(57)【要約】  本発明は、動物種の幹細胞の使用であって、同じ動物系統の生物に全体又は一部が移植される生物学的代用歯を得るための使用に関するものであり、前記幹細胞は成熟細胞でもよい。本発明は更に、生物学的代用歯の作製用の歯組織を形成することが可能な細胞を培養するための、組織工学の方法を開発することを目的とする。前記歯組織は、歯組織の欠損、不全又は不足を被っている人の治療のために使用することができる。前記歯組織はまた、患者の歯列を形態学的に修正する美容的用途に使用することもでき、例えば、患者は、美容上の理由から、より大きな、若しくはより小さな歯列を有することを希望又は要求することができる。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物種の幹細胞の使用であって、
同じ動物系統の生物に全体又は一部が移植される生物学的代用歯を得るための使用。
【請求項２】
前記幹細胞が胚細胞又は成熟細胞である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記幹細胞が成熟細胞である、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
生物学的代用歯の作製用の歯組織を形成することが可能な細胞を培養するための、組織工学の方法であって、
ａ）歯組織の形成が可能な細胞を幹細胞から得るステップと、
ｂ）ステップ（ａ）で得た細胞を培養するステップと、
ｃ）培養した細胞を生分解性材料の足場中に播種するステップと、
ｄ）足場の構築体を、元の歯細胞が由来する歯組織の形成が可能な細胞を有する同じ動物系統の生物中に移植するステップと、を含み、
ステップ（ｂ）において、細胞を、先ずウシ血清及び／又はウシ胎児血清の不在下で培養する方法。
【請求項５】
前記幹細胞が胚細胞又は成熟細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記幹細胞が成熟細胞である、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記幹細胞が、歯胚、好ましくは蕾状期の歯胚、から採取された成熟細胞である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ａ）の細胞調製と、次の分化及び／又は培養と、に使用した材料を、好ましくは、約３５〜約３９℃、特に約３７℃の温度で保存する、請求項４に記載の方法。
【請求項９】
ステップ（ａ）の細胞調製に使用した材料を、抗生物質を含有する平衡塩類溶液中で保存する、請求項４に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗生物質がストレプトマイシン及び／又はペニシリンであり、
ペニシリンの使用量が約５０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシンの使用量が約５０μｇ／ｍｌである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ａ）の細胞調製に使用した材料を、コラゲナーゼ又はディスパーゼの群から選択される少なくとも１種の酵素を含有する酵素溶液の添加によって消化させる、請求項４に記載の方法。
【請求項１２】
コラゲナーゼがＩ型コラゲナーゼであり、約５ｍｇ／２５ｍｌ〜約２０ｍｇ／２５ｍｌ、特に約１０ｍｇ／２５ｍｌの濃度で存在し、
ディスパーゼがＩ型ディスパーゼであり、約３ｍｇ／２５ｍｌ〜約１５ｍｇ／２５ｍｌ、特に約５ｍｇ／２５ｍｌの濃度で存在する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記材料の温度を約３７℃に維持したまま、前記消化を機械的作用によって終了させる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養の段階が、
ｉ）ウシ血清及び／又はウシ胎児血清を含有しない増殖培地を用いて、１時間以上、特に約４８時間培養する初期、及び
ｉｉ）ウシ血清及び／又はウシ胎児血清の両方を含有する培地を用いて培養する期間、
という二相に分けられる、請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
第２の相が、
各期間に富栄養培地を少なくとも１回交換する、少なくとも２回の約４８時間の期間、或いは、
各期間に富栄養培地を少なくとも１回、特に少なくとも４回交換する、約４回の約２４時間の期間、を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
ウシ血清及び／又はウシ胎児血清が約５％〜１０％の濃度で存在する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
ウシ血清及び／又はウシ胎児血清の添加量を、約５％の濃度から開始して約１０％の濃度に達するまで、各培地交換を通じて徐々に増加させる、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞培養の期間が６日間である、請求項４に記載の方法。
【請求項１９】
前記足場が、ポリマーマトリックスを成形して得られたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項２０】
前記ポリマーマトリックスが、ポリマー、特にα−ヒドロキシルポリカプロレート（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）及び／又はポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）から作製されたものである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリマーマトリックスが、ＰＧＡから作製されたものである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記マトリックスが、９５％より高い空隙率、特に約２５０〜５００μｍの細孔を有する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記足場が、６５％〜７５％、特に７０％のエタノール、エチレンオキシドガス、又は電離放射線によって滅菌されたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項２４】
前記足場が、電離放射線、特にγ線によって滅菌されたものである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記足場が、予めコラーゲン溶液を吸収させたものである、請求項４に記載の方法。
【請求項２６】
前記コラーゲン溶液が、懸濁液又はゲルの形態で、特に約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１Ｍの塩酸濃度で、Ｉ型及び／又はＩＩ型コラーゲンを含有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記足場に、１平方センチメートル当たり約１０００万〜３０００万、特に約２０００万個の細胞を植え付ける、請求項４に記載の方法。
【請求項２８】
前記移植の段階を、好ましくは、細胞の植付けから２４時間以内、特に１２時間以内、特に約１時間以内に実施する、請求項４に記載の方法。
【請求項２９】
植付けを行った足場を、約４℃又は室温で、ドライアイス下、移植時まで保存する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
植付けを行った足場を、約３７℃の温度で、移植時まで保存する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記移植を、網中又は動物の顎中で実施する、請求項４に記載の方法。
【請求項３２】
前記移植を、動物の顎中で実施する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項４に記載の方法によって得られる歯組織の使用であって、歯組織の欠損、不全又は不足を被っている人の治療のための使用。
【請求項３４】
請求項４に記載の方法によって得られる歯組織の美容的使用であって、患者の歯列を形態学的に修正するための使用。
【請求項３５】
幹細胞を培養するための方法であって、
ｉ）ウシ血清及び／又はウシ胎児血清を含有しない増殖培地を用いて、１時間以上、特に約４８時間培養する初期、及び
ｉｉ）ウシ血清及び／又はウシ胎児血清の両方を含有する培地を用いて培養する期間、を含む方法。
【請求項３６】
請求項４に記載の方法によって得られる生物学的代用歯であって、エナメル質、象牙質及び歯髄を有する生物学的代用歯。
【発明の詳細な説明】
【発明の分野】
【０００１】
本発明は、動物種の幹細胞の使用であって、同系統の生物に全体又は一部が移植される生物学的代用歯を得るための使用に関する。幹細胞は成熟細胞でもよい。
【０００２】
本発明はまた、生物学的代用歯を得るための歯組織の形成用の細胞を培養するための、組織工学の方法、及び得られる生物学的代用歯に関する。
【０００３】
本発明はまた、歯組織の欠損、不全又は不足を被っている個体の治療のための歯組織の使用、及び歯組織の美容的使用に関する。
【０００４】
本発明はまた、幹細胞に由来する材料を培養するための方法に関する。
【発明の背景】
【０００５】
合成材料が、実は、歯成分の機能的修復は促進するが、歯の構造の解剖学的及び機能的再生は促進しないことが、歯再生の最新の知見の全体又は一部によって知られている。このような方法は、金属インプラント、主に、歯科インプラント分野の多くの会社によって開発されている骨統合歯インプラントを含む。技術の発達にもかかわらず、そのような移植は、移植患者に多くの問題を引き起こす。
【０００６】
この産業部門の成長は、いくつかの理由により歯の代用物が求められていることを示唆している。
【０００７】
組織工学、すなわち、生物学的構築物から人体のパーツの代用物を作製する技術は、生物学的再生の革新的分野であり、医学分野の大きな進歩をもたらし、更には、生理学、分子生物学及び細胞生物学、並びに工学を始めとする多くの医学専門分野の統合をもたらす可能性を有する。
【０００８】
組織工学の基本原理は、実験室で細胞を培養増殖させ、これを、生体吸収性の人工マトリックスで作製された何らかの人工の足場（ｓｃａｆｆｏｌｄ）の細孔に結合させて、組織を作製することにある。最近の研究により、いくつかのタイプの細胞が、２次元の基板中で、又は３次元のマトリックス孔内部で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された場合に、増殖し、かつその表現型的特徴を保持することができることが示されている。基本的に、これは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの組織再生を得る最善の方法である。
【０００９】
生物学的物質の取扱い上の問題に関しては、細胞の表現型的特徴及び細胞の必要量の両方を解明することが困難であることにより、細胞の表現型解析を続けるための保証が当業者の最大の関心事となっている。
【００１０】
幹細胞由来の生物学的代用歯を標的とする研究がいくつかある。国際出願ＰＣＴ／ＧＢ０１／００６５１では、歯前駆細胞を作製するために培養された神経幹細胞若しくは胚性幹細胞及び口腔上皮細胞の使用が開示されている。更なる研究が、ブタ幹細胞を用いてラット上で実施された。免疫抑制されたラットの腹部における歯組織の特性決定に関しては、Ｙｏｕｎｇら（Ｙｏｕｎｇ  ＣＳ、Ｔｅｒａｄａ  Ｓ、Ｖａｃａｎｔｉ  ＪＰ、Ｈｏｎｄａ  Ｍ、Ｂａｒｌｅｔｔ  ＪＤ、Ｙｅｌｉｃｋ  ＰＣ（２００２年）「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏｏｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ」  Ｊ．Ｄｅｎｔ．Ｒｅｓ．，８１：６９５〜７００頁）が、ブタの第３臼歯から分離し、富栄養培地中で培養し、次いで、生分解性のポリグリコール酸（ＰＧＡ）足場上に植え付けた細胞を使用した。足場及び細胞の構築体が、ロウェット（Ｒｏｗｅｔｔ）無胸腺ラットの網（ｏｍｅｎｔｕｍ）中に移植され、移植後３０週目に取り出された。組織は氷中で保存された。著者は、免疫組織化学的解析によって歯組織を同定した。この研究によって、組織工学技術による歯組織開発が可能であることが明らかとなった。
【００１１】
同様に、機械的刺激を用いてポリマー基材上で細胞を培養するための方法の開発を探求しているＨｏｎｄａらの研究グループの結果である、国際公開第０３／１０１５０３号パンフレット及び国際公開第０３／１０１５０２号パンフレットを引用することもできる。
【００１２】
その研究は、組織工学分野における大きな可能性を示しているが、使用される幹細胞が、同じ生物、又は治療対象の動物と同じ種に由来しないため、いくつかの非適合性の問題を提示している。
【００１３】
本発明の発明者らは、胚細胞由来の歯組織の他に、成熟幹細胞由来の歯組織を開発すること、又は同種の動物に由来する歯組織を開発することを探求した。
【発明の説明】
【００１４】
本発明は、動物種の幹細胞の使用であって、同系統の生物に全体又は一部が移植される生物学的代用歯を得るための使用に関する。
【００１５】
上記幹細胞は、胚細胞でも成熟細胞でもよい。本発明の特定の実施形態では、使用する歯組織は、成熟細胞から形成された歯組織、特に歯蕾細胞から形成された歯組織である。
【００１６】
本発明は更に、生物学的代用歯を得るための歯組織を形成することが可能な細胞を培養するための、組織工学の方法であって、
ａ）歯組織の形成が可能な細胞を幹細胞から得るステップと、
ｂ）ステップ（ａ）で得た細胞を培養するステップと、
ｃ）培養した細胞を生分解性材料の足場中に播種するステップと、
ｄ）足場の構築体を、元の歯細胞が由来する歯組織の形成が可能な細胞を有する同じ動物系統の生物中に移植するステップと、を含み、
ステップ（ｂ）において、細胞を、先ずウシ血清及び／又はウシ胎児血清の不在下で培養する方法に関する。
【００１７】
本発明の特定の実施形態では、これらの幹細胞は、胚細胞又は成熟細胞であり、特に成熟細胞、特に蕾状期の歯胚細胞から採取された成熟細胞である。ラットにおける移植の場合、生後３〜７日（ａｆｔｅｒ−ｂｉｒｔｈ  ｄａｙｓ，ａｂｄ）、特に４ａｂｄの動物を利用すると、安定な細胞表現型の記憶を保持するのにより十分な細胞培養が実現される。
【００１８】
歯胚は、先ず、歯堤陥凹（ｄｅｐｒｅｓｓｉｏｎ）時に、増殖性の口腔外胚葉の基底層上で組織学的に観察される。これは、隣接した馬蹄形の外胚葉性間葉組織に侵入する、上皮の帯状隆起、すなわち歯蕾前駆体であり、歯のエナメル質を形成することになる。この時期は、多角形の円柱細胞が少ない蕾状期を特徴づける。
【００１９】
本発明の特定の実施形態では、幹細胞は、蕾状期の歯蕾から採取されたものである。
【００２０】
蕾状期の後、有糸分裂が、エナメル質構造の真下の組織凝集体（ｔｉｓｓｕｅ  ｃｏｎｄｅｎｓａｔｉｏｎ）で起こり、歯髄（結合組織）を生ずる。細胞凝集体の周囲のエナメル質及び歯髄が、象牙質及び最終的な歯髄を形成する。歯小嚢細胞は、歯セメント質及び歯根膜を生じる。歯胚の段階的な増殖は、最深の胚表面における軽い陥入を特徴とする帽状期をもたらす。この段階はまた、流体で満たされ、エナメル器の保護的な緩衝機能を有する細胞である星状網細胞を形成する。このプロセスの後に鐘状期が続き、この段階では、歯の内上皮（円柱細胞。グリコーゲンと共に減少）、中間層（高い代謝能を有する扁平細胞）、これを覆う星状網（多角形細胞）、及び外上皮（立方細胞）、という４種の細胞構造体のより優れた同定が可能になる。鐘状期の後期に、上皮細胞は象牙芽細胞及びエナメル芽細胞に分化し、有機象牙質基質、次いでエナメル基質の分泌を開始する。
【００２１】
細胞作製、並びにその次の分化及び／又は培養に使用される材料は、好ましくは約３５〜３９℃、特に約３７℃で保存する。特定の実施形態では、材料は、抗生物質、主にストレプトマイシン及び／又はペニシリンを含有する平衡塩類溶液中で保存する。特に、ペニシリン約５０ユニット／ｍｌ及びストレプトマイシン約５０μｇ／ｍｌを使用する。
【００２２】
材料は、より小さな部分に切断し、歯蕾組織を消化するための組織消化酵素溶液を添加した平衡塩類溶液でリンスする。本発明の特定の実施形態では、コラゲナーゼ又はディスパーゼからなる群より選択される少なくとも１種の酵素を使用する。特に、各群の少なくとも１種の酵素が存在する。更に、好適な形態では、コラゲナーゼはＩ型コラゲナーゼであり、約５ｍｇ／２５ｍｌ〜約２０ｍｇ／２５ｍｌ、特に約１０ｍｇ／２５ｍｌの濃度で存在する。また、ディスパーゼはＩ型ディスパーゼであり、約３ｍｇ／２５ｍｌ〜約１５ｍｇ／２５ｍｌ、特に約５ｍｇ／２５ｍｌの濃度で存在する。
【００２３】
次いで、細胞の分離を、機械的ステップ、例えば、温度約３７℃、３０分間の機械的攪拌によって完了させる。
【００２４】
培地で洗浄し、培養ステップで使用可能な細胞を調製した後、細胞を、単層を形成してより広い領域で成長するように、適切な瓶中に、特に１平方センチメートル当たり約２０００万個の密度で播種する。
【００２５】
本発明によれば、細胞培養ステップ（ｂ）は、
ｉ）ウシ血清及び／又はウシ胎児血清を含有しない増殖培地を用いて、１時間以上、特に約４８時間培養する初期、及び
ｉｉ）ウシ血清及び／又はウシ胎児血清の両方を含有する培地を用いて培養する期間、
という二相に分けることができる。
【００２６】
特に、第２の相（ｉｉ）は、各期間に富栄養培地を少なくとも１回交換する、少なくとも２回の約４８時間の期間、或いは、各期間に富栄養培地を少なくとも１回、特に少なくとも４回交換する、約４回の約２４時間の期間、を含んでもよい。従って、複数回の培地交換、特に少なくとも４回の培地交換が行われる。
【００２７】
上記富栄養培地は、ウシ血清及び／又はウシ胎児血清を約５％〜１０％の濃度で含有する。本発明の別の実施形態では、ウシ血清及び／又はウシ胎児血清の添加量は、約５％の濃度から開始して約１０％の濃度に達するまで、各培地交換を通じて徐々に増加させることができる。
【００２８】
本発明の特定の実施形態では、細胞培養ステップ（ｂ）の期間は約６日間である。歯胚の発達は上皮組織及び間葉組織の間の相互作用に依存するので、培養を持続させることは、歯組織作製に特に好都合である。歯において、間葉細胞は象牙質を形成し、上皮細胞はエナメル質を形成する。石灰化された各組織はその起源細胞から形成されるが、石灰化プロセスを開始するには、上皮細胞及び間葉細胞の間の相互作用が必要である。間葉が上皮よりも多く発達すると、上皮細胞が他の細胞の発達によって抑制されて、歯組織全体の発達が困難になることがある。
【００２９】
培養後、細胞を、トリプシンとの接触によって調製し、生分解性の足場における植付け、ステップ（ｃ）のためにリンスする。
【００３０】
本発明の特定の実施形態では、足場は、例えばシリコーン成形材料を用いて、置換対象の構造体、すなわち門歯、臼歯又は小臼歯に一致するように事前に組み立てる（図１及び図２）。
【００３１】
足場作製に使用される材料は、特にポリマーマトリックス、特に、ポリカプロレート（ｐｏｌｙｃａｐｒｏｌａｔｅ  ａｃｉｄ）（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、及び／又はポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）のようなα−ヒドロキシ酸から作製されるポリマーマトリックスである。特に、ポリマーマトリックスは、ＰＧＡから作製される。本発明の好ましい実施形態では、足場作製に使用される材料は、９５％より高い空隙率、すなわち約２５０〜５００μｍの細孔を有する。
【００３２】
足場は、例えば、６５％〜７５％エタノール、特に７０％濃縮エタノールを用いて、或いはエチレンオキシドガス又は電離放射線を用いて、既知の技術により事前に滅菌する。特に、電離放射線（特に、γ線）のような、使用される材料の構造又は物理的、化学的、機械的特性を妨害しない技術を用いる。足場構造体のメンテナンスは、細胞の分布及び足場への粘着性に影響を及ぼす。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、足場に植え付けられた細胞の組織化、すなわちステップ（ｃ）は、足場が、細胞の接着を増大させるコラーゲン溶液を予め吸収させている場合に促進される。特に、上記溶液は、懸濁液又はゲルの形態で、特に約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１Ｍの塩酸濃度でＩ型及び／又はＩＩ型コラーゲンを含有する。本発明の方法によって最良の結果を実現するには、そのようにして作製された足場に、１平方センチメートル当たり約１０００万〜３０００万、特に約２０００万個の細胞を植え付ける必要がある。この細胞量は、歯組織の発達のために特に好都合であり、必要な細胞を十分な量作製することができることは、従来技術に対する本発明の最大の利点である。
【００３４】
図３は、足場中に植え付けられた歯細胞の組織化を示す。
【００３５】
足場に細胞を植え付けた後、これは、移植時まで保存するのが望ましい。本発明によれば、足場／細胞の構築体は、約４℃又は室温で、ドライアイス下、保存することができる。本発明の特定の実施形態では、材料は、約３７℃で保存する。
【００３６】
次の移植ステップ（ｄ）は、好ましくは、細胞植付けから２４時間以内、特に１２時間以内、特に約１時間以内に実施する。
【００３７】
移植それ自体は、当技術分野において公知の外科的技術によって実施する。本発明の特定の実施形態では、足場／細胞の構築体は、網（ｏｍｅｎｔｕｍ）中、特に、動物の顎（ａｎｉｍａｌ  ｊａｗ）中に移植する。
【００３８】
足場が様々な所望の形状に成形可能なこと、及び／又は、それが新規の技術を要するものではなく、通常使用される技術で実施可能なこと、の両方の理由により、移植部位の変更は当業者にとって困難でない。
【００３９】
足場／細胞の構築体は、歯組織が発達する間に十分な血液栄養素を受け取ることができるような方法で、同系ラットの網中に移植する。腹部内部で形成された歯組織の解析は、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ／Ｅ）染色法及びゴルドナー（Ｇｏｌｄｎｅｒ）のトリクローム法の両方を用いた組織学的評価によって行う。免疫組織化学的解析もまた、上皮性（ケラチン、アメロゲニン）及び間葉性（オステオカルシン、骨シアロタンパク質、象牙質リン酸シアロタンパク質）のマーカーを有する歯構造体に対する特異的抗体を用いて行う。これらの解析の結果から、生物学的に構築された歯構造体の一部として、歯のエナメル質形成を担当するエナメル芽細胞、及び象牙質形成を担当する象牙芽細胞が存在することを確認することができる。
【００４０】
本発明はまた、幹細胞を培養するための方法であって、
ｉ）ウシ血清及び／又はウシ胎児血清を含有しない増殖培地を用いて、１時間以上、特に約４８時間培養する初期、及び
ｉｉ）ウシ血清及び／又はウシ胎児血清の両方を含有する培地を用いて培養する期間、を含む方法を開発することを目的とする。
【００４１】
上記方法は、主に他の細胞（間葉細胞等）と共に、上皮細胞を培養するのに特に有用である。
【００４２】
本発明はまた、歯組織の欠損、不全又は不足を被っている人の治療のための歯組織の使用にも関する。
【００４３】
本発明の範囲にはまた、患者の歯列の形態学的修正のための歯組織の美容的使用が包含される。例えば、患者は、病理学的な理由のみならず、美容上の理由からも、より大きな、若しくはより小さな歯列を有することを希望又は要求することができる。
【００４４】
本発明は更に、本発明の方法によって得られる生物学的代用歯であって、歯髄、エナメル質及び象牙質を有する生物学的代用歯に関する。
【００４５】
以下、本発明の特定の実施形態の実施例を説明するが、これらは、添付の特許請求の範囲の記載と異なる本発明の範囲に対して、いかなる制限も加えない。
【実施例】
【００４６】
ＡＬＡＣ規則及び国立衛生研究所、プロトコールＩＡＣＵＣ  ０１−００９番、及び動物保険（ａｎｉｍａｌ  ｉｎｓｕｒａｎｃｅ）Ａ３０５１−１番に従って、「フォーサイス動物研究施設（Ｆｏｒｓｙｔｈ  Ａｎｉｍａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）」でルイスラット（Ｌｅｗｉｓ  Ｒａｔ）を飼育し、外科手術を実施した。
【００４７】
（ポリマー足場の作製）
先行文献（Ｙｏｕｎｇ  ＣＳ、Ｔｅｒａｄａ  Ｓ、Ｖａｃａｎｔｉ  ＪＰ、Ｈｏｎｄａ  Ｍ、Ｂａｒｌｅｔｔ  ＪＤ、Ｙｅｌｉｃｋ  ＰＣ  （２００２年）、「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏｏｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｔｏ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ」、Ｊ．Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．８１：６９５〜７００頁）に記載の方法に従って、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）及び乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）の両方から長方形の足場（１×５×５ｍｍ）を作製した。簡単に述べると、ＰＬＬＡ（水溶液）３重量％を含有するＰＧＡファイバーウィックをクロロホルム中の鋳型中で成形し、次いで、４８時間凍結乾燥させ、かつ電離放射線で滅菌した。ＰＶＳ鋳型の半分にＮａＣｌ結晶を充填し、かつモル比率８５：１５のＰＬＧＡのクロロホルム（５重量％）溶液で残りの部分を満たし、４８時間凍結乾燥させ、次いで、蒸留水で２４時間足場を洗浄し、かつ電離放射線で滅菌することによって、歯のＰＬＧＡ足場を作製した。
【００４８】
（ラット歯胚細胞の単離、培養及び接種）
新生ルイスラット（３〜７日齢）の発達中の胚すべてを掻爬することによって臼歯の歯蕾を単離し、抗生物質を添加したＨＢＳＳ溶液（ペニシリン５０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ）中、３７℃で保存した。次いで、この材料を１ｍｍ３未満のサイズの部分に切断し、更に、平衡塩類ハンクス溶液（ＨＢＳＳ）（ＨＢＳＳ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、ゲーサーズバーグ、ＭＤ、米国）で少なくとも５回洗浄した。次いで、ビブリオ・アジノリティカス（Ｖｉｂｒｉｏ  ａｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ）のＩ型コラゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ＭＯ、米国）１０ｍｇ／２５ｍｌ、及びバチルス・ポリミキサ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｏｌｉｍｙｘａ）のディスパーゼＩ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ社、インディアナポリス、ＩＮ、米国）５ｍｇ／２５ｍｌの酵素溶液を、組織消化のために添加した。次いで、これを３７℃のインキュベーター中に入れ、３５分間機械的に混合した。次いで、グルタマックス（ｇｌｕｔａｍａｘ）５ｍｌ、ペニシリン５０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びアスコルビン酸２．５ｍｇ／ｍｌで強化したダルベッコ改変培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ社、ゲーサーズバーグ、ＭＤ、米国）、並びにＦ１２培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社、セントルイス、ＭＯ、米国）を比率５０：５０で用いて、組織を５回洗浄した。
【００４９】
１５００ＲＰＭのスピードに調節して、温度３７℃で１０分間、冷却遠心分離機で遠心分離することによって、単離した細胞（ペレット）の懸濁液を作製した。最終の洗浄ステップの後、細胞を４０μｍナイロン篩に通してろ過し、細胞をヘマトメーターで計測した。細胞の量が培地中で希釈されて、その増殖及び拡大が促進されるように、７５平方センチメートルの細胞培養瓶（Ｔ７５）（Ｃｏｓｔａｒ、ケンブリッジ、ＭＡ、米国）中に細胞を播種した。平均細胞量は各瓶当たり少なくとも１００万個であったが、多数の瓶を要した。３７℃、湿度９５％、５％炭酸ガス中で４８時間、細胞をインキュベートした。培地は前述のものと同じである。４８時間後、培地をピペットで除去し、新しい培地を瓶中に入れた。この新しい培地は、１０％ウシ胎児血清、グルタマックス５ｍｌ、ペニシリン５０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシン５０μｇ／ｍｌ、及びアスコルビン酸２．５ｍｇ／ｍ１で強化したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、並びにＦ１２の、比率５０：５０の混合物からなる。その後、２日毎に新しい培地への交換を行い、６日間培養した。培地を除去し、平衡化リン酸溶液（ＰＢＳ。ｐＨ７．４に調整し、高圧滅菌したリン酸緩衝生理食塩水。蒸留水９００ｍｌ中ＮａＣｌ  ８．０ｇ、ＫＣｌ  ０．２ｇ、Ｎａ２ＨＰＯ４  １．４４ｇ、ＫＨ２ＰＯ４  ０．２４ｇの組成）で瓶を洗浄し、１０％ウシ胎児血清を添加した新しい培地に播種し、インキュベーター中で維持した。約６日以内に細胞が集密になった後、３７℃で約１５分間、０．２５％トリプシン及び０．０５％ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）と共に、培養物をインキュベートした。次いで、ピペット操作によって細胞を採取し、温度を約３７℃に維持したまま、１５００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。そして、新しい培地で洗浄し、再度遠心分離及び計数を行った。次いで、所定の形状を有し、γ線滅菌条件で予め滅菌し、Ｉ型コラーゲン溶液（少なくとも１２時間予め冷却した０．０１Ｍ塩酸（ＨＣｌ）中で希釈した。）を予め吸収させておいた、ＰＬＧＡ又はＰＧＡ又はＰＬＬＡ又はＰＣＬポリマーからなる足場に、細胞を植え付けた（１平方センチメートル当たり約２０００万個の細胞）。細胞を植え付ける前に、ＰＢＳで２回、更に同様に新しい培地で２回、ポリマーを洗浄した。この新しい培地は、細胞を受け入れるまで、層流下、無菌状態で保存した。次いで、同系の宿主ルイスラットの網中に移植する外科的処置を行う前に、約１時間、室温環境下又は３７℃の条件で構築体を保存し、細胞を接着させた。
【００５０】
製造業者の推奨するプロトコールに従って、パンサイトケラチンモノクローナル抗体ＰＣＫ−２６（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、セントルイス、ＭＯ、米国）を用いて、培養された歯胚上皮細胞におけるサイトケラチン発現の免疫組織化学的な解析を行った。
【００５１】
（網中への移植の方法）
６〜１２月齢の成体ルイスラット（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ウィルミントン、ＭＡ、米国）を、歯組織移植用の宿主として使用した。文献（Ｙｏｕｎｇ  ＣＳ、Ｔｅｒａｄａ  Ｓ、Ｖａｃａｎｔｉ  ＪＰ、Ｈｏｎｄａ  Ｍ、Ｂａｒｌｅｔｔ  ＪＤ、Ｙｅｌｉｃｋ  ＰＣ  （２００２年）「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏｏｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｔｏ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ」  Ｊ．Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．８１：６９５〜７００頁）に記載の手法を用いて、網の外科手術を実施した。
【００５２】
（移植組織の解析）
Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ  Ｆａｘｉｔｒｏｎ（４３８５５  ＴＯ−２モデル）機器及び高速ホログラフィー用Ｋｏｄａｋ（ａｑ）社製フィルムＳＯ−２５３を４０ＫＶ、３ｍＡで３０分間、焦点距離４０ｃｍで用いて、Ｘ線解析を実施した。視覚的検査及びＸ線検査の後、インプラントを５％ホルマリン中で２４時間固定し、脱灰し、パラフィンで包埋し、長さ６μの間隔で切断し、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ／Ｅ）法又はゴルドナー法によって染色した。文献（Ｙｏｕｎｇ  ＣＳ、Ｔｅｒａｄａ  Ｓ、Ｖａｃａｎｔｉ  ＪＰ、Ｈｏｎｄａ  Ｍ、Ｂａｒｌｅｔｔ  ＪＤ、Ｙｅｌｉｃｋ  ＰＣ（２００２年）、「Ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｔｏｏｔｈ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｔｏ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ」、Ｊ．Ｄｅｎｔ  Ｒｅｓ．８１：６９５〜７００頁）に記載の方法に従って、ポリクローナルアメロゲニン抗体を用いて、免疫組織化学的解析を行った。試料を切断、染色し、Ｌｅｉｃａ  ＤＭＲＥで構成される顕微鏡、及びデジタルカメラＺｅｉｓ  Ａｘｉｏｃａｍ（ａｑ）を用いて検査した。
【００５３】
〔結果〕
（培養されたラットの歯胚に由来する細胞の特性決定）
組織工学に最適な歯胚を有するラットの年齢を決定するために、３〜７日齢のラットの歯胚に由来する培養歯細胞の集団を調製した。各発達期間に対して、最低６匹の新生ラット（４８個の臼歯の歯蕾）を用いて、少なくとも３回実験を行った。６日間培養した後、歯細胞は、小さい方の群をなす上皮様細胞と、繊維細胞である間葉細胞様細胞と、からなる異種遺伝子型の細胞であるように見えた。５、６及び７日間の培養において、歯胚細胞は６日以内に死滅するようであり、いくつかの不安定な細胞、及び全細胞量の低下が見られた。一方、３日及び４日齢の歯胚培養細胞は健康なようであり、それぞれの歯蕾当たりの平均細胞数は２．０×１０５個及び１．５×１０５個であった。４日齢の歯胚細胞は培地中で増殖するようであったが、３日齢の歯胚細胞は増殖しなかったため、後続の歯組織工学実験のすべてにおいて使用する細胞として、４日齢のラット臼歯の歯胚細胞を選択した。
【００５４】
サイトケラチン発現の免疫組織学的解析を用いて、上皮及び間葉の歯細胞培養物の混合物中の上皮細胞を同定した。陽性で蛍光性の歯上皮細胞サイトケラチンは紫外線下で明瞭であり、容易に同定可能であったが、歯間葉細胞は蛍光バックグラウンドを示しただけであった。陽性対照の口腔上皮は、異なるサイトケラチンへの免疫反応性を示した。６日間培養した歯細胞を採取し、５％ＣＯ２、高湿環境下、３７℃で１時間、ＰＧＡ足場及びＰＬＧＡ足場の両方に植え付けた。細胞を植え付けたＰＧＡ及びＰＬＧＡ足場の光学顕微鏡的解析では、両方のポリマー足場に付着した細胞が示された。
【００５５】
（移植、実験群及び対照群）
対照群Ｃ１〜Ｃ３は、（Ｃ１）陽性対照として移植された、４日齢の分離されていない臼歯胚７つ；（Ｃ２）植付けされていないＰＧＡ足場５つ；及び（Ｃ３）植付けされていないＰＬＧＡ足場５つ、からなる。実験群Ｅ１及びＥ２は、（Ｅ１）１時間植付けされたＰＧＡ足場のインプラント８つ；（Ｅ２）１時間植付けされたＰＬＧＡ足場のインプラント８つ、からなる。実験インプラント及び対照インプラントを同系の成体ラット宿主の網中で１２週間培養した。１２週間という期間は、歯細胞（ａｑ）を植え付けられた足場インプラントにおいてＸ線不透過性組織を検出する実験から、経験的に決定されたものである。
【００５６】
（切断されたインプラントのＸ線解析及び外観）
１２週目に、実験インプラント及び対照インプラントを切断して解析した。目視検査では、インプラントの色、サイズ及び形態は同様に見えた。多数の実験インプラントが、インプラントから突出した石灰化組織の存在を示していた。実験インプラントのＸ線解析により、高度に石灰化された組織の存在が明らかにされた。陰性対照、すなわち植付けされていない足場のＣ２群及びＣ３群は、Ｘ線不透過性組織を全く含まなかった。合計で８つ中７つ（８８％）のＰＧＡインプラント、及び８つ中４つ（５０％）のＰＬＧＡインプラントが、Ｘ線不透過性組織を含んでいた（図４のＡ及びＢ、並びに図５のＡ及びＢ）。
【００５７】
（１２週目のインプラントの組織学的解析）
石灰化されたインプラントの組織細胞の組織化を測定するために組織学的解析を行った。これら１２週目のインプラントにおいて歯根膜組織及びセメント質が完全には同定可能ではない場合でさえ、対照のＣ１インプラントはすべて、正確に形成されたラットの臼歯に発達し、象牙質、エナメル質及び歯髄が同定可能であった。細胞を植え付けたインプラント、ＰＧＡ足場及びＰＬＧＡ足場の組織学的解析により、象牙質、エナメル質及び歯髄組織の存在が示された。ヘルトビッヒ上皮鞘細胞構造体が、両方のタイプの足場材料で形成された。インプラント切断物の一部において、リンパ球の浸潤が明白に示された。
【００５８】
象牙質及び骨を青色に、新たに形成されたエナメル基質を赤色に、成熟エナメル質を灰色に染色するゴルドナー染色法（Ｂａｎｃｒｏｆｔ及びＧａｍｂｌｅ、１９９９年）によって、実験インプラント群及び対照インプラント群の石灰化された組織を検査した。対照の完全な歯胚のインプラントは、青色に染色された象牙質、赤色に染色された新しいエナメル質、及び灰色に染色された、脱石灰化された成熟エナメル質の存在を示していた。同様に、ＰＧＡ足場及びＰＬＧＡ足場の両方で人工的に作製された歯組織は、青色に染色された象牙質、及び灰色の成熟エナメル質の存在を示していた。ＰＧＡ足場上で生成された歯組織は、概して、ゴルドナー染色によって灰色に染色された成熟エナメル質の方をより多く生成していたのに対し、ＰＬＧＡ足場に植え付けられた細胞は、やや赤い色から灰色に染色された未成熟エナメル質及び成熟エナメル質の両方を生成していた（図６）。
【００５９】
（生物工学により作製されたラット歯組織の免疫組織学的解析）
免疫組織化学的解析を用いて、生物工学により生成されたエナメル質におけるアメロゲニンの発現を検査した。対照の完全な歯胚のインプラントは、エナメル芽細胞、及び脱石灰化されたエナメル質においてアメロゲニンの発現陽性を示したが、免疫前の対照組織は陰性であった。ＰＧＡ及びＰＬＧＡ足場の両方において、生物工学により培養されたエナメル質は、アメロゲニンに対する染色で陽性を示した（図８）。
【００６０】
本明細書のテーマに関与するすべての当業者によって理解されることであるが、本明細書に開示の知見に基づく本発明の修正態様及び変形態様は無数に存在し、それらは、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の範囲から逸脱するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】所定の形態を有する歯型のシリコーン材料成形を示す図である。
【図２】９５％より高い空隙率、すなわち細胞成分を覆う約２５０〜５００μｍの細孔を作り出すために実験室で予め組み立てられたポリマー材料における足場獲得を示す図である。
【図３】細胞成分に結合したポリマーマトリックスの顕微鏡写真である。写真Ａ及びＢは、歯の種細胞（ｓｅｅｄ  ｃｅｌｌ）を植え付け、それぞれ１時間及び１２時間、細胞接着を待機させたＰＧＡ足場を示す。写真Ｃ及びＤは、ＰＬＧＡ足場における同様の状態を示す。
【図４】１２週間後の、網中に移植された材料を除去する前のＰＧＡ足場を示す写真である。写真Ａは肉眼像を示し、写真ＢはＸ線像を示す。
【図５】１２週間後の、網中に移植された材料を除去する前のＰＬＧＡ足場を示す写真である。写真Ａは肉眼像を示し、写真ＢはＸ線像を示す。
【図６】ゴルドナーのトリクローム法によって染色した組織切片の組織像を示す写真である。写真Ａ及びＢは、対照群Ｃ１を、それぞれ倍率５倍及び２０倍で示す。写真Ｃ及びＤは、ＰＧＡ足場移植群ＩＶを、それぞれ倍率５倍及び２０倍で示す。写真Ｅ及びＦも同様である。写真Ｇ及びＨは、ＰＬＧＡ足場移植群ＩＶを倍率４０倍で示す。
【図７】Ｈ／Ｅ法によって染色した組織切片の組織像を示す写真である。写真Ａ及びＢは、対照群Ｃ１を、それぞれ倍率５倍及び２０倍で示す。写真Ｃ及びＤは、ＰＧＡ足場移植群ＩＶを、それぞれ倍率５倍及び２０倍で示す。写真Ｅ及びＦも同様である。写真Ｇ及びＨは共に、ＰＬＧＡ足場移植群ＩＶを倍率４０倍で示す。
【図８】アメロゲニン発現の免疫組織化学的解析の結果を示す写真である。写真Ａは、Ｃ１群のアメロゲニン発現を示す。写真Ｂは、免疫前に反応させた陰性対照を示す。写真Ｃは、歯細胞を植え付けられたＰＧＡインプラント上の歯エナメル質の存在を示す。写真Ａ及びＣにおいて、茶色がかった色はエナメル質の存在を示している。
【図１】
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【図１】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年8月16日(2006.8.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的代用歯作製用の歯組織の形成が可能な細胞を培養するための、組織工学の方法であって、
ａ）歯組織の形成が可能な細胞を幹細胞から得るステップと、
ｂ）ステップ（ａ）で得た細胞を培養するステップと、
ｃ）培養した細胞を生分解性材料の足場中に播種するステップと、を含み、
ステップ（ｂ）において、細胞を、先ずウシ血清及び／又はウシ胎児血清の不在下で培養する方法。
【請求項２】
前記幹細胞が胚細胞又は成熟細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記幹細胞が、歯胚、好ましくは蕾状期の歯胚、から抽出された成熟細胞である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）の細胞調製と、それに続く分化及び／又は培養と、に使用した材料を、好ましくは、約３５〜約３９℃、特に約３７℃の温度で保存する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ａ）の細胞調製に使用した材料を、抗生物質を含有する平衡塩類溶液中で保存する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記抗生物質がストレプトマイシン及び／又はペニシリンであり、
ペニシリンの使用量が約５０ユニット／ｍｌ、ストレプトマイシンの使用量が約５０μｇ／ｍｌである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ａ）の細胞調製に使用した材料を、コラゲナーゼ又はディスパーゼの群から選択される少なくとも１種の酵素を含有する酵素溶液の添加によって消化させる、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
コラゲナーゼがＩ型コラゲナーゼであり、約５ｍｇ／２５ｍｌ〜約２０ｍｇ／２５ｍｌ、特に約１０ｍｇ／２５ｍｌの濃度で存在し、
ディスパーゼがＩ型ディスパーゼであり、約３ｍｇ／２５ｍｌ〜約１５ｍｇ／２５ｍｌ、特に約５ｍｇ／２５ｍｌの濃度で存在する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記材料の温度を約３７℃に維持したまま、前記消化を機械的作用によって終了させる、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
細胞培養ステップ（ｂ）が、
ｉ）ウシ血清及び／又はウシ胎児血清を含有しない増殖培地を用いて、１時間以上、特に約４８時間培養する初期、及び
ｉｉ）ウシ血清及び／又はウシ胎児血清の両方を含有する培地を用いて培養する期間、
という二相に分けられる、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
第２の相が、
各期間に富栄養培地を少なくとも１回交換する、少なくとも２回の約４８時間の期間、或いは、
各期間に富栄養培地を少なくとも１回、特に少なくとも４回交換する、約４回の約２４時間の期間、を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ウシ血清及び／又はウシ胎児血清が約５％〜１０％の濃度で存在する、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１３】
ウシ血清及び／又はウシ胎児血清の添加量を、約５％の濃度から開始して約１０％の濃度に達するまで、各培地交換を通じて徐々に増加させる、請求項１０又は１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞培養の期間が６日間である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記足場が、ポリマーマトリックスを成形して得られたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ポリマーマトリックスが、ポリマー、特にα−ヒドロキシルポリカプロレート（ＰＣＬ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、乳酸−グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）及び／又はポリＬ−乳酸（ＰＬＬＡ）から作製されたものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ポリマーマトリックスが、ＰＧＡから作製されたものである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記マトリックスが、９５％より高い空隙率、特に約２５０〜５００μｍの細孔を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記足場が、６５％〜７５％、特に７０％のエタノール、エチレンオキシドガス、又は電離放射線によって滅菌されたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記電離放射線がγ線である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記足場が、予めコラーゲン溶液を吸収させたものである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記コラーゲン溶液が、懸濁液又はゲルの形態で、特に約１ｍｇ／ｍｌ、約０．１Ｍの塩酸濃度で、Ｉ型及び／又はＩＩ型コラーゲンを含有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記足場に、１平方センチメートル当たり約１０００万〜３０００万、特に約２０００万個の細胞を植え付ける、請求項１に記載の方法。
【国際調査報告】
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