(57)【要約】本発明は、式Ｉ：（Ｉ）Ｂ−Ａ＊［式中、Ｂ−Ａ＊はＡ＊を導入するための生物学的化合物Ｂの反応の生成物として形成された生物学的化合物又はその誘導体であり、Ａ＊はＡＭＳ放射性同位体＊を含む１０〜５００の範囲のＭＷを有する放射性同位体部分である］の生物学的化合物を単独又はＢと共に含む生物学的組成物を提供し、ここで組成物は最大比放射能の尺度である放射性同位体のパーセント取り込みの値により特徴付けられ、ここで１００％取り込みは分子当たり１つの放射性同位体の取り込みとして定義され、そしてここで、パーセント取り込みはゼロ超〜約１００％の範囲にある。また、この組成物の製造のためのプロセス、この組成物１つ以上のＡＭＳ検出のための方法、及びＡＭＳ検出における式Ｉの組成物又は化合物の使用を、提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
式Ｉ：
（Ｉ）  Ｂ−Ａ＊
［式中、Ｂ−Ａ＊はＡ＊を導入するための生物学的化合物Ｂの反応の生成物として形成された生物学的化合物又はその誘導体であり、Ａ＊はＡＭＳ放射性同位体＊を含む１０〜５００の範囲のＭＷを有する放射性同位体部分である］の生物学的化合物を単独又はＢと共に含む生物学的組成物であって、ここで該組成物は最大比放射能の尺度である放射性同位体のパーセント取り込みの値により特徴付けられ、ここで１００％取り込みは分子当たり１つの放射性同位体の取り込みとして定義され、そしてここで、パーセント取り込みはゼロ超〜約１００％の範囲にある組成物。
【請求項２】
パーセント取り込みがゼロ〜５％超の範囲の分数である請求項１記載の生物学的組成物。
【請求項３】
Ｂ−Ａ＊が生物学的化合物ＢとＡ＊への前駆体との間のエクスビボの化学反応の生成物として形成される請求項１又は請求項２記載の生物学的組成物。
【請求項４】
Ａ＊が１０〜２００の範囲のＭＷを有する放射性同位体部分である請求項１〜３の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項５】
放射性同位体Ａ＊標識分子のその分子集団における量が、生物学的化合物Ｂのその分子集団における量に対して、化合物又は組成物の生物学的活性を改変しない程度に低値である請求項１〜４の何れか１項に記載の生物学的組成物。
【請求項６】
パーセント取り込み（ｍ）が最大比放射能の尺度であり、１００％取り込みは、自身の放射性等価物で置き換えられたある特定の原子を各分子が有する物質のある量をとった場合の分子当たり１つの放射性同位体の取り込みとして定義され、そしてパーセント取り込みは等式Ｅｑｕ２：
【数１】
2008531670.tif 000007
により決定される、請求項１〜５の何れか１項に記載の生物学的組成物。
【請求項７】
分子当たり１つの放射性同位体に基づいて、（１００％取り込みに相当する）最大比放射能が、等式Ｅｑｕ１：
【数２】
2008531670.tif 000008
［式中、ｌｎ２は２の自然対数（＝０．６９３２）であり、ｔ１／２は分単位の放射性同位体の半減期であり、Ｎは１ｍｍｏｌｅ中の放射性同位体原子の数（生物学的物質モル×６．０２２５×１０２０）である］で示される請求項１〜６の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項８】
パーセント取り込みが１×１０−１２〜５％、より好ましくは０．１〜２％の範囲にある請求項１〜７の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項９】
ＡＭＳ同位体の半減期が数週間を超えている請求項１〜８の何れか１項に記載の生物学的組成物。
【請求項１０】
Ｂが１０００を超えている、例えば１０００〜５百万以上の分子量ＭＷのものである請求項１〜９の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項１１】
Ｂが多糖類、生物重合体、アミノ酸、蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂肪酸、炭水化物、インスリン類縁体、成長ホルモン類縁体、植物又は遺伝子療法製品等、例えば抗体、例えば組換え抗体、ＧＨ組換え抗体及びエリスロポエチンから選択される請求項１〜１０の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項１２】
Ｂがヒト又は動物の身体又は植物の処置において使用するための医薬、獣医科用製品又は農薬、又はその候補である請求項１〜１１の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項１３】
Ａ＊が有機部分、例えば、１４Ｃ又は３ＨＣ１−４アルキル、アルコール、エーテル等、例えばメチル（ホルミル）、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル等、又は、未コンジュゲートの同位体、例えば未コンジュゲートの３６Ｃｌ同位体から選択される請求項１〜１２の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項１４】
Ａ＊が活性エステルから、又は、マレイミドから誘導される請求項１〜１２の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項１５】
水素、ベリリウム、炭素、アルミニウム、リン、塩素、カルシウム、マンガン、鉄、セレン、ヨウ素、バリウム及びランタニド類及びアクチニド類、例えばウラン又はプルトニウムの放射性同位体＊を含む請求項１〜１４の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項１６】
３Ｈ、Ｂａの同位体、７Ｂｅ、１０Ｂｅ、１４Ｃ、１７Ｏ、１８Ｏ、２６Ｍｇ、２６Ａｌ、３２Ｓｉ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、４１Ｃａ、５５Ｆｅ、６０Ｆｅ、５３Ｍｎ、７９Ｓｅ、５９Ｎｉ及び１２９Ｉの何れか１つ以上から選択される、最も好ましくは３Ｈ、１４Ｃ及び３６Ｃｌの何れか１つ以上から選択される放射性同位体＊を含む請求項１〜１５の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項１７】
Ａ＊が１４Ｃ−Ｎ−エチルマレイミドから誘導される請求項１〜１２の何れかに記載の生物学的組成物。
【請求項１８】
式Ｉ：
（Ｉ）  Ｂ−Ａ＊
［式中、Ｂ−Ａ＊はＡ＊を導入するための生物学的化合物Ｂの反応の生成物であり、Ａ＊はＡＭＳ放射性同位体＊を含む１０〜５００の範囲のＭＷを有する放射性同位体部分である］の生物学的化合物であって、ここで該化合物は最大比放射能の尺度である放射性同位体のパーセント取り込みの値により特徴付けられ、ここで１００％取り込みは分子当たり１つの放射性同位体の取り込みとして定義され、そしてここで、パーセント取り込みはゼロ〜約１００％の範囲にある化合物。
【請求項１９】
パーセント取り込みがゼロ〜５％超の範囲の分数である請求項１８記載の生物学的化合物。
【請求項２０】
Ｂ−Ａ＊が請求項１〜１７の何れか１項に記載の通り定義される請求項１８又は請求項１９記載の生物学的化合物。
【請求項２１】
請求項１〜１７の何れか１項に記載の通り定義される生物学的組成物の製造プロセスであって、そのある量を、ＡＭＳ放射性同位体＊のパーセント取り込みが前記定義した通りゼロ超〜約１００％の範囲にあるように前記の通り定義される部分Ａ＊で化学標識することを含むプロセス。
【請求項２２】
パーセント取り込みがゼロ〜５％超の範囲の分数である請求項２１記載のプロセス。
【請求項２３】
前記標識がエクスビボ標識である請求項２１又は請求項２２記載のプロセス。
【請求項２４】
式ＩＩ又はＩＩＩ：
Ａ’＊（ＩＩ）
ＸｎＡ＊（ＩＩＩ）
［式中、Ｂ、Ａ及び＊は前記の通り定義され、Ａ’はＡへの反応前駆体であり、ｎは０又は１であり、Ｘは脱離基である］の反応性物質に前記定義した生物学的化合物Ｂを反応させること、ここで式ＩＩ又はＩＩＩの物質は前記の通り定義される組成物の所望のパーセント取り込みまたはそれ以上に相当する放射性同位体＊のパーセント取り込みにより特徴付けられるものであること、
そして、式ＩＩ又はＩＩＩの物質が所望に相当する放射性同位体＊のパーセント取り込みにより特徴付けられる場合は前記の通り定義される生成組成物を得ること、
又は、式ＩＩ又はＩＩＩの物質が所望を超過する放射性同位体＊のパーセント取り込みにより特徴付けられる場合は前記の通り定義されるものを超えた放射性同位体＊のパーセント取り込みを有する式Ｉの化合物を得ること、そして更に、得られた式Ｉの化合物をある量のＢと組み合わせること、及び、前記の通り定義される生成組成物を得ること、を含む請求項２１〜２３の何れか１項に記載のプロセス。
【請求項２５】
式ＩＩ又はＩＩＩの化合物が官能化された又は官能化されないＣ１−４炭化水素であり、ここでＡ’又はＡは１４Ｃ又は３ＨＣ１−４ヒドロカルビル又は未コンジュゲートの放射性同位体であり、Ｘは−Ｃ＝Ｏ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｃｌ、−ＯＨ等から選択されるか、又は、未コンジュゲートの原子である、請求項２４記載のプロセス。
【請求項２６】
式ＩＩ又はＩＩＩの化合物が１４Ｃ又は３Ｈアルケン、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド又は当該分野で公知の任意の他のメチル化剤であるか、又は３６Ｃｌ塩素ガス（Ｃｌ２）である請求項２４又は請求項２５記載のプロセス。
【請求項２７】
前記反応性物質がマレイミドである請求項２４又は請求項２５記載のプロセス。
【請求項２８】
前記反応性物質が１４Ｃ−Ｎ−エチルマレイミドである請求項２４又は請求項２５記載のプロセス。
【請求項２９】
物質ＩＩ又はＩＩＩを標識するか化合物Ｂを標識して式Ｉの化合物とすること、その比放射能を測定すること、所望の比放射能を決定して所望のパーセント取り込みとすること、及び、十分な量の相当する未標識の物質又は式Ｉの化合物又は生物学的物質Ｂを組み合わせること、及び、均質な生成物として、又は、前記の通り定義される所望のパーセント取り込みを有する組成物として単離すること、を含む請求項２４〜２８のいずれかに記載のプロセス。
【請求項３０】
同じか又は異なる起源のＢを含む請求項１〜１７の何れかに定義された生物学的組成物１つ以上のＡＭＳ検出のための方法であって、少なくとも１対象に投与するための生物学的組成物１つ以上及び場合により生物学的化合物Ｂを含む対照組成物１つ以上を準備すること、前記の通り定義される前記生物学的物質を投与されている対象から代謝サンプルを得ること、及び、各生物学的物質に関してＡＭＳ検出を実施すること及びＡＭＳ結果を得ること、を含む方法。
【請求項３１】
対象が何れかのヒト、動物又は植物であるか、又は試験媒体又は細胞培養物である請求項３０記載の方法。
【請求項３２】
標的への結合、代謝的消長等を調べる目的の為に請求項１〜１６において定義した生物学的組成物１つを検出するための方法である請求項３０〜３１の何れかに記載の方法。
【請求項３３】
同じか又は異なる起源から誘導された生物学的物質Ｂ２つ以上の生物学的同等性を測定するための方法であり、そして、生物学的物質Ｂの原料の製品管理及び再生産性確立のための方法であるか、又は、異なる原料１つ以上から誘導された生物学的物質Ｂ１つ以上が第１の原料に由来する生物学的物質Ｂと生物学的に同等であることを調べるための方法であり、各々の場合、前記の通り定義されるその相当する組成物に対してＡＭＳを実施することにより行う、請求項３０〜３１の何れかに記載の方法。
【請求項３４】
各生物学的物質Ｂに関するＡＭＳ結果をその相当する組成物と比較する追加的工程を含む請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
ＡＭＳ結果を比較することが、生物学的物質Ｂが同一であるかどうか、そして何らかの相違がある場合はそれらが生物学的非同等性によるか、又は生物学的同等性とは無関係のサンプル又は宿主の変動による結果であるかどうかを決定する請求項３３又は３４の何れかに記載の方法。
【請求項３６】
ＡＭＳ結果を比較することが、内因性のヒト又は動物の生物学的物質Ｂ又は内因性の遺伝子操作された生物学的物質Ｂの生物学的同等性のＡＭＳを測定する請求項３３及び３４の何れかに記載の方法。
【請求項３７】
競合ジェネリック生物学的物質Ｂの専売生物学的物質Ｂとの生物学的非同等性を決定することによりジェネリックがジェネリック生物学的物質として、又は、海賊版生物学的物質として専売品を誤って置き換えているのではないことを確実なものとするための方法である請求項３３及び３４の何れかに記載の方法。
【請求項３８】
ＡＭＳ検出における請求項１〜２０の何れかにおいて定義された式Ｉの生物学的組成物又は化合物の使用であって、そのインビトロ又はインビボの代謝の特性を与える使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は放射性同位体で標識された生物学的組成物、放射性同位体で標識された式Ｉの生物学的化合物、その製造のためのプロセス、生物学的組成物１つ以上を投与された対象から誘導したサンプル１つ以上のＡＭＳ（加速器質量分析法）検出のための方法；及び生物学的組成物のインビトロ又はインビボの代謝の特性を与えるＡＭＳ検出におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬剤として開発中の生物学的物質は、（１）それらを定量するため、及び（２）動物種、特にヒトにおけるその存在及び代謝的消長を検出するために、分析する必要がある。組換え抗体、化学合成ペプチド、オリゴヌクレオチド等は全て質量分析法、免疫試験（例えばＥＬＩＳＡ免疫測定法）又は他の方法、例えば蛍光又はＵＶ吸収を用いて分析することが困難である。これは生物学的薬剤に対する内因性同等物が存在する場合に特に当てはまる。例えば市販及び開発中の抗体系薬剤の数は急速に増加しているが、これらのヒト対象への投与後の分析は内因性抗体の高バックグラウンドの為に困難である。これらの生物学的物質の代謝的消長試験は応答における個体差、インビトロにおける標的受容体への高親和性の結合にも関わらず臨床的には生物学的活性が観察されない理由を理解するためには重要であることがわかっている。更に又、グリコシル化の状態が臨床活性と代謝安定性の両方に影響し得ることも知られている。更に又、Ｆａｂのような小型の生物学的分子はヒトにおいて不安定であり、そのため、ポリエチレングリコールのような安定化分子に化学的に結合させることにより安定化される。ここでも又、このような安定化分子の血中の水準を定量することは高い分析能力を要する。
【０００３】
更に又、異なる原料から誘導された生物学的分子の生物学的同等性を調べる必要がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明者等は今回、生物学的分子の標的への結合、代謝的消長等を試験するための検出方法として加速器質量分析法（ＡＭＳ）を使用することが可能であることを発見した。方法の利点はＥＬＩＳＡのような現在の分析方法よりも高い感度と特異性を有し、方法の開発は比較的短期間に実施できる点である。
【０００５】
ＡＭＳは放射性薬剤を投与されているヒトから得られた体液中の同位体標識薬剤の同位体定量を行う。ＡＭＳの最も顕著な利点の１つは、ヒト対象に投与しなければならない用量が規制当局の認可を必要とする放射能の基準水準より低値となるほどの低い放射能水準を比較的短い分析時間で検出し、定量することができる点である。
【０００６】
放射性同位体タグによる生物学的分子の標識は、例えば１３１Ｉ、１４Ｃ等を用いて同位体に生物学的分子を反応させることによる等で知られている。或いは、１４Ｃを放射性培養において生合成的に取り込ませることができる。しかしながら、これは幾つかの問題点を呈し、例えばそのような手段により誘導された標識された生物学的化合物は典型的にはヒトへの投与に関して規制当局により許可される量を超えた放射能を有する。逆に液体シンチレーション計数のような従来の方法では放射能が低値すぎて検出不可能となるおそれがある。放射性ヨウ素のような標識を使用する場合、これらはガンマ放射物であり、従ってヒトに投与した場合は特殊な安全性の問題を生じさせる。更に又、１２５Ｉの半減期は僅か６０．３日であり、従って標識された化合物の有用な寿命は限定される。
【０００７】
生物学的化合物の放射性同位体標識を行う合成化学的な方策が良好に行えるとは考えられない。例えばホルムアルデヒドにリジンを反応させる蛋白質の製剤は、それが蛋白質を交差結合するため、組織を固定するためのよく知られた手法となっている。従って、生物学的化合物の放射性同位体標識誘導体を形成することは化合物を破壊する可能性が高いのみならず、その特性及び活性にも影響する。
【０００８】
しかしながら本発明者等は今回、対象に投与された生物学的物質のＡＭＳ検出のためには十分であるが標識された生物学的物質の生物学的活性又は代謝的消長を改変するほどは高値ではない標識の水準において低分子量の標識試薬で標識した放射性同位体標識生物学的化合物を提供することが可能であることを発見した。
【０００９】
従って、本発明の最も広範な態様において、下記式Ｉ：
（Ｉ）  Ｂ−Ａ＊
［式中、Ｂ−Ａ＊はＡ＊を導入するための生物学的化合物Ｂの反応の生成物として形成された生物学的化合物又はその誘導体であり、Ａ＊はＡＭＳ放射性同位体＊を含む１０〜５００の範囲のＭＷを有する放射性同位体部分である］の生物学的化合物を単独又はＢと共に含む生物学的組成物であって、ここで組成物は最大比放射能の尺度である放射性同位体のパーセント取り込みの値により特徴付けられ、ここで１００％取り込みは分子当たり１つの放射性同位体の取り込みとして定義され、そしてここで、パーセント取り込みはゼロ超〜約１００％の範囲にある上記組成物が提供される。
【００１０】
特定の利点において、放射性同位体Ａ＊標識分子のその分子集団における量は、生物学的化合物Ｂに対して、化合物又は組成物の生物学的活性を改変しない程度に低値である。
【００１１】
特定の利点において、本発明者等は、標識のより高値のパーセ既知及び新規な手段により本発明の生物学的組成物が製造できることを発見した。しかしながら、放射性同位体はＡＭＳ検出の限界内の量で存在する。
【００１２】
以後、軽度に標識された生物学的物質とは、好ましくは上記において定義した範囲のパーセント取り込みに関する値に相当するＡＭＳにより検出可能な量で存在する放射性同位体を含む生物学的組成物又は化合物を指すものとする。パーセント取り込みは、最大比放射能に比例し、ここで１００％取り込みとは、分子当たり１つの放射性同位体の取り込みとして定義され、即ち、物質の各モルがモル量の放射性同位体を含有する。
【００１３】
ＡＭＳ放射性同位体は本明細書においては、ＡＭＳ分析に該当するか、それに付すことができる如何なる同位体であってもよい。ＡＭＳ放射性同位体は好ましくは極めて低値、例えば１×１０−５％以下、例えば１×１０−１５％以下の範囲の天然のバックグラウンドを有し、そして人工的に入手できる同位体は天然アバンダンスはゼロである。ＡＭＳの感度はＡＭＳ放射性同位体が例えば１４Ｃに関して約１．４×１０−１０％のような極めて低値の天然のバックグラウンドを有するという事実に依存している。１３Ｃに関するバックグラウンドは１．１％であり、これは比較すれば巨大値である。このことは１３Ｃの取り込み率が１４Ｃより遥かに高値であることを意味している。好ましくは、ＡＭＳ放射性同位体は取り扱いが簡便であるためには数週間〜１０００年超の長い半減期を有する。好ましくはＡＭＳ放射性同位体はＡＭＳ水準において非毒性であり、これによりそれらはヒトの代謝に適し、好ましくは生物医薬としての利益が生じる。
【００１４】
好ましくはパーセント取り込みはゼロ〜５％超の範囲の分数、例えば１×１０−１２〜５％、より好ましくは０．１〜２％の範囲の分数である。従って本発明はＡＭＳの分析力及び微量の放射性同位体で標識した生物学的物質へのＡＭＳの独特の適用が可能であるという事実を利用している。
【００１５】
パーセント取り込みは直接誘導するか、生物学的物質Ｂの比放射能から計算することができる。最大比放射能はｄｐｍ／ｍｍｏｌｅで表され、放射能の基本単位、即ち分当たりの崩壊であり、毎分平均で生じる核の崩壊の数である。しかしながらパーセント取り込みは全ての放射性同位体について比較できる正規化関数であり、放射性同位体に依存する非放射能の用語よりも指標となりやすい。
【００１６】
従って、好ましくは、本発明の生物学的組成物に関する％取り込みは以下の等式Ｅｑｕ１：
【００１７】
【数３】
2008531670.tif 000002
により決定される。
【００１８】
何れかの放射性同位体に関して（１００％取り込みに相当する分子当たり１つの放射性同位体に基づく）、最大比放射能は以下の等式Ｅｑｕ２：
【００１９】
【数４】
2008531670.tif 000003
［式中、ｌｎ２は２の自然対数（＝０．６９３２）であり、ｔ１／２は分単位の放射性同位体の半減期であり、Ｎは標識された生物学的組成物１ｍｍｏｌｅ中の分子数（生物学的物質モル×６．０２２５×１０２０）である］により表される（Ｌａｐｐｉｎ，Ｇ  ａｎｄ  Ｇａｒｎｅｒ，  ＲＣ（２００３）Ｕｌｔｒａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  Ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．  Ｃｈａｐｔｅｒ  １１ｉｎ：Ｗｉｌｓｏｎ，ＩＤ（ｅｄ）Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｖｏｌ．４，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＢＶ  Ａｍｓｔｅｒｄａｍ）。
【００２０】
経時的な放射性同位体の半減期のため、等式２は減衰する放射能（ｄｐｍ値）を考慮していない（即ちゼロ時における最大比放射能を計算する）。
【００２１】
以下の例は１４Ｃに関して分子当たり１つの放射性同位体に基づいた最大比放射能を計算している。１４Ｃの半減期は５７３０年（５７３０×３６５．３×２４×６０分）であり、そのため、短時間に渡る放射能の減少は何れも無視できるものである。後述する説明においては単位は以下の通りとする。
Ｂｑ＝ベクレル＝６０ｄｐｍ
ｋＢｑ＝６０×１０３ｄｐｍ
ＧＢｑ＝６０×１０９ｄｐｍ
ｋＢｑ／ｍｍｏｌｅ＝最大比放射能の理論値（分子当たり１つの放射性同位体に基づく）
ｍｍｏｌｅ＝１０−３モル
ａｍｏｌｅ＝１０−１８モル
等式Ｅｑｕ２より以下が導かれる。
【００２２】
【数５】
2008531670.tif 000004
。
【００２３】
即ち、１４Ｃに関する最大比放射能の理論値は２．３０８３ＧＢｑ／ｍｍｏｌｅとなる（分子当たり１つの放射性同位体に基づく）。これが１００％取り込みに相当する。
【００２４】
従って、本発明による軽度に標識された生物学的物質に関するパーセント取り込みは上記等式Ｅｑｕ１より適宜決定される。
【００２５】
分子量１６０，０００の生物学的物質Ｂを考えた場合、１００％取り込みのためには、比放射能は２．３ＧＢｑ／１６０，０００ｍｇ又は６．９ｄｐｍ／ｎｇ（上記計算参照）となる。一般原則として、ＡＭＳは０．０６ｄｐｍ／ｍＬ血漿を検出でき、従って試験はｆｇの範囲となる。即ち、１４Ｃの取り込み率が僅か１％である場合、試験はピコグラムの範囲となる（約１００ｐｇの低ｐｇ範囲）。典型的なＥＬＩＳＡ試験に関する検出限界は一桁高いため、これはＡＭＳ測定に関しては十分以上の感度である（ｎｇ＝１０−９、ｐｇ＝１０−１２、ｆｇ＝１０−１５ｇ）。
【００２６】
Ｂは適宜、１０００超の分子量ＭＷのものであり、例えば１０００〜５百万以上であってよい。多くの生物学的物質は１０００〜２００，０００ダルトン、例えば５０，０００〜２００，０００ダルトンの範囲である。
【００２７】
Ｂはヒト又は動物の身体又は植物又は土壌物質に関連して検討すべき生物学的物質の何れかのクラスから選択してよく、天然又は合成の生物学的化合物であってよく、例えば多糖類、生物重合体、アミノ酸、蛋白質、ペプチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ＲＮＡ、ＤＮＡ、脂肪酸、炭水化物、インスリン類縁体、成長ホルモン類縁体、植物又は遺伝子療法製品等、例えば抗体、例えば、組換え抗体、ＧＨ組換え抗体及びエリスロポエチン等から選択してよい。好ましくは、Ｂはヒト又は動物の身体又は植物の処置において使用するための医薬、獣医科用製品又は農薬、又はその候補である。
【００２８】
放射性同位体部分Ａ＊は好ましくは、有機部分、例えば、１４Ｃ又は３ＨＣ１−４アルキル、アルコール、エーテル等、例えばメチル（ホルミル）、ヒドロキシメチル、ヒドロキシエチル等、又は、未コンジュゲートの同位体、例えば、未コンジュゲートの３６Ｃｌ同位体から選択される。
【００２９】
組成物が上記定義した式Ｉの生物学的化合物を含む場合、放射性同位体部分Ａ＊は前記定義した式Ｉの化合物の場合に相当するパーセント取り込みにより特徴付けられる。或いは、組成物が前記定義した生物学的化合物Ｂと共に式Ｉの生物学的化合物を含む場合は、放射性同位体部分Ａ＊は前記定義した式Ｉの化合物の場合よりも高値のパーセント取り込みにより特徴付けられる。
【００３０】
放射性同位体＊は適宜、ＡＭＳ検出手法による検出に適する何れかの放射性同位体から選択される。放射性同位体は半減期が多様であり、それにより放射能も多様となり、そして、より少量又は大量で検出を可能とし、これにより特定の放射性同位体は、同位体の化学的性質により、又は、その放射特性により、特定の想定される用途に特に適するものとなる。全ての原子は同位体型を有し、その一部はＡＭＳ分析に適している。例えば、１２９Ｉで標識した生物学的物質はＡＭＳ検出に適しているのに対し、１３１Ｉで標識した生物学的物質は高い放射能を有するが安全性の問題のためヒトにおける使用は恐らく制限される。同様に、１４Ｃで標識した生物学的物質はＡＭＳ検出に適しているのに対し、１３Ｃで標識した生物学的物質は例えばＷＯ９７／０１０９８に開示されているＮＭＲ検出のような多くの非放射性の手法において広範な用途を有しているが、ＡＭＳ分析では使用できない。特に適さない同位体は負イオンを形成せず、特に窒素が上げられる。
【００３１】
従って本発明の生物学的組成物は適宜、水素、ベリリウム、炭素、アルミニウム、リン、塩素、カルシウム、マンガン、鉄、セレン、ヨウ素、バリウム及びランタニド類及びアクチニド類、例えばウラン又はプルトニウムのＡＭＳ放射性同位体から選択されるＡＭＳ放射性同位体を含む。好ましくは、本発明の生物学的組成物は３Ｈ、Ｂａの同位体、７Ｂｅ、１０Ｂｅ、１４Ｃ、１７Ｏ、１８Ｏ、２６Ｍｇ、２６Ａｌ、３２Ｓｉ、３５Ｓ、３６Ｃｌ、４１Ｃａ、５５Ｆｅ、６０Ｆｅ、５３Ｍｎ、７９Ｓｅ、５９Ｎｉ及び１２９Ｉのいずれか１つ以上から選択される、最も好ましくは３Ｈ、１４Ｃ及び３６Ｃｌから選択される同位体で標識された放射性同位体である。
【００３２】
好ましい実施形態においては、本発明はＡＭＳ放射性同位体が１４Ｃ放射性同位体；或いは、又は追加的に３６Ｃｌ又は３Ｈ放射性同位体であることを特徴とする上記定義した生物学的組成物を含む。本発明の生物学的組成物は同じか又は異なっていてよい、そして好ましくは異なる、放射性同位体を１つより多く含んでよい。
【００３３】
本発明の別の態様において、下記式Ｉ：
（Ｉ）  Ｂ−Ａ＊
［式中、Ｂ−Ａ＊はＡ＊を導入するための生物学的化合物Ｂの反応の生成物であり、Ａ＊はＡＭＳ放射性同位体＊を含む１０〜５００の範囲のＭＷを有する放射性同位体部分である］の生物学的化合物であって、ここで化合物は最大比放射能の尺度である放射性同位体のパーセント取り込みの値により特徴付けられ、ここで１００％取り込みは分子当たり１つの放射性同位体の取り込みとして定義され、そしてここで、パーセント取り込みはゼロ超〜約１００％の範囲にある上記化合物が提供される。
【００３４】
好ましくは、本発明の化合物は前述の通り定義される本発明の組成物と同様の特徴及び利点により特徴付けられる。例えば好ましくはパーセント取り込みはゼロ超〜１００％の範囲、例えば１×１０−１２〜５％、より好ましくは０．１〜２％の範囲にある分数である。
【００３５】
本発明の別の態様において、前述の通り定義される生物学的組成物の製造プロセスであって、そのある量を、ＡＭＳ放射性同位体＊のパーセント取り込みが上記定義した通りゼロ超〜約１００％の範囲にある、好ましくは前述の通りゼロ超〜約１００％の範囲の分数であるように前述の通り定義される部分Ａ＊で化学標識することを含む上記プロセスが提供される。好ましくはそのような標識はエクスビボで行われる。同様に、このプロセスは前述の通り定義される本発明の化合物を製造するために使用してよい。
【００３６】
好ましくは前述の通り定義される生物学的組成物の製造のための化学標識プロセスは、下記式ＩＩ又はＩＩＩ：
Ａ’＊（ＩＩ）
ＸｎＡ＊（ＩＩＩ）
［式中、Ｂ、Ａ及び＊は前述の通り定義され、Ａ’はＡへの反応前駆体であり、ｎは０又は１であり、Ｘは脱離基である］の反応性物質に上記定義した生物学的化合物Ｂを反応させること、ここで式ＩＩ又はＩＩＩの物質は前記の通り定義される組成物の所望のパーセント取り込み以上に相当する放射性同位体のパーセント取り込みにより特徴付けられるものであること、
そして、式ＩＩ又はＩＩＩの物質が所望に相当する放射性同位体のパーセント取り込みにより特徴付けられる場合は前述の通り定義される生成組成物を得ること、
又は、式ＩＩ又はＩＩＩの物質が所望を超過する放射性同位体のパーセント取り込みにより特徴付けられる場合は前述の通り定義されるものを超えた放射性同位体のパーセント取り込みを有する式Ｉの化合物を得ること、そして更に、得られた式Ｉの化合物をある量のＢと組み合わせること、及び、前述の通り定義される生成組成物を得ること、を含む。
【００３７】
１つの特に好ましい化学標識プロセスでは、前述の通り定義される生物学的化合物Ｂ、特に蛋白質、好ましくはヒトへの治療上の利点があるものを反応させることによりそれに放射性同位体部分Ａ＊を結合させる。
【００３８】
本発明の全ての態様において、Ａ＊は１０〜５００のＭＷを有する放射性同位体部分である。好ましくはこの範囲は１０〜２００、より好ましくは３０〜１５０である。好ましくはＡ＊は単一の１４Ｃ原子を含有する。
【００３９】
本発明者等は、標識プロセスはいわゆるコンジュゲーション法であり、これによりＡＭＳ放射性同位体＊を化学種に結合させ、次にこの化学種を生物学的化合物Ｂと反応させることに特に注目した。
【００４０】
市販のコンジュゲート試薬は広範な種類が存在し、当業者にはＡＭＳ放射性同位体を取り込む相当する試薬を製造する方法は自明である。そのようなＡＭＳ放射性同位体含有コンジュゲートは本発明の化学標識プロセスの実施において使用してよく、そして使用するのが好ましい。
【００４１】
コンジュゲート試薬の有用なクラスの例はマレイミドであり、これはｐＨ＜７でチオールと、そしてｐＨ９〜１０程度でアミンと反応し、これは以下のスキームで模式的に示される。
【００４２】
【化１】
2008531670.tif 000005
特に好都合なマレイミドは以下に示す市販化合物の１４Ｃ−Ｎ−エチルマレイミドである。
【００４３】
【化２】
2008531670.tif 000006
コンジュゲート試薬の別の有用なクラスの例は活性エステルであり、これは遊離のアミン部分と反応させるために使用できる。「活性エステル」という用語は当該分野で良く知られている用語であり、そしてエステルＲ’Ｃ（Ｏ）ＯＲを指し、ここでＲはエステルカルボニル官能基の求電子性を増大させる作用を有するアルキル基以外の基である。やはり当業者の知る通り、エステルの求電子性は特定のＯＲ基を取り込むことにより調節してよく；例えばＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬及び本明細書において考察するその修飾は遊離アミン基による求核攻撃を受けやすい。活性エステルの特に好ましいクラスはＢｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬に関連するものである（Ｂｏｌｔｏｎ，  Ａ．Ｅ．  ａｎｄ  Ｈｕｎｔｅｒ，  Ｗ．Ｍ．，Ｔｈｅ  ｌａｂｅｌｌｉｎｇ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｔｏ  ｈｉｇｈ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ  ｂｙ  ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｔｏ  ａ  １２５Ｉ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ａｃｙｌａｔｉｎｇ  ａｇｅｎｔ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １３３（３），５２９−３９，１９７３）。本発明によれば、Ｂｏｌｔｏｎ−Ｈｕｎｔｅｒ試薬に構造的に関連している試薬は試薬中の１２５Ｉ原子が存在しないものとして製造してよい。或いは、検出手段として、ＡＭＳ活性同位体、例えば試薬のフェニル環内に含有される１４Ｃ原子が存在する。
【００４４】
好ましくは、式ＩＩ又はＩＩＩの化合物は、官能化された又は官能化されないＣ１−４炭化水素であり、ここでＡ’又はＡは１４Ｃ又は３ＨＣ１−４ヒドロカルビル又は未コンジュゲートの放射性同位体であり、Ｘは−Ｃ＝Ｏ、−Ｂｒ、−Ｉ、−Ｃｌ、−ＯＨ等から選択されるか、又は、未コンジュゲートの原子である。好ましくは、式ＩＩ又はＩＩＩの化合物は、１４Ｃ又は３Ｈアルケン、ホルムアルデヒド、アセトアルデヒド又は当該分野で知られた何れかの他のメチル化剤であるか、又は３６Ｃｌ塩素ガス（Ｃｌ２）である。
【００４５】
本発明の特定の利点において、物質の前述の通り定義される部分Ａ＊による標識はその生物学的活性を改変しないものである。好ましくはＧＭＰ物質等の化学標識はＧＭＰ条件において標識を行う場合にそのＧＭＰ状態に影響しないものである、別の利点において、本発明者等は前述の通り定義される生物学的物質を軽度に標識することは、例えばホルムアルデヒドによる交差結合等のような生物学的物質自体の破壊が無い低水準において行われることを発見した。
【００４６】
従って好ましくは、プロセスは、物質ＩＩ又はＩＩＩを標識するか化合物Ｂを標識して式Ｉの化合物とすること、その比放射能を測定すること、所望の比放射能を決定して所望のパーセント取り込みとすること、及び、十分な量の相当する未標識の物質又は式Ｉの化合物又は生物学的物質Ｂを組み合わせること、及び、均質な生成物として、又は、前述の通り定義される所望のパーセント取り込みを有する組成物として単離すること、を含む。
【００４７】
本発明の別の態様において、同じか又は異なる起源のＢを含む前述の通り定義される本発明の生物学的組成物１つ以上のＡＭＳ検出のための方法であって、少なくとも１対象に投与するための生物学的組成物１つ以上及び場合により生物学的化合物Ｂを含む対照組成物１つ以上を準備すること、前述の通り定義される前記生物学的物質が投与されている対象から代謝サンプルを得ること、及び、各生物学的物質に関してＡＭＳ検出を実施すること及びＡＭＳ結果を得ること、を含む上記方法が提供される。
【００４８】
好ましくは方法は、第１段階において、各原料から生物学的物質Ｂのサンプルを準備すること、及び、前述の通り定義される生物学的組成物の製造の為に前述の通り定義される本発明のプロセスを実施することを含む。このように本発明のプロセスを実施することは、エクスビボの実施である。対象は何れかのヒト、動物又は植物であるか、又は試験媒体又は細胞培養物であってよい。
【００４９】
本発明の第１の実施形態において、ＡＭＳ検出のための方法は標的への結合、代謝的消長等を測定する目的の為に生物学的組成物１つを検出するための方法である。熟練したオオペレーターはＡＭＳ結果を解釈し、生物学的組成物の効果、その毒性学、薬物動力学、代謝的消長等に関する情報を誘導することができる。
【００５０】
本発明の第２の実施形態において、本方法は、同じか又は異なる起源から誘導された生物学的物質Ｂ２つ以上の生物学的同等性を測定するための方法であり、そして、生物学的物質Ｂの原料の製品管理及び再生産性確立のための方法であるか、又は、異なる原料１つ以上から誘導された生物学的物質Ｂ１つ以上が第１の原料に由来する生物学的物質Ｂと生物学的に同等であることを調べるための方法であり、各々の場合、前述の通り定義されるその相当する組成物に対してＡＭＳを実施することにより行う。従って、好ましくは、本方法は各生物学的物質Ｂに関するＡＭＳ結果をその相当する組成物と比較する追加的工程を含む。
【００５１】
生物学的同等性は、当業者の知る通り、ある薬剤を他のものと相対比較した場合の生体利用性の尺度である。更に又、それに関連する特定の規制ガイドライン（ＥＭＥＡ、生体利用性及び生物学的同等性の検討に関するガイダンス、２００１年７月２６日ロンドンＣＰＭＰ／ＥＷＰ／ＱＷＰ／１４０１／９８参照）があり、生物学的同等性に関する本明細書に記載した全ての参考文献はこのガイドラインに従って定義されるものとする。
【００５２】
好ましくは異なる原料から誘導された生物学的物質Ｂ１つ以上は既知の専売の生物学的物質、典型的には医薬、動物又は植物用の保健製品と同じ目的の為に使用されることを意図しているジェネリックの生物学的物質である。
【００５３】
本発明の方法はインビトロ及びインビボ両方の活性、反応性、抑制性、又は、生物学的物質Ｂの機能的スクリーニング及び選択、生物学的物質Ｂの結合又は代謝のデータを与える場合、特にＡＤＭＥ及びＰＫデータを与えるために有用である。
【００５４】
ＡＭＳ投薬は軽度に標識された生物学的物質を単独又は適当な担体と共にヒト又は動物対象に投与することにより適宜行われる。投与は典型的には経口、経皮、口腔、膣内、肛門、皮下、経鼻、静脈内、眼内の経路、又は、吸入により行う。用量は適宜、放射性標識のナノキュリーのオーダーの低線量を与えるのに十分な生物学的物質を含み、例えばｎｇ〜ｍｇのオーダーである。好ましくは、線量は１マイクロシーベルト未満であり、これにより規制当局認可の免除となる。従って、用量は本発明の軽度に放射標識された生物学的物質１ナノグラムから１ミリグラム、好ましくは１マイクログラム〜５００マイクログラムを含んでよい。
【００５５】
数日、数週間又は数ヶ月の期間の後、組織又は細胞、血液サンプル、尿又は糞便、呼気等のサンプルを採取する。サンプルは生物学的代謝速度を検出し、急速及び徐々に代謝される生物学的物質を示すために時間間隔を置いて適宜採取する。本方法はＷＯ０１／５９４７６に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。ＡＭＳ結果の分析により例えば１４Ｃの同位体計数値、モダン（即ち天然に存在する）同位体の比及び計数値とモダン同位体の比の組合せとしてのパーセントモダン同位体が示される。ｐＭＣ（パーセントモダンカーボン）は放射能のＡＭＳ用語であり、サンプル中の炭素含有量の尺度となる。ｐＭＣ＝倍数量モダン×１００。１倍数量モダン＝１９５２年大気中１４Ｃ／１２Ｃ比。１２Ｃ／１３Ｃ比は比較的一定に維持されている。
【００５６】
サンプルは好ましくは試験から誘導された何れかのサンプル、例えば細胞又は細胞膜のサンプルから、又はヒト、動物又は植物誘導の投薬サンプル、例えば組織又は細胞、体液、例えば、血液又は尿、糞便、植物組織、土壌又は土壌生物、例えば蠕虫から、ＡＭＳ用に調製する。
【００５７】
本発明の方法においては、サンプルは組織又は細胞では数マイクログラム以下、血液又は尿は数マイクロリットルの範囲においてＡＭＳ分析用に調製する。試料は又、当該分野で知られる通り、植物組織、土壌、土壌生物、例えば蠕虫を含んでよい。
【００５８】
サンプルは当該分野で知られる通り機器のイオン源内で負イオンを生成できる形態に調製する。サンプル調製は熱的及び電気的に伝導性の個体を製造する伝統的方法によるものであってよく、非分画、効率的であり、及び、等圧により汚染又は実験器具における希少同位体の予想外の濃縮化から保護される。サンプルと標準物質の間の均一性及び比較同等性は、最終標的物質の製造元となる均質な状態となるまで全サンプルを還元することにより確保する。次に還元したサンプルを円筒状のアルミニウムカソード内で圧縮して錠剤成型し、その後ＡＭＳにおける元素同位体比分析に付す。
【００５９】
例えば、本発明の線量付与同位体炭素標識生物学的組成物から得られたサンプルをグラファイトに変換してよく、本発明の微量線量付与同位体ハロゲン化物標識生物学的組成物から得られたサンプルをハロゲン化銀の塩に変換してよく、本発明の微量線量付与同位体アルミニウム標識生物学的組成物から得られたサンプルを酸化アルミニウムに変換してよく、そして、本発明の微量線量付与同位体カルシウム標識生物学的組成物から得られたサンプルを二ハロゲン化カルシウム又は二無水物に変換してよい。変換は例えば一般的には水素又は鉄又はコバルトの触媒又はバインダー上の亜鉛によるＣＯ２の還元によりグラファイトに還元する前にＣＯ２にまで酸化することにより炭素サンプル（１４Ｃを含有する）について実施する（Ｖｏｇｅｌ  Ｊ  Ｓ（１９９２）Ｒａｐｉｄ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｒａｐｈｉｔｅ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ＡＭＳ，Ｒａｄｉｏｃａｒｂｏｎ，３４，３４４−３５０）。酸化は酸化銅のような酸化剤と共に９００℃までの温度において約８時間、炉内で加熱される密封試験管内で行う。得られたＣＯ２は、冷却しながら約１８時間、約５００℃までの温度で、亜鉛及びチタンの水素化物のような還元剤及び触媒としてのコバルトを用いながら低温転移の後の第２工程においてグラファイトまで還元する。次にコバルト／グラファイトを円筒状のアルミニウムカソード内で圧縮して錠剤成型し、その後ＡＭＳにおける元素同位体比分析に付す。
【００６０】
或いは、サンプル調製は例えばＷＯ０１／５９４７６の向上した手法により行ってよく、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。好ましくはＷＯ０１／５９４７６の方法に従って、好ましくは電気伝導性でありサンプルとバインダーの混合物を錠剤に圧縮成型できる何れかの物質であってよいバインダーとサンプルを均質に混合する。より好ましくは、バインダーは例えば、検出すべき同位体が１４Ｃである場合は何れかのグラファイト、コバルト又はアルミニウム粉末の１つ又は混合物であり、例えば検出すべき同位体がプルトニウムである場合は酸化アルミニウム及び鉄又は酸化鉄の１つ又は混合物である。
【００６１】
本発明の本実施形態の特定の利点においては、専売性の細胞系統は通常は入手できないため、放射性培地中で専売性の細胞系統を培養することにより放射性同位体１つ以上を包含する専売性の他社製生物学的物質を含む放射性同位体標識生物学的物質を製造することは通常は不可能である。例えば、専売性生物医薬の排他性は誘導元の細胞系統の排他性を維持することにより維持してよい。本発明の方法はその放射性同位体標識類縁体の化学的合成手段によるが、その生物学的活性を改変することなく製造を可能にし、これにより、ジェネリックの等価物との直接比較及び生物学的同等性の測定が可能となる。
【００６２】
このような場合、熟練したＡＭＳオペレーターはＡＭＳ結果を解釈し、それらが同一かどうか、そして何らかの相違がある場合はそれらが生物学的非同等性の結果であるか、又は生物学的同等性とは無関係のサンプル又は宿主の変動の結果であるかどうかを判断することができる。
【００６３】
或いは、生物学的物質自体の合成が不可能である場合は、放射性同位体標識内因性ヒト又は動物の生物学的物質を合成することはできない。本発明の方法は、内因性のヒト又は動物の生物学的物質Ｂ又は内因性の遺伝子操作された生物学的物質Ｂの生物学的同等性のＡＭＳ測定を可能にする。
【００６４】
或いは、方法は、競合ジェネリック生物学的物質Ｂの専売生物学的物質Ｂとの生物学的非同等性を決定することによりジェネリックがジェネリック生物学的物質として、又は、海賊版生物学的物質として専売品を誤って置き換えているのではないことを確実なものとするためのものであってよい。
【００６５】
本発明の別の態様において、インビトロ又はインビボの代謝の特性を与えるＡＭＳ検出における本発明の生物学的組成物の使用が提供される。好ましくは、本方法は前述の通り定義される方法を用いて対象に投薬し、ＡＭＳ検出用のサンプルを誘導することにおいて行う。投薬及びＡＭＳ検出は当業者の知る通りであり、例えばＷＯ０１／５９４７６に記載されており、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。対象は前述で定義した通り何れかのヒト、動物又は植物であってよい。
【００６６】
図１は１４Ｃ−ＮＥＭ−標識ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の５０ｄｐｍもの少量と共に予め投与した場合に、ＡＭＳにより、ラットにおける蛋白質濃度を測定できることを示したグラフである。
【実施例】
【００６７】
本発明は、以下の実施例を参照しながら非限定的方法においてこれより説明する。
【００６８】
（実施例１−生物学的物質Ｂの生物学的活性が本発明のプロセスにより影響されないことの実証）
約１５０，０００ＭＷの抗体を１４Ｃ標識して２段階の異なるパーセント取り込みの本発明の生物学的組成物とした。組成物の生物学的活性を試験し、結果は生物学的活性に影響が無いことを示していた。未標識の抗体を対照として使用したところ、生物学的活性に影響が無いことが示された。
【００６９】
（実施例２−生物学的物質Ｂの生物学的活性が本発明のプロセスにより影響されないことの実証）
実施例１のサンプルを対象に投与し、ＡＭＳ試料を得た。ＡＭＳ検出をサンプルに対して実施し、結果を得た。結果は代謝安定性に影響が無いことを示していた。
【００７０】
（実施例３−生物学的物質Ｂの生物学的活性が本発明のプロセスにより影響されないことの実証）
本試験においては、ＡＭＳ同位体含有部分を蛋白質に共有結合した。標識された蛋白質をラットに静脈内投与し、次に血液及び血清を経時的にサンプリングした。血液及び血清サンプルをＡＭＳにより分析し、各時点における蛋白質濃度を測定した。
【００７１】
（方法）
（蛋白質標識）
ヒト血清アルブミン（ＨｕＳＡ）をＳｅｒａＣａｒｅ，ＵＳＡより組換え型として購入した（純度＞９８％）。ＨｕＳＡは分子量６６，５００の十分特性化された蛋白質であり、３５システイニル残基を含有し、そのうち１つのみ（残基３４）が遊離の還元型である［１］。マレイミドは遊離のスルフィドリルと反応することが知られており［２］、従って、１４Ｃ−Ｎ−エチルマレイミド（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒａｄｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）をＨｕＳＡと１４Ｃ−ＮＥＭ１モル対ＨｕＳＡ１モルの比で３７℃で６時間、反応させた。（本実施例においては１４Ｃは「ＡＭＳ同位体」とした。）反応混合物をリン酸塩緩衝食塩水（ｐＨ７）中に入れた。反応の後、１４Ｃ−ＮＥＭ−ＨｕＳＡ産物をＵｌｔｒａ遠心分離フィルター装置（Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−４，１０，０００分子量、入手元：Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＵＫ）を用いて精製した。濾液（蛋白質）を生理食塩水に溶解した。１４Ｃ−標識蛋白質を非標識蛋白質で希釈し、それぞれ、非放射能３７８５、１９８２及び１８９崩壊／分（ｄｐｍ）／ｍｇの３溶液を得た。反応のモル比は１１４Ｃ−ＮＥＭ対２０ＨｕＳＡとした。
【００７２】
（１４Ｃ−ＮＥＭ−ＨｕＳＡの分析）
１４Ｃ−ＮＥＭ−ＨｕＳＡ産物のサンプルをトリプシン消化及び蛋白質分析に適用可能な標準的方法を用いたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦによる分析に付した［例えば３］。総蛋白質は［４］に記載される通り測定した。
【００７３】
（動物及び投薬）
各１４Ｃ−標識薬剤をＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ  Ｃｒｌ：ＣＤ（ＳＤ）ラット各々４匹の３群（平均体重２４２ｇ）に投与し、各群には異なる比放射能の蛋白質の１つを与えた。全用量は１ｍｇ／ｋｇ体重の用量比率で静脈内投与した（動物当たり約０．５ｍｌ投与）。各投与群に対する投与放射能量は動物当たりそれぞれ９１４、４８６及び５０ｄｐｍとなった。
【００７４】
投薬前、動物は最低５日間馴化させた。投薬の前後、動物は相対湿度４０〜７０％において１９〜２５℃の温度にサーモスタットで維持された室内で飼育し、１２時間照明（０６００〜１８００）／１２時間消灯の周期で蛍光灯に曝露した。
【００７５】
（血液及び血清のサンプリング）
投与後１、２、６、１２、２４、３０、４８、５４及び７２時間の各々において各動物の側方尾部静脈から血液サンプル（名目７５μｌ）を採取した。血液の追加サンプル（名目５００μｌ）を１２、２４、４８及び７２時間に採取した。血液は非ヘパリン処理の試験管内に収集した。５００μｌサンプルを凝固させ、遠心分離して血清を調製した。血液及び血清は採取後即座に凍結し、分析時まで−６０〜−８０℃で保存した。
【００７６】
（サンプルの分析）
全ての血液及び血清試料を予め記載［５］されている通りＡＭＳにより分析して１２Ｃ：１４Ｃ比（パーセントモダンカーボンとして報告）を測定した。その結果をｄｐｍ／ｍｌ血液又は血清に変換［６］し、次に投与した蛋白質の比放射能から蛋白質のｎｇ等量に変換した。
【００７７】
（結果及び考察）
トリプシン消化物及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦは１４Ｃ−ＮＥＭが残基３４において遊離のスルフィドリル基に共有結合していることを示していた。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＦはトリプシン消化により生成した蛋白質フラグメントの分子量を測定するものである。ＮＥＭは約１２５質量追加し、２５５８．３６の分子イオンを有するフラグメントが観察され、以下のアミノ酸配列：
ＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫ（配列番号１）
におけるシステイン残基へのＮＥＭの結合に相当していた。
【００７８】
１４Ｃ−ＮＥＭ−ＨｕＳＡの濃度は全血及び血清の全サンプルにおいてＡＭＳで測定した。僅か５０ｄｐｍの標識蛋白質を投与したラットからも誘導されたサンプル中の蛋白質濃度を測定することが可能であった（図１）。これを考慮すれば、この型の従来の試験においては放射能投与量は動物当たり約３×１０７ｄｐｍとなる。大部分の従来の実験室における放射能のバックグラウンド値は約５０ｄｐｍである。エクスビボで比較的大分子量の化合物に「ＡＭＳ同位体」を結合させる標識手法を用いることは、インビボの生物学的な系において化合物を追跡可能にしたことが試験により示されている。この特定の例において、生物学的系はラットであるが、概念はヒトを包含する如何なる動物種に対しても等しく証明されている。使用した１４Ｃの水準は従来の放射能測定方法により検出されるには少量すぎており、そして唯一ＡＭＳのみが必要な感度を有している。
【００７９】
図１。１ｍｇ／ｋｇ１４Ｃ−標識ＨｕＳＡ投与後の経時的なラット血液及び血清中のＨＳＡ濃度（μｇ／ｍｌ）。蛋白質濃度はＨｕＳＡ上の１４Ｃ−標識のＡＭＳ分析を用いて測定した。エラーバーは標準偏差であり、ｎ＝４である。
【００８０】
ＨＳＡは標識を付加できる遊離ＳＨ基を僅か１つ含有するのみであるため、それは方法論的に困難な試験をもたらすことは当業者には明らかであるだろう。更に又、標識された蛋白質は血清及び全血の両方において測定できることも示されている。ＥＬＩＳＡのような蛋白質測定の従来法は血清で使用できるのみである。
【００８１】
（参考文献）
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３．    Ｔｉｅ，Ｊ．Ｋ．，Ｖ．Ｐ．Ｍｕｔｕｃｕｍａｒａｎａ，Ｄ．Ｌ．Ｓｔｒａｉｇｈｔ，Ｋ．Ｌ．Ｃａｒｒｉｃｋ，Ｒ．Ｍ．Ｐｏｐｅ，およびＤ．Ｗ．Ｓｔａｆｆｏｒｄ，Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ  ａｓｓｉｇｎｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖｉｔａｍｉｎ  Ｋ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｇａｍｍａ−ｇｌｕｔａｍｙｌ  ｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ  ｂｙ  ｍａｔｒｉｘ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｌａｓｅｒ  ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ／ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ−ｏｆ−ｆｌｉｇｈｔ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００３．２７８（４６）：ｐ．４５４６８−７５．
４．    Ｍｏｈａｍｍｅｄｉ，Ｈ．，Ｓ．Ｍａｍｏｕｚｉ，Ｃ．Ａｌｌａｌ，Ｍ．Ｇｈａｆｆｏｒ，Ｈ．Ｒａｂｈｉ，およびＭ．Ｃ．Ａｂｂａｄｉ，Ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｍｉｃｒｏｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ−ｂｌｕｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ａｒｃｈ  Ｉｎｓｔ  Ｐａｓｔｅｕｒ  Ａｌｇｅｒ，１９８９．５７：ｐ．１５１−６２．
５．    Ｓａｒａｐａ，Ｎ．，Ｐ．Ｈ．Ｈｓｙｕ，Ｇ．Ｌａｐｐｉｎ，およびＲ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｒ，Ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｏ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ：ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｍｉｃｒｏｄｏｓｅ  ｏｆ  １４Ｃ−ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ  ｍｅｓｙｌａｔｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｒａｌ  ｎｅｌｆｉｎａｖｉｒ  ｔｏ  ｈｅａｌｔｈｙ  ｖｏｌｕｎｔｅｅｒｓ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ，２００５．４５（１０）：ｐ．１１９８−２０５．
６．    Ｌａｐｐｉｎ，Ｇ．およびＲ．Ｃ．Ｇａｒｎｅｒ，Ｕｌｔｒａ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｄｉｏｌａｂｅｌｌｅｄ  ｄｒｕｇｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ａｃｃｅｌｅｒａｔｏｒ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ，ｉｎ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ｉ．Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅｄｉｔｏｒ．２００３，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ：Ａｍｓｔｅｒｄａｍ．ｐ．３３１−３４９．
本発明のさらなる局面は、上記から明らかとなる。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
【図１】１ｍｇ／ｋｇ１４Ｃ−標識ＨｕＳＡ投与後の経時的なラット血液及び血清中のＨＳＡ濃度（μｇ／ｍｌ）。蛋白質濃度はＨｕＳＡ上の１４Ｃ−標識のＡＭＳ分析を用いて測定した。エラーバーは標準偏差であり、ｎ＝４である。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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