(57)【要約】  本発明は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）感染症を治療するための組成物および方法に関する。とりわけ本発明は、Panton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原を含むワクチン、PVL抗原と結合する抗体およびその抗体を含む組成物、そうした組成物を作製する方法、ならびに市中感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌感染症をはじめとする黄色ブドウ球菌感染症を治療する方法を提供する。本発明はまた、単独のPVLサブユニットに特異的なPVL抗体をはじめとするPVL抗体、ならびに複合体化PVL抗原および変異型PVL抗原をはじめとするPVL抗原を提供する。
2008546648.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌（S. aureus）のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原と特異的に結合する抗体であって、(i) LukF-PVサブユニットと特異的に結合するがLukS-PVサブユニットとは特異的に結合しない抗体、および(ii) LukS-PVサブユニットとは特異的に結合するがLukF-PVとは特異的に結合しない抗体、からなる群から選択される前記抗体。
【請求項２】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
(i) (a) PVL抗原としてLukF-PVサブユニットを含むがLukS-PVサブユニットは含まない組成物、および(b) PVL抗原としてLukS-PVサブユニットを含むがLukF-PVサブユニットは含まない組成物、からなる群から選択される組成物を被験体に投与すること、ならびに
(ii) 該被験体から抗体を得ること、
を含む方法によって調製される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
PVL抗原が、精製野生型PVL抗原および組換えPVL抗原からなる群から選択される、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
PVL抗原が、そのアミノ酸配列中に、その野生型アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む変異を有する、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
前記変異が、(i) 細胞膜へのPVLの結合を妨げる変異、(ii) 膜貫通領域のステムもしくは細胞質側の先端がLukSもしくはLukFに向けてアンフォールディングしないようにする変異、(iii) LukF-PVとLukS-PVの組み立て（assembly）を阻止する変異、(iv) Ca2+チャネル活性を阻害する変異、(v) PVL孔の活性を阻害する変異、(vi) LukS-PVのリン酸化部位を変更する変異、(vii) LukF-PV の膜結合クレフトを崩壊させる変異、(viii) PVL抗原の「アミノラッチ（amino latch）」のN末端欠失をもたらす変異、ならびに(ix) プレステムのアンフォールディングおよび膜への挿入を妨げるシステイン二重変異体を生じる変異、からなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
PVL抗原が(i) E191A、(ii) R197A、(iii) W176A、および(iv) Y179Aからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するLukF-PVサブユニットを含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
PVL抗原が(i) T28F、(ii) T28N、および(iii) T28Dからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するLukS-PVサブユニットを含む、請求項６に記載の抗体。
【請求項１０】
PVL抗原が別の細菌抗原と複合体化している、請求項４に記載の抗体。
【請求項１１】
PVL抗原が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される抗原と複合体化している、請求項１０に記載の抗体。
【請求項１２】
請求項１に記載の抗体、および製薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項１３】
前記組成物がIVIG組成物である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記組成物が高度免疫特異的IVIG組成物である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原に対する１つまたはそれ以上の抗体をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
１つまたはそれ以上の抗体が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたはそれ以上の黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体からなる群から選択される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載の抗体を含む組成物を、個体に投与することを含む、個体においてPVL関連細胞毒性を中和する方法。
【請求項１８】
前記抗体がLukS-PVに特異的に結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記抗体がLukF-PVに特異的に結合する、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
サンプルを、請求項１に記載の抗体と接触させることを含む、サンプル中のPVL抗原を検出する方法。
【請求項２１】
黄色ブドウ球菌のPVL抗原、および製薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項２２】
PVL抗原が別の細菌抗原と複合体化している、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
別の細菌抗原が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
(a) LukS-PVサブユニットと複合体化したLukF-PVサブユニット、(b) 別のLukF-PVサブユニットと複合体化したLukF-PVサブユニット、および(c) 別のLukS-PVサブユニットと複合体化したLukS-PVサブユニットからなる群から選択されるPVL抗原複合体を含む、請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
PVL抗原が、LukF-PVまたはLukS-PVアミノ酸配列の少なくとも一方に、その野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む変異を有する、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２６】
PVL抗原が、(i) 細胞膜へのPVLの結合を妨げる変異、(ii) 膜貫通領域のステムもしくは細胞質側の先端がLukSもしくはLukFに向けてアンフォールディングしないようにする変異、(iii) LukF-PVとLukS-PVの組み立てを阻止する変異、(iv) Ca2+チャネル活性を阻害する変異、(v) PVL孔の活性を阻害する変異、(vi) LukS-PVのリン酸化部位を変更する変異、(vii) LukF-PVの膜結合クレフトを崩壊させる変異、(viii) PVL抗原の「アミノラッチ」のN末端欠失をもたらす変異、ならびに(ix) プレステムのアンフォールディングおよび膜への挿入を妨げるシステイン二重変異体を生じる変異、からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２７】
PVL抗原が(i) E191A、(ii) R197A、(iii) W176A、および(iv) Y179Aからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するLukF-PVサブユニットを含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２８】
PVL抗原が(i) T28F、(ii) T28N、および(iii) T28Dからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するLukS-PVサブユニットを含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項２９】
組成物が、(a) 変異型LukF-PVサブユニットおよび野生型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、(b) 野生型LukF-PVサブユニットおよび変異型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、ならびに(c) 変異型LukF-PVサブユニットおよび変異型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、からなる群から選択されるPVL抗原を含む、請求項２５に記載の組成物。
【請求項３０】
組成物がLukF-PVサブユニットを含むがLukS-PVサブユニットは含まない、またはLukS-PVサブユニットを含むがLukF-PVサブユニットは含まない、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３１】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項３２】
前記１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
１つまたはそれ以上の追加のPVL抗原をさらに含む、請求項３１に記載の組成物。
【請求項３４】
別の細菌抗原と複合体化した、黄色ブドウ球菌のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原を含む、PVL抗原。
【請求項３５】
PVL抗原が、精製野生型PVL抗原および組換えPVL抗原からなる群から選択される、請求項１に記載のPVL抗原。
【請求項３６】
別の細菌抗原が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌 PSl、表皮ブドウ球菌 GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される、請求項３４に記載のPVL抗原。
【請求項３７】
(i) LukS-PVサブユニットと複合体化したLukF-PVサブユニット、(ii) 別のLukF-PVサブユニットと複合体化したLukF-PVサブユニット、および(iii) 別のLukS-PVサブユニットと複合体化したLukS-PVサブユニットからなる群から選択される複合体を含む、請求項３４に記載のPVL抗原。
【請求項３８】
LukF-PVサブユニットとLukS-PVサブユニットの融合タンパク質または化学的複合体を含む、請求項３７に記載のPVL抗原。
【請求項３９】
(a) LukF-PVサブユニットを含むがLukS-PVサブユニットは含まないPVL抗原、および(b) LukS-PVサブユニットを含むがLukF-PVサブユニットは含まないPVL抗原、からなる群から選択される、請求項３４に記載のPVL抗原。
【請求項４０】
LukF-PVまたはLukS-PVアミノ酸配列の少なくとも一方に、その野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む変異を有する、PVL抗原。
【請求項４１】
前記変異が、(i)細胞膜へのPVLの結合を妨げる変異、(ii)膜貫通領域のステムもしくは細胞質側の先端がLukSもしくはLukFに向けてアンフォールディングしないようにする変異、(iii) LukF-PVとLukS-PVの組み立てを阻止する変異、(iv) Ca2+チャネル活性を阻害する変異、(v) PVL孔の活性を阻害する変異、(vi) LukS-PVのリン酸化部位を変更する変異、(vii) LukF-PVの膜結合クレフトを崩壊させる変異、(viii) PVL抗原の「アミノラッチ」のN末端欠失をもたらす変異、ならびに(ix) プレステムのアンフォールディングおよび膜への挿入を妨げるシステイン二重変異体を生じる変異、からなる群から選択される、請求項４０に記載のPVL抗原。
【請求項４２】
PVL抗原が(i) E191A、(ii) R197A、(iii) W176A、および(iv) Y179Aからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するLukF-PVサブユニットを含む、請求項４０に記載のPVL抗原。
【請求項４３】
PVL抗原が(i) T28F、(ii) T28N、および(iii) T28Dからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するLukS-PVサブユニットを含む、請求項４０に記載のPVL抗原。
【請求項４４】
(a) LukF-PVサブユニットは含むがLukS-PVサブユニットは含まないPVL抗原、(b) LukS-PVサブユニットは含むがLukF-PVサブユニットは含まないPVL抗原、(c) 変異型LukF-PVサブユニットおよび野生型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、(d) 野生型LukF-PVサブユニットおよび変異型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、ならびに(e) 変異型LukF-PVサブユニットおよび変異型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、からなる群から選択される、請求項４０に記載のPVL抗原。
【請求項４５】
請求項３４または４０に記載のPVL抗原に特異的に結合する抗体。
【請求項４６】
請求項１７、２２、２５または３１のいずれか１つに記載の組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、黄色ブドウ球菌感染症を治療または予防する方法。
【請求項４７】
抗感染薬、抗生物質、および抗微生物薬からなる群から選択される薬剤を投与することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
抗生物質薬剤が、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびリゾスタフィンからなる群から選択される、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
黄色ブドウ球菌感染症が、市中感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（CA-MRSA）感染症、皮膚もしくは軟部組織感染症、壊死性肺炎、乳腺炎、壊死性筋膜炎、ウォーターハウス・フリードリクセン（Waterhouse Friderichsen）症候群、CA-MRSA敗血症、ならびにPVL抗原を発現する黄色ブドウ球菌菌株による感染症、からなる群から選択される、請求項４６に記載の方法。
【請求項５０】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原に対する１つまたはそれ以上の抗体を投与することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５１】
１つまたはそれ以上の抗体が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体からなる群から選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原を投与することをさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項５３】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
(i) PVL抗原を被験体に投与すること、(ii) 被験体から血漿を採取すること、および(iii) 被験体からの免疫グロブリンを精製すること、を含む、高度免疫特異的IVIG製剤を製造する方法。
【請求項５５】
PVL抗原が、(a) LukF-PVサブユニットは含むがLukS-PVサブユニットは含まないPVL抗原、(b) LukS-PVサブユニットは含むがLukF-PVサブユニットは含まないPVL抗原、(c) 変異型LukF-PVサブユニットおよび野生型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、(d) 野生型LukF-PVサブユニットおよび変異型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、(e) 変異型LukF-PVサブユニットおよび変異型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、ならびに(f) 別の細菌抗原と複合体化したPVL抗原、からなる群から選択される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
PVL抗原が、LukF-PVまたはLukS-PVアミノ酸配列の少なくとも一方に、その野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む変異を有する、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
PVL抗原が、(i) LukS-PVサブユニットと複合体化したLukF-PVサブユニット、(ii) 別のLukF-PVサブユニットと複合体化したLukF-PVサブユニット、ならびに(iii) 別のLukS-PVサブユニットと複合体化したLukS-PVサブユニットからなる群から選択される複合体を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５８】
PVL抗原が別の細菌抗原と複合体化している、請求項５４に記載の方法。
【請求項５９】
被験体に別の細菌抗原を投与することをさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項６０】
(i) PVL抗原を投与されたことのない被験体を、高力価の抗PVL抗体についてスクリーニングすること、(ii) その被験体から血漿を採取すること、および(iii) その被験体からの免疫グロブリンを精製することを含む、高度免疫特異的IVIG製剤を製造する方法。
【請求項６１】
(i) 黄色ブドウ球菌のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原と特異的に結合する抗体を含む、静脈注射用免疫グロブリン（IVIG）組成物、および(ii) 製薬上許容される担体、を含む組成物であって、前記IVIG組成物が、通常のIVIGにおいて認められるよりも少なくとも2倍高い抗PVL抗体価を有する、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2005年6月13日に出願された米国仮出願第60/689,526号（この出願は参照により本明細書に組み入れられる）に対して優先権を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は全体としては、細菌感染の治療および予防に関する。より詳細には、本明細書で開示されるのは、Panton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原またはそれに特異的に結合する抗体を含む組成物を使用して、市中感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（CA-MRSA）感染をはじめとする黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus (S. aureus)）感染を治療および予防する組成物ならびに方法である。本発明はまた、全体としては、LukF-PVおよびLukS-PVタンパク質、該タンパク質の変異型、ならびにそれらPVLサブユニットの融合タンパク質組み合わせ体に関する、抗体および抗原に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
しばしば"staph"、"Staph. aureus"、または"S. aureus"と呼ばれる黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）細菌は、通常、健康な個体の皮膚上もしくは鼻内に保持されている。人口の約20〜30%は、常時、黄色ブドウ球菌が定着している。この細菌は多くの場合、吹き出物やおできのような軽度の感染を引き起こす。しかしながら、黄色ブドウ球菌は、重篤で、死に至らしめるおそれのある菌血症も引き起こすものであり、菌血症は血流中に生菌が存在することを特徴とする病状である。
【０００４】
黄色ブドウ球菌は、莢膜多糖およびタンパク質毒素を含む、多くの病原性因子を発現する。PVLは、SHT毒素（synergohymenotropic toxin）ファミリーに属する黄色ブドウ球菌タンパク質であるが、このファミリーの毒素は２つの関連のないクラスの分泌タンパク質もしくはサブユニットの相乗作用によって、宿主防御細胞、白血球、および赤血球の膜を損傷する。Supersacら、Infect. Immun. 61:580-7 (1993)。このタンパク質ファミリーには、α-ヘモリシン（α毒素）、β-ヘモリシン、δ-ヘモリシン、γ-ヘモリシン、ロイコシジン（Luk）およびPVLタンパク質（LukS-PVおよびLukF-PV）が含まれる。
【０００５】
PVLは最初に、黄色ブドウ球菌に白血球毒性が認められることによって発見された。Van der Velde, La Cellule, 10:401-9 (1894). のちにPantonおよびValentineは、慢性せつ腫症（furnuculosis）患者に由来するV8株においてPVLと他のヘモリシンを識別することができた。Panton P., Lancet, 222:506-8 (1932). Woodinは、その後、PVLが2つのサブユニット、LukS-PVおよびLukF-PVから構成されることを発見した。Woodin AM., Biochem. J., 73:225-37 (1959) ならびにWoodin AM., Biochem. J., 75:158-65 (1960)。
【０００６】
PVLは、ウサギおよびヒトの多形核白血球（PMN）およびマクロファージに対する孔誘発により、白血球毒性があることが明らかになった。Finck-Barbanconら、Biochim. Biophys. Acta, 1182:275-82 (1993)。精製PVLは、ウサギに皮内注射すると重い炎症性病変を引き起こし、毛細血管拡張、走化性、PMN浸潤、PMN核崩壊、ならびに皮膚の壊死をもたらす。Prevostら、J. Med. Microbiol., 42:237-45 (1995)およびWardら、Infect. Immun., 28:393-7 (1980)。PVLの白血球毒性ならびに溶血作用は、2つのPVLサブユニットの逐次結合および相乗的な関連を伴う。始めに、LukS-PVが膜標的と相互作用する（Colinら、Infect. Immun. 62:3184-8 (1994)）。その後LukF-PVサブユニットがLukS-PVサブユニットと結合する。Woodin, AM およびWieneke AA, Biochem J, 105:1029-1038 (1967) ならびにColinら、上記。
【０００７】
LukS-PVおよびLukF-PVは、病院関連の黄色ブドウ球菌分離株のうちほんのわずかな割合の株でしか発現されない（Prevostら、Infect. Immun., 63:4121-9 (1995)）が、世界中に広がった市中感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（CA-MRSA）菌株では、PVL発現が優勢であると思われる。Dufourら、Clin. Infect. Dis., 35:819-24 (2002)ならびにVandeneschら、Emerg. Infect. Dis., 9:978-84 (2003)。実際、CA-MRSAの出現および蔓延は近年、膿瘍およびせつ腫症（Linaら、Clin. Infect. Dis., 29: 1128-32 (1999) およびKazakovaら、N. Engl. J. Med., 352:468-75 (2005)）、ならびに壊死性肺炎のような重症な毒血症を含むさまざまな疾患の大発生を招いている。Francisら、Clin. Infect. Dis., 40:100-7 (2005)。
【０００８】
米国では黄色ブドウ球菌菌株の50%より多くが今ではメチシリン耐性であると推定される。たとえば、1999年に、全米院内感染サーベイランスシステム（NNISS）に報告されたすべての黄色ブドウ球菌分離株の54.5%がメチシリン耐性であった。疾病管理センターは、2002年に、米国内で約100,000件の院内感染型MRSA感染があったと推定しているが、この感染の問題は悪化するばかりである。メチシリン耐性の割合は、特定のアジアおよびヨーロッパの国々で非常に高い（たとえば、日本ではMRSA比率72%；香港では74%）。
【０００９】
その結果、抗生物質耐性株は現在、黄色ブドウ球菌感染の治療に問題を引き起こしており、新たな治療手段が開発されない限りこの問題は悪くなる一方であろう。したがって、一般的には黄色ブドウ球菌感染を、とりわけCA-MRSA感染を治療する組成物および方法が必要である。
【００１０】
PVL抗原を用いてワクチンを作る従前の試みは、投与される抗原の毒性および有効性がないことなどの重大な欠点をかかえていた。たとえば、Banffer & Franken, Path. Microbiol. 30: 16-74 (1967)は、ロイコシジントキソイド（PVL）による妊婦の免疫化、ならびに、抗体レベルおよび乳腺炎発症率へのその効果を報告している。著者らは、免疫された被験者において抗ロイコシジン抗体の増加を認めたが、乳腺炎の発生には統計的に有意な差は見られなかった。著者らは、免疫された被験者153人のうち11人が、「触知可能な腋窩リンパ腺を伴う注射部位の痛みを報告したこと（中程度）」、および「3症例で、反応が重症と見なされたこと」を記載している。
【００１１】
Gladstone, Br. J. Exp. Path. 54: 255-59 (1973)は、この著者らによってなされた研究について、精製ロイコシジン（LukF-PVおよびLukS-PVサブユニットの両方を含む）の、ブドウ球菌感染に対する治療上の有効性を示したとされているとコメントしているが、「健康な人にそれを使用することは…しばしば観察される各種局所反応および全身反応により禁忌である」ことを認めている。この著者は、ホルマリンを用いて無毒化された精製ロイコシジン製剤による免疫化の結果を報告しており、17人のうち16人は免疫化に十分耐えられたが、17人目の被験者は発熱、倦怠感および嘔吐を経験したことが注目される。著者はまた、免疫された被験者における抗ロイコシジン抗体レベルにはかなりばらつきがあることを報告している。この論文では、ホルマリン無毒化ロイコシジン製剤の予防もしくは治療上の有効性は調べなかった。
【００１２】
Ward & Turner, Infect. & Immun. 27: 393-97 (1980)は、LukF-PV製剤およびLukS-PV製剤を用いて実施された実験を報告しているが、ただし、各製剤がLukF-PVおよびLukS-PVの両方に対して抗体を生じることが示されたため、これらの製剤の純度は不明であり、このことは純度不足または抗原の交差反応性を示唆する。この著者らは、LukF-PV製剤による免疫化が、LukF-PV、LukS-PV、またはその両者の投与によるその後のチャレンジに対して防御をもたらすのに対して、LukS-PV製剤を用いた免疫化は、いずれのチャレンジに対しても防御をもたらさないことを見出した。しかしながら、LukF-PVおよびLukS-PVチャレンジが毒性応答を引き起こしたという事実は、一方のサブユニット単独では毒性がないので、それぞれの製剤に異種サブユニットが混入していたことを示唆する。
【００１３】
抗PVL抗体の潜在的有用性に関して、Gauduchonら、J. Infect. Dis. 189: 346 (2004)は、市販のIVIG製剤がin vitroで黄色ブドウ球菌PVLを中和することができることを見出した。著者らは、精製した組換えPVL（rLukF-PVおよびrLukS-PV）を使用して、市販のIVIG製剤中の抗PVL抗体を確認した。組換えによって作製された抗原をIVIGとともにプレインキュベートすることによって、IVIG濃度に依存して細胞毒性が阻害されることが見出された。同様の結果は、2つの異なる黄色ブドウ球菌PVL産生株の培養上清をIVIGとともにプレインキュベートしたときにも認められた。しかしながら、その著者らは、報告された活性が、抗PVL抗体それ自体によるものであることを立証しておらず、IVIGの全般的な免疫調節効果について対照をとらなかった。
【００１４】
したがって、黄色ブドウ球菌感染を治療および予防する方法に有用な、PVL抗原およびPVL抗体を含む組成物が依然として必要である。
【発明の開示】
【００１５】
概要
本発明は、PVL抗体および抗原組成物、それらを作製する方法、ならびにそれらを用いて黄色ブドウ球菌感染を予防および治療する方法を提供する。
【００１６】
ある実施形態において、本発明は、黄色ブドウ球菌のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原に特異的に結合する抗体であって、(i) LukF-PVサブユニットと特異的に結合するが、LukS-PVサブユニットとは特異的に結合しない抗体、および(ii) LukS-PVサブユニットとは特異的に結合するが、LukF-PVとは特異的に結合しない抗体、からなる群から選択される抗体を提供する。その抗体は、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体でありうる。ある特定の実施形態において、該抗体は、(i)(a) PVL抗原としてLukF-PVサブユニットを含むがLukS-PVサブユニットを含まない組成物、および(b) PVL抗原としてLukS-PVサブユニットを含むがLukF-PVサブユニットは含まない組成物からなる群から選択される組成物を被験体に投与すること、ならびに(ii)その被験体から抗体を得ることを含む方法によって調製される。
【００１７】
本発明はまた、抗体および製薬上許容される担体を含む組成物を提供するが、ある特定の実施形態において、該組成物はIVIG組成物または高度免疫特異的IVIG組成物である。ある特定の実施形態において、抗体組成物はさらに、1つまたはそれ以上の他の細菌抗原に対する1つまたはそれ以上の抗体、たとえば、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌 PSl、表皮ブドウ球菌 GPl、α毒素、リポタイコ酸 (LTA),および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分(microbial surface components recognizing adhesive matrix molecule; MSCRAMM)タンパク質からなる群から選択される１つまたはそれ以上の黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体、ならびにそれらの組み合わせを含む。
【００１８】
本発明はまた、個体においてPVL関連細胞毒性を中和する方法をであって、該抗体を含む組成物を個体に投与することを含む方法を提供する。ある実施形態において、該抗体は特異的にLukS-PVと結合する。別の実施形態では、該抗体はLukF-PVに、特異的に結合する。
【００１９】
本発明はまた、サンプルを該抗体と接触させることを含む、サンプル中のPVL抗原を検出する方法を提供する。
【００２０】
本発明のもう一つの態様は、PVL抗原に関する。ある実施形態において、本発明は、別の細菌抗原と複合体化（conjugated）した、黄色ブドウ球菌のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原を含むPVL抗原を提供する。ある実施形態において、PVL抗原は、(a) LukF-PVサブユニットを含むがLukS-PVサブユニットは含まないPVL抗原、および(b) LukS-PVサブユニットを含むがLukF-PVサブユニットは含まないPVL抗原からなる群から選択される。ある実施形態において、PVL抗原は、精製された野生型PVL抗原および組換えPVL抗原からなる群から選択される。ある実施形態において、もう一方の細菌抗原は、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸(LTA)、および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分(MSCRAMM)タンパク質からなる群から選択される。別の実施形態において、もう一方の細菌抗原は別のPVLサブユニットであり、このPVL抗原は、(i) LukS-PVサブユニットと複合体化したLukF-PVサブユニット、(ii) 別のLukF-PVサブユニットと複合体化したLukF-PVサブユニット、および(iii) 別のLukS-PVサブユニットと複合体化したLukS-PVサブユニット、からなる群から選択される複合体を含む。ある実施形態において、該複合体は融合タンパク質もしくは化学複合体である。
【００２１】
別の実施形態において、本発明は、LukF-PVまたはLukS-PVアミノ酸配列の少なくとも一方に、その野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入または欠失を含む変異を含むPVL抗原を提供する。ある実施形態において、その変異は、(i) 細胞膜へのPVLの結合を妨げる変異、(ii) 膜貫通領域のステムもしくは細胞質側の先端がLukSもしくはLukFに向けてアンフォールディングしないようにする変異、(iii) LukF-PVとLukS-PVの組み立て（assembly）を阻止する変異、(iv) Ca2+チャネル活性を阻害する変異、(v) PVL孔の活性を阻害する変異、(vi) LukS-PVのリン酸化部位を変更する変異、(vii) LukF-PVの膜結合クレフト（cleft）を崩壊させる変異、(viii) PVL抗原の「アミノラッチ（"amino latch"）」のN末端欠失をもたらす変異、ならびに(ix)プレステムのアンフォールディングおよび膜への挿入を妨げるシステイン二重変異体を生じる変異、からなる群から選択される。ある特定の実施形態において、PVL抗原は、(i) E191A、(ii) R197A、(iii) W176A、および(iv) Y179Aからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するLukF-PVサブユニットを含む。もう一つの特定の実施形態において、PVL抗原は、(i) T28F、(ii) T28N、および(iii) T28Dからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するLukS-PVサブユニットを含む。ある実施形態において、PVL抗原は、(a) LukF-PVサブユニットを含むがLukS-PVサブユニットは含まないPVL抗原、(b) LukS-PVサブユニットを含むがLukF-PVサブユニットは含まないPVL抗原、(c) 変異型LukF-PVサブユニットおよび野生型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、(d)野生型LukF-PVサブユニットおよび変異型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、ならびに(e) 変異型LukF-PVサブユニットおよび変異型LukS-PVサブユニットを含むPVL抗原、からなる群から選択される。
【００２２】
本発明はまた、黄色ブドウ球菌のPVL抗原および製薬上許容される担体を含む組成物を提供する。PVL抗原は、上記の任意の抗原とすることができる。ある実施形態において、該組成物はLukF-PVサブユニットおよびLukS-PVサブユニットを含む。別の実施形態において、該組成物はLukF-PVサブユニットを含むがLukS-PVサブユニットは含まないか、またはLukS-PVサブユニットを含むがLukF-PVサブユニットは含まない。ある実施形態において、該組成物はさらに、１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原を含む。ある特定の実施形態において、１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原は、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8および黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸(LTA)、ならびに接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分(MSCRAMM)タンパク質からなる群から選択される。
【００２３】
本発明はまた、本明細書に記載のPVL抗原のいずれかと特異的に結合する抗体を提供する。
【００２４】
本発明はまた、黄色ブドウ球菌感染を治療または予防する方法であって、それを必要とする被験体に、本明細書に記載の抗体または抗原を含有する組成物を投与することを含む方法を提供する。該方法は、抗感染薬、抗生物質、および抗微生物薬からなる群から選択される薬剤を投与することをさらに含んでもよい。ある実施形態において、抗生物質薬剤は、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびリゾスタフィンからなる群から選択される。ある実施形態において、黄色ブドウ球菌感染症は、市中感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（CA-MRSA）感染症、皮膚もしくは軟部組織感染症、壊死性肺炎、乳腺炎、壊死性筋膜炎、ウォーターハウス・フリードリクセン（Waterhouse Friderichsen）症候群、CA-MRSA敗血症、ならびにPVL抗原を発現する黄色ブドウ球菌菌株による感染症からなる群から選択される。
【００２５】
ある実施形態において、上記方法は、１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原に対する１つまたはそれ以上の抗体を投与することをさらに含む。ある特定の実施形態において、１つまたはそれ以上の抗体は、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8および黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸(LTA)、ならびに 接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分(MSCRAMM)タンパク質からなる群から選択される黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体からなる群から選択される。もう一つの実施形態において、該方法は、１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原を投与することをさらに含む。ある特定の実施形態において、１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原は、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8および黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸(LTA)、ならびに 接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分(MSCRAMM)タンパク質からなる群から選択される。
【００２６】
本発明はまた、高度免疫特異的IVIG製剤を製造する方法であって、(i) PVL抗原を被験体に投与すること、(ii) その被験体から血漿を採取すること、および(iii) その被験体からの免疫グロブリンを精製することを含む方法も提供する。代替的な実施形態において、本発明は高度免疫特異的IVIG製剤を製造する方法であって、(i) PVL抗原を投与されたことのない被験体を、高力価の抗PVL抗体についてスクリーニングすること、(ii) その被験体から血漿を採取すること、および(iii) その被験体からの免疫グロブリンを精製することを含む方法を提供する。本発明はまた、(i) 黄色ブドウ球菌のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原に特異的に結合する抗体を含む、静脈注射用免疫グロブリン（IVIG）組成物、および(ii) 製薬上許容される担体、を含む組成物を提供するが、このIVIG組成物は、標準的なIVIGで認められるよりも少なくとも2倍高い抗PVL抗体力価を有する。
【００２７】
本発明のさらなる態様は下記に、より詳細に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
詳細な説明
本発明は、CA-MRSA感染症を含めた黄色ブドウ球菌感染症を治療および予防する組成物ならびに方法を提供する。該組成物は、より詳細に以下に定義および記載されるPVL抗原、またはPVL抗原に特異的に結合する抗体を含む。該方法は、本発明のPVL抗体またはPVL抗原組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む。
【００２９】
以下の議論において、"a," "an,"および"the"は、特に指定のない限り「単数もしくは複数」を意味する。さらに、本発明の態様が、代替物のリストを参照して記載される場合、本発明はその代替リストの任意の個々のメンバーまたはサブグループ、ならびにそれらのうちの１つまたはそれ以上からなる任意の組み合わせを包含する。
【００３０】
I. 組成物
Panton Valentineロイコシジン（PVL）抗原
本発明はPVL抗原を含む組成物を提供する。本明細書で使用される場合、「PVL抗原」は、単離精製された野生型PVL抗原、組換えPVL抗原、LukS-PVサブユニットのみまたはLukF-PVサブユニットのみを含有するPVL抗原、ならびにLukS-PVおよびLukF-PVサブユニットの両方を含有するPVL抗原をいう。たとえば、LukS-PVおよびLukF-PVサブユニットを含む野生型PVL抗原は、黄色ブドウ球菌原株V8（ATCC 49775）から一連のクロマトグラフィー工程を用いて精製することができる。Finck-Barbanconら、 Biochim. Biophys. Acta, 1182:275-82 (1993) およびPrevostら、Infect. Immun., 63:4121-9 (1995)。
【００３１】
ある実施形態では、PVL抗原は組換えPVL抗原である。本明細書で使用される場合、「組換えPVL抗原」という用語は、組換えDNA技術によって作製されたPVL抗原を呼ぶ。こうした組換えDNA技術は、当技術分野でよく知られている。一般的に言って、組換えPVL抗原は、野生型PVLがその天然の状態で付随する他のタンパク質および細胞成分（たとえば、ブドウ球菌細胞内に存在するタンパク質および細胞成分）を含まない。
【００３２】
ある実施形態によれば、PVL抗原は精製PVL抗原である。本明細書で使用される場合、「精製PVL抗原」という用語は、野生型PVLが、その天然の状態で付随する他のタンパク質および細胞成分（たとえば、ブドウ球菌細胞内に存在するタンパク質および細胞成分）から少なくとも部分的に分離されたPVL抗原をいう。
【００３３】
本発明の特定の実施形態において、単一のPVLサブユニットの製剤が提供されるが、これはたとえば、LukS-PVを含まないLukF-PV製剤、またはLukF-PVを含まないLukS-PV製剤である。こうした製剤の純度は、たとえば、LukF-PV製剤に対して生じた抗体がLukS-PVとは特異的に結合しないこと、またはLukS-PV製剤に対して生じた抗体がLukF-PVとは特異的に結合しないことを実証することによって確認することができる。ある実施形態において、単独のPVLサブユニットを含む製剤は、他のPVLサブユニットをコードする機能的遺伝子を含有しない（また、含有するよう操作されていない）宿主におけるその単独のPVLサブユニットの組換え発現によって得られる。
【００３４】
本発明のある態様によると、LukF-PVおよびLukS-PVサブユニットは、大腸菌（E. coli）細胞において組換えにより発現され、その後、イオン交換クロマトグラフィー（たとえば、SPセファロースカラムを使用する）とそれに続くアフィニティクロマトグラフィー（たとえば、セラミックヒドロキシアパタイト（CHT）カラムを使用する）を含めた2段階カラムスキームを用いて大腸菌から精製される。
【００３５】
本明細書に記載のPVL抗原は、PVL抗原断片、LukS-PVサブユニット断片、およびLukF-PVサブユニット断片もいう。本発明で使用するのに適した断片は、野生型PVL抗原に類似した抗原性を有する。たとえば、PVL抗原断片、LukS-PVサブユニット断片、およびLukF-PVサブユニット断片は、野生型PVL抗原を特異的に認識する抗体を誘導する断片である。
【００３６】
本発明のPVL抗原（LukS-PVおよび／またはLukF-PVサブユニット、ならびにPVLおよびサブユニット断片を含む）は、LukS-PVサブユニット、LukF-PVサブユニットのいずれか一方、またはその両方に、1つもしくはそれ以上のアミノ酸挿入、置換または欠失を含んでいてもよい。たとえば、LukF-PVまたはLukS-PV配列内の１つまたはそれ以上のアミノ酸残基を、機能上等価なものとして機能する、類似の極性を有する別のアミノ酸で置換することが可能であり、その結果サイレントな変化を生じる。該配列内のアミノ酸を置換するものは、そのアミノ酸が属するクラスの他のメンバーから選択することができる。たとえば、非極性（疎水性）アミノ酸には、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが含まれる。極性中性アミノ酸には、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが含まれる。正荷電（塩基性）アミノ酸には、アルギニン、リジンおよびヒスチジンが含まれる。負荷電（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。あるいはまた、無毒化と関連して下記でより詳細に検討される変異を含め、非保存的アミノ酸変化が作製されうる。したがって、ある実施形態において、非保存的アミノ酸変化をPVL抗原に作製して、タンパク質を無毒化し、またはタンパク質を安定化して膜内への挿入を妨げる。
【００３７】
本明細書に記載の「PVL抗原」は改変を受けたPVL抗原も意味し、そのような改変はたとえば、(i) 細胞膜へのPVLの結合を妨げる改変、(ii) 膜貫通領域のステムもしくは細胞質側の先端がLukSもしくはLukFに向けてアンフォールディングしないようにする改変、(iii) LukF-PVとLukS-PVの組み立てを阻止する改変、(iv) Ca2+チャネル活性を阻害する改変、(v) PVL孔の活性を阻害する改変、(vi) LukS-PVのリン酸化部位を変更する改変、(vii) LukF-PVの膜結合クレフトを崩壊させる改変、(viii) PVL抗原の「アミノラッチ」のN末端欠失をもたらす改変、ならびに(ix) プレステムのアンフォールディングおよび膜への挿入を妨げるシステイン二重変異体を生じる改変である。
【００３８】
下記に詳細に記載するように、これらの改変の1つまたはそれ以上は、化学処理、複合体化、およびアミノ酸の欠失もしくは置換のような変異を含む方法によって、達成することができる。
【００３９】
ある実施形態において、PVL抗原は無毒化PVL抗原である。本明細書で使用される場合、「無毒化」PVL抗原は、好中球の細胞カルシウムチャネルを通じた2価カチオンの流入、もしくはPVL孔を通じた1価カチオンの流入、またはPVL孔の形成を生じさせない。
【００４０】
ヒト多形核好中球（PMN）に対するPVLの毒性は、当技術分野で知られている技術、たとえば、光学もしくは蛍光顕微鏡法、フローサイトメトリー、および蛍光定量法によって測定することができる。Staaliら、J Membrane Biol. 162: 209-216 (1998), Meunierら、Cytometry 21 : 241-247 (1995), Wernerら、Infection and Immunity: 70: (3) 1310-1318 (2002)を参照されたい。たとえば、PVL抗原は、PMN膜上の既存の細胞カルシウムチャネルの開口を誘導する。カルシウムチャネルの開口およびそれに続くカルシウム流入は、蛍光指示薬Fura2、Fluo3、Fluo4またはCalcium 3を用いてモニターすることが可能であり、成熟好中球（PMN）への分化のためにDMSOを用いて細胞内へのCa+の流入を測定するアッセイが確立されている。
【００４１】
加えて、PVLは、そのサブユニットを細胞膜内に挿入することによって別個の孔を形成する。孔形成は、1価カチオンの細胞への流入、もしくは細胞からの流出によって測定することができる。臭化エチジウムも、こうした孔を通って細胞に入ることができるので、臭化エチジウムを用いて1価カチオンの流入を追跡することができる。臭化エチジウムは細胞に入ると、核酸とインターカレートし、その結果蛍光を発する。細胞内の蛍光は、蛍光顕微鏡を用いて視覚的に、または蛍光光度計を用いて定量的に、検出することができる。同様に、PBFI (ホスフェート結合性蛍光指示薬)およびNa-Greenといった蛍光指示薬はカリウムおよびナトリウムをキレート化するが、これらを用いてPVL孔の形成をモニターすることができる。
【００４２】
ある実施形態において、PVL抗原は分子的に無毒化されており、これは、当技術分野で知られている方法、たとえば元のKunkel法（Kunkel, TA, Proc. Acad. Sci., USA, 82:488-492 (1985)）による一本鎖鋳型または二本鎖DNA鋳型（Papworthら、Strategies, 9(3):3-4 (1996)）を用いた、およびPCRクローニング（Braman,J.編、IN VITRO MUTAGENESIS PROTOCOLS, 第2版、Humana Press, Totowa, NJ (2002), Ishii et al., Meth. EnzymoL, 293, 53-71 (1998), Kammann et al, Nucleic Acids Res., 17:5404 (1989), Hemsley et al, Nucleic Acids Res., 17:6545-6551 (1989), Giebel et al, Nucleic Acids Res., 18:4947 (1990), Landt et al., Gene, 96:125-128 (1990), Stemmer et al, BioTechniques, 13:214-220 (1992), Marini et al, Nucleic Acids Res., 21 :2277-2278 (1993), and Weiner et al, Gene, 151:119-123 (1994)）による、プラスミド鋳型上のプライマー伸長法などによって、達成することができる。
【００４３】
もう一つの実施形態において、PVL抗原は、化学的な手段、たとえば、PVL抗原を別の分子と複合体化（conjugate）することによって、無毒化される。この実施形態には、別の分子との複合体化以外のいかなる手段によっても無毒化されないPVL抗原が含まれる。もう一つの実施形態において、PVL抗原は、別の抗原、たとえば、別のPVL抗原と複合体化している。たとえば、LukF-PVサブユニットを別のLukF-PVサブユニット、またはLukS-PVサブユニットと、複合体化することができる。いかなる理論によっても拘束されたくはないが、本発明者らは、LukS-PVサブユニットのLukF-PVサブユニットとの複合体化が、直接であれリンカーを介してであれ、抗原が毒性のある状態に折り畳まれないようにすることによって、たとえば、SおよびFサブユニットが毒性を示すのに必要な様式で相互作用しないようにすることによって、該抗原を無毒化することができると考える。
【００４４】
別の実施形態において、PVL抗原は別の抗原と複合体化されるが、この別の抗原としてはたとえば、グラム陰性もしくはグラム陽性抗原、別のブドウ球菌抗原、および／または細菌多糖などの別の細菌抗原がある。たとえば、PVL抗原は、１つまたはそれ以上の他の黄色ブドウ球菌抗原、たとえば、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、LTA、MSCRAMM、他の防御抗原もしくは毒素、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原と、複合体化することができる。もう一つの実施形態において、PVL抗原は、LukF-PVまたはLukS-PVアミノ酸配列のうち少なくとも一方における、少なくとも1つのアミノ酸の置換、挿入、または欠失を含む変異によって無毒化される。
【００４５】
ワクチンなどの本組成物は、LukF-PVサブユニットおよびLukS-PVサブユニットの一方もしくは両方を含みうる。ある実施形態では、ワクチンなどの組成物は、1つまたはそれ以上の黄色ブドウ球菌抗原、たとえば、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸(LTA)、および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分(MSCRAMM)タンパク質、他の防御抗原もしくは毒素、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される抗原も含む。このように、たとえば、本発明のワクチン組成物は、PVL-Type 5複合体、PVL-Type 8複合体、PVL-Type 336複合体、PVL-PSl複合体、PVL-GPl複合体、PVL-α毒素複合体、PVL-LTA複合体、もしくはPVL-MSCRAMM複合体を含んでもよく、この場合これらの複合体はいずれもPVL抗原を含む。
【００４６】
ある実施形態において、PVL抗原は誘導体化され、別の細菌抗原、たとえば別の黄色ブドウ球菌抗原、たとえば黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される抗原、他の防御抗原もしくは毒素、ならびにそれらの組み合わせと、結合している。たとえば、Type 5またはType 8抗原は、1-エチル-3-(3-ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド(EDAC)によって活性化され、システアミン誘導体を形成することができる。PVLを、N-スクシンイミジル-3-(-2-ピリジルジチオ)プロピオネート(SPDP)で修飾した後、チオールの置換によってT5 CPもしくはT8 CPのシステアミン誘導体と複合体化する。その結果得られる複合体は、サイズ排除クロマトグラフィーによって、複合体化していない抗原から分離することができる。
【００４７】
別の実施形態において、たとえば、臭化シアンもしくは1-シアノ-4-ジメチルアミノ-ピリジニウムテトラフルオロホウ酸塩を用いて、抗原上のヒドロキシル基を活性化すること、ならびに求核基を含むリンカーを介して、もしくはリンカーなしでPVLと結合することにより、PVL抗原を336抗原と複合体化する。たとえば、Kohnら、FEBS Lett., 154: 209:210 (1993); Schneersonら、J. Exp. Med., 152:361-376 (1980); Chuら、Infect. Immun., 40:245-256 (1983); Kossaczkaら、Infect. Immun., 68:5037-5043 (2000)を参照されたい。得られた複合体を次に、複合体化していない抗原から分離することができる。類似の方法を用いて、PVL抗原をLTAと複合体化することができる。
【００４８】
もう一つの実施形態において、PVL抗原は、黄色ブドウ球菌のほとんどの病原性菌株によって産生される、孔形成性の溶血性外毒素タンパク質である、α毒素（αヘモリシン）と複合体化される。
【００４９】
さらに別の実施形態においては、たとえば、アジピン酸ジヒドラジド（ADH）を用いて、EDC促進性反応を介して表皮ブドウ球菌PS1もしくはGP1を改変し、PS1のアジピン酸ヒドラジド誘導体（PS1AH）を調製することにより、PVL抗原をPS1抗原またはGP1抗原と複合体化する。PVL抗原をその後スクシニル化し、PVLのコハク酸誘導体（PVLsuc）をPS1AHと複合体化するが、これはEDCを介して行われる。同様の方法を用いてLTAとPVL抗原を複合体化することができる。
【００５０】
当技術分野で知られている他の複合体化法があるが、それはたとえば、過ヨウ素酸酸化に続く還元的アミノ化、カルボジイミド処理、および、PSとタンパク質担体との直接的もしくは間接的（リンカーを介する）な共有結合をもたらしそれによって複合体を生成することができる他の方法ならびに／またはそれらのさまざまな組み合わせである。たとえば、ビス（スルホスクシンイミジル）スベラート(BS3)のような、速やかに第一級アミンと反応する不可逆性ホモ二官能性架橋剤を用いて、PVL抗原と別のタンパク質を処理することによって、PVL抗原をその別のタンパク質と複合体化することができる。Partisら、J. Prot. Chem. 2: 263-77 (1983)も参照されたい。抗原を担体タンパク質に複合体化するために使用される方法にかかわらず、PSとタンパク質担体との共有結合によって、PSは、T細胞非依存性抗原からT細胞依存性抗原へと変換される。結果として、PSタンパク質複合体は、PS単独を投与したときにはそうした応答が見られないのとは対照的に、免疫された動物においてPS特異的抗体応答を惹起する。
【００５１】
上記のように、本発明はLukS-PVおよびLukF-PVを含む融合タンパク質、または2つのLukF-PVサブユニットを含む、もしくは2つのLukS-PVサブユニットを含む融合タンパク質を意図する。こうした融合タンパク質は、組換え法によって、または化学的な複合体化によって作製することができる。
【００５２】
ある実施形態において、本発明の融合タンパク質は、適切に構築されたDNA配列を用いて発現される。たとえば、LukF-PVサブユニットをコードする核酸配列を、LukS-PVサブユニットをコードする核酸配列に直接的、または間接的に結合してもよいが、例を挙げると、LukF-PV核酸の一方の末端をLukS-PV核酸の一端に直接連結してもよく、またはそうしたサブユニットをコードする配列を、「リンカー」または「スペーサー」核酸配列で隔ててもよい。本発明は、LukF-PVサブユニットがその3'末端でLukS-PVサブユニットに直接的、または間接的に連結されているものを含む融合タンパク質を包含する。本発明はまた、LukS-PVサブユニットがその3'末端でLukF-PVサブユニットに直接的、または間接的に連結されているものを含む融合タンパク質を包含する。
【００５３】
本発明は、同一のまたは別の発現ベクター中での、同一の構築物または別々の構築物中での、LukF-PVおよびLukS-PVサブユニットの組換え発現を意図する。したがって、たとえば、LukF-PVをコードするDNA配列、およびLukS-PVをコードするDNA配列は、単一の構築物内に、発現のための適当な調節エレメント、たとえば、プロモーターおよびターミネーターに、機能しうるように連結されて存在してもよい。あるいはまた、本発明は2つの構築物（１つはLukF-PV発現用、1つはLukS-PV発現用）を用いた発現を意図する。このような実施形態において、それぞれのサブユニット配列は、その自身の調節エレメントに機能しうるように連結され、たとえば、異なるプロモーターがそれぞれのサブユニットの発現を駆動するものでもよい。発現構築物は、同一の発現ベクター中に存在してもよいが、異なる発現ベクター内に存在してもよい。したがって、本発明は、LukS-PVおよびLukF-PVサブユニットの両方の配列を含む単一のmRNAを組換え技術によって転写すること、またはそれぞれが所定のサブユニットをコードする少なくとも2つのmRNA転写物を、組換え技術によって転写することを意図する。単一の発現ベクターを使用する場合、単一の宿主細胞が発現のために用いられ、それは両方のサブユニットを産生するであろう。2つ以上の発現ベクターを使用する場合、１つまたはそれ以上の宿主細胞を発現のために使用することができる。たとえば、すべてのベクターについて単一の細胞を使用することができるが、ベクター毎に1つの細胞を用いてもよく、1つのベクターに対して1つの細胞を用い、別の細胞を1つまたはそれ以上のベクターについて使用することもできる。
【００５４】
このように、本発明は、それぞれが特定のサブユニットを組換え法によって発現する複数の細胞株を意図する。1つの細胞株から発現されるサブユニットを単離した後、別の細胞株から発現され単離された別のサブユニットに連結することができる。この実施形態において、2つのサブユニットは、化学的に、たとえば化学的な複合体化によって、連結することができる。もちろん、本発明は、組換え以外の手段によって得られたPVLサブユニット、たとえば、天然PVLのサブユニット、または細胞もしくはブドウ球菌モデル系のゲノムから発現されたサブユニットの化学的複合体化も意図する。
【００５５】
PVL融合タンパク質が組換え技術を用いて作られるか、化学的な複合体化を用いて作られるかにかかわらず、LukF-PVおよびLukS-PVサブユニットのいずれか一方または両方が、1つまたはそれ以上のアミノ酸変異、たとえば、野生型配列に比較した、アミノ酸置換、挿入、または欠失、を含みうる。したがって、PVL融合タンパク質は、(i) 変異型LukF-PVおよび野生型LukS-PV、(ii) 変異型LukS-PVおよび野生型LukF-PV、または(iii) 変異型LukF-PVおよび変異型LukS-PVを含みうる。
【００５６】
本発明の一部の実施形態においては、PVL抗原は、LukF-PVもしくはLukS-PVアミノ酸配列中に少なくとも1つのアミノ酸の変異を含有するようにPVL抗原を改変することによって無毒化される。その変異の例としては、細胞膜へのPVL結合を妨げるもの、膜貫通領域の「ステム」もしくは細胞質側の先端がLukS-PVもしくはLukF-PVに向けてアンフォールディングしないようにするもの、LukF-PVサブユニットおよび／またはLukS-PVサブユニットの組み立てを阻止するもの、Ca2+チャネル活性を阻害するもの、PVL孔の活性を阻害するもの、LukS-PVのリン酸化部位を変更するもの、ならびに／またはLukF-PVの膜結合クレフトを崩壊させるものがありうる。変異の例としては、内部ジスルフィド結合を生成もしくは除去するもの、リン酸化部位を生成もしくは除去するもの、またはLukF-PVサブユニットとLukS-PVサブユニットとの間の相互作用を排除するものがありうる。変異には、少なくとも１つの点変異、少なくとも１つのアミノ酸欠失、またはそれらの組み合わせを含みうる。
【００５７】
ある実施形態において、LukS-PVサブユニットのThr28は、たとえばロイシン、フェニルアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、ヒスチジンもしくはシステインで置換される。この位置での変異は、ロイコトキシンの組み立てに影響を及ぼす。たとえば、Guilletら、J. Biol. Chem., 279:41028-41037 (2004)を参照されたい。
【００５８】
別の実施形態において、γヘモリシン由来のLukSのThr246での変異が作製される。このアミノ酸位置が、γヘモリシンの白血球溶解活性を担うことが報告されている。Nariyaら、FEBS Letters, 415:96-100 (1997)を参照されたいが、これは全体として参照により本明細書に含められる。LukS-PVの推定リン酸化部位であるThr244での点変異、またはLukS-PVのThr240〜Thr244残基の欠失も作製されうるが、これはLukS-PVの白血球溶解活性を喪失させるものである。
【００５９】
本明細書で意図される他の変異としては、LukF-PVの膜貫通領域の「ステム」もしくは細胞質側の先端における、Val110、Val114、Tyr116、Tyr118、Ile122、Ile124および／またはLeu128等での、少なくとも１つの点変異および／または少なくとも１つの欠失、ならびにLukS-PVのステムにおける、Val103、Val105、Leu109、Tyr111、Ile113およびPhe117等での、同様の変異が挙げられる。Leu128〜Ser135、Ile124〜Ser129、および／またはSer125〜Leu128の間の１つまたはそれ以上のアミノ酸欠失も本発明に含まれる。こうした変異によって、PVLの孔形成活性のCa2+誘導を失わせることができる。Moussaら、FEBS Letters, 461:280-286 (1999)およびWernerら、Infect. Immun., 70:1310-1318 (2002)を参照されたいが、これらは全体として参照により本明細書に含められる。
【００６０】
本発明で意図される他の変異には、PVL抗原の「アミノラッチ」のN末端欠失、たとえば、LukF-PVのAla1〜Val12、LukF-PVのIle124〜Ser129、および／またはLukS-PVのAsp1〜Ile7、Phe117〜Ser122における欠失を、生じさせる変異がある。さらに、βサンドイッチコアとプレステムの間にジスルフィド結合を生じさせて、プレステムのアンフォールディングおよび膜への挿入を妨げるシステイン二重変異体を生じる変異も、本発明での使用に適している。たとえば、Val13Cys-Lys136Cys、Asp43Cys-Tyr116CysもしくはSer45Cys-Gly119CysといったLukF-PVシステイン変異体、またはIle7Cys-Asn130CysおよびAsp38Cys-Ile113CysといったLukS-PVシステイン変異体、あるいは類似の変異体が本発明で意図される。たとえば、本発明はLukS-PVのβサンドイッチ接触領域における変異を意図する。したがって、この領域における特定の変異には、T28F、T28N、およびT28Dがあるが、それに限定されない。たとえば、LukS-PVの28位または28位に相当するアミノ酸位置にあるスレオニンが、フェニルアラニン、アスパラギン、もしくはアスパラギン酸で置換される。本発明はまた、LukS-PVのリン酸化部位における変異であって、その部位でのリン酸化をなくす、または減少させるものも意図する。したがって、この領域の１つの特定の変異としてはT244Aがあるがそれに限定されない。
【００６１】
本発明において意図される他の変異には、LukF-PVの膜結合クレフトを崩壊させる変異（たとえば、推定ホスファチジルコリン結合クレフト中）が挙げられる。たとえば、N173、W176、Y179、E191およびR197位でのLukF-PV変異体が、本発明で意図される。このように、本発明で意図される１つの特定の変異体にはE191Aが含まれるが、それに限定されない。それはたとえば、LukF-PVの191位または191位に相当するアミノ酸位置にあるグルタミン酸がアラニンで置換される。同様に、他の特定のLukF-PV変異には、N173A、W176A、R197A、およびY179Aがある。
【００６２】
本発明は、上記の1つまたはそれ以上の変異の組み合わせを有するPVL抗原、たとえば、アミノラッチの欠失したPVL抗原、およびLukS-PVのリン酸化部位での点変異体を意図する。
組成物／ワクチン
本発明は、PVL抗原および製薬上許容される担体を含む、ワクチンを含めた組成物を提供する。PVL抗原は、精製野生型PVL抗原もしくは組換えPVL抗原を含めて、上記のいずれの抗原でもよい。PVL抗原は、LukF-PVサブユニット、LukS-PVサブユニット、またはその両方を含んでもよいし、あるいはPVLの断片、LukF-PVサブユニットの断片、LukS-PVサブユニットの断片、もしくは両方の断片を含んでもよい。PVL抗原は、上記のように、改変された抗原および／または無毒化された抗原であってもよく、別のPVL抗原もしくは別の分子、たとえば別の細菌抗原と複合体化することができる。PVL抗原は、１つまたはそれ以上の上記の変異、たとえば２つの変異を含むことができる。
【００６３】
ワクチンを作製する方法は当技術分野で広く知られている。たとえば、Di Tommasoら、Vaccine, 15:1218-24 (1997)、ならびにFattomら、Infect. and Immun. 58:2367-2374 (1990) および64:1659-1665 (1996)を参照されたい。
【００６４】
本発明のワクチンは典型的には、製薬上許容される担体を含む。製薬上許容される担体は、その材料はワクチン投与との関連で、不活性であるか、さもなければ製薬上許容されるものであり、同時に前記活性物質と適合するために、ブドウ球菌抗原の媒体として使用することができる材料である。適当な賦形剤に加えて、製薬上許容される担体は、希釈剤、アジュバントおよび他の免疫賦活剤、抗酸化剤、保存剤ならびに可溶化剤のような従来のワクチン添加物を含有することができる。たとえば、凝集を最小限にし、可溶化剤として機能するように、ポリソルベート80を添加してもよく、pH調整のためにバッファーを加えることもできる。本明細書に記載のワクチン製剤は、比較的容易に、組成物を損なうことなく、アジュバントの添加が可能となる。
【００６５】
加えて、本発明のワクチンは、投与部位において抗原性物質の保持性を高める「デポー」成分を含むように製剤することができる。一例として、アジュバントの他に（それが使用されている場合）、ミョウバン（水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニウム）、QS-21、デキストラン硫酸、またはミネラルオイルを、こうしたデポー効果を与えるために添加することができる。
【００６６】
抗体
本発明はまた、黄色ブドウ球菌のPVL抗原、たとえば上記のPVL抗原のいずれかと特異的に結合する抗体（PVL抗体）を含み、製薬上許容される担体とともに製剤化される組成物を提供する。本発明の抗体組成物は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、抗体フラグメント、またはそれらの組み合わせを含むことができる。
【００６７】
本明細書に記載の「PVL抗体」は、全長（すなわち、天然に存在する、もしくは正常な免疫グロブリン遺伝子断片のリコンビナトリアル法によって作製された）免疫グロブリン分子（たとえば、IgG抗体）、または抗体フラグメントを含む、免疫グロブリン分子の免疫学的に活性のある（すなわち、特異的に結合する）部分をいう。抗体フラグメントは、F(ab')2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、sFvなどといった、抗体の一部である。構造のいかんを問わず、抗体フラグメントは全長抗体によって認識される同一抗体と結合し、本発明との関連では、PVL抗原と特異的に結合する。抗体フラグメントを作製しスクリーニングする方法は当技術分野でよく知られている。
【００６８】
本発明のPVL抗体は、数多くの種々の方法によって調製することができる。たとえば、PVL抗体はPVL抗原を投与された被験体から、またはPVL抗体についてスクリーニングされた血漿から、下記により詳細に記載するようにして得ることができる。もう一つの実施形態によれば、PVL抗体は、組換え法によって作製される。組換えモノクローナル抗体は、当技術分野で広く知られる技術によって作製することができる。組換えポリクローナル抗体は、免疫原としてPVL抗原を用いて、米国特許出願第2002/0009453号 (Haurumら)に記載の方法と同様の方法で、作製することができる。
【００６９】
本発明のPVL抗体は、マウス抗体、ヒト抗体、もしくはヒト化抗体でありうる。ヒト化抗体は、ある種に由来する抗体のCDR、たとえば、齧歯類の抗体のCDRを、齧歯類抗体の重鎖および軽鎖可変鎖からヒトの重鎖および軽鎖可変領域へと導入した組換えタンパク質である。この抗体分子の定常領域はヒト抗体に由来する。ヒト化抗体の作製方法は当技術分野でよく知られている。
【００７０】
ある実施形態において、LukS-PVと特異的に結合する抗体は、LukF-PVとは特異的に結合しない。別の実施形態において、LukF-PVと特異的に結合する抗体はLukS-PVとは特異的に結合しない。したがって、たとえば、抗LukS-PV抗体はLukF-PVと交差反応せず、抗LukF-PV抗体はLukS-PVと交差反応しない。
【００７１】
ある実施形態において、本発明の抗体は、たとえば天然もしくは融合タンパク質上の立体構造エピトープに特異的に結合することによって、天然の状態（たとえば、その天然のフォールディング状態、および／または他のPVLサブユニットと複合体化したその天然の状態）で存在するようにPVL上にあるPVLサブユニット（たとえば、LukF-PVもしくはLukS-PV）上のエピトープに特異的に結合するか、または、PVLサブユニットを含む融合タンパク質上に存在するエピトープに特異的に結合する。他の実施形態において、本発明の抗体は、たとえば、線状エピトープに特異的に結合することによって、その３次元構造にかかわらず、1つのPVLサブユニットに特異的に結合する。
【００７２】
ある実施形態において、本発明の抗体は、本明細書に記載の１つまたはそれ以上の変異型PVL抗原に特異的に結合するが、当該抗原の野生型とは交差反応しない。したがって、本発明は、本明細書に記載の組換え融合タンパク質もしくは化学的に複合体化された融合タンパク質の１つと、特異的に結合する抗体を包含する。さらに、本発明の抗体は、その野生型抗原と交差反応することなく、本明細書に記載の1つまたはそれ以上の変異型PVL抗原と特異的に結合することができる。ある実施形態において、変異型PVL抗原は、天然のPVL変異体またはバリアントの変異を有するようにデザインされているが、そうした変異型PVL抗原に特異的な抗体は、自然発生PVL変異体またはバリアントを標的とする診断法および治療法において有用である。
【００７３】
本発明のある方法は、1つまたはそれ以上のそうした抗体を個体に投与することを伴う。ある実施形態において、抗体は抗LukS-PV抗体である。別の実施形態において、抗体は抗LukF-PV抗体である。さらに別の実施形態において、上記抗体の一方もしくは両方、たとえば、抗LukF-PV抗体および／または抗LukS-PV抗体は、同時に、もしくは連続的に投与される。あるいはまた、ただ１つの抗体が個体に投与される。
【００７４】
上記抗体は、従来法によって得られる。たとえば、PVL抗原（上記）を被験体に投与し、その結果得られたIgGを、標準的な方法によって、被験体から採取された血漿から精製することができる。PVL抗体を得るために使用されるPVL抗原は、上記の任意のPVL抗原とすることができる。ある実施形態において、PVL抗体を得るために使用されるPVL抗原は、変異もしくは複合体化によることを含め、上記の教示にしたがって、非毒性とされる。あるいはまた、抗体は組換え法によって作製することができる。
【００７５】
抗体組成物
本発明は、抗体および製薬上許容される担体を含む組成物のような、投与に適した抗体組成物を包含する。抗体組成物は、当技術分野で知られている方法によって、静脈内、筋肉内、皮下および経皮などの任意の投与経路用に製剤化することができる。
【００７６】
ある実施形態において、抗体組成物はIVIG組成物である。本明細書で使用される場合、「IVIG」は、静脈内投与に適した免疫グロブリン組成物を指す。「特異的IVIG」は、本明細書で使用される場合、１つまたはそれ以上のPVL抗原、たとえば、上記PVL抗原の任意のものに特異的なIVIGをいう。
【００７７】
ある実施形態によれば、本発明は、上記PVL抗原のいずれかのような、黄色ブドウ球菌のPVL抗原と特異的に結合する抗体、および製薬上許容される担体を含むIVIG組成物を含む、PVL抗体組成物を提供する。
【００７８】
ある実施形態によると、PVL抗体を含むIVIG組成物は、PVL抗原で刺激されたドナー被験体から採取された血漿から得られる。この実施形態にしたがって、（上記のいずれかのような）PVL抗原は、PVL抗体の産生を誘発するために、ヒト、もしくはマウスを含む他の動物等の被験体に投与される。ある実施形態において、PVL抗原は、ワクチンとして投与される。ワクチンの成分として、PVL抗原は、たとえば上記の任意の方法によって、無毒化されている。PVL抗原と特異的に結合する抗体は、その後、たとえば、従来の血漿分画法によって血漿から免疫グロブリンを得ることによって、被験体から得られる。
【００７９】
上記実施形態のある特定の態様において、PVL抗体は、高度免疫特異的免疫グロブリン（IVIG）製剤として得られる。「高度免疫特異的IVIG」は、高力価のPVL抗体を含有するIVIG製剤を指す。高度免疫特異的IVIG組成物は、PVL抗原を被験体に投与し、その被験体から血漿を採取して、従来の血漿分画法によってその血漿から高度免疫特異的IVIGを得ることによって、得ることができる。あるいはまた、高度免疫特異的IVIG組成物は、PVL抗原を投与されたことのない被験体（未刺激の被験体）から得られた血漿から得ることができる。こうした実施例において、未刺激の被験体由来の血漿は、LukS-PV、LukF-PVの一方だけ、もしくは両方を含むPVL抗原をはじめとするPVL抗原に対する抗体の高力価についてスクリーニングされる。ある実施形態において、標準的なIVIG製剤で典型的に見られるレベルより2倍以上高いPVL抗体力価について、血漿をスクリーニングし、そうした血漿を用いて高度免疫特異的IVIG組成物を調製する。この場合もやはり、被験体はヒトもしくは動物のいずれかであってよい。
【００８０】
PVL抗体組成物を得るために使用されるPVL抗原は、精製された野生型PVL抗原、組換えPVL抗原、LukF-PVサブユニットおよびLukS-PVサブユニットの一方もしくは両方を含むPVL抗原、１つまたはそれ以上のアミノ酸挿入、置換を有するPVL抗原、LukF-PVまたはLukS-PVアミノ酸配列の少なくとも一方において欠失を有するPVL抗原、改変されたPVL抗原、PVL抗原の断片、または無毒化されたPVL抗原（別のPVL抗原もしくは別の分子と複合体化することによって無毒化されたPVL抗原を含む）を含めて、上記のいかなるPVL抗原であってもよい。
【００８１】
ある実施形態によれば、本発明のPVL抗体組成物（IVIGおよび高度免疫特異的IVIG組成物を含む）は、さらに、下記のような、１つまたはそれ以上のブドウ球菌抗原に対する１つまたはそれ以上の抗体を含む。下記のように、黄色ブドウ球菌抗原の例としては、Type 5、Type 8、およびType 336ブドウ球菌抗原がある。表皮ブドウ球菌抗原の例としてはPS1およびGP1がある。たとえば、組成物は、黄色ブドウ球菌抗原からなる群から選択される抗原、たとえば、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌Type 336、表皮ブドウ球菌PS1、表皮ブドウ球菌GP1、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分(MSCRAMM)タンパク質からなる群から選択される抗原、他の防御抗原もしくは毒素、ならびにそれらの組み合わせ、に対する抗体を含むことができる。したがって、ある実施形態において、本発明のIVIG組成物は、PVL抗原と結合し別のブドウ球菌とも結合する少なくとも１つの抗体、またはPVL抗原と結合する少なくとも１つの抗体、および別のブドウ球菌抗原と結合する少なくとも１つの抗体を含む。
【００８２】
追加的な随意の抗原／抗体成分
上記のPVL抗原もしくは抗体に加えて、本発明のPVL抗原もしくはPVL抗体組成物は、追加の抗原もしくは抗体、たとえば、Fattomら、Infec. and Immun., 58:2367-2374 (1990), およびFattomら、Infec. and Immun., 64:1659-1665 (1996)に記載のType 5およびType 8抗原のような、１つまたはそれ以上の黄色ブドウ球菌莢膜多糖抗原、またはそれらに対する抗体を、含んでもよい。それに加えて、またはその代わりに、該組成物は、米国特許第5,770,208; 6,194,161; 6,537,559号に記載の黄色ブドウ球菌336抗原、もしくは米国特許第5,770,208号および第6,194,161号に記載のブドウ球菌336 CPS抗原、またはそれらに対する抗体を含みうる。
【００８３】
他の黄色ブドウ球菌抗原も当技術分野で知られており、たとえばAdamsら、J. Clin. Microbiol., 26:1175-1180 (1988), Rieneckら、Biochim. Biophys. Acta., 1350:128-132 (1977)およびO’Riordanら、Clin. Microbiol. Rev., 17: 218-34 (2004)を参照されたいが、そうした抗原またはそれに対する抗体を含む組成物もまた、本発明において有用である。
【００８４】
同様に、表皮ブドウ球菌抗原（もしくはそれに対する抗体）も、本発明にしたがって使用することができる。PS1とも称される表皮ブドウ球菌Type II抗原は、米国特許第5,961,975号および第5,866,140号において開示されている。この抗原は、ATCC 55254（Type II分離株）に対する抗血清を凝集させる表皮ブドウ球菌分離株の細胞を、増殖させることを含む方法によって得られうる、酸性多糖抗原である。
【００８５】
本発明に有用な、さらに別のブドウ球菌抗原が、国際公開番号WO 00/56357に記載されている。この抗原は、アミノ酸およびN-アセチル化ヘキソサミンをα配置で含み、O-アセチル基を含有し、ヘキソースを含有しない。これはATCC 202176のもとで寄託されたブドウ球菌菌株に対する抗体と特異的に結合する。この抗原のアミノ酸解析は、セリン、アラニン、アスパラギン酸／アスパラギン、バリン、およびスレオニンがおよそ39:25:16:10:7のモル比で存在することを示す。アミノ酸は、重量比で抗原分子の約32%を構成する。この抗原またはそれに対する抗体は、本発明のPVL抗原（もしくはPVL抗体）組成物に含めることができる。
【００８６】
本発明に有用なもう一つのブドウ球菌抗原は、公開された米国特許出願第2005/0118190号に記載され、表皮ブドウ球菌「GP1抗原」として知られている。その抗原は、表皮ブドウ球菌、Staphylococcus haemolyticusおよびStaphylococcus hominisを含む、ブドウ球菌属の多くのコアグラーゼ陰性菌株と共通している。この抗原は、ATCC 202176として寄託された表皮ブドウ球菌の菌株から得ることができる。この抗原、もしくはそれに対する抗体は、本発明のPVL抗原（もしくはPVL抗体）組成物に含めることができる。抗原にはまた、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分(MSCRAMM)タンパク質、および他の防御抗原もしくは毒素に関わるものが含まれる。
【００８７】
方法
細菌感染を治療および予防する方法
本発明は、PVL抗体もしくはPVL抗原を含む組成物を用いて、黄色ブドウ球菌感染症を治療もしくは予防する方法を提供する。本明細書に記載の治療および予防法の対象となる患者集団には、黄色ブドウ球菌（CA-MRSAを含む）もしくは表皮ブドウ球菌といった病原菌に感染している、または感染するリスクのある哺乳類、たとえばヒトが含まれる。
【００８８】
ある実施形態によれば、本発明は、PVL抗体を含む組成物を用いて、黄色ブドウ球菌感染症を治療もしくは予防する方法を提供する。この方法に従って、必要性のある患者に、黄色ブドウ球菌のPVL抗原に特異的に結合する抗体および製薬上許容される担体を含む組成物を、投与する。抗体組成物は、上記の任意のPVL抗体を含むことができるが、場合によりIVIG組成物、高度免疫特異的IVIG組成物、組換えPVL抗体を含む組成物（PVL抗体フラグメントを含む組成物を含める）、またはヒト化PVL抗体を含む組成物であってもよい。
【００８９】
PVL抗体組成物は、抗感染薬、抗生物質、もしくは抗微生物薬と組み合わせて投与することができる。抗感染薬の例としては、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびリゾスタフィンがあるが、それらに限定されない。抗生物質および抗微生物薬の例には、ペニシリナーゼ抵抗性ペニシリン系、セファロスポリン系、およびカルバペネム系抗生物質があり、これには、バンコマイシン、リゾスタフィン、ペニシリンG、アンピシリン、オキサシリン、ナフシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、セファロチン、セファゾリン、セファレキシン、セフラジン、セファマンドール、セフォキシチン、イミペネム、メロペネム、ゲンタマイシン、テイコプラニン、リンコマイシン、およびクリンダマイシンが含まれるが、これらに限定されない。こうした抗生物質の投与量は当技術分野でよく知られている。たとえば、Merck Manual of Diagnosis and Therapy、第100版、157章、13項(Beers & Berkow編、2004)を参照されたい。抗感染薬、抗生物質および／または抗菌薬は、上記IVIG組成物の投与に先立って併用することができるが、その投与と同時に、または順次、投与してもよい。
【００９０】
ある実施形態において、PVL抗体組成物を比較的少数回の投与で、たとえば、1回もしくは2回、投与し、さらに従来の抗生物質治療を用いるが、これは数日または数週間にわたる複数回の投与を伴うものである。したがって、抗生物質は一定期間にわたり、たとえば少なくとも5日間、10日間、または14日間もしくはそれ以上の日数にわたり、毎日1回、2回、または3回以上服用することができるが、PVL抗体組成物は通常、1回もしくは2回だけ投与される。しかしながら、当業者は、PVL抗体組成物および抗生物質について、さまざまな投与量、投与時期、および相対量を選択し、調整することができる。
【００９１】
本発明のPVL抗体組成物は、市中感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（CA-MRSA）感染症の治療に適しており、こうした感染症には、壊死性肺炎、乳腺炎、壊死性筋膜炎、ウォーターハウス・フリードリクセン（Waterhouse Friderichsen）症候群、CA-MRSA敗血症、ならびに皮膚および軟部組織感染症があるがそれらに限定されない。当業者は、通常の方法によって適当な投与量を決定することができる。投与量は、感染症の重症度、使用される個々のPVL抗体組成物、投与頻度、および被験体の詳細（たとえば、被験体の齢数、体重および免疫状態）といった多くの要因に左右されうる。ある実施形態において、投与量は、少なくとも体重１キログラム当たり50mg PVL抗体組成物（mg/kg）であるが、たとえば少なくとも100 mg/kg、少なくとも150 mg/kg、少なくとも200 mg/kg、少なくとも250 mg/kg、少なくとも500 mg/kg、少なくとも750 mg/kg、および少なくとも1000 mg/kgが挙げられる。
【００９２】
投与頻度および投与回数も、感染症の重症度および患者の免疫状態といった多くの要因に依存する。しかしながら、当業者は、当技術分野で知られている通常の方法を用いて、適切な投与計画を決定することができる。ある実施形態において、1回分の投与量は、少なくとも１日おきに投与することができるが、これはたとえば少なくとも1日1回、および少なくとも1日2回である。感染症を効果的に治療するために必要とされる投与回数はさまざまである。たとえば、1回、2回、3回、4回、もしくはそれ以上の回数のPVL抗体組成物の投与が必要であることもある。免疫系の弱くなった、もしくは特に重症な感染症の患者は、投与量および／または投与回数を増やす必要があろう。
【００９３】
本明細書に記載の抗原組成物を用いて黄色ブドウ球菌感染症を予防および／または治療する方法も本発明に開示されている。この方法は、そうした必要のある被験体に、ワクチン等のPVL抗原（上記）および製薬上許容される担体を含む組成物を投与することを含む。本明細書に記載の治療および予防法の標的となる患者集団には、黄色ブドウ球菌といった病原菌に感染している、または感染するリスクのある哺乳類、たとえばヒトが含まれる。この方法には、皮膚および軟部組織感染症、壊死性肺炎、乳腺炎、壊死性筋膜炎、ウォーターハウス・フリードリクセン（Waterhouse Friderichsen）症候群、およびCA-MRSA敗血症などのCA-MRSA感染症の予防が含まれる。上記のように、本発明のワクチンはPVL抗原および製薬上許容される担体を含む。ある実施形態によると、PVL抗原は上記のように無毒化される。ある特定の実施形態によれば、PVLは別の分子との複合体化によって無毒化されるが、これは、別のPVL抗原もしくは別の細菌抗原との複合体化による無毒化を含む。
【００９４】
本発明はまた、ブドウ球菌抗原もしくは他の細菌多糖といった、グラム陰性もしくはグラム陽性細菌抗原のような別の細菌抗原と複合体化したPVL抗原（上記）を含む、ワクチンなどの抗原組成物を用いて、細菌感染症を治療および／または予防する方法を提供する。本明細書に記載の治療および予防法の標的となる患者集団には、黄色ブドウ球菌のような病原菌に感染している、または感染するリスクのある哺乳類、たとえばヒトが含まれる。ある実施形態によると、PVL抗原は上記のように無毒化される。ある特定の実施形態によれば、PVLは別の分子との複合体化によって、たとえば、別のPVL抗原もしくは別の細菌抗原との複合体化によって、無毒化される。
【００９５】
抗原組成物もしくはワクチンを、追加の抗原、たとえば、上記のType 5、Type 8、および336抗原のような１つまたはそれ以上の黄色ブドウ球菌莢膜多糖抗原、および／または当技術分野で知られている他の黄色ブドウ球菌抗原とともに投与することができる。それに加えて、もしくはその代わりに、組成物もしくはワクチンを、１つまたはそれ以上の表皮ブドウ球菌抗原、たとえば、上記PS1抗原とともに、または他の任意のブドウ球菌抗原、たとえば、国際公開番号WO 00/56357に記載の抗原、および公開された米国特許出願第2005/0118190号に記載の抗原(GP1)（上記）とともに投与してもよい。本発明の組成物もしくはワクチンはまた、α毒素、リポタイコ酸（LTA）もしくは接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分(MSCRAMM)タンパク質といった抗原、または他の防御抗原もしくは毒素を含んでいてもよい。１つまたはそれ以上の追加の抗原は、PVLワクチン組成物とは別々に投与することができるが、PVLワクチン組成物に含めてもよい。
【００９６】
抗原組成物もしくはワクチンは、上記のような併用療法で、抗感染薬、抗生物質、および／または抗微生物薬と組み合わせて投与することができる。また、本発明のワクチン組成物は、アジュバントを含めて、またはアジュバントなしで、投与することができる。アジュバントを使用する場合、それはアジュバント誘導毒性を回避するように選択される。本発明の組成物もしくはワクチンは、βグルカンもしくは顆粒球コロニー刺激因子、とりわけ1999年9月14日出願、2002年3月12日公開の米国特許第6,355,625号に記載のβグルカン、を追加的に含有することができる。
【００９７】
本発明の抗原組成物もしくはワクチンの治療上有効な量は、当技術分野で日常的な方法によって決定することができる。その量が、ワクチンの組成、個別の患者の特性、選択された投与経路、および治療すべき細菌感染症の種類に応じて変動しうることは、当然当業者に認識されよう。一般的な指針は、たとえば、International Conference on Harmonisationの出版物、およびRemington's Pharmaceutical Sciences, 第27および28章、484-528ページ (Mack Publishing Company 1990)に見出すことができる。典型的なワクチン投与量は、約1μgから約400μgまで様々でありうる。
【００９８】
組成物もしくはワクチンは、静脈内、筋肉内、皮下、もしくは経皮的にヒトに投与することができる剤形を含め、任意の望ましい剤形で提供される。組成物もしくはワクチンは、単回投与で、または複数回投与プロトコルにしたがって投与することができる。投与は、皮下、皮内および静脈内等の、任意の数の経路によって行うことができる。ある実施形態においては、筋肉内投与が用いられる。当業者には当然のことであるが、投与経路は、治療すべき細菌感染症、およびワクチンの組成に応じて変わるはずである。
【００９９】
PVL感染を確認する方法
本発明はまた、PVL抗原の存在についてサンプルをスクリーニングする方法を提供する。本発明のこの態様によって、上記PVL抗原のいずれかをサンプルと接触させ、抗体とサンプル中に存在するPVL抗原との結合を評価することができる。抗体に基づくアッセイは当技術分野でよく知られており、本発明は、天然PVLトキソイドおよび上記の任意のPVL抗原をはじめとするPVL抗原を検出するための、本発明の抗体を用いた定性的および定量的アッセイの両方を意図する。PVL抗原について検査されうるサンプルは限定されず、たとえば、患者からの生物学的サンプル（たとえば血液もしくは血清サンプル）、細胞培養上清サンプル、細菌サンプル、およびPVLを含有する疑いがある他のいかなるサンプルも包含する。
【０１００】
本発明は下記の実施例を参照することによってさらに説明されるが、これらは説明のためにのみ与えられる。本発明は実施例に限定されることはなく、むしろ本明細書で与えられる教示から明らかな、あらゆるバリエーションを包含するものである。
【実施例１】
【０１０１】
rLukF-PVおよびrLukS-PV野生型クローンの作製
高レベルのPVLを産生するPVL原株である、受託番号49775のもとでATCCに寄託された黄色ブドウ球菌から、メーカー（Promega）によるプロトコルを若干変更して（再懸濁バッファーにリゾスタフィンを加えた）使用することによって、ゲノムDNAを単離した。
【０１０２】
PVL遺伝子の公開された配列（GenBankアクセッション番号X72700およびAB006796）を用いて、LukF-PVおよびLukS-PV遺伝子を別個に挟み込むように、オリゴヌクレオチドプライマーをデザインした。順方向プライマーは、推定シグナルペプチドを除去し、NcoI部位を組み込むようにデザインされた。NcoI部位のATGは、翻訳開始コドンとして機能するように計画デザインされ、ベクターにコードされたN末端アミノ酸の付加を排除した。逆方向プライマーは、終止コドンのすぐ下流にBamHI部位を組み込むようにデザインされた。luks-PVおよびlukf-PV遺伝子は、標準的なPCR増幅条件を用いて、黄色ブドウ球菌ATCC 49775からPCRによって増幅された。NcoIおよびBamHI部位を用いて、PCR産物をpTrcHisB中にクローニングした。さらに、luks-PVおよびlukf-PV遺伝子を含有するNcoI-BamHIインサートを次にpET28 (Novagen)にサブクローニングした。
【実施例２】
【０１０３】
rLukF-PVおよびrLukS-PV融合タンパク質クローンの作製
PCRクローニング法を用いて、PVL融合タンパク質、すなわちlukf-PVおよびluks-PV遺伝子を1つにつなぎ合わせることにより作製されたヌクレオチド配列によってコードされる人工タンパク質を、構築する。PVLサブユニットは、短いアミノ酸リンカーを介して共有結合で連結され、rLukF-PV−アミノ酸リンカー−rLukS-PV、またはrLukS-PV−アミノ酸リンカー−rLukF-PVの配置をとる。この融合タンパク質は非細胞毒性であるが、これは2つのサブユニットが、毒性を示すのに必要な様式、たとえば、白血球の膜に正しく挿入するのに必要な様式で、組み立てられる、および／または相互作用することができないためである。該融合タンパク質は、宿主において、PVLの両方ののサブユニット（例えば、LukS-PVおよびLukF-PV）に対して、およびPVL毒素全体に対する抗体を誘発するために有用である。
【実施例３】
【０１０４】
rLukF-PVおよびrLukS-PV変異体クローンの作製
下記の変異体は、QuickChange変異誘発キットを用いて、メーカー（Stratagene）記載のプロトコルと鋳型としてのpTrcHisBLukF-PVおよび／またはpTrcHisBLukS-PVを用いて、構築された：
rLukF-PV変異体：ΔI124-S129、E191A、N173A、R197A、W176A、およびY179A
rLukS-PV変異体：ΔD1-I17、ΔF117-S122、T28D、T28F、T28N、およびT244A
【０１０５】
遺伝学分野の当業者には当然のことであるが、この命名は標準的な学術用語である。すなわち、「ΔI124-S129」は、rLukF-PV変異体において、124位のイソロイシンおよび129位のセリンが終端となる領域が欠失している（「Δ」）ことを意味する。同様に「ΔD1-I17」は、1位（アスパラギン酸）から17位（イソロイシン）までの残基がrLukS-PV変異体において欠失していることを示す。同様に、当業者には分かるであろうが、「E191A」は、191位のグルタミン酸がアラニンで置換されていることを意味し、「N173A」はrLukF-PV変異体が173位に天然アスパラギン（N）の代わりにアラニン（A）を有することを示し、「R197A」は、197位のアルギニン（R）がアラニン（A）で置換されていることを意味するが、他も同様である。
【０１０６】
他に特に意図された変異体には次のものがある：
rLukF-PV変異体：内部ジスルフィド結合を生成するための二重変異体V12C/K136C、ΔW176、ΔG175-G177、ΔR197およびΔS196-Q198。
【０１０７】
rLukS-PV変異体：リン酸化部位を除去するためのT244AもしくはΔT244、安定したジスルフィド結合を生成する二重変異体I7C/N130Cもしくは二重変異体D38/I113C；ΔT28、ΔV27-Q29、ΔG115-G124、およびT28D/ΔD1-I7といった他の二重変異体。
【０１０８】
構築物はすべて、メーカーのプロトコル（Gene Choice）を用いて大腸菌（E.coli）GC10細胞に形質転換した。配列決定は、ABI PRISM Dye Terminator Cycle Sequencingを用いて行った。正しい配列を有するすべてのクローンを、発現のため大腸菌GC10もしくは大腸菌BL21(DE3) pLysSに形質転換した。
【実施例４】
【０１０９】
rLukS-PVおよびrLukF-PV野生型および変異型抗原の発現および精製
振盪フラスコ内で、rLukS-PVまたはrLukF-PVプラスミドを含有する大腸菌株GC10もしくはBL21(DE3) pLysSを、対数増殖期中期まで37℃にて選択培地中で培養し、終濃度1mMのイソプロピル-β-D-チオガラクトピラノシド（IPTG）を用いて2〜3時間誘導した。細胞を遠心によって集めた。振盪フラスコ培養物のSDS-PAGEによる分析、およびウェスタンブロット分析は、誘導前には見られなかった約33〜34 kDaにバンドを示した。
【０１１０】
細胞ペレットを細胞溶解バッファー（20 mM Na2HPO4、50 mM NaCl、5% グリセロール、pH 6.5）に再懸濁し、室温にて2 mg/mlリゾチームで処理した後、Misonix超音波処理器で超音波処理した。細胞溶解液の上清を遠心によって集めた。可溶性タンパク質を、あらかじめ細胞溶解バッファーで平衡化した陽イオン交換カラムに負荷した。結合したLukS-PVまたはLukF-PVタンパク質を、20 mM Na2HPO4、5% グリセロール、pH 6.5バッファー中50〜500 mM NaClの線形勾配で溶出した。rLukS-PVもしくはrLukF-PV含有画分をプールし、セラミックヒドロキシアパタイトカラムに適用した。純粋なrLukS-PVもしくはrLukF-PVが、20 mM Na2HPO4、5% グリセロール、pH 6.8バッファー中50 mM NaClから750 mM NaClまでの線形勾配で溶出された。
【０１１１】
rLukF-PVおよびrLukS-PV組換えタンパク質および変異体は、これと同じ方法によって精製され、高純度であることが判明している（それぞれrLukF-PVおよびrLukS-PVに対して約33または34 kDaの単一バンド；SDS-PAGE/クーマシーブルー染色により純度>95%）。ウェスタンブロット分析のために、タンパク質をポリフッ化ビニリデン（PVDF）膜に転写し、rLukF-PVもしくはrLukS-PVに対する一次モノクローナル抗体を用いて、当業界で知られている標準的な手順によって処理した。ブロットによって、おおよそ約33-34 kDaのバンドを示すrLukS-PVおよびrLukF-PV抗原の存在が確認された。さらに、rLukS-PVおよびrLukF-PVのN末端配列決定により、lukS-PVおよびlukf-PV遺伝子産物の存在が確認された。
【実施例５】
【０１１２】
rLukF-PVまたはrLukS-PVポリクローナル抗体の作製および特徴付け
rLukS-PVもしくはrLukF-PV（それぞれ50μg）を、2週間間隔で3回、1:1の割合でアジュバント（CFAの後にIFA）とともに用いて、ニュージーランドホワイト種ウサギに注射した。LukS-PV抗血清は、当該抗原に対する免疫拡散アッセイにおいて同一抗原としてrLukS-PVを認識し、一方rLukF-PV抗血清はLukF-PVを認識した。rLukS-PVまたはrLukF-PVは、異種抗血清とは反応しなかった。このことは、rLukS-PVワクチンまたはrLukF-PVワクチンはいずれも、異種タンパク質サブユニットと交差反応性である抗体を生じなかったことを示している。したがって、本発明のワクチンはLukF-PVと交差反応しない抗LukS抗体、ならびにLukS-PVと交差反応しない抗LukF抗体を得るために有用である。
【０１１３】
陽性血液を混合し、IgGをプロテインGカラムで精製した。精製された抗PVL IgGは、下記のように動物モデルにおいて使用した。
【実施例６】
【０１１４】
rLukF-PVまたはrLukS-PV抗原の免疫化学的解析
二重免疫拡散法を行って、LukS-PVおよびLukF-PV抗血清の特異性を決定し、併せてPVLサブユニット抗原の抗原性を測定した。簡単に述べると、10μl/ウェルの200μg/ml各PVL抗原（外側のウェル）および10μl/ウェルの抗血清（中央のウェル）を1% アガロースゲル中にロードし、湿潤環境で一晩かけて拡散させた。その後、3回連続してPBS中でアガロースゲルを洗浄してプレスした後、乾燥してクーマシーブルーで染色した。沈降バンドについてゲルを解析したが、沈降バンドは抗原と抗体が反応して免疫複合体を形成したときに生じるものである。
【０１１５】
図１に示すように、rLukF-PV抗原は抗LukF-PV抗体と単一の沈降バンドで反応したが、rLukS-PV抗原はこの抗血清とは交差反応しなかった。同様にrLukS-PV抗原は抗LukS-PV抗体とは単一の沈降バンドで反応したがrLukF-PV抗原はこの抗体と交差反応しなかった。したがって、該抗体は、相同なPVL抗原に対して特異的である。
【０１１６】
下記の抗原をテストした：
2008546648.tif 000003
【０１１７】
図１に示すように、変異型rLukF-PV抗原およびrLukS-PV抗原はすべて、相同な野生型組換えサブユニットと、一連の同一性を共有することが観察されたが、それはその変異型タンパク質が相同な野生型タンパク質と、抗原性の上で同一であることを示している。たとえば、野生型rLukS-PV、rLukS-PV ΔD1-I17、rLukS-PV ΔF117-S122、rLukS-PV T28F、rLukS-PV T28N、rLukS-PV T28D、およびrLukS-PV T244Aはそれぞれ、抗LukS-PV抗体と反応性であり、一連の同一性を共有する。さらに、野生型rLukF-PV、rLukF-PV ΔI124-S129、rLukF-PV E191A、rLukF-PV N173A、rLukF-PV R197A、rLukF-PV W176AおよびrLukF-PV Y179Aは、抗LukF-PV抗体と反応性であり、一連の同一性を共有する。
【０１１８】
抗LukF-PV抗体および抗LukS-PV抗体の双方について定量的ELISAを実施したが、それは異種抗血清に対してどちらのPVLサブユニットも交差反応性がないことを示した。これらのデータから、本明細書に記載のrLukF-PVおよびrLukS-PV抗原は交差反応性のないPVL抗原であることが確認された。
【実施例７】
【０１１９】
LukS-PVおよびLukF-PVハイブリドーマの作製（モノクローナル抗体）
BALB/cマウスを、rLukS-PVまたはrLukF-PVのいずれか一方で免疫した。免疫された脾細胞を、各試験のマウスから別個の手順で採取し、50%ポリエチレングリコールを用いて、別個の実験でSp2/O骨髄腫細胞と融合した。融合細胞は選択培地中に再懸濁して、96ウェル組織培養プレートに播種し、8% CO2の37℃インキュベーター内で、加湿条件下でインキュベートした。各免疫原（rLukS-PVもしくはrLukF-PV）を代表する精製抗原でコーティングされたELISAプレート上で、モノクローナル抗体（MAb）分泌体について、増殖中の培養物の上清をスクリーニングした。単一細胞から生じたMAb分泌コロニーを確立するために、クローニング実験を行う前に、ELISA陽性のものをrLukS-PVおよびrLukF-PV抗原に対する交差反応性について再スクリーニングして、分泌されるMAbの特異性を検証した。シードストックは、こうしたクローンから確立された大量培養物から作製したが、こうしたクローンはマウス腹水を生じさせるためにも使用され、この腹水から精製MAbが調製され、さらに特徴付けされた。
【実施例８】
【０１２０】
LukS-PVおよびLukF-PVモノクローナル抗体の特徴付け
PVLタンパク質サブユニットのそれぞれに対するモノクローナル抗体（MAb）はすべて、IgG1κサブクラスに属することが明らかになった。LukS-PVおよびLukF-PVのそれぞれにつき10種のMAbの上清を、ELISAプレート上にコーティングされたrLukS-PVおよびrLukF-PV抗原に対する交差反応性について、ELISAアッセイでテストした。MAbはすべて、その相同な抗原に対して特異的であった（LukS MAbはrLukS-PV抗原とのみ結合し、LukF MAbはrLukF-PV抗原とのみ結合する）。ウェスタンブロットアッセイで、rLukS-PVおよびrLukF-PVタンパク質との結合についてMAbをすべて調べた。この場合もやはり、それぞれのMAbが、その抗原に特異的に結合することが立証され、他方の抗原に対する交差反応性は示されなかった。
【実施例９】
【０１２１】
カルシウム流入アッセイによるPVL活性のin vitro測定
HL-60細胞（ATCC CLL-240; Gallagherら、Blood 54: 713-33 (1979)）を2x105 細胞/mlの濃度で播種し、6または7日後、細胞密度が約1x106 細胞/mlに達したときに継代した。HL-60細胞は下記のようにして分化させた：細胞計数を行って、細胞数を測定し、Trypan Blueを用いて細胞生存率を測定し、細胞培養培地に1.25%までDMSOを添加し、DMSO含有細胞培養培地で1ml当たり2x105個に細胞を希釈した。CO2インキュベーター内で37°C/8% CO2にて6〜7日間細胞を培養した後、細胞計数を行い、細胞密度は約1 x 106 細胞/mlであると測定された。
【０１２２】
分化したHL-60細胞に、室温にて30分間、10μM Fluo-4および0.1% Pluronic acid F-127を添加した。インキュベーション後、細胞をHBSS / HEPES / Probenecidで2回洗浄し、細胞をHBSS / HEPES / Probenecid中で6 x 106 細胞/mlとなるように調整して、Costar社製の黒い壁面/透明底の96ウェルマイクロタイターの各ウェルに添加した。次に20 mM CaCl2を5μl添加した後、続いて25μlのrLukS-PVおよび／または25μlのrLukF-PV、またはバッファー対照を加えた。PVLのHL-60細胞に対する細胞毒性は、Tecan's Safire2モノクロメーター搭載型マイクロプレート検出システムを用いて蛍光の変化によって測定される細胞内カルシウムの変化を測ることによって測定された。
【０１２３】
蛍光の変化により測定されるHL-60細胞中へのカルシウムの流入は、rLukS-PVおよびrLukF-PVがともに存在する場合にのみ検出されたが、それは、in vitro細胞毒性にはそれらPVLサブユニットが両方とも必要であることを示す。１つのサブユニットだけでは、蛍光の増加は見られなかったので、rLukF-PVおよびrLukS-PVは単独では細胞毒性がなく、無毒化する必要なしにワクチン用の抗原として個別に使用可能であることが示された。
【０１２４】
上記条件下でのカルシウム流入アッセイを用いて、上記のrLukS-PVおよびrLukF-PV変異体の選択を、異種野生型タンパク質を変異体と合わせて使用して、野生型タンパク質と比較してその活性について評価した。たとえば、変異型rLukS-PVタンパク質は野生型rLukF-PVと組み合わせ、変異型rLukF-PVタンパク質は野生型rLukS-PVと組み合わせ、そして変異型／野生型の組み合わせ体の活性を、野生型rLukF-PVおよびrLukS-PVの活性と比較した。すべての変異体が不活性複合体を生じると認められたわけではなかったが、いくつかの変異体は、結果として、カルシウム流入アッセイによって測定される不活性型（野生型活性の<10%）を生じた。下記の表１および２を参照されたい。これには、ホスファチジルコリン結合クレフト（cleft）中に変異を有するようにデザインされたLukF-PV変異体（たとえば、E191A、R197A、W176AおよびY179A）、ならびにLukS-PV変異体T28F、T28N、およびT28Dが含まれた。
【０１２５】
上記のように、一方のサブユニットの、細胞毒性のない任意の変異体（点変異、欠失、トランケーションを有する変異体、もしくは2以上のそうした変異で二重に無毒化された変異体を含む）を、異種サブユニットの野生型とともに使用して、無毒な刺激抗原もしくはワクチンを作り出すことができる。さらに、両方のサブユニットの変異体を使用することができる。いずれの場合も、そのワクチンはLukS-PVおよびLukF-PVに対する抗体をいずれも誘導することができる。
【０１２６】
LukF-PVおよびLukS-PVを含む融合タンパク質もしくは化学的複合体が無毒であることは、上記のカルシウム流入アッセイによって確認することができる。上記のように、こうした融合タンパク質もしくは化学的複合体を、刺激抗原もしくはワクチンとして使用して、LukS-PVおよびLukF-PVの両方に対する抗体を生成させることができた。
【表１】
2008546648.tif 000004
【０１２７】
【表２】
2008546648.tif 000005
【実施例１０】
【０１２８】
カルシウム流入アッセイを用いたPVL細胞毒性のポリクローナル抗体中和
PVL抗体の中和活性を測定するために、カルシウム流入アッセイを上記のようにして行ったが、但し抗LukS-PVまたは抗LukF-PVウサギ抗血清は、ロードしたHL-60細胞への添加の30分前に、rLukS-PVもしくはrLukF-PVのいずれか一方とともにインキュベートした。中和パーセントを決定するために、この反応に関する蛍光変化を、野生型PVLタンパク質単独の変化と比較した。
【０１２９】
表３は、上記のようにして測定したPVL細胞毒性の中和を示す。抗LukS-PV抗血清および抗LukF-PV抗血清はいずれも、in vitro細胞毒性を中和するのに有効であった。抗LukS-PV抗血清および抗LukF-PV抗血清の両方を一緒に中和について評価したとき、相乗効果は検出されなかった。すなわち、最適濃度以下の両抗体タイプを一緒に使用したとき（両方とも1:160希釈）、相加的中和を超えるものは観察されなかった。この結果は、一方のPVLサブユニットのみに対する抗体、たとえば、抗LukF-PV抗体または抗LukS-PV抗体が、PVL毒素の中和に必要であることを示す。
【表３】
2008546648.tif 000006
【実施例１１】
【０１３０】
XTTアッセイによるPVL細胞毒性のin vitro測定
維持培地（MM）として、50μg/mLゲンタマイシンおよび1% 熱不活性化ウシ胎仔血清（HI-FBS）（Gibco）を添加した、フェノールレッドを含まない高グルコースダルベッコ改変イーグル培地（HG-DMEM）（Gibco）中に、rLukS-PVおよびrLukF-PV（各20 nM）を含有する溶液を調製した。MM中で、20 nMからの毒素の連続2倍希釈を、96ウェル細胞培養プレートで行った。陰性培地対照ウェルおよび細胞対照ウェルは、それぞれ希釈毒素の代わりにMMを含有するように準備されて、すべてのアッセイプレートに含められた。約5 x 105の生存HL-60細胞（ジメチルスルホキシド（DMSO）によって、好中球経路のより成熟したPVL感受性細胞へと分化誘導された）を、希釈した毒素とともに各ウェルに添加し、細胞対照については培地とともにウェルに添加した。すべての培地対照ウェルには、細胞懸濁液の代わりにMMを与えた。サンプルを入れたアッセイプレートは、加湿条件下、37℃インキュベーター内で8% CO2下で、24〜48時間インキュベートした。
【０１３１】
化合物2,3-ビス[2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル]-2H-テトラゾリウム-5-カルボキシアニリド(Sigma, カタログ番号TOX-2)のナトリウム塩であるXTTをメーカーの説明書にしたがってMM中に調製した後、それを各ウェル内の培地体積の20%量にて全ウェルに添加した。プレートを、さらにインキュベートするためにインキュベーターに戻し、XTTの作用により発色させた。（生きた細胞のミトコンドリア・デヒドロゲナーゼは、XTTのテトラゾリウム環を切断し、その結果オレンジ色を呈する溶液を生じる。）次にプレートをインキュベーターから取り出し、遠心して、細胞および残渣をペレット状にした後、各ウェルから得られた上清の一定量を、丸底のELISAプレートの対応するウェルに移した。データを記録する前にバックグラウンドとしての培地のみのODを差し引くELISAプレートリーダーを用いて、450 nmで上清の吸光度（OD）を測定した。その後PVL細胞毒性作用によって死滅した細胞のパーセントを計算した。
【０１３２】
XTTアッセイで測定した場合、両方の野生型サブユニット、すなわちrLukF-PVおよびrLukS-PVが、≧ 0.5 nMで、in vitro細胞毒性のために必要とされた。それぞれのPVLサブユニット単独では10 nMで細胞毒性のないことが観察された。このように、一方のPVLサブユニット単独では、細胞毒性がなく、個別にワクチンまたは刺激抗原として使用することができることがデータからさらに立証された。
【実施例１２】
【０１３３】
XTTアッセイを用いたPVL細胞毒性の抗体中和
哺乳類細胞の融合実験でハイブリドーマを作製するために免疫化した脾細胞を生じるように実施されたLukS-PVおよびLukF-PV研究から採取されたマウス免疫血清由来の精製抗体、ならびに毒素サブユニットに特異的なMAbを分泌する、樹立されたハイブリドーマを用いて生成させた腹水由来の精製抗体の、in vitroでPVL毒素を中和する能力について、特徴付けした。
【０１３４】
96ウェル細胞培養プレートで抗体の連続2倍希釈を行った。陰性培地対照ウェルおよび細胞対照ウェル（どちらも毒素を含まない）、ならびに陽性毒素対照ウェルのセットを、すべてのアッセイプレートに含めた。等量のMM（上記）中40 nM PVL毒素サブユニットを、抗体を入れたすべてのウェル、および毒素陽性対照用のウェルに添加した。すべての培地対照ウェルおよび細胞対照ウェルには等量のMMを加えた。希釈された抗体、毒素、および細胞対照用の培地を入れたそれぞれのウェルに、約1 x 106の生存DMSO誘導HL-60細胞を、各ウェル内に入っている量と等量にて添加した。培地対照ウェルすべてには、細胞懸濁液の代わりにMMを入れた。したがって、すべての抗体および毒素濃度は、出発濃度の４倍に希釈された。各ウェルの内容物を混合し、その体積の50%を別の96ウェル細胞培養プレートの対応するウェルに移した。両方のプレートを加湿した37℃のインキュベーター内で8% CO2下でインキュベートした。
【０１３５】
化合物2,3-ビス[2-メトキシ-4-ニトロ-5-スルホフェニル]-2H-テトラゾリウム-5-カルボキシアニリド(Sigma, カタログ番号TOX-2)のナトリウム塩であるXTTをメーカーの説明書にしたがってMM中に調製した後、各ウェル内の培地体積の20%量で全ウェルに添加した。プレートを、さらにインキュベートするためにインキュベーターに戻し、XTTの作用により発色させた。次にプレートをインキュベーターから取り出し、遠心して細胞および残渣をペレット状にした後、各ウェルから得られた上清の一定量を、丸底のELISAプレートの対応するウェルに移した。上清の吸光度（OD）を450 nmで測定した。その後PVL細胞毒性作用のために死滅した細胞のパーセントを計算した。
【０１３６】
表４に示すように、LukS-PVに対するMAbは、PVL細胞毒性を中和する上で、このアッセイにおいてLukF-PVに対するMAbよりも10倍有効であった。すなわち、XTTアッセイで測定すると、in vitroでPVL細胞毒性を中和するためには、約10倍高いLukF-PV MAbが必要とされた。たとえば、PVL細胞毒性の50%中和は0.4〜10μg/mL LukS MAbを用いて達成されたのに対して、5〜95 μg/mL LukF MAbが50%中和を達成するために必要であった。表４の結果はまた、rLukS-PV（“LukS-M-IgG”）またはrLukF-PV（“LukF-M-IgG”）に特異的なポリクローナル抗体がin vitroでPVL細胞毒性を中和することができたことを示す。
【０１３７】
これらの結果は、LukS-PV抗原を単独で含む（すなわちLukF-PVを含まない）組成物がワクチンとして有効であること、および抗LukS-PV抗体（MAb、または抗LukS-PV 抗体を含むIVIGもしくは高度免疫特異的IVIGを含める）を単独で含む（すなわち抗LukF-PV抗体を含まない）組成物はPVL細胞毒性を中和するために有効であることを示している。類似のLukF-PV抗原／抗体組成物は、効力は劣るかもしれないが、このアッセイにおいてLukF MAb が単独でPVL細胞毒性を中和することができることから実証されるように、これもまた有用であると考えられる。
【表４】
2008546648.tif 000007
【実施例１３】
【０１３８】
PVL介在細胞毒性のモノクローナルもしくはポリクローナル抗LukS抗体による中和
末梢血を健康な有志者から採取し、ヒトPMNをパーコール密度勾配によって精製した。モノクローナル(1LukS235)もしくはポリクローナル（ウサギ）抗LukS-PV抗体を、様々な希釈度でヒトPMN（5x105細胞/ウェル）に加えて、rPVL（10 nM）またはUSA300 24時間培養上清（1:40希釈）（これはLukS-PVを1.2μg/mL、およびLukF-PVを0.5μg/mL含有した）の細胞毒性作用を阻害した。これらの選択された希釈物は、ヒトPMNに対してそれぞれ85%（MAb）および70%（PAb）の細胞毒性を誘導した。対照として、ウサギ血清および抗α毒素MAbを使用した。抗LukS-PV抗体の阻害効果を、2時間培養後、450 nmの蛍光変化によって測定するXTTアッセイで評価した。
【０１３９】
結果は、誘導されたHL-60細胞および末梢血から精製されたヒトPMNが同じ濃度のrPVLに感受性であることを示した。rPVLおよびCA-MRSA USA300の培養上清から得られたPVLは、ヒトPMNに対する細胞毒性を誘導する上で、同じように有効であった。表５に示すように、ポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両方が、ヒトPMNへのPVL依存性細胞毒性の中和に有効である。対照として、ナイーブウサギ血清（1:10希釈）は、rPVLおよびPVL含有USA300上清の両者に対して細胞毒性の10%中和をもたらしただけであった。これらの結果は、モノクローナルおよびポリクローナル抗LukS-PV抗体が、rPVL、およびCA-MRSAにより発現される天然PVLの両方の細胞毒性作用の中和に有効であることを示している。
【表５】
2008546648.tif 000008
【実施例１４】
【０１４０】
PVL毒素、rLukF-PVおよびrLukS-PVの毒性
ニュージーランド雌ウサギ（Harlan）（4〜5月齢）を剪毛し、rLukF-PVおよびrLukS-PV、またはrPVL毒素（rLukF-PVおよびrLukS-PV）を、おおよそ等モル濃度で漸増させた用量（12.5、25、50および100μg）で皮内に注射した。1週間毎日、皮膚壊死を追跡調査した。すなわち病変の大きさを測定した。
【０１４１】
この試験は、rPVL毒素（rLukF-PVおよびrLukS-PV）の皮内注射によって引き起こされる皮膚壊死に対するウサギの感受性を明らかにした。rPVL毒素（12.5〜100μg）を注射した24時間後に皮膚壊死は認められたが、PVLサブユニット単独（200μg rLukS-PVまたは200μg rLukF-PVのいずれか一方）の注射は、病変をまったく生じなかった。用量依存的効果が認められ、その病変の大きさはrPVL毒素の濃度の増加につれて増大した。これらの結果はさらに、rLukS-PVもrLukF-PVも単独では、さらに無毒化することなくワクチン抗原または刺激抗原として使用することができる、無毒な抗原であることを示す。
【実施例１５】
【０１４２】
PVL毒素のin vivo中和におけるPVL抗体の有効性
rLukS-PV、rLukF-PV、またはrPVL（rLukS-PV＋rLukF-PV）を含むワクチンがrPVL毒素（12.5〜200μg）をin vivoで中和する能力を評価した。5〜6月齢のニュージーランド雌ウサギを、筋肉内経路で、アジュバントとしてTitermax (Sigma)を1:1の比率で使用して、50μg rLukS-PV、50μg rLukF-PV、または両方のサブユニット(それぞれ50μg)を用いて2週間間隔で3回免疫した。ウサギは、3回目の注射の7日後に採血し、LukS-PVおよびLukF-PVに対するIgG力価をELISAによって評価した。すべての関連血清において、LukS-PV IgGおよびLukF-PV IgGの力価は、OD450nm＝2.0で1/106希釈であった。rLukF-PVで免疫されたウサギ由来の抗血清は、rLukF-PVとのみ反応し、rLukS-PVで免疫されたウサギはrLukS-PVとのみ反応したが、そのことは、異種サブユニットおよび抗体の間で交差反応性がないことを示す。
【０１４３】
ウサギを剪毛し、背部にrPVL毒素（各サブユニットを200μgずつ）、200μg rLukF-PV、200μg rLukS-PVまたはPBSを注射した（チャレンジした）。rLukS-PVおよびrLukF-PVによるワクチン接種は、それぞれ、各サブユニットに対して高い抗体価を生じた（OD = 2で1/106希釈）。さらに、これらの抗体は、rPVL毒素のチャレンジに起因する皮膚壊死に対する防御を示した。すなわち、rPVLチャレンジ後、rPVLサブユニットのいずれか（rLukS-PVまたはrLukF-PV）で免疫されたウサギでは、皮膚壊死は観察されなかった。これに対して、プラセボ（PBS＋Titermax）を投与された対照ウサギでは皮膚壊死が観察された。さらに、すべてのウサギで、一方のPVLサブユニットのみをチャレンジに使用した場合には、壊死は観察されなかった。
【０１４４】
これらの結果は、rLukS-PVまたはrLukF-PV単独での（すなわちもう一方のサブユニットを用いない）免疫化は、PVLによって引き起こされる壊死の予防に有効であることをさらに立証する。したがって、これらのPVL抗原の一方を含む組成物は、PVL産生CA-MRSAによって引き起こされる壊死の予防に有用であろう。
【実施例１６】
【０１４５】
PVL＋CA-MRSA感染に対する防御におけるPVL抗体の有効性
rLukS-PV、rLukF-PV、またはrPVL（rLukS-PV + rLukF-PV）を含むワクチンがPVL産生黄色ブドウ球菌の皮膚感染を中和する能力を評価した。5〜6月齢のニュージーランド雌ウサギを、筋肉内経路で、アジュバントとして1:1の比率でTitermax（Sigma）を使用して、50μg rLukS-PV、50μg rLukF-PV、または両方のサブユニット（それぞれ50μg）を用いて2週間間隔で3回免疫した。ウサギは、3回目の注射の7日後に採血し、LukS-PVおよびLukF-PV IgG力価をELISAによって評価した。すべての関連血清において、LukS-PV IgGおよびLukF-PV IgGの力価は、OD450nm = 2.0で1/106希釈であった。rLukF-PVで免疫されたウサギ由来の抗血清は、rLukF-PVとのみ反応し、rLukS-PVで免疫されたウサギはrLukS-PVとのみ反応したが、そのことは、異種サブユニットおよび抗体の間で交差反応性がないことを示す。両方のサブユニットで免疫されたウサギ由来の抗血清は、LukF-PVおよびLukS-PVの両者と反応した。
【０１４６】
ウサギを剪毛し、背部に108 CFU/100μLの黄色ブドウ球菌菌株USA300（PVL産生CA-MRSA）を注射した。rLukS-PVおよびrLukF-PVを用いたワクチン接種は、それぞれ、各サブユニットに対して高い抗体価を誘導した（OD = 2で1/106希釈）。これらの抗体は、PVL産生黄色ブドウ球菌分離株（すなわちCA-MRSA USA300）に起因する皮膚壊死に対する防御を示した。すなわち、rPVLサブユニットのいずれか（rLukS-PVもしくはrLukF-PV）、またはrPVL（rLukS-PVおよびrLukF-PV）で免疫されたウサギでは、皮膚壊死は観察されなかった。これに対して、プラセボ（PBS＋Titermax）を投与された対照ウサギ、またはナイーブウサギでは皮膚壊死が観察された。さらに、rPVL（rLukS-PVおよびrLukF-PV）で免疫されたウサギは、感染の重症度が減少していた。rPVL免疫ウサギはいずれも病変を発生しなかったのに対して、対照ウサギは病変を生じた。rLukS-PVもしくはrPVL（rLukF-PVおよびrLukS-PV）のいずれか一方で免疫されたウサギ達は、第７日に健康であった。しかしながら、rLukF-PVで免疫されたウサギは、第５日に病的状態（体重減少、発熱）の臨床徴候を示し、PBSを投与された対照ウサギは40時間後に死亡した。rLukS-PVワクチンおよびrPVL（rLukF-PVおよびrLukS-PV）ワクチンは、CA-MRSA感染症の予防に有効であった。rLukF-PVワクチンで免疫された１羽のウサギにおける病的状態の徴候は、rLukF-PVワクチンがrLukS-PVワクチンほど有効ではなかったことを示すと考えられるが、サンプルサイズが小さすぎて科学的に妥当な結論を引き出すことができない。いずれにしても、rLukF-PVワクチンは、ウサギが感染から完全には防御されないとしても、少なくとも病気の発症および／または重症度を遅延させた。
【実施例１７】
【０１４７】
PVL抗原のクローニング、発現、および精製
LukF-PVおよびLukS-PVをコードするヌクレオチド配列を、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって、黄色ブドウ球菌ATCC番号49774のゲノムDNAからpTrcHis-Bベクター(Stratagene)に、アミノ末端およびカルボキシ末端にてそれぞれNcoIおよびBamHI制限酵素部位を用いて、クローニングする。プラスミドpTrcLukS PV1およびpTrcLukF PV1を形成させ、DNA配列決定によって確認する。プラスミドの発現はlacオペロンの制御下にあるので、タンパク質発現を誘導するためにIPTGを使用する。このプラスミドで形質転換された大腸菌細胞において発現が達成される。
【０１４８】
LukF-PVおよびLukS-PVサブユニットは、その後、二段階カラムスキームによって大腸菌細胞から精製される。LukF-PVおよびLukS-PVを含有する大腸菌細胞を溶解し、細胞残渣を遠心により除去した。細胞溶解物を最初に、5%グリセロール含有0.05M NaCl/0.02 Mリン酸ナトリウム（pH 6.5）中でSP-Sepharoseカラム上にロードし、0.05〜0.5 M NaCl線形勾配で溶出した。SDS-PAGEによって検出される抗原LukF-PVまたはLukS-PVを含有する画分をプールした。プールした抗原を、セラミックヒドロキシアパタイト（CHT）アフィニティカラム上でさらに精製した。CHTカラムははじめに、5%グリセロール含有0.05 M NaCl/0.02 Mリン酸ナトリウム、pH 6.8で平衡化し、0.05M〜0.75 M NaClの線形勾配で溶出した。最終産物の純度をSDS-PAGE/銀染色によって分析した。
【実施例１８】
【０１４９】
無毒性PVL変異型タンパク質の作製
無毒性PVL変異型タンパク質は、突然変異誘発によって作製される。この変異型タンパク質は、PCRクローニング／突然変異誘発技術によって作製される。変異体は、標準的な部位特異的突然変異誘発法を用いて、鋳型DNAとしてプラスミドDNA[pTrcLukF PV1 (LukF-PV用)およびpTrcLukS PV1(LukS-PV用)]を使用して作製される。変異型タンパク質は、細胞膜内に自身を挿入するLukS-PVサブユニットの能力を排除する変異、膜貫通領域のステムもしくは細胞質側の先端がLukSもしくはLukFに向けてアンフォールディングしないようにする変異、白血球溶解活性に必要とされるリン酸化部位を変更する変異、Ca2+チャネル活性を阻害する変異、PVL孔の活性を阻害する変異、および／またはLukS-PVおよびLukF-PVサブユニット間相互作用を崩壊させる変異を含有する。
【実施例１９】
【０１５０】
中和アッセイ
動物実験から得られた抗血清の、PVL LukF-PVおよびLukS-PVサブユニットに対する力価をELISAによってアッセイする。高い力価を有する抗血清を中和アッセイに使用する。基本的に、細胞毒性アッセイは、中和抗体を添加することによって実施される。抗体は、多形核白血球と混合する前にPVLサブユニットに加えるか、またはアッセイ時に多形核白血球に同時に加える。中和は、PVLによって引き起こされる形態変化の減少を観察することによって、および／または活性化されたカルシウムチャネルもしくはPVL孔のいずれかを通った陽イオンの流入によって引き起こされる蛍光発光の減少を検出することによって、検知される。
【実施例２０】
【０１５１】
PVL抗体産生
ドナー刺激
PVLタンパク質を用いて血漿ドナーをワクチン接種する。血漿を採取し、標準法を用いてIgGを精製する。
【０１５２】
PVL特異的モノクローナル抗体（MAb）の作製
MAb作製のために、毒素ごとに2群のマウスについて、4群のBALB/cマウスをPVL毒素（LukF-PVサブユニット、LukS-PVサブユニット、または両者）で免疫する。免疫化は、マウス屠殺の3日前に行われる最後の注射を除き、2週間間隔で行う。それぞれの毒素は、各群のマウス毎に5μgおよび10μgで注射する。最初の2回の注射については、毒素はフロイント完全アジュバントおよび不完全アジュバントと順次組み合わせて、投与される。その後の注射は、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に希釈した毒素を用いて行う。脾細胞懸濁液は、屠殺したマウスからの各群のプールとして調製され、後日の融合実験に使用するために液体窒素中で適当な量に分割して保存する。LukF-PVおよびLukS-PVに特異的なMAbの濃縮ストック供給の在庫は、融合実験の日から約4か月の間に作製される。
【０１５３】
マウスモノクローナル抗体は、選抜された後、抗体の特異性の高い抗原認識部分についてのマウス遺伝子を、抗体分子の残りの部分をコードするヒト遺伝子中へとスプライシングすることによってヒト化する。通常はヒト化モノクローナル抗体が含有するマウス成分は10%未満であり、免疫反応を最小限にする。
【０１５４】
組換え抗体の作製−ファージディスプレイを用いた抗体作製
ファージディスプレイ技術を使用する場合2つの戦略が適用される。第1は、ペプチドまたはヒト抗体フラグメントのいずれかを発現する、ナイーブライブラリとして知られている既製ライブラリの使用である。第2は、目的のタンパク質に特異的な抗体ライブラリの構築を伴う。
【０１５５】
どちらのアプローチを使用するかを決める前に、市販のライブラリを調査して比較する。もう一つの方法として、免疫した動物から得られた脾細胞を用いて、目的のタンパク質に特異的なライブラリを構築する。
【０１５６】
ライブラリ戦略を決定した後、LukS-PVおよびLukF-PVをスクリーニング用のターゲットとして使用する。特異的ペプチドまたは抗体フラグメントを提示するファージを捕捉するためにLukS-PVおよびLukF-PVサブユニットを固体支持体に吸着させる。捕捉されたファージ粒子を、高親和性ペプチドもしくは抗体フラグメントの選択のために、特異的に溶出させる。高特異性ペプチドまたは抗体フラグメントの単離のために、一般にが3ラウンドの選択が用いられる。特異性を高めるために、必要に応じて、ファージライブラリのランダム突然変異誘発も使用される。
【０１５７】
本発明の範囲および精神から逸脱することなく、さまざまな置換および改変を本明細書に記載の発明に対して行うことができる。上記の記述および実施例は、説明のためだけのものであって、発明の範囲を限定するものではなく、その範囲は特許請求の範囲によって規定される。
【図面の簡単な説明】
【０１５８】
【図１】抗LukS-PVおよび抗LukF-PVウサギ抗血清を用いたrLukS-PVおよびrLukF-PV抗原の免疫拡散法。
【図１】
2008546648.tif 000009
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月13日(2008.2.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
黄色ブドウ球菌（S. aureus）のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原のLukS-PVサブユニットと特異的に結合するがLukF-PVサブユニットとは特異的に結合しない、抗体。
【請求項２】
前記抗体がポリクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１に記載の抗体。
【請求項４】
(i) 黄色ブドウ球菌のPVL抗原のLukS-PVサブユニットを含むがLukF-PVサブユニットは含まない組成物を被験体に投与すること、および
(ii) 該被験体から抗体を得ること、
を含む方法によって調製される、請求項１に記載の抗体。
【請求項５】
LukS-PVサブユニットが、精製野生型LukS-PVサブユニットおよび組換えLukS-PVサブユニットからなる群から選択される、請求項４に記載の抗体。
【請求項６】
LukS-PVサブユニットが、そのアミノ酸配列中に、その野生型アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む変異を有する、請求項４に記載の抗体。
【請求項７】
前記変異が、(i) 細胞膜へのPVLの結合を妨げる変異、(ii) 膜貫通領域のステムもしくは細胞質側の先端がLukSに向けてアンフォールディングしないようにする変異、(iii) LukF-PVとLukS-PVの組み立てを阻止する変異、(iv) Ca2+チャネル活性を阻害する変異、(v) PVL孔の活性を阻害する変異、(vi) LukS-PVのリン酸化部位を変更する変異、(vii) LukS-PVの「アミノラッチ（amino latch）」のN末端欠失をもたらす変異、ならびに(viii) プレステムのアンフォールディングおよび膜への挿入を妨げるシステイン二重変異体を生じる変異、からなる群から選択される少なくとも１つの変異である、請求項６に記載の抗体。
【請求項８】
LukS-PVサブユニットが(i) T28F、(ii) T28N、および(iii) T28Dからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する、請求項６に記載の抗体。
【請求項９】
請求項１に記載の抗体、および製薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項１０】
前記組成物がIVIG組成物である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記組成物が高度免疫特異的IVIG組成物である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原に対する１つまたはそれ以上の抗体をさらに含む、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
１つまたはそれ以上の抗体が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質、ならびにそれらの組み合わせからなる群から選択される１つまたはそれ以上の黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体からなる群から選択される、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体を含む組成物を、個体に投与することを含む、個体においてPVL関連細胞毒性を中和する方法。
【請求項１５】
黄色ブドウ球菌のPVL抗原のLukS-PVサブユニットおよび製薬上許容される担体を含む組成物であって、LukS-PVサブユニットが、そのLukS-PVアミノ酸配列中に、その野生型アミノ酸配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む変異を有する、組成物。
【請求項１６】
LukS-PVサブユニットが、(i) 細胞膜へのPVLの結合を妨げる変異、(ii) 膜貫通領域のステムもしくは細胞質側の先端がLukSに向けてアンフォールディングしないようにする変異、(iii) LukF-PVとLukS-PVの組み立てを阻止する変異、(iv) Ca2+チャネル活性を阻害する変異、(v) PVL孔の活性を阻害する変異、(vi) LukS-PVのリン酸化部位を変更する変異、(vii) LukS-PVの「アミノラッチ（amino latch）」のN末端欠失をもたらす変異、ならびに(viii) プレステムのアンフォールディングおよび膜への挿入を妨げるシステイン二重変異体を生じる変異、からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
PVL抗原が(i) T28F、(ii) T28N、および(iii) T28Dからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有するLukS-PVサブユニットを含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
組成物がLukF-PVサブユニットを含まない、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２０】
前記１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
１つまたはそれ以上の追加のPVL抗原をさらに含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項２２】
LukS-PVアミノ酸配列中に、その野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む変異を有する、黄色ブドウ球菌のPVL抗原のLukS-PVサブユニット。
【請求項２３】
前記変異が、(i)細胞膜へのPVLの結合を妨げる変異、(ii)膜貫通領域のステムもしくは細胞質側の先端がLukSに向けてアンフォールディングしないようにする変異、(iii) LukF-PVとLukS-PVの組み立てを阻止する変異、(iv) Ca2+チャネル活性を阻害する変異、(v) PVL孔の活性を阻害する変異、(vi) LukS-PVのリン酸化部位を変更する変異、(vii) PVL抗原の「アミノラッチ」のN末端欠失をもたらす変異、ならびに(viii) プレステムのアンフォールディングおよび膜への挿入を妨げるシステイン二重変異体を生じる変異、からなる群から選択される、請求項２２に記載のLukS-PVサブユニット。
【請求項２４】
LukS-PVサブユニットが(i) T28F、(ii) T28N、および(iii) T28Dからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する、請求項２２に記載のLukS-PVサブユニット。
【請求項２５】
請求項２２に記載のLukS-PVサブユニットに特異的に結合する抗体。
【請求項２６】
以下の(i)および(ii)：
(i) 黄色ブドウ球菌のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原のLukS-PVサブユニットと特異的に結合するがLukF-PVサブユニットとは特異的に結合しない抗体、および製薬上許容される担体、を含む組成物、および
(ii) 黄色ブドウ球菌のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原のLukS-PVサブユニットを含むがLukF-PVサブユニットは含まず、かつ製薬上許容される担体を含む組成物、
からなる群から選択される組成物を、それを必要とする被験体に投与することを含む、黄色ブドウ球菌のPVL発現株と関連する黄色ブドウ球菌感染症を治療または予防する方法。
【請求項２７】
抗感染薬、抗生物質、および抗微生物薬からなる群から選択される薬剤を投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
抗生物質薬剤が、バンコマイシン、クリンダマイシンおよびリゾスタフィンからなる群から選択される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
黄色ブドウ球菌感染症が、市中感染型メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（CA-MRSA）感染症、皮膚もしくは軟部組織感染症、壊死性肺炎、乳腺炎、壊死性筋膜炎、ウォーターハウス・フリードリクセン（Waterhouse Friderichsen）症候群、CA-MRSA敗血症、ならびにPVL抗原を発現する黄色ブドウ球菌菌株による感染症、からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原に対する１つまたはそれ以上の抗体を投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３１】
１つまたはそれ以上の抗体が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される黄色ブドウ球菌抗原に対する抗体からなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原を投与することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項３３】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
(i) 黄色ブドウ球菌のPVL抗原のLukS-PVサブユニットを含むがLukF-PVサブユニットは含まず、かつ製薬上許容される担体を含む組成物を、被験体に投与すること、(ii) 被験体から血漿を採取すること、および(iii) 被験体からの免疫グロブリンを精製すること、を含む、高度免疫特異的IVIG製剤を製造する方法。
【請求項３５】
LukS-PVサブユニットが、野生型LukS-PVサブユニットおよび変異型LukS-PVサブユニットからなる群から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
LukS-PVサブユニットが、LukS-PVアミノ酸配列中に、その野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む変異を有する、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
被験体に１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原を投与することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
(i) 黄色ブドウ球菌のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原のLukS-PVサブユニットと特異的に結合するがLukF-PVサブユニットには特異的に結合しない抗体を含む静脈注射用免疫グロブリン（IVIG）組成物、および(ii) 製薬上許容される担体、を含む組成物であって、前記IVIG組成物が、通常のIVIGにおいて認められるよりも少なくとも2倍高い抗LukS-PVサブユニット抗体価を有する、前記組成物。
【請求項３９】
LukS-PVサブユニットを含む前記組成物が投与される、請求項２６に記載の方法。
【請求項４０】
前記組成物が、LukS-PVアミノ酸配列中に、その野生型配列と比較して、少なくとも１つのアミノ酸置換、挿入、または欠失を含む変異を有するLukS-PVサブユニットを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記変異が、(i)細胞膜へのPVLの結合を妨げる変異、(ii)膜貫通領域のステムもしくは細胞質側の先端がLukSに向けてアンフォールディングしないようにする変異、(iii) LukF-PVとLukS-PVの組み立て（assembly）を阻止する変異、(iv) Ca2+チャネル活性を阻害する変異、(v) PVL孔の活性を阻害する変異、(vi) LukS-PVのリン酸化部位を変更する変異、(vii) PVL抗原の「アミノラッチ」のN末端欠失をもたらす変異、ならびに(viii) プレステムのアンフォールディングおよび膜への挿入を妨げるシステイン二重変異体を生じる変異、からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
LukS-PVサブユニットが(i) T28F、(ii) T28N、および(iii) T28Dからなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
LukS-PVサブユニットが野生型LukS-PVサブユニットを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４４】
前記組成物が、黄色ブドウ球菌のPanton-Valentineロイコシジン（PVL）抗原のLukS-PVサブユニットと特異的に結合するがLukF-PVサブユニットとは特異的に結合しない抗体を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項４５】
LukS-PVサブユニットが野生型LukS-PVサブユニットを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４６】
１つまたはそれ以上の追加の細菌抗原が、黄色ブドウ球菌Type 5、黄色ブドウ球菌Type 8、黄色ブドウ球菌336、表皮ブドウ球菌PSl、表皮ブドウ球菌GPl、α毒素、リポタイコ酸（LTA）および接着性マトリックス分子を認識する微生物表面成分（MSCRAMM）タンパク質からなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。
【国際調査報告】
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