(57)【要約】  構造ヒドロゲナーゼ遺伝子（複数）および／または成熟遺伝子ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧを、これらの遺伝子を含有する生物から発現プラスミドへクローニングすることと、このプラスミドを、生来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを欠くか、または破壊された［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを有する生物に導入してそれを好気性培養することと、および嫌気生活に誘導して［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ生合成およびＨ2生成をさせることを含む、［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの構造遺伝子（複数）および／または成熟遺伝子ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、およびＨｙＧのホモローグのいずれかを含まない宿主生物で活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現させる方法。
2008531055.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの構造遺伝子（複数）および／または該成熟遺伝子ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、およびＨｙＧのホモローグのいずれかを含まない宿主生物において活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現させる方法であって、
構造ヒドロゲナーゼ遺伝子（複数）および／または成熟遺伝子ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧを、これらの遺伝子を含有する生物から発現プラスミドへクローニングすることと、
該プラスミドを、生来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを欠くか、または破壊された［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを有する生物に導入してそれを好気性培養することと、および
嫌気生活に誘導して［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ生合成およびＨ2産生をさせること
を含む方法。
【請求項２】
前記［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを含有する生物が緑藻である請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記生物が［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを含有する任意の真核生物または原核生物である請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記生物が、Ｃ．ラインハーディＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧ遺伝子のホモローグを含有する請求項３記載の方法。
【請求項５】
Ｃ．ラインハーディＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧ遺伝子のホモローグを含有する前記ホモローグが、限定はされないが、Ｔ．マリティマ、Ｔ．ネアポリタナ、Ｃ．サーモセラム、Ｃ．パステリアヌム、Ｂ．セタイオタオミクロン、Ｔ．テンコンゲンシス、Ｄ．ブルガリス、Ｃ．アセトブチリカム、Ｃ．パーフリンジェンス、Ｄ．デスルフリカンス、Ｃ．ボツリヌム、Ｃ．ディフィシル、Ｓ．オネイデンシス、およびＣ．テタニからなる群より選択される請求項４記載の方法。
【請求項６】
生来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを欠く前記生物がＥ．コリである請求項１記載の方法。
【請求項７】
生来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを欠く前記生物が、破壊された不活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを含有する任意の生物である請求項１記載の方法。生来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを欠く前記生物が、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼを含有する任意の生物である請求項１記載の方法。
【請求項９】
嫌気生活に誘導することが、暗中で中性ガスをパージすることによるか、還元剤を添加することによる請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記中性ガスはアルゴンである請求項９記載の方法。
【請求項１１】
嫌気生活に誘導することが、硫黄欠乏培養物を露光させることによる請求項１記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧ遺伝子が、Ｃ．アセトブチリカムから選択され、かつ前記ヒドロゲナーゼ構造遺伝子、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧ遺伝子が発現することになる前記宿主生物がＥ．コリである請求項５記載の方法。
【請求項１３】
前記Ｃ．ラインハーディＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、ＨｙｄＧのホモローグおよび前記ヒドロゲナーゼ構造遺伝子（複数）を同時発現するＥ．コリ。
【請求項１４】
前記生来のヒドロゲナーゼ（［ＦｅＦｅ］または［ＮｉＦｅ］のいずれか）遺伝子（複数）が破壊され、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦ、ＨｙｄＧおよび［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ構造遺伝子を同時発現し、かつ活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを合成する宿主生物。
【請求項１５】
前記生物が限定されないが、Ｅ．コリである請求項１４記載の宿主生物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００５年２月２８日出願の仮出願第６０／６５６，９５７号の利益を主張する。
【０００２】
［本発明の契約上の起源］
米国政府は、米国エネルギー省とミッドウエスト  リサーチ  インスティチュート（Midwest Research Institute）との間の契約番号第ＤＥ−ＡＣ３６−９９ＧＯ１０３３７号に従って、本発明の権利を有する。
【０００３】
［技術分野］
本発明は、適切な生物由来の遺伝子の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼアセンブリを用いて、任意の適切な宿主において発現する、任意の活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの発現および過剰発現を提供するための遺伝子の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
水素を無公害性燃料として用いることで、化石燃料の利用に伴う環境的および政治的懸念が軽減される可能性は非常に高い。
【０００５】
最も効率的なＨ2産生触媒の中で、光合成緑藻のクラミドモナス・ラインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）などの多くの微生物に見られる［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ酵素が既知である。水から水素を生成させるために、緑藻類としても知られるクラミドモナス・ラインハーディを用いることは、６０年以上も前から認識されていた。水素を生成する反応は、短期間の嫌気生活に曝すと細胞に誘導される酵素である可逆性ヒドロゲナーゼにより触媒される。この酵素の活性は、光が当たると、光合成で発生したＯ2により可逆性ヒドロゲナーゼが直ちに不活性化してしまうため、速やかに失われてしまう。
【０００６】
Ghirardiらは、「水素の光生成用生物学的システム（Biological Systems For Hydrogen Photoproduction）」（FY 2004 Progress Report）において、Ｏ2耐性を高めて好気性Ｈ2生成系で機能するようにした藻類ヒドロゲナーゼ変異体を生み出す方法を開示しているが、これは藻類の生成システムを用いるＨ2光生成にさらに最適化される。これは、酵素の触媒部位にＯ2が到達するための経路が閉鎖されることによりＯ2耐性が高まった［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ発現組換え藻を生み出す。
【０００７】
T.Happeらは、「緑藻クラミドモナス・ラインハーディにおける嫌気性適応中のＦｅヒドロゲナーゼの差異調節（Differential Regulation Of The Fe-Hydrogenase During Anaerobic Adaptation ln The Green Alga Chlamydomonas reinhardtii）」Eur. J. Biochem. 269, 1022-1032（2002）において、抑制サブトラクティブハイブリダイゼーション（suppression subtractive hybridization）（ＳＳＨ）法の使用を開示しており、その中で嫌気生活下での遺伝子の差次的発現が分析された。細菌Ｆｅ−ヒドロゲナーゼの遺伝子と類似性を有するＰＣＲフラグメントが単離され、Ｃ．ラインハーディの嫌気性ｃＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングするのに用いられた。ＨｙｄＡのｃＤＮＡ配列は、見掛けの分子量が５３．１ｋＤａのタンパク質をコードする１４９４-ｂｐのＯＲＦを含有する。ヒドロゲナーゼ遺伝子の転写は、細胞の嫌気性適応中に非常に速やかに誘導される。推定アミノ酸配列は、単離された生来のタンパク質の配列分析により決定された２つのポリペプチド配列に対応する。Ｆｅ−ヒドロゲナーゼは５６アミノ酸の短い輸送ペプチドを含有し、これがヒドロゲナーゼから葉緑体ストロマへの経路である。単離されたタンパク質はＦｅ−ヒドロゲナーゼのクラスに属する。４個のシステイン残基と他のアミノ酸１２個は全て、Ｆｅ−ヒドロゲナーゼの活性部位（Ｈ−クラスター）に完全に保存され、同定されている。Ｃ．ラインハーディのタンパク質のＮ末端は、他の非藻類Ｆｅ−ヒドロゲナーゼと比較して明らかに切断されている。しかも、他のＦｅ−ヒドロゲナーゼでは付加的なＦｅ−Ｓ−クラスターに配位するシステインが保存されているが、それが失われている。天然の電子供与体であるフェレドキシンＰｅｔＦは、Ｃ．ラインハーディ由来のヒドロゲナーゼを光合成電子伝達鎖に繋げる。ヒドロゲナーゼは、還元当量から電子を酵素に伝達することにより、嫌気性条件下で緑藻類が生存することを可能にする。
【０００８】
緑藻、クラミドモナス・ラインハーディ由来の第二の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の単離および同定、ここで５０５アミノ酸からなるタンパク質をコードするＨｙｄＡ２遺伝子はＣ．ラインハーディ由来の既知のＨｙｄＡ１ヒドロゲナーゼと７４％類似であり６８％同一である。ＨｙｄＡ２は、Forestierらによって「嫌気性条件下でのクラミドモナス・ラインハーディの２つの［Ｆｅ］−ヒドロゲナーゼの発現（Expression Of Two [Fe]-Hydrogenase In Chlamydomonas reinhardtii Under Anaerobic Conditions）」、Eur. J. Biochem. 270, 2750-2758（2003）で開示した［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼのファミリーの触媒核に見いだされる保存された残基およびモチーフを全て含む。ＨｙｄＡ１転写物およびＨｙｄＡ２転写物の両方が、嫌気性誘導の際発現し、中性ガスパージまたは培地の硫黄欠乏のいずれかにより完成（achieve）されることが実証されている。さらに、両転写物の発現レベルは、嫌気生活の長さ、Ｏ2の再添加、酢酸エステルの存在、および／または成長中の硫酸塩などの栄養素の欠如などのインキュベーション条件により調節される。ＨｙｄＡ２に特異的な抗体が、嫌気性誘導したＣ．ラインハーディ細胞からの抽出物中の約４９ｋＤａのタンパク質を認識し、このことはＨｙｄＡ２が発現したタンパク質をコードすることを強く示唆している。ＨｙｄＡ２ヒドロゲナーゼの相同性に基づく３Ｄモデリングは、その触媒部位が、Ｈ2ガスチャンネルも含めてクロストリジウム・パステリアヌム（Clostridium pasteurianum）ＣｐＩの既知構造とよく似ていることを示す。ＨｙｄＡ１、ＨｙｄＡ２とＣｐＩとの主な違いは、Ｎ末端Ｆｅ−Ｓ中心がないこと、および藻類酵素には余分な配列が存在することである。
【０００９】
「エンタモエバ・ヒストリティカおよびジアルジア・ランブリアの鉄依存性ヒドロゲナーゼ：組換えエンタモエバ酵素の活性および水平遺伝子伝達の証拠（Iron-Dependent Hydrogenases of Entamoeba histolytica and Giardialamblia:Activity of the Recombinant Entamoebic Enzyme and Evidence for Lateral Gene Transfer）」、Biol. Bull. 204: 1-9.（２００３年２月）には、エンタモエバ・ヒストリティカおよびスピロヌクレウス・バルカヌス（Spironucleus barkhanus）は短い鉄依存性ヒドロゲナーゼ（Ｆｅ−ヒドロゲナーゼ）をコードする遺伝子を有するが、これらの原生生物はヒドロゲノソームが欠けていることが開示されている。Ｅ．ヒストリティカの組換え短Ｆｅ−ヒドロゲナーゼを調製し、その活性をインビトロで測定する。短Ｆｅ−ヒドロゲナーゼをコードするジアルジア・ランブリア遺伝子をショットガンゲノム（shotgun genomic）配列から同定すると、ＲＴ−ＰＣＲにより培養したエンタモエバおよびジアルジアがｍＲＮＡで短Ｆｅヒドロゲナーゼを転写することが示された。長Ｆｅ−ヒドロゲナーゼをコードするＥ．ヒストリティカの第二の遺伝子をショットガンゲノム配列から同定した。系統発生学的分析は、エンタモエバとディプロモナス類の短Ｆｅ−ヒドロゲナーゼ遺伝子は祖先を共有するのに対して、エンタモエバの長Ｆｅ−ヒドロゲナーゼ遺伝子は細菌から外部（laterally）伝達されたようであることを示した。これらの結果は、こうした原生生物の発酵酵素をコードする遺伝子の起源についての競合する意見の脈絡において議論される。
【００１０】
米国特許出願公開第２００４／０２００９２５６号明細書は、水素を産生させるために微生物を操作する方法および組成物を開示する。本発明の方法の中には、ヒドロゲナーゼ遺伝子の記録と続いて記録された遺伝子をアニーリングに基づく組換え法にかけることを含むものがある。本発明はさらに、異なるゲノム配列を含む他の生物で再コード化し組み換えられたヒドロゲナーゼ遺伝子で形質転換された生物を交配する方法を提供する。
【００１１】
多数の微生物（Ｃ．ラインハーディを含む）で見いだされる［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ酵素のＨ2産生触媒の分野では、Ｃ．ラインハーディ遺伝子の同時発現なしに藻類［ＦｅＦｅ］ヒドロゲナーゼ構造遺伝子が発現すると不活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの蓄積がもたらされるという事実があるため、活性藻類［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ酵素の形成に必要な遺伝子を同定する必要がある。
【００１２】
その上さらに、［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ酵素のＨ2産生触媒の分野では、Ｅ．コリにおけるＣ．ラインハーディ遺伝子と藻類［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ構造遺伝子との同時発現により生来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを欠くこの細菌で活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの合成をもたらす必要がある。
【００１３】
［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ酵素のＨ2産生触媒の分野では、安定な組換えＥ．コリ系で活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを過剰発現させる方法を実証および提供すること、および、Ｃ．アセトブチリカムのＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧタンパク質を用いてＨクラスターをＣ．ラインハーディ［Ｆｅ］−ヒドロゲナーゼにアセンブリおよび挿入して非同種［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの活性化を達成することというさらに別の必要があり、これはＣ．アセトブチリカムの［ＦｅＦｅ］ヒドロゲナーゼアセンブリ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカムもしくはＣ．ラインハーディの構造遺伝子、または発現宿主としてのＥ．コリの使用に限らず、任意の適した生物由来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼアセンブリ遺伝子を用いて、任意の適した宿主で発現する、任意の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの発現を達成することでもある。
【発明の開示】
【００１４】
本発明の１つの目的は、Ｃ．ラインハーディ遺伝子を同時発現しない藻類［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ構造遺伝子の発現が、不活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの蓄積をもたらすことを考えれば、活性藻類［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ酵素の形成に必須である遺伝子を同定することである。
【００１５】
本発明の別の目的は、Ｃ．ラインハーディ遺伝子と藻類［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ構造遺伝子の同時発現を利用してＣ．ラインハーディで活性藻類［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼをアセンブリすることができる方法を提供することである。
【００１６】
本発明のさらなる目的は、Ｅ．コリでＣ．ラインハーディ遺伝子と藻類［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ構造遺伝子を同時発現させて生来の［Ｆｅ］−ヒドロゲナーゼを欠くこの細菌で活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを合成させることである。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、安定な組換えＥ．コリ系で活性［ＦｅＦｅ］ヒドロゲナーゼを過剰発現させ、またＣ．アセトブチリカムのＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧタンパク質を用いてＨクラスターをＣ．ラインハーディ［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼにアセンブリし、および挿入して非同種［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの活性化を達成する方法を実証かつ提供することであり、これはＣ．アセトブチリカム由来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼアセンブリ遺伝子、Ｃ．アセトブチリカムもしくはＣ．ラインハーディ由来の構造遺伝子、または発現宿主としてのＥ．コリの使用に限らず、適した任意の生物由来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼアセンブリ遺伝子を用いて、適した任意の宿主で発現する、任意の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの発現を達成することでもある。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１８】
実験手順  株
Ｃ．ラインハーディ株ＣＣ４２５（ｃｗ１５、ｓｒ−ｕ−６０、ａｒｇ７−８、ｍｔ＋）を、Anastasios Melis教授（カリフォルニア大学、バークレー、ＣＡ）により提供されたｐＪＤ６７プラスミド（Davies, J. P.ら、[1999] Plant Cell 11, 1179-1190）で形質転換することにより、挿入変異ライブラリーを作製した。
【００１９】
水素および酸素アッセイ
トリス−アセテート−ホスフェート（ＴＡＰ）寒天板上で増殖するコロニーを用いて化学クロミック（chemochromic）スクリーニングを行った。ヒドロゲナーゼ活性を暗中で嫌気性誘導し、翌日Ｈ2の光生成を観察した。液体培養物での光合成、呼吸、およびＨ2の光生成率を求めた（M. Forestier ら、[2003] Eur. J. Biochem. 270, 2750-2758）。
【００２０】
バリアン（Varian）３７００型ガスクロマトグラフ（ＧＣ）を用いて、嫌気性に密閉した培養物のヘッドスペースの水素をアッセイした。ヒドロゲナーゼ活性のメチルビオロゲン（ＭＶ）アッセイのため、細胞を取り除いて、密閉した嫌気性バイアル中、等量の嫌気性２×ＭＶ溶液（１００ｍＭのＭＶ（酸化）、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、および０．２％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）を添加した。脱気した亜ジチオン酸ナトリウムを、最終濃度が４ｍＭとなるように添加して、還元されたＭＶからＨ2生成を開始させた。
【００２１】
細胞懸濁液の嫌気性誘導
Ｃ．ラインハーディ培養物を、ＴＡＰ培地で、クロロフィル合計が約２０μｇ／ｍｌになるまで増殖させ、２５００ｇで５分間遠心分離し、５０ｍＭのリン酸カルシウム（ｐＨ７．０）および３ｍＭのＭｇＣｌ2を含む誘導緩衝液（ＡＩＢ）に１０分の１の体積で再懸濁させた［２７］。試料を、遮光用アルミホイルを巻いてゴムのセプタムで栓をしたバイアルに入れ、アルゴンを１５分間フラッシュし、そして室温で暗中嫌気下インキュベートした。
【００２２】
サザンブロット分析およびノーザンブロット分析
標準的な方法でサザンブロット実験を行った。DNeasy  Plantミニキット（キアゲン（Qiagen））を用いて、ゲノムＤＮＡを抽出して精製した。既に記載したように、各サンプルについて１０μｇの総ＲＮＡを用いてノーザンブロット分析を行った。α−32ｄＣＴＰ（ＩＣＮ）およびｒｅｄｉｐｒｉｍｅ  II  ＤＮＡランダムプライム標識化システム（アマシャム・ファルマシア・バイオテック（Amersham Pharmacia Biotech））を用いてプローブを標識した。
【００２３】
ウェスタンブロット分析
嫌気性誘導の４時間後、嫌気性条件下で細胞を溶解した。好気性対照試料を、ＡＩＢに再懸濁後直ちに溶解した。細胞を溶解緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、および０．２５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で３０分間穏やかに振動して破壊し、細胞抽出物を１０分間１０，０００ｇで遠心分離した。厳密な嫌気性条件下、ヒドロゲナーゼ活性を有する溶解性上澄をＱセファロースファストフローカラム（ファルマシア（Pharmacia））にかけることで、嫌気性誘導した細胞および嫌気性誘導していない細胞からヒドロゲナーゼタンパク質を部分的に精製した。カラムを、カラム２つ分の体積の洗浄緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、１００ｍＭのＫＣｌ）で１度洗浄して、カラム２つ分の体積の溶出緩衝液（５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、２５０ｍＭのＫＣｌ）で溶出させた。部分精製したフラクションでは、嫌気性誘導したＷＴ培養物の粗溶解物で検出されたヒドロゲナーゼ活性の約８５％を取り戻した。Ａｍｉｃｏｎタンパク質濃縮セルとＹＭ１０膜を用いてタンパク質試料を濃縮した。標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ方法で等量のタンパク質（Ａ280）をロードして分離した。Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｍｉｎｉ−Ｐｒｏｔｅａｎ  III電気泳動およびブロッティング装置を用いて、ウェスタンブロッティングを行った。一次ヒドロゲナーゼ抗体は、ＨｙｄＡ１およびＨｙｄＡ２タンパク質の両方に共通する配列を含む合成ペプチド（ＤＫＡＫＲＱＡＡＬＹＮＬ）に由来し、市場用にウサギにおいて産生されたものである（シグマ  ジェノシス（Sigma GenoSys））。二次抗体はアルカリホスファターゼコンジュゲートとして市販されており（バイオラッド（Bio Rad））、ヒドロゲナーゼ検出に標準的な化学クロミック検出技術を利用した。
【００２４】
遺伝子同定
ゲノム歩行法でｐＪＤ６７の挿入部位に隣接するＤＮＡ領域を決定した。ユニバーサルゲノム歩行キットおよびアドバンテージ−ＧＣゲノミックＰＣＲミックス（共にクローンテック）に概要されるＰＣＲ法に従って、挿入部位の下流のＤＮＡを増幅した。ＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧタンパク質の両方について、両遺伝子に対応するｃＤＮＡを配列決定することによりコード配列を求めた。ｃＤＮＡ構築物は、かずさＤＮＡ研究所（Kazusa DNA Research Institute,（http://www.kazusa.or.jp/））から入手した。全てのＤＮＡ生成物は、カリフォルニア大学（Davis）により配列決定された。
【００２５】
相補性
ＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧ遺伝子を含むＢＡＣクローンをクレムソン大学遺伝子センター（Clemson University Genetics center）から入手した。ＢＡＣクローンのＫｐｎＩ消化によりゲノムＨｙｄＥＦ遺伝子を得て、プロモーター配列および末端配列とともに全長ＨｙｄＥＦ遺伝子を含むインサートを、ｐＳＰ１２４Ｓ（Saul Purton, University College, ロンドンより）のＫｐｎＩ部位にクローニングした。得られたプラスミド、ｐＭＰ１０１は、ＨｙｄＥＦ遺伝子および嫌気性選別に用いられるＢｌｅr遺伝子を含んでいる。ｐＭＰ１０１プラスミドをＳｗａＩで消化して直線化してKindleのガラスビーズ法（K. L. Kindle [1990] Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1228-1232）を用いてｈｙｄＥＦ−１変異体に転換した。細胞のみまたは１μｇのｐＳＰ１２４Ｓ（V. Lumbrerasら、[1998] Plant j.,441-448）を用いた対照も使用した。
【００２６】
異種発現および精製
ＨｙｄＦＦおよびＨｙｄＧ  ｃＤＮＡ構築物を、Ｔ７プロモーターにより駆動されるＥ．コリ発現プラスミドにクローニングして、活性Ｃ．ラインハーディＨｙｄＡ１の発現を達成した。２つの遺伝子をｐＡＣＹＣ  Ｄｕｅｔ発現プラスミド（ノバゲン（Novagen））にクローニングした。ＨｙｄＥＦまたはＨｙｄＧ遺伝子のみを含む別の対照プラスミドもまた、ｐＡＣＹＣプラスミドにクローニングした。Ｃ．ラインハーディＨｙｄＡ１遺伝子をｐＥＴＢｌｕｅ−１にクローニングし、ＨｙｄＡ１のアフィニティ精製用にＳｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎアフィニティタグ（Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇII）をそのＣ末端に付加した。プラスミドをＥ．コリＢｌ−２１（ＤＥ３）細胞（ノバゲン）に同時形質転換した。適したプラスミドの存在を、限定解析および配列決定により確認した。タグ付きＨｙｄＡ１の発現および精製を以下のように行った：形質転換ＢＬ２１（ＤＥ３）の一晩培養物からの種菌を、適した抗生物質含有Ｌブロス中で増殖させた。ＯＤ600が０．５〜０．７に達するまで細胞を増殖させて、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ノバゲン）を１．０ｍＭまで加えた。１時間の好気性誘導後、培養物をアルゴンでパージして５時間嫌気性とした。細胞を収穫して、氷上で超音波処理により破壊した。ＨｙｄＡ１−ＳｔｒｅｐＴａｇIIを、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎセファロース（ＩＢＡ）を用いて精製して、ＭＶを用いてヒドロゲナーゼ活性についてアッセイした。
【００２７】
Ｃ．アセトブチリカムＨｙｄＡ、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧの発現クローニング
ＰＣＲ増幅により、精製ゲノムＤＮＡ（株ＡＴＣＣ８２４）からＣ．アセトブチリカムＨｙｄ遺伝子を単離した。遺伝子特異的プライマーは、ＨｙｄＡの既知配列（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号第ＡＡＢ０３７２３号）（１９、２０）、ならびにＨｙｄＥ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号第ＣＡＣ１６３１）、ＨｙｄＦ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号第ＣＡＣ１６５１）、ＨｙｄＧ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号第ＣＡＣ１３５６）およびＨｙｄＢ（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号第ＣＡＣ３２３０）の配列（Ｃ．ラインハーディＨｙｄＥＦ、ＨｙｄＧおよびＨｙｄＡ２ペプチド配列を用いてＮＣＢＩでＣ．アセトブチリカムゲノムのｔＢＬＡＳＴｎ相同性サーチにより同定された）、に基づくものであった。各Ｈｙｄ遺伝子（ＩＤＴテクノロジーズ）の末端が一致するように、また、発現クローニングに適した制限部位を含むように、遺伝子特異的プライマーを設計した。約２０μｇのゲノムＤＮＡをＢａｍＨＩで一晩消化して、２００ｎｇをＫＯＤポリメラーゼ（ノバゲン）で行うＰＣＲ増幅反応用テンプレートとして用いた。ＰＣＲフラグメントをゲル精製し、制限酵素で一晩消化し、そしてプラスミドｐＣＤＦＤｕｅｔ−１（ノバゲン）（ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧ）の二重マルチクローニング部位（ＭＣＳ）にサブクローニングしてｐＣａＦＧを形成するか、ｐＥＴＤｕｅｔ−１（ノバゲン）（ＨｙｄＡまたはＨｙｄＢおよびＨｙｄＥ）でｐＣａＡＥおよび８ｐＣａＢＥを形成するかのいずれかを行った。ＰＣＲ増幅の間にＳｔｒｅｐII−タグ配列ＷＳＨＰＱＦＥＫを［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ構造遺伝子、ＨｙｄＡおよびＨｙｄＢのＣ末端に付加した。各遺伝子の配列および読み枠をＤＮＡ配列決定により確認した（Davis Sequencing, LLC）。
【００２８】
他の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子の発現クローニング
Ｃ．ラインハーディおよびクロストリジウム・パステリアヌム由来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ構造遺伝子を、以下のように精製ゲノムＤＮＡからクローニングした。Ｃ．パステリアヌムＨｙｄＡをクローニングするのに、ＡＴＣＣ株６０１３を強化クロストリジウム培地上嫌気性で培養して、ゲノムＤＮＡをＱｉａｇｅｎ  ＤＮＡｅａｓｙ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｋｉｔ（キアゲン）で精製した。精製ＤＮＡ（５００ｎｇ）をＢａｍＨＩで一晩消化し、インフレームクローニング用に５'−ＮｃｏＩおよび３'−ＢａｍＨＩ部位を含むＨｙｄＡ特異的オリゴヌクレオチドでのＰＣＲ反応に１００ｎｇを用いた。遺伝子フラグメントをゲル精製し、ＮｃｏＩおよびＢａｍＨＩで消化し、ｐＣａＥ２のＭＣＳ１にクローニングしてｐＣｐＩＥを作った。
【００２９】
上記に記載されるように、Ｃ．ラインハーディＨｙｄＡ１およびＨｙｄＡ２のｃＤＮＡのクローンを、５'−および３'−末端制限部位とともに設計されたオリゴヌクレオチドでのＰＣＲ増幅用のテンプレートとして用いた。ＳｔｒｅｐIIタグ配列ＷＳＨＰＱＦＥＫを、ＨｙｄＡ１の５'−端オリゴヌクレオチドに、およびＨｙｄＡ２の３'−端オリゴヌクレオチドに付加した。遺伝子フラグメントをゲル電気泳動により単離し、消化し、そしてｐＣａＥ１のＭＣＳ部位２（ＭＣＳ部位１でＨｙｄＥを有するｐＥＴＤｕｅｔ−１）にサブクローニングしてｐＥＣｒ１（ＨｙｄＡ１）、およびｐＥＣｒ２（ＨｙｄＡ２）を形成した。読み枠および遺伝子配列を、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【００３０】
Ｅ．コリにおける［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ発現
構築物の発現試験のため、Ｔ７調節されたＨｙｄ遺伝子の完全セットを抱えているプラスミドを、Ａｐr（ｐＥＴＤｕｅｔ−１クローン）およびＳｍr（ｐＣＤＦＤｕｅｔクローン）を同時選択するとともに、Ｅ．コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）（ノバゲン）に同時形質転換した。形質転換細胞を、抗生物質を加えたＬＢ培地（シグマ）で一晩増殖させ、翌日、抗生物質および１００μＭのＦｅクエン酸を補充した新鮮なＬＢ培地１１５ｍｌ中にサブクローニング（１：５０希釈）した。ロータリーシェーカー上２５０ｒｐｍで、培養物をＯＤ600が０．５〜０．７になるまで、嫌気性、３７℃で増殖させた。イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）（ノバゲン）を最終濃度１．５ｍＭで添加して、培養物を室温で約１００ｒｐｍで震盪して嫌気性誘導前のＨｙｄ発現のプレインキュベーションとした。１時間後、培養物を１２０ｍｌの血清バイアルに移し、ゴムのセプタムで栓をして、室温で３〜５時間アルゴンでパージして嫌気性条件と［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ生合成の誘導を達成した。アフィニティ精製用の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの発現を最小培地で行った。０．５％のグルコース、０．４％のカゼイン加水分解物、１００∝ＭのＦｅクエン酸、３００∝ｇ／ｍｌのアンピシリン、および５０∝ｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補充した５ｍｌのＭ６３中、形質転換細胞を一晩培養した。一晩増殖した培養物を、２５ｍｌの新鮮な培地に１：５０で希釈し、ＯＤ600が０．５に達するまで３７℃で増殖させ、そして１ＬのＭ６３（Ｆｅクエン酸を含まず）に播種するのに用いた。１Ｌ培養物をＯＤ600が０．５になるまで３７℃で増殖させた。Ｆｅクエン酸の１Ｍ溶液を、最終濃度１００μＭで添加して、培養物をさらに１０分間３７℃でインキュベートした。ＩＰＴＧ（１．５ｍＭ）を添加して、培養物を、室温で１時間、１００ｒｐｍで震盪した。最初の誘導期に続いて、培養物を密閉した１Ｌフラスコに移し、室温で一晩、アルゴンでスパージャして［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの生合成を誘導した。
【００３１】
組換えＳｔｒｅｐIIタグ付き［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの精製
精製工程は嫌気性条件下で行った。ＳｔｒｅｐIIタグ付き［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現する細胞を、６０００×ｇで１０分間遠心分離して集めた。細胞ペレットを、破壊緩衝液（ＢＢ）（１５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１００ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ、１ｍＭの亜ジチオン酸Ｎａ、１００μＭのＰＭＳＦ、５％のグリセロール）に再懸濁させ、フレンチプレスで破壊した。ビオチンとビオチン化タンパク質の結合をブロックするために、アビジンを３ｎＭで添加した。破壊された細胞懸濁液を１９,０００×ｇで３０分間遠心分離して細胞デブリをペレットにした。清澄な粗抽出物を、あらかじめ緩衝液ＢＢで平衡化したストレプタクチン−セファロース（ＩＢＡ）アフィニティカラムに通した。カラム３〜５本分の容積の氷冷ＢＢでカラムを洗浄し、ＳｔｒｅｐIIタグ付きヒドロゲナーゼを２．５ｍＭのデスチオビオチン含有ＢＢで溶出させた。
【００３２】
異種発現したタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウェスタンブロット
ＳＤＳ−ＰＡＧＥのため、タンパク質試料を１×ＳＤＳ−ＰＡＧＥロード緩衝液（ノバゲン）に希釈して、１０分間煮沸し、氷上で冷却した。試料を１２％ＳＤＳゲル上にロードして、４５ｍＡで２時間走らせた。電気泳動に続いて、タンパク質をＰＶＤＦ膜にブロッティングして、ストレプタクチン−アルカリホスファターゼ複合体検出キット（ＩＢＡ）を用いて検出した。
【００３３】
［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ活性アッセイ
精製した［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼまたは全細胞抽出物の活性を、還元メチルビオロゲン（ＭＶ）から生成するＨ2ガスとしてルーチンで測定した。嫌気下で調製した、２×全細胞反応緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７；１０ｍＭのメチルビオロゲン；２０ｍＭの亜ジチオン酸ナトリウム；６ｍＭのＮａＯＨ；０．２％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）１ｍｌおよび１ｍｌの細胞を入れてアルゴンフラッシュした１３．５ｍｌの密閉血清バイアルで、全細胞の活性アッセイを行った。精製した酵素のアッセイは、１ｍｌの嫌気下で調製した、２×酵素反応緩衝液（５０ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７；１０ｍＭのメチルビオロゲン；２０ｍＭの亜ジチオン酸ナトリウム；６ｍＭのＮａＯＨ）を入れてアルゴンフラッシュしたバイアル中、アリコート（２５〜５０□ｌ）を１ｍｌの嫌気下で調製したＢＢ緩衝液で希釈して行った。全ての反応は３７□Ｃでインキュベートした。インキュベーション後、４００□ｌのヘッドスペースガスを気密シリンジで取り出してガスクロマトグラフィー（ヒューレット  パッカー（Hewlett Packard）、５８２０）でＨ2レベルを測定した。
【００３４】
結果
変異体特性決定
Ｃ．ラインハーディでは、２つの［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ酵素、ＨｙｄＡ１およびＨｙｄＡ２が既知である。これらの酵素の発現および活性に必要な遺伝子を同定する目的で、本発明者らは、化学クロミックＨ2センサー4を用いて、必要な嫌気性誘導に続いてＨ2を光生成できないクローンについて、ランダム変異導入ライブラリーをスクリーニングした。Ａｒｇ７遺伝子をアルギニン栄養要求性であるＣ．ラインハーディ株ＣＣ４２５に形質転換して、変異体を作製した。Ａｒｇ７遺伝子はランダムにＣ．ラインハーディゲノムに組み込まれて野生型（ＷＴ）ゲノムＤＮＡの小セクションを分裂させる。図１Ａに示されるとおり、変異体ｈｙｄＥＦ−１は検出可能な量のＨ2を産生できないことにより同定される。同一ライブラリー由来の他の５つのコロニーについて観測された暗青色スポットは、ＷＴのＨ2産生能力を示している。
【００３５】
変異体ｈｙｄＥＦ−１を、ＣＯ2を唯一の炭素源として用いて最小培地の寒天板上で増殖させ、それにより細胞が光合成コンピテントであることを実証した。さらに、親株およびｈｙｄＥＦ−１株両方の光合成および呼吸率を、Ｃｌａｒｋ型電極を用いて液体培地で測定した（図１Ｂ）。ＷＴと比較して、ｈｙｄＥＦ−１変異体は通常の呼吸率および光合成Ｏ2発放出率を示した。このことは、ｈｙｄＥＦ−１がＨ2光生成活性を欠いていることは、二次代謝や光合成電子輸送欠陥の結果ではなく、むしろヒドロゲナーゼ酵素に特異的であることを実証している。
【００３６】
暗中で不活性ガス（または外因性還元剤）を用いて密閉した培養物からＯ2をパージすることによるか、または明中で密閉した培養物から硫黄を奪う（これにより光合成Ｏ2放出の速度を減弱する）ことによるかのいずれかにより達成された嫌気生活でＣ．ラインハーディのヒドロゲナーゼ活性を誘導する。暗中嫌気性誘導に続く水素産生を、複数の技法を用いて、ＷＴおよびｈｙｄＥＦ−１変異体培養物でモニタリングした：（１）Ｈ2光生成の初期速度（図１Ｃ）をＣｌａｒｋ型電極を用いてアッセイし、（２）還元されたＭＶが介するヒドロゲナーゼ活性をＧＣで検出し、そして（３）発酵性Ｈ2産生をＧＣ分析でアッセイした。ＷＴ培養物とは対照的に、これらのアッセイのいずれでもｈｙｄＥＦ−１変異体培養物からＨ2生成は検出されなかた。その上、硫黄剥奪条件下、明中嫌気性誘導したｈｙｄＥＦ−１変異体培養物は、どのような検出可能なＨ2も生成できなかった。１リットルのＣＣ４２５ＷＴ培養物は、初期条件下で数日間にわたり、一貫して少なくとも７０ｍｌのＨ2を生成した。従って、本発明者らは、ｈｙｄＥＦ−１変異体が、本研究の誘導およびアッセイ条件の全てにおいて、活性［Ｆｅ］ヒドロゲナーゼを合成することができないと結論づけた。
【００３７】
ＨｙｄＥＦ遺伝子およびＨｙｄＧ遺伝子の同定
ｈｙｄＥＦ−１変異体の実際の表現型の原因である遺伝子変異を決定するために、本発明者らは、ゲノム歩行戦略を用いて、変異誘発するＡｒｇ７インサートに隣接するゲノムＤＮＡをクローニングして配列決定した。隣接ＷＴ配列を、配列決定されたＣ．ラインハーディゲノムと比較して、Ａｒｇ７挿入により破壊された遺伝子を求めた。ｈｙｄＥＦ−１で欠失された遺伝子、ＨｙｄＥＦと示すが、これは２つの独特なドメインを有するタンパク質をコードすることが示された。ＨｙｄＥＦタンパク質のＮ末端部分は、今まで［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを含有する原核生物でしか見つかってなくかつラジカルＳＡＭタンパク質スーパーファミリーのこれまで特性決定されてないサブセットに所属する、タンパク質の特異的グループと相同である（H. J. Sofiaら、[2001] Nucleic Acids Res. 1097-1106）。ＨｙｄＥＦタンパク質のＣ−末端部分は、予測されるＧＴＰアーゼ活性を有するドメインを含む。このドメインは、原核生物タンパク質の第二の特異的グループ（これらもまた［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを含有する生物に独特である）と相同である。Ｃ．ラインハーディで破壊されたＨｙｄＥＦ遺伝子に直接隣接するのは、第二の遺伝子、ＨｙｄＧであり、これは、同じプロモーター領域からの分岐発現を思わせる順序で配置されている。ＢＬＡＳＴサーチにより、ＨｙｄＧと相同なタンパク質が独特なタンパク質の第三のセット（これもラジカルＳＡＭタンパク質スーパーファミリーに属する）を含むことが明らかになった。ＨｙｄＥおよびＨｙｄＦでそうであるように、ＨｙｄＧホモローグは［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを有する原核生物でのみ見つかる。Ｃ．ラインハーディのＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧに相当するｃＤＮＡを入手して配列決定し、２つの遺伝子のタンパク質コード配列を確認した。Ｃ．ラインハーディ遺伝子のゲノム構成の概要およびＨｙｄＥＦ破壊部位を図２Ａに示す。
【００３８】
明らかに、バクテロイデス・セタイオタオミクロン、デスルホビブリオ・ブルガリス、デスルホビブリオ・デスルフリカンス、およびシュワネラ・オネイデンシスのゲノムでは、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧ遺伝子は［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ構造遺伝子とともに推定オペロンを形成する（図３）。しかしながら、ＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧの機能は、今までのところ割り当てられていない。以下に記載されるように、本発明者らのデータは、これらのタンパク質が活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼのアセンブリに必要であることを示唆し、従って、本発明者らは提案されているヒドロゲナーゼ命名法（P. M. Vignaisら、[2001] FEMS Microbiol. Rev. 25, 455-501）に従って、Ｃ．ラインハーディ遺伝子、ＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧを命名した。Ｃ．ラインハーディでは、ＨｙｄＥＦ遺伝子は、原核生物で観測される２つの異なる遺伝子に相当するように２つの文字ＥとＦが割り当てられる。図３では、Ｃ．ラインハーディＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧタンパク質ホモローグを［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを含む原核生物と比較している。この図は、これらの生物内での推定［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子と関連づけてＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧの読み取り枠の組織も示す。先に記載された生物で観測される、提案されている［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼアセンブリ遺伝子は、［Ｆｅ］−ヒドロゲナーゼ構造遺伝子とともに推定オペロンで見いだされるものの、図３に示される生物の大半で提案されるアセンブリタンパク質は、構造遺伝子とは離れて見いだされる。
【００３９】
ＨｙｄＥＦ遺伝子の相補性
Ｃ．ラインハーディｈｙｄＥＦ−１変異体で観測されるＨ2生成の欠如をＨｙｄＥＦの破壊と結びつけるため、本発明者らは遺伝子相補性を利用した。ＷＴ  ＨｙｄＥＦ遺伝子を含むゲノムＤＮＡを、Ｃ．ラインハーディゲノムＤＮＡのライブラリーで見いだされるシングルＢＡＣクローンから得た。ＨｙｄＥＦ遺伝子を含有するＢＡＣプラスミドを、適切な制限酵素で消化して、全長ＨｙｄＥＦゲノム遺伝子およびその推定プロモーターのみを含むと予測されるフラグメントを作成した。このインサートを、プラスミドＳＰ１２４Ｓ（これは抗生物質ゼオシンに対する抵抗性を与えるＢｌｅ遺伝子を含む）にクローニングした。図２Ｂに示すとおり、ｈｙｄＥＦ−１変異体をこの構築物で形質転換し、ゼオシンを含むＴＡＰ寒天板上で増殖させ、復活したＨ2生成能力を有するクローンを得た。相補遺伝子の統合および変異体バックグラウンドの照合をサザンブロット法で確認した（図２Ｃ）。ＣＣ４２５試料は、変異体および相補されたクローンの両方に存在しないＷＴバンドを示す。相補されたクローンは、形質転換ＨｙｄＥＦゲノムフラグメントの変異体ゲノムへの複数ランダム統合に相当する２つの強いバンド、ならびにＨｙｄＥＦ遺伝子の一部のみの統合を示すと思われるかすかなバンドを示す。
【００４０】
遺伝子発現および［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ蓄積の分析
次いで、ノーザンブロット分析を行って、（ａ）変異体でヒドロゲナーゼ活性の欠如が観測されたのがＨｙｄＡ１および／またはＨｙｄＡ２遺伝子転写の破壊によるものなのかどうか、および（ｂ）ＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧがヒドロゲナーゼ遺伝子とともに嫌気性で同時発現するかどうかを決定した。ＷＴおよびｈｙｄＥＦ−１変異体の好気性培養物、ならびに暗中で０．５時間および４．０時間嫌気性誘導したＷＴおよびｈｙｄＥＦ−１変異体からＲＮＡアリコートを収集した。図４Ａ〜Ｄはそれぞれ、ＣＣ４２５親ＷＴおよびｈｙｄＥＦ−１変異体培養物の両方からのＨｙｄＡ１遺伝子、ＨｙｄＡ２遺伝子、ＨｙｄＧ遺伝子、およびＨｙｄＥＦ遺伝子の発現プロファイルを比較するものである。データは、ＷＴ培養物で、ＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧが、ＨｙｄＡ１遺伝子およびＨｙｄＡ２遺伝子とともに嫌気性誘導されることを示す。同様に、ＨｙｄＡ１、ＨｙｄＡ２、およびＨｙｄＧ転写物もｈｙｄＥＦ−１変異体で嫌気性誘導され、そして予想されるとおり、ＨｙｄＥＦ転写物はない。嫌気性誘導されたｈｙｄＥＦ−１培養物におけるＨｙｄＡ１およびＨｙｄＡ２転写物の存在は、ＨｙｄＥＦ遺伝子の破壊がどのような有意義な様式でもヒドロゲナーゼ転写に悪影響を与えないこと、ｈｙｄＥＦ−１培養物におけるＨ2生成の欠如はヒドロゲナーゼ遺伝子転写の欠陥の結果ではないことを、はっきりと示す。
【００４１】
次いで、ウェスタンブロットを得て、ヒドロゲナーゼタンパク質レベルに対するＨｙｄＥＦ遺伝子破壊の結果を求めた（図４Ｅ）。Ｃ．ラインハーディＨｙｄＡ１およびＨｙｄＡ２の両方を認識するように設計された抗体を、ヒドロゲナーゼタンパク質の存在を探索するのに用いた。予想通り、部分精製したＷＴ試料（実験手順を参照）は、２種のヒドロゲナーゼの同時移動による、約４７〜４８ｋｄの電気泳動移動度を持つ１つの嫌気性誘導バンドのみを示す。Ｃ．ラインハーディの全長ＨｙｄＡ１ヒドロゲナーゼ酵素および全長ＨｙｄＡ２ヒドロゲナーゼ酵素はそれぞれ５３．１ｋｄおよび５３．７ｋｄ、の推定質量を有するものの、ＨｙｄＡ１は葉緑体輸送ペプチド配列のＮ末端タンパク質分解プロセシングを受けて、葉緑体に局在する４７．５ｋｄの成熟タンパク質となる（T. Happeら、[1993] Eur. J Biochem. 214, 475-481）。ＨｙｄＡ２タンパク質は、同様なプロセシングを受けて推定４７．３ｋｄの成熟タンパク質になると予測される（M. Forestierら、[2003] Eur. J. Biochem. 270, 2750-2758）。嫌気性誘導されたｈｙｄＥＦ−１培養物のウェスタンブロットのデータは、検出可能な酵素活性がないにもかかわらず免疫学的に検出可能な酵素もｈｙｄＥＦ−１変異体培養物で見いだされることを示す。ｈｙｄＥＦ−１変異体培養物のヒドロゲナーゼバンドの電気泳動移動度は、ＷＴバンドに比べてわずかに低い方に移動し、プロセシングされていないＣ．ラインハーディヒドロゲナーゼの電気泳動移動度と一致する。［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの場合、タンパク質分解プロセシングはＮｉの挿入後に起こり、プロセシングされていない［ＮｉＦｅ］−酵素に比べて移動したウェスタンバンドをもたらす（N. K. Menonら、[1991] J. Bacteriol. 173, 4851-4861）（A. Jacobiら、[1992] Arch. Microbiol. 158, 444-451）。嫌気性誘導されたｈｙｄＥＦ−１タンパク質の抽出物に移動したバンドが存在することは、完全にアセンブリされた活性部位を欠くＣ．ラインハーディ［Ｆｅ］ヒドロゲナーゼの場合にも生じるかもしれないことを示唆する。
【００４２】
Ｅ．コリでのＣ．ラインハーディＨｙｄＡ１の異種発現
ＨｙｄＥＦタンパク質およびＨｙｄＧタンパク質が活性［Ｆｅ］−ヒドロゲナーゼの形成に必要であるという結論を支持するさらなる証拠は、生来の［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを欠く細菌であるＥ．コリでの活性Ｃ．ラインハーディＨｙｄＡ１タンパク質の異種発現により示される。ＨｙｄＡ１タンパク質は、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇIIアフィニティー配列を含む融合タンパク質として発現し、Ｅ．コリ抽出物から精製された。図５に示すとおり、Ｅ．コリでのＨｙｄＡ１構築物単独の発現またはＨｙｄＡ１とＨｙｄＥＦ、もしくはＨｙｄＡ１とＨｙｄＧ遺伝子の同時発現は全て、精製後機能しないＨｙｄＡ１タンパク質の発現をもたらした。しかしながら、嫌気性Ｅ．コリ培養物でＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧ両方と一緒にＣ．ラインハーディＨｙｄＡ１が同時発現すると、活性ＨｙｄＡ１酵素が得られた（図５）。発現系が最適化されていないため、それぞれの実験で得られた活性ＨｙｄＡ１の量は少なく、かつ大きく変化する。それでも、機能性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼは３種の遺伝子全てが発現して存在してのみ得られた。ラジカルＳＡＭタンパク質の中には非常に少ない代謝回転数で作用し、反応物質でしかなかったり、触媒にさえならないものもあることが注目される（H. J. Sofiaら、[2001] Nucleic Acids Res. 29. 1097-1106）。
【００４３】
ラジカルＳＡＭ相同性
ＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧタンパク質は、ラジカルＳＡＭ（ＡｄｏＭｅｔラジカルとしても既知である）スーパーファミリーに属する。これらのタンパク質は多数の生化学反応に参加しており、反応として硫黄挿入、ラジカル形成、有機環合成、および嫌気性酸化が上げられるがこれらに限定されない。ＨｙｄＧタンパク質およびＣ．ラインハーディＨｙｄＥＦタンパク質のＨｙｄＥドメインの両方が、ラジカルＳＡＭタンパク質スーパーファミリー内で典型的に見いだされるサインＣｙｓ−Ｘ3−Ｃｙｓ−Ｘ2−Ｃｙｓモチーフを含む（図６）。このモチーフは、還元条件下、酸化還元活性［４Ｆｅ４Ｓ］クラスターに配位する。ラジカルＳＡＭタンパク質が行う反応は、典型的には、［４Ｆｅ４Ｓ］クラスターでのＳ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）の還元的開裂、これによりメチオニンと５'−デオキシアデノシルラジカルが生じて、フリーラジカルが発生することにより開始される。次いで、この高エネルギー有機ラジカルは、各ラジカルＳＡＭタンパク質に独特である基質から水素原子を抽出する。
【００４４】
ＨクラスターアセンブリにおけるＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧの役割
ラジカルＳＡＭタンパク質は、複雑な生分子および不安定であることが多い協調的異常［ＦｅＳ］クラスターの嫌気性合成に係わっていることが多い。これらの特性は、Ｈクラスターの独自リガンドを合成するのに、そして［ＦｅＦｅ］ヒドロゲナーゼ触媒クラスターをアセンブリするのに必要な化学種の種類と一致する。ラジカルＳＡＭスーパーファミリーの最近の分類では、ビオチンシンターゼ（ＢｉｏＢ）およびニトロゲナーゼアクセサリータンパク質ＮｉｆＢをはじめとする関連性がもっとも低いタンパク質が、Ｓ伝達に関与しているらしいことが示されている。目立つのは、ＮｉｆＢの代謝産物、ＮｉｆＢ補因子に由来するＦｅおよびＳが、最終的に、Ｈ2を生成し得る別の酵素であるジニトロゲナーゼの［ＦｅＭｏ］補因子に組み込まれることである（R. M. Allen [1995] J. Biol. Chem. 270, 26890-26896）。従って、［Ｆｅ］−金属酵素の触媒金属クラスターにＦｅを提供するのにラジカルＳＡＭタンパク質が関与しているという前例から、本発明者らは、［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼＨクラスターのアセンブリのためのＦｅ動員に、ＨｙｄＥおよび／またはＨｙｄＧタンパク質が同様な役割を果たすことを提案する。
【００４５】
Ｈクラスターは、ＣＮ、ＣＯ、および推定ジ（チオメチル）アミンリガンドも必要とする。上記のアクセサリータンパク質ＨｙｄＥＦおよび／またはＨｙｄＧもまたＦｅに配位するこれら生成物の生合成およびアセンブリの原因であると考えられる。ＣＮおよびＣＯは生物学的に最も毒性のある化合物に含まれ、また細胞内では自由に存在していないようであるので、これらのリガンドをＨクラスターアセンブリ部位で合成する必要があるだろう。［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼの場合、ＨｙｐＥタンパク質およびＨｙｐＦタンパク質により、前駆体としてカルバモイルホスフェートを用いてチオカルバメートを形成して、ＣＮおよびＣＯが合成されることを示す強力な証拠があるが、しかしながら、ＨｙｐＥおよびＨｙｐＦタンパク質のホモローグは、Ｃ．ラインハーディでも、［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼのみを含む他の生物でも観測されていない。このことは、ＣＮおよびＣＯ合成の代替経路またはチオカルバメートを形成する代替手段を示唆する。ラジカルＳＡＭタンパク質は、有機ラジカル形成、過硫化物形成、ピロキシダルホスフェート活性化、チオカルボニル形成、およびアミン移動をはじめとする化学反応を利用し、これらの全てまたはいずれか１つがＨクラスター有機リガンドの合成に関与し得る。
【００４６】
Ｃ．ラインハーディＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧとそれらのタンパク質分解ホモローグとの間の相同性配列比較を図６に示す。ラジカルＳＡＭモチーフに加え、ＨｙｄＧタンパク質およびＨｙｄＦタンパク質は、金属イオンに配意する可能性を持つ他の保存配列を有する。これらには、ＨｙｄＦドメインのＣ−末端近くのＥ（Ａ／Ｇ）ＣＸＨモチーフおよび（Ｌ／Ｖ）ＨＣ（Ｇ／Ａ）（Ｇ／Ａ）Ｃモチーフ、ならびにＨｙｄＧタンパク質のＣ−末端近くのＣＴ（Ａ／Ｇ）ＣＹＲモチーフが含まれる。これら３つのモチーフは全て［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼアセンブリタンパク質にはしっかりと保存されているが、他のラジカルＳＡＭタンパク質では存在せず、このことは、これらのモチーフが［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼアクセサリータンパク質に独特であることを示唆している。いくつかの他の保存アミノ酸はＨｙｄＥＦタンパク質およびＨｙｄＧタンパク質中で見いだされる。しかしながら、［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼのアセンブリにおけるこれらの決定因子の役割および考えられる金属結合モチーフの解明は将来の研究を待つしかないようである。ＨｙｄＥＦタンパク質のＨｙｄＦドメインが推定ＧＴＰアーゼドメインを含み、そして、同じくＧＴＰアーゼ活性を有するＨｙｐＢタンパク質がＮｉの［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ活性部位への組み込みを促進することにも注目するべきである。興味深いことに、ＨｙｄＥＦタンパク質またはＨｙｄＧタンパク質のいずれも、Ｔ．マリティマから特性決定されたＴＭ１４２０タンパク質と相同性は高くない（G. Panら、[2003] J Biol. Inorg. Chem. 8, 469-474）。後者は、８．５ｋＤ長しかなく、特徴的なラジカルＳＡＭモチーフを含有しない。このことは、ＴＭ１４２０が、今までに特性決定された中で最も複雑な［ＦｅＦｅ］ヒドロゲナーゼを有するＴ．マリティマに独特なものである可能性を示唆する。
【００４７】
クラミドモナス［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの異種発現
Ｃ．ラインハーディＨｙｄＡ１のＥ．コリでの異種発現は、２種のＣ．ラインハーディ遺伝子産物、ＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧ（３種の原核生物遺伝子に等しい）のみがＨｙｄＡ１のアセンブリに必要であることを実証する。しかしながら、活性［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ酵素の形成に最小限で７つのアクセサリー遺伝子産物が必要である（L. Casalotら、[2001] Trends Microbiol. 9, 228-237）。このことは、［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼがＮｉを欠く（P. M. Vignaisら、[2001] FEMS Microbiol. Rev. 25, 455-501）ことからこれらの酵素は成熟タンパク質を多くは必要としないかもしれないという推定と一致する。［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼのアセンブリに必要とされる完全に独特な成熟タンパク質の存在は、［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼと［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼとの系統学的関連性がないことと一致する。
【００４８】
ＣｐＩまたはＤｄＨ［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ酵素をＥ．コリで発現させる先の試みは、Ｈ2ガスを放出させるまたは摂取することができない不活性タンパク質の合成という結果になった（G. Voordouwら、[1987] Eur, J Biochem. 162, 31-36）（Y. Asadaら、[2000] Biochim. Biophys. Acta. 1490,269-278）。対照的に、シアノバクテリア、シネココッカス（Synechococcus）ＰＣＣ７９４２を、ＣｐＩ［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ構造遺伝子で形質転換させると、活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを発現する株をもたらした。シネココッカスＰＣＣ７９４２に［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼが存在するという生化学的または遺伝的証拠がないことを考えると、シネココッカス［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼのアセンブリ化をつかさどるアクセサリータンパク質は、Ｃｐｌ［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ酵素も活性化するのに十分な柔軟性を持っているようである。どうしてこれがシネココッカスでは可能でありＥ．コリでは不可能なのかははっきりしないが、これらの結果は、異なる微生物でのヒドロゲナーゼ発現および活性化が複雑なものであることを強調する。
【００４９】
Ｃ．アセトブチリカム［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼＨｙｄＡのＥ．コリでの発現および生合成
上記のようにＥ．コリで発現した藻類［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼを精製しても活性であるが、発現プラスミドが不安定なため形質転換体が増殖することは難しく、このことがＨｙｄＡ１発現レベルの低さをもたらしている。藻類遺伝子のＤＮＡ組成物は、全体で６４％、第三コドン部位では９０％と非常にＧＣ偏向している。遺伝子安定性および発現におけるコドン偏向効果に対処するため、本発明者らは、様々な嫌気性微生物の配列決定されたゲノムで、藻類の良い電子の代替物として用いるためのＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧのホモローグを探索した。Ｃ．アセトブチリカムのゲノムは、この生物で報告された可溶性、単量体［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ（ＣａＨｙｄＡ）の特性決定と一致して、ＨｙｄＥホモローグ、ＨｙｄＦホモローグ、およびＨｙｄＧホモローグを保有することがわかった。Ｃ．ラインハーディＨｙｄＥＦ遺伝子（７０％）およびＨｙｄＧ遺伝子（６５％）のＧＣ含有量が高いのとは異なり、Ｃ．アセトブチリカム遺伝子はよりＡＴが豊富であり（ＧＣ含有量；ＨｙｄＥ、３２％；ＨｙｄＦ、３３％；ＨｙｄＧ、３５％）、従ってより安定かつＥ．コリでよりよく発現されると期待された。Ｃ．アセトブチリカムＨｙｄＥ、ＨｙｄＦおよびＨｙｄＧ遺伝子をＰＣＲ増幅して、産物をＴ７発現プラスミドのセットに［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼをコードするＨｙｄＡ遺伝子と一緒にクローニングした（図７）。Ｃ．アセトブチリカム成熟遺伝子および構造遺伝子の完全セットを保有するプラスミドをＩＰＴＧ誘導発現のためＥ．コリ株ＢＬ２１（ＤＥ３）に転換した。Ｅ．コリでの増殖の際なんらかの再配置を受けることが観測された（未発表の結果）プラスミドコード化Ｃ．ラインハーディＨｙｄＥＦ遺伝子およびＨｙｄＧ遺伝子と比較して、プラスミドコード化Ｃ．アセトブチリカムＨｙｄＥ遺伝子、ＨｙｄＦ遺伝子、およびＨｙｄＧ遺伝子は、どのような配列変更も示さなかった。Ｃ．アセトブチリカム遺伝子の方が安定性が高いことで、形質転換細胞の数も増え、発現条件下での増殖速度も速くなる（データは示さず）。
【００５０】
Ｅ．コリを発酵性糖の不在下嫌気性増殖で培養する場合、内因性［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ、Ｈｙｄ１、Ｈｙｄ２、およびＨｙｄ３はギ酸エステルの欠乏のため誘導されない。ギ酸エステルは、それぞれ成熟遺伝子およびＨｙｄ３構造遺伝子をコードするｈｙｐオペロンおよびｈｙｃオペロンの転写活性化に必要な発酵性代謝産物である。結果として、ギ酸エステルの欠乏下でのＥ．コリの嫌気性増殖は、表１に示すとおり、全細胞抽出物での［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ活性の基礎レベルとなる。表１はＥ．コリでＣ．アセトブチリカム成熟タンパク質と嫌気性同時発現した［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの活性の展開も示す。
【００５１】
【表１】
2008531055.tif 000003
ａ  ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で溶解した全細胞
ｂ  ［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ構造および成熟タンパク質非存在下での全細胞活性
ｃ  ＮＤ、不検出
【００５２】
こうした増殖条件下での基礎［ＮｉＦｅ］−ヒドロゲナーゼ活性により、組換え発現した［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの成熟および生合成の研究ができる。表１に示すとおり、ＣａＨｙｄＡとともにＣ．アセトブチリカム成熟系を発現するＥ．コリ細胞を嫌気性増殖して抽出したものは、非形質転換細胞の抽出物における活性よりも倍大きい還元ＭＶ触媒化、Ｈ2放出活性を示した。こうしたヒドロゲナーゼ活性の上昇は、高レベルでのプラスミドコード化Ｃ．アセトブチリカム遺伝子発現およびＣａＨｙｄＡ［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ生合成に直接起因する。
【００５３】
Ｃ．アセトブチリカム成熟系は、１リットル当たりｍｇ量でのＣａＨｙｄＡを生成するが、本発明者らの先のＣ．ラインハーディ成熟系は１リットル当たりμｇ量でしかＣ．ラインハーディＨｙｄＡ１を生成しない。表１に示すとおり、アフィニティ精製したＳｔｒｅｐｌｌタグ付きＣａＨｙｄＡによる還元ＭＶ触媒化、Ｈ2放出の特異的活性は７５μモルＨ2ｍｇ-1ｍｉｎ-1であり、Girbalらにより報告されたＣ．アセトブチリカムから精製したＣａＩの値（L. Gerbalら、Appl. Env Microbiol. 71, 2777-2781）より７．５倍高い。
【００５４】
Ｃ．アセトブチリカム成熟系による異種［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの生合成
緑藻類Ｃ．ラインハーディで見いだされる［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの生化学的性質および構造特性の研究で本発明者らは興味を引かれてＣ．アセトブチリカムの藻類酵素を生合成する能力の試験を行った。藻類［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼペプチド配列の特徴は、高度に保存されたＨクラスター／触媒ドメインにとって補助的なアクセサリー鉄硫黄クラスタードメインが欠けていることである（図９）。この構造的複雑さの縮小により藻類ヒドロゲナーゼは、今まで特性決定されている中で最も簡単なものに分類される。Ｃ．ラインハーディにおいて、ＣｒＨｙｄＡ１［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼは細胞質から葉緑体ストローマへ転位置した結果としてＮ末端プロセシングを受ける。ＣｒＨｙｄＡ１と同様に、ＣｒＨｙｄＡ２のＮ末端配列も６１位アミノ酸近くの推定開裂部位とともにシグナル配列特性を保有する。Ｅ．コリでの発現のため、切り詰めたＨｙｄＡ２を６２位でＮ末端を作る発現プラスミドｐＣａＥにクローニングした。これは、プロセシングされた産物と推定されるものに相当する。表１に示すとおり、ＣｒＨｙｄＡ１およびＣｒＨｙｄＡ２両方の成熟型が、Ｅ．コリで活性酵素として生合成された。アフィニティ精製に続くこれらのタンパク質の代表的な収率は、１リットルの培養物あたり０．８〜１．０ｍｇの範囲であった。精製ＣｒＨｙｄＡ１およびＣｒＨｙｄＡ２の、還元ＭＶからのＨ2生成活性はそれぞれ、１５０および１１６μｍｏｌＨ2ｍｇ-1ｍｉｎ-1であった。本Ｅ．コリ発現系から精製されたＣｒＨｙｄＡ１について測定されたこの活性は、組換え体または天然源から精製したこの酵素の活性についてすでに報告されたものより５〜６倍低い。嫌気性条件下、Ｃ．ラインハーディはインビボＨ2産生のため還元［２Ｆｅ２Ｓ］−フェレドキシンを［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼへの電子供与体として利用することが確立されている。部分精製したＣ．ラインハーディヒドロゲナーゼおよび還元Ｃ．ラインハーディ［２Ｆｅ２Ｓ］フェレドキシンを用いたＨ2放出速度の先の測定は、１０μＭのＫmを示した。この研究で、精製ＨｙｄＡ２についての還元ホウレンソウ［２Ｆｅ２Ｓ］−フェレドキシンのＫmは３１μＭと測定された。この値は、精製ＨｙｄＡ１と還元ホウレンソウフェレドキシンについて先に報告された３５μＭという値と近く、このことはＨｙｄＡ２にＣ．ラインハーディでインビボＨ2産生を触媒する能力があることを示唆している。
【００５５】
まとめると、Ｃ．ラインハーディで見いだされた２種の新規遺伝子、ＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧは、［Ｆｅ］−ヒドロゲナーゼを含有する生物で厳密に保存されている。ＨｙｄＥＦおよびＨｙｄＧ遺伝子は、Ｃ．ラインハーディで、ＨｙｄＡ１およびＨｙｄＡ２［Ｆｅ］−ヒドロゲナーゼ遺伝子とともに、嫌気下平行して転写される。ＨｙｄＥＦの破壊は、全てのＨ2生成を駄目にし、またウェスタンブロッティング法により全長ヒドロゲナーゼタンパク質が検出されても酵素活性は観測されない。水素生成は、ＨｙｄＥＦ遺伝子を含有するＷＴゲノムＤＮＡでｈｙｄＥＦ−１変異体を補完すると回復する。その上、本発明者らは、Ｅ．コリでのＣ．ラインハーディＨｙｄＥＦ遺伝子、ＨｙｄＧ遺伝子、およびＨｙｄＡ１遺伝子の同時発現およびこの微生物での活性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの合成の初めての成功を報告する。最近の研究も、新規クラスの金属−酵素アクセサリータンパク質を同定し、そしてラジカルＳＡＭスーパーファミリーのサブセットに属する２種のタンパク質に対するアセンブリ機能を割り当てている。こうした［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼアセンブリタンパク質の特性決定は、自然界で［Ｆｅ］−ヒドロゲナーゼを合成する機構のさらなる調査を大きく促進するだろう。
【００５６】
本発明者らの結果は、Ｈクラスターの生合成が高度に保存された方法であることをはっきりと示す。［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼＣｐｌ（本研究ではＣｐＨｙｄＡと示す）およびＤｄＨの最近の構造データと合わせて、本発明者らの研究は、様々な［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼが基本的に同一なＨクラスターを保有するという初期の観測を支持する。このことは、おそらく、ＣａＨｙｄＡと低い配列相同性（約１９％）しか有さないが、Ｃ．アセトブチリカムタンパク質の同一セットにより成熟させられるＣａＨｙｄＢの場合においてより明らかであるだろう。
【００５７】
化石燃料の生物学的代替物を開発する努力は、多数のエネルギーキャリアの生成源としての微生物の利用における継続的な興味を刺激する助けとなってきた。大きいスケールのＨ2生成源として利用するために、Ｈ2生成生物の生理、およびＨ2代謝を媒介するヒドロゲナーゼが熱心に研究されてきた。ヒドロゲナーゼがどのように生合成されるのか、そしてそれらの独特な構造が生化学的および代謝機能にどう寄与しているかの理解がさらに進めば、生物学的および生物にヒントを得たＨ2生成システムの両方の継続的な開発に役立つだろう。
【００５８】
好適な実施形態を挙げて本発明を詳細に記載してきたが、この記載は例示にすぎず、制限とは解釈されないことが理解されるべきではない。従って、本発明の実施形態の詳細における多数の変更および本発明のさらなる実施形態は当業者に明らかであり、そしてこの記載を参照して当業者によりなされ得る。そしてそのような変更およびさらなる実施形態の全てが、本明細書中以下に請求されるとおり、本発明の精神の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】Ｃ．ラインハーディｈｙｄＥＦ−１変異体の初期特性決定を示し、図中（Ａ）ＴＡＰ寒天板上で成長するＣ．ラインハーディ挿入変異体のコロニー（左）および嫌気性誘導に続くＨ2光生成を、化学クロミック（chemochromic）センサーで視覚的に検知したもの（右）、暗青色点の４つのコロニー（下部、左）は比色検出するのに十分なＨ2を生成するのに失敗；（Ｂ）は藻類の光合成率および呼吸率を示す；ならびに（Ｃ）は暗中嫌気性誘導された培養物からの初期のＨ2光生成率を示す。ＷＴのみがＨ2を生成した。
【図２】ｈｙｄＥＦ−１変異体における遺伝子破壊および変異体表現型の相補性を示し、図中（Ａ）はＣ．ラインハーディゲノムにおけるＨｙｄＥＦ遺伝子およびＨｙｄＧ遺伝子の組織の概略図を示す（上部）。エクソンは三角、ＨｙｄＧおよびＨｙｄＥＦはそれぞれ灰色または黒で示される。５'ＵＴＲはそれぞれのＡＴＧ開始コドンで終わるブロック矢印で示される。終止コドンもアスタリスクで示され３'ＵＴＲが続いている。ＨｙｄＥＦへのａｒｇ７遺伝子挿入位置は、逆向きの三角で示される。ＨｙｄＥＦ遺伝子のうちこの三角より右の部分は、ＨｙｄＥＦ−１変異体では消去されている。推定プロモーター領域は白色三角で示される。プロモーター領域とそれに続く最初の２つのエクソンの拡張模式図を以下に示す；（Ｂ）は（１−ｒ）親株（ＣＣ４２５）、ｈｙｄＥＦ−１変異体、およびＨｙｄＥＦ遺伝子で補完されたｈｙｄＥＦ−１変異体で測定したＨ2光生成を示す（暗中嫌気性誘導の４時間後にアッセイ）。平均からの平均偏差が示される。および（Ｃ）は（Ｂ）に示されたのと同じコロニーのサザンブロット法を示す。ゲノムＤＮＡをＮｃｏｌで消化し、ブロッティングし、そしてｈｙｄＥＦ−１変異体ですでに消去されているＤＮＡ配列を用いて探索した。
【図３】各生物で見いだされるＣ．ラインハーディＨｙｄＡ１、ＨｙｄＥＦ（両方ともそれぞれＨｙｄＥドメインおよびＨｙｄＦドメイン）およびＨｙｄＧの推定類似性を配列決定されたゲノムと並べて示す。Ｃ．ラインハーディタンパク質に対する遺伝子同定、同一アミノ酸パーセント（％Ｉ）、Ｅ値、相同性長および相同性ランクを示す。生物のゲノム内の各遺伝子の組織も含まれる。
【図４】ＣＣ４２５またはｈｙｄＥＦ−１培養物から単離した（Ａ）ＨｙｄＡ１転写物、ＣＢ）ＨｙｄＡ２転写物、（Ｃ）ＨｙｄＧ転写物、および（Ｄ）ＨｙｄＥＦ転写物のノーザンブロットを示す。０時間、０．５時間、および４時間の嫌気性誘導が示される。ノーザンブロット実験で一緒にＷＴおよびｈｙｄＥＦ−１培養物からのＲＮＡを電気泳動させ、ブロッティングし、そして探索した。リボソーム２３ＳＲＮＡバンドは、各ノーザンブロットの下部にロード対照として示される。（Ｅ）では、ウェスタンブロットは、好気性および嫌気性誘導された試料からの一部精製されたタンパク質抽出物のものである。Ｃ．ラインハーディＨｙｄＡ１およびＨｙｄＡ２の両方を認識するように設計された抗体でブロットを探索した。
【図５】異種ＨｙｄＡ１を単独で発現、または指示されたＨｙｄタンパク質とともに同時発現のいずれかである精製されたＥ．コリからの水素産生速度を示す。水素産生はメチルビオロゲンを利用したアッセイで測定した。表示されるデータは、４回の独立した実験の平均を表し、平均からの平均偏差が示される。
【図６】Ｃ．ラインハーディ（Ａ）ＨｙｄＥＦアミノ酸配列および（Ｂ）ＨｙｄＧアミノ酸配列と他の生物で見いだされる対応する推定類似物との配列比較を示す。アミノ酸配列は、Ｃ．ラインハーディｃＤＮＡに由来した。同一アミノ酸領域は黒色で示し、同様なアミノ酸の領域は灰色で影をつけてある。（Ａ）に示されるのは、ＨｙｄＥ類似体、続いてＣ．ラインハーディリンカー領域、そして最後にＨｙｄＦ類自体である。配列比較に示される生物は以下を含む：サーモトガ・マリティマ（Thermotoga maritima）、クロストリジウム・サーモセラム（Clostridium thermocellum）、クロストリジウム・テタニ（Clostridium tetani）、デスルホビブリオ・デスルフリカンス（Desulfovibrio desulfuricans）、シュワネラ・オネイデンシス（Shewanella oneidensis）、バクテロイデス・セタイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomicron）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、およびクロストリジウム・アセトブチリカム（Clostridium acetobutylicum）。
【図７】［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼ成熟遺伝子および構造遺伝子のＴ７プロモーター発現用のプラスミド構築物を示す。（Ａ）バックボーンｐＣａＥ２を用いてＨｙｄＥをＣ．アセトブチリカム由来のＣａＨｙｄＡ（ｐＣａＡＥ）（図中に表示）、ＣａＨｙｄＢ（ｐＣａＢＥ）、またはＣａＨｙｄＡΔＮ（ｐＣａＡΔＮＥ）、またはＣ．パステリアヌム（C.pasteurianum）由来のＣｐＨｙｄＡ（ｐＣｐＡＥ）またはＣｐＨｙｄＡΔＮ（ｐＣｐＡΔＮＥ）のいずれかと同時発現させた。（Ｂ）バックボーンｐＣａＥ１を用いてＨｙｄＥをＣ．ラインハーディＣｒＨｙｄＡ１（ｐＥＣｒ１）（図中に表示）またはＣｒＨｙｄＡ２（ｐＥＣｒ２）のいずれかと同時発現させた。（Ｃ）ｐＣａＦＧはＣ．アセトブチリカムＨｙｄＦおよびＨｙｄＧと同時発現する。（Ｄ）ｐＣａＨｙｄＡはＣ．アセトブチリカムＨｙｄＡを発現する。（Ｅ）ｐＣａＥ１（ＭＣＳ１のＮｃｏＩＢａｍＨＩ部位におけるＨｙｄＥ）およびｐＣａＥ２（ＭＣＳ２のＮｄｅＩ−ＢｇｌII部位におけるＨｙｄＥ）。（Ｆ）ｐＣａＦはＣ．アセトブチリカムＨｙｄＦを発現する。（Ｇ）ｐＣａＧはＣ．アセトブチリカムＨｙｄＧを発現する。
【図８】精製した、ＳｔｒｅｐIIタグ付き［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼのウェスタンブロット分析を示す。レーン１、Ｃ．アセトブチリカムＨｙｄＡ（１．５μｇ、６５Ｋｄ）；レーン２、Ｃ．アセトブチリカムＨｙｄＡΔＮ（２μｇ、４３Ｋｄ）；レーン３、Ｃ．アセトブチリカムＨｙｄＢ（５μｇ、５０Ｋｄ）；レーン４、Ｃ．ラインハーディＨｙｄＡ１（２．２５μｇ、４９Ｋｄ）；レーン５Ｃ．ラインハーディＨｙｄＡ２（１μｇ、４９Ｋｄ）；レーン６、分子量マーカー、７５、５０、および３５Ｋｄ。
【図９】本研究で用いた［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼの配列比較の模式図である（Ｃａ＝Ｃ．アセトブチリカム、Ｃｐ＝Ｃ．パステリアヌム、Ｃｒ＝Ｃ．ラインハーディ）。最上部の図は、溶解性［ＦｅＦｅ］−ヒドロゲナーゼで見られる保存Ｆクラスター結合ドメイン（平行斜線がけ）、およびＨクラスター結合モチーフＨＣ１（ＴＳＣＣＰ）およびＨＣ２（ＭＡＣＰＧＧＣ）（塗りつぶし棒）の相対位置を表す。矢印の頭は、Ｃ．アセトブチリカムおよびＣ．パステリアヌムＨｙｄＡΔＮ構造物では消去された保存Ｆクラスター結合ドメインのＮ末端を示す。
【図１】
2008531055.tif 000004
【図２】
2008531055.tif 000005
【図３】
2008531055.tif 000006
【図４】
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【図５】
2008531055.tif 000008
【図６−１】
2008531055.tif 000009
【図６−２】
2008531055.tif 000010
【図６−３】
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【図７】
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【図８】
2008531055.tif 000013
【図９】
2008531055.tif 000014
【図１１】
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【国際調査報告】
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