(57)【要約】  本発明は、複数の反応を実施するためのマイクロ流体装置に関する。特に、本発明は、毛管の内面に解放可能な試薬のアレイを設けることにより、複数の化学的及び／又は生物学的反応を並行的に実施するための方法及び装置に関する。本発明は、毛管アレイを使用して多数のポリヌクレオチド増幅反応を実施することによって例証される。加えて、本発明は、ポリヌクレオチドの増幅と増幅産物の検出及び／又は解析とを統合するための方法及び装置に関する。
2008506376.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数の化学反応を並行的に実施する方法であって、
ａ．その内面に設計された複数の機能性リング（ＦＲ1〜ＦＲn）を含み、各機能性リングが、少なくとも第一の区域（Ｒ）及び第二の区域（Ｆ）を含む内面を有し、第一の解放可能な試薬が機能性リングの内面内で前記第一の区域（Ｒ）に解放可能に付着しており、第二の解放可能な試薬が毛管の機能性リングの内面内で前記第二の区域（Ｆ）に解放可能に付着しており、各所定のリングにおいて、前記区域（Ｆ）が、前記区域（Ｒ）と重複する、又は第一の試薬と第二の試薬とをそれらの解放後に混合させて、少なくとも二つの解放された試薬を基剤として含む反応を実施するのに十分なほど前記区域（Ｒ）と接近しているものである毛管を用意するステップ、
ｂ．すべての反応に共通の一つ以上の試薬及び適切なバッファを含む反応溶液で前記毛管を満たすステップ、
ｃ）毛管の内面に付着した試薬を解放するステップ
を含み、それにより、前記毛管中で複数の反応を並行的に実施することを可能にして、各反応を、適切な試薬が混合するところの別々の領域で起こさせるものである方法。
【請求項２】
おそらくは試料に含まれる一つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の増幅を並行的に実施するための、
ａ．その内面に設計された複数の機能性リング（ＦＲ1〜ＦＲn）を含み、各機能性リングが、少なくとも第一の区域（Ｒ）及び第二の区域（Ｆ）を含む内面を有し、各機能性リングがリバースオリゴヌクレオチドプライマーとフォワードオリゴヌクレオチドプライマーとの少なくとも一つの対を有し、前記フォワードプライマーが、毛管の内面内で前記第一の区域（Ｒ）に解放可能に付着しており、前記リバースプライマーが、毛管の内面内で同じ機能性リングの前記第二の区域（Ｆ）に解放可能に付着しており、前記区域（Ｆ）が、前記区域（Ｒ）と重複する、又はリバースプライマーとフォワードプライマーとをそれらの解放後に混合させ、前記標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施するのに十分なほど前記区域（Ｒ）と接近しているものである毛管を用意するステップ、
ｂ．増幅のための可能な標的としてのポリヌクレオチド配列、適切なバッファ及び増幅反応に必要な一つ以上の試薬を含む反応溶液で前記毛管を満たすステップ、
ｃ．毛管の内面に付着したフォワード及びリバースプライマーを解放するステップ
を含み、それにより、前記プライマーが標的ポリヌクレオチド配列とで特異的にハイブリッド形成することを可能にし、複数の増幅反応が前記毛管中で並行的に起こることを許し、各増幅反応を、前記標的ポリヌクレオチド配列とでハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプライマーが混合するところの別々の領域で起こさせる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
毛管の内面に付着した複数のポリヌクレオチドプローブによってハイブリッド形成を介して増幅産物を捕捉するステップ（ｄ）をさらに含む、請求項２記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｄ）で得られたハイブリッド形成複合体を検出することによってポリヌクレオチド配列の変異を検出するステップをさらに含む、請求項３記載の方法。
【請求項５】
毛管の前記機能性リングが、スペーサ（Ｓ）を形成する領域によって分けられ、前記スペーサ領域中の毛管の内面には試薬が付着しておらず、スペーサが、二つの別個の機能性リングから解放された試薬が混合することを防ぐ、請求項１〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
毛管の前記機能性リングが、スペーサ（Ｓ）を形成する領域によって分けられ、前記スペーサ領域中の毛管の内面にはプライマーが付着しておらず、スペーサが、二つの別個の機能性リングから解放されたプライマーが混合することを防ぐ、請求項２〜４のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
前記毛管が剛性であり、好ましくはガラス製である、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
前記毛管が、１〜５００μm、好ましくは１〜２００μm、より好ましくは１〜１００μmの直径を有する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
前記機能性リングが、２０μm〜１０mm、好ましくは１００μm〜１mmの軸方向長さを有する、請求項１〜８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記第一及び第二の試薬又はオリゴヌクレオチドプライマーが付着しているとき、解放後にそれらを混合させて反応を実施させるためのそれらの間の距離が１〜５００μmの範囲である、請求項１〜９のいずれか１項記載の方法。
【請求項１１】
前記解放可能なオリゴヌクレオチドプライマーが、毛管の内面に結合した開裂可能な部分に共有結合的にリンクしている、請求項２〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１２】
前記開裂可能な部分が光分解によって開裂可能である、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
前記解放可能なオリゴヌクレオチドプライマーが鎖の分断によって解放可能である、請求項２〜１０のいずれか１項記載の方法。
【請求項１４】
各機能性リング中の毛管の内面に付着したオリゴヌクレオチドプライマーの密度が１平方ミリメートルあたり１〜１０００フェントモルである、請求項２〜１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
毛管上の機能性リングの数が約２〜１００、好ましくは１０〜５０である、請求項１〜１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
前記反応溶液が、
―標的ポリヌクレオチド配列、たとえば標的ＤＮＡ、
―適切な増幅バッファ、
―場合によっては修飾されているｄＮＴＰ、
―ＭｇＣｌ2、及び
―ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ
を含む、請求項２〜１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
複数の反応を並行的に実施するのに適した毛管であって、その内面に設計された複数の機能性リング（ＦＲ1〜ＦＲn）を含み、各機能性リングが、少なくとも第一の区域（Ｒ）及び第二の区域（Ｆ）を含む内面を有し、各機能性リングが、毛管の機能性リングの内面内で前記第一の区域（Ｒ）に付着した第一の解放可能な試薬及び毛管の機能性リングの内面内で前記第二の区域（Ｆ）に付着した第二の解放可能な試薬を有し、各所定のリングにおいて、前記区域（Ｆ）が、前記区域（Ｒ）と重複する、又はそれぞれの試薬をそれらの解放後に混合させ、少なくとも二つの解放された試薬を基剤として含む反応を実施するのに十分なほど前記区域（Ｒ）と接近しているものである毛管。
【請求項１８】
一つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の増幅を並行的に実施するのに適した、その内面に設計された複数の機能性リング（ＦＲ1〜ＦＲn）を含み、各機能性リングが、少なくとも第一の区域（Ｒ）及び第二の区域（Ｆ）を含む内面を有し、各機能性リングがリバースオリゴヌクレオチドプライマーとフォワードオリゴヌクレオチドプライマーとの少なくとも一つの対を有し、前記フォワードプライマーが、毛管の内面内で前記第一の区域（Ｒ）に解放可能に付着しており、前記リバースプライマーが、毛管の内面内で同じ機能性リングの前記第二の区域（Ｆ）に解放可能に付着しており、前記区域（Ｆ）が、前記区域（Ｒ）と重複する、又はリバースプライマーとフォワードプライマーとをそれらの解放後に混合させ、標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施するのに十分なほど前記区域（Ｒ）と接近している、請求項１７記載の毛管。
【請求項１９】
複数の反応を実施するためのマイクロ流体装置であって、
ａ．請求項１７〜１８のいずれかに記載の一つ以上の毛管、
ｂ．反応溶液を循環させるための手段、
ｃ．毛管中の反応溶液の流量を制御するための手段、
ｄ．毛管の内面に付着した解放可能な試薬又はオリゴヌクレオチドプライマを解放するための手段、
ｅ．場合によっては、反応生成物を定量するための手段
を含むマイクロ流体装置。
【請求項２０】
反応溶液を循環させるための前記手段が圧力駆動シリンジポンプを含む、請求項１９記載のマイクロ流体装置。
【請求項２１】
蛍光材料で標識された反応生成物を定量するための手段として、毛管の定量的蛍光画像を生成するための、励起光源を蛍光発光の検出器、たとえばＰＭＴ、スキャナ又は線形電荷結合素子（ＣＣＤ）と関連させたものを含む、請求項１９又は２０記載のマイクロ流体装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、複数の反応を実施するためのマイクロ流体装置に関する。特に、本発明は、毛管の内面に解放可能な試薬のアレイを設けることにより、複数の化学的及び／又は生物学的反応を並行的に実施するための方法及び装置に関する。本発明は、毛管アレイを使用して多数のポリヌクレオチド増幅反応を実施することによって実証される。加えて、本発明は、ポリヌクレオチドの増幅と増幅産物の検出及び／又は解析とを統合するための方法及び装置に関する。
【０００２】
発明の背景
多数のゲノムに関して現在利用可能なドラフト配列は、個々のサンプル配列を参照配列と比較するために開発されているアッセイのための参照配列として働くことができる。一例として、医療の分野では、参照配列と、障害を示す、又はそのような障害もしくは疾病に対する素因を有する人から得られた配列との間のそのような比較解析は、前記人の障害又は疾病の診断、予後及び／又は適切な処置の提供を可能にするはずである。したがって、ゲノム全体の配列決定によって生成される配列と比較して、特にモノ又はポリヌクレオチド多形に基づいて遺伝子多様性を研究するためには、核酸配列の解析ツールが必要である。
【０００３】
核酸検出及び／又は解析のための一般的前提条件は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）プロトコルのようなプロトコルに準じる標的核酸配列の増幅である。
【０００４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、主として簡単かつ非常に汎用的であり、具現化するのに比較的低いコストしか要しない理由で、遺伝子解析にとって驚くほどの成功であることが証明された。ポリメラーゼ連鎖反応の方法論は、米国特許第４，６８３，２０２号及び第４，６８３，１９５号でより詳細に記載されている。
【０００５】
基本的には、ＰＣＲの第一のステップは、標的ＤＮＡ、大きく過剰量のプライマー、４種のヌクレオチド塩基及びＤＮＡポリメラーゼを含有する反応混合物を加熱して、試料中のＤＮＡのすべての対合鎖を変性又は分離させることにある。このようにして、プライマーに関して一本鎖がアクセス可能になる。次に、試料を冷却して二本鎖を再び形成させる。大きく過剰量のプライマーのせいで、標的ＤＮＡテンプレートの変性又は分離した鎖の２本の鎖は、互いに結合するのではなく、相補的プライマーに結合する。第三のステップで、温度を調節してＤＮＡポリメラーゼ酵素にとって最大限の活性を得る。短いプライマーにアニールされるＤＮＡ配列ごとに、酵素はプライマーの配列を伸長させて、ＤＮＡ配列の元の二重らせん構造が複製されるようにする
【０００６】
このプロセスは複数回、通常は２０〜３０回繰り返され、１回ごとに、存在するＤＮＡの量がほぼ倍増する。結果、標的ＤＮＡの「増幅」として知られる、標的ＤＮＡ濃度の指数関数的増大が得られる。
【０００７】
核酸増幅技術は、たとえば食品産業や農産業をはじめとする種々の分野では汚染物質検出のために、又は医療の分野では疾病診断や遺伝子試験のために開発されてきた。
【０００８】
ＰＣＲは通常、熱的に制御される熱交換器を含む機器の中に配置される使い捨て反応管、たとえば小さなプラスチック製のマイクロ遠心分離管又は試験管の中で実施される。ＰＣＲ反応量は、反応混合物がマイクロ遠心分離管中に貯蔵される従来のヒートブロック又は液槽熱交換ＰＣＲ機器設計では、一般には１０マイクロリットル〜１．５ミリリットルである。
【０００９】
完全な診断又は解析目的の場合、同じ試料に対して多数回の増幅反応を実施することをしばしば要する。理想的には、複数の増幅を並行的に実施するための手順は、増幅反応ことに少量の試料及び少量の反応混合物を用いながら感度を損失することなく実施されるべきである。
【００１０】
手法はまた、実施しやすいもの、すなわち、技術者によって実施される手作業ステップを最小限しか要しないものであるべきである。
【００１１】
したがって、少量の同じ試料に頼るだけで複数の増幅アッセイを並行的に実施することを可能にする新たな手法を開発する必要がある。
【００１２】
一つの解決策は、特に遺伝子型解析のために当該技術で広く使用されている多重増幅である。多重増幅は、互いには相互作用しないように設計されている異なるプライマー対を混合することによって同じ反応管の中で多数のＰＣＲ増幅を実施することにある。同じ反応管の中で混合した異なる増幅産物は、たとえば毛管電気泳動によるサイズ分離によって検出することができる。
【００１３】
しかし、異なるプライマー対の間での競合的阻害をはじめとする様々な理由から、標的配列が異なるプライマー間で重複又はハイブリッド形成する場合、一部の増幅反応が起こらず、偽陰性につながり、多重増幅の感度を下げることがある。
【００１４】
ＰＣＴ特許出願ＷＯ０１／２７３２７（Protogene、２０００年１０月６日）は、二つのアレイを並列にし、それらのアレイの表面上の試薬どうしを接触させることによって多重増幅を実施するための装置を記載している。しかし、このようなアレイベースの装置はそのフォーマットによって妨げられる。平面アレイは実に取り扱いにくく、複雑な酵素反応を起こさせない。
【００１５】
したがって、当該技術において、複数のヌクレオチド増幅を実施するのに適した高感度の代替方法を提供する必要がある。
【００１６】
したがって、本発明の第一の目的は、単一の反応量で複数のヌクレオチド増幅を並行的に実施するための方法及び装置を提供することである。
【００１７】
より一般的には、本発明の一つの目的は、単一の反応量で複数の反応、特に複数の化学反応を実施するための方法及び装置を提供することである。
【００１８】
本発明の方法及び装置は、実に、単一の反応量を使用して多数の反応を実施することによって単位時間あたり多量の産物を生成することができる。さらには、本発明は完全自動化に適応させやすい。
【００１９】
本発明において、好都合にも、各反応に対応する試薬が毛管の別々の区域中に解放される一つの毛管を使用して、単一の反応量で種々の反応を実施することができることが示された。実際に、本発明において、毛管の別々の区域に存在する産物は軸方向の制御可能な拡散能力を有し、その能力を利用して、毛管の別々の領域に存在する他の産物と混合させ、他の別々の領域に存在する他の産物と混合することを防ぐことができる。
【００２０】
ＰＣＲ増幅反応チャンバを毛管電気泳動と組み合わせたものを含むマイクロ流体装置が米国特許第６，３７２，４８４号に記載されている。毛管は、増幅産物の電気泳動及びさらなる解析を可能にする。
【００２１】
また、反応溶液を受けるための反応チャンバならびに加熱要素及び冷却要素に隣接する毛管を含み、それによって反応溶液における温度設定を促進する、ＰＣＲ増幅を実施するための装置が当該技術で記載されている（たとえば、米国特許第５，１７６，２０３号、米国特許第５，８２７，４８０号を参照）。
【００２２】
また、温度を制御するためのシステムを含む、毛管中でＰＣＲ増幅を実施するための装置がRoche Diagnosticsから市販化されている（Lightcycler（著作権）、F. Hoffman-La Roche社、スイスBasel）。
【００２３】
上述の毛管は、小さなＰＣＲ反応量を異なる反応チャンバから移動させるための手段として使用されるか、小さなＰＣＲ反応量への効率的な熱伝導を最適化し、それによって反応時間を制限するために使用される。
【００２４】
これらの装置のいずれも、多重増幅を実施するための解決策を提供していない。
【００２５】
したがって、本発明の第一の目的は、複数の反応を並行的に実施するのに適した毛管であって、その内面に設計された複数の機能性リング（ＦＲ1〜ＦＲn）を含み、各機能性リングが、少なくとも第一の区域（Ｒ）及び第二の区域（Ｆ）を含む内面を有し、各機能性リングが、毛管の機能性リングの内面内で前記第一の区域（Ｒ）に付着した第一の解放可能な試薬及び毛管の機能性リングの内面内で前記第二の区域（Ｆ）に付着した第二の解放可能な試薬を有し、各所定のリングにおいて、前記区域（Ｆ）が、前記区域（Ｒ）と重複する、又はそれぞれの試薬をそれらの解放後に混合させ、少なくとも二つの解放された試薬を基剤として含む反応を実施するのに十分なほど前記区域（Ｒ）と接近しているものである毛管に関する。
【００２６】
本明細書で使用する「毛管」とは、直径１ミリメートル未満の単一の管又は単一の通路をいう。
【００２７】
上記定義では、機能性リングの内面とは、機能性リングの全面と同一又はそれよりも小さい、区域Ｒ及びＦを含む毛管の内面の一部である。
【００２８】
毛管に適したいかなる材料をも本発明で使用することができる。これらの材料としては、とりわけガラス、ケイ素、石英、金属、より好ましくはガラス、ケイ素又は石英がある。
【００２９】
一つの実施態様では、実施例１及び２で例示するように、毛管は剛性であり、好ましくはガラス製である。
【００３０】
本発明の毛管の直径の例を表１に記す。一つの実施態様では、本発明の毛管は、直径が１〜５００μm、好ましくは１〜２００μm、より好ましくは１〜１００μmである。
【００３１】
【表１】
2008506376.tif 000003
【００３２】
本明細書で使用する「機能性リング」とは、少なくとも二つの解放可能な試薬が解放可能な方法で付着している毛管の内面の区分に対応する毛管の機能単位であって、一つの第一の試薬が第一の区域に付着しており、一つの第二の試薬が第二の区域に付着しており、前記第二の区域が、第一の区域と重複する、又は試薬どうしを特にそれらの解放後に混合させ、少なくとも二つの解放された試薬を基剤として含む少なくとも一つの反応を実施するのに十分なほど第一の区域と接近しているところの機能単位をいう。
【００３３】
本明細書で使用する「十分に接近」とは、各機能性リング（Ｆ1／Ｒ1〜Ｆ2／Ｒ2・・・）の二つの区域が、二つの解放可能な試薬（それぞれ第一及び第二の区域に付着している）が反応に加わることを可能にするのに十分な隣接状態にあることを示す。増幅反応の場合、これは、二つの解放可能なリバース及びフォワードプライマーが標的ポリヌクレオチド配列とでハイブリッド形成して増幅を可能にすることを含意又は意味する。
【００３４】
一例では、前記第一及び第二の試薬又はオリゴヌクレオチドプライマーが付着しているとき、解放後にそれらを混合させて反応を実施させるためのそれらの間の距離は１mm以下であり、たとえば、１〜５００μm、１〜２００μm、１〜１００μm、１〜５０μm又は１〜２０μmである。
【００３５】
各機能性リング中に解放される二つの試薬の混合によって誘発される反応を実施するための毛管を記載することは好都合であるが、前記毛管の多くの変形が本発明の考察の範囲内である。場合によっては、三つ以上の試薬を同じ機能性リングに付着させて、三つ以上の試薬を使用して一つの反応を実施することもできるし、同じ反応量で多数の反応、たとえば多重増幅を実施することもできる。
【００３６】
各試薬は、毛管の内面に付着すると、解放後、制御された拡散の結果として一つの機能性リングの試薬が混合ののち互いに反応することを許されるような方法で延びることができる画定区域を占有する。
【００３７】
当業者によって理解されるように、解放された試薬及び反応生成物の密閉反応領域における分子拡散は、流体粘度に依存するアインシュタインの法則、温度ならびに試薬及び反応生成物の流体力学的径に基づく。
【００３８】
表面積／容積の比が高い毛管では、試薬と内壁との相互作用が軸方向拡散係数に影響を及ぼすということが本発明で示された。
【００３９】
より具体的には、以下のことが示された。
【００４０】
機能性リングのサイズと毛管の半径との比が十分に高いならば、最初の何秒かで、試薬は最初の機能性リングによって画定される毛管区分を占有し、驚くことに、この最初の期間中、軸方向拡散は弱い。軸方向拡散はより広範囲の時間でより重要になる。この結果には二つの原因、幾何学的原因及び生化学的原因がある。拡散係数は等方性であり、そのため、拡散の速度は半径方向と軸方向とで同じである。しかし、毛管の概ね異方性の形状のせいで、毛管半径に等しい距離における半径方向への拡散の特徴的時間は、機能性リング間の空間に等しい距離における軸方向への拡散の特徴的時間よりも小さい。そのうえ、プライマーは、機能性リングの壁に再び捕捉されることがあり、これが、より低速の軸方向拡散をもたらす。
【００４１】
したがって、当業者は、別個の機能性リングからの他の試薬の混合をさけながらも反応が起こるために必要な臨界最低濃度以上である解放後の両試薬の濃度を局所的に得るために、毛管中の分子拡散の有利な性質を考慮しながら、毛管の構造、毛管の内面に付着させる試薬の密度及び区域の寸法を決定する。
【００４２】
一つの実施態様にしたがって、前記画定区域は、図１に示す前記内面の円柱形区分である。
【００４３】
一つの実施態様では、機能性リングの二つの試薬を混合し、同じ円柱形区分の内面に付着させることができ、このように、第一の区域（Ｒ）と第二の区域（Ｆ）とは区別不可能である。もう一つの態様では、図１に示すように、二つの試薬を、毛管の隣接区分に対応する別々の区域に付着させることができる。
【００４４】
本発明の毛管の一つの利点は、一つの機能性リングの試薬が解放後に別の機能性リングに入ることを防ぐために特定の機械的方法、たとえば微細加工された反応ウェル又は化学的方法、たとえば疎水性化学物質を含む化学的バリヤが要らないということである。
【００４５】
毛管の一つの好ましい実施態様によると、各機能性リングは、軸方向長さが２０μm〜１０mm、好ましくは１００μm〜１mmである。
【００４６】
機能性リングの軸方向長さ、毛管の長さ及び毛管の内面に付着させる試薬のタイプに依存して、性能を発揮するための毛管中の機能性リングの数は、約２〜１０００、好ましくは約２〜１００、より好ましくは１０〜５０で異なることができる。
【００４７】
場合によっては、一つの反応の試薬又は生成物が別の反応の試薬又は生成物と混合することを防ぐため、毛管は、図１に示すように、二つの機能性リングの間にスペーサ（Ｓ）を形成する領域を含むことができ、前記スペーサ領域中の毛管の内面には試薬が付着しておらず、スペーサが、二つの別個の機能性リングから解放された試薬が混合することを防ぐ。
【００４８】
ある対の二つのオリゴヌクレオチドプライマーが毛管の内面に付着した試薬として使用される特定の実施態様では、毛管の機能性リングは、スペーサ（Ｓ）を形成する領域によって分けられ、前記スペーサ領域中の毛管の内面にはプライマーは付着していない。スペーサは、二つの別個の機能性リングから解放されたプライマーが混合することを防ぐ。
【００４９】
本装置及び方法と適合性である反応は非常に広く、場合によっては一つ以上の試薬を共通に含む同じ反応溶液中で反応を実施することができるならば、すべての非単分子反応、好ましくは、二つ以上の試薬を伴う化学反応を包含する。
【００５０】
したがって、試薬は、非限定的に、ペプチド、多糖類、炭水化物、脂質、タンパク質、細胞、ウイルス及び核酸の中から選択することができる。
【００５１】
反応は、少なくとも一つの機能性リングに関して毛管の内面に付着した試薬を解放し、それらを混合することによって誘発される。試薬及び反応生成物は、毛管中の限られた軸方向拡散にしたがって機能性リング中の別々の領域に密閉されたままである。
【００５２】
解放可能な試薬を毛管中に固定化する方法は当該技術で記載されている。特に、解放可能な試薬は、現場で合成し、毛管に付着させることもできるし、第一のステップで合成し、第二のステップで毛管に付着させることもできる。
【００５３】
試薬は、解放可能な部位を介して、たとえば固定化された分子を開裂可能な部分とつなぐことによって固定化される。解放可能な試薬を指定区域で毛管の内面に付着させる方法は、当該技術、特に米国特許出願２００３−００３２０３５−Ａ１（Chatelainら、ＣＥＡ、２００３年）に記載されている。
【００５４】
本発明の一つの好ましい実施態様では、毛管は、一つ以上のポリヌクレオチド増幅を実施するのに適している。
【００５５】
特に、毛管は、複数のポリヌクレオチド増幅を並行的に実施するのに適している。
【００５６】
好ましい実施態様では、各機能性リングは、少なくとも第一の区域（Ｒ）及び第二の区域（Ｆ）を含む内面を有し、一つのポリヌクレオチド増幅のフォワードプライマーとしての第一の解放可能なオリゴヌクレオチドが毛管の内面内の前記第一の区域（Ｒ）に解放可能に付着しており、リバースプライマーとしての使用に適した第二の解放可能なオリゴヌクレオチドが毛管の内面内の前記第二の区域（Ｆ）に解放可能に付着している。
【００５７】
したがって、本発明はまた、一つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の増幅を並行的に実施するのに適した毛管であって、その内面に設計された複数の機能性リング（ＦＲ1〜ＦＲn）を含み、各機能性リングが、少なくとも第一の区域（Ｒ）及び第二の区域（Ｆ）を含む内面を有し、各機能性リングがリバースオリゴヌクレオチドプライマーとフォワードオリゴヌクレオチドプライマーとの少なくとも一つの対を有し、前記フォワードプライマーが、毛管の内面内で前記第一の区域（Ｒ）に解放可能に付着しており、前記リバースプライマーが、毛管の内面内で同じ機能性リングの前記第二の区域（Ｆ）に解放可能に付着しており、前記区域（Ｆ）が、前記区域（Ｒ）と重複する、又はリバースプライマーとフォワードプライマーとをそれらの解放後に混合させ、標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施するのに十分なほど前記区域（Ｒ）と接近しているものである毛管に関する。
【００５８】
本発明にしたがって、フォワードプライマーとは、ハイブリッド形成後、標的ポリヌクレオチド配列（特に標的ＤＮＡ）の一つの鎖（＋）への伸長を起動することができるプライマーである。リバースプライマーとは、ハイブリッド形成後、前記標的ポリヌクレオチド配列（特に標的ＤＮＡ）の相補的鎖（-）への伸長を起動することができるプライマーである。各機能性リングは、一つの特定の核酸配列を増幅するためのリバースプライマーとフォワードプライマーとの少なくとも一つの対を含む。同じ標的配列の異なる領域に特異的な異なるプライマー配列を同じ毛管中で異なる機能性リングに付着させると、同じ標的配列の異なるフラグメントの多数の増幅を実施することができる。
【００５９】
プライマーは、酵素的、化学的、熱的又は光分解的処理をはじめとする当該技術で公知の通常技術を使用して解放することができる。
【００６０】
たとえば、プライマーは、はじめに固定化されたポリヌクレオチドとでハイブリッド形成させ、次いで毛管の内面から鎖の分断によって解放してもよい。プライマー解放のもう一つの例では、ポリヌクレオチド増幅反応のための一つ以上のプライマーを開裂可能な部位を介してアレイ上に共有結合的に固定化することもできる。開裂可能な部位は、現場合成中に毛管の内面に結合した部分に導入することができる。あるいはまた、共有結合的又は非共有結合的に毛管上に固定化する前に、解放可能な部位を含有する固定化された部分を調製してもよい。
【００６１】
一つの特定の実施態様では、前記開裂可能な部分は光分解によって開裂可能である。
【００６２】
通常、各機能性リング中の毛管の内面内に付着させるオリゴヌクレオチドプライマーの密度は、１平方ミリメートルあたり約１〜１０００フェントモル、好ましくは１０〜１００fmole/mm2である。
【００６３】
好ましい実施態様では、各機能性リングは、それぞれが一つの増幅反応のためのリバースプライマー及びフォワードプライマーを含む二つの円柱形区分に分割されている。
【００６４】
毛管のいくつかの寸法及び対応する機能性リングの数を以下の表２に記す。この表で一覧する値は例を示すにすぎず、本発明の範囲を限定しない。
【００６５】
【表２】
2008506376.tif 000004
【００６６】
一つの実施態様では、毛管上の機能性リングの数は、約２〜１００、好ましくは１０〜５０である。
【００６７】
本発明の毛管のもう一つの利点は、マイクロ流体装置に容易に統合することができることである。
【００６８】
したがって、本発明のもう一つの目的は、複数の化学反応を実施するためのマイクロ流体装置であって、
ａ）本明細書で先に定義した発明の一つ以上の毛管、
ｂ）反応溶液を循環させるための手段、
ｃ）毛管中の反応溶液の流量を制御するための手段、
ｄ）毛管の内面に付着した解放可能な試薬を解放するための手段、及び
ｅ）場合によっては、反応生成物を定量するための手段
を含むマイクロ流体装置を提供することである。
【００６９】
装置は、反応溶液を循環させるための手段、すなわち、反応溶液が装置に導入されたのち反応溶液を毛管（反応が起こるところ）に入れて、前記反応生成物の解析の前、最中又は後で反応期間中に溶液流を固定化し、反応生成物を含有する溶液を毛管から取り出すための手段を提供するべきである。
【００７０】
前記装置の一つの実施態様では、毛管流の溶液流は圧力誘発され、反応溶液を循環させるための前記手段は圧力駆動シリンジポンプを含む。
【００７１】
当業者は、多数のオートマットのために開発された加圧注入装置が市販されていることを認識している［Carvo（Applied Biosystems、米カリフォルニア州Foster City）、Hamilton社（米ネバダ州Reno）、Tecan Group社（スイスMannedorf）製のコンピュータ制御シリンジポンプ、Beckman Coulter社のP/ACE（商標）シリーズシステム］。このように、広い範囲の容積及び流量が達成可能である。
【００７２】
他の実施態様にしたがって、溶液流は、たとえば、界面動電的に誘発されたり、剪断力、重力、毛管作用などによって誘発されたりする。
【００７３】
装置はまた、解放可能な試薬を解放するための手段を提供するべきである。このような手段は、たとえば、熱的方法又は照射によって誘発される光化学的方法に基づくことができる。
【００７４】
光化学的方法が使用される場合、前記手段は、レーザ光、ＣＲＴ、ＬＥＤ、共振空洞アノード、フォトダイオード、広波長光などを含むが、これらに限定されない照射光源を含むことができる。照射は、光学的又は物理的な方法を使用して、別々の部位、たとえば毛管の長手に沿いの特定の機能性リングに集束させることができる。この実施態様では、毛管は、好ましくは、光学的に明澄な材料、たとえばガラス又は石英製であり、光を毛管壁に透過させる。
【００７５】
光化学的方法を使用する現場合成を可能にするため、装置はまた、有利には、平行光ビームを発するための手段、たとえば個々のレーザ、マスク、ミラーのアレイ及びＴＶ画面を含むこともできる。
【００７６】
毛管中の生物学的生成物を検出するための方法がいくつか開発された。毛管中の反応生成物の検出は、光化学的、電気化学的、電気泳動的、蛍光的、ＵＶ／ＶＩＳ吸光度、ＭＳ、ＩＲ及び／又はクロマトグラフィー的方法をはじめとする方法によって実施することができる。
【００７７】
光学的検出法が、毛管端部の生成物を検出する必要性によって提起される問題を軽減するため、通常に使用されている。適当な方法は、たとえば、ＵＶ−ＶＩＳ分光光度法、直接蛍光法及び時分解蛍光法である。
【００７８】
一つの特定の実施態様では、装置は、光学的検出を実施するための手段、たとえば、蛍光材料で標識された反応生成物を定量するための手段として、毛管の定量的蛍光画像を生成するための、励起光源を蛍光発光の検出器、たとえばＰＭＴ、スキャナ又は線形電荷結合素子（ＣＣＤ）と関連させたものを含む。
【００７９】
そのうえ、大部分の生物学的反応及び／又は解析が温度を正確に制御することを要する限りにおいて、本発明のマイクロ流体装置は、毛管中の温度を制御するための手段をさらに含むことができる。一例として、ＰＣＲを使用して標的ＤＮＡを増幅する場合、装置温度は通常、４０〜９５℃の間で循環させる。ＰＣＲを毛管中で実施することを可能にするためのシステムは開発され、市販されている。そのようなシステム、たとえばRoche Diagnostics（F. Hoffman-Laroche社、スイスBasel）のLightcyler（毛管中のＰＣＲ）、Beckman Coulter社（Brea、米カリフォルニア州Fullerton）のP/ACE（商標）シリーズシステム（サーモスタットを備えた毛管コンパートメントを用いる毛管電気泳動）を、本明細書に記載する発明のマイクロ流体装置で温度制御された実験（ＰＣＲの場合だけでなく）を実施するように適合させることができる。
【００８０】
一つの特定の実施態様では、装置は複数の毛管を含むことができる。
【００８１】
本発明のもう一つの態様は、複数の反応を実施する方法であって、先に定義した本発明の毛管又は先に定義したような毛管を含む本発明のマイクロ流体装置の使用を含む方法に関する。
【００８２】
より具体的には、本発明は、複数の反応を実施する方法であって、
ａ）先に定義した本発明の毛管又は先に定義したような毛管を含む本発明のマイクロ流体装置を用意するステップ、
ｂ）すべての反応に共通の一つ以上の試薬及び適切なバッファを含む反応溶液で毛管を満たすステップ、及び
ｃ）毛管の内面に付着した試薬を解放するステップ
を含み、それにより、前記毛管中で一つ以上の反応を実施することを可能にして、各反応を、適切な試薬が解放され、混合するところの別々の領域で起こさせるものである方法に関する。
【００８３】
「先に定義した本発明の毛管」により、本明細書で定義されているいかなる毛管をも、一般的な定義として、具体的な実施態様として、又は少なくとも二つの具体的な実施態様の組み合わせとして、本発明で使用することができるということが理解されるべきである。
【００８４】
特に、本発明は、複数の化学反応を並行的に実施する方法であって、
ａ）その内面に設計された複数の機能性リング（ＦＲ1〜ＦＲn）を含み、各機能性リングが、少なくとも第一の区域（Ｒ）及び第二の区域（Ｆ）を含む内面を有し、第一の解放可能な試薬が機能性リングの内面内で前記第一の区域（Ｒ）に解放可能に付着しており、第二の解放可能な試薬が毛管の機能性リングの内面内で前記第二の区域（Ｆ）に解放可能に付着しており、各所定のリングにおいて、前記区域（Ｆ）が、前記区域（Ｒ）と重複する、又は第一の試薬と第二の試薬とをそれらの解放後に混合させて、少なくとも二つの解放された試薬を基剤として含む反応を実施するのに十分なほど前記区域（Ｒ）と接近しているものである毛管を用意するステップ、
ｂ）すべての反応に共通の一つ以上の試薬及び適切なバッファを含む反応溶液で前記毛管を満たすステップ、
ｃ）毛管の内面に付着した試薬を解放するステップ
を含み、それにより、前記毛管中で複数の反応を並行的に実施することを可能にして、各反応を、適切な試薬が混合するところの別々の領域で起こさせるものである方法に関する。
【００８５】
方法の一つの実施態様によると、毛管の別々の機能性リングからの試薬は同時に解放され、それにより、多数の反応を単一の反応量で並行的に実施することを可能にする。
【００８６】
したがって、本発明はまた、複数のポリヌクレオチド増幅を実施する方法であって、先に定義した本発明の多数のポリヌクレオチド増幅を実施するのに適した毛管又は先に定義したような毛管を含む本発明のマイクロ流体装置の使用を含む方法に関する。
【００８７】
より具体的には、本発明は、複数のポリヌクレオチド増幅を実施する方法であって、
ａ）先に定義した本発明の多数のポリヌクレオチド増幅を実施するのに適した毛管又は先に定義したような毛管を含む本発明のマイクロ流体装置を用意するステップ、
ｂ）ポリヌクレオチド増幅に適切な反応溶液及び適切なバッファで毛管を満たすステップ、及び
ｃ）毛管の内面に付着したプライマーを解放するステップ
を含み、それにより、前記毛管中で一つ以上のポリヌクレオチド増幅を実施することを可能にして、各増幅を、適切なリバース及びフォワードプライマーが解放され、混合するところの別々の領域で起こさせるものである方法に関する。
【００８８】
本発明はまた、おそらくは試料に含まれる一つ以上の標的ポリヌクレオチド配列の増幅を並行的に実施する方法であって、
ａ）その内面に設計された複数の機能性リング（ＦＲ1〜ＦＲn）を含み、各機能性リングが、少なくとも第一の区域（Ｒ）及び第二の区域（Ｆ）を含む内面を有し、各機能性リングがリバースオリゴヌクレオチドプライマーとフォワードオリゴヌクレオチドプライマーとの少なくとも一つの対を有し、前記フォワードプライマーが、毛管の内面内で前記第一の区域（Ｒ）に解放可能に付着しており、前記リバースプライマーが、毛管の内面内で同じ機能性リングの前記第二の区域（Ｆ）に解放可能に付着しており、前記区域（Ｆ）が、前記区域（Ｒ）と重複する、又はリバースプライマーとフォワードプライマーとをそれらの解放後に混合させ、前記標的ポリヌクレオチド配列の増幅を実施するのに十分なほど前記区域（Ｒ）と接近しているものである毛管を用意するステップ、
ｂ）増幅のための可能な標的としてのポリヌクレオチド配列、適切なバッファ及び増幅反応に必要な一つ以上の試薬を含む反応溶液で前記毛管を満たすステップ、
ｃ）毛管の内面に付着したフォワード及びリバースプライマーを解放するステップ
を含み、それにより、前記プライマーが標的ポリヌクレオチド配列とで特異的にハイブリッド形成することを可能にし、複数の増幅反応が前記毛管中で並行的に起こることを許し、各増幅反応を、前記標的ポリヌクレオチド配列とでハイブリッド形成するオリゴヌクレオチドプライマーが混合するところの別々の領域で起こさせるものである方法に関する。
【００８９】
方法の一つの実施態様にしたがって、毛管の別々の機能性リングからのプライマーが同時に解放され、それにより、多数のポリヌクレオチド増幅を単一の反応量の中で並行的に実施することを可能にする。
【００９０】
ポリヌクレオチド増幅に適切な反応溶液は、以下の成分の少なくとも一つを含むことができる。
―標的ポリヌクレオチド配列、たとえば標的ＤＮＡ、特にゲノムＤＮＡ又はｃＤＮＡ、
―塩、たとえばＫＣｌもしくはＮａＣｌ溶液及び／又は他の適切な増幅ＰＣＲバッファ、一般的にはＮａＣｌとＭｇＣｌ2との混合物、
―場合によっては修飾されているｄＮＴＰ（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＧＴＰ）、たとえばｄＩＴＰもしくはｄＹＴＰ又は場合によっては標識されているｄＮＴＰ、
―すべての増幅反応に共通に使用される一つのプライマー、
―ＭｇＣｌ2及び／又は
―ポリメラーゼ、特にＤＮＡポリメラーゼ。
【００９１】
標的は、ｍＲＮＡであってもよいし、その場合、第一のステップはｃＤＮＡを生成するための逆転写である。
【００９２】
溶液はまた、ＤＮＡ結合性染料、たとえばＳｙＢＲ緑色染料、フルオロフォアを含有する標識プローブを含むことができ、単位複製配列のリアルタイム検出を可能にする。反応溶液は、適切な検出法で使用するための蛍光ｄＸＴＰを含むかもしれない。反応溶液はさらに、蛍光消光剤プローブタイプＴａｑＭａｎ又は蛍光挿入剤、たとえばＳｙＢＲグリーンを含むこともできる。
【００９３】
反応溶液は、生物学的試料から抽出したＤＮＡを含むことができる。特に、ＤＮＡは、生検材料から、血液、尿、唾液を含む生物学的流体から抽出することができる。
【００９４】
ＤＮＡは、生検材料又は動物、非ヒト哺乳動物もしくはヒトの生物学的流体から抽出することができる。また、細胞培養物、真核細胞もしくは原核細胞、バクテリア、真菌又は酵母から抽出することもできる。
【００９５】
また、穀類、果実、肉及び食品全般から抽出することもできる。
【００９６】
当業者に公知の多様なポリヌクレオチド増幅反応が本発明に適しているかもしれない。ＰＣＲとして知られる、もっとも一般的な形態のポリヌクレオチド増幅反応は当該技術で周知である。ヌクレオチド合成を指図するために使用されるポリメラーゼとしては、たとえば、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼのクレノウフラグメント、ポリメラーゼ突然変異タンパク質、熱安定性酵素、たとえばＴａｑポリメラーゼ、Ventポリメラーゼなどを挙げることができる。
【００９７】
当業者は、本方法及び装置を使用して、他にも多くのポリヌクレオチド増幅反応を実施することができることを理解するであろう（Isaksson及びLandegrenのCurr. Opin. Biotechnol. 10: 11-15 (1999)を参照すること）。一般に、標的核酸のいずれか又は両方の鎖の増幅は、一つ以上の核酸修飾性酵素、たとえばＤＮＡポリメラーゼ、リガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡ依存性逆転写酵素の使用を含む。たとえば、ポリヌクレオチド増幅反応としては、とりわけ、自立性配列複製（Ｓ３Ｒ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換活性化（ＳＤＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）及びＱｐレプリカーゼシステムを挙げることができる。
【００９８】
本発明は、増幅産物の増幅手法と検出手法とを統合して、それによって複数の増幅反応を同時に実施し、次いで増幅産物の同時検出を実施するための環境を提供するために使用することもできる。
【００９９】
本発明の方法のいくつかの実施態様では、方法は、毛管の内面の複数の固定化ポリヌクレオチドプローブによってハイブリッド形成を介して増幅産物を捕捉するステップ（ｄ）をさらに含む。
【０１００】
したがって、本発明は、試料中の核酸を検出し、解析する方法であって、先に定義した本発明の多数のポリヌクレオチド増幅を実施するのに適した毛管又は先に定義したような毛管を含む本発明のマイクロ流体装置の使用を含む方法に関する。
【０１０１】
たとえば、固定化ポリヌクレオチドの画分は、増幅産物をプロービング（捕捉）するように設計された非解放可能なポリヌクレオチドを含むこともできる。非解放可能なプローブは、前記プローブによって捕捉される産物を増幅するための解放可能なプライマーを含有する対応する機能性リング中の位置で、毛管の内面の区域に付着させることができる。たとえば、一つの実施態様では、非解放可能なプローブは、フォワードプライマーを含む（Ｆ）区域とリバースプライマーを含む（Ｒ）区域との間の位置で、毛管の内面の区域に付着させる。
【０１０２】
あるいはまた、プローブは、捕捉される配列を増幅するための対応するプライマーを含有する機能性リングとは異なる区域に付着させることもできる。
【０１０３】
標的核酸の増幅産物が捕捉されたのち、ポリヌクレオチド配列の変異を検出することにより、それらを直接的又は間接的に解析することもできる。毛管中のポリヌクレオチド配列の変異の特定及び検出の戦略は、当該技術で、特に米国特許出願２００３−００３２０３５（Chatelainら、ＣＥＡ、２００２年）又はＷＯ０２／１８９４９（カリフォルニア大学、２００１年）に記載されている。
【０１０４】
本発明の方法の一つの実施態様にしたがって、前記方法は、ステップ（ｃ）で得られたハイブリッド形成複合体を検出することによってポリヌクレオチド配列の変異を検出するステップをさらに含む。
【０１０５】
本発明はまた、タンパク質検出及び／又は解析のための、先に定義した毛管又はそのような毛管を含むマイクロ流体装置の使用に関する。
【０１０６】
当業者は、以下に記す実施例を読むことにより、本発明及びその利点をよりよく理解するであろう。当然、これらの例は、本発明の特定の好ましい実施態様を例示するにすぎず、請求項に係わる発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【０１０７】
実験部
Ａ．毛管中に解放されたプライマーの拡散のモデル化
図式的には、多重増幅の方法は、フォワード（Ｆ）及びリバース（Ｒ）プライマーをその内面に備えた機能性リングを含む毛管（図１）によって達成される。
【０１０８】
機能性リングを含む毛管は、本発明にしたがって調製したものである。各機能性リングは、図１に示すようなフォワード又はリバースプライマーを含む。増幅されるＤＮＡを含有するキャリヤ流体を毛管の内部に注入する。キャリヤ流体は、毛管の内部に注入されたのち、静止状態になり、プライマーが異なるリングから解放され、毛管中に拡散する。プライマーＦ１及びＲ１、Ｆ２及びＲ２などの濃度の量的ゾーンでは、ＰＣＲ反応ＰＣＲ１、ＰＣＲ２などが、十分な温度過渡期を示す約３０の一連のサイクルによって実施され、その場合、各温度過渡期は３０秒程度である。
【０１０９】
最適な構造が図２に記載されている。異なるリングは、別個のＰＣＲ区域を有し、ＰＣＲ産物を混合させないのに十分なほど離間している（検出の理由のため）が、コンパクトなシステムを有するために互いから離れすぎてはいない。
【０１１０】
フォワード及びリバースプライマーを含むリングの対は、図２に示されるように、スペーサによって離間していることもできる。
【０１１１】
モデル化の目的は、満足な装置の作動を考慮した物理的特性を数値的に計算する際に方法の実現可能性を増すことである。
【０１１２】
より具体的には、ＰＣＲサイクルを実施する場合に、リングの配設が以下の要件を満たすかどうかを知ることが望まれる。
【０１１３】
（１）プライマーＦ及びＲの有効濃度、
（２）ＰＣＲリング間の有効距離、及び
（３）リングのコンパクトな設計。
【０１１４】
問題には二つのステップで対処した。第一のステップは、毛管内部の分子拡散だけをモデル化することにあり、第二のステップは、壁上での会合／解離の効果を含める。第一のステップでは、プライマーは壁から瞬時に解放され、壁に付着しないものと仮定する。第二のステップでは、プライマーが一時的に壁に会合することを許容し、この現象はラングミュア速度論に従うと考えられる。
【０１１５】
第一のケースでは、壁への他着による遅延はないため、毛管軸沿いの拡散の速度を過大評価する。第二のケースでは、異なるプライマーどうしが相互作用することはないと仮定し、それを、成分ごとに固有の拡散係数によってモデルに導入する。
【０１１６】
【表３】
2008506376.tif 000005
【０１１７】
Ａ．１  プライマーが壁に付着しないと仮定した場合のプライマーの拡散のモデル化
第一のステップで、プライマーが壁に他着しないと仮定して、本発明の毛管の内部でのプライマーの拡散を解析する。壁における相補的配列とのプライマーの会合／解離による遅延はないため、このモデルは、拡散速度の過大評価を与える。換言するならば、プライマーは、壁に当たって弾性的に跳ね返る粒子とみなす。
【０１１８】
Ａ．１．１  拡散モデル
化学種又は生化学種の拡散は、通常はアインシュタインの関係式から導かれるその分子拡散係数によって決まる。
【０１１９】
【数１】
2008506376.tif 000006
【０１２０】
式中、Ｄは分子拡散係数（m2/s）であり、ｋBはボルツマン定数（ｋB＝１．３８  １０-23J/K）であり、Ｔは温度（Ｋ）であり、ηはキャリヤ流体の粘度（kg/m/s）であり、RHは粒子の動水半径である。この場合、キャリヤ流体の動粘度は水の動粘度η＝１０-3kg/m/sに近く、動水半径は３〜１０nmのオーダであり、温度は周囲温度、約３００Kである。すると、係数Ｄは２．１０-11〜６．１０-11m2/sである。軸対称円柱座標系（ｒ、ｚ）における拡散の方程式は以下のとおりである。
【０１２１】
【数２】
2008506376.tif 000007
【０１２２】
この問題で、毛管の寸法は、内半径と毛管の全長との比Ｒ／Ｌが非常に小さい（５．１０-3未満である）ような寸法である。この比から、システムのメッシングにおける難点が生じる。良好な数値解は、軸方向ｒと半径方向ｚとでほぼ等しいサイズのメッシュを要する。ｒ方向に２０のメッシュを選択する、すなわちこの方向におけるメッシュサイズが約２．５μmであるならば、軸方向ｚには８０００を超えるメッシュを有することが必要である。この欠点を解消するため、変数における以下の変更ｚ→ｚ*＝ｚ×Ｒ／Ｌを加えることができ、これが、計算ドメインをＲ＝Ｌの軸対称ドメインに変更する。したがって、今や、両方向ｒ及びｚで同じメッシュ数を選択することが可能である。しかし、この変数の変更は式（２）の変更を誘発する。
【０１２３】
【数３】
2008506376.tif 000008
【０１２４】
拡散係数は今や新たな座標系では異方性であり、ｚ方向における拡散係数はＤz＝Ｄ×Ｒ2／Ｌ2及びＤr＝Ｄである。異方性比Ｄz／ＤrはＲ2／Ｌ2に等しい。
【０１２５】
より多くの汎用性を考慮して、拡散方程式は、変数の変更ｚ→ｚ*＝ｚ／Ｌ及びｒ→ｒ*＝ｒ／Ｒによって完全に無次元の形態に書かれた。計算ドメインは次元Ｒ*＝１及びＬ*＝１の正方形の箱に囲まれ、軸方向と半径方向とで同じメッシュ数を有する。リング上にはじめに固定化されたプライマーの数を対応する環容積で割ったものにより、基準濃度ｃ0が規定される。
【０１２６】
【数４】
2008506376.tif 000009
【０１２７】
ｃ*＝ｃ／ｃ0及びｔ*＝ｔ／τ＝ｔ／ＲＬ／Ｄと指定すると（τは時間の特性スケールである）、式（２）は、以下のように書き換えることができる。
【０１２８】
【数５】
2008506376.tif 000010
【０１２９】
拡散係数はまたもや異方性であり、Ｄz＝Ｒ／Ｌ及びＤr＝Ｌ／Ｒである。比Ｄz／ＤrがなおもＲ2／Ｌ2に等しいことを立証することができる。以下すべてで式（４）を使用する。
【０１３０】
Ａ．１．２  数値解及び結果
データ
計算に必要なデータを表３に記す。
【０１３１】
【表４】
2008506376.tif 000011
【０１３２】
数値計算プログラムＦＥＭＬＡＢ［１］を使用して毛管中の種（ここではプライマ）の拡散を計算した。より正確には、モジュラス「化学工学」の式と類似した式を生成するためにバージョン２．３で拡散方程式をプログラムした。
【０１３３】
壁からのプライマーの解放を考慮するため、壁に沿って非常に小さな幅の領域を設定した。そのような領域の軸方向寸法は１mmであり、半径方向寸法は２．５μmである。プライマーの解放が起こる最初の時間ステップの正確な計算を考慮するため、壁に沿ってメッシングを精巧化した。
【０１３４】
本計算においては、機能化長さは１mmであり、リングとリングとの間には空間を設けなかった。
【０１３５】
そして、プライマーの拡散を解析した。
【０１３６】
図式的には、結果は、プライマーが時間ｔ＝０で解放され、５〜１０秒で毛管の全区分を満たし、その後、毛管中を軸方向に拡散することを示す。５００秒後、おおよその伝搬距離は０．５mmである。
【０１３７】
ブラウンモデル
ブラウン運動の直接シミュレーションを使用するもう一つの手法を実施することができる。この手法は、「連続媒体」手法よりも詳細化されているが、計算リソース（計算時間及びメモリ）において要求がはるかに厳しい。そのうえ、２Ｄ軸対称形状は３Ｄ処理を要する。
【０１３８】
計算法は、各プライマーが規定のドメインでランダムウォークを実行するモンテカルロ法である。統計的には、拡散は多数のランダムウォークの計算によって決まる。各時間ステップで、各粒子は直線をたどり、次いで次の時間ステップで、その方向がランダムに変化する。壁に衝突すると、粒子は跳ね返るものと考える。
【０１３９】
理論的には、二つのパラメータが必要である。（１）時間ステップ中に粒子が移動する直線距離、（２）各時間ステップにおける方向の変化。第一のパラメータは一定であり、以下の関係によって求められる。
【０１４０】
【数６】
2008506376.tif 000012
【０１４１】
第二のパラメータは、０〜３６０の間の均一な確率のランダムな選択の結果である。
【０１４２】
出発点は、はじめに壁に固定化され、機能性リングの壁に沿ってランダムに分布している多数のプライマーの出発点である。
【０１４３】
ブラウン運動はプライマーの解放とともに始まる。５及び１０秒後、プライマーが最初のリングの正面の環状領域を非常に速やかに満たすが、これらの時点では軸方向拡散はあまりないということを実証した。２秒後、プライマーはまだ毛管の断面で均一には分布していない。
【０１４４】
結果は、１０秒までに粒子の弱い軸方向伝搬があることを明らかにする。
【０１４５】
ブラウンモデルは数値「連続」（４）と合致している。ブラウンケースを処理するために要する非常に重大な計算時間のため、より大きな時間で計算を実施したことはない。
【０１４６】
解析モデル
序論
数秒後、プライマー中の濃度の「スラッグ」が最初のリングの正面の容積を占める。この場合、濃度の拡散は軸方向に１Ｄであるとみなすことが可能である。成分ｉの拡散方程式は以下のとおりである。
【０１４７】
【数７】
2008506376.tif 000013
【０１４８】
この方程式の解は既知であり［２］、それは誤差関数「erf」であり、初期及び境界の条件を考慮すると、解を以下の形に配列することができる。
【０１４９】
【数８】
2008506376.tif 000014
【０１５０】
式中、ａiはリングの１／２長さであり、関数「erf」は以下によって規定される。
【０１５１】
【数９】
2008506376.tif 000015
【０１５２】
数値モデルとの比較
解析モデルの結果と数値モデルの結果との合致は、リングの長さ（Ｌf）と半径（Ｒ）との比率が大きければ大きいほどよくなり、そのような場合、半径方向拡散の固有時間は軸方向拡散のそれに比べて小さい。
【０１５３】
この作業の序論で明確に述べた要件の一つ、すなわち異なるＰＣＲゾーンの分離に関する要件が、Ｆ１（「フォワード１」）及びＲ２（「リバース２」）における濃度に目を向けさせてくれる。理由は、これらの濃度が混合するならば、要件は満たされないからである。ここで、リング長Ｌf＝１mm及びＲ＝５０μmの場合で解析式及び数値モデルの両方によって計算した、時間ｔ＝５００秒での種Ｆ１及びＲ２の濃度分布の比較を提示する。解析モデル及び数値モデルで得られた結果は、類似した濃度分布を明らかにする。
【０１５４】
１に関して比Ｌf／Ｒが大きい限り、解析モデルは毛管中の拡散の良好な近似である。
【０１５５】
解析モデルの結果
ここで、異なるプライマーがそれらの固有拡散係数に依存してどのように軸方向に拡散するのかを示す。異なる時点ではじめに壁の隣接するリング（Ｆ１とＲ１又はＲ１とＦ２又はＦ２とＲ２）を占める二つのプライマーに関する結果を提示する。解析計算の利点の一つは、新たな種を加える可能性である。
【０１５６】
多重増幅のための装置の機能は、フォワード及びリバースプライマーが十分な量（しきい値は２５nM、又は２５  １０-6mole/m3である）で存在するところの区域を要する。合同濃度、すなわち素流体量中で混合したフォワード及びリバースプライマーの濃度を定量するため、ほぼ等しい二つの基準を定義する。以下の関数を定義することができる。
【０１５７】
【数１０】
2008506376.tif 000016
【０１５８】
プライマーＦ及びＲの合同濃度の良好な基準である。２種の一方が存在しないならば、ｃ＝０である。この関数（７）は、時間１、２００、５００及び９００秒で具現化した。この計算で、プライマー中の初期濃度は同じであり、二つの拡散係数も同じである。結果は、種の相互拡散により、「合同濃度」の質量が時間とともに増大することを示す。
【０１５９】
合同濃度のもう一つの基準は以下のとおりである。
【０１６０】
【数１１】
2008506376.tif 000017
【０１６１】
合同濃度のこの第二の関数をも具現化した。二つの基準の類似性は明らかである。結果は、両基準が類似していることを示した。
【０１６２】
得られた結果によると、二つのＰＣＲゾーンは９００秒後に非空隙共通部分を有する。二つの合同濃度の共通部分が以下の二つの式のいずれかによって規定されると、共通部分のより詳細な画像が得られる。
【０１６３】
【数１２】
2008506376.tif 000018
【０１６４】
ＰＣＲのしきい濃度の１／１０（０．１*ＳPCR）の値によって規定されるしきい濃度を考えてみる。このしきい値は、それを超えるとＰＣＲ産物が混合して正確な検出を妨げる限界と考えられる。計算のためにここで取り上げる参照値及びこのしきい値の値に関して、５００秒後、ＰＣＲ１及びＰＣＲ２における濃度がしきい値を超えたところで重複することを見いだした。
【０１６５】
パラメータ研究
拡散係数の影響
ここでは、この問題において拡散係数の値が非常に重要であることを示す。Ｄ＝１．１０-10m2/sの参照値が最大値である可能性は非常に高い。より小さな値Ｄ＝２．１０-11m2/sを考えてみると、１mmの隣接する機能性リングの場合で、２７００秒後でもしきい値（２．５  １０-6mole/m3）に達しない。
【０１６６】
リングの長さの影響
参照の拡散係数よりも低い拡散係数の場合、機能性リングの長さを減らすことが可能である。Ｄ＝２．１０-11m2/s及びＬf＝５００μmとすると、検出可能な共通部分は、６００秒後ほどなく出現し、７００秒でしきい値に達する。
【０１６７】
二つのパラメータＤ及びＬの影響
解析式の利点は、パラメータの影響を容易に調査することができることである。リングが一つしかないと仮定して、式（６）を用いて、ｔ＝９００sでプライマーが達する距離（＝３０サイクル×３０秒）を１／２リング長ａ＝Ｌ／２及び拡散係数Ｄ及び初期濃度ｃ0又はｃ0に等しい初期機能化Ｇの関数として決定する。２．５  １０-6mole/m3のしきい値を伝搬距離の基準として採用する。伝搬距離をＤ及びａの関数として具現化した。
【０１６８】
拡散係数Ｄ及び機能化長さ（リング長）Ｌfが結果に対して顕著な影響を及ぼすということを見いだした。軸方向寸法を減らすことを望むならば、拡散係数を減らす必要がある。拡散係数を１０-11m2/s未満に減らすことができるならば（たとえばキャリヤ流体の粘度を高めることにより）、リングの長さを２００μmに減らすことができる。
【０１６９】
Ａ．１．３  考察／結論
機能化リング（リング長さ）と半径Ｌf／Ｒとの比が十分に大きいならば、最初の１０秒間、プライマーは、毛管のうち、リングに対応する部分を漸進的に占める。軸方向伝搬は小さな時間では重要ではない。軸方向拡散は後になってはじめて見られる。
【０１７０】
濃度のスラッグが形成されると、拡散は軸方向になり、毛管の内部でほぼ１Ｄである。異なるプライマーどうしが相互作用しないという仮説の下、拡散係数、初期濃度及び初期位置の関数として異なる濃度分布を重ね合わせることが可能である。
【０１７１】
装置の設計は、１mmの機能性リング、１．１０-10m2/sの拡散係数及び５０femtomole/mm2の初期表面濃度の場合で、５００秒までは満足である。しかし、５００秒を過ぎると、ＰＣＲ区域の重複が起こる。拡散係数が２．１０-11m2/sにより近いならば、設計は２７００秒までは満足である。そのような状況では、リングのサイズを５００μm未満まで減らし、９００秒までは重複を起こさせないことが可能である。
【０１７２】
一般的な規則として、伝搬距離はほぼ
【０１７３】
【数１３】
2008506376.tif 000019
【０１７４】
であり、軸方向伝搬速度はほぼ
【０１７５】
【数１４】
2008506376.tif 000020
【０１７６】
である。
【０１７７】
次いで、プライマーと壁との相互作用を考慮する、より完全なケースを解析する。
【０１７８】
Ａ．２  プライマーの拡散及び他着のモデル化
まず、プライマーの拡散を解析した。拡散がプライマーの輸送の唯一の原因であるならば、拡散の速度は決まっている。会合／解離反応は無視したため、この速度を毛管中の実輸送速度の上限とみなすことができる。ここで、プライマーと壁との相互作用が結果として軸方向伝搬の速度を下げるということを示す。したがって、軸方向寸法をさらに減らすことができる。
【０１７９】
次いで、毛管中の拡散と機能化された壁へのプライマーの一時的結合との結合を解析する。壁との相互作用は複雑であり、この研究では、会合係数（ｋon）及び解離係数（ｋoff）でラングミュア反応に従うものと仮定する。
【０１８０】
数値解に関して、容積／壁でのラングミュア反応において結合系拡散を数値的に解いたLigler［４］及びHibbert［５］の手法を踏襲する。本ケースでは、Masonの２コンパートメントモデル［６］とは違い、流体移流は起こらず、それが保存方程式をより簡単にする。しかし、このモデルに移流を組み込むのに多大な作業を要することはない。より一般的には、本モデルは、固定化抗体への抗原の捕捉を扱うことができる［７］、［８］。
【０１８１】
Ａ．２．１  モデル
結合系（簡約座標）
毛管の内部、壁から遠いところでは、仮説は以前と同じである。すなわち、プライマーどうしは相互作用しない。その場合、拡散の方程式は先の式（２）と全く同じであり、
【０１８２】
【数１５】
2008506376.tif 000021
【０１８３】
が得られ、次元尺度構成法ののち、この式は、（４）
【０１８４】
【数１６】
2008506376.tif 000022
【０１８５】
に簡約される。
【０１８６】
壁においては、ラングミュアタイプ反応［４］があると仮定する。
【０１８７】
【数１７】
2008506376.tif 000023
【０１８８】
式中、ｋon及びｋoffは、それぞれ会合定数及び解離定数であり、Γ0は、壁で利用可能な会合部位における初期濃度であり、Γは、壁に固定化されたプライマーの表面濃度である。（１１）中、ｗは「壁」を意味する。
【０１８９】
前記二つの式をフィックの法則によって合わせる。一次座標（実寸のもの）を使用するならば、フィックの法則は以下のように書くことができる。
【０１９０】
【数１８】
2008506376.tif 000024
【０１９１】
式中、Ｊは、mole/m2/s単位の、壁における質量流束である。
【０１９２】
無次元座標を使用しなければならない（非常に細長い形状のせいで）ため、系全体を無次元にしなければならない。したがって、その手法は、まず、拡散方程式をその無次元形態で使用することである。
【０１９３】
【数１９】
2008506376.tif 000025
【０１９４】
この場合、簡約拡散係数は異方性である。すなわち、ｚ*方向ではＤ*z＝Ｒ／Ｌであり、ｒ*方向ではＤ*r＝Ｌ／Ｒである。壁における無次元の流束は以下のとおりである。
【０１９５】
【数２０】
2008506376.tif 000026
【０１９６】
式（１３）は、以下の形に配列することができる。
【０１９７】
【数２１】
2008506376.tif 000027
【０１９８】
そして、（１４）に（１１）及び（１２）を代入したのち、
【０１９９】
【数２２】
2008506376.tif 000028
【０２００】
と表す。
【０２０１】
式（４）及び（１５）を見たのち、現象の物理的過程が四つの無次元数のみに依存することに気付く。
【０２０２】
１．拡散方程式に見られる、毛管の長さとその半径との幾何学的比率Ｌ／Ｒ
２．壁上で利用可能な会合部位の数と半径×初期自由濃度の積との比Γ0／ｃ0Ｒ。会合部位が各リング中で均一に配置されていると仮定するならば、この比を以下の形に配列することができる。
【０２０３】
【数２３】
2008506376.tif 000029
【０２０４】
３．比ｋonΓ0Ｌ／Ｄは、会合（吸着）の場合のDammkolher数であり、
【０２０５】
【数２４】
2008506376.tif 000030
【０２０６】
であるため、吸着速度と軸方向拡散速度との比を表す。
【０２０７】
４．比ｋoffΓ0Ｌ／Ｄｃ0は、解離（脱着）の場合のDammkolher数であり、
【０２０８】
【数２５】
2008506376.tif 000031
【０２０９】
であるため、解離速度と軸方向拡散速度との比を表す。
【０２１０】
事実、バッキンガムのΠ定理を使用するならば、系全体が四つの無次元数に依存していることがわかるであろう［３］。この定理は、物理系が、Ｍ個の異なる単位に基づくＮ個のパラメータに依存しているならば、その系は、Ｎ−Ｍ個の無次元数によって決まることを証明する。以下の表には、物理系に関連するパラメータ（拡散のみ及び拡散＋壁での反応）及びそれらのパラメータの単位ならびに、最後に、発見された無次元数を一覧で示した。次元解析がバッキンガムの定理と合致していることを実証する。
【０２１１】
【表５】
2008506376.tif 000032
【０２１２】
ドメインの形状及びメッシングを評価した。
【０２１３】
方程式系（４）、（１３）及び（１５）は、ＦＥＭＬＡＢ数値プログラムで具現化した。最初の方程式（４）は形式「係数」で書かれ、方程式（１３）は質量流束の境界条件であり、方程式（１５）は、偏微分方程式に結合され、「弱」形式で記載された微分方程式である。
【０２１４】
参照データの値を表５に記す。
【０２１５】
【表６】
2008506376.tif 000033
【０２１６】
会合及び解離定数の値は周知ではない。会合定数は、Liglerの公表されている研究［７］から抜粋したものである。このように、プライマーは、順次に壁で捕らえられ、解放されることができる。
【０２１７】
無次元参照値を表６に記す。
【０２１８】
【表７】
2008506376.tif 000034
【０２１９】
Ａ．２．２  結果及び考察
パラメータ研究
ここでは、直前の段落で生成した無次元パラメータの役割を調べる。簡略化するため、Ｄａon＝ｋonΓ0Ｌ／Ｄ及びＤａoff＝ｋonΓ0Ｌ／Ｄｃ0と指定する。会合（一時的なものでさえ）が固定化及び解放過程を介して軸方向拡散速度を下げるということが直感的にわかる。会合定数が大きければ大きいほど、プライマーは長い時間固定化されたままになる。他方、大きな解離定数は、壁における滞留を短くする。これが、はじめに異なるＤａon及びＤａoff値の場合の系の挙動を解析する理由である。
【０２２０】
Ｄａon（Dammkolher吸着数）の影響
この段落では、吸着Dammkolher数Ｄａon＝ｋonΓ0Ｌ／Ｄを変更する。他のパラメータは常に参照ケースのパラメータと同じである（表６を参照）。時間ｔ＝１０００秒での拡散距離を重要視する。この距離は、０．１に等しい濃度しきい値（ＳPCR／ｃ0）によって決まる。軸方向濃度プロフィールを具現化した。濃度分布はなおも同じガウス分布を有するが、Dammkolher吸着数が小さくなるにつれ、より離散する。予想どおり、拡散のみに基づくプロフィールは常にもっとも離散的である。
【０２２１】
Ｄａon＝ｋonΓ0Ｌ／Ｄの関数として１０００秒での拡散距離を評価した。吸着Dammkolher数が増すとともにより多くのプライマーが壁に固定化されるにつれ、毛管中の自由プライマーの濃度は低下する。Dammkolher数が増すとともに、毛管中の最大濃度の低下が認められる。
【０２２２】
吸着Dammkolher数が増すと、軸方向拡散は減速する。物理的に、これは、壁へのプライマーの一時的固定化によって説明される。この現象は、毛管中の自由プライマーの減少によって確認される。
【０２２３】
Ｄａoff（脱着Dammkolher数）の影響
直前の段落で、吸着（又は会合もしくは固定化）が軸方向拡散速度を下げるということを示した。拡散波頭に位置するプライマーが捕捉されるため、拡散波頭は毛管中でより低速で進行する。この段落では、脱着を解析する。ｔ＝１０００秒での拡散距離と脱着数Ｄａoffとの間の関係を調査した。
【０２２４】
脱着（又は解離もしくは解放）が会合の場合とは反対の効果を有することを見いだした。Ｄａoff（又はｋoff）が大きければ大きいほど、軸方向拡散は速くなる。脱着係数が大きいとき、固定化されたプライマーは非常に短い時間で解放される。脱着係数が大きければ大きいほど、毛管中の自由濃度は高まる。しかし、軸方向拡散速度は常に純粋な拡散の速度よりも遅い。
【０２２５】
半径Ｒの影響
半径が変化すると、アスペクト比Ｌ／Ｒ及び比Γ0／ｃ0Ｒが変化する。この段落では、半径を１０から１０００μmまで変化させる。Ｌ／Ｒ＞５０（Ｌf／Ｒ＞５）である限り、プライマーの拡散に目に見える変化は起こらない。より小さなこの比の値、たとえばＬ／Ｒ＝１０又はＬf／Ｒ＝１の場合、プロフィールは拡散のみの場合のプロフィールである。アスペクト比が低下すると壁の影響が減るため、これは予想されたことである。
【０２２６】
四つのリングの場合の計算
直前の段落で、壁への一時的な固定化によって伝搬速度を下げることができることを示した。ここで、四つリングを伴う場合の二つの計算を述べる。第一の計算は、基準形状を使用し、パラメータＤａon＝ｋonΓ0Ｌ／Ｄ及びＤａoff＝ｋonΓ0Ｌ／Ｄｃ0の好都合な選択によって軸方向拡散過程を減速させることを試みる。これらの値を使用して、よりコンパクトな形状で第二の計算を実施する。
【０２２７】
スペーサなしの２×２リングの場合の計算（Ｄ＝１．１０-10m2/s）
この計算で、会合係数ｋonは大きく、５００m3/mole/sに等しく、解離係数ｋoffもまた比較的大きく、４．１０-21/sに等しい。計算のデータを表７に記す。
【０２２８】
【表８】
2008506376.tif 000035
【０２２９】
パラメータの無次元値を表８に記す。
【０２３０】
【表９】
2008506376.tif 000036
【０２３１】
濃度プロフィールは、ｔ＝５００、９００及び１０００秒での、四つの濃度の和ｃ／ｃ0＝ｃF1＋ｃR1＋ｃF2＋ｃR2／ｃ0ならびに
【０２３２】
【数２６】
2008506376.tif 000037
【０２３３】
によって規定されるタイプ１及びタイプ２のプライマー中の「合同濃度」によって具現化される。
【０２３４】
一方で、軸方向拡散は、二つのDammkolher数（非常に強い会合定数及びいくらか弱めの会合定数。二つの機構の相対的重要性を特徴づける比Ｄａon／Ｄａoff＝ｋonc／ｋoffは２に等しい）によって大幅に減らされる。プライマーが順次に壁で会合し、次いで解離するため、軸方向伝搬はほぼ停止する。自由濃度は比較的低いが、なおも、ＰＣＲ反応が起こるのには十分である。他方、ＰＣＲ産物はｔ＝１０００sでさえ混合しない。「拡散のみ」の場合とで比較を実施した。一つには、毛管中の「自由濃度」の低下があり、他方、ＰＣＲ産物は、「自由拡散」の場合とは違って混合しない。
【０２３５】
５００μmの２×２ゾーンを５００μmスペーサとともに使用する場合の計算
この計算は、先の計算の際に見いだした好都合なDammkolher数を使用してリングのサイズをコンパクト化する可能性を評価することを目的とする。計算のデータを表９に記す。
【０２３６】
【表１０】
2008506376.tif 000038
【０２３７】
対応する無次元パラメータを表１０に記す。
【０２３８】
【表１１】
2008506376.tif 000039
【０２３９】
ここで、リングは、０．５mmの軸方向範囲を有し、０．５mmのスペーサによって分けられている。四つの濃度の和のプロットをｔ＝０．５、１０及び１０００秒で決定した。ｔ＝０．５秒で、初期リングが非常に明確に見られる。ｔ＝１０秒で、結果は、プライマーがリングの内部を満たしたことを示す。
【０２４０】
ｔ＝０．５、１０及び５００秒で「合同濃度」
【０２４１】
【数２７】
2008506376.tif 000040
【０２４２】
を調査した。ＰＣＲゾーンの重複は５００秒で始まると思われる。これは、ｔ＝９００ｓでの濃度ｃ1_2＝min（min（ｃF1,ｃR1）,min（ｃF2,ｃR2）)で確認される。ＰＣＲゾーンの混合をｔ＝５００ｓで見ることができ、したがって、この延びは９００秒でさえ非常に限られている。
【０２４３】
Ａ．３  結論
本研究では、円柱形容積中のプライマーの拡散の問題を機能化された壁における会合及び解離の反応と併せて解決した。
【０２４４】
軸方向拡散速度が、毛管ＰＣＲ装置の実現可能性のための主要因である。多くの機能性リングを毛管内部に組み込み、なおかつコンパクトな装置を得ることを望むならば、毛管内部でのプライマーの輸送が十分に低速でなければならない。
【０２４５】
本研究の第一の部分は、拡散過程のみを考慮する（そして、プライマーと壁との間の相互作用を除外する）。この手法は、毛管中のプライマーの拡散速度の上限を見い出させる。これは、拡散係数がＤ＝１０-10m2/sと仮定して、３０サイクルのＰＣＲに求められる９００秒の間にＰＣＲ産物を重複させないためには、フォワードリングとリバースリングとの各対が次の対から少なくとも１mmの距離だけ離間していなければならないことを示す。拡散係数がそれ未満、たとえばＤ＝２．１０-11m2/sであるならば、リング対間の間隔を５００μmまで減らすことができる。
【０２４６】
この研究の第二の部分は、機能性リング上でのプライマーの会合及び解離を考慮して、結果、プライマーの軸方向輸送のより正確な推定を行う。非常に重要な結論は、物理的機構が四つの無次元数のみに依存するということである（したがって、バッキンガムΠ定理を実証する）。もう一つの結論は、軸方向輸送速度は、吸着Dammkolher数Ｄａon＝ｋonΓ0Ｌ／Ｄが増すにつれ低下し、脱着Dammkolher数Ｄａoff＝ｋoffΓ0Ｌ／Ｄｃ0とともに増大するということである。半径に対する機能化長さの比Ｌf／Ｒが５よりも大きい限り、プライマーの軸方向伝搬速度に対する毛管半径の影響は弱い。
【０２４７】
軸方向伝搬速度を下げることを望むならば、以下の「理論的」条件を満たすことが最良である。
【０２４８】
１．拡散するプライマーの波頭を減速させるのに十分な大きさの吸着Dammkolher数。ただし、非常に重大な吸着はプライマーの完全な枯渇をもたらす。
２．吸着Dammkolher数の値の約１／２の脱着Dammkolher数の値。
３．機能性リングの長さと半径との、約５の比。
４．拡散「バリヤ」を構成するためのリング対（Ｆ１、Ｒ１）（Ｆ２、Ｒ２）などの間の間隔。たとえば、このスペーサを、Ｒ１及びＦ２タイプのオリゴヌクレオチドに対して相補的なオリゴヌクレオチドで機能化してもよい。
【０２４９】
ここでの要点は、二つのDammkolher数の間の最適な比Ｄａon／Ｄａoff＝ｋonc／ｋoffを選択することができるならば、毛管中のプライマーの伝搬速度を大きく下げることができることである。この報告では、この比が２に近いとき、低速の軸方向流量を得ることができることが示された。このような比を物理的に得ることができるならば、リングのサイズ減少によって装置を非常にコンパクトにすることができる。
【０２５０】
【表１２】
2008506376.tif 000041
【０２５１】
Ｂ．実施例
実施例１：複数のヌクレオチド増幅を並行的に実施するための毛管の下処理
毛管の下処理
毛管は、英国Milton KanyesのＳＧＥから購入した。内径は１００μmであり、内壁を含むが、Teflonジャケットを除外するその径は３００μmであった。これらの毛管は、石英ガラス製であり、ＵＶ透過性であった。
【０２５２】
毛管の内面を特異的に扱うために、ベンゾフェノン（Ｂｚ）を使用して光反応性面を形成した。ベンゾフェノンは、その光化学的性質が周知であるために選択した。特に、広い範囲の異なる化学的環境で、ＵＶ照射の下、Ｃ−Ｈと反応する。さらには、ベンゾフェノンは、光の非存在では化学的に不活性であり、水溶液中で安定である。５０％エタノール中３．６ＮのＮａＯＨ溶液を使用して毛管を清浄したのち、蒸留水で洗浄した。気流を使用して毛管を乾燥させたのち、高純度エタノール中アミノプロピルシランの５％溶液で処理した。反応を終夜実施した。毛管を、まず９５％エタノールですすぎ、次いで蒸留水ですすぎ、再度９５％エタノールですすいだ。毛管を１１５℃で３時間ベーキングすることにより、シラン層を網状化した。そして、得られたアミノ面を、ＤＭＦ中２００mMのＢｚ−イソチオシアネートと終夜反応させた。毛管をＤＭＦで２回洗浄し、９５％エタノールで２回洗浄した。
【０２５３】
解放可能なプライマーの付着
Ｂｚ修飾毛管を最初のオリゴヌクレオチド溶液で満たし、毛管の一部をＵＶ３６５nm照射した。固定化されなかったオリゴヌクレオチドを毛管から洗い流した。オリゴヌクレオチドごとにこれらのステップを繰り返すことによってアレイを形成した。
【０２５４】
発光装置は、水銀灯を備えた倒立顕微鏡であった。照射は、１６０μmスロットを通して毛管に対して直交方向に４mW/mm2で実施した。毛管を装置の下で動かしてオリゴヌクレオチドアレイを形成した。
【０２５５】
ハイブリッド形成バッファ（ＰＢＳ中２５μM  １×、ＮａＣｌ  ０．５Ｍ、ＥＤＴＡ  １０mM、サケ精子ＤＮＡ  １００μg/ml、ホルムアミド５０％）中のプライマーを毛管に注入し、ハイブリッド形成を４２℃で１時間実施した。
【０２５６】
ハイブリッド形成後、毛管をＳＳＣ  ２×、ＳＤＳ０．１％で２回洗浄した。
【０２５７】
実施例２：毛管の表面に付着した試薬の解放
毛管は、実施例１に記載のようにして下処理した。相補的オリゴヌクレオチドの固定化ののち、毛管を、上記プロトコルにしたがって、シアニン３標識されたプライマーとでハイブリッド形成させた。洗浄後、標準ＤＮＡチップスキャナを使用して、ハイブリッド形成した標識されたプライマーを毛管壁越しに検出した。各プライマーの蛍光輝度を記録した。
【０２５８】
毛管をハイブリッド形成バッファで満たし、１時間、温度を６５℃に上げた。毛管を新鮮なハイブリッド形成バッファでフラッシュし、スキャンした。各プライマーに対応する蛍光輝度を記録すると、解放前に記録された輝度の３０％未満までの低下を示した。ＰＣＲ増幅に適した、ハイブリッド形成したプライマーの７０％が毛管中に解放されたと結論づける。
【０２５９】
実施例３：ＮＡＴ２遺伝子の増幅
この実施例は、人為的に創造された配列をも含む任意の種のＤＮＡ配列を増幅するための一般的手法を示す。ここで例示するものは、ヒトＮＡＴ２遺伝子の一部の増幅である。増幅産物は、８７２塩基対に及ぶヒトＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）遺伝子（GenBankアセッション番号ＮＭ＿００００１５）のコード領域を含む。
【０２６０】
フォワード
【０２６１】
【表１３】
2008506376.tif 000042
【０２６２】
配列ＩＤ番号１プライマー）プライマー及びリバース
【０２６３】
【表１４】
2008506376.tif 000043
【０２６４】
配列ＩＤ番号２）プライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡからＮＡＴ２遺伝子のＰＣＲ産物を生成するため、毛管を形成した。
【０２６５】
これらのプライマーは、予備合成し、開裂可能なリンカーを介して毛管の表面に付着させることもできるし、毛管中、開裂可能なリンカー上で現場合成することもできる。解放機構に依存して種々のリンカーを使用することができる。たとえば、開裂は、光照射によって達成することもできるし（光開裂性リンカー）、試薬によって達成することもできるし（化学開裂）、制限酵素を使用して達成することもできる（ＤＮＡ配列リンカー）。
【０２６６】
あるいはまた、プライマー相補的配列は、予備合成し、毛管の表面に共有結合的に永久に付着させることもできるし、毛管中で現場合成することもできる。そして、毛管を、ハイブリッド形成により、大きく過剰量のプライマー溶液で装填する。プライマーは、９４℃での変性ステップによって解放させる。
【０２６７】
ＰＣＲ増幅反応の前に、毛管を１×ＰＣＲバッファ（５０mM  ＫＣｌ、１．５mM  ＭｇＣｌ2、１０mMトリスＨＣｌ  ｐＨ８．０）で洗浄した。次いで、ＰＣＲ増幅のために、１０ngヒトゲノムＤＮＡ、ＰＣＲバッファ、２００μMデオキシヌクレオチド三リン酸及び１単位ＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ試薬を毛管に加えた。
【０２６８】
プライマーを解放し（前記のとおり）、ＰＣＲ試薬と混合させた。そして、毛管を受け入れるための専用の温度サイクリング装置を使用して毛管を温度サイクリングに付した。得られた増幅産物（単位複製配列）は、長さ約１．２kbであり、長さ８７２塩基対のＮＡＴ２遺伝子のコード配列ならびに５′及び３′フランキング配列を含むものであった。当業者に公知の標準技術を使用して、たとえばアガロースゲル電気泳動を使用して、ＰＣＲ産物を解析した。
【０２６９】
実施例４：対立遺伝子特異的伸長によるＮＡＴ２遺伝子における多形の遺伝子型決定
ヒトＮ−アセチルトランスフェラーゼ２（ＮＡＴ２）遺伝子の対象のコード領域は８７２塩基対に及ぶ（GenBankアセッション番号ＮＭ＿００００１５）。機能低下に関連することができる集団において、低速、中間及び高速の代謝を決定する多数の対立遺伝子が見いだされている。酵素は、発ガン物質を含む芳香族及び複素環式化合物の不活性化において役割を演じることが示されている。特定の対立遺伝子のキャリヤが特定のガン、すなわち大腸ガン及び膀胱ガンに対してより感受性である可能性が高い。対立遺伝子の一覧を表１１に見ることができる。
【０２７０】
【表１５】
2008506376.tif 000044
【０２７１】
低い複雑さ、十分に理解された遺伝子学的性質及び臨床的関連性が、ＮＡＴ２遺伝子を、原理検証型アッセイを開発するための良好な候補物質にする。以下に記すアッセイは、F. Chatelain及びF. FruehのＰＣＴ／ＥＰ０２／０５４５９、ＵＳ第６０／２８８，５２６号から応用したものである。各対立遺伝子は二つ以上のＳＮＰによって規定されるため、各多形部位でホモ接合及びヘテロ接合遺伝子型を決定し、特定された遺伝子型にしたがって対立遺伝子割り当てを実施し、それにより、アッセイを保証し、改善する。
【０２７２】
まず、フォワード
【０２７３】
【表１６】
2008506376.tif 000045
【０２７４】
配列ＩＤ番号１）プライマー及びリバース
【０２７５】
【表１７】
2008506376.tif 000046
【０２７６】
配列ＩＤ番号２）プライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡからＰＣＲ産物を生成するため、毛管を形成した。これらのプライマーは、予備合成し、開裂可能なリンカーを介して毛管の表面に付着させることもできるし、現場で合成することもできる。ＮＡＴ２単位複製配列を生成するために使用されるプライマーに加えて、プローブを、毛管の表面に付着させるか、現場で合成して、表１１に記載する位置におけるＮＡＴ遺伝子の配列の特定に使用した。これらのプローブは、その３′末端に対立遺伝子特異的ヌクレオチド（表１１で概説するヌクレオチドの位置を表す）を含有して対立遺伝子特異的であった。「プライマー伸長」として当業者に知られる酵素的反応を実施することにより、これらの末端を露出させ、伸長させることができる。詳細は先に記載されている（F. Chatelain及びF. FruehのＰＣＴ／ＥＰ０２／０５４５９、ＵＳ第６０／２８８，５２６号）。
【０２７７】
次に、毛管を１×ＰＣＲバッファ（５０mM  ＫＣｌ、１．５mM  ＭｇＣｌ2、１０mMトリスＨＣｌ  ｐＨ８．０）で洗浄した。次いで、１０ngヒトゲノムＤＮＡ、ＰＣＲバッファ、２００μM  ｄＡＴＰ、２００μM  ｄＧＴＰ、１７５μM  ｄＴＴＰ、２５μM標識ｄＵＴＰ（すなわちＣｙ３−ｄＵＴＰ）、１７５μM  ｄＣＴＰ、２５μM標識ｄＣＴＰ（すなわちＣｙ３−ｄＣＴＰ）及び１単位ＤＮＡポリメラーゼを含有するＰＣＲ試薬を毛管に加えた。プライマーを解放し（実施例２に記載のとおり）、ＰＣＲ試薬と混合させた。そして、毛管を受け入れるための専用の温度サイクリング装置を使用して毛管を温度サイクリングに付した。温度サイクリングの完了ののち、毛管をトリエチルアミン及びアルコール（１：１）の溶液で１５分間洗浄し、水で数回すすぎ、ＰＣＲ反応中に解析し、鋳型ＤＮＡをまずプライマーによって増幅した（配列ＩＤ番号１及び２）。十分な量の単位複製配列が存在するとき、その３′末端（表１で概説し、先に記したヌクレオチドの位置を表す）に対立遺伝子特異的ヌクレオチドを含有する対立遺伝子特異的プローブを伸長させた。これらのプローブは、既知の場所で毛管表面に付着したままであり、対立遺伝子特異的増幅産物を毛管表面上のそれらの場所に基づいて特定することを可能にする。
【０２７８】
あるいはまた、非対立遺伝子特異的プローブを使用することもできる。これらのプローブは、多形部位までちょうど１塩基分足りないところ（上流）で終端する。多形部位の実体を視覚化するため、異なる標識を付されたジデオキシヌクレオチドターミネータ（ｄｄＮＴＰ）をｄＮＴＰに代えて伸長反応に用いる。理想的には、四つの異なるｄｄＮＴＰを、色検出装置によって区別することができる異なる色で標識する。このようなターミネータの使用は、対立遺伝子特異的プローブを１塩基分だけ伸長させることができる。四つの可能な塩基それぞれに特徴的である標識が、各プローブ位置における付着したヌクレオチドを特定し、したがって、多形部位における配列を特定する。
【図面の簡単な説明】
【０２７９】
【図１】本発明の毛管の本体構造を示す図である。毛管は機能性リング（ＦＲ１、ＦＲ２）を含み、各機能性リングは、解放可能な試薬を含む第一の区域（Ｆ１又はＦ２）及び第二の区域（Ｒ１又はＲ２）を少なくとも含む内面を有し、機能性リングの各試薬を混合させるためにＦ区域はＲ区域に比較的近い。拡散による試薬Ｆ１及びＲ１と試薬Ｆ２及びＲ２との混合を防ぐためにＦＲ１とＦＲ２との間にはスペーサが配置されている。
【図２】毛管中での反応部分の解放及び反応部分のおおよその拡散を示す図である。上の図は、毛管中のプライマーＦ及びＲの相対濃度を表す。ＰＣＲ反応はゾーンＦ１とＲ１との境界、ゾーンＦ２とＲ２との境界などで起こる。最適な設計は、ＰＣＲ産物が互いに混合しないようリングが十分に離間し、かつ、システムの長さを最小限にする基準を満たすために離間しすぎていない場合の設計である。下の図は、毛管中の反応生成物の相対濃度を表す。
【図１】
2008506376.tif 000047
【図２】
2008506376.tif 000048
【配列表】
2008506376000001.app
【国際調査報告】
2008506376.tif 000049
2008506376.tif 000050
2008506376.tif 000051