(57)【要約】本発明は、生物学的実体（例えば、細胞）内の、生物学的機能（例えば、転写因子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在）のネットワークを解析する方法およびシステムを提供する。詳しくは、本発明の目的は、細胞を複雑系と見なして、改変を加えずに全体的な様式で生物学的な情報を提示するシステムおよび方法を提供することである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法であって、該方法は：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程、
を包含する、方法。
【請求項２】
前記生物学的実体が細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記摂動因子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびリボザイムを含むＲＮＡ、化合物、ｃＤＮＡ、抗体、ポリペプチド、光、音、圧力変化、放射、熱ならびにガスからなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記摂動因子が、前記機能レポーターの機能を特異的に調節し得るｓｉＲＮＡを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記機能レポーターが測定可能なシグナルを伝達し得る、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記機能レポーターが、転写因子、調節遺伝子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
請求項１に記載の方法であって、前記集合論による処理が、前記少なくとも２種類の機能レポーターのうち、２種類の特定の機能レポーターを、
ａ）独立、
ｂ）包含、および
ｃ）共通部分、
からなる群より選択される関係へ分類する工程を包含し、
ここで、該関係が独立であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターが、前記ネットワーク内で関係を有さないと決定され、
該関係が包含であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターのうちの一方が、該２種類の特定の機能レポーターのうちの他方に含まれると決定され、かつ該２種類の特定の機能レポーターのうちの一方が、該２種類の特定の機能レポーターのうちの他方の下流に位置し、
該関係が共通部分であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターが、別の共通の機能から分岐した下流に位置すると決定される、
方法。
【請求項８】
前記集合論による処理が、前記機能レポーターごとに、前記摂動因子による応答の有無をマッピングする工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記レポーター間の関係の計算が、独立、包含および共通部分に分類された、各々の機能レポーター間の相関を含み、該相関の一覧を作成する工程を包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
１つの細胞内パスウェイを等しく標的化するのに十分な個数の前記摂動因子が調製される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも２種類の機能レポーターについての情報は、所望の時間後の前記摂動因子の影響に基づく、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１に記載の方法であって、前記影響が、閾値に関して、以下の３つの群：
ポジティブな影響＝＋；
影響なし＝０および
ネガティブな影響＝−
に分類される、方法。
【請求項１３】
請求項１に記載の方法であって、前記少なくとも２種類の機能レポーターについての情報は、所望の時間後の前記摂動因子の影響に基づき、ここで、前記集合論による処理は、以下の工程を包含する：
ａ）該影響と該機能レポーターについての閾値とを比較し、
ポジティブな影響＝＋、影響なし＝０、およびネガティブな影響＝−
の３つの群に分類することにより、該情報を３つのカテゴリに分類する工程、
ｂ）該機能レポーターのうちの２種類が、同一の型の影響を有する共通の摂動因子を有するか否かを決定する工程であって、ここで、
このような共通の摂動因子が存在しない場合、該２種類の機能レポーターに対応する２種類の機能は、互いに異なる摂動因子の下に配置され、
このような共通の摂動因子が存在する場合、以下の工程ｃ）を実施する、工程
ｃ）該２種類の機能のうちの一方の機能に対する摂動因子の集合が、該２種類の機能のうちの他方の機能に対する摂動因子の集合に完全に包含されるか否かを決定する工程であって、ここで、
このことが真である場合、より大きな集合を有する一方の機能が、より小さな集合を有する他方の機能の下に配置され、
このことが真ではない場合、該２種類の機能が、同一の摂動因子の下に並行して配置される、工程、
ｄ）該機能レポーターの全ての組合せを調べるか否かを決定する工程であって、ここで、
このことが真である場合、該機能の関係の全てを統合して、現時点での全体的な摂動影響ネットワークにし、
このことが真ではない場合、工程ａ）〜工程ｃ）を反復する、
方法。
【請求項１４】
前記３つの群が、＋１、０および−１に分類される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記工程ａ）〜工程ｃ）が、Ｍ×Ｎ行列を作製することによって判断され、ここでＭは機能レポーターの個数を指し、Ｎは摂動因子の個数を指す、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
実際の生物学的実験を実行することによって、前記作製されたネットワークを解析する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記解析工程が、該機能に特異的な調節因子の使用を包含する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記調節因子がｓｉＲＮＡである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記ネットワークが、シグナル伝達経路および細胞パスウェイを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
前記ネットワークが、バイオマーカーの同定、創薬ターゲットの解析、副作用解析、細胞機能の診断、細胞パスウェイ解析、化合物の生物影響評価および感染症診断からなる群より選択される使用のために使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
生物学的実体内の生物学的機能のネットワーク解析システムであって、該システムは：
Ａ）生物学的実体に対する、少なくとも１種類の摂動因子、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る手段、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作製する手段、
を備える、システム。
【請求項２２】
前記生物学的実体が細胞である、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２３】
前記摂動因子が、ｓｉＲＮＡ、化合物、ｃＤＮＡ、抗体、ポリペプチド、光、音、圧力変化、放射、熱ならびにガスからなる群より選択される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２４】
前記摂動因子が、前記機能レポーターの機能を特異的に調節し得るｓｉＲＮＡを含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２５】
前記機能レポーターが測定可能なシグナルを伝達し得る、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２６】
前記機能レポーターが、転写因子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在からなる群より選択される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２７】
請求項２１に記載のシステムであって、前記集合論による処理が、前記少なくとも２種類の機能レポーターのうち、２種類の特定の機能レポーターを、以下からなる群より選択される関係へ分類する工程を包含する：
ａ）独立、
ｂ）包含、および
ｃ）共通部分、
ここで、該関係が独立であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターが、前記ネットワーク内で関係を有さないと決定され、
該関係が包含であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターのうちの一方が、該２種類の特定の機能レポーターのうちの他方に含まれると決定され、かつ該２種類の特定の機能レポーターのうちの一方が、該２種類の特定の機能レポーターのうちの他方の下流に位置し、
該関係が共通部分であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターが、別の共通の機能から分岐した下流に位置すると決定される、
システム。
【請求項２８】
前記集合論による処理が、前記機能レポーターごとに、前記摂動因子による応答の有無をマッピングする工程を包含する、請求項２１に記載のシステム。
【請求項２９】
前記レポーター間の関係の計算が、独立、包含および共通部分に分類された、各々の機能レポーター間の相関を含み、該相関の一覧を作成する工程を包含する、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３０】
１つの細胞内パスウェイを等しく標的化するのに十分な個数の前記摂動因子が調製される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３１】
情報を得るための前記手段は、所望の時間後の前記摂動因子の影響に基づく、前記少なくとも２種類の機能レポーターについての情報を得るための手段を備える、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３２】
請求項２１に記載のシステムであって、前記影響が、閾値に関して、ポジティブな影響＝＋、影響なし＝０、およびネガティブな影響＝−の３つの群に分類される、システム。
【請求項３３】
請求項２１に記載のシステムであって、前記少なくとも２種類の機能レポーターについての情報は、所望の時間後の前記摂動因子の影響に基づき、ここで、該得られた情報を集合論による処理に供する手段は、以下の手段を備える：
ａ）該影響と該機能レポーターについての閾値とを比較し、ポジティブな影響＝＋、影響なし＝０、およびネガティブな影響＝−の３つの群に分類することにより、該情報を３つのカテゴリに分類するための手段、
ｂ）該機能レポーターのうちの２種類が、同一の型の影響を有する共通の摂動因子を有するか否かを決定するための手段であって、ここで、
このような共通の摂動因子が存在しない場合、該２種類の機能レポーターに対応する２種類の機能は、互いに異なる摂動因子の下に配置され、
このような共通の摂動因子が存在する場合、以下の工程ｃ）を実施する、手段
ｃ）該２種類の機能のうちの一方の機能に対する摂動因子の集合が、該２種類の機能のうちの他方の機能に対する摂動因子の集合に完全に包含されるか否かを決定するための手段であって、ここで、
このことが真である場合、より大きな集合を有する一方の機能が、より小さな集合を有する他方の機能の下に配置され、
このことが真ではない場合、該２種類の機能が、同一の摂動因子の下に並行して配置される、手段、
ｄ）該機能レポーターの全ての組合せを調べるか否かを決定するための手段であって、ここで、
このことが真である場合、該機能の関係の全てを統合して、現時点での全体的な摂動影響ネットワークにし、
このことが真ではない場合、工程ａ）〜工程ｃ）を反復する、
システム。
【請求項３４】
前記３つの群が、＋１、０および−１に分類される、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３５】
前記手段ａ）〜手段ｃ）が、Ｍ×Ｎ行列を作製することによって実行され、ここでＭは機能レポーターの個数を指し、Ｎは摂動因子の個数を指す、請求項３３に記載のシステム。
【請求項３６】
実際の生物学的実験を実行することによって、前記作製されたネットワークを解析するための手段をさらに備える、請求項２１に記載のシステム。
【請求項３７】
前記解析するための手段が、該機能に特異的な調節因子を含む、請求項３６に記載のシステム。
【請求項３８】
前記調節因子がｓｉＲＮＡである、請求項３７に記載のシステム。
【請求項３９】
前記ネットワークが、シグナル伝達経路を含む、請求項２１に記載のシステム。
【請求項４０】
前記ネットワークが、バイオマーカーの同定、創薬ターゲットの解析、副作用解析、細胞機能の診断、細胞パスウェイ解析、化合物の生物影響評価および感染症診断からなる群より選択される使用のために使用される、請求項２１に記載のシステム。
【請求項４１】
生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法を、コンピュータ上で実行するコンピュータプログラムであって、該方法は：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程、
を包含する、コンピュータプログラム。
【請求項４２】
生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法を、コンピュータ上で実行するコンピュータプログラムを含む記憶媒体であって、該方法は：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程、
を包含する、記憶媒体。
【請求項４３】
生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法を、コンピュータ上で実行するコンピュータプログラムを含む通信媒体であって、該方法は：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程、
を包含する、通信媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、生物学的解析の分野に関し、より詳しくは、細胞のような生物学的実体の論理的な解析に関する。
【背景技術】
【０００２】
生物の生存は、摂動因子（例えば、細胞外シグナル）を認知し、その摂動因子に応答する能力に依存する。分子レベルにおいて、摂動因子（例えば、シグナル）は、生物学的実体内に存在する、相互作用する因子（例えば、タンパク質または代謝産物など）のネットワークを介して、認知され、そして伝達される。これらの因子は、細胞のホメオスタシスを維持するように協同して作用し、そして増殖、分裂、分化および薬物応答のような活性を調節する。生物学的実体のネットワークを通した情報伝達は、主に、シグナルに応答して動的に集合および分解し得る、種々の機能を有する因子間の相互作用によって媒介され、外部事象を特定の内部の出力（例えば、遺伝子発現、遺伝子発現、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在における変化）に連結する一過性の回路を作製する。これらのネットワークの基礎となる相互作用をマップするために、多数の戦略が開発されている。これらの研究は、集合的に、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｖｉｓｉａｅおよび他の生物について、ゲノム全体にわたるタンパク質−タンパク質相互作用の輪郭を描く豊富なデータを提供している。これらの手段は、非常に強力であるが、部分的に完成した像を提供するだけであって、おそらく、微妙な状況にある多くの相互作用（その相互作用は、それらの適切なシグナルが存在する場合にのみ、形成される）を見過ごしている。
【０００３】
摂動因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、抗体、リガンド、ホルモン、薬物、タンパク質、変異または低分子）による相互作用の変化は、生物学的な表現型（例えば、細胞表現型）における大きな変化を誘発する、生物学的機能のネットワークの小さな摂動（例えば、転写因子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在に現れるもの）を可能にする生物学的な支柱を作製し得るが、所定のシグナル伝達経路における全ての相互作用がこの力を保有するわけではないようである。従って、全体的な相互作用を同定することを目的とする補完的な戦略が興味深い。この戦略において、細胞中へ外来因子またはペプチドを人工的に導入し（これらは、内因性調節相互作用と競合し、そしてその関係を崩す（ｔｉｔｒａｔｅ−ｏｕｔ））、それによって外部シグナルを細胞応答に連結させる正常な回路を破壊する。機能的なアッセイ（例えば、シグナルに応答した遺伝子の活性化）とこの戦略とを合わせることによって、機能的な妨害についてのスクリーニングは、調節性タンパク質−タンパク質相互作用を摂動させるペプチドを同定するために使用され得る。この戦略（しばしば、ドミナント阻害遺伝学またはドミナントネガティブ遺伝学と称される）は、いくつかのモデル生物において好首尾に使用される（ここで、ハイスループットのスクリーニング方法が、容易に適用されている）が、哺乳動物においては、その使用の程度は少ない（旧来、哺乳動物は、この型のスクリーニングの対象となりにくい）。ドミナントネガティブ戦略の１つの利点は、この戦略が機能的に関連するタンパク質−タンパク質相互作用の「支柱の点」の位置を正確に示し、それによって、外部の因子による機能的な調節を受けやすいタンパク質ネットワークの大きな網の中で、少ない数の中心点をあらわにすることである。従って、ドミナントネガティブ戦略の結果は、特定の経路を規定する調節成分に関する極めて重大な情報を提供し得、そして薬物スクリーニングプログラムによって標的化するのに適した重要な相互作用を解明し得る。
【０００４】
Ｒｏｓｅｔｔａ  Ｉｎｐｈａｒｍａｔｉｃｓは、種々の特許出願において、細胞の情報をプロファイルとして提供することを提案している（特許文献１〜１１）。しかし、このようなプロファイルは、いずれも、別々の細胞からの情報を連続情報としてではなく、別個の情報の集合として処理しており、真の意味で、一個の（同じ）細胞に注目した情報解析を行っていないという点で限界がある。特に、このような技術では、ある変化の前後の特定の各一時点のみに注目して解析がなされており、ある一点（遺伝子）がとる時間的変化のプロセスを解析するものではない。
【０００５】
プロファイリング技術については、近年の技術の進歩により、細胞の構成要素を正確に測定すること、それゆえに細胞の情報のプロファイルを導出することが可能になってきている（例えば、非特許文献１〜３；特許文献１２）。ゲノム全体が知られている生物では、その細胞内の全遺伝子の転写産物を解析することが可能である。ゲノムの情報が増えつつある他の生物の場合には、細胞内の多数の遺伝子を同時にモニタリングすることが可能である。
【０００６】
アレイ技術の進展により、薬物探索の分野などでもアレイが使用されている（例えば、非特許文献４〜５）。プロファイルを用いた解析（例えば、特許文献１３を参照）およびプロファイルのクラスター化は、細胞の状態、移植、薬物の標的分子および候補ならびに／または薬物の関連機能、効力および毒性に関する情報を与える。これらの技術は理想的な薬物活性または疾病状態を表す共通のプロファイルを誘導するためにも使用できる。プロファイルの比較は、患者の疾病を初期段階で検出するのに役立ち、病気があると診断された患者のための改善された臨床結果の予測を提供する。
【０００７】
しかし、生物学的実体（例えば、細胞）内に存在する生物学的機能のネットワークに関する実際の情報を、単純であり、有効かつ正確な様式で提供することのできる技術は存在していない。上記の技術においては、二成分性の様式でしかデータは解析されない、言い換えれば、２つの特定のネットワーク間の関係しか解析されず、それゆえ、全体的な様式ではデータは解析されない。このようなデータに基づく解析および評価は、正確さを欠き、時折誤った解釈を導き得る。したがって、生物学的実体内の生物学的機能のネットワークの解析法を提供する方法への需要が高まっている。
【特許文献１】国際公開０１／００６０１３号パンフレット
【特許文献２】国際公開０１／００５９３５号パンフレット
【特許文献３】国際公開００／３９３３９号パンフレット
【特許文献４】国際公開００／３９３３８号パンフレット
【特許文献５】国際公開００／３９３３７号パンフレット
【特許文献６】国際公開００／２４９３６号パンフレット
【特許文献７】国際公開００／１７４０２号パンフレット
【特許文献８】国際公開９９／６６０６７号パンフレット
【特許文献９】国際公開９９／６６０２４号パンフレット
【特許文献１０】国際公開９９／５８７２０号パンフレット
【特許文献１１】国際公開９９／５９０３７号パンフレット
【特許文献１２】国際公開０１／００６０１３号パンフレット
【特許文献１３】米国特許第５，７７７，８８８号明細書
【非特許文献１】Ｓｃｈｅｎａら、「Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  ＤＮＡ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ」Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９５年，２７０：４６７−４７０
【非特許文献２】Ｌｏｃｋｈａｒｔら、「Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｂｙ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ａｒｒａｙｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６年，１４：１６７５−１６８０
【非特許文献３】Ｂｌａｎｃｈａｒｄら、「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｔｏ  ａｒｒａｙ：  Ｐｒｏｂｉｎｇ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ’ｓ  ｓｅｃｒｅｔｓ」Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９６年，１４：１６４９
【非特許文献４】Ｍａｒｔｏｎら、「Ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｃｏｎｄａｒｙ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｓ」Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１９９８年  Ｎｏｖ；４（１１）：１２９３−３０１
【非特許文献５】Ｇｒａｙら、「Ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｌｉｂｒａｌｉｅｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ａｎｄ  ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ」Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８年，２８１：５３３−５３８
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、生物学的実体（例えば、細胞）内の生物学的機能（例えば、転写因子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在）のネットワーク解析法およびシステムを提供することを課題とする。詳しくは、本発明は、改変を加えずに、細胞を複雑なシステムとしてみなす、全体的な様式で生物学的な情報を提示するためのシステムおよび方法を提供することを課題とする。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
（発明の要旨）
本発明の上記課題は、以下の工程を包含する方法を提供することによって達成された：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）上記の生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）上記で得た情報を集合論による処理に供し、上記の機能レポーター間の関係を計算する工程。
以上の工程の結果、生物学的機能のネットワークの関係を作製し、そして生物学的実体内の生物学的機能のネットワーク解析システムを開発する。このシステムは、以下を備える：
Ａ）生物学的実体に対する、少なくとも１種類の摂動因子、
Ｂ）上記の生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得るための手段、および
Ｃ）上記で得られた情報を集合論による処理に供し、上記の機能レポーター間の関係を計算し、生物学的機能のネットワークの関係を作製するための手段。
【００１０】
本発明は、生物学的実体（例えば、細胞）のネットワークを解析するための、単純であり、有効かつ正確な方法およびシステムを達成した。本発明を使用して、全体的なネットワークを、容易かつ徹底的に解析することができる。生物学的機能のネットワークを、このように徹底的かつ全体的に解析することは、先行技術においてなされておらず、それゆえ、本発明は、従来技術で予期されない顕著な効果を提供する。
【００１１】
したがって、本発明は、バイオマーカーの同定、創薬ターゲットの解析、副作用解析、細胞機能の診断、細胞パスウェイ解析、化合物の生物影響評価および感染症診断などのような種々の使用において有用である。
【００１２】
したがって、本発明は、以下の発明を提供する。
（１）生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法であって、該方法は：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程、
を包含する、方法。
（２）前記生物学的実体が細胞である、項目１に記載の方法。
（３）前記摂動因子が、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびリボザイムを含むＲＮＡ、化合物、ｃＤＮＡ、抗体、ポリペプチド、光、音、圧力変化、放射、熱ならびにガスからなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（４）前記摂動因子が、前記機能レポーターの機能を特異的に調節し得るｓｉＲＮＡを含む、項目１に記載の方法。
（５）前記機能レポーターが測定可能なシグナルを伝達し得る、項目１に記載の方法。
（６）前記機能レポーターが、転写因子、調節遺伝子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在からなる群より選択される、項目１に記載の方法。
（７）項目１に記載の方法であって、前記集合論による処理が、前記少なくとも２種類の機能レポーターのうち、２種類の特定の機能レポーターを、以下からなる群より選択される関係へ分類する工程を包含する：
ａ）独立、
ｂ）包含、および
ｃ）共通部分、
ここで、該関係が独立であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターが、前記ネットワーク内で関係を有さないと決定され、
該関係が包含であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターのうちの一方が、該２種類の特定の機能レポーターのうちの他方に含まれると決定され、かつ該２種類の特定の機能レポーターのうちの一方が、該２種類の特定の機能レポーターのうちの他方の下流に位置し、
該関係が共通部分であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターが、別の共通の機能から分岐した下流に位置すると決定される、
方法。
（８）前記集合論による処理が、前記機能レポーターごとに、前記摂動因子による応答の有無をマッピングする工程を包含する、項目１に記載の方法。
（９）前記レポーター間の関係の計算が、独立、包含および共通部分に分類された、各々の機能レポーター間の相関を含み、該相関の一覧を作成する工程を包含する、項目１に記載の方法。
（１０）１つの細胞内パスウェイを等しく標的化するのに十分な個数の前記摂動因子が調製される、項目１に記載の方法。
（１１）前記少なくとも２種類の機能レポーターについての情報は、所望の時間後の前記摂動因子の影響に基づく、項目１に記載の方法。
（１２）項目１に記載の方法であって、前記影響が、閾値に関して、以下の３つの群に分類される：ポジティブな影響  ＝  ＋、影響なし  ＝  ０、およびネガティブな影響  ＝  −、方法。
（１３）項目１に記載の方法であって、前記少なくとも２種類の機能レポーターについての情報は、所望の時間後の前記摂動因子の影響に基づき、ここで、前記集合論による処理は、以下の工程を包含する：
ａ）該影響と該機能レポーターについての閾値とを比較し、ポジティブな影響  ＝  ＋、影響なし  ＝  ０、およびネガティブな影響  ＝  −、の３つの群に分類することにより、該情報を３つのカテゴリに分類する工程、
ｂ）該機能レポーターのうちの２種類が、同一の型の影響を有する共通の摂動因子を有するか否かを決定する工程であって、ここで、
このような共通の摂動因子が存在しない場合、該２種類の機能レポーターに対応する２種類の機能は、互いに異なる摂動因子の下に配置され、
このような共通の摂動因子が存在する場合、以下の工程ｃ）を実施する、工程
ｃ）該２種類の機能のうちの一方の機能に対する摂動因子の集合が、該２種類の機能のうちの他方の機能に対する摂動因子の集合に完全に包含されるか否かを決定する工程であって、ここで、
このことが真である場合、より大きな集合を有する一方の機能が、より小さな集合を有する他方の機能の下に配置され、
このことが真ではない場合、該２種類の機能が、同一の摂動因子の下に並行して配置される、工程、
ｄ）該機能レポーターの全ての組合せを調べるか否かを決定する工程であって、ここで、
このことが真である場合、該機能の関係の全てを統合して、現時点での全体的な摂動影響ネットワークにし、
このことが真ではない場合、工程ａ）〜工程ｃ）を反復する、
方法。
（１４）前記３つの群が、＋１、０および−１に分類される、項目１３に記載の方法。
（１５）前記工程ａ）〜工程ｃ）が、Ｍ×Ｎ行列を作製することによって判断され、ここでＭは機能レポーターの個数を指し、Ｎは摂動因子の個数を指す、項目１３に記載の方法。
（１６）実際の生物学的実験を実行することによって、前記作製されたネットワークを解析する工程をさらに包含する、項目１に記載の方法。
（１７）前記解析工程が、該機能に特異的な調節因子の使用を包含する、項目１６に記載の方法。
（１８）前記調節因子がｓｉＲＮＡである、項目１７に記載の方法。
（１９）前記ネットワークが、シグナル伝達経路および細胞パスウェイを含む、項目１に記載の方法。
（２０）前記ネットワークが、バイオマーカーの同定、創薬ターゲットの解析、副作用解析、細胞機能の診断、細胞パスウェイ解析、化合物の生物影響評価および感染症診断からなる群より選択される使用のために使用される、項目１に記載の方法。
（２１）生物学的実体内の生物学的機能のネットワーク解析システムであって、該システムは：
Ａ）生物学的実体に対する、少なくとも１種類の摂動因子、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る手段、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作製する手段、
を備える、システム。
（２２）前記生物学的実体が細胞である、項目２１に記載のシステム。
（２３）前記摂動因子が、ｓｉＲＮＡ、化合物、ｃＤＮＡ、抗体、ポリペプチド、光、音、圧力変化、放射、熱ならびにガスからなる群より選択される、項目２１に記載のシステム。
（２４）前記摂動因子が、前記機能レポーターの機能を特異的に調節し得るｓｉＲＮＡを含む、項目２１に記載のシステム。
（２５）前記機能レポーターが測定可能なシグナルを伝達し得る、項目２１に記載のシステム。
（２６）前記機能レポーターが、転写因子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在からなる群より選択される、項目２１に記載のシステム。
（２７）項目２１に記載のシステムであって、前記集合論による処理が、前記少なくとも２種類の機能レポーターのうち、２種類の特定の機能レポーターを、以下からなる群より選択される関係へ分類する工程を包含する：
ａ）独立、
ｂ）包含、および
ｃ）共通部分、
ここで、該関係が独立であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターが、前記ネットワーク内で関係を有さないと決定され、
該関係が包含であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターのうちの一方が、該２種類の特定の機能レポーターのうちの他方に含まれると決定され、かつ該２種類の特定の機能レポーターのうちの一方が、該２種類の特定の機能レポーターのうちの他方の下流に位置し、
該関係が共通部分であると決定される場合、該２種類の特定の機能レポーターが、別の共通の機能から分岐した下流に位置すると決定される、
システム。
（２８）前記集合論による処理が、前記機能レポーターごとに、前記摂動因子による応答の有無をマッピングする工程を包含する、項目２１に記載のシステム。
（２９）前記レポーター間の関係の計算が、独立、包含および共通部分に分類された、各々の機能レポーター間の相関を含み、該相関の一覧を作成する工程を包含する、項目２１に記載のシステム。
（３０）１つの細胞内パスウェイを等しく標的化するのに十分な個数の前記摂動因子が調製される、項目２１に記載のシステム。
（３１）情報を得るための前記手段は、所望の時間後の前記摂動因子の影響に基づく、前記少なくとも２種類の機能レポーターについての情報を得るための手段を備える、項目２１に記載のシステム。
（３２）項目２１に記載のシステムであって、前記影響が、閾値に関して、以下の３つの群に分類される：ポジティブな影響  ＝  ＋、影響なし  ＝  ０、およびネガティブな影響  ＝  −、システム。
（３３）項目２１に記載のシステムであって、前記少なくとも２種類の機能レポーターについての情報は、所望の時間後の前記摂動因子の影響に基づき、ここで、該得られた情報を集合論による処理に供する手段は、以下の手段を備える：
ａ）該影響と該機能レポーターについての閾値とを比較し、ポジティブな影響  ＝  ＋、影響なし  ＝  ０、およびネガティブな影響  ＝  −、の３つの群に分類することにより、該情報を３つのカテゴリに分類するための手段、
ｂ）該機能レポーターのうちの２種類が、同一の型の影響を有する共通の摂動因子を有するか否かを決定するための手段であって、ここで、
このような共通の摂動因子が存在しない場合、該２種類の機能レポーターに対応する２種類の機能は、互いに異なる摂動因子の下に配置され、
このような共通の摂動因子が存在する場合、以下の工程ｃ）を実施する、手段
ｃ）該２種類の機能のうちの一方の機能に対する摂動因子の集合が、該２種類の機能のうちの他方の機能に対する摂動因子の集合に完全に包含されるか否かを決定するための手段であって、ここで、
このことが真である場合、より大きな集合を有する一方の機能が、より小さな集合を有する他方の機能の下に配置され、
このことが真ではない場合、該２種類の機能が、同一の摂動因子の下に並行して配置される、手段、
ｄ）該機能レポーターの全ての組合せを調べるか否かを決定するための手段であって、ここで、
このことが真である場合、該機能の関係の全てを統合して、現時点での全体的な摂動影響ネットワークにし、
このことが真ではない場合、工程ａ）〜工程ｃ）を反復する、
システム。
（３４）前記３つの群が、＋１、０および−１に分類される、項目３３に記載のシステム。
（３５）前記手段ａ）〜手段ｃ）が、Ｍ×Ｎ行列を作製することによって実行され、ここでＭは機能レポーターの個数を指し、Ｎは摂動因子の個数を指す、項目３３に記載のシステム。
（３６）実際の生物学的実験を実行することによって、前記作製されたネットワークを解析するための手段をさらに備える、項目２１に記載のシステム。
（３７）前記解析するための手段が、該機能に特異的な調節因子を含む、項目３６に記載のシステム。
（３８）前記調節因子がｓｉＲＮＡである、項目３７に記載のシステム。
（３９）前記ネットワークが、シグナル伝達経路を含む、項目２１に記載のシステム。
（４０）前記ネットワークが、バイオマーカーの同定、創薬ターゲットの解析、副作用解析、細胞機能の診断、細胞パスウェイ解析、化合物の生物影響評価および感染症診断からなる群より選択される使用のために使用される、項目２１に記載のシステム。
（４１）生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法を、コンピュータ上で実行するコンピュータプログラムであって、該方法は：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程、
を包含する、コンピュータプログラム。
（４２）生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法を、コンピュータ上で実行するコンピュータプログラムを含む記憶媒体であって、該方法は：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程、
を包含する、記憶媒体。
（４３）生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法を、コンピュータ上で実行するコンピュータプログラムを含む通信媒体であって、該方法は：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程、
を包含する、通信媒体。
【００１３】
以下に、好ましい実施形態により本発明を説明する。本明細書の記載および添付の図面ならびに当該分野における周知慣用技術に基づき、本発明を適切に作製または実行することができることを、当業者は理解する。本発明の作用および効果は、容易に理解され得る。
【００１４】
本明細書で使用されたＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ、ＥＰＨＡ２−ｓｉＲＮＡ、ＥＰＨＡ３−ｓｉＲＮＡ、＃０７５−ｓｉＲＮＡ、ＫＩＴ−ｓｉＲＮＡ、＃０５４−ｓｉＲＮＡ、ＲＥＴ−ｓｉＲＮＡおよび＃００６−ｓｉＲＮＡは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｊａｐａｎから以下のカタログ番号で利用可能である：ＥＧＦＲ  ｓｉＲＮＡ：Ｍ−００３１１４−０１；ＫＩＴ  ｓｉＲＮＡ：Ｍ−００３１５０−０１；ＲＥＴ  ｓｉＲＮＡ：Ｍ−００３１７０−０１；ＥＰＨＡ２  ｓｉＲＮＡ：Ｍ−００３１１６−０１；ＥＰＨＡ３  ｓｉＲＮＡ：Ｍ−００３１１７−０１；＃００６  ｓｉＲＮＡ：Ｍ−００３１７１−０１；＃０７５  ｓｉＲＮＡ：Ｍ−００３１４９−０１；および＃０５４  ｓｉＲＮＡ：Ｍ−００３１５２−０１。これらの配列は公開されていないが、同等なものを、当該分野で周知の技術を使用して調製することができる。
【００１５】
本明細書で使用されたｃ−Ｍｙｃ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＳｉｌｅｎｃｅｒＴＭ  ｃ−ｍｙｃ  ｓｉＲＮＡとしてＡｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．から入手できる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞または形容詞（例えば、英語における、「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」など、および他の言語における冠詞、形容詞など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。それゆえ、「ａ」または「ａｎ」、「１つ以上」および「少なくとも１つ」は、本明細書において交換可能に使用され得る。また、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「有する（ｈａｖｉｎｇ）」が交換可能に使用され得ことにも留意されるべきである。さらに、「からなる群より選択される」化合物とは、続くリスト中の１種以上の化合物（２種以上のこれらの化合物の混合物（すなわち、組み合わせ）を含む）をいう。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
【００１７】
本発明の化合物、組成物、システム、デバイスおよび／または方法が開示および説明される前に、本発明は、特定の合成方法、特定の試薬または実験室技術もしくは製造技術に限定されず、それゆえ、本発明は、当然のことながら、特に言及しない限り変化し得ることが理解されるべきである。また、本明細書で使用される専門用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみであって、限定するとは意図されないことも理解されるべきである。
【００１８】
（用語の定義）
以下に本明細書において特に使用される用語を定義する。
【００１９】
（生物学的機能）
本明細書で使用される用語「生物学的機能のネットワーク」とは、生物学的実体（例えば、遺伝子、転写因子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在など）のパラメータのあらゆるネットワークをいう。このようなネットワークは、パラメータのパスウェイ（例えば、遺伝子およびシグナル伝達経路など）であり得るが、これに限定されない。
【００２０】
本明細書で使用される「パスウェイ」または「経路」とは、生物学的実体のパラメータのあらゆるパスウェイをいう。このようなパスウェイは、薬物刺激のパスウェイなどであり得るが、これに限定されない。
【００２１】
本明細書で使用される用語「生物学的機能」とは、生物学的実体（例えば、細胞）の生存している状態に関連するか、および／またはそれを反映する、あらゆるパラメータをいう。このような生物学的機能としては、転写因子、調節遺伝子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在が挙げられるが、これらに限定されない。このような生物学的機能は、それに特異的な機能レポーターを使用することによって測定され得る。本明細書で使用され、生物学的機能に関する用語「特異的」とは、生物学的機能と機能レポーターとの間の関係をいい、この機能レポーターの変化は、生物学的機能の状態の変化に関する。
【００２２】
本明細書で使用される用語「摂動因子」とは、生物学的実体内において摂動を引き起こす、あらゆる因子をいう。このような摂動因子としては、例えば、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、リボザイム）、化合物、ｃＤＮＡ、抗体、ポリペプチド、光、音、圧力変化、放射、熱およびガスなどが挙げられるが、これらに限定されない。特に、上記機能レポーターの機能を特異的に制御し得るｓｉＲＮＡが好ましい。なぜなら、このようなｓｉＲＮＡは、生物学的実体（例えば、細胞）内の機能を特異的に標的化するからである。
【００２３】
本明細書で使用される用語「機能レポーター」とは、生物学的機能のシグナルを測定可能なシグナル（例えば、光、タンパク質の発現、代謝産物の産生、色の変化、蛍光および化学発光など）に変化させる因子をいう。
【００２４】
本明細書で使用される用語「集合論」とは、当該分野で使用および理解される理論をいい、そして集合の性質および関係を取り扱う純粋な数学の一部門をいい、対象（「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）または元（ｍｅｍｂｅｒ）」）の「集合」（集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）または収集物（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））の理論を数学的に公式化することである。多くの数学者は、他の全ての数学の基礎として集合論を用いる。このような集合論としては、集合内の要素の解析、ならびに包含、独立および共通部分への集合の分類などが挙げられる。
【００２５】
本明細書で使用される用語「集合」は、当該分野の集合論において使用され、要素の群をいう。
【００２６】
本明細書で使用される用語「元（ｍｅｍｂｅｒ）」、「濃度（ｃａｒｄｉｎａｌｉｔｙ）」または「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、集合の基本的な単位を指すために交換可能に使用される。本発明において、機能レポーターは集合として見なされ得、これらから得られる摂動因子または情報／データ／結果は要素として見なされ得る。
【００２７】
本明細書で使用される用語「包含」とは、一方の集合の全ての要素が、他方の集合に含まれる場合の、これら２つの集合の関係をいう。
【００２８】
本明細書で使用される用語「独立」とは、一方の集合の全ての要素が、他方の集合に含まれず、かつこのことの逆もまた成り立つ場合の、これら２つの群の関係をいう。
【００２９】
本明細書で使用される用語「共通部分」とは、一方の集合の一部の要素が他方の集合に含まれ、かつ一方の集合の一部の要素が他方の集合に含まれず、かつこのことの逆もまた成り立つ場合の、これらの２つの集合の関係をいい、それゆえ、これらの２つの集合の間に重複する集合が存在する。
【００３０】
本明細書で使用される用語「ネットワークの関係」とは、ネットワークの要素の関係をいう。このような関係は、一方の要素が他方の要素に及ぼす影響の方向を示す矢印によって、要素のマップにおいて表され得る。
【００３１】
本明細書で使用される用語「並行」は、２つのパラメータの関係に関して使用される場合、２つのパラメータがネットワーク内の異なるパスウェイに位置する状態をいう。
【００３２】
本明細書で使用される用語「下流」は、２つのパラメータの関係に関して使用される場合、２つのパラメータのうちの一方が、パスウェイまたはネットワークにおいて、他方の下流に位置する状態をいう。
【００３３】
本明細書で使用される用語「上流」は、２つのパラメータの関係に関して使用される場合、２つのパラメータのうちの一方が、パスウェイまたはネットワークにおいて、他方の上流に位置する状態をいう。
【００３４】
本明細書で使用される用語「共通の」とは、２つのパラメータが、生物学的実体の機能または他の任意のパラメータに関して同一の関係にある状態をいう。
【００３５】
本明細書で使用される句「等しく標的化する」とは、分布している摂動因子の状態をいい、これらの導入される摂動因子は、目的の標的に対して実質的に同一の影響を有する。本発明において、生物学的実体（例えば、細胞）のネットワーク構造を変更するために、２種類以上の摂動因子を使用するが、このような等しく標的化する摂動因子を使用することが好ましい。
【００３６】
本明細書で使用される用語「閾値」とは、機能が活性化されるか、または抑制されるかを評価するための特異的な値をいう。このような閾値は、実験的、経験的または理論的に決められ得る。閾値は、特定の場合のために任意に選択され得る。
【００３７】
（生物学）
本明細書で使用される用語「生物学的実体」とは、生物学的に生存している、あらゆる実体をいう。このような生物学的実体の例としては、生存している生物、器官、組織、細胞、微生物（例えば、細菌およびウイルスなど）が挙げられる。
【００３８】
本明細書において使用される「細胞」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、多細胞生物の組織の構成単位であって、外界を隔離する膜構造に包まれ、内部に自己再生能を備え、遺伝情報およびその発現機構を有する生命体をいう。本明細書において使用される細胞は、天然に存在する細胞であっても、人工的に改変された細胞（例えば、融合細胞、遺伝子改変細胞）であってもよい。細胞の供給源としては、例えば、単一の細胞培養物であり得、あるいは、正常に成長したトランスジェニック動物の胚、血液、または体組織、または正常に成長した細胞株由来の細胞のような細胞混合物が挙げられるがそれらに限定されない。  
【００３９】
本発明で用いられる細胞は、どの生物由来の細胞（たとえば、任意の種類の単細胞生物（例えば、細菌、酵母）または多細胞生物（例えば、動物（たとえば、脊椎動物、無脊椎動物）、植物（たとえば、単子葉植物、双子葉植物など）など））でもよい。例えば、脊椎動物（たとえば、メクラウナギ類、ヤツメウナギ類、軟骨魚類、硬骨魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物など）由来の細胞が用いられ、より詳細には、哺乳動物（例えば、単孔類、有袋類、貧歯類、皮翼類、翼手類、食肉類、食虫類、長鼻類、奇蹄類、偶蹄類、管歯類、有鱗類、海牛類、クジラ目、霊長類、齧歯類、ウサギ目など）由来の細胞が用いられる。１つの実施形態では、霊長類（たとえば、チンパンジー、ニホンザル、ヒト）由来の細胞、特にヒト由来の細胞が用いられるがそれに限定されない。本発明において用いられる細胞は、上記細胞は、幹細胞であってもよく体細胞であってもよい。また、そのような細胞は、付着細胞、浮遊細胞、組織形成細胞およびそれらの混合物などであり得る。そのような細胞は、移植目的に使用されるものであってもよい。
【００４０】
本発明により、あらゆる器官が標的化され得る。本発明により標的化される生物学的実体（例えば、組織または細胞）は、どの器官に由来してもよい。本明細書で使用される用語「器官」とは、生物個体のある機能が個体内の特定の部分に局在して営まれ，かつその部分が形態的に独立した構造体をいう。多細胞生物（例えば、動物、植物）では器官は特定の空間的配置をもついくつかの組織からなり、組織は多数の細胞からなる。そのような器官の例としては、血管系に関連する器官が挙げられる。１つの実施形態では、本発明により標的化される器官としては、皮膚、血管、角膜、腎臓、心臓、肝臓、臍帯、腸、神経、肺、胎盤、膵臓、脳、四肢末梢、網膜などが挙げられるがそれらに限定されない。多能性細胞から分化した細胞の例としては、表皮細胞、膵実質細胞、膵管細胞、肝細胞、血液細胞、心筋細胞、骨格筋細胞、骨芽細胞、骨格筋芽細胞、神経細胞、血管内皮細胞、色素細胞、平滑筋細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００４１】
本明細書において使用される用語「組織」（ｔｉｓｓｕｅ）とは、多細胞生物において、実質的に同一の機能および／または形態をもつ細胞集団をいう。通常「組織」は、同じ起源を有するが、異なる起源を持つ細胞集団であっても、同一の機能および／または形態を有するのであれば、組織と呼ばれ得る。従って、本明細書で使用され得る組織は、２以上の異なる起源を有する細胞集団からなり得る。通常、組織は、器官の一部を構成する。動物の組織は，形態的、機能的または発生的根拠に基づき、上皮組織、結合組織、筋肉組織、神経組織などに区別される。植物では、組織を構成する細胞の発達段階によって分裂組織と永久組織とに大別され、また構成細胞の種類によって単一組織と複合組織とに分けるなど、いろいろな分類が行われている。
【００４２】
本明細書において「単離された」とは、通常の環境において天然に付随する物質が少なくとも低減されていること、好ましくは実質的に含まないことをいう。本明細書で使用される、単離された生物学的実体は、本発明により標的化され得、従って、単離された細胞とは、天然の環境において付随する他の物質（たとえば、他の細胞、タンパク質、核酸分子など）を実質的に含まない細胞をいう。核酸分子またはポリペプチドについていう場合、「単離された」とは、たとえば、組換えＤＮＡ技術により作製された場合には細胞物質または培養培地を実質的に含まず、化学合成された場合には前駆体化学物質またはその他の化学物質を実質的に含まない、核酸分子またはポリペプチドを指す。単離された核酸分子は、好ましくは、その核酸分子が由来する生物において天然に該核酸分子に隣接している（ｆｌａｎｋｉｎｇ）配列（即ち、該核酸の５’末端および３’末端に位置する配列）を含まない。好ましくは、単離された細胞が、本発明の解析のために使用される。
【００４３】
本明細書において、「樹立された」細胞とは、特定の性質（例えば、多分化能）を維持し、かつ、細胞が培養条件下で安定に増殖し続けるようになった状態をいう。本発明において、このような樹立された細胞が使用され得る。
【００４４】
本明細書で使用される用語「状態（ｓｔａｔｅ）」とは、細胞のような生物学的実体の種々のパラメータ（例えば、細胞周期、外来因子に対する応答、シグナル伝達、遺伝子発現、遺伝子の転写など）に関する状況をさす。そのような状態としては、例えば、分化状態、未分化状態、外来因子に対する細胞応答、細胞周期、増殖状態などが挙げられるがそれらに限定されない。本明細書で使用される用語「遺伝子状態」とは、遺伝子に関連するあらゆる状態（例えば、発現状態、転写状態など）をいう。
【００４５】
本明細書において、「分化」または「細胞分化」とは、１個の細胞の分裂によって由来した娘細胞集団の中で形態的および／または機能的に質的な差をもった二つ以上のタイプの細胞が生じてくる現象をいう。従って、元来特別な特徴を検出できない細胞に由来する細胞集団（細胞系譜）が、特定のタンパク質の産生などはっきりした特徴を示すに至る過程も分化に包含される。現在では細胞分化を，ゲノム中の特定の遺伝子群が発現した状態と考えることが一般的であり、このような遺伝子発現状態をもたらす細胞内あるいは細胞外の因子または条件を探索することにより細胞分化を同定することができる。細胞分化の結果は原則として安定であって、特に動物細胞では，別のタイプの細胞に分化することは例外的にしか起こらない。
【００４６】
本明細書において「多能性」とは、細胞の性質をいい、１以上、好ましくは２以上の種々の組織または臓器に分化し得る能力をいう。従って、「多能性」および「未分化」は、本明細書においては特に言及しない限り互換可能に用いられる。通常、細胞の多能性は発生の間、制限され、成体では一つの組織または器官の構成細胞が別のものの細胞に変化することは少ない。従って多能性は通常失われている。とくに上皮性の細胞は他の上皮性細胞に変化しにくい。これが起きる場合通常病的な状態であり、化生（ｍｅｔａｐｌａｓｉａ）と呼ばれる。しかし間葉系細胞では比較的単純な刺激で他の間葉性細胞にかわり化生を起こしやすいので多能性の程度は高い。胚性幹細胞は、多能性を有する。組織幹細胞は、多能性を有する。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は全能性といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。ある細胞が多能性を有するかどうかは、たとえば、分化誘導条件下での、胚様体（Ｅｍｂｒｙｏｉｄ  Ｂｏｄｙ）の形成および分化が挙げられるがそれらに限定されない。また、生体を用いた多能性の有無についてのアッセイ法としては、免疫不全マウスへの移植による奇形種（テラトーマ）の形成、胚盤胞への注入によるキメラ胚の形成、器官の組織への細胞の移植（例えば、腹水への細胞の注入）による増殖等が挙げられるがそれらに限定されない。本明細書において、多能性のうち、受精卵のように生体を構成する全ての種類の細胞に分化する能力は「全能性」といい、多能性は全能性の概念を包含し得る。また、１つの方向にのみ分化する能力は、単能性ともいう。
【００４７】
本明細書において、「遺伝子」とは、遺伝形質を規定する因子をいい、これは、生物学的実体の生物学的機能である。遺伝子は、通常染色体または染色体外因子上に一定の順序に配列している。タンパク質の一次構造を規定するものを構造遺伝子といい、その発現を左右するものを調節遺伝子（たとえば、プロモーター）という。本明細書では、遺伝子は、特に言及しない限り、構造遺伝子および調節遺伝子を包含する。したがって、例えば、用語「サイクリン遺伝子」は、通常、サイクリンの構造遺伝子およびサイクリンのプロモーターの両方を包含する。本明細書では、「遺伝子」は、「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を指すことがある。本明細書においてはまた、「遺伝子産物」は、遺伝子によって発現された「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸」および「核酸分子」ならびに／または「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」を包含する。当業者であれば、遺伝子産物が何たるかはその状況に応じて理解することができる。
【００４８】
本明細書において配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「相同性」とは、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、ある２つの遺伝子の相同性が高いほど、それらの配列の同一性または類似性は高い。２種類の遺伝子が相同性を有するか否かは、配列の直接の比較、または核酸の場合ストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーション法によって調べられ得る。２つの遺伝子配列を直接比較する場合、その遺伝子配列間でＤＮＡ配列が、代表的には少なくとも５０％同一である場合、好ましくは少なくとも７０％同一である場合、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一である場合、それらの遺伝子は相同性を有する。本明細書において、配列（例えば、核酸配列、アミノ酸配列など）の「類似性」とは、上記相同性において、保存的置換をポジティブ（同一）とみなした場合の、２以上の遺伝子配列の、互いに対する同一性の程度をいう。従って、保存的置換がある場合は、その保存的置換の存在に応じて同一性と類似性とは異なる。また、保存的置換がない場合は、同一性と類似性とは同じ数値を示す。このような相同な遺伝子などは、ネットワークにおいて、適用可能であるならば同一の機能として使用されても、異なる摂動因子として使用されてもよい。
【００４９】
本明細書において使用される用語「タンパク質」、「ポリペプチド」、「オリゴペプチド」および「ペプチド」は、本明細書において同じ意味を有し、任意の長さのアミノ酸のポリマーをいう。このポリマーは、直鎖であっても分岐していてもよく、環状であってもよい。アミノ酸は、天然のものであっても非天然のものであってもよく、改変されたアミノ酸であってもよい。この用語はまた、複数のポリペプチド鎖の複合体へとアセンブルされたものを包含し得る。この用語はまた、天然または人工的に改変されたアミノ酸ポリマーも包含する。そのような改変としては、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または任意の他の操作もしくは改変（例えば、標識成分との結合体化）が挙げられる。この定義にはまた、例えば、アミノ酸の１または２以上のアナログを含むポリペプチド（例えば、非天然のアミノ酸などを含む）、ペプチド様化合物（例えば、ペプトイド）および当該分野において公知の他の改変体が包含される。フィブロネクチンのような細胞外マトリクスタンパク質の遺伝子産物は、通常ポリペプチド形態をとる。本発明で使用されるポリペプチドは、例えば、それらのペプチドを産生する初代培養細胞またはその細胞株を培養し、続いて、培養上清からそれらのペプチドを分離または精製することによって生成され得る。あるいは、遺伝子操作技術を使用して、目的のポリペプチドをコードする遺伝子を適切な発現ベクターに組込み、このベクターにより発現宿主に形質転換し、この形質転換した細胞の培養上清から組換えポリペプチドを収集してもよい。上記の宿主細胞は、それらがペプチドの生理学的な活性を維持しながら、目的のポリペプチドを発現し得る限り、遺伝子操作技術において慣習的に使用される任意の宿主細胞（例えば、大腸菌、酵母、動物細胞など）であってもよい。このように取得された細胞から得られるポリペプチドは、それらが天然に存在するポリペプチドと実質的に同一な機能を有する限り、少なくとも１アミノ酸の置換、付加および／または欠失、あるいは、少なくとも１本の糖鎖の置換、付加および／または欠失を有し得る。
【００５０】
本明細書で使用される用語「ポリヌクレオチド」、「オリゴヌクレオチド」、「核酸分子」および「核酸」は、同一の意味を有し、任意の長さのヌクレオチドポリマーをいう。この用語はまた、「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」を含む。「誘導体オリゴヌクレオチド」または「誘導体ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドの誘導体を含むか、またはヌクレオチド間の結合が通常とは異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドをいい、互換的に使用される。そのようなオリゴヌクレオチドとして具体的には、例えば、２’−Ｏ−メチル−リボヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がホスホロチオエート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリン酸ジエステル結合がＮ３’−Ｐ５’ホスホロアミデート結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のリボースとリン酸ジエステル結合とがペプチド核酸結合に変換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５プロピニルウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のウラシルがＣ−５チアゾールウラシルで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがＣ−５プロピニルシトシンで置換された誘導体オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド中のシトシンがフェノキサジン修飾シトシン（ｐｈｅｎｏｘａｚｉｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｃｙｔｏｓｉｎｅ）で置換された誘導体オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ中のリボースが２’−Ｏ−プロピルリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチド中のリボースが２’−メトキシエトキシリボースで置換された誘導体オリゴヌクレオチドなどが例示される。他にそうではないと示されなければ、特定の核酸配列はまた、明示的に示された配列と同様に、その保存的に改変された改変体（例えば、縮重コドン置換体）および相補配列を包含することが企図される。具体的には、縮重コドン置換体は、１またはそれ以上の選択された（または、すべての）コドンの３番目の位置が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作成することにより達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５−２６０８（１９８５）；Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１−９８（１９９４））。フィブロネクチンのような細胞外マトリクスタンパク質などの遺伝子は、通常、このポリヌクレオチド形態をとる。また、トランスフェクションの対象となる分子もこのポリヌクレオチドである。
【００５１】
本明細書で使用される用語「対応する」は、機能レポーターと機能との間の関係に関して使用される場合、目的の機能レポーターに由来するシグナルが機能の状態を反映する状況をいう。したがって、機能に対応する機能レポーターのシグナルに基づいて、このような機能の状態を決定することができる。例えば、転写因子下に作動可能に連結された、蛍光タンパク質を発現する遺伝子は、その転写因子に対応する機能レポーターなどであると言われる。
【００５２】
本明細書において、用語「対応する」アミノ酸または核酸とは、それぞれあるポリペプチド分子またはポリヌクレオチド分子において、比較の基準となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドにおける所定のアミノ酸と同様の作用を有するか、あるいは有することが予測されるアミノ酸または核酸をいい、特に酵素分子にあっては、活性部位中の同様の位置に存在し触媒活性に同様の寄与をするアミノ酸をいう。例えば、特定のポリヌクレオチドに対するアンチセンス分子の場合であれば、この用語は、そのアンチセンス分子の特定の部分に対応するオルソログにおける同様の部分をいう。
【００５３】
本明細書において、用語「対応する」遺伝子（例えば、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド分子）とは、ある種において、比較の基準となる種における所定の遺伝子と同様の作用を有するか、または有することが予測される遺伝子をいい、そのような作用を有する遺伝子が複数存在する場合、進化学的に同じ起源を有するものをいう。従って、ある遺伝子の対応する遺伝子は、その遺伝子のオルソログであり得る。したがって、マウスサイクリン遺伝子に対応する遺伝子は、他の動物においても見出すことができる。そのような対応する遺伝子は、当該分野において周知の技術を用いて同定することができる。したがって、例えば、ある動物における対応する遺伝子は、対応する遺伝子の基準となる遺伝子（例えば、マウスサイクリン遺伝子など）の配列をクエリ配列として用いてその動物（例えばヒト、ラット）の配列データベースを検索することによって見出すことができる。
【００５４】
本明細書において、「フラグメント」とは、全長のポリペプチドまたはポリヌクレオチド（長さがｎ）に対して、１〜ｎ−１までの配列長さを有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドをいう。フラグメントの長さは、その目的に応じて、適宜変更することができ、例えば、その長さの下限としては、ポリペプチドの場合、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０およびそれ以上のアミノ酸が挙げられ、ここの具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。また、ポリヌクレオチドの場合、５、６、７、８、９、１０、１５，２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００およびそれ以上のヌクレオチドが挙げられ、ここで具体的に列挙していない整数で表される長さ（例えば、１１など）もまた、下限として適切であり得る。本明細書において、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの長さは、上述のようにそれぞれアミノ酸または核酸の個数で表すことができるが、上述の個数は絶対的なものではなく、同じ機能を有する限り、上限または下限としての上述の個数は、その個数の上下数個（または例えば±１０％）のものも含むことが意図される。そのような意図を表現するために、本明細書では、個数の前に「約」を付けて表現することがある。しかし、本明細書では、「約」の有無はその数値の解釈に影響を与えないことが理解されるべきである。
【００５５】
本明細書において「生物学的活性」とは、ある因子（例えば、ポリヌクレオチドまたはタンパク質など）が、生体内において有し得る活性のことをいい、種々の機能（例えば、転写促進活性）を発揮する活性が包含される。例えば、ある因子が酵素である場合、その生物学的活性は、その酵素活性を包含する。別の例では、ある因子がリガンドである場合、そのリガンドが対応するレセプターへの結合を包含する。上記の生物学的活性は、当該分野において周知の技術によって測定することができる。
【００５６】
本明細書において、「検索」とは、電子的または生物学的あるいは他の方法により、ある核酸塩基配列を利用して、特定の機能および／または性質を有する他の核酸塩基配列を見出すことをいう。電子的な検索としては、ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ＆  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，  ＵＳＡ  ８５：２４４４−２４４８（１９８８））、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ法（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：１９５−１９７（１９８１））、およびＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ法（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０））などが挙げられるがそれらに限定されない。生物学的な検索としては、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での、ゲノムＤＮＡをナイロンメンブレン等に貼り付けたマクロアレイまたはガラス板に貼り付けたマイクロアレイ（マイクロアレイアッセイ）、ＰＣＲおよび  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなどが挙げられるがそれらに限定されない。このような検索は、本発明の方法またはシステムを使用して実行され得る。
【００５７】
本明細書において「プローブ」とは、インビトロおよび／またはインビボのスクリーニングなどの生物学的実験において用いられる、検索の対象となる物質をいい、例えば、特定の塩基配列を含む核酸分子または特定のアミノ酸配列を含むペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００５８】
通常プローブとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相同または相補的な、少なくとも８ヌクレオチド連続する長さの核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９ヌクレオチド連続する長さの、より好ましく少なくとも１０ヌクレオチド連続する長さの、さらに好ましくは少なくとも１１ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１２ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１３ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１４ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１５ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも２０ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも２５ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも３０ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも４０ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも５０ヌクレオチド連続する長さの、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。
【００５９】
本明細書における「プライマー」とは、高分子合成酵素反応において、合成される高分子化合物の反応の開始に必要な物質をいう。核酸分子の合成反応では、合成されるべき高分子化合物の一部の配列に相補的な核酸分子（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡなど）が用いられ得る。
【００６０】
通常プライマーとして用いられる核酸分子としては、目的とする遺伝子の核酸配列と相補的な、少なくとも８ヌクレオチド連続する長さの核酸配列を有するものが挙げられる。そのような核酸配列は、好ましくは、少なくとも９ヌクレオチド連続する長さの、より好ましく少なくとも１０ヌクレオチド連続する長さの、さらに好ましくは少なくとも１１ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１２ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１３ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１４ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１５ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１６ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１７ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも１８ヌクレオチド連続する長さの、１９ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも２０ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも２５ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも３０ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも４０ヌクレオチド連続する長さの、少なくとも５０ヌクレオチド連続する長さの、核酸配列であり得る。プローブとして使用される核酸配列には、上述の配列に対して、少なくとも７０％相同な、より好ましくは、少なくとも８０％相同な、さらに好ましくは、少なくとも９０％相同な、少なくとも９５％相同な核酸配列が含まれる。プライマーとして適切な配列は、合成（増幅）が意図される配列の性質によって変動し得るが、当業者は、意図される配列に応じて適宜プライマーを設計することができる。そのようなプライマーの設計は当該分野において周知であり、手動でおこなってもよくコンピュータプログラム（例えば、ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ，ＰｒｉｍｅｒＳｅｌｅｃｔ，ＤＮＡＳｔａｒ）を用いて行ってもよい。
【００６１】
本明細書において、「エピトープ」とは、抗原決定基をいう。従って、エピトープには、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット、または、Ｔ細胞の場合は、Ｔ細胞レセプタータンパク質および／もしくは主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）レセプターによる認識について必要であるアミノ酸残基のセットが包含される。この用語はまた、「抗原決定基」または「抗原決定部位」と交換可能に使用される。免疫系分野において、インビボまたはインビトロで、エピトープは、分子の特徴（例えば、一次ペプチド構造、二次ペプチド構造または三次ペプチド構造および電荷）であり、免疫グロブリン、Ｔ細胞レセプターまたはＨＬＡ分子によって認識される部位を形成する。ペプチドを含むエピトープは、エピトープに独特な空間的コンフォメーション中に３つ以上のアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも５つのこのようなアミノ酸からなり、代表的には少なくとも６つ、７つ、８つ、９つ、または１０のこのようなアミノ酸からなる。エピトープの長さは、より長いほど、もとのペプチドの抗原性に類似することから一般的に好ましいが、コンフォメーションを考慮すると、必ずしもそうでないことがある。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該分野で公知であり、例えば、Ｘ線結晶学、および２次元核磁気共鳴分光法を含む。さらに、所定のタンパク質におけるエピトープの同定は、当該分野で周知の技術を使用して容易に達成される。例えば、Ｇｅｙｓｅｎら（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：３９９８（所定の抗原における免疫原性エピトープの位置を決定するために迅速にペプチドを合成する一般的な方法）；米国特許第４，７０８，８７１号（抗原のエピトープを同定し、そして化学的に合成するための手順）；およびＧｅｙｓｅｎら（１９８６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２３：７０９（所定の抗体に対して高い親和性を有するペプチドを同定するための技術）を参照されたい。同じエピトープを認識する抗体は、単純な免疫アッセイにおいて同定され得る。このように、ペプチドを含むエピトープを決定する方法は、当該分野において周知であり、そのようなエピトープは、核酸またはアミノ酸の一次配列が提供されると、当業者はそのような周知慣用技術を用いて決定することができる。
【００６２】
従って、ペプチドを含むエピトープとして使用するためには、少なくとも３アミノ酸の長さの配列が必要であり、好ましくは、この配列は、少なくとも４アミノ酸、より好ましくは少なくとも５アミノ酸、少なくとも６アミノ酸、少なくとも７アミノ酸、少なくとも８アミノ酸、少なくとも９アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも２５アミノ酸の長さの配列が必要であり得る。エピトープは、直鎖的であっても高次構造的であってもよい。
【００６３】
本明細書において使用される用語「生体分子」とは、生物および生物の集合体に関する分子または分子の集合体に関連する分子をいう。本明細書で使用される用語「生体」または「生物」とは、生物学的な有機体をいい、動物、植物、真菌、ウイルスなどを含むがそれらに限定されない。本発明を通して、生体分子は、生物およびその集合体から抽出される分子を包含するが、それに限定されず、生物およびその集合体に関連する分子または分子の集合体であれば生体分子の定義に入る。したがって、医薬品として利用され得る低分子量分子（たとえば、低分子量リガンドなど）もまた生物への効果が意図され得るかぎり、生体分子の定義に入る。そのような生体分子の例としては、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカライド、オリゴサッカライド、脂質、低分子量分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、低分子量の有機分子など）、これらの複合分子（糖脂質、糖タンパク質、リポタンパク質など）およびこれらの集合体などが挙げられるがそれらに限定されない。生体分子にはまた、細胞への導入が企図される限り、細胞自体、組織の一部も包含され得る。通常、生体分子は、核酸、タンパク質、脂質、糖、プロテオリピッド、リポプロテイン、糖タンパク質およびプロテオグリカンなどであり得る。好ましくは、生体分子は、核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）またはタンパク質を含む。一実施形態では、生体分子は、核酸（例えば、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ、あるいはＰＣＲなどによって合成されたＤＮＡ）である。他の実施形態では、生体分子はタンパク質であり得る。好ましくは、そのような生体分子は、ホルモンまたはサイトカインであり得る。
【００６４】
本明細書において使用される「サイトカイン」は、当該分野において用いられる最も広義の意味と同様に定義され、細胞から産生され同じ細胞または異なる細胞に作用する生理活性物質をいう。サイトカインは、一般にタンパク質またはポリペプチドであり、免疫応答の制御作用、内分泌系の調節、神経系の調節、抗腫瘍作用、抗ウイルス作用、細胞増殖の調節作用、細胞分化の調節作用などを有する。本明細書では、サイトカインはタンパク質形態または核酸形態あるいは他の形態であり得るが、実際に作用する時点においては、サイトカインは通常はタンパク質である。本明細書において用いられる「増殖因子」とは、細胞の増殖を促進または制御する物質をいう。増殖因子は、「成長因子」または「発育因子」ともいわれる。増殖因子は、細胞培養または組織培養において、培地に添加されて血清高分子物質の作用を代替し得る。多くの増殖因子は、細胞の増殖以外に、分化状態の制御因子としても機能することが判明している。サイトカインには、代表的には、インターロイキン類、ケモカイン類、コロニー刺激因子のような造血因子、腫瘍壊死因子、インターフェロン類が含まれる。増殖因子としては、代表的には、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、肝実質細胞増殖因子（ＨＧＦ）、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、カルディオトロフィン（ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ）のような増殖活性を有するものが挙げられる。
【００６５】
本明細書において使用される「ホルモン」とは、当該分野において通常用いられる最も広い意味と同じ意味で用いられ、動植物の特定の器官または細胞で作られ，産出される部位からは隔たった器官にその特異的な生理作用をあらわす生理的有機化合物をいう。そのようなホルモンとしては、成長ホルモン、性ホルモン、甲状腺ホルモンなどが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなホルモンは、一部、上記サイトカインとそのさす範囲が重複し得る。
【００６６】
本明細書において「細胞接着因子」もしくは「細胞接着分子」（ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）または「接着因子」もしくは「接着分子」とは、互換可能に使用され、２つ以上の細胞の互いの結合（細胞接着）または基質と細胞との間の接着を媒介し得る分子をいう。細胞接着因子（例えば、フィブロネクチン）は、本発明で使用されるトランスフェクションアレイのために使用され得る。一般には、細胞接着因子は、以下の２つの群に分類される：細胞と細胞の接着（細胞間接着）に関する分子（ｃｅｌｌ−ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）および細胞と細胞外マトリクスとの接着（細胞−基質接着）に関与する分子（ｃｅｌｌ−ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）。本発明の方法では、いずれの分子も有用であり、有効に使用することができる。従って、本明細書において細胞接着分子は、細胞−基質接着に関与する、基質タンパク質と細胞タンパク質（例えば、インテグリンなど）とを包含する。タンパク質以外の分子であっても、細胞接着を媒介する限り、細胞接着分子の概念に入り得る。
【００６７】
細胞間接着に関しては、カドヘリン、免疫グロブリンスーパーファミリーに属する多くの分子（ＮＣＡＭ、Ｌ１、ＩＣＡＭ、ファシクリンＩＩ、ＩＩＩなど）、セレクチンなどが知られており、それぞれ特異的な分子反応を介して細胞膜に結合することも知られている。
【００６８】
他方、細胞−基質接着のために働く主要な細胞接着分子はインテグリンで，細胞外マトリックスに含まれる種々のタンパク質を認識し結合する。これらの細胞接着分子はすべて細胞膜表面にあり，一種のレセプター（細胞接着受容体）とみなすこともできる。従って、細胞膜にあるこのようなレセプターもまた本発明の方法において使用することができる。そのようなレセプターとしては、例えば、αインテグリン、βインテグリン、ＣＤ４４，シンデカンおよびアグリカンなどが挙げられるがそれらに限定されない。細胞接着に関する技術は、上述のもののほかの知見も周知であり、例えば、細胞外マトリックス−臨床への応用−  メディカルレビュー社に記載されている。
【００６９】
ある分子が細胞接着分子であるかどうかは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、標識コラーゲン法など）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的研究）、ＰＤＲ法、ハイブリダイゼーション法などのようなアッセイにおいて陽性となることを決定することにより判定することができる。このような細胞接着分子としては、コラーゲン、インテグリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、フィブリノゲン、免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１）、セレクチン、カドヘリンなどが挙げられるがそれらに限定されない。このような細胞接着分子の多くは、細胞への接着と同時に細胞間相互作用による細胞活性化の補助シグナルを細胞内に伝達する。そのような補助シグナルを細胞内に伝達することができるか否かは、生化学的定量（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法、標識コラーゲン法など）、免疫学的定量（酵素抗体法、蛍光抗体法、免疫組織学的検討）、ＰＣＲ法、ハイブリダイゼーション法というアッセイにおいて陽性となることを決定することにより判定することができる。
【００７０】
細胞接着分子としては、例えば、免疫グロブリンスーパーファミリー分子（ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＩＣＡＭ１、ＩＣＡＭ２、ＶＣＡＭ１など）；インテグリンファミリー分子（ＬＦＡ−１、Ｍａｃ−１、ｇｐＩＩｂＩＩＩａ、ｐ１５０、ｐ９５、ＶＬＡ１、ＶＬＡ２、ＶＬＡ３、ＶＬＡ４、ＶＬＡ５、ＶＬＡ６など）；セレクチンファミリー分子（Ｌ−セレクチン，Ｅ−セレクチン，Ｐ−セレクチンなど）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７１】
本明細書において「細胞外マトリクスタンパク質」とは、「細胞外マトリクス」を構成するタンパク質をいう。本明細書において「細胞外マトリクス」（ＥＣＭ）とは「細胞外基質」とも呼ばれ、当該分野において通常用いられる意味と同様の意味で用いられ、上皮細胞、非上皮細胞を問わず体細胞（ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌ）の間に存在する物質をいう。細胞外マトリクスは、組織の支持だけでなく、すべての体細胞の生存に必要な内部環境の構造体に関与する。細胞外マトリクスは一般に、結合組織細胞から産生されるが、一部は上皮細胞や内皮細胞のような基底膜を保有する細胞からも分泌される。細胞外マトリクスは、線維成分とその間を満たす基質とに大別され、線維成分としては膠原線維および弾性線維がある。基質の基本構成成分はグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）であり、その大部分は非コラーゲン性タンパクと結合してプロテオグリカン（酸性ムコ多糖−タンパク複合体）の高分子を形成する。このほかに、基底膜のラミニン、弾性線維周囲のミクロフィブリル（ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌ）、線維、細胞表面のフィブロネクチンなどの糖タンパクも基質に含まれる。特殊に分化した組織でも基本構造は同一で、例えば硝子軟骨では軟骨芽細胞によって特徴的に大量のプロテオグリカンを含む軟骨基質が産生され、骨では骨芽細胞によって石灰沈着が起こる骨基質が産生される。従って、本発明において用いられる細胞外マトリクスとしては、例えば、コラーゲン、エラスチン、プロテオグリカン、グリコサミノグリカン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、ラミニン、弾性繊維、膠原繊維などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７２】
本明細書において「レセプター」とは、細胞上または核内などに存在し、外界からの因子または細胞内の因子に対する結合能を有し、その結合によりシグナルが伝達される分子をいう。レセプターは通常タンパク質の形態をとる。レセプターの結合パートナーは、通常リガンドという。
【００７３】
本明細書において「アゴニスト」とは、ある生体作用物質（リガンド）のレセプターに結合し、その物質のもつ作用と同じ（あるいは類似の）作用を有する因子をいう。
【００７４】
本明細書において「アンタゴニスト」とは、ある生体作用物質（リガンド）のレセプターへの結合に拮抗的に働き、それ自身はそのレセプターを介した生理作用を現わさない因子をいう。拮抗薬、遮断剤（ブロッカー）、阻害剤（インヒビター）などもこのアンタゴニストに包含される。
【００７５】
本明細書において「因子」（ａｇｅｎｔ）としては、意図する目的を達成することができる限りどのような物質または他の実体（例えば、光、放射、熱、電気などのエネルギー）でもあってもよい。そのような物質としては、例えば、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド、ペプチド、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、核酸（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのようなＤＮＡ、ｍＲＮＡのようなＲＮＡを含む）、ポリサッカリド、オリゴサッカリド、脂質、低分子量の有機分子（例えば、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、低分子量の分子（例えば、薬学的に受容可能な低分子量のリガンドなど）など）、これら分子の組み合わせが挙げられるがそれらに限定されない。ポリヌクレオチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリヌクレオチドの配列に対して一定の配列相同性を（例えば、７０％以上の配列同一性）もって相補性を有するポリヌクレオチド、プロモーター領域に結合する転写因子のようなポリペプチドなどが挙げられるがそれらに限定されない。ポリペプチドに対して特異的な因子としては、代表的には、そのポリペプチドに対して特異的に指向された抗体またはその誘導体あるいはその類似物（例えば、単鎖抗体）、そのポリペプチドがレセプターまたはリガンドである場合の特異的なリガンドまたはレセプター、そのポリペプチドが酵素である場合、その基質などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７６】
本明細書において特定の因子（例えば、核酸分子またはポリペプチド）に「特異的に結合する因子」とは、その核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルが、その核酸分子またはポリペプチド以外の核酸分子またはポリペプチドに対するその因子の結合レベルと同じかまたはそれよりも高い因子をいう。そのような因子としては、例えば、対象が核酸分子の場合、対象となる核酸分子に対して相補的な配列を有する核酸分子、対象となる核酸配列に対して結合するポリペプチド（例えば、転写因子など）などが挙げられ、対象がポリペプチドの場合、抗体、単鎖抗体、レセプター−リガンドの対のいずれか一方、酵素−基質のいずれか一方などが挙げられるがそれらに限定されない。
【００７７】
本明細書で使用される用語「化合物」とは、同定可能な、あらゆる化学物質または化学分子をいい、これらとしては、低分子量の分子、ペプチド、タンパク質、糖、ヌクレオチドまたは核酸が挙げられるが、これらに限定されない。このような化合物は、天然に存在する産物であっても、合成産物であってもよい。
【００７８】
本明細書で使用される用語「低分子量の有機分子」とは、比較的小さな分子量を有する有機分子をいう。通常、低分子量の有機分子とは、約１，０００以下の分子量の分子をいっても、１，０００より大きな分子量の分子をいってもよい。低分子量の有機分子は、当該分野で公知の方法またはその組み合わせにより、通常合成できる。これらの低分子量の有機分子は生物により生成され得る。低分子量の有機分子の例としては、ホルモン、リガンド、情報伝達物質、コンビナトリアルケミストリで合成された分子、薬学的に受容可能な低分子量の分子（例えば、低分子量のリガンドなど）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７９】
本明細書で使用される用語「接触」とは、本発明のポリペプチドまたはポリヌクレオチドへ物理的に近接した、化合物の直接的な配置または間接的な配置をいう。ポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、数多くの緩衝液、塩および溶液などの中に存在し得る。用語「接触」としては、核酸またはそのフラグメントによりコードされるポリペプチドを含む、ビーカー、マイクロタイタープレート、細胞培養フラスコまたはマイクロアレイ（例えば、ＤＮＡチップ）などの中に化合物を配置することが挙げられる。
【００８０】
本明細書において用いられる用語「抗体」とは、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、多重特異性抗体、キメラ抗体、および抗イディオタイプ抗体、ならびにそれらの断片、例えばＦ（ａｂ’）２およびＦａｂ断片、ならびにその他の組換えにより生産された結合体を含む。さらにこのような抗体を、酵素、例えばアルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、αガラクトシダーゼなどに共有結合させても、組換えにより融合させてよい。抗体は、本発明において摂動因子として使用され得る。
【００８１】
本明細書において「抗原」とは、抗体分子によって特異的に結合され得る任意の基質をいう。本明細書において「免疫原」とは、抗原特異的免疫応答を生じるリンパ球活性化を開始し得る抗原をいう。抗原は、本発明において摂動因子として使用され得る。
【００８２】
あるタンパク質分子において、所定のアミノ酸は、相互作用結合能力の明らかな低下または消失なしに、例えば、カチオン性領域または基質分子の結合部位のような構造的に重要な領域において、別のアミノ酸に置換され得る。あるタンパク質の生物学的機能を規定するのは、タンパク質の相互作用能力または他の性質である。従って、特定のアミノ酸の置換がアミノ酸配列において、またはそのＤＮＡ配列のレベルにおいて行われ得、置換後もなお、もとの性質を維持するタンパク質が生じ得る。従って、生物学的活性の明らかな損失なしに、種々の改変が、本明細書において開示されたペプチドまたはこのペプチドをコードするＤＮＡにおいて行われ得る。
【００８３】
上記のような改変を設計する際に、アミノ酸の疎水性指数が考慮され得る。タンパク質における相互作用的な生物学的機能を与える際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、一般に当該分野で認められている（Ｋｙｔｅ．ＪおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ｒ．Ｆ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７（１）：１０５−１３２，１９８２）。アミノ酸の疎水的性質は、生成したタンパク質の二次構造に寄与し、次いでそのタンパク質と他の分子（例えば、酵素、基質、レセプター、ＤＮＡ、抗体、抗原など）との相互作用を規定する。各アミノ酸は、それらの疎水性および電荷の性質に基づく疎水性指数を割り当てられる。それらは：イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン酸（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；およびアルギニン（−４．５））である。
【００８４】
あるアミノ酸を、同様の疎水性指数を有する他のアミノ酸により置換して、そして依然として同様の生物学的機能を有するタンパク質（例えば、酵素活性において等価なタンパク質）を生じさせ得ることが当該分野で周知である。このようなアミノ酸置換において、疎水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。疎水性に基づくこのようなアミノ酸の置換は効率的であることが当該分野において理解される。米国特許第４，５５４，１０１号に記載されるように、以下の親水性指数がアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；およびトリプトファン（−３．４）。アミノ酸が、同様の親水性指数を有しかつ依然として生物学的等価体を与え得る別のアミノ酸に置換され得ることが理解される。このようなアミノ酸置換において、親水性指数が±２以内であることが好ましく、±１以内であることがより好ましく、および±０．５以内であることがさらにより好ましい。
【００８５】
（デバイスおよび固相支持体）
本明細書において「デバイス」とは、装置の一部または全部を構成することができる部分をいい、支持体（好ましくは固相支持体）およびその支持体に担持されるべき標的物質などから構成される。そのようなデバイスとしては、チップ、アレイ、マイクロタイタープレート、細胞培養プレート、シャーレ、フィルム、ビーズなどが挙げられるがそれらに限定されない。このようなデバイスは、本発明のシステムを構成し得る。特に、このようなデバイスは、上記の生物学的実体内の、生物学的機能を反映する少なくとも２種類の機能レポーターについての情報を得るための手段として使用され得る。
【００８６】
本明細書において使用される「支持体」は、生体分子のような物質を固定することができる材料（ｍａｔｅｒｉａｌ）をいう。このような支持体は、共有結合または非共有結合を介して、本明細書で使用される生体分子に結合する能力を有するかまたはそのような能力を有するように誘導され得る、任意の固体材料から作製され得る。
【００８７】
支持体として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）などが挙げられるがそれらに限定されない。支持体は、複数の材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、酸化珪素、炭化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用することができる。ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホンなどの有機材料を用いることができる。本発明においてはまた、ニトロセルロース膜、ナイロン膜、ＰＶＤＦ膜など、ブロッティングに使用される膜を用いることもできる。支持体を構成する材料が固相である場合、本明細書において特に「固相支持体」という。本明細書において固相支持体は、プレート、マイクロウェルプレート、チップ、スライドグラス、フィルム、ビーズ、金属（表面）などの形態をとり得る。支持体はコーティングされていてもよく、コーティングされていなくてもよい。
【００８８】
本明細書において「液相」とは、当業者に通常理解される意味と同じ意味を有し、通常、溶液中での状態をいう。
【００８９】
本明細書において「固相」とは、当業者に通常理解される意味と同じ意味を有し、通常、固体の状態をいう。本明細書において液体および固体を総合して「流体」ということがある。
【００９０】
本明細書において使用される「基板」とは、本発明のチップまたはアレイが構築される材料（好ましくは固体）をいう。したがって、基板はプレートの概念に包含される。基板の材料としては、共有結合または非共有結合を介して、本明細書で使用される生体分子に結合する能力を有するかまたはそのような能力を有するように誘導され得る、任意の固体材料が挙げられる。
【００９１】
プレートおよび基板として使用するためのそのような材料としては、固体表面を形成し得る任意の材料が使用され得るが、例えば、ガラス、シリカ、シリコン、セラミック、二酸化珪素、プラスチック、金属（合金も含まれる）、天然および合成のポリマー（例えば、ポリスチレン、セルロース、キトサン、デキストラン、およびナイロン）が挙げられるがそれらに限定されない。基板は、複数の異なる材料の層から形成されていてもよい。例えば、ガラス、石英ガラス、アルミナ、サファイア、フォルステライト、炭化珪素、酸化珪素、窒化珪素などの無機絶縁材料を使用できる。また、ポリエチレン、エチレン、ポリプロピレン、ポリイソブチレン、ポリエチレンテレフタレート、不飽和ポリエステル、含フッ素樹脂、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリビニルアセタール、アクリル樹脂、ポリアクリロニトリル、ポリスチレン、アセタール樹脂、ポリカーボネート、ポリアミド、フェノール樹脂、ユリア樹脂、エポキシ樹脂、メラミン樹脂、スチレン・アクリロニトリル共重合体、アクリロニトリルブタジエンスチレン共重合体、シリコーン樹脂、ポリフェニレンオキサイド、ポリスルホン等の有機材料を用いることができる。基板として好ましい材質は、測定機器などの種々のパラメータによって変動し、当業者は、上述のような種々の材料から適切なものを適宜選択することができる。トランスフェクションアレイのためには、スライドグラスが好ましい。好ましくは、そのような基材は、コーティングされ得る。
【００９２】
本明細書において「コーティング」とは、固相支持体または基板について用いられるとき、その固相支持体または基板の表面上にある物質の膜を形成させることおよびそのような膜をいう。コーティングは種々の目的で行われ、例えば、固相支持体および基板の品質向上（例えば、寿命の向上、耐酸性などの耐環境性の向上）、固相支持体または基板に結合されるべき物質の親和性の向上などを目的とすることが多い。そのようなコーティングのための物質としては、種々の物質が用いられ得、上述の固相支持体および基板自体に使用される物質のほか、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、脂質などの生体物質、ポリマー（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ＭＡＳ（松浪硝子、岸和田、日本から入手可能）、疎水性フッ素樹脂）、シラン（ＡＰＳ（例えば、γ−アミノプロピルシラン））、金属（例えば、金など）が使用され得るがそれらに限定されない。そのような物質の選択は当業者の技術範囲内にあり、当該分野において周知の技術を用いて場合ごとに選択することができる。一つの好ましい実施形態では、そのようなコーティングは、ポリ−Ｌ−リジン、シラン、（例えば、エポキシシランまたはメルカプトシラン、ＡＰＳ（γ−アミノプロピルシラン））、ＭＡＳ、疎水性フッ素樹脂、金のような金属を用いることが有利であり得る。このような物質は、細胞または細胞を含む物体（例えば、生物、器官など）に適合する物質を用いることが好ましい。
【００９３】
本明細書において「チップ」または「マイクロチップ」は、互換可能に用いられ、多様の機能をもち、システムの一部となる超小型集積回路をいう。チップとしては、例えば、ＤＮＡチップ、プロテインチップなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【００９４】
本明細書において「アレイ」とは、少なくとも１種類（例えば、１０００種類以上）の標的物質を含む組成物（例えば、ＤＮＡ、タンパク質、トランスフェクト混合物）が整列されて配置されたパターンまたはパターンを有する基板（例えば、チップ）をいう。アレイの中で、小さな基板（例えば、１０ｍｍ×１０ｍｍなど）上にパターン化されているものはマイクロアレイというが、本明細書では、マイクロアレイとアレイとは互換可能に使用される。従って、上述の基板より大きなものにパターン化されたものでもマイクロアレイと呼ぶことがある。例えば、アレイはそれ自身固相表面または膜に固定されている所望のトランスフェクト混合物のセットで構成される。アレイは好ましくは同一のまたは異なる抗体を少なくとも１０２個、より好ましくは少なくとも１０３個、およびさらに好ましくは少なくとも１０４個、さらにより好ましくは少なくとも１０５個を含む。これらの抗体は、好ましくは表面が１２５×８０ｍｍ、より好ましくは１０×１０ｍｍ上に配置される。形式としては、９６ウェルマイクロタイタープレート、３８４ウェルマイクロタイタープレートなどのマイクロタイタープレートの大きさのものから、スライドグラス程度の大きさのものが企図される。固定される標的物質を含む組成物は、１種類であっても複数種類であってもよい。そのような種類の数は、１個〜スポット数までの任意の数であり得る。例えば限定しないが、約１０種類、約１００種類、約５００種類、約１０００種類の標的物質を含む組成物が固定され得る。
【００９５】
本明細書で使用される用語「トランスフェクションアレイ」とは、アレイにおける各々のスポットまたはアドレス上でのトランスフェクションを具体化するアレイをいう。このようなトランスフェクションは、本明細書に記載される技術または実施例で例示される技術を使用して実行され得る。
【００９６】
固相表面または膜には、上述のように任意の数の標的物質（例えば、抗体のようなタンパク質）が提供され得るが、通常、基板１つあたり、１０８個の生体分子まで、他の実施形態において１０７個の生体分子まで、１０６個の生体分子まで、１０５個の生体分子まで、１０４個の生体分子まで、１０３個の生体分子まで、または１０２個の生体分子までの生体分子が配置され得るが、１０８個の生体分子を超える標的物質を含む組成物が配置されていてもよい。これらの場合において、基板の大きさはより小さいことが好ましい。特に、標的物質を含む組成物（例えば、抗体のようなタンパク質）のスポットの大きさは、単一の生体分子のサイズと同じ小ささであり得る（これは、１ｎｍ〜２ｎｍのオーダーであり得る）。基板の最小限の面積は、いくつかの場合において基板上の生体分子の数によって決定される。本発明では、細胞への導入が企図される標的物質を含む組成物は、通常、０．０１ｍｍ〜１０ｍｍのスポット状に共有結合あるいは物理的相互作用によって配列固定されている。
【００９７】
アレイ上には、生体分子の「スポット」が配置され得る。本明細書において「スポット」とは、標的物質を含む組成物の一定の集合をいう。本明細書において「スポッティング」とは、ある標的物質を含む組成物のスポットをある基板またはプレートに作製することをいう。スポッティングはどのような方法でも行うことができ、例えば、ピペッティングなどによって達成され得、あるいは自動装置で行うこともでき、そのような方法は当該分野において周知である。
【００９８】
本明細書において使用される用語「アドレス」とは、基板上のユニークな位置をいい、他のユニークな位置から弁別可能であり得るものをいう。アドレスは、そのアドレスを伴うスポットとの関連づけに適切であり、そしてすべての各々のアドレスにおける存在物が他のアドレスにおける存在物から識別され得る（例えば、光学的）、任意の形状を採り得る。アドレスを定める形は、例えば、円状、楕円状、正方形、長方形であり得るか、または不規則な形であり得る。したがって、「アドレス」は、抽象的な概念を示し、「スポット」は具体的な概念を示すために使用され得るが、両者を区別する必要がない場合、本明細書においては、「アドレス」と「スポット」とは互換的に使用され得る。
【００９９】
各々のアドレスを定めるサイズは、とりわけ、その基板の大きさ、特定の基板上のアドレスの数、標的物質を含む組成物の量および／または利用可能な試薬、微粒子のサイズおよびそのアレイが使用される任意の方法のために必要な解像度の程度に依存する。大きさは、例えば、１−２ｎｍから数ｃｍの範囲であり得るが、そのアレイの適用に一致した任意の大きさが可能である。
【０１００】
アドレスを定める空間配置および形状は、そのマイクロアレイが使用される特定の適用に適合するように設計される。アドレスは、密に配置され得、広汎に分散され得るか、または特定の型の解析物に適切な所望のパターンへとサブグループ化され得る。
【０１０１】
マイクロアレイについては、ゲノム機能研究プロトコール（実験医学別冊  ポストゲノム時代の実験講座１）、ゲノム医科学とこれからのゲノム医療（実験医学増刊）などに広く概説されている。
【０１０２】
マイクロアレイから得られるデータは膨大であることから、クローンとスポットとの対応の管理、データ解析などを行うためのデータ解析ソフトウェアが重要である。そのようなソフトウェアとしては、各種検出システムに付属のソフトウェアが利用可能である（Ｅｒｍｏｌａｅｖａ  Ｏら（１９９８）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．２０：１９−２３）。また、データベースのフォーマットとしては、例えば、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘが提唱しているＧＡＴＣ（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ）と呼ばれる形式が挙げられる。
【０１０３】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１０４】
（検出）
本発明の細胞解析または判定方法では、細胞またはそれに相互作用する物質に起因する情報を検出することができる限り、種々の検出方法および検出手段を用いることができる。そのような検出方法および検出手段としては、例えば、目視、光学顕微鏡、共焦点顕微鏡、蛍光顕微鏡、レーザー光源を用いた読取装置、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）イメージング、電気信号、化学的または生化学的マーカーのいずれかあるいは複数種を用いる方法および手段を挙げることができるがそれらに限定されない。そのような検出装置としてはまた、蛍光分析装置、分光光度計、シンチレーションカウンター、ＣＣＤ、ルミノメーターなども挙げられるがそれらに限定されず、生体分子を検出することができる手段であればどのようなものでもよい。
【０１０５】
本明細書において、「マーカー」または「バイオマーカー」とは互換可能に使用され、目的とする物質または状態についてレベルまたは頻度を反映する生物学的因子をいう。そのようなマーカーとしては、例えば、遺伝子をコードする核酸、遺伝子産物、代謝産物、レセプター、リガンド、抗体などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０６】
したがって、本明細書において細胞の状態に関連するマーカーとは、転写制御因子のほか、細胞の状態を示す細胞内因子（例えば、遺伝子をコードする核酸、遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ、タンパク質、翻訳後修飾タンパク質）、代謝産物、レセプターなど）に対して相互作用する因子（例えば、リガンド、抗体など、相補的な核酸）などが挙げられるがそれらに限定されない。本発明において、このようなマーカーは、続いて解析される情報を生成するために使用され得る。そのようなマーカーは、好ましくは、目的とする因子に対して相互作用し得る。本明細書で、マーカーに関連して使用される用語「特異性」とは、他の類似の分子よりも目的の分子に対する相互作用の程度が有意に高いマーカーの性質をいう。本発明では、好ましくは、そのようなマーカーは、細胞内部に存在するが、細胞外のものであってもよい。
【０１０７】
本明細書において「標識」とは、目的となる分子または物質を他から識別するための因子（たとえば、物質、エネルギー、電磁波など）をいう。そのような標識方法としては、ＲＩ（ラジオアイソトープ）法、蛍光法、ビオチン法、化学発光法等を挙げることができる。上記の核酸断片および相補性を示すオリゴヌクレオチドを何れも蛍光法によって標識する場合には、蛍光発光極大波長が互いに異なる蛍光物質によって標識を行う。蛍光発光極大波長の差は、１０ｎｍ以上であることが好ましい。蛍光物質としては、核酸の塩基部分と結合できるものであれば何れも用いることができるが、シアニン色素（例えば、ＣｙＤｙｅＴＭシリーズのＣｙ３、Ｃｙ５等）、ローダミン６Ｇ試薬、Ｎ−アセトキシ−Ｎ２−アセチルアミノフルオレン（ＡＡＦ）、ＡＡＩＦ（ＡＡＦのヨウ素誘導体）等を使用することが好ましい。蛍光発光極大波長の差が１０ｎｍ以上である蛍光物質としては、例えば、Ｃｙ５とローダミン６Ｇ試薬との組み合わせ、Ｃｙ３とフルオレセインとの組み合わせ、ローダミン６Ｇ試薬とフルオレセインとの組み合わせ等を挙げることができる。本発明では、このような標識を利用して、検出手段に検出され得るように目的とするサンプルを改変することができる。そのような改変は、当該分野において公知であり、当業者は標識におよび目的とする対象に応じて適宜そのような方法を実施することができる。
【０１０８】
本明細書において「相互作用」には、疎水性相互作用、親水性相互作用、水素結合、ファンデルワールス力、イオン性相互作用、非イオン性相互作用、静電的相互作用などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１０９】
本明細書において「相互作用のレベル」とは、２つの物質（細胞などを含む）の間の相互作用について言及する場合、その２つの物質の間の相互作用の程度または頻度をいう。そのような相互作用のレベルは、当該分野において周知の方法によって測定することができる。そのような方法としては、例えば、実際に相互作用し固定状態にある細胞の数を、例えば、光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、位相差顕微鏡などを利用して、直接または間接的に（例えば、反射光強度）計数すること、細胞に特異的なマーカー、抗体、蛍光標識などで染色しその強度を測定することなどが挙げられるがそれらに限定されない。これらのレベルは、マーカーから直接または標識を介して間接的に表示することができる。このような測定値から、例えば、あるスポットにおいて実際に転写または発現する遺伝子の個数または頻度を計算することができる。
【０１１０】
（提示および表示）
本明細書において「表示」（ディスプレイ）および「提示」とは、互換可能に使用され、本発明の方法に従って得られたプロファイルまたはそれに由来する情報を直接または間接的にあるいは情報処理をした形態で具現化することをいう。そのような表示の形態としては、グラフ、写真、表、アニメーションなど種々の方法があり、限定されない。そのような技術としては、例えば、ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＣＥＬＬ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  ＶＯＬ．  ５６，  ｅｄ．  １９９８，  ｐｐ：１８５−２１５、Ａ  Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｓｉｏｎ  Ｍｕｌｔｉｍｏｄｅ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｌｕｄｅｒ  ＆  Ｗｏｌｆ、Ｓａｌｍｏｎ）において、顕微鏡を自動化し、カメラを制御するためのアプリケーションソフトウェアとともに、自動光学顕微鏡の顕微鏡、カメラ、Ｚ軸フォーカス装置を含む、ハードウェアシステムの設計について議論されており、本発明において利用することができる。カメラによるイメージ取得は、Ｉｎｏｕｅ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇ，  Ｖｉｄｅｏ  Ｍｉｒｏｓｃｏｐｙ，  ２ｄ．  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９７に詳細に記載されており、本明細書において参考文献として援用される。リアルタイムの表示もまた、当該分野において周知の技術を用いて行うことができる。例えば、全てのイメージが取得され、半永久的メモリに格納された後、あるいはイメージの取得と実質的に同時に、適切なアプリケーションソフトウェアで処理し、処理されたデータを得ることができる。例えば、取得されたデータを処理する方法は、画像が中断されないシーケンスをプレイバックする、あるいは、リアルタイムで表示する、焦点面における変化および継続として、照射光を示す「ムービー」として表示することができる。
【０１１１】
別の実施形態では、測定および表示用アプリケーションは、通常刺激付与の条件や得られた検出信号の記録条件を設定するためのソフトウエアを含んでいる。この測定および表示用アプリケーションによって、コンピュータは細胞に刺激を付与する手段と、細胞から検出された信号を処理する手段とを構成するだけでなく、光学観察手段（ＳＩＴカメラ及び画像ファイル装置）および／または細胞培養手段の制御を行うこともできる。
【０１１２】
パラメータ設定画面では、キーボード、タッチパネルまたはマウスなどを用いて画面上で刺激条件を入力することにより、所望の複雑な刺激条件の設定が可能である。その他、細胞培養の温度、ｐＨなどの諸条件の設定をキーボード、マウスなどを用いて行うことができる。表示画面では、細胞から検出されたネットワークについての情報またはそれから得られる情報をリアルタイムでまたは記録後に表示する。また、細胞の記録された別の情報またはそれに由来する情報を、細胞の顕微鏡像に重ねて表示することもできる。記録情報に加えて、記録時の測定パラメータ（刺激条件、記録条件、表示条件、処理条件、細胞の諸条件、温度、ｐＨ等）もまたリアルタイムで表示することができる。温度またはｐＨが許容範囲を外れたときの警報機能も備えられていてもよい。
【０１１３】
データ解析画面では、本発明で使用される集合論に加えて、種々の数理解析、フーリエ変換、クラスター解析、ＦＦＴ解析、コヒーレンス解析、コリレーション解析などの条件を設定することが可能である。一時的なネットワーク情報表示機能、トポグラフィー表示機能なども備えていてもよい。これらの解析結果は、記録媒体に保存されている顕微鏡像に重ねて表示することができる。
【０１１４】
（遺伝子導入）
本明細書において、核酸分子を細胞に導入する技術は、どのような技術でもよく、例えば、形質転換、形質導入、トランスフェクションなどが挙げられる。本明細書では、トランスフェクションが好ましい。
【０１１５】
本明細書において「トランスフェクション」とは、遺伝子ＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＤＮＡ、ウイルスＲＮＡなどを、ウイルス粒子などの形をとらない裸に近い状態で細胞の培養、または細胞の懸濁液に加えて細胞に取り込ませて遺伝子導入または感染を行うことをいう。通常トランスフェクションによって導入された遺伝子は、一過的に細胞において発現するが、永続的に取り込まれる場合もある。
【０１１６】
そのような核酸分子の導入技術は、当該分野において周知であり、かつ、慣用されるものであり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ａ．ら編（１９８８）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ＮＹ；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊら（１９８７）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．およびその第三版，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載される。遺伝子の導入は、ノーザンブロット分析、ウェスタンブロット分析のような本明細書に記載される方法または他の周知慣用技術を用いて確認することができる。
【０１１７】
本明細書において遺伝子について言及する場合、「ベクター」または「組み換えベクター」とは、目的のポリヌクレオチド配列を目的の細胞へと移入させるベクターをいう。そのようなベクターとしては、原核細胞、酵母、動物細胞、植物細胞、昆虫細胞、動物個体および植物個体などの宿主細胞において自立複製が可能、または染色体中への組込みが可能で、本発明のポリヌクレオチドの転写に適した位置にプロモーターを含有しているものが例示される。ベクターのうち、クローニングに適したベクターを「クローニングベクター」という。そのようなクローニングベクターは通常、制限酵素部位を複数含むマルチクローニング部位を含む。そのような制限酵素部位およびマルチクローニング部位は、当該分野において周知であり、当業者は、目的に合わせて適宜選択して使用することができる。そのような技術は、本明細書に記載される文献（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、前出）に記載されている。
【０１１８】
本明細書において「発現ベクター」とは、構造遺伝子およびその発現を調節するプロモーターに加えて種々の調節エレメントが宿主の細胞中で作動し得る状態で連結されている核酸配列をいう。調節エレメントは、好ましくは、ターミネーター、薬剤耐性遺伝子のような選択マーカーおよび、エンハンサーを含み得る。
【０１１９】
原核細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡ３（＋）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ−ＳＫ（＋／−）、ｐＧＥＭ−Ｔ、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰ、ｐＨＡＴ、ｐＵＣ１８、ｐＦＴ−ＤＥＳＴＴＭ４２ＧＡＴＥＷＡＹ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２０】
動物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐｃＤＮＡＩ／Ａｍｐ、ｐｃＤＮＡＩ、ｐＣＤＭ８（いずれもフナコシより市販）、ｐＡＧＥ１０７［特開平３−２２９（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ｐＡＧＥ１０３［Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０１，１３０７（１９８７）］、ｐＡＭｏ、ｐＡＭｏＡ［Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８，２２７８２−２２７８７（１９９３）］、マウス幹細胞ウイルス（Ｍｕｒｉｎｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉｒｕｓ）（ＭＳＣＶ）に基づいたレトロウイルス型発現ベクター、ｐＥＦ−ＢＯＳ、ｐＥＧＦＰなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２１】
植物細胞に対する組換えベクターとしては、ｐＰＣＶＩＣＥｎ４ＨＰＴ、ｐＣＧＮ１５４８、ｐＣＧＮ１５４９、ｐＢＩ２２１、ｐＢＩ１２１などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２２】
また、ベクターの導入方法としては、細胞にＤＮＡを導入する上述のような方法であればいずれも用いることができ、例えば、トランスフェクション、形質導入、形質転換など（例えば、リン酸カルシウム法、リポソーム法、ＤＥＡＥデキストラン法、エレクトロポレーション法、パーティクルガン（遺伝子銃）を用いる方法など）、リポフェクション法、スフェロプラスト法［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８４，１９２９（１９７８）］、酢酸リチウム法［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１５３，１６３（１９８３）］、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７５，１９２９（１９７８）記載の方法が挙げられる。
【０１２３】
本明細書において「遺伝子導入試薬」とは、遺伝子導入方法において、導入効率を促進するために用いられる試薬をいう。そのような遺伝子導入試薬としては、例えば、カチオン性高分子、カチオン性脂質、ポリアミン系試薬、ポリイミン系試薬、リン酸カルシウムなどが挙げられるがそれらに限定されない。トランスフェクションの際に利用される試薬の具体例としては、種々な供給源から市販されている試薬が挙げられ、例えば、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＴｆｘＴＭ−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ），ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ），ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ），ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１２４】
本明細書において遺伝子発現（たとえば、ｍＲＮＡ発現、ポリペプチド発現）の「検出」または「定量」は、例えば、ｍＲＮＡの測定および免疫学的測定方法を含む適切な方法を用いて達成され得る。分子生物学的測定方法としては、例えば、ノーザンブロット法、ドットブロット法またはＰＣＲ法などが例示される。免疫学的測定方法としては、例えば、方法としては、マイクロタイタープレートを用いるＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などが例示される。また、定量方法としては、ＥＬＩＳＡ法またはＲＩＡ法などが例示される。アレイ（例えば、ＤＮＡアレイ、プロテインアレイ）を用いた遺伝子解析方法によっても行われ得る。ＤＮＡアレイについては、（秀潤社編、細胞工学別冊「ＤＮＡマイクロアレイと最新ＰＣＲ法」）に広く概説されている。プロテインアレイについては、Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００２  Ｄｅｃ；３２  Ｓｕｐｐｌ：５２６−３２に詳述されている。遺伝子発現の解析法としては、上述に加えて、ＲＴ−ＰＣＲ、ＲＡＣＥ法、ＳＳＣＰ法、免疫沈降法、ｔｗｏ−ｈｙｂｒｉｄシステム、インビトロ翻訳などが挙げられるがそれらに限定されない。そのようなさらなる解析方法は、例えば、ゲノム解析実験法・中村祐輔ラボ・マニュアル、編集・中村祐輔  羊土社（２００２）などに記載されており、本明細書においてそれらの記載はすべて参考として援用される。
【０１２５】
本明細書で使用される、用語「発現量」とは、目的の細胞などにおいて、ポリペプチドまたはｍＲＮＡが発現される量をいう。用語「発現レベル」は、抗体を用いてＥＬＩＳＡ法、ＲＩＡ法、蛍光抗体法、ウェスタンブロット法、免疫組織染色法などの免疫学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価されるポリペプチドのタンパク質の発現レベル、またはノーザンブロット法、ドットブロット法、ＰＣＲ法などの分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価される本発明のポリペプチドの発現のｍＲＮＡレベルを包含する。「発現レベルの変化」とは、上記免疫学的測定方法または分子生物学的測定方法を含む任意の適切な方法により評価されるポリペプチドのタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルでの発現量が増加あるいは減少することを意味する。
【０１２６】
（スクリーニング）
本明細書において「スクリーニング」とは、目的とするある特定の性質をもつ生物または物質などの標的を、特定の操作／評価方法で多数の成分を含む集団の中から選抜することをいう。スクリーニングのために、本発明の因子（例えば、抗体）、ポリペプチドまたは核酸分子を使用することができる。
【０１２７】
本明細書において、免疫反応を利用してスクリーニングを行うことを、「免疫表現型分類（ｉｍｍｕｎｏｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）」ともいう。この場合、抗体または単鎖抗体は、細胞株および生物学的サンプルの免疫表現型分類のために利用され得る。遺伝子の転写産物・翻訳産物は、細胞特異的マーカーとして、あるいはより詳細には、特定の細胞型の分化および／または成熟の種々の段階で示差的に発現される細胞マーカーとして有用である。特異的エピトープ、またはエピトープの組み合わせに対して指向されるモノクローナル抗体は、マーカーを発現する細胞集団のスクリーニングを可能とする。種々の技術が、マーカーを発現する細胞集団をスクリーニングするために、モノクローナル抗体を用いて利用され得、そしてその技術には、抗体でコーティングされた磁気ビーズを用いる磁気分離、固体マトリクス（すなわち、プレート）に付着した抗体を用いる「パニング（ｐａｎｎｉｎｇ）」、ならびにフローサイトメトリーが挙げられる（例えば、米国特許第５，９８５，６６０号；およびＭｏｒｒｉｓｏｎら、Ｃｅｌｌ，９６：７３７−４９（１９９９）を参照）。
【０１２８】
これらの技術は、ヒト臍帯血において見出され得るような細胞増殖および／または分化を起こし得るかまたは未分化状態への改変処置を行ったような細胞集団のような、未分化の細胞（例えば、胚性幹細胞、組織幹細胞など）を含む細胞集団についてスクリーニングするために利用され得る。
【０１２９】
（診断）
本明細書において「診断」とは、被験体における疾患、障害、状態などに関連する種々のパラメータを同定し、そのような疾患、障害、状態の現状を判定することをいう。本発明の方法、装置、システムを用いることによって、細胞ネットワーク、薬物耐性レベル、バイオマーカーの同定、創薬ターゲットの解析、副作用解析、細胞機能の診断、細胞パスウェイ解析、化合物の生物影響評価および感染症診断などを解析することができる。そのような情報を用いて、被験体における疾患、障害、状態、処置または予防のための処方物または方法などの種々のパラメータを選定することができる。
【０１３０】
本発明の診断方法は、原則として、身体から出たものを利用することができ、医師などの医療従事者の手を離れて実施することができることから、産業上有用である。
【０１３１】
（治療）
本明細書において「治療」とは、ある疾患または障害について、そのような状態になった場合に、そのような疾患または障害の悪化を防止、好ましくは、現状維持、より好ましくは、軽減、さらに好ましくは消長させることをいう。
【０１３２】
本明細書において「被験体」とは、本発明の処置が適用される生物をいい、「患者」ともいわれる。患者または被験体は好ましくは、ヒトであり得る。
【０１３３】
本明細書において、用語「病因」または「病原体」とは、被験体の疾患、障害または状態（本明細書において、総称して「病変」ともいい、植物では「病害」ともいう）に関連する因子をいい、例えば、原因となる病原物質（病原因子）、病原体、病変細胞、病原ウイルスなどが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３４】
本発明が対象とする「疾患」は、病原遺伝子が関連する任意の疾患であり得る。そのような疾患としては、癌、ウイルスまたは細菌による感染症、アレルギー、高血圧、高脂血症、糖尿病、心臓病、脳梗塞、痴呆症、肥満、動脈硬化性疾患、不妊症、精神神経疾患、白内障、早老症、紫外線放射線過敏症などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３５】
本発明が対象とする「障害」は、病原遺伝子が関連する任意の障害であり得る。
【０１３６】
そのような疾患、障害または状態の具体例としては、例えば、循環器系疾患（貧血（例えば、再生不良性貧血（特に重症再生不良性貧血）、腎性貧血、がん性貧血、二次性貧血、不応性貧血など）、がんまたは腫瘍（例えば、白血病、多発性骨髄腫）など）；神経系疾患（痴呆症、脳卒中およびその後遺症、脳腫瘍、脊髄損傷など）；免疫系疾患（Ｔ細胞欠損症、白血病など）；運動器・骨格系疾患（骨折、骨粗鬆症、関節の脱臼、亜脱臼、捻挫、靱帯損傷、変形性関節症、骨肉腫、ユーイング肉腫、骨形成不全症、骨軟骨異形成症など）；皮膚系疾患（無毛症、黒色腫、皮膚悪性リンパ腫、血管肉腫、組織球症、水疱症、膿疱症、皮膚炎、湿疹など）；内分泌系疾患（視床下部・下垂体疾患、甲状腺疾患、副甲状腺（上皮小体）疾患、副腎皮質・髄質疾患、糖代謝異常、脂質代謝異常、タンパク質代謝異常、核酸代謝異常、先天性代謝異常（フェニールケトン尿症、ガラクトース血症、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症）、無アルブミン血症、アスコルビン酸合成能欠如、高ビリルビン血症、高ビリルビン尿症、カリクレイン欠損、肥満細胞欠損、尿崩症、バソプレッシン分泌異常、侏儒症、ウオルマン病（酸リパーゼ（Ａｃｉｄ  ｌｉｐａｓｅ）欠損症）、ムコ多糖症ＶＩ型など）；呼吸器系疾患（肺疾患（例えば、肺炎、肺がんなど）、気管支疾患、肺がん、気管支がんなど）；消化器系疾患（食道疾患（たとえば、食道がん）、胃・十二指腸疾患（たとえば、胃がん、十二指腸がん）、小腸疾患・大腸疾患（たとえば、大腸ポリープ、結腸がん、直腸がんなど）、胆道疾患、肝臓疾患（たとえば、肝硬変、肝炎（Ａ型、Ｂ型、Ｃ型、Ｄ型、Ｅ型など）、劇症肝炎、慢性肝炎、原発性肝がん、アルコール性肝障害、薬物性肝障害）、膵臓疾患（急性膵炎、慢性膵炎、膵臓がん、嚢胞性膵疾患）、腹膜・腹壁・横隔膜疾患（ヘルニアなど）、ヒルシュスプラング病など）；泌尿器系疾患（腎疾患（腎不全、原発性糸球体疾患、腎血管障害、尿細管機能異常、間質性腎疾患、全身性疾患による腎障害、腎がんなど）、膀胱疾患（膀胱炎、膀胱がんなど）など）；生殖器系疾患（男性生殖器疾患（男性不妊、前立腺肥大症、前立腺がん、精巣がんなど）、女性生殖器疾患（女性不妊、卵巣機能障害、子宮筋腫、子宮腺筋症、子宮がん、子宮内膜症、卵巣がん、絨毛性疾患など）など）；循環器系疾患（心不全、狭心症、心筋梗塞、不整脈、弁膜症、心筋・心膜疾患、先天性心疾患（たとえば、心房中隔欠損、心室中隔欠損、動脈管開存、ファロー四徴）、動脈疾患（たとえば、動脈硬化、動脈瘤）、静脈疾患（たとえば、静脈瘤）、リンパ管疾患（たとえば、リンパ浮腫）など）などが挙げられるがそれらに限定されない。
【０１３７】
本明細書において「薬学的に受容可能なキャリア」は、医薬、動物薬または農薬を製造するときに使用される物質であり、有効成分に有害な影響を与えないものをいう。そのような薬学的に受容可能なキャリアとしては、例えば、以下が挙げられるがそれらに限定されない：抗酸化剤、保存剤、着色料、風味料、および希釈剤、乳化剤、懸濁化剤、溶媒、フィラー、増量剤、緩衝剤、送達ビヒクル、希釈剤、賦形剤および／または農学的もしくは薬学的アジュバント。    
【０１３８】
本発明の処置方法において使用される薬剤の種類および量は、本発明の方法によって得られた情報（例えば、薬剤耐性レベルに関する情報）を元に、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、細胞の形態または種類などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。本発明の処置方法を被験体（または患者）に対して施す頻度もまた、使用目的、対象疾患（種類、重篤度など）、患者の年齢、体重、性別、既往歴、および治療経過などを考慮して、当業者が容易に決定することができる。頻度の例としては、例えば、毎日−数ヶ月に１回（例えば、１週間に１回−１ヶ月に１回）の投与が挙げられる。１週間−１ヶ月に１回の投与を、経過を見ながら施すことが好ましい。
【０１３９】
本明細書において「指示書」は、本発明のテイラーメイド治療方法などを医師、患者など投与を行う人に対して記載したものである。この指示書は、本発明の医薬などを例えば、放射線治療直後または直前（例えば、２４時間以内など）に投与することを指示する文言が記載されている。この指示書は、本発明が実施される国の監督官庁（例えば、日本であれば厚生労働省、米国であれば食品医薬品局（ＦＤＡ）など）が規定した様式に従って作成され、その監督官庁により承認を受けた旨が明記される。指示書は、いわゆる添付文書（ｐａｃｋａｇｅ  ｉｎｓｅｒｔ）であり、通常は紙媒体で提供されるが、それに限定されず、例えば、電子媒体（例えば、インターネットで提供されるホームページ、電子メール）のような形態でも提供され得る。
【０１４０】
必要に応じて、本発明の治療では、２種類以上の薬剤が使用され得る。２種類以上の薬剤を使用する場合、類似の性質または由来の物質を使用してもよく、異なる性質または由来の薬剤を使用してもよい。このような２種類以上の薬剤を投与する方法のための薬剤耐性レベルに関する情報も、本発明の方法によって入手することができる。
【０１４１】
本発明ではまた、得られた薬剤耐性に関する情報を元に、遺伝子治療を施すことも可能である。本明細書で使用される用語「遺伝子治療」とは、発現されたか、または発現可能な核酸の、被験体への投与により行われる治療をいう。本発明のこの実施形態において、核酸は、それらのコードされたタンパク質を産生し、そのタンパク質は治療効果を媒介する。
【０１４２】
本発明では、いったん類似の種類（例えば、ヒトに対するマウスなど）の生物に関し、ある特定の情報の解析結果と、生物学的実体（例えば、細胞）の状態とが相関付けられた場合、対応する情報の分析結果と、生物学的実体（例えば、細胞）の状態とが相関付けることができることは、当業者は容易に理解する。そのような事項は、例えば、動物培養細胞マニュアル、瀬野ら編著、共立出版、１９９３年などに記載され支持されており、本明細書においてこのすべての記載を援用する。
【０１４３】
本発明はまた、ネットワーク解析の結果のこのようなある特定の情報に基づいて、遺伝子治療に応用され得る。
【０１４４】
当該分野で利用可能な遺伝子治療のための任意の方法が、本発明に従って使用され得る。例示的な方法は、以下のとおりである。
【０１４５】
遺伝子治療の方法の一般的な概説については、Ｇｏｌｄｓｐｉｅｌら，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  １２：４８８−５０５（１９９３）；ＷｕおよびＷｕ，Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ  ３：８７−９５（１９９１）；Ｔｏｌｓｔｏｓｈｅｖ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．３２：５７３−５９６（１９９３）；Ｍｕｌｌｉｇａｎ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：９２６−９３２（１９９３）；ならびにＭｏｒｇａｎおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．６２：１９１−２１７（１９９３）；Ｍａｙ，ＴＩＢＴＥＣＨ  １１（５）：１５５−２１５（１９９３）を参照のこと。遺伝子治療において使用される一般的に公知の組換えＤＮＡ技術は、Ａｕｓｕｂｅｌら（編），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ（１９９３）；およびＫｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ（１９９０）に記載される。
【０１４６】
（基本技術）
本明細書において使用される技術は、そうではないと具体的に指示しない限り、当該分野の技術範囲内にある、流体工学（ｆｌｕｉｄｉｃｓ）、微細加工、有機化学、生化学、遺伝子工学、分子生物学、微生物学、遺伝学および関連する分野における周知慣用技術を使用する。そのような技術は、例えば、以下に列挙した文献および本明細書において他の場所おいて引用した文献においても十分に説明されている。
【０１４７】
微細加工については、例えば、Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｓ．Ａ．（１９９６）．Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｚａｕｔ，Ｐ．Ｖ．（１９９６）．Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ，Ｓｅｍｉｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ；Ｍａｄｏｕ，Ｍ．Ｊ．（１９９７）．Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ，ＣＲＣ１  ５  Ｐｒｅｓｓ；Ｒａｉ−Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，Ｐ．（１９９７）．Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙ，Ｍｉｃｒｏｍａｃｈｉｎｉｎｇ，＆  Ｍｉｃｒｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ：Ｍｉｃｒｏｌｉｔｈｏｇｒａｐｈｙなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１４８】
本明細書において用いられる分子生物学的手法、生化学的手法、微生物学的手法は、当該分野において周知であり慣用されるものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９８９）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒおよびその３ｒｄ  Ｅｄ．（２００１）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８７）．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９８９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．（１９９０）．ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９２）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９５）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ；Ｉｎｎｉｓ，Ｍ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）．ＰＣＲ  Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９９）．Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：  Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗｉｌｅｙ，ａｎｄ  ａｎｎｕａｌ  ｕｐｄａｔｅｓ；Ｓｎｉｎｓｋｙ，Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）．ＰＣＲ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ：  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、別冊実験医学「遺伝子導入＆発現解析実験法」羊土社、１９９７などに記載されており、これらは本明細書において関連する部分（全部であり得る）が参考として援用される。
【０１４９】
人工的に合成した遺伝子を作製するためのＤＮＡ合成技術および核酸化学については、例えば、Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８５）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９９０）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）．Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｃｈａｐｍａｎ＆Ｈａｌｌ；Ｓｈａｂａｒｏｖａ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ；Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ，Ｇ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９６）．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ，Ｇ．Ｔ．（Ｉ９９６）．Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓなどに記載されており、これらは本明細書において関連する部分が参考として援用される。
【０１５０】
（ＲＮＡｉ）
本明細書で使用される用語「ＲＮＡｉ」とは、ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅの略称で、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡともいう）のようなＲＮＡｉを引き起こす因子を細胞に導入することにより、相同なｍＲＮＡが特異的に分解され、遺伝子産物の合成が抑制される現象およびそれに用いられる技術をいう。本明細書においてＲＮＡｉはまた、場合によっては、ＲＮＡｉを引き起こす因子と同義に用いられ得る。
【０１５１】
本明細書において「ＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる任意の因子をいう。本明細書において「遺伝子のＲＮＡｉを引き起こす因子」とは、その遺伝子に関するＲＮＡｉを引き起こし、ＲＮＡｉがもたらす効果（例えば、その遺伝子の発現抑制など）が達成されることをいう。そのようなＲＮＡｉを引き起こす因子としては、例えば、標的遺伝子の核酸配列の一部に対して少なくとも約７０％の相同性を有する配列またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列を含む、少なくとも１０ヌクレオチド長の二本鎖部分を含むＲＮＡまたはその改変体が挙げられるがそれに限定されない。ここで、この因子は、好ましくは、３’突出末端を含み、より好ましくは、３’突出末端は、２ヌクレオチド長以上のＤＮＡ（例えば、２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡ）であり得る。
【０１５２】
理論に束縛されることを望まないが、ＲＮＡｉが働く機構として考えられるものの一つとして、ｄｓＲＮＡのようなＲＮＡｉを引き起こす分子が細胞に導入されると、比較的長い（例えば、４０塩基対以上）ＲＮＡの場合、ヘリカーゼドメインを持つダイサー（Ｄｉｃｅｒ）と呼ばれるＲＮａｓｅＩＩＩ様のヌクレアーゼがＡＴＰ存在下で、その分子を３’末端から約２０塩基対ずつ切り出し、短鎖ｄｓＲＮＡ（ｓｉＲＮＡとも呼ばれる）を生じる。本明細書において「ｓｉＲＮＡ」とは、ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡの略称であり、人工的に化学合成されるかまたは生化学的に合成されたものか、あるいは生物体内で合成されたものか、あるいは約４０塩基以上の二本鎖ＲＮＡが体内で分解されてできた１０塩基対以上の短鎖二本鎖ＲＮＡをいい、通常、５’−リン酸、３’−ＯＨの構造を有しており、３’末端は約２塩基突出している。このｓｉＲＮＡに特異的なタンパク質が結合して、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ−ｉｎｄｕｃｅｄ−ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ−ｃｏｍｐｌｅｘ）が形成される。この複合体は、ｓｉＲＮＡと同じ配列を有するｍＲＮＡを認識して結合し、ＲＮａｓｅＩＩＩ様の酵素活性によってｓｉＲＮＡの中央部でｍＲＮＡを切断する。ｓｉＲＮＡの配列と標的として切断するｍＲＮＡの配列の関係については、１００％一致することが好ましい。しかし、ｓｉＲＮＡの中央から外れた位置についての塩基の変異については、完全にＲＮＡｉによる切断活性がなくなるのではなく、部分的な活性が残存する。他方、ｓｉＲＮＡの中央部の塩基の変異は影響が大きく、ＲＮＡｉによるｍＲＮＡの切断活性が極度に低下する。このような性質を利用して、変異をもつｍＲＮＡについては、その変異を中央に配したｓｉＲＮＡを合成し、細胞内に導入することで特異的に変異を含むｍＲＮＡだけを分解することができる。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡそのものをＲＮＡｉを引き起こす因子として用いることができるし、ｓｉＲＮＡを生成するような因子（例えば、代表的に約４０塩基以上のｄｓＲＮＡ）をそのような因子として用いることができる。
【０１５３】
また、いかなる理論にも束縛されることを望まないが、ｓｉＲＮＡは、上記経路とは別に、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖がｍＲＮＡに結合してＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼ（ＲｄＲＰ）のプライマーとして作用し、ｄｓＲＮＡが合成され、このｄｓＲＮＡが再びダイサーの基質となり、新たなｓｉＲＮＡを生じて作用を増幅することも企図される。従って、本発明では、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子もまた、有用である。実際に、昆虫などでは、例えば３５分子のｄｓＲＮＡ分子が、１，０００コピー以上ある細胞内のｍＲＮＡをほぼ完全に分解することから、ｓｉＲＮＡ自体およびｓｉＲＮＡが生じるような因子が有用であることが理解される。
【０１５４】
本発明においてｓｉＲＮＡと呼ばれる、約２０塩基前後（例えば、代表的には約２１〜２３塩基長）またはそれ未満の長さの二本鎖ＲＮＡを用いることができる。このようなｓｉＲＮＡは、細胞に発現させることにより遺伝子発現を抑制し、そのｓｉＲＮＡの標的となる病原遺伝子の発現を抑えることから、疾患の治療、予防、予後などに使用することができる。
【０１５５】
本発明において用いられるｓｉＲＮＡは、ＲＮＡｉを引き起こすことができる限り、どのような形態を採っていてもよい。
【０１５６】
別の実施形態において、本発明のＲＮＡｉを引き起こし得る因子は、３’末端に突出部を有する短いヘアピン構造（ｓｈＲＮＡ；ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）であり得る。本明細書において「ｓｈＲＮＡ」とは、一本鎖ＲＮＡで部分的に回文状の塩基配列を含むことにより、分子内で二本鎖構造をとり、ヘアピンのような構造となる約２０塩基対以上の分子をいう。そのようなｓｈＲＮＡは、人工的に化学合成される。あるいは、そのようなｓｈＲＮＡは、センス鎖およびアンチセンス鎖のＤＮＡ配列を逆向きに連結したヘアピン構造のＤＮＡをＴ７  ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでＲＮＡを合成することによって生成することができる。理論に束縛されることは希望しないが、そのようなｓｈＲＮＡは、細胞内に導入された後、細胞内で約２０塩基（代表的には例えば、２１塩基、２２塩基、２３塩基）の長さに分解され、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こし、本発明の処置効果があることが理解されるべきである。このような効果は、昆虫、植物、動物（哺乳動物を含む）など広汎な生物において発揮されることが理解されるべきである。このように、ｓｈＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同様にＲＮＡｉを引き起こすことから、本発明の有効成分として用いることができる。ｓｈＲＮＡはまた、好ましくは、３’突出末端を有し得る。二本鎖部分の長さは特に限定されないが、好ましくは約１０ヌクレオチド長以上、より好ましくは約２０ヌクレオチド長以上であり得る。ここで、３’突出末端は、好ましくはＤＮＡであり得、より好ましくは少なくとも２ヌクレオチド長以上のＤＮＡであり得、さらに好ましくは２〜４ヌクレオチド長のＤＮＡであり得る。
【０１５７】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こし得る因子は、人工的に合成した（例えば、化学的または生化学的）ものでも、天然に存在するものでも用いることができ、この両者の間で本発明の効果に本質的な違いは生じない。化学的に合成したものでは、液体クロマトグラフィーなどにより精製をすることが好ましい。
【０１５８】
本発明において用いられるＲＮＡｉを引き起こし得る因子は、インビトロで合成することもできる。この合成系において、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼおよびＴ７プロモーターを用いて、鋳型ＤＮＡからアンチセンスおよびセンスのＲＮＡを合成する。これらをインビトロでアニーリングした後、細胞に導入すると、上述のような機構を通じてＲＮＡｉが引き起こされ、本発明の効果が達成される。ここでは、例えば、リン酸カルシウム法でそのようなＲＮＡを細胞内に導入することができる。
【０１５９】
本発明のＲＮＡｉを引き起こし得る因子の例としては、ｍＲＮＡとハイブリダイズし得る一本鎖、あるいはそれらのすべての類似の核酸アナログのような因子も挙げられる。そのような因子もまた、本発明の方法および組成物において有用である。
【０１６０】
（集合論）
上記されるように、本明細書で使用される用語「集合論」とは、当該分野で使用および理解される理論であって、集合の性質および関係を取り扱う純粋数学の一部門をいう。多くの数学者は、他の全ての数学の基礎として集合論を用いる。このような集合論としては、集合（集合体（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）または収集物（ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））内の対象（「要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）または元（ｍｅｍｂｅｒ）」）の解析、ならびに包含、独立および共通部分へのこれらの集合の分類などが挙げられる。集合論は当該分野において周知であり、当業者は以下を参照し得る：Ｃａｎｔｏｒ，Ｇ．，１９３２，Ｇｅｓａｍｍｅｌｔｅ  Ａｂｈａｎｄｌｕｎｇｅｎ，Ｂｅｒｌｉｎ：Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ；Ｕｌａｍ，Ｓ．，１９３０，’Ｚｕｒ  Ｍａｓｓｔｈｅｏｒｉｅ  ｉｎ  ｄｅｒ  ａｌｌｇｅｍｅｉｎｅｎ  Ｍｅｎｇｅｎｌｅｈｒｅ’，Ｆｕｎｄ．Ｍａｔｈ．，１６，１４０−１５０；Ｇoｄｅｌ，Ｋ．，１９４０，‘Ｔｈｅ  ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｘｉｏｍ  ｏｆ  ｃｈｏｉｃｅ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｇｅｎｅｒａｌｉｚｅｄ  ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ’，Ａｎｎ．Ｍａｔｈ．Ｓｔｕｄｉｅｓ，３；Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，１９６１，‘Ｍｅａｓｕｒａｂｌｅ  ｃａｒｄｉｎａｌｓ  ａｎｄ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｂｌｅ  ｓｅｔｓ’，Ｂｕｌｌ．Ａｃａｄ．Ｐｏｌ．Ｓｃｉ．，９，５２１−５２４；Ｃｏｈｅｎ，Ｐ．，１９６６，Ｓｅｔ  ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｉｎｕｕｍ  ｈｙｐｏｔｈｅｓｉｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｂｅｎｊａｍｉｎ；Ｊｅｎｓｅｎ，Ｒ．，１９７２，‘Ｔｈｅ  ｆｉｎｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｂｌｅ  ｈｉｅｒａｒｃｈｙ’，Ａｎｎ．Ｍａｔｈ．Ｌｏｇｉｃ，４，２２９−３０８；Ｍａｒｔｉｎ，Ｄ．およびＳｔｅｅｌ，Ｊ．，１９８９，‘Ａ  ｐｒｏｏｆ  ｏｆ  ｐｒｏｊｅｃｔｉｖｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｃｙ’，Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍａｔｈ．Ｓｏｃ．，２，７１−１２５；Ｈｒｂａｃｅｋ，Ｋ．およびＪｅｃｈ，Ｔ．，１９９９，Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｓｅｔ  ｔｈｅｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ，ｈｔｔｐ：／／ｐｌａｔｏ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／ｅｎｔｒｉｅｓ／ｓｅｔ−ｔｈｅｏｒｙ／ｐｒｉｍｅｒ．ｈｔｍｌなど。
【０１６１】
集合論における術語は、メンバーシップ（ｍｅｍｂｅｒｓｈｉｐ）と呼ばれる、共通の根元的関係に基づく。ＡはＢの元である（記号では、Ａ∈Ｂ）または集合Ｂはその要素としてＡを包含すると言い表す。集合がその要素により決定されることが理解される。言い換えると、２つの集合は、それらが厳密に同一の要素を有する場合、等しいとみなされる。実際に、数の集合、点の集合、関数の集合、他の集合の集合などが考慮される。理論では、対象間を必ずしも分類する必要はない。集合を考慮することのみが必要とされる。
【０１６２】
メンバーシップ関係を使用すると、たいていの集合に関する他の概念（例えば、合併集合（和集合）および共通部分（積集合）を導くことができる。例えば、集合Ｃの元が厳密に、Ａの元またはＢの元のいずれかである対象の場合、集合Ｃは、２つの集合ＡおよびＢの合併集合である。集合Ｃは一意的に決定される。なぜなら、その要素が何たるかを既に特定したからである。集合論の術語により定義され得る（すなわち、関係∈のみが使用される）集合について、より複雑な演算が存在するが、ここではそのようなものには触れない。以下、別の演算について言及する。すなわち、（非順序）対｛Ａ，Ｂ｝は、その要素として厳密に集合ＡおよびＢを有する。（Ａ＝Ｂであるならば、「対」は厳密には１種類の元であり、これは単集合｛Ａ｝と呼ばれる）。合併集合および対形成の演算を組み合わせることにより、任意の有限の集合の並びからこれらの集合を元として含む集合｛Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ，…，Ｋ，Ｌ，Ｍ｝が生成され得る。また、空集合、すなわち、要素を含まない集合についても言及すべきである。（空集合は、その特性により一意的に決定される。なぜなら、要素を含まない、唯一の集合だからである。このことは、集合が、その要素により決定されるという理解の帰結である）。略式で集合を扱う場合、集合についてのこのような演算は、自明であり、公理的アプローチを用いると、このような演算が適用可能であることが自明なこととして仮定される。例えば、任意の集合ＡおよびＢについて、集合｛Ａ，Ｂ｝が存在するとことは自明であると仮定される。十分な表現力を集合論に与えるために、上述のものよりも包括的な構築公理を仮定する必要がある。その処理原則は、選び出すことが可能な対象は、集合を構成し得るということである。
【０１６３】
ａおよびｂが集合である場合、非順序対｛ａ，ｂ｝では、その要素が厳密にａおよびｂである集合である。ａとｂを一緒に並べた場合ときの「順序」はなんら役割を果たすものではなく、すなわち、｛ａ，ｂ｝＝｛ｂ，ａ｝である。多くの応用例においては、どの集合が「第一（一番目）」のもので、どの集合が「第二（二番目）」のものであるかを「読み取り」得るように、ａとｂの対をとる必要がある。（ａ，ｂ）とする場合、このａとｂとの順序対を意味する。ここで、ａは、対（ａ，ｂ）の第一番目の要素であり、ｂは、第二番目の要素である。
【０１６４】
本研究における対象のいずれにおいても、その順序対は集合であるべきである。２要素からなる順序対の第一番目の要素が等しくかつ第二番目の要素が等しい場合にのみ、この順序対が等しいように定義されなければならない。このことは、特にａ≠ｂである場合、（ａ，ｂ）≠（ｂ，ａ）であることを担保するものである。
【０１６５】
定義：（ａ，ｂ）＝｛｛ａ｝，｛ａ，ｂ｝｝
ａ≠ｂである場合、（ａ，ｂ）は、２つの要素、単集合｛ａ｝および非順序対｛ａ，ｂ｝を有する。｛ａ｝の要素に鑑みると、第一番目の要素が見出される。そのため、第二番目要素は、｛ａ，ｂ｝のうち残りの一方の要素である。
ａ＝ｂである場合、（ａ，ａ）＝｛｛ａ｝，｛ａ，ａ｝｝＝｛｛ａ｝｝は、要素を一つのみ有する。いずれの場合においても、集合（ａ，ｂ）から、両方の順序を一意的に「読み取る」ことができることは自明であろう。その記述は、以下の定理によりさらに正確なものとなる。
定理：ａ＝ａ′かつｂ＝ｂ′である場合にのみ、（ａ，ｂ）＝（ａ′，ｂ′）である。
証明：ａ＝ａ′かつｂ＝ｂ′である場合、もちろん、（ａ，ｂ）＝｛｛ａ｝，｛ａ，ｂ｝｝＝｛｛ａ′｝，｛ａ′，ｂ′｝｝＝（ａ′，ｂ′）である。別の解釈はより複雑なものである。｛｛ａ｝，｛ａ，ｂ｝｝＝｛｛ａ′｝，｛ａ′，ｂ′｝｝を仮定する。ａ≠ｂであるならば、｛ａ｝＝｛ａ′｝、かつ｛ａ，ｂ｝＝｛ａ′，ｂ′｝である。ゆえに、まずａ＝ａ′であり、次に｛ａ，ｂ｝＝｛ａ，ｂ′｝は、ｂ＝ｂ′を意味する。ａ＝ｂであるならば、｛｛ａ｝，｛ａ，ａ｝｝＝｛｛ａ｝｝である。ゆえに、｛ａ｝＝｛ａ′｝であり、｛ａ｝＝｛ａ′，ｂ′｝であり、そしてａ＝ａ′＝ｂ′が得られ、ゆえに、この場合においてもａ＝ａ′かつｂ＝ｂ′となる。
【０１６６】
任意に順序対を用いる場合、順序付けた３つの要素（ｔｒｉｐｌｅ）は、
（ａ，ｂ，ｃ）＝（（ａ，ｂ），ｃ）、
さらに、順序付けた４つの要素（ｑｕａｄｒｕｐｌｅ）は、
（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）＝（（ａ，ｂ，ｃ），ｄ）、
などと定義付けることが可能である。
また、以下のように順序付けた「１タプル（１要素からなる集合）」を定義することができる：
（ａ）＝ａ。
【０１６７】
２項関係は、その関係にある対象の全ての順序対を特定することによって決定され、どのような性質によってそれらの順序対の集合が決定されるかということは問題ではない。
以下の定義を導く。
【０１６８】
定義：Ｒの全ての要素が順序対である場合、すなわち任意のｚ∈Ｒであり、ｚ＝（ｘ，ｙ）であるようなｘとｙとが存在する場合、集合Ｒは２項関係である。
【０１６９】
（ｘ，ｙ）∈Ｒの代わりに、ｘＲｙと慣用的に表す。ｘＲｙが適用できる場合、ｘとｙはＲ関係にあるといわれる。
【０１７０】
ｙの一部とＲ関係にあるｘの全ての集合は、Ｒの定義域と呼ばれ、「ｄｏｍ  Ｒ」と示される。
従って、ｄｏｍ  Ｒ＝｛ｘ｜ｘＲｙであるようなｙが存在する｝。
ｄｏｍ  Ｒは、Ｒに存在する順序対における一番目の要素全ての集合である。
【０１７１】
一部のｘに関してｘがｙとＲ関係にあるようなｙ全ての集合は、Ｒの値域と呼ばれ、「ｒａｎ  Ｒ」と示される。
従って、ｒａｎ  Ｒ＝｛ｙ｜ｘＲｙであるようなｘが存在する｝。
【０１７２】
数学において解釈される場合、関数は、関数の定義域の任意の対象ａに固有の対象ｂ（ａにおける関数の値）を割り当てる、手順または規則である。従って、関数は、特別な形の関係を表すものであって、この関係は、その定義域における全ての対象ａの一つひとつが、その値域にある１つの対象（すなわち、ａにおけるその関数の値）と関連付けられる関係である。
【０１７３】
定義：２項関係Ｆは、任意のａ、ｂ１およびｂ２に関して、ａＦｂ１およびａＦｂ２がｂ１＝ｂ２を意味する場合、関数（または写像、対応）と呼ばれる。
言い換えると、ｄｏｍ  Ｆにある全てａのそれぞれについて、ａＦｂであるような唯一のｂが存在する場合にのみ、２項関係Ｆは関数である。この固有のｂは、ａにおけるＦの値と呼ばれ、Ｆ（ａ）またはＦａと示される。［ｄｏｍＦがａを要素として含まない場合、Ｆ（ａ）は定義されない］。Ｆが、ｄｏｍ  Ｆ＝Ａ、かつｒａｎ  Ｆ⊆Ｂであるときの関数である場合、関数Ｆに関して、以下のような表記法が慣用的に使用される：
【０１７４】
【数１】
2008518319.tif 000002
【０１７５】
したがって、関数Ｆの値域は、｛Ｆ（ａ）｜ａ∈Ａ｝または｛Ｆａ｝ａ∈Ａと示され得る。
【０１７６】
以下のように、外延性公理が関数に適用され得る。
【０１７７】
補助定理：ＦおよびＧが関数であるとすると、
全てのｘ∈ｄｏｍ  Ｆに対して、ｄｏｍ  Ｆ＝ｄｏｍ  Ｇ、かつＦ（ｘ）＝Ｇ（ｘ）
であるときかつその場合に限り、Ｆ＝Ｇである。
【０１７８】
ａ１∈ｄｏｍ  ｆ、ａ２∈ｄｏｍ  ｆ、かつａ１≠ａ２がｆ（ａ１）≠ｆ（ａ２）を意味する場合、関数ｆは１対１であるまたは単射であると呼称される。言い換えると、
ａ１∈ｄｏｍ  ｆ、ａ２∈ｄｏｍ  ｆ、かつｆ（ａ１）＝ｆ（ａ２）であるなら、
ａ１＝ａ２である。
【０１７９】
公理的集合論の枠組みの中で数学を展開するためには、自然数を定義する必要がある。自然数は、「０，１，２，３，…，１５，…，５１５」などのように直感的に理解される。そして、要素を有さない集合、１つ、２つまたは３つの要素を有する集合の例は、容易に与えられ得る。
【０１８０】
数としてのゼロ（０）を定義するために、要素を有さない集合の全ての代表が選択される。しかしながら、これは難しいことではない。なぜなら、このような集合は１つしか存在しないからである。以下が定義される：
【０１８１】
【数１Ａ】
2008518319.tif 000003
【０１８２】
１つの要素を有する集合（単集合）については、以下：
【０１８３】
【数２】
2008518319.tif 000004
【０１８４】
であり；一般的に、｛ｘ｝である。以下のように、代表を選択することができる：既に１つの特定の対象（すなわち、０）を定義したので、当然｛０｝が選択される。ゆえに、以下が定義される：
【０１８５】
【数３】
2008518319.tif 000005
【０１８６】
次に、２つの要素を有する集合を以下のように考える：
【０１８７】
【数４】
2008518319.tif 000006
【０１８８】
すでに、定義された０と１と明確にされており、かつ０≠１である。その集合の要素が、先に定義された数０および１である、特定の２つの要素からなる集合を以下のように選択する：
【０１８９】
【数５】
2008518319.tif 000007
【０１９０】
如何にしてこの過程を連続させるかは、以下のように自明である：
【０１９１】
【数６】
2008518319.tif 000008
【０１９２】
この概念によると、自然数ｎは、それより小さな自然数の全てからなる集合、すなわち、｛０、１、…、ｎ−１｝としてのみ定義される。この様式において、ｎは、ｎ個の要素からなる特定集合である。
【０１９３】
この概念は、依然として根本的な欠陥を有する。０、１、２、３、４および５が定義され、これらによって１５を定義することは容易であるが、そう簡単に５１５を定義することはできない。しかし、このような定義を連ねたところで、一般的に自然数とはいかなるものであるかということを示さない。「集合ｎは、…であるならば、自然数である」といった形式での命題が必要である。ただ単に、「集合ｎの要素が、それより小さな自然数の全てからなるならば、集合ｎは自然数である」とすることはできない。なぜなら、このような「定義」は、まさにこれから定義付けようとしている概念を包含しているからである。
【０１９４】
ここで、再度、最初のいくつかの数の構築を観察する。２＝｛０，１｝を定義した。３を得るために、２に第三の要素（すなわち、２自身）を付加する必要があった。すなわち、
３＝２∪｛２｝＝｛０，１｝∪｛２｝。
【０１９５】
同様に、
４＝３∪｛３｝＝｛０，１，２｝∪｛３｝；
５＝４∪｛４｝など。
【０１９６】
自然数ｎが与えられた場合、要素をさらに１つ（すなわち、「ｎ」自身）をｎに付加することにより、「次の」数を得る。この手順は、１および２に対してさえも機能する。すなわち、１＝０∪｛０｝、そして、２＝１∪｛１｝である。しかし、当然のことながら、０（最小の自然数）に対しては、機能しない。
【０１９７】
これらの考察は以下を示唆する。
【０１９８】
定義：集合ｘの後者（ｓｕｃｃｅｓｓｏｒ）は、集合Ｓ（ｘ）＝ｘ∪｛ｘ｝である。
【０１９９】
直感的に、自然数ｎの後者Ｓ（ｎ）は、「１つ大きな」数ｎ＋１である。これにしたがうＳ（ｎ）に関して、より示唆的に富む表記法ｎ＋１を使用する。のちほど、自然数の加算を（後者の概念を利用することで）実際にｎ＋１がｎと１との和に等しくなるように定義する。その時点まで、これは単に表記法であり、これにより加算の性質を仮定も意味もしない。
【０２００】
ここで、自然数の直感的な理解を以下にまとめることができる：
（１）０は自然数である。
（２）ｎが自然数であるならば、その後者であるｎ＋１もまた自然数である。
（３）（１）と（２）とを適用すること（すなわち、０から始めて、後者を反復して適用すること、すなわち、０、０＋１＝１、１＋１＝２、２＋１＝３、３＋１＝４、４＋１＝５、などにより、全ての自然数が得られる。
【０２０１】
定義：集合Ｉは、以下であるならば、帰納的であるとされる：
１．０∈Ｉ、
２．ｎ∈Ｉであるならば、（ｎ＋１）∈Ｉ。
【０２０２】
帰納的集合は、０と、各々の要素とともに、その後者もまた含む。（３）にしたがって、帰納的集合は全ての自然数を含むはずである。（３）の正確な意味は、自然数の集合が、自然数以外の他の要素を含まない帰納的集合（すなわち、最小の帰納的集合）であるということである。このことは、以下の定義を導く。
【０２０３】
定義：全ての自然数の集合は、集合＝｛ｘ｜全ての帰納的集合Ｉに関して、ｘ∈Ｉ｝である。
【０２０４】
この集合の要素は、いわゆる自然数であり、それゆえ、集合ｘがあらゆる帰納的集合に属するときかつその場合に限り、集合ｘは自然数である。
【０２０５】
純粋集合論の観点から、集合についての最も基本的な疑問は、それがどれ程の要素を有するか、ということである。個数について何も知ることなく、「集合ＡおよびＢが、同一の個数の要素を有する」との命題を明確にし得ることが原則として判断される。
【０２０６】
定義：定義域Ａと値域Ｂとによる、１対１関数が存在する場合、集合ＡおよびＢは同一の濃度を有する。このことを｜Ａ｜＝｜Ｂ｜により表す。
【０２０７】
定義：ＡからＢの上への１対１写像が存在する場合、Ａの濃度はＢの濃度以下である（表記法：｜Ａ｜≦｜Ｂ｜）。
【０２０８】
｜Ａ｜≦｜Ｂ｜は、Ｂのある部分集合Ｃに関して、｜Ａ｜＝｜Ｃ｜であることを意味することに留意すること。｜Ａ｜≦｜Ｂ｜であって、｜Ａ｜＝｜Ｂ｜ではない（すなわち、Ｂの部分集合上へのＡの１対１写像が存在するが、ＡからＢの上への１対１写像は存在しない）ことを意味するために、｜Ａ｜＜｜Ｂ｜とも記述する。
補助定理
１．｜Ａ｜≦｜Ｂ｜かつ｜Ａ｜＝｜Ｃ｜ならば、｜Ｃ｜≦｜Ｂ｜である。
２．｜Ａ｜≦｜Ｂ｜かつ｜Ｂ｜＝｜Ｃ｜ならば、｜Ａ｜≦｜Ｃ｜である。
３．｜Ａ｜≦｜Ａ｜。
４．｜Ａ｜≦｜Ｂ｜かつ｜Ｂ｜≦｜Ｃ｜ならば、｜Ａ｜≦｜Ｃ｜である。
【０２０９】
カントール−ベルンシュタイン（Ｃａｎｔｏｒ−Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ）の定理：
｜Ｘ｜≦｜Ｙ｜かつ｜Ｙ｜≦｜Ｘ｜ならば、｜Ｘ｜＝｜Ｙ｜である。
【０２１０】
有限集合は、その大きさが自然数である集合として定義され得る。
【０２１１】
定義：集合であるＳが、ある自然数ｎと同一の濃度を有する場合、Ｓは有限である。したがって、｜Ｓ｜＝ｎを定義し、Ｓはｎ個の要素を有するという。有限でないならば、集合は無限である。
【０２１２】
先に記載されるように、集合論は、本発明の解析に適用され得る。
【０２１３】
例えば、試験結果は、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）フォーマットのファイルでまとめられ得、ここで、機能レポーター（例えば、転写因子レポーター）と摂動因子（例えば、ｓｉＲＮＡ）はｘ−ｙ様式でプロットされ、それらの各々の組み合わせに対応する値が、そのファイルに記入される。実測値を、基準値と比較しても、目的の閾値（例えば、スクランブルｓｉＲＮＡを使用することにより得られる結果）と比較してもよい。これらの値は、３つの値（例えば、＋、０および−）へ正規化され得る。これらの値は、以下のように評価される：例えば、閾値の８０％以下である場合、これは「−１」へ正規化され、閾値の８０％と１２０％との間である場合、「０」へ正規化され、そして閾値の１２０％以上である場合、「＋１」へ正規化される。正規化行列または縮退行列を使用して、より単純な様式で摂動因子（例えば、ｓｉＲＮＡ）がレポーターに及ぼす影響を分析し、各々のレポーターに対する影響を与える摂動因子の集合を取得し得る。例示的な表を以下に示す。
【０２１４】
【表１】
2008518319.tif 000009
【０２１５】
（好ましい実施形態の説明）
以下に、実施形態により本発明を説明するが、以下に記載される実施形態は、例示目的に限り提供される。したがって、本発明の技術範囲は、それらの実施形態により限定されず、添付の特許請求の範囲により限定される。
【０２１６】
一局面において、本発明は、生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法を提供する。この本発明の方法は、以下の工程を包含する：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）該生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）該得られた情報を集合論による処理に供し、該機能レポーター間の関係を計算して、該生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程。
【０２１７】
生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程は、摂動因子がこの実体に伝達され、目的の影響を達成する限り、あらゆる様式で実施され得、使用される摂動の型に依存する。
【０２１８】
少なくとも２種類の機能レポーターについての情報を得る工程は、このようなレポーターのシグナルが測定され得る限り、あらゆる様式で実施され得る。好ましくは、レポーターは、摂動因子が影響を有する場合に、測定可能なシグナル（例えば、光、蛍光およびタンパク質の発現など）を放出する。したがって、好ましくは、機能レポーターは測定可能なシグナルを伝達し得る。
【０２１９】
集合論を実行することができる限り、データを集合論に供する工程が実行され得る。
【０２２０】
好ましくは、本発明で使用される生物学的実体は細胞である。
【０２２１】
本発明で使用される摂動因子は、生物学的実体またはシステムへ摂動または変化を与える、あらゆる因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡおよびリボザイムを含むＲＮＡ、化合物、ｃＤＮＡ、抗体、ポリペプチド、光、音、圧力変化、放射、熱ならびにガスなど）であり得る。好ましくは、上記機能レポーターの機能を特異的に制御し得るｓｉＲＮＡである。
【０２２２】
本発明で使用される機能レポーターとしては、転写因子、調節遺伝子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２３】
特定の実施形態において、本発明で使用される集合論による処理は、少なくとも２種類の機能レポーターのうち、２種類の特定の機能レポーターを、以下からなる群より選択される関係へ分類する工程を包含する：
ａ）独立、
ｂ）包含、および
ｃ）共通部分、
ここで、この関係が独立であると決定される場合、この２種類の特定の機能レポーターが、ネットワーク内で関係を有さないと決定され、
この関係が包含であると決定される場合、この２種類の特定の機能レポーターのうちの一方が、この２種類の特定の機能レポーターのうちの他方に含まれると決定され、かつこの２種類の特定の機能レポーターのうちの一方が、この２種類の特定の機能レポーターのうちの他方の下流に位置し、
この関係が共通部分であると決定される場合、この２種類の特定の機能レポーターが、別の共通の機能から分岐した下流に位置すると決定される。
【０２２４】
本発明において、集合が集合論にしたがって分析され得る限り、集合論のあらゆる数学的処理が使用され得る。本発明の特定の実施形態において、集合論による処理は、機能レポーターごとに、摂動因子による応答の有無をマッピングする工程を包含する。
【０２２５】
本発明の特定の実施形態において、集合論による処理は、機能レポーター間の関係の計算を包含し得、この計算は、独立、包含および共通部分に分類された、各々の機能レポーター間の相関を含み、この相関の一覧を作成する工程を包含する。この計算は、行列を使用することによって実行され得る。
【０２２６】
本発明の好ましい実施形態において、本発明で使用される摂動因子は、１つの細胞内パスウェイを等しく標的化するのに十分な個数であるように、有利に調製される。本発明において、２種類以上の摂動因子を通常使用して、生物学的実体（例えば、細胞）のネットワークを変更する。等しく標的化する摂動因子を使用することが好ましい。生物学的機能を構成する基本的な要素は、環境刺激に応答して、ネットワーク（例えば、分子ネットワーク）内で変更される。言い換えると、いかなる特定の理論に拘束されるのも望まないが、生物学的機能における多様性の存在が、生物学的実体（例えば、細胞）内のこのようなネットワークもまた多様性を有することを示していることが考えられる。したがって、生物学的実体（例えば、細胞）の状態におけるＭ個の変化を調べるために、Ｎ個の摂動因子が生物学的実体に与えられ得、ネットワーク解析（例えば、分子ネットワーク解析）、または多様性を有する状態の個数の分析が可能になる。さらに、固定のＭに関して分析が実行される場合、好ましくは、場合の数（または組み合わせの数）がネットワーク解析（例えば、細胞内ネットワーク解析）に十分であるように、十分な個数Ｎの摂動因子が使用される。さらに、等しく標的化する摂動因子は、ネットワークに偏った影響を及ぼすことなく、ネットワーク構造に変化を引き起こすとみなされる。したがって、好ましくは、このような等しく標的化する摂動因子が使用され、より好ましくは、ある数のこのような摂動因子が使用される。このような数は、本明細書の開示から当業者に容易に理解される。
【０２２７】
本発明で分析される、少なくとも２種類の機能レポーターについての情報は、所望の時間後の上記摂動因子の影響に基づき得る。本明細書で使用される、このような所望の時間は、実行されるべき分析の環境および目的などに基づいて選択され得る。例えば、細胞に対する因子の影響が観察される場合、数十分〜数時間、または数日までが通常使用され得る。
【０２２８】
特定の実施形態において、使用される摂動因子により得られる影響は、閾値に関して、以下の３つの群に分類される：ポジティブな影響  ＝  ＋（好ましくは、＋１）、影響なし  ＝  ０、およびネガティブな影響  ＝  −（好ましくは、−１）。
【０２２９】
本発明の好ましい実施形態において、少なくとも２種類の機能レポーターについての情報は、所望の時間後の摂動因子の影響に基づき、ここで、集合論による処理は、以下の工程を包含する：
ａ）影響と機能レポーターについての閾値とを比較し、ポジティブな影響  ＝  ＋（好ましくは、＋１）、影響なし  ＝  ０、およびネガティブな影響  ＝  −（好ましくは、−１）、の３つの群に分類することにより、この情報を３つのカテゴリに分類する工程、
ｂ）機能レポーターのうちの２種類が、同一の型の影響を有する共通の摂動因子を有するか否かを決定する工程であって、ここで、
このような共通の摂動因子が存在しない場合、これらの２種類の機能レポーターに対応する２種類の機能は、互いに異なる摂動因子の下に配置され、
このような共通の摂動因子が存在する場合、以下の工程ｃ）を実施する、工程
ｃ）これらの２種類の機能のうちの一方の機能に対する摂動因子の集合が、これらの２種類の機能のうちの他方の機能に対する摂動因子の集合に完全に包含されるか否かを決定する工程であって、ここで、
このことが真である場合、より大きな集合を有する一方の機能が、より小さな集合を有する他方の機能の下に配置され、
このことが真ではない場合、これらの２種類の機能が、同一の摂動因子の下に並行して配置される、工程、
ｄ）これらの機能レポーターの全ての組合せを調べるか否かを決定する工程であって、ここで、
このことが真である場合、これらの機能の関係の全てを統合して、現時点での全体的な摂動影響ネットワークにし、
このことが真ではない場合、工程ａ）〜工程ｃ）を反復する。これらの工程は、目的の処理および工程を実行するコンピュータプログラムを備えるコンピュータ上で実行され得る。
【０２３０】
本発明の好ましい実施形態において、上記の工程ａ）〜工程ｃ）は、Ｍ×Ｎ行列を作製することによって判断され、ここでＭは機能レポーターの個数を指し、Ｎは摂動因子の個数を指す。このような行列を使用することにより、標準的な行列計算処理によって、集合論を容易に処理することができる。
【０２３１】
本発明のさらなる実施形態において、本発明は、実際の生物学的実験を実行することにより、作製されたネットワークを分析する工程をさらに包含する。好ましくは、このような分析は、機能に特異的な調節因子（例えば、ｓｉＲＮＡ、抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、インヒビター、アクチベーター、リガンドおよびレセプターなど）の使用を包含する。好ましくは、ｓｉＲＮＡを使用する。
【０２３２】
本発明は、ネットワーク（例えば、シグナル伝達経路および細胞パスウェイなど）を分析するために使用され得る。
【０２３３】
本発明は、バイオマーカーの同定、創薬ターゲットの解析、副作用解析、細胞機能の診断、細胞パスウェイ解析、化合物の生物影響評価および感染症診断などに有用である。
【０２３４】
本発明の別の局面において、本発明は、生物学的実体内の生物学的機能のネットワーク解析システムを提供し、このシステムは以下を備える：
Ａ）生物学的実体に対する、少なくとも１種類の摂動因子、
Ｂ）上記生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る手段、および
Ｃ）得られた情報を集合論による処理に供し、機能レポーター間の関係を計算して、生物学的機能のネットワークの関係を作製する手段。本発明のシステムにおいて、摂動因子は、別個に供給され得る。したがって、一実施形態において、本発明は、以下の手段のみを備える：
Ｂ）上記生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る手段、および
Ｃ）得られた情報を集合論による処理に供し、機能レポーター間の関係を計算して、生物学的機能のネットワークの関係を作製する手段。
【０２３５】
上記生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る手段は、トランスフェクションアレイとして提供され得るが、本発明はこれに限定されない。このようなトランスフェクションアレイは、本明細書の別の箇所に広範に記載され、以下の実施例において例示される。
【０２３６】
得られた情報を集合論による処理に供し、機能レポーター間の関係を計算して、生物学的機能のネットワークの関係を作製する手段は、コンピュータプログラムとして提供され得るが、本発明はこれに限定されない。集合論は当該分野において公知であるように、集合論に基づいて、このような計算を実行する、あらゆるコンピュータプログラムが本発明において使用され得ることが理解される。
【０２３７】
上記の方法について、任意の他の特定の実施形態が、必要に応じて、本発明のシステムに使用され得、かつ適用可能であることを当業者が理解することに留意すべきである。
【０２３８】
本発明のさらなる局面において、本発明は、生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法を、コンピュータ上で実行するコンピュータプログラムを提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）上記生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）得られた情報を集合論による処理に供し、機能レポーター間の関係を計算して、生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程。
【０２３９】
上記の方法およびシステムについて、任意の他の特定の実施形態が、必要に応じて、本発明のコンピュータプログラムに使用され得、かつ適用可能であることを当業者が理解することに留意すべきである。
【０２４０】
生物学的実体内の生物学的機能のネットワークを分析する本発明の方法を実行するコンピュータ構成あるいはそれを実現するシステムを図１０に示す。図１０は、生物学的実体内の生物学的機能のネットワークを分析する本発明の方法を実行するコンピュータの５００の構成例を示す。
【０２４１】
コンピュータ５００は、入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４と、バス５０５とを備える。入力部５０１と、ＣＰＵ５０２と、出力部５０３と、メモリ５０４とは、バス５０５によって相互に接続されている。入力部５０１と出力部５０３とは入出力装置５０６に接続されている。
【０２４２】
コンピュータ５００によって実行される、生物学的実体内の生物学的機能のネットワークを分析する処理の概略を以下に説明する。
【０２４３】
生物学的実体内の生物学的機能のネットワークを分析する方法を実行するプログラムは、例えば、メモリ５０２に格納されている。あるいは、この方法のために必要な情報は、それぞれ独立してあるいは一緒に、フロッピー（登録商標）ディスク、ＭＯ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＣＤ−Ｒ、ＤＶＤ−ＲＯＭのような任意のタイプの記録媒体に記録され得る。あるいは、アプリケーションサーバに格納されていてもよい。そのような記録媒体に格納された情報またはデータは、出入力装置５０６（例えば、ディスクドライブ、ネットワーク（例えば、インターネット））を介してコンピュータ５００のメモリ５０４にロードされる。ＣＰＵ５０２がこのプログラムを実行することによって、コンピュータ５００は、生物学的実体内の生物学的機能のネットワークを分析する本発明の方法を実行する装置として機能する。
【０２４４】
入力部５０１を介して、細胞に関する情報などを入力する。また、測定されたプロファイルのデータも入力される。必要に応じて、既知の情報も入力してもよい。
【０２４５】
ＣＰＵ５０２は、入力部５０１によるデータおよび細胞についての情報をもとに、表示データを生成し、メモリ５０４に表示データを格納する。その後、ＣＰＵ５０２は、これらの情報をメモリ５０４に格納し得る。その後、出力部５０３は、ＣＰＵ５０２が分析したネットワークを表示データとして出力する。出力されたデータは、入出力装置５０６から出力され得る。
【０２４６】
本発明のなお異なる局面において、本発明は、生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法を、コンピュータ上で実行するコンピュータプログラムを含む記憶媒体を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）上記生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）得られた情報を集合論による処理に供し、機能レポーター間の関係を計算して、生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程。
【０２４７】
上記の方法、システムおよびコンピュータプログラムについて、任意の他の特定の実施形態が、必要に応じて、本発明の記憶媒体に使用され得、かつ適用可能であることを当業者が理解することに留意すべきである。このような記憶媒体は、どんな記録媒体（例えば、ＣＤ−ＲＯＭ、フレキシブルディスク、ＣＤ−Ｒ、ＣＤ−ＲＷ、ＭＯ、ミニディスク、ＤＶＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−Ｒ、メモリースティック、ハードディスクなど）でもよい。
【０２４８】
本発明のなおさらなる局面において、本発明は、生物学的実体における生物学的機能のネットワークを解析するための方法を、コンピュータ上で実行するコンピュータプログラムを含む通信媒体を提供し、この方法は、以下の工程を包含する：
Ａ）生物学的実体を少なくとも１種類の摂動因子に供する工程、
Ｂ）上記生物学的実体内の、生物学的機能を反映する機能レポーターのうち、少なくとも２種類についての情報を得る工程、および
Ｃ）得られた情報を集合論による処理に供し、機能レポーター間の関係を計算して、生物学的機能のネットワークの関係を作成する工程。
【０２４９】
上記の方法、システム、コンピュータプログラムおよび記憶媒体について、任意の他の特定の実施形態が、必要に応じて、本発明の通信媒体に使用され得、かつ適用可能であることを当業者が理解することに留意すべきである。このような通信媒体の例としては、ネットワーク（例えば、イントラネットおよびインターネットなど）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５０】
以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、以下の実施例は、例示の目的のみに提供される。従って、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲以外には限定されない。当業者は、以下の実施例から、適宜細胞、支持体、生物学的因子、塩、正に荷電した物質、負に荷電した物質、アクチン作用物質などを選択し、本発明を作製または実施することができることが理解される。
【実施例】
【０２５１】
以下に実施例を示して本発明をさらに詳しく説明するが、この発明は以下の例に限定されるものではない。以下の実施例において用いられる試薬、支持体などは、例外を除き、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＵＳＡ、和光純薬（大阪、日本）、松浪硝子（岸和田、日本）などから市販されるものを用いた。
【０２５２】
（実施例１：試薬）
以下の処方物を、実施例１で調製した。フィブロネクチンなどは市販されている。フラグメントおよび改変体を、遺伝工学技術により取得した：
１）フィブロネクチン（配列番号５２）；
２）プロネクチンＦ（三洋化成、京都、日本）；
３）プロネクチンＬ（三洋化成）；
４）プロネクチンＰｌｕｓ（三洋化成）；
５）ゼラチン。
【０２５３】
ＤＮＡとしてトランスフェクションのためのプラスミドを調製した。プラスミドｐＥＧＦＰ−Ｎ１、プラスミドｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１、ならびに他の転写因子およびキナーゼをコードする遺伝子を含むプラスミド（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、ＣＡ、ＵＳＡから利用可能）を用いた。これらのプラスミドにおいては、遺伝子発現は、サイトメガロイウルス（ＣＭＶ）の制御下においた。プラスミドＤＮＡを、Ｅ．ｃｏｌｉ（ＸＬ１  ｂｌｕｅ、Ｓｔｒａｔｇｅｎｅ，ＴＸ，ＵＳＡ）中で増幅し、増幅したプラスミドＤＮＡを複合体パートナーとして用いた。ＤＮＡは、ＤＮａｓｅもＲＮａｓｅも含まない蒸留水中に溶解した。
【０２５４】
ｓｈＲＮＡおよび／またはｓｉＲＮＡもまた、公知の技術にしたがって調製した。
【０２５５】
以下のトランスフェクション試薬を使用した：Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ｃａｔ．ｎｏ．３０１４２５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）、ＴｆｘＴＭ−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１，Ｐｒｏｍｅｇａ，ＷＩ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５，Ｑｉａｇｅｎ，ＣＡ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９，Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）およびＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１，Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）。これらのトランスフェクション試薬は、上記ＤＮＡおよびアクチン作用物質にあらかじめ加えるかあるいはＤＮＡと複合体を先に生成してから使用した。
【０２５６】
このようにして調製した溶液を以下のトランスフェクションアレイを用いたアッセイに用いた。
【０２５７】
（実施例２：トランスフェクションアレイ−間葉系幹細胞を用いた実証）
本実施例では、固相におけるトランスフェクション効率の改善を観察した。そのプロトコールを以下に示す。
【０２５８】
（プロトコール）
ＤＮＡの最終濃度は、１μｇ／μＬに調整した。アクチン作用物質は、ｄｄＨ２Ｏ中で１０μｇ／μＬのストックとして保存した。全ての希釈をＰＢＳ、ｄｄＨ２ＯまたはダルベッコＭＥＭ培地を用いて行った。希釈系列として、例えば、０．２μｇ／μＬ、０．２７μｇ／μＬ、０．４μｇ／μＬ、０．５３μｇ／μＬ、０．６μｇ／μＬ、０．８μｇ／μＬ、１．０μｇ／μＬ、１．０７μｇ／μＬ、１．３３μｇ／μＬ、などを調製した。
【０２５９】
トランスフェクション試薬は、それぞれの製造業者が提供する指示書に従って、使用した。
【０２６０】
プラスミドＤＮＡ：グリセロールストックから１００ｍＬのＬ−ａｍｐ中で一晩増殖させ、Ｑｉａｐｒｅｐ  ＭｉｎｉｐｒｅｐまたはＱｉａｇｅｎ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍａｘｉを用いて製造業者が提供する標準プロトコールによって精製した。
【０２６１】
本実施例では、以下の５種類の細胞を利用して、効果を確認した：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣｓ、ＰＴ−２５０１、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）、ヒト胚性腎細胞（ＨＥＫ２９３、ＲＣＢ１６３７、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）、ＮＩＨ３Ｔ３−３細胞（ＲＣＢ０１５０，ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）、ＨｅＬａ細胞（ＲＣＢ０００７、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）およびＨｅｐＧ２（ＲＣＢ１６４８、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）。これらは、Ｌ−ｇｌｕｔおよびｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを含むＤＭＥＭ／１０％ＩＦＳ中で培養した。
【０２６２】
（希釈およびＤＮＡのスポット）
トランスフェクション試薬とＤＮＡとを混合してＤＮＡ−トランスフェクション試薬複合体を形成させた。複合体形成にはある程度の時間が必要であることから、上記混合物を、アレイ作製機（ａｒｒａｙｅｒ）を用いて固相支持体（例えば、ポリ−Ｌ−リジンスライド）にスポットした。実施例２では、固相支持体として、ポリ−Ｌ−リジンスライドのほか、ＡＰＳスライド、ＭＡＳスライド、コーティングなしのスライドを用いた。これらは、松浪硝子（岸和田、日本）などから入手可能である。
【０２６３】
複合体形成およびスポット固定のために、真空乾燥機中で一晩スライドを乾燥させた。乾燥時間の範囲は、２時間から１週間とした。
【０２６４】
フィブロネクチンなどは、上記複合体形成時に使用してもよいが、実施例２では、スポッティングの直前に使用した。
【０２６５】
（混合液の調製および固相支持体への適用）
エッペンドルフチューブに、３００μＬのＤＮＡ濃縮緩衝液（ＥＣ緩衝液）＋１６μＬのエンハンサーを混合した。これをボルテックスによって混合し、５分間インキュベートした。５０μＬのトランスフェクション試薬（Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅなど）を加え、そしてピペッティングによって混合した。トランスフェクション試薬を適用するために、スライドのスポットのまわりにワックス環状バリヤーを引いた。ワックスで囲まれたスポット領域に３６６μＬの混合物を加え、室温で１０分間〜２０分間インキュベートした。これにより、支持体への手動による固定が達成された。
【０２６６】
（細胞の分配）
次に、細胞を添加するプロトコールを示す。トランスフェクトのために細胞を分配した。この分配は、通常、フード内で減圧吸引して行った。スライドを皿に置き、そしてトランスフェクションのために細胞を含む溶液を加えた。細胞の分配は、以下のとおりである。
【０２６７】
細胞の濃度が２５ｍＬ中１０７細胞になるように、増殖中の細胞を分配した。１００×１００×１５ｍｍの四角形のペトリ皿または半径１００ｍｍ×１５ｍｍの円形ディッシュ中で、スライド上に細胞をプレーティングした。約４０時間、トランスフェクションを進行させた。これは、約２細胞周期にあたる。免疫蛍光のためにスライドを処理した。アレイの例については、図４左上のパネルを参照のこと。
【０２６８】
（遺伝子導入の評価）
遺伝子導入の評価は、例えば、免疫蛍光、蛍光顕微鏡検査、レーザー走査、放射性標識および感受性フィルムまたはエマルジョンを用いた検出によって達成した。
【０２６９】
可視化されるべき発現タンパク質が蛍光タンパク質であるなら、それらを蛍光顕微鏡検査で見、そして写真を撮ることができる。大型の発現アレイに関しては、スライドをデータ保存のためにレーザースキャナーで走査し得る。発現されたタンパク質を蛍光抗体が検出し得るなら、免疫蛍光のプロトコールを引き続いて行うことができる。検出が放射能に基づくなら、スライドを上記で示したように接着し得、そしてフィルムまたはエマルジョンを用いたオートラジオグラフィーによって放射能を検出することができる。
【０２７０】
（レーザー走査および蛍光強度定量）
トランスフェクション効率を定量するために、本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイスキャナ（ＧｅｎｅＴＡＣ  ＵＣ４×４、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＭＩ）を使用した。総蛍光強度（任意の単位）を測定した後、単位表面積あたりの蛍光強度を計算した。
【０２７１】
（共焦点顕走査顕微鏡による切片観察）
細胞を、組織培養ディッシュに最終濃度１×１０５細胞／ウェルで播種し、適切な培地（ヒト間葉系細胞基本培地（ＭＳＣＧＭ、ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ  ＰＴ−３００１、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．、ＭＤ，ＵＳＡ）により培養した。細胞層を４％パラホルムアルデヒド溶液で固定した後、染色試薬であるＳＹＴＯおよびＴｅｘａｓ  Ｒｅｄ−Ｘファロイジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｉｎｃ．，ＯＲ，ＵＳＡ）を細胞層に添加して、核およびＦアクチンを観察した。遺伝子産物によって発光するサンプルまたは染色されたサンプルを共焦点レーザー顕微鏡（ＬＳＭ５１０、Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏ．，Ｌｒｄ、ピンホールサイズ＝Ｃｈ１＝１２３μｍ、Ｃｈ２＝１０８μｍ；画像間隔＝０．４）を用いて、切片像を得た。
【０２７２】
（実験プロトコール）
（細胞供給源、培養培地、および培養条件）
この実施例では、５種類の異なる細胞株を使用した：ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ、ＰＴ−２５０１、Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）、ヒト胚性腎細胞ＨＥＫ２９３（ＲＣＢ１６３７、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）、ＮＩＨ３Ｔ３−３（ＲＣＢ０１５０、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）、ＨｅＬａ（ＲＣＢ０００７、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）、およびＨｅｐＧ２（ＲＣＢ１６４８、ＲＩＫＥＮ  Ｃｅｌｌ  Ｂａｎｋ，ＪＰＮ）。ヒトＭＳＣ細胞の場合、この細胞を、市販のヒト間葉細胞基本培地（ＭＳＣＧＭ  ＢｕｌｌｅｔＫｉｔ  ＰＴ−３００１，Ｃａｍｂｒｅｘ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ  Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，Ｉｎｃ．，ＭＤ）中で維持した。ＨＥＫ２９３細胞、ＮＩＨ３Ｔ３−３細胞、ＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞の場合、これらの細胞を、１０％  ウシ胎仔血清（ＦＢＳ、２９−１６７−５４、Ｌｏｔ  Ｎｏ．２０２５Ｆ、Ｄａｉｎｉｐｐｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ＣＯ．，ＬＴＤ．，ＪＰＮ）を有するダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｌ−グルタミンおよびピルビン酸ナトリウムを有する高グルコース（４．５ｇ／Ｌ）；１４２４６−２５、Ｎａｋａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ，ＪＰＮ）中で維持した。全ての細胞を、３７℃、５％  ＣＯ２に制御されたインキュベーター中で培養した。ｈＭＳＣを含む実験において、本発明者らは、表現型の変化を回避するために、５継代未満のｈＭＳＣを使用した。
【０２７３】
（プラスミドおよびトランスフェクション試薬）
トランスフェクションの効率を評価するために、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１ベクターおよびｐＤｓＲｅｄ２−Ｎ１ベクター（カタログ番号６０８５−１、６９７３−１、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，ＣＡ）を使用した。共に遺伝子発現は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下であった。トランスフェクトされた細胞は、それぞれ、連続的にＥＧＦＰまたはＤｓＲｅｄ２を発現した。プラスミドＤＮＡを、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、ＸＬ１−ｂｌｕｅ株（２００２４９，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＴＸ）を使用して増幅し、そしてＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ（ＥｎｄｏＦｒｅｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ  １２３６２、ＱＩＡＧＥＮ、ＣＡ）によって精製した。全ての場合において、プラスミドＤＮＡを、ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅを含まない水に溶解した。トランスフェクション試薬は以下のようにして得た：Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（カタログ番号３０１４２５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２４３１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）、ＴｆｘＴＭ−２０  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅ２３９１、Ｐｒｏｍｅｇａ、ＷＩ）、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１３０５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（３０１１０５、Ｑｉａｇｅｎ、ＣＡ）、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００  Ｒｅａｇｅｎｔ（１１６６８−０１９、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＣＡ）、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．（１０１−３０、Ｐｏｌｙｐｌｕｓ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ、Ｆｒａｎｃｅ）、およびＥｘＧｅｎ  ５００（Ｒ０５１１、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｉｎｃ．，ＭＤ）。
【０２７４】
（固相系トランスフェクションアレイ（ＳＰＴＡ）生成）
「リバーストランスフェクション」についてのプロトコールの詳細は、ウェブサイト  ｈｔｔｐ：／／ｓｔａｆｆａ．ｗｉ．ｍｉｔ．ｅｄｕ／ｓａｂａｔｉｎｉ＿ｐｕｂｌｉｃ／ｒｅｖｅｒｓｅ＿ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ．ｈｔｍ  の「Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｈｏｍｅｐａｇｅ」またはＪ．Ｚｉａｕｄｄｉｎ，Ｄ．Ｍ．Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｎａｔｕｒｅ，４１１，２００１，１０７；および、Ｒ．Ｗ．Ｚｕ，Ｓ．Ｎ．Ｂａｉｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１２，Ｎｏ．１０，４８５に記載されていた。本発明者らの固相系トランスフェクション（ＳＰＴＡ方法）において、疎水性フッ素樹脂コーティングによって区分した４８平方パターン（３ｍｍ×３ｍｍ）を有する３つの型のスライドガラス（シラン処理したスライドガラス；ＡＰＳスライド、およびポリ−Ｌ−リジンでコーティングしたスライドガラス；ＰＬＬスライド、およびＭＡＳでコーティングしたスライド；Ｍａｔｓｕｎａｍｉ  Ｇｌａｓｓ  Ｉｎｄ．，ＬＴＤ．，ＪＰＮ）を研究した。
【０２７５】
（プラスミドＤＮＡプリンティング溶液の調製）
ＳＰＴＡを生成するための２つの異なる方法を開発した。その主な違いは、プラスミドＤＮＡプリンティング溶液の調製にある。
【０２７６】
（方法Ａ）
Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用する場合、プリンティング溶液は、プラスミドＤＮＡおよび細胞接着分子（４ｍｇ／ｍＬの濃度で超純水に溶解したウシ血漿フィブロネクチン（カタログ番号１６０４２−４１、Ｎａｋａｌａｉ  Ｔｅｓｑｕｅ、ＪＰＮ））を含んだ。上記の溶液を、インクジェットプリンタ（ｓｙｎＱＵＡＤＴＭ、Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ＣＡ）を用いてか、または手動で０．５〜１０μＬチップを用いて、スライドの表面に適用した。このプリントしたスライドガラスを安全キャビネットの内側で室温にて１５分間かけて乾燥させた。トランスフェクションの前に、全てのＥｆｆｅｃｔｅｎｅ試薬を、ＤＮＡプリントしたスライドガラス上に静かに注ぎ、そして室温にて１５分間インキュベートした。過剰のＥｆｆｅｃｔｅｎｅ溶液を、吸引アスピレーターを用いてスライドガラスから除去し、そして安全キャビネットの内側で室温にて１５分間かけて乾燥させた。得られたＤＮＡプリントしたスライドガラスを、１００ｍｍ培養ディッシュの底に置き、そして約２５ｍＬの細胞懸濁液（２〜４×１０４細胞／ｍＬ）を、このディッシュに静かに注いだ。次いで、このディッシュを３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーターに移し、２〜３日間インキュベートした。
【０２７７】
（方法Ｂ）
他のトランスフェクション試薬（ＴｒａｎｓＦａｓｔＴＭ、ＴｆｘＴＭ−２０、ＳｕｐｅｒＦｅｃｔ、ＰｏｌｙＦｅｃｔ、ＬｉｐｏｆｅｃｔＡＭＩＮＥ  ２０００、ＪｅｔＰＥＩ（×４）ｃｏｎｃ．またはＥｘＧｅｎ）の場合、プラスミドＤＮＡ、フィブロネクチン、およびトランスフェクション試薬を、製造業業者が配布する指示書に示される比率に従って１．５ｍＬのマイクロチューブ中で均一に混合し、室温で１５分間インキュベートしてから、チップ上にプリンティングした。プリンティング溶液を、インクジェットプリンターまたは０．５〜１０μＬチップを用いてスライドガラスの表面上に適用した。このプリントしたスライドガラスを、安全キャビネットの内側で室温にて１０分間かけて完全に乾燥させた。プリントしたスライドガラスを１００ｍｍ培養ディッシュの底に置き、そして約３ｍＬの細胞懸濁液（２〜４×１０４細胞／ｍＬ）を添加し、安全キャビネットの内側で室温にて１５分間にわたってインキュベートした。インキュベーション後、新鮮な培地をこのディッシュに静かに注いだ。次いで、このディッシュを３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーターに移し、２〜３日間インキュベートした。インキュベーション後、本発明者らは、蛍光顕微鏡（ＩＸ−７１、Ｏｌｙｍｐｕｓ  ＰＲＯＭＡＲＫＥＴＩＮＧ，ＩＮＣ．，ＪＰＮ）を用いて、増強された蛍光タンパク質（ＥＦＰ、ＥＧＦＰ、およびＤｓＲｅｄ２）の発現に基づいてトランスフェクト体を観察した。位相差画像を同じ顕微鏡を用いて撮った。両プロトコールにおいて、細胞をパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）固定方法（ＰＢＳ中の４％  ＰＦＡ、処理時間は、室温にて１０分間）を用いることによって固定した。
【０２７８】
（レーザー走査および蛍光強度定量）
トランスフェクション効率を定量するために、本発明者らは、ＤＮＡマイクロアレイスキャナ（ＧｅｎｅＴＡＣ  ＵＣ４×４、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ  Ｉｎｃ．，ＭＩ）を使用した。総蛍光強度（任意の単位）を測定した後、表面積あたりの蛍光強度を計算した。
【０２７９】
（ヒト間葉系幹細胞の固相系トランスフェクションアレイ）
多様な種類の細胞に分化するヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の能力は、組織再生および組織復活を標的とする研究にとって特に興味深いものになっている。特に、これらの細胞の形質転換に関する遺伝子解析は、ｈＭＳＣの多能性を制御する因子を解明する上で、関心が高まっている。ｈＭＳＣの研究は、所望の遺伝物質を用いたトランスフェクションが不可能な点にある。
【０２８０】
固相系トランスフェクションにより、インビボ遺伝子送達のために使用され得る「トランスフェクションパッチ」、ならびにｈＭＳＣにおけるハイスループット遺伝子機能研究のための固相系トランスフェクションアレイ（ＳＰＴＡ）が達成され得ることを実証した。
【０２８１】
哺乳動物細胞をトランスフェクトするための多数の標準的な方法が存在するが、遺伝物質のｈＭＳＣへの導入については、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａなどの細胞株と比較して不便かつ困難であることが知られている。従来使用されるウイルスベクター送達またはエレクトロポレーションのいずれも重要であるが、潜在的な毒性（ウイルス方法）、ゲノムスケールハイスループット解析の困難性、およびインビボ研究に対して（エレクトロポレーションに関して）適用性が制限を受けることのような不便さが存在する。
【０２８２】
固相支持体に簡便に固定することができかつ徐放性および細胞親和性を保持した固相支持体固定系を本発明者らが開発したことにより、上述の欠点のほとんどを克服し得、かつ集合論による、生物学的実体（例えば、細胞）のネットワークの分析を達成した。
【０２８３】
本実施例の結果、いくつかの重要な効果が達成された：トランスフェクション効率が高いこと（その結果、統計学的に有意な細胞集団が研究され得る）、異なるＤＮＡ分子を有する領域間の相互夾雑が低いこと（その結果、個々の遺伝子の効果が、別々に研究され得る）、トランスフェクト細胞の生存が長期化したこと、ハイスループットであり互換性のあって簡便な検出方法。これらの基準を全て満たすＳＰＴＡは、さらなる研究のための適切な基盤となる。
【０２８４】
チップ上での高いトランスフェクション効率の達成のために重要な点は、使用されるコーティング剤である。ガラス製のチップを用いた場合、ＰＬＬが、トランスフェクション効率および相互夾雑の両方に関して、（以下に記載されるように）最良の結果を提供することを発見した。フィブロネクチンコーティングしない場合（他のすべての実験条件は一定に保った）、トランスフェクト体はほとんど観察されなかった。完全に立証したわけではないが、フィブロネクチンの役割は細胞接着プロセスを加速することであることがほぼ確実であり（データは示していない）、それゆえに、表面から解離したＤＮＡを拡散させてしまう時間を制限する。
【０２８５】
（実施例３：ＲＮＡｉトランスフェクションマイクロアレイ）
実施例２に記載されるようにアレイを作製した。遺伝物質として、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）とｓｈＲＮＡとの混合物を使用した。この混合物の組成を、表２に示す。
【０２８６】
【表２】
2008518319.tif 000010
【０２８７】
したがって、本発明の方法が、ｓｈＲＮＡを使用して分析するためのあらゆる細胞に適用可能であることが明らかとなった。
【０２８８】
（実施例４：ｓｉＲＮＡを用いるＲＮＡｉマイクロアレイの使用）
次に、ｓｈＲＮＡの代わりにｓｉＲＮＡを使用して、実施例２に記載されるプロトコールに従い、ＲＮＡｉトランスフェクションマイクロアレイを構築した。
【０２８９】
表２に記載される、転写因子に対する機能レポーターおよびフィブロネクチンを使用して、転写因子（ＳＲＥ、ＴＲＥ、Ｅ２Ｆ、ｐ５３、Ｒｂ、アクチン、ＮＦＡＴ、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ３、ＲＡＲＥ、ＰＭＡ、ＩＳＲＡ、ＨＳＥ、Ｍｙｃ、ＡＰ１、ＧＡＳ、ＥＲＥ、ＧＲＥおよびＣＲＥを含む）に対するｓｉＲＮＡを合成した。ＥＧＦＰに対するｓｉＲＮＡをコントロールとして使用し、各々のｓｉＲＮＡが、その標的転写因子をノックアウトするか否かを評価した。スクランブル（ｓｃｒａｍｂｌｅ）ＲＮＡを、ネガティブコントロールとして使用し、それらの比率を評価した。
【０２９０】
以下の表は、本実施例で使用されたｓｉＲＮＡにより標的化される転写因子を示す。
【０２９１】
【表３−１】
2008518319.tif 000011
【０２９２】
【表３−２】
2008518319.tif 000012
【０２９３】
【表３−３】
2008518319.tif 000013
【０２９４】
【表３−４】
2008518319.tif 000014
【０２９５】
本実施例で使用した機能レポーターは、以下の通りである：
【０２９６】
【表４−１】
2008518319.tif 000015
【０２９７】
【表４−２】
2008518319.tif 000016
【０２９８】
【表４−３】
2008518319.tif 000017
【０２９９】
【表４−４】
2008518319.tif 000018
【０３００】
各々の細胞を固相系トランスフェクションに供し、２日間培養した。蛍光画像スキャナーを使用して画像を取得し、蛍光レベルを定量化した。詳細には、以下のように実行した：
以下の試薬を混合して、トランスフェクションアレイ上にＤＮＡを「プリンティング」した。
【０３０１】
【表４−５】
2008518319.tif 000019
【０３０２】
バブルジェット（登録商標）ＤＮＡプリンター（Ｃａｒｔｅｓｉａｎ  Ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ，ＵＳＡ製）を使用して、上記で調製したスライドガラス上にＤＮＡ混合物をプリンティングした。このアッセイのために、１９種類のレポーターと２６種類のｓｉＲＮＡとの全ての組み合わせを調製し、各々の組み合わせにつき４つのスポットをトランスフェクションアレイに作り、本実施例用のトランスフェクションアレイを作製した。
【０３０３】
ＨｅＬａ細胞（ヒト子宮頸癌細胞株）およびＨｅｐＧ２（ヒト肝癌細胞株）を、それぞれ２×１０６細胞／ｍＬで播種し、ＣＯ２インキュベーターで４８時間培養した。
【０３０４】
細胞の培養後、ＤＮＡマイクロアレイ用のスキャナー（ＡｒｒａｙＷｏＲｘ（商標名），Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ，ＬＬＣ，Ｉｓｓａｑｕａｈ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＵＳＡ）を使用して、ＥＧＦＰ発現の蛍光画像を取得した。これらの画像を、画像分析ソフトウェア（ＩｍａＧｅｎｅ；ＢｉｏＤｉｓｃｏｖｅｒｙ；Ｅｌ  Ｓｅｇｕｎｄｏ，ＣＡ  ＵＳＡ）を用いて分析し、ＥＧＦＰの蛍光強度を整数値にした。
【０３０５】
Ｓｃｒａｍｂｌｅ  ＩＩ  Ｄｕｐｌｅｘ（ネガティブコントロール）の場合の強度に対する、相対強度の比率を計算した。ネガティブコントロールの１２０％以上の相対強度はアップレギュレーションとみなし、ネガティブコントロールの８０％以下の相対強度はダウンレギュレーションとみなし、これらの間（すなわち、８０％＜相対強度＜１２０％）の相対強度を変化なしとみなした。ＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞の結果を以下に示す。
【０３０６】
【表５−１】
2008518319.tif 000020
【０３０７】
【表５−２】
2008518319.tif 000021
【０３０８】
【表５−３】
2008518319.tif 000022
【０３０９】
ＨｅＬａ細胞についてのネットワークを正規化した行列を以下に示す。
【０３１０】
【表５−４】
2008518319.tif 000023
【０３１１】
【表６−１】
2008518319.tif 000024
【０３１２】
【表６−２】
2008518319.tif 000025
【０３１３】
【表６−３】
2008518319.tif 000026
【０３１４】
ＨｅｐＧ２細胞についてのネットワークを正規化した行列を以下に示す。
【０３１５】
【表６−４】
2008518319.tif 000027
【０３１６】
例示的な結果を図５と図７とにまとめた。
【０３１７】
図５と図７とに示されるように、ＲＮＡｉを使用した場合、各々の遺伝子の発現は、種々の様式で特異的に抑制された。したがって、ＲＮＡｉに適用可能な、多数の遺伝物質を有するアレイを実現することができ、かつ、細胞に対するＲＮＡｉの影響は集合論を使用して解析可能であることを実証した。
【０３１８】
（実施例５：集合論を用いた数理解析）
次に、実施例２〜４に記載の技術を使用して得たデータに基づき、集合論を用いる分析を行った。ここでは、解析のためにＨｅＬａ細胞とＨｅｐＧ２細胞とを使用した。ＨｅＬａ細胞とＨｅｐＧ２細胞とに対し、転写因子ＳＲＥ、ＴＲＥ、Ｅ２Ｆ、ｐ５３、Ｒｂ、アクチン、ＮＦＡＴ、ＮＦｋＢ、ＳＴＡＴ３、ＲＡＲＥ、ＰＭＡ、ＩＳＲＡ、ＨＳＥ、Ｍｙｃ、ＡＰ１、ＧＡＳ、ＥＲＥ、ＧＲＥおよびＣＲＥを使用した。
【０３１９】
（数理解析技術）
本明細書で使用した数理解析技術を図１および図９に示す。図１は、本発明の一実施形態に従う解析の模式図を示す。ＡおよびＢは、生物学的実体（例えば、細胞）の機能を反映する集合とみなされ得る機能レポーターを指す。使用される摂動因子は、集合Ａ内に位置するか、集合Ｂ内に位置するか、集合Ａと集合Ｂとの共通部分内に位置するか、集合Ａまたは集合Ｂの外側に位置する。ｉ）は、機能Ａ（集合Ａ）と機能Ｂ（集合Ｂ）とに対する摂動因子が存在しない場合を示す。ｉ）では、機能Ａと機能Ｂとは異なる摂動因子の下で位置づけられている。ｉｉ）は、機能Ａおよび機能Ｂに関して摂動因子が存在しており、機能Ｂに包含される全ての摂動因子がまた、機能Ａにも包含される場合を示している。ｉｉ）において、機能Ｂは、機能Ａの下流に位置する。ｉｉｉ）は、共通の摂動因子が存在する場合を示すが、そのうちのあるものは機能Ａにのみ包含され、あるものは機能Ｂにのみ包含される。ｉｉｉ）では、機能Ａと機能Ｂとは、共通の摂動因子の下に並行して位置する。ｉｖ）とｖ）とは、３種類の機能が関与する場合を示す。これらは、２種類の機能の場合と同様な様式で説明され得る。原理的には、２種類の機能の全ての機能を統合することにより、全ての機能についての全体的なネットワークを作成する。図９は、本発明の例示的な実施形態の模式的なフローチャートを示す。このフローチャートは、コンピューター上で実行され得る。
【０３２０】
コントロール条件（細胞、追加要因、培養条件など）下で、ｓｉＲＮＡに対するレポーターを使用して、アッセイを実行した。以下の解析については、実施例４に記載の条件を使用した。
【０３２１】
機能レポーターとｓｉＲＮＡとの組み合わせ行列の計算に用いた行列を、図１１に示す。各々の列は、Ｅｘｃｅｌ（登録商標）シートに対応する列と行とを表す。
【０３２２】
実際に使用したトランスフェクションアレイを、図１２に示す。図１２は、ＨｅＬａアレイを走査した画像（１６ビット  ＴＩＦＦ画像）を示す。各々の混合溶液を、下部パネルのようにプリントし、細胞の播種後、アレイスキャナーを使用して、画像を得た（上部のパネルを参照のこと）。
【０３２３】
例示的な結果を図５と図７とにまとめる。この様式でＤＮＡを比較した場合に限り、誘導因子を添加すると、大半の転写因子が誘導された。
【０３２４】
次に、ｓｉＲＮＡの活性を、＋、０および−を含む３つの群に分類した。結果は、行列を使用して表現され得る。図１に示されるスキームを用いる集合論に従って、これらの影響を解析した。この場合では、ｓｉＲＮＡがパラメータ（例えば、細胞形態、神経突起成長および遺伝子発現など）に及ぼす影響を比較した。目的の影響を観察するのに十分な特定の時間が経過してから、任意の時点において測定を実行してもよい。例えば、本実施例において、特定の時間として１時間と６時間とを選んだ。
【０３２５】
結果を図６と図８とに示す。図６に示すように、ＨｅＬａ細胞では、ＳＲＥは、ネットワークの最下流に位置し、その上流にｐ５３、Ｅ２Ｆ、ＲｂおよびＴＲＥが位置する。アクチンは、Ｅ２ＦとＲｂとの上流に位置し、そのＲｂは、上流にアクチン、ＮＦＡＴおよびＳＴＡＴ３を有する。ＮＦｋＢは、ＮＦＡＴの上流であり、ＮＦｋＢの上流にはＲＡＲＥが存在する。ＳＴＡＴ３は、その上流にＡＰ１とＨＳＥとを有し、そのＡＰ１は、ＰＭＡとＩＳＲＥとの上流に位置する。ＣＲＥは、使用したパラメータのネットワークの最上流に位置し、その直下にＧＲＥ、ＲＡＲＥ、ＡＰ１およびＭｙｃを有する。ＧＡＳとＥＲＥとは関連するパラメータを有さず、したがって、これらは解析したネットワークでは独立している。
【０３２６】
図８に示すように、ＨｅｐＧ２細胞では、ＣＲＥが、分析したネットワークの最上流に位置し、その下流にはＧＲＥ、ＩＳＩＲおよびＳＲＥが存在する。ＳＲＥの下流には、ＰＭＡ、ＳＴＡＴ３およびＲＡＲＥが存在し、ＲｂおよびＥ２Ｆは、ＨＳＥ、アクチン、ＴＲＥ、ｐ５３、ＮＦＡＴおよびＳＴＡＴ３の下流に位置する。ＳＴＡＴ３は、ＳＲＥの下流に位置する。ＰＭＡは、ＡＰ１の上流に位置し、ＡＰ１の下流にはＨＳＥが存在する。ＮＦｋＢおよびＭｙｃは、ＲＡＲＥの下流に位置する。ＥＲＥとＧＡＳとは関連するパラメータを有さず、したがって、これらは、解析したネットワークでは独立している。
【０３２７】
確証実験のために、ＨｅＬａ細胞およびＨｅｐＧ２細胞における、ＣＲＥに対するｓｉＲＮＡの影響を分析した。その結果を矢印で示す。矢印は、ＣＲＥに対するｓｉＲＮＡの添加により阻害効果が生じた転写因子を示し、したがって、これらの因子がネットワーク内においてＣＲＥにきわめて近接することを示唆する。
【０３２８】
結論として、集合論を適用する本発明により、生物学的実体（例えば、細胞）のネットワークを正確に解析することができる。未だかつて、集合論を使用して、生物学的機能（特に、生物学的機能のネットワーク）を解析した事例はなかった。従って、集合論を使用することで、生物学的実体におけるパラメータのネットワークの関係を正確に構築することが可能であるとの知見は、特筆すべき顕著な結果である。
【０３２９】
（実施例６：マイクロＲＮＡ）
次に、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする核酸分子を使用して、細胞のネットワークを作製した。ｍｉＲＮＡとして、ｍｉＲＮＡ−２３を使用した。上記の実施例と同様なプロトコールを使用した。
【０３３０】
マイクロＲＮＡは、１８塩基〜２５塩基の非翻訳性（非コード）ＲＮＡ（タンパク質に翻訳されない）であり、最初に線虫で見出され、その後、動植物において広範に保存されていることが明らかとなった。ｍｉＲＮＡが、線虫および植物における発生および分化に関与していることが報告されている。このことから、動物も同様なプロセスを有することが示唆されている。現在までに、２００種類以上のｍｉＲＮＡが報告されている。
【０３３１】
Ｈ．Ｋａｗａｓａｋｉ、Ｋ．Ｔａｉｒａ、Ｎａｔｕｒｅ  ４２３，８３８−８４２（２００３）は、ｍｉＲＮＡ−２３の標的がＨｅｓ１遺伝子（Ｈｅｓ１は、ニューロンへの幹細胞の分化を抑制するリプレッサー転写因子である）であることを報告した。ｍｉＲＮＡ−２３は、この遺伝子の翻訳終止コドンの近傍に存在し、不完全な相補的な塩基対合（７７％）を形成する。このような不完全な相補的な塩基対合は、ｍｉＲＮＡの機能に重要であり、実際に、合成ｍｉＲＮＡ−２３をＮＴ２ヒト胚性腫瘍細胞に導入した場合に、Ｈｅｓ１の発現を抑制し得ることが既に見出されている。この活性は、ｓｉＲＮＡなどを使用することによってノックアウトされ得る。
【０３３２】
上記の原理にしたがって、ｍｉＲＮＡを作製する。
【０３３３】
このようなシステムを使用して、ｍｉＲＮＡに関して上記で説明されたものと同様な様式で、集合論により解析し得ることが実証され得る。
【０３３４】
（実施例７：生体系−リボザイム）
次に、リボザイムを使用して、細胞のネットワークを作製した。薬学雑誌  １２３（５）  ３０５−３１３（２００３）に記載されるリボザイムを使用した。上記の実施例と同様なプロトコールを使用した。
【０３３５】
テトラヒメナのグループＩイントロンがＲＮＡ鎖の部位特異的な切断および結合反応を触媒することから、リボザイムが発見された。リボザイムとは、このような酵素活性を有するＲＮＡをいう。リボザイムの例としては、ハンマーヘッド型リボザイムおよびヘアピン型リボザイムなどが挙げられる。
【０３３６】
このようなシステムを使用して、ｍｉＲＮＡに関して上記で説明されたものと同様な様式で、集合論によって分析することができることが実証され得る。
【０３３７】
（実施例８：薬物スクリーニング）
次に、化合物ライブラリを使用して、薬物をスクリーニングする。疾患モデルの細胞（例えば、癌細胞、正常細胞および幹細胞）を、スクリーニングに用いる。１，０００種類の化合物を含むライブラリを摂動因子として使用する。パラメータ（例えば、転写因子、調節遺伝子、構造遺伝子、細胞マーカー、細胞表面マーカー、細胞の形状、細胞小器官の形状、細胞の運動性、酵素活性、代謝産物の濃度および細胞の構成要素の局在）が選択される。例示的なパラメータは、制癌剤および糖尿病に対する薬などである。
【０３３８】
これらのパラメータを、それぞれ適切な様式で測定し、それらについての情報を収集する。収集した情報を、上記の集合論に基づいて解析する。
【０３３９】
これらの結果を解析することにより、どの化合物が薬物の最有力候補になりそうかを明らかにし、それを薬物スクリーニングに使用することが可能になる。
【０３４０】
したがって、本発明は、新規の薬物を同定することにも有用である。
【０３４１】
（実施例９：バイオマーカーの同定）
本発明は、バイオマーカーの同定に使用することができる。一般に、バイオマーカーとは、生物学的な情報を定量化またはデジタル化する指標であり、そのようなものとしては、糖尿病のバイオマーカーとしての血中グルコースレベル、ＴＮＦαおよびＰＡＩ−１などが挙げられ、これらは徐々に臨床的に使用され始めている。生物学的な情報のデジタル化は、摂動因子が細胞に及ぼす影響、および種々の細胞（癌、正常細胞および幹細胞など）内の特徴的なネットワーク構造を特定することにおいて解釈され得る。
【０３４２】
この点に関して、ｓｉＲＮＡを薬物の発見のための標的として使用することができ、そして、同定されたｓｉＲＮＡは、薬物の開発に使用することができる。
【０３４３】
したがって、本実施例は、摂動因子（例えば、ｓｉＲＮＡなど）の機能レポーターとして種々のバイオマーカーを使用する。本実施例で同定された、特定の機能レポーターは、目的とする特定の細胞についてのバイオマーカーとして使用することができる。
【０３４４】
（実施例１０：有害な影響の分析および細胞機能の診断）
本発明を使用して、薬物の有害な影響を分析すること、および／または細胞もしくは他の生物学的実体を診断すること（感染症の診断が挙げられる）もできる。細胞パスウェイを解析することもできる。
【０３４５】
本実施例において、摂動因子によるネットワーク構造の変化は、カタログ形式で分類され、正常な細胞と異常な細胞とを見分けるための評価基準を提供する。さらに、細胞機能を特徴付けるネットワーク構造を取得することにより、細胞機能を評価する方法を実行することができる。
【０３４６】
例えば、種々の器官に由来する種々の細胞に薬物を投与した場合に、（薬物を投与していない）正常なネットワーク構造と比較することにより、影響（薬物が生物学的実体（例えば、細胞）に及ぼす有害な影響が挙げられる）の評価が可能である。さらに、ネットワークデータベース（ネットワーク構造のカタログおよび公知のデータベース（例えば、ＫＥＧＧシグナル伝達ゲートウェイ）の情報などが挙げられる）を使用して、細胞機能を特徴付けることもできる。細胞機能に影響を及ぼす摂動因子を、これらのデータベースにより作成したマップにマッピングすることにより、細胞機能を特徴付けるパスウェイの解析が可能となる。
【０３４７】
（実施例１１：化合物の生物学的評価）
摂動因子には、単一の標的を有するものに限らず、多くの標的を有するものも存在するので、薬物スクリーニングに使用される化合物および／またはｓｉＲＮＡを組み合わせて、生物学的影響が評価され得る。これらの化合物および／またはｓｉＲＮＡを使用する場合、これらの因子が複数のものを標的化し、ネットワークを構成する複数の機能に影響を及ぼすことを考慮しなければならない。本実施例により得られる、このようなネットワーク構造への影響はまた、化合物が生物学的実体に及ぼす影響を分析するのに有用である。
【０３４８】
（実施例１２：神経突起生成における、チロシンキナーゼの機能上の役割を分析する合理的アプローチ）
本実施例では、ヒト神経芽細胞腫であるＳＨＳＹ５Ｙを使用して、本発明の方法から得られた情報に基づき、ニューロン様細胞への分化を観察した。
【０３４９】
レチノイン酸の存在下で、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞はコリンアセチルトランスフェラーゼを発現し、その神経突起を伸長させる。ＮＧＦの存在下で、この細胞はチロシンヒドロキシラーゼを発現し、やはりその神経突起を伸長させる。
【０３５０】
したがって、細胞の事象へのシグナル伝達経路において、チロシンキナーゼは、「弁」として重要な役割を果たす。
【０３５１】
本実施例では、膨大な数のチロシンキナーゼの中でも、どのチロシンキナーゼがコリンアセチルトランスフェラーゼ誘導、チロシンヒドロキシラーゼ発現および神経突起伸長事象を引き起こすのかを研究する。
【０３５２】
（実験）
（材料と方法）
使用した細胞：ＳＨ−ＳＹ５Ｙ（ＡＴＣＣ  Ｎｏ：ＣＲＬ−２２６６）
使用した試薬：
レチノイン酸（オールトランス型、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｐｒｏｄ．Ｎｏ．Ｒ  ２６２５）
ＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ  ２．５Ｓ  ＃Ｎ−６００９）
イーグル最小必須培地、ウシ胎仔血清、グルタミンおよびペニシリン／ストレプトマイシンを、ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ，Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ，ＭＤから購入した。
【０３５３】
（細胞培養）
細胞培養
ヒト神経芽細胞腫（ＳＨＳＹ５Ｙ）細胞を、１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、２％（ｖ／ｖ）グルタミンおよび１％（ｖ／ｖ）ペニシリン／ストレプトマイシン（１０％  培地）を補充したイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ）（以後、増殖培地と呼ぶ）内で維持した。細胞を、３７°Ｃ、５％二酸化炭素の加湿雰囲気中でインキュベートした。
【０３５４】
（分化）
Ｙａｍａｄａ  Ｙ．ら、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．２００４  Ｊｕｎ  ２４；３６４（１）：１１−１５にしたがって、分化を実行した。簡潔に述べると、１００ｎｇ／ｍｌのＮＧＦまたは１０μｇのレチノイン酸を培養培地に添加し、ＳＨＳＹ５Ｙ細胞を分化させた。通常、レチノイン酸を添加すると、細胞は、図１３に例示されるコリン作用性のニューロン様細胞に分化する。ＮＧＦを添加すると、細胞は、図１３に例示されるドーパミン作用性のニューロン様細胞に分化する。
【０３５５】
（トランスフェクションマイクロアレイ）
トランスフェクションマイクロアレイ実験を、上記の実施例にしたがって実行した。
【０３５６】
（オンチップ画像に基づく、チロシンキナーゼに標的化するｓｉＲＮＡによる神経突起成長阻害の定量化）
種々の型のキナーゼを分析するために、チロシンキナーゼに特異的なｓｉＲＮＡを使用した。ｓｉＲＮＡを、上記の実施例にしたがって調製した。
【０３５７】
神経突起成長の測定は、Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｌｅｔｔ．２００５  Ａｐｒ  １１；３７８（１）：４０−３．Ｅｐｕｂ  ２００５  Ｊａｎ  ７にしたがう、画像に基づく神経突起成長の頻度の定量化によった。簡潔に述べると、このプロトコールは以下の通りである。
【０３５８】
ラット褐色細胞腫（ＰＣ１２）細胞（Ｔｉｓｃｈｌｅｒ，Ａ．Ｓ．およびＬ．Ａ．Ｇｒｅｅｎｅ．１９７５．Ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｃｕｌｔｕｒｅｄ  ｒａｔ  ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ｃｅｌｌｓ．Ｎａｔｕｒｅ  （Ｌｏｎｄ．）．２５８：３４１−３４２）を、１０％  熱失活させたウマ血清、５％  新生仔ウシ血清、グルタミン（２ｍＭ）およびペニシリン／ストレプトマイシン（１００Ｕ／ｍｌ）を補充した、４．５ｇ／ｌ  グルコース含有ＤＭＥ中で単層培養で増殖させ、１０継代未満のＰＣ１２細胞を使用した。ＰＣ１２細胞を、ＮＧＦにより「活性化（ｐｒｉｍｅｄ）」した（Ｇｒｅｅｎｅ，Ｌ．Ａ．１９７７．「Ａ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｂｉｏａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ（ＮＧＦ）ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ  ａ  ｃｌｏｎａｌ  ｐｈｅｏｃｈｒｏｍｏｃｙｔｏｍａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ．」Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．１３３：３５０−３５３；Ｇｒｅｅｎｅ，Ｌ．Ａ．、Ｄ．Ｅ．ＢｕｒｓｔｅｉｎおよびＭ．Ｍ．Ｂｌａｃｋ．１９８２．「Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｐｒｉｍｉｎｇ  ｉｎ  ｎｅｒｖｅ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｄ  ｎｅｕｒｅｉｔｅ  ｏｕｔｇｒｏｗｔｈ．」Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．９１：３０５−３１６に記載される）。増殖過程についての研究のために、ＮＧＦで活性化させたＰＣ１２細胞を継代し、これを小口径の９インチパスツールピペットに通して粉砕し、機械的にその神経突起を剥離させた。増殖培地で３回洗った後、５０ｎｇ／ｍｌ  ＮＧＦ含有増殖培地またはＮＧＦ非含有増殖培地により、細胞を１０５細胞／ｍｌの濃度に再懸濁し、この細胞懸濁物１００μｌを１ウェル（表面積０．２８ｃｍ２）ごとに添加した。
【０３５９】
固定後、神経フィラメント１００タンパク質に対するフルオレセイン標識抗体、またはチューブリンに対するＤＭ１Ａ抗体による染色（４時間）を行った。ＩＮ  Ｃｅｌｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  １０００（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｃｅｎｃｅｓ）を用い、プレートあたり３分で画像を取得した。
【０３６０】
（画像の取得）
１３９２×１０４０ピクセル、１２ビットの精度、４００ｍ秒の露光により画像を取得した。１枚の９６ウェルプレート全体の画像の取得に要する総時間（移動／焦点を合わせる／取得）は、約３分であった。蛍光外（ｅｐｉｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）（４×および１０×の対物レンズ）およびＤＩＣ（１０×）の両方の光学系を使用した。
【０３６１】
（手動のスコア付け）
熟達した技術者２人で、ＭＣＩＤＴＭ  Ｅｌｉｔｅ画像解析ソフトウェアを使用して神経突起および細胞本体を追跡した。最小の長さのパラメータと目視評価とを合わせ、神経突起を他の構造と見分けた。
【０３６２】
（自動のスコア付け）
分析の前に規定されたスコア付けパラメータ（神経突起の最小の幅および最大の幅、神経突起の最小の長さ、条件ごとの平均の細胞の大きさ）の設定を機械に入力した。この事前の規定の処理に要する時間は、約１時間であった。
【０３６３】
（結果）
結果を図１４に示す。図１４は、神経突起の全長／核の個数、対、チロシンキナーゼに標的化するｓｉＲＮＡ（８５種類）のグラフである。
【０３６４】
（神経突起生成における、チロシンキナーゼの機能上の役割を分析する合理的アプローチ）
神経突起生成における、チロシンキナーゼの機能上の役割を分析する合理的アプローチを図１５で概説する。図１５Ａ（左上）のように、レチノイン酸（ＲＡ）存在下で、ｓｉＲＮＡが神経突起伸長を阻害した集合（以後、ＲＡ集合）と、ＮＧＦ存在下で、ｓｉＲＮＡが神経突起伸長を阻害した集合（以後、ＮＧＦ集合）とは、別個に（独立して）存在し、それゆえ、コリンアセチルトランスフェラーゼ（コリン作用性のニューロン様細胞への分化）により誘発されるパスウェイと、チロシンヒドロキシラーゼ（ドーパミン作用性のニューロン様細胞への分化）により誘発されるパスウェイとは、互いに独立している。コリン作用性のニューロン様細胞を、抗コリンアセチルトランスフェラーゼ抗体を使用して、そしてドーパミン作用性のニューロン様細胞を、抗チロシンヒドロキシラーゼ抗体（両者の抗体はＣｌｏｎｔｅｃｈから市販されている）を使用して、それぞれ同定した。
【０３６５】
ＲＡ集合とＮＧＦ集合とが重複する元を有する場合、このパスウェイは、図１５Ｂのように解釈され、ＲＡのシグナルとＮＧＦシグナルとは、神経突起方向へ向かう同一のパスウェイに統合される。
【０３６６】
図１５Ｃに示すように、ＮＧＦ集合がＲＡ集合に包含される場合、ＮＧＦシグナル伝達（チロシンヒドロホスフェート（ｈｙｄｒｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ））が、ＲＡシグナル伝達（コリンアセチルトランスフェラーゼ）の上流に位置し、最終的に神経突起成長に至ると解釈される。
【０３６７】
図１５Ｄに示すように、ＲＡ集合がＮＧＦ集合に包含される場合、ＲＡシグナル伝達（コリンアセチルトランスフェラーゼ）が、ＮＧＦシグナル伝達（チロシンヒドロホスフェート）の上流に位置し、最終的に神経突起成長に至ると解釈される。
【０３６８】
上記の分析を実行することにより、細胞ベースのｓｉＲＮＡアッセイの包括的なデータから得た合理的な関係により多くのキナーゼを明らかにした（図１６）。図１６は、ＦＧＦＲ１、ＦＧＦＲ２およびＫＤＲに対するｓｉＲＮＡが、ＲＡの存在下では神経突起伸長を阻害したが、ＮＧＦの存在下では阻害しなかったことを示す。ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＮＴＲＫ２、ＰＤＧＦＲＡおよびＩＮＳＲは、ＮＧＦの存在下では神経突起伸長を阻害したが、ＲＡの存在下では阻害しなかった。さらに、ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ２、ＫＩＴおよびＲＥＴに対するｓｉＲＮＡは、ＲＡおよびＮＧＦのどちらの存在下においても神経突起伸長を阻害した。
【０３６９】
（ＲＴＫタンパク質のノックダウン）
チロシンキナーゼの機能をさらに分析するために、チロシンキナーゼに対する種々のｓｉＲＮＡを使用してノックダウン実験を実施した。上記のプロトコールまたは当該分野の一般知識にしたがって、ｓｉＲＮＡを設計した。図１７は、ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ、ＥＰＨＡ２−ｓｉＲＮＡ、ＥＰＨＡ３−ｓｉＲＮＡ、＃０７５−ｓｉＲＮＡ、ＫＩＴ−ｓｉＲＮＡ、＃０５４−ｓｉＲＮＡ、ＲＥＴ−ｓｉＲＮＡおよび＃００６−ｓｉＲＮＡの結果を示す。ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、＃０７５、ＫＩＴ、＃０５４、ＲＥＴおよび＃００６の完全なヌクレオチド配列を、配列表に示す（それぞれ配列番号７８、配列番号８０、配列番号８２、配列番号８４、配列番号８６、配列番号８８、配列番号９０および配列番号９２）。ＥＧＦＲ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３、＃０７５、ＫＩＴ、＃０５４、ＲＥＴおよび＃００６の完全なアミノ酸配列を、配列表（それぞれ配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１および配列番号９３）に示す。
【０３７０】
レセプター型チロシンキナーゼの特異的なリガンドの存在下での神経突起伸長も調べた。特異的な因子を含まないＦＢＳをコントロールとして用い、ＲＡ−ＦＢＳ、ＮＧＦ、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＢＤＮＦ、ＰＤＧＦ、インシュリン、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥｐｈｒｉｎＡ３、ＧＤＮＦおよびＮｅｕｒｔｕｒｉｎを調べた。図１８は、各々の因子に曝露した場合の、神経突起を保持する細胞のパーセンテージを示す。ＲＡの部分集合は、ＫＤＲ、ＦＧＦＲ１およびＦＧＦＲ２を包含し、これらはそれぞれ、リガンドであるＶＥＧＦ、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２に対応するレセプターである。ＮＧＦの部分集合は、ＥＰＨＢ１、ＥＰＨＢ２、ＥＰＨＢ３、ＮＴＲＫ２、ＰＤＦＧＲＡおよびＩＮＳＲを包含し、これらはそれぞれ、リガンドであるＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＥｐｈｒｉｎＢ２、ＢＤＮＦ、ＰＤＧＦおよびインシュリンに対応するレセプターである。ＲＡの部分集合とＮＧＦの部分集合との共通部分の部分集合は、ＥＧＦＲ、ＫＩＴ、ＥＰＨＡ２、ＥＰＨＡ３およびＲＥＴを包含し、これらはそれぞれ、リガンドであるＥＧＦ、ＳＣＦ、ＥｐｈｅｒｉｎＡ３、ＥＰｈｒｉｎＡ３およびＧＦＮＦ／Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎに対応するレセプターである。
【０３７１】
次に、レセプター型チロシンキナーゼに対する各々のリガンドの存在下での、マーカー酵素の発現を研究した。まず、ＣｈＡＴ、ＴＨおよびβ−アクチン（コントロール）により亢進された、各々のリガンドの発現を調べた。各々のリガンドの発現の強度をまず示し（ウェットのデータ；図１９、上部のパネル）、相対的な発現レベルでも示す（図１９、下部パネル）。示すように、ＲＡとＶＥＧＦ、ＦＧＦ１およびＦＧＦ２とは強く相関し、これらのリガンドがコリン作用性であることを示す一方で、ＮＧＦとＮＧＦ、Ｅｐｈｒｉｎ  Ｂ２、ＢＤＮＦ、ＰＤＧＦ、インシュリンおよびＥｐｈｅｒｉｎ  Ａ３とは強く相関し、これらのリガンドがドーパミン作用性であることを示す。
【０３７２】
まとめると、図２０（合理的な関係と生物学的な結果との比較）に示すように、本発明の集合論による分析に基づいて、種々のキナーゼを生物学的な有意性の部分集合に分類する。具体的には、ＦＧＦＲ１とＦＧＦＲ２とは、統合される前のＲＡシグナル伝達経路の上流に位置するものに分類され、ＥＰＨＢ１とＥＰＨＢ２とＥＰＨＢ３とＮＴＲＫ２とＰＤＧＦＲＡとＩＮＳＲとは、ＮＧＦシグナル伝達経路の上流に位置するものに分類される。ＥＧＦＲとＫＩＴとＲＥＴとは、統合された後でかつ神経突起伸長を促進する前の経路の下流に位置するものに分類される。
【０３７３】
本発明の特定の好ましい実施形態を説明してきたが、上記に添付された特許請求の範囲を除いて、このような実施形態により、本発明の範囲は限定されない。本明細書の記述を読むことにより、本発明の範囲および意図から逸脱することなく、種々のほかの改変および等価物が当業者に明らかになり、かつ容易に作製され得る。本明細書に引用された全ての特許、公開特許出願および刊行物は、あたかもその全体が示されるように、参考として援用される。
【産業上の利用可能性】
【０３７４】
本発明により、驚くほど少ない因子を観察することによって、細胞の状態を判定することが可能になった。このような判定により、診断、予防、治療に応用することが可能となり、その応用範囲は医療のみならず、食品工学、化粧品工学、農業工学、環境工学など種々の分野に及ぶ。
【図面の簡単な説明】
【０３７５】
【図１】図１は、本発明の一実施形態にしたがう分析の模式図を示す。ＡとＢとは、生物学的実体（例えば、細胞）の機能を反映する機能レポーター（集合）をいう。使用される摂動因子は、集合Ａ内に位置するか、集合Ｂ内に位置するか、集合Ａと集合Ｂとの共通部分内に位置するか、集合Ａまたは集合Ｂの外側に位置する。ｉ）は、機能Ａ（集合Ａ）と機能Ｂ（集合Ｂ）とに対する摂動因子が存在しない場合を示す。ｉ）では、機能Ａと機能Ｂとは異なる摂動因子下にある。ｉｉ）は、機能Ａと機能Ｂとに対する摂動因子が存在する場合を示し、この場合において、機能Ｂに包含されるべき全ての摂動因子はまた、機能Ａにも包含される。ｉｉ）において、機能Ｂは、機能Ａの下流に位置する。ｉｉｉ）は、共通の摂動因子が存在する場合を示すが、そのうちのあるものは機能Ａにのみ包含され、あるものは機能Ｂにのみ包含される。ｉｉｉ）では、機能Ａと機能Ｂとは、共通の摂動因子の下に並行して位置する。ｉｖ）とｖ）とは、３種類の機能が関与する場合を示す。これらは、２種類の機能の場合と同様な様式で説明され得る。原理的には、２種類の機能の全ての機能を統合することにより、全ての機能についての全体的なネットワークを作製する。
【図２】図２では、ＲＮＡｉおよび機能レポーターを用いてパスウェイ解析がなされる本発明の例示的なスキームを示す。ＲＮＡｉライブラリ（ｓｉＲＮＡライブラリ）を使用して、細胞機能に対する阻害効果（例えば、代謝産物、遺伝子発現レベルなどの変化）を測定する。機能Ａ、ＢおよびＣは、特定の機能に影響を及ぼす摂動因子（ｓｉＲＮＡ）を包含する。
【図３】図３は、図２のスキームの解析結果を示す。１種類のＲＮＡｉにより阻害される共通の遺伝子および共通して阻害されない遺伝子を同定することにより、特定の機能に特異的な遺伝子（例えば、「Ａ」特異的遺伝子など）を同定することができる。このようなＲＮＡｉ阻害実験の結果から、細胞内パスウェイ構造が計算される。
【図４】図４は、細胞パスウェイ解析用のトランスフェクションデバイスを使用する、本発明の一実施形態である。左上のパネルは、本発明で代表的に使用されるチップ型デバイスの一覧を示す。左下では、ＲＮＡｉおよび機能レポーターを使用して、どのようにしてネットワーク（例えば、生物学的実体のパスウェイ）を解析するかを示す。
【図５】図５は、生物学的実体としてＨｅＬａ細胞を使用する一実施例における、摂動因子の結果を表すグラフである。Ｙ軸は発現レベルを示し、本実施例では閾値を８０％に設定する。Ｘ軸上の矢印は、使用した機能レポーター（例えば、ＣＲＥ、ＡＰ１、ＧＲＥ、ＩＳＲＥ、Ｍｙｃ、ＲＡＲＥおよびアクチン）に反映される機能を示す。
【図６】図６は、ＨｅＬａ細胞の転写ネットワーク解析の結果およびその確証を示す。全体的なネットワークを、この解析で使用した転写因子（遺伝子）により示す。下向きの矢印は、ＣＲＥ特異的なｓｉＲＮＡによりＣＲＥが阻害される場合にダウンレギュレートされる遺伝子を示す。
【図７】図７は、生物学的実体としてＨｅｐＧ２細胞を使用する一実施例における、摂動因子に関する結果を表すグラフである。Ｙ軸は発現レベルを示し、本実施例では閾値を８０％に設定する。Ｘ軸上の矢印は、使用した機能レポーター（例えば、ＣＲＥ、ＩＳＲＥ、Ｍｙｃ、ＳＲＥおよびＲＡＲＥ）に反映される機能を示す。
【図８】図８は、ＨｅｐＧ２細胞の転写ネットワーク解析の結果およびその確証を示す。全体的なネットワークを、この解析で使用した転写因子（遺伝子）により示す。下向きの矢印は、ＣＲＥ特異的なｓｉＲＮＡによりＣＲＥが阻害される場合にダウンレギュレートされる遺伝子を示す。
【図９】図９は、本発明の例示的な実施形態についての模式的なフローチャートを示す。このフローチャートは、コンピューター上で実行され得る。
【図１０】図１０は、本発明の例示的なコンピュータシステムである。
【図１１】図１１は、機能レポーターとｓｉＲＮＡとの組み合わせ行列の例である。
【図１２】図１２は、ＨｅＬａアレイを走査した画像（１６ビット  ＴＩＦＦ画像）である。各々の混合溶液を、下部パネルのようにプリントし、細胞の播種後、アレイスキャナーを使用して、画像を得た（上部のパネルを参照のこと）。
【図１３】図１３は、ヒト神経芽細胞腫ＳＨＳＹ５Ｙの神経突起生成を示す。ＳＨ−ＳＹ５Ｙを培養し、これらにＲＡを添加すると、コリン作用性のニューロン様細胞に分化し、ＮＧＦを添加すると、ドーパミン作用性のニューロン様細胞に分化した。この実験では、１５１２個のスポット／ｓｉＲＮＡのチップを研究した。
【図１４】図１４は、神経突起の全長／核の個数、対、チロシンキナーゼに標的化するｓｉＲＮＡ（８５種類）のグラフである。
【図１５】図１５は、神経突起生成におけるチロシンキナーゼの機能上の役割を解析する合理的アプローチの概要である。図１５Ａ（左上）のように、レチノイン酸（ＲＡ）存在下で、ｓｉＲＮＡが神経突起伸長を阻害した集合（以後、ＲＡ集合）と、ＮＧＦ存在下で、ｓｉＲＮＡが神経突起伸長を阻害した集合（以後、ＮＧＦ集合）とは、別個に（独立して）存在する。図１５Ｂは（右上）、ＲＡ集合とＮＧＦ集合とが重複する元を有する場合を示す。図１５Ｃ（左下）は、ＮＧＦ集合がＲＡ集合に包含される場合を示す。図１５Ｄ（左下）は、ＲＡ集合がＮＧＦ集合に包含される場合を示す。
【図１６】図１６は、細胞ベースのｓｉＲＮＡアッセイの包括的なデータから得た合理的な関係により多くのキナーゼを明らかにしたことを示す。
【図１７】図１７は、ＥＧＦＲ−ｓｉＲＮＡ、ＥＰＨＡ２−ｓｉＲＮＡ、ＥＰＨＡ３−ｓｉＲＮＡ、＃０７５−ｓｉＲＮＡ、ＫＩＴ−ｓｉＲＮＡ、＃０５４−ｓｉＲＮＡ、ＲＥＴ−ｓｉＲＮＡおよび＃００６−ｓｉＲＮＡの結果を示す。
【図１８】図１８は、各々の因子に曝露した場合の、神経突起を保持する細胞のパーセンテージを示す。
【図１９】図１９は、レセプター型チロシンキナーゼに対する各々のリガンドの存在下での、マーカー酵素の発現を示す。
【図２０】図２０は、合理的な関係と生物学的な結果との比較である。
【配列表フリーテキスト】
【０３７６】
（配列表の説明）
配列番号１は、ｃ−Ｍｙｃのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｖ００５６８）を示す。
【０３７７】
配列番号２は、ｃ−Ｍｙｃのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｖ００５６８）を示す。
【０３７８】
配列番号３は、ｃ−Ｆｏｓのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｋ００６５０）を示す。
【０３７９】
配列番号４は、ｃ−Ｆｏｓのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｋ００６５０）を示す。
【０３８０】
配列番号５は、ｃ−Ｊｕｎのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｊ０４１１１）を示す。
【０３８１】
配列番号６は、ｃ−Ｊｕｎのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｊ０４１１１）を示す。
【０３８２】
配列番号７は、ＣＲＥＢのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ２７６９１）を示す。
【０３８３】
配列番号８は、ＣＲＥＢのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ２７６９１）を示す。
【０３８４】
配列番号９は、Ｅ２Ｆのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ９６５７７）を示す。
【０３８５】
配列番号１０は、Ｅ２Ｆのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ９６５７７）を示す。
【０３８６】
配列番号１１は、ＥＲのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ１２６７４）を示す。
【０３８７】
配列番号１２は、ＥＲのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ１２６７４）を示す。
【０３８８】
配列番号１３は、ＧＲのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ１０９０１）を示す。
【０３８９】
配列番号１４は、ＧＲのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ１０９０１）を示す。
【０３９０】
配列番号１５は、ＨＳＦ−１のヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：ＮＭ＿００５５２６）を示す。
【０３９１】
配列番号１６は、ＨＳＦ−１のアミノ酸配列（遺伝子登録番号：ＮＭ＿００５５２６）を示す。
【０３９２】
配列番号１７は、ＨＳＦ−２のヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ６５２１７）を示す。
【０３９３】
配列番号１８は、ＨＳＦ−２のアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ６５２１７）を示す。
【０３９４】
配列番号１９は、ＨＳＦ−４のヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｄ８７６７３）を示す。
【０３９５】
配列番号２０は、ＨＳＦ−４のアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｄ８７６７３）を示す。
【０３９６】
配列番号２１は、ＩｋＢａのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ６９０４３）を示す。
【０３９７】
配列番号２２は、ＩｋＢａのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ６９０４３）を示す。
【０３９８】
配列番号２３は、ＮＦＡＴ３のヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｌ４１０６６）を示す。
【０３９９】
配列番号２４は、ＮＦＡＴ３のアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｌ４１０６６）を示す。
【０４００】
配列番号２５は、ＮＦｋＢのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｓ７６６３８）を示す。
【０４０１】
配列番号２６は、ＮＦｋＢのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｓ７６６３８）を示す。
【０４０２】
配列番号２７は、ＲＡＲＡのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：ＮＭ＿０００９６４）を示す。
【０４０３】
配列番号２８は、ＲＡＲＡのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：ＮＭ＿０００９６４）を示す。
【０４０４】
配列番号２９は、ＲＡＲＡのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：ＮＭ＿０００９６５）を示す。
【０４０５】
配列番号３０は、ＲＡＲＡのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：ＮＭ＿０００９６５）を示す。
【０４０６】
配列番号３１は、ＲＡＲＢ１のヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：ＮＭ＿０１６１５２）を示す。
【０４０７】
配列番号３２は、ＲＡＲＢ１のアミノ酸配列（遺伝子登録番号：ＮＭ＿０１６１５２）を示す。
【０４０８】
配列番号３３は、ＲＡＲＢ２のヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ５７７０７）を示す。
【０４０９】
配列番号３４は、ＲＡＲＢ２のアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ５７７０７）を示す。
【０４１０】
配列番号３５は、ＲＡＲＧのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ１５４００）を示す。
【０４１１】
配列番号３６は、ＲＡＲＧのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ１５４００）を示す。
【０４１２】
配列番号３７は、Ｒｂのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｊ０３１６１）を示す。
【０４１３】
配列番号３８は、Ｒｂのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｊ０３１６１）を示す。
【０４１４】
配列番号３９は、ＳＲＦのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ９７９３５）を示す。
【０４１５】
配列番号４０は、ＳＲＦのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ９７９３５）を示す。
【０４１６】
配列番号４１は、ＳＴＡＴ１ａのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ９７９３６）を示す。
【０４１７】
配列番号４２は、ＳＴＡＴ１ａのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ９７９３６）を示す。
【０４１８】
配列番号４３は、ＳＴＡＴ１ｂのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｍ９７９３４）を示す。
【０４１９】
配列番号４４は、ＳＴＡＴ１ｂのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｍ９７９３４）を示す。
【０４２０】
配列番号４５は、ＳＴＡＴ２のヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｌ２９２７７）を示す。
【０４２１】
配列番号４６は、ＳＴＡＴ２のアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｌ２９２７７）を示す。
【０４２２】
配列番号４７は、ＳＴＡＴ３のヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：Ｙ００４７９）を示す。
【０４２３】
配列番号４８は、ＳＴＡＴ３のアミノ酸配列（遺伝子登録番号：Ｙ００４７９）を示す。
【０４２４】
配列番号４９は、Ｐ５３のヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：ＡＦ３０７８５１）を示す。
【０４２５】
配列番号５０は、Ｓｃｒａｍｂｌｅのアミノ酸配列（遺伝子登録番号：ＡＦ３０７８５１）を示す。
【０４２６】
配列番号５１は、フィブロネクチンのヌクレオチド配列を示す。
【０４２７】
配列番号５２は、フィブロネクチンのアミノ酸配列を示す。
【０４２８】
配列番号５３は、ｃ−Ｆｏｓ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４２９】
配列番号５４は、ｃ−Ｊｕｎ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４３０】
配列番号５５は、ＣＲＥＢ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４３１】
配列番号５６は、Ｅ２Ｆ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４３２】
配列番号５７は、ＥＲ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４３３】
配列番号５８は、ＧＲ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４３４】
配列番号５９は、ＨＳＦ−１  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４３５】
配列番号６０は、ＨＳＦ−２  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４３６】
配列番号６１は、ＨＳＦ−４  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４３７】
配列番号６２は、ＩｋＢａ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４３８】
配列番号６３は、ＮＦＡＴ３  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４３９】
配列番号６４は、ＮＦｋＢ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４４０】
配列番号６５は、ＲＡＲＡ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４４１】
配列番号６６は、ＲＡＲＢ１  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４４２】
配列番号６７は、ＲＡＲＢ２  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４４３】
配列番号６８は、ＲＡＲＧ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４４４】
配列番号６９は、Ｒｂ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４４５】
配列番号７０は、ＳＲＦ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４４６】
配列番号７１は、ＳＴＡＴ１ａ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４４７】
配列番号７２は、ＳＴＡＴ１ｂ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４４８】
配列番号７３は、ＳＴＡＴ２  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４４９】
配列番号７４は、ＳＴＡＴ３  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４５０】
配列番号７５は、ＴＲ  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４５１】
配列番号７６は、ｐ５３  ｓｉＲＮＡのヌクレオチド配列を示す。
【０４５２】
配列番号７７は、ｓｃｒａｍｂｌｅ  ＩＩ  Ｄｕｐｌｅｘのヌクレオチド配列（遺伝子登録番号：ＡＦ３０７８５１）を示す。
【０４５３】
配列番号７８は、キナーゼＥＧＦＲのヌクレオチド配列を示す。
【０４５４】
配列番号７９は、キナーゼＥＧＦＲのアミノ酸配列を示す。
【０４５５】
配列番号８０は、キナーゼＥＰＨＡ２のヌクレオチド配列を示す。
【０４５６】
配列番号８１は、キナーゼＥＰＨＡ２のアミノ酸配列を示す。
【０４５７】
配列番号８２は、キナーゼＥＰＨＡ３のヌクレオチド配列を示す。
【０４５８】
配列番号８３は、キナーゼＥＰＨＡ３のアミノ酸配列を示す。
【０４５９】
配列番号８４は、キナーゼ＃０７５のヌクレオチド配列を示す。
【０４６０】
配列番号８５は、キナーゼ＃０７５のアミノ酸配列を示す。
【０４６１】
配列番号８６は、キナーゼＫＩＴのヌクレオチド配列を示す。
【０４６２】
配列番号８７は、キナーゼＫＩＴのアミノ酸配列を示す。
【０４６３】
配列番号８８は、キナーゼ＃０５４のヌクレオチド配列を示す。
【０４６４】
配列番号８９は、キナーゼ＃０５４のアミノ酸配列を示す。
【０４６５】
配列番号９０は、キナーゼＲＥＴのヌクレオチド配列を示す。
【０４６６】
配列番号９１は、キナーゼＲＥＴのアミノ酸配列を示す。
【０４６７】
配列番号９２は、キナーゼ＃００６のヌクレオチド配列を示す。
【０４６８】
配列番号９３は、キナーゼ＃００６のアミノ酸配列を示す。
【図７】
2008518319.tif 000028
【図１０】
2008518319.tif 000029
【図１２】
2008518319.tif 000030
【図１】
2008518319.tif 000031
【図２】
2008518319.tif 000032
【図３】
2008518319.tif 000033
【図４】
2008518319.tif 000034
【図５】
2008518319.tif 000035
【図６】
2008518319.tif 000036
【図８】
2008518319.tif 000037
【図９】
2008518319.tif 000038
【図１１】
2008518319.tif 000039
【図１３】
2008518319.tif 000040
【図１４】
2008518319.tif 000041
【図１５】
2008518319.tif 000042
【図１６】
2008518319.tif 000043
【図１７】
2008518319.tif 000044
【図１８】
2008518319.tif 000045
【図１９】
2008518319.tif 000046
【図２０】
2008518319.tif 000047
【配列表】
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