(57)【要約】  細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法は、固相結合材料を使用し、溶解溶液の使用を避けることを開示している。固相結合材料の使用により、細胞の核酸内容物を遊離させて、直接的にかつ一工程で捕捉することが予想外にも可能となる。新規な方法は、現存の方法を超える著しい簡易化を示している。本発明の方法および組成物で使用される好適な固相材料は、４級オニウム核酸結合部分を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞材料のサンプルから核酸を単離する方法において、
ａ）核酸結合部分と結合する基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、いかなる溶解溶液をも加えることなく、核酸を含んでいる細胞材料のサンプルと前記固相とを一緒にする工程と、
ｃ）前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）前記固相から結合核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。
【請求項２】
前記細胞材料が、動物、植物または細菌起源の無傷細胞、および、動物、植物または細菌起源の無傷細胞を含んでいる組織からなる群から選択される請求項１記載の単離方法。
【請求項３】
前記サンプルが、細菌の培養組織、体液、全血および血液成分、組織抽出物、植物材料、並びに細胞材料を含む環境サンプルからなる群から選択される請求項１記載の単離方法。
【請求項４】
前記サンプルが、全血である請求項１記載の単離方法。
【請求項５】
前記核酸が、ＤＮＡおよびＲＮＡからなる群から選択される請求項１記載の単離方法。
【請求項６】
前記核酸が、有機体のゲノムＤＮＡである請求項５記載の単離方法。
【請求項７】
前記核酸が、全血から得られたヒトのゲノムＤＮＡである請求項５記載の単離方法。
【請求項８】
前記基質が、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類から選択される請求項１記載の単離方法。
【請求項９】
前記固相の前記基質が、シリカである請求項１記載の単離方法。
【請求項１０】
前記固相が、さらに磁性反応部分を含む請求項１記載の単離方法。
【請求項１１】
前記核酸結合部分が、３級スルホニウム基、４級アンモニウム基および４級ホスホニウム基からなる群から選択される請求項１記載の単離方法。
【請求項１２】
前記核酸結合部分が、選択的に開裂されうる結合を介して基質に結合される請求項１記載の単離方法。
【請求項１３】
前記結合核酸が、強アルカリ溶液中で前記固相から解離される請求項１記載の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸、特に生物学起源の材料からの全体ゲノム核酸を捕捉および単離するための簡易な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子診断（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）および分子生物学における最新の技術（逆転写、クローニング、制限分析、増幅、および配列解析を含む）においては、核酸の抽出が要求される。核酸を得ることは、標的核酸が見出されるのが基質（ｍａｔｒｉｘ）サンプルの複合物中であるために、複雑である。かかるサンプルには、例えば、組織（ｔｉｓｓｕｅｓ）からの細胞、体液からの細胞、血液、培養組織中の細菌細胞、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、または標的核酸の増幅から得られる溶液が含まれる。基質サンプルはしばしば顕著な量の汚染物質を含み、関心のある核酸を分子生物学的または診断技術において使用する前に、これらをその核酸から除去しなければならない。
【０００３】
上述のような細胞や組織より生成される混合物から標的核酸を得るための慣用の技術には、フェノール、クロロホルム、および臭化エチジウム等の有害な化学薬品の使用が必要となる。フェノール／クロロホルム抽出は、標的核酸と様々な汚染物質との混合物から汚染物質を抽出するためのかかる手法において用いられる。あるいはまた、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配が、公知技術の方法として使用される。例えば、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」，サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著（１９８９），コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ），１．４２〜１．５０頁を参照。後者の方法は、一般に、エタノールまたは２−プロパノールを水相に添加して核酸を沈殿させることにより、抽出された水相中に残留する核酸材料を沈殿することによる。沈殿物は、通常は遠心分離により溶液から除去され、結果として得られる沈殿物のペレットは、さらなる使用のために水または緩衝液中に再懸濁される前に、乾燥される。
【０００４】
様々なタイプの固相を使用する単純かつ迅速な方法が、細胞溶解物または核酸と汚染物質との他の混合物から核酸を分離するために、開発されている。かかる固相には、クロマトグラフィ樹脂、ポリマーおよびシリカ、または、繊維、フィルターおよびコーティングされた容器などの様々な外形および形態でのガラスベース材料が含まれる。小さな微粒子の形態である場合には、磁性コアが時に分離の実行において助けを与える。
【０００５】
固相結合支持体材料を含んでいるキットが開発され、細菌の培養組織から、またヒト全血からゲノムを単離する方法に使用するために市場で入手可能である。製品によって供給される手順には、常に、核酸の除去と精製を始める前に細胞が溶解されなければならないことが明記されている。付加的な沈殿工程もまた、固相支持体の使用の前に時々使用される（例えば、Ｋ．スミス（Ｋ．Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４１（６），２４４０−３（２００３）；Ｐ．レビソン（Ｐ．Ｌｅｖｉｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，８２７、３３７−４４（１９９８））。
【０００６】
核酸の単離に使用される１つのタイプの固相には、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）での使用のために設計された多孔質シリカゲル粒子が含まれる。多孔質シリカゲル粒子の表面は、一定の塩およびｐＨ条件下でプラスミドＤＮＡと交換されるアニオン交換体で官能化されている。例えば、米国特許４，６９９，７１７号および５，０５７，４２６号明細書を参照。これらの固相材料に結合したプラスミドＤＮＡは、高濃度の塩を含んでいる水溶液中で溶離される。そこで溶離された核酸溶液は、下流のプロセスで使用される前に、塩を除去するためにさらに処理されなければならない。
【０００７】
他のシリカベース固相材料には、制御ポアガラス（ＣＰＧ）、シリカ粒子で取り囲まれたフィルター、シリカゲル粒子、珪藻土、ガラス繊維または上記の混合物が含まれる。各シリカベース固相材料は、核酸を含んでいるサンプル中で、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、グアニジニウム（ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）チオシアネートまたは塩化グアニジニウムなどのカオトロピック（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ）剤の存在下で、可逆的に核酸と結合する。かかる固相は、核酸材料と結合して保持し、残留しているサンプル成分から、基質とそれに結合した核酸材料とを分離するために、固相の遠心分離または減圧ろ過が行なわれる。核酸材料はその後、水または低塩溶離緩衝液で溶離することにより固相から遊離される。市場で入手可能な核酸単離用のシリカベース固相材料には、例えば、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＤＮＡ精製システム製品（プロメガ（株），マディソン，ＷＩ）、ｔｈｅ  ＱｉａＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ単離システム（（株）キアゲン，サンタクラリタ，ＣＡ）、ハイピュア（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））、およびＧＦＸマイクロプラスミドキット（Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ）（アマルシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））が含まれる。
【０００８】
粒子の形態での重合樹脂も、核酸の単離および精製のために広範に使用されている。カルボキシレート変性重合粒子（バーンズ，エージェンコート（Ｂａｎｇｓ，Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ））は、公知である。４級アンモニウム先端基を有するポリマーは、欧州特許出願公開番号ＥＰ１２４３６４９Ａ１号中に開示されている。このポリマーは共有結合された線状非架橋ポリマーを有する不活性担体粒子である。このタイプの重合固相は一般に、触手（テンタクル）樹脂と呼ばれる。この線状ポリマーは、４級テトラアルキルアンモニウム基を包含する。アルキル基は、メチル基またはエチル基として明示されている（４欄、５２〜５５行）。より長いアルキル基は、望ましくないと考えられる。
【０００９】
アニオン交換則に基づいて核酸と結合するための他の固相材料が、現在使用されている。これらには、ＤＥＡＥ先端基（（株）キアゲン）を有するシリカベース材料および欧州特許公報ＥＰ０４９６８２２Ｂ１号に記載されたクロマトグラフィ支持体に基づくシリカ−ヌクレオボンドＡＸ（ベクトン  ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），ロシュ−ゲノピュア（Ｒｏｃｈｅ−Ｇｅｎｏｐｕｒｅ））が含まれる。重合トリアルキルアンモニウム基をもつポリマー樹脂が、欧州特許公報ＥＰ１２４３６４９号中に開示されている（ゲネスキャン（ＧｅｎｅＳｃａｎ））。ＤＮＡ単離用のカルボキシ変性ポリマーは、非常に多くの供給先から入手可能である。核酸は、高塩条件下で引き寄せられて、低イオン強度条件下で解離される。カチオン性のトリメチルアミンを外側に有する重合マイクロキャリアビーズは、米国特許６，２１４，６１８号明細書に開示されている。このビーズは、比較的大きな径を有し、細胞結合と培養組織中での成長のための支持体として有用である。
【００１０】
トリブチルホスホニウム先端基を有する重合ビーズは、３相システムでの相転写触媒としての使用について開示されている。このビーズは、架橋ポリスチレンから生成される（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  ＩＩ，１８２７−１８３０，（１９８３））。アルキレン鎖およびアルキレンエーテル鎖を通して架橋ポリスチレン樹脂に結合されたペンダント型のトリアルキルホスホニウム基を有するポリマービーズも開示されている（トモイ（Ｔｏｍｏｉ）ら，Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，１８７（２），３５７−６５（１９８６）；トモイ（Ｔｏｍｏｉ）ら，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ，Ｓｏｒｂｅｎｔｓ，３（４），３４１−９（１９８５））。架橋ポリスチレン樹脂をベースとする混合された４級アンモニウム／ホスホニウム不溶性ポリマーは、触媒および殺生物剤として開示されている（ダビデシュー（Ｄａｖｉｄｅｓｃｕ）ら，Ｃｈｅｍ．Ｂｕｌｌ．Ｔｅｃｈｎ．Ｕｎｉｖ．Ｔｉｍｉｓｏａｒａ，４０（５４），６３−７２（１９９５）；パルベルシュー（Ｐａｒｖｕｌｅｓｃｕ）ら，Ｒｅａｃｔｉｖｅ＆Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，３３（２，３），３２９−３６（１９９７））。
【００１１】
磁性反応性粒子もまた、核酸を単離する際に固相として使用するために開発されている。核酸単離用に設計された幾つかの異なるタイプの磁性反応粒子は公知技術であり、かつ、いくつかの出所から市場で入手可能である。可逆的に核酸材料と結合する磁性粒子には、まさにマグネシル（Ｍａｇｎｅｓｉｌ）（登録商標）粒子（プロメガ（株））が含まれる。磁性粒子は、ｍＲＮＡのポリＡ末端とのハイブリッド形成のために結びついたオリゴｄＴ末端を有する共有結合されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して、可逆的にｍＲＮＡと結合することも知られている。
【００１２】
種々のタイプの磁性反応シリカベース粒子を、核酸結合単離法において固相として使用することは公知である。かかる粒子の１つのタイプは、磁性反応ガラスビーズであり、好ましくは、ＣＰＧ社（リンカーンパーク，ＮＪ）から磁性ポアガラス（ＭＰＧ）粒子として入手可能な制御ポア径を有するもの、または、米国特許４，３９５，２７１号，４，２３３，１６９号，もしくは４，２９７，３３７号明細書に記載された磁性ポアガラス粒子である。核酸の結合および単離のために有用な他のタイプの磁性粒子は、重合二酸化シリコン化合物の基質中に磁性材料を混合することにより製造される。（ドイツ特許ＤＥ４３０７２６２Ａ１号）。４級アンモニウム基を有するセルロース基質に固定された酸化鉄ナノ粒子を含んでいる磁性粒子は、ＭａｇａＣｅｌｌ−Ｑ（登録商標）としてコルテックスバイオケム（Ｃｏｒｔｅｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）により市場で製造されている。
【００１３】
誘導可能な磁性特性を有する粒子またはビーズは、磁石の存在下で一時的に磁性特性を発現しうる金属酸化物を形成するための遷移金属、例えば、鉄、ニッケル、銅、コバルトおよびマンガンの小粒子を含む。これらの粒子は、常磁性体または超常磁性体と呼ばれる。常磁性体または超常磁性体ビーズを形成するために、金属酸化物は、水中で比較的安定なポリマーで被覆される。米国特許４，５５４，０８８号明細書には、重合シランの層により被包された金属酸化物コアを含んでいる常磁性体粒子が開示されている。米国特許５，３５６，７１３号明細書には、疎水性ビニル芳香族モノマーの殻で被包された磁化しうる粒子のコアからなる、磁化しうるミクロスフェアが開示されている。米国特許５，３９５，６８８号明細書には、混合された常磁性体金属酸化物−ポリマー層で被覆されたポリマーコアが開示されている。他の方法は、例えば米国特許４，７７４，２６５号明細書中におけるように、ポリマーコアを、金属酸化物を吸着するために利用する。常磁性体金属酸化物粒子層で被覆された重合コア粒子を含んでいる磁性粒子は、米国特許５，０９１，２０６号明細書中に開示されている。この粒子は、その後さらに、金属酸化物層を遮蔽するとともに反応性コーティングを与えるために、付加的な重合層で被覆される。米国特許５，８６６，０９９号明細書には、タンパク質の存在下で２つの金属塩の混合物を共沈させて、金属塩を配位結合させるとともに混合された金属酸化物粒子を捕捉する磁性粒子の調製が開示されている。非常に多くの典型的な金属塩対が記載されている。米国特許５，４１１，７３０号明細書には、沈殿された混合金属酸化物粒子をデキストラン、オリゴ糖類中で捕捉する、類似の方法が記載されている。
【００１４】
ＤＮＡおよびＲＮＡを不可逆的に捕捉するためのアルミナ（酸化アルミニウム）粒子が、米国特許６，２９１，１６６号明細書に開示されている。結合核酸は、ＰＣＲなどの固相増幅法での使用に、利用できる。
【００１５】
これらの固相材料に結合したＤＮＡは、高濃度の塩を含んでいる水溶液中で溶離される。これらから溶離された核酸溶液は、下流のプロセスで使用される前に、塩を除去するためにさらに処理されなければならない。対称的に、シリカベース材料に結合した核酸は、水または低塩溶離緩衝液での溶離により、固相から遊離される。米国特許５，７９２，６５１号明細書には、細胞内のトランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）での核酸の能力を増大する核酸のクロマトグラフィ単離のための組成物が開示されている。この組成物は、２−プロパノールと任意の塩と緩衝材料を含んでいる水溶液を含む。
【００１６】
さらに、磁性微粒子コアを含むアガロースまたはセルロース粒子を含んでいる他の磁性固相材料は、高濃度の塩とポリアルキレングリコールを含んでいる組成物での処理により、核酸に結合して核酸を保持することが報告されている（例えば、米国特許５，８９８，０７１号明細書およびＰＣＴ公報ＷＯ０２０６６９９３号）。核酸は、水または低イオン強度緩衝液での処理により、続いて解離される。
【００１７】
本出願人により出願中の、米国出願番号１０／７１４，７６３号、１０／７１５，２８４号および１０／８９１，８８０号明細書は、ここで参照として受け入れられ、開裂可能な材料と核酸の結合と解離の方法を含めて、新規な固相核酸結合材料を開示する。
【発明の開示】
【００１８】
本発明の第１の目的は、化学的溶解工程なしで、固相核酸結合材料を使用して生物学材料から核酸を捕捉するための方法を提供することである。
【００１９】
本発明の他の目的は、化学的溶解工程とそれに続く捕捉した核酸の解離なしで、固相核酸結合材料を使用して核酸を捕捉することにより生物学材料から核酸を単離するための方法を提供することである。
【００２０】
本発明の目的は、開裂可能な結合基を有する固相核酸結合材料を使用して生物学材料および細胞材料から核酸を捕捉および単離するための方法を提供することである。
【００２１】
本発明の目的は、ホスホニウム、アンモニウムおよびスルホニウム基から選択されるカチオン基を有する固相核酸結合材料を使用して生物学材料および細胞材料から核酸を捕捉および単離するための方法を提供することである。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
図１は、本発明による血液サンプルからの核酸の単離を概略的に示す。
【００２３】
図２Ａは、実施例１の粒子を使用して、ヒト血液サンプルから単離したＤＮＡを表すゲル像である。図２Ｂは、図２Ａで単離したゲノムＤＮＡの範囲の増幅を表すゲル像である。
【００２４】
図３は、実施例１または実施例４の粒子と様々な添加剤を使用して本方法により単離したゲノムＤＮＡの範囲の増幅を表すゲル像である。
【００２５】
図４は、実施例５〜７の粒子を使用して本方法により単離したゲノムＤＮＡの範囲の増幅を表すゲル像である。
【００２６】
図５Ａは、実施例１または２の粒子を使用し、様々なＮａＯＨ濃度で溶離してヒト血液サンプルから単離したＤＮＡを表すゲル像である。図５Ｂは、図５Ａに示した単離したゲノムＤＮＡの範囲の増幅を表すゲル像である。
【００２７】
発明の詳細な説明
定義
アルキル基−１〜２０個の炭素原子を含む分岐、直鎖または環状炭化水素基であり、水素原子以外の１またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。ここで使用されるような低級アルキル基は、炭素原子を８個まで含むアルキル基に当てはまる。
【００２８】
アラルキル基−アリール基で置換されたアルキル基である。
【００２９】
アリール基−１〜５個の炭素環式芳香環を含む芳香環含有基であり、水素原子以外の１またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００３０】
細胞材料−無傷細胞または材料であり、動物、植物または細菌起源の無傷細胞を含有する組織を含む。
【００３１】
細胞の核酸内容物（ｃｏｎｔｅｎｔ）  −  細胞材料中に見られる核酸に関連し、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡおよび、ウイルスやプラスミドを含む感染要因由来のもの等の他の核酸でありうる。
【００３２】
磁性粒子−外部磁場に対し反応する粒子、微粒子またはビーズである。この粒子はそれ自体が磁性体、常磁性体または超常磁性体であってよい。強磁性材料を用いる場合のように、外部磁石かまたは適用された磁場に引き付けられてもよい。粒子は、磁性的に反応し、１またはそれ以上の非磁性的に反応する層により被包された固体コア部分を有してもよい。あるいはまた、磁性的に反応する部分は周囲の層であってもよく、または、非磁性的に反応するコア内に配置された粒子であってもよい。
【００３３】
オリゴマー、オリゴヌクレオチド  −  ここに使用されるものとして、ホスホジエステルヌクレオチド間結合および５’−末端モノホスフェート基を含む化合物が当てはまる。ヌクレオチドは、通常生ずるリボヌクレオチドＡ，Ｃ，ＧおよびＵまたはデオキシリボヌクレオチドｄＡ，ｄＣ，ｄＧおよびｄＴであってよい。
【００３４】
核酸−ポリヌクレオチドはＤＮＡ，ＲＮＡまたはＰＮＡ等の合成ＤＮＡ類似体であってよい。これら３つのいかなるタイプの鎖の一本鎖化合物および二本鎖ハイブリッドもまた、この用語の範囲内である。
【００３５】
解離、溶離−溶液または組成物と接触させることにより、固相材料の表面またはポアに結合した材料の実質的な部分を除去すること。
【００３６】
サンプル−核酸を含むかまたは含んでいる可能性のある流体である。本発明の方法において使用可能である代表的なサンプルは、血液、血漿、漿液、尿、精液、唾液等の体液、細胞培養組織、組織抽出物等を含む。他のタイプのサンプルには、溶剤、海水、工業用水サンプル、食品サンプル、ならびに、土壌または水、植物材料、原核生物、真核生物、細菌、プラスミド、およびウイルス由来の細胞等の環境サンプルが含まれる。
【００３７】
固相材料−核酸分子を引き寄せ得る表面を有する材料である。この材料は、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態を有してよい。
【００３８】
置換−１つの基内における少なくとも１個の水素原子の、非水素基による置換に当てはまる。置換基に関しては、明確に他のことを示している場合を除き、置換基が複数となる点が存在し得ることを意味することに留意すべきである。
【００３９】
核酸は、様々な技術によって種々のサンプルタイプから抽出、単離され、その他の方法で精製される。これらの技術の多くは、核酸に対するいくらかの親和力による材料の表面への選択的吸着による。他の強固な結合でない組成物を除去するための洗浄工程後、固相は、結合核酸を除去するか、または溶離するために溶液で処理される。細胞材料の一部からゲノム核酸を抽出して単離することは、しばしば必要である。そうして得られた核酸は、増幅、診断テスト、突然変異の分析、遺伝子の表現プロファイリング（ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ）およびクローニングを含む次のプロセスで使用される。本発明の方法により単離されうる核酸からのサンプルには、細菌の培養組織、体液、全血と血液成分、組織抽出物、植物材料および細胞材料を含んでいる環境サンプルが含まれる。
【００４０】
細胞の核酸内容物の除去は、内部にアクセスするために細胞膜または細胞壁の破裂あるいは浸透を必要とする。この目的のために、従来の方法では、溶解を実行するための試薬を使用する細胞溶解工程を使用していた。溶解溶液には、使用される溶解方法に依存して２つのタイプがある。１つのタイプは、アルカリ溶解用の高ｐＨ水溶液である。もう１つのタイプは、細胞膜を粉砕するために１つまたはそれ以上の界面活性剤あるいは洗浄剤を使用する。溶解溶液は、また細胞の核酸内容物の遊離を助けるために、プロテイナーゼ酵素等の消化酵素を含んでもよい。本出願人は、溶解溶液の使用を避けて、固相結合材料を使用して細胞材料サンプルから核酸を単離するための方法を開発した。固相結合材料は、細胞の核酸内容物を遊離させて、直接にかつ一工程で捕捉することを、予想外にも可能とした。新しい方法は、溶解溶液の使用を排除したことから、簡易性、利便性及び自動化の容易性において著しい改善を示している。
【００４１】
本発明の１つの側面は、次の工程を含む細胞材料のサンプルからの核酸の単離方法を提供する。
ａ）核酸結合部分と結合する基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、いかなる溶解溶液をも加えることなく、核酸を含んでいる細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
ｃ）前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）前記固相から結合核酸を解離する工程。
【００４２】
本発明の方法で使用する核酸を結合するための固相材料は、そのサイズ、形、多孔性、物理学的特性および共有結合した核酸結合基を規定する基質を含み、粒子、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態とすることができる。さらにこの材料は、様々な長さの核酸分子の捕捉および結合をさせる表面において、またはその近傍に、核酸結合部分を含む。ここで、表面は、固相材料の外表面だけでなく、固相材料内の利用できるいかなる多孔質領域の表面をも意味する。
【００４３】
基質材料は、いかなる適切な物質でもよい。好適な基質材料は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される。典型的な材料には、細胞を粉砕して核酸を誘引する役割を有する共有結合した表面官能基で官能化され、あるいは被覆されたシリカベース材料が含まれる。また、好適に表面を官能化された炭水化物ベース材料、およびこの表面官能性をもつ重合材料も含まれる。非常に多くの特有の材料およびそれらの調製は、本出願人により出願中の、米国出願番号１０／７１４，７６３号、１０／７１５，２８４号および１０／８９１，８８０号明細書に記載されている。核酸結合基として利用される表面官能基には、細胞の構造的な完全性を粉砕し、かつ、固体支持体に核酸を誘引させることのできるいかなる基も含まれる。かかる基には、限定はされないが、以下に記載される４級アンモニウムおよびホスホニウム塩、並びに、３級スルホニウム塩タイプの材料が含まれる。
【００４４】
さらに、固相は磁性反応部分を含んでいてもよく、その部分は通常、磁性微粒子の形態であり、粒子は磁場により誘引され、操作することができる。かかる磁性微粒子は、磁性金属酸化物または金属硫化物のコアを含み、これは通常、核酸結合基が共有結合される層であって、吸着結合または共有結合された当該層により囲まれ、これにより表面が被覆されている。磁性金属酸化物コアは、好ましくは鉄酸化物または鉄硫化物であり、鉄は、Ｆｅ２＋、Ｆｅ３＋またはその両方である。磁性粒子はまた、米国特許４，６５４，２６７号明細書に開示されているように、多孔質ポリマーの存在下で金属粒子を沈殿させて、磁性反応性金属粒子を捕捉することにより形成することができる。これにより調製されうる磁性金属酸化物には、Ｆｅ３Ｏ４，ＭｎＦｅ２Ｏ４，ＮｉＦｅ２Ｏ４，およびＣｏＦｅ２Ｏ４が含まれる。他の磁性粒子はまた、米国特許５，４１１，７３０号明細書に開示されているように、多糖類デキストランの存在下で金属酸化物粒子を沈殿させて、磁性反応性金属粒子を捕捉することにより形成することができる。さらに、他の種類の磁性粒子は、前述の米国特許５，０９１，２０６号明細書中に開示されている。この粒子は、金属酸化物層を遮蔽するとともに反応性コーティングを与えるために、常磁性金属酸化物粒子層および付加的な重合層で被覆された重合コア粒子を含む。クロロメチル化メリーフィールド樹脂を含んでいるマグネタイトの調製は、出版物（テトラへドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４０（１９９９），８１３７−８１４０））中に記載されている。
【００４５】
市場で入手可能な磁性シリカまたは磁性重合粒子は、本発明において有用な磁性固相結合材料の調製における出発材料として使用することができる。表面カルボキシル基を有する好適なタイプの重合粒子は、商品名セラマグ（ＳｅｒａＭａｇ，登録商標）（セラダイン社，Ｓｅｒａｄｙｎ）およびビオマグ（ＢｉｏＭａｇ，登録商標）（ポリサイエンスアンドバーンズラボラトリーズ）により公知である。好適なタイプのシリカ磁性粒子は、商品名マグネシル（ＭａｇｎｅＳｉｌ，登録商標）（プロメガ（株））により公知である。表面にカルボキシル基またはアミノ基を有するシリカ磁性粒子は、ケミセル（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ）ＧｍｂＨ社（ベルリン）から入手可能である。
【００４６】
固相結合材料が不溶性合成ポリマー部分を含んでいる場合、有用なポリマーは、ホモポリマーまたは１若しくはそれ以上のエチレン不飽和モノマー単位のコポリマーであり、架橋されていても架橋されていなくてもよい。好ましいポリマーは、ポリスチレンを含むポリオレフィンおよびポリアクリル型ポリマーである。後者には、種々の置換されたアクリル酸、アミドおよびエステルのポリマーが含まれ、ここで、アクリルモノマーは、２−または３−炭素において、アルキル置換基を有してもよく有しなくてもよい。
【００４７】
本発明の方法で有用な固相結合材料中に含まれる核酸結合（ＮＡＢ）基は、２つの目的に利用できるようである。ＮＡＢ基は、種々の長さおよび塩基組成または配列をもつオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチドおよび核酸を引き寄せて、これらと結合する。これらはまた、細胞の外被から核酸を遊離するために役割を果す多少の能力を発揮することができる。核酸結合基には、例えば、カルボキシル基、アミン基および３級または４級オニウム基が含まれる。アミン基は、ＮＨ２、アルキルアミンおよびジアルキルアミン基であってよい。３級または４級オニウム基には、４級トリアルキルアンモニウム基（−ＱＲ３＋）、トリアルキルホスホニウム若しくはトリアリールホスホニウムまたは混合アルキルアリールホスホニウム基を含むホスホニウム基（−ＱＲ３＋）、および３級スルホニウム基（−ＱＲ２＋）が含まれる。固相は、ここに記載されているような核酸結合基の一種を超えて含んでもよい。Ｒ基が少なくとも４個の炭素原子をもつアルキル基である３級または４級オニウム基−ＱＲ２＋または−ＱＲ３＋を含む固相材料は、核酸結合において特に有効であるが、１個程度の少ない炭素原子を有するアルキル基もまた、アリール基と同様に有用である。かかる固相材料は、結合核酸を強固に保持し、かつ、従来技術において公知の溶離のために使用される大抵の条件下で、核酸の除去または溶離を阻害する。低および高イオン強度の両方の大抵の公知の溶離条件は、結合核酸の除去において効果を有しない。ＤＥＡＥおよびＰＥＩ基を含む慣用のアニオン交換樹脂とは異なり、３級または４級オニウム固相材料は、反応媒体のｐＨに関わらず、プラスに荷電されたままである。
【００４８】
本発明の他の実施形態は、次の工程を含むサンプルからの核酸の単離方法を提供する。
ａ）シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類から選択される基質、および、式ＱＲ２＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される３級スルホニウム基、式ＮＲ３＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される４級アンモニウム基（４級オニウム基）および式ＰＲ３＋Ｘ−（ここでＲはＣ１〜Ｃ２０のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される４級ホスホニウム基から選択される、前記基質の表面に結合されたオニウム基を含む固相を与える工程と、
ｂ）前記核酸を前記固相に結合させるに十分な時間、いかなる溶解溶液をも加えることなく、核酸を含んでいる細胞材料のサンプルと前記固相を一緒にする工程と、
ｃ）前記固相から前記サンプルを分離する工程と、
ｄ）前記固相から結合核酸を解離する工程。
【００４９】
核酸を含んでいる細胞材料のサンプルと固相を一緒にする工程は、サンプル材料と固相結合材料を混合することを伴い、随意に混合物を機械的に攪拌して、細胞材料を粉砕し固相に核酸を結合させるに有効な時間、サンプルの容積内で固相を均一に分散させる。サンプルの核酸内容物のすべてを固相に結合させる必要はないが、可能な限り多く結合させることが有利である。サンプル／固相混合物の攪拌は、振盪、機械的な振動子あるいはロッカー（ｒｏｃｋｅｒ）、ボルテキシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）、超音波攪拌などを含む任意便宜形態とすることができる。この工程で核酸を結合させるために必要とされる時間は、通常２，３分のオーダーであるが、日常の実験によって、実験的に立証されうる。
【００５０】
固相からサンプルを分離する工程は、例えば、ろ過、重力沈殿、傾瀉、磁力分離、遠心分離、真空吸引、および多孔膜またはフィルターマットに液体を強制的に通すための空気または他のガスによる過圧により実施されうる。核酸以外のサンプルの成分は、この工程において除去される。他の成分の除去が完全でない限り、１またはそれ以上の洗浄を行って、それらの完全な除去を助けることができる。塩、細胞の残渣、タンパク質およびヘモグロビンなどのサンプル成分を除去するための洗浄試薬には、水および緩衝剤水溶液があり、界面活性剤を含んでもよい。
【００５１】
固相から結合核酸を解離する工程は、固相から結合核酸を解離させるために溶液と固相材料を接触させることを必要とする。この溶液は、解離した核酸を溶解し、かつ、十分に保護する必要がある。この溶液は、ｐＨ約７〜９である緩衝剤水溶液を含む試薬組成物であり、随意に０．１〜３Ｍの緩衝塩、金属ハライドあるいは酢酸塩を含んでいてもよく、随意に０．１〜５０％の有機補助溶剤または界面活性剤を含んでいてもよい。
【００５２】
あるいはまた、開裂後の固相から核酸を解離するための試薬は、強アルカリ水溶液でもよい。少なくとも１０−４Ｍの濃度のアルカリ金属水酸化物または水酸化アンモニウムの溶液は、開裂した固相から核酸を溶離させるのに効果的である。かかる強アルカリ溶液はＲＮＡの安定性に有害であることがわかっている。ＲＮＡを得ることを望む場合、強アルカリ溶液との接触をさけるか、または最小限の時間にする必要がある。強アルカリ溶液は、共役結合の切断により開裂または分断されうる基を介して核酸結合部分が基質に結合する固相結合材料と共に有用である。かかる材料は、以下および前述の出願中の、米国出願番号１０／７１４，７６３号、１０／７１５，２８４号および１０／８９１，８８０号明細書に記載されている。
【００５３】
ある好適な実施形態は、選択的に切断されうる結合を介してＮＡＢ基が基質に結合する固相結合材料を使用する。この結合の切断は、固相からいかなる結合核酸をも効果的に分離する。この結合は、明確に開裂可能な結合部分で結合を切断するが関心のある核酸を破壊することのない、いかなる化学的、酵素的、光化学的または他の方法によっても開裂させることができる。かかる開裂可能な固相材料は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固体支持体部分を含み、これは、表面に、核酸を引き寄せて結合するための核酸結合（ＮＡＢ）部分を有しており、このＮＡＢ部分は、開裂可能な結合部分により、固体支持体部分に対し結合されている。
【００５４】
2008513008.tif 000002
【００５５】
１つの実施形態においては、ＮＡＢは、上述したように一般式ＱＲ２＋Ｘ−で示される３級オニウム基または４級オニウム基ＱＲ３＋Ｘ−である。
【００５６】
2008513008.tif 000003
【００５７】
開裂可能な固相の１つのタイプは、市場において入手可能なポリスチレン型ポリマー、例えば、メリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂（架橋）と称する種類のものから誘導することができる。これらのポリマーにおいて、スチレン単位の割合には、共有結合の手段としての反応基、通常はクロロメチルまたはヒドロキシメチル基が含まれる。硫化物（Ｒ２Ｓ）または３級アミンまたはホスフィンとの反応によるいくらかの塩素の置換により、本発明の固相材料が生成される。この規定に従い調製されたポリマーは、反応性クロロメチル基の全てが３級または４級オニウム基に転化された場合には、以下の式（１）により表すことができる。本発明の重合性固相がしばしばオニウム基およびクロロメチル基の混合物を含むようにするために、かかる基の全てが転化されることは必要ではない。
【００５８】
2008513008.tif 000004
【００５９】
上記式において、ｍ，ｎ，およびｏはポリマー内のそれぞれのモノマー単位のモル％を表し、ｍは０．１％〜１００％、ｎは０％〜９９％、ｏは０％〜１０％の値をとりうる。より好ましくは、ｍは１％〜２０％であり、ｎは８０％〜９９％であり、また、ｏは０％〜１０％である。
【００６０】
他の実施形態においては、開裂可能な固相は、共有結合のための反応性クロロアセチルまたはクロロプロピオニル基を含むスチレン単位の割合を有する、市場で入手可能な架橋されたメリーフィールド樹脂から誘導することができる。非常に多くの他の公知技術の重合樹脂を、開裂可能な固相材料の調製において、固体基質として用いることができる。重合樹脂は、アドバンスド  ケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）（ルイビル，ＫＹ）およびノバビオケム社（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）などの市場における供給者より入手可能である。この樹脂は、一般に、反応性官能基を有する架橋された重合粒子をベースとする。アドバンスド  ケムテック社２００２カタログの１０５〜１４０ページに記載されているような、ペプチド合成をサポートした固体で使用される多くの好適な重合樹脂が、出発材料として適している。反応性のＮＨ２，ＮＨ−ＮＨ２，ＯＨ，ＳＨ，ＣＨＯ，ＣＯＯＨ，ＣＯ２ＣＨ＝ＣＨ２，ＮＣＯ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＳＯ２ＣＨ＝ＣＨ２，ＳＯ２Ｃｌ，ＳＯ２ＮＨ２，アクリルイミダゾール、オキシム（Ｃ＝Ｎ−ＯＨ）、サクシンイミドエステル基を有するポリマーは、本発明の重合固相の調製における使用のために、それぞれ市場で入手可能である。以下に示すように、非常に多くの例および前述の出願中の特許出願において、前駆体ポリマー樹脂を３級または４級オニウム基に対し共有結合させる手段を与えることが、ときに必要であるか、あるいは望まれる。これは、一般に、アルキレン、アリーレンまたはアラルキレン基から選択される１〜２０個の原子からなる鎖または環状基を含む。この鎖または環はまた、Ｏ，Ｓ，またはＮ原子、および、ケトン、エステル、チオエステル、アミド、ウレタン、カーボネート、キサントゲン酸塩、ウレア、イミン、オキシム、スルホキシドおよびチオケトンの形態でのカルボニル基を含んでもよい。
【００６１】
開裂可能な結合部分は、好ましくは、直鎖、分岐鎖および環から選択される有機基であり、１〜１００個の原子、より好ましくは１〜約５０個の原子を含む。この原子は、好ましくは、Ｃ，Ｈ，Ｂ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｓｉ，Ｐ、ハロゲンおよびアルカリ金属から選択される。典型的な結合基は、加水分解的に開裂可能な基であり、これは加水分解により開裂する。カルボキシエステルおよび無水物、チオエステル、カーボネートエステル、チオカーボネートエステル、ウレタン、イミド、スルホンアミド、およびスルホンイミドは、スルホネートエステルのように、典型的である。他の典型的な結合基の種類は、エタンチオール、メルカプトエタノール、およびＤＴＴなどのチオールにより開裂されるジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）などの還元開裂を受ける基である。他の典型的な基は、過酸化結合（Ｏ−Ｏ）を含む有機基である。過酸化結合は、チオール、アミンおよびホスフィンにより開裂可能である。他の典型的な基は、次式のニトロで置換された芳香族のエーテル及びエステル等の光化学的に開裂可能な結合基である。
【００６２】
2008513008.tif 000005
【００６３】
ここで、ＲｄおよびＨは、アルキル基またはフェニル基であり、オルト−ニトロベンジルエステルは、以下のよく知られた反応として紫外光により開裂する。
【００６４】
2008513008.tif 000006
【００６５】
他の典型的な開裂可能な基は、酵素的に開裂可能な結合基である。典型的な基には、エステラーゼおよび加水分解酵素により開裂可能なエステル、プロテアーゼおよびペプチダーゼにより開裂可能なアミドおよびペプチド、グリコシダーゼにより開裂可能なグリコシド基が含まれる。
【００６６】
他の典型的な開裂可能な基は、開裂可能な１，２−ジオキセタン部分である。かかる材料は、熱により分解されうるか、または化学反応もしくは酵素剤により断片化を開始されうるジオキセタン部分を含む。オキシアニオンを生成するための保護基の除去は、ジオキセタン環の分解を促進する。断片化（フラグメンテーション）は、過酸化結合Ｏ−Ｏの開裂により、Ｃ−Ｃ結合と同様に、よく知られたプロセスに従って生ずる。開裂可能なジオキセタンは、非常に多くの特許および出版物に記載されている。典型的な例には、米国特許４，９５２，７０７号、５，７０７，５５９号、５，５７８，２５３号、６，０３６，８９２号、６，２２８，６５３号および６，４６１，８７６号明細書が含まれる。
【００６７】
2008513008.tif 000007
【００６８】
あるいはまた、結合したオニウム基はアリール基Ａｒに対してか、または、開裂可能な基Ｙに対して、結合可能である。さらにあるいはまた、固相および３級または４級オニウム基に対する結合は、示された方向とは逆である。
【００６９】
他の開裂可能な結合基は、不安定な１，２−ジオキセタン部分に転化されうるエレクトロンリッチＣ−Ｃ二重結合である。二重結合における少なくとも１個の置換基は、Ｏ，ＳまたはＮ原子を用いて二重結合と結合する。エレクトロンリッチ二重結合の一重項酸素との反応により、不安定な１，２−ジオキセタン環基が生成され、このジオキセタン環基は、周囲温度にて自然に断片化して、２つのカルボニル断片を生成する。エレクトロンリッチ二重結合から構成される不安定なジオキセタンは、Ａ．Ｐ．シャップ（Ａ．Ｐ．Ｓｃｈａａｐ）およびＳ．Ｄ．ガグノン（Ｓ．Ｄ．Ｇａｇｎｏｎ），Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０４，３５０４−６（１９８２）；Ｗ．アダム（Ｗ．Ａｄａｍ），Ｃｈｅｍ．Ｂｅｒ．，１１６，８３９−４６，（１９８３）；米国特許５，７８０，６４６号明細書によって例示される非常に多くの特許および出版物に記載されている。
【００７０】
2008513008.tif 000008
【００７１】
開裂可能な結合基を有する固相材料の他の基は、ＰＣＴ公報ＷＯ０３／０５３９３４号に開示されているように、開裂可能な部分としてケテンジチオアセタールを有する。ケテンジチオアセタールは、ペルオキシダーゼ酵素および過酸化水素を用いた酵素の酸化により、酸化開裂を受ける。
【００７２】
2008513008.tif 000009
【００７３】
開裂可能な部分は示された構造を有し、アクリダン環において置換基をもつ類似体を含み、ここでＲａ、ＲｂおよびＲＣはそれぞれ、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜約５０個の非水素原子を含む有機基であり、ここでＲａおよびＲｂは互いに結合して環を形成してもよい。非常に多くの他の開裂可能な基は、熟練した技術者には明らかである。
【００７４】
固相核酸の捕捉方法は、非常に多くの用途に用いることができる。以下の特有の個々の実施例に示すように、一本鎖と二本鎖の核酸の両方が捕捉され、解離されうる。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡは捕捉および解離され得る。
【００７５】
好適な用途は、全血からのＤＮＡの単離である。ＤＮＡは、通常使用される技術で白血球から抽出される。血液は、赤血球を選択的に溶解するために典型的に処理され、沈殿または遠心分離工程の後に無傷の白血球が、核酸内容物を露出させるために分離して溶解される。タンパク質は蒸解され、得られたＤＮＡは固相で単離され、次いで配列多形（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）の決定、配列解析、ＲＦＬＰ分析、突然変異検出または他のタイプの診断分析のために使用される。
【００７６】
他の用途は、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物からのＤＮＡの単離である。強アルカリ溶離条件、特に高温で使用される条件を含んでいる本発明の方法では、ＤＮＡを無傷の状態にしている間に、存在するＲＮＡが減成または破壊されうる。強アルカリ開裂反応を含んでいる方法は、同様に作用する。
【００７７】
付加的な用途には、他のサンプル−土壌、植物、細菌および汚水からの核酸材料の抽出、および、保管目的のための核酸材料の長期保存が含まれる。
【００７８】
本方法の重要な利点は、多くの下流の分子生物学プロセスと両立できることである。本方法により単離された核酸は、多くの場合、さらなるプロセスで直接的に使用することができる。ＰＣＲ、米国特許５，９９８，１７５号明細書に記載された多重オリゴマーの連結反応（ＬＭＯ）およびＬＣＲなどの増幅反応には、かかる核酸の溶離剤を使用することができる。慣用技術によって、特に細菌細胞培養組織または血液サンプルから単離された核酸には、沈殿工程を使用する。水溶液から核酸を沈殿させるために、低分子量のアルコールが高体積％で加えられる。次いで、沈殿した材料は、使用する前に、分離され、収集され、かつ、好適な溶媒中に再溶解させなければならない。これらの工程は、本方法を使用した本発明の固相結合材料からの核酸の溶離によって不要にすることができる。解離された核酸を含んでいる溶液を直接的に核酸増幅反応において使用して、核酸またはそれのセグメントの量をポリメラーゼまたはリガーゼ仲介反応を用いて増幅させることは、好ましい実施である。
【００７９】
実施例：
下記実施例に示された構造式の図は、固相材料の開裂可能な結合部分のみを図示することを意図したものである。図は、固相材料の完全な規定を示すものではない。
【００８０】
実施例１
トリブチルホスホニウム基および開裂可能なアリールチオエステル結合を含有し、ポリメタクリレート結合部分（ｌｉｎｋｅｒ）により官能化された磁性シリカ粒子の合成
【００８１】
2008513008.tif 000010
【００８２】
磁性カルボン酸により官能化されたシリカ粒子（ケミセル社，ＳｉＭＡＧ−ＴＣＬ，１．０ｍｅｑ／ｇ，１．５ｇ）を２０ｍＬの塩化チオニルの中にいれ４時間還流した。過剰の塩化チオニルを減圧下で除去した。樹脂を２５ｍＬのクロロホルム中に再懸濁し、超音波で懸濁液を分散させた。溶媒を蒸発させた後、超音波洗浄処理を繰り返した。粒子をさらなる使用のため、減圧下で乾燥させた。
【００８３】
酸塩化物により官能化された粒子を、３８８ｍｇのジイソプロピルエチルアミンと共に３８ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中で懸濁した。４’−ヒドロキシフェニル４−クロロメチルチオベンゾエート（５２４ｍｇ）を加え、密閉反応フラスコ中で一晩振盪機にて振盪した。粒子を５０ｍＬのプラスチック製試験管に移し、磁性分離にて、ＣＨ２Ｃｌ２、ＣＨ３ＯＨ、１：１ＣＨ２Ｃｌ２／ＣＨ３ＯＨ、次いでＣＨ２Ｃｌ２で繰り返し洗浄した。未反応の可溶性出発材料の除去のため、洗浄液をＴＬＣにてモニターした。さらなる使用の前に、固形物を風乾した。
【００８４】
アルゴン雰囲気中で、樹脂（１．２３３ｇ）を２０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に懸濁した。トリブチルホスフィン（３９５ｍｇ）を加え、スラリーを７日間振盪した。粒子を５０ｍＬプラスチック製試験管に移し、４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、次いで、４０ｍＬのＭｅＯＨで４回、４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄した。次いで、樹脂を風乾し、ライトブラウンの固形物を１．１７ｇ得た。
【００８５】
実施例２
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により官能化されたシリカ粒子の合成
【００８６】
2008513008.tif 000011
【００８７】
１３ｍＬのエタノールと７５ｍＬのヘプタン中に３−アミノプロピルトリエトキシシラン（１３．２ｍＬ）を溶解した溶液をアルゴン雰囲気中に置き、５．５ｇの無水コハク酸（ｓｕｃｃｉｎｉｃ  ａｎｈｙｄｒｉｄｅ）と共に攪拌した。反応は、４．５時間還流させ、その後一晩室温で冷却した。溶媒を除去し、透明なオイルとしてアミド生成物を得た。
【００８８】
４．１６ｇ、５．５ｇの４’−ヒドロキシ−フェニル４−クロロメチルチオベンゾエートを加える前に、１００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中にＥＤＣハイドロクロライド（ＥＤＣ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）（４．０ｇ）と上記生成物２．８６ｇを溶解した溶液をアルゴン雰囲気下に置き、１時間攪拌した。反応は一晩攪拌することにより行った。反応混合物を１５０ｇのシリカを用いクロマトグラフにかけ、１〜２％のＥｔＯＨ／ＣＨ２Ｃｌ２で溶離し、白色の固形物としてカップリングした生成物１．８４ｇを得た。
【００８９】
アルゴン雰囲気下で、５０ｍＬの乾燥トルエン中の前工程の生成物（１．８４ｇ）を、オーブンで乾燥させた３．８３ｇのシリカの入ったフラスコにカニューレを介して加えた。反応は、一晩還流させた。室温まで冷却した後、シリカをろ過し、５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、４時間減圧乾燥した。
【００９０】
５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中のクロロベンジル末端基を有する誘導体化されたシリカ（２．０ｇ）を８．０ｇのトリブチルホスフィンと混合した。反応混合物をアルゴン雰囲気下で２日間攪拌した。シリカをろ過し、ＣＨ２Ｃｌ２とヘキサンで洗浄し、数時間減圧乾燥した。
【００９１】
実施例３
トリブチルホスホニウム基を含有する開裂可能な結合部分により被覆された磁性シリカ粒子の合成
開裂可能な核酸結合基をシリカ粒子の表面上に受動的に吸着させることで、核酸結合材料を調製した。
【００９２】
３Ｌフラスコに１００．９ｇの４−クロロメチル安息香酸と１．２ＬのＳＯＣｌ２を入れた。反応は４時間還流させ、その後、減圧下で塩化チオニルを除去した。残留ＳＯＣｌ２は、ＣＨ２Ｃｌ２を加えて、減圧下で蒸発させることにより除去した。
【００９３】
１１３．１ｇの４−クロロメチル安息香酸クロライドの入った３Ｌフラスコに、９８．１７ｇの４−ヒドロキシ−チオフェノールと１．５ＬのＣＨ２Ｃｌ２を加えた。アルゴンでパージし、６７．７５ｍＬのピリジンを加えた。一晩攪拌した後、反応混合物を１ＬのＣＨ２Ｃｌ２で希釈し、５Ｌの水で抽出した。水相をＣＨ２Ｃｌ２で逆抽出した。ＣＨ２Ｃｌ２の混合液を硫酸ナトリウムで乾燥させ、固形物まで濃縮した。固形物を５００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で洗浄し、ろ過し、風乾した。１Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ６）：δ４．８０９（ｓ、２Ｈ）、６．９４６−６．９６８（ｄ、２Ｈ）、７．３２３−７．３４６（ｄ、２Ｈ）、７．６４３−７．６６４（ｄ、２Ｈ）、８．００４−８．０２５（ｄ、２Ｈ）。
【００９４】
ステアリン酸（１．３３ｇ）を１０ｍＬのＳＯＣｌ２で２時間還流させた。過剰のＳＯＣｌ２を減圧下で除去し、褐色の液体としてステアロイルクロライドを生成させた。
【００９５】
ステアロイルクロライドを１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に溶解し、３０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に１．０ｇの４’−ヒドロキシフェニル４−クロロメチルチオベンゾエートと１．５６ｍＬのジイソプロピルエチルアミンを溶解した溶液に加え、混合物を一晩攪拌した。溶媒を除去し、残留物を１：１のヘキサン／ＣＨ２Ｃｌ２溶液を溶離剤として用いて、カラムクロマトグラフィーにかけた。ステアロイルエステル（１．４３ｇ）を、白色の固形物として単離した。
【００９６】
３０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の上記生成物（１．４３ｇ）とトリブチルホスフィン（１．２７ｍＬ）の溶液をアルゴン雰囲気下で２日間攪拌した。ＣＨ２Ｃｌ２除去後、残留物を６×５０ｍＬのエーテルで洗浄し、ＣＨ２Ｃｌ２に再溶解し、エーテルで沈殿して、１．６９ｇのホスホニウム塩生成物を生成した。この材料は水に不溶であることがわかった。
【００９７】
2008513008.tif 000012
【００９８】
ホスホニウム塩（０．６ｇ）を６ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に溶解させ、６．０ｇのシリカゲルに攪拌しながら加えた。溶媒を蒸発させ、核酸結合材料を得た。
【００９９】
実施例４
ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム基を含有するポリマー層を有する磁性粒子の合成
【０１００】
2008513008.tif 000013
【０１０１】
磁性メリフィールドペプチド樹脂（ケミセル社  ＳｉＭａｇ  クロロメチル，１００ｍｇ）をガラスバイアル中で２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に加えた。トリブチルホスフィン（８０μＬ）を加え、そのスラリーを室温で３日間振盪した。バイアルの下に磁石を置き、ピペットで、上澄みを除去した。固形物を２ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回洗浄した（洗浄液もまた磁石／ピペットの手順で除去した）。樹脂を風乾した（９３ｍｇ）。
【０１０２】
実施例５
トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマー粒子の合成
【０１０３】
2008513008.tif 000014
【０１０４】
ポリ（メタクリロイルクロライド）粒子（１．０ｍｅｑ／ｇ，１．５ｇ）を２．４５ｇのジイソプロピルエチルアミンを含む７５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に加えた。トリエチルアミン（１．２ｇ）を加えた。４’−ヒドロキシフェニル４−クロロメチルチオベンゾエート（４．５ｇ）を加え、密閉した反応混合物を室温で一晩攪拌した。そのスラリーをろ過し、樹脂を１０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、２００ｍＬのアセトン、２００ｍＬのＭｅＯＨ、２×１００ｍＬの１：１のＴＨＦ／ＣＨ２Ｃｌ２、２５０ｍＬのＴＨＦ、２５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、２５０ｍＬのヘキサンで洗浄した。樹脂はさらなる使用のため風乾した。
【０１０５】
樹脂（１．５２５ｇ）をアルゴン雰囲気下で２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に懸濁した。トリブチルホスフィン（１．７ｇ）を加え、そのスラリーを４日間攪拌した。樹脂をろ過して、２２５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で４回、続いて１７５ｍＬのヘキサンで洗浄した。樹脂をその後風乾させ、１．６８ｇの固形物を得た。
【０１０６】
実施例６
トリブチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
【０１０７】
2008513008.tif 000015
【０１０８】
架橋結合したクロロメチル化ポリスチレンであるメリフィールドペプチド樹脂（シグマ社，１．１ｍｅｑ／ｇ，２０．０ｇ）をアルゴン雰囲気下で２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２／ＤＭＦ（５０／５０）中で攪拌した。過剰のトリブチルホスフィン（４８．１ｇ，１０当量）を加え、そのスラリーを７日間室温で攪拌した。そのスラリーをろ過し、得られた固形物を２００ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で２回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（２１．５ｇ）。元素分析：実測値Ｐ  ２．５２％，Ｃｌ  ３．０８％，期待値  Ｐ  ２．７９％，Ｃｌ  ３．１９％：Ｐ／Ｃｌ比は０．９４
【０１０９】
実施例７
トリブチルアンモニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
【０１１０】
2008513008.tif 000016
【０１１１】
メリフィールドペプチド樹脂（オールドリッチ社、１．４３ｍｅｑ／ｇ，２５．１ｇ）をアルゴン雰囲気下で１５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中で攪拌した。過剰のトリブチルアミン（２５．６ｍｇ，４当量）を加え、そのスラリーを室温で、８日間攪拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物を２５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で２回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（２８．９ｇ）。元素分析：実測値  Ｎ  １．１８％  Ｃｌ  ３．４０％；期待値  Ｎ  １．５８％  Ｃｌ  ４．０１％：Ｎ／Ｃｌ比  ０．８８
【０１１２】
実施例８
トリブチルホスホニウム基により官能化されたシリカ粒子の合成
【０１１３】
2008513008.tif 000017
【０１１４】
１時間、１１０℃でアルゴン雰囲気下にて乾燥させたシリカゲル（４．８２ｇ）を２．７９ｇのＥｔ３Ｎと共に５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２に加えた。混合物を２０分間攪拌し、その後、２．５６ｇの３−ブロモプロピルトリクロロシランを加え、発熱を生じさせた。混合物を２４時間攪拌し、ろ過し、固形物を３×４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２、４×４０ｍＬのＭｅＯＨ、および２×４０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２で順次洗浄した。固形物を一晩風乾し、６．１３ｇを得た。
【０１１５】
５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中の上記により調製した官能化されたシリカ（５．８ｇ）を５．３３ｍＬのトリブチルホスフィンとともに１０日間攪拌した。混合物をろ過し、固形物を７×５０ｍＬのアセトンで洗浄した。固形物を風乾して、５．８８ｇの生成物を得た。
【０１１６】
実施例９
実施例３のＮＡＢ材料中の結合部分の制御された開裂
実施例３の被覆されたシリカ材料（７０ｍｇ）を１．０ｍＬのＤ２Ｏに懸濁させ、３分間ボルテクシング（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）により混合した。１Ｈ  ＮＭＲによる水溶液の分析では、溶液中への原料の解離は見られなかった。
【０１１７】
４０μＬの４０％ＮａＯＤにてシリカ懸濁液を処理し、３分間ボルテクシングし、上澄みをＮＭＲにて分析すると、結合部分の開裂とシリカから溶液中への解離がみられた。
【０１１８】
実施例１０
ヒト全血からのＤＮＡの捕捉
実施例１〜８の各々の粒子１０ｍｇを試験管中で７０μＬのヒト全血と混合した。試験管を１５秒間ボルテックス混合し、５分間室温に置き、再び１５秒間ボルテックス混合した。混合物を１０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ８．０、３００μＬで希釈し、粒子から液体を除去した。磁性反応粒子を使用した場合は磁石を用いた。
【０１１９】
実施例１１
ヒト全血からのＤＮＡの単離
前述の実施例の手順により固相結合材料上に捕捉された核酸を１０ｍＭのトリス緩衝液、ｐＨ８．０、５００μＬで３回洗浄し、その都度上澄みを廃棄した。０．１ＭのＮａＯＨ１００μＬを用いて、３７℃、５分間で溶離することにより核酸を粒子から除いた。その他のＮａＯＨ濃度もまた図５Ａ、５Ｂに示すように効果的であった。
【０１２０】
実施例１２
ゲノムＤＮＡのＰＣＲ増幅
０．１ＭのＮａＯＨ中の前記実施例の溶離したＤＮＡ（１μＬ）を、２００ｂｐアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）により生成した一対の２４塩基プライマーとともに、ＰＣＲ増幅に用いた。ＰＣＲ反応混合物は以下の表に記載された成分を含んでいた。
【０１２１】
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【０１２２】
ネガティブコントロールとして反応混合物中でテンプレート（ｔｅｍｐｌａｔｅ）を水１μＬと置き換えた。さらなる反応では１：１０に水で希釈した１μＬのテンプレートを使用した。反応混合物を、９４℃で３０秒間、６０℃で３０秒間、７２℃で３０秒間を３０回のサイクルに供した。反応生成物を、１．５％アガロースゲル（ａｇａｒｏｓｅ  ｇｅｌ）で実験した。図３はビーズから溶離したＤＮＡが無傷であることを示している。
【国際調査報告】
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