、１３５μｌ、１．１当量）を滴下し添加する。該反応を５時間後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：８８％。
（例１４）
Ｎ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート−Ｎ−メチルイミダゾール混合物を用いた、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
１．００ｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−３’−ＯＨ（１．５６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、２ｍｌのジクロロメタン及び２ｍｌのアセトン中に溶解する。２．００ｇのモレキュラーシーブ３Å、３６７ｍｇのＮ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート（１．８７ｍｍｏｌ、１．２当量）及び３８３ｍｇのＮ−メチルイミダゾール（４．６８ｍｍｏｌ、３７１μｌ、３．０当量）を、続いて５６３ｍｇの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１．８７ｍｍｏｌ、５９３μｌ、１．２当量）を添加する。該反応を２０分後完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：９０％。
【００３３】
（例１５）
Ｎ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート−Ｎ−メチルイミダゾール混合物を用いた、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＣBz−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
１．００ｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＧiBu−３’−ＯＨ（１．５６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、２ｍｌのジクロロメタン及び２ｍｌのアセトン中に溶解する。２．００ｇのモレキュラーシーブ３Å、３６７ｍｇのＮ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート（１．８７ｍｍｏｌ、１．２当量）及び３８３ｍｇのＮ−メチルイミダゾール（４．６８ｍｍｏｌ、３７１μｌ、３．０当量）を、次いで５６３ｍｇの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１．８７ｍｍｏｌ、５９３μｌ、１．２当量）を添加する。該反応を２０分後完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：９０％。
（例１６）
メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートのインサイチューでの発生を介した、５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＣBz−Ｐ（Ｏ）−ｄＡBz−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
１００ｍｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＣBz−Ｐ（Ｏ）−ｄＡBz−３’−ＯＨ（９０．７μｍｏｌ、１．０当量）を、２００μｌのジクロロメタン及び２００μｌのアセトン中に溶解する。１５ｍｇのＮ−メチルイミダゾール（１８０μｍｏｌ、１４μｌ、２．０当量）及び５４．６ｍｇの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１８１μｍｏｌ、５７μｌ、２．０当量）を、続いて１００ｍｇのモレキュラーシーブ３Åを添加する。この攪拌した懸濁液に対して、ジクロロメタン中における１Ｍのトリフルオロ酢酸溶液１００μｌを滴下して添加する。該反応を３０分後完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：９０％。
【００３４】
（例１７）
Ｎ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートを用いた、５’−Ｏ−ホスホルアミダイト−ｄＴ−Ｐ（Ｏ）−ｄＧiBu−Ｐ（Ｏ）−ｄＧiBu−３’−Ｏ−Ｌｅｖの合成
２．０ｇの５’−ＨＯ−ｄＴ−Ｐ（Ｏ）−ｄＧiBu−Ｐ（Ｏ）−ｄＧiBu−３’−Ｏ−Ｌｅｖ（１．６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、８０ｍｌのアセトン中に溶解し、５００ｍｇのメチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート（２．５ｍｍｏｌ、１．５６当量）及び４．０ｇのモレキュラーシーブ３Åを添加した。２．７６ｍｌの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（２．６２ｇ、８．７ｍｍｏｌ、５当量）を添加して、及び３０分の攪拌後、ホスホルアミダイトを３００ｍｌのｎ−ヘプタンの添加により沈殿させた。収率（ＨＰＬＣにより決定）：７２％。
（例１８）
Ｎ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートを用いた、５’−Ｏ−ホスホルアミダイト−ｄＣBz−Ｐ（Ｏ）−ｄＡBz−３’−Ｏ−Ｌｅｖの合成
１．０ｇの５’−ＨＯ−ｄＣBz−Ｐ（Ｏ）−ｄＡBz−３’−Ｏ−Ｌｅｖ（１．１ｍｍｏｌ、１．０当量）及び３２６ｍｇのメチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート（１．６６ｍｍｏｌ、１．５当量）を、８ｍｌアセトン及び１０ｍｌジクロロメタン中に溶解して、次いで２．０ｇのモレキュラーシーブ３Åを添加した。７００μｌの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（６６４ｍｇ、２．２ｍｍｏｌ、２当量）を添加して、１時間の攪拌後、該ホスホルアミダイトを５０ｍｌのｎ−ヘプタンを添加することにより沈殿させた。収率（ＨＰＬＣにより決定）：７８％。
【００３５】
（例１９）
Ｎ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートを用いた、５’−Ｏ−ホスホルアミダイト−Ｔ−Ｐ（Ｏ）−ｄＣBz−Ｐ（Ｏ）−ｄＣBz−Ｐ（Ｏ）−ｄＣBz−３’−Ｏ−Ｌｅｖの合成
２０ｍｇの５’−ＨＯ−Ｔ−Ｐ（Ｏ）−ｄＣBz−Ｐ（Ｏ）−ｄＣBz−Ｐ（Ｏ）−ｄＣBz−３’−Ｏ−Ｌｅｖ（１１．６μｍｏｌ、１．０当量）及び４．３ｍｇのＮ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート（２２μｍｏｌ、１．９当量）を、２ｍｌアセトン中に溶解し、及び４０ｍｇのモレキュラーシーブ３Åを添加した。１５μｌの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（１４ｍｇ、４７μｍｏｌ、４当量）を添加し、１時間の攪拌後、該ホスホルアミダイトを、３ｍｌのｎ−ヘプタンを添加することにより沈殿させた。収率（ＨＰＬＣにより決定）：８６％。
（例２０）
Ｎ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートを用いた、５’−Ｏ−ＴＢＤＰＳ−ｄＴ−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
５１０ｍｇの５’−Ｏ−ＤＭＴｒ−ｄＴ−３’−ＯＨ（１．０６ｍｍｏｌ、１．０当量）を、２０ｍｌのアセトン中に溶解し、及び２５１ｍｇのＮ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート（１．２７ｍｍｏｌ、１．２当量）、１．０ｇのモレキュラーシーブ３Å及び３８３ｍｇの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（４０３μｌ、１．２７ｍｍｏｌ、１．２当量）を攪拌下で添加する。該反応を３０分後完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：８８％。
【００３６】
（例２１）
Ｎ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテートを用いた、５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ｄＧiBu−３’−Ｏ−ホスホルアミダイトの合成
１ｍｇの５’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ−ｄＧiBu−３’−ＯＨ（２．２１ｍｍｏｌ、１．０当量）を２０ｍｌのアセトン中に溶解し、次いで８７５ｍｇのＮ−メチルイミダゾリウムトリフルオロアセテート（４．４２ｍｍｏｌ、２当量）、２．０ｇのモレキュラーシーブ３Å及び３．３３ｇの２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトライソプロピルホスホルジアミダイト（３．５ｍｌ、１１ｍｍｏｌ、５当量）を攪拌下で添加する。該反応を３０分後に完結する。収率（ＨＰＬＣにより決定）：８８％。
【国際調査報告】
2008524163.tif 000017
2008524163.tif 000018
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