(57)【要約】  本発明は、マイクロアレイ上で特異的プローブとハイブリッド形成したゲノム標的の直接検出のための新規、高感度かつ迅速な電子式検出方法を提案する。この方法は、マイクロ電極アレイでの特定の電極部位へのＤＮＡ標的の高速電子的蓄積、標的ＤＮＡへのオリゴヌクレオチド標識金属（ナノ）粒子の連続的電気ハイブリッド形成および電極部位での電気化学ＡＣインピーダンス変化のモニタリングからなる。この方法は、金属化テンプレートとして働くＤＮＡ標的上および迅速電気めっきのシードを提供する粒子上に電気めっきすることによって促進される。ＡＣインピーダンス変化はＤＮＡ標的上およびアレイ電極部位間を電気めっきしている間モニターする。標的ＤＮＡの存在下または不存在下での信号は、アレイ電極間の「無接続」と「短絡」との違いである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ハイブリッド形成した標的の電子検出方法であって、
２以上のマイクロアレイ位置に関連付けられた特定のプローブを有する電子式マイクロアレイを準備し、
前記マイクロアレイにて特定の電極部位に前記標的を電子的に蓄積し、
オリゴヌクレオチド標識導電性粒子を前記標的上に連続して電子的ハイブリッド形成し、ついで、
前記電極部位にて電気化学的ＡＣインピーダンス変化をモニターするステップを含む方法。
【請求項２】
前記標的がゲノム標的である請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ゲノム標的が核酸である請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記核酸がＤＮＡである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記核酸がＲＮＡである請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記粒子がナノ粒子である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ標的全体に電気めっきを行うステップをさらに含む請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記標的が金属化テンプレートとして機能する請求項４に記載の方法。
【請求項９】
前記導電性粒子が金属粒子である請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記金属粒子が金である請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記金属粒子が銀である請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記金属粒子がパラジウムである請求項９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００４年５月２８日に出願され、「ナノスケール電子式検出システム(Nanoscale Electronic Detection System)」と題され、出典明示によって本願明細書の一部とみなされる米国仮出願第６０／５７５,４４５号を基礎とする優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、マイクロスケールおよびナノスケール電子式システムおよびその製造方法に関する。より詳しくは、本発明の装置および方法は、検出器、特に、単一配列検出システムに関する。
【背景技術】
【０００３】
ヒトゲノムの配列決定は、ＤＮＡ構造、遺伝子機能、標的治療薬の薬効およびその発現と、様々な遺伝的および感染病の発症との間の相関を理解する上の新たな知見をもたらした。ＤＮＡに基づく分子診断は、数例を挙げると、がん、ＨＩＶ、嚢胞性線維症、心臓および肺病、新興感染症を含む多数の危険な病気のメカニズムおよび進行を明らかにした。迅速かつ高感度ＤＮＡ解析が必要とされるいくつかの例、例えば、感染症および生物剤検出があるが、より高速かつより高感度のＤＮＡ検出法が人類の健康における全ての分野で有益である。近年のバイオテロの脅威の攻撃ならびに新興感染症の出現が、さまざまな医学または環境サンプル中の病原の検出および同定のための新規で、より高感度、単純かつ迅速なポイント・オブ・ユースまたはポイント・オブ・ケア装置 (point-of-use or point-of-care equipment) の急速な開発を促した。現在、一般の肺感染症と新興感染症病原とを識別して、救急処置室または診療所で迅速なスクリーニングを提供するプラットフォームは存在しない。ＤＮＡマイクロアレイプラットフォームが多数の特徴的遺伝子の高度多重認識を可能にする。
【０００４】
しかしながら、制限されたサンプル量の少数の病原またはがん細胞を検出するのに感度が不足することがよくある。ＤＮＡベース技術は、未だに、ＤＮＡ濃度を上げるためのＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応増幅）または同様の分子増幅技術に頼っている。これらの技術は時間を浪費し、満足する増幅を達成するまで、普通、３０分から２時間かかる。冗長な分子増幅を必要とせず、特定のＤＮＡ配列を直接検出できる新規ＤＮＡ技術が緊急に必要である。天然ＤＮＡハイブリッド形成プロセスは、なんらかの特異性を示すが、ほとんどのＤＮＡマイクロアレイ技術は、マイクロアレイチップ上での受動拡散および標的ＤＮＡのプローブへのハイブリッド形成に頼り、普通、完了までに数時間かかる。電子式マイクロアレイ技術（参考文献１−８（例えば、www.nanogen.com）を参照）は、チップ上の特定場所へのＤＮＡ配列の高速輸送（１分未満）を提供する。検出は蛍光発色団レポーターおよびレーザベースの蛍光検出（参考文献９−１４を参照）により達成される。この技術は、時間を浪費するＰＣＲまたはストランド・ディスプレイスメント増幅（ＳＤＡ）ＤＮＡを標的サンプルとして用いるので、これらの方法は、所望する全分析時間が２０分以内である緊急状況下に適していない。
【０００５】
ＤＮＡマイクロアレイ技術は、多数のアレイスポットを多重検出するという固有の可能性のため、親子鑑定のための単一ヌクレオチド多型性（ＳＮＰ）、短縦列反復（ＳＴＲ）のＤＮＡベース解析のためまたはウイルスおよび病原の検出のための他の方法と比較して決定的な利点を有する。近年、病原またはウイルスの検出のための数々の方法が開発されたが（参考文献１５−１９を参照）、現場での実用的ポータブルシステムとしての使用における主たる欠点は、高度多重検出の要求を満たさないことである。頻繁な検出限界、重量限界または精度、あるいは器具の操作に精通した者の必要性のため、それらの器具は所望の仕様に適合しない。ＤＮＡベース分子診断のための病院または臨床研究所用のポータブル器具は、軽量（約２０〜３０ポンド未満）であり、一組の遺伝子、特定ＳＮＰまたは病原の特徴（２０から１００までの特徴的遺伝子のパネルが所望される）を０．５ないし１時間未満の分析時間およびほんの数コピーＤＮＡまたは１０−１００ｃｆｕ／ｍＬに近い検出限界で特異的に検出できなければならない。
【０００６】
ここ１０年間、マイクロアレイの開発は、タンパク質およびＤＮＡ解析の分析可能性を大いに拡張した（参考文献２０を参照）。いまや、多くの新規技術により、本発明者らは、マイクロリッターの体積中の数千のＤＮＡ配列をピコモラーの感度で同時解析できる。例えば、AffymetrixのGeneChipTM（参考文献２１−２３を参照）、Nanosphereの金ナノ粒子テクノロジー（参考文献２４を参照）および Nanogenの電気活性NanochipRテクノロジー（参考文献２５を参照）がある。遺伝子発現解析（参考文献２６を参照）、法医学（参考文献２７を参照）、ＳＮＰ（参考文献２８を参照）解析のためのアッセイおよび他の新規アッセイフォーマットの宿主が開発されている。
【０００７】
今日、主に、生物兵器または病原の検出のごとき緊急適用のための競合ＤＮＡベースポータブルシステムが開発されている。これらは、微生物のオンチップ溶解、ポリメラーゼ連鎖反応による特徴的ＤＮＡの増幅およびＤＮＡの蛍光検出を統合できるIdaho TechnologyのRuggedized Advanced Pathogen Identification Device (R.A.P.I.D System)およびRapid Cycler systems（参考文献２９）、LLNLで開発されたAutonomous Pathogen Detection System (APDS)（参考文献３０−３１）およびCepheidのSmart Cycler system（参考文献３２−３４）を含む。これらのシステムの多くが、より少ない剤の検出に対する明快な解法を提供するが、多数の剤または遺伝子を検出すべき場合、設置された光学チャネル数がその適用を制限する。それらの技術と比較して、マイクロアレイプラットフォームは、現実的に、多数の病原の多重検出ならびに複数遺伝子によるキャラクタリゼーションに制限を置かない。今日、ポータブルなポイント・オブ・ケアマイクロアレイベースＤＮＡ解析システムは商業的使用のために開発されていない。
【０００８】
近年、NanochipR microarray technologyがポータブル電子式マイクロアレイシステムを開発し、それは、４００箇所の電極アレイを内蔵し、指定ＤＮＡ標的の検出のために蛍光ベース検出を用いる。第ＩＩおよびＶ因子のためのアッセイ、ミトコンドリアＤＮＡに基づく親子鑑定のためのＳＮＰ、ならびに新興感染症および生物兵器病原のためのアッセイが開発された。
【０００９】
上記技術の全てがＰＣＲまたは同様の分子増幅技術を用いてサンプル中のＤＮＡ標的を増幅する。この提案が、サンプル中のＤＮＡ濃度を増幅するためのＰＣＲまたは他の長期増幅法を必要としない新たな直接電子式ＤＮＡ検出技術の開発を開始させる。この方法は、高感度および特定のセットの標的遺伝子に特異的な極迅速ＤＮＡ解析用の新規マイクロアレイベースプラットフォームを提供する。エレクトロニクスベース検出技術は小型、ポータブル、手持ち可能マイクロアレイ器具を可能とし、敏感なレーザー、レンズその他の光学部品からなるより複雑かつ場に影響される光学検出システムを必要としない。
【００１０】
裸のＤＮＡの固有導電率は非常に低くて、分子ワイヤーとして用いたり、２つの電極センサー間の単純な導電率測定によってその存在を直接測定したりすることはできない（参考文献３５−３６を参照）。電極間または基板上の所望の位置での極少数の標的ＤＮＡ分子の局在化および結合は非常に遅い。なぜならば、このステップは遅い拡散プロセスによって制御されるからである。ある濃度の分析物がほんのわずかな分子のＤＮＡであれば、ＤＮＡを捕捉する受動的プロセスは非常に低い統計学的確率を有する。ここで提案する技術は、ＤＮＡ標的の電極アレイ部位への指向性高速電気泳動輸送によって、これらの課題を容易に克服する。
【００１１】
いくつかの異なるＤＮＡ金属化技術が報告され（参考文献３７を参照）、銀（参考文献３８を参照）、パラジウム（参考文献３９を参照）、およびプラチナ（参考文献４０を参照）を含む様々な金属が用いられる。一般に、それらの方法は無電解めっき法に基づき、それは普通ツーステップからなる。まず、金属クラスターをＤＮＡ上に形成し、ついで、ＤＮＡ分子の連続的金属化が得られるまで次の金属還元プロセスで、それを選択的金属堆積の核形成部位として用いる。金属核形成中心の形成は、金属のイオンまたは錯体がＤＮＡに結合し、金属クラスターを形成するための次なる還元に頼るか、または、小さな金属粒子のＤＮＡへの結合に頼る。これらの金属化技術にはいくつかの欠点がある。第１に、これらの金属化プロセスは、特に、ＤＮＡの粒子結合に基づく場合、非常に遅い。それらはＤＮＡの足場全体に均一であり、かくして、非特異的であり、ＤＮＡが存在しない場所にて基質上に金属イオンまたは金属粒子の高度に非特異的堆積をもたらし、高レベルの偽陽性信号を発する。より重要なことは、無電解めっき法はＤＮＡの認識特性を損ない、かくして、ハイブリッド形成によるいかなる次のレポーター結合ステップをも妨害することである。分子リソグラフィーベースの方法が、最近開発され、それはある程度ＤＮＡ分子の特異的配列を金属化プロセスから保護する（参考文献４１を参照）。この方法は、ＤＮＡへの局所的還元剤として働くグルタルアルデヒドでの配列特異的誘導化によるＤＮＡ分子の金属化を要件とする。ついで、銀イオンをアルデヒド誘導領域におけるＤＮＡ結合アルデヒド基によって特異的還元して、ＤＮＡに沿った銀クラスター鎖を形成する。無電解金堆積プロセス（参考文献４２を参照）は、銀クラスターによって触媒され、ついで、連続ＤＮＡテンプレート金金属化を発生させるために用いられる。このプロセスは、新たに調製することが必要ないくつかの試薬を要する多数のやっかいなステップからなる。
【００１２】
J. Wangによる最近のレビュー記事（参考文献４３を参照）は、ＤＮＡテンプレート金属化用の検出技術をまとめている。彼のグループは、堆積銀イオンが還元され、引き続いて溶解される電気化学ベースの技術を開発した。ついで、銀イオン濃度をアノードストリッピングボルタンメトリー(ASV)を用いて決定する。この技術は銀イオンの測定に高感度であるが、高度に偽陽性結果となりやすい。なぜならば、基質に吸着され、かつ、ＤＮＡ分子上にない単一の銀粒子が高い銀イオンＡＳＶ信号を生じるからである。Mirkinのグループは、ナノ粒子ＤＮＡアッセンブリーをナノファブリケーションおよびセンサーアプリケーションに適用する革新をリードするグループの一つである（参考文献４４−４７を参照）。彼らは、オリゴヌクレオチド機能化金ナノ粒子および近接させたインターデジット式マイクロ電極を用いる電気式ＤＮＡ検出法を開発した（参考文献４８を参照）。オリゴヌクレオチドプローブは、二つのマイクロ電極の間の間隙に固定化された。金ナノ粒子はオリゴヌクレオチドプローブ上のＤＮＡ標的に結合させる。この方法は、測定可能な導電率信号を生じる次なる銀堆積を要件とする。この方法は、検出限界が０．５ｐＭという高い感度を示した。このプロジェクトで提案された方法は、指向され、制御された、ＤＮＡ標的およびオリゴヌクレオチド標識金属粒子の双方の電気泳動蓄積の点で、この技術とは異なり、テンプレート上で金属粒子をクラスター化することによって信号の電気泳動増幅を誘発する。これは、金属粒子タグが増幅信号を生じる反復および／またはサイクリック電気泳動プロセスによって金属化ＤＮＡ上でクラスター化する金属粒子の高信号対雑音ＡＣインピーダンス測定を保証する。この提案する方法は、立体的に非特異的無電解めっきに反して、標的ＤＮＡテンプレートの高速指向性電気めっきを用いる。この提案する検出方法の技術的原理は以下の別の節にまとめている。
【００１３】
Nanogenのマイクロアレイテクノロジー(http://www.nanogen.com)は、アレイにてＤＮＡ分析物および／またはプローブ分子の電気泳動による能動的輸送を用いるので、ＤＮＡマイクロアレイの中でも異彩を放っている。アレイ上の輸送は、アレイ部位を電極として接続することによって電子制御される。アレイでの生体分子の電子式アドレス指定が伝統的な受動的方法と比較して１,０００倍までマイク色チップ上の分子結合を加速し得る。例えば、受動的マイクロアレイ上のハイブリッド形成は数時間もかかることがあり、低濃度のＤＮＡ標的を測定すべき場合、重大である。NanochipRの最新版は、各々がチップ内に設計された回路によって独立して制御およびモニターされる４００個の直径５０μｍのプラチナ電極のアレイである。共重合されたストレプトアビジンを含有する薄いハイドロゲル透過膜がマイクロアレイ電極の表面を覆っている。ハイドロゲルマトリクスの主たる機能は、ビオチン標識ＤＮＡプローブの結合部位を提供することであるが、ＤＮＡを電極表面の有害な電気化学環境から保護も行う。本発明者らは、陽電極で発生したＨ＋を利用して電気ハイブリッド形成を行い、ヒスチジンのごとき両性イオンバッファー中での十分なＤＮＡハイブリッド形成の条件を促進する。Nanogenの市販機器(NanochipR System)は、正確、精密かつ厳格な制御にため、アプリケーションに応じて電子的、熱的または化学的技術を用いる。これは、アッセイデザインに対して非常に柔軟なプラットフォームを提供し、いくつかのタイプの多重解析、例えば、一つのサンプル中の複数の遺伝子、一つの遺伝子につき多数のサンプル、または複数の遺伝子につき複数のサンプルの測定を可能にする。個々の試験部位を制御する能力は、生物学的に無関係な分子を同一マイクロチップ上で同時に使用することを許容する。対照的に、従来のＤＮＡアレイの部位は別々に制御できず、全てのプロセスステップを全アレイについて行わなければならない。市販システムは、蛍光発色団標識オリゴヌクレオチドプローブすなわちレポーターを用いる蛍光ベース検出を用いる。
【００１４】
ナノファブリケーションについてのマイクロアレイの使用に関する先行特許は以下のもの：「電子式アッセンブリーおよび装置の製造の方法(Methods for the Electronic Assembly and Fabrication of Devices)」と題された米国特許第６,６５２,８０８号、「電子式均質アッセンブリーおよび装置の製造の方法(Method for the Electronic, Homogenous Assembly and Fabrication of Devices)」と題された米国特許第６,５６９,３８２号および「光電気泳動輸送およびオリゴヌクレオチドのハイブリッド形成のためのシステムおよび装置(Systems and Devices For Photoelectrophoretic Transport and Hybridization of Oligonuceotides)」と題された米国特許第６,７０６,４７３号を含み、それらの全ては出典明示して本明細書の一部とみなされる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
マイクロアレイ上で特異的プローブとハイブリッド形成したゲノム標的の直接検出のための新規、高感度かつ迅速な電子式検出方法を提案する。この方法は、マイクロ電極アレイでの特定の電極部位へのＤＮＡ標的の高速電子的蓄積、標的ＤＮＡへのオリゴヌクレオチド標識金属（ナノ）粒子の連続的電気ハイブリッド形成および電極部位での電気化学ＡＣインピーダンス変化のモニタリングからなる。この方法は、金属化テンプレートとして働くＤＮＡ標的上および迅速電気めっきのシードを提供する粒子上に電気めっきすることによって促進される。ＡＣインピーダンス変化はＤＮＡ標的上およびアレイ電極部位間を電気めっきしている間モニターする。標的ＤＮＡの存在下または不存在下での信号は、アレイ電極間の「無接続」と「短絡」との違いである。これは驚くべき信号対雑音比を保証する。この方法は、前例のない感度を提供し、理論的に、電極部位に結合した単一またはわずか数個のＤＮＡ分子を検出する。マイクロアレイへのＤＮＡ標的および標識ナノ粒子の迅速電子式アドレス指定は、これらのレベルの感度がたったの数分間で達成されることを保証する。
【課題を解決するための手段】
【００１６】
電子式検出システムに用いられるイノベーションの適用は、少なくとも以下のもの：電気活性マイクロアレイ上での標的ＤＮＡの電子的捕捉およびＤＮＡテンプレート電気めっきのシードとしての標識粒子の電子的整列、ＡＣインピーダンス信号増幅−サイクリック電気泳動ＡＣ信号増幅のタグとしてのＤＮＡ標的への標識粒子の連続またはサイクリック電気泳動蓄積、ならびに電気活性マイクロアレイ上へのＤＮＡテンプレート電気めっき標識金属粒子上の電気活性アレイ部位間および／または電気めっきオン、例えば、Ａｇ、Ａｕ、Ｐｄの存在下で直接標識ＤＮＡを電気めっきすることを含む。
【００１７】
分子診断用のポータブルＤＮＡ解析システムはサンプル調製および検出ステップを単一プラットフォームに統合する。本発明は、マイクロアレイテクノロジーのための電子式検出技術を含み、それは磁気粒子に基づくものを含む様々なサンプル調製法と容易に統合できる。
【００１８】
標的ＤＮＡテンプレート電気めっき検出システムは、マイクロアレイ検出信号としての電極アレイ部位間の電気化学インピーダンススペクトロスコピーを用い、ＤＮＡセンシングへの革新的なアプローチを提供する。しかしながら、検出技術は、ＤＮＡ金属化のために同様の、確立され、例示された無電解めっき技術構築し、それは金属イオンとＤＮＡとの間の電荷相互作用およびつぎなる結合金属イオンの還元を用いる。他のそのような技術は、ＤＮＡ構造へのミクロまたはナノ粒子の結合を用いて金属粒子層を達成し、ついで、それは異なるセットの金属粒子を用いて受動的に被覆される。これらの技術は、しばしば、ＤＮＡめっきプロセスを完了するのに数時間かかり、部位特異的でもない。提案する検出システムの卓越した利点は、ＤＮＡ標的ならびに金属粒子タグが非常に迅速かつ特異的に電気活性マイクロアレイにアドレス指定され、それらが、特定のアレイ部位に容易に蓄積され、ＡＣ信号が粒子タグのサイクリック電気泳動蓄積において増大されることである。電気的整列および標的ＤＮＡ上での金属粒子クラスターの電子的形成によるこの独特かつ迅速な信号増大は、電極部位で容易に測定可能な電気化学インピーダンス変化を保証する。さらに、電子的に整列された粒子はＤＮＡテンプレートの高速シーディングならびに非常に正確なＤＮＡ電気めっきを可能にする。遅い無電解めっき技術に代えて、ＤＮＡの直接的、連続的、特異的電気めっきの使用を、ここに、初めて提案する。
【００１９】
電気活性輸送は、各サイクルは数秒以内に起こるサイクリックかつ増幅可能な様式で金属タグのＤＮＡへの結合を可能にし、基礎的電子式マイクロアレイテクノロジーは、ＤＮＡ信号の迅速増大のためのこの新規「電気泳動増幅」技術の開発および非制限的な実施を可能にする。同様の増幅技術を蛍光ベース検出に用いることができ、そこでは、ＤＮＡおよび蛍光発色団が結合したタグが電気活性輸送を用いて蓄積され増幅される。このプロジェクトは、本発明者らのマイクロアレイテクノロジーに非常に適合した信号のＡＣインピーダンスベース検出に着目している。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２０】
ＤＮＡテンプレート電気めっきの検出用のＡＣインピーダンスシステム
図１は、ＤＮＡ標的の特異的かつ高感度検出のための提案する電子式検出システムの概略図を示す。検出は以下のステップからなる。
【００２１】
標的ＤＮＡの電子式アドレス指定を最初に行う。このステップは、Nanogenが開発したテクノロジーにより行われ、電気泳動によって、低濃度のＤＮＡを溶液から電極アレイ部位に蓄積させることを含む。電子式マイクロアレイはストレプトアビジンを含有するハイドロゲル透過層（約７〜１０ミクロン厚）に覆われている。この提案するシステムは、標的ＤＮＡ上の対象とする特定の遺伝子領域に相補的な予め充填されているビオチン化プローブの使用を当然のこととする。標的ＤＮＡは、非常に迅速に、１分間以内に、溶液から蓄積され、特定のアレイ部位で電気的にハイブリッド形成され得、検出プロセスの局所化を提供する。
【００２２】
一旦、標的ＤＮＡ分子が電極でオリゴヌクレオチドとハイブリッド形成すると、オリゴヌクレオチド標識金属粒子は捕捉された標的ＤＮＡに沿ってハイブリッド形成される。粒子上のオリゴプローブの配列は、ＤＮＡテンプレートのサイズおよび粒子の直径に依存して変化し、かくして、つぎなる金属化のためにＤＮＡ上の粒子間に適正な間隔を与える。オリゴ標識粒子の使用は、付随的なレベルの特異性を与えて、非特異的結合および起こり得る偽陽性の発生を最小限に低減する。
【００２３】
非捕捉粒子を洗い流し、ＤＮＡ標的上に捕捉されたものを電気泳動で整列させて、連続金属化のために一連のシーディング部位を形成する。
【００２４】
Nanogenのテクノロジーは、特定のマイクロアレイ部位でのＤＮＡ標的の正確な間隔の捕捉を可能とし、この特徴は、さらに、局在化ＤＮＡテンプレート電気めっきのための提案されたシステムに用いられる。電気めっきは、最初に、透過薄層のナノポア（直径約５０〜２００ｎｍ）を通して発生し、第１に、そして、ＤＮＡ標的に沿って配列された（ハイブリッド形成された）次なる金属粒子に進行する。粒子のサイズおよび個数がＤＮＡ標的に対して最適化されるので、電気めっきプロセスはたったの数分間以内に完了し得る。
【００２５】
捕捉ＤＮＡテンプレートへの金属粒子の蓄積は、電極部位でのＡＣインピーダンスの変化を生じる。図２は、ＡＣ信号モニタリングがマイクロアレイ上でいかに行われるかを示す。ＤＮＡ標的が蓄積されハイドロゲル透過層のポアを通って延在する電極上に、電気化学二重層が形成される。金属マイクロ粒子がＤＮＡ標的上に電気泳動的に蓄積されるので、それらは、２つの電極アレイ部位間の溶液を通って延在する電場線を遮蔽し、作用電極（ＤＮＡ標的がアドレス指定される電極）のインピーダンスの容量および／または抵抗成分を特に変化させる。各金属粒子は自身の電気化学二重層を有している。電気化学二重層（ＥＤＬ）の厚みは、典型的に、１０ｎｍから１００ｎｍまでの範囲にある（参考文献４９を参照）。かくして、各粒子は自身の粒子ＥＤＬの容量成分により電極のインピーダンス成分をさらに攪乱する。さらに、整列された金属粒子は２つの電極アレイ部位に装入された一連の双極性電極として作用し得る。
【００２６】
これらのプロセスは、シード粒子上の電気めっきプロセスを促進し、電極ＥＤＬに影響し得る。電気めっきプロセスがなくても粒子が蓄積するので、ＡＣインピーダンス信号は著しく変化することが想定される。しかしながら、より高い信号感度のために、整列された金属粒子を電気めっきする。それらは電極アレイ部位と電気接続され、作用電極表面性を有効に拡張する。ナノ粒子の使用は、作用電極の電気化学的表面積を著しく変化させ、ＡＣインピーダンス信号変化を容易に測定可能にする。提案する検出技術は、金属粒子が２つの電極アレイ部位の間の間隙を架橋するときに発生する信号増幅をさらに想定する。架橋は、電極での比較的長いオリゴヌクレオチドプローブを用い、電極間隔を最小限化することによって促進できる。
【００２７】
図２は、特定の電極部位に捕捉されたＤＮＡ標的に沿って電気泳動的に蓄積され整列された金属粒子を用いる標的ＤＮＡテンプレート電気めっきプロセスのＡＣインピーダンスモニタリングを示す。２つのケースが示されており、一方は、金属粒子タグのクラスタリングによる電極インピーダンスの変化および電場線に対するその影響（破線）（左側）を実証するものであり、他方は、金属粒子が電極部位間の間隙を架橋したときのものである。
【００２８】
ポリ−Ｔの具体例
さらにもうひとつの信号増幅技術があり、それは、提案する電子式検出技術の一部であって、非常に低濃度のＤＮＡ標的を検出する必要があるときに用い得る。図３は、金属粒子タグのいくつかのタイプの使用を示す。第１のステップは、標的ＤＮＡに相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドおよびポリ−Ｔテールのごとき単純な反復配列を有するオリゴヌクレオチドの双方で標識された金属粒子の電気泳動アドレス指定を含む。他の単純な配列を使用することができる。第２のタイプの金属粒子タグは、ポリ−Ｔに対して相補的なオリゴヌクレオチド、すなわち、ポリ−Ａ配列（または第１の組の粒子タグ上の配列に相補的な同様の単純な配列を含有する。この方法は、金属粒子タグの反復的電気泳動アドレス指定を含み、金属粒子タグは、次なるアドレス指定ステップにおいて、互いにハイブリッド形成し、かくして、ＤＮＡ標的が捕捉される電極部位にて金属粒子の高速クラスタリングを促進する。これは、ＡＣインピーダンス信号に劇的な変化をもたらす。なぜならば、電極面積の大部分が即座にカバーされるからである。この新規な、信号の「電気泳動増幅」は、いくつかの別個のステップまたはサイクル（洗浄ステップが粒子タグの添加の間に必要であろう）における複数の粒子タグの高速電気泳動アドレス指定を用いる。第２の添加すなわち、第２のサイクルがすでに粒子タグ間の鎖状ハイブリッド形成を達成しているので、高い信号対雑音比を得るために、そのようなサイクルはほんのわずかで済むことが想定される。各サイクルの電気泳動アドレス指定は、数十秒しかかからず、かくして、全サイクルの増幅プロセスは３〜５分間もかからない。この新規信号増幅技術は、極度に高速かつ高感度なＤＮＡ検出システムをもたらし得る。
【００２９】
サイクリック電気泳動アドレス指定は、反対電荷の粒子タグのアドレス指定も想定する。いくつかの金属粒子タグは負電荷（例えば、カルボキシル化粒子）または正電荷（例えば、アミノ化粒子）として作製される。これらの粒子タグは、上記のごとく、同一タイプのオリゴヌクレオチド標識を含有する。この手法の利点は、一旦ＤＮＡテンプレートが電気ハイブリッド形成し、透過層に固定されれば、これらの金属粒子は、２つの電極（一方はＤＮＡ標的を含有し、他方は対電極である。）の極性を反復的に反転させることによって、より高速かつ電気化学的な「撹拌」モードでアドレス指定し得る。第２または第３のサイクルにおいてタグを同時に添加し、鎖状ハイブリッド形成およびクラスタリングを極性反転により誘導することができる。
【００３０】
図３は、互いに鎖状ハイブリッド形成し得る種々の金属粒子タグのサイクリック電気泳動ハイブリッド形成によるＡＣインピーダンス信号の増大を示す。これは、たった数回の高速サイクルで、反対電荷の粒子を用い、電極部位に負荷される電場の極性を反転させることによって行い得る。
【実施例】
【００３１】
Nanogen, Inc.は、以前、マイクロアレイベースＤＮＡ検出用の小型化され統合されたシステムを設計開発した（参考文献５０−５２を参照）。ＤＮＡ検出のためのNanogenのテクノロジー（市販のNanochipR 電子式マイクロアレイシステム）は、単一ヌクレオチド多型性変異の迅速かつ正確な測定を可能にする（参考文献５３を参照）。Nanogenは、多数の冠状およびヘモクロマトーシス症（例えば、第ＩＩ因子、第Ｖ因子、第Ｖ／ＩＩ因子コンビネーションアッセイ、嚢包性線維症、ＨＦＥ、カナバン病およびＡｐｏＥ遺伝子−遅発性アルツハイマー病）の診断用の分析物特異的試薬を市販する。Nanogenのプラットフォームは、独特かつオープンなプラットフォームであり、それは顧客が彼ら独自のアレイおよびアッセイを創製することを可能にする。本発明者らのプラットフォームを用いるＳＮＰ測定に基づくアプリケーションの顧客リストは、冠状動脈疾患、心血管疾患、高血圧、心機能、がんアプリケーション、細菌同定、多重薬物耐性、血友病、サラセミア等）を含む。
【００３２】
電子式マイクロアレイを用いる感染症病原の高感度検出
この節は、Nanogenで行われた最近の研究をまとめ、電子式マイクロアレイ上でのＰＣＲおよびＳＤＡ（ストランド・ディスプレイスメント増幅）ＤＮＡ標的の有効な電子的蓄積および現行の蛍光ベース検出を用いたその検出を実証する。５つのヒトパピローマウイルス、ＨＰＶ型（ＨＰＶ１６，ＨＰＶ１８、ＨＰＶ３１、ＨＰＶ３３およびＨＰＶ４５）を用いて予備調査を行った。Perkin-Elmer 9700上で２５μＬ反応物でのＰＣＲ（AmpliTaq GoldR）を用いて増幅を行った。検出は１００サイトチップ上で行った。図４は、５つのＨＰＶ型全ての同時検出を示す。５つ全ての型は、バックグラウンド信号に対して明らかに顕著な信号を示している。５のＨＰＶ型のうち３つはたった１０コピーしかなかった。
【００３３】
図４は、ＰＣＲを用いて増幅した５つのＨＰＶ型の検出用の１００サイト電子式マイクロアレイ上で得られた蛍光データを示す。各ＨＰＶ型の１０コピー程度の低いもので検出を行った
【００３４】
炭疽菌(Bacillus anthracis)およびワクシニア(vaccinia)のための多重ＰＣＲベースアッセイが開発され、別個の確認が本発明者と共同研究するMidwest Research Instituteによって行われた。試験は、ワクシニアおよびCapBおよび炭疽菌の保護的ＰＡ遺伝子用の赤血球凝集素遺伝子を用いるスクリーニングアッセイおよび確認アッセイの評価を含む。アッセイの特異性は、２８の炭疽菌株および炭疽菌の類縁、ワクシニア、ウサギ痘(rabbitpox)、タヌキ痘(raccoonpox)および野ウサギ病菌(Francisella tularensis)、ペスト菌(Yersinia pestis)、ボツリヌス菌(Clostridium botulinum)、および植物葉面細菌(Erwinia Herbicola)を含む多数の他の選択された剤に対して評価された。その手順は、（ｉ）炭疽菌（ＡＴＣＣから入手可能）、ワクシニア、および用いた全ての競合株の一晩増殖、（ｉｉ）市販キット（改良Qiagenキット）によるビーズビーティング、遠心および溶出を用いたそれらのＤＮＡの抽出、（ｉｉｉ）ＤＮＡ定量（PicoGreen dsDNA Quantitation kit, Molecular Probes）、および（ｉｖ）（ａ）スクリーニングアッセイ、（ｂ）確認、競合アッセイおよび（ｃ）特異性アッセイの実行を含む。実験は、必要であれば、ＢＳＬ３安全条件の下で実行した。検出限界（ＬＯＤ）は、定量されたＤＮＡの連続希釈を用いて、（ＰＣＲ反応あたり）炭疽菌株につき０．１７ないし１,７００またはワクシニアにつき０．００１５ないし１,５００ＰＦＵの間の範囲で決定した。（５０μリッターＰＣＲ反応をPE 9600サーモサイクラー上で実行し、検出はNanogenの１００サイト電子式マイクロアレイ上で達成した）。炭疽菌（ボラム(Vollum)株）の試験は、CapBスクリーンアッセイについて１ｐｇすなわち１７０コピー、ＰＡ遺伝子について１０ｐｇすなわち１,７０００コピーの検出限界を示した（２０個の複製物について１００％の陽性結果）。CapB遺伝子の確認アッセイは、１００ｆｇすなわち１７コピーの検出限界を示した（２０個の複製物について１００％の陽性結果）。ＨｅｍａアッセイでのワクシニアATCC VR-2010の試験は１５ＰＦＵ（プラーク形成単位）のＬＯＤを示した。特異性試験（see list of near neighbors and other select agents tested above）は、標的遺伝子CapB、PA、またはHemaが試料中に存在し、かつ他の剤が陽性結果を阻害しないときにのみ、陽性結果が得られることを示した。反応あたり１ｎｇのＤＮＡ（１７０,０００コピー）を特異性試験に用いた。
【００３５】
オンチップ−ストランド・ディスプレイスメント増幅――ＤＮＡ標的の高効率蓄積のデモンストレーション
本発明者らは、ＤＮＡ標的の等温ストランド・ディスプレイスメント増幅（参考文献５４−５５を参照）（Bectkon Dickinsonから使用許諾されたＳＤＡ）を用いる数々のアッセイを開発してきた。なぜならば、この方法が必要とするのは、ＰＣＲ増幅に用いられるサーマルサイクラーと比較してポータブル機器で温度制御できる非常に簡単な装置だからである。ＳＤＡ増幅において、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡの切欠けストランドを認識し、そのストランドの再合成を開始させ、オリジナルストランドを置き換える。それから、遊離したアンプリコンは溶液中で溶液中かまたは固定されているかのいずれかである相補的ストランドのプライマーまで移動する。バンパープライマー(bumper primers)と呼ばれる切欠け部位のないオリゴヌクレオチドプライマーは、丁度生成されたアンプリコンに接する領域内に合成され、ストランド・ディスプレイスメントおよび初期テンプレート複製で支援する。ＳＤＡ増幅の典型的な反応混合物は以下の物質：（ａ）センスおよびアンチセンスプライマー５００ｎＭ、（ｂ）バンパープライマー５０ｎＭ、（ｃ）各々ｄＮＴＰミックス１．４ｍＭ、（ｄ）Ｂｓｔポリメラーゼ９．６Ｕ／ｒｎ、（ｅ）Ｂｂｖニッキング酵素３．７５Ｕ／ｒｘｎＭｇ（ＯＡｃ）、（ｆ）１０ｍＭ ｐＨ７．６リン酸バッファー、２５ｍＭからなる。一般に、反応体積は１０〜５０μＬである。これらのパラメータは実験パラメータの実験設計（ＤＯＥ）最適化により最適化される。本発明者らは、固定化ＳＤＡ増幅法を開発し、そこでは、内部増幅プライマー（バンパープライマーではない）をビオチン化し、それらがハイドロゲル透過膜内のストレプトアビジンに結合する特定の電子式マイクロアレイ部位にアドレス指定される。これらのプライマーは、製造段階でチップ上に充填し得る。約２月間行った初期安定性実験は、予備充填プライマーで良好な安定性を示した。このステップは、アッセイを加速し、標的およびレポーターのみをアドレス指定するのに重要である。ついで、標的ＤＮＡをアレイ部位にアドレス指定し、そこで、それを固定化プライマーに電気ハイブリッド形成する。最後に、マイクロアレイを酵素、バンパープライマーおよびｄＮＴＰを含有する反応混合物で覆い、３０分間ないし１時間５０℃に加熱して、反応生成物を得る。
【００３６】
図５は、１０重オンチップＳＤＡ増幅を示す。増幅遺伝子のパターンは左に示される。右側は、増幅およびレポート後のマイクロアレイの蛍光像である（Nature Biotechnology, Feb. 2000）。
【００３７】
図５は、単一サンプル中の１０種類までの異なる遺伝子の同時オンチップＳＤＡ増幅の実行が可能であることを実証する。この実験は、感染症および／または生物兵器剤の同定に関連した、電子式マイクロアレイ上での５人と５つの細菌遺伝子との掛け合わせを示す。本発明の小型プロトタイプマイクロアレイ検出機器（図７に示す）を用いた感染病原および／または生物兵器剤の検出のための数々のオンチップＳＤＡベースアッセイを開発した。４つの生物兵器剤についての以下の６つの遺伝子：炭疽菌（アンスラックス）（cap B および PA遺伝子）、ワクシニア（赤血球凝集素遺伝子）、黄色ブドウ球菌(Staphylococcus aureus)（seaおよびseb遺伝子）およびプラグ（ペスト菌）（プラスミノゲン・アクチベータ(plasminogen activator)、PLA遺伝子）を分析した。各ＤＮＡの濃度範囲は固定化増幅前にアドレス指定された。８５コピーのＤＮＡ／マイクロリッター程度の低い濃度（検出室内）は、通常、ワクシニアで検出される。ＢリストＣＤＣ剤、例えば、大腸菌(E. Coli)およびサルモネラ菌(S. typhymurium)について、（増幅反応物の出発体積に対して）１０〜１００コピーのＤＮＡの範囲で再現可能な固定かＳＤＡデータの結果が得られた。ごく近年、本発明者らは、アレイ電極あたり５コピー程度の低い濃度のワクシニアＤＮＡ標的遺伝子を１分間以内の電子式アドレス指定時間で効率的に蓄積し得ることを実証した（結果はポータブル機器で得た）。チップ上で８５コピー／マイクロリッターを用いて１８のアドレス指定された電極で（８５／１５、電極あたり約５コピーを与える）陽性結果を得た。結果は、各電極アレイ部位上で、ＤＮＡ濃度のＳＤＡ増幅後に得られた。これは、サンプル中に存在するほんの数個のＤＮＡ分子を電極アレイ部位に効率的に捕捉できる提案の直接増幅無しの技術に用いるのに、電子式アドレス指定が十分に有効であることを実証した。これは、提案の検出技術の課題の一つを解決する。すなわち、１または数個のＤＮＡ標的分子を非常に短い時間（１分間）以内にアレイ部位に結合させ得ることを実証した。
【００３８】
電子式マイクロアレイ上でのＡＣインピーダンス測定
本発明者らは、電気泳動ＤＮＡ蓄積が促進される条件で４００サイトマイクロアレイの電極アレイ部位間で初期ＡＣインピーダンス測定を行った。図６ａおよび６ｂに示すＡＣインピーダンススペクトルは、ヒスチジン支持電解質濃度の関数でチップ参照電極に対して負荷された２つの作用電極電位にて、２つの電極アレイ部位（位置１,１および１,１０を示す；第１の数字はマイクロアレイの行を示し、第２の数字は列を示す。）の間で発生する容量および抵抗成分に変化を示した。スペクトルは、典型的なランドルス等価回路環形状を示している（図６を参照）。ヒスチジンの濃度を増加することによって、半円が小さくなり、溶液中の電気活性種の濃度がより高くなったために電流が高くなったことを示す。図６に示される半円にフィットさせる最小自乗法を用いて、分極抵抗Ｒｐおよび溶液抵抗Ｒｓを全てのインピーダンススペクトルにつき算出した。低導電率にて、すなわち、低電解質濃度にて、ＥＤＣ＝０．０ＶでのＲｐ／Ｒｓ比は、より高い電解質濃度と比較して２桁までは高くなる。この傾向はＥＤＣ＝１．３Ｖでも観察されるが、濃度によるＲｐ／Ｒｓ比の減少が小さい。すなわち、１０倍までの減少である。これは、低電解質濃度にて、前抵抗が非常に高く、分極抵抗に支配されることを明確に示している。結果として、電極アレイでの全電流は非常に小さく、溶液インピーダンスは電極の形状的配列によって影響され得る。これらのインピーダンス特性は、電子式マイクロアレイ上での本発明のアッセイに関する条件を正確に表している。データは、アレイ部位上の電極／電解質境界が電極上の吸着周の存在によっておよび電極形状の何らかの変化によって顕著に影響されることを示唆する。金属ナノ粒子タグの蓄積は、ＤＮＡ標的の鎖状電気めっきにおける特定の指数関数的増幅において、電極電気化学表面を増大し、アレイ部位に蓄積されたＤＮＡ濃度に依存するインピーダンス信号の測定を容易にする。
【００３９】
研究設計および方法
提案する研究の全般的な目的は、低コピー数のＤＮＡ標的の電子式アドレス指定を用いる新規マイクロアレイ検出プラットフォームの開発の実現可能な局面および、アレイ部位に結合したＤＮＡ標的分子の金属化プロセスの電気化学的ＡＣインピーダンス信号を用いる検出を実証することにある。金属粒子タグを用いてＤＮＡテンプレート電気めっきの間のＡＣ信号を増大させ、その信号を粒子タグのサイクリック電気泳動アドレス指定により増幅する。電子式検出システムは、ポータブル機器の開発を可能にする小型フォーマットにおけるカートリッジおよび機器パッケージングを可能にする。提案する研究は、ポータブルＤＮＡマイクロアレイ機器の開発における本発明者らの努力にてこ入れさせ、必要な流体を含有する現行のプロトタイプ小型プラットフォーム；電子およびソフトウェア構成要素を、提案する検出システムの確認に適合させて使用する。
以下は、提案する研究の特別の技術的目的である。
金属粒子タグの存在下のＤＮＡ金属化プロセスのＡＣインピーダンス検出
提案する検出システムに適した電極アレイ形状での電子式マイクロアレイおよびカートリッジの設計および製造
ＤＮＡ標的分子の無増幅、迅速かつ高感度検出の実証
代表的なアッセイの設計および試験ならびに検出システムの確認
【００４０】
提案する研究及び開発努力において計画された実験は、全てNanogenの設備で行われる。マイクロチップ製造用のマスクは、シリコン微細加工工場に外部委託し、アレイおよびカートリッジの製造は、本出願人の市販器具を用いて確立した方法および業者を用いて自社で行う。Nanogenは、全ての必要な器具、マイクロファブリケーション設備（クリーンルーム、クラス１００および１０００）、微生物学および分子生物学研究所ならびにこのプロジェクトの全ての任務を遂行できる人材を所有している。
【００４１】
金属粒子タグの存在下でのＤＮＡ金属化プロセスのＡＣインピーダンス検出
電気化学インピーダンススペクトロスコピー（参考文献５６を参照）は、作用電極に負荷されたある周波数帯域（数マイクロヘルツないしＭＨｚ帯域）の小さな１０〜５０ｍＶ正弦波電位信号を用いて、電極／電解質界面での容量および抵抗成分を測定する。この方法は、電気化学二重層の構造に対する洞察（容量的挙動）を与え、電流および拡散制御プロセスのファラデーすなわち電気活性成分を識別し、ならびに、それは電極上のコーティングまたは吸着の抵抗的または容量的挙動を付与する。インピーダンスは、普通、複素関数で表現され（式１〜３を参照）、データは、実数すなわち抵抗成分をＸ軸に表し、虚数すなわち容量成分をＹ軸に表すナイキストプロットを用いて表記する。ボードプロットを用いて、周波数の関数で、インピーダンスの相位相および絶対値を調べる。電子等価回路が通常確立され、それは界面のモデルを提供し、実験条件が変化したときのインピーダンス信号の支配的実数時間（抵抗）成分または虚数（容量）成分の理解を助ける。
【００４２】
E(t)  E0 exp(jωt)                                          (1)
I(t)  I0 exp(jωt  j φ)                                    (2)
【００４３】
式中、Ｅは負荷された正弦波電位、Ｉは電流応答、ωは角速度である。そして、インピーダンスは複素関数で表記できる。
【００４４】
Z= E/I =  Z0 exp(j, φ) = Z0 (cos φ + j sin φ)               (3)
【００４５】
最近、ＡＣインピーダンスを用いて、機能電極での抗体／抗原結合効果が検出された（参考文献５７を参照）。これらの結果は、特定の抗体で機能化された電極と対照（非結合）抗体の電極と比較してＡＣ信号に２５％の差異を示した。これらの例および本発明者らの予備的なデータのいくつかは、ＡＣインピーダンス研究が電極表面上に直接生じる吸着または堆積プロセスをモニターするのに適し、かくして、作用電極の表面における微小変化を反映する。粒子蓄積は、特に、ＤＮＡ標的分子上のサイクリック電気泳動アドレス指定によって促進されたとき、ハイドロゲル層ナノポアを通して広がる電気化学二重層に影響し、ＤＮＡ標的および金属粒子シードの電気めっきの間に実質的な変化を生じる。
【００４６】
提案する実験の本質は以下である。１．ＡＣインピーダンススペクトルを作成し、マイクロアレイ電極部位数および確立された信号の再現性について、捕捉ＤＮＡ標的の存在の有無で比較する。；２．インピーダンスパラメータの基本的変化を特定の電極部位での電気めっきプロセスにつき調査する。；３．ＤＮＡ標的にアドレス指定した金属粒子の存在の有無でＤＮＡテンプレート電気めっきプロセスにつき、インピーダンス信号を測定する。；４．ＡＣ信号の最も支配的なインピーダンス成分の依存性をアレイ流体チャンバーに添加されたＤＮＡの濃度の関数で調査する。ＤＮＡ標的はいくつかのレベルの複雑性を含む。（ａ）初期最適化は、既知の配列（ＡＴＣＣから入手可能なゲノムＤＮＡ；ＤＮＡ標的および設計されたプライマーは数々の病原、例えば、ペスト菌(Yersinia pestis)、ｐｌａ遺伝子(pla gene)、リステリア・モノサイトゲネス(Lysteria monocytogenes)、ｈｌｙ遺伝子(hly gene)、肺炎球菌(Streptoccocus pneumoniae)、ｐｌｙ遺伝子(ply gene)、アンスラックス(anthrax)、いくつかの遺伝子等について入手可能である。）のＰＣＲ増幅および精製ゲノムＤＮＡ（２００〜１,０００ｂｐの範囲のサイズ）を用いて実行し；（ｂ）一旦、条件を最適化すれば、特徴的遺伝子配列を標的するゲノムＤＮＡ（５〜６Ｍｂｐ）を試験し；（ｃ）タスク４のゲノムＤＮＡを用いて完全アッセイを試験する。
【００４７】
基本インピーダンス研究は、Autolab Eco Chemieポテンショスタット／周波数応答性分析器Model PGSTAT20（いくつかはNanogenで利用可能である。）を用いて行う。インピーダンスパラメータは以下の範囲：アレイ電極間で１０〜５０ｍＶ振幅の正弦波ＡＣ信号；周波数帯域２０ｋＨｚないし５Ｈｚで調べる。ＤＣ電位（ＥＤＣ）は、電極アレイを取り巻くAg/AgO QREに対して、および／または、外部標準カロメル電極に対して制御される。バッファー電解質は、電子式マイクロアレイＤＮＡ分析の実行用の本発明者らの標準バッファーを含み、そのバッファーはヒスチジン（濃度１０〜１００ｍＭ）、低塩バッファー（リン酸バッファー）および高塩バッファー（塩化ナトリウムイオン入りのリン酸バッファー）を含む。本発明者らは、カートリッジおよびチップへの接触を与えられる装置を開発した。ＤＵＳＴプログラムの部分として開発された４００サイト小型プロトタイプシステム（図７を参照）は４００サイトのアレイ／カートリッジを受容し（図８を参照）、これを用いて電子式アドレス指定、さらには、インピーダンス測定を実行する。このシステムは、ＤＮＡ標的への粒子のハイブリッド形成（蛍光標識粒子をこの目的に用いる。）および透過層のオリゴヌクレオチドプローブへのＤＮＡ結合の確認のため用いるビルトイン蛍光検出システムを有する。チップは１６×２５（４００サイト）のアレイを有し、各電極は直径５０μｍで、中心間距離は１５０μｍである。CMOSチップはセラミック基板（0.015”厚）上にフリップチップボンドし、さらに、カートリッジ内で、加工したカバープレート（アクリル製）と感圧接着剤で貼り合わせる（図８を参照）。ＤＮＡの長さを塩基対あたり約０．３４ｎｍとすると、ＤＮＡ架橋実験は２０〜４０,０００ｂｐＤＮＡテンプレートを用いることになる。したがって、これらのＤＮＡのサイズは２〜４ミクロンの範囲にあり、新たに設計されたチップの電極間距離を架橋することができる。
【００４８】
図７は、電気活性マイクロアレイおよび光学検出を有するNanogenのポータブルプロトタイプ機器を示す。この機器はラップトップで操作される（左）。機器の構成要素はカートリッジ入り口、試薬容器、ペルスタルティック・ポンプ、電子制御およびＣＣＤカメラ付きの光学検出システムを含む（右）。
【００４９】
図８は、４００サイトCMOS ACV400-チップおよびアレイの写真を示す。２つは縦方向に、２つは横方向に位置する４つの対電極が活性作用電極アレイを取り囲む。
【００５０】
提案する検出システムに適した電極アレイ形状の電子式マイクロアレイおよびカートリッジの設計および製造
このタスクの主目的は、提案する検出メカニズムのため最高のＡＣ信号を保証する電極形状のマイクロ電子アレイを開発することにある。これは、電極の間隔および直径を減少させることを要件とするであろう。直径が３〜５ミクロンの間の範囲にあり、間隔がほぼ同様の電極がより高いＡＣ信号を提供することが想定され、特に、２つの電極部位間の架橋を達成する可能性を増大する。このレベルの線解像度は現行の４００サイトアレイの製造に用いられる同一のリソグラフィー技術（プラチナ堆積のためのＲＦスパッタリングおよび二酸化シリコン堆積のためのプラズマ促進化学気相成長法（ＰＥＣＤＶ）を用いて達成し得る。全ての器具は入手可能であり、そのようなチップを製造するための方法は、Nanogenで確立されている。マスク製造およびフリップチッププロセスは標準業者を用いて行う。ハイドロゲル透過層は、自動化ミクロモールディングおよびＵＶ硬化機器を用いて自社で製造する。このタスクの実験は、隣接する電極アレイ部位間の間隙（例えば１,００００〜１０,０００塩基対）を架橋するためのより大きなオリゴヌクレオチドプローブおよび、それらのプローブとハイブリッド形成し、テンプレートＤＮＡに特異的な配列を有するより小さなヌクレオチドプローブの使用を要件とする。
【００５１】
ＤＮＡ標的分子の無増幅、迅速かつ高感度検出の実証
このタスクは、ＤＮＡ標的金属化のＡＣインピーダンスキャラクタリゼーションの最適化のための他の重要なパラメータを規定し試験することに終始する。ＤＮＡ標的は比較的短いオリゴヌクレオチドであり、ＰＣＲ増幅ＤＮＡサンプルをミミックする。その長さは数十ないし数百塩基対の間の範囲にある。より短いテンプレートは生成物のＰＣＲ増幅および精製によって得る。本発明者らは、多数のＤＮＡテンプレートを有し、第ＩＩ因子または第Ｖ因子配列のごとき十分に制御されたＤＮＡサンプルとして用いる。オリゴヌクレオチドプローブは、ＤＮＡテンプレートに対して高い特異性を保証するために、５０〜８０塩基対の範囲にある。このタスクにおいて計画される実験は、（ａ）１０ｎｍないし１μｍ直径の範囲にある粒子径；（ｂ）粒子の電荷：正電荷のカルボキシル化粒子および負電荷のアミノ化粒子を、すでに説明したように、ＡＣ信号の増大のために電極極性反転を伴うサイクリック電気泳動測定において用いる。；（ｃ）オリゴヌクレオチド標識：１の組の粒子タグをＤＮＡ標的に相補的な配列および次なる電気泳動アドレス指定（増幅）サイクルで他の粒子タグをレポートしそれとハイブリッド形成するポリ−Ｔ（または同様の反復配列）の双方で標識し；（第１の組に加えて次なる）他の粒子タグは、ポリ−Ｔに相補的な配列（または同様の相補的配列）で標識したポリ−Ａオリゴ標識を含有する。；（ｄ）粒子タグを覆うオリゴヌクレオチドプローブの濃度――ＤＮＡテンプレート上に粒子タグの十分なクラスタリングを達成することに対して最適な粒子上のオリゴプローブ濃度；（ｅ）ＤＮＡ標的テンプレートに相補的なオリゴヌクレオチドプローブ付きの粒子タグの個数――ＤＮＡに沿って整列した相補的タグの個数はＤＮＡ標的のサイズおよび粒子のサイズに対して最適化して最速シーディングおよび最善の金属化のための条件を達成する。；に関する金属粒子タグの最適化を要件とする。
【００５２】
粒子とオリゴプローブとの間のいくつかの結合技術を試験することができるが、可能な限り商業的に入手可能な粒子を用いる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドプローブをビーズに直接共有結合させて、粒子当たりわずか数本から１０５本度程のプローブの範囲の表面カバレッジを得る。オリゴヌクレオチド粒子タグは、ポリｄＴ、ポリｄＡ、ポリｄＣまたはポリｄＧ配列からなる。さらに、特異的捕捉配列をこれらのビーズに添加するか、またはビーズの混合物を用いることができる。あるいは、ビーツをストレプトアビジンで共有的修飾し、ついで、それを用いてビオチン化オリゴヌクレオチドプローブに結合させる。カルボキシおよびアミン末端化粒子、ならびにアミン末端化量子ドットが、Polysciences, MoSci、Nanosphere、Pierce、Seradyn、Dynal and Quantum Dotを含むいくつかの業者から入手可能である。いくつかの試薬を用いて、ストレプトアビジンまたはＤＮＡを直接ビーズに共有結合させることができる。正電荷アミノ化ビーズに関して、グルタルアルデヒドを用いてビーズを活性化し、その後、5'または3'-アミノ修飾ＤＮＡ配列を、ビーズあたり制御された密度のプローブを達成するために丁度よい濃度で添加することができる。あるいは、ストレプトアビジンをグルタルアルデヒド活性化ビーズに添加し、ストレプトアビジンサブユニット上の末端リジン残基を介して共有結合させることができる。ついで、モノエチルアミンを用いて連結ビーズを不活性化して、正味の正表面電荷を維持し、残りのアルデヒド結合と反応させる。
【００５３】
負電荷カルボキシルビーズに関して、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）を用いてビーズを活性化し、その後、5'または3'-アミノ修飾ＤＮＡ配列を、ビーズあたり制御された密度のプローブを達成するために適当な希釈で添加することができる。あるいは、ストレプトアビジンをＥＤＣ活性化ビーズに添加し、ストレプトアビジンサブユニット上の末端リジン残基を介して共有結合させることができる。ついで、モノエチルアミンを用いて連結ビーズを不活性化して、正味の負表面電荷を維持し、残りのｏ−アシルリソウレア結合と反応させる。
【００５４】
大きなサイズのＤＮＡテンプレートを用いてＤＮＡテンプレート／オリゴ抜きレオチドプローブ架橋実験における可能性および条件を試験する。それらは、商業的に入手可能な５ないし２０ｋｂ塩基対のサイズ範囲にあるクローン化プラスミド（例えば、は様々なサイズの凍結乾燥プラスミドを提供する。例えば、pREP4、エピソーマルほ乳類発現ベクター、Catalog #V004-50は１０．３ｋｂである。）を含むであろう。プラスミドを所望の長さに切断するために用いられる一連の制限酵素（例えば、AatIはpREP4をたった一箇所で切断する。）が準備される。既知の配列のプラスミドを用いて、センサーアプリケーション用のオリゴヌクレオチドプローブの設計を単純にする。これらの長めのプローブを隣接する電極に結合させて、ＤＮＡテンプレート架橋するための長いアームおよび延長した粒子タグを提供する。一旦金属化すると（すでに記載したように）、電流が金属化架橋を流れ、非常に高いインピーダンスの信号対雑音比を提供する。なぜならば、２つの電極間に短絡が生じるからである。２つの電極部位間の架橋は、互いが末端でまたは金属粒子タグを介して結合した単一ストランドＤＮＡのいくつかの部分から構成され、かくして、電極間が長く延長する。
【００５５】
代表的アッセイの設計および試験ならびに検出システムの確認
提案する検出方法を適正に確認するために、正確に既知の配列を有するＤＮＡ標的サンプルをアッセイ設計に用いる。われわれは、いくつかの関連するプラスミド構築物ならびに既知の配列のゲノムＤＮＡ、例えば、USAMRIIDから入手することができるワクシニアプラスミド、ｐｌａプラスミド（プラグ）を有している。このタスクはサンプル調製ステップと統合する可能性を含む全体のアッセイを実行する局面を調べる。DUSTプログラムにより開発されたポータブル機器はサンプル調製および提案された新規検出システムを包含する。抗体またはオリゴヌクレオチド標識磁性粒子を提案する検出技術に用いることができる。これは、単純なアンプル調製ステップと統合することができ、それは、抗体標識ビーズを用いてサンプルから病原を磁気分離することからなる（DUSTプログラムにより、本発明者らは、いくつかの感染症病原、例えば、大腸菌(E. Coli)、チフス菌(S. typhimurium)、肺炎球菌(S. pneumoniae)等に特異的な抗体標識ビーズを多数開発している）。かくして、最初に病原（または対象の細胞）を磁気分離し、溶解する（本発明者らは、簡単な熱的溶解ステップが十分な分離を満足することを立証し、１０〜１００／ｍＬ程度の低い病原レベルであることを確認した）。必要であれば、遊離したゲノムＤＮＡをまず酵素的に切断して、既知の配列を有する正確な個数の切断物にすることができる。ＤＮＡ標的は、ハイドロゲル透過層上のビオチン化オリゴヌクレオチドプローブに電子式アドレス指定することによってマイクロアレイ上に捕捉する。ついで、オリゴヌクレオチド標識金属粒子を添加し、すでに記載したように、ＤＮＡ標的金属化のＡＣインピーダンス検出のためのアッセイを実行する。このタスクは、アッセイステップの最適化をもたらし、提案する電子式検出法の厳格性、再現性および感度を評価する。対象のＰＣＲ増幅配列、ＤＮＡサイズ２００〜１,０００ｂｐおよび代表的なゲノムＤＮＡ（４〜６Ｍｂｐ、サンプル調製プロセスにおいて、酵素的または熱的処理によって細かく切断した。）について確認を実行した。
【００５６】
当業者には、本発明の本質および範囲から逸脱することなく変形することがでいることは明らかである。したがって、本発明が、付随する特許請求の範囲の観点から必要である場合を除き、制限されることは意図されない。
【００５７】
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【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＤＮＡ標的の特異的かつ高感度検出のための提案する電子式検出システムの概略図
【図２】ＡＣ信号モニタリングがマイクロアレイ上でいかに行われるかを示す概略図
【図３】金属粒子タグのいくつかのタイプの使用を示す概略図
【図４】５つのＨＰＶ型全ての同時検出を示す概略図
【図５】単一サンプル中の１０種類までの異なる遺伝子の同時オンチップＳＤＡ増幅の実行が可能であることを実証する概略図
【図６ａ】ＡＣインピーダンススペクトル
【図６ｂ】ＡＣインピーダンススペクトル
【図７】電気活性マイクロアレイおよび光学検出を有するNanogenのポータブルプロトタイプ機器の概略図
【図８】４００サイトCMOS ACV400-チップおよびアレイの写真
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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