(57)【要約】  任意にはプロテアーゼ及び/又はアミラーゼと組合しての、配列番号１のアミノ酸1-269を含んで成るサーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）（ヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginose））リパーゼの変異体に関連するリパーゼの医薬使用に関する。医学的適応の例は、消化異常、膵臓の外分泌不十分（PEI）、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理である。本発明のリパーゼは、インビボで改良された効力を有し、プロテアーゼ−分解に対して安定し、そして/又は胆汁塩の存在下で安定している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸1-269に対して少なくとも90％の同一性を有するが、但し配列番号２のアミノ酸1-269ではない、薬剤としての使用のためのリパーゼ。
【請求項２】
ａ）前記リパーゼが配列番号１のアミノ酸1-269を含んで成り、又は
ｂ）前記リパーゼが配列番号1のアミノ酸1-269の変異体であり、ここで前記変異体が25個以下のアミノ酸により、配列番号１のアミノ酸1-269とは異なり、そしてここで
（i）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269に比較して、１又は複数のアミノ酸の少なくとも１つの保存性置換及び/又は挿入を含んで成り；そして/又は
（ii）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269に比較して、少なくとも１つの小さな欠失を含んで成り；そして/又は
（iii）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269に比較して、少なくとも１つの小さなN−又はC−末端延長を含んで成り；そして/又は
（iv）前記変異体が、配列番号２のアミノ酸1-269を有するリパーゼの対立遺伝子変体であり；そして/又は
（v）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269を有するリパーゼのフラグメントである、請求項１記載のリパーゼ。
【請求項３】
薬剤としての使用のために、プロテアーゼ又はアミラーゼと組合しての、請求項１〜２のいずれか１項記載のリパーゼ。
【請求項４】
薬剤としての使用のために、プロテアーゼ及びアミラーゼと組合しての、請求項１〜２のいずれか１項記載のリパーゼ。
【請求項５】
（i）前記プロテアーゼが、
ａ）配列番号３のアミノ酸１−274を有するプロテアーゼ、
ｂ）配列番号４のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、及び
ｃ）配列番号５のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、
から成る群から選択されたプロテアーゼに対して少なくとも70％の同一性を有し；
（ii）前記アミラーゼが、
ａ）配列番号６のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、
ｂ）配列番号７のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及び
ｃ）配列番号８のアミノ酸１−483を有するアミラーゼ、
から成る群から選択されたアミラーゼに対して少なくとも70％の同一性を有する、請求項３又は４記載のプロテアーゼ及び/又はアミラーゼと組合してのリパーゼ。
【請求項６】
（i）前記リパーゼが配列番号１のアミノ酸２−269を含んで成り；
（ii）前記プロテアーゼが、
ａ）配列番号３のアミノ酸１−274を有するプロテアーゼ、
ｂ）配列番号４のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、及び
ｃ）配列番号５のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、
から成る群から選択されたプロテアーゼであり；
（iii）前記アミラーゼが、
ａ）配列番号６のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、
ｂ）配列番号７のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及び
ｃ）配列番号８のアミノ酸１−483を有するアミラーゼ、
から成る群から選択されたアミラーゼである、請求項３又は４記載のプロテアーゼ及び/又はアミラーゼと組合してのリパーゼ。
【請求項７】
消化異常、膵臓の外分泌不十分、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理のための薬剤の製造のためへの請求項１〜２のいずれか１項記載のリパーゼ又はリパーゼ混合物の使用。
【請求項８】
プロテアーゼ又はアミラーゼの使用をさらに含んで成る請求項７記載の使用。
【請求項９】
プロテアーゼ及びアミラーゼの使用をさらに含んで成る請求項７記載の使用。
【請求項１０】
前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが請求項５又は６に定義される通りである請求項８又は９記載の使用。
【請求項１１】
少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤材料と共に、請求項１〜２のいずれか１項記載のリパーゼ又はリパーゼ混合物を含んで成る医薬組成物。
【請求項１２】
プロテアーゼ又はアミラーゼをさらに含んで成る請求項11記載の組成物。
【請求項１３】
プロテアーゼ及びアミラーゼをさらに含んで成る請求項11記載の組成物。
【請求項１４】
前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが請求項５又は６に定義される通りである請求項12又は13に記載の組成物。
【請求項１５】
治療的有効量の請求項１〜２のいずれか１項記載のリパーゼ又はリパーゼ混合物を投与することによる、消化異常、膵臓の外分泌不十分、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理方法。
【請求項１６】
治療的有効量のプロテアーゼ又はアミラーゼを投与することをさらに含んで成る請求項15記載の方法。
【請求項１７】
治療的有効量のプロテアーゼ及びアミラーゼを投与することをさらに含んで成る請求項15記載の方法。
【請求項１８】
前記プロテアーゼ及び/又はアミラーゼが請求項５又は６に定義される通りである請求項16又は17記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号１のアミノ酸1-269を含んで成るサーモミセス・ラヌギノサス（Thermomyces lanuginosus）（類似語：ヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginose））リパーゼ変異体に関連するリパーゼの医薬使用に関する。リパーゼは、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼと組合して使用され得る。医学的適応の例は、消化異常、膵臓の外分泌不十分（PEI）、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理である。
【背景技術】
【０００２】
背景技術：
膵臓酵素サプリメントの形でのいくつかの市販の薬剤は、膵臓外分泌不十分の処理のために知られている。それらの製品中の活性成分は、膵臓において通常、生成され、そして小腸の上方部分（十二指腸）に排泄される消化酵素、主にアミラーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼである。そのような薬剤に使用される酵素はウシ又はブタ膵臓に由来するが、しかしながら、微生物酵素に関しての市販の製品、例えばリゾパス・オリザエ（Rhizopus oryzae）からのリパーゼ、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）からのプロテアーゼ、及びアスペルギラス・オリザエからのアミラーゼを含む製品Nortase（商標）が存在する。
【０００３】
アメリカ特許第5614189号（EP600868号）は、嚢胞性線維症を有する患者の処理における膵臓酵素置換療法へのヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginose）由来のリパーゼの使用を記載する。このリパーゼは、ヒューミコラ・ラヌギノサDSM4109からであり、そして配列番号２のアミノ酸1−269のアミノ酸配列を有する。
【０００４】
WO00/54799号は、I型及びII型糖尿病の処理における脂肪分解、タンパク質分解及びデンプン分解活性を有する生理学的に許容できる酵素混合物の使用を記載する。
WO02/060474号は、リゾパス・デレマー（Rhizopus delemar）からの濃縮されたリパーゼ、アスペルギラス・メレウス（Aspergillus melleus）からの中性プロテアーゼ、及びアスペルギラス・オリザエからのアミラーゼの消化不良の処理への使用を記載する。
【０００５】
WO01/62280号は、多官能架橋剤、プロテアーゼ及びアミラーゼにより架橋された非菌類リパーゼ結晶の使用を記載し、ここで前記リパーゼ結晶は、哺乳類における胃腸障害を処理するか又は予防するために約2.0〜9.0の範囲のpHで活性的である。好ましいリパーゼは、シュードモナス（Pseudomonas）からであり、好ましいアミラーゼは、バチルス又はアスペルギラスからであり、好ましいプロテアーゼはブロメライン、パパイン又はフィシンである。
【０００６】
EP0828509号は、膵臓外分泌不十分の処理への一定の酸安定性アミラーゼと、任意には一定の酸安定性リパーゼ及び/又はプロテアーゼとの組合しての使用を記載する。好ましいアミラーゼはアスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）からであり、そして好ましいリパーゼはリゾパス・アルヒザス（Rhizopus arrhizus）又はリゾパス・ジバニカス（Rhizopus javanicus）からである。
【０００７】
WO00/60063号は、ヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼの多くの変異体、及び洗剤へのそれらの使用を記載する。配列番号１のアミノ酸1-269を有するリパーゼが、特異的に記載されているが、しかしその医薬使用について記載されていない。
WO04/111216号及びEP1428874号は、配列番号１の変異体を包含する、配列番号２の変異体を開示するが、しかしその医薬使用については両者とも開示していない。
医薬使用のための他の、好ましく改良された酵素についての必要性が、当業界において存在する。
【発明の開示】
【０００８】
発明の要約：
本発明は、医薬使用のための他の、好ましく改良された酵素、すなわち新規リパーゼ、アミラーゼ及びプロテアーゼを提供する。好ましくは、本発明の使用のための酵素は、インビボ及び/又はインビトロでの改良された効能；改良されたpH−安定性プロフィール；改良されたpH−活性プロフィールを有し；プロテアーゼによる分解に対して安定し；胆汁塩の存在下で安定し；そして/又は低められたアレルギー性を有する。
【０００９】
本発明は、配列番号１のアミノ酸1-269に対して少なくとも90％の同一性を有するが、但し配列番号２のアミノ酸1-269ではない、薬剤としての使用のためのリパーゼに関する。前記リパーゼは、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼと組合して使用され得る。
本発明はまた、消化異常、PEI、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理のための薬剤の製造のためへのそのようなリパーゼの使用にも関し、それらの使用はさらに、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼの使用を包含する。
【００１０】
本発明はさらに、少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤材料、任意にはプロテアーゼ及び/又はアミラーゼと共にそのようなリパーゼを含んで成る医薬組成物に関する。
本発明はまた、治療的有効量のそのようなリパーゼを、任意にはプロテアーゼ及び/又はアミラーゼと共に投与することによる、消化異常、PEI、膵炎（急性及び/又は慢性）、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理方法に関する。
発明の特定の記載：
【発明を実施するための最良の形態】
【００１１】
酵素：
本発明は、配列番号１のアミノ酸1-269に対して少なくとも90％の同一性を有するアミノ酸配列を有するか、又は含んで成る、配列番号２のアミノ酸1-269ではないリパーゼの医薬使用に関する。
【００１２】
特定の態様においては、ａ）前記リパーゼが配列番号１のアミノ酸1-269を含んで成り、又はｂ）前記リパーゼが配列番号1のアミノ酸1-269の変異体であり、ここで前記変異体が25個以下のアミノ酸により、配列番号１のアミノ酸1-269とは異なり、そしてここで（i）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269に比較して、１又は複数のアミノ酸の少なくとも１つの保存性置換及び/又は挿入を含んで成り；そして/又は（ii）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269に比較して、少なくとも１つの小さな欠失を含んで成り；そして/又は（iii）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269に比較して、少なくとも１つの小さなN−又はC−末端延長を含んで成り；そして/又は（iv）前記変異体が、配列番号２のアミノ酸1-269を有するリパーゼの対立遺伝子変体であり；そして/又は（v）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269を有するリパーゼのフラグメントである。
【００１３】
本発明はまた、消化異常、PEI、膵炎（急性及び/又は慢性）、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理のための薬剤の製造のためへのそのようなリパーゼの使用にも関する。本発明はさらに、少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤材料と共にそのようなリパーゼを含んで成る医薬組成物、並びに治療的有効量のそのようなリパーゼを、上記言及された疾病の処理方法に関する。配列番号１のアミノ酸1-269を含んで成るリパーゼは、ヒューミコラ・ラヌギノサ（サーモミセス・ラヌギノサ）DSM4109（配列番号２）の変異体である。
【００１４】
続いて、本発明の組成物、方法及び使用への使用のためのプリパーゼは、“本発明のリパーゼ”として言及される。
本明細書においては、リパーゼは、カルボン酸エステルヒドロラーゼEC3.1.1‐を意味し、それは活性、例えばEC3.1.1.3トリアシルグリセロールリパーゼ、EC3.1.1.4ホスホリパーゼA1, EC3.1.1.5リソホスホリパーゼ、EC3.1.1.26ガラクトリパーゼ、EC3.1.1.32ホスホリパーゼA1, EC3.1.1.73フェルロイルエステラーゼを含む。特定の態様においは、リパーゼは、EC3.1.1.3トリアシルグリセロールリパーゼである。EC番号は、それぞれ、Eur. J. Biochem. 1994,223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995,232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996,237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997,250, 1-6; and Eur. J. Biochem. 1999,264, 610-650に公開されている付録を包含する、NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Californiaからの酵素命名法1992を言及する。命名法は定期的に補充され、そして更新されている：http://www. chem. qmw. ac. uk/iubmb/enzyme/index. HtmlでのWorld Wide Web (WWW)を参照のこと。
【００１５】
上記に定義されるような本発明のリパーゼは、配列番号２のアミノ酸1-269を有するリパーゼを包含しない。後者の配列は、二重置換R231T＋R233Nにより、配列番号１のアミノ酸1−269とは異なる。配列番号１における“二重置換R231T＋R233N”とは、それぞれ、位置231及び233における２種のアルギニン残基（Arg又はR）が、それぞれ、トレオニン（Thr又はT）及びアスペルギン（Asn又はN）により置換されている、配列番号１の変異体を言及する。用語“位置”とは、配列列挙の配列番号１における正のアミノ酸残基番号を言及する。それらの２種の置換は、下記に定義されるように、保存性ではない（それらは、２種の極性アミノ酸により２種の塩基性アミノ酸を置換するので）。
【００１６】
従って、特定の態様においては、本発明のリパーゼは、二重置換R231T＋R233Nが行われている配列番号１に対応する、配列番号２のアミノ酸1-269から成るアミノ酸配列を有さない。
【００１７】
保存性置換、挿入、欠失、N-末端延長、及び/又はC-末端延長を含んで成るリパーゼ、及び配列番号１のアミノ酸1-269の配列に比較してのリパーゼフラグメントは、当業界において知られているいずれかの方法、例えば特定部位の突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、コンセンサス誘導方法（EP897985号）及び２遺伝子シャフリング（WO95/22625号、WO96/00343号）、等により、この分子から調製され得る。そのようなリパーゼはまた、ハイブリッド、又はキメラ酵素でもあり得る。
【００１８】
本発明の変異体リパーゼはもちろん、リパーゼ活性を有する。特定の態様においては、変異体リパーゼの比活性は、配列番号１のアミノ酸1-269を有するリパーゼの比活性の少なくとも50％である。追加の特定の態様においては、変異体リパーゼの比活性は、配列番号１のアミノ酸1-269を有するリパーゼの比活性の少なくとも60, 70, 75, 80, 90又は95％である。前記比活性は、本明細書における例1のいずれかのリパーゼアッセイを用いて測定され得るが、しかし好ましくは例１のLU-アッセイを用いて、LU/mgの酵素のタンパク質で測定され、そして例５に記載のようにして、アミノ酸分析により酵素タンパク質含有率が決定される。
【００１９】
本発明のリパーゼ変異体を可能にするアミノ酸変更は、タンパク質の折りたたみ及び/又は活性に対して実質的に影響を与えない、保存性アミノ酸置換又は挿入であるマイナーな性質、好ましくは少数のそのような置換又は挿入；小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシル−末端延長、例えばアミノ末端メチオニン残基の延長；小さなリンカーペプチド；又は実効電荷又は他の機能、例えばポリ−ヒスチジン路、抗原性エピトープ又は結合ドメインを変更することにより精製を促進する小さな延長のものである。
【００２０】
これに関して、用語、“小さな”とは独立して、25個まで数のアミノ酸残基を表す。好ましい態様においては、用語“小さな”とは独立して、24, 23, 22, 21又は20個までのアミノ酸残基を表す。さらなる好ましい態様においては、用語、“小さな”とは独立して、19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 , 又は10個までのアミノ酸残基を表す。さらなる好ましい態様においては、用語、“小さな”とは独立して、9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2,又は1個までのアミノ酸残基を表す。他の態様においては、用語“小さな”とは独立して、40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 , 30, 29, 28, 27, 又は26個までのアミノ酸残基を表す。
【００２１】
本発明のリパーゼは、配列番号１のアミノ酸1-269とは、25, 24, 23, 22, 21 , 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 又は11個以下のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有し；又はそれは10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 又は1個以下のアミノ酸により、配列番号１のアミノ酸１-269とは異なり、いずれの場合においても、好ましくは、上記で定義されるように、配列番号１における二重置換R231T＋R233Nを除く。他の態様においては、本発明のリパーゼは、配列番号１のアミノ酸1-269とは、40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 , 30, 29, 28, 27, 又は26個以下のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有し、好ましくは、上記に定義されるように、配列番号１における二重置換R231T＋R233Nを除く。
【００２２】
保存性置換の例は、保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（セリン、トレオニン、グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。
【００２３】
他方では、保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。比活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られており、そして例えば、H. Neurath and R.L. Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New York により記載されている。最も通常生じる交換は次のものである： Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu及びAsp/Gly。
【００２４】
保存性置換（１つの極性アミノ酸のもう１つの極性アミノ酸による置換）を含んで成る本発明の変異体リパーゼの例は、配列番号１のアミノ酸1-269の変異体Asn33Gln（N33Q）である。これは、本発明のための配列番号１として効果的であるグリコシル化されていない変異体である（例５を参照のこと）。本発明はまた、この変異体リパーゼ、及び配列番号１のアミノ酸-5-269, -4-269, -3-269及び2-269の相応じて置換された変異体にも関する。
【００２５】
好ましい態様においては、本発明の変異体リパーゼにおける置換の個々は、保存性である。
小さなN末端延長を含んで成る本発明の変異体リパーゼの例は、配列番号１のアミノ酸-5-269 (-5 -+269), -4-269 (-4 - +269), 及び-3-269 (-3 - +269)、すなわちそれぞれ、SPI.., PIR..,及び IRR..のN-末端である（例５を参照のこと）。
本発明のリパーゼはまた、配列番号２のアミノ酸1-269を、好ましくは配列番号２の二重置換T231R＋233R（配列番号１について上記のように定義された；必要な変更を加えて）と共に有するリパーゼの対立遺伝子変異体でもあり得る。
【００２６】
用語“対立遺伝子変異体とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の二者択一形のいずれかを示す。対立遺伝子変異体は、突然変異を通して天然において発生し、そして集団内での多形現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異はサイレントであり得（コードされるポリペプチドにおける変更がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。本発明のリパーゼの対立遺伝子変異体の例は、ヒューミコラ・ラヌギノサの異なった株由来のリパーゼである。
【００２７】
本発明のリパーゼは、配列番号１のアミノ酸1-269を有するリパーゼのフラグメントであり得、ここで前記フラグメントはリパーゼ活性を有する。用語フラグメントは、配列番号２のアミノ酸1−274のアミノ及び/又はカルボキシル末端、又は配列番号5−13のいずれか１つのアミノ及び/又はカルボキシル末端、好ましくはそれらの成熟部分から欠失された１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドとして、本明細書においては定義される。好ましくは、少数のアミノ酸が欠失されており、ここで少数とは上記で説明されたように定義される。より好ましくは、フラグメントは、少なくとも244, 245, 246, 247, 248, 249, 又は250個のアミノ酸残基を含む。最も好ましくは、フラグメントは、少なくとも251 , 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267又は268個のアミノ酸残基を含む。他の態様においては、フラグメントは、少なくとも239, 240, 241, 242又は少なくとも243個のアミノ酸残基を含む。
【００２８】
配列番号１のアミノ酸1-269のフラグメントである本発明の変異体リパーゼの例は、VSQのN-末端と共に、配列番号１のアミノ酸2-269(＋2〜＋269)のアミノ酸配列を有する変異体である（例５を参照のこと）。
【００２９】
本発明はまた、
（ａ）配列番号１のアミノ酸1-269に対して少なくとも99.4％の同一性を有する、薬剤としての使用のためのリパーゼ；
（ｂ）薬剤として使用のための、配列番号１のアミノ酸１−269を含んで成るリパーゼ又はその変異体に関し、ここで前記変異体は、配列番号１のアミノ酸1-269とは、25以下のアミノ酸により異なり、そして配列番号１のアミノ酸1-269に比較して、前記変異体は、
（i）１又は複数のアミノ酸の少なくとも１つの保存性置換及び/又は挿入；及び/又は
（ii）少なくとも１つの小さな欠失；及び/又は
（iii）少なくとも１つの小さなN-又はC-末端延長を含んで成り；そして/又は前記変異体は、
（iv）配列番号２のアミノ酸1-269を有するリパーゼの対立遺伝子変異体；及び/又は
（v）配列番号１のアミノ酸1−269を有するリパーゼのフラグメントを含んで成り；任意には、但し、前記変異体は配列番号２のアミノ酸１〜269ではなく；並びに本発明は、（ａ）及び（ｂ）のそのようなリパーゼの本発明にしたがっての、対応する組成物、方法及び使用にも関する。同一性の百分率（％）は、下記のようにして決定される。
【００３０】
次のアミノ酸配列を有するリパーゼが、本発明のリパーゼの好ましい例である：（i）配列番号１のアミノ酸＋1−＋269、（ii）配列番号１のアミノ酸-5−＋269、（iii）配列番号１のアミノ酸-4−＋269、（iv）配列番号１のアミノ酸-3−＋269、（v）配列番号１のアミノ酸-2−＋269、（vi）配列番号１のアミノ酸-1−＋269、（vii）配列番号１のアミノ酸＋2−＋269、及び（viii）（i）−（vii）の複数のリパーゼのいずれかの混合物。特定の態様においては、リパーゼは、（i）、（ii）、及び（i）及び（ii）のいずれかの混合物のリパーゼから選択される。（i）及び（ii）の好ましい混合物は、例５に記載されるようなEdman方法を用いてN−末端配列決定により、その％が決定される場合、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%又は少なくとも95％のリパーゼ（i）を含んで成る。
【００３１】
他の好ましい混合物は、（ａ）35−75％、好ましくは40−70％、より好ましくは45−65％のリパーゼ（ii）を含んで成る組成物；（ｂ）20−60％、好ましくは25−55％、より好ましくは30−50％、最も好ましくは35−47％のリパーゼ（i）を含んで成る組成物；（ｃ）30％までの、好ましくは25％までの、より好ましくは20％までの、最も好ましくは16％までのリパーゼ（vii）を含んで成る組成物；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び/又は（ｃ）のいずれかの組合せ、例えば45−65％のリパーゼ（ii）、35−47％のリパーゼ（i）及び16％までのリパーゼ（vii）を含んで成る組成物である。
【００３２】
本発明はまた、上記に記載される単離されたリパーゼ（iii）−（Vii）、並びに、特に本明細書に定義されるような医薬使用のための上記リパーゼ混合物及びリパーゼ組成物のいずれかにも関する。
【００３３】
もう１つの特定の態様においては、本発明のリパーゼは、追加のリパーゼと組合して使用され得る。追加のリパーゼの例は、哺乳類リパーゼ及び微生物リパーゼである。好ましい哺乳類リパーゼは、ブタ又は雄牛からの膵臓抽出物、例えばパンクレアチンである。パンクレアチンは、被覆されていない（生の）生成物の形で、又は配合された生成物（腸溶性被覆された（胃酸に対する耐性を付与するために）、又は非機能的に被覆された（被覆されているが、しかし胃酸に対する耐性は付与しない））の形で使用され得る。
【００３４】
パンクレアチンは実質的に、さらなる酵素活性成分、例えば膵臓プロテアーゼ及び/又は膵臓アミラーゼを含んで成る。微生物リパーゼは、例えば細菌又は細菌リパーゼに基づかれるか、又は由来することができる。細菌リパーゼは、例えばバチルス又はシードモナスに由来し、菌類リパーゼは例えば、リゾパス、カンジダ又はヒューミコラ、例えばリゾパス・テレマー、リゾパス・ジャバニカス、リゾパス・オリザエ又はヒューミコラ・ラヌギノサに由来し、特にAmano Pharmaceuticals, Japanから市販されている製品Lipase D2TM 又はLipase D Amano 2000TM (リパーゼ、EC3.1.1.3)のいずれかである。
【００３５】
本発明のリパーゼは、下記のように、アミラーゼを伴って又は伴わないで、プロテアーゼと組合して使用され得る。用語“プロテアーゼ”とは、本明細書においては、ペプチド結合を加水分解する酵素として定義される。それは、EC3.4酵素グループ（その13種の亜綱の個々を包含し、それらの酵素は“EC3.4.-.-酵素グループに属する”として言及される）に属するいずれかの酵素を包含する。
【００３６】
プロテアーゼの例は、哺乳類プロテアーゼ及び菌類プロテアーゼである。好ましい哺乳類プロテアーゼは、例えばブタ又は雄牛からの膵臓抽出物、例えばパンクレアチンである。パンクレアチンは、被覆されていない（生の）生成物の形で、又は配合された生成物（上記のように、腸溶性被覆された、又は非機能的に被覆された）の形で使用され得る。パンクレアチンは実質的に、さらなる酵素活性成分、例えば膵臓リパーゼ、BSSL（胆汁塩刺激されたリパーゼ）、及び/又は膵臓アミラーゼを含んで成る。
【００３７】
微生物プロテアーゼは、例えば細菌又は菌類株に基づくか又はそれに由来することができる。プロテアーゼは、アスペルギラス株、例えばアスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・メレウスに由来し、特にAmano Pharmaceuticals, Japanから入手できる製品Prozyme 6TM（中性、アルカリ性プロテアーゼE3.4.2.63）である。細菌プロテアーゼの例は、バチルス及びノカルジオプシスからのプロテアーゼ、例えば配列番号３のアミノ酸1-274のアミノ酸配列を有するバチルス・リケニホルミスプロテアーゼ、配列番号４のアミノ酸1-188のアミノ酸配列を有するノカルジオプシスsp. プロテアーゼ、又は配列番号５のアミノ酸1-188のアミノ酸配列を有するノカルジオプシス・ダソンビエレイsubsp.ダソンビエレイプロテアーゼからのプロテアーゼである。
【００３８】
配列番号３のアミノ酸1-274のプロテアーゼは例えば、“医薬使用のためのプロテアーゼ”の表題の及びSolvay Pharmaceuticals GmbH and Novozymes A/Sにより2005年6月24日出願されたDK特許出願番号2005/00930号に記載のようにして調製され得る。配列番号４−５のアミノ酸1-188のプロテアーゼは、WO2001/58276号及びWO2004/111244号に記載のようにして調製され得る。
【００３９】
好ましい態様においては、本発明のプロテアーゼは、（i）配列番号３のアミノ酸1-274, (ii)配列番号４のアミノ酸1-188, 及び/又は配列番号５のアミノ酸1-188のいずれかを有するか、又は含んで成るプロテアーゼに対して少なくとも70％同一である。（i）、（ii）又は（iii）のいずれかのさらなる好ましい態様においては、同一性の程度は、少なくとも71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%、又は少なくとも99％である。（i）、（ii）又は（iii）の他の態様においては、同一性の程度は、少なくとも約50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%、又は少なくとも69％である。
【００４０】
上記のようなプロテアーゼと共に又はそれを伴わないでの本発明のリパーゼは、アミラーゼと組合して使用される。
本明細書においては、アミラーゼは、澱粉及び他の線状及び枝分かれ鎖のオリゴ−多糖の末端−加水分解を触媒する酵素である。澱粉のアミロース部分は、１，４−α−グルコシド結合に富んでおり、そしてアミロペクチン部分は、１，４−α−のみならず、また、１，６−α−グルコシド結合を含む枝分かれ鎖である。特定の態様においては、アミラーゼは、EC3.2.1.1グループに属する酵素である。
【００４１】
特定の態様においては、アミラーゼは哺乳類アミラーゼ、又は細菌アミラーゼである。哺乳類アミラーゼの例は、例えばブタ又は雄牛からの膵臓抽出物、例えばパンクレアチンである。パンクレアチンは、被覆されていない（生の）生成物の形で、又は配合された生成物（上記のように、腸溶性被覆された、又は非機能的に被覆された）の形で使用され得る。パンクレアチンは実質的に、さらなる酵素活性成分、例えば膵臓プロテアーゼ、及び/又は膵臓リパーゼを含んで成る。微生物アミラーゼは例えば、細菌又は菌類株、例えばバチルス、シュードモナスアスペルギラス又はリゾパスに基づくか、又はそれに由来することができる。
【００４２】
アミラーゼは特に、アスペルギラス株、例えばアスペルギラス・ニガー、アスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・メレウス由来のもの、例えばAmano Pharmaceuticals, Japanから市販されているアスペルギラス・オリザエ由来のもの、例えばAmano Pharmaceuticals, Japanから市販されているアスペルギラス・オリザエ由来の製品Amylase A1TM、又はExtract−Chemie, Germanyから市販されているアスペルギラス・メレウス由来のAmylase ECTMであり得る。
【００４３】
好ましいアミラーゼは、配列番号６のアミノ酸1−481（例えば、そのアミノ酸1−481、1−484又は1−486）、配列番号７のアミノ酸1−481、及び/又は配列番号８のアミノ酸1−483を含んで成るアミラーゼである。好ましい態様においては、アミラーゼは、（i）配列番号６のアミノ酸1−481、（ii）配列番号７のアミノ酸1−481、及び/又は（iii）配列番号８のアミノ酸1−483のいずれかに対して少なくとも70％同一であるアミノ酸配列を有するか、又は含んで成るアミラーゼである。
【００４４】
配列番号６−８のアミラーゼは例えば、“医薬使用のためのアミラーゼ”の名称の及びSolvay Pharmaceuticals GmbH and Novozymes A/Sにより2005年6月24日に出願された同時継続DK出願番号2005/00931号に記載のようにして調製され得る。（i）、（ii）又は（iii）のいずれかの追加の好ましい態様においては、同一性の程度は、少なくとも71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%、又は少なくとも99％である。（i）、（ii）又は（iii）のいずれかの他の態様においては、同一性の程度は、少なくとも約50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%、又は少なくとも69％である。
【００４５】
１つの態様においては、本発明は、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼとを組合してのリパーゼに関し、ここで（i）前記リパーゼが配列番号１のアミノ酸２−269を含んで成り；（ii）前記プロテアーゼが、ａ）配列番号３のアミノ酸１−274を有するプロテアーゼ、ｂ）配列番号４のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、及びｃ）配列番号５のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、から成る群から選択されたプロテアーゼであり；（iii）前記アミラーゼが、ａ）配列番号６のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、ｂ）配列番号７のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及びｃ）配列番号８のアミノ酸１−483を有するアミラーゼ、から成る群から選択されたアミラーゼである。
【００４６】
本発明のためには、酵素の特に好ましい組合せは、次の通りである：
（i）配列番号３のアミノ酸1-274を有するプロテアーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
（ii）配列番号4のアミノ酸1-188を有するプロテアーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
（iii）配列番号5のアミノ酸1-188を有するプロテアーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
【００４７】
（iv）配列番号６のアミノ酸1-481（例えば、そのアミノ酸１-481、１-484又は１-486）を含んで成るアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
（v）配列番号７のアミノ酸1-481を有するアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
（vi）配列番号８のアミノ酸1-483を有するアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
【００４８】
（vii）配列番号３のアミノ酸1-274を有するプロテアーゼ及び配列番号６のアミノ酸1-481（例えば、そのアミノ酸１-481、１-484又は１-486）を含んで成るアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
（viii）配列番号３のアミノ酸1-274を有するプロテアーゼ及び配列番号７のアミノ酸1-481を有するアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
（ix）配列番号３のアミノ酸1-274を有するプロテアーゼ及び配列番号８のアミノ酸1-481を有するアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
【００４９】
（x）配列番号４のアミノ酸1-188を有するプロテアーゼ及び配列番号６のアミノ酸1-481（例えば、そのアミノ酸１-481、１-484又は１-486）を含んで成るアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
（xi）配列番号４のアミノ酸1-188を有するプロテアーゼ及び配列番号７のアミノ酸1-481を有するアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
（xii）配列番号４のアミノ酸1-188を有するプロテアーゼ及び配列番号８のアミノ酸1-483を有するアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
【００５０】
（xiii）配列番号５のアミノ酸1-188を有するプロテアーゼ及び配列番号６のアミノ酸1-481（例えば、そのアミノ酸１-481、１-484又は１-486）を含んで成るアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；
（xiv）配列番号５のアミノ酸1-188を有するプロテアーゼ及び配列番号７のアミノ酸1-481を有するアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ；及び
（xv）配列番号５のアミノ酸1-188を有するプロテアーゼ及び配列番号８のアミノ酸1-483を有するアミラーゼと組合しての配列番号１のアミノ酸1-269又は2-269を含んで成るリパーゼ。
【００５１】
酵素の他の好ましい組合せは、次の通りである：
（i）配列番号３のアミノ酸1-274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
（ii）配列番号４のアミノ酸1-188に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
（iii）配列番号５のアミノ酸1-188に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
【００５２】
（iv）配列番号６のアミノ酸1-481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
（v）配列番号７のアミノ酸1-481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
（vi）配列番号８のアミノ酸1-483に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
【００５３】
（vii）配列番号３のアミノ酸1-274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ及び配列番号６のアミノ酸1-481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
（viii）配列番号３のアミノ酸1-274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ及び配列番号７のアミノ酸1-481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
【００５４】
（ix）配列番号３のアミノ酸1-274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ及び配列番号８のアミノ酸1-483に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
（x）配列番号４のアミノ酸1-188に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ及び配列番号６のアミノ酸1-481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
【００５５】
（xi）配列番号４のアミノ酸1-188に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ及び配列番号７のアミノ酸1-481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
（xii）配列番号４のアミノ酸1-188に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ及び配列番号８のアミノ酸1-481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
【００５６】
（xiii）配列番号５のアミノ酸1-188に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ及び配列番号６のアミノ酸1-481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；
（xiv）配列番号５のアミノ酸1-188に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ及び配列番号７のアミノ酸1-481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ；及び
（xv）配列番号５のアミノ酸1-188に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ及び配列番号８のアミノ酸1-483に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合しての配列番号1のアミノ酸1-269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼ。
【００５７】
（i）- (xv)の好ましい態様においては、個々の同一性の程度は独立して、少なくとも51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%、又は少なくとも99％である。
【００５８】
1つの態様においては、本発明は、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼと共にリパーゼの酵素の組合せに関し、ここで
（i）前記リパーゼは、配列番号１のアミノ酸1-269に対して少なくとも90％の同一性を有するが、但し配列番号２のアミノ酸1-269ではないアミノ酸配列を含んで成り；
（ii）前記プロテアーゼは、ａ）配列番号３のアミノ酸１−274を有するプロテアーゼ、ｂ）配列番号４のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、及びｃ）配列番号５のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼから成る群から選択されたプロテアーゼに対して少なくとも70％の同一性を有し；及び/又は
（iii）前記アミラーゼは、ａ）配列番号６のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、ｂ）配列番号７のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及びｃ）配列番号８のアミノ酸１−483を有するアミラーゼから成る群から選択されたアミラーゼに対して少なくとも70％の同一性を有する。
【００５９】
この態様のおいては、リパーゼは好ましくは、ａ）配列番号１のアミノ酸1-269を含んで成るリパーゼ、又はｂ）配列番号1のアミノ酸1-269の変異体であるリパーゼであり、ここで前記変異体が25個以下のアミノ酸により、配列番号１のアミノ酸1-269とは異なり、そしてここで（i）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269に比較して、１又は複数のアミノ酸の少なくとも１つの保存性置換及び/又は挿入を含んで成り；そして/又は（ii）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269に比較して、少なくとも１つの小さな欠失を含んで成り；そして/又は（iii）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269に比較して、少なくとも１つの小さなN−又はC−末端延長を含んで成り；そして/又は（iv）前記変異体が、配列番号２のアミノ酸1-269を有するリパーゼの対立遺伝子変体であり；そして/又は（v）前記変異体が、配列番号１のアミノ酸1-269を有するリパーゼのフラグメントである。
【００６０】
一般的に、リパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼ酵素（この後、“酵素”、すなわち本発明の酵素）は、中性又は野生型酵素（動物、特に哺乳類、例えばヒト又はブタ酵素から；植物から；又は微生物から得られる）であり得るが、しかしまた、所望する酵素活性を示すいずれかの変異体、フラグメント、等、並びに合成酵素、例えばシャフリングされた、ハイブリッド又は、キメラ酵素、及びコンセンサス酵素であり得る。
【００６１】
特定の態様においては、酵素は、動物、たとえばヒトに暴露される場合、低い免疫原応答をもたらすよう企画された低アレルギー性変異体である。免疫学的応答は、酵素に暴露される動物の免疫系によるいずれかの応答として理解されるべきである。１つのタイプの免疫学的応答は、暴露された動物における高められたレベルのIgEを導くアレルギー応答である。低アレルギー性変異体は、当業界において知られている技法を用いて調製され得る。例えば、酵素は、免疫学的応答に関与する酵素の一部又はエピトープを保護するポリマー成分により接合され得る。ポリマーによる接合は、WO96/17929号、WO98/30682gou、WO98/35026号及び/又はWO99/00489号に記載のように、酵素へのポリマーのインビトロ化学的カップリングを包含する。
【００６２】
接合は、さらに又は他方では、酵素へのポリマーのインビボカップリングを包含する。そのような接合は、酵素をコードするヌクレオチド配列を遺伝的に構築し、酵素における追加のグリコシル化部位をコードするコンセンサス配列を挿入し、そして酵素をグリコシル化できる宿主において酵素を発現することによって達成され得る。例えば、WO00/26354号を参照のこと。低アレルギー性変異体を供給するもう１つの手段は、酵素モノマーが他の酵素モノマーのエピトープを保護し、そしてそれにより、オリゴマーの抗原性を低める、酵素の自己オリゴマー化を引き起こすために、酵素をコードするヌクレオチド配列の遺伝的構築である。
【００６３】
そのような生成物及びそれらの調製法は、例えばWO96/16177号に記載されている。免疫学的応答に関与するエピトープは、種々の方法、例えばWO00/26230号に記載されるファージ表示法、又はEP561907号に記載されるランダムアプローチにより同定され得る。エピトープが同定されると、そのアミノ酸配列は、既知の遺伝子操作技法、例えば特定部位の突然変異誘発により酵素の変更された免疫学的性質を生成するために変更され得（例えば、WO00/26230号、WO00/26354号及び/又はWO00/22103号を参照のこと）、そして/又はポリマーの接合がエピトープを保護するために、ポリマーのためのエピトープに十分に接近して行われ得る。
【００６４】
特定の態様においては、酵素は、（i）pH2−8、好ましくはまた、pH3−7、より好ましくはpH4−6で安定性であり；(ii)pH4−9、好ましくは4−8で活性的であり；（iii）ペプシン及び他の消化プロテアーゼ（例えば、膵臓プロテアーゼ、すなわち主にトリプシン及びキモトリプシン）による分解に対して安定性であり；そして/又は胆汁塩の存在下で活性的である。
【００６５】
本発明のリパーゼは好ましくは、胆汁塩の存在下で、例えば0.1-50mMの胆汁塩の存在下で、好ましくは0.5-20mMの胆汁塩の存在下で、及びさらにより好ましくは、1-10mMの胆汁塩の存在下で安定している。胆汁塩の存在下でのリパーゼの安定性は例えば、胆汁塩の存在下でのインキュベーションの後、残存するリパーゼ活性として測定され得る。胆汁塩の存在下でのリパーゼ安定性を測定するための適切な方法は、例のセクションに与えられる（pH6.5及び25℃で、1.8mMの胆汁塩の存在下で60分間、測定される）。好ましくは、本発明のリパーゼの残存するリパーゼの活性は、配列番号２のアミノ酸配列を有する比較リパーゼのその対応する残存活性よりも、少なくとも1.1 , 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2.0, 2.2, 2.4, 2.6 又は2.7倍、高く、ここでアッセイは好ましくは、1.8mMの胆汁塩の存在下でpH6.5及び25℃で60分間のインキュベーションにより行われる。
【００６６】
本発明のリパーゼは、さらに好ましくは、特にpH3.0で、消化プロテアーゼ、特にペプシンの存在下で安定している。pH3でブタペプシンの存在下でリパーゼ安定性を処理するための適切な方法は、例のセクションに与えられている（75μg/mlのブタペプシンの存在下で、pH3.0及び周囲温度で３時間、測定される）。好ましくは、本発明のリパーゼの残留リパーゼ活性は、配列番号２のアミノ酸配列を有する比較リパーゼのその対応する残留活性よりも少なくとも1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 3.5, 4.0又は少なくとも4.5倍、高い。
【００６７】
用語“〜と組合せて”とは、リパーゼ、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼの本発明に従っての組合された使用を意味する。組合された使用は、同時であり、重複し、又は連続的であり得、それらの３種の用語は一般的に、医師により行われる処方により中断される。
用語“同時”とは、酵素が、それらが１又は複数の別々の医薬製品と同時に投与される場合、又はそれらが１つの及び同じ医薬組成物において投与される場合、同時に活性的である環境を言及する。
【００６８】
用語“連続的”とは、1及び/又は２種の酵素が第１、及び第２、及び/又は第３の酵素と連続的に作用する、そのような情況を言及する。連続的作用は、別々の医薬配合物として又問題の酵素を所望する間隔で投与するか、又は問題の酵素が、異なった開放時間を得、改良された生成物安定性を付与し、又は酵素投与量を最適化するために、異なって配合されている（区分された）、１つの医薬組成物として投与することにより得られる。
用語“重複”とは、酵素活性期間が完全に同時でも又は完全に連続的でもなく、すなわち酵素が両者とも、又はすべて活性的である一定の期間が存在するそのような情況を言及する。
【００６９】
用語“１つの（ａ）”とは、例えば本発明のプロテアーゼ、リパーゼ、及び/又はアミラーゼに関して使用される場合、少なくとも１種を意味する。特定の態様においては、“１つの”とは、１，２，３，４，５、等を再び意味する、“１つ又はそれ以上”又は“少なくとも１つ”を意味する。
２種のアミノ酸配列間の関係は、パラメーター“同一性”により記載される。
【００７０】
本発明のためには、２種のアミノ酸配列は、EMBOSSパッケージ (http://emboss.org)バージョン2.8.0からのNeedleプログラムを用いることにより決定される。このNeedle−プログラムは、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453に記載される世界的一列整列アルゴリズムを実行する。使用される置換マトリックスはBLOSUM62であり、ギャップ開放ペナルティーは10であり、そしてギャップ延長ペナルティーは0.5である。
【００７１】
本発明のアミノ酸配列（“発明の配列”、例えば配列番号１のアミノ酸１−269）と、異なったアミノ酸配列（“外来性配列”、例えばWO2005/115445号の配列番号２のアミノ酸１−269）との間の同一性の程度は、“発明の配列”の長さ、又はいずれにせよ、最も短い“外来性配列”の長さにより割り算された、２種の配列一列整列での正確な適合の数として計算される。結果は、％同一性で表される。
【００７２】
正確な適合は、“発明の配列”及び“外来性配列”がオーバーラップの同じ位置において同一のアミノ酸残基を有する場合、発生する（下記一列整列の例においては、これは“|”により表される）。配列の長さは、配列におけるアミノ酸残基の数である（例えば、配列番号１の長さは269である）。
下記純粋に推定的な一列整列の例においては、オーバーラップは、配列１のアミノ酸配列“HTWGER-NL”又は配列番号２のアミノ酸配列“NGWGEDANL”である。この例においては、ギャップは、“−”により示される。
【００７３】
【化１】
2008546394.tif 000002
【００７４】
従って、配列２に対する配列１の同一性の％は、6/12＝0.5であり、50％に対応する。
特定の態様においては、配列番号１のアミノ酸１−269に対するポリペプチドのアミノ酸配列の同一性の％は、i)２種のアミノ酸を、BLOSUM62置換マトリックス、10のギャップ開放ペナルティー及び0.5のギャップ延長ペナルティーを伴って、Needleプログラムを用いて、一列整列し；ii)前記一列整列における正確な適合の数を計数し；iii)２種のアミノ酸配列の最短の長さにより前記正確な適合の数を割り算し；そしてiv) iii)の割り算の結果を％に転換することにより決定される。本発明の他の配列、例えば配列番号４のアミノ酸１-188に対する、又はそれとの同一性の百分率は類似する手段で計算される。
【００７５】
一方では、２種のアミノ酸配列間の同一性の程度は、Needleman-Wunsch一列整列（すなわち、包括的な一列整列）であるプログラム“align”により決定される。配列は、デフォールト評点マトリックスBLOSUM50を用いて、前記プログラムにより一列整列される。ギャップの最初の残基についてのペナルティーは、12であり、そしてギャップのさらなる残基のためのペナルティーは、２である。
【００７６】
Needleman-Wunschアルゴリズムは、Needleman, S.B. and Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453に記載されており、そしてAlignプログラムはMyers and W. Miller ： Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17により記載されている。“Align”は、FASTAパッケージバージョンv20u6の一部である（W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988),"Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85 : 2444-2448,及び W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, "Methods in Enzymology 183: 63-98を参照のこと）。
【００７７】
本発明のいずれかの酵素のサンプル又は試験配列と、特定される配列との間の同一性の程度は、次の通りにして決定され得る：２種の配列が、プログラム“align”を用いて一列整列される。その一列整列における完全な適合（“N−完全−適合”）の数が決定される（完全な適合は、一列整列の同じ位置における同じアミノ酸残基を意味する）。２種の一列整列された配列の共通する長さがまた決定され、すなわち存在するなら（“N−オーバーラップ”）、一列配列により創造される追跡及び先導ギャップを包含する、一列整列（オーバーラップ）におけるアミノ酸の合計数が決定される。同一性の程度は、“N−完全−適合”と“N−オーバーラップ”との間の比率（％同一性への転換のためには、100により掛け算される）として計算される。
【００７８】
サンプル又は試験配列と特定される配列との間の同一性の程度はまた、次の通りにして決定され得る：配列が、プログラム“align”を用いて一列整列される。その一列整列における完全な適合（“N−完全−適合”）の数が決定される（完全な適合とは、一列整列の同じ位置における同じアミノ酸残基を意味する）。サンプル配列の長さ（アミノ酸残基の数）が決定される（“N−サンプル”）。同一性の程度が、“N−完全−適合”と“N−サンプル”との間の比として計算される（％同一性に転換するために、100により掛け算される）。
【００７９】
サンプル又は試験配列と特定される配列との間の同一性の程度はまた、次の通りにして決定され得る：配列が、プログラム“align”を用いて一列整列される。その一列整列における完全な適合（“N−完全−適合”）の数が決定される（完全な適合とは、一列整列の同じ位置における同じアミノ酸残基を意味する）。特定される配列の長さ（アミノ酸残基の数）が決定される（“N−特定される”）。同一性の程度が、“N−完全−適合”と“N−特定される”との間の比として計算される（％同一性に転換するために、100により掛け算される）。
【００８０】
好ましくは、重複は、特定された配列の少なくとも20％（上記に定義されたような“N−重複”×100/特定された配列（“N−特定された”）におけるアミノ酸の数）、より好ましくは、少なくとも25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 又は95%である。これは、サンプル配列が特定された配列に対して一列整列される場合、特定された配列のアミノ酸の少なくとも20％（好ましくは、25〜95％）が重複に包含されて終結することを意味する。
【００８１】
他においては、重複は、特定された配列の少なくとも20％（上記に定義されたような“N−サンプル”×100/特定された配列（“N−特定された”）におけるアミノ酸の数）、より好ましくは、少なくとも25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 又は95%である。これは、特定された配列に対して一列整列される場合、特定された配列のアミノ酸の少なくとも20％（好ましくは、25〜95％）が重複に包含されて終結することを意味する。
【００８２】
本発明の酵素の活性は、いずれかの適切なアッセイを用いて測定され得る。一般的に、アッセイ−pH及びアッセイ−温度が、問題の酵素に適合され得る。アッセイ−pH−値の例は、pH2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 又は12である。アッセイ−温度の例は、30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 又は95℃である。好ましいpH値及び温度は、生理学的範囲において、4, 5, 6, 7又は8のpH値及び30, 35, 37又は40℃の温度である。
【００８３】
適切な酵素アッセイの例は、実験部分に包含さる。他の例は、プロテアーゼ及びアミラーゼ活性についてのFIP又はPh. Enr.アッセイである。それらのアッセイは、例えばそれぞれ、同時継続出願DK 2005 00930 及び DK 2005 00931に記載される。
【００８４】
薬剤：
本明細書においては、用語“薬剤”とは、疾病の徴候を処理し、予防し、そして/又は軽減する；好ましくは疾病の徴候を処理し、そして/又は軽減する、化合物、又は化合物の混合物を意味する。薬剤は、医者により処方され得るか、又はそれは店頭取引製品であり得る。
【００８５】
医薬組成物：
本発明の酵素の単離、精製及び濃縮は、従来の手段により実施され得る。例えばそれらは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る（例えば、Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publlishers, New York, 1989を参照のこと）。
【００８６】
配列番号１のリパーゼは、アメリカ特許第5,869,438号（ここで、配列番号１は、ここにおける配列番号２のリパーゼをコードするDNA配列である）に基づいて、すなわち前記アメリカ特許の配列番号１の修飾（この修飾は、ここにおける配列番号１と２との間のアミノ酸差異に影響を及ぼす）であるDNA配列の適切な宿主細胞における組換え発現により調製され得る。そのような修飾は、当業界において知られているように、特定部位の突然変異誘発により行われ得る。
【００８７】
特定の態様においては、個々の酵素の濃縮された固体又は液体調製物は、別々に調製される。それらの濃縮物はまた、下記により詳細に説明されるように、少なくとも一部、別々に配合され得る。
さらなる特定の態様においては、酵素は、固体濃縮物の形で、本発明の医薬組成物に導入される。酵素は、当業界において知られているように、種々の方法により固体状態にされる。例えば、固体状態は、酵素が高度な規則形で配置されている結晶、又は酵素分子が低い程度の規則形か又は不規則な形で配置されている沈殿物のいずれかであり得る。
【００８８】
結晶化は例えば、EP691982号に記載されているように酵素のpIに近いpHで、及び例えば10mS/cm又はそれ以下の低い導電率で行われ得る。特定の態様においては、本発明に従っての使用のためのリパーゼは、EP600868B1の例１に記載のようにして調製され得る結晶性リパーゼである。さらに、リパーゼ結晶は、WO2006/044529号に記載のようにして架橋をされ得る。
【００８９】
種々の沈殿方法、例えば塩、例えば硫酸アンモニウム及び/又は硫酸ナトリウムによる；有機溶媒、例えばエタノール及び/又はイソプロパノールによる；又はポリマー、例えばPEG（ポリエチレングリコール）による沈殿が当業界において知られている。他においては、酵素は、当業界において知られている種々の方法、例えば凍結乾燥、蒸発（例えば、減圧下で）、及び/又は噴霧乾燥により、溶媒（典型的には、水）を除去することにより、溶液から沈殿され得る。
【００９０】
さらなる特定の態様においては、酵素の固体濃縮物は、その固体濃縮物の合計タンパク質用量に対して、少なくとも50％（w/w）の含有率の活性酵素のタンパク質を有する。さらなる特定の態様においては、固体濃縮物の合計タンパク質含有率に対して、活性酵素のタンパク質の含有率は、少なくとも55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 又は95%(w/w)である。タンパク質含有率は、BIO-RADからのGS-800校正密度計を用いて、クーマシー染色されたSDS−PAGEゲルの濃度計走査により；Rocheから市販されている、市販のキット、例えばProtein Assay ESL（注文番号1767003）を用いて；又はWO01/58276号の例８に記載される方法に基づいて、当業界において知られているようにして測定され得る。
【００９１】
好ましくは、プロテアーゼ酵素タンパク質は、クーマシー染色されたSDS−PAGEゲルの濃度計走査により測定される場合、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 又は97%の本発明への使用のための固体プロテアーゼ濃縮物のタンパク質範囲を構成する。アスペルギラスにおいて発現され、そして例５において説明されるようにして、配列番号１の種々のN-末端形の混合物を含んで成るリパーゼに関しては、SDS−PAGEゲル上での適切なバンドは、34−40kDaの分子量に対応して位置する。配列番号１のグリコシル化されていない変異体N33Qに関しては、適切なバシドは、30kDa近くで位置する。
【００９２】
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤、又は補助材料、例えば（i）少なくとも１つのキャリヤー及び/又は賦形剤；又は（ii）少なくとも１つのキャリヤー、賦形剤、希釈剤及び/又はアジュバントと共に、好ましくは濃縮された酵素調製物、好ましくは固体の濃縮物の形で、酵素を含んで成る。任意の他の成分の非制限的な例（すべては医薬的に許容できる）は、砕解剤及びビークルである。
【００９３】
一般的に、問題の医学的徴候に依存して、本発明の組成物は、当業界において知られているすべての投与の態様、好ましくは例えば、腸内投与（消化管を通して）のために企画され得る。従って、組成物は、固体、半固体、液体又は気体形、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、微小球体、軟骨、クリーム、発泡体、液体、坐剤、注射、吸入、ゲル、ローション及びエアロゾルの形であり得る。医者は、最も適切な投与路を選択し、そしてもちろん、危険な又は他方では、不都合な投与路を実質的に回避することを知っているであろう。
【００９４】
従って、次の方法及び補助材料は単なる例示であり、そして制限的ではない。
固体経口制剤に関しては、酵素は、ペレット、微小ペレット、錠剤、微小錠剤、粉末、顆粒又はカプセルを製造するために、単独で、又は例えば従来のキャリヤー、例えば結晶性又は微結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシ澱粉又はゼラチン；砕解剤、例えばトウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉又はナトリウムカルボキシメチルセルロース；滑剤、例えばカルナバ蝋、ホワイト蝋、セラック、水を含まないコロイド状シリカ、ポリエチレングリコール（PEG, またマクロゲルとして知られている）1500〜20000、特にPEG4000, PEG6000, PEG8000, ボビドン、タルク、モノレイン又はステアリン酸マグネシウム；及び所望には、希釈剤、アジュバント、緩衝剤、保湿剤、保存剤、例えばメチルパラヒドロキシペンゾエート（E218）、着色剤、例えば二酸化チタン（E171）と共に、適切な添加剤と組合して使用され得る。経口製剤は、PEIの医学的徴候の処理のための好ましい製剤の例である。
【００９５】
酵素はまた、一般的には、水性溶媒、例えば水、又は非水性溶媒、例えば植物油又は他の類似する油、合成脂肪酸グリセリド、高脂肪酸のエステル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばPEG4000又は低級アルコール、例えば線状又は枝分かれC1-C4アルコール、例えば２−プロパノール；及び所望には、従来の補助材料又は添加剤、例えば溶解剤、アジュバント、希釈材、等張剤、沈殿防止剤、乳化剤、安定剤及び保存剤に、それらを溶解し、懸濁し、又は乳化することにより、液体経口製剤に配合され得る。
【００９６】
さらに、酵素は一般的に、種々の塩基と共に混合し、例えば塩基又は水溶性塩基を乳化することにより、直腸投与のための坐薬に製造され得る。坐薬は、室温で固化されるが、体温で溶融する、ビークル、例えばココアバター、カルボワックス及びポリエチレングリコールを含むことができる。
【００９７】
供給ビークルとしてのリポソームの使用は、可能性ある一般的な興味のもう１つの方法である。リポソームは、標的部位の細胞と融合し、そして内腔の内容物を細胞内に供給する。リポソームは、接触を維持するために種々の手段、単離、結合剤及び同様のものを用いて、融合のために十分な時間、細胞と接触して維持される。リポソームは、膜の融合に介在する精製されたタンパク質又はペプチド、例えばSendaiウィルス又はインフルエンザウィルス、等により調製され得る。脂質は、既知のリポソーム形成脂質、例えばカチオン性又は両性イオン脂質、例えばホスファチジルコリンのいずれかの有用な組合せであり得る。残る脂質は通常、中性又は酸性脂質、例えばコレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及び同様のものであろう。リポソームを調製するためには、Kato et al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266:3361により記載される方法が使用され得る。
【００９８】
経口又は直腸投与のための単位用量形、例えばシロップ、エリキシル、粉末及び懸濁液が供給され得、ここで個々の用量単位、例えばカプセル、錠剤又は坐剤は、予定された量の組成物を含む。同様に、注射のための単位用量形又は静脈内投与は、無菌水、通常の塩溶液又はもう１つの医薬的に許容できるキャリヤーに溶液としての組成物に酵素を含んで成ることができる。
【００９９】
用語“単位用量形”とは、本明細書において使用される場合、ヒト及び動物対象のための単位用量として適切な、生理学的に別々の単位を言及し、個々の単位は、所望する効果を生成するのに十分な量で、予測される量の酵素を含む。
特定の態様においては、本発明の医薬組成物は、腸、好ましくは経口投与のためである。
【０１００】
さらなる特定の態様においては、経口組成物は、（i）酵素結晶を含む液体組成物；（ii）(高く)精製された酵素の沈殿物の液体懸濁液；（iii）固体形又は溶解された形で酵素を含むゲル：（iv）固定された酵素又は粒子及び同様のものに吸着された酵素の液体懸濁液；又は（v）酵素含有の粉末、ペレット、顆粒又は微小球の形、所望には、酸安定性被膜により任意に被覆される、錠剤、カプセル又は同様のものの形での固体組成物である。
【０１０１】
組成物のもう１つの特定の態様においては、酵素は区分され、すなわち分離用被膜によりお互い分離される。
組成物のさらなる特定の態様においては、プロテアーゼは、組成物中の他の酵素成分、例えばリパーゼ及び/又はアミラーゼから分離される。
酵素の投与量は、投与される特定の酵素、投与の頻度、投与の態様、徴候の重症度、及び副作用に対する対象の感受性、及び同様のものに依存して、広く変化することであろう。特定の酵素のいくつかが、他のものより有能であり得る。
【０１０２】
本発明の酵素の固体経口製剤の例は、次のものを含んで成る：
（i）配列番号１のアミノ酸1-269に対して少なくとも90％の同一性を有する本発明のリパーゼ；
（ii）ａ）配列番号３のアミノ酸１−274を有するプロテアーゼ、ｂ）配列番号４のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、及びｃ）配列番号５のアミノ酸１−188を有するプロテアーゼ、から成る群から選択されたプロテアーゼに対して少なくとも70％の同一性を有するプロテアーゼ；及び/又は
【０１０３】
（iii）ａ）配列番号６のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、ｂ）配列番号７のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及びｃ）配列番号８のアミノ酸１−483を有するアミラーゼ、から成る群から選択されたアミラーゼに対して少なくとも70％の同一性を有するアミラーゼ；ここで好ましくは、（i）, (ii)及び（iii）の酵素の予測される毎日の臨床学的投与量は次の通りである（すべては、mg酵素タンパク質/kg体重（bw）である）：（i）のリパーゼに関しては、0.01-1000, 0.05-500, 0.1-250,又は 0.5-100mg/kg（bw）；（ii）のアミラーゼに関しては、0.001-250, 0.005-100, 0.01-50, 又は0.05-10mg/kg（bw）；（iii）のプロテアーゼに関しては、0.005-500, 0.01-250, 0.05-100,又は 0.1-50mg/kg（bw）；である。
【０１０４】
本発明の酵素の固体経口製剤の好ましい例は、（i）配列番号１のアミノ酸2−269を含んで成るリパーゼ；及び（ii）；配列番号６のアミノ酸1−481を含んで成るアミラーゼ及び/又は（iii）配列番号３のアミノ酸1−274を含んで成る、好ましくは有するプロテアーゼを含んで成る。
【０１０５】
予測される毎日の臨床学的投与量は次の通りである（すべては、mg酵素タンパク質/kg体重（bw）である）：（i）のリパーゼに関しては、0.1-250, 0.5-100, 又は1-50mg/kg（bw）；（ii）のアミラーゼに関しては、0.01-50, 0.05-10, 又は0.1-5mg/kg（bw）；（iii）のプロテアーゼに関しては、0.05-100, 0.1-50, 又は 0.5-25 mg/kg（bw）である。
アミド（ペプチド）結合、及びアミノ及びカルボキシ末端は、経口投与に対してより高い安定性に修飾され得る。カルボキシ末端はアミド化され得る。
【０１０６】
消化異常、PEI、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理のための適切な本発明の医薬組成物の特定の態様は、本発明の酵素をペレット中に導入することにより調製され得る。ペレットは一般的に、10〜90％（w/w, 得られるペレットの乾量に対して）の生理学的に許容できる有機ポリマー、10〜90％（w/w, 得られるペレットの乾量に対して）のセルロース又はセルロース誘導体、及び80〜20％（w/w, 得られるペレットの乾量に対して）の酵素を含んで成り、ここで前記有機ポリマー、セルロース誘導体及び酵素の合計量は、それぞれの場合、100％に近づく。
【０１０７】
生理学的に許容できる有機ポリマーは、ポリエチレングリコール1500、ポリエチレングリコール2000、ポリエチレングリコール3000、ポリエチレングリコール4000、ポリエチレングリコール6000、ポリエチレングリコール8000、ポリエチレングリコール10000、ポリエチレングリコール20000、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンのコポリマー、及び前記有機ポリマーの混合物から成る群から選択され得る。ポリエチレングリコール4000が、生理学的に許容できる有機ポリマーとして好ましい。
【０１０８】
セルロース又はセルロース誘導体は、セルロース酢酸セルロース、セルロース脂肪酸エステル、硝酸セルロース、セルロースエーテル、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、メチルエチルセルロース、及びメチルヒドロキシプロピルセルロースから選択され得る。セルロース、特に微晶性セルロースが、セルロース又はセルロース誘導体として好ましい。
【０１０９】
得られるペレットは、適切な腸溶性被膜、他の非機能的被膜により被覆されるか、又はそのような被膜なしに、直接的に使用され得る。さらに、得られるペレットは、上記に詳細に記載されたように、障害又は疾病の治療のために適切なサイズのカプセル、例えばハードゼラチンカプセル又はゼラチンフリーのカプセル中に充填され得る。本発明の態様においては、異なった酵素型、特にリパーゼ、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼから生成されたペレットが、前記カプセル中に充填され得る。異なった酵素型によりカプセルを充填したが、単一酵素型（すなわち、リパーゼ、プロテアーゼ又はアミラーゼ）の用量が、特定された量のいずれかのリパーゼ、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼをカプセルに添加することにより、一定の徴候グループ又は一定の患者サブグループの特定の必要性に適合され得、すなわちリパーゼ：プロテアーゼ：アミラーゼのそれらの特定の比率で変化するカプセルが生成され得る。
【０１１０】
本発明のリパーゼの好ましい医薬組成物、特に本明細書において言及された好ましい賦形剤を含んで成る配合物が、WO2005/092370号に記載されている。特に好ましい態様においては、医薬組成物は、モノ−、ジ−及びトリ−アシルグリセルド及びポリエチレングリコール（PEG）のマイクロゲルグリセリド混合物、脂肪族C6-C22 カルボン酸のモノ−及びジ−エステル、及びまた、たぶん低割合のグリセロール及び遊離ポリエチレングリコールを含んで成る。
マイクロゲルグリセリド混合物に含まれるポリエチレングリコール（PEG）は好ましくは、分子当たり平均して６〜多くとも40の酸化エチレン単位、又は200〜2000の分子量を有するPEGである。
【０１１１】
本発明のもう１つのさらなる観点は、界面活性剤、補助−界面活性剤及び親油性相から成る、10以上から又は10に等しいHLB値（親水性−親油性バラシス）及び30℃以上か又は30℃に等しい融点を有するシステムを含んで成る、本発明の酵素の医薬組成物を提供する。好ましい態様においては、前記システムは、10〜16好ましくは12〜15のHLB値を有し、そして30〜600℃の融点を有する。
【０１１２】
特に、HLB値及び融点により特徴づけられるシステムは、モノ−、ジー及びトリグリセリド及びポリエチレングリコール（PEG）のモノ−及びジエステルと、8〜24、好ましくは8〜18個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸との混合物であり、それにより、前記ポリエチレングリコールは、好ましくは、分子当たり約６〜約32の酸化エチレン単離を有し、そして前記システムは任意には、遊離グリセリン及び/又は遊離ポリエチレングリコールを含む。そのようなシステムのHLB値は好ましくは、PEGの鎖長により調節される。そのようなシステムの融点は、脂肪酸の鎖長、PEGの鎖長及び脂肪酸鎖の飽和の程度、及び従って、マクロゲルグリセリド混合物の調製のための出発油により調節される。
【０１１３】
“脂肪族C8-C18カルボン酸”とは、カプリル酸（C8）、カプリン酸（C10)、ラウリン酸（C12), ミリスチン酸（C14）、パルミチン酸（C16）及びステアリン酸（C18）が、それらの酸が飽和化される場合、有意な及び種々の割合で含まれる混合物、及びその対応する不飽和C8-C18カルボン酸を表す。それらの脂肪酸の割合は、出発油に従って変化できる。
【０１１４】
モノ−、ジ−及びトリアシルグリセリド及びポリエチレングリコール（PEG）のモノ−及びジエステルと、８〜18個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸とのそのような混合物は、例えば200〜1500の分子量を有するポリエチレングリコールと出発油との間の反応により得られ、ここで前記出発油はカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノレン酸を、個々に含むか又は混合物として含む群から選択される脂肪酸とのトリグリセリド混合物から成る。任意には、そのような反応の生成物はまた、低い割合のグリセリン及び遊離ポリエチレングリコールを含むことができる。
【０１１５】
そのような混合物は、商品名Gelucire（商標）として市販されている。本発明の１つの好都合な態様は、商品名Gelucire（商標）として知られている製品のうち、特に“Gelucire（商標）50/13”及び/又は“Gelucire（商標）44/14”が本発明の医薬製剤への使用のための適切な混合物を表すことを提供する。
【０１１６】
Gelucire（商標）50/13は、モノ−、ジ及びトリグリセリド及びポリエチレングリコールのモノ−及びジエステルと、それぞれ結合された脂肪酸の主要割合を生成する、40％〜50％及び48％〜58％でのパルミチル酸（C15）及びステアリン酸（C18）との混合物である。カプリ酸（C8）及びカプリン酸（C10）の割合は個々の場合、３％以下であり、そしてラウリン酸（C12）及びミリスチン酸（C14）の割合は個々の場合、５％以下である。
【０１１７】
Gelucire（商標）44/14は、モノ−、ジ−及びトリアシルグリセリド及びポリエチレングリコールのモノ−及びジエステルの混合物であり、パルミチン酸（C16）のそれぞれの割合は４〜25％であり、ステアリン酸（C18）は５〜35％であり、カプリル酸（C8）は15％以下であり、カプリン酸（C10）は12％以下であり、ラウリン酸（C12）は30〜50％であり、そしてミリスチン酸（C14）は５〜25％である。Gelucire（商標）44/14は、例えばヤシ油及びポリエチレングリコール1500を用いてのアルコール分解/エステル化反応により調製され得る。
【０１１８】
本発明の好ましい態様は、モノ、ジ−及びトリグリセリド及びポリエチレングリコールの混合物、脂肪酸C8-C18カルボン酸のモノ−及びジエステル、及びまた、たぶん低い割合のグリセリン及び遊離ポリエチレングリコールを含むシステムを含んで成る、本発明の酵素の医薬組成物を提供し、ここで前記システムは、40℃〜55℃の融点及び12〜15の範囲のHLG値を有する。より好ましくは、システムは、44℃〜50℃の融点及び13〜14の範囲のHLB値を有する。他方では、システムは、約44℃の融点及び14のHLB値を有し、又はシステム約50℃の融点及び13のHLB値を有する。
【０１１９】
処理方法：
本発明のリパーゼは、任意には、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼ（本発明の酵素）と組合して、動物における種々の疾病又は障害及び/又は予防処理において有用である。用語、動物とは、すべての動物及び特にヒトを包含する。動物の例は、非反芻動物、及び反芻動物、例えば、羊、ヤギ、及び牛、例えば蓄牛、及び乳牛及び子牛を包含する。特定の態様においては、動物は非反芻動物である。非反芻動物は、単一の胃を有する動物、例えば馬、ブタ（子ブタ、成長しているブタ及び雌ブタを包含するが、但しそれらだけには限定されない）；家禽類、例えば七面鳥、鴨及び鶏（ブロイラー鶏、産卵鶏を包含するが、但しそれらだけには限定されない）；子牛；ペット、例えばネコ及び犬；及び魚（サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及び鯉を包含するが、但しそれだけには限定されない）；及び甲殻類（小エビ及び車えびを包含するが、但しそれだけには限定されない）を包含する。特定の態様においては、動物は哺乳類、より特定にはヒトである。
【０１２０】
例えば、酵素は、消化障害、例えば胃及び膵臓から通常分泌される消化酵素の胃腸管への不十分な生成及び/又は分泌により、しばしば引起される消化不良の処理において有用である。
【０１２１】
さらに、酵素PEIの処理において特に有用である。PEIは、Borgstrom 試験 (JOP. J Pancreas (Online) 2002; 3(5): 116-125)を用いて確かめられ得、そしてそれは、疾病及び病状、例えば膵癌、膵臓及び/又は胃の手術、例えば膵臓の全体的又は部分的切開、胃切除、後胃腸バイパス手術（例えば、Billroch II胃腸切断）；慢性膵炎；Shwachman Diamond症候群；膵臓又は通常の胆管の管閉塞（例えば、新形成からの）；及び/又は嚢胞性繊維症（濃粘液が膵臓の管を阻止する固有の疾病）により引起され得る。酵素はまた、急性膵炎の処理においても有用である。
【０１２２】
消化障害に対する酵素の効果は、EP0600868号に一般的に記載のようにして、測定され、ここで例２は胃の条件下でのリパーゼ安定性試験を測定するためのインビトロ消化試験を記載し、そして例３は胆汁塩の存在下でのリパーゼ活性についてのインビトロ消化試験を記載する。対応する試験がプロテアーゼのために構築され得る。また、WO02/060474号は、適切な試験、例えば（１）ブタ試験飼料における脂質消化を測定するためのインビトロ試験、及び（２）脂肪、タンパク質及び澱粉の消化が測定される、膵臓不十分ブタによるインビボ試験を開示する。
【０１２３】
特定の態様においては、本発明のリパーゼの効果が、例２のプロテアーゼ効率についてのインビボスクリーニング試験を用いて測定される。
もう１つの例として、酵素は、I及び/又はII型糖尿病の処理において、特に後での合併症を低める観点から、通常この疾病に付随する消化障害の糖尿病治療における補助処理のために有用である。
【０１２４】
酵素の糖尿病に対する効果が、WO00/54799号に記載される１又は複数の方法により、例えばグリコシル化されたヘモグロビンのレベル、血液グルコースレベル、低血糖攻撃、脂溶性ビタミン、例えばビタミンA、D及びEの状態、インスリンの必要とされる毎日の用量、体重の基準及び高血糖期間を調節することにより決定され得る。
【０１２５】
本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特許の態様により範囲を限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点を例示するものである。いずれかの同等の態様が本発明の範囲内で意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの修飾の他に、本発明の種々の修飾は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた本発明の範囲内にある。
種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０１２６】
例１：酵素アッセイ：
ブタパンクレアチンのリパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼについてのアッセイは、FIP（Federation Internationale Pharmaceutique）並びにヨーロッパ薬局方及びアメリカ合衆国薬局方により公開されている。1FIP−単位＝1Ph.Eur.−単位（ヨーロッパ薬局）。このアッセイは、例えばFederation Internationale Pharmaceutique, Scientific Section: International Commission for the standardisation of pharmaceutical enzymes, a) "Pharmaceutical Enzymes," Editors: R. Ruyssen and A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Belgium (1978), b) European Pharmacopoeiaに記載されている。また、Deemester et al in Lauwers A, Scharpe S (eds): Pharmaceutical Enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385も参照のこと。適切な酵素標準は、International Commission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for Standards, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghentから入手できる。
【０１２７】
リパーゼFIPアッセイ、並びにリパーゼ、プロテアーゼ及びアミラーゼについての他の適切なアッセイは下記に記載される。
【０１２８】
リパーゼFIPアッセイ：
パンクレアチンの脂肪分解活性を測定するために、ヨーロッパ薬局方5.1に公開される方法を使用した。特にことわらない限り、微生物リパーゼの脂肪分解活性の決定に関しては、FIPにより公開されるリゾパス・オリザエリパーゼについてのアッセイを使用した。
【０１２９】
リパーゼpNPアッセイ：
基質：パラ−ニトロ−フェニル（pNP）バレレート：
アッセイpH：7.7。
アッセイ温度：40℃
反応時間：25分。
【０１３０】
黄色の消化された生成物は、405nmでの特徴的な吸光度を有する。その量を分光計により決定する。１リパーゼ単位は、所定のアッセイ条件下で１分当たり1μモルの粉砕できる酪酸を開放する酵素の量である。より詳細なアッセイの記載AF95/6−GBは、必要に応じて、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから入手できる。
【０１３１】
リパーゼLUアッセイ：
このアッセイにおいては、pH7.00及び30℃（±1℃）での0.16Mのトリブチリン（グリセロールトリブチレート、Merck 1.01958.000）のリパーゼ触媒された分解に続いて、0.025Mのガス抜きされた、CO2フリーの水酸化ナトリウム（水酸化ナトリウムチトリソール、Merck9956）による開放される酪酸のpH−安定滴定を行う。滴定液の消費を、時間の関数として記録する。
【０１３２】
基質を、0.6％w/vのアラビアガム乳化剤により乳化する（20.0gのアラビアガム、89.5gのNaCl, 2.05gのKH2PO4に水を添加し、1.5Lにし、完全に溶解するまで放置し、2700mlのグリセロールを添加し、pHを4.5に調節し、90mlのトリブチリンを、300mlのアラビアガム乳化剤及び1410mlの脱イオン水と共に混合し、そして例えば7000rpmでのSilverson乳化機L4RTを用いて３分間、均質化し、そして次にpH4.75に調節する）。リパーゼサンプルを、まず、0.1Mのグリシン緩衝液（pH10.8）に希釈し、次の脱イオン水に希釈し、1.5−4.0LU/mlの活性レベルを定める。15mlの乳化された基質溶液を、滴定容器中に注ぐ。1.0mlのサンプル溶液を添加し、そしてpHを、滴定の間、7.0で維持する。一定のpHを維持するために１分当たり添加される滴定液の量を測定する。活性の計算は、滴定曲線の線状範囲の平均傾斜に基づかれる。既知活性の標準を、レベルを調べるために使用することができる。
【０１３３】
１LU(リパーゼ単位)は、上記に与えられるアッセイ条件かで１分当たり１μモルの滴定可能な酪酸を開放する酵素の量である。１kＬＵ(キロリパーゼ単位)＝1000LU。
より詳細なアッセイの記載EB-SM-0095.02は、必要に応じて、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから入手できる。
【０１３４】
リパーゼpH安定アッセイ：
このアッセイは、0.65mMの胆汁塩の存在下でオリーブ油エマルジョンからの脂肪酸のリパーゼ触媒された開放に基づかれている。基質を、乳化剤としてのアラビアガムと共に乳化する（175gのオリーブ油を、630mlのアラビアガム溶液（4000mlの水中、474.6gのアラビアガム、64gの塩化カルシウム）と共にブレンダーにおいて15分間、乳化し；室温への冷却の後、pHを、4MのNaOHを用いて、pH6.8−7.0に調節する）。
【０１３５】
決定するために、19mlのエマルジョン及び10mlの胆汁塩溶液（492mgの胆汁塩を水に溶解し、そして500mlまで満たす）を、反応容器において混合し、そして36.9℃〜37.5℃まで加熱する。反応を、1.0mlの酵素溶液の添加により開始する。開放された酸を、0.1Mの水酸化ナトリウムの添加により、合計5分間、pH7.0で自動的に滴定する。活性を、第１回目と第５回目との間の滴定曲線の傾斜から計算する。検量のために、標準を、３種の異なった活性レベルで測定する。
【０１３６】
プロテアーゼSuc-AAPF-pNAアッセイ：
基質：Suc-AAPF−pＮA（Sigma（商標） S-7388）.
アッセイ緩衝液：10OmM の琥珀酸, 10OmMの HEPES (Sigma H-3375), 10OmMの CHES (Sigma C-2885), 10OmMの CABS (Sigma C-5580), 1 mMの CaCl2, 15OmMの KCI, 0.01 % Triton（商標） X-100、HCI 又は NaOHによりpH 9.0に調節された。
アッセイ温度：25℃。
【０１３７】
300μlの希釈されたプロテアーゼサンプルを、1.5mlのアッセイ緩衝液と共に混合し、そして活性反応を、1.5mlのpNA基質を添加することにより開始し（50mgを1.0mlのDMSOに溶解し、そしてさらに、0.01％のTriton（商標）X-100により45倍に希釈した）、そして混合の後、A405の上昇を、プロテアーゼ活性の測定として、分光計によりモニターした。プロテアーゼサンプルを、すべてのアッセイ測定値がアッセイについての用量−応答曲線の直線部分以内にあることを確認するために、活性測定の前、希釈した。
【０１３８】
プロテアーゼAUアッセイ：
変性されたヘモグロビン（ウレア含有の6.7mMのKH2PO4/NaOH緩衝液（pH7.50）中、0.65％（w/w））を、25℃で10分間、プロテアーゼにより分解し、そして分解されていないヘモグロビンを、トリクロロ酢酸（TCA）により沈殿せしめ、そして濾過により除去する。濾液中、TCA可溶性ヘモグロビン分解性生物を、Folin & Ciocalteuのフェノール試薬（2体積の脱イオン水に対する１体積のFolin−Ciocalteuフェノール試薬Merck9001.0500）により決定し、これは、いくつかのアミノ酸により青色を付与する（750nmで測定される）。
【０１３９】
活性単位（AU）を測定し、そして標準への参照により定義する。変性されたヘモグロビン基質を次の通りにして調製する：1154gのウレア（Hamstoff, Merck 8487）を、1000mlの脱イオン水に溶解し、240.3gのNaOHを添加し、そして次に、63.45gのヘモグロビン（Merck 4300）をゆっくり添加し、続いて315.6gのKH2PO4及び3260gの脱イオン水を添加する。pHを7.63に調節する。より詳細及び適切なアルカラーゼ標準は、必要に応じて、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark (assay no. EB-SM-0349.01 )から入手できる。
【０１４０】
アミラーゼ：
基質：Phadebas錠剤（Pharmacla Diagnostics：ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と共に混合される不溶性の青色に着色された澱粉ポリマーを架橋し、そして錠剤に製造する）。
アッセイ温度：37℃。
アッセイpH：4.3（又は、7.0、所望により）。
反応時間：20分。
【０１４１】
水における懸濁の後、澱粉をα−アミラーゼにより加水分解し、可溶性青色フラグメントを得る。620nmで測定される、その得られる青色溶液の吸光度は、α−アミラーゼ活性の関数である。１菌類αアミラーゼ単位（1FAU）は、標準のアッセイ条件下で、１時間当たり5.26gの澱粉（Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Batch 9947275）を分解する酵素の量である。より詳細なアッセイ説明APTSMYQI−3207は、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから必要に応じて入手できる。
【０１４２】
例２：インビボ消化試験：
配列番号１のアミノ酸1-269を有する精製されたヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体（配列番号１のアミノ酸-5-269を含んで成る少量のその誘導体と共に）を、雌のGottingenミニブタ（Ellegaard）における十分な消化研究において試験した。効力が、配列番号２のヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼ（アメリカ特許5614189号に記載される）の効力と比較した。
【０１４３】
膵臓外分泌不十分（PEI）を、膵管の連結によりミニブタにおいて誘発し、そしてそれらをまた、回腸−盲腸再入カニューレにより固定し、すべてはハロタン麻酔下で及び約25kgの体重で、次に記載のようにして実施された：Tabeling など., J. 1999, Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution, J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263 (この後"Tabeling 1999"として言及される); 及びGregoryなど., J. 1999. Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation in "Biology of the Pancreas in Growing Animals" (SG Pierzynowski & R. Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393 (この後"Gregory et al 1999"として言及される)。研究が開始される前、少なくとも４週後、手術から回復した。研究の開始の前、個々のブタのPEI状態を、便キモトリプシン試験（lmmundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Germany,カタログ番号K 6990から市販されている）により確認した。
【０１４４】
研究の間、ブタは、12：12時間の明暗サイクルに基づいて囲いに収容され、そして水へは自由に接近でき、そして１日２回の飼料が与えられた。
【０１４５】
リパーゼ効力を評価するために、ブタは、1Lの水及び0.625gのCr2O3（酸化クロムマーカーと共に混合された、180gの二重粉砕された規定食Altramin 902006＋70gの大豆油（Roth）を含む試験ミール250gを供給され、このミール中に異なった量の２種のリパーゼの１つ又は他が接種の直前、混合された。投与される個々のリパーゼの量、すなわちFIP Uリパーゼ/ミール（リパーゼFIP単位、例１を参照のこと）での活性は、表１において括弧で示されている。試験ミールは、16.3％のタンパク質、28.9％の澱粉及び32.9％の脂肪を含み、そしてブタについての栄養必要条件通りに、ビタミン、鉱物及び微量元素を含んだ。個々の酵素の用量は、少なくとも14日間、供給され、すなわちブタは、高脂肪規定食＋個々の新規酵素用量を９日間、与えられ、その後、すべての便が次の日、集められ、計量され、そして-20℃で貯蔵された。
【０１４６】
個々のブタからの凍結された便を凍結乾燥し、再び計量し、そして粉砕した。次に、5日目の粉砕されたサンプル（毎日の便生成に従って）の個々のアリコートをプールし、そして一緒に混合し、すなわち個々の用量の酵素について、個々のブタについての１つのプールされたサンプルを与えた。個々のプールされたサンプルから、乾燥物質及び粗脂肪の内容率を決定した（Naumann & Bassler 1993; Die chemische Untersuchung von Futtermitteln, 3. edition, VDLUFA-Verlag, Darmstadt (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und For- schungsanstalten）。
【０１４７】
乾燥物質を、凍結乾燥、続く103℃での８時間のインキュベーションの後、評価し；粗脂肪を、濃HClにおける30分の煮沸、続く石油エーテルによる６時間の抽出の後、重量的に決定し；Cr2O3をクロメートに酸化し、そしてPetry and Rapp ：Zeitung fur Tierphysiologie (1970), vol. 27, p. 181-189. (Petry & Rapp 1970; Z. Tierphysiol. 27; 181-189)により記載のようにして、365nmでの減衰（分光計）を通して計算した。
【０１４８】
消化能力値（脂肪吸収の係数；CFA）を、下記式に従ってのマーカー方法により評価した：
CFA（％）＝100−[（飼料における％Cr2O3・便における％脂肪）・100/（便における％Cr2O3・飼料における％脂肪）]
【０１４９】
【表１】
2008546394.tif 000003
【０１５０】
表１における結果から、配列番号１のリパーゼが、配列番号２の既知のリパーゼよりも、より良好に遂行することが明白である。特に、配列番号２の既知リパーゼよりも、脂肪吸収の量を高めることは、より効果的である。
本発明のリパーゼは、試験された最低用量で高い効果的な改良性をすでに示しているので、脂肪消化において非常に強く且つ用量依存性の改良性を引起した。
【０１５１】
例３：医薬組成物：
（A）高い強度のペレット：
約59％の配列番号１のアミノ酸-5-269を有するリパーゼ、36％の配列番号１のアミノ酸1-269を有するリパーゼ、及び5％の配列番号1のアミノ酸2-269を有するリパーゼ（N−末端配列決定により決定された）、そしてESIMS（例３に記載のような、Electro Spray Ionisation Mass Spectrometry）により確認された）を含んで成る液体リパーゼ濃縮物を調製した。その調製物は、SDS-PAGEにより判断される場合、タンパク質に基づいて約92％純粋であることが推定され、すなわち配列番号１の３種の変異体の合計量は、前記濃縮物におけるタンパク質の合計量の約92％を構成した。液体濃縮物を噴霧乾燥した。噴霧乾燥された粉末の測定されたリパーゼタンパク質含有率は、52.6％であった。1145gの噴霧乾燥されたプロテアーゼ粉末を、市販のミキサーにおいて、微晶性セルロース（458g）及びポリエチレングリコール4000（MacrogolTM4000；687g）と共に乾燥プレ−混合した。
【０１５２】
イソプロピルアルコール（460g；100％）を添加し、そして得られる湿潤塊状物を、室温で十分に混合し続けた。次に、均質化された塊状物を、0.8mmの穴の直径を有する穴開用ダイを備えた市販の押出し機において押出し、円柱上のペレットを形成した。ビース温度は、押出しの間、50℃を越さなかった。生成される押出し物を、必要な量のイソプロピルアルコール（100％；87g）を添加することにより、市販の真空乾燥機（Voetschからの）において、約40℃の生成物温度で乾燥した。生成物温度は45℃を越えなかった。次に、乾燥されたペレットを、0.7及び14mmのスクリーンを有する機械的篩機械を用いることにより分離した。0.7mm〜1.4mmの篩画分を集め、そしてサイズ２のカプセルにそれぞれ200mgのペレットの部分を充填した。得られる乾燥ペレットのリパーゼ濃度は、約26％（w/w）であった。
【０１５３】
（B）低い強度のペレット：
上記（A）に提供される例に類似して、薬剤物質として低い含有率のリパーゼを有するペレットを、450gの同じ噴霧乾燥されたリパーゼ調製物、微晶性セルロース（1350g）、ポリエチレングリコール4000（450g）、イソプロピルアルコール（119.5g）及び球状化のためのイソプロピルアルコール（119.5g）を用いて、2250gのバッチサイズで生成した。得られる乾燥ペレットのプロテアーゼ濃度は、約11％（w/v）であった。
【０１５４】
例（A）及び（B）からの得られるペレットを、例１に記載されるリパーゼpH-安定アッセイを適用することにより、脂肪分解活性について試験した。脂肪分解についての損失は、出発の粉末リパーゼ材料に関して、個々の場合、ペレットに見出されなかった。
例（A）及び（B）からの得られるペレットを、Pharm. Eur. 2.9.1（“錠剤及びカプセルの砕解”のセクション）にしたがって、砕解について試験した（試験溶液：水−500ml、37℃）。
【０１５５】
例（A）からのペレットの砕解を４分以内に完結し、そして15〜60分で見出される活性は、初期活性の99〜101％の以内であった。
例（B）からのペレットの砕解を20分以内に完結し、そして15〜60分で見出される活性は、初期活性の101〜99％以内であった。
結果は、リパーゼ活性の損失なしに、ペレットとして本発明のリパーゼを配合することが可能であることを示す。
【０１５６】
（C）Gelucireにより形成されるパレット：
ペレットを、次に262.5gのGelucire（商標） 44/14 (Gattefosse)を、約65℃の温度で加熱チャンバーにおけるビーカにおいて溶融した。975gの上記のような噴霧乾燥されたリパーゼ粉末を、48℃で二重ジャケットミキサーに供給した。その後、溶融されたGelucireを添加し、化合物を、異なった速度レベルを用いて混合し、そして最終的に冷却した（溶融ペレット化）。
【０１５７】
例４：胆汁塩の存在下での活性：
例２において使用されたのと同じ２種の精製されたリパーゼ（すなわち、本発明の配列番号１、及び比較のための配列番号２）を、次の通りに、胆汁塩の存在下で活性についてインビトロで試験した：
【０１５８】
胆汁塩（Sigma-Aldrichからの製品番号B3301）を、pH6.5での0.1Mの緩衝液（ビストリス−HCl緩衝液）中に溶解し、2nMの溶液を形成した。基質として、28mgのオリーブ油及び18.8mgのパラ−ニトロフェニル−パルミテート（pNP-パルミテート、又はpNPP）（オリーブ油：pNPPモル比２：１）を、100mlのヘキサン中に溶解し、そして200μlの得られる溶液を、96ウェルマイクロタイタープレートのウェル中にピペットで添加した。マイクロタイタープレートを、フード下で放置し、約25℃で一晩、ヘキサンを蒸発し、オリーブ油及びpNPPを壁に被覆したまま放置した。リパーゼを、0.01mg/mlに希釈した。上記に言及される200μlの胆汁塩溶液及び20μlのリパーゼ溶液を、脂質−被覆されたマイクロタイタープレートに添加し/混合し、そして60分間インキュベートした。酵素フリーのブランクは、除去のための対照として作用した。
【０１５９】
黄色の色彩が、基質からのパラニトロフェニル（pNP）のリパーゼ触媒された発生の結果として進行した。405nmでの吸光度（A405）を測定し、従って、サンプル中のリパーゼ活性を測定する。
結果は、下記表２に示される。数値は、三重反復測定の平均として及び酵素フリーのブランクの控除を伴って計算された
【０１６０】
【表２】
2008546394.tif 000004
【０１６１】
表２の結果は、本発明のリパーゼが、比較リパーゼよりも、胆汁塩の存在下でより安定していることを示す。
【０１６２】
例５：精製及び特徴づけ：
配列番号１のリパーゼを、アスペルギラス・オリザエにおいて発現し、そしてアメリカ特許第5,869,438号の例22及び23に記載のようにして発酵ブイヨンから精製した。精製されたリパーゼの多くのバッチをSDS-PAGにより分析し、そしてリパーゼを、34−40kDaでの主要タンパク質バンドとして同定した。クーマシー染色されたSDS-PAGEゲルの密度計走査によれば、このバンドは、タンパク質スペクトルの92〜97％を構成することが見出された。この密度計は、BIO-RADからの校正されたGS-800密度計であった。
【０１６３】
しかしながら、配列番号１の次のわずかに異なったN−末端形を、多数下記に列挙される、この主要タンパク質バンドのN−末端配列決定により同定した。種々の形の量を、Edman分析の最初のサイクルにおける異なった形の初期収率を比較することによるN−末端配列決定により決定した。サンプルにおける5種のN−末端の形の収率をまた示す：
#1 SPIRREVSQDLF...（配列番号１のアミノ酸-5-269）  45−65％
#2 EVSQDLF...（配列番号１のアミノ酸1-269）  35−47％
#3 VSQDLF...（配列番号１のアミノ酸2-269）  <1％−16％
#4 PIRREVSQDLF...（配列番号１のアミノ酸-4-269） <１％
#5 IRREVSQDLF...（配列番号１のアミノ酸-3-269） <1％
【０１６４】
2種の主要形＃１及び＃２は、すべてのバッチにおいて、主要形＃３はすべてではないが、いくつかのバッチにおいて見出され、そして＃４及び＃５形はいくつかのバッチにおいて非常に低い量であった（検出限界に近いか又はそれ以下）。
【０１６５】
それらの変異体は、内因性アスペルギラス宿主プロテアーゼによる分解の結果として形成されたと思われる。例えば、＃２は、KexBプロテアーゼによる＃１の分散により形成され、＃３は、KexB及びその後、アミノペプチダーゼによる分解により形成され、そして＃４及び＃５は、アミノペプチダーゼによる分解により形成される。
N−末端配列決定に基づく定量化を、適合する質量強度を示す、ESIMS（電気噴霧イオン化 質量分光学）により確認した。
【０１６６】
＃１、＃２及び＃３間の差異は、それぞれ、5.45、5.11及び5.23の異なった理論的pI値をもたらす。従って、それらの３種の形は、pH3-7のIEFゲル上でのIEF（等電点電気泳動）により分離された。バンドを、ブロットされたIEFゲルのN−末端配列決定により確かめた。従って、IEFは、配列番号１の＃１、＃２及び＃３形の検出及び定量化のための容易且つ早い方法である。
【０１６７】
配列番号１の＃１及び２形は、LU/mg酵素タンパク質で、同じ比活性を有することが見出された。特定のリパーゼ活性を検出するために、純粋な調製物のLU/mlでのリパーゼ活性を、例１のLU-アッセイを用いて決定した。特定のリパーゼのタンパク質現有率（mg酵素タンパク質/ml）を、下記のようにしてアミノ酸分析により決定し、そして比活性（LU/mg）を活性（LU/ml）AAA（mg/ml）として計算した。
【０１６８】
アミノ酸分析（AAA）/（mg/ml）：リパーゼサンプルのペプチド結合を、酸加水分解し、続いて、Bie & Berntsen A/S, Sandbaekvej 5-7, DK-2610 Roedovre, Denmarkから市販されているBiochrom 20 Plus Amino Acid Analyser上で、製造業者の説明書に従って、開放されるアミノ酸を分離し、そしてそれを定量化した。それぞれ個々のアミノ酸の量を、ニンヒドリンとの反応より決定した。
【０１６９】
種々のリパーゼバッチのESIMSデータはまた、１つのヘキソースに対応する分子量により分離される多くの質量ピークと共に、高マンノノースグリコシル化に対応する複雑なグリコシル化パターンを明白に示した。
【０１７０】
配列番号１は、１つの推定上のN−グリコシル化部位（NIT）を含み、Nは配列番号１の残基番号33である。菌類発現宿主においては、N−アセチルグルコサミン残基は、後−翻訳修飾の結果としてNIT−配列におけるN−残基に結合され、そして多くのマンノノースモノマー（５〜21）がN−アセチルグルコサミン残基に結合されるであろう。これは、個々のグリコシル化された分子の分子量の高い変動を導く。ESIMSによれば、分子量は約30〜34kDaの範囲である。グリコシル化されていない＃１及び＃２の理論的分子量は、それぞれ30.2kDa及び29.6kDaである。これは、非グリコシル化宿主において発現される場合、SDS−PAGEゲル上での主要バンドが狭く、そして約30kDaの分子量に対応することを意味する。
【０１７１】
配列番号１の変異体N33Q（保存性置換）は、例えば菌類宿主において発現されても、グリコシル化されないであろう。配列番号１の非グリコシル化されたN33Q変異体は、インビボリパーゼスクリーニング試験において、配列番号１に類似する効力を示した。
【０１７２】
例６：プロテアーゼの存在下でのインビボ安定性及び効力：
プロテアーゼの存在下での配列番号１のヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体の安定性及び効力を次の通りに試験した：
例２に記載される、精製されたリパーゼを、例２に一般的に記載のようにして、インビボ試験において試験した（但し、投与量は、膵臓FIPアッセイにおいて評価されたリパーゼ単位に従った）。消化値（脂肪吸収の係数；CFA）を、例２に記載のようにして評価した。
【０１７３】
リパーゼを、単独で、及び種々の用量の組合せでのプロテアーゼと組合して試験した。使用されるプロテアーゼ活性は、配列番号３のバチルス・リケニホルミスプロテアーゼであった。プロテアーゼ活性は、膵臓FIPアッセイを用いて決定した（例１における引例を参照のこと）。
【０１７４】
結果は、平均CFA（％）値及び標準偏差（sd）の表示と共に、下記表３に示される。
【表３】
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【０１７５】
試験される２種のリパーゼ用量の個々について、２種の異なった用量において、プロテアーゼを伴わないでの結果と、プロテアーゼを伴っての結果との間に有意な差異は存在しなかった。従って、プロテアーゼはインビボでリパーゼに対して悪影響を与えなかったことが結論づけられ得る。
【０１７６】
例７：消化プロテアーゼの存在下での安定性：
主要消化プロテアーゼの１つの存在下及び生理学的に適切なpHでの本発明の精製されたリパーゼのインビトロ安定性を、配列番号２の既知リパーゼに比較して、下記のようにして測定した。
安定性を、pH3.0でブタペプシンによる処理の後、残留活性として決定した。
【０１７７】
個々のリパーゼサンプルを25mlのクエン酸緩衝液（pH3.0）中、75/mlのブタペプシン、2mMの塩化カルシウム、0.01％のTriton X-100（最終処理条件）により処理した。1部の個々の希釈されたサンプル（希釈剤＝10mMのNaCl、0.01％のTriton X-100）を、１部の処理溶液に添加し、そして未処理のサンプル（対照）を、１部の希釈剤に希釈されたサンプルを添加することにより製造した。すべての処理された及び処理されていないサンプルを、周囲温度（20−25℃）で３時間インキュベートし、続いて残留活性について分析した。
【０１７８】
活性のアッセイを、100mMのTRIS緩衝液（pH8.0）中、基質としての1mMの４−ニトロフェノールパルミテート及び1.2％のTriton X-100、4mMの塩化カルシウムにより行った。アッセイを、処理されたサンプルについて、10部の基質を、１部の処理されたサンプル及び１部の希釈剤（0.01％のTriton X-100, 10mMのNaCl）に添加するようにして実施した。処理されていないサンプルに関しては、10部の基質を、希釈剤中、１部のサンプル及び１部の処理溶液（pH3.0）に添加した。ODは、405nmで読み取られ、そしてサンプル中のリパーゼ活性の測定である。
【０１７９】
残留活性の得られる百分率（％RA）を、未処理のサンプルについてのアッセイ結果に対する、処理されたサンプルについてのアッセイ結果として計算した。その結果は下記表４に示される。C.V. は変動係数を示し、そしてnは反復数である。
【０１８０】
【表４】
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【０１８１】
表４は、本発明のリパーゼが、既知のリパーゼに比較して、pH3.0で及びブタペプシンの存在下でより安定性であることを示す。
【配列表】
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【国際調査報告】
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