(57)【要約】  下記の：第１及び第２アーム配列；両アーム配列に対して少なくとも部分的に相補的であって、ハイブリダイゼーション条件下で被分析体がないとプローブに第１立体構造を形成させ、被分析体があると第２立体構造を形成させることができる支持配列；並びにプローブと結合し、プローブの立体構造の指標となるシグナルを発生する標識；を含む核酸ハイブリダイゼーションスイッチプローブに結合する結合パートナーへの被分析体の結合を検出するための組成物を開示する。ハイブリダイゼーションスイッチプローブに結合する結合パートナーと特異的結合対を形成してプローブを第１立体構造から第２立体構造へ変化させ、その結果、試料中に被分析体が存在することの指標となる検出可能なシグナルを発生させる被分析体を検出する方法もまた記載する。
2008531052.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
被分析体の検出に特異的なハイブリダイゼーションスイッチプローブ（ＨＳＰ）であって、下記の：
第１核酸アーム配列；
第１核酸アーム配列と異なる第２核酸アーム配列；
第１核酸アーム配列に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ第２核酸アーム配列に対して少なくとも部分的に相補的である、核酸支持配列であって、前記支持配列は、ハイブリダイゼーション条件下で第１核酸アーム配列とハイブリダイゼーション二本鎖を形成して第１ＨＳＰ立体構造を形成するか、又は第２核酸アーム配列とハイブリダイゼーション二本鎖を形成して第２ＨＳＰ立体構造を形成する；
ハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造の指標となるシグナルを発生する標識；及び
被分析体と特異的結合対複合体を形成する結合対メンバーであって、前記特異的結合対複合体がハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造を変化させ、その結果、検出可能なシグナルが発生する；
を含む、前記ハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項２】
第１アーム配列が第２アーム配列より短い、請求項１のハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項３】
標識が均一アッセイ系で検出可能なシグナルを発生する、請求項１のハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項４】
標識がＨＳＰ核酸の一部である請求項１のハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項５】
標識がＨＳＰに直接又は間接的に結合した他の部分である、請求項１のハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項６】
標識が、
他の核酸プローブ配列を結合するＨＳＰ核酸配列、
核酸増幅反応でプライマーとして機能するＨＳＰ核酸配列、
核酸増幅反応で鋳型として機能するＨＳＰ核酸配列及びアプタマー
からなる群から選択される、請求項４のハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項７】
標識が、放射性核種、リガンド、酵素、酵素基質、酵素補因子、反応性基、発色団、粒子、生物発光性化合物、リン光性化合物、化学発光性化合物及び蛍光色素分子からなる群から選択される、請求項５のハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項８】
標識が第１アーム配列又は第２アーム配列のいずれかに結合した化学発光性化合物である、請求項１のハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項９】
請求項１のハイブリダイゼーションスイッチプローブであって、
標識は第１アーム配列に結合した蛍光色素分子であり、支持配列は第１アーム配列と支持配列がハイブリダイゼーション二本鎖を形成する場合に蛍光色素分子に近接する消光化合物を含み、又は
標識は第２アーム配列に結合した蛍光色素分子であり、支持配列は第２アーム配列と支持配列がハイブリダイゼーション二本鎖を形成した場合に蛍光色素分子に近接する消光化合物を含み、又は
標識は支持配列に結合した蛍光色素分子であり、第１アーム配列は第１アーム配列と支持配列がハイブリダイゼーション二本鎖を形成した場合に蛍光色素分子に近接する消光化合物を含み、又は
標識は支持配列に結合した蛍光色素分子であり、第２アーム配列は第２アーム配列と支持配列がハイブリダイゼーション二本鎖を形成した場合に蛍光色素分子に近接する消光化合物を含む、
前記ハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項１０】
第１アーム配列が連結エレメントで支持配列に結合し、第２アーム配列が連結エレメントで支持配列に結合している、請求項１のハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項１１】
被分析体と特異的結合対複合体を形成する結合対メンバーがアプタマーである、請求項１のハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項１２】
検出可能なシグナルが、核酸増幅反応に関与するＨＳＰの部分を用いて作製される増幅核酸である、請求項１のハイブリダイゼーションスイッチプローブ。
【請求項１３】
ハイブリダイゼーションスイッチプローブを含むキットであって、前記ハイブリダイゼーションスイッチプローブが以下の：
第１核酸アーム配列；
第１核酸アーム配列と異なる第２核酸アーム配列；
第１核酸アーム配列及び第２核酸アーム配列に対して少なくとも部分的に相補的な、核酸支持配列：支持配列は、ハイブリダイゼーション条件下で第１核酸アーム配列とハイブリダイゼーション二本鎖を形成してハイブリダイゼーションスイッチプローブの第１立体構造を形成するか、又は第２核酸アーム配列とハイブリダイゼーション二本鎖を形成してハイブリダイゼーションスイッチプローブの第２立体構造を形成する；
ハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造の指標となるシグナルを発生する標識；及び
ハイブリダイゼーションスイッチプローブにより検出される被分析体と特異的結合対複合体を形成する結合対メンバーであって、前記特異的結合対複合体がハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造を変化させ、その結果、検出可能なシグナルが標識から発生する；
前記キット。
【請求項１４】
さらに、被分析体を含有する試料を調製するための１以上の試薬、被分析体と結合対メンバーの結合を促進する１以上の試薬、標識を処理して検出可能なシグナルを発生させる１以上の試薬、又はＨＳＰ配列の一部を用いて核酸配列を増幅する核酸増幅反応に用いられる１以上の試薬を含む、請求項１３のキット。
【請求項１５】
試料中の被分析体を検出する方法であって、以下の：
被分析体を含有する試料及びその被分析体に特異的なハイブリダイゼーションスイッチプローブを含む反応混合物を調製する工程であって、
前記ハイブリダイゼーションスイッチプローブは、第１核酸アーム配列、第１核酸アーム配列と異なる第２核酸アーム配列、第１核酸アーム配列及び第２核酸アーム配列に対して少なくとも部分的に相補的な核酸支持配列、検出可能なシグナルを発生する標識及び被分析体を結合してハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造を変化させる特異的結合対複合体を形成する結合対メンバーから構成され、
その際、ハイブリダイゼーションスイッチプローブは、１のアーム配列が支持配列とのハイブリダイゼーション二本鎖中の第１ＨＳＰ立体構造にあり；
被分析体を結合対メンバーに結合させて、ハイブリダイゼーションスイッチプローブ上に特異的結合対複合体を形成させる工程；
特異的結合対複合体の形成に起因する第１ＨＳＰ立体構造から第２ＨＳＰ立体構造へ立体構造を変化させる工程；及び
標識からの立体構造変化の指標となるシグナル変化を検出して試料中に被分析体が存在することの指標とする工程；
を含む、前記方法。
【請求項１６】
ハイブリダイゼーションスイッチプローブの第１アーム配列に標識が結合し、第２アーム配列に結合対メンバーが結合し、第１ＨＳＰ立体構造が第２アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を含み、特異的結合対複合体が形成された場合に脱安定化されて、ハイブリダイゼーションスイッチプローブは、第１アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を含む第２ＨＳＰ立体構造に変化する、請求項１５の方法。
【請求項１７】
ハイブリダイゼーションスイッチプローブの第２アーム配列に標識が結合し、第１アーム配列に結合対メンバーが結合し、第１ＨＳＰ立体構造が第１アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を含み、特異的結合対複合体が形成された場合に脱安定化されて、ハイブリダイゼーションスイッチプローブは、第２アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を含む第２ＨＳＰ立体構造に変化する、請求項１５の方法。
【請求項１８】
ハイブリダイゼーションスイッチプローブの１のアーム配列が、標識及び結合対メンバーが共に結合する標識アーム配列であり、第１ＨＳＰ立体構造が標識アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を含み、特異的結合対複合体が形成された場合に脱安定化されて、ハイブリダイゼーションスイッチプローブは、標識アーム配列が支持配列にハイブリダイズしない第２ＨＳＰ立体構造に変化する、請求項１５の方法。
【請求項１９】
被分析体が結合対メンバーに特異的に結合するリガンドであり、結合対メンバー及び被分析体が共に公知の化学構造又は生化学構造である、請求項１５の方法。
【請求項２０】
被分析体が結合対メンバーに特異的に結合するリガンドであり、リガンド又は結合対メンバーが未知の化学構造又は生化学構造である、請求項１５の方法。
【請求項２１】
結合対メンバーがハイブリダイゼーションスイッチプローブ中の核酸配列の一部である、請求項１５の方法。
【請求項２２】
結合対メンバーがアプタマーである、請求項１５の方法。
【請求項２３】
検出工程で、検出可能なシグナルの増強を検出して、試料中に被分析体が存在することの指標とする、請求項１５の方法。
【請求項２４】
検出工程で、検出可能なシグナルの減弱を検出して、試料中に被分析体が存在することの指標とする、請求項１５の方法。
【請求項２５】
検出工程で、ハイブリダイゼーションスイッチプローブ中に存在する核酸配列のインビトロ増幅から発生するシグナルを検出する、請求項１５の方法。
【請求項２６】
検出工程で、第２ＨＳＰ立体構造のハイブリダイゼーションスイッチプローブの一部をインビトロ核酸増幅反応におけるプライマーとして用いて発生するシグナルを検出する、請求項１５の方法。
【請求項２７】
検出工程で、第２ＨＳＰ立体構造のハイブリダイゼーションスイッチプローブの一部をインビトロ核酸増幅反応における鋳型として用いて発生するシグナルを検出する、請求項１５の方法。
【請求項２８】
検出工程で、第１ＨＳＰ立体構造のハイブリダイゼーションスイッチプローブの一部をインビトロ核酸増幅反応におけるプライマーとして用いて発生するシグナルを検出する、請求項１５の方法。
【請求項２９】
検出工程で、第１ＨＳＰ立体構造のハイブリダイゼーションスイッチプローブの一部をインビトロ核酸増幅反応における鋳型として用いて発生するシグナルを検出する、請求項１５の方法。
【請求項３０】
検出工程で、ハイブリダイゼーションスイッチプローブが第２ＨＳＰ立体構造にある場合にのみ増幅される配列のインビトロ増幅から発生するシグナルを検出する、請求項１５の方法。
【請求項３１】
検出工程で、ハイブリダイゼーションスイッチプローブが第１ＨＳＰ立体構造にある場合にのみ増幅される配列のインビトロ増幅から発生するシグナルを検出する、請求項１５の方法。
【請求項３２】
検出工程を均一態様で実施する、請求項１５の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．１１９（ｅ）のもとで２００５年２月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／６５７，５２３に基づく優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、試料中の化学分子又は生化学分子の検出に関し、具体的には、被分析体に特異的に結合する特異的結合対の第１メンバー及びハイブリダイゼーション複合体を形成する相補的核酸配列を含む核酸オリゴマープローブを用いて被分析体を検出してオリゴマープローブの立体構造変化の検出を試料中に被分析体が存在することの指標とするための組成物及びアッセイ法に関する。
【背景技術】
【０００３】
化学分子又は生化学分子の検出は、診断アッセイ、環境及び食品の検査、化学的、生化学的又は生物学的証拠を検出するための法医学的方法、病原性又は感染性因子を同定又は特定するための疫学的アッセイ等の多くの用途で用いられている。当該アッセイでは、一方の結合対メンバーと検出すべき被分析体である第２の結合対メンバーとから構成される結合対複合体を検出することが多い。公知のタイプの結合対としては、抗原又はリガンドとその抗体又はＦａｂフラグメント、ホルモン又は他の細胞シグナル伝達分子（例えば神経伝達物質又はインターロイキン）とそのコグネイト受容体、薬物とその受容体、酵素とその基質又は補因子、及びハイブリダイゼーション複合体を形成する相補的核酸配列があげられる。上記例に示されるように、結合対のメンバーは化学的若しくは生化学的化合物、複合体、又は凝集体（例えば細胞断片又は細胞小器官）でもよい。
【０００４】
結合対のメンバーである被分析体を検出する方法は公知である。当該方法は、結合対複合体の形成又は形成阻害、及び当該結合対複合体の形成又は阻害に伴うシグナルの検出に依存する。結合対複合体を検出するアッセイ法としては、免疫沈降法、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合測定法（ＥＬＩＳＡ）、イムノＰＣＲ法（ｉＰＣＲ）、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ（例えばサザンブロット又はバイオチップアッセイ）、及びタンパク質結合アッセイ（例えばウェスタンブロット）があげられる。当該アッセイ法は、結合対複合体に伴う可視又は検出可能な沈殿、ゲル、凝集体又はシグナルを生じることが多い。一般的なアッセイ系では、標的被分析体を含む結合対複合体に伴う標識から、検出可能なシグナルが直接又は間接的に発生する。他の一般的なアッセイ方式では、標的被分析体が存在し、シグナルを発生する検出可能な結合対複合体の形成を被分析体が阻害する場合には、シグナルが阻害される。当該アッセイは、適切な条件下で検出可能なシグナルを発生する様々な標識、例えば放射性核種、酵素、色素、発色団、蛍光色素分子又は発光性化合物に依存してもよい。
【０００５】
分析アッセイの多くの用途が、試料中に存在する少量の標的被分析体の検出を必要とするので、アッセイ感度を高めるための方法及び成分が開発された。例としては、標的抗原又はリガンドに対してポリクローナル抗体より親和性が高いモノクローナル抗体、Ｆａｂフラグメント又は合成構築体の使用、及びＥＬＩＳＡにおける酵素代謝回転の使用があげられる。他の例としては、標的又はプローブ核酸配列の増幅（例えば米国特許第４，６８３，１９５号、Ｍｕｌｌｉｓら；米国特許第４，７８６，６００号、Ｋｒａｍｅｒら；米国特許第５，１３０、２３８号、Ｍａｌｅｋら；米国特許第５，４０９，８１８号、Ｄａｖｅｙら；米国特許第５，４２２，２５２号、Ｗａｌｋｅｒら；米国特許第５，２１５，８９９号、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａ；米国特許第６，０８７，１３３号、Ｄａｔｔａｇｕｐｔａら；米国特許第５，８２７，６４９号、Ｒｏｓｅら；米国特許第５，３９９，４９１号、Ｋａｃｉａｎら；米国特許第５，７１４，３２０号及び第６，０７７，６６８号、Ｋｏｏｌ）、及びイムノＰＣＲ（ｉＰＣＲ）反応における免疫複合体形成と核酸増幅の組合わせ（例えばＷＯ２００４/０７２３０１、ＭｃＣｒｅａｖｙら）があげられる。シグナル増幅は、標的核酸を含むハイブリダイゼーション複合体の大型凝集体を形成することで達成できる（例えば米国特許第５，７１０，２６４号、第５，８４９，４８１号、及び第５，１２４，２４６号、Ｕｒｄｅａら；米国特許第６，２２１，５８１号、Ｅｎｇｅｌｈａｒｄｔら）。
【０００６】
多くの検出法は、非結合の標識を検出工程の実施前に結合対複合体から分離する必要がある。非結合の標識は、被分析体を含む結合対複合体に伴う標識から発生するシグナルと識別できないシグナルを発生するからである。すなわち、非結合の標識成分からのシグナルが結合対複合体に伴う標識からのシグナルを遮蔽するので、非結合の標識成分を反応混合物から分離しなければ、標的被分析体の存在を検出できない。
【０００７】
均一アッセイ方式は、非結合の標識を分離せずに標的被分析体に伴う標識からのシグナルを検出できる。しかし、非結合の標識を分離した系と比較して、残存する非結合の標識から相対的に高いノイズシグナルが発生する可能性があるので、当該系は感度が低下する場合がある。ノイズを低下させてアッセイ感度を高めるために用いられる「均一保護アッセイ」（ＨＰＡ）という均一系は、被分析体が結合パートナーを結合した際に検出可能な安定性変化を示す物質で標識された被分析体結合パートナーを含有する（例えば米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６３９，６０４号、Ａｒｎｏｌｄら）。
【０００８】
ハイブリダイゼーション複合体中の核酸を検出するための公知の系は、プローブがそのプローブの標的核酸配列にハイブリダイズした場合に優先的にシグナルを発生する核酸プローブを用いる。当該プローブとしては、互いに相補的なスイッチ配列で囲まれた、「分子スイッチ」プローブ又は「分子ビーコン」プローブというプローブ配列があげられる（例えば米国特許第５，１１８，８０１号及び第５，３１２，７２８号、Ｌｉｚａｒｄｉら、米国特許第５，９２５，５１７号及び第６，１５０，０９７号、Ｔｙａｇｉら）。当該プローブは、一般に、一方のスイッチ配列上に標識（例えば蛍光色素分子）を含み、他方のスイッチ配列上には阻害化合物（例えば発色団）を含み、ヘアピンプローブが閉鎖立体構造にある場合に生じるように、標識と阻害化合物が近接している場合には標識からのシグナルを阻害又は消失させる。このプローブ配列がその標的核酸にハイブリダイズすると、プローブは標識と阻害化合物を分離する開放立体構造へ変換して検出可能なシグナルが発生する。「分子トーチ」プローブという他の系には、標的結合ドメイン、標的閉鎖ドメイン及び連結領域が含まれ、標的結合ドメインは、同じハイブリダイゼーション条件下で標的閉鎖ドメインよりも標的配列とより安定なハイブリッドを形成することにより、標的配列が存在する場合は検出可能なシグナルが発生する（米国特許第６，３６１，９４５号、Ｂｅｃｋｅｒら）。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
本発明の１の側面は、第１核酸アーム配列；第１核酸アーム配列と異なる第２核酸アーム配列；第１核酸アーム配列に対して少なくとも部分的に相補的であり、かつ第２核酸アーム配列に対して少なくとも部分的に相補的である、核酸支持配列であって、：支持配列は、ハイブリダイゼーション条件下で第１核酸アーム配列とハイブリダイゼーション二本鎖を形成して第１ＨＳＰ立体構造を形成するか、又は第２核酸アーム配列とハイブリダイゼーション二本鎖を形成して第２ＨＳＰ立体構造を形成する；ハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造の指標となるシグナルを発生する標識；を含む、被分析体の検出に特異的なハイブリダイゼーションスイッチプローブ（ＨＳＰ）及び、特異的結合対複合体がハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造を変化させ、その結果、検出可能なシグナルが発生する、被分析体と特異的結合対複合体を形成する結合対メンバーである。ハイブリダイゼーションスイッチプローブの１態様では、第１アーム配列は第２アーム配列より短い。他の態様では、標識は均一アッセイ系で検出可能なシグナルを発生する。１態様では、標識はＨＳＰ核酸の一部でありのに対し、他の態様では、標識はＨＳＰに直接又は間接的に結合した他の部分である。ある好ましい態様では、標識は、他の核酸プローブ配列を結合するＨＳＰ核酸配列、核酸増幅反応でプライマーとして機能するＨＳＰ核酸配列、核酸増幅反応で鋳型として機能するＨＳＰ核酸配列及びアプタマーからなる群から選択される。他の好ましい態様では、標識は、放射性核種、リガンド、酵素、酵素基質、酵素補因子、反応性基、発色団、粒子、生物発光性化合物、リン光性化合物、化学発光性化合物、及び蛍光色素分子からなる群から選択される。好ましい態様には、第１アーム配列又は第２アーム配列のいずれかに結合した化学発光性化合物である標識が含まれる。１態様では、標識は第１アーム配列に結合した蛍光色素分子であり、支持配列は第１アーム配列と支持配列がハイブリダイゼーション二本鎖を形成した場合に蛍光色素分子に近接する消光化合物を含む。他の態様では、標識は第２アーム配列に結合した蛍光色素分子であり、支持配列は第２アーム配列と支持配列がハイブリダイゼーション二本鎖を形成した場合に蛍光色素分子に近接する消光化合物を含む。他の態様では、標識は支持配列に結合した蛍光色素分子であり、第１アーム配列は第１アーム配列と支持配列がハイブリダイゼーション二本鎖を形成した場合に蛍光色素分子に近接する消光化合物を含む。他の態様では、標識は支持配列に結合した蛍光色素分子であり、第２アーム配列は第２アーム配列と支持配列がハイブリダイゼーション二本鎖を形成した場合に蛍光色素分子に近接する消光化合物を含む。１態様では、第１アーム配列は連結エレメントで支持配列に結合し、第２アーム配列は連結エレメントで支持配列に結合している。ある態様では、被分析体と特異的結合対複合体を形成する結合対メンバーはアプタマーである。あるハイブリダイゼーションスイッチプローブにおいて、検出可能なシグナルは核酸増幅反応に関与するＨＳＰ部分を用いて作製される増幅核酸である。
【００１０】
本発明の他の側面は、第１核酸アーム配列；第１核酸アーム配列と異なる第２核酸アーム配列；第１核酸アーム配列及び第２核酸アーム配列に対して少なくとも部分的に相補的な核酸支持配列：支持配列は、ハイブリダイゼーション条件下で第１核酸アーム配列とハイブリダイゼーション二本鎖を形成してハイブリダイゼーションスイッチプローブの第１立体構造を形成するか、又は第２核酸アーム配列とハイブリダイゼーション二本鎖を形成してハイブリダイゼーションスイッチプローブの第２立体構造を形成する；ハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造の指標となるシグナルを発生する標識；及びハイブリダイゼーションスイッチプローブにより検出された被分析体と特異的結合対複合体を形成する結合対メンバーから構成されるハイブリダイゼーションスイッチプローブを含み、この特異的結合対複合体がハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造を変化させ、その結果、検出可能なシグナルが標識から発生する、キットである。キットの態様は、さらに、被分析体を含有する試料を調製するための１以上の試薬、被分析体と結合対メンバーの結合を促進する１以上の試薬、標識を処理して検出可能なシグナルを発生させる１以上の試薬、又はＨＳＰ配列の一部を用いて核酸配列を増幅する核酸増幅反応に用いられる１以上の試薬を含む。
【００１１】
本発明の他の側面は、試料中の被分析体を検出する方法であって、被分析体を含有する試料及びその被分析体に特異的な、第１核酸アーム配列、第１核酸アーム配列と異なる第２核酸アーム配列、第１核酸アーム配列及び第２核酸アーム配列に対して少なくとも部分的に相補的な核酸支持配列、検出可能なシグナルを発生する標識、及び被分析体を結合してハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造を変化させる特異的結合対複合体を形成する結合対メンバーから構成され、並びに、１のアーム配列が支持配列とのハイブリダイゼーション二本鎖中にある第１ＨＳＰ立体構造にある、ハイブリダイゼーションスイッチプローブを含む、反応混合物を調製し；被分析体を結合対メンバーに結合させて、ハイブリダイゼーションスイッチプローブ上に特異的結合対複合体を形成させ；特異的結合対複合体の形成で起きる第１ＨＳＰ立体構造から第２ＨＳＰ立体構造への立体構造変化を生じさせ；そして、標識からの立体構造変化の指標となるシグナル変化を検出して試料中に被分析体が存在することの指標とする工程を含む。１態様では、ＨＳＰの第１アーム配列に標識が結合し、第２アーム配列に結合対メンバーが結合し、第１ＨＳＰ立体構造は第２アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を含み、特異的結合対複合体が形成された場合に脱安定化されることによりＨＳＰは、第１アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を含む第２ＨＳＰ立体構造に変化する。他の態様では、ＨＳＰの第２アーム配列に標識が結合しており、第１アーム配列に結合対メンバーが結合し、第１ＨＳＰ立体構造が第１アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を含み、特異的結合対複合体が形成された場合に脱安定化されることによりハイブリダイゼーションスイッチプローブは、第２アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を含む第２ＨＳＰ立体構造に変化する。他の態様では、ハイブリダイゼーションスイッチプローブの１のアーム配列は、結合する標識と結合する結合対メンバーの両方を有する標識アーム配列であり、第１ＨＳＰ立体構造は標識アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を含み、特異的結合対複合体が形成された場合に脱安定化されることによりハイブリダイゼーションスイッチプローブは、標識アーム配列が支持配列にハイブリダイズしていない第２ＨＳＰ立体構造に変化する。他の態様では、被分析体は結合対メンバーに特異的に結合するリガンドであり、結合対メンバー及び被分析体が共に公知の化学構造又は生化学構造である。他の態様では、被分析体は結合対メンバーに特異的に結合するリガンドであり、リガンド又は結合対メンバーが未知の化学構造又は生化学構造である。他の態様では、結合対メンバーはハイブリダイゼーションスイッチプローブ中の核酸配列の一部である。好ましい態様では、結合対メンバーはアプタマーである。１態様では、検出工程により検出可能なシグナルの増強を検出して試料中に被分析体が存在することの指標とするのに対し、他の態様では、検出工程で検出可能なシグナルの減弱を検出して試料中に被分析体が存在することの指標とする。１態様では、検出工程で、ＨＳＰ中に存在する核酸配列のインビトロ増幅から発生するシグナルを検出する。他の態様では、検出工程で、第２ＨＳＰ立体構造のハイブリダイゼーションスイッチプローブの一部をインビトロ核酸増幅反応のプライマー又は鋳型として用いて発生するシグナルを検出する。他の態様では、検出工程で、第１ＨＳＰ立体構造のハイブリダイゼーションスイッチプローブの一部をインビトロ核酸増幅反応のプライマー又は鋳型として用いて発生するシグナルを検出する。１態様では、検出工程で、ハイブリダイゼーションスイッチプローブが第２ＨＳＰ立体構造にある場合にのみ増幅される配列のインビトロ核酸増幅から発生するシグナルを検出する。他の態様では、検出工程で、ハイブリダイゼーションスイッチプローブが第１ＨＳＰ立体構造にある場合にのみ増幅される配列のインビトロ核酸増幅から発生するシグナルを検出する。好ましい態様では、検出工程を均一方式で実施する。
【００１２】
本明細書の一部を構成する添付の図面に、本発明のある側面を図示する。本図面は本明細書と共に本発明の原理を説明し、図示するためのものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な記載
本発明としては、ハイブリダイゼーションスイッチプローブ（ＨＳＰ）における核酸ハイブリダイゼーションと特異的結合対のメンバー間の特異的結合相互作用とを組み合わせてハイブリダイゼーションスイッチプローブの立体構造変化を誘導して、被分析体を検出する方法があげられる。本発明は、これはプローブの支持配列に対して相補的な少なくとも２つのアーム配列を含み、第１アーム配列にはシグナルを発生する標識があり、第２アーム配列には特異的結合対の一方のメンバーがある核酸オリゴマーであるＨＳＰをもあげられる。両アーム配列とも支持配列の一部に対して相補的であり、適切なハイブリダイゼーション条件下で、アーム配列の１つと支持配列とのハイブリダイゼーション二本鎖が先立って形成される。１態様では、被分析体とアーム配列上の結合対メンバーとの結合相互作用により、ＨＳＰのアーム配列の１つと支持配列とのハイブリダイゼーション複合体の安定性が変化してＨＳＰの立体構造が変化し、その結果、用いた標識に応じてシグナルの変化（すなわちシグナルの発生又は消失）が起きる。例えば、図２の態様に示すように、被分析体（Ｍ２）と第２アーム（２）上の特異的結合対パートナー（Ｍ１）との結合相互作用により、鎖２と３の二本鎖が脱安定化し、このため標識アーム（１）と支持配列（３）とのハイブリダイゼーション二本鎖が先立って形成される。被分析体が存在する場合、このＨＳＰ立体構造の変化でアクリジニウムエステル（ＡＥ）標識が安定化して、均一保護アッセイで検出可能な化学発光シグナルを発生させることができる。すなわち、図２の上側部分ではＡＥ標識は分解されやすいのに対し、下側部分ではＡＥ標識は加水分解から保護されるため、被分析体がＨＳＰに結合した場合は化学発光シグナルを検出することができる。好ましい態様では、ＨＳＰを用いるアッセイで存在する被分析体の量は、均一アッセイでＨＳＰの標識から検出されるシグナルの量と直線関係にある。
【００１４】
本明細書に記載する本発明の側面の理解の促すため、本明細書で用いる用語を以下に定義する。
「試料」とは、検査すべきいずれかの代表的な部分又は物体を意味し、一般に、ＨＳＰを用いて検出すべき目的被分析体を含有しうるいかなる液体、固体又は気体状の混合物をもいう。例えば、試料は水若しくは土壌の検体、食品の一部、生物由来の検体、又は検体から分離した成分でもよい。生物試料には、生存又は死亡したヒト又は動物に由来するいかなる組織又は材料であって、標的被分析体を含有しうるもの、例えば喀痰、末梢血、血漿、血清、身体開口部から採取したスワブ試料、生検体、呼吸器官組織若しくは滲出物、消化器官組織、尿、糞便、精液、又は他の体液も含まれるがこれらに限定されない。生物試料は、植物又は微生物に由来する組織、液体又は材料でもよい。生物試料を物理的又は機械的に処理して材料又は細胞構造を破壊し、ＨＳＰを用いる分析に適切な試料を調製するための標準的な実験室法により調製した溶液又は懸濁液中へ、細胞内成分その他の物質を放出させてもよい。ＨＳＰベースの検査に用いうる溶液又は懸濁液中へ検体の成分を分離するために、試料を標準法（例えば濾過、濃縮、沈降等）により処理してもよい。
【００１５】
「核酸」とは、窒素複素環式塩基又は塩基類似体をもつヌクレオシド又はヌクレオシド類似体を含む多量体化合物をいい、ヌクレオシドはホスホジエステル結合により互いに連結してポリヌクレオチドを形成し、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）並びにその類似体があげられる。核酸「主鎖」は、当技術分野で公知の様々な結合で構成されてもよく、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（国際公開ＷＯ９５／３２３０５，Ｈｙｄｉｇ−Ｈｉｅｌｓｅｎら）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホナート結合又はその組合わせの１以上が含まれる。核酸の糖部分はリボース若しくはデオキシリボース又は公知の置換基がある類似化合物、例えば２’−メトキシ又は２’−ハライド置換体でもよい。窒素塩基は、一般的な塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、公知の類似体（例えばイノシン、すなわち「Ｉ」）、プリン塩基又はピリミジン塩基の公知の誘導体（例えばＮ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−又はアザ−プリン類、及びデアザ−又はアザ−ピリミジン類、５又は６位に置換基をもつピリミジン塩基、２、６又は８位に変更又は交換された置換基をもつプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン類、４−アミノ−ピリミジン類、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン類、及びＯ４−アルキル−ピリミジン類（米国特許第５，３７８，８２５号及びＷＯ９３／１３１２１を参照）、又は主鎖がポリマーの１以上の残基に窒素塩基を含まない「非塩基」残基（米国特許第５，５８５，４８１号、Ａｒｎｏｌｄら）でもよい。核酸はＲＮＡ及び／又はＤＮＡ中の一般的な糖、塩基及び結合しか含まなくてもよく、又は一般的な成分と置換体を共に含んでもよい（例えば２’−メトキシ主鎖で結合した一般的な塩基、又は一般的な塩基と１以上の塩基類似体を含む核酸）。核酸は数千塩基から構成されるポリマーでもよく、又は全般的に１０００個以下の塩基から構成され、一般に１００個以下の塩基から構成される、オリゴヌクレオチド又はオリゴマーでもよい。オリゴマーには、大きさの下限が約２〜５塩基で上限が約５００〜９００塩基の範囲に含まれるポリマーが含まれ、好ましいオリゴマーの大きさは下限が約５０塩基で上限が約７０塩基の範囲である。これらは様々な周知の酵素法又は化学的方法を用いて合成でき、例えばクロマトグラフィーなどの標準的な実験室法で精製できる。
【００１６】
核酸配列の主鎖組成は、その配列を含むハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及しうる。好ましい主鎖としては、一般的なＲＮＡ若しくはＤＮＡ又はその誘導体等中の糖−ホスホジエステル結合、ペプチド核酸等中のペプチド結合、並びに糖基及び／又はその基を連結する結合が標準的なＤＮＡ又はＲＮＡと異なる糖−ホスホジエステル結合があげられる。例えば１以上の２’−メトキシ置換ＲＮＡ基又は２’−フルオロ置換ＲＮＡ基をもつ配列は、相補的２’−ＯＨ ＲＮＡ配列とのハイブリダイゼーション複合体の安定性を高めうる。他の態様としては、複合体の安定性に影響を及ぼす荷電基（例えばホスホロチオエート）又は中性基（例えばメチルホスホナート）がある結合があげられる。
【００１７】
「プローブ」は、一般に、試料中の被分析体の存在を検出するために用いられる核酸オリゴマーをいう。ハイブリダイゼーションスイッチプローブ（ＨＳＰ）は、好ましくは共有結合する、種々の官能性部分から構成されるプローブをいう。ＨＳＰの官能性部分には、検出すべき被分析体に特異的な結合パートナーが結合する第１アーム配列、支持配列に対する第２アームの立体構造に応じてシグナルを発生する標識が結合する第２アーム配列、並びに第１アーム配列及び第２アーム配列に対して相補的な部分を含む支持配列が含まれる。第１アーム配列及び第２アーム配列に対して相補的な支持配列部分は、完全な支持配列中で重複する配列であることが好ましい。従って、ハイブリダイゼーションしうる条件下で、アーム配列の１つが支持配列と優先的にハイブリダイズしてハイブリダイゼーション二本鎖を形成する。これらのアーム配列に対する支持配列の位置は決定的ではなく、例えば支持配列はアーム配列間の介在配列であってもよく、又は支持配列は少なくとも１のアーム配列を含むオリゴマーの５’又は３’末端に位置してもよい。支持配列がＨＳＰの一方若しくは両方のアーム配列に直接に共有結合してもよく、又はＨＳＰの２配列がリンカーエレメントで連結されてもよく、リンカーエレメントは他のオリゴマー配列又は他の化学成分でもよい。
【００１８】
プローブの「被分析体」又は「標的被分析体」は一般に、プローブを用いるアッセイで試料中で検出すべき化学的、生化学的又は生物学的目的物をいう。ＨＳＰの被分析体は、ＨＳＰのアーム配列に結合する結合パートナーのメンバーと特異的に相互作用するリガンドである。すなわち、被分析体とその結合パートナーは特異的結合対である。被分析体の一部が、ＨＳＰアームに結合する結合対メンバーと特異的に相互作用する限り、被分析体は検出すべきいかなる化合物又は高分子構造体でもよい。
【００１９】
「特異的結合対」及び「結合対」との語は、様々な非共有結合性の相互作用（例えば水素結合、イオン結合若しくはイオン性相互作用、疎水性相互作用又はファン−デル−ワールス力）のいずれかにより互いに安定な特異的結合を形成するいずれか一対の部分を表わすために、本明細書中で相互に用いられる。結合対のメンバーはいかなる公知の分子構造体から構成してもよく、タンパク質、ペプチド、脂質、脂肪酸、多糖類、リポ多糖類、核酸、これらの分子構造体若しくはその類似体を組合わせて構成される化合物又は他の分子構造体に特異的に結合する有機化合物があげられる。特異的結合対は特異的に相互作用する部分であるが、例えばアビジン及びストレプトアビジンは共にビオチンに対するリガンドであるように、特異的結合対の個々のメンバーが他の化合物と特異的に相互作用する場合もある。結合対の各部分は、類似又は異なる化学組成又は構造であってよい（例えば相補的ＤＮＡ鎖は類似の化合物部分とみなされるのに対し、タンパク質−脂質相互作用は異なる化合物部分とみなされる）。特異的結合対の例は当該技術分野で周知であり、例えば抗体と抗原、ハプテン若しくはリガンド；ホルモン、薬物、代謝産物、ビタミン及び補酵素の受容体若しくは結合パートナー；酵素とそれらの基質；相補的核酸；核酸に特異的に結合するタンパク質；金属に対するキレート化剤等である。本明細書中で化学的又は生化学的化合物という「結合対」のメンバーは、合成したもの又は天然源から単離したものいずれでも、小型及び大型の（高分子）化学的、生化学的及び生物学的分子組成物を含む。一般に、特異的結合対の一方のメンバーは被分析体、標的、リガンド又は検出すべき目的化合物とし、特異的結合対の他方のメンバーをリガンド又は結合対メンバーとしてもよい。当業者であれば、ＨＳＰに適切な結合対メンバーを選択して、本明細書に記載するＨＳＰ組成物及びＨＳＰベースの方法を用いて多数の被分析体を検出できることを認識するであろう。すなわち、本発明はいかなる特定のタイプ又は組合わせの結合対メンバーに依存するものではない。結合対相互作用によりＨＳＰの立体構造が変化する限り、いかなる標的被分析体及びその特異的結合パートナーも、本明細書に記載のＨＳＰベースの方法で検出できる。さらに、当業者であれば、標的被分析体及びその特異的結合パートナーが公知の化学的又は生化学的な化合物又は構造体でなくてもよいことを認識するであろう。例えば、本明細書に記載のＨＳＰ組成物及び方法は、ＨＳＰに結合する結合対メンバーである公知化合物への新規な合成リガンドの結合の検出等の公知の結合パートナーメンバーに対する新規リガンドの検出に使用できる。
【００２０】
「リンカーエレメント」又は「リンカー」とは、ＨＳＰの２つの他の官能性エレメントを連結する原子鎖をいう。リンカーエレメントは、ＨＳＰの２つの配列を連結する、他の核酸配列、非塩基核酸残基（１以上）、ＰＮＡ、化学物質、又はポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等のいかなる公知の化学構造体でもよく、側鎖枝又は環状基等の他の構造を含んでもよい。
【００２１】
「十分に相補的」とは、適切なハイブリダイゼーション条件下で相補的塩基間での標準的な水素結合（塩基対合という場合もある；例えばＧ−Ｃ、Ａ−Ｔ又はＡ−Ｕ対合）により他の塩基配列と安定なハイブリダイゼーション二本鎖を形成しうる、連続した核酸塩基配列をいう。十分に相補的な配列は、完全又は部分的に相補的な配列でもよく、塩基を含まない位置（すなわち非塩基残基）が１以上あってもよい。連続塩基は、ハイブリダイズする配列に対して、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは１００％相補的である。
【００２２】
「ハイブリダイゼーション条件」とは、相補的核酸配列が標準的な塩基対合により結合する反応混合物の累積的生化学的及び物理的条件をいう。これには、例えば、緩衝剤、塩類、界面活性剤等の溶液の成分及び濃度、インキュベーションの時間、温度、並びに反応器の物理的パラメーターがあげられる。適切なハイブリダイゼーション条件は当業者に周知であり、配列組成に基づいて推定できるか、日常試験で経験的に判定できる（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，1989）, §§1.90-1.91, 7.37-7.57, 9.47-9.51, 及び11.47-11.57、特に§§9.50-9.51, 11.12-11.13, 11.45-11.47及び11.55-11.57)。
【００２３】
ＨＳＰプローブは、もっぱら溶液相中（例えば水性又は有機液体混合物中）で生じる適当なハイブリダイゼーション条件で使用できるか、又は固体又はゲル成分等の支持体上に「固定化」することができる。固定化プローブは、試料中の結合した標的被分析体を結合しない物質から容易に分離させ、及び／又はプローブ及び結合した被分析体をアッセイ装置の特定の位置に濃縮するため、ある態様では固定化プローブが好ましい。いずれか公知の支持体は、ニトロセルロース、ナイロン、ガラス、ポリアクリラート、ポリスチレン、シランポリプロピレン、混合ポリマーから作製したもの又は磁気付着性粒子等の金属等のマトリックス及び粒子を使用できる。好ましい支持体は、単分散磁性球体（例えば均一サイズ±５％）であり、これに１以上の固定化ＨＳＰが直接結合するか（例えば直接共有結合、キレート形成又はイオン性相互作用で）、又は間接的に結合し（例えば１以上のリンカーにより）、その際この結合又は相互作用によりＨＳＰの全体又は一部が支持体に結合するためアッセイ条件で安定である。ＨＳＰを結合した支持体の混合物は、例えば種々の大きさの支持体の混合物で、大きさごとに特定のＨＳＰを結合したものを使用できる。他の好ましい支持体は、「アレイ」中にアドレサブル検出位置（パッド、アドレス又はマイクロロケーションとしてもよい）の行列を含む実質的に二次元の表面である。好ましいＨＳＰアレイは、少なくとも２種類のＨＳＰを支持体上の異なる位置に含む。ＨＳＰアレイの大きさ及び組成はアレイの目的とする最終用途に依存するが、一般にアレイは約２から数千の異なる固定化ＨＳＰを異なるアドレスに含む。これは様々な公知手法のいずれか、例えば所定の位置における各ＨＳＰの沈着又は合成により作製できる。アレイ中のＨＳＰは、支持体当たり約２〜約１０，０００のＨＳＰ、好ましくは支持体当たり約５〜約１０００のＨＳＰ、より好ましくは支持体当たり約１０〜約１００のＨＳＰである。
【００２４】
「標識」は、検出可能な応答若しくはシグナル検出できるか又は発生することができる、分子部分又は化合物をいう。標識はＨＳＰの核酸の一部でもよく、又はＨＳＰに直接又は間接的に結合した他の部分でもよい。ＨＳＰ核酸の一部である標識は、他の核酸プローブに結合するＨＳＰ配列を含む。例えば他のプローブが分子ビーコン又は分子トーチの場合、他のプローブがＨＳＰ配列に結合していない場合、ＨＳＰの立体構造状態のためシグナルの発生を阻害する閉鎖状態である。しかし、ＨＳＰが異なる立体構造状態に変換されると、この他のプローブはＨＳＰに結合し、他のプローブの開放状態から生じる検出可能なシグナルを発生する。他の例としては、ＨＳＰ配列の一部である標識は、ＨＳＰが特定の立体構造にある場合にのみ核酸増幅反応でプライマー又は鋳型として機能する配列であり、増幅した核酸生成物が検出されてＨＳＰの立体構造状態の指標となる。他の部分の直接標識には、他の標識部分をＨＳＰに結合させる結合又は相互作用が用いられ、共有結合又は非共有結合性の相互作用（例えば水素結合、疎水性及びイオン性相互作用、キレート又は配位錯体）があげられる。間接標識には架橋部分又は「リンカー」が用いられ、ＨＳＰに結合する標識部分に直接又は間接的に結合する。標識は公知のいかなる検出可能な部分、例えば放射性核種、リガンド、酵素、酵素基質、反応性基、発色団、粒子、発光性化合物（例えば生物発光性、リン光性又は化学発光性の標識）又は蛍光色素分子でもよい。好ましい標識は均一アッセイ系で検出でき、その場合、混合物中の結合した標識が混合物中の非結合の標識と対比して、安定性、分解性の差、又は発光特性等の検出可能な変化を示す。均一アッセイに用いるのに好ましい標識には、公知の化学発光性化合物があげられる（例えば米国特許第５，６５６，２０７号、第５，６５８，７３７号、第５，２８３，１７４号及び第５，６３９，６０４号）。好ましい化学発光性標識はアクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物であり、標準的ＡＥ又はその誘導体、例えばナフチル−ＡＥ、オルト−ＡＥ、１−又は３−メチル−ＡＥ、２，７−ジメチル−ＡＥ、４，５−ジメチル−ＡＥ、オルト−ジブロモ−ＡＥ、オルト−ジメチル−ＡＥ、メタ−ジメチル−ＡＥ、オルト−メトキシ−ＡＥ、オルト−メトキシ（シンナミル）−ＡＥ、オルト−メチル−ＡＥ、オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−オルト−フルオロ−ＡＥ、１−又は３−メチル−メタ−ジフルオロ−ＡＥ、及び２−メチル−ＡＥがあげられる。標識を核酸に結合させる合成方法及び標識からのシグナルを検出する方法は周知である（例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 第2版 (Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー，1989),10章；米国特許第５，６５８，７３７号、第５，６５６，２０７号；米国特許第５，５４７，８４２号、Ｈｏｇａｎら；米国特許第５，２８３，１７４号、Ａｒｎｏｌｄら；及び米国特許第４，５８１，３３３号、Ｋｏｕｒｉｌｓｋｙら）。
【００２５】
「均一検出可能な標識」は、物理的状態（例えばＨＳＰのハイブリダイズした二本鎖中にあるもの）に基づき、混合物中のハイブリダイズした形態の標識の存在をハイブリダイズしていない形態の標識から物理的に分離せずに均一系で検出できる標識をいう。均一検出可能な標識系は詳述されており（例えば米国特許第５，２８３，１７４号、第５，６５６，２０７号、及び第５，６５８，７３７号）、好ましい態様には均一保護アッセイ（「ＨＰＡ」；参照：米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６３９，６０４号、Ａｒｍｏｌｄら）の標識及び条件を用いる。
【００２６】
「本質的に〜からなる」とは、ＨＳＰの、又は標的被分析体の存在の検出でＨＳＰを用いる場合、基本的かつ新規な特性を実質的に変化させない他の成分、組成物又は工程が、本発明の組成物、キット又が方法に含まれてもよいことをいう。当該特性には、ＨＳＰに結合する結合対メンバーとそのリガンド、すなわち標的被分析体とから構成される特異的結合対を形成してＨＳＰの立体構造構造に影響を及ぼした結果、プラスシグナル又はシグナル消失をもたらし、ＨＳＰに結合する特異的結合対中に被分析体が存在することの指標となり、つまり、試料中に被分析体が存在することの指標とすることで、被分析体を検出する機能があげられる。当該特性には、同一の被分析体について、ＨＳＰベースのアッセイでは放射免疫測定法（ＲＩＡ）と比較して被分析体の検出感度が少なくとも１０倍高いことがあげられる。本発明の基本的かつ新規な特性に実質的な影響を及ぼす成分、組成物又は工程は、本用語に含まれない。
【００２７】
別途定義しない限り、本明細書中で用いる科学及び技術用語は全て、関連技術分野の専門家が一般に理解するのと同じ意味である。本明細書中で用いる多くの用語の一般的定義は、例えばDictionary of Microbiology and Molecular Biology, 第2版(Singleton et al., 1994, John Wiley & Sons,ニューヨーク州ニューヨーク)又はThe Harper Collins Dictionary of Biology(Hale & Marham, 1991, Harper Perennial,ニューヨーク州ニューヨーク)中にある。別途記載しない限り、本明細書中で使用又は意図する技術は当業者に周知の標準的な方法である。本明細書に含まれる実施例で本発明のある態様を説明する。
【００２８】
ハイブリダイゼーションスイッチプローブ（ＨＳＰ）は、結合パートナーメンバーが結合する第１アーム配列、標識が結合する第２アーム配列、及びアーム配列に相補的な支持配列の機能エレメントを含む核酸組成物である。ＨＳＰの構造エレメントは、ＨＳＰの１以上の機能を果たすことができる。例えば１態様では、第１又は第２アーム配列が支持配列でもよい（すなわち、アーム配列が互いに相補的である）。他の態様では、アーム配列は支持配列から独立した配列である（すなわち、３つのオリゴマー配列があり、２つがアーム配列、１つが支持配列である）。アーム配列エレメントと支持配列エレメントが他のオリゴマー上にあり、これらがハイブリダイゼーション条件下での相補的塩基対合により互いに結合するような非共有結合でもよく、又は好ましい態様では、アーム配列と支持配列が直接又は間接的に共有結合してもよい。上記核酸配列を連結するために、ヌクレオチド及び非ヌクレオチドリンカーエレメントを含むいかなる公知の方法をも使用できる。好ましい態様では、アーム配列と支持配列が、アームエレメント又は支持エレメントの配列に対して実質的に相補的ではない、好ましくは長さ約５〜１５残基の短い核酸配列で連結する。例えば、ポリ−Ａ又はポリ−Ｔ配列等の短いホモポリマー配列でアーム配列を支持配列に連結することができる。リンカーエレメントの他の例としては、非塩基核酸残基、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、又は他のポリマー、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、多糖類若しくはポリペプチドがあげられる。
【００２９】
図１Ａ〜１Ｄは、あるハイブリダイゼーションスイッチプローブ（ＨＳＰ）の態様を示す。図１Ａでは、ＨＳＰの１態様は他の鎖中にある２つの相補的核酸配列から構成され、ハイブリダイゼーション条件下で標準的な塩基対合により結合して二本鎖を形成する。図１Ａに図示した態様は、標識（Ｌ）が結合する第１鎖（１）及び検出すべき被分析体に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）が結合する第２鎖（２）を示す。当業者であれば、標識及び結合対メンバーの位置をＨＳＰの鎖に対して逆転させることができることを認識するであろう。図１Ａは、一方のアーム配列（例えば１）が機能的に他方のアーム配列（例えば２）に対する支持配列である２つの鎖の態様を示す。
【００３０】
図１Ｂでは、図示したＨＳＰの態様は図１Ａのものと類似するが、リンカーエレメント（ＬＥ）で共有結合した２つの相補的核酸配列（１、２）から構成される。この態様では、一方のアーム配列は他方のアーム配列に対する支持配列として機能する。
【００３１】
図１Ｃについて、このＨＳＰの態様は、リンカーエレメント（ＬＥ）で共有結合した３つの核酸配列（１、２、３）から構成され、２つのアーム配列（１及び２）が他の支持配列（３）をフランキングする。図示した態様では、第１アーム配列（１）に標識（Ｌ）が結合し、第２アーム配列（２）に結合対メンバー（Ｍ１）が結合するが、他の態様では標識と結合対メンバーの位置がアーム配列に対して逆転してもよい（すなわち１が結合対メンバーに結合し、２が標識に結合する）。介在する支持配列（３）は両アーム配列（１及び２）に対して少なくとも部分的に相補的であるので、（配列２と３のハイブリダイゼーション二本鎖が示すように）各アーム配列は適切なハイブリダイゼーション条件下で支持配列と二本鎖を形成することができる。
【００３２】
図１Ｄについて、このＨＳＰの態様は、リンカーエレメント（ＬＥ）で共有結合した３つの核酸配列（１、２、３）から構成されるが、図１Ｃに機能した態様とは異なる順序である。図１Ｄで、標識（Ｌ）が結合する第１アーム配列（１）は、リンカーエレメント（ＬＥ）で結合対メンバー（Ｍ１）が結合する第２アーム配列（２）に結合し、これがリンカーエレメント（ＬＥ）により支持配列（３）に結合し、これが両アーム配列（１及び２）に対して少なくとも部分的に相補的である。図１Ｄに配列２と３の間で形成された二本鎖が示すように、アーム配列１又は２は適切なハイブリダイゼーション条件下で支持配列とハイブリダイゼーション二本鎖を形成できる。
【００３３】
多数の機能性ＨＳＰの態様が考えられるが、好ましい態様は図１Ｂ、１Ｃ及び１Ｄに図示する、アーム配列エレメントと支持配列エレメントを共有結合により連結したものである。当該構造体は、相補的なアーム配列と支持配列を結合させる分子内ハイブリダイゼーションの動力学的利点を利用して立体構造を変化させ、これを用いて、ＨＳＰに結合する結合対メンバーに特異的な被分析体をアッセイする。
【００３４】
ＨＳＰをベースとするアッセイの１態様を図２に示す。図示したＨＳＰは、図１Ｄと同様に第１アーム上に、化学発光シグナルを発生するアクリジニウムエステル（ＡＥ）である標識を含む。図２の上部では、被分析体が存在せず、ＨＳＰは第１立体構造にあり、標的被分析体（Ｍ２）に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）に結合するアーム配列（２）が、支持配列（３）とのハイブリダイゼーション二本鎖中にある。アーム配列２に相補的な支持配列部分はアーム配列１に相補的な支持配列部分と重複するので、配列２と３の二本鎖は配列３と１の二本鎖形成を制限する。図２の下側部分に示すように、アッセイ混合物中に被分析体（Ｍ２）が存在すると、被分析体と結合対メンバー（Ｍ１）が特異的結合対複合体（ＢＰＣ）を形成し、これが配列２と３の二本鎖を脱安定化し、配列３と１が安定な二本鎖を形成することができる。ハイブリダイゼーション保護アッセイ（ＨＰＡ）方式を用いて、この第２立体構造では、ＡＥ標識は配列１と３のハイブリダイゼーション二本鎖で加水分解から保護され、ＡＥ標識からの化学発光シグナルを検出することができる（米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６３９，６０４号）。要約すると、一本鎖配列上に存在するＡＥ標識は、例えば酸性（例えばｐＨ５〜６）若しくは塩基性（例えばｐＨ８〜９）の溶液又は酸化剤によって選択的に分解される。これに対し、二本鎖構造体中の鎖上に存在するＡＥは分解から保護される。次いで分解しなかったＡＥ標識を活性化して（例えばＨ２Ｏ２を用いる処理による）化学発光シグナルを発生させ、これを標準法（例えばルミノメトリー）で検出する。本態様で検出したシグナルは、アッセイした試料中に存在する被分析体の量に比例する。
【００３５】
図３に示す他の態様は、上側部分に示すように、第１アーム配列（１）、第２アーム配列（２）及び支持配列（３）が、この順序でリンカーエレメント（ＬＥ）により連結するＨＳＰを用いる。図３の中間部分は、図１Ｄのものと同様、被分析体の不存在下で第１立体構造にあるＨＳＰを示す。この場合、配列２と３がハイブリダイゼーション二本鎖中にあり、標識アーム配列は実質的に一本鎖のままである。図３の下側部分に示すように、被分析体（Ｍ２）が存在して結合対メンバー（Ｍ１）に結合した場合、結合対複合体（ＢＰＣ）が形成され、配列２と３の二本鎖を脱安定化する。これにより配列１と３がハイブリダイゼーション二本鎖を形成し、アーム配列２はＢＰＣが結合した状態でループ状になる。標識がＡＥ化合物であれば、ＨＰＡ検出方式に従い、検出した化学発光シグナルは試料中に存在する被分析体の量に比例する。
【００３６】
図４Ａに示す他のアッセイ態様は、蛍光色素分子標識をもつＨＳＰを用いる。このＨＳＰは図１Ｃのものと類似するが、第１アーム配列（１）が蛍光色素分子（Ｆ）で標識され、支持配列（３）には消光化合物（Ｑ）が結合し、蛍光色素分子と消光化合物が近接すると蛍光発光を阻害する。第１アーム配列（１）はリンカーエレメント（ＬＥ）で支持配列（３）に結合し、リンカーエレメント（ＬＥ）により、標的被分析体（Ｍ２）に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）が結合した第２アーム配列（２）に結合する。図４Ａの上側部分に示すように、被分析体がなければＨＳＰは第１立体構造にある。この場合、配列２と３がハイブリダイズして二本鎖を形成し、配列１は実質的に一本鎖のままで自由に動き、結合している蛍光色素分子は消光化合物から離れ、その結果、検出可能な蛍光シグナルを発生する。アッセイ試料中に被分析体が存在すると、被分析体（Ｍ２）が第２アーム配列（２）上の結合対メンバー（Ｍ１）に結合し、生成した結合対複合体（ＢＰＣ）が配列２と３から構成される二本鎖を脱安定化して配列１と３がハイブリダイズして、図４Ａの下側部分に示す第２立体構造を形成することができる。配列１と３から構成される二本鎖を含む第２立体構造では、蛍光色素分子と消光化合物が近接して検出可能な蛍光シグナルの量が減少する。従って、被分析体の量は検出可能なシグナルに反比例する。すなわち、試料中に存在する被分析体の量は、被分析体を含有せずに第１立体構造から生じるシグナルを発生する対照混合物と対比した第２立体構造により生じるシグナル阻害に比例する。
【００３７】
当業者であれば、被分析体が存在する場合の立体構造により蛍光色素分子と消光化合物が近接して蛍光が減弱する限り、図４Ａに図示するものと実質的に同じ結果を達成するように蛍光色素分子と消光化合物の位置をＨＳＰ上で変更できることを認識するであろう。例えば蛍光色素分子を支持配列に結合させ、消光化合物を第１アーム配列に結合させ、結合対メンバーを第２アーム配列に結合させて、図４Ａに図示する態様と実質的に同じ結果を達成することができる。すなわち、被分析体が存在しない場合、ＨＳＰは第１立体構造であり、消光化合物が結合している支持配列３は結合対メンバー（Ｍ１）が結合しているアーム配列２に結合しており、蛍光色素分子と消光化合物は分離している。この立体構造では、蛍光色素分子と消光化合物は比較的離れているためＨＳＰ標識は蛍光を発生する。これに対し、被分析体（Ｍ２）が存在すると被分析体がその結合対メンバーに結合して特異的結合対複合体（ＢＰＣ）を形成し、配列２と３の二本鎖を脱安定化し、配列１と３から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖が先立って形成されるため、ＨＳＰは第２立体構造に変換される。このため蛍光色素分子と消光化合物が近接してＨＳＰからの蛍光が制限される。従って、図４Ａに図示した態様と同様に本態様でも、試料中に被分析体が存在すると、被分析体を含有しない対照と比較して蛍光が減弱する。当該ＨＳＰベースのアッセイの好ましい態様は、試料中の被分析体の量に反比例する蛍光シグナルを発生する。
【００３８】
図４Ｂは、試料中に被分析体が存在する場合にプラスのシグナルを発生するＨＳＰベースのアッセイの態様を図示する。本態様では、蛍光色素分子標識（Ｆ）と結合対メンバー（Ｍ１）が両方ともアーム配列２上に存在し、消光化合物（Ｑ）は支持配列３上にある。被分析体がないと、上側部分に示すように、ＨＳＰの第１立体構造が優先する。この場合、配列２と３が二本鎖を形成して蛍光色素分子と消光化合物が近接するため蛍光が制限される。被分析体（Ｍ２）が存在すると、下側部分に示すように、被分析体とその結合対メンバー（Ｍ１）がアーム配列２上で特異的結合対複合体（ＢＰＣ）を形成し、鎖２と３の二本鎖を脱安定化して、ＨＳＰを鎖１と３の二本鎖が優先した第２立体構造に変換される。第２立体構造はＦとＱを効果的に分離するためＦが蛍光を発生する。従って、図４Ｂに示す態様では、被分析体（Ｍ２）が存在する場合はプラスのシグナルが発生し、試料中の被分析体の量に比例する。
【００３９】
１の分子構造体中に２つのアーム配列の存在を含むＨＳＰ態様を用いる方法は、分子内ハイブリダイゼーションの利点を利用して、同一ハイブリダイゼーション条件で支持配列と一方のアーム配列を含む二本鎖を効果的に形成する。一方のアーム配列と支持配列を含む二本鎖の安定性の変化は、他方のアーム配列と支持配列から構成される二本鎖の安定性の変化と反平衡する。すなわち、第１ハイブリダイゼーション二本鎖を脱安定化する条件は第２ハイブリダイゼーション二本鎖の形成を優先し、その結果、同じＨＳＰが第１立体構造から第２立体構造に変化する。例えば、第１アーム配列と支持配列から構成される二本鎖が、被分析体とその結合パートナーを含む特異的結合対複合体の形成により脱安定化されると、第２アーム配列と支持配列から構成される他の二本鎖の形成が優先する。
【００４０】
図５は、これを包括的なＨＳＰ及びＨＳＰベースのアッセイにおいて示す。上部では、被分析体がないと、結合対メンバー（Ｍ１）が結合しているＨＳＰは、ＨＳＰに結合する標識が不活性状態である第１立体構造である。下部では、被分析体があると、結合対メンバー（Ｍ１）が被分析体（Ｍ２）と結合して結合対複合体（ＢＰＣ）を形成してＨＳＰは標識が活性状態である第２立体構造に変換する。従って、試料中の被分析体の存在は、ＨＳＰの第１立体構造状態から第２立体構造状態への変換により標識から発生するシグナルを測定して検出される。
【００４１】
いずれか特定の機序又は解釈には拘束されるつもりはないが、一般にＨＳＰの異なる立体構造状態は、ＨＳＰに結合した特異的結合対複合体の存在下又は不存在下での核酸二本鎖構造体の相対安定性に起因すると考えられる。標的被分析体がないと、ＨＳＰ構造体は支持配列と結合対メンバーが結合する配列との間で形成される相対的に安定なハイブリダイゼーション二本鎖の形成を優先する。これに対し、標的被分析体があれば結合対複合体が形成され、おそらく立体効果のためハイブリダイゼーション二本鎖脱安定化する。第１ハイブリダイゼーション二本鎖が脱安定化した結果、支持配列と結合対複合体が結合しない他の配列との間で形成される相対的に安定なハイブリダイゼーション二本鎖が生成する。被分析体と特異的結合対複合体を形成する結合対メンバーは、ＨＳＰである状態から他の状態へ立体構造が変換されるのに十分ないかなるリガンド組合わせでもよく、本立体構造変換で発生する検出可能なシグナルは試料中に被分析体が存在することの指標となる。
【００４２】
当業者であれば、本明細書に示すＨＳＰ及びＨＳＰベースのアッセイの種々の態様の図示及び記載から、様々な形態のＨＳＰを用いて被分析体を検出できることを認識するであろう。例えばＨＳＰベースのアッセイには、図１Ａに示すように分子間ハイブリダイゼーションで第１立体構造を形成するＨＳＰ、又は図１Ｂ〜１Ｄに示すように立体構造状態を決定するのに分子内ハイブリダイゼーションに依存するＨＳＰを使用できる。ハイブリダイゼーション保護アッセイ方式でＡＥ標識を用いる態様は、図１Ａ及び１Ｂに示すように二本鎖立体構造により保護されている標識をもつが、結合対メンバー（Ｍ１）に対する被分析体が結合して特異的結合対複合体を形成すると、この二本鎖立体構造は脱安定化されて、ＡＥ標識が分解されうる。従って、被分析体がないとＡＥ標識は加水分解から保護されてプラスの化学発光シグナルが検出されるが、アッセイで被分析体が存在すると、この二本鎖は脱安定化され、ＡＥ標識は加水分解を受けやすくなる結果、化学発光が減少する。他の態様、例えば図４Ａ及び４Ｂに示す態様では、標識は蛍光色素分子でもよく、ＨＳＰがある立体構造状態の場合に蛍光を発生し、被分析体を含む結合対複合体の形成により生じる他の立体構造状態へＨＳＰが変換すると蛍光発光が減少する。図４Ａ及び４Ｂは消光化合物を伴う蛍光色素分子標識を示し、当業者であれば、消光化合物への蛍光色素分子の接近に応じて蛍光発光を変調するが、他の形態の蛍光シグナル発生を用いうることを認識するであろう。例えば、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）色素の組合わせを用いてＨＳＰを標識し、ＨＳＰの立体構造状態に応じた測定可能な蛍光変化が得られる。ＦＲＥＴを用いるＨＳＰベースのアッセイでは蛍光供与分子が近接する（例えば１０〜７０Å）受容体である蛍光色素分子へ双極子−双極子相互作用によりエネルギーを移動させて供与体の蛍光は減少し、受容体の蛍光が増強され、検出されたシグナルの変化が被分析体の結合によるＨＳＰ立体構造変化の指標となる。他の例では、蛍光色素分子で標識したＨＳＰを用いて蛍光偏光測定を行い、アッセイでＨＳＰの立体構造状態に関する情報を得ることができ、好ましくは被験試料中の被分析体量の指標となる蛍光偏光の定量測定を行うことができる。蛍光性化合物は周知であり、フルオレセイン色素（例えばＦＩＴＣ、５−カルボキシフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、フルオレセインジアセテート、ナフトフルオレセイン、ＨＥＸ、ＴＥＴ、５−カルボキシＪＯＥ、６−カルボキシＪＯＥ、オレゴングリーン（ＯｒｅｇｏｎＧｒｅｅｎ）４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、エリスロシン、エオシン）、ローダミン色素（例えばローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラエチルローダミン、５−カルボキシローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、６−カルボキシＲ６Ｇ、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、５−カルボキシＴＭＲ又は５−ＴＡＭＲＡ、６−カルボキシＴＭＲ又は６−ＴＡＭＲＡ、ローダミンＢ、Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、５−カルボキシＲＯＸ、６−カルボキシＲＯＸ、リサミンローダミンＢ（ｌｉｓｓａｍｉｎｅ ｒｈｏｄａｍｉｎｅＢ）、テキサスレッド（ＴｅｘａｓＲｅｄ））��ＢＯＤＩＰＹ色素、シアニン色素（例えばＣｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７）、フタロシアニン色素、クマリン色素（例えば７−ヒドロキシクマリン、７−ジメチルアミノクマリン、７−メトキシクマリン、７−アミノ−４−メチルクマリン−３−酢酸（ＡＭＣＡ））、ピレン又はスルホン化ピレン色素、フィコビリプロテイン（ｐｈｙｃｏｂｉｌｉｐｒｏｔｅｉｎ）色素（例えばＢ−フィコエリトリン（Ｂ−ＰＥ）、Ｒ−フィコエリトリン（Ｒ−ＰＥ）、及びアロフィコシアニン（ＡＰＣ））、スクアリアン（ｓｑｕａｒｉａｎｅ）色素、アレクサ（Ａｌｅｘａ）色素（Ａｌｅｘａ３５０、Ａｌｅｘａ４３０、Ａｌｅｘａ４８８、Ａｌｅｘａ５３２、Ａｌｅｘａ５４６、Ａｌｅｘａ５６８、Ａｌｅｘａ５９４）、ルシファーイエロー（Ｌｕｃｉｆｅｒ ｙｅｌｌｏｗ）及びザンテン（ｚａｎｔｈｅｎｅ）があげられる。ＨＳＰの立体構造状態に応じて検出可能なシグナル変化を生じる標識の他の例は、他の立体構造状態（例えば一本鎖）と比較してある立体構造状態（例えば二本鎖）のＤＮＡに選択的に挿入される色素、又は二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡに結合した色素に特徴的な異なる吸光波長及び発光波長の色素であり、被分析体を含む結合対複合体の形成に応じて二本鎖立体構造と一本鎖立体構造の間で変換させるために分子間ハイブリダイゼーションを利用するＨＳＰ（例えば図１Ａを参照）に特に有用である。例えばアクリジンオレンジ、アクリジンレッド、トルイジンブルー（２−アミノ−７−ジメチルアミノ−３−メチルフェノチアジニウムクロリド）、チアゾールオレンジ、ヨウ化プロピジウム（３，８−ジアミノ−５−（３−ジエチルアミノプロピル）−６−フェニル−フェナントリジウム・ヨージド・メチオジド）、ヨウ化ヘキシジウム、ジヒドロエチジウム、臭化エチジウム、エチジウムモノアジド、Ｓｙｂｒグリーン、Ｓｙｂｒゴールド、シアニン色素（例えばＳＹＴＯ（商標）、ＴＯＴＯ（商標）、ＹＯＹＯ（商標）及びＢＯＢＯ（商標）色素、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）等の色素は周知である。ＨＳＰの立体構造状態に応じて検出可能なシグナル変化を生じさせるために用いうる標識の他の例は、ＨＳＰのある立体構造状態に応じて検出可能なシグナルを発生する発色団である。例えばコロイド粒子（例えば金又は銀のコロイド）又はオリゴヌクレオチド配列が結合したナノ粒子は、立体構造がある状態の場合にＨＳＰに伴う検出可能な構造体（例えばクラスター、凝集構造体又は結晶構造体）を形成することができる。他の発色団を用いてＨＳＰの立体構造状態に応じた色を変化させることができる；これは例えば、異なるＨＳＰ部分に発色団が互いに近接して、ＨＳＰ立体構造状態に特異的な色に変化することに起因する。比色定量シグナルを発生する標識の他の例は、ＨＳＰが特定の立体構造にあるとき酸化−還元（ＲｅｄＯｘ）反応に関与する部分である；すなわち、被分析体の存在が介在するＨＳＰ立体構造変化に応答して原子がその酸化状態を変化させて被分析体の存在を示すシグナルを発生する。ＨＳＰの立体構造状態に応じて検出可能なシグナル変化を生じる標識の他の例は、結合により電気シグナルが発生する部分、例えば非金属���の電気的特性をもつ金−ジチオールナノ網状構造体の形成であって、この網状構造体はあるＨＳＰ立体構造状態について優先的に形成される。
【００４３】
他の態様では、ＨＳＰ核酸の一部が検出工程の成分として機能しうる。一例では、ＨＳＰ核酸の一部が、結合対メンバーへの被分析体の結合に応じたＨＳＰ立体構造状態の指標とするために検出する標識として機能しうる。すなわち、ある立体構造状態で、ＨＳＰの一部又はそれが他の核酸と結合して、検出可能なシグナル、例えば枝分かれ、マルチアーム、結節、環状又は連鎖形成した（ｃａｔｅｎａｔｅｄ）ＤＮＡ構造体を形成し、これを検出することができる。従って、ＨＳＰのこの立体構造状態が単独で、又は他の成分と共に、被分析体の存在の指標となる。
【００４４】
他の態様では、ＨＳＰ核酸の一部が、検出可能なシグナルをもたらす核酸増幅工程の成分として機能しうる。ＨＳＰのハイブリダイズしていないアーム配列を、周知の方法、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）又は転写関連増幅（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）で、核酸増幅のプライマー又は基質として用いることができる。例えば図２では、上側部分に示す立体構造の自由な第１アーム配列（１）又は下側部分に示す立体構造の自由な第２アーム配列（２）が、自由なアーム配列に部分相補的な核酸の増幅のためのプライマーとして機能しうる。又は、図２の上側部分の自由な第１アーム配列（１）又は下側部分の自由な第２アーム配列（２）中の配列は、核酸増幅反応に用いるプライマー（１以上）に対する基質として機能し、従って自由なアーム配列の少なくとも一部を増幅することができる。当該増幅配列は、被分析体の検出に利用するＨＳＰ立体構造変化に核酸増幅の利点（すなわち、多数のコピーを産生して検出可能な部分を増幅する）を関連づける検出工程に使用できる。当業者であれば、ハイブリダイズしていない配列を含む方式又は立体構造のＨＳＰはいずれも、ハイブリダイズしていないＨＳＰ配列の全体又は一部を利用する核酸増幅反応に連結しうることを認識するであろう。例えば図５では、「標識」は、ＨＳＰが特定の立体構造にある場合にプライマー又は基質として核酸増幅反応に関与するＨＳＰ部分でもよい。図５の上部は、被分析体がないとＨＳＰは不活性立体構造であり、核酸増幅のためのプライマー又は鋳型として機能せず、従って増幅した核酸配列に伴う検出可能なシグナルはほとんど又は全く発生しない。図５の下部では、被分析体があるとＨＳＰは活性立体構造であり、プライマー又は鋳型として核酸増幅反応に関与する結果、増幅した核酸配列を生成し、これが被験試料中に被分析体が存在することの指標となる検出可能なシグナルを発生する。ＨＳＰベースのアッセイを核酸増幅工程に連結することにより、核酸増幅を利用してシグナル増幅を達成できるので、ＨＳＰベースのアッセイの感度を高めることができる。
【００４５】
ＨＳＰベースのアッセイの他の態様は、ある立体構造のＨＳＰの一部に結合する循環型プローブ部分に依存したシグナル増幅を含みうる。再度図５を参照すると、本態様では「標識」は、このＨＳＰ標識部分に結合した場合にのみシグナルを発生する第２核酸プローブに結合するＨＳＰ部分である。図５の上部では、被分析体がないとＨＳＰは不活性立体構造で、第２プローブが結合できないため混合物中で第２プローブからのシグナルの発生は阻止される。図５の下部では、被分析体があるとＨＳＰは活性立体構造であり、第２プローブを結合して試料中に存在する被分析体により生じるＨＳＰ立体構造変化の指標となるシグナルが第２プローブから発生できる。次いで活性立体構造のＨＳＰに結合した第２プローブを物理的に破断し（すなわち開裂させ）、第２プローブをＨＳＰから分離し、阻害された形の第２プローブの再形成を阻止する。すなわち、破壊された第２プローブはＨＳＰに形成していなくてもシグナルを発生し続ける。その間に、活性ＨＳＰは他の第２プローブを結合でき、次いで破断して第２系列の第２プローブを生成させて検出可能なシグナルを発生する。各活性ＨＳＰ立体構造は多数コピーの第２プローブを結合でき、第２プローブから発生するシグナルは増強される。結合した第２プローブの破断は酵素法により、例えば第２プローブ中にあるＲＮａｓｅＨ感受性の切断性結合をＲＮａｓｅＨ消化して達成でき、この結合は第２プローブがＨＳＰに結合する場合にのみ本酵素に認識される。他の例では、結合した第２プローブの破断は、プローブがＨＳＰに結合する場合のみプローブ中の認識配列を開裂する制限エンドヌクレアーゼで実施できる。
【００４６】
ＨＳＰには、検出すべき被分析体と特異的結合対複合体を形成するいかなる結合対メンバーをも使用できる。被分析体としては、リガンド又は反応性基質と相互作用しうる膜又は膜フラグメント（例えば細胞、核又は細胞小器官の）、受容体（例えばサイトカイン、ホルモン、オピオイド、ステロイド又は感染性因子に対するもの）、細胞、細菌、ウイルス、プリオン、毒素、タンパク質、炭水化物、脂質、酵素、プロテアーゼ、キナーゼ、抗原、抗体又は抗体断片、レクチン、核酸及びいかなる生物種、有機種又は有機金属種があげられるがこれらに限定されない。特異的結合対メンバーの組合わせは当技術分野で周知であり、そのリガンドを結合する機能を維持した状態で周知の結合法でＨＳＰと結合させることができるいかなる結合対メンバーをも使用できる。ある例では、ＨＳＰの核酸構造体の一部を、検出すべき被分析体に対する結合対メンバーとして用いる。好ましい態様では、ＨＳＰの一部が被分析体を結合するアプタマーであって、これは前記のようにＨＳＰ標識からのシグナルの変化により検出されるＨＳＰの立体構造を変化させうる。
【００４７】
当業者であれば、図面に示した方法はＨＳＰを利用する検出アッセイ法のある態様にすぎず、例えば競合アッセイ法等の他の公知のアッセイ方式が本発明に含まれることを理解するであろう。例えば、ＨＳＰベースのアッセイ法は、目的とする被分析体と他のリガンドに共に特異的なＨＳＰ結合対メンバーを含んでもよく、従って被分析体と他のリガンドがＨＳＰ−結合対メンバーへの結合に対して競合し、異なる結合対複合体が異なるＨＳＰ立体構造変化に介在し、これを試料中の被分析体の存在又は相対量の指標となるシグナル変化として検出することができる。１の当該態様では、被分析体とＨＳＰ結合する結合対メンバーとから構成される結合対複合体はプラスのシグナルを発生するＨＳＰ立体構造変化に介在し、これに対し他方のリガンドと結合対メンバーから構成される結合対複合体は検出可能なシグナルを発生しないＨＳＰ立体構造をもたらす。従って、被分析体とリガンドの競合により、試料中の被分析体の量に比例してシグナルが増強される。競合アッセイ方式の他の例では、被分析体に対するＨＳＰ結合する結合対メンバー及び同一被分析体に対する公知量の遊離する結合対メンバーがアッセイに含まれ、従ってこれら２つの結合対メンバーが被分析体への結合に対して競合する。すなわち、同一被分析体分子への一方の結合により他方の結合が排除される。この態様では、ＨＳＰ上での結合対複合体の形成に介在するＨＳＰ立体構造変化（これがシグナルの変化をもたらす）は、遊離する結合対メンバーとＨＳＰ結合する結合対メンバーに共に結合するのに十分な量の被分析体を試料が含有する場合に生じる。ＨＳＰベース競合アッセイの好ましい態様では、ＨＳＰ−結合対メンバーに結合した被分析体から発生するシグナルは、被験試料中の被分析体の量に比例する。すなわち、本アッセイ法は定量的結果をもたらす。
【００４８】
同様に、溶液中の１以上のＨＳＰ又は支持体に結合する１以上のＨＳＰであって、それぞれ特定の被分析体に特異的なＨＳＰを、アッセイに使用できる。当該アッセイ法のための支持体には、１以上のＨＳＰが結合する粒子、マトリックス又は固体支持体、例えばアレイ方式のものを含めることができ、アッセイを実施する際にはこれらを１以上の試料と接触させる。溶液相アッセイ法は、固定化した成分と比較して溶液中で起きる結合反応の動力学的利点のため有利である。支持体結合型のアッセイ法は、検出のために比較的希薄な試料から限定された空間又は位置内へ被分析体を濃縮できるため、またそれらを例えばアレイ上でのハイスループット試験に使用できるため、有利である。溶液中又は支持体に結合する、多数の異なるＨＳＰの立体構造状態が変化して発生するシグナルの検出は、様々な周知の方法のいずれかを用いて、例えば１以上の波長、周波数、エネルギーレベル又はこれらに類する特性で、位置及び／又は時間−相関シグナルを収集する検出器を用いて、例えばアレイの特定位置へ向けた１以上の励起波長により照射した結果として固定化ＨＳＰ系からの発光データを収集するように配置した検出器を用いて達成できる。
【００４９】
本発明には、本明細書に記載するＨＳＰ組成物及び／又はＨＳＰベースの方法を用いるキット及びシステムが含まれる。キットはある被分析体に特異的な少なくとも１種類のＨＳＰを含み、同一被分析体又は異なる被分析体に特異的な多数の異なるＨＳＰを含んでもよい。キット中の異なるＨＳＰは、実質的に同じ方式（例えば図面に示したものいずれか）であり、各ＨＳＰが検出する特異的結合対のみが異なってもよい。あるいは、キットは異なる方式（例えば図面に示した少なくとも２つの態様の組合わせ）のＨＳＰを含み、これらがすべて同一又は異なる特異的結合対を検出するものでもよい。キットのＨＳＰ成分（１以上）のほかに、キットはアッセイの実施に用いられる他の試薬、例えばＨＳＰと試料を混合する前に試料を調製するための試薬、及び／又は適切なハイブリダイゼーション条件を得るための試薬、例えば緩衝剤、キレート化剤、塩類、若しくはそれらの試薬の混合物、及び／又はＨＳＰに結合する標識からシグナルを発生させるための試薬、例えば酵素若しくは基質、加水分解剤等を含んでもよい。ＨＳＰベースのアッセイを実施するために用いられる計測器システムも本発明に含まれる。当該システムは、例えば１以上のＨＳＰを収容した容器又はアレイを含めて、検出方法を手動操作で行う単純なものでもよい。当該システムは、検出工程及び／又は追加工程、例えば試料の調製に伴う工程の自動的実施のための構成部品を含む、より複雑なものでもよい。自動化工程には、試薬の分注、試料とＨＳＰ試薬及び／又は他の試薬の混合、ＨＳＰの立体構造変化をもたらす結合対複合体を形成させる混合物のインキュベーション、並びに結合対複合体の形成及びＨＳＰ立体構造の変化により生じるシグナル変化の検出を含めることができる。当該システムには、発光、蛍光、比色、電気その他のタイプのシグナルから生じるシグナルの発生又は吸収を検出するシグナル検出用計測器が含まれうる。好ましい態様のシステムは、シグナルを検出して、被験試料中に存在する被分析体の量に比例した定性的又は定量的出力を生じる。
【００５０】
本発明の組成物、方法、キット及びシステムは、生物試料、工業試料又は環境試料中に薬物、感染性因子、毒素等が存在することの指標となるタンパク質、炭水化物、脂質、脂肪酸又は高分子複合体の検出等の様々な試料中の様々な標的被分析体を検出するのに有用である。本発明の組成物及び方法の他の適用例には、生物試料中の抗原、抗体又は微生物、ウイルス又はプリオン等の感染性因子の診断検出が含まれる。ＨＳＰベースの方法は比較的単純なため、当該アッセイ法はリガンドの存在を検出するために多数の試料をハイスループットスクリーニングするため、例えば多数の環境試料又は食品試料を感染性因子又は毒素の存在をスクリーニングするために有用である。ＨＳＰベースの方法は単純及び感度がよいため、当該アッセイ法は検査室外での試料の迅速検査、例えば環境現場、食品加工施設の検査、又は法医学的証拠を得るためのある区域のスクリーニングに有用である。
【００５１】
以下の実施例により、本発明のある態様を説明する。ＨＳＰベースの方法を説明するために用いたモデル系は、ビオチンとストレプトアビジンの結合対を用いる。化学発光性標識を用いる態様では、本発明の組成物及び方法は、特異的結合対のメンバーである被分析体を１０−１７〜１０−１８モルのレベルまで検出することができる。これは、一般的なＲＩＡで同一の特異的結合対中の同一被分析体を検出する他のアッセイ方式より、一般に感度が１０２〜１０５高い。本発明の組成物及び方法は、ＨＳＰ上に蛍光標識等の他の標識を使用でき、異なるレベルのアッセイ感度をもたらしうる。従って、個々の被分析体についてのアッセイ感度は、検出すべき被分析体について希望する感度レベルを達成する標識を選択して変更できる。例えば、生物試料中のＨＩＶ−１等の感染性因子の診断検出には、環境水試料中の大腸菌の検出に要求されるより高いレベルのＨＳＰベースアッセイ感度が必要であろう。ＨＳＰ組成物及びＨＳＰベースの検出方法は、約３〜４ｌｏｇの動的範囲でアッセイ応答はほぼ直線となり、本発明の組成物及び方法は定量的結果が必要な用途に特に有用なものとなる。ＨＳＰ組成物は、標的被分析体を検出するための様々な一般的方法、例えばプラスのシグナル出力又はシグナル出力阻害をもたらす標準アッセイ方式又は競合アッセイ方式に使用できる。ＨＳＰ組成物及び方法は、アレイ等の溶液相系又は１以上の固定化成分を用いる系に使用でき、好ましい態様は均一検出系を用いる。これらのいずれの方式でも、ＨＳＰベースの方法は簡単に実施でき、広い温度範囲で有効であり（例えば２０〜５０℃）、核酸ハイブリダイゼーションさせるために必要な条件が比較的単純である。従って、ＨＳＰベースの方法の多くの態様を、核酸増幅法等他の方法で用いるような複雑な操作又は装置なしに実施できる。ＨＳＰベースの方法は比較的単純であるので、ＨＳＰ組成物及びＨＳＰベースのアッセイ法は容易に手動で実施でき、あるいは自動化したシステム又は装置での使用に適応させることができる。
【００５２】
以下の実施例において、用いた試薬は一般に以下のものであるが、当業者であれば、特異的結合対の結合及び核酸をハイブリダイゼーションさせる様々な公知の条件を採用できることを認識するであろう。プローブ試薬は、１００ｍＭコハク酸リチウム、３％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１０ｍＭメルカプトエタンスルホナート及び３％（ｗ／ｖ）ポリビニルピロリドン又は１００ｍＭコハク酸リチウム、０．１％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ及び１０ｍＭメルカプトエタンスルホナートのいずれかで構成される溶液中に１以上の標識プローブを含有した。ハイブリダイゼーション試薬は、１９０ｍＭコハク酸、１７％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１００ｍＭ水酸化リチウム、３ｍＭＥＤＴＡ及び３ｍＭＥＧＴＡ（ｐＨ５．１）又は１００ｍＭコハク酸、２％（ｗ／ｖ）ＬＬＳ、１００ｍＭ水酸化リチウム、１５ｍＭアルドリチオール−２、１．２Ｍの塩化リチウム、２０ｍＭのＥＤＴＡ及び３．０％（ｖ／ｖ）のエタノール（ｐＨ４．７）のいずれかを含有した。ＡＥ化合物で標識したプローブについて、ＡＥの加水分解を開始するために用いた選択試薬は、６００ｍＭホウ酸、１８２．５ｍＭの水酸化ナトリウム、１％（ｖ／ｖ）のオクトキシノール（ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ−１００）（ｐＨ８．５〜９．６）を含有し、検出試薬は、１ｍＭの硝酸及び３２ｍＭの過酸化水素を含有する検出試薬Ｉ、並びに１．５Ｍの水酸化ナトリウムである検出試薬ＩＩであった。化学発光（相対光単位「ＲＬＵ」として表示）は、ルミノメーター（例えばＬＥＡＤＥＲ（登録商標）ＨＣ，Gen-ProbeIncorporated,カリフォルニア州サンディエゴ）により検出され、蛍光は蛍光光度計で測定した。
【００５３】
一般に、ＡＥ標識ＨＳＰを用いる反応は下記の工程を伴った。反応混合物は、ＨＳＰに対する被分析体を含有する試料と混合した公知量のＡＥ標識ＨＳＰを、ハイブリダイゼーション条件下の水溶液（すなわちハイブリダイゼーション試薬）中に含有した。反応混合物を約２２〜３７℃で１０〜１５分間インキュベートして、結合対複合体（被分析体とＨＳＰ上の結合パートナー）を形成させ、ＨＳＰの立体構造を変化させた。次いで等容量の選択試薬を反応混合物に添加し、これを混合し、蒸発を抑えるために不活性油層で覆い、３７〜６０℃で１０分間インキュベートして、核酸二本鎖構造体中に存在しないＡＥを加水分解し、室温に冷却した。残った加水分解されていない標識からの化学発光を、順に検出試薬Ｉ及びＩＩを添加して開始させ、化学発光を０．５〜２秒間、ルミノメーター（ＨＣ ＬＥＡＤＥＲ（登録商標），Gen-Probe Incorporated）により相対光単位（ＲＬＵ）として検出した；実質的に米国特許第５，６５８，７３７号第２５欄第２７〜４６行目及びNelson et al., 1996, Biochem. 35: 8429-8438, 8432の記載に従った。
【００５４】
蛍光色素分子で標識したＨＳＰを用いる反応は、被分析体−結合対複合体をＨＳＰ上に形成させてＨＳＰの立体構造を変化させるためのインキュベーション工程及びこのＨＳＰ立体構造変化に関連する蛍光シグナルを検出するための検出工程を伴った。蛍光色素分子は化学的活性化工程を要しないので、前記ＡＥ標識に用いた選択工程を含まなかった。すなわち、蛍光色素分子で標識したＨＳＰを用いる一般的な反応は下記の工程を含んだ。反応混合物は、ＨＳＰに対する被分析体を含有する試料と混合した公知量の蛍光色素分子標識ＨＳＰを、ハイブリダイゼーション条件下の水溶液（すなわちハイブリダイゼーション試薬）中に含有した。これを約２２〜３７℃で１０〜１５分間インキュベートして、結合対複合体を形成させ、ＨＳＰの立体構造を変化させた。蛍光光度計を用いて標準法で蛍光シグナルを検出及び測定した。検出には、反応混合物を蛍光色素分子標識に特異的な励起波長で照射し、続いてＨＳＰ立体構造変化の指標となる蛍光シグナルを検出するのに適切な発光波長又は波長範囲の蛍光シグナルを検出することが含まれる。当業者であれば、用いる蛍光色素分子標識に適した励起及び／又は発光スペクトルを設定して、例えば用いる各蛍光色素分子標識に異なる波長を選択して最大発光又は重複しない発光を検出して、異なる蛍光色素分子ごとに標識した、異なるＨＳＰからの多重蛍光シグナルを検出できることを認識するであろう。
【００５５】
以下の実施例により、本発明の原理並びに簡易で及び検出感度が高い利点を説明する。
【実施例１】
【００５６】
ハイブリダイゼーションスイッチプローブの各態様の設計、合成及び試験
図１Ｃに示す一般的方式のハイブリダイゼーションスイッチプローブを、各々、短いホモポリマー配列（Ｔ５）から構成されるリンカーエレメントで種々に組合わせたアーム配列（配列番号１〜７）に連結した１種類の支持配列（配列番号８）を用いて設計した。設計した各態様では、両アーム配列とも支持配列中の配列にハイブリダイズすることができる。上記組合わせ配列を含むオリゴマーを標準的な化学反応で合成して、表２に示す配列をもつＨＳＰオリゴマー（配列番号９〜１５）を作製した。表１はＨＳＰオリゴマーの設計に用いたアーム配列を示す。表２は完成したＨＳＰ配列を示し、アーム配列をイタリック体で、支持配列に下線を施した。ＨＳＰオリゴマーでは、５’側、すなわち第１アーム配列（配列番号１〜４）を、共有化学結合で（配列番号１では残基６と７の間、配列番号２では残基５と６の間、配列番号３では残基７と８の間、配列番号４では残基８と９の間）、周知の方法（例えば米国特許第５，１８５，４３９号、Ａｒｎｏｌｄら）を用いてＡＥ化合物で標識した。ＨＳＰオリゴマーでは、３’側、すなわち第２アーム配列（配列番号５〜７）を、共有化学結合で（配列番号５では残基７と８の間、配列番号６及び７では残基８と９の間）ビオチンホスホルアミダイトを核酸に結合させ、ビオチンで標識した。
【００５７】
【表１】
2008531052.tif 000003
【００５８】
【表２】
2008531052.tif 000004
【００５９】
これらのＨＳＰ態様では、３’側の第２アーム配列は５’側の第１アーム配列より長いので、被分析体がないと、第１アーム配列が支持配列と二本鎖を形成せず、ビオチンが結合する第２アーム配列が優先的に支持配列とハイブリダイズしてハイブリダイゼーション二本鎖を形成する。被分析体ストレプトアビジンが存在して第２アーム上の結合対メンバーであるビオチンに結合すると、第２アーム配列と支持配列から構成される二本鎖は、ストレプトアビジン−ビオチン結合対複合体により脱安定化されて、第１アーム配列と支持配列から構成される二本鎖が優先して形成される。すなわち、特異的結合対複合体が形成されると、ＨＳＰは３’側アーム配列−支持配列二本鎖をもつ第１立体構造から、５’側アーム配列−支持配列二本鎖をもつ第２立体構造へ変換する。第１アーム配列に結合するＡＥ標識は、第２立体構造の二本鎖で加水分解から相対的に保護される。第２立体構造（すなわち被分析体が結合したＨＳＰ）を含有する混合物をビオチンで滴定すると、この溶液相のビオチンが被分析体ストレプトアビジンへの結合に対してＨＳＰに結合するビオチンと競合する。溶液相ビオチンは、ＨＳＰに結合するストレプトアビジン−ビオチン複合体からストレプトアビジンを除去してＨＳＰの立体構造が変化し、第２立体構造（被分析体が結合したＨＳＰ）から第１立体構造（被分析体を含まないＨＳＰ）へ変換する。第１アーム配列と比較して第２アーム配列が相対的に長いため、第２アーム配列と支持配列から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖が優先するからである。
【００６０】
これらのＨＳＰを独立して、一定量の被験ＨＳＰ、例えば各反応につき約５×１０６ＲＬＵを供給する量のＡＥ標識ＨＳＰを含有する水性反応混合物中の反復反応（各ＨＳＰにつき３回の反復）で試験した。各一定量のＨＳＰをハイブリダイゼーション試薬中に種々の量のストレプトアビジン（ＨＳＰに結合するビオチンに対して０〜２５０倍）の混合物として含有する反応混合物（アッセイ毎０．０５ｍｌ）を、室温で１５分間インキュベートして、結合対複合体（ビオチンとストレプトアビジン）を形成させ、立体構造を変化させた。次いで混合物を選択試薬（０．２５ｍｌ）と混合し、蒸発を抑えるために不活性油の層で覆い、６０℃で１０分間インキュベートして、二本鎖構造体中に存在しないＡＥを加水分解し、次いで室温に冷却した。残存する標識からの化学発光を開始させ、ルミノメーター（ＨＣ ＬＥＡＤＥＲ（登録商標））によりシグナルをＲＬＵ（２秒）として検出した；実質的に米国特許第５，６５８，７３７号第２５欄第２７〜４６行目及びNelson et al., 1996, Biochem. 35: 8429-8438, 8432の記載に従う。
【００６１】
ＨＳＰ１４−１３（配列番号１１）及びＨＳＰ１５−１３（配列番号１２）を用いて実施したアッセイの結果を表３に示す（各条件につき３回のアッセイの平均ＲＬＵとして報告）。この結果は、すべての試験で、ストレプトアビジンを含有しない対照と比較して被分析体の存在により検出可能なシグナルが有意に増強したことを示す。
【００６２】
【表３】
2008531052.tif 000005
【００６３】
同様な実験で、ＨＳＰをコハク酸リチウム緩衝液（プローブ試薬）中で０〜１０倍過剰のストレプトアビジンと混合し、次いで二本鎖構造体中に存在しないＡＥを加水分解処理し、前記の条件を用いてＲＬＵシグナルを検出した。上記実験で、アッセイ混合物中に被分析体が存在する場合、被分析体を含有しない対照より検出可能なシグナル（ＲＬＵ）は有意に高かったが、最大検出シグナルは最大入力シグナルより約１００倍少なかった。従って、このＨＳＰベースの被分析体結合アッセイが効率的であって最適シグナルを発生する温度範囲を判定するために、実験を行った。
【実施例２】
【００６４】
異なる温度でのＨＳＰベースの被分析体検出アッセイ
本実施例では、各アッセイ条件でシグナルを検出する前の選択工程に関してアッセイでのインキュベーション温度が２２〜７０℃以外は、実施例１に記載したものと同様な条件を用いてアッセイを行った。本試験のために、プローブ試薬中で、ＨＳＰ１５−１３（配列番号１２）を１０倍過剰の被分析体と混合した（０．０１ｍｌの０．７１ｍＭ ＨＳＰを１ｍｌの０．０７１ｍＭストレプトアビジンと混合）。各条件の対照は、被分析体は含まずに同一量のＨＳＰを同一試薬中に含有した。各試験で、０．２ｍｌの混合物を室温で１５分間インキュベートして、溶液相ストレプトアビジンとＨＳＰ結合するビオチンにＨＳＰ上で特異的結合対複合体を形成させた。次いで各混合物を０．２５ｍｌの選択試薬と混合し、蒸発を抑えるために不活性油の層で覆い、２２℃、３０℃、３７℃、４４℃、５０℃、６０℃又は７０℃で３０分間インキュベートして、実質的にＨＳＰの一本鎖部分に結合するＡＥ標識を不活性化した。実質的に実施例１の記載と同様に化学発光シグナル（ＲＬＵ）を検出した。得られた結果を表４に示し、各温度について、１０倍過剰のストレプトアビジンを含有する混合物及びストレプトアビジンを含有しない対照混合物について検出したＲＬＵ、並びにストレプトアビジンを含有するものと含有しないものとの比率（「検出シグナル比」）として報告する。
【００６５】
【表４】
2008531052.tif 000006
【００６６】
表４に示す結果は、ＨＳＰベースのアッセイで室温から約６０℃までの温度範囲で被分析体が検出され、被分析体含有試料を被分析体なしの対照と比較した最高比率のシグナルは約３０〜約５０℃の範囲でみられ、被分析体陽性試験の最大シグナルは選択工程を室温から４４℃までの範囲で実施した場合で示されたことを示す。上記結果は、化学発光性化合物で標識したＨＳＰが、標識を保護するＨＳＰ立体構造の変化により被分析体を容易に検出でき、少なくとも２０℃の温度範囲で検出できることを示す。
【００６７】
同様な実験を、ビオチンが結合するＨＳＰ１５−１３を用い、ストレプトアビジン被分析体と共に又は被分析体なしにインキュベートして、検出工程にＡＥ加水分解を含むＨＳＰベースのアッセイが他の条件下で機能するかを判定した。本試験では、ＡＥの加水分解を３７℃で５〜９０分間、ｐＨ９．０、９．３又は９．６の選択試薬を用いて実施した（選択試薬のｐＨをＮａＯＨの添加により調製した）。上記条件はすべて、被分析体を含有する混合物に関して、被分析体を含有しない混合物について同様に実施した対照アッセイ（バックグラウンドシグナル）と比較して検出可能なシグナルを発生したが、ｐＨ９．６の選択試薬を用いて実施したアッセイが最良のシグナル−対−バックグラウンド比を示した。上記結果は、ＨＳＰベースのアッセイが様々な条件下で機能することを示す。
【実施例３】
【００６８】
ＨＳＰ１５−１３及びＨＳＰ１６−１４を用いたＨＳＰベースのアッセイでの被分析体の滴定
本実施例は、ＨＳＰベースのアッセイで被分析体を滴定したＨＳＰアッセイの感度を示す。本試験では、ビオチンが結合する一定量のＡＥ標識ＨＳＰ１５−１３（配列番号１２）を用い（アッセイ毎４０ｆｍｏｌ）、被分析体（ストレプトアビジン）の量を、被分析体とＨＳＰに結合する結合対メンバーとのモル比が１×１０−５、１×１０−４、１×１０−３、１×１０−２、０．１、０．２５、０．５、１及び１０になるように変更した。陰性対照アッセイは被分析体を含有しなかった。実質的に実施例２の記載と同様にアッセイを実施し、ｐＨ９．６の選択試薬で３７℃で１５分間インキュベーションの加水分解条件を用いて、ハイブリダイゼーション二本鎖中に存在しない配列に結合するＡＥ標識を選択的に加水分解した。被分析体の各濃度で１０回の反復試験を行い、実施例１の記載と同様に化学発光シグナル（ＲＬＵ）を検出した。上記試験で検出した平均ＲＬＵを表５に示す。
【００６９】
【表５】
2008531052.tif 000007
【００７０】
バックグラウンドシグナル（被分析体を含有しない対照反応からのＲＬＵ）を被分析体陽性試料の結果から差し引いた結果を図６の滴定曲線にグラフに示す。上記結果は、ＨＳＰベースのアッセイが０．０１ｆｍｏｌ以上の被分析体を検出する高感度であり、０．０１〜４０ｆｍｏｌの広い動的範囲で被分析体を検出することを示す。
【００７１】
ビオチンが結合する一定量（４０ｆｍｏｌ）のＡＥ標識ＨＳＰ１６−１４（配列番号１５）を用い、種々の量（０〜１０００ｆｍｏｌ）の被分析体ストレプトアビジンを用いて、同様な滴定アッセイを行った。バックグラウンドシグナルを差し引いた上記試験の結果からも、図７に示すように同様な滴定曲線が得られた。濃度がより低い（２ｆｍｏｌ）ＨＳＰ１６−１４及び濃度がより低い（０〜１００ｆｍｏｌ）ストレプトアビジンを用いて、さらにアッセイを行った。バックグラウンドシグナルを差し引いた上記試験の結果を図８の滴定曲線にグラフで示す。上記結果はすべて、ＨＳＰベースのアッセイが高感度、かつ、動的範囲が広いことを示す。
【実施例４】
【００７２】
アーム配列がより長いＨＳＰの態様
以上の例に記載したＨＳＰ及びＨＳＰアッセイと比較するために、第１アーム配列と第２アーム配列の差が２塩基長であるＨＳＰをさらに４種類設計した。本ＨＳＰをＨＳＰ１７−１５、１８−１６、１９−１７及び２０−１８とする。このＨＳＰの第１及び第２アーム配列を表６に示す（配列番号１６〜２３）。支持配列は、ＨＳＰ１７−１５及びＨＳＰ１８−１６は配列番号２４、ＨＳＰ１９−１７及びＨＳＰ２０−１８は配列番号２５であった。このＨＳＰは、表７の配列（配列番号２６〜２９）に示すように、アーム配列をイタリック体で、支持配列は下線を施して、アーム配列と支持配列を５’側から３’側へアーム１−支持配列−アーム２の順序で、短いホモポリマー配列（Ｔ５）から構成されるリンカーエレメントで結合させて連結するための、標準的な化学反応を用いて合成した。各ＨＳＰは、両アーム配列とも支持配列中の配列にハイブリダイズすることができる。このＨＳＰオリゴマーで、第２アーム配列（配列番号２０〜２３）に、配列番号２０及び２１は残基９と１０の間、配列番号２２及び２３は残基１０と１１の間に、ビオチン−ホスホルアミダイトを用いて化学結合によりビオチンを共有結合させた。このＨＳＰオリゴマーを、実質的に実施例１の記載と同様に、第１アーム配列（配列番号１６〜１９）上のＡＥ化合物で標識して、配列番号１６は残基８と９の間、配列番号１７及び１８は残基９と１０の間、配列番号１９は残基１０と１１の間の共有化学結合を用いて結合させた。
【００７３】
【表６】
2008531052.tif 000008
【００７４】
【表７】
2008531052.tif 000009
【００７５】
このより長いＨＳＰを被分析体（ストレプトアビジン）と共に用いて、実質的に実施１〜３の記載と同様の方法でＨＳＰベースのアッセイを実施し、ＡＥ標識の加水分解後の化学発光を測定して被分析体の存在下でのＨＳＰの立体構造変化を検出した。この長いＨＳＰと比較するために、ＨＳＰ１４−１２、１５−１３及び１６−１４（実施例１に記載）を同じ方法で同時に試験した。簡潔には、ＨＳＰオリゴマー及び被分析体ストレプトアビジンを含有する溶液０．１ｍｌをコハク酸リチウム緩衝化プローブ試薬０．１ｍｌと混合し、本混合物を室温で１０〜１５分間インキュベートし、次いで０．２５ｍｌの選択試薬（ｐＨ９．６）を添加し、混合物をＡＥ加水分解のために３７℃で４０分間まで種々の時間インキュベートした。ハイブリダイゼーション二本鎖中に含まれない配列に結合するＡＥを加水分解するために３７℃で０、５、１０、１５、２０、３０及び４０分間インキュベートした後、実施例１の記載と同様に化学発光を検出した。ストレプトアビジンを含有しない対照混合物を同様に各ＨＳＰについて試験した。
【００７６】
表８に示すように一般に０〜２０分で、試験した全てのＨＳＰで、検出した化学発光シグナル（ＲＬＵ）は、ストレプトアビジンを含有しない対照と比較してストレプトアビジンが存在する場合の方が高かった。各加水分解（５、１０、１５、２０、３０及び４０分間）に対して、検出シグナル（「シグナル」）及びシグナル−対−バックグラウンド比（「シグナル／Ｂｋｇｄ」）をＨＳＰ１７−１５、１８−１６、１９−１７及び２０−１８について示す。各ＨＳＰについて、被分析体の存在下で試験した１０回の反復試料に関して検出した平均ＲＬＵから、同一ＨＳＰを用いて被分析体なしに試験した１０回の反復対照試料に関して検出した平均ＲＬＵを差し引いてシグナルを算出した。「シグナル／Ｂｋｇｄ」比は、被分析体存在下で試験した１０回の反復試料で検出した平均ＲＬＵを、同一ＨＳＰについて１０回の反復対照試料に関して検出した平均ＲＬＵで割って算出した。
【００７７】
【表８】
2008531052.tif 000010
【００７８】
検出した化学発光結果をグラフで表すと、被分析体陽性試料の全ての加水分解曲線が類似したが、被分析体の不存在下での加水分解曲線は、アームが短いＨＳＰと比較してアームが長いＨＳＰに結合するＡＥ標識の方がより速やかに加水分解された。
【実施例５】
【００７９】
ＨＳＰベースの競合滴定アッセイ
本実施例は、ＨＳＰオリゴマーをアッセイに添加する前にビオチンをストレプトアビジンと混合した以外は、実施例３に記載した同様な条件を用いた滴定アッセイで得られた結果を示す。この溶液相ビオチンは、ＨＳＰを添加する前に混合物中のストレプトアビジンに結合できるので、ＨＳＰに結合するビオチンへの結合に用いる被分析体が少なくてすみ、化学発光の測定で検出されるＨＳＰ立体構造の変化は少ない。すなわち、存在する溶液相ビオチンの量が多くなるほど、立体構造が変化するＨＳＰは少なくなり、ハイブリダイズしていない鎖中に存在する（すなわち、ハイブリダイゼーション二本鎖中に保護されていない）ＡＥ標識の量は多くなる。その結果、多量のＡＥが加水分解され、アッセイで検出可能なシグナルが減弱する。
【００８０】
本アッセイでは、最初の混合物はストレプトアビジン（９ｆｍｏｌ）及びビオチン（０〜１０７ｆｍｏｌ）の水性混合物で、ビオチンがアーム配列に結合するＡＥ標識ＨＳＰ１６−１４（４０ｆｍｏｌ）をプローブ試薬と共に添加した以外は、実施例３に記載したのと同じ方法を用いた。混合物を室温で１０〜１５分間インキュベートして、利用可能なストレプトアビジンとＨＳＰに結合するビオチンにＨＳＰ上で特異的結合対複合体を形成させた後、ハイブリダイズしていないアーム配列上のＡＥ標識の加水分解を行い、前記同様に化学発光シグナルを検出した。本競合滴定アッセイの結果を図９にグラフで示す。反応混合物中に存在するビオチン量（ｆｍｏｌ）をＸ−軸に、検出したシグナル（ＲＬＵ）をＹ−軸に示す。結果は、１０ｆｍｏｌ未満の競合体ビオチンが存在する場合、被分析体がＨＳＰへ結合するためＨＳＰの立体構造が変化し、比較的高いシグナル（５×１０５ＲＬＵ以上）が検出されたことを示す。混合物中に存在する競合体ビオチンの量が多くなれば、ＨＳＰ上のビオチンの結合に用いられる被分析体が減少し、その結果、第２立体構造に変換するＨＳＰが減少するが、これらは、検出されたシグナルの減弱により示される。本結果は、溶液相ビオチンが被分析体ストレプトアビジンに対してＨＳＰに結合するビオチンと競合してＡＥ標識アーム配列がハイブリダイゼーション二本鎖に含まれないＨＳＰ立体構造が生成し、ＡＥ標識は加水分解から保護されず、シグナルが減弱することを示す。
【実施例６】
【００８１】
蛍光色素分子で標識したＨＳＰを用いる被分析体検出
本実施例は、被分析体をＨＳＰへ結合させてＨＳＰの立体構造を変化させ、ＨＳＰ立体構造を変化させる蛍光の検出で検出するＨＳＰベースのアッセイで、蛍光色素分子で標識したＨＳＰが被分析体を検出することを示す。本実施例に記載するＨＳＰは、５’側アーム配列の直後で支持配列の前に配置されたリンカーエレメント（ポリ−Ｔ配列）に隣接した内部位置に結合した蛍光色素分子（フルオレセイン）及び被分析体を検出する結合対メンバーとして機能するビオチン部分が結合する３’側アーム配列の末端に結合した消光化合物をもつ。被分析体ストレプトアビジンが存在しない場合、ＨＳＰは第１立体構造で、その場合、ビオチン結合アーム配列と支持配列の間でハイブリダイゼーション二本鎖が形成されるため消光化合物と蛍光色素分子は近接した結果、蛍光色素分子からは蛍光がほとんど発生しない。被分析体がＨＳＰのビオチン部分に結合すると、この二本鎖が脱安定化され、ＨＳＰは第２立体構造に変換した結果、フルオレセイン標識と消光化合物が分離して蛍光色素分子から発生する検出可能な蛍光が増強される。
【００８２】
蛍光色素分子で標識したＨＳＰを設計して合成した。内部フルオレセイン標識、結合したビオチン結合対メンバー及び３’側消光化合物（Ｄａｂｃｙｌ又は「Ｄａｂ」）で１のプローブ、蛍光性ＨＳＰ１６−１４（配列番号１５）を合成した。この合成オリゴマーは、ヌクレオチド配列及び非核酸部分の相対位置により下記のように模式的に示される：
【００８３】
【化１】
2008531052.tif 000011
【００８４】
ヌクレオチド配列及び非核酸部分の相対位置により下記のように模式的に示される、他のプローブ、蛍光性ＨＳＰ２０−１８（配列番号２９）を、内部フルオレセイン標識、結合したビオチン結合対メンバー及び３’側消光化合物（ＢＨ２）で合成した：
【００８５】
【化２】
2008531052.tif 000012
【００８６】
３’側配列と５’側配列が関与するハイブリダイゼーション二本鎖形成でヘアピン立体構造を形成しうる配列を含む、ポリ−Ｔ配列がヘアピンのループを形成し、ループ長は５、１０又は１５ヌクレオチドである、ビオチンが結合する他の蛍光色素分子標識ＨＳＰ（配列番号３０〜３２）を設計した。このＨＳＰは図１Ｂに示す態様と類似し、ＨＳＰ６、ＨＳＰ６−１０及びＨＳＰ６−１５とし、ヌクレオチド配列及び非核酸部分の相対位置により下記のように模式的に示される：
【００８７】
【化３】
2008531052.tif 000013
【００８８】
選択工程及び化学発光工程を除き、実施例１に記載したのと同様な方法を用いて、ＨＳＰに結合するビオチン結合パートナーへの被分析体ストレプトアビジンの結合を検出するアッセイで、蛍光色素分子で標識したＨＳＰを試験し、蛍光光度計で蛍光シグナルを検出した。簡潔には、蛍光色素分子で標識したＨＳＰ（２ｐｍｏｌ）と種々の量のストレプトアビジン（ＨＳＰ結合ビオチンに対して０．０１〜１００倍モル量）を、ストレプトアビジンがＨＳＰ結合ビオチンに結合しうる条件下で（例えば、プローブ試薬中３７℃で１５分間）混合した後、蛍光色素分子に適した波長で蛍光を検出する装置を用いて（フルオレセインは、励起波長として４７０ｎｍを用い、５１０ｎｍで４秒間、発光を検出する）、反応混合物の蛍光発光を分析した。対照はストレプトアビジン以外は同一成分を含有し、被験試料と同一の工程及び条件を用いて処理した。蛍光を検出するための自動化装置（ROTOR-GENE(商標) 3000、Corbett Robotics Inc.、カリフォルニア州サンフランシスコ）を用いて試験を行ったが、他の自動方式又は手動工程を用いてアッセイを実施することもできる。各アッセイ条件について３回の反復アッセイを実施し、平均蛍光強度を算出した。蛍光色素分子で標識したＨＳＰ６を用いて実施した実験は１００倍過剰のストレプトアビジンを用いてもシグナルが増強せず、ストレプトアビジン−ビオチン結合がなかったか、あるいは結合したがＨＳＰ６の立体構造が変化しなかったことを示唆する。これに対し、蛍光色素分子で標識したＨＳＰ６−１０及びＨＳＰ６−１５を用いて実施した結合アッセイは、被分析体ストレプトアビジンの存在下でインキュベートした場合、蛍光増強が類似した。ＨＳＰ１６−１４及び６−１０を用いて得た結果を表９に示す。
【００８９】
【表９】
2008531052.tif 000014
【００９０】
表９に示す結果は、蛍光性化合物で標識したＨＳＰが、試料中の被分析体の量に比例した蛍光増強を検出することで、ＨＳＰアーム配列に結合する結合パートナーに対する被分析体の結合を検出しうることを示す。被分析体ストレプトアビジンの量が増加すると、蛍光シグナルが増強して検出された。これは、ＨＳＰのビオチン部分に被分析体が結合すると、第１ＨＳＰ立体構造で蛍光色素分子と消光化合物が近接して保持されるハイブリダイゼーション二本鎖が脱安定化したことを示唆する。ビオチン結合アーム配列を含む二本鎖が解離すると、ＨＳＰは第２立体構造へ変化して、検出可能なシグナルが増強した。
【実施例７】
【００９１】
ＨＳＰベースのアッセイでのタンパク質被分析体の検出
本実施例は、組織に由来する試料中のタンパク質被分析体、すなわち哺乳動物組織から調製した細胞溶解物中に存在するプリオンを検出する方法を記載する。ウシ海綿状脳症（ＢＳＥ）の症状のウシ又は慢性消耗性疾患の症状のアカシカ（ｒｅｄ ｄｅｅｒ）等の伝染性海綿状脳症（ＴＳＥ）疾患の症状を示す動物から、組織試料（例えば脳及び／又は脊髄）を採取する。当該組織試料を標準的な実験室方法で物理的に破砕し、細胞を溶解する（例えば刻んだ組織を界面活性剤で細胞溶解する）。溶解物をヌクレアーゼ（例えばＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅ）で処理して試料の粘度を限定し、核酸を破壊して、ＨＳＰベースのアッセイにおけるプリオン（タンパク性感染性粒子、すなわちＰｒＰＳＣ）の検出に用いるタンパク質抽出試料を得る。
【００９２】
ＡＥ標識が結合する約１８ｎｔの５’側第１アーム配列、第１リンカーエレメント（ＬＥ）、約２０ｎｔの第２アーム配列、ＰｒＰＳＣを結合するが対応する正常細胞タンパク質（ＰｒＰＣ）を結合しないアプタマーを含む第２のＬＥ、及び第１アーム配列及び第２アーム配列中の配列に別個にハイブリダイズしうる約２０ｎｔの３’側支持配列の各エレメントの順であるＨＳＰオリゴヌクレオチド（図１Ｄに示すＨＳＰに類似）を合成する。核酸ハイブリダイゼーション条件下でＰｒＰＳＣが存在しない場合は、第２アーム配列が優先的に支持配列とハイブリダイズして二本鎖を形成し、第１ＨＳＰ立体構造ではＡＥ標識した第１アーム配列は一本鎖のままである。ＰｒＰＳＣがあると、アプタマーがＰｒＰＳＣを結合してＨＳＰの立体構造が変化して、第２アーム配列と支持配列から構成される二本鎖は解離して、第１アーム配列と支持配列のハイブリダイゼーションが可能になり、第２ＨＳＰ立体構造が生成する。上記で詳述した条件で（米国特許第５，２８３，１７４号及び第５，６３９，６０４号）、第１ＨＳＰ立体構造中ではＡＥ標識は加水分解を受けやすいが、第２ＨＳＰ立体構造中ではＡＥ標識は加水分解から保護される。ハイブリダイゼーション試薬中のＨＳＰ（すなわち第１ＨＳＰ立体構造のもの）を、個々の反応混合物中で前記のタンパク質抽出試料と混合し、約２２〜４５℃で１０〜２０分間インキュベートして、ＰｒＰＳＣと第２のＬＥのアプタマーから構成される結合対複合体を形成させると、第２ＨＳＰ立体構造が形成される。次いで反応混合物を実質的に実施例２の記載と同様に、最適なシグナル−対−バックグラウンド比が得られる条件（例えば約４４〜５０℃）を用いて処理して、一本鎖の第１アーム中にあるＡＥ標識を加水分解し、各アッセイについて化学発光シグナルを検出する。対照として、ＴＳＥ疾患を示さず、かつＴＳＥ疾患を伴う動物と接触したことが知られていない動物から正常組織試料を採取し、ＴＳＥ関連試料の試験に用いたものと同じ方法及び試薬を用いてタンパク質抽出試料を調製し、試験する。バックグラウンド対照として、アッセイ中、タンパク質抽出試料以外は前記と同じ条件下でＨＳＰを処理する。バックグラウンドより有意に高い化学発光（ＲＬＵ）の検出は、そのＨＳＰが第１立体構造から第２立体構造へ変換した指標となり、被験試料中にＰｒＰＳＣが存在することの指標となる。正常組織の抽出試料の化学発光はバックグラウンドレベルより有意に高くないが、ＴＳＥ症状を示する動物から抽出した試料のうち約５〜１０％は化学発光がバックグラウンドレベルより有意に高く、かつ正常対照アッセイのレベルより有意に高い。これは、ＴＳＥ関連試料中にＨＳＰベースのアッセイで化学発光の増強をもたらすＰｒＰＳＣが存在することの指標となる。
【実施例８】
【００９３】
ＨＳＰベースのアッセイにおけるタンパク質被分析体の検出
本実施例では実質的に７に記載した試料を試験するが、ＡＥ標識を含む代わりに核酸増幅工程に関与するＨＳＰ配列部分を用いて検出可能な増幅核酸を生成するＨＳＰを用いる。これにより、試料中に被分析体が存在する指標となる立体構造であるＨＳＰから、増幅したシグナルが発生する。
【００９４】
順に、ＰｒＰＳＣに結合するがＰｒＰＣに結合しないアプタマーを含む約３０ｎｔの５’側第１アーム配列、プロモーター配列を含む一本鎖ＤＮＡ配列である第１リンカーエレメント（ＬＥ）、第１アーム配列及び第２アーム配列中の配列に別個にハイブリダイズしうる約２０ｎｔの支持配列、第２のＬＥ、及び約１８ｎｔの３’側第２アーム配列の各エレメントをその順で有するＨＳＰオリゴヌクレオチドを合成する。例えば、プロモーター配列はバクテリオファージＴ７プロモーター配列であり、これはこのプロモーター配列が二本鎖である場合にＴ７ ＲＮＡポリメラーゼにより認識される。核酸ハイブリダイゼーション条件下でＰｒＰＳＣが存在しない場合、第１アームが優先的に支持配列にハイブリダイズして二本鎖を形成し、第１ＨＳＰ立体構造では第２アーム配列は一本鎖のままである。ＰｒＰＳＣがあると、第１アーム配列中のアプタマーがＰｒＰＳＣを結合して立体構造を変化させて第１アーム配列と支持配列から構成される二本鎖は解離して、第２アーム配列と支持配列のハイブリダイゼーションが可能になり、第２ＨＳＰ立体構造が生成する。第１ＨＳＰ立体構造では、ＨＳＰオリゴヌクレオチドの３’末端は一本鎖の第２アーム上にあり、鋳型鎖がＨＳＰの３’末端と結合しないので、核酸重合のためのプライマーとして機能することができない。第２ＨＳＰ立体構造では、ＨＳＰオリゴヌクレオチドの３’末端は第２アームと支持配列から構成される二本鎖中に存在し、この３’末端は支持配列の一部、第１のＬＥ及び第１アーム配列を鋳型鎖として用いる核酸重合のためのプライマーとして機能することができる。
【００９５】
第１立体構造である（すなわち、ＰｒＰＳＣが存在しないハイブリダイゼーション条件下）ＨＳＰを、個々の反応混合物中で実施例７に記載したタンパク質抽出物と混合し、約２２〜４５℃で１０〜２０分間インキュベートして、ＰｒＰＳＣと第１アームのアプタマーから構成される結合対複合体を形成させると、第１アーム配列と支持配列から構成される二本鎖が脱安定化される。これにより第２アーム配列と支持配列から構成される二本鎖の形成が可能になり、第２ＨＳＰ立体構造に変換する。次いで反応混合物を逆転写（ＲＴ）酵素（例えばＭＭＬＶ ＲＴ）、ｄＮＴＰ基質並びに適切な塩類及び緩衝液と混合すると、ＨＳＰの３’末端からＤＮＡ合成が進行する。すなわち、第２アーム配列は、支持配列の一部、第１のＬＥ及び第１アーム配列を鋳型鎖として用いる核酸合成のためのプライマーとして機能し、二本鎖の機能性プロモーターを生成する。反応物を、本プロモーターに適切なＲＮＡポリメラーゼ（例えばＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ）、ｒＮＴＰ基質並びに適切な塩類及び緩衝液と混合して、この機能性プロモーターからＲＮＡ合成（転写）を進行させて、ＨＳＰに含まれる核酸配列の多数コピー（転写体）を作製することができる。この増幅コピー、すなわち転写体を、いずれかの標準法により（例えば色素又は標識したハイブリダイゼーションプローブを用いて）検出すると、試料中にＰｒＰＳＣが存在することにより形成される第２ＨＳＰ立体構造の指標となる増幅したシグナルが発生する。
【００９６】
同様なアッセイで、前記と同じ工程を行い、後の核酸増幅工程で転写体をさらに増幅する。すなわち、後の増幅反応、例えば転写介在増幅（ＴＭＡ）（米国特許第５，３９９，４９１号、第５，４８０，７８４号、第５，８２４，５１８号及び第５，８８８，７７９号、Ｋａｃｉａｎら）、ＮＡＳＢＡ反応（米国特許第５，１３０，２３８号、Ｍａｌｅｋら；米国特許第５，４０９，８１８号、Ｄａｖｅｙら）、又は前の反応混合物中に供給したＲＴを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号及び第４，８００，１５９号、Ｍｕｌｌｉｓら）で、上記転写体が鋳型として機能する。このＴＭＡ、ＮＡＳＢＡ又はＰＣＲ反応で生成した他の増幅配列を、いずれかの標準方法で（例えば色素又は標識したハイブリダイゼーションプローブを用いて）検出すると、被験試料中にＰｒＰＳＣが存在するためにＨＳＰが第２ＨＳＰ立体構造に変化したことの指標となる増幅したシグナルが発生する。
【００９７】
上記方法を用いると、ＴＳＥ症状を示す動物からのタンパク質抽出試料のうち３０〜９０％について、正常対照試料を用いるアッセイからのシグナルより有意に高い増幅したシグナルが検出される。増強したシグナルは、ＴＳＥ関連試料のあるものにＰｒＰＳＣが存在することの指標となり、シグナル増幅工程を含むＨＳＰベースのアッセイの感度が高まったことを示す。
【００９８】
以上の例は本発明のある態様を説明するが、特許請求の範囲には他の態様も含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００９９】
【図１Ａ】ハイブリダイゼーションスイッチプローブ（ＨＳＰ）の１態様の模式図である。他の鎖中に存在する２つの相補的核酸配列から構成され、これらがハイブリダイゼーション条件下で生じる標準的な塩基対合で分子間ハイブリダイゼーション二本鎖として結合したＨＳＰを図示する。第１鎖（１）に標識（Ｌ）が結合し、第２鎖（２）には検出すべき被分析体に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）が結合する。
【図１Ｂ】ＨＳＰの他の態様の模式図である。リンカーエレメント（ＬＥ）で共有結合した２つの相補的核酸配列（１、２）から構成され、この２つの相補的配列が塩基対合で分子内ハイブリダイゼーション二本鎖として結合したＨＳＰを図示する。第１配列（１）に標識（Ｌ）が結合し、第２配列（２）には被分析体に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）が結合する。
【図１Ｃ】ＨＳＰの他の態様の模式図である。リンカーエレメント（ＬＥ）で共有結合した３つの核酸配列（１、２、３）から構成されるＨＳＰを図示する。第１アーム配列（１）に標識（Ｌ）が結合し、第２アーム配列（２）には被分析体に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）が結合し、配列２と３の間で形成されたハイブリダイゼーション二本鎖が示すように、介在する支持配列（３）は両アーム配列（１及び２）に対して少なくとも部分的に相補的である。
【図１Ｄ】ＨＳＰの他の態様の模式図である。リンカーエレメント（ＬＥ）で共有結合した３つの核酸配列（１、２、３）から構成されるＨＳＰを図示する。第１アーム配列（１）に標識（Ｌ）が結合し、第２アーム配列（２）には被分析体に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）が結合し、配列２と３の間で形成されたハイブリダイゼーション二本鎖が示すように、末端の支持配列（３）は両アーム配列（１及び２）に対して少なくとも部分的に相補的である。
【図２】ハイブリダイゼーションスイッチプローブをベースとするアッセイの模式図である。ＨＳＰは、アクリジニウムエステル標識（ＡＥ）が結合する第１アーム配列（１）、及び被分析体（Ｍ２）に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）が結合する第２アーム配列（２）を含む。上部では、被分析体がないと、第２アーム配列（２）がＨＳＰの支持配列（３）の一部にハイブリダイズし、第１アーム（１）は実質的にＨＳＰの一本鎖部分となる。下部では、被分析体があると、被分析体（Ｍ２）が結合対メンバー（Ｍ１）に結合して、第２アーム配列（２）と支持配列（３）との二本鎖が脱安定化されて、第１アーム配列（１）と支持配列（３）から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖が形成される。
【図３】ハイブリダイゼーションスイッチプローブをベースとするアッセイの模式図である。ＨＳＰは、標識（Ｌ）が結合する第１アーム配列（１）を含み、これはリンカーエレメント（ＬＥ）で被分析体（Ｍ２）に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）が結合する第２配列アーム配列（２）に結合し、これはリンカーエレメント（ＬＥ）で支持配列（３）に結合する。被分析体（Ｍ２）は、ＨＳＰの結合対メンバー（Ｍ１）に対して特異的な結合パートナーである。上部は、直線的構造にあるＨＳＰの各エレメントを示す；中間部分は、被分析体がない場合に配列２と３がハイブリダイゼーション二本鎖中にあるＨＳＰを示す；下部は、被分析体がある場合に配列１と３がハイブリダイゼーション二本鎖中にあるＨＳＰを示す。被分析体（Ｍ２）がないと配列２と３から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖が優先するのに対し、被分析体があると被分析体（Ｍ２）が結合対メンバー（Ｍ１）に結合して結合対複合体（ＢＰＣ）を形成することにより、配列２と３の二本鎖を脱安定化して配列１と３から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖が先立って形成されてＨＳＰの立体構造変化が起きる。
【図４Ａ】ハイブリダイゼーションスイッチプローブをベースとするアッセイの模式図である。蛍光色素分子（Ｆ）で標識した第１アーム配列（１）を含み、これがリンカーエレメント（ＬＥ）により、消光化合物（Ｑ）が結合する支持配列（３）に結合し、これがリンカーエレメント（ＬＥ）により、被分析体（Ｍ２）に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）が結合する第２アーム配列（２）に結合するＨＳＰを用いる。上部では、被分析体がないとＨＳＰは第１立体構造である。第２アーム配列（２）が支持配列（３）の一部にハイブリダイズし、蛍光色素分子（Ｆ）は消光化合物（Ｑ）から離れており、蛍光を発生できる。下部では、被分析体があるとＨＳＰは第２立体構造である。被分析体（Ｍ２）が結合対メンバー（Ｍ１）に結合して結合対複合体（ＢＰＣ）を形成して生じて、第２アーム配列（２）と支持配列（３）との二本鎖を脱安定化し、第１アーム配列（１）と支持配列（３）のハイブリダイゼーション二本鎖を形成させて、蛍光色素分子（Ｆ）と消光化合物（Ｑ）が近接して蛍光が減弱する。
【図４Ｂ】ハイブリダイゼーションスイッチプローブをベースとするアッセイの模式図である。これは、第１アーム配列（１）を含み、これがリンカーエレメント（ＬＥ）により、消光化合物（Ｑ）が結合する支持配列（３）に結合し、これがリンカーエレメント（ＬＥ）により、被分析体（Ｍ２）に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）及び蛍光色素分子標識（Ｆ）が結合する第２アーム配列（２）に結合するＨＳＰを用いる。上部では、被分析体がないと、ＨＳＰは第１立体構造である。第２アーム配列（２）が支持配列（３）の一部にハイブリダイズし、蛍光色素分子（Ｆ）と消光化合物（Ｑ）は近接して蛍光が抑制されている。下部では、被分析体があると、ＨＳＰは第２立体構造である。被分析体（Ｍ２）が結合対メンバー（Ｍ１）に結合して特異的結合対複合体（ＢＰＣ）を形成して生じ、第２アーム配列（２）と支持配列（３）との二本鎖を脱安定化し、蛍光色素分子（Ｆ）と消光化合物（Ｑ）を分離して蛍光を増強させ、第１アーム配列（１）と支持配列（３）から構成されるハイブリダイゼーション二本鎖を形成させる。
【図５】包括的なＨＳＰベースのアッセイの模式図である。ＨＳＰは被分析体（Ｍ２）に特異的な結合対メンバー（Ｍ１）及び標識を含む。上部では、被分析体がないと、ＨＳＰは標識が不活性状態である第１立体構造であるのに対し、下部では、被分析体があると、被分析体（Ｍ２）とその結合対メンバー（Ｍ１）が特異的結合対複合体（ＢＰＣ）を形成してＨＳＰは標識が活性状態である第２立体構造に変化する。
【図６】ビオチンと特異的結合対を形成する被分析体ストレプトアビジンを用いて、ビオチンが結合するＡＥ標識ＨＳＰ（ＨＳＰ１５−１３，配列番号１２）を滴定したグラフである。反応混合物中に存在するストレプトアビジンの量（ｆｍｏｌ）をＸ−軸に、検出したシグナル（相対光単位「ＲＬＵ」）をＹ−軸に示す。
【図７】ビオチンと特異的結合対を形成する被分析体ストレプトアビジンを用いて、ビオチンが結合するＡＥ標識ＨＳＰ（ＨＳＰ１６−１４，４０ｆｍｏｌ；配列番号１５）を滴定したグラフである。反応混合物中に存在するストレプトアビジンの量（ｆｍｏｌ）をＸ−軸に、検出したシグナル（ＲＬＵ）をＹ−軸に示す。
【図８】ビオチンと特異的結合対を形成する被分析体ストレプトアビジンを用いて、ビオチンが結合するＡＥ標識ＨＳＰ（ＨＳＰ１６−１４，２ｆｍｏｌ）を滴定したグラフである。反応混合物中に存在するストレプトアビジンの量（ｆｍｏｌ）をＸ−軸に、検出したシグナル（ＲＬＵ）をＹ−軸に示す。
【図９】被分析体ストレプトアビジン、及びＨＳＰに結合するビオチンと特異的結合対を形成する被分析体に対する競合体としての溶液中遊離ビオチンを用いて、ビオチンが結合するＡＥ標識ＨＳＰ（ＨＳＰ１６−１４）を競合滴定アッセイしたグラフである。反応混合物中に存在する競合体ビオチンの量（ｆｍｏｌ）をＸ−軸に、検出したシグナル（ＲＬＵ）をＹ−軸に示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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