(57)【要約】  ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの混合物中にあるＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡ（式中、Ｒはアルキル基であり、Ａは表面または生物学的に活性な材料またはその他の有用なものと結合するための官能基であり、ｎは１０を超える整数である）を測定するための化学分析方法であって、。該方法は、混合物の試料を液体クロマトグラフィーにより臨界条件下でクロマトグラフして、該混合物中のＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの相対量を測定するステップを含む。加えて、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの混合物中にあるＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡ（式中、Ｒはアルキル基であり、Ａは生物学的に活性な材料と結合するための官能基であり、ｎは１０を超える整数である）を測定するための化学分析方法である。該方法は２つのステップを含む。第１のステップは、混合物のＡ基を誘導体化剤で誘導体化することによる、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤおよびＤＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤ（式中、ＡＤは誘導体化されたＡ基である）を含む誘導体化混合物の形成である。第２のステップは、誘導体化混合物の試料を液体クロマトグラフィーにより臨界条件下でクロマトグラフすることによる、該誘導体化混合物中のＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤおよびＤＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤの相対量の測定である。【選択図】図１
2008532046.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの混合物中にあるＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡ（式中、Ｒがアルキル基であり、Ａが表面または生物学的に活性な材料またはその他の有用なものと結合するための官能基であり、ｎが１０を超える整数である）を測定するための化学分析方法であって、前記混合物の試料を液体クロマトグラフィーにより臨界条件下でクロマトグラフして、前記混合物中のＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの相対量を測定するステップを含む方法。
【請求項２】
Ｒが本質的にメチル基からなる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Ａがアルデヒド基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記アルデヒドがプロピオンアルデヒドである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
Ａがプロピオンアルデヒドジアセタールである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
Ａがメシラートである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
Ａがパラニトロフェニルカーボネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
Ａがマレイミド基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
Ａがアミン基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ａがチオール基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
Ａがジチオール基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの重量平均分子量が５，０００グラム毎モルを超える、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの重量平均分子量が１０，０００グラム毎モルを超える、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの混合物中にあるＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡ（式中、Ｒがアルキル基であり、Ａが表面または生物学的に活性な材料またはその他の有用なものと結合するための官能基であり、ｎが１０を超える整数である）を測定するための化学分析方法であって、（ａ）前記混合物のＡ基を誘導体化剤で誘導体化して、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤおよびＤＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤ（式中、ＡＤは誘導体化されたＡ基である）を含む誘導体化混合物を形成するステップと、（ｂ）前記誘導体化混合物の試料を液体クロマトグラフィーにより臨界条件下でクロマトグラフして、前記誘導体化混合物中のＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤおよびＤＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤの相対量を測定するステップとを含む方法。
【請求項１５】
Ｒが本質的にメチル基からなる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
Ａがカルボニル基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
Ａがアルデヒド基を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アルデヒド基がプロピオンアルデヒドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記誘導体化剤が１−（ヒドラジノカルボニルメチル）ピリジニウムクロライドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記誘導体化剤がジニトロフェニルヒドラジンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
Ａがマレイミドである、請求項１４に記載の方法。
【請求項２２】
前記誘導体化剤がチオナフタレンである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
Ａがアミンを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
前記誘導体化剤が芳香族アルデヒドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
Ａがチオール基を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項２６】
前記誘導体化剤がオルトジピリジニルジスルフィドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの重量平均分子量が５，０００グラム毎モルを超える、請求項１４に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの重量平均分子量が１０，０００グラム毎モルを超える、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
活性化基Ａによって活性化されたＰＥＧを含む組成物の試料を準備すること、そして液体クロマトグラフィーにより臨界条件下で前記試料をクロマトグラフして、活性化度を種々有するＰＥＧの前記試料中の相対量を測定することを含む化学分析方法。
【請求項３０】
前記試料が、化学式Ｍ［Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＢ］x（式中、
Ｍは、Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＢ基と結合するための少なくともｘ個の場所を有する小分子またはポリマー主鎖であり、
ｎは、各々の出現において独立して１以上の整数であり、
Ｂは、各々の出現において独立して水素またはＡであり、
ｘは、２以上の整数である）
のポリエチレングリコール化合物を含み、
液体クロマトグラフィーにより臨界条件下で混合物の試料をクロマトグラフして、Ａ基による活性化度を種々有するポリエチレングリコールの相対量を測定する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料がポリエチレングリコールを含み、前記活性化基Ａがポリマー鎖の側鎖である、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が、化学式：ＢＯ［（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＭ］m（ＯＣＨ2ＣＨ2）pＯＢ（式中、
Ｍは、２つのＰＥＧに付着する小分子であってＢを含む側基を有し、
Ｂは、各々の出現において独立してＨまたはＡであり、
ｍ，ｎおよびｐは、独立して１を超える整数であり、
Ａは、上記定義の通りである）
のポリマーを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料をクロマトグラフする前に、誘導体化剤によるＡ基の誘導体化をさらに含む、請求項２９−３２のいずれかに記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ポリエチレングリコール化合物を分析するための化学分析方法に関する。より詳しくは、本発明は、液体クロマトグラフィーによる「臨界条件」下でのポリエチレングリコール化合物の分析に関する。本発明のポリエチレングリコール化合物は、生理学的に活性な材料の化学的修飾を促進するために「活性化され」ており、修飾された材料は例えばドラッグデリバリーシステムに適用できる。
【背景技術】
【０００２】
ポリオキシアルキンレンでコンジュゲートされた生物学的に活性な化合物は、該化合物に改善された生体適合性を付与することができる。たとえば米国特許第５、３６６、７３５号明細書および米国特許第６，２８０，７４５号明細書を参照されたい。バイオコンジュゲート  ケミストリー（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇｅｔｅ  Ｃｈｅｍ．），１９９５，６，第１５０−１６５頁におけるツァリプスキー（Ｚａｌｉｐｓｋｙ）によるこの主題の概説において、ポリエチレングリコールは、生物学的に活性な化合物（薬物、タンパク、ペプチドまたは酵素のような）とコンジュゲートして、適切な溶解特性、より低い毒性、改善された表面親和性、より長い循環時間およびより低い免疫原性のような改善された特性を有するコンジュゲートを形成する、最も生体適合性が高いポリマーの一つとされている。
【０００３】
ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）は、末端が水酸基で終わっている直鎖のポリオキシアルキレンであり、一般に、化学式：ＨＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、で表される。モノメトキシポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）は、一般に、化学式：ＣＨ3Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、で表される。ｍＰＥＧは、生物学的に活性な材料の基と結合し得る「Ａ」基で「活性化」されることができる。活性化ｍＰＥＧは、一般に、化学式：ＣＨ3Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＡで表される。バイオコンジュゲート  テクニクス（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）（１９９６）第１５章においてヘンマンソン（Ｈｅｎｍａｎｓｏｎ）によって議論されているように、たとえば、トリクロロ−ｓ−トリアジン活性化ｍＰＥＧは、生物学的に活性な材料のアミン基に結合し得る。ジ−活性化直鎖ＰＥＧはまた、ヒドロゲルの形成において有用である。
【０００４】
最近では、たとえば、ｍＰＥＧのジオール不純物の混入という問題を最小限にしてＰＥＧの分子量およびリンカーの安定性を向上させる、いわゆる「第二世代」ＰＥＧ化試薬が開発されている。ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら，アドバンスド  ドラッグ  デリバリー  レビューズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）５４（２００２）第４５９−４頁を参照されたい。米国特許第６，４５５，６３９号明細書には、狭い分子量分布を有し分子量が増大したｍＰＥＧが記載されている。
【０００５】
臨界条件下での液体クロマトグラフィーはポリマー分析のために重要な方法となっている。たとえば、ゴルブノフ（Ｇｏｒｂｕｎｏｖ）ら，ジャーナル  オブ  クロマトグラフィー  Ａ（Ｊ．，Ｃｈｒｏｍ  Ａ），９５５（２００２）９−１７を参照されたい。臨界条件下での液体クロマトグラフィーは、ｍＰＥＧ中のポリエチレングリコールを測定するために用いられてきた（たとえば、バラン（Ｂａｒａｎ）ら，ジャーナル  オブ  クロマトグラフィー  Ｂ（Ｊ．，Ｃｈｒｏｍ．Ｂ），７５３（２００１）１３９−１４９、および、カザンスキー（Ｋａｚａｎｓｋｉｉ）ら，ポリマー  サイエンス（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），シリーズＡ，第４２巻，第６号（２０００），第５８５-５９５頁を参照されたい。しかしながら、ｍＰＥＧの分子量が５，０００グラム毎モル以上の場合にはポリエチレングリコールのピークとｍＰＥＧのピークの分解能が劣っている（カザンスキーらの出典の図２を参照されたい）。また、臨界条件下での液体クロマトグラフィーは、活性化ｍＰＥＧの分析には用いられていない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明は、活性化されたＰＥＧを、残留活性化ＰＥＧおよび活性化度が異なるＰＥＧにおいて分析するために、臨界条件下の液体クロマトグラフィー（ＬＣＣＣ）を用いることができることを見出したことにある。たとえば、ＬＣＣＣは、ｍＰＥＧの分子量が５，０００グラム毎モル以上であっても、活性化されたｍＰＥＧ中での非活性化ｍＰＥＧアルコールおよび非活性化ＰＥＧジオール、モノ−活性化ｍＰＥＧおよびモノ−活性化ＰＥＧジオール、ジ−活性化ＰＥＧの相対量を測定するために用いることができる。さらに、活性化ＰＥＧの誘導体化によってクロマトグラフィーの分解能を向上させることができる。よって、たとえば、ジ−活性化ＰＥＧを含むモノ−活性化ｍＰＥＧの本発明に従った誘導体化によって、これらのクロマトグラフィーの分解能を向上させることができる。加えて、ジ−活性化ＰＥＧジオールを含むモノ−活性化ｍＰＥＧの本発明に従った誘導体化によって、クロマトグラフィーによって分離された後のＰＥＧの検出能力を向上させることができる。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
よって、本発明の一つの態様は、活性化基Ａによって活性化されたＰＥＧを含む組成物の試料を準備すること、そして液体クロマトグラフィーにより臨界条件下で該試料をクロマトグラフして、活性化度を種々有するＰＥＧの該試料中での相対量を測定することを含む化学分析方法である。
【０００８】
より具体的には、本発明の一つの態様は、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの混合物中にあるＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡ（式中、Ｒが水素またはアルキル基であり、Ａが表面または生物学的に活性な材料またはその他の有用なものと結合するための官能基であり、ｎが１０を超える整数である）を測定するための化学分析方法であり、該混合物の試料を液体クロマトグラフィーにより臨界条件下でクロマトグラフして、該混合物中のＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの相対量を測定するステップを含む。
【０００９】
本発明の他の一つの態様は、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの混合物中にあるＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡ（式中、Ｒが水素またはアルキル基であり、Ａが表面または生物学的に活性な材料またはその他の有用なものと結合するための官能基であり、ｎが１０を超える整数である）を測定するための化学分析方法であり、（ａ）該混合物のＡ基を誘導体化剤で誘導体化して、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤおよびＤＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤ（式中、ＡＤは誘導体化されたＡ基である）を含む誘導体化混合物を形成するステップと、（ｂ）該誘導体化混合物の試料を液体クロマトグラフィーによって臨界条件下でクロマトグラフして、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤおよびＤＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤの該誘導体化混合物における相対量を測定するステップと、を含む。
【００１０】
別の態様として、水酸基、Ｒ基またはＡ基は、２つを超えて存在し、そして／またはＰＥＧ鎖の末端以外の部位に存在しても良い。
【００１１】
よって、他の態様では、本発明は、化学式Ｍ［Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＢ］x、（式中、
Ｍは、Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＢ基と結合するための少なくともｘ個の場所を有する小分子またはポリマー主鎖であり、
ｎは、各々の出現において独立して１以上、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上の整数であり、ｎは、好ましくは２５００より小さく、より好ましくは２０００より小さく、より好ましくは１０００より小さく、
Ｂは、各々の出現において独立して水素またはＡ基であり、ここでＡは上記定義の通りであり、
ｘは、２以上、好ましくは３以上の整数である）
のポリエチレングリコール化合物を含む試料を準備すること、そして該混合物の試料を液体クロマトグラフィーにより臨界条件下でクロマトグラフして、Ａ基の活性化度を種々有するポリエチレングリコールの相対量を測定することを含む化学分析方法である。この変形として、クロマトグラフィーのステップの前に化合物をＤ基で誘導体化しても良い。
【００１２】
他の一つの態様において、本発明の方法は、活性化基が側基としてＰＥＧを含むポリマーに結合している活性化ポリエチレン化合物の混合物の分析に用いることができる。よって、この態様によれば、該試料は、化学式：ＢＯ［（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＭ］m（ＯＣＨ2ＣＨ2）pＯＢ（式中、
Ｍは、２つのＰＥＧに付着する小分子であってＢを含む側基を有し、
Ｂは、各々の出現において独立してＨまたはＡであり、
ｍ，ｎおよびｐは、独立して１を超える整数であり、
Ａは、上記定義の通りである）
の化合物を含む。この変形として、該化合物はＤ基で誘導体化されても良い。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明の一方法によって分析される化合物は、化学式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩ、
（Ｉ）ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡ、
（ＩＩ）ＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡ、および
（ＩＩＩ）ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＨ
で表され、上式中、Ｒは（各々の出現において独立して）水素またはＣ1-7炭化水素基（通常メチル基）を表し、ｎはＣ2Ｈ4Ｏ基の平均モル数、たとえば１０から２０００、を表し、Ａは「活性化」基である。多くの用途において、化学式Ｉの化合物が望ましい材料である。化学式ＩＩＩの化合物は、非反応性である非活性化ＰＥＧである。化学式ＩＩの化合物は、ＰＥＧジオール不純物から生成するジ−活性化ＰＥＧである。よって、分析される試料は通常、混合物中の比較的低いレベルの化学式ＩＩおよびＩＩＩの化合物とともに、主として化学式Ｉの化合物からなる。化学式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩの化合物の相対量は、混合物の試料を液体クロマトグラフィーによって臨界条件下でクロマトグラフィーし、該混合物中のＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの相対量を測定することにより測定される。
【００１４】
本発明はその全ての範囲において、ＰＥＧ共重合体（たとえば、Ｃ2Ｈ4Ｏ基を含む、ランダム共重合体またはブロック共重合体）、および、線状、分岐状、櫛状および星状を含むがこれらに限定されないポリマートポロジーのいずれもを含むと理解されるべきである。
【００１５】
活性化基Ａは、たとえば生理学的に活性な物質への結合のような後反応のためのＰＥＧの活性化において有用であることが知られているいずれの官能基であっても良い。このような活性化基の限定されない例には、ハライド、スルホネート（たとえばメシラート）、イソシアネート、アミン、ヒドラジン、アミノオキシ、チオール、カルボン酸、エステル、カーボネート（たとえばパラニトロフェニルカーボネート）、アミド、カルバメート、アルデヒド（たとえばプロピオンアルデヒド）、アセタール（たとえばプロピオンアルデヒドアセタール）、ケトン、ケタール、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセタミド、ジスルフィド（たとえばピリジルスルフィド）が含まれる。
【００１６】
臨界条件下での液体クロマトグラフィーを達成するためにはある程度の実験が要求されることが理解されるべきである。しかし、文献を参照すれば液体クロマトグラフィー分野の当業者は必要な条件に導かれるであろう。たとえば、ゴルブノフ（Ｇｏｒｂｕｎｏｖ）ら，ジャーナル  オブ  クロマトグラフィー  Ａ，９５５（２００２）９−１７を参照されたい。
【００１７】
臨界条件ＬＣは、ポリマーの末端基の組成に基づいてポリマーを分離する傾向があり、（理論的には）ポリマー分子量とは無関係である。たとえば、臨界条件下で逆相カラムを稼動させれば、親水性の末端基を有するポリマーから疎水性の末端基を有するポリマーを分離できる。ＬＣＣＣは、アイソクラティックに運転することも、初めアイソクラティックにしてその後グラジエント操作を行うこともできる。条件は臨界とすることが望ましいが、臨界から若干外れた条件で操作すると、試料中の種々の官能基を有するＰＥＧに応じた多少の測定値も与えられる。
【実施例】
【００１８】
実施例１
重量平均分子量５，０００のプロピオンアルデヒドジアセタール活性化ｍＰＥＧ０．１グラムを水３ミリリットルと混合して、注入のための試料を得る。注入のための該試料５マイクロリットルを、５２％Ａおよび４８％Ｂ（ここで、Ａは水中４７％アセトニトリルであり、Ｂは水中４３％アセトニトリルである）である移動相中に、移動相の流速０．７５ミリリットル毎分で注入して、充填剤の径が５マイクロメータであるＳｕｐｅｌｃｏ  ＬＣ−１８逆相カラムを、カラム温度摂氏３０度で流通させる。カラムは、内径４．６ミリメートル、長さ２５０ミリメートルである。続いて、蒸発光散乱検出器により図１に示すクロマトグラムを得る。図１のクロマトグラムは、ｍＰＥＧに対する約３．８分のピーク、活性化ｍＰＥＧに対する約４．８分のピーク、および、活性化ジオールに対する約５．６分のピークを示している。ピーク面積および蒸発光散乱検出器の応答係数から、種々のＰＥＧの相対量を決定する。
【００１９】
蒸発光散乱検出は、液体クロマトグラフィーにおいてよく知られている。たとえば、リスラー（Ｒｉｓｓｌｅｒ），ジャーナル  オブ  クロマトグラフィー  Ａ（Ｊ．Ｃｈｒｏｍ．Ａ），７４２（１９９６）４５を参照されたい。
【００２０】
実施例２
重量平均分子量５，０００のメシラート活性化ｍＰＥＧ０．１グラムを水３ミリリットルと混合して、注入のための試料を得る。注入のための該試料５マイクロリットルを、５２％Ａおよび４８％Ｂ（ここで、Ａは水中４７％アセトニトリルであり、Ｂは水中４３％アセトニトリルである）である移動相中に、移動相の流速０．７５ミリリットル毎分で注入して、充填剤の径が５マイクロメータであるＳｕｐｅｌｃｏ  ＬＣ−１８逆相カラムを、カラム温度摂氏３０度で流通させる。カラムは、内径４．６ミリメートル、長さ２５０ミリメートルである。続いて、蒸発光散乱検出器により図２に示すクロマトグラムを得る。図２のクロマトグラムは、ｍＰＥＧに対する約３．８分のピーク、活性化ジオールに対する約４．４分のピーク、および、活性化ｍＰＥＧに対する約４．９分のピークを示している。ピーク面積および蒸発光散乱検出器の応答係数から、種々のＰＥＧの相対量を決定する。
【００２１】
実施例３
重量平均分子量２０，０００のパラニトロフェニルカーボネート活性化ｍＰＥＧ０．１グラムを水３ミリリットルと混合して、注入のための試料を得る。注入のための該試料５マイクロリットルを、５２％Ａおよび４８％Ｂ（ここで、Ａは水中４７％アセトニトリルであり、Ｂは水中４３％アセトニトリルである）である移動相中に、移動相の流速０．７５ミリリットル毎分で注入して、充填剤の径が５マイクロメータであるＪｕｐｉｔｅｒ  Ｃ−１８逆相カラムを、カラム温度摂氏２９度で流通させる。カラムは、内径４．６ミリメートル、長さ１５０ミリメートルである。続いて、蒸発光散乱検出器により図３に示すクロマトグラムを得る。図３のクロマトグラムは、ｍＰＥＧに対する約３分のピーク、活性化ｍＰＥＧに対する約４．８分のピーク、および、活性化ジオールに対する約８．５分の小さなピークを示している。ピーク面積および蒸発光散乱検出器の応答係数から、種々のＰＥＧの相対量を決定する。
【００２２】
誘導体化された活性化ｍＰＥＧ
本発明の他の一つの態様は、ＰＥＧ中のＡ基を誘導体化剤Ｄで誘導体化することを含む、上記で議論した活性化ＰＥＧの測定のための化学分析方法である。
【００２３】
よって、一つの態様によれば、該方法は、混合物中のＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡである試料の準備と、該混合物のＡ基を誘導体化剤で誘導体化することによる、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤおよびＤＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤ（式中、ＡＤは誘導体化されたＡ基である）を含む誘導体化混合物の形成と、該誘導体化混合物の試料を液体クロマトグラフィーにより臨界条件下でクロマトグラフすることによる、該誘導体化混合物中のＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤおよびＤＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤの相対量の測定と、を含む。
【００２４】
本発明のこの態様は、活性化基が、これらに限定されないがアルデヒド、マレイミド、アミンまたはチオールを含む基のように親水性である場合に特に適用可能である。親水性基で活性化されたｍＰＥＧは、ｍＰＥＧアルコールからの分離が困難である可能性があり、これはｍＰＥＧアルコールの水酸基もまた親水性であることに起因する。しかし、活性化ｍＰＥＧのＡ基に疎水性基を付着させる誘導体化剤でこのような活性化ｍＰＥＧを誘導体化すれば、非活性化ＰＥＧアルコールから誘導体化された活性化ｍＰＥＧをより容易に分離できることが見出された。
【００２５】
同様に、親水性基で活性化されたｍＰＥＧは、２つの親水性基で活性化されたＰＥＧジオールからの分離が困難である可能性があり、これは、ｍＰＥＧアルコールのメチル基があまり疎水性でないことに起因する。しかし、活性化ｍＰＥＧ上およびジ−活性化ＰＥＧ上の両方のＡ基に疎水性基を付着させる誘導体化剤で活性化ｍＰＥＧおよびジ−活性化ＰＥＧのＡ基を誘導体化すると、誘導体化されたジ−活性化ＰＥＧから誘導体化された活性化ｍＰＥＧをより容易に分離できることが見出された。
【００２６】
したがって、誘導体化剤は、活性化基Ａと反応して基の親水性／疎水性を変える基である。活性化基Ａに可逆的に戻ることが可能となるように誘導体化する誘導体化剤を使用することもまた望ましい場合がある。好適な誘導体化剤の限定されない例には、アルコール、アミン、ヒドラジン（たとえば、ＰＥＧアルデヒド（たとえば、プロピオンアルデヒド）、アセタール、ケトンおよびケタールと反応してＰＥＧヒドラゾンを形成する、１−（ヒドラジノカルボニルメチル）ピリジニウムクロライドおよびジニトロフェニルフェニルヒドラジン）、アミノオキシ、チオール（たとえば、ＰＥＧマレイミドと反応してＰＥＧチオエーテルを形成するナフタレンチオール）、アルデヒド（たとえば、ＰＥＧアミンと反応してＰＥＧイミンを生成する芳香族アルデヒド）、アセタール、ケトン、ケタール、マレイミド、ビニルスルホン、ヨードアセタミド、ジスルフィド（たとえば、ＰＥＧチオールと反応してＰＥＧピリジルジスルフィドを形成するジピリジルジスルフィド）、ハライド、スルホネート、イソシアネート、カルボン酸、エステル、カーボネート、アミド、カルバメート、が含まれる。
【００２７】
誘導体化剤は、たとえば紫外（ＵＶ）発色団または蛍光基のような検出可能な特性を誘導体化された活性化ＰＥＧ（たとえばｍＰＥＧ）に与え、臨界ＬＣシステムから溶出した際の誘導体化された活性化ＰＥＧ（たとえばｍＰＥＧ）の検出を可能にするものであることが最も好ましい。また、活性化基Ａが十分な疎水的特徴を有し、ジ−活性化ＰＥＧからのモノ−活性化ＰＥＧ（たとえばｍＰＥＧ）の分解能が臨界ＬＣクロマトグラムにおいて十分に得られる場合にも、これに関わらず、臨界ＬＣシステムから溶出した際に検出されるための検出可能な特徴を十分に与える誘導体化剤を用いて活性化ｍＰＥＧおよびジ−活性化ＰＥＧを誘導体化することが望ましいことが理解されるべきである。
【００２８】
結論
結論として、本発明をその好ましい態様に関して上述したが、本発明はこれに限定されず、特許請求の範囲によって規定される発明の範囲内に含まれる全ての別法、変法および均等の方法を包含するものであることが容易に理解されよう。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ｍＰＥＧ、プロピオンアルデヒドジアセタール活性化ｍＰＥＧおよびプロピオンアルデヒドジアセタール活性化ジオールの分離を示すクロマトグラムの再現図である。
【図２】ｍＰＥＧアルコール、メシラート活性化ｍＰＥＧおよびメシラート活性化ジオールの分離を示すクロマトグラムの再現図である。
【図３】ｍＰＥＧアルコール、パラニトロフェニルカーボネート活性化ｍＰＥＧおよびパラニトロフェニルカーボネート活性化ジオールの分離を示すクロマトグラムの再現図である。
【図１】
2008532046.tif 000003
【図２】
2008532046.tif 000004
【図３】
2008532046.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】平成19年9月18日(2007.9.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
表面または生物学的に活性な材料と結合するための官能基である活性化基Ａで活性化されたポリエチレングリコールを含む組成物である試料を準備すること、そして、
液体クロマトグラフィーにより臨界条件においてまたはその付近で前記試料をクロマトグラフして、活性化度を種々有するポリエチレングリコールの前記試料中の相対量を測定することを含み、
前記ポリエチレングリコールが、重量平均分子量が少なくとも５０００グラム毎モルである線状の構造、または、分岐状、櫛状もしくは星状の構造であり、
前記活性化基Ａが疎水性であるか、または、親水性である場合には、前記試料をクロマトグラフする前に、前記活性化基と反応する疎水性の誘導体化基で誘導体化されている、
化学分析方法。
【請求項２】
前記試料が、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡ（式中、Ｒはアルキル基であり、Ａは疎水性の活性化官能基である）を含む、請求項１に記載の化学分析方法。
【請求項３】
前記試料が、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡおよびＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡ（式中、Ｒはアルキル基であり、Ａは活性化基である）を含み、クロマトグラフするステップの前に混合物のＡ基を誘導体化剤で誘導体化することによる、ＲＯ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＨ、ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤおよびＤＡＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡＤ（式中、ＡＤは疎水性の誘導体化された基である）を含む誘導体化混合物の形成を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
Ｒが本質的にメチル基からなる、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
Ａがアルデヒド基を含む、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記アルデヒドがプロピオンアルデヒドである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
Ａがプロピオンアルデヒドジアセタールである、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
Ａがメシラートである、請求項１または３に記載の方法。
【請求項９】
Ａがパラニトロフェニルカーボネートである、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
Ａがマレイミド基を含む、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
Ａがアミン基を含む、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
Ａがチオール基を含む、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
Ａがジスルフィド基を含む、請求項１−３のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
Ａがカルボニル基を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＯ（Ｃ2Ｈ4Ｏ）nＡの重量平均分子量が１０，０００グラム毎モルを超える、請求項２−１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記誘導体化剤が１−（ヒドラジノカルボニルメチル）ピリジニウムクロライドまたはジニトロフェニルヒドラジンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ａが親水性であり、前記誘導体化剤がチオナフタレンである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１８】
Ａが親水性であり、前記誘導体化剤が芳香族アルデヒドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
Ａが親水性であり、前記誘導体化剤がオルトジピリジニルジスルフィドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料が、化学式Ｍ［Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＢ］x（式中、
Ｍは、Ｏ（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＢ基と結合するための少なくともｘ個の場所を有する小分子またはポリマー主鎖であり、
ｎは、各々の出現において独立して１以上の整数であり、
Ｂは、各々の出現において独立して水素またはＡであり、
ｘは、３以上の整数である）
のポリエチレングリコール化合物を含み、
液体クロマトグラフィーにより臨界条件下で混合物の試料をクロマトグラフして、Ａ基による活性化度を種々有するポリエチレングリコールの相対量を測定する、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
前記試料がポリエチレングリコールを含み、前記活性化基Ａがポリマー鎖の側基である、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が、化学式：ＢＯ［（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）nＭ］m（ＯＣＨ2ＣＨ2）pＯＢ（式中、
Ｍは、２つのＰＥＧに付着する小分子であってＢを含む側基を有し、
Ｂは、各々の出現において独立してＨまたはＡであり、
ｍ，ｎおよびｐは、独立して１を超える整数であり、
Ａは、上記定義の通りである）
のポリマーを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記試料をクロマトグラフする前に、誘導体化剤によるＡ基の誘導体化をさらに含む、請求項２０−２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記クロマトグラフのステップにおける逆相カラムの使用を含む、請求項１−２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
前記クロマトグラフのステップを臨界条件において行う、請求項１−２４のいずれかに記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
最近では、たとえば、ｍＰＥＧのジオール不純物の混入という問題を最小限にしてＰＥＧの分子量およびリンカーの安定性を向上させる、いわゆる「第二世代」ＰＥＧ化試薬が開発されている。ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら，アドバンスド  ドラッグ  デリバリー  レビューズ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ）５４（２００２）第４５９−４７６頁を参照されたい。米国特許第６，４５５，６３９号明細書には、狭い分子量分布を有し分子量が増大したｍＰＥＧが記載されている。
【国際調査報告】
2008532046.tif 000006
2008532046.tif 000007
2008532046.tif 000008