(57)【要約】本発明は、概して、EGFR媒介の細胞機能活性を調節する方法、およびそれに有用な作用物質に関する。より具体的には、本発明は、上流の細胞内スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達の調節による、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞増殖を調節する方法に関する。本発明の方法は、とりわけ、異常なEGFR媒介の細胞機能、特に異常なEGFR媒介の細胞増殖によって特徴付けられる状態の処置および/または予防に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節する段階を含む、EGFR媒介の細胞活性を調節する方法であって、ここでスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによってEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する、方法。
【請求項２】
細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節するのに十分な時間および条件下で有効量の作用物質を哺乳動物に投与する段階を含む、哺乳動物における異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なEGFR媒介の細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法であって、
ここでスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによってEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する、方法。
【請求項３】
スフィンゴシンキナーゼがヒトスフィンゴシンキナーゼである、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
スフィンゴシンキナーゼがスフィンゴシンキナーゼ1または2である、請求項3記載の方法。
【請求項５】
EGFR媒介の細胞活性がアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞活性である、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
アゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞機能活性が細胞増殖である、請求項5記載の方法。
【請求項７】
細胞増殖が腫瘍性細胞増殖である、請求項6記載の方法。
【請求項８】
腫瘍性細胞が、乳房、結腸、胃、肺、脳、骨、食道、膵臓、卵巣、または子宮由来の悪性細胞である、請求項7記載の方法。
【請求項９】
腫瘍性細胞が、悪性乳房細胞または抗エストロゲン耐性の悪性乳房細胞である、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
アゴニストがエストロゲンである、請求項5〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
前記調節が、スフィンゴシンキナーゼ活性レベルの上方制御であり、かつ該上方制御が、スフィンゴシンキナーゼもしくはその機能的等価物、誘導体もしくはホモログ、またはスフィンゴシンキナーゼ発現産物もしくはその機能的誘導体、ホモログ、アナログ、等価物もしくは模倣体をコードする核酸分子を細胞に導入することによって達成される、請求項1または2記載の方法。
【請求項１２】
前記調節が、スフィンゴシンキナーゼ活性レベルの上方制御であり、かつ該上方制御が、細胞と、スフィンゴシンキナーゼ発現産物のアゴニストとして機能するタンパク質性または非タンパク質性の分子とを接触させることによって達成される、請求項1または2記載の方法。
【請求項１３】
前記調節が、スフィンゴシンキナーゼ活性レベルの下方制御であり、かつ該下方制御が、細胞と、スフィンゴシンキナーゼ発現産物のアンタゴニストとして機能するタンパク質性または非タンパク質性の分子とを接触させることによって達成される、請求項1〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１４】
アンタゴニストがスフィンゴシンキナーゼ基質競合物質(competitor)である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
基質がATPである、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
基質がスフィンゴシンである、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
作用物質が、N,N-ジメチルスフィンゴシンまたはDL-トレオ-ジヒドロスフィンゴシンである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
作用物質が、SphKG82Dなどのスフィンゴシンキナーゼドミナントネガティブである、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
アンタゴニストが、スフィンゴシンキナーゼ酵素活性化を下方制御する、請求項13記載の方法。
【請求項２０】
作用物質が、スフィンゴシンキナーゼ関連リン酸化事象を変更する、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
作用物質が、スフィンゴシンキナーゼ脂質組成を変更する、請求項19記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物における異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なEGFR媒介の細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための薬剤の製造における、スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能活性を調節することができる作用物質の使用であって、
ここで該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによってEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する、使用。
【請求項２３】
スフィンゴシンキナーゼがヒトスフィンゴシンキナーゼである、請求項22記載の使用。
【請求項２４】
スフィンゴシンキナーゼがスフィンゴシン1または2である、請求項23記載の使用。
【請求項２５】
不適切なEGFR媒介の細胞活性がアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞活性である、請求項22〜24のいずれか一項記載の使用。
【請求項２６】
不適切な細胞活性が細胞増殖である、請求項25記載の使用。
【請求項２７】
細胞増殖が、制御されていない腫瘍性細胞増殖である、請求項26記載の使用。
【請求項２８】
制御されていない腫瘍性細胞増殖が悪性細胞増殖である、請求項27記載の使用。
【請求項２９】
悪性細胞が、乳房、結腸、胃、肺、脳、骨、食道、膵臓、卵巣、または子宮由来である、請求項28記載の使用。
【請求項３０】
アゴニストがエストロゲンである、請求項25〜29のいずれか一項記載の使用。
【請求項３１】
前記状態が、エストロゲン誘導性の乳房細胞悪性または抗エストロゲン耐性の乳房細胞悪性腫瘍である、請求項22〜30のいずれか一項記載の使用。
【請求項３２】
前記調節が、スフィンゴシンキナーゼ活性レベルの上方制御であり、かつ該上方制御が、スフィンゴシンキナーゼもしくはその機能的等価物、誘導体もしくはホモログ、またはスフィンゴシンキナーゼ発現産物もしくはその機能的誘導体、ホモログ、アナログ、等価物もしくは模倣体をコードする核酸分子を細胞に導入することによって達成される、請求項22記載の使用。
【請求項３３】
前記調節が、スフィンゴシンキナーゼ活性レベルの上方制御であり、かつ該上方制御が、細胞と、スフィンゴシンキナーゼ発現産物のアゴニストとして機能するタンパク質性または非タンパク質性の分子とを接触させることによって達成される、請求項22記載の使用。
【請求項３４】
前記調節が、スフィンゴシンキナーゼ活性レベルの下方制御であり、かつ該下方制御が、細胞と、スフィンゴシンキナーゼ発現産物のアンタゴニストとして機能するタンパク質性または非タンパク質性の分子とを接触させることによって達成される、請求項22〜31のいずれか一項記載の使用。
【請求項３５】
アンタゴニストが、スフィンゴシンキナーゼ基質競合物質である、請求項34記載の使用。
【請求項３６】
基質がATPである、請求項35記載の使用。
【請求項３７】
基質がスフィンゴシンである、請求項35記載の使用。
【請求項３８】
作用物質が、N,N-ジメチルスフィンゴシンまたはDL-トレオ-ジヒドロスフィンゴシンである、請求項37記載の使用。
【請求項３９】
作用物質が、SphKG82Dなどのスフィンゴシンキナーゼドミナントネガティブである、請求項37記載の使用。
【請求項４０】
アンタゴニストが、スフィンゴシンキナーゼ酵素活性化を下方制御する、請求項34記載の使用。
【請求項４１】
作用物質が、スフィンゴシンキナーゼ関連リン酸化事象を変更する、請求項34記載の使用。
【請求項４２】
作用物質が、スフィンゴシンキナーゼ脂質組成を変更する、請求項34記載の使用。
【請求項４３】
請求項1〜21のいずれか一項記載の方法に従って使用される場合、EGFR媒介の細胞活性を調節することができる調節作用物質、および1つまたは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む薬学的組成物。
【請求項４４】
請求項1〜21のいずれか一項に従って使用される場合、EGFR媒介の細胞機能活性を調節する作用物質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、概して、EGFR媒介の細胞機能活性を調節する方法、およびそれに有用な作用物質に関する。より具体的には、本発明は、上流の細胞内スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達の調節によって、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞増殖を調節する方法に関する。本発明の方法は、とりわけ、異常なEGFR媒介の細胞機能、特に異常なEGFR媒介の細胞増殖によって特徴付けられる状態の処置および/または予防に有用である。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
本明細書において、著者によって引用されている刊行物の参考文献一覧の詳細は、本明細書の最後にアルファベット順にまとめている。
【０００３】
本明細書中の任意の先行技術に対する言及も、その先行技術がオーストラリアにおける共通の一般的な知見の一部を形成することの承認または任意の形態の示唆でもなく、およびそのようにとられるべきではない。
【０００４】
別々のシグナル伝達経路は、エストロゲン（E2）作用を統合することが示されており、正常な哺乳動物の発生および乳癌増殖を含むその機能に直接影響する。エストロゲンは、乳癌細胞において増殖促進活性の増加を示す増殖因子ネットワークと結び付くことが数十年にわたって知られている。大多数の増殖因子およびそれらの受容体は、エストロゲンシグナル伝達と相互作用すると説明されており、その中で、受容体チロシンキナーゼである上皮細胞増殖因子受容体（EGFR）ファミリーは、ヒト癌におけるそれらの臨床的関与により、特に関心対象となっている（Bange et al., 2001, Nat Med, 7:548-552（非特許文献1）; Levin, 2003, Mol Endocrinol, 17:309-317（非特許文献2））。実際に、EGFRの異常な発現および活性化は、多くの場合、様々な腫瘍、特に乳房および卵巣の腫瘍において観察され、それはより不良な患者の予後と相関している（Keen and Davidson, 2003, Cancer, 97:825-833（非特許文献3）; Roskoski, Jr., 2004, Biochem Biophys Res Commun, 319:1-11（非特許文献4））。しかも、EGFRシグナル伝達の上方制御は、内分泌療法の不成功をもたらす乳癌の抗エストロゲン耐性を与える重要なメカニズムであると考えられている（Ali and Coombes, 2002, Nat Rev Cancer, 2:101-112（非特許文献5）; Nicholson et al., 2003, Breast Cancer Res Treat, 80 Suppl 1, S29-S34（非特許文献6））。
【０００５】
多様な証拠は、EGFRとエストロゲンシグナル伝達との相互作用が様々なレベルで起こり得ることを示唆している。エストロゲンは、主として、遺伝子発現の制御へと導く核エストロゲン受容体（ER）に作用するが、それは、伝統的には、エストロゲンのゲノム作用であると思われていた。これらのエストロゲン応答遺伝子の多くは、実際には、EGFRシグナル伝達に関与する主要なシグナル伝達分子である（Levin, 2003、前記）。あるいは、EGFRシグナル伝達は、エストロゲンが存在しない場合にERを活性化することができる（Picard et al., 1997, Biochem Soc Trans, 25:597-602（非特許文献7））。さらに、最近の研究では、Gタンパク質依存的様式に、EGFRと膜会合形態のER（mER)との間の相互作用を示す証拠が提供され（Filardo et al., 2000, Mol Endocrinol, 14:1649-1660（非特許文献8）; Razandi et al., 2003, J Biol Chem, 278:2701-2712（非特許文献9））、他の十分に裏付けられたGタンパク質結合受容体（GPCR）リガンドによって誘導されるものと類似したエストロゲンによるEGFRトランス活性のモデルを示唆する（Gschwind et al., 2001, Oncogene, 20:1594-1600（非特許文献10））。しかしながら、mERは、未だに分子レベルで同定されていない。mERは、それ自体もしくは核ERに関連した代替の転写物に由来するか（Razandi et al., 1999, Mol Endocrinol, 13:307-319（非特許文献11））、またはGPCRファミリー（例えば、GPR30）に属すか（Filardo et al., 2000、前記）、またはPCR-ER複合体の一部である可能性がある（Razandi et al., 2003、前記）ことが様々に示唆されている。したがって、mERの実際の性質は、依然と不明確であり、エストロゲン誘導性のEGFRのトランス活性を基礎とするメカニズムは、大部分未知のままである。
【０００６】
乳癌が女性および社会一般の両方に与える非常に深刻な問題、特に、抗エストロゲン療法に耐性である乳癌の罹患率の増加を考慮すると、これらの細胞の欠陥を支持する細胞内メカニズムを解明し、それによって、新規であり、しかも代替となる処置手段を開発することが継続的に必要である。Ullrichおよび共同研究者（Prenzel et al. 1999, Nature, 402:884-888（非特許文献12））によって最初に説明されて以来、GPCRリガンドによるEGFRのトランス活性化は、細胞の情報伝達の重要なモデルとして考えられている。数種のGPCRリガンドには、リゾホスファチジン酸、トロンビン、アンジオテンシンIIおよびエンドセリン-1が含まれ、これらはEGFRをトランス活性化することが示され、生存経路または細胞分裂経路の活性化へと導く（Gschwind et al. 2001、前記）。しかしながら、本発明に至るまでの研究において、驚くべきことに、しかも予期せずに、スフィンゴシンキナーゼが、S1P受容体を経由したEGFRの十字の(criss-cross)トランス活性化のためのエストロゲン非ゲノムシグナル伝達の媒介において重大な役割を果たすことが見出された。したがって、スフィンゴシンキナーゼは、エストロゲン、S1PおよびEGFによって誘導される3種の膜貫通事象間の相互作用を媒介する。これらの知見は、現在、EGFRよりはむしろ上流のシグナル伝達分子、またはエストロゲン誘導性のEGFR活性化の場合にはエストロゲンもしくはエストロゲン受容体分子を標的とすることによって、異常なEGFR媒介の細胞機能、特に異常な細胞増殖の代替的な処置手段の開発を促進している。
【０００７】
【非特許文献１】Bange et al., 2001, Nat Med, 7:548-552
【非特許文献２】Levin, 2003, Mol Endocrinol, 17:309-317
【非特許文献３】Keen and Davidson, 2003, Cancer, 97:825-833
【非特許文献４】Roskoski, Jr., 2004, Biochem Biophys Res Commun, 319:1-11
【非特許文献５】Ali and Coombes, 2002, Nat Rev Cancer, 2:101-112
【非特許文献６】Nicholson et al., 2003, Breast Cancer Res Treat, 80 Suppl 1, S29-S34
【非特許文献７】Picard et al., 1997, Biochem Soc Trans, 25:597-602
【非特許文献８】Filardo et al., 2000, Mol Endocrinol, 14:1649-1660
【非特許文献９】Razandi et al., 2003, J Biol Chem, 278:2701-2712
【非特許文献１０】Gschwind et al., 2001, Oncogene, 20:1594-1600
【非特許文献１１】Razandi et al., 1999, Mol Endocrinol, 13:307-319
【非特許文献１２】Prenzel et al. 1999, Nature, 402:884-888
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本明細書および添付の特許請求の範囲を通じて、文脈が他に必要としない限り、用語「含む（comprise）」、ならびに「含む（comprises）」および「含んでいる（comprising）」などの変化形は、規定された整数もしくは段階、または整数もしくは段階のグループを含むことを意味するが、任意の他の整数もしくは段階、または整数もしくは段階のグループを含まないことを意味していないことは理解される。
【０００９】
本明細書は、プログラムのPatentIn Version 3.1を用いて作成された核酸配列情報を含み、核酸配列情報は本明細書では参考文献一覧の後に示されている。各々の核酸配列は、数字見出し<201>とそれに続く配列識別子（例えば、<201>1、<201>2など）によって配列表中で特定される。各々の核酸配列の長さ、配列のタイプ（DNAなど）および生物起源は、それぞれ、数字見出し欄の<211>、<212>および<213>において提供される情報によって示される。本明細書において言及されている核酸配列は、見出しSEQ ID NO：とそれに続く配列識別子（例えば、SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2など）によって特定される。本明細書において言及されている配列識別子は、配列表中の数字見出し欄<400>とそれに続く配列識別子（例えば、<400>1、<400>2など）において提供される情報と相関している。つまり、本明細書において詳述されるSEQ ID NO：1は、配列表中の<400>1として指示される配列と相関している。
【００１０】
本発明の一局面は、EGFR媒介の細胞機能活性を調節する方法に関し、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介シグナル伝達の機能を調節することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００１１】
別の局面では、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞機能活性を調節する方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節することを含み、該スフィンゴシンキナーゼを下方制御することによりアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００１２】
さらに別の局面では、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞増殖を調節する方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００１３】
本発明のなおさらに別の局面は、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の腫瘍性細胞増殖を下方制御する方法を提供し、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を下方制御することを含む。
【００１４】
本発明のさらになお別の局面は、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の腫瘍性細胞増殖を下方制御する方法を提供し、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ-1媒介性シグナル伝達の機能を下方制御することを含む。
【００１５】
本発明のさらなる局面は、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なEGFR媒介の細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法に関し、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節するのに十分な時間および条件下で有効量の作用物質を哺乳動物に投与することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００１６】
別の局面では、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節するのに十分な時間および条件下で有効量の作用物質を哺乳動物に投与することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００１７】
さらに別のさらなる局面では、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞増殖によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節するのに十分な時間および条件下で有効量の作用物質を哺乳動物に投与することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００１８】
本発明のなお別のさらなる局面は、エストロゲン誘導性の乳房細胞悪性腫瘍の処置および/または予防のための方法を提供し、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を下方制御するのに十分な時間および条件下で有効量の作用物質を哺乳動物に投与することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することにより、EGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００１９】
別の局面では、本発明は、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なEGFR媒介の細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための薬剤の製造における、スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能活性を調節することができる作用物質の使用に関し、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００２０】
なお別の局面では、本発明は、上記で定義される調節作用物質、および1つまたは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む薬学的組成物に関する。
【００２１】
本発明のなお別の局面は、本発明の方法で使用される場合、上記で定義される調節作用物質に関する。
【００２２】
発明の詳細な説明
本発明は、1つには、EGFR媒介の細胞シグナル伝達の上方制御をもたらすシグナル伝達の十字メカニズムの存在の同定を基礎としている。したがって、この知見は、異常なEGFR媒介の細胞機能を処置する代替の手段の開発を促進し、これは、特に、抗エストロゲン耐性の乳癌などの癌の処置の点で関連している。さらに、スフィンゴシンキナーゼが、EGFR関連細胞シグナル伝達の重大な上流のメディエーターであるという決定は、治療的介入のために、現在利用されているEGFR自身以外、または乳癌エストロゲンの場合における、特定の標的を提供する。
【００２３】
したがって、本発明の一局面は、EGFR媒介の細胞機能活性を調節する方法に関し、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００２４】
「EGFR」は、上皮細胞増殖因子受容体のあらゆる形態に言及するものとして理解されるべきである。例えば、EGFR mRNAの選択的スプライシングから生じる任意のアイソフォーム、またはEGFRの機能的突然変異体もしくは多型変種への言及を含むことが理解されるべきである。本発明をいずれか1つの理論または作用様式に限定することなく、EGFRは、上皮細胞増殖因子（EGF）または同様に形質転換増殖因子-α（TGF-α）の生物学的シグナルのメディエーターである。それは、1つの膜貫通ドメイン、および細胞質ドメインではチロシンキナーゼ活性を有する膜タンパク質であり；細胞外ドメインは、EGFに結合し、非常にグリコシル化されている。EGFのその受容体への結合は、チロシンキナーゼ活性の誘導、および二量体形成をもたらし、結果として、自己リン酸化が起こる。次に細胞DNA合成および細胞増殖の刺激が起こる。EGF受容体複合体の内在化はEGFを結合した後に起こる。
【００２５】
より具体的には、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞機能活性を調節する方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００２６】
「アゴニスト誘導性の」EGFR媒介の細胞機能活性は、EGFR受容体以外の受容体に結合する分子の作用によって初期に誘導されるEGFR媒介の細胞機能活性への言及として理解されるべきである。例えば、エストロゲン誘導性乳癌との関連で、細胞増殖へと導く最終的なシグナルは、EGFR分子を介して媒介されるが、EGFR刺激へと導く段階のカスケードを開始する分子は、エストロゲン受容体へのエストロゲンの結合である。この具体的な例では、主要な「アゴニスト」はエストロゲンである。本発明をいずれか1つの理論または作用様式に限定することなく、アゴニスト誘導性のEGFRで刺激された細胞機能の概念の解明が促進されるのは、十字の活性化メカニズムの存在の同定を通じてのみであって、それによって代替の処置方法の設計が可能となる。
【００２７】
「EGFR媒介の細胞機能活性」は、EGFR刺激の結果として、細胞が実行し得る任意の1つまたは複数の機能活性への言及として理解されるべきである。好ましくは、この機能活性は、細胞増殖である。
【００２８】
この好ましい態様によれば、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞増殖を調節する方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００２９】
本発明との関連で「細胞」は、細胞の起源に関係なく、細胞の任意の形態または型への言及であることと理解されるべきである。例えば、細胞は、天然の正常もしくは異常な細胞であってもよく、またはインビトロもしくはインビボのいずれかで凍結/融解されるか、または遺伝的に、生化学的にもしくはそうでなければ改変された細胞（例えば、2つの異なる細胞型の融合の結果物である細胞を含む）などのようにインビトロもしくはインビボのいずれかにおいて操作され、改変されるか、またはそうでなければ処置されてもよい。好ましくは、細胞は、腫瘍性細胞である。「腫瘍性細胞」とは、制御されていない増殖を示す細胞を意味する。腫瘍性細胞は、良性細胞または悪性細胞であってもよい。好ましくは、細胞は悪性である。特定の一態様では、腫瘍性細胞は、悪性細胞であり、その増殖は、乳房、結腸、胃、肺、脳、骨、食道、または膵臓に由来する悪性細胞などの固形腫瘍を形成する。
【００３０】
したがって、本明細書においては、最も好ましくは、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の腫瘍性細胞増殖を下方制御する方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を下方制御することを含む。
【００３１】
好ましくは、腫瘍性細胞は、乳房、結腸、胃、肺、脳、骨、食道、膵臓、卵巣、または子宮由来の悪性細胞である。
【００３２】
なおより好ましくは、アゴニストはエストロゲンであり、細胞は悪性乳房細胞または抗エストロゲン耐性の悪性乳房細胞である。
【００３３】
「スフィンゴシンキナーゼ」は、このタンパク質のあらゆる形態およびその機能的誘導体への言及として理解されるべきである。これは、例えば、対象であるスフィンゴシンキナーゼmRNAの選択的スプライシングから生じる任意のアイソフォーム、またはこれらのタンパク質の機能的突然変異体もしくは多型変種を含む。例えば、この定義は、アイソフォームであるスフィンゴシンキナーゼ-1およびスフィンゴシンキナーゼ-2まで及ぶが、該スフィンゴシンキナーゼは、好ましくはスフィンゴシンキナーゼ-1である。
【００３４】
したがって、本明細書においては、好ましくは、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の腫瘍性細胞増殖を下方制御する方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ-1媒介のシグナル伝達の機能を下方制御することを含む。
【００３５】
好ましくは、腫瘍性細胞は、乳房、結腸、胃、肺、脳、骨、食道、膵臓、卵巣、または子宮由来の悪性細胞である。
【００３６】
なおより好ましくは、アゴニストはエストロゲンであり、細胞は悪性乳房細胞または抗エストロゲン耐性の悪性乳房細胞である。
【００３７】
「スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達」は、スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的誘導体を利用する細胞内シグナル伝達経路への言及として理解されるべきである。スフィンゴシンキナーゼは、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の活性における主要な制御酵素であり、内因性のスフィンゴ脂質メディエーターのスフィンゴシン-1-ホスフェートを生じるように機能する。なおさらに、多少なりとも本発明を制限することなく、スフィンゴシンキナーゼは、EGFRトランス活性化を媒介する新規なシグナル伝達システムの一部を形成することが見出された。エストロゲン誘導性乳癌と特に関連して、エストロゲンは、スフィンゴシンキナーゼの活性化およびスフィンゴシン-1-ホスフェートの放出を刺激し、エストロゲンは、マトリックスメタロプロテアーゼ依存的にEGFRトランス活性化をもたらすスフィンゴシン-1-ホスフェート特異的なGPCR、Edg3を活性化することができる。したがって、これらの知見は、エストロゲン、S1PおよびEGFによって誘導される3回の膜貫通事象間の相互作用の媒介におけるスフィンゴシンキナーゼの役割を特定し、3つの個々のリガンド受容体システム間の新規な情報伝達メカニズムを明らかにし、このメカニズムは「十字の」活性化と命名された。
【００３８】
スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の「機能」を調節することは、スフィンゴシンキナーゼそれ自体の濃度とは対照的に、任意の所与の細胞に存在するスフィンゴシンキナーゼ活性のレベルを調節することへの言及として理解されるべきである。スフィンゴシンキナーゼの細胞内濃度の減少は、一般的に、細胞において観察されるスフィンゴシンキナーゼ機能活性レベルの減少と相関するが、当業者はまた、この活性レベルの減少は、絶対的な細胞内スフィンゴシンキナーゼ濃度の単なる減少以外の手段によって達成され得ると理解する。例えば、1つは、スフィンゴシンキナーゼの半減期を減少させる手段、この分子によるその基質への結合を立体的に障害する手段、または機能的スフィンゴシンキナーゼによるその基質への結合を競合的に阻害する手段を利用してもよい。
【００３９】
また、スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達、特にその下方制御の調節は、このシグナル伝達経路の活性が基底レベルまで戻る必要があることを必ずしも意味していないと理解されるべきである。むしろ、このレベルは、前処理のレベルと比較して変化していることだけが必要である。したがって、本発明の方法は、完全に停止し得るような時間まで、少なくとも、制御されていない細胞増殖を低下させるように適用されてもよい。本調節は、特定の状況の要件に依存して、一時的または長期であってもよい。
【００４０】
したがって、スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の「活性」の調節は、シグナル伝達メカニズムを上方制御すること、または下方制御することのいずれかへの言及として理解されるべきである。好ましい方法は、制御されていない細胞増殖を示す患者との関連で、対象のシグナル伝達を下方制御することであるが、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を上方制御すること、例えば、対象の細胞の形質転換を必然的に誘導することなしに、細胞株モデルの分析を促進するかまたは細胞増殖の急激な拡大を促進することが望まれる、ある種の環境が存在してもよい。いずれかの調節形態は、任意の適した手段によって達成されてもよく、下記を含む。
（i）スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートなどのスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達経路の構成要素の絶対レベルを調節すること。これにより、多かれ少なかれ、どちらのこれらの分子も、活性のために、および/またはEdg-3などの下流の標的と相互作用するために利用可能である。
（ii）スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートなどのスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達経路の構成要素を作動させるかまたは拮抗すること。これにより、任意の1つまたは複数のこれらの分子の機能的効果は、増加するかまたは減少する。例えば、スフィンゴシンキナーゼの半減期の増加は、スフィンゴシンキナーゼの絶対的な細胞内濃度の増加を実際に必要とせずに、スフィンゴシンキナーゼ活性の全体的なレベルの増加を達成されてもよい。同様に、スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-ホスフェートの部分的な拮抗作用は、例えば、下流の標的へのそれらの結合に関連して、何らかの立体障害を誘導する構成要素にこれらの分子を結合させることによって、それらが提供するシグナル伝達の効果を、必ずしも排除する必要はないが、低下させるように作用してもよい。したがって、このことは、この経路の構成要素の絶対的な濃度を必ずしも下方制御することなしに、スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達を下方制御する手段を提供する可能性がある。
【００４１】
スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の上方制御または下方制御を達成する点について、この目的を達成する手段は、当業者に周知であり、下記を含むがそれに限定されるわけではない。
（i）スフィンゴシンキナーゼ媒介性経路の構成要素を発現する細胞の能力を上方制御するために、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の構成要素またはその機能的な等価物もしくは誘導体をコードする核酸分子を細胞に導入すること。
（ii）遺伝子の転写および/または翻訳制御を調節するタンパク質性または非タンパク質性分子を細胞に導入すること。この遺伝子は、任意のスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の構成要素、特に、スフィンゴシンキナーゼもしくはスフィンゴシン-1-ホスフェートまたはその機能的部分、またはスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達経路の構成要素の発現を直接的または間接的に調節するいくつかの他の遺伝子であってもよい。
（iii）1つまたは複数のスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達経路の構成要素の発現産物（活性形態もしくは不活性形態のいずれかで）、またはその機能的誘導体、ホモログもしくは模倣体を細胞に導入すること。
（iv）スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-ホスフェートのアンタゴニストとして機能するタンパク質性または非タンパク質性分子を導入すること。
（v）スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-ホスフェート受容体の発現および/または機能を調節するタンパク質性または非タンパク質性分子を細胞に導入すること。
（vi）N'N'-ジメチルスフィンゴシン（スフィンゴシンキナーゼ化学的阻害剤）、DL-トレオ-ジヒドロスフィンゴシンまたはSphKG82D（突然変異スフィンゴシンキナーゼドミナントネガティブ）などの、任意の1つまたは複数の構成要素のスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の発現産物に対するアンタゴニストとして機能するタンパク質性または非タンパク質性分子を導入すること。
（vii）スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達経路の発現産物に対するアゴニストとして機能するタンパク質性または非タンパク質性分子を導入すること。
【００４２】
上述したタンパク質性分子は、天然の、組換えの、または合成の供給源などの任意の適した供給源に由来してもよく、融合タンパク質、または、例えば天然産物のスクリーニング後に同定された分子を含む。非タンパク質性分子は、例えば、核酸分子への言及であってもよく、または、例えば天然産物のスクリーニングなどの天然供給源由来の分子であってもよく、または化学的に合成した分子であってもよい。本発明は、スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の構成要素のアナログ、またはアゴニストもしくはアンタゴニストとして作用することができる小分子を意図する。
【００４３】
化学的アゴニストは、必ずしも、スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達経路産物の構成要素に由来しなくてもよいが、ある種の立体構造的な類似性を共有してもよい。あるいは、化学的アゴニストは、ある種の物理化学的特性を満たすように特別に設計されてもよい。アンタゴニストは、活性化を妨げる分子かまたは他の活性化した分子の下流の機能を妨げる分子などの、スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達経路の構成要素がそれらの正常な生物学的機能を果たすことをブロックし、阻害するか、またはそうでなければ妨げることができる任意の化合物であってもよい。アンタゴニストは、モノクローナル抗体、ドミナントネガティブなスフィンゴシンキナーゼ突然変異体、および哺乳動物細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達経路の構成要素の遺伝子またはmRNAの転写または翻訳を妨げるアンチセンス核酸を含む。発現の調節はまた、抗原、RNA（特にsiRNA）、リボソーム、DNAザイム、RNAアプタマー、抗体または共抑制(cosuppression)での使用に適した分子を用いることで達成してもよい。上記の点（i）〜（vii）で言及されるタンパク質性および非タンパク質性分子は、本明細書において、集合的に、「調節作用物質」と称する。
【００４４】
上記で定義した調節作用物質のスクリーニングは、スフィンゴシンキナーゼ遺伝子（またはスフィンゴシンキナーゼシグナル伝達経路の構成要素をコードする任意の他の遺伝子）またはその機能的等価物もしくは誘導体を含む細胞と作用物質とを接触させること、ならびに、スフィンゴシンキナーゼタンパク質産生もしくは機能活性の調節、スフィンゴシンキナーゼをコードする核酸分子の発現の調節、または下流のスフィンゴシンキナーゼの細胞標的の活性もしくは発現の調節についてスクリーニングすることを含むがそれらに限定されるわけではない、いくつかの適した方法の内のいずれか1つによって達成することができる。このような調節の検出は、ウェスタンブロッティング、電気泳動移動シフトアッセイ、および/またはルシフェラーゼ、CATなどのスフィンゴシンキナーゼ活性のレポーターの読み出しなどの手法を利用することによって達成することができる。
【００４５】
スフィンゴシンキナーゼ遺伝子またはその機能的等価物もしくは誘導体は、試験の対象である細胞に天然に存在してもよく、または試験の目的で宿主細胞にトランスフェクトされてもよいことが理解されるべきである。さらに、天然に存在するかまたはトランスフェクトされる遺伝子は構成的に発現されていてもよく、それによって、とりわけ、核酸もしくは発現産物レベルのいずれかでスフィンゴシンキナーゼ活性を下方制御する作用物質をスクリーニングするための有用なモデルが提供されるか、または、この遺伝子は活性を要求してもよく、それによって、とりわけ、スフィンゴシンキナーゼ発現を上方制御する作用物質をスクリーニングするための有用なモデルが提供される。さらに、スフィンゴシンキナーゼの核酸分子が細胞にトランスフェクトされる限りにおいて、その分子は、完全なスフィンゴシンキナーゼ遺伝子を含んでもよく、またはスフィンゴシンキナーゼ産物の発現を制御する部分などの遺伝子の一部を単に含んでいてもよい。例えば、スフィンゴシンキナーゼプロモータ領域は、試験の対象となる細胞にトランスフェクトされてもよい。これに関しては、プロモータだけが利用される場合、プロモータの活性の調節を検出することは、例えば、プロモータをレポーター遺伝子に連結させることによって達成することができる。例えば、プロモータは、ルシフェラーゼまたはCATレポーターに連結されてもよく、遺伝子発現の調節は、それぞれ、蛍光強度またはCATレポーター活性の調節を介して検出することができる。
【００４６】
別の例では、検出の対象は、スフィンゴシンキナーゼそれ自体というよりはむしろ、下流のスフィンゴシンキナーゼ制御標的（例えば、スフィンゴシン-1-ホスフェート）であり得る。さらに別の例には、最小レポーターに連結したスフィンゴシンキナーゼ結合部位を含む。例えば、スフィンゴシンキナーゼ活性の調節は、乳房細胞の増殖能力の調節をスクリーニングすることによって検出することができる。これは、スフィンゴシンキナーゼ発現それ自体の調節が検出対象ではない場合の間接的なシステムの一例である。むしろ、スフィンゴシンキナーゼが発現を制御する分子の調節がモニターされる。
【００４７】
これらの方法は、合成ライブラリー、コンビナトリアルライブラリー、化学ライブラリー、および天然のライブラリーを含むタンパク質性または非タンパク質性作用物質などの推定される調節作用物質のハイスループットスクリーニングを実行するためのメカニズムを提供する。これらの方法はまた、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子もしくはその発現産物自体のいずれかと結合する作用物質、または上流分子がスフィンゴシンキナーゼ発現もしくは発現産物の活性をその後に調節する上流分子の発現を調節する作用物質の検出を促進する。したがって、これらの方法は、スフィンゴシンキナーゼ発現および/または活性を直接的または間接的に調節する作用物質を検出するメカニズムを提供する。
【００４８】
本発明の方法に従って利用される作用物質は、任意の適した形態であってもよい。例えば、タンパク質性作用物質は、様々な程度でグリコシル化されるかもしくはグリコシル化されてもよく、リン酸化されるかもしくは脱リン酸化されてもよく、および/またはアミノ酸、脂質、糖質または他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質などの、タンパク質と共に使用され、連結され、結合されるか、または他に関連付けられる一連の他の分子を含んでもよい。同様に、対象の非タンパク質性分子はまた、任意の適した形態であってもよい。本明細書において記載されるタンパク質性および非タンパク質性作用物質の両方は、任意の他のタンパク質性または非タンパク質性の分子と連結され、結合されるか、またはそうでなければ会合されてもよい。例えば、本発明の一態様では、この作用物質は、局所領域へのそのターゲティングを可能にする分子と会合される。
【００４９】
対象のタンパク質性および非タンパク質性分子は、スフィンゴシンキナーゼの発現またはスフィンゴシンキナーゼ発現産物の活性を調節するために直接的または間接的に作用してもよい。該分子は、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子または発現産物と会合する場合、それぞれ発現または活性を調節するために直接作用する。該分子は、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子または発現産物以外の分子と会合する場合には間接的に作用して、他の分子は、それぞれ、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子または発現産物の発現または活性を直接的または間接的に調節する。したがって、本発明の方法は、制御段階のカスケードの導入を介して、スフィンゴシンキナーゼ核酸分子発現または発現産物活性の制御を包含する。
【００５０】
用語「発現」は、核酸分子の転写および翻訳を指す。「発現産物」は、核酸分子の転写および翻訳から産生される生産物をいう。「調節」は、上方制御または下方制御への言及として理解されるべきである。
【００５１】
本明細書において記載される分子（例えば、スフィンゴシンキナーゼ、スフィンゴシン-1-ホスフェートまたは他のタンパク質性もしくは非タンパク質性の作用物質）の「誘導体」は、天然または非天然の供給源からの断片、部分、一部または変種を含む。非天然の供給源は、例えば、組換えまたは合成の供給源を含む。「組換え供給源」とは、対象の分子を回収する細胞の供給源が遺伝的に改変されていることを意味する。例えば、特定の細胞供給源による産生速度および産生量を増加させるかまたはそうでなければ増強させるために遺伝的な改変が行われてもよい。部分または断片は、例えば、分子の活性領域を含む。誘導体は、アミノ酸の挿入、欠失または置換から誘導されてもよい。アミノ酸の挿入による誘導体には、アミノ末端および/またはカルボキシ末端の融合、ならびに1個または複数個のアミノ酸の配列内の挿入が含まれる。挿入されるアミノ酸配列の変種は、1つまたは複数のアミノ酸残基がタンパク質の所定の部位に導入されるものであるが、ランダムな挿入も、もたらされる産物の適したスクリーニングを用いて可能である。欠失される変種は、配列からの1つまたは複数のアミノ酸の除去によって特徴付けられる。置換されるアミノ酸の変種は、配列中の少なくとも1個の残基が除去され、その場所で異なる残基が挿入されるものである。アミノ酸配列への付加は、上記で詳述される他のペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質との融合を含む。
【００５２】
誘導体はまた、ペプチド、ポリペプチドまたは他のタンパク質性もしくは非タンパク質性分子に融合した完全なタンパク質の特定のエピトープまたは部分を有する断片を含む。例えば、スフィンゴシンキナーゼまたはその誘導体を、細胞へのその導入を促進するための分子に融合することができる。本明細書において意図される分子のアナログは、非限定的に、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質の合成中の非天然のアミノ酸および/またはそれらの誘導体の挿入を含み、架橋剤および他の方法の使用は、構造制約をタンパク質性分子またはそれらのアナログに課す。
【００５３】
本発明の方法に従って利用することができる核酸配列の誘導体は、同様に、他の核酸分子との融合を含む1個または複数個のヌクレオチドの置換、欠失および/または付加から誘導されてもよい。本発明で利用される核酸分子の誘導体は、オリゴヌクレオチド、PCRプライマー、アンチセンス分子、共抑制での使用に適した分子、および核酸分子の融合を含む。核酸配列の誘導体はまた、変性変種を含む。
【００５４】
スフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-ホスフェートの「変種」は、変種であるスフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-ホスフェートの形態の機能活性の少なくともいくつかを示す分子を意味するものと理解されるべきである。変異は、任意の形態をとることができ、天然または非天然でもよい。突然変異分子は、変更された機能活性を示す分子である。
【００５５】
「ホモログ」とは、本発明の方法に従って処理されるもの以外の種から誘導される。例えば、処理される種以外の種が、処理を受ける対象によって天然に生産されるスフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-ホスフェートに類似し、かつ適した機能的特徴を示すスフィンゴシンキナーゼまたはスフィンゴシン-1-ホスフェートの形態を生産することが決定される場合に、ホモログは生じてもよい。
【００５６】
化学的および機能的等価物（模倣体）は、天然産物のスクリーニングなどのスクリーニングプロセスを介して化学的に合成または同定されるような任意の供給源から誘導されてもよい、対象の分子の任意の1つまたは複数の機能的活性を示す分子として理解されるべきである。例えば、化学的または機能的等価物は、コンビナトリアルケミストリーもしくは組換えライブラリーのハイスループットスクリーニング、またはそれに続く天然産物のスクリーニングなどの周知の方法を利用して設計されおよび/または同定することができる。
【００５７】
例えば、有機小分子を含有するライブラリーがスクリーニングされてもよく、大多数の特定の親の置換基を有する有機分子が使用される。一般的な合成スキームは、公開された方法に従ってもよい（例えば、Bunin BA, et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:4708-4712; DeWitt SH, et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6909-6913）。簡単には、各々の連続した合成工程で、複数の異なる選択された置換基の1つは、ライブラリーの生産に採用される異なった置換基の全ての可能な順列を生じるようにチューブのサブセットの選択を用いて、アレイ中でチューブの選択されたサブセットの各々に添加される。1つの適した順列戦略は、米国特許第5,763,263号に概要されている。
【００５８】
生物学的に活性な化合物を探索するために、ランダムな有機分子のコンビナトリアルライブラリーを用いることに、現在、広く関心が持たれている（例えば、米国特許第5,763,263号を参照されたい）。このタイプのライブラリーをスクリーニングすることによって発見されたリガンドは、天然のリガンドの模倣もしくはブロック、または生物学的標的の天然のリガンドとの干渉において有用であり得る。この関連で、例えば、それらは、より強力な薬理学的効果などの特性を示すスフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートアナログの開発のための出発点として使用されてもよい。スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートまたはその機能的部分は、本発明に従って、様々な固相または液相の合成法によって形成されるコンビネーションライブラリーにおいて用いられてもよい（例えば、米国特許第5,763,263号およびそこで引用される参考文献を参照されたい）。米国特許第5,753,187号に開示されているような技術を用いることによって、数百万の新規な化学的および/または生物学的化合物を数週間未満で日常的にスクリーニングすることが可能である。大多数の同定された化合物の内、適した生物学的活性を示すものだけがさらに解析される。
【００５９】
ハイスループットライブラリースクリーニング法に関して、生体分子、高分子複合体または細胞などの、選択される生物学的作用物質と特異的に相互作用することができるオリゴマーライブラリー化合物または小分子ライブラリー化合物は、上述したような周知の方法の範囲から当業者によって容易に選択されるコンビナトリアルライブラリーデバイスを利用してスクリーニングされる。このような方法では、ライブラリーの各メンバーは、選択される作用物質と特異的に相互作用する能力についてスクリーニングされる。この方法の実施において、生物学的作用物質は、化合物を含むチューブに集められ、各チューブ内で個々のライブラリー化合物と相互作用することが可能となる。相互作用は、所望の相互作用の存在をモニターするために用いることができる検出可能なシグナルを生産するように設計される。好ましくは、生物学的作用物質は、水溶液中に存在し、さらなる条件が、所望の相互作用に応じて適応される。検出は、例えば、物質を検出するための任意の周知の機能ベースのまたは非機能ベース方法によって行われてもよい。
【００６０】
スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートの活性を模倣する分子のスクリーニングに加えて、EGFR媒介の細胞増殖の調節に関して、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートの機能活性を上方制御または下方制御するために、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートに対して作動薬的に(agonistically)、または最も好ましくは拮抗的に機能する分子を同定し、利用することがまた望まれる場合がある。このような分子の使用は、下記により詳細に記載される。対象の分子がタンパク質性である限りにおいて、分子は、例えば、融合タンパク質を含む天然の供給源または組換え供給源から誘導されてもよく、あるいは、例えば、上述したスクリーング方法に従ってもよい。非タンパク質性分子は、例えば、上記で特定した方法論に従って同定または発生した化学分子または合成分子であってもよい。したがって、本発明は、アゴニストまたはアンタゴニストとして作用することができるスフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートの化学的アナログの使用を意図する。化学的アゴニストは、必ずしも、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートから誘導されなくてもよいが、ある種の立体構造的な類似性を共有する場合がある。あるいは、化学的アゴニストは、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートのある種の物理化学的特性を模倣するように特別に設計されてもよい。アンタゴニストは、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートの正常な生物学的機能を果たすことをブロックし、阻害するか、またはそうでなければ妨げることができる任意の化合物であってもよい。アンタゴニストは、スフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェート、あるいはスフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートの部分に特異的なモノクローナル抗体を含む。
【００６１】
本明細書において意図されるスフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートあるいはスフィンゴシンキナーゼおよび/またはスフィンゴシン-1-ホスフェートの作動薬性または拮抗性の作用物質のアナログは、非限定的に、側鎖への修飾、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質合成中に非天然のアミノ酸および/またはそれらの誘導体の挿入を含み、架橋剤および他の方法の使用は、構造制約をそれらのアナログに課す。このような修飾が取り得る特別な形態は、対象の分子がタンパク質性または非タンパク質性であるか否かに依存する。特定の修飾の性質および/または適合性は、当業者によって日常的に測定することができる。
【００６２】
例えば、本発明によって意図される側鎖修飾の例には、アルデヒドと反応し、次にNaBH4で還元する還元アルキル化；メチルアセトイミダートを用いたアミド化；無水酢酸を用いたアシル化；シアン酸塩を用いたアミノ基のカルバモイル化；2,4,6-トリニトロベンゼンスルホン酸（TNBS）を用いたアミノ基のトリニトロベンジル化；無水コハク酸および無水テトラヒドロフタル酸を用いたアミノ基のアシル化；およびピリドキサル-5-ホスフェートを用いたリジンのピリドキシル化とその後のNaBH4を用いた還元などのアミノ基の修飾が挙げられる。
【００６３】
アルギニン残基のグアニジン基は、2,3-ブタンジオン、フェニルグリオキサルおよびグリオキサルなどの試薬を用いた複素環縮合の形成によって修飾されてもよい。
【００６４】
カルボキシル基は、O-アシルイソウレアの形成を介したカルボジイミド活性化、続いて、例えば、対応するアミドへの誘導体化によって修飾してもよい。
【００６５】
スルフヒドリル基は、ヨード酢酸またはヨードアセトアミドを用いたカルボキシメチル化；システイン酸への過ギ酸酸化；他のチオール化合物と合わせたジスルフィドの形成；マレイミド、無水マレイン酸または他の置換されたマレイミドとの反応；4-クロロメルクリベンゾアート、4-クロロメルクリフェニルスルホン酸、塩化フェニル水銀、2-クロロメルクリ-4-ニトロフェノールおよび他の水銀化合物を用いた水銀誘導体の形成；アルカリ性pHでシアナートを用いたカルバモイル化などの方法によって修飾することができる。
【００６６】
トリプトファン残基は、例えば、N-ブロモスクシンイミドを用いた酸化、または2-ヒドロキシ-5-ニトロベンジルブロミドもしくはハロゲン化スルフェニルを用いたインドール環のアルキル化によって修飾することができる。一方、チロシン残基は、テトラニトロメタンを用いたニトロ化によって改変して3-ニトロチロシン誘導体を形成してもよい。
【００６７】
ヒスチジン残基のイミダゾール環の修飾は、ヨード酢酸誘導体を用いたアルキル化またはジエチルピロカルボネートを用いたN-カルボエトキシル化によって達成することができる。
【００６８】
タンパク質合成中の非天然アミノ酸および誘導体の導入の例は、ノルロイシン、4-アミノ酪酸、4-アミノ-3-ヒドロキシ-5-フェニルペンタン酸、6-アミノヘキサン酸、t-ブチルグリシン、ノルバリン、フェニルグリシン、オルニチン、サルコシン、4-アミノ-3-ヒドロキシ-6-メチルヘプタン酸、2-チエニルアラニンおよび/またはアミノ酸のD-異性体の使用を含むが、それらに限定されるわけではない。本明細書において意図される非天然のアミノ酸のリストを表1に示す。
【００６９】
【表１】
2008546720.tif 000002
2008546720.tif 000003
2008546720.tif 000004
【００７０】
架橋剤は、例えば、n=1〜n=6である(CH2)nスペーサー基を有する二官能性イミドエステル、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステルなどのホモ二官能性架橋剤、ならびにN-ヒドロキシスクシンイミドなどのアミノ反応部分および別の基に特異的な反応部分を通常含有するヘテロ二官能性試薬を用いて、3D立体構造を安定化させるために使用することができる。
【００７１】
本発明の方法は、インビトロおよびインビボの両方でのEGFR媒介の細胞活性、特に細胞増殖の調節を意図する。好ましい方法は、インビボで個体を処置することであるが、それにもかかわらず、本発明の方法が、インビトロ環境下で、例えば、制御されていない細胞増殖などの細胞増殖の分析のためのインビトロモデルを提供するために適用されてもよいことが望ましいことは、理解されるべきである。別の例では、インビトロ環境への本発明の方法の適用は、前述したものなどのスクリーニング技術のための読み出しメカニズムの提供まで拡張してもよい。すなわち、これらのスクリーニング技術を利用して同定した分子は、高血糖症誘導性の内皮細胞機能に対するそれらの機能的効果の程度および/または性質を観察するために評価され得る。
【００７２】
好ましい方法は、EGFR媒介の細胞増殖、特にアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞増殖を下方制御すること（例えば、制御されていない細胞増殖の進行を下方制御するために）であるが、対象の機能活性を上方制御すること、例えば、急激ではあるが制御された細胞増殖の発生を促進することが望まれる環境があってもよいことが理解されるべきである。
【００７３】
関連した局面では、上記で詳述されるように、本発明は、インビボでのEGFR媒介の機能活性を調節するために、哺乳動物に適用される。
【００７４】
本発明のさらなる局面は、疾患状態の処置および/または予防に関連した本発明の使用に関する。本発明を任意の1つの理論または作用様式に限定することなく、社会における癌（特に、乳癌）の益々増える発症率を伴って、癌を標的とする新規な方法の開発が不可欠となっている。特に、癌の開始の基礎となるメカニズムの観点から癌には多様性があることが、未だに完全には理解されていないが、現在、幅広く認識されている。したがって、細胞の異常集団をより狭く標的とすることができる一連の方法の開発が、任意に急激に分裂する細胞を死滅へと方向付けた伝統的な処置方法と比較して前進した有意な段階を提供する。本発明の方法は、望ましくないアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞機能活性を下方制御する手段を促進する点において、この目的に有意に貢献し、これは、アゴニスト誘導性のEGFR媒介の望ましくない細胞増殖との関連で特に重要である。したがって、本発明の方法は、乳房、結腸、胃、肺、脳、骨、食道および膵臓の固形腫瘍と関連したものなどの原発性および二次的な悪性腫瘍の処置における使用に特に有用であるが、決してそれらに限定されるわけではない。好ましい方法は、対象において制御されていない細胞増殖を下方制御することであるが、細胞増殖の上方制御はまた、創傷治癒、血管新生または他の治癒プロセスを促進するようなある種の環境においては期待されてもよい。
【００７５】
したがって、本発明のさらに別の局面は、異常な、望ましくない、または他の不適切なEGFR媒介の細胞活性によって特徴付けられる状態を処置および/または予防する方法に関し、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節するのに十分な時間および条件下で有効量の作用物質を哺乳動物に投与することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００７６】
より具体的には、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞活性によって特徴付けられる状態を処置および/または予防する方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節するのに十分な時間および条件下で有効量の作用物質を哺乳動物に投与することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００７７】
さらにより具体的には、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なアゴニスト誘導性のEGFR媒介の細胞増殖によって特徴付けられる状態を処置および/または予防する方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を調節するのに十分な時間および条件下で有効量の作用物質を哺乳動物に投与することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００７８】
「異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切な」な細胞増殖は、過剰に活性な細胞増殖、不要である点で不適切である生理学的に正常な細胞増殖、または不十分な細胞増殖への言及として理解されるべきである。好ましくは、不適切な細胞増殖は、制御されていない細胞増殖である。
【００７９】
好ましくは、細胞増殖は、制御されていない腫瘍性細胞増殖である。最も好ましくは、悪性細胞が、乳房、結腸、胃、肺、脳、骨、食道、膵臓、卵巣、または子宮由来である。
【００８０】
本発明のこれらの局面によれば、異常なEGFR媒介の細胞増殖はアゴニスト誘導性である。
【００８１】
最も好ましい態様では、状態は、エストロゲン誘導性の乳房細胞悪性腫瘍または抗エストロゲン耐性の乳房細胞悪性腫瘍である。
【００８２】
したがって、好ましくは、エストロゲン誘導性の乳房細胞悪性腫瘍を処置および/または予防するための方法が提供され、この方法は、細胞におけるスフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能を下方制御するのに十分な時間および条件下で有効量の作用物質を哺乳動物に投与することを含み、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００８３】
本発明の方法は、好ましくは、対象の増殖を減少させ、遅らせるか、またはそうでなければ阻害することを促進する。「減少させ、遅らせるか、またはそうでなければ阻害する」とは、細胞増殖の部分的なまたは完全な阻害を誘導または促進することへの言及として理解されるべきである。
【００８４】
処置または予防の対象は、一般的に、ヒト、霊長類、家畜用動物（例えば、ヒツジ、ウシ、ウマ、ロバ、ブタ）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）、実験用試験用動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット、ハムスター）、捕獲された野生動物（例えば、キツネ、シカ）などであるが、それらに限定されるわけではない、哺乳動物である。好ましくは、哺乳動物は、ヒトまたは霊長類である。最も好ましくは、哺乳動物はヒトである。本発明は、マウスモデルを利用して例証されるものであるが、これは、本発明の方法の他の種、特にヒトへの適用に関して制限となることを意図してはいない。
【００８５】
本明細書において、「処置」および「予防」は、最も広い状況で考慮されるべきである。用語「処置」は、必ずしも、哺乳動物が全回復まで処置されることを意味しない。同様に、「予防」は、必ずしも、対象が最終的に疾患状態にかからないことを意味しない。したがって、処置および予防は、特定の状態の症候の改善、または特定の状態を発症する危険を妨げるか、もしくはそうでなければ減少させることを含む。用語「予防」は、特定の状態の重症度または開始を減少させるものとして考慮されてもよい。「処置」はまた、現状の重症度を低減させてもよい。
【００８６】
作用物質（スフィンゴシンキナーゼまたはその機能的誘導体もしくは模倣体、またはスフィンゴシンキナーゼ核酸分子を含む）［本明細書において、「調節作用物質」という］の投与は、薬学的組成物の形態で、任意の都合の良い手段で行うことができる。調節作用物質の薬学的組成物は、特定の事例に応じた量で投与される場合、治療的活性を示すことが意図される。変化量は、例えば、ヒトまたは動物および選択される調節作用物質に依存する。広範な投薬量が適用可能である。患者を考慮して、例えば、約0.1mg〜約1mgの調節作用物質が1日に体重1キログラムに対して投与されてもよい。投薬の処方計画は、最適な治療応答を提供するように調整されてもよい。例えば、いくつかに分割した投薬量は、毎日、週ごと、月ごともしくは他に適切な時間間隔で投与することができ、または投薬量は、状況の緊急性によって示されるように比例的に減少させてもよい。調節作用物質は、経口、静脈内（水溶性である場合）、腹腔内、筋肉内、皮下、皮内または坐剤による経路または移植（例えば、持続放出分子を用いる）によるなどの都合の良い方法で投与されてもよい。調節作用物質は、酸付加塩、または例えば、亜鉛、鉄等（この適用の目的で塩として考慮される）との金属錯体などの薬学的に許容される無毒性な塩の形態で投与することができる。このような酸付加塩の例には、塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレイン酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、安息香酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等が挙げられる。有効成分が錠剤形態で投与されなければならない場合、錠剤は、トラガカント、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；アルギン酸などの崩壊剤；およびステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤を含有してもよい。
【００８７】
投与経路には、呼吸器投与、気管内投与、鼻咽頭投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、頭蓋内投与、皮内投与、筋肉内投与、眼内投与、髄腔内投与、大脳内(intracereberally)投与、鼻腔内投与、注入、経口投与、直腸内投与、IV点滴パッチおよび移植が含まれるが、それらに限定されるわけではない。
【００８８】
別の局面では、本発明は、異常な、望ましくない、またはそうでなければ不適切なEGFR媒介の細胞活性によって特徴付けられる状態の処置および/または予防のための薬剤の製造における、スフィンゴシンキナーゼ媒介性シグナル伝達の機能活性を調節することができる作用物質の使用に関し、該スフィンゴシンキナーゼシグナル伝達を下方制御することによりEGFR媒介の細胞内シグナル伝達を下方制御する。
【００８９】
より具体的には、該細胞活性は、細胞増殖である。
【００９０】
好ましくは、該細胞増殖は、制御されていない腫瘍性細胞増殖、およびさらにより好ましくは悪性細胞増殖である。最も好ましくは、悪性細胞は、乳房、結腸、胃、肺、脳、骨、食道、膵臓、卵巣、または子宮由来である。
【００９１】
本発明のこれらの局面に従って、異常なEGFR媒介の細胞増殖はアゴニスト誘導性である。
【００９２】
最も好ましい態様では、状態は、エストロゲン誘導性の乳房細胞悪性腫瘍または抗エストロゲン耐性の乳房細胞悪性腫瘍である。
【００９３】
さらに別の局面では、本発明は、上記で定義した調節作用物質、および1つまたは複数の、薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む薬学的組成物に関する。調節作用物質は、有効成分を指す。
【００９４】
注射可能な使用に適した薬学的形態は、無菌の水溶液（水溶性である場合）または分散液、および無菌の水溶液または分散液の即時調製用の無菌粉末を含み、クリームの形態もしくは局所適用に適した他の形態であってもよい。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならないし、細菌および真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等）、それらの適した混合物、および植物油を含有する溶媒または分散媒体であってもよい。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要な粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物作用の予防は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等によって成し遂げることができる。多くの場合、等張剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期吸収は、組成物において、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によって成し遂げることができる。
【００９５】
無菌の注射可能な溶液は、適切な溶媒中の必要量の活性化合物と、上記で列挙された種々の他の成分を混ぜ、必要に応じて、その後、ろ過滅菌によって調製される。一般的に、分散液は、基本の分散媒体および上記で列挙した成分から必要な他の成分を含有する無菌のビヒクルに種々の滅菌した有効成分を混ぜることによって調製される。無菌の注射可能な溶液の調製用の無菌粉末剤の場合、好ましい調製法は、予めろ過滅菌したその溶液からの任意の追加の所望の成分を加えた有効成分の粉末を生じる真空乾燥技術および凍結乾燥技術である。
【００９６】
有効成分が適切に保護される場合、それらは、例えば、不活性な希釈剤または吸収可能な食用担体と一緒に経口投与することができ、または硬質もしくは軟質の殻のゼラチンカプセルに入れてもよく、または錠剤に圧搾してもよく、または規定食の食物と一緒に直接取り込んでもよい。治療的な経口投与については、活性化合物は、賦形剤と共に取り込んでもよく、摂取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、懸濁液、シロップ、ウエハース等の形態で使用してもよい。このような組成物および調製物は、少なくとも1重量%の有効成分を含有しなければならない。組成物および調製物の割合は、当然、変化させてもよく、都合良くは、単位重量の約5〜約80%であってよい。このような治療的に有用な組成物中の活性化合物の量は、適した投薬量が得られるものである。本発明によれば、好ましい組成物または調製物は、経口の投与量の単位形態が活性化合物の約0.1μg〜2000mgを含有するように調製される。
【００９７】
錠剤、トローチ、丸薬、カプセル等はまた、以下に列挙した成分を含有してもよい。ガム、アカシア、コーンスターチまたはゼラチンなどの結合剤；第二リン酸カルシウムなどの賦形剤；コーンスターチ、ジャガイモスターチ、アルギン酸などの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；および添加されてもよいショ糖、ラクトースまたはサッカリンなどの甘味剤、またはペパーミント、ウィンターグリーン油もしくはチェリーフレーバーなどの香味剤。投与量の単位形態がカプセルである場合、上記のタイプの材料に加えて、液体担体を含有してもよい。種々の他の材料は、コーティング剤として、または他に投与量の単位の物理的形態を修飾するために存在してもよい。例えば、錠剤、丸薬またはカプセルは、セラック、糖またはその両方で被覆されてもよい。シロップまたはエリキシルは、活性化合物、甘味剤としてのショ糖、防腐剤としてのメチルパラベンおよびプロピルパラベン、チェリーまたはオレンジフレーバーなどの色素および香味剤を含有してもよい。当然、任意の投与量の単位形態の調製に使用される任意の材料は、薬学的に純粋であり、使用される量で実質的に無毒でなければならない。さらに、活性化合物は、持続放出調製物および製剤に混ぜられてもよい。
【００９８】
薬学的組成物はまた、標的細胞をトランスフェクトすることができるベクターなどの遺伝子分子を含むことができ、ベクターは、調節作用物質をコードする核酸分子を担持する。ベクターは、例えば、ウイルスベクターであってもよい。
【００９９】
本発明のさらに別の局面は、本発明の方法に使用される場合、上記で定義した調節作用物質に関する。
【０１００】
本発明は、下記の非制限的な実施例を参照することによりさらに説明される。
【０１０１】
実施例1
スフィンゴシンキナーゼはエストロゲンによる上皮細胞増殖因子受容体の「クロス-クロス」トランス活性化を媒介する
材料および方法
細胞培養およびトランスフェクション
ヒト乳癌MCF-7細胞（EFα+/β+；ATCC HTB-22）を、10%ウシ胎児血清（FBS）を含むフェノールレッドを含まないダルベッコ変法イーグル培地（CSL Biosciences, Parkville, Australia）中で培養した。SphKWTおよびSphKG82Dのコンストラクト、およびSphKWT、SphKG82Dまたは空のベクター単独を過剰発現する、安定にトランスフェクトされたMCF-7細胞株はすでに記載されている（Pitson et al., 2000b, J Biol Chem, 275:33945-33950; Sukocheva et al., 2003, Mol Endocrinol, 17:2002-2012）。
【０１０２】
siRNAおよびアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた実験
3'-フルオレセイン修飾を含む化学的に合成されたsiRNA二重鎖は、Qiagen-Xeragon（Germantown, MD）から購入した。siRNA標的配列は、以下の通りであった。
2008546720.tif 000005
下記の18-merのホスホチオエートオリゴヌクレオチドは、Geneworks（Australia）によって合成された。
EDG-3アンチセンス、
2008546720.tif 000006
EDG-3センス、
2008546720.tif 000007
。
トランスフェクションに関しては、Lipofectamine-2000試薬（Invitrogen）を使用し、MCF-7細胞は、実験の前日に、50,000細胞/ウェルの密度で6ウェルプレートに播種した。トランスフェクションの36〜48時間後、標的遺伝子の発現レベルを、RT-PCRおよび/またはウェスタンブロットによって検出した。
【０１０３】
逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（RT-PCR）解析
総RNAをTRIzol（Invitrogen）を用いて細胞培養物から抽出した。一本鎖cDNAを、Omniscript逆転写酵素（Qiagen）およびオリゴ-dTプライマー（Geneworks）を用いて、20ml全量で、1mgの総RNAから合成した。SphK1、SphK2およびEdgG-3は、内部GAPDH対照と共に、PTC-100 Programmable Thermal Controller（MJ Research, Inc）で増幅させた。増幅に使用したプライマーは、以下の通りであった。
SphK1（センス）
2008546720.tif 000008
およびSphK1（アンチセンス）
2008546720.tif 000009
SphK2（センス）
2008546720.tif 000010
およびSphK2（アンチセンス）
2008546720.tif 000011
Edg-3（センス）
2008546720.tif 000012
およびEdg-3（アンチセンス）
2008546720.tif 000013
。
増幅産物は、エチジウムブロマイドで染色された1.5%アガロース中で電気泳動を行い視覚化した。画像は、UVitec Gelドキュメンテーションシステムに記録させた。
【０１０４】
イムノブロット解析
細胞を回収し、50mM Tris/HCl（pH 7.4）、10%グリセロール、0.05% Triton X-100、150mM NaCl、1mMジチオスレイトール、2mM Na3VO4、10mM NaF、1mM EDTAおよびプロテアーゼ阻害剤（Roche Molecular Biochemicals）を含有する可溶化バッファー中で超音波処理により溶解した。細胞溶解物のアリコートを、8〜12% SDS-PAGEによって分離し、Hybond-Pメンブラン（Amersham）に転写した。次に、メンブレンを、製造業者の標準的な方法に従って、適切な抗体を用いて調べた。免疫複合体は、増強化学発光PLUSキット（Amersham Pharmacia Biotech）を用いて検出した。Image Quantプログラムを用いて、Typhoon 9410上でデンシトメトリーを行った。
【０１０５】
免疫蛍光顕微鏡解析
MCF-7細胞を、フィブロネクチンを被覆した8ウェルチャンバースライド（Lab-Tech）上に播種し、48時間培養した。刺激後、細胞を4%パラホルムアルデヒドで固定し、0.1% Triton X-100で透過性にした。次に、細胞を、モノクローナル抗Edg-3（1:100）抗体およびポリクローナル抗EGFR（1:100）抗体と共にインキュベートし、間接免疫蛍光は、蛍光プローブ（Alexa Fluor488またはFluor594）が結合された二次抗体で検出した。蛍光染色した細胞を、Cool Snap FXチャージを連結したデバイスカメラ（Photometrics）を装備したOlympus BX-51顕微鏡で落射蛍光顕微鏡法によって映像化した。画像を、V++ソフトウェア（Digital Optics Ltd. Auckland New Zealand）を用いて解析した。
【０１０６】
SphK活性およびS1P放出アッセイ
SphK活性は、すでに説明されるように（Xia et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA, 95:14196-14201）、0.1% Triton X-100に溶解した5mM D-エリスロ-スフィンゴシン、および[γ32P]ATPと共に細胞分画を30分間、37℃でインキュベートすることによって慣例的に測定した。酵素活性を、S1P形成（pmol）/分/mgタンパク質の量として定義した。細胞外のS1P放出を測定するために、細胞を、[3H]セリン（5μCi/ml）を用いて、48時間、代謝的に標識した。30分間のE2刺激後、培地を回収し、脂質を、クロロホルム：メタノール：酢酸（10:10:1, v/v）を添加することによって抽出した。次に、[3H]S1Pを、すでに説明されるように（Xia et al., 1998、前記）、薄層クロマトグラフィーによって分離し、シンチレーションスペクトロメトリーによって定量し、全体の細胞外の脂質に回収された放射活性によって標準化した。
【０１０７】
結果
MCF-7細胞におけるEGFRのS1P刺激活性化
MCF-7細胞におけるS1Pの効果を試験した。図1Aは、1mmol/L S1Pに応答して、EGFRのチロシンリン酸化がMCF-7細胞において時間依存的に増加したことを示す。EGFRリン酸化は、10分でピークに達したが、その後、減少は、処置後240分でなお明確に確認された。並行して、EGFRの主要な下流のシグナル分子であるERF1/2はまた、EGFRのリン酸化に類似して時間依存的にリン酸化された（図1A）。S1Pの濃度応答は、EGFRおよびERK1/2の両方のリン酸化に対して約5nmol/LのEC50を示し、最大のリン酸化は、約500nmol/Lで観察された（図1B）。総合すると、これらの結果は、乳癌細胞においてEGFR活性化を誘導するS1Pの能力を示している。
【０１０８】
E2およびS1Pは共通のシグナル経路を通じてEGFRのトランス活性化を誘導した
S1PがMCF-7細胞におけるEGFRトランス活性化の刺激においてE2を模倣することができるか否かについて探索した。MCF-7細胞のE2処理は、S1P処理した細胞において観察されたのと同様にEGFRおよびERK1/2活性化の急激なチロシンリン酸化をもたらした（図2A）。E2誘導性およびS1P誘導性のEGFRのトランス活性化は、Gi特異的阻害剤である百日咳毒素（PTX）によってブロックされた。PTXはまた、E2またはS1P刺激のいずれかに応答してERK1/2のリン酸化を有意に阻害した（図2A）。対照的に、EGF刺激によるEGFRおよびERK1/2のリン酸化は、PTXによって阻害されなかった（図2A）。
【０１０９】
EGFRのトランス活性化がその内部のチロシンキナーゼ活性に依存する（Prenzel et al., 1999、前記）ので、チロシンキナーゼ活性がE2誘導性またはS1P誘導性のEGFRトランス活性化に必要であるか否かについて解析を行った。AG1478の存在下で、特異的なEGFRチロシンキナーゼ阻害剤であるE2誘導性およびS1P誘導性のEGFRトランス活性化は、完全に消失した（図2A）。ERK1/2の活性化は、有意に阻害された。対照として、AG1478は、EGFで刺激したEGFRリン酸化の完全な阻害を誘導し、MCF-7細胞においてのEGFR活性におけるAG1478の特異的な作用を支持している。
【０１１０】
Srcファミリーキナーゼは、GPCR媒介のEGFRのトランス活性化におけるシグナル伝達の役割を果たすことが示唆されている（Gschwind et al.,2001、前記）。このSrcの役割を評価するために、刺激前30分間、Src阻害剤であるPP2（100nmol/L）で細胞を前処理した。図2Aに示されるように、E2およびS1Pで刺激したEGFRトランス活性化は共に、PP2処理によって有意に阻害された。
【０１１１】
マトリックスメタロプロテアーゼ（MMP）活性によるヘパリン結合EGF（HB-EGF）の脱落はまた、GPCRリガンドによるEGFRトランス活性化を媒介する重要なメカニズムとして認識されている（Prenzel et al., 1999、前記）。したがって、HB-EGF脱落が、E2誘導性またはS1P誘導性のEGFRトランス活性化に関与しているか否かについて解析を行った。最初に、MCF-7細胞を、バックグラウンドの自己分泌による刺激を減らすために酸洗浄工程に供し、次に、MMP阻害剤であるo-フェナントロリンまたはGM6001で前処理した。E2誘導性およびS1P誘導性のEGFRトランス活性化ならびにERK1/2活性化は、これらの2つのMMP阻害剤によってブロックされた（図2B）。対照的に、MMP阻害剤は、EGFRそれ自体の固有のキナーゼ活性、およびEGFRの自己リン酸化を誘導するEGFの能力に影響しなかった。さらに、EGF中和抗体による培養物からのHB-EGF産物の枯渇は、E2誘導性およびS1P誘導性のEGFRトランス活性化の有意な阻害をもたらした（図2B）。中和抗体の効率および特異性は、EGFで刺激したEGFRチロシンリン酸化の阻害によって示された。これらのデータは、さらに、HB-EGF脱落およびE2またはS1P処理した細胞がEGFRトランス活性化のプロセスに関与することを示唆している。
【０１１２】
SphK1活性化はE2誘導性のEGFRトランス活性化に関与する
S1Pは、E2刺激のEGFRトランス活性化の効果を模倣することができ、E2は、SphK1活性化によるS1P産生を刺激することができたので、E2誘導性のEGFRトランス活性化は、SphK1活性化を通じて媒介され得ると仮定された。この仮説を調べるために、野生型SphK1（SphK1WT）、ドミナントネガティブなSphK1（SphK1G82D）、または空のベクター単独をそれぞれ過剰発現する、安定にトランスフェクトされたMCF-7細胞株を使用した。SphK1WTをトランスフェクトされた細胞における基底のSphK活性は、対照細胞よりも約10倍高いことが以前に示されている（Sukocheva et al., 2003、前記）。E2刺激は、SphK1WTをトランスフェクトした細胞および対照のMCF-7細胞の両方において、基底レベルを約2倍超えるSphK活性の急激な増加をもたらした。対照的に、SphK1G82Dをトランスフェクトした細胞は、対照細胞と同様の基底のSphK活性を示したが、E2で刺激したSphK活性は、完全に消失した。興味深いことに、E2で刺激したEGFRのチロシンリン酸化およびERK1/2の活性化は、SphK1 WTをトランスフェクトした細胞において増大したが、E2の刺激作用は、SphK1G82Dトランスフェクタントにおいて消失した（図3A）。ウェスタンブロット分析によって測定した全EGFR発現レベル（図3A）、またはフローサイトメトリーによって測定したEGFRの細胞表面の発現レベル（図3B）のいずれかにおけるこれらのトランスフェクトされた細胞株間に有意な相違はない。対照的に、EGFおよびS1Pで刺激したEGFRリン酸化のいずれもSphK1G82Dによっては有意に影響されなかった。したがって、これらの結果は、E2誘導性のEGFRトランス活性化におけるSphK活性についての特異的な役割を示唆している。
【０１１３】
2種の哺乳類のSphKアイソフォーム（すなわち、SphK1およびSphK2）がクローニングされ、両アイソフォームは、細胞のSphK活性の全体を占める（Kohama et al., 1998, J Biol Chem, 273:23722-23728; Liu et al., 1999, Mol Biol Cell,10:1179-1190）。いずれのアイソフォーム（または両方）がEGFRのトランス活性化ならびに内因性のSphKに対する役割に関与するかを特定するために、siRNAストラテジーを用いて、MCF-7細胞における各SphKアイソフォーム遺伝子発現をノックダウンさせた。SphK1特異的なsiRNAを用いた細胞の処理により、スクランブルsiRNAで処理した細胞と比較して、SphK1 mRNAは86±11%まで抑制され、基底のSphK活性は48±12%まで阻害された（図4A）。さらに、E2、EGFまたはS1Pに応答して増加したSphK活性は、SphK1 siRNAによってほとんど完全に消失した（図4B）。結論として、SphK1 siRNAは、SphK1G82Dをトランスフェクトした細胞において示されたのと同程度まで、E2誘導性のEGFRチロシンリン酸化およびERK1/2活性の有意な阻害を誘導した（図4C）。重ねて、SphK1G82Dを用いた実験の観察と一致して、EGFRおよびERK1/2のEGFおよびS1P誘導性の活性化は、SphK1 siRNAによって有意に影響されなかった。興味深いことに、SphK2特異的なsiRNAは、SphK2発現を効果的にノックダウンし、約50%まで基底のSphK活性を阻害したが、E2、EGFまたはS1Pによって誘導されるSphK活性の増加の程度は、変化しなかった（図4AおよびB）。同様に、SphK2 siRNAは、E2、S1PまたはEGF刺激にに対する応答において、EGFRチロシンリン酸化またはERK1/2活性化において有意な阻害効果はなかった（図4C）。総合すれば、これらのデータは、E2刺激によるEGFRのトランス活性化の媒介における、SphK2ではなく、SphK1の重大な役割を示唆している。
【０１１４】
S1P受容体、Edg-3はE2によるEGFRのSphK1に依存したトランス活性化に必要である
E2によるSphK1に依存したEGFRのトランス活性化における、S1Pおよびその受容体の役割を決定するために探索を行った。解析は、最初に、S1Pが、細胞におけるE2刺激に対する応答においてSphK1活性化により放出されるか否かということに向けられた。図5Aに示されるように、S1Pレベルは、未処理の細胞よりも、E2で刺激されたMCF-7細胞から回収した馴化培地（CM）において有意に高かった（172±22%）。さらに、S1Pレベルは、対照のMCF-7細胞と比較して、基底レベルと刺激されたレベルの両方で、SphK1WTをトランスフェクトした細胞からのCMにおいておよそ5倍まで増加した。SphK1G82Dをトランスフェクトした細胞からのCMでは、E2刺激後にS1Pレベルの増加は検出されず（図5A）、SphK1活性化は、S1Pの産生およびE2で刺激された細胞からの放出をもたらすことを示している。同様に、E2で処理した細胞由来のCMは、未処理の細胞からのCMと比較して、EGFRチロシンリン酸化を刺激する実質的により大きな能力を示した（図5B）。さらに、E2で処理したSphK1WTをトランスフェクトした細胞からのCMは、EGFRのチロシンリン酸化においてさらに刺激作用があった。対照的に、本発明者らは、E2で処理したSphK1G82Dをトランスフェクトした細胞由来のCMでは、EGFRリン酸化のいかなる刺激も検出できず、このことは細胞のSphK活性またはS1Pの放出は、CM誘導性のEGFR活性化をもたらすことを示唆している。加えて、CM誘導性のEGFR活性化は、PTXによって完全にブロックされ（図5B）、さらに、E2で刺激したトランス活性化経路においてS1PとそのGPCRの決定的な関与を支持している。
【０１１５】
E2シグナル伝達におけるEdg-3の潜在的な役割を評価するために、Edg-3活性化におけるE2の効果を直接試験した。Edg-3様の大部分の他のGPCRは、リガンド結合および受容体の活性化に続いて内在化を受ける（Liu et al., 1999、前記）。したがって、Edg-3の内在化は、免疫蛍光顕微鏡解析によって評価した。図6の結果は、MCF-7細胞において、Edg-3が、E2（10nmol/L）による2分の刺激後に急速に内在化され、約30分間そのままであったことを示す。対照として、100nmol/L S1Pによる細胞の処理は、E2刺激後に観察されたものと同じパターンで急速であり一時的なEdg-3の内在化を誘導した。E2媒介のEGFRトランス活性化におけるEdg-3の関与に関する証拠をさらに固めるために、アンチセンスストラテジーを用いて、内因性Edg-3発現をノックダウンさせた。Edg-3アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてトランスフェクトされた細胞では、Edg-3センストランスフェクタントと比較して、Edg-3 mRNAおよびタンパク質レベルをそれぞれ61±17%および68±12%まで減少する結果となった（図7AおよびB）。顕著に、Edg-3アンチセンスは、E2またはS1P刺激のいずれかと応答して、細胞においてEGFRチロシンリン酸化の有意な阻害を誘導し、一方で、EGF誘導性のEGFR自己リン酸化は保持された（図7B）。総合すると、これらの結果は、EGFRをトランス活性化するE2シグナル伝達の媒介においてS1P受容体Edg-3の重大な役割を示唆している。
【０１１６】
当業者は、本明細書において記載された発明が、具体的に記載されたもの以外の変形および変更を受け入れる余地があることを理解すると考えられる。本発明は、全てのこのような変形および変更を含むことが理解されるべきである。本発明はまた、個別または集合的に、本明細書において言及または指示された段階、特色、組成物および化合物の全て、および任意の2つまたはそれ以上の段階または特色の任意の組合せおよび全ての組合せを含む。
【０１１７】
参考文献一覧
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【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】S1PがEGFRをトランス活性化することを表す画像である。MCF-7細胞を、（A）1mmol/L S1Pで所定時間、または（B）濃度を増加させたS1Pで15分間刺激した。細胞溶解物をSDS-PAGEに供し、EGFRおよびERK1/2のリン酸化をリン酸特異的抗体によって分析した。棒グラフは、対照値のパーセントで表される3つの組み合わせた実験値を示す（平均±SD）。活性の密度値を、全タンパク質レベルによって標準化した。
【図２】S1Pが、MCF-7細胞においてEGFRトランス活性化を誘導するE2を模倣することを表す画像である。血清を枯渇させたMCF-7細胞を、（A）PTX（100ng/ml）で16時間もしくはAG1478（50mmol/L）、およびPP2（100nmol/L）で1時間、前培養し、または（B）MMP阻害性フェナントロリン（20mmol/L）、GM6001（50nmol/L）もしくはEGF中和抗体（15mg/ml）で1時間、前処理し、その後、10nmol/L E2、1mmol/L S1Pまたは25ng/ml EGFで15分間刺激した。次に、細胞溶解物を、ウェスタンブロッティングによって分析し、リン酸化されたEGFRおよびERK1/2の程度は、図1のように定量した。データは、平均±SDである。＊p<0.01; †p<0.05、処理対未処理。
【図３】E2誘導性のEGFRトランス活性化に対するSphK活性の効果を表す画像である。（A）SphK1WT、SphK1G82Dまたはベクター単独を過剰発現する安定にトランスフェクトされたMCF-7細胞を、10nmol/L E2、1mmol/L S1Pまたは25ng/ml EGFで15分間刺激した。次に、細胞溶解物を、ウェスタンブロッティングによって分析し、リン酸化されたEGFRおよびERK1/2の程度は、図1のように定量した。データは、平均±SDである。＊p<0.01; †p<0.05、SphK1WTまたはSphK1G82D対ベクター単独。（B）フローサイトメトリープロファイルは、トランスフェクトされたMCF-7細胞株のEGFRの細胞表面発現レベルを示す。
【図４】SphK2ではなく、SphK1がE2誘導性のEGFRトランス活性化をもたらすことを表す画像である。MCF-7細胞は、「材料および方法」に記載されるSphK1、SphK2またはスクランブルコントロールRNAに特異的なsiRNAでトランスフェクトされた。トランスフェクションの24時間後、下記の実験を行った：（A）SphK1およびSphK2 mRNAのレベルを、RT-PCRによって決定し、GAPDH mRNAレベルとの比によって定量した。（B）siRNAをトランスフェクトされたMCF-7細胞を、10nmol/L E2、1mmol/L S1Pまたは25ng/ml EGFで15分間刺激した。次に、SphK活性を評価し、（C）リン酸化されたEGFRおよびERK1/2のレベルを、図1のように分析した。データは、平均±SDである。＊p<0.01; †p<0.05、SphK1またはSphK2 siRNA対 対照。
【図５】E2誘導性のEGFRトランス活性化が、MCF-7細胞からのS1P放出によって媒介されることを表す画像である。（A）細胞外S1Pレベルを、SphK1WT、SphK1G82Dまたはベクター単独を過剰発現しているトランスフェクトされたMCF-7細胞において、10nmol/L E2で15分間の刺激後に決定した。データは、平均±SDである。（B）MCF-7細胞を、PTXを用いるかまたは用いず16時間前処理し、かつE2を用いるかまたは用いず処理されたトランスフェクトされたMCF-7細胞由来の馴化培地で15分間刺激した。次に、リン酸化されたEGFRのレベルを図1のように決定した。
【図６】MCF-7細胞におけるE2刺激のEdg-3内在化の画像である。10nmol/L エストロゲンまたは100nmol/L S1Pで2分間または30分間刺激後、MCF-7細胞を、Edg-3（上段パネル）またはEGFR（中段パネル）に対する抗体で免疫蛍光的に染色した。Edg-3（赤）およびEGFR（緑）染色の画像を下段パネルに重ね合わせた。
【図７】E2誘導性のEGFRトランス活性化に対するEdg-3の効果を表す画像である。MCF-7細胞は、「材料および方法」に記載されるEdg-3アンチセンスまたはセンスでトランスフェクトされた。トランスフェクションの24時間後、下記の検討を行った：（A）Edg-3 mRNAのレベルを、RT-PCRによって測定し、GAPDH mRNAレベルとの比によって定量した。（B）Edg-3センスまたはアンチセンスをトランスフェクトした細胞を、10nmol/L E2、1mmol/L S1Pまたは25ng/ml EGFで15分間刺激し、リン酸化されたEGFRおよびERK1/2の程度は、図1のように分析した。データは、平均±SDである。＊p<0.01; †p<0.05、Edg-3アンチセンス対センス。
【図８】SphK1/S1Pシグナル伝達経路の活性化を通じたE2誘導性のEGFRトランス活性化のためのモデルを示した略図である。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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