(57)【要約】  本発明は、哺乳動物で抗原に対する免疫応答を誘導し、更に、抗原の除去するという両方を行うことのできる分子の発見に関する方法及び組成物を提供するものである。当該分子は、補体受容体1（CR1）には特異的に結合するが補体受容体2（CR2）には実質的に結合しない第一部分を、抗原を含む、又は抗原に結合する第二部分に連結して含む。このような分子の作製法や、それらの治療的及び／又は予防的使用も特徴とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、循環から抗原を除去するために有効な分子を投与するステップを含み、前記分子が、補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、抗原に結合する第二部分に連結して含み、前記抗原に対する免疫応答が前記哺乳動物で誘導される、方法。
【請求項２】
前記第一部分が抗体を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が抗ヒトCR1抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第一部分が7G9、H4、E11、H9、及びYZ-1から成る群より選択される抗CR1抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記第一又は第二部分の少なくとも一方が抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記第一又は第二部分の少なくとも一方が、Fab
フラグメント、 F(ab’)2 フラグメント、一本鎖抗体、及びscFv 分子から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記抗原が病原性物質又はそれを由来とするエピトープである、請求項８に記載の方法。
【請求項８】
前記病原性物質が、ウィルス、細菌、真菌、及び寄生生物又はこれらを由来とするエピトープから成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記病原性物質がホスト細胞上の受容性に結合し、そして前記第二部分が可溶型の受容体を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記病原性物質がウィルスであり、そして前記第二部分が、前記ウィルスに結合する可溶型の細胞受容体を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第二部分が低分子又は薬物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記病原性物質が真菌であり、そして前記第二部分がアンホテリシンＢを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
前記抗原が毒素又はそれを由来とするエピトープである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗原が腫瘍細胞、腫瘍細胞毒素、腫瘍細胞を由来とするエピトープ、及び腫瘍細胞毒素を由来とするエピトープ、から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記抗原が病原性たんぱく質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記エピトープがたんぱく質、ペプチド、糖質、脂質、リポ多糖、多糖、低分子、糖たんぱく質、及びペプチドグリカンから成る群より選択される、請求項６又は８に記載の方法。
【請求項１７】
前記第一及び第二部分が化学的架橋剤を介して連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記化学的架橋剤がポリエチレングリコール（PEG）をスペーサとして含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第一及び第二部分が共有結合により連結される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記第一及び第二部分が非共有結合により連結される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記第一及び第二部分が遺伝子融合により連結される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記分子がヘテロ重合体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子が二重特異的抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記分子が融合たんぱく質である、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記抗原が非感染性型の病原体、病原体のワクチン株、又はこれらを由来とするエピトープを含み、前記抗原を哺乳動物に投与するステップを更に含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
前記抗原を前記分子の前に投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記抗原を前記分子と一緒に投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原がコンストラクトの一部である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原を前記分子の後に投与する、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記分子の少なくとも第一又は第二部分がヒト抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
前記分子の少なくとも第一又は第二部分が免疫原性を減らすために改変される、請求項１に記載の方法。
【請求項３２】
前記分子の少なくとも第一又は第二部分がキメラ抗体又はその抗原結合部分、ヒト化抗体又はその抗原結合部分、及びデイミュナイズド抗体又はその抗原結合部分から成る群より選択される実体を含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫応答が前記抗原に対する防御的免疫応答である、請求項１に記載の方法。
【請求項３４】
疾患が哺乳動物において治療される、請求項１に記載の方法。
【請求項３５】
疾患が哺乳動物において防止される、請求項１に記載の方法。
【請求項３６】
感染が哺乳動物において治療される、請求項１に記載の方法。
【請求項３７】
前記感染が細菌感染である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記感染がウィルス感染である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記感染が真菌感染である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４０】
前記感染が寄生生物感染である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記感染が院内性である、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
感染が哺乳動物において防止される、請求項１に記載の方法。
【請求項４３】
前記哺乳動物に再発性感染のリスクがある、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記哺乳動物が再発性感染を有する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
前記分子を侵襲的医療法の前に投与する、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記医療法が外科術である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
対象において抗原に対する免疫応答を誘導する組成物であって、循環から抗原を除去するために有効な分子を投与するステップを含み、前記分子が、ヒト補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、抗原に結合する第二部分に連結して含み、前記抗原に対する免疫応答が前記対象で誘導される、組成物。
【請求項４８】
補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、スタフィロコッカス-アウレウスプロテインＡに結合する第二部分に連結して含み、循環から抗原を除去するために有効である、分子。
【請求項４９】
前記第一部分が抗体を含む、請求項４８に記載の分子。
【請求項５０】
前記抗体が抗ヒトCR1抗体である、請求項４９に記載の分子。
【請求項５１】
前記第二部分が抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項４８に記載の分子。
【請求項５２】
前記第二部分が、Fab フラグメント、 F(ab’)2 、一本鎖抗体、scFv 分子、及びFc分子のプロテインＡ結合部分から成る群より選択される抗体フラグメントを含む、請求項４８に記載の分子。
【請求項５３】
前記第二部分が抗プロテインＡ抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項４８に記載の分子。
【請求項５４】
前記第一及び第二部分が化学的架橋剤を介して連結される、請求項４８に記載の分子。
【請求項５５】
前記化学的架橋剤がポリエチレングリコール（PEG）をスペーサとして含む、請求項５４に記載の分子。
【請求項５６】
前記第一及び第二部分が共有結合により連結される、請求項５４に記載の分子。
【請求項５７】
前記第一及び第二部分が非共有結合により連結される、請求項５４に記載の分子。
【請求項５８】
前記第一及び第二部分が遺伝子融合により連結される、請求項４８に記載の分子。
【請求項５９】
前記分子がヘテロ重合体である、請求項４８に記載の分子。
【請求項６０】
前記分子が二重特異的抗体である、請求項４８に記載の分子。
【請求項６１】
前記分子が融合たんぱく質である、請求項４８に記載の分子。
【請求項６２】
請求項４８に記載の分子を対象に投与するステップを更に含む、対象において細菌感染を防止する方法。
【請求項６３】
前記対象に再発性感染のリスクがある、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記対象が再発性感染を有する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
前記分子を侵襲的医療法の前に投与する、請求項６２に記載の方法。
【請求項６６】
前記医療法が外科術である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
請求項４２に記載の分子を対象に投与するステップを含む、対象において細菌感染を治療する方法。
【請求項６８】
前記感染が院内性である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
循環からの抗原除去を誘導する方法であって、その循環中に抗原を有する哺乳動物に分子を投与するステップを含み、前記分子が、循環からの抗原除去が誘導されるように、CR1には特異的に結合するがCR2には実質的に結合しない第一部分と、抗原に結合する第二部分とを含む、方法。
【請求項７０】
前記第一部分が抗体を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗体が抗ヒトCR1抗体である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記第二部分が抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７３】
前記第一又は第二部分の少なくとも一方が、Fab
フラグメント、 F(ab’)2 フラグメント、一本鎖抗体、及びscFv 分子から成る群より選択される、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗原が病原性物質又はそれを由来とするエピトープである、請求項６９記載の方法。
【請求項７５】
前記病原性物質が、ウィルス、細菌、真菌、及び寄生生物又はこれらを由来とするエピトープから成る群より選択される、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記病原性物質がホスト細胞上の受容性に結合し、そして前記第二部分が可溶型の受容体を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７７】
前記病原性物質がウィルスであり、そして前記第二部分が、ウィルスに結合する可溶型の細胞受容体を含む、請求項７６に記載の方法。
【請求項７８】
前記病原性物質が真菌であり、そして前記第二部分がアンホテリシンＢを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記抗原が毒素又はそれを由来とするエピトープである、請求項６９に記載の方法。
【請求項８０】
前記抗原が、腫瘍細胞、腫瘍細胞毒素、腫瘍細胞を由来とするエピトープ、及び腫瘍細胞毒素を由来とするエピトープから成る群より選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項８１】
前記抗原が病原性たんぱく質である、請求項６９に記載の方法。
【請求項８２】
哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導するコンストラクトであって、補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、抗原に結合する第二部分に連結して含み、循環から前記抗原を除去するためには有効ではない、コンストラクト。
【請求項８３】
哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導するコンストラクトであって、補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、対する免疫応答が望まれる抗原を含む第二部分に連結して含む、コンストラクト。
【請求項８４】
前記第一部分が抗体を含む、請求項８３に記載のコンストラクト。
【請求項８５】
前記抗体が抗ヒトCR1抗体である、請求項８４に記載のコンストラクト。
【請求項８６】
前記抗体が7G9、H4、E11、H9、及びYZ-1から成る群より選択される、請求項８５に記載のコンストラクト。
【請求項８７】
前記抗原が病原体のワクチン株である、請求項８３に記載のコンストラクト。
【請求項８８】
前記第一部分がC3b又はC4bを含む、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項８９】
前記第二部分が抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項９０】
前記抗体又はその抗原結合部分が抗原に結合されている、請求項８９に記載のコンストラクト。
【請求項９１】
前記第一又は第二部分の少なくとも一方が、Fab
フラグメント、 F(ab’)2 フラグメント、一本鎖抗体、及びscFv 分子から成る群より選択される、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項９２】
前記抗原が病原性物質又はそれを由来とするエピトープである、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項９３】
前記病原性物質が、ウィルス、細菌、真菌、及び寄生生物又はこれらを由来とするエピトープから成る群より選択される、請求項９２に記載のコンストラクト。
【請求項９４】
前記病原性物質が細胞受容体を有し、そして前記第二部分が可溶型の細胞受容体を含む、請求項９３に記載のコンストラクト。
【請求項９５】
前記病原性物質がウィルスであり、そして前記第二部分が、ウィルスに結合する可溶型の細胞受容体を含む、請求項９３に記載のコンストラクト。
【請求項９６】
前記第二部分が低分子又は薬物である、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項９７】
前記病原性物質が真菌であり、そして前記第二部分がアンホテリシンＢを含む、請求項９７に記載のコンストラクト。
【請求項９８】
前記抗原が毒素又はそれを由来とするエピトープである、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項９９】
前記抗原が、腫瘍細胞、腫瘍細胞毒素、腫瘍細胞を由来とするエピトープ、及び腫瘍細胞毒素を由来とするエピトープから成る群より選択される、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項１００】
前記抗原が病原性たんぱく質である、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項１０１】
前記抗原が、抗イディオタイプ抗体を生じる抗体の一部分を含む、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項１０２】
前記エピトープがたんぱく質、ペプチド、糖質、脂質、リポ多糖、多糖、低分子、糖たんぱく質、及びペプチドグリカンから成る群より選択される、請求項９３に記載のコンストラクト。
【請求項１０３】
前記第一及び第二部分が化学的架橋剤を介して連結される、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項１０４】
前記化学的架橋剤がポリエチレングリコール（PEG）をスペーサとして含む、請求項１０３に記載のコンストラクト。
【請求項１０５】
前記第一及び第二部分が共有結合により連結される、請求項１０３に記載のコンストラクト。
【請求項１０６】
前記第一及び第二部分が非共有結合により連結される、請求項１０３に記載のコンストラクト。
【請求項１０７】
前記第一及び第二部分が遺伝子融合により連結される、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項１０８】
前記第一及び第二部分が受容体−リガンド相互作用により連結される、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項１０９】
前記コンストラクトの少なくとも第一又は第二部分がヒト抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項１１０】
前記コンストラクトの少なくとも第一又は第二部分がその免疫原性を減らすために改変される、請求項８２又は８３に記載のコンストラクト。
【請求項１１１】
前記コンストラクトの第一又は第二部分の少なくとも一方が、ヒト抗体又はその抗原結合部分、キメラ抗体又はその抗原結合部分、ヒト化抗体又はその抗原結合部分、及びデイミュナイズド抗体又はその抗原結合部分から成る群より選択される実体を含む、請求項１１０に記載のコンストラクト。
【請求項１１２】
哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、免疫応答が誘導されるように、補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、対する免疫応答が望まれる抗原を含む第二部分に連結して含むコンストラクトを投与するステップを含む、方法。
【請求項１１３】
前記第一部分が抗体を含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記抗体が抗ヒトCR1抗体である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
前記抗体が7G9、H4、E11、H9、及びYZ-1から成る群より選択される、請求項１１３に記載の方法。
【請求項１１６】
前記抗原が病原体のワクチン株である、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１７】
哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導する方法であって、前記抗原を循環から除去するためには有効でないと共に、補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、抗原に結合する第二部分に連結して含むコンストラクトを対象に投与するステップを含み、前記抗原に対する免疫応答が前記哺乳動物で誘導される、方法。
【請求項１１８】
前記抗原が非感染性型の病原体、病原体のワクチン株、又はこれらを由来とするエピトープを含み、前記抗原を哺乳動物に投与するステップを更に含む、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記抗原を前記コンストラクトの前に投与する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記抗原を前記コンストラクトと一緒に投与する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記抗原が前記コンストラクトの一部である、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記抗原を前記コンストラクトの後に投与する、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２３】
前記第一部分がC3b又はC4bを含む、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１２４】
前記第二部分が抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１２５】
前記抗体又はその抗原結合部分が前記抗原に結合される、請求項１２４に記載の方法。
【請求項１２６】
前記第一又は第二部分の少なくとも一方が、Fab
フラグメント、 F(ab’)2 フラグメント、一本鎖抗体、及びscFv 分子から成る群より選択される、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１２７】
前記抗原が病原性物質又はそれを由来とするエピトープである、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１２８】
前記病原性物質が、ウィルス、細菌、真菌、及び寄生生物又はこれらを由来とするエピトープから成る群より選択される、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記病原性物質が細胞受容体に結合し、そして前記第二部分が可溶型の細胞受容体を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３０】
前記病原性物質がウィルスであり、そして前記第二部分が、ウィルスに結合する可溶型の細胞受容体を含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３１】
前記第二部分が低分子又は薬物である、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１３２】
前記病原性物質が真菌であり、そして前記第二部分がアンホテリシンＢを含む、請求項１２７に記載の方法。
【請求項１３３】
前記抗原が毒素又はそれを由来とするエピトープである、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１３４】
前記抗原が、腫瘍細胞、腫瘍細胞毒素、腫瘍細胞を由来とするエピトープ、及び腫瘍細胞毒素を由来とするエピトープから成る群より選択される、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１３５】
前記抗原が病原性たんぱく質である、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１３６】
前記抗原が、抗イディオタイプ抗体を生じる抗体の一部分を含む、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１３７】
前記エピトープがたんぱく質、ペプチド、糖質、脂質、リポ多糖、多糖、低分子、糖たんぱく質、及びペプチドグリカンから成る群より選択される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３８】
前記第一及び第二部分が化学的架橋剤を介して連結される、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記化学的架橋剤がポリエチレングリコール（PEG）をスペーサとして含む、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４０】
前記第一及び第二部分が共有結合により連結される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４１】
前記第一及び第二部分が非共有結合により連結される、請求項１３８に記載の方法。
【請求項１４２】
前記第一及び第二部分が遺伝子融合により連結される、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１４３】
前記第一及び第二部分が受容体−リガンド相互作用により連結される、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１４４】
前記コンストラクトの少なくとも第一又は第二部分がヒト抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１４５】
前記コンストラクトの少なくとも第一又は第二部分がその免疫原性を減らすために改変される、請求項１１２又は１１７に記載の方法。
【請求項１４６】
前記コンストラクトの第一又は第二部分の少なくとも一方が、ヒト抗体又はその抗原結合部分、キメラ抗体又はその抗原結合部分、ヒト化抗体又はその抗原結合部分、及びデイミュナイズド抗体又はその抗原結合部分から成る群より選択される実体を含む、請求項１４５に記載の方法。
【請求項１４７】
哺乳動物の組織から抗原を除去する方法であって、前記組織から抗原を除去するために有効な分子を投与するステップを含み、前記分子が、補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、抗原に結合する第二部分に連結して含み、前記抗原が前記哺乳動物の組織から除去される、方法。
【請求項１４８】
前記組織が器官である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１４９】
前記器官が肝臓、肺及び脾臓から成る群より選択される、請求項１４８に記載の方法。
【請求項１５０】
前記第一部分が抗体を含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５１】
前記抗体が抗ヒトCR1抗体である、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記第一部分が7G9、H4、E11、H9、及びYZ-1から成る群より選択される抗CR1抗体である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５３】
前記第一又は第二部分の少なくとも一方が抗体又はその抗原結合部分を含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５４】
前記第一又は第二部分の少なくとも一方が、Fab
フラグメント、 F(ab’)2 フラグメント、一本鎖抗体、及びscFv 分子から成る群より選択される、請求項１５３に記載の方法。
【請求項１５５】
前記抗原が病原性物質又はそれを由来とするエピトープである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１５６】
前記病原性物質が、ウィルス、細菌、真菌、及び寄生生物又はこれらを由来とするエピトープから成る群より選択される、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５７】
前記病原性物質がホスト細胞上の受容体に結合し、そして前記第二部分が可溶型の受容体を含む、請求項１５５に記載の方法。
【請求項１５８】
前記病原性物質がウィルスであり、そして前記第二部分が、ウィルスに結合する可溶型の細胞受容体を含む、請求項１５７に記載の方法。
【請求項１５９】
前記第二部分が低分子又は薬物である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６０】
前記病原性物質が真菌であり、そして前記第二部分がアンホテリシンＢを含む、請求項１５６に記載の方法。
【請求項１６１】
前記抗原が毒素又はそれを由来とするエピトープである、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６２】
前記抗原が、腫瘍細胞、腫瘍細胞毒素、腫瘍細胞を由来とするエピトープ、及び腫瘍細胞毒素を由来とするエピトープから成る群より選択される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６３】
前記抗原が病原性たんぱく質である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６４】
前記エピトープがたんぱく質、ペプチド、糖質、脂質、リポ多糖、多糖、低分子、糖たんぱく質、及びペプチドグリカンから成る群より選択される、請求項１５４又は１５６に記載の方法。
【請求項１６５】
前記第一及び第二部分が化学的架橋剤を介して連結される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１６６】
前記化学的架橋剤がポリエチレングリコール（PEG）をスペーサとして含む、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６７】
前記第一及び第二部分が共有結合により連結される、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６８】
前記第一及び第二部分が非共有結合により連結される、請求項１６５に記載の方法。
【請求項１６９】
前記第一及び第二部分が遺伝子融合により連結される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１７０】
前記分子がヘテロ重合体である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１７１】
前記分子が二重特異的抗体である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１７２】
前記分子が融合たんぱく質である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１７３】
前記抗原が非感染性型の病原体、病原体のワクチン株、又はこれらを由来とするエピトープを含み、前記抗原を哺乳動物に投与するステップを更に含む、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１７４】
前記抗原を前記分子の前に投与する、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７５】
前記抗原を前記分子と一緒に投与する、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７６】
前記抗原が前記分子の一部である、請求項１７５に記載の方法。
【請求項１７７】
前記抗原を前記分子の後に投与する、請求項１７３に記載の方法。
【請求項１７８】
前記分子の少なくとも第一又は第二部分がヒト抗体である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１７９】
前記分子の少なくとも第一又は第二部分がその免疫原性を減らすために改変される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１８０】
前記分子の第一又は第二部分の少なくとも一方が、キメラ抗体又はその抗原結合部分、ヒト化抗体又はその抗原結合部分、及びデイミュナイズド抗体又はその抗原結合部分から成る群より選択される実体を含む、請求項１７９に記載の方法。
【請求項１８１】
前記免疫応答が前記抗原に対する防御的免疫応答である、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１８２】
疾患が哺乳動物において治療される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１８３】
疾患が哺乳動物において防止される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１８４】
感染が哺乳動物において治療される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１８５】
前記感染が細菌感染である、請求項１８４記載の方法。
【請求項１８６】
前記感染がウィルス感染である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８７】
前記感染が真菌感染である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８８】
前記感染が寄生生物感染である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１８９】
前記感染が院内性である、請求項１８４に記載の方法。
【請求項１９０】
感染が哺乳動物において防止される、請求項１４７に記載の方法。
【請求項１９１】
前記哺乳動物に再発性感染のリスクがある、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９２】
前記哺乳動物が再発性感染を有する、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９３】
前記分子を侵襲的医療法の前に投与する、請求項１９０に記載の方法。
【請求項１９４】
前記医療法が外科術である、請求項１９３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００４年１０月２９日出願の標題「たんぱく質に結合する二重特異的分子及びそれらの使用法」である米国一連番号 USSN 60/623,736号；２００５年３月２２日出願の標題「たんぱく質に結合する二重特異的分子及びそれらの使用法」である米国一連番号60/664,472号；２００５年９月２６日出願の標題「免疫応答のクリアランス及び誘導におけるCR1特異的分子の使用」である米国一連番号 60/720,789号；及び２００５年９月２６日出願の標題「CR1を特異的に認識するコンストラクト及び免疫応答を誘導するためのそれらの使用」である米国一連番号
USSN 60/720,956号に基づく優先権を主張するものである。更に本出願は、２００４年３月２９日出願の標題「抗体活性の変換のための方法及び組成物」である米国一連番号10/812,636にも関する。これらの出願の各々の内容全体を、引用をもってここに援用することとする。
【０００２】
発明の背景
霊長類の赤血球、即ち赤血球（RBC）は循環系からの抗原除去で重要な役割を果たしている。霊長類では、循環系で免疫複合体が形成されると補体因子C3bが活性化して、C3bがこの免疫複合体に結合する。その後、このC3b/免疫複合体が、赤血球表面上に発現した１型補体受容体（CR1）であるC3b受容体に、該免疫複合体に付着したC3b分子を介して結合する。次に、この免疫複合体が赤血球に付き添われて肝臓及び脾臓の細網内皮系(RES)に送られて中和される。このRES細胞は、特に肝臓内では、固定組織マクロファージであるクッパー細胞と呼ばれ、C3b／免疫複合体を認識して、C3b受容体とRBCとの接合部を切断することによりこの複合体をRBCから切り離すことで赤血球及びC3b／免疫複合体を解放する。すると、この複合体はクッパー細胞に飲み込まれ、クッパー細胞の細胞レベル下オルガネラ内で完全に破壊される。しかしながら、この病原体除去のプロセスは補体依存的であり、即ち、C3b受容体により認識される免疫複合体に限られており、C3b受容体によっては認識されない免疫複合体を除去する上では効果がない。
【０００３】
Taylor らは、循環系から病原体を除去する補体独立的な方法を発見した。Taylor らは、霊長類C3b受容体に特異的な第一モノクローナル抗体（mAb）を病原性抗原性分子に特異的な第二モノクローナル抗体に化学的に架橋すると、補体を活性化することなく、病原性抗原性分子を霊長類のC3b受容体に結合させる二重特異的ヘテロ重合抗体又は二重特異的ヘテロ重合体（HP）ができることを示した。（米国特許第5,487,890号；第5,470,570号；及び第5,879,679号）。Taylor はまた、循環中から病原性自己抗体を除去するために用いることのできるHPも報告した。このようなHPは、「抗原ベースのヘテロ重合体」（AHP）とも呼ばれ、病原性自己抗体に認識される、抗原に架橋されたCR1を認識する抗体を含有する（例えば米国特許第5,879,679号； Lindorfer et al., 2001, Immunol Rev.
183: 10-24; Lindorfer et al., 2001, J. Immunol Methods 248: 125-138;
Ferguson et al., 1995, Arthritis Rheum 38: 190-200を参照されたい）。HP及びAHPが免疫応答を誘導することは示されたことはない。
【０００４】
補体受容体２（CR2）は哺乳動物細胞表面受容体であり、その配列及び哺乳動物における進化上の起源は補体受容体１（CR1）に関係している。マウスでは、CR1およびCR2はCR2遺伝子の選択的スプライシング・バリアントから生ずるが、ヒトでは、CR1及びCR2はゲノム中で互いに75kb以内に位置する別々の遺伝子座にコードされていることから、この領域で起きた重複事象はマウス及びヒトの進化系統が分岐した後のいつかの時点で起きたことが示唆される。ヒトCR1及びCR2たんぱく質は、（確かにいくつかのドメイン、特にこれらの２つのたんぱく質の反復ドメインは70%を越える同一性を有するが）僅かに34%の配列同一性しか示さず、別個の細胞種上で発現し、また異なる補体結合特異性を示す。CR1はＢ及びいくつかのＴリンパ球、濾胞樹状細胞、好中球、単球、好酸球、マスト細胞、糸球体足細胞、及び赤血球上に存在するが、CR2はＢ細胞、濾胞樹状細胞、及びおそらくはであるが咽頭上皮細胞、存在する。CR1はC3bに高親和結合するが（更にC3b、C4b 及びC3にも結合するが、このとき内側のチオエステルは加水分解されている)、CR2はC3dg、C3d、iC3bに、そして程度は弱いがC3bに結合する。最近、抗原のCR2への標的決定が、このCR2-標的決定された抗原に対する免疫応答を惹起することが示されている。しかしながら、CR1に特異的に標的決定された抗原については、このような効果は何ら記述されたことはない。  
【０００５】
動物（例えば病原体を持つ哺乳動物）において、例えば毒素、感染性病原体又は日和見性生物、及び／又は、抗原性マーカを含む望ましくない細胞の感染を減らすような、及び／又は、毒性を減らすような、組成物及び方法を開発することは大きな課題である。循環中から所定の抗原を除去する、及び／又は、所定の抗原に対する免疫応答を誘導する、新しい組成物及び方法の発見により、ワクチン及び抗病原体、毒素及び癌治療を含め、優れた予防薬及び治療薬の開発が可能になるであろう。抗原を除去する、及び／又は、このような抗原に対する免疫応答を誘導する、方法があれば、対象において感染又は疾病を治療及び／又は防止する際により大きな効験が期待され、大きな利益がもたらされるであろう。
【０００６】
発明の概要
本発明は、対象から分子を除去するための、及び／又は、免疫応答の誘導のための、組成物及び方法を提供することにより、当業を進歩させるものである。
【０００７】
ある実施態様では、本方法は、対象の循環及び／又は組織から抗原を除去するために有効なコンストラクトを利用するものであり、前記コンストラクトは、CR1に結合する一部分を含む第一部分を、抗原に結合する第二部分に連結して含む。別の実施態様では、このようなコンストラクトは免疫応答を誘導する及び／又は亢進する際に有効である。
【０００８】
他の実施態様では、本発明は、対象の循環からの抗原除去に影響せずに、対象において免疫応答を誘導する及び／又は亢進することができる、哺乳動物CR1に特異的に結合することのできる組成物を特徴とする。
【０００９】
ある実施態様では、本発明のコンストラクトは、CR1には結合するがCR2には実質的に結合しない部分と、抗原又は抗原に結合する分子を含む部分とを含む。
【００１０】
ある局面では、本発明は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導する方法に関し、本方法は、循環から抗原を除去するのに有効な分子を投与するステップを含み、但し前記分子は、補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、抗原に結合する第二部分に連結して含む。ある実施態様では、前記第一部分は抗体を含む。関連する実施態様では、前記抗体は、抗ヒトCR1抗体であり、選択的には7G9、H4、E11、H9、及びYZ-1から成る群より選択される。別の実施態様では、前記第一又は第二部分の少なくとも一方は、抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施態様では、前記第一又は第二部分の少なくとも一方は、Fab フラグメント、F(ab’)2フラグメント、一本鎖抗体、及びscFv
分子から成る群より選択される。
【００１１】
更なる実施態様では、前記抗原は病原性物質又はそれを由来とするエピトープである。ある関連する実施態様では、前記病原性物質はウィルス、細菌、真菌、及び寄生生物又はそれらを由来とするエピトープから成る群より選択される。更なる実施態様では、前記病原性物質はホスト細胞上の受容体に結合するものであり、前記第二部分は可溶型の受容体を含む。別の実施態様では、前記病原性物質はウィルスであり、前記第二部分は、ウィルスに結合する、可溶型の細胞受容体を含む。いくつかの実施態様では、前記第二部分は低分子又は薬物である。ある具体的な実施態様では、前記病原性物質は真菌であり、前記第二部分はアンホテリシンＢを含む。別の実施態様では、前記抗原は毒素又はそれを由来とするエピトープである。いくつかの実施態様では、前記抗原は、腫瘍細胞、腫瘍細胞毒素、腫瘍細胞を由来とするエピトープ、及び腫瘍細胞毒素を由来とするエピトープから成る群より選択される。更なる実施態様では、前記抗原は病原性たんぱく質である。他の実施態様では、前記エピトープはたんぱく質、ペプチド、糖質、脂質、リポ多糖、多糖、低分子糖たんぱく質、及びペプチドグリカンから成る群より選択される。
【００１２】
ある実施態様では、前記第一及び第二部分は化学的架橋剤を介して連結される。いくつかの実施態様では、前記化学的架橋剤はポリエチレングリコール(PEG)をスペーサとして含む。別の実施態様では、前記第一及び第二部分は共有結合により連結される。更なる実施態様では、前記第一及び第二部分は非共有結合により連結される。ある具体的な実施態様では、前記第一及び第二部分は遺伝子融合を介して連結される。
【００１３】
いくつかの実施態様では、前記分子はヘテロ重合体である。別の実施態様では、前記分子は二重特異的抗体である。更なる実施態様では、前記分子は融合たんぱく質である。ある具体的な実施態様では、前記抗原は病原体の非感染性型、病原体のワクチン株、又はそれらを由来とするエピトープを含み、本方法は更に、前記抗原を哺乳動物に投与するステップを含む。ある関連する実施態様では、前記抗原を分子の前に投与する。別の関連する実施態様では、前記抗原を分子と一緒に投与する。更なる実施態様では、前記抗原を分子の後に投与する。いくつかの実施態様では、前記抗原は本コンストラクトの一部分である。
【００１４】
ある実施態様では、前記分子の少なくとも第一又は第二部分はヒト抗体である。いくつかの実施態様では、前記分子の少なくとも第一又は第二部分は免疫原性を減らすために改変される。ある具体的な実施態様では、前記分子の第一又は第二部分の少なくとも一方はキメラ抗体又はその抗原結合部分、ヒト化抗体又はその抗原結合部分、及びデイミュナイズド（原語：deimmunized）抗体又はその抗原結合部分から成る群より選択される実体を含む。
【００１５】
いくつかの実施態様では、免疫応答は抗原に対する防御的免疫応答である。ある実施態様では、哺乳動物において疾患が治療される。別の実施態様では、哺乳動物において疾患が防止される。更なる実施態様では、哺乳動物において感染が治療される。いくつかの実施態様では、前記感染は細菌感染である。他の実施態様では、前記感染はウィルス感染である。更なる実施態様では、前記感染は真菌感染である。ある実施態様では、前記感染は寄生生物感染である。別の実施態様では、前記感染は院内性である。いくつかの実施態様では、哺乳動物において前記感染が防止される。いくつかの実施態様では、前記哺乳動物を再発性感染のリスクがある。ある関連する実施態様では、前記哺乳動物は再発性感染を有する。更なる実施態様では、前記分子を侵襲的医療法の前に投与する。ある付加的な実施態様では、前記分子を侵襲的医療法の後に投与する。ある具体的な実施態様では、前記治医療法は外科術である。
【００１６】
別の局面では、本発明は、循環から抗原を除去するために有効な分子を投与するステップを含む、対象において抗原に対する免疫応答を誘導する組成物を特徴とするものであり、但しこの場合、本分子は、ヒト補体受容体1(CR1)に特異的に結合する第一部分を、抗原に結合する第二部分に連結して含むものである。関連する局面は、ヒト補体受容体1(CR1)に結合する第一部分を、スタフィロコッカス-アウレウスたんぱく質Ａに結合する第二部分に連結して含む分子を特徴とし、この場合、本分子は、循環から抗原を除去するために有効である。
【００１７】
ある実施態様では、前記第二部分は抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。いくつかの実施態様では、前記第二部分は、Fab、F(ab’)2、一本鎖抗体、scFv 分子、及びFc分子のプロテインＡ結合部分から成る群より選択される抗体フラグメントを含む。ある具体的な実施態様では、前記第二部分は抗プロテインＡ抗体又はその抗原結合部分を含む。
別の実施態様では、本発明の分子の対象への投与を、この対象における細菌感染を防止するために用いる。
【００１８】
更なる局面では、本発明は循環からの抗原除去を誘導する方法を特徴とし、その循環中に抗原を有する哺乳動物に、CR1に特異的に結合するがCR2には実質的に結合しない第一部分と、抗原に結合する第二部分とを含む分子を提供するステップを含む。
【００１９】
更なる局面では、本発明は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導するコンストラクトであって、補体受容体1(CR1)に特異的に結合する第一部分を、抗原に結合する第二部分に連結して含むコンストラクトに関し、但しこの場合の本コンストラクトは、循環から抗原を除去するためには有効でない。ある関連する局面では、本発明は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導するコンストラクトであって、補体受容体1(CR1)に特異的に結合する第一部分を、対する免疫応答を誘導したい抗原を含む第二部分に連結して含むコンストラクトに関する。
【００２０】
ある実施態様では、前記第一部分は抗体を含む。いくつかの実施態様では、前記抗体は抗ヒトCR1抗体である。具体的な実施態様では、前記抗体は7G9、H4、E11、H9、及びYZ-1から成る群より選択される。別の実施態様では、前記抗原は病原体のワクチン株である。更なる実施態様では、前記第一部分はC3b 又はC4bを含む。
【００２１】
いくつかの実施態様では、前記第二部分は抗体又はその抗原結合フラグメントを含む。ある関連する実施態様では、前記抗体又はその抗原結合フラグメントは、抗原に結合されている。具体的な実施態様では、前記第一又は第二部分の少なくとも一方はFabフラグメント、F(ab’)2 フラグメント、一本鎖抗体、及びscFv
分子から成る群より選択される。
【００２２】
別の実施態様では、前記抗原は病原性物質又はそれを由来とするエピトープである。いくつかの実施態様では、前記病原性物質はウィルス、細菌、真菌、及び寄生生物又はそれらを由来とするエピトープから成る群より選択される。ある関連する実施態様では、前記病原性物質は細胞受容体を有し、前記第二部分は前記細胞受容体の可溶性型を含む。更なる実施態様では、前記病原性物質はウィルスであり、前記第二部分はウィルスに結合する細胞受容体の可溶性型を含む。
【００２３】
ある実施態様では、前記第二部分は低分子又は薬物である。別の実施態様では、前記病原性物質は真菌であり、前記第二部分はアンホテリシンＢを含む。
【００２４】
更なる実施態様では、前記抗原は毒素又はそれを由来とするエピトープである。いくつかの実施態様では、前記抗原は腫瘍細胞、腫瘍細胞毒素、腫瘍細胞を由来とするエピトープ、及び腫瘍細胞毒素を由来とするエピトープから成る群より選択される。具体的な実施態様では、前記エピトープはたんぱく質、ペプチド、糖質、脂質、リポ多糖、多糖、低分子、糖たんぱく質、及びペプチドグリカンから成る群より選択される。別の実施態様では、前記抗原は病原性たんぱく質である。更なる実施態様では、前記抗原は、抗イディオタイプ抗体を生じる抗体部分である。
【００２５】
いくつかの実施態様では、前記第一及び第二部分は架橋剤により連結される。いくつかの実施態様では、前記架橋剤をポリエチレングリコール（PEG）をスペーサとして含む。 別の実施態様では、前記第一及び第二部分は共有結合により連結される。他の実施態様では、前記第一及び第二部分は非共有結合により連結される。更なる実施態様では、前記第一及び第二部分は遺伝子融合により連結される。更なる実施態様では、前記第一及び第二部分は受容体−リガンド相互作用を介して連結される。
【００２６】
いくつかの実施態様では、本コンストラクトの少なくとも前記第一又は第二部分はヒト抗体又はその抗原結合部分を含む。ある関連する実施態様では、本コンストラクトの少なくとも前記第一又は第二部分はその免疫原性を減らすために改変される。具体的な実施態様では、本コンストラクトの前記第一又は第二部分の少なくとも一方は、ヒト抗体又はその抗原結合部分、キメラ抗体又はその抗原結合部分、ヒト化抗体又はその抗原結合部分、及び、デイミュナイズド抗体又はその抗原結合部分から成る群より選択される実体を含む。
【００２７】
別の局面では、本発明は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導する方法に関し、本方法は、補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、対する免疫応答が望まれる抗原を含む第二部分に連結して含むコンストラクトを対象に投与するステップを含む。ある関連する局面では、本発明は、哺乳動物において抗原に対する免疫応答を誘導する方法を特徴とし、本方法は、循環から抗原を除去するためには有効でないコンストラクトであって、補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、前記抗原を含む第二部分に連結して含むコンストラクトを、対象に投与するステップを含み、この場合、前記抗原に対する免疫応答が哺乳動物において誘導される。
【００２８】
ある実施態様では、前記抗原は、病原体の非感染性型、病原体のワクチン株、又はこれらを由来とするエピトープを含み、本方法は更に、前記抗原を哺乳動物に投与するステップを含む。いくつかの実施態様では、前記抗原を本コンストラクトの前に投与する。他の実施態様では、前記抗原を本コンストラクトと一緒に投与する。具体的な実施態様では、前記抗原は本コンストラクトの一部である。別の実施態様では、前記抗原を本コンストラクトの後で投与する。
【００２９】
ある更なる局面では、本発明は、組織から抗原を除去するために有効な分子の投与を通じ、哺乳動物の組織から抗原を除去する方法に関し、この場合前記分子は、補体受容体1（CR1）に特異的に結合する第一部分を、抗原に結合する第二部分に連結して含み、前記抗原は前記哺乳動物の組織から除去される。いくつかの実施態様では、当該組織は一器官である。ある実施態様では、前記器官は肺、肝臓又は脾臓である。
【００３０】
発明の詳細な説明
本発明は、（例えばCR1には特異的に結合するがCR2には実質的に結合しない部分など）哺乳動物CR1に結合する部分と、抗原又は抗原に結合する部分とを含む組成物が、対象からの抗原除去を媒介する、及び／又は、対象における免疫応答を誘導又は亢進する、という発見に少なくとも部分的に基づくものである。本発明は、例えばコンストラクト、本発明のコンストラクトの作成法や、本発明のコンストラクトの治療的及び／又は予防的使用法を特徴とする。ある具体的な実施態様では、本発明は、細網内皮細胞除去を媒介する細胞表面受容体に結合する抗原結合部分を含む第一部分を、プロテインＡなど、スタフィロコッカス表面抗原に結合する抗原結合部分を含む第二部分に連結して含む分子を提供する。ある実施態様では、本発明のコンストラクトは、対象の循環からの抗原除去を媒介する。別の実施態様では、本発明のコンストラクトは、対象の組織からの抗原除去を媒介する。ある実施態様では、このようなコンストラクトは対象における免疫応答を誘導するものである。更なる実施態様は、哺乳動物CR1に結合すると共に、抗原除去に影響せずに抗原に対する免疫応答を誘導及び／又は亢進する組成物と、その使用法とを特徴とする。
【００３１】
１．  定義
ここで用いられる用語「免疫応答」はＴ細胞媒介性及び／又はＢ細胞媒介性免疫応答を含む。免疫応答の例には、サイトカイン産生及び細胞障害性などのＴ細胞応答がある。加えて、免疫応答という用語には、抗体産生（体液性応答）及びマクロファージなどのサイトカイン応答性細胞の活性化がある。
【００３２】
ここで用いられる場合の用語「抗体」とは免疫グロブリン分子を言う。用語「抗体」には、完全抗体分子や、その抗原結合部分が含まれる。免疫グロブリン分子はカッパ、ラムダ、アルファ、ガンマ、デルタ、イプシロン及びmu定常領域や、無数の免疫グロブリン可変領域を含む遺伝子にコードされている。軽鎖はカッパ又はラムダのいずれかに分類される。軽鎖は、可変軽鎖（VL）及び定常軽鎖（CL）ドメインを含む。重鎖は、ガンマ、mu、アルファ、デルタ、又はイプシロンに分類され、これらがひいてはそれぞれ免疫グロブリン・クラス
IgG、IgM、IgA、IgD 及びIgEを定義する。重鎖は可変重鎖（VH）、定常重鎖1（CH1）、ヒンジ、定常重鎖2（CH2）、及び定常重鎖3（CH3）ドメインを含む。IgG重鎖は更にそれらの配列のバリエーションに基づいて下位分類され、そのサブクラスはIgG1、IgG2、IgG3 及びIgG4と指定されている。 「抗体」という用語には、例えば天然型抗体又は免疫グロブリン分子、あるいは天然型抗体分子に似た改変された（例えば遺伝子操作された）抗体分子を包含する。ここで用いられる場合の用語「抗体」には、更に、改変型の抗体分子、例えばscfv分子、ミニボディ等も含まれる。本発明の抗体はこれらのクラス及び／又はアイソタイプのいずれのものに属するものであってもよい。本発明のある実施態様では、
本発明の抗体は非中和性である。別の実施態様では、本発明の抗体は中和性である。
【００３３】
ここで用いられる場合の抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合フラグメント」と言う用語は、抗体のうちで抗原（例えばCR1）への特異的結合能を保持した一つ以上のフラグメントを言う。一個の抗体の抗原結合機能は、完全長抗体のうちの数フラグメントに行わせることができることが示されている。ある抗体の用語「抗原結合部分」に包含される結合フラグメントの例には、(i) VL、VH、CL 及び CH1 ドメインから成る一価のフラグメントであるFabフラグメント；(ii) 二つのFabフラグメントをジスルフィド架橋によりヒンジ領域で連結して含む二価のフラグメントであるF(ab’)2 フラグメント；(iii) VH 及び CH1 ドメインから成るFdフラグメント；(iv) 抗体の一本の腕のVL 及びVH ドメインから成るFvフラグメント、 (v) VHドメインから成るdAb フラグメント（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）；及び (vi) 単離された相補性決定領域（CDR）がある。更に、Fv フラグメント、VL 及び VH という二つのドメインは別々の遺伝子にコードされているが、このVL及びVH領域が対になって一価の分子を形成しているような一本のたんぱく質鎖（一本鎖 Fv (scFv)として知られる；例えば Bird et al.
(1988) Science 242:423-426; 及び Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）に作製できるようにする合成リンカにより、組換え法を用いてこれらを接合することができる。このような分子は、抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される。これらの抗体フラグメントを、当業者に公知の従来技術を用いて得、これらのフラグメントを、インタクト抗体と同じ態様で、結合についてスクリーニングする。
【００３４】
「キメラ」たんぱく質は、第一アミノ酸配列を、それが自然界で天然では連結していない第二アミノ酸配列に連結して含むものである。これらのアミノ酸配列は、通常では別々のたんぱく質中に存在するが融合ポリペプチドとして一緒になったものか、あるいは通常でも同じたんぱく質内に存在するが当該融合ポリペプチドでは新たな構成で配置されたものかも知れない。キメラたんぱく質は、例えば化学合成によって、あるいはペプチド領域が所望の関係でコードされているポリヌクレオチドを創出して翻訳することにより、創出されよう。
【００３５】
ここで用いられる場合の用語「キメラ抗体」とは、例えばマウスmAbを由来とする可変領域とヒト免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる部分が異なる動物種を由来とするような分子を言う（例えば各々の全文を引用をもってここに援用することとする Cabilly らの米国特許第4,816,567号；及び Boss らの米国特許第4,816,397号を参照されたい）。
【００３６】
用語「ヒト化抗体」は、ここで用いられる場合、非ヒト種を由来とする一箇所以上の相補性決定領域(CDR)と、ヒト免疫グロブリン分子を由来とするフレームワーク領域とを有する非ヒト種由来の抗体分子を言う（例えばその全文を引用をもってここに援用することとする米国特許第5,585,089号を参照されたい）。このようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、例えばＰＣＴ公報 WO 87/02671；ヨーロッパ特許出願第184,187号；ヨーロッパ特許出願第171,496号； ヨーロッパ特許出願第173,494号；PCT 公報 WO 86/01533；米国特許第4,816,567号及び第5,225,539号；ヨーロッパ特許出願第125,023号；Better et al.,
1988, Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al.,
1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985,
Nature 314:446-449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559;
Morrison 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4:214;
Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science
239:1534; 及びBeidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060に解説された方法を用いるなど、当業で公知の組換えＤＮＡ技術により、作製することができる。
【００３７】
ヒトCR1受容体には結合するがCR2には結合しないデイミュナイズド抗体も本発明で用いることができる。ここで用いられる用語「デイミュナイズド抗体」とは、非ヒト起源のものであるが、改変、即ち一箇所以上のアミノ酸置換を持ち、その結果、開始材料の非ヒト抗体に比べてヒトに対して非免疫原性であるか、又は免疫原性が低くなったような抗体を言う。好適な実施態様では、前記デイミュナイズド抗CR1抗体は、当該デイミュナイズド抗体が、各未改変の非ヒト配列に比較したときにヒトに対して非免疫原性であるか、又は免疫原性が低くなるように一箇所以上のアミノ酸置換を含める改変をなされた一つ以上の非ヒトVH又はVL配列を含む（すべての全文を引用をもってここに編入することとする WO 00/34317、WO 98/52976、及びWO2005/002529を参照されたい）。
【００３８】
ここで用いられる用語「架橋」とは、２つのたんぱく質の、一般的には非ペプチド結合を介した共有結合による連結を言う。架橋剤はたんぱく質又は改変たんぱく質上の部位と共有結合により反応して架橋を起こすことができる。ここで用いられる場合の用語「架橋剤」又は「架橋剤」とは、二つの分子を共有結合により互いに結合させることのできる化合物を言う。反応後、架橋剤又は架橋剤の一部は一般に、結合した分子同士の間の結合部の一部を成す。
【００３９】
抗体の抗原への結合に関し、ある特定のポリペプチド、又は、ある特定の標的上のエピトープに対する用語「特異的結合」又は「特異的に結合する」又は「特異的である」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なる結合を意味する。好ましくは、非特異的相互作用におけるいずれの結合も、バックグラウンドとは実質的に異ならないとよい。ある実施態様では、用語「特異的結合」とは、特異的でない相手の分子とは実質的に結合することなく（例えば基本的にバックグラウンドの結合を示しつつ）、特異的である特定のポリペプチド又はその分子上のエピトープに結合することを言う。特異的結合は、例えばコントロール分子の結合に比較したときのある分子の結合を判定するなどにより、測定することができる。ある特定のポリペプチド又はある特定のポリペプチド標的上のエピトープに対して「特異的結合」を示す、又は、「特異的に結合する」、又は、「特異的である」、抗体は、その標的に対し、少なくとも約10-4 M、代替的には少なくとも約10-5
M、代替的には少なくとも約 10-6
M、代替的には少なくとも約 10-7
M、代替的には少なくとも約 10-8
M、代替的には少なくとも約 10-9
M、代替的には少なくとも約 10-10
M、代替的には少なくとも約 10-11
M、代替的には少なくとも約 10-12
M、又はそれより大きいKdを有するであろう。
【００４０】
例えば「補体受容体1（CR1）に特異的に結合する」という文言は、CR1には結合するが非CR1分子には実質的に結合しない（例えばCR2には実質的に結合しない）部分（例えば抗体、C3b、C4b等）を言う。従って、このような部分は充分な親和性でCR1に結合するため、当該抗体分子は、CR1には結合するがCR2とは大きく交差反応しない予防薬及び／又は治療薬として有用である。このような実施態様では、抗体のCR1への結合の程度は、例えば蛍光活性化セルソーティング（FACS）分析又は放射性免疫沈降法(RIA)で判定したときにバックグラウンド・シグナル又はノイズの少なくとも約 5 又は少なくとも約 100倍である。同じ実施態様では、CR1特異的部分のCR2へのいずれの結合も、実質上、このような結合検定のバックグラウンド結合の制限内である。
【００４１】
ここで用いられる場合の用語「循環から抗原を除去する」とは、CR1に結合する組成物／複合体（例えば抗CR1抗体を、病原体に結合する抗体に連結して含む二重特異的へテロ重合体など）が対象の循環から除去されるプロセスを言う。理論に縛られたいわけではないが、このような組成物の除去は、少なくとも部分的には、赤血球の補体受容体へのこのような組成物の結合、ひいては肝臓及び脾臓内の細網内皮系（RES）への当該組成物の送達、を介して媒介されることで、当該組成物中の抗体が結合した当該組成物及び抗原が循環から除去されるのだと考えられる。このRES細胞は、特に肝臓内では、固定組織マクロファージであるクッパー細胞と呼ばれ、おそらくはこのような組成物／複合体をRBCから破壊し、赤血球及び組成物／複合体を解放する。すると、この組成物／複合体はクッパー細胞に飲み込まれ、クッパー細胞の細胞レベル下オルガネラ内で完全に破壊される。「循環から抗原を除去するために有効な」コンストラクトとは、例えば上記の機序などにより、循環から抗原を除去又は取り除く結果になるものである。ある実施態様では、このようなコンストラクトは、除去を誘導するために充分に、細胞上のFcγ受容体に結合する。このようなコンストラクトは、例えば一個の抗体の少なくとも一つの（例えば一つ又は２つの）インタクトFc領域などであってもよい。
【００４２】
対照的に、「循環から抗原を除去するために有効ではない」コンストラクトとは、例えば上記の機序などにより、循環から抗原を除去又は取り除く結果にならないものである。ある実施態様では、このようなコンストラクトは、除去を誘導するほど充分には、細胞上のFcγ受容体に結合しない。このようなコンストラクトは、例えば、Fcγ受容体の結合を減らす又は無くすために当業で公知の技術を用いて改変してある一つ以上の抗体であっても、あるいは、抗体のFc領域を欠く、抗体の一つ以上の抗原結合部分を含むものであってもよい。
【００４３】
ここで用いられる用語「対象」にはヒト又は非ヒト哺乳動物が含まれる。
【００４４】
ここで用いられる用語「抗原提示細胞（APC）」とは、抗原性決定基が細胞表面上にMHC関連複合体として免疫系（例えばMHCクラスＩ限定細胞障害性Ｔリンパ球及び／又はMHCクラスII限定ヘルパＴリンパ球）により認識可能な態様で提示されるように、抗原を内部移行及びプロセッシングすることのできるクラスの免疫細胞を言う。細胞がAPCとして機能できるために必要な２つの特性は、飲食された抗原のプロセッシング能と、ＭＨＣ遺伝子産物の発現である。APCの例には、樹状細胞（DC）、単核性貪食細胞（例えばマクロファージ）、Ｂリンパ球、皮膚のランゲルハンス細胞、及びヒトでの内皮細胞がある。
【００４５】
用語「抗原」又は「免疫原」はここでは交換可能に用いられており、抗体により特異的に認識され、対する抗体を産生させることのできる物体又は物質を言う。抗原は分子全体でも、又は、対する免疫応答が望まれるエピトープなどの分子の一部分であってもよい。好ましくは、ここで用いられる用語「抗原」に、治療しようとする対象で広範囲には発現していない分子又はそれを由来とするエピトープ、例えば非自己抗原、又は、病原性物質（例えばウィルス、細菌、真菌、寄生生物）由来、病原性たんぱく質（例えば病原性アミロイド又はプリオンたんぱく質）由来であるエピトープ、あるいは、腫瘍特異的（例えば腫瘍細胞、腫瘍細胞毒素又はエピトープ）であるエピトープ、がある。
【００４６】
用語「エピトープ」は、抗体に特異的に結合することのできる抗原性決定基が含まれる。エピトープは通常、アミノ酸又は糖側鎖などの化学的に活性な表面分子群から成り、通常は特異的な三次元構造上の特徴や、特異的な荷電上の特徴を有する。コンホメーション的エピトープ及び非コンホメーション的なエピトープは、前者への結合が、変性溶媒の存在時に失われるが、後者の場合では失われないことで区別される。エピトープは例えば自然界のたんぱく質、ペプチド、糖質、脂質、リポ多糖、多糖、低分子、糖たんぱく質、又はペプチドグリカンであってよい。
【００４７】
ここで用いられる場合の用語「病原体のワクチン株」とは、ワクチンで用いるのに適した病原体の株を言う。ワクチン株は病原体の疾患発症性株よりも重篤な結果を起こすリスクは低いが、それでも尚、その病原体株に対する免疫応答を生じさせることができる。「ワクチン株」には、限定するわけではないが、非病原性の株、死滅させた株（例えば加熱で死滅させた、化学的に死滅させた、放射線又は他の方法で死滅させたなど）、弱毒化株、又は、遺伝子改変してその感染性及び／又は菌力を減らしてある株、を含めることができる。
【００４８】
ここで用いられる用語「C3b」及び「C4b」は当業で公知の意味を有する。これらの補体たんぱく質はCR1に特異的に結合するが、CR2には実質的に結合しない。
【００４９】
ここで用いられる場合の用語「C3b様受容体」とは、C3bに結合するという点で、霊長類CR1と類似の機能を有する、哺乳動物の血球表面上に発現する哺乳動物分子を言う。
【００５０】
ここで用いられる場合の用語「病原体」又は「病原性物質」は、正常なホスト（例えば（例えば哺乳動物、好ましくはヒトなどの霊長類）動物）に感染又は寄生することのできる微生物を包含する。ここで用いられる場合のこの用語には、更に、対象でのその複製が望ましくない微生物、又は、微生物が生ずる毒性分子（例えば毒素）も含まれる。ここで用いられる日和見性物質には、例えば治療計画の結果正常な生理的菌叢が乗っ取られたホストや、又は免疫無防備状態となったホストなど、異常なホストに感染又は寄生することのできる微生物なども含まれる。
【００５１】
用語「低分子」は、ここで用いられる場合、約1kD未満、そして最も好ましくは約0.4kD未満の分子量を有する分子を言う。低分子の例には、限定はしないが、ヌクレオチド、アミノ酸、ペプチド、ペプチドミメティック、糖質、脂質又は他の有機（炭素を含有する）分子がある。有機低分子は典型的には複数の炭素対炭素の結合を有する。
【００５２】
用語「毒素」は、ここで用いられる場合、真核細胞、微生物細胞が産生する物質、又は、ホスト細胞、病原体、又は両者に対して細胞障害が可能であるように合成により作製された物質を言う。用語「毒素」には、Ｂ．アンスラシス由来の炭素菌毒素、タチナタマメ由来のリシン、ジフテリア毒素、及び他の天然の（例えば病原体由来）及び人工の毒素などを含め、細胞毒性を及ぼすことのできる物質が包含される。腫瘍細胞毒素も毒素の例である。
【００５３】
用語「病原性たんぱく質」とは、ここで用いられる場合、例えば特定の癌、細菌又はウィルス感染などの疾患状態又は条件に関連する一種以上の内因性又は外因性たんぱく質を言う。一般に、このようなたんぱく質は真核細胞に対して直接的又は間接的な病原性効果を有する。病原性たんぱく質の例には、病原性型のアミロイドたんぱく質又はプリオンたんぱく質がある。この用語は更に、このようなたんぱく質の病原性フラグメントも包含する。
【００５４】
ここで用いられる用語「遺伝子融合」とは、二つ以上のたんぱく質又はそれらのフラグメントを、これらのたんぱく質をコードするポリヌクレオチド分子の遺伝子発現を通じ、それらの個々のペプチド骨格を介して共直線上に共有結合により連結することを言う
【００５５】
用語「受容体」又は「細胞受容体」には、相補的な塩基対の対合が関与しない親和性ベースの相互作用によりリガンドに特異的に結合することのできる分子が含まれる。リガンド及びその対応する受容体をここでは特異的結合ペアのメンバーと言う（従って、ここで交換可能に用いられる用語「リガンド−受容体の相互作用」又は「受容体−リガンドの相互作用」とは、受容体及びリガンド部分のいずれかの特異的結合を言う）。「細胞受容体」には、細胞表面上に発現する受容体が含まれる。用語「リガンド」には、親和性ベースの誘引により、受容体に特異的に結合することのできる分子が含まれる。
【００５６】
用語「薬物」は、ここで用いられる場合、診断、治療、医療又は獣医目的のために生物に投与される分子、分子群、錯体、又は物質を包含する。
【００５７】
用語「スペーサ分子」又は「スペーサ」とは、２つの分子を接合すると共に、好ましくはこれら２つの分子間の距離を変える又は調節するように選択された又はデザインされた一つ以上の分子、群又は化合物を言う。
【００５８】
ＩＩ．  本発明のコンストラクト
ある実施態様では、本発明のコンストラクトは、CR1に特異的に結合する第一部分と、抗原を含むか、又は抗原に結合する、第二部分とを含む。
【００５９】
ある実施態様では、前記第一部分はCR1には結合するがCR2には実質的に結合しない。
【００６０】
本発明のコンストラクトはここで解説された部分のいずれの組合せを用いても、作製することができる。例えば、コンストラクトの例は、 (a) 抗CR1モノクローナル抗体（例えば抗CR1特異的モノクローナル抗体）又は (b) 抗CR1抗原結合フラグメントから成る群より選択されるCR1結合部分を、 (a) 抗抗原モノクローナル抗体；(b) 抗抗原scFv 分子； (c) 抗病原体抗体の抗原結合フラグメント；(d) 病原体のワクチン株、 (e) 抗原又はそのエピトープ (f) 毒素； (g) 抗原性及び／又は抗原結合低分子又は薬物；又は (h) 抗原に結合する受容体、リガンド又は他のたんぱく質、から成る群より選択される第二部分に連結して含んでいてもよい。好適なコンストラクトには、例えば：FcγR又はその抗原結合部分には結合しない抗病原体モノクローナル抗体を抗CR1特異的 scFv 分子に結合させたもの；抗病原体scFv 分子を抗CR1 特異的 scFv分子に結合させたもの；病原体のワクチン株を抗CR1特異的抗体又はその抗原結合部分に結合させたもの；病原体のワクチン株を、FcγR又はその抗原結合部分に結合しない抗特異的CR1 抗体に結合させたもの；病原体のエピトープを、FcγR又はその抗原結合部分に結合しない抗CR1 特異的抗体に結合させたもの；病原体のワクチン株を抗CR1 特異的scFv 分子に結合させたもの、がある。
【００６１】
本発明のコンストラクトで使用するこれら及び他の部分の例を以下で更に詳述する。
【００６２】
Ａ．  CR1に結合する部分
好ましくは、CR1に結合する部分は特異的に結合するとよく、CR2などには実質的に結合しないとよい。
【００６３】
１．  CR1リガンド：  C3b及びC4b
C3b 及びC4b は糖たんぱく質であり、遺伝子的及び/又は有機的な合成手段により精製又は単離できよう。天然C3b及びC4b はそれぞれC3 及びC4から合成される。たんぱく質C3及びC4は、それらのコンホメーション状態だけでなくそれらのリガンド結合特性も制御しつつ、病原体表面上の標的求核試薬へのそれらの共有結合による付着をも、たんぱく質分解活性化依存的態様で媒介する分子内チオエステル結合を含有する。他方、成熟血漿C3はジスルフィド連結型ヘテロ二量体であり、119-kDa の鎖と75-kDaのβ鎖とから成り、血漿C4 はジスルフィド連結型へテロ三量体であり、93-kDaの鎖、75-kDa のβ鎖、及び33-kDaの鎖から成る。両方の場合で、各鎖、即ちそれぞれC3a及びC4aのNH2末端から７７残基の活性化ペプチドがたんぱく質分解により取り除かれると、このチオエステルが露出し、活性化する。チオエステルのアシル基転移後、又は競合する加水分解反応後、その結果のC3b 及びC4b 分子は、それぞれのもとの分子には存在しなかったCR1特異性を含むリガンド結合特性を獲得する。
【００６４】
C3b 及び C4b はそれぞれCR1に特異的に結合する。従ってある実施態様では、C3b 又はC4b、あるいはそのCR1結合部分を本発明のコンストラクトに含めて、CR1への特異的結合をもたらすことができる。C3 及びC4 は同様な全体的構造を有するが、成熟型の C4 (例えば C4b) はプロセッシングされて３本の鎖になり、他方C3bは２本の鎖を含む。CR1受容体のC4b 及びC3b 分子への結合には、CR1受容体内の反復配列が関与している。
【００６５】
ある実施態様では、CR1結合分子の一部分を本発明のコンストラクト内に含めてもよい。 CR1はC3b のうちで、アルファ鎖のNH2末端内に内包された領域に結合する。C3cのNH2末端アルファ鎖フラグメント（X42、NH2末端から４２残基長）由来のペプチドがCR1のC3bへの結合を阻害することが示された。ある実施態様では、本発明のコンストラクトはこのようなペプチドのNH2末端の一部分から成るものであろう。Becherer.  1988.  J. Biol. Chem.  263:14586-91。
【００６６】
２．  CR1に結合する抗体
本発明のある実施態様では、CR1に特異的に結合するなど、CR1には結合するがCR2には実質的に結合しないような抗体又は抗体の抗原結合部分に、CR1結合を付与させることができる。本発明の抗CR1抗体は、新規な抗体であっても、又は、CR1に結合することが当業で公知の抗体であってもよい。本発明の抗CR1抗体はCR1には特異的に結合するが、CR2には実質的に結合しない。ある実施態様では、このような抗体は、例えば下に解説する通りなど、当業で公知の方法を用いて作製することができる。
【００６７】
ａ．  CR1抗体の作製
抗体例としては、天然源から得ても、あるいは、ハイブリドーマ、遺伝子操作技術（米国特許第5,624,821号）による定常領域機能の改変を含む組換え又は化学合成法により、作製してもよい。本発明の抗体は哺乳動物由来であってもよく、またいずれのアイソタイプのものとすることもできる。
【００６８】
ヒトCR1に特異的に結合する抗CR1mAbは、当業者に公知の技術を用いて作製することができる。例えば、哺乳動物をCR1又はそのフラグメント（又は当該分子の相同性の高い形）で免疫することができる。
【００６９】
CR1は一本のポリペプチド鎖から成る糖たんぱく質である。４種類のアロタイプ型のCR1が見つかっており、 ~40,000-50,000 ダルトンの分子量ずつ、異なる。２つの最も一般的な形であるF 及び Sアロタイプは A 及びB アロタイプとも呼ばれ、それぞれ250,000 及び 290,000 ダルトンの分子量を有し (Dykman, T. R., et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80:1698; Wong, W. W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685)、二つのより頻度の少ない形は210,000 及び >290,000 ダルトンの分子量を有する
(Dykman, T. R., et al., 1984, J. Exp. Med. 159:691; Dykman, T.
R., et al., 1985, J. Immunol. 134:1787)。４種類のCR1アロタイプの全てがC3b結合活性を有する (Dykman, T. R., et al., 1983, Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A.
80:1698; Wong, W. W., et al., 1983, J. Clin. Invest. 72:685; Dykman, T. R., et al., 1984, J.
Exp. Med. 159:691; Dykman T. R., et al., 1985, J. Immunol. 134:1787)。
【００７０】
例えば特異的抗体価が最高になったときなど、哺乳動物の免疫後の適した時点で抗体産生細胞をこの対象から得、Kohler 及び Milstein が最初に解説したハイブリドーマ技術(1975, Nature 256:495-497)、Kozbor et al.によるヒトB細胞ハイブリドーマ技術 (1983, Immunol. Today 4:72)、Cole et al. によるEBV-ハイブリドーマ技術 (1985,
Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96) 又はトリオーマ技術などの標準的な技術により、モノクローナル抗体を調製するために用いることができる。ハイブリドーマを作製する技術は公知である（Current Protocols in Immunology, 1994, John Wiley & Sons, Inc.,
New York, NYを参照されたい）。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞は、ハイブリドーマ培養上清を、目的のポリペプチドには結合するが、CR2などの非CR1分子には結合しない抗体を求めて標準的ELISAなどを用いてスクリーニングすることにより、検出される。
【００７１】
モノクローナル抗体は、実質的に同質な抗体集団から得られ、即ち、この集団を成す個々の抗体は、少量存在する可能性のある天然で生じる変異の他には同一である。従って、修飾語「モノクローナル」とは、別個の抗体の混合物ではないという公知あの特徴を指す。本発明のモノクローナル抗体は、組換えDNA法（米国特許第
4,816,567号）によっても作製できよう。
【００７２】
モノクローナル抗体を作製するハイブリドーマ法においては、マウス又はハムスターなどの哺乳動物を、例えば上述した通りに免疫して、CR1に結合するであろう抗体を産生する又は産生することのできるリンパ球を惹起する（例えばその全文を引用をもってここに援用することとする米国特許第5,914,112号を参照されたい）。
【００７３】
代替的には、リンパ球を in vitroで免疫してもよい。
次にリンパ球を骨髄腫細胞にポリエチレングリコールなどの適した融合剤を用いて融合させて、ハイブリドーマ細胞を形成する (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59
103, Academic Press, 1986)。このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは未融合の親骨髄腫細胞の成長又は生存を阻害する一種以上の物質を含有する、適した培地に播種し、成長させる。例えば親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシル転移酵素（HGPRT 又はHPRT）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培地は、典型的には、HGPRT欠損細胞の成長を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン(HAT培地)を含むであろう。
【００７４】
好適な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による安定で高レベルな抗体産生を支援し、HAT培地などの培地に感受性があるものである。これらの中でも好適な骨髄腫細胞系は、例えば米国カリフォルニア州サンディエゴ、Salk Institute Cell Distribution Centerから入手可能なMOPC 21及びMPC 11マウス腫瘍由来のもの、及び、米国メリーランド州ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクションから入手可能なSP 2 細胞などのマウス骨髄腫系である。ヒト骨髄腫およびマウス−ヒトへテロ骨髄腫細胞系も、ヒト抗体の産生について解説されている (Kozbor, 1984, J. Immunol., 133:3001; Brodeur et al.,
Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51 63 (Marcel
Dekker, Inc., New York, 1987))。ハイブリドーマが中で成長中の培地を、抗原に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。
【００７５】
好ましくは、ハイブリドーマ細胞の産生したモノクローナル抗体の結合特異性を、例えばラジオイムノアッセイ（RIA）又は酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）などの免疫沈降法又はin vitro結合検定で判定するとよい。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson et
al., 1980, Anal. Biochem., 107:220のスカッチャード分析により、判定することができる。
【００７６】
所望の特異性、親和性及び／又は活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞を特定したら、限界希釈法によりそのクローンをサブクローニングし、標準的方法により成長させることができる (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp. 59 103
(Academic Press, 1986))。この目的にとって適した培地には、例えばD-MEM 又は RPMI 1640培地がある。加えて、ハイブリドーマ細胞を動物の in vivo で腹水腫瘍として成長させてもよい。サブクローンの分泌したモノクローナル抗体を適宜、培地、腹水、又は血清から、例えばプロテインＡセファロース、ヒドロキシルアパタイト・クロマトグラフィ、ゲル電気泳動法、透析、アフィニティ・クロマトグラフィなどの従来の免疫グロブリン精製法により分離する。
【００７７】
モノクローナル抗体分泌性ハイブリドーマを調製する代わりに、CR2には結合しない抗CR1特異的抗体は、他の当業で公知の技術を用いて同定することができ、例えば組換えコンビナトリアル免疫グロブリン・ライブラリ（例えば抗体ファージ・ディスプレイ・ライブラリ）をヒトCR1などでスクリーニングすることにより、同定することができる。ファージ・ディスプレイ・ライブラリを作製及びスクリーニングするためのキットは市販されている（例えばPharmacia Recombinant Phage Antibody System、カタログ番号 27-9400-01; 及びStratagene 社の抗原SurfZAP（登録商標） ファージ・ディスプレイ・キット、カタログ番号240612）。加えて、抗体ディスプレイ・ライブラリの作製及びスクリーニングで用いるために特に適した方法及び試薬の例は、例えば米国特許第5,223,409号及び第5,514,548号； PCT公報 No. WO 92/18619; PCT公報 No. WO 91/17271; PCT公報 No. WO 92/20791; PCT公報 No. WO 92/15679; PCT公報 No. WO 93/01288; PCT公報 No. WO 92/01047; PCT公報 No. WO 92/09690; PCT公報 No. WO 90/02809; Fuchs et al., 1991, Bio/Technology 9:1370-1372;
Hay et al., 1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281; Griffiths et
al., 1993, EMBO J. 12:725-734に見ることができる。
【００７８】
他の実施態様では、抗CR1 mAb、好ましくは抗CR1 IgG、の重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子を、ハイブリドーマ細胞株から、当業で公知の標準的方法により、調製する。非限定的な例としては、抗CR1 IgGの重鎖及び軽鎖をコードする
cDNAを、適したプライマを用いてmRNAをプライミングした後、適した正方向及び逆方向プライマを用いてPCR増幅することにより、調製する。cDNA合成のためのいずれかの市販のキットも用いることができる。該核酸を、発現ベクタの構築に用いる。発現ベクタを適したホストにトランスフェクトする。非限定的な例には、E. coli 、酵母、昆虫細胞、及び哺乳動物系、例えばチャイニーズ・ハムスター卵巣細胞株など、がある。抗体の産生は、当業で公知の標準的な方法により、誘導することができる。
【００７９】
非ヒト抗体又はその抗原結合部分をコンストラクトに取り入れる実施態様では、抗体又はその抗原結合部分を改変して、ヒトの対象でその免疫原性が低下しているようにしてもよい。例えば適した抗原特異性を持つマウス抗体分子由来の遺伝子を、適した対生物活性のヒト抗体分子由来の遺伝子と一緒にスプライシングすることによる「キメラ抗体」の作製のために開発された技術（Morrison, et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci., 81, 6851-6855;
Neuberger, et al., 1984, Nature 312, 604-608; Takeda, et al., 1985, Nature,
314, 452-454）を用いることができる。キメラ抗体とは、例えばマウスmAb由来の可変領域と、ヒト免疫グロブリン定常領域とを有するものなど、異なる部分が異なる動物種由来である分子である。（例えば引用をもってその全文をここに援用することとするCabilly et al., 米国特許第4,816,567号；及びBoss et al., 米国特許第 4,816,397号を参照されたい）。
【００８０】
ヒト化抗体又はその抗原結合部分も本発明のコンストラクトで用いることができる。ヒト化抗体は、非ヒト種を由来とする一つ以上の相補性決定領域（CDR）と、ヒト免疫グロブリン分子を由来とするフレームワーク領域とを有する、非ヒト種由来の抗体分子である。（例えば引用をもってその全文をここに援用することとする米国特許第5,585,089号を参照されたい）このようなキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当業で公知の組換えDNA技術により、PCT公報 No. WO 87/02671; ヨーロッパ特許出願 184,187; ヨーロッパ特許出願 171,496; ヨーロッパ特許出願 173,494; PCT公報 No. WO 86/01533; 米国特許第4,816,567号及び第5,225,539号; ヨーロッパ特許出願 125,023; Better et al., 1988,
Science 240:1041-1043; Liu et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443; Liu et al.,
1987, J. Immunol. 139:3521-3526; Sun et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA
84:214-218; Nishimura et al., 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood et al., 1985,
Nature 314:446-449; Shaw et al., 1988, J. Natl. Cancer Inst. 80:1553-1559;
Morrison 1985, Science 229:1202-1207; Oi et al., 1986, Bio/Techniques 4:214;
Jones et al., 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan et al., 1988, Science
239:1534; 及び Beidler et al., 1988, J. Immunol. 141:4053-4060に解説された方法を用いるなどして、作製することができる。
【００８１】
相補性決定領域（CDR）グラフティングは、抗体をヒト化する別の方法である。それは完全な抗原特異性及び結合親和性をヒトフレームワークに移すためにマウス抗体を整形することを含む（Winter et al. 米国特許第5,225,539号）。CDRをグラフトされた抗体は、例えばQueen et al., 1989 （Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029）に解説されたようなIL-2受容体に対する抗体；Riechmann
et al. (1988, Nature, 332:323に解説されたような細胞表面受容体CAMPATHに対する抗体；Cole et
al. (1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:2869)のＢ型肝炎に対する抗体；や、Tempest et al. (1991, Bio-Technology 9:267)のウィルス抗原-呼吸系発疹ウィルスに対する抗体など、多種の抗原に対して成功裡に構築されてきた。マウスモノクローナル抗体のCDRがヒト抗体にグラフトされた、CDRグラフト抗体が生じる。グラフティング後、ある実施態様では、フレームワーク領域に付加的なアミノ酸変更を行って親和性を維持しようとしてもよい。なぜなら、おそらくはフレームワーク残基はCDRのコンホメーションを維持するために必要であり、そしていくつかのフレームワーク残基が抗原結合部位の一部分であることが実証されているからである。しかしながら、いずれの抗原性部位も導入しないようにフレームワーク領域を保存するために、当該配列を、確立された生殖細胞系配列に比較した後、コンピュータ・モデリングを行う。
【００８２】
デイミュナイズド抗体又はその抗原結合部位も本発明で用いることができる。ここで用いられる用語「デイミュナイズド抗体」とは、非ヒト起源のものであるが、開始物質の非ヒト抗体に比較して、それがヒトに対して非免疫原性又は低免疫原性であるように改変された、即ち一つ以上のアミノ酸置換を持つ、抗体を言う。好適な実施態様では、前記のデイミュナイズド抗CR1抗体は、このデイミュナイズド抗体が、それぞれ未改変の非ヒト配列に比較して、ヒトにとって非免疫原性又は低免疫原性であるように一つ以上のアミノ酸置換を含むように改変された一つ以上の非ヒトVH又はVL配列を含む（全て、引用をもってその全文をここに援用することとする WO 00/34317、WO 98/52976、及び２００３年３月２８日に出願された米国仮出願No. 60/458,869を参照されたい）。
【００８３】
完全ヒト抗体がヒト患者の治療的治療にとっては特に好ましい。ある実施態様では、完全ヒト抗体は、当業で公知の技術を用いて作製することができる。例えば、特定の抗原に対する完全ヒト抗体は、抗原刺激に応答してこのような抗体を産生するように改変されているが、その内因性遺伝子座が不能にされているようなトランスジェニック動物に当該抗原を投与することにより、調製することができる。抗体を作製するために用いることのできる技術の例が米国特許第6,150,584号；第6,458,592号；第6,420,140号に解説されている。
【００８４】
トランスジェニック・マウスが持つヒト免疫グロブリン導入遺伝子は、Ｂ細胞分化中に再編成した後、クラス・スイッチング及び体細胞変異を起こす。このように、このような技術を用いると、治療上有用なIgG、IgA及びIgE抗体を作製することができる。ヒト抗体を作製するこの技術の概観については、Lonberg and Huszar （1995, Int. Rev. Immunol. 13:65-93）を参照されたい。ヒト抗体及びヒトモノクローナル抗体を作製するこの技術の詳細な議論や、このような抗体を作製するためのプロトコルについては、例えば米国特許第5,625,126号；米国特許第5,633,425号；米国特許第5,569,825号；米国特許
第5,661,016号；及び米国特許第5,545,806号を参照されたい。加えて、Abgenix社（カリフォルニア州フレモント、例えば米国特許第5,985,615号を参照されたい）及びMedarex社（ニュージャージー州プリンストン）などの会社は、ヒトCR1に対するヒト抗体を、上述したものと同様な技術を用いて提供しようと、取り組むことができる。
【００８５】
選択されたエピトープを認識して結合する完全ヒト抗体は、「ガイデッド・セレクション（原語：guided selection）」と呼ばれる技術を用いて作製することもできる。このアプローチでは、マウス抗体などの選択された非ヒトモノクローナル抗体を用いて、同じエピトープを認識する完全ヒト抗体の選択を案内する (Jespers et al., 1994,
Bio/technology 12:899-903)。 
【００８６】
7G9 (Reist et al. 1994.
Eur. J. Immunol. 24:2018)、YZ-1
(Changelian et al. 1985.  J.
Immunol. 134:1851)、及びE11 (AXXORA, LLC (カリフォルニア州サンディエゴ)も、H4 及びH9 デイミュナイズド型のE11 (Biovation, Ltd. (英国アバディーン))を含め、しかしこれらに限らず、既存の抗CR1抗体も用いることができる。
【００８７】
Ｂ．  抗体の抗原結合部分
ある実施態様では、CR1に特異的に結合する部分は抗体の抗原結合部分から成る。ある実施態様では、プロテインＡに結合する抗原結合部分はFcドメインを含まない。例えば本発明のコンストラクトに、このような抗CR1抗体のCR1結合フラグメントを含めることができる。このようなフラグメントは、組換えにより作製したり、操作したり、合成したり、あるいは抗CR1抗体をたんぱく質分解酵素で紹介することにより作製したりすることができよう。
【００８８】
ある好適な実施態様では、抗原結合部分は免疫グロブリン分子のFab、Fab’、 (Fab’)2、又はFv フラグメントである。このようなFab、Fab’ 又はFv フラグメントは、例えば酵素プロセッシングにより完全抗体から得ることができる。例えば、ペプシンは抗体をジスルフィド結合の下方のヒンジ領域で消化することで、軽鎖をジスルフィド結合でVH-CH1に接合したものから成る、Fabフラグメントの二量体である、この抗体の(Fab’)2 フラグメントを生じる。（Fab’)2 フラグメントを、穏和条件下で還元することで、ヒンジ領域のジスルフィド架橋を還元して、（Fab’)2 二量体をFab’ 単量体に転化させてもよい。Fab’ 単量体は基本的には、ヒンジ領域の一部を持つFabである。エピトープ、抗体及び抗体フラグメントの詳細な解説についてはPaul, ed.,
1993, Fundamental Immunology, Third Edition (ニューヨーク、レイブン・プレス刊)を参照されたい。当業者であれば、このようなFab’
フラグメントは、化学的か、又は組換えDNA技術を用いてde novoで合成できるであろうことは認識されよう。このように、ここで用いる場合の抗原結合部分という用語には、全抗体の改変により生ずる、抗体の抗原結合部分や、又はde novo合成されたものが含まれる。
【００８９】
代替的には、このようなフラグメントを、ファージ・ディスプレイ・ライブラリから、アフィニティ・スクリーニング及びその後の組換え発現により得ることができる（例えば、引用をもってその全文をここに援用することとするWatkins et al., Vox
Sanguinis 78:72-79; 米国特許第5,223,409号及び第5,514,548号；PCT公報 No. WO
92/18619; PCT公報 No. WO
91/17271; PCT公報 No. WO
92/20791; PCT公報 No. WO
92/15679; PCT公報 No. WO
93/01288; PCT公報 No. WO
92/01047; PCT公報 No. WO
92/09690; PCT公報 No. WO
90/02809; Fuchs et al., 1991,
Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al.,
1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281; Griffiths et al., 1993, EMBO J. 12:725-734; 及びMcCafferty et al., 1990,
Nature 348:552-554を参照されたい）。
【００９０】
更に別の代替法は「一本鎖」Fvフラグメントを用いることである。一本鎖Fv（scFv）フラグメントは多様な方法で作製することができる。Fvフラグメントの２つのドメインVL及びVHは別々の遺伝子にコードされているが、このVL及びVH領域が対になって一価の分子を形成しているような一本のたんぱく質鎖（一本鎖 Fv (scFv)として知られる；例えば Bird et al. (1988) Science 242:423-426;
及び Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）に作製できるようにする合成リンカにより、組換え法を用いてこれらを接合することができる。例えば VH のC末端を VLのN末端に連結することができる。典型的には、リンカ（例えば (GGGGS)4）をVH 及びVL間に配置する。しかしながら、鎖を連結する順序を逆転させてもよく、また検出又は精製を容易にするタグ（例えば Myc-、His-、又はFLAG-タグ）を含めることもできる（これらなどのタグは本発明のコンストラクトのいずれの抗CR1抗体又は抗体フラグメントにも付属させることができる：それらの使用はscFvに限られない）。 scFv のレビューについては Pluckthun in The Pharmacology of
Monoclonal Antibodies, vol. 113, 269-315 (Rosenburg and Moore eds.,
Springer-Verlag, New York 1994)を参照されたい。
【００９１】
別の好適な実施態様では、一本鎖Fv（scFv）フラグメントを、例えばファージ・ディスプレイ抗体フラグメントのライブラリから、アフィニティ・スクリーニング及びその後の組換え発現により得ることができる。
【００９２】
更に別の実施態様では、本コンストラクト分子の抗原結合部分は一本鎖抗体（scAb）である。ここで用いられる場合の一本鎖抗体（scAb）には、scFvを免疫グロブリン分子の定常κドメインなどの定常ドメインに融合させたものから成る抗体フラグメントが含まれる。別の実施態様では、本コンストラクト分子の抗原結合部分はFab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFv、又はscAb フラグメントを、選択されたアミノ酸配列を含む所望の長さのリンカ・ペプチドに融合させたものである。好適な実施態様では、該リンカ・ペプチドは１、２、５、１０、又は２０個のアミノ酸から成る。リンカ・ペプチドの例は当業で公知である。
【００９３】
代替的な実施態様では、本発明のコンストラクトで用いられる抗CR1抗体は重鎖二量体又は軽鎖二量体であってよい。更に、抗CR1抗体軽鎖又は重鎖、あるいはそれらの一部分、例えば単一ドメインの抗CR抗体（DAb）を用いることができる。
【００９４】
抗体フラグメントという用語にはジアボディ（原語：diabodies）も含まれる。用語「ジアボディ」とは、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体フラグメントを言い、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（VH-VL）中の軽鎖可変ドメイン（VL）に接続された重鎖可変ドメイン（VH）を含む。同じ鎖上のこれら二つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカを用いることで、これらのドメインに、別の鎖の相補なドメインとペアを作らせるように強制して、二つの抗原結合部位を生じさせる。ジアボディは例えば EP 404,097; WO 93/11161; 及び Hollinger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8に十二分に解説されている。
【００９５】
Ｂ．  抗原又は抗原結合分子を含む部分
ある実施態様では、本発明のコンストラクトは、対する免疫応答の発生が予防上及び／又は治療上有益であろう幅広い病原性物質、腫瘍細胞又は毒素、又は病原性たんぱく質を由来とする少なくとも一種の抗原（例えば一種、二種、三種、四種、又はそれ以上の抗原など）を含む。抗原性部分の由来と成る本発明の病原体の例には、例えばウィルス、細菌、真菌、寄生生物、及びこれらを由来とするエピトープがある。
【００９６】
別の実施態様では、本発明のコンストラクトは、対する免疫応答の発生が予防上及び／又は治療上有益であろう幅広い病原性物質、腫瘍細胞又は毒素、又は病原性たんぱく質を由来とする少なくとも一種の抗原（例えば一種、二種、三種、四種、又はそれ以上の抗原など）に結合する部分を含む。結合性部分を結合させてもよい本発明の病原体の例には、例えばウィルス、細菌、真菌、及び寄生生物がある。
【００９７】
１．  病原性物質
ａ．細菌
結合性分子を結合させてもよい細菌（又はそのエピトープ）の例には： シュードモナス- アエルギノーサ（原語：Pseudomonas
aeruginosa）、シュードモナス- フルオレセンス(原語：Pseudomonas fluorescens)、シュードモナス- アシドボランス（原語：Pseudomonas
acidovorans）、シュードモナス- アルカリゲンス（原語：Pseudomonas
alcaligenes）、シュードモナス-プチダ（原語：Pseudomonas
putida）、ステノトロフォモナス-マルトフィリア（原語：Stenotrophomonas
maltophilia）、ブルクホルデリア-カパシア（原語：Burkholderia
cepacia）、エアロモナス-ヒドロフィリア（原語：Aeromonas
hydrophilia）、エシェリヒア-コリ（原語：Escherichia
coli）、シトロバクター-フロインディイ（原語：
Citrobacter freundii）、サルモネラ-エンテリカ-チフィムリウム-（原語：Salmonella
enterica Typhimurium）、サルモネラ-エンテリカ-チフィー（原語：Salmonella
enterica Typhi）、サルモネラ-エンテリカ-パラチフィー（原語：Salmonella
enterica Paratyphi）、サルモネラ-エンテリカ-エンテリディティス（原語：Salmonella
enterica Enteridtidis）、シゲラ-ジセンテリア（原語：Shigella dysenteriae）、シゲラ-フレクスネリ（原語：Shigella
flexneri）、シゲラ-ソネイ（原語：Shigella
sonnei）、エンテロバクター-クロアカエ（原語：
Enterobacter cloacae）、エンテロバクター-アエロゲネス（原語：Enterobacter
aerogenes）、クレブシエラ-ニューモニアエ（原語：Klebsiella
pneumoniae）、クレブシエラ-オキシトカ（原語：Klebsiella
oxytoca）、セラチア-マルケセンス（原語：Serratia
marcescens）、フランシセラ-ツラレンシス（原語：Francisella
tularensis）、モルガネラ-モルガニイ（原語：Morganella
morganii）、プロテウス-ミラビリス（原語：Proteus
mirabilis）、プロテウス-ブルガリス（原語：Proteus
vulgaris）、プロビデンシア-アルカリファシエンス（原語：Providencia
alcalifaciens）、プロビデンシア-レットゲリ（原語：Providencia
rettgeri）、プロビデンシア-スチュアルティイ（原語：Providencia
stuartii）、アシネトバクター-カルコアセティクス（原語：Acinetobacter
calcoaceticus）、アシネトバクター-ハエモリティクス（原語：Acinetobacter
haemolyticus）、エルシニア-エンテロォリティカ（原語Yersinia
enterocolitica）、エルシニア-ペスティス（原語Yersinia
pestis）、エルシニア- シュードツベルキュローシス（原語：Yersinia pseudotuberculosis）、エルシニア-インテルメディア（原語：Yersinia intermedia）、ボルデテッラ-ペルツーシス（原語：Bordetella
pertussis）、ボルデテッラ-パラペルツーシス（原語：Bordetella
parapertussis）、ボルデテッラ-ブロンキセプティカ（原語：Bordetella
bronchiseptica）、ハエモフィラス-インフルエンザ（原語：Haemophilus
influenzae）、ハエモフィラス-パラインフルエンザ（原語：Haemophilus
parainfluenzae）、ハエモフィラス-ハエモリティクス（原語：Haemophilus
haemolyticus）、ハエモフィラス-パラハエモリティクス（原語：Haemophilus
parahaemolyticus）、ハエモフィラス-デュクレイ（原語：Haemophilus
ducreyi）、パスツーレラ-マルトシダ（原語：Pasteurella
multocida）、パスツーレラ-ハエモリティカ（原語：Pasteurella
haemolytica）、ブランハメラ-カタールハリス（原語：Branhamella
catarrhalis）、ヘリコバクター-ピロリ（原語：Helicobacter
pylori）、カンピロバクター-フェトゥス（原語：Campylobacter
fetus）、カンピロバクター-ジェジュニ（原語：Campylobacter
jejuni）、カンピロバクター-コリ（原語：Campylobacter
coli）、ボレリア-ブルグドーフェリ（原語：Borrelia
burgdorferi）、ビブリオ-コレラ（原語：Vibrio
cholerae）、ビブリオ-パラハエモリティクス（原語：Vibrio
parahaemolyticus）、レジオネラ-ニューモフィラ（原語：Legionella
pneumophila）、リステリア-モノサイトゲネス（原語：Listeria
monocytogenes）、ネイセリア-ゴノローエアエ（原語：Neisseria
gonorrhoeae）、ネイセリア-メニンギティディス（原語：Neisseria
meningitidis）、ガルドネレラ-バギナリス（原語：Gardnerella
vaginalis）、バクテロイデス-フラギリス（原語：Bacteroides
fragilis）、バクテロイデス-ディスタソニス（原語：Bacteroides
distasonis）、バクテロイデス3452A相同群、バクテロイデス-ブッルガツス（原語：Bacteroides
vulgatus）、バクテロイデス-オヴァルス（原語：Bacteroides
ovalus）、バクテロイデス-テタイオタオミクロン（原語：Bacteroides
thetaiotaomicron）、バクテロイデス-ユニフォルミス（原語：Bacteroides
uniformis）、バクテロイデス-エゲルシー（原語：Bacteroides
eggerthii）、バクテロイデス-スプランクニキュス（原語：Bacteroides
splanchnicus）、クロストリジウム-ディフィシル（原語：Clostridium
difficile）、マイコバクテリウム-ツベルキュローシス（原語：Mycobacterium
tuberculosis）、マイコバクテリウム-アビウム（原語：Mycobacterium
avium）、マイコバクテリウム-イントラセルラーレ（原語：Mycobacterium
intracellulare）、マイコバクテリウム-リプリー（原語：Mycobacterium
leprae）、コリネバクテリウム-ジフテリア（原語：Corynebacterium
diphtheriae）、コリネバクテリウム-ウルセランス（原語：Corynebacterium
ulcerans）、ストレプトコッカス-ニューモニエ（原語：Streptococcus
pneumoniae）、ストレプトコッカス-アガラクティエ（原語：Streptococcus
agalactiae）、ストレプトコッカス-パイオゲネス（原語：Streptococcus
pyogenes）、エンテロコッカス-フェカーリス（原語：Enterococcus
faecalis）、エンテロコッカス-フェシウム（原語：Enterococcus
faecium）、スタフィロコッカス-アウレウス、スタフィロコッカス-エピデルミディス（原語： Staphylococcus epidermidis）、スタフィロコッカス-サプロフィティクス（原語：Staphylococcus
saprophyticus）、スタフィロコッカス-インテルメディウス（原語：
Staphylococcus intermedius）、スタフィロコッカス-ヒイカス（原語：Staphylococcus
hyicus）亜種ヒイカス、スタフィロコッカス-ハエモリティクス（原語：Staphylococcus
haemolyticus）、スタフィロコッカス-ホミニス（原語：Staphylococcus
hominis）、及びスタフィロコッカス-サッカロリティクス（原語：Staphylococcus
saccharolyticus）、がある。具体的な実施態様では、本発明のコンストラクトは、スタフィロコッカス・プロテインＡに結合する結合性分子を含む。
【００９８】
ｂ．  ウィルス
本コンストラクトに含めてもよい、及び／又は、結合性分子を結合させてもよい、ウィルス（又はそのエピトープ）の例には：インフルエンザウィルスヘマグルチニン (Genbank 受託番号JO2132; Air,
1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:7639-7643; Newton et al., 1983,
Virology 128:495-501)、ヒト呼吸系発疹ウィルスＧ糖たんぱく質 (Genbank 受託番号 Z33429; Garcia et al., 1994, J. Virol.;
Collins et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:7683)、はしかウィルスヘマグルチニン
(Genbank 受託番号 M81899; Rota et al., 1992, Virology 188:135-142)、単純疱疹ウィルス２型糖たんぱく質 gB (Genbank 受託番号. M14923; Bzik et
al., 1986, Virology 155:322-333)、ポリオウィルス I VP1 (Emini et al., 1983, Nature
304:699)、HIV I のエンベロープ糖たんぱく質(Putney et al., 1986, Science
234:1392-1395)、Ｂ型肝炎表面抗原 (Itoh et al., 1986, Nature 308:19; Neurath et al., 1986,
Vaccine 4:34)、ジフテリア毒素 (Audibert et al., 1981, Nature 289:543)、ストレプトコッカス24M エピトープ (Beachey,
1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:193)、淋菌ピリン (Rothbard and Schoolnik, 1985, Adv.
Exp. Med. Biol. 185:247)、偽狂犬病ウィルス g50
(gpD)、偽狂犬病ウィルス II (gpB)、偽狂犬病ウィルス gIII (gpC)、偽狂犬病ウィルス糖たんぱく質H、偽狂犬病ウィルス糖たんぱく質E、伝染性胃腸炎糖たんぱく質 195、伝染性胃腸炎マトリックスたんぱく質、ブタロタウィルス糖たんぱく質 38、ブタパルボウィルスカプシドたんぱく質、セルプリナ-ヒドジセンテリア（原語：Serpulina hydodysenteriae）防御抗原、ウシウィルス性下痢糖たんぱく質55、ニューカッスル病ウィルスヘマグルチニンノイラミニダーゼ、ブタインフルエンザヘマグルチニン、ブタインフルエンザノイラミニダーゼ、口蹄病ウィルス、豚コレラウィルス、豚インフルエンザウィルス、アフリカ豚発熱ウィルス、マイコプラズマ-ヒオニューモニエ（原語：Mycoplasma
hyopneumoniae）、感染性ウシ鼻気管支炎ウィルス（例えば感染性ウシ鼻気管支炎ウィルス糖たんぱく質Ｅ又は糖たんぱく質Ｇ）、又は感染性喉頭気管支炎ウィルス（例えば感染性喉頭気管支炎ウィルス糖たんぱく質Ｇ又は糖たんぱく質Ｉ）、ラクロスウィルスの糖たんぱく質（Gonzales Scarano et al., 1982, Virology 120 :42）、新生仔ウシ下痢ウィルス (Matsuno and Inouye, 1983,
Infection and Immunity 39:155)、ベネズエラウマ脳脊髄炎ウィルス (Mathews and Roehrig, 1982, J. Immunol. 129:2763)、プンタトロ（原語：punta toro ）ウィルス (Dalrymple et al., 1981,  Replication of Negative Strand Viruses,
Bishop and Compans (eds.), Elsevier, NY, p. 167)、マウス白血病ウィルス (Steeves et al., 1974, J. Virol. 14:187)、マウス乳腺腫瘍ウィルス (Massey and Schochetman, 1981,
Virology 115:20)、Ｂ型肝炎ウィルスコアたんぱく質及び／又はＢ型肝炎ウィルス表面抗原又はそのフラグメントもしくは誘導体（例えば１９８０年６月４日に公開された英国特許公報 GB 2034323A published June 4, 1980; Ganem and Varmus, 1987, Ann.
Rev. Biochem. 56:651 693; Tiollais et al., 1985, Nature 317:489 495を参照されたい)、今インフルエンザウィルス又はウマ疱疹ウィルスのもの（例えばウマインフルエンザウィルスタイプＡ／アラスカ９１ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウィルスタイプＡ／マイアミ６３ノイラミニダーゼ、ウマインフルエンザウィルスタイプＡ／ケンタッキー８１ノイラミニダーゼウマ疱疹ウィルスタイプ１糖たんぱく質Ｂ、及びウマ疱疹ウィルスタイプ１糖たんぱく質Ｄ、ウシ呼吸系発疹ウィルス又はウシパラインフルエンザウィルスの抗原（例えばウシ呼吸系発疹ウィルス付着たんぱく質 (BRSV G)、ウシ呼吸系発疹ウィルス融合たんぱく質 (BRSV F)、ウシ呼吸系発疹ウィルスヌクレオカプシドたんぱく質(BRSV N)、ウシパラインフルエンザウィルスタイプ３融合たんぱく質、及びウシパラインフルエンザウィルスタイプ３ヘマグルチニンノイラミニダーゼ）、ウシウィルス性下痢ウィルス糖たんぱく質 48 又は糖たんぱく質53がある。
【００９９】
他のウィルス例には：Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、インフルエンザ、バリセラ、アデノウィルス、Ｉ型単純疱疹(HSV I)、ＩＩ型単純疱疹II (HSV
II)、牛疫、ライのウィルス、エコーウィルス、ロタウィルス、呼吸系発疹ウィルス、パピローマウィルス、パポバウィルス、サイトメガロウィルス、エキノウィルス、アルボウィルス、ハンタウィルス、コクサッキーウィルス、おたふくかぜウィルス、はしかウィルス、風疹ウィルス、ポリオウィルス、Ｉ型ヒト免疫不全ウィルス
(HIV I)、及びＩＩ型ヒト免疫不全ウィルス、いずれかのピコルナウィルス、エンテロウィルス、カリチウィルス、ノーウォークウィルス群のいずれか、トガウィルス、例えばアルファウィルス、フラビウィルス、コロナウィルス、狂犬病ウィルス、マーブルグウィルス、エボラウィルス、パラインフルエンザウィルス、オルトミクソウィルス、ブンヤウィルス、アレナウィルス、レオウィルス、ロタウィルス、オルビウィルス、Ｉ型ヒトＴ細胞白血病ウィルス、ＩＩ型ヒトＴ細胞白血病ウィルス、サル免疫不全ウィルス、レンチウィルス、ポリオーマウィルス、パルボウィルス、エプスタイン-バーウィルス、ヒト疱疹ウィルス6、セルコピテシン（原語：cercopithecine）疱疹ウィルス1 (B ウィルス)、及びポックスウィルス、がある。
【０１００】
ｃ．真菌
本コンストラクトに含めてもよい、及び／又は、結合性分子を結合させてもよい、真菌（又はそのエピトープ）の例には、ケカビ属、カンジダ属、及びアスペルギルス属の真菌、例えばムコール-ラクメオスス（原語：Mucor
racmeosus）、カンジダ-アルビカンス（原語：Candida
albicans）、及びアスペルギルス-ニゲル（原語：Aspergillus
niger）がある。
【０１０１】
ｄ．寄生生物
本コンストラクトに含めてもよい、及び／又は、結合性分子を結合させてもよい、寄生生物（又はそのエピトープ）には：トキソプラズマ-ゴンジ（原語：Toxoplasna gondii）、トレポネマ-パリドゥン（原語：Treponema pallidun）、マラリア、及びクリプトスポリジウムがある。
【０１０２】
ｅ．微生物毒素
本コンストラクトに含めてもよい、及び／又は、結合性分子を結合させてもよい、 微生物毒素（又はそのエピトープ）には：バシラス-アンスラシス（原語：Bacillus
anthracis）、バシラス-セレウス（原語：Bacillus cereus）、ボルダテッラ-ペルツーシス（原語： Bordatella pertussis）、クロストリジウム-ボツリヌム（原語：Clostridium
botulinum）、クロストリジウム-ペルフリンゲンス（原語：Clostridium perfringens）、クロストリジウム-テタニー（原語：Clostridium tetani）、クロイネバクテリウム-ジフテリア（原語：Croynebacterium
diptheriae）、サルモネラ種、シゲラ種、スタフィロコッカス種、及びビブリオ-コレラ（原語：Vibrio cholerae）が産生する毒素がある。
【０１０３】
タチナタマメ由来のリシンなどの毒素や他の天然型（例えば生物が生じる）及び人工の毒素又はそれらの部分も本コンストラクトに含めてよい。
【０１０４】
ｆ．  病原体のワクチン株
ある実施態様では、本発明のコンストラクトは病原体のワクチン株を含む、及び／又は、病原体のワクチン株に結合する。
【０１０５】
一般的なワクチン戦略は、生ワクチン株の使用を含む。生ワクチンには、生弱毒化病原体、生組換えワクチン、及び異種ワクチンがある。生弱毒化ワクチンとは、in vitro培養操作（例えば温度変化又は化学的改変）で菌力が減らしてあるウィルスである。これらの生弱毒化ウィルスは、標準的な疾患病理を起こすことなくワクチン・レシピエント中で複製するが、それでも尚、細胞媒介性免疫と、その後もとの菌力ある病原体を認識する抗体応答の両方を惹起する。生組換えワクチンは、それらが菌力ある病原体を起源とするという点で生弱毒化ワクチンと似ているが、ゲノム改変により菌力を弱めるように変更されている。従って、生組換えワクチンは長期の体液性及び細胞媒介性免疫応答を誘導する。異種ワクチンとは、対象の菌力ある病原体に関係が近く、共通の抗原を有すると共にホスト内で疾患を起こすことなく複製する病原体である。生弱毒化及び生組換えワクチンと同様に、異種ワクチンは長期の体液性及び細胞媒介性免疫応答を誘導する。
【０１０６】
生ワクチンよりも安全な代替物は死菌又は不活化ワクチンである。死菌及び不活化ワクチンは、全死菌ワクチン又はサブユニットワクチンのいずれかである。全死菌ワクチンは、in vitroで病原体を培養した後、それらを（例えばベータ-プロピオラクトン又はホルムアルデヒドで）死滅させることにより、作製される。この処理の後では、ワクチンは複製できず、従って比較的に安全である。
【０１０７】
サブユニットワクチンが用いられるのは、公知の免疫性の相関関係から、免疫性が一種又は２、３種の病原体抗原に対して生じることが示唆された場合である。サブユニットワクチンは、大量の病原体を培養した後、目的のたんぱく質／抗原を精製することにより、作製される。組換えサブユニットワクチンは、病原性生物の免疫原性たんぱく質であり、発現ベクタ内で当該抗原の遺伝子を発現させることにより、作製される。不活化ワクチンと同様に、組換えサブユニットワクチンは抗原に対してＢ細胞抗体防御を誘導するのみである。特定の病原体（特にウィルス）の遺伝学的ばらつきが非常に大きいため、 組換えサブユニットワクチンに考慮できるのは保存度の高い抗原だけである。
【０１０８】
ｇ．  病原性たんぱく質
本発明のいくつかのコンストラクトの抗原性第二部分は、病原性たんぱく質を含んでいても、及び／又は、例えば特定の癌、細菌又はウィルス感染など、疾患状態又は条件に関連する一種以上の内因性又は外因性のたんぱく質などの病原性たんぱく質に結合する分子を含んでいてもよい。このような病原性たんぱく質の具体的な例には、例えばアミロイドたんぱく質、プリオンたんぱく質、PSA等があり、コンストラクトの第二部分は抗原性エピトープ／それを由来とするポリペプチドを含むであろう。
【０１０９】
ｈ．  対する抗イディオタイプ抗体が望まれる抗体
本発明のいくつかのコンストラクトの抗原性第二部分は、ホスト内で抗イディオタイプ抗体応答を惹起する抗体部分を含んでいてもよい。抗イディオタイプとは、他の抗体の抗原認識部位を狙うモノクローナル抗体である。抗イディオタイプは、免疫系及び他の生物学的プロセスを調節することができる。抗イディオタイプ抗体の作製法は当業で公知である。（例えば
Antibodies, Antigens, and Molecular Mimicry, Volume 178: Antibodies, Antigens and Molecular
Mimicry Editor-in-chief Abelson, John N.
Editor-in-chief Simon, Melvin I. Volume editor (United Kingdom) 及びそこで引用された文献を参照されたい）。
【０１１０】
抗イディオタイプ抗体は、癌治療を含む多様な場面で有用であることが公知である（例えばWettendorff, M., et al. . 1990. Modulation of anti-tumor immunity by
anti-idiotypic antibodies. In: Idiotypic Network and Diseases (J. Cerny and J.
Hiernaux, eds. Am. Soc. Microbiol., Washington, DC, pp 203-229を参照されたい)。加えて、抗原の内側画像を持つ抗イディオタイプ抗体は微生物に対する防御的体液性免疫を誘導することができる。例えば、合成ペプチドで定義されたヒト免疫不全ウィルス（HIV）エンベロープたんぱく質の異なるエピトープのモノクローナル抗イディオタイプによる抗原模倣により、三種類の哺乳動物種で抗体が誘導されたが、この抗体がHIV-1 gp120と相互作用して、HIV-1、IIIB 及び MN 分離株により引き起こされるin
vitro合胞体形成を阻害した (Zaghouani et
al. 1991.  PNAS. 88: 5645-5649)。
【０１１１】
ｉ．  エピトープ
ある実施態様では、本発明のコンストラクトは抗原のエピトープを含む。エピトープは たんぱく質、（ポリ）ペプチド、糖質、脂質、リポ多糖、多糖、低分子、ペプチドグリカン及び／又は糖たんぱく質を由来とする、及び／又は、含んでいてよい。
【０１１２】
当該のコンストラクトに含めるのに適したエピトープは、標準的な方法を用いて調製することができる。本コンストラクトに用いられる抗原のエピトープは多様な長さであってよいが、一般的には当該部分は少なくとも９アミノ酸長であるとよい。２つ以上のエピトープを本発明のコンストラクトに含めることができることを理解されよう。ある実施態様では、本発明のコンストラクトは、例えば完全な一個の病原体など、対する免疫応答が望まれる分子全体を含む。
【０１１３】
エピトープを選択する際、Ｂ細胞エピトープにとっての主要な考慮点は、病原体表面へと到達性と、抗原の抗体認識が精確に行われるように、エピトープ開発の上でのたんぱく質コンホメーションの保存である。
【０１１４】
Ｔリンパ球はHLA分子（ヒトMHC−組織適合性複合体分子）の流れで提示されるペプチドに特異的である。ペプチドは抗原提示細胞（APC）のサイトゾルで、利用可能なたんぱく質の制限あるたんぱく質分解フラグメント化でプロセッシングされ、小胞体に輸送されて、そこでHLA分子に結合する。その後このHLA-ペプチド複合体は細胞表面に運び出され、CTLなどのＴ細胞に提示される。このプロセスで重要な要素は、様々なペプチドに対するHLA分子の特異性である。HLA分子は多型性が非常に高く、個人間や民族間で異なる。従って、Ｔ細胞ワクチンの開発はしばしば、HLA型の制約を受ける。従って、Ｔ細胞エピトープの選択は主に、エピトープの保存、プロテオソーム・プロセッシング、及びHLA選択性の支配を受ける。しかしながら、ほとんど全てのHLA型を、それぞれ順番に似たペプチドに選択的である９種の「HLAスーパータイプ」に分類することができる。例えば March, S., et al., HLA Facts Book,
Academic Press, 2000を参照されたい。
【０１１５】
数多くの病原体に関する分子配列データが多くの公共データベースで入手できる。このような配列データを、重複エピトープ法又はバイオインフォマティクス法で利用して、Ｔ細胞エピトープを同定することができる（例えば Brusic et al.  2005.  Expert Rev. Vaccines 4:407 及びそこで引用された文献を参照されたい)。
【０１１６】
ある実施態様では、重複法を用いてＴ細胞エピトープを同定する。例えば、目的のたんぱく質の全アミノ酸配列を網羅する部分的に重複するペプチド（例えば５個のアミノ酸分で重複する10 aa 長のペプチドなど）を作製した後、HLA分子への結合能又はＴ細胞応答誘導能についてスクリーニングする。
【０１１７】
別の実施態様では、バイオインフォマティクス予測法を、結合モチーフ、定量的マトリックス、決定ツリー、人工神経ネットワーク、隠れマルコフ・モデル、及び分子モデリングを含め、HLA結合ペプチドの同定に用いることができる。新規なＴ細胞エピトープが、癌抗原（Dong et al. 2004.  Cancer
Biol. Ther. 3:891; Consogno et al. 
2003 Blood 101:1038）、自己抗原（Flynn et
al.  2004.  Cell. Immunol. 229:79）、病原体抗原 （DeGroot et
al.  2003.  Vaccine 21:4486; Al-Attiyah and
Mustafa.  2004.  Scand. J. Immunol.  59:16; Brusic et al.  2001.  J. Mol. Graph. Model. 19:405）、及びアレルゲン（DeLalla et al.  1999.  J. Immunol. 163:1725）などの抗原について計算予測法を用いて発見されている。エピトープ評価で用いることのできるアルゴリズムの例には：EpiMatrix アルゴリズム、ClustiMer
アルゴリズム、及びConservatrix アルゴリズムがある。（例えば Sbai, et al.  2001を参照されたい）。ある実施態様では、潜在的Ｔヘルパ部位及びCTL部位をスキャンするために、Ｔ細胞エピトープをTSITES （メリーランド州、MedImmune）などのコンピュータ・アルゴリズムを用いて予測してもよい。 Current
Drug Targets -  Infectious Disorders
1:303 及びそこで引用された文献）。
【０１１８】
例えば、当該のプロセスを、疾患プロセスで役割を果たしていると考えられる標的たんぱく質の同定で始めてもよい。その後、当該たんぱく質の全長に延びる重複するアミノ酸配列のライブラリを合成する。MHC及び位置決定ペプチドの折り畳みを解除し、解離させるようにデザインされた緩衝剤をマイクロタイタ・ウェルに導入することにより、検査ペプチドのそれぞれに対して結合検定を行う。位置決定ペプチド及びベータ2ミクログロブリンを洗い流し、折り畳みを解除されたMHCを反応ウェルに結合したままにする。合成ライブラリからのペプチドと、追加したベータ2ミクログロブリンを各ウェルに加え、複合体の再フォールディングを促進するようにデザインされた緩衝剤中でインキュベートする。
【０１１９】
適正に折り畳まれたペプチド／MHC複合体のみを認識するようにデザインされた蛍光標識済み抗体を各ウェルに加える。このステップにより、MHCに結合する検査ペプチドが同定でき、また、それらの結合親和性及び解離速度を特徴付けるための付加的な分析が保証される。MHCに結合しないペプチドは明らかに判別され、その後の研究から除かれる。
【０１２０】
その後、成功裏のペプチド-HLA複合体（例えば９種の特定されたHLAスーパータイプ）を複数のワクチン法で送達することができよう。ワクチン法の一つは９種のペプチド-HLAスーパータイプ複合体の全てを一個のポリトープ・ワクチンデザインに一体化することである。(Thomson
SA, et al. Proc Natl Acad Sci U S A 
92: 5845-5849) 。ポリトープ、即ちポリエピトープワクチンは単一のウィルス又はDNAベクタに発現させた多数のエピトープに対して免疫応答を成功裏に惹起することが示されている。
【０１２１】
この分析から、ペプチドを合成し、in
vitro細胞障害性検定でターゲットとして用いることができる。ELISA、又は例えば新たに導入されたベクタに対する抗体の存在を検出するELISPOTなどや、ガンマ-インターフェロン検定、IL-2産生検定及び増殖検定など、Ｔヘルパ細胞を調べる検定を含め、他の検定も利用してよい。
【０１２２】
免疫原性であるエピトープを他の当業で公知の方法により選択してもよい。例えばHLA A2.1 トランスジェニック・マウスは、ウィルス抗原のヒトＴ細胞認識のモデルとして有用であることが示されている。簡単に説明すると、インフルエンザ及びＢ型肝炎ウィルス系では、マウスＴ細胞受容体レパートリーは、ヒトＴ細胞が認識する同じ抗原性決定基を認識する。両方の系において、HLA A2.1 トランスジェニック・マウスで生じるCTL応答は、HLA A2.1 ハプロタイプのヒトCTLが認識するのと実質的にほぼ同じエピトープに向かう(Vitiello et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1007-1015; Vitiello et al.
(1992) Abstract of Molecular Biology of Hepatitis B Virus Symposia)。
【０１２３】
別の実施態様では、例えばある病原体のゲノムの一つ以上のドメインを含めるようにするなど、多様な位置でコーディング配列を切断することにより、抗原の一部分を得てもよい。例えばHIV病原体の場合、このようなドメインには、Gag、Gag-ポリメラーゼ、Gag-プロテアーゼ、逆転写酵素 (RT)、インテグラーゼ (IN) 及び Envなどの構造ドメインが含まれる。
この構造ドメインはしばしば更に、例えば p55、p24、p6 (Gag)；p160、p10、p15、p31、p65 (pol、prot、RT 及びIN)；並びにChiron Corporation社で構築された場合にはgp160、gp120 及びgp41 (Ems) 又はor Ogp140 などのポリペプチドに分割される。このようなポリペプチドの分子バリアントも、例えばPCT/US99/31245; PCT/US99/31273 及び PCT/US99/31272で解説された通りに用いてよい。
【０１２４】
本発明のエピトープを、例えばこれらがより高い免疫応答を誘導するようになど、当業で公知の方法を用いて至適化（免疫原性を高める）ことができる。例えば特定の病原体由来抗原（例えば HIVのOgp140 )をコードするポリヌクレオチド配列を、野生型配列のコドン置換により至適化することができる。
【０１２５】
別の実施態様では、エピトープ（又はコンストラクト）を直接、改変して、免疫原性又は安定性などの物理的特性を高めてもよい。例えばペプチドを環化又は環状化すると、そのペプチドの抗原又は免疫原としての効力を高めることができる。例えば引用をもってここに援用することとする米国特許第5,001,049号を参照されたい。
【０１２６】
特定のエピトープ（又はコンストラクト）の免疫原性は、脂肪酸部分に結合させて脂質化したペプチドを作製することでも調節できよう。便利な脂肪酸部分には、グリコリピド類似体、N-パルミチル-S-(2RS)-2,3-ビス-(パルミトイルオキシ)プロピル-システイニル-セリン (PAM3 Cys-Ser)、N-パルミチル-S-[2,3 ビス (パルミトイルオキシ)-(2RS)-プロピル-[R]-システイン (TPC)、トリパルミトイル-S-グリセリルシステイニルセリル-セリン (P3CSS)、又はアジパルミチル-リジン-部分がある。
【０１２７】
更に、本発明のエピトープ又はコンストラクトを、アクタデシル-トリオシン（原語：actadecyl-tryrosine）（OTH）を含むチロシンなどの芳香族酸のオクタデシルエステルなどの脂質化したアミノ酸に結合させてもよい。
【０１２８】
ｊ．  腫瘍細胞抗原
結合性分子を結合させてもよい他の適した抗原には、癌の防止または治療のための腫瘍関連抗原がある。腫瘍関連抗原の例には、限定はしないが、phCG、gp100 又はPmell7、HER2/neu、CEA、gp100、MART1、TRP-2、melan-A、NY-ESO-1、MN (gp250)、イディオタイプ、MAGE-1、MAGE-3、チロシナーゼ、テロメラーゼ、MUC-1
抗原、及び生殖細胞由来腫瘍抗原がある。更に腫瘍関連抗原には、血液型抗原、例えばLea、Leb、LeX、LeY、H-2、B- 1、B-2 抗原がある。代替的には、２種以上の抗原を本発明のコンストラクトに含めることができる。例えばMAGE 抗原をメラニンＡ、チロシナーゼ、及びgp100 などの他の抗原と、GM-CSF 又はIL-12などのアジュバントと合わせて配合し、抗CR1特異的抗体に連結することができる。
【０１２９】
例えば、CD20は、悪性及び非悪性の両方のＢ細胞の表面に見られるpan B抗原であり、非ホジキンリンパ腫治療の免疫治療的抗体にとって非常に有効なターゲットであることが立証されている。この観点では、CD2、CD3、CD5、CD6 及びCD7 などのpan T細胞も、本発明の意味内の腫瘍関連抗原を含む。更に他の例示的な腫瘍関連抗原は、限定はしないが、MAGE-1、MAGE-3、MUC-1、HPV 16、HPV E6 & E7、TAG-72、CEA、L6-抗原、CD19、CD22、CD37、CD52、HLA-DR、EGF 受容体及びHER2 受容体を含む。多くの場合、これらの抗原のそれぞれに対する免疫反応性の抗体が文献で報告されている。
【０１３０】
Ｃ．  抗原に結合する分子
ある実施態様では、あるコンストラクトの第二部分は、抗原に結合する一種以上の分子（例えば一つ、二つ、三つ、四つ、又はそれ以上の分子）を含んでいてもよい。このような分子は当業で公知であるが、その中には、例えば抗原に結合する抗体、又は、このような抗体の抗原結合部分がある。ある実施態様では、本コンストラクトは、抗原に結合する部分に加え、該部分が結合する先の抗原も更に含む。抗原結合部分の例を以下に解説する。
【０１３１】
１．  抗体
ある実施態様では、本発明のコンストラクトの抗原結合部分は、抗原又はそれを由来とするエピトープに結合するモノクローナル抗体である。このような抗体は、例えば当業で公知のようにここで例示した病原体など、病原体を認識するであろう。モノクローナル抗体を作製する方法（例えば引用をもってここに援用することとするKohler and Milstein, Nature 256:495-497, 1975 and
Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and
Applications, CRC Press, Inc., Boca
Raton, Fla., 1982を参照されたい）や、免疫グロブリンをコードするDNAを骨髄腫細胞に安定に導入する技術（例えば Oi et†al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:825-829, 1983; Neuberger, EMBO J. 2:1373-1378,
1983; 及び Ochi et†al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:6351-6355, 1983を参照されたい）は当業で公知である。In vitro変異誘発法及びDNAトランスフェクションを含めこれらの技術により、組換え免疫グロブリンの構築が可能である。これらの技術を用いて、本発明の特定のコンストラクトで用いられる抗原結合抗体を作製することができる。
代替的には、この抗原結合抗体を市販の業者から得ることもできる。
【０１３２】
代替的には、本発明の特定のコンストラクトの抗原結合部分はポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体を調製する方法は当業で公知である（例えば引用をもってここに援用することとするSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second
Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい）。当業者にとっては明白であるように、ポリクローナル抗体は、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、及びラットなど、多種の温血動物から作製することができる。本発明の特定のコンストラクトの抗原結合抗体はIgA、IgD、IgE、IgG、又はIgM クラスの抗体であってよい。
【０１３３】
ある実施態様では、スタフィロコッカスに結合する抗原結合部分を含む部分は、プロテインＡなど、スタフィロコッカス表面抗原を認識するいずれの抗体又はその抗原結合部分であってもよい。代表的な抗体は市販のものを入手可能である。ある実施態様では、抗プロテインＡ抗体はSPA 27 (Sigma Aldrich 社のカタログ番号 P 2921  (ミズーリ州セントルイス))である。下の解説では、プロテインＡ抗原がしばしば簡便さのために言及されるが、他のスタフィロコッカス表面抗原を認識する抗体又はその抗原結合部分、本二重特異的分子に取り入れることができることは理解されよう。細菌の細胞への付着を阻害する、Ｓ．アウレウス表面たんぱく質を狙う他の分子例（例えばスタフィロコッカスマトリックス結合たんぱく質又は接着）。
【０１３４】
ある実施態様では、本発明のコンストラクトの抗原結合部分は、抗原又はそれを由来とするエピトープに結合するモノクローナル抗体である。このような抗体は、例えば当業で公知の通り、ここで挙げた病原体例などの病原体を認識するものであろう。モノクローナル抗体を作製する方法（例えば引用をもってここに援用することとするKohler and Milstein, Nature 256:495-497, 1975 and
Hurrell, J. G. R., Ed., Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and
Applications, CRC Press, Inc., Boca
Raton, Fla., 1982を参照されたい）や、免疫グロブリンをコードするDNAを骨髄腫細胞に安定に導入する技術（例えば Oi et†al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80:825-829, 1983; Neuberger, EMBO J. 2:1373-1378,
1983; and Ochi et†al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:6351-6355,
1983を参照されたい）は当業で公知である。In
vitro変異誘発法及びDNAトランスフェクションを含むこれらの技術により、組換え免疫グロブリンの構築が可能である。これらの技術を用いて、本発明の特定のコンストラクトで用いられる抗原結合抗体を作製することができる。
代替的には、この抗原結合抗体を市販の業者から得ることもできる。
【０１３５】
代替的には、本発明の特定のコンストラクトの抗原結合部分はポリクローナル抗体であってもよい。ポリクローナル抗体を調製する方法は当業で公知である（例えば引用をもってここに援用することとするSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second
Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照されたい）。当業者にとっては明白であるように、ポリクローナル抗体は、例えばウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ニワトリ、ウサギ、マウス、及びラットなど、多種の温血動物から作製することができる。本発明の特定のコンストラクトの抗原結合抗体はIgA、IgD、IgE、IgG、又はIgM クラスの抗体であってよい。
【０１３６】
ある実施態様では、抗原に結合する部分は、ある抗体の抗原結合部分から成る。ある実施態様では、プロテインＡに結合する該抗原結合部分はFcドメインを含まない。このようなフラグメントは、組換えにより作製及び操作しても、合成しても、あるいは、たんぱく質分解酵素で抗体を消化することにより作製してもよい。
【０１３７】
ある好適な実施態様では、該抗原結合部分は免疫グロブリン分子のFab、Fab’、(Fab’)2、又はFvフラグメントであってもよい。このようなFab、Fab’ 又はFv フラグメントは、例えば酵素プロセッシングにより完全抗体などから得ることができる。例えばペプシンは抗体をジスルフィド結合の下のヒンジ領域で消化して、軽鎖をジスルフィド結合でVH-CH1に接合したものから成る、Fabフラグメントの二量体である、この抗体の(Fab’)2 フラグメントを生じる。（Fab’)2 フラグメントを、穏和条件下で還元することで、ヒンジ領域のジスルフィド架橋を還元して、（Fab’)2 二量体をFab’ 単量体に転化させてもよい。Fab’ 単量体は基本的には、ヒンジ領域の一部を持つFabである。エピトープ、抗体及び抗体フラグメントの詳細な解説についてはPaul, ed.,
1993, Fundamental Immunology, Third Edition (ニューヨーク、レイブン・プレス刊)を参照されたい。当業者であれば、このようなFab’
フラグメントは、化学的か、又は組換えDNA技術を用いてde novoで合成できるであろうことは認識されよう。このように、ここで用いる場合の抗原結合部分という用語には、全抗体の改変により生ずる、抗体の抗原結合部分や、又はde novo合成されたものが含まれる。
【０１３８】
代替的には、このようなフラグメントを、ファージ・ディスプレイ・ライブラリから、アフィニティ・スクリーニング及びその後の組換え発現により得ることができる（例えば、引用をもってその全文をここに援用することとするWatkins et al., Vox
Sanguinis 78:72-79; 米国特許第5,223,409号及び第5,514,548号；PCT公報 No. WO
92/18619; PCT公報 No. WO
91/17271; PCT公報 No. WO
92/20791; PCT公報 No. WO
92/15679; PCT公報 No. WO
93/01288; PCT公報 No. WO
92/01047; PCT公報 No. WO
92/09690; PCT公報 No. WO
90/02809; Fuchs et al., 1991,
Bio/Technology 9:1370-1372; Hay et al.,
1992, Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85; Huse et al., 1989, Science 246:1275-1281; Griffiths et al., 1993, EMBO J. 12:725-734; 及びMcCafferty et al., 1990,
Nature 348:552-554を参照されたい）。
【０１３９】
更に別の代替法は「一本鎖」Fvフラグメントを用いることである。一本鎖Fv（scFv）フラグメントは多様な方法で作製することができる。Fvフラグメントの２つのドメインVL及びVHは別々の遺伝子にコードされているが、このVL及びVH領域が対になって一価の分子を形成しているような一本のたんぱく質鎖（一本鎖 Fv (scFv)として知られる；例えば Bird et al. (1988) Science 242:423-426;
及び Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照されたい）に作製できるようにする合成リンカにより、組換え法を用いてこれらを接合することができる。例えば VH のC末端を VLのN末端に連結することができる。典型的には、リンカ（例えば (GGGGS)4）をVH 及びVL間に配置する。しかしながら、鎖を連結する順序を逆転させてもよく、また検出又は精製を容易にするタグ（例えば Myc-、His-、又はFLAG-タグ）を含めることもできる（これらなどのタグは本発明のコンストラクトのいずれの抗CR1抗体又は抗体フラグメントにも付属させることができる：それらの使用はscFvに限られない）。 scFv のレビューについては Pluckthun in The Pharmacology of
Monoclonal Antibodies, vol. 113, 269-315 (Rosenburg and Moore eds.,
Springer-Verlag, New York 1994)を参照されたい。
【０１４０】
別の好適な実施態様では、一本鎖Fv（scFv）フラグメントを、例えばファージ・ディスプレイ抗体フラグメントのライブラリから、アフィニティ・スクリーニング及びその後の組換え発現により得ることができる。
【０１４１】
更に別の実施態様では、本コンストラクト分子の抗原結合部分は一本鎖抗体（scAb）である。ここで用いられる場合の一本鎖抗体（scAb）には、scFvを免疫グロブリン分子の定常κドメインなどの定常ドメインに融合させたものから成る抗体フラグメントが含まれる。別の実施態様では、本コンストラクト分子の抗原結合部分はFab、Fab'、(Fab')2、Fv、scFv、又はscAb フラグメントを、選択されたアミノ酸配列を含む所望の長さのリンカ・ペプチドに融合させたものである。好適な実施態様では、該リンカ・ペプチドは１、２、５、１０、又は２０個のアミノ酸から成る。
【０１４２】
代替的な実施態様では、本発明のコンストラクトで用いられる抗体は重鎖二量体又は軽鎖二量体であってよい。更に、抗体軽鎖又は重鎖、あるいはそれらの一部分、例えば単一ドメインの抗CR抗体（DAb）を用いることができる。
【０１４３】
抗体フラグメントという用語にはジアボディ（原語：diabodies）も含まれる。用語「ジアボディ」とは、２つの抗原結合部位を持つ小さな抗体フラグメントを言い、これらのフラグメントは、同じポリペプチド鎖（VH-VL）中の軽鎖可変ドメイン（VL）に接続された重鎖可変ドメイン（VH）を含む。同じ鎖上のこれら二つのドメイン間で対を形成するには短すぎるリンカを用いることで、これらのドメインに、別の鎖の相補なドメインとペアを作らせるように強制して、二つの抗原結合部位を生じさせる。ジアボディは例えば EP 404,097; WO 93/11161; 及び Hollinger et al., 1993 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-8に十二分に解説されている。
【０１４４】
ヒトでの免疫原性が低下するように作製又は変更された抗体（例えばキメラ抗体、ヒト化抗体、デイミュナイズド抗体、又は完全ヒト抗体）を本コンストラクトに含めることができることは理解されよう。このような抗体の作製技術は当業で公知であり、方法の例を下にCR1抗体について解説する。
【０１４５】
２．  可溶型の細胞受容体
本発明のある実施態様では、 抗原に結合する部分は細胞受容体を有する物質である。例えば特定のウィルスは、ウィルスの向性及び取り込みを担う特異的受容体を細胞上に有する。可溶型のこのような受容体を作製し、本コンストラクトに取り入れることができる。
【０１４６】
本発明のコンストラクトで用いてもよい細胞表面受容体のよく特徴付けられた例には、例えばHIVにはCD4 及びCCR5、多くのヒトライノウィルスにはICAM-1、ポリオウィルスにはPVR (ポリオウィルス受容体) 、多くのヒトコロナウィルスにはアミノペプチダーゼN 、HSVにはヘパラン硫酸部分及びおそらくはであるがEGFを含有する細胞表面プロテオグリカン、及びEBVにはCR2、があり、この前述のリストの受容体が最も広範に特徴付けられたものの一部である（Norkin 1995 Clin. Microbiol. Reviews 8: 293-315を参照）。一般的には、このような可溶型の細胞表面受容体分子の作製は、いずれの膜に広がる形の、及び／又は、膜に繋がれた形のたんぱく質と同様に、たんぱく質及び／又は当該たんぱく質をコードするヌクレオチド配列の切断（及び／又は膜アンカーの除去）を含むプロセスを介して、当該たんぱく質の膜貫通及び／又は膜アンカードメインの削除を行うことにより、行われよう。可溶型の細胞表面受容体のこのような作製は、例えばGreve, JM et al. 1991 J. Virol. 65: 6015-6023 及び Marlin SD et al. 1990 Nature 344:
70-72 (可溶型のICAM-1の作製)、及びSchooley RT et al. 1990 Ann. Intern. Med. 112: 247-253, Daar ES et al, 1990 Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 87:6574-6578, Kahn JO et al. 1990 Ann. Intern. Med.
112: 254-261, 及び O’Brien WA et al. 1990 Nature 348: 69-73 （組換えによる可溶型のCD4）などに記載されたような方法を含むであろう。これらの引用文献のそれぞれのないよう全体を引用をもってここに援用することとする。当業者であれば、可溶型のいずれの細胞表面受容体もこのような方法の使用を通じて作製できようことは理解されよう。
【０１４７】
３．  抗原結合低分子又は薬物
ある実施態様では、抗原に特異的に結合する低分子又は薬物を本発明のコンストラクトに取り入れることができる。例えば、アンホテリシンＢは主たる真菌細胞膜捨てロールであるエルゴステロールに優先的に結合することが知られている。この結合により、真菌の膜の浸透圧一体性が破壊されて、細胞内のカリウム、マグネシウム、糖、及び代謝産物が漏出して、その後細胞死に至る（引用をもってここに援用するTerrell, CL, and Hughes, CE, 1992 Mayo Clin
Proc. 67:69-91を参照）。ある実施態様では、本発明のコンストラクトはアンホテリシンＢを第二部分として含む。当業者であれば、抗原に特異的に結合する付加的な低分子又は薬物も、本発明のコンストラクトに用いてよいことは容易に認識されよう。
【０１４８】
ＩＩＩ．  本発明のコンストラクトの作製法
本発明は、CR2に結合しないCR1結合部分を含む第一部分と、抗原に結合する抗原又は分子を含む第二部分とを含むコンストラクトを提供するものである。
【０１４９】
本発明において、CR1特異的結合部分と、対する免疫応答が望まれる抗原、又は、それに結合する分子とを、例えば共有結合又は非共有結合により、当業で公知の方法を用いて連結することができる。連結法の例には、限定はしないが化学的架橋がある。更に別の実施態様では、本コンストラクト分子は、限定はしないがハイブリドーマ細胞株の融合を含む方法、組換え技術、及びたんぱく質transスプライシングを含め、化学的架橋以外の当業で公知の方法により、作製される。例えばそれら全ての全文を引用をもってここに援用することとするPCT 公報WO 02/46208 及びPCT 公報 WO 01/80883を参照されたい。本コンストラクトの第一及び第二部分を連結する手段の例を下に更に詳述する。
【０１５０】
Ａ．  架橋
本発明の具体的な実施態様では、本コンストラクトは、抗CR1 mAbを、対する免疫応答が望まれる一種以上の抗原に、又は、このような抗原に結合する一種以上の抗原結合分子に、架橋して含む。具体的な実施態様では、本コンストラクトは、抗CR1 mAbを少なくとも 1、2、3、4、5 又は 6 種の抗原又は抗原結合部分又は抗原結合分子に架橋して含む。好ましくは、CR1結合が損なわれないように抗CR1特異的部分が抗原に付着しているとよい。好適な実施態様では、本発明のコンストラクトは、CR1結合部分の由来となった元の天然CR1結合部分（例えば天然抗体） の活性（例えば親和性又は結合力）少なくとも 5%、15%、25%、50%、90% 又は99% のそれでCR1に結合するとよい。
【０１５１】
ある実施態様では、対する免疫応答が望まれる抗原、又は、抗原結合分子を、所定の部位で、CR1に結合する部分に付着させる。好ましくは、このような所定の部位は、CR1特異的抗体のCR1結合親和性と、対する免疫応答の亢進が惹起される当該抗原の抗原性が損なわれないように選択されるとよい。より好ましくは、このような所定の部位が、CR1特異的結合部分の表面上の部位（即ち、露出された部位）であるとよい。ある好適な実施態様では、その（又は）（原語：the or ）抗原結合分子をCR1特異的結合部分に、抗原及び／又はCR1結合部分中のシステイン残基に付着させる。
【０１５２】
二種以上の抗原又は抗原結合分子を、CR1に結合する一つの部分に架橋する場合、当該分子は同じであっても（例えば同じ病原性ペプチド及び／又は同じエピトープを由来とするなど）、又は、異なっていても（例えば異なる病原性ペプチドを由来とするなど）、あるいは同じ又は異なる抗原に結合するものでもよい。
【０１５３】
ある実施態様では、あるコンストラクトの２つの部分が架橋剤（架橋剤）により架橋することにより結合していることが好ましい。架橋化学法の例は当業で公知である。本発明のある好適な実施態様では、CR1結合部分と、抗原又は抗原結合部分とは、架橋剤スルホスクシンイミジル4 (N マレイミドメチル) シクロヘキサン1 カルボキシレート (sSMCC) 又は N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート (SATA)を用いて連結されている。本発明の別の実施態様では、CR1結合抗体と、抗原又は抗原結合分子を含む部分とが、ポリ-（エチレングリコール）架橋剤 (PEG)を介して結合している。この実施態様では、PEG部分はいずれの所望の長さも有することができる。例えばPEG 部分は200 乃至 20,000 ダルトンの範囲の分子量を有することができる。好ましくは、PEG部分は500 乃至1000 ダルトンの範囲、又は1000 乃至8000 ダルトンの範囲、より好ましくは3250 乃至5000 ダルトンの範囲、そして最も好ましくは約5000ダルトンの分子量を有するとよい。このようなコンストラクトは、架橋剤N-スクシンイミジル-S-アセチルチオアセテート (SATA) 及びポリ（エチレングリコール）-マレイミド、例えばモノメトキシポリ（エチレングリコール）-マレイミド（mPEG-MAL）又はNHS-ポリ（エチレングリコール）-マレイミド (PEG-MAL)を用いて作製することができる。PEGで連結された二重特異的分子などを作製する方法は、引用をもってここに援用することとする２００２年９月１６日出願の米国仮出願No. 60/411,731に解説されている。
【０１５４】
更に別の実施態様では、対する免疫応答の亢進を誘導する抗原、又は、このような抗原に結合する抗原結合分子は、適したホスト細胞により遊離チオールと一緒に作製され（例えばその全文を引用をもってここに援用することとするCarterの米国特許第5,648,237号を参照されたい）、本コンストラクトは、この遊離チオール含有抗原又は抗原結合部分を、例えばsSMCC誘導体化など、適宜誘導体化されたCR1結合部分に反応させることにより、作製される。遊離チオールを持つ、CR1に結合する部分を、直接、即ち、マレイミドなどの化学的架橋剤を用いずに、作製することもできる。例えば別の実施態様では、本コンストラクトは、抗原又は抗原結合分子にジスルフィド結合を介して結合されたモノクローナル抗CR1結合部分（例えば抗体）を含む。ある実施態様では、遊離チオールを有する抗原性又は抗原結合部分を、遊離チオールを持つCR1結合部分と混合することにより、このようなコンストラクトを作製することができる。
【０１５５】
Ｂ．  遺伝子融合
別の実施態様では、本コンストラクトは、化学的架橋を含まない方法により連結された、
CR1に結合する部分と、抗原及び／又は抗原結合部分とを含む。本発明の融合たんぱく質は、CR1特異的結合部分と、抗原又は抗原結合部分を含む第二部分とを含むキメラ分子である。融合たんぱく質は当業で公知の方法を用いて作製することができる。例えば本発明の融合たんぱく質を、米国特許第6,194,177号、PCT 公報 WO 02/46208；及びPCT 公報WO 01/80883で解説された通りに構築できよう。加えて、本融合たんぱく質は、ある一つの種の抗体由来の可変ドメインを、別の種の可変ドメインに置換してあるキメラ抗体を作製するために用いられる方法を利用して作製することができる。例えば EP 0 125 023; Munro, Nature 312: (13 Dec. 1984); Neuberger et al.,
Nature 312: (13 Dec. 1984); Sharon
et al., Nature 309: (24 May 1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984); Morrison
et al., Science 229:1202-1207 (1985); 及び Boulianne et al., Nature
312:643-646 (13 Dec. 1984)を参照されたい。一般的には、あるコンストラクトの第一部分をコードするDNAをPCRによりクローニングし、当該コンストラクトの第二部分をコードするDNAにインフレームでライゲートする。本融合たんぱく質をコードするDNAを、発現に向けてホスト細胞にトランスフェクトする。最終的なコンストラクトの配列は配列決定により確認することができる。ある実施態様では、本発明の融合たんぱく質の調製時に、第一部分をコードする核酸分子を、第二部分のN末端をコードする核酸分子にインフレームでC末端で融合することになるであろう。第二部分が第一部分のN末端に融合されるようなN末端融合も可能である。融合を行う正確な部位は重要ではない。当該分子の対生物活性、分泌、又は結合上の特徴を至適化するために、特定の部位を選択してよい。融合たんぱく質の他の作製法は、例えばWO0069913A1、WO0040615A2、米国特許第5,116,964 号及び第5,225,538号に教示されている。
【０１５６】
加えて、PCT 公報WO 01/80883 は、ハイブリドーマ細胞株の融合、組換え技術、及び、適したモノクローナル抗体から得られる重鎖及び軽鎖のin vitro再構築を含む方法により作製される二重特異的分子を解説している。PCT 公報WO 02/46208 はたんぱく質のtransスプライシングにより作製される二重特異的分子を解説している。
【０１５７】
Ｃ．  受容体リガンド相互作用
受容体とは、相補性塩基対の対合を含まない親和性ベースの相互作用によりリガンドに特異的に結合することのできる分子である。リガンド及びその対応する受容体（例えばEGF 及びEGFR、エストロゲン及びエストロゲン受容体、酵母アルファ因子及びアルファ因子受容体等）は特異的結合対を形成する。このような受容体−リガンドの相互作用の強さを、本発明の方法及び組成物の特定のコンストラクトで利用できると思われる。なぜなら、このような受容体−リガンドの対形成は、本発明のコンストラクトの第一及び第二部分間での連結を生じさせることができるからである。いずれかの充分に頑丈な受容体−リガンド相互作用を本発明の特定のコンストラクトで用いることで、このような連結を生じさせることができることは、当業者であれば容易に明白であろう。
【０１５８】
ＩＶ．  コンストラクトの精製及び検査
ある実施態様では、上に解説したような方法により作製されたコンストラクトを精製する。コンストラクトは、例えば分子サイズ又は特異的結合親和性又はこれらの組合せなどを用いて、当業者に公知のいずれかの方法により、精製することができる。ある実施態様では、DEAE、ハイドロキシアパタイト、燐酸カルシウム（概略的にはCurrent Protocols in Immunology, 1994, John Wiley & Sons, Inc.,
New York, NYを参照されたい）を含め、本発明のコンストラクトの単離に適したカラムを用いて、本コンストラクトをイオン交換クロマトグラフィにより、精製することができる。別の実施態様では、本コンストラクトをサイズ排除クロマトグラフィにより精製することができる。
【０１５９】
別の実施態様では、プロテインＡ結合領域を含むコンストラクトを３段階連続アフィニティ・クロマトグラフィで精製する（Corvalan and Smith, 1987, Cancer Immunol. Immunother., 24:127-132）：一番目のカラムは固体のマトリックスに結合させたプロテインＡから成り、この場合、コンストラクト中に存在する抗体のFc部分はプロテインＡに結合し、そして抗体はカラムに結合する；続いて二番目のカラムは、本発明のコンストラクト（例えばCR1又は抗原）が結合する部分が結合する相手である分子を固体のマトリックスに結合させて用いる；続いて三番目のカラムは、例えば対する免疫応答が亢進される抗原に対して抗体を提供するカラムなど、対する免疫応答の亢進が起きる部分の特異的結合を用いる。別の実施態様では、上記のステップのいずれかを個々に用いることができる。
【０１６０】
更に本コンストラクトを、サイズ排除HPLC及びアフィニティ・クロマトグラフィの組合せにより精製することもできる。ある実施態様では、サイズ排除HPLCから溶出した適した画分を、例えば本コンストラクトの抗原に、又は、本コンストラクトの抗原と相互作用することが公知の他の部分に、結合することのできる抗体など、本コンストラクトの抗原に特異的な分子を含有するカラムを用いて更に精製する。
【０１６１】
別の実施態様では、抗体又はその抗原結合部分、あるいは、免疫応答を誘導するための抗原、をコードするDNA配列を、短いペプチド・タグのDNA配列に融合させて細胞に導入し、「タグの付いたたんぱく質」を発現させる。このペプチド・タグに対する抗体は市販されているため、このような抗体を用いて当該たんぱく質を免疫親和性精製することができる。タグの例には、例えば FLAG（登録商標）、HA、HIS、c-Myc、VSV-G、V5 及び HSVがある。
【０１６２】
例えばそれが対象において抗原に対する免疫応答を誘導及び／又は亢進することができるかどうかなど、あるコンストラクトの活性は、当業で公知の適した方法により、検査することができる。
【０１６３】
本発明の多様なコンストラクトを配合して、コンストラクトの「カクテル」にすることができる。このようなコンストラクトのカクテルには、それぞれが、CR1結合部分を、抗原又は抗原結合分子の少なくとも一つのコピーに結合させて有するコンストラクト分子など含めることができる。例えば、当該のコンストラクト・カクテルが複数の異なるコンストラクト分子を含み、この場合、この複数の中の各異なるコンストラクト分子が、対する免疫応答が望まれる異なる抗原結合部分及び／又は抗原を含有する。このようなコンストラクト・カクテルは、個々の患者のニーズに従ってテーラーメードされた個人向け医療として有用である。代替的には、コンストラクトのカクテルには、それぞれが、CR1上の異なる部位に結合する異なる抗体など、異なるCR1結合部分を一つ以上の抗原又は抗原結合部分に結合させて有するようなコンストラクトを含めることができる。
【０１６４】
ＶＩ．  コンストラクトの特徴付け
本発明のコンストラクトは、当業で公知の多様な方法により特徴付けることができる。コンストラクトの収量は、たんぱく質濃度に基づき、特徴付けることができる。ある実施態様では、たんぱく質濃度はローリー検定を用いて判定される。好ましくは、本発明の方法で作製されるコンストラクトは、少なくとも 0.100 mg/ml、より好ましくは少なくとも
2.0 mg/ml、更により好ましくは少なくとも 5.0
mg/ml、最も好ましくは少なくとも 10.0 mg/mlのたんぱく質濃度を有するとよい。別の実施態様では、本コンストラクトの濃度は紫外線吸光度を測定することにより、判定される。濃度は２８０ｎｍでの吸光度として判定される。好ましくは、本発明の方法により作製されるコンストラクトが２８０ｎｍで少なくとも 0.14の吸光度を有するとよい。
【０１６５】
本発明のコンストラクトを、当業で公知の他の標準的方法を用いて特徴付けることもできる。例えばある実施態様では、高性能サイズ排除クロマトグラフィ(HPLC-SEC) 検定を用いて、例えば遊離IgGたんぱく質などの混入含有量を判定する。好適な実施態様では、本発明の方法により作製されるコンストラクトは、6.0 mg/ml未満、より好ましくは2.0
mg/ml未満、更により好ましくは0.5 mg/ml未満、最も好ましくは0.03 mg/ml未満の混入IgG濃度を有するとよい。 ある実施態様では、コンストラクトを、SDS-PAGEを用いて特徴付けて、当該コンストラクトの分子量を判定することができる。
【０１６６】
更に、当該コンストラクトを含む部分の機能的活性に基づき、コンストラクトを特徴付けることもでき、例えば対する免疫応答の亢進を狙いとする抗原に対する免疫応答を亢進する上でのコンストラクトの有効性などを、in vivo 又は in vitro モデルを用いて検査することができる。
【０１６７】
例えばある実施態様では、動物を微生物などに暴露し、CR1結合分子を抗原又は抗原結合分子に連結して含むコンストラクトで処理する。例えば抗体産生、Ｔ細胞活性化、生存、症状又は微生物数（コロニー又は感染性粒子の数）など、動物からの免疫応答の誘導及び／又は亢進の一つ以上のパラメータを評価し、本コンストラクトで処理されていない動物であるコントロール動物で観察されるそれと比較することができる。
【０１６８】
ある実施態様では、CR1への結合能を、固定したCR1受容体分子（微量定量プレートなどの固相に付着させたもの）をELISAで用いて判定する（その全文を引用をもってここに援用することとするPorter et al., 米国仮出願No. 60/380,211を参照されたい）。ある好適な実施態様では、高結合性平底ELISAプレート（Costar
EIA/RIA ストリップ・プレート 2592）などのELISA プレートを、適量の受容体重炭酸溶液と一緒にインキュベートすることにより、ELISAプレートを調製する。好ましくは、受容体重炭酸溶液の濃度は、5 mg/ml のCR1 受容体ストック（Avant Technology 社） 及び炭酸−重炭酸緩衝液 (pH 9.6、Sigma C-3041)から調製された0.2 g/mlであるとよい。 ある好適な実施態様では、100 ul の受容体−重炭酸溶液をELISAプレートの各ウェルに入れ、このプレートを４℃で一晩、インキュベートする。その後このプレートを好ましくは、例えば洗浄緩衝液 （PBS、0.1% Tween-20、0.05% 2-クロロアセトアミド）を用いて洗浄する。別の好適な実施態様では、この洗浄後、SuperBlock
Blocking Buffer のPBS (Pierce) 溶液をプレートに約３０乃至６０分間、室温で加える。次にこのプレートを乾燥させ、４℃で保存することができる。CR1には結合するがCR2には結合しない抗CR1特異的抗体又はコンストラクトの抗体価測定を、例えばヒト抗CR1 IgGを較正子として行うことができる。ある好適な実施態様では、この較正子ヒト抗CR1 IgG は 300 又は600 mg/mlの濃度を有する。ある実施態様では、本発明のコンストラクトの精製済み組成物の抗体価測定を、PBS、0.25% BSA、0.1% Tween-20 を希釈剤緩衝液とし、PBS、0.1% Tween-20、0.05% 2-クロロアセトアミドを洗浄緩衝液とし、ELISAにはTMB-Liquid
Substrate System (3,3’, 5.5’-テトラメチル−ベンジジン) 及び2N H2SO4
を停止溶液として用いて行う。好ましくは、本発明の方法により作製されるコンストラクト組成物は、このような検定で少なくとも 0.10 mg/ml、より好ましくは少なくとも
0.20 mg/ml、更により好ましくは少なくとも 0.30
mg/ml、及び最も好ましくは少なくとも 0.50
mg/mlの抗体価を有するとよい。いくつかの実施態様では、特異的活性を判定する。当該の特異的抗CR1抗体活性とは、ローリー又はいずれか他のたんぱく質検定で判定したときの抗体価、対、濃度の比である。
【０１６９】
抗原−結合活性は、例えば固定した抗原分子を用いるなどして、ELISAを用いて判定することができる。
【０１７０】
ＶＩＩ．  本発明のコンストラクトの使用
本発明のコンストラクトは、病原性及び／又は疾患関連抗原性分子、新生物成長、又は毒素の存在に伴う疾患又は障害又は他の望ましくない状態を治療又は防止する上で有用である。
【０１７１】
治療又は予防を目的として本発明のコンストラクトを投与するのに適した対象には、限定はしないがヒト以外の動物を含む哺乳動物（例えばウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ラット等）があり、ある好適な実施態様では、ヒト又は非ヒト霊長類である。ある実施態様では、本発明のコンストラクトを予防的に用いて、病原体に感染するリスクのある対象を処置する。別の実施態様では、本発明のコンストラクトを治療的に用いて、循環毒素を持つ病原体感染のある、及び／又は、癌のある、対象を治療する。別の実施態様では、本発明のコンストラクトを用いて、対象が病原体及び／又はそれを由来とする抗原に対して免疫を生じるように、前記病原体又はそれを由来とする抗原に対して対象を免疫する。
【０１７２】
具体的な実施態様では、感染性疾患及び／又はそれに伴う症状を、本発明のコンストラクトの投与により治療又は防止する。
【０１７３】
ある実施態様では、本発明のコンストラクトを用いて感染のリスクの高い対象を処置する。別の実施態様では、本発明のコンストラクトを用いて免疫無防備状態の患者を処置する。別の実施態様では、本発明のコンストラクトを用いて、外科的手法又は留置装置の移植前に対象を処置する。
【０１７４】
別の実施態様では、本発明のコンストラクトを用いて菌血症の対象を治療する。別の実施態様では、本発明のコンストラクトを用いて対象の院内感染を治療する。更に別の実施態様では、本発明のコンストラクトを用いて、抗生物質耐性生物への感染を治療する。
【０１７５】
いくつかの実施態様では、本発明のコンストラクトを用いて対象における免疫応答を誘導する。対象におけるこのような応答の誘導は、例えばin vitro検定の実施、例えばＴ及びＢ細胞活性化を検出するようにデザインされた検定（例えばELISAまたは他の当業で公知の抗体検出検定により）などにより、測定することができる。更に、本発明のコンストラクトにより対象で誘導された免疫応答の誘導を、例えば処置済みの対象の病原性抗原などへのその後の感染耐性能を評価するなどの公知の技術を用いてin  vivoで、及び／又は、未処置の対象における病原性抗原又は腫瘍に伴うであろう症状、罹患率及び／又は死亡率を測定するなどproxyで、測定することもできよう。
【０１７６】
ある実施態様では、本発明のコンストラクトをワクチンとして用いて、再発性感染のリスクのある対象又は再発性感染を有する対象を治療する。ある実施態様では、本発明のコンストラクトを予防ワクチンとして投与する。別の実施態様では、本発明のコンストラクトを治療ワクチンとして投与する（例えば病原体への感染後のいずれかの時点で投与するなど）。好ましくは、本発明のコンストラクトを投与すると、防御的免疫応答が起きるとよい。防御的免疫応答は、防御された対象（即ち、本発明のコンストラクトで処置された対象）の免疫血清が第二の対象を受動的に保護する能力により実証することができる。
【０１７７】
:
別の実施態様では、本発明のコンストラクトをワクチン・アジュバントとして用いることができる。ある実施態様では、本発明のコンストラクトを抗原（例えば精製済み細菌抗原又は弱毒化された病原体）と一緒に、選択的には本コンストラクトの抗原部分に加えて、投与する。
【０１７８】
更なる実施態様では、本発明のコンストラクトを用いて哺乳動物の循環及び／又は組織から抗原を除去する。循環からの抗原除去の測定は当業で公知の技術を用いて測定することができる。同様に、処置済みの哺乳動物の一種以上の組織からの除去の測定を、in vivo でも、又は in
vitro でも判定できよう。例えば処置済みの対象からの抗原除去のin vivo の判定は、例えば生検又は他の侵襲的な組織／器官観察法を含んでもよく、あるいは代替的には、MRI、CAT又は他の当業で公知の画像法など、（選択的には標識済みの）抗原の除去の検出などを通じた、非侵襲的な除去検出を含んでもよい。処置済みの哺乳動物の組織からの抗原除去の in vivo 評価は、処置済みの対象がその後、病原性抗原に抵抗する能力を評価する方法、及び／又は、未処置の対象で病原性抗原に伴うであろう症状、罹患率及び／又は死亡率の測定など、proxyで行われてもよい。本発明のコンストラクトを用いた抗原の組織除去のin vitro 判定は、例えば抗体媒介型抗原検出法、抗原の活性検出などを含む、当業で公知のこのような検出手段のいずれかにより、抗原の存在に関する生検（及び／又は全組織及び／又は器官）組織の評価などを通じて行えよう。抗原除去を、処置済みの哺乳動物のいずれか及び／又は全ての組織及び／又は器官で評価してよい。
【０１７９】
ある実施態様では、対象を本発明のコンストラクトと、感染を治療及び／又は症状を軽減するようにデザインされた少なくとも一つの他の治療薬とで処置する。別の実施態様では、対象を本発明のコンストラクトのみで処置する。
【０１８０】
ＶＩＩＩ．  医薬調合物及び投与
本発明のコンストラクトを、投与に適した医薬組成物中に取り入れることができる。このような組成物は、典型的には、コンストラクト及び薬学的に許容可能な担体を含む。ここで用いられる場合の言語「薬学的に許容可能な担体」には、薬学的投与に適合性ある、例えば溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤及び抗カビ剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性な物質のためのこのような媒質及び薬剤の使用は当業で公知である。補助的なコンストラクトも組成物中に取り入れることができる。
【０１８１】
本発明の医薬組成物は、それに意図された投与経路に適合性があるように調合される。好適な投与経路は静脈内である。投与経路の他の例には、筋肉内、非経口、皮内、皮下、経皮（局所）、及び経粘膜がある。非経口、皮内、又は皮下適用に用いられる溶液又は分散液には、以下の成分を含めることができる：注射用の水、生理食塩水、非揮発性の油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール又は他の合成溶媒などの無菌の希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩などの緩衝剤や、塩化ナトリウム又はデキストロースなど、張性の調節のための作用薬。ｐＨは、例えば塩酸又は水酸化ナトリウムなどの酸又は塩基で調節することができる。非経口用の製剤は、ガラス製もしくはプラスチック製のアンプル、使い捨て用シリンジ又は多人数用バイアル内に封入することができる。
【０１８２】
注射用に適した医薬組成物には、無菌の水溶液（水溶性の場合）又は分散液や、無菌の注射用溶液又は分散液の即時調製用の無菌粉末がある。静脈内投与の場合、適した担体には生理食塩水、静菌水、Cremophor EL TM（BASF社；ニュージャージー州パーシパニー）、又はリン酸緩衝生理食塩水（PBS）がある。好ましくは、本組成物は無菌であるとよいが、粘性が低く、かつ、当該のコンストラクトが注入可能である程度に、流動性でなくてはならない。製造及び保管条件下で安定であることが好ましく、また細菌及びカビなどの微生物の汚染作用から保護されていなくてはならない。
【０１８３】
担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等）及びこれらの適した混合物などを含有する溶媒又は分散媒であってよい。適正な流動性は、例えばレシチンなどのコーティングを用いたり、分散液の場合には必要な粒子サイズを維持したり、そして界面活性剤を用いるなどにより、維持することができる。微生物の作用を防ぐには、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等の多種の抗菌剤及び抗カビ剤により、達成が可能である。多くの場合、例えば糖類、マンニトールなどの多価アルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物中に含めることが好ましいであろう。注射用組成物の吸収を長引かせるには、本組成物中に、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど、吸収を遅らせる作用薬を含めることにより、可能である。
【０１８４】
無菌の注射用溶液は、必要量の当該の本コンストラクト（例えば一種以上のコンストラクト）を、適した溶媒に、必要に応じて上に列挙した成分の１つ又は組合せと一緒に取り入れた後、濾過滅菌することにより、調製することができる。一般的には、分散液は、本コンストラクトを、塩基性の分散媒と、上に列挙したものの中の必要な他の成分とを含有する無菌の賦形剤に取り入れることにより、調製される。無菌の注射用溶液の調製用の無菌粉末の場合、好適な調製法は真空乾燥及び凍結乾燥であり、その結果、活性成分と、予め無菌濾過されたその溶液から出る付加的な所望の成分との粉末が生ずる。
【０１８５】
ある実施態様では、本コンストラクトは、インプラント及びマイクロ封入送達系を含め、制御放出調合物など、身体から当該化合物が急速に消失しないように保護するであろう担体と一緒に調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸などの生分解性で生体適合性あるポリマを用いることができる。このような調合物の調製法は当業者に明白であろう。材料はまた、アルザ・コーポレーション及びノヴァ・ファーマシューティカルズ社から市販のものを得ることもできる。（ウィルス抗原に対するモノクローナル抗体で、感染細胞に標的決定されたリポソームを含む）リポソーム懸濁液も、薬学的に許容可能な担体として用いることができる。これらは、例えば引用をもってその全文をここに援用することとする米国特許第4,522,811号に解説されたように、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１８６】
投与を簡便にし、また投薬量を均一にするために、非経口用組成物を単位剤形で調合すると有利である。ここで用いる単位剤形とは、治療しようとする対象にとって単位型の投薬量として適合させた物理的に別個の単位を言う。各単位は、必要な薬品用担体との関連から所望の免疫応答及び／又は治療効果を生ずるよう計算された所定量のコンストラクトを含有する。本発明の単位剤形の詳細は、当該コンストラクトの固有の特徴、及び、達成しようとする特定の治療効果、並びにこのようなコンストラクトを、個体の予防及び／又は治療に向けて配合する技術に内在する限界、によって決定され、またこれらに直接依存する。
【０１８７】
当該の医薬組成物は、キット、容器、パック、又はディスペンサ内に、投与に関する指示と一緒に含めることができる。
【０１８８】
本発明のコンストラクトを単独で投与しても、あるいは付加的な薬剤と組み合わせてホストに投与してもよい。本発明のいくつかの実施態様では、このような付加的に投与される薬剤には、例えば抗原、化学療法薬、抗生物質、抗ウィルス薬等が含まれよう。
【０１８９】
本発明の具体的な実施態様（特に、CR1特異的結合部分を、抗原結合フラグメントを含む第二部分に連結して含むコンストラクトを特徴とするもの）では、本発明のコンストラクトを投与する哺乳動物に抗原を付加的に投与してもよい。このような投与は、この付加的に投与された抗原に対する免疫応答を予防的及び／又は治療的の両方で上昇させるために、行うことができる。このような抗原投与のタイミングは、本発明のコンストラクト分子の投与の前でもよく、当該抗原投与と同時行ってもよく、あるいは当該抗原投与後に行ってもよい。
【０１９０】
本コンストラクトを、当業者が適切と判断する経路で送達することができる。例えば本コンストラクトを皮下、上皮、皮内、筋肉内、静脈内、経粘膜（例えば鼻腔、直腸及び膣）、腹腔内、経口又はこれらの組合せで投与してよい。好ましくは、本コンストラクトを経粘膜送達するとよい。より好ましくは、本コンストラクトを鼻腔内、膣内、又は直腸内送達するとよい。
【０１９１】
担体も本発明のコンストラクトと一緒に用いてよい。担体は当業で公知であるが、その中には、例えばチオグロブリン、ヒト血清アルブミンなどのアルブミン、破傷風毒素、ポリLリジン、ポリL-グルタミン酸等などのポリアミノ酸などがある。担体には水又は生理食塩水、好ましくはリン酸緩衝生理食塩水などの生理的に寛容可能な（即ち許容できる）希釈剤を含有させてよい。更に本コンストラクトをアジュバントと一緒に投与してもよい。不完全フロイントアジュバントなどのアジュバント、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、又は明礬は当業で公知の材料の例である。
【０１９２】
別の実施態様では、本発明のポリヌクレオチド組成物を用いてたんぱく質を合成させることもできる。このようなポリヌクレオチドを、一種以上の遺伝子ベクタを用いて送達し、標準的な遺伝子送達プロトコルを用いた核酸免疫処理等により、投与することができる。遺伝子送達の方法は当業で公知である。例えば米国特許第5,399,346号、第5,580,859号、第5,589,466号を参照されたい。本発明の実施において用いてもよい例示的な複製欠損遺伝子送達伝播体は、例えば米国特許第6,342,372号；第6,329,201号及び国際公報 WO 01/92552などに解説されたアルファウィルス・ベクタのいずれかである。
【０１９３】
本発明のコンストラクトの投与のための用量は、慣例的な検査をすれば当業者であれば判断することができる。ヒトへの投与前に、動物モデルで効験を示すことが好ましい。当業で公知の免疫応答を生じるいずれの動物モデルも用いることができる。より具体的には、本コンストラクトの用量は、免疫細胞濃度や、本発明のコンストラクトに結合するCR1エピトープ部位の数に基づいて決定することができる。
【０１９４】
ここで定義する場合、あるコンストラクトの治療上有効量（即ち有効な投薬量）は、約0.001 乃至 50 mg/体重1kg、好ましくは約0.01 乃至5 mg/体重1kg 、より好ましくは約0.1 乃至 2 mg/体重1kg、そして更により好ましくは約0.1 乃至 1 mg/kg、0.2 乃至 1 mg/kg、0.3 乃至 1 mg/kg、0.4 乃至 1 mg/kg、又は0.5 乃至 1 mg/体重1kg の範囲である。
【０１９５】
当業者であれば、疾患又は障害の重篤度、以前の治療、対象の全身の健康及び／又は年齢、並びに他の既往症を含め、いくつかの因子が、対象を有効に治療するために必要な投薬量に影響すると考えられることは理解されよう。更に、治療上有効量の本発明のコンストラクトによる対象の治療には、一回の治療を含めることができるが、好ましくは一連の治療を含めることができるとよい。ある好適な例では、対象を、約0.1 乃至 5 mg/体重1kg の範囲のコンストラクトで１週間に１回、約1 乃至10 週、好ましくは2 乃至 8 週、より好ましくは約 3 乃至 7 週、そして更により好ましくは約4、5、又は 6 週の間、治療する。更に、治療に用いられるコンストラクトの有効な投薬量を、ある特定の治療経過にわたって増減させてもよいことも理解されよう。投薬量の変更があってもよく、また、ここで解説する通りの診断検定の結果から明白になるであろう。
【０１９６】
コンストラクト薬剤の適した用量は、通常の技術を持つ医師、獣医、又は研究者の知見の範囲内にある多くの因子に依存すると考えられる。本コンストラクトの用量は、例えば処置しようとする対象又は試料の種類、大きさ及び状態に応じて、更には、該当すれば本組成物を投与する経路、そして開業医が本コンストラクトに望む免疫応答に対する効果にも応じて、様々であろう。
【０１９７】
更に、コンストラクトの適した用量は、対する免疫応答の亢進が起きる抗原性部分に対する当該コンストラクトの効力に依存するとも、理解される。このような適した用量は、ここで解説する検定を用いて判定できよう。抗原に対する免疫応答を亢進するために、これらのコンストラクトのうちの一つ以上を動物（例えばヒト）に投与する場合、医師、獣医、又は研究者は、例えばまず比較的に低用量を処方し、その後、適した応答が得られるまでこの用量を増加させていってもよい。加えて、いずれか特定の動物の対象にとっての具体的な用量レベルは、用いるコンストラクトの活性、対象の年齢、体重、全身の健康、性別、及び食事、投与時間、投与経路、排出速度、いずれかの薬物の組合せ、及び、対する免疫応答を亢進させる抗原の濃度を含む多種の因子に依存するであろうと理解される。
【０１９８】
ＩＸ．  キット
本発明は、本コンストラクトを含有する、又は、本発明のコンストラクトを作製するために必要な成分を含有する、キットを提供するものである。本発明の医薬組成物を含有するキットも提供される。
【０１９９】
ここで引用された全参考文献（例えば書籍、会報記事、発行済み特許、及び特許公報を含む）の全文を、各個々の公開文献又は特許又は特許出願を具体的かつ個別に、あらゆる目的でその全文を引用をもって援用すると示唆した場合と同じ程度に引用をもってここに援用することとする。
【０２００】
本発明の多くの改良及び変更を、当業者には明白であるように、その精神及び範囲から逸脱することなく行うことができる。ここで解説された具体的な実施態様は、例示を目的として提供されたのであり、本発明は、添付の請求項の観点を、そのような請求項の及ぶ均等物の全範囲と併せたものによってのみ、限定されるものとする。
【０２０１】
実施例
実施例１．  スタフィロコッカス-アウレウスに対する、該病原体を不活性化するためのプロテインＡモノクローナル抗体を用いて作製された二重特異的分子の使用
Ｓ．アウレウスによる致死性攻撃の動物モデルが開発されるであろう。このモデルを用いて、プロテインＡ  Mabを用いて作製された二重特異的分子が、その標的病原体Ｓ．アウレウスを不活性化することができるであろうという仮説が調べられるであろう。用いる抗Ｓ．アウレウスMabは抗プロテインＡ Mab （カタログ番号 P 2921、ミズーリ州セントルイス）である。このMab はプロテインＡであると思われる。なぜならプロテインＡは動物でも、又はヒトでも、いずれの表面たんぱく質への結合にも関与しているとは知られていないからである。抗プロテインＡ Mab を抗補体受容体タイプ 1
(CR1) Mab 7G9 に架橋することにより作製されるヘテロ重合体（ＨＰ）は、Ｓ．アウレウスを赤血球(E)表面に除去するであろう。前述のＨＰ作用モデルに基づくと、 E:HP:Ｓ．アウレウス複合体は肝臓内の固定組織マクロファージ（クッパー細胞）に除去されることになるが、他方、免疫複合体（CR1:HP:Ｓ．アウレウス）は破壊されることになる。他方、Mab のみでは、致死性Ｓ．アウレウスによる抗原からマウスを防御する上ではそれほど有効ではなかったであろう。なぜなら（ｉ）プロテインＡは組織浸潤に関与しておらず、そして（ｉｉ）この生物の表面上のプロテインＡの密度は比較的に高く、表面上のたんぱく質のすべてがMabによって遮断されるわけではないと考えられるからである。Mab単独とは対照的に、HPが有効になるためには、プロテインＡの全てが結合する必要はない。なぜなら数少ないHPでもこの微生物をEに繋ぎ止め、この病原体を不活性化することができるからである。
【０２０２】
方法：
この実験の目的は、Ｓ．アウレウスを注射されたCR1トランスジェニック・マウスで死亡を防ぐ上で二重特異的分子、対、Mabの効験を判定することである。CR1マウスに、PBS、Mab 又は二重特異的分子 IVのうちのいずれかが注射された後、Ｓ．アウレウス IVが注射されるであろう。群の大きさは 10 マウス／群であろう。
【０２０３】
Ｓ．アウレウスのストック培養株を調製し、分取し、−８０℃で凍結させることになるであろう。解凍後の細菌を前もって力価測定することになるであろう。注射の当日、細菌を注射に向けて希釈し、再度、力価測定することになる。動物（例えばマウス）に生理食塩水、HP又はMabを総量100μlにして静脈内注射する。１時間後にＳ．アウレウスを総量100μlにして静脈内注射する。注射後２１日目まで、又は死亡するまで、動物を観察する。２１日間、動物を死亡までの時間（TTD）について１日当り２回、観察することになる。瀕死になった動物を安楽死させる。この実験デザインの概要を表８に示す。
【０２０４】
【表１】
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【０２０５】
表８：  致死性Ｓ．アウレウス抗原に対する防御の上でのHP対Mabの効験を判定する動物モデルでの研究
【０２０６】
実施例２．  攻撃前又は後の抗プロテインＡ
HPの投与はマウスを致死性Ｓ．アウレウスから防御する
マウスMAb 7G9 (抗-DR1) をマウス抗プロテインＡ SpA-27 モノクローナル抗体 （カタログ番号 P 2921、ミズーリ州セントルイス、Sigma
Aldrich社）に化学的に結合させて二重特異的分子を作製した。簡単に説明すると、MAb 7G9 をマレイミドへテロ二重官能性架橋剤 SMCCで活性化した。抗Ｓ．アウレウスMAbをチオールへテロ二重官能性架橋剤SATAで活性化した。次に、7G9-マレイミド及びspa-27-スルフヒドリル修飾たんぱく質を反応させて、チオエーテル結合した二重特異的分子結合体を作製した。生成物をサイズ排除クロマトグラフィにより高分解能Sephacryl 300ＡＥカラムを用いて精製した。
【０２０７】
二重特異的分子により媒介される、Ｓ．アウレウスのマクロファージへの送達があると、in vitroでは殺菌活性が亢進する。培地、可溶性SpA-27、又はSpA-27 二重特異的分子をRBC及びＳ．アウレウスと一緒にインキュベートした。その後、これらの反応混合物をRAW 264.7 マクロファージと一緒に９０分間、インキュベートした。RBCを溶解させ、マクロファージを洗浄した。マクロファージを０時間目、１時間目、２時間目、３時間、４時間目、及び５時間目に溶解させ、そのライセートを寒天プレート上に塗って、Ｓ．アウレウス・コロニ数を得た。データは、５時間目の時点で、二重特異的分子と一緒にインキュベートした場合に、マクロファージに内部移行したＳ．アウレウスに統計上有意なコロニ数の減少があったことを示す。このように、この二重特異的分子系によりマクロファージへＳ．アウレウスが送達されると、マクロファージの殺菌活性が亢進する。
【０２０８】
致死量（LD50の１０倍のＳ．アウレウス株MW2）のＳ．アウレウスの攻撃を受けた抗Ｓ．アウレウスプロテインＡ二重特異的処置済みマウスの生存に対する防御効果を調べた。１群当り１０匹のマウスに、抗Ｓ．アウレウスプロテインＡ二重特異的（1-16μg／マウス）、抗Ｓ．アウレウスプロテインＡモノクローナル抗体（50μg／マウス）又はＰＢＳPBSを静脈内投与した。これらのマウス群の生存を２８日間の期間にわたって観察したが、完全な生存4μg／マウス、8μg／マウス、及び16μg／マウス（図１）の二重特異的分子用量を投与されたマウスで観察された。1μg／マウスという低い抗Ｓ．アウレウス二重特異的分子を投与した場合にも有意な防御が提供された。遺伝的に異なるＳ．アウレウス株13301で攻撃しても、同様に防御的だった。従って二重特異的分子は、Ｓ．アウレウス抗原に対して有効な予防薬である。
【０２０９】
致死量（LD50の１０倍のＳ．アウレウス株MW2）のＳ．アウレウスの攻撃を受けた抗Ｓ．アウレウスプロテインＡ二重特異的処置済みマウスの生存に対する治療効果を調べた。１群当り１０匹のマウスに、マウスにLD50の１０倍のＳ．アウレウス株MW2の攻撃をしてから６時間後に二重特異的分子又はPBSのいずれかを静脈内投与した。この二重特異的分子治療を施されたマウス群に、生存に対する治療的効果が観察された（図２）。
【０２１０】
実施例３．  二重特異的分子による防御で、強固な防御的免疫応答が発生する
１群当り５匹のマウスを、LD50のほぼ１０倍の用量のＳ．アウレウス株MW2又は13301による攻撃から３０乃至４５分前に二重特異的分子を投与して攻撃した。２８日目にこれらのマウスをLD50のほぼ１０倍の用量のＳ．アウレウス株MW2又は13301で再攻撃した。二重特異的分子で処置されたマウス群の全てに対するHP投与の防御効果は２８日目のこの再攻撃を通じても存続した（図３）。
【０２１１】
Ｓ．アウレウスによる最初の攻撃後から２８日目に、二重特異的分子で処置されたマウス（１群当り５匹）をＳ．エピデルミディス（原語：S. epidermidis）（株10683）で再攻撃しても、防御的であることが観察された。１０８CFU／マウス（最高LD50の１０倍）のＳ．エピデルミディスにより２８日目に再攻撃を受けたマウスはすべて、この再攻撃を生き延びたことが観察された（図４）。二重特異的分子は、これらのマウスの最初の攻撃から３０乃至４５分前に投与された。このように、二重特異的分子投与の持続的な防御効果は、Ｓ．エピデルミディスによる二回目の攻撃に対して有効であることが観察された。
【０２１２】
二重特異的分子による処置を受けたマウスの、Ｓ．アウレウスによる最初の攻撃時の抗体応答を調べた。未処置又は二重特異的分子処置群。それぞれ５匹のマウスの群にＳ．アウレウスで攻撃した後、抗Ｓ．アウレウス（図５Ａ）又は抗Ｓ．エピデルミディス（図５Ｂ）抗体応答について調べた。二重特異的分子で防御されたマウスは、２８日目までに、未処置マウスの抗体価の５乃至１０倍の抗体価を生じた。Ｓ．アウレウスによる再攻撃後、これらのマウスは強固な抗体応答を生じ、再攻撃から７乃至１４日目までに未処置マウスでの抗体価の２０乃至２５倍になった。これらの抗体はＳ．エピデルミディスと交差反応した。このように、二重特異的分子による処置を受けたマウスは、様々な株のＳ．アウレウスやＳ．エピデルミディスによる再攻撃に対して免疫があった。
【０２１３】
実施例４．  抗プロテインＡ HPコンストラクトを投与すると、血液及び標的器官からＳ．アウレウスが除去される
Ｓ．アウレウス注射後のマウスの血液及び標的器官からのＳ．アウレウスを除去する上でのStaphA HP分子（抗プロテインＡ HPコンストラクト）の効験を調べた。マウスにPBS 又はStaphA HP（マウス１匹当り12μg）を注射し、１時間後にＳ．アウレウス株MW2（マウス１匹当り１０６cfu）で攻撃した。３０分の時点で採集された最初の血液試料は、HP- 及び PBSを注射したマウス（5-8 x １０３)と同様な細菌数を示した。その後、血液試料を攻撃からほぼ８４時間目に採集し、血液採集後にマウスをと殺した。すべての血液試料を寒天プレート上に塗ってcfu数を判定した。各マウスの腎臓、肝臓及び脾臓を均質化させ、cfu数用に塗った。StaphA HP 分子又はPBS のいずれかを投与されたマウスはプレート上で何のコロニも示さず、StaphA HP 群又はPBS 群のいずれにも血液中に細菌がいないことが示唆された。StaphA HP 分子を投与されたマウスは、肝臓、腎臓及び脾臓というＳ．アウレウス標的器官からのＳ．アウレウスの驚くほど強力な除去を示した（図６を参照）。検査した３つの器官すべてで、cfu 数はPBS 群の方がStaphA HP 群よりも有意に高かった。StaphA HPを投与されたマウスの腎臓及び脾臓では検出可能な数はなく、肝臓での細菌数はバックグラウンドに近かった。１器官当りで最高４log単位のcfu数減少があった。このように、StaphA HP 分子は、血液及び標的器官の両方からＳ．アウレウスを除去する上で非常に有効だった。
【０２１４】
実施例５．カンジダ感染のカンジダHPコンストラクトを用いた有効な治療
全身性カンジダ-アルビカンス（原語：Candida albicans ）感染を除去するようにデザインされたHPを作製し、検査した。同じ表面抗原を認識する二種の異なるモノクローナル抗体を用いて二種のHPを作製した。これらの抗体のうちの一つ C3.1は、動物研究で前に用いられたことがあり、部分的に防御的であることが示された IgG3である。二つ目のMAbであるG11.1は、前に非防御的であることが示されたIgG1 である。効験研究をヒトCR1についてトランスジェニックなマウスで行った。動物（１０匹／群）にPBS、G11.2 HP （20μg／マウス）又は C3.1 HP （20μg／マウス）を投与してから１時間後に致死性Ｃ．アルビカンスを尾の静脈に静脈内投与（１×１０６cfu／マウス）して攻撃した。正のコントロールとして、１群のマウスをアンホテリシンの脂質調合物であるアンビソーム（4mg/kg）で１乃至１４研究日に毎日一回、処置した。そのデータを解析し、Kaplan-Meier 生存表として提供した。
【０２１５】
Ｃ．アルビカンス抗原（１×LD100）と一致して、PBSを投与されたすべてのマウスが４日目から８日目の間に死亡した。正のコントロールであるアンビソーム処置されたマウスのすべてが研究日１４日目まで生き延びた。カンジダHPで処置された動物は有意な生存率と、死亡の遅延を示した。C3.1 HP は４０％の生存率を提供し、死亡は３日目から１３日目の間に起きた。この結果はPBS (P=.0123) 及びアンビオソーム（P=.0025）処置マウスとは有意に異なった。興味深いことに、これらのC3.1 HP処置マウスは、統計上有意な違いをG11.1 HP処置マウスに対して示した (P<.0001)。G11.1 HP は40%の生存率を提供し、死亡は８日目、１０日目及び１４日目に起きたが、この結果は PBS (P=.0004)処置マウスからは有意に異なるが、アンビオソーム（P=.0.0700）処置マウスからは有意に異ならない。
【０２１６】
これらのデータは、Ｃ．アルビカンス上の表面エピトープに対する抗体を含むHPが有効な治療薬であることを実証している。この結果はまた、抗Ｃ．アルビカンス抗体が防御的であることは有効な薬物を作製するためには必要でないことも示した。
【０２１７】
実施例６．  CR1結合部分を含むコンストラクトによるワクチン接種
組換え防御抗原（PA）をCR1に標的決定すると、Ｂ．アンスラシスの非被包性弱毒化株を水酸化アルミニウムに組み合わせた無細胞濾液(Puziss, 1963)を含有する、又は、組換えPAを水酸化アルミニウムに配合した無細胞濾液を含有する、炭疽菌用の既存のワクチンの安全で有効な代替物となる。CR1に結合する部分をPA又はPA由来抗原に付着させた部分を持つ分子により、防御的免疫応答の発生を可能にすることができる。マウス・モデル系を用いることで、ヒトCR1についてトランスジェニックなマウスを、PA（例えば10μg/マウスの用量で静脈内）のみで、PA中和化抗体（MAb；例えば5μg／マウスを静脈内）の存在下でPA（例えば10μg/マウスを静脈内）で、あるいは、CR1に結合する部分をPA又はその抗原性フラグメントに付着させて含む分子（例えば10μg／マウスを静脈内）で、ワクチン接種する。このワクチン接種後、血液試料をこのマウスから最初の処置から７日目に採集し、そして再度、２回目のワクチン追加接種から７日目に採集する。
【０２１８】
その後、ワクチン接種に応答したTgN hCR1
マウスの、PAに対する中和化抗体の産生を検定する。まず、PA競合的ELISAを行うが、この際、マウス血清を希釈し、PAで被覆したプレート上に塗る。インキュベート後、HRP （西洋わさびペルオキシダーゼ）結合体-14B7 を加えた後、TMBを加え、このプレートを450 nmで読み取る。個のデータを、O.D1.5を生じるために必要な抗体価として報告することができる。
【０２１９】
炭疽致死性毒素 (LeTx) 中和検定をワクチンの検査として行う。マウスマクロファージ細胞系 J774A.1 は、LeTxによる急速な細胞溶解へのその感受性が知られているため、毒素中和検定に用いられている (Little, 1990)。細胞の生存力をテトラゾリウムMTTでのシグナルとして測定する。J774.1 細胞の完全な及び／又は50%の致死に必要なPA及びLFの最小濃度を判定する（例えばおそらく数値は、完全な致死の場合は0.16μg/mlの範囲内の各たんぱく質であり、50%の致死の場合には0.026μg/mlの各たんぱく質である）。毒素の中和の場合、血清をLeTx と一緒に１時間、３７℃でプレインキュベートし、その混合液を、マクロファージを含有するウェルに加え、そしてインキュベートを４時間、３７℃で進行させる。データは、Mohamedらが報告した、デイミュナイズド抗PA抗体であるAnthimに対する比例関係で報告することができる(Mohamed, 2005)。
【０２２０】
PAを認識する抗体の存在について、競合的ELISAで、そして血清の致死性毒素中和能についてはin vitro検定で血清を分析する。抗体価及び毒素中和値を評価し、全ワクチン接種条件について比較する。
【０２２１】
均等物
当業者であれば、ごく慣例的な実験を用いるのみで、ここに解説した本発明の具体的な実施例の均等物を数多く認識され、又は確認できることであろう。このような均等物は以下の請求の範囲の包含するところと意図されている。
【図面の簡単な説明】
【０２２２】
【図１】図１は、マウス１匹当り1μg、2μg、4μg、8μg及び16μgの用量で投与されたときの抗Ｓ．アウレウスプロテインＡ HPの生存率に対する防御効果を示す。マウス１匹当り50μgの用量のモノクローナルＳ．アウレウスプロテインＡ抗体（Mab）及びPBSは防御的でなかった。
【図２】図２は、Ｓ．アウレウスによる攻撃から６時間後の抗プロテインＡ HP投与による生存に対する治療効果を示す。
【図３】図３は、抗Ｓ．アウレウスプロテインＡHP投与の生存に対する持続的な防御効果を示す。HP投与をＳ．アウレウス株 MW2 又は 13301による１回目の攻撃から３０乃至３４分前に行い、それから２８日後にマウスにＳ．アウレウス株 MW2 又は 13301のいずれかで２回目に攻撃した場合には全てのマウスが生き延びた。
【図４】図４は、抗Ｓ．アウレウスプロテインＡHP 投与の生存に対する防御効果が，Ｓ．エピデルミディスによる２８日目の２回目の攻撃からも防御することを示す。
【図５】図５は、抗Ｓ．アウレウスプロテインＡHP投与が生存に及ぼすこの二回目の攻撃防御効果が、Ｓ．アウレウス及びＳ．エピデルミディスの両方に対する抗体応答が原因と思われることを示す。
【図６】図６は、抗プロテインＡ HPコンストラクトの投与により、血液及び器官（肝臓、腎臓及び脾臓）からＳ．アウレウスが除去されたことを示す。
【図７】図７は、HPが致死性Ｃ．アルビカンス抗原に対する防御を提供したことを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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