(57)【要約】  本発明は、ダッフィ抗原ケモカイン受容体及びその使用に関するものである。１つの実施態様では、本発明は血管形成を阻害する薬物候補のスクリーニング方法を提供する。この方法は、分子をダッフィ抗原ケモカイン受容体と接触させ、前記分子がダッフィ抗原ケモカイン受容体と結合するかどうかを決定することを含む。別の実施態様では、本発明は腫瘍成長を阻害する方法を提供する。さらに別の実施態様では、本発明は血管形成を阻害する方法を提供する。別の実施態様では、本発明は腫瘍壊死を促進する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
血管形成を阻害する薬物候補のスクリーニング方法であって、
（ｉ）分子をダッフィ抗原ケモカイン受容体と接触させ、及び
（ii）前記分子がダッフィ抗原ケモカイン受容体と結合するかどうかを決定することを含み、
ダッフィ抗原ケモカイン受容体と結合する分子が血管形成を阻害する薬物候補である、前記方法。
【請求項２】
さらに、薬物候補が血管形成を阻害するかどうかを決定することを含む請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記分子が小分子である、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記分子が生体分子である、請求項１記載の方法。
【請求項５】
生体分子がポリアミノ酸である、請求項４記載の方法。
【請求項６】
それを必要とする哺乳動物における腫瘍成長を阻害する方法であって、哺乳動物に血管形成ケモカインのダッフィ抗原ケモカイン受容体との結合を阻害する分子を有効量投与することを含む前記方法。
【請求項７】
前記分子がダッフィ抗原ケモカイン受容体と結合する、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記分子が生体分子である、請求項６記載の方法。
【請求項９】
生体分子がポリアミノ酸である、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
ポリアミノ酸がダッフィ抗原ケモカイン受容体の抗体である、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
哺乳動物がヒトである、請求項６記載の方法。
【請求項１２】
ケモカインがCXCケモカインである、請求項６記載の方法。
【請求項１３】
CXCケモカインがCXC/ELR+ケモカインである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
ケモカインがCCケモカインである、請求項６記載の方法。
【請求項１５】
それを必要とする哺乳動物における血管形成を阻害する方法であって、哺乳動物に血管形成ケモカインのダッフィ抗原ケモカイン受容体との結合を阻害する分子を有効量投与することを含む前記方法。
【請求項１６】
それを必要とする哺乳動物における腫瘍壊死を促進する方法であって、哺乳動物に血管形成ケモカインのダッフィ抗原ケモカイン受容体との結合を阻害する分子を有効量投与することを含む前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は2004年10月21日に出願された米国仮出願第60/620993号の優先権を主張する（その明細書は参照によりそっくりそのまま本明細書に組み込まれるものとする）。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ダッフィ血液型タンパク質は７つの膜貫通領域ケモカイン受容体ファミリーのメンバーである（Chaudhuri et al., PNAS, 1993, 90:10793-10797）。前記タンパク質はケモカイン（例えば、CXC及びCCケモカイン）を束縛することができる。したがって、前記タンパク質はダッフィ抗原ケモカイン受容体（DARC）とも呼ばれる（Chaudhuri et al., J Biol Chem. 1994, 269:7835-7838 and Horuk et al., Immunol Today 1994, 15:169-174）。
赤血球細胞で発現されることに加えて、DARCは内皮細胞にも存在する。例えば、DARCは肝臓、肺、甲状腺及び脾臓のようないくつかの非赤血球系器官の微小血管内皮細胞に存在し、同様に肺及び腎臓集合管の上皮細胞にも存在する（Chaudhuri et al., Blood 1997, 89:701-712）。脳のプルキンエ細胞もDARCを含む（Horuk et al., J Leukocyte Biol. 1996, 59:29-38）。
血管形成は新しい血管を発生させるプロセスである。このプロセスは既存の血管からの毛細血管内皮細胞の増殖、遊走及び組織浸潤に関するものである。しかしながら、血管内皮は、健康な成人では、通常静止状態であり、その活性化は血管形成の際に厳しく制御されている。
血管形成は胚発生、濾胞成長及び創傷治癒などの正常な生理的プロセスにおいて重要であり、同様に腫瘍成長、転移、異常な眼性血管形成、関節炎、乾癬及び女性生殖系のいくつかの障害においても重要である。例えば、成長腫瘍は、腫瘍に栄養分を供給するために急速に成長する脈管構造を必要とすることが報告されている。このように、血管形成の制御及び/又は阻害は病理学的状態（例えば、癌）において有益である。
【０００３】
ケモカイン受容体ファミリーのリガンドは走化性サイトカインであり、ケモカインとも呼ばれる。ケモカインは、２つのジスルフィド結合を形成する４つの高保存Cys残基を一般に含むペプチドである（Baggiolini et al., New England Journal of Medicine 1998, 338:436-445）。サイトカインには、いくつかのファミリーが存在する。２つの最も大きなファミリーはCXCケモカイン及びCCケモカインである。他のケモカインファミリーとしては、Cケモカイン及びCX3Cケモカインなどが挙げられる。
ケモカインのCXCファミリーは、任意のアミノ酸によって分離されたペプチドアミノ末端に２つの高保存Cys残基を含む。CCファミリーに属するケモカインは互いに近接する２つのCys残基を有する。
ケモカインは多くの標的細胞でケモカイン受容体と結合することによって細胞遊走及び活性化を誘導する。ケモカインは種々の疾病に関与することが報告されている。レビューのために、Luster, New England Journal of Medicine 1998, 338:436を参照のこと。
いくつかのケモカイン（IL-8など）は、血管形成において促進効果を有することが報告されている（Dawson et al., Blood 2000, 96:1681-1684）。例えば、Debsailletsら（J. Exp. Med. 1997, 186:1201-1212）は、増大したIL-8がDARCと結合することによって脈管形成を直接及び/又は間接的に促進するかどうかを調べた。著者らは、さらにインビボ研究により、IL-8及び他の血管形成ケモカインが血管形成応答への本質的な寄与体であるかどうか、及びこの応答がDARCによって媒介されるかどうかを証明する必要があると結論付けている。
【０００４】
さらに、Gershengornの米国特許第6,365,356号明細書には、血管形成及びアンギオスタシス（angiostasis）のシグナルを伝達する細胞が内皮細胞におけるDARC及びケモカイン受容体の同時発現に関係していることが報告されている。しかしながら、DARCの正確な機能は報告されていない。
さらに、最近の文献に、DARCを発現する腫瘍において、腫瘍壊死の増加及び腫瘍関連血管形成の減少が報告された。Addisonら（BMC Cancer, 2004, 4:28）を参照のこと。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
血管形成におけるDARCの役割について記載された上記参考文献の中で、Debsailletsらは、さらにインビボ研究が必要であると報告しており、GershengornはDARCの正確な機能を報告しておらず、Addisonらは、DARCを発現する腫瘍が腫瘍関連血管形成の減少を示すことを報告している。このように、血管形成におけるDARCの役割は明らかではない。
血管形成及び腫瘍成長を阻害するための、及び腫瘍壊死を促進するための改善された方法が必要とされている。また、血管形成を阻害する薬物候補を発見するためのスクリーニング方法が必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要約）
これらの、及び他の目的は、血管形成を阻害する薬物候補のスクリーニング方法を提供する本発明によって達成された。この方法は、分子をダッフィ抗原ケモカイン受容体と接触させ、前記分子がダッフィ抗原ケモカイン受容体と結合するかどうかを決定することを含む。ダッフィ抗原ケモカイン受容体と結合する分子は、血管形成を阻害する薬物候補である。
別の実施態様では、本発明はそれを必要とする哺乳動物における腫瘍成長を阻害する方法を提供する。この方法は、哺乳動物に血管形成ケモカインのダッフィ抗原ケモカイン受容体との結合を阻害する分子を有効量投与することを含む。
さらに別の実施態様では、本発明はそれを必要とする哺乳動物における血管形成を阻害する方法を提供する。この方法は哺乳動物に血管形成ケモカインのダッフィ抗原ケモカイン受容体との結合を阻害する分子を有効量投与することを含む。
別の実施態様では、本発明はそれを必要とする哺乳動物における腫瘍壊死を促進する方法を提供する。この方法は哺乳動物に血管形成ケモカインのダッフィ抗原ケモカイン受容体との結合を阻害する分子を有効量投与することを含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００７】
（発明の詳細な説明）
本発明は、DARCの阻害剤が腫瘍成長及び血管形成を阻害するという本発明者による予想外の発見に基づいている。また、本発明者は、DARCの阻害剤が腫瘍壊死を促進することを思いがけなく発見した。
【０００８】
（腫瘍成長の阻害）
１つの実施態様では、本発明はそれを必要とする哺乳動物における腫瘍成長を阻害する方法を提供する。腫瘍成長を阻害することが必要な哺乳動物は腫瘍で苦しむ哺乳動物である。血管形成を必要とするどんなタイプの腫瘍も本発明の方法に従って治療できる。
腫瘍は、典型的には過剰な細胞分裂に一般に起因する組織又は細胞の異常な塊である。腫瘍は任意の組織又は細胞から生じ得る。組織又は細胞の例としては、上皮細胞、内分泌組織、骨細胞、前立腺細胞、脳組織、腎細胞、肺細胞、乳房組織、卵巣組織、結腸組織、網膜組織などが挙げられる。腫瘍は良性（癌性ではない）又は悪性（癌性）であり得る。本発明の方法は、腫瘍が悪性である場合に特に効果的である。
腫瘍成長を阻害する方法は、血管形成ケモカインのDARCへの結合を阻害する有効量の分子を哺乳動物に投与することを含む。DARCは当業者によく知られている。DARCの簡単な説明についての背景セクションを参照のこと。
本発明の方法で阻害されるDARCは任意の細胞、特に内皮細胞及び上皮細胞に存在する任意のDARCであってもよい。内皮細胞の例としては、これに限定されないが、静脈内皮細胞、動脈内皮細胞及び微小血管内皮細胞などが挙げられる。上皮細胞の例としては、肺胞及び集合管の細胞などが挙げられる。
【０００９】
DARCはケモカイン、特に血管形成ケモカインと結合できる。本明細書で用いられる「血管形成ケモカイン」という用語は、血管形成を刺激又は促進するケモカインを意味する。血管形成ケモカインは、ケモカイン（例えば、C、CC、CXC及びCX3C）の任意のファミリーに属することができる。
DARCと結合することができ、血管形成であるCCケモカインの例としては、これに限定されないが、単球走化性タンパク質-1（MCP-1、CCL2としても知られる）、MPC-3（CCL7）、ランテス（CCL5）及びエオタキシン（CCL11）などが挙げられる。
CXCケモカインはそのアミノ末端に配列Glu-Leu-Arg（ELR）を含むペプチド（ELR+）及び含まないペプチド（ELR-）に細分され得る。一般に、血管形成CXCケモカインはELR+である。DARCと結合できる血管形成CXC RLT+ケモカインの例としては、Gro-α（CXCL1）、Gro-β（CXCL2）、ENA-78（CXCL5）、I-TAC（CXCL11）、インターロイキン-8（IL-8、CXCL8としても知られる）及びホメオスタティックケモカイン（例えば、TARC（CCL17））などが挙げられる。
血管形成ケモカインのDARCへの結合を阻害する任意の分子は本発明の方法で有用である。結合をブロックする任意のメカニズムを利用してもよい。前記分子は、例えば、DARC又は血管形成ケモカインと結合することによって血管形成ケモカインのDARCへの結合をブロックできる。
前記分子は小分子又は生体分子であってもよい。小分子は典型的には有機化合物（有機金属及び有機ケイ素化合物などを含む）などであり、一般に約450以下の分子量をもつ。小分子はさらにその分子量が450以下であることを除いて、他の点では生体分子と考えられる分子を含んでもよい。このように、小分子は、450以下の分子量を有する単糖類、オリゴ糖類、アミノ酸、オリゴペプチド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド及びこれらの誘導体を含んでもよい。
【００１０】
小分子は任意の分子量をもつことができると強調される。それらは、生体分子とは認められないために単に小分子と呼ばれ、典型的には450未満の分子量を有する。
生体分子は、ポリアミノ酸、ポリヌクレオチド又は多糖類を含む分子であり、一般に450よりも大きい分子量を有する。ポリアミノ酸としては、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドなどが挙げられる。本発明の方法で有用なポリアミノ酸の例としては、DARC又は血管形成ケモカインと結合する抗体及び血管形成ケモカインのDARCとの結合を阻害する抗体などが挙げられる。
本明細書において、抗体は、エピトープと特異的に結合するタンパク質であると広く定義される。エピトープに特異的に結合する抗体は抗体高頻度可変領域を含んでもよい。抗体高頻度可変領域を含むタンパク質は抗体全体又は抗体断片であってもよい。
例えば、高頻度可変領域は抗体可変領域全体を含んでもよい。抗体可変領域はさらに抗体定常部を含んでもよい。前記抗体はポリクローナル又はモノクローナルであってもよい。
非ヒト抗体の適した可変及び高頻度可変領域は、モノクローナル抗体が作られる任意の非ヒト哺乳動物によって産生される抗体から誘導されてもよい。ヒト以外の哺乳動物の適した例としては、例えばラビット、ラット、マウス、ウマ、ヤギ又は霊長類などが挙げられる。
【００１１】
好ましくは、前記抗体はヒト抗体である。ヒト抗体は遺伝子導入マウスにおいて産生してもよい。そのようなマウスの例は、Green, LL.（"Antibody Engineering Via Genetic Engineering of the Mouse: XenoMouse Stains are a Vehicle for the Facile Generation of Therapeutic Human Monoclonal Antibodies," J. Immunol. Methods," 10;231(1-2):11-23(1999)）によって記載されるいわゆるXenoMouse（商標）（Abgenix、Freemont、CA）である。
抗体断片は、抗体全体と同じか、又はそれに匹敵する結合特性を有する。抗体の適した断片としては、例えばDARC又は血管形成ケモカインと特異的に結合するのに十分な高頻度可変（すなわち、相補的な決定）領域の一部を含み、DARC又は血管形成ケモカインとの十分な親和力を有する任意の断片などが挙げられる。
好ましい断片は単鎖抗体である。単鎖抗体は、相互接続リンカーの有無に関わらず、少なくとも前記抗体の重鎖の可変領域及び軽鎖の可変領域を含むポリペプチドである。
非ヒト抗体はキメラであってもよい。キメラ抗体は非ヒト抗体の可変領域及びヒト抗体の定常部を含む。
非ヒト抗体は、より好ましくはヒト化抗体である。ヒト化抗体は非ヒト抗体の高頻度可変領域（CDRs）を含む。高頻度領域以外の可変領域、例えばフレームワーク可変領域及びヒト化抗体の定常部はヒト抗体のものである。
前記抗体は、免疫グロブリン（immunoglobins）（例えば、IgG、IgM、IgA、IgD又はIgE）の任意のクラス及びそのサブクラスのメンバーであってもよい。
【００１２】
前記抗体は当業者に公知の任意の方法によって作ることができる。モノクローナル抗体を作る方法としては、例えばKohler及びMilstein（1975. Nature 256:495-497）及びCampbell（"Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" in Burdon, et al., Eds, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)）によって記載された免疫学的方法などが挙げられる。Huseら（1989 Science 246:1275-1281）によって記載された組換えDNA法も適している。
抗体又は抗体断片は、例えば適した抗体又は抗体断片を選ぶために所定の抗原を用いるMcCaffertyら（1990. Nature 348: 552-554）に記載された方法を用いて産生された抗体ファージライブラリーから単離できる。Clacksonら（1991. Nature 352: 624-628）及びMarksら（1991. J. Mol. Biol. 222: 581-597）は、それぞれファージライブラリーを用いるマウス及びヒト抗体の単離について記載する。その後の刊行物には、鎖混合による高親和性（nM範囲）ヒト抗体の産生について（Mark et al. 1992. Bio/Technol. 10: 779-783）並びに非常に大きなファージライブラリーを構築するための方法として組合せ感染及びインビボ組換えについて（Waterhouse et al. 1993. Nuc. Acids Res. 21: 2265-2266）記載されている。
【００１３】
キメラ及びヒト化抗体を作る方法もまた技術的に知られている。例えば、キメラ抗体を作る方法としては、Boss（Celltech）及びCabilly（Genentech）による米国特許に記載されているものなどが挙げられる。それぞれ、米国特許第4,816,397号明細書及び第4,816,567号明細書を参照のこと。ヒト化抗体を作る方法は、例えばWinter（米国特許第5,225,539号明細書）に記載されている。
好ましい抗体のヒト化方法はCDR-移植と呼ばれる。CDR-移植では、抗原との結合に直接関係する非ヒト哺乳動物抗体（好ましくはマウス抗体）の領域（相補性決定領域又はCDR）は、ヒト可変領域に移植されて「新形態ヒト」可変領域を生成する。これらの完全にヒト化された可変領域は、次いでヒト定常部と結合されて完全な「十分にヒト化された」抗体を生成する。
抗原とよく結合する十分にヒト化された抗体を生成するために、新形態ヒト可変領域を慎重に設計することが有利である。CDRが移植されるヒト可変領域は慎重に選択され、ヒト可変領域のフレームワーク領域（FR）内の重要な位置にいくつかのアミノ酸変化を作ることが通常必要である。
【００１４】
単鎖抗体を作る方法もまた技術的に知られている。そのような方法としては、米国特許第5,565,332号明細書、第5,5837,242号明細書、第5,855,885号明細書、5,885,793号明細書及び第5,969,108号明細書に記載される免疫グロブリン遺伝子によってトランスフェクトされたファージライブラリーをスクリーニングすることなどが挙げられる。別の方法としては、米国特許第4,946,778号明細書、第5,260,203号明細書、第5,455,030号明細書及び第5,518,889号明細書に記載される、２つの別個のポリペプチド鎖を単鎖抗体に変換するためのリンカーペプチドを設計するためのコンピュータベースシステムの使用などが挙げられる。
上述の抗体を生成する他の方法は、Welら（欧州特許出願公開第502 812号明細書及びInt. J. Cancer 60:137-144 (1995)、国際公開第93/21319号パンフレット、欧州特許出願公開第239 400号明細書、国際公開第89/09622号パンフレット、欧州特許出願公開第338 745号明細書、米国特許第5,658,570号明細書及び第5,693,780号明細書、並びに欧州特許出願公開第332 424号明細書）によって開示されている。
【００１５】
血管形成ケモカインのDARCとの結合を阻害する生体分子の他の例としては、変異血管形成ケモカイン、例えば上述の血管形成CXC又はCCケモカインの変異体などが挙げられる。本明細書で使用される「変異血管形成ケモカイン」という用語は天然の（例えば、非変異）血管形成ケモカインの類似体を意味する。類似体はDARCと結合することができるが、血管形成を刺激又は促進する能力が低い。
血管形成を刺激又は促進する変異血管形成ケモカインの能力は、非変異血管形成ケモカインと比較して、血管形成が少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約50％、さらにより好ましくは少なくとも約75％、最も好ましくは少なくとも約90％まで阻害される場合、減少していると考えられる。
血管形成ケモカインは当業者に公知の任意の方法によって変異させることができる。例えば、変異血管形成ケモカインは天然血管形成ケモカインの断片を含んでもよい。
血管形成ケモカインの断片は活性である（例えば、DARCと結合することができるが、血管形成を刺激又は促進する能力は低下している）。前記断片は血管形成ケモカインのN-末端、C-末端又はN-末端とC-末端の間由来である。前記断片は、例えば血管形成ケモカインにおいて、少なくとも、約10％、好ましくは約25％、より好ましくは約50％、さらにより好ましくは約75％、最も好ましくは約90％のアミノ酸を含むことができる。例えば、血管形成ケモカインの長さが100アミノ酸である場合、前記断片は少なくとも、約10、好ましくは約25、より好ましくは約50、さらにより好ましくは約75、最も好ましくは約90アミノ酸を含むことができる。
あるいは、天然の血管形成ケモカインの１つ以上のアミノ酸は他のアミノ酸で置き換えられてもよい。DARCに結合することができる変異血管形成ケモカインの例は、黒色腫増殖刺激活性（MGSA）E6Aである。MGSAはグルタミン酸の代わりにアミノ酸位６でアラニンを含む。MGSA E6Aは、例えばHesselgesser et al., JBC, 1995, 270:11472-11476に開示されている。
【００１６】
血管形成ケモカインのDARCとの結合を阻害する生体分子のさらに別の例としては、非免疫原生マラリア寄生虫リガンドなどが挙げられる。マラリア寄生虫由来のリガンドはDARCと結合する能力がある。そのようなリガンドは当業者に公知であり、例えばマラリア寄生虫である三日熱マラリア原虫（Plasmodium vivax）のリガンドのダッフィ結合タンパク質（DBP、135kd）又は熱帯熱マラリア原虫（Plasmodium falciparum）のリガンドのその等価物（例えば、ダッフィ結合様（DBL）領域を含む赤血球結合抗原-175（EBA-175））などが挙げられる。
本明細書で使用される「非免疫原生」という用語は、DARCと結合する能力があるが免疫原生を欠くマラリア寄生虫由来のリガンドの類似体の性質を意味する。マラリア寄生虫由来のリガンドは当業者に公知の任意の方法によって非免疫原生とすることができる。例えば、非免疫原生マラリア寄生虫のリガンドは免疫原生マラリア寄生虫のリガンドの断片を含んでもよい。あるいは、マラリア寄生虫のリガンドの１つ以上のアミノ酸は他のアミノ酸で置き換えられてもよい。
マラリア寄生虫のリガンドの断片は活性である（例えば、DARCと結合する能力があるが、非免疫原生である）。前記断片はマラリア寄生虫のリガンドのN-末端、C-末端又はN-末端とC-末端の間由来である。前記断片は、例えばマラリア寄生虫のリガンドのアミノ酸の少なくとも、約10％、好ましくは約25％、より好ましくは約50％、さらにより好ましくは約75％、最も好ましくは約90％を含むことができる。例えば、マラリア寄生虫のリガンドの長さが100アミノ酸である場合、前記断片は少なくとも、約10個、好ましくは約25個、より好ましくは約50個、さらにより好ましくは約75個、最も好ましくは約90個のアミノ酸を含むことができる。
【００１７】
血管形成ケモカインのDARCとの結合を阻害する分子の他の例としては、上述のポリアミノ酸のいずれかのペプチド模倣薬などが挙げられる。本明細書で使用される「ペプチド模倣薬」という用語は、ポリアミノ酸の結合成分の立体特異性（stereospatial properties）を再形成する分子、特に生体分子を意味する。
さらに、ペプチド模倣薬は、典型的にはもとのポリアミノ酸のいくつかの性質を高める。そのような性質としては、例えば安定性の増大、結合の増大、活性の増大、効力の増大、送達の増大、半減期の延長などが挙げられる。公知のポリアミノ酸配列に基づくペプチド模倣薬を製造する方法は、例えば米国特許第5,631,280号明細書、第5,612,895号明細書及び第5,579,250号明細書に記載されている。
ペプチド模倣薬の合成は、ポリアミノ酸に、所定の位置で非アミド結合を有する非アミノ酸残基を導入することを含むことができる。例えば、ポリアミノ酸のペプチド模倣薬を得るために、結合、バックボーン又はアミノ酸残基を適した模倣薬で置き換えることができる。適したアミノ酸模倣物であってもよい異常なアミノ酸残基のいくつかの非限定的な例としては、β-アラニン、L-α-アミノ酪酸、L-γ-アミノ酪酸、L-α-アミノイソ酪酸、L-ε-アミノカプロン酸、7-アミノヘプタン酸、L-アスパラギン酸、N-ε-Boc-N-α-CBZ-L-リジン、N-ε-Boc-N-α-Fmoc-L--リジン、L-メチオニンスルホン、L-ノルロイシン、L-ノルバリン、N-α-Boc-N-δCBZ-L-オルニチン、N-δ-Boc-N-α-CBZ-L-オルニチン、Boc-p-ニトロ-L-フェニルアラニン、Boc-ヒドロキシプロリン及びBoc-L-チオプロリンなどが挙げられる。
【００１８】
（血管形成の阻害）
別の実施態様では、本発明はそれを必要とする哺乳動物における血管形成の阻害方法を提供する。背景セクションで考察したように、血管形成は新しい血管の成長を意味する。血管形成の阻害は任意のタイプの細胞、特に内皮細胞及び上皮細胞、例えば上述のもので起こりうる。
血管形成の阻害方法は血管形成ケモカインのDARCへの結合を阻害する分子を有効量哺乳動物に投与することを含む。前記分子、血管形成ケモカイン及びDARCには、上述のものが含まれる。
血管形成を阻害する必要がある哺乳動物は、血管形成が哺乳動物にとって有益でない疾患又は状態を患っている哺乳動物である。任意のそのような疾患又は状態は本発明の方法に従って治療できる。適した疾患又は状態の例としては、これに限定されないが、良性又は悪性腫瘍成長、転移、異常な目の血管形成、関節炎、乾癬、及び子宮内膜症、月経困難症（dysmenorhea）、子宮内膜（endrometrial）及び子宮癌のような状態における血管成長の増強による過剰な出血を含む雌性生殖器系のいくつかの障害などが挙げられる。
【００１９】
（腫瘍壊死の促進）
さらに別の実施態様では、本発明はそれを必要とする哺乳動物における腫瘍壊死の促進方法を提供する。腫瘍壊死は腫瘍の細胞死を意味する。典型的には、腫瘍の壊死は血液の供給の欠如から生じる。腫瘍壊死の促進は、血液の供給を必要とする任意のタイプの腫瘍、例えば上述のものにおいて起こりうる。
腫瘍壊死の促進方法は血管形成ケモカインのDARCへの結合を阻害する分子を有効量哺乳動物に投与することを含む。前記分子、血管形成ケモカイン及びDARCには、上述のものが含まれる。
腫瘍壊死を促進する必要がある哺乳動物は腫瘍を患っている哺乳動物である。血液の供給を必要とする任意のタイプの腫瘍は本発明の方法に従って治療できる。そのような腫瘍の例としては上述のものなどが挙げられる。
【００２０】
（薬剤候補のスクリーニング）
別の実施態様では、本発明は血管形成を阻害する薬剤候補のスクリーニング方法に関する。薬剤候補は有用な薬剤である可能性を有する分子であり、さらに動物試験中である。
薬剤候補をスクリーニング方法における最初の工程は分子をDARCと接触させることである。前記分子は任意の分子であってもよく、上述のものなどを含む。
上で考察したように、DARCは当業者によく知られている。このスクリーニング方法で有用なDARCは細胞上に存在できる。DARCを含む細胞の例としては、内皮細胞及び上皮細胞、例えば上で考察したもの、及び赤血球細胞などが挙げられる。
前記細胞は、例えばエキソビボで固定できる。細胞を固定する方法は当業者によく知られている。典型的には、細胞はホルマリン又はパラホルムアルデヒド（paraformakdhyde）を含む溶液で固定される。DARCを含む細胞膜標本を用いてもよい。
あるいは、DARCは、技術的によく知られている方法によってインビトロで調製してもよい。１つのそのような方法としては、DARCをコードするDNAを単離又は合成すること、及び適した宿主細胞でDNA（組換えベクター内でもよい)を発現することによって組換えタンパク質を産生することなどが挙げられる。DARCを調製する他の方法としては、細胞からDARCを単離するか、又はDARCを合成することなどが挙げられる。適したDARCの調製方法は下記に記載されている。
前記分子及びDARCは当業者に公知の任意の方法によって互いに接触させることができる。典型的には、DARC又は前記分子のいずれかを固体支持体上に固定化する。
例えば、DARCを固体支持体上に、例えばカラム内の樹脂上に固定化してもよい。樹脂上に固定化されたDARCを含むカラムから分子を溶出することによって、DARCを前記分子と接触させることができる。
【００２１】
あるいは、前記分子は固体表面、例えばマイクロタイタープレートのウエル上に固定化されてもよい。前記ウエルにDARCを添加し、プレートをインキュベートすることによって、DARCを前記分子と接触させてもよい。多くの異なる分子をプレート上に固定化してもよく、これによって前記分子の迅速なスクリーニングが可能となる。
スクリーニングにおける次の工程は、前記分子がDARCと結合するかどうかを決定することである。結合は、技術的に公知の任意の方法によって決定することができる。
例えば、ラベルは、どちらが固体支持体に固定化されるかによって、分子又はDARCに結合されてもよい。通常、固定化されない成分がラベルを付される成分である。このように、前記分子が固定化される場合には、DARCにラベルが付される。DARCが固定化される場合には、前記分子にラベルが付される。
前記分子とDARCとの接触後、前記分子とDARCとの結合の検出（例えば、ラベルの検出による）は、前記分子が血管形成を阻害する薬剤候補であることを示す。
薬剤候補のスクリーニング方法は、前記薬剤候補が血管形成を阻害するかどうかを決定する工程をさらに含んでもよい。当業者に公知の任意の方法は、前記薬剤候補が血管形成を阻害するかどうかを決定するために使用してもよい。
例えば、内皮細胞のインビトロ培養物を前記候補薬剤とともにインキュベートしてもよい。次いで、前記培養物を当業者に公知の任意の方法によってアッセイして、前記薬剤候補が、前記薬剤候補を含まないコントロール培養物と比較して、内皮細胞の増殖及び転移並びに毛細管の形成を阻害したかどうかを決定することができる。
【００２２】
あるいは、インビボ血管形成アッセイを利用できる。そのようなアッセイは当業者によく知られている。例えば、マトリゲルを哺乳動物（例えば、ラット）に移植し、続いて薬剤候補又はコントロール化合物を投与する。所定時間のインキュベーション後、マトリゲルを除去し、アッセイして、血管が治療された動物において、及びコントロールと比較してマトリゲル中に存在するかどうかを決定する。コントロール動物と比較して薬剤候補によって治療された動物のマトリゲル中に存在する少量の血管は、又は血管が存在しないことは、前期薬剤候補が血管形成を阻害することを示す。
血管形成は、血管形成が少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約50％、さらにより好ましくは少なくとも約75％、さらにより好ましくは少なくとも約90％阻害される場合に、阻害されたと考えられる。最適には、血管形成は100％阻害される。
【００２３】
（分子の投与）
本発明の方法に従って投与される分子の有効量は、その目的（例えば、腫瘍成長の阻害、血管形成の阻害又は腫瘍壊死の促進）に対して効果的である任意の量である。そのような有効量は、有益な効果を与える（例えば、腫瘍成長を阻害する、血管形成を阻害する、又は腫瘍壊死を促進する）量である。
分子の実際の量は、技術的によく知られた種々の因子（例えば、利用される特定の分子、適用形態、治療される特定の対象、腫瘍の大きさ、血管形成の程度など）に従って変わる。前記分子の適した量は前臨床試験及び臨床試験の際に当業者によって容易に決定できる。
哺乳動物に投与される分子の最小量は、その目的を達成することができる最も少ない量である。哺乳動物に投与される最大量は、望ましくない副作用を生じない最も高い有効量である。
分子は、血管形成ケモカインのDARCへの結合の明らかな減少を生じる場合に、そのような結合を阻害すると考えられる。分子は、腫瘍成長又は血管形成の明らかな減少を生じる場合に、腫瘍成長を阻害し、又は血管形成を阻害すると考えられる。結合、腫瘍成長又は血管形成の減少は、例えば結合、腫瘍成長又は血管形成が、分子が存在しないときの結合、腫瘍成長又は血管形成の少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約75％、最も好ましくは少なくとも約90％である場合に、明らかであると考えられる。
【００２４】
別の実施態様では、腫瘍のサイズが少なくとも約10％、好ましくは少なくとも約25％、より好ましくは少なくとも約75％、最も好ましくは少なくとも約90％減少する場合に、分子は腫瘍壊死における明らかな促進を生じると考えられる。
任意の哺乳動物は本発明の方法に従って治療できる。哺乳動物としては、例えばヒト、ヒヒ及び他の霊長類並びにイヌ及びネコのようなペット動物、ラット及びマウスのような実験動物並びにウマ、ヒツジ及びウシのような家畜などが挙げられる。
前記分子は技術的に知られている任意の方法によって投与されてもよい。適した投与方法の例としては、経口及び全身投与などが挙げられる。全身投与は腸又は腸管外であってもよい。液体又は固体（例えば、錠剤、ゼラチンカプセル）調合物を用いてもよい。
前記分子の腸管外投与としては、例えば静脈内、筋肉内及び皮下注射などが挙げられる。例えば、分子は、技術的に知られている徐放性によって哺乳動物に投与されてもよい。徐放性投与は特定の期間にわたって薬剤のある特定の濃度を達成するための薬物送達方法である。
他の投与経路としては、経口、局所、気管支内又は鼻腔内投与などが挙げられる。経口投与について、液体又は固体調合物を使用してもよい。経口投与に適した調合物の例としては、錠剤、ゼラチンカプセル、丸剤、トローチ剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップ剤及びカシェ剤などが挙げられる。気管支内投与は吸入器スプレーを含むことができる。鼻腔内投与について、分子の投与はネブライザ又は液体ミストによって達成できる。
前記分子は適した医薬担体中に調合してもよい。本明細書では、医薬担体は、当業者によって理解されている賦形剤（vehicle）又は賦形剤（excipient）と同じ意味合いであると考えられる。担体の例としては、澱粉、ミルク、糖、特定のタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸又はその塩、ステアリン酸マグネシウム又はカルシウム、タルク、植物油脂、ゴム質及びグリコールなどが挙げられる。
【００２５】
前記分子は安定化剤、界面活性剤、好ましくは非イオン性界面活性剤、及び必要により塩及び/又は緩衝剤の１つ以上を含む組成物に調合されてもよい。
安定化剤は、例えばアミノ酸、例えばグリシン又はオリゴ糖、例えばスクロース、テトラロース（tetralose）、ラクトース又はデキストランであってもよい。あるいは、安定化剤は糖アルコール、例えばマンニトール又はその組合せであってもよい。好ましくは、安定化剤又は安定化剤の組合せは前記分子の重量の約0.1〜約10重量％である。
界面活性剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベートである。適した界面活性剤の例としては、約0.001％（w/v）〜約10％（w/v）でのTween 20、Tween 80、ポリエチレングリコール又はポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコール、例えばPluronic F-68などが挙げられる。
塩又は緩衝剤は任意の塩又は緩衝剤、例えばそれぞれ塩化ナトリウム又はリン酸ナトリウム/カリウムであってもよい。好ましくは、緩衝剤は約5.5〜約7.5の範囲の分子調合物のpHを維持する。塩及び/又は緩衝剤は、また哺乳動物への投与に適した濃度でオスモル濃度を維持するために有用である。好ましくは、塩又は緩衝剤は約150〜約300mMのおよその等張性濃度で存在する。
前記分子はさらに１つ以上の従来の添加剤を含んでもよい組成物に調合してもよい。そのような添加剤の例としては、上述のような、例えばグリセロールのような可溶化剤、例えば塩化ベンザルコニウム（第４級アンモニウム化合物の混合物、「クオート（quart）」として知られる）、ベンジルアルコール、クロレトン又はクロロブタノールのような酸化防止剤、例えばモルヒネ誘導体のような麻酔剤又は等張性剤などが挙げられる。酸化又は他の腐敗に対する更なる予防として、前記組成物は不浸透性ストッパーでシールしたガラス瓶において窒素ガス下で貯蔵してもよい。
【００２６】
（DARCを調製するための一般的な方法）
DARCをコードする核酸はインビトロで合成してもよい。DARCのためのcDNAは、例えばChaudhuriらのPNAS 1993, 90:10793-10797に記載されている。DNAを合成するための適した方法は、CaruthersらのScience 1985, 230:281-285及びDNA Structure, Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Lilley, D.M.J. and Dahlberg, J.E. (Eds.), Methods Enzymol., 211, Academic Press, Inc. New York (1992)に記載されている。
DARC DNAは適した宿主細胞において複製及び発現される。適した宿主細胞としては、原核宿主細胞及び真核宿主細胞が挙げられる。適した原核宿主細胞は大腸菌（E. coli）である。適した真核宿主細胞としては、酵母細胞、虫細胞及び哺乳動物細胞などが挙げられる。
DARCは、例えば細胞膜画分からタンパク質単離及び精製の標準的な方法で単離してもよい。適した方法としては、例えば高速液体クロマトグラフィー（HPLC）、イオン交換、疎水性相互作用クロマトグラフィー、免疫沈降、脂質抽出、アフィニティークロマトグラフィー及びゲルろ過のような沈殿及び液体/クロマトグラフィー手順などが挙げられる。例えば、Guide to Protein Purification, Deutscher, M.P. (Ed.) Methods Enzymol., 182, Academic Press, Inc., New York (1990)及びScopes, R.K. and Cantor, C.R. (Eds), Protein Purification (3d), springer-Verlag, New York (1994)を参照のこと。
【００２７】
DARCは、また合成的に、すなわち個々のアミノ酸から、又は半合成的に、すなわちオリゴペプチド単位又はオリゴペプチド単位及び個々のアミノ酸の組合せから作ってもよい。タンパク質を合成するのに適した方法はStuart及びYoungにより“Solid Phase Peptide Snthesis,” Second Edition, Pierce chemical Company (1984), Solid Phase Peptide Synthesis, Methods Enzymol., 298, Academic Press, Inc., New York (1997)に記載されている。
DNA及びタンパク質の組換え方法における到達水準を反映する多くの標準的なよく知られたクローニング及び発現及び単離/精製技術は、Sambrook & Russel, Molecular Cloning: A Laboratory Mamual, Third Edition, cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (2001)に詳細に記載されている。
【実施例】
【００２８】
（実施例）
（実施例１：材料及び方法）
マウス系統：ダッフィノックアウト（DKO）マウス構成はすでに記載されている（Luo et al., Genome Research 1997, 7:932-941）。異型接合ノックアウトマウス［Dfy(+/-)］を交雑させてDfy(+/+)及びDfy(-/-)ホモ接合同胞を生成した。同年齢及び同性動物で実験を行った。C57BL/6Jマウスをジャクソンラボラトリー（バーハーバー、ME）から購入した。
【００２９】
腫瘍発生：ルイス肺癌（LLC）細胞を対数期で成長させ、収集し、PBSに１×107細胞/mlで懸濁した。100μlの細胞懸濁液を各動物（ｎ＝５）の正中背側付近に皮下注射した。注射後14日間、各グループのマウスにおける腫瘍成長及び壊死をモニターした。マウスを屠殺した後、腫瘍サイズをデジタル写真で記録し、全腫瘍成長の重さを測った。
【００３０】
組織化学：壊死及び血管形成を評価するために、腫瘍を10％のリン酸緩衝ホルマリンに固定した。標準的な組織学的手順に従って、腫瘍をパラフィンで包埋した。組織学的研究のために、腫瘍の断面（厚さ５μm）をヘマトキシリン及びエオシンで染色した。
【００３１】
腫瘍の抗体阻害：LLC細胞注射の３日後、１mlのPBS、免疫前血清、抗グリコホリン（Gyp）、抗ケル（Kell）又は抗Dfy血清（１：１希釈）のいずれかを５つのグループのWTC57BL/6Jマウス（ｎ＝５）に腹膜内注射した。腫瘍を14日間成長させた。マウスを安楽死させ、腫瘍の重さを測った。平均重量を比較のためにプロットした。
【００３２】
（実施例２：ダッフィ野生型及びダッフィノックアウトマウスにおける腫瘍成長）
ルイス肺癌（LLC）細胞を注入することによって、Dfy(+/+)（野生型、WT）及びDfy(-/-)（ダッフィノックアウト、DKO）両マウスの固形腫瘍を発生させた。野生型及びノックアウトマウスでは、初めは腫瘍が同じ速さで成長した。興味深いことに、ノックアウトマウスの腫瘍は、野生型マウスの腫瘍よりも早く壊死の兆候を示し始めた。
14日後、マウスを屠殺した。腫瘍を取り出し、重さを測り、比較した。結果は、野生型マウスと比較してDARCノックアウトマウスでは、固形腫瘍（サイズ及び重量）がゆっくりと成長したことを示した（図１）。
ノックアウトマウスの腫瘍は激しい壊死を受けた（図２ａの矢印を参照のこと）が、野生型マウスの腫瘍では壊死は観測されなかった（図２ａ）。Dfy(+/+)マウスと比較してダッフィノックアウトマウスの腫瘍では、より多くの壊死及び血管破裂があった（図２ｂ）。さらに、免疫組織学的研究は、Dfy(+/+)マウスの腫瘍と比較してダッフィノックアウトマウスの腫瘍における微小血管形成が少なかったことを示した（図２ｃの矢印を参照のこと）。
ダッフィタンパク質に対する抗体が腫瘍成長の低減において同様の効果を有するか否かを決定するために、タンパク質のN-末端領域に対して作られた抗ダッフィ抗体を腹膜に注入した。腫瘍の成長は、PBS又は免疫前血清を注射したマウスグループと比較して抗体を注射したマウスでは、さらにゆっくりとなった。
抗体の効果が非特異的でないことを確認するために、２つの他の血液型抗原、例えばグリコホリン及びケルに対する抗体をマウスグループに注射した。興味深いことに、他の血液型抗原に対する抗体はいずれも腫瘍成長に対して影響しなかった（図３）。腫瘍壊死の促進は、野生型マウスに抗ダッフィ抗体を注入したときに観測された（データは示されない）。
結果は、DARCが腫瘍成長の際の血管形成において重要な役割を果たすことを示している。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】Dfy(-/-)及びDfy(+/+)マウスにおける腫瘍重量。
【図２】WT [Dfy(+/+)] & DKOマウスにおけるLLC注入腫瘍成長。（Ａ）Dfy(-/-)マウスにおける壊死を矢印で示す。（Ｂ）WTマウスにおける腫瘍は、DKOマウスと比較してより固く、密度が高い。（Ｃ）腫瘍組織の組織学により、腫瘍密度及びDKOマウスと比較して腫瘍のより多いミクロキャピラリー形成（矢印）が示された。
【図３】LLC誘導腫瘍成長における抗Duffy抗体の効果。
【図１】
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【図３】
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【図２】
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【国際調査報告】
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