(57)【要約】  本発明は、神経突起伸張を刺激すること、細胞生存を刺激すること、記憶および学習に関連した神経可塑性を刺激すること、ならびに細胞運動を調節することが可能である新規ペプチド断片に関する。ペプチド断片の生物学的活性は、Ｔｒｋファミリーのニューロトロフィン受容体に結合し、そして活性化させるそれらの能力と関係する。本発明のペプチド断片には、Ｔｒｋファミリーのニューロトロフィン受容体に結合し、活性化させるのに必須のアミノ酸モチーフが含まれる。本発明はまた、前記化合物を含む医薬組成物、ならびにニューロトロフィン、Ｔｒｋ受容体および／またはＮＣＡＭが重要な役割を果たし、そして神経突起伸張、細胞生存、記憶および学習に関連した神経可塑性を刺激すること、および／または細胞運動を調節することが処置のために有益である状態および／または疾患の予防および／または処置のためのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
６個から１３個のアミノ酸残基からなる単離された連続的ペプチド配列であって、
Ｇ−ｘａ−Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｔ−Ｖ−ｘｂ−Ｖ／Ｌ
［式中、
ｘａは、任意のアミノ酸残基であり、
ｘｂは、Ｉ、Ｔ、ＭまたはＥである。］
で示されるアミノ酸モチーフを含むペプチド配列。
【請求項２】
ｘａが塩基性アミノ酸残基である、請求項１に記載の単離された連続的ペプチド配列。
【請求項３】
ｘａがＬである、請求項１に記載の単離された連続的ペプチド配列。
【請求項４】
ｘａがＧである、請求項１に記載の単離された連続的ペプチド配列。
【請求項５】
式（Ｉ）
ｘ０−ｘ１−ｘ２−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−ｘ７−ｘ８−ｘ９−ｘ１０−ｘ９−ｘ９−ｘ１０−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０は、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ａまたは結合であり、
ｘ１は、Ｇであり、
ｘ２は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、
ｘ３は、ＥまたはＤであり、
ｘ４は、Ｖであり、
ｘ５は、疎水性アミノ酸残基であり、
ｘ６は、ＶまたはＬであり、
ｘ７は、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ８は、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ９は、Ｅ、Ｄ、ＫまたはＱであり、
ｘ１０は、ＶまたはＬであり、
ｘ１１は、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ１２は、疎水性アミノ酸残基またはＴであり、
ｘ１３は、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａまたは結合である。］
により定義される、請求項１から４のいずれか一項に記載の単離された連続的ペプチド配列。
【請求項６】
ｘ３が、Ｑ、ＮまたはＴである、請求項５に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項７】
ｘ５が、ＴまたはＥである、請求項５に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項８】
ｘ７およびｘ８が、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、ＥまたはＡから独立して選択される、請求項５に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項９】
ｘ７がＬである、請求項６、７または８に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１０】
ｘ８がＧである、請求項５、７および９のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１１】
ｘ８がＥである、請求項５、７および９のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１２】
ｘ１１が、Ｒ、Ｋ、Ｌ、ＮまたはＰである、請求項５に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１３】
ｘ１２が、疎水性アミノ酸残基であり、Ｆ、Ｖ、Ｉ、ＴまたはＡから選択される、請求項５に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１４】
式（Ｉ）
ｘ０−Ｇ−ｘ２−Ｄ／Ｅ−Ｖ−Ｉ−Ｌ−ｘ７−ｘ８−ｘ９−Ｖ−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０が、Ｋ、Ｒ、ＡまたはＮから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ２が、ＲまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ７が、Ｋ、Ａ、ＮまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ８が、Ｋ、ＮまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ９が、ＤまたはＱから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１１が、ＲまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１２が、ＶまたはＦから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１３が、Ｉ、ＬまたはＶから選択されるアミノ酸残基である。］
で定義される、請求項１または５に記載の単離された連続的ペプチド配列。
【請求項１５】
式（ＩＩＩ）
ｘ０−Ｇ−ｘ２−ｘ３−Ｖ−ｘ５−Ｖ−Ｌ−Ｇ／Ｅ−ｘ９−Ｖ／Ｌ−ｘ１０−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０、ｘ２、ｘ３、ｘ５、ｘ９、ｘ１０が、請求項５に定義の通りであり、
ｘ１１が、Ｎ、ＫまたはＰであり、
ｘ１２が、Ｉ、Ｔ、ＡまたはＶであり、そして
ｘ１３が、Ｓ、Ａ、ＮまたはＧである。］
で定義される、請求項１または５に記載の単離された連続的ペプチド配列。
【請求項１６】
ｘ３がＱである、請求項１５に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１７】
ｘ１１が、Ｒ、Ｎ、ＰまたはＬである、請求項５または１５に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が、請求項１に定義のアミノ酸配列モチーフを含む、請求項５または１５に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILKKDVRFI（配列番号１）である、請求項１、２、５または１４に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２０】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILAKDVRVI（配列番号２）である、請求項１、２、５または１４に記載の単離されたペプチド配列化合物。
【請求項２１】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILNNDVRFI（配列番号３）である、請求項１、２、５または１４に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２２】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILNNQVRFI（配列番号４）である、請求項１、２、５または１４に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２３】
前記アミノ酸配列が、AGRDVILNNDVRFI（配列番号５）である、請求項１、２、５または１４に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２４】
前記アミノ酸配列が、NGRDVILKKDVLFI（配列番号６）である、請求項１、２、５または１４に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２５】
前記アミノ酸配列が、NGLDVILIIDVRFI（配列番号７）である、請求項１、３、５または１４に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２６】
前記アミノ酸配列が、KGKEVMVLGEVNIN（配列番号８）である、請求項１、２、５、９、１０または１５に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２７】
前記アミノ酸配列が、RGHQVTVLGEIKTG（配列番号９）である、請求項１、２、５、６、７、９、１０または１５に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２８】
前記アミノ酸配列が、RGREVEVLGEVPAA（配列番号１０）である、請求項１、２、５、７、９、１０または１５に記載のペプチド。
【請求項２９】
前記アミノ酸配列が、SGGTVTVLEKVPVS（配列番号１１）である、請求項１、４、５、６、７、９、１１または１５に記載のペプチド。
【請求項３０】
前記ペプチド配列が、配列番号１−１０から選択される配列のいずれかの断片、変異体または相同体であり、該断片、変異体または相同体が請求項１に記載のモチーフを含む、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３１】
Ｔｒｋ Ａ、Ｔｒｋ ＢおよびＴｒｋ Ｃを含むＴｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体に結合することが可能な、請求項１から３０のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３２】
前記受容体が、Ｔｒｋ ＡまたはＴｒｋ Ｂである、請求項３１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３３】
神経細胞分化を刺激することが可能である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３４】
神経突起伸張を刺激することが可能である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３５】
神経細胞生存を刺激することが可能である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３６】
細胞運動を調節することが可能である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３７】
細胞運動を阻害することが可能である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３８】
学習および／または記憶に関係する神経可塑性を刺激することが可能である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３９】
前記ペプチド配列が、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のペプチド断片である、請求項１９に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項４０】
前記ペプチド配列が、神経成長因子（ＮＧＦ）のペプチド断片である、請求項２６に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項４１】
前記ペプチド配列が、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）のペプチド断片である、請求項２７に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項４２】
前記ペプチドが、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）のペプチド断片である、請求項２８に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項４３】
前記ペプチドが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のペプチド断片である、請求項２９に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項４４】
請求項１から４３のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列を含む化合物。
【請求項４５】
前記ペプチド配列が、個々のペプチド配列の単一コピーからなる単量体として構築(formulated)される、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４６】
前記ペプチド配列が、個々のペプチド配列の二量体または四量体のような、個々のペプチド配列の２個以上のコピーからなる多量体として構築される、請求項４４に記載の化合物。
【請求項４７】
前記多量体が、２個以上の個々のペプチド配列のデンドリマーである、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４８】
前記多量体が、２個の同一のペプチド配列を含む二量体である、請求項４６に記載の化合物。
【請求項４９】
前記多量体が、２個の異なるペプチド配列を含む二量体である、請求項４６に記載の化合物。
【請求項５０】
薬剤を製造するための、請求項１から４３のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列または請求項４４から４９のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項５１】
前記薬剤が、神経細胞分化、神経細胞生存、神経細胞可塑性を刺激すること、学習および／または記憶を刺激すること、細胞運動を調節することまたはＴｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体の活性を調節することが、処置の一部である状態または疾患の処置用である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記状態または疾患が、中枢および末梢神経系の状態または疾患である、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記状態または疾患が、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、卒中後のような虚血後損傷、糖尿病と関連した神経変性、概日時計または神経筋伝達に影響を与える疾患から選択される、請求項５０に記載の使用。
【請求項５４】
前記薬剤が、臓器移植後、または遺伝性もしくは外傷性萎縮性筋疾患のような神経筋接合部の機能障害を有する状態を含む筋肉の状態または疾患から選択される状態または疾患の処置用である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５５】
前記薬剤が、血管新生、組織リモデリングおよび／または細胞の増加した運動と関連する状態または疾患の処置用である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５６】
前記疾患が癌である、請求項５５に記載の使用。
【請求項５７】
前記癌が、血管新生を伴う全ての癌である、請求項５６に記載の使用。
【請求項５８】
前記癌が、神経系の癌である、請求項５６に記載の使用。
【請求項５９】
前記状態または疾患が、学習能力障害および／または記憶障害である、請求項５１に記載の使用。
【請求項６０】
前記状態または疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病または多発脳梗塞性認知症のような認知症である、請求項５１または５９に記載の使用。
【請求項６１】
前記状態または疾患が、思考および／または気分の障害、双極性（ＢＰＤ）、遺伝的に関係する単極性感情障害を含む精神神経疾患、妄想性障害、パラフレニー、妄想性精神病、統合失調症、統合失調性障害、統合失調性感情障害、統合失調性双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、心因性精神病、緊張病、定期的な双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、循環型精神病、統合失調質人格障害、妄想性人格障害、双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、ならびに単極性感情障害のサブタイプのような精神疾患である、請求項５１に記載の使用。
【請求項６２】
前記薬剤が、アルコール摂取による身体損傷に関連する状態または疾患の処置用である、請求項５０に記載の使用。
【請求項６３】
前記薬剤が、プリオン病の処置用である、請求項５０に記載の使用。
【請求項６４】
請求項１から４３のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列または請求項４４から４９のいずれか一項に記載の化合物を含む薬剤。
【請求項６５】
請求項６４に記載の薬剤の有効量を含む医薬組成物。
【請求項６６】
請求項１から４３のいずれか一項に記載のペプチド配列、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の化合物、請求項６４に記載の薬剤および／または請求項６５に記載の医薬組成物の有効量を、必要とする個体に投与することを含む処置方法。
【請求項６７】
神経細胞分化、神経細胞生存、神経細胞可塑性および／または細胞運動変化を刺激する方法であって、請求項１から４３のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列、請求項４４から４９のいずれか一項に記載の化合物、請求項６４に記載の薬剤または請求項６５に記載の医薬組成物の使用を含む方法。
【請求項６８】
抗体の産生のための、請求項１から３３のいずれか一項に記載のペプチド配列の使用。
【請求項６９】
請求項１に記載のモチーフを含むエピトープを認識し、結合することが可能である抗体。
【請求項７０】
請求項６９に記載の抗体を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、神経突起伸張、細胞生存、記憶および学習に関連する神経可塑性を刺激すること、ならびに細胞運動を調節することが可能である新規ペプチド化合物に関する。本発明の化合物は、Ｔｒｋファミリーのニューロトロフィン受容体に結合し、活性化させることができる。本発明はまた、前記化合物を含む医薬組成物、ならびに神経突起伸張、神経細胞生存、記憶および学習に関連する神経可塑性を刺激すること、および／または細胞運動を調節することが有益である状態の処置のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
免疫グロブリンスーパーファミリーの神経細胞接着分子（ＣＡＭ）は、初期発生中および成人において、重要な部位で核となり細胞群を維持する。それらの接着特性に加えて、ＣＡＭ同種および異種相互作用は、細胞内シグナル伝達に影響を与え得る。故に、細胞移動、増殖、および分化を含む発達事象に影響を与えるそれらの能力は、それらの接着、ならびにシグナル伝達特性の両方の結果であり得る。しかしながら、蓄積されつつある証拠は、細胞が、異なる生理学的過程の補助において別個に、互いに独立してＣＡＭの接着特性およびシグナル伝達特性を同様に用い得ることを示す。
【０００３】
神経細胞接着分子であるＮＣＡＭは、最初に発見された神経ＣＡＭであった。発見以来、ＮＣＡＭは集中的に研究され、現在、それはよく特徴付けされている（Ronn et al. （2000） Int J Dev Neurosci 18:193−9）。ＮＣＡＭは、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーに属する。その細胞外部分は、５個のＩｇ様モジュールおよび２個のフィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆ３）モジュールからなる。ＮＣＡＭは、細胞−細胞および細胞−基質相互作用の両方を補助する。ＮＣＡＭは、ヘパリン／ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸プロテオグリカンおよび異なる種類のコラーゲンのような様々な細胞外マトリックス成分に結合する。細胞−細胞相互作用は、ほとんどがＮＣＡＭ同種結合によって補助される。ＮＣＡＭの異なるモジュールは、別の機能を果たすことが示されている。従って、現在、ＮＣＡＭ同種結合は、最初の３個のＩｇモジュールに依存すると考えられている。ヘパリン結合配列は、Ｉｇ２モジュールに位置する。ＮＣＡＭはまた、神経細胞接着分子Ｌ１に結合する。この相互作用は、ＮＣＡＭの４番目のＩｇモジュールとＬ１上に発現されるオリゴマンノース部分（oligomannosidic moiety）との間で起こると考えられている。２個のＮＣＡＭの膜隣接Ｆ３モジュールは、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）結合に関与することが示されている。
【０００４】
タンパク質の異なる相互作用に関与するＮＣＡＭの多くの結合部位が同定されており、異なる結合部位の配列を含む多くのＮＣＡＭ配列の短い断片は、治療適用における生物学的活性化合物としての使用が示唆されている（Berezin V., Bock E. （2004） J Mol Neurosci. 22 （1−2）:33−39）。多くのＮＣＡＭのこれらのペプチド断片は、同種ＮＣＡＭ結合部位に由来し、それ故に、ＮＣＡＭを発現する細胞を刺激するために使用され得る。
【０００５】
ＮＣＡＭの異種結合パートナーのうちよく記載されるものは、ＦＧＦＲである。従って、ＮＣＡＭは、ＦＧＦＲの推定上の代替的リガンドの新しいクラスのメンバーとして考えられており、最近、ＮＣＡＭと前記受容体間の直接的相互作用についての証拠が得られた（Kiselyov et al. （2003） Structure （Camb） 11:691−701）。ＮＣＡＭとＦＧＦＲ間の直接的相互作用に関与する配列EVYVVAENQQGKSKA（ＦＧＬペプチド）を有する同定されたＮＣＡＭ断片は、最近、ＦＧＦＲの活性の刺激が重要な役割を果たし得る、様々な病理学的疾患の処置のための新規候補化合物として示唆されている（ＷＯ０３／０１６３５１）。興味深いことに、神経突起伸張の刺激をもたらす同種ＮＣＡＭ相互作用は、ＦＧＦＲの刺激にも部分的に関与することが示されている（Soroka et al. （2002） J Biol Chem. 277（27）:24676−83）。
【０００６】
ＮＣＡＭリガンド／受容体として記載される他のクラスの分子は、ヘパラン硫酸およびコンドロイチン硫酸プロテオグリカンである（それぞれ、ＨＳＰＧおよびＣＳＰＧ）（Cole et al. （1985）. J Cell Biol. 100（4）:1192−9；Cole et al. （1986）. Nature 320:445−7；Cole, G. J., Akeson, R. （1989） Neuron 2（2）:1157−65）。多数のＨＳＰＧおよびＣＳＰＧが、脳においてＮＣＡＭと相互作用し、細胞接着に影響を与え得る。従って、細胞表面上に発現されるＮＣＡＭは、ＨＳＰＧアグリンと結合し、それにより細胞接着を仲介する能力を有し（Storms et al. （1996） Cell Adhes Commun. 3（6）:497−509）、そして脳特異的ＣＳＰＧニューロカンは、ＮＣＡＭと結合し、それによりその同種相互作用を阻害し、次いで神経接着を阻害することが示されている（Retzler et al. （1996） J Biol Chem. 271（44）:27304−10）。細胞増殖基質として用いられるとき、Ｉｇ２ＮＣＡＭモジュールにおいて同定されたＮＣＡＭ（ＨＢＤ）の推定上のヘパリン結合ドメインから誘導されたアミノ酸配列を含む異なる合成ペプチドは、ＮＣＡＭ発現細胞の接着を促進し、そして神経突起伸張の刺激を調節し得ることが示されている（Cole, G. J., Akeson, R. （1989） Neuron 2（2）:1157−65；Kallapur S.G., Akeson R.J. （1992） J Neurosci Res. 33（4）: 538−48）。近年、ＮＣＡＭ（SwissProt P13596）のアミノ酸残基１５２−１６５を含むＮＣＡＭ ＨＢＤドメインに由来する１４個のアミノ酸の配列は、フィブリン３Ｄマトリックスゲルに組み込まれたニューロンの神経突起伸張を増強するためのこのゲルの融合成分として示唆されている（ＵＳ２００３／０１１９１８６）。残基１４９−１６６を含むＮＣＡＭ ＨＢＤの他の断片は、ＮＣＡＭにより仲介される接着の阻害剤として示唆されたが（ＵＳ６，３３３，３０７）、後者の断片の生物学的活性は証明されていない。
【０００７】
配列IWKHKGRDVILKKDVRFIを含むＮＣＡＭ ＨＢＤは、ヘパリン結合に対するＮＣＡＭの能力およびまた同種ＮＣＡＭ接着に不可欠であることが証明されている塩基性アミノ酸の２個のクラスターを含む。これらの塩基性アミノ酸残基の変異は、前記ドメインの生物学的活性に影響を与えることが示されている（Kallapur S.G., Akeson R.J. （1992） J Neurosci Res. 33（4）: 538−48；Cole, G. J., Akeson, R. （1989） Neuron 2（2）:1157−65）。
【発明の開示】
【０００８】
発明の概要
本発明によれば、下記：
１）ＮＣＡＭ（SwissProt P13596）のアミノ酸残基１５４−１６７を含む配列に相当するＮＣＡＭのヘパリン結合ドメイン（ＨＢＤ）のペプチド断片（本明細書中、ヘパリン結合ペプチド（ＨＢＰ）と称される）は、非常に高い神経突起伸張活性を有し；
２）ペプチドの生物学的活性に重要であることが知られている塩基性アミノ酸残基が、他のアミノ酸残基に置換されたＨＢＰ変異体も、ＨＢＰの非変異配列と同程度に神経突起伸張を刺激することが可能であり；
３）ＨＢＰおよびＨＢＰ変異体の神経突起伸張活性は、ｉ）ＮＣＡＭ−ＮＣＡＭ結合、ｉｉ）ＦＧＦＲ−ＮＣＡＭ結合、およびｉｉｉ）ＨＳＰＧ−またはＣＳＰＧ−ＮＣＡＭ結合とは無関係であり;
４）本発明のペプチド断片は、細胞運動の調節することが可能であり；
５）本発明のペプチド断片は、細胞増殖基質の固定基質および細胞増殖培地の可溶性成分の両方としての活性化合物であり;
６）本発明のペプチド断片には、ニューロトロフィン中に見出されるアミノ酸モチーフが含まれ；
７）本発明のペプチド断片は、Ｔｒｋファミリーのニューロトロフィン受容体に結合することが可能である。
【０００９】
従って、本発明の一局面は、アミノ酸モチーフＧ−ｘａ−Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｔ−Ｖ−ｘｂ−Ｖ／Ｌ（式中、ｘａは、任意のアミノ酸残基であり、ｘｂは、Ｉ、Ｔ、ＭまたはＥである。）を含む、６個から１３個のアミノ酸残基の単離された連続的配列である、ペプチドに関する。
【００１０】
本発明の上記モチーフを含む単離されたペプチド配列は、ｉ）Ｔｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体に結合すること、ｉｉ）神経突起伸張を刺激すること、ｉｉｉ）細胞運動を調節すること、ｉｉｉ）神経細胞生存を刺激すること、ｉｖ）神経細胞分化を刺激すること、および／またはｖ）学習および記憶に関係する神経可塑性を刺激することが可能である。
【００１１】
従って、本発明の他の局面は、ｉ）神経突起伸張を刺激すること、ｉｉ）細胞運動を調節すること、ｉｉ）神経細胞生存を刺激すること、ｉｉｉ）神経細胞分化を刺激すること、ｉｖ）神経可塑性を刺激すること、ｖ）Ｔｒｋファミリーのニューロトロフィン受容体の活性を調節することが一部分である、状態または疾患の処置のための薬剤の製造を目的として該配列を含む、本発明のペプチド配列および／または化合物の使用に関する。
【００１２】
さらに、他の局面において本発明のペプチド配列または該配列を含む化合物を、抗体の産生のために用いることができる。
【００１３】
本発明はさらに、本発明のペプチド配列を含む化合物および該ペプチド配列および／または該化合物を含む医薬組成物に関する。本発明のモチーフを含むエピトープを認識し得る抗体を含む医薬組成物も、本発明の範囲内である。
【００１４】
本発明はまた、神経突起伸張を刺激すること、細胞運動を調節すること、神経細胞生存を刺激すること、神経細胞分化を刺激すること、神経可塑性を刺激すること、および／またはＴｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体の活性を調節することが有益である状態の処置方法であって、本発明のペプチド配列、本発明の化合物、本発明の抗体または該ペプチド配列、該化合物または該抗体を含む医薬組成物を、必要とする個体に投与する工程を含む方法に関する。
【００１５】
図面の説明
図１は、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞は、ＮＣＡＭを発現しない対照線維芽細胞と比較して、ラット小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）の神経突起伸張を著しく促進し、そしてＨＢＰ（配列番号１）は、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞上およびＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞上で増殖させたＣＧＮの神経突起伸張を用量依存的に増加させることを示す。対照的に、ペプチドＭは、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞上で増殖させたＣＧＮからの神経突起伸張応答に影響を与えないが、ＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞上で増殖させたＣＧＮの神経突起伸張を刺激する。
【００１６】
図２は、ＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞の単層上で増殖させたＣＧＮでのＨＢＰ（配列番号１）の神経突起効果は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の阻害剤であるＳＵ５４０２で処理することにより阻害されず、そしてＮＣＡＭを発現する線維芽細胞の単層上で増殖させたＣＧＮのＮＣＡＭ仲介神経突起伸張は、部分的にしか阻害されないが、ＳＵ５４０２は、ＨＢＰ不存在下でＮＣＡＭ仲介神経突起伸張を阻害することを示す。
【００１７】
図３は、特異的にヘパラン硫酸を主に二糖類に切断することが知られている酵素である、ヘパリナーゼＩＩＩの存在下または不存在下での単一ＣＧＮへのＨＢＰ（配列番号１）およびＭペプチド（配列番号２）の効果を示す。
【００１８】
図４は、ヘパリナーゼＩＩＩの存在下または不存在下におけるペプチドＨＢＰ（配列番号１）、Ｍ（配列番号２）、Ｍ１ｎ（配列番号３）、およびＭ３ｎ（配列番号４）の神経突起伸張効果を示す。
【００１９】
図５は、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞および対照のＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞の両方のＨＢＰ（配列番号１）およびＭペプチド（配列番号２）を用いた処理により、細胞の拡散速度（Ｒ）、平均細胞速度（Ｓτ）、および移動指標（ＬＩ）の顕著な減少により反映される通り細胞運動の明白な阻害がもたらされることを示す。
【００２０】
図６は、ＮＣＡＭ ＨＢＤの異なるペプチド断片の分析結果を示す。
【００２１】
図７は、ＨＢＰ（配列番号１）（Ａ）およびＮＣＡＭの組換えＩｇ２モジュール（Ｂ）の組換えＴｒｋ Ｂ受容体への結合を示す。
【００２２】
発明の詳しい説明
１．ペプチド配列
本発明の第一の局面は、
Ｇ−ｘａ−Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｔ−Ｖ−ｘｂ−Ｖ／Ｌ
［式中、
ｘａは、任意のアミノ酸残基であり、
ｘｂは、Ｉ、Ｔ、ＭまたはＥである。］
で示されるアミノ酸モチーフを含む、６個から１３個のアミノ酸残基からなる単離された連続的ペプチド配列に関する。
【００２３】
１つの態様において、ｘａが塩基性アミノ酸残基であって良い。いくつかの好ましい態様は、ｘａがＫであり、他の好ましい態様は、ｘａがＲであり、そしてさらなる他の好ましい態様は、ｘａがＨであるものに関する。
【００２４】
他の態様において、ｘａがＬであって良く、さらなる他の態様において、ｘａがＧであって良い。
【００２５】
従って、本発明は、単離されたペプチド配列である、互いに隣接し、かつ上記のモチーフを含む少なくとも６個のアミノ酸のペプチド配列に関する。これは、本発明が、個々の化学物質として存在し、そして個々の化学物質として本発明の目的に使用されるペプチド配列に関することを意味する。本発明は、本発明のモチーフを含むペプチド配列であって、１）１４個以上のアミノ酸残基の単離されたペプチド配列、例えば、配列LNEQVSPKHKGRDVILKKDVR中に共に融合されたアンチトロンビンＩＩＩのペプチド断片およびＮＣＡＭ ＨＢＤの断片を含む二ドメイン（bi−domain）ペプチドのような、ＵＳ２００３／０１１９１８６の二ドメインペプチド；２）例えば、１４個より長いアミノ酸長の、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）または脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のポリペプチドまたは断片のような、天然または組換えポリペプチドの組込配列、３）任意の種類の３Ｄ構造、例えばフィブリンまたはコラーゲンゲルの組込部分であるものに関係しない。
【００２６】
より具体的には、本発明は、式（Ｉ）
ｘ０−ｘ１−ｘ２−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−ｘ７−ｘ８−ｘ９−ｘ１０−ｘ９−ｘ９−ｘ１０−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０が、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ａまたは結合であり、
ｘ１が、Ｇであり、
ｘ２が、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、
ｘ３が、ＥまたはＤであり、
ｘ４が、Ｖであり、
ｘ５が、疎水性アミノ酸残基であり、
ｘ６が、ＶまたはＬであり、
ｘ７が、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ８が、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ９が、Ｅ、Ｄ、ＫまたはＱであり、
ｘ１０が、ＶまたはＬであり、
ｘ１１が、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ１２が、疎水性アミノ酸残基またはＴであり、
ｘ１３が、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａまたは結合である。］
で定義され得る、単離された連続的ペプチド配列に関する。
【００２７】
いくつかの態様において、残基ｘ０は、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ａから選択されるアミノ酸残基であって良い。他の態様において、式に対応する単離されたペプチド配列は、残基ｘ０を有しなくて良い。この場合、配列の最初の残基は、ｘ１である。ｘ０は、配列が下記の化合物の一部であるとき、結合であって良い。
【００２８】
１つの好ましい態様によれば、ｘ３は、Ｑ、ＮまたはＴから選択されて良い。他の好ましい態様によれば、ｘ５は、ＴまたはＥから選択されて良い。他の好ましい態様は、ｘ７およびｘ８が、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、ＥまたはＡから独立して選択されるペプチド配列に関する。いくつかの好ましい態様において、ｘ７がＬであり、他の好ましい態様において、ｘ８がＧまたはＥであって良い。異なる好ましい態様は、ｘ１１が、Ｒ、Ｋ、Ｌ、ＮまたはＰから選択され、そしてｘ１２が、Ｆ、Ｖ、Ｉ、ＴまたはＡから選択される疎水性アミノ酸残基である配列に関し得る。配列が下記の化合物の一部であるとき、ｘ１３が、アミノ酸残基Ｉ、Ｎ、Ｓ、ＧまたはＡから選択され得るか、または結合であり得る。ｘ０および／またはｘ１３が結合である、いくつかの好ましい態様もある。
【００２９】
さらに、本発明のいくつかの好ましい態様は、式（Ｉ）
ｘ０−Ｇ−ｘ２−Ｄ／Ｅ−Ｖ−Ｉ−Ｌ−ｘ７−ｘ８−ｘ９−Ｖ−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０が、Ｋ、Ｒ、ＡまたはＮから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ２が、ＲまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ７が、Ｋ、Ａ、ＮまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ８が、Ｋ、ＮまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ９が、ＤまたはＱから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１１が、ＲまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１２が、ＶまたはＦから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１３が、Ｉ、ＬまたはＶから選択されるアミノ酸残基である。］
で定義され得る配列に関する。
【００３０】
本発明の他の好ましい態様は、式（ＩＩＩ）
ｘ０−Ｇ−ｘ２−ｘ３−Ｖ−ｘ５−Ｖ−Ｌ−Ｇ／Ｅ−ｘ９−Ｖ／Ｌ−ｘ１０−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０、ｘ２、ｘ３、ｘ５、ｘ９、ｘ１０が、上記の式（Ｉ）で定義される通りであり、
ｘ１１が、Ｎ、ＫまたはＰであり、
ｘ１２が、Ｉ、Ｔ、ＡまたはＶであり、
ｘ１３が、Ｓ、Ａ、ＮまたはＧである。］
で定義され得る配列に関し得る。
【００３１】
異なる好ましい態様は、ｘ３がＱであり、ｘ１１がＲ、Ｎ、ＰまたはＬから選択される配列を含み得る。
【００３２】
上記に開示される異なる態様とは関係なく、式Ｉ、ＩＩおよびＩＩＩに対応するペプチド配列は全て、本発明のモチーフを含む。ペプチド配列中の一定の構造、例えば特定のアミノ酸モチーフの存在はしばしば、異なるペプチド配列の群の共通の生物学的活性に必要である。本発明によれば、上記のモチーフは、本発明の配列の生物学的活性に必要である。
【００３３】
本発明は、本明細書中、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに対応する上記のモチーフを含むペプチド配列の群を同定し、これらの配列の共通の構造的特徴（前記モチーフ）と関係する、前記配列の共通の生物学的活性を証明する。前記群は、下記の配列からなる：
KGRDVILKKDVRFI（配列番号１）、
KGRDVILAKDVRVI（配列番号２）、
KGRDVILNNDVRFI（配列番号３）、
KGRDVILNNQVRFI（配列番号４）、
AGRDVILNNDVRFI（配列番号５）、
NGRDVILKKDVLFI（配列番号６）、
NGLDVILIIDVRFI（配列番号７）、
KGKEVMVLGEVNIN（配列番号８）、
RGHQVTVLGEIKTG（配列番号９）、
RGREVEVLGEVPAA（配列番号１０）、および
SGGTVTVLEKVPVS（配列番号１１）。
【００３４】
上記リストの配列は、本発明のモチーフおよび／または式ＩＩまたは式ＩＩＩのモチーフを含み、ペプチド配列の構造中のこれらのモチーフの存在と関係する少なくとも１種の共通な生物学的活性を有する、配列の非限定的例のリストを示すことが理解される。上記の構造的特徴と関係する生物学的活性は、限定されないが、細胞分化、記憶および学習、神経細胞生存を刺激する能力、ニューロトロフィン受容体を活性化する能力、または細胞運動を調節する能力から選択される。
【００３５】
本発明のモチーフＧ−ｘａ−Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｔ−Ｖ−ｘｂ−Ｖ／Ｌ〔式中、ｘａは、任意のアミノ酸残基であり、ｘｂは、Ｉ、Ｔ、ＭまたはＥである。〕を含む単離されたペプチド配列は、６個から１３個のアミノ酸残基を含む。しかしながら、それは、該配列が、例えば、配列番号１−１１の配列のような上記の式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩに対応するとき、１４個のアミノ酸残基の配列であって良い。本発明はまた、式Ｉ−ＩＩＩに対応する配列の断片、特に配列番号１−１１と同定される配列の断片、およびまた上記断片を含む６−１３個のアミノ酸残基長の任意のペプチド配列を含む。従って、本発明の断片は、１２、１１、１０、９、８、７または６個のアミノ酸残基長であり得る。上記に定義される式のモチーフのいずれかを含む断片は、本発明の好ましい断片であり得る。しかしながら、いくつかの態様は、より好ましくは、式ＩＩのモチーフＧ−ｘ２−Ｄ／Ｅ−Ｖ−Ｉ−Ｌ〔式中、ｘ２は、ＲまたはＬである。〕を含む断片に関し、他の態様は、より好ましくは、式ＩＩＩのモチーフＶ−Ｌ−Ｇ／Ｅ−ｘ９−Ｖ／Ｌ〔式中、ｘ９は、Ｅ、Ｄ、ＫまたはＱである。〕を含む断片に関し得る。
【００３６】
本発明はまた、該配列の少なくともいくつかの生物学的活性を有する、上記の配列の変異体および相同体に関する。好ましくは、そのような変異体および相同体は、上記のアミノ酸モチーフ、すなわち
ｉ）本発明のモチーフ：Ｇ−ｘａ−Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｔ−Ｖ−ｘｂ−Ｖ／Ｌ〔式中、ｘａは、任意のアミノ酸残基であり、ｘｂは、Ｉ、Ｔ、ＭまたはＥである。〕、
ｉｉ）式ＩＩのモチーフ：Ｇ−ｘ２−Ｄ／Ｅ−Ｖ−Ｉ−Ｌ〔式中、ｘ２はＲまたはＬである。〕、または
ｉｉｉ）式ＩＩＩのモチーフ：Ｖ−Ｌ−Ｇ／Ｅ−ｘ９−Ｖ／Ｌ〔式中、ｘ９はＥ、Ｄ、ＫまたはＱである。〕
を含む。
【００３７】
本明細書中、アミノ酸残基についての標準的一文字コードならびに標準的三文字コードを用いる。アミノ酸についての略語は、IUPAC−IUB Joint Commission on Biochemical Nomenclature（Eur. J. Biochem, 1984, vol. 184, pp 9−37）の推奨に従う。本明細書および特許請求の範囲中、天然アミノ酸については、三文字コードまたは一文字コードのどちらかを用いる。Ｌ型またはＤ型が特定されていないとき、問題のアミノ酸は、形成されるペプチドが、Ｌ型、Ｄ型またはＬ型およびＤ型の混合配列のアミノ酸から構成され得るため、天然のＬ型（Pure ＆ Appl. Chem. Vol. （56（5） pp 595−624 （1984）を参照のこと）またはＤ型であると理解されるべきである。
【００３８】
特に記載がないとき、本発明のペプチドのＣ末端アミノ酸は、遊離カルボン酸として存在すると理解されるべきであり、これは、“−ＯＨ”と記載されても良い。しかしながら、本発明の化合物のＣ末端アミノ酸は、アミド化された誘導体であって良く、それは、“−ＮＨ２”と記載される。遊離アミノ基を含むポリペプチドのＮ末端アミノ酸について他に記載がないとき、これは、“Ｈ−”と特定されても良い。
【００３９】
特に記載がないとき、アミノ酸は、αアミノ酸、βアミノ酸、および／またはγアミノ酸のような、天然に存在するかまたは存在しない、全てのアミノ酸から選択され得る。従って、その群には、限定されないが、下記：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｍｅｔ、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｉｂ、Ｎａｌ、Ｓａｒ、Ｏｒｎ、リシン類似体、ＤＡＰ、ＤＡＰＡおよび４Ｈｙｐが含まれる。
【００４０】
また、本発明に従い、アミノ酸のグリコシル化および／またはアセチル化のような化合物／ペプチドの修飾を行い得る。
【００４１】
本発明に従い、塩基性アミノ酸残基は、アミノ酸残基Ａｒｇ、Ｌｙｓ、およびＨｉｓで示され、酸性アミノ酸残基は、アミノ酸残基ＧｌｕおよびＡｓｐで示され、疎水性アミノ酸残基は、アミノ酸残基Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＡｌａで示され、そして荷電アミノ酸残基は、アミノ酸残基Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＧｌｕおよびＡｓｐで示される。
【００４２】
上記の通り、本発明は、上記のペプチド配列の断片、変異体および相同体に関する。本明細書中、
ｉ）断片は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより定義される配列に対応する配列、または配列番号１−１１の配列から選択される配列の長さの少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％を有する配列であり；
【００４３】
ｉｉ）変異体は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより定義される配列、または配列番号１−１１の配列から選択される配列と、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％の相同性を有するアミノ酸配列であるか、または式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより定義される配列、または配列番号１−１０の配列と比較して、少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは９５％の陽性（positive）のアミノ酸一致を有するアミノ酸配列である。陽性のアミノ酸一致は、本明細書中、２個の比較配列中の同じ位置のアミノ酸の物理的および／または化学的性質により定義された同一性または類似性として定義される。本発明の好ましい陽性のアミノ酸一致は、ＫとＲ、ＥとＤ、ＬとＭ、ＱとＥ、ＩとＶ、ＩとＬ、ＡとＳ、ＹとＷ、ＫとＱ、ＳとＴ、ＮとＳおよびＱとＲである。１個のアミノ酸配列と他のアミノ酸との相同性は、２個の照合配列における同一アミノ酸の割合として定義される。配列の相同性を、ＢＬＯＳＵＭ３０、ＢＬＯＳＵＭ４０、ＢＬＯＳＵＭ４５、ＢＬＯＳＵＭ５０、ＢＬＯＳＵＭ５５、ＢＬＯＳＵＭ６０、ＢＬＯＳＵＭ６２、ＢＬＯＳＵＭ６５、ＢＬＯＳＵＭ７０、ＢＬＯＳＵＭ７５、ＢＬＯＳＵＭ８０、ＢＬＯＳＵＭ８５またはＢＬＯＳＵＭ９０のようなよく知られているアルゴリズムを用いて計算することができる；
【００４４】
ｉｉｉ）相同体は、式Ｉ、ＩＩまたはＩＩＩにより定義される配列、または配列番号１−１１の配列と、５０−５９％、例えば５５％のような、４０−４９％、例えば４５％のような、３０−３９％、例えば３５％のような、６０％未満であるが、３０％より大きい相同性を有するアミノ酸配列である。
【００４５】
上記の断片、変異体および相同体は、元の配列の生物学的活性、例えば神経細胞分化ならびに／または記憶および学習と関係するような神経可塑性を刺激する能力、アポトーシスを阻害するような細胞生存を刺激する能力、Ｔｒｋ受容体を活性化するようなニューロトロフィン受容体を活性化する能力、細胞運動を阻害するような細胞運動を調節する能力を少なくともいくつか残していると考えられる。
【００４６】
本発明に従い、本発明のモチーフおよび／または式ＩＩもしくは式ＩＩＩのモチーフを含む上記の配列は、SwissProt受託番号：P13596の神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）の配列、例えばＮＣＡＭのＩｇ２モジュールの配列から誘導され得る。そのような配列の一例は、本明細書中、配列番号１と指定される配列KGRDVILKKDVRFIであり得る。この配列は、ＮＣＡＭのＩｇモジュールのヘパリン結合ドメインの一部である。他の態様において、前記配列を、神経成長因子（ＮＧＦ）のようなニューロトリフィン、例えばSwissProt受託番号：NP_02497で指定されるＮＧＦポリペプチドの配列、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、例えばSwissProt受託番号：NP_002518で指定されるＮＴ−３ポリペプチドの配列、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）、例えばSwissProt受託番号：AAAV38176で指定されるＮＴ−４／５ポリペプチドの配列、または脳由来ニューロトロフィン因子（ＢＤＮＦ）、例えばSwissProt受託番号：NP_733928で指定されるＢＤＮＦポリペプチドの配列から誘導することができる。本発明に従い、配列KGKEVMVLGEVNIN（配列番号８）を、上記で指定されるＮＧＦポリペプチドから誘導し、配列RGHQVTVLGEIKTG（配列番号９）を、上記で指定されるＮＴ−３ポリペプチドから誘導し、配列RGREVEVLGEVPAA（配列番号１０）を、上記で指定されるＮＴ−４／５ポリペプチドから誘導し、そして配列SGGTVTVLEKVPVS（配列番号１１）を、上記で指定されるＢＤＮＦポリペプチドから誘導する。
【００４７】
本発明に従い、上記の単離されたペプチド配列を、化合物として製剤することができる。
【００４８】
化合物は、上記のいずれかから選択される個々のアミノ酸配列の単一コピーを含み得るか、またはそのようなアミノ酸配列の２個以上のコピーを含み得る。これは、本発明の化合物が、単一の個々のペプチド配列を含むようなペプチド配列の単量体として構築(formulated)され得るか、またはペプチド配列の多量体、すなわち２個以上の個々のペプチド配列を含むものとして構築され得ることを意味し、ここで該個々のペプチド配列は、同じ配列の２個以上のコピーか、または２個以上の異なる個々のペプチド配列を表し得る。多量体はまた、全長配列およびその１個以上の断片の組み合わせを含んでいて良い。１つの態様において、化合物は、２個のアミノ酸配列を含み得、そのような化合物は、本明細書中、二量体として定義され、他の態様において、化合物は、例えば３個、４個またはそれ以上の配列のような２個より多いアミノ酸配列を含み得る。本発明は、好ましくは、２個または４個の本発明のペプチド配列を含む化合物に関する。しかしながら、３個、５個、６個、７個、８個またはそれ以上の配列を含む化合物も、本発明の範囲内である。
【００４９】
二量体または多量体として構築されたペプチド断片は、同一のアミノ酸配列を有し得るか、または異なるアミノ酸配列を有し得る。そのような化合物の一例は、配列番号１および配列番号２を含む化合物であって良く、他の例は、配列番号１および配列番号８を含む化合物であって良い。本発明の配列の任意の他の組み合わせは、本発明の異なる態様により作製されて良い。その配列は、ペプチド結合により互いに結合し得るか、またはリンカー分子または群を介して互いに結合し得る。他の態様において、化合物は、例えば、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０および１１から選択される配列の２個のコピーのような、配列の２個以上の同一コピーを含み得、ここで該２個の配列は、リンカー分子または群により互いに結合し得る。前記配列が、リンカー群により結合される化合物が好ましい。そのようなリンカー群の一例は、アキラルなジ−、トリ−またはテトラカルボン酸であって良い。適するアキラルなジ−、トリ−またはテトラカルボン酸およびそのような化合物の産生方法（リガンド提示組立法（ligand presentation assembly method）（ＬＰＡ））を、本明細書中さらに詳細に説明する。可能性のあるリンカーの他の例は、アミノ酸であるリシンであり得る。個々のペプチド配列は、リシンのようなコア分子に結合し得、それにより個々のペプチド配列（複数可）のデンドリック（dendrimeric）多量体（デンドリマー）を形成する。デンドリマーの産生は、当技術分野でよく知られており（ＰＣＴ／ＵＳ９０／０２０３９、Lu et al., （1991） Mol Immunol. 28:623−630；Defoort et al., （1992） Int J Pept Prot Res. 40:214−221；Drijfhout et al. （1991） Int J Pept Prot Res. 37:27−32）、現在、デンドリマーは、研究用および医薬用として広く用いられている。リシンコア分子に結合された４個の個々のアミノ酸配列を含むデンドリック化合物を提供するための本発明の態様が好ましい。また、４個の個々のアミノ酸配列のうち少なくとも１個が、上記の式のアミノ酸配列を含むことも好ましい。さらに、デンドリック化合物の４個全ての個々のアミノ酸配列が、個々に上記に定義される式のアミノ酸配列を含むとき、より好ましい。
【００５０】
ＬＰＡ二量体またはリシンデンドリマーのような本発明の多量体化合物は、本発明の化合物として好ましい。しかしながら、２個以上の個々の本発明の配列を含む多量体化合物の他のタイプが、その態様により好ましいかもしれない。
【００５１】
本発明の個々の配列の１個以上のコピー、またはその断片、変異体もしくは相同体、および他の生物学的活性化合物、例えば他のペプチド配列を含む多量体化合物も、本発明の範囲内である。かかる化合物のうち、最も好ましいのは、少なくとも１個の本発明のペプチド配列を含み、さらに、Ｔｒｋファミリーのニューロトロフィン受容体を刺激する能力を有する何らかの他の化学物質、例えばＴｒｋ受容体リガンドまたはＴｒｋ受容体活性化タンパク質から誘導されるペプチド配列（ここで、該配列は、本発明の配列とは異なる）であり得る化学物質を含むものである。
【００５２】
２．生物学的活性
本発明のペプチド配列および本発明の配列を含む化合物は、生物学的活性を有する。本発明は、好ましくは、例えば神経突起伸張を刺激するような、神経細胞分化と関係する神経可塑性を刺激する能力、ならびに／または例えばシナプス効力を刺激するような、記憶および学習に関連する神経可塑性を刺激する能力、例えばアポトーシスを阻害するような細胞生存を刺激する能力、例えばＴｒｋ受容体を活性化するようなニューロトロフィン受容体を活性化する能力、ならびに例えば細胞運動を阻害するような細胞運動を調節する能力から選択される生物学的活性に関する。
【００５３】
従って、１つの態様において、上記の単離されたペプチド配列は、Ｔｒｋ Ａ、Ｔｒｋ ＢおよびＴｒｋ Ｃから選択されるニューロトロフィン受容体に結合し得る。１つの好ましい態様において、前記受容体はＴｒｋ Ａであり得、他の好ましい態様において、前記受容体はＴｒｋ Ｂであり得、さらに他の好ましい態様において、前記受容体はＴｒｋ Ｃであり得る。
【００５４】
本発明者らは、ニューロトロフィン（ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５、ＢＤＮＦ）およびＮＣＡＭの両方に存在するアミノ酸モチーフを同定し、このモチーフの存在と本発明のペプチド断片の生物学的活性とを関連付けた。本発明のモチーフは、Ｔｒｋ受容体、特にＴｒｋ Ｂへの本発明のペプチド配列の結合に必須である。Ｔｒｋ受容体は、神経細胞の分化を誘導する、神経系における主な受容体である。Ｔｒｋ受容体、特にＴｒｋ Ｂ受容体はまた、ニューロン生存の促進に重要であり、学習および記憶と関係する神経可塑性に関与する。本発明のペプチド配列の前記受容体と結合し、そして活性化する能力は、受容体の活性に依存して生物学的反応を調節する役割を果たす。従って、本発明は、本発明の単離されたペプチド配列または該配列を含む化合物を用いることを含む、Ｔｒｋファミリーのニューロトロフィン受容体の活性を調節する方法を提供する。好ましい態様において、本発明は、Ｔｒｋファミリーのニューロトロフィン受容体を活性化するための方法に関する。
【００５５】
本発明の単離されたペプチド配列は、神経細胞分化を刺激することができる。用語“神経細胞分化”は、神経前駆体細胞、または神経幹細胞の分化、および分化したニューロンの成熟のようなニューロンの分化の両方であると解される。そのような分化の例は、未分化ニューロンからの神経突起伸張、神経突起の分岐、神経再生であり得る。１つの好ましい態様において、本発明は、神経前駆体細胞／幹細胞、または未成熟細胞の分化を刺激することに関するかもしれず、他の好ましい態様において、本発明は、成熟ニューロン、例えば外傷を負ったが生き残った成熟ニューロンからの神経突起伸張を刺激することに関するかもしれない。従って、本発明はまた、本発明のペプチド配列または該配列を含む化合物を用いることを含む、神経細胞分化を刺激する方法を提供する。
【００５６】
本発明の１つの最も好ましい態様は、学習および記憶と関係するペプチド配列の活性に関する。特に、本発明の１つの態様において、前記ペプチド配列は、脊椎形成を刺激し得、他の態様において、前記配列は、シナプス効力を促進し得る。従って、本発明は、本発明のペプチド配列および／または該配列を含む化合物を用いることを含む、記憶および／または学習を刺激するための方法をさらに提供する。本発明は、短期記憶および長期記憶の両方に関する。
【００５７】
本発明のペプチド配列はまた、神経細胞生存を刺激し得る。本発明は、外傷および変性疾患の両方による神経細胞生存を刺激する能力に関する。従って、本発明は、細胞生存、好ましくは神経細胞生存を、本発明のペプチド配列および／または該配列を含む化合物を用いることにより刺激するための方法を提供する。
【００５８】
さらに他の態様において、本発明のペプチド配列は、細胞運動を調節し得る。用語“細胞運動を調節すること”には、細胞運動を刺激することおよび阻害することの両方が含まれる。細胞運動を阻害する結果となるペプチド配列の活性が好ましい。従って、本発明のペプチド配列または該配列を含む化合物を用いる細胞運動を調節する、特に細胞運動を阻害するための方法はまた、本発明により提供される細胞過程および生理学的過程を調節するための方法のうちの１つである。
【００５９】
本発明のペプチド配列およびそれを含む化合物は、細胞増殖培地の可溶性／移動性物質、および細胞増殖基質の固定物質の両方として生物学的に活性である。いくつかの態様において、ペプチド物質またはそれを含む化合物を細胞基質として用いることが好ましいかもしれない。しかしながら、可溶性ペプチド配列またはそれを含む化合物が、最も好ましい。
【００６０】
本発明のペプチド配列およびそれを含む化合物の生物学的活性の、非限定的例を、本明細書中に記載する（下記および実施例２、３および５を参照のこと）。
【００６１】
神経突起伸張の刺激
ある内因性栄養因子のような、神経突起伸張を促進する、ならびに神経細胞の再生および／または分化を刺激する可能性を有する物質は、例えば神経再生および他の神経可塑性形態を容易にする化合物の探索において最初の目標である。本化合物の可能性を評価するために、神経突起伸張に関係するシグナル伝達を刺激する能力、細胞接着を阻害する能力、神経突起伸張を刺激する能力、神経の再生能力を調査することができる。本発明の化合物は、神経突起伸張を促進することが示され、それ故に、神経結合の再生、それによる損傷後の機能的回復の良好なプロモーターである、ならびにそのような効果が必要な他の状態における神経機能のプロモーターであると考えられる。
【００６２】
本明細書中、“分化”とは、神経細胞の成熟および神経突起の伸長の促進に関係し、それは、該神経細胞の最後の細胞分化後に起こる。本発明の化合物は、神経細胞分割を停止し、神経突起の伸長を開始させるような該細胞の成熟を開始させることができる。他に、“分化”とは、当技術分野で定義される特徴のような正常な神経細胞の機能的特徴を有する細胞の形成を誘導する、神経前駆体細胞、未熟な神経細胞または胚性幹細胞の遺伝的、生化学的、形態学的および生理学的形質転換過程の開始に関係する。本発明は、“未成熟な神経細胞”を、神経細胞の特徴である特性として当技術分野で認容される神経細胞の特性を少なくとも１個有する細胞として定義する。
【００６３】
本発明によれば、上記ペプチド配列の少なくとも１個を含む化合物は、神経突起伸張を刺激することが可能である。本発明は、神経突起伸張の改善／刺激、例えば対照／非刺激細胞の神経突起伸張値を、約７５％程度、例えば５０％、約１５０％程度、例えば１００％、約２５０％程度、例えば２００％、約３５０％程度、例えば３００％、約４５０％程度、例えば４００％、約５００％程度超える改善／刺激に関する。
【００６４】
候補化合物の神経突起伸張を刺激する能力の評価を、何らかの公知の方法または例えば本明細書の実施例２に記載のような神経突起伸張の評価についての分析を用いて行うことができる。
【００６５】
本発明によれば、化合物は、細胞増殖基質の不溶性固定成分、および細胞増殖培地の可溶性成分の両方として神経突起伸張活性を有する。本明細書中、“固定“とは、化合物が、水または水溶液に不溶性の物質に結合／付着し、それによりそのような溶液に不溶性となることを意味する。医薬適用に関して、不溶性および可溶性化合物は両方とも、本発明により考慮されるが、可溶性化合物が好ましい。“可溶性化合物”とは、水または水溶液に可溶性の化合物であると理解される。
【００６６】
細胞運動の阻害
細胞移動は、神経系の発達中、創傷治癒中および腫瘍浸潤中に必要とされる。神経系の正確な形成および正常な機能は両方とも、多数のニューロンが、神経系の発生中、それらの起始部位からそれらの最終的な位置へ移動することを必要とする。
【００６７】
いくつかのタイプの細胞は、成熟した生物中でも運動する能力を維持するが、他のタイプの細胞は、それを失う。疾患または外傷のようないくつかの厳しい状態において、細胞の運動能力は、創傷治癒または癌細胞浸潤および転移のような疾患からの救済またはそれによる死の開始点を規定し得る。それ故に、ある内生の栄養素のような細胞運動を調節する可能性を有する物質は、例えば外傷からの回復、癌細胞の浸潤予防または炎症の拡大阻害を促進する化合物の探索における第一の目標である。本化合物の可能性を評価するために、細胞接着を妨げるか、細胞運動を刺激するかまたは阻害する、細胞運動に関係するシグナル伝達を調節する能力を調べることができる。本発明の化合物は、細胞運動を阻害することができ、それ故に、阻害が必要なときの状態における、例えば癌細胞の浸潤および拡散の阻害ならびに何らかのタイプの細胞浸潤の阻害のための良好な候補化合物であると見なされる。
【００６８】
本発明によれば、少なくとも１個の上記の配列を含む化合物は、細胞運動を阻害することができる。本発明は、対照細胞運動と比較したとき、約７５％、例えば５０％、約１５０％程度、例えば１００％、約２５０％程度、例えば２００％、約３５０％程度、例えば３００％、約４５０％程度、例えば４００％、例えば約５００％程度であると概算される細胞運動の阻害に関する。用語“運動”は、本明細書中、一定期間におけるそれが存在した場所から他の場所への細胞の移動として定義され、本明細書中、細胞運動は、細胞の最初および最後の位置に対応する２点間のユークリッド距離として測定される。阻害または運動の上記の“値”のような細胞運動および化合物の阻害能の定量を考えるとき、本発明は、パラメータを、細胞の拡散速度（Ｒ）、平均細胞速度（Ｓτ）および移動指標（ＬＩ）として“値”を定義することに関係する。後者のパラメータは、通常、細胞運動の定量化に関して当技術分野で用いられ、例えばWalmod et al. （2001） Methods Mol Biol. 161:59−83に記載され、かつ下記に特に記載する。
【００６９】
細胞運動の分析を、この目的に関して当技術分野で開発された、何らかの利用可能な方法および分析を用いて行うことができる。それを、例えば本明細書の実施例３に記載の通りに行うことができる。
【００７０】
３．ペプチド配列の産生
本発明の化合物は、好ましくは、合成的に産生される。しかしながら、化合物の組換え産生も、意図される。
【００７１】
組換え産生
従って、１つの態様において、本発明のペプチド配列を、組換えＤＮＡ技術の使用により産生することができる。
【００７２】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列またはそれが由来するペプチドの対応する全長タンパク質を、確立された標準方法、例えばBeaucage and Caruthers, 1981、Tetrahedron Lett. 22:1859−1869に記載のホスホアミジン（phosphoamidine）法、またはMatthes et al., 1984, EMBO J. 3:801−805に記載の方法により合成的に産生することができる。ホスホアミジン法に従い、例えば自動ＤＮＡ合成装置でオリゴヌクレオチドを合成し、精製し、アニール化し、ライゲーションし、そして適するベクター中にクローニングする。
【００７３】
ペプチドをコードするＤＮＡ配列を、標準プロトコール（Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory manual. 2 rd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989）に従い、元のペプチドの対応する全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列を、ＤＮＡａｓｅＩを用いて断片化することにより製造することもできる。本発明は、上記で指定されたタンパク質群から選択された全長タンパク質に関係する。あるいは、本発明の全長タンパク質をコードするＤＮＡを、特定の制限エンドヌクレアーゼを用いて断片化することもできる。ＤＮＡの断片をさらに、Sambrook et al., Molecular cloning: A Laboratory manual. 2 rd ed., CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989に記載の標準的方法を用いて精製する。
【００７４】
全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列はまた、例えばゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリを調製し、標準的技術（Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor, 1989を参照のこと）に従い合成オリゴヌクレオチドプローブを用いてバイブリダイゼーションすることにより全長タンパク質の全体または一部をコードするＤＮＡ配列についてスクリーニングすることにより得られる、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ起源であって良い。前記ＤＮＡ配列を、例えばＵＳ４，６８３，２０２またはSaiki et al., 1988, Science 239:487−491に記載の通りに、特異的プライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応により製造することもできる。
【００７５】
その後、前記ＤＮＡ配列を、任意のベクターであって良く、組換えＤＮＡ法に都合良く付され得る組換え発現ベクター中に挿入する。ベクターの選択は、しばしば導入されるべき宿主細胞に依存して変わる。従って、前記ベクターは、自己複製ベクター、すなわち、染色体外要素として存在し、その複製が染色体複製とは独立したベクター、例えばプラスミドであって良い。あるいは、ベクターは、宿主細胞中に導入されたとき、宿主細胞ゲノム中に組み込まれ、そしてそれが組み込まれた染色体と共に複製されるものであって良い。
【００７６】
ベクター中、ペプチドまたは全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、適するプロモーター配列に作動可能に連結されるべきである。前記プロモーターは、選択された宿主細胞中で転写活性を示し、かつ宿主細胞に対して同種または異種のいずれかのタンパク質をコードする遺伝子から誘導され得る、何らかのＤＮＡ配列であって良い。哺乳動物細胞中でコーディングＤＮＡ配列の転写を指示するのに適するプロモーターの例は、ＳＶ４０プロモーター（Subramani et al., 1981, Mol. Cell Biol. 1:854−864）、ＭＴ−１（メタロチオネイン遺伝子）プロモーター（Palmiter et al., 1983, Science 222: 809−814）またはアデノウイルス２主要後期プロモーターである。昆虫細胞における使用に適するプロモーターは、ポリヘドリンプロモーターである（Vasuvedan et al., 1992, FEBS Lett. 311:7−11）。酵母宿主細胞における使用に適するプロモーターには、酵母解糖系遺伝子 （Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255:12073−12080；Alber and Kawasaki, 1982, J. Mol. Appl. Gen. 1: 419−434）もしくはアルコールデヒドロゲナーゼ遺伝子（Young et al., 1982, in Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al, eds., Plenum Press, New York）由来のプロモーター、またはＴＰＩ１（ＵＳ４，５９９，３１１）もしくはＡＤＨ２―４ｃ（Russell et al., 1983, Nature 304:652−654）プロモーターが含まれる。糸状菌宿主細胞における使用に適するプロモーターは、例えば、ＡＤＨ３プロモーター（McKnight et al., 1985, EMBO J. 4:2093−2099）、またはｔｐ１Ａプロモーターである。
【００７７】
前記コーディングＤＮＡ配列はまた、ヒト成長ホルモンターミネーター（Palmiter et al., op. cit.）または（真菌宿主について）ＴＰＩ１（Alber and Kawasaki, op. cit.）またはＡＤＨ３（McKnight et al., op. cit.）プロモーターのような適するターミネーターと作動可能に連結されていて良い。ベクターはさらに、ポリアデニル化シグナル（例えば、ＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ部位由来）、転写エンハンサー配列（例えば、ＳＶ４０エンハンサー）および翻訳エンハンサー配列（例えば、アデノウイルスＶＡ ＲＮＡをコードするもの）のような要素を含んでいて良い。
【００７８】
組換え発現ベクターはさらに、ベクターが問題の宿主細胞中で複製可能となるＤＮＡ配列を含んでいて良い。そのような配列の例（宿主細胞が、哺乳動物であるとき）は、ＳＶ４０複製起点である。ベクターはまた、選択可能マーカー、例えばジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードする遺伝子のような、その産物が宿主細胞における欠損を補完する遺伝子または薬剤、例えばネオマイシン、ヒドロマイシンまたはメトトレキサートに耐性を与える遺伝子を含んでいて良い。
【００７９】
ペプチドまたは全長タンパク質をコードするＤＮＡ配列、プロモーターおよびターミネーターそれぞれをライゲーションするため、および複製に必要な情報を含む適するベクター中にそれを挿入するために用いる方法は、当業者によく知られている（例えば、Sambrook et al., op.cit.を参照のこと）。
【００８０】
本発明の組換えペプチドを得るため、前記コーディングＤＮＡ配列を、第二のペプチドコーディング配列およびプロテアーゼ切断部位コーディング配列と有用に融合させ、融合タンパク質をコードするＤＮＡコンストラクトを得（ここでプロテアーゼ切断部位コーディング配列は、ＨＢＰ断片と第二のペプチドコーディングＤＮＡの間に位置する。）、組換え発現ベクター中に挿入し、そして組換え宿主細胞中で発現させ得る。１つの態様において、該第二のペプチドは、グルタチオン−Ｓ−レダクターゼ、仔牛チモシン、細菌チオレドキシンまたはヒトユビキチンの天然物もしくは合成変異体、またはそのペプチドを含む群から選択されるが、それらに限定されない。他の態様において、プロテアーゼ切断部位を含むペプチド配列は、アミノ酸配列ＩＥＧＲを有する因子Ｘａ切断部位、アミノ酸配列ＤＤＤＤＫを有するエンテロキナーゼ切断部位、アミノ酸配列ＬＶＰＲ／ＧＳを有するトロンビン切断部位またはアミノ酸配列ＸＫＸを有するアクロモバクター・リチクス（Acharombacter lyticus）切断部位であり得る。
【００８１】
その中に発現ベクターを導入される宿主細胞は、ペプチドまたは全長タンパク質を発現することができる任意の細胞であり得、好ましくは、無脊椎動物（昆虫）細胞または脊椎動物細胞、例えばアフリカツメガエル卵母細胞または哺乳動物細胞、特に昆虫および哺乳動物細胞のような真核細胞である。適する哺乳動物細胞株は、ＨＥＫ２９３（ATCC CRL−1573）、ＣＯＳ（ATCC CRL−1650）、ＢＨＫ（ATCC CRL−1632、ATCC CCL−10）またはＣＨＯ（ＡＴＣＣ ＣＣＬ−６１）細胞株である。哺乳動物細胞をトランフフェクトし、細胞中に導入されたＤＮＡ配列を発現させる方法は、例えばKaufman and Sharp, J. Mol. Biol. 159, 1982, pp. 601−621；Southern and Berg, 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:327−341；Loyter et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 422−426；Wigler et al., 1978, Cell 14:725；Corsaro and Pearson, 1981, in Somatic Cell Genetics 7, p. 603；Graham and van der Eb, 1973, Virol. 52:456;および、Neumann et al., 1982, EMBO J. 1:841−845に記載される。
【００８２】
あるいは、真菌細胞（酵母細胞を含む）を、宿主細胞として用いることができる。適する酵母細胞の例には、サッカロマイセス属またはシゾサッカロマイセス属、特にサッカロマイセス・セレビシエ株の細胞が含まれる。他の真菌細胞の例は、糸状菌、例えばアスペルギルス属またはアカパンカビ属（Neurospora spp.）、特に、アスペルギルス・オリゼー株またはアスペルギルス・ニガー株の細胞である。タンパク質発現のためのアカパンカビ属の使用は、例えばＥＰ２３８０２３に記載される。
【００８３】
細胞を培養するために用いられる培地は、適当な補助剤を含む血清含有または血清不含有培地のような哺乳動物細胞の増殖に適する任意の常套的培地、または昆虫、酵母もしくは真菌細胞の増殖に適する培地であって良い。適する培地は、商業的供給者により利用可能であるか、または公開された製法（例えば、American Type Culture Collectionのカタログ中）に従い調製され得る。
【００８４】
その後、細胞により組換え的に産生されるペプチドまたは全長タンパク質を、宿主細胞を遠心またはろ過により培地から分離すること、上清またはろ液のタンパク質性成分を、塩、例えば硫酸アンモニウムの手段により沈殿させること、様々なクロマトグラフィー法、例えばＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、親和性クロマトグラフィーにより精製することなどを含む常套法により、培養培地から回収することができる。
【００８５】
個々のペプチド配列の合成的産生
ペプチドの合成的産生のための方法は、当技術分野でよく知られている。合成ペプチドを産生するための詳細な記載ならびに実用的助言は、Synthetic Peptides：A User’s Guide （Advances in Molecular Biology）, Grant G. A. ed., Oxford University Press, 2002、またはPharmaceutical Formulation: Development of Peptides and Proteins, Frokjaer and Hovgaard eds., Taylor and Francis, 1999に見出される。
【００８６】
ペプチドを、例えば、Ｆｍｏｃ化学を用いて、Ａｃｍにより保護されたシステインを用いて合成することができる。逆相ＨＰＬＣにより精製後、ペプチドを、例えば環状またはＣ−もしくはＮ末端修飾異性体を得るためにさらに処理することができる。環化および末端修飾のための方法は、当技術分野で公知であり、かつ上記の便覧に詳しく記載されている。
【００８７】
好ましい態様において、本発明の個々のペプチド配列は、特に、上記の便覧に記載の配列援用ペプチド合成（Sequence Assisted Peptide Synthesis）（ＳＡＰＳ）法により合成的に産生される。
【００８８】
別に、本発明の個々のペプチド配列の合成を、例えば、Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（ＵＳＡ）のような商業的製造業者に依頼し、購入することができる。
【００８９】
個々のペプチド配列の多量体の産生  ＬＰＡ法
ＬＰＡ法は、ＷＯ００／１８７９１に開示される。その方法は、下記の工程を基本的に含む：
（ａ）所望の配列（複数可）を含むペプチド断片（複数可）を固相合成または断片カップリングにより提供する工程（ペプチド断片（複数可）は、固相に結合されている）；
（ｂ）必要ならば、ペプチド断片（複数可）全体を固相に結合させたまま、任意のＮ末端アミノ基を脱保護する工程
（ｃ）環構造を有するコンストラクトを提供するために、非保護Ｎ末端基を有するペプチド断片（複数可）をアキラルのジ−、トリ−、またはテトラカルボン酸と反応させる工程、および
（ｄ）遊離Ｃ末端基を有するペプチド断片（複数可）を含むＬＰＡを提供するように、固相からコンストラクトを切断する工程。
【００９０】
上記の方法において、工程（ｄ）の前に下記の工程を行うことができる：
（ｃ１）存在するならば、工程（ｃ）で用いるカルボン酸由来の任意のＮ保護基を脱保護する工程、
（ｃ２）少なくとも１個のＮ保護されたＮ末端アミノ酸基を有し、および／または化学作用部分に結合する所望の配列（複数可）を含むペプチド断片（複数可）を提供するために、固相合成または断片カップリングを継続する工程、および
（ｃ３）存在するならば、任意のＮ末端アミノ基を脱保護する工程（工程（ｄ）の前または後）。
【００９１】
前記方法は、とりわけ、ＮからＣ配向を有する本発明の所望の配列を示すＬＰＡを提供する（工程（ｃ））。そしてまた、同時にＣからＮ配向を有する配列を示すＬＰＡを提供する（工程（ｃ２））。
【００９２】
従って、本発明の化合物を得るため、固相に結合した２個のペプチド鎖を、アキラルのジ−、トリ−またはテトラカルボン酸を用いて構築すべきである。本方法で使用される適当なアキラルのジ−、トリ−またはテトラカルボン酸は、一般式
Ｘ［（Ａ）ｎＣＯＯＨ］［（Ｂ）ｍＣＯＯＨ］
〔式中、ｎおよびｍは、独立して１から２０の整数であり、Ｘは、ＨＮであり、ＡおよびＢは、独立して、置換もしくは非置換Ｃ１−１０アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２−１０アルケニル、置換もしくは非置換環状部分、置換もしくは非置換ヘテロ環状部分、置換もしくは非置換芳香族部分であるか、またはＡおよびＢは、共に、置換もしくは非置換環状部分、置換もしくは非置換ヘテロ環状部分、置換もしくは非置換芳香族部分を形成する。〕
を有する。
【００９３】
他の態様において、本方法で使用される適当なアキラルのジ−、トリ−またはテトラカルボン酸は、一般式
Ｘ［（Ａ）ｎＣＯＯＨ］［（Ｂ）ｍＣＯＯＨ］
〔式中、ｎおよびｍは、０または１から２０の整数であり、Ｘは、Ｈ２Ｎ（ＣＲ２）ｐＣＲ、またはＲＨＮ（ＣＲ２）ｐＣＲ（ここで、ｐは、０または１から２０の整数であり、各ＲはＨ、置換もしくは非置換Ｃ１−１０アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２−１０アルケニル、置換もしくは非置換環状部分、置換もしくは非置換ヘテロ環状部分、置換もしくは非置換芳香族部分である。）であるか、またはＡおよびＢは、共に、置換または非置換環状部分、置換もしくは非置換ヘテロ環状部分、置換もしくは非置換芳香族部分を形成する。〕
を有する。
【００９４】
さらに他の態様において、本方法で使用される適当なアキラルのジ−、トリ−またはテトラカルボン酸は、一般式
Ｘ［（Ａ）ｎＣＯＯＨ］［（Ｂ）ｍＣＯＯＨ］
〔式中、ｎおよびｍは、０または１から２０の整数であり、Ｘは、ＨＯ（ＣＲ２）ｐＣＲ、ＨＳ（ＣＲ２）ｐＣＲ、ハロゲン−（ＣＲ２）ｐＣＲ、ＨＯＯＣ（ＣＲ２）ｐＣＲ、ＲＯＯＣ（ＣＲ２）ｐＣＲ、ＨＣＯ（ＣＲ２）ｐＣＲ、ＲＣＯ（ＣＲ２）ｐＣＲ、または［ＨＯＯＣ（Ａ）ｎ］［ＨＯＯＣ（Ｂ）ｍ］ＣＲ（ＣＲ２）ｐＣＲ（ここで、ｐは０または１から２０の整数であり、各Ｒは、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１−１０アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２−１０アルケニル、置換もしくは非置換環状部分、置換もしくは非置換ヘテロ環状部分、置換または非置換芳香族部分である。）であるか、またはＡおよびＢは、共に、置換もしくは非置換環状部分、置換もしくは非置換ヘテロ環状部分、置換もしくは非置換芳香族部分を形成する。〕
を有する。
【００９５】
また他の態様において、本方法で使用される適当なアキラルのジ−、トリ−またはテトラカルボン酸は、一般式
Ｘ［（Ａ）ｎＣＯＯＨ］［（Ｂ）ｍＣＯＯＨ］
〔式中、ｎおよびｍは、０または１から２０の整数であり、Ｘは、Ｈ２Ｎ（ＣＲ２）ｐ、ＲＨＮ（ＣＲ２）ｐ、ＨＯ（ＣＲ２）ｐ、ＨＳ（ＣＲ２）ｐ、ハロゲン−（ＣＲ２）ｐ、ＨＯＯＣ（ＣＲ２）ｐ、ＲＯＯＣ（ＣＲ２）ｐ、ＨＣＯ（ＣＲ２）ｐ、ＲＣＯ（ＣＲ２）ｐ、または［ＨＯＯＣ（Ａ）ｎ］［ＨＯＯＣ（Ｂ）ｍ］（ＣＲ２）ｐ（ここで、ｐは、０または１から２０の整数であり、各Ｒは、独立して、Ｈまたは置換もしくは非置換Ｃ１−１０アルキル、置換もしくは非置換Ｃ２−１０アルケニル、置換もしくは非置換環状部分、置換もしく非置換ヘテロ環状部分、置換もしくは非置換芳香族部分である。）であるか、またはＡおよびＢは、共に、置換もしくは非置換環状部分、置換もしくは非置換ヘテロ環状部分、置換もしくは非置換芳香族部分を形成する。〕
を有する。
【００９６】
用語Ｃ１−１０アルキルは、１−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルキル基、例えばメチル、エチル、イソプロピル、ブチルおよびｔｅｒｔ−ブチルを意味する。
【００９７】
用語Ｃ２−１０アルケニルは、２−１０個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖アルケニル基、例えばエチニル、プロペニル、イソプロペニル、ブテニルおよびｔｅｒｔ−ブテニルを意味する。
【００９８】
用語環状部分は、シクロヘキサン、およびシクロペンタンを意味する。
用語芳香族部分は、フェニルを意味する。
用語“ＡおよびＢは、環状、ヘテロ環または芳香族部分を形成する”は、シクロヘキサン、ピペリジン、ベンゼン、およびピリジンを示す。
【００９９】
カルボン酸と反応させることにより、Ｘ（ＣＯ−配列）２−固相（ここで、Ｘは上記に定義の通りである。）タイプのコンストラクトが得られる。
【０１００】
用語“配列”は、本明細書中、天然に存在するおよび／または天然に存在しないアミノ酸、ＰＮＡ配列、またはペプチド模倣物を含むペプチドを意味する。“天然に存在するアミノ酸”は、天然に見出される２０個の酸のＬおよびＤ型を意味する。天然に存在しないアミノ酸は、例えば、修飾された天然に存在するアミノ酸である。用語、配列は、１個またはそれ以上のそのような配列を含むことがさらに意図される。適するペプチド模倣物の例は、Marshall G.R.,(1993) Tetrahedron, 49:3547−3558に記載される。用語“化学作用部分”は、ＬＰＡの溶解性または生物学的活性を増大させる部分、およびＬＰＡをその標的またはマーカーに向けさせる部分を示す。配列について好ましい態様を、上記に記載する。
【０１０１】
基Ｘは、直接的または間接的に連続した段階的合成工程を可能にするか、または同じ配列、もしくは１個以上の異なる配列および／もしくは部分の断片カップリングを可能にする。ＬＰＡ中のペプチド断片の配向（ＮからＣ、またはＣからＮ）は、所望の通りに定義規定される。１つの態様において、本発明は、ＮからＣ配向を有するＬＰＡを特徴とし、他の態様において、同時にＮからＣおよびＣからＮの配列表示を有する化合物に関し、さらに他の態様において、配列はＣからＮ配向を有する。
【０１０２】
Ｘが、一時的に保護されたアミノ官能基を含む場合において、合成またはカップリングを、保護後直ぐに行うことができる。環系の効率的な形成を供するカルボキシルを含む基全ての適する活性化（上記、工程（ｃ）で）を、半当量のカルボン酸(carboxy acid)を用いて確実にすることができる。トリ−またはテトラカルボン酸の場合、活性化カルボキシ基を、さらに、メルカプト−、オキシ−、オキソまたはカルボキシル基のようなさらなる反応のために好適に官能化されたエチレンジアミンまたはアミンのようなジアミンを用いて誘導することができる。ジアミンの場合、ペプチド合成または断片カップリングを、所望の配列または化学作用部分により、直接連続して行うことができる。好ましい態様において、Ｆｍｏｃ保護法を用いるが、任意のアミノ保護基を、合成またはカップリング法に依存して用いることができる。例は、Ｂｏｃ保護基法である。
【０１０３】
連続した段階的合成工程または断片カップリング法が、１個の、またはリシンのような二官能性化学作用部分の場合には２個のアミノ酸基で行われるため、驚くことに、ＭＡＰ合成により得られる通常の四量体リシンデンドリマー（dendimer）と比較してより良い結果が得られることが発見された。さらに、最適なペプチド合成法またはカップリング法を、固相に結合した一本鎖に用いることができ、それらの均一性を、ＬＰＡを形成する前に確認することができる。固相からの切断および同時の側鎖脱保護を、標準的ペプチド合成法（上記）により行うことができる。故に、最適かつよく定義された組成を有する最終産物を、得ることができる。ＨＰＬＣまたはゲルろ過のような標準的クロマトグラフィー法による精製を、所望または必要ならば、簡単に行うことができる。
【０１０４】
環構造を供するために好適なジ−、トリ−およびテトラカルボン酸は、イミノ二酢酸、２−アミノマロン酸、３−アミノグルタル酸、３−メチルアミノグルタル酸、３−クロログルタミン酸、３−メトキシ−カルボニルグルタル酸、３−アセチルグルタル酸、グルタル酸、トリカルバリル酸、３，４−ビス−カルボキシメチルアジピン酸、４−（２−カルボキシエチル）−ピメリン酸、（３，５−ビス−カルボキシメチル−フェニル）−酢酸、３，４−ビス−カルボキシメチル−アジピン酸、ベンゼン−１，２，４，５−テトラカルボン酸、４−（３−カルボキシ−アリルアミノ）−ブト−２−エン酸、４，４−イミノ−二安息香酸、１，４−ジヒドロピリジン−３，５−ジカルボン酸、５−アミノイソフタル酸、２−クロロマロン酸、３−ヒドロキシグルタル酸、およびベンゼン−１，３，５−トリカルボン酸から選択され得る。
【０１０５】
断片カップリング（断片カップリングまたは断片縮合）を、標準法、例えばPeptide Synthesis protocols, Methods in Molecular Biology Vol. 35, Chapter 15, 303−316、Nyfeler R, Pennington MW and Dunne BM Eds.,Humana Press, 1994に記載の通りに行うことができる。従って、上記の通り断片を固相上で合成し、保護基を完全に保持しながら固相から切断し、精製および特徴付けることができる。適するフラグメントを、上記の他の技術により得ることもできる。
【０１０６】
本発明の化合物の産生に上記のＬＰＡ法を用いることは、本発明の好ましい態様である。
【０１０７】
４．抗体
本発明の式Ｉに対応する配列、または該配列の断片、変異体もしくは相同体を含むか、またはそれから成る(comprised by)エピトープ、好ましい態様において、本発明のモチーフを含むエピトープを認識し、それに選択的に結合し得る抗体、その抗原結合断片または組換えタンパク質を提供することは、本発明の目的である。１つの好ましい態様において、抗体は、モチーフＧ−ｘａ−Ｄ／Ｅ／Ｑ／Ｔ−Ｖ−ｘｂ−Ｖ／Ｌ（ここで、ｘａは任意のアミノ酸残基であり、ｘｂはＩ、Ｔ、ＭまたはＥである。）を含むエピトープを認識し、それに結合する抗体である。他の好ましい態様において、抗体は、モチーフＧ−ｘ２−Ｄ／Ｅ−Ｖ−Ｉ−Ｌ（ここで、ｘ２はＲまたはＬである。）を含むエピトープを認識し、それに結合する抗体である。さらに他の好ましい態様において、抗体は、モチーフＶ−Ｌ−Ｇ／Ｅ−ｘ９−Ｖ／Ｌ（ここで、ｘ９は、Ｅ、Ｄ、Ｋ、またはＱである。）を含むエピトープを認識し、それに結合する抗体であり、他の好ましい態様において、抗体は、配列番号１−１１の配列のいずれか、または該配列の断片もしくは変異体もしくは相同体から選択される配列を含むか、またはそれに含まれるエピトープを認識し、結合する抗体から選択されて良い。
【０１０８】
好ましくは、エピトープは、ＮＣＡＭ、ＮＧＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４／５ポリペプチド上に位置する。
【０１０９】
用語“エピトープ”は、（その抗原の）抗体により認識される（それにより、免疫応答を引き起こす）、（抗原分子上の）原子の特定の群を意味する。用語“エピトープ”は、用語“抗原決定基”と同等である。エピトープには、連続的アミノ酸配列内のような近位に位置するか、または抗原のアミノ酸配列の離れた部位に位置するが、タンパク質の折りたたみのために互いに近づいている３個以上のアミノ酸残基、例えば４、５、６、７、８個のアミノ酸残基が含まれる。
【０１１０】
免疫グロブリンと称される血漿タンパク質のファミリーに属する抗体分子、その基本構成単位、免疫グロブリン折りたたみまたはドメインは、免疫系および他の生物学的認識系の多くの分子の様々な形態で用いられる。典型的な免疫グロブリンは、可変領域として知られる抗原結合領域および定常領域として知られる不変領域を含む、４個のポリペプチド鎖を有する。
【０１１１】
天然の抗体および免疫グロブリンは、通常、２個の同一の軽（Ｌ）鎖および２個の同一の重（Ｈ）鎖からなる、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１個の共有ジスルフィド結合により重鎖と結合するが、ジスルフィド結合の数は、異なる免疫グロブリンイソ型の重鎖により変わる。各重鎖および軽鎖はまた、一定間隔の鎖内ジスルフィド架橋を有する。各重鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、その後に多数の定常ドメインを有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＬ）を有し、他端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは、重鎖の第一の定常ドメインと整列し、そして軽鎖の可変ドメインは、重鎖の可変ドメインと整列する。特定のアミノ酸残基は、軽鎖および重鎖の可変ドメインの接続部分を形成すると考えられる（Novotny J, ＆ Haber E. Proc Natl Acad Sci U S A. 82（14）:4592−6, 1985）。
【０１１２】
免疫グロブリンを、それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、異なるクラスに割り当てることができる。少なくとも５個の免疫グロブリンの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭが存在し、これらのうちいくつかを、さらにサブクラス（イソ型）、例えばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３およびＩｇＧ−４；ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２に分けることができる。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ（α）、デルタ（δ）、イプシロン（ε）、ガンマ（γ）およびミュー（μ）と称される。抗体の軽鎖を、それらの定常ドメインのアミノ配列に基づき、カッパー（κ）およびラムダ（λ）と称される２個の明らかに異なるタイプのうち一方に割り当てることができる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造および三次元構造は、よく知られている。
【０１１３】
抗体の可変ドメインについて、本明細書中“可変”なる用語は、可変ドメインのある部分が、抗体間の配列において非常に異なるという事実を示す。可変ドメインは、それぞれの特定の抗体の、その特定の抗原に対する結合のため、および特異性を決定するためのものである。しかしながら、可変性は、抗体の可変ドメインに均一に分布されるわけではない。それは、軽鎖および重鎖可変ドメインの両方における高可変領域としても公知の相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される３区域に集合している。
【０１１４】
可変ドメインのより高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）と称される。天然の重鎖および軽鎖の可変ドメインは各々４個のＦＲ領域を含み、概してβシート構造によって、３個のＣＤＲにより接続され、それはループ状の接続を形成し、そして、いくつかの場合に、βシート構造の一部を形成する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域により近接近で結合され、そして他の鎖からのＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に貢献する。定常ドメインは、抗体と抗原との結合に直接関与しないが、抗体依存的細胞毒性における抗体の参加のような、様々なエフェクター機能を示す。
【０１１５】
従って、本発明において使用を予定される抗体は、免疫グロブリン全体、Ｆｖ、Ｆａｂ、および同様の断片のような抗体断片、可変ドメイン相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む一本鎖抗体などの形態を含む、任意の様々な形態であり得、それらは全て、本明細書中で用いられる広義の用語“抗体”に包含される。本発明は、抗体、ポリクローナルおよびモノクローナルの任意の特異性の使用を意図し、特定の抗原を認識し、それと免疫反応する抗体のみに限られない。好ましい態様において、下記の治療法およびスクリーニング法の両方に照らして、本発明の抗原またはエピトープに対して免疫特異性である抗体またはその断片を使用する。
【０１１６】
用語“抗体断片”は、全長の抗体の一部分、一般的には抗原結合領域または可変領域を示す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖ断片が含まれる。抗体のパパイン消化により、２個の同一の抗原結合断片であって、それぞれ単一の抗原結合部位を有するＦａｂ断片と称される断片、および残りの、すぐに結晶化するその能力のために称される“Ｆｃ”断片が得られる。ペプシン処理により、抗原と架橋形成し得る２個の抗原結合断片、および残りの他の断片（ｐＦｃ’と称される）を有するＦ（ａｂ’）２断片が得られる。さらなる断片には、抗体断片から形成される二重特異性抗体（diabody）、線形抗体、一本鎖抗体分子、および多特異的抗体が含まれ得る。本明細書で用いる、抗体についての“機能的断片”とは、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ）およびＦ（ａｂ’）２断片を示す。
【０１１７】
用語“抗体断片”は、本明細書中、用語“抗原結合断片”と互換的に用いられる。
【０１１８】
抗体断片は、約４個のアミノ酸、５個のアミノ酸、６個のアミノ酸、７個のアミノ酸、９個のアミノ酸、約１２個のアミノ酸、約１５個のアミノ酸、約１７個のアミノ酸、約１８個のアミノ酸、約２０個のアミノ酸、約２５個のアミノ酸、約３０個のアミノ酸またはそれ以上の程度と小さいかもしれない。一般的に、本発明の抗体断片は、配列番号１−１１として本明細書中に同定された配列のいずれかから選択されたペプチド配列、または該配列の断片を含むエピトープに特異的に結合する抗体に関連した類似の特性または免疫学的性質を有する限り、何らかの大きさの上限を有し得る。故に、本発明に関して、用語“抗体断片”は、用語“抗原結合断片”と同義である。
【０１１９】
抗体断片は、その抗原または受容体と選択的に結合するいくつかの能力を有する。いくつかのタイプの抗体断片を、下記に定義する：
（１）Ｆａｂは、抗体分子の一価の抗原結合断片を含む断片である。Ｆａｂ断片は、抗体全体を酵素パパインで消化して、無傷の軽鎖および１個の重鎖の一部が得られることにより産され得る。
（２）Ｆａｂ’は、抗体全体をペプシンで処理し、次いで還元し、無傷の軽鎖および重鎖の一部が得られることにより得られる抗体分子の断片である。抗体分子当たり、２個のＦａｂ’断片が得られる。
Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１個以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシル末端へのいくつかの残基の付加によりＦａｂ断片とは異なる。
【０１２０】
（３）（Ｆａｂ’）２は、抗体全体を、その後の還元なしに酵素ペプシンを用いて処理することにより得られる抗体断片である。
【０１２１】
（４）Ｆ（ａｂ’）２は、２個のジスルフィド結合により結合された２個のＦａｂ’断片の二量体である。
Ｆｖは、完全な抗原認識部位および結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、強力な非共有結合の、１個の重鎖および１個の軽鎖可変ドメインの二量体からなる（ＶＨ−ＶＬ二量体）。この構造中、それぞれの可変ドメインの３個のＣＤＲが相互作用し、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を決定する。まとめて、６個のＣＤＲが、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（または、抗原に特異的な３個のＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でも、結合部位全体より親和性は低いが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【０１２２】
（５）一本鎖抗体（“ＳＣＡ”）は、遺伝子的に融合した一本鎖分子として適するポリペプチドリンカーにより結合した、軽鎖の可変領域、重鎖の可変領域を含む遺伝子組み換え分子として定義される。かかる一本鎖抗体は、“一本鎖Ｆｖ”または“ｓＦｖ”抗体断片とも称される。一般的に、Ｆｖポリペプチドはさらに、ｓＦｖが、抗原結合のために所望の構造を形成するのを可能にする、ＶＨおよびＶＬドメイン間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの概要については、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies 113: 269−315 Rosenburg and Moore eds. Springer−Verlag, NY, 1994を参照のこと。
【０１２３】
用語“二重特異性抗体”は、２個の抗原結合部位を有する小さい抗体断片であって、同じポリペプチド鎖内に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結合した重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む断片（ＶＨ−ＶＬ）を示す。リンカーの使用により、同じ鎖上の２個のドメイン間は短く、対形成が不可能であり、そのドメインは、他の鎖の相補性ドメインと対形成し、そして２個の抗原結合部位を作成する。二重特異性抗体は、例えば、ＥＰ４０４，０９７；ＷＯ９３／１１１６１、およびHollinger et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 90: 6444−6448 （1993）により完全に記載される。
【０１２４】
本発明は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体の両方、本発明のエピトープを結合し得るその抗原結合断片および組換えタンパク質を意図する。
【０１２５】
ポリクローナル抗体の製造方法は、当業者に周知である。例えば、参照により本明細書中に包含される、Green et al. 1992. Production of Polyclonal Antisera, in：Immunochemical Protocols (Manson, ed.), pages 1−5 （Humana Press）；Coligan, et al., Production of Polyclonal Antisera in Rabbits, Rats Mice and Hamsters, in：Current Protocols in Immunology, section 2.4.1を参照のこと。
【０１２６】
モノクローナル抗体の製造方法は同様に、常套的である。例えば、Kohler ＆ Milstein, Nature, 256:495−7 （1975）；Coligan, et al., sections 2.5.1−2.6.7;および、Harlow, et al., in: Antibodies: A Laboratory Manual, page 726 ,Cold Spring Harbor Pub. （1988）を参照のこと。モノクローナル抗体は、様々なよく確立された技術によりハイブリドーマ培養から単離および精製され得る。かかる単離技術には、プロテインＡセファロースを用いた親和性クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、およびイオン交換クロマトグラフィーが含まれる。例えば、Coligan, et al., sections 2.7.1−2.7.12 and sections 2.9.1−2.9.3；Barnes, et al., Purification of Immunoglobulin G （IgG）. In: Methods in Molecular Biology, 1992, 10:79−104, Humana Press, NYを参照のこと。
【０１２７】
モノクローナル抗体のインビトロおよびインビボ操作法は、当業者によく知られている。例えば、本発明で使用されるべきモノクローナル抗体を、Kohler and Milstein, 1975, Nature 256, 495−7に最初に記載されたハイブリドーマ法により作製するか、または組換え法、例えばＵＳ４，８１６，５６７に記載の方法により作製することができる。本発明での使用のためのモノクローナル抗体はまた、Clackson et al., 1991, Nature 352: 624−628、ならびにMarks et al., 1991, J Mol Biol 222: 581−597に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離され得る。他の方法は、組換え手段によりモノクローナル抗体をヒト化し、ヒトに特異的かつ認識可能配列を含む抗体を作製することを含む。参考として、Holmes, et al., 1997, J Immunol 158:2192−2201およびVaswani, et al., 1998, Annals Allergy, Asthma ＆ Immunol 81:105−115を参照のこと。
【０１２８】
本明細書で用いる用語“モノクローナル抗体”は、実質的に同一な抗体の集団から得られる抗体、すなわち少量存在し得る天然に存在する変異体の可能性を除いて同一である集団を含む個々の抗体を示す。モノクローナル抗体は、高い特異性を単一の抗原部位に対して向けている。さらに、典型的に、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含む、常套的なポリクローナル抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられている。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、他の免疫グロブリンの混入なく、有利にハイブリドーマ培養により合成される。修飾語“モノクローナル”は、抗体の実質的に同一の集団から得られる抗体の特徴を示し、何らかの特定の方法による抗体の産生を要するものと解釈されるべきではない。
【０１２９】
本明細書中、モノクローナル抗体には特に、それらが所望の生物学的活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の種に由来するか、または特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、残りの鎖が、他の種に由来するか、または他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体、ならびにかかる抗体の断片の対応する配列と同一または相同である、“キメラ”抗体（免疫グロブリン）が含まれる（ＵＳ４，８１６，５６７）；Morrison et al., 1984, Proc Natl Acad Sci 81: 6851−6855。
【０１３０】
抗体断片の作製方法はまた、当技術分野で公知である（例えば、参照により本明細書中に包含されるHarlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, NY, 1988を参照のこと）。本発明の抗体断片は、抗体のタンパク質加水分解によるか、または断片をコードするＤＮＡの大腸菌での発現により製造され得る。抗体断片を、常套法の抗体全体のペプシンまたはパパイン消化により得ることができる。例えば、抗体断片を、ペプシンを用いて抗体を酵素的に切断し、Ｆ（ａｂ’）２と示される５Ｓ断片を得ることにより製造することができる。この断片をさらに、チオール還元剤を用いて切断し、要すれば、ジスルフィド結合の切断により生じるスルフヒドリル基のために基を保護して、３．５Ｓ Ｆａｂ’一価断片を産生する。あるいは、ペプシンを用いる酵素切断により、２個の一価Ｆａｂ’断片およびＦｃ断片が直接産生される。これらの方法は、例えばＵＳ４，０３６，９４５およびＵＳ４，３３１，６４７、ならびに本明細書中に包含される刊行物に記載される。これらの特許は、参照によりその全体を本明細書中に包含される。
【０１３１】
断片が、無傷の抗体により認識される抗原に結合する限り、重鎖の分離により一価の軽−重鎖断片を形成させ、さらに断片を切断するような、抗体を切断する他の方法、または他の酵素的、化学的、または遺伝的技術を、用いることもできる。例えば、Ｆｖ断片には、ＶＨおよびＶＬ鎖の結合が含まれる。この結合は、非共有であり得るか、または可変鎖は、分子間シスルフィド結合またはグルタルアルデヒドのような化学基による架橋により結合し得る。好ましくは、前記Ｆｖ断片には、ペプチドリンカーにより結合されたＶＨおよびＶＬ鎖が含まれる。これらの一本鎖抗原結合タンパク質（ｓＦＶ）は、オリゴヌクレオチドにより結合されたＶＨおよびＶＬドメインをコードするＤＮＡ配列を含む構造遺伝子を構築することにより調製される。構造遺伝子は、発現ベクター内に挿入され、それは次いで大腸菌のような宿主細胞に導入される。組換え宿主細胞は、２個のＶドメインをつなぐリンカーペプチドを有する。一本鎖ポリペプチドを合成する。ｓＦｖを製造するための方法は、例えばWhitlow, et al., 1991, In:  Methods: A Companion to Methods in Enzymology, 2:97；Bird et al., 1988, Science 242:423−426；US 4,946,778;および、Pack, et al., 1993, BioTechnology 11:1271−77に記載される。
【０１３２】
抗体断片の他の形態は、単一の相補性決定領域（ＣＤＲ）をコードするペプチドである。ＣＤＲペプチド（“最小認識単位”）はしばしば、抗原認識および結合に関与する。ＣＤＲペプチドを、興味のある抗体のＣＤＲをコード化する遺伝子をクローニングするか、または構築することにより得ることができる。そのような遺伝子を、例えばポリメラーゼ連鎖反応を用いて、抗体産生細胞のＲＮＡから可変領域を合成することにより調製する。例えば、Larrick, et al., Methods: a Companion to Methods in Enzymology, Vol. 2, page 106 （1991）を参照のこと。
【０１３３】
本発明は、ヒトおよびヒト化形態の非ヒト（例えばマウス）抗体を意図する。そのようなヒト化抗体は、エピトープ認識配列のような、非ヒト免疫グロブリン由来の最小配列を含む、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ７’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合サブ配列など）である。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、受容側の相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラットまたはウサギのような非ヒト種（供与側抗体）のＣＤＲからの残基により置換されるヒト免疫グロブリン（受容側抗体）である。本明細書に記載のエピトープ（複数可）を含む配列（複数可）のような、本発明の抗体（複数可）の最小配列（複数可）を含むヒト化抗体（複数可）は、本発明の好ましい態様の１つである。
【０１３４】
いくつかの例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、ヒト化抗体は、受容側抗体にも挿入ＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいて良い。これらの修飾は、抗体性能をさらに精緻化および最適化するように作製される。一般的に、ヒト化抗体には、少なくとも１個の、典型的には２個の可変ドメインの実質的に全てが含まれ得、ここで、全てまたは実質的に全てのＣＤＲ領域は、非ヒト免疫グロブリンのそれに相当し、そして全てまたは実質的に全てのＦＲ領域は、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のそれに相当する。ヒト化抗体は、最適にはまた、少なくとも一部分の免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、典型的にはヒト免疫グロブリンのそれを含み得る。さらに詳細には、Jones et al., 1986, Nature 321, 522−525；Reichmann et al., 1988, Nature 332, 323−329；Presta, 1992, Curr Op Struct Biol 2:593−596；Holmes et al., 1997, J Immunol 158:2192−2201 and Vaswani, et al., 1998, Annals Allergy, Asthma ＆ Immunol 81:105−115を参照のこと。
【０１３５】
抗体の作製は、例えば配列番号１−１１として同定される配列のような本発明のモチーフを抗原として含む、ＮＣＡＭ、ＮＧＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４／５の天然または組換え断片を用いて、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を作製するための当技術分野での任意の標準方法により達成することができる。かかる抗体を、配列番号１−１１のペプチド配列の変異体、相同体もしくは断片、または何らかの他の免疫原性ペプチド配列もしくはその免疫原性断片を用いて作製することができ、それは、下記の基準を満たす：
（ｉ）少なくとも６個のアミノ酸の連続的アミノ酸配列であること、そして
（ｉｉ）少なくとも１個の上記のアミノ酸モチーフを含むこと。
【０１３６】
抗体を、処置されるべき個体により、例えば本発明の免疫原性断片を該個体に投与することにより、インビボで産生することもできる。従って、本発明はさらに、上記の免疫原性断片を含むワクチンに関する。
【０１３７】
本発明はまた、本発明の抗体を産生するための方法であって、上記の免疫原性断片を提供する抗体を含む方法に関する。
【０１３８】
本発明は、１）ヒトＮＣＡＭおよび／またはニューロトロフィンおよび／またはＴｒｋ受容体の生物学的機能、特に細胞増殖、分化および生存に関係する機能、学習および記憶に関係する神経可塑性、および／または細胞運動を増強または軽減するような、調節することのできる抗体、２）ＮＧＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４／５のようなＮＣＡＭおよび／またはＴｒｋ受容体リガンドを認識し、特異的に結合し、そしてＮＣＡＭおよび／またはＴｒｋ受容体リガンドの機能を調節し得る抗体；ならびに、３）その生物学的活性を調節することなく、ＮＧＦ、ＮＴ−３またはＮＴ−４／５のようなＮＣＡＭおよび／またはＴｒｋ受容体リガンドを認識し、特異的に結合し得る抗体に関する。そのような抗体が、上記の免疫原性ペプチド配列を用いて産生されることが好ましい。
【０１３９】
本発明は、１）ニューロトロフィン、ＮＣＡＭおよび／またはＴｒｋ受容体の活性の調節を伴う治療適用のため；２）細胞分化、生存および運動、ならびに学習および記憶に関係する神経可塑性を含む細胞過程および生理学的過程を調節するため、３）診断目的のため、インビトロおよび／またはインビボでニューロトロフィン、ＮＣＡＭおよび／またはＴｒｋ受容体を検出および／または観測するため、４）研究目的のための上記の抗体の使用に関する。
【０１４０】
１つの態様において、本発明は、上記の抗体を含む医薬組成物に関する。
【０１４１】
５．薬剤
本発明は、ｉ）神経突起伸張を刺激すること；ｉｉ）細胞運動を調節すること；ｉｉ）神経細胞生存を刺激すること；ｉｉｉ）神経細胞分化を刺激すること；ｉｖ）記憶および学習に関係する神経可塑性を刺激すること；ｖ）Ｔｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体の活性を調節することの可能なペプチド配列および化合物を提供する。従って、前記化合物は、神経突起伸張を刺激するため、神経細胞生存を刺激するため、神経可塑性を刺激するため、神経細胞分化を刺激するため、Ｔｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体の活性を調節するためおよび細胞運動を調節するため、ならびに該刺激または該調節が必要とされる疾患および／または状態の処置のための薬剤の製造のために有用であり得る。いくつかの態様において、本発明のペプチド配列および化合物には、ＮＧＦ、ＮＴ−３およびＮＴ−４／５、および／またはＮＣＡＭのようなニューロトロフィン（neutrophins）の単離されたペプチド断片が含まれる。
【０１４２】
神経成長因子（ＮＧＦ）は、コリン作動性機能を刺激し、記憶を改善し、そして損傷、アミロイド過剰発現および老化の動物モデルにおけるコリン作動性変性を防止し、神経突起伸張および神経生存を刺激する（Tuszynski MH, et al. Nat Med. 2005 Jun;11（6）:551−5；Jakubowska−Dogru E, Gumusbas U Neurosci Lett. 2005 Jul 1;382（1−2）:45−50；Walz R, et al  Neurochem Res. 2005 Feb;30（2）:185−90；Hu Z et al. Neurobiol Dis. 2005 Feb;18（1）:184−92）。さらに、様々なＴｒｋ受容体の発現および活性レベルは、癌患者の生存と相関関係を有し（Schramm A et al. Cancer Lett. 2005 May 24, 出版前にPubMed Epubで公開）、そして癌細胞の侵入行動は、ＮＣＡＭ、Ｔｒｋ受容体およびＮＧＦの発現および活性の両方に依存する（Chen−Tsai CP et al Dermatol Surg. 2004 Jul;30（7）:1009−16）。
【０１４３】
ＮＣＡＭ機能は、様々な身体組織および臓器、特に神経系の多様な正常および病的状態について重要であることが示されている（Sandi C. Nat Rev Neurosci. 2004 Dec;5（12）:917−30；Kiryushko D et al. Ann N Y Acad Sci. 2004 Apr;1014:140−54；Gniadecki R et al. Arch Dermatol. 2004 Apr;140（4）:427−36；Berezin V, Bock E. J Mol Neurosci. 2004;22（1−2）:33−39）。
【０１４４】
従って、本発明のペプチド配列および／または化合物を、ニューロトロフィンもしくはニューロトロフィン受容体の機能、またはＮＣＡＭの機能が重要な役割を果たす状態または疾患の予防および／または処置のために用いることができる。
【０１４５】
従って、状態および疾患の下記の限定されない例は、本発明のペプチド配列および／または化合物の使用が、その処置または予防に有益な効果を有し得るものを意図し得る：
１）術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば卒中の結果起こる虚血後損傷、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、多発脳梗塞性認知症のような認知症、硬化症、糖尿病に関係する神経変性、概日時計または神経筋伝達に影響する疾患のような、またはそれに関係する中枢および末梢神経系の疾患および状態、および／または
【０１４６】
２）思考および／または気分障害、双極性障害（ＢＰＤ）、遺伝的に関係する単極性感情障害を含む精神神経疾患、妄想性障害、パラフレニー、妄想性精神病、統合失調症、統合失調症性障害、統合失調性感情障害、統合失調性双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、心因性精神病、緊張病、周期性双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、循環型精神病、統合失調症性人格障害、妄想性人格障害、双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害関連感情障害、ならびに単極性感情障害のサブタイプのような精神疾患および障害、および／または
【０１４７】
３）臓器移植後のような、または遺伝性もしくは外傷性萎縮性筋疾患のような神経筋接合部の機能障害と関係する状態を含む筋肉の疾患または状態；および／または
４）生殖腺の、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病のような膵臓の、ネフローゼのような腎臓の、ならびに心臓、肝臓および腸の変性状態のような様々な臓器の疾患または状態、および／または
５）学習能力障害、ならびに／または短期および／もしくは長期記憶障害。
【０１４８】
特に、本発明は、正常、変性または損傷ＮＣＡＭ、Ｔｒｋ受容体および／またはニューロトロフィン提示細胞の処置に関する。
【０１４９】
本発明の化合物は、細胞運動を調節すること、すなわち細胞運動を阻害することも可能である。故に、該化合物はまた、本発明により細胞運動を調節するため、好ましくは細胞運動を阻害することに関する。
【０１５０】
従って、この観点に置いて、本発明の化合物および薬剤を、
１）癌
２）炎症性疾患
３）アレルギー状態、および／または
４）血管新生
の予防および／または処置のために使用することができる。
【０１５１】
本発明は、何らかのタイプの血管新生を必要とする固形腫瘍および何らかの悪性癌である癌に関する。特に、本発明は、神経系の癌に関する。
【０１５２】
本発明のペプチド配列および／または化合物を、アルコール摂取による身体損傷を有する個体を処置するため、およびプリオン病を有する個体を処置するために使用することもできる。
【０１５３】
従って、それは、薬剤を製造するためのペプチド配列、化合物および／または抗体の使用を目的とする。本発明の薬剤を、神経突起伸張を刺激すること、神経細胞生存を刺激すること、神経可塑性を刺激すること、神経細胞分化を刺激すること、Ｔｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体の活性を調節すること、および細胞運動を調節することが、処置のために有益である何らかの状態または疾患の処置に用いることができる。状態または疾患の非限定的例は、上記に記載される。
【０１５４】
本発明の薬剤には、１個以上の上記の単離されたペプチド配列、化合物または抗体の有効量が含まれていてよいか、またはそれは、１個以上の上記の単離されたペプチド配列、化合物または抗体の有効量、および薬学的に許容される添加剤を含む医薬組成物として製剤され得る。いくつかの態様において、薬剤または医薬組成物には、１個以上の上記の単離されたペプチド配列、化合物および／または抗体の有効量の組合せが含まれ得る。
【０１５５】
従って、他の局面において、本発明は、少なくとも１個の本発明の単離されたペプチド配列、化合物および／または抗体を含む医薬組成物に関する。
【０１５６】
本発明のさらなる局面は、１個以上の本発明の単離されたペプチド配列、化合物または抗体の有効量、または本発明の医薬組成物と１個以上の薬学的に許容される添加剤または担体を混合することを含む、医薬組成物を製造する方法である。
【０１５７】
上記の方法の１つの態様において、前記化合物を、人工神経ガイド（prosthetic nerve guide）である、人工補助装置（prosthetic device）と併用する。故に、さらなる局面において、本発明は、１個以上の上記の化合物または医薬組成物を含むことを特徴とする人工神経ガイドに関する。神経ガイドは、当技術分野で公知である。
【０１５８】
本発明はまた、本明細書中に記載のいずれかの疾患および状態の処置または予防のための、本発明の化合物を含む医薬組成物の使用に関する。
【０１５９】
いくつかの態様において、本発明は、本発明のアミノ酸モチーフを含むエピトープを認識し得る抗体を含む医薬組成物に関する。そのような医薬組成物はまた、補明細書に記載の状態および疾患の処置に有用であり得る。
【０１６０】
本発明の薬剤および／または医薬組成物を、経口、経皮、筋肉内、静脈内、頭蓋内、髄腔内、脳室内、鼻腔内または肺投与用に好適に製剤し得る。
【０１６１】
本発明の化合物を基にした薬剤および組成物の製剤開発における戦略は、一般的に、何らかの他のタンパク質ベース薬物のための製剤戦略と一致する。可能性のある問題およびこれらの問題を克服するために必要なガイダンスは、いくつかのテキスト、例えば“Therapeutic Peptides and Protein Formulation. Processing and Delivery Systems”, Ed. A.K. Banga, Technomic Publishing AG, Basel, 1995で扱われている。
【０１６２】
注射剤は、通常、液体溶液もしくは懸濁液のどちらか、または注射前に液体溶液もしくは懸濁液とするのに適する固体形態として製造される。前記製剤はまた、乳化され得る。活性成分はしばしば、薬学的に許容され、活性成分と混合可能な賦形剤と混合される。適する賦形剤は、例えば水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなど、およびそれらの組み合わせである。さらに、要すれば、前記製剤には、少量の、湿潤剤または乳化剤のような補助剤、ｐＨ緩衝剤または製剤の有効性もしくは送達を増大するものが含まれていて良い。
【０１６３】
本発明の化合物の製剤を、当業者に公知の技術により製造することができる。前記製剤には、薬学的に許容される担体およびミクロスフェア、リポソーム、マイクロカプセル、ナノ粒子などを含む賦形剤が含まれていて良い。
【０１６４】
製剤は、所望により活性成分が、その効果を発揮する部位に、注射により好適に投与され得る。他の投与形態に適するさらなる製剤には、坐剤、鼻腔投与剤、肺投与剤、およびいくつかの場合に、経口製剤が含まれる。坐剤に関して、慣用の結合剤および担体には、ポリアルキレングリコールまたはトリグリセリドが含まれる。かかる坐剤は、活性成分（複数可）を０．５％から１０％、好ましくは１−２％の範囲で含む混合物から形成され得る。経口製剤には、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ナトリウムサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような、通常用いられる賦形剤が含まれる。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、持続放出製剤または粉末の形態をとり、一般的に、１０−９５％、好ましくは２５−７０％の活性成分（複数可）を含む。
【０１６５】
他の製剤は、経鼻および肺投与に適するような、例えば吸入剤およびエアロゾルである。
【０１６６】
活性化合物は、中性型または塩形として製剤化され得る。薬学的に許容される塩には、酸付加塩（ペプチド化合物の遊離アミノ基と共に形成される）が含まれ、それらは、例えば塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と共に形成される。遊離カルボキシル基と共に形成される塩はまた、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄（ＩＩＩ）のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどのような有機塩基からも誘導され得る。
【０１６７】
製剤は、投与量製剤に適合する方法で、治療的有効量であろう量で投与される。投与される量は、例えば対象の体重年齢を含む処置されるべき対象、処置されるべき疾患および疾患の段階に依存する。適する投与量範囲は、体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから５０００μｇの好ましい範囲で、１回の投与につき、体重１ｋｇ当たり、通常数百μｇ程度の活性成分である。化合物の単量体形態を用いるとき、適する投与量は、しばしば、体重１ｋｇ当たり０．１μｇから５０００μｇの範囲、例えば体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから３０００μｇの範囲、とりわけ体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから１０００μｇの範囲である。化合物の多量体形態を用いるとき、適する投与量は、しばしば、体重１ｋｇ当たり０．１μｇから１０００μｇの範囲、例えば体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから７５０μｇの範囲、とりわけ体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから５００μｇの範囲、例えば体重１ｋｇ当たり約０．１μｇから２５０μｇの範囲である。特に、経鼻的に投与するとき、他の経路で投与されるときよりも少量の投与量が用いられる。投与は一度に行われるか、またはその後の投与が続いても良い。投与量は、投与経路にも依存し、処置されるべき対象の年齢および体重により変わるだろう。多量体形態の好ましい投与量は、体重７０ｋｇ当たり１ｍｇから７０ｍｇの間であり得る
【０１６８】
いくつかの適応症に関して、局所または実質的な局所適用が好ましい。
他の適用に関して、鼻内投与が好ましい。
【０１６９】
本発明の化合物のいくつかは、十分に活性であるが、他のいくつかに関して、その効果は、前記製剤が、薬学的に許容される添加剤および／または担体をさらに含むとき、増強され得る。かかる添加剤および担体は、当技術分野で公知である。いくつかの場合に、それは、その標的への活性成分の送達を促進する化合物を含むことが有利であり得る。
【０１７０】
多くの例において、製剤の多数回投与が必要とされる。投与は、脳室内注入のような持続注入、または１日数回を毎日、一週間に数回を毎週などのような多数回投与であり得る。薬剤の投与を、個体が細胞死を誘導し得る因子（複数可）にさらされる前またはさらされた直後に開始するのが好ましい。好ましくは、前記薬剤の投与を、因子の発現から５時間以内のような、因子の発現から８時間以内に投与する。化合物の多くは、長期の効果を示し、それにより化合物の投与を、１週間または２週間のような長い間隔で行うことができる。
【０１７１】
神経ガイドにおける使用に関して、前記投与は、活性化合物（複数可）の制御放出に基づき連続してか、または少量ずつであり得る。さらに、前駆体を、放出速度および／または放出部位を制御するために用いることができる。他の種類の移植ならびに経口投与は、同様に、制御放出および／または前駆体の使用に基づいていて良い。
【０１７２】
６．処置
本発明のペプチド配列、それを含む化合物（複数可）、抗体、それを含む医薬（複数可）、および／またはそれを含む医薬組成物（複数可）の使用による処置は、１つの態様において、分化の誘導、細胞増殖および運動の調節、再生、生存および神経可塑性の刺激に有用である。
【０１７３】
従って、処置には、術後神経損傷、例えば脊髄損傷の結果起こる外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、例えば卒中の結果起こる虚血後損傷、多発脳梗塞性認知症、多発性硬化症、糖尿病と関係する神経変性、神経筋変性、統合失調症、アルツハイマー病、パーキンソン病またはハンチントン病のような中枢および末梢神経系の疾患または状態の処置および／または予防が含まれる。
【０１７４】
また、遺伝性または外傷性萎縮性筋疾患のような神経筋接合部の機能障害を有する状態を含む筋肉の疾患または状態に関して；または、生殖腺の、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病のような膵臓の、ネフローゼのような腎臓の変性状態のような様々な臓器の疾患または状態の処置のために、本発明の化合物を、分化の誘導、増殖の調節、再生、神経可塑性の刺激のために使用できる。
【０１７５】
本発明はさらに、癌の処置における化合物および／または医薬組成物の使用に関する。癌細胞の運動制御は、癌細胞を含む腫瘍の増殖、浸潤、血管新生およびその拡大に重要である。故に、前記化合物を、癌の予防および治療において後期過程を阻害するための薬剤として有利に用いることができる。
【０１７６】
さらなる態様において、本発明は、短期および／または長期記憶、および／または学習能力を刺激するための化合物、およびそれを含む医薬および／またはそれを含む医薬組成物の使用に関する。促進された神経突起伸張および新しい神経結合の確立は、記憶の固定メカニズムの一部分である。ペプチド配列およびそれを含む化合物は、長期記憶および短期記憶の両方を刺激するために有用であり得る。
【０１７７】
本発明の化合物、薬剤および／または医薬組成物を、例えば悪性新生物、良性新生物、上皮内癌腫および不確定な新生物（neoplasms of uncertain behavior）のような新生物、糖尿病のような内分泌腺の疾患、老年性および初老性器質性精神状態のような精神病、アルコール精神病、薬物性精神病、一時的器質性精神状態、アルツハイマー病、脳類脂質沈着症、てんかん、進行性麻痺[梅毒]、肝レンズ核変性症、ハンチントン舞踏病、クロイツフェルト・ヤコブ病、多発性硬化症、脳のピック病、梅毒、統合失調症、情動精神病、神経症、性格神経症、器質脳症候群に関係する非精神病性人格障害、妄想性人格障害、狂信的人格障害（fanatic personality）、妄想性人格（障害）、妄想性（paranoid traits）、性的倒錯および障害を含む人格障害、知的障害、神経系および感覚器官の疾患、認知異常、髄膜炎のような中枢神経系の炎症性疾患、脳炎、アルツハイマー病のような脳変性、ピック病、脳の老年性変性、交通性水頭症、閉塞性水頭症、他の錐体外路疾患および異常行動疾患を含むパーキンソン病、脊髄小脳疾患、小脳性運動失調、マリー病、サンガー−ブラウン病、ミオクローヌス性小脳性共同運動障害、脊髄性筋萎縮症、家族性、若年性、成人脊髄性筋萎縮症のような原発性小脳変性、運動ニューロン疾患、筋萎縮性側索硬化症、運動ニューロン疾患、進行性球麻痺、偽球麻痺、原発性側索硬化症、他の前角細胞疾患、前角細胞疾患、脊髄の不特定の他の疾患、脊髄空洞症および延髄空洞症、血管性脊髄症、脊髄の急性梗塞（塞栓性）（非塞栓性）、脊髄の動脈血栓症、脊髄の浮腫、他に分類される疾患における亜急性壊死脊髄症、亜急性脊髄連合変性症、脊髄症、薬剤誘発性、放射線誘発性脊髄炎、自律神経系の疾患、末梢自律神経系、交感神経系、副交感神経系、または自律神経系（vegetative system）の疾患、家族性自律神経失調症[ライリ−デイ症候群]、特発性末梢自律神経症、頸動脈洞性失神または症候群、頸部交感神経性ジストロフィーまたは麻痺、他に分類される障害における末梢性自律神経障害、アミロイド症、末梢神経系の疾患、上腕神経叢病変、頸肋症候群、肋骨鎖骨症候群、前斜角筋症候群、胸郭出口症候群、上腕神経炎または神経根炎（新生児におけるものを含む）、急性感染性多発神経炎を含む炎症性および中毒性神経障害、ギランバレー症候群、感染後の多発性神経炎、膠原血管疾患における多発性神経障害、眼の多重構造に影響する疾患、化膿性内眼球炎、耳および乳様突起の疾患、慢性リウマチ性心疾患、虚血性心疾患、不整脈、肺系の疾患、神経系を含む、新生児の臓器および軟組織の異常、陣痛および出産における麻酔または他の鎮静剤の投与の合併症、感染を含む皮膚における疾患、不十分な循環の問題、術後を含む損傷、圧迫性創傷（crushing injury）、火傷、神経の分裂を含む神経および脊髄損傷、連続的損傷（lesion in continuity）（開放創を有するかまたは有しない）、外傷性神経腫（開放創を有するかまたは有しない）、外傷性一過性麻痺（開放創を有するかまたは有しない）、医療処置中の偶発的穿刺または裂傷、視神経および神覚経路損傷、視神経損傷、第二脳神経損傷、視交叉損傷、視覚経路損傷、視覚野損傷、不特定の失明（unspecified blindness）、他の脳神経の損傷、他のおよび不特定の神経の損��、薬物、薬剤および生物学的物質の中毒、遺伝性または外傷性萎縮性筋疾患のような臨床状態の処置において；または、生殖腺の、Ｉ型およびＩＩ型糖尿病のような膵臓の、ネフローゼのような腎臓の変性状態のような様々な臓器の疾患または状態、スクレイピー、クロイツフェルト・ヤコブ病、ゲルストマン・ストロイスラー・シャインカー病（ＧＳＳ）の処置のために使用できる。
【０１７８】
本発明によれば、上記の状態および徴候の処置および／または予防の方法は、本発明のペプチド配列および／もしくは化合物、ならびに／または抗体および／もしくは薬剤、ならびに／または医薬組成物の治療的有効量を、必要とする個体に投与する工程を含む。
【実施例】
【０１７９】
７．実施例
実施例１．ペプチド配列の合成
ペプチドを、リンクアミドリンカー（ｐ−（Ｒ，Ｓ）−α−（１−（９Ｈ−フルオレン−９−イル）−メトキシホルムアミド）−２，４−ジメトキシベンジル）−フェノキシ酢酸（Novabiochem））を備えるＴｅｎｔａＧｅｌ樹脂上で、Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（３当量）を用いて合成する。カップリングを、手動のマルチカラム装置中で、ＴＢＴＵ（３当量）、ＨＯＢｔ（３当量）およびＤＩＥＡ（４．５当量）を用いて６０分以上行う。Ｆｍｏｃを、ＤＭＦ中２０％ピペリジンを用いて、１０分間脱保護する。ペプチドのデンドリマーの合成を、Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨ（Novabiochem）とリンカー樹脂をカップリングし、次いでＦｍｏｃ基のＦｍｏｃ脱保護を行い、さらにＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｆｍｏｃ）−ＯＨのカップリングを行うことにより達成する。Ｆｍｏｃ脱保護後、ペプチドの合成を、単量体ペプチドについて上記の通りに行う。ペプチジル樹脂を、９０％ＴＦＡ、５％Ｈ２Ｏ、３％ＥＤＴ、２％チオアニソールを用いて脱保護し、ジエニルエーテル中で沈殿させ、ジエチルエーテル中で３回洗浄し、５％ＡｃＯＨ中に溶解させ、そして凍結乾燥させる。アミノ酸分析を、WatersのｐｉｃｏｔａｇおよびＷＩＳＰ７１２とポンプで接続されたＷａｔｅｒｓ５０１を用いて行う。Ｗａｔｅｒｓ９９６を備えるＷａｔｅｒｓ６００Ｅフォトダイオードアレイ検出器を、Ｃ１８カラム（Delta−Pak 100Å 15um, Millipore）の分析用および分取用ＨＰＬＣのために用いる。Ｍａｌｄｉ−ＭＳを、Fisions InstrumentのＶＧ ＴＯＦ Ｓｐｅｃ Ｅで行うことができる。ペプチドは、ＨＰＬＣにより概算された少なくとも９５％の純度である。
【０１８０】
実施例２．ＮＣＡＭ ＨＢＰによる神経突起伸張の刺激
ＮＣＡＭを発現するかまたは発現しない線維芽細胞および初代培養ＣＧＮの共培養
ＮＣＡＭを発現するかまたは発現しない遺伝子組み換えされた線維芽細胞（マウス線維芽細胞様Ｌ細胞）を、８ウェルのＬａｂＴｅｋ組織培養チャンバースライド（Nunc, Roskilde, Denmark）中に、７×１０４細胞／ウェルの密度で播き、１０％ＨＳ、１００Ｕ／ｍｌペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ中、３７℃および５％ＣＯ２に維持する。播種２４時間後、培地を除去し、そしてＣＧＮ（１０４細胞／ウェル）を、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１％ｇｌｕｔａｍａｘを含み、かつＢ２７を添加されたＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地中、単層のＮＣＡＭを発現するかまたは発現しない線維芽細胞上に播き、２４時間共培養にて増殖させ、その後、神経突起伸張を測定する。ＣＧＮを、Ronn, L.C., Doherty, P., Holm, A., Berezin, V., Bock, E. (2000). J Neurochem. 75(2):665−71に記載の通りに生後３−４日のラットから調製する。
【０１８１】
ＮＣＡＭ（KGRDVILKKDVRFI）（配列番号１）（ＩｇＩＩ ＮＣＡＭ（SwissProt P13596）のアミノ酸１５４−１６７）のヘパリン結合ペプチド（ＨＢＰ）の効果を評価する。ＣＧＮを、異なる濃度のＨＢＰまたはＬｙｓ−１６１およびＰｈｅ−１６６（ＨＢＰ配列の残基に対応する）が、ＡｌａおよびＶａｌにそれぞれ置き換わっているペプチドＭ（KGRDVILAKDVRVI）（配列番号２）の存在下、ＮＣＡＭを発現するかまたは発現しない線維芽細胞上に播く。図１から、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞は、対照のＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞と比較して、ＣＧＮの神経突起伸張を顕著に促進し、そしてＨＢＰは、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞ならびにＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞上で増殖するＣＧＮの神経突起伸張を濃度依存的に増大することが示される。対照的に、ペプチドＭは、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞上で増殖するＣＧＮの神経突起伸張応答に影響を与えないが、ＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞上で増殖するＣＧＮの神経突起伸張を刺激する。
【０１８２】
図２から、対照の線維芽細胞上で増殖するＣＧＮにおけるＨＢＰの神経突起伸張作用は、ＳＵ５４０２、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の阻害剤での処理により阻害されず、そしてＣＧＮとＮＣＡＭを発現する線維芽細胞の共培養におけるＮＣＡＭにより仲介される神経突起伸張は、部分的にしか阻害されないが、ＳＵ５４０２は、ＨＢＰの不存在下でＮＣＡＭにより仲介される神経突起伸張を阻害することが示される。このことは、ＨＢＰにより誘導される神経突起伸張は、少なくとも２個の作用機序に依存することを示す：１．トランスＮＣＡＭ同種相互作用が関係するとき、ＮＣＡＭ−ＦＧＦＲシグナル伝達の活性化に依存する、および２．トランスＮＣＡＭ同種相互作用がないとき、ＦＧＦＲシグナル伝達に依存しない。
【０１８３】
単一ＣＧＮニューロンの初代培養
初代小脳顆粒細胞（ＣＧＮ）を、Ronn, L.C., Doherty, P., Holm, A., Berezin, V., Bock, E. (2000). J Neurochem. 75(2):665−71に記載の通りに生後３−４日のラットから調製する。解離した小脳細胞を、２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１％ｇｌｕｔａｍａｘを含み、Ｂ２７（全てGibco BRLから購入）を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地中、３７℃および５％ＣＯ２にて増殖させる。ペプチドの効果を試験するため、ＣＧＮを、Ｐｅｒｍａｎｏｘプラスチック（Nunc）の増殖表面を備える、８ウェルのＬａｂＴｅｃｈ組織チャンバースライド中に、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１％ｇｌｕｔａｍａｘを含み、Ｂ２７を添加したＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地中、１０４細胞／ウェルの密度で播く。ヘパリナーゼＩＩＩ（１Ｕ／ｍｌ）で処理されるとき、その酵素を、プレーティング後直ぐに培養培地に添加する。ＣＧＮを、異なる濃度（１μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、および２０μｇ／ｍｌ）のペプチドを添加する１時間前に、その酵素で処理する。培養２４時間後、細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）に対するマウス一次抗体（１：２００）（Caltag Laboratories, USA）（ＰＣ１２−Ｅ２細胞）またはＧＡＰ−４３（１：１０００）（Chemicon, USA）（ＣＧＮ）、ならびにマウスＩｇＧに対するＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ二次抗体（１：１０００）（Molecular Probes, Netherlands）で免疫染色し、そして神経突起の長さを、上記の通り立体的方法により測定する（Ronn, L. C., Ralets, I., Hartz, B. P., Bech, M., Berezin, A., Berezin, V., Moeller, A., Bock, E （2000）. J Neurosci Methods. 100（1−2）, 25−32）。
【０１８４】
図３は、ヘパラン硫酸を、主に二糖類に特異的に切断することが知られている酵素であるヘパリナーゼＩＩＩの存在下または不存在下で、培養中に増殖した単一の初代培養ＣＧＮに対するＮＣＡＭ ＨＢＰ（配列番号１）の効果を示す。組織培養プラスチック上に固定されたＨＢＰは、５μｇ／ｍｌのコーティング濃度にて、濃度依存的方法でＣＧＮの神経突起伸張に６８０％の最大効果をもたらし得る。ペプチドＭは、５μｇ／ｍｌのコーティング濃度にて４００％の最大効果を有した。ヘパリナーゼＩＩＩ処理は、ＨＢＰの効果を減少させるが、Ｍペプチドは減少させない。これらの結果は、神経突起伸張を刺激するＮＣＡＭ ＨＢＰの活性が、２個の標的、ヘパラン硫酸感受性およびヘパラン硫酸非感受性標的の共同作用に依存することを示唆する。
【０１８５】
図４は、ヘパリナーゼＩＩＩの存在下および不存在下における、ペプチド：ＨＢＰ（KGRDVILKKDVRFI）（配列番号１）、ペプチドＭ（KGRDVILAKDVRVI）（配列番号２）、ペプチドＭ１ｎ（KGRDVILNNDVRFI）（配列番号３）、およびペプチドＭ３ｎ（KGRDVILNNQVRFI)（配列番号４）の神経突起伸張効果を示す。全てのペプチドは、処理ニューロンの４−７倍長い軸索長に反映される非常に強い神経突起伸張活性を有する。ＮＣＡＭ ＨＢＰ（配列番号１）のヘパリン結合活性は、ペプチドによる神経突起伸張の刺激の必須条件ではないが、配列の神経突起伸張の可能性は、ヘパラン硫酸の存在下でより強力である。
【０１８６】
実施例３．ＮＣＡＭ ＨＢＰによる線維芽細胞の運動調節
細胞運動へのペプチドの効果を評価するために、コンフルエントのＮＣＡＭを発現するかまたは発現しない線維芽細胞培養を、修飾Ｐｕｃｋの食塩水（Gibco BRL）中、０．５ｍｇ／ｍｌのトリプシンおよび０．７５ｍＭ ＥＤＴＡを用いて採取し、６ウェルの組織培養プレート（Ｎｕｎｃ）に４×１０３細胞／ｃｍ２の密度で播き、２４時間、３７℃および５％ＣＯ２にて増殖させる。
【０１８７】
無作為な細胞運動を、既述（Walmod, et al. (1998). Cell Motil Cytoskeleton. 40(3), 220−37）のとおり、低速度ビデオ撮影（time−lapse video−recording）およびイメージ分析の使用により評価した。簡単には、接着テープで密封された組織培養ディッシュを、Ｎｉｋｏｎ Ｄｉａｐｈｏｔ ３００倒立顕微鏡（Nikon, Denmark）に備え付けられた温度調節ステージ上に置く（Lincam Scientific Instruments Ltd., UK）。顕微鏡ステージの周りに設置されたプレキシガラスインキュベーターの内部温度を、温度調節用加熱ファン（DFA, Denmark）を用いて３７℃に維持する。顕微鏡に備え付けられたモーター駆動ステージは、多くの（５０−１００）異なる顕微鏡視野からの同時記録を可能にする。生細胞のビデオ撮影は、顕微鏡に接続されたモノクロＣＣＤビデオカメラ（Burle, Lancaster, PA）を用いて行う。自動７６８×５７６ピクセルイメージ取得および保存を、ソフトウェアＰＲＩＭＡ（Protein Laboratory, Copenhagen, Denmark）を用いて、１５分間隔で４時間、１０×対物レンズを用いて位相差オプティクスで行う。
【０１８８】
細胞運動および形態の評価を、イメージ処理用ソフトウェアＰＲＩＭＡを用いて行う。個々の細胞の位置を、核の中心を手動でマークすることにより決定する。単一細胞の軌跡を、異なる時間点での核の中心の座標列として定義する。平均二乗細胞スピード（Ｓτ）、拡散速度（Ｒ）、および移動指数（ＬＩ）のパラメータを、下記の通り、Walmod, et al. (2000) (Methods Mol. Biology. 161, 59−83）に従い決定する。
【０１８９】
細胞運動の分析
細胞の移動は、細胞の最初および最後の位置に対応する２点間のユークリッド距離である。細胞の位置決定を、連続的観察間の一定期間で行った。所定時間（ｔｉ）の観察の後、細胞集団の平均二乗細胞移動を、下記の通りに計算した：
【数１】
2008503596.tif 000002
〔式中、ｉは、観察数（ｉ＝０、１、２、…ｋ）であり、ｋは、全観察数−１であり、ｔｉは、観察開始時間（ｔ０）と観察数ｉの時間間隔であり（ｔｉ＝ｉ×τ）、ｘｍ（ｔｉ）およびｙｍ（ｔｉ）は、時間点ｔｉでの細胞数ｍの座標であり、そしてＮは、全細胞数である。〕。拡散速度Ｒは、時間に対して平均二乗移動＜ｄ２＞をプロットし、次いで下記方程式に曲線の当てはめを行うことにより概算した。
【数２】
2008503596.tif 000003
〔式中、Ｐは、方向性の持続時間である（２３）。〕。平均細胞速度Ｓτを、時間間隔τに対する平均細胞移動の速度（＜ｄτ＞）の比として計算した。これを下記の方程式により行った：
【数３】
2008503596.tif 000004
【０１９０】
平均細胞路長＜Ｌ＞を、観察の一定期間での細胞集団の試料について、下記の通りに計算した：
【数４】
2008503596.tif 000005
移動指数ＬＩを、平均細胞移動（＜ｄ＞）と平均細胞路長の比として計算した：
【数５】
2008503596.tif 000006
【０１９１】
ＬＩを、細胞の方向持続性（directional persistence）の測定として用いた。完全に直線的に移動する細胞は、ＬＩ＝１を有するが、低い方向持続性は、より低いＬＩ値となるだろう。無作為に移動する細胞に関して、ＬＩは、単一細胞の移動方向における有意な変化間の平均時間を反映して、方向の持続時間（Ｐ）、パラメータに対して統計的に有意な相関関係を示すことが証明されている。
【０１９２】
図５から、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞は、ＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞と比較して、ＮＣＡＭ陽性のより早い線維芽細胞の拡散速度（Ｒ）に反映される通り、対照線維芽細胞より大分早く移動する（２７５％）ことが示される。ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞および対照線維芽細胞の両方をＨＢＰで処理することにより、Ｒ、Ｓτ、およびＬＩの顕著な減少に反映される通り、細胞運動の明確な阻害がもたらされる。ペプチドＭ（配列番号２）は、ＨＢＰの効果と同様に、線維芽細胞の運動に阻害効果を有する。これらの結果は、ＨＢＰが、ＮＣＡＭ発現に依存せず、さらに場合によりヘパリン結合に依存せず線維芽細胞運動を阻害することを示す。後者は、ＮＣＡＭ ＨＢＰの神経突起伸張を刺激する活性が、ヘパラン硫酸非感受性成分を含むという示唆を支持する。
【０１９３】
実施例４．本発明のペプチド配列の分析
図６は、本発明のペプチド配列（配列番号１−７に同定される）および当技術分野で記載されているＮＣＡＭ ＨＢＤの断片の比較分析の結果を示す。この図から、１）本発明のペプチド断片、すなわちＨＢＰ、Ｍ、Ｍ１ｎ、Ｍ３ｎ、Ｍ４、Ｍ５およびＭ６は、神経突起伸張の非常に可能性のある刺激剤であるが（インビトロでのそのペプチドを用いたニューロンの処置が、対照（未処理）ニューロンと比較して神経突起伸張の４００％以上の刺激をもたらす）、一方、当技術分野で公知のＮＣＡＭ ＨＢＤ断片は、遙かに可能性が少ない（報告された刺激が、５０％未満である）ことが明らかである。興味深いことに、ＮＣＡＭ ＨＢＰの生物学的活性に重要であることが報告されているアミノ酸残基の変異は、神経突起伸張および細胞運動を刺激するようなそれらの生物学的活性に関与するペプチド配列において、他の構造が存在することを示す変異体ペプチドの活性に影響されない。本発明のＮＣＡＭ ＨＢＤの１４アミノ酸ペプチド断片のアミノ配列と、ＵＳ２００３／０１１９１８６の１４アミノ酸長のペプチドの比較は、断片の配列とペプチドの配列の実質的な相違を明らかにする。ペプチドは、Ｎ末端上に２個のさらなる負電荷アミノ酸残基を有し、かつＣ末端上の２個の疎水性残基を欠く。神経突起伸張に刺激効果を有することが報告されている他の配列（Kallapur et al., 1992）（図６を参照のこと）は、１８アミノ酸長であり、Ｃ末端疎水性残基およびさらなる塩基性残基の両方を含む。前記配列は、本発明の配列よりも刺激剤としての効果が低い。
【０１９４】
上記の分析および神経細胞分化および神経突起伸張のよく知られている主要な刺激剤であるニューロトロフィンの効果と同程度の神経突起伸張への前記ペプチド配列の刺激効果閾値を説明するため、本発明者らは、本発明のペプチドの配列とニューロトロフィンの配列、特にＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４／５およびＢＤＮＦの配列を比較し、それにより新規ニューロトロフィン受容体のＴｒｋ結合モチーフを同定した。
【０１９５】
ニューロトロフィンは、２個のタイプの受容体：ｐ７５ＮＴＲ受容体（その活性化が、神経細胞アポトーシスの誘導に関係する。）、およびＴｒｋファミリーの受容体（その活性化が、神経突起伸張の刺激に関係する。）に結合し、活性化する。驚くべき事に、本発明のペプチドの配列は、ＮＧＦと受容体ｐ７５ＮＴＲの結合に不可欠であることが報告されている（Williams et al, J Biol Chem 280:5862−69, 2005；Ibanez et al., Cell 69:329−341,1992；He and Garcia, Science 304:870−875, 2004）アミノ酸モチーフＴＤＩＫＧＫＥを含むタンパク質のβ−ヘアピンループ１中に位置するＮＧＦ断片の配列と非常に相同性を有することが明らかになったが、本発明のペプチド配列には、Ｔｒｋ受容体結合および活性化に重要であることが報告されているアミノ酸モチーフであるＲＧＥ（Williams et al, J Biol Chem 280:5862−69, 2005；ＷＯ２００５０２５５１４）は含まれない。
【０１９６】
しかしながら、本発明者らは、ＨＢＰペプチドとＴｒｋ Ｂ受容体の直接結合を本明細書中に示し、そして上記に詳述する新規Ｔｒｋ受容体結合アミノ酸モチーフについて特許請求する。本発明にて開示されるアミノ酸モチーフは、本発明のペプチド配列の神経突起伸張活性に不可欠なそれらのアミノ酸残基を示す。従って、重要なＣ末端疎水性残基を欠くＵＳ２００３／０１１９１８６のＮＣＡＭ ＨＢＤペプチドの配列は、本発明のペプチド配列と同程度に神経突起伸張を刺激することができない。その一方、Ｎ末端の負電荷残基は、これらの残基を有しない、対応する配列型のＢＤＮＦ（本発明の配列番号１１）がＴｒｋ Ｂ受容体の天然リガンドであるため、Ｔｒｋ受容体への結合に必須でないと考えられる。後者は、これらの残基（Kallapur et al., 1992）を含むＮＣＡＭ ＨＢＰの配列の神経突起伸張への減少した効果を説明することができる。
【０１９７】
従って、本発明者らは、Ｔｒｋ受容体に結合し、受容体の活性化をもたらす効果が最も大きいペプチド配列の構造式を本明細書中に同定し、特許請求する。
【０１９８】
実施例５．ＮＣＡＭ ＨＢＰのＴｒｋ Ｂ受容体への結合
ＮＣＡＭの組換えＩｇ２モジュールを、酵母ピー・パストリ（P. pastoris）発現系（Invitrogen, USA)を、既述(Kiselyov et al., Biol.Chem. 272, 10125−10134, 1997）の通りに用いて製造した。組換えＴｒｋ Ｂ受容体を、RD Systems（USA）から購入した。
【０１９９】
結合分析を、泳動バッファーとして１０ｍＭリン酸ナトリウム  ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌを用いて、２５℃にてＢＩＡｃｏｒｅＸ装置（Biosensor AB）を用いて行った。流速を、５μｌ／分とした。データを、製造者のソフトウェアを用いて、非線形曲線適合により分析した。ＨＢＰまたはＮＣＡＭの組換えＩｇ２モジュールを、アミンカップリングキット（Biosensor AB）を下記の通りに用いてセンサーチップＣＭ５上に固定した：１）チップの２個の半片（Ｆｃ１およびＦｃ２と表す）を、２０μｌの活性化溶液で活性化させ；２）タンパク質を、１２μｌの、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液  ｐＨ６．０中２０μｇ／ｍｌタンパク質を用いてＦｃ１上に固定し；３）Ｆｃ１およびＦｃ２を、３５μｌのブロッキング溶液でブロックした。固定化したＨＢＰまたはＮＣＡＭのＩｇモジュールＩＩへのＴｒｋ Ｂの結合を、下記の通り実験した：Ｔｒｋ Ｂを、Ｆｃ１（固定化されたＨＢＰまたはＮＣＡＭのＩｇモジュールＩＩを有する）およびＦｃ２（固定化されたものを有しない）に同時に注入した。Ｆｃ２の表面への化合物の非特異的結合を示す曲線を、固定化されたタンパク質（ＨＢＰまたはＮＣＡＭのＩｇ２モジュール）およびＦｃ１の表面へのＴｒｋ Ｂの結合を示す曲線から引いた。記録された結合を示す得られた曲線を、図７に示す。ＨＢＰ ＮＣＡＭは、ＮＣＡＭのＩｇ２モジュールの単離されたペプチド配列および合わせた配列の両方として、それぞれＫＤ〜１０−８−１０−７ＭおよびＫＤ〜１０−９−１０−８ＭでＴｒｋ Ｂ受容体に結合する。
【図面の簡単な説明】
【０２００】
【図１】図１は、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞は、ＮＣＡＭを発現しない対照線維芽細胞と比較してラット小脳顆粒ニューロン（ＣＧＮ）の神経突起伸張を著しく促進し、そしてＨＢＰ（配列番号１）は、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞上およびＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞上で増殖させたＣＧＮの神経突起伸張を用量依存的に増加させることを示す。対照的に、ペプチドＭは、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞上で増殖させたＣＧＮからの神経突起伸張応答に影響を与えないが、ＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞上で増殖させたＣＧＮの神経突起伸張は刺激する。
【図２】図２は、ＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞の単層上で増殖させたＣＧＮでのＨＢＰ（配列番号１）の神経突起効果は、線維芽細胞増殖因子受容体（ＦＧＦＲ）の阻害剤であるＳＵ５４０２で処理することにより阻害されず、そしてＮＣＡＭを発現する線維芽細胞の単層上で増殖させたＣＧＮのＮＣＡＭ仲介神経突起伸張は、部分的にしか阻害されないが、ＳＵ５４０２は、ＨＢＰ不存在下でＮＣＡＭ仲介神経突起伸張を阻害することを示す。
【図３】図３は、特異的にヘパラン硫酸を主に二糖類に切断することが知られている酵素である、ヘパリナーゼＩＩＩの存在下または不存在下での単一ＣＧＮへのＨＢＰ（配列番号１）およびＭペプチド（配列番号２）の効果を示す。
【図４】図４は、ヘパリナーゼＩＩＩの存在下または不存在下におけるペプチドＨＢＰ（配列番号１）、Ｍ（配列番号２）、Ｍ１ｎ（配列番号３）、およびＭ３ｎ（配列番号４）の神経突起伸張効果を示す。
【図５】図５は、ＮＣＡＭを発現する線維芽細胞および対照のＮＣＡＭを発現しない線維芽細胞の両方のＨＢＰ（配列番号１）およびＭペプチド（配列番号２）を用いた処理により、細胞の拡散速度（Ｒ）、平均細胞速度（Ｓτ）、および移動指標（ＬＩ）の顕著な減少により反映される通り細胞運動の明白な阻害がもたらされることを示す。
【図６】図６は、ＮＣＡＭ ＨＢＤの異なるペプチド断片の分析結果を示す。
【図７】図７は、ＨＢＰ（配列番号１）（Ａ）およびＮＣＡＭの組換えＩｇ２モジュール（Ｂ）の組換えＴｒｋ Ｂ受容体への結合を示す。
【図１】
2008503596.tif 000007
【図２】
2008503596.tif 000008
【図３】
2008503596.tif 000009
【図４】
2008503596.tif 000010
【図５】
2008503596.tif 000011
【図６】
2008503596.tif 000012
【図７】
2008503596.tif 000013
【配列表】
2008503596000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年5月5日(2006.5.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
ｘ０−ｘ１−ｘ２−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−ｘ７−ｘ８−ｘ９−ｘ１０−ｘ９−ｘ９−ｘ１０−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０は、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ａまたは不存在であり、
ｘ１は、Ｇであり、
ｘ２は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、
ｘ３は、ＥまたはＤであり、
ｘ４は、Ｖであり、
ｘ５は、疎水性アミノ酸残基であり、
ｘ６は、ＶまたはＬであり、
ｘ７は、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ８は、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ９は、Ｅ、Ｄ、ＫまたはＱであり、
ｘ１０は、ＶまたはＬであり、
ｘ１１は、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ１２は、疎水性アミノ酸残基またはＴであり、
ｘ１３は、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａまたは不存在である。］
で定義される、単離された連続的ペプチド配列。
【請求項２】
ｘ３が、Ｑ、ＮまたはＴである、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３】
ｘ５が、ＴまたはＥである、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項４】
ｘ７およびｘ８が、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、ＥまたはＡから独立して選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項５】
ｘ７がＬである、請求項２、３または４に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項６】
ｘ８がＧである、請求項１、３および５のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項７】
ｘ８がＥである、請求項１、３および５のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項８】
ｘ１１が、Ｒ、Ｋ、Ｌ、ＮまたはＰである、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項９】
ｘ１２が、疎水性アミノ酸残基であり、Ｆ、Ｖ、Ｉ、ＴまたはＡから選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１０】
式（ＩＩ）
ｘ０−Ｇ−ｘ２−Ｄ／Ｅ−Ｖ−Ｉ−Ｌ−ｘ７−ｘ８−ｘ９−Ｖ−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０が、Ｋ、Ｒ、ＡまたはＮから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ２が、ＲまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ７が、Ｋ、Ａ、ＮまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ８が、Ｋ、ＮまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ９が、ＤまたはＱから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１１が、ＲまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１２が、ＶまたはＦから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１３が、Ｉ、ＬまたはＶから選択されるアミノ酸残基である。］
で定義される、請求項１に記載の単離された連続的ペプチド配列。
【請求項１１】
式（ＩＩＩ）
ｘ０−Ｇ−ｘ２−ｘ３−Ｖ−ｘ５−Ｖ−Ｌ−Ｇ／Ｅ−ｘ９−Ｖ／Ｌ−ｘ１０−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０、ｘ２、ｘ３、ｘ５、ｘ９、ｘ１０が、請求項１に定義の通りであり、
ｘ１１が、Ｎ、ＫまたはＰであり、
ｘ１２が、Ｉ、Ｔ、ＡまたはＶであり、そして
ｘ１３が、Ｓ、Ａ、ＮまたはＧである。］
で定義される、請求項１に記載の単離された連続的ペプチド配列。
【請求項１２】
ｘ３がＱである、請求項１１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１３】
ｘ１１が、Ｒ、Ｎ、ＰまたはＬである、請求項１または１１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILKKDVRFI（配列番号１）である、請求項１または１０に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILAKDVRVI（配列番号２）である、請求項１または１０に記載の単離されたペプチド配列化合物。
【請求項１６】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILNNDVRFI（配列番号３）である、請求項１または１０に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILNNQVRFI（配列番号４）である、請求項１または１０に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が、AGRDVILNNDVRFI（配列番号５）である、請求項１または１０に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１９】
前記アミノ酸配列が、NGRDVILKKDVLFI（配列番号６）である、請求項１または１０に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２０】
前記アミノ酸配列が、NGLDVILIIDVRFI（配列番号７）である、請求項１または１０に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２１】
前記アミノ酸配列が、KGKEVMVLGEVNIN（配列番号８）である、請求項１、５、６または１１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２２】
前記アミノ酸配列が、RGHQVTVLGEIKTG（配列番号９）である、請求項１、２、３、５、６または１１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２３】
前記アミノ酸配列が、RGREVEVLGEVPAA（配列番号１０）である、請求項１、２、３、５、６または１１に記載のペプチド。
【請求項２４】
前記アミノ酸配列が、SGGTVTVLEKVPVS（配列番号１１）である、請求項１、２、３、５、７または１１に記載のペプチド。
【請求項２５】
前記ペプチド配列が、配列番号１−１１から選択される配列のいずれかの断片、変異体または相同体である、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２６】
Ｔｒｋ Ａ、Ｔｒｋ ＢおよびＴｒｋ Ｃを含むＴｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体に結合することが可能である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２７】
前記受容体が、Ｔｒｋ ＡまたはＴｒｋ Ｂである、請求項２６に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２８】
神経細胞分化を刺激することが可能である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２９】
神経突起伸張を刺激することが可能である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３０】
神経細胞生存を刺激することが可能である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３１】
細胞運動を調節することが可能である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３２】
細胞運動を阻害することが可能である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３３】
学習および／または記憶に関係する神経可塑性を刺激することが可能である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３４】
前記ペプチド配列が、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のペプチド断片である、請求項１４に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３５】
前記ペプチド配列が、神経成長因子（ＮＧＦ）のペプチド断片である、請求項２１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３６】
前記ペプチド配列が、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）のペプチド断片である、請求項２２に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３７】
前記ペプチドが、ニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）のペプチド断片である、請求項２３に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３８】
前記ペプチドが、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）のペプチド断片である、請求項２４に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３９】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列を含む化合物。
【請求項４０】
前記ペプチド配列が、個々のペプチド配列の単一コピーからなる単量体として構築(formulated)される、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４１】
前記ペプチド配列が、個々のペプチド配列の二量体または四量体のような、個々のペプチド配列の２個以上のコピーからなる多量体として構築される、請求項３９に記載の化合物。
【請求項４２】
前記多量体が、２個以上の個々のペプチド配列のデンドリマーである、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４３】
前記多量体が、２個の同一のペプチド配列を含む二量体である、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４４】
前記多量体が、２個の異なるペプチド配列を含む二量体である、請求項４１に記載の化合物。
【請求項４５】
薬剤としての、請求項１から３８のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列または請求項３９から４４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項４６】
前記薬剤が、神経細胞分化、神経細胞生存、神経細胞可塑性を刺激すること、学習および／または記憶を刺激すること、細胞運動を調節すること、またはＴｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体の活性を調節することが、処置の一部である状態または疾患の処置用である、請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記状態または疾患が、中枢および末梢神経系の状態または疾患である、請求項４６に記載の使用。
【請求項４８】
前記状態または疾患が、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、卒中後のような虚血後損傷、糖尿病と関連した神経変性、概日時計または神経筋伝達に影響を与える疾患から選択される、請求項４５に記載の使用。
【請求項４９】
前記薬剤が、臓器移植後、または遺伝性もしくは外傷性萎縮性筋疾患のような神経筋接合部の機能障害を有する状態を含む筋肉の状態または疾患から選択される状態または疾患の処置用である、請求項４５に記載の使用。
【請求項５０】
前記薬剤が、血管新生、組織リモデリングおよび／または増加した細胞運動性と関連する状態または疾患の処置用である、請求項４５に記載の使用。
【請求項５１】
前記疾患が癌である、請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
前記癌が、血管新生を伴う全ての癌である、請求項５１に記載の使用。
【請求項５３】
前記癌が、神経系の癌である、請求項５１に記載の使用。
【請求項５４】
前記状態または疾患が、学習能力障害および／または記憶障害である、請求項４６に記載の使用。
【請求項５５】
前記状態または疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病または多発脳梗塞性認知症のような認知症である、請求項４６または５４に記載の使用。
【請求項５６】
前記状態または疾患が、思考および／または気分障害、双極性障害（ＢＰＤ）、遺伝的に関係する単極性感情障害を含む精神神経疾患、妄想性障害、パラフレニー、妄想性精神病、統合失調症、統合失調性障害、統合失調性感情障害、統合失調性双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、心因性精神病、緊張病、周期性双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、循環型精神病、統合失調症性人格障害、妄想性人格障害、双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、ならびに単極性感情障害のサブタイプのような精神疾患である、請求項４６に記載の使用。
【請求項５７】
前記薬剤が、アルコール摂取による身体損傷に関係する状態または疾患の処置用である、請求項４５に記載の使用。
【請求項５８】
前記薬剤が、プリオン病の処置用である、請求項４５に記載の使用。
【請求項５９】
請求項４６から５８のいずれか一項に定義の状態または疾患の処置用薬剤を製造するための、請求項１から３８のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列または請求項３９から４４のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項６０】
請求項１から３８のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列または請求項３９から４４のいずれか一項に記載の化合物を含む薬剤。
【請求項６１】
請求項６０に記載の薬剤の有効量を含む医薬組成物。
【請求項６２】
請求項１から３８のいずれか一項に記載のペプチド配列、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の化合物、請求項６０に記載の薬剤および／または請求項６１に記載の医薬組成物の有効量を、必要とする個体に投与することを含む処置方法。
【請求項６３】
神経細胞分化、神経細胞生存、神経細胞可塑性および／または細胞運動変化を刺激する方法であって、請求項１から３８のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列、請求項３９から４４のいずれか一項に記載の化合物、請求項６０に記載の薬剤または請求項６１に記載の医薬組成物を用いることを含む方法。
【請求項６４】
抗体の産生のための、請求項１から２５のいずれか一項に記載のペプチド配列の使用。
【請求項６５】
請求項１から２５のいずれか一項に記載のモチーフを含むエピトープを認識し、結合することが可能である抗体。
【請求項６６】
請求項６５に記載の抗体を含む医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成19年5月24日(2007.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
ｘ０−ｘ１−ｘ２−ｘ３−ｘ４−ｘ５−ｘ６−ｘ７−ｘ８−ｘ９−ｘ１０−ｘ９−ｘ９−ｘ１０−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０は、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ａまたは不存在であり、
ｘ１は、Ｇであり、
ｘ２は、塩基性または疎水性アミノ酸残基であり、
ｘ３は、ＥまたはＤであり、
ｘ４は、Ｖであり、
ｘ５は、疎水性アミノ酸残基であり、
ｘ６は、ＶまたはＬであり、
ｘ７は、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ８は、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ９は、Ｅ、Ｄ、ＫまたはＱであり、
ｘ１０は、ＶまたはＬであり、
ｘ１１は、任意のアミノ酸残基であり、
ｘ１２は、疎水性アミノ酸残基またはＴであり、
ｘ１３は、Ｉ、Ｎ、Ｓ、Ｇ、Ａまたは不存在である。］
で定義される、単離された連続的ペプチド配列。
【請求項２】
ｘ７およびｘ８が、Ｋ、Ｒ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｇ、ＥまたはＡから独立して選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３】
ｘ７がＬである、請求項２に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項４】
ｘ８がＧである、請求項１および３のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項５】
ｘ８がＥである、請求項１および３のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項６】
ｘ１１が、Ｒ、Ｋ、Ｌ、ＮまたはＰである、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項７】
ｘ１２が、疎水性アミノ酸残基であり、Ｆ、Ｖ、Ｉ、ＴまたはＡから選択される、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項８】
式（ＩＩ）
ｘ０−Ｇ−ｘ２−Ｄ／Ｅ−Ｖ−Ｉ−Ｌ−ｘ７−ｘ８−ｘ９−Ｖ−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０が、Ｋ、Ｒ、ＡまたはＮから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ２が、ＲまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ７が、Ｋ、Ａ、Ｎ、ＬまたはＩから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ８が、Ｋ、Ｎ、ＬまたはＩから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ９が、ＤまたはＱから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１１が、ＲまたはＬから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１２が、ＶまたはＦから選択されるアミノ酸残基であり、
ｘ１３が、Ｉである。］
で定義される、請求項１に記載の単離された連続的ペプチド配列。
【請求項９】
式（ＩＩＩ）
ｘ０−Ｇ−ｘ２−ｘ３−Ｖ−ｘ５−Ｖ−Ｌ−Ｇ／Ｅ−ｘ９−Ｖ／Ｌ−ｘ１０−ｘ１１−ｘ１２−ｘ１３
［式中、
ｘ０、ｘ２、ｘ３、ｘ５、ｘ９、ｘ１０が、請求項１に定義の通りであり、
ｘ１１が、Ｎ、ＫまたはＰであり、
ｘ１２が、Ｉ、Ｔ、ＡまたはＶであり、そして
ｘ１３が、Ｓ、Ａ、ＮまたはＧである。］
で定義される、請求項１に記載の単離された連続的ペプチド配列。
【請求項１０】
ｘ１１が、Ｒ、Ｎ、ＰまたはＬである、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１１】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILKKDVRFI（配列番号１）である、請求項１または８に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１２】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILAKDVRVI（配列番号２）である、請求項１または８に記載の単離されたペプチド配列化合物。
【請求項１３】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILNNDVRFI（配列番号３）である、請求項１または８に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１４】
前記アミノ酸配列が、KGRDVILNNQVRFI（配列番号４）である、請求項１または８に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１５】
前記アミノ酸配列が、AGRDVILNNDVRFI（配列番号５）である、請求項１または８に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１６】
前記アミノ酸配列が、NGRDVILKKDVLFI（配列番号６）である、請求項１または８に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１７】
前記アミノ酸配列が、NGLDVILIIDVRFI（配列番号７）である、請求項１または８に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１８】
前記アミノ酸配列が、KGKEVMVLGEVNIN（配列番号８）である、請求項１、３、４または９に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項１９】
前記ペプチド配列が、配列番号１から８から選択される配列のいずれかの断片、変異体または相同体である、請求項１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２０】
Ｔｒｋ Ａ、Ｔｒｋ ＢおよびＴｒｋ Ｃを含むＴｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体に結合することが可能である、請求項１から１９のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２１】
前記受容体が、Ｔｒｋ ＡまたはＴｒｋ Ｂである、請求項２０に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２２】
神経細胞分化を刺激することが可能である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２３】
神経突起伸張を刺激することが可能である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２４】
神経細胞生存を刺激することが可能である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２５】
細胞運動を調節することが可能である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２６】
細胞運動を阻害することが可能である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２７】
学習および／または記憶に関係する神経可塑性を刺激することが可能である、請求項１から２０のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２８】
前記ペプチド配列が、神経細胞接着分子（ＮＣＡＭ）のペプチド断片である、請求項１１に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項２９】
前記ペプチド配列が、神経成長因子（ＮＧＦ）のペプチド断片である、請求項１８に記載の単離されたペプチド配列。
【請求項３０】
請求項１から２９のいずれか一項に記載の単離されたペプチド配列を含む化合物。
【請求項３１】
前記ペプチド配列が、個々のペプチド配列の単一コピーからなる単量体として構築(formulated)される、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
前記ペプチド配列が、個々のペプチド配列の二量体または四量体のような、個々のペプチド配列の２個以上のコピーからなる多量体として構築される、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３３】
前記多量体が、２個以上の個々のペプチド配列のデンドリマーである、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３４】
前記多量体が、２個の同一のペプチド配列を含む二量体である、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３５】
前記多量体が、２個の異なるペプチド配列を含む二量体である、請求項３２に記載の化合物。
【請求項３６】
薬剤としての、請求項１から２９のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列または請求項３０から３５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項３７】
前記薬剤が、神経細胞分化、神経細胞生存、神経細胞可塑性を刺激すること、学習および／または記憶を刺激すること、細胞運動を調節すること、またはＴｒｋファミリー受容体のニューロトロフィン受容体の活性を調節することが、処置の一部である状態または疾患の処置用である、請求項３６に記載の使用。
【請求項３８】
前記状態または疾患が、中枢および末梢神経系の状態または疾患である、請求項３７に記載の使用。
【請求項３９】
前記状態または疾患が、術後神経損傷、外傷性神経損傷、神経線維の髄鞘形成障害、卒中後のような虚血後損傷、糖尿病と関連した神経変性、概日時計または神経筋伝達に影響を与える疾患から選択される、請求項３６に記載の使用。
【請求項４０】
前記薬剤が、臓器移植後、または遺伝性もしくは外傷性萎縮性筋疾患のような神経筋接合部の機能障害を有する状態を含む筋肉の状態または疾患から選択される状態または疾患の処置用である、請求項３６に記載の使用。
【請求項４１】
前記薬剤が、血管新生、組織リモデリングおよび／または増加した細胞運動性と関連する状態または疾患の処置用である、請求項３６に記載の使用。
【請求項４２】
前記疾患が癌である、請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記癌が、血管新生を伴う全ての癌である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記癌が、神経系の癌である、請求項４２に記載の使用。
【請求項４５】
前記状態または疾患が、学習能力障害および／または記憶障害である、請求項３７に記載の使用。
【請求項４６】
前記状態または疾患が、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病または多発脳梗塞性認知症のような認知症である、請求項３７または４５に記載の使用。
【請求項４７】
前記状態または疾患が、思考および／または気分障害、双極性障害（ＢＰＤ）、遺伝的に関係する単極性感情障害を含む精神神経疾患、妄想性障害、パラフレニー、妄想性精神病、統合失調症、統合失調性障害、統合失調性感情障害、統合失調性双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、心因性精神病、緊張病、周期性双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、循環型精神病、統合失調症性人格障害、妄想性人格障害、双極性および遺伝的に関係する単極性感情障害、ならびに単極性感情障害のサブタイプのような精神疾患である、請求項３７に記載の使用。
【請求項４８】
前記薬剤が、アルコール摂取による身体損傷に関係する状態または疾患の処置用である、請求項３６に記載の使用。
【請求項４９】
前記薬剤が、プリオン病の処置用である、請求項３６に記載の使用。
【請求項５０】
請求項３７から４９のいずれか一項に定義の状態または疾患の処置用薬剤を製造するための、請求項１から２９のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列または請求項３０から３５のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項５１】
請求項１から２９のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列または請求項３０から３５のいずれか一項に記載の化合物を含む薬剤。
【請求項５２】
請求項５１に記載の薬剤の有効量を含む医薬組成物。
【請求項５３】
請求項１から２９のいずれか一項に記載のペプチド配列、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の化合物、請求項５１に記載の薬剤および／または請求項５２に記載の医薬組成物の有効量を、必要とする個体に投与することを含む処置方法。
【請求項５４】
神経細胞分化、神経細胞生存、神経細胞可塑性および／または細胞運動変化を刺激する方法であって、請求項１から２９のいずれか一項に記載の個々のペプチド配列、請求項３０から３５のいずれか一項に記載の化合物、請求項５１に記載の薬剤または請求項５２に記載の医薬組成物を用いることを含む方法。
【請求項５５】
抗体の産生のための、請求項１から１９のいずれか一項に記載のペプチド配列の使用。
【請求項５６】
請求項１から１９のいずれか一項に記載のモチーフを含むエピトープを認識し、結合することが可能である抗体。
【請求項５７】
請求項５６に記載の抗体を含む医薬組成物。
【手続補正書】
【提出日】平成19年8月2日(2007.8.2)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008503596000001.app
【国際調査報告】
2008503596.tif 000019
2008503596.tif 000020
2008503596.tif 000021
2008503596.tif 000022