(57)【要約】  本開示は、免疫抑制活性が、例えば、シクロスポリン（ＣｓＡ）などのＴＧＦ−βのアップレギュレーションを介して仲介される免疫抑制剤の腎毒性の副作用を緩和する方法に関する。本開示は、免疫抑制を必要とする患者、例えば、移植拒絶の危険性にあるかまたは自己免疫疾患の患者に使用するための処置の様相を提供する。本発明の方法では、ＴＧＦ−βアンタゴニスト、例えば、抗ＴＧＦ−β抗体は、免疫抑制剤によって処置される患者に投与される。そのようなＴＧＦ−βアンタゴニストは、薬剤の免疫抑制活性を実質的に妨げずに免疫抑制剤の腎毒性作用を緩和するのに十分な治療有効量で投与される。
2008513542.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫抑制の必要があり、免疫抑制剤で処置される哺乳動物において免疫抑制剤によって誘発される腎炎を処置または防止する方法であって、哺乳動物に、薬剤の免疫抑制活性を実質的に妨げずに免疫抑制剤の腎毒性作用を緩和するのに十分な治療有効量のＴＧＦ−βアンタゴニストを投与することを含んでなる、方法。
【請求項２】
哺乳動物がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物に投与する場合、免疫抑制剤がＴＧＦ−βの発現を誘導する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
免疫抑制剤が、シクロスポリン、タクロリムス、およびシロリムス、または薬学的に許容可能なその誘導体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
シクロスポリンがシクロスポリンＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＴＧＦ−βアンタゴニストが、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−β受容体抗体、および可溶性ＴＧＦ−β受容体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
抗体が１Ｄ１１またはそのヒトもしくはヒト化誘導体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
抗体がＣＡＴ１９２またはその誘導体である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
哺乳動物が自己免疫障害を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
哺乳動物が移植を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
移植が同種移植片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
移植が、心臓、腎臓、肺、肝臓、角膜、骨髄、血管および膵島細胞移植からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ＴＧＦ−βアンタゴニストが、免疫抑制剤の非存在下で腎炎を処置するために推奨される用量より低い用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
ＴＧＦ−βアンタゴニストが投与される用量が、免疫抑制剤の非存在下で腎炎を処置するために推奨される用量より少なくとも２０％低い、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＴＧＦ−βアンタゴニストが、免疫抑制剤の非存在下で通常投与される最大値治療有効量の少なくとも３０％未満の用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＴＧＦ−βアンタゴニストが、ラットに投与される場合、１Ｄ１１抗体の２ｍｇ／ｋｇ体重に等価な用量未満の用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ＴＧＦ−βアンタゴニストが、ラットに投与される場合、１Ｄ１１抗体の１ｍｇ／ｋｇ体重に等価な用量で投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
抗ＴＧＦ−β抗体をヒトに投与することを含んでなる、ヒトを処置する方法であって、ヒトが、移植を有し、かつシクロスポリン、タクロリムス、およびシロリムス、または薬学的に許容可能なその誘導体からなる群から選択される免疫抑制剤による免疫抑制療法を経験している、方法。
【請求項１９】
ＴＧＦ−β抗体の投与による拒絶の危険性が治療的に許容可能である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
免疫抑制剤の腎毒性作用の低減が治療的に許容可能である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
免疫抑制を必要とする患者に投与される免疫抑制剤によって誘発される腎炎を処置または防止するためのＴＧＦ−βアンタゴニストの使用。
【請求項２２】
免疫抑制を必要とする患者に投与される免疫抑制剤によって誘発される腎炎を処置または防止するための医薬品の製造におけるＴＧＦ−βアンタゴニストの使用。
【請求項２３】
免疫抑制剤の腎毒性を検出する方法であって、
（ａ）免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｕｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）が投与されている哺乳動物から生物学的サンプルを入手すること、および
（ｂ）ＴＧＦ−β、ＮＯＸ−１、ｐ２２ｐｈｏｘ、ＲＡＣ−１、ＳＯＤ、およびＴＲＸからなる群から選択される１つもしくはそれ以上の分子の発現レベルを決定すること、
を含んでなり、
発現レベルが哺乳動物に対して腎毒性であるかどうかを示す、方法。
【請求項２４】
免疫抑制剤の腎毒性を低減する能力について組成物の化合物を評価する方法であって、
（ａ）免疫抑制剤（ｉｍｍｕｎｕｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｇｅｎｔ）および試験化合物または組成物が投与されている哺乳動物から生物学的サンプルを入手すること、および
（ｂ）ＴＧＦ−β、ＮＯＸ−１、ｐ２２ｐｈｏｘ、ＲＡＣ−１、ＳＯＤ、およびＴＲＸからなる群から選択される１つもしくはそれ以上の分子の発現レベルを決定すること、
を含んでなり、
発現レベルが、試験化合物または組成物は、免疫抑制剤の腎毒性を低減するのに有効であるかどうかを示す、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２００４年９月２２日に出願された米国仮出願第６０／６１２，１８７号明細書（参考としてその全体が本明細書に引用される）に対し優先権を主張する。
【０００２】
本発明の技術分野は、臓器移植（移植学）、臨床免疫学、および腎臓病学の分野に関する。本発明は、シクロスポリンを含む所定の免疫抑制剤の腎毒性の副作用を低減する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
免疫抑制は、組織／臓器移植ならびに自己免疫および炎症性障害の治療における拒絶の危険性を低減するために日常的に使用される。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、現在最も広範に使用されている免疫抑制剤である。タクロリムス（ＴＡＣ）（ＦＫ５０６としても公知である）およびシロルムス（ｓｉｒｏｌｕｍｕｓ）（ラパマイシンとしても公知である）は、他の２つの一般に使用される免疫抑制薬である。多様な免疫抑制療法のレビューについては、例えば、シュウアマン（Ｓｃｈｕｕｒｍａｎ）ら（２００１年）Ｍｏｄｅｒｎ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅｓ（Ｍｉｌｅｓｔｏｎｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ），Ｂｉｒｋｈａｕｓｅｒ，Ｂｏｓｔｏｎ；およびセイグ（Ｓａｙｅｇｈ）ら（２００１年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｎｄ  Ｆｕｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  Ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓを参照のこと。
【０００４】
改善された治療ストラテジーが開発されているが、免疫抑制剤に関連する有害な副作用については重要な課題として残されたままである。腎毒性は、多くの免疫抑制療法、特に、カルシニューリンインヒビターを利用する療法の重大な合併症である。
【０００５】
急性シクロスポリン（ＣｓＡ）毒性は、糸球体濾過量（ＧＦＲ）および腎血流の減少、低マグネシウム血症、ならびに尿細管損傷を特徴とする腎炎を引き起こす。同様に、慢性ＣｓＡ毒性は、間質の繊維化、管萎縮、および動脈虚血などの管変化を特徴とする進行性の状態の腎機能障害を生じる。これらの変化は、最終的に、末期の腎疾患および腎不全をもたらす。腎毒性は、例えば、タクロリムス（例えば、イングリッシュ（Ｅｎｇｌｉｓｈ）ら（２００２年）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，２：７６９−２７３を参照のこと）およびシロルムス（ｓｉｒｏｌｕｍｕｓ）（例えば、フェルベンザ（Ｆｅｒｖｅｎｚａ）ら（２００４年）Ｎｅｐｈｒｏｌ．Ｄｉａｌ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，１９（５）：１２８８−１２９２を参照のこと）で処置された移植レシピエントにおいて観察された。
【０００６】
最近の研究は、ＣｓＡ、タクロリムス、およびラパマイシンを含む所定の免疫抑制薬の免疫抑制活性ならびに／または腎毒性の両方のメディエーターとしてのトランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）に関与している（カナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（２０００年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７０（４）：９０−６９４）。抗ＴＧＦ−β抗体の投与によるＣｓＡ腎毒性の非移植モデルにおいてＴＧＦ−βをブロックすることによって、組織線維化全体が実質的に低減することが示された（カナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６７：８８２−８８９；イスラム（Ｉｓｌａｍ）（２００１年）５９：４９８−５０６；リング（Ｌｉｎｇ）ら（２００３年）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１４：３７７−３８８）が、しかし、それはまた、薬剤の免疫抑制効果も阻害する。
【０００７】
腎毒性を低減する一方、このクラスの薬物における免疫抑制を保持することを目的とした多くの実験ストラテジーが試験されている。ＴＧＦ−βに関連するが間接的な機構によって腎毒性を和らげ得る薬剤として：ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）（シハブ（Ｓｈｉｈａｂ）ら（２００３年）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．，３：１５５０−１５５９）、スピロノラクトン（フェリア（Ｆｅｒｉａ）ら（２００３年）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．，６３：４３−５２）、ロサルタン（ヤン（Ｙａｎｇ）ら（２００３年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７５：３０９−３１５）、ビタミンＥ（ジェンキンズ（Ｊｅｎｋｉｎｓ）ら（２００１年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７１：３３１−３３４）、パーフェニドン（シハブ（Ｓｈｉｈａｂ）（２００２年）Ａｍ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，２：１１１−１１９）、およびアンギオテンシン受容体拮抗薬（バファ（Ｂｏｆｆａ）ら（２００３年）Ｊ．Ａｍ．Ｓｏｃ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１４：１１３２−１１４４）が挙げられる。しかし、完全に満足できるものはない。
【０００８】
従って、ＣｓＡまたは他の免疫抑制剤の腎毒性の低減を可能にする一方、それらの免疫抑制活性を維持する処置モダリティの必要性がある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＴＧＦ−βは、所定の免疫抑制剤の免疫抑制および腎毒性作用の両方を仲介する。この二重の活性のため、本発明より以前は、例えば、抗ＴＧＦ−β抗体などの直接的なＴＧＦ−βアンタゴニストによる補助療法がこれらの薬剤の腎毒性作用を十分に減少し得、同時にそれらの免疫抑制活性を実質的に妨げないかどうかについては不明であった。
【００１０】
本発明は、特に、臓器移植または自己免疫疾患について、免疫抑制剤の腎毒性を低減するための方法および組成物を提供する。従って、方法は、移植片拒絶を防止するかまたは自己免疫疾患を処置するために免疫抑制療法を経験している患者を処置するのに有用である。
【００１１】
本発明は、低（高ではない）用量の抗ＴＧＦ−β抗体が、同種移植生存率によって判定されるように、ＣｓＡの免疫抑制活性を実質的に妨げることなく、ＣｓＡ仲介腎毒性を軽減することの発見および実証に部分的に基づく。
【００１２】
本発明に関連して行われた実験では、心臓移植を施されたＣｓＡ免疫抑制ラットに抗ＴＧＦ−β抗体を投与した。より低い用量（１ｍｇ／ｋｇ）の抗ＴＧＦ−β抗体で処置されたラットは腎毒性作用の低減を実証した一方、それらの移植片生存率は、ＣｓＡ単独で処置したコントロールに類似した。同じ条件下で、より高い用量（２．５ｍｇ／ｋｇ）の抗ＴＧＦ−β抗体は、ＣｓＡの免疫抑制効果をほぼ完全に撤廃した。
【００１３】
従って、本発明は、少なくとも部分的に、ＴＧＦ−βのアップレギュレーションを介して、それらの免疫抑制活性を仲介する該免疫抑制剤の腎毒性の副作用の緩和のための補助療法を提供する。典型的に、そのような薬剤は、投与時に、ＴＧＦ−βの発現を誘発する。そのような免疫抑制剤の例として、シクロスポリン、タクロリムス、およびシロリムスが挙げられるが、これらに限定されない。本発明は、そのような薬剤によって誘発される腎炎を処置または防止する方法を提供する。
【００１４】
本発明の方法は、免疫抑制剤で処置される免疫抑制を必要とする哺乳動物に、ＴＧＦ−βアンタゴニストを投与することを含む。ＴＧＦ−βアンタゴニストは、薬剤の免疫抑制活性を実質的に妨げずに免疫抑制剤の腎毒性作用を緩和するのに十分な治療有効量で投与される。
【００１５】
ＴＧＦ−βアンタゴニストが投与される用量は、免疫抑制剤の腎毒性作用の低減が達成される一方、免疫抑制剤の治療効力を維持するようなものである。典型的に、ＴＧＦ−βアンタゴニストが投与される用量は、免疫抑制剤の非存在下で腎炎を処置するために投与される推奨用量より（例えば、２０％）低い。
【００１６】
いくつかの実施態様では、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、例えば、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−β受容体抗体、または可溶性ＴＧＦ−β受容体などの直接的なＴＧＦ−βアンタゴニストである。特定の実施態様では、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、抗ＴＧＦ−β抗体１Ｄ１１、抗ＴＧＦ−β抗体ＣＡＴ１９２、もしくは抗ＴＧＦ−β抗体ＣＡＴ１５２、または該抗体のいずれかの誘導体である。非制限的な好適な実施態様では、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、米国仮出願第６０／６５１，３４３号明細書において開示されているＰＥＴ１０７３Ｇ１２、ＰＥＴ１０７４Ｂ９またはＰＥＴ１２８７Ａ１０などのヒトｐａｎ特異的抗体である。
【００１７】
本発明は、免疫抑制剤の腎毒性を検出するための方法ならびに免疫抑制剤の腎毒性作用を低減する能力について試験化合物または組成物を評価するための方法をさらに提供する。そのような方法は、免疫抑制剤で処置した哺乳動物から生物学的サンプルを得ること、ならびにＴＧＦ−β、ＮＯＸ−１、ｐ２２ｐｈｏｘ、ＲＡＣ−１、ＳＯＤ、およびＴＲＸからなる群から選択される１つもしくはそれ以上の分子の発現レベルを決定することを含んでなる。発現レベルは、免疫抑制剤の腎毒性および／または該腎毒性を低減する際の化合物または組成物の有効性を示す。
【００１８】
配列の簡単な説明
配列番号１〜１２は、実施例において記載の腎臓における遺伝子発現レベルを評価するために使用されるＰＣＲプライマーを表す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本発明の方法は、免疫抑制剤で処置されている哺乳動物に、ＴＧＦ−βアンタゴニストを投与することを含む。本発明の方法は、免疫抑制薬剤による処置に関連する腎毒性を低減するが、薬剤の免疫抑制活性を実質的に低減しない。
【００２０】
ＴＧＦ−βアンタゴニスト
ＴＧＦ−βは、成熟ＴＧＦ−βを産生するために分泌前に切断される約４００アミノ酸（ａａ）のプレプロタンパク質として合成されるジスルフィド結合ダイマーである。「潜伏関連ペプチド」（ＬＡＰ）として公知であるＮ末端切断フラグメントは、ダイマーへの非共有結合を保持し得、それによって、ＴＧＦ−βを不活化する。インビボで単離されたＴＧＦ−βは、この不活性な「潜伏」形態（即ち、ＬＡＰに関連する）において主に見出される。潜伏ＴＧＦ−β複合体は、いくらかの方法、例えば、カチオン非依存性マンノース−６−リン酸／インスリン様増殖因子ＩＩ受容体と呼ばれる細胞表面受容体に結合することによって、不活化され得る。結合は、ＬＡＰ内のグリコシル化部位に付着したマンノース−６−リン酸残基を介して生じる。受容体に結合する際に、ＴＧＦ−βは、その成熟形態で放出される。次いで、成熟型の活性なＴＧＦ−βは、自由にその受容体に結合し、その生物学的機能を発揮する。ＩＩ型ＴＧＦ−β受容体における主要なＴＧＦ−β結合性ドメインは、１９アミノ酸配列にマッピングされている（ディミートリオウ（Ｄｅｍｅｔｒｉｏｕ）ら（１９９６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１２７５５）。
【００２１】
本明細書において使用される用語「ＴＧＦ−β」は、任意の１つもしくはそれ以上のアイソフォームのＴＧＦ−βを指す。同様に、他に明記しない限り、用語「ＴＧＦ−β受容体」は、少なくとも１つのＴＧＦ−βアイソフォームに結合する任意の受容体を指す。現在、５つの既知のＴＧＦ−βのアイソフォーム（ＴＧＦ−β１〜ＴＧＦ−β５）が存在し、それらのすべてが相互に相同（６０〜８０％同一性）であり、約２５ｋＤａのホモダイマーを形成し、共通のＴＧＦ−β受容体（ＴβＲ−Ｉ、ＴβＲ−ＩＩ、ＴβＲ−ＩＩＢ、およびＴβＲ−ＩＩＩ）に作用する。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３は哺乳動物において見出される。ＴＧＦ−βならびにＴＧＦ−β受容体の構造および機能的局面については、当該分野において周知である（例えば、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ、オペンハイム（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ）ら編、Ａｃａｄｅｍｉｃ  ＰｒｅｓｓＳａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州、２００１年を参照のこと）。ＴＧＦ−βは、種間で顕著に保存されている。例えば、ラットおよびヒト成熟ＴＦＧ−β１のアミノ酸配列はほぼ同一である。従って、ＴＧＦ−βのアンタゴニストは、高い種交差反応性を有することが予想される。
【００２２】
用語「ＴＧＦ−βアンタゴニスト」ならびに「インヒビター」、「中和する」、および「ダウンレギュレートする」などのその同系用語は、ＴＧＦ−βの生物学的活性のアンタゴニストとして作用する化合物（または該当する場合はその特性）を指す。ＴＧＦ−βアンタゴニストは、例えば、結合して、ＴＧＦ−βの活性を中和する；ＴＧＦ−β発現レベルを低減する；安定性または前駆体分子の活性な成熟型への変換に影響を及ぼす；ＴＧＦ−βの１つもしくはそれ以上の受容体への結合を妨げ得；またはそれはＴＧＦ−β受容体の細胞内シグナル伝達を妨げ得る。用語「直接的なＴＧＦ−βアンタゴニスト」は、一般的に、ＴＧＦ−βの生物学的活性を直接ダウンレギュレートする任意の化合物を指す。分子は、それが、ＴＧＦ−β遺伝子、ＴＧＦ−β転写物、ＴＧＦ−βリガンド、またはＴＧＦ−β受容体を妨げることによって活性をダウンレギュレートする場合、ＴＧＦ−βの生物学的活性を「直接ダウンレギュレートする」。
【００２３】
ＴＧＦ−βおよびＴＧＦ−βアンタゴニストの生物学的活性を中和することを評価するための方法は、当該分野において公知である。より頻繁に使用されるインビトロバイオアッセイのいくつかの例として、以下のものが挙げられる：
（１）ＥＧＦの存在下における軟寒天中のＮＲＫ細胞のコロニー形成の誘導（ロバーツ（Ｒｏｂｅｒｔｓ）ら（１９８１年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７８：５３３９−５３４３）；
（２）軟骨表現型を発現させるための初代間葉系細胞の分化の誘導（セイェヂン（Ｓｅｙｅｄｉｎ）ら（１９８５年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８２：２２６７−２２７１）；
（３）Ｍｖ１Ｌｕミンク肺上皮細胞（ダニエルポール（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ）ら（１９８９年）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１３８：７９−８６）およびＢＢＣ−１サル腎臓細胞（ホリー（Ｈｏｌｌｅｙ）ら（１９８０年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：５９８９−５９９２）の増殖の阻害；
（４）Ｃ３Ｈ／ＨｅＪマウス胸腺細胞の有糸分裂誘発の阻害（ラン（Ｗｒａｎｎ）ら（１９８７年）ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：１６３３−１６３６）；
（５）ラットＬ６筋芽細胞の分化の阻害（フロリニ（Ｆｌｏｒｉｎｉ）ら（１９８６年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６１：１６５０９−１６５１３）；
（６）フィブロネクチン産生の測定（ラナ（Ｗｒａｎａ）ら（１９９２年）Ｃｅｌｌ，７１：１００３−１０１４）；
（７）ルシフェラーゼレポーター遺伝子に融合されたプラスミノーゲンアクチベーターインヒビターＩ（ＰＡＩ−１）プロモーターの誘導（アベ（Ａｂｅ）ら（１９９４年）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２１６：２７６−２８４）；
（８）サンドイッチ酵素免疫測定法（ダニエルポール（Ｄａｎｉｅｌｐｏｕｒ）ら（１９８９年）Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ，２：６１−７１）；ならびに
（９）シング（Ｓｉｎｇｈ）ら（２００３年）Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１３（２４）：４３５５−４３５９に記載の細胞アッセイ。
【００２４】
本発明の方法において使用され得るＴＧＦ−βアンタゴニストの例として：ＴＧＦ−βの１つもしくはそれ以上のアイソフォームに対して指向されたモノクローナルおよびポリクローナル抗体（米国特許第５，５７１，７１４号明細書；国際公開第９７／１３８４４号パンフレット；国際公開第００／６６６３１号パンフレット；主要なネガティブおよび可能性のＴＧＦ−β受容体またはＴＧＦ−β受容体に対して指向された抗体（フラベル（Ｆｌａｖｅｌｌ）ら（２００２年）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２（１）：４６−５３）；米国特許第５，６９３，６０７号明細書；米国特許第６，００１，９６９号明細書；米国特許第６，００８，０１１号明細書；米国特許第６，０１０，８７２号明細書；国際公開第９２／００３３０号パンフレット；国際公開第９３／０９２２８号パンフレット；国際公開第９５／１０６１０号パンフレット；および国際公開第９８／４８０２４号パンフレット；ＬＡＰ（国際公開第９１／０８２９１号パンフレット）；ＬＡＰ関連ＴＧＦ−β（国際公開第９４／０９８１２号パンフレット）；フェチュインなどのＴＧＦ−β結合性糖タンパク質／プロテオグリカン（米国特許第５，８２１，２２７号明細書）；デコリン、バイグリカン、フィブロモデュリン、ルミカン、およびエンドグリン（米国特許第５，５８３，１０３号明細書；米国特許第５，６５４，２７０号明細書；米国特許第５，７０５，６０９号明細書；米国特許第５，７２６，１４９号明細書；米国特許第５，８２４，６５５号明細書；米国特許第５，８３０，８４７号明細書；米国特許第６，０１５，６９３号明細書；国際公開第９１／０４７４８号パンフレット；国際公開第９１／１０７２７号パンフレット；国際公開第９３／０９８００号パンフレット；および国際公開第９４／１０１８７号パンフレット）；マンノース−６−リン酸またはマンノース−１−リン酸（米国特許第５，５２０，９２６号明細書）；プロラクチン（国際公開第９７／４０８４８号パンフレット）；インスリン様増殖因子ＩＩ（国際公開第９８／１７３０４号パンフレット）；植物、真菌、および細菌の抽出物（ＥＵ８１３８７５号明細書；特開平８１１９９８４号公報；および米国特許第５，６９３，６１０号明細書）；アンチセンスオリゴヌクレオチド（米国特許第５，６８３，９８８号明細書；米国特許第５，７７２，９９５号明細書；米国特許第５，８２１，２３４号明細書；米国特許第５，８６９，４６２号明細書；および国際公開第９４／２５５８８号パンフレット）；ＳＭＡＤおよびＭＡＤを含むＴＧＦ−βシグナル伝達に関与するタンパク質（ＥＰ８７４０４６号明細書；国際公開第９７／３１０２０号パンフレット；国際公開第９７／３８７２９号パンフレット；国際公開第９８／０３６６３号パンフレット；国際公開第９８／０７７３５号パンフレット；国際公開第９８／０７８４９号パンフレット；国際公開第９８／４５４６７号パンフレット；国際公開第９８／５３０６８号パンフレット；国際公開第９８／５５５１２号パンフレット；国際公開第９８／５６９１３号パンフレット；国際公開第９８／５３８３０号パンフレット；国際公開第９９／５０２９６号パンフレット；米国特許第５，８３４，２４８号明細書���米国特許第５，８０７，７０８号明細書；および米国特許第５，９４８，６３９号明細書）、スキー（Ｓｋｉ）およびスノ（Ｓｎｏ）（ボーゲル（Ｖｏｇｅｌ）（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：６６５およびストロシャイン（Ｓｔｒｏｓｃｈｅｉｎ）ら（１９９９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２８６：７７１−７７４）；ならびにＴＧＦ−βの生物学的活性を直接阻害する能力を保持する上記で同定される分子の任意の変異体、フラグメント、または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２５】
本発明の方法において使用され得るＴＧＦ−βアンタゴニストの例として：セリン／スレオニンキナーゼインヒビターなどの小分子インヒビター、例えば、ＷＯ０４／２１９８９；ＷＯ０３／８７３０４；ＷＯ０４／２６８７１；ＷＯ０４／２６３０２；ＷＯ０４／２４１５９、米国特許第６，１８４，２２６号明細書；ＷＯ０３／９７６３９；およびＷＯ０４／１６６０６に記載のものが挙げられる。
【００２６】
いくつかの実施態様では、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、直接的なＴＧＦ−βアンタゴニスト、例えば、その受容体に結合するＴＧＦ−βをブロックする抗体である。
【００２７】
本明細書において使用する用語「抗体」は、免疫グロブリンまたはその部分を指し、供給源、産生の方法、および他の特徴にかかわらず、抗原結合部位を含んでなる任意のポリペプチドを包含する。該用語は、ポリクローナル、モノクローナル、単一特異性、多特異性、ヒト化、ヒト、一本鎖、キメラ、合成、組換え、ハイブリッド、変異、およびＣＤＲ移植抗体を含むが、これらに限定されない。用語「抗原結合性ドメイン」は、抗原の部分もしくはすべてに特異的に結合するかまたは相補的である領域を含んでなる抗体分子の部分を指す。抗原が大きい場合、抗体は、抗原の特定の部分にのみ結合し得る。「エピトープ」、または「抗原決定基」は、抗体の抗原結合性ドメインとの特異的相互作用を担う抗原分子の一部である。抗原結合性ドメインは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）および抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含んでなり得る。抗原結合性ドメインは、１つもしくはそれ以上の抗体可変ドメイン（例えば、ＶＨドメインよりなるＦｄ抗体フラグメント、ＶＨドメインおよびＶＬドメインよりなるＦｖ抗体フラグメント、またはリンカーによって接続されたＶＨドメインおよびＶＬドメインよりなるｓｃＦｖ抗体フラグメント）によって提供され得る。用語「抗ＴＧＦ−β抗体」、または「ＴＧＦ−βの少なくとも１つのアイソフォームに対する抗体」は、ＴＧＦ−βの少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体を指す。用語「ＴＧＦ−β受容体抗体」および「ＴＧＦ−β受容体に対する抗体」は、ＴＧＦ−β受容体（例えば、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型）の少なくとも１つのエピトープに特異的に結合する任意の抗体を指す。
【００２８】
本発明の方法において有用な抗体は、それらがＴＧＦ−βの少なくとも１つのアイソフォームまたは少なくとも１つのＴＧＦ−β受容体の細胞外ドメインに特異的に結合するようなものである。本明細書において使用する用語「特異的相互作用」、もしくは「特異的に結合する」、またはそれらの同系用語は、２つの分子が、生理学的条件下で比較的安定である複合体を形成することを意味する。特異的結合は、高い親和性および低〜中等度の能力によって特徴付けられる。非特異的結合は通常、中等度〜高い能力を伴う低い親和性を有する。典型的に、結合は、親和定数Ｋａが１０６Ｍ−１より高い、または好ましくは、１０８Ｍ−１より高い場合、特異的とみなされる。
【００２９】
他のいくつかの実施態様では、抗ＴＧＦ−β抗体は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３からなる群から選択されるＴＧＦ−βの少なくとも１つのアイソフォームに特異的に結合する。さらに他の実施態様では、抗ＴＧＦ−β抗体は、少なくとも：（ａ）ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３（「ｐａｎ中和抗体」）；（ｂ）ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２；（ｃ）ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３；ならびに（ｄ）ＴＧＦ−β２およびＴＧＦ−β３に特異的に結合する。多様な実施態様では、それが特異的に結合するＴＧＦ−βの少なくとも１つのアイソフォームに対するＴＧＦ−β抗体の親和定数Ｋａは、好ましくは、１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、または１０１２Ｍ−１を超える。さらなる実施態様では、本発明の抗体は、ヒトＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、および／またはＴＧＦ−β３に実質的に同一なタンパク質に特異的に結合する。また、引用文献に記載の任意の脊椎動物種由来の非ヒト抗体のヒト化および完全なヒト形態ならびに誘導体も、ヒトに使用するために考慮される。そのような変種を産生させることは、当業者内において良好である（例えば、Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ボレベック（Ｂｏｒｒｅｂａｅｃｋ）編、第２版、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ、１９９５年を参照のこと）。
【００３０】
非制限的な例示的実施態様では、抗ＴＧＦ−β抗体は、ハイブリドーマ１Ｄ１１．１６（米国特許第５，５７１，７１４号明細書；同第５，７７２，９９８号明細書；および同第５，７８３，１８５号明細書においても記載のＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ９８４９）によって産生されるマウスモノクローナル抗体１Ｄ１１である。１Ｄ１１重鎖可変領域の配列は、受託番号ＡＡＢ４６７８７下で入手可能である。従って、関連する実施態様では、抗ＴＧＦ−β抗体は、１Ｄ１１の誘導体、例えば、ヒト化抗体などのＡＡＢ４６７８７におけるそれらに同一のＣＤＲ配列を含んでなる抗体である。さらなる実施態様では、抗ＴＧＦ−β抗体は、国際公開第００／６６６３１号パンフレット、米国特許第６，４９２，４９７号明細書、ならびに米国特許出願公開番号第２００３／００９１５６６号明細書および同第２００３／００６４０６９号明細書に記載のＣＡＴ１９２およびＣＡＴ１５２、または本明細書において開示するＣＤＲ配列を含んでなる抗体などのファージディスプレイによって作製される完全なヒト組換え抗体である。なおさらなる実施態様では、抗ＴＧＦ−β抗体は、１Ｄ１１、ＣＡＴ１９２、またはＣＡＴ１５２からのガイド選択によって産生される抗体である。
【００３１】
非制限的な好適な実施態様では、抗ＴＧＦ−β抗体は、米国仮出願第６０／６５１，３４３号明細書において開示されているＰＥＴ１０７３Ｇ１２、ＰＥＴ１０７４Ｂ９またはＰＥＴ１２８７Ａ１０などのヒトｐａｎ特異的抗体である。
【００３２】
１Ｄ１１抗体は、ＴＧＦ−βの３つのすべての哺乳動物アイソフォームに特異的に結合する一方、ＣＡＴ１９２はＴＧＦ−β１のみに特異的に結合する。１Ｄ１１およびＣＡＴ１９２に対する抗原親和性は、それぞれ約１ｎＭおよび８．４ｐＭである。１Ｄ１１（ダシュ（Ｄａｓｃｈ）ら（１９９８年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４２：１５３６−１５４１）およびＣＡＴ１９２に対するエピトープは、成熟ＴＧＦ−βのＣ末端部分に対してマッピングされている。
【００３３】
免疫抑制剤
本発明は、少なくとも部分的に、ＴＧＦ−βのアップレギュレーションを介して、それらの免疫抑制活性を仲介する該免疫抑制剤の腎毒性の副作用の緩和のための補助療法を提供する。本明細書において使用する用語「免疫抑制剤」、「免疫抑制薬」および「免疫抑制薬剤」は、免疫抑制を誘導する化合物または組成物（即ち、それは、免疫学的応答の発達を防止または妨げる）を指す。免疫抑制剤の例として、ＳａｎｄｉｍｍｕｎｅＴＭ（シクロスポリン）；ＰｒｏｇｒａｆＴＭ、ＰｒｏｔｏｐｉｃＴＭ（タクロリムス）；ＲａｐａｍｕｎｅＴＭ、ＮｅｏｒａｌＴＭ（シロリムス）；ＦＴＹ７２０；ＣｅｒｔｉｃａｎＴＭ（エベロリムス、ラパマイシン誘導体）；ＣａｍｐａｔｈＴＭ−１Ｈ（アレムツズマブ、抗ＣＤ５２抗体）；ＲｉｔｕｘａｎＴＭ（リツキシマブ、抗ＣＤ２０抗体）；ＯＫＴ４；ＬＥＡ２９Ｙ（ＢＭＳ−２２４８１８、ＣＴＬＡ４Ｉｇ）；インドリル−ＡＳＣ（タクロリムスおよびアスコマイシンの３２−インドールエーテル誘導体）；ＩｍｕｒａｎＴＭ（アザチオプリン）；ＡｔｇａｍＴＭ（公共線細胞／グロブリン）；ＯｒｔｈｏｃｌｏｎｅＴＭ（ＯＫＴ３；ムロモナブ−ＣＤ３）；ＣｅｌｌｃｅｐｔＴＭ（ミコフェノール酸モフェチル）；ＺｅｎａｐａｘＴＭ（ダクリズマブ）、ＣｙｔｏｘａｎＴＭ（シクロホスファミド）、プレドニゾン、プレドニゾロンならびに他の副腎皮質ステロイドマロノニトリラマイド（ＭＮＡ（レフルノミド、ＦＫ７７８、ＦＫ７７９））、および１５−デオキシスパガリン（ＤＳＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
薬剤の免疫抑制活性を評価するための方法は当該分野において公知である。実施例に記載のように、薬理学的介入を伴うおよび伴わない移植された臓器のインビボでの生存時間の長さは、免疫応答の抑制に対する定量測定としての役割を果たす。また、インビトロアッセイ、例えば、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイ（例えば、ファスマン（Ｆａｔｈｍａｎ）ら（１９７７年）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１１８（４）：１２３２−１２３８を参照のこと）；ＣＤ３アッセイ（抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３）を介する免疫細胞の特異的活性化）（例えば、カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６７（６）：８８２−８８９およびカンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６７（７）：Ｓ５８を参照のこと）；ならびにＩＬ−２Ｒアッセイ（外部から添加したサイトカインＩＬ−２による免疫細胞の特異的活性化）（例えば、ファラー（Ｆａｒｒａｒ）ら、（１９８１年）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２６（３）：１１２０−１１２５を参照のこと）を使用することもできる。
【００３５】
本発明は、少なくとも部分的にＴＧＦ−βのアップレギュレーションを介してそれらの免疫抑制活性を仲介する腎毒性のある免疫抑制剤による特定の使用に関する。そのような薬剤は、投与時に急性または慢性腎炎を誘発し得る。典型的に、誘発は、薬剤の投与時におけるＴＧＦ−βの発現の上昇と相関関係がある。本発明は、そのような薬剤によって誘発される腎炎を処置または防止する方法を提供する。
【００３６】
特定の免疫抑制剤がＴＧＦ−βのアップレギュレーションを介してその免疫抑制活性を仲介するかどうかは、例えば、実施例に記載のような当該分野において既知の方法を使用して決定することができる。ＴＧＦ−βのアップレギュレーションを介してそれらの免疫抑制活性を仲介する薬剤の特定の例として、シクロスポリン、タクロリムス、およびシロリムスが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、カンナ（Ｋｈａｎｎａ）（２０００年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７０（４）：６９０−６９４；カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６７（７）：Ｓ８４；およびカンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６７（６）：８８２−８８９を参照のこと）。
【００３７】
シクロスポリンＡ（ＣＡＳ番号５９８６５−１３−３；米国特許第３，７３７，４３３号明細書）は、［Ｒ−［ＲＲ＊（Ｅ）｝］環式（Ｌ−アラニル−Ｄ−アラニル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｎ−メチル−Ｌ−バリル−３−ヒドロキシ−Ｎ，４−ジメチル−Ｌ−２−アミノ−６−オクテノイル−Ｌ−α−アミノ−ブチリル−Ｎ−メチルグリシル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−バリル−Ｎ−メチル−Ｌ−ロイシル）として表される。その免疫抑制効果は、１９７２年以来公知である（ボレル，Ｊ．Ｆ．（Ｂｏｒｅｌ，Ｊ．Ｆ．）：シクロスポリン：デール（Ｄａｌｅ）ら（編）：Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（第３版）、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔ．Ｐｕｂｌ．Ｏｘｆｏｒｄ  １９９４年、３２０−３２９頁）。免疫抑制活性を示す他の多くのシクロスポリン系薬剤ならびにそれらの誘導体およびアナログが公知である。シクロスポリン系薬剤およびそれらの処方については、例えば、２００４Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）（２００３年）Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、第５８版、ならびに米国仮出願第５，７６６，６２９号明細書；同第５，８２７，８２２号明細書；同第４，２２０，６４１号明細書；同第４，６３９，４３４号明細書；同第４，２８９，８５１号明細書；および同第４，３８４，９９６号明細書；同第５，０４７，３９６号明細書；同第４，３８８，３０７号明細書；同第４，９７０，０７６号明細書；および同第４，９９０，３３７号明細書；同第４，８２２，６１８号明細書；同第４，５７６，２８４号明細書；同第５，１２０，７１０号明細書；および同第４，８９４，２３５号明細書に記載されている。
【００３８】
タクロリムス（ＦＫ５０６）は、その作用分子様式およびその臨床効力に関して、ＣｓＡにかなり類似の効果を発揮するマクロライドである（リュウ（Ｌｉｕ）（１９９３年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１４：２９０−２９５；シュライバー（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ）ら（１９９２年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ，１３：１３６−１４２）が；しかし、これらの効果は、ＣｓＡより２０〜１００倍低い用量で示される（ペータース（Ｐｅｔｅｒｓ）ら（１９９３年）Ｄｒｕｇｓ，４６：７４６−７９４）。化学的に、タクロリムスは［３Ｓ−［３Ｒ＊［Ｅ（１Ｓ＊，３Ｓ＊，４Ｓ＊）］，４Ｓ＊，５Ｒ＊，８Ｓ＊，９Ｅ，１２Ｒ＊，１４Ｒ＊，１５Ｓ＊，１６Ｒ＊，１８Ｓ＊，１９Ｓ＊，２６ａＲ＊］］−５，６，８，１１，１２，１３，１４，１５，１６，１７，１８，１９，２４，２５，２６，２６ａ−ヘキサデカヒドロ−５，１９−ジヒドロキシ−３−［２−（４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル）−１−メチルエテニル］−１４，１６−ジメトキシ−４，１０，１２，１８−テトラメチル−８−（２−プロペニル）−１５，１９−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］オキサアザシクロトリコシン−１，７，２０，２１（４Ｈ，２３Ｈ）−テトロン一水和物である。タクロリムスおよびその処方については、例えば、２００４  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）（２００３年）Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、第５８版、ならびに米国特許第４，８９４，３６６号明細書；同第４，９２９，６１１号明細書；および同第５，１６４，４９５号明細書に記載されている。
【００３９】
シロリムス（ラパマイシン）は、例えば、ストレプトマイセス・ヒグロスコピカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）より産生可能な免疫抑制性ラクタムマクロライド（ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｖｅ  ｌａｃｔａｍ  ｍａｃｒｏｌｉｄｅ）である。化学的に、シロリムスは、（３Ｓ，６Ｒ，７Ｅ，９Ｒ，１０Ｒ，１２Ｒ，１４Ｓ，１５Ｅ，１７Ｅ，１９Ｅ，２１Ｓ，２３Ｓ，２６Ｒ，２７Ｒ，３４ａＳ）−９，１０，１２，１３，１４，２１，２２，２３，２４，２５，２６，２７，３２，３３，３４，３４ａ−ヘキサデカヒドロ−９，２７−ジヒドロキシ−３−［（１Ｒ）−２−［（１Ｓ，３Ｒ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−３−メトキシシクロヘキシル］−１−メチルエチル］−１０，２１−ジメトキシ−６，８，１２，１４，２０，２６−ヘキサメチル−２３，２７−エポキシ−３Ｈ−ピリド［２，１−ｃ］［１，４］−オキサアザシクロヘントリ−アコンチン−１，５，１１，２８，２９（４Ｈ，６Ｈ，３１Ｈ）−ペントンである。シロリムスの構造は、例えば、ケスラー（Ｋｅｓｓｅｌｅｒ）ら（１９９３年）Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，７６：１１７に付与されている。
【００４０】
シロリムスおよびそのアナログの多数の誘導体ならびにそれらの処方は公知であり、例えば、２００４Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）（ＰＤＲ）（２００３年）Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、第５８版、国際公開第９４／０２１３６号パンフレット、国際公開第９４／０９０１０号パンフレット、国際公開第９２／０５１７９号パンフレット、国際公開第９３／１１１３０号パンフレット、国際公開第９４／０２３８５号パンフレット、国際公開第９５／１４０２３号パンフレット、国際公開第９４／０２１３６号パンフレットならびに米国特許第５，２５８，３８９号明細書；同第５，１１８，６７７号明細書；同第５，１１８，６７８号明細書；同第５，１００，８８３号明細書；同第５，１５１，４１３号明細書；同第５，１２０，８４２号明細書；および同第５，２５６，７９０号明細書に記載されている。
【００４１】
使用および投与の方法
本発明の方法は、腎毒性のある免疫抑制剤を伴う哺乳動物に、ＴＧＦ−βアンタゴニストを投与することを含む。
【００４２】
本発明の方法に従って処置される哺乳動物として、ヒトおよび他の霊長類、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）、ウサギ、ネコ、イヌ、ウシ、およびブタが挙げられるが、これらに限定されない。
【００４３】
本発明の方法に従って処置される哺乳動物として、免疫抑制を必要とする患者、例えば、自己免疫疾患の患者が挙げられる。本発明の方法に従い得る自己免疫疾患の例として、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、多発性硬化症、クローン病（炎症性腸疾患）、１型糖尿病、重症筋無力症、乾癬、グレーブス病、バーガー病、強皮症、シェーグレン症候群、強直性脊椎炎、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血、アジソン病、橋本甲状腺炎、特発性血小板減少性紫斑病、悪性貧血、および自発不妊（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｉｎｆｅｒｔｉｌｉｔｙ）が挙げられる。
【００４４】
本発明の方法に従って処置される哺乳動物として、さらに、免疫抑制を必要とする患者、例えば、免疫抑制療法を経験している臓器または組織移植を伴う患者が挙げられる。「移植」は、任意の移植片もしくは組織または臓器の全体もしくは部分、またはレシピエント（宿主）に対して外来性である細胞を指す。移植の例として、心臓、腎臓、肺、肝臓、角膜、骨髄、血管および島細胞移植が挙げられるが、これらに限定されない。移植は、レシピエントと同じ種（同種移植）由来またはレシピエント以外の種（異種移植）由来のいずれでもあり得る。
【００４５】
移植患者の免疫抑制管理は、導入期、周術期および移植直後から開始する。導入療法は、促進性および急性拒絶の可能性を低減するために、移植の免疫系を「スイッチオフ」する目的を伴う術直後の約２週間（但し、しばしば、術直前に開始される）の集中的免疫抑制のコースである。次いで、維持療法は、同種移植片の寿命期間継続する。導入および維持ストラテジーは、異なる免疫抑制薬を、特定の用量または至適移植片生存率を提供する治療レベルを達成するために調整された用量で使用することができる。所定の実施態様では、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、免疫抑制療法の導入期中、維持期中、またはその両方で、患者に投与される。
【００４６】
ＴＧＦ−βアンタゴニストは、薬剤の免疫抑制活性を実質的に妨げずに免疫抑制剤の腎毒性作用を緩和するのに十分な治療有効量で投与される。
【００４７】
用語「腎毒性効果を緩和するのに十分な」は、免疫抑制剤による腎機能の消失または腎構造の悪化を遅延もしくは反転することを指す。「腎機能」は、腎臓が、加圧ろ過、選択的な再吸収、細尿管分泌、および／または全身血圧調節などのその生理学的機能を達成する能力を指す。
【００４８】
腎機能を評価するための方法は当該分野において周知であり、全身血圧および糸球体毛細管圧の測定、タンパク尿（例えば、アルブミン尿（ａｌｂｕｍｉｎｕｒｅａ））、顕微鏡的および肉眼的血尿（ｈｅｍａｔｕｒｅａ）、血清中クレアチニンレベル（例えば、ヒトにおける腎機能を評価するための１つの公式は、２．０ｍｇ／ｄｌのクレアチニンレベルを正常腎臓機能の５０パーセントに、および４．０ｍｇ／ｄｌを２５パーセントに換算する）、糸球体濾過量（ＧＦＲ）（例えば、クレアチニンクリアランスの速度）の低下、ならびに管損傷の程度を含むが、これらに限定されない。
【００４９】
腎機能および疾患状態の詳細なレビューについては、Ｔｈｅ  Ｋｉｄｎｅｙ：Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ、セルヂン（Ｓｅｌｄｉｎ）ら編、第３版、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ、２０００年を参照のこと。通常、２４時間の期間あたり０．１５ｇ未満のタンパク質が尿中に排泄される。ほぼすべてのタイプの腎臓疾患が、尿への軽度（１日あたり５００ｍｇまで）〜中等度（１日あたり４ｇまで）のタンパク質漏出を引き起こす。尿におけるアルブミンの正常濃度は、１．０ｍｇ／ｄｌ未満である。一般的に、３０〜３００ｍｇ／ｄｌの尿中アルブミンは微量アルブミン尿とみなされ、３００ｍｇ／ｄｌ以上はマクロアルブミン尿とみなされる。血清中クレアチニンの正常値は、男性では０．６〜１．５ｍｇ／ｄｌおよび女性では０．６〜１．１ｍｇ／ｄｌである。クレアチニンレベル、腎機能、および腎疾患の病期との間の関係を表１に示す。
【００５０】
【表１】
2008513542.tif 000003
【００５１】
本発明の方法は、免疫抑制剤の腎毒性に少なくとも部分的に帰すことができる腎機能不全、腎不全、または末期腎疾患を伴う患者において特に有用であり得る。免疫抑制療法を経験している患者において、他の適応症は、９７（男性）および８８（女性）ｍｌ／ｍｉｎより低いクレアチニンクリアランスレベル、２０〜２５ｍｇ／ｄｌもしくはそれより高い血中尿素を含み得る。さらに、処置は、微量アルブミン尿、マクロアルブミン尿、および／または２４時間の期間あたり１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ｇもしくはそれを超えるタンパク尿レベル、ならびに／あるいは約１．０、１．５、２．０、２．５、３、３．５、４．０、４．５、５、５．５、６、７、８、９、１０ｍｇ／ｄｌもしくはそれより高い血清中クレアチニンレベルを伴う患者において有用であり得る。
【００５２】
本発明の方法は、腎機能がコントロール被験体と比べて正常より２５％、４０％、５０％、６０％、７５％、８０％、９０％もしくはそれ以上低い患者における腎疾患の進行を遅延するかまたは反転するために使用することができる。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、コントロール被験体と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％もしくはそれ以上腎機能の消失を遅延する。他の実施態様では、本発明の方法は、コントロール被験体と比べて、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくはそれ以上、患者の血清中クレアチニンレベル、タンパク尿、および／または尿中アルブミン排泄を改善する。腎機能を評価するための非制限的な例示的方法については、本明細書、および例えば、国際公開第０１／６６１４０号パンフレットに記載されている。
【００５３】
腎構造の悪化を評価する方法もまた周知である。例示的方法を実施例に示す。そのような方法として、腎臓の画像化（例えば、ＭＲＩ、超音波）、または腎生検の組織学的評価が挙げられる。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、例えば、尿細管間質または糸球体損傷の程度ならびに／または腎線維症の程度（例えば、コラーゲンおよびフィブロネクチンの沈着）によって判定されるように、腎構造の悪化を低減する。いくつかの実施態様では、本発明の方法は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％もしくはそれ以上、構造的変化を改善する。
【００５４】
治療医師は、ＴＧＦ−βアンタゴニストの正確な用量およびレジメンを決定する。一般的に、ＴＧＦ−βアンタゴニストの用量は、アンタゴニストの投与による拒絶の危険性が治療的に許容可能（即ち、それは、免疫抑制薬の免疫抑制活性を実質的に妨げない）以下の量だけ増加されるようなものであるべきである。さらに、用量は、免疫抑制剤の腎毒性効果の低減が治療的に許容可能であるようなものであるべきである。例えば、維持期における拒絶比の５、１０、１５、２０、２５、３０、４０もしくは５０％以下の増加は、治療的に許容可能であり得る。
【００５５】
本発明の方法では、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、一般に、免疫抑制剤の非存在下で投与するのに推奨される用量より低い治療有効量で投与される。所定の実施態様では、この用量は、免疫抑制剤の非存在下で腎炎を処置するために推奨される用量より少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくはそれ以上低い。いくつかの実施態様では、ＴＧＦ−βアンタゴニストの治療有効量は、免疫抑制剤の非存在下で投与される最大治療有効量よりも少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくはそれ以上低い。
【００５６】
所定の実施態様では、げっ歯類において、例えば、実施例に記載のような条件下で投与される場合、ＴＧＦ−βアンタゴニストは、２、１．９、１．８、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、もしくは１．０ｍｇ／ｋｇ体重の１Ｄ１１抗体に等価な用量未満の用量で投与される。治療医師は、ＴＧＦ−βアンタゴニストについて正確な用量およびレジメンならびに補助治療を決定する。開始時点で、抗ＴＧＦ−β抗体、抗ＴＧＦ−β受容体抗体、可溶性ＴＧＦ−β受容体、または別のＴＧＦ−βアンタゴニストの治療有効量は、０．００５〜５０、０．０５〜５、または０．５〜５ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの範囲であり得る。
【００５７】
１つの動物において達成される治療有効量は、当該分野において公知の変換因子を使用して、ヒトを含む別の動物に使用するために、変換することができる（例えば、フレイレイヒ（Ｆｒｅｉｒｅｉｃｈ）ら（１９６６年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｒｅｐｏｒｔｓ，５０（４）：２１９−２４４および等価な表面積用量因子に関する表２を参照のこと）。
【００５８】
【表２】
2008513542.tif 000004
【００５９】
「投与」は、任意の特定の処方、送達システム、または経路に限定されず、例えば、非経口（皮下、静脈内、脊髄内、関節内、筋肉内、もしくは腹腔内注入を含む）、直腸、局所、経皮、または経口（例えば、カプセル、懸濁液、もしくは錠剤中）を含んでもよい。個体への投与は、単回用量または反復用量で、ならびに生理学的に許容可能な塩形態および／または許容可能な薬学的キャリアおよび／または薬学的組成物の部分としての添加物を含有する様々な薬学的組成物のいずれかで、生じ得る。生理学的に許容可能な塩形態および標準的な薬学的処方技術ならびに賦形剤は公知である（例えば、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）２００３年、第５７版、Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｅｃｏｎｏｍｉｃｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ、２００２年；およびレミングトン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、ジェンナド（Ｇｅｎｎａｄｏ）ら編、第２０編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ、２０００年を参照のこと）。
【００６０】
アンタゴニストの個体への投与はまた、遺伝子治療によって達成してもよい、ここで、アンタゴニストをコードする核酸配列は、インビボで患者に投与されるか、またはインビトロで細胞に投与され、次いで、患者に導入され、アンタゴニスト（例えば、アンチセンスＲＮＡ、可溶性ＴＧＦ−β受容体）が、核酸配列によってコードされる産物の発現によって産生される。ＴＧＦ−βアンタゴニストを送達する遺伝子治療のための方法が説明されている（例えば、ファクライ（Ｆａｋｈｒａｉ）ら（１９９６）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：２９０９−２９１４を参照のこと）。ＴＧＦ−βアンタゴニストの投与は、例えば、米国特許出願公開番号第２００３／０１８０３０１号明細書に記載のように、アンタゴニストをコードするｃＤＮＡ、最も好ましくは、ＩＩ型ＴＧＦ−β（ｒｓＴＧＦＢＩＩＲ）またはＩＩＩ型受容体（ｒｓＴＧＦＢＩＩＩＲ）の細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡを含んでなるベクターを使用する遺伝子導入によって行われる。
【００６１】
ＴＧＦ−βアンタゴニストおよび免疫抑制剤は、同時に、または重複するかもしくは重複しない間隔で連続的に投与してもよい。連続投与では、ＴＧＦ−βアンタゴニストおよび免疫抑制剤は、任意の順序で投与することができる。アンタゴニストは、唯一活性な化合物としてまたは別の化合物もしくは組成物との組み合わせで投与される。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）に示されるような免疫抑制剤の特定の用量使用してもよい。
【００６２】
本発明は、免疫抑制を必要とし、免疫抑制のための薬剤が投与されている哺乳動物において免疫抑制剤（例えば、ＣｓＡ、ＴＡＣ、ラパマイシン、または別の免疫抑制剤）の腎毒性を検出するための方法をさらに提供する。方法は、哺乳動物から生物学的サンプルを得ること、ならびにＴＧＦ−β、ＮＯＸ−１、ｐ２２ｐｈｏｘ、ＲＡＣ−１、ＳＯＤ、およびＴＲＸからなる群から選択される１つもしくはそれ以上の分子の発現レベルを決定することを含んでなる。本発明は、免疫抑制を必要とし、免疫抑制のための薬剤が投与されている哺乳動物において免疫抑制剤（例えば、ＣｓＡ、ＴＡＣ、ラパマイシン、または別の免疫抑制剤）の腎毒性を検出するための方法をさらに提供する。
【００６３】
本発明は、免疫抑制剤の腎毒性作用を低減する能力について、試験化合物または組成物（例えば、抗ＴＧＦ−β抗体などのＴＧＦ−βアンタゴニスト）を評価するための方法をなおさらに提供する。これらの方法は、免疫抑制剤および目的の試験化合物または組成物の両方が投与されている哺乳動物から生物学的サンプルを得ること、およびＴＧＦ−β、ＮＯＸ−１、ｐ２２ｐｈｏｘ、ＲＡＣ−１、ＳＯＤ、およびＴＲＸからなる群から選択される１つもしくはそれ以上の分子（１、２、３、４、５、もしくは６種すべて）の発現レベルを決定することを含んでなる。
【００６４】
適切なコントロールを超える発現レベルは、免疫抑制剤の腎毒性および／または該腎毒性を低減する際の化合物または組成物の有効性を示す。例えば、適切なコントロールから２０、３０、４０、もしくは５パーセント、または少なくとも２、４、５、もしくは１０倍だけ異なる発現レベルは、薬剤が腎毒性を誘発しているおよび／または試験化合物もしくは組成物が該腎毒性を低減するのに有効であることを示す。発現レベルは、例えば、任意の適切な方法によって、タンパク質および／またはｍＲＮＡレベルで決定することができる。
【００６５】
得られる生物学的サンプルは、例えば、組織サンプル（例えば、いくつかの実施態様における腎臓生検）、血液、または血清であり得る。
【００６６】
以下の実施例は、本発明の例示的実施態様を提供する。当業者は、本発明の精神または範囲を変更することなく、実施され得る多数の改変および変種を認識する。そのような改変および変種は、本発明の範囲内に包含される。実施例は、いかなる方法においても本発明を制限しない。
【実施例】
【００６７】
材料および方法（第１部）
以下の材料および方法を実施例１および２において使用した。
【００６８】
実験群
ラットを、以下を含む６群（それぞれにおいてｎ＝６）に分けた：
（１）非処置コントロール；
（２）２．５ｍｇ／ｋｇ  ＣｓＡ；
（３）２．５ｍｇ／ｋｇ  ＣｓＡ＋２．５ｍｇ／ｋｇコントロール抗体；
（４）２．５ｍｇ／ｋｇ  ＣｓＡ＋２．５ｍｇ／ｋｇ抗ＴＧＦ−β抗体；
（５）２．５ｍｇ／ｋｇ  ＣｓＡ＋１．０ｍｇ／ｋｇ抗ＴＧＦ−β抗体；および
（６）同系移植コントロール；
【００６９】
実験期間中、移植日に開始して、２．５ｍｇ／ｋｇ（筋肉内）の用量でＣｓＡを使用することによって、免疫抑制を達成した。屠殺時または臓器拒絶まで、３日ごとの腹腔内注入によって、抗ＴＧＦ−β抗体またはコントロール抗体を投与した。
【００７０】
調製および移植
ホウセンパド（Ｈｏｓｅｎｐｕｄ）ら（２０００年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６９：２１７３−２１７８に記載のように、研究集団全体に対して異所性心移植を実施した。ドナーラットをヘパリン処置（１０００単位、腹腔内）し、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔した。腹部切開を行って、胸腔から拡げ、胸壁を取り出した。心臓、大動脈、および肺動脈の鈍的切開を実施した。肺静脈および下大静脈を結紮し、移植片を摘出して、氷冷した生理食塩水中に置いた。次いで、レシピエントラットを、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔した。正中開腹を実施した。腹部大動脈および大静脈を解剖し、ストレート型血管鉗子でクランプして出血を防止した。長さ約５ｍｍの大動脈および静脈の縦切開を実施した。８−０プロリン縫合糸による標準的な微小血管技術を使用して、大動脈から腹部大動脈および肺動脈から下大静脈への端側吻合を行った。止血を達成し、切開部を３−０ＶｉｃｒｙｌＴＭ縫合糸で閉鎖した。
【００７１】
動物のモニタリング、屠殺、組織回収
同種移植片の低速化および不全の証拠についてラットを連日モニターした。次いで、それらを、ペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔した。動物を、生来の心室穿刺を介して放血させた。血漿サンプルを、ＥＬＩＳＡキット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を使用して、ＴＧＦ−βタンパク質についてアッセイした。両方の腎臓を入手した（一方は遺伝子発現用として、一方は組織学および免疫組織学用として）。
【００７２】
免疫抑制プロトコル
適切な群においてＣｓＡを使用して、免疫抑制を達成した。ＣｓＡは、抗ＴＧＦ−β抗体（１Ｄ１１）またはコントロール抗体を伴うおよび伴わない研究の期間中、２．５ｍｇ／ｋｇの用量で使用した。屠殺時または臓器拒絶まで、３日ごとの腹腔内注入によって、抗ＴＧＦ−β抗体またはコントロール抗体の処置を投与した。
【００７３】
コントロール抗体（１３Ｃ４）はまた、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）毒素に特異的に結合するマウスモノクローナル抗体（ＩｇＧ１）である。両抗体を産生させ、Ｇｅｎｚｙｍｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎで精製した。抗体は、検出可能な内毒素を含まないことが決定された。
【００７４】
ラット血漿におけるＴＧＦ−βタンパク質の測定
ＴＧＦ−β１タンパク質を、（カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６７：８８２−８８９）に先に記載されているように測定した。ラットから血漿を分離し、−７０℃で貯蔵した。ＴＧＦ−β１タンパク質を、酸活性化したサンプルに対し、市販のＴＧＦ−β１特異的キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州）を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡによって、アッセイした。
【００７５】
ＴＧＦ−β１についての病理組織学および免疫組織化学
各動物由来の１つの腎臓をホルマリン中に固定化し、パラフィン包埋した。ヘマトキシリンおよびエオシンならびにマッソントリクローム染色を使用して、組織学的変化を評価した。ＴＧＦ−βを、標準的な免疫組織化学的方法（カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６７：８８２−８８９）を使用して、同定した。ホルマリン固定化、パラフィン包埋された組織を、５μｍで切片化し、キシレン中で脱パラフィンし、ＰＢＳに対し段階別に調製したエタノール中で再水和した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール／過酸化物（１８：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）で３０分間ブロックした後、非特異的結合を、１０％正常ウマ血清、および３％ＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈した１．５％アビジン／ビオチンで１時間、ブロックした。次いで、組織切片を、１晩、４℃で、上記のＰＢＳ中１Ｄ１１ｍＡｂ（５０ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。ＰＢＳによる複数回の洗浄後、スライドを、１時間、１：１０００希釈ビオチン標識抗マウスＩｇＧウマ抗血清と共に、室温でインキュベートし、再度、ＰＢＳ中で広範に洗浄し、次いで、ＡＢＣ溶液中で３０分間洗浄した。次いで、スライドを、１０分間、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）中で展開し、水で１０分間、濯いだ。次いで、スライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、続いて、段階的に調製したエタノールおよびキシレン中で脱水した。スライドを、評価のために、ＰｅｒｍｏｕｎｔＴＭでマウントした。各群由来のサンプルを、病理組織学的変化および免疫組織化学染色のために等級付けした。免疫染色の強度を、０（非染色）〜４＋（最大染色）に等級付けした。
【００７６】
腎臓組織における逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によるｍＲＮＡの検出
ＳＶ  ＴｏｔａｌＴＭＲＮＡ単離Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｄｉｓｏｎ、米国）を使用して、ラット由来の腎臓組織の小片から全ＲＮＡを単離し、ＲＮＡの質を２６０／２８０ｎｍ比によって確認した。１マイクログラムのＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲのためのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ＳｙｎｔｈｅｓｉｓＴＭシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州、米国）を使用して、ｃＤＮＡに逆転写した。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅を、１μｌのｃＤＮＡ、ならびに２μｌのそれぞれの２．５ｍＭコーディングおよび非コーディングオリゴヌクレオチドプライマーならびにＰｌａｔｉｎｕｍ  ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒｍｉｘＴＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、メリーランド州、米国）を使用して、行った。使用したプライマー配列および対応する参考文献は以下に列挙したとおりである。
【００７７】
１）ＴＧＦ−β１（チィエン（Ｑｉａｎ）ら（１９９０年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１８：３０５９）
コーディング：ＡＣＧ  ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＴＧＧ  ＣＴＧ  ＴＣＴ  ＴＴＴ  （配列番号１）
非コーディング：ＡＣＧ  ＴＧＧ  ＡＧＴ  ＴＴＧ  ＴＴＡ  ＴＣＴ  ＴＴＧ（配列番号２）
２）β−アクチン（ポンテ（Ｐｏｎｔｅ）ら（１９８４年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１２：１６８７）
コーディング：ＧＡＴ  ＣＴＧ  ＧＣＡ  ＣＣＡ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＡ  （配列番号３）
非コーディング：ＧＣＡ  ＧＧＡ  ＴＧＧ  ＣＧＴ  ＧＡＧ  ＧＧＡ  ＧＡＧ（配列番号４）
３）コラーゲンＩ（フランケル（Ｆｒａｎｋｅｌ）ら（１９８８年）ＤＮＡ，７：３４７−３５４）
コーディング：ＣＣＣ  ＡＣＧ  ＴＡＧ  ＧＴＧ  ＴＣＣ  ＴＡＡ  ＡＧＴ  （配列番号５）
非コーディング：ＣＣＧ  ＴＧＧ  ＴＧＣ  ＴＡＡ  ＡＡＴ  ＡＡＴ  ＡＡＡ（配列番号６）
４）フィブロネクチン（シュバルツバウアー（Ｓｃｈｗａｒｚｂａｕｅｒ）（１９８７年）ＥＭＢＯ  Ｊ．，６：２５７３−２５８０）
コーディング：ＡＴＧ  ＡＴＧ  ＡＧＧ  ＴＧＣ  ＡＣＧ  ＴＧＴ  ＧＴ    （配列番号７）
非コーディング：ＧＡＴ  ＧＧＧ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＴＴＴ  ＣＣＡ  ＴＣ  （配列番号８）
５）ＭＭＰ−２（ポロック（Ｐｏｌｌｏｃｋ）ら（１９９５年）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１８７８６−１８７９６）
コーディング：ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＡＧ  ＧＡＣ  ＡＣＡ  ＣＴＡ  ＡＡ    （配列番号９）
非コーディング：ＴＴＧ  ＣＣＡ  ＴＣＣ  ＴＴＣ  ＴＴＴ  ＴＣＡ  ＡＡ  （配列番号１０）
６）ＴＩＭＰ−２（バッタリア（Ｂａｔｔａｇｌｉａ）ら（１９９４年）Ｅｘｐ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．，２１３：３９８−４０３）
コーディング：ＡＡＡ  ＣＧＡ  ＣＡＣ  ＴＴＡ  ＴＧＧ  ＣＡＡ  ＡＣ    （配列番号１１）
非コーディング：ＡＣＡ  ＧＧＡ  ＡＧＣ  ＧＴＣ  ＡＣＴ  ＴＣＴ  ＣＴ  （配列番号１２）
【００７８】
このような遺伝子の発現の半定量的評価のために、各プライマー対についてサイクル分析を実施し、至適増幅のサイクル数を決定した。ＰＣＲ産物を、１％アガロースゲル電気泳動において分離した。エチジウムブロマイド染色した特定のバンドをＵＶ光下で可視化し、写真撮影した。特定のバンドのデンシトメトリー分析を、Ａｌｐｈａ−ＩｍａｇｅｒＴＭ（Ａｌｐｈａ  Ｉｎｎｏｔｅｃｈ  Ｃｏｒｐ．，Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、カリフォルニア州、米国）を使用して行い、データを、β−アクチンに対する特定の遺伝子の比として表す。
【００７９】
データ解析
報告されたデータを平均±ＳＥＭとして表す。次いで、適切な群間の差異を、分散分析を使用して解析した。
【００８０】
実施例１：ＣｓＡの免疫抑制効果に対する抗ＴＧＦ−β抗体の効果
これらの研究において使用したＷＦ（ＲＴ１ｕ）からＬＥＷ（ＲＴ１１）への完全な不一致株に組み合わせを用いるラット異所性心移植モデルは、拒絶を防止するための長期免疫抑制を必要とする。ＴＧＦ−β中和抗体またはアイソタイプ一致コントロール抗体を投与して、ＴＧＦ−β発現が、最初の３０日以内のＣｓＡ処置動物の同種移植片生存率に影響を及ぼすかどうかを決定した。
【００８１】
非処置動物由来の移植片は、移植の平均１１日後に拒絶した（ｎ＝６、１１±１．５）。対照的に、ＣｓＡ処置動物由来の移植片は、平均で１１７日間、生存した（ｎ＝６、１１７±９、ｐ＜０．００１）。慢性拒絶の病因におけるＴＧＦ−βの役割をより良好に理解するため、心臓移植レシピエントに、移植３日後に開始して、週３回、１．０または２．５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＧＦ−β抗体を投与した。コントロール抗体を、同一濃度および投与スケジュールで投与した。非処置同種移植片と、ＣｓＡ＋２．５ｍｇ／ｋｇ抗ＴＧＦ−β抗体で処置した群との間で、生存率の統計的有意差は観察されず、１２．７±１．２日の平均生存時間を有した（図１）。ＣｓＡ＋２．５ｍｇ／ｋｇコントロール抗体は拒絶しなかったが、組織学的変化の比較の目的のために、ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置動物と類似の日数で屠殺した。
【００８２】
全く対照的に、１．０ｍｇ／ｋｇの抗体を注入した動物は、ＣｓＡ＋２．５ｍｇ／ｋｇの抗ＴＧＦ−β抗体を受容した動物と同様に拒絶せず、平均生存時間は９９±８日であった。これは、より高い抗体群と比較して高度に有意であった（ｐ＜０．０１）。この時点でのデータは、２．５ｍｇ／ｋｇの濃度での抗ＴＧＦ−βはＣｓＡの効力を全廃するため、ＣｓＡの免疫抑制効果がＴＧＦ−βによって仲介されるという仮説を強く支持する。現在のデータは、おそらく、ＴＧＦ−βの線維形成特性が抗ＴＧＦ−β抗体によって中和されたため、より低い用量の抗ＴＧＦ−β抗体を注入したラットはより低い重症度の腎病理学的変化を有したことを実証する。
【００８３】
実施例２：ＣｓＡの腎毒性作用に対する抗ＴＧＦ−β抗体の効果
これらの実験は、ＣｓＡの腎毒性作用におけるＴＧＦ−βの役割を研究するために実施した。ＣｓＡと共に、レシピエントを、拒絶時まで、１週間に３回、ＴＧＦ−βまたはコントロール抗体（１．０ｍｇ／ｋｇ）でも処置した。群には次のものが含まれた：非処置同種移植；ＣｓＡ処置同種移植；ＣｓＡ＋コントロール抗体（１．０ｍｇ／ｋｇ）処置同種移植およびＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体（１．０ｍｇ／Ｋｇ）、処置されたおよびアイソタイプコントロール。
【００８４】
腎機能
研究したすべての実験動物から屠殺後に得られるラットの血漿におけるクレアチニンおよび血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルを定量化することによって、腎機能を測定した。定量化は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、米国）製のキットを使用して実施した。ＢＵＮレベルは、ＣｓＡ処置動物において、同系移植コントロールと対比して上昇し（１８．６±０．８５対１２．６±０．４ｍｇ／ｄｌ；ｐ＜０．０００１）、ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置した動物（１３．８±０．６３、ｐ＜０．０３）においてレベルの低減が観察されたが、ＣｓＡ＋コントロール処置した動物（１７．８±０．４５）では認められなかった。血清クレアチニンの有意な増加（０．７５±０．０３対０．４３±０．２ｍｇ／ｄｌ；ｐ＜０．０００１）が同系移植と比較してＣｓＡ処置レシピエントに観察された。ＢＵＮレベルと同様に、ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体で処置した動物（０．４９±０．０６．ｐ＜０．００３）はクレアチニンレベルの低減を示したが、コントロール抗体（０．６８±０．０８）では示さなかった。
【００８５】
ＴＧＦ−β、コラーゲン、およびフィブロネクチンｍＲＮＡの腎内発現
（遺伝子／β−アクチン比、それぞれｎ＝６）として表される結果（図２）は、ＴＧＦ−β１、コラーゲンおよびフィブロネクチンの腎内ｍＲＮＡ発現に対する抗ＴＧＦ−βまたはコントロール抗体を伴うおよび伴わないＣｓＡの長期処置の効果を実証する。
【００８６】
ＴＧＦ−β
ＣｓＡの長期処置は、同系移植と比較して、ＴＧＦ−βｍＲＮＡの腎内発現の増加（ｐ＜０．０１）を生じた。同系移植およびＣｓＡ抗ＴＧＦ−β抗体（１．０ｍｇ／ｋｇ）で処置したレシピエント間においてＴＧＦ−βｍＲＮＡ発現の差異（ｐ＝０．１２）は認められなかった一方；ＣｓＡおよびＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）処置レシピエント間においては有意差（ｐ＜０．００３）が観察された。ＣｓＡおよびＣｓＡ＋コントロール抗体処置レシピエント間では差異が観察されなかった。
【００８７】
コラーゲン
ＣｓＡの長期処置は、同系移植と比較して、コラーゲンｍＲＮＡの腎内発現の増加（ｐ＜０．０００１）を生じた。ＣｓＡおよびＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置レシピエント間では、有意差（ｐ＜０．００８）が観察された（図２）。ＣｓＡおよびＣｓＡ＋コントロール抗体処置レシピエント間では差異が観察されなかった。
【００８８】
フィブロネクチン
類似の結果が、フィブロネクチンｍＲＮＡで得られ（図２）、ＣｓＡの長期処置は、同系移植と比較して、フィブロネクチンｍＲＮＡの腎内発現の増加を生じた（ｐ＜０．０００１）。ＣｓＡおよびＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置レシピエント間では、有意差（ｐ＜０．００２）が観察された。ＣｓＡおよびＣｓＡ＋コントロール抗体処置レシピエント間では差異が観察されなかった。
【００８９】
ＭＭＰ−２およびＴＩＭＰ−２の腎内発現
結果（図３）は、ＣｓＡの長期処置は、同系移植と比較して、ＭＭＰ−２ｍＲＮＡの腎内発現の増加（ｐ＜０．０００２）を生じたことを実証する。ＣｓＡおよびＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置レシピエント間では、有意差（ｐ＜０．００４）が観察された。ＣｓＡおよびＣｓＡ＋コントロール抗体処置レシピエント間では差異が観察されなかった。抗ＴＧＦ−β抗体処置レシピエントは、ＴＩＭＰ−２ｍＲＮＡの腎内発現の低減を実証したが、統計的に有意な差異ではなかった。ＣｓＡおよびＣｓＡ＋コントロール抗体処置レシピエント間では差異が観察されなかった。
【００９０】
ＴＧＦ−βタンパク質の循環レベルに対する抗ＴＧＦ−β抗体の効果
これらの結果（図４）は、同系移植と比較して、ＣｓＡの長期処置がＴＧＦ−βタンパク質の循環レベルの有意な（ｐ＜０．０００１）増加を生じたことを実証する。同系移植およびＣｓＡ＋コントロール抗体処置レシピエント間ではＴＧＦ−βレベルの差異は認められなかった；しかし、ＣｓＡおよびＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置レシピエント間では統計的に有意な差異（ｐ＜０．００３）が観察された。
【００９１】
ＴＧＦ−βタンパク質の腎内発現に対する抗ＴＧＦ−β抗体の効果
腎内ＴＧＦ−βタンパク質発現の有意に高い（３＋−４＋）染色がＣｓＡ処置レシピエントにおいて観察されたが、これは、コントロール抗体＋ＣｓＡで処置した群において異ならなかった。ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体（１．０ｍｇ／ｋｇ）で処置した動物におけるＴＧＦ−βタンパク質染色は減少したが、同系移植コントロールより若干高い状態を保持した。
【００９２】
腎組織学に対する抗ＴＧＦ−β抗体の効果
ＣｓＡによる処置は、ＣｓＡによる長期処置を受容している患者に類似の病理組織学的変化を生じた。Ｉ）ＣｓＡ単独；ＩＩ）ＣｓＡ＋コントロール抗体；およびＩＩＩ）ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体（１．０ｍｇ／ｋｇ）で処置した心移植レシピエントラットの腎組織由来のＰＡＳおよびＨ＆Ｅ染色スライドの病理組織学的分析を実施した。管構造のＰＡＳ染色の増加を含む管空胞化および脈管変化が、ＣｓＡおよびＣｓＡ＋コントロール抗体処置動物において見出された。群ＩＩＩのすべての動物が完全に正常な腎組織学を有したわけではないが、変化は、時折しか観察されず、この群において顕著ではなかった。ＰＡＳ染色もまた、抗ＴＧＦ−β処置レシピエントにおいて減少した。結果は、ＣｓＡおよびＣｓＡ＋コントロール抗体処置動物における基底膜の肥厚および空胞化を含む管および脈管変化を実証する。
【００９３】
材料および方法（第２部）
以下の材料および方法を実施例３〜９において使用した。
【００９４】
実験群
Ｌｅｗｉｓ（ＬＥＷ  ＲＴ１１）ラットを以下の５群に分けた：
（１）非処置同種移植コントロール；
（２）非処置同系移植コントロール；
（３）ＴＡＣ；
（４）ＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体；および
（５）ＴＡＣ＋コントロール抗体。
【００９５】
ＴＡＣを、０．２５ｍｇ／ｋｇで筋肉内に９０日間投与し；抗ＴＧＦ−β抗体、１Ｄ１１を、１ｍｇ／ｋｇで週２回投与した。使用したコントロール抗体は１３Ｃ４であった。
【００９６】
ラット腎移植
ＬＥＷ  ＲＴ１１またはＷｉｓｔａｒ−Ｆｕｒｔｈ  ＷＦ  ＲＴ１ｕドナーの腎臓を、それぞれ、同系および同種移植のために、ＬＥＷ  ＲＴ１１レシピエントに移植した。（ＬＥＷ  ＲＴ１１およびＷＦ  ＲＴ１ｕ）ラットは、主要およびマイナー組織適合性遺伝子座の両方において完全な遺伝子不均衡を示す。）
【００９７】
移植は、以下のとおりに行った。５０ｍｇ／ｋｇペントバルビタール（腹腔内）による全身麻酔の導入後に、腎臓ドナーに対して正中開腹を実施した。左腎臓をその血管茎に対して動員し、尿管を分割した。ヘパリン処置（１，０００Ｕ、腹腔内）後、豊富な周囲大動脈および大静脈を伴う左腎臓を取り出した。次いで、腎臓に氷冷食塩水を軽く流し、移植するまで貯蔵した。レシピエント（上記のように麻酔した）では、正中開腹を介して、下大動脈および静脈を暴露した。標準的な微小血管外科技術を使用して、左ドナー腎臓を、端側形式でレシピエントの管に吻合し、血流を回復させた。尿管を膀胱壁に挿入し、短いセグメントのＰＥ５０管でステントした。
【００９８】
動物のモニタリング、屠殺、組織回収
代謝ゲージに収容したラットを移植片拒絶の証拠について毎日モニターした（即ち、有意な重量増加および尿量の減少）。腎機能を、血清中クレアチニンおよびＢＵＮレベルの変化によって決定した。拒絶の時点または観察期間の終了時に、動物をペントバルビタールナトリウム（５０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内）で麻酔した。心臓穿刺を介する放血後、同系移植および同種移植を、以下に記載の日常的な組織学、免疫組織化学、ウエスタンブロッティング、およびＲＴ−ＰＣＲを使用して、分析した。
【００９９】
ＢＵＮおよびクレアチニンレベル
腎機能を評価するために、それぞれＷａｋｏ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、バージニア州およびＯｘｆｏｒｄ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ、ミシガン州由来の市販のキットを使用して、血清中ＢＵＮおよびクレアチニンを分析した。
【０１００】
同種移植片の組織学、免疫組織化学および病理組織学的変化の定量化
各動物由来の移植した腎臓の一部をホルマリンで固定化し、パラフィン中に包埋した。ヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）ならびに過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を使用して、組織学的変化を評価した。腎臓の組織学的変化については、本発明者らは、標準的な手順によって定量した。糸球体障害の重症度を、カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（２０００年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７３：１５４３−１５４９に記載のようにスコア評価した。簡単に説明すると、各領域において、少なくとも５０〜６０個の糸球体を各標本について計数し、病変を、５ポイントスケール（０、増殖なし、ほとんど正常な組織学；１、約２５％のセグメント状病巣；２、２５％を超えるが５０％を超えないセグメント病巣；３、広汎な増殖を伴う繊維化病巣；４、ほとんど完全な繊維化変化）に対してスコア評価した。ＰＡＳ染色を使用して、細胞外マトリックスタンパク質蓄積の程度を決定した（スコア評価せず）。Ｈ＆Ｅ染色スライドにおける小葉間動脈および病巣をスコア評価した。
【０１０１】
血漿中ＴＧＦ−βタンパク質および腎臓組織における免疫化学
ＴＧＦ−βタンパク質の血漿中レベルを、カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６７：８８２−８８９に記載されているように測定した。ＴＧＦ−βの腎内タンパク質発現を、カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（２０００年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，７３：１５４３−１５４９；カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（２００２年）Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔｌ．，６２：２２５７−６３；およびカンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（１９９９年）Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６７：６１４−６１９に本質的に記載のように、免疫組織化学的に調べた。ホルマリン固定化パラフィン包埋された組織を、細かい切片にスライスし、キシレン中で脱パラフィンし、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）に対し段階別に調製したエタノール中で再水和した。内因性ペルオキシダーゼ活性を、メタノール／Ｈ２Ｏ２（１８：１ｖｏｌ／ｖｏｌ）で３０分間ブロックした後、非特異的結合を、１０％正常ウマ血清および３％ＢＳＡを補充したＰＢＳ中に希釈した１．５％アビジン／ビオチンで１時間、ブロックした。組織切片を、１晩、４℃で、上記のＰＢＳ中の特異的第一抗体（５０μｇ／ｍｌ）と共にインキュベートした。ＰＢＳ中での広範な洗浄後、スライドを、室温で、１時間、希釈した（１：１，０００）ビオチン標識抗マウスＩｇＧウマ抗血清と共にインキュベートし、ＰＢＳ中で再度広範に洗浄し、次いで、ＡＢＣ溶液中で３０分間洗浄した。スライドを、１０分間、ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）中で展開し、水で１０分間、濯いだ。次いで、スライドを、ヘマトキシリンで対比染色し、段階的に調製したエタノールおよびキシレン中で脱水した。
【０１０２】
スライドを、評価のために、ＰｅｒｍｏｕｎｔＴＭでマウントした。各群由来のサンプルを、病理組織学的変化および免疫組織化学染色のために等級付けした。免疫染色の強度を、０（非染色）〜４＋（最大染色）に等級付けした。各動物についての腎臓組織化学の重症度を、次のパラメータ：間質の線維化、動脈変化、および糸球体硬化症のそれぞれについて２名の個体によって盲検的に等級付けした。
【０１０３】
リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡの検出
ＲＴ−ＰＣＲを、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｉＣｙｃｌｅｒＴＭシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、カリフォルニア州）を使用して実施した。Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ニュージャージー州）製キットを使用して腎組織からＲＮＡを単離し、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、カリフォルニア州）製ｃＤＮＡ合成キットを使用してｃＤＮＡに逆転写した。プライマーの特異性を、９５℃で２０秒間および６０℃で１分間の４０サイクルの正規のＰＣＲを稼動し、続いて、エチジウムブロマイド含有アガロースゲルにおいて分離することによって、試験した。リアルタイムＰＣＲを、ＳＹＢＲ  Ｓｕｐｅｒｍｉｘキット（Ｂｉｏ−ＲＡＤ）（９５℃で２０秒間および６０℃で１分間の４０サイクル）を使用して、実施した。ＰＣＲ効率は、テンプレートｃＤＮＡを連続的に希釈することによって調べた。融解曲線データを回収して、ＰＣＲ特異性を確認し、各アッセイに適切なネガティブコントロールを含めた。各サンプルの各遺伝子についてのｍＲＮＡレベルを、β−アクチンｍＲＮＡに対して正規化し、カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（２００５年）Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１０１：１１９−１２６に記載のように２［（Ｃｔ／β−アクチン−Ｃｔ／目的の遺伝子）］として提示した。
【０１０４】
ウエスタンブロッティング
凍結組織を、１％トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニル、３５ｎｇ／ｍｌペプスタチンＡおよび１０ｎｇ／ｍｌロイペプチンを伴う氷冷ＰＢＳにおいて均質化した。遠心分離後、５０μｇのタンパク質を、カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（２００５年）Ｎｅｐｈｒｏｎ  Ｅｘｐ．Ｎｅｐｈｒｏｌ．，１０１：１１９−１２６に記載のようにＳＤＳ  ＰＡＧＥによって遠心分離した。ブロットを、適切な希釈のポリクローナル抗ｐ２２ｐｈｏｘ抗体（Ｒ５５５４、Ｍａｒｓｈ  Ｌａｂ，Ｂｏｚｅｍａｎ、モンタナ州より贈与）または抗ＮＯＸ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、カリフォルニア州）でプロービングし、１：５，０００希釈の西洋ワサビペルオキシダーゼ−コンジュゲート第二抗体と共にインキュベートし、増強された化学発光によって可視化した。
【０１０５】
統計解析
ＡＮＯＶＡおよびスチューデントのｔ検定を使用して、ＴＧＦ−βの遺伝子発現および血漿レベルについての群の平均間の差異を評価した。ＧｒａｐｈＰａｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、カリフォルニア州製の統計ソフトウェアプログラムを使用して、解析を実施した。結果を平均±ＳＥＭで表し、両側検定の有意水準を、ｐ＜０．０５のレベルで決定した。
【０１０６】
実施例３：腎臓機能に対するＴＡＣの影響を低減する抗ＴＧＦ−β抗体
ＢＵＮレベル（図５Ａ）は、９０日間の処置後のＴＡＣ処置ラットにおいて、移植９０日後に回収した同系移植コントロールと対比して上昇した（２９．９±１．３対１７．３±１．３ｍｇ／ｄｌ；ｐ＜０．０００１）。抗ＴＧＦ−β抗体（２１．３±０．９、ｐ＜０．０１）はＢＵＮレベルを減少させたが、コントロール抗体（２６．６±１．１ｍｇ／ｄｌ）は減少させなかった。同様に、ＴＡＣ処置レシピエントでは、同時に行われた同系移植コントロールと比較して、血清中クレアチニンの有意な増加（０．８３±０．０６対０．５２±０．０９ｍｇ／ｄｌ；ｐ＜０．０４）が観察された。ＢＵＮレベルと同様に、抗ＴＧＦ−β抗体（０．４８±０．０８ｍｇ／ｄｌ；ｐ＜０．０２）はＴＡＣ誘導性クレアチニンレベルを阻害したが、コントロール抗体（０．７８±０．０９）は阻害しなかった（図５Ｂ）。
【０１０７】
実施例４：ＴＧＦ−β、ＮＯＸ−１、ｐ２２ｐｈｏｘならびにＲＡＣ−１ｍＲＮＡの抗ＴＧＦ−β抗体およびＴＡＣ誘導性腎内発現
移植９０日後の（１）同系移植、（２）ＴＡＣ、（３）ＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体、および（３）ＴＡＣ＋コントロール抗体処置動物由来の腎臓組織におけるＴＧＦ−β、ＮＯＸ−１およびｐ２２ｐｈｏｘの腎内発現を、ＲＴ−ＰＣＲによって分析した。ＴＡＣによる処置は、ＴＧＦ−β（３７倍）、ＮＯＸ−１（１８倍）、およびｐ２２ｐｈｏｘ（３１倍）、およびＲＡＣ−１（２０倍）のｍＲＮＡ発現を増加した。遺伝子発現の増加は、抗ＴＧＦ−β抗体（それぞれ、ｐ＜０．０１；ｐ＜０．００８、ｐ＜０．０４、およびｐ＜０．０３）によって減少したが、コントロール抗体では減少しなかった（図６）。同系移植コントロールに関する結果を提示する。
【０１０８】
実施例５：ＴＧＦ−β、ＳＯＤおよびＴＲＸの特異な腎内ｍＲＮＡ発現
ＴＡＣによる長期処置の抗酸化遺伝子に対する効果についてさらに調べるために、ＳＯＤおよびＴＲＸの腎内ｍＲＮＡ発現を決定した。データは、ＳＯＤおよびＴＲＸｍＲＮＡが減少した一方、同系移植コントロールと比較して、ＴＡＣ処置ラットではＴＧＦ−βｍＲＮＡが増加したことを実証した（図７）。ＴＡＣによる処置は、ＴＧＦ−βｍＲＮＡの３７倍の増加生じた一方、ＳＯＤおよびＴＲＸのｍＲＮＡ発現は、それぞれ２７および８０倍減少した。ＳＯＤｍＲＮＡは、抗ＴＧＦ−β抗体を部分的に反転する一方、ＴＲＸｍＲＮＡは、完全に反転された。
【０１０９】
実施例６：ｐ２２ｐｈｏｘおよびＮＯＸ−１タンパク質の移植片内発現
同系移植、非処置同種移植、およびＴＡＣによって処置された動物由来の腎臓組織において、ｐ２２ｐｈｏｘおよびＮＯＸ−１タンパク質の発現を分析した。タンパク質溶解物（１０μｇ）を電気泳動し、ニトロセルロース紙に移し、抗ｐ２２ｐｈｏｘおよび抗ＮＯＸ−１抗体でプロービングした。図８に示されるように、ＴＡＣによる処置は、ｐ２２ｐｈｏｘおよびＮＯＸ−１の移植片内（ｉｎｔｒａｇｒａｆｔ）発現の増加を生じた。
【０１１０】
実施例７：ＴＡＣによる処置は、腎移植における腎毒性特異的組織学的変化を生じる。
Ｈ＆ＥおよびＰＡＳ染色腎臓薄切片における病理組織学的試験によって、形態学的変化に対するＴＡＣ、ＴＡＣ＋コントロール抗体およびＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置の効果を評価した。
【０１１１】
コントロールラットの腎臓（同系移植）の光学顕微鏡的所見は、正常な糸球体、輸入細動脈および細管細胞を示した。全く対照的に、ＴＡＣを受容したラットの腎臓組織は、重度〜中等度の尖端突起の形成（ｅｐｉｃａｌ  ｂｌｅｂｂｉｎｇ）、硝子化、糸球体基底膜肥厚、尿細管間質の線維化のパターンならびに輸入細動脈および小葉間動脈の末端部分の細動脈病変を含む顕著な組織学的変化を示した。これらの変化は、ＴＡＣおよび抗ＴＧＦ−β抗体の同時投与では観察されなかった。しかし、類似の変化が、ＴＡＣ＋コントロール抗体で処置した動物において認められた。ＰＡＳ染色切片もまた、抗ＴＧＦ−β抗体処置レシピエントにおいて、ほぼ正常と比較して、基底膜の肥厚を示す。抗ＴＧＦ−β抗体によるＴＡＣ誘導性変化の反転が観察された。ＴＡＣ＋コントロール抗体処置動物における組織学は、ＴＡＣ単独のそれと異ならなかった。硝子化および細動脈病変尿細管間質の線維化および糸球体基底膜肥厚が、ＴＡＣおよびＴＡＣ＋コントロール抗体処置レシピエントにおいて観察されたが、ＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置レシピエントでは観察されなかった。腎毒性に特異的な近位尿細管上皮細胞特異的変化が、ＴＡＣおよびＴＡＣ＋コントロール抗体処置ラット移植レシピエントにおいて認められ、同系移植またはＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置ラットでは認められなかった。定量分析は、ＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置同種移植と統計的に異ならない同系移植と比較して、ＴＡＣ処置レシピエントでは統計的有意（ｐ＜０．０３６）差を実証した。
【０１１２】
実施例８：ＴＡＣはＴＧＦ−βの腎内発現を増加する。
免疫組織化学を使用して、ＴＡＣ、ＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体、ＴＡＣ＋コントロール抗体処置または非処置同種移植で処置した腎臓移植のレシピエント由来の腎臓組織におけるＴＧＦ−βタンパク質の腎内発現について分析した。腎臓切片を、カンナ（Ｋｈａｎｎａ）ら（２００４年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，１１０：３８２２−３８２９に記載のように抗ＴＧＦ−β抗体で染色した。ＴＡＣおよびＴＡＣ＋コントロール抗体処置レシピエントでは、硝子化および細動脈病変尿細管間質の線維化および糸球体基底膜肥厚の他に、ＴＧＦ−βタンパク質についての染色の増加が観察されたが、ＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置レシピエントではほぼ正常であった（図８）。
【０１１３】
実施例９：ＴＧＦ−βの循環レベルに対するＴＡＣの効果
図９は、ＴＡＣによる長期処置が、同系移植コントロールと比較して、ＴＧＦ−βタンパク質の循環レベルの有意な増加を生じた（９．８±１．７対５７±６ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０１）ことを実証した。ＴＧＦ−βレベルでは、同系移植とＴＡＣ＋コントロール抗体処置レシピエント（５７±６対５２±６ｎｇ／ｍｌ）との間に差異が認められなかった；しかし、ＴＡＣおよびＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体処置レシピエントの間では統計的有意差（９±１．３対５７±６ｎｇ／ｍｌ；ｐ＜０．０１）が観察された。
【０１１４】
本明細書は、本明細書内において引用した参考文献の教示内容と照らし合わせて、ほぼ完全に理解される。本明細書内の実施態様は、本発明の実施態様の例示を提供するが、これは、本発明の範囲を制限するものと解釈されるべきではない。当業者であれば、他の多くの実施態様が本発明に包含されることを容易に認識する。本開示物において引用したすべての刊行物、特許、特許出願、および生物学的配列は、それらの全体が参考として引用される。本明細書におけるいずれの参考文献の引用も、そのような参考文献が本発明に先行する技術であることを認めていない。
【０１１５】
他に明記しない限り、特許請求の範囲を含む本明細書において、成分、細胞培養、処置条件などの数量を表現するすべての数は、すべての場合において、用語「約」によって修飾されることが理解されるべきである。従って、対照的に、他に明記しない限り、数的パラメータは近似値であり、本発明によって得られることが求められる所望される特性に依存して、変動してもよい。他に明記しない限り、一連の要素に先行する用語「少なくとも」は、連続しているすべての要素を指すと理解されるべきである。当業者であれば、本明細書に記載の本発明の特定の実施態様に対する多くの等価物を認識し、日常的域を超えない程度の実験を使用して、これを確かめることが可能である。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】ＣｓＡの免疫抑制効果に対する高用量の抗ＴＧＦ−β抗体のネガティブな効果および腎毒性に対するより低用量の抗体の有益な効果を示すＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒグラフを示す。ＣｓＡに加えて、レシピエントはまた、抗ＴＧＦ−βまたはコントロール抗体（それぞれ２．５もしくは１．０ｍｇ／ｋｇ）で、週３回処置された。群には次のものが含まれた：同系移植、非処置同種移植、ＣｓＡ処置同種移植、ＣｓＡ＋コントロール抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体（２．５ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ＋コントロール抗体（１．０ｍｇ／ｋｇ）、ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体（１．０ｍｇ／ｋｇ）、およびアイソタイプ抗体コントロール。２．５ｍｇ／ｋｇ用量の抗ＴＧＦ−β抗体はＣｓＡの免疫抑制効果を無効にするが、１．０ｍｇ／ｋｇでは無効にしない。ＣｓＡ＋コントロール抗体処置レシピエントは、抗ＴＧＦ−β抗体処置レシピエントと比較して、移植片拒絶を示さなかったが、屠殺した。
【図２】図１に記載の多様な処置群におけるＴＧＦ−β、コラーゲン、およびフィブロネクチンｍＲＮＡの腎内発現レベルを示す。結果を、ハウスキーピング遺伝子、β−アクチンに対するＴＧＦ−β、コラーゲンまたはフィブロネクチンの比として表す。同系移植と比較して、ＣｓＡ処置レシピエントにおいて、ＴＧＦ−β、コラーゲン、およびフィブロネクチンｍＲＮＡの発現の統計的に有意な増加が認められる。ＣｓＡ処置動物と比較して、ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体群において、ＴＧＦ−β、コラーゲン、およびフィブロネクチンｍＲＮＡの発現の統計的に有意な減少が認められる一方、ＣｓＡ＋コントロール抗体群との差異は存在しない。（Ｐ値は次のとおりである：ＴＧＦ−β＊ｐ＜０．０２および＊＊ｐ＜０．００３；コラーゲン！ｐ＜０．０００１および！！ｐ＜０．００８；フィブロネクチン＃ｐ＜０．０００１および＃＃ｐ＜０．００２。）
【図３】ＭＭＰ−２およびＴＩＭＰ−２ｍＲＮＡの腎内発現を示す。結果を、ハウスキーピング遺伝子、β−アクチンに対するＭＭＰ−２およびＴＩＭＰ−２の比として表す。同系移植と比較して、ＣｓＡ処置レシピエントにおいて、ＭＭＰ−２およびＴＩＭＰ−２の発現の統計的に有意な増加が認められる。ＣｓＡ処置動物と比較して、ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体群において、ＭＭＰ−２の発現の統計的に有意な減少が認められる一方、ＣｓＡ＋コントロール抗体群との差異は存在しない。ＴＩＭＰ−２については、ＣｓＡ処置動物と比較して、ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体群において、発現の減少が認められる（但し、統計的に有意ではない）。（Ｐ値は次のとおりである：ＭＭＰ−２＊ｐ＜０．０００２および＊＊ｐ＜０．００４；ＴＩＭＰ−２！ｐ＜０．０３および！！ｐ＜０．１８。）
【図４】図１に記載の１ｍｇ／ｋｇ抗ＴＧＦ−β抗体で処置した動物におけるＴＧＦ−βの血漿レベルを示す。同系移植コントロールと比較して、ＣｓＡで処置した動物において、血漿中ＴＧＦ−βレベルの統計的に有意な増加が認められる。ＣｓＡ処置動物と比較して、ＣｓＡ＋抗ＴＧＦ−β抗体群において、ＴＧＦ−βレベルの統計的に有意な減少が認められる。（Ｐ値は次のとおりである：＊ｐ＜０．０００１および＊＊ｐ＜０．００３。）
【図５】腎移植レシピエントの腎機能に対するＴＡＣおよび／または抗ＴＧＦ−β抗体の効果を実証する。図５Ａは、０．２５ｍｇ／ｋｇのＴＡＣで９０日間処置した動物または同系移植コントロールにおけるＢＵＮレベルを示す。ＴＡＣに加えて、レシピエントをまた、抗ＴＧＦ−βまたはコントロール抗体（それぞれ１ｍｇ／ｋｇ）で、週２回処置した。群には次のものが含まれた：同系移植、ＴＡＣ処置同種移植、ＴＡＣ＋コントロール抗体、およびＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体。同系移植コントロール（ｐ＜０．０００１）またはコントロール抗体と比較して、ＴＡＣ処置動物において、ＢＵＮレベルの統計的に有意な増加を観察した。抗ＴＧＦ−β抗体を伴う処置では、ＴＡＣ単独と比較して、ＢＵＮレベルが減少した（ｐ＜０．０１）。コントロール抗体を伴う処置においてもまた、ＢＵＮレベルが若干減少したが、この減少は統計的に有意ではなかった。図５Ｂは、ＴＡＣで処置した動物または同系移植コントロールのクレアチニンレベルを示す。動物を、図５Ａについて記載のように処置した。同系移植コントロール（ｐ＜０．０４）またはコントロール抗体と比較して、ＴＡＣ単独で処置した動物において、クレアチニンレベルの統計的に有意な増加を観察した。抗ＴＧＦ−β抗体を伴う処置では、ＴＡＣ単独と比較して、ＢＵＮレベルが減少した（ｐ＜０．０２）。コントロール抗体を伴う処置においてもまた、クレアチニンレベルが若干減少したが、この減少は統計的に有意ではなかった。
【図６】ＴＧＦ−β、ＮＯＸ−１、ｐ２２ｐｈｏｘ、およびＲａｃ−１ｍＲＮＡの腎内発現に対する抗ＴＧＦ−β抗体の効果を示す。動物を、図５Ａについて記載のように処置した。抗ＴＧＦ−β抗体は、ＴＡＣ誘導性腎内ＴＧＦ−β、ＮＯＸ−１、ｐ２２ｐｈｏｘ、およびＲａｃ−１ｍＲＮＡ発現を阻害したが、コントロール抗体は阻害しなかった。
【図７】ラット腎移植におけるＴＧＦ−β、ＳＯＤ、およびＴＲＸｍＲＮＡ発現に対するＴＡＣの効果を示す。動物を、図５Ａについて記載のように処置した。ＴＧＦ−β対ＳＯＤおよびＴＲＸｍＲＮＡは、ＴＡＣ処置ラット移植レシピエントにおいてレシプロカルに発現されることを見出した。抗ＴＧＦ−β抗体は腎内ＴＧＦ−βを阻害するが、ＳＯＤおよびＴＲＸｍＲＮＡ発現を部分的に回復した。
【図８】図５Ａについて記載のように処置された動物におけるｐ２２ｐｈｏｘおよびＮＯＸ−１発現のウエスタンブロット分析の結果を示す。ｐ２２ｐｈｏｘおよびＮＯＸ−１の腎内発現は、非処置同種移植（最後の２つのレーン）および同系移植コントロール（最初の２つのレーン）の両方と比較して、ＴＡＣによる処置後に上昇した。
【図９】腎移植レシピエントのＴＧＦ−βタンパク質の循環レベルに対するＴＡＣおよび／または抗ＴＧＦβ抗体の効果を示す。動物を、図５Ａについて記載のように処置した。血漿サンプル中のＴＧＦ−βタンパク質の循環レベルをＥＬＩＳＡによって定量した。ＴＡＣ処置レシピエントは、同系移植コントロールと比較して、ＴＧＦ−β発現の統計的に有意な増加を示した。ＴＡＣ処置動物と比較して、ＴＡＣ＋抗ＴＧＦ−β抗体群において、ＴＧＦ−βレベルの統計的に有意な減少を観察した；ＴＡＣ単独による処置に関しては、ＴＡＣ＋コントロール抗体処置レシピエントと比較して、ＴＧＦ−β発現の統計的に有意な差異は観察されなかった。（Ｐ値は次のとおりである：＊ｐ＜０．０１および＊＊ｐ＜０．０１）。
【図１】
2008513542.tif 000005
【図２】
2008513542.tif 000006
【図３】
2008513542.tif 000007
【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
2008513542000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月22日(2007.5.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008513542000001.app
【国際調査報告】
2008513542.tif 000018
2008513542.tif 000019
2008513542.tif 000020
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