(57)【要約】  遺伝子サイレンシングを達成するため、リバーストランスフェクション装置を細胞内へｓｉＲＮＡを導入するために使用することができる。こうした装置は、細胞をトランスフェクトするために構成されたウェルを有するウェルプレートを含むことができる。ウェルは第一の標的遺伝子を沈黙させる少なくとも第一のｓｉＲＮＡを有する実質的乾燥遺伝子サイレンシング組成物を含むことができる。遺伝子サイレンシング組成物は、少なくとも第一のｓｉＲＮＡがウェル中で細胞をトランスフェクトするために十分な量で水性媒質中に可溶化され、又は懸濁化できるように構成することができる。加えて、少なくとも第一のｓｉＲＮＡは修飾又はコンジュゲートを含むことができる。リバーストランスフェクション装置は、キット又はシステムとして提供することができ、それは加えて、細胞、ポリヌクレオチド担体、リバーストランスフェクション試薬などを含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子サイレンシングを達成するために細胞内にｓｉＲＮＡを導入するリバーストランスフェクション装置であって、
細胞をトランスフェクトするためのウェルを有するウェルプレート；及び
ウェル中の実質的乾燥遺伝子サイレンシング組成物、前記遺伝子サイレンシング組成物は、少なくとも第一の標的遺伝子を沈黙させる少なくとも第一のｓｉＲＮＡを有しており、前記遺伝子サイレンシング組成物は、少なくとも第一のｓｉＲＮＡがウェル中で細胞をトランスフェクトするために十分な量で水性媒質中に可溶化又は懸濁化されることが可能であるように構成されており、前記少なくとも第一のｓｉＲＮＡは少なくとも一つのヘアピン構造、修飾又はコンジュゲートを有している；
を含んでなる前記装置。
【請求項２】
修飾が少なくとも下記の一つにより特徴付けられる：
リン酸基を有する５’アンチセンス末端ヌクレオチド；
２’修飾を有するセンスヌクレオチド；
２’修飾を有するアンチセンスヌクレオチド；又は
２’ハロゲン修飾を有するアンチセンスヌクレオチド；
請求項１に記載の装置。
【請求項３】
修飾が少なくとも下記の一つによりさらに特徴付けられる：
２’修飾が、２’−Ｏ−脂肪族、２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−イソプロピル、２’−Ｏ−ブチル、２’−Ｏ−イソブチル、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＨ、２’−オルトエステル、２’−ＡＣＥ基オルトエステル、及びそれらの組み合わせから成る群より選択され；又は
２’ハロゲン修飾が、フッ素、塩素、臭素、ヨウ素及びそれらの組み合わせから成る群より選択されるハロゲンを含む；
請求項２に記載の装置。
【請求項４】
修飾が下記の少なくとも一つにより特徴付けられる：
２’修飾を有する第一及び第二のセンスヌクレオチド；
２’修飾を有する第一及び第二のアンチセンスヌクレオチド；又は
２’修飾を有する第二のアンチセンスヌクレオチド；
請求項３に記載の装置。
【請求項５】
修飾が下記の少なくとも一つによりさらに特徴付けられる：
少なくとも一つのセンスピリミジンヌクレオチドが２’修飾を有し；
少なくとも一つのアンチセンスピリミジンヌクレオチドが２’修飾を有し；又は
少なくとも一つのアンチセンスピリミジンヌクレオチドが２’ハロゲン修飾を有する；
請求項４に記載の装置。
【請求項６】
第一位及び第二位のセンスヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、第二位のアンチセンスヌクレオチドが２’−Ｏ−アルキル修飾を含み、及び５’アンチセンス末端ヌクレオチドがリン酸基を有する、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
コンジュゲートが、アミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、糖、炭水化物、ポリエチレングリコール、ステロイド、コレステロール、リン脂質、ジ−及びトリ−アシルグリセロール、脂肪酸、置換炭化水素、非置換炭化水素、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、ポリサッカリド、チオエーテル、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール、チオコレステロール、ドデカンジオール、ウンデシル基、リン脂質、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール、トリエチルアンモニウム、１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリアミン、酢酸アダマンタン、パルミチル部分、オクタデシルアミン部分、ヘキシルアミノカルボニル−オキシコレステロール、ファルネシル、ゲラニル、ゲラニルゲラニル、ラベル、蛍光ラベル、質量ラベル、及び放射活性ラベルから成る群より選択される、請求項１に記載の装置。
【請求項８】
コンジュゲートがコレステロール及び蛍光ラベルから成る群より選択される、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
コンジュゲートが、センス鎖又はアンチセンス鎖の一つの上で５’末端ヌクレオチド又は３’末端ヌクレオチドとカップルされる、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
コンジュゲートが、修飾ヌクレオチド、無修飾ヌクレオチド、ポリエーテル、ポリエチレングリコール、ポリアルコール、ポリプロピレン、ポリアルキルアミン、ポリアミン、スペルミジン、ポリエステル、ポリエチルアクリレート、ポリホスホジエステル、炭水化物、糖、プロピレングリコール、エチレングリコール、アルキレン及びそれらの組み合わせから成る群より選択されるリンカーを介して連結される、請求項７に記載の装置。
【請求項１１】
ｓｉＲＮＡを欠く少なくとも一つのウェルをさらに含んでなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１２】
少なくとも第一の対照ｓｉＲＮＡを有する少なくとも一つのウェルをさらに含んでなる、請求項１に記載の装置。
【請求項１３】
対照ｓｉＲＮＡが、既知の遺伝子をサイレンシングできるｓｉＲＮＡの少なくとも一つ、トランスフェクション対照ｓｉＲＮＡ、蛍光マーカーを有するｓｉＲＮＡ、少なくとも一つの毒素モチーフを有するｓｉＲＮＡ、又は非機能的ｓｉＲＮＡを含む、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
遺伝子サイレンシング組成物がｓｉＲＮＡのプールを含む、請求項１に記載の装置。
【請求項１５】
前記少なくとも第一のｓｉＲＮＡが合理的に設計されている、請求項１に記載の装置。
【請求項１６】
前記遺伝子サイレンシング組成物中のｓｉＲＮＡの総量が、そのウェルのみの細胞をトランスフェクトするために十分な量で存在する、請求項１に記載の装置。
【請求項１７】
ｓｉＲＮＡの総濃度が、水性媒質で可溶化又は懸濁化された場合、約１００ｎＭ未満である、請求項１６に記載の装置。
【請求項１８】
ｓｉＲＮＡの総濃度が、水性媒質で可溶化又は懸濁化された場合、約１ｎＭ未満である、請求項１７に記載の装置。
【請求項１９】
ウェルが実質的に平たい底表面を有する、請求項１に記載の装置。
【請求項２０】
プレートがポリスチレンから成っており、及び平底がカチオン性ポリマーで実質的にコートされている、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
遺伝子サイレンシングを達成するために細胞内にｓｉＲＮＡを導入するリバーストランスフェクション装置であって、
細胞をトランスフェクトするために構成されたウェルを有するウェルプレート；及び
ウェル中の実質的乾燥遺伝子サイレンシング組成物、前記遺伝子サイレンシング組成物は、少なくとも第一の標的遺伝子を沈黙させる少なくとも第一のｓｉＲＮＡを有しており、前記遺伝子サイレンシング組成物は、少なくとも第一のｓｉＲＮＡがウェル中で細胞をトランスフェクトするために十分な量で水性媒質中に可溶化又は懸濁化されることが可能であるように構成されている；
を含んでなる前記装置。
【請求項２２】
遺伝子サイレンシングを達成するために細胞内にｓｉＲＮＡを導入する請求項２１の装置を含むシステムであって、
請求項２１のウェルプレート；及び
少なくとも第一のｓｉＲＮＡと複合体形成するように構成されたポリヌクレオチド担体；
を含んでなる前記システム。
【請求項２３】
前記少なくとも第一のｓｉＲＮＡが、少なくとも一つのヘアピン構造、修飾又はコンジュゲートを含む、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２４】
ｓｉＲＮＡのプールが合理的に設計されている、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２５】
前記遺伝子サイレンシング組成物中のｓｉＲＮＡの総量が、そのウェルのみの細胞をトランスフェクトするために十分な量で存在する、請求項２２に記載のシステム。
【請求項２６】
遺伝子サイレンシングを達成するために細胞内にｓｉＲＮＡを導入するリバーストランスフェクションの方法であって、
少なくとも一つのヘアピン構造、修飾又はコンジュゲートを含んだ少なくとも第一のｓｉＲＮＡを有している実質的に乾燥された遺伝子サイレンシング組成物を含有するウェルを提供すること；
前記少なくとも第一のｓｉＲＮＡを溶液内に懸濁する、又は可溶化するために水性溶液を加えること；及び
前記少なくとも第一のｓｉＲＮＡが細胞内に導入されることを可能にする条件下でウェルに細胞を加えること；
を含んでなる方法。
【請求項２７】
さらに、
ｓｉＲＮＡ−担体複合体を形成するため、ウェルにポリヌクレオチド担体を加えること、ここでｓｉＲＮＡ−担体複合体は溶液中に懸濁又は可溶化される；及び
ｓｉＲＮＡ−担体複合体を細胞に接触させること；
を含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ポリヌクレオチド担体が脂質である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
さらに、細胞増殖、細胞分割及び／又は遺伝子サイレンシングが起こる条件下でウェルを維持することを含んでなる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
さらに、少なくとも５０％の標的ポリペプチドのサイレンシング産生を含んでなる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
さらに、少なくとも８０％の標的ポリペプチドのサイレンシング産生を含んでなる、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
細胞が、０．３５ｃｍ２の細胞増殖表面面積当たり、約２ｘ１０３〜約３ｘ１０４細胞の量で加えられる、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
この米国特許出願は、２００４年１１月２２日に提出された米国仮出願番号第60/630,320号及び２００４年１１月２２日に提出された米国仮出願番号第60/678,165号（両方とも本明細書において援用される）の優先権を主張する。この出願は、「APPARATUS AND SYSTEM HAVING DRY GENE SILENCING COMPOSITIONS」と題し、２００５年１１月１８日に提出された米国実用特許出願番号未詳、代理人整理番号第16542.1.1号；「APPARATUS AND SYSTEM HAVING DRY GENE SILENCING POOLS」と題し、２００５年１１月１８日に提出された米国実用特許出願番号未詳、代理人整理番号第16542.1.2号；「APPARATUS AND SYSTEM HAVING DRY CONTROL GENE SILENCING COMPOSITIONS」と題し、２００５年１１月１８日に提出された米国実用特許出願番号未詳、代理人整理番号第16542.1.3号；及び「METHOD OF DETERMINING A CELLULAR RESPONSE TO A BIOLOGICAL AGENT」と題し、２００５年１１月１８日に提出された米国実用特許出願番号未詳、代理人整理番号第16542.1.4号（ここで、各々は本明細書において援用される）も請求する。
【背景技術】
【０００２】
１．技術分野
本発明は、ＲＮＡ干渉に使用するための装置及びシステムに関する。特に、本発明はｓｉＲＮＡを含んでなる乾燥遺伝子サイレンシング組成物を有するウェルプレートを含む、装置及びシステムに関する。
【０００３】
２．関連技術
最近、タンパク質産生を制御するために、転写されたマイクロＲＮＡ（「ｍｉＲＮＡ」）を使用する天然の細胞制御経路が発見された。ｍｉＲＮＡは、センス及びアンチセンスＲＮＡの二本鎖領域を含む。この制御経路は、相補的ｍＲＮＡを標的とするためにｍｉＲＮＡを使用し、コードされたタンパク質の産生を阻害する。従って、ｍＲＮＡによりコードされたタンパク質の産生を抑制又は停止させるためのこのＲＮＡ干渉経路には複雑な一連のタンパク質が関与する。そのようなものとして、本プロセスは、ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉと称されている。
【０００４】
加えて、遺伝子をサイレンシングする及びタンパク質発現を抑制するために、合成ｄｓＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ）でＲＮＡｉ経路を使用することが可能である。このことは、産生されるべき特異的配列を有するｓｉＲＮＡが、特異的タンパク質をコードする相補的ＲＮＡ及び／又はＲＮＡを標的とすることを可能にする。ｓｉＲＮＡは天然のＲＮＡｉ経路と相互作用することが可能であり、標的遺伝子を沈黙（ｓｉｌｅｎｃｅ）させ、そしてコードされたポリペプチドの産生を抑制する。特異的遺伝子を沈黙させ、そしてコードされたタンパク質の産生を抑制する能力は、遺伝子機能、遺伝子マッピング、細胞経路分析及び他の遺伝子関連研究の基本的探究に使用されてきた。
【０００５】
遺伝子サイレンシングを導入するためには、ｓｉＲＮＡは細胞内に導入される必要がある。細胞内に核酸を導入するための最も普通の方法はフォワードトランスフェクションであったが、より最近になってリバーストランスフェクション（「ＲＴＦ」）が開発され、フォワードトランスフェクション法の代替法として使用された。ＲＴＦプロトコルの特定のバージョンにおいて、脂質−核酸の複合体（例えば、リポプレックス（ｌｉｐｏｐｌｅｘ））を製造し、そしてウェルプレートの試験ウェル内に導入することができる。細胞を脂質−核酸複合体を含む試験ウェル内に導入し、ｓｉＲＮＡが細胞内に侵入するようにインキュベートする。いくつかのＲＴＦプロトコルの例を、Palsson による米国特許第５，８１１，２７４号、Palsson による米国特許第５，８０４，４３１号、Sabatini による米国特許第６，５４４，７９０号、及びSabatini による米国公開出願第２００２／０００６６６４号及びCaldwell et al. による米国公開出願第２００３／０７０６４２号に見ることができる。これらの参考文献に記載されているように、核酸のＲＴＦ法は一般に、伝統的なフォワードトランスフェクションと比較してより少ない工程であることが可能であり、ガラススライドのような単一表面の特定の領域にトランスフェクトされた細胞を単離する試みにおいて利点を与えることができる。しかしながら、ｓｉＲＮＡについてのＲＴＦ法は実際的な応用に点については最適化されておらず、特に、複数の異なったｓｉＲＮＡ、異なった遺伝子標的又は異なった細胞株で実験しているような状況について、遺伝子サイレンシング効率における改良がまだ必要とされている。
【０００６】
それ故、ＲＮＡｉ経路を介した遺伝子サイレンシングを達成するため、細胞内へｓｉＲＮＡを送達する、改良されたＲＴＦプロトコルを有することは都合がよいであろう。加えて、遺伝子サイレンシングの効率を増強する様式に設定されたＲＴＦフォーマットを有することも有益であろう。
【発明の開示】
【０００７】
【発明の要旨】
【０００８】
一般に、本発明の態様は、細胞において遺伝子サイレンシングを達成するためのウェルプレート、キット、システム及びそれを使用する方法を含む。従って、本発明は、ＲＮＡｉ経路を介して遺伝子サイレンシングを達成するため、細胞内へｓｉＲＮＡを送達するための改良されたＲＴＦプロトコルを実行する、ウェルプレート、キット及びシステムを提供する。加えて、本ウェルプレート、キット及びシステムは、リバーストランスフェクション間の安定性を増強する様式で、ＲＴＦプロトコルで実行されるように設定されたｓｉＲＮＡを含むことが可能である。さらに、本発明は、こうしたウェルプレート、キット及びシステムを使用する方法を含む。
【０００９】
一つの態様において、本発明は、遺伝子サイレンシングを達成するため、細胞内へｓｉＲＮＡを導入するように設定されたリバーストランスフェクション装置を含む。本ウェルは、少なくとも第一の標的遺伝子を沈黙させる少なくとも第一のｓｉＲＮＡを有する、実質的乾燥遺伝子サイレンシング組成物を含むことが可能である。遺伝子サイレンシング組成物は、ｓｉＲＮＡがウェル中で細胞をトランスフェクトするために十分な量で水性媒質中に可溶化又は懸濁化されることができるように設定されている。場合により、遺伝子サイレンシング組成物中のｓｉＲＮＡの総量は、一つのウェルのみについて、リバーストランスフェクションを実行するために十分である。加えて、ｓｉＲＮＡはループ、修飾又はコンジュゲートを有している少なくとも一つのヘアピン構造を有していてもよい。また、ｓｉＲＮＡは、非標的遺伝子の有意なサイレンシングを誘導しない効率的な様式で、標的遺伝子を特異的に沈黙させるように合理的に設計することが可能である。さらに、遺伝子サイレンシング組成物は、同一遺伝子の異なったポリヌクレオチドを標的とするｓｉＲＮＡのプールを含むことが可能である。
【００１０】
一つの態様において、本発明は、前記の特徴付けのいずれかと一致したウェルプレートを含む、キット又はシステムを提供する。加えて、こうしたキット又はシステムはポリヌクレオチド担体を含むことが可能である。ポリヌクレオチド担体は、カチオン性脂質、ポリマー、ポリペプチド、リポポリマー、脂質−ポリペプチド組み合わせなどであることができる。加えて、本キット又はシステムは、以下により詳細に議論される多様な可溶化溶液、試薬、細胞培養培地などを含むことが可能である。
【００１１】
一つの態様において、本発明は遺伝子サイレンシングを達成するため、細胞内にｓｉＲＮＡを導入するためのリバーストランスフェクションの方法を含む。こうした方法は、前記の特徴付けに従ったウェルプレートを提供することを含むことが可能である。遺伝子サイレンシング組成物及び／又はｓｉＲＮＡを溶液内に懸濁又は可溶化するように、水性媒質をウェルへ加えることが可能である。加えて、ｓｉＲＮＡが細胞へ入ることを可能にする条件下で、細胞をウェルに加えることが可能である。例えば、細胞を９６ウェルプレート中の異なったウェルに、約０．３ｃｍ２〜約０．３５ｃｍ２の細胞増殖表面領域当たり、約１ｘ１０３〜約３．５ｘ１０４細胞、より好ましくは、２ｘ１０３〜約３ｘ１０４の量で加えることが可能である。
【００１２】
一つの態様において、本方法は、ｓｉＲＮＡ−担体複合体を形成するように、ポリヌクレオチド担体を加えることを含むことが可能である。ｓｉＲＮＡ−担体複合体は、水性媒質中に懸濁又は可溶化することが可能であり、そして細胞内への侵入（それはいずれのエンドサイトーシス過程であってもよい）を誘導するために細胞と接触させることが可能である。そのようなものとして、ポリヌクレオチド担体を、水性媒質の一部として又はそれに加えて、ウェルへ加えることが可能である。ポリヌクレオチド担体は、カチオン性脂質、ポリマー、リポポリマー、ポリペプチド、抗体−ポリペプチドコンジュゲートなどであることができる。もしくは、エレクトロポレーション、沈降、物理的衝撃、オプトポレーションなどを含む他のポリヌクレオチド送達法を、細胞内へｓｉＲＮＡを送達するために使用することが可能である。
【００１３】
ウェル中で細胞をｓｉＲＮＡ組成物と混合した後、ウェルプレートを細胞増殖、細胞分割及び／又は遺伝子サイレンシングが起こるような条件下で維持することが可能である。こうした条件は、通常は当該技術分野ではよく知られている正常細胞培養条件である。そのようなものとして、ｓｉＲＮＡは標的遺伝子をサイレンシングし、少なくとも５０％まで、より好ましくは少なくとも７０％まで、及び最も好ましくは少なくとも９０％まで標的ポリペプチドの産生を抑制することが可能である。
【００１４】
本発明のこれら及び他の態様及び特色は、以下の記述及び付随する特許請求の範囲からより明らかになるであろうし、又は以下に示した本発明の実施により学ぶことができる。
【発明の詳細な説明】
【００１５】
一般的には、本発明は細胞中で遺伝子サイレンシングを達成することに使用するための装置及びシステムに関する。本装置は、ＲＴＦプロトコルで使用するために可溶化又は懸濁化することが可能である、ｓｉＲＮＡを含んでなる乾燥遺伝子サイレンシング組成物を有する、ウェルを伴ったプレートを含む。キットとして提供することが可能である本システムは、プレート、及びｓｉＲＮＡを送達するために細胞に侵入することが可能なトランスフェクション複合体を形成するためのｓｉＲＮＡと混合できるポリヌクレオチド担体を含む。加えて、本キットは、ｓｉＲＮＡ可溶化又は懸濁化水性媒質、対応する担体溶液中のポリヌクレオチド担体、細胞培養培地などを含むことが可能である。
【００１６】
本発明のウェルプレート、システム、キット及び方法は、実験室自動化設備の使用を伴った又は伴わない、高含量スクリーニング（「ＨＣＳ」）及び高スループットスクリーニング（「ＨＴＳ」）応用での使用に設定することが可能である。また、本ウェルプレート、システム、キット及び方法は、ロボットシステムのような自動化システムで使用することも可能である。しかしながら、本ウェルプレート、システム、キット及び方法は、自動化送達システム又はロボット工学の助けなしにＲＴＦプロトコルで使用することも可能であり、そしてそれ故、手動処理を使用する、実験室のための高価なロボット送達システムの効率的な代替手段を提供することが可能である。それ故、本ウェルプレート、システム、キット及び方法は、高スループットスクリーニングを費用的に効率的な様式で行うことが可能であるように、選択における多用途性を提供する。
【００１７】
以下の用語法は、本発明の態様を記述する際に使用される用語を明確にするために本明細書で定義され、制限することを意図するものではない。そのようなものとして、以下の用語法は、関連する分野の当業者によるこうした用語の理解を補足するために提供される。
【００１８】
本明細書において用語「２’修飾」とは、二番目の位置の原子で起こる、ヌクレオチドの化学修飾を指すことが意図される。そのようなものとして、２’修飾は、ヌクレオチド、又はオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド内ヌクレオチドのリボース環の２’炭素への、化学修飾基のコンジュゲーションを含むことが可能である。それ故、２’修飾は、ヌクレオチドの２’位原子で起こる。
【００１９】
本明細書において用語「脂肪族」とは、主鎖中に２０又はそれ未満の炭素又はヘテロ原子を有する、アルキル基のような炭化水素部分を指すことが意図され、それは直鎖又は分枝鎖、飽和又は不飽和、及び／又は置換又は未置換であることができる。脂肪族基は、直線状、分枝状、環式及び／又はヘテロ環式である部分を含んでなることができ、及びエーテル、ケトン、アルデヒド、カルボキシレートなどのような官能基を含むことができる。脂肪族基内の置換は、限定されるわけではないが、ハロゲン、硫黄、チオール、チオエーテル、チオエステル、アミン（第一、第二又は第三）、アミド、エーテル、エステル、アルコール、酸素などを含む、脂肪族部分に許容できるいずれかの原子又は基を含むことが可能である。さらに脂肪族基は、例えば、窒素、酸素、リン又は硫黄のようなヘテロ原子よるヘテロ置換（これらは炭素原子の置換である）も含むことができる。
【００２０】
本明細書において用語「アルキル」とは、鎖中に炭素及び水素両方を有するヒドロカルビル部分を指すことが意図される。好ましくは、アルキル部分は水素及び炭素のみから成っている。アルキル部分は、直線状、分枝状及び／又は環式であることができる。好ましくは、アルキル部分は枝分れされてなく、環式ではなく、完全に飽和されており、そして置換されていない。
【００２１】
アルキル基の例には、限定されるわけではないが、例えば、メチル、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシル及びより多い炭素数のアルキル基、並びに、２−メチルプロピル、２−メチル−４−エチルブチル、２，４−ジエチルプロピル、３−プロピルブチル、２，８−ジブチルデシル、６，６−ジメチルオクチル、６−プロピル−６−ブチルオクチル、２−メチルブチル、２−メチルペンチル、３−メチルペンチル、２−エチルヘキシル、イソプロピル、イソブチル、イソペンチルなどが含まれる。用語アルキルは、ビニルのようなアルケニル基、アリル、アラルキル及びアルキニル基も包含する。アルキル基の置換は、こうした置換が、アルキル基が置換されている分子の機能を実質的に妨害しない限り、いずれかの適した原子に行うことが可能である。
【００２２】
本明細書において用語「アンチセンス鎖」とは、目的の標的核酸と少なくとも実質的に（例えば、約８０％又はそれ以上）又は１００％相補的であるポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドの領域を指すことが意図される。また、ｄｓＲＮＡのアンチセンス鎖はそのセンス鎖と相補的である。アンチセンス鎖は、ＲＮＡ、ＤＮＡ又はキメラＲＮＡ／ＤＮＡであるポリヌクレオチドを含んでなることができる。加えて、アンチセンス鎖内のいずれのヌクレオチドもそれらにカップルされた置換基を導入することにより修飾することが可能である（２’での修飾のような）。アンチセンス鎖は、小分子及び／又はコンジュゲートの多様な基で修飾することが可能である。例えば、アンチセンス鎖は、全部又は一部が、メッセンジャーＲＮＡ（「ｍＲＮＡ」）の分子、非翻訳領域ＲＮＡを含んでいるｍＲＮＡではないＲＮＡ配列（例えば、ｔＲＮＡ及びｒＲＮＡ）、又は翻訳領域あるいは非翻訳領域であるＤＮＡの配列と相補的であることができる。用語「アンチセンス鎖」及び「アンチセンス領域」は均等であることが意図されており、相互交換的に使用される。
【００２３】
本明細書において用語「相補的」及び「相補性」とは、お互いに塩基対を形成するポリヌクレオチドの能力を指すことが意図される。塩基対は典型的には、逆平行ポリヌクレオチド鎖中のヌクレオチドユニット間の水素結合により形成される。相補的ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン−クリック様式（例えば、ＡとＴ、ＡとＵ、ＣとＧ）で、又は二重鎖の形成を可能にするいずれか他の様式で塩基対を作ることが可能である。当業者には認識されるように、ＤＮＡに対するものとしてＲＮＡを使用した場合、アデノシンに相補的であると考えられている塩基は、チミンよりもむしろウラシルである。
【００２４】
完全相補性又は１００％相補性とは、一つのポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチドユニットが逆平行ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチドユニットと水素結合可能である状況を指す。完全相補性未満の相補性とは、二つの鎖の、全部ではないがいくつかのヌクレオチドユニットがお互いに水素結合可能である状況を指す。例えば、二つの２０−ｍｅｒについて、もし各鎖上の二つのみの塩基対がお互いに水素結合可能であれば、ポリヌクレオチド鎖は１０％相補性を示す。同じ例において、もし各鎖上の１８の塩基対がお互いに水素結合可能であれば、ポリヌクレオチド鎖は９０％相補性を示す。「実質的な相補性」とは、非相補的となるように選択された、オーバーハングのようなポリヌクレオチド鎖の領域を除いて、７９％又はより多い相補性を示しているポリヌクレオチド鎖を指す。従って、相補性は、逆平行鎖上のヌクレオチドと同一又は相補的でないように選択されたオーバーハングを考慮しない。
【００２５】
本明細書において用語「コンジュゲート」とは、ｓｉＲＮＡのセンス鎖かあるいはアンチセンス鎖と結合されている分子、大分子又は高分子構造を指すことが意図される。即ち、ｓｉＲＮＡに結合されている部分がコンジュゲートと考えられる。目的を明確にするため、ｓｉＲＮＡは、共有結合、イオン相互作用及び類似のカップリングによりカップルされているコンジュゲートを含むことが可能である。通常、コンジュゲートは安定化又は標的化特異性以外の機能性を与えるためにｓｉＲＮＡとカップルされる。例えば、コレステロールのようないくつかのコンジュゲートは、細胞へ侵入するｓｉＲＮＡの能力を増強するために使用することが可能である。他のコンジュゲートは、トランスフェクション又は細胞中でのｓｉＲＮＡの存在を検出するために使用されるラベルであることができる。通常、コンジュゲートはリンカーを介してｓｉＲＮＡとカップルされる。
【００２６】
本明細書において用語「デオキシヌクレオチド」とは、その糖部分の２’位のヒドロキシル基（例えば、ＯＨ基）を欠くヌクレオチドを指すことが意図される。代わりに、水素が２’炭素に結合されている。それ故、一つ又はそれより多くのデオキシヌクレオチドを含んでなるＲＮＡ分子は、糖部分の２’位でのＯＨ基の欠如を示し、２’炭素に直接結合された水素を有する。同様に、用語「デオキシリボヌクレオチド」及び「ＤＮＡ」は、その２’位に水素を有する、少なくとも一つの糖部分を含んでなるリボヌクレオチド又はポリリボヌクレオチドを含む。
【００２７】
本明細書において、遺伝子サイレンシング組成物に関連して使用される用語「乾燥された」又は「乾燥」とは、流体ではなくそして流動しない組成物を指すことが意図される。しかしながら、これは少量の水又は他の溶媒を排除するものではなく、調製物が実質的には液体形態ではないが、ウェル中で「乾燥されて」いるように、例えば、１気圧、室温及び外界湿度のような標準又は外界条件で平衡化されたＲＮＡ調製物に残存する水分量を含む。例えば、もし約１気圧で、約２０〜４０℃で、そして約５０〜約９５％の湿度で、調製物が平衡化され、ウェルプレートが、反転された場合、又は、例えば水平から９０゜へ傾けられても、ＲＮＡ調製物が移動しない又はウェル内で流れないならば、ｓｉＲＮＡ調製物は「乾燥されている」又は実質的に「乾燥している」。このことは、傾けられた場合に流れる又は広がるであろう液体調製物と比較される。種々の態様において、トランスフェクションを実施するために乾燥遺伝子サイレンシング組成物を使用する方法は、混合物を形成させるため、乾燥調製物を適した媒質に可溶化させること又は懸濁させることを含むことができる。加えて、適した水性媒質は、細胞内へのｓｉＲＮＡの導入を容易にすること、及びトランスフェクションを達成するために混合物を一つ又はそれより多くの細胞に暴露することが可能なポリヌクレオチド担体を含むことができる。
【００２８】
本明細書において用語「二重鎖領域」とは、ワトソン−クリック塩基対形成かあるいはポリヌクレオチド鎖間の安定化された二重鎖を可能にする他の様式により、お互いに塩対を形成する二つの相補的又は実質的に相補的なポリヌクレオチド中の領域を指すことが意図される。例えば、２１ヌクレオチドユニットを有している一つのポリヌクレオチド鎖は、たとえ「二重鎖領域」が１９塩基対を有するように、各鎖上の１９塩基のみが相補的であっても、別の２１ヌクレオチドユニットのポリヌクレオチドと塩基対形成可能である。残りの塩基は、例えば、５’及び／又は３’オーバーハングとして存在することができる。さらに、二重鎖領域内で１００％相補性は必要とされず、実質的相補性が二重鎖領域内で許容可能である。実質的相補性とは７９％又はそれ以上の相補性を指し、結果としてミスマッチ及び／又はバルジを生じることが可能である。例えば、１９塩基対から成る二重鎖領域中の単一ミスマッチは９４．７％相補性となり、二重鎖領域を実質的に相補性を与えている。
【００２９】
本明細書において用語「機能性」とは、ｓｉＲＮＡにより誘導された遺伝子特異的サイレンシングのレベルを指すことが意図される。一般に、機能性は遺伝子サイレンシングのパーセンテージで表現されている。それ故、遺伝子（例えば、Ｆ９０）の９０％サイレンシングとは、正常レベルの１０％のみの遺伝子発現が観察される状況を指す。同様に、遺伝子（例えば、Ｆ９０）の８０％サイレンシングとは、正常レベルの２０％のみの遺伝子発現が観察される状況を指す。
【００３０】
本明細書において用語「遺伝子サイレンシング」とは、特異的遺伝子産物の発現が、少なくなっている、弱められている及び／又は停止されていることにより抑制されるプロセスを指すことが意図される。遺伝子サイレンシングは多様な経路により起こすことが可能である。一つの例において、遺伝子サイレンシングはＲＮＡｉ経路によって生じる遺伝子産物発現の減少を指すことが可能であり、ここにおいてｓｉＲＮＡは宿主タンパク質（例えば、ＲＩＳＣ）と協力して働き、配列依存的様式で遺伝子産物を減少させる。もしくは、遺伝子サイレンシングは、ｓｉＲＮＡ仲介翻訳阻害によって生じる遺伝子産物の減少を指すことが可能である。さらに別の方法において、遺伝子サイレンシングは、ｓｉＲＮＡ仲介転写阻害によって生じる遺伝子産物の減少を指すことが可能である。遺伝子サイレンシングのレベルは、ノーザンブロット分析による転写レベルの測定、Ｂ−ＤＮＡ技術、転写感受性レセプター構築物、発現プロファイリング（例えば、ＤＮＡチップ）及び関連する技術及びアッセイを含むことが可能な種々の方法により測定することが可能である。もしくは、遺伝子サイレンシングのレベルは、対応するｍＲＮＡから翻訳された特異的遺伝子によりコードされたタンパク質のレベルを評価することにより測定することが可能である。このことは、ウェスタン分析、比色又は蛍光特性（例えば、ＧＥＰ）、酵素活性（例えば、アルカリホスファターゼ）のようなレポータータンパク質の発現のレベルを測定すること、又は他のよく知られた分析法を含む、いくつかの研究法を実行することにより達成することが可能である。
【００３１】
本明細書において用語「ヌクレオチド間結合（ｌｉｎｋａｇｅ）」とは、ポリヌクレオチド中の二つのヌクレオチドユニット間に存在する化学結合（ｂｏｎｄ）又は連結（ｌｉｎｋ）のタイプを指すことが意図され、ここにおいて結合は修飾されていても修飾されていなくてもよい。句「修飾ヌクレオチド間結合」は、現在知られている又は後で開発されるすべての修飾ヌクレオチド間結合を含む。ヌクレオチド間結合は付随する対イオンを有していてもよく、そして前記の句は、こうした対イオン及びヌクレオチド間結合で形成可能ないずれの配位錯体も含むことが意図される。
【００３２】
本明細書において用語「ミスマッチ」は、センス鎖のヌクレオチド及びアンチセンス鎖のヌクレオチド間でワトソン−クリック塩基対形成が起こっていない状況を含み、ここで非塩基対形成ヌクレオチドには、非塩基対形成ヌクレオチド直後に始まるミスマッチから５’方向に（例えば、５’方向に）、そして非塩基対形成ヌクレオチドの直後に始まるミスマッチから３’方向に（例えば、３’方向に）、塩基対を含んでなる二重鎖が隣接する。ミスマッチの例は、Ｇの向かいにＡ、Ａの向かいにＣ、Ｃの向かいにＵ、Ａの向かいにＡ、Ｇの向かいにＧ、Ｃの向かいにＣなどであろう。ミスマッチは、ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドの向かいに塩基脱落残基、ヌクレオチド又は修飾ヌクレオチドの向かいに非環式残基、ギャップ又は不対ループを含むことも意図される。その最も広い意味においては、本明細書で使用されるミスマッチは、特定の位置での二重鎖の熱力学的安定性がその位置でのワトソン−クリック塩基対の熱力学的安定性よりも小さいように、改変が出現した位置の又は近傍の熱力学的安定性を減少させる、所与の位置でのいずれかの改変を含む。
【００３３】
本明細書において用語「ヌクレオチド」は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド又はそれらの修飾形、ならびにそれらの類似体を指すことが意図される。ヌクレオチドは、プリン類、例えば、アデニン、ヒポキサンチン、グアニン及びそれらの誘導体及び類似体、ならびにピリミジン類、例えば、シトシン、ウラシル、チミン及びそれらの誘導体及び類似体を含んでなる化学種を含む。ヌクレオチドは当該技術分野では公知である。ヌクレオチド類似体には、限定されるわけではないが、５’位ピリミジン修飾、８’位プリン修飾、シトシン環外アミンでの修飾、５−ブロモ−ウラシルの置換及び２’位糖修飾（例えば、２’修飾）を含む、塩基、糖及び／又はリン酸の化学構造中に修飾を有しているヌクレオチドが含まれる。こうした修飾には、２’−ＯＨがＨ、ＯＲ、Ｒ、ハロ、ＳＨ、ＳＲ、ＮＨ２、ＮＨＲ、ＮＲ２又はＣＮ（式中Ｒは、アルキル又は脂肪族部分である）のような基により置き換えられている糖修飾リボヌクレオチドが含まれる。ヌクレオチド類似体には、イノシン、キュェオシン、キサンチンのような塩基、２’−メチルリボースのような糖、メチルホスホネート、ホスホロチオエート及びペプチドのような非天然ホスホジエステル結合を有するヌクレオチドも含まれる。また、第一のヌクレオチド又は第一位のヌクレオチドに関しては、二重鎖領域の最も５’位のヌクレオチドを指し、そして第二のヌクレオチドは３’末端に向かって次のヌクレオチドである。ｓｉＲＮＡの末端に伸びる二重鎖領域の例では、５’末端ヌクレオチドが第一のヌクレオチドでありうる。
【００３４】
本明細書において用語「修飾塩基」は、例えば、一つ又はそれより多くの原子又は基の置き換え又は付加により修飾されているアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシン及びキュェオシンのようなヌクレオチド塩基を指すことが意図される。塩基部分への修飾のタイプのいくつかの例には、限定されるわけではないが、個々に又は組み合わされた、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化又はアセチル化塩基が含まれる。より具体的な例には、例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジン及び５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、７−デアザ−アデノシンのようなデアザヌクレオチド、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン及び４−チオウリジン及び２−チオシチジンのような他のチオ塩基、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キュェオシン、アーケオシン、ナフチル及び置換ナフチル基、Ｎ６−メチルアデノシンのようないずれかのＯ−及びＮ−アルキル化プリン及びピリミジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン  ５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、アミノフェノール又は２，４，６−トリメトキシベンゼンのようなフェニル及び修飾フェニル基、Ｇ−クランプ（ｃｌａｍｐ）ヌクレオチドとして働く修飾シトシン、８−置換アデニン及びグアニン、５−置換ウラシル及びチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、及びアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが含まれる。修飾ヌクレオチドは、糖部分に関して修飾されたヌクレオチド、ならびにリボシルではない糖又は類似体を有するヌクレオチドも含む。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース及び他の糖、ヘテロ環又は炭素環であること、または基づくことができる［注：必要に応じ調査及び編集されたい］。
【００３５】
加えて、用語「ヌクレオチド」は、ユニバーサル塩基として当該技術分野で公知のものを含むことが意図される。例としては、限定されるわけではないが、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール又はネブラリンが含まれる。用語「ヌクレオチド」は、アミン基によるリボシル３’酸素の置換により生じるＮ３’からＰ５’へのホスホロアミデートを含むことも意図する。
【００３６】
本明細書において用語「オフターゲット」及び「オフターゲット効果」は、合成ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡのようなｓｉＲＮＡが所与の標的mRNAに対して方向付けられているが、非標的タンパク質発現を減少させる様式で、別のｍＲＮＡ、ＤＮＡ、細胞性タンパク質又は他の部分と直接的か又は間接的に相互作用することにより意図されない影響を生じるいずれかの例を指すことが意図される。しばしば、ｓｉＲＮＡがｓｉＲＮＡと同一の又は類似のポリヌクレオチド配列を有する非標的mRNAと相互作用した場合にこのことを起こすことができる。例えば、「オフターゲット効果」は、非標的mRNAとｓｉＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンス鎖間の部分的相同性又は相補性による他の非標的mRNAの同時分解がある場合に起こってもよい。
【００３７】
本明細書において用語「オンターゲット」は、標的mRNA又はＤＮＡによりコードされているポリペプチドの産生を抑制するため、ｓｉＲＮＡが優先的に標的mRNA又はＤＮＡを標的とし及び相互作用するであろう可能性を増加させる、ｓｉＲＮＡの修飾の一組を指すことが意図される。これは、標的遺伝子をサイレンシングすることについてｓｉＲＮＡの特異性を増加させる。例えば、オンターゲット修飾は、センス領域の第一及び第二のヌクレオチドが各々２’−Ｏ−メチル部分を有し、そしてアンチセンス鎖がその５’末端でリン酸化されているｓｉＲＮＡを含むことができ、こうしたオンターゲット修飾は、
Ｏｎ−Ｔａｒｇｅｔ（商標）（Dharmacon,Inc.）と名付けられた専売の修飾も指す。いずれにしても、オンターゲット修飾はオフターゲット効果を減少させるのを助けるために使用することが可能である。また、ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡのアンチセンス領域に相補性を有するセンス領域を有することが可能であり、ここでアンチセンス領域は標的mRNAに相補性を有する領域である。
【００３８】
本明細書において用語「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチド間結合を介してお互いに連結されたヌクレオチドのポリマーを指すことが意図される。また、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、規則的に及び／又は不規則に交互するデオキシリボシル部分及びリボシル部分のポリヌクレオチド鎖を含むＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド（即ち、交互するヌクレオチドユニットは、糖部分の２’位に−ＯＨ、次に−Ｈ、次に−ＯＨ、次に−Ｈなどを有する）、及びこれらの種類のポリヌクレオチドの修飾物を含む。また、ポリヌクレオチドは、種々の修飾を有する又はいずれかの位置でヌクレオチドユニットへの種々のエンティティー又は部分の付着を有するヌクレオチドも含む。
【００３９】
本明細書において用語「ポリリボヌクレオチド」は、２つ又はそれより多くの修飾又は無修飾リボヌクレオチド及び／又はそれらの類似体を含んでなるポリヌクレオチドを指すことが意図される。用語「ポリリボヌクレオチド」は用語「オリゴリボヌクレオチド」と相互交換的に使用される。
【００４０】
本明細書において用語「合理的設計」及び「合理的に設計された」は、標的配列とは無関係である一つ又はそれより多くの基準に基づいて、遺伝子サイレンシング応用に使用するための一つ又はそれより多くのｓｉＲＮＡ（単数又は複数）の選択又は設計を指すことが意図される。そのようなものとして、合理的に設計されたｓｉＲＮＡが、選択されたｍＲＮＡと特異的に相互作用しそして選択されたｍＲＮＡからのポリペプチド翻訳を阻害するように選択される。それ故、いずれか一つの標的mRNAについて、標的mRNAと１００％相補的である１８〜３１塩基対を有する数百の潜在的ｓｉＲＮＡが存在することができる。一部、このことは単一ｍＲＮＡが、ｓｉＲＮＡにより特異的に標的とされることが可能である複数の配列を有することができるからである。しかしながら、すべてのｓｉＲＮＡが等しい機能性を有しないであろうことはあり得ることである。経験的研究を通して、特定の位置における特定の窒素性塩基の存在又は不在、相対的ＧＣ含量などを含む多数の他の因子が、特定的なｓｉＲＮＡの機能性に影響することが可能である。合理的に設計されたｓｉＲＮＡに関する追加の情報は、２００３年１１月１４日に提出された、共同所有の米国特許出願１０／７１４，３３３、ＷＯ２００４／０４５５４３  Ａ２として２００４年６月３日に公開された関連ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／３６７８７、２００４年９月１４日に提出され、米国特許出願公開２００５／０２５５４８７として公開された米国特許出願１０／９４０，８９２、２００４年５月１２日に提出された関連ＰＣＴ出願  ＰＣＴ／ＵＳ０４／１４８８５、及び米国特許出願公開２００５／０２４６７９４（各々は本明細書において援用される）に見ることが可能である。
【００４１】
本明細書において用語「リバーストランスフェクション」及び略語「ＲＴＦ」は各々、細胞内へｓｉＲＮＡのような核酸を導入するためのプロセスを指すことが意図される。細胞内へのｓｉＲＮＡのこうした導入は、ウェル中で核酸及び細胞を混合することにより達成することが可能であり、ここで細胞はまだ増殖表面に前もって付着又は維持されていない。リバーストランスフェクションは、核酸が細胞内に侵入できるような様式で、細胞表面上に核酸を接触させることにより進行する。通常、ｓｉＲＮＡは、細胞へ接触させることに先だって、脂質又は他のポリヌクレオチド担体と複合体形成される。リバーストランスフェクションは、ｓｉＲＮＡの添加前にウェル又は他の容器の細胞増殖表面に播種及び維持されていないので、フォワードトランスフェクションとは異なる。
【００４２】
本明細書において用語「リボヌクレオチド」、「リボ核酸」及び「ＲＮＡ」は、少なくとも一つのリボヌクレオチドユニットを含んでなる修飾又は無修飾ヌクレオチド又はポリヌクレオチドを指すことが意図される。典型的には、すべてのヌクレオチドユニットはリボヌクレオチドである。無修飾リボヌクレオチドユニットは、リボシル部分の１’位にＮ−グリコシド結合で付着された窒素性塩基を有するリボシル部分の２’位へ付着されたヒドロキシル基、及び別のヌクレオチドへの結合を可能にするか又は結合を防止する部分を含んでなる。リボヌクレオチド、リボ核酸及びＲＮＡは当該技術分野では公知である。
【００４３】
本明細書において用語「センス鎖」は、メッセンジャーＲＮＡ又はＤＮＡの配列のような標的核酸と、全体が又は一部が、同一のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド又は領域を指すことが意図される。用語「センス鎖」は、別のポリヌクレオチドのアンチセンス領域と二重鎖を形成するポリヌクレオチドのセンス領域を含む。また、センス鎖は、第一及び第二のポリヌクレオチド配列の両方を含む同一の単分子ポリヌクレオチド上の第二のポリヌクレオチド配列と二重鎖を形成する第一のポリヌクレオチド配列であることができる。そのようなものとして、センス鎖は、ｓｈＲＮＡのようなヘアピン構造を形成することができる単分子ｓｉＲＮＡの一つの部分を含むことが可能である。配列が提供された場合、慣例により、特に指摘しない限り、それはセンス鎖又は領域であり、相補的アンチセンス鎖又は領域の存在が暗に示されている。句「センス鎖」及び「センス領域」は均等であることが意図されており、相互交換的に使用される。
【００４４】
本明細書において用語「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡ干渉（「ＲＮＡｉ」）経路内で作動することにより遺伝子サイレンシングを誘導する、スモールインヒビトリー（ｓｍａｌｌ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ）ＲＮＡ二重鎖を指すことが意図される。これらのｓｉＲＮＡは、長さが変化可能であり、アンチセンス及びセンス鎖間、及びアンチセンス鎖及び標的配列間の異なった程度の相補性を含有することが可能なｄｓＲＮＡである。各ｓｉＲＮＡは１７〜３１の間の塩基対、より好ましくは１８〜２６の間の塩基対、及び最も好ましくは１９〜２１の間の塩基対を含むことが可能である。全てではないがいくつかのｓｉＲＮＡはセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖の５’及び／又は３’末端上に不対のオーバーハングヌクレオチドを有する。加えて、用語「ｓｉＲＮＡ」は、二つの別々の鎖の二重鎖、ならびにショートヘアピン（ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ）ＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）と呼ぶことができる、二重鎖領域を含んでなるヘアピン構造を形成することが可能な一本鎖を含む。
【００４５】
本明細書において用語「ｓｉＲＮＡライブラリー」又は「ＲＴＦ  ｓｉＲＮＡライブラリー」は、特定の生物学的経路又は遺伝子標的を分析する際に使用するためのｓｉＲＮＡのアレーを指すことが意図される。ｓｉＲＮＡライブラリーは特定の経路又は遺伝子標的を分析するための多様なｓｉＲＮＡプールを含んでなる。プールは典型的には、単一標的遺伝子に対して方向付けられた２つ又はそれより多くの同一でないｓｉＲＮＡを含んでなる。通常、プールは、合理的に設計された４つ又はそれより多くの同一でないｓｉＲＮＡを含む。ｓｉＲＮＡライブラリーの例示的リストが下記表１に提供されている。プール試薬を含む特定のｓｉＲＮＡライブラリーで使用される配列は、援用された仮出願の表Ｉ及び表ＩＩに提供されている。
【００４６】
本明細書において用語「ｓｉＲＮＡプール」、「プール」、「ｓｉＲＮＡのプール」及び「プール試薬」は、単一標的遺伝子、ｍＲＮＡ及び／又はタンパク質の翻訳に向かって方向付けられた２つ又はそれより多くのｓｉＲＮＡ（典型的には４ｓｉＲＮＡ）を指すことが意図される。プール試薬のｓｉＲＮＡは、非標的特異的判断基準に従って選択することにより、合理的に設計することが可能である。例えば、１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ濃度を使用し、複数の９６ウェルプレートの約２００ウェル中の細胞をトランスフェクトするのに、各プール試薬は２ナノモルで十分可能である。プール試薬はプールとしてプレートすることが可能である（即ち、単一のトランスフェクションウェル中に、ＤｈａｒｍａｃｏｎのＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（登録商標）試薬の２つ又はそれより多くのｓｉＲＮＡ）。時々本明細書においてＳＭＡＲＴｓｅｌｅｃｔｉｏｎ（商標）ｓｉＲＮＡ（Dharmacon, Inc.）と称される、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（登録商標）試薬を含んでなる個々のｓｉＲＮＡは、ＳＭＡＲＴｐｏｏｌ（登録商標）試薬と同一のプレートに個々にプレートすることが可能である。
【００４７】
本明細書において用語「標的」は、この文書を通してさまざまな異なった形態で使用され、それが使用される文脈により定義される。用語「標的遺伝子」は、ｓｉＲＮＡによりサイレンシングされるべきタンパク質をコードし、及び標的mRNAの産生をコードする遺伝子を指すことが意図される。用語「標的mRNA」は、所与のｓｉＲＮＡがポリペプチド産物の転写をサイレンシングするように方向付けられているｍＲＮＡを指すことが意図される。用語「標的配列」及び「標的部位」は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖がさまざまな程度の相同性を示し、そしてアンチセンス鎖がさまざまな程度の相補性を示す、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ又はＤＮＡコード又はプロモーター領域内の配列を指すことが意図される。用語「標的ポリペプチド」又は「標的タンパク質」は、標的遺伝子、標的mRNA及び／又は標的配列によりコードされた遺伝子産物を指すことが意図される。用語「ｓｉＲＮＡ標的」は、ｓｉＲＮＡがサイレンシングのために方向付けられている遺伝子、ｍＲＮＡ又はタンパク質を指すことが可能である。同様に、「標的サイレンシング」は、遺伝子又は対応するｍＲＮＡ又はタンパク質をサイレンシングする状態を指すことが可能である。
【００４８】
本明細書において用語「トランスフェクション」は、核酸が細胞内に導入されるプロセスを指すことが意図される。トランスフェクト可能である核酸のリストは巨大であり、そして限定されるわけではないが、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、センス及び／又はアンチセンス配列、ＤＮＡ、ＲＮＡなどが含まれる。細胞内へ核酸をトランスフェクトするためには複数の様式があり、限定されるわけではないが、エレクトロポレーション、粒子衝撃、リン酸カルシウム送達、ＤＥＡＥ−デキストラン送達、脂質送達、ポリマー送達、分子コンジュゲート送達（例えば、ポリリジン−ＤＮＡ又は−ＲＮＡコンジュゲート、抗体−ポリペプチドコンジュゲート、抗体−ポリマーコンジュゲート又はペプチドコンジュゲート）、マイクロインジェクション、レーザー又は光補助マイクロインジェクション、オプトポレーション又は可視及び／又は電磁放射線の非可視波長でのフォトポレーションなどが含まれる。トランスフェクションは「フォワードトランスフェクション」であり得、そこでは細胞が最初にウェル中に蒔かれて次ぎに核酸で処理されるが、あるいはそれは「リバーストランスフェクション」（ＲＴＦ）でもあり得、そこでは細胞がウェルの底に蒔かれる及び／又は付着する前に又はその間に、核酸を細胞と混合する。上に記載したような、細胞をトランスフェクトするいずれの様式も、リバーストランスフェクションを実行するため、水性媒質にｓｉＲＮＡを可溶化又は懸濁化した後に細胞内へ導入されるべき核酸を誘導することにより、本発明で使用することが可能である。リバーストランスフェクションの様式に関する詳細は、以下により詳細に記載されている。
【００４９】
本明細書において用語「ウェルプレート」は、一つの分離した領域から別の分離した領域への移動を防止する、分離した領域内へ分割された基材を指すことが意図され、ここで分離した領域はウェルである。例えば、多ウェルウェルプレートの各ウェルは、傾斜していても平らでもよい水平基底を含むことができ、ならびに側壁を有する。もしくは、側壁は、分離した水平基底部分がないように、特定の角度又は曲率で一緒になることができる。以下に記載するように、平らな又は実質的に平らな水平面を有するウェルプレートが、本発明の多くの態様、特に付着細胞を使用する場合に好ましい。形にかかわらず、最も重要なことは、ウェルプレート中の各ウェルが物理的に他のウェルから分離していることである。ウェルは典型的には、容易な物質の添加及び除去を可能にするために上端が開口している。普通のウェルプレートは典型的には４８、９６、３８４又は１３５６ウェルを含んでなり、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネート、ガラス又は均等な物質からできている。プレート中のウェルはさまざまな化合物でコートする、又はｓｉＲＮＡ及び／又は細胞付着を増強することができるさまざまな物理的処理にかけられている。プレート中のウェルは、さまざまな液体容量を保つように、そして特に水平基底に沿ったさまざまな表面領域を提供するように設計することも可能である。本明細書の図のウェルは、単純化するために四角として図式的に示されているが、いずれかの適した形であることも可能である。加えて、ウェルプレートは当該技術分野で公知である。
【００５０】
濃度、重量及び容量のような測定可能な物質量を定義するための単位の使用は、当業者により日常的に用いられているものであることが意図される。加えて、好ましくは、単位はメートル法に対応して説明される。また、「ｕｇ」又は「ｕＬ」における「ｕ」の使用は、各々、マイクログラム及びマイクロリットルに応用される「マイクロ」を指すことが意図される。
【００５１】
加えて、前記の用語定義は当業者の知識を補完することが意図されており、この文書内の全ての用語が定義されてはいない。そのようなものとして、未定義の用語は当業者の知識及び／又は用語の明白な意味で解釈されるべきことが意図されている。加えて、前記の用語は本明細書に提供された例に限定されることは意図されておらず、本明細書に記載した本発明の理解及び実施に有用であることが意図されている。
【００５２】
Ｉ．リバーストランスフェクション
一般的には、本発明はｓｉＲＮＡのリバーストランスフェクションを実行するためのウェルプレート、システム、キット及び方法を提供する。本発明は、改良され及びより効率的である、ｓｉＲＮＡを用いたリバーストランスフェクションプロトコルを提供する。これらの改良は、マニュアルアッセイならびに高スループットスクリーニングに特好都合である。
【００５３】
一つの態様において、本発明は遺伝子サイレンシングを達成するために細胞内にｓｉＲＮＡを導入するためのリバーストランスフェクション法を含む。こうした方法は、実質的乾燥遺伝子サイレンシング組成物を有しているウェルを含むウェルプレートを提供することを含むことが可能である。遺伝子サイレンシング組成物は、対応する遺伝子産物の産生が抑制又は停止されるように、標的遺伝子を沈黙させるｓｉＲＮＡを含むことが可能である。ｓｉＲＮＡは、ＲＴＦプロトコルが実施されるかなり前に、プレートを製造する、封じ、貯蔵し及び／又は出荷することが可能であるように、乾燥遺伝子サイレンシング組成物の一部としてウェル中に存在する。一部、このことは、乾燥遺伝子サイレンシング組成物がウェル中、機能的状態でｓｉＲＮＡを安定に保持でき、及びＲＴＦプロトコル間に水性溶液で懸濁化又は再溶解化できるためである。それ故、遺伝子サイレンシング組成物を有しているウェルプレートは、不活性環境下で製造する、及び密封することが可能であり、ここでプレートは特異的遺伝子標的について前もって決められたタイプのｓｉＲＮＡを有する異なったウェルを含むことが可能である。サイレンシングのためのこうしたｓｉＲＮＡのタイプ及び位置された遺伝子標的は、以下により詳細に記述されている。
【００５４】
水性媒質は、ｓｉＲＮＡを溶液内に懸濁又は可溶化するように、遺伝子サイレンシング組成物を含有する各ウェルに加えることが可能である。水性媒質は、十分な持続時間、ｓｉＲＮＡを可溶化することを可能にする。場合により、水性媒質又は追加の媒質は、ポリヌクレオチド担体を含んでなる。そのようなものとして、ポリヌクレオチド担体を遺伝子サイレンシング組成物を有している各ウェルへも加えることが可能であり、そしてｓｉＲＮＡ−担体複合体が形成するのに十分なインキュベーション期間、プレートを維持することが可能である。しかしながら、ポリヌクレオチド担体はいくつかの態様においては必要ではなく、トランスフェクションの他の様式を使用してｓｉＲＮＡを細胞内にトランスフェクトすることが可能である。
【００５５】
ｓｉＲＮＡが適切に可溶化又は懸濁化された後、ｓｉＲＮＡが細胞内に導入されるのを可能にする条件下、ウェルに細胞を加える。細胞は、約０．３５ｃｍ２〜約０．３５ｃｍ２の細胞増殖表面当たり、約１ｘ１０３〜約３．５ｘ１０４細胞の量で加えることが可能である。ｓｉＲＮＡが細胞内へ侵入することを促進する条件は、当該技術分野で公知である細胞を播種することに使用される典型的な細胞培養技術により記述することが可能である。即ち、細胞を、通常の播種と同様の様式で、ｓｉＲＮＡを含有するウェルに加えることが可能である。ｓｉＲＮＡ及び細胞を含有するウェルは、遺伝子サイレンシングが起こるのに十分な持続時間、インキュベートすることが可能であり、それは典型的には７２時間未満、より好ましくは４８時間未満、そして最も好ましくは約２４時間又はそれ未満である。
【００５６】
一つの態様において、ＲＴＦプロトコルは、ｓｉＲＮＡ−担体複合体を形成するために、ウェル中にポリヌクレオチド担体を添加することを含むことが可能であり、ここでｓｉＲＮＡ−担体複合体は溶液中に懸濁化又は可溶化されている。細胞が加えられた後、ｓｉＲＮＡ−担体複合体は細胞に接触することが可能であり、複合体のエンドサイトーシスを誘導する。そのようなものとして、ポリヌクレオチド担体を水性媒質の一部として加えるか、又はそれに加えて加えることが可能である。それ故、ポリヌクレオチド担体は、水性媒質に可溶化され、又は懸濁されて水性媒質中に存在することが可能である。ポリヌクレオチド担体は、脂質、カチオン性ポリマー、リポポリマーなどであり得る。
【００５７】
細胞をｓｉＲＮＡと混合した後、ウェルプレートは、細胞増殖、細胞分割及び／又は遺伝子サイレンシングが起こるような条件下で維持することが可能である。通常、細胞を、ｓｉＲＮＡ存在下、遺伝子サイレンシングを評価する前に約６〜約７２時間、より好ましくは約１２〜約３６時間、及び最も好ましくは約２４〜約４８時間維持する。しかしながら、対応する遺伝子産物の量が減少できるように、遺伝子をサイレンシングするのに十分な期間、細胞をｓｉＲＮＡとインキュベートすることを認識すべきである。そのようなものとして、標的ポリペプチドの産生は、少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、そして最も好ましくは少なくとも約９０％まで沈黙させることが可能である。
【００５８】
懸濁液中で増殖する細胞が標的細胞である例においては、こうした細胞を適切な細胞密度でウェルに加えることが可能であり、そしてプレートを細胞生存率に有害ではない低い重力下で回転させることが可能であり、細胞及び脂質をウェルの底で近接近させる。
【００５９】
一つの態様において、ＲＴＦフォーマットにおいてｓｉＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、細胞生存率、遺伝子サイレンシングなどについて評価することが可能である。細胞製造率研究は、公知の方法に従ってウェルプレート中で実施することが可能である。加えて、遺伝子サイレンシングは、標的タンパク質の存在又は不存在を評価するための、当該技術分野で公知の多様な技術によりウェル中の内容物で評価することも可能である。もしくは、遺伝子サイレンシングの量は、公知のアッセイにより、ウェルから内容物を取り除くことによって評価することが可能である。多様な態様において、例えば、ＵＶ、発光、蛍光又は光散乱検出システムのような光学検出システムに適合するように設計される。光学検出システムに適合した態様において、ウェルの壁は、不透明に、又は光学的検出を妨害することが可能な光散乱が減少する、又は最少になるように作製することが可能である。
【００６０】
一つの態様において、遺伝子サイレンシングを誘導するためのＲＴＦプロトコルの結果は、高含量スクリーニング（「ＨＣＳ」）又は高スループットスクリーニング（「ＨＴＳ」）を実施するためのシステムを使用して検出する又はモニターすることが可能である。ＨＣＳ分析は、特異的トランスロケーション及び形態学変化、レセプター輸送、細胞毒性、細胞移動度、細胞伸展などを測定するために使用することが可能である。ＨＣＳ研究は、ＡｒｒａｙＳｃａｎ（登録商標）  ＨＣＳリーダー又はＫｉｎｅｔｉｃＳｃａｎ（登録商標）  ＨＣＳリーダー（Cellomics, Inc.）で実施することが可能である。ＨＣＳについての追加の情報は、米国特許第６，９０２，８８３、６，８７５，５７８、６，７５９，２０６、６，７１６，５８８、６，６７１，６２４、６，６２０，５９１、６，５７３，０３９、６，４１６，９５９、５，９８９，８３５号（これらの各々は本明細書において援用される）に見ることができる。ＨＴＳ分析（典型的には単一測定としての各ウェルからの蛍光）は、種々の利用可能なリーダーを使用して実行することが可能である。
【００６１】
一つの態様において、本発明は、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルの結果の検出が実施される場所、装置又はシステムへウェルの内容物を有するように構成されたウェルプレートを含む。そのようなものとして、細胞がウェルからニトロセルロースのような基材へ移されるシステムを含む、湿式移送検出システムを用いることが可能である。ウェル内容物の前記基材への移送に続いて、検出プロトコルを実行することが可能である。こうしたウェルプレート移送システムの例はニトロセルロースを含むことが可能であり、ここで細胞内内容物に到達するため細胞膜を透過性にする、又は破壊するように、ウェル内容物を処理することが可能である。ニトロセルロースへのウェル内容物の移送は、重力又は真空マニフォールドの使用を含むいずれかの適した方法により達成することが可能である。ウェル内容物を含有しているニトロセルロースは次ぎに、特定のウェルを含んでなる、一つまたはそれより多くの細胞の内容物の存在又はレベルを検出するため、抗体に基づいた検出システムなどを使用する検出プロトコルをさらに受けることが可能である。
【００６２】
ＩＩ．ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの最適化
ＲＮＡｉ経路の独特の及び高度に鋭敏な性質のため、細胞内にｓｉＲＮＡのプールを導入するための、特別に有用な方法論が開発された。従って、新規ＲＴＦ方法論はｓｉＲＮＡのプールを使用するために開発された（「ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦ」）。そのようなものとして、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦを実行するために最近開発されたプロトコルは、合理的設計、ｓｉＲＮＡ安定化、ｓｉＲＮＡ標的化特異性及びｓｉＲＮＡをプールすることに基づいた最近開発されたｓｉＲＮＡ技術でこうしたプロトコルを増強することにより改変された。それ故、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルで遺伝子サイレンシングを実行するための改良された方法が本明細書に示されている。
【００６３】
一つの態様において、本発明は植物及び動物界の種の多様な組からの細胞の多様なタイプに関して使用することができる。好ましくは、細胞は哺乳類種からのものであり、ヒト、他の霊長類、ウマ、ブタ及びマウスからの細胞が含まれる。例えば、細胞はＨＴ−２９細胞、ＬＮＣａＰ−ＦＧＣ細胞、Ａ５４９細胞、ＭＤＡ−ＭＢ４５３細胞、ＨｅｐＧ２細胞、ＴＨＰ−Ｉ細胞、ｍｉＭＣＤ−３細胞、ＨＥＫ２９３細胞、３Ｔ３細胞、ＨｅＬａＳ３細胞、ＭＣＦ７細胞、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＢｘＰＣ−３細胞、ＤＵ１４５細胞、ジャーカット細胞、ＰＣ−３細胞、Ｃａｐａｎ−１細胞、ＨｕＶＥＣ細胞、ＨｕＡＳＭＣ細胞などであり得る。加えて、植物のいずれの種も、遺伝子サイレンシングの効果を決定するために使用することができる。
【００６４】
細胞密度と称される、ウェル当たりの細胞数は、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦを成功させるための重要なパラメーターである。ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルは、ＤＮＡを使用するＲＴＦプロトコルと比較して、より低い細胞密度でより良好な結果を得ることができる。例えば、９６ウェルプレートは、ウェル当たり約１，０００〜３５，０００細胞、より好ましくはウェル当たり約２，０００〜３０，０００細胞、さらにより好ましくはウェル当たり約２，５００〜２０，０００細胞の細胞密度、さらにより好ましくはウェル当たり約３，０００〜１５，０００細胞、そして最も好ましくはウェル当たり約３，５００〜１０，０００細胞の細胞密度である。また、ウェル当たりの細胞数は、異なった細胞培養面積を有するウェルに外挿することが可能である。所与のウェルに播種される、細胞の適切な数を計算するための一つの可能な式は、約０．３ｃｍ２〜約０．３５ｃｍ２の細胞培養面積を有する９６ウェルプレートに基づいており（式中、ウェル＃２は９６ウェルプレートである）、以下のように表される：ウェル＃１中の細胞＝（ウェル＃１の面積／ウェル＃２の面積）ｘウェル＃２中の細胞。
【００６５】
加えて、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルは、トランスフェクションの特定の様式が有用であるか、又は最適な結果を提供するかを決定するために、最適化することが可能である。従って、トランスフェクションのいずれの様式も、本明細書に記載したｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルで使用することが可能である。陽性対照ｓｉＲＮＡのような、よく特徴付けられたｓｉＲＮＡを有する頑強で容易にトランスフェクトされる細胞株（例えば、ＨｅＬａ）を使用することにより、ポリヌクレオチド担体を広い範囲の濃度を越えて使え、細胞密度及び総ｓｉＲＮＡ濃度の通常使用される範囲を越えて使用できる。従って、細胞生存率及びトランスフェクション効率を、前記濃度勾配でアッセイすることが可能である。それ故、どのトランスフェクション様式が好ましくない細胞毒性を含むことなしに高度に効率的な遺伝子サイレンシングを生み出すことができるかどうかを決定するため、最適化研究をトランスフェクションの特定の様式又はポリヌクレオチド担体濃度勾配で実施することが可能である。
【００６６】
一つの態様において、本発明は、ＲＮＡｉ経路を介した遺伝子サイレンシングを実行するためのｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルの最適化に関する。そのようなものとして、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの最適化は次のいずれかを含むことが可能である：（１）プレートのタイプを選択すること；（２）ウェル中に沈着され、及び乾燥されているｓｉＲＮＡを可溶化又は懸濁化するための適切な溶液を選択すること；（３）具体的遺伝子を沈黙させるための特定のｓｉＲＮＡを選択すること；（４）ｓｉＲＮＡ安定性及び／又は特異性を増強するために個々のｓｉＲＮＡに対して応用可能ないずれかの修飾又はコンジュゲートを同定すること；（５）ｓｉＲＮＡが適した水性媒質に可溶化又は懸濁化できるように、固体表面上にｓｉＲＮＡを応用すること及び乾燥させること；（６）トランスフェクションの適した様式を選択すること；（７）脂質のような、ｓｉＲＮＡのためのポリヌクレオチド担体を選択すること；（８）ｓｉＲＮＡを可溶化すること、又は懸濁化すること；（９）ｓｉＲＮＡをポリヌクレオチド担体と複合体形成させてｓｉＲＮＡ−担体複合体を形成させること；及び（１０）ｓｉＲＮＡ−担体複合体と細胞タイプ又は選択されたタイプと混合させること。それ故、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルを最適化することで、従来のフォワード及びリバーストランスフェクション法よりも劇的な改良を生じることが可能である。
【００６７】
一つの態様において、本発明は、前記の最適化を伴って実行するためのｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルを含むことが可能であり、次のいずれかを含むことができる：（ａ）多ウェルプレートの２又はそれより多くのウェルに少なくとも一つのｓｉＲＮＡを応用すること、ここでｓｉＲＮＡは標準遺伝子を標的としている対照ｓｉＲＮＡである；（ｂ）各ウェルの底にｓｉＲＮＡを乾燥させること；（ｃ）ｓｉＲＮＡを可溶化又は懸濁化するため、各ウェル中のｓｉＲＮＡに媒質又は緩衝液のような水性溶液を加えること、及び場合により、溶液はｓｉＲＮＡ−担体複合体が形成可能なように、ポリヌクレオチド担体を含み；（ｄ）ｓｉＲＮＡが単独で又はｓｉＲＮＡ−担体複合体として溶液中ぬ存在する各ウェルに適切な数の細胞を添加すること；（ｅ）細胞が添加された後、トランスフェクションのいずれかの様式により可能である、ｓｉＲＮＡの細胞内への侵入を起こすこと；及び（ｆ）ｓｉＲＮＡによる細胞のトランスフェクションが起こりうる条件下にプレートを維持すること。トランスフェクションに続いて、細胞増殖及び／又は細胞分割が起こるであろう、及び遺伝子サイレンシングが起こることができる条件（液体媒質、温度、ガス分圧など）に細胞をさらす。これらの条件は、必須ではないが、トランスフェクションが起こる条件と同一であることができ、当該技術分野では公知である。
【００６８】
ＩＩＩ．ウェルプレート
一つの態様において、本発明は、ウェルプレート中の底で乾燥された遺伝子サイレンシング溶液の使用を含む。本発明に関連して使用されるウェルプレートは、好ましくは、ＮＵＮＣ（商標）、ＮＵＮＣＬＯＮ（商標）、ＭＩＣＲＯＷＥＬＬ（商標）及びＦＬＵＯＲＯＮＵＮＣ（商標）プレート（例えば、それらの各々はNalge Nunc International of Rochester, NY、及びNunc A/S of Denmark から得ることができる）、ＣＯＳＴＡＲ（商標）、ＣＯＳＴＡＲ  ＴＨＥＲＭＯＷＥＬＬ（商標）及びＣＯＲＮＩＮＧ（商標）プレート（例えば、それらの各々はCorning から入手可能である）、ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ（商標）及びＯＰＴＩＬＵＸ（商標）プレート（例えば、Becton, Dickinson and Company から入手可能である）及びＧＲＥＩＮＥＲ（商標）、ＣＥＬＬ  ＣＯＡＴ（商標）及びＣＥＬＬＳＴＡＲ（商標）プレート（例えば、Greiner Bio-One から入手可能）のような製品を含む、細胞培養プレート及び他の細胞培養表面含有装置のかなり多数の商業的供給元から購入可能である、フォーマットされた、及び区別できるウェルアレー（例えば、４８、９６、３８４又は１５３６−ウェルプレート）である。
【００６９】
一つの態様において、本ウェルプレートは、細胞生長及び増殖に適するように構成されていることで特徴付けることが可能である。ウェルプレートは、ガラス、ポリスチレン又はいずれかの均等材料により作成することが可能であり、丸い及び／又は平たいウェル床を有することが可能である。しかしながら、特定の分析機器は、平底表面を使用した場合に増強された機能性を有することが可能である。加えて、実質的に平たい床を有しているウェルは、均一な細胞間隔及び単層形成を提供することができる。それ故、実質的に平底表面を有するのがウェル床には好ましい。ウェル床は、ポリスチレンの照射、コロナ放電、プラズマ放電又はマイクロ波プラズマ放電のような物理的又は化学的処理を受けることが可能である。こうした処理は、組織培養品表面では慣用的であることができ、それにより接着性真核細胞が接着し及び成長することができる。加えて、ウェルはいずれの化学コーティングによっても修飾することができないが、ポリ−Ｌ−リジン（「ＰＬＬ」）、ラミニン、コラーゲン、又は細胞の接着性を改良する均等物でコートすることが可能である。
【００７０】
加えて、各ウェルが、６〜２０００の間のウェル、及びより好ましくは１５３６ウェル、３８４ウェル又は９６ウェルを有することが好ましい。また、約５〜約２０００マイクロリットル（「ｕＬ」）の間で変化する容量、及び約０．０２ｃｍ２〜約４．２ｃｍ２、９６ウェルプレートについて約０．３ｃｍ２〜約０．３５ｃｍ２の間の範囲にある、ウェル底表面又は細胞床により表される総培養面積を有するウェルが好ましい。
【００７１】
さらに、いくつかの例において、ウェルはＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）（Beckinson Dickerson）のような物質でコートされておらず、又はＣＥＬＬＢＩＮＤ（商標）プレート（Corning）を構築するために使用されているものと同一の方法で製造されていないことが好ましい。このことは、一部、これらの技術の両方が細胞接着を増強するために慣用的に使用されているが、ＲＴＦプロトコルにおいてはｓｉＲＮＡ取り込み及び／又は遺伝子サイレンシングを減少させる又は減弱させることが観察されているからである。
【００７２】
さらに、処理ポリスチレンのような単一材料で形成された多ウェルプレートを本発明で使用することができる一方、２つ又はそれより多くの材料から形成されたプレートも使用することができる。こうした多材料ウェルプレートは、その各々が本明細書において援用される米国特許第６，５１４，４６４、５，４５７，５２７、ＲＥ３８，２１４及び５，４８７，８７２号に概説されている。従って、多材料ウェルプレートは、組織培養及びＲＮＡｉ沈着に適したウェル床表面を含む所望の構造特性を提供することが可能である（ここで、壁は適していない）。また、ウェル床は、特定の下流アッセイに適している光学特性を有することが可能である。例えば、ウェル床真下のプラスチック又はガラスは可視及び／又はＵＶ光に対して透明であり、各ウェルの側壁を取り囲んでいるプラスチックは、隣接するウェル間の光の通過を遮断している。
【００７３】
一つの態様において、プレートは除去可能な底を含んでなる。そのようなものとして、除去可能な底は、ウェル内容物を基材へ移送することにおいて好ましい。また、除去可能な底を有するプレートは、本明細書に記載した態様のいずれに関連しても使用することが可能である。除去可能な底を有するプレートの態様の一例は、底として除去可能なフィルムを有するプレートである。除去可能フィルムは、いずれの適した材料、例えば、ポリオレフィンから作製することが可能である。除去可能フィルムは、光学検出システムに適合可能である（即ち、例えば、可視又はＵＶ光に対して透明であるように、電磁照射の一つまたはそれより多くの波長に対して透明である）。除去可能フィルムを含んでなる態様において、フィルムがプレートから除去される前に、ウェルの内容物の少なくともいくばくかをフィルムに付着させるように、ウェルの内容物を容量で減少させることが可能である。プレートの除去に続いて、フィルムは、ウェルの位置に対応するフィルム上の位置に付着したプレートの内容物を含む。フィルムは次ぎに、いずれか適した検出法で使用することが可能である。一つの例において、ウェル内容物を、例えば、ニトロセルロースのような別の基材に移すためにフィルムを使用することが可能である。また、フィルムがプレートから除去される前に細胞内内容物を暴露させるように、各ウェル中の細胞を破壊することが可能である。基材へ移されたら、前記基材はウェルの内容物を含んでおり、いずれか適した検出法にかけることが可能である。検出法のいくつかの例には、ウェスタンブロッティング、タンパク質−タンパク質ブロッティング、リガンドブロッティング及び核酸ハイブリダイゼーションが含まれる。プレートの内容物をフィルムに付着させる一つの方法は、ウェルの内容物を蒸発させること、及びウェルの水分含量を減少させることである。
【００７４】
一つの態様において、こうしたフィルムを、選択的に透過性である材料で作成することが可能であり、ここで選択的透過性は、例えば、分子サイズに基づいている。この態様において、フィルムはモレキュラーシーブであることができる。一つの例において、フィルムは、陽圧（例えば、ウェルの上から）又は陰圧（例えば、ウェルの下から）が適用された場合、約１０ｋＤａより小さな分子が膜を横切るのを可能にするモレキュラーシーブを含んでなることができる。フィルムがモレキュラーシーブを含んでなるところでは、シーブを介して透過可能液体を引き出すこと、そしてウェル内容物を含んでなるより大きな分子を後に残すことによりウェル内容物の水分を減少させることが可能である。
【００７５】
一つの態様において、シーブを含んでなるフィルムを上端に適用できる。ウェル内容物がシーブと接触するように、プレートを反転させることが可能である。プレートの底に穴を開けることができ、又は、もしプレート底にフィルムが存在するならば、フィルムを除去する。モレキュラーシーブに向かってウェル内容物に陽圧を適用することが可能である。もしくは、シーブの下方から陰圧を適用することが可能である。この様式において、ウェルの水分含量が除去され、その間、ウェル内容物がシーブの表面に移される。シーブはその後、本来のプレートと同じ相対的位置に、プレートのウェル内容物を含むであろう。もし望むなら、シーブは次ぎに、例えば、ニトロセルロースのような適した基材に、ウェル内容物を移すために使用することができる（ウェル内容物の既知の位置に）。
【００７６】
一つの態様において、特定の光学特性を与えるために、プレートと組み合わせて用いることが可能である。これらの態様において、プレートの上端及び／又は底の少なくとも一部に、電磁照射の特定の波長に対して選択的に不透明又は選択的に透明であるフィルムを適用することが可能である。フィルムは、電磁照射の一つまたはそれより多くの波長に対するフィルムフィルターとして使用される。例えば、フィルムはＵＶ光に対して不透明であり、可視光に対しては透明であることが可能である（又はその逆）。フィルムはプレートの上部を覆って置くことが可能であり、また、プレートの底に置くことも可能である。電磁照射が下方から試料に到達する態様においては、フィルムをプレートの底に置くことが可能である。電磁照射が上方から試料に到達する態様においては、フィルムをプレートの上端に置くことが可能である。フィルムフィルターは典型的には、プレート基材と接触するであろう。２つ以上のフィルムを一緒に使用することが可能である。２つ又はそれより多くのフィルムを、お互いに隣接させてプレートに適用することにより使用することが可能である（例えば、第一のフィルムを適用し、次ぎに第一にフィルム上に第二のフィルムを適用する）。
【００７７】
本明細書に記載した態様のいずれかに使用されたフィルムは、特定の適用に有用ないずれかの適した材料から作製することが可能である。フィルムは薄く及び柔軟性であるか、又は薄く及び硬質であることができる。フィルムは、ロボットシステムに適合するように作製することも可能である。典型的には、ロボットシステムに適合したフィルムは、一旦フィルムがプレートから除去されたらウェル内容物のパターン又は配置に支障を来すことなく操作可能なように、比較的硬質であろう。
【００７８】
ＩＶ．遺伝子サイレンシングプレート
本発明の一つの態様において、前記に従ったウェルプレートは、遺伝子サイレンシングプレートであるように構成することが可能である。従って、ウェルプレートは一つまたはそれより多くのウェル中に遺伝子サイレンシング組成物を含むことが可能である。遺伝子サイレンシング組成物は、サイレンシングのために少なくとも第一の遺伝子を標的とする、少なくとも第一のｓｉＲＮＡを含む。また、遺伝子サイレンシング組成物は、関係する遺伝子のファミリーに対して方向付けられた単一ｓｉＲＮＡを有することが可能である。加えて、ウェルプレートは単一遺伝子を標的としている多ｓｉＲＮＡ、又は多遺伝子を標的としている多ｓｉＲＮＡを有しているウェルを有することが可能である。ウェルプレートは、少なくとも一つのウェルに適用されたｓｉＲＮＡ含有溶液を有していることにより遺伝子サイレンシングプレートであることができ、それは次ぎに、溶液を除去する様式で乾燥され、乾燥遺伝子サイレンシング組成物を残す。
【００７９】
いくつかの例において、適応する、沈着する及び／又はウェル床上にｓｉＲＮＡ溶液をスポットする、及びプレート上に物質を乾燥することに先だって、溶液のこれらのタイプのいくつかの一つに可溶化する。通常、限外濾過によるような、ＲＮａｓｅの夾雑を除去するためのさまざまな当該技術分野で認識されている技術の一つにより処理された蒸留水中に、ｓｉＲＮＡを溶解する。もしくは、限定されるわけではないが、リン酸緩衝液、ハンクスＢＳＳ、アールＢＳＳ又は生理学的食塩水を含む、いくつかの生理学的に適合したＲＮａｓｅフリー緩衝液の一つにｓｉＲＮＡを溶解することができる。これらの溶液は、ｓｉＲＮＡの特性を変化させることなく又はＲＴＦ法の続いての段階で加えられる細胞を損傷させることなしに、ｓｉＲＮＡの安定性を増強する（例えば、ＲＮａｓｅ阻害剤）又はスポッティング又は乾燥効率を増強するために溶液の粘度を改変する（例えば、スクロース）、一つまたはそれより多くの追加の試薬を含有することができる。
【００８０】
さらに別の場合において、ｓｉＲＮＡは、選択されたプレートへのスポッティング、乾燥又はスティッキングを増強するであろう溶液又は媒質に可溶化することができる。場合により、ｓｉＲＮＡに適合している揮発性溶媒を使用することが可能である。一つの例には、エタノールのようなアルコールの使用が含まれ、容易に乾燥することが可能であり、そしてウェル床上に乾燥遺伝子サイレンシング組成物を残すことが可能である揮発性溶媒を形成させるため、水と混合することが可能である。いくつかの例において、ｓｉＲＮＡの溶液は、時間経過により容易に酸化され、細胞へ毒性であることが可能である脂質を含んでいない。他の例においては、ウェル床上に沈着され及び乾燥される前に、ｓｉＲＮＡをポリヌクレオチド担体と前複合体形成される。
【００８１】
従って、ｓｉＲＮＡが乾燥されそして再懸濁された時に、対照ｓｉＲＮＡの既知の量又は濃度が遺伝子サイレンシングに利用可能であるように、ウェルに前もって決定された量のｓｉＲＮＡを投与することが可能である。各ウェルの底に沈着されたｓｉＲＮＡ溶液の容量は、保存溶液の濃度、ｓｉＲＮＡの機能性、及び遺伝子サイレンシングに利用可能な所望のｓｉＲＮＡ量又は濃度に依存することが可能である。一般に、効率的に標的とされた遺伝子を沈黙させるために必要とされるトランスフェクション間のｓｉＲＮＡの濃度は、ｓｉＲＮＡの機能性に依存する。例えば、トランスフェクション間のｓｉＲＮＡの濃度は、高度に機能的なｓｉＲＮＡ（例えば、５０〜１００ｎＭで標的発現の＞９０％を沈黙させる）についてピコモル（例えば、３００〜９００ｐＭ）から、中程度に機能的なｓｉＲＮＡ（例えば、５０〜１００ｎＭで標的発現の７０％〜９０％のサイレンシング）についてナノモル（例えば、１００ｎＭ）まで、及び低機能性についてマイクロモル（例えば、１ｕＭ）までの範囲であることができる。例えば、９６ウェルプレートについて、１ｕＭ  ｓｉＲＮＡ含有溶液の５〜５０ｕＬの沈着が、ＲＴＦプロトコルについてのｓｉＲＮＡの受容可能な濃度を発生させるために十分である。より小さな又はより大きなサイズのウェルについては、ｓｉＲＮＡの量及び濃度を、各ウェルの最終濃度について補正することにより調整することが可能である。
【００８２】
一つの態様において、遺伝子サイレンシング組成物中のｓｉＲＮＡの総量は、細胞が含まれているウェルのみのトランスフェクトしている細胞についての量で表現することが可能である。そのようなものとして、ＲＴＦ間に水性媒質中に可溶化され又は懸濁化されている場合、ｓｉＲＮＡの総濃度は約１００ｎＭ未満であることができる。より好ましくは、ＲＴＦ間に水性媒質中に可溶化され又は懸濁化されている場合、ｓｉＲＮＡの総濃度は約５０ｎＭ未満であることができる。さらにより好ましくは、ＲＴＦ間に水性媒質中に可溶化され又は懸濁化されている場合、ｓｉＲＮＡの総濃度は約２５ｎＭ未満であることができる。その上に好ましくは、ＲＴＦ間に水性媒質中に可溶化され又は懸濁化されている場合、ｓｉＲＮＡの総濃度は約１０ｎＭ未満であることができる。最も好ましくは、ＲＴＦ間に水性媒質中に可溶化され又は懸濁化されている場合、ｓｉＲＮＡの総濃度は約１ｎＭ未満であることができる。例えば、９６ウェルプレート中のｓｉＲＮＡの量は、ウェル当たり０．１ピコモル（ｐｍ」）〜約１００ｐｍ、より好ましくは約１ｐｍ〜約７５ｐｍ、そして最も好ましくは約１０ｐｍ〜約６２．５ｐｍであることが可能であり、ここで他の数のウェルを有しているプレートについては、対応するｓｉＲＮＡの量を計算することが可能である。
【００８３】
加えて、各ウェルに加えられたｓｉＲＮＡの量は、そのウェル内での単一ＲＴＦプロトコルで使用するためには十分であることができる。即ち、遺伝子サイレンシング組成物中のｓｉＲＮＡは、ウェルへ加えられる細胞で使用されるだけの量で存在することが可能である。そのようなものとして、ウェル中に乾燥されたｓｉＲＮＡの量は、二つの異なったウェルで二つのＲＴＦプロトコルを実施するには不十分である。このことは、遺伝子サイレンシング組成物中に提供されたｓｉＲＮＡの量は、最適な結果を生み出すため、単一ＲＴＦプロトコルのために構成されているからである。また、このことは、多ウェル内に移される保存ｓｉＲＮＡ溶液を作製する必要性を除去し、それによりＲＴＦプロトコルの複雑さを減少させ、効率を増加させている。
【００８４】
ｓｉＲＮＡ含有溶液は、手作業の及び自動化プロセスを含むことが可能である、ウェルプレートのウェル内に液体を沈着させるために当該技術分野の多様な公知の技術を使用して沈着させることが可能である。多様な方法を、ｓｉＲＮＡ含有溶液を遺伝子サイレンシング組成物に乾燥させるために使用することが可能である。一つの態様において、プレートを滅菌環境で室温にて乾燥させると、沈着溶液を蒸発させて、ｓｉＲＮＡ及び塩、糖などのような他の条件付け化合物を後に残す。乾燥プレートは、好ましくは、真空で封じるか又は滅菌容器内で不活性ガスの存在下で封じ、サイレンシング機能性を喪失することなく長時間、−８０℃〜３７℃の範囲の温度で貯蔵される。それ故、少なくとも一つのウェル中に、実質的に乾燥された遺伝子サイレンシング組成物を有しているプレートは、室温で貯蔵し、そして従来の経路を介して出荷することが可能であり、それでもｓｉＲＮＡの完全性及び機能性を維持している。
【００８５】
一つの態様において、ウェルプレートは、対照及び較正機能に使用することが可能である、種々の他のウェルを有することができる。そのようなものとして、ウェルプレートはｓｉＲＮＡを欠いている、又は実質的に欠いている少なくとも一つのウェルを有することが可能である。また、ウェルプレートは、トランスフェクション対照、陽性対照又は陰性対照であり得る、少なくとも第一の対照ｓｉＲＮＡを含む少なくとも一つのウェルを有することが可能である。例えば、対照ｓｉＲＮＡは以下の少なくとも一つを含むことが可能である：（ａ）既知の遺伝子をサイレンシング可能であるｓｉＲＮＡ；（ｂ）トランスフェクション対照ｓｉＲＮＡ；（ｃ）蛍光マーカーを有しているｓｉＲＮＡ；（ｄ）少なくとも一つの毒性モチーフを有しているｓｉＲＮＡ；（ｅ）非機能的ｓｉＲＮＡ；又は（ｆ）ＲＩＳＣにより用いられることを阻害し、及び加工されるｓｉＲＮＡ。
【００８６】
Ｖ．ｓｉＲＮＡ
一つの態様において、前記乾燥遺伝子サイレンシング組成物は、少なくとも第一の標的遺伝子を沈黙させる少なくとも第一のｓｉＲＮＡを含む。本遺伝子サイレンシングは、ｓｉＲＮＡがウェル中で細胞をトランスフェクトするために十分な量で水性媒質中に可溶化又は懸濁化されることが可能であるように構成されている。場合により、ウェル中のｓｉＲＮＡの総量は、そのウェルについてのみリバーストランスフェクションを実行するために十分である。加えて、ｓｉＲＮＡが、少なくとも一つのループを有するヘアピン構造、修飾又はコンジュゲートを有していてもよい。また、ｓｉＲＮＡは、遺伝子を標的とするように合理的に設計することが可能である。さらに、遺伝子サイレンシング組成物は、ｓｉＲＮＡのプールを含むことが可能である。
【００８７】
一つの態様において、ｓｉＲＮＡは標的遺伝子をサイレンシングすることにおいて機能的に最適化するように選択される。好ましくは、ｓｉＲＮＡは５０％〜１００％の間の遺伝子サイレンシング機能性を有する。より好ましくは、ｓｉＲＮＡは７０％〜１００％の間の遺伝子サイレンシング機能性を有する。さらにより好ましくは、ｓｉＲＮＡは９０％〜１００％の間の遺伝子サイレンシング機能性を有する。機能的遺伝子の設計は、オンターゲッティングを増加させ、オフターゲッティングを減少させ、安定性を増加させる修飾を提供することに基づいており、特定のｍＲＮＡ遺伝子及びそれらの組合わせについて合理的に設計される。
【００８８】
加えて、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖は、標的配列（例えば、ｍＲＮＡ）と多様なレベルの相補性を有することが可能である。即ち、アンチセンス鎖は、標的配列の遺伝子サイレンシングを誘導することについて機能的である。そのようなものとして、センス鎖は、標的配列と実質的に相同であり得る。好ましくは、アンチセンス鎖は標的配列と５０〜１００％の相補性を有することが可能である。より好ましくは、アンチセンス鎖は標的配列と７０〜１００％の相補性を有することが可能である。さらにより好ましくは、アンチセンス鎖は標的配列と８０〜１００％の相補性を有することが可能である。さらにまたより好ましくは、アンチセンス鎖は標的配列と９０〜１００％の相補性を有することが可能である。最も好ましくは、アンチセンス鎖は標的配列と１００％の相補性を有することが可能である。
【００８９】
１００％未満の相補性を有している配列は、一つまたはそれより多くのヌクレオチドのバルジ、オーバーハング、又は一つまたはそれより多くのヌクレオチドミスマッチを有することが可能である。加えて、ｓｉＲＮＡは、センス又はアンチセンス鎖の３’及び／又は５’末端に付随した１〜６ヌクレオチドのオーバーハングを有することが可能である。加えて、オーバーハングは相補性の計算から除外されるが、標的配列との相同性又は相補性を有することが可能なことを認識すべきである。化学修飾、バルジ又はミスマッチは、特定の位置でｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを切断するために、ＲＮａｓｅ−ＩＩＩ  Ｄｉｃｅｒを方向付けることが可能である。二つのヌクレオチド３’オーバーハングは、天然のｓｉＲＮＡを模倣することができ、普通に使用されているが必須ではない。好ましくは、オーバーハングは二つのヌクレオチド、最も好ましくはｄＴｄＴ又はＵＵを含むことが可能である。また、オーバーハングは、標的配列と相補性又は相同性を有しているセンス及び／又はアンチセンス鎖の３’末端に二つのヌクレオチドを含むことが可能である。ｓｉＲＮＡは二つのヌクレオチドオーバーハングを有することが可能であり、ここで内部位置についてはＣ＞Ｕ＞Ｇ＞Ａ、及び末端位置についてはＡ＞Ｇ＞Ｕ＞Ｃのヒエラルキーが好ましい。ｓｉＲＮＡ構造の追加の情報及びＤｉｃｅｒ特異性は、Vermeulen A, et. al; The contributions of dsRNA structure to Dicer specificity and efficiency; RNA (2005), 11 :674-682 に見ることができる。
【００９０】
一つの態様において、合理的に設計されているとして同定されているリストからｓｉＲＮＡを選択することが好ましい。そのようなものとして、ｓｉＲＮＡを出願番号６０／６７８，１６５を有する援用された米国仮出願の表Ｉから選択することが可能である。表Ｉは「ｓｉＧＥＮＯＭＥ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  ｓｉＲＮＡ」と題し、カラム「遺伝子名」、「寄託番号」、「配列」及び「配列番号」から成っている。表Ｉは約９２、４４８の１９−ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡセンス鎖配列を掲げており、ここでアンチセンス鎖配列は、明瞭さのため割愛されている。表Ｉに掲げられているｓｉＲＮＡ配列は配列番号１から約９２，４４８を含んでおり、ここで各々は、好ましくは、センス鎖上の及び／又はアンチセンス鎖上の３’ＵＵオーバーハングも含むことが可能である。表Ｉの約９２，４４８配列の各々は、アンチセンス鎖上に５’リン酸も含むことが可能である。援用された仮出願の表Ｉに掲げられた約９２，４４８配列の内、約１９，５５９は、修飾のオンターゲッティングセットを含む。オンターゲット修飾を有する、配列番号により同定された配列のリストが、「List of Table I Sequences Having On-Target Modifications Identified by SEQ.ID NO.」と題された表ＩＩに示されている。オンターゲット修飾は配列番号１〜２２，３００にある。遺伝子サイレンシング組成物のｓｉＲＮＡは、個々に（例えば、ウェル当たり一つのｓｉＲＮＡ配列）又はプールのセットの一部として使用することができる。
【００９１】
一つの態様において、ｓｉＲＮＡはショートヘアピンｓｉＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）として構成することができる。このことは、ｓｈＲＮＡが、センス領域とアンチセンス領域を連結しているループ構造を含んでヘアピン構造を形成する、ｓｉＲＮＡの一つの形態であるためである。また、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの他のタイプと比較して実質的に類似の機能性を有することが可能である。加えて、ｓｈＲＮＡは、ヌクレオチドが以下により詳細に記載される修飾を含んでいない限り、修飾ｓｉＲＮＡとは考えられない。ｓｉＲＮＡがヘアピンｓｈＲＮＡとして存在する場合、鎖のサイズ及び配向は変化しうる。好ましくは、遺伝子サイレンシング組成物中に存在するｓｈＲＮＡは、センス鎖又は領域及びアンチセンス鎖又は領域を有する。ｓｈＲＮＡのセンス領域及びアンチセンス領域は、約１８〜３１塩基対のステム中に組織化されている、より長い単分子構造の一部である。センス領域及びアンチセンス領域はポリヌクレオチド又は他の連結基、ならびにそれらの組み合わせを含んでなることが可能であるループ構造を介して連結されている。好ましくは、ポリヌクレオチドループは４〜１０の間のヌクレオチドから成っている。より好ましくは、ステムは２６〜３１の間の塩基対であり、ループはヒトｍＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉｒ−１７（配列５’→３’：−ＡＵＡＵＧＵＧ−、配列番号１）から誘導される。ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡの他のタイプに類似した３’及び／又は５’オーバーハングも含むことが可能である。もし存在する場合、オーバーハングはｄＴｄＴ、ＵＵであり得るか、又は標的配列と相同性又は相補性を有することが可能である。
【００９２】
ｓｈＲＮＡは、右回りか又は左回りであるヘアピン、ならびに折れたヘアピンを含むことが可能である。右回りｓｈＲＮＡとは、その５’→３’配向中にセンス領域、ループ領域そして次ぎにアンチセンス領域を有する単分子配列を指すことを意味する。同様に、左回りｓｈＲＮＡとは、その５’→３’配向中にアンチセンス領域、ループ領域そして次ぎにセンス領域を有する単分子配列を指すことを意味する。最も好ましくは、ｓｈＲＮＡは：（１）アンチセンス−ループ−センス組織化で組織化され；（２）２６〜３１ヌクレオチドのステム長を有し；及び（３）ヒトｍｉＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉｒ−１７から誘導されたループを有する。ヘアピン構造を有しているｓｉＲＮＡの記述及びさらなる例は、本明細書で援用される、「Hairpin Constructs」と題され、２００５年３月２９日に提出された米国仮特許出願題６０／６６６，４７４号、及び米国特許出願２００４／００５８８８６に見ることができる。
【００９３】
Ａ．化学修飾
一つの態様において、遺伝子サイレンシング組成物中のｓｉＲＮＡは、化学合成（例えば、本発明で援用される米国特許第５，８８９，１３６号の２’−ＡＣＥ化学）、酵素的方法を使用する合成（例えば、長いｄｓＲＮＡのインビトロＤｉｃｅｒ消化）、又はプラスミド又はベクター構築物からの発現を含む、いくつかの本分野で認められている手段の一つにより発生することが可能である。ｓｉＲＮＡを製造するためにＡＣＥ化学が使用される例において、ｓｉＲＮＡを可溶化するために使用される溶液は、２’−ＡＣＥ保護基の保存に適合しているｐＨを有することが好ましい。それ故、６．０以上、より好ましくは約７．０〜約８．０の間、そして最も好ましくは約７．５〜約８．０の間のｐＨを溶液が持つようにするのが好ましい。ＡＣＥ基は存在しないが、他の化学修飾が存在する場合、ｐＨは約ｐＨ７．０〜約７．３の間であることができる。
【００９４】
簡単に記載したように、遺伝子サイレンシング組成物中のｓｉＲＮＡは、特異性及び／又は安定性を増加させるように修飾することが可能である。従って、オフターゲッティングを減少させるために特異性修飾をいずれのｓｉＲＮＡ内にも取り込むことが可能である。こうした特異性修飾はオンターゲッティングの一つの側面であることが可能である。加えて、ｓｉＲＮＡは特異性及び安定性修飾の両方を有することが可能である。特異性を増強する修飾のさらなる記述には、２００４年４月１日に提出されたＰＣＴ特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／１０３４３、公開番号ＷＯ２００５／０９７９９２を有するＰＣＴ出願、及び米国仮特許出願番号６０／５４２，６６８及び６０／５４３，６６１（これらの開示は本明細書において援用される）に記載されているものが含まれる。
【００９５】
オフターゲット効果を減少できる化学修飾の例には、ｓｉＲＮＡのリボース基上の多様な２’修飾が含まれ、及びリン酸基を含むことができる５’ホスホリル修飾も含むことが可能である。こうした化学修飾は、各々、二重鎖領域の第一の５’センスヌクレオチド及び第二の５’センスヌクレオチドである、センス鎖の１位及び２位のヌクレオチド上の２’修飾を含むことが可能である。加えて、化学修飾は、各々、二重鎖領域の第一の５’アンチセンスヌクレオチド及び第二の５’アンチセンスヌクレオチドである、アンチセンス鎖の１位及び２位のヌクレオチド上の２’修飾を含むことが可能である。化学修飾は、アンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’炭素上での、リン酸基のようなホスホリル部分も含むことが可能である。
【００９６】
特異性増強化学修飾の例は、第一及び第二センスヌクレオチドでの２’修飾を含むことができ、及びアンチセンス５’末端ヌクレオチドの５’炭素上でのホスホリル部分を含むことが可能である。第二の例は、第一及び第二センスヌクレオチド及び第一及び第二アンチセンスヌクレオチドでの２’修飾を含むことができ、及びアンチセンス５’末端ヌクレオチドの５’炭素上でのホスホリル部分を含むことが可能である。第三の例は、第一及び第二センスヌクレオチド及び第二アンチセンスヌクレオチドでの２’修飾を含むことができ、及びアンチセンス５’末端ヌクレオチドの５’炭素上でのホスホリル部分を含むことが可能である。第四の例は、センス５’末端ヌクレオチド上の５’デオキシ基修飾、及び第一及び第二センスヌクレオチドでの２’修飾を伴った又は伴わない第一及び／又は第二アンチセンスヌクレオチドでの２’修飾、ならびにアンチセンス５’末端ヌクレオチドの５’炭素上でのホスホリル部分を含むことが可能である。さらに、いずれの２’修飾も不在下で、一アンチセンスヌクレオチドの５’炭素上のリン酸基の修飾を含むことは、オフターゲッティングを減少させるためにいくらかの利点を与えることが可能である。いくつかの例において、センス５’末端ヌクレオチドの５’炭素がリン酸基を有していないことが好適である。
【００９７】
例えば、オンターゲット修飾は、センス鎖のヌクレオチド位１及び２（例えば、５’末端の第一及び第二ヌクレオチド）上の２’−Ｏ−メチル、及びアンチセンス鎖上の５’ リン酸を含むことが可能である。加えて、オンターゲット修飾は、アンチセンス鎖の１及び／又は２位のヌクレオチド（アンチセンス鎖の５’末端から二番目のヌクレオチド）上の２’修飾、及びアンチセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’位のリン酸部分を含むことが可能である。好ましい修飾は、第一及び第二センスヌクレオチド及び第二アンチセンスヌクレオチドでの２’修飾、及びアンチセンス５’末端ヌクレオチド上のリン酸基を含む。
【００９８】
一つの態様において、本発明は、安定性増強修飾を有しているｓｉＲＮＡを含む。そのようなものとして、安定性修飾は、特異性修飾に加えて、又は代わりに使用することが可能である。加えて、安定性修飾を有しているｓｉＲＮＡは、ヌクレアーゼによる分解を防止できるので都合がよい。従って、安定性修飾はｓｉＲＮＡの可能な有効期間を延長でき、長時間にわたって、乾燥遺伝子サイレンシング組成物を有しているプレートを製造及び貯蔵する能力を増加させることが可能である。さらに、安定性修飾は、長時間にわたって、標的サイレンシングを誘導するために使用することが可能である。こうした安定性修飾は、米国特許出願番号６０／５４２，６４６,６０／５４３，６４０及び６０／５７２，２７０、米国出願番号２００４／０２６６７０７及び２００４／０１９８６４０及び国際公開番号ＷＯ２００５／０９７９９２及びＷＯ２００４／０９０１０５（各々が本明細書において援用される）に記載されている。細胞中で延長された遺伝子サイレンシングはいくつかの理由で都合がよい。いくつかの例において、標的化された遺伝子のタンパク質は長い半減期（例えば、２４〜４８時間を超えた）を有することが可能であり、タンパク質の量を減少させるためには延長された遺伝子サイレンシングを必要とする。
【００９９】
一つの態様において、本発明は、センス鎖、アンチセンス鎖及び／又はｓｉＲＮＡ二重鎖の安定性を増強するように設計された化学修飾パターンを含有するｓｉＲＮＡを含む。例えば、安定化ｓｉＲＮＡは、第一及び第二センスヌクレオチド上の２’修飾、少なくとも一つのからすべてのピリミジンセンスヌクレオチド上の２’修飾、第一及び／又は第二アンチセンスヌクレオチド上の２’修飾、少なくとも一つのからすべてのピリミジンアンチセンスヌクレオチド上の２’修飾、及び／又はセンス又はアンチセンス５’末端ヌクレオチドでのリン酸修飾を有している５’炭素を含有することが可能である。２’修飾は２’−Ｏ−脂肪族修飾又は２’−ハロゲン修飾であり得る。安定性修飾は、ホスホロチオエート又はメチルホスホネートによるヌクレオチド間修飾も含むことが可能である。
【０１００】
第一の例において、安定化ｓｉＲＮＡは、第一センス及び第二センスヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾、少なくとも一つのからすべてのセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾又は無修飾、少なくとも一つのからすべてのアンチセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−ハロゲン修飾、及びアンチセンス５’末端ヌクレオチドでの５’炭素ホスホリル修飾を含むことが可能である。第二の例は、第一センス及び第二センスヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾、少なくとも一つのからすべてのセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾又は無修飾、少なくとも一つのからすべてのアンチセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−ハロゲン修飾、アンチセンス５’末端ヌクレオチドでの５’炭素ホスホリル修飾、及び第一センスヌクレオチドの５’炭素上のコレステロールコンジュゲートを含むことが可能である。第三の例は、第一センス及び第二センスヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾、少なくとも一つのからすべてのセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾又は無修飾、少なくとも一つのからすべてのアンチセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−ハロゲン修飾、アンチセンス５’末端ヌクレオチドでの５’炭素ホスホリル修飾、及び第一センスヌクレオチドの５’炭素上の蛍光タグコンジュゲートを含むことが可能であり、ここで蛍光タグは、Ｃｙ３のようないずれか公知の蛍光基によることができる。第四の例は、第一センス及び第二センスヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾、少なくとも一つのからすべてのセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾又は無修飾、第一及び／又は第二アンチセンスヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾、少なくとも一つのからすべてのアンチセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾又は無修飾、及び第一センスヌクレオチドの５’炭素上の蛍光タグコンジュゲートを含むことが可能である。第五の例は、第一センス及び第二センスヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾、少なくとも一つのからすべてのセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾又は無修飾、第一及び／又は第二アンチセンスヌクレオチド上の２’−Ｏ−脂肪族修飾、少なくとも一つのからすべてのアンチセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−ハロゲン修飾又は無修飾、及びアンチセンス５’末端ヌクレオチドでの５’炭素ホスホリル修飾を含むことが可能である。加えて、２’−ハロゲンのいずれもを２’又は３’原子のホスホロチオエート基で置き換えることが可能である。また、ｓｉＲＮＡのいずれもが、アンチセンス鎖の３’末端にオーバーハングを含むことが可能である。場合により、第二アンチセンスヌクレオチドは、２’−Ｏ−メチルのような２’−Ｏ−アルキル基を含んでなることが可能であり、及び第一アンチセンスヌクレオチドは、２’−ＯＨ又は２’−Ｏ−メチルを含んでなることが可能である。別の選択肢において、オーバーハングヌクレオチドは２’修飾を含むことが可能である。
【０１０１】
前記に従うと、２’修飾は２’−Ｏ−脂肪族修飾であり得る。また、２’−Ｏ−脂肪族修飾はセンス鎖及び／又はアンチセンス鎖のいずれのヌクレオチドにも存在することが可能である。脂肪族基は、１〜２０炭素又はヘテロ原子を有する飽和又は不飽和、置換又は非置換、及び分枝又は非分枝鎖を含むことが可能である。より好ましくは、脂肪族基は１０未満の炭素又はヘテロ原子、より好ましくは５未満の炭素又はヘテロ原子を有し、又はアルキル基である。一つの選択肢において、２−Ｏ−脂肪族修飾は２’−Ｏ−芳香族置換で置き換えること、又は芳香族基を含むことが可能である。別の選択肢において、脂肪族基は環式であることが可能である。例えば、２’−Ｏ−アルキルは、２’−Ｏ−メチル、２’−Ｏ−エチル、２’−Ｏ−プロピル、２’−Ｏ−イソプロピル、２’−Ｏ−ブチル、２’−Ｏ−イソブチル、２’−Ｏ−エチル−Ｏ−メチル（即ち、−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３）、２’−Ｏ−エチル−ＯＨ（即ち、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＨ）、２’−オルトエステル、２’−ＡＣＥ基オルトエステル及びそれらの組み合わせから成る群より選択することが可能である。最も好ましくは、２’−Ｏ−アルキル修飾は２’−Ｏ−メチル部分である。加えて、ｓｉＲＮＡが修飾を有する多ヌクレオチドを含む場合、修飾が修飾ヌクレオチドの各々について同一であるという要求はない。しかしながら、本発明の分子を合成することに関して実際的な問題として、全体を通して同一の修飾を使用することが望ましい。
【０１０２】
一つの態様において、２’修飾がオルトエステルであるのが好ましい。そのようなものとして、２’修飾は２’−ＡＣＥ基であり得る。２’−ＡＣＥ基修飾は、米国特許番号第６，５９０，０９３、６，００８，４００，及び５，８８９，１３６号（各々が本明細書において援用される）に概説されている。
【０１０３】
加えて、２’−ハロゲン修飾は、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素から成る群より選択することが可能である；しかしながら、フッ素が好ましい。特異性修飾と同様に、各それぞれの鎖を通して同一の２’修飾を使用することが望ましい。例えば、２’−Ｏ−メチルをセンス鎖上で使用することができ、及び２’−Ｆをアンチセンス鎖で使用することができる。しかしながら、異なった２’修飾を、同一鎖の異なったヌクレオチド上で使用することも可能である。
【０１０４】
Ｂ．コンジュゲート
本発明の一つの態様において、ｓｉＲＮＡは、センス及び／又はアンチセンス鎖へカップリングされたコンジュゲートを含むことが可能である。コンジュゲートは多様な機能を遂行することができ、又はｓｉＲＮＡに追加の機能性を提供する。例えば、コンジュゲートは担体と複合体形成されていても又はいなくても、細胞膜を通したｓｉＲＮＡの貫入を増加させることが可能である。加えて、コンジュゲートはラベルすることが可能であり、ラベルされたｓｉＲＮＡが細胞に侵入したかどうかを決定するためにモニターする、又は同定することが可能である。
【０１０５】
例えば、コンジュゲートはアミノ酸、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、抗原、毒素、ホルモン、脂質、ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリヌクレオチド、糖、ステロイド、炭水化物、ポリサッカリド、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのようなポリアルキレングリコール、コレステロール、リン脂質、ジ−及びトリ−アシルグリセロール、脂肪酸、脂肪族、酵素基質、ビオチン、ジゴキシゲニン、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオールのようなチオエーテル、チオコレステロール、ドデカンジオール又はウンデシル基のようなアシル鎖、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール、トリエチルアンモニウム  １，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート、ポリリシン及びポリエチレンイミンのようなポリアミン、アダマンタン酢酸、パルミチル部分、オクタデシルアミン部分、ヘキシルアミノカルボニル−オキシコレステロール、ファルメシル、ゲラニル  ゲラニルゲラニル部分、ローダミン及びフルオレセインのような蛍光ラベル、放射活性ラベル、酵素ラベルなどを含むことが可能である。好ましいコンジュゲートは、コレステロール及び蛍光ラベルを含む。
【０１０６】
コレステロール，ポリエチレングリコール又はポリペプチドのようなコンジュゲートは、細胞内へのｓｉＲＮＡの送達を容易にすることができる。好ましくは、コンジュゲートが脂質である場合、脂質はｓｉＲＮＡに付随している時には細胞毒性を誘発しない。加えて、ポリペプチド又は脂肪酸又はコレステロールのような脂質コンジュゲートについては、ｓｉＲＮＡ−担体複合体（例えば、リポプレックス）を形成する必要性を除くことが可能である。一部、このことは、ポリペプチド又は脂質が、細胞膜を横切って輸送することに貢献することが可能であるためである。
【０１０７】
例えば、コレステロールコンジュゲートは、サイレンシング剤としてのｓｉＲＮＡの効力を改良するために用いることが可能である。この改良は、修飾及び無修飾ｓｉＲＮＡ、ならびにｓｈＲＮＡで得ることが可能である。センス鎖へのコレステロールのカップリングは、センス鎖への２’修飾による負の効果を軽減することができる。いくつかの場合において、コレステロールは、ポリヌクレオチド担体を使用することなしに、細胞内へのｓｉＲＮＡの受動送達を可能にすることができる；しかしながら、脂質のようなポリヌクレオチド担体は、コレステロールコンジュゲートと共に使用することが可能である。従って、孔を形成し、それを通ってｓｉＲＮＡが通過することができることによるか、又は膜内へ取り込まれ、続いてエンドサイトーシス経路又は膜リサイクリングにより細胞内へ送達されることによりｓｉＲＮＡ−コレステロールが送達される。
【０１０８】
加えて、蛍光コンジュゲートのようなラベルは、細胞内へのｓｉＲＮＡの送達をモニターするために使用することが可能である。蛍光ラベルは、細胞内への対照ｓｉＲＮＡの送達を測光法的にモニターするために使用することが可能である。好ましくは、蛍光ラベルはローダミン又はフルオレセインである；しかしながら、ｓｉＲＮＡとカップルすることができる他の蛍光分子も使用することが可能である。蛍光ラベルの具体的例には、Ｃｙ３（商標）、Ｃｙ５（商標）（Amersham）、他のシアナイン誘導体、ＦＩＴＣ、ＡＬＥＸＡ（商標）又はＢＯＤＩＰＹ（商標）色素の一つ（Molecular Probes、Eugene,OR)、ダンシル部分などが含まれる。粒子がトランスフェクション効率に影響しないサイズを有する限り、無機蛍光粒子のような蛍光微粒子を使用することも可能である。ラベルは、トランスフェクトされた細胞内のラベルされたｓｉＲＮＡの分布を可視化するために使用することができる。加えて、ラベルは、トランスフェクト細胞と非トランスフェクト細胞を区別するために使用することが可能である。そのようなものとして、細胞の集団をラベルされたｓｉＲＮＡでトランスフェクトし、そしてＦＡＣＳにより選別することができる。さらに、蛍光ラベルはＨＣＳ及びＨＴＣ分析技術に特によく適している。例えば、トランスフェクトされた細胞を同定し、次ぎにＨＣＳ分析を使用してさらに試験することが可能である。
【０１０９】
ラベルされたヌクレオチドの使用は当業者には公知であり、質量又は放射活性ラベルのような蛍光ラベル以外のラベルを、こうしたタイプのラベルが都合がよいであろう応用で使用することができる。ｓｉＲＮＡリバーストランスフェクションに適用可能であるラベルされた分子のさらなる記述は、米国仮特許出願番号６０／５４２，６４６、６０／５４３，６４０及び６０／５７２，２７０、及びＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＵＳ０４／１０３４３（各々が本明細書において援用される）に見られる。
【０１１０】
コンジュゲートはｓｉＲＮＡに直接又はリンカーを介して結合させることが可能である。コンジュゲートは、ｓｉＲＮＡ内のいずれのセンス又はアンチセンスヌクレオチドへも結合させることが可能であるが、３’末端ヌクレオチド及び／又は５’末端ヌクレオチドを介したカップリングが好ましい。内部コンジュゲートは、リボース基の２’位のヌクレオチドへ、又は別の適した位置へ直接的に又はリンカーを介して間接的に結合することができる。例えば、コンジュゲートは５−アミノアリルウリジンへカップリングさせることが可能である。好ましくは、コンジュゲートを、センス３’末端ヌクレオチド、アンチセンス３’末端ヌクレオチド及びアンチセンス５’末端ヌクレオチドへ結合することが可能である。
【０１１１】
例えば、リンカーは、修飾又は無修飾ヌクレオチド、ヌクレオシド、ポリマー、糖、炭水化物、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのようなポリアルキレン、ポリアルコール、ポリプロピレン、エチレン及びプロピレングリコールの混合物、ポリアルキアミン、ポリリジン及びスペルミジンのようなポリアミン、ポリ（エチルアクリレート）のようなポリエステル、ポリリン酸ジエステル、脂肪族化合物、及びアルキレンを含んでなることが可能である。コンジュゲート及びそのリンカーの例は、コレステロール−ＴＥＧ−ホスホラミダイトであり、ここでコレステロールはコンジュゲートであり、テトラエチレングリコール（「ＴＥＧ」）及びリン酸はリンカーとして働く。
【０１１２】
加えて、コンジュゲート、コンジュゲートの使用、及びコンジュゲートを含んでなるｄｓＲＮＡを作製する方法を例示している例は、以下の参照文献に開示されている：２００３年４月２日に提出され、米国特許出願番号２００４／０１９８６４０として公開された米国特許出願番号１０／４０６，９０８；２００３年７月１日に提出され、２００４年１２月３０日に米国特許出願番号２００４／０２６６７０７  Ａ１として公開された米国特許出願番号１０／６１３，０７７；及び、国際出願日２００４年４月１日、２００４年１０月２１日にＷＯ２００４／０９０１０５Ａ２として公開されたＰＣＴ／ＵＳ０４／１０３４３；ここで前記出願の各々が本明細書において援用される。しかしながら、コンジュゲートを含んでなるｓｉＲＮＡは、当該技術分野で公知のいずれか適した方法により合成することが可能である。
【０１１３】
ＶＩ．オフターゲッティングを減少させること
オフターゲッティングは、一つの遺伝子を標的とし、及び沈黙させるように設計されたｓｉＲＮＡが意図せずに一つまたはそれより多くの追加の遺伝子を標的とし、及び沈黙させた場合に起こる。こうしたオフターゲッティングは、ｓｉＲＮＡのセンス及び／又はアンチセンスと意図されていない標的ｍＲＮＡ間の相補性レベルを変化させることにより起こすことが可能である。オフターゲッティングにより生じる結果は重大な遺伝子のサイレンシングを含むことができ、そして多様な表現型（例えば、細胞死、細胞分化）を生じさせる。また、オフターゲッティングは種々の表現型スクリーニングにおいて偽陽性を発生させることが可能である。そのようなものとして、オフターゲッティングの結果は、大規模なゲノム全域にわたるｓｉＲＮＡに基づいた表現型スクリーニングの実行には、取り組みがいのある障害を代表している。従って、いずれのオフターゲッティング遺伝子サイレンシングも減少させる、及び除去することが有利である。
【０１１４】
一つの態様において、ｓｉＲＮＡのプールを使用することにより、オフターゲッティングの結果を最小化又は抑制することが可能である。ｓｉＲＮＡのプールは、単一ｓｉＲＮＡと比較してより少ないオフターゲット効果を発生することが示されている。上で指摘したように、プールは一つの標的ｍＲＮＡの異なった配列と実質的に相補的である二つ又はそれより多くのｓｉＲＮＡを含んでなることができ、又はそれらは異なった標的ｍＲＮＡの配列と実質的に相補的であることができる。例えば、第一のｓｉＲＮＡ及び第二のｓｉＲＮＡは、一つの標的ｍＲＮＡの第一の及び第二の副配列と実質的に相補的であるアンチセンス配列を含むことが可能である。第一の及び第二の副配列は、相互に排他的に、又はオーバーラップさせることが可能である。遺伝子サイレンシング組成物は、二つ、三つ、四つ、五つ又はそれより多くの異なったｓｉＲＮＡを有するプールを含むことが可能である。ｓｉＲＮＡのプールによるオフターゲット効果を減少させることの利点は、少なくとも二つのｓｉＲＮＡが同一の標的に対して方向付けられている場合に特に顕著である。また、修飾ｓｉＲＮＡのプール、ヘアピン構造を有しているｓｉＲＮＡのプール、又はコンジュゲートを有しているｓｉＲＮＡのプールも都合がよい。ｓｉＲＮＡのプールを使用することの利点は、２００３年１１月１４日に提出された米国特許出願１０／７１４，３３３；ＷＯ２００４／０４５５４３  Ａ２として２００４年６月３日に公開された関連ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ０３／３６７８７；２００４年９月１４日に提出され、米国特許出願公開２００５／０２５５４８７として公開された米国特許出願１０／９４０，８９２、及び米国特許出願公開２００５／０２４６７９４（各々が本明細書において援用される）、に記載されている。
【０１１５】
オフターゲッティングの減少又は増加した特異性は、オフターゲット効果を誘発するレベル以下であるｓｉＲＮＡ濃度を使用することによっても達成することが可能である。例としては、１００ｎＭでの単一ｓｉＲＮＡのトランスフェクションは９０％サイレンシングを誘導でき、けれども、ｓｉＲＮＡの高い濃度はオフターゲット効果も誘導することができる。対照的に、四つのｓｉＲＮＡのプール（例えば、１００ｎＭの総濃度、各２５  ｎＭ）も同様に９０％サイレンシングを誘導できる。各ｓｉＲＮＡは４分の１のより低い濃度であるので、オフターゲットの総数はより少ない。それ故、抑制された又はオフターゲット効果がないサイレンシングを得るためには、高度に機能的なｓｉＲＮＡを低濃度で使用するか、又は同一の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡのプール（ここでプールの各ｓｉＲＮＡはオフターゲット効果を最少にするために十分に低い脳で有している）を使用することができる。好ましくは、ｓｉＲＮＡの総濃度が１００ｎＭに等しいか又はそれ未満の濃度で送達することが可能である。より好ましくは、ｓｉＲＮＡの総濃度が５０ｎＭに等しいか又はそれ未満の濃度で送達することが可能である。さらにより好ましくは、ｓｉＲＮＡの総濃度が２５ｎＭに等しいか又はそれ未満の濃度で送達することが可能である。さらにより好ましくは、ｓｉＲＮＡの総濃度が１０ｎＭに等しいか又はそれ未満の濃度で送達することが可能である。最も好ましくは、ｓｉＲＮＡの総濃度が１ｎＭに等しいか又はそれ未満の濃度で送達することが可能である。
【０１１６】
別の態様において、オフターゲット効果を抑制する又は停止するための別の方法は、第二のアンチセンスヌクレオチドの二重鎖塩基対形成内に熱力学的不安定性を導入することである。例えば、このことは前記ｓｉＲＮＡアンチセンスヌクレオチド及び標的ｍＲＮＡ中で存在すべき補体に位置しているヌクレオチド間のミスマッチを介して達成することが可能である。もしくは、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖又はセンス鎖中のヌクレオチドの挿入又は欠失が、ｓｉＲＮＡアンチセンス鎖又はセンス鎖と標的ｍＲＮＡ又はオフターゲットされた配列間に形成される二重鎖中にバルジを発生させることが可能である。加えて、熱力学的不安定性は、５’末端から三番目、四番目、五番目、六番目及び／又は七番目のアンチセンスヌクレオチドに導入することも可能である。しかしながら、生じた熱力学的不安定性は、他の配列のサイレンシングを導くことも可能であるが（即ち、他の又は二次的オフターゲット効果）、合理的に設計された熱力学的不安定性により避けることが可能である。
【０１１７】
ＶＩＩ．ポリヌクレオチド担体
一つの態様において、本発明は、ｓｉＲＮＡと相互作用可能で、細胞膜を横切ってｓｉＲＮＡを輸送するポリヌクレオチド担体を含む。しかしながら、本発明の他の態様において、エレクトロポレーション、沈降、粒子衝撃、オプトポレーション及びマイクロインジェクションによるような、トランスフェクション様式は担体なしで実行することが可能である。通常、ポリヌクレオチド担体は、ポリヌクレオチド主鎖上の陰性に荷電されたリン酸と相互作用する陽性電荷を含む。ポリヌクレオチド担体は、細胞性核酸送達の分野では公知である。好ましいポリヌクレオチド担体には、ｓｉＲＮＡと複合体形成でき、そして過度に毒性ではなく遺伝子サイレンシング機能性を保持した様式で細胞内へｓｉＲＮＡを送達できる、ポリマー、脂質、リポポリマー、脂質−ペプチド混合物などが含まれる。そのようなものとして、特定のシステム又は細胞についての最適なポリヌクレオチド担体を同定するため、ルーチン実験をＲＴＦを最適化することに関して本明細書で記載された方法で実行することが可能である。
【０１１８】
一つの態様において、脂質又は脂質−ペプチド混合物は、標的細胞内にｓｉＲＮＡを導入することについて好適である。典型的には、脂質はカチオン性脂質である。細胞内にｓｉＲＮＡを導入するために使用することが可能であるカチオン性脂質は、ほとんど又は全く毒性を有しないこと（例えば、１５〜２０％未満の毒性として定義される）により特徴付けられ、それはアラマーブルー（ＡｌａｍａｒＢｌｕｅ）又は等価な細胞生存率アッセイにより測定することが可能である。加えて、脂質は、遺伝子サイレンシングを誘発するため、細胞内へ十分な量のｓｉＲＮＡを送達することが可能である。脂質は、限定されるわけではないが、Invitrogen（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００）、Ambion（ｓｉＰＯＲＴ（商標））、B-Bridge International（ｓｉＦＥＣＴＯＲ（商標））、Mirus（ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（商標））及びQiagen（ＲＮＡｉＦＥＣＴ（商標））を含む多様な商業的供給元から入手可能である。しかしながら、すべての脂質が機能的に等価ではなく、特定の脂質が具体的細胞株でより良好に実施できる。それ故、前記最適化過程を、具体的細胞株についてｓｉＲＮＡを送達するための適切な脂質及び脂質濃度を決定するために用いることが可能である。また、脂質−ペプチド混合物は、細胞内へのｓｉＲＮＡの増強された送達を提供することが可能である。一つまたはそれより多くのタンパク質、脂質、脂質−ポリサッカリド又は細胞膜の他の成分に親和性を有するペプチドをｓｉＲＮＡにコンジュゲートすることが可能であり、脂質とは独立して、又は一つまたはそれより多くの脂質と都合よく混合してポリヌクレオチド担体を形成させて使用する。こうした脂質−ペプチド混合物は、ｓｉＲＮＡのＲＴＦを増強できる。コレステロールコンジュゲートは同様にｓｉＲＮＡとカップリングでき、ポリヌクレオチド担体とは独立して、又はそれらと都合よく混合して使用することが可能である。
【０１１９】
簡単に説明すると、所与の脂質がｓｉＲＮＡ  ＲＴＦに許容できるかどうかを同定するため、二つ又はそれより多くのよく特徴付けられたｓｉＲＮＡを、本明細書に記載した最適化ＲＴＦ法を使用して、種々の脂質、媒質及びｓｉＲＮＡ濃度下で試験することが可能である。引き続いて、標的化遺伝子のサイレンシングのレベル及び細胞死のレベルを当該技術分野で許容されている技術を使用して定量する。ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦに適した脂質には、限定されるわけではないが、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＫＯ（商標）又はＴＢＩＯ  Ｌｉｐｉｄ６（商標）（Transgenomic  部品番号24-1001-05）が含まれる。より好ましくは、本発明はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００（Invitrogen）を使用する。そして最も好ましくは、本発明は、ｓｉＲＮＡの送達のために特別に設計された脂質：ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）２、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）３、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）４（Dharmacon、Inc.）を使用する。用語「ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）」（番号１、２、３又は４のいずれかが続く）又は句「ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）トランスフェクション試薬」とは、より大きな核酸（例えば、プラスミド）よりもむしろｓｉＲＮＡをトランスフェクトするために最適化されている一つまたはそれより多くの脂質に基づいたトランスフェクション試薬を指す。
【０１２０】
機能性ｓｉＲＮＡ−脂質複合体の形成は、ｓｉＲＮＡ及び脂質を混合することにより調整することが可能である。そのようなものとして、選択された濃度の脂質の適切な容量を、媒質及び／又は緩衝液の容量と混合することにより、適した濃度の脂質を有している脂質−媒質又は脂質−緩衝液を形成させる。例えば、約５〜５０マイクロリットル（「ｕＬ」）の範囲の脂質媒質の容量は、９６ウェルプレートの各ウェル内に導入されるべき約０．０３〜２マイクログラム（「ｕｇ」）の脂質を含むことができ、他のウェルサイズに対応して脂質の量を変化させることが可能である。ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦのための媒質及び／又は緩衝液の選択で、ＲＴＦプロトコルの効率を改良することが可能である。いくつかの媒質は、ＲＴＦの間に細胞毒性及び／又は非特異的遺伝子変調を誘導する、一つまたはそれより多くの添加物を含んでいる。好ましい媒質又は緩衝液の例には、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）（GIBCO、カタログ番号31985-070）、ＨｙＱ−ＭＥＭ−ＲＳ（商標）（HyClone、カタログ番号SH30564.01）、ハンクス平衡塩溶液（商標）又は均等な媒質が含まれる。適した媒質は、本明細書に記載した最適化プロトコルを用いることにより同定することが可能である。
【０１２１】
脂質−媒質又は脂質−緩衝液は、ハンドヘルドシングル又はマルチチャネルピペッター、又はウェル内に液体溶液の一定量を注入可能なより進化した及び自動化送達システムを含む種々の方法により、ウェル内へ導入することが可能である。液体溶液は、乾燥遺伝子サイレンシング組成物を含有するウェル中で、ｓｉＲＮＡを可溶化又は懸濁するのに十分な時間インキュベートし、ｓｉＲＮＡ−脂質複合体（例えば、リポプレックス）を形成させる。一般に、ｓｉＲＮＡ可溶化及びリポプレックス形成のプロセスは約２０分を必要とするが、通常１２０分は超えない。複合体形成プロセスは一般には室温で実施されるが、４〜３７℃の範囲のオンで実施することが可能である。いくつかの例において、脂質及びｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ可溶化及び複合体形成の速度を促進するため、短期間（例えば、秒〜分）、プレートを激しく動かすことにより（例えば、旋回、ボルテックス、超音波処理）混合することが可能である。
【０１２２】
ＶＩＩＩ．ウェル配置
一つの態様において、異なった乾燥遺伝子サイレンシング組成物を有している多ウェルｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプレートは、前もって決定された配置に組織化されたウェルを有することが可能である。こうした配置は、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプレートに用いられているアッセイのタイプに対応することが可能である。即ち、遺伝子のファミリーが研究されている場合、同一の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡは、一つのカラム又は列に組織化することができ、一方、異なった遺伝子を標的としているｓｉＲＮＡは異なったカラム又は列に組織化することができる。それ故、ウェルを、特定のｓｉＲＮＡがプレート上の前もって選択されたパターンになるように、前もって選択された配置に組織化することが可能である。前もって選択されたパターンは、一つまたはそれより多くの陰性及び／又は陽性ｓｉＲＮＡ対照、及びトランスフェクション対照を含むウェルのような、対照ウェルを含むことが可能である。また、前もって選択されたパターンは、対照及び較正として使用することが可能である、空又は実質的にｓｉＲＮＡを欠いているウェルも含むことが可能である。
【０１２３】
多数のプレートを同時に調製することができるように、異なったウェルプレートのウェル中に前もって乾燥されたｓｉＲＮＡを有することが有利である。このことは、ウェルプレートがｓｉＲＮＡの標準化された位置及び量で遺伝子サイレンシング組成物を有することを可能にし、それはプレート間に可変性を導入することなしに長い間にわたって実施することが可能な多数の実験において、標準化ウェルプレートを使用するために有利である。標準化されたプレート配置の使用は、長い間にわたって使用することが可能な一連のプレートを提供することが可能であり、一緒に分析することが可能であるデータを提供する。
【０１２４】
例えば、複数のウェルのカラムを含んでなるプレートは、第一のカラムにトランスフェクション対照、第二のカラムにＲＮＡｉのための陽性対照、第三のカラムにＲＮＡｉのための陰性対照、第四のカラムに単一標的に対して方向付けられたｓｉＲＮＡのプールを含み、及び第四のカラムに含まれているｓｉＲＮＡプールの個々のメンバーは、五番目から十二番目のカラムのような続いてのカラムである。もしくは、五番目から十二番目のカラムは第四のカラムのプール中の各ｓｉＲＮＡの異なった濃度を含んでなることが可能であり、ｓｉＲＮＡの量をウェルからウェルへ増加させ、又はウェルからウェルへ減少させる。各ウェルはプール中の各ｓｉＲＮＡの一つの濃度、又は異なったウェル中にあることができるプールの各ｓｉＲＮＡの二つ、三つ、四つ、五つ又はそれより多くの濃度を含むことが可能である。使用することが可能なｓｉＲＮＡの濃度の数は、プレート上のウェルの数のみにより制限される；しかしながら、多プレートは、プレートのすべてを横切って広がる前もって決められたパターンと一緒に使用されるように構成することが可能である。
【０１２５】
従って、特定のｓｉＲＮＡの多数の濃度で、特定のｓｉＲＮＡによるサイレンシングのレベルを観察することにより、プール中の各ｓｉＲＮＡの最適濃度が決定できるように、ｓｉＲＮＡ濃度勾配の前もって選択されたパターンを、観察可能なパターンとして使用することが可能である。例えば、第四のカラム中の連続した列は、全プールｓｉＲＮＡの連続的に増加する、又は減少する量を有することが可能である。加えて、連続的カラムは、プールの個々のｓｉＲＮＡの連続的に増加する、又は減少する量を含むことが可能である。
【０１２６】
図１Ａ及び１Ｂは、前記の濃度配置と類似したプレート配置の態様を例示している。ウェルは四角であるように示されているが、それはいずれの形状でも可能なことを認識すべきである。また、ウェルプレートはかなり多数のウェルを含むことが可能であり、描かれているウェルの数は単なる例である。図において、ウェルは以下のように定義される：「Ｔｃ」は、トランスフェクション対照ウェルを示しており、ここで増加している対応数字は異なった対照を同定している；ブランクウェルは、いずれかのｓｉＲＮＡを欠く又は実質的に欠くウェルを示している；「＋」は陽性対照を示している；「−」は陰性対照を示している；「Ｐ１」〜「Ｐ１Ｎ」は、濃度勾配での第一の遺伝子を沈黙させる第一のプールを示している；「Ｐ２」〜「Ｐ２Ｎ」は、濃度勾配での第二の遺伝子を沈黙させる第二のプールを示している；「１Ａ」〜「１Ｎ」は、濃度勾配での第一のプールの第一の個々のｓｉＲＮＡを示している；「２Ａ」〜「２Ｎ」は、濃度勾配での第一のプールの第二の個々のｓｉＲＮＡを示している；「３Ａ」〜「３Ｎ」は、濃度勾配での第一のプールの第三の個々のｓｉＲＮＡを示している；「４Ａ」〜「４Ｎ」は、濃度勾配での第二のプールの第一の個々のｓｉＲＮＡを示している；「５Ａ」〜「５Ｎ」は、濃度勾配での第二のプールの第二の個々のｓｉＲＮＡを示している；及び「６Ａ」〜「６Ｎ」は、濃度勾配での第二のプールの第三の個々のｓｉＲＮＡを示している。それ故、図１Ａは、単一プールをアッセイしているウェルプレートを例示し、図１Ｂは、多プールをアッセイしているウェルプレートを例示している。加えて、ウェルプレートは、二つより多くのプールを含むことが可能である。また、プール及び単一ｓｉＲＮＡは、合理的に設計すること、及び／又は修飾又はコンジュゲートを有することが可能である。
【０１２７】
加えて、プレート配置の態様は、プレートが単一の生物学的に関連する経路、細胞プロセス、細胞的事象、調節タンパク、胚性プロセス、染色体中の特異的座位、細胞周期、有機体又は器官の発生、細胞の分化、炎症プロセス、増殖プロセス、血管新生などに対して方向付けられたｓｉＲＮＡを含んでなるように組織化することが可能である。別の態様において、疾患又は障害、又は疾患又は障害に先だった生物学的プロセスに結びつけられることが既知である及び／又は疑われているｓｉＲＮＡ標的化遺伝子でプレートを整列させることが可能である。別の態様において、ウェルプレートは、ｍＲＮＡ阻害剤として機能するｓｉＲＮＡを含むことが可能である。別の態様において、既知の又は疑われる上流及び下流効果が付随するｓｉＲＮＡで生物学的経路を研究するためのプレート配置の原理は、キナーゼではないタンパク質に応用することが可能である。多様な研究のための、これら及び他のプレート配置の追加の記述は、援用される米国仮出願番号６０／６７８，１６５に概説されている。
【０１２８】
別の態様において、ウェルプレートは、一つまたはそれより多くの単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）を有する遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡで配置することが可能である。こうしたウェルプレートは、表現型、生物学的機能、疾患状態又は他の事象への、特別のＳＮＰの寄与を評価するために調製することが可能である。例えば、ＳＮＰプレートは、異なったｓｉＲＮＡ（単数又は複数）を有するウェルを含んでなることができ、以下を含んでいる：（ｉ）第一の標的に対して方向付けられた第一のｓｉＲＮＡ；（ｉｉ）第一のｓｉＲＮＡとは一つの塩基対が異なる第二のｓｉＲＮＡ、ＳＮＰを含む；（ｉｉｉ）第一のｓｉＲＮＡ及び第二のｓｉＲＮＡを含んでなるｓｉＲＮＡプール；及び（ｉｖ）対照ｓｉＲＮＡ。また、第一の標的及び第二の標的は潜在的致死的対をコードすることが可能である。このようにして、研究者は、癌、神経学上の疾患、糖尿病、代謝病、骨の疾患、軟骨、筋肉、心臓、腎臓、肝臓、前立腺、胃腸管及びその他に付随する状態を含む多様な疾患を研究することが可能である。これらのプレートのウェルは、個々の又はプールのｓｉＲＮＡを含んでなることができる。
【０１２９】
加えて、異なったウェルに、修飾された及び／又は修飾されていない多数の異なったｓｉＲＮＡを含むように、ウェルプレートを配置することが可能である。例えば、９６ウェルプレートは以下のものを含むことができる：修飾されていない第一のｓｉＲＮＡの１０−１２ウェル；修飾されている第一のｓｉＲＮＡの１０−１２ウェル；修飾されていない第二のｓｉＲＮＡの１０−１２ウェル；修飾されている第二のｓｉＲＮＡの１０−１２ウェル；修飾されていない第三のｓｉＲＮＡの１０−１２ウェル；修飾されている第三のｓｉＲＮＡの１０−１２ウェル；修飾されていない第四のｓｉＲＮＡの１０−１２ウェル；及び修飾されている第四のｓｉＲＮＡの１０−１２ウェル。第一、第二、第三及び第四のｓｉＲＮＡは、それらが重複できる又はできない、又はそれらが無関係のタンパク質又は同一の生物学的経路において類似の機能を有する又は作用するタンパク質をコードする異なったｍＲＮＡへ方向付けることができるように、同一標的ｍＲＮＡの異なった領域へ方向付けることができる。
【０１３０】
別の態様において、ウェルのいくつかがプール含んでなり、そしてウェルのいくつかがｓｉＲＮＡの単一のタイプを含んでなるようにウェルプレートを配置することが可能である。それ故、ウェルプレートは、以下のものを含んでなる異なったウェルを有することができる：（ｉ）第一のｓｉＲＮＡ、第二のｓｉＲＮＡ、第三のｓｉＲＮＡ、第四のｓｉＲＮＡ及び第五のｓｉＲＮＡ、そのいずれもが修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｉｉ）第一のｓｉＲＮＡ、第二のｓｉＲＮＡ、第三のｓｉＲＮＡ及び第四のｓｉＲＮＡ、そのいずれもが修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｉｉｉ）第一のｓｉＲＮＡ、第二のｓｉＲＮＡ、第三のｓｉＲＮＡ及び第五のｓｉＲＮＡ、そのいずれもが修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｉｖ）第一のｓｉＲＮＡ、第二のｓｉＲＮＡ、第四のｓｉＲＮＡ及び第五のｓｉＲＮＡ、そのいずれもが修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｖ）第一のｓｉＲＮＡ、第三のｓｉＲＮＡ、第四のｓｉＲＮＡ及び第五のｓｉＲＮＡ、そのいずれもが修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｖｉ）第二のｓｉＲＮＡ、第三のｓｉＲＮＡ、第四のｓｉＲＮＡ及び第五のｓｉＲＮＡ、そのいずれもが修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｖｉｉ）第五のｓｉＲＮＡ、それは修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｖｉｉ）第六のｓｉＲＮＡ、それは修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｖｉｉｉ）第七のｓｉＲＮＡ、それは修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｉｘ）第八のｓｉＲＮＡ、それは修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｘ）第九のｓｉＲＮＡ、それは修飾されていてもよいし又は修飾されていなくてもよい；（ｘｉ）対照ｓｉＲＮＡ。
【０１３１】
加えて、ウェルプレート配置は、ｓｉＲＮＡのライブラリーを研究するために組織化することができ、それはアレーフォーマットで提供することが可能である。好ましくは、アレーはＲＴＦ  ｓｉＲＮＡライブラリーを含んでなる。ＲＴＦ  ｓｉＲＮＡライブラリーは、全遺伝子ファミリー又は調節経路を研究するために使用することが可能である。これらのｓｉＲＮＡライブラリーは、特定の経路に関係あること又は指示された遺伝子ファミリーに系統学的に関係することが確認されている、ｓｉＲＮＡ試薬標的化遺伝子の合理的に設計されたプールの前もって選択された群を含む。加えて、こうしたｓｉＲＮＡライブラリーの例は、表１で再検討することが可能である。
【０１３２】
【表１】
2008532480.tif 000002
【０１３３】
表１のｓｉＲＮＡライブラリーを含んでなるｓｉＲＮＡの説明、表１に特定された経路を研究するための遺伝子サイレンシングの使用のより完全な説明、及びプレート配置及びｓｉＲＮＡのプールを使用して研究することが可能な遺伝子のタイプの追加の説明は、米国仮出願番号６０／６７８，１６５に提供されている。
【実施例】
【０１３４】
以下の実施例は、本発明のいくつかの態様を、本発明を実施するために当業者が使用することが可能である様式で記述するために提供する。従って、以下の実施例は、実際に実行された実験ならびに机上の実験を含む。追加の実験及び以下の実施例の補足の情報は、「APPARATUS AND SYSTEM HAVING DRY GENE SILENCING POOLS」と題し、発明者としてBarbara Robertson, Ph.D., et al.による、代理人整理番号第16542.1.2号；「APPARATUS AND SYSTEM HAVING DRY CONTROL GENE SILENCING COMPOSITIONS」と題し、発明者としてBarbara Robertson, Ph.D., et al.による、代理人整理番号第16542.1.3号；及び米国仮出願番号60/678,165 、を有する援用された参照文献に概説されている。本実験で使用されたポリヌクレオチド配列は、米国仮出願番号60/678,165 の表Ｉ〜ＩＶに見ることができる。
【０１３５】
実施例１
本発明のポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡを形成するポリヌクレオチドを製造するために使用することが可能である、現在既知の又は将来開発されるいずれの方法によっても合成することが可能である。本明細書に記載した修飾を含むｓｉＲＮＡ二重鎖の一本鎖は、Scaringe, S.A. (2000) Advanced 5’-silyl-2’-orthoester Approach to RNA Oligonucleotide Synthesis, Methods Enzymol., 317, 3-18; Scaringe, S.A. (2001) RNA Oligonucleotide Synthesis via 5’-silyl-2’-orthoester Chemistry, Methods, 23, 206-217; 米国特許第5,889,136号;米国特許第6,008,400号;米国特許第6,111,086号;及び米国特許第6,590,093号;その各々は本明細書において援用される；に記載されている材料の組成物及び方法を使用して、化学的に合成することができる。簡単には、合成法は、特異的ｓｉＲＮＡ配列を有しているポリヌクレオチド内に修飾又は無修飾ヌクレオチドを取り込ませるため、ヌクレオシド塩基保護５’−Ｏ−シリル-２’−Ｏ−オルトエステル−３’−Ｏ−ホスホラミダイト又は他のブロッキング剤を利用することが可能である。合成は、典型的には、３’から５’方向に、固体支持体からポリヌクレオチドが伸張するように実施した。
【０１３６】
実施例２
ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖及びアンチセンス鎖は、実施例１に記載した方法とは別の反応手順で化学的に合成した。簡単には、各合成手順は類似しており、そして最も３’のヌクレオシドが共有結合で繋留されている固体ポリスチレン支持体から連続的に伸張されているヌクレオチドで開始され、ここでセンスヌクレオシドＸ２１及びアンチセンスヌクレオシドＹ２１が支持体に繋留されている。ヌクレオシドを次ぎに、３’から５’方向の配列特異的様式で、反復サイクルを使用して支持体結合化学種に加えた。反応サイクルは以下のように実施した：第一のサイクルはＸ２１にセンスヌクレオシドＸ２０又はＹ２１にアンチセンスヌクレオシドＹ２０を加え；第二のサイクルは、Ｘ２０Ｘ２ＩにセンスヌクレオシドＸ１９又はＹ２０Ｙ２１にアンチセンスヌクレオシドＹ１９を加え；そしてセンス又はアンチセンス鎖が完成するまで続けた。各サイクルは４工程から成っている：支持体結合化学種の５’−ヒドロキシル基の脱保護；支持体結合化学種の５’−ヒドロキシル基への入来ヌクレオシド上の反応性カップリング基のカップリング；未反応５’−ヒドロキシル基のキャッピング；及びヌクレオチド結合の酸化。典型的には、反応性カップリング基は、５’−Ｏ−ベンズヒドロキシビス（トリメチルシリロキシ）シリル−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエチル）オルソホルミル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスホラミダイト（例えば、構造１）のような５’−シリル−２’−オルトエステル−３’−ホスホラミダイトである。センス鎖は、１及び２位に２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを有するように合成することが可能である（例えば、ｍＸｑ、ｑ＝１及び２）。これらの修飾ヌクレオシドは、配列に適切な５’−シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−ホスホラミダイト、特に、５’−Ｏ−ベンズヒドロキシ−ビス（トリメチルシリルオキシ）−シリル−２’−Ｏ−メチル−３’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）メチルホスホラミダイト（例えば、構造２）を使用して組み込まれる。構造１及び２は以下のことにより特徴付けられる：Ｂはアデノシン、グアノシン、シチジン又はウリジンのようなヌクレオシド塩基であり；及びＺは、環外アミンのための保護基である（例えば、Ａ及びＧについてはイソブチリル、Ｃについてはアセチル）。アンチセンス鎖は５’−末端ヌクレオチド（例えば、１位）上にリン酸基を有するように合成した。このリン酸基は、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ−ビス（２−シアノエチル）ホスホラミダイト（例えば、構造３）を使用して導入される。完全センス鎖は以下の通りである：
5’> HO-mX1mX2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-OH<3’ 。完全アンチセンス鎖は以下の通りである： 3’> HO-Y2IY2OYI9YI8Y17YI6YI5YI4YI3Y12Y11Y10Y9Y8Y7X6Y5Y4Y3Y2Y1-PO4<5’ 。Ｘｑ及びＹｑヌクレオシドはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵを含む。ｍＸｑヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル−Ａ、２’−Ｏ−メチル−Ｃ、２’−Ｏ−メチル−Ｇ及び２’−Ｏ−メチル−Ｕを含んでいる２’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。センス鎖及びアンチセンス鎖は、二重鎖ｓｉＲＮＡを形成することが可能である。
【０１３７】
【化１】
2008532480.tif 000003
【０１３８】
【化２】
2008532480.tif 000004
【０１３９】
【化３】
2008532480.tif 000005
【０１４０】
実施例３
別のｓｉＲＮＡ二重鎖は、実施例２に記載したものと実質的に同一合成手順で製造した。より特別には、センス鎖は実施例２に記載した通りに製造し、そしてアンチセンス鎖は、ヌクレオシドｍＹ１及びｍＹ２が２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含むことを除いて、同様に製造した。従って、アンチセンス鎖上の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドは、センス鎖について実施例２に記載した通りに組み込んだ。完全センス鎖は以下の通りである：5’> HO-mX1mX2X3X4X5X6X7X8X9X1OX11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-OH <3’ 。完全アンチセンス鎖は以下の通りである： 3’> HO-Y2lY20Yl9Yl8Yl7Yl6Yl5Yl4Yl3Yl2YllYl0Y9Y8Y7X6Y5Y4Y3mY2mY1-P04<5’ 。Ｘｑ及びＹｑヌクレオシドはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵを含む。ｍＸｑ及びｍＹｑヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル−Ａ、２’−Ｏ−メチル−Ｃ、２’−Ｏ−メチル−Ｇ及び２’−Ｏ−メチル−Ｕを含んでいる２’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。センス鎖及びアンチセンス鎖は、実施例２に記載した通り、二重鎖ｓｉＲＮＡを形成することが可能である。
【０１４１】
実施例４
別のｓｉＲＮＡ二重鎖は、実施例２に記載したものと実質的に同一合成手順で製造した。より特別には、センス鎖は実施例２に記載した通りに製造し、そしてアンチセンス鎖は、ヌクレオシドｍＹ２が２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを含むことを除いて、同様に製造した。従って、アンチセンス鎖上の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドは、センス鎖について実施例２に記載した通りに組み込んだ。完全センス鎖は以下の通りである：5’> HO-mX1mX2X3X4X5X6X7X8X9X1OX11X12X13X14X15X16X17X18X19X20X21-OH <3’ 。完全アンチセンス鎖は以下の通りである： 3’> HO-Y2lY20Yl9Yl8Yl7Yl6Yl5Yl4Yl3Yl2YllYl0Y9Y8Y7X6Y5Y4Y3mY2Y1-P04<5’ 。Ｘｑ及びＹｑヌクレオシドはＡ、Ｃ、Ｇ又はＵを含む。ｍＸｑ及びｍＹｑヌクレオシドは、２’−Ｏ−メチル−Ａ、２’−Ｏ−メチル−Ｃ、２’−Ｏ−メチル−Ｇ及び２’−Ｏ−メチル−Ｕを含んでいる２’−Ｏ−メチルヌクレオシドである。センス鎖及びアンチセンス鎖は、実施例２に記載した通り、二重鎖ｓｉＲＮＡを形成することが可能である。
【０１４２】
実施例５
以下の実施例において、遺伝子サイレンシング、ｍＲＮＡ検出、細胞毒性、トランスフェクション効率などを研究するために細胞培養を使用する。従って、細胞培養物は、当該技術分野で公知の技術により維持及び培養することが可能である。発現のレベル及び遺伝子サイレンシングは分枝（ｂｒａｎｃｈｅｄ）ＤＮＡ（「Ｂ−ＤＮＡ」）アッセイ（Genospectra, Fremont, CA）又は均等物、当該技術分野で認められている技術により研究することができる。細胞毒性を、アラマーブルーアッセイ（Biosource International, Camarillo California）を使用し、遺伝子サイレンシング研究のために評価することが可能であり、それは実験手順により生じる細胞死の程度を評価するために実施した。
【０１４３】
実施例６
リバーストランスフェクション（「ＲＴＦ」）プロトコルを、ＤＮＡのために構成されたＲＴＦプロトコルがｓｉＲＮＡにそのまま応用できるかどうかを決定するため、ＤＮＡ及びｓｉＲＮＡについて実施した。従って、ＤＮＡ及びｓｉＲＮＡを、種々の脂質、脂質濃度及びプラスミド又はｓｉＲＮＡ濃度を使用して細胞内へリバーストランスフェクトした。プラスミドＤＮＡのＲＴＦは、９６ウェルポリ−Ｌ−リジンプレートを使用して実施し、ここで、５０ｕＬ（「ｕＬ」）の容量中の６２．５〜２５０ｕｇのｐＣＭＶ−Ｌｕｃ（例えば、公知のルシフェラーゼ発現プラスミド）溶液をウェル内へ沈着させ、乾燥した。続いて、異なったウェルにおいて、ｐＣＭＶ−ＬｕｃをＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００−媒質、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）−媒質、及びＴＲＡＮＳＩＴ−ＴＫＯ（商標）−媒質（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標））で可溶化し複合体形成させ、ここで脂質は、３０ｕＬの総容量中、ウェル当たり０．１２５〜１マイクログラム（「ｕｇ」）で加えた。複合体を３０〜６０分形成させた後、７０ｕＬの媒質中の１０，０００のＨｅＬａ細胞を加え、１００ｕＬの総容量とした。プレートを４８時間インキュベートし、ＳＴＥＡＤＹＧＬＯＷ（商標）キット（Promega）を使用してルシフェラーゼ発現を試験した。
【０１４４】
対照として、フォワードトランスフェクション法を使用して、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃを細胞内に導入した。具体的には、ＨｅＬａ細胞を９６ウェルプレートのウェル当たり１０，０００細胞の密度で播種した。次の日、さまざまな量のｐＣＭＶ−ＬｕｃをＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００と室温で２０分複合体形成させ、そしてＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）と混合した（例えば、各２０ｕＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００−プラスミド混合物について８０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標））。各ウェルから培養培地を除去し、５０ｕＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）及び５０ｕＬの脂質−ＣＭＶ−Ｌｕｃプラスミド−媒質複合体を連続して加えた。これらの手順の結果として、ＣＭＶ−Ｌｕｃプラスミド及び脂質の最終量は各々、ウェル当たり５〜５０ｕｇ、及び０．１２５〜１．０ｕｇの間であった。
【０１４５】
対照ｓｉＲＮＡを、ＤＮＡ  ＲＴＦと比較するために、同一細胞株内へリバーストランスフェクトした。２５ｕＬの容量中の約６２．５〜２５０ナノグラムのシクロフィリンＢ  ｓｉＲＮＡ（例えば、ｃｙｃｌｏ３）を９６ウェルポリ−Ｌ−リジンプレートに沈着し、及び乾燥した。異なったウェルにおいて、ｓｉＲＮＡをＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００−媒質、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）−媒質、及びＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ（商標）−媒質、又は「ｓｉＲＮＡ１６８」−媒質（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標））で可溶化し複合体形成させ、ここで脂質は、２５ｕＬの総容量中、ウェル当たり約０．１５６〜１．２５ｕｇ送達した。ｓｉＲＮＡ１６８はｓｉＲＮＡ送達のための脂質処方である。複合体を３０〜６０分形成させた後、７５ｕＬの媒質中の１０，０００のＨｅＬａ細胞を加え、１００ｕＬの総容量とした。プレートを４８時間インキュベートし、Ｂ−ＤＮＡアッセイを使用して、ヒトシクロフィリンＢ  ｍＲＮＡの下方調節レベルについて評価した。
【０１４６】
これらの研究の結果は、図２Ａ−２Ｆに提供されており、ＲＴＦ法の効率を図示しているグラフである。グラフは、ＲＴＦ法がＤＮＡ及びｓｉＲＮＡ間の送達に不釣合なレベルを有していることを表現している。ｐＣＭＶ−Ｌｕｃはフォワードトランスフェクションプロトコルを使用した細胞において容易にトランスフェクトされ及び発現されている一方、ＲＴＦプロトコルは貧弱な送達を示した。対照的に、ｃｙｃｌｏ  ３  ｓｉＲＮＡのＲＴＦの条件は同一であったが、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００を使用することは成功しており、優れた遺伝子サイレンシングを提供した。これらの結果は、ＲＴＦプロトコルにおけるＤＮＡ及びｓｉＲＮＡの本質的に異なる性質を示している。加えて、データは、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦにおける脂質の有効性がかなり変化することを示している。
【０１４７】
実施例７
遺伝子サイレンシングを達成するＲＴＦプロトコルの能力を、ｓｉＲＮＡ機能性に関して研究した。さまざまなｓｉＲＮＡ機能性（例えば、Ｆ５０〜Ｆ９５）を、１００ｍＬ当たり、０．０３１〜０．５ｕｇの脂質の脂質濃度を使用し、単一細胞密度又はウェル当たり１０，０００細胞でリバーストランスフェクトした。具体的には、各々、９５、９０、７５及び５０のサイレンシング機能性を有する、ｃｙｃｌｏ３、ｃｙｃｌｏ１４、ｃｙｃｌｏ２８及びｃｙｃｌｏ３７を、さまざまな濃度でＲＮａｓｅ−フリーＨ２Ｏに懸濁し、９６ウェルプレートウェル床上に沈着させ、乾燥した。１００ｕＬ当たり０．０３１〜０．５ｕｇの最終脂質濃度を達成するため約２５ｕＬのＤｈａｒｍａＦＥＣｌ（商標）１−ＯｐｔｉＭＥＭ（商標）を各ウェルに加え、室温で３０〜６０分、ｓｉＲＮＡを可溶化及び複合体形成させた後、１０，０００のＨｅＬａ細胞を各ウェルに加えた。遺伝子サイレンシングを４日間にわたって研究した。
【０１４８】
図３Ａ−３Ｆは、遺伝子サイレンシングアッセイから得られた結果のグラフ的表現である。グラフに表現したように、高度に機能的なｓｉＲＮＡ（例えば、ｃｙｃｌｏ３及び１４）は、中程度に機能的なｓｉＲＮＡ（例えば、ｃｙｃｌｏ２８、２日間）又は不十分に機能的なｓｉＲＮＡ（例えば、ｃｙｃｌｏ３７、０日間）と比較して、より長い期間（例えば、４日間）、サイレンシングを示した。それ故、合理的設計による機能的ｓｉＲＮＡの選択は、遺伝子サイレンシングの長寿命を大きく改良することが可能である。
【０１４９】
実施例８
オフターゲット効果を誘発するｓｉＲＮＡの能力はフォワードトランスフェクションプロトコルを使用してアッセイした。具体的には、修飾及び無修飾ＩＧＦ１Ｒ−７３  ｓｉＲＮＡを、フォワードトランスフェクションフォーマットで細胞内へトランスフェクトし、細胞溶解物からｍＲＮＡを単離し、Agilent microArraysを使用して分析した。修飾には、第一及び第二センスヌクレオチドへの２’−Ｏ−メチル基の付加、加えて、第二アンチセンスヌクレオチドへの２’−Ｏ−メチル基の付加、加えて、アンチセンス５’末端ヌクレオチドの５’位へのリン酸基の付加が含まれる。簡単には、未処理又はｓｉＲＮＡ処理細胞から単離された１ｕｇの全ＲＮＡを増幅し、Agilent’s Low Input RNA Fluorescent Linear Amplification Kitを使用して、Ｃｙ５（商標）又は  Ｃｙ３（商標）（Perkin Elmer）でラベルした。ハイブリダイゼーションは、Agilent’s Human 1A(V2)Oligo Microarrays（例えば、２２，０００配列）を使用し、標準プロトコルに従い、各７５０ナノグラムのＣｙ−３（商標）及びＣｙ−５（商標）ラベル化物質を各アレー上に加えた。スライドを、各々０．０２５％Ｎ−ラウロイルザルコシンを含む６Ｘ及び０．０６Ｘ  ＳＳＰＥを使用して洗浄し、Agilent’s非水乾燥及び安定化溶液を使用して乾燥した。各試料アレーの生物学的複製物は、Agilent Microarray Scanner（モデルG2505B）でスキャンし、生の画像をFeature Extraction ソフトウェアー（v6.1.1又はv7.5.1）で加工した。さらなる分析を、Spotfire Decision Site 7.2ソフトウェアー及びSpotfire Functional Genomics Module を使用して実施した。緑及び赤加工シグナル合計の１０を底にしたｌｏｇから計算された自己−自己ハイブリダイゼーションにおいて、２．８未満を有する低いシグナルの遺伝子は分析から除外した。２倍カットオフ（例えば、＞０．３又は＜−０．３のＬｏｇ比）を、比較分析で使用した遺伝子に適用した。異常フラッギングは使用しなかった。
【０１５０】
図４は、これらの実験の結果を示している画像であり、ｓｉＲＮＡ  ＩＧＦ１Ｒ−７３が広範囲の遺伝子のアレーを下方調節することを示している。図４において、オフターゲットは、無修飾ｓｉＲＮＡである、画像の上側のより明るい色のラインとして示されている。一方、修飾ｓｉＲＮＡは実質的にオフターゲッティングを示さなかった。これらのオフターゲット効果は高度に有害であり、ゲノム全体のｓｉＲＮＡスクリーンの間に偽陽性を発生することができる。
【０１５１】
実施例９
オフターゲット効果を減少させ、及びオフターゲット発生表現型を減少させる修飾ｓｉＲＮＡの能力を、毒性モチーフを有しているｓｉＲＮＡで研究した。毒性ｓｉＲＮＡは、第一及び第二センスヌクレオチドへの２’−Ｏ−メチル基の付加、加えて、第二アンチセンスヌクレオチドへの２’−Ｏ−メチル基の付加、加えて、アンチセンス５’末端ヌクレオチドの５’位へのリン酸基の付加により修飾した。この修飾は、二重鎖により発生されるオフターゲット効果を有意に減少させた。
【０１５２】
図５は、毒性ｓｉＲＮＡが修飾された場合に生じる細胞毒性のグラフ的表現である。グラフは、八つの無修飾毒性ｓｉＲＮＡ（例えば、ＭＡＰ２Ｋ２  ｄ３、ＳＲＤ５Ａ１  ｄｌ、ＳＲＤ５Ａ１  ｄ２、ＳＲＤ５Ａ１  ｄ４、ＳＲＤ５Ａ２  ｄ３、ＰＤＥ８Ａ、ＳＴＫ１１及びＣＨＤ４）はすべて細胞生存率を７５％以下に減少させた。対照的に、８二重鎖すべての化学修飾は、標的特異的サイレンシングを有意に変化させることなく、ｓｉＲＮＡ誘発毒性を著しく減少させた。これらの発見は、ｓｉＲＮＡへの化学修飾の付加がオフターゲット発生表現型を除去できることを示している。
【０１５３】
実施例１０
ヌクレアーゼに対するｓｉＲＮＡの安定性を、ｓｉＲＮＡを１００％ヒト血清とインキュベートすることにより調べた。ｓｉＲＮＡは次ぎにエチジウムブロミドにより染色したアガロースゲルで試験した。図６はゲルの画像であり、無修飾ｓｉＲＮＡは、ＲＮａｓｅの存在下、迅速に分解され、数分以内と測定された半減期を有していた。示されているように、明確にするため、現れたポリヌクレオチドバンドの上に線が加えられている。従って、修飾ｓｉＲＮＡは研究期間にわたって、それらの完全性を維持することが可能であった。それ故、この結果は、修飾ｓｉＲＮＡがより長い期間にわたってそれらの完全性を維持することが可能であることを示している。このことは、本発明に従ったプレートは乾燥ｓｉＲＮＡを含み、これらのプレートは数週から数ヶ月を超える貯蔵寿命を必要とするので重要であり得るが、ＲＮＡａｓｅ夾雑及びｓｉＲＮＡ分解の可能性は存在する。
【０１５４】
実施例１１
ＲＮａｓｅによる分解に抵抗する修飾ｓｉＲＮＡ安定化の能力を研究した。安定化ｓｉＲＮＡは以下のように修飾されている：第一及び第二センスヌクレオチド上の２’−Ｏ−メチル基；すべてのセンスピリミジンヌクレオチド（例えば、Ｃ及びＵ）上の２’−Ｏ−メチル基；すべてのアンチセンスピリミジンヌクレオチド上の２’−Ｆ修飾；及びアンチセンス５’末端ヌクレオチドの５’炭素上のリン酸基。図７は四つの修飾ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｍ１−Ｍ４）及び四つの無修飾ｓｉＲＮＡ（例えば、Ｕ１−Ｕ４）のグラフ的表示を含んでいる。グラフは、修飾ｓｉＲＮＡが無修飾ｓｉＲＮＡと比較して有意に分解に抵抗していることを示している。修飾パターンはｓｉＲＮＡの血清半減期を数分から１００時間を超えるまで延長した。
【０１５５】
実施例１２
ＲＮａｓｅによる分解にかけられた安定化修飾ｓｉＲＮＡが機能性を保持する能力を研究した。機能性試験は、フォワードトランスフェクションにより実施例１１に記載したごとく実施し、無修飾ｓｉＲＮＡと比較した。図８は、より長い期間にわたって意図された標的の機能的サイレンシングを保存する化学修飾パターンを示している。無修飾ｓｉＲＮＡによるサイレンシングが４〜５日間続く一方、修飾ｓｉＲＮＡは指示した標的を７日よりも長く沈黙させた。それ故、化学修飾は、ＲＴＦフォーマットを使用するサイレンシングの効率を増強することも可能である。
【０１５６】
実施例１３
ＲＴＦプロトコルにおいて安定化修飾ｓｉＲＮＡの使用する能力を、無修飾ｓｉＲＮＡと比較して研究した。安定化修飾ｓｉＲＮＡは実施例１１に記載したものと同一の修飾をｓｉＲＮＡ上に有し、ヒトシクロフィリンＢ（ｃｙｃｌｏ  ３）を標的化している。水性溶液中のｓｉＲＮＡを９６ウェルポリ−Ｌ−リジン処理プレートのウェル中で乾燥し、１２５ｕＬの脂質−媒質及び細胞が加えられた場合、６１．５、１２５又は２５０ｎＭの濃度となる。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）、ＴＫＯ−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）又はＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１−Ｏｐｔｉ−ＭΕＭ（商標）の脂質溶液を、１００ｕＬ当たり０．１２５、０．２５又は０．５全ｕｇでウェルへ加え、３０〜６０分、ｓｉＲＮＡを可溶化し、及び複合体形成させた。約１０，０００のＨｅＬａ細胞を各ウェルへ加え、４８時間維持した後、毒性及びシクロフィリンＢ  ｍＲＮＡサイレンシングをアッセイした。
【０１５７】
図９Ａは、修飾及び無修飾ｓｉＲＮＡが同様に機能することをグラフにより説明しており、１００ｕＬ当たり０．１２５ｕｇのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００のみが細胞生存率の許容可能なレベルであった。より高いレベルの脂質は、細胞死の許容不可能なレベルを生じたが、それは１００ｕＬ当たり０．２５ｕｇの脂質で観察され、修飾二重鎖は無修飾二重鎖よりもより少ない毒性を誘発した。この観察は、修飾パターンが、ＲＴＦにより誘発されるｓｉＲＮＡの細胞毒性を制限する付加的利点を有することを示唆している。図９Ｂは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００を使用し、修飾及び無修飾二重鎖により遺伝子サイレンシングがほとんど同一であったことをグラフにより説明している。
【０１５８】
図１０Ａは、１００ｕＬ当たり０．１２５〜０．５ｕｇの脂質のＴＫＯ脂質濃度が、対照で観察された細胞生存率の約８０％以下の細胞生存率には変化させないことをグラフにより説明している。残念ながら、これらの条件下でのｓｉＲＮＡのサイレンシング実力は図１０Ｂに示されたようにより限定されているが、ｓｉＲＮＡのほとんどすべての濃度がシクロフィリンＢを沈黙させており、１００ｕＬ当たり０．１２５ｕｇの脂質で４０％のみ、１００ｕＬ当たり０．２５ｕｇの脂質で約５０〜７０％、及び１００ｕＬ当たり０．５ｕｇの脂質で８０〜９０％であった。これらの結果は、化学修飾がｓｉＲＮＡの毒性及びサイレンシング効率を認め得るほどは変化させないことを示している。さらに、このことは、すべての脂質がＲＴＦフォーマットにおいて均等な送達を提供するとは限らないことを示している。
【０１５９】
図１１Ａは、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１の毒性が、１００ｕＬ当たり０．１２５ｕｇの修飾及び無修飾ｓｉＲＮＡと同等であったこと、及びＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００及びＴＫＯ研究と比較してより毒性が弱かったことをグラフにより説明している。加えて、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１は、無修飾ｓｉＲＮＡと比較して修飾ｓｉＲＮＡと一緒の場合により毒性が弱かった。図１１Ｂは、１００ｕＬ当たり０．１２５ｕｇで比較されるべき遺伝子サイレンシング効率をグラフにより説明している。それ故、これらの条件下、ｓｉＲＮＡへの記述した化学修飾の付加は、二重鎖のサイレンシング効率を変化させない。
【０１６０】
実施例１４
四つの別々の遺伝子を沈黙させるｓｉＲＮＡの合理的に設計されたプールの能力を、Ｇ６ＰＤ、ＧＡＰＤＨ、ＰＬＫ及びＵＱＣを標的とするｓｉＲＮＡで研究した。ｓｉＲＮＡのプール（例えば、遺伝子当たり４ｓｉＲＮＡ）を、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００を使用し、ｓｉＲＮＡ当たり１００ｎＭ、６．２５ｎＭの濃度で細胞内にフォワードトランスフェクトし、２４時間後、Ｂ−ＤＮＡによりアッセイした。図１２は、合理的に設計された分子のプールが四つの異なった遺伝子を同時にサイレンシングできることを示す、グラフ的表現である。ＲＴＦフォーマットにおける標的多遺伝子に対する能力は、ｓｉＲＮＡの大きな（例えば、ゲノムのサイズの）コレクションのスクリーニングにＲＴＦを使用する能力を著しく単純化するであろう。
【０１６１】
実施例１５
ＲＴＦプロトコルにおける細胞密度の重要性を研究した。ｃｙｃｌｏ３、ｃｙｃｌｏ１４、ｃｙｃｌｏ２８及びｃｙｃｌｏ３７  ｓｉＲＮＡの溶液を４ｎＭ、８ｎＭ、１５．５ｎＭ、３１ｎＭ、６２．５ｎＭ、１２５ｎＭ及び２５０ｎＭの最終濃度となるように、ポリ−Ｌ−リシンでコートした９６ウェルプレートの底に沈着させ、乾燥した。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）の脂質溶液を、各ウェルに２５ｕＬ加え、１００ｕＬ当たり０．０１５ｕｇ、０．０３１ｕｇ、０．０６３ｕｇ、０．１２５ｕｇ又は０．２５ｕｇ脂質の最終濃度を得た。ＤｈａｒｍａＦＥＣＪ（商標）１−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）混合物は、３０〜６０分、乾燥ｓｉＲＮＡを可溶化及び複合体形成させた後、ウェル当たり、５，０００、１０，０００、２０，０００又は４０，０００細胞でＨｅＬａ細胞を添加した。「サイレンシング」は約８０％サイレンシング又はそれ以上として定義される。
【０１６２】
図１３Ａは、ウェル当たり５，０００細胞の細胞密度で２日目の遺伝子サイレンシングのグラフによる説明である。グラフは、１００ｕＬ当たり０．０３１ｕｇまでの脂質及び１２５〜２５０ｎＭ  ｓｉＲＮＡは、試験された四つのｓｉＲＮＡの内の三つ（例えば、ｃｙｃｌｏ３及びｃｙｃｌｏ１４及びｃｙｃｌｏ２８）でサイレンシングの許容可能なレベルが提供された。図１３Ｂは、毒性の対応するグラフによる説明であり、脂質が１００ｕＬ当たり０．１２５ｕｇに増加するまでの毒性の最小レベルを示している。すべての他の条件は、試験されたｓｉＲＮＡのコレクションにわたって許容不可能なレベルのサイレンシング及び／又は細胞死を引き起こした。
【０１６３】
図１４Ａは、ウェル当たり５，０００細胞の細胞密度で４日目の遺伝子サイレンシングのグラフによる説明である。グラフは、１００ｕＬ当たり０．０６３ｕｇまでの脂質及び１５．５ｎＭ〜６２．５ｎＭ  ｓｉＲＮＡは、試験された四つのｓｉＲＮＡの内の二つ（例えば、ｃｙｃｌｏ３及びｃｙｃｌｏ１４）でサイレンシングの許容可能なレベルが提供された。図１４Ｂは、毒性の対応するグラフによる説明であり、１００ｕＬ当たり０．０６３ｕｇの脂質及び１５．５ｎＭ〜６２．５ｎＭ  ｓｉＲＮＡが、ｃｙｃｌｏ３７を除いて許容可能な毒性を示している。すべての他の条件は、試験されたｓｉＲＮＡのコレクションにわたって許容不可能なレベルのサイレンシング及び／又は細胞死を引き起こした。
【０１６４】
図１５Ａは、ウェル当たり５，０００細胞の細胞密度で８日目の遺伝子サイレンシングのグラフによる説明である。グラフは、試験レベルのすべてが不十分であったことを示している。図１５Ｂは、毒性のグラフによる説明であり、すべての条件が過度に毒性であることを示しており、条件の実際の毒性というよりもむしろ持続の機能であってもよい。
【０１６５】
図１６Ａは、ウェル当たり１０，０００細胞の細胞密度で１日目の遺伝子サイレンシングのグラフによる説明である。グラフは、１００ｕＬ当たり０．０６３ｕｇまでの脂質は、試験された四つのｓｉＲＮＡの内の二つ（例えば、ｃｙｃｌｏ３及びｃｙｃｌｏ１４）でサイレンシングの許容可能なレベルが提供された。図１６Ｂは、毒性のグラフによる説明であり、最適サイレンシング条件下で最小であった。すべての他の条件は、試験されたｓｉＲＮＡのコレクションにわたって許容不可能なレベルのサイレンシング及び／又は細胞死を引き起こした。
【０１６６】
図１７Ａは、ウェル当たり１０，０００細胞の細胞密度で２日目の遺伝子サイレンシングのグラフによる説明である。グラフは、１００ｕＬ当たり０．０６３ｕｇまでの脂質は、試験された四つのｓｉＲＮＡの内の二つ（例えば、ｃｙｃｌｏ３及びｃｙｃｌｏ１４）でサイレンシングの許容可能なレベルが提供された。図１７Ｂは、毒性のグラフによる説明であり、最適サイレンシング条件下で最小であった。すべての他の条件は、試験されたｓｉＲＮＡのコレクションにわたって許容不可能なレベルのサイレンシング及び／又は細胞死を引き起こした。
【０１６７】
図１８Ａは、ウェル当たり１０，０００細胞の細胞密度で４日目の遺伝子サイレンシングのグラフによる説明である。グラフは、１００ｕＬ当たり０．０６３ｕｇまでの脂質、及び４〜３１ｎＭのｓｉＲＮＡは、試験された四つのｓｉＲＮＡの内の二つ（例えば、ｃｙｃｌｏ３及びｃｙｃｌｏ１４）でサイレンシングの許容可能なレベルが提供された。図１８Ｂは、毒性のグラフによる説明であり、最適サイレンシング条件下で最小であった。すべての他の条件は、試験されたｓｉＲＮＡのコレクションにわたって許容不可能なレベルのサイレンシング及び／又は細胞死を引き起こした。
【０１６８】
図１９Ａは、ウェル当たり２０，０００細胞の細胞密度で１日目の遺伝子サイレンシングのグラフによる説明である。グラフは、１００ｕＬ当たり０．１２５ｕｇまでの脂質、及び１２５〜２５０ｎＭ  ｓｉＲＮＡは、試験された四つのｓｉＲＮＡの内の一つ（例えば、ｃｙｃｌｏ１４）でサイレンシングの許容可能なレベルが提供された。図１９Ｂは、毒性のグラフによる説明であり、最適サイレンシング条件下で最小であった。すべての他の条件は、試験されたｓｉＲＮＡのコレクションにわたって許容不可能なレベルのサイレンシング及び／又は細胞死を引き起こした。
【０１６９】
図２０Ａは、ウェル当たり２０，０００細胞の細胞密度で２日目の遺伝子サイレンシングのグラフによる説明である。グラフは、１００ｕＬ当たり０．１２５ｕｇまでの脂質は、試験された四つのｓｉＲＮＡの内の二つ（例えば、ｃｙｃｌｏ３及びｃｙｃｌｏ１４）でサイレンシングの許容可能なレベルが提供された。図２０Ｂは、毒性のグラフによる説明であり、最適サイレンシング条件下で最小であった。すべての他の条件は、試験されたｓｉＲＮＡのコレクションにわたって許容不可能なレベルのサイレンシング及び／又は細胞死を引き起こした。
【０１７０】
図２１Ａは、ウェル当たり４０，０００細胞の細胞密度で１日目の遺伝子サイレンシングのグラフによる説明である。グラフは、すべての条件が許容不可能であったことを示している。加えて、図２１Ｂは、許容可能な毒性を示していない。本結果は、リバーストランスフェクションのプロセスは細胞密度に非常に感受性であること、及びこのフォーマットで遺伝子ノックダウンを成功させるには、ウェル（９６ウェルプレート中の）当たり４０，０００未満の密度が好ましいことを示唆している。
【０１７１】
実施例１６
キナーゼ経路に含まれる遺伝子をｓｉＲＮＡ  ＲＴＦにより研究し、細胞生存率の原因である遺伝子を決定した。キナーゼの７７９メンバーを標的としている合理的に設計されたｓｉＲＮＡをＲＮａｓｅフリー水に溶解し、ＰＬＬコート９６ウェルプレートの個々のウェルで乾燥した。各ｓｉＲＮＡの量は、１２５ｕＬの全溶液についておよそ２５ｎＭである。２５ｕＬの全容量のハンクス平衡塩緩衝液中に０．１ｕｇのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１脂質を有する脂質溶液を各ウェルに加え、２０〜４０分インキュベートして、ｓｉＲＮＡを可溶化及び複合体化した後、媒質中の１０，０００ＨｅＬａ細胞を加え、１２５ｕＬの最終容量とした。プレートを２４〜７２時間の間維持し、細胞生存率についてアッセイした。脂質単独で処理した培養物（即ち、対照ウェル）及びキナーゼｓｉＲＮＡアレーの個々のメンバーで処理した培養物の細胞生存率間の比較は、ＨｅＬａ細胞生存率に必須である遺伝子の同定を可能にする。
【０１７２】
実施例１７
サイトカインレセプターファミリーに含まれる遺伝子をｓｉＲＮＡ  ＲＴＦにより研究し、細胞生存率の原因である遺伝子を決定した。サイトカインレセプターファミリーの１６６メンバーを標的としている合理的に設計されたｓｉＲＮＡをＲＮａｓｅフリー水に溶解し、ＰＬＬコート９６ウェルプレートの個々のウェルで乾燥した。各ｓｉＲＮＡの量は、１２５ｕＬの全溶液についておよそ２５ｎＭである。２５ｕＬの全容量のハンクス平衡塩緩衝液中に０．１ｕｇのＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１脂質を有する脂質溶液を各ウェルに加え、２０〜４０分インキュベートして、ｓｉＲＮＡを可溶化及び複合体化した後、媒質中の１０，０００ＨＴ−２９細胞を加え、１２５ｕＬの最終容量とした。プレートを２４〜７２時間の間維持し、細胞生存率についてアッセイした。脂質単独で処理した培養物（即ち、対照ウェル）及びサイトカインレセプターファミリーｓｉＲＮＡアレーの個々のメンバーで処理した培養物の細胞生存率間の比較は、ＨＴ−２９細胞生存率に必須である遺伝子の同定を可能にする。
【０１７３】
実施例１８
ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルにおいて、細胞毒性を減少させる、又は抑制する、異なった脂質含有溶液（水性に基づいた）の能力を、毒性モチーフを有するｓｉＲＮＡで研究した。単独で又は他のストレス誘発因子（例えば、毒性小分子、脂質溶液、脂質）と組み合わされて投与された場合に細胞ストレス又は死を誘発することが可能である、モチーフAAA/UUU 又はGCCA/UGGC を含有するｓｉＲＮＡのグループを研究した。具体的には、ＳＲＤ５ａｌ（センス、5’ CCGGAAATTTGAAGAGTAT 配列番号２）遺伝子に対して方向付けられた毒性ｓｉＲＮＡを、ＰＰＬ＝コートプレート上に乾燥した。これらの研究に使用された毒性ｓｉＲＮＡは、無修飾であるか又は修飾されている。第一の修飾は、第一及び第二センスヌクレオチド上に２’−Ｏ−メチル基；第二アンチセンスヌクレオチド上に２’−Ｏ−メチル基；及びアンチセンス鎖（Ｍｏｄ  Ｔ１）のアンチセンス５’末端ヌクレオチドの５’炭素上にリン酸基を含む。第二の修飾は、センス５’末端ヌクレオチド上に５’デオキシヌクレオチド；第二アンチセンスヌクレオチド上に２’−Ｏ−エタノール基；及びアンチセンス５’末端ヌクレオチド（Ｍｏｄ  Ｔ２）の５’炭素上にリン酸基を含む。
【０１７４】
図２２は、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）及びＨＢＳＳ中のＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００を使用したＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）中において、無修飾毒性ｓｉＲＮＡは、脂質濃度と関係なく、すべての条件下で２０％を超える細胞死を誘発する（例えば、１０ｎＭ及び１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ）。しかしながら、１００ｕＬ当たり０．０４ｕｇの脂質は、８０％に接する細胞生存率を有していた。加えて、両方の修飾ｓｉＲＮＡは、８０％を超える細胞生存率を有していた。ＨＢＳＳにおいて、無修飾毒性ｓｉＲＮＡは１００ｕＬ全溶液当たり０．０４及び０．０６ｕｇの脂質では細胞毒性を誘発しなかった。２０％を超える細胞毒性は、１００ｕＬ全溶液当たり０１ｕｇの脂質において１００ｎＭ無修飾ｓｉＲＮＡでのみ観察された。すべての修飾ｓｉＲＮＡは最小毒性を示した。これらの結果は、ＲＴＦプロトコルにおいて、ＨＢＳＳが毒性を減少できることを示している。さらに、これらの結果は化学的に修飾されたｓｉＲＮＡはＲＴＦプロトコルに適合しており、ストレス及び毒性を発生するオフターゲット効果を制限できることを示している。
【０１７５】
実施例１９
ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルにおいて、細胞毒性を減少させる、又は抑制する、異なった脂質の能力を、毒性モチーフを有するｓｉＲＮＡで研究した。これらの分子により発生された毒性は、オフターゲット分子への不完全な結合を防止する、制限する、又は改変する化学修飾の付加により無効にすることが可能である。具体的には、ＳＲＤ５ａｌ遺伝子（センス、5’ CCGGAAATTTGAAGAGTAT 配列番号２）に対して方向付けられた毒性ｓｉＲＮＡを、ＰＰＬ＝コートプレートのウェル床上に沈着させそして乾燥し、１０又は１００ｎＭの最終濃度を達成した。これらの研究に使用された毒性ｓｉＲＮＡは、実施例１８のように、無修飾であるか又は修飾されている。
【０１７６】
図２３Ａは、異なった脂質についての細胞生存率のグラフ的表現である。ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）無修飾毒性ｓｉＲＮＡは、脂質濃度に関わらず（例えば、１００ｕＬ溶液当たり、０．０４、０．０６、０．０８、及び０．１ｕｇ）、すべての条件下で（例えば、１０ｎＭ及び１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡ）２０％を超える細胞死を誘発した。これについての一つの境界線例外は、１００ｕＬ当たり、０．０４ｕｇで観察され、培養物生存率は８０％に接していた。加えて、修飾ｓｉＲＮＡは細胞毒性を減少させた。ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１−Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）無修飾毒性ｓｉＲＮＡは、１０ｎＭ  ｓｉＲＮＡでは、１００ｕＬ当たり、０．０４及び０．０６ｕｇの脂質で無毒であった。２０％を超える細胞毒性は、１０ｎＭ及び１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡの両方において、１００ｕＬ全溶液当たり、０．０８及び０．１ｕｇの脂質で観察された。すべての修飾ｓｉＲＮＡは最小毒性を示した。
【０１７７】
図２３Ｂは、各条件下で提供されたサイレンシングのレベルをグラフにより示しており、すべての試料において大まかには均等であるように描かれている。それ故、この結果は、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１が広い範囲の脂質濃度にわたって細胞にストレスを与える配列により誘発される毒性のレベルを最小にすることにより、ＲＴＦプロトコルに改善を提供することを示している。さらに、これらの結果は、化学的に修飾されたｓｉＲＮＡは記載されたリバーストランスフェクションフォーマットに適合しており、ストレス及び毒性を発生するオフターゲット効果を除去することにおいて有効であることを示している。
【０１７８】
実施例２０
選択された遺伝子に対して方向付けられているｓｉＲＮＡのプールの能力を、ＲＴＦプロトコルにおいて研究した。単一標的個別ｓｉＲＮＡに対して方向付けられているｓｉＲＮＡのプール及びＧＡＰＤＨ、ＭＡＰ２Ｋ１又はＭＡＰ２Ｋ２に対して方向付けられている３又は４のｓｉＲＮＡのプールの有効性を評価するため、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１を使用してＨｅＬａ細胞内にリバーストランスフェクトした。
【０１７９】
この研究において、ｓｉＲＮＡが以下のように設計され、以下のような配列を含む（例えば、センス鎖、５’→３’にリストされている）：ＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡ二重鎖１(CAACGGAUUUGGUCGUAUU,配列番号３)、二重鎖２(CAACGGAUUUGGUCGUAUU, 配列番号３)、二重鎖３(GAAUUUGGCUACAGCAACA, 配列番号４)及び二重鎖４(GAAAUCCCAUCACCAUCUU, 配列番号５)；ＭＡＰ２Ｋ１  ｓｉＲＮＡ二重鎖１(GCACAUGGAUGGAGGUUCU, 配列番号６)、二重鎖２(GCAGAGAGAGCAGAUUUGA, 配列番号７)、二重鎖４(GAGCAGAUUUGAAGCAACU, 配列番号８)及び二重鎖５(CCAGAAAGCUAAUUCAUCU, 配列番号９); ＭＡＰ２Ｋ２  ｓｉＲＮＡ二重鎖１(CAAAGACGAUGACUUCGAA, 配列番号１０)、二重鎖２(GAUCAGCAUUUGCAUGGAA, 配列番号１１)、二重鎖４(GGAAGCUGAUCCACCUUGA, 配列番号１２)及び二重鎖７(GAAAGUCAGCAUCGCGGUU, 配列番号１３)。
【０１８０】
図２４Ａは、ＧＡＰＧＨサイレンシングの態様の結果のグラフによる表現であり、プールは個々のｓｉＲＮＡと同等に又はより良好に作用することを示している。図２４Ｂは、ＭＡＰ２Ｋ２サイレンシングの態様の結果のグラフによる表現であり、プールは個々のｓｉＲＮＡと同等に又はより良好に作用することを示している。図２４Ｃは、ＧＡＰＧＨサイレンシングの態様の結果のグラフによる表現であり、プールは個々のｓｉＲＮＡと同等に又はより良好に作用することを示しており、１０ｎＭにおいてプールは、いずれの個々のｓｉＲＮＡよりも優れたサイレンシングを提供した。試験されたすべてのケースにおいて、個々のｓｉＲＮＡ又はプールを使用する遺伝子サイレンシングは、全体の細胞毒性を変化させなかった（データは示されていない）。プールの別の利点には、実行のコンシステンシーが含まれる。例えば、ＧＡＰＤＨ及びＭＡＰ２Ｋ２を標的とする個々の二重鎖は適切に実行されるが（例えば、８ｓｉＲＮＡすべてについて１ｎＭ〜１００ｎＭ間の濃度で８０％を超えるサイレンシング）、単一ｓｉＲＮＡのみ（例えば、二重鎖４）、単一濃度で（例えば、５０ｎＭ）ＭＡＰ２Ｋ１について８０％を超えるサイレンシングを提供した。対照的に、三つすべての標的を標的とするプールされたｓｉＲＮＡは、１０ｎＭ、５０ｎＭ及び１００ｎＭの濃度で８０％又はそれ以上のサイレンシングを発生した。これらの結果は、プール化は、ＲＴＦフォーマットの遺伝子サイレンシングにおいて増加したコンシステンシーを提供できることを示している。
【０１８１】
実施例２１
選択された遺伝子に対して方向付けられているｓｉＲＮＡのプールの能力を、ＲＴＦプロトコルにおいて研究した。個別ｓｉＲＮＡの単一標的組み合わせに対して方向付けられているｓｉＲＮＡのプールの有効性を評価するため、多標的に方向付けた。ＧＡＰＤＨ、ＭＡＰ２Ｋ１又はＭＡＰ２Ｋ２に対して方向付けられているｓｉＲＮＡは、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１を使用してＨｅＬａ細胞内にリバーストランスフェクトした。これらのアッセイで使用されたｓｉＲＮＡは、実施例２０と同一である。
【０１８２】
図２５Ａ〜２５Ｃは、多遺伝子ノックダウンとの適合性を示しているグラフによる表現である。図２５Ａは、ＧＡＰＤＨ二重鎖１、ＭＡＰ２Ｋ２二重鎖１及びＭＡＰ２Ｋ１二重鎖１（１、ｌ＆ｌ）存在下でのＧＡＰＤＨノックダウン；ＧＡＰＤＨ二重鎖２、ＭＡＰ２Ｋ２二重鎖２及びＭＡＰ２Ｋ１二重鎖２（２、２＆２）存在下でのＧＡＰＤＨノックダウン；ＧＡＰＤＨ二重鎖４、ＭＡＰ２Ｋ２二重鎖４及びＭＡＰ２Ｋ１二重鎖３（４、４＆３）存在下でのＧＡＰＤＨノックダウン；ＧＡＰＤＨ二重鎖５、ＭＡＰ２Ｋ２二重鎖７及びＭＡＰ２Ｋ１二重鎖４（５、７＆４）存在下でのＧＡＰＤＨノックダウン；及び前記の二重鎖のすべてから成るＧＡＰＤＨ、ＭＡＰ２Ｋ２及びＭＡＰ２Ｋ１プール存在下でのＧＡＰＤＨノックダウンを示している。図２５Ｂは、図２５Ａに記載したすべての二重鎖組み合わせの存在下でのＭＡＰ２Ｋ２ノックダウンを示している。図２５Ｃは、図２５Ａに記載したすべての二重鎖組み合わせの存在下でのＭＡＰ２Ｋ１ノックダウンを示している。ＭＡＰ２Ｋ１及びＭＡＰ２Ｋ２標的に対して方向付けられた競合ｓｉＲＮＡの存在下でさえも、７５％を超えるサイレンシングが、試験されたすべてのＧＡＰＤＨ  ｓｉＲＮＡについて達成可能である。同様に、ＧＡＰＤＨ及びＭＡＰ２Ｋ１に対して方向付けられたｓｉＲＮＡの存在下でさえも、ＭＡＰ２Ｋ２について７５％を超えるサイレンシングが達成可能である。ＭＡＰ２Ｋ１については、どの個別のｓｉＲＮＡも７５％を超えるサイレンシングを提供しなかったが、ＭＡＰ２Ｋ１標的化ｓｉＲＮＡのプールは、ＧＡＰＤＨ及びＭＡＰ２Ｋ２を標的とするｓｉＲＮＡのプール存在下で、適切に機能することが可能であった（１〜１００ｎＭで）。多遺伝子標的化フォーマットについての本発明の適合性は著しい改良であり、使用者が大きなゲノム全体にわたるスクリーンを単純化することを可能にする。
【０１８３】
実施例３２
前記実施例が使用するいくつかの例示のｓｉＲＮＡ配列が下記表２に出ている。すべての配列はセンス鎖を示しており、５’→３’方向に配向している。すべてのアンチセンス鎖は、上記明細書の本文で示されない限り、二重鎖領域にわたって、下記センス鎖と１００％相補的であると推測される。いずれのｄＴｄＴオーバーハングも二重鎖領域の一部ではない。追加のｓｉＲＮＡ配列は、援用された仮出願の表Ｉ−ＩＶで再調査することが可能である。
【０１８４】
【表２】
2008532480.tif 000006
【０１８５】
実施例３１
一つの実施例において、ｓｉＲＮＡでＲＴＦを最適化するために、多ウェルＲＴＦプレート又は一連のプレートを設計することが可能である。従って、プレートは以下の変数のいずれかを含むために構成することが可能である：（１）０．０１〜２５０ｎＭの間、より好ましくは０．０５〜１００ｎＭの間、さらにより好ましくは０．１〜５０ｎＭの間、まださらに好ましくは０．５〜２５ｎＭの間、及び最も好ましくは０．７５〜１０ｎＭの間又は約１ｎＭである個別の又はプールのｓｉＲＮＡの濃度；（２）ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）２、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）３又はＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）４のような脂質であるポリヌクレオチド担体のタイプ；（３）１００ｕＬ溶液当たり０．０５〜１ｕｇの濃度、より好ましくは１００ｕＬ溶液当たり０．０５〜０．５ｕｇの脂質の濃度、さらにより好ましくは１００ｕＬ溶液当たり０．０５〜０．２５ｕｇの脂質の濃度、及び最も好ましくは１００ｕＬ溶液当たり０．０５〜０．１ｕｇの濃度である脂質ポリヌクレオチド担体の濃度；（４）脂質を複合体形成するために使用される媒質及び／又は緩衝液のタイプは、好ましくはＯｐｔｉ−ＭΕＭ（商標）、より好ましくはＨｙＱ−ＭΕＭ（商標）及び最も好ましくはハンクス緩衝塩溶液のような緩衝化塩溶液又は均等な混合物であること；及び（５）約０．３ｃｍ２〜約０．３５ｃｍ２当たり１，０００〜３５，０００細胞の密度、２，０００〜３０，０００細胞の好ましい密度、より好ましくは２，０００〜２０，０００細胞、さらにより好ましくは２，０００〜１５，０００細胞、及び最も好ましくは約０．３ｃｍ２〜約０．３５ｃｍ２当たり２，０００〜１０，０００細胞の細胞密度を有する細胞のタイプ及び量。ｓｉＲＮＡは、選択された標的遺伝子のサイレンシングの研究に使用することが可能であり、又は対照ｓｉＲＮＡは、既知の遺伝子を再現可能な様式で沈黙させるために使用することが可能である。
【０１８６】
本発明は、その精神又は必須の特性から離れることなく、他の特定の形態に具体化することができる。記載された態様は、すべてに関して例示としてのみ考えるべきであり、制限的ではない。本発明の範囲は、それ故、前記の記述よりもむしろ付随する特許請求の範囲により示されている。特許請求の範囲の均等物の意味及び範囲内にはいるすべての変更は、それらの範囲内に包含されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０１８７】
本発明の上記及び他の利点及び特色をさらに明らかにするため、本発明のより特別な記述が、付随する図に図示されているそれらの具体的態様を参照することにより与えられる。これらの図は本発明の典型的態様のみを表現していること、そしてそれ故、その範囲を限定していると考えるべきではないことを理解されたい。本発明は付随する図面の使用を通してさらなる具体性及び詳細さで記述及び説明することが可能である。
【図１Ａ】図１Ａは多ウェルプレート上のｓｉＲＮＡの配置の態様を例示する模式的ダイアグラムであり、ｓｉＲＮＡのプール（「Ｐ１」）がプールを含んでなる個々のｓｉＲＮＡ（例えば、１Ａ−１Ｎ、２Ａ−２Ｎ、３Ａ−３Ｎ）とともに位置されている。
【図１Ｂ】図１Ｂは、多ウェルプレート上のｓｉＲＮＡの配置の態様を例示する模式的ダイアグラムであり、一つ以上のプール（Ｐ１及びＰ２）が、個々のｓｉＲＮＡ（例えば、１Ａ−１Ｎ、２Ａ−２Ｎ、その他）及び対照（例えば、Ｔｃ１、Ｔｃ２及びＴｃ３）とともに位置されている。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｆは、細胞生存率及び遺伝子サイレンシング効率による、ＤＮＡ及びＲＮＡのＲＴＦの比較の態様のグラフによる表現である。図２Ａは、フォワードトランスフェクションプロトコルにおけるルシフェラーゼ発現の態様であり、ウェル当たり１０，０００細胞でＨｅＬａ細胞がＰＬＬプレートに播種され、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００−ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ複合体でトランスフェクトされており、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃ発現ベクターの機能性を示している。
【図２Ｂ】図２Ｂは、図２Ａに記載された条件を使用する細胞生存率研究の態様であり、Ｙ軸は、１００％生存率である１．０での生存の相対的レベルを表している。
【図２Ｃ】図２Ｃは、脂質（ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、Ｔｒａｎｓｉｔ  ＴＫＯ及びｓｉＲＮＡ１６８（１６８））及びプラスミド濃度範囲での、ｐＣＭＶ−Ｌｕｃプラスミドによるリバーストランスフェクションプロトコルの態様であり（ウェル当たり１０，０００細胞のＨｅＬａ細胞）、ルシフェラーゼ発現レベルは２４時間後、ＳＴＥＡＤＹＧＬＯＷ（商標）キットを使用して評価した。
【図２Ｄ】図２Ｄは、図２Ｃに記載した条件での細胞生存率の態様であり、「１．０」は１００％細胞生存率を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは遺伝子サイレンシングにＬＩＰＯＦＥＣＴ  ＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＴＫＯ又はｓｉＲＮＡ１６８脂質を使用する、ｃｙｃｌｏ３のリバーストランスフェクションの態様であり、Ｙ軸は対照と比較した遺伝子サイレンシングのレベルを表しており、１．０が１００％発現である。
【図２Ｆ】図２Ｆは、図２Ｅに記載した条件からの細胞生存率の態様である。
【図３Ａ】図３Ａは、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果の態様のグラフによる表現である。異なったサイレンシング機能性を有している（例えば、各々、９５、９０、７５及び＜５０％サイレンシング）四つの異なったｓｉＲＮＡ（例えば、ｃｙｃｌｏ３、１４、２８及び３７）をさまざまな濃度をＲＴＦに使用した。１００マイクロリットル（「ｕＬ」）当たり０〜０．５マイクログラム（「ｕｇ」）の脂質が送達されるように、さまざまな量のＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１脂質を加えた。ｓｉＲＮＡの可溶化及び複合体形成に続いて、ウェル当たり１０，０００細胞のＨｅＬａ細胞を加え、培養した（例えば、１、２又は４日間）。ＲＴＦフォーマットにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果を、図３Ａ、３Ｃ及び３ＥにおいてシクロフィリンＢサイレンシングでアッセイすることにより評価した。遺伝子サイレンシングについては、Ｙ軸は対照と比較した遺伝子サイレンシングのレベルを表しており、１．０が１００％発現である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果の態様のグラフによる表現である。異なったサイレンシング機能性を有している（例えば、各々、９５、９０、７５及び＜５０％サイレンシング）四つの異なったｓｉＲＮＡ（例えば、ｃｙｃｌｏ３、１４、２８及び３７）をさまざまな濃度をＲＴＦに使用した。１００マイクロリットル（「ｕＬ」）当たり０〜０．５マイクログラム（「ｕｇ」）の脂質が送達されるように、さまざまな量のＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１脂質を加えた。ｓｉＲＮＡの可溶化及び複合体形成に続いて、ウェル当たり１０，０００細胞のＨｅＬａ細胞を加え、培養した（例えば、１、２又は４日間）。ＲＴＦフォーマットにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果を、図３Ｂ、３Ｄ及び３Ｆにおいて細胞生存率でアッセイすることにより評価した。細胞生存測定については、Ｙ軸は生存の相対レベルを表しており、１．０が１００％生存率である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果の態様のグラフによる表現である。異なったサイレンシング機能性を有している（例えば、各々、９５、９０、７５及び＜５０％サイレンシング）四つの異なったｓｉＲＮＡ（例えば、ｃｙｃｌｏ３、１４、２８及び３７）をさまざまな濃度をＲＴＦに使用した。１００マイクロリットル（「ｕＬ」）当たり０〜０．５マイクログラム（「ｕｇ」）の脂質が送達されるように、さまざまな量のＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１脂質を加えた。ｓｉＲＮＡの可溶化及び複合体形成に続いて、ウェル当たり１０，０００細胞のＨｅＬａ細胞を加え、培養した（例えば、１、２又は４日間）。ＲＴＦフォーマットにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果を、図３Ａ、３Ｃ及び３ＥにおいてシクロフィリンＢサイレンシングでアッセイすることにより評価した。遺伝子サイレンシングについては、Ｙ軸は対照と比較した遺伝子サイレンシングのレベルを表しており、１．０が１００％発現である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果の態様のグラフによる表現である。異なったサイレンシング機能性を有している（例えば、各々、９５、９０、７５及び＜５０％サイレンシング）四つの異なったｓｉＲＮＡ（例えば、ｃｙｃｌｏ３、１４、２８及び３７）をさまざまな濃度をＲＴＦに使用した。１００マイクロリットル（「ｕＬ」）当たり０〜０．５マイクログラム（「ｕｇ」）の脂質が送達されるように、さまざまな量のＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１脂質を加えた。ｓｉＲＮＡの可溶化及び複合体形成に続いて、ウェル当たり１０，０００細胞のＨｅＬａ細胞を加え、培養した（例えば、１、２又は４日間）。ＲＴＦフォーマットにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果を、図３Ｂ、３Ｄ及び３Ｆにおいて細胞生存率でアッセイすることにより評価した。細胞生存測定については、Ｙ軸は生存の相対レベルを表しており、１．０が１００％生存率である。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果の態様のグラフによる表現である。異なったサイレンシング機能性を有している（例えば、各々、９５、９０、７５及び＜５０％サイレンシング）四つの異なったｓｉＲＮＡ（例えば、ｃｙｃｌｏ３、１４、２８及び３７）をさまざまな濃度をＲＴＦに使用した。１００マイクロリットル（「ｕＬ」）当たり０〜０．５マイクログラム（「ｕｇ」）の脂質が送達されるように、さまざまな量のＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１脂質を加えた。ｓｉＲＮＡの可溶化及び複合体形成に続いて、ウェル当たり１０，０００細胞のＨｅＬａ細胞を加え、培養した（例えば、１、２又は４日間）。ＲＴＦフォーマットにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果を、図３Ａ、３Ｃ及び３ＥにおいてシクロフィリンＢサイレンシングでアッセイすることにより評価した。遺伝子サイレンシングについては、Ｙ軸は対照と比較した遺伝子サイレンシングのレベルを表しており、１．０が１００％発現である。
【図３Ｆ】図３Ｆは、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果の態様のグラフによる表現である。異なったサイレンシング機能性を有している（例えば、各々、９５、９０、７５及び＜５０％サイレンシング）四つの異なったｓｉＲＮＡ（例えば、ｃｙｃｌｏ３、１４、２８及び３７）をさまざまな濃度をＲＴＦに使用した。１００マイクロリットル（「ｕＬ」）当たり０〜０．５マイクログラム（「ｕｇ」）の脂質が送達されるように、さまざまな量のＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１脂質を加えた。ｓｉＲＮＡの可溶化及び複合体形成に続いて、ウェル当たり１０，０００細胞のＨｅＬａ細胞を加え、培養した（例えば、１、２又は４日間）。ＲＴＦフォーマットにおけるｓｉＲＮＡ機能性の効果を、図３Ｂ、３Ｄ及び３Ｆにおいて細胞生存率でアッセイすることにより評価した。細胞生存測定については、Ｙ軸は生存の相対レベルを表しており、１．０が１００％生存率である。
【図４】図４は、マイクロアレー分析による、ｓｉＲＮＡ誘発オフターゲットサイレンシングの態様のヒートマップ像である。上部の括弧で囲まれた領域により強調された明るいラインは、無修飾ＩＧＦＲ１−７３  ｓｉＲＮＡによりオフターゲットされた下方調節遺伝子を表している。下部のラインは、ＩＧＦＲ１−７３  ｓｉＲＮＡが化学的に修飾された場合、オフターゲットの数が実質的に減少したことを示している。
【図５】図５は、細胞生存率に対する化学的に修飾されたｓｉＲＮＡの効果の態様のグラフによる表現である。
【図６】図６は、修飾及び無修飾ｓｉＲＮＡの分解の速度を示している、ＥｔＢｒ染色されたゲルの態様の像であり、分解されていないｓｉＲＮＡの存在をより良く示すために上書きされたラインが含まれている。
【図７】図７は、四つの異なった修飾及び無修飾ｓｉＲＮＡの分解の動力学を示すことにより、無修飾及び修飾ｓｉＲＮＡを分解するために血清中に存在するＲＮＡａｓｅの能力及び無能力さの態様のグラフによる表現を提供している。
【図８】図８は、無修飾及び安定化修飾ｓｉＲＮＡによる、サイレンシングの最長寿命の態様のグラフによる表現であり、ＤＦ１はＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１である。
【図９Ａ】図９Ａは、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＮＥ（商標）２０００及び安定化及び非安定化ｓｉＲＮＡによる細胞生存率の態様のグラフによる表現である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、図９Ａの条件の遺伝子サイレンシングの態様のグラフによる表現である。
【図１０Ａ】図１０Ａは、ＴＫＯ及び安定化及び非安定化ｓｉＲＮＡによる細胞生存率の態様のグラフによる表現である。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａの条件の遺伝子サイレンシングの態様のグラフによる表現である。
【図１１Ａ】図１１Ａは、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１及び安定化及び非安定化ｓｉＲＮＡによる細胞生存率の態様のグラフによる表現である。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、図１１Ａの条件の遺伝子サイレンシングの態様のグラフによる表現である。
【図１２】図１２は、単一及びプール化ｓｉＲＮＡを使用する多遺伝子サイレンシングの態様のグラフによる表現である。
【図１３Ａ】図１３Ａは、実験第２日目のウェル当たり５，０００のＨｅＬａ細胞における遺伝子サイレンシングに対する、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（「ＤＦ１」）濃度及び対照ｓｉＲＮＡ濃度の変化のｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図１３Ｂ】図１３Ｂは、図１３Ａの条件の細胞生存率のグラフによる表現である。
【図１４Ａ】図１４Ａは、実験第４日目のウェル当たり５，０００のＨｅＬａ細胞における遺伝子サイレンシングに対する、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（「ＤＦ１」）濃度及び対照ｓｉＲＮＡ濃度の変化のｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図１４Ｂ】図１４Ｂは、図１４Ａの条件の細胞生存率のグラフによる表現である。
【図１５Ａ】図１５Ａは、実験第６日目のウェル当たり５，０００のＨｅＬａ細胞における遺伝子サイレンシングに対する、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（「ＤＦ１」）濃度及び対照ｓｉＲＮＡ濃度の変化のｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図１５Ｂ】図１５Ｂは、図１５Ａの条件の細胞生存率のグラフによる表現である。
【図１６Ａ】図１６Ａは、実験第１日目のウェル当たり１０，０００のＨｅＬａ細胞における遺伝子サイレンシングに対する、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（「ＤＦ１」）濃度及び対照ｓｉＲＮＡ濃度の変化のｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図１６Ｂ】図１６Ｂは、図１６Ａの条件の細胞生存率のグラフによる表現である。
【図１７Ａ】図１７Ａは、実験第２日目のウェル当たり１０，０００のＨｅＬａ細胞における遺伝子サイレンシングに対する、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（「ＤＦ１」）濃度及び対照ｓｉＲＮＡ濃度の変化のｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、図１７Ａの条件の細胞生存率のグラフによる表現である。
【図１８Ａ】図１８Ａは、実験第４日目のウェル当たり１０，０００のＨｅＬａ細胞における遺伝子サイレンシングに対する、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（「ＤＦ１」）濃度及び対照ｓｉＲＮＡ濃度の変化のｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図１８Ｂ】図１８Ｂは、図１８Ａの条件の細胞生存率のグラフによる表現である。
【図１９Ａ】図１９Ａは、実験第１日目のウェル当たり２０，０００のＨｅＬａ細胞における遺伝子サイレンシングに対する、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（「ＤＦ１」）濃度及び対照ｓｉＲＮＡ濃度の変化のｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、図１９Ａの条件の細胞生存率のグラフによる表現である。
【図２０Ａ】図２０Ａは、実験第２日目のウェル当たり２０，０００のＨｅＬａ細胞における遺伝子サイレンシングに対する、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（「ＤＦ１」）濃度及び対照ｓｉＲＮＡ濃度の変化のｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図２０Ｂ】図２０Ｂは、図２０Ａの条件の細胞生存率のグラフによる表現である。
【図２１Ａ】図２１Ａは、実験第１日目のウェル当たり４０，０００のＨｅＬａ細胞における遺伝子サイレンシングに対する、ＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（「ＤＦ１」）濃度及び対照ｓｉＲＮＡ濃度の変化のｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図２１Ｂ】図２１Ｂは、図２１Ａの条件の細胞生存率のグラフによる表現である。
【図２２】図２２は、細胞生存率について、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００濃度及び対照ｓｉＲＮＡ濃度（例えば、修飾ｓｉＲＮＡ及び無修飾ｓｉＲＮＡ）を変化させて、緩衝液と比較した細胞媒質のｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図２３Ａ】図２３Ａは、細胞生存率について、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００及びＤｈａｒｍａＦＥＣＴ（商標）１（「ＤＦ１」）の濃度を変化させ、及び対照ｓｉＲＮＡ濃度（例えば、ＳＲＤ５ａ１遺伝子を標的としている修飾ｓｉＲＮＡ及び無修飾ｓｉＲＮＡ）を変化させた、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦの態様のグラフによる表現である。
【図２３Ｂ】図２３Ｂは、図２３Ａの条件の遺伝子サイレンシングの態様のグラフによる表現である。
【図２４Ａ】図２４Ａは、さまざまな濃度での、ＧＡＰＤＨ、ＭＡＰ２Ｋ２及びＭＡＰ２Ｋ１に対して方向付けられた個々のｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡのプールの有効性を比較した、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルの態様のグラフによる表現である。
【図２４Ｂ】図２４Ｂは、さまざまな濃度での、ＧＡＰＤＨ、ＭＡＰ２Ｋ２及びＭＡＰ２Ｋ１に対して方向付けられた個々のｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡのプールの有効性を比較した、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルの態様のグラフによる表現である。
【図２４Ｃ】図２４Ｃは、さまざまな濃度での、ＧＡＰＤＨ、ＭＡＰ２Ｋ２及びＭＡＰ２Ｋ１に対して方向付けられた個々のｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡのプールの有効性を比較した、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルの態様のグラフによる表現である。
【図２５Ａ】図２５Ａ〜２５Ｃは、さまざまな濃度での、ＧＡＰＤＨ、ＭＡＰ２Ｋ２及びＭＡＰ２Ｋ１に対して方向付けられた個々のｓｉＲＮＡ及びｓｉＲＮＡのプールの有効性を比較した、ｓｉＲＮＡ  ＲＴＦプロトコルの態様のグラフによる表現である。図２５Ａは、ＧＡＰＤＨ二重鎖１、ＭＡＰ２Ｋ２二重鎖１及びＭＡＰ２Ｋ１二重鎖１（１、ｌ＆ｌ）存在下でのＧＡＰＤＨノックダウン；ＧＡＰＤＨ二重鎖２、ＭＡＰ２Ｋ２二重鎖２及びＭＡＰ２Ｋ１二重鎖２（２、２＆２）存在下でのＧＡＰＤＨノックダウン；ＧＡＰＤＨ二重鎖４、ＭＡＰ２Ｋ２二重鎖４及びＭＡＰ２Ｋ１二重鎖３（４、４＆３）存在下でのＧＡＰＤＨノックダウン；ＧＡＰＤＨ二重鎖５、ＭＡＰ２Ｋ２二重鎖７及びＭＡＰ２Ｋ１二重鎖４（５、７＆４）存在下でのＧＡＰＤＨノックダウン；及び前記の二重鎖のすべてから成るＧＡＰＤＨ、ＭＡＰ２Ｋ２及びＭＡＰ２Ｋ１プール存在下でのＧＡＰＤＨノックダウンを示している。
【図２５Ｂ】図２５Ｂは、図２５Ａに記載したすべての二重鎖組み合わせの存在下でのＭＡＰ２Ｋ２ノックダウンを示している。
【図２５Ｃ】図２５Ｃは、図２５Ａに記載したすべての二重鎖組み合わせの存在下でのＭＡＰ２Ｋ１ノックダウンを示している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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