(57)【要約】ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１の少なくとも一部領域を含む抗ＰＲＲＳＶ有効性ワクチン。このようなワクチンをすれば、ＰＲＲＳＶに感染しやすい動物に免疫反応を誘発する。さらには、本発明に係る組成物は、ＰＲＲＳＶの重症度および／またはＰＲＲＳＶ罹患率の軽減だけでなく、ＰＲＲＳＶに対する防御免疫反応などの免疫反応の強化をもたらす。ＯＲＦ１の選択された部分領域は、単独での使用、１または複数の他のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦとの組合わせ、および他のＰＲＲＳＶワクチンとの組合わせでの使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡ由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチドを有する、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡの第一の部分領域と、
適切な医薬的担体と
を含む、ＰＲＲＳＶに対する免疫反応を惹起しうるワクチン。
【請求項２】
前記部分領域が、配列番号１−１４のいずれか１つと少なくとも８５％の配列配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも１５０の連続したヌクレオチドを有する請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
前記部分領域が、配列番号１−６、９、１０のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる請求項２に記載のワクチン。
【請求項４】
ＯＲＦ１以外のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ由来の最少２１の連続したヌクレオチド、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれるＰＲＲＳＶ由来のＤＮＡの部分領域をさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項５】
ＰＲＲＳＶ感染に対する免疫反応惹起に有効な他の組成物をさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項６】
前記ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１がＰＲＲＳＶの毒性株から誘導される、請求項１に記載のワクチン。
【請求項７】
助剤、賦形剤およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる成分をさらに含む、請求項１に記載のワクチン。
【請求項８】
ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡの部分領域由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチドを含む組成物を動物に投与する工程、および
その免疫反応誘発を生起させる工程
を含む方法である、ＰＲＲＳＶ感染症に感染しやすい動物に抗ＰＲＲＳＶ免疫反応を惹起する方法。
【請求項９】
前記組成物の２回目の投与を供する工程をさらに含む請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記部分領域が、配列番号１−１４のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも１５０の連続したヌクレオチドを含む請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記部分領域が、配列番号１−６、９、１０のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる請求項１０に記載の方法。
【請求項１１】
前記組成物が、ＯＲＦ１以外のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ由来の最少２１の連続したヌクレオチド、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる第二のＤＮＡ部分領域をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
ＰＲＲＳＶ感染に対する免疫反応惹起に有効な第二の組成物をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
前記組成物が、助剤、賦形剤およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる成分をさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
少なくともＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡの部分領域を含むベクター。
【請求項１６】
前記ベクターがプラスミドである請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
前記ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡの部分領域が、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡ由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチドを含む請求項１５に記載のベクター。
【請求項１８】
前記ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡの部分領域が、配列番号１−１４のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも１５０の連続したヌクレオチドを有する請求項１７に記載のベクター。
【請求項１９】
前記ベクターが、ＯＲＦ１以外のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ由来の最少２１の連続したヌクレオチド、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれるＰＲＲＳＶ  ＤＮＡの第二の部分領域をさらに含む、請求項１に記載のベクター。
【請求項２０】
前記ＰＲＲＳＶ  ＤＮＡがＰＲＲＳＶの毒性株から誘導される、請求項１５に記載のベクター。
【請求項２１】
ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡ由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチドを含むプラスミドを含有する細胞。
【請求項２２】
前記プラスミドが、配列番号１−１４のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも１５０の連続したヌクレオチドをさらに含む請求項２１に記載の細胞。
【請求項２３】
前記プラスミドが、ＯＲＦ１以外のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ由来の最少２１の連続したヌクレオチド、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれるＰＲＲＳＶ  ＤＮＡの第二の部分領域をさらに含む請求項２１に記載の細胞。
【請求項２４】
前記ＰＲＲＳＶ  ＤＮＡがＰＲＲＳＶの毒性株から誘導される、請求項２１に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２００４年６月１７日に出願された仮出願番号第６０／５８１，３５０号による利益を主張し、そこでの教示および内容は本明細書に記載されているものとして取り込まれる。
【０００２】
配列表
本願に添付する配列表の印刷物は、同一内容のものがＣＤ−ＲＯＭに記録されたコンピュータ読取可能なＡＳＣＩＩ形式ファイルとしても提出されている。
【背景技術】
【０００３】
発明の技術分野
本発明は、広くは豚繁殖・呼吸器障害症候群（ＰＲＲＳ）のためのワクチンに関する。より具体的には、本発明は、ＰＲＲＳウイルス（ＰＲＲＳＶ）のＤＮＡサブユニットを含むワクチンの投与によるブタ（swine）のＰＲＲＳ防止に関する。より詳細には、本発明は、ブタにＰＲＲＳＶに対する感染防御免疫力をつけるＤＮＡサブユニットワクチンにおけるオープンリーディングフレーム１（ＯＲＦ１）の使用に関する。さらに詳細には、本発明は、ＯＲＦ１の選択された部分領域の単独での使用、またはＰＲＲＳＶゲノムの他の部分領域との組合わせまたはＰＲＲＳＶに対する他のワクチンとの組合わせでの使用に関する。
【０００４】
従来技術の説明
ＰＲＲＳは、世界中の養豚業における主な病気である。ＰＲＲＳは、ＰＲＲＳＶ感染により引き起こされる。現在、正しく使用すれば、ブタにＰＲＲＳＶ感染によって生じる病態に対する抵抗力をつけさせることができる市販の改良型生ワクチン（ＭＬＶ）がある。ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶワクチンは、有効な免疫反応の惹起を保証するために、ワクチンを予防接種した動物での複製が必要である（非特許文献１など参照）。しかしながら、このよな複製には、ＰＲＲＳＶ  ＭＬＶが、ワクチン接種後、数週間もの間、動物中で存続しうる点、また、ＰＲＲＳＶ陰性のブタに放散される危険性もあるという点で問題がある。ワクチン接種動物からのＰＲＲＳＶ陰性集団へのＰＲＲＳＶ  ＭＬＶ放散を防御するための適切なバイオセキュリティ手段をもたないブタの群では、ワクチン接種動物からのＰＲＲＳＶ  ＭＬＶ放散は問題となるであろう。何百万ものＰＲＲＳ  ＭＬＶが保証もなく使われてきたが、より毒性の強い野生型ＰＲＲＳＶ株に先祖返りするＰＲＲＳ  ＭＬＶの能力について、散発的な文献報告も見られる。ＰＲＲＳ  ＭＬＶ放散および毒性への先祖返りの問題の解決を図って、不活性化ＰＲＲＳウィルス（すなわちＰＲＲＳ  ＫＶ）からなるワクチンの使用による試みもなされてきた。しかしながら、ＰＲＲＳ  ＫＶは、ワクチン接種したブタでの強い体液性反応を惹起するにも拘らず、ＰＲＲＳ関連疾患の予防には効能がないという研究結果が示されてきた。
【０００５】
【非特許文献１】メン（Meng）, X.J., 豚繁殖・呼吸器障害症候群の多様性（Heterogeneity of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus）:現ワクチンの効果および将来のワクチン開発についての示唆（Implication for Current Vaccine Efficacy and Future Vaccine Development）;74  Vet. Micro., 2000, 309-329
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
したがって、ＰＲＲＳ  ＭＬＶに付随するような問題を生じることなく防御免疫反応を惹起しうるワクチン接種方法およびワクチンが当分野で求められている。好ましくは、ワクチンの投与は、ワクチン接種した動物において、活性的に複製せず、強い体液性および細胞性免疫反応を惹起することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、特有のかつ従来技術の問題を解決し、ＰＲＲＳＶ  ＤＮＡワクチンの供与により、当分野の現状を著しく改善させる。理論的には、ＰＲＲＳＶ抗原を発現するＤＮＡワクチンプラスミドは、ＰＲＲＳＶ抗原（すなわちＰＲＲＳ  ＭＬＶの類）合成の鋳型として働くが、動物において、活性的に複製しない特徴も有する（すなわちＰＲＲＳ  ＫＶの類）。ＰＲＲＳＶに対する防御的な宿主反応を惹起するために必要な防御免疫源は知られていない。ＰＲＲＳ  ＭＬＶは、ワクチン接種したブタで防御反応を惹起しうることから、ワクチン接種した動物におけるＰＲＲＳ  ＭＬＶ複製は、ワクチン接種した動物における強い体液性および細胞性免疫反応の両方を惹起するにちがいないと考えられる。
【０００８】
ＰＲＲＳＶのＯＲＦ１は、ＰＲＲＳＶの複製および新世代発生のために必要な複製機構をコード化する。ＯＲＦ１は、ＯＲＦ１レプリカーゼ複合体を含む、ＯＲＦ１ａおよびＯＲＦ１ｂで示される２つの領域をもつ（ディー（Dea）ら，豚繁殖・呼吸器障害症候群（Ｐｒｒｓ）ウィルスの構造タンパク質についての最近の知識：北米分離株と欧州分離株との比較；145（4）Archives of Virology, 659-688 (2000)）。レプリカーゼでコード化されたタンパク質は、他のウィルスファミリーにおけるキーとなる免疫源であろうと考えられる（ライトナー（Leitner）ら，ＤＡＮおよびＲＮＡ系ワクチン：理論，進歩および展望；18 Vaccine 765-777 (2000)）。
【０００９】
細胞がＰＲＲＳＶに感染すると、ウィルスのレプリカーゼ活性は、細胞が感染している間レプリカーゼ関連抗原が発現される際の強力な補助効果をもたらす。レプリカーゼ関連抗原は、トランスフェクトされた細胞中に発生した“危険信号”として作用し、強い宿主反応（すなわちＩＦＮ，ＨＳＰ，アポトーシス）を誘発する。そのため、レプリカーゼ関連“危険信号”は、非複製ＰＲＲＳ（すなわちＰＲＲＳ  ＫＶにおける不活性化された抗原）が攻撃からの防御をもたらさないのに反して、なぜＰＲＲＳ  ＭＬＶが防御を誘発しうるかの主要因となり得る。
【００１０】
ＯＲＦ１は、真核生物細胞でのトランスフェクションおよび適切な発現が困難な、ほぼ１２，０００のヌクレオチド長である。そのため、さまざまな病原体の防御免疫源の決定手段として発現ライブラリー免疫法（ＥＬＩ）を用い、ＯＲＦ１を連続的かつ随意に小区分に分割した。ＥＬＩは、特定の病原体のゲノムを小さな断片に切断する。該断片は、ＤＮＡワクチンベクター中にクローニングされ、その後どの断片が免疫反応を誘発する能力を有するかを決定するために宿主に投与される（ジョンストン（Johnston）およびバリー（Barry）；ゲノムワクチン接種の遺伝学；15（8）Vaccine，808-809 (1997)）。好ましくは、免疫反応が防御される。
【００１１】
本発明は、ＯＲＦ１産生タンパク質に対する宿主の免疫反応はＰＲＲＳＶ攻撃からの防御に必須であるとの前提に基づいている。ＤＮＡワクチンベクターにおいて、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦｓ２−７をコード化する領域を配置することは、これらＯＲＦｓが３１７−７２０ヌクレオチド長の範囲であることから、比較的容易である。上記したとおり、ＰＲＲＳＶのＯＲＦ１領域のサイズは、ほぼ１２，０００のヌクレオチド長である。このサイズの領域をＤＮＡワクチンベクターナ中に配置しても、真核生物細胞でのトランスフェクション、それに続く発現が容易にいくといえない。したがって、ＯＲＦ１の全領域の適切な発現をより確実にするためには、ＯＲＦ１領域を小区分に分断することは必須である。
【００１２】
発現ライブラリー免疫法（ＥＬＩ）は、さまざまな病原体の防御免疫源の決定手段として用いられてきた。ＥＬＩは、特定の病原体のゲノムを小さな断片に切断する手法を用いる。これら小断片は、次いでＤＮＡワクチンベクター中にクローニングされ、その後どの断片が免疫反応を誘発する能力を有するかを決定するために宿主に投与される。本発明では、配列的に、ＰＲＲＳＶゲノム領域をコード化するＯＲＦ１からなるＰＲＲＳＶ  ＤＮＡワクチンの開発用にＥＬＩ法を改良した。この方法をＳＥＬＩ（配列発現ライブラリー免疫法）と表記する。これは、ＤＮＡワクチンとして完全なＯＲＦ１領域を用いたバーフォード（Barfoed）ら（ＰＲＲＳウィルスのオープンリーディングフレーム１−７をもつブタのＤＮＡワクチン接種）と大きく異なる。
【００１３】
本発明に係るワクチンは、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１の部分領域のみ、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１の他の部分領域との組合わせ、およびＰＲＲＳＶ感染に対する免疫反応を発生させる効果のある他の組成物たとえば他のＰＲＲＳＶワクチンなどとの併用からなる。本発明の目的に有用なＯＲＦ１部分領域はワクチン接種される動物において免疫反応を引き出す能力のあるサイズである。当該部分領域の含有する塩基対は、約９,０００以下が好ましい。より好ましくは、ＯＲＦ-１部分領域は、約２１−９,０００の間の連続したヌクレオチド塩基対、一層好ましくは約２１−６,０００の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約２１−３,０００の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約２１−２,０００の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約２１−１,０００の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約２１−５００の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約２１−３００の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約２１−１５０の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約２１−７５の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約２１−５０の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約２１−２５の間の連続したヌクレオチド塩基対、さらに好ましくは約２１−２３の間の連続したヌクレオチド塩基対、特に好ましくは少なくとも約２１の連続したヌクレオチド塩基対を含有する。どのＰＲＲＳＶ株のどのＯＲＦ１またはその一部のいずれも、本発明の目的のために用いることができるが、毒性の強い株を用いることが好ましい。
【００１４】
選択された部分領域（または各部分領域）は、適当な発現ベクター中にクローニングされる。適当なベクターとしては、アデノウィルスベクター、赤痢菌（Shigella）ベクター、ｐＶＣ１６５０（バレンティス社（Valentis Inc.）（バーリンゲーム，カリフォルニア州）、ＷＲＧ７２０（Ｗ．Ｒ．グレース（Grace），ニューヨーク，ンユーヨーク州）、およびｐｃＤＮＡ３（インヴィトロジェン（Invitrogen），カールズバッド，カリフォルニア州）などが例示される。いくつかの好ましいベクターは、前初期サイトメガロウィルスプロモーター、イントロンＡ、およびポリａアデニル化部分領域（すなわち、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）またはヒト成長ホルモン（ＨＧＨ））を含む。さらに、精製ＰＲＲＳＶタンパク質は、たとえば、バキュロウィルス発現系を用いて、昆虫細胞培養物中で発現することができる。その後、このようなタンパク質は、助剤と組み合わされ、投与される。勿論、本発明分野の当業者は、真核生物細胞中でさまざまなＰＲＲＳＶ  ＯＲＦｓの発現を誘導することができる適当な発現系およびベクターを選択することができる。好ましくは、各ＯＲＦ１部分領域を適当な発現ベクター中にクローニングした後、クローンの配置を確認する。
【００１５】
本発明の一実施態様例では、本発明を実施する際に使用するものとして、ＰＲＲＳＶウィルスＶＲ-２３３２が選択された。ＯＲＦ１の１３重複クローンを発生するため、ジーンバンク（Genbank）Ｕ８７３９２を用いた。このＯＲＦ１は、１２,０７１ヌクレオチド塩基対を含む。各部分領域のサイズは、７７３ないし９７５ｂｐの範囲であった。各クローンは、アルファベットＡ−Ｍで表し、クローンＡ（配列番号２）は９３９ｂｐ、クローンＢ（配列番号３）は９５７ｂｐ、クローンＣ（配列番号４）は９７６ｂｐ、クローンＤ（配列番号５）は９５４ｂｐ、クローンＥ（配列番号６）は９３９ｂｐ、クローンＦ（配列番号７）は９５７ｂｐ、クローンＧ（配列番号８）は９５７ｂｐ、クローンＨ（配列番号９）は８５２ｂｐ、クローンＩ（配列番号１０）は９１７ｂｐ、クローンＪ（配列番号１１）は９７２ｂｐ、クローンＫ（配列番号１２）は９６６ｂｐ、クローンＬ（配列番号１３）は７８３ｂｐ、クローンＭ（配列番号１４）は７７４ｂｐである。クローンＡ−Ｈは、ＯＲＦ１の領域１ａに由来し、クローンＩ−Ｍは、ＯＲＦ１の領域１ｂに由来する。
【００１６】
クローンＡは、真性のＯＲＦ１  ＡＴＧ開始コドンを用いた。残余のＯＲＦ１クローンは、それらの５’端に付加したインフレームＡＴＧ開始コドンを用いた。これら各クローンは、それぞれＤＮＡ発現ベクターｐＶＣ１６５０中にクローニングされた。このベクターは、前初期サイトメガロウィルスプロモーター、およびイントロンＡを含み、真核生物細胞中での種々のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦｓの発現を誘導する。表１は、各クローンおよび各クローンがヌクレオチド配列のどの領域由来かについての情報を示す。
【００１７】
表１  ＢＩＶ  ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１ａ／１ｂ配列発現ライブラリー免疫法（ＳＥＬＩ）クローン
【表１】
2008503221.tif 000002
＊注：オリジナルのＨおよびＩクローンは、ＯＲＦ１ａ／１ｂマイナス１フレームシフト領域の側面に位置し、新プライマーは若干小さいＲＴ−ＰＣＲ産生物をもたらすように設計された。
【００１８】
その後、各部分領域は、単独でだけなく種々組合わせて、他のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦｓを含むワクチンの各調製に用いられた。
【００１９】
他の実施態様例では、クローンＡ−ＭおよびＯＲＦｓ２−６のクローンは、ｐＶＣ１６５０発現ベクター中にクローニングし、ＯＲＦ７のクローンは、ＷＲＧ７２０発現ベクター中にクローニングした。勿論、本発明分野の当業者は、適当な発現系およびベクターを選択することができる。また、本発明の核酸配列は、標準的技術、特に制限されないが、たとえば一般的な分子クローニング法、突然変異生成法および化学的核酸合成法などにより製造することができる。
【００２０】
本発明の目的に沿うものとして、少なくとも７５％の配列同一性をもつＤＮＡ配列、好ましくはクローンＡ−Ｍのいずれかとの配列同一性が、少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、さらに好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらに好ましくは少なくとも９５％、さらに好ましくは少なくとも９８％、さらに好ましくは少なくとも９９％、特に好ましくは１００％であるＤＮＡ配列は、本発明の範疇といえる。
【００２１】
本発明の一態様において、クローンＡ−Ｍは、各々ワクチン成分として、単独で使用される。動物へのワクチン予防接種は、どのような慣用手段による投与でもよい。投与方法としては、たとえば経口、経皮、静脈注射、皮下、筋肉内、眼球内、腹腔内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、肺内またはそれらいずれかの組合わせなどが挙げられる。好ましい投与の形態は、筋肉内、皮下および鼻腔内である。所望または必要に応じて、追加の免疫接種を、１回または数回、種々の間隔で、行なうことができる。このようなワクチン投与すれば、有毒性ＰＲＲＳＶの攻撃後、動物中の免疫反応が誘発され、ＰＲＲＳＶ感染の臨床的徴候が、罹患率および／または重症度の点で軽減される。
【００２２】
本発明の他の態様において、クローンＡ−Ｍの組合わせで、上記のように動物に投与される。この組合わせは、２以上の上記クローンを含む。いくつかのこれらクローン（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，Ｅ，ＨおよびＪ）は、豚抗ＰＲＲＳＶ回復期血清を用いてトランスフェクションの後、ＩＦＡ反応を誘発するため、これらクローンの組合わせは本発明の目的にとって好ましい。
【００２３】
本発明の他の態様において、クローンＡ−Ｍは、上記のように、それぞれ単独でも、組合わせでも、ＰＲＲＳＶの他のＯＲＦ（またはｓ：複数）と組合わせてワクチン調製に用いられる。好ましいＯＲＦｓとしては、ＯＲＦｓ２−７が挙げられる。
【００２４】
本発明の他の態様において、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ  ＤＮＡは、他のＰＲＲＳＶワクチンと組合わされる。好ましくは、該ワクチンは、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡの追加に先立って、免疫反応の惹起に効果的である。
【００２５】
本発明のさらなる他の態様として、ベクターが供される。本発明に係るベクターは、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡの少なくとも一部を含む外来ＤＮＡ（ベクター由来ではない）が挿入されている。好ましい形態として、該ベクターはプラスミドである。ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡの該部分領域は、好ましくは、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡ由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチドを有する。いくつかの好ましい形態において、該部分領域は、配列番号１−１４のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも１５０の連続したヌクレオチドを有するであろう。
【００２６】
上記組成自体と同様に、配列同一性をもつパーセントおよび配列の長さは、上記のようにさまざまであってよい。他の好ましい形態では、上記ベクターは、ＰＲＲＳＶ  ＤＮＡの第二の部分領域をさらに含む。この第二の部分領域は、ＯＲＦ１以外のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ由来の最少２１の連続したヌクレオチド、ＯＲＦ１由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる。ＯＲＦ１由来の追加の２１連続したヌクレオチドを有する実施態様において、これら２１ヌクレオチドは、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡの第１の部分領域に含まれる少なくとも２１のヌクレオチドとは別異である。ベクター構築に用いられるＰＲＲＳＶ  ＤＮＡがＰＲＲＳＶの毒性株から誘導されることも好ましい。
【００２７】
本発明の他の態様は、本発明のプラスミドを含む宿主細胞を包含する。たとえば、上記のような各種ＯＲＦ１断片の誘導によって作出されるプラスミドを含むことができる。このような細胞は、好ましくは、ＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ１  ＤＮＡ由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチドを含むプラスミドを含有する。他の好ましい形態において、上記細胞は、配列番号１−１４のいずれか１つと少なくとも８５％の配列同一性をもつ配列およびそれらの組合わせからなる群より選ばれる配列由来の少なくとも１５０の連続したヌクレオチドを含むプラスミドを含有する。さらに別の好ましい態様において、上記細胞中のプラスミドは、ＯＲＦ１以外のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦ由来の最少２１の連続したヌクレオチド、ＯＲＦ１由来の少なくとも２１の連続したヌクレオチド、およびそれらの組合わせからなる群より選ばれるＰＲＲＳＶ  ＤＮＡの第二の部分領域をさらに含む。上記細胞中に含有されるプラスミドを発生させるために用いられるＰＲＲＳＶ  ＤＮＡがＰＲＲＳＶの毒性株から誘導されることも好ましい。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の他の態様において、本発明の組成物は、ＰＲＲＳＶ感染によって引き起こされる重篤な症状および徴候を完全予防または軽減する方法だけでなく、動物における免疫反応の惹起方法に有用である。
【００２９】
本発明の組成物は、医薬品上、許容しうる助剤、担体、および／または賦形剤を含有することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３０】
本明細書では、以下の定義を用いる。“配列同一性”とは、公知のとおり、２以上のポリペプチド配列間または２以上のポリヌクレオチド配列間の関係、すなわち、参照配列と、該参照配列との対比のための所定配列との間の関係をいう。配列同一性は、配列がもっとも高度に配列類似性を生じるように最適化調整した後、所定配列と参照配列とを対比することによって決定され、それら配列の鎖同士の合致により決定される。そのような調整の際には、配列同一性は、位置ごとの塩基で確認され、すなわち、その配列は、もし特定の位置において、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一であれば、その位置で“同一”である。そのような位置同一数の合計を、参照配列のヌクレオチドまたは残基数の合計で除すれば、配列同一性（％）が得られる。
【００３１】
配列同一性は、特に限定されないが、以下の文献に記載された公知の方法により容易に算出することができる。Computational Molecular Biology，レスク（Lesk），A．N.，Oxford University Press発行，New York（1988）、Biocomputing：Informatics and Genome Projects，スミス（Smith），D．W.，Academic Press発行，New York（1993）、Computer Analysis of Sequence Data，パートＩ，グリフィン（Griffin），A．M.およびH．G.，Humana Press発行，New Jersey（1994）、Sequence Analysis in Moleculer Biology，フォン  ハインゲ（von Heinge），G.，Academic Press（1987）、Sequence Analysys Primer，グリブスコフ（Gribskov），M．およびヅブリュー（Devereux），J．M．Stockton Press，New York（1991）、およびカリロ（Carillo），H．およびリップマン（Lipman），D.，SIAM J．Applied Math.，48：1073（1988）。これらの教示は引用することにより本明細書に記載されているものとする。
【００３２】
配列同一性を決定するための好ましい方法は、試験された配列同士の一致が最大となるように設計されることである。配列同一性の決定法は、所定配列間の配列同一性を決定するため公に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。そのようなプログラムとしては、特に限定されないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（ヅブリュー（Deveruex），J.ら，Nucleic Acids Research，12（1）：387（1984））、ＢＬＡＳＴＰ，ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（アルツシュール（Altschul），S．F.ら，J．Molec．Biol.，215：403-410（1990））などが例示される。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソース（ＢＬＡＳＴマニュアル，アルツシュール（Altschul），S.ら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  ベセスダ，ＭＤ  ２０８９４，アルツシュール（Altschul），S．F.ら，J．Molec．Biol．，215：403-410（1990）、これらの教示は引用することにより本明細書に記載されているものとする）。これらプログラムは、所定配列と参照配列との間での配列同一性を最大レベルにするために、デフォルトギャップウェイトを用いて、配列を最適化調整する。
【００３３】
例として、参照ヌクレオチド配列に対して少なくともたとえば９５％の“配列同一性”のヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドとは、所定ポリヌクレオチドの配列が、参照ヌクレオチド配列の各１００個のヌクレオチドあたり、突然変異を５個まで含んでよいことを除き、所定ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一性のヌクレオチド配列をもつポリヌクレオチドでは、参照配列の５％のヌクレオチドまでは欠失されるか他のヌクレオチドで置換されていてもよく、または参照配列の全ヌクレオチドの５％までのヌクレオチド数が参照配列中に挿入されていてもよい。このような参照配列の突然変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端で起きてもよく、またはこれら末端間のいずれかの位置で、参照配列中または参照配列内の１もしくは複数の連続基中のヌクレオチド間で個別に点在して起きてもよい。
【００３４】
同様に、参照アミノ酸配列に対して少なくともたとえば９５％の配列同一性をもつ所定アミノ酸配列をもつポリペプチドとは、所定ポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列の各１００個のアミノ酸あたり５個のアミノ酸の変更を含んでよいことを除き、所定ポリペプチドのアミノ酸配列が、参照配列と同一であることを意味する。換言すれば、参照アミノ酸配列と少なくとも９５％配列同一性をもつ所定ポリペプチド配列を得るためには、参照配列におけるアミノ酸残基の５％までは欠失されるか他のアミノ酸で置換されていてもよく、または参照配列中のアミノ酸残基の総数に対し５％までのアミノ酸数が参照配列中に挿入されていてもよい。このような参照配列の変更は、参照アミノ酸配列のアミノまたはカルボキシ末端で起きてもよく、またはこれら末端間のいずれかの位置で、参照配列中または参照配列内の１または複数の連続基内の残基間で個別に点在して起きてもよい。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存アミノ酸の置換数だけ異なる。しかしながら、同類置換は、配列同一性の決定時には、一致とみなされない。
【００３５】
同様に、本明細書で使用される“配列相同性”とは、２つの配列の類似性の決定方法に関する。配列相同性の決定には、２以上の配列を、上記のように最適化調整し、必要に応じてギャップを導入する。しかしながら、“配列同一性”とは対照的に、配列相同性の決定では、保存アミノ酸の置換は、一致として数えられる。換言すれば、参照配列と９５％配列相同性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るには、参照配列中のアミノ酸残基またはヌクレオチドの９５％が一致または他のアミノ酸もしくはヌクレオチドと同類置換を含む必要があり、または参照配列中の全アミノ酸残基もしくはヌクレオチド数の５％までの数のアミノ酸もしくはヌクレオチドが、ただし同類置換は含まないが、参照配列中に挿入されていてもよい。
【００３６】
“同類置換”とは、アミノ酸残基もしくはヌクレオチドを、全体的な機能を顕著に変化させない、たとえばサイズ、疎水性などの同様な特徴または特性をもつ他のアミノ酸残基もしくはヌクレオチドで置換することをいう。
【００３７】
“単離された”とは、その自然状態から“人間の手により”変化させられることを意味し、すなわち、もしそれが自然に生じるならば、そのオリジナルの環境から変更が加えられたか、または取出されたか、またはその両方を意味する。たとえば、生体内に自然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、“単離され”ていないが、その自然状態での共存物から分離されたそれと同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、本明細書で用いられる用語としての“単離された”にあたる。
【００３８】
“核酸”とは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）などのポリヌクレオチドをいい、リボ核酸（ＲＮＡ）にも適用する。また、この用語は、ヌクレオチド類似体からなるＲＮＡまたはＤＮＡの類似体も同等のものとして含み、さらに、単鎖（センスまたはアンチセンス）および二重鎖のポリヌクレオチドが記載されている態様にも適用されると解すべきである。
【００３９】
“プロモータ”とは、プロモータに動作可能に結合された選択されたＤＮＡ配列の発現を調整し、細胞中で該選択されたＤＮＡ配列の発現を生じさせるＤＮＡ配列をいう。該用語は、“組織特異性”プロモータ、すなわち選択されたＤＮＡ配列の発現を特異的細胞（たとえば特異的組織の細胞）においてのみ生じさせるプロモータを包含する。また、該用語は、最初、１つの細胞において選択されたＤＮＡの発現を調整するが、同様に他の細胞でも発現を生起する、“リーキー”と称されるプロモータをも包含する。該用語は、さらに、組織非特異性プロモータおよび構造的に発現するまたは誘導性である（すなわち発現レベルが調整可能）プロモータも包含する。
【００４０】
“トランスフェクション”は、たとえば発現ベクターを介して、核酸媒介遺伝子導入により受容細胞中への核酸の導入を意味する。本明細書において、“形質転換”は、細胞が外来ＤＮＡおよびＲＮＡを取り込んだ結果、細胞の遺伝子型が変化し、たとえば、形質転換した細胞がポリペプチドの組み換え体を発現するか、または導入された遺伝子由来のアンチセンス発現の場合には、自然発生形態のタンパク質の発現を妨害するプロセスをいう。トランスフェクションは化学試薬（すなわち脂質）を用いてもよい。
【００４１】
“ベクター”の語は、そこに結合している他の核酸を移送する能力を有する核酸分子をいう。好ましいベクターの一類型は、エピソーム、すなわち過剰染色体複製能力のある核酸である。好ましいベクターは、それが結合している核酸が自己複製および／または発現能力をもつものである。それが動作可能に結合された遺伝子の発現を誘導しうるベクターは、本明細書において、“発現ベクター”という。一般に、組み換えＤＮＡ技術で有用性ある発現ベクターは、しばしば、“プラスミド”の形態であり、プラスミドは、通常、環状二重鎖ＤＮＡループをいい、それのベクターの形態では染色体に結合していないものである。本明細書において、プラスミドがベクターのもっとも一般的な使用形態であることから、“プラスミド”および“ベクター”は、相互置き換えられる語として使用される。ベクターは、他のＤＮＡ断片を挿入して該挿入断片の複製をもたらすことができる他のレプリコン、たとえばファージまたはコスミドなどをも含む。本発明は、同等の機能を発揮し、本発明後に公知技術となるような他の形態の発現ベクターも含むことも意図する。
【００４２】
核酸またはポリヌクレオチドの“増幅”は、核酸またはポリヌクレオチド分子の１以上の複製生成（指数増幅）または核酸またはポリヌクレオチド分子の相補体のみの１以上の複製生成（リニア増幅）を達成する方法であればどの方法でもよい。増幅方法としては、変性、オリゴヌクレオチドプライマーアニーリングおよび好熱性鋳型依存ポリヌクレオチドポリメラーゼによるプライマー伸長のサイクル繰り返しに基づき、プライマーに側面配置されたポリヌクレオチド検体の所望配列のコピーを指数増加的にもたらすポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）が挙げられる。ＤＮＡの逆鎖に対合する２種のＰＣＲプライマーは、一方のプライマーのポリメラーゼで触媒された伸長産生物が他方の鋳型鎖として働くように配置されると、その長さがオリゴヌクレオチドプライマー５’端間の距離で定められる別個の二重鎖断片が累積することになる。
【００４３】
このような増幅を誘導する試薬としては、オリゴヌクレオチドプライマー、ヌクレオチドポリメラーゼおよびヌクレオシド三リン酸たとえばデオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）などが挙げられる。
【００４４】
他の増幅方法としては、単鎖オリゴヌクレオチドプライマーを用いる単鎖ポリヌクレオチドの増幅、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、核酸増幅法（ＮＡＳＢＡ）、Ｑ-β-レプリカーゼ法および３ＳＲなどが挙げられる。
本明細書に記載されたすべての参考文献の教示および内容は、引用により記載されているものとして取り込まれる。
【実施例】
【００４５】
本発明の好ましい実施態様
以下に示す実施例は、本発明の好ましい実施態様を示す。しかしながら、これら実施例は本発明の説明として提示されるものであり、これにより何ら本発明の総体的な範囲を限定するものでないと理解されるべきである。
【００４６】
（実施例１）
この実施例は、ＰＲＲＳＶゲノムのさまざまな領域を含むＤＮＡワクチンの効果に関するデータを示す。本実施例は、Spring Prairie Colony（ハーレー、ミネソタ州５６５４９）よりン入手したＰＲＲＳＶ陰性の性別混合豚４０頭で開始した。研究の開始時、豚は３−４週齢であった。研究の間、豚には、動物の大きさ、年齢、状態にみあって充分に給餌した。水は無制限に与えた。
【００４７】
ＰＲＲＳＶ  ＤＮＡワクチン作出のために、ＰＲＲＳウィルスから１９のｃＤＮＡクローンを作出した。ｐＲＲＳゲノムのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）１ａ／１ｂ領域を配列描写する１３のｃＤＮＡクローンを作出した。クローンＡは、真性のＯＲＦ１ａＡＴＧ開始コドンを用いる。残余のＯＲＦ１ａ／１ｂクローンＢないしＭは、それぞれのの５’端に付加したＡＴＧ開始コドンを有していた。上記のすべてのクローンは、それぞれＤＮＡ発現ベクターｐＶＣ１６５０中にクローニングされた。このｐＶＣ１６５０ベクターは、前初期サイトメガロウィルスプロモーターおよびイントロンＡを含み、真核生物細胞中での種々のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦｓの発現を誘導する。
【００４８】
６つの追加のｃＤＮＡクローンは、ＰＲＲＳＶ構造タンパク質ＯＲＦ２，３，４，５，６および７を描写する。ＯＲＦ２，３，４，５および６クローンも、上記と同様に、ｐＶＣ１６５０発現ベクター中にクローニングされた。ＯＲＦ７遺伝子は、ＷＲＧ７２０と称される類似発現ベクター中にクローニングされた。このＷＲＧ７２０ベクターも、真核生物細胞中での種々のＰＲＲＳＶ  ＯＲＦｓの発現を誘導する前初期サイトメガロウィルスプロモーターおよびイントロンＡを含む。
【００４９】
“Ａ１-１９”および“Ｔ１-１９”と称される２対のワクチンを作出した。Ａ１-１９ワクチンについて、上述のクローンをバレンティス社（Valentis, Inc.）ｐＶＣ１６５０発現プラスミド中にクローニングした。各プラスミド構築は、リン酸アルミニウム（Adju-PhosTM）（ウルマー（Ulmer）ら、Enhancement of DNA Vaccine Potency Using Conventional Aluminum Adjuvants；18 Vaccine,18-28(1999）を用いて別々に調製し、１ｍｌの投与量中アルミニウム理論量１０００μｇを含む各ＯＲＦクローン２５０μｇを得た。最終ワクチンは、別々の１ｍｌのＩＭ投与量の各調製ＯＲＦクローンからなる。
Ｔ１-１９ワクチンについて、上述のクローンをバレンティス社ｐＶＣ１６５０発現プラスミド中にクローニングした。各プラスミド構築は、ＴＧＶ２００ＰＩＮＣポリマーを用いて別々に調製し、１ｍｌの投与量中各ＯＲＦクローン２５０μｇを得た。最終ワクチンは、別々の１ｍｌのＩＭ投与量の各調製ＯＲＦクローンからなる。
【００５０】
対照の作出として、ＯＲＦ  ＰＣＶ２およびＳＩＶのＨＡ遺伝子のｃＤＮＡクローンからなるワクチンを生成させた。ＯＲＦはどれも、別々にバレンティス社ｐＶＣ１６５０発現プラスミド中にクローニングした。ＰＣＶ２  ＯＲＦ２およびＳＩＶのＨＡ遺伝子プラスミド構築はどちらも、リン酸アルミニウム（Adju-PhosTM）を用いて別々に調製し、１ｍｌの投与量中アルミニウム理論量１０００μｇを含む各ＯＲＦクローン２５０μｇを得た（Ａ２０およびＡ２１と称する）。さらに、ＰＣＶ２  ＯＲＦ２およびＳＩＶのＨＡ遺伝子プラスミド構築はどちらも、ＴＧＶ２００ＰＩＮＣポリマーを用いて別々に調製し、１ｍｌの投与量中各クローン２５０μｇを得た（Ｔ２０およびＴ２１と称する）。最終ワクチンは、４つ別々の１ｍｌのＩＭ投与量の各調製クローンからなる。表２は、対照ワクチンも含み、作出したすべてのワクチンを示す。
【００５１】
【表２】
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【００５２】
４０頭の豚を４つの群に分けた。群１は、０、２１および４２日目に、Ａ１−Ａ１９のAdju-Phosの各１ｍｌ投与量×１９を投与した。群２は、０、２１および４２日目に、Ｔ１−Ｔ１９のＴＧＶ２００の各１ｍｌ投与量×１９を投与した。群３は、０、２１および４２日目に、Ａ２０，Ａ２１，Ｔ２０およびＴ２１の各１ｍｌ投与量×４を投与した。群４は、陰性対照であり、なにも処理投与しなかった。
【００５３】
研究５６日目に、群１，２および３のすべての豚に、ＰＲＲＳＶの毒性ＳＤＳＵ＃７３株を投与した。ＰＲＲＳＶの毒性ＳＤＳＵ＃７３株は、豚に投与するに先立って、４％ウシ胎児血清を含むＥＭＥＭ中に１：１０希釈した。希釈した攻撃ウィルスの全量２ｍｌを経鼻的に送達し、豚に各鼻孔あたり１ｍｌの希釈ウィルスを配分した投与した。ＰＲＲＳＶ攻撃ウィルスの攻撃前および攻撃後の滴は、それぞれ１０4.59ＴＣＩＤ50／ｍｌおよび１０4.65ＴＣＩＤ50／ｍｌであった。
【００５４】
豚は、試験の０，２１，４２および５６日目に採血し、ワクチンの血清変換を観察した。また、豚は、試験の５７，５９，６１，６３，６６および７０日目にも採血し、血清変換およびウィルス血の観察も行なった。５４−７０日目の間、臨床的所見を記録した。７０日目に、豚を剖検し、全肺病巣についてＰＲＲＳＶによる肺病変のパーセントで記録した。豚は研究開始の前および５６日目および７０日目に体重測定した。この実施例のプロトコールの結果を表３に示す。
【００５５】
【表３】
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【００５６】
実施例の結果を評価するために、試験処理の効果を決定するものとして用いた主な基準は、ＰＲＲＳＶの肺病巣特徴の拡大である。基準のサポートとして、血清学的反応、攻撃後ＡＤＧおよび直腸温を測定した。実施例の結果を表４に示す。
【００５７】
【表４】
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【００５８】
Ａ１−Ａ１９  Adju-PhosまたはＴ１−Ｔ１９  ＴＧＶ２００  ＤＮＡワクチンプロトタイプそれぞれ３投与を受けた豚はいずれも、ＩＤＥＸＸ  ＰＲＲＳ  ＥＬＩＳＡで分析した結果、ＰＲＲＳＶへの血清変換はなかった。毒性ＰＲＲＳＶ攻撃の後、具体的に群２におけるＥＬＩＳＡ  Ｓ／Ｐ比は、群１よりも急速な上記のような上昇がみられた。群３（ワクチン非接種／攻撃対照）の豚は、毒性ＰＲＲＳＶ攻撃に暴露されるまでは負のＳ／Ｐ比であった。群４の完全陰性対照豚は、研究の間一貫して負のＳ／Ｐ比であった。血清学的結果を表５に示す。
【００５９】
【表５】
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【００６０】
【表６】
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【００６１】
攻撃の２日前から攻撃後１４日までの間、豚の体温を観察した。攻撃の間を通じて平均体温の基準群であるワクチン非接種／非攻撃対照の群４は、１０３．４°Ｆであった。
【００６２】
ＰＲＲＳＶ攻撃を受けたすべての群の群平均体温は、攻撃後にいくらか上昇したが、攻撃後の群平均体温の最高時である何日間での温度差はなかった。ＰＲＲＳＶ攻撃を受けたすべての群の群平均最高体温は、１０５．９〜１０６．１°Ｆの範囲であり、一方、陰性対照群の平均最高体温は、１０３．９°Ｆであった。群３は、攻撃後体温が徐々に上昇し、攻撃後９日目の最高１０６．１°Ｆになった。群１および２は、攻撃後体温の急激な上昇をみせ、攻撃後２日目にそれぞれ最高１０５．９°Ｆおよび１０５．６°Ｆになった。注目すべきは、群１および２中のＤＮＡワクチンを接種した豚での攻撃後体温の急激な上昇の仕方は、ＰＲＲＳ  ＫＶワクチンを接種した動物の攻撃後反応の仕方と同じであることである。実験的なＰＲＲＳ  ＫＶプロトタイプをワクチン接種した豚は、通常、“体液性感作”される（すなわち、ワクチン接種の後、ＰＲＲＳＶに血清反応陽性）。また、これら実験的なＰＲＲＳ  ＫＶプロトタイプをワクチン接種した動物は、本研究でのＤＮＡワクチン接種した群１および２の豚にみられるように、攻撃後、ただちに体温に上昇がみられる。ＰＲＲＳＶ攻撃に続きただちに体温上昇するとことにおけるこの類似性は、ＤＮＡワクチン接種した豚の免疫系が、実際ＰＲＲＳＶ抗原に感作されたことを追加的に示唆する。
【００６３】
群３の豚は、有効的なＰＲＲＳＶ攻撃に特徴的に見られる肺病巣を示した。群４の豚は、剖検で肺病巣はみられなかった。群１および２は、それぞれ１９．８４および２８．４２の群平均肺病巣であった。各豚の肺スコアを表６に示す。
【００６４】
【表７】
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【００６５】
【表８】
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【００６６】
これら結果から、ＰＲＲＳＶゲノムのさまざまな領域を含むＤＮＡワクチンは、呼吸器官モデルにおける毒性攻撃からの防御を惹起することができることが明らかである。
【配列表】
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【国際調査報告】
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2008503221.tif 000011
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