(57)【要約】本発明は、ＣＥＬ  ＩＩエンドヌクレアーゼをコードする単離された核酸配列並びに、これによりコードされたタンパク質を産生するためのベクターおよび宿主細胞に関する。
2008503210.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
【請求項２】
前記単離された核酸が：
（ａ）配列番号：１または配列番号：３を含むヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号：１もしくは配列番号：３を含むヌクレオチド配列またはこの相補的なヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズし、機能的なＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列をコードするが、遺伝子コードの縮重または翻訳されていないヌクレオチド配列の存在により、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する、ヌクレオチド配列
を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸を含む、ベクター。
【請求項５】
単離されたＣＥＬ  ＩＩポリペプチドであって、前記ポリペプチドが、配列番号：２もしくは配列番号：４を含むアミノ酸配列、またはこの機能的断片に対して、少なくとも約７０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を含む、前記単離されたＣＥＬ  ＩＩポリペプチド。
【請求項６】
請求項１に記載の単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項７】
請求項２に記載の単離された核酸を含む、宿主細胞。
【請求項８】
請求項３に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項９】
請求項４に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１０】
請求項５に記載の単離されたＣＥＬ  ＩＩポリペプチドを含む、宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
序論
本出願は、２００４年６月１７日出願の米国特許仮出願第60/580,450号の利益を請求し、これを、この全体にわたり、参照により本明細書中に導入する。
【背景技術】
【０００２】
本発明の背景
植物からのＤＮＡミスマッチ特異性エンドヌクレアーゼの新規な族は、最近発見された(Oleykowskiら(1998)、Nucl. Acid Res. 26:4597-4602; Yangら(2000)、Biochem. 39:3533-3541)。この群のエンドヌクレアーゼの最も高い外見上の濃度を有する植物供給源は、セロリであり(Oleykowskiら(1998)、上記)、従って酵素が、セロリから精製され、ＣＥＬ  Ｉと命名された(Oleykowskiら(1998)、上記；Yangら(2000)、上記)。ＣＥＬ  Ｉは、ＤＮＡを、塩基置換ミスマッチおよびＤＮＡ歪みの部位の３’側において切断する(Oleykowskiら(1998)、上記；Yangら(2000)、上記)。
【０００３】
ＣＥＬ  Ｉは、挿入／欠失および塩基置換ミスマッチにおいて二本鎖ＤＮＡに切れ目を挿入するかまたは切断することに依存するミスマッチ検出アッセイにおいて、有用であると示されている(Oleykowskiら(1998)、上記；Yangら(2000)、上記；Kulinskiら(2000)、BioTechniques 29:44-48; Colbertら(2001)、Plant Physiol. 126:480-484; Sokurenkoら(2001)、Nucl. Acids Res. 29:e111;米国特許第5,869,245号)。
【０００４】
ＣＥＬ  Ｉとして同定されたＣＥＬヌクレアーゼの精製された調合液は、２種の異なるタンパク質種、即ちＣＥＬ  ＩおよびＣＥＬ  ＩＩを含む(Yangら(2000)、上記；米国特許第5,869,245号)。ＣＥＬ  Ｉと呼ばれる１つの種は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されたように、４３ｋＤａの外見上の分子量を有する。Ｎ結合オリゴ糖類をＥｎｄｏ  Ｈｆで除去することにより、分子量は２９ｋＤａに減少する。ＣＥＬ  Ｉは、部分的に配列決定されており、ＣＥＬ  Ｉをコードする遺伝子は、セロリｃＤＮＡライブラリーから単離され、配列決定され、大腸菌中にクローン化された(Yangら(2000)、上記；米国特許第5,869,245号)。ＣＥＬ  ＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより決定されたように、３９ｋＤａの外見上の分子量を有し、Ｎ結合オリゴ糖類の除去により、分子量は３７ｋＤａに減少する。ＣＥＬ  ＩおよびＣＥＬ  ＩＩのクロマトグラフィー分離が記載されており、ＣＥＬ  ＩおよびＣＥＬ  ＩＩが、関連すると見られている一方、これらは、異なる酵素活性を有する；ＣＥＬ  ＩＩは、ＣＥＬ  Ｉよりも高いｐＨで最適であり、ＣＥＬ  ＩＩは、ミスマッチにおいてＤＮＡを切断するにあたり、ＣＥＬ  Ｉよりも効率が高い。
【０００５】
従って、当該分野において必要とされているものは、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチの存在の検出において用いるための、ＣＥＬ  Ｉの汚染がない単離されたＣＥＬ  ＩＩの容易に入手可能な供給源である。本発明は、ＣＥＬ  ＩＩをコードする核酸配列をこの組換え産生のために提供するこの長年の必要性を満たす。
【発明の開示】
【０００６】
発明の概要
本発明は、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードする単離された核酸に関する。前述の単離された核酸は：
（ａ）配列番号：１または配列番号：３のヌクレオチド配列；
（ｂ）配列番号：１のヌクレオチド配列またはこの相補的なヌクレオチド配列に、 ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズし、機能的なＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードする、ヌクレオチド配列；あるいは
（ｃ）（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列によりコードされたアミノ酸配列をコードするが、遺伝子コードの縮重または翻訳されていないヌクレオチド配列の存在により、（ａ）または（ｂ）のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する、ヌクレオチド配列
である。
【０００７】
本発明はさらに、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードする単離された核酸を含むベクターに関する。
本発明はさらに、配列番号：２もしくは配列番号：４のアミノ酸配列、またはこの機能的断片に対して、少なくとも約７０％のアミノ酸配列相同性を有するアミノ酸配列を有する、単離されたＣＥＬ  ＩＩポリペプチドに関する。
本発明はさらに、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドまたはこれによりコードされたポリペプチドをコードする、単離された核酸またはベクターを含む宿主細胞に関する。
【０００８】
発明の詳細な説明
一般的にＣＥＬ  Ｉと呼ばれる、ＣＥＬヌクレアーゼの精製された調合液は、２種のＣＥＬヌクレアーゼ、即ちＣＥＬ  ＩおよびＣＥＬ  ＩＩを含む(Yangら(2000)、上記)。２種の酵素を分離した、セロリからの改変された精製方法が、開発された。この手順は、本明細書中に、および表３中に要約されている。この方法に従って精製されたＣＥＬ  ＩＩは、ＣＥＬ  Ｉによる外見上の汚染を含まないが、４５および５７ｋＤａにおいて広帯域として移動した２種のタンパク質またはタンパク質の族で汚染されていた。この汚染を考慮した後に、当該精製方法により精製されたＣＥＬ  ＩＩの比活性は、それぞれｐＨ８．５および５．５において、２．３×１０８および０．２１×１０８単位／ｍｇであった。
【０００９】
SEPHACRYL（登録商標）Ｓ−１００  ＨＲによるゲル濾過により、これらの汚染物がほとんど除去された。ＣＥＬ  ＩＩが、SEPHACRYL（登録商標）Ｓ−１００  ＨＲから、３５．５ｋＤａの分子量と一致する位置において溶離した。ＣＥＬ  ＩＩを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを施す前にジスルフィド架橋を切断するための還元剤（例えばβ−メルカプトエタノール）で処理した場合には、タンパク質は、２種のバンドとして、〜１６および〜２８ｋＤａにおいて移動した。ＣＥＬ  ＩＩが、還元剤に曝露されなかった場合には、これは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥの間に、〜３５ｋＤａにおいて予測されたように移動していたであろう。これは、ＣＥＬ  ＩＩの精製の間にタンパク質分解的切断により導入されたＣＥＬ  ＩＩポリペプチド主鎖における切断に帰していた。改変された精製方法により精製されたほとんどのＣＥＬ  ＩＩを、この位置においてタンパク質分解的に切断した。時々、切断されていないある種のＣＥＬ  ＩＩが得られた。主鎖におけるこの切断は、酵素の機能的なミスマッチ切断活性に影響しなかった。
【００１０】
この方法により精製されたＣＥＬ  Ｉは、ＣＥＬ  ＩＩによる外見上の汚染を含まなかったが、比較的低い程度にであるが、ＣＥＬ  ＩＩ中に存在する同一の２種のタンパク質で汚染されていた。この汚染を考慮した後に、精製されたＣＥＬ  Ｉの比活性は、それぞれｐＨ５．５および８．５において、１．２×１０８および０．８×１０８単位／ｍｇであった。ＣＥＬ  Ｉヌクレアーゼの既知の調合液は、ＣＥＬ  ＩとＣＥＬ  ＩＩとを共に含み、３．１×１０７単位／ｍｇの比活性を有する(Yangら(2000)、上記)。ＣＥＬ  Ｉは、〜３９ｋＤａの分子量に整合するＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける位置において移動した。ＣＥＬ  Ｉは、精製の間にはタンパク質分解的に切断されなかった。
【００１１】
その後、精製されたＣＥＬ  ＩＩの酵素的特性を、分析した。いくつかの場合において、本明細書中に開示した方法で精製したＣＥＬ  Ｉの特性に対して、比較を行った。ＣＥＬ  ＩおよびＣＥＬ  ＩＩのＤＮＡ分解酵素可溶化アッセイにおけるｐＨ最適を、表１に示す。ＣＥＬ  Ｉは、ｐＨ６．０〜７．０を優先し、ＣＥＬ  ＩＩは、ｐＨ９．０より上で最適な活性を有していた。本明細書中に開示された方法により精製されたＣＥＬ  Ｉの酵素的特性は、既知の方法に従って精製されたＣＥＬ  Ｉの酵素的特性と同様であった(Yangら(2002)、上記)。
【００１２】
【表１】
2008503210.tif 000003
【００１３】
ミスマッチしたオリゴヌクレオチドアッセイを用いて、精製したＣＥＬ  ＩおよびＣＥＬ  ＩＩの単一塩基のミスマッチ切断優先傾向は、同一であると見出された：Ｃ／Ｔ〜Ａ／Ｃ〜Ｃ／Ｃ＞Ｔ／Ｔ＞Ａ／Ａ〜Ｇ／Ｇ≫Ａ／Ｇ〜Ｇ／Ｔ。ＣＥＬ  ＩＩが、ＰＣＲで増幅したＤＮＡ断片における種々の歪みを切断する能力もまた、試験した。突然変異体および基準のＰＣＲ産物を、等量でハイブリダイズさせた場合には、２種の交互のヘテロ二本鎖ミスマッチが形成し、これは、混合物中のＤＮＡの〜５０％を表す。ＣＥＬ  ＩＩは、Ｇ／ＧおよびＣ／Ｃ、Ｇ／ＡおよびＴ／Ｃ、Ｇ／ＴおよびＡ／Ｃ並びにＡ／ＡおよびＴ／Ｔを含む、６３２ｂｐ基質において試験したすべてのミスマッチした対において、二本鎖切断を生じた。ミスマッチが、Ａ／ＧおよびＣ／ＴまたはＴ／ＧおよびＣ／Ａであるように、最上部および底部のらせんにおいて、ミスマッチした塩基を切り換えることにより、同様の切断効率が得られた。さらに、ＣＥＬ  ＩＩは、１ｂｐ、２ｂｐ、３ｂｐ、６ｂｐ、９ｂｐまたは１２ｂｐの挿入を含む６３２ｂｐ基質中の部位において、有効に切断し、各々の場合において予測された切断産物を産生した。
【００１４】
ＣＥＬ  ＩＩにより発生した産物の量の比較により、酵素が、挿入／欠失を、単一の塩基のミスマッチよりも効率的に切断することが、明確に例証された。Ｇ／ＧおよびＣ／Ｃヘテロ二本鎖を用いて、ヘテロ二本鎖をＣＥＬ  ＩおよびＣＥＬ  ＩＩにより切断する効率を、比較した。消化産物を、分別し、ＨＰＬＣにより定量した。ＣＥＬ  ＩＩは、ミスマッチの切断においてＣＥＬ  Ｉよりも効率的であった。約４０単位（ｐＨ５．５）のＣＥＬ  Ｉ（１４ｆｍｏｌ）および１０単位（ｐＨ８．５）のＣＥＬ  ＩＩ（２．５ｆｍｏｌ）が、４００ｎｇのヘテロ二本鎖を同一の程度に切断するのに、必要であった。
【００１５】
ＣＥＬ  ＩＩの〜１６および〜２８ｋＤａの断片を、単離し、各断片のアミノ末端アミノ酸配列を、決定し、本明細書中ではそれぞれ配列番号：６および配列番号：７として示す（図１）。ＣＥＬ  Ｉ遺伝子とのアミノ酸配列の相同性に基づいて、１６ｋＤａの断片は、ＣＥＬ  ＩＩタンパク質のアミノ末端から由来しており、２８ｋＤａの断片は、タンパク質のカルボキシ末端から由来していた。縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを、これらの配列から設計し、ＣＥＬ  ＩＩ遺伝子の一部をコードする核酸配列を、クローン化した。その後、セロリｃＤＮＡライブラリーを、構成し、全長ＣＥＬ  ＩＩ遺伝子を、該ライブラリーから、ＣＥＬ  ＩＩ部分的ＤＮＡ配列から設計した重複するオリゴヌクレオチドプライマーを用いて単離した。ＣＥＬ  ＩＩをコードする核酸配列を、配列番号：１として示し、ペプチドリーダーを含むアミノ酸配列を、配列番号：２として示す。５’未翻訳領域およびペプチドリーダーをコードする核酸配列を欠いているＣＥＬ  ＩＩをコードする核酸配列を、配列番号：３として示し、ペプチドリーダーを欠いているアミノ酸配列を、配列番号：４として示す。
【００１６】
ペプチドリーダーを含み、ＣＥＬ  ＩＩおよびＣＥＬ  Ｉは、アミノ酸レベルで４５％同一である（図１）。成熟したタンパク質のアミノ末端における保存されたｔｒｐで開始して、ＣＥＬ  ＩＩおよびＣＥＬ  Ｉは、それぞれ２９１個および２７４個のアミノ酸を含んでいた。翻訳後改変を含まないＣＥＬ  ＩＩの計算された分子量は、３２，６２９ダルトンであり、一方ＣＥＬ  Ｉは、３１，４４０ダルトンの計算された分子量を有していた。ＣＥＬ  ＩＩ〜１６ｋＤａおよび〜２８ｋＤａ断片の計算された分子量は、それぞれ１２．３ｋＤａおよび２０．３ｋＤａであり、これは、両方の断片が、グリコシル化されていることを示していた。ＣＥＬ  Ｉにおけるように(Yangら(2000)、上記)、Ｐ１ヌクレアーゼにおいて３個の触媒的に必須のＺｎ原子に結合するためのリガンドであると知られている、９個の保存されたアミノ酸残基が、ＣＥＬ  ＩＩ中に存在していた（図１）。ＣＥＬ  ＩＩおよびＣＥＬ  Ｉは共に、ｃｙｓ−ｃｙｓ架橋の形成に関与するＰ１ヌクレアーゼ中に存在する４個の保存されたｃｙｓ残基を含んでいた。さらに、ＣＥＬ  ＩＩおよびＣＥＬ  Ｉは、保存された位置において４個の他のｃｙｓ残基を含んでおり、ＣＥＬ  ＩＩは、ＣＥＬ  Ｉにより共有されていない余分なｃｙｓ残基を含んでいた。
【００１７】
タンパク質分解的に切断されたＣＥＬ  ＩＩポリペプチド主鎖における領域（Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ａｓｎ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｍｅｔ↓Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ；配列番号：８）は、１３個のアミノ酸のうち３個のみが保存されている、ＣＥＬ  Ｉの対応するアミノ酸配列（Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｔｙｒ−Ａｓｎ−Ｍｅｔ；配列番号：９）に対する最小に保存された領域の１つである。この多岐にわたる領域に直接隣接している領域は、はるかに一層高度に保存されていた（１３個のアミノ酸のうち９個が、上流で保存されており、１３個のうち１１個が、下流において保存されていた）（図１）。Ｐ１ヌクレアーゼの３−Ｄ構造に対する比較に基づいて、アミノ酸のこの多岐にわたる伸張は、酵素の表面上に、露出したループ中に位置する。露出したループ構造の、ＣＥＬ  ＩＩに対して独特の適切なアミノ酸認識配列との組み合わせにより、この部位が、ＣＥＬ  ＩにおいてではなくＣＥＬ  ＩＩにおいて、タンパク質分解的な切断を受けやすくなる。
【００１８】
ＣＥＬ  ＩＩの明確な酵素活性および、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチの存在を検出するためのアッセイにおけるこの有用性に基づいて、ＣＥＬ  ＩＩの高度に純粋な調合液を、大規模で生産するのが、所望される。従って、本発明は、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。本明細書中で用いる、単離された分子（例えば単離された核酸、例えばゲノムＤＮＡ、ＲＮＡもしくはｃＤＮＡまたは単離されたポリペプチド）は、天然に存在する生物の他の成分の少なくとも数種、例えば細胞構造成分または、分子に関連して共通して見出される他のポリペプチドもしくは核酸から分離されているか、またはこれを実質的に含まない分子を意味する。単離された分子が、ポリペプチドである場合には、前述のポリペプチドは、少なくとも約２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはこれ以上の純度である（ｗ／ｗ）。
【００１９】
１つの態様において、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１または配列番号：３のヌクレオチド配列である。他の態様において、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、配列番号：１のヌクレオチド配列またはこの相補的なヌクレオチド配列に、ストリンジェントな条件の下でハイブリダイズするヌクレオチド配列であり、ここで、前述のヌクレオチド配列は、機能的なＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードする。他の態様において、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、機能的なＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードするヌクレオチド配列であるが、これは、遺伝子コードの縮重または翻訳されないヌクレオチド配列の存在のために、配列番号：１または配列番号：３のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を有する。
【００２０】
本明細書中で用いる、機能的なポリペプチドは、通常当該ポリペプチドと関連する少なくとも１種の生物学的活性を維持するものである。あるいはまた、機能的なポリペプチドは、修飾されていないポリペプチドにより保有された活性をすべて維持する。生物学的活性を維持するにより、ポリペプチドが、野生型の(native)ポリペプチドの少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％またはこれ以上の生物学的活性を維持する（かつさらに、野生型のポリペプチドよりも高いレベルの活性を有し得る）ことを、意味する。機能的でないポリペプチドは、通常はポリペプチドと関連する検出可能な生物学的活性を本質的に示さない（例えば、多くとも、例えば約１０％またはさらに５％より低い、有意ではない量に過ぎない）ものである。
【００２１】
本明細書中で用いる、ポリペプチドの用語は、他に示さない限り、ペプチドおよびタンパク質の両方を包含する。
【００２２】
本明細書中で用いる、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドまたはＣＥＬ  ＩＩタンパク質は、広範囲に解釈されるべきものであることを意図し、塩基対ミスマッチにおいて二本鎖ＤＮＡを切断することができる酵素を包含する。用語ＣＥＬ  ＩＩはまた、生物学的機能性を維持する（即ち、野生型のＣＥＬ  ＩＩタンパク質の少なくとも１種の生物学的活性を有する、例えば二本鎖ＤＮＡを塩基対ミスマッチにおいて切断するかまたは二本鎖ＤＮＡを塩基対ミスマッチにおいて結合する）、改変された（例えば突然変異した）ＣＥＬ  ＩＩ、切断された分子を含む機能的なＣＥＬ  ＩＩ断片および機能的なＣＥＬ  ＩＩ融合ポリペプチド（例えば、ＣＥＬ  ＩＩ−ＧＳＴタンパク質融合物またはＣＥＬ  ＩＩ−Ｈｉｓタグ付加タンパク質）を含む。
【００２３】
すべてのＣＥＬ  ＩＩポリペプチドまたはＣＥＬ  ＩＩコード核酸を、本発明のＣＥＬ  ＩＩであると考慮する。ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドまたはＣＥＬ  ＩＩコード核酸は、菌類、哺乳類またはArabidopsis、Zinnia、アルファルファ、アスパラガス、トマト、カリフラワー、ブロッコリー、キャベツ、ウイキョウ、ケール、水クレソン(water cress)、パセリ、レタス、マングビーンの芽、Hemerocallis、Oryza、HordeumまたはZeaを含む他の植物種から由来し得る。ＣＥＬ  ＩＩエンドヌクレアーゼは、同様の活性、ｐＨ最適および大きさを有する、セロリ以外の他の非組換えの、または天然の供給源から単離されたエンドヌクレアーゼ酵素を含むことを意図する。
【００２４】
セロリＣＥＬ  ＩＩの代表的なｃＤＮＡ配列を、それぞれ配列番号：１および配列番号：３として示し、代表的なアミノ酸配列を、配列番号：２および配列番号：４として示す。本発明により包含される他のＣＥＬ  ＩＩ配列には、GENBANK受託番号AAD00695、BAB03377、AAC34856、CAC33831およびNP_680734が含まれるが、これらには限定されない。
【００２５】
例示するために、このような配列のハイブリダイゼーションを、低下したストリンジェンシー、中程度のストリンジェンシーまたはさらにストリンジェントな条件（例えば、それぞれ３７℃における、５×デンハート液、０．５％のＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む３５〜４０％のホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーにより表される条件；４２℃における、５×デンハート液、０．５％のＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む４０〜４５％のホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーにより表される条件；および／または４２℃における、５×デンハート液、０．５％のＳＤＳおよび１×ＳＳＰＥを含む５０％のホルムアミドの洗浄ストリンジェンシーにより表される条件）の下で、本明細書中に具体的に開示した配列に対して行うことができる。例えば、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual（第２版、1989）(Cold Spring Harbor Laboratory)を参照。
【００２６】
代替的に述べて、本発明のＣＥＬ  ＩＩをコードする単離された核酸は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％またはこれより高い、本明細書中に具体的に開示した単離された核酸配列（または上記で定義したこの断片）との配列の相同性を有し、本明細書中に定義した機能的なＣＥＬ  ＩＩをコードする。
【００２７】
当業者には、本発明のＣＥＬ  ＩＩをコードする核酸には、遺伝子コードの縮重により可変性があり得ることが、理解される。異なる核酸配列が同一のポリペプチドをコードすることを可能にする遺伝子コードの縮重は、文献において十分知られている（表２を参照）。
【００２８】
【表２】
2008503210.tif 000004
【００２９】
核酸配列における他の変化は、翻訳されない配列、例えばイントロン配列並びに５’および３’非翻訳配列の存在（または不存在）により、導入され得る。
【００３０】
さらに、本発明の単離された核酸は、少なくとも約６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％、９８％またはこれより高い、本明細書中に具体的に開示したポリペプチド配列（またはこの断片）とのアミノ酸配列の同一性を有し、さらに本明細書中に定義した機能的なＣＥＬ  ＩＩをコードするＣＥＬ  ＩＩポリペプチドをコードする当該核酸を包含する。
【００３１】
当該分野において知られているように、多くの種々のプログラムを用いて、核酸またはポリペプチドが、既知の配列に対する配列の同一性または相同性を有するか否かを確認することができる。配列の同一性および／または相同性を、当該分野において知られている標準的な手法を用いて決定することができ、これには、SmithおよびWaterman (1981)、Adv. Appl. Math. 2:482の局所的な配列同一性アルゴリズム、NeedlemanおよびWunsch (1970)、J. Mol. Biol. 48:443の配列同一性整列アルゴリズムによるもの、PearsonおよびLipman (1988)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444の同一性方法のための検索によるもの、初期設定を用いるかまたは調査による、これらのアルゴリズム（GAP、BESTFIT、FASTAおよびWisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, WIにおけるTFASTA）、Devereuxら(1984)、Nucl. Acid Res. 12:387-395により記載されたBest Fit配列プログラムのコンピュータ化された履行によるものが含まれるが、これらには限定されない。
【００３２】
有用なアルゴリズムの例は、PILEUPである。PILEUPは、関連する配列の群からの複数の配列の整列を、連続的な対での整列を用いて作成する。これはまた、整列を作成するために用いられるクラスタリング関係を示す系図をプロットすることができる。PILEUPは、FengおよびDoolittle (1987)、J. Mol. Evol. 35:351-360の連続的な整列方法の単純化を用いる；この方法は、HigginsおよびSharp (1989)、CABIOS 5:151-153により記載されたものと類似する。
【００３３】
有用なアルゴリズムの他の例は、Altschulら(1990)、J. Mol. Biol. 215:403-410およびKarlinら(1993)、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5787中に記載されているBLASTアルゴリズムである。特に有用なBLASTプログラムは、Altschulら(1996)、Methods in Enzymology, 266:460-480; http://blast.wustl/edu/blast/README.htmlから得られたWU-BLAST-2プログラムである。WU-BLAST-2は、いくつかの検索パラメーターを用い、これを、初期値に設定することができる。パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の構成および関連する配列を検索する特定のデータベースの構成に依存して、プログラム自体により確立される；しかし、当該値を、感受性が増大するように調整することができる。
【００３４】
追加的な有用なアルゴリズムは、Altschulら(1997)、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402により報告された、ギャップを作成した(gapped)BLASTである。
【００３５】
百分率のアミノ酸配列の同一性の値を、整合する同一の残基の数を、整列した領域における長い方の配列の残基の合計の数で除することにより、決定することができる。長い方の配列は、整列した領域における最も実際的な残基を有する配列である（WU-Blast-2により導入して、整列スコアを最大化したギャップを、無視する）。
【００３６】
当該整列は、ギャップの導入を、整列させるべき配列中に含むことができる。さらに、本明細書中に具体的に開示したポリペプチドよりも多数の、または少数のアミノ酸を含む配列について、１つの態様において、配列の同一性の百分率は、同一のアミノ酸の数に基づいて、アミノ酸の合計の数に関連して決定されることが、理解される。従って、例えば、本明細書中に具体的に開示した配列よりも短い配列の配列同一性は、１つの態様においては、短い方の配列中のアミノ酸の数を用いて、決定される。百分率同一性の計算においては、相対的重量は、配列の変化、例えば挿入、欠失、置換などの種々の明示には帰されない。
【００３７】
１つの態様において、同一性のみが、正に評定され（＋１）、ギャップを含む配列の変化のすべての形態に、「０」の値を割り当て、これにより、配列同一性の計算について以下に記載する加重規模またはパラメーターについての必要性を解消する。配列同一性の百分率を、例えば、整合する同一の残基の数を、整列した領域における短い方の配列の残基の合計の数で除し、１００を乗じることにより、計算することができる。長い方の配列は、整列した領域における最も実際的な残基を有する配列である。
【００３８】
本明細書中に具体的に開示したか、または他の方法で当該分野において知られているＣＥＬ  ＩＩアミノ酸配列を改変するために、アミノ酸置換は、アミノ酸側鎖置換の相対的な相同性または差異を含む、当該分野において知られているすべての特性、例えばこれらの疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づくことができる。特定の態様において、保存的置換（即ち、同様の特性を有するアミノ酸残基での置換）を、ＣＥＬ  ＩＩをコードするアミノ酸配列において行う。このような改変を行って、ＣＥＬ  ＩＩのｐＨ最適、温度最適または安定性を変化させることができる。
【００３９】
アミノ酸置換を行うにあたり、アミノ酸の疎水性親水性指標の指数を、考慮することができる。相互作用的な生物学的機能をタンパク質に付与するにあたっての、疎水性親水性指標のアミノ酸の指数の重要性は、当該分野において一般的に理解されている（KyteおよびDoolittle (1982)、J. Mol. Biol. 157:105を参照）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性指標の特徴は、得られたタンパク質の二次構造に寄与し、次にこれにより、他の分子を有するタンパク質、例えば酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原などの相互作用が定められることが、認められている。
【００４０】
各々のアミノ酸には、この疎水性および電荷特性に基づく疎水性親水性指標の指数が割り当てられており(KyteおよびDoolittle (1982)、上記)、これらは、以下の通りである：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；トレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リシン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５）。
【００４１】
また、当該分野において、アミノ酸の置換を、親水性に基づいて行うことができることが、理解されている。米国特許第4,554,101号には、隣接するアミノ酸の親水性により左右される、タンパク質の最大の局所的な平均の親水性は、タンパク質の生物学的特性と相関することが、述べられている。
【００４２】
米国特許第4,554,101号に詳述されているように、以下の親水性値が、アミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リシン（±３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；トレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；トリプトファン（−３．４）。
【００４３】
本発明の単離された核酸には、ＲＮＡ、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびこれらのキメラが含まれる。単離された核酸は、さらに、改変されたヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体を含むことができる。
【００４４】
ＣＥＬ  ＩＩをコードする単離された核酸は、適切な発現制御配列、例えば転写／翻訳制御シグナルおよびポリアデニル化シグナルと関連し得る。
【００４５】
種々のプロモーター／エンハンサー要素を、所望のレベルおよび細胞または組織特異性発現に依存して用いることができることが、理解される。プロモーターは、所望の発現のパターンに依存して、構成的であるか、または誘発性であってもよい（例えば、メタロチオネインプロモーターまたはホルモン誘発性プロモーター）。プロモーターは、野生型であるかまたは外来性であってもよく、天然の、または合成の配列であってもよい。外来性のにより、転写開始領域が、該転写開始領域を導入する野性型の宿主中に見出されないことを意図する。プロモーターを、これが、関連する標的細胞（１または２以上）中で機能するように、選択する。特定の態様において、プロモーターは、大規模のタンパク質生産の目的のためにＣＥＬ  ＩＩをコードする核酸を発現するために用いることができる細胞中で機能する。同様に、プロモーターは、これらの細胞および組織に特異的であってもよい（即ち、特定の細胞または組織のタイプにおいて顕著な活性を示すのみである）。
【００４６】
例示するために、ＣＥＬ  ＩＩをコードする配列を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要最初期プロモーター、アルブミンプロモーター、伸張因子１−α（ＥＦ１−α）プロモーター、ＰγＫプロモーター、ＭＦＧプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターまたはグリセルアルデヒド−３−リン酸プロモーターと、動作可能に関連させることができる。
【００４７】
さらに、特定の開始シグナルが、一般的に、挿入されたタンパク質コード配列の効率的な翻訳のために、必要である。ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列を含むことができるこれらの翻訳制御配列は、天然および合成の両方の、種々の起源のものであってもよい。例えば、当業者は、内因性シグナルペプチドを欠いているＣＥＬ  ＩＩの発現には、成熟したＣＥＬ  ＩＩタンパク質の組換え発現のために、コード配列の５’末端において、開始コドンの付加が必要であることを、理解することができる。
【００４８】
ＣＥＬ  ＩＩは、直接のみならず、異種性のポリペプチド、即ち分泌のためのシグナル配列および／またはＣＥＬ  ＩＩの精製を補助する他のポリペプチドを有する融合タンパク質としても、発現することができる。１つの態様において、異種性のポリペプチドは、当該異種性のポリペプチドをＣＥＬ  ＩＩから除去するための特異的な切断部位を有する。
【００４９】
一般的に、シグナル配列は、配列番号：１によりコードされる内因性シグナル配列であってもよいか、またはベクターの成分であってもよく、宿主細胞により認識され、加工される（即ち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。原核生物中での産生のために、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐまたは熱安定性エンテロトキシンＩＩリーダーからの原核生物シグナル配列を、用いることができる。酵母分泌のために、例えば、酵母インベルターゼ、アルファ因子または酸ホスファターゼリーダー、Candida albicansグルコアミラーゼリーダー(EP 362,179)などを、用いることができる（例えば、WO 90/13646を参照）。哺乳類細胞発現において、同一の、または関連する種の分泌されたポリペプチドからのシグナル配列、並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペス糖タンパク質Ｄシグナルを、用いることができる。このようなシグナル配列を、有利には、成熟したＣＥＬ  ＩＩタンパク質をコードする核酸配列（例えば配列番号：３）に融合させることができる。
【００５０】
ＣＥＬ  ＩＩに融合させることができる他の有用な異種性のポリペプチドには、融合タンパク質の発現もしくは溶解性を増大させるか、またはアフィニティー精製においてリガンドとして作用することにより、融合タンパク質の精製を補助するものが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、ｐＧＥＸ(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)、ｐＭＡＬ(New England Biolabs, Beverly, Mass.)およびｐＲＩＴ５(Pharmacia, Piscataway, NJ)が含まれ、これらは、それぞれＧＳＴ、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを、標的の組換えタンパク質に融合する。
【００５１】
ＣＥＬ  ＩＩをコードする単離された核酸を、例えばクローン化または他の実験室的な操作、組換えタンパク質産生または遺伝子送達の目的のために、ベクター中に導入することができる。特定の態様において、ベクターは、発現ベクターである。例示的なベクターには、細菌性の人工的な染色体、コスミド、酵母の人工的な染色体、ファージ、プラスミド、脂質ベクターおよびウイルスベクターが含まれる。核酸コード配列、特にＣＥＬ  ＩＩコード配列の発現(express)、発現(expresses)または発現(expression)の用語により、当該配列が、転写され、随意に翻訳されることを、意味する。典型的に、本発明において、コード配列の転写および翻訳の結果、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドの産生がもたらされる。
【００５２】
本発明の方法は、インビトロで（例えば、大規模の組換えタンパク質生産のために）、またはインビボで（例えば、組換え大規模タンパク質生産もしくは治療的目的のために）分裂している、および分裂していない細胞を共に含む、広範囲の宿主細胞中にＣＥＬ  ＩＩをコードする核酸を送達し、随意に発現させるための手段を提供する。本発明の態様において、核酸を、標的細胞中で一過性に発現させることができるか、または核酸を、標的細胞中に、例えば細胞のゲノム中への組み込みもしくは安定に維持されたエピソーム（例えばエプスタインバーウイルスから由来する）からの持続性の発現により、安定に導入することができる。
【００５３】
ＣＥＬ  ＩＩをコードする単離された核酸を、細胞または対象により発現させて、ＣＥＬ  ＩＩが、即ち組換えＣＥＬ  ＩＩタンパク質の供給源として、これから産生され、精製されるようにすることができる。この態様において、ＣＥＬ  ＩＩは、全身的な循環中に、または他の体液（例えば乳汁、リンパ液、髄液、尿）中に分泌され、これは、容易に採集され、これから、ＣＥＬ  ＩＩをさらに精製することができる。他の代案として、ＣＥＬ  ＩＩタンパク質を、鳥類種において産生し、卵タンパク質中に蓄積し、かつこれから好都合に単離することができる。
【００５４】
同様に、ＣＥＬ  ＩＩをコードする核酸を、スクリーニングアッセイの目的のために、または大規模の組換えタンパク質生産のために、細胞培養系において、一過性に、または安定に発現させることができる。細胞は、細菌、原生動物、植物、酵母、菌類または動物細胞であってもよい。
【００５５】
特定の態様において、ＣＥＬ  ＩＩをコードする単離された核酸を、培養した細胞、例えば初代または不死化細胞系の細胞中に、組換えタンパク質産生のために導入することができる。組換え細胞を用いて、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドを産生することができ、これを、細胞または細胞培養培地から採集する。同様に、組換えタンパク質を、本質的にバイオリアクターとして用いられる生物（例えば微生物、動物または植物）中で産生し、随意に生物から精製することができる。
【００５６】
一般的に、単離された核酸を、発現ベクター（ウイルス性または非ウイルス性）中に導入する。当業者には、すべての好適なベクターを用いて、本発明の単離された核酸を関連する標的細胞（１もしくは２以上）または対象に送達することができることは、明らかである。送達ベクターの選択を、当該分野において知られている多数の要因に基づいて、行うことができ、これには、標的宿主の年齢および種、インビトロ対インビボ送達、所望される発現のレベルおよび持続性、意図される目的（例えば、大規模生産のため）、標的細胞または器官、送達の経路、単離された核酸の大きさ、安全性の懸念などが含まれる。
【００５７】
好適なベクターには、ウイルスベクター（例えばレトロウイルス、アルファウイルス；ワクシニアウイルス；アデノウイルス、アデノ関連ウイルスまたは単純ヘルペスウイルス）、脂質ベクター、ポリリシンベクター、核酸分子と共に用いられる合成ポリアミノポリマーベクター、例えばプラスミドなどが含まれる。
【００５８】
本明細書中で用いる、ウイルスベクターまたはウイルス送達ベクターの用語は、核酸送達ビヒクルとして機能し、ウイルス粒子内に包装されたベクターゲノムを含むウイルス粒子を意味することができる。あるいはまた、ウイルス粒子の不存在において核酸送達ビヒクルとして用いる場合には、これらの用語を用いて、ベクターゲノムを意味することができる。
【００５９】
組換えウイルスベクターを産生するための、およびウイルスベクターを、核酸送達のために用いるためのプロトコルは、Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. M.ら（編）、Greene Publishing Associates, (1989)および他の標準的な実験室マニュアル（例えばVectors for Gene Therapy. Current Protocols in Human Genetics中、John Wiley and Sons, Inc.: 1997）中に見出すことができる。
【００６０】
種々の宿主細胞と適合性の発現ベクターは、当該分野において十分知られており、核酸の転写および翻訳に適する要素を含む。典型的には、発現ベクターは、発現カセットを含み、これは、５’から３’への方向において、プロモーター、プロモーターと動作可能に関連するＣＥＬ  ＩＩをコードするコード配列並びに随意に、ＲＮＡポリメラーゼのための停止シグナルおよびポリアデニラーゼのためのポリアデニル化シグナルを含む末端配列を含む。
【００６１】
発現ベクターを、原核細胞または真核細胞中でのポリペプチドの発現のために、設計することができる。例えば、ポリペプチドを、細菌細胞、例えば大腸菌、昆虫細胞（例えばバキュロウイルス発現系において）、酵母細胞または哺乳類細胞中で発現させることができる。いくつかの好適な宿主細胞は、さらにGoeddel (1990)、Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA中に討議されている。酵母S. cerevisiae中での発現のためのベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃｌ(Baldariら(1987)、EMBO J. 6:229-234)、ｐＭＦａ(KurjanおよびHerskowitz (1982)、Cell 30:933-943)、ｐＪＲＹ８８(Schultzら(1987)、Gene 54:113-123)、およびｐＹＥＳ２(INVITROGEN Corporation, San Diego, CA)が含まれる。培養した昆虫細胞（例えばＳｆ９細胞）中でタンパク質を産生するための核酸の発現のために有用なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃ系列(Smithら(1983)、Mol. Cell. Biol. 3:2156-2165)およびｐＶＬ系列(LucklowおよびSummers (1989)、Virology 170:31-39)が含まれる。
【００６２】
哺乳類発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８(Seed (1987)、Nature 329:840)およびｐＭＴ２ＰＣ(Kaufmanら(1987)、EMBO J. 6:187-195)が含まれる。哺乳類細胞において用いる場合には、発現ベクターの制御機能は、しばしばウイルス調節要素により付与される。例えば、一般的に用いられているプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０から由来する。
【００６３】
本明細書中で討議した調節制御配列に加えて、組換え発現ベクターは、追加のヌクレオチド配列を含むことができる。例えば、組換え発現ベクターは、ベクターを包含している宿主細胞を識別するための、選択可能なマーカー遺伝子をコードすることができる。
【００６４】
ベクターを、原核細胞または真核細胞中に、慣用の形質転換またはトランスフェクション手法により導入することができる。本明細書中で用いる、形質転換およびトランスフェクションの用語は、外来の核酸（例えばＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための、種々の当該分野で認識されている手法を意味し、当該手法には、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストランにより媒介されたトランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、微量注入、ＤＮＡ負荷リポソーム、リポフェクタミン−ＤＮＡ複合体、細胞超音波処理、Agrobacteriumにより媒介された形質転換、高速微粒子銃を用いた遺伝子衝撃、およびウイルスにより媒介されたトランスフェクションが含まれる。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするのに適する方法は、Sambrookら(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory press (1989))および他の実験室マニュアル中に見出すことができる。
【００６５】
しばしば、細胞（特に哺乳類細胞）の小さい画分のみにより、外来のＤＮＡがこれらのゲノム中に組み込まれる。これらの組み込み体を同定し、選択するために、選択可能なマーカー（例えば抗生物質に対して耐性である）をコードする核酸を、関連する核酸と共に、宿主細胞中に導入することができる。特定の態様において、選択可能なマーカーには、薬剤、例えばＧ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキセートに対する耐性を付与するものが含まれる。選択可能なマーカーをコードする核酸を、関連する核酸を含むものと同一のベクター上の宿主細胞中に導入することができるかまたは、別個のベクター上に導入することができる。導入された核酸で安定にトランスフェクトされた細胞を、薬剤選択により同定することができる（例えば、選択可能なマーカー遺伝子を導入された細胞は、生存し、一方他の細胞は、死滅する）。
【００６６】
組換えタンパク質をまた、トランスジェニック植物中で産生することができ、ここで、タンパク質をコードする単離された核酸を、核または色素体ゲノム中に挿入する。植物および植物細胞を形質転換するためのベクター、植物、細胞培養物および方法は、当該分野として知られている。一般的に、Methods in Enzymology Vol. 153 (Recombinant DNA Part D) 1987, WuおよびGrossman編、Academic Pressおよび欧州特許出願第EP 693554号を参照。
【００６７】
植物細胞において、発現系は、しばしば、組換えＴｉおよびＲｉプラスミドベクター系から由来する。シャトルベクターの共組換え体群において、関連する遺伝子を、遺伝子組換えにより、植物形質転換に必要なシス作用性およびトランス作用性要素を共に含む、非発癌性のＴｉプラスミド中に挿入する。例示的なベクターには、ｐＭＬＪ１シャトルベクター(DeBlockら(1984)、EMBO J. 3:1681-1689)および非発癌性のＴｉプラスミドｐＧＶ２８５０(Zambryskiら(1983)、EMBO J. 2:2143-2150)が含まれる。二元系において、関連する遺伝子を、植物形質転換に必要なシス作用性要素を含むシャトルベクター中に挿入する。他の必要な機能は、トランスにおいて、非発癌性Ｔｉプラスミドにより提供されている。例示的なベクターには、ｐＢＩＮ１９シャトルベクター(Bevan (1984)、Nucl. Acids Res. 12:8711-8721)および非発癌性ＴｉプラスミドｐＡＬ４４０４(Hoekemaら(1983)、Nature 303:179-180)が含まれる。あるいはまた、ＣＥＬ  ＩＩ核酸配列を、適切な調節配列と共に、植物細胞中に、遺伝子銃形質転換により、導入することができる。
【００６８】
植物発現系において用いられるプロモーターは、典型的には、植物細胞のゲノムから（例えば、熱ショックプロモーター；RUBISCOの小さいサブユニットについてのプロモーター；クロロフィルａ／ｂ結合タンパク質についてのプロモーター）、または植物ウイルスから（例えば、ＣａＭＶの３５Ｓ  ＲＮＡプロモーター；ＴＭＶのコートタンパク質プロモーター）由来する。植物におけるＣＥＬ  ＩＩ配列の発現は、構成的であるか、または一時的に、もしくは空間的に調節されていてもよい。ＣＥＬ  ＩＩを発現するための例示的な植物には、タバコ（例えば葉における発現）、トウモロコシ（例えば種子における発現）またはジャガイモ（例えば塊茎における発現）が含まれるが、これらには限定されない。植物細胞系における発現が、さらに意図される。
【００６９】
本発明はさらに、本発明のスクリーニング方法および大規模なタンパク質生産方法において用いるための、ＣＥＬ  ＩＩをコードする単離された核酸を含む培養した、または組換え細胞を提供する（例えば、ＣＥＬ  ＩＩを、細胞から産生および採集し、随意に精製する）。
【００７０】
ＣＥＬ  ＩＩをまた、動物においてインビボで産生することができる。従って、尚他の観点として、本発明は、当該分野において十分知られている方法により産生することができる、ＣＥＬ  ＩＩをコードする単離された核酸を含むトランスジェニックの非ヒト動物を提供する。トランスジェニックの非ヒト動物は、鳥類および非ヒト哺乳類を含むすべての種であってもよい。本発明のこの観点において、好適な非ヒト哺乳類には、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、ヤギ、ヒツジ、ブタおよびウシが含まれる。
【００７１】
ＣＥＬ  ＩＩをコードする核酸は、トランスジェニック動物内の細胞中に安定に導入される（典型的には、ゲノム中への安定な組み込みにより、または安定に維持されたエピソーム作成物により）。十分な数の細胞が、ＣＥＬ  ＩＩ導入遺伝子を含み、発現する限りは、すべての細胞が、導入遺伝子を含む必要はなく、動物は、改変された、および改変されていない細胞のキメラであってもよい。
【００７２】
トランスジェニック動物を作成する方法は、当該分野において知られている。ＤＮＡ作成物を、鳥類または哺乳類の生殖系列中に導入して、トランスジェニック動物を作成することができる。例えば、作成物の１個または数個のコピーを、胚のゲノム中に、標準的なトランスジェニック手法により導入することができる。
【００７３】
例示的な態様において、トランスジェニック非ヒト動物を、非ヒト動物の生殖系列中に導入遺伝子を導入することにより、作成する。導入遺伝子を、胚標的細胞中に、種々の発生段階において導入することができる。胚標的細胞の発生の段階に依存して、種々の方法を用いる。用いるすべての動物の特定の系列（１または２以上）を、可能な場合には、一般的な良好な健康、良好な胚産生量、胚における良好な前核の視感度および良好な生殖適応度について、選択しなければならない。
【００７４】
導入遺伝子の胚中への導入を、当該分野において知られている種々の方法のいずれか、例えば微量注入、エレクトロポレーション、リポフェクションまたはウイルスベクターにより、達成することができる。例えば、導入遺伝子を、哺乳類中に、作成物を哺乳類受精卵（１または２以上）の前核中に微量注入して、発生している哺乳類（１または２以上）の細胞中に維持されるべき作成物の１個または２個以上のコピーを生じることにより、導入することができる。トランスジェニック作成物の受精卵中への導入に続いて、当該受精卵を、インビトロで、種々の量の時間にわたりインキュベートするか、または代理の宿主中に再び移植するか、またはこれらの両方とすることができる。１つの一般的な方法は、胚をインビトロで、種に依存して約１〜７日間インキュベートし、次にこれらを、代理の宿主中に再び移植することである。
【００７５】
トランスジェニック的に操作した胚の後代を、組織のセグメントの作成物の存在について試験することができる（例えばサザンブロット分析により）。ゲノム中に安定に組み込まれた、外因性のクローン化された作成物の１個または２個以上のコピーを有する胚を用いて、トランスジェニック的に加えられた作成物を有する永久的なトランスジェニック動物系を達成することができる。
【００７６】
トランスジェニック的に変化した動物を、生後に、子孫のゲノム中への作成物の導入について、アッセイすることができる。これを、後代からの染色体物質上に、ポリペプチドまたはこのセグメントをコードするＤＮＡ配列に相当するプローブをハイブリダイズすることにより、行うことができる。作成物の少なくとも１つのコピーをこれらのゲノム中に含むと見出されたこれらの後代を、成熟度に成長させる。
【００７７】
トランスジェニック鳥類を作成する方法はまた、当該分野において知られている。例えば、米国特許第5,162,215を参照。
【００７８】
大規模の生産のために、ＣＥＬ  ＩＩポリペプチドを、培養した細胞またはトランスジェニック動物から精製することができる。典型的には、ポリペプチドを、体液（例えばミルクまたは卵）の培養培地から、分泌されたポリペプチドとして回収するが、分泌シグナルを伴わずに直接発現する場合には、これをまた、宿主細胞溶菌液から回収することができる。ＣＥＬ  ＩＩを、セロリ起源のもの以外の組換え細胞中で発現させる場合には、ＣＥＬ  ＩＩは、セロリ起源のタンパク質またはポリペプチドを完全に含まない。しかし、組換え細胞タンパク質またはポリペプチドからＣＥＬ  ＩＩを精製して、ＣＥＬ  ＩＩに関して実質的に均質な調合液を得ることが、必要である。
【００７９】
最初の段階として、培養培地または溶菌液を、遠心分離して、粒子状の細胞残骸を除去する。次に、膜および可溶性タンパク質画分を、分離する。次に、ＣＥＬ  ＩＩを、可溶性タンパク質画分から精製することができる。次に、ＣＥＬ  ＩＩを、本明細書中に開示したように、または例えば以下の好適な精製手順を用いて、汚染可溶性タンパク質およびポリペプチドから精製することができる：免疫親和性における分別またはイオン交換カラム；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ上の、または陽イオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥ上のクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ−ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えばSEPHADEX（登録商標）Ｇ−７５を用いたゲル濾過；およびリガンドアフィニティークロマトグラフィー。
【００８０】
ＣＥＬ  ＩＩの好適に純粋な調合液を、ＣＥＬエンドヌクレアーゼ活性について、ＤＮＡ切れ目挿入アッセイ、ＤＮＡ分解酵素可溶化アッセイまたはミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイが含まれるが、これらには限定されない、１種または２種以上の十分知られているアッセイを用いて、分析することができる。精製された生成物をまた、電気泳動分離、例えばポリアクリルアミドゲル電気泳動により、分析することができる。
【００８１】
精製されたＣＥＬ  ＩＩ調合液を、二本鎖ＤＮＡにおけるミスマッチの存在を検出するかまたは、二本鎖ＤＮＡ中の二本鎖ＤＮＡミスマッチにおける突然変異の部位を決定するための方法において、用いることができる。このような方法の例は、米国特許第5,869,245号および6,027,898号中に見出される。本明細書中に開示されている核酸配列、ベクターおよび宿主細胞から産生されたＣＥＬ  ＩＩを、二本鎖ＤＮＡの試料を分析するための方法において用いて、この中の突然変異の存在を決定することができることが、意図される。このような方法は、二本鎖ＤＮＡを含む試料（例えば、生物学的試料、細胞、組織など）を、単離されたＣＥＬ  ＩＩエンドヌクレアーゼと接触させ、ＣＥＬ  ＩＩエンドヌクレアーゼ消化の産物を分離し、前述の産物を検出することを含む。
【００８２】
断片（即ち、アガロースゲル上で決定される、１つのバンドの２つもしくは３つ以上のバンドへのＣＥＬ  ＩＩ消化）の数の増大または、ＣＥＬ  ＩＩエンドヌクレアーゼの存在下でのＤＮＡの大きさの低下は、前述のＤＮＡにおけるミスマッチの指標となる。ＣＥＬ  ＩＩエンドヌクレアーゼ消化の産物を分離する段階を、ゲル電気泳動、毛細管電気泳動またはクロマトグラフィー分離、例えば整合イオンポリヌクレオチドクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーを用いて行うことができる。ＤＮＡ分子を検出するための標準的な方法は、当該分野において十分知られている（例えば、臭化エチジウム染色またはＵＶ光吸収；放射性同位体またはフルオロフォアでの標識）。
【００８３】
本発明を、以下の非限定的な例により、一層詳細に記載する。
例１：材料およびアッセイ
材料。子ウシ胸腺ＤＮＡ(SIGMA, St Louis, MO)を、プロテイナーゼＫ処理およびフェノール抽出の繰り返されたサイクルにより精製し、超音波処理により粘度を低下させ、沸騰水浴中で１０分間加熱することにより変性させ、続いて湿潤氷上で迅速に冷却した。Q SEPHAROSE（登録商標）高速流、ヘパリンSEPHAROSE（登録商標）高速流、G-25 SEPHADEX（登録商標）、SEPHACRYL（登録商標）Ｓ−１００  ＨＲ、およびConA-SEPHAROSE（登録商標）マトリックス並びにHIPREP（登録商標）１６／１０ヘパリンSEPHAROSE（登録商標）高速流、 MONO S（登録商標）HR 5/5、HITRAP（登録商標）ヘパリンＨＰ、およびMONO Q（登録商標）HR 5/5カラムは、AMERSHAM（登録商標）PHARMACIA（登録商標）Biotech(Piscataway, NJ)からのものであった。合成オリゴヌクレオチドは、INVITROGEN（登録商標）(Carlsbad, CA)からのものであった。
【００８４】
ＤＮＡ配列決定。個別の大腸菌コロニーを、液体培養において、３７℃で一晩成長させた。プラスミドＤＮＡを、プラスミドミニプレップキット(QIAGEN（登録商標）、Valencia, CA)を用いて単離し、適切な遺伝子を、ABI 3100遺伝子分析装置(ABI, Foster City, CA)を用いて配列決定した。
【００８５】
ＰＣＲ断片でのミスマッチ切断アッセイ。プラスミドｐＱＩＳ１５５は、ｐＥＴ２２ｂ(NOVAGEN（登録商標）、Madison, WI)のＮｄｅＩ部位とＸｈｏＩ部位との間にクローン化された、ＣＥＬ  Ｉ(Yangら(2000))についての遺伝子の誘導体を含む。GENETAILOR（登録商標）部位特異的変異誘発システム(INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad, CA)を用いて、ｐＱＩＳ１５５のＣＥＬ  Ｉ遺伝子中の標的部位と呼ばれる、位置６０５におけるＣを、Ａ、ＧおよびＴに変更するか、または１個、２個、３個、６個、９個および１２個の塩基の挿入を、当該部位において行った。プラスミドＤＮＡを、大腸菌ＤＨ５α(INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad, CA)中に形質転換し、細胞を、ＬＢ培地＋１００μｇ／ｍＬのアンピシリン中で成長させた。プラスミドＤＮＡを、プラスミドミニキット(QIAGEN（登録商標）、Valencia, CA)を用いて単離した。プラスミドを、標的部位におけるこれらの配列に基づいて命名した。例えば、ｐＱＩＳ１５５Ｇは、標的部位においてＧを有する。
【００８６】
６３２ｂｐ断片を、ｐＱＩＳ１５５プラスミドＤＮＡから増幅し、この誘導体は、以下のプライマー(INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad, CA)を用いた：ｐＣＥＬＲ：５’−ＣＧＣ  ＣＡＡ  ＡＧＡ  ＡＴＧ  ＡＴＣ  ＴＧＣ  ＧＧＡ  ＧＣＴ  Ｔ−３’（配列番号：１０）およびｐＣＥＬ１９０Ｆ：５’−ＡＣＡ  ＣＣＴ  ＧＡＴ  ＣＡＡ  ＧＣＣ  ＴＧＴ  ＴＣＡ  ＴＴＴ  ＧＡＴ  ＴＡＣ−３’（配列番号：１１）。ＰＣＲを、OPTIMASE（登録商標）ポリメラーゼ(Transgenomic, Omaha, NE)で、推薦された反応条件を用いて行った。ＰＣＲ反応において産生された増幅されたＤＮＡの量および品質を、ＤＮＡ産物の、アガロースゲル電気泳動により分別されたＤＮＡ質量ラダー(NEB, Beverly, MA)に対する視覚的比較により、決定した。
【００８７】
ヘテロ二本鎖を、等量のｐＱＩＳ１５５から調製した増幅されたＤＮＡおよびこの誘導体の１種をアニールすることにより、形成した。ＤＮＡハイブリダイゼーションを、以下のプログラムを用いた熱サイクラー(thermocycler)において、行った：９５℃で１０分間；−２℃／秒において９５℃から８５℃；および−０．１℃／秒において８５℃から２５℃。２種の異なる対立遺伝子を、１：１の混合物においてアニールした場合には、ミスマッチヘテロ二本鎖が、当初の約５０％で形成する。各々の塩基の変化について、２種のミスマッチが、形成する。改善されたホモ二本鎖(homoduplex)は、集団の他の５０％を構成する。
【００８８】
アニールしたＤＮＡ（２００ｎｇ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む５単位（ｐＨ８．５）のＣＥＬ  ＩＩを２０μＬの容積で、および１００単位のＴ４ＤＮＡリガーゼを用いて消化した。アニールしたＤＮＡ（２００ｎｇ）をまた、５単位のＣＥＬ  ＩＩヌクレアーゼを１×ＰＣＲ緩衝液中のＤＮＡに直接加えることにより、消化することができる。消化反応を、４２℃で２０分間インキュベートし、２μＬの０．５ＭのＥＤＴＡを加えることにより、停止した。切断産物を、２％アガロースゲルキャスト上で分別し、１×ＴＡＥ緩衝液（４０ｍＭのＴｒｉｓ−酢酸、ｐＨ８．３、１ｍＭのＥＤＴＡ）中を移動させた。ゲルを、臭化エチジウムで染色し、ＵＶ透視により撮影した。
【００８９】
ＨＰＬＣにより分析するべきアニールしたＤＮＡ（４００ｎｇ）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、２５ｍＭのＫＣｌおよび１０ｍＭのＭｇＣｌ２を含む所望の量のＣＥＬ  ＩまたはＣＥＬ  ＩＩを４０μＬの容積で用いて消化した。アニールしたＤＮＡ（４００ｎｇ）をまた、所望の量のＣＥＬ  ＩまたはＣＥＬ  ＩＩで、酵素を１×ＰＣＲ緩衝液中のＤＮＡに直接加えることにより、消化することができる。消化反応を、４２℃で２０分間インキュベートし、４μＬの０．５ＭのＥＤＴＡを加えることにより、停止した。発生した切断産物（４０μＬ）を、２６０ｎｍにおけるＵＶ検出を用いたＷＡＶＥシステム(Transgenomic, Omaha, NE)上で、分離した。DNASEP（登録商標）カートリッジを、５０℃で、非変性条件下で移動させて、ＤＮＡ断片を大きさに基づいて分離した。
【００９０】
ＤＮＡ分解酵素可溶化アッセイ。２種の可溶化アッセイを、ｐＨ５．５および８．５において行った。ｐＨ５．５における反応混合物（５０μＬ）は、２０ｍＭの酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）、１０ｍＭのＫＣｌ、０．５ｍｇ／ｍＬの変性子ウシ胸腺ＤＮＡおよび種々の量のＣＥＬヌクレアーゼを含んでいた。ｐＨ８．５における反応混合物は、緩衝液が、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．５）、１０ｍＭのＫＣｌおよび３ｍＭのＭｇＣｌ２であった以外は、同一の成分を含んでいた。反応を、３７℃で１０分間インキュベートし、０．２ＮのＨＣｌ中の低温の２０ｍＭのＬａＣｌ３を５０μＬ加えることにより、終了した。氷上で１０分およびEPPENDORF（登録商標）微量遠心管中で１３，０００ｒｐｍにおいて１０分間遠心分離した後に、上清の２６０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計において測定して、可溶化されたＤＮＡの量を決定した。１単位の可溶化活性（ＣＥＬヌクレアーゼ単位）は、１ｎｇの酸可溶性物質を１分間で３７℃において産生するのに必要な酵素の量である。
【００９１】
オリゴヌクレオチドを用いたミスマッチ切断アッセイ。ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイを、Oleylowskiら((1998)、上記)により、当該文献の図１Ｂ中に記載されているように、整合した、およびミスマッチのＤＮＡ６４量体二本鎖を用いた標準的な方法(Oleykowskiら(1998)、上記)を用いて、行った。用いた二本鎖は、平滑な末端を有していた。所望されるＤＮＡオリゴヌクレオチドを、５’末端において、［γ−３２Ｐ］ＡＴＰおよびＴ４ポリヌクレオチドキナーゼで標識した場合(Sambrookら、(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版、Cold Spring Harbor Laboratory press (1989))。ミスマッチエンドヌクレアーゼアッセイのための反応混合物（２０μＬ）は、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、５００ｎｇの標識していないＤＮＡ６４量体二本鎖または５ｎｇの５’末端を標識した二本鎖、およびＣＥＬヌクレアーゼを含んでいた。
【００９２】
標識した二本鎖を用いた場合には、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（２．５単位；PROMEGA（登録商標）、Madison WI）を加え、インキュベーションを、４２℃で５分間とした。標識していない二本鎖を用いた場合には、インキュベーションを、４２℃で３０分間とした。プロテイナーゼＫ（２μｇ）を、３０分の終了時に加え、インキュベーションを、４２℃で５分間継続した。インキュベーションを、１．５μＬの７０％（ｗ／ｖ）スクロース、５０ｍＭのＥＤＴＡ、５ｍＭの１，１０−フェナントロリン、０．１％（ｗ／ｖ）のキシレンシアノールおよび０．４％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルーを加えることにより、終了した。ＤＮＡを、１２％のＰＡＧＥゲル上で分別した。標識していないＤＮＡを、尿素を含まないゲル上で移動させ、ゲルを、臭化エチジウムで染色し、ゲルを、２５４ｎｍにおいてＵＶトランスイルミネータにより照射して、KODAK（登録商標）EDAS 290システムを用いて撮影した。標識したＤＮＡを、７Ｍの尿素を含まない、および含むゲルの両方上を移動させた。ゲルを乾燥し、放射活性を、PHOSPHORIMAGER（登録商標）(MOLECULAR DYNAMICS（登録商標）、Sunnyvale CA)上で分析した。
【００９３】
ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(Sambrookら(1989)、上記)を、１４％または１０〜２０％のプレキャストポリアクリルアミドゲル(INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad, CA)において行った。タンパク質を、ＴＣＡ沈殿、続いてＳＤＳ試料緩衝液中で加熱する前のアセトン洗浄により、濃縮した。タンパク質バンドを、銀染色(BIO-RAD（登録商標）、Hercules, CA)により検出した。MARK 12（登録商標）(INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad, CA)タンパク質標準を、試行して、分子量を確立した。
【００９４】
タンパク質濃度の決定。タンパク質の濃度を、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ(Pierce, Rockford, IL)を用いて、ウシ血清アルブミンを標準として決定した。
【００９５】
例２：ＣＥＬヌクレアーゼの精製
すべての段階を、４℃で行った。カラムクロマトグラフィーの間、ヌクレアーゼ活性を、ＤＮＡ分解酵素可溶化アッセイをｐＨ５．５および８．５において行ってモニタリングした。
【００９６】
粗製の抽出物の調製。冷却したセロリの茎（１５〜２０房）を、フードプロセッサ中で細分化し、WARING（登録商標）ブレンダー中でホモジナイズした。絞り汁を、果肉から、４層のチーズクロスを通して果肉を乾燥するまで搾り取ることにより、採集した。絞り汁を、５，０００×ｇにおいて２０分間遠心分離して、緑色の顆粒状物質を除去した。透明にした琥珀色の絞り汁を、ＣｏｎＡ緩衝液（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．７、１００μＭのフッ化フェニルメチルスルホニル（ＰＭＳＦ））の組成に、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．７）および０．１ＭのＰＭＳＦを加えることにより、調整した。固体の（ＮＨ４）２ＳＯ４を、絞り汁に、飽和の８０％に（５１．６ｇ／１００ｍＬ）加え、懸濁液を、２時間攪拌した。懸濁液を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離して、堅固なタンパク質ペレットを回収した。ペレットを、７００〜８００ｍＬのＣｏｎＡ緩衝液に溶解した。（ＮＨ４）２ＳＯ４を、飽和の１５％（８．４ｇ／１００ｍＬ）に溶解し、懸濁液を、３０分間攪拌した。懸濁液を、１０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、ペレットを廃棄した。
【００９７】
コンカナバリンＡ−SEPHAROSE（登録商標）アフィニティークロマトグラフィー。ＣｏｎＡ−SEPHAROSE（登録商標）（１００ｍＬ）（ジメチルスベルイミデート(dimethyl suberimidate)で架橋した）を、直径２．５ｃｍのカラム中に詰め込み、ＣｏｎＡ洗浄緩衝液（ＣｏｎＡ緩衝液＋０．５ＭのＫＣｌ）で平衡にした。（ＮＨ４）２ＳＯ４上清を、カラム上に、０．７５ｍＬ／分の流速で一晩負荷させた。次に、カラムを分解し、樹脂を、ブフナー漏斗中で、６〜８リットルのＣｏｎＡ洗浄緩衝液で洗浄した。次に、洗浄した樹脂を、２．５ｃｍのカラム中に、ＣｏｎＡ洗浄緩衝液を用いて再び詰め込んだ。ＣＥＬヌクレアーゼを、１００ｍＬのＣｏｎＡ洗浄緩衝液＋０．５Ｍのα−メチルマンノシドで溶離させた。溶離を、さらに４回繰り返した。溶出液を併せ、TRITON（登録商標）Ｘ−１００中０．０１％とした。
【００９８】
Ｇ−２５SEPHADEX（登録商標）クロマトグラフィー。ＣｏｎＡ−SEPHAROSE（登録商標）プールを、緩衝液Ａ（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、５ｍＭのα−メチルマンノシド、０．０１％のTRITON（登録商標）Ｘ−１００）で平衡にした２Ｌ（１０×２６ｃｍ）のＧ−２５SEPHADEX（登録商標）カラム上で脱塩した。カラムを、緩衝液Ａ＋１００μＭのＰＭＳＦ中で、２５〜３０ｍＬ／分において展開した。タンパク質が、７００ｍｌと１，４００ｍｌとの間の溶離容積で溶離し、これをプールした。このプールを、１Ｍのα−メチルマンノシドを加えることにより、α−メチルマンノシド中５０ｍＭとした。
【００９９】
Q SEPHAROSE（登録商標）クロマトグラフィー。脱塩したＣｏｎＡプールを、緩衝液Ａ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシドで平衡にした、５０ｍｌのQ SEPHAROSE（登録商標）高速流カラム（２．５×１０ｃｍ）上に、〜０．５ｍＬ／分で一晩負荷させた。カラムを、２５０ｍＬの緩衝液Ａ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシドで洗浄した。ＣＥＬヌクレアーゼを、緩衝液Ａ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド中０〜０．５ＭのＫＣｌの５００ｍＬ直線状勾配で、溶離させた。ＤＮＡエクソヌクレアーゼ活性（これは、ｐＨ５．５における可溶化アッセイにおいて活性であったが、ｐＨ８．５においては活性ではなかった）の大きいピークが、時々観察され、これは、０．０５Ｍと０．１２Ｍとの間のＫＣｌで、Q SEPHAROSE（登録商標）から溶離した。
【０１００】
ＣＥＬヌクレアーゼは、ｐＨ５．５の可溶化アッセイに基づいて０．１２Ｍと０．１８Ｍとの間のＫＣｌで、およびｐＨ８．５の可溶化アッセイに基づいて０．１２Ｍと０．３５Ｍとの間のＫＣｌで溶離した。フラクションを、０．１２Ｍと０．３５Ｍとの間のＫＣｌでプールし、低い濃度のＫＣｌにおけるエクソヌクレアーゼおよび高い濃度のＫＣｌにおける主要なタンパク質汚染物を回避した。汚染タンパク質の大部分が、ＫＣｌ濃度が増大するに伴って溶離したため、０．３５Ｍより高いＫＣｌのプールを、回避した。ＣＥＬ  ＩＩ活性（ｐＨ８．５において活性である）をすべてプールすることと、比較的高い濃度のＫＣｌで溶離した汚染タンパク質を排除することとの間で、妥協があった。ＣＥＬ  ＩおよびＣＥＬ  ＩＩを、一緒にプールした。
【０１０１】
ＣＥＬヌクレアーゼピークフラクションを、プールし、緩衝液Ｂ（２５ｍＭのＫＰＯ４、ｐＨ７．０、５ｍＭのα−メチルマンノシド、０．０１％のTRITON（登録商標）Ｘ−１００）＋１００μＭのＰＭＳＦに対して透析した。
【０１０２】
ヘパリンSEPHAROSE（登録商標）クロマトグラフィー。Q SEPHAROSE（登録商標）からの透析したＣＥＬヌクレアーゼプールを、α−メチルマンノシド中５０ｍＭとし、緩衝液Ｂ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド中で平衡にした、２０ｍＬのHIPREP（登録商標）１６／１０ヘパリンＦＦカラム（０．６×１８ｃｍ）上に、１ｍＬ／分で負荷させた。カラムを、１００ｍＬの緩衝液Ｂ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシドで、２ｍＬ／分で洗浄した。ＣＥＬヌクレアーゼを、緩衝液Ｂ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド＋１００μＭのＰＭＳＦ中で、２ｍＬ／分において、４ｍＬ／フラクションで、０〜０．３ＭのＫＣｌの２００ｍＬの直線状勾配で溶離させた。
【０１０３】
フラクションを、ｐＨ５．５および８．５においてアッセイした。ＣＥＬ  ＩおよびＣＥＬ  ＩＩを、ヘパリンSEPHAROSE（登録商標）クロマトグラフィーにより部分的に分離した。タンパク質汚染物の主要なピークは、０．０２〜０．１２ＭのＫＣｌにおいて溶離した。ＣＥＬ  ＩＩ（ｐＨ８．５において一層高い活性）は、０．０６〜０．１８ＭのＫＣｌにおいて溶離した。ＣＥＬ  Ｉ（ｐＨ５．５において一層高い活性）は、０．１２〜０．２２ＭのＫＣｌにおいて溶離した。ＣＥＬ  ＩＩを、低濃度のＫＣｌ側において、狭い範囲でプールして、タンパク質汚染を回避し、高濃度のＫＣｌ側においてプールして、ＣＥＬ  Ｉを回避した（０．０９〜０．１５ＭのＫＣｌでのプール）。ＣＥＬ  Ｉを、０．１５〜０．２１ＭのＫＣｌにおいてプールした。ＣＥＬ  ＩＩの精製を、その後行った。
【０１０４】
ＣＥＬ  Ｉプールを、２リットルの緩衝液Ａ＋１００μＭのＰＭＳＦに対して一晩透析し、最終的に精製するまで４℃で貯蔵した。
ＣＥＬ  ＩＩプールを、MONO S（登録商標）クロマトグラフィーについての調製において、２リットルの緩衝液Ｃ（１０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ７．２、５ｍＭのα−メチルマンノシド、０．０１％のTRITON（登録商標）Ｘ−１００）＋１００μＭのＰＭＳＦに対して一晩透析した。
【０１０５】
ＣＥＬ  ＩＩのMONO S（登録商標）ＨＲ  ５／５クロマトグラフィー。緩衝液Ｃ中の、ヘパリンSEPHAROSE（登録商標）カラムからの透析したＣＥＬ  ＩＩプールを、１Ｍのα−メチルマンノシドを加えることにより、α−メチルマンノシド中５０ｍＭとし、ｐＨを、１ＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．０）（〜２ｍＬ）を加えることにより、６．２に調整した。試料を、緩衝液Ｄ（５０ｍＭのＰＩＰＥＳ−ＮａＯＨ、ｐＨ６．２、５ｍＭのα−メチルマンノシド、０．０１％のTRITON（登録商標）Ｘ−１００）＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド＋１００μＭのＰＭＳＦ中で平衡にした１ｍＬのMONO S（登録商標）ＨＲ  ５／５カラム上に、０．５ｍＬ／分において負荷させた。カラムを、５ｍＬの緩衝液Ｄ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド＋１００μＭのＰＭＳＦで、１ｍＬ／分において洗浄した。
【０１０６】
ＣＥＬヌクレアーゼを、緩衝液Ｄ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド＋１００μＭのＰＭＳＦ中で、１ｍＬ／分において、０．５ｍＬ／フラクションで、０〜０．３ＭのＫＣｌの２５ｍＬの直線状勾配で溶離させた。可溶化アッセイを、ｐＨ５．５および８．５において行った。タンパク質汚染物の主要なピークは、０．０５〜０．２１ＭのＫＣｌにおいて溶離した。ＣＥＬ  Ｉは、０．１５〜０．２２ＭのＫＣｌにおいて溶離した。ＣＥＬ  ＩＩは、０．１８〜０．２８ＭのＫＣｌにおいて溶離した。ＣＥＬ  ＩＩを、０．２１〜０．２６ＭのＫＣｌの狭い範囲でプールして、タンパク質汚染を可能な限り回避し、ＣＥＬ  Ｉを、低濃度のＫＣｌ側においてプールした。プールした後に、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、直ちに加えて、ｐＨを、８．０とした（〜０．５ｍＬのＴｒｉｓを、３〜３．５ｍＬのプールした酵素に加えた）。
【０１０７】
ＣＥＬ  ＩＩプールを、１リットルの緩衝液Ａ＋１００μＭのＰＭＳＦに対して、一晩透析した。
【０１０８】
ＣＥＬ  ＩＩのMONO Q（登録商標）ＨＲ  ５／５クロマトグラフィー。MONO S（登録商標）カラムからの透析したＣＥＬ  ＩＩプールを、α−メチルマンノシド中５０ｍＭとし、緩衝液Ａ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド中で平衡にしたMONO Q（登録商標）ＨＲ  ５／５カラム上に、０．５ｍＬ／分において負荷させた。カラムを、５ｍＬの緩衝液Ａ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシドで、１ｍＬ／分において洗浄した。ＣＥＬ  ＩＩを、緩衝液Ａ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド中で、１ｍＬ／分において、０．５ｍＬ／フラクションで、０〜０．３ＭのＫＣｌの２５ｍＬの直線状勾配で溶離させた。可溶化アッセイを、ｐＨ８．５において行った。ＣＥＬ  ＩＩは、０．１〜０．２５ＭのＫＣｌにおいて溶離した。ＣＥＬ  ＩＩを、０．１〜０．１８ＭのＫＣｌの狭い範囲でプールして、一層高い、および一層低い濃度のＫＣｌにおいて溶離したタンパク質汚染物を回避した。
【０１０９】
ＣＥＬ  ＩＩプールを、１リットルの貯蔵緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、１０μＭのＺｎＣｌ２、０．０１％のTRITON（登録商標）Ｘ−１００、５０％のグリセロール）に対して一晩透析し、−２０℃で貯蔵した。
【０１１０】
緩衝液Ｃに対してのＣＥＬ  Ｉの透析。緩衝液Ａ中に４℃で貯蔵したＣＥＬ  ＩヘパリンSEPHAROSE（登録商標）プールを、HITRAP（登録商標）ヘパリンＨＰクロマトグラフィーの前に、２リットルの緩衝液Ｃ＋１００μＭのＰＭＳＦに対して一晩透析した。
【０１１１】
ＣＥＬ  ＩのHITRAP（登録商標）ヘパリンＨＰクロマトグラフィー。透析したヘパリンSEPHAROSE（登録商標）ＣＥＬ  Ｉプールを、α−メチルマンノシド中５０ｍＭとし、ｐＨを、１ＭのＰＩＰＥＳ（ｐＨ６．０）（〜２ｍＬ）を加えることにより、６．２に調整した。プールを、緩衝液Ｄ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド中で平衡にした１ｍＬのHITRAP（登録商標）ヘパリンＨＰカラム上に、０．５ｍＬ／分において負荷させた。カラムを、５ｍＬの緩衝液Ｄ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシドで、１ｍＬ／分において洗浄した。ＣＥＬ  Ｉを、緩衝液Ｄ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド中で、１ｍＬ／分において、０．５ｍＬ／フラクションで、０〜０．５ＭのＫＣｌの２０ｍＬの直線状勾配で溶離させた。アッセイを、ｐＨ５．５において行った。主要なタンパク質汚染ピークは、０．１〜０．３８ＭのＫＣｌにおいて溶離した。ＣＥＬ  Ｉは、０．３２〜０．４７ＭのＫＣｌにおいて溶離した。ＣＥＬ  Ｉを、狭い範囲でプールして、一層低い濃度のＫＣｌ、即ち０．３５〜０．４５ＭのＫＣｌにおいて溶離したタンパク質汚染物を回避した。プールした後に、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を、直ちに加えて、ｐＨを、８．０とした（〜０．５ｍＬのＴｒｉｓを、３〜３．５ｍＬのプールした酵素に加えた）。
【０１１２】
ＣＥＬ  Ｉプールを、１リットルの緩衝液Ａ＋１００μＭのＰＭＳＦに対して、一晩透析した。
【０１１３】
ＣＥＬ  ＩのMONO Q（登録商標）ＨＲ  ５／５クロマトグラフィー。HITRAP（登録商標）ヘパリンＨＰからの透析したＣＥＬ  Ｉプールを、α−メチルマンノシド中５０ｍＭとし、緩衝液Ａ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド中で平衡にしたMONO Q（登録商標）ＨＲ  ５／５カラム上に、０．５ｍＬ／分において負荷させた。カラムを、５ｍＬの緩衝液Ａ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシドで、１ｍＬ／分において洗浄した。ＣＥＬ  Ｉを、緩衝液Ａ＋４５ｍＭのα−メチルマンノシド中で、１ｍＬ／分において、０．５ｍＬ／フラクションで、０〜０．３ＭのＫＣｌの２５ｍＬの直線状勾配で溶離させた。フラクションを、ｐＨ５．５においてアッセイした。ＣＥＬ  Ｉは、０．０９〜０．１５ＭのＫＣｌにおいて溶離した。ＣＥＬ  Ｉ活性のピークフラクションを、０．１１〜０．１３ＭのＫＣｌでプールした。
【０１１４】
ＣＥＬ  Ｉプールを、貯蔵緩衝液に対して一晩透析し、−２０℃で貯蔵した。
【０１１５】
精製モニタリング。精製を、実施単位および各々の精製段階からのプールに対するタンパク質決定により、モニタリングした。このようなモニタリングの結果を、表３に示し、これは、各々の段階における精製からの典型的な収率および精製倍数結果を示す。さらに、各々のクロマトグラフィー段階について、グラフをプロットして、合理的なプール決定を行った。これらのグラフは、タンパク質濃度、ｐＨ５．５および８．５における単位活性、並びに塩濃度についてのプロフィールを含んでいた。
【０１１６】
SEPHACRYL（登録商標）Ｓ−１００  ＨＲゲル濾過。ＣＥＬ  ＩＩMONO Q（登録商標）濃縮物（表３；５００μＬ）を、緩衝液Ａ＋０．１５ＭのＮａＣｌに対して透析し、緩衝液Ａ＋０．１５ＭのＮａＣｌ中で、０．２５ｍＬ／分において展開したSEPHACRYL（登録商標）Ｓ−１００  ＨＲカラム（１．５×２８ｃｍ；５０ｍＬ）上で分別した。カラム空洞容積は、１８．３ｍＬであった。卵白アルブミン（４３ｋＤａ）が、２３．２ｍＬにおいて溶離し、ＣＥＬ  ＩＩが、２４．５ｍＬ（３５．５ｋＤａ）において鋭いピークとして溶離した。
【０１１７】
【表３】
2008503210.tif 000005
【０１１８】
【表４】
2008503210.tif 000006
ａ  丸括弧のない可溶化単位を、ｐＨ５．５において決定し、丸括弧のある可溶化単位を、ｐＨ８．５において決定した。
ｂ  ＣＥＬ  Ｉは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの視覚的調査により決定して、８０％均一であった。
ｃ  ＣＥＬ  ＩＩは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルの視覚的調査により決定して、２５％均一であった。
【０１１９】
例３：ＣＥＬ  ＩＩのアミノ酸配列決定
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＰＶＤＦ膜上へのエレクトロブロッティング(electroblotting)およびアミノ酸分析。ＣＥＬ  ＩＩヌクレアーゼ（MONO Q（登録商標）で濃縮したプール；表３）を、希釈緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、１０μＭのＺｎＣｌ２）中に緩衝液交換し、MICROCON（登録商標）ＹＭ−１０濃縮器(AMICON（登録商標）、Billerica, MA)を用いることにより、濃縮した。試料を、濃縮器中で１２，０００ｒｐｍにおいて、EPPENDORF（登録商標）５４１５Ｄ微量遠心管中で、４℃で遠心分離した。濃縮したタンパク質を、等しい容量の低温の３０％ＴＣＡを加え、当該管を氷上に３０分間配置することにより、沈殿させた。試料を、１２，０００ｒｐｍにおいて４℃で１０分間遠心分離し、上清を廃棄し、ペレットを、低温のアセトンで洗浄した。遠心分離後に得られたペレットを、自然乾燥し、β−メルカプトエタノールを含むＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料緩衝液に溶解した。
【０１２０】
試料を、１４％のＴｒｉｓ−グリシンゲル(INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad, CA)上で分離した。次に、タンパク質を、２５ボルト（一定の電圧）で１時間、１×エレクトロブロット緩衝液（１０ｍＭのＣＡＰＳ、ｐＨ１１．０、１０％メタノール）を用いて、ＰＶＤＦ膜上に電気移送した(electro-transferred)。膜を、０．１％のPonceau S(SIGMA)中で、５分間染色し、次に、１％酢酸中で脱染した。ＣＥＬ  ＩＩは、還元剤の存在下で、〜１６ｋＤａおよび〜２８ｋＤａにおいて２つの断片として分離した。このバンドの各々を含むＰＶＤＦ膜の切片を、切り出し、アミノ末端において配列決定した。ＣＥＬ  ＩＩの断片のアミノ末端アミノ酸配列は、以下の通りであった：
１６ＫＤａ断片：Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−（Ｇｌｙ）−（Ｈｉｓ）−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｌｙｓ−Ｉｌｅ−Ｘａａ−Ｇｌｎ−Ｘａａ−（Ｐｈｅ）；配列番号：６、および
２８ＫＤａ断片：Ｘａａ−（Ａｓｎ）−Ａｓｎ−Ｘａａ−Ｔｈｒ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ；配列番号：７
ここで、Ｘａａは、未決定のアミノ酸の存在を示し、丸括弧は、ある不確定度を示す。
【０１２１】
ＣＥＬ  Ｉ遺伝子とのアミノ酸配列の相同性に基づいて、１６ｋＤａの断片は、ＣＥＬ  ＩＩタンパク質のアミノ末端から由来しており、２８ｋＤａの断片は、当該タンパク質のカルボキシ末端から由来していた。縮重したオリゴヌクレオチドプライマーを、これらの配列から設計して、ＣＥＬ  ＩＩ遺伝子を、セロリｃＤＮＡからクローン化した。これらは、以下の通りである：
（順方向プライマー）５’−ＡＡＲ  ＣＡＲ  ＧＧＨ  ＣＡＹ  ＴＴＹ  ＧＣＨ  ＡＴ−３’（配列番号：１２）および
（逆方向プライマー）５’−ＡＡＣ  ＡＴＹ  ＡＲＤ  ＧＣＹ  ＴＣＹ  ＧＴ−３’（配列番号：１３）、
ここで、Ｒ＝ＡまたはＧ；Ｈ＝Ａ、ＣまたはＴ；Ｙ＝ＣまたはＴ；およびＤ＝Ａ、ＧまたはＴ。
【０１２２】
例４：ＣＥＬ  ＩＩ核酸配列の単離
セロリからの全ＲＮＡの単離。全ＲＮＡを、凍結したセロリの茎から、CONCERT（登録商標）植物ＲＮＡ試薬(INVITROGEN（登録商標）、Carlsbad, CA)を用いて、小規模ＲＮＡ単離プロトコルに従って単離した。凍結したセロリの茎を、乳鉢および乳棒で、粉末に粉砕した。低温の植物ＲＮＡ試薬（粉砕した組織０．１ｇあたり０．５ｍＬ）を、粉砕した組織に加え、試験管を、室温で５分間インキュベートした。懸濁液を、室温で遠心分離により透明にした（１２，０００×ｇ、２分間）。ＮａＣｌ（５Ｍ；０．１ｍＬ）を、透明にした抽出物に加え、内容物を、温和に反転させることにより混合した。
【０１２３】
等しい容積のクロロホルムを、試験管に加え、内容物を、反転により混合し、試料を、４℃で遠心分離（１２，０００×ｇ、１０分間）して、相を分離した。最上部の水性相を、新たな試験管に移送し、等しい容量のイソプロパノールを、試験管に加えた。試料を混合し、室温で１０分間放置し、４℃で遠心分離した（１２，０００×ｇ、１０分間）。上清を、デカンテーションし、ペレットを、７５％エタノールで洗浄した。短時間の遠心分離（１２，０００×ｇ、２分間）の後に、液体を、注意深く除去し、ペレットを、ＲＮＡ分解酵素を含まない水に溶解した。２６０ｎｍにおける吸光度を測定し、ＲＮＡの濃度を計算した。
【０１２４】
第一鎖ｃＤＮＡ合成およびＰＣＲ。第一鎖ｃＤＮＡを、CREATOR（登録商標）SMART（登録商標）ｃＤＮＡライブラリー構成キット(CLONTECH（登録商標）Laboratories Inc., Palo Alto, CA)を用いて合成した。全ＲＮＡ（〜１μｇ）を、キットプライマーSMART（登録商標）ＩＶおよびＣＤＳ  ＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマーで、６５℃で５分間インキュベートすることにより、アニールした。１×第一鎖緩衝液、２ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの各々のｄＮＴＰおよびPOWERSCRIPT（登録商標）逆転写酵素を含むｃＤＮＡ合成反応（１０μＬ）を、４２℃で６０分間インキュベートした。ＣＥＬ  ＩＩペプチドのアミノ末端配列に基づいて設計された縮重オリゴヌクレオチドおよび第一鎖ｃＤＮＡを鋳型として用いて、ＰＣＲを、ADVANTAGE（登録商標）２ポリメラーゼ混合物(CLONTECH（登録商標）Laboratories Inc.)を用いて行った。ＣＥＬ  ＩＩ遺伝子断片のアミノ末端の推定された位置に基づいて、ＣＥＬ  ＩＩ遺伝子の〜３００ないし４００ｂｐの５’部分を、予測した。
【０１２５】
増幅された産物のゲル分析により、〜１００ｂｐないし〜１，５００ｂｐの長さの一般的な塗抹が、いくつかの特定的なバンドと共に示された。２００〜４００ｂｐの領域におけるＤＮＡ塗抹を、ゲルから切り取り、ＤＮＡを、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キット(QIAGEN（登録商標）、Valencia, CA)を用いて抽出した。これを、１×ADVANTAGE（登録商標）２  ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭの各々のｄＮＴＰ、０．２μＭの各々のプライマー、増幅されたＤＮＡ、および１×ADVANTAGE（登録商標）２ポリメラーゼ混合物を含む反応混合物中での縮重したプライマーでの増幅のための鋳型として、再び用いた。ＰＣＲサイクリング条件は、９４℃で１５秒間、５５℃で１５秒間、および６８℃で１分間の１０サイクル、続いて９４℃で１５秒間、５０℃で１５秒間、および６８℃で１分間の１０サイクル、続いて９４℃で１５秒間、４５℃で１５秒間、および６８℃で１分間の１０サイクルであった。
【０１２６】
大きさが〜３５０ｂｐの特定のＰＣＲバンドが、ゲル分析により観察され、これを切り取り、抽出した。ＰＣＲ断片を、pCR 2.1-TOPO（登録商標）ベクター(INVITROGEN（登録商標）)中に、TOPO TA CLONING（登録商標）キットを用いてクローン化した。ＤＮＡを、１６個のコロニーから単離し、各々の挿入物のＤＮＡ配列を、ベクターに相補的なプライマーを用いて決定した。１６個のうちの１つのみのＤＮＡ配列は、翻訳された場合には、ＣＥＬ  ＩＩペプチド断片のアミノ酸配列に整合する末端において、アミノ酸配列を有していた。ＤＮＡ配列（５’から３’）およびこのクローンについて得られた対応するアミノ酸配列を、本明細書中で、それぞれ配列番号：１４および配列番号：１５として示す。
【０１２７】
ｃＤＮＡライブラリー構成。第一鎖ｃＤＮＡを、CREATOR（登録商標）SMART（登録商標）ｃＤＮＡライブラリー構成キット(CLONTECH（登録商標）Laboratories Inc.)で長距離ＰＣＲ（ＬＤ−ＰＣＲ）を行うことにより二本鎖ｃＤＮＡを作成するための鋳型として用いた。改変したオリゴ（ｄＴ）プライマー（ＣＤＳ  ＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー）を、SMART（登録商標）ＩＶオリゴヌクレオチドプライマーと共に用いて、ｍＲＮＡの完全な５’末端を含む全長ｃＤＮＡを得た。増幅反応混合物は、１×ADVANTAGE（登録商標）２  ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭの各々のｄＮＴＰ、０．２μＭのＣＤＣ  ＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマーおよび５’ＰＣＲプライマー、第一鎖ｃＤＮＡ、並びに１×ADVANTAGE（登録商標）２ポリメラーゼ混合物を含んでおり、９５℃で５秒間および６８℃で６分間を２６サイクル循環させた。
【０１２８】
二本鎖ｃＤＮＡ産物は、アガロースゲル電気泳動により分析した場合に、塗抹として出現した。二本鎖ｃＤＮＡを、プロテイナーゼＫでの処理、フェノール抽出およびエタノール沈殿により精製した。精製したＤＮＡを、ＳｆｉＩで消化した。ＤＮＡは、１％アガロースゲル上で分離し、〜０．５ｋｂないし３ｋｂのＤＮＡ塗抹を、ゲルから、QIAQUICK（登録商標）ゲル抽出キットで抽出した。ＳｆｉＩで消化した、ゲル精製した二本鎖ｃＤＮＡを、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで、キット中に供給した（１６℃、一晩）、ＳｆｉＩで消化した、脱リン酸化したｐＤＮＲ−ＬＩＢベクターに連結した。１マイクロリットルの連結混合物を、５０μＬのONE SHOT（登録商標）Ｔｏｐ１０大腸菌電子競合的(electrocompetent)細胞中に、BIO-RAD（登録商標）GENE PULSER（登録商標）を用いたエレクトロポレーションにより、形質転換した。
【０１２９】
５マイクロリットルの形質転換混合物を、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上に播種し、プレートを、３７℃で一晩インキュベートした。形質転換混合物の残りを、４℃で貯蔵した。挿入物の存在についての１８個の独立したクローンの分析を用いて、組換えクローンの百分率を決定した。形質転換混合物を、３０℃で、ＬＢ＋クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）中で、数時間成長させ、次に一層大きい培養物中に接種し、これを一晩３０℃で成長させた。培養物を、遠心分離し、ライブラリーＤＮＡを、細胞ペレットから、QIAGEN（登録商標）からのPlasmid Midi Prepキットを用いて、単離した。
【０１３０】
ｃＤＮＡライブラリーからのＣＥＬ  ＩＩ遺伝子の単離。ＣＥＬ  ＩＩ遺伝子の５’末端から得られた部分的なＤＮＡ配列に基づいて、２つの重複するオリゴヌクレオチドを、設計して、ＣＥＬ  ＩＩ遺伝子をｃＤＮＡライブラリーから増幅した：
順方向プライマー  ５’−ＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＣ  ＴＴＧ  ＡＡＴ  ＴＣＡ  ＡＡＡ  ＡＴＧ  ＡＡＴ  Ａ−３’（配列番号：１６）、および
逆方向プライマー  ５’−ＴＧＡ  ＡＴＴ  ＣＡＡ  ＧＴＣ  ＡＴＧ  ＡＡＣ  ＡＣＣ  ＣＡＡ  ＴＡＧ−３’（配列番号：１７）。
【０１３１】
ｃＤＮＡライブラリーＤＮＡを、ＣｐＧメチラーゼＭ．ＳｓｓＩ(New England Biolabs, Beverly, MA)を用いてメチル化した。鋳型としてのメチル化したＤＮＡおよびＣＥＬ  ＩＩ特異性プライマーを用いて、ｃＤＮＡを、１×ADVANTAGE（登録商標）２  ＰＣＲ緩衝液、０．２ｍＭの各々のｄＮＴＰ、０．２μＭの各々のプライマー、ｃＤＮＡおよび１×ADVANTAGE（登録商標）２ポリメラーゼ混合物を含む反応混合物中で、ＰＣＲにより増幅した。９５℃での２分間にわたる最初の変性の後に、９５℃で３０秒間、５５℃で３０秒間および６８℃で６分間のサイクルを３０回行った。重複するプライマーにより、産物がインビボでの環を形成することを可能にする相補性末端を含むＰＣＲ産物が生じた。ＰＣＲ産物を、大腸菌ＤＨ５α細胞中に形質転換し、クロラムフェニコール（３０μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天プレート上に播種した。
【０１３２】
ＤＨ５α細胞は、メチル化されたｃＤＮＡ鋳型を含む細胞中のＤＮＡを分解し、これらの成長を妨害し、ＰＣＲで増幅されたＤＮＡを含む細胞が成長するのを可能にするｍｃｒＢＣ遺伝子の野生型のコピーを含む。コロニーを、ミニプレップＤＮＡをＥｃｏＲＩで消化することにより、ＣＥＬ  ＩＩ遺伝子の存在についてスクリーニングした。ＣＥＬ  ＩＩ遺伝子のＤＮＡ配列から、加工したタンパク質（シグナルペプチドの除去の後）をコードする遺伝子の５’末端からの〜３１０ｂｐのＥｃｏＲＩ部位を、予測した。次に、予測されたＥｃｏＲＩ消化パターンを生じるクローンからのＤＮＡに、ＤＮＡ配列決定を施した。ＤＮＡを配列決定した１７個のクローンのうち、７個が、加工したタンパク質に相当するＣＥＬ  ＩＩ遺伝子の配列を有しており、１個が、シグナルペプチドを含むタンパク質に相当する全長の配列を有していた。
【図面の簡単な説明】
【０１３３】
【図１】ＣＥＬ  Ｉ（配列番号：５）の配列と共に整列した、ＣＥＬ  ＩＩ（配列番号：２）のアミノ酸配列を示す図である。ペプチドリーダー配列に、下線を付し、ＣＥＬ  ＩＩのタンパク質分解ペプチド断片から決定されたアミノ酸配列を、小文字で示す（配列番号：６および配列番号：７）。Ｚｎ原子結合のためのリガンドであると知られている、９つの保存された残基を、太字イタリックで示す。Ｐ１ヌクレアーゼおよびＣＥＬ  Ｉと共有されている４つの保存されたｃｙｓ残基を、下に＃で示す。ＣＥＬ  Ｉと共有されている４つの追加のｃｙｓ残基を、下に＊で示す。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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