(57)【要約】  本発明は、患者の死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度を測定するための方法に関し、該方法は上記患者のｓＰＬＡ２活性を測定すること、上記活性を所定値と比較すること、を含み、上記所定値と比較して上記患者のより高いｓＰＬＡ２活性は、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度を示す。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度を測定する方法であって：
−  前記患者のｓＰＬＡ２活性を測定すること、
−  前記活性を所定値と比較すること、
を含み、前記所定値と比較して前記患者のより高いｓＰＬＡ２活性は、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度を示す、方法。
【請求項２】
患者が、実質的に健康であると、特にアテローム性動脈硬化症、心および／または血管関連疾患に関して診断された、請求項１記載の方法。
【請求項３】
患者が、次の冠動脈障害：
−  無症候性虚血がある、または虚血がない無症候性冠動脈疾患、
−  安定または労作狭心症などの、心筋壊死を伴わない慢性虚血障害、
−  不安定狭心症などの、心筋壊死を伴わない急性虚血障害、
−  ＳＴ上昇心筋梗塞または非ＳＴ上昇心筋梗塞などの、心筋壊死を伴う虚血障害、
の１つの症状が見られると診断された、請求項１記載の方法
【請求項４】
虚血症状の発症を患者が診断されなかった、請求項１記載の方法。
【請求項５】
虚血症状の発症を患者が診断された、請求項１記載の方法。
【請求項６】
所定値が、実質的に健康な個人のｓＰＬＡ２活性範囲の最も高い２つの３分位に、特に上位半分に、とりわけ前記範囲の最も高い３分位に含まれているｓＰＬＡ２活性に対応する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
患者のｓＰＬＡ２活性が、約１．８nmol/ml/minより高く、特に約２nmol/ml/minより高く、とりわけ約２．５nmol/ml/minより高く、好ましくは約２．９nmol/ml/minより高く、およびより好ましくは３．３nmol/ml/minより高い、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
ｓＰＬＡ２活性を生体試料中で、特に血清または血漿試料中で、およびとりわけヘパリン処理された血漿試料中で測定する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
患者の心および／または血管疾患の診断のためのインビトロまたはエクスビボの方法であって：
−  前記患者のｓＰＬＡ２活性を測定すること、
−  前記活性を所定値と比較すること、
を含み、前記所定値と比較してより高い前記患者のｓＰＬＡ２活性が、心および／または血管疾患を示す、方法。
【請求項１０】
所定値と比較して患者のより高いｓＰＬＡ２活性が、前記患者が心および／または血管疾患に前記患者のｓＰＬＡ２活性測定をした時点で罹患していることを示し、あるいは前記患者の心および／または血管疾患への将来の罹患、特に前記患者のｓＰＬＡ２活性測定をした時点から７２時間を超える時間後には罹患していることを示す、請求項９記載のインビトロまたはエクスビボの方法。
【請求項１１】
患者のｓＰＬＡ２活性が、約１．８nmol/ml/minより高く、特に約２nmol/ml/minより高く、とりわけ約２．５nmol/ml/minより高く、好ましくは約２．９nmol/ml/minより高く、およびより好ましくは約３．３nmol/ml/minより高い、請求項９または１０記載のインビトロまたはエクスビボの方法。
【請求項１２】
ｓＰＬＡ２活性を、生体試料中で、特に血清または血漿試料中で、そして更に特別にはヘパリン処理された血漿試料中で測定する、請求項９〜１１のいずれか１項記載のインビトロまたはエクスビボの方法。
【請求項１３】
死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度の測定を目的とするキットの製造のための、ｓＰＬＡ２活性測定手段の使用。
【請求項１４】
心および／または血管疾患の診断を目的とするキットの製造のための、ｓＰＬＡ２活性測定手段の使用。
【請求項１５】
ｓＰＬＡ２活性測定手段がｓＰＬＡ２によって加水分解されやすい化合物を含み、その加水分解生成物が直接または間接的に定量することができる、請求項１３または１４記載の使用。
【請求項１６】
ｓＰＬＡ２により加水分解されやすい化合物が、蛍光性部分または発色性部分を含むリン脂質もしくはリン脂質類縁体である、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度の測定を目的とするキットであって：
−  ｓＰＬＡ２アッセイ用緩衝剤、
−  １−ピレンデカノイルなどの、ｓＰＬＡ２により加水分解されやすく、その加水分解生成物が直接または間接的に定量可能である化合物、
−  その活性が、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した可能性を測定するための所定値に対応している、対照のｓＰＬＡ２試料、
を含むキット。
【請求項１８】
心および／または血管疾患の診断を目的とするキットであって：
−  ｓＰＬＡ２アッセイ用緩衝剤、
−  １−ピレンデカノイルなどの、ｓＰＬＡ２により加水分解されやすく、その加水分解生成物が直接または間接的に定量可能である化合物、
−  その活性が、心および／または血管疾患を診断するための所定値に対応する、対照のｓＰＬＡ２試料、
を含むキット。
【請求項１９】
心および／または血管の病理の予防もしくは治療を目的とする医薬の製造に使用しやすい薬剤をスクリーニングするための方法であって：
−  第一の工程で、同じ種の実質的に健康な動物と比較してより高いｓＰＬＡ２活性を構成的に示し、かつスクリーニングするべき薬剤が投与されている、試験動物のｓＰＬＡ２活性をインビトロで測定し、
−  第２の工程で、測定された活性を、スクリーニングするべき前記薬剤投与前の前記試験動物のｓＰＬＡ２活性と比較し、
−  第３の工程で、測定された活性が、スクリーニングするべき前記薬剤投与前の試験動物のｓＰＬＡ２活性より低い場合は、そのスクリーニングに付した薬剤を選択する、
ことを特徴とする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、心血管障害の予知および診断に使用しやすい新しいマーカーに関する。
【０００２】
心血管障害は、先進国における罹患率および死亡率の主要な原因の一つであり、その疾患の予防は公衆衛生の主要な関心事である。その障害の予防のための措置の１つが、危険性のある個人の検出である。したがって、ＨＤＬコレステロールレベルなどのいくつかの生化学的危険マーカーが、心血管疾患の危険性がある患者の検出のために現在使用されている。しかし現在の時点では、多数の心血管障害が、それらのマーカーとの関連においては危険性があると考えられない個人に生じる場合がある。したがって、心血管イベントをより正確に予測する新しい生化学的マーカーの必要性が存在する。ｓＰＬＡ２の血漿レベルは、現在研究中の将来性ある危険マーカーの１つである。
【０００３】
ホスホリパーゼＡ２（ＰＬＡ２）酵素は、リン脂質をｓｎ−２の位置で加水分解して、リゾリン脂質および脂肪酸を生成する（Dennis, J Biol Chem. (1994) 269:13057-13060）。最も広範囲に研究されているＰＬＡ２の１つは、正常な動脈およびアテロームプラーク中で発現されることが示されている（Elinder et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. (1997) 17: 2257-63）低分子量（１４kDa）のIIａ群分泌性ＰＬＡ２（ｓＰＬＡ２）である。いくつかのデータが、アテローム性動脈硬化症の進行および合併症の両方におけるｓＰＬＡ２の潜在的に重要な役割を示唆している。ｓＰＬＡ２によるアラキドン酸の放出は、プロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエンを含む酸化誘導体の生成における律速イベント(rate limiting event)である。ｓＰＬＡ２は、リポキシゲナーゼによる低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）の酸化修飾（Mangin et al. Circ Res. (1993) 72:161-6）、ならびにＬＤＬおよびＨＤＬ粒子の両方からの生物学的活性のある酸化されたリン脂質の放出（Leitinger et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. (1999) 19:1291-8）に関係しており、これはアテローム発生における直接の役割を示唆している。
【０００４】
このように、いくつかの臨床的研究が、いくつかの心血管障害に対応するｓＰＬＡ２の血漿レベルの予測値を決定することを目指してきた。その結果、ｓＰＬＡ２の血漿レベルは、冠動脈疾患の患者において上昇し、安定した患者の冠動脈イベントを予測すると考えられている（Kugiyama et al. Circulation. (1999) 100:1280-4）。更に、経皮的冠動脈形成術を行っている安定した患者におけるｓＰＬＡ２の血漿レベルの増大は、また、他の標準的な生物学的および臨床的変数を超える独立した予知情報を提供する（Liu et al. Eur Heart J. (2003) 24:1824-32）。その上、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）の患者のｓＰＬＡ２の予後値を評価する研究が（それは不安定狭心症の患者に関する小さな研究に限られたものであるが）、ｓＰＬＡ２の血漿レベルの増大が、再発性冠動脈イベント（主として血管再生術）を、他の危険因子とは独立に、予測することを示した（Kugiyama et al. Am J Cardiol. (2000) 86:718-22）。
【０００５】
しかし、それらの研究は、統計的に有意であると考えるには、あまりにも少数の患者についてしか行なわれていないで、多くの議論の的となっている。実際、多数の患者について行なわれた最近の研究は、ｓＰＬＡ２血漿レベルと、死亡または心血管イベントの予測との間には、有意な相関が存在しないことを示している。
【０００６】
したがって、本発明の目的の１つは、先行技術のものより信頼性の高い、心血管疾患の新しい予知および／または診断方法を提供することである。
【０００７】
本発明の別の目的は、一見健康な人々にとって意味がある、心血管疾患の新しい予知および／または診断方法を提供することである。
【０００８】
本発明の更なる別の目標は、心血管イベントを予防および／または治療するために、効率的な治療手段のスクリーニングを可能にすることである。
【０００９】
したがって本発明は、患者における、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度を測定する方法であって：
−  上記患者のｓＰＬＡ２活性を測定すること、
−  上記活性を所定値と比較すること
を含み、上記所定値と比較して上記患者のより高いｓＰＬＡ２活性は、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度を示す、方法に関する。
【００１０】
「増大した危険度」とは、ｓＰＬＡ２活性が所定値より高い患者は、死亡するかあるいは心および／または血管イベントに罹患する可能性が、ｓＰＬＡ２活性が上記所定値より低い個人よりも高いことを意味する。
【００１１】
本発明によれば、心および／または血管イベントとして、特に、心筋梗塞（ＭＩ）、血管脳卒中、心および／または血管疾患による入院ならびに血管再生術が考えられる。
【００１２】
ｓＰＬＡ２活性の測定は、Pernasら(Pernas et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. (1991) 178:1298-1305) によって改良されたRadvanyi et al.(1989) Anal Biochem.177:103-9による蛍光アッセイにより、行うことができる。特に次のアッセイを用いる。１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノールナトリウム塩（Interchim, Montlucon, France）をｓＰＬＡ２の基質として用いる。ｓＰＬＡ２によるこの基質の加水分解が１−ピレンデカン酸をもたらし、それは３９７nmの蛍光を発する。小分けにされた血漿０．０３ml量（Ｅ）を、基質５nmolと、トリス-ＨＣｌ（ｐＨ８．７）１０mM、アルブミン０．１％、ＣａＣｌ2  １０mMの存在下、全量２．５mlで混合し、１分後に蛍光（Ｆ）を３９７nmで測定する。０．１Ｕのハチ毒ＰＬＡ２（Sigma Chemical Co., France）により１分間に基質が１００％加水分解され、したがって１分間の反応の終わりの蛍光値（Ｆｍａｘ）が、２nmol/minの活性（Ｖｍａｘ）に対応する。試料の活性（Ａ）（nmol/min/mlで表す）は、下式により与えられる：
【００１３】
【数１】
2008506374.tif 000002
【００１４】
基質の加水分解が５０％を超す場合は、試料を希釈する。血漿が存在しない状態での基質の加水分解をネガティブコントロールとして用いて、ＰＬＡ２活性から導出する。すべての試料を２回繰り返して試験する。最小検出活性および検出限界は０．１０nmol/min/mlであり、またアッセイ内およびアッセイ間の変動係数は１０％未満である。
【００１５】
本明細書に示した血漿ｓＰＬＡ２活性についてのすべての数値は、上に定めたアッセイにより測定されている。
【００１６】
「所定値」という表現は、血漿ｓＰＬＡ２活性がそれより上であると、患者が現在または将来に、心および／または血管関連イベントもしくは病理に罹患することを意味すると考えられる、閾値を指す。
【００１７】
「より高いｓＰＬＡ２活性」という表現は、増大した危険度を示すためには、患者のｓＰＬＡ２活性値が所定値より大きくなければならないことを意味する。
【００１８】
先に規定した方法の具体的な実施態様によれば、患者は、実質的に健康であると、特にアテローム性動脈硬化症、心および／または血管関連疾患に関して診断された。
【００１９】
「実質的に健康である」とは、患者が疾患に、特に、アテローム性動脈硬化症、心および／または血管関連疾患に、罹患した徴候を示さないことを意味する。そのような疾患には、特に、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、頸動脈アテローム性動脈硬化症、大動脈アテローム性動脈硬化症、腸骨もしくは大腿骨アテローム性動脈硬化症、血管動脈瘤、血管石灰化、高血圧症、心不全および糖尿病、が含まれる。
【００２０】
先に規定した方法の別の具体的な実施態様によれば、患者は、次の冠動脈障害の一つの症状を呈すると診断された：
−  無症候性虚血がある、または虚血がない無症候性冠動脈疾患、
−  安定または労作狭心症などの、心筋壊死を伴わない慢性虚血性障害、
−  不安定狭心症などの、心筋壊死のない急性虚血障害、
−  ＳＴ上昇心筋梗塞または非ＳＴ上昇心筋梗塞などの、心筋壊死を伴う虚血障害。
【００２１】
組織虚血はしばしば相対的関係で定義され、酸素の必要量が組織への酸素の送達を超える場合に生じる。組織（例えば心筋）の酸素要求量と供給との間に不均衡が存在する。この酸素欠乏状態には、潅流の低下の結果として起こる代謝産物の不十分な除去が伴うことがある。心筋虚血を、臨床的に（例えば胸痛）、生物学的に（例えばミエロペルオキシダーゼ活性の増加）、代謝的に（シンチグラフィを用いて）、局所壁運動障害の解析により、または心電図の使用（ＳＴ部分の典型的な変形、ＳＴ部分の上方または下方変位、Ｔ波反転または急勾配の対称的もしくは高振幅の陽性Ｔ波などのＴ波の典型的な変形）により、診断することができる。無症候性虚血は、通常はシンチグラフィまたは２４時間心電図記録を用いて、診断する。
【００２２】
安定および労作狭心症は、普通、運動中に胸痛が起こり、休息するとゆっくりと回復することにより顕在化する。それは通常、運動中の組織虚血を反映している。
【００２３】
不安定狭心症は、安定狭心症の頻度および／もしくは重症度の足元の増加、狭心症または安静時狭心症の最初のエピソードのうちのいずれかである。
【００２４】
心筋壊死は、通常は循環血液中の心筋酵素（例えば、トロポニンＩ、トロポニンＴ、ＣＰＫ）の増加により診断する。
【００２５】
先に規定した方法のより具体的な実施態様によれば、患者は、医学的に次の冠動脈障害の疑いがある：
−  無症候性虚血のある、または虚血のない無症候性冠動脈疾患、
−  安定または労作狭心症などの、心筋壊死を伴わない慢性虚血障害、
−  不安定狭心症などの、心筋壊死を伴わない急性虚血障害、
−  ＳＴ上昇心筋梗塞または非ＳＴ上昇心筋梗塞などの、心筋壊死を伴う虚血障害。
【００２６】
先に規定した方法の別の具体的な実施態様によれば、患者で虚血症状の発症は診断されなかった。
【００２７】
心筋虚血は、局所壁運動障害の分析により、または心電図の使用（ＳＴ部分の典型的な変形、ＳＴ部分の上方または下方変位、Ｔ波反転または急勾配の対称的もしくは高振幅の陽性Ｔ波などのＴ波の典型的な変形）により、臨床的（例えば胸痛）、生物学的（例えばミエロペルオキシダーゼ活性の増加）、代謝的（シンチグラフィを用いて）に診断することができる。
【００２８】
先に規定した方法の更に別の具体的な実施態様によれば、患者の虚血症状の発症が診断された。
【００２９】
先に規定した方法の好ましい実施態様では、所定値は、実質的に健康な個人のｓＰＬＡ２活性範囲で最も高い２つの３分位に、特により高い半分に、とりわけ上記範囲の最も高い３分位に含まれている、ｓＰＬＡ２活性に対応している。
【００３０】
先に規定した方法の別の好ましい実施態様では、所定値は、所与の実質的に健康な個人集団を構成するすべての個人に比べて、最も高いｓＰＬＡ２活性を有している個人の３分の２の、特に半分の、とりわけ３分の１の範囲のｓＰＬＡ２活性範囲に含まれる、ｓＰＬＡ２活性に対応している。
【００３１】
先に意図したように、所与の実質的に健康な個人の集団を３つの部分（即ち３分位）に分割する。すなわち、その各々は同数の個人を含み、１つの３分位は所与の集団のｓＰＬＡ２活性が最も高い部分に対応し、２番目の３分位は所与の集団の最低のｓＰＬＡ２活性を有する部分に対応し、そして３番目の３分位は集団の残りに対応する。
【００３２】
先に規定した方法の特に好ましい実施態様では、患者のｓＰＬＡ２活性は、約１．８nmol/ml/minより高く、特に約２nmol/ml/minより高く、とりわけ約２．５nmol/ml/minより高く、好ましくは約２．９nmol/ml/minより高く、そしてより好ましくは３．３より高い。
【００３３】
先に規定した方法の好ましい実施態様では、患者のｓＰＬＡ２活性は約７nmol/ml/minより低い。
【００３４】
先に規定した方法の別の好ましい実施態様では、患者のｓＰＬＡ２活性は、約１．８nmol/ml/minより高く７nmol/ml/min未満であり、特に約２nmol/ml/minより高く７nmol/ml/min未満であり、とりわけ約２．５nmol/ml/minより高く７nmol/ml/min未満であり、好ましくは約２．９nmol/ml/minより高く７未満であり、そしてより好ましくは３．３nmol/ml/minより高く７nmol/ml/min未満である。
【００３５】
上に規定された方法の更なる好ましい実施態様では、患者のｓＰＬＡ２活性は、約３．３nmol/ml/minより高く、７nmol/ml/min未満である。
【００３６】
ｓＰＬＡ２活性は、先に述べたアッセイ法により測定されるが、特に、用いる基質は１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノールのナトリウム塩であり、また標準化用ＰＬＡ２はハチ毒ＰＬＡ２である。
【００３７】
先に規定した方法の別の特に好ましい実施態様では、ｓＰＬＡ２活性は、生体試料、特に血清または血漿試料中で、そしてとりわけヘパリン処理された血漿試料中で測定される。
【００３８】
ヘパリン処理された血漿試料とは、血漿を集める試験管を、血漿を加える前にヘパリンで、特に分画されていないヘパリンで処理したことを意味する。
【００３９】
本発明はまた、患者の心および／または血管疾患の診断のためのインビトロまたはエクスビボの方法であって：
−  上記患者のｓＰＬＡ２活性を測定すること、
−  前記活性を所定値と比較すること、
を含む方法に関し、上記所定値と比較して上記患者のより高いｓＰＬＡ２活性は、心および／または血管疾患を示唆する。
【００４０】
心および／または血管疾患とは、冠動脈疾患（ＣＡＤ）、高血圧症、アテローム性動脈硬化症、腸骨または大腿骨アテローム性動脈硬化症、血管動脈瘤、血管石灰化、高血圧症、心不全、および糖尿病、などの疾患を意味する。
【００４１】
先に規定したインビトロまたはエクスビボの方法の具体的な実施態様では、所定値と比較してより高い患者のｓＰＬＡ２活性は、上記患者が心および／または血管疾患に、上記患者のｓＰＬＡ２活性測定をした時点で罹患していることを示し、あるいは上記患者の心および／または血管疾患への将来の罹患を、特に上記患者のｓＰＬＡ２活性測定をした時点から７２時間を超える時間後には罹患していることを示している。
【００４２】
「将来の罹患」とは、上記患者のｓＰＬＡ２活性測定時点の後に発症が起こる罹患を意味する。
【００４３】
先に規定したインビトロまたはエクスビボの方法の別の具体的な実施態様では、患者のｓＰＬＡ２活性が、約１．８nmol/ml/minより高く、特に約２nmol/ml/minより高く、とりわけ約２．５nmol/ml/minより高く、好ましくは約２．９nmol/ml/minより高く、そしてより好ましくは約３．３nmol/ml/minより高い。
【００４４】
先に規定したインビトロまたはエクスビボの方法の好ましい実施態様では、患者のｓＰＬＡ２活性が約７nmol/ml/minより低い。
【００４５】
先に規定したインビトロまたはエクスビボの方法の別の好ましい実施態様では、患者のｓＰＬＡ２活性は、約１．８nmol/ml/minより高く７nmol/ml/min未満であり、特に約２nmol/ml/minより高く７nmol/ml/min未満であり、とりわけ約２．５nmol/ml/minより高く７nmol/ml/min未満であり、好ましくは約２．９nmol/ml/minより高く７未満であり、そしてより好ましくは３．３nmol/ml/minより高く７nmol/ml/min未満である。
【００４６】
先に規定したインビトロまたはエクスビボの方法の別の具体的な実施態様では、ｓＰＬＡ２活性は、生体試料中で、特に血清または血漿試料中で、そしてとりわけヘパリン処理された血漿試料中で測定される。
【００４７】
本発明はまた、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度の測定を目的とするキットの製造のための、ｓＰＬＡ２活性を測定する手段の使用に関する。
【００４８】
本発明はまた、心および／または血管疾患の診断を目的とするキットの製造のための、ｓＰＬＡ２活性を測定する手段の使用に関する。
【００４９】
先に規定した使用の好ましい実施態様によれば、ｓＰＬＡ２活性を測定する手段は、ｓＰＬＡ２によって加水分解されやすい化合物を含み、その加水分解生成物は、直接または間接的に定量することができる。
【００５０】
ｓＰＬＡ２により加水分解されやすい化合物は、酵素の天然または非天然基質である。加水分解生成物それ自身が定量できない場合、この生成物と反応して定量可能な化合物を生ずる化合物を用いることができ、そのような方法が間接的な定量化である。
【００５１】
より詳細には、上に規定した使用において、ｓＰＬＡ２により加水分解されやすい化合物は、蛍光発光性部分または発色性部分を含むリン脂質もしくはリン脂質類似物質である。
【００５２】
好ましい実施態様では、リン脂質は、蛍光性アシルにより２位で置換されているグリセロリン脂質であり、そのようなグリセロリン脂質は、例えば１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノールであり、蛍光性アシルの１−ピレンデカノイルであることができる。
【００５３】
本発明に従って用いることができる他のリン脂質は、ｓＰＬＡ２により加水分解されやすいリン脂質を含み、そのようなリン脂質は当業者に周知である。
【００５４】
本発明において使用しやすい蛍光性のアシルは、例えばピレンまたはフルオレセインなどの当業者に周知の蛍光性の基により置換されているアシルを特に含む。
【００５５】
あるいは、２位で放射性アシルにより置換されているグリセロリン脂質または放射性ホスファチジルエタノールアミンなどの放射性グリセロリン脂質を、先に規定した方法において用いることができる。
【００５６】
本発明はまた：
−  ｓＰＬＡ２アッセイ用緩衝剤、
−  １−ピレンデカノイルなどの、ｓＰＬＡ２により加水分解されやすく、その加水分解生成物が直接的または間接的に定量可能である化合物、
−  対照ｓＰＬＡ２試料であって、その活性が死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した可能性を測定するための所定値に対応している試料、
を含む、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度の測定を目的とするキットに関する。
【００５７】
本発明はまた：
−  ｓＰＬＡ２アッセイ用緩衝剤、
−  １−ピレンデカノイルなどの、ｓＰＬＡ２により加水分解されやすく、その加水分解生成物が直接的または間接的に定量可能である化合物、
−  対照ｓＰＬＡ２試料であって、その活性が心および／または血管疾患を診断するための所定値に対応している試料、
を含む、心および／または血管疾患の診断を目的とするキットに関する
【００５８】
本発明は、更に、心および／または血管の病理の予防もしくは治療を目的とする医薬の製造のために使用しやすい薬剤をスクリーニングするための方法であって：
−  第一の工程で、同じ種の実質的に健康な動物と比較してより高いｓＰＬＡ２活性を構成的に示し、スクリーニングするべき薬剤が投与されている、試験動物のｓＰＬＡ２活性をインビトロで測定し、
−  第２の工程で、測定された活性を、スクリーニングするべき上記薬剤投与前の上記試験動物のｓＰＬＡ２活性と比較し、
−  第３の工程で、測定された活性が、スクリーニングするべき上記薬剤投与前の試験動物のｓＰＬＡ２活性より低い場合は、そのスクリーニングに付した薬剤を選択する、
ことを特徴とする方法に関する。
【００５９】
先に規定したスクリーニング方法の好ましい実施態様では、試験動物は、マウスまたはラットなどの非ヒト遺伝子組換え動物である。
【００６０】
先に規定したスクリーニング方法の別の好ましい実施態様では、ｓＰＬＡ２活性を試験動物の血漿試料から測定する。
【００６１】
先に規定したスクリーニング方法の更に別の好ましい実施態様では、ｓＰＬＡ２活性を測定した後に動物を殺す。
【００６２】
実施例
実施例１
方法
研究対象集団
ＧＲＡＣＥ方法論の全詳細は、公表されている（Steg et al. (2004) Circulation 109:494-9）。このサブ研究（２０００年９月２８日〜２００２年１０月２４日）に参加する患者を、フランスの３つのセンターおよびスコットランドの１つのセンターで募集した。本研究に参加するための基準は、年齢が１８歳以上であること、前もってＡＣＳ（急性冠動脈症候群）であると診断されていること、および次の基準：ＡＣＳと一致する動的なＥＣＧの変化、血清中の心臓壊死の生化学的マーカーの経時的増加、および／または冠動脈疾患の証拠記録、の少なくとも１つであった。除外する基準は、血清中の心臓壊死の生化学的マーカーの持続的上昇を伴う足元の心筋梗塞、Ｋｉｌｌｉｐ分類IV、外傷、手術、明らかな併発病態、６か月未満の平均余命、癌の診断、ＨＩＶ陽性、夜間の発作性血尿、溶血尿毒症症候群、血栓性血小板減少性紫斑病、自己免疫性血小板減少症、ヘパリン起因性血小板減少症、抗リン脂質症候群、全身性エリテマトーデス、およびクローン病、であった。退院６か月後に、電話、病院訪問、あるいは掛かりつけの医者への電話で患者を追跡調査した。
【００６３】
すべての患者に関する変数および臨床診断ならびに病院内合併症および転帰の標準化された定義を用いた。すべての症例を次のカテゴリー：ＳＴＥＭＩ（ＳＴ上昇心筋梗塞）、ＮＳＴＥＭＩ（非ＳＴ上昇心筋梗塞）、または不安定狭心症、の１つに割り当てた。これらの定義は、臨床症状、ＥＣＧ所見および血清の生化学的壊死マーカーの結果、を考慮に入れている。不安定狭心症を、正常な生化学的壊死マーカー（特にトロポニンＩ）を有するＡＣＳとして定義した。患者を入院時に、心不全の徴候に対するＫｉｌｌｉｐおよびＫｉｍｂａｌｌ分類により分類した。
【００６４】
採血および生化学的分析
血液試料を、登録時（入院後最初の平日の朝）にヘパリンチューブに収集し、直ちに４℃で１０分間３，０００rpmで遠心分離した。得られた血漿を小分けして冷凍し、ドライアイスにのせてXavier Bichat-Claude Bernard病院(Paris, France)へ輸送し、そこでそれらを分析まで−７０℃で保持した。
【００６５】
Ｃ反応性タンパク質（ＣＲＰ）を、Ｂｅｈｒｉｎｇ ＢＮIIアナライザー（Behring Diagnostics）で行う高感度テストにより測定し、心臓トロポニンＩ（ｃＴｎｌ）レベルを、自動化システム（RXL HM analyzer, Dade Behring）の使用により定量した。
【００６６】
高感度インターロイキン−１８（ＩＬ−１８）を、ヒトＥＬＩＳＡキット（MBL Co,Japan）を用いて、１２．５pg/mlの検出限界で測定した。
【００６７】
血漿中の免疫反応性ｓＰＬＡ２レベルを、二重抗体「サンドイッチ」技術に基づく免疫定量アッセイにより、IIＡ型分泌性ＰＬＡ２に対して特異的なモノクローナル抗体（Cayman Chemical Company, USA）を用いて、測定した。この抗体は、I、IV型、またはV型のｓＰＬＡ２と交差反応しない（Cayman Chemical Company, USA）。最小検出濃度は１５．６pg/mlであり、またアッセイ内およびアッセイ間変動係数（ＣＶ）は＜１０％であった。
【００６８】
血漿ｓＰＬＡ２活性を、Pernas et al.(1991) Biochem. Biophys. Res. Commun. 178: 1298-1305によって改良されたRadvanyi et al (1989) Anal.Biochem.177:103-9の選択的蛍光定量アッセイにより測定した。簡潔に言えば、１−ヘキサデカノイル−２−（１−ピレンデカノイル）−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホメタノールナトリウム塩（Molecular Probe）をｓＰＬＡ２の基質として用いた。ｓＰＬＡ２によるこの基質の加水分解が１−ピレンデカン酸をもたらし、それが３９７nmの蛍光を発する。小分けされた血漿０．０３ml量（Ｅ）を、基質５nmolと、トリス−ＨＣl（ｐＨ８．７）１０mM、アルブミン０．１％、ＣａＣｌ2  １０mMの存在下、全量２．５mlで混合して、１分後に蛍光（Ｆ）を３９７nmで測定した。０．１Ｕのハチ毒ＰＬＡ２（Sigma Chemical Co., France）で１分間に基質の１００％加水分解が得られ、よって、１分間の反応の終りの蛍光値（Ｆｍａｘ）が、２nmoles/minの活性（Ｖｍａｘ）に対応する。試料の活性（Ａ）(nmol/min/mlで表す）は、下式で与えられる：
【００６９】
【数２】
2008506374.tif 000003
【００７０】
基質の加水分解が５０％を超える場合は、試料を希釈した。血漿が存在しない状態での基質の加水分解を、ネガティブコントロールとして用いて、ＰＬＡ２活性から導出した。すべての試料を２回に繰り返して試験した。最小検出可能活性および検出限界は０．１０nmole/min/mlで、またアッセイ内およびアッセイ間ＣＶは＜１０％であった。
【００７１】
統計解析
血漿ｓＰＬＡ２活性と臨床パラメーターの間の潜在的関連性を、一変量解析で、カテゴリー変数についてはＳｔｕｄｅｎｔのｔ検定またはＡＮＯＶＡを用いて、そして年齢についてはＰｅａｒｓｏｎの相関を用いて、検定した。ｐ≦０．０５である一変量予測因子は、多変量逐次線形回帰解析に含めた。
【００７２】
血漿ｓＰＬＡ２活性と生物学的変数の間の相関を、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数により評価した。ｓＰＬＡ２活性の３分位による患者群間の比較を、連続変数についてはＡＮＯＶＡ、およびカテゴリー変数については、χ２乗検定またはＦｉｓｈｅｒの正確確率検定によって行なった。生存曲線をＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ推定値から導出した。全生存期間を、入院の日付とすべての原因による死亡日の間の時間間隔として定義した。最後の経過観察における生存患者は観察打ち切りとした。ＭＩ（心筋梗塞）のない生存期間を、入院の日付と心筋梗塞再発の日付の間の時間間隔として定義した。死者および最後の経過観察におけるＭＩの再発なしの生存患者を、観察打ち切りとした。組合せエンドポイントのためには、生存期間を、入院の日付と第１のイベントの日付の間の時間間隔として定義した。最後の経過観察におけるＭＩの再発なしの生存患者を観察打ち切りとした。生存期間分布の比較を、ログランク検定により行った。
【００７３】
死亡、ＭＩ、ならびに死亡またはＭＩ、の独立予測因子を、Ｃｏｘの比例ハザード回帰モデルを用いて特定した。モデルに含まれる変数は、ｐ＜０．０５の一変量予測因子であった。すべての解析をＳＡＳソフトウェア８．２版（SAS Institute, Cary, NC）で行った。
【００７４】
結果
研究対象集団は、ＡＣＳの４５８人の患者からなり、３８．５％がＳＴＥＭＩ、５２．５％がＮＳＴＥＭＩ、および４９％が不安定狭心症であった。入院後の経過観察の中央値は６．５ヶ月（第２５百分位数：６か月、第７５百分位数：７．５ヶ月）であった。臨床症状の発症から血液採取までの平均時間（±ＳＤ）は、３０．０５±２１．３時間であった。この時間間隔は、ｓＰＬＡ２の血漿レベルと関連していなかった（Ｐ＝０．４５）。血漿ｓＰＬＡ２活性は、≦０．１〜１６．９nmol/min/mlの範囲であり、平均は２．６３±１．６９nmol/min/mlであった。死亡またはＭＩの１年間の累積発生率：９．６３％（Ｓ．Ｅ．：０．０２）。
【００７５】
血漿ｓＰＬＡ２活性と、ベースラインの臨床および生物学的変数との関連性
一変量解析においては、より高いｓＰＬＡ２活性に関連した臨床変数は、スコットランドでの患者募集（フランスでの募集に対して）、男性、年齢、糖尿病罹患歴、高血圧症、ならびにＳＴＥＭＩの臨床症状またはＫｉｌｌｉｐ分類＞１の臨床症状、であった。最初の２４時間以内の未分画ヘパリンによる治療も、より高いｓＰＬＡ２活性に関連していた。狭心症、心筋梗塞、冠動脈造影法、または冠動脈血管形成術の病歴、高脂血症の病歴、またはＬＭＷ（低分子量）ヘパリンによる治療歴が、より低いｓＰＬＡ２レベルに関連していた。多変量解析においては、募集センター、年齢、入院時のＳＴＥＭＩの診断、Ｋｉｌｌｉｐ分類で＞１を示すこと、および未分画ヘパリンによる治療が、高いｓＰＬＡ２活性の有意な予測因子であった（表１）。高脂血症の病歴はより低いｓＰＬＡ２活性に有意に関連していた（表１）。
【００７６】
ｓＰＬＡ２活性の３分位によって患者集団を研究した場合（表２）は、高齢、心不全の病歴、入院時のＫｉｌｌｉｐ分類＞１、ならびにＴｎＩおよびＣＲＰのより高い値が、より頻繁により高いｓＰＬＡ２活性に関連していたが、一方で、冠動脈血管形成術歴、高脂血症、または入院後最初の２４時間の間に測定されたより高いコレステロールレベルは、ｓＰＬＡ２のより低い３分位において頻度がより高かった（表２）。
【００７７】
血漿ｓＰＬＡ２活性は、ＣＲＰレベルに中適度に関連していた（ｒ＝０．４７、Ｐ＜０．０００１）。統計的に有意ではあるが、ｓＰＬＡ２活性と、ＴｎＩレベル（ｒ＝０．１２、Ｐ＝０．０１）、総コレステロールレベル（ｒ＝−０．１７、Ｐ＝０．００９）、およびＬＤＬコレステロール（ｒ＝−０．１８、Ｐ＝０．００７）との間の関連性は弱かった。ｓＰＬＡ２活性とＩＬ−１８レベルとの間には相関がなかった（ｒ＝０．０２、Ｐ＝０．７４）。その上、ｓＰＬＡ２血漿活性とｓＰＬＡ２血漿抗原レベルの間の相関は、予想外に低く（ｒ＝０．６６、Ｐ＜０．０００１）；その結果、ｓＰＬＡ２活性について得られた結果を、ｓＰＬＡ２血漿レベルから推定することはできない。この予想外の発見は、相当量の不活性な、またはわずかに活性があるｓＰＬＡ２酵素の血漿中における存在によって、説明することができよう。
【００７８】
ベースライン血漿ｓＰＬＡ２活性と臨床転帰との関連性
平均ベースラインｓＰＬＡ２活性は、６ヶ月の経過観察で、死亡したかまたは、新規もしくは再発性のＭＩがあった患者において、６ヶ月の経過観察で生きていてＭＩがなかった患者の活性よりも、高かった（３．３１±１．２２対２．５７±１．７２、それぞれＰ＝０．０２）。臨床転帰とＣＲＰまたはＩＬ−１８レベルとの間のどちらにも関連性は見られなかった。
【００７９】
死亡率および新規または再発性ＭＩ発生率は、ｓＰＬＡ２活性の３分位が増すにつれて増大した。ｓＰＬＡ２の最も高い３分位の患者は、死亡およびＭＩに対して４．３０の相対危険度（９５パーセント信頼区間、２．１〜８．７）を有していた（Ｐ＜０．０００１）（図１）。この関連性は、ＳＴＥＭＩの患者（ＲＲ＝６．９；１．５〜３１．８）、ＮＳＴＥＭＩまたは不安定狭心症の患者（ＲＲ＝３．８；１．７〜８．７）、Ｋｉｌｌｉｐ分類＜１の患者（ＲＲ＝３．８；１．４〜１０．４）、Ｋｉｌｌｉｐ分類＞１の患者（ＲＲ＝２．８；１．０〜７．７）、ＣＲＰ＜１０mg/L（４．７；１．８〜１２．１）の患者およびＣＲＰレベル＞１０mg/Lの患者（４．０；１．３〜１２．２）、のサブグループにおいても依然として有意であった。
【００８０】
年齢ならびに、高血圧症、糖尿病、心筋梗塞、心不全、冠動脈造影法または血管形成術、Ｋｉｌｌｉｐ分類、ＳＴ部分偏位、冠動脈血管再生（血管形成術または冠動脈の動脈バイパス手術）、およびクレアチニン、の病歴を含む、コックス回帰モデルの潜在的交絡因子について調整しても、ｓＰＬＡ２活性の高いベースラインレベルと経過観察における重大な冠動脈イベントの増大した危険度との間の強い関連性は変化しなかった（表３）。
【００８１】
ｓＰＬＡ２の第３の３分位における、死亡、致命的ではないＭＩ、または死亡とＭＩの組合せエンドポイントに対する調整された相対危険度は、それぞれ２．６１（９５％信頼区間、１．０１〜６．３９）（Ｐ＝０．０３６）、６．１（９５％信頼区間、１．９１〜１９．２１）（Ｐ＝０．００２）、および３．３（９５％信頼区間、１．５６〜６．８５）（Ｐ＝０．００２）であった。
【００８２】
更に１．８を超える血漿ｓＰＬＡ２活性に対する、死亡とＭＩの組合せエンドポイントに対する調整された相対危険度は２．４４（９５％信頼区間、０．７０〜８．４８）、２を超える血漿ｓＰＬＡ２活性に対しては２．１９（９５％信頼区間、０．７３〜６．５８）、２．５を超える血漿ｓＰＬＡ２活性に対しては２．４（９５％信頼区間、１．０２〜５．６５）、２．９を超えるｓＰＬＡ２血漿活性に対しては３．０８（９５％信頼区間、１．３７〜６．９１）、および３．３を超える血漿ｓＰＬＡ２活性に対しては２．２６（９５％信頼区間、１．１１〜４．６６）であった（注意：ｓＰＬＡ２血漿活性はnmol/min/mlで表す）。
【００８３】
有意な関連性は、ｓＰＬＡ２抗原レベルと、死亡またはＭＩの合成エンドポイントとの間では見出されなかった（相対危険度、１．４４、Ｐ＝０．３）。最後に、以前、高度にイベント再発を予測することが示されたＧＲＡＣＥスコア（Eagle et al.(2004) Jama. 291:2727-33）が、本研究において有害転帰を有意に予測したことを確認した（スコアの各１ポイントの増大に対する相対危険度、１．０３；９５％信頼区間、１．０２〜１．０４、Ｐ＜０．０００１）。興味深いことに、ＧＲＡＣＥスコアを含むＣｏｘ回帰モデルでは、ｓＰＬＡ２活性の第３の３分位における死亡またはＭＩの組合せエンドポイントに対する調整された相対危険度は、２．７８（９５％信頼区間、１．３０〜５．９３）（Ｐ＝０．００６）であった。ｓＰＬＡ２抗原レベルは、ＧＲＡＣＥスコアに有意な予知情報を加えなかった（Ｐ＝０．３）。
【００８４】
他のマーカーとの比較
炎症性および血栓性のプロセスが、急性冠動脈症候群（ＡＣＳ）および急死をもたらすアテロームプラーク合併症の主な決定要因である。ヒトにおけるプラーク炎症とプラーク破裂との間の重要な関連性を示す病理学的研究、ならびにプラークの発生および組成の両方における免疫−炎症反応の決定的な役割を示す実験データに加えて、最近の十年間に、全身性炎症マーカーの役割、およびそれのアテローム性動脈硬化症の重症な臨床的合併症との関係に関する研究への関心の増大が見られた。ＣＲＰ、ＩＬ−６、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）、血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ）−１、および、より最近のミエロペルオキシダーゼを含む、いくつかの循環している炎症性マーカーが、ＡＣＳの患者において上昇し、経過観察での有害な臨床転帰に関連していることが示された。本研究で、本発明者らはＣＲＰまたはＩＬ−１８と対照的に、血漿ｓＰＬＡ２活性が、ＡＣＳの患者の、死亡および新規もしくは再発性ＭＩの主な独立予測因子であることを示した。
【００８５】
ＣＲＰ
Liuzzoらによる画期的な研究（Liuzzo et al. (1994) N Engl J Med.; 331:417-24）以来、多数の研究が、ＡＣＳの患者におけるＣＲＰの予後値に取り組んだ。高いＣＲＰレベルが、ＴＩＭＩ IIａ（Morrow et al. (1998) J Am Coll Cardiol; 31:1460-5）、ＣＡＰＴＵＲＥ（Heeschen et al. (2000) J Am Coll Cardiol; 35:1535-42）、ＦＲＩＳＣ（Lindahl et al.(2000) N Engl J Med.; 343:1139-47）およびＧＵＳＴＯ−IV（James et al. (2003) Circulation.; 108:275-81）を含む、不安定狭心症またはＮＳＴＥＭＩの患者の、いくつかのランダム化試験の経過観察において、増大した危険度に関連していた。早期侵襲性血管再生術を処置したＡＣＳ患者中のＣＲＰレベルもまた、有害転帰を予測する（Mueller et al. (2002) Circulation.; 105:1412-5）。しかし、ランダム化臨床試験以外で募集したＳＴＥＭＩの患者またはＡＣＳの患者における独立のＣＲＰの予測値については、議論の余地がある（Zairis et al. (2002) Am Heart J.; 144:782-9; Bennermo et al. (2003) J Intern Med.; 254:244-50; Benamer et al. (1998) Am J Cardiol; 82:845-50）。ＧＲＡＣＥからの本観察サブ研究では、ＡＣＳ（ほとんどＳＴＥＭＩおよびＮＳＴＥＭＩ）のために入院した数時間後に測定されたＣＲＰは、有害転帰に関連しておらず、毎日の医療では、ＡＣＳのために入院した患者におけるＣＲＰの単独の初期の測定は、臨床変数に有意な予測情報を加えないかもしれないことを示唆していた。
【００８６】
ＩＬ−１８
本発明者らおよび他者による、内因性ＩＬ−１８の強力なアテローム発生促進の役割を示す以前の実験データに基づいて（Mallat et al. (2001) Circ Res.; 89:E41-5; Whitman et al. (2002) Circ Res.; 90: E34-8）、血漿ＩＬ−１８レベルを、冠動脈疾患の病歴のある患者および健康な中年の男性で測定すると、それが冠動脈イベントの独立の予測因子であることが判明した（Blankenberg et al. (2002) Circulation; 106:24-30; Blankenberg et al. (2003) Circulation.; 108:2453-9）。本研究において、ＡＣＳ患者の入院時に測定したＩＬ−１８レベルと経過観察での有害転帰との間には、関連性は見出されなかった。これらの結果を総合すると、ＩＬ−１８測定の予後値は、サンプリング時の疾患の活動性により変化することが示唆された。これは、試験していない交絡変数、種々の臨床設定におけるＩＬ−１８の差異のある役割を含む複数の因子、またはＩＬ−１８結合タンパク質、即ちＩＬ−１８の内在的な阻害因子、の産生の差に関係している可能性があろう。これらの考察を、ＡＣＳの患者におけるＩＬ−１８の予後を評価する将来の研究において考慮に入れるべきである。
【００８７】
ｓＰＬＡ２血漿抗原レベル
この最新の研究で、最も重要でかつ最も新規な発見は、虚血症状の発症後２日の間に、平均３０時間で、得られたｓＰＬＡ２活性の単独の測定が、ＡＣＳの患者の強力な予後情報を提供することを実証したことである。ｓＰＬＡ２活性と死亡および心筋梗塞の危険度との間の関連性は、入院時の心筋梗塞の病歴の存在または不存在ならびに心不全の臨床症状の存在または不存在を含む、ＡＣＳ患者における主要な有害転帰の他の既知の予測因子とは独立であった（Steg et al. (2004) Circulation.; 109:494-9）。興味深いことに、このｓＰＬＡ２活性の強力な予測値の発見は、研究対象集団が、臨床症状、病態生理、ならびに各型の急性冠動脈症候群および現在の日常処置と一致して高い病院内血管再生実施率に関連した危険度、に関して不均一であったにもかかわらず得られたのである。これは、ｓＰＬＡ２の活性化が、急性冠動脈症候群後の、死亡および心筋梗塞の危険性がある患者間の、重大でかつ共通の機序であることを示唆している。
【００８８】
以前の小さな研究が、不安定狭心症の患者では、２年間の経過観察期間において、ｓＰＬＡ２のより高い血漿レベルが、臨床的冠動脈イベント（主として冠動脈血管再生および再入院）の発生のより高い可能性に関連していることを実証した（Kugiyama et al. (2000) Am J Cardiol.; 86:718-22）。この以前の研究は、限られた数の均質の患者に的をしぼり、壊死の生化学的マーカーの増大を有さない不安定狭心症のわずか５２人の患者しか含んでいなかった。更に、ｓＰＬＡ２活性の直接測定は行なわれなかった。
【００８９】
それに比べて、本研究は、ｓＰＬＡ２抗原レベルと、ＭＩ単独（相対危険度０．５、Ｐ＝０．７）との間だけではなく、死亡およびＭＩの組合せエンドポイントとの間には有意な関連性が見出されなかった（相対危険度、１．４４、Ｐ＝０．３）ことを示した（図２）。その上本研究は、重症のＡＣＳ患者に拡張され、ｓＰＬＡ２活性が、ＳＴＥＭＩ患者およびＮＳＴＥＭＩ患者における死亡および心筋梗塞の強力なまた独立した予測因子であることを示した。
【００９０】
危険マーカーとしてｓＰＬＡ２活性を用いる利点
急性冠動脈症候群における、他の以前に試験された炎症性マーカーと比較したｓＰＬＡ２活性評価の重要性は、数桁異なる。
【００９１】
ＡＣＳ患者の有害転帰を予測するために用いられる従来の心臓バイオマーカーと異なり、ｓＰＬＡ２活性は、脂質酸化から、血管細胞および炎症細胞の活性化およびアポトーシスのモジュレーションまでの、アテローム形成に含まれる複数の極めて重要な経路に作用することが示されている。ｓＰＬＡ２は、様々な組織で発現され、急性期反応物質の１つである可能性がある（Pruzanski and Vadas (1991) Immunol Today.; 12:143-6; Murakami et al.(1995) J Lipid Mediat Cell Signal.; 12:119-30）。興味深いことに、ｓＰＬＡ２は、既に正常な動脈壁中で発現されており（Hurt-Camejo et al. (1997) Arterioscler Thromb Vasc Biol.; 17:300-9; Elinder et al. (1997) Arterioscler Thromb Vasc Biol; 17:2257-63）、またその発現は、容易に炎症性の刺激により上方制御され（Pruzanski and Vadas (1991) Immunol Today.; 12:143-6; Murakami et al. (1995) J Lipid Mediat Cell Signal; 12:119-30; Nakano and Arita (1990) FEBS Lett.; 273:23-6, Murakami et al. (1993) J Biol Chem.; 268:839-44, Kuwata et al. (1998) J Biol Chem.; 273:1733-40）、これは損傷に対する血管の応答の初期に開始される、ｓＰＬＡ２の潜在的役割を示唆する。多くの他の炎症性マーカーとは対照的に、ｓＰＬＡ２は、アテローム性動脈硬化症の動物モデルで、強力なアテローム形成促進酵素であることが示されており、コレステロールレベルの上昇がない状態でさえ、脂肪線条の形成を引き起こすことができ（Ivandic et al. (1999) Arterioscler Thromb Vasc Biol; 19:1284-90）、これはｓＰＬＡ２に媒介される経路のアテローム性動脈硬化症への直接の関与を示唆する。
【００９２】
ｓＰＬＡ２は、天然のＬＤＬの酸化を刺激し（Mangin et al. (1993) Circ Res.; 72:161-6）、多価不飽和脂肪酸の放出に関係して、１−パルミトイル−２−アラキドノイル−ｓｎ−グリセロ−３ホスホリルコリン（ＰＡＰＣ）に由来する生物学的活性を有するリン脂質の産生をもたらす（Leitinger et al. (1999) Arterioscler Thromb Vasc Biol; 19:1291-8）。この酸化生成物は、血小板、単球および内皮の活性化に、ならびに単球−内皮間の相互作用に、アテローム形成の重大な段階であると知られているすべての過程に重要な役割を果たす。プロスタグランジン、トロンボキサンおよびロイコトリエンを含む、ｓＰＬＡ２により生成される脂質メディエイターは、有意の炎症促進性、血栓形成促進性、およびアテローム形成促進性の効果を示した。ｓＰＬＡ２活性化に続いて微小胞の形で血小板および他の細胞の細胞膜から放出される、リゾホスファチジルコリンおよびリゾホスファチジン酸を含むリゾリン脂質（Fourcade et al. (1995) Cell; 80:919-927）は、細胞の機能に影響を及ぼすことができ（Swarthout and Walling (2000) Cell MoI Life Sci.; 57:1978-85; Kume et al. (1992) J Clin Invest.; 90:1138-44）、ＰＡＦ（強力な細胞活性化因子であり、潜在的アテローム発生促進因子）の産生をもたらす。
【００９３】
ｓＰＬＡ２は、Ｔリンパ球の活性化を非常に強化して増強された増殖をもたらし、これは、アテロームプラークを含む炎症性部位へ分泌されるホスホリパーゼＡ２（Menschikowski et al. (1995) Atherosclerosis.; 118:173-81; Hurt-Camejo et al. (1997) Arterioscler Thromb Vasc Biol.; 17:300-9; Elinder et al (1997) Arterioscler Thromb Vasc Biol.; 17:2257-63）が、細胞応答の伝播においてある役割を果たすことを示唆している。非常に重要なのは、ｓＰＬＡ２が、完全な細胞からのリン脂質には事実上不活性であることであり、またいくつかの研究が、リン脂質の横断的な分布が乱されている膜のみが、酵素と相互作用することができる都合の良い表面を提供することを示唆している（Fourcade et al (1998) Adv Enzyme Regul; 38:99-107）。
【００９４】
本発明者らは以前に、急性冠動脈症候群の患者では、安定した非冠動脈患者に比較して、プラーク内および循環している脱落膜微粒子レベルの増大により、膜の外葉でのホスファチジルセリンの露出により、リン脂質分布が変化していることを示した（Mallat et al. (1999) Circulation.; 99:348-353; Mallat et al (2000) Circulation.; 101:841-3）。この微粒子は、プラーク併発部位および循環血液中の両方で、ｓＰＬＡ２の重要な基質を構成する可能性がある。総合して、これらのデータは、ｓＰＬＡ２活性が、動脈壁および循環血液中で急性冠動脈症候群をもたらす炎症経路において重大な役割を果たしており、ＡＣＳ患者中での新規または再発性心筋梗塞の６倍の増加の少なくとも一部分を説明できることを、示唆している。
【００９５】
ｓＰＬＡ２活性がＡＣＳ患者の臨床評価に役立つためには、それが臨床医の治療上の意思決定の助けにならなければならない。低いレベルのｓＰＬＡ２活性を有する患者は、経過観察において、主要な有害イベントの危険度が特に低いように見え、それはこの患者では攻撃的なまたは侵襲性の治療戦略を回避することができ、不必要な治療のコストおよび危険度の減少につながることを示唆している。他方で、ｓＰＬＡ２活性のレベルが高い患者は、ＭＩと死亡の危険度が増大しており、より攻撃的な医療および／または血管再生治療から利益を得ることができる。これらの問題は、将来の研究において詳細に扱うこととする。
【００９６】
結論として、虚血症状の発症の数時間後に、急性冠動脈症候群の患者において測定されたｓＰＬＡ２活性のレベルが、６ヶ月の経過観察における死亡およびＭＩの強い予測因子である。重要なことは、高いｓＰＬＡ２活性に関連した危険度は、増大した危険度に関連している他の臨床的および生物学的マーカーとは、統計的に独立であることである。これらの発見の更なる長所は、それらを、「現実世界」の設定中で行なわれた観察に基づく最新の研究で得たということである。したがって、ｓＰＬＡ２活性の測定は、将来、危険度の階層化に用いるための価値ある追加情報を提供するであろう。
【００９７】
実施例２
実施例１で概説した方法論に従い、極めて類似した研究標本について研究を行なった。得られた結果は、実施例１の結論と同じであった。
【００９８】
研究標本は、４４６人のＡＣＳ患者からなり、そのうち３８．５％がＳＴＥＭＩ、５２．５％がＮＳＴＥＭＩ、および９％が不安定狭心症であった。入院後の経過観察の中央値は、６．５ヶ月であった（第２５百分位数：６ヶ月；第７５百分位数：７．５ヶ月）。病院内での血管再生術（ＰＣＩまたはＣＡＢＧ）の比率は高く、４８．３％であった。１年間の死亡またはＭＩの累積発生率は、９．６３％（Ｓ．Ｅ：０．０２）であった。血漿ｓＰＬＡ２活性は≦０．１〜１６．９nmol/min/mlの範囲であり、平均値は２．６３±１．６９nmol/min/mlであった。臨床症状の発症から血液採取までの時間間隔は、ｓＰＬＡ２活性の血漿レベルとは関連していなかった（Ｐ＝０．４５）。
【００９９】
血漿ｓＰＬＡ２活性とベースラインの臨床および生物学的変数との関連性
標本特性を表４に示し、ｓＰＬＡ２活性に関連する臨床変数を表５に示す。多変量解析では、高いｓＰＬＡ２活性の有意な予測因子は、募集センター、年齢、入院時のＳＴＥＭＩの診断、Ｋｉｌｌｉｐ分類＞１の所見、および未分画ヘパリンによる治療であった（表５）。高脂血症の病歴が、低いｓＰＬＡ２活性に有意に関連していた（表５）。血漿ｓＰＬＡ２活性は、ＣＲＰと中程度の関連性を示した（ｒ＝０．３５、Ｐ＜０．０００１）。統計的には有意であるが、ｓＰＬＡ２活性とＴｎＩ（ｒ＝０．２３、Ｐ＜０．０００１）、総コレステロール（ｒ＝−０．２４、Ｐ＜０．０００１）およびＬＤＬコレステロール（ｒ＝−０．２４、Ｐ＝０．０００３）との間の関連性は、弱かった。ｓＰＬＡ２活性とＩＬ−１８レベルとの間には関連性は無かった（ｒ＝０．０３、Ｐ＝０．５３）。ｓＰＬＡ２活性は、ｓＰＬＡ２抗原レベルと中程度の関連性を示した（ｒ＝０．３７、Ｐ＜０．０００１）。ｓＰＬＡ２活性は、様々なｓＰＬＡ２サブタイプの活性であり、ｓＰＬＡ２抗原レベルは、IIＡ型ｓＰＬＡ２のレベルのみを反映するので、これは予期されないわけではなかった。
【０１００】
ベースライン血漿ｓＰＬＡ２活性と臨床転帰との関連性
３５の主要な有害イベント（２０の死亡および１５のＭＩ）があった。臨床転帰と、ＣＲＰまたはＩＬ−１８レベルのいずれの間にも、有意な関連性は見られなかった（表６）。死亡率および新規または再発性ＭＩの発生率が、ｓＰＬＡ２活性の３分位が増すにつれて増加した。ｓＰＬＡ２活性の最も高い３分位中の患者は、死亡またはＭＩに対して４．３０（９５％信頼区間、２．１〜８．７）のハザード比（他の２つの３分位と比較して）を有していた（Ｐ＜０．０００１）（表６）。逐次Ｃｏｘ回帰モデルにおける、年齢ならびに高血圧症、心筋梗塞、心不全、冠動脈疾患、冠状動脈バイパス術、Ｋｉｌｌｉｐ分類＞１およびクレアチニンレベル＞１．１、の病歴を含む、潜在的交絡因子に対して調整を行っても、ｓＰＬＡ２活性の高いベースラインレベルと経過観察における重大な冠動脈イベントの増大した危険度との間の強い関連性は変化しなかった（表６）。ｓＰＬＡ２活性の第３の３分位中の死亡またはＭＩの組合せエンドポイントの、第１と第２の３分位と比較した調整されたハザード比は、３．０８（９５％信頼区間、１．３７〜６．９１）であった（Ｐ＝０．００６）（表７）。
【０１０１】
ｓＰＬＡ２抗原レベルと死亡またはＭＩの合成エンドポイントとの間では、有意な関連性が見出されなかった（調整されたハザード比、１．４４、Ｐ＝０．３）。最後に、以前にイベント再発をよく予測することが示されたＧＲＡＣＥスコアが、本研究において有害転帰（ＭＩ／死亡）を有意に予測した（スコアの各１ポイント増加に対するハザード比、１．０３；９５％信頼区間、１．０２〜１．０４、Ｐ＜０．０００１）ことが確かめられた。興味深いことに、ｓＰＬＡ２活性は、Ｃｏｘ回帰モデルにおいて再発イベントに対するＧＲＡＣＥスコアについて調整した後にも、再発イベントに対する独立予測因子でありつづけた。ｓＰＬＡ２活性の第３の３分位における死亡またはＭＩの組合せエンドポイントに対する調整されたハザード比は、２．７８（９５％信頼区間、１．３０〜５．９３）（Ｐ＝０．００６）であった。
【０１０２】
ｓＰＬＡ２活性は、フランスで募集された患者よりも、スコットランドで募集された患者で高かった（表５）。これは、少なくとも一部分は、スコットランドで募集された患者の年齢の方が高かったこと（フランスと比較して、Ｐ＜０．０００１）、および入院時におけるスコットランドの患者のＫｉｌｌｉｐ分類＞１である割合が高かったこと（３４．５２％対フランスの患者標本のわずか１２．０２％）（Ｐ＜０．０００１）と関連している可能性がある。
【０１０３】
実施例３
別の集団で行なわれた研究の予備的な結果により、心および血管イベントの危険マーカーとしてのｓＰＬＡ２活性の使用についての、実施例１で得られた結果が確認された。
【０１０４】
１１０５人の個人が、本研究に含まれている。これらの個人は、２００３年１１月までに冠動脈疾患（致死性、または致死性でない）を発症していたので選定された（平均６年の経過観察期間）。性別、年齢、および研究対象に選定した日が適合する２２０９人の対照も、研究の一部であった。
【０１０５】
個人を、ＥＰＩＣ−Ｎｏｒｆｏｌｋ研究の参加者から選定した。後者は、研究参入の時（１９９３〜１９９７年）に、４５〜７９歳で、Ｎｏｒｆｏｌｋ（英国）に居住していて、アンケートに答え、臨床診断を受けた、２５，６６３人の男性および女性を含む集団についての期待される研究である（Day N, et al. EPIC- Norfolk: study design and characteristics of the cohort. European Prospective Investigation of Cancer. Br J Cancer 1999;80 Suppl 1:95-103）。例として、ＥＰＩＣ−Ｎｏｒｆｏｌｋ研究に含まれる１４００人の対照の個人および７００人の患者の特徴を表８に示す。各個人を、英国全国統計局で死亡診断書を調べて当人と確認することができ、また、コホート全体に対して生存状態が正確にわかった。入院した患者は、東Ｎｏｒｆｏｌｋ健康局データベースに関連した、独自の国民健康保険番号によって当人と確認された。患者を、経過観察期間に、彼らが冠動脈疾患と診断されて入院し、および／または冠動脈疾患の結果死亡した場合には、冠動脈疾患に罹患したものとして認定した。冠動脈疾患は、国際疾患分類第９版のコード４１０〜４１４に従って定義された。これらのコードは、安定狭心症から梗塞までの冠動脈疾患全体の臨床パネルを含んでいる。
【０１０６】
静脈血試料を、参入時に、クエン酸塩を加えた乾燥試験管に採取した。血液試料（血漿および血清）は、−８０℃で、英国ケンブリッジ大学臨床生化学教室で保管した。
【０１０７】
１１０５人の患者個人および２２０９人の対照者の試料を、ドライアイス中で輸送し、パリのＢｉｃｈａt病院のＢｉｏｃｈｉｍｉｅ Ｂ部門で、−８０℃で保管した。
【０１０８】
ｓＰＬＡ２活性を、実施例１に記述した方法に従って測定した。
【０１０９】
ｓＰＬＡ２活性の４分位による心血管危険因子分布を求めて、ｓＰＬＡ２活性と危険因子の関係を解析した。４分位を、対照におけるｓＰＬＡ２活性の分布により規定した。
【０１１０】
ｓＰＬＡ２活性（連続変数としての）と心血管危険度の他の連続変数との関係を、Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数ならびに対応する確率値を計算して、解析した。
【０１１１】
冠動脈疾患発生の相対危険度、およびそれの対応する信頼区間（９５％）を、年齢および性別マッチングを考慮に入れた条件付ロジスティック回帰分析を用いて、計算した。
【０１１２】
より低いｓＰＬＡ２活性の４分位を対照（ＲＲ＝Ｉ）と見なした。
【０１１３】
相対危険度を、心血管危険因子について調整した。冠動脈疾患の危険度に関連する他の生物学的変数についての追加の調整を行った。
【０１１４】
統計解析をＳＡＳ８．２版ソフトウェア（SAS Institute, Cary, NC）で行った。
【０１１５】
【表１】
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【０１１６】
【表２】
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【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
【表４】
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【０１１９】
【表５】
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【０１２０】
【表６】
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【０１２１】
【表７】
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【０１２２】
【表８】
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【図面の簡単な説明】
【０１２３】
【図１】図１は、ｓＰＬＡ２血漿中活性が、１．７nmol/ml/minより低い、１．８〜２．８nmol/ml/minの、および２．９nmol/ml/minより上の患者の、入院後の日数（横軸）に対する、死亡および心筋梗塞（ＭＩ）の累積発生率（縦軸、％）を表わす。
【図２】図２は、患者の入院後の日数（横軸）に対する、死亡せずまた心筋梗塞（ＭＩ）に罹患もしない患者の割合（縦軸）を表わしており、患者はそれぞれ、これらの患者のｓＰＬＡ２血漿レベルの全体配分の第１の３分位、第２の３分位、または第３の３分位における血漿レベルを有していた。
【図１】
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【図２】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年5月4日(2006.5.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度を測定する方法であって：
−  前記患者の分泌性ＰＬＡ２活性を測定すること、
−  前記活性を所定値と比較すること、
を含み、前記所定値と比較して前記患者のより高い分泌性ＰＬＡ２活性は、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度を示す、方法。
【請求項２】
患者が、実質的に健康であると、特にアテローム性動脈硬化症、心および／または血管関連疾患に関して診断された、請求項１記載の方法。
【請求項３】
患者が、次の冠動脈障害：
−  無症候性虚血がある、または虚血がない無症候性冠動脈疾患、
−  安定または労作狭心症などの、心筋壊死を伴わない慢性虚血障害、
−  不安定狭心症などの、心筋壊死を伴わない急性虚血障害、
−  ＳＴ上昇心筋梗塞または非ＳＴ上昇心筋梗塞などの、心筋壊死を伴う虚血障害、
の１つの症状が見られると診断された、請求項１記載の方法
【請求項４】
虚血症状の発症を患者が診断されなかった、請求項１記載の方法。
【請求項５】
虚血症状の発症を患者が診断された、請求項１記載の方法。
【請求項６】
所定値が、実質的に健康な個人の分泌性ＰＬＡ２活性範囲の最も高い２つの３分位に、特に上位半分に、とりわけ前記範囲の最も高い３分位に含まれている分泌性ＰＬＡ２活性に対応する、請求項１〜５のいずれか１項記載の方法。
【請求項７】
患者の分泌性ＰＬＡ２活性が、約１．８nmol/ml/minより高く、特に約２nmol/ml/minより高く、とりわけ約２．５nmol/ml/minより高く、好ましくは約２．９nmol/ml/minより高く、およびより好ましくは３．３nmol/ml/minより高い、請求項１〜６のいずれか１項記載の方法。
【請求項８】
分泌性ＰＬＡ２活性を生体試料中で、特に血清または血漿試料中で、およびとりわけヘパリン処理された血漿試料中で測定する、請求項１〜７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
患者の心および／または血管疾患の診断のためのインビトロまたはエクスビボの方法であって：
−  前記患者の分泌性ＰＬＡ２活性を測定すること、
−  前記活性を所定値と比較すること、
を含み、前記所定値と比較してより高い前記患者の分泌性ＰＬＡ２活性が、心および／または血管疾患を示す、方法。
【請求項１０】
所定値と比較して患者のより高い分泌性ＰＬＡ２活性が、前記患者が心および／または血管疾患に前記患者の分泌性ＰＬＡ２活性測定をした時点で罹患していることを示し、あるいは前記患者の心および／または血管疾患への将来の罹患、特に前記患者の分泌性ＰＬＡ２活性測定をした時点から７２時間を超える時間後には罹患していることを示す、請求項９記載のインビトロまたはエクスビボの方法。
【請求項１１】
患者の分泌性ＰＬＡ２活性が、約１．８nmol/ml/minより高く、特に約２nmol/ml/minより高く、とりわけ約２．５nmol/ml/minより高く、好ましくは約２．９nmol/ml/minより高く、およびより好ましくは約３．３nmol/ml/minより高い、請求項９または１０記載のインビトロまたはエクスビボの方法。
【請求項１２】
分泌性ＰＬＡ２活性を、生体試料中で、特に血清または血漿試料中で、そして更に特別にはヘパリン処理された血漿試料中で測定する、請求項９〜１１のいずれか１項記載のインビトロまたはエクスビボの方法。
【請求項１３】
死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度の測定を目的とするキットの製造のための、分泌性ＰＬＡ２活性測定手段の使用。
【請求項１４】
心および／または血管疾患の診断を目的とするキットの製造のための、分泌性ＰＬＡ２活性測定手段の使用。
【請求項１５】
分泌性ＰＬＡ２活性測定手段が分泌性ＰＬＡ２によって加水分解されやすい化合物を含み、その加水分解生成物が直接または間接的に定量することができる、請求項１３または１４記載の使用。
【請求項１６】
分泌性ＰＬＡ２により加水分解されやすい化合物が、蛍光性部分または発色性部分を含むリン脂質もしくはリン脂質類縁体である、請求項１５記載の使用。
【請求項１７】
死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した危険度の測定を目的とするキットであって：
−  分泌性ＰＬＡ２アッセイ用緩衝剤、
−  １−ピレンデカノイルなどの、分泌性ＰＬＡ２により加水分解されやすく、その加水分解生成物が直接または間接的に定量可能である化合物、
−  その活性が、死亡あるいは心および／または血管イベントの増大した可能性を測定するための所定値に対応している、対照の分泌性ＰＬＡ２試料、
を含むキット。
【請求項１８】
心および／または血管疾患の診断を目的とするキットであって：
−  分泌性ＰＬＡ２アッセイ用緩衝剤、
−  １−ピレンデカノイルなどの、分泌性ＰＬＡ２により加水分解されやすく、その加水分解生成物が直接または間接的に定量可能である化合物、
−  その活性が、心および／または血管疾患を診断するための所定値に対応する、対照の分泌性ＰＬＡ２試料、
を含むキット。
【請求項１９】
心および／または血管の病理の予防もしくは治療を目的とする医薬の製造に使用しやすい薬剤をスクリーニングするための方法であって：
−  第一の工程で、同じ種の実質的に健康な動物と比較してより高い分泌性ＰＬＡ２活性を構成的に示し、かつスクリーニングするべき薬剤が投与されている、試験動物の分泌性ＰＬＡ２活性をインビトロで測定し、
−  第２の工程で、測定された活性を、スクリーニングするべき前記薬剤投与前の前記試験動物の分泌性ＰＬＡ２活性と比較し、
−  第３の工程で、測定された活性が、スクリーニングするべき前記薬剤投与前の試験動物の分泌性ＰＬＡ２活性より低い場合は、そのスクリーニングに付した薬剤を選択する、
ことを特徴とする方法。
【国際調査報告】
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