(57)【要約】  二つのプロテアーゼすなわちMMP-9およびカテプシンを標的とすることによる癌の治療法が提供されている。MMP-9および／またはカテプシンを阻害する一つあるいはそれ以上の植物抽出物から成る治療成分もまた提供されており、当該植物抽出物は、新生細胞および／または内皮細胞の移動、腫瘍の成長、腫瘍により誘発された血管形成および／または転移を阻害する能力を有するものである。本発明の治療成分群を癌の治療に用いることができ、従って、当該治療成分群を単独であるいは抗癌剤との組み合わせで使用することによる、腫瘍の成長、腫瘍の転移、および／または腫瘍により誘発された血管形成を阻害する方法もまた、提供されている。
2008516899.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
MMP-9およびカテプシンBの活性を阻害するための成分であり、前記成分は、MMP-9および／またはカテプシンBの活性を阻害する能力を有する一つあるいはそれ以上の植物抽出物および生理的に許容可能な担体から成り、前記成分は一つあるいはそれ以上の新生細胞の移動、内皮細胞の移動、腫瘍の成長、腫瘍の転移、および腫瘍により誘発された血管形成を阻害することを特徴とする前記のMMP-9およびカテプシンBの活性を阻害するための成分。 
【請求項２】
前記成分が二つあるいはそれ以上の植物抽出物から成る、請求項1に記載の成分。
【請求項３】
前記植物抽出物が表6から表9に記載された植物に由来する、請求項1あるいは2に記載の成分。
【請求項４】
前記植物抽出物の少なくとも一つがショウガ属（Zingiber genus）、ツガ属（Tsuga genus）、あるいはアキノキリンソウ属（Solidago genus）に属する一つの植物に由来する、請求項１、２、あるいは3のいずれかに記載された成分。
【請求項５】
前記植物抽出物の少なくとも一つがショウガ（Zingiber officinale）、ソリダゴ（Solidago sp.）、およびカナダツガ（Tsuga canadensis）から成る群から選択された一つ植物に由来する、請求項１、２、3、あるいは4のいずれかに記載された成分。 
【請求項６】
前記ソリダゴ（Solidago sp.）がソリダゴ・カナデンシス（Solidago Canadensis）、オオアワダチソウ（Solidago gigantea）、アキノキリンソウ（Solidago virgaurea）、アキノキリンソウ属交雑種（Solidago hybrida）、あるいはそれらの組み合わせである、請求項5に記載の成分。
【請求項７】
前記植物抽出物がショウガ（Zingiber officinale）およびソリダゴ（Solidago sp.）に由来する、請求項１、2、3、4、あるいは5のいずれかに記載された成分。
【請求項８】
前記植物抽出物がショウガ（Zingiber officinale）、およびソリダゴ・カナデンシス（Solidago Canadensis）か、オオアワダチソウ（Solidago gigantea）か、あるいはソリダゴ・カナデンシス（Solidago Canadensis）とオオアワダチソウ（Solidago gigantea）の組み合わせに由来する、請求項１、２、3、4、あるいは5のいずれかに記載された成分。
【請求項９】
前記植物抽出物がショウガ（Zingiber officinale）およびカナダツガ（Tsuga canadensis）に由来する、請求項１、２、3、4、あるいは5のいずれかに記載された成分。
【請求項１０】
さらに、一つあるいはそれ以上の合成MMP-9および／またはカテプシンB阻害剤から成る、請求項１、2、3、4、5、6、7、8 あるいは9のいずれかに記載された成分。
【請求項１１】
前記合成MMP-9および／またはカテプシンB阻害剤が、マリマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、メタスタット、E-64、CA-074 メチル-エステル、ロイペプチン、1-phenyl-1,4-epoxy-1H,4H-naphtho（1,8-de）（1, 2）dioxepin ANO-2) およびアイロマスタットから成る群から選択された、請求項10に記載の成分。
【請求項１２】
当該成分が経口投与用のニュートラシューティカルとして製剤化された、請求項１、2、3、4、5、6、7、8、9、10 あるいは 11のいずれかに記載された成分。
【請求項１３】
被験体における腫瘍の成長を阻害するための、請求項１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、あるいは12のいずれかに記載された成分の効果的な量の使用法。
【請求項１４】
前記成分が一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤と組み合わせて使用される、請求項13に記載の使用法。 
【請求項１５】
前記抗癌治療剤が化学治療剤である、請求項14に記載の使用法。
【請求項１６】
前記成分が前記化学治療剤の治療効果を増す、請求項15に記載の使用法。
【請求項１７】
前記化学治療剤が最適以下の投与量で使用される、請求項14あるいは15に記載の使用法。
【請求項１８】
前記被験体が太り過ぎあるいは肥満した被験体である、請求項16あるいは17に記載の使用法。
【請求項１９】
被験体における腫瘍転移を阻害するための、請求項１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、あるいは12のいずれかに記載された成分の効果的な量の使用法。
【請求項２０】
前記成分が一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤と組み合わせて使用される、請求項19に記載の使用法。 
【請求項２１】
前記抗癌治療剤が化学治療剤である、請求項20に記載の使用法。
【請求項２２】
前記成分が前記化学治療剤の治療効果を増す、請求項21に記載の使用法。
【請求項２３】
前記化学治療剤が最適以下の投与量で使用される、請求項21あるいは22に記載の使用法。
【請求項２４】
前記被験体が太り過ぎあるいは肥満した被験体である、請求項22あるいは23に記載の使用法。
【請求項２５】
被験体における腫瘍により誘発された血管形成を阻害するための、請求項１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、あるいは12のいずれかに記載された成分の効果的な量の使用法。
【請求項２６】
前記成分が一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤と組み合わせて使用される、請求項25に記載の使用法
【請求項２７】
前記抗癌治療剤が化学治療剤である、請求項26に記載の使用法。
【請求項２８】
前記成分が前記化学治療剤の治療効果を増す、請求項27に記載の使用法。
【請求項２９】
前記化学治療剤が最適以下の投与量で使用される、請求項27あるいは28に記載の使用法。
【請求項３０】
前記被験体が太り過ぎあるいは肥満した被験体である、請求項28あるいは29に記載の使用法。
【請求項３１】
被験体内の癌を治療するための薬剤の製造における、請求項１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、あるいは11のいずれかに記載された成分の使用法。
【請求項３２】
前記薬剤が一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤と組み合わせて使用されるためのものである、請求項31に記載の使用法*34。 
【請求項３３】
前記抗癌治療剤が化学治療剤である、請求項32に記載の使用法。
【請求項３４】
前記薬剤が前記化学治療剤の治療効果を増す、請求項33に記載の使用法。
【請求項３５】
前記化学治療剤が最適以下の投与量で使用される、請求項33あるいは34に記載の使用法。
【請求項３６】
前記被験体が太り過ぎあるいは肥満した被験体である、請求項34あるいは35に記載の使用法。
【請求項３７】
被験体内の癌を治療するためのニュートラシューティカルの製造における、請求項１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、あるいは11のいずれかに記載された成分の使用法。
【請求項３８】
当該ニュートラシューティカルが経口投与用に製剤化された、請求項37に記載の使用法。
【請求項３９】
前記ニュートラシューティカルが一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤と組み合わせて使用されるためのものである、請求項37あるいは38に記載の使用法。*35。
【請求項４０】
前記抗癌治療剤が化学治療剤である、請求項39に記載の使用法。
【請求項４１】
前記ニュートラシューティカルが前記化学治療剤の治療効果を増す、請求項40に記載の使用法。
【請求項４２】
前記化学治療剤が最適以下の投与量で使用される、請求項40あるいは41に記載の使用法。
【請求項４３】
前記被験体が太り過ぎあるいは肥満した被験体である、請求項41あるいは42に記載の使用法。
【請求項４４】
請求項１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、あるいは12のいずれかに記載された成分と、少なくとも１個の容器と、さらに使用に関する任意の指示とから成るキット。
【請求項４５】
請求項１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、あるいは12のいずれかに記載された成分と一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤とから成るキット。
【請求項４６】
請求項１、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、あるいは12のいずれかに記載された成分の効果的な量を、被験体に投与することから成る、被験体における癌を治療する方法。
【請求項４７】
前記成分が経口投与される、請求項46に記載の方法。
【請求項４８】
前記成分が、一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤との組み合わせで投与される、請求項46あるいは47に記載の方法。 
【請求項４９】
前記抗癌治療剤が化学治療剤である、請求項48に記載の方法。
【請求項５０】
前記成分が前記化学治療剤の治療効果を増す、請求項49に記載の方法。
【請求項５１】
前記化学治療剤が最適以下の投与量で使用される、請求項49あるいは50に記載の方法。
【請求項５２】
前記被験体が太り過ぎあるいは肥満した被験体である、請求項50あるいは51に記載の方法。
【請求項５３】
被験体内の癌の治療において使用される化学治療剤のアジュバントとして使用することができる成分であり、前記成分は、MMP-9および／またはカテプシンBの活性を阻害する能力を有する一つあるいはそれ以上の植物抽出物および生理的に許容可能な担体から成り、前記成分は前記化学治療剤の治療効果を増すことを特徴とする、前記の被験体内の癌の治療において使用される化学治療剤のアジュバントとして使用することができる成分。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌治療の分野、より詳細には癌治療のための薬学的且つ自然療法的な成分の分野に関する。
【発明の背景】
【０００２】
癌は、多種多様な悪性新生物すなわち、正常な状態に比べてより迅速な細胞増殖により成長する異常な組織）の全てを表すのに用いられる一般的な用語であり、その多くが周囲の組織に浸潤し、複数の部位に転移する可能性があり、除去後に再発する可能性が高く、適切に治療しなければ死を招くStedman's Medical Dictionary, Williams & Wilkins, Baltimore, Md., 26th ed. 1995)。外科的切除、放射線治療、および化学療法を含む多様なアプローチが何年もの間利用可能であり広く利用されてきたが、癌は、全世界において依然として首位を占める死亡原因の一つである。 
【０００３】
数多くの化学療法が開発されてきたが、その多くが望ましくない有害事象と関連している。さらに、場合によっては、高齢の患者および肥満あるいは好中球減少症を有する患者などのある特定の患者サブグループは、標準あるいは最適な化学療法投与量に対する不耐を呈し、その結果として癌治療期間中に化学療法薬の最適以下の投与量を投与されている Griggs JJ, Sorbero MES, Lyman GH, 2005) Arch Inter Med, 16511):1267-73; Colleoni M, Gelber RD et al., 2005) Lancet, 3669491):1108-10. Madarnas Y, et al., 2001) Breast Cancer Res Treat, 662):123-33, and Lyman GH, Dale DC, Crawford J., 2003) J Clin Oncol, 2124):4524-31）。Griggs 等が実証したところによると、これらの最適以下の投与量を、乳癌に罹患した肥満女性の群の投与した場合、アウトカムは悪かったという。この場合、高投与量に関連した毒性効果が諸器官に及ぶことを考慮し、患者の身体の大きさに基づいた最適投与量を肥満した個人に対し投与することはできなかった。現在、アジュバントNeupogen(R)を投与すれば、化学療法薬をより高い投与量で投与することができる。ここでは、白血球の回復を早めることにより、患者が化学療法薬のより高い投与量に耐えることができるようにしている。 
【０００４】
セリンプロテアーゼ、カテプシン、およびマトリクス・メタロプロテアーゼ MMPs)のような細胞外プロテアーゼEPs)は、腫瘍成長の増進に複数の役割を果たしていると考えられている。EPsは、コラーゲンおよびグリコサミノグリカンを含む細胞外マトリクスECM)マクロ分子の代謝回転を制御すると知られており、この制御機能は、血管形成、白血球あるいは癌細胞移動および腫瘍浸潤などの多様な生物学的過程について重要である。EPsはまた、腫瘍成長を増進させる成長因子の分泌および活性化にも関係している。さらに、EPs の分泌は、腫瘍を直接囲む組織内においてECMを分解させ、腫瘍が拡大することを許容する過程において、重要であると考えられておりLiotta LA et al: Nature 1980 Mar 6; 284 5751):67-8)、ある種のEPsは新しい血管を形成する過程で必要であり、新血管形成は、酸素、廃棄物および成長因子を運搬する形成過程の腫瘍に必要であり、腫瘍の成長に貢献する。 
【０００５】
腫瘍が一旦成長し血管化されると、腫瘍は、最初の腫瘍から離れた場所に自己を確立させる可能性をも有するようになる転移として知られる、複雑な複数段階から成る過程）。首尾よく転移するためには、新生細胞が原発腫瘍の塊から組織壁を越えて移動する必要がある。これには、マトリックス物質の貫入およびタンパク質分解を伴った、原発部から間質性ストローマ （interstitial stroma）への細胞の遊走が関連する。EPsは、この過程に貢献すると考えられている。 
【０００６】
MMPs には、そのアップレギュレーションが、ある種の癌で観察されているものがある。例えば、MMP-9は、進行期の黒色腫細胞内で過剰発現されていることが報告されているMacDougall et al. Cancer Res 55: 4174-4181, 1995）。カテプシンBレベルもまた、同種の非悪性組織に比べて、腫瘍において高いことが報告されているMurnane et al, Cancer Res. 1991; 51:1137:42）。さらに、カテプシンB 発現は、腫瘍のグレードおよびリンパ節転移巣と相関関係を示すことが報告されており、さらにある腫瘍については全体生存率および疾患再発率と相関関係を示すことが報告されているPlebani et al., Cancer, 1995, 76:367-75）。例えば、転移した胃がんは、転移のない癌に比べて、カテプシンB のレベルが高かった。しかし、膵臓腫瘍においては、カテプシンB の過剰発現は、浸潤性と関連性があるように思われるが、転移には関連性がないように思われるOhta et al, Br. J Cancer, 1994; 69: 152-6）。  
【０００７】
癌の発症におけるMMPs および カテプシンの正確な役割は明確ではないが、MMP-9 あるいはカテプシン Bのような、個々のEPsに対する阻害因子が癌に対する新規の治療法を象徴し得るということが示唆されている。いくつかの合成MMP 阻害因子が、癌治療において使用される可能性を念頭において開発されており、その例には、マリマスタット、プリノマスタット、タノマスタットあるいはメタスタットが挙げられる。しかし、これらの薬剤は、進行癌に罹患した患者に対する第III相治験以降をまだ通過していない。
【０００８】
現在のところ、カテプシン Bの合成阻害因子あるいは天然阻害因子は、どれも治験に達していない。当初治療効果を有する可能性があると考えられた合成阻害因子が例えば、システインプロテアーゼの潜在的不可逆的阻害剤であるE-64や、より選択性の強いカテプシンB阻害剤であるCA-074メチルエステルなど）発見された。しかし、これらの阻害剤は、基質特異性の欠如あるいは不可逆的な阻害因子プロファイルという理由で、臨床的な使用法にはそれ以上開発されていない。非選択性のカテプシンB阻害剤であるロイペプチン（Leupeptin）を、ドキソルビシンと共に投与し、動物における腫瘍を治療した Leto et al. Anticancer Res., 50:6278, 1990）。ネズミグリア芽細胞腫につき、ロイペプチンをシスタチンC内因性分子）と組み合わせたKonduri et al., Oncogene 21:8705）。  ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性因子 u-PA) および カテプシンBの環式過酸化物1-フェニル-1, 4-エポキシ-1H,4H-ナフト（1,8-de）（1, 2）ジオキセピン; ANO-2)阻害剤もまた、近年発見されArakawa et al, Int. J. Cancer 2002 Jul 10:1002) 220-7) 、ルイス肺癌モデルにおいて有望な活性を示した。これらの結果にも関わらず、これらの薬剤のさらなる研究は、行なわれていないのは明らかである。 
【０００９】
MMP-9を含むMMPs の阻害剤を、植物から抽出した。例えば、Sazuka et al, 1997) Biosci. Biotechnol. Biochem., 61: 1504-1506は、ゼラチナーゼMMP-2 および MMP-9)および転移が、緑茶および紅茶から単離された化合物により阻害されたことを報告している。Kumagai et al, JP 08104628 A2, April 1, 1996 CA 125: 67741) は、コラゲナーゼあるMMP）を阻害する目的で、コガネバナ（Scutellaris baicanlensis） *1の根から単離したフラボンおよびアントシアニンを使用したことを報告している。Dubois et al., 1998) FEBS Lett., 427: 275-278は、ある植物レクチンにより、有毒性のゼラチナーゼB MMP-9)の分泌が増加したと報告している。Nagase et al.,1998) Planta Med., 64: 216-219は、ソラナム・メロンゲーナナス）（Solanum melongen） *2から単離したフラボノイドであるディルフィニジンにより、コラゲナーゼが弱く阻害されたことを報告している。
【００１０】
癌の治療あるいは血管形成の阻害のための、植物抽出物あるいは植物抽出物から成る構成要素が説明されている。例えば、米国特許番号6,649,650は、相乗効果を有するリグナン成分を説明している。この成分は、ヒマラヤマツ（Cedrus deodar）の植物抽出物から得たものであり、乳癌、子宮頸癌、神経芽細胞腫、結腸癌、肝臓癌、肺がん、口内癌、卵巣癌、および前立腺癌に対し抗癌活性を示した。米国特許番号6,632,798は、血管形成を阻害するオレウロペイン（oleouropein）から成る植物抽出物を説明している。米国特許出願番号2004/0009239は、アノエクトチルス属の植物、特にアノエクトチルス属キバナシュスラン（Anoectochilus formosanus） の草本抽出物、および多様なヒトの悪性疾患の化学予防あるいは補足的・代替的制御を目的として当該抽出物を使用することを開示している。米国特許出願番号2003/0171334 は、トウダイグサ科（Euphorbiaceae family）の要素から得たジテルペン属（diterpene family）の化学剤から成る植物抽出物を、前立腺癌あるいは関連癌あるいは病気を治療するために使用すること開示している。米国特許出願番号2003/0118677は、トウダイグサ科のオベサ（Euphorbaciae obesa）から得た植物抽出物、および癌細胞のアポプトシスおよび成長阻害を含むその使用について説明している。
【００１１】
この背景情報は、本発明に関連性があると出願人が考える情報を知らせる目的で、提供されている。先に記載した情報が本発明に反する従来の技術の一部をなすということは、故意に意図されておらず、あるいはそのように解釈されるべきでない。
【発明の要約】
【００１２】
本発明の一つの目的は、癌治療のための植物抽出物から成る方法群および成分群を提供することである。本発明の一局面は、腫瘍の成長および／または転移を弱め同時にMMP-9 および カテプシン Bの活性を阻害する方法群を提供している。 
【００１３】
本発明の一局面と一致して、MMP-9およびカテプシンB 活性を阻害する一成分が提供されており、当該成分は、MMP-9および／またはカテプシンB 活性を阻害する能力を有する一つあるいはそれ以上の植物抽出物と生理的に許容可能な担体から成り、当該成分は一つあるいはそれ以上の新生細胞の移動、内皮細胞の移動、腫瘍の成長、腫瘍の転移、および腫瘍により誘発された血管形成を阻害する。 
【００１４】
本発明の別の局面と一致して、被験体の体内の腫瘍の成長を阻害する目的で、本発明の成分を効果的な量で使用することが提供されている。
【００１５】
本発明の別の局面と一致して、被験体の体内の腫瘍の転移を阻害する目的で、本発明の成分を効果的な量で使用することが提供されている。
【００１６】
本発明の別の局面と一致して、被験体の体内の腫瘍により誘発された血管形成を阻害する目的で、本発明の成分を効果的な量で使用することが提供されている。 
【００１７】
本発明の別の局面と一致して、被験体の体内の癌を治療するための薬剤を製造する目的で、本発明の成分を使用することが提供されている。
【００１８】
本発明の別の局面と一致して、被験体の体内の癌を治療するためのニュートラシューティカルを製造する目的で、本発明の成分を使用することが提供されている。
【００１９】
本発明の別の局面と一致して、本発明の成分、少なくとも1個の容器、および任意に使用上の指示から成るキットが提供されている。
【００２０】
本発明の別の局面と一致して、本発明の成分、および一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤から成るキットが提供されている。
【００２１】
本発明の別の局面と一致して、被験体に対し本発明の成分の効果的な量を投与することから成る、被験体の体内の癌を治療する方法が提供されている。
【００２２】
本発明の一局面と一致して、被験体体内の癌を治療する過程において化学治療剤に対するアジュバントとして使用するための一成分が提供されており、当該成分は、MMP-9および／またはカテプシンB 活性を阻害する能力を有する一つあるいはそれ以上の植物抽出物と生理的に許容可能な担体から成り、当該成分は当該化学治療剤の治療効力を増す。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】図1は、それぞれ固体植物材料に由来する植物抽出物を作製するために、本発明の一つの実施例により従うことができる手続きの概要を表している。
【００２４】
【図２】図2は、それぞれ固体植物材料に由来する植物抽出物を作製するために、本発明の別の実施例により従うことができる手続きの概要を表している。
【００２５】
【図３】図3は、図1に示した手続きを詳細に説明している。
【００２６】
【図４】図4は、図2に示した手続きを詳細に説明している。
【００２７】
【図５】図5は、植物抽出物を作製するために、図1に示した手続きに基づき従うことができる商業的手続きの概要を表している。
【００２８】
【図６】図6は、あぶらな科イベリス属（Iberis sempervirens） から得た抽出物の新生細胞移動に対する効果を表している：A)処置を施さない対照細胞；B)濃度が0.5Xのあぶらな科イベリス属（Iberis sempervirens） 抽出物で処置した細胞；C)濃度が1Xのあぶらな科イベリス属（Iberis sempervirens） 抽出物で処置した細胞。
【００２９】
【図７】図7は、培養ヒト臍帯静脈血管内皮細胞 HUVEC)細胞モードにおける本発明の植物抽出物の抗血管形成効果を表している：A) 陰性対照ビヒクル）；B) 陽性対照GM-6001 25μg/mL)；C) 陽性対照フマギリン15μg/mL)、およびD) 植物抽出物B 10μg/mL)。
【００３０】
【図８】図8は、腫瘍細胞モデルにおける本発明の植物抽出物の抗浸潤効果を表している：A) 浸潤細胞MDA-MD231)； B) 非浸潤細胞MCF7)；および C) 植物抽出物A 50μg/mL)。
【００３１】
【図９】図9は、ネズミの転移ルイス肺癌モデルにおける、シスプラチンと組み合わせた場合の本発明の植物抽出物の効果を表している。
【００３２】
【図１０】図10は、シスプラチンと組み合わせて本発明の植物抽出物を用いて処置したネズミルイス肺癌モデル）の体重変化を表している。
【００３３】
【図１１】図11は、ネズミの腫瘍成長の黒色腫モデルにおける腫瘍の質量に対する、本発明の植物抽出物を単独で用いた場合の効果、およびドキソルビシンを組み合わせて用いた場合の効果を表している。
【００３４】
【図１２】図12は、ネズミの腫瘍成長の黒色腫モデルにおける腫瘍の百分率成長に対する、本発明の植物抽出物を単独で用いた場合の効果、およびドキソルビシンを組み合わせて用いた場合の効果を表している。
【発明の詳細なる説明】
【００３５】
本発明は、二つのプロテアーゼの同時標的化、マトリクス・メタロプロテアーゼ9 MMP-9)、およびカテプシンBによる、癌の治療に関する。本書で実証されているように、これらの二つのプロテアーゼの同時標的化は、一つあるいはそれ以上の新生細胞の移動、内皮細胞の移動、腫瘍の成長、腫瘍により誘発された血管形成、および腫瘍の転移を阻害する上で、効果的である。従って、本発明は、MMP-9 および カテプシンBの同時阻害が可能な治療成分群を提供する。本発明の治療成分群は、フィトシューティカル、ニュートラシューティカル、あるいは薬剤として製剤化することができ、これらを従来の治療プログラム、自然療法プログラム、および／または栄養／サプリメントプログラムに従って投与することができる。本発明はさらに、被験体の体内におけるMMP-9 および カテプシンBの組み合わせ阻害に関与する、癌治療のための一戦略を提供する。従って、MMP-9 阻害剤およびカテプシンB阻害剤の効果的な量を被験体に投与することにより、腫瘍の成長、腫瘍により誘発された血管形成、および／または転移を阻害する方法が提供されている。 
【００３６】
本発明の治療成分群は、ひとつあるいはそれ以上の植物抽出物、あるいは植物抽出物から作製された準精製された／精製された化合物群)から成り、MMP-9 および カテプシンB を阻害する能力を有する。当該治療成分群は、MMP-9 あるいは カテプシンB あるいはそれらの双方を阻害する能力を有する単一の植物抽出物から成っていてよく、あるいはまた当該治療成分は、それぞれがMMP-9 あるいは カテプシンB あるいはそれらの双方を阻害する能力を有する植物抽出物である二つあるいはそれ以上の植物抽出物から成っていてよい。当該治療成分群はさらに、それぞれがMMP-9 あるいは カテプシンB あるいはそれらの双方を阻害する能力を有するひとつあるいはそれ以上の合成阻害剤から成っていてよい。 
【００３７】
本発明の治療成分群は、一つあるいはそれ以上の新生細胞の移動、内皮細胞の移動、腫瘍の成長、腫瘍により誘発された血管形成、および腫瘍の転移を阻害する能力を有する。当該の治療成分群は、従って、腫瘍の成長、腫瘍の転移および／またはin vivoにおける腫瘍により誘発された血管形成を阻害することが望ましい癌の治療に用いることができる。本発明は、当該の治療成分群を初期の癌に罹患した哺乳類に投与し、腫瘍の成長および／または転移に対するその効果により、当該疾患の進行を弱めることを考慮している。当該の成分群を、腫瘍発生リスクの高い被験体に対し予防的に投与するか、あるいは癌の再発を予防する目的で第一の治療の直後に投与するということもまた、考慮されている。当該の成分群はまた、進行癌に罹患した哺乳類に投与するのに適切である。例えば、当該の治療成分群の効果は、腫瘍を弱体化させることにつながり、その結果、腫瘍は標準の抗癌治療剤に対し反応性が高くなる。
【００３８】
本発明は、当該成分群単独の使用、あるいはまた組み合わせ治療の一部として当該成分群を一つあるいはそれ以上の既知の抗癌剤と組み合わせた利用を考慮している。本発明の治療の組み合わせ群は、それらを構成する治療成分あるいは抗癌治療剤群) の治療効果より多大な最終治療効果を有する。例えば、望ましい効果を生むために必要である既知の抗癌治療剤の投与量における減少として、当該抗癌治療剤群)に関連した有害事象における減少として、当該抗癌治療剤群)の効用における増加として、あるいはまたこれらの効果の組み合わせとして、より多大な最終治療効果を現すことが可能である。このように、本発明は、標準抗癌治療を最適以下の投与量で投与する複数の組み合わせ治療で、当該治療成分群を使用することを考慮している。
【００３９】
本発明の当該治療成分群が化学治療剤群)の最適以下の投与量の効力を増すように作用することを考慮に入れ、一つのの治療剤をひとつあるいはそれ以上の化学治療剤と組み合わせて使用することが考慮されており、当該化学治療剤は標準化学治療剤に対し不耐性を呈する被験体の治療において最適以下の投与量で投与する。 
定義
【００４０】
別途定義しない限りは、本書で使用している全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する業界の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
【００４１】
「可能性のある植物」という語は、本書で使用されているように、植物界の全ての種を含むように意図されており、それには陸生、水生、あるいはその他の植物が含まれ、それらはさらに、緑色植物門 （Division Chlorophyta）、紅色植物門（Division Rhodophora might be a mistake for Division Rhodophyta） 、 褐藻植物門 （Division Paeophyta） 、コケ苔)植物門 （Division Bryophyta） 、および維管束植物門（Division Tracheophyta） ； ヒカゲノカズラ亜門（Subdivision Lycopsida） 、トクサ亜門（Subdivision Sphenopsida） 、シダ類亜門（Subdivision Pteropsida） 、およびSubdivision Spermopsida *3；裸子植物綱（Class Gymnospermae） 、被子植物綱（Class Angiospermae） 、双子葉植物亜綱（Subclass Dicotyledonidae） 、およびSubclass Monocotyledonidae *4が含まれる。一般的に言って、植物、草本、および藻類などの下等植物は、本発明に従って、可能性のある植物と考えられる。
【００４２】
可能性のある植物という語は、単一の植物種を意味するために使ってよく、また、例えば、ある地理的領域に固有の密接に関連した種の一群など、単一の属内の多くの密接に関連した種について使ってもよい。本書において植物が種名により同定されている場合は、その種の変種および雑種の全てがその種名により含まれるということを理解されたい。
【００４３】
「植物材料」という語は、本書で使用されているように、個々であるいは群で使用されている一つの植物のいかなる部分あるいは複数の部分をも意味する。その例には、本発明の可能性のある植物として本書で説明されている植物を含む、植物の葉、花、根、種子、茎、根茎、塊茎、およびその他の部分が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【００４４】
「細胞外プロテアーゼ」すなわち「EP」という語は、本書で使用されているように、タンパク質を分解するすなわち、タンパク質分解）能力を有し、細胞の外で分泌されるか、あるいは細胞の外に効果を及ぼす酵素を意味する。当該細胞は原核細胞あるいは真核細胞であってよい。細胞外プロテアーゼに例には、マトリックス・メタロプロテナーゼMMPs) *5、カテプシン、エラスターゼ、プラスミン、TPA、uPA、カリクレイン、ADAMS ファミリー構成要素、ネプリライシン、ジンジパイン、クロストリパイン、サーモライシン、セラライシン、およびその他のバクテリア系またはウィルス系のプロテアーゼが含まれるがそれらに限定されるものではない。カテプシンは一般的にリソソームに存在するが、カテプシンの多くが細胞外で起こる生理的および病理的事象になんらかの役割を果たしていることが報告されている Reinheckel T et al: Biol Chem 2001;3825):735-741; Tepel C et al: J Cell Sci. 2000 Dec;113 Pt 24:4487-98）。細胞外マトリックスにおいて顕著な効果を発揮するカテプシンのようなプロテアーゼは、従って、本発明の文脈では細胞外プロテアーゼと考えられる。カテプシンB および MMP-9は、細胞外プロテアーゼである。  
【００４５】
「細胞外プロテアーゼのパネル」という語は、本発明の抽出過程を通して阻害活性の有無をモニターするルーチンアッセイを行なうために使用される独特な複数の細胞外プロテアーゼを意味する。一つのパネルは、一般的に、少なくとも二つのプロテアーゼから成るが、ある目的ではわずか一つのプロテアーゼから成る場合もある。当業者は、スループットの高いスクリーニングテクニックが発達するにつれ、技術の許す限り多くの細胞外プロテアーゼについて阻害活性の有無を調べるアッセイをルーチンとして行なうことができるであろうということをよく理解するであろう。 
【００４６】
「植物抽出物」という語は、本書で使用されているように、本書に記載されているような標準手続きに続いて、植物材料に溶媒を接触させることにより調製された成分を意味する。当該の語は、簡単な抽出法により調製された粗抽出液のみならず、一つあるいはそれ以上の分離段階および／または精製段階に供された粗抽出液をも含み、それらには、粗抽出液を一つあるいはそれ以上の付加的な抽出段階、濃縮段階、分画段階、ろ過段階、凝縮段階、蒸留段階、あるいはその他の精製段階に供することにより粗抽出液から得られた準精製および精製した分画および濃縮液が含まれる。植物抽出物は、溶液、濃縮液あるいは蒸留水などの液体の形態であってよく、また顆粒あるいは粉末などの固体の形態であってよい。
【００４７】
「可能性のある抽出物」という語は、本書で使用されているように、一つあるいはそれ以上の細胞外プロテアーゼに対する阻害活性を有するとまだ判断されていない植物抽出物を意味する。
【００４８】
「本発明の抽出物」という語は、本書で使用されているように、MMP-9および／またはカテプシンBに対する阻害活性を示し、一つあるいはそれ以上の新生細胞の移動、内皮細胞の移動、腫瘍の成長、腫瘍により誘発された血管形成、および腫瘍の転移を阻害する能力を有する植物抽出物を意味する。
【００４９】
「プロテアーゼ阻害剤」という語は、本書で使用されているように、プロテアーゼのタンパク質分解活性を減衰させる植物抽出物あるいは化合物を意味する。プロテアーゼ阻害剤は、タンパク様であってもなくてもよい。 
【００５０】
「ストレッサー」という語は、本書で使用されているように、物理的因子、化学化合物、あるいは生物剤など、植物における防御反応を活性化させ、それにより細胞外プロテアーゼ阻害剤の産出を誘発するために使用される因子を意味する。誘導因子および誘発因子もまた、ストレッサーと考えられる。 
【００５１】
「実質的に精製された」あるいは「実質的に純粋である」あるいは「単離された」という語は、プロテアーゼ阻害活性を有する化合物あるいは化合物群について使用される場合には、当該化合物が植物において天然状態で関連性を持つタンパク質、核酸、脂質、炭水化物あるいはその他の物質を比較的含まない化合物群)の形態を意味する。本書に開示されているように、本発明の植物抽出物は、当該植物抽出物が得られた植物組織から当該植物抽出物が分離されているという点において、実質的に精製されていると考えられる。さらに、プロテアーゼ阻害活性を有する化合物群で抽出物内に存在しているものを、本書で説明しているようなルーチンあるいは既知の方法群を用いて、さらに精製することができる。そのようなものとして、本発明の実質的に純粋であるプロテアーゼ阻害剤は、１パーセント未満の試料から成るか、あるいは少なくとも約1パーセント乃至数パーセント、例えば、少なくとも約5パーセントの試料から成っていてよい。一つの実施例では、実質的に純粋であるプロテアーゼ阻害剤は、少なくとも約20パーセントの試料から成る。別の実施例では、プロテアーゼ阻害剤はさらに精製され、少なくとも約50パーセントの試料から成る。さらなる実施例では、プロテアーゼ阻害剤はさらに精製され、少なくとも約80パーセントの試料から成る。その他の実施例では、プロテアーゼ阻害剤はさらに精製され、少なくとも約90パーセントの試料、あるいは少なくとも約95パーセントの試料あるいはそれ以上パーセンテージの試料から成る。プロテアーゼ阻害剤が実質的に純粋であるという判断は、本書で開示している方法群あるいは当業界で既知である方法群を用いて下すことができ、そのような方法群の例には、例えば、電気泳動法を行なって化合物を比較的ディスクリートなバンドとして同定するか、あるいはまた薄層クロマトグラフィーを行なうことが含まれる。
【００５２】
「選択的」という語は、細胞外プロテアーゼの阻害に関連して本書で使用されているように、植物抽出物、分子、あるいは化合物が選択された細胞外プロテアーゼを、その他の酵素群に対するIC50 値に比べて、少なくとも1/2対数低いIC50 値で、阻害するということを示す。
【００５３】
「弱める」および「阻害する」という語は、本書で相互変換可能に使用されているように、遅くする、減少させる、遅延させる、あるいは防ぐという意味である。
【００５４】
「細胞移動」という語は、本書で使用されているように、単一の細胞あるいは複数の細胞群の、一つの遺伝子座から別の遺伝子座への移動一般的に、異常な移動）を意味する。細胞移動の例には、血管形成中に細胞群がECMあるいは基底板を通して移動することが、含まれる。
【００５５】
「治療」および「処置」という語は、本書で相互変換可能に使用されているように、治療および処置を受けている個体の状態を改善する意図を以って行なわれる介入を意味する。改善は、主観的あるいは客観的であってよく、治療されている疾患、障害、あるいは病気に関連した症状の改善、それらの発症の予防、あるいはそれらの病状を改変することに関連する。このように、治療および処置という語は、広範な意味で使用されており、多様な病期にある疾患、障害、あるいは病気の防止予防）、緩和、減少、および治癒が含まれる。治療および処置を受けている個体の病気が悪化することを防ぐことすなわち、疾患、障害あるいは病気の安定化）も、これらの語に含められる。治療および処置を必要としている対象には、既に疾患、障害あるいは病気に罹患している個体、疾患、障害あるいは病気を発症する傾向があるかあるいはリスクがある個体、および疾患、障害あるいは病気を予防する必要がある個体が含まれる。 
【００５６】
「ニュートラシューティカル」という語は、本書で使用されているように、健康を保護あるいは促進し、および／または被験体の長期的健康に影響を及ぼすような利益を被験体に提供する食物あるいは栄養補助食品を意味する。 
【００５７】
「 フィトシューティカル」という語は、本書で使用されているように、治療特質を有する植物から成る成分を意味する。
【００５８】
フィト合成（phyto-synthetic）成分という語は、本書で使用されているように、一つあるいはそれ以上の植物由来のMMP-9および／またはカテプシンB阻害剤に加えて、一つあるいはそれ以上の合成のMMP-9および／またはカテプシンB阻害剤を含む本発明の治療成分を意味する。
【００５９】
「アジュバント」という語は、本書で使用されているように、別の物質例えば、化学治療剤）の治療効果を高め、および／またはその効力を増す物質を意味する。それとは対照的に、「アジュバント療法」という語は、本書で癌治療に関連して使用されているように、第一次治療の後に施され、再発のリスクのある被験体に施される治療を意味する。「第一次治療」とは、被験体が癌であると診断された直後に行なわれるファーストラインの治療を意味する。 
【００６０】
「 最適以下の投与量」という語は、本書で使用されているように、所与の物質について推奨されている投与量以下の投与量を意味するすなわち、標準投与量あるいは最適投与量より少ない投与量を意味する）。本発明の一つの実施例では、所与の化学治療剤の投与量は、所与の治療サイクルにおいて当該薬剤の標準投与量を5%以上下回る場合に、最適以下の投与量として定義されている。別の実施例では、最適以下の投与量は、所与の治療サイクルにおいて当該薬剤の標準投与量を10%以上下回る投与量として定義されている。さらなる実施例では、最適以下の投与量は、所与の治療サイクルにおいて当該薬剤の標準投与量を15%以上下回る投与量として定義されている。
【００６１】
「改善する」あるいは「改善」という語は、一時的および長期的な、治療されている疾患、障害あるいは病気の、一つあるいはそれ以上の症状、兆候、および特徴における、停止、予防、減少、あるいは改善を意味する。
【００６２】
「被験体」あるいは「患者」という語は、本書で使用されているように、治療を必要としている動物を意味する。 
【００６３】
「 動物」という語は、本書で使用されているように、ヒトおよびヒト以外の動物を意味し、それには、哺乳類、鳥類、魚類が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【００６４】
一つあるいはそれ以上の治療剤「と組み合わせて」本発明の成分を投与することには、同時併用）投与および連続投与を含むように意図されている。併用投与には、多様な投与経路を介して被験体に対し、治療剤群)および本発明の成分群)を投与することが含まれるように意図されている。連続投与には、多様な順序および投与経路で被験体に対し、治療剤群)および本発明の成分群)を投与することが含まれるように意図されている。
【００６５】
本書で使用しているように、「約」という語は、記載された値から+/-10%の変動を意味する。そのような変動は、特に言及されるか否かに関わらず、本書に記載されている所与の値に常に含まれていると理解されたい。
【００６６】
本書で使用している化学用語は、The McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms ed. Parker, S., 1985, McGraw-Hill, San Francisco）に例示されているような、当業界における慣行用法に従って、使用されている。
治療成分群 
【００６７】
上記のように、本発明の治療成分群は、二つのプロテアーゼ、MMP-9およびカテプシンBを同時に阻害する能力を有する。本発明によると、当該治療成分群は、MMP-9プロテアーゼ活性および／またはカテプシンBプロテアーゼ活性を阻害する、一つあるいはそれ以上の植物抽出物群、あるいはそれらから調製された準精製／精製された化合物群)から成る。このように、当該治療成分に含まれているいかなる所与の植物抽出物も、MMP-9あるいはカテプシンBのどちらかを阻害する能力を有するか、あるいはこれらのプロテアーゼの双方を阻害する能力を有していてよい。当該成分群が一つ以上の植物抽出物から成る場合は、当該植物抽出物群はMMP-9あるいはカテプシンBのどちらかの阻害剤であるか、あるいはMMP-9阻害剤とカテプシンB阻害剤との組み合わせであってよい。本発明の一つの実施例では、当該成分は、一つの植物抽出物から成る。別の実施例では、当該成分は、二つの植物抽出物から成る。さらなる実施例では、該成分は、二つあるいはそれ以上の植物抽出物から成る。別の実施例では、当該成分は、一つあるいはそれ以上のMMP-9 阻害植物抽出物と一つあるいはそれ以上のカテプシンB阻害植物抽出物との組み合わせから成る。  
【００６８】
本発明のある特定の実施例では、当該の治療成分は、表6から表9に記載された植物に由来する、一つあるいはそれ以上の植物抽出物から成る。本発明のある代替の実施例では、当該の治療成分群は、ショウガ科（Family Zingiberaceae）、マツ科（Family Pinaceae）、キク科（Family Asteraceae）に属する植物に由来する、少なくとも一つの植物抽出物から成る。本発明の別の実施例では、当該の治療成分群は、ショウガ属（Zingiber genus）、ツガ属（Tsuga genus）、あるいはアキノキリンソウ属（Solidago genus）に属する植物に由来する、少なくとも一つの植物抽出物から成る。さらなる実施例では、当該の治療成分群は、ショウガ（Zingiber officinale）、ソリダゴ（Solidago sp.）、カナダツガ（Tsuga canadensis）から成る群から選択された植物に由来する一つあるいはそれ以上の植物抽出物から成る。さらなる実施例では、ソリダゴ（Solidago sp.）は、ソリダゴ・カナデンシス（Solidago Canadensis）、オオアワダチソウ（Solidago gigantean）別名Solidago serotina）、アキノキリンソウ（Solidago virgaurea）、アキノキリンソウ属交雑種（Solidago hybrida）、あるいはそれらの組み合わせである。別の実施例では、当該の治療成分群は二つの抽出物から成り、ここで当該植物抽出物群はショウガ（Zingiber officinale）およびソリダゴ（Solidago sp.）に由来する。
【００６９】
二つあるいはそれ以上の植物抽出物群から成る成分について、構成要素となる植物抽出物群が考慮されている。例を挙げれば、例えば抽出物Aおよび抽出物Bという二つの植物抽出物から成る成分について、抽出物Aおよび抽出物B の割合は、1:99 と99:1の間でいかように変わってもよい。「1:99 と99:1の間でいかように」というのは、当該の二つの抽出物の割合がこの範囲内のいかなる割合であってもよいと定義され得るという意味であり、従って、割合は98:2 から約1:99の間、約98:2から2:98の間、97:3 から1:99の間、97:3 から2:98の間、97:3 から3:97の間などであってよい。本発明の一つの実施例では、二つの抽出物の割合は、約90:10 から約10:90の間である。別の実施例では、二つの抽出物の割合は、約80:20 から約20:80の間である。さらなる実施例では、二つの抽出物の割合は、約70:30 から約30:70の間である。別の実施例では、二つの抽出物の割合は、約60:40 から約40:60の間である。別の実施例では、二つの抽出物の割合は、約50:50である。
【００７０】
代替の実施例では、二つの植物抽出物の割合は、約1:5 から約5:1の間である。さらなる実施例では、二つの植物抽出物の割合は、約1:4から約4:1の間である。その他の実施例では、二つの植物抽出物の割合は、約1:3から約3:1の間、および約1:2から約2:1の間である。 
【００７１】
類似した割合が、二つ以上の植物抽出物から成る成分群について考慮されている。このように、例えば、抽出物A、抽出物B、および抽出物Cという三つの植物抽出物から成る成分群について、抽出物A、抽出物B、および抽出物C 間の割合は、1:1:98 から98:1:1の間でいかように変わってもよい。同様に、抽出物A、抽出物B、抽出物C、および抽出物Dという四つの植物抽出物から成る成分群について、抽出物A、抽出物B、抽出物C、および抽出物D 間の割合は、1:1:1:97  から97:1:1:1の間でいかように変わってもよい。四つ以上の植物抽出物から成る成分群について同様の割合を、容易に予想することができる。
【００７２】
本発明は、MMP-9あるいはカテプシンBという二つのプロテアーゼを同時に標的とすることを考慮している。成分が一つ以上の抽出物から成る場合、MMP-9阻害剤およびカテプシンB阻害剤の多様な組み合わせが考慮されている。例えば、当該成分は、MMP-9のみを阻害する一つあるいはそれ以上の抽出物と、カテプシンBおよび／またはMMP-9を阻害する能力を有する一つの抽出物とから成っていてよい。同様に、当該成分は、カテプシンBのみを阻害する一つあるいはそれ以上の抽出物と、カテプシンBおよび／またはMMP-9を阻害する能力を有する一つの抽出物とから成っていてよい。また、それぞれの抽出物がカテプシンBとMMP-9の双方を阻害する能力を有する、一つ以上の植物抽出物から成る成分も考慮されている。 
【００７３】
本発明で考慮されている治療成分群にはまた、一つあるいはそれ以上の合成MMP-9阻害剤および／または合成カテプシンB阻害剤と組み合わせた一つあるいはそれ以上の植物抽出物から成る、フィト合成（phyto-synthetic）成分も含まれている。多様なMMP-9阻害剤とカテプシンB阻害剤との組み合わせが予測される。このように、例えば、治療成分に含まれている植物抽出物群)がMMP-9のみを阻害する場合は、当該治療成分に合成カテプシンB阻害剤を含めることにより、カテプシンB阻害活性を提供することができる。同様に、 治療成分に含まれている植物抽出物群)がカテプシンBのみを阻害する場合は、当該治療成分に合成MMP-9阻害剤を含めることにより、MMP-9阻害活性を提供することができる。いずれにしても、本発明で考慮されているフィト合成（phyto-synthetic）成分群は、MMP-9とカテプシンB の双方を阻害する能力を有し、さらに新生細胞の移動、内皮細胞の移動、腫瘍の成長、腫瘍により誘発された血管形成、および転移の一つあるいはそれ以上を阻害する能力をも有する。 
【００７４】
本発明の一つの実施例では、成分が、植物抽出物の形態、あるいはそれに由来する化合物の形態、あるいはまた合成阻害剤の形態の、MMP-9阻害剤とカテプシンB阻害剤の双方から成る場合は、当該成分の最終治療効果は、それらの阻害剤単独の治療効果より多大である。
【００７５】
本発明はさらに、一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤と組み合わせた一つの治療成分から成る治療法の組み合わせ群を考慮している。これらの治療法の組み合わせ群を、単一の薬学的成分として、製剤化することができ、あるいは、より一般的には、組み合わせて投与するようにデザインした別個の成分群から成る。 
治療成分群の成分群
1.植物抽出物群
【００７６】
本発明の治療成分に含めることができる植物抽出物の調製に適した植物材料は、「可能性のある植物」に由来する。MMP-9および／またはカテプシンBを阻害する能力を有する植物抽出物群が本書で説明している多様な植物種から単離されており、それらは本発明の成分群に含めることができる適切な候補抽出物である。広範囲の植物すなわち可能性のある植物から類似したテクニックを用いてMMP-9および／またはカテプシンBを阻害する能力を有するその他の抽出物群を単離することができるということは、当業者には明白であろう。可能性のある植物には、MMP-9および／またはカテプシンBを阻害する能力を求めてテストすることができる抽出物を作製する目的で、本書で説明しているような標準抽出手続きに供することができる、陸生、水生、あるいはその他の植物を含む植物界の全ての種が含まれる。MMP-9および／またはカテプシンBに対する阻害活性を示す抽出物群は、本発明の治療成分に使用するのに適切な候補であると考えられる。
【００７７】
可能性のある植物の例は、以下の分類を含むが、それらに限定されるものではない：種子植物上門（Superdivision Spermatophyta-Seed plants）；針葉樹類門（Division Coniferophyta-Conifers）；マツ綱（Class Pinopsida）；マツ目（Order Pinales）；南洋杉科（Family Araucariaceae-Araucaria family）；イヌガヤ科（Cephalotaxaceae-plum yew family）；ヒノキ科（Family Cupressaceae-Cypress family）；マツ科（Family Pinaceae-Pine family）；球果植物目 （Family Podocarpaceae-Podocarpus family）；スギ科（Family Taxodiaceae-Redwood family）；イチイ目（Order Taxales）；イチイ科（Family Taxaceae-Yew family）； ソテツ門（Division Cycadophyta-Cycads）、ソテツ綱（Class Cycadopsida）、ソテツ目（Order Cycadales）、ソテツ科 （Family Cycadaceae-Cycad family）；ザミア科（Zamiaceae-Sago-palm family）；イチョウ門 （Division Ginkgophyta-Ginkgo）、イチョウ綱（Class Ginkgoopsida）、イチョウ目 （Order Ginkgoales）、イチョウ科（Family Ginkgoaceae-Ginkgo family）；マオウ植物門（Division Gnetophyta- Mormon tea and other gnetophytes）、グネツム綱（Class Gnetopsida）、マオウ目（Order Ephedrales）、 マオウ科（Family Ephedraceae-Mormon-tea family）；グネツム目（Order Gnetales）、グネツム科（Family Gnetaceae-Gnetum family）； 被子植物門（Division Magnoliophyta-Flowering plants）、単子葉植物綱（Class Liliopsida-Monocotyledons）、オモダカ亜綱（Subclass Alismatidae）、オモダカ目（Order Alismatales）、オモダカ科 （Family Alismataceae-Water-plantain family）、ハナイ科（Family Butomaceae-Flowering Rush family）、黄花面高科（Family Limnocharitaceae -Water-poppy family）；トチカガミ目（Order Hydrocharitales）、トチカガミ科（Family Hydrocharitaceae-Tape-grass family）；イバラモ目（Order Najadales）、水▲よう▼科（Family Aponogetonaceae-Cape-pondweed family）、シオニラ科（Family Cymodoceaceae-Manatee-grass family）、 シバナ科（Family Juncaginaceae-Arrow-grass family）、イバラモ科（Family Najadaceae - Water-nymph family） 、ポシドニア科（Family Posidoniaceae - Posidonia family） 、ヒルムシロ科（Family Potamogetonaceae - Pondweed family） 、カワツルモ科（Family Ruppiaceae - Ditch-grass family）、ホロムイソウ科（Family Scheuchzeriaceae - Scheuchzeria family） 、イトクズモ科（Family Zannichelliaceae-Horned pondweed family）、 アマモ甘藻)科（Family Zosteraceae - Eel-grass family） ； ヤシ亜綱 （Subclass Arecidae） 、サトイモ目（Order Arales）、ショウブ菖蒲)科（Family Acoraceae - Calamus family）、サトイモ科（Family Araceae - Arum family）、ウキクサ科（Family Lemnaceae - Duckweed family）； ヤシ目（Order Arecales） ヤシ科（Family Arecaceae - Palm family）； パナマソウ目（Order Cyclanthales） 、パナマソウ科（Family Cyclanthaceae - Panama Hat family）； タコノキ目（Order Pandanales） 、タコノキ蛸木)科（Family Pandanaceae - Screw-pine family）； ツユクサ亜綱（Subclass Commelinidae）、 ツユクサ目（Order Commelinales）、ツユクサ科（Family Commelinaceae - Spiderwort family）、マヤカ科（Family Mayacaceae - Mayaca family） 、トウエンソウ科（Family Xyridaceae - Yellow-eyed Grass family）； カヤツリグサ目（Order Cyperales）、カヤツリグサ科（Family Cyperaceae - Sedge family）、イネ科（Family Poaceae - Grass family）； ホシクサ目（Order Eriocaulales） 、ホシクサ星草)科（Family Eriocaulaceae - Pipewort family）； （Order Juncales）、イグサ科（Family Juncaceae - Rush family）； サンアソウ目（Order Restionales） 、ヨインウィレア科（Family Joinvilleaceae - Joinvillea family）； ガマ目（Order Typhales） 、ミクリ科（Family Sparganiaceae - Bur-reed family） 、ガマ科（Family Typhaceae - Cat-tail family）； ユリ亜綱（Subclass Liliidae）、百合目（Order Liliales） 、リュウゼツラン科（Family Agavaceae - Century-plant family） 、アロエ科（Family Aloeaceae - Aloe family） 、ヤマノイモ科（Family Dioscoreaceae - Yam family）、ハゼリソウ科（Family Haemodoraceae - Bloodwort family） 、ハングアナ科（Family Hanguanaceae - Hanguana family） 、アヤメ科（Family Iridaceae - Iris family）、ユリ科（Family Liliaceae - Lily family） 、タヌキアヤメ科（Family Philydraceae - Philydraceae family） 、ミズアオイ科（Family Pontederiaceae - Water-Hyacinth family） 、サルトリイバラ科（Family Smilacaceae - Catbrier family） 、ビャクブ百部)科（Family Stemonaceae - Stemona family）、タシロイモ（Family Taccaceae - Tacca family）； ラン目（Order Orchidales）、ヒナノシャクジョウ科（Family Burmanniaceae - Burmannia family）、ラン科（Family Orchidaceae - Orchid family）； ショウガ亜綱（Subclass Zingiberidae）、パイナップル目（Order Bromeliales）、パイナップル科（Family Bromeliaceae - Bromeliad family）； ショウガ目（Order Zingiberales）、カンナ科（Family Cannaceae - Canna family）、オオホザキアヤメ科（Family Costaceae - Costus family）、オウムバナ科（Family Heliconiaceae - Heliconia family）、クズウコン科（Family Marantaceae - Prayer-Plant family）、バショウ科（Family Musaceae - Banana family）、ショウガ科（Family Zingiberaceae - Ginger family）； モクレン綱（Class Magnoliopsida - Dicotyledons）、キク亜綱（Subclass Asteridae）、キク目（Order Asterales）、キク科（Family Asteraceae - Aster family）； アワゴケ目（Order Callitrichales）、アワゴケ科（Family Callitrichaceae - Water-starwort family）、スギナモ科（Family Hippuridaceae - Mare's-tail family）； カリケラ目（Order Calycerales）、カリケラ科（Family Calyceraceae - Calycera family）； キキョウ目（Order Campanulales）、キキョウ科（Family Campanulaceae - Bellflower family）、クサトベラ科（Family Goodeniaceae - Goodenia family）、ナガボノウルシ科（Family Sphenocleaceae - Spenoclea family）； マツムシソウ目（Order Dipsacales）、レンプクソウ科（Family Adoxaceae - Moschatel family）、スイカズラ科（Family Caprifoliaceae - Honeysuckle family）、マツムシソウ科（Family Dipsacaceae - Teasel family）、オミナエシ科（Family Valerianaceae - Valerian family）； リンドウ目（Order Gentianales）、キョウチクトウ科（Family Apocynaceae - Dogbane family）、ガガイモ科（Family Asclepiadaceae - Milkweed family）、リンドウ科（Family Gentianaceae - Gentian family）、マチン科（Family Loganiaceae - Logania family）； シソ目（Order Lamiales）、ムラサキ科（Family Boraginaceae - Borage family）、シソ科（Family Lamiaceae - Mint family）、レンノア科（Family Lennoaceae - Lennoa family）、クマツヅラ科（Family Verbenaceae - Verbena family）； オオバコ目（Order Plantaginales）、オオバコ科（Family Plantaginaceae - Plantain family）； アカネ目（Order Rubiales）、アカネ科（Family Rubiaceae - Madder family）； ゴマノハグサ目（Order Scrophulariales）、キツネノマゴ科（Family Acanthaceae - Acanthus family）、ノウゼンカズラ科（Family Bignoniaceae - Trumpet-creeper family）、フジウツギ科（Family Buddlejaceae - Butterfly-bush family）、イワタバコ科（Family Gesneriaceae - Gesneriad family）、タヌキモ科（Family Lentibulariaceae - Bladderwort family）、ハマジンチョウ科（Family Myoporaceae - Myoporum family）、モクセイ科（Family Oleaceae - Olive family）、ハマウツボ科（Family Orobanchaceae - Broom-rape family）、ゴマ科（Family Pedaliaceae - Sesame family）、ゴマノハグサ科（Family Scrophulariaceae - Figwort family）； ナス目（Order Solanales）、ヒルガオ科（Family Convolvulaceae - Morning-glory family）、ネナシカズラ科（Family Cuscutaceae - Dodder family）、フォウクィエリア科（Family Fouquieriaceae - Ocotillo family）、ハゼリソウ科（Family Hydrophyllaceae - Waterleaf family）、ミツガシワ科（Family Menyanthaceae - Buckbean family）、ハナシノブ科（Family Polemoniaceae - Phlox family）、茄子科（Family Solanaceae - Potato family）； ナデシコ亜綱（Subclass Caryophyllidae）、 ナデシコ目（Order Caryophyllales）、アカトカルプス科（Family Achatocarpaceae - Achatocarpus family）、ハマミズナ科（Family Aizoaceae - Fig-marigold family）、ヒユ科（Family Amaranthaceae - Amaranth family）、ツルムラサキ科（Family Basellaceae - Basella family）、サボテン科（Family Cactaceae - Cactus family）、ナデシコ科（Family Caryophyllaceae - Pink family）、アカザ科（Family Chenopodiaceae - Goosefoot family）、ザクロソウ科（Family Molluginaceae - Carpet-weed family）、オシロイバナ科（Family Nyctaginaceae - Four o'clock family）、ヤマゴボウ科（Family Phytolaccaceae - Pokeweed family）、スベリヒユ科（Family Portulacaceae - Purslane family）； イソマツ目（Order Plumbaginales）、イソマツ科（Family Plumbaginaceae - Leadwort family）； タデ目（Order Polygonales）、タデ科（Family Polygonaceae - Buckwheat family）； ビワモドキ亜綱（Subclass Dilleniidae） 、バティス目（Order Batales）、バティス科（Family Bataceae - Saltwort family）； フウチョウソウ目（Order Capparales）、アブラナ科（Family Brassicaceae - Mustard family）、フウチョウソウ科（Family Capparaceae - Caper family）、ワサビノキ科（Family Moringaceae - Horse-radish tree family）、モクセイソウ科（Family Resedaceae - Mignonette family）； イワウメ目（Order Diapensiales）、イワウメ科（Family Diapensiaceae - Diapensia family）； ビワモドキ目（Order Dilleniales）、ビワモドキ科（Family Dilleniaceae - Dillenia family）、ボタン科（Family Paeoniaceae - Peony family）； カキノキ目（Order Ebenales）、カキノキ科（Family Ebenaceae - Ebony family）、アカテツ科（Family Sapotaceae - Sapodilla family）、エゴノキ科（Family Styracaceae - Storax family）、ハイノキ科（Family Symplocaceae - Sweetleaf family）； ツツジ目（Order Ericales）、リョウブ科（Family Clethraceae - Clethra family）、キリラ科（Family Cyrillaceae - Cyrilla family）、ガンコウラン科（Family Empetraceae - Crowberry family）、エパクリス科（Family Epacridaceae - Epacris family）、ツツジ科（Family Ericaceae - Heath family）、シャクジョウソウ科（Family Monotropaceae - Indian Pipe family）、イチヤクソウ科（Family Pyrolaceae - Shinleaf family）； サガリバナ目（Order Lecythidales）、サガリバナ科（Family Lecythidaceae - Brazil-nut family）； アオイ目（Order Malvales）、パンヤ科（Family Bombacaceae - Kapok-tree family）、ホルトノキ科（Family Elaeocarpaceae - Elaeocarpus family）、アオイ科（Family Malvaceae - Mallow family）、アオギリ科（Family Sterculiaceae - Cacao family）、シナノキ科（Family Tiliaceae - Linden family）； ウツボカズラ目（Order Nepenthales）、モウセンゴケ科（Family Droseraceae - Sundew family）、ウツボカズラ科（Family Nepenthaceae - East Indian Pitcher-plant family）、サラセニア科（Family Sarraceniaceae - Pitcher-plant family）； サクラソウ目（Order Primulales）、ヤブコウジ科（Family Myrsinaceae - Myrsine family）、サクラソウ科（Family Primulaceae - Primrose family）、テオフラスタ科（Family
Theophrastaceae - Theophrasta family）； ヤナギ目（Order Salicales）、ヤナギ科. （Family Salicaceae - Willow family）； ツバキ目（Order Theales）、マタタビ科（Family Actinidiaceae - Chinese Gooseberry family）、バターナット科（Family Caryocaraceae - Souari family）、テリハボク科（Family Clusiaceae - Mangosteen family）、フタバガキ亜科（Family Dipterocarpaceae - Meranti family）、ミゾハコベ科（Family Elatinaceae - Waterwort family）、マルクグラウィア科（Family Marcgraviaceae - Shingle Plant family）、オクナ科（Family Ochnaceae - Ochna family）、ツバキ科（Family Theaceae - Tea family）； スミレ目（Order Violales）、シュウカイドウ科（Family Begoniaceae - Begonia family）、ベニノキ科（Family Bixaceae - Lipstick-tree family）、パパイア科（Family Caricaceae - Papaya family）、ハンニチバナ科（Family Cistaceae - Rock-rose family）、ウリ科（Family Cucurbitaceae - Cucumber family）、ダティスカ科（Family Datiscaceae - Datisca family）、イイギリ科（Family Flacourtiaceae - Flacourtia family）、フランケニア科（Family Frankeniaceae - Frankenia family）、シレンゲ科（Family Loasaceae - Loasa family）、トケイソウ科（Family Passifloraceae - Passion-flower family）、ギョリュウ科（Family Tamaricaceae - Tamarix family）、トゥルネラ科（Family Turneraceae - Turnera family）、スミレ科（Family Violaceae - Violet family）； マンサク亜綱（Subclass Hamamelidae）、モクマオウ目（Order Casuarinales）、モクマオウ科（Family Casuarinaceae - She-oak family）； ブナ目（Order Fagales）、カバノキ科（Family Betulaceae - Birch family）、ブナ科（Family Fagaceae - Beech family）； マンサク目（Order Hamamelidales）、カツラ科（Family Cercidiphyllaceae - Katsura-tree family）、マンサク科（Family Hamamelidaceae - Witch-hazel family）、スズカケノキ科（Family Platanaceae - Plane-tree family）； クルミ目（Order Juglandales）、クルミ科（Family Juglandaceae - Walnut family）； レイトネリア目（Order Leitneriales）、レイトネリア科（Family Leitneriaceae - Corkwood family）； ヤマモモ目（Order Myricales）、ヤマモモ科（Family Myricaceae - Bayberry family）； イラクサ目（Order Urticales）、アサ科（Family Cannabaceae - Hemp family）、ケクロピア科（Family Cecropiaceae - Cecropia family）、クワ科（Family Moraceae - Mulberry family）、ニレ科（Family Ulmaceae - Elm family）、イラクサ科（Family Urticaceae - Nettle family）； モクレン亜綱（Subclass Magnoliidae） 、ウマノスズクサ目（Order Aristolochiales）、ウマノスズクサ科（Family Aristolochiaceae - Birthwort family）； シキミ目（Order Illiciales）、シキミ科（Family Illiciaceae - Star-anise family）、マツブサ科（Family Schisandraceae - Schisandra family）； クスノキ目（Order Laurales）、ロウバイ科（Family Calycanthaceae - Strawberry-shrub family）、ハスノハギリ科（Family Hernandiaceae - Hernandia family）、クスノキ科（Family Lauraceae - Laurel family）、モニミア科（Family Monimiaceae - Monimia family）； モクレン目（Order Magnoliales）、バンレイシ科（Family Annonaceae - Custard-apple family）、カネラ科（Family Canellaceae - Canella family）、モクレン科（Family Magnoliaceae - Magnolia family）、ニクズク科（Family Myristicaceae - Nutmeg family）、ハマザクロ科（Family Sonneratiaceae - Sonneratia family）、シキミモドキ科（Family Winteraceae - Wintera family）； スイレン目（Order Nymphaeales）、ハゴロモモ科（Family Cabombaceae - Water-shield family）、マツモ科（Family Ceratophyllaceae - Hornwort family）、ハス科（Family Nelumbonaceae - Lotus-lily family）（Family Nymphaeaceae - Water-lily family）； ケシ目（Order Papaverales）、ケマンソウ科（Family Fumariaceae - Fumitory family）、ケシ科（Family Papaveraceae - Poppy family）； 胡椒目（Order Piperales）、センリョウ科（Family Chloranthaceae - Chloranthus family）、胡椒科（Family Piperaceae - Pepper family）、▲どくだみ▼科（Family Saururaceae - Lizard's-tail family）； キンポウゲ目（Order Ranunculales）、メギ科（Family Berberidaceae - Barberry family）、アケビ科（Family Lardizabalaceae - Lardizabala family）、ツヅラフジ科（Family Menispermaceae - Moonseed family）、キンポウゲ科（Family Ranunculaceae - Buttercup family）、アワブキ科（Family Sabiaceae - Sabia family）； バラ亜綱（Subclass Rosidae）、セリ目（Order Apiales）、セリ科（Family Apiaceae - Carrot family）、ウマノスズクサ科（Family Araliaceae - Ginseng family）； ニシキギ目（Order Celastrales）、モチノキ科（Family Aquifoliaceae - Holly family）、ニシキギ科（Family Celastraceae - Bittersweet family）、コリノカルプス科（Family Corynocarpaceae - Karaka family）、デチンムル科（Family Hippocrateaceae - Hippocratea family）、クロタキカズラ科（Family Icacinaceae - Icacina family）、スタックホウシア科（Family Stackhousiaceae - Stackhousia family）； ミズキ目（Order Cornales）、ミズキ科（Family Cornaceae - Dogwood family）、ガリヤ科（Family Garryaceae - Silk Tassel family）、ヌマミズキ科（Family Nyssaceae - Sour Gum family）；  トウダイグサ目（Order Euphorbiales）、ツゲ科（Family Buxaceae - Boxwood family）、トウダイグサ科（Family Euphorbiaceae - Spurge family）、シムモンドシア科（Family Simmondsiaceae - Jojoba family）； マメ目（Order Fabales）、マメ科（Family Fabaceae - Pea family）； フウロソウ目（Order Geraniales）、ツリフネソウ科（Family Balsaminaceae - Touch-me-not family）、フウロウソウ科（Family Geraniaceae - Geranium family）、リムナンテス（Family Limnanthaceae - Meadow-Foam family）、カタバミ科（Family Oxalidaceae - Wood-Sorrel family）、ノウゼンハレン科（Family Tropaeolaceae - Nasturtium family）； アリノトウグサ目（Order Haloragales）、グンネラ科（Family Gunneraceae - Gunnera family）、アリノトウグサ科（Family Haloragaceae - Water Milfoil family）； アマ目（Order Linales）、コカノキ科（Family Erythroxylaceae - Coca family）、アマ科（Family Linaceae - Flax family）； フトモモ目（Order Myrtales）、シクンシ科（Family Combretaceae - Indian Almond family）、ミソハギ科（Family Lythraceae - Loosestrife family）、ノボタン科（Family Melastomataceae - Melastome family）、フトモモ科（Family Myrtaceae - Myrtle family）、アカバナ科（Family Onagraceae - Evening Primrose family）、ザクロ科（Family Punicaceae - Pomegranate family）、ジンチョウゲ科（Family Thymelaeaceae - Mezereum family）、ヒシ菱)科（Family Trapaceae - Water Chestnut family）； カワゴケソウ目（Order Podostemales）、カワゴケソウ科（Family Podostemaceae - River-weed family）； ヒメハギ目（Order Polygalales）、クラメリア科（Family Krameriaceae - Krameria family）、キントラノオ科（Family Malpighiaceae - Barbados Cherry family）、ヒメハギ科（Family Polygalaceae - Milkwort family）； ヤマモガシ目（Order Proteales）、ヤマモガシ科（Family Proteaceae - Protea family）； ラフレシア目（Order Rafflesiales）、ラフレシア科（Family Rafflesiaceae - Rafflesia family）； クロウメモドキ目（Order Rhamnales）、グミ科（Family Elaeagnaceae - Oleaster family）、クロウメモドキ科（Family Rhamnaceae - Buckthorn family）、ブドウ科（Family Vitaceae - Grape family）； ヒルギ目（Order Rhizophorales）、ヒルギ科（Family Rhizophoraceae - Red Mangrove family）； バラ目（Order Rosales）、ブルネリア科（Family Brunelliaceae - Brunellia family）、クリソバラヌス科��Family Chrysobalanaceae - Cocoa-plum family）、マメモドキ科（Family Connaraceae - Cannarus family）、ベンケイソウ科（Family Crassulaceae - Stonecrop family）、クロッソソマ科（Family Crossosomataceae - Crossosoma family）、クノニア科（Family Cunoniaceae - Cunonia family）、スグリ科（Family Grossulariaceae - Currant family）、アジサイ科（Family Hydrangeaceae - Hydrangea family）、トベラ科（Family Pittosporaceae - Pittosporum family）、バラ科（Family Rosaceae - Rose family）、ユキノシタ科（Family Saxifragaceae - Saxifrage family）、スリアナ科（Family Surianaceae - Suriana family）； ビャクダン目（Order Santalales）、ツチトリモチ科（Family Balanophoraceae - Balanophora family）、エレモレピス科（Family Eremolepidaceae - Catkin-mistletoe family）、オオバヤドリギ科（Family Loranthaceae - Showy Mistletoe family）、ボロボロノキ科（Family Olacaceae - Olax family）、ビャクダン科（Family Santalaceae - Sandalwood family）、ヤドリギ科（Family Viscaceae - Christmas Mistletoe family）； ムクロジ目（Order Sapindales）、カエデ科（Family Aceraceae - Maple family）、ウルシ科（Family Anacardiaceae - Sumac family）、カンラン科（Family Burseraceae - Frankincense family）、トチノキ科（Family Hippocastanaceae - Horse-chestnut family）、センダン科（Family Meliaceae - Mahogany family）、ミカン科（Family Rutaceae - Rue family）、ムクロジ科（Family Sapindaceae - Soapberry family）、ニガキ科（Family Simaroubaceae - Quassia family）、ミツバウツギ科（Family Staphyleaceae - Bladdernut family）、ハマビシ科（Family Zygophyllaceae - Creosote-bush family）。
【００７８】
可能性のある植物の群は、原産地域に基づいて選択され得る。例えば、可能性のある植物の一つの群は、乾燥地域原産の植物つまり、北緯35度と南緯35度の間に存在する植物）から成る。従って、本発明の別の実施例に応じて、可能性のある植物は以下を含む*6： Yucca elata、Y. breviflora、Agave deserti、A. chrysantha、およびDasylirion wheeleriを含むリュウゼツラン科（agave, Agavaceae, family）； Eriogonum fasciculatumを含むタデ科（buckwheat, Polygonaceae, family）；Delphinium scaposum、Anemone tuberosa、およびD. parishiiを含むキンポウゲ科（crowfoot, Ranunculaceae, family）；Platystemon califomicu、Argemone pleiacantha、Corydalis aurea、Eschschoizia californica、およびAr. Corymbosa を含むケシ科（poppy, Papaveraceae, family）；Dithyrea californica、Streptanthus carinatus、 およびLesquerella gordoniを含むアブラナ科（mustard, Cruciferae, family）； Acacia greggii、Prosopis velutina、A. constrica、Senna covesii、Cercidium floridum、C. microphyllum、Lotus huminstratus、Krameria parvifolia、Parkinsonia aculeata、Calliendia eriophylla、Lupinus arizonicus、Olyneya tesota、Astragalus lentiginosus、Psorothamunus spinosus、 およびLupinus sparsiflorusを含むマメ科（legume, Leguminosae, family）；Mentzelia involucrata、M. pumila、 およびMohavea Confertifloraを含むシレンゲ科（loasa family, Loasacea）；Carnegiea gigantia、Opuntia leptocaulis、Ferocactus wislizenii、O. bigelovii、O. pheacantha、O. versicolor、O. fulgida、Echinocereus engelmannii、Mammillaria microcarpa、O. basilaris、Stenocereins thurberi、O. violacea、M. tetrancistra、O. ramosissima、O. acanthocarpa、E. pectinatins、 およびO. arbusculaを含むサボテン科（cactus, Cactaceae, family； Oenothera deltoides、Camissonia claviformis）、 およびOe. Primiverisを含むアカバナ科（evening primrose, Onagraceae）；Asclepias erosa、A. sublata 、およびSarcostemma cynanchoidesを含むガガイモ科（milkweed, Asclepiadaceae, family）；Cryptantha augusti foliaおよびAmsinckia intermediaを含むムラサキ科（borage, Boraginaceae, family）；Baccharis sarothroides、Monoptiilon belloides、Erieron divergens、Zinnia acerosa、Melampodium leucanthan、Chaenactis fremontii、Calycoseris wrightii、Malacothrix californica、Helianthus annus、H. niveus、Geraea canescens、Hymenothrix wislizenii、Encelia farinosa、Psilostrophe cooperi、Baileya multiradiata、Bebbia juncea、Senecio douglasii、Trixis californica、Machaeranthera tephrodes、Xylorhiza tortifolia、Cirsiinm neomexicanum、Antennaria parvifloraおよびCh. Douglasiiを含むキク科（sunflower, Compositae, family）； Larrea tridentataおよびKallstroemia grandifloraを含むハマビシ科（caltrop, Zygophyllaceae, family）； Hibiscus coulteri、H. denudatus、およびSphaeralcea ambiguaを含むアオイ科（mallow, Malvaceae, family）；Luanthus aureusを含むハナシノブ科（phlox, Polemoniaceae, family）； （Proboscidiea altheaefolia）を含むツノゴマ科（unicorn plant, Martyniaceae, family）；Cucurbita digitataを含むウリ科（gourd, Cucurbitaceae, family）；Calochortus kennedyi、Dichelostemma pulchellum、Allium macropetalum、およびHesperocallis indulataを含むバイケイソウ（lily, Lilaceae, family）； Fouquieria splendensを含むフォウクィエリア科（ocotillo, Fouquieriaceae, family）；Castilleja sp.、Penstemon parryi、およびOrthocarpus purpurascensを含むゴマノハグサ科（figwort, Scrophulariaceae, family）；Anisacanthus thurberi、Justicia califomica、およびRuellia nudifloraを含むキツネノマゴ科（acanthus, Acanthaceae, family）；Allionia incarnata、Abronia villosa、およびMirabilis multifloraを含むオシロイバナ科（four o'clock, Nyctaginaceae, family）；Erodium cicutariumを含むフウロソウ科（geranium, Geraniaceae, family）； Nama demissum���Phacelia bombycinおよびPh. Distansを含むフウロウソウ科（waterleaf, Hydrophyllaceae, family）；Chilopsis linearisを含むノウゼンカズラ科（bignonia, Bignoniaceae, family）；Glandularia gooddugiiおよびVerbena neomexicanaを含むクマツヅラ科（vervain, Verbenaceae, family）；Hyptis emoryiおよびSalvia columbariaeを含むシソ科（mint, Labiatae, family）；Orobanche cooperiを含むハマウツボ科（broomrape, Orobanchaceae, family）；Talinum auriantiacumを含むスベリヒユ科 （portulaca, Portulaceae, family）；Sesuvium verrucosumを含むハマミズナ科（carpet-weed, Aizoaceae, family）；Linum lewisiiを含むアマ科（flax, Linaceae, family）；Nicotiana trigonophyllaおよびPhysalis lobataを含む茄子科（potato, Solanaceae, family）；およびAmoreuxia palmatifidaを含むワタモドキ科（cochlospermum, Cochlospermaceae, family）。
【００７９】
関心の持たれている地理的地域原産の他の可能性のある植物の群は、温帯原産の植物、アメリカ大陸南、中部、北）原産の植物、および北アメリカ大陸原産の植物を含むが，これらに限定されるものではない。
【００８０】
ある実施例においては、可能性のある植物を、表６、７、８、および９に記載した植物の群から選択している。その群は、以下を含む*7：Abelmochus esculentus、 Achillea millefolium、Aconitum napellus、 Acorus calamus、 Actinidia arguta、 Adiantum pedatum、 Agastache foeniculum、 Agrimonia eupatoria、 Agropyron cristatum、 Agropyron repens、 Agrostis alba、Agrostis tofonifera、 Alcea rosea、Alkanna tinctoria、 Allium cepa、Allium grande、Allium porrum、Allium sativum、Allium schoenoprasum、Allium tuberosum、Althaea officinalis、Amaranthus gangeticus、Amaranthus retroflexus、Ambrosia artemisiifolia、Amelanchier sanguinea、Anthemis nobilis、Anthemis tinctorium、Apium graveolens、Arachis hypogaea、Aralia cordata、Arctium minus、Arctostaphylos uva-ursi、Armoracia rusticana、Aronia melanocarpa、Arrhenatherum elatius、Artemisia dracunculus、Asparagus officinalis、Aster sp、Atropa belladonna、Beta vulgaris、Beta vulgaris subsp. Maritima、Beta vulgaris var. condivata、Brassica napus、Brassica nigra、Brassica oleracea、Brassica rapa、Bromus inermis、Campanula rapunculus、Canna edulis、Capsella bursa-pastoris、Capsicum annuum、Capsicum frutescens、Carthamus tinctorius Carum carvi、Chelidonium majus、Chenopodium bonus - henricus、Chenopodium quinoa、Chrysanthemum leucanthemum、Chrysanthemun coronarium var. spatiosum、Chrysanthenum coronarium、Cichorium intybus、Citrullus lanatus、Cornus canadensis、Cosmos sulphureus、Crataegus sp、Crataegus submollis、Cryptotaenia canadensis、Cucumis anguria、Cucumis melo、Cucumis sativus、Cucurbita maxima、Cucurbita moschata、Cucurbita pepo、Curcuma zedoaria、Curcurbita maxima、Cymbopogon citratus、Dactylis glomerata、Datisca cannabina、Daucus carota、Dirca palustris、Dolicos lablab、Dryopteris filix-mas、Eleusine coracana、Elymus junceus、Erigeron canadensis、Eruca vesicaria、Fagopyrum esculentum、Fagopyrum tartaricum、Festuca rubra、Foeniculum vulgare、Forsythia  x intermedia、Fragaria x ananassa、Galium odoratum、Gaultheria hispidula、Gentiana lutea、Glechoma hederacea、Glycine max、Glycyrrhiza glabra、Guizotia abyssinica、Hamamelis virginiana、Hedeoma pulegioides、Helianthus tuberosus、Helichrysum angustifolium、Heliotropium arborescens、Helleborus niger、Hordeum hexastichon、Hyssopus officinalis、Inula helenium、Isatis tinctoria、Lactuca serriola、Laportea canadensis、Lathyrus sativus、Lathyrus sylvestris、Laurus nobilis、Lavandula latifolia、Leonurus cardiaca、Lepidium sativum、Levisticum officinale、Linaria vulgaris、Linum usitatissimum、Lolium multiflorum、  Lolium perenne、Lotus corniculatus、Lotus tetragonolobus、Lycopersicon esculentum、Malva moschata、Malva sylvestris、Malva verticillata、Matteucia pensylvanica、Medicago sativa、Melilotus albus、Melissa officinalis、Mentha piperita、Mentha pulegium、Mentha spicata、Mentha suaveolens、Momordica charantia、Nicotiana rustica、Nicotiana tabacum、Nigella sativa、Oenothera biennis、Origanum vulgare、Oryza sativa、Oxyria digyna、Pastinaca sativa、Phalaris canariensis、Phaseolus mungo、Phaseolus vulgaris、Phlox paniculata、Physalis alkekengi、Physalis ixocarpa、Physalis pruinosa、Phytolacca americana、Pimpinella anisum、Plantago coronopus、Plantago major、Poa compressa、Poa pratensis、Polygonum pensylvanicum、Polygonum persicaria、Potentilla anserina、Poterium sanquisorba、Pteridium aquilinum、Raphanus sativus、Rheum rhabarbarum、Ribes nidigrolaria、Ribes nigrum、Ribes salivum、Ribes sylvestre、Ribes uva-crispa、Ricinus communis、Rosa rugosa、Rosmarinus officinalis、Rubus allegheniensis、Rubus canadensis、Rubus idaeus、Rumex acetosella、Rumex acetosa、Rumex crispus、Rumex patientia、Rumex scutatus、Ruta graveolens、Salix purpurea、Salvia elegans、Salvia officinalis、Salvia sclarea、Satureja montana、Scuttellaria lateriflora、Secale cereale、Sesamum indicum、Setaria italica、Sium sisarum、Solanum dulcamara、Solanum melanocerasum、Solanum melongena、Solidago sp、Spinacia oleracea、Stachys affinis、Symphytum officinale、Tanacetum cinerariifolium、Tanacetum vulgare、Teucrium chamaedrys、Thymus serpyllum、Thymus vulgaris、Thymus x citriodorus、Tragopogon porrifolius、Trifolium hybridum、Trifolium pannonicum、Trifolium repens、Trigonella foenum- graecum、Triticum spelta、Triticum turgidum、Typha latifolia、Urtica dioica、Vaccinium corymbosum、Vaccinum augustifolium、Vaccinum macrocarpon、Veratrum viride、Verbascum thapsus、Viburnum trilobum、Vicia sativa、Vicia villosa、Vigna unguiculata、Vinca minor、Vitis sp.、Xanthium sibiricum、Zea mays、Ageratum conyzoides、Alchemilla mollis、Allium ampeloprasum、Amaranthus candathus、Angelica archangelica、Asclepias incarnata、Brassica cepticepa、Brassica juncea、Chichorium endivia subsp endivia、Cicer arietinum、Coix lacryma-jobi、Cynara scolymus、Cyperus esculentus、Datura metel、Datura stramonium、 Dipsacus sativus、Echinochloa frumentacea、Erigeron speciosus、Errhenatherum elatius、Gaultheria procumbens、Helenium hoopesii、Helianthus annuus、Helianthus strumosus、Hordeum vulgare、Humulus lupulus、Hypericum sp、Hyssopus officinalis、  Iberis amara、Ipomoea batatas、Lactuca sativa、Lavandula angustifolia、Ledum groenlandicum、Lolium perenne、Malus hupehensis、Matricaria recutita、Nepeta cataria、Ocimum basilicum、Panicum miliaceum、Pennisetum alopecuroides、Petasites japonicus、Peucedanum oreaselinum、Phacelia tanacetifolia、Phalaris arundinacea、Phaseolus coccineus、Plectranthus sp.、Prunus cerasifera、Raphanus raphanistrum、Ribes grossularia、Rubus occidentalis、Ruta graveolens、Sambucus canadensis、Sambucus ebulus、Sanguisorba officinalis、Santolina chamaecyparissus、Serratula tinctoria、Silybum marianum、Solanum tuberosum、Sorghum caffrorum、Sorghum dochna、Sorghum durra、Sorghum sudanense、Tanacetum vulgare、Thymus fragantissumus、Tiarella cordifolia、Tropaeolum majus、Veronica officinalis、Vicia faba、Vigna angularia、Withania somnifera、Xanthium strumarium、Abies lasiocarpa、Agaricus bisporus、Allium ascalonicum、Amelanchier alnitolia、Ananas comosus、Anthriscus cerefolium、Aralia cordata、Aronia prunifolia、Asctinidia chinensis、Atriplex hortensis、Avena sativa、Averrhoa carambola、Betula glandulosa、Boletus edulis、Borago officinalis、Brassica Chinensis、Cantharellus ciparium、Carica papaya、Carthamus tinctorius、Castanea spp.、Chaerophyllum bulbosum、Chamaemelum nobile、Cichorium endivia、Cichorium endivia crispa、Cimicifuga racemosa、Citrullus colocynthus、Citrus limettoides、Citrus limon、Citrus paradisi、Citrus sinensis、Corchorus olitorius、Crithmum maritima、Cryptotaenia canadensis、Cucumis metuliferus、Cydonia oblonga、Cynara scolymus、Datura stramonium、Dioscorea batatas、Diospiros kaki、Echinacea purpurea、Eriobotrya japonica、Fortunella spp、Fragaria、Ginkgo biloba、Gossypium herbaceum、Hibiscus cannabinus、Hydrastis canadensis、Hyoscyamus niger、Hypericum henryi、Hypericum perforatum、Hypomyces lactiflorum、Juniperus communis、Lentinus edodes、Linum usitatissimum、Litchi chinensis、Lonicera ramosissima、Lonicera syringantha、Lunaria annua、Malus hupehensis Pamp.) Rehd.、Malus sp.、Mangifera indica、Manihot esculenta、Mentha arvensis、Menyanthes trifoliata、Miscanthus sinensis Andress、Monarda didyma、Monarda fistulosa、Montia perfoliata、Musa paradisiaca、Nasturtium officinale、Nephelium longana、Onobrychis viciafolia、Optunia sp.、Origanum marjonara、Panax quinquefolius L.、Passiflora spp、Persea americana、 Phoenix dactylifera、Physalis sp、 Pleurotus spp、Podophyllum peltatum、Polygonum aviculare Linne、Populus incrassata、Populus Tremula、Populus X petrowskyana、Prunus cerasus、  Prunus persica、Prunus spp、Psidium guajaba、Psidium spp、Punica granatum、Pyrus communis、Pyrus pyrifolia、Reseda luteola、Rhamnus frangula、Rheum officinale、Rheum palmatum、 Sabal serrulata syn. Serenoa repens、Santolina、Satureja repandra、Scorzorera hipanica、Sechium edule、Setaria italica、Solidago canadensis、Solidago virgaurea、Stachys byzantina、Stipa capillata L.、Taraxacum officinale、Phaseolus acutifolius var. latifolius、Thlaspi arvense、Thymus herba-barona、Thymus pseudolanuginosus、Thymus serpyllum、Tragopogon sp.、Trichosanthes kirilowii、Trifolium incarnatum、xTriticosecale sp.、Triticum aestivum、Tsuga canadensis、Tsuga diversifolia、Tsuga F. macrophylla、Vicia faba、Vigna angularia、Weigela coracensis、Withania somnifera、Xanthium strumarium、Zingiber officinale、Achillea tomentosa、Aconitum、Allium victorialis、Amelanchier canadensis、Anthoxanthum odoratum、Arctium lappa、Asarum europaeum、Athyrium asperum、Atropa belladonna、Begonia convolvulacea、Begonia eminii、Begonia glabra、Begonia Hannii、Begonia polygonoides、Berberis vulgaris、Brassica juncea、Calendula officinalis、Camellia sinensis、Chrysanthemum balsamita、Coriandrum sativum、Filipendula rubra、Geum rivale、Hylotelephium、Iberis sempervirens、Jeffersonia diphylla、Ligularia dentata、Miscanthus sacchariflorus、Petroselium crispum、Peucedanum cervaria、Philadelphus coronarius、Physostegia virginiana、Plectranthus fruticosus、Pulmonaria saccharata、Salvia nemorosa；Saponaria officinalis、Solidago hybrida、Stellaria graminea Linne、Tamarindus indica、Thalictrum aquilegiifolium、Thuja occidentalis、Thymus praecox subsp arctitus、Yucca filamentosa、Adiantum tenerum、Anaphalis margaritacea、Angelica dahurica、Begonia manii、Betula glandulosa、Equisetum hyemale、Erysimum perofskianum Fish. S.、Foeniculum purpureum、Filipendula ulmaria、Filipendula vulgaris、Lythrum salicaire、Passiflora caerula、Pongamia pinnata、Pulmonaria officinalis、Rhus aromaticaSilene vulgaris、Tetradenia riparia、Thymus vulgaris、Argenteus、Tussilago farfara、Aesculus hippocastanum、Allium fistulosumAlpinia oficinarum、Amsonia tabernaemontana、Anaphalis margaritacea、Angelica sinensis syn. A. polymorpha、Asclepias incarnata L.、Asclepias tuberosa、Asctinidia chinensis、Crataegus oxyacanta、Butomus umbellatus、Cinnamomum sp.、Chrysanthemum parthenium、Citrus paradisi、Cocos nucifera、Crataegus sanguinea、Fucus vesiculosis、Fumaria officinalis、Gentiana macrophylla、Juglans nigra、Kochia scoparia L.) Schrad.、Krameria Triandra、Ligustrum vulgare、Lupinus polyphyllus lindl.、Lychnis chalcedonica、Optunia sp.、Polygonium chinense、Pontederia cordata、Portulacea oleracea、Primula ver
is、 Pulmonaria officinalis、Punica granatum、Radix Paeonia rubra、Rhus trilobata、Sambucus nigra、Sanguisorba minor、Saponaria officinalis L.、Sechium edule、Tanacetum balsamila、Aronia x prunifolia、Manihot esculenta、Angelica sinensis、Conyza canadensis, and Cynara carduculus subsp. およびCardunculus。
【００８１】
本発明の一つの実施例においては、可能性のある植物を表8および表９に記載した植物の群から選択している。その群は、以下を含む： Allium tuberosum、Althacea officinalis、Ambrosia artemisiifolia、Angelica sinensis、Aronia x prunifolia、Asarum europaeum、Begonia Hannii、Begonia polygonoides、Brassica napus、Brassica oleracea、Bromus inermis、Chenopodium quinoa、Citrullus lanatus、Conyza canadensis、Daucus carota、Hypomyces lactifluorum、Iberis sempervirens、Lunaria annua、Manihot esculenta、Matricaria recutita、Melilotus albus、Phaseolus vulgaris、Physostegia virginiana、Pisum sativum、Raphanus raphanistrum、Ribes sylvestre、Rubus occidentalis、Rumex crispus、Solidago canadensis、Solidago sp.、Solidago x hybrida、Tamarindus indica、Taraxacum officinale、Tropaeolum majus、Tsuga canadensis、Tsuga diversifolia、Vaccinium angustifolium、Zea maysおよびZingiber officinale。
【００８２】
本発明の一つの実施例においては、可能性のある植物を表8に記載した植物の群から選択している。その群は、以下を含む：Amaranthus candathus: Ambrosia artemisiifolia、Aronia x prunifolia、Brassica napus、Brassica oleracea、Bromus inermis、Chenopodium quinoa、Citrullus lanatus、Dolichos lablab、Foeniculum vulgare、Hypomyces lactifluorum、Lotus corniculatus、Manihot esculenta、Matricaria recutita、Melilotus albus、Phaseolus vulgaris、Pisum sativum、Raphanus raphanistrum、Ribes sylvestre、Rumex crispus、Rumex scutatus、Tanacetum cinerariifolium、Tropaeolum majus、Tsuga canadensis、Tsuga diversifolia、Vaccinium angustifolium、Zea mays および Zingiber officinale。
【００８３】
本発明のさらなる実施例においては、可能性のある植物を表8に記載した植物の群から選択している。その群は、以下を含む： Allium tuberosum、Althacea officinalis、Ambrosia artemisiifolia、Angelica sinensis、Aronia x prunifolia、Asarum europaeum、Begonia Hannii、Begonia polygonoides、Brassica oleracea、Bromus inermis、Chenopodium quinoa、Conyza canadensis、Cynara cardunculus subsp. Cardunculus、Daucus carota、Hypomyces lactifluorum、Iberis sempervirens、Lunaria annua、Melilotus albus、Phaseolus vulgaris、Physostegia virginiana、Pisum sativum、Ribes sylvestre、Rubus occidentalis、Rumex crispus、Salvia officinalis、Solidago canadensis、Solidago sp.、Solidago x hybrida、Taraxacum officinale、Tsuga canadensis、Tsuga diversifolia、Zea maysおよびZingiber officinale。
【００８４】
本発明のさらなる実施例においては、可能性のある植物はショウガ科（Family Zingiberaceae）、マツ科（Family Pinaceae）、あるいはキク科（Family Asteraceae）のメンバーである。別の実施例においては、可能性のある植物は、アキノキリンソウ属（Solidago genus）、ツガ属（Tsuga genus）、あるいはショウガ属（Zingiber genus） のメンバーである。
【００８５】
別の実施例においては、可能性のある植物は、ソリダゴ（Solidago sp. ）、ツガ・カナデンシス（Tsuga Canadensis）、および ショウガ（Zingiber officinale）を含む群から選択される。さらなる実施例においては、可能性のある植物は、ソリダゴ・カナデンシス（Solidago Canadensis）、オオアワダチソウ（Solidago gigantean）別名Solidago serotina）、アキノキリンソウ（Solidago virgaurea）、およびアキノキリンソウ属交雑種（Solidago hybrida）を含む組から選択されるソリダゴ（Solidago sp.）である。
1.1植物抽出物群の作製
【００８６】
植物抽出物群を作製する方法群が国際特許出願PCT/CA02/00285 公開番号 WO 02/06992）に詳細に説明されており、これらの方法群は本発明の植物抽出物群の作製に使用するのに適切である。その他の方法群が当業界で既知である、それらの方法には本書で説明されているものが含まれる。本発明の一つの実施例に従い、MMP-9および／またはカテプシンBのプロテアーゼ活性を阻害する能力を有する一つの植物抽出物を得るための過程が提供されており、当該過程は、 
(a) 一つあるいはそれ以上の植物から植物材料を得る段階と；
(b) 得られた植物材料から、当該植物材料を水性溶媒、エタノール溶媒、あるいは有機溶媒、あるいはそれらの組み合わせと接触させることにより、一つの抽出物を得、それにより一つあるいはそれ以上の植物抽出物群を提供する段階と；
(c) MMP-9および／またはカテプシンBのプロテアーゼに対し阻害活性の有無を調べるために、得られた植物抽出物群)を分析する段階と；さらに
(d) どちらか一方あるいは双方のプロテアーゼに対し阻害活性を有する植物抽出物群を選択する段階とから成る。
【００８７】
植物材料は、選択された植物群)から材料を直接収穫することにより得ることができるが、市販の入手源から入手しもよい。 
【００８８】
作製方法群の例は図1から図4に示してあり、これら群は可能性のある植物の選択から始まる。選択した植物を、任意に、例えば、水による処理、水および／またはストレッサーによる処理、あるいは複数のストレッサーの組み合わせによる処理などの収穫前処理に供する。当該植物を、保存するための処理に供し抽出前に保存するしてもよいが、直ぐに使用してもよい。選択した植物から得た植物材料を、次いで溶媒で処理し、その後固体材料から液体を分離し、得られた液体が可能性のある抽出物Aになる。さらに可能性のある抽出物群を作製することが必要であれば、固体S2をさらに第二の溶媒および後続の溶媒群で処理する。  
1.1.1植物ストレッサー群
【００８９】
上記のように、必要であれば、可能性のある植物群を、収穫前処理に供してよく、当該の処理は、抽出物の作製前に、水あるいは水および／または一つあるいはそれ以上のストレッサー、誘導因子、あるいは誘発因子を用いて処理する。収穫前処理は、可能性のある植物を、水および／または一つあるいはそれ以上のストレッサー、誘導因子、あるいは誘発因子と接触させるかあるいはそれらを用いて処理する。ストレッサー、誘導因子、および誘発因子の例には、有機酸類および無機酸類、脂肪酸類、グリセライド類、リン脂質類、糖脂質類、有機溶媒類、アミノ酸類およびペプチド類、単糖類、オリゴ糖類、多糖類およびリポ多糖類、フェノール類、アルカロイド類、テルペン類およびテルペノイド類、抗生物質類、洗剤類、ポリアミン類、過酸化物類、イオノフォア類などの化学化合物群；および紫外線放射、サンドブラスト、低温および高温ストレス、塩あるいは糖類により誘導される浸透ストレス、必須の栄養素窒素、リン、あるいはカリウム）を植物から奪うことと定義される栄養ストレスなどの、一つあるいはそれ以上の化学物質の増強産出を誘導あるいは誘発するために植物材料を物理的処理に供することが含まれるがそれらに限定されるものではない。一つあるいはそれ以上のストレッサーすなわち、化学化合物あるいは物理処理）を、継続してあるいは断続的に、植物あるいは植物材料に適用してよく、あるいはまた、可能性のある植物を多様な収穫前処理に供し、それぞれの処置の後に一つの抽出物を作成してよい。抽出物作製の前に植物にストレスを負荷するための多様なストレッサーおよび手続きは先に説明してあり国際特許出願 WO 02/06992を参照せよ）、それらは本発明で使用するのに適切である。
【００９０】
本発明の一つの実施例では、可能性のある植物を、一つあるいはそれ以上の化学的ストレッサーで処理している。別の実施例では、可能性のある植物を、γ-リノレン酸、γ-リノレン酸低級アルキルエステル、アラキドン酸およびアラキドン酸低級アルキルエステルから成る群から選択された一つあるいはそれ以上のストレッサーで処理している。別の実施例では、可能性のある植物を、γ-リノレン酸あるいはアラキドン酸で処理している。さらなる実施例では、植物を、サンドブラストなどの物理的ストレスに供している。さらに別の実施例では、ストレスを負荷していない植物を使用している。
【００９１】
多様なストレッサーおよび処理計画の組み合わせを使用して、対照の植物材料にある一つあるいはそれ以上の細胞外プロテアーゼ阻害剤の産出を誘導あるいは高めることもできる。当業者は、ストレスを負荷した植物抽出物群およびストレスを負荷していない植物抽出物群のMMP-9あるいはカテプシンBに対する活性を調べるために行った、本書で説明しているようなアッセイの結果により、一つのストレッサー計画に従うことが望ましいかあるいはそれ以上のストレッサー計画に従うことが望ましいかを判断することができるであろう。
1.1.2抽出および任意の保存処理のための、植物材料の収穫
【００９２】
抽出手続きに用いるために可能性のある植物群)から収穫した植物材料は、植物全体から成っていてもよいが、その葉、種子、根、茎、花、あるいはそれらの組み合わせから得られた一つあるいはそれ以上の独特の組織であってもよい。植物材料は、植物から収穫した直後に使用してよく、任意の収穫前処理の直後に使用してよく、あるいはまた抽出手続き群)を行なう前にある期間植物材料を保存することが望ましいこともある。必要であれば、植物材料を、保存する前に、例えば、乾燥、凍結、乾燥凍結、あるいはそれらの組み合わせにより、処理してもよい。 
【００９３】
植物材料を保存するために処理した後、抽出手続き群)に供する前に、当該植物材料をある期間保存してよい。保存期間は長さが異なっていてよく、例えば、数日から数年の間であってよい。本発明の一つの実施例では、植物材料は、1週間未満の期間保存されている。別の実施例では、植物材料は、1週間から1ヶ月の期間保存されている。さらなる実施例では、植物材料は、1ヶ月から6ヶ月の期間保存されている。その他の実施例では、植物材料は、4ヶ月から1年の期間、および1年を超える期間保存されている。
1.1.3抽出過程
【００９４】
多様な抽出過程が当業界で既知であり、それらを本発明の方法群において用いることができる例えば、国際特許出願WO 02/06992を参照せよ）。抽出物は、一般的に、固体植物材料を溶媒に接触させることにより産出され、接触は、適切な配合の溶媒を用い、および当該固体植物材料が当該溶媒に適切に晒され当該植物材料に存在する阻害活性が当該溶媒により引き出されるように充分な長さの時間で行なう。
【００９５】
本発明の一つの実施例では、植物材料を、図１に示したような抽出過程に供している。この実施例によると、可能性のある抽出物A、B、およびCを作製するため、三つの基本的抽出過程が順番に行なわれている。 
【００９６】
本発明のその他の実施例では、抽出過程の数が多いものあるいは少ないものが考慮されている。例えば、代替の実施例では、植物材料を、図2に示したような抽出過程に供している。この実施例によると、植物材料を、二つの別個の抽出過程に供し、同時に二つの別個の、可能性のある抽出物Aを得ている。
【００９７】
抽出過程の数に関わらず、それぞれの抽出過程は一般的に、約10分から約24時間の時間で、約4oC から約50oCの温度で、行なわれる。溶媒を植物材料と適切に接触させるには、懸濁液を振るのがよい。その後、液体分画を固体不溶）分から分離し、二つの分画を作製する：液体分画これが可能性のある抽出物である）と固体分画。液体分画と固体分画の分離は、当業者に既知である一つあるいはそれ以上の標準過程により、行なうことができる。
【００９８】
図1に示した実施例に従って、次いで抽出過程を第二および第三の溶媒を用いて繰り返す。図1の溶媒A、B およびCは、一般的に、別個のクラスの溶媒例えば、水性、アルコール系および有機系）を表している。 溶媒群は、例えば、極性から非極性の順序あるいは非極性から極性の順序のような、特定の順序で適用することができる。あるいはまた、溶媒群は、無作為の順序で適用することもできる。しかし、全ての場合において、後続の溶媒と接触させる前に、固体分は乾燥していなければならない。 
【００９９】
抽出過程で用いる植物材料は、植物全体であってもよいが、その葉、種子、根、茎、花、あるいはそれらの組み合わせなどから得られた一つあるいはそれ以上の独特の植物組織であってもよい。植物材料は、新鮮であっても、乾燥してあっても、あるいは凍結してあってもよい。必要であれば、阻害活性の抽出を促進する目的で、抽出過程の前に、植物材料を処理してよい。一般的にそのような処置は、より広い面積を溶媒に晒すように、植物材料をなんらかの手段により断片化するものである。例えば、粉砕機あるいはその他の装置を用いて植物材料を機械的に潰すかあるいはスライスし、植物材料を小片あるいは粒子に断片化するか、あるいは液体窒素を用いて植物材料を凍結させ*8、その後潰すか断片化し、小片としてもよい。
【０１００】
それぞれの抽出過程で使用する溶媒は、水性、アルコール系、または有機系、あるいはそれらの組み合わせであってよい。本発明の一つの実施例では、ある水性溶媒を用いて植物材料を抽出している。適切な水性溶媒には、水、緩衝液、細胞培地、希酸あるいは希塩基などが含まれるがそれらに限定されるものではない。多様な緩衝液が当業界で既知である、それらを本発明の文脈で抽出溶媒として用いることができる。それらの例には、TRIS、BIS-TRIS、HEPES、PIPES、MES、BICINE、TRICINE、およびCAPSが含まれるがそれらに限定されるものではない。適切な細胞培地の例には、10% 血清DMEM、無血清DMEM、RPMI 1640、HAM's F12、CMRL 1066、マッコイ5A、199培地、ウェイマウス（Waymouth's） MB752、イーグル培地あるいはジョクリック培地、α-MEM培地が含まれるがそれらに限定されるものではない。別の実施例では、pH が6 から8である水性TRIS-HCl 緩衝液から成る水性溶媒を抽出に使用しており、その抽出条件は、時間が30分から8時間、および温度が約4oC から約50oCである*9。 
【０１０１】
本発明の代替の実施例では、アルコール溶媒を用いて植物材料を抽出している。適切なアルコール溶媒の例には、メタノール、エタノール、n-プロパノール、イソプロパノール、n-ブタノール、2-ブタノール、tert-ブタノール、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されるものではない。一つの実施例では、エタノールとメタノールとの組み合わせをアルコール溶媒として使用しており、この場合エタノール：メタノールの範囲は、約50:50 から約85:15の間である。さらなる実施例では、約10分から1時間の間、約4oC から約25oCの温度で、植物材料をアルコール溶媒と接触させている。 
【０１０２】
代替の実施例では、有機溶媒を用いて植物材料を抽出している。適切な有機溶媒の例には、ジエチルエーテル、ヘキサン、ヘプタン、ジクロロメタン、酢酸エチル、ブチルアルコール、ジメチル スル ホキサ イ ドDMSO)、クロロホルム、エーテル、アセトン、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されるものではない。一つの実施例では、ジクロロメタンを溶媒として用い、当該溶媒を用いて1時間から24時間に渡り、植物材料を振動させた。
【０１０３】
代替の実施例では、一つのアルコール溶媒を一つの共溶媒水性あるいは有機系であってよい）と組み合わせて使用し、植物材料を抽出している。一つの実施例では、エタノールと水との組み合わせを溶媒として使用しており、この場合エタノール：水の範囲は、約50:50および約85:15の間である。
【０１０４】
可能性のある抽出物群が単離されたら、単離された抽出物群を、細胞外プロテアーゼ活性を阻害するその能力について、直接テストしてよく適切な溶媒に溶解あるいは分散させた後）、あるいは、下記に説明し図2および図3にその概要を示した、さらなる手続きに供してもよい。例えば、可能性のある抽出物群を、プロテアーゼ活性あるいはその他のアッセイを妨害する可能性のある脂肪酸類あるいはクロロフィル分を取り除く手続きに供してもよい。当業界で既知である多様な手続きを、用いることができる。一つの実施例では、ヘキサン、ヘプタン、あるいは酢酸エチルなどの有機溶媒を使用する、一つあるいはそれ以上の付加的な分割段階が含まれている。必要であれば、一つあるいはそれ以上の分割段階の前に、液体状である、可能性のある抽出物を濃縮し、適切な溶媒に溶解してもよい。 
【０１０５】
本発明は、既知の大規模、中規模、小規模の抽出物調製方法群を含む、多様な規模を用いて、抽出過程を行うことができるということを考慮している。
【０１０６】
本発明は、本発明の選択植物抽出物群の大規模な調製を考慮している。対象の抽出物の単離につながる抽出過程を繰り返すことにより、そのような抽出物群を商業規模で調製することができる。本発明のこの局面に関する一つの実施例を、図5に示した。この実施例では、小規模の抽出手続きを単純に規模拡大し、品質管理の付加段階を含め、得られた抽出物群に関し再生産可能な結果を確保している。同様に、図4にその概要を示した過程も、図2に示したように、商業目的のため規模拡大することが可能である。
【０１０７】
工業的レベルの抽出物生産へ向かって規模を拡大する途中に必要と成る可能性がある、小規模手続きの改変もまた、本発明で考慮している。そのような改変には、例えば、規模拡大の途上に起こる変化を補正し、全体の手続きを工業規模生産に向かって体質改善しコスト効果を高める目的の、使用中の溶媒についての改変あるいは使用中の抽出手続きについての改変が含まれる。この種の改変は、業界の標準であり、当業者には明らかであろう。
1.1.4抽出物の精製／分画
【０１０８】
本発明の植物抽出物群は、必要に応じて、さらに精製あるいは濃縮することができる。「精製」というのは、抽出物が既に、付加的精製段階、部分的精製段階、および／または分画段階に供されているということである。
【０１０９】
そのような 精製段階、部分的精製段階、および／または分画段階を、当業界において既知である多様なテクニックをもちいて行なうことができ、そのようなテクニックの例には、例えば、固液抽出法、液液抽出法、固相抽出法SPE)、メンブレン濾過、限外ろ過、透析法、電気泳動法、溶媒濃縮、遠心分離、超遠心分離、高圧を伴ったあるいは伴わない液体あるいはガスクロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを含む）、凍結乾燥、蒸発、多様な「担体」PVPP、炭素、 抗体など）を用いた沈殿、あるいはそれらの組み合わせがある。当業者は、対象の活性すなわち、MMP-9および／またはカテプシンBの阻害）においてそれぞれの連続した分画を強める目的を以って、精製手続きを通して当該活性を追跡することにより、そのような選択肢を連続的にどのように使用するのかよく理解しているであろう。
【０１１０】
固液抽出法には当業界で既知の多様な溶媒の使用が含まれ、超臨界溶媒、ソックスレー抽出溶媒、ボルテックスシェーカー、超音波および抽出を高めるその他の手段、さらにろ過、遠心分離および文献例えば、R. J. P. Cannell, Natural Products Isolation, Humana Press, 1998を参照せよ)に記載されている関連方法群による回収法の使用が含まれる。使用可能な溶媒の例には、炭化水素溶媒、塩素化溶媒、有機エステル、アルコール、水、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されるものではない。超臨界流体抽出の場合は、本発明はまた、V. H. BrightSupercritical Fluid Technology, ACS Symp. Ser. Vol. 488, ch. 22, 1999）で説明されているような修飾因子の使用を網羅している。
【０１１１】
液液抽出法には、超臨界条件下の溶媒を含む、当業界で既知である溶媒の多様な混合物の使用が含まれる。一般的な溶媒には、炭化水素溶媒、塩素化溶媒、有機エステル、アルコール、水、多様な水溶液、およびそれらの組み合わせが含まれるがそれらに限定されるものではない。液液抽出法は、手動で行なうこともできるが、準自動化あるいは完全自動化することもでき、溶媒は当業界の標準テクニック例えば、S. Ahuja, Handbook of Bioseparations, Academic Press, 2000を参照せよ）を用いて除去あるいは濃縮することができる。
【０１１２】
固相抽出SPE)テクニックには、カートリッジ、カラム、あるいは業界で既知のその他の装置の使用が含まれる。そのようなテクニックと併用することができる吸収剤には、シリカ・ゲル順相）、逆相シリカ・ゲル修飾シリカ・ゲル）、イオン交換樹脂、およびフルオリシル（fluorisil）が含まれるがそれらに限定されるものではない。本発明はまた、有機的あるいは無機的なマクロ分子剤に由来する固相支持体に付着させたスカベンジャー樹脂あるいはその他のトラップ剤の使用も含む。
【０１１３】
メンブレン、逆浸透および限外ろ過の手段には、当業界で既知の多種のメンブレンの使用、および圧力、真空、遠心力、および／またはメンブレンおよび限外ろ過の過程に使用することができるその他の手段が含まれる例えば、S. Ahuja, Handbook of Bioseparations, Academic Press, 2000を参照せよ）。
【０１１４】
透析法には、阻止分子量が約0.5 KDa 未満から約50 KDa を超えるメンブレンが含まれる。本発明はまた、当業界で既知の多様な手段によって透析物あるいは濃縮水から得られた、精製および／または分画抽出物をも網羅しており、そのような既知の手段には、蒸発、減圧蒸発、蒸留、真空蒸留、および凍結乾燥が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【０１１５】
クロマトグラフィー手段には、当業者に既知であり本書に説明されているクロマトグラフィーを行なう多様な手段が含まれる例えば、G. Sofer, L. Hagel, Handbook of Process Chromatography, Academic Press, 1997を参照せよ）。その例には、通常のカラムクロマトグラフィー、フラッシュクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィーHPLC)、中圧液体クロマトグラフィーMPLC)、超臨界流体クロマトグラフィーSFC)、向流クロマトグラフィーCCC)、移動層方式クロマトグラフィー、擬似移動層方式クロマトグラフィー、膨張層方式クロマトグラフィー、および平面クロマトグラフィーが含まれるがそれらに限定されるものではない。それぞれのクロマトグラフィー法について、使用可能な吸収剤には、シリカ・ゲル、アルミナ、フルオリシル（fluorisil）、セルロースおよび修飾セルロース、多様な修飾シリカ・ゲル、イオン交換樹脂、サイズ排除ゲルおよび当業界で既知のその他の吸収剤例えば、T. Hanai, HPLC: A Practical Guide, RSC Press, UK 1999を参照せよ）が含まれるがそれらに限定されるものではない。本発明はまた、分画段階、部分的精製段階、および／または精製段階をクロマトグラフィー手段により行なうための、二つあるいはそれ以上の溶媒勾配をも含む。使用可能な溶媒の例には、ヘキサン、ヘプタン、ペンタン、石油エーテル、シクロヘキサン、ヘプタン*10、ジエチルエーテル、メタノール、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール、イソブタノール、tert-ブタノール、水、ジクロロメタン、ジクロロエタン、酢酸エチル、テトラヒロドフラン、ジオキサン、tert-ブチルメチルエーテル、アセトン、および2-ブタノンが含まれるがそれらに限定されるものではない。水あるいは水相を使用した場合は、当該の水あるいは水相には多様な量の無機塩類あるいは有機塩類が含まれていてよく、および／または、分画および／または精製が改善されるように酸あるいは塩基を用いてpH を異なる値に調整してよい。
【０１１６】
平面クロマトグラフィーの場合には、本発明は、この種のクロマトグラフィーの多様な形態の使用を含み、その例には、1次元および2次元薄層クロマトグラフィー1D- および 2D-TLC)、高速薄層クロマトグラフィーHPTLC)、および遠心薄層クロマトグラフィー遠心TLC)が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【０１１７】
向流クロマトグラフィーCCC)の場合には、本発明は、手動、準自動化、および自動化システムの使用、および分画段階および／または精製段階を行なうための多様な溶媒および溶媒の組み合わせの使用を含む例えば、W. D. Conway, R. J. Petroski, Modern Countercurrent Chromatography, ACS Symp. Ser. Vol. 593, 1995を参照せよ）。溶媒の除去および／または濃縮は、当業界で既知の多様な手段により行なうことができ、そのような手段の例には、減圧蒸発、蒸発、減圧蒸留、蒸留、および凍結乾燥が含まれるがそれらに限定されるものではない。
【０１１８】
本発明は、膨張層方式クロマトグラフィー、移動層方式クロマトグラフィー、擬似移動層方式クロマトグラフィー、および当業界で既知のその他の関連方法群による、分画段階、部分的精製段階、および／または精製段階を含む例えば、G. Sofer, L. Hagel, Handbook of Process Chromatography, Academic Press, 1997 and S. Ahuja, Handbook of Bioseparations, Academic Press, 2000を参照せよ）。
【０１１９】
選択的沈殿手段には、多様な溶媒および溶媒の組み合わせの使用、温度変更の使用、沈殿剤および／または 修飾因子の付加、および／または選択的沈殿を行なうための塩基あるいは酸を加えることによるpH の修飾を含む。
【０１２０】
本発明は、蒸気蒸留、水利用蒸留（hydrodistillation）、あるいは当業界で既知であるその他の関連蒸留方法群による、分画段階、部分的精製段階、および／または精製段階を含む 例えば、L. M. Harwood, C. J. Moody, Experimental Organic Chemistry, Blackwell Scientific Publications, UK, 1989を参照せよ）。
【０１２１】
精製の過程には、元来の抽出物および／または分画抽出物、および／または精製抽出物から、溶媒を除去することにより、精製されたあるいは部分精製された抽出物群を濃縮することが含まれる。溶媒除去のテクニックは、当業界の当業者に既知である、それらには、ロータリー蒸発、蒸留通常圧および減圧）、遠心真空蒸着speed-vac）、および凍結乾燥が含まれるがそれらに限定されるものではない。
1.2 MMP-9および／またはカテプシンBの活性を阻害する植物抽出物群の能力の判断
【０１２２】
上記のように、本発明の治療成分群に含めるべき、可能性のある植物抽出物群は、MMP-9および／またはカテプシンBの活性を阻害する能力を有する。可能性のある植物抽出物群を、これらのプロテアーゼを阻害するその能力につき、当業界で既知である多様なテクニックを用いて、テストすることができ、それらのテクニックは本書に記載したものを含むがそれらに限定されるものではない。本発明の文脈では、MMP-9および／またはカテプシンBの活性を少なくとも20%減少させる植物抽出物は、そのプロテアーゼの活性を阻害する能力を有すると考える。従って、本発明の一つの実施例により、当該治療成分群に含めるのに適切である植物抽出物群をスクリーニングする方法が提供されており、当該方法は、 
(a) 一つあるいはそれ以上の植物抽出物を提供する段階と；
(b) MMP-9および／またはカテプシンBに対する阻害活性を求めて、一つあるいはそれ以上の植物抽出物を分析する段階と；さらに
(c) MMP-9および／またはカテプシンBの活性を少なくとも20%減少させる植物抽出物を、当該治療成分群に含めるのに適切である植物抽出物群として選択する段階とから成る。
【０１２３】
可能性のある抽出物は、直接MMP-9および／またはカテプシンB についてテストしてもよいが、その前に事前スクリーニングに供してもよい。この事前スクリーニングは、既知の細胞外プロテアーゼ群EPs)のパネルについて、さらにテストを行なうために選択された少なくとも一つのEPを阻害する能力を有する抽出物群を用いて行なう。そのような事前スクリーニングで使用可能なEPs には、マトリックス・メタロプロテナーゼ MMPs)、カテプシン、 エラスターゼ、プラスミン、TPA、uPA、カリクレイン、ADAMS ファミリーメンバー、ネプリライシン、ジンジパイン、クロストリパイン、サーモライシン、セラライシン、およびその他のバクテリア系またはウィルス系のプロテアーゼが含まれるがそれらに限定されるものではない。 
【０１２４】
当業者は、MMP-9および／またはカテプシンBの活性を阻害する植物抽出物の能力を質的におよび／または量的に測定する多様な方法群およびテクニックがあることをよく理解しているであろう。 
【０１２５】
例えば、多様なMMPsMMP-9、エラスターゼおよびカテプシンを含む）の活性を測定するアッセイがいくつかありこれらの方法群を閲覧するには、Murphy and Crabbe, In Barrett ed.) Methods in Enzymology. Proteolytic Enzymes: Aspartic Acid and Metallopeptidases, New York: Academic Press, 1995, 248: 470を参照せよ）、 それらのアッセイには、ゼラチン分解アッセイ（gelatinolytic assay）これは、放射能標識を付けたタイプIコラーゲンの分解に基づく）、ザイモグラフィーアッセイこれは、基質含浸SDSポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動をモニターする、負染色したバンドの存在に基づく）、およびPacmen et al., Biochem. Pharm.1996) 52:105-111)により開発されたマイクロタイタープレートアッセイがある。
【０１２６】
その他の方法には、自動クエンチしたフルオロジェニックな基質を用いるものがある。多くのフルオロジェニックな基質が、蛍光レベル変化測定を用いて、MMP-9、エラスターゼおよびカテプシンの活性を定量化できるようにデザインされているNagase and Fields 1996) Biopolymers 40: 399-416により、再調査された）。例えば、自動クエンチしたフルオロジェニックなペプチド基質MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2 を用いて、MMP-9の活性を調べることができ、当該フルオロジェニックなペプチド基質はCalbiochem社米国カリフォルニア州サンディエゴ州)から購入することができる。自動クエンチしたペプチド基質Z-Arg-Arg-AMC もまた、Calbiochem 社より購入することができ、これはカテプシンB活性の評価に適切である。カテプシンB活性はまた、Alexa-488 染料オレゴン州ユージン市Molecular Probes社）で強力に標識化したヘモグロビンを用いて調べることができる。
【０１２７】
蛍光分極アッセイは、蛍光分子が平面偏光により励起されると、分子が励起状態の間静止状態であり続けるならば、当該蛍光分子は同一の偏光平面に光を放つという原理に基づいている。しかし、励起された分子が励起状態の間に回転するならばあるいは転がるならば、光は励起とは異なった平面に放たれる。垂直偏光を用いて蛍光体を励起すれば、放たれた光の強度を最初の垂直平面および水平面でもモニターすることができる。放たれた光の強度が垂直平面から水平面へ動く度合いは、蛍光で標識を付けた分子の動きと関連性を有する。蛍光で標識を付けた分子が非常に大きければ、そのような分子は励起状態の間歇の間にほとんど動かず、放たれた光は励起平面については依然として高度の偏光性を有している。蛍光で標識を付けた分子が小さければ、そのような分子は速く回転し転がり、その結果、放たれた光は励起平面については無偏光化する。従って、FP を用いてあらゆる生化学的反応例えば、タンパク質-DNA相互作用；免疫測定法；受容体-リガンド相互作用；分解反応）を行い、蛍光で標識を付けた分子の分子サイズを変えてもよい Bolger R, Checovich W. 1994) Biotechniques 173):585-9.より改作）。
【０１２８】
細胞外プロテアーゼ活性を測定する別の方法は、カナダ国特許番号2,189,486 1996)および St-Pierre et al., 1996) Cytometry 25: 374-380に説明されている、蛍光活性化基質変換（fluorescent activated substrate conversion、FASC）アッセイを使用するものである。 
【０１２９】
可能性のある抽出物群をEPsのパネルについてテストする場合、あるいは複数の抽出物群を単一のEPについてMMP-9またはカテプシンB、あるいはMMP-9とカテプシンBの双方を同時に）テストする場合は、当業界で既知である多様なフォーマットを利用することができる。例えば、可能性のある抽出物群を、一つあるいはそれ以上のプロテアーゼについて連続してテストすることもでき、あるいは複数のプロテアーゼについて例えば、細胞外プロテアーゼのアレイ）について同時にテストすることもでき、あるいはまた複数の植物抽出物を一つあるいはそれ以上のEPs について同時にテストすることもできる。これらのアッセイを、可能性のある抽出物群の同時テストを促進する目的で、高スループットに変えることもできる。高スループットテクニックは常に開発されており、これらのアッセイに将来改変を加えるそのようなテクニックもまた本発明の範囲内にあると考えられる。
【０１３０】
本発明の一つの実施例によると、MMP-9またはカテプシンB を選択的に阻害する能力を有する植物抽出物群が選択されている。「選択的に阻害する」というのは、その抽出物がMMP-9またはカテプシンB を、その他のEPs に比べて、より高い程度で阻害するということを意味する。選択的阻害は、当業界で既知であるように、IC50 値の測定により定量化することができる。IC50 値とは、プロテアーゼ触媒活性の50%の阻害が起こる抽出物の濃度と定義される。本発明によると、当該植物抽出物はその他のEPsに対するIC50 値に比べて少なくとも1/2対数低いIC50 値で選択されたプロテアーゼを阻害する場合に、植物抽出物はMMP-9またはカテプシンB を選択的に阻害すると考えられる。ある抽出物がMMP-9および／またはカテプシンBを選択的に阻害する能力を有するか否かを判断するために、当該抽出物をMMP-9および／またはカテプシンB および少なくとも一つのその他のEPについて、上記に説明した方法群および得られたIC50 値を用いて、テストする必要がある。IC50 値の比較において、MMP-9／カテプシンB に関する当該抽出物のIC50 値が、一つのその他のEP に関する当該抽出物のIC50 値に比べて、少なくとも1/2対数低ければ、当該抽出物はMMP-9／カテプシンB を選択的に阻害したと考えられる。
2.合成MMP-9阻害剤および合成カテプシンB阻害剤
【０１３１】
上記のように、本発明の治療成分群は、さらにひとつあるいはそれ以上の合成MMP-9阻害剤および／または合成カテプシンB阻害剤から成っていてよい。これらのフィト合成（phyto-synthetic）成分はMMP-9とカテプシンB を同時に標的としているので、当該成分はまた癌の治療に有用である。MMP-9あるいはカテプシンB を阻害する能力を有する数多くの合成化合物群が当業界で既知であり、それらの合成化合物群を本発明の成分群に含めることができる。その例には、マリマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、メタスタット、E-64、CA-074 メチル-エステル、ロイペプチン、1-phenyl-1,4-epoxy-1H,4H-naphtho（1,8-de）（1, 2）dioxepin ANO-2) およびアイロマスタット別名N-（2R)-2-hydroxamidocarbonylmethyl)-4-methylpentanoyl）-L-tryptophan methylamide、GalardinTM あるいは GM-6001）が含まれるがそれらに限定されるものではない。本発明の成分群に使用するのに適しているであろうその他の合成阻害剤が将来開発されるであろうことを理解されたい。
抗癌治療剤
【０１３２】
上記のように、本発明は一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤群と組み合わせた一つの治療成分から成る治療法の組み合わせを考慮している。本発明の文脈では、「抗癌治療剤群」には、癌細胞の成長および／または転移を防ぎ遅らせる、広範囲の化合物群、成分群、および治療法群が含まれる。そのような抗癌治療剤群には、例えば、化学治療剤、放射線治療、遺伝子療法、ホルモン操作、免疫療法、代替療法自然療法製剤の使用を含む)、およびアンチセンスオリゴヌクレオチド療法がある。
【０１３３】
本発明の実施例では、当該成分群が、一つあるいはそれ以上の化学治療剤、一つあるいはそれ以上の免疫治療剤、あるいは一つあるいはそれ以上の自然療法製剤と組み合わされて、使用されている。
1.化学治療剤
【０１３４】
本発明の当該治療成分群と組み合わせて使用するのに適切な化学治療剤群を、当業界で既知の広範囲の癌化学治療剤群から選択することができる。既知の化学治療剤群には、ある範囲の癌の治療に適用できる化学治療剤群すなわち、広域化学治療剤群；例えば、ドキソルビシン、カペシタビン、ミトキサントロン、イリノテカンCPT-11)、シスプラチン、およびジェムシタビンなど）と、ある特定の癌の治療に特異的である化学治療剤群が含まれる。 
【０１３５】
例えば、エトポシドは一般的に、白血病急性リンパ球性白血病および急性骨髄性白血病を含む）、生殖細胞腫瘍、ホジキン病および多様な肉腫の治療に適用される。シタラビンAra-C)も、急性骨髄性白血病、髄膜白血病、急性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、赤白血病、および非ホジキンリンパ腫を含む、多様な白血病の治療に適用可能である。
【０１３６】
本発明は、上記の双方の種類の化学治療剤を、本発明の治療成分群と組み合わせて使用することを考慮している。本発明の一つの実施例では、当該治療成分群を、一つあるいはそれ以上の広域化学治療剤と組み合わせて使用している。本発明の別の実施例では、治療法の組み合わせは、シスプラチンあるいはドキソルビシンから成る。
【０１３７】
特定の癌を治療するために、単独であるいは多様な組み合わせで使用することができる化学治療剤の例を、表1に示した*11。当業者は、その他の多くの化学治療剤が利用可能であり、以下のリストは代表例のみを記載したものであることを、よく理解しているであろう。
【０１３８】
表1：一般的癌の治療に用いられる化学治療剤の例
2008516899.tif 000003
2008516899.tif 000004
2008516899.tif 000005
【０１３９】
上記のように、一つ以上の化学治療剤を、組み合わせに使用してよい。ある特定の癌を治療するために標準癌化学治療剤を頻繁に組み合わせるということは、当業界で周知のことであり、そのような組み合わせをさらに本発明の治療成分群を組み合わせることができる。 
【０１４０】
化学治療剤組み合わせ療法の例には、乳癌の治療について言えば、エピルビシンのパクリタキセルあるいはドセタクセルとの組み合わせ、あるいはドキソルビシンあるいはエピルビシンのシクロホスファミドとの組み合わせが含まれる。多剤併用（Polychemotherapeutic） 治療計画もまた有用であり、そのような治療計画は、例えば、ドキソルビシン/シクロホスファミド/5-フルオロウラシルあるいはシクロホスファミド/エピルビシン/5-フルオロウラシルから成っていてよい。上記の組み合わせ群の多くが、多様な固体癌の治療に有用である。
【０１４１】
エトポシドをシスプラチンかカルボプラチンのどちらかと組み合わせ、小細胞肺がんの治療に使用する。胃癌あるいは食道癌の治療においては、ドキソルビシンかエピルビシンを、シスプラチンと5-フルオロウラシルと、組み合わせたものが有用である。結腸直腸癌については、CPT-11を5-フルオロウラシ系の薬剤群と組み合わせたもの、あるいはオキサリプラチンを5-フルオロウラシ系の薬剤群と組み合わせたものを使用することができる。オキサリプラチンは、カペシタビンと組み合わせて使用してもよい。
【０１４２】
その他の例には、非ホジキンリンパ腫の治療のためのシクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、および プレドニゾンの組み合わせ；ホジキン病の治療のためのドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチおよびダカルバジンDTIC)の組み合わせ；および 非小細胞肺癌の治療のためのシスプラチンあるいはカルボプラチンを、ジェムシタビン、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビンあるいは エトポシドの中の任意の一つの薬剤と組み合わせたもの、あるいはシスプラチンあるいはカルボプラチンを、ジェムシタビン、パクリタキセル、ドセタクセル、ビノレルビンあるいは エトポシドの組み合わせと組み合わせたものが、含まれる。
【０１４３】
多様な肉腫を、組み合わせ療法により治療することができ、例えば、骨肉腫には、ドキソルビシンおよびシスプラチンあるいは メ卜トレキサートをロイコボリンと組み合わせたものが使用され；進行肉腫には、エトポシドをイフォスファミドと組み合わせて使用することができ；軟部肉腫には、ドキソルビシン あるいはダカルバジンを単独で使用することができ、あるいは進行肉腫には、ドキソルビシン をイフォスファミド あるいはダカルバジンと組み合わせて、あるいはエトポシドをイフォスファミドと組み合わせて使用することができる。 
【０１４４】
Ewing肉腫／末梢性未分化神経外胚葉性腫瘍PNET)あるいは胎児性横紋筋肉種を、エトポシドおよびイフォスファミドを用いて、あるいはビンクリスチン、ドキソルビシンおよびシクロフォスファミド の組み合わせを用いて、治療することができる。多様な癌の治療において、シクロフォスファミド、シスプラチンおよびメルファランなどのアルキル化剤も、その他の化学治療剤との組み合わせ療法でよく用いられている。
2.免疫治療剤
【０１４５】
本発明はさらに、本発明の治療成分*13を一つあるいはそれ以上の免疫治療剤と組み合わせたものの使用を考慮している。一つの治療成分、化学治療剤群) および免疫治療剤群) から成る組み合わせ群もまた考慮されている。当業界で既知であるように、免疫治療剤は、非特異的であってよくすなわち、癌細胞の増殖および／または転移に対する闘いにおいて免疫系がより効果的になるように、免疫系を全般的に強めること)、あるいは特異的であってよいすなわち、癌細胞自体に標的を当てること）。免疫療法による治療計画は、非特異的免疫治療剤と特異的免疫治療剤の使用を組み合わせてよい。 
【０１４６】
非特異的免疫治療剤は、免疫系を刺激するかあるいは間接的に増強する物質である。これらの非特異的免疫治療剤のいくつかは、癌治療のための主たる治療法として単独で用いることができる。あるいはまた、非特異的免疫治療剤は、主たる治療法に付加する形で投与してもよく、そうするとその他の治療法群例えば、癌ワクチン類)の効果を高めるかあるいはその他の治療法群の有害事象例えば、ある種の化学治療剤により誘発される骨髄抑制)を抑えるためのアジュバントとして機能する。非特異的免疫治療剤は、重要な免疫系細胞に作用し、サイトカインおよび免疫グロブリンの産出を増強させるなどの二次的反応を引き起こす。あるいはまた、治療剤自体がサイトカインから成っていてもよい。非特異的免疫治療剤は、一般的に、サイトカイン類か、非サイトカインアジュバント類に分類される。
【０１４７】
本発明の組み合わせ療法群で使用することができる適切なサイトカインには、インターフェロン、インターロイキンおよびコロニー刺激因子が含まれる。インターフェロンIFNs)には、IFNs の一般種、IFN-アルファIFN-α)、IFN-ベータ IFN-β) および IFN-ガンマIFN-γ)が含まれる。組換えIFN-αが、ロフェロン（Roferon） Roche Pharmaceuticals)およびイントロンA（Intron A） Schering Corporation)という商品名で市販されている。インターロイキンには、IL-2 別名アルデスロイキン（aldesleukin）)、IL-4、IL-11 および IL-12 別名オプレルベキン（oprelvekin））が含まれる。市販されている組換えインターロイキンの例には、プロリュウキン（Proleukin）(R)IL-2; Chiron Corporation)および ニュウメガ（Neumega）(R) IL-12; Wyeth Pharmaceuticals)がある。Zymogenetics, Inc.ワシントン州シアトル市）は、現在、IL-21の組換えをテスト中であり、当該のIL-21の組換えは、本発明の組み合わせにおける使用が考慮されている。インターロイキン-2融合毒素あるいは、Seragen, Inc 製Ontak）として既知であるインターロイキン免疫トキシンコンジュゲートは、ジフテリア毒素にコンジュゲートしたIL-2から成るものであるが、皮下T細胞リンパ腫の治療剤としてFDAに承認された。コロニー刺激因子CSFs) には、顆粒球コロニー刺激因子G-CSFあるいはフィルグラスチム）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子GM-CSFあるいはサルグラモスチム）およびエリスロポエチンエポエチン-アルフア、ダーベポイエチン）が含まれる。多様な組換えコロニー刺激因子が市販されており、その例には、ニュウポゲン（Neupogen）(R)G-CSF; Amgen)、ニューラスタ（Neulasta） ペルフィルグラスチム；Amgen)、リューカイン（Leukine） GM-CSF; Berlex)、プロクリット（Procrit） エリスロポイエチン；Ortho Biotech)、エスポー（Epogen） エリスロポエチン; Amgen)、Arnesp *14 エリスロポイエチン)がある。 
【０１４８】
本発明の組み合わせ群で使用するのに適切である非サイトカインアジュバント類には、レバミゾール、水酸化アルミニウムalum）、カルメットとゲランの菌BCG)、不完全フロイントアジュバント、QS-21、DETOX、キーホールリンペットヘモシニアンKLH)およびジニトロフェニルDNP)が含まれるがそれらに限定されるものではない。 
【０１４９】
本発明はさらに、一つあるいはそれ以上のモノクロナール抗体を、癌治療の治療成分と組み合わせて使用することを考慮している。本発明の組み合わせ群に含めるのに適切である癌免疫治療剤として現在使用されているモノクロナール抗には、リツキマブ  （rituximab）リツキサン（Rituxan）(R)）、トラスツズマブ（trastuzumab）ヘルセプチン（Herceptin）(R)）、イブリツモマブチウキセタン（ibritumomab tiuxetan）ゼバリン（Zevalin）(R)）、トシツモマブ（tositumomab）ベキサール（Bexxar）(R)）、セツキシマブ（cetuximab）C-225、アービタックス（Erbitux）(R)）、ベバシズマブ（bevacizumab）アバスチン（Avastin）(R)）、ゲムツズマブオゾガマイシン（gemtuzumab ozogamicin）ミロターグ（Mylotarg）(R)）、アレムツズマブ（alemtuzumab）キャンパス（Campath）(R)）、およびBL22が含まれるがそれらに限定されるものではない。
3.自然療法
【０１５０】
本発明はさらに、例えば自然療法製剤としての治療成分群を、一つあるいはそれ以上の自然療法製剤と組み合わせたものを、自然療法の一部として使用することを考慮している。本発明において、「自然療法」という語は、癌治療のための多様な自然療法的、草本的、栄養的、植物的、同毒療法的、代替的、および補完的な治療法を含むように意図されている。 
【０１５１】
適切な自然療法製剤の例には、コンフリー、朝鮮人参、緑茶、サッサフラス、昆布茶、チャパラル茶、タヒボ茶、エサイック茶（Essaic）、およびイスカドール：アンチネオプラストンなどの草本的製剤およびお茶；ビタミン剤； 共酵素；鉱物；「Cancell」； 714-X；ホクセイハーバルトニック（Hoxsey herbal tonic）；硫酸ヒドラジン; ジメチルスルフォキサイドDMSO)；オゾン；過酸化水素；ビオフラボノイド、および鮫軟骨が含まれるがそれらに限定されるものではない。
治療成分群の効用
【０１５２】
本発明により、MMP-9およびカテプシンBの活性を同時に阻害する能力を有する治療成分群は、癌治療において有用である。本発明の治療成分群は、新生細胞の移動、内皮細胞の移動、腫瘍の成長、および腫瘍の転移の一つあるいはそれ以上を阻害する能力を有し、必要であれば当該成分群の活性を最初にin vitro で測定することができる。このように本発明は、当該治療成分に組み入れるべき適切な候補植物抽出物群をさらに特徴付けることを目的として、事前のin vitro スクリーニング段階を考慮している。細胞の移動、浸潤および／または増殖を阻害する被験化合物あるいは成分の能力を測定するための数多くの標準テストが当業界で既知であり、植物抽出物群および治療成分群をテストするために利用することができる。そのような手続きの例は、本書に説明してある。成分が一つ以上の植物抽出物から成る場合は、必要であれば、最終成分を精製するために複数の植物抽出物を組み合わせる前に、それぞれの抽出物をin vitroおよび／またはin vivoでテストすることができる。治療成分群と一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤との組み合わせ群の阻害能力を、類似した方法によりテストすることができる。 
1. in vitroテスト
【０１５３】
in vitroで成分群の活性をテストする方法群の代表的な例の概要を下記に記載し、実施例V、VIIIおよびIXに説明した。 
【０１５４】
一般的に、内皮細胞および／または新生細胞の移動／浸潤を阻害する本発明の植物抽出物あるいは治療成分の能力は、標準細胞移動アッセイを用いてin vitroで評価することができる。一般的に、そのようなアッセイは、上部と底部のセクションに適切なメンブレンで仕切られたマルチウェルプレートで行なう。当該メンブレンは、適切な化合物で被覆されており、当該化合物の選択は評価対象の細胞の種類によって異なり、当業者は容易に当該化合物の選択を決定することができる。そのような例には、内皮細胞用のコラーゲンおよびゼラチン、新生細胞ライン用のマトリゲルが含まれる。EGM-2、IL-8、α−FGF、β−FGF、ウシ胎児血清などの、適切な化学誘引物質を底部チェンバーに加える。被験細胞のアリコットを植物抽出物あるいは治療成分と共に、上部チェンバーに加える*15。一般的に、植物抽出物／治療成分の多様な希釈液をテストする。適切なインキュベーション時間を経た後、メンブレンを洗浄、固定、さらに染色する。メンブレンの上部にある細胞をふき取り、メンブレンの下部にある無作為に選択した領域を、標準法を用いて計数する。
【０１５５】
細胞移動はまた、コード形成アッセイを用いて評価することができる。例えば、植物抽出物あるいは成分を含んだあるいはそれらを含んでいない内皮細胞を、マトリゲル(tm)などの適切なマトリックスに植える。適切なインキュベーション時間をおき例えば、18時間から24時間）、3次元の毛細管様の構造物、すなわち「コード」を、外観検査および／または画像分析により、判断する。
【０１５６】
抽出物群および成分群の細胞毒性を、適切な癌細胞ラインを用いてin vitro で評価する。一般的に、選択した被験細胞ラインを適切な密度に増殖させ、候補化合物を加える。適切なインキュベーション時間をおき例えば、約48時間から72時間）、細胞生存率を評価する。細胞生存率を測定する方法群は当業界で既知であり、それらにはレサズリン還元テストFields & Lancaster 1993) Am.  Biotechnol.  Lab.  11:48-50; O'Brien et al., 2000) Eur.  J.  Biochem.  267:5421-5426 および米国特許番号 5,501,959を参照せよ）、スルホローダミン（sulforhodamine）アッセイ Rubinstein et al., 1990) J.  Natl.  Cancer Inst.  82:113-118）あるいはニュートラルレッド染色テストKitano et al., 1991) Euro.  J. Clin.  Investg.  21:53-58; West et al., 1992) J.  Investigative Derm.  99:95-100）が含まれるがそれらに限定されるものではない。細胞毒性を、処理を施した培養における細胞生存率と、一つあるいはそれ以上の対照培養における細胞生存率と比較することにより評価し、この場合対照培養は、例えば、処理を施していない培養および／または対照化合物一般的に既知の治療剤）により処理した培養である。
【０１５７】
同様に、植物抽出物群あるいは成分群の細胞増殖を阻害する能力は、標準テクニックを用いて評価することができる。一般的に、関心の対象である細胞ラインに由来する細胞例えば、癌細胞ラインあるいは内皮細胞ライン）を、適切な培地に植える*16。適切なインキュベーション時間をおき、細胞を植物抽出物あるいは成分で処理し、さらにもうしばらくインキュベートする。その後細胞を計数し、適切な対照と比較する。適切な対照には、例えば、標準治療剤で処理した細胞および／または未処置細胞がある。あるいはまた、細胞増殖に対する植物抽出物あるいは成分の効果は、3Hチミジン取込アッセイを用いて調べることができる。MTT 細胞増殖アッセイを使用して植物抽出物あるいは成分の細胞増殖率および／または細胞生存度に対する効果を調べることもできる。黄色テトラゾリウムMTT3-4, 5-ジメチルチアゾリル-2)-2, 5ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（3-4, 5-dimethylthiazolyl-2)-2, 5-diphenyltetrazolium bromide)）を、代謝活性を有する細胞により還元し、ホルマザンを産出し、得られたホルマザンを溶解させ分光光度手段により定量化する。 
【０１５８】
上記のアッセイ群に、多様な細胞ラインを用いることができる。適切な内皮細胞ラインには、ヒト臍帯静脈内皮細胞HUVEC)、ウシ大動脈内皮細胞BAEC)、ヒト冠状動脈内皮細胞HCAEC)、ウシ副腎毛細血管内皮細胞BCE)、ウシ脈絡膜内皮細胞および血管平滑筋細胞が含まれるがそれらに限定されるものではない。HUVECは、標準方法を用いて臍帯から単離するか例えば、Jaffe et al. 1973) J. Clin. Invest. 52: 2745を参照せよ）、あるいは、ATCCから入手することができ、またその他の適切な内皮細胞ラインが市販の入手源から入手できるように、多様な市販の入手源から入手できる。適切な新生細胞ラインは、現在950種類の癌細胞ラインを提供しているAmerican Type Culture Collection ATCC)、およびその他の市販の入手源から入手できる。 
【０１５９】
例えば、薬剤耐性を有する細胞ラインや転移性の高い細胞ラインなどのある特定の癌細胞ラインの細胞移動を阻害する成分群の能力を調べることが望ましく、さらに適切な細胞ラインは状況に応じて選択することができるということを当業者はよく理解するであろう。
2. In vivo テスト
【０１６０】
本発明の治療成分群の、細胞移動、腫瘍の成長および／または腫瘍の転移を阻害する能力は、多様な標準テクニックを用いて評価することができる。例えば、治療成分群の内皮細胞の移動を阻害する能力は、ニワトリひな由来の漿尿膜CAM)、マトリゲルプラグアッセイおよび／または角膜マイクロポケットアッセイを用いて測定することができ、さらに成分群の新生細胞の移動阻害する能力を、腫瘍の成長および転移の多様なネズミモデルを用いて調べることができる。
【０１６１】
CAMアッセイは、血管の多様な組織内での成長すなわち、血管形成および血管新生）を阻害することにおける被験化合物の能力を調べる標準アッセイであるBrooks et al., in Methods in Molecular Biology, Vol. 129, pp. 257-269 2000), ed. A.R. Howlett, Humana Press Inc., Totowa, NJ； Ausprunk et al., 1975) Am. J. Pathol., 79:597-618；Ossonski et al., 1980) Cancer Res., 40:2300-2309を参照せよ）。CAM アッセイは、全組織の血管新生を測定するのでニワトリ胚血管は漿尿膜すなわちCAM内に成長するか、あるいはCAMに移植した組織内に成長する）、in vivo血管形成にで使用可能なよく知られたアッセイである。 
【０１６２】
マトリゲルプラグアッセイもまた、化合物群の抗血管形成特性をin vivoで調べる標準方法である例えば、Passaniti, et al.,1992) Lab. Invest. 67:519-528を参照せよ）。このアッセイでは、被験化合物を冷液体状のマトリゲルに導入し、これを適切な動物モデルに皮下注入すると、固相化し宿主細胞の穿通および新しい血管の形成を許容する。適切な期間をおき、当該の動物を屠殺し、マトリゲルプラグを、通常隣接する皮下組織と共に、回収する。マトリゲルプラグにおける血管形成の評価を、ヘモグロビンを測定することにより、あるいは組織学的薄片の選択領域を血管密度について点数化することにより行ない、そのようなテクニックには、例えば、赤血球凝集素HA)、CD31血小板内皮細胞 接着分子-1)あるいは因子VIIIのような特定の因子を同定する免疫組織化テクニックがある。このアッセイの改変もまた説明されている例えば、Akhtar et al., 2002) Angiogenesis 5:75-80; Kragh et al., 2003) Int J Oncol. 22:305-11を参照せよ）。 
【０１６３】
角膜マイクロポケットアッセイは、通常ネズミ、ラットあるいはウサギを用いて行ない、その詳細が文献において説明されているD'Amato, et al., 1994) Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 91:4082-4085; Koch et al., 1991) Agents Actions, 34:350-7；Kenyon, et al., 1996) Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 37:1625-1632を参照せよ）。簡単に言えば、埋め込み用のペレットを、適切な量の被験化合物を含む滅菌済みのハイドロンポリマーから調製する。得られたペレットを、当該動物の外側角膜縁よりも内側の適切な距離の位置に作製した角膜間質性マイクロポケットに外科的に埋め込む。血管形成を、ペレット埋め込み後多様なタイミングで、実体顕微鏡のを利用して定量化することができる。一般的に、四肢の血管リングから角膜の中心に向かって形成された新血管の長さと、当該新血管の幅を測定する。 
【０１６４】
上記のように、治療成分群を単独あるいはその他の抗癌治療剤群)と組み合わせて使用し、in vivoでの腫瘍の成長および／または転移を弱めることができる。当業界で既知である、数多くの標準ネズミ癌モデルを使用し、当該成分群の腫瘍の成長および／または転移を弱める能力を初回評価することができる 例えば、Enna, et al., Current Protocols in Pharmacology, J. Wiley & Sons, Inc., New York, NYを参照せよ）。 
【０１６５】
一般的に、抗腫瘍化合物をスクリーニングするための現行の動物モデルは異種移植片モデルであり、これを用いてヒトの腫瘍がネズミに埋め込まれている。ヒトの異種移植片モデルには、皮下注入あるいは埋め込みにより埋め込まれ腫瘍成長アッセイにおいて使用される、ヒト固形腫瘍異種移植片モデル；脂肪パッド注入により埋め込まれ腫瘍成長アッセイにおいて使用される、ヒト固形腫瘍同質移植片モデル；直接関連組織に埋め込み腫瘍成長アッセイにおいて使用される、ヒト固形腫瘍正所性異種移植片モデル；ネズミにおける悪性リンパ腫および白血病の実験用モデルで、生存率アッセイに使用されるもの； およびネズミにおける肺転移の実験用モデルが含まれるがそれらに限定されるものではない。これらのアッセイで使用することができる癌細胞ラインの非限定的な例を、表2に示す。
【０１６６】
表2：癌の異種移植片モデルの例  
2008516899.tif 000006
【０１６７】
例えば、当該成分群の固形腫瘍に対する効果を、in vivo で、第０日目に、腫瘍断片を30 mgから 60 mg皮下注入するか、あるいは適切な数のがん細胞を埋め込んだネズミを用いて、テストすることができる。皮下注入した異種移植片の転移頻度は高くなく、隣接組織を浸潤することは稀であり、従って、腫瘍の成長率あるいは顕著な腫瘍の成長の遅延が、このモデルで使用されたエンドポイントである。腫瘍を有する動物を、多様な治療あるいは対照に供する前に、混在させた。進行腫瘍の治療の場合は、腫瘍を望ましい大きさまで成長させ、腫瘍の成長が不十分であった動物を除いた。選択した動物を無作為に治療および対照を受ける群に分配した。適切な対照は、研究対象の実際の成分および成分が化学治療剤と組み合わせて評価されているのか否かにより異なるであろう。このように、例えば、二つの植物抽出物からなる一つの成分をテストするには、適切な対照には、当該植物抽出物のそれぞれを単独で投与した動物、標準化学治療剤を投与した動物、および未処置の動物を含めることができる。成分を化学治療剤と組み合わせてテストする場合には、当該化学治療剤の効果的な量および準効果的な量を投与した動物、植物抽出物を単独で投与した動物、および未処置の動物を対照に含める。当該腫瘍に対する特異的な効果と毒性効果との関連性を分離することができるように、腫瘍を有していない動物に、腫瘍を有する動物と同じ治療を施してもよい。多様な成分および組み合わせの効用に関する実験 を、当業者は容易にデザインすることができるであろう。
【０１６８】
化学療法は、腫瘍の種類に拠るが一般的に移植後1日から22日で開始し、動物を毎日観察する。あるいはまた、成分の予防特質を評価するためには、成分を腫瘍の埋め込み前、例えば約7日前に、投与することができる。本発明の成分は、例えば、経口的に、i.p. 注入で、あるいはボーラス輸注で投与することができる。抗癌治療剤を使用した場合は）、同様の投与経路で投与することができる。異なった動物の群の体重を、最大限の体重減が達成されるまで週に約3回から4回測定し、その後当該動物の群の体重を研究の終わりまで少なくとも週に一度測定する。 
【０１６９】
所定の 期間を経た後に腫瘍を測定するか、あるいは腫瘍が所定のサイズおよび／または重量に達するまで、あるいは当該動物が死亡するまで腫瘍が所定のサイズおよび／または重量に達する以前に死亡が起こった場合）、腫瘍を週に約2度から3度測定することにより継続してモニターしてもよい。その後、動物を屠殺し、対象腫瘍の組織、サイズおよび／または増殖を調べる。
【０１７０】
正所性異種移植片モデルは皮下モデルの代替であり、癌成長過程をより正確に反映させることができる。このモデルにおいては、原発器官の部位に腫瘍細胞を埋め込み、体内で発症させる。従って、腫瘍のサイズを毎日調べることは、皮下モデルと比較して、より困難である。最近開発された、侵襲のない全身イメージングで腫瘍を表す緑色蛍光タンパク質GFP)を用いたテクニックが、この問題の解決を補助するYang and al, Proc. Nat. Aca. Sci, 2000), pp 1206-1211）。このテクニックでは、オワンクラゲ（Aequorea Victoria）緑色蛍光タンパク質を非常に高いレベルで安定して発現するヒトあるいはネズミの腫瘍を使用する。腫瘍を発現するGFP は体外に設置したビデオ検知器の手段により可視化することができ、それにより、腫瘍の成長、血管形成および転移の詳細をモニターすることが可能になる。血管形成は、腫瘍群)内の血管密度をモニターすることにより経時的に測定することができる。このモデルを使用することにより、腫瘍の進行に関連する複数の特徴を同時にモニターすることができるので、高度の前臨床的および臨床的な利用価値を有する。 
【０１７１】
白血病に対する当該成分の効果に関する研究のため、ある特定の数の細胞を動物に移植し、対照と比較して、処置ネズミの生存期間の延長により抗腫瘍活性を調べた。
【０１７２】
腫瘍の転移に対する本発明の成分の効果を調べるため、当業界で既知である実験的転移の多様なモデルを使用することができる。一般的に、これには、新生細胞を抽出物でex vivoで処置し、その後当該細胞を適切な被験動物に注入あるいは埋め込むことが含まれる。あるいはまた、当該新生細胞を当該動物に注入あるいは埋め込む前に、動物に処置を施す。その後、新生細胞の注入部位からの広がり、例えば、肺および／またはリンパ節への広がりを、標準テクニックを用いて適切な期間モニターする。
【０１７３】
代替のin vivo転移モデルは、転移性が高く化学療法に耐性のある培養ルイス肺癌細胞LLC1)を用いる。当該細胞を正常な非免疫不全症のネズミに静脈投与し、これにより癌細胞を即座に伝播させることができる。予防効果を観察するためには、LLC1細胞の注入の数日前に治療を開始すればよく、癌細胞を弱める効果を観察するためには、注入直後に治療を開始すればよい。約14日後、ネズミを屠殺し、肺を取り除き固定し、肺腫瘍の数とサイズを測定する。このモデルではLLC1を静脈経路で投与するので、治療の評価が迅速にできる。 
【０１７４】
別のモデルでは、LLC1細胞を皮下注入し、原発腫瘍を成長させ、その後ある大きさに達したら成長した腫瘍を一旦外科的に取り除く。原発腫瘍を取り除いた後、治療を開始し14日間行い、その後動物を屠殺し、静脈モデルで行なったように腫瘍を計数する。転移を抑制する可能性があるので、このモデルで原発腫瘍を取り除くことが推奨されている*17。
【０１７５】
本発明の治療成分をこのモデルを利用して評価する場合には、化学治療剤のより低い最適以下の）投与量を、治療成分を伴ってあるいは伴わずに評価してよい。これは、当該の二つの治療の潜在的治療相乗効果および／または化学治療剤の最適以下の投与量の効用を高める当該治療成分の能力を評価するために行なう。同様に、一つ以上の抽出物から成る成分群については、誠意剤的治療相乗効果を評価するために、それぞれの抽出物を任意に、別個に評価してもよい。
【０１７６】
当該成分群のIn vivo での毒性効果もまた、治療期間中の動物の体重に対するその効果を測定することにより、あるいは動物を屠殺した後に血液プロファイルおよび肝臓酵素分析を行なうことにより、上記の実験から評価することができる。あるいはまた、抽出物群あるいは成分群の毒性を調べる別個のテストを行なってもよい。
3.付加テスト
【０１７７】
上記のテストに加えて、本発明の治療成分群を、細胞毒性テスト、安定性テスト、生物学的利用率テストなどのその他の標準テストに供することができる。当業者には明確であるように、本発明の治療成分群は、ヒトあるいは動物に使用するに適切であるためには、また法的要件を満たすためには、ある種の判断基準を満たす必要がある。従って、本発明の治療成分群が動物に投与するに適切であると判断されれば、標準in vitro およびin vivoテストを行い、代謝および薬物動態PK)に関する情報を確認することができ、そのような情報には、薬剤と薬剤間の相互作用に関するデータが含まれ適切な場合には）、そのようなデータはヒトの治験をデザインするために使用することができる。毒性および投与量に関する情報は、標準前臨床評価を通して、同様に得ることもできる。適切な投与量は、そのような前臨床評価から容易に決定することができ、必要であれば、当該の治療成分群を下記に説明したような標準治験手続きにおいてその効用について評価することができる。 
4.組み合わせ治療の治療効果
【０１７８】
本発明の一つの実施例に従って、治療成分群を、一つあるいはそれ以上の標準抗癌治療剤群と組み合わせて癌の治療に用いることができる。本発明の治療成分を一つあるいはそれ以上の標準抗癌治療剤群とそのように組み合わせることにより、当該組み合わせの個々の構成要素のそれぞれが単独で投与された場合の治療効果に比べて、治療効果が高まった。 
【０１７９】
例えば、腫瘍の成長および／または転移を弱める、成分あるいは組み合わせの一つあるいはそれ以上の構成要素の効用における増強として、および／または一つあるいはそれ以上の構成要素に関連した毒性現象における減少あるいは遅延として、改善された治療効果が見られる。
【０１８０】
例えば、個々の構成要素のそれぞれに比較して、構成要素の組み合わせが治療指標の改善につながったかどうかを調べることにより、改善された治療効果を測定することができる。
【０１８１】
中央値の効果的な投与量ED50) および中央値の致死投与量LD50)を化合物の治療指標の表れとして使用することができる。ある薬剤のED50は被験集団の50% にある特定の効果を引き起こすのに必要な投与量であり、LD50 は被験集団の50% に致死効果を引き起こすのに必要な投与量である。LD50 は前臨床治験で決定されるが、ED50は前臨床治験あるいは臨床治験でテストすることができる。あるいはまた、当該治療指標は、治療効果を引き出す投与量および毒性効果を引き出す投与量に基づいて決定することも可能である例えば、それぞれED90 および LD10）。治験では、薬剤の毒性効果を引き起こすのに必要な投与量あるいは濃度例えば、血液、血清、あるいはプラズマにおける溶液中）を、当該の集団において当該の治療効果を引き起こすのに必要な濃度と比較し、臨床治療指標を評価することができる。臨床治療指標を評価する治験の方法は、当業者に周知である。 
【０１８２】
本発明の一つの実施例では、組み合わせの使用により、当該組み合わせの少なくとも一つの構成要素のLD50 が改善された結果となっている。別の実施例では、当該組み合わせの少なくとも一つの構成要素のED50が改善された結果となっている。 
【０１８３】
改善された治療効果はまた、治療相乗効果として現れる。その最適投与量で使用した場合の一つの構成要素よりも治療的に優れている場合に、組み合わせにより治療相乗効果が現れるT. H. Corbett et al., 1982) Cancer Treatment Reports, 66, 1187）。ある組み合わせの効用を実証するためには、当該組み合わせの最大耐用量を、対象研究における別個の構成要素のそれぞれの最大耐用量と比較することが必要であろう。この効用は、当業者に既知であるテクニックおよび公式を用いて定量化することができるT. H. Corbett et al., 1977) Cancer, 40, 2660.2680; F. M. Schabel et al., 1979) Cancer Drug Development, Part B, Methods in Cancer Research, 17, 3-51, New York, Academic Press Inc.）。
【０１８４】
当該組み合わせは、その最大耐用量で使用された場合は、構成要素のそれぞれはその最大耐用量MTD)を超えない投与量で当該組み合わせ内に存在しているのであるが、最良構成要素が単独で投与された場合の効用に比べて、当該組み合わせの効用がより大きい場合に治療相乗効果を現す。本発明の一つの実施例では、組み合わせの少なくとも一つの構成要素がそのMTD 未満の投与量で使用されている。発明の別の実施例では、組み合わせは、そのMTD 未満の投与量で使用されている一つの化学治療剤から成る。
【０１８５】
このように、本発明の一つの実施例では、治療組み合わせを調製するために、一つあるいはそれ以上の植物抽出物群）をまず選択し、当該抽出物群）の腫瘍の成長および／または転移を弱める効用を上記に概要を示したような標準テクニックを用いて評価する。その後、一つあるいはそれ以上の植物抽出物の単独の効用を、一つあるいはそれ以上の植物抽出物を別の構成要素すなわち別の植物抽出物、合成阻害剤、あるいは抗癌治療剤）の異なる量と組み合わせた場合の効用と比較する。個々の構成要素との比較において、治療相乗効果あるいは改善治療指標を示した組み合わせを、効果的な組み合わせと考える。 
本発明の植物抽出物を調製する商業的過程
【０１８６】
本発明は、本発明の選択植物抽出物を大規模に調製することを考慮している。対象の抽出物の単離につながる過程を繰り返すことにより、そのような抽出物を商業的規模で調製することができる。本発明のこの局面に関する一つの実施例を、図5に示した。この実施例では、小規模の抽出過程を簡単に規模拡大し、品質管理の付加段階を加え、得られる抽出物の再生可能な結果を確保している。同様に、図4に概要を示した過程を商業目的で規模拡大することができる。
【０１８７】
工業的レベルの抽出物生産へ向かって規模を拡大する途中に必要と成る可能性がある、小規模手続きの改変もまた、本発明で考慮している。そのような改変には、 例えば、規模拡大の途上に起こる変化を補正し、全体の手続きを工業規模生産に向かって体質改善しコスト効果を高める目的の、使用中の溶媒についての改変あるいは使用中の抽出手続きについての改変が含まれる。この種の改変は、業界の標準であり、当業者には明らかであろう。
本発明の抽出物由来の有効成分の精製／分画
【０１８８】
本発明はまた、本発明の植物抽出物から単離された精製／準精製有効成分も提供している。本発明の文脈では、「有効成分」は、MMP-9あるいはカテプシンBを阻害する能力を有する化合物である。当該化合物は、タンパク様であるか、あるいは非タンパク様であってよい。 
【０１８９】
混合物から有効成分を単離するための当業界で既知のテクニックが数多くある。例えば、精製、部分精製、および／または分画を、固液抽出法、液液抽出法、固相抽出法SPE)、膜濾過、限外ろ過、透析法、電気泳動法、溶媒濃縮、遠心分離、超遠心分離、高圧を伴ったあるいは伴わない液体あるいはガス相クロマトグラフィーサイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーを含む）、凍結乾燥、蒸発、多様な「担体」PVPP、炭素、 抗体など）を用いた沈殿、あるいはそれらの組み合わせを用いて行なう。そのようなテクニックは、上記1.1.4.項で説明してあり、本発明の抽出物からの有効成分の精製、部分精製、および／または分画に使用するのに適切である。 
【０１９０】
従って、対象の活性すなわち、MMP-9および／またはカテプシンBを阻害する能力）を保持する実質的に精製された化合物、あるいは化合物群を得る目的で、本発明の抽出物を、一つあるいはそれ以上の上記のテクニックに、順に供することができる。精製、部分精製、および／または濃縮した化合物を、そのMMP-9および／またはカテプシンBを阻害する能力について、上記の一つあるいはそれ以上の手続きに従ってテストする。さらに、そして本発明の抽出物の重要分画あるいは精製フィトケミカルの同定および／または定量が望ましい場合には、NMR、GC-MS、TLC、分光測光、マイクロスプレー、X 線回折および元素分析を含むがそれらに限定されない分析テクニックを行なって、抽出物の有効分あるいは分画を解明することができる。
薬学的製剤および自然療法製剤
【０１９１】
哺乳類に投与するには、治療成分を、例えば、フィトシューティカルあるいはニュートラシューティカルなどの薬学的製剤あるいは自然療法製剤として製剤化し、経口、局所、直腸あるいは非経口経路で投与、あるいは吸入あるいは噴霧により投与することができる。薬学的製剤あるいは自然療法製剤は、投与単位製剤に含まれた一つあるいはそれ以上の植物抽出物から成り、当該投与単位製剤は、従来の毒性のない生理的に許容可能な担体、アジュバントおよびビヒクルを含む。本書で使用されている非経口という語には、皮下注入、静脈内、筋肉内、包膜内、胸骨内注入、あるいは輸注テクニックが含まれる。 
【０１９２】
本発明の製剤群は、治療成分の少なくとも効果的な量を含む。当該の効果的な量とは、望ましい治療効果を引き出すために存在していなければならない、成分の量と考えられ、製剤全体の重量百分率で表わされる。当業者には明らかであるように、当該の効果的な量は、例えば治療対象の疾患および投与形態などにより異なる。一般的に、治療成分は、製剤の重量で約1％から約100％の範囲の量で存在する。本発明の一つの実施例では、治療成分は、製剤の重量で約10%から約90%の範囲の量で存在する。別の実施例では、治療成分は、製剤の重量で約20%から約80%の範囲の量で存在する。その他の実施例では、治療成分は、製剤の重量で約30%から約70%の範囲の量で、製剤の重量で約40%から約60%の範囲の量で、製剤の重量で約50%の量で存在する。
【０１９３】
薬学的製剤あるいは自然療法製剤は、経口使用に適した形態であってよく、その例には、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性あるいは油性の懸濁液、分散性の粉末あるいは顆粒、乳剤性のハードあるいはソフトカプセル、あるいはシロップまたはエリキシル剤がある。本発明の治療成分群は、フィトシューティカルあるいはニュートラシューティカルとして製剤化してよい。フィトシューティカルは、任意に、その他の植物由来の構成要素群から成っていてよく、従って、お茶、トニック、ジュース、あるいはシロップなどの非限定的なビヒクルにより投与してよい。本発明で考慮しているニュートラシューティカルは、栄養的および／または栄養補完的な利益を提供してよく、従って、例えば、食物、栄養補助食品、抽出物、飲料などとして投与してよい。フィトシューティカルおよびニュートラシューティカルは、従来の治療プログラム、自然療法プログラムに従って投与してよく、あるいはまた、食事あるいは補助食品のプログラムの一部を構成してもよい*18。
【０１９４】
経口用の製剤は、薬学的成分の製造業界で既知である方法群に従って作製してよく、口に合う製剤を提供するためには、甘味剤、着香剤、着色剤および保存剤から成る群から選択された一つあるいはそれ以上の薬剤を含んでいてよい。錠剤は、適切な毒性のない生理的の許容可能な賦形剤との混合物の形態で有効成分を含んでおり、そのような賦形剤の例には、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、乳糖、リン酸カルシウムあるいはリン酸ナトリウムなどの不活性の希釈剤；コーンスターチあるいはアルギン酸化などの顆粒化剤および分解剤；スターチ、ゼラチンあるいはアラビアゴムなどの結合剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸あるいはタルクなどの潤滑剤がある。錠剤は、被覆されていなくてもよく、あるいは胃腸管での分解および吸収を遅延させ、それによって長時間にわたって持続作用を提供する目的で、既知のテクニックにより被覆されていてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリン（glyceryl monostearate） *19ジステアリン酸グリセリン（glyceryl distearate）などの時間的遅延を起こす材料を使用してよい。
【０１９５】
多様な添加剤あるいは担体を、経口投与される本発明の薬学的製剤あるいは自然療法製剤に組み込んでよい*20。本成分群の任意の添加剤には、制限なく、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミンなどのリン脂質；さらにホスファチジル酸（phosphatidic acids）、セラミド、セレブロシド、スフィンゴミエリンおよびカルジオリピンが含まれる。二重層形成および非二重層形成の脂質を含む生物活性剤投与粒子もまた考慮されている。そのような脂質には、リン脂質、ジミリストイルフォスファチジルコリン（dimyristoylphosphatidylcholine DMPC)） およびジミリストイルフォスファチジルグリセロール （dimyristoylphosphatidylglycerol DMPG)）が含まれる。アポリポタンパクの組み入れもまた考慮されている。 
【０１９６】
経口用の薬学的製剤あるいは自然療法製剤はまた、ハードゼラチンカプセルあるいはソフトゼラチンカプセルとして調製してよく、ハードゼラチンカプセルの場合には、有効成分は不活性固相希釈剤例えば炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、あるいはカオリンなど）と混合してよく、ソフトゼラチンカプセルの場合には、有効成分は水あるいは油性媒体例えばピーナツオイル、液体パラフィン、あるいはオリーブオイルなど)と混合してよい。
【０１９７】
水性懸濁液は、適切な賦形剤と混合した植物抽出物群)を含んでおり、そのような賦形剤の例には、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、トラガカントゴムおよびアラビアゴムなどの懸濁液；天然型リン脂質例えば、レシチン）等の分散剤あるいは湿潤剤、脂肪酸を伴ったアルキレンオキシドの縮合物例えば、polyoxyethyene stearate *21）、あるいは長鎖脂肪族アルコールを伴ったエチレンオキサイドの縮合物例えば、 hepta-decaethyleneoxycetanol*22）、脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分的エステルを伴ったエチレンオキサイドの縮合物例えば、polyoxyethylene sorbitol monooleate*23）、脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分的エステルを伴ったエチレンオキサイドの縮合物例えば、polyethylene sorbitan monooleate*24）がある。当該の水性懸濁液はまた、一つあるいはそれ以上の保存剤エチル、あるいは n-propyl p-hydroxy-benzoate*25）、一つあるいはそれ以上の着色剤、一つあるいはそれ以上の着香剤、一つあるいはそれ以上の甘味剤スクロースあるいはサッカリン）を含んでいてよい。
【０１９８】
油性懸濁液は、植物抽出物群)を、落花生オイル、オリーブオイル、セサミオイルあるいはココナツオイルなどの植物オイル、あるいは液体パラフィンなどの鉱物オイルで懸濁させることにより調製してよい。当該の油性懸濁液は、蜜蝋、ハードパラフィン、あるいはセチルアルコールなどの濃縮剤を含んでいてよい。上記のような甘味剤および／または着香剤を加えて、口に合う経口用製剤を提供してよい。これらの製剤群は、アルコルビン酸などの抗酸化剤を加えることにより、保存することができる。
【０１９９】
水を加えることにより調製する水性懸濁液に適切である分散性の粉末あるいは顆粒は、分散剤あるいは湿潤剤、懸濁剤、および一つあるいはそれ以上の保存剤と混合した形態の有効成分を提供する。適切な分散剤あるいは湿潤剤および懸濁剤は、先に述べたものにより例示した。甘味剤、着香剤および着色剤などの付加的な賦形剤もまた含まれていてよい。
【０２００】
本発明の薬学的製剤および自然療法製剤はまた、水−油エマルションの形態であってもよい。油相は、オリーブオイルあるいは落花生オイルなどの植物オイルあるいは液体パラフィンなどの鉱物オイルであってよく、またこれらのオイルの混合物であってもよい。適切な乳化剤は、アラビアゴムあるいはトラガカントゴムなどの天然ゴム；大豆あるいはレシチンなどの天然型リン脂質；sorbitan monoleate*26などの、脂肪酸およびヘキシトール、無水物に由来するエステルあるいは部分的エステル；およびpolyoxyethylene sorbitan monoleate などの、エチレンオキサイドを伴った部分的エステルの縮合物であってよい *27。乳化剤はまた、甘味剤および着香剤を含んでいてもよい。
【０２０１】
シロップおよびエリキシル剤は、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトール、スクロースなどの甘味剤を含んで製剤化してよい。そのような製剤はまた、粘滑剤、保存剤、さらに着香剤および着色剤を含んでいてよい。 
【０２０２】
薬学的製剤および自然療法製剤はまた、滅菌済みの注入可能な水性あるいは油性の懸濁液の形態であってもよい。この懸濁液は、既知の技術に従って、上記のような適切な分散剤あるいは湿潤剤および懸濁剤を用いて製剤化してよい。滅菌済注入可能製剤はまた、毒性のない注射剤として許容可能な希釈剤*28あるいは溶媒に溶解した、滅菌済注入可能溶液あるいは懸濁液であってよく、その例には、1,3-ブタンジオール中の溶液が挙げられる。使用可能なビヒクルおよび溶媒には、水、リンゲル液、乳酸化リンゲル液、および等張性塩化ナトリウム溶液が含まれるがそれらに限定されるものではない。その他の例には、従来より溶媒あるいは懸濁媒体として使用されている滅菌済みの固定オイル、および合成モノグリセライドあるいは合成ジグリセライドなどの多様な無菌性固定オイルがある。さらに、オレイン酸などの脂肪酸を注射剤の調製に使用してよい。
【０２０３】
その他の薬学的製剤群および当該薬学的製剤群を調製する方法群が当業界で既知であり、例えば、"Remington: The Science and Practice of Pharmacy" 前 "Remingtons Pharmaceutical Sciences"）；Gennaro, A., Lippincott, Williams & Wilkins, Philidelphia, PA 2000)などの文献に説明されている。
治療成分群の用法
【０２０４】
本発明はさらに、癌治療においてMMP-9およびカテプシンBの阻害に標的を当てた治療成分群の使用を提供している。当該の治療成分群を単独であるいは一つあるいはそれ以上の抗癌剤と組み合わせて使用し、一つあるいはそれ以上の新生細胞の移動、内皮細胞の移動、腫瘍の成長、腫瘍の転移、および腫瘍により誘発された血管形成を抑制する。 
【０２０５】
本発明は、さらに例えば、最適あるいは標準の化学治療剤の投与量に耐えられない患者において、毒性が要因である場合例えば、肥満あるいは高齢の患者など）、あるいは患者の代謝が弱まっている場合肝臓疾患あるいは肝臓障害に罹患している個体など）は、当該治療成分を既知の抗癌治療剤群)の最適以下の投与量との組み合わて使用してよいということを、考慮している。 
1.癌治療の方法群
【０２０６】
本発明は、MMP-9およびカテプシンBを同時に阻害する一つの治療成分の効果的な量を投与することにより、癌を治療するための方法群を考慮している。本発明の治療成分を、癌治療において、単独であるいはあるいは一つあるいはそれ以上の標準抗癌治療剤と組み合わせて投与する。本発明は、例えば化学治療剤などの抗癌治療剤群)の最適以下の投与量を、当該治療成分と組み合わせて投与することにより、癌を治療するための方法群をさらに提供している。この文脈では、本発明の成分を用いて治療することにより、例えば、以下の結果が得られる：腫瘍のサイズの減少、腫瘍のサイズにおける増加の遅延あるいは予防、腫瘍の血管形成の減少、腫瘍の転移の減少、転移の増加の遅延あるいは予防、腫瘍の消失あるいは除去から再出現までの疾患のない生存期間の増加、腫瘍の初回発症あるいは後続発症例えば、転移）の予防、進行に至る期間の増加、腫瘍に関連した一つあるいはそれ以上の有害事象の減少、あるいは癌に罹患した被験者の全体生存率の増加。
【０２０７】
本発明のさらなる実施例により、被験者の体内の癌を治療するための方法が提供されており、当該の方法は、被験者に対しMMP-9 阻害剤の効果的な量をカテプシンB 阻害剤と組み合わせて投与することから成る。これらの阻害剤は、一つあるいはそれ以上の植物抽出物群あるいはそれらから精製された化合物群であってよく、あるいはまた合成MMP-9 阻害剤および合成カテプシンB 阻害剤あるいはそれらの組み合わせであってもよい。適切な合成MMP-9 阻害剤および合成カテプシンB 阻害剤には、当業界で既知のものが含まれ、現在例えば、マリマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、メタスタット、E-64、CA-074 メチルエステル、ロイペプチン、1-phenyl-1, 4-epoxy-1H,4H-naphtho（1,8-de）（1, 2）dioxepin ANO-2)  およびアイロマスタット 別名N-（2R)-2-hydroxamidocarbonylmethyl)-4-methylpentanoyl）-L-tryptophan methylamide, GalardinTM or GM-6001）が入手可能である。将来開発されるその他の合成阻害剤もまた、本発明の方法群で使用するのに適切である。 
1.1 癌の種類 
【０２０８】
本発明の治療成分群は、多様なの腫瘍の治療に使用することができる。腫瘍の例には、以下が含まれるがそれらに限定されるものではない：白血病およびリンパ腫を含む血液新生物；腺癌を含む癌腫；黒色腫、および肉腫。癌腫 、腺癌、および肉腫を、多くの場合、「固形腫瘍」と呼ぶ。通常に起こる固形腫瘍には、以下が含まれるがそれらに限定されるものではない：脳癌、乳癌、子宮頸癌、大腸癌、頭頸部癌、腎癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、胃癌、子宮癌、非小細胞肺癌、および結腸直腸癌。種々のリンパ腫の種類は固形腫瘍になる場合もあるため、それらを多くの場合固形腫瘍として考える。
【０２０９】
「白血病」という語は、進行性で悪性である、血液形成器官の疾患を広義に意味する。白血病は一般的に、血中および骨髄中における白血球およびその前駆体の異常な増殖および形成により特徴付けられるが、その他の血液細胞の悪性疾患未熟な赤血球に影響を及ぼす赤白血病）をも意味し得る。白血病は一般的に、以下基盤に基づき臨床的に分類される：1) 疾患の期間および性質急性あるいは慢性）；2) 関連細胞の種類骨髄性、リンパ性、あるいは単球性）、および 3) 血中における異常細胞の数の増加あるいは非増加｛白血病性あるいは 無白血病性 亜白血性）｝。白血病は、たとえば、以下を含む：Leukaemia includes, for example, 急性非リンパ性白血病  （acute nonlymphocytic leukaemia）、 慢性リンパ球性白血病（chronic lymphocytic leukaemia）、 急性骨髄性白血病（acute granulocytic leukaemia）, 慢性骨髄性白血病（chronic granulocytic leukaemia）、急性前骨髄球性白血病（acute promyelocytic leukaemia）、成人T細胞白血病・リンパ腫（adult T-cell leukaemia）、無白血病性白血病（aleukaemic leukaemia）、白細胞不▲ぞう▼多性白血病（aleukocythemic leukaemia）、好塩基球性白血病（basophylic leukaemia）、芽球性白血病（blast cell leukaemia）、牛白血病（bovine leukaemia）、慢性骨髄性白血病（chronic myelocytic leukaemia）、皮膚白血病（leukaemia cutis）、胚性白血病（embryonal leukaemia）、好酸球性白血病（eosinophilic leukaemia）、グロス型白血病（Gross' leukaemia）、有毛細胞白血病（hairy-cell leukaemia）、成血細胞白血病（hemoblastic leukaemia）、血球芽細胞白血病（hemocytoblastic leukaemia）、組織球性白血病（histiocytic leukaemia）、幹細胞白血病（stem cell leukaemia）、急性単球白血病（acute monocytic leukaemia）、白血球減少症の白血病（leukopenic leukaemia）、リンパ性白血病（lymphatic leukaemia）、リンパ芽球性白血病（lymphoblastic leukaemia）、リンパ性白血病（lymphocytic leukaemia）、リンパ向性白血病（lymphogenous leukaemia）、リンパ様白血病（lymphoid leukaemia）、リンパ肉腫胞性白血病（lymphosarcoma cell leukaemia）、肥満細胞性白血病（mast cell leukaemia）、巨核球白血病（megakaryocytic leukaemia）、小骨髄芽球性白血病（micromyeloblastic leukaemia）、単球白血病（monocytic leukaemia）、骨髄芽球性白血病（myeloblastic leukaemia）、骨髄球性白血病（myelocytic leukaemia）、骨髄性 顆粒球性白血病（myeloid granulocytic leukaemia）、骨髄単球性白血病（myelomonocytic leukaemia）、ネーゲリ型白血病（Naegeli leukaemia）、形質細胞性白血病（plasma cell leukaemia）、形質細胞性白血病（plasmacytic leukaemia）、前骨髄球性白血病（promyelocytic leukaemia）、リーダー細胞白血病（Rieder cell leukaemia）、シリング型白血病（Schilling's leukaemia）、幹細胞白血病（stem cell leukaemia）、亜白血性白血病（subleukaemic leukaemia）、および未分化白血病（undifferentiated cell leukaemia）。
【０２１０】
「リンパ腫」は一般的に、リンパ系の癌を含むリンパ系の悪性腫瘍を意味する。リンパ腫には２種類：ホジキン病ＨＤあるいはＨＬ）、および非ホジキンリンパ腫ＮＨＬ）、がある。異常細胞は、リンパ腺を肥大し、体内で固形腫瘍を形成する集合として現れる。珍しく、白血病のように、異常細胞は血液で循環する。ホジキンリンパ腫（Hodgkin's disease lymphomas）は以下を含む：結節性リンパ球優位型ホジキンリンパ腫（nodular lymphocyte predominance Hodgkin's lymphoma）; 古典的ホジキンリンパ腫（classical Hodgkin's lymphoma）; 結節硬化型ホジキンリンパ腫（nodular sclerosis Hodgkin's lymphoma）; 古典的ホジキンリンパ腫、リンパ球優位型（lymphocyte-rich classical Hodgkin's lymphoma）; 古典的ホジキンリンパ腫、混合細胞型（mixed cellularity Hodgkin's lymphoma）; リンパ球減少型ホジキンリンパ腫（lymphocyte depletion Hodgkin's lymphoma）。非ホジキンリンパ腫は以下を含む：小さなリンパ球のリンパ腫（small lymphocytic NHL）、濾胞性リンパ腫（follicular NHL）、マントル細胞リンパ腫（mantle cell NHL）、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（mucosa-associated lymphoid tissue MALT) NHL）、B細胞性びまん性大細胞型非ホジキンリンパ腫（diffuse large cell B-cell NHL）、前縦隔B 大細胞型リンパ腫（mediastinal large B-cell NHL）、前駆T リンパ芽球型リンパ腫（precursor T lymphoblastic NHL）、皮膚T細胞性リンパ腫（cutaneous T-cell NHL）、T細胞ならびにNK細胞腫瘍リンパ腫（T-cell and natural killer cell NHL）、成熟型末梢型)T細胞リンパ腫（mature peripheral) T-cell NHL）、バーキットリンパ腫（Burkitt's lymphoma）、菌状息肉症（mycosis fungoides）、セザリー症候群（Sezary Syndrome）、前駆B細胞リンパ芽球性リンパ腫（precursor B-lymophoblastic lymphoma）、B細胞小リンパ球性リンパ腫（B-cell small lymphocytic lymphoma）、リンパ形質細胞性リンパ腫（lymphoplasmacytic lymphoma）、脾性辺縁帯リンパ（spenic marginal zome B-cell lymphoma）、節性辺縁帯B細胞リンパ腫（nodal marginal zome lymphoma）、形質細胞性骨髄腫/形質細胞腫（plasma cell myeloma/plasmacytoma）、血管内 B 大細胞型リンパ腫（intravascular large B-cell NHL）、原発性体腔性リンパ腫（primary effusion lymphoma）、芽球NK細胞リンパ腫（blastic natural killer cell lymphoma）、腸症型T細胞リンパ腫（enteropathy-type T-cell lymphoma）、肝脾T細胞リンパ腫（hepatosplenic gamma-delta T-cell lymphoma）、皮下脂肪織炎様T細胞リンパ腫（subcutaneous panniculitis-like T-cell lymphoma）、血管免疫芽球T細胞リンパ腫（angioimmunoblastic T-cell lymphoma）、および未分化大細胞T/nullリンパ腫原発性全身型）（primary systemic anaplastic large T/null cell lymphoma）。
【０２１１】
「肉腫」は一般的に、筋肉、骨、軟骨、あるいは脂肪のような結合組織に由来し、胎仔結合組織様の物質によって構成され、多くの場合、原線維あるいは均質な物質に埋め込まれた最密充填構造を持つ細胞により構成される。肉腫は以下を含む：軟部組織肉腫（soft tissue sarcomas）、軟骨肉腫（chondrosarcoma）、線維肉腫（fibrosarcoma）、リンパ肉腫（lymphosarcoma）、黒肉腫（melanosarcoma）、粘液肉腫（myxosarcoma）、骨肉腫（osteosarcoma）、アベメシー肉腫（Abemethy's sarcoma）、脂肪肉腫（adipose sarcoma）、脂肪肉腫（liposarcoma）、胞巣状軟部肉腫（alveolar soft part sarcoma）、エナメル上皮肉腫（ameloblastic sarcoma）、ブドウ状肉腫（botryoid sarcoma）、緑色肉腫（chloroma sarcoma）、絨毛癌（chorio carcinoma）、胎児癌（embryonal sarcoma）、ウィルムス腫瘍肉腫（Wilms' tumour sarcoma）、子宮内肉腫（endometrial sarcoma）、膜間質肉腫（stromal sarcoma）、ユーイング肉腫（Ewing's sarcoma）、筋膜肉腫（fascial sarcoma）、繊維芽細胞性肉腫（fibroblastic sarcoma）、巨細胞性肉腫（giant cell sarcoma）、顆粒球性肉腫（granulocytic sarcoma）、ホジキン肉腫（Hodgkin's sarcoma）、多発性特発性色素性出血性肉腫 （idiopathic multiple pigmented haemorrhagic sarcoma）、免疫芽球性Ｂ細胞肉腫（immunoblastic sarcoma of B cells）、リンパ腫（lymphoma）、免疫芽球性T細胞肉腫（immunoblastic sarcoma of T-cells）、ジェンセン肉腫（Jensen's sarcoma）、カポジ肉腫（Kaposi's sarcoma）、クッパ−細胞肉腫（Kupffer cell sarcoma）、血管肉腫（angiosarcoma）、白血肉腫（leukosarcoma）、悪性間葉腫瘍肉腫（malignant mesenchymoma sarcoma）、傍骨性骨肉腫（parosteal sarcoma）、網状赤血球肉腫（reticulocytic sarcoma）、ラウス肉腫（Rous sarcoma）、ブロディ症候群（serocystic sarcoma）、滑膜肉腫（synovial sarcoma）、および血管拡張型肉腫（telangiectaltic sarcoma）。
【０２１２】
「黒色腫」は、皮膚および他の臓器のメラニン細胞系に由来する腫瘍を意味する。黒色腫は以下を含む：末端黒子型悪性黒色腫（acral-lentiginous melanoma）、無色素性黒色腫（amelanotic melanoma）、良性若年性黒色腫（benign juvenile melanoma）、クラウドマン黒色腫（Cloudman's melanoma）、S91黒色腫（S91 melanoma）、ハーデイング・パセイ黒色腫（Harding-Passey melanoma）、若年性黒色腫（juvenile melanoma）、悪性黒子型悪性黒色腫（lentigo maligna melanoma）、悪性黒色腫  （malignant melanoma）、結節型黒色腫（nodular melanoma）、爪甲下黒色腫（subungal melanoma）、および表在性拡大性悪性黒色腫（superficial spreading melanoma） 。
【０２１３】
「癌腫」は、周囲組織に浸潤し、転移を起こす傾向のある上皮細胞により構成される悪性新生物を意味する。代表的癌腫は以下を含む：腺房細胞癌（acinar carcinoma）、腺房癌（acinous carcinoma）、腺様嚢胞癌（adenocystic carcinoma）、腺様嚢胞癌（adenoid cystic carcinoma）、腺腫症の癌（carcinoma adenomatosum）、副腎皮質癌（carcinoma of adrenal cortex）、肺胞上皮癌（alveolar carcinoma）、肺胞上皮癌（alveolar cell carcinoma）、基底細胞癌（basal cell carcinoma）、基底細胞癌（carcinoma basocellulare）、類基底細胞癌（basaloid carcinoma）、基底細胞癌（basosquamous cell carcinoma）、肺胞上皮癌（bronchioalveolar carcinoma）、細気管支癌（bronchiolar carcinoma）、気管支原性癌（bronchogenic carcinoma）、脳回転状核の癌（cerebriform carcinoma）、胆管細胞癌（cholangiocellular carcinoma）、絨毛癌（chorionic carcinoma）、大腸癌（colorectal carcinoma）、膠様癌（colloid carcinoma）、面皰癌（comedo carcinoma）、子宮体癌（corpus carcinoma）、篩状癌（cribriform carcinoma）、鎧状癌（carcinoma en cuirasse）、皮膚癌（carcinoma cutaneum）、円柱細胞癌（cylindrical carcinoma）、円柱細胞癌（cylindrical cell carcinoma）、乳管癌（duct carcinoma）、硬性癌（carcinoma durum）、胎児性癌（embryonal carcinoma）、髓
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癌（encephaloid carcinoma）、肛門管癌（epiermoid carcinoma）、嚢状のアデノイド癌（carcinoma epitheliale adenoides）、外方性の癌（exophytic carcinoma）、潰瘍癌（carcinoma ex ulcere）、線維性癌（carcinoma fibrosum）、▲こう▼状癌（gelatiniform carcinoma）、膠様癌（gelatinous carcinoma）、膵巨細胞癌（giant cell carcinoma）、膵巨細胞癌（carcinoma gigantocellulare）、腺性癌（glandular carcinoma）、顆粒膜細胞癌（granulosa cell carcinoma）、毛母癌（hair-matrix carcinoma）、血性の癌（haematoid carcinoma）、肝細胞癌（hepatocellular carcinoma）、ハースル細胞癌（Hurthle cell carcinoma）、硝子の癌（hyaline carcinoma）、副腎様癌（hypemephroid ｛Hypernephroid｝ carcinoma）、胎児性胎児性癌（infantile embryonal carcinoma）、上皮内癌（carcinoma in situ）、表皮内癌（intraepidermal carcinoma）、上皮内癌（intraepithelial carcinoma）、基底細胞上皮腫癌（Krompecher's carcinoma）、神経内分泌細胞癌（Kulchitzky-cell carcinoma）、大細胞癌（large-cell carcinoma）、レンズ状の癌（lenticular carcinoma）、レンズ状の癌（carcinoma lenticulare）、脂肪癌（lipomatous carcinoma）、リンパ上皮がん（lymphoepithelial carcinoma）、髄様癌（carcinoma medullare）、髄様癌（medullary carcinoma）、黒色癌 （melanotic carcinoma）、軟性の癌（carcinoma molle）、粘液癌（mucinous carcinoma）、粘液癌（carcinoma muciparum）、粘液細胞性癌（carcinoma mucocellulare）、粘表皮癌（mucoepidermoid carcinoma）、粘液癌（carcinoma mucosum）、粘液癌（mucous carcinoma）、粘液線維の癌（carcinoma myxomatodes）、鼻咽癌（naspharyngeal carcinoma）、燕麦細胞型の癌（oat cell carcinoma）、非小細胞癌（non-small cell carcinoma）、骨化性の癌（carcinoma ossificans）、類骨の癌（osteoid carcinoma）、乳頭癌（papillary carcinoma）、門脈周囲性の癌（periportal carcinoma）、浸潤前の癌（preinvasive carcinoma）、有棘細胞癌（prickle cell carcinoma）、粥状アテローム）癌（pultaceous carcinoma）、腎細胞癌（renal cell carcinoma of kidney）、予備細胞癌（reserve cell carcinoma）、脂肪肉腫（carcinoma sarcomatodes）、シュナイダー乳頭腫（schneiderian carcinoma）、硬癌（scirrhous carcinoma）、膣癌（carcinoma scroti）、印環細胞癌（signet-ring cell carcinoma）、単純癌（carcinoma simplex）、小細胞癌（small-cell carcinoma）、ソラノイドの癌（solanoid carcinoma）、回転楕円面細胞癌（spheroidal cell carcinoma）、紡錘細胞癌（spindle cell carcinoma）、海綿質の癌（carcinoma spongiosum）、扁平上皮癌（squamous carcinoma）、扁平上皮癌（squamous cell carcinoma）、ストリングの癌（string carcinoma）、毛細血管拡張性の癌（carcinoma telangiectaticum）、血管拡張性の癌（carcinoma telangiectodes）、移行上皮癌（transitional cell carcinoma）、結節の癌（carcinoma tuberosum）、結節の癌（tuberous carcinoma）、疣状癌（verrucous carcinoma）、および絨毛癌（carcinoma villosum） 。
【０２１４】
「癌腫」は、腺癌も含む。腺癌は、腺性分泌性）の特徴を持つ臓器を形成する細胞、あるいは中空臓の内部を覆う細胞に由来する癌腫である。この例には、乳房、肺、膵、および前立腺が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０２１５】
本発明に含まれている付加的な癌の種類には、例えば、以下が含まれる：多発性骨髄腫（multiple myeloma）、神経芽腫（neuroblastoma）、横紋筋肉腫（rhabdomyosarcoma）、原発性血小板増多症（primary thrombocytosis）、原発性マクログロブリン血症（primary macroglobulinemia）、小細胞肺癌腫瘍（small-cell lung tumours）、原発性脳腫瘍（primary brain tumours）、悪性膵性インスリノーマ（malignant pancreatic insulanoma）、悪性癌様体（malignant carcinoid）、膀胱癌（urinary bladder cancer）、前癌病変（premalignant skin lesions）、神経膠腫（gliomas）、精巣癌（testicular cancer）、甲状腺癌（thyroid cancer）、食道癌（esophageal cancer）、尿生殖路癌（genitourinary tract cancer）、悪性高カルシウム血症（malignant hypercalcemia）、子宮体癌（endometrial cancer）、副腎癌（adrenal cortical cancer）、中皮腫（mesothelioma）および髄芽腫（medulloblastoma）。
【０２１６】
治療対象の癌は、不活性であっても攻撃的であってもよい。本発明は、不応性癌、進行癌、再発性癌、転移性癌の治療における治療成分群の使用を考慮している。当業者は、これらの分類の多くが重なり合っている、つまり例えば、攻撃性の癌が一般的に転移性であるということをよく理解するであろう。
【０２１７】
「攻撃性の癌」という語は、本書で使用されているように、急速に成長する癌を意味する。当業者は、以下のことをよく理解するであろう：例えば乳癌あるいは前立腺癌などのある種の癌については、「攻撃性の癌」という語は、所与の癌の再発期間の早期3分の2の期間内に再発した進行癌を意味し、例えば小細胞肺癌SCLC)などのその他の種類の癌については、ほとんどすべての症例が攻撃的と考えられる急速に成長する癌を呈する。この後は、従って、ある種の癌のサブセクションを意味することもあり、あるいはその他の癌の種類の全てを包含することもある。「不応性の」癌あるいは腫瘍という語は、治療に反応しない癌あるいは腫瘍を意味する。「進行癌」とは、ある患者における顕在的な疾患を意味し、そのような顕在的な疾患は、手術あるいは放射線治療などの局所的物理療法により改善され治癒することがない。進行疾患は、局所的に進行した癌を意味することもあり、転移性癌を意味することをもある。「転移性癌」という語は、身体の一部分から別の部分へ広がった癌を意味する。進行癌はまた切除不能、つまり、周囲組織へ広がってしまって、外科的に除去できない。 
【０２１８】
治療成分群はまた、多剤耐性腫瘍を含む、薬剤耐性を有する癌に使用することができる。当業界で既知であるように、癌細胞の化学治療に対する耐性は、癌の管理において最も重要な問題の一つである。
【０２１９】
例えば前立腺癌あるいは乳癌などのある種の癌は、ホルモン療法によりすなわち、身体の天然のホルモンをブロックすることにより、ある種の癌の成長を遅延あるいは停止させるホルモン剤あるいは抗ホルモン剤を使用して）治療することが可能である。そのような癌はホルモン療法に対し耐性を獲得するか、あるいは内因的に耐性を有する。本発明はさらに、そのような「ホルモン耐性」あるいは「ホルモン不応性」の癌の治療における当該治療成分の使用を考慮している。
【０２２０】
本発明はまた、「感作剤」としての当該成分群の使用を考慮している。この場合には、当該成分群単独では癌細胞に対する細胞障害効果はないが、癌細胞を弱める手段を提供し、それにより従来の抗癌治療剤の効力を促進させる。
1.2投与
【０２２１】
本発明は、治療成分の効果的な量を、単独で、あるいは一つあるいはそれ以上の標準抗癌治療剤と組み合わせて、癌の治療あるいは予防のため投与することを考慮している。本発明の文脈では、「癌の予防」には、例えば癌を発症するリスクの高い個体における腫瘍の最初の発症の予防が含まれ、またある患者における癌の再発の予防、あるいは一つあるいはそれ以上のその他の治療介入後の再発の予防が含まれる。 
【０２２２】
本発明は、腫瘍の病期および進行度におけるあらゆる段階で、当該の治療成分を使用することを考慮しており、それらには、初期、進行したおよび／または攻撃性の新生物、転移性の疾患、局所的に進行した疾患および／または不応性の腫瘍の治療がある。 
【０２２３】
従って、当該の成分群および組み合わせ群は、初回の診断後に、すなわち、主たる治療を補助する）ネオアジュバント療法の一部として、投与することができる。例示的な主たる治療には、手術、多様な化学療法、および放射線治療が含まれる。主たる治療の目的は、対象の腫瘍を除去すること手術の場合）あるいは対象疾患の進行および／または転移を遅延させることである。 
【０２２４】
本発明は、当該の治療成分を初期癌に罹患している哺乳動物に投与し、腫瘍成長および／または転移に対する当該の治療成分の効果により、対象疾患の進行を弱めることを補助することができるということを考慮している。後者の効果は、前立腺癌などの比較的ゆっくり進行する癌をさらに遅延させることにおいて、特に有用である。
【０２２５】
あるいはまた、アジュバント療法治療計画の一部として、再発を遅延させ、生存期間を延長させ、あるいは被験者を治癒させることを目的として、当該成分群を患者に投与することができる。アジュバント全身性治療法は一般的に主たる療法の直後に開始する。 
【０２２６】
腫瘍の成長あるいは転移を弱める目的で、当該成分を予防的に被験者に投与することができるということがさらに考慮されている。この応用は、容易に転移すると知られている攻撃性の疾患に罹患している患者に、特に有用である。 
【０２２７】
先に記載したように、当該治療成分群は、抗癌治療剤群）の効用を高める目的で、ひとつあるいはそれ以上の抗癌治療剤群と組み合わせて使用することができる。この文脈では、当該治療成分は、抗癌治療剤群）を補助する「アジュバント」と考えられる。当該成分は、従って、望ましい効果を達成するために必要とされる抗癌治療剤の量を減少させ、それにより、有害事象を減少させおよび／またはよりコスト効果の高い治療計画を達成できる。あるいはまた、対象腫瘍を弱め標準治療法に対する感受性を高めることを目的として、標準治療法に反応しない薬剤耐性を有する癌の治療にこのアプローチを使用することができる。当該治療成分群はまた、抗癌治療剤の標準投与量の効力を増すため、あるいは標準投与量に耐えられない患者において抗癌治療剤の最適以下の投与量の効力を増すために、使用することができる。
【０２２８】
当該治療成分をひとつあるいはそれ以上の抗癌治療剤群と組み合わせて投与する場合に、当該成分の構成要素群は共に投与してもよく、あるいは順に投与してもよい。一般的に癌治療においては、化学治療剤は、例えば、ボーラス注入あるいは継続輸注により患者の血流に、全身的に被験者に対し投与される。しかし、化学治療剤は、経口的に投与することもできる。本発明の治療成分は、組み合わせの治療剤を投与する前に、あるいはその後で、投与することができ、あるいは同時に投与することができる。
1.3投薬
【０２２９】
投与する治療成分の投与量は、定義された限界に左右されないが、通常効果的な量である。本発明の成分の一日当たりの投与量は、一般的に、単回あるいは複数回投与で、例えば、体重の10mg/kg から1000 mg/kgなどの、約体重の1 mg/kg から2000 mg/kgの範囲に入る。しかし、投与される成分の実際量は、治療対象の病状、選択された投与経路、投与される成分、個々の患者の年齢、体重、および反応、さらい患者の症状の重篤度などの関連状況を考慮に入れた上で、医師により決定されるということを理解されたい。上記の投与量の範囲は、例示のためのみに示しているのであって、本発明の範囲をいかようにも限定することを意図しているのではない。ある場合においては、前記の範囲の下限より下の投与量レベルが適量を超え、別の場合においては、例えば最初に多量の投与量を一日かけて投与するために複数の少量の投与量に分けることにより、遥かに多い投与量を用いても有害な副作用を起こさない場合もある。
1.4最適以下の投与量による投薬
【０２３０】
標準あるいは最適な抗癌治療剤治療に関連した毒性が耐えられないか禁止されている患者については例えば、高齢者、太り過ぎあるいは肥満の患者、肝臓疾患に罹患している個体など代謝の弱い個体、あるいは好中球減少症に罹患している個体）、本発明はまた、標準化学治療剤の効果的な代替の一部としての当該治療成分群の使用も考慮している。本書で説明しているように、本発明の治療成分を、ひとつあるいはそれ以上の化学治療剤群）と組み合わせて使用することにより、当該治療成分あるいは当該化学治療剤群）を単独で使用した場合に比較して、より大きな最終治療効果が得られる。この治療指標の向上は、例えば、抗癌治療剤群)の効果を本発明の治療成分により増大させた結果としてもたらされ、それにより、本発明の治療成分と組み合わせ抗癌治療剤群)のレベルを下げて投与することにより、効果的な治療を可能にする。従って、本発明の一つの実施例では、被験者に対し、一つあるいはそれ以上の化学治療剤の最適以下の投与量を、本発明の一つの治療成分と組み合わせて投与することによる、癌治療のための方法が提供されている。 
【０２３１】
上記のように、高齢者あるいは太り過ぎの被験者、および肥満、好中球減少症、あるいは肝臓疾患または障害に罹患した被験者は、本発明の最適以下の化学治療剤の組み合わせを受けるのに適切な候補者である。しかし、標準の化学治療剤を用いた治療と比較して、最適以下の化学治療剤の組み合わせに関連した効用の喪失がないことを考慮にいれ、本発明はまた、その他の癌患者を治療するために、本発明の当該治療成分の使用を考慮している。ここでは、例えば、当該標準治療法の有害事象を減少させ、標準抗癌治療剤の投与回数を減らし、および／またはよりコスト効果の高い治療計画を提供することを目的としている。 
治験
【０２３２】
当業者は、以下のことをよく理解しているであろう：本発明の治療成分群の効用がin vitro および動物モデルにおいて実証された後前臨床効用）、当該成分群の安全性プロファイルを、ヒト以外の少なくとも二つの種を用いて決定することができ、さらにその後、腫瘍の成長および／または転移を弱める当該成分群の効果についてさらに当該成分群を評価する目的で、また治療目的の使用に対する規制当局の許可を取る目的で、当該成分群を必要であれば治験段階に進めることができる。当業界で既知であるように、治験は複数の試験の相を経て進行し、これらの試験の相は、第I相、第II相、第III相、および第IV相となっている。当該成分群の代謝および薬物動態PK)に関するin vitro およびin vivo の情報前臨床試験で得られた薬物-薬物相互作用に関するデータを含めて）により、最初の第I相および第II相の治験のデザインが決まる。 
第I相
【０２３３】
第I相の治験は、通常、健常なヒトの志願者あるいは進行癌の患者を用いて行なわれる。これらの試験は、当該成分群の安全性、忍容性およびPKを調べるため、さらに適切な投与量、投与経路、投与計画について第II相治験のデザインを決める補助とするために、行なわれる。第I相の治験には、ヒトにおける標的の阻害における原理証明を評価するための薬力学アッセイを組み入れることができる。適切な薬力学エンドポイントは、健常な志願者のプラズマから測定した阻害活性を決定することである。例示的な第I相治験は、以下の情報を決定することを目的として構成することができる： 
1. 単回経口投与後の健常な被験者における安全性、忍容性およびPK ：適切な数の被験者を用いた、単盲検、無作為化、プラセボ対照試験。
2. 反復投与14日間）後の健常な被験者における安全性、忍容性およびPK ：適切な数の被験者を用いた、単盲検、無作為化、プラセボ対照試験。
3. 年齢、性別、あるいはその他の併用薬剤の、安全性、忍容性およびPK に対する効果*29 。
【０２３４】
本発明の治療成分の、ひとつあるいはそれ以上の抗癌治療剤との組み合わせについては、ファーストライン化学治療剤と組み合わせて使用した場合の当該治療成分のPK 調整を調べるため、健常志願者を使ったプラセボ対照確認試験が必要であるかもしれない。ファーストライン化学治療剤のPK における変化もまた調べる必要があるかもしれない。
第II相
【０２３５】
第I相の治験は、第II相の治験のために、安全な投与量の選択をする。第II相治験の治験実施計画デザインにおける重要な因子は、厳格な選択判断基準に基づいて、患者母集団を適切に集めることであり、当該選択判断基準は、治験の人口統計学的特性年齢、人種、および性別）、患者の病歴、癌の種類および病期、さらに癌治療歴を定義するものである。後者の因子は、当該成分が不応性の疾患に対する治療ではなくファーストライン治療のアジュバントとして意図される場合に、重要であり得る。第II相治験の治験実施計画は、一般的に、基準値データを特定するものであり、この基準値データは、母集団を特徴付けるため、重要な予後因子のバランスを達成することにおける無作為化の成功を評価するため、さらに調整分析を考慮に入れるために、使用される*30。
対象の癌の病期
【０２３６】
研究対象となっている癌の病期は重要であり得るので、必要であれば、統計学的分析および得られたデータの解釈を促進させるために、そのがんの病期が母集団全体でできるだけ均質である患者を集める必要がある。当業界で既知であるように、癌の病期を決定する方法群および判断基準群は、研究対象となっている特定の癌により、異なる。 
【０２３７】
例えば、前立腺癌について言えば、最初の病期は、生検の組織学的評価に関するT N M 分 類；表3を参照せよ)。血中前立腺特異抗原PSA)レベルリスクの高い患者において常にモニターされている）により、これらの生検が推奨されている。米国泌尿器科学会によると、PSA レベルの上昇に関連した癌のリスクは、以下の通りである：
PSA が4 ng/mL未満：正常
PSA が4 ng/mL から10 ng/mL：20% から30% のリスク
PSA が10 ng/mLから 20 ng/mL：50% から75%のリスク
PSAが 20 ng/mLを超える場合：90%
【０２３８】
表3：前立腺癌の病期、TNM分類
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2008516899.tif 000009
【０２３９】
治験において結腸直腸癌の病期を決定することは、この癌の進行率における変動性が大きいため、特に重要である。その他の癌とは異なり、結腸直腸癌の病期は、当該腫瘍のサイズとは関連性がないが、腫瘍の腸壁への貫通の深さに関連性があり、これにはタンパク質分解が関与している。結腸直腸癌の病期分類がAmerican Joint Committee on Cancer Manual for staging of Cancer AJCC): 2nd ed. Hagerstown MD, Lippincot 1983)において示唆されており、これを表4に示す。本発明の成分を用いた第II相治験の被験者には、例えば、化学治療介入をまさに受けようとしている被験者を含めることができる。
【０２４０】
表4：結腸直腸癌の病期：AJCC 1983)
2008516899.tif 000010
【０２４１】
脳癌については、脳癌がその他の癌と同じ様に病期決定できないため、公式の病期分類は存在しない。最初の診断は、通常、患者により報告された症状に従って行なう。組織学検査が可能な場合は、原発脳腫瘍を、グレード1からグレード4に分類することができる表5を参照せよ）。重篤度は、多くの場合、診断対象の細胞の種類が脳のその他の部分の広がる可能性に関連している。 
【０２４２】
表5：原発脳腫瘍病期：世界保健機構WHO)によるグレード付け
2008516899.tif 000011
臨床バイオマーカー
【０２４３】
効用の評価および／またはアウトカムの予測毒性を含む）のための 臨床バイオマーカーの選択は、第II相治験で重要であり、このバイオマーカーを、多くの場合に、第II相治験における患者の組み入れに選択判断基準として用いることができる。
【０２４４】
臨床バイオマーカーは、以下のように定義することができる Atkinson A et al: Clin. Pharmacol. Ther. 69, 89-95 2001))：
【０２４５】
生物学的マーカーバイオマーカー）：正常な生物学的過程、病原的過程、あるいは治療的介入に対する薬理学的反応の指標として客観的に測定あるいは評価される特徴。
【０２４６】
臨床エンドポイント：患者の気分あるいは機能状態、あるいは患者がどのくらい生存するかを反映する特徴あるいは変数。
【０２４７】
代替エンドポイント：臨床エンドポイントを代替するためのバイオマーカー。治験担当医師は、疫学的、治療的、病理生理学的、あるいはその他の科学的証拠を用いて、利益、損害、あるいは利益または損害の欠損を予測することが期待される代替エンドポイントを選択する。FDA は代替エンドポイントすなわちマーカーを以下のように定義している：患者の気分あるいは機能状態あるいは患者がどのくらい生存するかを示す直接的な尺度であり、さらに治療の効果を予測することが期待される、臨床的に意味のあるエンドポイントに代わるものとして治験において使用される臨床検査値あるいは生理的兆候。  
【０２４８】
生化学バイオマーカーは、長期に渡って癌におけるリスクと利益の評価に貢献してきており、前立腺特異抗原および癌胚胎抗原のようなバイオマーカーのルーチン臨床アッセイが利用可能であるGrizzle, WE et al, Arch. Pathol. Lab. Med. 125, 91-98, 2001)。より近年には、腫瘍のイメージングが受け入れられてきておりTherasse P et al, J. Natl. Cancer Inst. 92, 205-216, 2000) 、プロテアーゼ阻害についてはこれが特に重要であり得る。多次元のイメージングは精度が高まり、陽電子放射断層撮影装置とコンピュータ断層撮影装置を組み合わせた撮影装置（positron emission tomography-computed tomography PET-CT)）などのマルチモーダルイメージングにより代謝活性あるいは受容体の状態を定量化することができる。生検および生化学バイオマーカーに比較して、メージング方法群には、単一の腫瘍および全体の腫瘍の負担に関し、病期決定あるいは治療反応の定量化ができるという利益があり、この利益は良い臨床バイオマーカーであり得る。 
【０２４９】
バイオマーカーの潜在的用法は患者の選択の問題に関し、患者の選択を行なうには基準値を確立するためにマーカーが適用される。MMP 阻害剤のためにデザインされた過去の治験は最適にデザインされていなかったし、多くの場合病状が進んだ腫瘍に焦点を当てていたCoussens LM et al, Science 2002,295:2387-2392; Chantrain C et DeClerck YA, Medecines/Science 2002,18:565-75; およびOverall MO and Lopez-Otin, Nature Reviews, 2002, 2:657-672を参照せよ）。従って、将来の治験は、早期に診断された癌発生期の腫瘍）を有する患者あるいは緩解期の患者を含めることができ、これは乳癌、前立腺癌、黒色腫および直腸結腸癌のような、発見方法が整っている癌に特に実際的な重要性を有する。 
対照
【０２５０】
対照群において比較目的で使用することができる市販のMMP-9、カテプシンB、あるいは血管形成が現在存在しないため、最初の治験はプラセボ対照組み合わせ治療治験としてデザインする必要があろう。このプラセボ対照組み合わせ治療治験では、第一の群に標準治療にプラセボを加えたものを受けるように割り当て、第二の群に本発明の治療成分および標準治療法から成る組み合わせ治療法を受けるように割り当てる。最初の第II相の陽性の結果は、よく定義された腫瘍学指標腫瘍イメージングにより実証された進行あるいは退行の欠如など）の改善と組み合わされたよい安全プロファイルであろう。治療組み合わせの毒性プロファイルを治療の利益の関数で評価し、標準のファーストライン治療プラセボ群）の毒性プロファイルと比較する。組み合わせ治療中に腫瘍の進行に好ましい効果が観察された場合は、処置群における毒性の高まりは、後続の治験における新規療法の投与量の減少、あるいはファーストライン化学治療剤の投与量の減少につながる可能性がある。 
第III相
【０２５１】
第III相治験は、当該治療成分あるいは組み合わせと、標準あるいは最も広く受け入れられている治療との比較に焦点を当てるものである。第III相治験では、患者を無作為に二つあるいはそれ以上の「アーム」の一つに割り付ける。二つのアームを有する治験では、例えば、一つのアームは標準治療法を受け対照群)、もう一方のアームは当該の治療成分／組み合わせで処置する被験群）。
第IV相
【０２５２】
第IV相を利用して、当該成分の長期安全性および効用をさらに評価することができる。第IV相治験は、第I、II およびIII相の治験に比べて、一般性が低く、当該治療成分が標準使用に 承認された後に行なう。
キット
【０２５３】
本発明は、癌の治療、安定、および／または予防において使用する治療成分から成る治療キットを付加的に提供している。そのようなキットは、臨床であるいは医師の指導に基づいて使用されるように意図された薬学的キットであってよく、あるいはまた医療管理の下であるいは医療管理無くして使用される自然療法キットであってよい。当該キットは、付加的に、本発明の治療成分と組み合わせて使用する一つあるいはそれ以上のその他の抗癌治療剤あるいは自然療法製剤からなっていてもよい。
【０２５４】
当該キットの個々の構成要素は、別個の容器に入れ、そのような容器には、必要である場合には、行政省庁により指定された形式の、薬学的製品あるいは生物学的製品の製造、使用あるいは販売を規制する指示および／または通告が付いていてよく、そのような通告は、ヒトに投与する目的での製造、使用あるいは販売の当該省庁による承認を反映したものである。
【０２５５】
当該キットの構成要素が一つあるいはそれ以上の液体溶液で提供されている場合には、当該液体溶液は、例えば滅菌済みの水溶液のような、水溶液であってよい。この場合、容器自体が吸入器、シリンジ、ピペット、点眼瓶、あるいはそのような装置であってよく、それらの装置から当該成分が患者に投与されるか、あるいは当該キットのその他の構成要素に適用され混合される。
【０２５６】
当該キットの構成要素はまた、乾燥したあるいは乾燥凍結した形態で提供されてもよく、当該キットはさらに凍結乾燥されている構成要素を再構成するための適切な溶媒を含んでいてもよい。容器の数あるいは種類にっ関わらず、本発明のキットはまた、当該成分を患者に投与することを補助する器具から成っていてよい。そのような器具は、吸入器、シリンジ、ピペット、鉗子、計量スプーン、点眼瓶、あるいはその他の医学的に承認された投与用ビヒクルなどであってよい。
【０２５７】
本書で説明している発明をよりよく理解させるため、以下の実施例を記載する。これらの実施例は例示目的のみであることを理解されたい。従って、これらの実施例は、本発明の範囲をいかようにも限定するものではない。
【実施例】
【０２５８】
実施例１： ストレスを課した植物抽出物およびストレスを課していない植物抽出物方法A) 
収穫前処理： 生きている植物の地上部を、ガンマリノレン酸6,9,12-オクタデカトリエン酸、Sigma L-2378）ストレスG）あるいはアラキドン酸5,8,11,14-エルカ酸、Sigma A-3925）ストレスA）0.125% v/v) トリトン X-100を含む水を用いてM400 μとした）で噴霧し、葉を完全に覆った。ストレス負荷後20時間から24時間後に、植物を収穫した。
【０２５９】
固相S1の収穫および任意の保存処理：ストレス負荷後20時間から24時間後に、4グラムを越える葉、茎、果実、花、あるいはその他の部分を収穫し、ドライアイスで即座に冷凍し、-20oC の冷凍庫にできるだけ早く移し、使用するまで保存した。植物材料は、-20oC で、阻害活性を失わさせずに長期間、一年以上保存することができる。一定状態を確保するため、温度をモニターした。
【０２６０】
ストレスを課した植物およびストレスを課していない植物を湿潤試料として回収し、-20°C で多様な期間保存し、3つの亜分画を生成する過程に供した：水性、エタノール性、および有機性の分画。継続サイクルで、以下の段階を用いて、完全な抽出過程を行なった。植物試料の最初の5g を、攪拌器を用いて液体窒素中でホモジナイズした。得られた粉末を計量した。
【０２６１】
抽出過程1 -水抽出：植物粉末の4.5グラム毎に、100 mM Tris、pH 7.0の冷たい溶液12 ml を加えた。得られた混合物を、ボルテックスミキサーで2分間完全に攪拌した。当該混合物を、氷上に30分間置き、10分毎にボルテックスミキサーで攪拌した。試料をCorex(tm) 30 ml遠心管内で、5分間4500 rpmで遠心した。得られた上澄みを、Miracloth(tm) フィルターでろ過した後、 15 ml試験管内で、デカンテーションに供した。この抽出物が、可能性のある抽出物Aである。ペレット固相S1と呼ぶ）を、エタノール抽出のため保存した。 
【０２６２】
水抽出物可能性のある抽出物A）をさらに、そのEP阻害活性を調べるため精製した。当該の可能性のある抽出物A を、サイズ排除クロマトグラフィーで精製し、当該水抽出物を校正したSephadex G-25 カラム 1 × 10 cm）上で20 mM Tris-HCl、150 mM NaCl、pH 7.5 緩衝液を溶離液として使用しクロマトグラフィー処理した。1500 ダルトンD）未満の分子量MW）を有すると思われる化合物に対応する分画をプールし、精製水抽出物を構成し、得られた抽出物を、実施例II で説明しているように、阻害活性についてテストした。 
【０２６３】
この分析に先立って、非特異的な酵素リガンドを除去するために、当該抽出物を10% ゼラチン-セファロース スウェーデン国ウプサラ市Pharmacia Biotech)で処理した。1 mL の抽出物に対し、ゼラチン-セファロース樹脂100μL をマイクロアレイチューブに加え、チューブ内の溶液を混合し、氷上に30分間置き、その後5,000rpm で5分間遠心した。上澄みを取り除き、直接アッセイに使用した。 
【０２６４】
抽出過程II - アルコール抽出：先の水抽出から回収したペレット、固相S2に、冷エタノール：メタノール85:15) 12 ml を加え、得られた混合物をボルテックスで2分間よく攪拌する。得られた混合物を氷上で30分冷やし、10分毎にボルテックスで攪拌する。当該試料をCorex(tm) 30 ml 遠心管内で4,500 rpm で5分間遠心した。得られた上澄みを、Miracloth(tm) フィルターでろ過した後、 15 ml試験管内で、デカンテーションに供した。得られたペレット固相S3と呼ぶ）を、後続の有機抽出のため保存した。この抽出物を、可能性のある抽出物Bとする。エタノール抽出物である抽出物Bを、酵素アッセイに先立って液液抽出法により精製した。この目的のため、エタノール抽出物1 ml を真空下で蒸発させ、ジメチルスルホキシドDMSO) 150 μl に溶解し、トリス緩衝液を含む1.5 ml の最終量とした 最終濃度：Tris-HCl 20 mM；pH 7.5）。ヘキサン４ml を硝子試験管内のトリス相に加え、当該試験管をボルテックスで完全に混合し、その後二相性の液体を形成させる。有機相を除去し、抽出物を再び液液抽出法に供する。水相を除去し、10% ゼラチン-セファロース スウェーデン国ウプサラ市Pharmacia Biotech)で処理し、後続のアッセイを行なう前に非特異的な酵素リガンドを除去した。抽出物1 ml に、マイクロアレイ試験管内でゼラチン-セファロース樹脂100μL を加え、当該試験管を混合し、氷上に30分間置き、その後5,000rpm で5分間遠心した。実施例II で説明しているように、上澄みを取り除き、直接アッセイに使用した。
【０２６５】
抽出過程III - 有機抽出：先のエタノール抽出から回収したペレット、固相S3に、冷ジクロロメタン12 ml を加え、得られた混合物をボルテックスで2分間よく攪拌する。得られた混合物を氷上で30分冷やし、10分毎にボルテックスで攪拌する。当該試料をCorex(tm) 30 ml 遠心管内で4,500 rpm で5分間遠心した。得られた上澄みを、Miracloth(tm) フィルターでろ過した後、 15 mlガラス試験管内で、デカンテーションに供した。最終ペレットを廃棄した。有機溶媒を真空下で蒸発させ、当該相をジメチルスルホキシドDMSO) で溶解させた。この抽出物を、可能性のある抽出物Cとし、それを酵素アッセイによる分析に先立ちさらに固相抽出で精製した。  
【０２６６】
可能性のある抽出物C をアッセイに供するために、有機抽出物をDMSO:メタノール: トリス20mM, pH 7.5) 10 :50 :40)の溶液 溶液A）で1:10に希釈した言い換えれば、220 μlの抽出物を、2.0 ml の溶液Aに加えた）。ボルテックスで10秒間激しく攪拌した後、当該混合物に10秒間超音波処理を施した。溶解抽出物を、次に、固相の抽出プレートミズーリ州セントルイス市Sigma Chemical Co 製Discovery SPE-96）に適用した。1 mlのメタノールを用いてカラムを条件付けた後、カラムを溶液Aで用いて平衡化し、抽出試料をカラムに置いた。溶液Aを用いて溶出を完了させ最終量2 ml)、この分画を実施例IIで説明しているように直接アッセイに使用した。
実施例II：In vitro 酵素阻害アッセイ  
【０２６７】
試料成分群のヒトMMP-9あるいはヒトカテプシンBに対する阻害活性を、フルオロジェニックな基質かFASC アッセイのどちらかを用いて、調べた。 
フルオロジェニックなペプチド基質を用いたヒトMMP-活性の測定
【０２６８】
MMP-9 を、文献に説明されているように、I.M. Clark著"Matrix metalloproteinases protocols"Humana Press版、2001）に記載されているプロトコルに基づいて、天然源「MMP-9用のTHP-1 細胞 」ヴァージニア州マナサス市ATCC)から精製した。MMP-9のタンパク質分解活性を、自動消光したペプチド基質の開裂に基づいて評価したMCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2 ・TFA （Dpa = N-3-2,4-ジニトロフェニル)-L-2,3-ジアミノプロピニル））；インタクトペプチドにおいて、Dpa あるいは DNP がMCA 蛍光を消光する。ペプチドの開裂により、蛍光MCA基 が放出され、その後放出された蛍光MCA基を蛍光光度計カリフォルニア州サニーベール市Molecular Devices 社製Gemini XS）で定量した。アッセイを、ヒト精製プロテアーゼI.M. Clark: Matrix metalloproteinases protocols, Humana Press 2001)）を含んだTNCZ アッセイ緩衝液20mM Tris-HCl; NaCl 150mM; CaCL2 5mM; ZnCl2 0.5mM; pH 7.5）を用いて行なった。最初にDMSO に溶解した基質を、次にアッセイを行なうためTNCZ 緩衝液に再溶解させる。典型的なアッセイでは、10 μlの精製酵素1-50 ng)と、5μlの溶解基質最終濃度10 μM）を混合し、75 μlの最終量TNCZを用いて完了させる）を得た。全てのアッセイを、96穴プレートで行い、基質を加えることにより反応を開始した。アッセイを20分間、40分間、および60分間測定した励起325 nm、放出392 nm）。 
FASCアッセイを用いた、ヒトのMMP-9、カテプシン Bの活性の測定
【０２６９】
ヒトカテプシン B をCalbiochem 社カリフォルニア州サンディエゴ市）より入手した。ヒトカテプシン B を先に説明したように精製した。アッセイは、カナダ国特許番号2,189,486 1996) および St-Pierre et al., Cytometry 1996) 25:374-380に説明されている方法に基づいた。アッセイには、一般的に、5 μlの精製酵素1-100 ng)、5 μl の濃縮緩衝液20mM Tris-HCl; NaCl 150mM; CaCL2 5mM; ZnCl2 0.5mM; pH 7.5）、および5 μl の ゼラチン-FITC ビーズを用い、最終量100 μl を得た。反応混合物を37°C で90分間インキュベートすることにより、アッセイを行なった。混合物を0.5 ml の20 mM Tris、150 mM NaCl；pH 9.5 緩衝液に移すことにより、反応を停止させた。この試験管を、カナダ国特許番号2,189,486 1996)に説明されているように、フローサイトメーターオンタリオ州ミシソーガ市Beckman Coulter社Epics MCL）内で分析した。
蛍光タンパク基質を用いた、ヒトカテプシン Bの活性の測定
【０２７０】
カテプシン B を先に説明したように入手した。カテプシン B の活性を、Alexa-488 染料オレゴン州ユージン市Molecular Probes社）で強く標識化したタンパク基質ヘモグロビン）の蛍光の増加に基づいたアッセイにより測定した。当該基質は、染料で強く標識化した場合に、染料蛍光をほとんど消光する。基質の開裂の結果、蛍光が増加する。この蛍光の増加は蛍光分光光度計で測定することができるが、プロテアーゼ活性に比例していた。一般的に、10 μlの精製ヒトカテプシン B、10μLの ヘモグロビン-Alexa488あるいはベータ-カゼイン-Alexa488 100 ng）をアッセイに供し、最終量を20 mM citrate pH 3.3 緩衝液を用いて75 μl に調整した。蛍光を励起488 nm／放出525 nm 波長で読み取った以外は、先に既に説明したように反応を行なった。 
抽出物阻害アッセイ
【０２７１】
一般的アッセイに先立ち、実施例Iで説明したように調製した水抽出物を、1:10 のゼラチン-セファロース4B(tm) を用いて30分間プリインキュベーションに供し、蛍光消光を除去する。エタノール抽出物については、最初のヘキサン抽出を行ない、試料を1:10 のゼラチン-セファロース4B(tm) で処理し、消光を除去する。
【０２７２】
一般的な蛍光アッセイでは、酵素アッセイについて先に述べた濃度の10 μl の精製酵素 、5 μl の溶解フルオロジェニックペプチド基質あるいは10 μl の溶解蛍光タンパク基質最終濃度10 μM ）、および実施例Iで説明したように調製したテスト用の40μL の水抽出物、エタノール抽出物、あるいは有機抽出物を混合し、75 μl の最終量を得たフルオロジェニックペプチド基質アッセイについてはTNCZ で完了させ、蛍光タンパク基質アッセイについては20mM クエン酸 pH 3.3 緩衝液で完了させた）。全てのアッセイを、96穴プレートで行い、反応は基質を加えることにより開始させた。アッセイを20分間、40分間、および60分間測定したペプチドについては、励起325 nm、放出392 nm；タンパク質については、励起488 nm、放出525 nm）。活性および阻害の値を、蛍光の増加から定量した。
【０２７３】
FASC アッセイを行なうには、実施例I に説明したように調製した処理済抽出物35 μl 、先に説明したように調製した精製酵素5 μl、濃縮緩衝溶液 TNCZ）5 μl、およびゼラチン-FITC ビーズ5 μlを、一般的に用いた。アッセイの最初の段階で、阻害剤を酵素に結合させるため、ビーズを除いた反応を氷上で30分間インキュベートした。蛍光ビーズを加え、反応を37°C で90分間インキュベートした。0.5 ml の20 mM Tris、150 mM NaCl；pH 9.5 緩衝液に混合物を移すことにより、反応を停止させた。この試験管を、カナダ国特許番号2,189,486 1996)に説明されているように、フローサイトメーターオンタリオ州ミシソーガ市Beckman Coulter社Epics MCL）内で分析した。
【０２７４】
MMP-9およびカテプシンBに関する上記のアッセイ結果を、表6および表7にそれぞれ示した。これらの表では、以下の略語を使用した：
Str = ストレス。この欄では、以下の略語が、抽出物作製時に適用したストレスを表している：A：アラキドン酸；G：ガンマリノレン酸；N：ストレス処理無し
Extr = 抽出物。この欄では、以下の略語が、抽出物を作製するために使用した溶媒を表している：S ：有機溶媒；O：水性溶媒；R：アルコール性溶媒
【０２７５】
表６：MMP-9を阻害する能力を有する植物抽出物
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【０２７６】
表7：カテプシン Bを阻害する能力を有する植物抽出物
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実施例III:ある抽出物に発見された阻害活性の例示的精製  
【０２７７】
抽出物は、Agilent 1100 システムカリフォルニア州サンフェルナンド市）を用いて、HPLC により分離することができる。簡単に言えば、実施例I で説明したように調製した粗抽出物100μLを、C18 逆相カラム上に適用することができるカリフォルニア州サンフェルナンド市Agilent 社、Purospher RP-18 5μm、4.0 x 125mm HP)）。化合物の溶出を、10%から85%のアセトニトリルの線形勾配を用いて達成する。分画を回収し、蒸発させ、水性緩衝液中で再懸濁させ、既に説明したように特定の酵素に対するその阻害活性を再分析する。対象の分画生物学的活性を示している)をさらなる分析および特徴付けのためによりより大きな規模で最単離することができる。 
実施例IV: 植物抽出物の調整方法B)
【０２７８】
方法Bを一般的な面について、図２および４に要約する。当該方法は、二つの主たる部分に予備的な分析規模の抽出および第二のより大きな規模の抽出過程に従って二つの主たる部分に分けることができる。
1. 分析規模の抽出―植物・抽出物の選択
【０２７９】
処理済みの植物材料は葉、根、あるいは種子)は、専用の温室栽培により物理的・化学的ストレスを伴ったあるいは伴わない）、商業的サプライャー、あるいは非栽培の天然源から採集することにより得られる。分析規模、あるいは大規模の抽出のどちらかにおいて、用いられるそれぞれの植物について、適切に同定し、標識を付けた試料を実験室に保存する。
【０２８０】
予備的分析規模および大規模の抽出の双方に関する抽出プロトコルを、一般的について図４に示す。 
【０２８１】
回収した乾燥植物材料2 g から10 g）をまず固液抽出法に供し、粗抽出物Aミリグラム規模)を精製する。二つの異なった溶媒をテストするエタノール・メタノール混合物、あるいはエタノール・水混合物）。次にヘキサンを用いて、抽出物を脱脂し、ヒドロアルコール性あるいはアルコール性の抽出物Bおよヘキサン抽出物Cを得る。抽出物Bを水で希釈した後、酢酸エチルを用いて分割し、水性抽出物Eおよび有機的抽出物Fを得る。
【０２８２】
得られた抽出物を採集し、MMP-9および／またはカテプシンBを阻害するそれらの能力、および内皮細胞および新生細胞の移動を阻害するそれらの能力について、以下に説明した方法を用いて評価する。
【０２８３】
結果の分析により、大規模抽出に用いる植物材料を選択することができる。選択過程には、純粋な活性化合物の単離のための、抽出物の充分な量を得るために必要な植物の部分および乾燥材料の量に関する決定が含まれる。当該過程の選択にはまた、さらなる作業において使用される溶媒系水性対アルコール性）および活性抽出物B、E、あるいはF）の選択も含まれる。 
【０２８４】
抽出物をまた薄層クロマトグラフィーTLC) により分析する。天然産物の古典的化学基テルペン、アルカロイド、フェノール酸、ポリフェノール）に、特異的である異なった試液を用いて、薄層クロマトグラフィーTLC)により分析する。この目的は、それぞれの段階において行なわれる分割により達成される濃度における上昇を評価し、虚偽の陽性結果を生む可能性のある材料脂肪酸、クロロフィル）を除去し、およびさらなる抽出においてどの分画段階を使用したら良いかを示すことである。
2. 大規模抽出―単離
【０２８５】
それぞれの新しい試料について、反復分析規模抽出を行ない、大規模抽出過程を開始する前に生物学的活性を確認する。
【０２８６】
第一の段階は、分析規模調製で得られた結果に基づいて、選択された汎用溶媒混合物を用いて、乾燥および粉末材料に由来する二次的代謝物を放出させることである。これは、ほとんどの天然化合物を同時に溶解させる同じ溶媒を用いて、連続した解離・濾過操作により行なうことができる。その後、セルロースのような不活性且つ不溶性の材料のほとんどを、ろ過により取り除く。乾燥および粉砕の条件を管理する乾燥温度は45°C未満、粒子サイズ*31）。
【０２８７】
第二の段階は、対象のすべての天然産物を含む複数グラムの混合物を得ることを目的とし、さらに必要のない材料のほとんどを除去することを目的として、異なった極性の溶媒を用いて一連の液液低分解能抽出において必要のない材料の部分を除去することである。
【０２８８】
抽出プロトコルを、図４に示した。これは、分析調製で用いた手続きと本質的に同じである。乾燥および粉状の材料大規模抽出では２キロから３キロ）を、分析規模の結果抽出の収量）に基づいて、エタノール・メタノール（85:15） v/v a)あるいはエタノール・水（85:15） v/v b)の混合物3 x 5 - 10 L)を用いて２ｘ２４時間から48時間に渡って室温で、繰り返し解離・濾過）抽出する。
【０２８９】
アルコール抽出物a）の場合、組み合わせたアルコール抽出物A）を減圧で濃縮し、水10% -15%)により希釈し、ヘキサンあるいはヘプタン）により抽出し、ヘキサン抽出物C）およびヒドロアルコール分画B）を得る。その後、得られたものを濃縮し、エタノール20%)により希釈し、酢酸エチルにより抽出し、水E）および酢酸エチルF)の抽出物を得る。
【０２９０】
ヒドロアルコール抽出物b）の場合、組み合わせたアルコール抽出物A）をヘキサンにより抽出し、ヘキサン抽出物C）およびヒドロアルコール分画B）を得る。その後、後者を残留水により*32濃縮し、エタノール20%)により希釈し、酢酸エチルにより抽出し、水E）および酢酸エチルF)の抽出物を得る。
【０２９１】
すべての抽出物A-F)を試料として採取し、処理回収およびアリコットを生物学的な評価MMP-9 および／またはカテプシンB阻害)に供する。得られた結果を、分析規模セクションより得られた結果と比較し、その後選択した陽性抽出物を減圧で乾燥するまで濃縮する。
【０２９２】
すべての抽出物A-F)を、TLCにより分析し、分析規模抽出物と比較する。
実施例 V: 細胞移動に対するMMP-9およびカテプシンBを阻害する植物抽出物の効果
【０２９３】
植物抽出物を実施例 IVに説明したように調製し、製品開発に適切であるような安定且つ非細胞障害性の分子を含んでいることをさらにテストした。生理的条件を含む多様な条件下において、プロテアーゼ阻害の回復により経時的に、安定性を確認する。細胞障害性は、以下に示した細胞タイプを含む種々の細胞タイプと治療法の組み合わせとのインキュベーション、あるいは当該細胞タイプと治療法の組み合わせの構成要素とのインキュベーションにより確認する。
【０２９４】
MMP-9 およびカテプシBを阻害する植物抽出物の細胞移動および／またはコード形成に対する効果を、下記のように評価した。植物抽出物の濃度を、プロテアーゼ阻害について定量したIC50 濃度 の関数で表し、それを1X とする。従って、当該抽出物は、本書で説明しているアッセイの一つに従って測定した場合に、少なくとも一つの細胞外プロテアーゼの活性を少なくとも50%減少させる能力を有する。この1X 濃度は、当該抽出物を調製する過程で使用した植物および溶媒により、異なる。1X 水性抽出物の平均濃度は、約1.6 mg/ml であり、1X アルコール性抽出物の平均濃度は、約4 mg/ml である。以下に説明したアッセイ群でテストするそれぞれの抽出物につき、4つの異なった濃度0.31X、0.62X、1.25X および 2.5X）を正副二通りに使用した。
細胞移動アッセイ
【０２９５】
PETメンブレン穴サイズ8μm）により上部および底部セクションに区切られているマルチウェルシステムFalcon 1185、24穴フォーマット）を用いて、移動を評価した。対象アッセイで使用している細胞により、メンブレンを10μg/mlラット尾由来のコラーゲンHUVEC用）あるいは80μg/cm2 Matrigel 成長因子 BD Biosciences）癌細胞ライン用）で被覆し、乾燥させた。上部セクションで使用した溶液は全て、DMEM-0.1% BSA 中で調製したが、底部セクションで使用した溶液は全て、10%ウシ胎児血清を含む、その他の媒体中で調製した。 
【０２９６】
HUVECClonetics）については、底部チェンバーにケモアトラクタント（chemo-attractant）としてEGM-2 700μl)を加えた。HUVEC 100 μl の 106 cells/ml）および適切な希釈率で植物抽出物を含む緩衝液を、上部チェンバーに加えたそれぞれの希釈率のそれぞれの植物抽出物のウェルを正副用意した）。5% CO2 雰囲気において、３７℃ で5時間インキュベーションした後、メンブレンをPBS で洗浄し、固定染色した。メンブレンの上部を拭き取り、底部の無作為に選択した三つの領域を計数した。 
【０２９７】
移動阻害百分率を、以下のように計算する： 
（A - B)/A） x 100、  
式中、Aは対照ウェル内のフィールド当たりの平均細胞数であり、Bは処置ウェル内のフィールド当たりの平均細胞数である。
【０２９８】
癌細胞ラインについては、実験開始に先立って、Matrigel 含浸フィルターを200μl の DMEM再水和させた。細胞の混合物100μl の 2,5X105/ml HT1080 あるいはMDA-MB-231 細胞、双方ともATCCより入手）および植物抽出物をピペットで上部ウェルに分注し、底部ウェルに700μl の DMEM-5% SVF を加えた。当該細胞を、48時間HT1080 細胞）あるいは72時間MDA-MB-231細胞）インキュベートし、その後メンブレンを上記のように処置し、上記のように移動の阻害を調べた図6も参照せよ；図6は、あぶらな科イベリス属（Iberis sempervirens）由来の抽出物を使用した場合の結果を示している）。 
コード形成アッセイ
【０２９９】
Matrigel 60μl の10mg/ml) を、96穴プレートの平面底部プレートCostar 3096）に加え、5% CO2 雰囲気において、37℃ で30分間インキュベーションした。HUVECおよび植物抽出物の混合物、あるいは陽性対照フマギリンおよびGM6001）を、それぞれのウェルに加えた。HUVEC をEGM-2を用いてml 当たり2.5 x 105 個の細胞を含む懸濁液として調製し、その後得られたHUVEC調製物500μlを、植物抽出物あるいは対照薬剤の望ましい希釈度の500μlと混合し2X）、200μlをそれぞれのウェルに加えた。それぞれの抽出物につき4種類の濃度を、正副でテストした。5% CO2 雰囲気において、３７℃で18時間から24時間インキュベーションした後、当該細胞は移動し、コードを形成した。 
【０３００】
三つの無作為に選択した領域における細胞間結合の数を計数し、コード形成の阻害を以下のように計算する： 
（A - B)/A） x 100、
式中、Aは対照ウェル内のフィールド当たりの平均細胞間結合数であり、Bは処置ウェル内のフィールド当たりの平均細胞間結合数である。 
【０３０１】
上記の実験の結果を表8および表9に示す。図6は、あぶらな科イベリス属（Iberis sempervirens）由来の抽出物で処置した細胞を示している。
【０３０２】
表8：内皮細胞移動に対するMMP-9阻害植物抽出物の効果  
2008516899.tif 000044
2008516899.tif 000045
1 A：アラキドン酸； G：ガンマリノレン酸；N：ストレス処理無し
2 EP：植物全体：Fl：花；Fr：果実； L：葉； R：根；Se：種子；St：茎
【０３０３】
表9：新生細胞の移動に対するカテプシンB 阻害植物抽出物の効果
2008516899.tif 000046
2008516899.tif 000047
2008516899.tif 000048
1 A：アラキドン酸； G：ガンマリノレン酸；N：ストレス処理無し
2 EP：植物全体：Fl：花；Fr：果実； L：葉； R：根；Se：種子；St：茎
実施例VI ：ヒトプロテアーゼ活性に対する植物分画成分の効果
【０３０４】
以下の植物抽出物を、ストレスを負荷していない植物から、実施例IV.にその概要を示した方法に従って調製した。簡単に言えば、エタノール／水を用いた固液抽出法を行い、粗抽出物を得て、その後得られた粗抽出物をヘキサンを用いて脱脂し、ヒドロアルコール性の植物抽出物を得た。
【０３０５】
植物抽出物A：カテプシンBを阻害する、ソリダゴ（Solidago sp. ）の葉／花／茎の抽出物*。
【０３０６】
植物抽出物 B：MMP-9を阻害する、ショウガ（Zingiber officinale）の根の抽出物。
【０３０７】
*ソリダゴ（Solidago sp. ） 抽出物は、カナダ国ケベック州で収穫した植物に由来するものであり、そのようなものとして、ソリダゴ・カナデンシス（Solidago Canadensis）、オオアワダチソウ（Solidago gigantean）、アキノキリンソウ属交雑種（Solidago hybrida）、あるいはそれらの組み合わせを含み得る。市販源から入手したアキノキリンソウ（Solidago virgaurea）由来の抽出物から、類似した結果を得られる。
酵素
【０３０８】
ヒトMMP-9を、文献に説明されているようにShimokawa K, Nagase H. Methods Mol Biol. 2001;151:275-304)、天然源米国ヴァージニア州マナサス市ATCC THP-1 細胞ライン）から精製した。ヒトカテプシンB肝臓由来）を、Calbiochem社 米国カリフォルニア州サンディエゴ市）から購入した。 
アッセイ
【０３０９】
MMP-9タンパク質分解活性を、Shimokawa K, Nagase H. Methods Mol Biol. 2001;151:275-304に従って、アッセイ緩衝液20mM Tris-HCl; NaCl 150mM; CaCL2 5mM; ZnCl2 0.5mM; pH 7.5）中の自動クエンチしたペプチド基質MCA-Pro-Leu-Gly-Leu-Dpa-Ala-Arg-NH2）の開裂により調べた。 
【０３１０】
ヒトカテプシンB タンパク質分解活性を、Barrett AJ, Kirschke H. Cathepsin B, Cathepsin H, and cathepsin L. Methods Enzymol. 1981 :535-61に従って、自動クエンチしたペプチド基質Z-Arg-Arg-AMC）の開裂により調べた。全ての基質を、Calbiochem社 米国カリフォルニア州サンディエゴ市）から購入した。 
【０３１１】
蛍光キネティクス測定法をPolarion蛍光光度計Tecan社）を用いて行なった。全ての分析を正副で行い、品質管理判断基準を満たした実験エラー< 10%）。酵素を用いた蛍光測定法は、ノイズレベルに比べて3倍高いはずである。陽性対照MMP-9についてはGM-6001、および カテプシンB についてはCA-074）の固定濃度を、アッセイ間対照として使用した。陰性対照緩衝液+ 双方の酵素のための基質）も、ノイズレベルを調べるために、含めた。 
【０３１２】
テスト済みの植物抽出物による酵素阻害を、植物抽出物を含めた場合の酵素活性と植物抽出物を含めなかった場合の酵素活性とを比較することにより計算した。IC50 値は、標的酵素の活性を50%阻害する植物抽出の濃度を意味する。結果を表10に示す。
【０３１３】
表10：植物抽出物AおよびB のIC50 値  
2008516899.tif 000049
実施例VII ：In vitro 細胞毒性アッセイ  
【０３１４】
植物抽出物AおよびB実施例VIを参照せよ）の多様な細胞ラインに対する細胞毒性を、Page, B., et al., Int. J. Oncol. 3, 473-476 1993)に従って評価した。簡単に言えば、ウェル当たり2 x 103HUVEC、PC-3、HT1080、L929、B16F10、LLC/M27）、5 x 103MDA、MRC5）あるいは10 x 103Caco-2 および HepG2）の個数で植え、24時間後に適切な植物抽出物を加え、当該細胞をさらに72時間、5% CO2の雰囲気、37°Cでインキュベートした。多様な濃度の植物抽出物を、0.012 mg/mL から 0.4 mg/mL の範囲でテストした。細胞の生存を、アラマーブルーアッセイを用いて評価した。結果を表11に示す。この表に記載されている濃度は、50%の細胞死という結果をもたらしたそれぞれの抽出物の量を表している。
【０３１５】
表11：In vitro 細胞毒性
2008516899.tif 000050
実施例VIII：HUVECコード形成アッセイにおける植物抽出物の効果 
【０３１６】
植物抽出物B実施例VIを参照せよ）を、米国国立癌研究所のプロトコルに従って行なったHUVECコード形成アッセイにおいて、テストした。簡単に言えば、ヒト臍帯静脈内皮細胞メリーランド州ウオーカーズビル市Cambrex 社製HUVEC）を、Matrigel(r) ニュージャージー州フランクリンレイクス市Becton Dickinson社）のHUVEC 完全培地 EGM-2(r)）内の第4パッセージに植えたウェル当たり25 x 104 個）。植物抽出物あるいは対照を、ウェル当たり100μl ml のEGM-2に加え、細胞を37°C、5% CO2で18時間インキュベートした。その後、プレートを光学顕微鏡下で調べ、Matrigel(r) マトリックス上の内皮細胞により形成された三次元の毛細血管様構造の質的および量的分析を行なった。GM-6001MMP 阻害剤）およびフマギリンNIHプロトコルによると血管形成阻害剤）を陽性対照として使用した。代表的な結果を図7に示す。A. 陰性対照ビヒクル）；B. 陽性対照GM-6001 25μg/mL)；C. 陽性対照 フマギリン 15μg/mL)、およびD. 植物抽出物B 10μg/mL)。
実施例IX ：腫瘍細胞浸潤アッセイにおける植物抽出物の効果  
【０３１７】
植物抽出物A実施例VIを参照せよ）を、以下のように腫瘍細胞浸潤アッセイにおいてテストした。MDA-MD231 乳癌細胞ATCC HTB-26）を、ウェル当たり25 x 104 個の個数で、96穴MultiscreenMIC プレートMillipore）の8μ多孔メンブレン上に120μg/cm2で塗布した薄層 Matrigel(r) コーティング上に植えた。当該細胞を、上部コンパートメントに植え、DMEM-0.1% BSA培地において対照あるいは植物抽出物の存在下でインキュベートした。ケモアトラクタント（chemo-attractant）である、10% FCS ウシ胎児血清、Wisent社製)を含むDMEM培地を、下部コンパートメントにロードした。植物抽出物で処理した細胞を、37°C、5% CO2で48時間インキュベートした。その後、全ての培地を取り除き、下部コンパートメントに移動した細胞を固定し、プロピジウムアイオダイドで染色し、上部コンパートメントに残っている細胞を取り除いた。浸潤性の細胞を、倒立蛍光顕微鏡下で調べ、ImagePro Plus ソフトウェアーカナダ国 オンタリオ州マークハム市Carsen Group社）を用いて計数した。非浸潤性の MCF7細胞乳癌、ATCC HTB-22）を、対照として使用した。代表的結果を図8に示した。A. 浸潤性の細胞MDA-MD231）；B. 非浸潤性の細胞 MCF7）； および C.植物抽出物 A 50μg/mL)。
実施例X ：植物抽出物および植物抽出物成分のIn vivo 毒性
【０３１８】
単回投与および反復投与における植物抽出物AおよびB実施例VI を参照せよ）の経口毒性を、別個でおよび組み合わせで、絶食2時間）C57BL/6ネズミn=6)において、評価した。結果を表12に示した。研究期間中、体重に対する効果は観察されなかった。
【０３１９】
表12：In vivo 毒性結果
2008516899.tif 000051
実施例XI ：植物抽出物成分群の腫瘍転移に対する抗転移効果
【０３２０】
この実施例の目的は、ネズミにおける腫瘍転移のルイス肺癌LLC）モデルに関し、植物抽出物成分群単独の抗転移活性あるいは植物抽出物成分群を化学治療剤と組み合わせた場合の抗転移活性を評価することであった。実施例Xに示したように、これらの植物抽出物の個別あるいは組み合わせ投与は、C57BL/6 ネズミに対し7日間連続で投与した場合に、有毒性がないと報告されている。 
【０３２１】
この研究では、C57BL/6 ネズミのルイス肺癌モデルを使用した。ルイス肺癌は、攻撃的且つ転移性の高い細胞ラインである。LLC1 細胞クローン M27 3 x 105 個、マイコプラズマにつきスクリーニング済み）を、個々のネズミの尾静脈に第0日に注入した。当該ネズミを7群に分け、以下に概要を示した処置を施した。
【０３２２】
実施例VIに説明した植物抽出物AおよびBを、以下の植物抽出物と共に、本研究で使用した： 
【０３２３】
植物抽出物 C：MMP-9を阻害する、カナダツガ（Tsuga canadensis）の葉／茎。
【０３２４】
植物抽出物 C は、実施例VIにその概要を説明した方法に従って、ストレスを負荷していない植物から調製した。
【０３２５】
植物抽出物の経口投与を、LLC 細胞の注入第9日目）の9日前に開始し、最適以下の投与量のシスプラチンと併用して、14日間継続した下記参照）。 
【０３２６】
第一群：植物抽出物用に使用されるビヒクルであるヒドロキシプロピル-ベータ-シクロデキストリン（Hydroxypropyl-beta-cyclodextrin） 30%）を、実験の陰性対照として使用した。  
【０３２７】
第二群：ルイス肺癌モデルにおける標準陽性対照であるシスプラチン 5 mg/kg）を、腹腔内経路で、第1、4、7、10 および13日目に注入した。  
【０３２８】
第三群：このモデルにおける最適以下の投与量であるシスプラチン 2 mg/kg）を、腹腔内経路で、第1、4、7、10 および13日目に注入した。
【０３２９】
第四群：治療成分1TC1）を、この群に投与した。TC1は、植物抽出物A、植物抽出物B、およびシスプラチン2 mg/kg）から成っていた。植物抽出物Aおよび Bは第9日から第14日に栄養により投与しそれぞれの抽出物につき200 mg/kg）、シスプラチンは腹腔内経路で、第1、4、7、10 および13日目に注入した。 
【０３３０】
第五群：治療成分2TC2）を、この群に投与した。TC2は、植物抽出物A、植物抽出物C、およびシスプラチン2 mg/kg）から成っていた。植物抽出物Aおよび Cは第9日から第14日に栄養により投与しそれぞれの抽出物につき200 mg/kg）、シスプラチンは腹腔内経路で、第1、4、7、10 および13日目に注入した。
【０３３１】
第六群：治療成分3TC3）を、この群に投与した。TC3は、植物抽出物Bおよびシスプラチン2 mg/kg）から成っていた。植物抽出物Bは第9日から第14日に栄養により投与し200 mg/kg）、シスプラチンは腹腔内経路で、第1、4、7、10 および13日目に注入した。  
【０３３２】
第七群：治療成分4TC4）を、この群に投与した。TC４は、植物抽出物Cおよびシスプラチン2 mg/kg）から成っていた。植物抽出物Cは第9日から第14日に栄養により投与し200 mg/kg）、シスプラチンは腹腔内経路で、第1、4、7、10 および13日目に注入した。 
【０３３３】
実験の最後に第14日目)、動物を人道的に屠殺し、両肺を切除し、Bouin固定液に約24時間浸漬し固定した。それぞれのネズミの肺表面の転移コロニーを、3人の治験医師が盲検的に解剖顕微鏡を使って直接観察により計数した。
【０３３４】
以下の判断基準が満たされていたため、当該実験は有効であると考えられた：
1) 対照動物における肺腫瘍の数は、処置群と比べて充分であった。
2) 5 mg/kg シスプラチン群第二群）における肺腫瘍の数は、対照の第一群に比べて、統計学的に有意に低かった。 
3) シスプラチン2 mg/kg群第三群）における肺腫瘍の数は、5 mg/kg シスプラチン群第二群）に比べて、統計学的に有意に高かった。
【０３３５】
一匹のネズミを、状態悪化のため屠殺せざる得なかった第一群）。実験結果を表13に示す。 
【０３３６】
表13：腫瘍の計数三つの独立症例の計数から得た平均値）
2008516899.tif 000052
【０３３７】
上記の結果は以下の知見を示している：
1) シスプラチンは、このモデルにおいて、5 mg/kgの投与量で、肺腫瘍転移の数を減少させた96% 減少、p= < 0.001）。  
2) シスプラチンは、このモデルにおいて、2 mg/kgの投与量で、肺腫瘍転移の数をかろうじて減少させた27% 減少、p= 0.02）。 
3) 図9に示すように、シスプラチン 2 mg/kg 単独の場合に比較してp= 0.015）、TC1はこのモデルにおいて統計学的に有意に肺腫瘍転移の数を減少させた66%)。図9は、TC1により誘発された統計学的に有意なp<0.05)転移拡大の阻害を、シスプラチン 2 mg/kg) 単独およびビヒクル第一群)と比較して示している。 
4) TC2、TC3、およびTC4は、このモデルにおいて、肺腫瘍転移をそれぞれ50%、52% および 56%減少させた。
5) 植物抽出物AおよびBで処理された動物の体重は、図10に示すように、実験中を通して安定していた。対照的に、5 mg/kg の投与量のシスプラチンで処理された動物については、体重における激減が観察された過去の観察と一致している）。
【０３３８】
肺腫瘍転移の数は、TC3で処理した第六群の動物に比較してp=0.033)、TC1で処理した第四群の動物で有意に低かった。これは、このモデルにおける抽出物Aが抽出物Bとの間に相乗効果を生むということを示唆している。
実施例XII ：腫瘍成長に対する植物抽出物成分の効果
【０３３９】
この実施例の目的は、ネズミにおける腫瘍成長のB16F10 黒色腫モデルに関し、植物抽出物成分群単独の活性あるいは植物抽出物成分群を化学治療剤と組み合わせた場合の活性を評価することであった。実施例Xに示したように、これらの植物抽出物の個別あるいは組み合わせ投与は、C57BL/6 ネズミに対し7日間連続で投与した場合に、有毒性がないと報告されている。 
【０３４０】
この研究では、C57BL/6 ネズミのB16F10黒色腫モデルを使用した。B16F10細胞1 x 106個、マイコプラズマにつきスクリーニング済み）を、個々のネズミの右側面に第0日に皮下注入した。当該ネズミを9群に分け、以下に概要を示した処置を施した。植物抽出物AおよびB実施例VIを参照せよ）をこの研究で使用した。
【０３４１】
植物抽出物の経口投与を、B16F10 細胞の注入第7日目）の7日前に開始し、最適以下の投与量のドキソルビシンと併用してあるいは併用せずに、14日間継続した下記参照）。 
【０３４２】
第一群：植物抽出物の投与に使用されるビヒクルを、実験の陰性対照として使用した。  
【０３４３】
第二群：B16F10黒色腫モデルにおける標準陽性対照であるドキソルビシン2.5 mg/kg）を、腹腔内経路で、第5、９、および13日目に注入した。  
【０３４４】
第三群：このモデルにおける最適以下の投与量であるドキソルビシン 1 mg/kg）を、腹腔内経路で、第5、９、および13日目に注入した。
【０３４５】
第四群：治療植物抽出物APA1）を、第7日から第14日に栄養により投与した200 mg/kg）。 
【０３４６】
第五群：治療植物抽出物BPB1）を、第7日から第14日に栄養により投与した200 mg/kg）。 
【０３４７】
第六群：治療成分5TC5）を、この群に投与した。TC5は、植物抽出物Aおよびドキソルビシン1 mg/kg）から成っていた。植物抽出物Aは第７日から第14日に栄養により投与し200 mg/kg）、ドキソルビシンは、腹腔内経路で、第5、９、および13日目に注入した。 
【０３４８】
第七群：治療成分6TC6）を、この群に投与した。TC6は、植物抽出物Bおよびドキソルビシン1 mg/kg）から成っていた。植物抽出物Bは第７日から第14日に栄養により投与し200 mg/kg）、ドキソルビシンは、腹腔内経路で、第5、９、および13日目に注入した。  
【０３４９】
第八群：治療成分7TC7）を、この群に投与した。TC7は、植物抽出物A、植物抽出物Bおよびドキソルビシン1 mg/kg）から成っていた。植物抽出物AおよびBは第７日から第14日に栄養により投与しそれぞれの抽出物につき200 mg/kg）、ドキソルビシンは、腹腔内経路で、第5、９、および13日目に注入した。
【０３５０】
第九群：治療成分8TC8）を、この群に投与した。TC8は、植物抽出物Aおよび植物抽出物Bから成っていた。植物抽出物AおよびBは第７日から第14日に栄養により投与したそれぞれの抽出物につき200 mg/kg）。 
【０３５１】
皮下腫瘍を、それぞれの動物について、電気ノギスを用いて、第5日目に開始し第8日目、11日目、および14日目に繰り返して測定した。腫瘍の量を、以下の式に従って計算した： L  x  l2 x 0.53。実験の終わりに、使用動物を屠殺した。 
【０３５２】
表13：腫瘍量、百分率成長および腫瘍直径として示された第14日目の腫瘍データ
2008516899.tif 000053
*Doxo: ドキソルビシン
【０３５３】
上記の結果は以下の知見を示している：
1) TC7を用いた処置は、腫瘍直径および量を減じることにおいて、ドキソルビシンの最適以下の投与量1 mg/kg）および対照p< 0.05）と比較したドキソルビシンの治療的投与量2.5 mg/mL）として、効果的であった。図11を参照せよ。
2) PA1 と PB1との組み合わせは、この投与量のドキソルビシン1 mg/kg）を単独で投与した場合に比較して、ドキソルビシンの最適以下の投与量治療1 mg/kg）の効力を増した44% 腫瘍量減少、p< 0.05）。図12を参照せよ。
実施例XIII：植物抽出物の製剤化   
【０３５４】
以下に、本発明の例示的な治療製剤を示す。当該製剤は、二つの植物抽出物から成り、ゲルキャップの形態、粉末、あるいはプリ投与量袋の形態で、単独あるいは一つあるいはそれ以上の化学治療剤との組み合わせで投与してよい。以下に説明した製剤を、10g の単一投与量袋として調製する。この単一投与量袋は、投与前に水に溶解させる。この製剤は、経口投与用に意図されている。
【０３５５】
10g の単一投与量袋の製剤化：
少なくとも2gのレシチン
1 g から3g のショウガ（Zingiber officinale）抽出物†
1 gから3g ソリダゴ（Solidago sp.） 抽出物*
アグロメレーションを防ぐための二酸化ケイ素
甘味料 
【０３５６】
†ショウガ（Zingiber officinale）抽出物† は、水に溶解した50%エタノールを溶媒として用いて、乾燥根茎から調製した。
【０３５７】
* ソリダゴ（Solidago sp.） 抽出物は、Solidago sp. Ph. Eur.に由来するものであるから、ソリダゴ・カナデンシスL. （Solidago Canadensis L.）および／またはオオアワダチソウ（Solidago gigantea Ait）を含む。当該抽出物を、当該植物体の乾燥させた地上部から、水に溶解した60%エタノールを溶媒として用いて、調製した。 
実施例XIV ：ネズミモデルにおけるLLCの転移を防ぐことにおける投与量依存的な効果の実証 
【０３５８】
以下に、ネズミモデルにおけるLLCの転移を防ぐことにおける、当該植物抽出物単独あるいは化学治療剤と組み合わせた投与量依存的な効果を評価するための例示的方法を示す。実施例XI に説明した実験のプロトコルおよび表14にその概要を示した実験デザインを用いることができる。 
【０３５９】
表14：例示的実験デザイン 
2008516899.tif 000054
【０３６０】
この実験について陽性アウトカムを示すパラメータの例は以下である：
1. 阻害剤処置群と陰性対照の間において、転移の数に、統計学的に有意な差異p value < 0.05)。 
2. 阻害剤+ シスプラチン処置群とシスプラチン単独の間において、転移の数に、統計学的に有意な差異p value < 0.05)。 
3. 阻害剤の組み合わせといずれかの阻害剤単独の間において、転移の数に、統計学的に有意な差異p value < 0.05)。 
【０３６１】
上記に定義した三つのパラメータの陽性アウトカムにより、単一治療法としての効用、ファーストライン標準化学治療と組み合わせた場合の改善効果、および／または双方の阻害剤の相乗効果が証明されるであろう。
実施例XV：ネズミ異種移植片モデルにおける植物抽出物の効果の評価  
【０３６２】
以下に、ヒト癌細胞ラインを用いたネズミ異種移植片モデルにおいて、植物抽出物単独の活性、あるいは植物抽出物をある化学治療剤と組み合わせた場合の活性をテストするための例示的プロトコルを示す。 
【０３６３】
このモデルにおいては、注入およびそれに続く腫瘍評価が容易であるため、ヒト腫瘍細胞を免疫を弱めたネズミに多くの場合皮下注入により移している。腫瘍は、通常、成長率および使用した細胞ラインにより、成長するのに数日から数ヶ月を要する。これらの実験に使用可能なヒト腫瘍異種移植片モデルの例には、乳癌、結腸癌、前立腺癌、黒色腫および肺腫瘍が含まれる。 
【０３６４】
異種移植片モデルを使用した、提案実験デザインを表15に示す：
【０３６５】
表15：ネズミ異種移植片モデルにおいて使用できる例示的実験デザイン
2008516899.tif 000055
2008516899.tif 000056
* 投与期間は、選択した細胞ラインにより異なってよい。
# 陽性対照の投与量は、選択した薬剤により異なる。 
【０３６６】
この研究で使用する陽性対照化学治療剤は、選択した特定の癌細胞ラインに対し効果的であると報告されたものである必要がある。使用可能な癌細胞ラインと化学治療剤は、ヒト前立腺癌細胞PC-3) および シスプラチン、ヒト結腸直腸癌HT-29)およびビンクリスチンである。簡単に言えば、選択した細胞を皮下経路でメスのNU/NU-nuBR に注入し、その結果得られる腫瘍の長さL)および幅W)を、ノギスを用いてミリメートル単位で測定する。腫瘍の重量を、以下の式を用いて計算する：mg = L x W2)/2。
【０３６７】
当該治療成分のそれぞれの植物抽出物の力価を別個に確立したら、当該治療成分内のそれぞれの抽出物の最も効き目のある組み合わせ割合を決定することを目的として、MMP-9 および／またはカテプシンBを阻害する抽出物の組み合わせについての研究を行なうことができる。 
【０３６８】
陽性アウトカムを示すパラメータの例は以下である：
1) 治療成分処置群と陰性対照の間において、腫瘍の平均サイズに、統計学的に有意な差異p value < 0.05)。 
2) 治療成分処置群と陽性対照単独の間において、腫瘍の平均サイズに、統計学的に有意な差異p value < 0.05)。
3) ある治療成分と当該治療成分の個々の構成要素単独の間において、腫瘍の平均サイズに、統計学的に有意な差異p value < 0.05)。 
実施例XVI：ネズミ正所性異種移植片モデルにおける植物抽出物の効果の評価
【０３６９】
以下に、ヒト癌細胞ラインを用いたネズミ正所性異種移植片アッセイにおいて、植物抽出物単独の活性、あるいは植物抽出物をある化学治療剤と組み合わせた場合の活性をテストするための例示的プロトコルを示す。
【０３７０】
腫瘍を発現する緑色蛍光タンパク質GFP）を用いた近年開発されたテクニックおよび侵襲のない全身イメージングを使用することができるYang et al, Proc. Nat. Aca. Sci, Feb 2000, pp 1206-1211)。このモデルでは、オワンクラゲ（Aqueora vittoria） *33 緑色蛍光タンパク質を非常に高いレベルで安定して発現するヒトあるいはネズミの腫瘍を、正所的にヌードネズミに移植することができる。体外に設置したビデオ検知器の手段により、GFP 発現腫瘍を可視化することができ、それにより、腫瘍の成長、血管形成および転移の広がりを詳細にモニターすることができる。腫瘍群)内の血管密度をモニターすることにより、血管形成を経時的に測定することができる。
【０３７１】
概して、正所性異種移植片研究の研究デザインは、表15にその概要を示した皮下腫瘍成長のデザインと類似したものになろう。使用する癌の種には、例えば、ヌードネズミの結腸あるいは前立腺にそれぞれ注入した、ヒト結腸癌HT-29) あるいは前立腺癌PC-3) の細胞が含まれる。この研究で使用した陽性対照化学治療剤は、使用した特定の細胞ラインについて効果的であると報告されたものである必要がある。繰り返すが、当該成分内のそれぞれの植物抽出物および当該の治療法の組み合わせの力価を、別個に確立することができる。
【０３７２】
本明細書に参考として組み入れられている全ての特許、出版物出版された特許出願を含む）、およびデータベースは、そのような特許、出版物、およびデータベースが具体的に個別に参考として組み入れられていると記載されたと同程度に、そのまま参考として組み入れられているものである。
【０３７３】
本発明はこのように説明されているが、同じものが多様に改変されてよいということは明白である。そのような変化は本発明の精神および範囲からの逸脱とみなされるべきでなく、そのような改変の全てが、以下の請求項の範囲内に含まれると意図されていることは、当業者には明白である。
【図１】
2008516899.tif 000057
【図２】
2008516899.tif 000058
【図３】
2008516899.tif 000059
【図４】
2008516899.tif 000060
【図５】
2008516899.tif 000061
【図６】
2008516899.tif 000062
【図７−１】
2008516899.tif 000063
【図７−２】
2008516899.tif 000064
【図８】
2008516899.tif 000065
【図９】
2008516899.tif 000066
【図１０】
2008516899.tif 000067
【図１１】
2008516899.tif 000068
【図１２】
2008516899.tif 000069
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月20日(2007.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５２】
表１４：腫瘍量、百分率成長および腫瘍直径として示された第14日目の腫瘍データ
2008516899.tif 000070
*Doxo: ドキソルビシン
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５８】
以下に、ネズミモデルにおけるLLCの転移を防ぐことにおける、当該植物抽出物単独あるいは化学治療剤と組み合わせた投与量依存的な効果を評価するための例示的方法を示す。実施例XI に説明した実験のプロトコルおよび表１５にその概要を示した実験デザインを用いることができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５９】
表１５：例示的実験デザイン
2008516899.tif 000071
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６４】
異種移植片モデルを使用した、提案実験デザインを表１６に示す：
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６５】
表１６：ネズミ異種移植片モデルにおいて使用できる例示的実験デザイン
2008516899.tif 000072
2008516899.tif 000073
* 投与期間は、選択した細胞ラインにより異なってよい。
# 陽性対照の投与量は、選択した薬剤により異なる。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７１】
概して、正所性異種移植片研究の研究デザインは、表１６にその概要を示した皮下腫瘍成長のデザインと類似したものになろう。使用する癌の種には、例えば、ヌードネズミの結腸あるいは前立腺にそれぞれ注入した、ヒト結腸癌HT-29) あるいは前立腺癌PC-3) の細胞が含まれる。この研究で使用した陽性対照化学治療剤は、使用した特定の細胞ラインについて効果的であると報告されたものである必要がある。繰り返すが、当該成分内のそれぞれの植物抽出物および当該の治療法の組み合わせの力価を、別個に確立することができる。
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月6日(2007.9.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＭＰ−９およびカテプシンＢの活性を阻害するための成分であり、前記成分は、ＭＭＰ−９および／またはカテプシンＢの活性を阻害する能力を有する一つあるいはそれ以上の植物抽出物および生理的に許容可能な担体から成り、前記成分は一つあるいはそれ以上の新生細胞の移動、内皮細胞の移動、腫瘍の成長、腫瘍の転移、および腫瘍により誘発された血管形成を阻害し、前記一つあるいはそれ以上の植物抽出物それぞれが表6〜表9に記載された植物に由来することを特徴とする前記のＭＭＰ−９およびカテプシンＢの活性を阻害するための成分。
【請求項２】
前記成分が二つあるいはそれ以上の植物抽出物から成る、請求項１に記載の成分。
【請求項３】
前記植物抽出物の少なくとも一つがショウガ属（Zingiber genus）、ツガ属（Tsuga genus）、あるいはアキノキリンソウ属（Solidago genus）に属する一つの植物に由来する、請求項１あるいは２に記載された成分。
【請求項４】
前記植物抽出物の少なくとも一つがショウガ（Zingiber officinale）、ソリダゴ（Solidago sp.）、およびカナダツガ（Tsuga canadensis）から成る群から選択された一つの植物に由来する、請求項１、２、あるいは３のいずれかに記載された成分。
【請求項５】
前記ソリダゴ（Solidago sp.）がソリダゴ・カナデンシス（Solidago Canadensis）、オオアワダチソウ（Solidago gigantea）、アキノキリンソウ（Solidago virgaurea）、アキノキリンソウ属交雑種（Solidago hybrida）、あるいはそれらの組み合わせである、請求項４に記載の成分。
【請求項６】
前記植物抽出物がショウガ（Zingiber officinale）およびソリダゴ（Solidago sp.）に由来する、請求項１、２、３、４、あるいは５のいずれかに記載された成分。
【請求項７】
前記植物抽出物がショウガ（Zingiber officinale）、およびソリダゴ・カナデンシス（Solidago Canadensis）か、オオアワダチソウ（Solidago gigantea）か、あるいはソリダゴ・カナデンシス（Solidago Canadensis）とオオアワダチソウ（Solidago gigantea）の組み合わせに由来する、請求項１、２、３、４、あるいは５のいずれかに記載された成分。
【請求項８】
前記ソリダコ（Solidago sp.）がアキノキリンソウ（Solidago virgaurea）である、請求項６に記載された成分。
【請求項９】
前記植物抽出物がショウガ（Zingiber officinale）およびカナダツガ（Tsuga canadensis）に由来する、請求項１、２、３あるいは４のいずれかに記載された成分。
【請求項１０】
さらに、一つあるいはそれ以上の合成ＭＭＰ−９および／またはカテプシンＢ阻害剤から成る、請求項１、２、３、４、５、６、７、８あるいは９のいずれかに記載された成分。
【請求項１１】
前記合成ＭＭＰ−９および／またはカテプシンＢ阻害剤が、マリマスタット、プリノマスタット、タノマスタット、メタスタット、Ｅ−６４、ＣＡ−０７４メチル−エステル、ロイペプチン、1-phenyl-1,4-epoxy-1H,4H-naphtho（1,8-de）（1, 2）dioxepin (ANO-2) およびアイロマスタット、ならびにそれらの誘導体から成る群から選択された、請求項１０に記載の成分。
【請求項１２】
当該成分が経口投与用のニュートラシューティカル、栄養補助食品、あるいは自然療法製剤として製剤化された、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０あるいは１１のいずれかに記載された成分。
【請求項１３】
被験体における腫瘍の成長を阻害するための薬剤の製造における、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、あるいは１２のいずれかに記載された成分の使用法。
【請求項１４】
被験体における腫瘍転移を阻害するための薬剤の製造における、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、あるいは１２のいずれかに記載された成分の使用法。
【請求項１５】
被験体における腫瘍により誘発された血管形成を阻害するための薬剤の製造における、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、あるいは１２のいずれかに記載された成分の使用法。
【請求項１６】
被験体内の癌を治療または予防するための薬剤の製造における、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、あるいは１１のいずれかに記載された成分の使用法。
【請求項１７】
前記薬剤が一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤と組み合わせて使用されるためのものである、請求項１３、１４、１５、あるいは１６のいずれかに記載された使用法。
【請求項１８】
前記一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤が化学治療剤である、請求項１７に記載の使用法。
【請求項１９】
前記薬剤が前記化学治療剤の治療効果を増す、請求項１８に記載の使用法。
【請求項２０】
前記化学治療剤が最適以下の投与量で使用される、請求項１８あるいは１９に記載の使用法。
【請求項２１】
前記被験体が太り過ぎあるいは肥満した被験体である、請求項１９あるいは２０に記載の使用法。
【請求項２２】
被験体内の癌を治療あるいは予防するためのニュートラシューティカル、栄養補助食品、あるいは自然療法製剤の製造における、請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、あるいは１１のいずれかに記載された成分の使用法。
【請求項２３】
当該ニュートラシューティカル、栄養補助食品、あるいは自然療法製剤が経口投与用に製剤化された、請求項２２に記載の使用法。
【請求項２４】
前記ニュートラシューティカル、栄養補助食品、あるいは自然療法製剤が一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤と組み合わせて使用されるためのものである、請求項２２あるいは２３に記載の使用法。
【請求項２５】
前記一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤が化学治療剤である、請求項２４に記載の使用法。
【請求項２６】
前記ニュートラシューティカル、栄養補助食品、あるいは自然療法製剤が前記化学治療剤の治療効果を増す、請求項２５に記載の使用法。
【請求項２７】
前記化学治療剤が最適以下の投与量で使用される、請求項２５あるいは２６に記載の使用法。
【請求項２８】
前記被験体が太り過ぎあるいは肥満した被験体である、請求項２６あるいは２７に記載の使用法。
【請求項２９】
請求項１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、あるいは１２のいずれかに記載された成分と、少なくとも１個の容器と、さらに使用に関する任意の指示とから成るキット。
【請求項３０】
さらに、一つあるいはそれ以上の抗癌治療剤を備えた、請求項２９に記載されたキット。
【請求項３１】
一つあるいはそれ以上の植物抽出物と、生理的に許容可能な担体とからなる栄養補助食品であって、前記一つあるいはそれ以上の植物抽出物がショウガ（Zingiber officinale）、ソリダゴ（Solidago sp.）、カナダツガ（Tsuga canadensis）、あるいはそれらの組み合わせに由来する、栄養補助食品。
【請求項３２】
前記栄養補助食品が二つあるいはそれ以上の前記植物抽出物からなる、請求項３１に記載された栄養補助食品。
【請求項３３】
前記植物抽出物がショウガ（Zingiber officinale）およびソリダゴ（Solidago sp.）に由来する、請求項３１あるいは３２に記載された栄養補助食品。
【請求項３４】
前記ソリダゴ（Solidago sp.）がソリダゴ・カナデンシス（Solidago Canadensis）、オオアワダチソウ（Solidago gigantea）、アキノキリンソウ（Solidago virgaurea）、アキノキリンソウ属交雑種（Solidago hybrida）、あるいはそれらの組み合わせである、請求項３３に記載された栄養補助食品。
【請求項３５】
前記植物抽出物がショウガ（Zingiber officinale）およびアキノキリンソウ（Solidago virgaurea）に由来する、請求項３１、３２、あるいは３３のいずれかに記載された栄養補助食品。
【請求項３６】
前記二つの植物抽出物が約１：３〜約３：１の割合で存在する、請求項３３、３４、あるいは３５のいずれかに記載された栄養補助食品。
【請求項３７】
さらに、一つあるいはそれ以上のリン脂質類とからなる、請求項３１、３２、３３、３４、３５、あるいは３６のいずれかに記載された栄養補助食品。
【請求項３８】
前記リン脂質類がレシチンである、請求項３７に記載された栄養補助食品。
【請求項３９】
さらに、ＭＭＰ−９を阻害する能力を有する植物抽出物とからなる、請求項３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、あるいは３８のいずれかに記載された栄養補助食品。
【請求項４０】
ＭＭＰ−９を阻害する能力を有する前記植物抽出物がローブッシュブルーベリー(Vaccinium angustifolium)に由来する、請求項３９に記載された栄養補助食品。
【請求項４１】
前記栄養補助食品が液体中で再構成するための粉末あるいは顆粒として製剤化される、請求項３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、あるいは４０のいずれかに記載された栄養補助食品。
【請求項４２】
癌を治療または予防するための薬剤の製造における、請求項３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、あるいは４０のいずれかに記載された栄養補助食品の使用法。
【請求項４３】
前記癌が固形癌である、請求項４１に記載された使用法。
【請求項４４】
前記癌が前立腺癌あるいは結腸直腸癌である、請求項４１あるいは４２に記載された使用法。
【請求項４５】
請求項３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、あるいは４０のいずれかに記載された栄養補助食品と、使用に関する任意の指示とからなるキット。
【国際調査報告】
2008516899.tif 000074
2008516899.tif 000075
2008516899.tif 000076