(57)【要約】  自己免疫疾患および他の関連疾患の処置のための組成物および方法を提供する。３ｄ、非協調的蛋白質−９３ｂ（ｕｎｃ−９３Ｂ）の点突然変異、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂおよびｕｎｃ−９３Ｃポリペプチド、それらをコードする核酸、およびそれらを作製する方法およびそれらを使用する方法、例えば、ヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法。
2008531057.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性をモジュレートすることができる化合物を、哺乳動物対象に投与することを含む、哺乳動物対象における自己免疫疾患を処置するための方法であって、該化合物が、自己免疫疾患を軽減し、または取り除くのに、あるいはその発症もしくは再発を予防するのに有効な量で投与されるところの、方法。
【請求項２】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のアンタゴニストであるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの阻害物質であるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
化合物が、干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子化合物またはプロテイン阻害物質であるところの、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃによりエンドソームに標的化された蛋白質の阻害物質であるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
化合物がプロテアーゼ阻害物質であるところの、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ｕｎｃ−９３Ｂが、（ｉ）配列番号：４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）配列番号：３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドであって；該ポリペプチドが、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を有するところの、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
自己免疫疾患が、インスリン-依存型糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的ぶどう膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺機能亢進症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早期閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、突発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎Ｈｂｓ−ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性／皮膚筋炎、円板状ＬＥまたは全身性紅斑性狼瘡であるところの、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物対象に、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性をモジュレートすることができる化合物を投与することを含む、哺乳動物対象における感染症を処置するための方法であって、該化合物が、感染症を軽減し、または取り除くのに、あるいはその発症もしくは再発を予防するのに有効な量で投与されるところの、方法。
【請求項１０】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のアンタゴニストであるところの、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの阻害物質であるところの、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
化合物が、干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子化合物またはプロテイン阻害物質であるところの、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃによりエンドソームに標的化された蛋白質の阻害物質であるところの、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
化合物が、プロテアーゼ阻害物質であるところの、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ｕｎｃ−９３Ｂが、（ｉ）配列番号：４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）配列番号：３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドであって、該ポリペプチドが、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を有するところの、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物対象に、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性をモジュレートすることができる化合物を投与することを含む、哺乳動物対象における炎症性疾患を処置するための方法であって、該化合物が、当該疾患を軽減し、または取り除くのに、あるいはその発症もしくは再発を予防するのに有効な量で投与されるところの、方法。
【請求項１７】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のアンタゴニストであるところの、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの阻害物質であるところの、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
化合物が、干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子化合物、またはプロテイン阻害物質であるところの、請求項１８に記載の方法
【請求項２０】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃによりエンドソームに標的化された蛋白質の阻害物質であるところの、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
化合物が、プロテアーゼ阻害物質であるところの、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ｕｎｃ−９３Ｂが、（ｉ）配列番号：４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）配列番号：３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドであって、該ポリペプチドが、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を有するところの、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
哺乳動物対象に、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性をモジュレートすることができる化合物を投与することを含む、哺乳動物対象におけるＣＤ８細胞欠損症、ＣＤ４細胞欠損症、または抗原提示細胞欠損症を処置するための方法であって、該化合物が、当該疾患を軽減し、または取り除くのに、あるいはその発症もしくは再発を予防するのに有効な量で投与されるところの、方法。
【請求項２４】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のアンタゴニストであるところの、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
化合物が、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの阻害物質であるところの、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
化合物が、干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子化合物またはプロテイン阻害物質であるところの、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃによりエンドソームに標的化された蛋白質の阻害物質であるところの、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
化合物が、プロテアーゼ阻害物質であるところの、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ｕｎｃ−９３Ｂが、（ｉ）配列番号：４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）配列番号：３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドであって、該ポリペプチドが、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を有するところの、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
野生型の表現型と比較して、マクロファージ活性化の阻害、ウイルス感染もしくは細菌感染に対する感染率、ＴＮＦ−α産生の低下、またはそのいずれか２つもしくはそれ以上組み合わせた特徴を含む表現型を示す、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃまたはその変異型をコードする異種の核酸を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３１】
ｕｎｃ−９３Ｂをコードする核酸が、配列番号：１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列をさらに含むところの、請求項３０に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３２】
動物が、マウスまたはラットであるところの、請求項３０に記載のヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項３３】
請求項３０に記載のヒト以外のトランスジェニック動物から誘導された、細胞または細胞株。
【請求項３４】
Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のモジュレーターをスクリーニングするためのインビトロにおける方法であって、請求項３３に記載の細胞または細胞株を試験化合物と接触させること；ＴＮＦ−αの産生量、ウイルス感染もしくは細菌感染に対する感染率、またはＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−もしくはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能の増大または低下を検出すること；それにより、該試験化合物を、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能のモジュレーターと同定することを含む、方法。
【請求項３５】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターをスクリーニングするためのインビボにおける方法であって、請求項３０に記載のヒト以外のトランスジェニック動物を試験化合物と接触させること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下により、該試験化合物を、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターと同定するところの、方法。
【請求項３６】
自己免疫疾患が、インスリン-依存型糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的ぶどう膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺機能亢進症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早期閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、突発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎Ｈｂｓ−ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性／皮膚筋炎、円板状ＬＥまたは全身性紅斑性狼瘡であるところの、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、試験遺伝子を、請求項３０に記載のヒト以外のトランスジェニック動物の１つまたはそれ以上の細胞に挿入すること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下により、該試験遺伝子を、自己免疫疾患、感染症、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的なモジュレーターと同定するところの、方法。
【請求項３８】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、請求項３０に記載の第一のヒト以外のトランスジェニック動物を、その第一のヒト以外のトランスジェニック動物と反対の性の、ヒト以外の同系交配の動物系統、ヒト以外の無作為の突然変異動物、ヒト以外のトランスジェニック動物およびヒト以外のノックアウト動物よりなる群から選択される、第二のヒト以外の動物と交配させること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、前記交配の子孫を選択すること、それにより自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、方法。
【請求項３９】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、（ｉ）請求項３０に記載の第一のヒト以外のトランスジェニック動物を、その第一のヒト以外のトランスジェニック動物と反対の性の、ヒト以外の無作為の突然変異動物である第二のヒト以外の動物と交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫２体を交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの２つの突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、方法。
【請求項４０】
ｕｎｃ−９３Ｂ対立遺伝子が、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸であるところの、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、（ｉ）請求項３０に記載の第一のヒト以外のトランスジェニック動物を、その第一のヒト以外のトランスジェニック動物と反対の性の、ヒト以外の無作為の突然変異動物である第二のヒト以外の動物と交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫を、請求項３０に記載のヒト以外のトランスジェニック動物と交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの２つの突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、方法。
【請求項４２】
ｕｎｃ−９３Ｂ対立遺伝子が、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸であるところの、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、請求項３０に記載の第一のヒト以外のトランスジェニック動物を、その第一のヒト以外のトランスジェニック動物と反対の性の、ヒト以外の無作為の突然変異動物である第二のヒト以外の動物と交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫を、ヒト以外の無作為の突然変異動物と交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの２つの突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、方法。
【請求項４４】
ｕｎｃ−９３Ｂ対立遺伝子が、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸であるところの、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃをコードする核酸配列を含む内因性の遺伝子配列が、マクロファージ活性化の阻害、ウイルス感染もしくは細菌感染に対する感染率、ＴＮＦ−α産生の低下、またはそのいずれか２つもしくはそれ以上組み合わせた特徴を含む表現型を生じるように破壊されているところの、ヒト以外のノックアウト動物。
【請求項４６】
ｕｎｃ−９３Ｂをコードする核酸配列が、配列番号：３と少なくとも９０％の配列同一性を有するところの、請求項４５に記載のヒト以外のノックアウト動物。
【請求項４７】
動物が、マウスまたはラットであるところの、請求項４５に記載のヒト以外のノックアウト動物。
【請求項４８】
請求項４５に記載のヒト以外のノックアウト動物から誘導された細胞または細胞株。
【請求項４９】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターをスクリーニングするためのインビボにおける方法であって、請求項４５に記載のヒト以外のノックアウト動物を、試験化合物と接触させること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下により、該試験化合物を、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターと同定するところの、方法。
【請求項５０】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、試験遺伝子を、請求項４５に記載のヒト以外のノックアウト動物の１つまたはそれ以上の細胞に挿入すること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下により、該試験遺伝子を、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターと同定するところの、方法。
【請求項５１】
配列番号：４と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードする核酸配列のホモ接合体であるゲノムを含む、同系交配マウスであって、該ポリペプチドが、配列番号：４に記載のアミノ酸配列中、４１１番目のアミノ酸残基に変更を含むところの、同系交配マウス。
【請求項５２】
該ポリペプチドが、配列番号：２に記載される配列を含むところの、請求項５１に記載の同系交配マウス。
【請求項５３】
マウスが、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の特徴を含む表現型を有するところの、請求項５１に記載の同系交配マウス。
【請求項５４】
請求項５１に記載の同系交配マウスから誘導された、細胞または細胞株。
【請求項５５】
Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のモジュレーターをスクリーニングするためのインビトロにおける方法であって、請求項５４に記載の細胞または細胞株を、試験化合物と接触させること；およびＴＮＦ−αの産生量、ウイルス感染もしくは細菌感染に対する感染率、またはＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−もしくはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能における増大または低下を検出すること；それにより、該試験化合物を、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−もしくはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能のモジュレーターと同定することを含む、方法。
【請求項５６】
Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のモジュレーターをスクリーニングするインビボにおける方法であって、請求項５４に記載の細胞もしくは細胞株を、試験化合物と接触させること；およびＴＮＦ−αの産生量、ウイルス感染もしくは細菌感染に対する感染率、またはＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−もしくはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能における増大または低下を検出すること；それにより、該試験化合物を、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−もしくはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能のモジュレーターと同定することを含む、方法。
【請求項５７】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターをスクリーニングするためのインビボにおける方法であって、請求項５１に記載の同系マウスを、試験化合物と接触させること；および自己免疫疾患、感染症、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下により、該試験化合物を、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症と同定するところの、方法。
【請求項５８】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、試験遺伝子を、請求項５１に記載の同系マウスの１つまたはそれ以上の細胞に挿入すること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下により、該試験遺伝子を、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターと同定するところの、方法。
【請求項５９】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、請求項５１に記載の第一の同系マウスを、その第一の同系マウスと反対の性の、同系マウス系統、無作為の突然変異マウス、トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスよりなる群から選択される、第二のマウスと交配させること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、前記交配の子孫を選択すること、それにより自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、方法。
【請求項６０】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、請求項５１に記載の第一の同系マウスを、その第一の同系マウスと反対の性の、ヒト以外の無作為の突然変異動物である第二のマウスと交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫２体を交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃをコードする核酸の２つの突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、方法。
【請求項６１】
ｕｎｃ−９３Ｂをコードする核酸が、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有するところの、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、請求項５１に記載の第一の同系マウスを、その第一の同系マウスと反対の性の、ヒト以外の無作為の突然変異動物である第二のマウスと交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫を、請求項５１に記載の同系マウスと交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃをコードする核酸の２つの突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、方法。
【請求項６３】
ｕｎｃ−９３Ｂをコードする核酸が、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有するところの、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法であって、請求項５１に記載の第一の同系マウスを、その第一の同系マウスと反対の性の、無作為の突然変異マウスである第二のマウスと交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫を、無作為の突然変異マウスと交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃをコードする核酸の突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、方法。
【請求項６５】
ｕｎｃ−９３Ｂをコードする核酸が、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有するところの、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
対象に、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの発現を阻害するのに十分な量の、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すること、それにより、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を引き起こすこと、および該対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせることを含む、対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせるための方法。
【請求項６７】
ｕｎｃ−９３Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：３と相補的であるところの、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
対象に、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの活性を阻害するのに十分な量の、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドに対する抗体を投与すること、それにより、該対象に抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を引き起こすことを含む、対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせるための方法。
【請求項６９】
ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドに対する抗体が、配列番号：４に記載のポリペプチドに対する抗体であるところの、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
対象に、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの発現を阻害するのに十分な量の、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃをコードする核酸と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すること、それにより、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を引き起こし、そして該対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせること；ならびに、対象に抗原を投与すること、それにより、該対象を抗原に対して寛容化させることを含む、対象を抗原に対して寛容化させるための方法。
【請求項７１】
ｕｎｃ−９３Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドが、配列番号：３と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドであるところの、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
対象に、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの発現を阻害するのに十分な量の、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドに対する抗体を投与すること、それにより、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を引き起こし、そして該対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせること；ならびに、対象に抗原を投与すること、それにより、該対象を抗原に対して寛容化させることを含む、対象を抗原に対して寛容化させるための方法。
【請求項７３】
ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドに対する抗体が、配列番号：４に記載のポリペプチドに対する抗体であるところの、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
対象に、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの発現を阻害するのに十分な量の、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を有するｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドに対する低分子化学阻害物質を投与すること、それにより、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を引き起こし、そして該対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせること；ならびに、対象に抗原を投与すること、それにより、該対象を抗原に対して寛容化させることを含む、対象を抗原に対して寛容化させるための方法。
【請求項７５】
ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドをコードする一方または両方の対立遺伝子にノックアウト変異を有するヒト以外のトランスジェニック動物。
【請求項７６】
ゲノムが内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子にホモ接合型の破壊を含むトランスジェニックノックアウトマウスであって、該ホモ接合型の破壊が、機能的なｕｎｃ−９３Ａ蛋白質、ｕｎｃ−９３Ｂ蛋白質またはｕｎｃ−９３Ｃ蛋白質の発現を抑制し、トランスジェニックノックアウトマウスのマクロファージにおけるＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性の共刺激分子の発現が、野生型マウスのマクロファージにおけるＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性の共刺激分子の発現と比較して抑制される結果をもたらすところの、トランスジェニックノックアウトマウス。
【請求項７７】
ホモ接合型の破壊が、内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子の欠失もしくは一部の突然変異に起因し、それにより、機能しない遺伝子産物が産生されるか、または遺伝子産物が完全に産生されないところの、請求項７６に記載のトランスジェニックノックアウトマウス。
【請求項７８】
ゲノムが内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子にホモ接合型の破壊を含むトランスジェニックノックアウトマウスであって、該ホモ接合型の破壊が、機能的なｕｎｃ−９３Ａ蛋白質、ｕｎｃ−９３Ｂ蛋白質またはｕｎｃ−９３Ｃ蛋白質の発現を抑制し、トランスジェニックノックアウトマウスが、野生型マウスの細菌感染もしくはウイルス感染に対する感染率と比較して、増強された細菌感染もしくはウイルス感染に対する感染率を有する結果をもたらすところの、トランスジェニックノックアウトマウス。
【請求項７９】
ホモ接合型の破壊が、内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子の欠失または部分的な突然変異に起因し、それにより、機能しない遺伝子産物が産生されるか、または遺伝子産物が完全に産生されないところの、請求項７８に記載のトランスジェニックノックアウトマウス。
【請求項８０】
細菌感染もしくはウイルス感染に対する増大された感染率が、マウスサイトメガロウイルス感染に対する増大された感染率、または黄色ブドウ球菌感染に対する増大された感染率であるところの、請求項７８に記載のトランスジェニックノックアウトマウス。
【請求項８１】
ゲノムが内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子にホモ接合型の破壊を含むトランスジェニックノックアウトマウスであって、該ホモ接合型の破壊が、機能的なｕｎｃ−９３Ａ蛋白質、ｕｎｃ−９３Ｂ蛋白質またはｕｎｃ−９３Ｃ蛋白質の発現を抑制し、トランスジェニックノックアウトマウスが、野生型のマウスのＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド、レシキモド、またはポリＩ：Ｃにより誘導されるＴＮＦ−αの産生と比較して、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド、レシキモド、またはポリＩ：Ｃにより誘導されるＴＮＦ−αの減少した産生を有するところの、トランスジェニックノックアウトマウス
【請求項８２】
ホモ接合型の破壊が、内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子の欠失または部分的な突然変異に起因し、それにより、機能しない遺伝子産物が産生されるか、または遺伝子産物が完全に産生されないところの、請求項８１に記載のトランスジェニックノックアウトマウス。
【請求項８３】
ホモ接合型の破壊が、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドの４１１番目にヒスチジンからアルギニンへの置換を含むところの、請求項８１に記載のトランスジェニックノックアウトマウス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の記述
本発明は、国立衛生研究所の助成金番号Ｕ５４−ＡＩ５４５２３による政府支援により成された。当該政府は、本発明の一定の権利を所有する。
【０００２】
関連出願についての相互参照
本出願は、２００５年３月２日に出願された米国仮出願番号６０／６５８，１９７の利益を主張し、その全ての開示内容は出典明示により本明細書の一部とされる。
【０００３】
発明の分野
本発明は、一般的に、分子免疫学およびヒトの疾患の処置に関する。特に、本発明は、３ｄ、非協調的蛋白質−９３ｂ（ｕｎｃ−９３Ｂと称される；ｕｎｃ−９３ｂ１としても知られている）の点突然変異、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂおよびｕｎｃ−９３Ｃポリペプチド、それらをコードする核酸、およびそれらを作製する方法およびそれらを使用する方法、例えば、ヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。１つの態様において、本発明のポリペプチドは、改変されたＴｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７−、Ｔｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を有する。哺乳動物対象における疾患を処置するための方法は、Ｔｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７−、Ｔｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のモジュレーター、例えば阻害物質を投与することによって提供される。
【背景技術】
【０００４】
哺乳動物のＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）は、細菌性のリポ多糖類（ＬＰＳ）、リポペプチド、グルカン、フラジェリンおよび核酸を含む、微生物起源の変換される分子を感知する。Poltorak,A.ら、Science 282:2085-2088, 1998；Takeuchi,O.ら、J. Immunol. 164:554-557, 2000；Takeuchi,O.ら、13:933-940, 2001；Gantner,B.N.ら、J. Exp. Med. 197:1107-1117, 2003；Hayashi,F.ら、Nature 410:1099-1103, 2001；Hemmi,H.ら、Nature 408:740-745, 2000；Alexopoulou,L.ら、Nature 413:732-738, 2001；Diebold,S.S.ら、Science 303:1529-1531, 2004；Heil,F.ら、Science 303:1526-1529, 2004；Lund,J.M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 101:5598-5603, 2004。ＴＬＲ１、２、４および６は、哺乳動物の細胞表面に少なくとも部分的に表れているが、ＴＬＲ３、７および９は、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＲＮＡおよび非メチル化ＤＮＡを検出し、それぞれ小胞体（ＥＲ）および／またはエンドソーム内に存在する、主なもしくは完全な細胞内受容体である。Hemmi,H.ら、Nature 408:740-745, 2000；Alexopoulou,L.ら、Nature 413:732-738, 2001；Diebold,S.S.ら、Science 303:1529-1531, 2004；Heil,F.ら、Science 303:1526-1529, 2004；Lund,J.M.ら、Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 101:5598-5603, 2004；Matsumoto,M.ら、J. Immunol. 171:3154-3162, 2003；Funami,K.ら、Int. Immunol. 16:1143-1154, 2004；Ahmad-Nejad,P.ら、Eur. J. Immunol. 32:1958-1968, 2002；Leifer,C.A.ら、173:1179-1183, 2004；Latz,E.ら、5:190-198, 2004；Heil,F.ら、Eur. J. Immunol. 33:2987-2997, 2003。
【０００５】
ＴＬＲは、宿主細胞の抗原提示細胞により処理されて提示されたペプチドに対する適応的免疫応答を開始するのに要求される共刺激分子のアップレギュレーションを含み、微生物感染と関係する主要な現象を媒介する。Beutler,B. Nature 430:257-263, 2004。内因性または外来のいずれかの−抗原の処理および提示は、感染していなくても構成的に生じており、そしてＴＬＲシグナル伝達には依存しない。さらに、外来抗原が関係する場合には、ＭＨＣクラスＩの提示（交差提示）のプロセシングには、ＭＨＣクラスＩＩの提示のプロセシングに関係する生物学的事象とは大きく異なる一連の生物学的事象が関与する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
哺乳動物対象に、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介してＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性をモジュレートすることができる化合物を投与することを含む、疾患を処置するための組成物および方法が提供され、該化合物は、自己免疫疾患を軽減し、または取り除くのに、あるいはその発症もしくは再発を予防するのに有効な量で投与される。本発明の組成物および方法は、単一のヌクレオチド置換体、例えば、ｕｎｃ−９３Ｂの３ｄ対立遺伝子、またはＴｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３、７および９（他のＴＬＲは除く）を介したシグナル伝達を壊し、そしてクラスＩおよびクラスＩＩ両方のＭＨＣの外来抗原の提示を顕著に害する、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの対立遺伝子を提供する。これらの変異体は、外来抗原の提示に要求される細胞事象および細胞内ＴＬＲの活性化に要求される事象の間の共通点を明らかにする。
【０００７】
哺乳動物対象に、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介してＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性をモジュレートすることができる化合物を投与することを含む、哺乳動物対象の自己免疫疾患を処置するための方法が提供され、該化合物は自己免疫疾患を軽減し、または取り除くのに、あるいはその発症もしくは再発を予防するのに有効な量で投与される。
【０００８】
哺乳動物対象に、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介してＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性をモジュレートすることができる化合物を投与することを含む、哺乳動物対象の感染症を処置するための方法が提供され、該化合物は感染症を軽減し、または取り除くのに、あるいはその発症もしくは再発を予防するのに有効な量で投与される。
【０００９】
哺乳動物対象に、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介してＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性をモジュレートすることができる化合物を投与することを含む、哺乳動物対象の炎症性疾患を処置するための方法が提供され、該化合物は自己免疫疾患を軽減し、または取り除くのに、あるいはその発症もしくは再発を予防するのに有効な量で投与される。
【００１０】
哺乳動物対象に、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介してＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性をモジュレートすることができる化合物を投与することを含む、哺乳動物対象におけるＣＤ８細胞欠損症、ＣＤ４細胞欠損症、または抗原提示細胞欠損症を処置するための方法が提供され、該化合物は自己免疫疾患を軽減し、または取り除くのに、あるいはその発症もしくは再発を予防するのに有効な量で投与される。治療化合物は、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のアンタゴニストである。１つの態様において、化合物は、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの阻害物質である。さらなる態様において、化合物は、干渉ＲＮＡ、ショートヘアピンＲＮＡ、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子化合物またはプロテアーゼ阻害物質である。別の態様において、化合物は、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃによりエンドソームに標的化された蛋白質の阻害物質である。詳細な態様において、化合物はプロテアーゼ阻害物質である。さらなる態様において、ｕｎｃ−９３Ｂは、（ｉ）配列番号：４と少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列；または（ｉｉ）配列番号：３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む核酸によりコードされるアミノ酸配列を有するｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドであって、該ポリペプチドはＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を有する。
【００１１】
自己免疫疾患の処置には、限定されるものではないが、インスリン−依存型糖尿病、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的ぶどう膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫（primary myxoedema）、甲状腺機能亢進症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早期閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、突発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎Ｈｂｓ−ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性（poly）／皮膚筋炎、円板状ＬＥまたは全身性エリテマソーデスの処置が含まれる。
【００１２】
ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ、またはそれらの変異型をコードする非相同性の核酸を含むヒト以外のトランスジェニック動物が提供され、該動物は、野生型の表現型と比較して、マクロファージ活性化の阻害、ウイルス感染または細菌感染の感染性、ＴＮＦ−α生成量の減少、またはそれらのいずれか２つまたはそれ以上を組み合わせが特徴を含む、表現型を示す。ｕｎｃ−９３Ｂをコードする核酸は、配列番号：１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列をさらに含む。トランスジェニック動物には、限定されるものではないが、マウスまたはラットが含まれる。
【００１３】
ヒト以外のトランスジェニック動物を、試験化合物と接触させること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下により、その試験化合物を、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターと同定するところの、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターをスクリーニングするためのインビボ（invivo）の方法が提供される。
【００１４】
試験遺伝子を、ヒト以外のトランスジェニック動物の１つまたはそれ以上の細胞に挿入すること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下により、試験遺伝子が自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的なモジュレーターと同定するところの、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法が提供される。
【００１５】
第一のヒト以外のトランスジェニック動物を、その第一のヒト以外のトランスジェニック動物と反対の性の、ヒト以外の同系交配の動物系統、ヒト以外の無作為の突然変異動物、ヒト以外のトランスジェニック動物およびヒト以外のノックアウト動物よりなる群から選択される、第二のヒト以外の動物と交配させること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、前記交配の子孫を選択すること、それにより自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法が提供される。
【００１６】
自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するインビボにおける方法であって、（ｉ）第一のヒト以外のトランスジェニック動物を、その第一のヒト以外のトランスジェニック動物と反対の性の、ヒト以外の無作為の突然変異動物である第二のヒト以外の動物と交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫２体を交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの２つの突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、方法。さらなる態様において、該ｕｎｃ−９３Ｂ対立遺伝子は、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸である。
【００１７】
（ｉ）第一のヒト以外のトランスジェニック動物を、その第一のヒト以外のトランスジェニック動物と反対の性の、ヒト以外の無作為の突然変異動物である第二のヒト以外の動物と交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫を、第一のヒト以外のトランスジェニック動物と交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの２つの突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法が提供される。さらなる態様において、該ｕｎｃ−９３Ｂ対立遺伝子は、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸である。
【００１８】
第一のヒト以外のトランスジェニック動物を、その第一のヒト以外のトランスジェニック動物と反対の性の、ヒト以外の無作為の突然変異動物である第二のヒト以外の動物と交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫を、ヒト以外の無作為の突然変異動物と交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの２つの突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するインビボにおける方法が提供される。さらなる態様において、該ｕｎｃ−９３Ｂ対立遺伝子は、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有する核酸である。
【００１９】
１つの態様において、ヒト以外のトランスジェニック動物から誘導された細胞または細胞株。細胞または細胞株を試験化合物と接触させること；およびＴＮＦ−αの生成量、ウイルス感染もしくは細菌感染に対する感染率、またはＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−もしくはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能の増大または低下を検出すること、それにより、該試験化合物を、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能のモジュレーターと同定することを含む、Ｔｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のモジュレーターをスクリーニングするインビトロにおける方法が提供される。
【００２０】
ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃをコードする核酸配列を含む内因性の遺伝子配列が、マクロファージ活性化の阻害、ウイルス感染もしくは細菌感染の感染性、ＴＮＦ−α産生の低下、またはそのいずれか２つもしくはそれ以上組み合わせた特徴を含む表現型が生じるように破壊されている、ヒト以外のノックアウト動物が提供される。さらなる態様において、ｕｎｃ−９３Ｂをコードする核酸配列は、配列番号：３と少なくとも９０％の配列同一性を有する。該ヒト以外のノックアウト動物は、限定されるものではないが、マウスまたはラットを含む。１つの態様において、細胞または細胞株は、ヒト以外のノックアウト動物から誘導される。
【００２１】
ヒト以外のノックアウト動物を試験化合物と接触させること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下により、試験遺伝子が自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターと同定するところの、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターをスクリーニングするためのインビボにおける方法が提供される。
【００２２】
試験遺伝子を、ヒト以外のノックアウト動物の１つまたはそれ以上の細胞に挿入すること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下により、試験遺伝子が自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターと同定するところの、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法が提供される。
【００２３】
配列番号：４と少なくとも９５％の配列同一性を有するポリペプチドであって、配列番号：４で示されるアミノ酸配列の４１１番目のアミノ酸残基に変更を含むポリペプチドをコードする核酸配列のホモ接合型であるゲノムを含む、同系マウスが提供される。さらなる態様において、該ポリペプチドは、配列番号：２に記載の配列を含む。さらなる態様において、該同系マウスは、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の特徴を含む表現型を有する。
【００２４】
同系マウスを試験化合物と接触させること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出することを含み；その増大または低下より、該試験化合物を、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターと同定するところの、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーターをスクリーニングするためのインビボにおける方法が提供される。
【００２５】
試験遺伝子を、同系マウスからの１つまたはそれ以上の細胞に挿入すること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を検出すること；その増大または低下により、該試験遺伝子を、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターと同定することを含む、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法が提供される。
【００２６】
第一の同系マウスを、その第一の同系マウスと反対の性の、同系マウス系統、無作為の突然変異マウス、トランスジェニックマウスおよびノックアウトマウスよりなる群から選択される、第二のマウスと交配させること；および自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、前記交配の子孫を選択すること、それにより自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法が提供される。
【００２７】
（ｉ）第一の同系マウスを、その第一の同系マウスと反対の性の、ヒト以外の無作為の突然変異動物である第二のマウスと交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫２体を交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの２つの突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法が提供される。さらなる態様において、ｕｎｃ−９３Ｂをコードする核酸は、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有する。
【００２８】
（ｉ）第一の同系マウスを、その第一のマウスと反対の性の、ヒト以外の無作為の突然変異動物である第二のマウスと交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫を、第一の同系マウスと交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃをコードする核酸の２つの突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法が提供される。さらなる態様において、ｕｎｃ−９３Ｂをコードする核酸は、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有する。
【００２９】
（ｉ）第一の同系マウスを、その第一のマウスと反対の性の、無作為の突然変異マウスである第二のマウスと交配させること；（ｉｉ）工程（ｉ）の交配の子孫を、無作為の突然変異マウスと交配させること；および（ｉｉｉ）ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃをコードする核酸の突然変異対立遺伝子を保有し、そして自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の程度または重篤度の増大または低下を示す、工程（ｉｉ）の交配の子孫を同定すること、それにより、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定することを含む、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症の遺伝的モジュレーターを同定するためのインビボにおける方法が提供される。さらなる態様において、ｕｎｃ−９３Ｂをコードする核酸は、配列番号：１と少なくとも９０％の同一性を有する。
【００３０】
さらなる態様において、同系マウスから誘導される細胞または細胞株。細胞または細胞株を試験化合物と接触させること；およびＴＮＦ−α産生、ウイルス感染もしくは細菌感染に対する感染率、あるいはＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能の増大または低下を検出すること；それにより、該試験化合物を、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能のモジュレーターと同定することを含む、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のモジュレーターをスクリーニングするためのインビボにおける方法が提供される。細胞もしくは細胞株を試験化合物と接触させること；およびＴＮＦ−αの産生、ウイルス感染もしくは細菌感染に対する感染率、またはＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−もしくはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能における増大または低下を検出すること；それにより、該試験化合物を、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−もしくはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性のマクロファージ活性化能のモジュレーターと同定することを含む、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のモジュレーターをスクリーニングするためのインビボにおける方法が提供される。
【００３１】
対象に、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの発現を阻害するのに十分な量のｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すること、それにより、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を引き起こし、そして該対象に寛容を生ぜしめうる信号（tolerogenic signal）を生じさせることを含む、対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせるための方法が提供される。さらなる態様において、ｕｎｃ−９３Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：３と相補的である。
【００３２】
対象に、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの活性を阻害するのに十分な量のｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃに対する抗体を投与すること、それにより、該対象に、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を引き起こすことを含む、対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせるための方法が提供される。さらなる態様において、ｕｎｃ−９３Ｂに対する抗体は、配列番号：４で示されるポリペプチドに対する抗体である。
【００３３】
対象に、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの発現を阻害するのに十分な量のｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃをコードする核酸と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドを投与すること、それにより、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を引き起こし、そして該対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせること；ならびに、対象に抗原を投与すること、それにより、該対象を抗原に対して寛容化させることを含む、対象を抗原に対して寛容化させるための方法。さらなる態様において、ｕｎｃ−９３Ｂに対するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号：３と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドである。
【００３４】
対象に、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの発現を阻害するのに十分な量のｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドに対する抗体を投与すること、それにより、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を引き起し、そして該対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせること；ならびに、対象に抗原を投与すること、それにより、該対象を抗原に対して寛容化させることを含む、対象を抗原に対して寛容化させるための方法が提供される。さらなる態様において、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドに対する抗体は、配列番号：４で示されるポリペプチドに対する抗体である。
【００３５】
対象に、ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの発現を阻害するのに十分な量の、Ｔｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を有するｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドに対する低分子化学阻害物質を投与すること、それにより、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を引き起こし、そして該対象に寛容を生ぜしめうる信号を生じさせること；ならびに、対象に抗原を投与すること、それにより、該対象を抗原に対して寛容化させることを含む、対象を抗原に対して寛容化させるための方法。
【００３６】
ｕｎｃ−９３Ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドまたはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドと実質的に同一のポリペプチドをコードする１つまたは両方の対立遺伝子にノックアウト変異を有するヒト以外のトランスジェニック動物が提供される。
【００３７】
ゲノムが、内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子にホモ接合型の破壊を含むトランスジェニックノックアウトマウスであって、該ホモ接合型の破壊が、機能的なｕｎｃ−９３Ａ蛋白質、ｕｎｃ−９３Ｂ蛋白質またはｕｎｃ−９３Ｃ蛋白質の発現を抑制し、トランスジェニックノックアウトマウスのマクロファージにおけるＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−もしくはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性の共刺激分子の発現が、野生型マウスのマクロファージにおけるＴｏｌｌ様受容体３−、Ｔｏｌｌ様受容体７−またはＴｏｌｌ様受容体９−誘導性の共刺激分子の発現と比較して抑制される結果をもたらすところの、トランスジェニックノックアウトマウスが提供される。１つの態様において、トランスジェニックノックアウトマウスの遺伝子におけるホモ接合型の破壊が、内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子の欠失もしくは一部の突然変異に起因し、それにより、機能しない遺伝子産物が産生されるか、または遺伝子産物が完全に産生されなくなる。
【００３８】
ゲノムが、内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子にホモ接合型の破壊を含むトランスジェニックノックアウトマウスであって、該ホモ接合型の破壊が、機能的なｕｎｃ−９３Ａ蛋白質、ｕｎｃ−９３Ｂ蛋白質またはｕｎｃ−９３Ｃ蛋白質の発現を抑制し、トランスジェニックノックアウトマウスが、野生型マウスの細菌感染もしくはウイルス感染に対する感染率と比較して、増強された細菌感染もしくはウイルス感染に対する感染率を有する結果をもたらす、トランスジェニックノックアウトマウスが提供される。１つの態様において、トランスジェニックノックアウトマウスの遺伝子におけるホモ接合型の破壊は、内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子の欠失または部分的な突然変異に起因し、それにより、機能しない遺伝子産物が産生されるか、または遺伝子産物が完全に産生されなくする。さらなる態様において、細菌感染もしくはウイルス感染に対する増強された感染率が、マウスサイトメガロウイルス感染に対する増強された感染率、または黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）に対する増強された感染率である。
【００３９】
トランスジェニックノックアウトマウスのゲノムが、内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子にホモ接合型の破壊を含み、該ホモ接合型の破壊が、機能的なｕｎｃ−９３Ａ蛋白質、ｕｎｃ−９３Ｂ蛋白質またはｕｎｃ−９３Ｃ蛋白質の発現を抑制し、野生型のマウスのＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド、レシキモド（Ｒｅｓｉｑｕｉｍｏｄ）、またはポリＩ：Ｃにより誘導されるＴＮＦ−αの産生と比較して、ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド、レシキモド、またはポリＩ：Ｃにより誘導されるＴＮＦ−αの減少した産生を有する、トランスジェニックノックアウトマウスをもたらす結果となる。トランスジェニックノックアウトマウスにおけるホモ接合型の破壊が、内因性のｕｎｃ−９３Ａ遺伝子、ｕｎｃ−９３Ｂ遺伝子またはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子の欠失または一部の突然変異に起因し、それにより、機能しない遺伝子産物が産生されるか、または遺伝子産物が完全に産生されなくなる。さらなる態様において、ホモ接合型の破壊は、ｕｎｃ−９３Ｂポリペプチドの４１１番目にヒスチジンからアルギニンへの置換を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
１．導入
本発明は、３ｄ、非協調的蛋白質−９３ｂ（ｕｎｃ−９３Ｂと称される）の点突然変異、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチド、それらをコードする核酸およびそれらを作製するための方法および使用方法、例えばヒト以外のトランスジェニック動物を作製する方法を提供する。
【００４１】
１つの態様において、本発明のポリペプチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、例えば、ＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性を有する。本発明はまた、本発明の３ｄポリペプチドおよび／または核酸を含む、ヒト以外の動物例えば、トランスジェニック系統または近交系、およびそれらの動物の作製方法および使用方法を提供する。本発明は、ＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−、ＴＬＲ９−シグナル伝達活性の遺伝的もしくは化学的モジュレーターを同定するためのインビトロおよびインビボにおける方法を提供する。本発明は、自己免疫疾患、病態または障害の遺伝的もしくは化学的モジュレーターを同定するためのインビトロおよびインビボにおける方法を提供する。本発明はまた、本発明の核酸を用いて、例えば本発明のアンチセンスの核酸の使用により、または本発明の核酸を用いてｕｎｃ−９３ｂをコードする遺伝子座のノックアウトにより、無力化された内因性のｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ活性を有するヒト以外の動物を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物および近交系を提供する。
【００４２】
本明細書中で用いられる、非協調的−９３ａ、ｕｎｃ−９３ａ、ＵＮＣ９３Ａ、非協調的−９３ｂ、ｕｎｃ−９３ｂ、ＵＮＣ９３Ｂ１、非協調的−９３ｃ、ｕｎｃ−９３ｃ、ＵＮＣ９３Ｃ、ｕｎｃ−９３相同体Ａ、Ｂ１もしくはＣ（シー・エレガンス（C. elegans））、ｕｎｃ−９３関連蛋白質、ｕｎｃ９３（シー・エレガンス）相同体Ｂおよびｕｎｃ９３（シー・エレガンス）相同体Ｂ１、ＵＮＣ９３、ＵＮＣ９３Ａ、ＵＮＣ９３ＢおよびＵＮＣ９３Ｃは、相互交換可能に用いられる。ＵＮＣ９３Ｂ１は、ジーンバンク受入番号ＢＣ０１８３８８を有し、染色体１９Ａにマッピングされた（ＧｅｎｅＩＤ：５４４４５）。この遺伝子は、シー・エレガンスｕｎｃ９３蛋白質に類似する蛋白質をコードする。このｕｎｃ９３蛋白質は、毛虫の筋肉収縮の調節もしくは協調に関係している。Strausberg, R. L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 16899-16903, 2002）もまた参照のこと。ヒトおよびマウスの両方において、ｕｎｃ−９３Ａ（ＮＣＢＩ受入番号．ＣＡＤ１９５２３）は、ｕｎｃ−９３Ｂの最も近傍のパラログであり、その完全長に沿って明白に分岐した配列であることが見出された。その機能は決定されていない。マウスにおいて、ｕｎｃ−９３Ａは、第１７染色体の遺伝子にコードされている（Ｕｎｃ９３ａ；ＭＧＩ：１９３３２５０）。ｕｎｃ−９３Ａはそれ自体が、さらに離れた遠位のパラログの相同体、ｕｎｃ−９３Ｃであり、また機能未知であり（ＭＧＩ：１９１７１５０）、第１１染色体の遺伝子にコードされていることが見出された。Sureau, Aら、Nucleic Acids Res. 25, 4513-4522, 1997。さらに他の、さらに遠位のファミリーのメンバーの存在は、完全に否定できていない。
【００４３】
「オーソログ」は、１つの種から獲得されたペプチドまたは蛋白質であり、異なる種のポリペプチドまたは蛋白質の機能的な対応物である。オーソログ間の配列の差異は、種分化の結果である。
【００４４】
「パラログ」は、ある生物体により作り出される、別個のものであるが構造的に関係する蛋白質である。パラログは、遺伝子重複により生じたと考えられている。例えば、ｕｎｃ−９３ａ、ｕｎｃ−９３およびｕｎｃ−９３ｃは、相互にパラログである。
【００４５】
本発明は、特定の方法、試薬、成分、組成物または生物系に限定されるものではなく、当然ながら変更することができると理解されるべきである。本明細書で用いられる用語は、単に特定の態様を記載する目的ためのものであり、限定されることを意図するものではないこともまた、理解されるべきである。詳細な説明および添付する特許請求の範囲で用いられる、単数形の「ある（ａ、ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文章で特に明確しない限り、複数形を含む。従って、例えば「ある細胞」に対する言及には、２個またはそれ以上の細胞の組み合わせなどが含まれる。
【００４６】
測定値、例えば量、一時的な期間などに言及する場合に、本明細書で用いられる「約」は、開示する方法を実施するのに適当であるように、具体的な値から±２０％または±１０％、より好ましくは±５％、さらにより好ましくは±１％、およびさらにより好ましくは±０．１％の変分を含有することを意味する。
【００４７】
特に定義しない限り、本明細書で用いられる技術用語および科学用語は、本発明に属する当業者により一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書で記載するものと類似のまたは相当する方法および物質のいずれも、本発明を試験するための実地に用いることができ、好ましい物質および方法を本明細書に記載する。本発明の記載および請求項において、以下の用語が用いられよう。
【００４８】
「自己免疫疾患」は、自己の分子から外来分子を区別する免疫系の不能性および自己抗原に対する免疫学的寛容性の喪失により生じ、自己の分子を破壊することとなる疾患を意味する。自己免疫疾患には、限定されるものではないが、インスリン−依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）、多発性硬化症、実験的自己免疫性脳脊髄炎（動物モデルの多発性硬化症）、関節リウマチ、実験的自己免疫性関節炎、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的ぶどう膜網膜炎、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、甲状腺機能亢進症、悪性貧血、自己免疫性萎縮性胃炎、アジソン病、早期閉経、男性不妊症、若年性糖尿病、グッドパスチャー症候群、尋常性天疱瘡、類天疱瘡、交感性眼炎、水晶体起因性ブドウ膜炎、自己免疫性溶血性貧血、突発性白血球減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎Ｈｂｓ−ｖｅ、特発性肝硬変、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、強皮症、ヴェーゲナー肉芽腫症、多発性／皮膚筋炎、円板状ＬＥおよび全身性エリテマソーデスが含まれる。
【００４９】
「自己抗原」は、自分の抗原を意味し、それは、哺乳動物内で一般に見られる物質であり、通常自己として認識されるが、自己免疫疾患のため、その哺乳動物に外来物と誤って認識される。すなわち、自己抗原は、その哺乳動物のリンパ球または抗体に、その哺乳動物自身の一部と認識されず、その自己抗原が外来物質であるかのように、その哺乳動物の免疫調節系により誤って攻撃される。従って、自己抗原は、特定の自己免疫疾患を引き起こす要因となる免疫系部門を下方調節して作用する。本明細書で用いられる、「自己抗原」は、哺乳動物に投与された場合に、自己免疫疾患の症状を示す病態を誘発する自己抗原性の物質もまた意味する。本発明にかかる自己抗原は、哺乳動物により外来と認識されるが、病態でなければ自己の抗原として認識される、自己抗原から誘導されるエピトープまたはエピトープ群の組み合わせを含む。
【００５０】
本発明に関して有益な自己抗原は、限定されるものではないが、Ｔ−細胞媒介型の自己免疫疾患の抑制に関係する自己抗原を含む。
【００５１】
自己抗原は、免疫応答を引き起こす分子、または免疫寛容の状態を誘導する分子を意味し、限定されるものではないが、一本もしくは二本鎖のＤＮＡ、抗体またはその断片を含み、核酸遺伝子情報に対応する合成ペプチド、ガンマグロブリンまたはその断片を含み、核酸遺伝子情報に対応する合成ペプチド、移植抗原またはその断片を含み、核酸遺伝子情報に対応する合成ペプチドを含む。本発明に関する自己抗原にはまた、自己抗原から誘導されるエピトープまたはエピトープ群の組み合わせも含まれる。
【００５２】
「Ｔ−細胞媒介型の自己免疫疾患」は、疾患の影響が、リンパ球の炎症性サイトカイン生成のＴＨ１媒介刺激により誘導される自己免疫疾患を示す。Ｔ−細胞媒介型の自己免疫疾患は、限定されるものではないが、実験的自己免疫脳脊髄炎、多発性硬化症、関節リウマチ、重症筋無力症、甲状腺炎、実験的ぶどう膜網膜炎および放射免疫性疾患（  adioi disease）が含まれる。ＴＨ１媒介型の自己免疫疾患の抑制に関係する自己抗原は、限定されるものではないが、グルタミン酸デカルボキシラーゼ、インスリン、ミエリン塩基性蛋白質、ＩＩ型コラーゲン、ニコチン性アセチルコリン受容体、チログロブリン、甲状腺ペルオキシダーゼおよびロドプシン糖タンパクＳ抗原、ＩＲＢＰ−レチナール蛋白質およびリカバリンが含まれる。
【００５３】
「マクロファージ活性化の阻害」は、誘導物質ＣｐＧ、ＲｓｑまたはＰＩＣに応答した、マクロファージにおけるＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−およびＴＬＲ９−誘導共刺激分子（ＣＤ４０およびＣＤ８６）の発現の阻害を意味する。マイクロファージ上のＣＤ４０およびＣＤ８６発現は、ＦＡＣＳにより解析できる。
【００５４】
「ウイルス感染または細菌感染に対する感染率」は、感染性ウイルス、例えばマウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、または感染性細菌、リステリア菌に対する感染率（感染性）を意味する。ＭＣＭＶ感染に対する感染率は、ＭＣＭＶ感染に起因するマウスの死亡までの時間で測定される。リステリア菌感染に対する感染率は、リステリア菌に感染したマウスのマクロファージ中のＴＮＦおよびＩＬ−１２  ｐ４０  ｍＲＮＡ生成として測定される。黄色ブドウ球菌感染に対する感染率は、黄色ブドウ球菌感染に起因するマウスの死亡までの時間で測定される。
【００５５】
「ＴＮＦ−α産生の低下」は、哺乳動物対象のマクロファージが、ポリ−Ｉ：Ｃ（ＴＬＲ３−選択的刺激物）、レシキモド（ＴＬＲ７−選択的刺激物）およびＣｐＧモチーフを有する非メチル化ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ；ＴＬＲ９−選択的刺激物）に反応して正常な量のＴＮＦ−αを産生できないことを意味する。
【００５６】
「免疫細胞応答」は、免疫細胞遊走、標的細胞の破壊、食作用、抗体の産生、免疫応答の他の水溶性エフェクターなどの生成の結果をもたらす、生化学的変化を免疫細胞に生じさせる、外的または内的刺激（例えば、抗原、サイトカイン、ケモカインおよび他の細胞）に対する免疫系細胞の応答を意味する。
【００５７】
「Ｔリンパ球反応」および「Ｔリンパ球活性」は、Ｔリンパ球に依存する免疫応答の構成（すなわち、Ｔリンパ球の増殖および／またはヘルパー、細胞障害性キラーもしくはサプレッサーＴリンパ球への分化、抗体産生を引き起こすまたは抑制するヘルパーＴリンパ球によるＢリンパ球に対するシグナルの供給、細胞障害性Ｔリンパ球による特定の標的細胞の破壊、および他の免疫細胞の機能をモジュレートするサイトカインなどの可溶性因子の放出）に言及する際に、本明細書中では相互交換可能に用いられる。
【００５８】
「免疫応答」は、侵入病原体、病原体に感染した細胞もしくは組織、癌細胞、または自己免疫または病理学的炎症の場合には正常なヒト細胞もしくは組織に対する、選択的な損傷、破壊あるいは人体からの排除の結果を伴う、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒細胞、および前記細胞または肝臓により産生される可溶性高分子（抗体、サイトカインおよび補体を含む）の協調作用を意味する。
【００５９】
「炎症」または「炎症反応」は、組織が細菌、外傷、毒素、熱または他のいずれかの原因により損傷を受けた場合に起こる、先天的な免疫応答を意味する。その損傷組織は、ヒスタミン、ブラジキニンおよびセロトニンを含む化合物を放出する。炎症は、急性反応（すなわち、炎症の進行が盛んな時の反応）および慢性反応（すなわち、緩徐な進行および新しい結合組織の形成により示される反応）の両方を意味する。急性および慢性的炎症は、関与する細胞型により区別できる。急性炎症は、多形核好中球がしばしば関係するが、慢性的炎症は、リンパ組織球増加（lymphohistiocytic）および／または肉芽腫性反応により通常特徴付けられる。炎症は、特定および不特定の防衛システム両方の反応を含む。特定の防衛システム反応は、抗原（場合により、自己抗原を含む）に対する特定の免疫系の反応である。不特定の防衛システム反応は、免疫記憶不能な白血球により媒介される炎症反応である。そのような細胞には、顆粒細胞、マクロファージ、好中球および好酸球が含まれる。炎症の特定の型の例には、びまん性炎症、局所性炎症、クループ性炎症、介在性炎症、閉塞性炎症、実質性炎症、反応性炎症、特定炎症、毒性炎症および外傷性炎症がある。
【００６０】
「患者」、「対象」または「哺乳動物」は、相互交換可能に用いられ、哺乳動物、例えばヒト患者およびヒト以外の霊長類、並びに実験動物、例えばウサギ、ラットおよびマウスおよび他の動物を意味する。動物には、すべての脊椎動物、例えば、哺乳動物および哺乳類以外の動物、例えば羊、犬、牛、鶏、両生類および爬虫類が含まれる。
【００６１】
「処置する」または「処置」は、症状、合併症、または疾患の生化学的兆候の発症を予防または遅延させ、症状を軽減または改善させるか、または疾患、病状または障害（例えば、自己免疫疾患）のさらなる進行を抑制または阻害するため、本発明の組成物、化合物または薬剤を投与することを含む。「処置する」はさらに、処置または改善あるいは病気、病状または障害（例えば、自己免疫疾患）の予防における一連の兆候を示し、いずれかの客観的または主観的パラメータ、例えば、寛解すること；緩和すること；兆候の軽減もしくは患者を病状に対してより寛容化させること；衰退または減退の速度を遅らせること；または衰退の最終点をより弱めることを含む。兆候の処置または改善は、医師による検査結果を含む、客観的または主観的パラメータに基づき得る。従って、用語「処置する」は、自己免疫疾患に関連する兆候もしくは症状の進行を予防もしくは遅延させるため、軽減させるため、または阻止もしくは阻害するために、本発明の化合物または薬剤を投与することを含む。用語「治療効果」は、対象における疾患、病状もしくは疾患の副作用の軽減、解消もしくは予防を意味する。本発明の方法を用いて「処置する」または「処置」は、自己免疫疾患の増大した危険性を有し得るが、いまだ症状を経験も顕在化もしていない対象における症状の発症を予防すること、自己免疫疾患の症状を阻害すること（進行を遅らせること、または阻止すること）、自己免疫疾患の副作用の症状に対し軽減を与えること（緩和剤処置を含む）、および自己免疫疾患の症状を除去すること（退行を生じさせる）を含む。処置には、予防（疾病の発症の予防もしくは遅らせること、またはその臨床的もしくは亜臨床的症状の顕在化を予防すること）または治療的抑制、あるいは疾病または状態が顕在化した後の、症状の臨床的もしくは亜臨床的緩和があり得る。
【００６２】
細胞のＴｏｌｌ様受容体の「阻害物質」「活性物質」および「モジュレーター」は、阻害、活性化またはモジュレートする分子に言及して用いられ、それぞれ、Ｔｏｌｌ様受容体結合またはシグナル伝達についてのインビトロおよびインビボアッセイに用いることが確認された分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストおよびその相同体ならびに模倣物である。
【００６３】
用語「モジュレーター」は、阻害物質、活性物質を含む。阻害物質は、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する、部分的もしくは全体的に刺激を阻止する、低下させる、抑制する、遅延活性化する、不活性化する、脱感作する、またはＴｏｌｌ様受容体の活性を下方制御する物質、例えば、アンタゴニストである。活性物質は、Ｔｏｌｌ様受容体と結合する、Ｔｏｌｌ様受容体の活性を刺激する、増大させる、開放する、活性化する、促進する、活性化増強する、増感するまたは上方制御する物質、例えば、アゴニストである。モジュレーターは、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体との相互作用を改変する物質、活性物質または阻害物質と結合する蛋白質、受容体を含み、蛋白質、ペプチド、脂質、炭水化物、多糖類またはそれらの組み合わせ、例えば、リポ蛋白質、糖蛋白質およびその類似物が含まれる。モジュレーターには、例えば、改変された活性を有する、天然のＴｏｌｌ様受容体リガンドの遺伝的にモディファイされた形態、ならびに天然リガンドおよび合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低分子化合物およびその類似物が含まれる。阻害物質および活性物質のアッセイには、本明細書中に記載されるように、例えば、推定されるモジュレーター化合物を、Ｔｏｌｌ様受容体を発現する細胞に適用し、次いで、Ｔｏｌｌ様受容体シグナル伝達の機能効果を決定することが含まれる。潜在的な活性物質、阻害物質またはモジュレーターで処理されたＴｏｌｌ様受容体を含む試料および分析は、阻害範囲を調べるために阻害物質、活性物質またはモジュレーターを含まない対照試料と比較される。対照試料（阻害物質で処理していない）には、相対的なＴｏｌｌ様受容体活性値１００％を割り当てることができる。Ｔｏｌｌ様受容体の阻害は、対照に対してＴｏｌｌ様受容体活性値が約８０％、場合により５０％または２５−０％の場合に達成される。Ｔｏｌｌ様受容体の活性は、対照に対してＴｏｌｌ様受容体活性値が１１０％、場合により１５０％、場合により２００−５００％または１０００−３０００％以上の場合に達成される。
【００６４】
Ｔｏｌｌ様受容体に結合する分子能力は、例えば、アッセイプレート上に被覆されたＴｏｌｌ様受容体免疫接着因子（イムノアドヘシン）に結合する推定リガンドの能力により決定することができる。結合の特異性は、Ｔｏｌｌ様受容体以外のものへの結合と比較することにより決定することができる。
【００６５】
１つの態様において、Ｔｏｌｌ様受容体に結合する抗体は、リガンドまたは受容体のいずれかを固定することによりアッセイすることができる。例えば、その分析は、Ｎｉ−活性化ＮＴＡ樹脂ビーズ上に、Ｈｉｓタグ融合されたＴｏｌｌ様受容体を固定することを含み得る。抗体は、適当な緩衝液に加えられ、そのビーズを所定の温度で一定期間インキュベートし得る。結合していない物質を除去するために洗浄した後、結合した蛋白質を、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨの緩衝液およびその類似物を用いて放出させ、分析することができる。
【００６６】
ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介してＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性の「阻害物質」「活性物質」および「モジュレーター」は、阻害、活性化またはモジュレートする分子に言及して用いられ、それぞれ、ｕｎｃ−９３ａ、ｕｎｃ−９３ｂもしくはｕｎｃ−９３ｃ結合またはシグナル伝達についてのインビトロおよびインビボアッセイに用いることが確認された分子、例えば、リガンド、アゴニスト、アンタゴニストおよびその相同体ならびに模倣物である。用語「モジュレーター」は、阻害物質、活性物質を含む。阻害物質は、例えば、結合する、部分的もしくは全体的に刺激を阻止する、Ｔｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を、低下させる、抑制する、遅延活性化する、不活性化する、脱感作するまたはＴｏｌｌ様受容体の活性を下方制御する物質、例えば、アンタゴニストである。活性物質は、結合する、Ｔｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を刺激する、増大させる、開放する、活性化する、促進する、活性化増強する、増感するまたは上方制御する物質、例えば、アゴニストである。モジュレーターは、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７もしくはＴｏｌｌ様受容体９との相互作用を改変する物質、活性物質または阻害物質と結合する蛋白質、受容体を含み、蛋白質、ペプチド、脂質、炭水化物、多糖類またはそれらの組み合わせ、例えば、リポ蛋白質、糖蛋白質およびその類似物が含まれる。モジュレーターには、例えば、改変された活性を有する、Ｔｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７もしくはＴｏｌｌ様受容体９リガンドの遺伝的に修飾された形態、ならびに天然リガンドおよび合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、低分子化合物およびその類似物が含まれる。阻害物質および活性物質のアッセイには、本明細書中に記載されるように、例えば、推定されるモジュレーター化合物を、ｕｎｃ−９３ａ、ｕｎｃ−９３ｂもしくはｕｎｃ−９３ｃを発現する細胞に適用し、次いで、Ｔｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７もしくはＴｏｌｌ様受容体９のシグナル伝達の機能効果を決定することが含まれる。潜在的な活性物質、阻害物質またはモジュレーターで処理されたＴｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７もしくはＴｏｌｌ様受容体９を含む試料または分析は、阻害範囲を調べるために阻害物質、活性物質またはモジュレーターを含まない対照試料と比較される。対照試料（阻害物質で処理していない）には、相対的なＴｏｌｌ様受容体活性値１００％を割り当てることができる。ＴＮＦＲＩＩ／ＣＤ１２０ｂの阻害は、対照に対してＴｏｌｌ様受容体活性値が約８０％、場合により５０％または２５−０％の場合に達成される。Ｔｏｌｌ様受容体の活性は、対照に対してＴｏｌｌ様受容体活性値が１１０％、場合により１５０％、場合により２００−５００％または１０００−３０００％以上の場合に達成される。
【００６７】
「アンタゴニスト」は、最も広義で用いられ、ｕｎｃ−９３ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３ｂポリペプチドもしくはｕｎｃ−９３ｃポリペプチドまたはＴｏｌｌ様受容体３シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体９シグナル伝達の生物学的活性を部分的または完全に阻止、阻害もしくは不活性化する全ての分子を含む。同様に、用語「アゴニスト」も、最も広義で用いられ、ｕｎｃ−９３ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３ｂポリペプチドもしくはｕｎｃ−９３ｃポリペプチドまたはＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達の生物学的活性を模倣または増強する全ての分子を含む。適切なアゴニストまたはアンタゴニスト分子は、具体的には、アゴニストもしくはアンタゴニスト、抗体または抗体断片、天然のｕｎｃ−９３ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３ｂポリペプチドもしくはｕｎｃ−９３ｃポリペプチドの断片またはアミノ酸配列の変異型、ペプチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子有機分子およびその類似物含む。ｕｎｃ−９３ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３ｂポリペプチドもしくはｕｎｃ−９３ｃポリペプチドのアゴニストまたはアンタゴニストを同定する方法は、ｕｎｃ−９３ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３ｂポリペプチドもしくはｕｎｃ−９３ｃポリペプチドを、候補のアゴニストまたはアンタゴニスト分子と接触させ、通常、ｕｎｃ−９３ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３ｂポリペプチドもしくはｕｎｃ−９３ｃポリペプチドと関係する１つまたはそれ以上の生物学的活性において検出可能な変化を測定することを含み得る。
【００６８】
「細胞中のシグナル伝達」は、リガンド、例えば、内因性もしくは外因性リガンド、例えばunc-93A、unc-93Bもしくはunc-93Cと、受容体、例えば、Ｔｏｌｌ様受容体3-シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体7-シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体9-シグナル伝達経路との相互作用の結果、例えば、自己免疫応答、炎症反応、感染症またはCD8細胞もしくはCD4細胞シグナル伝達欠損症などの応答を起こさせる細胞シグナル伝達がを意味する。
【００６９】
「試験化合物」は、Ｔｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達経路、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達経路もしくはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達経路を通じたシグナル伝達の結果として、遺伝子発現の増加または減少に影響を及ぼすことが決定される、核酸、ＤＮＡ、ＲＮＡ、蛋白質、ポリペプチドもしくは低分子化学物質を意味する。試験化合物は、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ポリペプチドもしくは低分子分子化学物質であってもよい。用語「試験化合物」は、低分子化学化合物、または生物学的物体、例えば蛋白質、糖類、核酸もしくは脂質のいずれであってもよい。典型的には、試験化合物は、低分子化合物およびポリペプチドであろう。「Ｔｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達に特異的な試験化合物」は、ＴＮＦ−αを介したＴＮＦＲＩＩ／ＣＤ１２０ｂ経路のシグナル伝達のモジュレーターであることが決定される。
【００７０】
「細胞に基づいたアッセイ」は、Ｔｏｌｌ様受容体3、Ｔｏｌｌ様受容体7もしくはＴｏｌｌ様受容体9結合アッセイを含み、例えば、細胞、細胞膜、界面活性物質で可溶化した細胞膜蛋白質、固定されたコラーゲンにおけるunc-93A、unc-93Bもしくはunc-93Cを介したＴｏｌｌ様受容体3-シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体7-シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体9-シグナル伝達活性についての、放射性リガンドまたは蛍光性リガンド結合アッセイ(Alberdi、J Biol Chem. 274:31605-12、1999;Meyer ら、2002）；ＴＮＦＲＩＩ／ＣＤ１２０ｂ−親和性カラムクロマトグラフィー（Alberdi、J Biol Chem. 274:31605-12、1999;Aymerich ら、Invest Ophthalmol Vis Sci. 42:3287-93、2001）；放射性または蛍光性−リガンドを用いるＴＮＦＲＩＩ／ＣＤ１２０ｂリガンドブロット（Aymerichら、Invest Ophthalmol Vis Sci. 42:3287-93、2001;Meyerら、2002）；サイズ排除限外濾過（Alberdi ら、Biochem.、1998;Meyer ら、2002）；またはＥＬＩＳＡが含まれる。本発明の例示的なＴＮＦＲＩＩ／ＣＤ１２０ｂ結合活性アッセイは：ＴＮＦ−α／ＴＮＦＲＩＩ／ＣＤ１２０ｂリガンドブロットアッセイ（Aymerichら、Invest Ophthalmol Vis Sci. 42:3287-93、2001）；ＴＮＦＲＩＩ／ＣＤ１２０ｂ親和性カラムクロマトグラフィーアッセイ（Alberdi、J Biol Chem. 274:31605-12、1999）およびＴＮＦ−α／ＴＮＦＲＩＩ／ＣＤ１２０ｂリガンド結合アッセイ（Alberdi ら、J Biol Chem. 274:31605-12、1999)がある。各々はその全てを出典明示により一部とされる。
【００７１】
１つの態様において、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性は、リガンドまたは受容体のいずれかを固定することによりアッセイすることができる。例えば、アッセイは、Ｈｉｓタグ融合されたＴｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７もしくはＴｏｌｌ様受容体９を、Ｎｉ−活性ＮＴＡ樹脂ビーズ上に固定化することを含み得る。ｕｎｃ−９３ａポリペプチド、ｕｎｃ−９３ｂポリペプチドもしくはｕｎｃ−９３ｃポリペプチドを、適当な緩衝液に加えてもよく、ビーズは所定の温度で一定期間インキュベートし得る。結合していない物質を除去するために洗浄した後、結合した蛋白質は、例えば、ＳＤＳ、高ｐＨの緩衝液およびその類似物を用いて放出され、分析することができる。
【００７２】
「接触させる」は、受容体-媒介型のシグナル伝達おける影響が測定できるように、可溶型の試験化合物を、アッセイ系に、例えば細胞に基づくアッセイ系に混合することを意味する。
【００７３】
「シグナル伝達の応答能」または「シグナル伝達活性に有効」または「細胞に基づくアッセイ系を刺激する」は、免疫応答を阻害もしくは増強するための、または自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症もしくはＣＤ４細胞欠損症を処置するための、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性の能力を意味する。
【００７４】
「効果を検出する」は、細胞に基づくアッセイ系にて測定される効果を意味する。例えば、検出される効果は、アッセイ系、例えば、TNF細胞アッセイ、Ｔｏｌｌ様受容体3、Ｔｏｌｌ様受容体7もしくはＴｏｌｌ様受容体9結合アッセイにおける、Ｔｏｌｌ様受容体3-シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体7-シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体9-シグナル伝達であり得る。
【００７５】
「モジュレーションの指標となるアッセイ」は、unc-93A、unc-93Bもしくはunc-93Cを介したＴｏｌｌ様受容体3-シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体7-シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体9-シグナル伝達活性による細胞の活性化が、自己免疫疾患、感染病、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、CD8細胞欠損症またはCD4細胞欠損症に対して、細胞に防御反応の誘導を示す、細胞に基づくアッセイ系の結果を意味する。
【００７６】
本発明のｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のリガンドに関する「生物学的活性」および「生物学上の活性」は、天然または組み換えＴｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７もしくはＴｏｌｌ様受容体９と特異的に結合し、シグナル伝達する、あるいはシグナル伝達に関与する天然または組み換えＴｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７もしくはＴｏｌｌ様受容体９の能力を阻止する、リガンド分子の能力を意味する。従って、本発明のＴｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７もしくはＴｏｌｌ様受容体９の（天然および変異型）リガンドは、天然または組み換えＴＮＦＲＩＩ／ＣＤ１２０ｂのアゴニストおよびアンタゴニストを含む。本発明のＴｏｌｌ様受容体３、Ｔｏｌｌ様受容体７もしくはＴｏｌｌ様受容体９のリガンドの好ましい生物学的活性は、誘導もしくは阻害する能力、例えば、免疫応答の阻害もしくは増強すること、または自己免疫疾患、感染病、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症もしくはＣＤ４細胞欠損症の処置することが含まれる。従って、本発明の化合物または薬剤の投与により、自己免疫疾患、感染病、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症もしくはＣＤ４細胞欠損症または他の障害に関連する兆候もしくは症状の進行を、予防もしくは遅延させ、軽減し、または阻止もしくは阻害することができる。
【００７７】
本発明の化合物と既知の薬剤の「同調投与」は、既知薬剤と化合物の両方が、治療効果または診断効果を有するよう、適時の薬物と本化合物との投与を意味する。このような同調投与は、本発明の化合物の投与に関して、併用（すなわち、同時）、事前または後の投与を含んでいてもよい。当業者には、特定の薬物および本発明の化合物を投与する適当な時期、順序および投与量を決定することは困難ではない。
【００７８】
一般に、用語「よく寛容化される」は、処置結果として起こる健康状態、および処置の決定に影響する健康状態に不利な変化が見られないことを意味する。
【００７９】
本明細書中の「リンパ球」は、当分野の通常の意味を有し、血液、リンパ液およびリンパ組織、すなわちBおよびＴリンパ球中で見出される、全ての単核細胞、非食作用白血球（nonphagocytic leukocytes）を意味する。
【００８０】
「Ｔリンパ球の部分集団」または「T細胞の小集団」は、特定の細胞表面標識の発現により特徴づけられるＴリンパ球もしくはT細胞を意味する(Barclay, A. Nら、(編), THE LEUKOCYTE ANTIGEN FACTS BOOK, 第2版, Academic Press, London, United Kingdom, 1997を参照のこと;この文献は、すべての目的について出典明示により本明細書一部とされる)。
【００８１】
「エピトープ」は、抗体と特異的に結合できる蛋白質決定基を意味する。エピトープは、通常、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性のある表面基を構成し、通常、特異的な三次元構造特性、ならびに特異的な荷電特性を有する。立体配座性のエピトープと立体配座の関係ないエピトープとは、変性溶媒の存在下で、前者は結合するが、後者は結合しない点で区別される。
【００８２】
完全「抗体」は、ジスルフィド結合により相互に連結された少なくとも２本の重鎖（Ｈ鎖）と２本の軽鎖（Ｌ鎖）を含む。各重鎖は、重鎖可変領域（以下、ＶＨと省略する）と重鎖定常領域とから成る。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３から成る。各軽鎖は、軽鎖可変領域（以下、ＶＬと省略する）および軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬから成る。ＶＨおよびＶＬ領域は、さらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域に分かれている。ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲと４つのＦＲとから構成され、アミノ−末端からカルボキシル末端にかけて、次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で並ぶ。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫グロブリンと、細胞受容体、例えば、Ｆｃ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩおよびＦｃＲη）および典型的な補体系の第一成分（Ｃｌｑ）を通じ、種々の免疫系細胞（例えば、エフェクター細胞）を含む、宿主組織または因子との結合を媒介し得る。用語「抗体」は、抗原を結合する能力を有する、完全抗体の抗原結合部分を含む。抗原を結合する部分の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片；（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により架橋された２つのＦａｂ断片を含む、二価の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の一方の腕（アーム）のＶＬおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Ward ら、Nature 341:544-546、1989）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは、個別の遺伝子によりコードされているが、ＶＬおよびＶＨ領域の組を、一価の分子を形成させるために一本の蛋白質鎖として作製できるよう、組み換え技術を用いて、合成リンカーにより連結することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Bird ら、Science 242:423-426、1988;およびHuston ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:5879-5883、1988を参照のこと）。このような一本鎖抗体は、用語「抗体」に言及して含まれる。断片は、組み換え技術または、完全抗体の酵素的もしくは化学的分割により調製することができる。
【００８３】
「ヒト配列抗体」は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導される可変領域および定常領域（存在する場合）を有する抗体を含む。本発明のヒト配列抗体には、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によりコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的な突然変異生成またはインビボでの体細胞変異により導入される突然変異）を含んでいてもよい。しかしながら、本明細書にて用いられる、用語「ヒト配列抗体」は、抗原特異性を与えるのに十分であり、他の哺乳類の種から、例えばマウスの生殖細胞系から誘導される完全なＣＤＲ配列が、ヒトのフレームワーク配列に植え継がれた抗体（すなわち、ヒト化抗体）を含むことを意図しない。
【００８４】
「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、抗体分子の単一分子組成の調製物を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の特定的な結合および親和性を表す。従って、用語「ヒトモノクローナル抗体」は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列から誘導される可変領域および定常領域（存在する場合）を有する単一の特異的な結合を示す抗体を意味する。１つの態様において、ヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合される、ヒト重鎖トランス遺伝子および軽鎖トランス遺伝子を含むゲノムを有する、ヒト以外のトランスジェニック動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られるＢ細胞を含むハイブリドーマにより産生される。
【００８５】
「ジクローナル（Ｄｉｃｌｏｎａｌ）抗体」は、少なくとも２つの抗原に対する抗体の調製物を意味する。典型的には、異なる抗体は、異なるエピトープと結合する。
【００８６】
「オリゴクローナル抗体」は、抗原対する３個〜１００個の異なる抗体の調製物を意味する。典型的には、このような調製物中の抗体は、異なるエピトープ範囲と結合する。
【００８７】
「ポリクローナル抗体」は、抗原に対する1個以上（２個またはそれ以上）の異なる抗体の調製物を意味する。このような調製物は、異なるエピトープ範囲と結合する抗体を含む。
【００８８】
「組み換え型ヒト抗体」は、組み換え技術により調製、発現、作製または単離された本発明のすべてのヒト配列抗体を含み、例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子についてのトランスジェニックした動物（例えば、マウス）から単離した抗体（以下にさらに記載）；宿主細胞にトランスフェクトした組み換え発現ベクターを用いて発現された抗体、遺伝子組み換え、組み合わせヒト抗体ライブラリーから単離された抗体、またはヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む、他の全ての方法により調製、発現、作製または単離される抗体が含まれる。このような組み換えヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列の可変領域および定常領域（存在する場合）を有する。しかしながら、このような抗体は、インビトロで突然変異生成（または、ヒトＩｇ配列についてのトランスジェニック動物を用いた場合には、インビボでの体細胞変異）を受けることがあり、かくして、組み換え抗体のＶＨおよびＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨおよびＶＬ配列から誘導され、関係するものであるが、インビボでのヒト抗体生殖系の範囲で自然に存在するものではない配列であり得る。
【００８９】
「異種抗体」は、抗体を産生するヒト以外のトランスジェニック生物体に関して定義される。この用語は、ある生物体で見出されるが、そのヒト以外のトランスジェニック動物を構成しない、アミノ酸配列またはそれに対応するコード化核酸配列を有する抗体を示し、一般に、そのヒト以外のトランスジェニック動物のもの以外の種由来のものを示す。
【００９０】
「ヘテロハイブリッド抗体」は、異なる生物起源の軽鎖および重鎖を有する抗体を意味する。例えば、マウスの軽鎖に関してヒト重鎖を有する抗体は、ヘテロハイブリッド抗体である。
【００９１】
「実質的に純粋」または「単離された」は、対象の種類が主な種類で存在する(すなわち、モルに基づき、組成物中の他のいずれの種類よりも豊富である）よう、対象の種類(例えば、本発明中の抗体)が、同定され、分離され、および/またはその天然環境の成分から回収されたことを意味し;「実質的に純粋」または「単離された」組成物はまた、存在する全ての高分子種の少なくとも５０％（モルに基づく）を含むことを意味する。実質的に純粋または単離された組成物はまた、組成物中に存在する全ての高分子種の８０〜９０重量％以上を含むことを含んでいてもよい。単離された対象の種類(例えば、本発明の抗体)は、組成物が基本的に単一の高分子種の誘導体から構成され、本質的に均質(慣用の検出方法により、不純物種を組成物中で検出することがでいない)に精製され得る。例えば、単離された３ｄに対する抗体は、ヒト3dに結合せず、別の抗原と結合する他の抗体に実質的に含まない。しかしながら、エピトープと特異的に結合する単離された抗体、例えば、ヒト3dのアイソフォームまたは変異型は、例えば、他の種由来の他の関連する抗原(例えば、3dの種相同体)と交差反応性を、さらに有し得る。そのうえ、本発明の単離された抗体は、他の細胞物質(例えば、非免疫グロブリン関連蛋白質)および/または化学物質を実質的に含まない。
【００９２】
「特異的な結合」は、抗体が特定の抗原に、他の特定のものでない抗原と比べて、優先的に結合することを意味する。成句、抗体に「特異的に（または選択的に）結合する」は、不均一な蛋白質や他の生物物質の集団の中で、その蛋白質の存在を決定付ける結合反応を意味する。典型的には、抗体は、少なくとも約１０６Ｍ−１もしくは１０７Ｍ−１、または約１０８Ｍ−１〜１０９Ｍ−１、または約１０１０Ｍ−１〜１０１１Ｍ−１、またはそれ以上の結合定数（Ｋａ）で結合し、そして、その特定の抗原に対する親和力が、特定の抗原または近似する抗原以外の、特定のものでない抗原（例えばＢＳＡ、カゼイン）に対する結合親和力よりも少なくとも２倍以上大きい親和力で結合する。成句「抗原を認識する抗体」および「抗原に特異的な抗体」は、本明細書中では、用語「抗原と特異的に結合する抗体」と相互に変換して用いられる。前決定の抗原は、その抗原と結合する抗体を選択する前に選び出された抗原である。
【００９３】
ペプチドについて言及する場合に、「特異的に結合する」または「特異的な結合」は、標的分子に対して排他的もしくは優先的な、中間体または高い結合親和力を有するペプチド分子を示す。成句「特異的に結合する」は、不均一な蛋白質や他の生物物質の集団中に存在する標的蛋白質の存在を決定付ける結合反応を意味する。従って、所定のアッセイ条件下で、特異的に結合する分子は、特定の標的蛋白質と優先的に結合するが、試験試料中に存在する他の成分と有意な量で結合しない。そのような条件下で標的蛋白質に対する特異的な結合は、特定の標的抗原をその特異性で選択する結合部分が必要であろう。様々なアッセイ形式を用いて、特定の蛋白質と特異的に反応するリガンドを選択することができる。例えば、固相ELISA免疫アッセイ、免疫沈澱法、ビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）およびウェスタンブロットを用いて、抗原と特異的に反応するペプチドを同定する。典型的には、特異的もしくは選択的な反応は、バックグラウンドのシグナルまたはノイズの少なくとも２倍、より典型的にはバックグラウンドの１０倍以上であろう。
【００９４】
抗体について「高親和力」は、平衡結合定数（Ｋａ）が約１０７Ｍ−１、少なくとも約１０８Ｍ−１、少なくとも約１０９Ｍ−１、少なくとも約１０１０Ｍ−１、少なくとも約１０１１Ｍ−１または少なくとも約１０１２Ｍ−１またはそれ以上、例えば１０１３Ｍ−１もしくは１０１４Ｍ−１まで、あるいはそれ以上であることを意味する。しかしながら、「高親和力」結合は、他の抗体アイソタイプでは異なり得る。
【００９５】
本明細書で用いられる用語「「Ｋａ」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡結合定数を意味するものである。この定数は、1／Ｍの単位を有する。
【００９６】
本明細書で用いられる用語「Ｋｄ」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を意味するものである。この定数は、Ｍの単位を有する。
【００９７】
本明細書で用いられる用語「ｋａ」は、抗体−抗原相互作用の結合速度定数を意味するものである。この定数は、１／Ｍｓの単位を有する。
【００９８】
本明細書で用いられる用語「ｋｄ」は、抗体−抗原相互作用の解離速度定数を意味するものである。この定数は、１／ｓの単位を有する。
【００９９】
「特定の抗体−抗原相互作用」は、その平衡定数および速度定数を測定する実験条件を意味する。
【０１００】
「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子にコードされた抗体のクラスを意味する。重鎖は、ガンマ、ミュー、アルファ、デルタまたはイプシロンに分類され、抗体のアイソタイプはそれぞれＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＥと定義される。加えて、構造変動の特徴により、ＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）およびＩｇＡ（例えば、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のサブタイプに区別される。
【０１０１】
「アイソタイプスイッチング」は、抗体のクラスまたはアイソタイプが、あるＩｇクラスから別のＩｇクラスへ変化する現象を意味する。
【０１０２】
「スイッチしないアイソタイプ」は、アイソタイプのスイッチングが起こらない場合に産生される重鎖のアイソタイプ群を意味し：スイッチしないアイソタイプをコードするＣＨ遺伝子は、典型的には、機能的に再構成されるＶＤＪ遺伝子のすぐ下流にある最初のＣＨ遺伝子である。アイソタイプスイッチングは、典型的もしくは非典型的アイソタイプスイッチングに分類される。典型的なアイソタイプスイッチングは、トランス遺伝子中の少なくとも１つのスイッチ配列領域が関係する組み換え事象により生じる。非典型的なアイソタイプスイッチングは、ヒトσとヒトΣとの間の相同組み換え（δ-関連欠失）により生じ得る。あるいは、非典型的スイッチングの機序、例えばトランス遺伝子間および／または染色体間、その他の間の組み換えにより生じることがあり、アイソタイプスイッチングが達成される。
【０１０３】
「スイッチング配列」は、スイッチング組み換えに関与するＤＮＡ配列を意味する。「スイッチドナー」配列、典型的には、μスイッチ領域は、スイッチ組み換え時に欠失される５’（例えば上流）の定常領域である。「スイッチアクセプター」領域は、欠失される定常領域と、組み換え定常領域（例えば、γ、εなど）との間に存在する。組み換えはいつも特異的な部位で起こるわけではないので、最終的な遺伝子配列は、構成物から一般には予想できない。
【０１０４】
「糖鎖付加パターン」は、蛋白質に、より具体的には、免疫グロブリン蛋白質に共有結合している炭水化物単位のパターンとして定義される。異種抗体の糖鎖付加パターンは、ヒト外のトランスジェニック動物種により産生させる抗体に自然に生じる糖鎖付加パターンと実質的に類似するように特徴付けられ、当業者には、異種抗体の糖鎖付加パターンが、トランス遺伝子のＣＨ遺伝子が導入された種よりもより、ヒト以外のトランスジェニック動物種での糖鎖付加パターンに類似してることは認められよう。
【０１０５】
物に適用される「天然」は、ある物が自然界で見出すことができる事実を示す。例えば、生物体（ウイルスを含む）に存在し、天然資源から単離することができるが、研究室でヒトによりい意図的に修飾されていないポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然のものである。
【０１０６】
「免疫グロブリン遺伝子座」は、免疫グロブリンペプチドを発現するためにＢ細胞またはＢ前駆細胞により用いられ得る情報を含む、遺伝因子または連結された遺伝因子の組みを示す。このペプチドは、重鎖ペプチド、軽鎖ペプチド、または重鎖ペプチドと軽鎖ペプチドの融合体であり得る。再構成されていない遺伝子座の場合、遺伝要素は、免疫グロブリンペプチドをコードする遺伝子を形成するためにＢ前駆細胞により集められる。再構成された遺伝子座の場合、免疫グロブリンペプチドをコードする遺伝子は、その遺伝子座の中に含まれる。
【０１０７】
「再構成された」は、Ｖセグメントが本質的に完全なＶＨまたはＶＬドメインをそれぞれコードする構造でＤ−ＪまたはＪセグメントに近接して配置されている、重鎖または軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の配置を意味する。再構成された免疫グロブリン遺伝子配座は、生殖細胞系ＤＮＡと比較することによる確認することができる；再構成された遺伝子座は、少なくとも１つの組み換えられた７量体／９量体相同要素を有する。
【０１０８】
Ｖセグメントで言及される「再構成されていない」または「生殖細胞系の構成」は、ＶセグメントがＤまたはＪセグメントの近傍となるように組み換えられていない構成を意味する。
【０１０９】
「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの形態のデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを示し、特に限定しない限り、天然のヌクレオチドと同様の様式で機能することができる、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含み得る。
【０１１０】
抗体または抗原に結合する抗体部分（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＤＲ３）をコードする核酸について言及する「単離された核酸」は、抗体または抗体部分をコードするヌクレオチド配列が、例えば３ｄ以外の抗原と結合する抗体または抗体部分をコードする他のヌクレオチド配列を含まない核酸を意味し、他の配列は、当然ヒトのゲノムＤＮＡ中でその核酸の隣に存在し得る。
【０１１１】
２つの核酸またはポリペプチドの関係で、「実質的に同一」は、以下の配列比較方法を用いておよび／または目視により測定し、最大対比法（マキシマム・コレスポンデンス）で比較し、アライメントした場合に、少なくとも約８０％、約９０％、約９５％またはそれ以上のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する、２つまたはそれ以上の配列または部分配列を意味する。そのような「実質的に同一」の配列は、一般には、相同であると考えられる。「実質的に同一」は、比較されるべき２つの配列の少なくとも約５０残基長の配列領域に渡って、少なくとも約１００残基の領域に渡って、または少なくとも約１５０残基の領域に渡って、あるいは全長に渡って、存在し得る。上記のように、いずれかの２つの抗体の配列は、Kabatの付番スキーム（numbering scheme）を用いる方法で、単純にアライメントすることができる。このように、抗体についての同一性百分率は、独特ではっきりとした意味を有する。
【０１１２】
免疫グロブリンの成熟した重鎖および軽鎖の可変領域のアミノ酸は、それぞれＨｘおよびＬｘと称され、ここで、ｘは、Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1987および1991)に従って、アミノ酸の部位を示す数である。Ｋａｂａｔは、それぞれのサブグループの抗体のアミノ酸配列の多くを列挙し、そのサブグループにおいて各残基部で最も共通して存在するアミノ酸を列挙し、共通配列を生み出した。Ｋａｂａｔは、列挙した配列の各アミノ酸の残基番号を整列させるための方法を用い、この残基番号を配列させる方法は当該分野の標準法となった。Ｋａｂａｔのスキームは、保存されたアミノ酸を参照し、Ｋａｂａｔの共通配列のいずれかに対して問題となる抗体を整列させることで、彼の概論に含まれていなかった他の抗体にも拡張可能である。Ｋａｂａｔの付番方式の使用は、異なる抗体の等価な部位のアミノ酸を容易に同定できる。例えば、ヒトの抗体のＬ５０部位のアミノ酸は、マウス抗体のＬ５０部位のアミノ酸と等価な部位を示す。それぞれの核酸にコードされたアミノ酸配列を、Ｋａｂａｔ付番慣習に従って整列させた場合と同様に、抗体の鎖をコードする核酸を整列させる。代替となる構造の定義は、Chothiaら、J. Mol. Biol. 196:901-917, 1987；Chothiaら、Nature 342:878-883, 1989;およびChothia,ら、J. Mol. Biol. 186:651-663, 1989により提唱され、それらは、全ての目的について出典明示により本明細書の一部とされる。
【０１１３】
本発明の核酸は、完全な細胞内、細胞溶解物中、または部分的に精製された、もしくは実質的に純粋な形態で存在し得る。核酸は、アルカリ／ＳＤＳ処理、ＣｓＣｌ結合法、カラムクロマトグラフィー、アガロースゲル電気泳動法および当分野で周知の他の方法(例えば、本明細書中で言及されるSambrook, TijssenおよびAusubelを参照のこと、そしてその目的のすべては出典明示により一部とされる）を含む、標準技術により、他の細胞成分または他の異物、例えば他の細胞の核酸または蛋白質から精製された場合に、「単離され」または「実質的に純粋」にされる。本発明の核酸配列および本発明を実施するのに用いられる他の核酸、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの混成物のいずれかは、様々な供給源、遺伝的に作製されたもの、組み換え技術により増幅および／または発現されたものから単離することができる。細菌系に加えて、例えば酵母、昆虫または哺乳類の系を含む、組み換え技術による発現系のいずれかを用いることができる。別法として、これらの核酸は、インビトロで化学的に合成することができる。核酸操作に関する技術、例えば発現ベクターへのサブクローニング、標識化プローブ、配列決定およびハイブリダイゼーションは、科学文献および特許文献において広く記載されており、例えば、Sambrook, TijssenおよびAusubelを参照のこと。核酸は、当業者には周知の一般的な数多くの方法のいずれかにより分析し、定量することができる。それらには、例えば、分析生化学的方法、例えばＮＭＲ、分光法、分析撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、およびハイパーディフュージョン（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、種々の免疫学的方法、例えば液体もしくはゲル沈降反応、免疫拡散法（一重または二重）、免疫電気泳動法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫−蛍光アッセイ、サザン分析法、ノーザン分析法、ドット−ブロット分析法、ゲル電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、ＲＴ−ＰＣＲ、定量ＰＣＲ、他の核酸または標的もしくはシグナル増幅方法、放射同位元素標識法、シンチレーション計数法、および親和性クロマトグラフィーが含まれる。
【０１１４】
本発明の核酸組成物は、しばしばｃＤＮＡ、ゲノムまたはその混合物のいずれか由来の天然の配列であるが（修飾された制限酵素認識部位などを除く）、遺伝子配列を提供する標準技術に関して、それらを突然変異させることができる。コード配列について、これらの変異は、アミノ酸配列に所望するように影響を与えることができる。特に、天然、のＶＤＪ定常スイッチ（native V, D, J, constant, switches）および本明細書に記載した他のそのような配列と実質的に相同のまたは誘導されたＤＮＡ配列が考えられる（ここで、「誘導された」は、配列がその他の配列と同一またはそれらから修飾されていることを示す）。
【０１１５】
「組み換え宿主細胞」または「宿主細胞」は、組み換え発現ベクターが導入された細胞を意味する。該用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の娘細胞にも言及するものであることは理解されるべきである。突然変異または環境の影響のいずれかのため、特定のモディフィケーションが次の世代に生じ得るが、そのような娘細胞は、親細胞と実際には同一ではないが、なおも本明細書で用いる用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。
【０１１６】
「標識」は、分光法、分光法、光化学的方法、生化学的方法、免疫化学的方法または化学的方法により検出可能な組成物である。例えば、有用な標識には、３２Ｐ、蛍光色素、光電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡで一般的に用いられるもの）、ビオチン、ジゴキシゲニンまたはハプテンおよび抗血清またはモノクローナル抗体が利用できる蛋白質が含まれる（例えば、本発明のポリペプチドは、例えば、放射標識をペプチドに組み込み、そのペプチドと特異的に反応する抗体を検出するために用いることによって検出可能にすることができる）。
【０１１７】
細胞の内容に関し、本明細書で用いられる「ソーティング」は、例えば、蛍光化した細胞の仕分けを用いて実施し得る、細胞の物理的な仕分け（ソーティング）、ならびに細胞表面標識の発現に基づく細胞の分析、例えば、仕分けのないFACS分析の両方を意味する。
【０１１８】
免疫応答の成分は、当業者に周知の種々の方法によりインビトロで検出することができる。例えば、（１）細胞障害性Tリンパ球は、放射活性物質で標識化した標的細胞と共にインキュベートし、そしてその標的細胞の溶解を放射活性物質の放出により検出することができる、（２）ヘルパーＴリンパ球を、抗原と抗原提示細胞と共にインキュベートし、そしてサイトカインの合成および分泌を一般的な方法で測定することができる（Windhagen A；ら、Immunity 2:373-80, 1995)、（３）抗原提示細胞を、完全な蛋白質抗原と共にインキュベートし、ＭＨＣ上へのその抗原の提示をTリンパ球活性化アッセイまたは生物物理学的方法のいずれかにより検出することができる（Hardingら、Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86:4230-4, 1989）、（４）マスト細胞は、そのＦｃ−エプシロン受容体を架橋する試薬と共にインキュベートし、そしてヒスタミン放出を酵素免疫アッセイにより測定することができる（Siraganianら、TIPS 4:432-437, 1983）。
【０１１９】
同様に、モデル生物（例えば、マウス）またはヒト患者のいずれかの免疫応答の産生物は、当業者に周知の種々の方法により検出することもできる。例えば、（１）ワクチン接種に対する応答における抗体の産生は、現在臨床検査室で用いられている標準的な方法、例えばＥＬＩＳＡにより容易に検出することができる；（２）炎症部への免疫細胞の遊走は、皮膚表面を掻きとり、掻きとった部位に遊走した細胞を集めるため滅菌容器に移すことにより、検出することができる（Petersら、Blood 72:1310-5, 1988）；（３）有糸分裂促進物質に対する応答または複雑なリンパ球反応における抹消血単核球の増殖は、３Ｈ−チミジンを用いて測定することができる；（４）ＰＢＭＣにおける顆粒球、マクロファージ、および他の食細胞の食作用能は、標識化された粒子と共にＰＢＭＣをウェル中に移し測定することができる（Petersら、1988)；および（５）免疫系細胞の放射免疫測定法は、ＰＢＭＣを、ＣＤ分子、例えばＣＤ４およびＣＤ８に対する抗体で標識化し、これらの標識を発現するＰＢＭＣの画分を測定することにより測定することができる。
【０１２０】
本明細書で用いられる成句「シグナル伝達経路」または「シグナル伝達事象」は、細胞と刺激化合物もしくは物質との相互作用に起因する、少なくとも１つの生化学的な反応を意味するが、より一般的には一連の生化学反応を意味する。従って、刺激化合物と細胞との相互作用は、シグナル伝達経路を通じて伝達される「シグナル」を生成し、最終的には、細胞の応答、例えば上述の免疫応答をもたらす結果となる。
【０１２１】
シグナル伝達経路は、細胞のある部分から細胞の他の部分にシグナルを伝達する役割を果たす、種々のシグナル伝達物質間の生化学的な関係を意味する。本明細書で用いられる成句「細胞表面の受容体」には、シグナルを受け取り、そして細胞の原形質膜を横切ってそのシグナルを伝達することができる分子および分子複合体を含む。「細胞表面の受容体」の例としては、Ｔ細胞の受容体（ＴＣＲ）またはＣＴＬＡ−４のＢ７リガンドＣＴＬＡ−４がある。
【０１２２】
細胞のシグナル伝達経路は、細胞と、細胞の内側または外側の刺激物質との相互作用により開始され得る。外側（すなわち、細胞の外）の刺激物質（例えば、抗原提示細胞の表面にあるＭＨＣ−抗原複合体）が、細胞表面の受容体（例えば、Ｔ細胞受容体）と相互作用し、シグナル伝達経路は、その細胞の膜を横切り、その細胞の細胞質を通じて、そして場合によっては核内にシグナルを伝達することができる。シグナル伝達経路の例には、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）経路、例えば、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７もしくはＴＬＲ−９がある。
【０１２３】
シグナル伝達は、例えば、分子のリン酸化；非−共有結合のアロステリック相互作用；分子の複合体化；分子の立体配座変化；カルシウムの放出；イノシトールリン酸生成；蛋白質分解的切断；環状ヌクレオチド生成およびジアシルグリセリド生成を通じて生じ得る。典型的には、シグナル伝達は、シグナル伝達分子をリン酸化することにより生じる。
【０１２４】
「非特異的T細胞の活性化」は、それらの抗原特異性に依存しないT細胞の刺激を意味する。
【０１２５】
本発明は、組み換え遺伝子分野の慣用技術に拠っている。本発明において使用する一般的な方法を開示する基本書には、Sambrookら、Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版., 1989；Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual, 1990;およびAusubelら、著., Current Protocols in Molecular Biology, 1994が挙げられる。
【０１２６】
本明細書中で提供される配列と実質的に同一の、３ｄ、unc-93B, ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ、核酸、多型変異体、オーソログ、および対立遺伝子の変異体は、核酸のプローブと３ｄ、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃのオリゴヌクレオチドを用いて厳格なハイブリダイゼーションの条件下でライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。別法としては、発現ライブラリーを用い、ヒト３ｄ、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃまたはそれらの一部に対して作製された血清または精製された抗体を用いて発現された相同物を免疫学的に検出することによって、３ｄ蛋白質、またはｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃをコードする蛋白質、多型変異体、オーソログ、および対立遺伝子をクローン化することができる。
【０１２７】
２．標準技術
本発明の実施に用いられる、ＲＮＡ、ｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ベクター、ウイルスまたはそれらの混成物のいずれかの核酸は、種々の供給源から単離することができ、一般的に作製し、増幅し、および／または組み換え技術により発現させ／生成させることができる。これらのアクサンから生成される組み換えポリペプチドは、個別に単離し、もしくはクローン化することができ、そして、所望の活性について試験することができる。細菌、哺乳動物、酵母、昆虫または植物細胞発現系を含む、いずれかの組み換え発現系を用いることができる。
【０１２８】
別法としては、これらの核酸は、例えば、Adams, J. Am. Chem. Soc. 105:661, 1983；Belousov, Nucleic Acids Res. 25:3440-3444, 1997；Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19:373-380, 1995；Blommers, Biochemistry 33:7886-7896, 1994；Narang, Meth. Enzymol. 68:90, 1979；Brown Meth. Enzymol. 68:109, 1979；Beaucage, Tetra. Lett. 22:1859, 1981；米国特許第4,458,066号明細書に記載されるように、周知の化学合成技術によりインビトロで合成することができる。
【０１２９】
本発明は、本発明の配列を含むオリゴヌクレオチド、例えば、本発明にで例示する配列の部分配列を提供する。オリゴヌクレオチドには、例えば化学的に合成することができる、一本鎖のポリ−デオキシヌクレオチドまたは二本鎖の相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖が含まれる。
【０１３０】
核酸の操作技術、例えば、サブクローニング、標識化プローブ（例えば、クレノウポリメラーゼを用いたランダム−プライマー標識化、ニックトランスレーション法、増幅）、配列決定、ハイブリダイゼーションおよびその類似の方法は、科学文献および特許文献に広く記載されており、例えば、Sambrook著., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL (第2版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Ausubel編. John Wiley＆Sons, Inc., New York, 1997；LABORATORY TECHNIQUES IN BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY: HYBRIDIZATION WITH NUCLEIC ACID PROBES, 第I部. Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen編. Elsevier, N.Y., 1993を参照のこと。
【０１３１】
核酸、ベクター、キャプシド、ポリペプチドおよび類似物は、当業者に周知の多くの一般的な方法のいずれかにより分析し、定量化することができる。これらには、例えば、分析生化学的方法、例えば、ＮＭＲ、分光法、分析撮影法、電気泳動法、キャピラリー電気泳動法、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ），および高分散（ｈｙｐｅｒｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）クロマトグラフィー、種々の免疫学的方法、例えば、液体もしくはゲル沈降反応法、免疫拡散法、免疫−電気泳動法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫−蛍光アッセイ、サザン分析法、ノーザン分析法、ドット−ブロット分析法、ゲル電気泳動法（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、核酸もしくは標的もしくはシグナル増幅方法、放射同位元素標識法、シンチレーション計数法および親和性クロマトグラフィーが挙げられる。
【０１３２】
本発明の方法を実施するために用いられる核酸の取得および操作は、ゲノム試料からクローニングすることによって、要すれば、例えばゲノムクローンまたはｃDNAクローンから単離するかまたは増幅した挿入物をスクリーニングし、そして再びクローニングすることによって行うことができる。本発明の方法で用いられる核酸の供給源には、例えば、哺乳類の人工染色体（ＭＡＣ）、例えば、米国特許第5,721,118号明細書；第6,025,155号明細書を参照のこと；ヒトの人工染色体、例えば、Rosenfeld, Nat. Genet. 15:333-335, 1997を参照のこと;酵母の人工染色体（ＹＡＣ）；細菌の人工染色体（ＢＡＣ）；Ｐ１の人工染色体、例えば、Woon, Genomics 50:306-316, 1998を参照のこと；Ｐ１−誘導ベクター（ＰＡＣ）、例えば、Kern, Biotechniques 23:120-124, 1997を参照のこと；コスミド、組み換えウイルス、ファージまたはプラスミドに含まれる、ゲノムもしくはｃＤＮＡライブラリーが挙げられる。
【０１３３】
本発明は、融合蛋白質およびそれらをコードする核酸を提供する。本発明のｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドは、異種のペプチドもしくはポリペプチド、例えば、Ｎ−末端同定ペプチドと融合させ、所望の特性、例えば、増大された安定性または簡易化された精製を与えることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドもまた、例えば、さらなる免疫性ペプチドを産生するよう、より容易に組み換え合成したペプチドを単離できるよう、抗体および抗体発現Ｂ細胞などを同定し、単離できるよう、それらと１つまたはそれ以上のさらなるドメインを付加して融合蛋白質として合成し、発現させることができる。検出および生成を容易にするドメインには、例えば、金属キレート性のペプチド、例えば固定された金属上での生成を可能にするポリヒスチジン帯およびヒスチジン−トリプトファン分子、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインＡドメイン、ＦＬＡＧＳ伸長／親和性精製系（Immunex Corp, Seattle Wash.）で利用できるドメインが挙げられる。精製するドメインと精製を容易にするためのモチーフを含むペプチドまたはポリペプチドとの間に、開裂可能なリンカー配列、例えばＸａ因子またはエンテロキナーゼ（Invitrogen, San Diego Calif.)を含ませる。例えば、発現ベクターは、６個のヒスチジン残基、続いて、チオレドキシンおよびエンテロキナーゼ開裂部位に連結されたエピトープをコードする核酸配列を含ませることができる（例えば、Williams, Biochemistry 34:1787-1797, 1995；Dobeli, Protein Expr. Purif 12:404-414, 1998を参照のこと)。ヒスチジン残基は検出および精製を容易にするが、エンテロキナーゼ部位は、融合蛋白質の残部からエピトープを精製する手法を提供する。１つの態様において、本発明のポリペプチドをコードする核酸は、翻訳されたポリペプチドまたはその断片を分泌させることができるリーダー配列を用いて適当な段階で集められる。融合蛋白質をコードするベクターに関係する技術および融合蛋白質の応用は、科学文献および特許文献に広く記載されており、例えば、Kroll, DNA Cell. Biol. 12:441-53, 1993を参照のこと。
【０１３４】
３．転写調節因子
本発明の核酸は、プロモーターに作動可能に連結されていてもよい。プロモーターは、１個のモチーフであっても、または核酸の転写を方向づける核酸制御配列の群列であってもよい。プロモーターは、転写の開始部位、例えばポリメラーゼＩＩ型のプロモーターの場合には、ＴＡＴＡ分子の近くに必要な核酸配列を組み入れることができる。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対程度離れて配置される場合がある、遠位のエンハンサーまたはリプレッサー要素を含んでいてもよい。「構成的」プロモーターは、ほとんどの環境条件および発生条件下で活動するプロモーターである。「誘導」プロモーターは、環境もしくは発生制御下にあるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、生物の特定の組織型で活性であるが、同じ生物の他の組織型では活性でないプロモーターである。用語「作動可能に連結された」は、核酸発現制御配列（そのようなプロモーターまたは転写因子結合部位の群列）と第二の核酸配列との間にあり、該発現制御配列が第二の配列に相当する核酸の転写を方向づける、機能的な連結を意味する。
【０１３５】
４．発現ベクターおよびクローニング媒体
本発明は、本発明の核酸、例えば本発明の蛋白質をコードする配列を含む、発現ベクターおよびクローニングの賦形剤を提供する。本発明の発現ベクターおよびクローニング媒体は、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、ホスミド（ｆｏｓｍｉｄ）、細菌の人工染色体、ウイルスのＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、ファウルポックスウイルス、ＳＶ４０の仮性狂犬病および誘導体）、Ｐ１−に基づく人工染色体、酵母プラスミド、酵母の人工染色体および目的の特定の宿主に特異的な他のいずれかのベクター（例えば、バチルス、アスペルギルスおよび酵母）を含んでいてもよい。
【０１３６】
本発明の核酸は、要すれば、通常の分子生物学的方法；例えば、米国特許第5,426,039号明細書に記載されるインビトロ増幅された核酸をクローニングする方法を用いて、種々のベクターのいずれかにクローニングすることができる。増幅された配列のクローニングを容易にするため、制限酵素部位をＰＣＲプライマーの組みに「組み込む」ことができる。
【０１３７】
本発明は、本発明のポリペプチドおよびペプチドをコードする発現ベクターのライブラリーを提供する。これらの核酸は、ゲノム内に、または細胞質内にもしくは細胞核内に導入し、科学文献および特許文献に広く記載された、種々の慣用技術により発現させることができる。例えば、Roberts, Nature 328:731, 1987；Schneider, Protein Expr. Purif. 6435:10, 1995；Sambrook, Tijssen or Ausubelを参照のこと。ベクターは、天然資源から単離することができ、ATCCもしくはジーンバンクライブラリーなどの情報源から得ることができるし、あるいは、合成もしくは組み換え方法により調製することができる。例えば、本発明の核酸は、発現カセット、ベクターまたはウイルスにて、細胞内で安定にまたは一過性に発現させることができる（例えば、エピソーム発現系）。選択標識は、形質転換された細胞の選択的な表現型および配列を確認するために発現カセットおよびベクター中に組み込むことができる。例えば、選択的標識は、宿主のゲノム内に組み込むことが必要でない場合に、エピソームの維持および複製に関してコードすることができる。
【０１３８】
１つの態様において、本発明の核酸は、本発明のペプチドまたはポリペプチドのインシトゥ発現のためにインビボ投与される。核酸は、「裸のＤＮＡ」として（例えば、米国特許第5,580,859号明細書）、または発現ベクターの形式で、例えば組み換えウイルスの形式で投与することができる。核酸は、以下に記載されるように腫瘍周辺もしくは内部を含む、いずれかの経路により投与することができる。インビボ投与されるベクターは、組み換え技術により改変された被覆もしくは被覆されていないＤＮＡおよびＲＮＡウイルス、好ましくは、バキュロウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ヘルペスウイルス科、ポックスウイルス科、アデノウイルス科またはピコルナウイルス科（picornnaviridiae）から選択されるウイルスゲノムから誘導することができる。それぞれ元のベクターが有する特徴の有利な利点を巧みに利用するキメラベクターもまた、用いることができる (例えば、Feng, Nature Biotechnology 15:866-870, 1997を参照のこと）。そのようなウイルスゲノムは、組み換えＤＮＡ技術により本発明の核酸を含むように改変することができ；そして、さらに条件付で複製するまたは複製能を有する複製欠損性となるように作り出すことができる。別の態様において、ベクターは、アデノウイルスゲノム（例えば、ヒトアデノウイルスゲノムから誘導された複製不能のベクター、例えば、米国特許第6,096,718号明細書;第6,110,458号明細書;第6,113,913号明細書;第5,631,236号明細書を参照のこと）；アデノ−随伴ウイルスゲノムおよびレトロウイルスゲノムから誘導される。レトロウイルスベクターは、ネズミ白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびそれらの組合せに基づくものが含まれる；例えば、米国特許第6,117,681号明細書;第6,107,478号明細書;第5,658,775号明細書;第5,449,614号明細書；Buchscher, J. Virol. 66:2731-2739, 1992；Johann, J. Virol. 66:1635-1640, 1992を参照のこと)。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）−基づくベクターは、標的核酸を有する放射免疫細胞に用いることができ、例えばインビトロでの核酸およびペプチドの合成に、およびインビボおよび生体外（エックスビボ）での遺伝子治療手順に用いることができる；例えば、米国特許第6,110,456号明細書;第5,474,935号明細書；Okada, Gene Ther. 3:957-964, 1996を参照のこと。
【０１３９】
本明細書で用いられる「発現カセット」は、構造遺伝子（すなわち、蛋白質をコードする配列、例えば本発明のポリペプチド）の発現に、それらの配列と適合性のある宿主にて影響を与えることができるヌクレオチド配列を意味する。発現カセットには、少なくとも、ポリペプチドをコードする配列と作動可能に連結されたプロモーター；および、場合により他の配列、例えば転写終結シグナルを含む。発現を果たすのに必要もしくは助けとなるさらなる因子、例えばエンハンサーもまた用いることができる。
【０１４０】
核酸が、他の核酸配列と機能的な関係で設置された場合に、作動可能に連結される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーは、配列の転写に影響を与えるコード配列と作動可能に連結される。転写調節配列に関して、「作動可能に連結された」とは、連結されるＤＮＡ配列が隣接しており、２つの蛋白質のコード領域を繋げる必要のある場合には、読み取り枠内で隣接していることを意味する。スイッチ配列に関して、「作動可能に連結された」は、配列がスイッチ組み換えを果たすことができることを示す。従って、発現カセットはまた、プラスミド発現ベクター、組み換えウイルス、組み換え「裸のＤＮＡ」ベクターのいずれかの形態、およびその類似物が含まれる。
【０１４１】
「ベクター」は、連結された他の核酸を輸送することができる核酸分子を意味するものである。ベクターの1つの形式としては、「プラスミド」があり、これは、その中にさらなるＤＮＡ断片を連結することができる、環状の二本鎖ＤＮＡループを意味する。ベクターのその他の型には、ウイルスベクターがあり、そのウイルスゲノム中にさらなるＤＮＡ断片を連結することができる。特定のベクターは、宿主細胞内に導入され、そこで自己複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソームの哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、エピソームでない哺乳類ベクター）は、宿主細胞に導入されると、その宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと一緒に複製されることができる。さらに、特定のベクターは、作動可能に連結された遺伝子の発現を方向付けることができる。そのようなベクターは、本明細書中では「組み換え発現ベクター」（または、単純に「発現ベクター」）と称する。一般に、組み換えＤＮＡ技術に有用な発現ベクターは、しばしばプラスミド型である。詳細な説明において、「プラスミド」および「ベクター」は、相互に交換して用いることができ、プラスミドが最も一般的に用いられるベクター型である。しかしながら、本発明は、他の形式の発現ベクター、例えば同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むものである。
【０１４２】
５．宿主細胞および形質転換された細胞
本発明はまた、本発明の核酸配列、例えば発明のポリペプチドをコードする配列、または本発明のベクターを含む、形質転換された細胞を提供する。宿主細胞は、当業者によく知られた、原核細胞、真核細胞、例えば細菌細胞、菌類細胞、酵母細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞または植物細胞を含むいずれかの宿主細胞であってよい。細菌細胞の例には、大腸菌、ストレプトマイセス、枯草菌（Bacillus subtilis）、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）およびシュードモナス、ストレプトマイセスおよびブドウ球菌（Staphylococcus）属の範囲内の種々の種が挙げられる。例示的な昆虫細胞には、ショウジョウバエS2およびスポドプテラ（Spodoptera）Sf9が挙げられる。哺乳動物細胞の例には、CHO, COSまたはボウズ（Bowes）黒色腫またはマウスもしくはヒトのいずれかの細胞株が挙げられる。適当な宿主の選択は、当業者の能力の範囲内にある。
【０１４３】
ベクターは、形質転換、トランスフェクション、形質導入、ウイルス感染、遺伝子銃、またはＴｉ-媒介遺伝子導入を含む様々な技術のいずれかを用いて宿主細胞中に導入することができる。特定の方法には、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクションまたは電気穿孔法が含まれる。
【０１４４】
作り出された宿主細胞は、必要に応じてプロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、あるいは本発明の遺伝子を増幅するために、改変された典型的な栄養培地中で培養することができる。適切な細胞株の形質転換および適当な細胞密度に宿主細胞を増殖することに続いて、選択されたプロモーターを適当な方法（例えば、温度変化または化学的導入）により導入することができ、そして細胞に所望のポリペプチドまたはその断片を産生させる前に、さらに培養することもできる。
【０１４５】
細胞を遠心分離により集め、物理的もしくは化学的方法により破壊し、得られた粗抽出物を、さらに精製するために維持することができる。蛋白質の発現のために用いられる微生物細胞は、凍結融解サイクルリング、超音波処理、機械的な破壊、または細胞溶解試薬の使用を含む、典型的な方法のいずれかにより破壊することができる。そのような方法は、当業者には周知である。発現されたポリペプチドまたは断片は回収し、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン交換または陽イオン交換クロマトグラフィー、リン酸セルロースクロマトグラフィー、疎水相互作用クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含む方法により、組み換え細胞培養物から精製することができる。蛋白質のリフォールディンク工程、必要に応じて、ポリペプチドの遠心分離を完了して用いることができる。要すれば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を、最終的な精製工程に用いることができる。
【０１４６】
種々の哺乳類の細胞培養系を、組み換え蛋白質の発現のために用いることができる。哺乳類の発現系の例には、サル腎臓繊維芽細胞および適合性のベクターから蛋白質を発現することができる他の細胞系、例えばＣ１２７、３Ｔ３、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＢＨＫ細胞系が挙げられる。
【０１４７】
宿主細胞において構築物は、組み換え配列によりコードされる遺伝子産物を産生させるために、通常の様式で用いることができる。組み換え産生過程が行われている宿主細胞に依存して、ベクターを含む宿主細胞により産生されたポリペプチドは、グリコシル化される場合もあれば、グリコシル化されない場合もある。本発明のポリペプチドは、最初にメチオニンのアミノ残基を含んでいても、いなくてもよい。
【０１４８】
無細胞翻訳系もまた、本発明のポリペプチドを産生するために用いることができる。無細胞翻訳系は、該ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸と機能的作用させるために連結されているプロモーターを含むＤＮＡ構築物から転写されたｍＲＮＡを用いることができる。幾つかの態様において、DNA構築物は、インビトロ転写反応を行う前に、直鎖にしてもよい。次いで、転写されたｍＲＮＡを適当な無細胞翻訳抽出物、例えば、ラビット網状赤血球抽出液とインキュベートし、所望のポリペプチドまたはその断片を産生させる。
【０１４９】
発現ベクターは、形質転換された宿主細胞の選択のために、表現型の特徴を与えるため、１つまたはそれ以上の選択可能な標識の遺伝子、例えば、真核細胞培養については、ジヒドロ葉酸還元酵素耐性またはネオマイシン耐性、あるいは、例えば、大腸菌の場合は、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性を含ませることができる。
【０１５０】
６．核酸の増幅
本発明の実施において、本発明のポリペプチドをコードする核酸、または修飾された核酸を、例えば増幅により再生成することができる。本発明は、本発明のポリペプチドをコードする核酸を増幅するための増幅プライマー配列の組み、例えば、例として配列番号：１または配列番号：３またはその部分配列を含む核酸配列を増幅することができるプライマーの組みを提供する。
【０１５１】
増幅方法には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応、PCR(PCR PROTOCOLS, A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, ed. Innis, Academic Press, N.Y., 1990およびPCR STRATEGIES, 1995, ed. Innis, Academic Press, Inc., N.Y.,）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、Wu, Genomics 4:560, 1989；Landegren, Science 241:1077, 1988；Barringer, Gene 89:117, 1990を参照のこと）；転写増幅（例えば、Kwoh, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173, 1989を参照のこと）；および自家持続配列複製（self-sustained sequence replication）（例えば、Guatelli, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:1874, 1990）を参照のこと；Ｑベータ複製増幅（例えば、Smith, J. Clin. Microbiol. 35:1477-1491, 1997を参照のこと）、自動Ｑ−ベータ複製増幅アッセイ（例えば、Burg, Mol. Cell. Probes 10:257-271, 1996を参照のこと）および他のＲＮＡポリメラーゼ媒介技術（例えば、NASBA, Cangene, Mississauga, Ontario）が挙げられ;さらに、Berger, Methods Enzymol. 152:307-316, 1987；Sambrook；Ausubel；米国特許第4,683,195号明細書および第4,683,202号明細書；Sooknanan, Biotechnology 13:563-564, 1995を参照のこと。
【０１５２】
核酸のハイブリダイゼーション
本発明は、厳格な条件下で本発明の発明で例示する配列、例えば配列番号：１または配列番号：３に記載される配列、またはそれらのいずれかと相補的な配列、または本発明のポリペプチドをコードする核酸とハイブリダイズする単離されたまたは組み換え核酸を提供する。別の態様において、厳格な条件には、当分野で知られるように、また本明細書で記載されるように、より厳格な条件、緩めた厳格な条件または緩い厳格な条件がある。これらの方法は、本発明の核酸を単離するために用いることができる。
【０１５３】
別の態様において、厳格な条件下でハイブリダイズするその能力により確立されるように、本発明の核酸は、本発明の核酸の約５残基から全長の間であってもよい；例えば、それらは、少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００またはそれ以上の残基長であってよく、あるいは遺伝子もしくはコード配列、例えばｃＤＮＡの全長であってよい。全長よりも短い核酸もまた含まれる。これらの核酸は、例えば、ハイブリダイゼーションのプローブ、リーディングプローブ、ＰＣＲオリゴヌクレオチドプローブ、ｉＲＮＡ、抗体が結合するペプチド（エピトープ）、モチーフ、活性部位などをコードするアンチセンス配列もしくは配列として有用である。
【０１５４】
「選択的に（または特異的に）ハイブリダイズする」は、配列が、複合体混合物で存在する場合に（例えば、全ての細胞のもしくはライブラリーのＤＮＡまたはＲＮＡ）、特定のヌクレオチド配列が少なくとも約１０倍のバックグラウンドのもとで検出されるように、分子が、厳格なハイブリダイゼーションの条件下で、特定のヌクレオチド配列に結合すること、二本鎖すること、またはハイブリダイズすることを意味する。１つの実施形態において、核酸は、厳格な条件下で、核酸にハイブリダイズするその能力により、本発明の目的の範囲内（例えば、本明細書に記載した例示的な配列）にあるかどうかを決定することができる。
【０１５５】
「厳格なハイブリダイゼーション条件」は、その条件下で、あるプローブが、その標的物質に典型的に核酸の複合体混合物中でハイブリダイズするが、有意な量で他の配列にハイブリダイズしない条件を意味する（陽性信号（例えば本発明の核酸を同定する）は、バックグラウンドのハイブリダイゼーションの約１０倍要する）。厳格な条件は、配列に依存し、種々の環境により異なるものである。より長い配列は、より高い温度で特異的にハイブリダイズする。核酸のハイブリダイゼーションについての多くの手ほどきは、例えば、Sambrook著、Molecular Cloning: A Laboratory Manual (第2版), Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989；Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel著、John Wiley＆Sons, Inc., New York, 1997；Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology: Hybridization With NUCLEIC ACID Probes, 第I章、Theory and Nucleic Acid Preparation, Tijssen著、Elsevier, N.Y., 1993において見出される。
【０１５６】
一般的に、厳格な条件は、確定されたイオン強度ｐＨにおけるその特定の配列の融解温度Ｉよりも約５℃〜１０℃低い温度が選択される。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が標的の配列に平衡状態でハイブリダイズする温度である（標的配列が過剰に存在する場合、Ｔｍでは、５０％のプローブが平衡状態を占める）。厳格な条件は、塩の濃度が、ｐＨ７．０から８．３で、約１．０Ｍのナトリウムイオンよりも低い、典型的には約０．０１Ｍ〜１．０Ｍのナトリウムイオン濃度であり、温度は、短いプローブの場合には（例えば、１０〜５０ヌクレオチド）少なくとも約３０℃、および長いプローブの場合には（例えば、５０ヌクレオチド以上）少なくとも約６０℃である。厳格な条件は、Sambrookにおいて記載されるように（以下に詳述する）、不安定化剤、例えばホルムアミドを用いて達成することもできる。強い厳格なハイブリダイゼーションについて、陽性信号は、少なくともバックグラウンドの２倍、好ましくはバックグラウンドの１０倍のハイブリダイゼーションである。例示的な強い厳格なまたは厳格なハイブリダイゼーション条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳのもと４２℃でインキュベートするか、または５×ＳＳＣおよび１％ＳＤＳのもと６５℃でインキュベートし、０．２×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳのもと６５℃で洗浄することを含む。本発明において、本発明の核酸を含むゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡは、本明細書に開示される核酸配列を用いて厳格な条件下で標準的なサザンブロットにより同定することができる。ハイブリダイゼーションについてのさらなる厳格な条件は（本発明の目的の範囲内で核酸を同定するために）、４０％ホルムアミド、１Ｍ  ＮａＣｌ、１％ＳＤＳの緩衝液のもと３７℃でハイブリダイゼーションすることを含む。
【０１５７】
しかしながら、ハイブリダイゼーション形式の選択は、重要ではなく−核酸が、本発明の目的の範囲内にあるかどうかを決定する条件を記載した洗浄条件の厳格性が、重要である。本発明の目的の範囲内にある核酸であるかどうかを同定するために用いられる洗浄条件は、例えば、塩濃度は約０．０２モーラー、ｐＨ７および温度は少なくとも約５０℃または約５５℃から約６０℃の間；または、塩濃度は約０．１５ＭのＮａＣｌ、７２℃で約１５分間；または塩濃度は約０．２×ＳＳＣ、温度は少なくとも約５０℃、または約５５℃から約６０℃で約１５分から約２０分であり；あるいは、ハイブリダイゼーション複合体は、塩濃度が約０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣの溶液を用いて、６８℃にて１５分間の洗浄を２回行い、ついで、０．１％ＳＤＳを含む０．１×ＳＳＣの溶液、６８℃で１５分間の洗浄を２回；または同じ条件をおこなう。ＳＳＣ緩衝液および等価条件についての記載は、Sambrook, TijssenおよびAusubelを参照のこと。
【０１５８】
８．それらに用いるためのオリゴヌクレオチドプローブおよび方法
本発明はまた、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性のモジュレーターである、ポリペプチドをコードする核酸を同定するための核酸プローブを提供する。別には、本発明のプローブは、本発明の核酸において記載されるように、少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１５０もしくは約１０〜５０、約２０〜６０、約３０〜７０の連続する塩基の配列である。プローブは、結合および／またはハイブリダイゼーションすることにより、核酸を同定する。プローブは、後述するように、本発明のアレイで用いることができる。本発明のプローブはまた、他の核酸またはポリペプチドを単離するために用いることができる。
【０１５９】
９．配列同一性の程度を決定する
本発明は、配列番号：１または配列番号：３と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有する核酸を提供する。本発明は、配列番号：２または配列番号：４と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するポリペプチドを提供する。配列の同一性は、配列比較のアルゴリズムを用いた分析により、または目視により決定することができる。蛋白質および／または核酸配列の同一性（ホモロジー）は、当分野で既知の種々の配列比較アルゴリズムおよびプログラムのいずれかを用いて評価することができる。
【０１６０】
配列比較について、典型的には、１つの配列を参照配列として用い、それと試験配列を比べる。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、配列座標を設計し、要すれば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを設定する。プログラムの所定のパラメータを用いてもよいし、または、別のパラメータを設定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムのパラメータに応じて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。核酸および蛋白質の配列比較については、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．２．２．またはＦＡＳＴＡバージョン３．０ｔ７８アルゴリズム、および後述する所定のパラメータを用いることができる。
【０１６１】
本明細書で用いられる「比較ウィンドウ」は、２０個から６００個、一般的には約５０個から約２００個、より一般的には約１００個から約１５０個の群から選択されるある数の連続部分の断片に対する参照を含み、その配列は、同じ数の連続部分の参照配列と、その２つの配列を最適に並べた後に、比較され得る。比較のために配列を整列させる方法は、当業者には周知である。最適な比較のための配列の整列は、例えばSmith＆Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482, 1981の局地的相同性アルゴリズムにより、Needleman＆Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443, 1970のホモロジーアライメントアルゴリズムにより、Pearson＆Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444, 1988の類似方法の調査により、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実施（ＦＡＳＴＤＢ（Intelligenetics）、ＢＬＡＳＴ（National Center for Biomedical Information）、the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、あるいは、手作業によるアライメントおよび目視により（例えば、Ausubelら、(1999前掲)を参照のこと）、Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1987におけるCurrent Protocolにより実施することができる。
【０１６２】
本発明の配列同一性および配列類似性を決定するために適当なアルゴリズムの好ましい例は、FASTAアルゴリズムであり、それは、Pearson, W.R.＆Lipman, D.J., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 2444, 1988に記載されている。W. R. Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258, 1996を参照のこと。同一性の百分率を計算するため、ＤＮＡ配列のＦＡＳＴＡアライメントで用いられる好ましいパラメータは、最適化され、ＢＬ５０マトリクス１５：−５、ｋ−タプル＝２；ジョインティング・ペナルティー＝４０、最適化＝２８；ギャップペナルティー＝−１２、ギャップ長ペナルティー＝−２；および長さ＝１６である。
【０１６３】
配列同一性および配列類似性の百分率を決定するために好ましい、別の好ましいアルゴリズムの例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、それらは、Altschulら、Nuc. Acids Res. 25:3389-3402, 1977;およびAltschulら、J. Mol. Biol. 215:403-410, 1990にそれぞれ記載されている。BLASTおよびBLAST 2.0は、本明細書に記載したパラメータを用いて、本発明の核酸および蛋白質の配列同一性の百分率を決定するために使用される。BLAST分析を行うためのソフトウェアは、National Center for Biotechnology Information (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/)から公的に入手できる。このアルゴリズムは、最初に、クエリ配列中の長さWのショートワードを確認し、データベース配列中の同じ長さのワードを整列させて、陽性と評価される閾値Tと同等かまたは満足するかにより、高スコアの配列の組み（HSP)を同定することを含む。Tは、ネイフボード・ワード・スコア・スレッシュホールド（neighborhood word score threshold）と称される（(Altschulら、前掲)。これら最初のネイフボードワードヒットは、それらを含みより長いHSPを探し出すための当初の検索シードとして働く。このワードヒットは、追加方式のアライメントスコアが増加できる限り、各配列に沿って両方向に拡張される。追加方式のスコアは、ヌクレオチド配列については、パラメータM（マッチング残基の組みに対する報酬スコア；つねに＞０）およびN（マッチング残基に対するペナルティースコア；つねに＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列については、スコアリングマトリクスは、追加方式のスコアを計算するために用いられる。各方向のワードヒットの拡張は；追加様式のアライメントスコアが、その最大に達成される値からX量まで落ち込んだ場合；追加方式のスコアが、１つまたはそれ以上の負のスコアの残基アライメントの蓄積のために、ゼロまたはそれ以下になった場合；あるいは、いずれかの配列が最後に達した場合は中止される。BLASTアルゴリズムのパラメータ、W、TおよびXは、アライメントの精度および速度を決定する。BLASTプログラム（ヌクレオチド配列に関して）は、デフォルトとして、ワード長（W）１１、期待値（E)１０、M=5、N=4を用い、両鎖の比較を行う。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、長さ３、および期待値（Ｅ）１０を用い、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリクス（Henikoff＆Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915, 1989を参照のこと）アライメントは、（Ｂ）は５０、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４を用い、両鎖の比較を行う。
【０１６４】
BLASTアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計学的分析を行う（例えば、Karlin＆Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:5873-5787, 1993を参照のこと)。BLASTアルゴリズムにより提供される１つの類似性の方法は、最小の確率の合計（smallest sum probability）(P(N))であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間の一致度が偶然に生じ得る確率の指標を提供する。例えば、核酸は、最小の確率の合計が被検核酸と参照核酸との比較で、約０．２よりも小さい、より好ましくは約０．０１よりも小さい、さらに好ましくは約０．００１よりも小さい場合、参照配列と類似するとみなされる。
【０１６５】
有用なアルゴリズムの他の例には、PILEUPがある。PILEUPは、連続し対をなすアライメントを用いて関係する配列群から複数の配列アライメントを作成し、関係と配列同一性の百分率を示す。また、樹状もしくはデンドログラムをプロットし、アライメントを作り出すために用いられるクラスタリング化関係を示す。PILEUPは、Feng＆Doolittle, J. Mol. Evol. 35:351-360, 1987の簡素化した連続アライメント方法を用いる。用いられる方法は、Higgins＆Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989に記載された方法と似ている。このプログラムは、３００個までの配列で、ヌクレオチドまたはアミノ酸それぞれ最大５，０００までの長さをアライメントすることができる。この複雑なアライメント手順は、最も類似する２つの配列の対アライメントから開始し、２つのアライメントされた配列群を作成する。次に、この群を次に最も関係の深い配列か、アライメントされた配列群とアライメントする。２つの配列群は、２つの個別の配列の対アライメントの単純な拡張によりアライメントされる。最後のアライメントは、一連の連続する、対アライメントにより行われる。このプログラムは、特定の配列を指定することにより作動し、そのアミノ酸またはヌクレオチドは、配列比較の領域に関して、プログラムのパラメータを指定することにより調整される。ＰＩＬＥＵＰを用いることで、参照配列は、他の試験配列と比較され、次のパラメータ：デフォルトのギャップの幅（３．００）、デフォルトのギャップ長の幅（０．１０）および重み付けエンドギャップを用いて配列同一性の関係の百分率を決定する。ＰＩＬＥＵＰは、ＧＣＧ配列分析ソフトウェアパッケージ、例えば、バージョン７．０（Devereauxら、Nuc. Acids Res. 12:387-395, 1984）から得ることができる。
【０１６６】
複数のDNAおよびアミノ酸配列のアライメントに適した、別の好ましいアルゴリズムの例には、CLUSTALWプログラム(Thompson, J. D.ら、Nucl. Acids. Res. 22:4673-4680, 1994）がある。ClustalWは、配列群間の複数の対となる比較を行い、それらを平均してホモロジーに基づいて複数のアライメントとする。ギャップオープンおよびギャップエクステンションペナルティーは、それぞれ１０および０．０５である。アミノ酸アライメントについて、BLOSUMアルゴリズムは、プロテインウェイトマトリクスとして用いることができる(Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:10915-10919, 1992)。
【０１６７】
「配列同一性」は、アミノ酸またはヌクレオチド配列間の類似性の測定値を意味し、当分野で既知の方法、例えば後述する方法を用いて測定することができる。
【０１６８】
２つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチドの関係で、「同一性」または「同一性」百分率は、指定した配列を、次の配列比較アルゴリズムのいずれかを使用して、または手作業によりアライメントし目視により測定して、２つまたはそれ以上の配列または部分配列を比較した場合および対比ウィンドウにてマキシマムコレスポンデンスについてアライメントした場合に、同じであるか、または同じとされる特定の百分率（すなわち、特定の領域で、６０％の同一性、好ましくは６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％またはそれ以上の同一性）のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有することを意味する。
【０１６９】
２つの核酸またはポリペプチドの関係で、「実質的に同一」は、以下の配列比較アルゴリズムのいずれかを用いて、または目視により測定して、マキシマムコレスポンデンスについて比較しアライメントした場合に、少なくとも、少なくとも６０％、しばしば少なくとも７０％、好ましくは、少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％または少なくとも９５％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基同一性を有する２つまたはそれ以上の配列または部分配列を意味する。好ましくは、置換同一性は、少なくとも約５０塩基もしくは残基長の配列領域に渡って、より好ましくは少なくとも約１００塩基もしくは残基の配列領域に渡って存在し、最も好ましくは配列が、少なくとも約１５０塩基もしくは残基に渡って実質的に同一である。最も好ましい実施形態において、配列はコード領域の全量に渡って実質的に同一である。
【０１７０】
２つまたはそれ以上の核酸またはポリペプチド配列の関係で、「類似性（ホモロジー）」および「同一性」は、任意の数の配列比較アルゴリズムを用いて、または手作業によりアライメントし目視により測定して、比較ウィンドウまたは指定した領域に関してマキシマム・コレスポンダンスについて比較しアライメントした場合に、
同じまたは特定の百分率のアミノ酸残基またはヌクレオチドを有する、２つまたはそれ以上の配列または部分配列を意味する。配列比較について、１つの配列を参照配列（例として、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３，または配列番号：４）として用い、それと試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列をコンピューターに入力し、配列座標を設計し、要すれば、配列アルゴリズムプログラムのパラメータを設定する。プログラムのデフォルトパラメータを用いてもよいし、または、別のパラメータを設定してもよい。次いで、配列比較アルゴリズムは、プログラムのパラメータに応じて、参照配列に対する試験配列の配列同一性の百分率を計算する。
【０１７１】
本明細書で用いられる「比較ウィンドウ」は、多くの連続残基のいずれか１つのセグメントについての参照を含む。例えば、本発明の別の態様において、本発明の例示するポリペプチドまたは核酸配列、例えば、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、配列番号：５の２０から全長のいずれかの範囲の連続残基を、参照配列の同じ数の連続部分と、それら２つの配列を最適にアライメントした後に比較する。参照配列が、本発明の例示するポリペプチドまたは核酸配列と必要な配列同一性、例えば配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３または配列番号：４と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくはそれ以上の配列同一性を有する場合、その配列は、本発明の目的の範囲内にある。
【０１７２】
上記プログラムを用いて検出することができるモチーフには、ロイシンジッパー、ヘリックス−ターン−ヘリックスモチーフ、グリコシル化部位、ユビキチン化部位、アルファーヘリックスおよびベータシート、コードされた蛋白質の分泌を方向づけるシグナルペプチドをコードするシグナル配列、転写調節に関わる配列、例えばホメオボックス、酸性ストレッチ、酵素活性化部位、基質結合部位および酵素開裂部位が含まれる。
【０１７３】
１０．コンピューターシステムおよびコンピュータープログラム製品
配列同一性、構造ホモロジー、モチーフなどをコンピューター内（インシリコ）で決定し同定するため、本発明の配列を保存し、記録し、そしてコンピューターにより読み取ることができ、アクセスすることができる複数のメディアで操作することができる。従って、本発明は、本発明の核酸およびポリペプチド配列を記録し、保存するコンピューター、コンピューターシステム、コンピューターに読み取り可能なメディア、コンピュータープログラム製品などを提供する。本明細書で用いられる、用語「記録」および「保存」は、コンピューターのメディアに情報を保存するための過程を示す。当業者は、コンピューターに読み取り可能なメディア上の情報を読み取る既知のいずれかの方法を容易に用いて、本発明の核酸および／またはポリペプチド配列を含む製品を作製することができる。
【０１７４】
本発明の別の態様は、コンピューターに読み取り可能なメディアに記録された本発明の少なくとも１つの核酸および／またはポリペプチド配列を含む、コンピューターに読み取り可能なメディアである。コンピューターに読み取り可能なメディアは、磁気により読み取り可能なメディア、光により読み取り可能なメディア、電気により読み取り可能なメディア、および磁気／光のメディアが含まれる。例えば、コンピューターに読み取り可能なメディアは、ハードディスク、フロッピーディスク、磁気テープ、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、またはリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）、並びに当業者に既知のその他の形式のメディアが含まれる。
【０１７５】
本明細書で用いられる、用語「コンピューター」、「コンピュータープログラム」および「プロセッサー」は、広く一般的な内容で用いられ、そのような装置のすべてを包含する。
【０１７６】
１１．ポリペプチドの発現および転写の阻害
本発明は、さらに、本発明の核酸配列と相補的な核酸（例えば、アンチセンス配列）を提供する。アンチセンス配列は、蛋白質をコードする遺伝子の輸送、スプライシングまたは転写を阻害することができる配列、例えば本発明のｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドをコードする核酸である。その阻害は、ゲノムＤＮＡまたはメッセンジャーＲＮＡを標的として作用できる。標的核酸の転写または機能は、例えばハイブリダイゼーションおよび／または開裂により阻害することができる。本発明により提供される、１つの具体的な有用な阻害の組み合わせは、遺伝子またはメッセンジャーのいずれかに結合し、いずれかの様式でその蛋白質の産生もしくは機能を抑制もしくは阻害することのできるオリゴヌクレオチドを含む。結合は、配列に特異的なハイブリダイゼーションを通じて行われ得る。別の有用な一連の阻害剤には、蛋白質メッセンジャーの不活性化または開裂を引き起こすオリゴヌクレオチドを含む。そのような開裂を引き起こすオリゴヌクレオチドは、リボザイムのように、酵素活性を有し得る。オリゴヌクレオチドを、化学的に修飾することができるし、相補的な核酸を開裂できる酵素または組成物と複合体形成させることができる。オリゴヌクレオチドは、所望の活性を有するものについて、多種多様な該オリゴヌクレオチドのプールからスクリーニングすることができる。
【０１７７】
遺伝子発現を制御するためのアンチセンス、リボザイム技術およびＲＮＡｉ技術を用いる一般的な方法、またはその様式で内因性の遺伝子の発現のための遺伝子治療の一般的な方法は、当分野で周知である。これらの方法は各々、例えば本発明のホスファターゼポリペプチドのアンチセンスまたはリボザイム転写のいずれかをコードするベクターの系を利用する。用語「ＲＮＡｉ」は、ＲＮＡ干渉を意味する。この用語が、遺伝子をサイレント化できるＲＮＡ分子を用いる技術を包含することは、当分野では理解される。例えば、McManusら、Nature Reviews Genetics 3: 737, 2002を参照のこと。この応用では、用語「ＲＮＡｉ」は、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、一過性低分子ＲＮＡ（ｓｔＲＮＡ）などの分子を含む。概して、ＲＮＡ干渉は、遺伝子と二本鎖ＲＮＡとの相互作用に起因する。
【０１７８】
１２．アンチセンスオリゴヌクレオチド
本発明は、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドのメッセンジャーと結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチド、または他のポリペプチド、例えば、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性に関係するエンドソーム蛋白質と結合することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ｍＲＮＡを標的にすることによりポリペプチド活性を阻害することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを設計する方針は、科学文献および特許文献に広く記載されており、当業者であれば、本発明の新たな試薬を用いてそのようなオリゴヌクレオチドを設計することができる。例えば、効果的なアンチセンスオリゴヌクレオチドをスクリーニングするための遺伝子ウォーキング／ＲＮＡマッピングプロトコルは当分野では周知であり、例えば、可能性のあるアンチセンス配列を選択するための簡易かつ信頼のある方法を提供する標準的な分子技術に基づいたＲＮＡマッピングアッセイを記載したものについてはHo, Methods Enzymol. 314: 168-183, 2000を参照のこと。また、Smith, Eur. J. Pharm. Sci. 11: 191-198, 2000を参照のこと。
【０１７９】
天然の核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドとして用いられる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の鎖長であってよく、例えば、別の態様においてアンチセンスオリゴヌクレオチドは、約５から１００、約１０から８０、約１５から６０、約１８から４０である。最適な鎖長は、慣用のスクリーニングにより決定することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、任意の濃度で存在させることができる。最適な濃度は、慣用のスクリーニングにより決定することができる。多種多様な合成、天然でないヌクレオチドおよび核酸類似物が知られており、この潜在的な問題を扱うことができる。例えば、非イオンのバックボーンを有するペプチド核酸（ＰＮＡ）、例えばＮ−（２−アミノエチル）グリシンユニットを用いることができる。国際公開第97/03211号パンフレット；国際公開第96/39154号パンフレット;Mata, Toxicol Appl Pharmacol 144: 189-197, 1997；Antisense Therapeutics著. Agrawal (Humana Press, Totowa, N.J., 1996）に記載されるように、ホスホチオネート結合を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた用いることができる。本発明により提供される合成ＤＮＡバックボーン類似物を有するアンチセンスオリゴヌクレオチドは、上記のように、ホスホロ−チオエート、メチルスルホネート、ホスホロアミダート、アルキルホスホトリエステル、スルホネート、３’−チオ汗タール、メチレン（メチルイミノ）、３’−Ｎ−カルバメートおよびモルホリノカルバメート核酸もまた含む。
【０１８０】
組み合わせ化学方法論は、いずれかの標的に適当な結合親和性および特異性を有する特定のオリゴヌクレオチド、例えば本発明のセンスおよびアンチセンスポリペプチド配列を容易にスクリーニングすることができる莫大な数のオリゴヌクレオチドを作り出すために用いることができる（例えば、Gold、J. of Biol. Chem. 270: 13581-13584、1995を参照のこと）。
【０１８１】
１３．ｓｉＲＮＡ
「短鎖干渉ＲＮＡ」（ｓｉＲＮＡ）は、約１０から約３０ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子を意味し、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を通じて蛋白質発現を特異的に干渉するその能力にちなんで名づけられた。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、１２−２８ヌクレオチド長である。より好ましくは１５−２５ヌクレオチド長、さらにより好ましくは１９−２３ヌクレオチド長および最も好ましくは２１−２３ヌクレオチド長である。従って、好ましいｓｉＲＮＡ分子は、長さが１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８または２９ヌクレオチドである。
【０１８２】
ＲＮＡｉは、２つの工程の機序を有する（Elbashir ら、Genes Dev.、15(2): 188-200 (2001)）。第一は、長いｄｓＲＮＡが、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）として知られる酵素により、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる２１−２３リボヌクレオチド（ｎｔ）の断片に開裂される。次に、ｓｉＲＮＡは、リボヌクレアーゼ複合体（ＲＮＡ誘導型サイレンシング複合体を表すＲＩＳＣと称される）と会合し、その複合体を相補的なｍＲＮＡに標的化する。そして、ＲＩＳＣは、相補的なｍＲＮＡと反対の標的とするｍＲＮＡを開裂させ、他のＲＮＡ分解経路に処理されやすいｍＲＮＡとする。
【０１８３】
本発明のｓｉＲＮＡは、標的のリボヌクレオチド配列と相互作用させるために、その標的配列に結合するのに十分に標的配列に対して相補的であるという意味に設計される。本発明はまた、ヌクレアーゼ分解に対して増大された安定性を与えるよう化学的に修飾されているが、標的の核酸が存在する場合に、その標的核酸と結合する能力を保持しているｓｉＲＮＡ分子も含む。
【０１８４】
１４．阻害性リボザイム
本発明は、伝達物に結合することができ、ｍＲＮＡを標的とすることにより、例えば
ポリペプチド活性を阻害することができるリボザイムを提供し、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ活性、例えば、ＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性を有するポリペプチドの阻害物質、またはｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達もしくはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性に関係するエンドソーム蛋白質の阻害物質を提供する。リボザイムを設計し、標的化するための蛋白質−特異的なアンチセンス配列を選択する方策は、科学文献および特許文献において広く記載されており、当業者であれば、本発明の新しい試薬を用いてそのようなリボザイムを設計することができる。
【０１８５】
リボザイムは、リボザイムの標的ＲＮＡ結合部を通じて標的ＲＮＡと結合し、そのＲＮＡの酵素分解部位の近傍に留まって、標的ＲＮＡを開裂させることにより作用する。従って、リボザイムは、相補的な塩基対形成を通じて標的ＲＮＡを認識して、結合し、そしてひとたび正しい位置に結合すると、酵素のように作用し、その標的ＲＮＡを開裂させて不活性化する。このような様式の標的ＲＮＡの開裂は、その開裂がコード配列に生じた場合、そのコードされた蛋白質の合成を行う能力を破壊することになる。リボザイムは、そのＲＮＡ標的に結合し開裂させた後、典型的には、そのＲＮＡから離れ、そして再び新たな標的に結合し開裂させることができる。
【０１８６】
幾つかの環境下で、リボザイムの酵素的な性質は、治療処置に効果を発揮するために必要なリボザイムの有効濃度が、アンチセンスオリゴヌクレオチドの濃度よりも低くい場合があるため、他の技術、例えば、アンチセンス技術（ここで、核酸分子は単純に核酸標的に結合し、その転写、翻訳または他の分子との会合を阻害する）に対して有利となり得る。この潜在的な有利さは、酵素的な作用するリボザイムの能力を反映している。従って、単一のリボザイム分子は、多くの標的ＲＮＡ分子を開裂させることができる。加えて、リボザイムは典型的には特異性の高い阻害物質であり、その阻害の特異性は、塩基対形成機序の結合による機序だけでなく、分子が結合するＲＮＡの発現を阻害する機序にも依存する。すなわち、阻害は、ＲＮＡ標的の開裂により生じ、そして、その特異性は、標的でないＲＮＡの開裂速度よりも標的ＲＮＡの開裂速度の比のように定義される。この開裂機序は、塩基対形成に関係する因子を加えた因子に依存する。従って、リボザイム作用の特異性は、同じＲＮＡ部位に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチドの特異性よりも高くなり得る。
【０１８７】
酵素的なリボザイムＲＮＡ分子は、ハンマー型のモチーフで構成され得るが、ヘアピン、デルタ肝炎ウイルス、グループＩイントロンまたはＲｎａｓｅＰ−様ＲＮＡ（ＲＮＡガイド配列と関係がある）のモチーフであってもよい。そのようなハンマー型のモチーフの例は、Rossi, Aids Research and Human Retroviruses 8: 183, 1992に；デルタ肝炎ウイルスモチーフはPerrotta, Biochemistry 31: 16, 1992に；RnasePモチーフはGuerrier-Takada, Cell 35: 849, 1983に；そして、グループＩイントロンはＣｅｃｈによる米国特許第4,987,071号明細書に記載されている。これらの具体的なモチーフの反応は、限定されるものではないが、当業者であれば、本発明の酵素的なＲＮＡ分子は、１つまたはそれ以上の標的遺伝子のＲＮＡ領域と相補的な特異的な基質結合部位を有し、その基質結合部位の周辺のヌクレオチド配列が、その分子にＲＮＡ開裂活性を与えることは理解されよう。
【０１８８】
１５．ヒト以外のトランスジェニックおよび「ノックアウト」動物
本発明は、本発明の核酸、ポリペプチド、発現カセットまたはベクターまたはトランスフェクトされたもしくは形質転換された細胞を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物を提供する。ヒト以外のトランスジェニック動物は、例えば、本発明の核酸を含む、ヤギ、ラビット、ヒツジ、ブタ、ウシ、ラットおよびマウスであってよい。「トランスジェニック動物」は、細胞内に人工的に挿入されたＤＮＡを含み、そのＤＮＡがその細胞から発生した動物のゲノムの一部となっている細胞を有する動物である。好ましくは、トランスジェニック動物は、霊長類、マウス、ラット、ウシ、ブタ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、イヌおよびネコである。トランスジェニックＤＮＡは、哺乳類のキナーゼをコードしていてもよい。動物の自然な発現は、その受容体の発現を低下させるのに有効な量のアンチセンスＲＮＡまたはＤＮＡを与えることにより低下させることができる。
【０１８９】
これらの動物は、例えば、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃを介したＴｏｌｌ様受容体３−シグナル伝達、Ｔｏｌｌ様受容体７−シグナル伝達、またはＴｏｌｌ様受容体９−シグナル伝達活性を研究するためのインビボモデルとして、あるいは、インビボでのＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性を変化させる物質をスクリーニングするためのモデルとして用いることができる。
【０１９０】
１つの態様において、挿入されたトランスジェニック配列は、機能的な（ＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル活性化する）ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドが発現しないように設計された本発明の配列である。この欠損は、転写、翻訳および／または蛋白質レベルで起こるよう設計することができる。
【０１９１】
ヒト以外のトランスジェニック動物で発現されるべきポリペプチド、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチド、または３ｄ突然変異ポリペプチドは、構成的に、または組織特異的な制御下にあるように、発生特異的に、または転写調節因子誘導的に設計することができる。ヒト以外のトランスジェニック動物は、当分野で既知の方法のいずれかを用いて設計し、作製することができる；例えば、形質転換した細胞および卵そしてトランスジェニックマウス、ラット、ラビット、ヒツジ、ブタおよびウシを作製すること、および使用することを記載した、米国特許第6,211,428号明細書；第6,187,992号明細書；第6,156,952号明細書；第6,118,044号明細書；第6,111,166号明細書；第6,107,541号明細書；第5,959,171号明細書；第5,922,854号明細書；第5,892,070号明細書；第5,880,327号明細書；第5,891,698号明細書；第5,639,940号明細書；第5,573,933号明細書；第5,387,742号明細書；第5,087,571号明細書を参照のこと。また、例えば、トランスジェニック乳畜のミルク中の組み換え蛋白質生成を記載したPollock, J. Immunol. Methods 231: 147-157, 1999；トランスジェニックヤギの作製を実証したBaguisi, Nat. Biotechnol. 17: 456-461, 1999を参照のこと。米国特許第6,211,428号明細書は、DNA配列を含む核酸構築物を、その脳内で発現するヒト以外のトランスジェニック哺乳動物を作製し、使用することを記載する。米国特許第5,387,742号明細書は、クローン化した組み換えまたは合成DNA配列を、受精させたマウス卵に注入し、その注入された卵を偽妊娠した雌に移し、そしてその細胞がアルツハイマー病の病態に関係する蛋白質を発現する用語、トランスジェニックマウスまで成長させることを記載する。米国特許第6,187,992号明細書は、そのゲノムがアミロイド前駆体タンパク(APP)をコードする遺伝子の破壊を含むトランスジェニックマウスの作製および使用を記載する。遺伝的に改変されたヒト以外の動物を作製する方法の１つの例は、胚幹細胞を遺伝的に修飾する方法がある。その変更された細胞を、胚盤胞の卵割腔に注射する。次いで、それを、偽妊娠雌の子宮で成長させる。キメラ子孫を容易に検出するため、胚盤胞を胚幹細胞よりも分化の親株から得てもよい。例えば胚盤胞および胚幹細胞は、異なる毛の色または他に容易に見分けられる表現型を有する親株から誘導されてもよい。得られたキメラ動物は、生殖系列の伝達を通じてその修飾された遺伝子を受け継ぐ、キメラでない動物を得るために繁殖させてもよい。胚幹細胞を胚盤胞に導入する技術および得られたトランスジェニック動物の繁殖技術は周知である。
【０１９２】
細胞は、１つまたはそれ以上の遺伝子のコピーを含んでいるため、第一回目の標的から得られた細胞株は、標的とする対立遺伝子はヘテロ接合型であろう。両方の対立遺伝子が修飾されているヘテロ接合型は、多くの方法で実施することができる。１つのアプローチでは、１つのコピーが修飾された多くの細胞を増殖させる。次に、それらを、異なる選択標識を用いて別の回の標的化を受けさせる。あるいは、ホモ接合型は、修飾された対立遺伝子のヘテロ接合型の動物を、古典的なメンデル遺伝学に従って繁殖させることにより得ることができる。幾つの状況では、異なる２つの修飾された対立遺伝子を有することが望ましい場合がある。これは、連続して遺伝子標的化することにより、または所望の修飾された対立遺伝子の一方をそれぞれが保有するヘテロ接合体を繁殖させることにより、達成することができる。例えば、米国特許第5,789,215号明細書を参照のこと。
【０１９３】
種々の方法が、本発明に関係するトランスジェニック動物の作製に利用できる。DNAを、受精させた卵の前核に注射し、その後雄と雌の前核を融合させるか、または胚細胞の核(例えば、二細胞期の胚の核)に注射し、細胞分裂を開始させることができる(Brinsterら、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82: 4438-4442, 1985)。胎児に、ウイルス、特に本発明の無機イオン受容体ヌクレオチド配列を保有するように修飾されたレトロウイルスを感染させてもよい。
【０１９４】
胎児の内細胞塊から誘導され、培養中に安定化した多分化能の幹細胞を、培養液中で操作して、本発明のヌクレオチド配列を組み込むことができる。トランスジェニック動物は、胚盤胞への移植を通じ、乳母に移植された細胞から作製され、その時期が来るまで成長させることができる。トランスジェニック実験に適した動物は、標準的な商業的供給源、例えばCharles River (Wilmington, Mass.)、Taconic (Germantown, N.Y.)、Harlan Sprague Dawley (Indianapolis, Ind.)などから得ることができる。
【０１９５】
齧歯動物胎児の扱いの手順およびその受精卵の前核にDNAを顕微注入する手順は、当業者には周知である。魚類、両生類の卵および鳥類に対する顕微注入手順は、Houdebine and Chourrout, Experientia 47: 897-905, 1991に詳細に記載されている。動物の組織にDNAを導入する他の手順は、米国特許第4,945,050号明細書(Sanfordら、Jul. 30, 1990)に記載されている。
【０１９６】
ほんの一例として、トランスジェニックマウスを作製するため、雌のマウスを誘導して過剰排卵させる。雌を雄と一緒にし、交配した雌をCO2窒息または頸椎脱臼により犠牲にし、胎児を切除した卵管から得る。周辺の卵丘細胞を取り除く。次に、前核胎児を洗浄し、注入の時まで保存する。無作為に循環する雌の成体マウスを、精管切除した雄と対にする。受容体の雌を、提供体の雌と同時に交配させる。次いで、胎児を外科手術により移す。トランスジェニックラットを生成する手順は、マウスの手順と似ている(Hammerら、Cell 63: 1099-1112, 1990)。
【０１９７】
胚幹細胞（ＥＳ）の培養方法および電気穿孔法、リン酸カルシウム／ＤＮＡ沈殿および直接的な注入などの方法を用いて、ＤＮＡをＥＳ細胞に導入することにより次のトランスジェニック動物を作製する方法もまた、当業者には周知である(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, A Practical Approach, E. J. Robertson, ed., IRL Press, 1987)。
【０１９８】
無作為な遺伝子組み込みを伴う場合、本発明の配列（群）を含むクローンは、耐性をコードする遺伝子を同時にトランスフェクトされる。あるいは、ネオマイシン耐性をコードする遺伝子を、本発明の配列（群）に物理的に連結する。トランスフェクションおよび所定のクローンの単離は、当業者に周知の種々の方法のいずれかにより実施される(E. J. Robertson, 前掲)。
【０１９９】
ＥＳ細胞に導入されるＤＮＡ分子もまた、相同的組み換えの過程を通じて染色体中に組み込むこともできる(Capecchi, Science 244: 1288-1292, 1989)。組み換え事象の陽性選択（すなわち、ｎｅｏ耐性）および二重陽性−陰性選択（すなわち、ｎｅｏ耐性およびガンシクロビル耐性）の方法および次のＰＣＲによる所望のクローンの同定方法は、Capecchi（前掲）およびJoynerら、Nature 338: 153-156, 1989に記載されており、その教示内容は、全ての図面を含め、完全に出典明示により本明細書の一部とされる。この手順の最後の段階は、標的ＥＳ細胞を胚盤胞に注射し、その胚盤胞を偽妊娠の雌に移すことである。得られたキメラ動物を繁殖させ、その子孫をサザンブロッティングにより分析し、トランス遺伝子を有する個体を同定する。齧歯動物でない哺乳動物および他の動物の作製手順は、他者が記載している(HoudebineおよびChourrout, 前掲；Purselら、Science 244: 1281-1288, 1989；およびSimmsら、Bio/Technology 6: 179-183, 1988)。
【０２００】
１６．ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ機能ノックアウト
本発明は、内因性のｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドを発現しないか、または野生型のレベルよりも低く発現する（従って、完全に「ノックアウト」されていないが、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ活性は、機能的に「ノックアウト」されている）、ヒト以外の動物を提供する。本発明は、また、「ノックアウト動物」およびその作製方法および使用方法を提供する。例えば、１つの態様において、本発明のトランスジェニック動物または修飾された動物は、内因性の遺伝子、例えば、本発明のポリペプチドまたは本発明のポリペプチドを含む融合蛋白質を発現する遺伝子で置換され、内因性のｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子を発現しないように作り出された、「ノックアウト動物」、例えば、「ノックアウトマウス」を含む。従って、１つの態様において、挿入されたトランスジェニック配列は、機能的なｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ（ＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナルの活性化）ポリペプチドを発現しないように設計された本発明の配列である。欠損は、転写、翻訳および/または蛋白質レベルで設計することができる。内因性のunc-93, ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子は、本発明の挿入されたポリペプチドが発現するだけで、「ノックアウト」された。
【０２０１】
「ノック−アウト動物」は、核酸配列に変更を含有するＤＮＡを含む細胞を有するトランスジェニック動物の特異型であり、変更されていない遺伝子の生物学的活性と比較して、核酸配列に正常にコードされたポリペプチドの生物活性より少なくとも８０％まで低下する特異型である。この変更は、挿入、欠失、フレームシフト変異、ミスセンス変異、終始コドンの導入、重要なアミノ酸崎の変異、イントロン結合の除去、およびその類似型式であってよい。好ましくは、変更は、挿入または欠失であるか、または終止コドンを生じるフレームシフト変異である。典型的に、特定の内因性の遺伝子の破壊は、遺伝子のある部分の欠失またはヌル対立遺伝子を生成する他の配列との置換により生じ得る。ヌル対立遺伝子を有する交雑育種哺乳動物は、その遺伝子の有効なコピーを欠くホモ接合型の哺乳動物を生み出す。
【０２０２】
そのような哺乳動物の多くが開発され、医薬の開発に非常に役立っている。例えば、米国特許第5,616,491号明細書は、ＣＤ２８およびＣＤ４５の抑制を有するノック−アウトマウスを記載する。細胞および胎児の調製手順および操作手順は、トランスジェニック動物に関して以上で記載した手順と類似しており、当業者には周知である。
【０２０３】
ノックアウト構築物は、幹細胞系に導入され、興味ある遺伝子の染色体座でそのゲノムに組み込まれ、突然変異を生じる、特定の形状の核酸断片を意味する。従って、所定のノックアウト構築物は、破壊のために標的化された特定の遺伝子に対して特異的である。それにもかかわらず、多くの共通因子が、構築物間に存在し、これらの因子は、当分野で周知である。典型的なノックアウト構築物は、突然変異を起こさるべき遺伝子をコードする染色体座の５’端と３’端の両方の核酸断片約０．５ｋｂ〜約１０．０ｋｂを含む。これらの２つの断片は、典型的には、陽性選択可能な標識、例えばネオマイシン耐性遺伝子をコードする核酸断片が挿入されて分離されている。陽性選択可能な標識をコードする核酸に染色体座の５’末端の核酸が連結され、次に目的の染色体座の３’末端の核酸が連結されて構成され、得られた核酸断片は、目的の遺伝子をコードする配列の大部分を脱落させてノックアウトする。得られた構築物が、その染色体座で相同的に組み換えを起こすことにより、そのゲノム遺伝子座から、別には、構造遺伝子として知られるコード配列を脱落させて消失させることとなる。そのような稀な相同的組み換え事象が生じた幹細胞は、陽性選択可能な標識をコードする核酸遺伝子のゲノム内への安定した組み込み、その特徴により、次に適当な薬剤の存在下でその標識遺伝子を発現する細胞を選択することで選び出すことができる。
【０２０４】
この基本的な技術の変法もまた存在し、当分野では周知である。例えば、「ノック−イン」構築物は、陽性選択可能な標識をコードする核酸に、５’ゲノム遺伝子座の断片をコードする核酸が連結され、次に３’のゲノム遺伝子座断片をコードする核酸が連結され、基本的に同じ配置を示すが、コード配列が脱落せず、そして用いた５’および３’のゲノム断片が当初連続しているが、その後、陽性選択可能な標識遺伝子をコードする核酸の導入により破壊される点で異なっている。従って、この「ノック−イン」型の構築物は、変異を起こさせる遺伝子のゲノム遺伝子座の限定された領域、例えば単一のエキソンだけをクローニングおよび遺伝子操作に利用でき、突然変異トランスジェニック動物の構築に非常に有効である。あるいは、「ノック−イン」構築物は、標的遺伝子の単一の機能ドメインを特異的に排除するのに用いることができ、コードされたポリペプチドのある機能は欠損しているが、他のドメインの機能は残っている、標的遺伝子のポリペプチドを発現するトランスジェニック動物を得ることができる。この型式の「ノック−イン」変異体は、ホモで複合体形成する蛋白質の場合は特に、野生型遺伝子から誘導されるポリペプチド産生物の作用を特異的に阻害することができるため、「優性劣勢」変異と呼ばれる特徴をしばしば有する。
【０２０５】
細胞に挿入される各ノックアウト構築物は、ます、直鎖型にしなければならない。従って、ノックアウト構築物が、ベクター中に挿入されている場合、適切に選択された制限酵素のエンドヌクレアーゼを用いて、そのベクター配列内であるが、ノックアウト構築配列内ではない場所を一箇所切断してDNAを分解し、直鎖化を行う。挿入について、ノックアウト構築は、当業者には周知なように、選択される挿入方法に適当な条件下でES細胞に加えられる。１個以上の構築物をES細胞に導入する場合、各ノックアウト構築物は、同時かまたは１個ずつ導入することができる。
【０２０６】
適当な配座にノックアウト構築物を含む適当なＥＳ細胞を、上述の選択技術により同定した後、その細胞を胎児の中に入れる。挿入は、当業者に既知の様々な方法で行うことができるが、好ましい方法は、顕微注入による方法である。顕微注入については、約１０個〜３０個の細胞をマイクロピペット内に集め、そして発生中の胎児にノックアウト構築物を含む外来のＥＳ細胞の組み込みが可能な適当な発生段階の胎児に注入する。例えば、形質転換されたＥＳ細胞は、胚細胞に顕微注入することができる。ＥＳ細胞の挿入に用いられる適切な発生段階の胎児は、非常に種に依存するが、マウスの場合は約３．５日である。胎児は、妊娠した雌の子宮を還流することにより得られる。これを行うための適切な方法は、当業者には既知である。ＥＳ細胞を胎児に導入した後、その胎児を、上記のように、妊娠期間の偽妊娠乳母の死乳に移植することができる。
【０２０７】
ノックアウトまたは破壊トランスジェニック動物を作製するその他の方法もまた一般に知られている。例えば、Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)を参照のこと。組み換えによるノックアウトもまた、相同的組み換えにより、組織特異的に、標的配列を挿入して作製することができ、および／または標的遺伝子の一時的な不活性化制御は、組み換え配列により制御することができる（以下に記載する）。
【０２０８】
１つ以上のノックアウト構築および／または１個以上のトランス遺伝子発現構築物を含む動物は、様々な方法のいずれかで調製される。好ましい調製方法は、それぞれが所望のトランスジェニック表現型の１つを含む一連の哺乳動物を作り出すことである。そのような動物を、一連の交雑交配、戻し交配および選択を通じて互いに交配させ、最終的に所望のノックアウト構築物および／または構築物の発現の全てを含む単一の動物か、あるいは、ノックアウト構築物（群）および／またはトランス遺伝子（群）の存在を除いて野生型と類遺伝子性（遺伝的に同一）の動物を作り出す。
【０２０９】
本発明の、機能的なｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃのヒト以外の「ノックアウト」動物は、種々の型が存在する。機能的なｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃが「ノックアウト」している、本発明のヒト以外の動物のいくつかは、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの阻害性の核酸、例えば、本発明のアンチセンス配列またはリボザイムを十分なレベルで発現し、機能的なポリペプチドの発現レベルが低下するか、ノックアウトされている。機能的なｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃが「ノックアウト」している、本発明のヒト以外の動物のいくつかは、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの有効な量が減少し内因性活性がなくなるように、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ優性劣勢ポリペプチドが十分なレベルで発現している。機能的なｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃが「ノックアウト」している、本発明のヒト以外の動物のいくつかは、内因性でない活性のあるｕｎｃ−９３ｂの有効な量が減少するように、十分なレベルで本発明の抗体、例えば、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ抗体を発現している。機能的なｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃが「ノックアウト」している、本発明のヒト以外の動物のいくつかは、「典型的な」ノックアウトであり、その内因性のｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ遺伝子は、破壊されているか変異している。
【０２１０】
本発明の機能的なｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃのヒト以外の「ノックアウト」動物は、本発明の同系マウス系統およびそのマウスから誘導された細胞および細胞系もまた含む。
【０２１１】
本発明は、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を有し、十分なレベルのｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドを発現しない動物を発見することにより、これらのヒト以外の動物の新たな使用を提供する。従って、ヒト以外のトランスジェニック動物または近交系、例えば、本発明のマウス系統を用いることにより、本発明は、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、ＣＤ８細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症のモジュレーター、例えば、化学的もしくは遺伝的モジュレーターを同定するインビボにおける方法を提供する。
【０２１２】
本発明は、対象を抗原に対して寛容化させる方法を提供する（例えば、免疫原に対する体液性のもしくは細胞性のアネルギーを含む）。本方法は、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ活性の阻害物質（ＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達阻害活性）、例えば、本発明の核酸（例えば、アンチセンス、リボザイム）またはポリペプチド（例えば、抗体または優性劣勢）を提供する。阻害物質は、対象にｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの発現を阻害するのに十分な量で投与される。これにより、ＴＣＲ刺激後のＣＤ２８−シグナル伝達を介したＣＤ６９の同時シグナル上方制御の欠損を含むＴ細胞欠損症が生じ、対象に寛容を生ぜしめうる信号が生じる。次いで、抗原をその対象に投与する。これにより、その対象は抗原に対して寛容化する。当分野で既知の、対象を抗原に対して寛容化する方法および組成物は、本発明の方法を実施するために用いることができ、例えば米国特許第6,245,752号明細書；第6,211,160号明細書；第6,060,056号明細書；第5,935,577号明細書；第5,856,446号明細書；第5,833,990号明細書；第4,428,965号明細書を参照のこと。
【０２１３】
１７．同系マウス系統
本発明は、本明細書に記載されるように作り出すことができ、そして標準的な技術により交配させることができる、同系マウスおよび同系マウス系統を提供し、例えば、米国特許第6,040,495号明細書；第5,552,287号明細書を参照のこと。
【０２１４】
劣性の影響をもたらす変異をスクリーニングするため、多くの方策を用いることができ、これら全ての方策はさらに２世代を用いる。例えば、雄Ｇ１マウスを、野生型の雌マウスと繁殖させることができる。得られた子供（Ｇ２）を、異種交配させるか、またはＧ１の父と戻り繁殖させることができる。これらの交雑の結果得られたＧ３マウスを、ゲノム中の少数の遺伝子（３〜６）にて突然変異のホモ接合体とするが、それらの遺伝子の同一性は未知である。十分なＧ３マウスを用いれば、良いゲノムの試料収集となるはずである。
【０２１５】
１８．ペプチドおよびポリペプチド
本発明は、配列番号：２または配列番号：５と、少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００もしくはそれ以上の残基領域またはポリペプチドの全長にわたって、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸配列、または本発明の核酸にコードされたポリペプチドを含む単離されたまたは組み換えポリペプチドを提供する。１つの態様において、ポリペプチドは、配列番号：２または配列番号：４に記載された配列を含む。本発明は、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチド、例えば本発明のポリペプチドの活性を阻害する方法を提供する。本発明はまた、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチド、例えば、本発明のポリペプチド活性を阻害するか、または結合する（例えば、活性部位に結合する）組成物をスクリーニングする方法を提供する。
【０２１６】
１つの態様において、本発明は、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチド（それらをコードする核酸）を提供し、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの１つ、幾つかまたはその全部が、置換アミノ酸で置換されている。１つの態様において、本発明は、抗原提示経路、限定されるものではないが、Ｔｏｌｌ用受容体−シグナル伝達経路、ＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達経路における、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの、他の蛋白質との相互作用を破壊するための方法を提供する。
【０２１７】
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、上記のように、核酸の投与後に、インビボで組み換え技術により発現させることができるし、またはそれらを、例えば医薬組成物として直接投与することができる。ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ活性のモジュレーターについて、または自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症、またはＣＤ４細胞欠損症を改善することができる物質について、インビトロまたはインビボでスクリーニングするために発現させることができる。本発明のポリペプチド（例えば、抗体または優性劣勢）はまた、対象を抗原に対して寛容化させるために、例えば、免疫原に対する体液性もしくは細胞性のアネルギーについて用いることができる。
【０２１８】
本発明のポリペプチドおよびペプチドは、天然資源から単離することができるし、合成物であってもよいし、または組み換え技術により生成されたポリペプチドであってもよい。ペプチドおよび蛋白質は、インビトロまたはインビボで組み換え技術により発現させることができる。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、当分野で既知の方法のいずれかを用いて作り出すことができるし、単離することができる。本発明のポリペプチドおよびペプチドはまた、当分野で周知の化学法を用いて、全長がまたは一部が、合成されてよく、例えば、Caruthers, Nucleic Acids Res.. Symp. Ser. 215-223, 1980；Horn, Nucleic Acids Res.. Symp. Ser. 225-232, 1980；Banga, A. K., Therapeutic Peptides and Proteins, Formulation, Processing and Delivery Systems  Technomic Publishing Co., Lancaster, PA, 1995を参照のこと。例えば、ペプチド合成は、種々の固相技術（例えば、Roberge, Science 269: 202, 1995；Merrifield, Methods Enzymol. 289: 3-13, 1997を参照のこと）を用いて実施でき、そして自動合成で、例えばABI 431Aペプチドシンセイサイザー(Perkin Elmer)を用いて、製造元から提供される指示に従って行うことができる。
【０２１９】
上記のように、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、「ミメティック」および「ペプチドミメティック」型の全てを含む。用語「ミメティック」および「ペプチドミメティック」は、本発明のポリペプチドと構造および／または機能的特徴が実質的に同じ合成化学化合物を意味する。ミメティックは、完全に合成されたものであってもよいし、天然でないアミノ酸類似体のいずれかであってもよく、部分的に天然のペプチドアミノ酸および部分的に天然でないアミノ酸の類似体から成るキメラ分子であってもよい。ミメティックはまた、ミメティックの構造および／または活性を実質的に変更しない置換である限り、天然アミノ酸の保存的置換を任意の量で組み込まれていてもよい。保存的な変異体である本発明のポリペプチドを用いた場合、慣用の実験により、ミメティックが本発明の目的の範囲内にあるかどうか、すなわちその構造およびまたは機能が実質的に変更されてないかどうかを決定できよう。従って、細胞に投与した場合または発現させた場合に、ＴＬＲ−３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性を示すミメティック組成物は、本発明の目的の範囲内にある。本発明のｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの活性を阻害することができる、例えば、優性劣勢変異体であるか、または本発明の抗体に結合する場合、そのミメティック組成物もまた本発明の目的の範囲内にあり得る。
【０２２０】
ポリペプチドミメティック組成物は、天然でない構成成分のいずれかの組み合わせを含んでいてもよく、それは、典型的には、３つの構造基：ａ）天然のアミド結合以外の残基の連結基（「ペプチド結合」連結基）；ｂ）天然のアミノ酸残基の代わりの天然でない残基；またはｃ）二次構造擬態を含む残基、すなわち、二次構造、例えばベータターン、ガンマターン、ベータシート、アルファーヘリックス形成などを誘導し、または安定化する残基からなる。例えば、その残基の全てもしくは幾つかが、天然のペプチド結合以外の化学的な方法で連結されている場合、ポリペプチドは、ミメティックと特徴付けることができる。個々のペプチドミメティック残基は、ペプチド結合により連結され得るし、他の化学結合またはカップリング方法、例えば、グルタルアルデヒド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、二機能性マレイミド、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）またはＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）により結合されていても良い。典型的なアミド結合（「ペプチド結合」）連結基と択一的な結合基には、例えば、ケトメチレン（例えば、−Ｃ（＝Ｏ）ＣＨ２の代わりにＣ（＝Ｏ）ＮＨ−）、アミノメチレン（ＣＨ２ＮＨ）、エチレン、オレフィン（ＣＨ＝ＣＨ）、エーテル（ＣＨ２Ｏ）、チオエーテル（ＣＨ２Ｓ）、テトラゾール（ＣＮ４−）、チアゾール、レトロアミド、チオアミドまたはエステルが挙げられる（例えば、Spatola (1983) in Chemistry and Biochemistry of Amino Acids, Peptides and Proteins, Vol. 7, pp 267-357, 「Peptide Backbone Modifications」 Marcell Dekker, NYを参照のこと）。
【０２２１】
ポリペプチドはまた、天然のアミノ酸算の変わりに天然でない残基を全てまたは幾つか含むことにより、ミメティックと特徴付けられ得る。天然でない残基は、科学文献および特許文献で広く記載されており;天然のアミノ酸残基のミメティックとして有用な幾つかの天然でない組成物の例および指針を以下に記載する。芳香族アミノ酸のミメティックは、例えば、Ｄ−もしくはＬ−ナフィルアラニン；Ｄ−もしくはＬ−フェニルグリシン；Ｄ−もしくはＬ−２チエニルアラニン；Ｄ−もしくはＬ−１、−２，３−もしくは４−ピレネイルアラニン（pyreneylalanine）；Ｄ−もしくはＬ−３チエニルアラニン；Ｄ−もしくはＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−もしくはＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−もしくはＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−もしくはＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ｐ−フルオロ−フェニルアラニン；Ｄ−もしくはＬ−ｐ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｋ−もしくはＬ−ｐ−メトキシ−ビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−もしくはＬ−２−インドール（アルキル）アラニン；およびＤ−もしくはL-アルキルアイニン（alkylainine）により置換されて生成され得るが、ここで、アルキルは、置換されているもしくは置換されていないメチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソ−ブチル、ｓｅｃ−イソチル、イソ−ペンチルまたは酸性でないアミノ酸であってよい。天然でないアミノ酸の芳香環には、例えば、チアゾリル、チオフェニル、ピラゾリル、ベンゾイミダゾリル、ナフチル、フラニル、ピロリルおよびピリジル芳香環が含まれる。
【０２２２】
酸性アミノ酸のミメティックは、例えば、負電荷を維持するがカルボン酸塩でないアミノ酸；（ホスホノ）アラニン；硫酸化トレオニンにより置換されて生成され得る。カルボキシル側基（例えば、アスパルチルまたはグルタミル）もまた、カルボジイミド（Ｒ’ＮＣＮＲ’）、例えば、１−シクロヘキシル−３（２−モルホリン−イル−（４−エチル）カルボジイミドまたは１−エチル−３（４−アゾニア−４，４−ジメトルペンチル（dimetholpentyl））カルボジイミドとの反応により選択的に修飾することができる。アスパルチルまたはグルタミルはまた、アンモニウムイオンとの反応により、アスパラギニルおよびグルタミニル残基に変換することができる。
【０２２３】
塩基性アミノ酸のミメティックは、例えば、（リジンおよびアルギニンに加えて）アミノ酸、オルニチン、シトルリンまたは(ラジオイムノ)-酢酸または(ラジオイムノ)アルキル-酢酸との置換により生成され得り、ここで、アルキルは、以上で定義されたものである。ニトリル誘導体（例えば、COOHの代わりにCN部分を含む）は、ラジオイムノまたはグルタミンと置換され得る。アスパラギニルおよびグルタミニル残基は、アミノ基を取り除かれ、対応するアスパルチルまたはグルタミル残基となってもよい。
【０２２４】
アルギニン残基ミメティックは、アルギニンを、例えば１つまたはそれ以上の典型的な試薬、例えば、フェニルグリオキサル、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオンまたはニンヒドリンを含む試薬と、好ましくはアルカリ条件下で反応させることによって生成することができる。チロシン残基ミメティックは、チロシンを例えば、芳香族ジアゾニウム化合物またはテトラニトロメタンと反応させることにより生成することができる。Ｎ−アセチルイミジゾールおよびテトラニトロメタンを用いて、Ｏ−アセチルチロシル分子種および３−ニトロ誘導体をそれぞれ形成させることができる。システイン残基ミメティックは、カルボキシメチルまたはカルボキシアミドメチル誘導体を得るために、システイニル残基を、例えば、アルファ−ハロ酢酸塩、例えば２−クロロ酢酸またはクロロアセトアミドおよび対応するアミンと反応させることにより、生成することができる。システイン残基ミメティックはまた、システイニル残基を、例えば、ブロモ−トリフルオロアセトン、アルファ−ブロモ−ベータ−（５−イミドゾイル）プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド；メチル２−ピリジルジスルフィド；ｐ−クロロメルクリ安息香酸；２−クロロメルクリ−４ニトロフェノール；またはクロロ−７−ニトロベンゾ−オキソ−１，３−ジアゾールと反応させることにより、生成することができる。リジンミメティックは、リシニルを、例えばコハク酸無水物または他のカルボン酸無水物と反応させることにより生成することができる（さらに、アミノ末端残基が変更されていてもよい）。リジンおよび他のアルファ−アミノ−含有残基ミメティックもまた、イミドエステル、例えばメチルピコリンイミデート、ピリドキサルホスフェート、ピリドキサル、クロロホウ素化水素、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ−メチルイソウレア、２，４、ペンタンジオンとの反応、そしてグリオキシル酸を用いたトランスアミダーゼ−触媒反応により生成することができる。メチオニンのミメティックは、例えば、メチオニンスルホキシドを用いた反応により生成することができる。ラジオイム（Radioim）のミメティックには、例えば、ピペコリン酸、チアゾリジンカルボン酸、３−もしくは４−ヒドロキシ；ラジオイム、デヒドロプロリン、３−もしくは４−メチルプロリン、または３，３，−ジメチルプロリンが含まれる。ヒスチジン残基ミメティックは、ヒスチジルを、例えば、ジエチルプロカルボネートまたはパラ−ブロモフェンアシル臭化物塩と反応させることにより生成することができる。他のミメティックには、例えば、；ラジオイムとリジンのヒドロキシル化；セリルまたはトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化；リジン、アルギニンおよびヒスチジンのアルファ−アミノ基のメチル化；Ｎ−末端アミンのアセチル化；主鎖アミド残基のメチル化またはＮ−メチルアミノ酸での置換；あるいはＣ−末端カルボキシル基のアミド化により、生成されるものが含まれる。
【０２２５】
本発明のポリペプチド成分はまた、反対のキラリティーを有するアミノ酸（またはペプチドミメティック残基）で置換されていてもよい。従って、Ｌ−配置の天然アミノ酸のいずれも（これは、その化学物質の構造に応じて；ＲまたはＳと称されることがある）、同じキメラ構造のアミノ酸またはペプチドミメティックで置換されていてもよいが、Ｄ−アミノ酸と称される反対のキラリティーのアミノ酸（さらにＲ−もしくはＳ−型と称されることがある）を除く。
【０２２６】
本発明はまた、本発明のポリペプチドと「実質的に同一」なポリペプチドも提供する。
「実質的に同一」なアミノ酸配列は、１つまたはそれ以上の保存的なもしくは非保存的なアミノ酸置換、欠失、もしくは挿入により参照配列と異なっている配列であって、特に、そのような置換が分子の活性部位以外の部位で生じており、そのポリペプチドが本質的にその機能的な特徴を維持していることが条件の配列である。保存的なアミノ酸置換は、例えばあるアミノ酸を同じクラスの別のものに置換することである（例えば、疎水性のアミノ酸、例えばイソロイシン、バリン、ロイシン，もしくはメチオニンを別のものに置換すること、または極性のあるアミノ酸を別のものに置換すること、例えばアルギニンのリジンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、またはグルタミンのラジオイムノへの置換）。１つまたはそれ以上のアミノ酸が、例えば本発明のｕｎｃ−９３ｂポリペプチドから欠失して、その生物活性が顕著に変化しなければ、そのポリペプチドの構造的に変化が生じてもよい。例えば、アミノ−もしくはカルボキシル−末端、または内部のアミノ酸で、ＴＬＲ−３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性に必要とされないアミノ酸が取り除かれてもよい。
【０２２７】
当業者であれば、これらのミメティックを含む個々の合成残基およびポリペプチドは、様々な手順および方法論を用いて合成することができることは認められうであろうし、それらは、科学文献および特許文献、例えば Organic Syntheses Collective Volumes, Gilmanら(編集)、John Wiley＆Sons, Inc., NY. Peptidesに詳しく記載されており、本発明のペプチドおよびペプチドミメティックはまた、一般的な方法論を用いて合成することもできる。ペプチドおよびペプチドミメティックライブラリーの作製に関する様々な技術が広く知られており、例えばマルチピン、ティーバッグおよびスプリット−カップル−ミックス技術が挙げられ；例えば、al-Obeidi, Mol. Biotechnol. 9: 205-223, 1998；Hruby, Curr. Opin. Chem. Biol. 1: 114-119, 1997；Ostergaard, Mol. Divers. 3: 17-27, 1997；Ostresh, Methods Enzymol. 267: 220-234, 1996を参照のこと。本発明の修飾されたペプチドは、さらに化学的修飾法により生成することができる、例えばBelousov, Nucleic Acids Res. 25: 3440-3444, 1997；Frenkel, Free Radic. Biol. Med. 19: 373-380, 1995；Blommers, Biochemistry 33: 7886-7896, 1994を参照のこと。
【０２２８】
本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、例えば、さらなる免疫原性ペプチドを産生するために、組み換え技術により合成されたペプチドをより容易に単離するために、抗体および抗体を発現するB細胞を同定し単離するためなどのために、それらに繋げられた１つまたはそれ以上のさらなるドメインを有する融合蛋白質として合成および発現させることができる。検出および精製を容易にするドメインには、例えば金属キレーティングペプチド、例えば固定された金属上での精製を可能にするポリヒスチジン系およびヒスチジン−トリプトファンモジュール、固定された免疫グロブリン上での精製を可能にするプロテインAドメイン、およびFLAGS伸長/親和性精製系(Immunex Corp, Seattle Wash)で利用されるドメインが含まれる。開裂するリンカー配列の組成には、精製を容易にするために、例えば、Ｘａ因子またはエンテロキナーゼ (Invitrogen, San Diego Calif.)が、精製ドメインとモチーフを含むペプチドまたはポリペプチドの間にある。例えば、発現ベクターは、エピトープをコードする核酸配列に連結される、６個のヒスチジン残基、続いて、チオレドキシンおよびエンテロキナーゼを含んでいてもよい（例えば、Williams, Biochemistry 34: 1787-1797, 1995；Dobeli, Protein Expr. Purif. 12: 404-14, 1998を参照のこと)。ヒスチジン残基は検出および精製を容易にするが、エンテロキナーゼ開裂部位は、エピトープを融合蛋白質の残りの部分から精製する方法を提供する。融合蛋白質をコードするベクターに関する技術および融合蛋白質の応用は、科学文献および特許文献に広く記載されており、例えば、Kroll, DNA Cell. Biol., 12: 441-53, 1993を参照のこと。
【０２２９】
本明細書で用いられる、用語「ポリペプチド」および「蛋白質」は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、により互いに結合されたアミノ酸、すなわちペプチドアイソスターを意味し、２０個の遺伝子にコードされたアミノ酸以外のモディファイされたアミノ酸を含んでいてもよい。用語「ポリペプチド」はまた、ペプチドおよびポリペプチド断片、モチーフなどを含む。また、この用語には、糖化されたポリペプチドも含まれる。本発明のペプチドおよびポリペプチドはまた、以下にさらに詳細に記載されるように、すべの「ミメティック」および「ペプチドミメティック」型を含む。
【０２３０】
本明細書で用いられる、用語「単離された」は、物質がその元あった環境（例えば、それが天然物である場合には、自然環境）から取り出されることを意味する。例えば、生きている動物に存在する天然のポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されていないが、自然系で同時に存在する物質の幾つかまたは全てから分離された、同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、単離されている。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部として存在し、および／またはそのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部として存在し、さらにそのようなベクター内にあっても単離されており、また組成物は、天然環境の一部ではなくなっている。本明細書で用いられる、単離された物質または組成物はまた、「精製された」組成物であってもよく、すなわち、絶対的な純度が要求されるのではなく、むしろ、相対的な定義を意図する。ライブラリーから得られる個々の核酸は、典型的に精製して、電気泳動上均一とすることができる。別の態様において、本発明は、ゲノムＤＮＡから、またはライブラリーもしくは他の環境の他の配列から、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、またはそれ以上のオーダーの範囲で、精製された核酸を提供する。
【０２３１】
例示的なｕｎｃ−９３ｂは、核酸配列である配列番号：１、およびそのアミノ酸翻訳物である配列番号：２で与えられる。例示的なｕｎｃ−９３ｂの３ｄ変異体は、核酸配列である配列番号：３、およびそのアミノ酸翻訳物である配列番号：４で与えられる。
【０２３２】
１９．スクリーニング方法論
本発明の方法を実施するにあったて、様々な装置および方法論を、例えば、ＴＬＲ３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性に対するポリペプチドをスクリーニングするために、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ活性、例えば、ＴＬＲ−３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性の潜在的なモジュレーターとしての化合物（例えば、阻害物質または活性化物質）をスクリーニングするために、本発明のポリペプチドに結合する抗体について、本発明の核酸にハイブリダイズする核酸について、本発明のポリペプチドを発現する細胞などについてスクリーニングするために、本発明のポリペプチドおよび核酸と併せて用いることができる。
【０２３３】
１つの態様において、本発明のペプチドおよびポリペプチドは、固体担体に固定化されている。固体担体には、例えば、メンブレン（例えば、ニトロセルロースまたはナイロン）、マイクロタイターディッシュ（例えば、ＰＶＣ、ポリプロピレンまたはポリスチレン）、試験管（ガラスまたはプラスチック）、ディップスティック（例えば、ガラス、ＰＶＣ、ポリプロピレン、ポリスチレン、ラテックスおよび類似物）、マイクロ遠心管、またはガラス、シリカ、プラスチック、金属もしくはポリマービーズまたは他の基材、例えば紙が含まれ得る。１つの固体担体は、ペプチド上で作り出された特異的にヒスチジンタグと結合する、金属（例えば、コバルトまたはニッケル）−含有のカラムを使用する。
【０２３４】
ペプチドの固体担体への吸着は、直接的（すなわち、蛋白質が固体担体と接触する）であってもよいし、あるいは間接的（特定の化合物または物質が担体と結合しており、標的蛋白質は固体担体よりもその化合物と結合する）であってもよい。ペプチドは、共有結合（単一のシステイン残基の反応性のチオール基を利用するもの（例えば、Colliuod, Bioconjugate Chem. 4: 528-536, 1993を参照のこと）か、または非共有結合が特異的に（例えば、固定された抗体を介したもの（例えば、Schuhmann, Adv. Mater. 3: 388-391, 1991；Lu, Anal. Chem. 67: 83-87, 1995を参照のこと）；ビオチン／ストレプトアビジン系（例えば、Iwane, Biophys. Biochem. Res. Comm. 230: 76-80, 1997を参照のこと）；金属キレーティング、例えば、ラングミュアーブロジェット膜（例えば、Ng, Langmuir 11: 4048-55, 1995を参照のこと）；ポリヒスチジン融合体の結合のための、金属キレーティング自己組織化単分子膜（例えば、Sigal, Anal. Chem. 68: 490-497, 1996を参照のこと）のいずれかにより固定することができる。
【０２３５】
間接的な結合は、商業的に入手できる様々なリンカーを用いて実施することができる。反応性末端は、様々な官能基のいずれかであってよく、限定されるものではないが：アミノ反応性末端、例えばＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、イミドエステル、アルデヒド、エポキシド、ハロゲン化スルホニル、イソシアネート、イソチオシアネートおよびニトロアリールハロゲン化物；ならびにチオール反応性末端、例えばピリジルジスルフィド、マレイミド、チオフタルイミド、および活性ハロゲンが含まれる。ヘテロ二機能性連結試薬は、２つの異なる反応性末端、例えばアミノ−反応性末端とチオール反応性末端を有するが、ホモ二機能性試薬は、２つの類似する反応性末端、例えば、スルフヒドリルを含む化合物の架橋を可能にするビスマレイミドヘキサン（ＢＭＨ）を有する。スペーサは可変長であり、脂肪族であっても芳香族であってもよい。商業的に利用できるホモ二機能性架橋試薬の例には、限定されるものではないが、イミドエステル、例えばジメチルアジポイミデート（adipimidate）二塩酸塩（ＤＭＡ）；ジメチルピメリミデート（pimelimidate）二塩酸塩（ＤＭＰ）；およびジメチルスベルイミデート（suberimidate）二塩酸塩（ＤＭＳ）が含まれる。ヘテロ二機能性試薬には、商業的に入手できる活性ハロゲン−ＮＨＳ、活性エステルカップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジルブロモ酢酸塩およびＮ−スクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸（ＳＬＡＢ）およびスルフォスクシンイミジル誘導体、例えばスルフォスクシンイミジル（４−ヨードアセチル）アミノ安息香酸（スルフォ−ＳＩＡＢ）（ピアース（Ｐｉｅｒｃｅ）が含まれる。別の基のカップリング剤には、ヘテロ二機能性およびチオール開裂剤、例えばＮ−スクシンイミジル３−（２−ピリジイジチオ（pyridyidithio））プロピオネート（ＳＰＤＰ）(ピアースケミカルズ（Pierce Chemicals, Rockford, Ill.)がある。
【０２３６】
抗体は、本発明のポリペプチドおよびペプチドを固体担体に結合させるために用いることができる。これは、ペプチド−特異的抗体をカラムに直接結合させることによって行うことができるし、あるいは、例えば、既知のエピトープ（例えば、タグ（例えば、ＦＬＡＧ、ｍｙｃ）または適当な免疫グロブリン定常領域の配列（「免疫付着因子」、例えば、Capon, Nature 377: 525-531, 1989を参照のこと）に連結された、モチーフ含有ペプチドを含む融合蛋白質キメラを作製することにより行うことができる。
【０２３７】
２０．アレイまたは「バイオチップ」
本発明は、アレイを用いた、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ活性、例えば、ＴＬＲ−３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性のモジュレーター（例えば、阻害物質、活性化物質）の同定／スクリーニング方法を提供する。低分子物質、核酸、ポリペプチド（抗体を含む）を含む潜在的なモジュレーターをアレイに固定化することができる。本発明の核酸またはポリペプチドは、固定化してアレイに適用できる。アレイを用いて、組成物ライブラリー（例えば、低分子物質、抗体、核酸など）を、本発明の核酸またはポリペプチドと結合するか、あるいは、その活性、例えば、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ活性をモジュレートするその能力について、スクリーニングし、またはモニタすることができる。例えば、本発明の１つの態様において、モニタするパラメータは、本発明の核酸を含む遺伝子の転写産物発現である。１つまたはそれ以上の、もしくは全ての細胞内の転写産物を、細胞の転写産物、細胞の代表的な核酸、または転写産物に相補的な核酸を含む試料のハイブリダイゼーションにより、あるいは、アレイまたは「バイオチップ」に固定された核酸に対するハイブリダイゼーションにより測定することができる。マイクロチップ上の核酸の「アレイ」を用いることにより、細胞の転写産物の幾つかまたは全てを、同時に定量することができる。あるいは、ゲノムの核酸を含むアレイを用いて、本発明の方法により新たに作り出された株の遺伝子型を決定するために用いることもできる。ポリペプチドアレイを用いて、大多数の蛋白質を同時に定量することができる。低分子物質のアレイを用いて、大多数のｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃモジュレートもしくは結合活性を同時に分析することができる。
【０２３８】
本発明は、既知の「アレイ」、また「マイクロアレイ」または「核酸アレイ」または「ポリペプチドアレイ」または「抗体アレイ」または「バイオチップ」、あるいはその類似物のいずれかを用いて実施することができる。アレイは、一般に、多数の「スポット」または「標的因子」があり、それぞれの標的因子は、試料分子、例えばｍRNA転写物と特異的に結合する、基質表面の所定領域に固定された所定量の１つまたはそれ以上の生物学的分子、例えば、オリゴヌクレオチドを含む。本発明の方法を実施するにあたって、既知のアレイのいずれかおよび／またはアレイを作製および使用する方法、類似の方法は、例えば、米国特許第6,277,628号明細書;第6,277,489号明細書;第6,261,776号明細書;第6,258,606号明細書;第6,054,270号明細書；第6,048,695号明細書;第6,045,996号明細書;第6,022,963号明細書;第6,013,440号明細書；第5,965,452号明細書；第5,959,098号明細書；第5,856,174号明細書；第5,830,645号明細書；第5,770,456号明細書；第5,632,957号明細書；第5,556,752号明細書；第5,143,854号明細書；第5,807,522号明細書；第5,800,992号明細書；第5,744,305号明細書；第5,700,637号明細書；第5,556,752号明細書；第5,434,049号明細書に記載されうように、完全にまたは部分的に本方法の一部とされる。例えば、国際公開第99/51773号パンフレット；国際公開第99/09217号パンフレット；国際公開第97/46313号パンフレット；国際公開第96/17958を参照のこと;また、例えば、Johnston, Curr. Biol. 8: R171-R174, 1998；Schummer, Biotechniques 23: 1087-1092, 1997；Kern, Biotechniques 23: 120-124, 1997；Solinas-Toldo, Genes, Chromosomes＆Cancer 20: 399-407, 1997；Bowtell, Nature Genetics Supp. 21: 25-32, 1999を参照のこと。さらに、公開された米国特許出願第20010018642号;第20010019827号;第20010016322号;第20010014449号;第20010014448号;第20010012537号;第20010008765号を参照のこと。
【０２３９】
本明細書で用いられる用語「アレイ」または「マイクロアレイ」あるいは「バイオチップ」または「チップ」は、多くの標的因子を有し、それぞれの標的因子が、基質表面の特定の領域に固定された特定の量の１つまたはそれ以上のポリペプチド（抗体を含む）または核酸を含む。
【０２４０】
２１．組み合わせ化学ライブラリー
本発明は、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃ  活性、例えば、ＴＬＲ−３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性のモジュレーター（例えば、阻害物質、活性化物質）を同定／スクリーニングする方法を提供する。本発明のスクリーニング方法を実施するにあたって、試験化合物を提供する。それを、本発明のポリペプチドとインビトロで、または本発明の細胞もしくは本発明の動物とインビボで接触させることができる。化合物はまた、本発明の組成物、細胞、ヒト以外の動物および方法を用い、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症もしくはＣＤ４細胞欠損症を改善することができるその能力について、および、または動物に寛容化環境を与えるその能力について、スクリーニングすることができる。組み合わせ化学ライブラリーは、例えばＴＬＲ−３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性を阻害する化合物、または、本発明のヒト以外のトランスジェニックもしくはノックアウト動物を用いて、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症もしくはＣＤ４細胞欠損症を処置または改善するために用いることができる化合物、あるいは対象を抗原に対して寛容化させるのに用いられる化合物を導く新しい化学物質の作製の助けとなる１つの方法である。
【０２４１】
組み合わせ化学ライブラリーは、化学合成または生物学的合成のいずれかで、多くの化学「構成ブロック」、例えば、試薬を組み合わせることにより作り出される、多種多様な化学化合物の集合物である。例えば、リニア組み合わせ化学ライブラリー、例えばポリペプチドライブラリーは、化学構成ブロックと呼ばれるアミノ酸の組みを、所定の化合物長(すなわち、ポリペプチド化合物中のアミノ酸の数)について可能な全ての方法で組み合わせることにより形成される。百万の化学化合物を、化学構成ブロックを組み合わせ混合して、合成することができる。例えば、１００個の代替性のある構成ブロックの体系的な、組み合わせ混合により、理論的には一億通りの４量体化合物または百億通りの５量体化合物の合成をもたらす(例えば、Gallopら、(1994) 37(9): 1233-1250を参照のこと)。組み合わせ化学ライブラリーの調製およびスクリーニングは、当業者には周知であり、例えば、米国特許第6,004,617号明細書;第5,985,356号明細書を参照のこと。そのような組み合わせ化学ライブラリーには、限定されるものではないが、ペプチドライブラリー(例えば、米国特許第5,010,175号明細書；Furka, Int. J. Pept. Prot. Res. 37: 487-493, 1991, Houghtonら、Nature, 354: 84-88, 1991を参照のこと)が挙げられる。他の化学誘導体ライブラリーを作製するための化学には、限定されるものではないが:ペプトイド（peptoid）(例えば、国際公開第91/19735号パンフレットを参照のこと)、コードされたペプチド(例えば、国際公開第93/20242号パンフレットを参照のこと)、ランダムバイオ−オリゴマー(例えば、国際公開第92/00091号パンフレットを参照のこと)、ベンゾジアゼピン(例えば、米国特許第5,288,514号明細書を参照のこと)、ダイバーソマー（diversomer）、例えばヒダントイン、ベンゾジアゼピンおよびジペプチド(例えば、Hobbs, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 90: 6909-6913, 1993を参照のこと)、ビニル性ポリペプチド（vinylogous polypeptide）(例えば、Hagihara, J. Amer. Chem. Soc. 114: 6568, 1992を参照のこと)、ベータ-D-グルコース骨格を有する非ペプチド性ペプチドミメティック(例えば、Hirschmann, J. Amer. Chem. Soc. 114: 9217-9218, 1992を参照のこと)、類似の有機合成体の低分子化合物ライブラリー(例えば、Chen, J. Amer. Chem. Soc. 116: 2661, 1994を参照のこと)、オリゴカルバメート(例えば、Cho, Science 261: 1303, 1993を参照のこと)、および/またはペプチジルホスホノエート(例えば、Campbell, J. Org. Chem. 59: 658, 1994を参照のこと)が挙げられる。また、Gordon, J. Med. Chem. 37: 1385, 1994を参照のこと;核酸ライブラリー、ペプチド核酸ライブラリーについては、例えば、米国特許第5,539,083号明細書を参照のこと;抗体ライブラリーについていは、例えば、Vaughn, Nature Biotechnology 14: 309-314, 1996を参照のこと;炭水化物ライブラリーについては、例えば、Liangら、Science 274: 1520-1522, 1996、米国特許第5,593,853号明細書を参照のこと;低分子有機分子ライブラリーについては、例えば、イソプレノイドについては、米国特許第5,569,588号明細書を参照のこと;チアゾリジノン（thiazolidinone）およびメタチアザノン（metathiazanone）については、米国特許第5,549,974号明細書を参照のこと;ピロリジンについては、米国特許第5,525,735号明細書および第5,519,134号明細書を参照のこと;モルホリノ化合物については、米国特許第5,506,337号明細書を参照のこと;ベンゾジアゼピンについては��国特許第5,288,514号明細書を参照のこと。
【０２４２】
組み換えライブラリーを調製するための装置は、商業的に入手できる(例えば、米国特許第6,045,755号明細書;第5,792,431号明細書；357 MPS, 390 MPS, Advanced Chem Tech, Louisville Ky., Symphony, Rainin, Woburn, Mass., 433A Applied Biosystems, Foster City, Calif., 9050 Plus, Millipore, Bedford, Massを参照のこと)。液相化学について、多くのロボット化された系が開発された。これらの系には、自動化されたワークステーション、例えばTakeda Chemical Industries, LTD. (大阪、日本)により開発された自動合成装置や、化学者により行われる手作業の合成操作をまねたロボットアームを利用した多くのロボットシステム(Zymate II, Zymark Corporation, Hopkinton, Mass；Orca, Hewlett-Packard, Palo Alto, Calif.)などが含まれる。上記の装置のいずれも、本発明での使用に適している。本明細書で述べらたように操作できるよう（必要であれば）、それらの装置の性質および器具を改変することは、当業者には認められよう。加えて、それらの多くの組み合わせライブラリーが商業的に入手できる（例えば、ComGenex, Princeton, N.J., Asinex, Moscow, Ru, Tripos, Inc., St. Louis, Mo., ChemStar, Ltd, Moscow, RU, 3D Pharmaceuticals, Exton, PA, Martek Biosciences, Columbia, Mdなどを参照のこと)。
【０２４３】
２２．抗体および抗体に基づくスクリーニング方法
本発明は、本発明のポリペプチドまたは核酸、例えばｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃの核酸もしくはポリペプチド、または３ｄ変異体の核酸もしくはポリペプチドと特異的に結合する単離された抗体または組み換え抗体を提供する。これらの抗体は、本発明のポリペプチドまたは関連ポリペプチドを単離し、同定し、または定量するのに用いることができる。これらの抗体は、本発明の範囲内にある他のポリペプチド、または他の関連するＴＬＲ−３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性ポリペプチドを単離するために用いることができる。
【０２４４】
用語「抗体」には、抗原またはエピトープに特異的に結合することができる、免疫グロブリン遺伝子もしくは免疫グロブリン遺伝子群から誘導された、その後作られた、または実質的にコードされているペプチドまたはポリペプチド、またはそれらの断片が含まれ、例えば、Fundamental Immunology, Third Edition, W. E. Paul, 編集., Raven Press, N.Y., 1993；Wilson, J. Immunol. Methods 175: 267-273, 1994；Yarmush, J. Biochem. Biophys. Methods 25: 85-97, 1992を参照のこと。用語「抗体」には、抗原に結合する部分、すなわち抗原と結合する能力を保持している「抗原結合部位」（例えば、断片、部分配列、相補性決定領域（ＣＤＲ））が含まれ、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価性断片；（ｉｉ）ａＦ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド結合により連結された２個のＦａｂ断片を含む二価性の断片；（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の一方の腕のＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなる、ｄＡｂ断片（Wardら、Nature 341: 544-546, 1989）；および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。一本鎖抗体もまた、用語「抗体」の言及に含まれる。
【０２４５】
抗体は、免疫沈澱法、染色法（例えばＦＡＣＳ）、免疫親和性カラムなどに用いることができる。要すれば、特定の抗原をコードする核酸配列を、免疫感作し、続いて、ポリペプチドまたは核酸を分離し、増幅またはクローニングして、本アレイにポリペプチドを固定することにより作り出すことができる。あるいは、本発明の方法を用いて、モディファイされるべき、細胞により産生される抗体の構造を、抗体の親和力が増大または低下するようにモディファイすることができる。さらに、本発明の方法により、抗体を作製もしくはモディファイすることで、細胞内で改変された表現型とすることができる。
【０２４６】
免疫感作、抗体を産生し単離する方法（ポリクローナルおよびモノクローナル）は、当業者には既知であり、科学文献および特許文献に記載されており、例えば、Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY (1991)；Stites (編) BASIC AND CLINICAL IMMUNOLOGY (第7版) Lange Medical Publications, Los Altos, Calif. (「Stites」)；Goding, MONOCLONAL ANTIBODIES: PRINCIPLES AND PRACTICE (第2版) Academic Press, New York, N.Y., 1986；Kohler, Nature 256: 495, 1975；Harlow, ANTIBODIES, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988を参照のこと。抗体は、インビトロで、例えば組み換え抗体結合部位を発現するファージディスプレイライブラリーを用いて作り出すことができ、さらに動物を用いた古典的なインビボにおける方法を用いることもできる。例えば、Hoogenboom, Trends Biotechnol. 15: 62-70, 1997；Katz, Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 26: 27-45, 1997を参照のこと。
【０２４７】
ポリペプチドまたはペプチドは、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生するために用いることができる。得られた抗体は、そのポリペプチドを単離もしくは精製するために、免疫親和性クロマトグラフィー手順で用いることができ、あるいはポリペプチドが生物学的試料中に存在するかどうかを決定するために用いることができる。そのような蛋白質調製の手順では、例えば抽出または生物学的試料を、本発明のポリペプチドの１つと特異的に結合することができる抗体と接触させる。
【０２４８】
免疫親和性手順では、抗体を固体担体、例えばビーズもしくは他のカラムマトリクスに結合させる。蛋白質調製物を、抗体が本発明のポリペプチドの１つと特異的に結合する条件下で抗体と接触させるよう置く。非特異的に結合した蛋白質を取り除くために洗浄した後、特異的に結合したポリペプチドを溶出する。
【０２４９】
生物学的試料中の蛋白質が抗体と結合する能力は、当業者にとって既知の様々な手順のいずれかを用いて決定することができる。例えば、結合は、抗体を検出可能な標識、例えば蛍光試薬、酵素標識、または放射性同位元素で標識することにより決定することができる。あるいは、抗体と試料との結合は、それ上に上記の検出可能な標識を有する２次抗体を用いて検出することができる。特定のアッセイには、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドウィッチアッセイ、放射免疫測定、ウェスタンブロットが含まれる。
【０２５０】
本発明のポリペプチドに対して産生されたポリクローナル抗体は、該ポリペプチドを動物に直接注射することにより、または該ポリペプチドをヒト以外の動物に投与することにより得ることができる。次に、そのようにして得られた抗体を該ポリペプチド自体と結合させる。この様式では、ポリペプチドの断片のみをコードする配列を用いても、完全な天然ポリペプチドと結合することができる抗体を産生することができる。そのような抗体は、そのポリペプチドを発現する細胞から該ポリペプチドを単離するのに用いることができる。
【０２５１】
モノクローナル抗体の調製については、連続細胞株培養により産生される抗体を与えるいずれかの技術を用いることができる。例としては、ハイブリドーマ技術、トリオーマ技術、ヒトＢ−細胞ハイブリドーマ技術、およびＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（例えば、Cole (1985) in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと）が挙げられる。
【０２５２】
一本鎖抗体を生成するために記載された技術（例えば、米国特許第4,946,778号明細書）を、本発明のポリペプチドに対する一本鎖抗体を生成するために応用することができる。あるいは、トランスジェニックマウスを用いて、本ポリペプチドまたはその断片に対するヒト化抗体を発現させることができる。
【０２５３】
本発明のポリペプチドに対して産生された抗体は、他の生物体および試料から類似のポリペプチドをスクリーニングするのに用いることができる。そのような技術には、生物体からのポリペプチドを、抗体と接触させ、その抗体と特異的に結合するポリペプチドを検出する。上記手順のいずれも、抗体の結合を検出するために用いることができる。
【０２５４】
２３．キット
本発明は、本発明の組成物、例えば、核酸、発現カセット、ベクター、細胞、ポリペプチド（例えば、ｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３ＣポリペプチドまたはＴＬＲ−３−、ＴＬＲ７−もしくはＴＬＲ９−シグナル伝達活性化ポリペプチド）および／または抗体を含むキットを提供する。キットには、本明細書で記載されるような、本発明の方法論および使用法を示す教材も含まれ得る。
【０２５５】
２４．治療への応用
本発明の方法により同定された化合物およびモジュレーターは、様々な処置方法に用いることができる。従って、本発明は、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を処置するための組成物および方法を提供する。
【０２５６】
自己免疫疾患の例としては、急性突発性血小板減少性紫斑病、慢性的突発性血小板減少性紫斑病、皮膚筋炎、シデナム舞踏病、重症筋無力症、全身性紅斑性狼瘡、ループス腎炎、リウマチ熱、多内分泌腺症候群、水疱性類天疱瘡、糖尿病、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、連鎖球菌感染後腎炎（post-streptococcalnephritis）、紅斑結節炎（erythema nodosurn）、高安動脈炎、アジソン病、関節リウマチ、多発性硬化症、サルコイドーシス、潰瘍性大腸炎、多形性紅斑、ＩｇＡ腎症、結節性多発動脈炎、強直性関節炎、グッドパスチャー症候群、閉塞性血管血栓炎（thromboangitisubiterans）、シェーグレン症候群、原発性胆汁性肝硬変、橋本甲状腺炎、甲状腺機能亢進症、強皮症、慢性的活動性肝炎、多発筋炎/皮膚筋炎、多発性軟骨炎、尋常性触覚錯誤症（parnphigus vulgaris）、ヴェーゲナー肉芽腫症、膜性腎症、筋萎縮性側索硬化症、脊髄ろう、巨細胞性動脈炎/多発筋痛、ペミシウスサネミア（pemiciousanemia）、急速進行性糸球体腎炎および線維化肺胞炎がある。
【０２５７】
感染症の例としては、限定されるものではないが、ウイルス性、細菌性、菌性または寄生虫性の疾患が含まれる。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染源の処置または検出に用いることができる。例えば、免疫応答の増大、Ｂ細胞および／またはＴ細胞の増殖および分化の部分的な増大により、感染症を処置し得る。免疫応答は、存在する免疫応答を増強すること、あるいは新たに免疫応答を開始させることのいずれかにより、増大させることができる。一方、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、必ずしも免疫応答を惹起させる必要がなく、感染物質を直接阻害することもできる。
【０２５８】
ウイルスは、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置または検出することができる疾患または徴候の原因となり得る感染源の１つの例である。ウイルスの例として、限定されるものではないが、以下のＤＮＡおよびＲＮＡのウイルスファミリー：アルボウイルス、アデノウイルス科、アレナウイルス科、動脈ウイルス、ビルナウイルス科、ブニヤウイルス科、カリシウイルス科、サーコウイルス科、コロナウイルス科、フラビウイルス科、ヘパドナウイルス科（肝炎）、ヘルペスウイルス科（例えば、サイトメガロウイルス、ヘルペスシンプレックス、帯状疱疹）、モノネガウイルス（例えば、パラミクソウイルス科、麻疹ウイルス、ラブドウイルス科）、オルソミクソウイルス科（例えば、インフルエンザ）、パポバウイルス科、パルボウイルス科、ピコルナウイルス科、ポックスウイルス科（例えば、疱瘡またはワクシニア）、レオウイルス科（例えば、ロタウイルス）、レトロウイルス科（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ、レンチウイルス）およびトガウイルス科（例えば、ルビウイルス）が含まれる。こららのファミリーに含まれるウイルスは、さまざまな疾患および徴候、限定されるものではないが：関節炎、細気管支炎、脳炎、眼感染症（例えば、結膜炎、隔膜炎）、慢性疲労症候群、肝炎（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｅ、慢性活動性、デルタ）、髄膜炎、日和見感染（例えば、ＡＩＤＳ）、肺炎、バーキット−リンパ種、水痘、出血熱、麻疹、流行性耳下腺炎、パラインフルエンザ、狂犬病、風邪、ポリオ、白血病、風疹、性感染症、皮膚疾患（例えば、カポジ肉腫（Ｋａｐｏｓｉ’ｓ）、疣贅）、およびウイルス血症の原因となり得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらすべての徴候または疾患の処置または検出に用いることができる。
【０２５９】
同様に、疾患または徴候の原因となり、そして本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置または検出され得る細菌のまたは菌物質は、限定されるものではないが、以下のグラム陰性およびグラム陽性細菌性のファミリーおよび菌類：放線菌（例えば、コリネバクテリウム、マイコバクテリア、ノルカルディア）、アスペルギルス属、バシラス科（例えば、炭疽、クロストリジウム属）、バクテロイデス科、ブラストミセス属、ボルデテラ属、ボレリア属、ブルセラ属、カンジダ属、カンピロバクター属、コクシジオイデス属、クリプトコックス属、皮膚真菌（Dermatocycoses）、腸内細菌科(クレブシエラ属、サルモネラ属、霊菌属、エルシニア属、エリジペロスリックス属、ヘリコバクター属、レジオネラ属、レプトスピラ属、リステリア属、マイコプラズマウイルス、ナイセリア科（例えば、アシネトバクター属、淋病、髄膜炎菌）、パスツレラ科感染症（例えば、アクチノバチルス属、ヘモフィラス属、パスツレラ属）、シュードモナス科、リッケチア科、クラミジア科、梅毒およびブドウ球菌が含まれる。これらの細菌または菌ファミリーは、以下の疾患または徴候、限定されるものではないが：菌血症、心内膜炎、眼感染症（結膜炎、結核、ブドウ膜炎）、歯肉炎、日和見感染症（例えば、ＡＩＤＳ関連感染症）、爪囲炎、人工器官関連感染症、ライター病、呼吸器感染症、例えば、百日咳または蓄膿症、敗血症、ライム病、猫引っかき病、赤痢、パラチフス熱、食中毒、チフス症、肺炎、淋病、髄膜炎、クラミジア、梅毒、ジフテリア、らい病、パラ結核、結核、狼瘡、ボツリヌス中毒症、壊疽、破傷風、膿痂疹、リウマチ熱、猩紅熱、性感染症、皮膚疾患（例えば、蜂巣炎、皮膚真菌）、毒血症、尿路感染症、創傷感染を含む疾患または徴候の原因となり得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらすべての徴候または疾患を処置または検出するために使用することができる。
【０２６０】
さらに、本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドにより処置または検出され得る疾患または徴候の原因となる寄生性作用は、限定されるものではないが、以下のファミリー：アメーバ症、バベシア症、コクシジウム症、クリプトスポリジウム症、二核アメーバー症（Dientamoebiasis）、媾疫、外部寄生者、ジアルジア症、蠕虫病、リーシュマニア症、タイレリア症、トキソプラズマ症、トリパノソーマ症およびトリコモナスを含む。これらの寄生虫は、限定されるものではないが：疥癬、ツツガムシ病、眼感染症、腸疾患（例えば、赤痢、ジアルジア症）、肝疾患、肺疾患、日和見感染（例えば、ＡＩＤＳ関連）、マラリア、妊娠合併症およびトキソプラズマ症を含むさまざまな疾患または徴候の原因となり得る。本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、これらすべての徴候または疾患の処置または検出のために使用することができる。
【０２６１】
好ましくは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドを用いる処置は、患者に有効量のポリペプチドを投与してもよし、患者の細胞を取り出し、その細胞に本発明のポリヌクレオチドを供して、そして作製した細胞を元の患者に戻してもよい（エックスビボ治療）。さらに、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、感染症に対する免疫応答を惹起するワクチンの抗原として用いることができる。
【０２６２】
２５．組成物および医薬組成物の投与
本発明は、本発明の核酸、ペプチドおよびポリペプチド（Ａｂを含む）を含む医薬組成物を提供する。上記のように、本発明の核酸、ペプチドおよびポリペプチドは、内因性のｕｎｃ−９３、ｕｎｃ−９３Ａ、ｕｎｃ−９３Ｂもしくはｕｎｃ−９３Ｃポリペプチドの発現を阻害するため、または活性化するために用いることができる。細胞またはヒト以外の動物におけるそのような阻害は、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症またはＣＤ４細胞欠損症を標的とする、または軽減する化合物を同定するためのスクリーニング様式を与え得る。本発明の医薬組成物の対象への投与は、その対象に寛容化した免疫学的環境を生じさせるために用いられる。これを用いて、対象を抗原に対して寛容化させることができる。
【０２６３】
本発明の核酸、ペプチドおよびポリペプチドは、医薬上許容される担体（賦形剤）と組み合わせて、医薬組成物を形成させることができる。医薬上許容される担体は、本発明の医薬組成物に作用し、例えば安定化させ、または吸収もしくは排除の割合を増加もしくは低下させる、生理学上許容される化合物が含まれ得る。生理学的に許容される化合物には、例えば炭水化物、例えばグルコース、シュークロースもしくはデキストラン、抗酸化物質、例えばアスコルビン酸もしくはグルタチオン、キレート剤、低分子量蛋白質、ペプチドまたはポリペプチドの浄化値もしくは加水分解を低下させる組成物、または賦形剤、または他の安定化剤および／または緩衝剤を含んでいてもよい。希釈剤もまた、リポソーム担体、医薬上許容される担体を含む医薬組成物を安定化させるために、あるいはその吸収を増加もしくは低下させるために用いることができ、そしてペプチドおよびポリペプチドの組成物当業者には既知であり、詳細は科学文献および特許文献に記載されており、例えば、最近の出版物ではRemington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton, Pa. （「Remington's」）を参照のこと。
【０２６４】
他の生理学的に許容される化合物には、特に美西部の増殖または活動を予防するのに有用な、湿潤剤、乳化剤、分散剤または防腐剤が含まれる。様々な防腐剤が広く知られており、例えば、フェノールおよびアスコルビン酸が含まれる。当業者であれば、生理学的に許容される化合物を含む医薬上許容される担体の選択は、例えば本発明のペプチドまたはポリペプチドの投与経路に、およびその具体的な物理−化学的な特徴に依存することは認められよう。
【０２６５】
１つの態様において、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチド溶液は、医薬上許容される担体、例えば、組成物が可溶性である場合、水性担体に溶解させる。経腸, 非経口または経粘膜的薬物輸送のための組成物に使用することができる水溶液の例としては、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ハンクス液、リンゲル液、デキストロース/食塩水、グルコース溶液およびその類似物が含まれる。組成物には、生理条件に近づけることが要求される場合、医薬上許容される補助剤、例えば緩衝剤、等張調節剤、湿潤剤、希釈剤およびその類似物を含ませることができる。添加剤は、さらなる活性成分、例えば殺菌剤、または安定剤を含ませてよい。例えば、溶液は、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリンソルビタンまたはオレイン酸トリエタノールアミンを含んでいてもよい。これらの組成物は、慣用の、周知の滅菌技術により滅菌されていてよく、滅菌濾過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装されてもよく、また投与前に滅菌水と組み合わされる凍結乾燥品のために凍結乾燥されてもよい。組成物中のペプチド濃度は、種々変更でき、主として液量、粘性、体重などに基づいて、そして選択される具体的な投与形式や患者の供給に従って選択されるであろう。
【０２６６】
固体組成物も、経腸（経口）投与に使用することができる。それらは、例えば丸薬、錠剤、粉剤またはカプセル剤として製剤化されていてよい。固体組成物について、慣用の非毒性の固体担体を用いることができ、それには、例えば、医薬品等級のマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウム  サッカリン、滑石粉、セルロース、グルコース、シュークロース、炭酸マグネシウムなどが含まれる。経口投与について、医薬上許容される非毒性の組成物は、通常用いられる賦形剤、例えば上記の担体のいずれかと、通常１０％〜９５％の活性成分（例えばペプチド）を組み合わせて製剤化される。固体以外の組成物もまた、経腸投与に用いることができる。担体は、鉱油、動物油、植物油、または合成油を含む種々の湯物、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油などから選択できる。適切な医薬賦形剤には、例えば澱粉、セルロース、タルク、グルコース、ラクトース、シュークロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、白亜、シリカゲル、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールが含まれる。
【０２６７】
経口で投与される、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、分解から保護することができる。これは、核酸、ペプチドまたはポリペプチドを酸や酵素加水分解に対して耐性にさせるために、それを組成物と複合体形成させること、あるいは核酸、ペプチドまたはポリペプチドを適当な耐性のある担体、例えばリポソーム内に包み込むことのいずれかにより達成することができる。消化から化合物を保護する方法は、当分野では周知であり、例えば、治療薬の経口輸送のための脂質組成物（リポソーム輸送は、後掲でさらに詳細に記載される）を記載するFix, Pharm Res. 13: 1760-1764, 1996；Samanen, J. Pharm. Pharmacol. 48: 119-135, 1996；米国特許第5,391,377号明細書を参照のこと。
【０２６８】
全身投与はまた、経粘膜的方法または経皮方法であってよい。経粘膜投与または経皮投与について、浸透されるべき障壁に対する適当な浸透剤は、組成物に用いることができる。そのような浸透剤は、当分野で一般に知られており、例えば、経粘膜投与については、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が含まれる。加えて、希釈剤を用いて、浸透を容易にすることができる。経粘膜投与は、鼻スプレイを通じるものであってもよいし、または坐剤を用いてもよい。例えば、Sayani, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 13: 85-184, 1996を参照のこと。局所、経皮投与について、試薬は、軟膏、クリーム、塗剤、粉剤およびゲルに製剤化される。経皮輸送系、例えばパッチも含む。
【０２６９】
本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドはまた、徐放または持続放出機序で投与することができ、組成物を内部に輸送することができる。例えば、生分解性の微小球またはカプセル剤、またはペプチドを徐放できる他の生分解性の高分子構造物は、本発明の組成物に含まれる（例えば、Putney, Nat. Biotechnol. 16: 153-157, 1998を参照のこと)。
【０２７０】
吸入について、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、乾燥粉末エアロゾル、液体輸送経、エアージェット噴霧器、噴射剤系およびその類似系を含む、当分野で既知の系を用いて輸送することができる。例えば、Patton, Biotechniques 16: 141-143, 1998を参照のこと；例えば、デュラ・ファーマセウティカル（Dura Pharmaceuticals）(サンディエゴ、カルフォルニア)、アラジーン（Aradigrn）(へーワード、カルフォルニア、エアロジェン（Aerogen）(サンタクララ、カルフォルニア)、吸入治療システム（Inhale Therapeutic Systems）(サンカルロス、カリフォルニア)などによる、ポリペプチド高分子の生産物および吸入輸送系。例えば、医薬組成物は、エアロゾルまたはミストの形態で投与することができる。エアロゾル投与について、組成物は、界面活性剤および噴射剤と共に、細かく分割された形態で提供され得る。別の態様では、呼吸組織に組成物を輸送するための装置には、組成物を蒸発させる吸入器がある。他の液体輸送系には、例えばエアージェット噴霧器が含まれる。
【０２７１】
本発明の医薬を調製するにあたって、薬物動力学および生体分布を改変するため、種々の組成物の改良を行って、操作することができる。薬物動力学および生体分布を改変するための方法は数多く、当業者には知られている。そのような方法の例としては、蛋白質、脂質（例えば、リポソーム、以下を参照のこと）、炭水化物または合成高分子（上述したもの）などの基質からなる小胞にて本発明の組成物を保護することが含まれる。薬物動力学の一般的な議論は、例えば、Remington's３７章〜３９章を参照のこと。
【０２７２】
本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドは、単独で輸送することができるし、または当分野で既知のいずれかの方法、例えば、全身、局部もしくは局所で（例えば、組織に直接もしくは組織への方向付け）；動脈内、くも膜内（ＩＴ）、静脈内（ＩＶ）、非経口、膜腔内、局部、経口、または皮下、気管内（例えば、エアロゾルにより）もしくは経粘膜（例えば、頬、膀胱、膣、子宮、直腸、鼻粘膜）のように局所投与により、医薬組成物として輸送することができる。処置する組成物を実際に調製する方法は、当業者には知られており、また明らかであろうし、詳細は、科学文献および特許文献を、例えば、Remington'sを参照のこと。「局所的効果」について、例えば、特定の器官に絞った投与の１つの形式には、例えば特定の器官、例えば脳およびＣＮＳに絞った、動脈内またはくも膜内（ＩＴ）注射が含まれる(例えば、Gurun, Anesth Analg. 85: 317-323, 1997を参照のこと)。例えば、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドを脳に直接輸送することが望ましい場合、好ましくは頚動脈内注射である。非経口投与は、全身投与量が必要な場合の好ましい輸送経路である。非経口投与可能な組成物を調製する実際の方法は、当業者には知られており、また明らかであろうし、詳細は、例えば、Remington'sに記載されている。また、Bai, J. Neuroimmunol. 80: 65-75, 1997；Warren, J. Neurol. Sci. 152: 31-38, 1997；Tonegawa, J. Exp. Med. 186: 507-515, 1997を参照のこと。
【０２７３】
１つの態様において、本発明は、本発明の核酸、ペプチドまたはポリペプチドを含む医薬組成物は、脂質単分子層または脂質二重層、例えばリポソームに包含されいてもよく、例えば、米国特許第6,110,490号明細書；第6,096,716号明細書；第5,283,185号明細書；第5,279,833号明細書を参照のこと。本発明はまた、本発明の可溶性の核酸、ペプチドまたはポリペプチドが、その単重層もしくは二重層の表面に結合されている組成物も提供する。例えば、ペプチドを、ヒドラジド−ＰＥＧ−（ジステアロイルホスファチジル（distearoylphosphatidyl）エタノールアミン−含有リポソーム（例えば、Zalipsky, Bioconjug. Chem. 6: 705-708, 1995を参照のこと）に結合させてもよい。リポソームまたはいずれかの形態の液体膜、例えば、脂質平面膜または無傷の細胞、例えば、赤血球の細胞膜を用いルことができる。リポソーム組成物は、静脈内、経皮（例えば、Vutla, J. Pharm. Sci. 85: 5-8, 1996を参照のこと）、経粘膜的または経口投与を含み、どのような様式であってもよい。本発明はまた、本発明の核酸、ペプチドおよび／またはポリペプチドを、ミセルおよび／またはリポソーム内部に包含する医薬製剤(例えば、Suntres, J. Pharm. Pharmacol. 46: 23-28, 1994；Woodle, Pharm. Res. 9: 260-265, 1992を参照のこと）を提供する。リポソームおよびリポソーム組成物は、標準的な方法よび当分野で周知の方法に従って調製することができ、Remington's；Akimaru, Cytokines Mol. Ther. 1: 197-210, 1995；Alving, Immunol. Rev. 145: 5-31, 1995；Szoka, Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9: 467, 1980、米国特許第4、235,871号明細書、第4,501,728号明細書および第4,837,028号明細書を参照のこと。
【０２７４】
医薬組成物は、一般に、滅菌として、実質的に等浸透圧で、そして米国の食品医薬品局の適正製品基準（ＧＭＰ）を全て順守して製造される。
【０２７５】
２６．処置計画：薬物動態解析
本発明の医薬組成物は、投与方法に応じて、様々な単位投与剤型で投与することができる。典型的な核酸、ペプチドおよびポリペプチド医薬組成物の投薬量は、当業者に周知である。そのような投薬量は、性質を参考にして、具体的な治療内容、患者の許容度などに応じて調整される。これを実施するのに適した核酸、ペプチドもしくはポリペプチドの量は、「治療上有効量」と定義される。投薬スケジュールおよびこの使用に有効な量、すなわち「投薬計画」は、疾病もしくは状態のステージ、疾病または状態の重篤度、患者の健康の一般的状況、患者の身体的状況、年齢、医薬組成物、および活性成分の濃度などを含む様々な要因に依存するであろう。患者に合った投薬計画を立てるに当たって、投与型式もまた考慮される。投薬計画はまた、薬物動力学、すなわち医薬組成物の吸収速度、生体適合性、代謝、浄化などを熟慮する必要もある。例えば、最新のRemington's；Egleton, Peptides 18: 1431-1439, 1997；Langer, Science 249: 1527-1533, 1990を参照のこと。
【０２７６】
治療への適用において、組成物は、自己免疫疾患、感染症、炎症性疾患、抗原提示細胞欠損症もしくはＣＤ４細胞欠損症に罹患した患者に、該状態または疾病および／またはその合併症を少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で投与される。例えば、１つの態様において、適切なペプチド医薬組成物の静脈内（ＩＶ）投与の投薬量は、約０．０１ｍｇ／時間から約１．０ｍｇ／時間を数時間に渡って（典型的には、１、３または６時間）投与され、この投与は、断続的な周期で数週間繰返すことができる。相当高い投薬量（例えば、約１０ｍｇ／ｍｌまでの範囲）は、薬物を隠れた部位にで、血流中でなく、特に、例えば，器官の体腔中にもしくは管腔中に、例えば、脳脊髄液（ＣＳＦ）中に投与する場合に用いることができる。
【０２７７】
本発明は、実施例を参照してさらに記載されるが；しかしながら、本発明はそのような実施例に限定されるものではないと理解されるべきである。
【０２７８】
ＥＮＵ−誘導型生殖細胞系の突然変異について、Ｃ５７ＢＬ／６マウスホモ接合型から誘導されたマクロファージをスクリーニングすることにより、我々は、ポリ−Ｉ：Ｃ（ＴＬＲ３−選択的刺激物）、レシキモド（ＴＬＲ７−選択的刺激物）およびＣｐＧモチーフを有する非メチル化ＤＮＡオリゴヌクレオチド（ＣｐＧ−ＯＤＮ；ＴＬＲ９−選択的刺激物）に対する応答で、正常な量のＴＮＦを産生できない、単一血統のＧ３動物を２体確認した。これらのマウスを繁殖させ、数多くのホモ接合型および偏性ヘテロ接合型の表現型の特徴を表す、ホモ接合型の変異体ストックを作製した。核酸感知（センシング）における三重の欠陥を意味する「トリプルＤ」（３ｄ）と称される、この変異体の表現型は、完全に劣性形質であり、１００％膜貫通性（ペネラント）であり、そして核酸の検出に特異的であった（図１ａ）。ＬＰＳ、リポタイコ酸、およびジ−およびトリ−両方のアシル化細菌性リポペプチドでは正常な感知が観察された。ＴＮＦ産生だけでなく、共刺激分子発現の誘導もまた、３ｄ変異体には見られなかった（図１ｂ）。しかしながら、ｐｏｌｙ−Ｉ：Ｃに対してある程度残留した応答は、以下のアッセイで明らかにされ、ｄｓＲＮＡ感知に関してＴｏｌｌ／ＩＬ−１受容体／耐性モチーフ（ＴＩＲ）−非依存的な経路が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに存在するという以前の観察結果と一致した（Hoebe,K.ら、Nature Immunology 4: 1223-1229, 2003）。とりわけ、３ｄホモ接合体は、正常に発達したリンパ系器官を有し、そして正常な数の末梢ＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞、およびＮＫＴ細胞を示した。これらはまた、抗原提示細胞表面に正常なレベルのクラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ抗原を発現する。
【０２７９】
３ｄ表現型は、刺激前に細胞をクロロキンで処理することによって部分的に模倣される（図示しない）。しかしながら、マクロファージおよび樹状細胞におけるエンドソームｐHの詳細な分析は、３ｄマウスの多数のエンドソーム成分ならびにゴルジ体の正常な酸性化を明らかにした（図１ｃ−ｄ）。
【０２８０】
図１は、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９のシグナル伝達が、３ｄ突然変異により抑制されるが、エンドソームｐＨに影響を与えないことを示す。（ａ）マウスに、３％チオグリコレートを腹膜内に注射した。３日後、マクロファージを単離し、種々の濃度のＴＬＲ−依存性の誘導物質、ポリ−Ｉ：Ｃ；レシキモド（Ｒｅｓ）；ＣｐＧ−オリゴデオキシヌクレオチド（ＣｐＧ）；リポ多糖（ＬＰＳ）；細菌性リポペプチドＰＡＭ、ＣｙｓＳｅｒ（Ｌｙｓ）４（ＬＰ）；およびペプチドグリカン／リポタイコ酸調製物（ＰＧＮ／ＬＴＡ）を含む、９６−ウェルプレートの各ウェルに５×１０５細胞密度で培養した。４時間、３７℃でインキュベートした後、培地をＴＮＦ−αバイオアッセイ（Ｌ−９２９細胞崩壊）のために回収した。値は、平均値±ｓ．ｅ．ｍで表す（ｎ＝マウス６匹）。（ｂ）ＴＬＲ３、７および９−誘導性の共刺激分子発現は、３ｄホモ接合体において阻害される。各点は、単一のマウスからのマクロファージ測定値を表す。青点は３ｄ／３ｄ；赤点は３ｄ／＋である。腹膜マクロファージは、誘導物質（ＣｐＧ、Ｒｓｑ、ＰＩＣ）と共に２４時間、または誘導せずそのまま（ＣＴＬ）インキュベートした。ＣＤ４０およびＣＤ８６の発現は、ＦＡＣＳにより分析した。
【０２８１】
実施例２
Ｃ５７ＢＬ／６マウスは通常、マウスサイトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）、β−ヘルペスウイルスに強い抵抗性を示すが、ＴＬＲ３およびＴＬＲ９経路を介したシグナル伝達に影響を与える突然変異は、それらに対する感染率を増大させることが知られているため、我々は、３ｄホモ接合型のその感染率を試験した（Hoebe,K.ら、Nature 424: 743-748, 2003；Tabeta,K.ら、Proc. Natl Acad. Sci. U. S. A. 101: 3516-3521, 2004）。ＭＣＭを１０５ｐｆｕ接種した動物は全て５日以内に死に、その脾臓の均一物中のウイルスの力価は、Ｃ５７ＢＬ／６対照動物（ＢＡＬＢ／ｃマウスに匹敵するＭＣＭＶ感染率を有する）と比較して、約１０，０００倍高い力価を示した。さらに、３ｄホモ接合体は、インビボでＭＣＭＶに対して適切なサイトカイン応答を起こさない（図２ａ−２ｆ）。ＭＣＭＶ感染の結果生じる死の短期間化は、３ｄにより先天的な免疫不全が生じていることを示す。他の微生物に対する先天的応答もまた損なわれていた。例えば、リステリア菌（Listeria monocytogenes）に対する応答でのＴＮＦおよびＩＬ−１２ｐ４０ｍＲＮＡの産生は、ＭｙＤ８８−依存性であることが知られている過程であり、エンドソームから脱出できない生物体（リステロリシン蛋白質を欠損するｈｌｙ変異体；図２ｇ−ｈ）を用いてマクロファージを感染させた場合、顕著に減少する。Edelson,B.T.およびUnanue,E.R. J. Immunol. 169: 3869-3875, 2002；McCaffrey,R.L.ら、Proc. Natl. Acad. Sci U. S. A 101: 11386-11391, 2004；Serbina,N.V.ら、Immunity 19: 891-901, 2003。とりわけ、マクロファージをｈｌｙ変異体のリステリア菌（L. monocytogenes）で感染させた場合、それらは、効率的にエンドソームから脱出できる野生型のリステリア菌生物で感染させたマクロファージよりも非常に多くのＩＬ−１２ｐ４０ｍＲＮＡを産生し、このことは、比較的強いシグナルが、エンドソーム内抑留の結果として生じることを示している。しかし、このシグナルは、宿主が３ｄ変異のホモ接合型の場合、無くなる。３ｄホモ接合型はまた、黄色ブドウ球菌感染をほとんど排除できなかった（図５）
【０２８２】
図２は、３ｄホモ接合体における感染に対する感染率を示す。（ａ）脾臓ウイルスの力価は、５×１０５ｐｆｕのＭＣＭＶを接種した４日目のプラーク形成アッセイにより決定した。Ｎは、それぞれの群のマウスの数を示す。ＢＡＬＢ／ｃマウスは、感染率に対する陽性対照として用いた。（ｂ）５×１０５ｐｆｕのＭＣＭＶをｉ．ｐ．接種した後の死亡率。Ｐ値は、３ｄ／３ｄマウスと＋／＋マウスとの間の比較を意味する。（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）および（ｆ）ＭＣＭＶ摂取（５×１０５ｐｆｕ、ｉ．ｐ）後３６時間の血漿中のインターフェロン−γ、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−αおよびＩ型インターフェロンそれぞれの濃度。インターフェロン−γ、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αは、ＥＬＩＳＡにより測定した；Ｉ型インターフェロン活性は、生物学的アッセイにより測定した（ＶＳＶプラーク形成の阻害）。Ｎは、マウスの数を示す。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍを表す。（ｇ）および（ｈ）３ｄ／３ｄ変異マウスからの初代骨髄由来マクロファージは、リステリア菌を用いた感染後のＩＬ−１２ｐ４０およびＴＮＦαの減少した発現を示す。野生型またはｈｌｙ変異リステリア菌に感染したＣ５７ＢＬ／６または３ｄ変異マウスからのマクロファージ中の、ＩＬ−１２ｐ４０およびＴＮＦ−αそれぞれをコードするｍＲＮＡ。測定は、感染（またはＰＡＭ３ＣＳＫ４を用いた刺激）後６時間で実時間ＰＣＲにより実施した。結果は、３回の独立した実験の平均値±ｓ．ｄとして示す。
【０２８３】
図5は、３ｄホモ接合変異体マウスが、グラム陽性黄色ブドウ球菌感染を阻止することができないことを示す。（ａ）野生型Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびホモ接合型の３ｄマウスは、それぞれ発光性の黄色ブドウ球菌（１０８Ｃ．ｆ．ｕ．ｍｌ−１）を静脈内注射された。３ｄホモ接合型のマウスは、注射後２日目に野生型の対照動物の細菌増殖と比較して、明らかに高い細菌増殖を示した。細菌増殖は、発光強度として表される。（ｂ）Ｘｅｎｏｇｅｎ  ＩＶＩＳイメージングシステムを用いた黄色ブドウ球菌増殖の実時間追跡。（ｃ）野生型および３ｄホモ接合体から分離されたマクロファージの熱殺菌された黄色ブドウ球菌誘導性のＴＮＦα産生。（ｄ）黄色ブドウ球菌（１０８ｃ．ｆ．ｕ．ｍｌ−１）の静脈内投与後の野生型のＣ５７ＢＬ／６マウス、３ｄ／３ｄおよびＴｌｒ２−／−マウスの生存率。
【０２８４】
実施例３
上記の欠陥から離れて、３ｄホモ接合体は、正常に抗原を処理することもできない。３ｄホモ接合体に、ＣＦＳＥ−標識ＯＴ−２細胞（オボアルブミン［ＯＶＡ］を認識する再配置されたＴ−細胞受容体のトランスジェニックＣ５７ＢＬ／６マウスからのＣＤ４Ｔ−細胞）を注射し、続いて高純度のＯＶＡを用いて抗原に暴露した場合、低下したＯＴ−２有糸分裂応答がインビボで観察された。かくして、クラスＩＩの抗原提示は大きく低下したが、３ｄ環境では完全に消失しなかった（図３ａ）。クラスＩの活性化のためのＯＶＡの交差提示は、３ｄ突然変異によっても阻害される。３ｄホモ接合型およびＣ５７ＢＬ／６対照マウスに、ＯＶＡを発現する、ＵＶ−照射したＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞（いずれかで示したように、ＴＬＲシグナル伝達から完全に独立した適切な免疫応答を示す；Ｈｏｅｂｅら、同時に提出された）を用いて免疫性を与えた。それらの脾臓を７日後に回収し、脾臓細胞をインビトロでクラスＩ−特異的ＯＶＡペプチドを用いて再び刺激した。この３ｄホモ接合体は、ＯＶＡペプチドＩ−特異的ＣＤ８＋、ＩＦＮγ＋細胞を生成せず、これらの細胞はペプチド抗原−付加標的に対して細胞溶解活性を示さなかった（図３ｂ）。
【０２８５】
図３は、３ｄホモ接合型マウスが、抗原提示能の欠損を示すことを表す。（ａ）クラスＩＩのＭＨＣ提示は、インビボでＣ５７ＢＬ／６３ｄ／３ｄマウスにおいて損なわれている。３ｄホモ接合型マウスに、静脈内注射でＣＦＳＥ−標識Ｖａ２＋ＣＤ４＋ＯＴ−２細胞を受けさせ、次いで、卵白から調製され、微生物汚染のない新鮮なニワトリ・オボアルブミン（ＯＶＡ）０．２５ｍｇを用いて抗原に暴露した。抗原−特異的Ｖａ２＋ＣＤ４＋細胞の分裂は、脾臓細胞において４８時間および７２時間後に測定した。２匹の突然変異マウスおよび２匹の野生型マウスにおいて実施した実験結果を示す。（ｂ）、（ｃ）クラスＩの活性化についてのオボアルブミンの交差提示は、３ｄ突然変異により阻害される。３ｄホモ接合型およびＣ５７ＢＬ／６対照マウスは、ＯＶＡを発現する、ＵＶ−照射したＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を用いて免疫性を与えた。７日後に、脾臓細胞を、インビトロでクラスＩ−特異的ＯＶＡペプチドを用いて再び刺激するか、または刺激しないで維持した（対照）。交差提示は、ＯＶＡペプチド−特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ−γ＋細胞の数およびＯＶＡペプチド−付加標的に対する細胞溶解活性を決定することにより評価した。
【０２８６】
実施例４
３ｄの遺伝子座は、一般的に、突然変異株を、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮマウス、および戻し交配した子孫および交雑した子孫と異系交配させることによりマッピングした。４５の有糸分裂では、その遺伝子座は、ＬＯＤのピーク値、８．６を示して、隣接する１９番目の染色体に割り当てられ、５１３１の有糸分裂では、その遺伝子座は、染色体間隔が０．４５Ｍｂ長であると確認された（セントロメアから０．５２から０．９７Ｍｂの間；アンサンブル距離、リリース２７．３３ｃ．１）。１つの交雑は、近接標識Ｄ１９Ｍｉｔ６８から突然変異を分離し、そして２つの交雑は、遠位標識Ｄ１９ＳＮＰ３から突然変異を分離した（図６）。これら３つの交雑事象はそれぞれ、次の世代のマウスでも確認された。重要な領域（図４ｂ）は、注釈が付された２０個の遺伝子を含む。全ての候補遺伝子は、注釈が付されたエキソンおよびスプライス部位のすべてを増幅するプライマーの組みを用いて、ｃＤＮＡレベルで、さらにゲノムＤＮＡレベルで配列決定された。１個および１個のみの突然変異、単一の塩基対転換が、ｕｎｃ−９３ｂ遺伝子の１１個のエキソンの９番目のエキソン内に確認され、ゲノムおよびｃＤＮＡ鋳型の両方で可視化された（図４ｃ）。この突然変異は、ミスセンス対立遺伝子を作り出し、予想される１２回膜貫通領域の９番目に正電荷の残基を導入することとなるため（Ｈ４１２Ｒ）、５９８ａａのｕｎｃ−９３ｂ蛋白質を変化させることが予想される。この問題の残基は、マウス、ラット、ヒト、ニワトリ、およびミドリフグ（green pufferfish）を含む、知られているすべての脊椎動物のｕｎｃ−９３ｂオーソログの中で普遍の残基である(図4d)。
【０２８７】
３ｄホモ接合体のマクロファージを、正常なｕｎｃ−９３ｂｃＤＮＡ配列を発現するようにトランスフェクトすることで、その表現型の欠陥（機能が損なわれた核酸感知）をインビトロで補完し、確認されたミスセンス変異の意義を確認する。変異ｃＤＮＡが過剰発現された場合、適度な相互優性の効果が明らかになる。正常型の蛋白質も変異型の蛋白質も、ＴＬＲ４−シグナル伝達に影響を及ぼさなかった（図４ｅ）。ＲＡＷ２６４．７マクロファージにおいて発現された場合、Ｃ−末端ＧＦＰ−標識種のｕｎｃ−９３ｂは、カルレティキュリンと共局在したため、このことは、ｕｎｃ−９３ｂが小胞体成分であることを示している（図４ｆ）。細胞表面の蛍光、エンドソームの蛍光、ゴルジ体の蛍光は観察されず、エンドソーム標識と共局在していないことは明白であった。
【０２８８】
図４は、３ｄ変異のポジショナルクローニングを示す。（ａ）３ｄ遺伝子座の粗いマイクロサテライトマッピング。表現型の分類は、ＣｐＧ−ＯＤＮ、レシキモドおよびポリＩ：Ｃにより誘導されるＴＮＦ−α産生の測定に基づく。５９の減数分裂では、Ｃ３Ｈ／ＨｅＮ×Ｃ５７ＢＬ／６交配に情報を与える５８個の標識を用い、突然変異は、ＬＯＤのピーク値８．７．を示して近傍の１９番目の染色体に位置した。（ｂ）３ｄの重要な領域の図解。３ｄの重要な領域は、パブリック・マイクロサテライト標識Ｄ１９Ｍｉｔ６８の側に、およびＤ１９ＳＮＰ３（セレラ・受入番号＃ｍｃｖ２４７１１４３０）の側にある。ｕｎｃ−９３ｂ（丸付き）は、３ｄと一致することが見出された。（ｃ）ｕｎｃ−９３ｂにおける突然変異のＣｏｎｓｅｄ表示(http://www.phrap.org/consed.html)。単一の塩基対転換（Ｔ→Ｃ）は、Ｈ４１２Ｒを生じる。（ｄ）３ｄ表現型のレスキューは、３ｄ対立遺伝子の穏やかな優性阻害の効果を明らかにする。変異型または野生型マウスからの骨髄−誘導樹状細胞を、所定のｃＤＮＡを含む２シストロン性のＧＦＰ−コード発現ベクターを用いてトランスフェクトした。ＴＮＦ−α陽性細胞を、ＰＩＣ刺激（１０μｇ／ｍｌ）、ＬＰＳ（１０ｎｇ／ｍｌ）を行い、または行わずに定量した。エラーバーは、独立した３回の実験のｓ．ｅ．ｍを示す。
【０２８９】
図６は、３ｄ領域の詳細な遺伝地図を示す。５１３１個の減数分裂において、突然変異多は、パブリック・マクロサイト標識Ｄ１９ｍｉｔ６８とＳＮＰ３との間に確認され（網かけのボックス；標識およびＳＮＰを表１に示す）、近傍の１つの交配および遠位の２つの交配に分けられる。
【０２９０】
実施例５
シー．エレガンス（C. elegans）において、ｕｎｃ９３は、３量体のカリウムチャネルの調節サブユニットである。Greenwald,I.S.およびHorvitz,H.R. Genetics 96: 147-164, 1980；Levin,J.Z.およびHorvitz,H.R. J Cell Biol. 117: 143-155, 1992；De,L.C.ら、J Neurosci. 23: 9133-9145, 2003。このチャネルの他の成分は、遺伝子ｓｕｐ−９およびｓｕｐ−１０にコードされている。このｓｕｐ−９産物は、哺乳類のＴＡＳＫファミリー蛋白質：２個の孔を有する酸−感受性カリウムチャネルと類似の配列を有する、３２９個のアミノ酸からなる蛋白質である。Bayliss,D.A.ら、Mol. Interv. 3: 205-219, 2003。遺伝的および生化学的議論に基づき、ｓｕｐ−１０およびｓｕｐ−９３は、カリウムチャネルの重要な調節成分をコードすると考えられている。De,L.C.ら、J Neurosci. 23: 9133-9145, 2003。哺乳類の状況では、ｕｎｃ−９３ｂは、関連する機能；すなわち、２個の孔を有するカリウムチャネルを調節する機能を果たすことが仮定できよう。あるいは、この蛋白質は、哺乳動物において、イオン輸送体と関係のない、全く新しい機能を担っているかもしれない。実際に、哺乳類の蛋白質は、シー．エレガンスの類似体とわずか１８％のアミノ酸同一性を有するのみである。
【０２９１】
ｕｎｃ−９３ｂは、ヒト樹状細胞において、およびマウスＢ−細胞において高発現されており（ＧＮＦエクスプレッション・アナトミイ・データベース（expression anatomy database））、このことは、微生物の感知および抗原提示における役割と一致する。この発現様式は、３ｄホモ接合体で観察された表現効果と一致する。ｕｎｃ−９３ｂの遠位パラログ（ｕｎｃ−９３ａ）が存在することが知られいるが、その機能は確立されないままである。ＳＭＡＲＴ（シンプル・モジュラー・アーキテクチャー・リサーチツール（Simple Modular Architecture Research Tool））は、ｕｎｃ−９３ａには高い信頼度をもって機能を割り当てられるようなドメインが存在しないことを示す。ｕｎｃ−９３ｂは１２回膜貫通領域を有するが、ｕｎｃ−９３ａは１０回膜貫通領域を有することが予測されている（図７）。
【０２９２】
実施例６
クラスＩのＭＨＣ分子における交差提示またはクラスＩＩのＭＨＣ提示のための微生物による外来抗原の感知および処理は両方とも、最初はファゴソーム中に、次いでエンドソームに、そして最終的にリソソーム成分中に存在する巨大分子の指向性輸送に関係する。クラスＩＩのＭＨＣペプチドのローディングは、酸性化した小胞区画内で生じ、局所的な蛋白質分解に関与すると考えられるが、クラスＩのＭＨＣ交差提示は、蛋白質がペプチドに変換されなければならず、次に、それらはＥＲに接近し易くなるはずであり、そこでクラスＩのＭＨＣへテロ二量体の抗原を提示する溝に組み込まれることとなることが必要である。交差提示のための蛋白質分解が、プロテアソームの作用を通じて細胞質内で生じること、および抗原提示に関係する輸送体（ＴＡＰ）の複合体は、細胞質のペプチドのＥＲへの輸送に関するチャネルとして役立つことは幅広く信じられている。核酸は、エンドソームの境界内またはＥＲ内でＴＬＲの活性化を潜在的に引き起こすが、後者の部位への輸送形式は、例え起こっているとしても現在は理解されていない。
【０２９３】
ｕｎｃ−９３ｂ内の単一のアミノ酸置換は、３つのＴＬＲを介したシグナル伝達を大きく損ない、生物学的に別個の２つの抗原提示経路もまた損なう。ｕｎｃ−９３ｂの細胞レベルの局在に関する最終的な結論は、直接的な抗体結合の研究を待たなければならない。しかしながら、ｕｎｃ−９３ｂがＥＲ内に存在するというこれまでの証拠からして、ｕｎｃ−９３ｂはクラスＩＩのＭＨＣ抗原またはクラスＩＩ  ＭＨＣローディングに必要とされる他の蛋白質のエンドソーム−標的化発現に潜在的に影響を及ぼし得る。あるいは、クラスＩＩ  ＭＨＣ抗原のペプチドローディングおよび表面発現は、「エンドソームの自立的な」過程ではなく、エンドソームとＥＲとの間の伝達を何らかの方法で必要とする。交差提示および核酸感知におけるｕｎｃ−９３ｂの役割は、同様に不明であるが、これら両方の過程でＥＲが関与していることは明白である。ｕｎｃ−９３ｂ自体のように、ＴＬＲ９は主にＥＲに局在するが、エンドソームで取り込まれたＤＮＡはエンドソームから管状のリソソームに送られる。Latz,E.ら、5: 190-198, 2004。ＴＬＲ９と、その標的リガンドとして機能し、ＴＬＲ９の活性化に必要とされるエンドソームで取り込まれたＤＮＡとの分子接触は、共通の細胞小器官内でリガンドと受容体の共局在を必要とするはずである。Bauer,S.ら、Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98: 9237-9242, 2001。本明細書で示されたデータは、ＥＲにｕｎｃ−９３ｂが明らかに存在する場所であるから、この活性化はＥＲ内で生じる可能性が高いことを示している。
【０２９４】
３ｄ突然変異は、抗原プロセシング、ＴＬＲシグナル転換、およびそれらの相互の関係に関する多くの疑問を抱かせる。直接的かもしくは間接的に、ｕｎｃ−９３ｂはエンドサイトーシスの成分とＥＲとの情報交換に必要とされ得る；すなわち、エンドソーム内で生じる巨大分子のチャネル、または小胞輸送、ドッキングまたは融合に必要とされ得る。ｕｎｃ−９３ｂが先天性免疫応答および適応的免疫応答の両方に必要とされるため、ｕｎｃ−９３ｂは、自己免疫病態および／または炎症病態の薬理学的介入についての魅力的な標的である。ｕｎｃ−９３ｂの完全な機序の理解は、ｕｎｃ−９３ｂが先天的防御にも必要とされる蛋白質として構成されているようであるため、適応免疫応答についての外来抗原プロセシングの進化に光を当てる助けともなり得る。
【０２９５】
実施例７
Ｕｎｃ９３ｂ１の構造、発現およびホモ接合型。生物情報科学分析は、Ｕｎｃ９３ｂ１が、マウスＢ−細胞で高発現されていること、およびそのヒト相同体（ＵＮＣ９３Ｂ１）が樹状細胞で高発現されていることを明らかにし（ＧＮＦエクスプレッション・アナトミイ・データベース）、このことは、微生物の感知および抗原提示の役割と一致し、そして３ｄホモ接合型で観察される表現効果と一致する。ＵＮＣ９３Ｂ１は、ジーンバンク・受入番号ＢＣ０１８３８８を有し、そして染色体１９Ａ（ＧｅｎｅＩＤ：５４４４５）に対してマッピングされた。ヒトにおいて、ｕｎｃ−９３Ｂに対して総数５個の蛋白質相同体が、アンサンブル（Ｅｎｓｅｍｂｌ）により予想されている。これらの内３個（非常に近接した遺伝子および他の染色体上にある２つの遺伝子によりコードされるものを含む）は、ほぼ完全な配列同一性を有するｕｎｃ−９３Ｂの切断型のようである。発現された蛋白質としてのそれらの存在は、まだ実験的に確かめられていない。ヒトおよびマウスの両方で、ｕｎｃ−９３Ａ（ＮＣＢＩ受入番号．ＣＡＤ１９５２３）は、その全長に沿って明らかな分散配列を有するｕｎｃ−９３Ｂの最も近傍のパラログであることが見出された。その機能は決定されていない。マウスでは、ｕｎｃ−９３Ａは、１７番目の染色体上の遺伝子（Ｕｎｃ９３Ａ；ＭＧＩ：１９３３２５０）によりコードされている。ｕｎｃ−９３Ａは、それ自体、機能未知であり、１１番明の染色体上の遺伝子によりコードされている、さらに遠位のパラログ（Ｕｎｃ９３Ｃ；ＭＧＩ：１９１７１５０）とホモ接合体であることが見出された。Ｓｕｒｅａｕ，A.ら、Nucleic Acids Res.. 25, 4513-4522, 1997。残りのその他の、より遠いファミリーメンバーの存在は、完全には否定できない。
【０２９６】
シンプル・モジュラー・アーキテクチャー・リサーチツール（Simple Modular Architecture Research Tool）（ＳＭＡＲＴ）分析は、高い信頼度で、機能を割り当てられることができるドメインがｕｎｃ−９３Ｂに存在しないことを明らかにした。１２４番目の残基と１８９番目の残基の間に、機能未知のｐＦＡＭドメイン（ＤＵＦ８９５）が同定され、ｕｎｃ−９３Ａ内および上記のより遠位のパラログ内で繰り返されていることも見出された。
【０２９７】
実施例８
ｕｎｃ−９３Ｂの細胞レベルの局在。ＴＬＲ３、７および９シグナル伝達、クラスＩＩ  ＭＨＣローディング、および交差提示されることとなる抗原の獲得はすべて、エンドソーム／リソソーム区画内で生じるため、ｕｎｃ−９３Ｂはこの細胞小器官系の成分であろうと予想される。しかしながら、驚くべきことに、Ｃ−末端ＧＦＰ−標識化またはｍｙｃ−標識化した分子種をＲＡＷ２６４．７マクロファージに発現させた場合、ｕｎｃ−９３Ｂは、広域に分散し、ＥＲ局在を連想させる網状模様を示すことが見出された。これは、ｍｙｃ−標識化ｕｎｃ−９３ＢがＥＲ標識、ＧＦＰ−ＫＤＥＬと共に広域の共局在を示すことにより確認された（ピアソンの共局在係＝０．８８；ｐ＜０．０１）。それと反対に、ｕｎｃ−９３Ｂの分布は、後期エンドソームおよびリソソームの標識であるＬＡＭＰ−１の分布とは明らかに異なっており、さらにゴルジまたは原形質膜の分布と明らかに異なっていた。
【０２９８】
次に、３ｄ突然変異が、クラスＩおよびクラスＩＩのＭＨＣ蛋白質の細胞内の分布、ならびにこれらの蛋白質の輸送における効果を通じてＴＬＲ３、７および９の細胞内の分布を変化させることが考えられた。しかしながら、詳細な免疫学的局在決定はこの仮説を否定する。ＴＬＲ９の直接の免疫染色は、点状の細胞膜様の小胞画分内に存在することを明らかにし、このことは、これまでの局在についてのＴＬＲ９のＧＦＰ−標識型を使用した研究の結論とは反対に、明らかにＥＲとは異なっていた。ＧＦＰ−標識ｕｎｃ−９３Ｂの再分配は、ＴＬＲ９またはＴＬＲ３リガンドに対する応答では観察されず、またホモ接合型の３ｄ細胞と野生型細胞との比較で観察されたリガンド取り込みまたは分布と異なっていた。３ｄホモ接合型および野生型マウスから集められたマクロファージの超微細構造分析では、これらの細胞はすべての点で同一と考えられ、unc-93Bの作用機序にこれ以上の見識を与えるものではなかった。
【０２９９】
実施例９
予備のデータは、Ｆａｓ抗原をコードする遺伝子のＬｐｒ対立遺伝子のホモ接合型を有するＣ５７ＢＬ／６マウスで通常発現する狼瘡様疾患は、Ｕｎｃ９３ｂ１の３ｄ対立遺伝子の同時のホモ接合型により抑制されることを示す。このことは、さらに全身性紅斑性狼瘡、マウスにおけるＦａｓ抗原の変異体によりモデル化されたヒト疾患の処置において、ｕｎｃ−９３Ｂ阻害物質の使用を支持する。ｕｎｃ−９３Ｂの阻害物質だけでなく、ｕｎｃ−９３Ｂに依存する下流の事象を阻害する阻害剤（例えば、ｕｎｃ−９３ｂによりエンドソームに標的化されたプロテアーゼの阻害物質）もまた、この点で有用であろう。
【０３００】
実施例１０
生殖細胞系突然変異生成：ＥＮＵは、シグマ社から入手し、生殖細胞系突然変異生成は、他の文献、Hoebe,K.ら、Nature 424: 743-748, 2003；Hoebe,K.ら、J. Endotoxin Res. 9: 250-255, 2003に記載されるように実施した。
【０３０１】
先天的な免疫活性体および抗体：サルモネラ・ミネソタ（Salmonella minesota）Ｒｅ５９５ＬＰＳは、アレキシス（Ａｌｅｘｉｓ）から入手した。ペプチドグリカンは、フルカ（Ｆｌｕｋａ）から購入した。ｄｓＲＮＡ（ポリ（Ｉ：Ｃ））は、アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Amersham Pharmacia Biotech）から入手した。Ｐａｍ３ＣｙｓＳｅｒ（Ｌｙｓ）４は、ＥＭＣマイクロコレクションズ（ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ）から購入した。ＧｍｂＨホスホチオネート−安定化ＣｐＧ−ＯＤＮ（５’−ＴＣＣＡＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＡＴＧＣＴ−３’）は、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手した。ＣＤ４０およびＣＤ８６に対するＦＩＴＣ−標識化抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから購入した。ＩＬ−１２およびＩＮＦ−γ測定のためのＥＬＩＳＡキットは、Ｒ＆Ｄシステムズから入手した。
【０３０２】
ＴＮＦ−αおよびＩ型インターフェロンアッセイ：ＴＮＦ−αアッセイは、以前に記載されたように実施した。Hoebe,K.ら、Nature 424: 743-748, 2003；Hoebe,K.ら、J. Endotoxin Res. 9: 250-255, 2003。Ｉ型インターフェロンアッセイは、OrangeおよびBironにより記載されたように実施された。Orange,J.S.およびBiron,C.A. J. Immunol. 156: 4746-4756, 1996。精製されたＩＦＮ−α（Ｒ＆Ｄシステムズ）を標準として用いた。
【０３０３】
エンドソームｐＨの決定
局在化についてのＧＦＰ−標識ｕｎｃ−９３ｂのレスキュー実験および発現。
骨髄細胞を用いたレスキュー実験は、他の文献に記載されるように実施した。Hoebe,K.ら、Nature 424: 743-748, 2003；Hoebe,K.ら、J. Endotoxin Res. 9: 250-255, 2003。ｕｎｃ−９３ｂおよびｕｎｃ−９３３ｄは、ベクターｐＧＦＰ−Ｎ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて発現させた。トランスフェクトした細胞を、ＧＦＰの蛍光により確認し、細胞内ＴＮＦ染色は、標識化した二次抗体を用いて集団で実施した。ＲＡＷ２６４．７細胞は、Ｃ−末端ＧＦＰ−標識型のｕｎｃ−９３ｂを有するベクターを用いて安定にトランスフェクトし、共局在の研究に用いた。
【０３０４】
MCMV感染研究。MCMV感染の研究は、以前に記載されたように実施した。Tabeta,K.ら、Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A 101: 3516-3521, 2004。
【０３０５】
リステリア菌による骨髄−由来マクロファージの感染。Ｃ５７ＢＬ／６および３ｄ／３ｄマウスから調製した初代骨髄マクロファージを、１００Ｕ／ｍｌのＩＦＮγ（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）と共に３６時間インキュベートした後、リステリア菌の野生株（ＭＯＩ〜５：１の１０４０３Ｓ）、アイソタイプΔｈｌｙ株（ＭＯＩ〜１００：１のＤＰ−Ｌ２１６１）で感染させるか、またはＰａｍ３ＣＳＫ４（３００ｎｇ／ｍｌ、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ））で刺激する。感染の６時間後に、全ＲＮＡを抽出し、ランダムヘキサマーを用いて逆転写した。ＩＬ−１２ｐ４０およびＴＮＦαをコードするｍＲＮＡレベルを、特異的なプライマーを用いたＳＹＢＲ（登録商標）グリーン・実時間定量ＰＣＲにより定量し、ＧＡＰＤＨｍＲＮＡのレベルで規格化した。
【０３０６】
クラスＩＩの抗原提示。ＯＴ−２マウスから得た１０７ＣＦＳＥ−標識化Ｖａ２＋ＣＤ４＋細胞を、３ｄホモ接合型マウスに静脈内注射にて移した。０．２５ｍｇ  ＯＶＡを用いて免疫性を与えた後、クラスＩＩの提示を、４８時間後および７２時間後に分裂したＶａ２＋ＣＤ４＋細胞のＣＦＳＥ強度をそれぞれ分析した。
【０３０７】
クラスＩ交差提示。３ｄホモ接合型およびＣ５７ＢＬ／６対照マウスを、アクチンプロモーターの影響下でＯＶＡ発現するＵＶ−照射した１０７  トランスジェニックＣ５７ＢＬ／６脾臓細胞を用いて免疫性を与えた。７日後に、脾臓細胞を免疫にしたマウスから回収し、クラスＩ−特異的ＯＶＡペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）を用いてインビボで再び刺激した。交差提示は、ＯＶＡペプチド−特異的ＣＤ８＋ＩＦＮ＋細胞の百分率ならびに作動体：標的の割合１００：１でＯＶＡペプチド−標識化標的細胞に対する細胞溶解活性を測定することによって評価した。
【０３０８】
それぞれ列挙した範囲には、それらの範囲およびそこに含まれる特定の数字のコンビネーションおよびサブ−コンビネーションの全てが含まれる。
【０３０９】
本明細書の詳細な説明で引用される文献および特許出願は全て、それら個々の文献または特許出願が具体的に、そして個別に示され、全ての目的に関し出典明示により一部とされるように、全ての目的について完全に出典明示により本明細書の一部とされる。
【０３１０】
上述の発明は、理解を明瞭にする目的で例示および実施例の形で幾分詳しく記載したが、当業者であれば本発明の教示内容に照らし、添付する請求の範囲の意図または目的を逸脱することなく、特定の変更および改良をこれらに施すことができることは容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【０３１１】
【図１】図１Ａ、１Ｂは、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７およびＴＬＲ９シグナル伝達が、３ｄ突然変異により抑制され、エンドソームのｐＨに影響を与えないことを示す。
【図２】図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、２Ｅ、２Ｆ、２Ｇ、２Ｈは、３ｄホモ接合体の感染に対する感染率を示す。
【図３】図３Ａ、３Ｂ、３Ｃは、３ｄホモ接合型マウスが提示抗原に対する不完全な能力を表すことを示す。
【図４】図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、４Ｄは、３ｄ突然変異のボジショナルクローニングを示す。
【図５】図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄは、３ｄホモ接合型の突然変異マウスが、グラム陽性の黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）の感染を阻止できないことを示す。
【図６】３ｄ領域の詳細な遺伝子マッピング（地図作製）を示す。
【図７】３ｄの重要な領域（アンサンブル距離）を確認するために用いたＳＮＰおよび新規なマイクロサテライト標識を示す。
【図８】ｕｎｃ−９３ｂの３ｄ変異体のｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図９】野生型のｕｎｃ−９３ｂのｃＤＮＡ配列およびアミノ酸配列を示す。
【図１】
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【図１Ａ】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月5日(2007.11.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008531057000001.app
【国際調査報告】
2008531057.tif 000028
2008531057.tif 000029
2008531057.tif 000030
2008531057.tif 000031
2008531057.tif 000032
2008531057.tif 000033
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