(57)【要約】本発明は、適切なプロモーターの制御下にある、スペーサー配列の後ろに続くサケ科魚類のアルファウイルスのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡを含んだ組換えＤＮＡに関するものである。これら組換えＤＮＡは、発現ベクターを得るため、サケ科魚類の組換えアルファウイルスを産生するため、そしてワクチンを得るために利用可能なものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サケ科魚類のアルファウイルスのゲノムに由来する組換えＤＮＡであり、
−転写プロモーター、
そして該プロモーターの下流に、かつ該プロモーターの転写制御下に、
−少なくとも５個のヌクレオチドからなるスペーサー配列と、
−サケ科魚類のアルファウイルスのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ、
を含んでいる、組換えＤＮＡ。
【請求項２】
スペーサー配列が、
５’  Ｘ１ＣＴＧＡＮＧＡＲＸ２Ｂ２Ｘ’２ＹＧＡＡＡＸ３Ｂ３Ｘ’３ＴＨ  ３’  （Ｉ）、
という一般式（Ｉ）によって定義され、
該式において、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣは通常の意味を有し、Ｈは、Ｃ、ＴまたはＡを表し、ＹはＡまたはＧを表し、ＲはＣまたはＴを表し、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣを表し、Ｘ１は、前記アルファウイルスのゲノムの５’末端の配列に相補的な配列の、少なくとも３個のヌクレオチド、好ましくは６個〜１０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｘ２は、任意の配列の、少なくとも３個のヌクレオチド、好ましくは３個〜５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ２は、任意の配列の、４個または５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｘ’２はＸ２に相補的なオリゴヌクレオチドを表し、Ｘ３は、任意の配列の、少なくとも２個のヌクレオチド、好ましくは６個〜１０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ３は、任意の配列の、４個または５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、そしてＸ’３は、Ｘ３に相補的なオリゴヌクレオチドを表していることを特徴とする、請求項１に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項３】
サケ科魚類のアルファウイルスのｃＤＮＡインサートが一つまたは複数の発現カセットを含んでおり、該発現カセットのそれぞれが、前記サブゲノムプロモーターのコピーと、前記サブゲノムプロモーターの下流かつ該プロモーターの転写制御下に、発現させようとする非相同性配列またはこの配列の導入を可能にするクローニング部位を含んでいることを特徴とする、請求項１または請求項２に記載の組換えＤＮＡ。
【請求項４】
サケ科魚類のアルファウイルスのＲＮＡレプリコンの調製方法であり、宿主細胞に、請求項２または請求項３に記載の組換えＤＮＡを導入することと、前記宿主細胞を培養することを含むことを特徴とする方法。
【請求項５】
請求項４に記載の方法によって得ることのできるサケ科魚類のアルファウイルスのＲＮＡレプリコン。
【請求項６】
サケ科魚類の組換えアルファウイルスの調製方法であり、請求項２または請求項３に記載の組換えＤＮＡまたは請求項５に記載のＲＮＡレプリコンを、自身のパッケージングに不可欠な前記アルファウイルスの構造タンパク質の全てが発現する宿主細胞に導入することと、前記宿主細胞を培養することを含む方法。
【請求項７】
前記構造タンパク質の発現を可能にする全遺伝情報が前記組換えＤＮＡまたは前記ＲＮＡレプリコンに保持されていることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記構造タンパク質の発現を可能にする遺伝情報の全部または一部が宿主細胞によってトランスで提供されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項６〜請求項８のいずれか一つに記載の方法によって得ることのできる、サケ科魚類の組換えアルファウイルス。
【請求項１０】
請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の組換えＤＮＡ、請求項５に記載のサケ科魚類のアルファウイルスのＲＮＡレプリコン、または、請求項９に記載のサケ科魚類の組換えアルファウイルスの、ワクチンを得るための利用方法。
【請求項１１】
請求項１〜請求項３のいずれか一つに記載の組換えＤＮＡを含むワクチン。
【請求項１２】
請求項５に記載のサケ科魚類のアルファウイルスのＲＮＡレプリコンを含むワクチン。
【請求項１３】
請求項９に記載のサケ科魚類の組換えアルファウイルスを含むワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、サケ科魚類のアルファウイルスの感染性ｃＤＮＡの取得法と、これらのｃＤＮＡの利用法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
アルファウイルスは、トガウイルス科のプラス鎖ＲＮＡのエンベロープを有するウイルスである。
【０００３】
現状では、代表的な二つのサケ科魚類のアルファウイルスが知られている。すなわち、マスの病原である睡眠病ウイルス（ＳＭＶ）と、サケの病原である膵臓病のウイルス（ＰＭＶ）である。これら二つのウイルスは、遺伝学的に非常に近似したものであり、既知のアルファウイルスのゲノムとの構成の類似性に基づき、アルファウイルスのファミリーに関係づけられている。しかし、該ウイルスの推定されているヌクレオチド配列ならびにポリペプチド配列は、その他のアルファウイルスとは弱い相同性の程度しか有していない（ＶＩＬＬＯＩＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１７３−１８３，２０００；ＷＥＳＴＯＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５６，１８８−１９５，１９９９；ＷＥＳＴＯＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７６，６１５５−６３，２００２）。したがって、該ウイルスは、哺乳動物のアルファウイルスとは異なるアルファウイルスのサブグループに相当するものであると考えられている。
【０００４】
アルファウイルスのゲノムは２つのポリタンパク質をコードしている。コード配列の５’部分は、該配列のおよそ三分の二に相当するものであり、タンパク質分解切断の後にウイルスの複製に関与する非構造タンパク質（ｎｓｐ）ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４を生じさせるポリタンパク質をコードしている。ゲノムの三分の一の末端は、タンパク質分解切断によって構造タンパク質（Ｓｔｒｕｃｔ）、すなわちカプシドタンパク質（Ｃ）と２つのエンベロープ糖タンパク質（Ｅ３−Ｅ２および６Ｋ−Ｅ１）が生じるポリタンパク質をコードしている。ｎｓＰとＳｔｒｕｃｔをコードしている領域は、結合領域（Ｊ）と呼ばれる非コード領域によって隔てられている。また、二つの非コード領域がゲノムの５’末端と３’末端にも存在している。さらに、このゲノムは５’末端にキャップを、３’末端にはポリＡテールを有している（ＳＴＲＡＵＳＳ  ｅｔ  ＳＴＲＡＵＳＳ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，  ５８，４９１−５６２，１９９４）。
【０００５】
サケ科魚類のアルファウイルスでは、このゲノム構成は保存されている。その他のアルファウイルスのゲノムとの主要な差異は、コード配列の弱い相同性の他にも、５’非コード領域および３’非コード領域のサイズがあり、該領域はサケ科魚類のアルファウイルスではより短くなっている。
【０００６】
ＳＭＶおよびＰＭＶによって引き起こされる病変は現在、サケ養殖で高まってきている問題である。これらのウイルスは今日、ヨーロッパの風土病となっており、北アメリカ大陸でも出現している。
【０００７】
これらのウイルス性因子に対するサケ科魚類の保護方法は、ワクチンの利用にある。ワクチン投与は、ワクチン投与すべき魚の種および年齢に応じて、さまざまな様式で実施することができる。たとえば、ワクチン投与は浸漬によって行うことができる。このワクチン投与の手段は、非常に効果的かつコストの低いものであり、弱毒化生ウイルスによるワクチン投与に対する優れた方法である。また、ワクチン投与は弱毒化生ウイルスあるいは不活性ウイルスの注射によって実施することもできる。浸漬によるワクチン投与よりコストはかかるが、この方法は１０グラム以上の魚のワクチン投与に利用可能であり、したがって、とりわけサケや海マスのような種のワクチン投与に適している。有利には、弱毒化生ウイルスの存在下での浸漬による初回接種と、弱毒化生ウイルスあるいは不活性ウイルスの注射による再接種を組み合わせてもよい。
【０００８】
ＲＮＡウイルスのゲノムの操作、とりわけ弱毒化した株を生成するための操作には、感染性ｃＤＮＡのシステム、つまり、これらのウイルスのゲノムＲＮＡの完全なＤＮＡのコピー（およそ１２０００個の塩基）であって、宿主細胞内で転写されることで、この細胞内で複製することのできるウイルスＲＮＡを生成することができるコピーを利用することが必要となる。
【０００９】
従来的には、アルファウイルスの感染性ｃＤＮＡを産生するために、プロモーター配列ＳＰ６またはＴ７に５’末端で融合した完全なウイルスゲノムのｃＤＮＡをプラスミド内でクローニングする。このプラスミド構築物は制限酵素によって３’末端で切断され、ＲＮＡポリメラーゼＳＰ６またはＴ７によってゲノムＲＮＡを合成するために、インビトロの転写系で用いられる。このＲＮＡは対象となるウイルスに感受性のある細胞にトランスフェクトされる。数日後、新しく形成されたウイルスが培養上清において塩折される。こうして、多くのアルファウイルス、たとえばＳＶ（シンドビスウイルス、ＲＩＣＥ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６１，３８０９−３８１９，１９８７）、ＳＦＶ（セムリキ森林ウイルス、ＬＩＬＪＥＳＴＲＯＭ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，６５，４１０７−４１１３，１９９１）、ＶＥＥウイルス（ベネズエラウマ脳炎、ＤＡＶＩＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，１７１，１８９−２０４，１９８９），ＥＥＥウイルス（東部ウマ脳炎；ＳＣＨＯＥＰＰ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３０２，２９９−３０９，２００２）についての感染性ｃＤＮＡが得られた。
【非特許文献１】ＶＩＬＬＯＩＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７４，１７３−１８３，２０００；ＷＥＳＴＯＮ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２５６，１８８−１９５，１９９９
【非特許文献２】ＳＴＲＡＵＳＳ  ｅｔ  ＳＴＲＡＵＳＳ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，  ５８，４９１−５６２，１９９４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
しかし、サケ科魚類のアルファウイルスの場合、このアプローチを用いた感染性ｃＤＮＡを生成するために行われた試みは失敗している。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、スペーサーの役割を果たすランダムな追加の配列をプロモーターＳＰ６またはＴ７とウイルスゲノムの起点との間に導入することで、この問題が解決できることを発見した。この配列の付加によって、魚の細胞におけるトランスフェクションによって非構造タンパク質の合成を可能にするゲノムＲＮＡをインビトロで生成することが可能となる。
【００１２】
感染性ＲＮＡを生成するために、本発明者らは、スペーサーの役割を果たすランダム配列を、ハンマーヘッド型リボザイムの配列で置換した。本発明者らは、この構築物から新しく合成されたＲＮＡが、アルファウイルスのゲノムＲＮＡの最初のヌクレオチドのところで厳密に切断されることを見出した。こうして得られたＲＮＡは、タンパク質ｎｓＰを合成する能力、複製される能力、構造タンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡの合成を可能にする能力、そして、感染性の新たなウイルス粒子を生成するためにパッケージングされる能力を有している。
【００１３】
さらに、本発明者らは、ＳＭＶのサブゲノムプロモーターの制御下で非相同性配列を導入するためにこの構築物を用いた。本発明者らは、この配列がこの構築物によって感染した細胞内で発現することと、この配列を含んだウイルスゲノムが通常、ウイルス粒子にパッケージングできることを見出した。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
本発明は、サケ科魚類のアルファウイルスのゲノムに由来する組換えＤＮＡを対象とするものであり、該ＤＮＡは、
−転写プロモーター、
そして該プロモーターの下流に、かつ該プロモーターの転写制御下に、
−少なくとも５個のヌクレオチド、好ましくは１０〜１００個のヌクレオチドからなるスペーサー配列と、
−サケ科魚類のアルファウイルスのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ、
を含んでいる。
【００１５】
転写プロモーターは、宿主細胞内で発現するＲＮＡポリメラーゼによって認識される、どのようなプロモーターであってもよい。たとえば、プロモーターＴ７、プロモーターＴ３またはプロモーターＳＰ６のようなバクテリオファージプロモーターとすることができ、この場合、本発明にしたがった組換えＤＮＡは、このプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを発現する構築物と組み合わせて用いる必要がある。
【００１６】
また、宿主細胞の内因性のＲＮＡポリメラーゼ、特にＲＮＡポリメラーゼＩＩによって認識されるプロモーターを使うこともできる。それは、ウイルスプロモーター、たとえば、ＣＭＶプロモーター（サイトメガロウイルス）、ＲＳＶプロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＳＶ４０初期プロモーター、ＭｏＭＬＶプロモーター（モロニーマウス白血病ウイルス）などのような、哺乳動物の細胞内で非相同性遺伝子を発現させるために一般的に用いられているものの一つとすることができる。また、真核生物のプロモーター、たとえば、ＡＬＯＮＳＯ  ｅｔ  ａｌ．（Ｖａｃｃｉｎｅ，２１，１５９１−１６００，２００３）に記載されているような魚のプロモーターとすることもできる。
【００１７】
スペーサー配列の機能は、プロモーターをアルファウイルスのゲノムの起点から遠ざけることである。したがって、スペーサー配列の配列は本発明の実施に対して重要ではない。該配列の長さに関し、本発明者らは、６個のヌクレオチドによる配列によって十分な間隔がもたらされることを見出した。一般的には、およそ１０個〜１００個のヌクレオチドからなるより長い配列、好ましくは５０個〜１００個のヌクレオチドからなる配列を用いることが好まれる。
【００１８】
非常に有利には、ゲノムＲＮＡの５’末端へのハンマーヘッド型リボザイムの導入を可能にするスペーサー配列が用いられることになる。
【００１９】
ハンマーヘッド型リボザイムは（一般的にはおよそ４０個〜８０個のヌクレオチドからなる）小さなリボザイムであり、該リボザイムは、サイズと配列は異なることがある、触媒活性に不可欠な保存された中心の核によって連結されている３つのらせんで形成された二次構造を共通して有している。（ＲＵＦＦＮＥＲ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２９，１０６９５−１０７０２，１９９０）。
【００２０】
ハンマーヘッド型リボザイムを、サケ科魚類のアルファウイルスのゲノムＲＮＡの５’末端に導入することを可能にする配列は、
５’  Ｘ１ＣＴＧＡＮＧＡＲＸ２Ｂ２Ｘ’２ＹＧＡＡＡＸ３Ｂ３Ｘ’３ＴＨ  ３’（Ｉ）、
という一般式（Ｉ）によって定義することができ、
該式において、Ａ、Ｔ、ＧおよびＣは通常の意味を有し、Ｈは、Ｃ、ＴまたはＡを表し、ＹはＡまたはＧを表し、ＲはＣまたはＴを表し、ＮはＡ、Ｔ、ＧまたはＣを表し、Ｘ１は、前記アルファウイルスのゲノムの５’末端の配列に相補的な配列の、少なくとも３個のヌクレオチド、好ましくは６個〜１０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｘ２は、任意の配列の、少なくとも３個のヌクレオチド、好ましくは３個〜５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ２は、任意の配列の、４個または５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｘ’２はＸ２に相補的なオリゴヌクレオチドを表し、Ｘ３は、任意の配列の、少なくとも２個のヌクレオチド、好ましくは６個〜１０個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、Ｂ３は、任意の配列の、４個または５個のヌクレオチドからなるオリゴヌクレオチドを表し、そしてＸ’３は、Ｘ３に相補的なオリゴヌクレオチドを表している。
【００２１】
バクテリオファージプロモーターを用いた場合にアルファウイルスのＲＮＡの正しい終止を保証するために、本発明にしたがった組換えＤＮＡはさらに、従来通りに、用いられるプロモーターに対応する転写ターミネーターを含む。宿主細胞の内因性のＲＮＡポリメラーゼによって認識されるプロモーターを用いる場合には、ウイルスゲノムの３’末端に融合されたポリＡテールが用いられる。
【００２２】
本発明にしたがった組換えＤＮＡは、選択されたサケ科魚類のアルファウイルスのゲノムＲＮＡを逆転写することで得られたｃＤＮＡから容易に構築することができる。必要なら、本発明にしたがった組換えＤＮＡについて計画されている利用法に応じて、このｃＤＮＡにさまざまな修飾を行うことができる。たとえば、一つまたは複数の制限部位の導入、ウイルスゲノムの一部の削除、とりわけ、該ウイルスの複製に必要ではない部分の削除（たとえば、構造タンパク質をコードする領域の全部または一部）、ウイルス配列の重複、非相同性配列の導入などである。また、これらのアルファウイルスの特性、たとえば該アルファウイルスの感染力、病原性または抗原性に対する効果をテストするための変異であってもよい。
【００２３】
ここで用いる「サケ科魚類のアルファウイルスのゲノムＲＮＡのｃＤＮＡ」または「サケ科魚類のアルファウイルスのｃＤＮＡ」という表現は、前記アルファウイルスのゲノムＲＮＡを逆転写することで得られたｃＤＮＡだけでなく、上記のように修飾されたｃＤＮＡも含むものとして解釈すべきものである。
【００２４】
このように、本発明は、さまざまな用途を目的として、サケ科魚類のアルファウイルスのゲノムの操作を実施することと、こうして得られたサケ科魚類のアルファウイルスを大量かつ複製可能な様式で産生することを可能にする。
【００２５】
とりわけ、本発明は、サケ科魚類のアルファウイルスから、他のアルファウイルスからすでに構築されている発現ベクター（たとえばＦＲＯＬＯＶ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９３，１１３７１−１１３７７，１９９６参照）に類似した構造の発現ベクターを構築することを可能にする。これらの発現ベクターは二つの主要なタイプとすることができ、該二つの主要なタイプとは、
−複製する能力と、自身に導入される非相同性配列を発現させる能力、そして、新しいウイルス粒子を産生するためにパッケージングされる能力をもったベクターであり、一般的には、サブゲノムプロモーターのコピーの制御下に置かれた有益な非相同性配列をアルファウイルスの完全なゲノムに導入することで該アルファウイルスの完全なゲノムから得られるベクターと、
−複製する能力と、自身に導入される非相同性配列を発現する能力は持っているが、新しいウイルス粒子を産生する能力は持たないベクターであり、一般的には、構造タンパク質をコードするアルファウイルスのゲノム領域を、有益な非相同性配列で置換することによって得られるものであり、たとえば、これらのタンパク質を発現する補助のベクターを宿主細胞に導入することにより、または、宿主細胞として、これらのタンパク質を発現する発現カセットによって安定的に形質転換された細胞株を利用することにより、構造タンパク質が宿主細胞内にトランスで存在するときにだけ、ウイルスのパッケージングが行われるベクターである。
【００２６】
本発明にしたがった組換えＤＮＡは、サケ科魚類のアルファウイルスのサブゲノムプロモーターの制御下で、有益な非相同性配列を発現させるために用いることができる。この場合、サケ科魚類のアルファウイルスのｃＤＮＡインサートは、一つまたは複数の発現カセットを含んでおり、該発現カセットのそれぞれは、前記サブゲノムプロモーターのコピーと、前記サブゲノムプロモーターの下流かつ該プロモータの転写制御下に、発現させようとする非相同性配列またはこの配列の導入を可能にするクローニング部位を含んでいる。
【００２７】
アルファウイルスのサブゲノムプロモーターは、ｎｓＰの複合体によって認識され、サケ科魚類のアルファウイルスにおける構造タンパク質をコードする遺伝子の転写を制御するものであって、このプロモーターは、ｎｓｐ４をコードする配列の終端と結合領域を含んだゲノム領域内に位置している（ＳＭＶの場合、このプロモーターは、ｎｓｐ４をコードする配列の最後の１２４個のヌクレオチドと結合領域を含む、ゲノムのヌクレオチド７６８６〜７８４６に対応する領域内に位置している）。
【００２８】
非相同性配列は、有益なタンパク質をコードする配列、あるいは、たとえばアンチセンスＲＮＡまたは干渉ＲＮＡのような、ＲＮＡに転写された有益な配列とすることができる。
【００２９】
また、本発明はサケ科魚類のアルファウイルスのＲＮＡを得るための方法も対象としており、該方法は、本発明にしたがった構築物を適切な宿主細胞に導入することと、前記宿主細胞を培養することを含むことを特徴としている。
【００３０】
本発明の枠組みにおいて利用可能な宿主細胞は、好ましくは魚の細胞である。非限定的な例として、ＢＦ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−９１）、ＣＨＳＥ２１４細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５５）またはＲＴＧ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６８１）が挙げられる。必要であれば、これらの細胞は、本発明にしたがった組換えＤＮＡ構築物に用いられたプロモーターを認識するＲＮＡポリメラーゼを発現する構築物によって、一過性でまたは安定的に形質転換される。
【００３１】
また、本発明はサケ科魚類のアルファウイルスのＲＮＡレプリコンを得るための方法も対象としており、該方法は、適切な宿主細胞に、スペーサー配列が一般式（Ｉ）で定義されるハンマーヘッド型リボザイムの配列である、本発明にしたがった組換えＤＮＡを導入することと、前記宿主細胞を培養することを含むことを特徴としている。
【００３２】
ここでは、「ＲＮＡレプリコン」を、宿主細胞において自己複製する能力をもったＲＮＡ分子として定義する。
【００３３】
組換えアルファウイルスの産生のためには、パッケージングに必要となる全構造タンパク質も宿主細胞の中で発現することが必要となる。この発現は、シス（これらのタンパク質の発現に必要な全遺伝情報はアルファウイルスのＲＮＡレプリコンに保持されている）またはトランス（アルファウイルスのＲＮＡレプリコンはこれらのタンパク質の発現に必要な全遺伝情報は保持しておらず、欠けている遺伝情報は宿主細胞によって与えられる）で行うことができる。
【００３４】
本発明にしたがった組換えＤＮＡがパッケージングに必要な全遺伝情報を含んでいれば、産生されたＲＮＡレプリコンは宿主細胞にパッケージングされてサケ科魚類の組換えアルファウイルスを産生することができ、該組換えアルファウイルスは、他の細胞に浸透し、ゲノムを複製し、そして自ら宿主細胞内にパッケージングされる能力をもっている。このようなウイルスはここでは「感染性ウイルス」として定義する。
【００３５】
本発明にしたがった組換えＤＮＡがパッケージングに必要な全遺伝情報を含んでいなければ（とりわけ、該ＤＮＡから構造タンパク質をコードする領域の全部または一部が欠けていれば）、産生されたＲＮＡレプリコンは、宿主細胞が欠陥のあるパッケージング機能を補完することを可能にする遺伝情報をトランスで提供しない限り（たとえば該宿主細胞が、欠けている構造タンパク質を発現する構築物によって一過性でまたは安定的に形質転換されていれば）、該宿主細胞内でパッケージングされることはない。後者の場合、サケ科魚類の組換えアルファウイルスはこの宿主細胞の中で産生されることができる。該アルファウイルスは他の細胞に浸透し、そこでゲノムを複製する能力を持っているが、初期の宿主細胞のように、該他の細胞が欠陥のあるパッケージング機能をトランスで補完できるときにだけ、該細胞内でパッケージングすることができる。このようなウイルスはここでは「不稔感染性ウイルス」として定義される。
【００３６】
また、本発明は、サケ科魚類のアルファウイルスのＲＮＡレプリコンおよびサケ科魚類の組換えアルファウイルスと並んで、感染性または不稔感染性の、上述したように本発明にしたがった組換えＤＮＡから得ることのできる、転写産物を対象としたものである。
【００３７】
本発明は、より特徴的には、ＲＮＡレプリコンと、上述したようにアルファウイルスのｃＤＮＡに一つまたは複数の修飾が導入された、本発明にしたがった組換えＤＮＡから得ることのできるサケ科魚類の組換えアルファウイルスを対象に含んでいる。
【００３８】
発現した、本発明にしたがった組換えＤＮＡ、ＲＮＡレプリコンおよびサケ科魚類の組換えアルファウイルスは、ワクチンを得るため、たとえば、弱毒化した、または不活性化したサケ科魚類のアルファウイルスのワクチン株を得るために用いることができる。
【００３９】
また、本発明は、本発明にしたがった組換えＤＮＡ、ＲＮＡレプリコン、もしくはサケ科魚類の組換アルファウイルスを含むか、またはこれらから得ることのできる、ワクチンも対象とするものである。これらのワクチンはとりわけ、アルファウイルス感染からサケ科魚類を保護するために利用することができる。
【００４０】
本発明は、ＳＭＶから本発明にしたがった組換えＤＮＡ、ＲＮＡレプリコンおよび組換えウイルスを得る方法を例示している、以下の非制限的な実施例を対象とする補助的な説明によってより良く理解されるものである。
【００４１】
実施例
ウイルスおよび細胞
以下の実施例で用いたウイルスは、前述したＳＭＶのＳ４９Ｐ株に由来するものである（ＣＡＳＴＲＩＣ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｉｓｈ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｓｔｓ，１７，２７−３０，１９９７）。
【００４２】
これらのウイルスは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨ７．４に緩衝し、１０％ウシ胎児血清を補充したイーグル最少必須培地（ＥＭＥＭ、Ｓｉｇｍａ、フランス）において１０℃で培養した、ＢＦ−２細胞の単層培養で増殖させた。トランスフェクションの際に最良の収量を得るために、用いたＢＦ−２細胞は、効果的にトランスフェクトされる適性に基づいて選択したサブクローニングに由来するものである。
【００４３】
この選択は以下のように行った。
【００４４】
ＢＦ−２細胞は、９６ウェルプレートにおいて、ウェル毎に一つの細胞の割合で培養した。一ヶ月後、こうして得られた２４個のクローンをランダムに選択し、２つの１２ウェルプレートで増幅した。これらのクローンのそれぞれは、ｐｌａｓｍｉｄｅ−ｔｅｓｔ（ｐｃＤＮＡ３−Ｇ）によってトランスフェクトしたが、該ｐｌａｓｍｉｄｅ−ｔｅｓｔは、ＶＨＳＶウイルス（ウイルス性出血性敗血症ウイルス）の糖タンパク質Ｇをコードする配列を、ｐｃＤＮＡ３ベクター（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）の、ＣＭＶプロモーターとＴ７プロモーターの下流に導入することによって得られたものである。トランスフェクションの効率は、糖タンパク質Ｇに対する抗体を用いて、免疫蛍光法によって、ＣＭＶプロモーターの制御下における糖タンパク質Ｇの発現レベルを評価することで判定した。
【００４５】
蛍光がもっとも強かった１１個のクローンを選択し、増幅した。これらのクローンのそれぞれを、ｐｃＤＮＡ３−Ｇによってトランスフェクトされる能力について改めて上述のようにテストしたが、今回は、ｖＴＦ７−３（ＦＵＥＲＳＴ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３，８１２２−８１２６，１９８６）による事前の感染の後に、Ｔ７プロモーターの制御下における糖タンパク質Ｇの発現レベルを評価することにより行った。最後に、効果的にトランスフェクトされる適性と関連づけられる、ｖＴＦ７−３によって感染される能力について、５個のクローンを選択した。
【００４６】
増幅プライマー
以下の実施例で用いたプライマーの配列は以下の表１に示している。
【００４７】
【表１】
2008546399.tif 000002
【実施例１】
【００４８】
ＳＭＶの完全なゲノムのクローニング
ＳＭＶのｃＤＮＡの完全な構築物であるｐＢＳ−ＳＭＶはｃＤＮＡ断片（１〜３として番号を付けた）から得られたものであり、該断片は、ＳＭＶの完全なゲノムをカバーし、先行して公開された配列（ＶＩＬＬＯＩＮＧ  ｅｔ  ａｌ．，２０００；先掲したＷＥＳＴＯＮ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，ＧＥＮＢＡＮＫのアクセス番号：ＮＣ＿００３４３３．１／ＧＩ：１９３５２４２３）から得られたものである。各断片を、ＳＭＶのゲノムＲＮＡを鋳型として用いて、逆転写とそれに続くＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）によって増幅した。ＲＮＡは、ＰＥＧで濃縮された、感染したＳＭＶ細胞の上清から、精製キットＱＩＡａｍｐ  Ｖｉｒａｌ  ＲＮＡ（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて抽出した。逆転写およびＰＣＲ増幅に用いたプライマー（Ｐ１〜Ｐ６）は表１に示されている。
【００４９】
得られたｃＤＮＡ断片は互いにライゲートし、制限部位ＥｃｏＲＩ、ＳｍａＩ、ＸｂａＩおよびＮｏｔＩを用いて、プラスミドｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔのマルチクローニング部位に組み込んだ。得られたプラスミドは図１に示されている。
【００５０】
図１に示したように、クローニングの後の過程を容易にするために、制限部位ＸｂａＩを人工的に導入した。ｐＢＳ−ＳＭＶ構築物のシーケンシングによって、公開された配列と比較して４２個の変異が明らかになった。これらの変異は以下の表２にリストアップされ、図１に示したｐＢＳ−ＳＭＶ構築物について文字（ａ〜ｘ）によって示されている。
【００５１】
該変異のうち、８個の偶発的な変異は以下のように修正した。すなわち、変異を含むｃＤＮＡゲノムの領域に対応するＳＭＶのゲノムＲＮＡのさまざまな部分をＲＴ−ＰＣＲで再増幅した。各ＰＣＲ産物をシーケンシングし、そして配列が正しければ、適切な制限部位と標準的な技術を用いてｐＢＳ−ＳＭＶ構築物における相同な位置に導入した（ＳＡＭＢＲＯＯＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，  １９８９）。制限部位ＸｂａＩを除いて、最終的なｐＢＳ−ＳＭＶ構築物は、ＳＭＶのゲノムＲＮＡの正確なｃＤＮＡのコピーを含んでいる。
【００５２】
【表２】
2008546399.tif 000003
【実施例２】
【００５３】
魚の細胞におけるＳＭＶの非構造タンパク質と、ＧＦＰおよびルシフェラーゼを発現するＳＭＶのレプリコンとの合成を可能にするゲノムＲＮＡ構築物。ＳＭＶのｃＤＮＡインサートを、ｐＢＳ−ＳＭＶから、ベクターｐｃＤＮＡ３の、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の前初期プロモーターとＲＮＡポリメラーゼＴ７のプロモーターの下流にある、制限部位ＥｃｏＲＩとＮｏｔＩの間に移入した。その結果得られる構築物はｐＳＤＶと名付けた。
【００５４】
構造タンパク質をコードするｃＤＮＡの領域をＸｂａＩで消化することで取り除いたのだが、該ＸｂａＩの一方の部位は結合領域に位置し、他方はｃＤＮＡの下流にある、ｐｃＤＮＡ３のマルチクローニング部位に位置している。図２Ａに示されているプラスミドｐ−ｎｓＰを発生させるために、構築物をセルフライゲートした。
【００５５】
続いてプラスミドｐ−ｎｓＰをＸｂａＩによって線状化することで、非構造タンパク質をコードする領域の下流に、ＧＦＰまたはルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードしている配列を導入したのだが、該配列は、結合領域の終端の後に続き、そして、ポリ（Ａ）テールと融合した、ＳＭＶの３’非翻訳末端の前にある。結合領域の人工ＸｂａＩ部位は、ＳａｎＤＩ／ＢｌｐＩ断片を入れ替えることで取り除いた。ＧＦＰのリーディングフレームまたはルシフェラーゼのリーディングフレームは二つの固有の制限部位、すなわちＥｃｏＲＶ部位とＢｌｐＩ部位に挟まれている。ｐ−ｎｓＰ−ＧＦＰおよびｐ−ｎｓＰ−ＬＵＣと名付けられたこれらの最終的な構築物において、ＣＭＶ／Ｔ７プロモーターのセットは、ＳＭＶのゲノムの５’末端から、ｐｃＤＮＡ３のマルチクローニング部位に属する６１個のヌクレオチドによって隔てられている。これらの構築物は図２Ｂに示されている。
【００５６】
ＧＦＰレポーター遺伝子およびＬＵＣレポーター遺伝子の発現を目的としたこれらの構築物の機能を評価するために、該構築物のそれぞれを用いてＢＦ−２細胞をトランスフェクトし、該細胞を培養プレートのウェル（６×１０５細胞／ウェル）において１０℃でインキュベートし、ルシフェラーゼ活性およびＧＦＰ活性を毎日測定した。
【００５７】
ルシフェラーゼ活性を測定するために、トランスフェクトした細胞を測定前に回収し、ＰＢＳで洗浄し、そして、７５μｌの１×溶解緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−リン酸（ｐＨ７．８）、２ｍＭのＤＴＴ、２ｍＭの１，２−ジアミノシクロヘキサン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸、１０％のグリセロール、１％のトリトンＸ−１００）で溶解した。溶解物を低速の遠心分離によって清澄化し、タンパク質をブラッドフォード法によって定量することで、サンプルを標準化した。
【００５８】
５０μｌの反応性ルシフェラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を清澄化した溶解物のアリコートに加えた。
【００５９】
ＧＦＰの場合、トランスフェクトした細胞における発現の直後に、紫外線顕微鏡で観察を行った。
【００６０】
非構造タンパク質の発現は、トランスフェクションの翌日からすぐ、免疫蛍光法によって検出された。逆に、トランスフェクション後のいつであっても、ルシフェラーゼ活性もＧＦＰの蛍光も検出されなかった。
【００６１】
結果は以下の表３に示している。
【００６２】
【表３】
2008546399.tif 000004
【００６３】
これらの結果は、ウイルスＲＮＡは転写されるが、レポーター遺伝子であるＧＦＰまたはルシフェラーゼの発現が観察されず、ＧＦＰおよびルシフェラーゼがＳＭＶの２６Ｓサブゲノムプロモーターの制御下に置かれていることを示している。
【００６４】
これによって、５’末端がＳＭＶゲノムの５’末端とは厳密には同一ではないことから、ウイルスの複製された複合体が機能性ではないと考えることができる。
【００６５】
スペーサーとしてのリボザイムの利用
ハンマーヘッド型リボザイムの配列（ＨＨ配列）をＳＭＶのゲノムｃＤＮＡの５’末端の最初のヌクレオチドに、以下の要領で融合させた。ＳＭＶのｃＤＮＡの最初の２Ｋｂを含んでいるｐ−ｎｓＰのＨｉｎｄＩＩＩ断片を削除し、プラスミドｐＵＣ１９の中でサブクローニングし、ｐＵＣ−ＳＤＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ構築物を得た。この構築物から、ＳＭＶのゲノムの５’末端を含んだＢａｍＨＩ／ＮａｅＩ断片を削除し、合成ＤＮＡ断片で置換した。該合成ＤＮＡは、ＳＭＶゲノムの５’末端に融合しているハンマーヘッド型リボザイムの配列を含んだ、７９個および８０個からなるヌクレオチドの、部分的に相補的な二つのオリゴヌクレオチドをハイブリダイズし、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で平滑化することによって得られたものである。これらのオリゴヌクレオチドの配列（５’ＲＩＢＯおよび３’ＲＩＢＯ）は表１に示されている。
【００６６】
ハンマーヘッド型リボザイムの配列は図３Ａに示しており、ＢａｍＨＩ部位、ＮａｅＩ部位およびＴ７プロモーターに下線を引いている。リボザイムの切断部位とＳＭＶゲノムの起点は矢印で指示している。
【００６７】
適切な制限酵素による消化の後、合成ＤＮＡ断片を、プラスミドｐＵＣ−ＳＤＶ  ＨｉｎｄＩＩＩに導入し、ｐＵＣ−ＨＨ−ＳＤＶ  ＨｉｎｄＩＩＩ構築物を得た。修飾したＨｉｎｄＩＩＩ断片をこの構築物から回収し、プラスミドｐ−ｎｓＰに再導入し、ｐＨＨ−ｎｓＰ構築物を得た。
【００６８】
続いて、得られたｐＨＨ−ｎｓＰ構築物をＸｂａＩによって線状化し、ｐ−ｎｓＰの場合と同様に修飾した。つまり、非構造タンパク質をコードする領域の下流に、ＢｌｐＩ部位およびＥｃｏＲＶ部位に挟まれ、結合領域の終端に後続し、ポリ（Ａ）テールと融合したＳＭＶの３’非翻訳末端の前にある、ＧＦＰまたはルシフェラーゼ（ＬＵＣ）をコードする配列を導入することと、人工ＸｂａＩ部位を修正することである。最終的な構築物はｐＨＨ−ｎｓＰ−ＧＦＰおよびｐＨＨ−ｎｓＰ−ＬＵＣと名付けた。これらの構築物の取得過程は図３Ｂに示している。
【００６９】
これらの構築物の機能性は、ｐ−ｎｓＰ−ＧＦＰ構築物およびｐ−ｎｓＰ−ＬＵＣ構築物の機能性と同様に評価した。
【００７０】
結果は図４に示している。
【００７１】
有意なルシフェラーゼ活性がトランスフェクションの２日後に検出され、トランスフェクションの９日後まで増加した（図４Ａ）。ＧＦＰの発現はトランスフェクションの４日後に明らかとなり、ルシフェラーゼの場合と同様に９日目に最適となった（図４Ｂ）。
【００７２】
これらの結果は、ベクターｐＨＨ−ｎｓＰ−ＬＵＣまたはｐＨＨ−ｎｓＰ−ＧＦＰによって発現したＳＭＶのレプリカーゼ複合体（ｎｓＰ１、ｎｓＰ２、ｎｓＰ３およびｎｓＰ４）が生物学的に活性であり、レポーター遺伝子を含んだサブゲノムＲＮＡを複製し、転写する能力を持っていることを示している。また、これらのデータは、ＳＭＶゲノムの５’末端での切断が、ハンマーヘッド型リボザイムによって効果的に行われたことも示している。
【実施例３】
【００７３】
ＳＭＶの感染性組換えｃＤＮＡ構築物
ＳＭＶの感染性ｃＤＮＡクローンを以下の要領で構築した。
【００７４】
ＳＭＶの構造タンパク質をコードしている領域を、ｐＨＨ−ｎｓＰ−ＬＵＣのＢｌｐＩ部位とＥｃｏＲＶ部位の間に導入し、ルシフェラーゼをコードしている配列を置換することで、ｐＨＨ−ＳＤＶ構築物を得た。
【００７５】
さらに、この構築物をＴ７ターミネーター（Ｔ７ｔ）の導入によって修飾した。ベクターｐＨＨ−ＳＤＶを制限酵素ＮｏｔＩによる消化によって線状化し、Ｔ７ターミネーターを含むベクターｐＥＴ−１４ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＢｌｐＩ／ＮｈｅＩ断片と平滑末端でライゲートした（ライゲーションの前に、二つの断片の端部をＴ４ＤＮＡポリメラーゼのクレノウ断片で平滑化した）。得られた構築物はｐＨＨ−ＳＤＶ−Ｔ７ｔと名付けた。この構築物の取得過程は図５に概略的に示している。
【００７６】
この構築物を、ＲＮＡポリメラーゼＴ７を発現する組換えワクシニアウイルスｖＴＦ７−３に感染したＢＦ−２細胞をトランスフェクトするために（先掲のＦＵＥＲＳＴ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８６）用いた。ＢＦ−２細胞（およそ１．２×１０６細胞／ウェル）を１２ウェルプレートで培養し、ｖＴＦ７−３で感染させた（感染多重度＝５）。３７℃での１時間の吸着の後、細胞を２回洗浄し、製造者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の指示にしたがって反応性のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００を用いて、１．６μｇのｐＳＤＶでトランスフェクトした。細胞を３７℃で７時間インキュベートし、ＭＥＭ培地で洗浄した後、１０℃で移入し、７日間または１０日間、この温度でインキュベートした。いくつかの実験においては、トランスフェクションは同一の手順に従って行ったが、ｖＴＦ７−３による事前の細胞の感染は行わなかった。
【００７７】
トランスフェクションの７日後および１０日後、細胞を２０℃で１５分間、１／１のアルコール／アセトンの混合物で固定し、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎで１／１０００に希釈した、ＳＭＶの構造または非構造タンパク質に対するモノクローナル抗体の組み合わせとインキュベートした。室温で４５分のインキュベートの後、細胞を洗浄し、マウスの抗免疫グロブリン抗体（Ｂｉｏｓｙｓ、フランス）とインキュベートした。洗浄後、細胞を紫外線照射のもと顕微鏡で検査した。
【００７８】
同時に、上清を回収し、マイクロ遠心チューブ内で１００００×ｇでの遠心分離によって清澄化し、新鮮なＢＦ−２細胞を感染させるために用い、１０℃で２４ウェルプレートにおいて単層培養した。こうして感染した細胞を上述した免疫蛍光法によって分析した。
【００７９】
トランスフェクションの７日後に観察された結果は図６Ａに示されている。いくつかの小さなスポットが現れ、そのサイズはトランスフェクションの１０日後でより大きくなっているのだが、このことは、組換えＳＭＶによる細胞から細胞への感染を反映している可能性がある。
【００８０】
組換えＳＭＶは、野生型ウイルスには存在しない制限部位ＢｌｐＩを有している。感染した細胞によって産生されたウイルスが組換えＳＭＶであることを確認するため、最初の処理の後、組換えＳＭＶによって感染した細胞からＲＮＡを抽出し、該ＲＮＡを、ＢｌｐＩ部位に挟まれたプライマーＮｓＰ４−ＦおよびＣａｐＲを用いてＲＴ−ＰＣＲを実行するための鋳型として用いた。これらのプライマーの位置は図６Ｃに示している。ＲＴ−ＰＣＲも同一のプライマーを用いて、野生型ウイルスで感染させた細胞から抽出したＲＮＡをもとに実施した。
【００８１】
増幅産物をＢｌｐＩによって消化し、それらの制限の特徴を比較した。結果は図６Ｂに示している。ＢｌｐＩの不在のもとでは（−ＢｌｐＩ）、野生型ウイルスと同様に、組換えＳＭＶの場合、１３２６個のヌクレオチドからなる断片が観察された。ＢｌｐＩによる消化の後（＋ＢｌｐＩ）、この断片は野生型ウイルスの場合には無傷のまま残り、組換えＳＭＶの場合には９９０個のヌクレオチドからなる断片および３３６個のヌクレオチドからなる断片が生じた。
【実施例４】
【００８２】
組換えＳＭＶによるインビボでの感染
組換えＳＭＶの感染力を確認するため、５０匹の若い健康なニジマス（Ｏｎｃｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｍｙｋｉｓｓ）を、感染したＢＦ−２細胞から得た５×１０４ＵＦＰ／ｍｌの野生型ＳＭＶまたは組換えＳＭＶを含む１０℃の水で満たした水槽に２時間にわたって浸漬することで感染させた。次に、水槽を３０リットルの新鮮な水で満たした。対照として用いた魚は、ウイルス懸濁液の代わりに培養培地を用いて、同じ条件で処理した。
【００８３】
感染の３週間後に数匹の魚を殺し、各魚の臓器のホモジェネートを用いてＢＦ−２細胞を感染させた。免疫蛍光法によるこれらの細胞の分析は、上記実施例３で説明したように、野生型ＳＭＶまたは組換えＳＭＶに感染した魚の臓器のホモジェネートにより感染した細胞におけるウイルスの存在を示している（結果は示していない）。
【００８４】
殺したすべての魚はＳＭＶについて陽性であり、組換えＳＭＶと同様に野生型ＳＭＶについても、ウイルス力価はおよそ１０７ＵＦＰ／ｍｌであった。
【実施例５】
【００８５】
非相同性遺伝子を発現する感染性組換えＳＭＶ構築物
ＧＦＰを発現する感染性の組換えウイルスを産生するため、感染性のｃＤＮＡであるｐＨＨ−ＳＤＶ−Ｔ７ｔを二つの異なる様式で修飾することで、ＧＦＰを発現する追加の発現カセットを導入した。
【００８６】
１）感染性ｃＤＮＡであるｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰｆｉｒｓｔ構築物
ｐＨＨ−ｎｓＰ−ＧＦＰ構築物を、別個の二つのＰＣＲ増幅産物を生成するための鋳型として用いた。産物「ＧＦＰ  ＰＣＲ」は５’ＧＦＰプライマーおよび３’ＧＦＰプライマーを用いることで得られ（表１）、産物「ＳＭＶサブゲノムＰＣＲ」は５’ｎｓＰ４プライマー（７７０６〜７７５０）および３’Ｊｕｎプライマーを用いて得られた（表１）。ＳＭＶのサブゲノムプロモーターの正確な位置と最小のサイズはまだ判定されていないため、ｎｓＰ４の配列の終端と結合領域とを含む約１００個のヌクレオチドからなる断片を用いた。次に、ＳＭＶのサブゲノムプロモーターを、第一の増幅に起因する二つの産物を混合し、５’ＧＦＰプライマーと３’Ｊｕｎプライマーを用いることで、ＧＦＰをコードする配列の３’末端においてＰＣＲによってライゲートした。
【００８７】
得られた増幅産物（ＧＦＰ−ＳＤＶＰｒｏ）をＢｌｐＩによって消化し、事前にＢｌｐＩによって消化したｐＨＨ−ＳＤＶ−Ｔ７ｔ構築物に導入して、感染性ｃＤＮＡであるｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰｆｉｒｓｔを得た。
【００８８】
２）感染性ｃＤＮＡであるｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰｓｅｃｏｎｄ構築物
この構築物において、ＧＦＰの発現カセットを構造遺伝子の下流に導入した。
【００８９】
二つのＰＣＲ増幅産物が生じたのだが、該産物とは、
−５’ＰｒｏＧＦＰおよび３’ＰｒｏＧＦＰをプライマーとして用い（表１）、ｐＨＨ−ｎｓＰ−ＧＦＰ構築物を鋳型として用いることで、ＧＦＰと融合したＳＭＶのサブゲノムプロモーター（産物ＰＣＲ１）と、
−３’ＵＴＲおよびＴ７ｔをプライマーとして用い（表１）、ｐＨＨＳＤＶ−Ｔ７ｔ構築物を鋳型として用いることで、ポリ（Ａ）テールとＴ７ターミネーターと融合したＳＭＶの３’非翻訳領域（産物ＰＣＲ２）である。
【００９０】
産物ＰＣＲ１およびＰＣＲ２は、５’ＰｒｏＧＦＰプライマーとＴ７ｔプライマーを用いてＰＣＲによって組み合わせた。ＰＣＲ増幅産物は、ＥｃｏＲＶとＮｏｔｌによって消化され、そして同一の酵素によって消化されたｐＨＨ−ＳＤＶ構築物に導入することで、感染性のｃＤＮＡであるｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰｓｅｃｏｎｄを得た。
【００９１】
これら二つの構造は図７Ａに概略的に示している。
【００９２】
これらの構築物を、ｖＴＦ７によって感染したＢＦ−２細胞をトランスフェクトするために用い、ＧＦＰの発現を毎日確認した。結果は図７Ｂに示している。
【００９３】
二つのｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰ構築物について、ＧＦＰの発現は、トランスフェクションの７日後から検出可能となっている。しかし、ＧＦＰ遺伝子がゲノムにおける構造タンパク質の遺伝子の下流に位置するとき、より強いＧＦＰの発現が観察された。
【００９４】
ｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰｆｉｒｓｔ構築物を得るためにｐＳＤＶにおいてＧＦＰ遺伝子をクローニングする間、３つのＧＦＰカセットを含んでいる疑いのあるプラスミド（ｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰ３）を選択した。
【００９５】
このプラスミドは図８Ａに概略的に示している。
【００９６】
ｎｓＰ４−ＦプライマーおよびＧＦＰ−Ｒプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲ（表１）によって、実際に３つのＧＦＰカセットがプラスミドｐＨＨＳＤＶ−ＧＦＰ３に存在することを確認することができた。
【００９７】
このＲＴ−ＰＣＲの結果は図８Ｂに示している。全体として、これら三つのＧＦＰカセットは２．７ＫｂのＤＮＡ断片に相当している。
【００９８】
この構築物をｖＴＦ７−３で感染したＢＦ−２細胞にトランスフェクトしたのだが、９日後における感染細胞のスポットの出現はこの構築物の機能性を確証している。
【００９９】
これらの結果は、ＳＭＶが、野生型ウイルスのゲノムよりも２０％以上長い非相同性の核酸を含みうることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】ＳＭＶの完全なゲノムのクローニングを示した図。
【図２Ａ】プラスミドｐ−ｎｓＰの取得を示した図。
【図２Ｂ】プラスミドｐ−ｎｓＰ−ＧＦＰおよびｐ−ｎｓＰ−ＬＵＣの取得を示した図。
【図３Ａ】ハンマーヘッド型リボザイムの配列を示した図。
【図３Ｂ】ｐＨＨ−ｎｓＰ−ＧＦＰおよびｐＨＨ−ｎｓＰ−ＬＵＣの取得を示した図。
【図４Ａ】ｐＨＨ−ｎｓＰ−ＧＦＰおよびｐＨＨ−ｎｓＰ−ＬＵＣの機能性の評価の結果を示したグラフ。
【図４Ｂ】ｐＨＨ−ｎｓＰ−ＧＦＰおよびｐＨＨ−ｎｓＰ−ＬＵＣの機能性の評価の結果を示した写真。
【図５】プラスミドｐＨＨ−ＳＤＶ−Ｔ７ｔの取得を示した図。
【図６Ａ】細胞の感染の結果を示した写真。
【図６Ｂ】増幅産物の制限部位を示した写真。
【図６Ｃ】プライマーＮｓＰ４−ＦおよびＣａｐＲの位置を示した図。
【図７Ａ】ｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰ  ｆｉｒｓｔおよびｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰｓｅｃｏｎｄの構造を示した図。
【図７Ｂ】ｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰ  ｆｉｒｓｔおよびｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰｓｅｃｏｎｄのＧＦＰの発現を示した写真。
【図８Ａ】ｐＨＨ−ＳＤＶ−ＧＦＰ３を示した図。
【図８Ｂ】ＲＴ−ＰＣＲの結果を示した写真。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【配列表】
2008546399000001.app
【国際調査報告】
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2008546399.tif 000019
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