(57)【要約】  ＲＳＦ１０１０レプリコンを有し、Ｒｅｐタンパク質をコードする遺伝子を含み、可動性に関連する遺伝子が不活性化されるように改変されたＭｏｂ−プラスミド。本発明はまた、上記プラスミドを含み、有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌であって、ｔｈｙＡ遺伝子によりコードされる活性チミジル酸シンターゼ及びｔｄｋ遺伝子によりコードされるチミジンキナーゼを欠損する細菌、並びに上記細菌を使用して、天然又は組換えタンパク質、酵素、Ｌ−アミノ酸、ヌクレオシド及びヌクレオチド、有機酸、ビタミンのような有用な代謝産物を製造する方法についても記載する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２４、配列番号２７及び配列番号４８、並びに配列番号２４及び配列番号２７及び配列番号４８に対して少なくとも９５％相同である配列番号２４、配列番号２７及び配列番号４８の改変体からなる群から選択され、可動性に関連する遺伝子が不活性化されるように改変された、ＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミド。
【請求項２】
前記プラスミドは抗生物質耐性遺伝子が不活性化されるように改変された、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項３】
前記プラスミドは該プラスミドのコピー数を増大させるように改変された、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項４】
ＰｌａｃＵＶ５プロモーター及びＲＳＦ１０１０由来の複製起点を含み、ｍｏｂ遺伝子座を有さない、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項５】
チミジル酸シンターゼ遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項６】
目的遺伝子をさらに含む、請求項１に記載のプラスミド。
【請求項７】
請求項１のプラスミドを含む細菌。
【請求項８】
前記細菌がグラム陰性細菌である、請求項７に記載の細菌。
【請求項９】
前記細菌が活性チミジル酸シンターゼおよび活性チミジンキナーゼを欠損する、請求項８に記載の細菌。
【請求項１０】
前記細菌が有用な代謝産物を生産する能力を有する、請求項９に記載の細菌。
【請求項１１】
前記有用な代謝産物が、天然又は組換えタンパク質、酵素、Ｌ−アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、有機酸及びビタミンからなる群から選択される、請求項１０に記載の細菌。
【請求項１２】
有用な代謝産物を製造する方法であって、
（ａ）培地中で請求項１０に記載の細菌を培養すること、及び
（ｂ）前記培地から有用な代謝産物を採取すること
を含む方法。
【請求項１３】
前記有用な代謝産物は、天然又は組換えタンパク質、酵素、Ｌ−アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、有機酸及びビタミンからなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベクター変異体及びその使用に関し、より具体的には、広い宿主範囲のＲＳＦ１０１０から誘導される、抗生物質耐性遺伝子を含まないＭｏｂ-プラスミドに関する。本発明はまた、上記プラスミドを含む細菌、及び有用な代謝産物を生産するために上記細菌を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＳＦ１０１０は、グラム陰性細菌の大部分を含む広範囲の細菌宿主において複製する顕著な能力を有するＩｎｃＱ群の、可動性であるが自己伝達性のない公知のプラスミドである(Frey J. and Bagdasarian, M. ＩｎｃＱプラスミドの分子生物学(The molecular biology of IncQ plasmids). In: Thomas, C.M. (Ed.), グラム陰性細菌の広宿主域プラスミド(Promiscuous Plasmids of Gram Negative Bacteria). Academic Press, London, 1989, p.79-94)。ＲＳＦ１０１０プラスミドの塩基配列は知られており（Scholz, P.他 Gene, 75(2), 271-288 (1989)；ＧｅｎＢａｎｋにおけるアクセッション番号  Ｍ２８８２９，ｇｉ：１５２５７７）、プラスミドの機能的構造は、ほぼ完全に研究されている。ＲＳＦ１０１０プラスミドは、増殖期ＤＮＡ複製の特有の起点であるｏｒｉＶ[De Graaf, J.他, J. Bacteriol., 134, 1117-1122(1978); Haring, V. and Scherizinger, E, ＩｎｃＱプラスミドＲＳＦ１０１０の複製タンパク質(Replication Proteins of the IncQ plasmid RSF1010), In: Thomas, C.M. (Ed.), グラム陰性細菌の広宿主域プラスミド(Promiscuous Plasmids of Gram Negative Bacteria). Academic Press, London, 1989, p.95-124]、並びにプラスミドの複製に必須の遺伝子であるｒｅｐＡ、ｒｅｐＢ、ｒｅｐＢ’及びｒｅｐＣ［Scherzinger, E 他, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 654-658(1984); Scherzinger, E 他, Nucleic Acids Res., 19, 1203-1211 (1991); Scholz, P. 他, 広い宿主範囲のプラスミドＲＳＦ１０１０の複製決定要因(Replication determinants of the broad-host-range plasmid RSF1010). In: Helinski, D.R.他(Eds), Plasmids in Bacteria,
Plenum Press, New York, 1984, p243-259］を含有する。ＲＳＦ１０１０プラスミドはまた、弛緩複合体部位、接合性ＤＮＡ転移の起点であるｏｒｉＴ、プラスミド可動性に関与するトランス活性タンパク質をコードする遺伝子であるｍｏｂＡ（代替的フレームにおけるｒｅｐＢ遺伝子を含む）、ｍｏｂＢ及びｍｏｂＣ（ｍｏｂ遺伝子座）(Nordheim, A他, J. Bacteriol. 144, 923-932 (1980); Derbyshire. K.M.他, Mol. Gen. Genet., 206, 161-168 (1987))、並びにスルホンアミド耐性（ＳｕｌR）遺伝子及びストレプトマイシン耐性（ＳｔｒR）遺伝子（それぞれ、ｓｕｌ遺伝子及びｓｔｒ遺伝子）(Scholz, P.他, Gene, 75(2), 271-288(1989))を含む。
【０００３】
ＲＳＦ１０１０物理地図上のプラスミドタンパク質の翻訳を引き起こすプロモーターは、電子顕微鏡法により認識され(Bagdasarian, J. Frey, and K. Timmis. Gene 16, 237-247 (1981))、プラスミド配列が完成された時点で確認された(Scholz, P.他, Gene, 75(2), 271-288 (1989))。
【０００４】
ＲＳＦ１０１０プラスミドの複製の開始は、プラスミドによりコードされる３つのタンパク質：ＲｅｐＡ、ＲｅｐＢ及びＲｅｐＣ（それぞれ、ｒｅｐＡ、ｒｅｐＢ及びｒｅｐＣ遺伝子によりコードされる）を要する。ＲｅｐＣ遺伝子は、（反復配列において）複製起点を認識し、複製の開始を正に調節し、ＲｅｐＡは、ヘリカーゼ活性を有し、ＲｅｐＢ及びＲｅｐＢ*（これらは、同じフレームによりコードされる２つのタンパク質に相当するが、それぞれ異なるコドンで開始される）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ＲＳＦ１０１０特異的プライマーゼ活性を有する。ＲＳＦ１０１０プラスミドの複製は、宿主のＤＮＡポリメ
ラーゼＩＩＩ及びジャイレースに依存する。ＲＳＦ１０１０プラスミドは、不適合グループＩｎｃＩ−α、ＩｎｃＭ、ＩｎｃＸ、及びとりわけ特にＩｎｃＰのプラスミドのｔｒａ機能により、あるグラム陰性細菌から別のグラム陰性細菌へと可動性を有する(Derbyshire. K.M.他, Mol. Gen. Genet., 206, 161-168 (1987))。
【０００５】
Ｅ．ｃｏｌｉでは、ＲＳＦ１０１０は、１細胞当たり１２コピー存在する(Bagdasarian, M.M. 他 広い宿主範囲のプラスミドＲＳＦ１０１０のｒｅｐオペロン発現の調節(Regulation of the rep operon expression of the broad-host-range plasmid RSF1010). In:
Novick, R and Levy, S(Eds.), Evolution and Environmental Spread of Antibiotic Resistance Genes. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1986, p.209-223)。ｍｏｂＣ遺伝子とｍｏｂＢ遺伝子との間に位置するプラスミドのｏｒｉＴ領域の構造はやや複雑である。しかしながら、この領域が、可動開始に必須であり、またプラスミド複製に必須のプロモーターを含有することが知られている。プラスミド可動性に関与する個々の遺伝子の排除は、プラスミド特性を予測できないほど変化させ得ることが知られている。例えば、調節タンパク質をコードするｍｏｂＣ遺伝子の欠損は、プラスミドのコピー数の著しい増加を招く(Frey, J.他, Gene, 113, 101-106(1992))。このことが、可動性に必須の既知の配列すべてを含まないＲＦＳ１０１０プラスミドの変異体が依然として知られていないことの理由であろう。
【０００６】
ＲＳＦ１０１０及びその誘導体の安定性に関する研究は、今日まで報告されていない。さらに、ＲＳＦ１０１０の配列は知られているが、プラスミド安定性の決定因子は、機能解析又は分子解析のいずれによっても同定されていない。
【０００７】
バイオセーフティの制約により、組換え株は生物学的に非常に制限されざるを得ない。ＮＩＨにより１９８７年５月７日に出版された「組換えＤＮＡ分子を含む研究に関するガイドライン(Guidelines for research involving recombinant DNA molecules)」に記載されるバイオセーフティレベル１（ＢＬ１）系は、これらの制約の幾つかに相当する。例えば、組換え微生物が自然環境へ誤って放出された場合、このようなプラスミドは、他の生物へ伝播されないことが必須である。遺伝的に改変された生物の環境への意図的な放出に関する１９９０年４月２３日の協議会指令（９０／２２０／ＥＥＣ）、遺伝的に改変された微生物の自制使用に関する指令（９０／２１９／ＥＥＣ）を修正する１９９８年１０月２６日の協議会指令（９８／８１／ＥＣ）のような欧州指令において、同様の規制が明言されている。
【０００８】
グラム陰性細菌で機能する複製起点であるプラスミドＲＰ４のｐａｒ領域を含み、且つ可動性が欠如しているグラム陰性細菌ベクターが開示されている（米国特許第５６７０３４３号）。本願発明のベクターは、あるグラム陰性細菌から別のグラム陰性細菌へ可動しない。したがって、本願発明のベクターは、これらの細菌とともにクラス１宿主−ベクター系を形成し、産業規制を満たす。この系は、エシェリヒア・コリ及びシュードモナス・プチダの両方において、非接合性プラスミド及び非可動性プラスミドの使用を想定している。本願発明のベクターのこの非常に好適な特性は、特にｍｏｂ遺伝子座を含有する領域を欠損させることにより得られた。グラム陰性細菌において広い宿主範囲を有するこのような新たなクローニング及び／又は発現ベクターは、このようなベクターを含有する宿主細胞による組換えタンパク質又は代謝産物の生産において使用することができる。
【０００９】
今日まで、微生物の遺伝子操作は、受容細胞を遺伝的に標識するために、又は遺伝子操作プロトコルにおいてベクターとして使用されるプラスミドを同定及び維持するために、大半を抗生物質耐性遺伝子の使用に依存してきた。一般環境への遺伝的に改変された微生物（ＧＭＯ）の放出、農業及び食品加工産業におけるこれらの使用又は医療産業におけるこれらの使用は、株が抗生物質耐性遺伝子を保有する場合、規制機関により縮小される可
能性が高い。したがって、抗生物質耐性遺伝子の代わりに使用することができ、且つ代替マーカー遺伝子を保持するＧＭＯの規制機関による取り扱い許可を遅らせるいかなる結果も有さないマーカー遺伝子が明らかに必要とされる。
【００１０】
以前に、チミジル酸シンターゼ（ＴＳ）遺伝子は、選択マーカーとして抗生物質耐性遺伝子に代替するのに適していると報告された（ＥＰ０４０６００３Ａ１号）。特に、チーズ製造に日常的に使用される（したがって、安全な微生物として確立されている）細菌種であるストレプトコッカス・ラクティス由来のチミジル酸シンターゼ遺伝子が、特に「食品用」マーカー遺伝子として、抗生物質耐性遺伝子に代わり得るマーカー遺伝子として適切な候補物であることが見出された。チミジル酸シンターゼ（５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸：ｄＵＭＰ  Ｃ−メチル−トランスフェラーゼ、ＥＣ２．１．１．４５）は、ＤＮＡ合成において重要な役割を果たし、チミジル酸シンターゼは、補因子である５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸の７，８−ジヒドロ葉酸への変換を伴って、ｄＴＭＰへのｄＵＭＰの還元的メチル化を触媒する。この活性は、ＤＮＡのデノボ生合成において必須の工程である。ＴＳ遺伝子における変異によりＴＳ活性を欠損している細胞は、ＤＮＡを合成することができず、代替経路によりｄＴＭＰへ変換されるチミン又はチミジンが補給されない限り、生存することはできない。チミジル酸シンターゼ活性を欠如している微生物の株（すなわちＴＳ-）は、容易に正常なＴＳ+株と区別することができる。ＴＳ+株の正の生育を支持する化学的に規定される生育培地では、ＴＳ-細胞は、培地にチミン又はチミジンが補足されない限り死滅する。さらに、Ｓ．ラクティス ＴＳ遺伝子を含むクローニングされたベクタープラスミドは、十分なチミン又はチミジンを有さない培地或いは環境中で、ＴＳ-細胞中で安定に維持され、該プラスミドの欠損が細胞死をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
［発明の開示］
本発明の目的は、ＲＳＦ１０１０プラスミドに由来する、抗生物質耐性遺伝子を含有しない、広い宿主範囲のＭｏｂ-ベクターを提供すること、上記ベクターを含み、且つチミジル酸シンターゼ及びチミジンキナーゼの活性を欠損する細菌を提供し、非常に安定なベクター−宿主系を提供すること、並びにこの細菌を使用して有用な代謝産物を製造する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
この目的は、可動性に関連する遺伝子を含有せず、且つ抗生物質耐性遺伝子を有さないＲＳＦ１０１０プラスミド誘導体を構築することにより達成された。さらに、選択マーカーとしてのチミジル酸シンターゼ遺伝子は、構築されたプラスミドへ導入された。さらには、活性なチミジル酸シンターゼ遺伝子及びチミジンキナーゼ遺伝子を欠損する細菌は、上記プラスミドで形質転換された。結果として、プラスミド上に存在するチミジル酸シンターゼ遺伝子は、選択マーカーとなっただけでなく、細菌中のプラスミドの安定化のための要素となった。このようにして、本発明は完成した。
【００１３】
本発明の目的は、配列番号２４、配列番号２７及び配列番号４８、並びに配列番号２４及び配列番号２７及び配列番号４８に対して少なくとも９５％相同である配列番号２４、配列番号２７及び配列番号４８の変異体からなる群から選択され、可動性に関連する遺伝子を不活性化するように改変された、ＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドを提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、抗生物質耐性遺伝子が不活性化されるように改変された上記プラスミドを提供することである。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、プラスミドのコピー数を増大させるように改変された上記プラスミドを提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、ｍｏｂ遺伝子座を含まず、ＰｌａｃＵＶ５プロモーター及びＲＳＦ１０１０由来の複製起点を含む上記プラスミドを提供することである。
【００１７】
本発明のさらなる目的は、チミジル酸シンターゼ遺伝子をさらに含む上記プラスミドを提供することである。
【００１８】
本発明のさらなる目的は、目的遺伝子をさらに含む上記プラスミドを提供することである。
【００１９】
本発明のさらなる目的は、上記プラスミドを含む細菌を提供することである。
【００２０】
本発明のさらなる目的は、グラム陰性細菌である上記細菌を提供することである。
【００２１】
本発明のさらなる目的は、活性チミジル酸シンターゼを欠損し、且つ活性チミジンキナーゼを欠損する上記細菌を提供することである。
【００２２】
本発明のさらなる目的は、有用な代謝産物を生産する能力を有する上記細菌を提供することである。
【００２３】
本発明のさらなる目的は、有用な代謝産物が、天然又は組換えタンパク質、酵素、Ｌ−アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、有機酸及びビタミンからなる群から選択される上記細菌を提供することである。
【００２４】
本発明のさらなる目的は、
（ａ）培養培地中で上記細菌を培養すること、及び
（ｂ）上記培養培地から上記有用な代謝産物を採取すること
を含む、有用な代謝産物を製造する方法を提供することである。
【００２５】
本発明のさらなる目的は、上記有用な代謝産物が、天然又は組換えタンパク質、酵素、Ｌ−アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、有機酸及びビタミンからなる群から選択される上記方法を提供することである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２６】
本発明のＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドは、可動性に関連する遺伝子が不活性化されたＲＳＦ１０１０プラスミドから構築されるプラスミドを包含する。
【００２７】
本発明で使用する場合「ＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミド」という語句は、可動性に関連する遺伝子が不活性化された、以下及び配列番号１で定義されるようなＲＳＦ１０１０プラスミド、並びにそれらの変異体として定義される。ＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドの例は、図３、図５に提示され、ＤＮＡ配列は、配列番号２４、２７及び４８に開示されている。
【００２８】
本発明のプラスミドの「誘導体」という語句は、本発明のプラスミドの一部及び／又は別のＤＮＡ配列からなる別のプラスミドを意味する。「プラスミドの一部」は、細菌における複製を維持するために、複製起点（ｏｒｉ）及び複製に必要な遺伝子（ｒｅｐ）のようなプラスミドの自己複製に必須の領域を含有する部分を意味する。
【００２９】
可動性に関連する遺伝子としては、ｍｏｂＡ、ｍｏｂＢ、ｍｏｂＣ及びｏｒｉＴが挙げられるが、これらに限定されない。プラスミドＲＳＦ１０１０中に包含される遺伝子の位置を表１に示す。
【００３０】
【表１】
2008503202.tif 000002
【００３１】
ＲＳＦ１０１０プラスミドの塩基配列は既知であり（Scholz, P.他 Gene, 75 (2), 271-288 (1989)；ＧｅｎＢａｎｋにおけるアクセッション番号Ｍ２８８２９，ｇｉ：１５２５７７）、配列番号１に表される。ＲＳＦ１０１０プラスミドは、増殖期ＤＮＡ複製の特有の起点であるｏｒｉＶ、必須複製タンパク質をコードする遺伝子であるｒｅｐＡ、ｒｅｐＢ、ｒｅｐＢ’及びｒｅｐＣ、弛緩複合体部位及び接合性ＤＮＡ転移起点であるｏｒｉＴ、プラスミド可動性に関与するトランス活性タンパク質をコードする遺伝子であるｍｏｂＡ、ｍｏｂＢ及びｍｏｂＣ、並びにスルホンアミド耐性遺伝子及びストレプトマイシン耐性（ＳｔｒR）遺伝子（それぞれｓｕｌ及びｓｔｒＡ、ｓｔｒＢ遺伝子）を含有する。
【００３２】
ＲＳＦ１０１０プラスミドは、配列番号１３、１９及び２１に示されるアミノ酸配列を有するＲｅｐタンパク質をコードする遺伝子を含む。
【００３３】
Ｒｅｐ遺伝子は、ＲＳＦ１０１０又はそれらの相同体由来のｒｅｐＡ、Ｂ、Ｃ遺伝子である。ＲｅｐＡ、Ｂ、Ｃ遺伝子は、アミノ酸配列番号１３、１９、２１を有するタンパク質をコードする遺伝子を包含する。ｒｅｐ遺伝子相同体は、配列番号１３、１９、２１の全長アミノ酸配列に対して、７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、特に好ましくは９８％以上の相同性を有するタンパク質をコードし、且つ複製能力を有する遺伝子であり得る。アミノ酸配列及びＤＮＡ配列の相同性は、Karlin及びAltschulによるアルゴリズムＢＬＡＳＴ(Pro. Natl. Acad. Sci.
USA, 90 and 5873 (1993))及びＦＡＳＴＡ(Methods Enzymol., 183, and 63 (1990))を使用して計算することができる。ＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＸと呼ばれるプログラムは、このアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて開発されている（http://www.ncbi.nlm.nih.govを参照）。
【００３４】
さらに、本発明のｒｅｐ遺伝子は、野生型遺伝子に限定されず、配列番号１３、１９及び２１のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする変異体又は人工的に改変された遺
伝子であってもよい。コードされるタンパク質は、コードされるＲｅｐタンパク質の機能、すなわち複製能力が維持される限り、１つ又は複数の位置で、１個又は数個のアミノ酸残基の置換、欠失或いは挿入を包含してもよい。本明細書中で言及される「数個の」アミノ酸残基の数は、三次元構造における位置又はアミノ酸残基のタイプに応じて変わりうるが、２〜２０個、好ましくは２〜１０個、より好ましくは２〜５個であり得る。アミノ酸の置換は好ましくは、ａｌａのｓｅｒ又はｔｈｒへの置換、ａｒｇのｇｌｎ、ｈｉｓ又はｌｙｓへの置換、ａｓｎのｇｌｕ、ｇｌｎ、ｌｙｓ、ｈｉｓ又はａｓｐへの置換、ａｓｐのａｓｎ、ｇｌｕ又はｇｌｎへの置換、ｃｙｓのｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｇｌｎのａｓｎ、ｇｌｕ、ｌｙｓ、ｈｉｓ、ａｓｐ又はａｒｇへの置換、ｇｌｕのｇｌｙ、ａｓｎ、ｇｌｎ、ｌｙｓ又はａｓｐへの置換、ｇｌｙのｐｒｏへの置換、ｈｉｓのａｓｎ、ｌｙｓ、ｇｌｎ、ａｒｇ又はｔｙｒへの置換、ｉｌｅのｌｅｕ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｅｕのｉｌｅ、ｍｅｔ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｌｙｓのａｓｎ、ｇｌｕ、ｇｌｎ、ｈｉｓ又はａｒｇへの置換、ｍｅｔのｉｌｅ、ｌｅｕ、ｖａｌ又はｐｈｅへの置換、ｐｈｅのｔｒｐ、ｔｙｒ、ｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換、ｓｅｒのｔｈｒ又はａｌａへの置換、ｔｈｒのｓｅｒ又はａｌａへの置換、ｔｒｐのｐｈｅ又はｔｙｒへの置換、ｔｙｒのｈｉｓ、ｐｈｅ又はｔｒｐへの置換、ｖａｌのｍｅｔ、ｉｌｅ又はｌｅｕへの置換を含む保存置換である。上述のような１個又は数個の塩基の置換、欠失又は挿入はまた、個体差及びｒｅｐ遺伝子を保有する微生物の種における差に起因する天然に発生する突然変異（変異体又は誘導体）を包含する。
【００３５】
このような遺伝子は、例えば部位特異的変異誘発により、配列番号１２、１８及び２０に示される塩基配列を、１つ又はそれ以上の置換、欠失又は挿入が、遺伝子によりコードされるタンパク質の特定部位で導入されるように改変することにより得ることができる。
【００３６】
さらに、このような遺伝子はまた、以下に記載するような従来の変異誘発処理によっても得ることができる。変異誘発処理の例としては、配列番号１２、１８及び２０に示される塩基配列を有する遺伝子を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒドロキシルアミンで処理すること、及びＲＳＦ１０１０を保有するエシェリヒア属細菌などの微生物を、紫外線照射又は典型的な変異処理で使用されるＮ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）又はＥＭＳ（メタンスルホン酸エチル）などの変異誘発剤で処理することが挙げられる。
【００３７】
ｒｅｐ遺伝子はまた、配列番号１２、１８、２０の塩基配列、又はこれらの配列から調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることが可能であり、且つ複製能力を有するタンパク質をコードするＤＮＡを包含する。本明細書中で使用する場合「ストリンジェントな条件」は、いわゆる特異的ハイブリッドが形成され、且つ非特異的ハイブリッドは形成されない条件である。数値を使用することによりこの条件を明確に表現することは困難である。しかしながら、ストリンジェントな条件の例としては、互いに高い相同性を有するＤＮＡ、例えば５０％以上の相同性を有するＤＮＡが互いにハイブリダイズし、且つ５０％未満の相同性を有するＤＮＡは互いにハイブリダイズしない条件、及びＤＮＡが、サザンハイブリダイゼーションに典型的な洗浄の塩濃度、すなわち６０℃での１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、好ましくは６０℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より好ましくは６８℃での０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ下で、１回或いは好ましくは２〜３回洗浄する条件で互いにハイブリダイズする条件が挙げられる。
【００３８】
本発明で使用される可動性タンパク質をコードするＤＮＡ又は他の遺伝子は、上述のように、Ｒｅｐタンパク質と同様の手順に従って得ることができる。
【００３９】
本明細書中で使用する場合「可動性に関連する遺伝子を不活性化する」という語句は、細胞から他の細胞への可動性を欠損させることを意味する。可動性に関連する遺伝子とし
ては、ｍｏｂＡ及びｍｏｂＢ及びｍｏｂＣが挙げられる。遺伝子を不活性化する方法の例としては、ｍｏｂＡ、ｍｏｂＢ及びｍｏｂＣから選択される遺伝子の一部を変異又は欠失させることが挙げられる。遺伝子を変異又は欠失させる方法の例としては、プロモーター配列及びシャイン・ダルガノ（ＳＤ）配列のような発現調節配列の改変、オープンリーディングフレームへのミス−センス変異、ナンセンス変異又はフレームシフト変異の導入、及び、遺伝子の一部の欠失（J Biol Chem. 1997 272(13):8611-7）又は可動性タンパク質をコードする全領域の欠失が挙げられる。変異遺伝子は、染色体上の野生型遺伝子を変異遺伝子に置換するという相同組換え法を使用することにより、或いはトランスポゾン又はＩＳ因子を使用することにより、微生物へ導入することができる。相同組換え法としては、線状ＤＮＡ、温度感受性プラスミドまたは複製不可能なプラスミドを使用する方法が挙げられる。これらの方法は、Proc Natl Acad Sci USA. 2000 Jun 6; 97(12): 6640-5、米国特許第６３０３３８３号、特開平０５−００７４９１号等に記載されている。
【００４０】
ｍｏｂＡ遺伝子は、代替フレームにおいてｍｏｂＢを含有し、ｍｏｂＡ遺伝子の３’末端は、プラスミド複製に必須であるＲｅｐＢタンパク質をコードする。さらに、ｒｅｐＢ遺伝子の開始コドンは、ｍｏｂＢ遺伝子の終止コドンと重複し、これらの遺伝子の翻訳連関が存在すると仮定する。
【００４１】
プラスミドのｏｒｉＴ領域は、ｍｏｂＣ遺伝子とｍｏｂＢ遺伝子との間に存在し、可動性開始に必要な要素である。この領域はまた、ｒｅｐＢ遺伝子翻訳に必須のプロモーターを含有することが知られている。したがって、ｒｅｐＢ遺伝子翻訳に関して機能し得る別のプロモーターを導入することが必要である。
【００４２】
プラスミドの一部の欠失は、制限酵素による消化とプラスミドの残存部分の連結、組換え又は組込み等のような組換えプラスミドを構築する従来の方法により実施することができる。
【００４３】
本発明の特定の実施形態は、ｍｏｂＡ、ｍｏｂＢ及びｍｏｂＣ遺伝子が欠損したＲＳＦ１０１０誘導体プラスミドである。元のＲＳＦ１０１０プラスミド（配列番号１）上で、ｍｏｂＡ遺伝子は、塩基番号３２５０から塩基番号５３７９に及び、ｍｏｂＢ遺伝子は、塩基番号３９９８から塩基番号４４１１に及び、ｍｏｂＣ遺伝子は、塩基番号３０５１から塩基番号２７６７に及ぶ。ｒｅｐＢ及びｍｏｂＡのコード領域は重複する。したがって、塩基３２５０〜５３７９にあるｒｅｐＢを欠損させることなくｍｏｂＡを欠損させることが好ましい。ｍｏｂ遺伝子座を失損したＲＳＦ１０１０誘導体、すなわちＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-の配列は、配列表の配列番号２４、２７及び４８で示される。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態は、抗生物質耐性マーカーを含まないＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドである。元のＲＳＦ１０１０プラスミドは、ストレプトマイシン耐性遺伝子（ｓｔｒＡ及びｓｔｒＢ遺伝子）及びスルホンアミド耐性遺伝子（ｓｕｌ遺伝子）を含有する。ＲＳＦ１０１０プラスミド（配列番号１）上で、ｓｔｒＡ遺伝子は、塩基番号６３から８６６に及び、ｓｔｒＢ遺伝子は、塩基番号８６６から１７０２に及び、ｓｕｌ遺伝子は、塩基番号７８７５から８６６３に及ぶ。抗生物質耐性マーカーを含まないＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドは、配列番号２７及び図５で示される。
【００４５】
本発明のさらなる実施形態は、抗生物質耐性遺伝子が不活性化するように改変された、ＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドである。本発明における抗生物質耐性遺伝子に関連する遺伝子は、スルホンアミド耐性遺伝子及びストレプトマイシン耐性（ＳｔｒR）遺伝子（それぞれ、ｓｕｌ及びｓｔｒＡ、ｓｔｒＢ遺伝子）である。
【００４６】
本発明のさらなる実施形態は、プラスミドのコピー数を増大させるように改変された、
ＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドである。強力なプロモーター又は誘導プロモーターは、ｒｅｐＢ遺伝子の発現に使用することができ、プラスミドのコピー数が増大するように改変される。このような強力なプロモーターの例としては、ｌａｃプロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔｒｃプロモーター、ｔａｃプロモーター、ラムダファージのＰＲプロモーター及びＰＬプロモーター、ｔｅｔプロモーター、ａｍｙＥプロモーター、ｓｐａｃプロモーター等が挙げられる。このような強力なプロモーターの例としては、ＰlacUV5プロモーター、ｌａｃプロモーターが挙げられ、特にＰlacUV5プロモーターが好ましい。ＰlacUV5プロモーターを含むＲＳＦ１０１０誘導体ｍｏｂ-プラスミドは、配列番号２４、２７、４８に示される。
【００４７】
コピー数を条件付きで調節するために、ＰlacUV5プロモーターとＰlacUV5プロモーターに制御されたｌａｃＩ遺伝子との組合せが使用され得る。ＰlacUV5プロモーターは、ＩＰＴＧ添加により誘導可能であり、ＰlacUV5プロモーターからの発現は、ｌａｃＩ遺伝子により抑制され(J Mol Biol. 1982 Nov 5; 161(3): 417-38.)、したがって、コピー数を増大させるためには、ＩＰＴＧを添加し得るか、或いはｌａｃＩ遺伝子が欠損され得る。このプラスミドのコピー数が、ＲＳＦ１０１０と比較して、２倍、３倍及び４倍に至るまで増大させることが望ましい。ＰlacUV5プロモーターを含むＲＳＦ１０１０ｍｏｂ−ｌａｃＩ−プラスミドは、配列番号４８に記載されている。プラスミドのコピー数を減少させるためには、ｌａｃＩ遺伝子が過剰発現するように改変されることが好ましい。ＰlacUV5プロモーターを含むＲＳＦ１０１０ｍｏｂ−ｌａｃＩ−プラスミドは、配列番号４８に記載されている。
【００４８】
プラスミドのコピー数を減少させるためには、ｌａｃＩ遺伝子が過剰発現されるように改変されることが好ましい。
【００４９】
ＰlacUV5プロモーターの塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ００４１２（塩基番号７〜１００）に開示されている。ｌａｃＩの塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４１４８７９に開示されている。さらに、本発明で使用されるＰlacUV5プロモーターの塩基配列は、配列番号２４（塩基番号２８２４〜２９１２）に記載されている。ＰlacUV5プロモーターは、配列番号２４の塩基配列に従って化学合成により、又はｐＥＴ発現系(Novagen)から調製することにより得ることができる。ｌａｃＩの塩基配列はまた、配列番号２５に記載されている。ｌａｃＩは、鋳型としてＥ．ｃｏｌｉＫ−１２（ＭＧ１６５５）の染色体ＤＮＡを使用して、配列番号２５の塩基配列又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４１４８７９の塩基配列に従ってＰＣＲにより得ることができる。ＰlacUV5プロモーター及びｌａｃＩを含むＲＳＦ１０１０ｍｏｂ−プラスミドは、配列番号２４及び図３に示される。
【００５０】
本発明のさらなる実施形態は、選択マーカーとしてチミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ遺伝子、配列番号４４）をさらに含有するＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドである。チミジル酸シンターゼは、７，８−ジヒドロ葉酸の放出時に５，１０−メチレンテトラヒドロ葉酸を消費することにより、２’−デオキシウリジン−５’−リン酸（ｄＵＭＰ）からのチミジン−５’−一リン酸（ｄＴＭＰ）の生成を触媒する。エシェリヒア・コリのチミジル酸シンターゼをコードするｔｈｙＡ遺伝子は同定されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１３０７３１の配列における塩基番号２９６２３８３〜２９６３１７７）。ｔｈｙＡ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉＫ１２株の染色体上でｐｐｄＡ遺伝子とｌｇｔ遺伝子との間に位置する。したがって、上述の遺伝子は、報告された遺伝子の塩基配列に基づいたプライマー利用して、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応、White, T.J.他, Trends Genet., 5, 185 (1989))により得ることができる。ｍｏｂ遺伝子座及びすべての抗生物質耐性遺伝子が欠損され、且つ選択マーカーとしてチミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ遺伝子、配列番号２７  １９６〜９９０）を含有する
ＲＳＦ１０１０の誘導体の配列は、配列表の配列番号４４及び４５に示される。
【００５１】
選択マーカーとしてチミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ遺伝子）をさらに含有するＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドは、ベクターとして使用することができる。ベクターは、適切なサイズの別のＤＮＡ断片を自己複製に関するベクター能力を損失せずに組み込むことができるＤＮＡ分子であり、ベクターは、宿主細胞へ外来ＤＮＡを導入し、そこで、大量に複製され得る。ｔｈｙＡ遺伝子を含有するプラスミドは、配列番号２７（ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ−ＭＴ）及び図５に記載される。
【００５２】
このため、本発明のさらなる実施形態は、選択マーカーであるチミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ遺伝子）を含有し、且つ目的遺伝子をさらに含有するＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドである。「目的遺伝子」という用語は、有用な代謝産物の生合成経路に関与するか又はそれに影響を及ぼす遺伝子を意味する。これらは、天然タンパク質若しくは組換えタンパク質に関与するか、又はＬ−アミノ酸、ヌクレオシド、ヌクレオチド、有機酸及びビタミンの生合成に関与する遺伝子、又は調節タンパク質をコードする遺伝子であり得る。「有用な代謝産物」という用語には、天然タンパク質又は組換えタンパク質、酵素、Ｌ−アミノ酸、ヌクレオシド及びヌクレオチド、有機酸、ビタミンが含まれる。Ｌ−アミノ酸としては、Ｌ−アラニン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−システイン、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−グルタミン、Ｌ−グリシン、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−セリン、Ｌ−スレオニン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−チロシン、Ｌ−バリン及びＬ−ホモセリンが挙げられ、好ましくは、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニン及びＬ−チロシン等の芳香族Ｌ−アミノ酸が挙げられる。ヌクレオシドとしては、アデノシン、シチジン、イノシン、グアノシン、チミジン、ウリジン及びキサントシン等の、プリンヌクレオシド及びピリミジンヌクレオシドが挙げられる。ヌクレオチドとしては、リン酸化ヌクレオシド、好ましくは５’−リン酸化ヌクレオシド、例えば２’−デオキシアデノシン−５’−一リン酸（ｄＡＭＰ）、２’−デオキシシチジン−５’−一リン酸（ｄＣＭＰ）、２’−デオキシグアノシン−５’−一リン酸（ｄＧＭＰ）、チミジン−５’−一リン酸（ｄＴＭＰ）、アデノシン−５’−一リン酸（ＡＭＰ）、シチジン−５’−一リン酸（ＣＭＰ）、グアノシン−５’−一リン酸（ＧＭＰ）、イノシン−５’−一リン酸（ＩＭＰ）、ウリジン−５’−一リン酸（ＵＭＰ）、キサントシン−５’−一リン酸（ＸＭＰ）が挙げられる。有機酸としては、コハク酸、フマル酸、リンゴ酸、ケトグルコン酸が挙げられる。ビタミンとしてはパントテン酸が挙げられる。
【００５３】
変異前のプラスミドと比較した場合に細菌において機能し得る限り、本発明のプラスミド、特に配列番号２４、２７及び４８に示されるプラスミドは、これらの配列の変異体を包含する。本明細書中で使用する場合のプラスミドの機能は、プラスミドが細菌へ形質転換される場合に、プラスミド自体を複製する能力を有し、且つ目的遺伝子を発現し、並びにプラスミドの複製に必要な遺伝子を発現することを意味する。大きな改変、または欠失は、ＲＳＦ１０１０誘導体ｍｏｂ-プラスミド（配列番号２４）における塩基番号７２１９〜８３３５の領域及び塩基番号１〜２３４７の領域、並びにＲＳＦ１０１０−ＭＴプラスミド（配列番号２７）における塩基番号１００４〜１６４９及び／又は６５５７〜６８６４の領域のようなプラスミドの機能及び複製に重要でないプラスミドの領域で行われ得る。これらの領域は通常、１個又は数個の選択用マーカーを含有し得る。さらに、プラスミド複製の調節に必要なｌａｃＩ遺伝子のコード部分（ＲＳＦｍｏｂ-プラスミド（配列番号２４）における塩基番号２２５２〜３３７９、及びＲＳＦ１０１０−ＭＴプラスミド（配列番号２７）における塩基番号２９１４〜４０４１）もまた改変又は欠失され得る（実施例２を参照）が、但し、このような改変又は欠失は、ｌａｃＩ遺伝子内に終止コドンを生成しないか、又はフレームシフトを生成しない。変異前に機能及び複製したように、プラスミドが機能及び複製し得る限り、さらなる変異は、配列番号２４、２７及び４８の
他の領域における塩基の置換、欠失又は挿入であり得る。好ましくは、変異体は、配列番号２４、２７及び４８の配列と比較した場合に少なくとも８０％相同性があり、より好ましくは少なくとも９０％相同性、さらに好ましくは少なくとも９５％相同性、特に好ましくは少なくとも９７％相同性がある。相同性は、ＢＬＡＳＴのような慣例且つ既知の方法により計算することができ、配列番号２４、２７及び４８の配列の全長にわたって決定される。例えば、２つのアミノ酸配列間の相同性は、３つのパラメーター：スコア、同一性及び類似性を算出するソフトウェアプログラムＢＬＡＳＴ２．０を使用して推定することができる。また、算出中に得られる類似性の値は、相同性のパーセントを推定するのに考慮される。ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）は、プログラムｂｌａｓｔａ、ｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｍｅｇａｂｌａｓｔ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘにより使用されるヒューリスティックな検索アルゴリズムであり、これらのプログラムは、Karlin、Samuel及びStephen F. Altschulの統計学的方法を使用して、これらの所見に有意性を帰する（「一般的なスコアリング方式を使用することにより分子配列の特徴の統計学的有意性を評価する方法(Methods for assessing the
statistical significance of molecular sequence features by using general scoring schemes)」. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:2264-68 (1990)、「分子配列における複数の高スコアリングセグメントに関する用途及び統計(Applications and statistics for multiple high-scoring segments in molecular sequences)」. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 5873-7 (1993)）。
【００５４】
染色体ＤＮＡの調製、ハイブリッド形成、ＰＣＲ、プラスミドＤＮＡの調製、ＤＮＡの消化及び連結、形質転換、プライマーとしてのオリゴヌクレオチドの選択等の方法は、当業者に既知の慣例の方法を包含する。これらの方法は、Sambrook, J., and Russell D著 「Molecular Cloning A Laboratory Manual, Third Edition」, Cold Spring Harbor Laboratory Press (2001)等に記載されている。
【００５５】
本発明の細菌は、本発明のプラスミドを含有する細菌、好ましくはグラム陰性細菌を包含する。好ましくは、本発明の細菌は、有用な代謝産物を生産する能力を有する。さらに、本発明の細菌は、活性な固有のチミジル酸シンターゼ及びチミジンキナーゼを欠損する上述のような細菌を包含する。しかしながら、本発明の細菌は、細菌により保有される本発明のプラスミドから発現される活性なチミジル酸シンターゼを有していてもよい。
【００５６】
「有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌」という用語は、細菌の細胞中で、好ましくは、本発明の細菌が培地中で培養される場合には培地中で、代謝産物の蓄積を引き起こす能力を有する細菌を意味する。このような代謝産物を生産する能力は、育種により付与又は増強され得る。本明細書中で使用する場合「有用な代謝産物を生産する能力を有する細菌」という用語はまた、野生型又は親株よりも大量に、培地中で代謝産物を生産し、且つその蓄積を引き起こすことが可能である細菌を意味し、好ましくは０．５ｇ／Ｌ以上、より好ましくは、１．０ｇ／Ｌ以上の量で微生物が、目的代謝産物を生産し、且つその培地中での蓄積を引き起こすことが可能であることを意味する。
【００５７】
「グラム陰性細菌」という用語は、細菌が、微生物学における熟練者に既知の分類に従って、グラム陰性細菌として分類されることを意味する。このような分類に関しては、例えば、「Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, Ninth edition」（Bergey, John G. Holt(Editor), Noel R. Krieg, Peter H.A. Sneath, D. Bergy, Publisher: Lippincott, Williams & Wilkinsによる）を参照されたい。グラム陰性細菌としては、例えば、以下の科の細菌：アセトバクター科(Acetobacteriaceae)、アルカリゲネス科(Alcaligenaceae)、バクテロイデス科(Bacteroidaceae)、クロマチウム科(Chromatiaceae)、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、レジオネラ科(Legionellaceae)、ネイセリア科(Neisseriaceae)、ニトロバクター科(Nitrobacteriaceae)、シュードモナス科(Pseudomonadaceae)、
リゾビウム科(Rhizobiaceae)、リケッチア科(Rickettsiaceae)、スピロヘータ科(Spirochaetaceae)、ビブリオ科(Vibrionaceae)等が挙げられる。
【００５８】
腸内細菌科としては、例えば、エンテロバクター属(Enterobacter)、エルビニア属(Erwinia)、エシェリヒア属、クレブシエラ(Klebsiella)、プロビデンシア属(Providencia)、サルモネラ属(Salmonella)、セラチア属(Serratia)、シゲラ属(Shigella)等に属する細菌が挙げられる。
【００５９】
「活性なチミジル酸シンターゼ及びチミジンキナーゼを欠損する」という用語は、これらの酵素をコードする固有の遺伝子が、完全に不活性なタンパク質をコードするような様式で改変されることを意味する。遺伝子の一部の欠失、リーディングフレームをシフトさせることに起因して、或いはプロモーター、エンハンサー、アテニュエーター等のようなオペロン発現を制御する配列を含む遺伝子の隣接領域の改変により発現することができないように改変してもよい。
【００６０】
チミジル酸シンターゼ活性を欠損した細胞は、ＤＮＡを合成することができず、またチミン又はチミジン（これらは代替経路によりｄＴＭＰに変換される）を供給しない限り生存することができないことが知られている。チミジンキナーゼのさらなる不活性化は、培地中に存在するチミン又はチミジンを利用することが不可能な細菌を生じ得る。結果として、本発明のプラスミド上に存在するチミジル酸シンターゼ遺伝子は、選択マーカーとなっただけでなく、細菌中のプラスミドの安定化用の要素となった。
【００６１】
チミジンキナーゼは、チミジンのＡＴＰ依存性リン酸化を触媒して、チミジン−５’−一リン酸（ｄＴＭＰ）を生じる。エシェリヒア・コリのチミジンキナーゼをコードするｔｄｋ遺伝子は解明されている（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮＣ＿０００９１３．１，ｇｉ：１６１２９１９９の配列における塩基番号１２９２７５０〜１２９３３６７）。ｔｄｋ遺伝子は、Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｋ１２の染色体上でｈｎｓ遺伝子とｙｃｈＧ  ＯＲＦとの間に位置する。ｔｄｋ遺伝子の塩基配列、及び遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４６及び４７に示される。
【００６２】
遺伝子の不活性化は、ＵＶ照射又はニトロソグアニジン（Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン）処理、部位特異的変異誘発、相同組換えを使用した遺伝子破壊又は／及び「Ｒｅｄ駆動型組込み」とも呼ばれる挿入−欠失変異誘発(Datsenko K.A. and
Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12: 6640-45 (2000))を使用した変異誘発処理のような従来の方法により実施することができる。
【００６３】
特に、宿主株ｔｈｙＡ遺伝子の不活性化に続いて、ｍｏｂ遺伝子座及びすべての抗生物質耐性遺伝子が欠損され、且つチミジル酸シンターゼ遺伝子（配列番号４４）を含有するＲＳＦ１０１０改変プラスミドで変異宿主を形質転換し、その後、チミジンを含有しない培地上で形質転換体のさらなる選択を行う。続いて、ｔｄｋ遺伝子の不活性化が実施される。遺伝子の不活性化は、抗生物質耐性遺伝子のさらなる除去に適した配列に隣接する抗生物質耐性遺伝子による標的遺伝子の置換により実施されてもよい。除去用の系は、ＦＲＴ部位及びファージラムダＲｅｄレコンビナーゼ（Ｆｌｐレコンビナーゼ）を使用する系(Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97:12:6640-45 (2000))、ａｔｔＬ部位及びａｔｔＲ部位並びにファージラムダ由来のｉｎｔ遺伝子及びｘｉｓ遺伝子の産物を使用する系(Peredelchuk, M.Y. and Bennett, G.N., Gene, 187, 231-238
(1997))、ｌｏｘＰ部位及びバクテリオファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼを使用する系(Guo, F.他, Nature, 389, 40-46)、Campbell, A.M.により記載される同様の系(J.
Bacteriol., 174, 23, 7495-7499 (1992))等により例示される。
【００６４】
本発明の細菌は、有用な代謝産物を生産する固有の能力を有し、且つ活性なチミジル酸シンターゼ及びチミジンキナーゼを欠損する細菌に本発明のプラスミドを細菌へ導入することにより得ることができる。或いは、本発明の細菌は、有用な代謝産物を生産する能力を、活性なチミジル酸シンターゼ及びチミジンキナーゼをすでに欠損し、且つ同プラスミドを保有する細菌へ付与することにより得ることができる。
【００６５】
本発明の方法は、有用な代謝産物を製造する方法であって、培地中で本発明の細菌を培養すること、上記代謝産物を培地中に蓄積させること、及び代謝産物を培地から採取することを含む方法を包含する。
【００６６】
本発明では、培養、培地からの目的代謝産物の回収及び精製等は、標的代謝産物が微生物を用いて生産される従来の発酵法にならった様式で実施され得る。培養に有用な培地は、培地が炭素源及び窒素源及びミネラル、並びに必要であれば微生物の生育に必要な適切な量の栄養分を包含する限り、合成培地であってもよく、或いは天然培地であってもよい。炭素源としては、グルコース及びスクロースのような様々な炭水化物、並びに様々な有機酸が挙げられる。選択した微生物の資化の様式に応じて、エタノール及びグリセロールを含むアルコールを使用してもよい。窒素源としては、アンモニア及び硫酸アンモニウムのような様々なアンモニウム塩、アミンのような他の窒素化合物、ペプトン、大豆加水分解物及び消化発酵性微生物のような天然窒素源が使用され得る。ミネラルとしては、一リン酸カリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリウム、硫酸第一鉄、硫酸マンガン、塩化カルシウム等が使用され得る。例えば栄養要求性を補足するために、さらなる栄養分を、必要であれば培地へ添加することができる。
【００６７】
培養後、細胞などの固形分は、遠心分離又は膜濾過により液体培地から除去することができ、続いて、目的代謝産物は、イオン交換、アフィニティクロマトグラフィ、濃縮、結晶化並びに特定の所望の代謝産物に適した他の方法などの従来の方法により回収及び精製することができる。
【００６８】
［実施例］
本発明は、以下の非限定的な例を参照して、以下でより具体的に説明される。
【実施例１】
【００６９】
実施例１．ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-プラスミドの構築
ＲＳＦ１０１０Ｍｏｂ-プラスミドの構築は、ＲＳＦ１０１０プラスミドへ、ｍｏｂ遺伝子座の代わりに、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ遺伝子）が付加された、自己調節要素ＰlacUV5−ｌａｃＩを含有するＤＮＡ断片を「Ｒｅｄ駆動型組込み」(Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45)することにより実施された。
【００７０】
最初に、ＰlacUV5プロモーターの制御下にあるｌａｃＩ遺伝子の構造部分を有するＤＮＡ断片を、プライマーＰ１（配列番号２９）及びＰ２（配列番号３０）並びに鋳型としてｐＭＷ−ＰlacUV5−ｌａｃＩ−１１８プラスミド(Skorokhodova, A.Y.他, Biotechnologiya(rus), No.5, (2004))を使用するＰＣＲにより増幅した。ＰlacUV5プロモーターの塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｙ００４１２（塩基番号７〜１００）に開示されている。ｌａｃＩの塩基配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４１４８７９に開示されている。さらに、本発明で使用されるＰlacUV5プロモーターの塩基配列は、配列番号２４（塩基番号２８２４〜２９１２）に記載されている。ＰlacUV5プロモーターは、配列番号２４の塩基配列に従って化学合成により、又はｐＥＴ発現系(Novagen)から調製することにより得ることができる。ｌａｃＩの塩基配列はまた、配列番号２５に記載されている。ｌａｃＩは、鋳型としてＥ．ｃｏｌｉＫ−１２（ＭＧ１６５５）の染色体
ＤＮＡを使用して、配列番号２５又はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４１４８７９の塩基配列に従ってＰＣＲにより得ることができる。
【００７１】
プライマーＰ１は、ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｌａｃＩ−１１８プラスミド中の、同プラスミド上のＸｂａＩ制限部位の上流に位置する領域と一致する。プライマーＰ２は、その５’末端へ導入されたＢａｍＨＩ制限部位を含有する。プラスミドＲＳＦ１０１０由来のｒｅｐＢ遺伝子（配列番号１３）の断片は、プライマーＰ３（配列番号３１）及びＰ４（配列番号３２）を使用するＰＣＲにより増幅された。ｒｅｐＢ遺伝子の開始コドン及びｍｏｂＢ遺伝子の終止コドンは、プラスミドＲＳＦ１０１０上で重複する（図１）。ｒｅｐＢ遺伝子のＳＤ配列は、その開始コドンの４塩基対上流に位置する。近位ｍｏｂＢ遺伝子の非存在下でＲｅｐＢタンパク質の翻訳を提供するために、ｒｅｐＢ遺伝子の翻訳開始領域は、プライマーＰ３への４個の塩基の付加により改変された。さらに、プライマーＰ３は、その５’末端へ導入されたＢａｍＨＩ制限部位を含有し、プライマーＰ４は、その５’末端に導入されたＫｐｎＩ制限部位を含有する。２つの得られたＰＣＲ産物は、アガロースゲル電気泳動により精製されて、ＢａｍＨＩ制限酵素で処理されて、連結されて、プライマーＰ１及びＰ４を使用するＰＣＲ用の鋳型として使用された。得られたＤＮＡ断片をＸｂａＩ及びＫｐｎＩ制限酵素で処理して、同じ制限酵素で予め処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＳＫ（＋）ベクター(Stratagene)へクローニングした。得られたプラスミドをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：：ｌａｃＩｒｅｐＢと称した。
【００７２】
続いて、クロラムフェニコール耐性遺伝子（ｃａｔ遺伝子）及びＰlacUV5プロモーターを含有するＤＮＡ断片を構築した。ｃａｔ遺伝子は、プライマーＰ５（配列番号３３）及びＰ６（配列番号３４）を使用して、プラスミドｐＡＣＹＣ１８４(Takara Bio)から増幅した。プライマーＰ５は、ＢｇｌＩＩ制限部位を含有し、これは、その５’末端に導入され、ｍｏｂ-プラスミドの選択後のｃａｔ遺伝子のさらなる切除に必要である。プライマーＰ６は、その５’末端に導入されたＳａｃＩ制限部位を含有する。ＰlacUV5プロモーターは、プライマーＰ７（配列番号３５）及びＰ８（配列番号３６）を使用して、ｐＭＷ−ＰlacUV5−ｌａｃＩ−１１８プラスミドから増幅した。プライマーＰ７は、その５’末端に導入されたＳａｃＩ制限部位を含有する。プライマーＰ８は、その５’末端へ導入されたＸｂａＩ制限部位を含有する。得られた断片は、アガロースゲル電気泳動により精製され、ＳａｃＩ制限酵素で処理され、連結されて、プライマーＰ５及びＰ８を使用するＰＣＲ用の鋳型として使用された。得られた産物をＸｂａＩ制限酵素で処理して、同じ制限酵素で予め処理したｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：：ｌａｃＩｒｅｐＢプラスミドと連結させた。得られた線状産物は、プライマーＰ４（配列番号３２）及びＰ９（配列番号３７）によるＰＣＲ用の鋳型として使用された。プライマーＰ９は、ｏｒｉＶとｍｏｂＣ遺伝子の３’末端との間に位置するＲＳＦ１０１０領域の３８個の塩基配列、ＢｇｌＩＩ制限部位及びｃａｔ遺伝子の５’末端に相補的な１７個の塩基配列を含有する。
【００７３】
ｒｅｐＢ遺伝子の３’末端、ＰlacUV5プロモーターの制御下にあるｌａｃＩ遺伝子、ｃａｔ遺伝子、及びｏｒｉＶとｍｏｂＣ遺伝子の３’末端との間に位置するＲＳＦ１０１０領域の３８個の塩基配列を含有する得られたＰＣＲ産物は、ＲＳＦ１０１０プラスミドへの組込みに使用され、「Ｒｅｄ駆動型組み込み」(Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45)を使用して、プラスミドのｍｏｂ遺伝子座を置換した。手順に従って、プラスミドｐＫＤ４６をヘルパープラスミドとして使用した。組換えプラスミドｐＫＤ４６を含有するエシェリヒア・コリ株ＢＷ２５１１３は、E.
coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, USAから得ることができ、そのアクセッション番号は、ＣＧＳＣ７６３０である。
【００７４】
ＲＳＦ１０１０プラスミドは、エレクトロポレーションにより上述のＤＮＡ断片とともに株ＭＧ１６５５（ｐＫＤ４６）へ導入された。ＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ４７０７６）
は、American Type Culture Collectoin（ＡＴＣＣ、住所：P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108, United States of America)から入手可能である。
【００７５】
ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片１００〜２００ｎｇ及びＲＳＦ１０１０プラスミド１００ｎｇをエレクトロポレーションに使用した。エレクトロポレーションは、エレクトロポレータＢｉｏＲａｄ(No. 165-2098, ver. 2-89, USA)を使用して実施した（刺激時間は、４〜５ｍ秒であり、電界強度は、１２．５ｋＶ／ｃｍ）であった）。エレクトロポレーション後、ＳＯＣ培地１ｍｌを細胞懸濁液へ速やかに添加した。細胞を３７℃で２時間生育させて、クロラムフェニコール３０μｇ／ｍｌを含有するＬＢ寒天上にまいた後、３７℃で一晩生育させた。
【００７６】
相同組換えの結果として得られた単離ＲＳＦｍｏｂ-ｃａｔプラスミドをＢｇｌＩＩ及びＸｂａＩ制限酵素で処理して、ｃａｔ遺伝子を除去した後、同じ制限酵素で処理したＰlacUV5プロモーターを含有するＰＣＲ断片と連結させた。ＰlacUV5プロモーターを含有するＰＣＲ断片は、プライマーＰ１（配列番号２９）及びＰ８（配列番号３６）を使用して得られた。ｍｏｂ遺伝子座が欠損したＲＳＦ１０１０誘導体（ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-、８３３８ｂｐ）の配列は、配列表の配列番号２４に、及び図３に提示される。
【００７７】
得られたプラスミドの安定性に関して、７代継代のプラスミド−キャリア培養が、非選択的条件で、且つ１００個の非依存的クローン間で提供され、その結果、ストレプトマイシン感受性（ＳｍS）クローンは得られなかった。したがって、得られたプラスミドＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-の安定性は、選択なしでの７代継代後には９９％以上であった。
【００７８】
親プラスミドＲＳＦ１０１０と比較した場合のＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-プラスミドの可動効率が研究された。この目的で、ドナー株は、内在性プラスミドＲＰ１−２（Ｔｃr）を含有するＥ．ｃｏｌｉ株Ｃ６００（ｒ＋ｍ＋）(Funakoshi)に基づいて構築された。このプラスミドは、接合性移入に必要なｔｒａ−オペロン遺伝子を提供する。プラスミドＲＳＦ１０１０及びＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-は、選択マーカーとしてＳｔｒrを使用して、Ｃ６００（ＲＰ１−２）株へ形質転換により導入された。３つの対照ドナー株は、プラスミドｐＡＹＣ３２(Chistoserdov, A.Y. and Tsygankov, Y.D., Plasmid, 16, 161-167 (1986))、ｐＢＲ３２２及びｐＵＣ１９による形質転換により構築された。構築されたドナー株はすべて、可動化効率を測定するために、受容株ＬＥ３９２ｍｅｔ-ＲｉｆR(Promega)を用いた接合実験で使用した。これらの実験の結果を表２に提示する。
【００７９】
【表２】
2008503202.tif 000003
aＣ６００ドナーと受容株ＬＥ３９２との一晩の接合後のドナー１つ当たりのトランス接合体の数。
bＲＳＦ１０１０及びその誘導体の可動性は、ＬＢ−リファンピシン−ストレプトマイシン培地上で測定された。
cプラスミドの可動性は、ＬＢ−リファンピシン−アンピシリン培地上で測定された。
【００８０】
表２の結果は、プラスミドＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-が可動性を完全に損失したことを示している。この点で、プラスミドＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-は、ｍｏｂ遺伝子を含有しないｐＵＣ１９対照プラスミドに類似している。
【実施例２】
【００８１】
実施例２．コピー数が増大したＲＳＦ１０１０プラスミドｍｏｂ-誘導体の構築
我々のデータによれば、定常期のＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-は、ＲＳＦ１０１０と同じコピー数を有していた。対数増殖期では、得られた誘導体のコピー数は、ＲＳＦ１０１０プラスミドのコピー数よりも約２倍少なかった。ＲＳＦ様プラスミドの複製に関与するｒｅｐＢ遺伝子が、ＰlacUV5−ｌａｃＩ自己調節因子の転写制御下に置かれたため、培養培地へのＩＰＴＧの添加は、対数増殖期においてＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-プラスミドのコピー数の増大を引き起こした。したがって、ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-プラスミドからのｌａｃＩ遺伝子の排除が、プラスミドのコピー数を増大し得ることが考えられた。ｌａｃＩ遺伝子を伴わないＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-の相当する誘導体は、ＸｂａＩ及びＢａｍＨＩ制限酵素を使用して、ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-プラスミドからのｌａｃＩ遺伝子の除去することにより得られた。続いて、得られたＤＮＡ断片の付着末端を平滑末端化して連結することにより、ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-ｌａｃＩ-プラスミドが得られた。ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-ｌａｃＩ-プラスミドのＤＮＡ配列を、配列番号４８に示した。
【００８２】
ＲＳＦ１０１０プラスミド誘導体のコピー数を推定するために、３つのプラスミドをＥ．ｃｏｌｉ株ＭＧ１６５５へ別個に導入した。プラスミドＤＮＡは、「ＧｅｎＥｌｕｔｅ
Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ」(Sigma, USA)を使用して、ＩＰＴＧなしでＬＢ培地中で一晩生育させた等量の細胞から単離して、ＥｃｏＲＶ制限酵素及びＲＮＡ分解酵素で処理した。プラスミドのコピー数は、臭化エチジウムによるアガロースゲルの着色後に、各プラスミドの巨大なＥｃｏＲＶ断片に相当する電気泳動バンドのスキャニングにより「Ｓｏｒｂｆｉｌ」プログラムを使用して推定した。各タイプの３つの独立した形質転換体をこの実験で使用した。ＲＳＦ１０１０の誘導体の相対コピー数を表３に示す。ＲＦＳ１０１０プラスミドのコピー数を１．０とした。
【００８３】
【表３】
2008503202.tif 000004
【実施例３】
【００８４】
実施例３．抗生物質耐性遺伝子を欠損し、且つ選択マーカーとしてｔｈｙＡ遺伝子を含有するＲＳＦ１０１０Ｍｏｂ-プラスミドの構築
最初に、野生型Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５株をもとに２つの株を構築した；一つ目の株は、ｔｈｙＡ遺伝子が欠損しており、もう一つの株は、ｔｄｋ遺伝子が欠損している。いわゆる「Ｒｅｄ駆動型組込み」法(Datsenko K.A. and Wanner B.L., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97:12:6640-45)は、上記それぞれの株への抗生物質耐性マーカーを含む断片の組込みによる標的遺伝子の不活性化に使用した。プラスミドｐＡＣＹＣ１８４由来のクロラムフェニコール耐性遺伝子は、ｔｈｙＡ遺伝子（Ｃｍr）の破壊に使用され、プ
ラスミドｐＡＣＹＣ１７７由来のカナマイシン耐性遺伝子は、ｔｄｋ遺伝子（Ｋｍr）の破壊に使用された。得られた抗生物質耐性マーカーを保有する変異体はともに、他のＥ．ｃｏｌｉ株へのΔｔｈｙＡ欠損及びΔｔｄｋ欠損のＰ１形質導入用のドナーとして使用され得る。
【００８５】
ｔｈｙＡを欠損する株は、種々のプラスミド上でクローニングされたｔｈｙＡ遺伝子の機能的に活性なコピーのスクリーニング用に本発明で使用された。
【００８６】
第２段階は、ｔｈｙＡ遺伝子の機能的に活性なコピーのクローニングを包含した。Ｅ．ｃｏｌｉＭＧ１６５５株の染色体では、ｔｈｙＡ遺伝子は、提唱されるオペロン構造−ｌｇｔ−ｔｈｙＡの遠位部分に位置する。このオペロン用の近位プロモーターが存在し得る。ｔｈｙＡ遺伝子は、開始コドンのごく近傍にアノテートされた２つのプロモーター（ＰthyA1及びＰthyA2）を保有するが、それらの配列は、基準配列とは異なり、したがって、それらの潜在効率は疑問であった。
【００８７】
Ｅ．ｃｏｌｉ染色体の物理地図によれば、構造ｔｈｙＡ遺伝子は、７９５ｂｐから構成され、相当するタンパク質チミジル酸シンターゼは、２６４個のアミノ酸を含有する。ｔｈｙＡ遺伝子の塩基配列及び当該遺伝子によりコードされるアミノ酸配列は、それぞれ配列番号４４及び４５に示される。
【００８８】
両方の天然プロモーターを含有するｔｈｙＡ遺伝子の構造部分は、プライマーＴｈｙＡ１（配列番号３８）及びＴｈｙＡ２（配列番号３９）並びにＥ．ｃｏｌｉ細胞ＴＧ１(Amersham Pharmacia Biotech)由来の染色体ＤＮＡを使用するＰＣＲにより増幅された。これらのプライマーは、ベクターｐＵＣ１８(Takara Bio)、ｐＵＣ１９(Takara Bio)及びｐＥＴ２２（＋）(Promega)へのｔｈｙＡ遺伝子のクローニングのために、それぞれＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を含有する。ＰＣＲ増幅後、ｔｈｙＡ遺伝子を含有する９９４ｂｐのＤＮＡ断片を単離して、プラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９及びｐＥＴ２２（＋）のＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ部位へクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１株を形質転換した後、ＡｍｐRクローンを単離して、プライマーＴｈｙＡ１及びＴｈｙＡ２を用いた対照ＰＣＲを使用して、クローニングされたｔｈｙＡ遺伝子の存在を試験した。予測ＤＮＡ断片を含有する幾つかのクローンを、組換えプラスミドの単離、及びクローニングされたｔｈｙＡ遺伝子の機能的活性の測定用に選択した。
【００８９】
プラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９及びｐＥＴ２２（＋）にクローニングされたｔｈｙＡ遺伝子の機能的活性を測定するために、プラスミドはすべて、受容細胞：ＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr）株へ形質転換により導入された。各形質転換実験から５０個の独立したＡｍｐRクローンを選択して、ｔｈｙＡ変異を補完する能力に関して調べた。プラスミドｐＵＣ１８  ｔｈｙＡ、ｐＵＣ１９  ｔｈｙＡ及びｐＥＴ２２（＋）ｔｈｙＡを含有するクローンにおけるクローニングされたｔｈｙＡ遺伝子の存在は、ＴｈｙＡ１及びＴｈｙＡ２プライマーを用いた対照ＰＣＲにより確認された。さらに、試験した形質転換体はすべて（プラスミドｐＥＴ２２に由来するものを除く）、チミジンなしの最小培地上で生育することが可能であることが示された。これらのデータにより、クローニングされたｔｈｙＡ遺伝子は、それが多コピープラスミドｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９上でクローニングされた場合の条件下でのみ、それ自身のプロモーターから発現することが可能であることが示される。
【００９０】
ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９プラスミド上でクローニングされたｔｈｙＡ遺伝子を含有するＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ断片は、互いに逆の配向にあることに留意すべきである。したがって、ｔｈｙＡ遺伝子のｐＵＣ１８プラスミド転写は、プラスミドｌａｃＺ遺伝子の転写と一致し、すなわち、ｔｈｙＡ遺伝子の転写は、ｌａｃＺプロモーターから行われ
得る一方で、ｐＵＣ１９プラスミドでは、ｔｈｙＡ遺伝子の転写は、それ自身のプロモーターからのみ方向付けられ得る。したがって、ｐＵＣ１８及びｐＵＣ１９プラスミド上でクローニングされたｔｈｙＡの発現の比較により、ｔｈｙＡプロモーターの有効性を推定することが可能となる。ｐＵＣ１８  ｔｈｙＡプラスミドを含有するＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr）株のクローンは、ｐＵＣ１９  ｔｈｙＡプラスミドを含有するクローンと比較した場合、最小培地上でより良好に生育することが見出された。これらのデータは、自身のプロモーターからのｔｈｙＡ転写のレベルが、上流にｌａｃＺプロモーターを含有する構築物と比較するとより低いことを示唆する。
【００９１】
他方で、クローニングされたｔｈｙＡ遺伝子を含むｐＥＴ２２（＋）ベクターを含有する受容株ＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr）は、チミジンなしの最小倍地上で非常にゆっくりと生育する。このデータにより、プラスミドｐＥＴ２２（＋）上での自身のプロモーターからのｔｈｙＡ遺伝子の発現は、受容株ＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr）の生育を支持するのに十分でないことが示される。ｐＥＴ２２プラスミドのコピー数は、ｐＵＣ１８（１９）プラスミドと比較してより低いことが知られている。本発明の最終的なベクターＲＳＦ１０１０もまた、あまり高くないコピー数のプラスミドであるため、ｐＥＴ２２（＋）ベクター上にクローニングされたｔｈｙＡ遺伝子の発現を改良することにした。その目的で、ｔｈｙＡ遺伝子プロモーターの−１０領域への幾つかのさらなる変異を、部位特異的ＰＣＲ変異誘発を使用して導入した。
【００９２】
２つのプライマーを設計した：ＴｈｙＡ４（配列番号４０）及びＴｈｙＡ５（配列番号４１）。両方のプライマーは、プロモーターの−１０領域において、また位置−１５及び−１４でのＴＧモチーフにおいて置換を含有し、ｔｈｙＡプロモーターからの転写の効率を改善させるはずである。プライマーＴｈｙＡ１−ＴｈｙＡ５及びＴｈｙＡ２−ＴｈｙＡ４の対並びに鋳型としてｐＥＴ２２−ｔｈｙＡプラスミドを用いた２つの別個のＰＣＲ増幅を実施して、ｔｈｙＡ遺伝子の２つの断片を単離した。続いて、ＰＣＲ増幅産物を一緒にアニーリングして、得られた混合物を、ＴｈｙＡ１及びＴｈｙＡ２プライマーを用いたＰＣＲ用の鋳型として使用して、改良された−１０領域を有する完全サイズのｔｈｙＡ遺伝子を単離した。ＰＣＲ増幅後、この改変９９４ｂｐ断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化して、同じ制限酵素で予め処理しておいたベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９及びｐＥＴ２２へクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１株を形質転換した後、ＡｍｐRクローンを単離して、ＴｈｙＡ１及びＴｈｙＡ２プライマーを用いた対照ＰＣＲを使用することにより、クローニングされたｔｈｙＡ遺伝子の存在を試験した。予測ＤＮＡ断片を含有する幾つかのクローンを、組換えプラスミドの単離、クローニングされたｔｈｙＡ遺伝子のシーケンシング並びに機能的活性の測定用に選択した。
【００９３】
まず、改変ｔｈｙＡ遺伝子（以下、ｔｈｙＡ*遺伝子と称する）をシーケンシングして、プロモーター領域における導入変異の存在を確認した。新たなプロモーターは、完全なプリブノーボックス：ＴＡＴＡＡＴ、またそれぞれ位置−１５及び−１４でＴＧモチーフを含有する（図１  配列番号２７における塩基番号８７〜９５）。
【００９４】
改良されたｔｈｙＡプロモーターの、ｔｈｙＡ栄養要求株の生育に十分なｔｈｙＡ*遺伝子発現のレベルを提供する能力を調べるために、改変プロモーターの制御下でｔｈｙＡ*遺伝子を含有するプラスミドｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９及びｐＥＴ２２（＋）で、受容細胞：ＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr）株を形質転換した。各形質転換実験からの５０個の独立したＡｍｐRクローンを選択して、ｔｈｙＡ変異を補完するこれらの能力に関して調べた。プラスミドｐＵＣ１８ｔｈｙＡ*、ｐＵＣ１９ｔｈｙＡ*及びｐＥＴ２２ｔｈｙＡ*を含有するクローンにおけるクローニングされたｔｈｙＡ*遺伝子の存在は、ＴｈｙＡ１及びＴｈｙＡ２プライマーを用いた対照ＰＣＲにより確認された。さらに、試験した形質転換体はすべて（ｐＥＴ２２プラスミドを含有するものを含む）、チミジンなしの最
小培地上で生育することが可能であることが示された。これらのデータにより、改良されたｔｈｙＡ*プロモーターの制御下にあるチミジル酸シンターゼの活性は、ｔｈｙＡ栄養要求株の生育に十分であることが示された。
【００９５】
ｔｈｙＡ*遺伝子のもう１つの改変が、遺伝子の構造部分におけるＰｓｔＩ制限部位を取り除くのに必要とされた。この部位は、ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ−プラスミドからＳｕｌR遺伝子（配列番号２２）を切断するように仕組まれた。機能的に活性な遺伝子の構造の改変は、プロモーター領域を改変するための部位特異的変異誘発に関して上述するようなＰＣＲ法を使用して着手された。プライマーＴｈｙＡ１−ＴｈｙＡ１６及びＴｈｙＡ１７−ＴｈｙＡ２の対並びに鋳型としてｐＥＴ−２２−ｔｈｙＡ*プラスミドを用いた２種類の別個のＰＣＲ増幅を実施して、ｔｈｙＡ遺伝子の２つの断片を単離した。プライマーＴｈｙＡ１６（配列番号４２）及びＴｈｙＡ１７（配列番号４３）は、ｔｈｙＡ遺伝子の構造部分からＰｓｔＩ制限部位を排除する同義のコドンの導入を提供した。続いて、ＰＣＲ増幅産物を一緒にアニーリングして、得られた混合物を、ＴｈｙＡ１及びＴｈｙＡ２プライマーを用いたＰＣＲ用の鋳型として使用して、その構造部分においてＰｓｔＩ制限部位を有さない完全サイズのｔｈｙＡ*遺伝子を単離した。ＰＣＲ増幅後、この改変した９９４ｂｐの断片をＥｃｏＲＩ及びＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化して、同じ制限酵素で予め処理したベクターｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９及びｐＥＴ２２へクローニングした。Ｅ．ｃｏｌｉＴＧ１株の形質転換後、ＡｍｐRクローンを単離して、ＴｈｙＡ１及びＴｈｙＡ２プライマーを用いた対照ＰＣＲを使用することにより、クローニングされたｔｈｙＡ*遺伝子の存在に関して試験した。予測ＤＮＡ断片を含有する幾つかのクローンを、組換えプラスミドの単離、クローニングされたｔｈｙＡ*遺伝子のシーケンシング並びに機能的活性の測定用に選択した。
【実施例４】
【００９６】
実施例４．ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ−の抗生物質耐性マーカー（ＳｔｒR及びＳｕｌR）のｔｈｙＡ*遺伝子による置換
単離したクローンの１つを、改変ｔｈｙＡ*遺伝子を含有するプラスミドｐＥＴ２２（＋）の単離に使用した。プラスミドＤＮＡを、ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ−プラスミドの相当する部位へサブクローニングするためにＥｃｏＲＩ及びＮｏｔＩ制限酵素で消化した。ライゲーション混合物で受容株ＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr）を形質転換して、ＴｈｙＡ+形質転換体を、チミジンなしの最小グルコース培地上で単離した。ｔｈｙＡ*遺伝子に隣接するプライマーＴｈｙＡ１及びＴｈｙＡ２を用いたＰＣＲを使用することにより、組換えＲＳＦ１０１０プラスミド内のｔｈｙＡ*遺伝子の存在に関してＴｈｙＡ+形質転換体を調べた。試験したＴｈｙＡ+形質転換体はすべて、ストレプトマイシンに対して感受性を示すことがわかった。これらのデータにより、新たな単離ベクターＲＳＦ１０１０ｍｏｂ−ｔｈｙＡ*（ＰｓｔＩ部位を有さない）において、ｓｔｒＡ及びｓｔｒＢ遺伝子（配列番号２及び４）によりコードされるＳｔｒR遺伝子がｔｈｙＡ*遺伝子に置換されたことが示される。次の工程に関して、ｓｕｌ遺伝子（配列番号２２）によりコードされるＳｕｌRマーカーを欠損させるために、プラスミドＲＳＦ１０１０ｍｏｂ−ｔｈｙＡ*をＰｓｔＩ制限酵素で消化して、自己連結させた。結果として、ｔｈｙＡ*選択マーカーによる両方（ＳｔｒR及びＳｕｌR）の抗生物質耐性マーカーの置換を伴う新たなＲＳＦ１０１０ｍｏｂ−ｔｈｙＡ*プラスミドを単離した。ｍｏｂ遺伝子座及びすべての抗生物質耐性遺伝子が欠損され、且つ選択マーカーとしてチミジル酸シンターゼ遺伝子（ｔｈｙＡ*遺伝子）を含有するＲＳＦ１０１０の誘導体の配列は、配列表の配列番号２７に、及び図５に示される。当該新たなプラスミドをＲＳＦ１０１０−ＭＴと称した。
【実施例５】
【００９７】
実施例５．ｔｈｙＡ-、ｔｄｋ-受容株におけるＲＳＦ１０１０−ＭＴプラスミドの安定性の研究
ＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr）株をＲＳＦ１０１０−ＭＴプラスミドで形質転換して、ＴｈｙＡ+形質転換体をチミジンなしの最小培地上で単離した。Ｅ．ｃｏｌｉ染色体の物理地図によれば、構造ｔｄｋ遺伝子は、６１８ｂｐから成り、相当するタンパク質チミジル酸シンターゼは、２０５個のアミノ酸を含有する（配列番号４６及び４７）。
【００９８】
続いて、我々は、染色体上にｔｄｋ：：ＫｍR挿入を含有するＭＧ１６５５（ＭＧ１６５５（Δｔｄｋ：：Ｋｍr））株で生育させたファージＰ１ストック、及びＲＳＦ１０１０−ＭＴプラスミドを保有する受容株ＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr）株を用いてＰ１形質導入実験を実施した。カナマイシン耐性コロニーが得られ、染色体上でのｔｄｋ：：ＫｍRの挿入の存在をＰＣＲにより調べた。
【００９９】
ＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr，Δｔｄｋ：：Ｋｍr）／ＲＳＦ１０１０−ＭＴ株の単離後、非選択的条件下での増殖中のＲＳＦ１０１−ＭＴプラスミドの安定性の研究を実施した。この目的で、ＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr，Δｔｄｋ：：Ｋｍr）／ＲＳＦ１０１０−ＭＴの受容細胞を、チューブ中のＬＢブロスにおいて、３７℃で７２時間生育させた。続いて、培養サンプルをＬＢプレート上へ撒いて、２４時間後に出現した単一コロニーを、チミジンなしの最小培地上で複製させた（各培養に関して２００個のコロニー）。その結果、ＲＳＦ１０１０−ＭＴプラスミドを含有するＭＧ１６５５（ΔｔｈｙＡ：：Ｃｍr，Δｔｄｋ：：Ｋｍr）株に由来する２００個のコロニーすべてがチミジンなしの最小培地上で生育することができ、このことは、試験した組換え体は全て、ベクターの安定な維持を示すことが示された。
【０１００】
これらのデータは、ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-プラスミドにクローニングされたｔｈｙＡ*遺伝子が、抗生物質耐性マーカーの代わりに選択マーカーとしてプラスミドの安定な維持を提供することを示す。
【０１０１】
本発明を、これらの好ましい実施形態を参照して詳述してきたが、本発明の範囲を逸脱することなく、様々な変更がなされ、均等物が使用され得ることが、当業者に明らかとなろう。
【産業上の利用可能性】
【０１０２】
本発明は、抗生物質耐性遺伝子を含まない、広い宿主範囲のＲＳＦ１０１０から誘導されたＭｏｂ-プラスミドを提供する。本発明のＲＳＦ１０１０誘導体Ｍｏｂ-プラスミドは、細菌を使用した有用な代謝産物の生産に使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１】ＲＳＦ１０１０プラスミドの構造を示す図である。
【図２】ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ：：ｌａｃＩｒｅｐＢプラスミドの構造を示す図である。
【図３】ＲＳＦ１０１０ｍｏｂ-プラスミドの構造を示す図である。
【図４】野生型の配列及び改良されたｔｈｙＡプロモーター領域を示す図である。−３５及び−１０の領域に下線を付し、−１０、−１４及び−１５領域における置換は太字にした。
【図５】ＲＳＦ１０１０−ＭＴプラスミドの構造を示す図である。
【図１】
2008503202.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
2008503202000001.xml
【国際調査報告】
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2008503202.tif 000076
2008503202.tif 000077
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