(57)【要約】  改変したＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡに対する親和性を有し、当該のポリメラーゼは、各反応サイクルにおいて、１種又は複数のヌクレオチドを、複数の別々のＤＮＡ鋳型内に取り込む能力を有するようになっている。当該のポリメラーゼは、各反応サイクルにおいて、より多くの生産的なポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を形成することができる。改変したＤＮＡポリメラーゼを、多くのＤＮＡシークエンシングの用途に、特に、クラスターアレイに関連して、使用することができる。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＤＮＡに対する低下した親和性を有する変化させたポリメラーゼであって、対照ポリメラーゼと比較して、各反応サイクルにおいて１種又は複数のヌクレオチドを複数の別々のＤＮＡ鋳型内に取り込む能力を有するポリメラーゼ。
【請求項２】
ＤＮＡに対する低下した親和性を有する変化させたポリメラーゼであって、対照ポリメラーゼと比較して、各反応サイクルにおいて、より多くの生産的なポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を形成することができるポリメラーゼ。
【請求項３】
対照ポリメラーゼが、ポリメラーゼと同一のタイプである、請求項１又は２に記載のポリメラーゼ。
【請求項４】
対照ポリメラーゼが、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｅｕ４０８Ｔｙｒ及びＴｙｒ４０９Ａｌａ及びＰｒｏ４１０Ｖａｌと機能的に同等である置換変異を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項５】
対照ポリメラーゼが、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＣｙｓ２２３Ｓｅｒと機能的に同等である置換変異をさらに含む、請求項４に記載のポリメラーゼ。
【請求項６】
対照ポリメラーゼが、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４又は５に記載のポリメラーゼ。
【請求項７】
変化が、ポリメラーゼとＤＮＡとの相互作用を安定化する、ポリメラーゼ中の残基において、少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項８】
変化が、ポリメラーゼ中のＤＮＡと結合する残基において、少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項９】
変化が、ポリメラーゼのＤＮＡ結合ドメインに見出される残基において、少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項１０】
変化が、ポリメラーゼ中の塩基性アミノ酸残基において、少なくとも１つの変異を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項１１】
変化が、少なくとも１つの置換変異を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項１２】
２つの置換変異を含む、請求項１１に記載のポリメラーゼ。
【請求項１３】
ポリメラーゼが、ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項１４】
ＤＮＡポリメラーゼが、ファミリーＢタイプのＤＮＡポリメラーゼである、請求項１３に記載のポリメラーゼ。
【請求項１５】
ファミリーＢの古細菌ＤＮＡポリメラーゼのいずれか、ヒトＤＮＡポリメラーゼα、並びにＴ４、ＲＢ６９及びφ２９ファージのＤＮＡポリメラーゼから選択される、請求項１４に記載のポリメラーゼ。
【請求項１６】
Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、９°Ｎ及びＰｆｕのポリメラーゼから選択される、請求項１５に記載のファミリーＢの古細菌ＤＮＡポリメラーゼ。
【請求項１７】
ファミリーＢの古細菌ＤＮＡポリメラーゼが、９°Ｎポリメラーゼである、請求項１６に記載のポリメラーゼ。
【請求項１８】
ポリメラーゼのヌクレオチドに対する親和性及び／又はポリメラーゼの忠実度が、変化によって実質的に影響されない、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項１９】
１つ、２つ又は３つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換変異を、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７０５、Ａｒｇ７１３及び／又はＡｒｇ７４３と機能的に同等である１つ又は複数の位置において含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項２０】
１つ、２つ又は３つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換変異を、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７０５、Ａｒｇ７１３及び／又はＡｒｇ７４３と機能的に同等である１つ又は複数の位置において含む、変化させたポリメラーゼ。
【請求項２１】
少なくとも１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換変異を、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＡｒｇ７１３又はＡｒｇ７４３のいずれかと機能的に同等である位置において含む、請求項２０に記載のポリメラーゼ。
【請求項２２】
１つ又は２つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換変異を、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＡｒｇ６０６及び／又はＨｉｓ６７９と機能的に同等である１つ又は複数の位置において含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の変化させたポリメラーゼ。
【請求項２３】
１つ又は２つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換変異を、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＡｒｇ６０６及び／又はＨｉｓ６７９と機能的に同等である１つ又は複数の位置において含む、変化させたポリメラーゼ。
【請求項２４】
１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換変異を、ＲＢ６９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７９０、Ｌｙｓ８００、Ａｒｇ８０６、Ｌｙｓ８４４、Ｌｙｓ８７４及び／又はＬｙｓ８７８と機能的に同等である１つ又は複数の位置において含む、変化させたポリメラーゼ。
【請求項２５】
１つ又は複数の置換変異が、置換されるアミノ酸を非塩基性のアミノ酸に変換する、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のポリメラーゼ。
【請求項２６】
１つ又は複数の置換変異が、置換されるアミノ酸を、
（ｉ）酸性アミノ酸と；
（ｉｉ）芳香族アミノ酸、特に、チロシン（Ｙ）又はフェニルアラニン（Ｆ）と；
（ｉｉｉ）非極性アミノ酸、特に、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はメチオニン（Ｍ）と
から選択されるアミノ酸に変換する、請求項２５に記載のポリメラーゼ。
【請求項２７】
１つ又は複数の置換変異が、置換されるアミノ酸をアラニンに変換する、請求項２６に記載のポリメラーゼ。
【請求項２８】
９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７０５Ａｌａ及び／又はＡｒｇ７１３Ａｌａ及び／又はＡｒｇ７４３Ａｌａと機能的に同等である１つ又は複数の置換変異を含む、変化させたポリメラーゼ。
【請求項２９】
Ａｒｇ７１３Ａｌａと機能的に同等であるアミノ酸置換を含む、請求項２８に記載の変化させたポリメラーゼ。
【請求項３０】
Ａｒｇ７４３Ａｌａと機能的に同等であるアミノ酸置換を含む、請求項２８又は２９に記載の変化させたポリメラーゼ。
【請求項３１】
１つ又は複数のアミノ酸の置換変異を、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｅｕ４０８及び／又はＴｙｒ４０９及び／又はＰｒｏ４１０と機能的に同等である１つ又は複数の位置においてさらに含む、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の変化させたポリメラーゼ。
【請求項３２】
９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｅｕ４０８Ｔｙｒ及びＴｙｒ４０９Ａｌａ及びＰｒｏ４１０Ｖａｌと機能的に同等である置換変異を含む、請求項３１に記載の変化させたポリメラーゼ。
【請求項３３】
異なるアミノ酸への置換変異を、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＣｙｓ２２３と機能的に同等である位置においてさらに含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の変化させたポリメラーゼ。
【請求項３４】
ポリメラーゼが、９°Ｎポリメラーゼのアミノ酸配列中のＣｙｓ２２３Ｓｅｒと機能的に同等である置換変異を含む、請求項３３に記載の変化させたポリメラーゼ。
【請求項３５】
配列番号１、３、５又は２１のいずれか１つであるアミノ酸配列を含む、変化させた９°Ｎポリメラーゼ。
【請求項３６】
請求項１〜３５のいずれか一項で定義する変化させたポリメラーゼをコードする核酸分子。
【請求項３７】
変化させた９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼコードする、請求項３６に記載の核酸分子であって、配列番号２、４又は６のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項３８】
配列番号１９又は２０のヌクレオチド配列を含む核酸分子。
【請求項３９】
請求項３６〜３８に記載の核酸分子を含む発現ベクター。
【請求項４０】
請求項３９に記載のベクターを含有する宿主細胞。
【請求項４１】
ポリメラーゼの使用であって、前記ポリメラーゼがＤＮＡに対する低下した親和性を示すように変化させられており、その結果、前記ポリメラーゼが、標識ヌクレオチドをポリヌクレオチド内に取り込むための各反応サイクルにおいて標識ヌクレオチドを複数の別々のＤＮＡ鋳型内に取り込む能力を有し、前記標識は付加したヌクレオチドの性質を決定するために用いられる使用。
【請求項４２】
ヌクレオチドをポリヌクレオチド内に取り込むための、請求項１〜３５のいずれか一項に記載のポリメラーゼの使用。
【請求項４３】
取り込みがクラスターアレイ上で起きる、請求項４１又は４２に記載の使用。
【請求項４４】
標識ヌクレオチドをＤＮＡ内に取り込むための方法であって、以下の成分：
（ｉ）各反応サイクルにおいて標識ヌクレオチドを複数の別々のＤＮＡ鋳型内に取り込む能力を有するように、ＤＮＡに対する低下した親和性を示すように変化させられているポリメラーゼと
（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型と；
（ｉｉｉ）ヌクレオチド溶液と
が相互作用させることを含む方法。
【請求項４５】
ヌクレオチドをＤＮＡ内に取り込む方法であって、以下の成分：
（ｉ）請求項１〜３５のいずれか一項に記載のポリメラーゼと
（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型と；
（ｉｉｉ）ヌクレオチド溶液と
が相互作用させることを含む方法。
【請求項４６】
ＤＮＡ鋳型が、クラスターアレイを含む、請求項４４又は４５に記載の方法。
【請求項４７】
ヌクレオチド取り込み反応を行う場合に使用するキットであって、
請求項１〜３６のいずれか一項に記載のポリメラーゼと、ヌクレオチド溶液とを含むキット。
【請求項４８】
ヌクレオチド溶液が、標識化ヌクレオチドを含む、請求項４７に記載のキット。
【請求項４９】
ヌクレオチドが、合成ヌクレオチドを含む、請求項４７又は４８に記載のキット。
【請求項５０】
ヌクレオチドが、修飾ヌクレオチドを含む、請求項４７〜４９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項５１】
置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなるように、ヌクレオチドが３’糖ヒドロキシル基において修飾されている、請求項５０に記載のキット。
【請求項５２】
置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなるように、３’糖ヒドロキシル基において修飾されているヌクレオチドが、修飾されているヌクレオチド又はヌクレオシドの分子を含み、前記分子が、プリン又はピリミジン塩基と、リボース又はデオキシリボースの糖部分であって、当該糖部分に共有結合している取り除くことができる３’−ＯＨブロック基を有する糖部分とを含み、前記３’炭素原子が、
【化１】
2008539750.tif 000009
［ただし、Ｚは、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆのいずれかである］の構造の基に結合しており、
Ｒ’’が、取り除くことができる保護基であるか、その一部であり；
Ｒ’のそれぞれが、独立に、水素原子、アルキル、置換されているアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ若しくはアミド基、又は連結基を介して結合した検出可能な標識であるか；（Ｒ’）２が、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２（ただし、Ｒ’’’は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、水素及びハロゲンの原子並びにアルキル基を含む群から選択される）のアルキリデン基を示し；且つ
前記の分子を反応させて、Ｒ’’のそれぞれが、Ｈに交換されているか、Ｚが、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆである場合には、Ｆが、ＯＨ、ＳＨ又はＮＨ２、好ましくはＯＨに交換されているかである中間体を得ることができ、この中間体が、水性の状態下で解離して、遊離の３’ＯＨを有する分子を産出するが；
Ｚが、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’である場合には、両方のＲ’基が、水素ではない、
請求項５１に記載のキット。
【請求項５３】
修飾されているヌクレオチド又はヌクレオシドのＲ’が、アルキル又は置換されているアルキルである、請求項５２に記載のキット。
【請求項５４】
修飾されているヌクレオチド又はヌクレオシドの−Ｚが、−Ｃ（Ｒ１）２−Ｎ３の式である、請求項５３に記載のキット。
【請求項５５】
Ｚが、アジドメチル基である、請求項５４に記載のキット。
【請求項５６】
置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなるように、３’糖ヒドロキシル基において修飾されているヌクレオチドが、蛍光標識されており検出が可能である、請求項５１に記載のキット。
【請求項５７】
置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなるように、３’糖ヒドロキシル基において修飾されているヌクレオチドが、
【化２】
2008539750.tif 000010
［ただし、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＱ（Ｑは、Ｃ１−１０の置換されている又は置換されていないアルキル基である）を含む群から選択され、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮ（アリル）を含む群から選択され、Ｔは、水素又はＣ１−１０の置換されている若しくは置換されていないアルキル基であり、＊は、部分がどこでヌクレオチド又はヌクレオシドの残部と接続するかを示す］
を含む群から選択される部分を含有することを特徴とする切断可能なリンカーを介して検出可能な標識に結合した塩基を有するヌクレオチド又はヌクレオシドを含む、請求項５１に記載のキット。
【請求項５８】
検出可能な標識が、蛍光標識を含む、請求項５７に記載のキット。
【請求項５９】
１種若しくは複数のＤＮＡ鋳型分子及び／又はプライマーをさらに含む、請求項４７〜５８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項６０】
請求項１〜３５のいずれか一項に記載のポリメラーゼを作製する方法であって、
（ｉ）ポリメラーゼ中で変異誘発のための残基を選択するステップと；
（ｉｉ）（ｉ）で実施した選択に従って、変異ポリメラーゼを作製するステップと；
（ｉｉｉ）変異ポリメラーゼのＤＮＡに対する親和性を決定するステップと；
（ｉｖ）ＤＮＡに対する親和性が低下した場合、各反応サイクルにおいて、より多くの生産的なポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を形成する能力に関して、前記ポリメラーゼを試験するステップと
を含む方法。
【請求項６１】
付随する図を参照する以上に記載した変化させたポリメラーゼ。
【請求項６２】
付随する図を参照する以上に記載した使用。
【請求項６３】
付随する図を参照する以上に記載した、ヌクレオチドを取り込むための方法。
【請求項６４】
付随する図を参照する以上に記載したキット。
【請求項６５】
付随する図を参照する以上に記載した、ポリメラーゼを作製する方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、ポリメラーゼ酵素に関し、より具体的には、ＤＮＡに対する親和性を有する、改変したＤＮＡポリメラーゼに関し、当該のポリメラーゼは、各反応サイクルにおいて、１種又は複数のヌクレオチドを、複数の別々のＤＮＡ鋳型に取り込む能力を有し、且つ各反応サイクルにおいて、より多くの生産的なポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を形成することができるようになっている。また、本発明の範囲には、当該の改変したポリメラーゼを、ＤＮＡシークエンシングに、特に、クラスターアレイに関連して、使用する方法も含まれる。
【０００２】
［関連技術の説明］
あるＤＮＡポリメラーゼの３次元結晶構造は、３つの別々のサブドメインを明らかにし、これらは、掌（ｐａｌｍ）、指（ｆｉｎｇｅｒ）及び親指（ｔｈｕｍｂ）と名付けられており（Ｊｏｙｃｅ，Ｃ．Ｍ．及びＳｔｅｉｚ，Ｔ．Ａ．（１９９４）Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ｉｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，６３，７７７−８２２）、それぞれがＤＮＡの重合の際に重要な役割を有する。
【０００３】
ＤＮＡポリメラーゼのＣ末端の親指サブドメインは、ＤＮＡとの結合及び処理能力に関係があるとされている（Ｄｏｕｂｌｉｅら、１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，２５１；Ｔｒｕｎｉｇｅｒら、２００４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２，３７１）。ＤＮＡポリメラーゼのこの領域の残基が、プライマー：鋳型の二本鎖と相互作用する。
【０００４】
部位特異的変異の導入又は少数のアミノ酸の欠失による切り詰めのいずれかによって、この領域の構造を破壊させて、ＤＮＡ親和性及び処理能力が低下するが、ｄＮＴＰ親和性及びヌクレオチド挿入の忠実度等、その他の物性に関しては総じて変化がないバリアントが証明されている（Ｔｒｕｎｉｇｅｒら、２００４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２，３７１；Ｍｉｎｎｉｃｋら、１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１，２４９５４；Ｐｏｌｅｓｋｙら、１９９０．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１４５７９）。
【０００５】
ポリメラーゼを、ファミリーＡ及びファミリーＢと呼ばれる２種の構造的に異なるファミリーに分けることができる。
【０００６】
ファミリーＢのポリメラーゼのＣ末端のサブドメインは、十分には研究されていないが、主にポリメラーゼＲＢ６９の閉鎖型（ＤＮＡ結合）のＸ線結晶構造の観察に基づいて、ＤＮＡとの結合に関与すると考えられている。変異誘発試験が、この親指ドメイン内で、ファミリーＢの２つの例、すなわち、Ｐｈｉ２９及びＴ４について行われている。しかし、これらの研究は、ドメインの広い部分にわたるアミノ酸の欠失に限定されるものであった。同一のタイプの欠失を、Ｋｌｅｎｏｗ（ファミリーＡのポリメラーゼ）で起こしている。これらの研究におけるバリアントの性能を、それらがｄＮＴＰに結合し、それを取り込む能力の面から評価したところ、欠失の効果は、忠実度及びＤＮＡに対する親和性に及び、さらに、アクセサリータンパク質との相互作用にも及んだ。
【０００７】
好熱性古細菌からのポリメラーゼの親指ドメインの研究は、過去に行われていない。
【０００８】
［発明の概要］
本発明は、ポリメラーゼがＤＮＡ鋳型と密接に結合することは、必ずしも有利な特性であるとは限らないという認識に基づく。このことは、各反応サイクルで、単一のヌクレオチドの取り込みが１回のみ発生することが要求されるシークエンシング反応の場合に、特に当てはまる。したがって、ＤＮＡと密接に結合するポリメラーゼの場合、ＤＮＡに対する親和性が低いバリアントポリメラーゼと比較して、複数のＤＮＡ鎖上でヌクレオチドの取り込みに関与するポリメラーゼの能力が制限される。
【０００９】
本発明者らは、３’糖ヒドロキシル基における修飾を有するヌクレオチド類似体を使用する、ＤＮＡをシークエンシングするための方法を考案するに至った。当該の修飾は、さらなるヌクレオチドの取り込みをブロックする（中に例及び引用が記載されている国際公開第０３／０４８３８７号パンフレットを参照）。３’ブロックを有するヌクレオチドの使用によって、ポリヌクレオチド鎖内へのヌクレオチドの連続的な取り込みを制御することが可能になる。ヌクレオチドが付加される毎に、３’ブロックが存在すると、鎖内へのさらなるヌクレオチドの取り込みが阻止される。取り込まれたヌクレオチドの性質が決定されると、当該のブロックを取り除き、次のヌクレオチドの付加のために、遊離の３’ヒドロキシル基を残しておくことができる。
【００１０】
その上、（上記で議論し、本明細書中の以下でより詳細に議論するような）修飾されたヌクレオチドが関与するシークエンシング反応等の反応の場合には、ポリメラーゼの密接な結合は、実は、反応の完了の面から、特定の不利益をもたらすことがある。例えば、密接なＤＮＡ結合親和性を有する不活性なポリメラーゼ分子が、鋳型ＤＮＡ分子と安定な複合体を形成する場合、その特定の鋳型ＤＮＡ分子からの伸長は不可能となる。
【００１１】
このような認識の下、本発明は、鋳型ＤＮＡとより弱く相互作用する、変化させたポリメラーゼを提供する。したがって、本発明のポリメラーゼは、１反応サイクルの間に、ある鋳型ＤＮＡ分子から別の鋳型ＤＮＡ分子へ移動する能力が改良されている。より多くの生産的なポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を形成するこの能力は、各反応サイクルで単一のヌクレオチドの付加が関与する反応のレベル又は反応の完了を大幅に改良することができるという利点を有する。
【００１２】
未改変のポリメラーゼは、高い親和性でＤＮＡと結合する傾向にあり、したがって、式：
【数１】
2008539750.tif 000002
は、［Ｐｏｌ：ＤＮＡ］複合体を好む方へ大きくシフトしている。
【００１３】
対照的に、本発明では、変化させたポリメラーゼは、ＤＮＡとの結合がそれより弱いので、平衡の位置が、左辺側にシフトしている。
【００１４】
したがって、本発明は、ＤＮＡに対する親和性が低下した、改変したポリメラーゼを提供し、当該のポリメラーゼは、各反応サイクルにおいて、１種又は複数のヌクレオチドを、複数の別々のＤＮＡ鋳型内に取り込む能力を有するようになっている。
【００１５】
「ＤＮＡ鋳型」とは、これにポリメラーゼが結合し、核酸合成のための鋳型として用いることができる、あらゆるＤＮＡ分子を意味する。
【００１６】
本明細書では、「ヌクレオチド」は、ヌクレオチド及びヌクレオシドの両方を含むと定義される。ヌクレオシドは、ヌクレオチドについてと同様、プリン塩基又はピリミジン塩基が、グリコシド結合によってリボース又はデオキシリボースと結合しているが、ヌクレオシドは、リン酸基を欠いている。ヌクレオシドにリン酸基が結合すると、ヌクレオチドとなる。合成及び天然のヌクレオチドが、本定義の内に含まれる。標識化ヌクレオチドも、本定義の内に含まれる。本ポリメラーゼの有利な特性は、ＤＮＡ鋳型に対する親和性が低下している一方で、本ポリメラーゼが取り込むヌクレオチオドに対する親和性及び忠実度を維持している点である。
【００１７】
好ましい一態様では、ＤＮＡに対する親和性が低下した、変化させたポリメラーゼを提供し、当該のポリメラーゼは、各反応サイクルにおいて、少なくとも１種の合成ヌクレオチドを、複数のＤＮＡ鋳型内に取り込む能力を有するようになっている。本発明の前は、ポリメラーゼを改変して、有利な特性を維持する一方で、自然でないヌクレオチドを取り込み、ＤＮＡ親和性が低下するようになすという問題は、認識されておらず、誰もそれに取り組んでいなかった。
【００１８】
一実施形態では、ヌクレオチドは、周知のサンガーのシークエンシング反応で使用されるようなジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を含む。これらのヌクレオチドを、例えば、質量標識、放射標識又は蛍光標識のうちのいずれかを用いて標識化することができる。
【００１９】
別の実施形態では、ヌクレオチドは、３’糖ヒドロキシル基において修飾されているヌクレオチドを含み、対照ポリメラーゼと比較して、置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなっている。
【００２０】
好ましい実施形態では、ヌクレオチドは、プリン又はピリミジン塩基と、リボース又はデオキシリボースの糖部分であって、当該糖部分に共有結合している取り除くことができる３’−ＯＨブロック基を有する糖部分とを含み、前記３’炭素原子が、
【化１】
2008539750.tif 000003
［ただし、Ｚは、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｏ−Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｒ’’）２、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｎ（Ｈ）Ｒ’’、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’及び−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆのいずれかである］の構造の基に結合しており、
Ｒ’’が、取り除くことができる保護基であるか、その一部であり；
Ｒ’のそれぞれが、独立に、水素原子、アルキル、置換されているアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アシル、シアノ、アルコキシ、アリールオキシ、ヘテロアリールオキシ若しくはアミド基、又は連結基を介して結合した検出可能な標識であるか；（Ｒ’）２が、式＝Ｃ（Ｒ’’’）２（ただし、Ｒ’’’は、同一であってもよいし、異なっていてもよく、水素及びハロゲンの原子並びにアルキル基を含む群から選択される）のアルキリデン基を示し；且つ
前記の分子を反応させて、Ｒ’’のそれぞれが、Ｈに交換されているか、Ｚが、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｆである場合には、Ｆが、ＯＨ、ＳＨ又はＮＨ２、好ましくはＯＨに交換されているかである中間体を得ることができ、この中間体が、水性の状態下で解離して、遊離の３’ＯＨを有する分子を産出するが；
Ｚが、−Ｃ（Ｒ’）２−Ｓ−Ｒ’’である場合には、両方のＲ’基は、水素ではない。
【００２１】
一実施形態によると、本発明のポリメラーゼが取り込むヌクレオシド又はヌクレオチドは、プリン塩基又はピリミジン塩基と、リボース又はデオキシリボースの糖部分であって、それに共有結合したブロック基を、好ましくは、３’Ｏ位で有する糖部分とを含み、当該のブロック基は、追加のヌクレオチドの取り込みを阻止するために３’−ＯＨ基のブロックが要求される手法、例えば、シークエンシング反応、ポリヌクレオチド合成、核酸の増幅、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、一塩基多型研究及びその他のそのような手法等において、当該の分子を有用にする。
【００２２】
いったんブロック基が取り外されると、別のヌクレオチドを遊離の３’−ＯＨ基へ取り込むことが可能となる。
【００２３】
好ましい修飾されたヌクレオチドは、Ｓｏｌｅｘａ  Ｌｉｍｉｔｅｄの名の下で、国際公開第２００４／０１８４９７号パンフレットに例示されており、この参照文献は、本明細書にその全体が組み入れられている。
【００２４】
好ましい実施形態では、修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシドのＲ’基は、アルキル又は置換されているアルキルである。別の実施形態では、修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシドの−Ｚ基は、−Ｃ（Ｒ１）２−Ｎ３の式で表される。最も好ましい実施形態では、修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシドは、アジドメチル基であるＺ基を含む。
【００２５】
本発明の好ましいポリメラーゼは、以下で詳細に議論するように、Ｚがアジドメチル基であるヌクレオチド類似体の取り込みに関して、特に好ましい。
【００２６】
修飾されたヌクレオチドを、所望のリンカーによって、塩基を介して検出可能な標識に連結することができ、そのような標識は、例えば、フルオロフォアであることができる。検出可能な標識は、所望であれば、その代わりに、式「Ｚ」のブロック基内に組み入れることができる。リンカーは、酸反応性であってもよく、感光性であってもよく、又はジスルフィド結合を含有してもよい。その他の結合、特に、その内容の全体が本明細書に組み入れられている国際公開第２００４／０１８４９７号パンフレットにより詳細に記載されているように、ホスフィン切断可能アジド含有リンカーを本発明に利用することができる。
【００２７】
好ましい標識及び結合には、国際公開第０３／０４８３８７号パンフレットに開示されているものが含まれる。この参照文献は、本明細書にその全体が組み入れられている。
【００２８】
一実施形態では、修飾されたヌクレオチド又はヌクレオシドは、切断可能なリンカーを介して検出可能な標識に結合した塩基を有し、当該の切断可能なリンカーは、
【化２】
2008539750.tif 000004
［ただし、Ｘは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮＱ（Ｑは、Ｃ１−１０の置換されている又は置換されていないアルキル基である）を含む群から選択され、Ｙは、Ｏ、Ｓ、ＮＨ及びＮ（アリル）を含む群から選択され、Ｔは、水素又はＣ１−１０の置換されている若しくは置換されていないアルキル基であり、＊は、当該の部分がどこでヌクレオチド又はヌクレオシドの残部と接続するかを示す］
を含む群から選択される部分を含有することを特徴とする。
【００２９】
一実施形態では、検出可能な標識は、蛍光標識を含む。適切なフルオロフォアは、当技術分野では周知である。好ましい実施形態では、異なるヌクレオチドのタイプのそれぞれが、異なる蛍光標識を保有する。これは、特定のヌクレオチドの同定及び取り込みを容易にする。したがって、例えば、修飾されたアデニン、グアニン、シトシン及びチミンはいずれも、異なるフルオロフォアに結合して、容易にそれらを相互に識別することを可能にするであろう。驚くべきことに、変化させたポリメラーゼは、いくつもの異なる蛍光標識を保有する修飾されたヌクレオチド誘導体を取り込むことができることが見出されている。さらに、本ポリメラーゼは、４種の塩基のいずれをも取り込むことができる。これらの特性は、核酸シークエンシングのプロトコールにおいて、本発明のポリメラーゼの使用に関して、実質的な利点をもたらす。
【００３０】
上記で述べたように、好ましいヌクレオチド誘導体には、３’位においてＯ−アジドメチル官能基を含有するものが含まれる。その他のヌクレオチド誘導体に対しては、ＤＮＡ結合に顕著に関与するＣ末端の親指サブドメイン領域におけるポリメラーゼの好ましいアミノ酸配列は、最適な取り込みのために、変化させることができることが理解されよう。いかなる所与のヌクレオチド誘導体に対しても、Ｃ末端の親指サブドメイン領域（以下でより詳細に議論するように、ＲＢ６９中の残基Ｌｙｓ７９０、８００、８４４、８７４，８７８及びＡｒｇ８０６、並びに９°Ｎポリメラーゼ中の残基Ａｒｇ７４３、Ａｒｇ７１３及びＬｙｓ７０５等）における最適配列の優先度を、実験によって、例えば、ライブラリー又は別々の数の変異体を構築し、次いで、取り込みアッセイ系中で個々のバリアントを試験することによって決定することができる。
【００３１】
上記で述べたように、本発明の変化させたポリメラーゼは、異なる大きさ及び異なる化学的性質の大きな３’置換基を有する広い範囲の修飾されたヌクレオチドを含む、全てのヌクレオチドの改良された取り込みを可能にする。本ポリメラーゼの有利な特性は、それらが取り込むヌクレオチドに対する親和性及び忠実度に不利に作用することなく、ポリメラーゼのＤＮＡからの解離の増加をもたらす、ＤＮＡ鋳型に対する親和性の低下によるものである。
【００３２】
本発明のポリメラーゼの低下したＤＮＡ結合親和性のおかげで、単一の反応サイクル中に、１種又は複数のヌクレオチドを、いくつかの異なるＤＮＡ分子内への取り込むことができる。したがって、反応の全体的な効率が改良され、より高いレベルの完了をもたらす。
【００３３】
「反応サイクル」とは、鋳型中へのヌクレオチドの取り込みを可能にする適切な反応期間を意味する。単一の反応サイクルの例示的な条件として、３０分、４５℃のインキュベーション期間があげられる。
【００３４】
多くの重合反応が、ポリメラーゼと比較して過剰量のＤＮＡの存在下で起こる。本発明のポリメラーゼは、別々の鋳型のＤＮＡ分子上で、１種又は複数のヌクレオチドの多数回の取り込みを触媒することができることから、本ポリメラーゼは、そのような重合反応が、より効果的に進行することを可能にする。他方、未変化のポリメラーゼ、特に、ＤＮＡにさらにより密接に結合するポリメラーゼは、各反応サイクルで単一の鋳型上におけるヌクレオチドの取り込みにのみ関与する可能性が大きいことから、この能力を有さないであろう。本発明によるポリメラーゼは、ＤＮＡの濃度と比較してポリメラーゼの濃度が制限的である条件下で、高いレベルの反応の完了を可能にする。具体的には、本ポリメラーゼは、ＤＮＡ：ポリメラーゼの比が少なくとも約２：１、３：１又は５：１である条件下で、１種又は複数のヌクレオチドを別々のＤＮＡ分子内に取り込む、改良された能力を示す。しかし、ポリメラーゼの高い濃度では、本改良は、覆い隠されてしまう場合がある。
【００３５】
したがって、所与の親和性を有する、変化させたポリメラーゼを提供し、当該のポリメラーゼは、各反応サイクルにおいて、より多くの生産的なポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を形成することができるようになっている。
【００３６】
本発明のポリメラーゼの改良された特性を、適切な対照と比較することができる。「対照ポリメラーゼ」は、本明細書では、変化させたポリメラーゼの活性を比較する対象となるポリメラーゼと定義される。対照ポリメラーゼは、変化させたポリメラーゼと同一のタイプであるが、ポリメラーゼのＤＮＡに対する親和性を低下させる変化を保有しない。したがって、最も好ましい実施形態では、対照ポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼであり、改変したポリメラーゼは、９°ＮポリメラーゼのＤＮＡに対する親和性を低下させる１つ又は複数の改変が存在する以外は、同一の９°Ｎポリメラーゼである。
【００３７】
一実施形態では、対照ポリメラーゼは、野生型のポリメラーゼであり、これを変化させて、変化させたポリメラーゼを提供し、この変化させたポリメラーゼを、未変化のポリメラーゼと直接比較することができる。
【００３８】
一実施形態では、対照ポリメラーゼは、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｅｕ４０８及びＴｙｒ４０９及びＰｒｏ４１０と機能的に同等である位置において、置換変異を含む。したがって、この実施形態では、対照ポリメラーゼは、４０８位においてロイシンから異なるアミノ酸、４０９位においてチロシンから異なるアミノ酸、及び４１０位においてプロリンから異なるアミノ酸への置換変異を有するか、又はポリメラーゼが９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼではない場合には機能的に同等である位置において置換変異を有する。好ましい実施形態では、対照ポリメラーゼは、当該の置換変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００３９】
別の実施形態では、対照ポリメラーゼは、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｅｕ４０８Ｔｙｒ及びＴｙｒ４０９Ａｌａ及びＰｒｏ４１０Ｖａｌと機能的に同等である置換変異を含む。したがって、この実施形態では、対照ポリメラーゼは、４０８位においてロイシンからチロシン、４０９位においてチロシンからアラニン、及び４１０位においてプロリンから異なるバリンへの置換変異を有するか、又はポリメラーゼが９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼではない場合には機能的に同等である位置において置換変異を有する。好ましい実施形態では、対照ポリメラーゼは、当該の置換変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００４０】
対照ポリメラーゼは、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＣｙｓ２２３と機能的に同等である位置において、置換変異をさらに含むことができる。したがって、この実施形態では、対照ポリメラーゼは、２２３位においてシステインから異なるアミノ酸への置換変異を有するか、又はポリメラーゼが９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼではない場合には機能的に同等である位置において置換変異を有する。好ましい実施形態では、対照ポリメラーゼは、当該の置換変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。別の実施形態では、対照ポリメラーゼは、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＣｙｓ２２３Ｓｅｒと機能的に同等である置換変異を含む。したがって、この実施形態では、対照ポリメラーゼは、２２３位においてシステインからセリンの置換変異を有するか、又はポリメラーゼが９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼではない場合には機能的に同等である位置において置換変異を有する。好ましい実施形態では、対照ポリメラーゼは、当該の置換変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００４１】
好ましくは、対照ポリメラーゼは、上記で述べた変異の組合せを含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００４２】
本ポリメラーゼは、通常、ＤＮＡに対する親和性が低下している。これは、解離定数の面から定義することができる。したがって、野生型ポリメラーゼは、ナノ−ピコモルの範囲の解離定数を有する傾向がある。本発明の目的のためには、未変化の対照ポリメラーゼと比較してＤＮＡに対する親和性が低下しているポリメラーゼが適する。好ましくは、変化させた結果、未変化の対照ポリメラーゼと比較して、解離定数が、少なくとも、又はおよそ、２倍、３倍、４倍又は５倍等に増加している。
【００４３】
「機能的に同等」とは、別のポリメラーゼのアミノ酸の位置において起きるアミノ酸置換であって、酵素において同一の機能的役割を有するとみなされる置換を意味する。例えば、Ｖｅｎｔ  ＤＮＡポリメラーゼ中の４１２位におけるチロシンからバリンへの変異（Ｙ４１２Ｖ）は、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ中の４０９位におけるチロシンからバリンへの置換（Ｙ４０９Ｖ）と機能的に同等であろう。このアミノ酸残基のかさ高い部分が、「立体ゲート（ｓｔｅｒｉｃ  ｇａｔｅ）」として作用して、ヌクレオチドの糖の２’−ヒドロキシルが結合部位に接近するのをブロックすると考えられている。また、Ｖｅｎｔポリメラーゼ中の残基４８８は、９°Ｎ  ポリメラーゼ中のアミノ酸４８５と同等であるとみなされており、したがって、Ｖｅｎｔ中の４８８位におけるアラニンからロイシンへの変異（Ａ４８８Ｌ）は、９°Ｎ  ポリメラーゼ中のＡ４８５Ｌ変異と同等であるとみなされる。
【００４４】
一般に、２種以上の異なるポリメラーゼにおける機能的に同等な置換変異は、それらのポリメラーゼのアミノ酸配列中の相同なアミノ酸位置において起きる。したがって、本明細書における「機能的に同等」という用語の使用は、変異したアミノ酸の特定の機能が知られているか否かにかかわらず、所与の変異と「位置的に同等」又は「相同」である変異も包含する。２種以上の異なるポリメラーゼのアミノ酸配列中の位置的に同等又は相同であるアミノ酸残基を、配列アライメント及び／又は分子モデル化に基づいて同定することが可能である。
【００４５】
変化させたポリメラーゼは、通常、「単離した」又は「精製した」ポリペプチドである。「単離したポリペプチド」とは、炭水化物、脂質、核酸又は本来ポリペプチドに関連させることができるその他のタンパク質性の不純物等、細胞性の汚染成分を実質的に含まないポリペプチドを意味する。典型的には、単離したポリメラーゼの調製物は、ポリメラーゼを、高度に精製した形態、すなわち、少なくとも約８０％の純度、好ましくは、少なくとも約９０％の純度、より好ましくは、少なくとも約９５％の純度、それより好ましくは、少なくとも約９８％、最も好ましくは、少なくとも約９９％の純度で含有する。酵素調製物の純度を、例えば、標準的なＳＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動ゲル上の単一のバンドの出現によって評価することができる。
【００４６】
変化させたポリメラーゼは、「組換え」のポリペプチドであることができる。
【００４７】
本発明による変化させたポリメラーゼは、いずれのＤＮＡポリメラーゼであってもよい。より具体的には、変化させたポリメラーゼは、ファミリーＢタイプのＤＮＡポリメラーゼ、或いはその変異体又はバリアントであることができる。ファミリーＢのＤＮＡポリメラーゼとして、多数の古細菌のＤＮＡポリメラーゼ、ヒトのＤＮＡポリメラーゼα、並びにＴ４、ＲＢ６９及びφ２９ファージのＤＮＡポリメラーゼがあげられる。これらのポリメラーゼは、Ｔａｑ及びＴ７のＤＮＡポリメラーゼ等のポリメラーゼを含むファミリーＡのポリメラーゼほどには十分に研究されていない。一実施形態では、ポリメラーゼは、ファミリーＢの古細菌のＤＮＡポリメラーゼ、ヒトのＤＮＡポリメラーゼα、並びにＴ４、ＲＢ６９及びφ２９ファージのＤＮＡポリメラーゼから選択される。
【００４８】
古細菌のＤＮＡポリメラーゼは、多くの場合、超好熱性古細菌に由来し、このことは、ポリメラーゼがしばしば熱安定性であることを意味する。したがって、より好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、好熱性古細菌のポリメラーゼであり、好ましくは、Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ  Ｖｅｎｔ、９°Ｎ及びＰｆｕポリメラーゼから選択される。Ｖｅｎｔ及びＤｅｅｐ  Ｖｅｎｔはそれぞれ、超好熱性古細菌サーモコッカス・リトラリス（Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｌｉｔｏｒａｌｉｓ）及びピロコッカス・フリオサス（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆｕｒｉｏｓｕｓ）から単離されたファミリーＢのポリメラーゼに使用される商品名である。また、９°Ｎポリメラーゼも、サーモコッカス種から同定された。Ｐｆｕポリメラーゼは、ピロコッカス・フリオサスから単離された。上記で述べたように、本発明までは、好熱性のポリメラーゼの親指ドメインは、研究されていなかった。本発明の最も好ましいポリメラーゼは、９°Ｎポリメラーゼであり、その変異体及びバリアントも含まれる。９°Ｎポリメラーゼは、アクセサリータンパク質を要求しない。このことは、親指ドメインの欠失が、ポリメラーゼのその他の特性を変化させない一方で、アクセサリータンパク質との相互作用に不利に影響することが示された、以前に研究されたポリメラーゼと対照をなすことができる。対照的に、以下の実験の項で示すように、９°Ｎの多数の残基の欠失は、９°Ｎの重要な特性に対して顕著に不利に作用し、触媒活性が顕著に損なわれるようになる。
【００４９】
本発明をファミリーＢのポリメラーゼの変異体及びバリアントに限定する意図がないことを理解されたい。また、変化させたポリメラーゼは、ファミリーＡのポリメラーゼ、或いはその変異体又はバリアント、例えば、変異体又はバリアントのＴａｑ又はＴ７のＤＮＡポリメラーゼ酵素であってもよく、或いはファミリーＡ又はファミリーＢのいずれにも属さないポリメラーゼ、例えば、逆転写酵素等であってもよい。しかし、本明細書に記載する理由によって、ファミリーＢのポリメラーゼが特に好ましい。
【００５０】
本発明によって、いくつかの異なるタイプの変化が意図されており、ＤＮＡに対する親和性が低下する結果として、所望の特性を示すポリメラーゼを得る。付加変異及び欠失変異も有用なポリメラーゼを生じることができるが、特に好ましいのは、ポリメラーゼの一次アミノ酸配列中の置換変異である。例えば、部位特異的変異誘発等、適切な変化の手法が、当技術分野では周知である。
【００５１】
したがって、「変化させたポリメラーゼ」とは、対照ポリメラーゼ酵素と比較して、少なくとも１つのアミノ酸の変化を有するポリメラーゼを意味する。通常、この変化は、少なくとも１つのアミノ酸の別のアミノ酸への置換を含む。好ましい実施形態では、これらの変化は、非保存的な変化であるが、本発明は、タンパク質の全体的な電荷の分布を維持する保存的な変化も想定している。さらに、得られるポリメラーゼは、対照ポリメラーゼと比較して、ＤＮＡ親和性が低下し、各反応サイクルにおいて、１種又は複数のヌクレオチドを、複数の別々のＤＮＡ鋳型内に取り込む能力を有するならば、ポリメラーゼ配列の改変が、１つ又は複数のアミノ酸のタンパク質からの欠失又はタンパク質への付加であることができることも、本発明の意図の範囲内である。
【００５２】
一実施形態では、本発明のポリメラーゼを形成する変化は、ポリメラーゼ中の残基における少なくとも１つの変異、好ましくは、少なくとも１つの置換変異を含み、その変異はポリメラーゼとＤＮＡとの相互作用を不安定化する。したがって、得られるポリメラーゼは、安定性のより低い様式でＤＮＡと相互作用する。上記で述べたように、ポリメラーゼのＤＮＡに対する親和性の低下は、各反応サイクルにおける１種又は複数のヌクレオチドのいくつかの異なるＤＮＡ分子内への取り込みを可能にする。したがって、反応の全体的な効率が改良され、より高いレベルの反応の完了をもたらす。
【００５３】
別の実施形態では、変化は、少なくとも１つの変異、好ましくは、少なくとも１つの置換変異を、ＤＮＡと結合するポリメラーゼ中の残基において含む。変異を起こす適切な標的残基を、適切なポリメラーゼについての入手可能な、特に、閉鎖状態（ＤＮＡに結合している）で結晶化した結晶構造によって選択することができる。ＤＮＡとの結合の接点を減らすことによって、ＤＮＡ結合親和性の全体的な低下を達成することができる。したがって、得られるポリメラーゼは、ＤＮＡへの密接な結合が不利になるヌクレオチド取り込み反応の場合に、改良された特徴を示す。
【００５４】
同様に、ポリメラーゼは、少なくとも１つの変異、好ましくは、少なくとも１つの置換変異を、ポリメラーゼのＤＮＡ結合ドメインに存在する残基において含む変化を保有することもできる。ここでも、そのような変異は、変化させたポリメラーゼのＤＮＡ結合親和性を低下させることが予想され、したがって、反応中に、ポリメラーゼは、より容易に別の鋳型のＤＮＡ分子と結合したり、それから解離したりできる。
【００５５】
一実施形態では、ポリメラーゼは、少なくとも１つの変異、好ましくは、少なくとも１つの置換変異を、ポリメラーゼ中の塩基性アミノ酸残基において含む変化を含む。当技術分野では周知であるように、ポリメラーゼ中の正に荷電しているアミノ酸残基の多くは、全体的に負に荷電しているＤＮＡの二重らせん、特に、ＤＮＡ中のヌクレオチドの特異的なリン酸基と相互作用する。
【００５６】
上記で述べたように、本発明によってポリメラーゼに得られる好ましいタイプの変化は、少なくとも１つの置換変異を含む。以下の実験の項で示すように、ポリメラーゼのアミノ酸配列からの残基の欠失は、低下したＤＮＡに対する親和性を有する一方で、触媒活性が損なわれることから、全体的に有利な特性は有しないポリメラーゼをもたらす場合がある。特に好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、２つの置換変異を含むが、得られるポリメラーゼが所望の特性を有するならば、４つ、５つ、６つ又は７つ等の変異を含有することができる。
【００５７】
好ましくは、ヌクレオチドに対するポリメラーゼの親和性は、当該の変化によって実質的に影響されない。実験の項（特に、実施例６）で示すように、ポリメラーゼを変異させ、例えば、ｄＮＴＰ又はｄｄＮＴＰ、或いはそれらの修飾型であることができるヌクレオチド（上記のヌクレオチドの定義を参照）に対するポリメラーゼの親和性に不利に影響しない一方で、ＤＮＡに対する親和性が低下するようになすことができる。この文脈での「実質的に影響されない」とは、ヌクレオチドに対する親和性が、未変化のポリメラーゼの場合と同一の次数に留まることを意味する。好ましくは、ヌクレオチドに対する親和性が、変化によって影響されない。
【００５８】
好ましくは、ポリメラーゼの忠実度は、当該の変化によって実質的に影響されない。実験の項（特に、実施例６）で示すように、ポリメラーゼを変異させ、ポリメラーゼの忠実度が変化によって実質的に影響されない一方で、ＤＮＡに対する親和性が低下するようになすことができる。この文脈での「実質的に影響されない」とは、各ヌクレオチドについての誤取り込みの頻度が、未変化のポリメラーゼの場合と同一の次数に留まることを意味する。好ましくは、ポリメラーゼの忠実度が、変化によって影響されない。
【００５９】
特異的で且つ好ましい構造変異体の面から、これらは、最も好ましいポリメラーゼ、すなわち、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼに基づくことができる。以下の実施例１で議論するように、９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼの開放型（ＰＤＢ＝１ｇｈｔ）、密接に関連するＤＮＡポリメラーゼＲＢ６９の開放構造（ＰＤＢ＝１ｉｈ７）及びＲＢ６９の閉鎖型（ＰＤＢ＝１ｉｇ９）の結晶構造の、エネルギーを最少にする重複アライメント（Ｃｒｅｓｓｅｔに委託）を、ＤＮＡ結合に関与する重要な残基の同定のための構造モデルとして使用した。したがって、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７０５、Ａｒｇ７１３及び／又はＡｒｇ７４３と機能的に同等である１つ又は複数の位置において、１つ、２つ又は３つのアミノ酸を別のアミノ酸に置換する変異を含む又は組み入れた、変化させたポリメラーゼを提供する。好ましくは、ポリメラーゼは、これらの変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。１つ、２つ又は３つの変異の順列及び組合せの全てが、本発明の範囲内で意図されている。
【００６０】
また、変異は、ＤＮＡと複合体を形成したＲＢ６９ポリメラーゼの既知の結晶構造との「開放」９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ構造（すなわち、ＤＮＡに結合していない）のアライメントに基づいて、その他の特異的な残基において起こすこともできる。したがって、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＡｒｇ６０６及び／又はＨｉｓ６７９と機能的に同等である１つ又は複数の位置において、１つ又は２つのアミノ酸を別のアミノ酸に置換する変異を含む又は組み入れた、変化させたポリメラーゼを提供する。好ましくは、ポリメラーゼは、これらの変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。異なる変異の順列及び組合せの全てが、本発明の範囲内で意図されている。したがって、これらの変異を、上記で議論したその他の変異と組み合わせて起こすことができる。
【００６１】
好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＡｒｇ７１３又はＡｒｇ７４３のいずれかと機能的に同等である位置において、少なくとも１つのアミノ酸を別のアミノ酸に置換する変異を含む。以下の実験の項でより詳細に議論するように、これらの２つの位置は、変異にとって特に好ましい部位の代表である。両方の残基を、同一のポリメラーゼ中で、異なるアミノ酸に変異させることができる。
【００６２】
異なるアミノ酸の性質の面から、好ましくは、１つ又は複数の置換変異は、置換されるアミノ酸を、非塩基性のアミノ酸（すなわち、リジン及びアルギニンではない）に変換する。いずれの非塩基性のアミノ酸をも選択することができる。
【００６３】
好ましい１つ又は複数の置換変異は、置換されるアミノ酸を、
（ｉ）酸性アミノ酸、
（ｉｉ）芳香族アミノ酸、特に、チロシン（Ｙ）又はフェニルアラニン（Ｆ）；及び
（ｉｉｉ）非極性アミノ酸、特に、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はメチオニン（Ｍ）
から選択されるアミノ酸に変換する。
【００６４】
一実施形態では、１つ又は複数の置換変異は、置換されるアミノ酸を、アラニンに変換する。
【００６５】
より特異的な実施形態では、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７０５Ａｌａ及び／又はＡｒｇ７１３Ａｌａ及び／又はＡｒｇ７４３Ａｌａと機能的に同等である、１つ又は複数の置換変異を含む、変化させたポリメラーゼを提供する。したがって、この実施形態では、ポリメラーゼは、７０５位においてリジンからアラニン、及び／又は７１３位においてアルギニンからアラニン、及び／又は７４３位において、アルギニンからアラニンへの置換変異を有するか、或いはポリメラーゼが９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼではない場合には機能的に同等である位置において変異置換を有する。好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、当該の置換変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００６６】
一実施形態では、変化させたポリメラーゼは、Ａｒｇ７１３Ａｌａと機能的に同等であるアミノ酸の置換を含み、別の実施形態では、変化させたポリメラーゼは、Ａｒｇ７４３Ａｌａと機能的に同等であるアミノ酸の置換を含む。好ましくは、変化させたポリメラーゼは、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００６７】
また、特異的な構造的な変異は、「開放」構造及び「閉鎖」構造が知られているＲＢ６９ポリメラーゼ等、その他のタイプのポリメラーゼに基づくこともできる。したがって、ＲＢ６９ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｙｓ７９０、Ｌｙｓ８００、Ａｒｇ８０６、Ｌｙｓ８４４、Ｌｙｓ８７４及び／又はＬｙｓ８７８と機能的に同等である１つ又は複数の位置において、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つのアミノ酸を別のアミノ酸に置換する変異を含む又組み入れた、変化させたポリメラーゼを提供する。好ましくは、これらの類似の又は機能的に同等な変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又は６つの変異の順列及び組合せの全てが、本発明の範囲内で意図されている。
【００６８】
異なるアミノ酸の性質の面から、好ましくは、１つ又は複数の置換変異は、置換されるアミノ酸を、非塩基性のアミノ酸（すなわち、リジン及びアルギニンではない）に変換する。いずれの非塩基性のアミノ酸をも選択することができる。
【００６９】
好ましい１つ又は複数の置換変異は、置換されるアミノ酸を、
（ｉ）酸性アミノ酸、
（ｉｉ）芳香族アミノ酸、特に、チロシン（Ｙ）又はフェニルアラニン（Ｆ）；及び
（ｉｉｉ）非極性アミノ酸、特に、アラニン（Ａ）、グリシン（Ｇ）又はメチオニン（Ｍ）
から選択されるアミノ酸に変換する。
【００７０】
一実施形態では、１つ又は複数の置換変異は、置換されるアミノ酸を、アラニンに変換する。
【００７１】
本発明を上記で述べた様式で変化させているポリメラーゼのみに限定する意図がないことに留意されたい。本発明のポリメラーゼは、例えば、国際公開第２００５／０２４０１０号パンフレットに詳細に開示されている好ましい変異ポリメラーゼ等、いくつかの追加の変異を含むことができる。特に、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｅｕ４０８及びＴｙｒ４０９及びＰｒｏ４１０と機能的に同等である位置において変異置換を含むポリメラーゼが意図されている。好ましい実施形態では、当該の置換変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００７２】
特異的な実施形態では、ポリメラーゼは、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＬｅｕ４０８Ｔｙｒ及びＴｙｒ４０９Ａｌａ及びＰｒｏ４１０Ｖａｌの少なくとも１つ又は２つ、しかし好ましくは全部と機能的に同等である置換変異を含む。好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、当該の置換変異の全部を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００７３】
ポリメラーゼは、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＣｙｓ２２３と機能的に同等である位置において置換変異をさらに含むことができる。好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、当該の置換変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。一実施形態では、ポリメラーゼは、９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列中のＣｙｓ２２３Ｓｅｒと機能的に同等である置換変異を含む。好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、当該の置換変異を含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００７４】
好ましくは、ポリメラーゼは、上記で述べた変異の組合せを含む９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼである。
【００７５】
また、本発明は、配列番号１、３、５又は２１のいずれか１つに示すアミノ酸配列を含むか、配列番号１、３、５又は２１のいずれか１つに示すアミノ酸配列から実質的になるか、或いは配列番号１、３、５又は２１のいずれか１つに示すアミノ酸配列からなる９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼ分子にも関する。また、本発明は、配列番号１、３、５又は２１に示すアミノ酸配列とは、ポリメラーゼの機能に多大に影響することがないアミノ酸の変化の点のみで異なるアミノ酸配列を有するポリメラーゼも包含する。この場合、ポリメラーゼの当面の機能は、（対照ポリメラーゼと比較して）当該のポリメラーゼが各反応サイクルにおいて１種又は複数のヌクレオチドを複数の別々のＤＮＡ鋳型に内に取り込む能力を有するようになる、及び／又は（対照ポリメラーゼと比較して）当該のポリメラーゼが各反応サイクルにおいてより多くの生産的なポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を形成することができるようになる、低下したＤＮＡに対する親和性と定義する。
【００７６】
したがって、低下したＤＮＡ親和性を有するポリメラーゼのバリアントのこの活性に関しては重要でない残基における保存的置換は、本発明の範囲内に含まれる。酵素の機能に対するさらなる変異の効果は、例えば、周知のヌクレオチド取り込みアッセイ（国際公開第２００５／０２４０１０号パンフレットの実施例、並びに以下の実施例３及び４に記載されているアッセイ等）を使用して、容易に試験することができる。
【００７７】
また、本発明の変化させたポリメラーゼを、その低下したＤＮＡに対する親和性に直接注目して定義することもでき、その低下したＤＮＡに対する親和性は、実質的に未変化の忠実度及びヌクレオチドに対する親和性と一緒になって、本発明のポリメラーゼに伴う利点をもたらす。したがって、ＤＮＡに対する解離定数（ＫＤ）が、未変化の対照ポリメラーゼの少なくとも、およそ２倍超、３倍超、４倍超又は５倍超である、或いはこの範囲内である、変化させたポリメラーゼを提供する。
【００７８】
一実施形態では、約５００ｍＭ以下、好ましくは５００ｍＭ未満の濃度を有する塩溶液、好ましくは、ＮａＣｌ溶液の存在下で、ＤＮＡから解離するものとする、変化させたポリメラーゼを提供する。塩溶液は、本発明の低下した親和性のポリメラーゼを、ＤＮＡとより密接に結合する未変化のポリメラーゼと区別することが可能であるような適切な濃度であることができる。適切な塩溶液濃度（好ましくは、ＮａＣｌ）は、およそ１５０ｍＭ、２００ｍＭ、２５０ｍＭ、３００ｍＭ又は３５０ｍＭの範囲内であり、好ましくは２００ｍＭである。いずれかの適切な二本鎖ＤＮＡ分子を用いて、変化がＤＮＡ親和性の低下の面で所望の効果を有するか否かを決定することができる。好ましくは、それからポリメラーゼが解離するＤＮＡ分子は、配列番号１８に記載する配列を含む。好ましくは、洗浄用液中の当面のＮａＣｌ濃度で、ポリメラーゼの少なくともおよそ４０％、５０％、６０％、７０％等がＤＮＡから解離するものとする。
【００７９】
解離実験を、いずれかの既知の手段、例えば、以下の実験の項の実施例５で詳述する洗浄アッセイ（図６及び７も参照）等を用いることによって行うことができる。
【００８０】
上記で述べたように、ＤＮＡ親和性の低下は、（好ましくは）ヌクレオチドに対するポリメラーゼの親和性を顕著に又は有意に低下させることなく達成される。また、驚くべきことに、本発明の変化させたポリメラーゼは、ＤＮＡ結合親和性が低下しているにもかかわらず、Ｖｍａｘの面では、未改変のポリメラーゼに匹敵する活性も示す。本発明のポリメラーゼが示すこの驚くべき特性を、特に、以下の実験の項の実施例６において及び図８を参照して、本発明の特定の酵素の反応速度論的解析において示す。
【００８１】
また、本発明の変化させたポリメラーゼは、ポリメラーゼを発現させた宿主細胞から精製される能力の改良に直接注目して定義することもできる。したがって、変化させたポリメラーゼの低下したＤＮＡに対する親和性（これは、実質的に未変化のヌクレオチドに対する親和性及び忠実度と一緒になって、本発明のポリメラーゼに伴う利点をもたらす）のおかげで、当該のポリメラーゼをより容易に精製することができる。酵素の精製の際に、宿主細胞からの内在性ＤＮＡによる持ち越し汚染が減少する。したがって、精製過程後にポリメラーゼに結合して残留する内在性のＤＮＡが減少することから、より純粋な産物を得る。変化させたポリメラーゼの低下したＤＮＡに対する親和性の追加の利点は、実質的に純粋なポリメラーゼの調製物を提供するために、それほど厳密な精製の手順を用いる必要がないことである。したがって、精製過程自体によって不利に影響されるポリメラーゼが減少し、高いレベルの全体的な活性を有するポリメラーゼ調製物を得るであろう。その上、より均一な精製が可能になるはずであり、ポリメラーゼのバッチ間の変動が減少する。精製手順の際の内在性ＤＮＡによる持ち越し汚染の改良に関する代表的なデータを、以下の実験の項の実施例７に提供する。
【００８２】
好ましくは、約６０ｎｇ／ｍｌ、５０ｎｇ／ｍｌ、４０ｎｇ／ｍｌ、３０ｎｇ／ｍｌ、２０ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは、約５ｎｇ／ｍｌ未満の宿主のＤＮＡが、ポリメラーゼの精製後に持ち越し汚染する。標準的な精製プロトコール、例えば、Ｃｏｌｌｅｙら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１７６１９−１７６２２（１９８９）；Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．１８２（Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ編、１９９０）を参照等、を用いることができる。
【００８３】
したがって、本発明は、ＤＮＡに対する親和性を有する、変化させたポリメラーゼを提供し；
（ｉ）当該のポリメラーゼは、ＤＮＡに対する解離定数が、未変化／対照ポリメラーゼの少なくとも約、又はおよそ、２倍、３倍、４倍又は５倍を超え、及び／又は
（ｉｉ）約２００ｎＭから５００ｎＭの間、好ましくは、約２００ｎＭから３００ｎＭの間の濃度を有する塩化ナトリウム溶液を作用させると、少なくとも５０％、６０％、７０％又は８０％の当該のポリメラーゼが、当該のポリメラーゼが結合しているＤＮＡから解離し、及び／又は
（ｉｉｉ）当該のポリメラーゼを発現させた細胞からの精製過程後に、約６０、５０、４５、４０、３５、３０、２５、２０、１５、１０、５、３、１又は０．５ｎｇ／ｍｌ未満の内在性のＤＮＡが、当該のポリメラーゼに結合して残留する
ようになっており；
当該の変化は、ヌクレオチド結合親和性に対しても、忠実度に対しても、顕著に不利に影響することがなく、したがって、当該のポリメラーゼは、
（ａ）反応サイクルの間中、より多くの生産的なポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を形成する（反応の完了のレベルを改良する）こと、及び／又は
（ｂ）全体的なレベルが改良された（／増加した／上昇した）ヌクレオチドの取り込みを触媒すること
が可能であり；
特に、ＤＮＡの濃度と比較して、ポリメラーゼの濃度が制限的である条件下で、これらのことが可能である。
【００８４】
さらに、本発明は、本発明の変化させたポリメラーゼ酵素をコードする核酸分子にも関する。
【００８５】
アミノ酸配列がわかっており、好ましくは、ポリメラーゼをコードする野性型のヌクレオチド配列もわかっているポリメラーゼの変異型である、いずれか所与の変化させたポリメラーゼに関して、分子生物学の基本原理によって、当該の変異体をコードするヌクレオチド配列を得ることができる。例えば、９°Ｎポリメラーゼをコードする野性型のヌクレオチド配列がわかっていることを考慮すると、標準的な遺伝暗号を使用して、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する９°Ｎのいずれか所与の変異型をコードするヌクレオチド配列を推定することができる。同様に、ヌクレオチド配列を、ファミリーＡ及びファミリーＢのポリメラーゼの両方からのその他のポリメラーゼ、例えば、Ｖｅｎｔ（商標）、Ｐｆｕ、Ｔｓｐ  ＪＤＦ−３、Ｔａｑ等の変異型に関しても容易に引き出すことができる。次いで、要求されるヌクレオチド配列を有する核酸分子を、当技術分野で既知の標準的な分子生物学の手法を使用して、構築することができる。
【００８６】
特異的な実施形態では、本発明は、９°Ｎポリメラーゼの変異型をコードする核酸分子に関する。
【００８７】
したがって、本発明は、変化させた９°Ｎ  ＤＮＡポリメラーゼをコードする核酸分子を提供し、当該の核酸分子は、配列番号２、４、６、１９又は２０のいずれかのヌクレオチド配列を含むか、配列番号２、４、６、１９又は２０のいずれかのヌクレオチド配列から実質的になるか、或いは配列番号２、４、６、１９又は２０のいずれかのヌクレオチド配列からなる。
【００８８】
本発明によると、定義した核酸は、同一の核酸を含むのみならず、特に、保存的アミノ酸置換における縮重コードによる同義のコドン（同一のアミノ酸残基を特定する異なるコドン）に至る場合の置換を含む、何れかのマイナーな塩基の変化もまた含む。また、「核酸配列」という用語は、塩基の変化に関して与えられたいずれかの一本鎖の配列に対する相補的な配列も含む。
【００８９】
また、本明細書に記載する核酸分子を、好都合に、適切な発現ベクター内に含ませ、適切な宿主内で、当該の核酸分子がコードするポリメラーゼのタンパク質を発現させることもできる。したがって、ここに、配列番号２、４、６、１９又は２０のいずれかのヌクレオチド配列を含むか、配列番号２、４、６、１９又は２０のいずれかのヌクレオチド配列から実質的になるか、或いは配列番号２、４、６、１９又は２０のいずれかのヌクレオチド配列からなる発現ベクターを提供する。クローン化したＤＮＡの適切な発現ベクターへの組み入れ及びそれに続く上記の細胞のその後の形質転換及びそれに続く形質転換させた細胞の選択は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、（１９８９），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに提供されているように、当業者には周知である。
【００９０】
そのような発現ベクターは、プロモーター領域等、当該のＤＮＡ断片の発現をもたらすことができる制御配列に操作可能に連結させた本発明による核酸を有するベクターを含む。「操作可能に連結させた」という用語は、記載する成分が意図する様式で機能することを可能にする関係で存在する近位を指す。そのようなベクターを適切な宿主細胞内に形質転換して、本発明によるタンパク質を発現させることができる。
【００９１】
核酸分子は、成熟タンパク質をコードしてもよく、又は前タンパク質上のリーダー配列をコードする前配列をはじめとする、前配列を有するタンパク質をコードしてもよく、これは、続いて宿主細胞によって切断されて成熟たんぱく質を形成する。
【００９２】
ベクターは、例えば、複製開始点、並びに所望により当該のヌクレオチドの発現のためのプロモーター及び所望によりプロモーターの制御因子を提供されたプラスミド、ウイルス又はファージのベクターであることができる。ベクターは、１種又は複数の選択可能なマーカー、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子等を含有することができる。
【００９３】
発現に必要となる制御エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼに結合するプロモーター配列及び転写開始を適切なレベルに導くプロモーター配列を含み、さらに、リボゾームに結合するための翻訳開始配列も含む。例えば、細菌の発現ベクターは、ｌａｃプロモーター等のプロモーター及び翻訳開始のためのシャイン−ダルガノ配列、並びに開始コドンＡＵＧを含むことができる。同様に、真核細胞の発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する異種又は同種のプロモーター、下流のポリアデニル化シグナル、開始コドンＡＵＧ及びリボゾームからの解離のための終始コドンを含むことができる。そのようなベクターは、市販品が入手可能であることもあれば、当技術分野で周知の方法によって、記載されている配列から構築することも可能である。
【００９４】
より高等な真核細胞による本発明のポリメラーゼをコードするＤＮＡの転写を、ベクター内にエンハンサー配列を含ませることによって最適化することができる。エンハンサーはＤＮＡのシス作動性エレメントであり、プロモーターに作用して、転写レベルを増加させる。また、ベクターは、通常、選択可能なマーカーに加えて、複製開始点も含む。
【００９５】
（変化させたポリメラーゼの好ましい使用）
別の態様では、本発明は、ヌクレオチドのポリヌクレオチド内への取り込みに用いる、本発明によるＤＮＡに対する親和性が低下した、変化させたポリメラーゼの使用に関する。上記で述べたように、本発明の変化させたポリメラーゼは、当面のヌクレオチドに対する親和性を保持することから、ヌクレオチドの性質は、制限的ではない。
【００９６】
上記で述べたように、本発明は、ポリメラーゼがＤＮＡ鋳型と密接に結合することは、必ずしも有利な特性であるとは限らないという認識に基づく。このことは、各反応サイクルで、各鋳型ＤＮＡ分子に対して、単一のヌクレオチドの取り込みが１回のみ発生することが要求されるシークエンシング反応の場合に、特に当てはまる。多くのこれらのシークエンシング反応で、標識化ヌクレオチドを用いる。
【００９７】
したがって、本発明は、変化させてあるポリメラーゼの使用を提供し、当該のポリメラーゼは、標識化ヌクレオチドをポリヌクレオチド内に取り込むために、低下したＤＮＡに対する親和性及び各反応サイクルで標識化ヌクレオチドを複数の別々のＤＮＡ鋳型内に取り込む能力を示すようになっており、当該の標識は、添加したヌクレオチドの性質を決定するために用いる。
【００９８】
一実施形態では、ヌクレオチドは、ｄｄＮＴＰを含む。したがって、本発明のポリメラーゼを、当技術分野でその詳細が周知である従来のサンガーのシークエンシング反応に用いることができる。
【００９９】
好ましい実施形態では、ヌクレオチドは、３’糖ヒドロキシルにおいて修飾されており、置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなっている、修飾されたヌクレオチドである。
【０１００】
本発明のポリメラーゼを、ヌクレオチド、例えば、３’糖ヒドロキシル位において天然のヒドロキシル基より大きい置換基を有する修飾されたヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖内への取り込みを可能にすることが要求される／望まれる技術のいずれかの領域で使用することができる。本発明のポリメラーゼを、本酵素のいずれかの望ましい特性が必要とされる技術のいずれかの領域で使用することができ、例えば、ＤＮＡが過剰に存在する条件下であっても、ヌクレオチドの取り込み速度が改良されること、及びこのような条件下において、反応完了のレベルが増加することが望まれている。これは、実用的、技術的又は経済的な利点である。
【０１０１】
変化させたポリメラーゼは、低下したＤＮＡに対する親和性によって、大きな３’置換基を有する修飾されたヌクレオチドの取り込みに関して、望ましい特性を示すが、本酵素の有用性は、そのようなヌクレオチド誘導体の取り込みに限定されない。低下したＤＮＡに対する親和性による、変化させたポリメラーゼの望ましい特性は、当技術分野で既知の酵素と比較して、未修飾のヌクレオチドを含む、いずれかのその他のヌクレオチドの取り込みに関して、利点をもたらすことができる。本質的に、本発明の変化させたポリメラーゼを使用して、当該のポリメラーゼが取り込む能力を有するタイプのヌクレオチドであれば、いずれのタイプをも取り込むことができる。
【０１０２】
本発明のポリメラーゼは、ヌクレオチドのポリヌクレオチド内への取り込みを必要とする種々の手法において有用であり、それらには、シークエンシング反応、ポリヌクレオチド合成、核酸の増幅、核酸ハイブリダイゼーションアッセイ、一塩基多型研究及びその他のそのような手法が含まれる。シークエンシング反応における使用は、最も好ましい実施形態の代表である。本発明の改変したポリメラーゼを用いる全てのそのような使用及び方法は、本発明の範囲内に含まれる。
【０１０３】
また、本発明は、ヌクレオチドをＤＮＡ内に取り込むための方法であって、以下の成分：
（ｉ）本発明によるポリメラーゼ；
（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド溶液
が相互作用することを可能にするステップを含む方法にも関する。
上記で議論したように、本発明のポリメラーゼは、各反応サイクルで、単一のみ又は比較的少数のヌクレオチドの取り込みが要求される反応において特別の応用性を有する。しばしば、これらの反応では、ヌクレオチドの１種又は複数が標識化されるであろう。したがって、本発明は、標識化ヌクレオチドをＤＮＡ内に取り込むための方法であって、以下の成分：
（ｉ）変化させてあるポリメラーゼであって、低下したＤＮＡに対する親和性及び各反応サイクルで標識化ヌクレオチドを複数の別々のＤＮＡ鋳型内に取り込む能力を示すようになっているポリメラーゼ；
（ｉｉ）ＤＮＡ鋳型；及び
（ｉｉｉ）ヌクレオチド溶液
が相互作用することを可能にするステップを含む方法を提供する。
【０１０４】
特異的な実施形態では、本発明は、３’糖ヒドロキシルにおいて、置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなるように、修飾されたヌクレオチドをＤＮＡ内に取り込むための方法であって、以下の成分：
−（上記に記載したような）本発明によるポリメラーゼ
−ＤＮＡ鋳型；及び
−３’糖ヒドロキシルにおいて、置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなるように、修飾されているヌクレオチドを含有するヌクレオチド溶液
が相互作用することを可能にすることを含む方法を提供する。
【０１０５】
特に好ましいのは、クラスターアレイ上で行われる使用及び方法である。核酸分子のクラスターアレイを、当技術分野で一般に知られる手法を使用して作製することができる。例えば、国際公開第９８／４４１５１号パンフレット及び国際公開第００／１８９５７号パンフレット（これらはいずれも、本明細書に参照によって組み入れられている）はいずれも、固定化された核酸分子のクラスター又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体の支持体上に固定化することを可能にする核酸増幅の方法を記載している。また、その全部の内容が参照によって本明細書に組み入れられている国際公開第２００５／０７８１３０号パンフレットも、そこで参照されている引用を含め、参照されたい。本ポリメラーゼは、ヌクレオチドを非常に近接している複数のＤＮＡ鋳型内に取り込むことができ、したがって、高度に効率的な反応を提供することから、クラスター上への取り込み、特に、クラスターアレイ上でのシークエンシングは、特異的な利点をもたらす。
【０１０６】
上記の成分は、ヌクレオチドの５’リン酸基とＤＮＡ鋳型上の遊離の３’ヒドロキシル基との間でリン酸ジエステル結合を形成させる条件下で、相互作用することが可能になり、それによって、ヌクレオチドがポリヌクレオチド内へ取り込まれる。修飾されたヌクレオチドを含む、好ましいヌクレオチドは、上記で詳細に記載されている。
【０１０７】
取り込み反応を、遊離の溶液中で起こしてもよいし、又はＤＮＡ鋳型を固体の支持体上に固定してもよい。
【０１０８】
変異酵素が示すヌクレオチドの取り込み速度は、未変化の酵素が示すヌクレオチドの取り込み速度に類似することができる。低下したＤＮＡに対する親和性のおかげで、改変した酵素の改良された活性により、同一の取り込み速度は、単一の反応サイクルにおいて、ヌクレオチドを複数の鋳型内に取り込む能力と組み合わさって、完了の全体的な速度を改良する。しかし、変異酵素が実用的に有用であるためには、ヌクレオチドの取り込み速度が、未変化の酵素のヌクレオチドの取り込み速度と正確に同一である必要はない。反応の完了の面で、全体的な反応の効率が改良されるならば、取り込み速度は、未変化の酵素のヌクレオチドの取り込み速度と比較して、遅くてもよいし、同等であってもよいし、又は速くてもよい。
【０１０９】
本発明の特定の実施形態では、本発明の変化させたポリメラーゼを使用して、合成による配列解析（ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−ｂｙ−ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）プロトコールに関連して、修飾されたヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖内に取り込むことができる。本方法のこの特定の態様では、ヌクレオチドは、３’糖ヒドロキシルにおいて、置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなるように、修飾されていることができる。ＤＮＡ鋳型の配列を決定するために、これらのヌクレオチドを検出する。
【０１１０】
したがって、さらに別の態様では、本発明は、ＤＮＡをシークエンシングする方法であって、以下の成分：
−（上記に記載したような）本発明によるポリメラーゼ
−ＤＮＡ鋳型；及び
−３’糖ヒドロキシルにおいて、置換基が天然の３’ヒドロキシル基より大きくなるように、修飾されているヌクレオチドを含有するヌクレオチド溶液が相互作用することを可能にし、次いで、取り込まれた修飾されたヌクレオチドを検出し、それによって、ＤＮＡ鋳型のシークエンシングを可能にする
ことを含む方法を提供する。
【０１１１】
シークエンシング反応のためのＤＮＡ鋳型は、典型的には、シークエンシング反応において、さらなるヌクレオチドを付加するためのプライマー又は開始点として働く遊離の３’ヒドロキシル基を有する二本鎖領域を含むものとする。シークエンシングの対象であるＤＮＡ鋳型の領域は、相補鎖上の、この遊離の３’ヒドロキシル基を突出する。遊離の３’ヒドロキシル基を有するプライマーを、シークエンシングの対象である鋳型の領域とハイブリダイズする別の成分（例えば、短いオリゴヌクレオチド）として添加することができる。別法として、プライマー及びシークエンシングの対象である鋳型の鎖のそれぞれが、分子内二本鎖を形成することができる部分的に自己相補的な核酸の一本鎖の部分、例えば、ヘアピンループ構造等を形成することができる。ヌクレオチドは、遊離の３’ヒドロキシル基に連続的に付加し、その結果、５’から３’の方向にポリヌクレオチド鎖が合成される。１つのヌクレオチドが付加する度に、付加した塩基の性質を決定することになり、こうして、ＤＮＡ鋳型に関する配列情報を提供する。
【０１１２】
そのようなＤＮＡシークエンシングは、修飾されたヌクレオチドが、鎖ターミネーターとして作用することができる場合に、可能になるであろう。修飾されたヌクレオチドが、シークエンシングされている鋳型の領域に相補的である、成長しているポリヌクレオチド鎖内に取り込まれると、さらなる配列の伸長を導くのに利用可能な遊離の３’−ＯＨ基はもはや存在せず、したがって、ポリメラーゼは、さらなるヌクレオチドを付加することができない。成長している鎖内に取り込まれた塩基の性質を決定したら、３’ブロックを取り除いて、次に続くヌクレオチドを付加させることができる。これらの修飾されたヌクレオチドを使用して誘導した産物を整理することによって、ＤＮＡ鋳型のＤＮＡ配列を推定することができる。修飾されたヌクレオチドのそれぞれが、特定の塩基に対応することがわかっている異なる標識を結合しており、各取り込みステップにおいて付加した塩基間の識別を容易にする場合には、そのような反応を、単一の実験で行うことができる。別法として、修飾されたヌクレオチドのそれぞれを別々に含有する反応を個別に行うことができる。
【０１１３】
好ましい実施形態では、修飾されたヌクレオチドは、ヌクレオチドの検出を容易にする標識を保有する。好ましくは、これは、蛍光標識である。各ヌクレオチドのタイプが、異なる蛍光標識を保有することができる。しかし、検出可能な標識は、蛍光標識である必要はない。ＤＮＡ配列内へのヌクレオチドの取り込みの検出を可能にする標識であれば、いずれをも使用することができる。
【０１１４】
本発明の方法において使用するのに適した蛍光標識化ヌクレオチドを検出するための一方法は、標識化ヌクレオチドに特異的な波長のレーザー光の使用又はその他の適切な照光源の使用を含む。
【０１１５】
一実施形態では、ヌクレオチド上の標識からの蛍光を、ＣＣＤカメラによって検出することができる。
【０１１６】
ＤＮＡ鋳型を表面上に固定化する場合には、好ましくは、ＤＮＡ鋳型を、表面上に固定化して、高密度アレイを形成することができ、このようなアレイは、好ましくは、上記で議論したようなクラスター又は「コロニーからなる」アレイである。一実施形態における、さらに、本発明の出願人によって開発された技術による高密度アレイは、単一分子のアレイを含み、そこでは、アレイ上に、検出可能である単一のＤＮＡ分子が別々の各部位において存在する。光学的な手段によって個別に分解可能な核酸分子からなる単一分子アレイ及びシークエンシングにおけるそのようなアレイの使用が、例えば、その内容が参照によって本明細書に組み入れられている国際公開第００／０６７７０号パンフレットに記載されている。個別に分解可能な、ヘアピンループ構造をはじめとする、核酸分子からなる単一分子のアレイは、その内容も参照によって本明細書に組み入れられている国際公開第０１／５７２４８号パンフレットに記載されている。本発明のポリメラーゼは、国際公開第００／０６７７０号パンフレット又は国際公開第０１／５７２４８号パンフレットの開示によって作成する単一分子のアレイと共に使用するのに適する。しかし、本発明の範囲を、単一分子のアレイに関連する本ポリメラーゼの使用に限定する意図がないことを理解されたい。
【０１１７】
単一分子のアレイに基づくシークエンシングの方法は、単一分子のアレイに蛍光で標識化した修飾ヌクレオチド及び変化させたポリメラーゼを添加することによって効果を上げることができる。相補的なヌクレオチドが、各ヌクレオチド断片の第１の塩基と塩基対を形成し、次いで、改良されたポリメラーゼ酵素によって触媒される反応においてプライマーに付加される。残留する遊離のヌクレオチドは、取り除かれる。
【０１１８】
次いで、それぞれの修飾されたヌクレオチドの特異的な波長のレーザー光が、取り込まれた修飾ヌクレオチド上の適切な標識を励起させ、標識の蛍光を生じる。この蛍光を、アレイ全体を走査して各断片上に取り込まれた修飾ヌクレオチドを同定することができる適切なＣＣＤカメラによって検出することができる。したがって、場合によっては、数百万個の部位を並行して検出することができる。次いで、蛍光を取り除くことができる。
【０１１９】
取り込まれた修飾ヌクレオチドの正体は、検体配列中の修飾ヌクレオチドが対を形成した塩基の正体を明らかにする。次いで、取り込み、検出及び同定のサイクルをおよそ２５回繰り返して、アレイに結合した、オリゴヌクレオチド断片のそれぞれの中のはじめの２５個の塩基を決定することができ、オリゴヌクレオチド断片のそれぞれを検出することが可能になる。
【０１２０】
したがって、アレイ上で全ての分子を同時にシークエンシングすることによって、これらの分子を検出することが可能になり、アレイに単一のコピーで結合した数億個のオリゴヌクレオチドの断片について、はじめの２５個の塩基を決定することができる。明らかに、本発明は、２５個の塩基のシークエンシングに限定されない。要求される配列情報の詳細のレベル及びアレイの複雑度によって、より多い又はより少ない多様な塩基を、シークエンスすることができる。
【０１２１】
適切なバイオインフォマティクスのプログラムを使用して、生成した配列を、整列させ、特異的な参照配列と比較することができる。これによって、いかなる数の既知及び未知の遺伝的変異、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）等の決定も可能になる。
【０１２２】
本発明の変化させたポリメラーゼの有用性は、単一分子のアレイを使用するシークエンシングへの応用に限定されない。ヌクレオチドをポリヌクレオチド鎖内に取り込むためにポリメラーゼの使用を必要とする、いずれかのタイプのアレイに基づく（特に、いずれかの高密度アレイに基づく）シークエンシングの技術、特に、３’ブロック基等の大きな３’置換基（自然のヒドロキシル基より大きい）を有する修飾ヌクレオチドの取り込みに頼る、いずれかのアレイに基づくシークエンシングの技術と共に、本ポリメラーゼを使用することができる。
【０１２３】
本発明のポリメラーゼを、固体の支持体上への核酸分子の固定化によって形成されたアレイであれば、本質的にいかなるタイプのアレイであっても、核酸のシークエンシングのために使用することができる。単一分子のアレイに加え、適切なアレイとして、例えば、アレイ上の特徴的な領域が、１種の単一のポリヌクレオチド分子の複数のコピー又は少数の異なるポリヌクレオチド分子の複数のコピー（例えば、２本の相補的な核酸の鎖の複数のコピー）さえも含むマルチポリヌクレオチドアレイ又はクラスターアレイがあげられる。
【０１２４】
特に、本発明のポリメラーゼを、その内容が参照によって本明細書に組み入れられている国際公開第９８／４４１５２号パンフレットに記載されている核酸のシークエンシング法において用いることができる。この国際出願は、固体の支持体上の特徴的な位置に存在する複数の鋳型の並行シークエンシングの方法を記載している。この方法は、標識化ヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖内への取り込みに頼る。
【０１２５】
本発明のポリメラーゼを、その内容が参照によって本明細書に組み入れられている国際公開第００／１８９５７号パンフレットに記載されている方法において使用することができる。この出願は、多数の特徴的な核酸分子をアレイ化し、核酸コロニーの形成により高密度で同時に増幅した後、核酸コロニーをシークエンシングする固相の核酸増幅及びシークエンシングの方法を記載している。本発明の変化させたポリメラーゼを、この方法のシークエンシングのステップにおいて用いることができる。
【０１２６】
核酸分子のマルチポリヌクレオチドアレイ又はクラスターアレイを、当技術分野で一般に知られる手法を使用して作製することができる。例えば、国際公開第９８／４４１５１号パンフレット及び国際公開第００／１８９５７号パンフレットはいずれも、固定化された核酸分子のクラスター又は「コロニー」からなるアレイを形成するために、増幅産物を固体の支持体上に固定化することを可能にする核酸増幅の方法を記載している。クラスターアレイの作成及びそのようなアレイの核酸のシークエンシングの鋳型としての使用に関する国際公開第９８／４４１５１号パンフレット及び国際公開第００／１８９５７号パンフレットの内容は、参照によって本明細書に組み入れられている。これらの方法によって作成したクラスターアレイ上に存在する核酸分子は、本発明のポリメラーゼを使用するシークエンシングに適した鋳型である。しかし、本発明を、これらの特異的な方法により作成したクラスターアレイ上で行うシークエンシング反応における本ポリメラーゼの使用に限定する意図はない。
【０１２７】
さらに、本発明のポリメラーゼを、Ｍｉｔｒａら、Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３２０，５５−６５，２００３に記載されている方法のような蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕシークエンシングの方法においても使用することができる。
【０１２８】
また、本発明は、本発明のポリメラーゼを含むキットも意図し、これは、使用のための適切な説明書と一緒にパッケージされるであろう。本ポリメラーゼを、使用に適した形態で、例えば、適切な緩衝液中に提供することになるか、又は本ポリメラーゼは、使用のために再構成することができる形態（例えば、凍結乾燥形態）であることができる。
【０１２９】
したがって、ヌクレオチド取り込み反応又はアッセイに使用するためのキットであって、本明細書に記載するような本発明のポリメラーゼ及びヌクレオチドの溶液を含むキットを提供し、当該のヌクレオチドは、当該のポリメラーゼが、当該のヌクレオチドを、成長しているＤＮＡ鎖内に取り込むことができるようになっている。好ましいヌクレオチドは、適切に標識されたヌクレオチドを含み、したがって、これを例えば、シークエンシング反応において使用することができる。標識は、当技術分野で周知であるように、蛍光標識、放射標識及び／又は質量標識を含むことができる。
【０１３０】
好ましい実施形態では、ヌクレオチドの溶液は、合成の（すなわち、自然でない）ヌクレオチド、例えば、ｄｄＮＴＰ等を含む、合成の（すなわち、自然でない）ヌクレオチドか、例えば、ｄｄＮＴＰ等から実質的になる、又は合成の（すなわち、自然でない）ヌクレオチドか、例えば、ｄｄＮＴＰ等からなる。したがって、本キットは、例えば、サンガーのシークエンシング反応において用いることができる。
【０１３１】
別の実施形態では、ヌクレオチドの溶液は、修飾されたヌクレオチド含むか、修飾されたヌクレオチドから実質的になるか、又は修飾されたヌクレオチドからなる。好ましい修飾ヌクレオチドは、本発明のポリメラーゼに関連して、上記で定義されており、この記載は、ここで準用する。
【０１３２】
また、本キットは、別の実施形態では、ヌクレオチド取り込み反応の実行を可能にする適切なプライマー及び／又はＤＮＡ鋳型の分子も組み入れることができる。
【０１３３】
さらに別の態様では、本発明は、本発明によるポリメラーゼを作製するための方法であって、
（ｉ）ポリメラーゼ中で変異誘発のための残基を選択すること；
（ｉｉ）（ｉ）で実施した選択に従って、変異ポリメラーゼを作製すること；
（ｉｉｉ）変異ポリメラーゼのＤＮＡに対する親和性を決定すること；
（ｉｖ）ＤＮＡに対する親和性が低下した場合、各反応サイクルにおいて、より多くの生産的なポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体を形成する能力に関して、当該のポリメラーゼを試験すること
を含む方法を提供する。
【０１３４】
好ましくは、ヌクレオチドに対する親和性は、影響されないが、親和性が未改変のポリメラーゼに対してと同一の次数に留まる場合には、満足であるとみなすことができる。
【０１３５】
一実施形態では、本方法は、変異誘発後に、ポリメラーゼの忠実度が同一の次数に留まることを保障することをさらに含む。
【０１３６】
好ましくは、忠実度は、影響されないが、忠実度が改変したポリメラーゼに対してと同一の次数に留まる場合には、許容できるとみなすことができる。
【０１３７】
反応サイクルは、上記で定義されている。
【０１３８】
好ましい実施形態では、ポリメラーゼの試験は、より多くの生産的なポリメラーゼ−ＤＮＡ複合体が形成されているか否かを決定するための合成ヌクレオチドの使用を含む。ポリメラーゼを試験することができる適切なヌクレオチド取り込みアッセイは、当技術分野では既知であり（例えば、国際公開第２００５／０２４０１０号パンフレットを参照）、以下の実験の項でより詳細に記載されている。
【０１３９】
一実施形態では、残基を、９°Ｎの一次アミノ酸配列に基づいて選択する。一実施形態では、選択を、どのアミノ酸がＤＮＡと接触するであろうかを予想することによって実施する。別法として、ポリメラーゼのＤＮＡとの相互作用を安定化させると予想される残基、及び／又はポリメラーゼのＤＮＡ結合ドメインに見出される残基、及び／又は塩基性である残基を選択することができる。予想は、上記及び実験の項（実施例１）で議論するように、適切なポリメラーゼの結晶構造に基づくことができる。
【０１４０】
変異誘発、特に、部位特異的変異の方法は、当技術分野で十分に特徴付けられており、市販のキットが入手可能である。したがって、これらの手法は、詳細には議論しない。いずれかの適切な手法を、本発明の方法において用いることができる。
【０１４１】
ＤＮＡに対する親和性の低下を、いずれかの適切な方法によって測定することができる。好ましくは、親和性は、元々の未変化のポリメラーゼと比較して、少なくとも、又はおよそ、１．５倍、２倍、３倍、４倍又は５倍等低下する。この親和性を、例えば、解離定数に注目して測定することができる。
【０１４２】
好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、ファミリーＢのポリメラーゼであり、好ましくは、好熱性古細菌に由来し、最も好ましくは、９°Ｎポリメラーゼである。
【０１４３】
本発明は、以下の実験の項及び図を参照することによって、さらに理解が深まるであろう。
【０１４４】
［発明の詳細な説明］
（実験の項）
（実施例１−変化させたポリメラーゼの調製）
（原理）
部位特異的変異を、酵素のＤＮＡに対する親和性を低下させる試みで、９°Ｎ−７  ＹＡＶ  Ｃ２２３ＳポリメラーゼのＣ末端領域に導入した（野生型９°Ｎ−７ポリメラーゼは、ＤＮＡに対する親和性が非常に高い、Ｋｄ＝５０ｐＭ；Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈら、１９９６．ＰＮＡＳ．９３，５２８１）。
【０１４５】
９°Ｎ−７  ＤＮＡポリメラーゼの開放型（ＰＤＢ＝１ｇｈｔ）、密接に関連するＤＮＡポリメラーゼＲＢ６９の開放構造（ＰＤＢ＝１ｉｈ７）及びＲＢ６９の閉鎖型（ＰＤＢ＝１ｉｇ９）の結晶構造の、エネルギーを最少にする重複アライメントを、ＤＮＡ結合に関与する重要な残基の同定のための構造モデルとして使用した（Ｃｒｅｓｓｅｔに委託）。ＲＢ６９ポリメラーゼの閉鎖型の結晶構造（Ｆｒａｎｋｌｉｎら、２００１．Ｃｅｌｌ  １０５，６５７）が、複合体を形成したＤＮＡと、Ｈ−結合又は静電気的な相互作用を、ヌクレオチドの塩基と直接的に又はリン酸骨格とのいずれかで形成するいくつかの残基を特定した。これらの残基が塩基性である割合が高く（Ｌｙｓ７９０、８００、８４４、８７４、８７８及びＡｒｇ８０６）、これは、酸性のリン酸基との予想される相互作用と一貫性がある。ＲＢ６９の閉鎖構造を観察すると、これらの残基の大部分が、結合している二本鎖に向かう配向をとっていることがわかった。９°Ｎ−７  ｐｏｌの閉鎖型については、類似の構造が全く存在せず、したがって、我々は、我々の構造アライメントを使用して、ＲＢ６９の開放構造から、（上記の残基のうちの）塩基性残基に類似する立体構造をとる、９°Ｎ−７  ｐｏｌの開放型中の塩基性の残基を同定した。ＲＢ６９からの６つの塩基性残基のうち、３つが、９°Ｎ−７中に対応する塩基性残基を有することを見出し、これらは、Ａｒｇ７４３（ＲＢ６９のＬｙｓ８７８）、Ａｒｇ７１３（Ｌｙｓ８００）及びＬｙｓ７０５（Ｌｙｓ８４４）であった。４種の変異酵素、すなわち、見出された残基のアラニンのバリアント（Ｒ７４３Ａ、Ｒ７１３Ａ及びＫ７０５Ａ）及び７１アミノ酸の欠失（Δ７１）を設計することが決まった。７１アミノ酸の欠失は、その内部に上記の３つの残基が存在する親指サブドメインからα−へリックスを除去した（９°Ｎ−７  ｐｏｌの構造中で、残基が秩序を乱した）。
【０１４６】
（変異誘発及びクローン化）
変異を、ｐＳＶ１９（９°Ｎ−７  ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  ｅｘｏ−  ポリメラーゼをコードするプラスミド）内に、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ  ＸＬキット及びそのプロトコールを使用してＰＣＲ法によって導入した（国際公開第２００５／０２４０１０号パンフレットも参照）。
【０１４７】
使用した変異原生プライマー：
・    Ｒ７４３Ａ。
順行（ｆｗｄ）  ５’−ＣＣＣＧＧＣＧＧＴＧＧＡＧＧＣＧＡＴＴＣＴＡＡＡＡＧＣＣ−３’（配列番号９）
逆行（ｒｅｖ）  ３’−ＧＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＧＣＴＡＡＧＡＴＴＴＴＣＧＧ−５’（配列番号１０）
・    Ｒ７１３Ａ
順行（ｆｗｄ）  ５’−ＧＡＡＧＧＡＴＡＧＧＣＧＡＣＧＣＧＧＣＧＡＴＴＣＣＡＧＣＴＧ−３’（配列番号１１）
逆行（ｒｅｖ）  ３’−ＣＴＴＣＣＴＡＴＣＣＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＴＡＡＧＧＴＣＧＡＣ−５’（配列番号１２）
・    Ｋ７０５Ａ
順行（ｆｗｄ）  ５’−ＧＣＴＡＣＡＴＣＧＴＣＣＴＡＧＣＧＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＧ−３’（配列番号１３）
逆行（ｒｅｖ）  ３’−ＣＧＡＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡＴＣＧＣＣＣＧＡＧＡＣＣＴＴＣＣ−５’（配列番号１４）
・    Δ７１（Ｃ末端７０４）
順行（ｆｗｄ）  ５’−ＧＣＴＡＣＡＴＣＧＴＣＣＴＡＴＧＡＧＧＣＴＣＴＧＧＡＡＧＧ−３’（配列番号１５）
逆行（ｒｅｖ）  ３’−ＣＧＡＴＧＴＡＧＣＡＧＧＡＴＡＣＴＣＣＧＡＧＡＣＣＴＴＣＣ−５’（配列番号１６）
【０１４８】
有望なクローンを選択し、遺伝子のＰＣＲ断片をシークエンシングして、変異の存在を確認した。全ての変異体に関して、陽性のクローンを得た。
【０１４９】
（過剰発現及び増殖：）
・発現株Ｎｏｖａｇｅｎ製ＲｏｓｅｔｔａＢｌｕｅ  ＤＥ３  ｐＬｙｓＳ内に形質転換した。
・国際公開第２００５／０２４０１０号パンフレットの実験の項に記載されているように、増殖及び誘導を行った。
・国際公開第２００５／０２４０１０号パンフレットの実験の項に記載されているように、回収及び溶解を行った。
・国際公開第２００５／０２４０１０号パンフレットの実験の項に記載されているように、精製を行った。
【０１５０】
（結果）
変異酵素の過剰発現に成功した。全ての変異酵素が、過剰発現した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを行い、構築物の過剰発現を調べた（−＝未誘導；＋＝ＩＰＴＧ誘導）。得られたゲルを、図１に示す。
【０１５１】
（実施例２−タンパク質の粗調製物を使用したＮＵＮＣ製チューブのアッセイ）
変異酵素のわずか５ｍｌの培養液を（直接比較のために、ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  ｅｘｏ−  の培養液も）、国際公開第２００５／０２４０１０号パンフレットに概要を述べるように熱処理のステップまで迅速精製を行った。この時点で、検体は、活性を試験するには、十分な純度であるとみなした。
【０１５２】
それぞれの粗調製物の緩衝液を、酵素学的緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）に、Ｓ３００ゲルろ過スピンカラムを使用して交換した。検体は、濃度に関して規準化しなかった。用いた試験は、ｆｆＴＴＰの表面結合Ａ鋳型ヘアピン内への単純な取り込みであった。２ｐｍｏｌの５’−アミノオリゴ８１５
（５’−ＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＧＣＧ−３’）（配列番号１７）
をＮＵＮＣ−ヌクレオリンクストリップに、メーカーのプロトコールに従って結合させた。
【０１５３】
洗浄後、各ウェルを、各２０μｌの酵素の粗調製物（以下に、酵素の正体を列挙する）及び５μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−６４７と共にインキュベートした。次いで、ストリップを、４５℃にて、３０分間インキュベートした。実験は、二つ組で行った。３０分間のインキュベートが完了したら、ウェルを、１００μｌの高塩洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて３回洗浄し、次いで、１００μｌのミリＱ水を用いて３回洗浄した。ストリップを、Ｔｙｐｈｏｏｎ蛍光イメージャー上、ＣＹ５フィルター、ＰＭＴ＝４５０Ｖ）で走査した。
【０１５４】
結果を、図２に示す。図中、ウェルは、以下の通りである。
１＝２０μｌの酵素学的緩衝液のみ＋１μｌの１００μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−６４７
２＝２０μｌの粗ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  ｅｘｏ−  ＋１μｌの１００μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−６４７
３＝２０μｌの粗ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  Ｒ７４３Ａ  ｅｘｏ−  （クローン１２）＋１μｌの１００μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−６４７
４＝２０μｌの粗ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  Ｋ７０５Ａ  ｅｘｏ−  （クローン１５）＋１μｌの１００μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−６４７
５＝２０μｌの粗ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  Ｒ７４３Ａ  ｅｘｏ−  （クローン１６）＋１μｌの１００μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−６４７
６＝２０μｌの粗ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  Ｒ７１３Ａ  ｅｘｏ−  （クローン２４）＋１μｌの１００μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−６４７
７＝２０μｌの粗ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  Δ７１  ｅｘｏ−  （クローン３８）＋１μｌの１００μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−６４７
８＝２０μｌの粗ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  Ｒ７１３Ａ  ｅｘｏ−  （クローン３９）＋１μｌの１００μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−６４７
【０１５５】
（結果）
酵素学的応答が、バックグラウンドのウェル（ミリＱのみ）及びウェル１（酵素を含有しない対照）を除く、全てのウェルで観察された。蛍光の密度は、ｆｆＴＴＰの取り込み量に比例し、ウェルが濃いほど、取り込みのレベルが高い。変異酵素の性能を、ＹＡＶ（クローン９）（ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  ｅｘｏ−）と比較して議論するものとする。親指サブドメインの先端部の欠失（Δ７１変異体）の結果、触媒活性が大幅に損なわれている酵素を得、取り込みは、クローン９で認められるレベルの３５％に過ぎない。変異体Ｋ７０５Ａは、クローン９と同等であった。２種のアルギニンの変異体であるＲ７４３Ａ及びＲ７１３Ａは、取り込みのレベルが上昇し、クローン９より約４５％改良した。
【０１５６】
（結論）
変異酵素であるＫ７０５Ａ、Ｒ７１３Ａ及びＲ７４３Ａは、改良されたレベルの取り込み、及び酵素の低下したＤＮＡに対する親和性を示す。これら３つの塩基性の残基の全てを取り除き、さらに、追加の残基を除去すると、活性が消滅する（Δ７１変異体）。３つの残基全てを置換しても、さらなる変異／欠失がなければ、活性の低下には至らないであろうと思われる。
【０１５７】
（実施例３−一塩基取り込みアッセイ）
酵素の粗調製物の活性（濃度を規準化した）を、国際公開第２００５／０２４０１０号パンフレットに記載されているように、一塩基取り込みアッセイを使用して測定した。３０μｇ／ｍｌ又は３μｇ／ｍｌの酵素の粗調製物のいずれかを用いて、２μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−ｃｙ３及び２０ｎＭ  １０ＡヘアピンＤＮＡ（３２Ｐで標識化されている）の存在下で、１０分間インキュベートし、一定量の反応混合液を、０、３０、６０、１８０及び６００秒で取り出し、１２％アクリルアミドゲル上に供した。
【０１５８】
（結果）
ゲルの画像を、図３に示す。
【０１５９】
バンドの強度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを使用して定量化し、蛍光強度を、インキュベートした時間に対しプロットして、図４に示す時間経過を得た。
【０１６０】
これらのデータから、ＹＡＶと比較して、ｆｆＴＴＰの第１の塩基の取り込みについて、変異酵素の性能を推定する。濃度の規準化によって、活性を直接比較することができる。Δ７１変異体は、実質的に不活性であり（ｋｏｂｓは、ＹＡＶについて観察されたｋｏｂｓの２１％である）、Ｒ７４３Ａ及びＫ７０５Ａは、ＹＡＶに匹敵する活性を有するが、Ｒ７１３Ａは、ｋｏｂｓ（ＹＡＶについて観察されたｋｏｂｓの２倍）及びサイクルの完了のレベルの両方において顕著な増強を示した。
【０１６１】
（実施例４−［ＤＮＡ］が［ｐｏｌ］より大きい条件下における精製したポリメラーゼに関する一塩基取り込みアッセイ）
クローン９のポリメラーゼ（ＹＡＶ  Ｃ２２３Ｓ  ｅｘｏ−）、並びに親指ドメインの変異体あるＫ７０５Ａ、Ｒ７１３Ａ及びＲ７４３Ａの酵素の精製した標品の活性を、国際公開第２００５／０２４０１０号パンフレットに記載されているように、一塩基取り込みアッセイを使用して測定した。それぞれのＤＮＡ及びポリメラーゼの濃度が、およそ５：１の比であるようにして、実験を行った。こうして、単一の反応サイクルでヌクレオチドを複数のＤＮＡ鋳型内に取り込む酵素の能力を調べた。４ｎＭの精製した酵素を用いて、２０ｎＭ  １０ＡヘアピンＤＮＡ（３２Ｐで標識化されている）及び２μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−ｃｙ３の存在下で、３０分間インキュベートし、一定量の反応混合液を、０、１５、３０、６０、１８０、４８０、９００及び１８００秒の間隔で取り出し、１２％アクリルアミドゲル上に供した。
【０１６２】
（結果）
バンドの強度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを使用して定量化し、蛍光強度を、（ゲル上の出発物質及び最終産物のバンドの相対強度に基づく）完了パーセントに変換し、これを、インキュベートした時間に対しプロットして、図５に示す時間経過を得た。
【０１６３】
クローン９及びＫ７０５Ａの時間経過のプロットは、本来、二相性であり、はじめに、指数関数的な「突発」相（黒色の線）、次いで、時間に対する産物の線形関係（灰色の線）を示している。突発相の大きさは、Ｋ７０５Ａの方がクローン９より大きく（それぞれ、〜  ２８％及び１９％）、線形相の勾配は、Ｋ７０５Ａの方がクローン９より急である（したがって、速い）。この観察の重要性は、以下で議論する。
【０１６４】
これとは対照的に、Ｒ７１３Ａ及びＲ７４３Ａの変異酵素の両方は、このような二相性を示さず、その代わり、急速な指数関数的な相のみが観察される。いずれの場合も、指数関数的な相の大きさは、〜  ９０％であり、このことは、このような指数関数的な相内においては、産物変換の程度が、クローン９又はＫ７０５Ａのいずれよりも大きいことを示している。突発相は、反応の開始に先立ってポリメラーゼに結合したＤＮＡ分子集団がｆｆＴＴＰを取り込む速度、すなわち、ｐｏｌ：ＤＮＡ：ｆｆＴＴＰの三元複合体が入れ替わることができる最大の速度に相当する。それに続く相はいずれも、ポリメラーゼが新しい基質分子（ＤＮＡ及びｆｆＴＴＰ）を捕捉するのに要する、より緩慢な解離／再結合の過程に起因する。クローン９及びＫ７０５Ａに観察された二相性は、突発に続く遅い相が、酵素がＤＮＡから解離し、ＤＮＡと再結合することが困難であることから生じ、それは、Ｋｄ（ＤＮＡ）が低いことによる可能性が最も高いことを示唆している。
【０１６５】
ポリメラーゼが結合した場合に、二本鎖ＤＮＡと接触することができる塩基性残基を変異させて（すなわち、Ｒ７１３及びＲ７４３）、この機能性を取り除くと、その結果、突発性の動態のみを示す変異酵素（Ｒ７１３Ａ及びＲ７４３Ａ）を得る。我々は、これを、ｉ）ＤＮＡに対する親和性を低下させること（Ｋｄ（ＤＮＡ）の増加）によって、ＤＮＡに関する解離及び再結合の酵素の能力が改良されている；及び／又はｉｉ）これらの変異体においてＤＮＡに対する親和性が低下し、その結果、ポリメラーゼ調製物中に、より大きな「活性な酵素」の画分を得た、の２つのうちの１つの様式であると解釈する。（溶解から持ち込まれた大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のゲノムＤＮＡで汚染されている）不純なＤＮＡポリメラーゼは、調製物の活性な酵素の画分が減少することによって酵素を阻害することが示されている。
【０１６６】
時間経過を大まかにつき合わせると、クローン９及びＫ７０５Ａについて認められた突発相の観察された速度定数は同等である（ｋｏｂｓ  〜  ０．０６  Ｓ−１）が、このような速度定数は、Ｒ７１３Ａ（ｋｏｂｓ  〜  ０．０１  Ｓ−１）及びＲ７４３Ａ（ｋｏｂｓ  〜  ０．００４／  Ｓ−１）については、より小さいことが示唆されている。これらの実験条件下では、突発は、クローン９及びＫ７０５Ａに関しての方が、Ｒ７１３Ａ又はＲ７４３Ａよりも、速いが、後者の２種の酵素は、クローン９及びＫ７０５Ａに固有の緩慢な、線形の解離／再結合の相が存在しないことから、より短時間で完了に達する。
【０１６７】
（実施例５−洗浄アッセイ）
洗浄アッセイを用いて、精製した酵素調製物のＤＮＡに対する親和性を定性的に評価する。２ｐｍｏｌの５’−アミノＡ−鋳型ヘアピン、オリゴ８１５
（５’Ｈ２Ｎ−ＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＧＣＧ−３’）（配列番号１８）を用いて、メーカーのプロトコールに従って、４本のＮＵＮＣ−ヌクレオリンクストリップ（１×８）に機能性をもたせた。
【０１６８】
洗浄後、各ウェルを、２０μｌの５００ｎＭの酵素（クローン９、Ｋ７０５Ａ、Ｒ７１３Ａ又はＲ７４３Ａの変異体）と共に４５℃にて、３０分間インキュベートした。インキュベート後、各ウェルを、種々の濃度（０、０．０５、０．１、０．３、０．４、０．７５、１．０、２．０Ｍ）のＮａＣｌを含む、１００ｍｌの１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＥＤＴＡを用いて３回洗浄し、次いで、１００ｍｌのミリＱ水を用いて３回洗浄した。次いで、ウェルを、酵素学的緩衝液を用いて、あらかじめ平衡化してから、さらに、２０μｌの２μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−６４７を用いて、４５℃にて、３０分間インキュベートした。ウェルを、１００ｍｌの高塩洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて３回洗浄し、次いで、１００ｍｌのミリＱ水を用いて３回洗浄した。ストリップを、Ｔｙｐｈｏｏｎ蛍光イメージャー（ｙ５フィルター、ＰＭＴ＝５００Ｖ）上で走査した。
【０１６９】
（結果）
ＮＵＮＣ製ウェルの蛍光画像を、図６に示す。
【０１７０】
ウェルの蛍光はいずれも、洗浄後に、表面結合ＤＮＡに結合して残留する酵素が原因である。インキュベートの間に洗浄緩衝液のイオン強度を増加させると、静電気的な相互作用の遮蔽によって、ポリメラーゼとＤＮＡとの間の相互作用が不安定化するはずである。酵素は、イオン強度が高いほど、効率的に洗い流されるはずである。
【０１７１】
インキュベートの間に低いイオン強度で洗浄すると、試験した酵素は全て、高いレベルの取り込みを示し、したがって、ＤＮＡからの酵素の解離には無効であった。洗浄緩衝液中のＮａＣｌ濃度を増加させると、酵素間で挙動が変化した。変異酵素であるＲ７１３Ａ及びＲ７４３Ａは、［ＮａＣｌ］＜２００ｍＭで、ＤＮＡからより効果的に解離したが、Ｋ７０５Ａ及びクローン９は、相互に同様な応答を示し、ＤＮＡから解離するためには、より高い［ＮａＣｌ］を要した。クローン９については、２Ｍ  ＮａＣｌを用いた洗浄後でさえ、０Ｍ  ＮａＣｌを用いた洗浄と比較して、顕著なレベル（およそ７５％）の取り込みを観察した。このことは、図７に示すプロットに明確に示されている（Ｋ７０５Ａのデータは、明確さのために省略されている）。興味深いことに、２Ｍ  ＮａＣｌを用いた洗浄を経た後でも、試験した酵素の中で、ＤＮＡからの完全な解離を示した酵素は１つもなかった。
【０１７２】
本実験から、残基Ｒ７１３及びＲ７４３を変異させた結果、より低いイオン強度の洗浄によってＤＮＡから洗い流される能力によって立証されるように、クローン９より低いＤＮＡに対する親和性を示す酵素を得ることが明らかである。
【０１７３】
（実施例６−クローン９、Ｒ７１３Ａ及びＲ７４３ＡによるｆｆＴ−Ｎ３−ｃｙ３の取り込み反応速度論）
酵素反応速度論の特徴付けを、ＮＵＮＣ製チューブのアッセイを使用して行い、種々の［ｆｆＴＴＰ］における［ＤＮＡ］＜＜［ｐｏｌ］又は［ｆｆＮＴＰ］の場合の、ｆｆＴ  Ｎ３  ｃｙ３の一次の取り込みの速度定数を測定した。以下に、試験した３種のポリメラーゼのそれぞれに使用した方法を記載する。
【０１７４】
２ｐｍｏｌの５’−アミノＡ鋳型ヘアピンオリゴ８１５（５’Ｈ２Ｎ−ＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＡＴＣＡＣＧＣＴＧＡＴＧＴＧＣＡＴＧＣＴＧＴＴＧＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＧＣＡＴＧＣＡＣＡＴＣＡＧＣＧ−３’）（配列番号１８）を用いて、メーカーのプロトコールに従って、６本のＮＵＮＣ製ヌクレオリンクストリップ（１×８）に機能性をもたせた。
【０１７５】
各ストリップを、特定の［ｆｆＴ−Ｎ３−ｃｙ３］における時間経過実験に用いた。２０μｌの酵素学的緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、６ｍＭ  ＭｇＳＯ４、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０）を、各ＮＵＮＣ製のウェル内で、４５℃にて、２分間インキュベートした。
【０１７６】
４５℃にて、２分間、あらかじめ平衡化した各２０μｌの２×酵素学的混合液（酵素学的緩衝液中のＸ  μＭ  ｆｆＴ−Ｎ３−ｃｙ３、１．１μＭポリメラーゼ）を、個別のウェルで同一の時点で反応を開始するために、８チェネルマルチピペット使用して添加することによって、時間経過を開始した。２×酵素学的混合液をウェル内の緩衝液に添加する動作は、混合を適切に行うのに十分である。所望の時点で、１２５μｌの２５０ｍＭ  ＥＤＴＡを添加することによって、反応を停止した。８つのウェル全ての反応を停止した後、ストリップを、１００ｍｌの高塩洗浄緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０、１Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を用いて３回洗浄し、次いで、１００ｍｌのミリＱ水を用いて３回洗浄した後、Ｔｙｐｈｏｏｎ蛍光イメージャー（Ｃｙ３フィルター、ＰＭＴ＝５００Ｖ）上で走査した。各ウェルの蛍光強度を、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔを使用して定量化した。Ｃｙ３の蛍光強度の変化を、時間に対しプロットして、時間経過のグラフを得る。我々の実験条件下では、これらの時間経過のプロットは、単一の指数関数的な減衰過程（式：ｙ＝ｙｏ＋Ａｅｘｐ（ｘ／ｔ）に当てはまる）を十分に評価し、これから反応の半減期ｔが決定され、その逆数は、実測した速度定数ｋｏｂｓ（ｋｏｂｓ＝１／ｔ）と名付けられている。
【０１７７】
実測した速度定数の大きさは、ｆｆＴ−Ｎ３−ｃｙ３の濃度によって決まり、したがって、本実験を異なるｆｆＴ−Ｎ３−ｃｙ３の濃度で繰り返すことによって、特定の酵素について、所与の範囲のｋｏｂｓ値を決定することができる。ｆｆＴ−Ｎ３−ｃｙ３の濃度に伴うｋｏｂｓの変化は、双曲線であり、標準的な酵素学的解析によるミカエリスメンテン式：Ｖｍａｘ＝（ｋｐｏｌ×［Ｓ］）／（Ｋｄ＋［Ｓ］）、ここでは、Ｓ＝ｆｆＴ  Ｎ３−ｃｙ３、によく当てはまる。ミカエリスのプロットから、特定の反応を触媒する特定の酵素に特徴的である重要な値、すなわち、ｋｐｏｌ（無限の基質濃度における当該の過程の速度定数と定義される）及びＫｄ（解離定数、ｋｐｏｌ／２における基質の濃度と定義される）を得ることができる。この過程を、クローン９、Ｒ７１３Ａ及びＲ７４３Ａについて繰り返した。
【０１７８】
全ての酵素のミカエリスのプロットを、図８に重複させて示す。
【０１７９】
（結果）
試験した酵素に関するｆｆＴ−Ｎ３−ｃｙ３の取り込みの反応速度論的な特徴を、以下にまとめる。
【０１８０】
【表１】
2008539750.tif 000005
【０１８１】
これから、ポリメラーゼのＤＮＡ結合領域への変異は、酵素の活性（高い基質濃度では、ｋｐｏｌはＶｍａｘに近づく）に対しても、酵素が完全に機能的なヌクレオチド（この場合は、ｆｆＴ−Ｎ３−ｃｙ３であるが、本動向は全ての塩基に当てはまるとみなされる）に対して有する親和性に対しても、不利に影響することはないようである。変異は、酵素のＤＮＡ結合親和性を改変する望ましい効果を有しているが、その他の重要な触媒特性には影響しないことから、これは、理想的な状態である。
【０１８２】
（実施例７−ポリメラーゼの精製及び持ち越し汚染ＤＮＡのレベルの測定）
（ＤＮＡ汚染）
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎアッセイ
（  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓキット、カタログ番号Ｐ１１４９６）
【０１８３】
（必要な溶液）
ＴＥ緩衝液
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ  ＨＣｌ  ｐＨ７．５
１ｍＭ  ＥＤＴＡ
４０ｍＬを必要とし、２ｍＬの２０×ＴＥ緩衝液を３８ｍＬのＨ２Ｏに添加する
【０１８４】
（λＤＮＡ）
溶液１（２μｇ／ｍＬ  λＤＮＡ）：１５μＬのλＤＮＡを、７３５λＬの１×ＴＥ緩衝液で希釈する。
溶液２（５０ｎｇ／ｍＬ  λ）：２５μＬのλＤＮＡを、９７５μＬの１×ＴＥ緩衝液で希釈する。
【０１８５】
（検量線）
２ｍＬのエッペンドルフチューブ内に、以下の検体を調製した：
【０１８６】
【表２】
2008539750.tif 000006
【０１８７】
各検体から、５００μＬを３回採り、３本のエッペンドルフチューブ入れた。
【０１８８】
（酵素検体）
５ｍＬの小型の瓶内に、以下の検体を調製した：
【０１８９】
【表３】
2008539750.tif 000007
【０１９０】
各検体から、５００μＬを２回採り、２本のエッペンドルフチューブ入れた。
【０１９１】
８５μＬのＰｉｃｏＧｒｅｅｎ原液を、１７ｍＬの１×ＴＥ緩衝液に添加して、
ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ溶液を調製した。
【０１９２】
５００μＬのこの溶液を、検量線用検体及び酵素検体のそれぞれに添加し、ピペットによってよく攪拌した後、全ての検体を、１．５ｍＬの蛍光光度計のキュベットへ移した。
【０１９３】
（蛍光光度計の使用）
新型の読み取りプログラムであるＣａｒｙ  Ｅｃｌｉｐｓｅファイルを用いた。励起波長を４８０ｎｍに設定し、発光波長を５２０ｎｍに設定し、１０００ボルトを使用した。
【０１９４】
（分析）
検量線用のデータを、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍに入力した。式：ｙ＝ａｘ＋ｃの検量線を当てはめた。次いで、濃度の値であるｘを決定した。
【０１９５】
（結果）
【０１９６】
【表４】
2008539750.tif 000008
【０１９７】
本実験から、精製中に内在性ＤＮＡによる持ち越し汚染が減少することから、ポリメラーゼの変化によって酵素の精製が向上されることが明らかである。上記で述べたように、内在性ＤＮＡの持ち越し汚染は、酵素の活性に不利な影響を及ぼすことができるので、変異は明らかに利点をもたらす。
【０１９８】
（実施例８：クローン９のポリメラーゼをコードする、コドンの使用を最適化した、改変ヌクレオチド配列の調製）
配列番号１に示すアミノ酸配列を、要求される／望ましいアミノ酸をコードする各コドンにおいて最適な核酸配列を使用して、核酸配列に翻訳した。
【０１９９】
推定される核酸配列を、配列番号１９に示す。
【０２００】
同様の筋書で、配列番号２０に示す核酸配列も、配列番号２１に示すポリメラーゼのアミノ酸配列に基づいて推定した。配列番号２１に示すポリメラーゼのアミノ酸配列を有するポリメラーゼは、Ｒ７４３Ａの変異を含み、さらに、残基１４１及び１４３の両方におけるセリンへの置換変異も保有する。それぞれのヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を含む核酸分子及びタンパク質は、本発明の一部を形成する。
【０２０１】
（クローン９のコドン改変遺伝子を、発現ベクターｐＥＴ１１−ａ内に、ＮｄｅＩ−Ｎｈｅ  Ｉ部位を使用してクローン化する（内部Ｂａｍ  Ｈ  Ｉ部位は保存する））
（クローン９のコドン最適化遺伝子の合成）
配列番号１９の核酸配列は、ＧＥＮＥＡＲＴによって、合成され、ｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔに供給された。ＤＮＡ配列及びタンパク質配列を確認した（結果は表示されていない）。
【０２０２】
（ｐＳＶ５７（ｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔベクター中のクローン９のコドン改変遺伝子）をｐＥＴ１１−ａ内にクローン化する（以下、ｐＳＶ５２と呼ぶ））
（ｐＥＴ１１−ａベクターの調製）
ｐＥＴ１１−ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、カタログ番号６９４３６−３）を、Ｎｄｅ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉを用いて消化し、脱リン酸化し、未消化のベクターをいずれも、標準的な手法を使用してライゲーションした。
【０２０３】
消化されたベクターを、０．８％アガロースゲル上で、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）製のＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）ゲル抽出キットのプロトコールを使用して精製した。
【０２０４】
精製した消化されたｐＥＴ１１−ａベクターを、ポリアクリルアミドＴＢ  ４−２０％ゲルを使用して定量した。
【０２０５】
（挿入断片（クローン９のコドン改変遺伝子）の調製）
ｐＰＣＲＳｃｒｉｐｔベクター中の、ＧＥＮＥＡＲＴによって合成されたクローン９のコドン改変遺伝子（以下、ｐＳＶ５７）を、Ｎｄｅ  Ｉ及びＮｈｅを用いて消化した。
【０２０６】
消化された挿入断片を、０．８％アガロースゲル上で、Ｑｉａｇｅｎ（登録商標）製のＭｉｎＥｌｕｔｅ（登録商標）ゲル抽出キットのプロトコールを使用して精製した。
【０２０７】
精製した消化された挿入断片を、ポリアクリルアミドＴＢ  ４−２０％ゲルを使用して定量した。
【０２０８】
（ライゲーション）
ｐＥＴ１１−ａベクター及び挿入断片を、Ｎｄｅ  Ｉ及びＮｈｅ  Ｉの制限部位において、Ｑｕｉｃｋライゲーションキット（ＮＥＢ、Ｍ２２００Ｓ）を使用してライゲーションした（１：３の比）。
【０２０９】
（形質転換）
２μｌのライゲーション混合液を使用して、ＸＬ１０−ｇｏｌｄウルトラコンピテント細胞（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２００３１５）を形質転換した。挿入断片を含有するコロニーのＰＣＲスクリーニング。
【０２１０】
形質転換体を拾い、ライゲーション産物で形質転換したＸＬ１０−ｇｏｌｄの３種の陽性クローンのＤＮＡのミニプレップを調製した。３種の精製したプラスミド（以下、ｐＳＶ５２、クローン１、２及び４は、クローン化部位でシークエンシングし、３種のクローンの全てが、クローン化部位に正しい配列を有することを見出した。
【０２１１】
また、ミニプレップを使用して、以下に記載するように、発現大腸菌宿主ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２３０２４５）も形質転換した。
【０２１２】
（サザンブロット法）
ｐＶｅｎｔ（ｐＮＥＢ９１７由来ベクター）、ｐＳＶ４３（ｐＥＴ１１−ａ中のクローン９）、ｐＳＶ５４（ｐＥＴ１１−ａ中のコドン最適化クローン）、及びｐＳＶ５７（ＧＥＮＥＡＲＴによって供給されたｐＰＣＲ−Ｓｃｒｉｐｔ中のコドン改変遺伝子）を、制限酵素処理し（ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ）、サザンブロットして、遺伝子間のクロスハイブリダイゼーションを調べた（結果は表示されていない）。
【０２１３】
（Ｐｏｌ５２の発現研究）
ｐＳＶ５２（クローン１、２及び４）を、発現宿主大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）ＲＩＬ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、カタログ番号２３０２４５）へ形質転換。
【０２１４】
２１−２５ｎｇの精製したｐＳＶ５２プラスミドＤＮＡ（クローン１、２及び４）を使用して、発現宿主大腸菌ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）ＲＩＬのコンピテント細胞（以下、ＲＩＬ）を、メーカーの指示を使用して形質転換した。
【０２１５】
５０μｌの各形質転換を、１００μｇ／ｍｌのカルベニシリン及び３４μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する新鮮なＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）寒天培養液（ＬＢＣＣ寒天培養液）上に蒔き、３７℃にて、一晩インキュベートした。
【０２１６】
また、以下のグリセロール原液も、発現研究用の対照として使用するためにＬＢＣＣ寒天プレート上に蒔き、３７℃にて、一晩インキュベートした。
【０２１７】
ＳＯＬ１０２０４：ＲＩＬ−ｐＳＶ１９（ｐＮＥＢ９１７ベクター中のクローン９）
ＳＯＬ１０３５４：ＲＩＬ−ｐＳＶ４３（ｐＥＴ１１−ａベクター中のクローン９）
【０２１８】
（Ｐｏｌ５２及びクローン９の陽性対照を発現する細胞ペレットの調製）
単一の形質転換した大腸菌コロニーを使用して、３ｍｌのＬＢＣＣ培養液のスターターカルチャーを、カルチャーチューブ内に播種し、振とう（２２５ｒｐｍ）しながら、３７℃にて、一晩インキュベートした。
【０２１９】
スターターカルチャーを、無菌の通気三角フラスコ中で、５０ｍＬのＬＢＣＣ培養液中に１／１００希釈し、ＯＤ６００ｎｍがおよそ１．０になるまで、激しく振とう（３００ｒｐｍ）しながら、３７℃にて、およそ４時間インキュベートした。
【０２２０】
１０ｍｌの未誘導の培養液を取り出し、（下記に記載するように）細胞を回収した。
【０２２１】
ＩＰＴＧを、１ｍＭの最終濃度で添加し、培養液を、激しく振とう（３００ｒｐｍ）しながら、３７℃にて、２時間誘導した。
【０２２２】
１０ｍｌの誘導した培養液を取り出し、以下のように細胞を回収した。
【０２２３】
未誘導の細胞及び誘導細胞を、５０００×ｇで、４℃にて、３０分間遠心分離することによって回収した。
【０２２４】
細胞ペレットを洗浄し、培養液の容積の１／１０の１×リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中に再懸濁させた後、上記のように遠心分離した。
【０２２５】
上清をデカントし、ペレットを、細胞の溶解及び精製のステップまで、−２０℃にて保存した。
【０２２６】
（Ｐｏｌ５２及びクローン９の細胞の溶解及び粗精製）
細胞ペレットを解凍し、培養液の容積の１／５０の１×洗浄緩衝液（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、５０ｍＭグルコース、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）であって、新たに添加された４ｍｇ／ｍｌのリゾチームを含有する１×洗浄緩衝液中に、再懸濁させた後、室温にて、１５分間インキュベートした。
【０２２７】
等容積の１×溶解緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．９、５０ｍＭ  ＫＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ  ２０）であって、０．５％（ｗ／ｖ）Ｔｅｒｇｉｔｏｌ  ＮＰ−４０及び１×「ＥＤＴＡを全く含有しない」プロテイナーゼ阻害剤のカクテルを含有する（両方を、１×溶解緩衝液に新たに添加した）１×溶解緩衝液を、細胞に添加した後、穏やかに混合し、室温にて、３０分間インキュベートした。
【０２２８】
細胞を、水浴中で、８０℃にて、１時間加熱した後、３８，８００×ｇで、４℃にて、３０分間遠心分離して、細胞の残骸及び変性したタンパク質を除去した。
【０２２９】
（容積及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの分析に用いる規準化した検体の調製）
Ｐｏｌ５２及びクローン９のＤＮＡポリメラーゼの発現を、未誘導及び誘導の対照検体の粗溶菌液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、次いで、クーマシーブルーで染色することによって評価した。
【０２３０】
上清を注意深く除去し、５０：５０（ｖ／ｖ）の１×洗浄緩衝液及び１×溶解緩衝液を添加して、最終容積を３７０μｌとすることによって、検体の容積を規準化した。
【０２３１】
（ゲル  Ｉに用いる検体の調製）
１０μｌの（未誘導検体及び誘導検体からの）規準化した粗溶菌液を、１４３ｍＭ  ＤＴＴを含有する１０μｌのローディング緩衝液（ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）と混合した。
【０２３２】
（ゲル  ＩＩに用いる検体の調製）
誘導検体からの規準化した粗溶菌液のみを、蒸留水中で１／１０に希釈し、最終容積を１０μｌとし、１４３ｍＭ  ＤＴＴを含有する１０μｌのローディング緩衝液と混合した。
【０２３３】
全ての検体を、７０℃にて、１０分間加熱した。
【０２３４】
（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
ＮｕＰａｇｅ（登録商標）４−１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＮＰ０３２１ＢＯＸ）を、メーカーの指示に従って調製した。
【０２３５】
１０μｌのＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標）Ｐｌｕｓ２染色済みタンパク質標準物質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ５９２５）及びμｌの各検体を添加し、ゲルを、定電圧（ｃｏｎｓｔａｎｔ）２００Ｖで、５０分間泳動（ｒｕｎ）した。
【０２３６】
ゲルを、クーマシーブルー（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ（商標）Ｓａｆｅ染色、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号ＬＣ６０６０）で染色した。
【０２３７】
（結果）
ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果を、図１０に示す。
本実験で推定される発現レベルは、培養液中２０ｍｇ／Ｌである。
発現ベクターｐＥＴ１１−ａを使用して、大腸菌宿主ＢＬ２１−ＣｏｄｏｎＰｌｕｓ（ＤＥ３）−ＲＩＬ（Ｐｏｌ５２）中のクローン９のコドン改変遺伝子の同様の発現レベルが、発現ベクターｐＮＥＢ９１７（Ｐｏｌ１９）又はｐＥＴ１１（Ｐｏｌ４３）のいずれかを使用した同一の細胞中のクローン９の未改変の遺伝子と比較した場合に、得られた。
【０２３８】
Ｐｏｌ５２の３種の異なるクローンの発現レベルについては、顕著な差は認められなかった。
【図面の簡単な説明】
【０２３９】
【図１Ａ】図１は本発明の変異酵素の過剰発現を示す。
【図１Ｂ】図１は本発明の変異酵素の過剰発現を示す。
【図２】図２は変異酵素の粗調製物を使用したＮＵＮＣ製チューブのアッセイの結果を示す。
【図３Ａ】図３は変異酵素を用いた一塩基取り込みアッセイの結果を示す。
【図３Ｂ】図３は変異酵素を用いた一塩基取り込みアッセイの結果を示す。
【図４】図４は変異酵素の活性のさらなる提示である。
【図５】図５は対照ポリメラーゼ（ＹＡＶ）及び３種の変異酵素（Ｋ７０５Ａ、Ｒ７１３Ａ及びＲ７４３Ａ）のそれぞれについて、［ＤＮＡ］＞［ｐｏｌ］（５：１の比）における一塩基取り込みアッセイの時間経過の結果を示す。
【図６】図６はＮＵＮＣ製ウェルの蛍光画像を用いて、洗浄アッセイの結果を示す。
【図７】図７はそれぞれのポリメラーゼのＤＮＡ鋳型に対する親和性を示す、洗浄アッセイの結果を示す（Ｋ７０５Ａのデータは、明確さのために省略されている）。
【図８】図８はポリメラーゼ酵素の反応速度論的特徴を示す、ミカエリスプロットを示し、酵素を重複させて示す。
【図９−１】図９はクローン９のコドン改変遺伝子がコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図９−２】図９はクローン９のコドン改変遺伝子がコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図９−３】図９はクローン９のコドン改変遺伝子がコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図９−４】図９はクローン９のコドン改変遺伝子がコードするヌクレオチド配列及びアミノ酸配列を示す。
【図１０】図１０はＳＤＳ−ＰＡＧＥ実験の結果を示す。未誘導の培養液（ゲルＩ）及び誘導の培養液（ゲルＩ、ＩＩ）の粗溶菌液中で、Ｐｏｌ５２（ｐＥＴ１１−ａ発現ベクター中で発現させたクローン９のコドン改変遺伝子）の３種のクローン（１、２及び４）の発現を、Ｐｏｌ１９（ｐＮＥＢ９１７発現ベクターから発現させたクローン９の遺伝子）及びＰｏｌ４３（ｐＥＴ１１−ａ発現ベクターから発現させたクローン９の遺伝子）と比較した。  略語：ＭＷ−分子量；ＰＭ−タンパク質マーカー；ｃｌ  ９−クローン  ９
【０２４０】
（参考文献）
・  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  Ｔ７  ＤＮＡ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ａｔ  ２．２Å  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ．
Ｄｏｕｂｌｉｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８．Ｎａｔｕｒｅ  ３９１，２５１．
・  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃ−ｔｅｒｍｉｎｕｓ  ｏｆ  Ｐｈｉ２９  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｉｎ  ＤＮＡ  ａｎｄ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ．
Ｔｒｕｎｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２００４．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３２，３７１．
・  Ａ  ｔｈｕｍｂ  ｓｕｂｄｏｍａｉｎ  ｍｕｔａｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌａｒｇｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＤＮＡ．ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ｗｉｔｈ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ＤＮＡ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｆｆｉｎｉｔｙ，ｐｒｏｃｅｓｓｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｆｒａｍｅｓｈｉｆｔ  ｆｉｄｅｌｉｔｙ．
Ｍｉｎｎｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１．２４９５４．
・  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｋｌｅｎｏｗ  ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｉ  ｆｒｏｍ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ．
Ｐｏｌｅｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９０．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５，１４５７９．
・  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ｍａｒｉｎｅ  ａｒｃｈａｅａ  ｗｉｔｈ  ｅｍｐｈａｓｉｓ  ｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７  ａｎｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ３’−５’ｅｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．
Ｓｏｕｔｈｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９９６．ＰＮＡＳ．９３，５２８１
・  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌ  ａｌｐｈａ  ｆａｍｉｌｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ．
Ｆｒａｎｋｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２００１．Ｃｅｌｌ  １０５，６５７．
・  Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ａ  ｐｏｌ  ａｌｐｈａ  ｆａｍｉｌｙ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｉｃ  ａｒｃｈａｅｏｎ  Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．９°Ｎ−７．  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９９，４７１．
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図９−４】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図６】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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