(57)【要約】  本開示は、生体サンプルにおいて、ＧＤＦ−８調節剤、例えば、ＭＹＯ−０２９に対する抗体を検出する方法を提供する。ＧＤＦ−８調節剤に対する免疫応答を検出する方法も含まれる。特に、ヒトを包含する動物における、ＧＤＦ−８調節剤、例えば、ＧＤＦ−８阻害剤に対する免疫応答を評価する方法が提供される。
2008537777.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体サンプルにおいてＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体を検出する方法であって：
（ａ）ＧＤＦ−８調節剤を反応容器中ＧＤＦ−８活性についてのインビトロアッセイに添加し；
（ｂ）生体サンプルを反応容器中ＧＤＦ−８活性のインビトロアッセイに添加し；
（ｃ）生体サンプルによりＧＤＦ−８活性についての調節を検出し；
（ｄ）生体サンプルの存在下でのＧＤＦ−８活性の調節を、ＧＤＦ−８調節剤単独の存在下でのＧＤＦ−８活性の調節と比較することを含む方法。
【請求項２】
インビトロアッセイが：
（ａ）ＧＤＦ−８調節剤を反応容器の表面と接触させ；
（ｂ）次に、生体サンプルを反応容器に添加し；
（ｃ）検出剤を反応容器に添加し；
（ｄ）表面と結合したＧＤＦ−８調節剤／抗体複合体を検出することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
検出剤が、検出可能な標識を有するＧＤＦ−８調節剤である請求項２記載の方法。
【請求項４】
検出剤が標識されたＧＤＦ−８タンパク質である請求項２記載の方法。
【請求項５】
標識がビオチンである請求項４記載の方法。
【請求項６】
取り込まれたビオチンのモル数の薬剤のモル数に対する比が５：１未満である請求項５記載の方法。
【請求項７】
ビオチンの薬剤に対する比が約０．５：１から４：１の間である請求項５記載の方法。
【請求項８】
生体サンプル中のＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体を検出する方法であって：
（ａ）ＧＤＦ−８調節剤を反応容器の表面と接触させ；
（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加し；
（ｃ）検出剤を反応容器に添加し；
（ｄ）反応容器の表面と結合するＧＤＦ−８調節剤／抗体複合体を検出することを含む方法。
【請求項９】
検出剤が、検出可能な標識を有する工程（ａ）のＧＤＦ−８調節剤である請求項８記載の方法。
【請求項１０】
検出剤が標識されたＧＤＦ−８タンパク質である請求項８記載の方法。
【請求項１１】
試験サンプル中のＧＤＦ−８調節剤／標識されたＧＤＦ−８タンパク質複合体レベルを対照サンプル中のレベルと比較することによりＧＤＦ−８調節剤／抗体複合体が検出される、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
ＧＤＦ−８調節剤がＧＤＦ−８阻害剤である請求項８記載の方法。
【請求項１３】
ＧＤＦ−８阻害剤が抗体である請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
抗体がＧＤＦ−８と特異的に結合する請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
抗体がＭＹＯ−０２９である請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
ＧＤＦ−８調節剤が：
（ａ）ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体；
（ｂ）ＧＤＦ−８結合パートナーと特異的に結合する抗体；
（ｃ）可溶性ＧＤＦ−８レセプター；
（ｄ）ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質；
（ｅ）フォリスタチンドメイン含有タンパク質；
（ｆ）フォリスタチンタンパク質；
（ｇ）ＧＡＳＰ−１タンパク質；
（ｈ）ＧＤＦ−８タンパク質；
（ｉ）ＧＤＦ−８プロペプチド；
（ｊ）非タンパク質様阻害剤；
（ｋ）核酸；および
（ｌ）小分子から選択される請求項８記載の方法。
【請求項１７】
生体サンプルが、哺乳類、鳥類、は虫類、または魚類から得られる請求項８記載の方法。
【請求項１８】
生体サンプルが哺乳類から得られる請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
哺乳動物がヒトである請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
生体サンプルが、血清、血液、血漿、生検標本、組織サンプル、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ、尿、汗、涙液、胃液、滑液、および粘液から選択される請求項８記載の方法。
【請求項２１】
生体サンプルが、血清、血液、および血漿から選択される請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
標識が、酵素、エピトープ標識、放射性標識、ビオチン、色素、蛍光タグ標識、および発光標識から選択される請求項１０記載の方法。
【請求項２３】
標識がビオチンである請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
組み入れられたビオチンのモル数の検出剤のモル数に対する比が５：１未満である請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
ビオチンの薬剤に対する比が約０．５：１から４：１の間である請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
アビジン−酵素複合体を添加することをさらに含む請求項２３記載の方法。
【請求項２７】
酵素の存在下で、色、発光、または蛍光を変える基質を添加することをさらに含む請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
生体サンプル中のＧＤＦ−８阻害剤と特異的に結合する抗体を検出する方法であって：
（ａ）第一ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器の表面と接触させ；
（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加し；
（ｃ）標識された第二ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器に添加し；
（ｄ）表面と結合した、標識された第二ＧＤＦ−８阻害剤を検出することを含む方法。
【請求項２９】
生体サンプルが、哺乳動物、鳥類、は虫類、または魚類から得られる請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
生体サンプルが哺乳類から得られる請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
哺乳動物がヒトである請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
生体サンプルが、血清、血液、血漿、生検標本、組織サンプル、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ、尿、汗、涙液、胃液、滑液、および粘液から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
生体サンプルが、血清、血液、および血漿から選択される請求項３２記載の方法。
【請求項３４】
第一ＧＤＦ−８阻害剤および第二のＧＤＦ−８阻害剤が同じである請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
第一ＧＤＦ−８阻害剤が、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体である請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
第二ＧＤＦ−８阻害剤が、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体である請求項２８記載の方法。
【請求項３７】
標識が、酵素、エピトープ標識、放射標識、ビオチン、色素、蛍光タグ標識、および発光標識から選択される請求項２８記載の方法。
【請求項３８】
標識がビオチンである請求項２８記載の方法。
【請求項３９】
アビジン−酵素複合体を添加することをさらに含む請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
酵素の存在下で、色、発光、または蛍光を変化させる基質を添加することをさらに含む請求項３９記載の方法。
【請求項４１】
生体サンプルにおいてＭＹＯ−０２９と特異的に結合する抗体を検出する方法であって：
（ａ）単離されたＭＹＯ−０２９を反応容器の表面と接触させ；
（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加し；
（ｃ）標識されたＭＹＯ−０２９を反応容器に添加し；
（ｄ）表面に結合した、標識されたＭＹＯ−０２９を検出することを含む方法。
【請求項４２】
生体サンプルにおいてＭＹＯ特異的に結合する抗体を検出する方法であって：
（ａ）反応容器中でレポーター遺伝子構造を含む宿主細胞を提供し（ここで、前記構造はＧＤＦ−８−反応性制御エレメントおよびレポーター遺伝子を含む）；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現を活性化を調節するために十分な量の成熟ＧＤＦ−８タンパク質をの容器に添加し；
（ｃ）レポーター遺伝子のＧＤＦ−８活性化を調節するために十分な量のＭＹＯ−０２９を工程（ｂ）の容器に添加し；
（ｄ）生体サンプルを工程（ｃ）の反応容器に添加し；
（ｅ）生物学的サンプルの存在下および不在下でレポーター遺伝子発現を検出することを含む方法。
【請求項４３】
生体サンプルが哺乳動物、鳥類、は虫類、または魚類から得られる請求項４１記載の方法。
【請求項４４】
生体サンプルが哺乳動物から得られる請求項４３記載の方法。
【請求項４５】
哺乳動物がヒトである請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
生体サンプルが、血清、血液、血漿、生検標本、組織サンプル、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ、尿、汗、涙液、胃液、滑液、および粘液から選択される請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
生体サンプルが血清、血液、および血漿から選択される請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
標識が、酵素、エピトープ標識、放射性標識、ビオチン、色素、蛍光タグ標識、および発光標識から選択される請求項４１記載の方法。
【請求項４９】
標識がビオチンである請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
取り込まれたビオチンのモル数の薬剤のモル数に対する中央比が少なくとも５：１である請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ビオチンの薬剤に対する中央比が少なくとも１０：１である請求項４９記載の方法。
【請求項５２】
アビジン−酵素複合体を添加することをさらに含む請求項４９記載の方法。
【請求項５３】
酵素の存在下で色、発光、または蛍光を変える基質を添加することをさらに含む請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
生体サンプル中ＭＹＯ−０２９と特異的に結合する抗体を検出する方法であって：
（ａ）単離されたＭＹＯ−０２９を反応容器と接触させ；
（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加し；
（ｃ）標識されたＧＤＦ−８を反応容器に添加し；
（ｄ）生体サンプルの存在下および不在下で表面と結合した、標識されたＧＤＦ−８を添加することを含む方法。
【請求項５５】
生体サンプルが哺乳動物、鳥類、は虫類、または魚類から得られる請求項５４記載の方法。
【請求項５６】
生体サンプルが哺乳動物から得られる請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
哺乳動物がヒトである請求項５６記載の方法。
【請求項５８】
生体サンプルが、血清、血液、血漿、生検標本、組織サンプル、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ、尿、汗、涙液、胃液、滑液、および粘液から選択される請求項５４記載の方法。
【請求項５９】
生体サンプルが、血清、血液、および血漿から選択される請求項５４記載の方法。
【請求項６０】
生体サンプルが、酵素、エピトープ標識、放射性標識、ビオチン、色素、蛍光タグ標識、および発光標識から選択される請求項５４記載の方法。
【請求項６１】
標識がビオチンである請求項６０記載の方法。
【請求項６２】
アビジン−酵素複合体を添加することをさらに含む請求項６１記載の方法。
【請求項６３】
酵素の存在下および不在下で、色、発光、または蛍光を変える基質を添加することをさらに含む請求項６２記載の方法。
【請求項６４】
第一ＧＤＦ−８阻害剤に対する個体の免疫応答を評価する方法であって：
（ａ）第一ＧＤＦ―８阻害剤を反応容器の表面と接触させ；
（ｂ）個体からの生体サンプルを反応容器に添加し；
（ｃ）標識された第二ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器に添加し；
（ｄ）表面と結合した、標識された第二ＧＤＦ−８阻害剤／抗体複合体を検出することを含み、
標識された複合体の検出が、第一ＧＤＦ−８阻害剤に対する免疫応答を示す方法。
【請求項６５】
第一ＧＤＦ−８阻害剤に対する個体の免疫応答を評価する方法であって：
（ａ）ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器の表面と接触させ；
（ｂ）個体からの生体サンプルを反応容器に添加し；
（ｃ）標識されたＧＤＦ−８タンパク質を反応容器に添加し；
（ｄ）試験サンプル中の表面と結合した、標識されたＧＤＦ−８タンパク質の量を対照サンプルと比較することを含み、
標識された複合体の減少したレベルの検出が、ＧＤＦ−８阻害剤に対する免疫応答を示す方法。
【請求項６６】
第一ＧＤＦ−８阻害剤に対する個体の免疫応答を評価する方法であって、
（ａ）反応容器中にレポーター遺伝子構造を含む宿主細胞を提供し（ここで、前記構造はＧＤＦ−８−反応性制御エレメントおよびレポーター遺伝子を含む）；
（ｂ）レポーター遺伝子の発現を活性化するために十分な量の成熟ＧＤＦ−８タンパク質を容器に添加し；
（ｃ）レポーター遺伝子のＧＤＦ−８活性化を調節するために十分な量のＭＹＯ−０２９を工程（ｂ）の容器に添加し；
（ｄ）生体サンプルを工程（ｃ）の反応容器に添加し；
（ｅ）生体サンプルの存在下および不在下でレポーター遺伝子発現を検出することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年３月２３日に出願された米国仮出願番号６０／６６４，６４３の利益を主張し、その内容は全体として本発明の一部として参照される。
本発明はＧＤＦ−８調節剤に対する免疫応答の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長および分化因子−８（ＧＤＦ−８）は、ミオスタチンとも呼ばれ、構造的に関連する成長因子の形質転換成長因子−ベータ（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーのメンバーである。このスーパーファミリーのメンバーは、生理学的に重要な成長調節および形態形成特性を有する（Ｋｉｎｇｓｌｅｙら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ８：１３３−１４６（１９９４）；  Ｈｏｏｄｌｅｓｓら、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２８：２３５−２７２（１９９８））。同様に、これらは、分泌のための短いペプチドシグナルおよび高度に保存されたタンパク分解開裂部位により生活性カルボキシ末端部分から隔てられたアミノ末端部分を含む共通の構造的構成を共有する。
【０００３】
ヒトＧＤＦ−８は、アミノ末端プロペプチド部分およびカルボキシ末端成熟部分を含む３７５アミノ酸長の前駆体タンパク質として合成される。プロペプチドは、Ａｒｇ−２６６で成熟ＧＤＦ−８から開裂される。成熟ＧＤＦ−８タンパク質は、ジスルフィド結合ホモダイマーとして活性である。タンパク質分解処理後、２つのＧＤＦ−８プロペプチドはＧＤＦ−８成熟ドメインダイマーと非共有結合により錯体形成したままであり、ＧＤＦ−８を潜伏不活性状態に維持すると考えられる（Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８：９３０６−９３１１（２００１）；  Ｔｈｉｅｓら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １８：２５１−２５９（２００１））。他のタンパク質も、成熟ＧＤＦ−８と結合し、その生物活性を阻害することが知られている。このような阻害剤タンパク質としては、フォリスタチンおよびフォリスタチン関連タンパク質、例えば、ＧＡＳＰ−１が挙げられる（Ｇａｍｅｒら、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２０８：２２２−２３２（１９９９）；米国特許公開番号２００３−０１８０３０６−Ａ１；米国特許公開番号２００３−０１６２７１４−Ａ１）。
【０００４】
様々な種からの推定アミノ酸配列の位置合わせにより、進化を通してＧＤＦ−８が高度に保存されていることが示される（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：１２４５７−１２４６１（１９９７））。実際、ヒト、マウス、ラット、ブタ、およびニワトリＧＤＦ−８の配列は、Ｃ末端領域において１００％同一である。ヒヒ、ウシ、およびヒツジＧＤＦ−８において、配列は３個のアミノ酸のみが異なる。ゼブラフィッシュＧＤＦ−８はさらに多様であるが、それでもヒトと８８％同一である。
【０００５】
ＧＤＦ−８は、成育中および成体の骨格筋において高度に発現される骨格筋量の負の調節因子である。トランスジェニックマウスにおけるＧＤＦ−８ゼロ突然変異は、骨格筋の顕著な肥大および過形成により特徴づけられる（ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：８３−９０（１９９７））。骨格筋量における同様の増加は、ウシにおけるＧＤＦ−８の天然に存在する突然変異において顕著である（Ａｓｈｍｏｒｅら、Ｇｒｏｗｔｈ  ３８：５０１−５０７（１９７４）；Ｓｗａｔｌａｎｄら、Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．  ３８：７５２−７５７（１９９４）；ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：１２４５７−１２４６１（１９９７）；Ｋａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７：９１０−９１５（１９９７））。研究ではまた、ヒトにおけるＨＩＶ感染に関連する筋肉疲労はＧＤＦ−８タンパク質発現の増加を伴うことが証明されている（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９５：１４９３８−４３（１９９８））。加えて、ＧＤＦ−８は筋肉特異的酵素（例えば、クレアチンキナーゼ）の産生を調節でき、また、筋芽細胞増殖を調節することができる（ＷＯ  ００／４３７８１）。
【特許文献１】米国仮出願番号６０／６６４，６４３
【特許文献２】米国特許公開番号２００３−０１８０３０６−Ａ１
【特許文献３】米国特許公開番号２００３−０１６２７１４−Ａ１
【特許文献４】ＷＯ  ００／４３７８１
【特許文献５】米国特許公開番号２００４−０１４２３８２
【非特許文献１】Ｋｉｎｇｓｌｅｙら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．  ８：１３３−１４６（１９９４）
【非特許文献２】Ｈｏｏｄｌｅｓｓら、Ｃｕｒｒ．  Ｔｏｐｉｃｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２２８：２３５−２７２（１９９８）
【非特許文献３】Ｌｅｅら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９８：９３０６−９３１１（２００１）
【非特許文献４】Ｔｈｉｅｓら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １８：２５１−２５９（２００１）
【非特許文献５】Ｇａｍｅｒら、Ｄｅｖ．  Ｂｉｏｌ．  ２０８：２２２−２３２（１９９９）
【非特許文献６】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：１２４５７−１２４６１（１９９７）
【非特許文献７】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：８３−９０（１９９７）
【非特許文献８】Ａｓｈｍｏｒｅら、Ｇｒｏｗｔｈ  ３８：５０１−５０７（１９７４）
【非特許文献９】Ｓｗａｔｌａｎｄら、Ｊ．  Ａｎｉｍ．  Ｓｃｉ．  ３８：７５２−７５７（１９９４）
【非特許文献１０】ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：１２４５７−１２４６１（１９９７）
【非特許文献１１】Ｋａｍｂａｄｕｒら、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．  ７：９１０−９１５（１９９７）
【非特許文献１２】Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｃａｄａｖｉｄら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９５：１４９３８−４３（１９９８）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
筋肉組織の増加が治療的に有効であるヒトまたは動物の障害を治療するために、ＧＤＦ−８の活性を阻害する治療薬を用いることができる。さらに、筋肉量または筋力を増加させること、あるいは、例えば家畜において成長または筋肉組織量を増加させることが望ましい場合がある。したがって、たとえば、筋肉量を増加させるために、あるいは脂肪組織、筋肉、代謝、および骨関連障害を治療するための医薬として、ＧＤＦ−８の生体活性を調節する因子を投与することは非常に興味深い。
【０００７】
例えば、生物学的製剤での治療を受けている個体が遭遇する一つの有害な副作用は、治療薬に対する免疫応答である。ＧＤＦ−８調節剤の個体への投与は、個体がＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体を発生する原因となる。このような免疫応答は、健康に重大な悪影響を及ぼし得る。ＧＤＦ−８調節剤のインビボ投与の結果としての免疫複合体の形成は、薬剤の生体内分布およびクリアランス率に影響を及ぼし得る。このような複合体は、循環免疫グロブリンに結合した、投与されたＧＤＦ−８調節剤、またはその一部を含む。一般に、免疫複合体の形成は、治療目的に関して利用可能な治療剤の量を減少させ、非標的組織において投与された薬剤が保持される。幾つかの場合において、循環免疫複合体は非標的組織、例えば、肝臓および腎臓において蓄積（し、潜在的に損傷）する。
【０００８】
ＧＤＦ−８活性の阻害剤をはじめとする、個体における免疫応答を誘発できるＧＤＦ−８調節剤が数多くある。ＭＹＯ−０２９は、米国特許公開番号２００４−０１４２３８２においてさらに詳細に記載されている完全ヒト抗体である。ＭＹＯ−０２９は、成熟ＧＤＦ−８と高い親和性で結合でき、インビトロおよびインビボでＧＤＦ−８活性を阻害でき、骨格筋量および骨密度の負の調節と関連してＧＤＦ−８活性を阻害できる。ＭＹＯ−０２９はマウスに投与された場合に骨格筋量の増大を促進する。
【０００９】
ＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体、例えば、生物学的製剤を検出する方法が望ましい。特に、ＧＤＦ−８調節剤、例えば、ＧＤＦ−８阻害剤および抗ＧＤＦ−８抗体に対する免疫応答の検出および／または定量化を可能にする方法が必要とされる。このような方法は、例えば、ＧＤＦ−８調節剤に対する抗体の検出、薬剤に対する免疫応答の存在の検出または治療の経路のモニタリングまたは最適化、および治療についての対象の評価を可能にする。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、生体サンプルにおいてＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体を検出する方法に関する。ＧＤＦ−８調節剤に対する免疫応答を検出する方法が含まれる。特に、ＧＤＦ−８調節剤、例えば、ＧＤＦ−８阻害剤に対する、ヒトをはじめとする動物における免疫応答を評価する方法が本発明において提供される。一つの実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤、例えば、ＭＹＯ−０２９に対する抗体の存在を検出する方法が提供される。特に、ＧＤＦ−８調節剤が投与された個体から得られる生体サンプルにおいてＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する中和抗体をはじめとする抗体の存在および／または量を評価する方法が提供される。
【００１１】
一つの実施態様において、生体サンプルにおいてＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体を検出する方法が提供され、ここにおいて、前記方法は：（ａ）反応容器においてＧＤＦ−８活性についてのインビトロアッセイにＧＤＦ−８調節剤を添加し；（ｂ）生体サンプルを反応容器中ＧＤＦ−８活性についてのインビトロアッセイに添加し；（ｃ）生体サンプルによるＧＤＦ−８活性の調節を検出し；（ｄ）生体サンプルの存在下でのＧＤＦ−８活性の調節をＧＤＦ−８調節剤単独の存在下でのＧＤＦ−８活性の調節と比較する工程を含む。ある実施態様において、インビトロアッセイはレポーター遺伝子アッセイである。他の実施態様において、インビトロアッセイは、ＧＤＦ−８調節剤との特異的結合を検出するためのアッセイ、例えば、免疫学的検定である。
【００１２】
ある実施態様において、生体サンプルにおいてＭＹＯ−０２９と特異的に結合する抗体を検出する方法であって：（ａ）反応容器中、レポーター遺伝子構造を含む宿主細胞を提供し（ここで、前記構造はＧＤＦ−８−反応性制御エレメントおよびレポーター遺伝子を含む）；（ｂ）レポーター遺伝子の発現を活性化するために十分な量の成熟ＧＤＦ−８タンパク質を容器に添加し；（ｃ）レポーター遺伝子のＧＤＦ−８活性化を調節するために十分な量のＭＹＯ−０２９を工程（ｂ）の反応容器に添加し；（ｄ）工程（ｃ）の反応容器に生体サンプルを添加し；（ｅ）生体サンプルの存在下および不在下でレポーター遺伝子発現を検出する工程を含む方法が提供される。
【００１３】
一つの実施態様において、生体サンプルにおいてＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体の検出法であって：（ａ）ＧＤＦ−８調節剤を反応容器の表面と接触させ；（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加し；（ｃ）検出剤を反応容器に添加し；（ｄ）反応容器の表面と結合したＧＤＦ−８調節剤／抗体複合体を検出することを含む方法が提供される。数例において、検出剤は工程（ａ）のＧＤＦ−８調節剤および検出可能な標識である。数例において、検出剤は標識されたＧＤＦ−８タンパク質である。
【００１４】
もう一つ別の実施態様において、生体サンプルにおいてＧＤＦ−８阻害剤に対する抗体を検出する方法が提供される。この方法は：（ａ）第一ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器の表面と接触させ；（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加し；（ｃ）標識された第二ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器に添加し；（ｄ）前記表面と結合した、標識されたＧＤＦ−８阻害剤を検出することを含む。幾つかの実施態様において、第一ＧＤＦ−８阻害剤および第二ＧＤＦ−８阻害剤は同じである。幾つかの実施態様においては、第一ＧＤＦ−８阻害剤は、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体である。幾つかの実施態様において、第二ＧＤＦ−８阻害剤は、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体である。さらなる実施態様において、ＧＤＦ−８阻害剤は、ＢＭＰ−１１よりも優先的にＧＤＦ−８と結合する。
【００１５】
さらなる実施態様において、生体サンプルにおいてＭＹＯ−０２９と特異的に結合する抗体を検出する方法であって：（ａ）単離されたＭＹＯ−０２９を反応容器の表面と接触させ；（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加し；（ｃ）標識されたＭＹＯ−０２９を反応容器に添加し；（ｄ）表面と結合した、標識されたＭＹＯ−０２９を検出することを含む方法が提供される。
【００１６】
生体サンプルにおいてＭＹＯ−０２９と特異的に結合する抗体を検出する方法も具体例として提供される。この実施態様の方法は：（ａ）  単離されたＭＹＯ−０２９を反応容器の表面と接触させ；（ｂ）反応容器に生体サンプルを添加し；（ｃ）標識されたＧＤＦ−８を反応容器に添加し；（ｄ）生体サンプルの存在下および不在下で表面と結合した、標識されたＧＤＦ−８を検出することを含む。
【００１７】
もう一つ別の実施態様において、個体の第一ＧＤＦ−８阻害剤に対する免疫応答を評価する方法であって：（ａ）第一ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器の表面と接触させ；（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加し；（ｃ）標識された第二ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器に添加し；（ｄ）前記表面と結合した、標識された第二ＧＤＦ−８阻害剤／抗体複合体を検出することを含む方法が提供され、ここにおいて、標識された複合体の検出は第一ＧＤＦ−８阻害剤の免疫応答を示す。
【００１８】
さらなる実施態様において、個体の第一ＧＤＦ−８阻害剤に対する免疫応答を評価する方法が提供される。これらの方法は：（ａ）ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器の表面と接触させ；（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加し；（ｃ）標識されたＧＤＦ−８タンパク質を反応容器に添加し；（ｄ）試験サンプル中の表面と結合した、標識されたＧＤＦ−８タンパク質の量を、対照サンプル中の表面と結合した、標識されたＧＤＦ−８タンパク質の量と比較することを含み、ここにおいて、対照サンプルと比較して、試験サンプル中の標識された複合体の減少したレベルの検出は、ＧＤＦ−８阻害剤に対する免疫応答を示す。
【００１９】
特定の実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤は、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体、ＧＤＦ−８結合パートナーと特異的に結合する抗体、可溶性ＧＤＦ−８レセプター、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質、フォリスタチンドメイン含有タンパク質、フォリスタチンタンパク質、ＧＡＳＰ−１タンパク質、ＧＤＦ−８タンパク質、ＧＤＦ−８プロペプチド、非タンパク質様阻害剤、核酸、および小分子から選択される。幾つかの好ましい実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤はＧＤＦ−８阻害剤である。幾つかの好ましい実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤は、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体、例えば、ＭＹＯ−０２９である。
【００２０】
ある実施態様において、生体サンプルは、哺乳動物、鳥類、は虫類、または魚類から得られる。幾つかの好ましい実施態様において、生体サンプルはヒトから得られる。特定の実施態様において、生体サンプルは、血清、血液、血漿、生検標本、組織サンプル、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ、尿、汗、涙液、胃液、滑液、および粘液から選択される。幾つかの好ましい実施態様において、生体サンプルは血清、血液、または血漿である。
【００２１】
様々な他の実施態様において、標識は、酵素、エピトープ標識、放射性標識、ビオチン、色素、蛍光タグ標識、および発光標識から選択される。標識が酵素である実施態様において、方法は、酵素の存在下で、色、発光、または蛍光を変える基質を添加することをさらに含む。実施態様例において、標識はビオチンであり、方法は、アビジン−酵素複合体を添加することをさらに含む。一つの特定の実施態様において、方法は、酵素の存在下で、色、発光、または蛍光を変える基質を添加することをさらに含む。
【００２２】
本発明のさらなる態様および実施態様はを以下の説明の部分に記載され、説明から一部明らかになるか、または本発明の実施により確認できるであろう。この要約および以下の説明は、請求の範囲において提供されるように、本発明を制限することを意図されない。
【００２３】
配列の簡単な説明
ＧＤＦ−８、ＭＹＯ−０２９、および関連するｓｃＦｖフラグメント、ＶＨおよびＶＬドメイン、および相補性決定領域（ＣＤＲ）のＤＮＡおよびアミノ酸（ＡＡ）配列を配列例に記載し、表に列挙する。
【００２４】
【表１】
2008537777.tif 000003
【発明を実施するための最良の形態】
【００２５】
本発明は、生体サンプル中のＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体を検出する方法に関する。ＧＤＦ−８調節剤に対する免疫反応を検出する方法も含まれる。特に、ヒトを包含する動物における外因性ＧＤＦ−８調節剤、たとえば、ＧＤＦ−８阻害剤に対する免疫反応を評価する方法も本発明において提供される。１つの実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤、たとえばＭＹＯ−０２９に対する中和抗体の存在を検出する方法が提供される。特に、ＧＤＦ−８調節剤が投与された個体から得られる生体サンプル中のＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体の存在および／または量を評価する方法が提供される。
【００２６】
ＧＤＦ−８調節剤が固体に投与される場合、投与されたＧＤＦ−８調節剤に対する免疫反応を検出するための方法は、生体サンプル中のＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体の存在および／または程度を決定するために有用である。この方法により、たとえば、治療計画の評価、治療の経過の追跡、ＧＤＦ−８調節剤の適性の評価、治療の対象の特定、または医薬の用量の調節も可能になる。方法は、さらに、ＧＤＦ−８調節剤の乱用の特定も可能にする。
【００２７】
本発明をさらに容易に理解するために、ある用語を本明細書において定義する。さらなる定義は、詳細な説明全体にわたって記載されている。
【００２８】
「ＧＤＦ−８」なる用語は、特異的な成長および分化因子−８を意味する。この用語は、ＧＤＦ−８の完全長非プロセッシング前駆体形態ならびに翻訳後開裂の結果生じる成熟およびプロペプチド形態を意味する。特に「不活性」として記載されていない限り、「ＧＤＦ−８タンパク質」は１以上のＧＤＦ−８生物学的活性を保持する。この用語はまた、本明細書において前述のような、成熟ＧＤＦ−８と関連する少なくとも１つの生物学的活性を維持するＧＤＦ−８の任意のフラグメントおよび変異体、たとえば、修飾された配列も意味する。成熟ヒトＧＤＦ−８のアミノ酸配列は、配列番号１において提供され、前駆体、完全長ヒトＧＤＦ−８配列は、配列番号２において提供される。本発明は、これらに限定されないが、ヒト、ウシ、ニワトリ、マウス、ラット、ブタ、ヒツジ、シチメンチョウ、ヒヒ、および魚類を包含する全ての脊椎動物種由来のＧＤＦ−８に関する（配列情報については、たとえば、ＭｃＰｈｅｒｒｏｎら、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  ９４：１２４５７−１２４６１（１９９７）参照）。
【００２９】
「成熟ＧＤＦ−８」なる用語は、ＧＤＦ−８前駆体タンパク質のカルボキシ末端ドメインから開裂されるタンパク質を意味する。条件に応じて、成熟ＧＤＦ−８はモノマーとして、ホモダイマーとして、および／またはＧＤＦ−８潜在複合体において存在し得る。その生物学的に活性な形態において、成熟ＧＤＦ−８は「活性ＧＤＦ−８」とも呼ばれる。この用語は、修飾された配列を包含する、本明細書において記載される成熟ＧＤＦ−８に関連する少なくとも１つの生物学的活性を維持するＧＤＦ−８の任意のフラグメントおよび変異体も意味する。
【００３０】
「ＧＤＦ−８プロペプチド」なる用語は、ＧＤＦ−８前駆体タンパク質のアミノ末端ドメインから開裂されるポリペプチドを意味する。ＧＤＦ−８プロペプチドは、成熟ＧＤＦ−８上のプロペプチド結合ドメインと結合することができる。ＧＤＦ−８プロペプチドは成熟ＧＤＦ−８ホモダイマーと複合体を形成する。２つのＧＤＦ−８プロペプチドは、ホモダイマー中の成熟ＧＤＦ−８の２つの分子と結合して、潜在的複合体と呼ばれる不活性テトラマー複合体を形成すると考えられる。潜在的複合体は、１以上のＧＤＦ−８プロペプチドの代わりに、または１以上のＧＤＦ−８プロペプチドに加えて、他のＧＤＦ阻害剤を含み得る。
【００３１】
「ＧＤＦ−８活性」なる用語は、活性ＧＤＦ−８タンパク質に関連する、１以上の生理的成長調節または形態形成活性を意味する。たとえば、活性なＧＤＦ−８は骨格筋量の負の調節因子である。活性なＧＤＦ−８は筋肉特異的酵素（たとえば、クレアチンキナーゼ）の産生を調節し、筋芽細胞増殖を刺激し、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を調節することもできる。「ＧＤＦ−８活性」は、「ＧＤＦ−８結合活性」を包含する。たとえば、成熟ＧＤＦ−８は、ＧＤＦ−８のプロペプチド領域、ＡｃｔＲＩＩＢ、ＧＤＦ−８レセプター、アクチビン、フォリスタチン、フォリスタチンドメイン−含有タンパク質、ＧＡＳＰ−１、および他のタンパク質と特異的に結合する。ＧＤＦ−８阻害物質、たとえば、抗体またはその一部は、これらの結合活性の１以上を減少させる。インビボおよびインビトロのＧＤＦ−８活性を測定するための手順の例を以下に記載する。
【００３２】
「ＧＤＦ−８調節剤」なる用語は、ＧＤＦ−８、またはその医薬的に許容される誘導体の活性、発現、プロセッシング、または分泌を調節できる任意の作用物質を包含する。１以上のＧＤＦ−８活性を増大させる作用物質および１以上のＧＤＦ−８活性を減少させる作用物質もこの用語に含まれる。「ＧＤＦ−８阻害剤」なる用語は、ＧＤＦ−８、またはその医薬的に許容される誘導体の活性、発現、またはプロセッシングに影響を及ぼすことができる任意の作用物質を包含する。ＧＤＦ−８阻害剤は、ＧＤＦ−８に関連する１以上の活性を減少させる。ある実施態様において、ＧＤＦ−８阻害剤は、ＧＤＦ−８の、１以上のその生理学的結合パラメータ、たとえばこれに限定されないが、レセプター（たとえば、ＡｃｔＲＩＩＢ）、フォリスタチンドメイン含有タンパク質（たとえば、フォリスタチン、ＦＬＲＧ、ＧＡＳＰ−１、ＧＡＳＰ−２）、またはＧＤＦ−８タンパク質、たとえば、ＧＤＦ−８プロペプチドおよびその突然変異体および誘導体との結合に影響を及ぼす。このようなＧＤＦ−８阻害剤は、たとえば、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体（ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２、ＪＡ−１６、およびそのフラグメントおよび誘導体を包含する）、ＧＤＦ−８レセプターと特異的に結合する抗体（たとえば、米国特許第６，６５６，４７５号、米国特許公開番号２００４／００７７０５３−Ａ１参照）、修飾可溶性レセプター（レセプター融合タンパク質、たとえば、ＡｃｔＲＩＩＢ−Ｆｃ融合タンパク質を包含する）、ＧＤＦ−８と特異的に結合する他のタンパク質（たとえば、ＧＤＦ−８プロペプチド、ＧＤＦ−８プロペプチドの突然変異体および誘導体、フォリスタチン、フォリスタチンドメイン含有タンパク質、およびこれらのタンパク質のＦｃ融合体）、ＧＤＦ−８レセプターと結合するタンパク質これらのタンパク質のＦｃ融合体、および模倣物も含まれる。非タンパク質様阻害剤（たとえば、核酸）もＧＤＦ−８阻害剤なる用語に含まれる。ＧＤＦ−８阻害剤は、タンパク質、抗体、ペプチド、ペプチド模倣物、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、二本鎖ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ（たとえば、ＲＮＡｉ）、および他の小分子であって、ＧＤＦ−８を特異的に阻害するものを包含する。このような阻害剤は、ＧＤＦ−８の生物学的活性を「阻害」、「減少」または「中和」すると言われ、以下にさらに詳細に記載する。
【００３３】
「ＧＤＦ−８阻害剤」は、ＧＤＦ−８の少なくとも１つの生物的活性、たとえば、活性なＧＤＦ−８タンパク質と関連する生理学的、成長調節、または形態形成活性を「阻害」、「中和」、または「減少」させる。たとえば、ＧＤＦ−８は骨格筋成長の負の調節因子である。ＧＤＦ−８阻害剤は、筋肉量を増大させ、筋力を増大させ、筋肉特異的酵素（たとえば、クレアチンキナーゼ）のレベルを調節し、筋芽細胞増殖を刺激し、前脂肪細胞が分化して脂肪細胞になることを調節し、脂肪蓄積を減少させ、血清トリグリセリドレベルを減少させ、血清コレステロールレベルを減少させ、グルコース代謝を調節し、高血糖症を軽減することができる。さらに、ＧＤＦ−８はＧＬＵＴ４のインスリン誘発性発現をブロックし、インスリンによる前脂肪細胞の分化をブロックする。
【００３４】
「阻害する」、「阻害性」なる用語およびその同義語は、ＧＤＦ−８阻害剤の不在下でのＧＤＦ−８の活性に対する、ＧＤＦ−８阻害剤によるＧＤＦ−８の１以上の活性の減少を意味する。活性の減少は、好ましくは少なくとも約２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上である。ある実施態様において、ＧＤＦ−８の活性は、ＧＤＦ−８阻害剤の不在下でのＧＤＦ−８タンパク質に対して、１以上の現在開示されている阻害剤により影響を受ける場合、少なくとも５０％、好ましくは少なくとも６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、または８８％、さらに好ましくは少なくとも９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、または９９％、およびなおいっそう好ましくは少なくとも９５％〜１００％減少する。「中和する（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ）」、「中和する（ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ）」なる用語およびその同義語は、１以上のＧＤＦ−８活性の少なくとも８０％、８５％、９０％、または９５％の減少を意味する。ＧＤＦ−８活性の阻害はＴｈｉｅｓ  ら、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １８：２５１−２５９（２００１）において記載されているようなｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）、またはたとえば以下に示されるようなＡｃｔＲＩＩＢレセプターアッセイにより測定できる。
【００３５】
本明細書において用いられる「抗体」なる用語は、免疫グロブリンまたはそのフラグメントなどの、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドであり、その供給源、起源の種、産生方法、および特性に関係なく、抗原結合部位を含む任意のポリペプチドを包含する。非制限的例として、「抗体」なる用語は、合成、ヒト、オランウータン、サル、霊長類、マウス、ラット、ヤギ、イヌ、ヒツジ、およびニワトリ抗体を包含する。この用語は、これに限定されないが、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異的、多特異的、非特異的、ヒト化、単鎖、キメラ、合成、組み換え、ハイブリッド、突然変異、およびＣＤＲ移植抗体を包含する。本発明の目的に関して、「抗体」はさらに、反対の記載しない限り（「無傷」なる用語がその前にある場合など）、抗体フラグメントも包含する。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、Ｆｄ、ｄＡｂ、および抗原結合機能を保持する他のフラグメントを含む。典型的には、このようなフラグメントは、抗原結合ドメインを含む。当業者により認識されるように、このような分子のいずれか、たとえば「ヒト」抗体は、免疫原性を減少させるか、その親和性を増大させるか、その特異性を変更するか、または他の目的のために操作（たとえば、生殖）することができる。
【００３６】
抗体は、たとえば、伝統的なハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９９（１９７５））、組み換えＤＮＡ法（米国特許第４，８１６，５６７号）、または抗体ライブラリーを使用するファージディスプレー技術（Ｃｌａｃｋｓｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：６２４−６２８（１９９１）；Ｍａｒｋｓら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２２２：５８１−５９７（１９９１））により調製できる。様々な他の抗体産生技術については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ｅｄｓ．  Ｈａｒｌｏｗら、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、１９８８参照。
【００３７】
「抗原結合ドメイン」なる用語は、抗原の一部または全部と特異的に結合するか、または相補的である部分を含む、抗体分子の部分を意味する。抗原が大きい場合、抗体は抗原の特定の部分とのみ結合する。「エピトープ」または「抗原決定因子」とは、抗体の抗原結合ドメインとの特異的相互作用に関与する抗原分子の一部である。抗原結合ドメインは１以上の抗体可変ドメインにより提供することができる（たとえば、ＶＨドメインからなるＦｄ抗体フラグメント）。ある実施態様において、抗原結合ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む（米国特許第５，５６５，３３２号）。
【００３８】
「特異的結合」、「特異的に結合する」などの用語は、２以上の分子が、生理的またはアッセイ条件下で測定可能であり、選択的である複合体を形成することを意味する。抗体または他の阻害剤は、適当に選択された条件下で、このような結合が実質的に阻害されず、一方、非特異結合は阻害されるならばタンパク質と「特異的に結合する」と言われる。特異的結合は、比較的高い親和性により特徴づけられ、化合物またはタンパク質に対して選択的である。非特異結合は通常低い親和性を有する。典型的には、結合は親和性定数Ｋａが少なくとも約１０６  Ｍ−１、または好ましくは少なくとも約１０７、１０８、１０９、または１０１０  Ｍ−１である場合に特異的と見なされる。ある方法は、特異的結合に対して高い親和性を必要とするが、他の方法、たとえば、表面プラズモン共鳴アッセイはより安定性の低い複合体およびより低い親和性相互作用を検出し得る。必要ならば、非特異的結合は、結合条件を変えることにより特異的結合に実質的に影響を及ぼすことなく減少させることができる。このような条件は当該分野において公知であり、当業者は慣用技術を用いて適当な条件を選択できる。条件は通常、結合パートナーの濃度、溶液のイオン強度、温度、結合に許容される時間、関連しない分子の濃度（たとえば、血清アルブミン、ミルクカゼイン）などに関して定義される。結合条件の例は、実施例において記載される。
【００３９】
「単離された」なる用語は、その自然環境が実質的にない分子を意味する。たとえば、単離されたタンパク質は細胞物質またはこれが由来する細胞または組織源からの他のタンパク質が実質的にない。この用語は、単離されたタンパク質が治療組成物として投与されるために十分純粋であるか、または少なくとも７０％から８０％（ｗ／ｗ）純粋であり、さらに好ましくは少なくとも８０％〜９０％（ｗ／ｗ）純粋であり、なおいっそう好ましくは９０〜９５％純粋であり；もっとも好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％（ｗ／ｗ）純粋であることをさす。
【００４０】
「個体」なる用語は、任意の脊椎動物、たとえば、哺乳動物、鳥類、は虫類、両生類、または魚類を意味する。「哺乳動物」なる用語は、たとえば、ヒト、ヒト以外の霊長類、サル、イヌ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシなどをはじめとする、そのようなものとして分類される、オスまたはメスの任意の動物を包含する。哺乳動物以外の動物の例としては、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル、ガチョウ、魚類、サケ、ナマズ、バス、カエル、およびマスが挙げられる。個体は、たとえば、ヒト、スポーツ選手、または家畜、家畜類、動物園の動物、スポーツ用動物、レース用動物、またはペット動物から選択することができる。
【００４１】
「有効用量」または「有効量」なる用語は、ＧＤＦ−８関連障害を有する個体を包含する個体において臨床症状を改善するか、または所望の生物学的成果（たとえば、筋肉量、筋力、および／または骨密度の増大）を達成するために十分である用量またはレベルを意味する。このような量は、たとえば、骨格筋量および骨密度の負の調節に関連するＧＤＦ−８の活性を減少させるために十分であるべきである。治療成果および臨床症状は、体脂肪の減少、筋肉量の増大、改善された心臓血管指標、または改善されたグルコース代謝調節を包含し得る。ＧＤＦ−８阻害剤は、たとえば、筋肉量、筋力を増大させ、筋肉特異的酵素（たとえば、クレアチンキナーゼ）のレベルを調節し、および／または筋芽細胞増殖を刺激することができる。好ましい実施態様において、ＧＤＦ−８阻害剤は、ＧＤＦ−８関連疾患の臨床症状を軽減する。ＧＤＦ−８調節剤は、たとえば、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を調節し、脂肪蓄積を減少させ、血清トリグリセリドレベルを減少させ、血清コレステロールレベルを減少させ、グルコース代謝を調節し、骨密度を調節し、高血糖症を軽減することができる。ＧＤＦ−８阻害剤は、筋肉量を増加させるか、運動能力を改善するか、あるいは筋肉成長をはじめとする成長を増加または促進するために投与することもできる。有効量は、次の章において記載されるようにして決定できる。ＧＤＦ−８阻害剤の「治療的に有効な量」とは、障害または再発性障害の治療、予防、治癒、遅延、重篤性の軽減、または少なくとも１つの症状の改善、あるいはこのような治療がない場合に予想されるものを超えた患者の生存の延長を目的として、個体（たとえば、ヒト）に１回量または複数回投与量を投与することにより有効である量を意味する。
【００４２】
「ＧＤＦ−８関連障害」とは、対象がＧＤＦ−８調節剤、たとえば、ＧＤＦ−８阻害剤の投与から恩恵を受けるであろう障害または状態である。ＧＤＦ−８関連障害は、内科的疾患、たとえば、筋肉関連または神経筋障害または状態、あるいは脂肪組織、代謝、または骨関連障害または状態を包含する。
【００４３】
ＧＤＦ−８阻害剤の投与は、症状または障害の改善および／または予防を包含する、障害の治療のためにこの阻害剤が投与される場合、「治療的」である。治療的使用は、内科的疾患を有する個体または最終的に障害を獲得し得る個体に、障害または再発性障害の予防、治癒、遅延、重篤性の軽減、または１以上の症状の改善のために、あるいはかかる治療がない場合の予想を超えて対象の生存を延長するために投与することを含む。ＧＤＦ−８阻害剤は、たとえば、筋肉量、筋力を増加させ、筋肉特異的酵素（たとえば、クレアチンキナーゼ）のレベルを調節し、筋芽細胞増殖を刺激することができる。ＧＤＦ−８調節剤は、たとえば、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を調節し、脂肪蓄積を減少させ、血清トリグリセリドレベルを減少させ、血清コレステロールレベルを減少させ、グルコース代謝を調節し、骨密度を調節し、高血糖症を軽減することができる。ＧＤＦ−８阻害剤はさらに、筋肉量を増加させるか、運動能力を改善するか、あるいは筋肉成長をはじめとする成長を増加または促進するために投与することもできる。
【００４４】
「高ストリンジェント」または「高ストリンジェンシー」なる用語は、核酸−核酸相互作用を決定するために用いられるハイブリッド形成および洗浄のための条件を説明する。このような条件は、当業者には公知であり、たとえば、Ｗｉｌｅｙら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  分子  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、Ｎ．Ｙ．、６．３．１−６．３．６（１９８９）において見出すことができる。当該分野において記載されているような水性および非水性条件はどちらも使用できる。高ストリンジェントハイブリッド形成条件の一例は、６Ｘ  塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中、約４５℃でハイブリッド形成し、それに続いて、０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）中５０℃で少なくとも１回洗浄する。高ストリンジェントハイブリッド形成条件の他の例は、６Ｘ  ＳＳＣ中、約４５℃（または５０℃、６０℃、または６５℃）でのハイブリッド形成と、それに続く０．２Ｘ  ＳＳＣ、０．１％  ＳＤＳ中約５５℃、６０℃または６５℃での少なくとも１回の洗浄を含む。高ストリンジェント条件は、０．５Ｍ  リン酸ナトリウム、７％  ＳＤＳ中６５℃でのハイブリッド形成と、それに続く０．２Ｘ  ＳＳＣ、１％  ＳＤＳ、  ６５℃での少なくとも１回の洗浄であってもよい（たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、分子  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９８９参照）。
【００４５】
「実質的に同一」または「実質的に類似」なる語句は、たとえば、本発明のＧＤＦ−８阻害剤などの関連するアミノ酸またはヌクレオチド配列が、開示された配列と比較して（保存されたアミノ酸置換により）同一であるかまたは実質的でない差を有することを意味する。本発明のヌクレオチドおよびポリペプチドは、たとえば、開示された核酸分子およびポリペプチドと少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％配列が同一であるものを含む。
【００４６】
ポリペプチドについて、少なくとも２０、３０、５０、１００、またはそれ以上のアミノ酸をもとのポリペプチドおよび原型と実質的に同一である変異ポリペプチド間で比較する。核酸について、少なくとも５０、１００、１５０、３００またはそれ以上のヌクレオチドをもとの核酸および原型と実質的に同一である変異体核酸間で比較する。かくして、「実質的に同一」の定義を依然として満たしながら、変異体は実質的にある領域が同一であるが、他の領域において異なる。２つの配列間の同一性（％）は、標準的整列アルゴリズム、たとえば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５：４０３−４１０（１９９０）により記載されているＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８：４４４−４５３（１９７０）のアルゴリズム、またはＭｅｙｅｒｓら、Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．、４：１１−１７（１９８８）のアルゴリズムにより決定される。
【００４７】
「変異体」なる用語は、たとえば、それぞれ提供されたＧＤＦ−８阻害剤のヌクレオチドおよびアミノ酸配列と実質的に同一または類似したヌクレオチドおよびアミノ酸配列を意味する。変異体は、天然に存在するものであり得、たとえば、天然に存在するヒトおよびヒト以外のヌクレオチド配列であるか、または人工的に生成させることができる。変異体の例は、ｍＲＮＡの別のスプライシング、たとえば、３’および５’スプライス変異体の両方、点突然変異および他の突然変異、またはタンパク質のタンパク質分解開裂から得られるものである。変異体は、核酸分子またはそのフラグメントおよびアミノ酸配列およびそのフラグメントであって、それぞれ他の核酸（あるいはこれらが最適に整列された場合（適当な挿入または欠失を伴う）、その相補鎖）またはアミノ酸配列と実質的に同一または類似したものを包含する。一つの実施態様において、最適に整列された場合、それぞれ、本発明の核酸分子またはタンパク質と別の核酸分子またはタンパク質の間に少なくとも約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性がある。さらに、変異体は、本出願において議論されているように、ＧＤＦ−８活性を示すか、またはＧＤＦ−８活性を阻害するタンパク質またはポリペプチドを包含する。
【００４８】
「生体サンプル」は、個体、たとえば、細胞、組織、器官、または液体から集められた生物学的物質である。生体サンプルの例としては、血清、血液、および血漿が挙げられる。
【００４９】
「反応容器」なる用語は、その中でインビトロアッセイ、たとえば、ＧＤＦ−８調節剤と抗体の間の会合反応が起こり、検出できる容器を意味する。「表面」とは、任意の固体（たとえば、ガラス、セルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、硫酸デキストラン、または処理されたポリプロピレン）の外側部分であって、これにＧＤＦ−８調節剤を直接または間接的に「接触させる」か、「固定するか」、または「コーティングする」ことができるものである。「反応容器の表面」は、容器自体の一部であってもよいし、あるいは表面は反応容器中にあってもよい。表面、たとえば、ポリスチレンは、化学または放射線処理に付して、その表面の結合特性を変えることができる。中程度の結合、高い結合、アミノ化、および活性化表面はこの用語に含まれる。ＧＤＦ−８調節剤は、たとえば表面に対する物理的吸着または共有結合により直接表面と接触させることができるか、またはたとえば表面と直接接触する物質または部分との相互作用により間接的に接触させることができる。
【００５０】
本明細書において用いられる「捕捉剤」なる用語は、タンパク質などの分子であって、たとえば、ＧＤＦ−８調節剤またはＧＤＦ−８それ自体などの標的タンパク質と特異的に結合するために免疫学的検定において用いられる分子を意味する。本発明の方法に適した捕捉剤は、ＧＤＦ−８調節剤および／またはＧＤＦ−８タンパク質と特異的に結合する。たとえば、捕捉剤は、成熟ＧＤＦ−８ダイマー、またはＧＤＦ−８タンパク質と特異的に結合するタンパク質をはじめとするＧＤＦ−８タンパク質であってよい。同様に、捕捉剤は、ＧＤＦ−８調節剤またはＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合するタンパク質であってよい。
【００５１】
「検出剤」は、タンパク質または小分子であって、ＧＤＦ−８調節剤に対する抗体に特異的に結合するものである。検出剤は、任意に、検出可能な標識を含んでもよい。検出剤は、検出可能な標識を含む検出剤により、それ自体検出可能であってもよい。「標識」なる用語は、その化学的性質により、アッセイ的に特定可能なシグナルを提供し、これにより分子相互作用の検出が可能になる分子を意味する。抗体をはじめとするタンパク質は、（たとえば、発色団、フルオロフォア、または放射線同位元素により）直接検出できるか、または（たとえば、着色、発光、または蛍光生成物を産生する反応を触媒することにより）間接的に検出できる分子と共有結合または非共有結合するならば、検出可能な標識を有する。
【００５２】
本発明は、ＧＤＦ−８調節剤に対する免疫応答を検出する方法、ならびに生体サンプル中のＧＤＦ−８調節剤に対する抗体を検出する方法に関する。一つの実施態様において、この方法は、抗体、特にインビボ治療的ＧＤＦ−８調節剤の構成成分、たとえばＧＤＦ−８阻害剤と結合できる抗体を検出する。いくつかの実施態様において、アッセイ法は、中和抗体、たとえば、ＧＤＦ−８調節剤の作用を阻害する抗体を検出する。特定の実施態様において、アッセイ法は、ＭＹＯ−０２９のＧＤＦ−８に対する結合を阻害する抗体を検出する。この方法は、ヒト患者の治療抗体、または他のＧＤＦ−８調節剤、たとえば、ＧＤＦ−８の生物学的活性を阻害するものを受容することに対する適合性を評価するのに有用である。ある具体例において、この方法は、ＭＹＯ−０２９に対する生体サンプル中の抗体の存在を検出する。
【００５３】
ＧＤＦ−８関連障害を有する個体、ＧＤＦ−８関連障害を発症する危険性がある個体、ＧＤＦ−８調節剤を用いた治療を受けている個体、およびＧＤＦ−８調節剤投与の対象である個体は、本発明において提供される方法の対象であり得る。本発明の方法は、有害な免疫応答の検出または予防、および／またはＧＤＦ−８調節剤の有効性、生物学的安定性、または使用の適合性を評価することができる。
【００５４】
ＧＤＦ−８関連障害、たとえば、筋肉関連障害または神経筋障害を発症する危険性がある個体は、本発明において提供される方法の対象である。ＧＤＦ−８活性の阻害は、筋肉関連障害にかかっている個体をはじめとする個体において筋肉組織を増加させる。多くの障害は、たとえば、機能が損なわれた筋肉または神経組織に関連し、たとえば、筋ジストロフィー、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、サルコペニア、カへキシー、筋肉疲労、筋萎縮、あるいは疲労、萎縮、または弱さを包含する筋肉変性である。筋ジストロフィーは、たとえば、偽肥大性、顔面肩甲上腕型、および肢体筋ジストロフィーを包含する。筋ジストロフィーの例は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（Ｌｅｙｄｅｎ−Ｍｏｅｂｉｕｓ）、ベッカー型筋ジストロフィー、エメリー・ドレイファス型ジストロフィー、肢体筋ジストロフィー、硬直脊椎症候群、ウルリッヒ症候群、フクヤマ筋ジストロフィー、ウォーカー・ワールブルグ症候群、筋眼脳病（ｍｕｓｃｌｅ  ｅｙｅ  ｂｒａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅ）、顔面肩甲上腕型筋ジストロフィー（Ｌａｎｄｏｕｚｙ−Ｄｅｊｅｒｉｎｅ）、先天性筋ジストロフィー、筋剛直性ジストロフィー（シュタイネルト病）、先天性筋硬直症、およびガワーズ病を包含する。
【００５５】
ＧＤＦ−８関連筋肉障害は心臓血管疾患に関連する筋肉変性、または器官萎縮、臓器不全、癌などの別の疾患または状態に続発するものから選択される障害も包含する。後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）、床上安静、運動不足、長期間の不使用、あるいは他の障害または状態もこの用語に含まれる。
【００５６】
脂肪組織障害（たとえば、肥満）、心臓血管障害（筋肉喪失または筋肉疲労に関連する場合）、およびインスリン代謝の障害にかかっているか、または発症の危険性がある個体は、対象になり得る。同様に、骨の喪失に関連する障害、たとえば、骨粗鬆症、特に高齢および／または閉経後の女性において、グルココルチコイド誘発性骨粗鬆症、骨減少症、変形性関節症、および骨粗鬆症に関連する骨折を有するか、または発症の危険性がある個体は本発明における方法の対象である。他のＧＤＦ−８関連状態は、代謝性骨疾患および低い骨量、たとえば、慢性グルココルチコイド療法、早期性腺機能不全、アンドロゲン抑制、ビタミンＤ欠乏、二次性副甲状腺機能亢進症、栄養失調、および拒食症により特徴づけられる障害を包含する。
【００５７】
心臓血管障害の例は、冠動脈疾患（アテローム性動脈硬化症）、狭心症（急性狭心症および不安定狭心症を包含する）、心臓発作、脳卒中（虚血性脳卒中を包含する）、高血圧関連心臓血管疾患、心不全、鬱血性心不全、冠動脈疾患、高血圧、脂質異常症、末梢動脈障害、および末梢血管障害を包含する。インスリン代謝の障害の例は、異常なグルコース恒常性、２型糖尿病、前糖尿病、耐糖能異常、脂質異常症、メタボリック症候群（たとえば、Ｘ症候群）、および外傷、たとえばやけどまたは窒素のアンバランスにより誘発されるインスリン耐性に関連する状態を包含する。
【００５８】
さらに、筋肉量または筋力の増加、たとえば、運動能力の改善または家畜動物における成長または筋肉組織量の増大を望む個人は本発明により提供される方法の対象である。筋肉量の増加、たとえば筋肉細胞サイズの増大（肥大）または筋肉細胞数の増大（過形成）を示す個体は、外因性ＧＤＦ−８調節剤に対する抗体を検出する方法の対象であり得る。増加は、哺乳動物または他の動物の１型および／または２型筋繊維であり得る。筋肉量における増加を測定する方法は当該分野において周知である。たとえば、筋肉は、標準的技術、たとえば、水中秤量を用いて、ＧＤＦ−８調節剤の投与の前後に測定することができる。筋肉サイズにおける増加は、少なくとも約５％、１０％、２０％、またはそれ以上の増量により証明することができる。
【００５９】
一つの実施態様において、本発明は、少なくとも１つの個体からの生体サンプルにおいてＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体を検出する方法であって：（ａ）反応容器中でＧＤＦ−８活性についてのインビトロアッセイにＧＤＦ−８調節剤を添加する工程；（ｂ）反応容器中でＧＤＦ−８活性についてのインビトロアッセイに生体サンプルを添加する工程；（ｃ）生体サンプルによるＧＤＦ−８活性の調節を検出する工程；および（ｄ）生体サンプルの存在下でのＧＤＦ−８活性の調節をＧＤＦ−８調節剤単独の存在下でのＧＤＦ−８活性の調節と比較する工程を含む方法を提供する。ある実施態様において、インビトロアッセイは、たとえば、酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）様式における抗体のＧＤＦ−８剤に対する結合を検出する免疫学的検定である。一つの実施態様において、ＧＤＦ−８剤に対する結合は、検出可能な標識を有するＧＤＦ−８調節剤である検出剤で検出される。別の実施態様において、検出剤は、標識されたＧＤＦ−８タンパク質である。もう一つ別の実施態様において、インビトロアッセイは、レポーター遺伝子アッセイなどのＧＤＦ−８活性についての細胞に基づいたアッセイ法である。
【００６０】
ある実施態様において、インビトロアッセイは、活性なＧＤＦ−８タンパク質に関連する１以上の生理的成長調節または形態形成活性を測定する。ＧＤＦ−８活性の調節を検出するためのインビトロアッセイは、細胞に基づくアッセイまたは無細胞アッセイ法（たとえば、転写、複製または細胞周期阻止の調節を測定するためのアッセイ法）または結合アッセイ（たとえば、免疫学的検定、表面プラズモン共鳴アッセイ法、免疫沈降、または放射性免疫アッセイ）から選択される。たとえば、活性なＧＤＦ−８は骨格筋肉量の負の調節因子であり、筋肉特異的酵素（たとえば、クレアチンキナーゼ）の産生を調節し、筋芽細胞増殖を刺激し、前脂肪細胞の脂肪細胞への分化を調節する。いくつかの方法において、ＢＭＰ−１１調節剤からのＧＤＦ−８調節剤の選択が行われる。ＧＤＦ−８活性についての細胞に基づくアッセイ法および無細胞アッセイ法は、当該分野において公知であり、以下に記載する。
【００６１】
結合アッセイ
一つの実施態様において、本発明は、１以上の患者サンプルから選択される生体サンプルにおける抗体の存在を検出する方法を含み、この方法は：（ａ）ＧＤＦ−８調節剤を反応容器の表面と接触させる工程；（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加する工程；（ｃ）検出剤を反応容器に添加する工程；および（ｄ）反応容器の表面と結合したＧＤＦ−８調節剤／抗体複合体を検出する工程を含む。２つの例を図１および２において示す。
【００６２】
ある実施態様の工程（ａ）において、ＧＤＦ−８調節剤を、たとえば、表面に対する共有結合または非共有結合のいずれかにより、反応容器の表面と接触させる。接触は、直接的であっても、間接的であってもよい。固体表面は典型的にはガラスまたはポリマー、たとえば、セルロース、硫酸デキストラン、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニルまたはポリプロピレンであり、磁気または常時性ビーズをはじめとするビーズの形態であってよい。表面を、たとえば、化学または放射線処理により修飾して、表面の結合特性に影響を及ぼすことができる。表面上のリガンドの固定化は、共有または非共有相互作用、たとえば、物理的吸着により達成できる。ＧＤＦ−８調節剤、たとえば、ＭＹＯ−０２９は、反応容器の表面に直接に吸着され得る。他の実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤は、前記薬剤と共有結合したビオチン分子の、反応容器の表面と接触したアビジン分子との相互作用により、反応容器表面と結合させることができる。共有結合法は、架橋剤、たとえば、グルタルアルデヒド、ヘキサメチレンイソシアネート、スルホ含有剤、ペプチド、アルキル化剤、または類似の試薬とのカップリングを包含する。いくつかの好ましい実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤は、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体、ＧＤＦ−８と特異的に結合するモノクローナル抗体、ＧＤＦ−８、ＭＹＯ−０２９、ＭＹＯ−０２８、ＭＹＯ−０２２、またはＪＡ−１６に対する中和抗体、あるいはそのフラグメントである。これらのＧＤＦ−８阻害剤の構造的および機能的特性は、たとえば、米国特許公開番号２００４／０１４２３８２−Ａ１および２００３／０１３８４２２−Ａ１に記載され、これらの部分は全文書を組み入れることに加えて参照として本発明に特に組み入れられる。特に、ある中和抗体、たとえば、ＭＹＯ−０２９の特性は、米国特許公開番号２００４／０１４２３８２−Ａ１の段落５４−９０、および請求項１−４２において記載されている。同様に、米国特許公開番号２００３／０１３８４２２−Ａ１の抗体阻害剤は、段落５６−７０、９３−１１０、および請求項１−５４に記載されている。
【００６３】
ある実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤の反応容器の表面との接触後、反応容器を洗浄して、生体サンプルの添加前に未結合ＧＤＦ−８調節剤を除去する。非特異性相互作用は、ブロッキング工程に関して最小限に抑えられ、ここで、少なくとも１つのブロッキング剤、たとえば、標的と特異的に結合しないタンパク質を含む緩衝液を反応容器に添加する。他の実施態様において、界面活性剤は、たとえば、イオン性または非イオン性界面活性剤を添加することができる。ブロッキング緩衝液は、たとえば、血清、ウシ血清アルブミン、乳、カゼイン、ゼラチン、および／または非イオン性界面活性剤を含むことができる。いくつかの実施態様において、反応容器を約ｐＨ  ５から約ｐＨ  ９の間の緩衝液、たとえば、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液または酢酸塩緩衝液で洗浄する。
【００６４】
ある実施態様は、工程（ｂ）を含み、ここにおいて、生体サンプルは反応容器に添加される。試験される生体サンプルは、血清、血液、血漿、生検標本、組織サンプル、細胞懸濁液、唾液、口腔液、脳脊髄液、羊水、乳、初乳、乳腺分泌物、リンパ、尿、汗、および涙液から選択することができる。好ましい実施態様において、生体サンプルは流体である。いくつかの好ましい実施態様において、生体サンプルは、血液、血清、および血漿から選択される。特定の実施態様において、生体サンプルは、血清、たとえば、ヒト、サル、ラット、またはマウス血清である。
【００６５】
他の実施態様において、生体サンプルは個体から単離され、試験前に任意に処理されていてもよい。生体サンプルは、集めたままで使用することができるか、または好適な希釈剤で希釈した後に使用することができる。希釈は、アッセイに関するマトリックス干渉を減少および／または除去するために最適化される。希釈剤は、特に限定されないが、脱イオン水または約ｐＨ  ５から約ｐＨ  ９の範囲、好ましくは約ｐＨ  ６．５からｐＨ  ８．５の範囲内で緩衝作用を有する様々な緩衝液（たとえば、クエン酸緩衝液、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、酢酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液）を含むことができる。いくつかの好ましい実施態様において、希釈剤は、正常ヒト血清を含む。希釈剤は、たとえば、サンプルマトリックスのバックグラウンド効果または干渉を抑制するために試験生体サンプルに対応して選択される、一定濃度の対照生体サンプルを含むことができる。
【００６６】
一つの実施態様において、ヒト血清の試験サンプルは、ＴＨＳＴ（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１．０  ｍＭグリシン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含有）緩衝液中に１：８倍に希釈することができ、８倍を超える試験サンプルの希釈物がＴＨＳＴ＋１２．５％ヒト血清中で調製される。サンプルをおよそ２、４、８、１６、３２、６４、または１２８倍に希釈することができる。他の実施態様において、試験サンプルを連続して、１：１．５または１：１．６に希釈して、希釈直線性およびマトリックス効果の証明を可能にするある範囲のデータポイントを得ることができる。好ましい生体サンプルマトリックスに関して、マトリックス干渉およびアッセイ感度が最適化される希釈度を選択することができる。
【００６７】
いくつかの実施態様において、サンプルは、任意に、周知の方法を用いて分画または濃縮することができ、次いで本明細書に記載されたＧＤＦ−８調節剤を検出するための方法に添加することができる。たとえば、マトリックス干渉がアッセイにおけるＧＤＦ−８調節剤の検出を制限するならば、分画（精製を含む）または濃縮を使用できる。分画および濃縮技術は、これに限定されないが、遠心分離、硫酸アンモニウム沈殿、ポリエチレングリコール沈殿、トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）沈殿、親和性技術（たとえば、抗体、すなわち、抗ヒトＦｃ抗体，タンパク質  Ａまたはタンパク質  Ｇなどの特異的結合パートナーと結合した樹脂を用いた免疫沈降）、クロマトグラフィー技術、および他の分離技術を包含する。好ましい実施態様において、生体サンプルは、ＧＤＦ−８調節剤の検出前に分画または濃縮されない。
【００６８】
生体サンプルは投薬を受けていない個体から集めることができるか、またはサンプルは  ＧＤＦ−８調節剤の投与前、投与中、または投与後に採取できる。たとえば、サンプルは、ＧＤＦ−８調節剤の投与後１、２、４、６、８、１０、１２、１５、２０、２５、３０日、またはそれ以上の個体から得ることができる。サンプルは、ＧＤＦ−８調節剤投与後１、２、３、４、６、８、１０、１２、１６週、またはそれ以上の個体から得ることもできる。循環ＧＤＦ−８調節剤の実質的な量は、本発明において提供される方法のある実施態様における薬剤に対する抗体の検出を含むので（たとえば、実施例７参照）、サンプル収集のタイミングは、ＧＤＦ−８調節剤からの干渉を軽減するために最適化することができる。抗体応答の持続は、延長された時点を調べることによっても試験される。いくつかの場合において、１年まで、またはそれを超える時点が適当である。
【００６９】
ある実施態様において、試験されるサンプルのアリコートを固定化抗原と接触させ、任意の抗体をサンプル中に存在するＧＤＦ−８調節剤と結合させ、抗体／ＧＤＦ−８調節剤複合体を形成させるために十分な時間（たとえば、２〜１２０分、１〜４時間）、適当な条件下（たとえば、２３℃）でインキュベートする。他の実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤／抗体反応は特に限定されないが、従来の免疫学的検定に関して通常使用される条件下で行うことができる。典型的な手順は、抗体およびＧＤＦ−８調節剤を含む反応系を、一般に４５℃を超えない温度、好ましくは約４℃から約４０℃の間、さらに好ましくは約２３℃から約４０℃の間で、約０．５から４０時間の間、好ましくは約１から約２０時間の間インキュベートするか、または静置することを含む。好ましい実施態様において、反応緩衝液は、反応またはその検出の干渉を回避するために選択される。したがって、実施態様は、これに限定されないが、約ｐＨ  ５から約ｐＨ  ９の間の緩衝液、たとえば、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、および酢酸塩緩衝液を包含する。
【００７０】
ある実施態様において、工程（ｃ）は検出剤を反応容器に添加することを含む。インキュベーション期間の後、ＧＤＦ−８調節剤に対する固定化抗体は、いくつかの実施態様において、緩衝液で洗浄して、工程（ｃ）の前に、未結合溶質を除去する。他の実施態様において、同時定量を行い、これにより工程（ｂ）および（ｃ）が同時に起こる。
【００７１】
工程（ｃ）が工程（ｂ）後に行われる特定の実施態様において、手順は、抗体および検出剤を一般に４５℃を超えない温度、好ましくは約４  ℃および約４０  ℃の間、さらに好ましくは、約２５  ℃  から約４０  ℃の間で、約０．５から４０時間の間、好ましくは約１から約２０時間の間インキュベートするか、または静置することを含むことができる。ある実施態様において、反応緩衝液は、反応またはその検出を干渉しないように選択される。したがって、実施態様は、これに限定されないが、約ｐＨ  ５から約ｐＨ  ９の間の緩衝液、たとえば、クエン酸塩緩衝液、リン酸塩緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、および酢酸塩緩衝液を包含する。
【００７２】
ある実施態様において、検出剤は、ＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体と特異的に結合できる分子である。いくつかの実施態様において、検出剤は、検出可能な標識を含む。ある好ましい検出剤は、ある免疫グロブリン、およびヒト免疫グロブリン配列と結合できる試薬（ヤギ抗ヒト抗体、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇなどを包含する）、たとえば、免疫グロブリンの定常領域を包含する。ＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する免疫グロブリンの定常部分が含まれる。ＭＹＯ−０２９は、ラムダ軽鎖を有するヒトＩｇＧ１であり、様々な実施態様において、検出剤は、ラムダ軽鎖を有するヒト免疫グロブリンを結合できる試薬を包含する。他の実施態様において、非ヒトＩｇＧ１免疫グロブリンと結合できる薬剤が含まれる。様々な実施態様において、検出は定性的であるか、または定量的である。いくつかの実施態様において、標識は、装置の力をかりずに視覚的手段により検出できる。
【００７３】
好ましい実施態様において、検出剤、たとえば、ＭＹＯ−０２９または成熟ＧＤＦ−８ダイマーはビオチニル化されている。たとえば、機能的、成熟ＧＤＦ−８タンパク質は、実施例１２において記載されるアミン特異性試薬でビオチニル化することができる。同様に、別の調製法において、潜在複合体中のＧＤＦ−８タンパク質は、米国特許公開番号２００４／０１４２３８２  Ａ１の実施例１のアッセイ法に従って、産生され、単離される。潜在的複合体は、周知技術および／または本発明において記載されている技術を用いてその後ビオチニル化される。
【００７４】
成熟ＧＤＦ−８は、たとえば、リシン残基上の第一アミン基のビオチニル化に予想外に敏感である。超ビオチニル化ＧＤＦ−８は、アミン特異性ビオチニル化試薬でビオチニル化される場合、ビオチンのないＧＤＦ−８と比較して活性が低いか、または不活性化されている。ビオチニル化後の機能的、成熟ＧＤＦ−８タンパク質を保持するために、アミン基上の成熟ＧＤＦ−８調製物中に組み入れられるビオチンの量は重要であることが判明した。たとえば、ＭＹＯ−０２９およびＡｃｔＲＩＩＢ結合活性は、超ビオチニル化調製物において減少する。したがって、ＧＤＦ−８ダイマー１モルあたり５モル未満のビオチンを有するアミンビオチニル化成熟ＧＤＦ−８調製物が好ましい。別の実施態様において、タンパク質をスルフヒドリル、カルボキシル、および／または  炭水化物上でビオチニル化することができる。光活性化に際して非特異的に結合するか、または反応する光反応性ビオチン化合物も利用できる。
【００７５】
本発明において提供されるある方法において、ＧＤＦ−８は、潜在複合体としてアミン特異性ビオチニル化試薬でビオチニル化され、その後、成熟ＧＤＦ−８が複合体から単離される。これらの方法において、成熟ＧＤＦ−８ダイマー中に組み入れられたビオチンは、生物学的活性を保持するために、たとえば、レセプター結合部位の不活性化を回避するために最適化される。ＧＤＦ−８タンパク質は、スルフヒドリル特異性ビオチニル化試薬を用いて、表面システイン残基（または表面チオール基）上でビオチニル化することもできる。さらに、たとえば、反応性アルデヒドを生成するための酸化的前処理およびビオチンヒドラジド試薬の使用を含む、炭水化物をビオチニル化する方法は、当該分野において公知であり、本明細書において記載されるタンパク質、たとえば成熟ＧＤＦ−８タンパク質であって、最適には修飾された形態であるものについて最適化することができる。さらに、たとえば、アスパラギン酸塩およびグルタミン酸塩残基によるビオチニル化を可能にするカルボキシル反応性ビオチニル化試薬および反応を使用できる。当業者には明らかなように、ビオチンのＧＤＦ−８ダイマーに対する最適モル比は、使用されるビオチニル化手順および試薬によって変わるであろう。たとえば、当業者は、少なくとも１つのＧＤＦ−８活性を保持しつつ、異なる、ビオチンのＧＤＦ−８に対する最適モル比を有するビオチニル化成熟ＧＤＦ−８タンパク質を生成するために、本明細書において記載された方法を公知ビオチニル化手順と組み合わせて使用して、活性なビオチニル化ＧＤＦ−８調製物を最適化する方法を理解するであろう。
【００７６】
さまざまなビオチニル化試薬が、ＧＤＦ−８潜在複合体をはじめとするタンパク質を有効に標識化することができる。反応におけるビオチン誘導体のＧＤＦ−８潜在複合体に対するモル比は、約１０、１５、２０、４０、または８０：１であり、試薬組成および濃縮反応時間、および温度は、反応中に組み入れられるビオチンの量を調節するために変えることができる。たとえば、塩および他の薬剤を任意に最適化することができる。ある実施態様において、成熟ＧＤＦ−８ダイマーをＧＤＦ−８のアミノ末端プロペプチド部分と関連してビオチニル化して、ビオチニル化反応の間の成熟ダイマーの不活性化を回避する。ビオチン誘導体はよく知られており、当該分野において入手可能である。ビオチンの修飾は、様々なスペーサーアーム、溶解度に影響を及ぼす修飾、および／または反応性基を含み、たとえば、ビオチン部分の開裂を可能にする。ビオチンのスクシンイミジルエステルおよびその誘導体、たとえば、水溶性スルホスクシンイミジルエステルを、たとえば、リシン残基上のＧＤＦ−８のビオチニル化に使用できる。たとえば、組み入れられたビオチンの量を定量するために、周知のアッセイおよびサイジング技術、たとえば、逆相高圧液体クロマトグラフィー、質量アッセイなどが使用される。さらに、たとえば、比色アッセイまたは蛍光アッセイによる市販のビオチン定量キットを利用できる（たとえば、ＥＺＴＭ  Ｂｉｏｔｉｎ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｐｉｅｒｃｅ、ＨＡＢＡ（２−（４’−ヒドロキシアゾ  ベンゼン）−安息香酸）を利用）。
【００７７】
さらなるビオチニル化法の例は、たとえば、ＧＤＦ−８潜在複合体を、１モルのＧＤＦ−８複合体に対して１５または２０モルのＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−Ｂｉｏｔｉｎ（Ｐｉｅｒｃｅ）の比で２時間、２〜８℃でビオチニル化することを含む（たとえば、米国特許公開番号２００４／０１４２３８２  Ａ１の実施例３参照）。０．５％ＴＦＡを用いてｐＨを下げることにより反応を停止することができ、その後、複合体をおよびＣ４  Ｊｕｐｉｔｅｒ  ２５０  ｘ  ４．６  ｍｍカラム（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）上クロマトグラフィーに付して、成熟ＧＤＦ−８をＧＤＦ−８プロペプチドから分離する。ＴＦＡ／ＣＨ３ＣＮ勾配で溶出されたビオチニル化成熟ＧＤＦ−８フラクションをプールし、濃縮し、ＭｉｃｒｏＢＣＡＴＭタンパク質アッセイ試薬キット（Ｐｉｅｒｃｅ）によるか、または他の周知の単離および濃縮技術を用いて定量する。
【００７８】
好ましい実施態様において、インビトロ結合アッセイは、ビオチニル化ＧＤＦ−８タンパク質捕捉剤を含み、ＧＤＦ−８タンパク質は、ビオチン部分の反応容器の表面上のアビジンとの相互作用により、反応容器の表面と接触する。いくつかの実施態様において、ビオチン部分の成熟ＧＤＦ−８タンパク質に対するモル比は、ビオチニル化成熟ＧＤＦ−８タンパク質において、約０．５：１から約４：１の間である。他の実施態様において、ビオチンのＧＤＦ−８ダイマーに対する平均比は、約５：１未満、約２：１未満、または約１：１未満である。ビオチンの成熟ＧＤＦ−８タンパク質に対する比は、活性なＧＤＦ−８調製物において、０：３のモル比の混合物であると測定され、分子の大部分は約１：１である。いくつかの実施態様において、ビオチニル化成熟ＧＤＦ−８調製物は、成熟ＧＤＦ−８ダイマー１モルあたり約１、２、３、４、または５モル未満のビオチンを含む。ビオチンの成熟ＧＤＦ−８タンパク質に対する平均または中央比は、たとえば、約０．５、０．７５、１、１．２５、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、７、８、または９、あるいはこの値より少ない。ビオチンの成熟ＧＤＦ−８タンパク質に対する比についてのモードは、たとえば、約１、２、３、４、または５、あるいはこの値より少ない。他の検出および捕捉剤もビオチニル化により標識することができる。たとえば、ビオチニル化ＭＹＯ−０２９は、たとえば、少なくとも１０：１、２０：１（または未満）、またはそれ以上の比までビオチニル化することができる。好ましい実施態様において、ビオチニル化成熟ＧＤＦ−８タンパク質調製物の平均モル比は、１モルの成熟ＧＤＦ−８ダイマーに対して約１から３モルの間のビオチンである。任意に、別の捕捉剤を使用することができる。
【００７９】
一つの実施態様において、ビオチニル化ＭＹＯ−０２９は、反応容器、たとえば、９６穴プレートの表面上に固定化されたＭＹＯ−０２９と結合する抗−ＭＹＯ−０２９抗体を検出するための検出剤である。同様にして、フォリスタチン、さまざまなＧＤＦ−８結合レセプター、アクチビン、またはＧＤＦ−８プロペプチドに対する抗体を検出するためのＥＬＩＳＡは、これらの物質およびそのそれぞれのビオチニル化体をＭＹＯ−０２９およびビオチニル化ＭＹＯ−０２９と置換することにより、これらの方法に含まれる。加えて、ＧＤＦ−８の阻害剤に対して形成される抗体を認識し、結合することができる任意の試薬を、使用可能な用量反応性シグナルを生成させるために単独で使用されるか、または他の試薬との組み合わせにおいて使用されるかにかかわらず、ＧＤＦ−８の阻害剤に対する抗体を検出するために使用できる。これらの試薬を直接結合アッセイ様式（特に、ヒト以外の起源のサンプルについて）または競合的様式（以下に記載）において用いることができる。
【００８０】
さらなる実施態様において、検出剤は、これもまたＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する（架橋）ことにより複合体を形成する抗体と特異的に結合することにより、複合体形成する。この架橋アッセイは、検体抗体の多価性により可能になる。ある実施態様において、サンプル中の標的抗体の存在または不在あるいはその含量は、標識活性を測定することにより評価され、これは、検出剤の標識化において用いられる標識剤に依存する。
【００８１】
いくつかの実施態様において、「直接」標識は、補助試薬を添加せずに検出可能なシグナルを自発的に生成できる特異的結合メンバーと結合または接合する任意の分子である。いくつかの例は、放射性同位元素（たとえば、１２５Ｉ、３Ｈ、１４Ｃ）、重金属、フルオロフォア（たとえば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質、フルオレセイン  イソチオシアネート、テトラメチルローダミンイソチオシアネート、１−Ｎ−（２，２，６，６−テトラメチル−１−オキシル−４−ピペリジル）−５−Ｎ−（アスパルテート）−２，４−ジニトロベンゼン）、色素（たとえば、フィコシアニン、フィコエリトリン、テキサスレッド、ｏ−フタルアルデヒド）、発光分子、たとえば、化学発光および生物発光分子、コロイド状金粒子、コロイド状銀粒子、他のコロイド状金属粒子、ヨーロピウム、ポリスチレン色素粒子、着色微粒子、たとえば、染料ゾル、および着色ラテックス粒子を包含する。多くのこのような物質は当業者に周知である。
【００８２】
ある場合において、標識は、酵素、たとえば、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ（たとえば、西洋ワサビペルオキシダーゼ）、グルコースオキシダーゼ、またはβ−ガラクトシダーゼであってよい。様々な実施態様において、特異的酵素とともに使用される基質は、対応する酵素の存在下での、色、蛍光、または発光における検出可能な変化の生成について選択される。酵素は、グルタルアルデヒドまたは還元的アミノ化架橋によりＧＤＦ−８調節剤と接合させることができる。しかしながら、容易に認識されるように、様々な異なる接合技術が存在し、当業者には容易に利用可能である。
【００８３】
特定の実施態様において、ビオチニル化および／または酵素標識検出剤、たとえば、抗体をＧＤＦ−８調節剤／抗体複合体に添加して、結合させる。過剰の試薬を洗い流し、適切な基体を含有する溶液を次いで反応容器に添加する。基質は酵素触媒反応を受け、その結果、分光光度アッセイにより測定可能な変化が起こり、この変化はサンプル中に存在する抗体の量を示す。
【００８４】
ペルオキシダーゼは、可溶性基質（たとえば、３，３’，５，５’テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、ｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、２，２’−アジノ−ジ［３−エチル−ベンズチアゾリン］スルホネート（ＡＢＴＳ）、パラニトロフェニルホスフェート、ルミノール、ポリフェノール、アクリジンエステル、およびルシフェリン）とともにインキュベートされた場合、前記基質において分光的に検出可能な発色または発光性変化をもたらす。典型的には、基質との一定のインキュベーション期間の後、反応をクエンチし（たとえば、酸性化による）、光学密度（吸光度）または発光を測定することにより結果を定量する。吸光度結果を発色反応の直線範囲におけるＯＤ値と比較することができ、発光免疫学的検定を相対的光単位（ＲＬＵ）で測定する。さらなる代替案として、結合および実用的な用量反応シグナルを生成させる試薬の任意の組み合わせを使用できる（たとえば、放射性標識剤、酵素／基質試薬、またはビオチン／アビジンを利用した検出増幅系）。
【００８５】
さらなる他の態様において、標識は、ビオチン、ハプテン、またはエピトープ標識（たとえば、ヒスチジン−タグ、ＨＡ−タグ（ヘマグルチニンペプチド）、マルトース結合タンパク質、ＡｖｉＴａｇ（登録商標）、またはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）であり、これは、ＧＤＦ−８調節剤複合体と結合した標識と相互作用する標識された検出剤の添加により検出できる。ビオチン−標識（ビオチニル化）検出剤は、続いて前記アビジン−酵素複合体および好適な発色または蛍光性基質とともにインキュベーションした後、そのアビジン−酵素、たとえば、アビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼの複合体との相互作用により検出できる。特定の実施態様において、ビオチニル化ＧＤＦ−８調節剤は、ヨーロピウムで標識されたストレプトアビジンでも検出できる。
【００８６】
ある実施態様の工程（ｄ）において、反応容器の表面と結合したＧＤＦ−８調節剤／抗体複合体は、標識のシグナルの定性的または定量的評価により検出される。数例において、標識は直接、たとえば、蛍光または発光により、あるいは基質の添加により間接的に測定される。他の例において、標識は追加の試薬とともにインキュベーションした後に測定される。標識がビオチンである実施態様において、アビジン複合体（たとえば、いくつかの好ましい実施態様において、西洋ワサビペルオキシダーゼ）をその後の工程で添加することができる。一つの実施態様において、アビジン複合体は固定化された検出剤と結合できる。過剰のアビジン複合体は洗い流される。酵素の基質を次に添加し、その結果、たとえば、色、蛍光、または発光において測定可能な変化が生じる。いくつかの実施態様において、西洋ワサビペルオキシダーゼの基質は、３，３′，５，５′−テトラメチルベンジジンである。
【００８７】
工程（ｃ）および（ｄ）における検出剤は、いくつかの実施態様において（たとえば、図１において示される実施態様において）、第二の標識されたＧＤＦ−８調節剤である。ＧＤＦ−８調節剤は、ＧＤＦ−８と特異的に結合する抗体、ＧＤＦ−８結合パートナーと特異的に結合する抗体、ＧＤＦ−８レセプター、ＡｃｔＲＩＩＢタンパク質、フォリスタチンドメイン含有タンパク質、フォリスタチンタンパク質、ＧＡＳＰ−１タンパク質、ＧＤＦ−８タンパク質、ＧＤＦ−８プロペプチド、非タンパク質様阻害剤、および小分子をはじめとする抗体であり得る。いくつかの実施態様において、検出剤は、最初に反応容器の表面上にある未標識ＧＤＦ−８調節剤と同じＧＤＦ−８調節剤である。好ましい実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤はＭＹＯ−０２９である。
【００８８】
ある実施態様において、本発明の方法は、フォリスタチン、さまざまなＧＤＦ−８結合レセプター、アクチビン、ＧＤＦ−８プロペプチド、または生体サンプル中の他のＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する生体サンプル中の抗体の検出を可能にする。他の実施態様において、この方法は、個体からの生体サンプルにおける、投与されたＧＤＦ−８調節剤に対する抗体の検出を可能にする。
【００８９】
工程（ｃ）および（ｄ）における検出剤は、いくつかの実施態様において（たとえば、図２において示されるように）、検出剤で標識されたＧＤＦ−８である。いくつかの好ましい実施態様において、検出剤はビオチンを含む。本発明の方法は、フォリスタチンと特異的に結合する生体サンプル中の抗体、さまざまなＧＤＦ−８結合レセプター、アクチビン、ＧＤＦ−８プロペプチド、または生体サンプル中の他のＧＤＦ−８調節剤の検出も包含する。他の実施態様において、この方法は、個体からの生体サンプルにおける投与された治療用ＧＤＦ−８調節タンパク質の検出を可能にする。
【００９０】
本発明は、第一ＧＤＦ−８阻害剤に対する個体の免疫応答を評価する方法を提供し、この方法は：（ａ）第一ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器の表面と接触させ；（ｂ）反応容器に生体サンプルを添加し；（ｃ）標識された第二ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器に添加し；（ｄ）前記表面と結合した、標識された第二ＧＤＦ−８阻害剤／抗体複合体を検出する工程を含み、ここにおいて、標識された複合体の検出は、第一ＧＤＦ−８阻害剤に対する免疫応答を示す。いくつかの好ましい実施態様において、第一ＧＤＦ−８阻害剤はＭＹＯ−０２９である。いくつかの好ましい実施態様において、第二のＧＤＦ−８阻害剤はＭＹＯ−０２９である。
【００９１】
さらに、ＧＤＦ−８調節剤に対する個体の免疫応答を評価する方法が提供される。一つの実施態様において、第一ＧＤＦ−８阻害剤に対する個体の免疫応答を評価する方法は：（ａ）ＧＤＦ−８阻害剤を反応容器の表面と接触させ；（ｂ）生体サンプルを反応容器に添加し；（ｃ）標識されたＧＤＦ−８タンパク質を反応容器に添加し；（ｄ）試験サンプル中の表面と結合した、標識されたＧＤＦ−８タンパク質の量を対照サンプルと比較することを含み、ここにおいて、標識された複合体の減少したレベルが検出されることは、ＧＤＦ−８阻害剤に対する免疫応答を示す。いくつかの好ましい実施態様において、第一ＧＤＦ−８阻害剤はＭＹＯ−０２９である。
【００９２】
レポーター遺伝子アッセイ
他の実施態様において、インビトロアッセイはレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）（たとえば、Ｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  １８：２５１−２５９（２００１）参照）である。ある実施態様において、ＲＧＡは：（ａ）反応容器中にレポーター遺伝子構造を含む宿主細胞を提供する工程（ここにおいて、前記構造は、ＧＤＦ−８−反応性制御エレメントおよびレポーター遺伝子を含む）；（ｂ）レポーター遺伝子の発現を活性化するために十分な量の成熟ＧＤＦ−８タンパク質を容器に添加する工程；（ｃ）レポーター遺伝子のＧＤＦ−８活性化を調節するために十分な量のＧＤＦ−８調節剤を工程（ｂ）の容器に添加する工程；（ｄ）生体サンプルを反応容器に添加する工程；および（ｅ）生体サンプルの存在下および不在下で細胞においてレポーター遺伝子発現を検出する工程を含む。いくつかの実施態様において、方法は、レポーター遺伝子の存在下で、色、発光、または蛍光を変える基質を添加するさらなる工程をさらに含む。
【００９３】
宿主細胞は、ヒト、哺乳動物  または他の動物からの真核細胞であってよい。好ましい実施態様において、宿主細胞は細胞系、たとえば、真核細胞系、哺乳動物細胞系、または癌細胞系、たとえば、横紋筋肉腫細胞系である。レポーター遺伝子構造は、トランスフェクション、エレクトロポレーションなどをはじめとする当該分野において公知の任意の手段により、一時的に、または安定的に宿主細胞中に導入することができる。レポーター遺伝子構造は、ＧＤＦ−８−反応性制御エレメント、たとえば、プロモーターおよび／またはエンハンサー配列、および前記制御エレメントと操作により結合したレポーター遺伝子（たとえば、酵素などの検出剤を発現できるもの）を含む（たとえば、米国特許公開番号２００３／０１３８４２２、および前記特許において記載されている参考文献を参照）。好ましい実施態様において、酵素は、たとえば、比色分析、蛍光、または発光分子への基質の変換を触媒し、レポーター遺伝子発現の量は、前記のように、基質の検出可能な生成物への変換を測定することにより測定される。
【００９４】
たとえば、ＧＤＦ−８の活性を示すために、ルシフェラーゼを発現するレポーターベクターｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２を使用するレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）が開発された。アッセイに添加されたＧＤＦ−８タンパク質の量を最適化のために滴定することができる。最大レポーター構造活性化の４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％を生じさせるために十分なＧＤＦ−８タンパク質の量が選択される。ＧＤＦ−８タンパク質は、たとえば、０．０５、０．１、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、または１，０００ｎｇ／ｍＬで添加される。一定量のＧＤＦ−８タンパク質を使用して、ＧＤＦ−８調節剤を滴定して、ＧＤＦ−８活性の調節の滴定を準備することができる。たとえば、ＧＤＦ−８調節剤（たとえば、ＭＹＯ−０２９）は、たとえば、０．５、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、５００、または１，０００ｎｇ／ｍＬから選択される濃度で試験することができる。好ましい実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤滴定は、アッセイにおける阻害の直線的範囲に及ぶ。ＧＤＦ−８調節剤の生体活性を阻害する抗体を特定するために、ＧＤＦ−８タンパク質活性を、たとえば、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％阻害するために十分な量の薬剤が反応に添加される。ＧＤＦ−８タンパク質による活性の少なくとも約５０％阻害をもたらすＭＹＯ−０２９の量が選択され、生体サンプルが反応中に滴定される。任意に、ＧＤＦ−８シグナルを約８０％阻害するＭＹＯ−０２９量を選択してもよい。たとえば、サンプル中の抗体の、レポーター遺伝子アッセイにおけるＧＤＦ−８調節剤の効果を克服する能力を特定するために、生体サンプルを次に１以上の量で添加することができる。好ましい実施態様において、薬剤は、アッセイに添加される前に、試験サンプルとともにプレインキュベートされる。添加される生体サンプルの量を変えるために、たとえば、約１：４、１：５、１：８、１：１０、１：１５、１：２０、１：２５、１：３０、１：３５、１：４０、１：４５、および／または１：５０の希釈度が用いられる。任意に、生体サンプルは前記のように濃縮または分画することができる。
【００９５】
細胞を次いで、１０  ｎｇ／ｍＬ  ＧＤＦ−８の有無両方で、たとえば、グルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリン、および１  ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミンを含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地中試験生体サンプルの有無両方で、６時間３７℃で処理する。ある実施態様において、ＧＤＦ−８調節剤対照は、約１０ｐＭ〜５０μＭの濃度を用いて平行して実験される。濃度の例は、１０ｐＭ、５０ｐＭ、１００ｐＭ、１ｎＭ、１０ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、５００ｎＭ、１μＭ、５μＭ、１０μＭ、および５０μＭのＧＤＦ−８調節剤を包含する。好ましい実施態様において、試験サンプル中のＧＤＦ−８調節剤の量を、既知量の薬剤の対照滴定と比較し、かくして定量化する。ルシフェラーゼは、周知の技術を用いて処理された細胞において定量することができる。別法として、ＧＤＦ−８調節に対して反応性であるレポーター構造であって、任意にルシフェラーゼ以外の検出マーカーを含んでもよいものを用いることができる。
【００９６】
本開示は、標的ＧＤＦ−８調節剤と結合できる抗体を検出するための好ましい実施態様について言及しているが、本発明の方法を用いて様々な標的物質に対する抗体を検出できると理解される。同様に、本発明の開示は、診断用または治療用生成物のインビボ投与に関連したヒトにおけるアンチグロブリン産生の検出および／またはモニタリングに関するが、この方法は他の用途および種における使用にも適用できると理解される。
【００９７】
実施例
【実施例１】
【００９８】
ビオチニル化ＭＹＯ−０２９でＭＹＯ−０２９に対する抗体を検出するためのアッセイ
ＧＤＦ−８調節剤、たとえば、ＭＹＯ−０２９に対する免疫応答のキャラクタライゼーションにおいて、３つのアッセイ：スクリーニング、滴定、および特異性アッセイを行うことができる。陽性の結果（たとえば、ＭＹＯ−０２９に対する免疫応答の検出）を確認するためのプロトコルは、まず、スクリーニングアッセイ様式において全てのサンプルを試験することを含む。カットポイントよりも低いＯＤを生成するスクリーニング陰性サンプルは、陰性として記載され、さらに試験されない。スクリーニング陽性サンプル、すなわち、カットポイント以上のＯＤを生成するサンプルは続いて滴定および特異性アッセイにおいて試験される。
【００９９】
１つの抗−ＭＹＯ−０２９抗体酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）は、スクリーニング、滴定および特異性アッセイのために開発された具体例である。この実施態様は、中和ＧＤＦ−８調節抗体ＭＹＯ−０２９に対する抗体を検出するために設計された架橋アッセイである。抗−ＭＹＯ−０２９抗体ＥＬＩＳＡ法は、ラット、サル、マウス、ウサギ、およびヒト血清サンプルについて行われてきた。このアッセイにおいて、ＭＹＯ−０２９をマイクロタイタープレートのウェル上に吸着させる。ビオチニル化ＭＹＯ−０２９を希釈された血清サンプルとともに同時インキュベートして、ＧＤＦ−８調節剤特異的免疫グロブリンを吸着されたＭＹＯ−０２９およびビオチニル化されたＭＹＯ−０２９間で架橋させ、アッセイに添加する。架橋したビオチニル化ＭＹＯ−０２９は、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）ペルオキシダーゼ基質が添加されると、プレートのウェル中に着色溶液を生成するアビジン−西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合体により検出される。各ウェルのＯＤは、結合したビオチニル化ＭＹＯ−０２９の量に正比例し、分光光度アッセイにより決定される。
【０１００】
正および負の対照を各プレートで実験して、アッセイ性能をモニターする。サンプルのＯＤをプレートのカットポイントＯＤと比較して、ＭＹＯ−０２９について特異的な抗体が存在するかどうかを究明する。カットポイントＯＤは、負の対照ＯＤの平均の２倍として定義される。ヒトおよびウサギ血清について、カットポイント１／ＯＤは、負の対照の１／ＯＤ（正常なヒトまたは正常なウサギ血清であって、それぞれ１：８に希釈されたもの）の平均の１．２倍として定義される。サンプルをまず、１：８および１：１６の希釈度でスクリーニング様式において試験する。カットポイント以上のＯＤを生成する任意のサンプルを滴定様式（サンプルを１：８から出発して１：２に連続的に希釈）において再アッセイして、力価を得る。抗体価は、カットポイントＯＤと等しいＯＤを生成するサンプルの希釈度の逆数として定義される。この力価の対数を記載する。正の結果を特定し、ＭＹＯ−０２９の抗体の特異性を確認するために、特異性アッセイを行うことができる。滴定様式において陽性であるサンプルを、ＭＹＯ−０２９でコーティングされていないプレート（コーティング緩衝液のみをウェルに添加）上でのＥＬＩＳＡにおいて試験する。
【０１０１】
滴定様式において陽性であり、特異性様式において陰性であるサンプルは、次のガイドラインに従って抗−ＭＹＯ−０２９抗体について陽性であると確認される：１）スクリーニング陰性サンプルは、陰性であると記載され、さらに試験されない；２）スクリーニング陽性サンプルは、続いて滴定および特異性ＥＬＩＳＡにおいて試験される；３）滴定陽性サンプルの最終サンプル結果は、特異性試験結果に依存する；４）特異性陰性サンプルは陽性（下記参照）であると見なされ、一方、特異性陽性サンプルは、特異性結果の大きさによって陽性であり得る。
【実施例２】
【０１０２】
ビオチニル化ＭＹＯ−０２９を有するＭＹＯ−０２９に対する抗体についてスクリーンするためのアッセイ法
生体サンプルをまず、この実施例において記載されるスクリーニングアッセイ様式において試験する。９８穴マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（高結合、Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルを、ウェルあたり１００  μｌのコーティング溶液（１００ｍＭ重炭酸塩緩衝液中０．５  μｇ／ｍＬ  ＭＹＯ−０２９、ｐＨ  ９．６）でサンプルアッセイの前日にコーティングした。プレートをフィルムで覆い、２〜８℃で一夜（１６−２０時間）インキュベートした。翌日、プレートを、自動プレート洗浄機を用い、３００  μｌ／ウェルのＴＨＳＴ洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１．０  ｍＭグリシン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含有）で２回洗浄した。
【０１０３】
ブロッキング緩衝液（ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ  ＋４％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳；各ウェルあたり２００  μｌ）を次いで添加し、プレートを密封フィルムで覆い、室温で１．５〜３．０時間インキュベートした。プレートを次いで洗浄緩衝液（３００  μｌ／ウェル）で４回洗浄し、２回目の洗浄後、プレートを反転させた。洗浄されたプレートをその後直ちにアッセイにおいて使用するか、または密封し、２〜８  ℃で、第１日をブロッキングの日として、最高４日まで保存した。
【０１０４】
ヒト血清サンプルを室温で解凍し、よく混合した。まず、ＰＢＳＴ（ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ  ＋０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標））中１：２５の希釈、次にＰＢＳＴ＋４％（ｖ／ｖ）正常ヒト血清中で１：３希釈を行った。サンプル溶液（５０  μｌ／ウェル）をプレートウェルに重複して移した。ビオチニル化ＭＹＯ−０２９（実施例１２参照）をプレートウェルのそれぞれに添加した（５０  μｌ／ウェル）。（正および負の対照は、次の実施例においてさらに説明する。）プレートをプレート密封フィルムで覆い、プレートシェーカー上で２時間±１０分間、室温でインキュベートした。プレートを次いで３００  μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で４回洗浄し、２回目の洗浄後にプレートを反転した。
【０１０５】
ＰＢＳＴで最終希釈度１：５０，０００（１００  μＬ／ウェル）に希釈されたアビジンＤ−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を次いでプレートウェルのそれぞれに添加した。プレートを覆い、プレートシェーカー上、室温で１時間±１０分間インキュベートした。プレートを次いで洗浄緩衝液（３００  μＬ／ウェル）で６回洗浄し、３回目の洗浄後、プレートを反転させた。
【０１０６】
室温で、西洋ワサビペルオキシダーゼ基質ＴＭＢ（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒａｎｄａｌｌｓｔｏｗｎ、ＭＤ））の溶液を次いで、プレートの各ウェルに添加した（１００  μｌ／ウェル）。プレートを暗所、室温で約１２±１分間インキュベートした後、０．１８Ｍ硫酸（１００  μｌ／ウェル）をプレートのウェルに基質添加と同じ順序で添加することにより反応をクエンチした。
【０１０７】
４５０  ｎｍの波長でのサンプルのＯＤを、プレートのカットポイントＯＤと比較し、ＭＹＯ−０２９に対して特異的な抗体が存在するかどうかを究明した。カットポイントＯＤは１：２５に希釈された正常なヒト血清である負の対照の平均の１．５倍として定義される。４５０ｎｍでの吸光度を、反応のクエンチ後３０分以内で、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ  ２５０プレートリーダーで測定した。
【０１０８】
アッセイのために、負の対照の平均ＯＤは＜０．１５０である。平均対照価は、実施例７の式を用いて、プレートカットポイントＯＤ値に基づいて決定される（カットポイントは、負の対照ＯＤの平均×１．５として定義される）。
【０１０９】
スクリーニング陰性サンプルであって、カットポイントよりも低いＯＤを生成するサンプルは、陰性として記載され、対数力価＜１．４０であり、さらに試験されない。スクリーニング陽性サンプル（カットポイント以上のＯＤを生成するサンプル）は、その後、滴定および特異性検定において試験される。
【実施例３】
【０１１０】
対照
負の対照
概論−−プールされた正常ヒト血清（たとえば、Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ  Ｉｎｃ．（Ｈｉｃｋｓｖｉｌｌｅ、ＮＹ）から入手）を負の対照として使用した。室温で血清をＰＢＳＴで１：２５に希釈することにより、負の対照溶液を実験当日に調製した。
【０１１１】
アッセイ内変動−−負の対照溶液のＯＤおよびカットポイント値のアッセイ内変動（ＣＶ）を、各プレート上の１６の複製ウェルのアッセイにより決定した。試験の３日を評価した。各プレートについて得られたデータを、内部アッセイ精度結果を得るために独立してアッセイした。１、２、および３日から得られたカットポイント値の平均は、それぞれ０．０８７、０．０７７、および０．０７２である。対応するＣＶ値は１８．７、６．４、および３．７％である。負の対照ＯＤ値のＣＶ（１プレートあたり１６回複製）は２．２％から１３．３％の間の範囲であった。
【０１１２】
アッセイ間変動−−負の対照溶液のＯＤおよびカットポイント値のアッセイ間変動を決定した。平均カットポイントＯＤおよび対応するＣＤ値は、それぞれ０．０８９および２５．０％であることが判明した。負の対照の平均ＯＤおよび対応するＣＶ値は、それぞれ０．０６０および２５．０％であることが判明した。各プレート上の負の対照の１６ＯＤ複製のＣＶ値は２．２％から１３．３％の間の範囲であった。
【０１１３】
正の対照
概論−−親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｓｂｕｒｇ、ＭＤ）をＭＹＯ−０２９架橋ＥＬＩＳＡアッセイの正の対照として使用した。１  ｍｇのヤギ抗ヒトＩｇＧを０．５ｍＬ精製水および０．５ｍＬグリセロールの混合物中で水和することにより、正の対照ストック溶液を実験当日に調製した。ストック溶液をＰＢＳ  ＋０．１％  ＢＳＡ中５００  ｎｇ／ｍＬ、またはＰＢＳ  ＋０．１％  ＢＳＡ中５００  ｎｇ／ｍＬに希釈した。
【０１１４】
希釈ライブラリー−−正の対照溶液について、希釈ライブラリー試験を行った。まず１：２５、１：７５、１：２２５、１：６７５、および１：２０２５の正の対照の出発希釈度で５つの試験溶液を調製した。結果から、試験された５つの正の対照滴定について計算できる力価の全ての間のＣＶは１．６％であることが示された。試験において検出される非直線性の傾向はなかった。
【０１１５】
アッセイ内変動−−正の対照溶液のＯＤおよび力価値についてアッセイ内変動を決定した。正の対照を同じプレート上で複数回試験した（内部アッセイ）。各プレートはそれぞれ５つの個々の正の対照滴定を含有していた。１日に合計４プレート、２日に２プレート、３日に４プレートを用いて試験を行った。アッセイ内変動を３つの別個の日で評価した。各プレートについて得られた値を、アッセイ内精度結果を得る順序と独立してアッセイした。
【０１１６】
１日ごとに試験された全てのプレートから得られたデータを用いて、正の対照の最大ＯＤおよび力価値のプレート間変動を決定した。力価対数について得られたアッセイ内（プレート内）ＣＶ値は２．２％以内であった。１、２、および３日に試験された全てのプレート全体についての個々の正の対照の力価の対数を用いて得られたＣＶ値はそれぞれ１２．４、１．７、および１．５％であった。１、２、および３日の試験された全プレートの正の対照により得られた最大ＯＤについて得られたＣＶ値は、それぞれ１８．９、２．８、および３．２％であった。
【０１１７】
４プレート全体の正の対照の各希釈度でのＯＤ値の平均ＳＤおよびＣＶをアッセイ内評価の３日についてアッセイした。ＣＶ値は２．８％から４．７％の範囲であった。正の対照滴定の滴定アッセイを行った。ｐｒｏｚｏｎｅ効果の証拠はなかった。
【０１１８】
アッセイ間変動−−正の対照ＯＤ値および力価のランダムなアッセイ間変動を決定するために、対照溶液を６日にわたって２０プレートについてアッセイした。各プレートについて、最終データアッセイの間、正の対照の１組の重複試験（各プレート上の同じ位置）を使用した。正の対照溶液について、平均力価対数および対数力価ＣＶ値は、それぞれ３．３７および６．６％であった。平均最大ＯＤおよび最大ＯＤ  ＣＶ値はそれぞれ２．１３７および１１．９％であった。
【０１１９】
処方−−正の対照希釈標準ストック溶液（５００ｎｇ／ｍＬ）を評価のために０．１％  ＢＳＡを含む脱イオン水中でまず調製した。妥当性検証実験はすべて、脱イオン水＋０．１％  ＢＳＡ中で調製された希釈標準ストック溶液を用いて行った。ＰＢＳが所望の希釈剤であるので、正の対照希釈標準ストック溶液を次いで０．１％  ＢＳＡを有するＰＢＳ中で調製した。同じプレート実験で２つの異なるストック溶液から調製された正の対照をアッセイすることにより、両溶液の対数力価および最大ＯＤの比較を行った。正の対照の対数力価において有意な差は観察されなかった（データは省略）。最大ＯＤおよび力価（数値）の差は、アッセイ変動の範囲内と見なすことができる。希釈標準ストック溶液は、ＰＢＳ＋０．１％  ＢＳＡ中で調製され、−７０℃で最高１年まで保存される。
【実施例４】
【０１２０】
未暴露集団における反応性
実施例１の手順を用いて、ＯＤの統計的分散をアッセイし、統計に基づくアッセイカットポイント値を決定するために、２５の個々の正常血清サンプルを３日にわたって３回試験した（ｎ＝７５結果）。
【０１２１】
３日にわたってアッセイされた２５サンプルのサンプルＯＤの平均値は０．０５８であり、これは同じプレート上でアッセイされた負の対照の平均ＯＤ値と同じである。このことは、負の対照性能は、正常な個々のサンプル性能の代表例であり、プレート間のカットポイントＯＤを標準化するために使用できることを示す。したがって、個々のプレートのカットポイントは、プレートの負の対照平均ＯＤに、２５の正常サンプルの推定９５パーセントに基づいて導かれる倍数ｎをかけることにより計算できる。
【０１２２】
９５％の母数によらない概算は、ＯＤ値の得られた集団をアッセイし、値（０．０８１）の９５％含むために十分高いＯＤを決定することによりなされた。サンプルの平均の９５％と負の対照ＯＤの比は１．３９であった。この評価は短期間（連続３日）にわたり試験された限定されたサンプル組を使用して行われたので、複数の場所から集められ、長期間にわたってアッセイされる臨床試験サンプルの性能における変動はさらに広範囲であると予想される。実験の予想されるさらに高い変動を考慮して、また簡便のために、プレートカット値の計算に用いられる倍数ｎを１．３９から１．５に丸めた。
【実施例５】
【０１２３】
アッセイ感度
正の対照溶液を調製するために親和性精製ヤギ抗ヒトＩｇＧを使用した。よって、アッセイの感度を当初の正の対照試薬濃度およびその力価に基づいて計算した。アッセイにおいて、正の対照試薬の出発濃度は、５００ｎｇ／ｍＬであった。ＰＢＳ＋０．１％ ＢＳＡ中で調製された正の対照溶液について行われた評価の間に得られた平均力価値は４６８０であった。アッセイ感度は次の式：
正の対照溶液の出発濃度
感度＝―――――――――――――
負の対照の力価数
を用いて１０７ｐｇ／ｍＬ（５００ｎｇ／ｍＬ／４６８０）であると決定された。
【実施例６】
【０１２４】
薬剤干渉の試験
正の対照溶液（１：２５）を様々な量のＭＹＯ−０２９でスパイクして、０．０１、０．１、１．０、および１０μｇ／ｍＬの最終薬剤濃度を得た後、ＰＢＳＴ中で３倍希釈した（１：７５、１：２２５、１：６７５、１：２０２５、１：６０７５、１：１８２２５、および１：５４６７５）。力価および最大ＯＤを表２に示す。
【０１２５】
【表２】
2008537777.tif 000004
結果は、正の対照の性能は０．１μｇ／ｍＬ以上のサンプル中のＭＹＯ−０２９の濃度で有意に影響を受けることを示した。最大ＯＤにおける減少が、０．０１μｇ／ｍＬ濃度のＭＹＯ−０２９について観察された。抗体応答の不均一性のために、サンプルにおいて見られるＭＹＯ−０２９の干渉は、正の対照について検出される干渉と異なり得る。
【実施例７】
【０１２６】
滴定アッセイ
サンプルをまずスクリーニング様式において１：２５および１：７５の希釈度で試験した。カットポイント以上のＯＤを生成する任意のサンプルを滴定および特異性アッセイにおいて再アッセイする（もしカットポイント以上のＯＤを生成するサンプルが投与後サンプルであるならば、対応する投与前サンプルとともに）。サンプルの滴定および特異性アッセイは、同時に、または連続して行うことができる。抗体価を得るために、サンプルをまず１：２５に希釈し、次いで連続して、ＰＢＳＴ＋４％ヒト血清で１：２５から１：３に希釈して、１：５４，６７５の希釈度を得る。各サンプルを重複してアッセイする。アッセイは本質的に実施例２に記載されるようにして行われる。
【０１２７】
所定のサンプルの力価は、カットポイントと等しいＯＤ値を生成するサンプルの希釈度の逆数として定義される。以下の式１を用いた内挿により力価数を計算し、式中、ＯＤｃｐはカットポイントＯＤであり、ＯＤ１は希釈系列におけるカットポイントＯＤより高いサンプルＯＤ値であり、ＯＤ２は希釈系列におけるカットポイントＯＤより低いサンプルＯＤ値であり、ＤｉｌｎＯＤ１はサンプルのＯＤ１での希釈度の逆数であり、ＤｉｌｎＯＤ２はサンプルのＯＤ２での希釈度の逆数である。
【数１】
2008537777.tif 000005
【０１２８】
力価数の対数値を最終結果として記載する。
【数２】
2008537777.tif 000006
【０１２９】
たとえば、以下の表３に示されるラット血清サンプルのアッセイにおいて、ＯＤｃｐ  ＝  ０．２５２、Ｄｉｌｎ  ＯＤ１  ＝  ６７５、Ｄｉｌｎ  ＯＤ２  ＝  ２０２５、未知サンプルの力価の対数は３．２９である。Ｗａｔｓｏｎ  ＬＩＭＳシステムを用いて未処理データをアッセイした。
【０１３０】
【表３】
2008537777.tif 000007
【実施例８】
【０１３１】
特異性アッセイ
サンプルをまずスクリーニング様式において、１：２５および１：７５の希釈度で試験した。正のサンプルを試験した。ＭＹＯ−０２９の抗体の特異性を確認するために、スクリーニングまたは滴定様式において陽性であるサンプルを、ＭＹＯ−０２９でコーティングされていないプレート（コーティング緩衝液のみをウェルに添加）上で試験する。  
【０１３２】
サンプルを連続してＰＢＳＴ＋４％ヒト血清で１：２５から１：３に希釈して、１：５４，６７５の希釈度を得る。各サンプルを重複してアッセイする。アッセイは実施例１において記載されたようにして行われる。９６穴マクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルを各ウェルあたり１００μｌのコーティング緩衝液（１００ｍＭ重炭酸塩緩衝液、ｐＨ  ９．６）でサンプルアッセイ前の日にコーティングした。プレートを密封フィルムで覆い、２〜８  ℃で一夜（１６〜２０時間）インキュベートした。翌日、プレートを３００  μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で、自動プレート洗浄機を用いて２回洗浄した。
【０１３３】
ブロッキング緩衝液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ  ＋４％（ｗ／ｖ）脱脂粉乳；  ２００  μｌ／ウェル）を次いで添加し、プレートを密封フィルムで覆い、室温で１．５〜３．０時間インキュベートした。プレートを次いで洗浄緩衝液（３００  μｌ／ウェル）で４回洗浄し、２回目の洗浄後にプレートを反転させた。洗浄されたプレートをその後、アッセイにおいて直ちに使用するか、または１日をブロッキングの日として、２〜８  ℃で最高４日まで保存した。
【０１３４】
サンプルを室温で解凍し、よく混合した。ＰＢＳＴ（ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ＋０．０５％（ｗ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中１：２５の初期希釈度、その後のＰＢＳＴ＋４％（ｖ／ｖ）正常ヒト血清中１：３の希釈度を調製した。ビオチニル化ＭＹＯ−０２９をプレートウェル（５０  μｌ／ウェル）のそれぞれに重複して添加した。（正および負の対照は以下の実施例においてさらに説明する。）サンプル溶液（５０  μｌ／ウェル）を重複してプレートウェルに移した。プレートを密封フィルムで覆い、プレートシェーカー上、２時間±１０分間、室温でインキュベートした。プレートを次いで３００  μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で４回洗浄し、２回目の洗浄後にプレートを反転させた。
【０１３５】
アビジンＤ−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）溶液（１００  μＬ／ウェル）を次いでプレートウェルのそれぞれに添加した。プレートを覆い、プレートシェーカー上、室温で１時間±１０分間インキュベートした。プレートを次いで洗浄緩衝液（３００  μＬ／ウェル）で６回洗浄し、３回目の洗浄後にプレートを反転させた。
【０１３６】
室温で、西洋ワサビペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ基質；  ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｒａｎｄａｌｌｓｔｏｗｎ、ＭＤ））の溶液を次いでプレートの各ウェルに添加した（１００  μｌ／ウェル）。プレートを暗所、室温で約１２±１分間インキュベートした後、０．１８  Ｍ硫酸（１００  μｌ／ウェル）を基質添加と同じ順序でプレートウェルのそれぞれに添加することにより、反応をクエンチした。
【０１３７】
サンプルのＯＤをプレートのカットポイントＯＤと比較し、滴定アッセイから得られたシグナルがＭＹＯ−０２９について特異的な抗体を検出するかどうかを究明した。カットポイントＯＤは負の対照の平均の１．５倍として定義される。４５０ｎｍでの吸光度を反応のクエンチ後３０分以内に測定した。
【０１３８】
滴定−陽性のサンプルの最終サンプル結果は、特異性結果に依存する（たとえば、特異性−陰性のサンプルは陽性と見なされる）。滴定様式において陽性であり、特異性様式において陰性であるサンプルは、抗−ＭＹＯ−０２９抗体について陽性であると確認される。特異性陽性サンプルは、特異性結果の大きさに応じて陽性と見なされるか、または見なされない。
【実施例９】
【０１３９】
サンプル評価
滴定および特異性アッセイ結果を次の表に基づいて評価する。滴定アッセイの繰り返しがもとの結果と一致しない結果を生じる場合、初期設定は当初の結果である。
【０１４０】
【表４】
2008537777.tif 000008
【０１４１】
ＭＹＯ−０２９に対する抗体が対象中に存在するかどうかの究明は、投与前および投与後サンプル結果の比較に基づいて行われる。投与前サンプルが陰性であり、対応する投与後サンプルが陽性であるならば、対象は免疫応答に対して陽性であると見なされる。投与前および投与後サンプルがどちらも陽性であるならば、対象は、投与後サンプル力価が、対応する投与前サンプルについて測定された力価値よりも少なくとも１希釈度（３倍）高い場合に、免疫応答について陽性であると言われる。
【実施例１０】
【０１４２】
ビオチニル化ＧＤＦ−８でのＭＹＯ−０２９に対する抗体の検出
ビオチニル化ＧＤＦ−８のＭＹＯ−０２９に対する結合を阻害する抗体を検出するために、９６穴マイクロタイターＥＬＩＳＡプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルを、各ウェルあたり１００μｌのコーティング溶液（１００  ｍＭ重炭酸塩緩衝液中６μｇ／ｍＬ  ＭＹＯ−０２９、ｐＨ  ９．６）で、サンプルアッセイの前の日にコーティングした。別法として、０．５  μｇ／ｍＬのＭＹＯ−０２９を使用した。プレートを密封フィルムで覆い、２〜８  ℃で一夜（１６〜２２時間）インキュベートした。翌日、プレートを、３００  μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で、自動プレート洗浄機を用いて２回洗浄した。
【０１４３】
ブロッキング緩衝液（ＤｕｌｂｅｃｃｏのＰＢＳ＋１％（ｗ／ｖ）ウシ血清アルブミン；  ２５０μｌ／ウェル）を次いで添加し、プレートを密封フィルムで覆い、室温で１．５〜３．０時間インキュベートした。プレートを次いで３００μｌ／ウェルのＴＨＳＴ洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ  ８．０、１．０  ｍＭグリシン、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、および０．０５％（ｖ／ｖ）  Ｔｗｅｅｎ  ２０（登録商標）を含有）で４回洗浄し、２回目の洗浄後にプレートを反転させた。洗浄されたプレートをその後、アッセイにおいて直ちに使用するか、または１日をブロッキングの日と定めて、２〜８  ℃で最高４日まで保存した。
【０１４４】
サンプルを室温で解凍し、よく混合した。ＴＨＳＴ中１：８の初期希釈、その後ＴＨＳＴ中で１：２希釈を行った。サンプル溶液（１００  μｌ／ウェル）をプレートウェルに重複して移した。別法として、ＰＢＳＴ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ＰＢＳ  ０．０５％  ｗ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ  ２０）中１：２５の初期サンプル希釈、続いて１：３希釈を行い、５０  μｌ／ウェルを移した。
【０１４５】
正の対照ストック溶液（ウサギ抗−ＭＹＯ−０２９抗血清、正常ヒト血清中に１：６．２５希釈度でスパイク）を解凍し、ＴＨＳＴ中１：８に希釈した。２倍の連続希釈をその後、１２．５％のプールされた正常ヒト血清を含有するＴＨＳＴ中で行い、次の正の対照希釈の組を得た：１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、１：１０２４。正の対照溶液（１００  μｌ／ウェル）をプレートウェルに重複して移した。プレートを密封フィルムで覆い、プレートシェーカー上で２時間±１０分間、室温でインキュベートした。プレートを次いで３００  μｌ／ウェルＴＨＳＴ緩衝液で４回洗浄し、２回目の洗浄後にプレートを反転させた。
【０１４６】
ビオチニル化ＧＤＦ−８（実施例１２参照）を次いでプレートウェルのそれぞれに添加した（１００  μｌ／ウェルの３５ｎｇ／ｍＬ溶液）。プレートをプレート密封フィルムで覆い、プレートシェーカー上、１．５時間±１０分間室温でインキュベートした。プレートを３００μｌ／ウェルの洗浄緩衝液で４回洗浄し、２回目の洗浄後にプレートを反転させた。
【０１４７】
アビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）溶液（１００  μＬ／ウェル）をつぎにプレートウェルのそれぞれに添加した。アビジンＤ−ＨＲＰ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）を代わりに使用した。プレートを覆い、プレートシェーカー上、室温で４０分間または１時間インキュベートした。プレートを次いで洗浄緩衝液（３００  μＬ／ウェル）で４回洗浄し、２回目の洗浄後にプレートを反転させた。
【０１４８】
室温で、ペルオキシダーゼ基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ基質；  ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｒａｎｄａｌｌｓｔｏｗｎ、ＭＤ）をプレートの各ウェルに添加した（１００  μｌ／ウェル）。プレートを暗所、室温で約１０分間インキュベートした後、０．１８  Ｍ硫酸（１００  μｌ／ウェル）を基質添加と同じ順序でプレートウェルのそれぞれに添加することにより、反応をクエンチした。光学密度を４５０  ｎｍで分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）でクエンチの３０分以内に読み取り、ＯＤをアッセイ用に１／ＯＤに変換した。
【実施例１１】
【０１４９】
力価の測定およびデータアッセイ
前記スクリーニングアッセイ（実施例１０）において陽性であるサンプルについて、サンプルをＴＨＳＴ中１：２に希釈し、続いて、１２．５％のプールされた正常ヒト血清を含有するＴＨＳＴ中７回１：８に連続希釈して、１：８、１：１６、１：３２、１：６４、１：１２８、１：２５６、１：５１２、および１：１０２４の最終希釈度を得た。所定のサンプルの力価は、カットポイントに等しい１／ＯＤ値を生成するサンプルの希釈度の逆数として定義される。アッセイのカットポイントは負の対照の１／ＯＤ値の平均の１．２倍として定義され；正常な個人から得られる血清サンプルのパネルにおいて観察される１／ＯＤ値の９５％に基づく。力価数は、以下の式を用いた内挿により計算され、式中、ＯＤｃｐはカットポイントＯＤであり、ＯＤ１は希釈系列におけるカットポイントＯＤよりも高いＯＤ値であり、ＯＤ２は希釈系列におけるカットポイントＯＤより低いＯＤ値であり、ＤｉｌｎＯＤ１はＯＤ１でのサンプル希釈度の逆数であり、およびＤｉｌｎＯＤ２はＯＤ２でのサンプル希釈度の逆数である。
【数３】
2008537777.tif 000009
【０１５０】
滴定および特異性アッセイ結果を、次の表を用いて評価した。滴定アッセイの繰り返しがもとの結果と一致しない結果をもたらす場合、初期設定は当初の結果である。
【０１５１】
【表５】
2008537777.tif 000010
【実施例１２】
【０１５２】
ビオチニル化
ＧＤＦ−８を次のようにしてビオチニル化した。完全長ＧＤＦ−８をｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ＣＨＯ細胞培養バイオリアクタープロセスにおいて発現させ、ＧＤＦ−８の潜在複合体形態を提供した。正常フロー微細孔濾過、次いで濃縮、および接線流限外濾過を用いて透析を用いて細胞培養収穫物を清澄化した。この濃縮プールを次いでＮｉ２＋−ＮＴＡ固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）にかけ、ここで、ＧＤＦ−８複合体が捕捉される。５０  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３００  ｍＭ  ＮａＣｌ、２０−５００  ｍＭイミダゾール直線勾配で５カラム容積にわたって溶出が起こった。得られたピークは次いで、透析による緩衝液交換を受け、ＩＭＡＣ−由来のイミダゾールの除去およびビオチニル化反応のために適切な緩衝液の導入が可能になる。
【０１５３】
潜在複合体調製物を次いでビオチニル化した。１４：１の標的スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン対ＧＤＦ−８複合体モル比を反応において使用した。たとえば、１０：１、１５：１、および２０：１の試薬対基質比も試験した。固体ビオチン試薬（ＥＺ−ｌｉｎｋ  Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ−ビオチン、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に２００  ｇ／Ｌで溶解させた後、ＧＤＦ−８複合体サンプルに添加した。反応を、１００  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１５０  ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ  ７．２中１．５ｇ／Ｌ未満の複合体濃度、４℃で、１２０分間行った。反応混合物を穏やかに反応の開始時に混合し、反応の経過中は光を遮断した。０．５％（ｖ／ｖ）エタノールアミンまたは５．０％（ｖ／ｖ）  １  Ｍ  Ｔｒｉｓを添加することにより、反応を停止させた。
【０１５４】
このビオチニル化ＧＤＦ−８複合体を次いで、低ｐＨ、高カオトロープ濃度緩衝液（６０００  ｍＭ尿素、３００ ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ ｍＭ  Ｈ３ＰＯ４、ｐＨ  ＝  ２．５）中への透析により緩衝液交換した。複合体の解離が低ｐＨでプロトン化とともに起こった。この緩衝液において、複合体は解離し、プロペプチドおよび成熟ダイマー中に可溶化する。さらに、遊離ビオチンが透析の間に除去される。この濃縮プールを次いで高性能サイズ排除クロマトグラフィーにかけ、ここで、ＧＤＦ−８の成熟ダイマー形態がプロペプチドおよび残存モノマーから分離される。
【０１５５】
ＧＤＦ−８のビオチニル化、成熟ダイマー形態を含むこのフラクションを次にブチル高性能逆相クロマトグラフィー上で、０−９０％（ｖ／ｖ）  ＣＨ３ＣＮ、０．１％（ｖ／ｖ）  ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、ｐＨ  ＝  ２．０直線状勾配を５カラム容積にわたって使用して、さらに処理した。この工程からのピークを、低ｐＨ処方緩衝液（０．１％（ｖ／ｖ）  ＣＦ３ＣＯ２Ｈ、ｐＨ  ＝  ２．０）中への透析により緩衝液交換した。
【０１５６】
ビオチニル化成熟ＧＤＦ−８ダイマーを、機能、たとえば、結合およびレポーター遺伝子アッセイにおけるその活性の保持について評価した。ビオチニル化成熟ＧＤＦ−８タンパク質を逆相高性能液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレー−イオン化四極子飛行時間形質量アッセイ（ＲＰ−ＨＰＬＣ／ＥＳＩ−ＱＴＯＦ−ＭＳ）により測定し、調製物は約０〜３のモル比の混合物を含有し、分子の大部分は１：１であった。さらに高い標的モル比は、当該分野において周知の条件の調節により、９：１もの高い測定値をもたらした。
【０１５７】
ＭＹＯ−０２９は同様のアッセイ法を用いてビオチニル化され、以下に記載される方法において用いることができる。本質的に、単離されたＭＹＯ−０２９を希釈し、緩衝液交換し、次いでビオチニル化する。反応および保存条件は、いくつかのパラメータを除いて、ＧＤＦ−８と同じである。ＭＹＯ−０２９濃度値は１０〜２４  ｇ／Ｌの範囲である。ビオチニル化反応における標的スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン対ＭＹＯ−０２９モル比は４０：１であり、これは８〜１１のモル比測定値をもたらす。これは、アビジン：ＨＡＢＡ  Ａ６００  ｎｍ分光光度アッセイ（ＩｍｍｕｎｏＰｕｒｅ  アビジンおよびＨＡＢＡ、Ｐｉｅｒｃｅ）により測定される。透析を用いて、試薬を次いで低塩、中性ｐＨ処方緩衝液（１３７  ｍＭ  ＮａＣｌ、１  ｍＭ  ＫＣｌ、８  ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、３  ｍＭ  ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ  ＝  ７．２）中へ緩衝液交換する。
【実施例１３】
【０１５８】
レポーター遺伝子アッセイ
ＧＤＦ−８調節剤と特異的に結合する抗体は、ＧＤＦ−８の生物活性についての細胞に基づくレポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）において検出される。ＧＤＦ−８調節剤の活性を阻害する抗体、たとえば、ＭＹＯ−０２９活性を中和する抗体が次のアッセイにより検出される。
【０１５９】
ヒト横紋筋肉腫細胞系Ａ２０４ｐＣＡＧＡを使用し、ここにおいて、Ａ２０４（ＡＴＣＣ  ＨＴＢ−８２）は、周知の技術を用いて、レポーター遺伝子構造物、ｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２（米国特許公開番号２００３／０１３８４２２  Ａ１および２００４／０１４２３８２  Ａ１において記載）で安定的にトランスフェクトされた。別法として、ＦｕＧＥＮＥ．ＴＭ．６トランスフェクション試薬（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｈｅｉｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて、Ａ２０４細胞をｐＧＬ３（ＣＡＧＡ）１２で一時的にトランスフェクトする。トランスフェクション後、細胞を、９６穴プレート上、２  ｍＭグルタミン、１００  Ｕ／ｍＬストレプトマイシン、１００  μｇ／ｍＬペニシリンおよび１０％ウシ胎仔血清で補足されたＭｃＣｏｙの５Ａ培地中で１６時間培養した。細胞を、対照について、一定量（７５  ｎｇ／ｍＬ）の成熟ＧＤＦ−８タンパク質、一定量（４００  ｎｇ／ｍＬ）のＭＹＯ−０２９およびグルタミン、ストレプトマイシン、ペニシリン、および１０％ウシ胎仔牛血清を含むＭｃＣｏｙの５Ａ培地中の希釈系列の正の対照の有無両方で、３７℃で６時間処理した。任意に最大ルシフェラーゼシグナルの約８０％をもたらすＧＤＦ−８の量を選択してもよい。ＭＹＯ−０２９を６．２５  ｎｇ／ｍＬ〜４００  ｎｇ／ｍＬ（５．９  ｎＭ〜３７５  ｎＭ）の濃度でＧＤＦ−８とともに１時間、室温でプレインキュベートし、次いでタンパク質をＲＧＡ中に添加する。ＧＤＦ−８調節剤に対する正の対照抗体をＭＹＯ−０２９とともにインキュベートし、ＲＧＡにおいてアッセイした。任意に、ＧＤＦ−８シグナルを約８０％阻害するＭＹＯ−０２９の量を選択してもよい。Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて処理された細胞においてルシフェラーゼを定量した。このアッセイにおいて、７５ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８は８０％活性化をもたらし、一方、４００  ｎｇ／ｍＬのＭＹＯ−０２９はレポーター遺伝子構造物の８０％阻害をもたらす。
【０１６０】
平行反応において、細胞を、７５  ｎｇ／ｍＬの成熟ＧＤＦ−８タンパク質の有無両方で、ＭＹＯ−０２９（または他のＧＤＦ−８調節剤）の有無両方で、および試験生体サンプルの有無両方で処理する。ヒト血清は、ＭＹＯ−０２９処理を受けた個体から得られ、緩衝液中、１：５、１：１０、１：１５、１：２０、および１：４０に希釈される。１：１０より低い希釈について、試験サンプル血清を、１０％ヒト血清を含有する緩衝液（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ、Ｉｎｃ．）中でさらに希釈する。
【０１６１】
機能的細胞に基づくアッセイを、次のような公開されたＧＤＦ−８反応性レポーター遺伝子アッセイ（米国特許公開番号２００３／０１３８４２２  Ａ１）に基づいて行った：このアッセイにおいて、７５  ｎｇ／ｍＬのＧＤＦ−８を４００  ｎｇ／ｍＬのＭＹＯ−０２９（３７５  ｎＭ）とともにプレインキュベートし、ＰＧＬ３（ｐＣＡＧＡ）１２細胞とともに、ヒト血清サンプルの存在下および不在下で移されたＡ２０４細胞に添加した。ヒト血清サンプルを１：２０に希釈し、たとえば１：１００、１：２００、１：４００、１：８００、１：１６００、１：３２００、および１：６４００に希釈されたウサギ抗ＭＹＯ−０２９ポリクローナル血清を含む正の対照と比較した。アッセイは、ヒト血清サンプルまたは正の対照ウサギ抗体をＭＹＯ−０２９、次いでＧＤＦ−８と混合し、ＲＧＡにおける細胞に直接添加するか、あるいはヒト血清サンプルまたは正の対照ウサギ抗体をＭＹＯ−０２９とともに１時間プレインキュベートし、ＲＧＡにおける細胞に添加し、次いでＧＤＦ−８をサンプルウェルに添加するかのいずれかで行うことができる。
【０１６２】
ＭＹＯ−０２９に対する中和抗体の正の対照を次のようにして作成した。ウサギを無傷ＭＹＯ−０２９またはＭＹＯ−０２９結合部位を含むＭＹＯ−０２９タンパク質フラグメントで免疫化した。このヒト抗体の定常領域に対する、ウサギにおける強力な免疫応答の生成を回避するために、消化を行って、ＭＹＯ−０２９抗体のＦｃ部分を除去した。２匹のウサギを無傷または消化されたＭＹＯ−０２９のいずれかで免疫化した。リガンド結合アッセイを用いて、中和活性について血液を試験した。４匹はすべて良好な抗体価結果を示し、対照ウサギ血清は全４匹からの血液をプールすることにより得た。
【０１６３】
本開示において記載される刊行物、特許、および生物学的配列は、全体として本発明の一部として参照される。参考に組み入れられる物質が本明細書と矛盾するか、または一致しない範囲で、本明細書はこのような物質に優先する。本明細書における文献の記載は、このような文献が本発明の先行技術であることを承認するものではない。
【０１６４】
特に反対の記載がない限り、請求の範囲を包含する本明細書において用いられる成分、細胞培養物、処理条件などの量を表す全ての数値は、「約」なる用語により全ての場合において修飾されると理解される。従って、特に反対の記載がない限り、数値パラメータは近似値であり、本発明が得ようとする所望の特性に応じて変わるであろう。特に反対の記載がない限り、一連の要素の前の「少なくとも」は、この一連の数値における全ての要素について言及すると理解される。当業者らは、常用の実験程度のものを使用して、本明細書において記載される本発明の具体例と等価な多くのものを認識または解明することができる。このような同等物も以下の請求の範囲に含まれることが意図される。
【０１６５】
本明細書内の具体例は、本発明の実施態様を説明し、本発明の範囲を限定すると理解すべきではない。当業者らは、多くの他の実施形態が本発明に含まれることを容易に認識する。本発明の他の実施形態は、本明細書において開示された明細および実施を考慮することから当業者には明らかになるであろう。明細書および実施例は、例示のみとして見なされ、本発明の真の範囲および精神は請求の範囲により示されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】本発明の方法の一実施態様を示し、ここで、ＧＤＦ−８調節剤はＭＹＯ−０２９であり、検出剤はビオチニル化ＭＹＯ−０２９である。
【０１６７】
【図２】本発明の方法の一実施態様を示し、ここで、ＧＤＦ−８調節剤はＭＹＯ−０２９であり、検出剤はビオチニル化ＧＤＦ−８である。
【図１】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月20日(2007.11.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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