(57)【要約】  正常組織と相対する腫瘍組織における優先的局在、約660〜900nmの波長における優先的電磁吸収、及び少なくとも+30nm、好ましくは少なくとも+50nmだけ優先的吸収から移動した波長における蛍光を有する化合物。化合物は、更に、その優先的吸収波長の光にさらされる場合に吸収される腫瘍組織を破壊することが好ましい。本発明の好ましい実施態様においては、化合物は腫瘍親和性テトラピロール化合物と蛍光色素との結合体であり、より好ましくは、蛍光色素はインドシアニングリーンのようなインドシアニン色素である。腫瘍親和性テトラピロール化合物は、好ましくはクロリン、バクテリオクロリン、プルプリン及びそれらの誘導体からなる群より選ばれるポルフィリン誘導体である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
正常組織と相対する腫瘍組織において優先的局在、約660〜900nmの波長における優先的電磁吸収、及び少なくとも+30nmだけ優先的吸収から移動した波長における蛍光を有する化合物。
【請求項２】
移動が少なくとも+50nmである、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
化合物が、腫瘍親和性テトラピロール化合物と蛍光色素との結合体である、請求項1記載の化合物。
【請求項４】
蛍光色素がインドシアニン色素である、請求項3記載の化合物。
【請求項５】
腫瘍親和性テトラピロール化合物が、クロリン、バクテリオクロリン及びポルフィリンからなる群より選ばれる、請求項3記載の化合物。
【請求項６】
色素がインドシアニン色素である、請求項5記載の化合物。
【請求項７】
色素がインドシアニングリーンである、請求項5記載の化合物。
【請求項８】
下記一般式を有するテトラピロール-蛍光色素複合化合物。
【化１】
2008506694.tif 000015
(式中、R1は、置換された又は置換されていない、-CH=CH2、-CHO、COOH、又は
【化２】
2008506694.tif 000016
2008506694.tif 000017
であり、ここで、R9 =-OR10、ここで、R10は炭素原子1〜8個の低級アルキルである、又は-(CH2-O)nCH3であり; R2、R2a、R3、R3a、R4、R5、R5a、R7、R7aは、独立して水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、低級アルキレン又は置換された低級アルキレンであるか又は隣接の炭素原子について2つのR2、R2a、R3、R3a、R5、R5a、R7、R7aの基が共に結合して共有結合形成を形成してもよく又は同じ炭素原子について2つのR2、R2a、R3、R3a、R5、R5a、R7、R7aの基が2価のペンダント基に二重結合を形成してもよく; R2とR3は、共に酸素、窒素又はイオウを含有する5又は6員複素環を形成してもよく; R6は、-CH2-、-NR11-であり、ここで、R11は置換された又は置換されていない、低級アルキル、又は低級アルキレンである; 又はR6は、共有結合であり; R8は、-(CH2)2CO2R12、ここで、R12は水素又は置換された又は置換されていない、低級アルキル、低級アルキレン又は-NH2であり、ここで、R1、R2a、R3、R3a、R4、R5、R5a、R7、R7a、R8、R9、R10、R11、又はR12の少なくとも1つは約800〜約900nmのピーク発光波長で蛍光を発し、また、そのピーク発光より少なくとも30nm下でピーク吸収を有する色素によって置換されている。)
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
一度湿潤癌や転移が起こると治療が難しいために、初期の新生物性変化の検出は予後の観点から重要である。現在、組織学によって行われる切採生検は、初期の新生物性変化や癌腫の診断にとって“最も基準になる検査”とみなされている。場合によっては、切採生検よりは細胞学、即ち、表面細胞又は排出細胞による分析が行われる。これらの手法は、組織の細胞構造や亜細胞構造の高解像空間的情報や形態学的情報を示すことから強力な診断手段である。染色や処理の使用は、組織病理学のコントラストや特異性を増強することができる。しかしながら、これらの診断法はいずれも検査材料の物理的除去に続いて研究室における組織処理を必要とする。これらの方法は、検査材料の処理が必要とされることから相対的に高コストを招き、より重要なことに、診断情報が直ちに利用できない。
【０００２】
蛍光技術は、試料採取切除と処理を必要とせずに組織について生体内診断を行う可能性を有し、近年、癌の診断のために蛍光分光法の使用が探究されてきた。分光学的物質を用いる赤外線イメージング(IRI)は、技術が非侵襲性であるという点で試験管内及び他の生体内技術よりいくつかの利点を有し、適当な条件下で定量的結果を得ることができ、切採生検又は細胞学より問題の臓器のより完全な試験を達成することができる。更に、蛍光物質を試験する際に、必要とされた分光学的物質の取込み、保持及び除去の完全なプロファイルを単一実験動物内で行うことができるので、臨床前の試験に必要とされる動物の数が減少する。
【０００３】
赤外線イメージング技術に必要とされる理想的な分光学的物質のための要求は以下の通りである。i)腫瘍細胞に優先的に局在しなければならない; ii)蛍光効率が高くなければならない; iii)患者において光毒性又は他の悪影響が生じてはならない; iv)合成が容易でなければならない; v)化学的に純粋でなければならない; 及びvi)深在腫瘍を検出することができるように、長い波長発光がなければならない。
【０００４】
クロリン、バクテリオクロリン及びそれらの類似体及び誘導体を含む他のポルフィリンベースの誘導体を含むポルフィリンは、疾患、特にある種の癌や他の過剰増殖性疾患、例えば、黄斑変性の診断や治療に用いられる光線力学的化合物としての優れた効用が最近わかった。これらの化合物は、乾癬や乳頭腫症の治療における効用もわかった。
【０００５】
このような誘導体としては、これらの化合物の二量体と三重体とが含まれる。許容される誘導体としては、これらの化合物の環態様も含まれるが、これらの化合物の中央の16の面をもった4つ窒素複素環は、そのままである。それ故、クロロフィリン、プルプリン及びフェオホルビド及びそれらの誘導体は“ポルフィリン、クロリン、及びバクテリオクロリン及びそれらの誘導体及び類似体”の中に含まれる。このような誘導体としては、これらの環構造について置換基の修飾も含まれる。
【０００６】
数多くの論文がこの主題について書かれてきた。例えば、"Use of the Chlorophyll Derivative Purpurin-18, for Synthesis of Sensitizers for Use in Photodynamic Therapy", Lee et al., J.Chem.Soc., 1993, (19) 2369-77; "Synthesis of New Bacteriochlorins And Their Antitumor Activity", Pandey et al., Biology and Med. Chem. Letters, 1992; "Photosensitizing Properties of Bacteriochlorophyllin a and Bacteriochlorin a, Two Derivatives of Bacteriochlorophyll a", Beems et al., Photochemistry and Photobiology, 1987, v. 46, 639-643; "Photoradiation Therapy. II. Cure of Animal Tumors With Hematoporphyrin and Light", Dougherty et al., Journal of the National Cancer Institute, July 1975, v. 55, 115-119; "Photodynamic therapy of C3H mouse mammary carcinoma with hematoporphyrin di-esters as sensitizers", Evensen et al., Br. J. Cancer, 1987, 55, 483-486; "Substituent Effects in Tetrapyrrole Subunit Reactivity and Pinacol-Pinacolone Rearrangements: VIC-Dihydroxychlorins and VIC-Dihydroxybacteriochlorins" Pandey et al., Tetrahedron Letters, 1992, v. 33, 7815-7818; "Photodynamic Sensitizers from Chlorophyll: Purpurin-18 and Chlorin p6 ", Hoober et al., 1988, v.48, 579-582; "Structure/Activity Relationships Among Photosensitizers Related to Pheophorbides and Bacteriopheophorbides", Pandey et al., Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 1992, v 2, 491-496; "Photodynamic Therapy Mechanisms", Pandey et al., Proceedings Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers (SPIE), 1989, v 1065, 164-174; "Fast Atom Bombardment Mass Spectral Analyses of Photofrin II(登録商標) and its Synthetic Analogs", Pandey et al., Biomedical and Environmental Mass Spectrometry, 1990, v. 19, 405-414。これらの論文の記載は、背景技術として本願明細書に含まれるものとする。
【０００７】
この領域における数多くの特許がこれらの光線力学的化合物に適用され世界中で付与されてきた。例えば、以下の米国特許第4,649,151号; 同第4,866,168号; 同第4,889,129号; 同第4,932,934号; 同第4,968,715号; 同第5,002,962号; 同第5,015,463号; 同第5,028,621号; 同第5,145,863号; 同第5,198,460号; 同第5,225,433号; 同第5,314,905号; 同第5,459,159号; 同第5,498,710号; 同第5,591,847号を参照することができ、これらの明細書の記載は本願明細書に含まれるものとする。
【０００８】
これらの化合物の1つ“フォトフリン(登録商標)”は、米国、カナダ、日本における使用が承認されている。これらの化合物の他のものも、少なくとも限定された、例えば、黄斑変性の治療のためのBPDが承認され、他のものは、臨床試験中か又はこのような試験が考慮されている。
【０００９】
本明細書に用いられる“ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン”という用語は、上記のように、また、背景技術として本願明細書に含まれている上述の論文や特許によって図と共に説明されるように、それらの誘導体や類似体を含むことを意味する。
【００１０】
このような化合物は、肝臓と脾臓を除くほとんどの正常な細胞や臓器よりも腫瘍に優先して蓄積するという注目すべき特徴を有することがわかった。更にまた、腫瘍が毒性になることを考慮して化合物を活性化することができることからこのような多くの腫瘍を死滅させることができる。
【００１１】
このような化合物は、癌細胞に優先的に吸収され、近赤外(NIR)吸収の優先的波長吸光度で光にさらされる際に癌細胞を破壊する。更に、このような化合物は、優先的吸収波長より長い波長で放射線を放出し、数センチメートルの組織を光が透過する。従って、拡散光伝搬の測定から表面下の組織における光感受性物質濃度を検出し数量化することが可能である。従って、PDT剤や他の蛍光物質と関連する、NIR吸光度、蛍光、蛍光減衰速度論における特別な変化に基づき、拡散NIR光を、罹患した表面下の組織を検出し画像化するために用いることができることが提唱された。画像増強電荷結合素子(CCD)による周波数領域光子移動(FDPM)を、蛍光コントラスト剤を用いて生体内での罹患した組織の検出に用いることができることが示されている。ポルフィリンベースの化合物は、上記のように、非常に蛍光性であるので、この特徴は光造影剤としてそれらの効用を調べるのに探求されてきた。都合の悪いことに、これらの化合物は、一般的には、このために適切な吸収と放出との間に充分な移動(“ストークシフト”)を示さないので、このような化合物は検出の良好な手段でない。即ち、このような化合物の蛍光発光波長は、それらの優先的吸光度の波長に近く、従って、検出妨害が生じる。
【００１２】
一方法は、例えば、"Carotene Analogs of Porphyrins, Chlorins and Bacteriochlorins as therapeutic and Diagnostic Agents"の米国特許第6,103,751号に記載されるように、より長い波長での発光を可能にするためにポルフィリン構造を修飾することであった。都合の悪いことに、ポルフィリンにカロテン部分を添加する作用は治療効果を低下させたので、治療的治療のためのその使用は非実用的であり、従って、このような構造は発光波長の改善と引きかえに有益な性質を損失することを予想せずに修飾することができないことを明らかにした。
【００１３】
しかしながら、ほとんどあらゆるタイプの癌、特にヒトに見られる初期の新生物の変化の診断に調べられ用いられてきた検出可能な波長で蛍光を発する多くの化合物が知られる。しかし、蛍光を発する化合物の活性化に対しても腫瘍又は生物体の外で検出すべき充分な透過を有する発光に対しても重大な優先的腫瘍吸光度の欠徐、毒性、充分な透過の欠徐を含むいくつかの因子のためにこのような方法において重大な問題点があった。更に、このような化合物は、おそらく検出可能性を有するが、腫瘍及び他の過剰増殖組織を破壊するように機能しない。
【００１４】
それ故、
1. 正常組織と相対して腫瘍組織が優先的に局在し、
2. 蛍光効率が高く、
3. 毒性、光毒性、発癌性又は催奇形性であってはならず、
4. 合成が容易でなければならず、
5. 化学的に純粋でなければならず、
6. 深在腫瘍が検出され得るように600〜800nmの範囲にある長波長吸収を有しなければならず、
7. 活性化によって局在する腫瘍を破壊しなければならず、
8.腫瘍が生体内蛍光分光法によって簡単に検出され得るように発光波長が優先的吸収波長から充分に分けられ(移動され)て重大な妨害を防止しなければならない、
生理的に適合する化合物が望ましい。
【００１５】
本発明は、正常組織に相対する腫瘍組織における優先的局在、約660〜900nmの波長における優先的電磁吸収、及び少なくとも+30nm、好ましくは少なくとも+50nmだけ優先的吸収から移動した波長における蛍光を有する化合物を含む。化合物は、更に、その優先的吸収波長で光にさらした場合に吸収される腫瘍組織を破壊することが好ましい。本発明の好ましい実施態様においては、化合物は、腫瘍親和性テトラピロール化合物と蛍光色素との結合体であり、より好ましくは、蛍光色素は、インドシアニン色素、例えばインドシアニングリーンである。腫瘍親和性テトラピロール化合物は、好ましくは、クロリン、バクテリオクロリン、プルプリン及びそれらの誘導体からなる群より選ばれるポルフィリン誘導体(ひとまとめにして“ポルフィリン”)であり、通常は下記一般式:
【００１６】
【化１】
2008506694.tif 000002
【００１７】
(式中、R1は、置換された又は置換されていない、-CH=CH2、-CHO、COOH又は
【００１８】
【化２】
2008506694.tif 000003
【００１９】
であり、ここで、R9 = -OR10であり、ここで、R10は炭素原子1〜8個の低級アルキル、又は-(CH2-O)nCH3であり; R2、R2a、R3、R3a、R4、R5、R5a、R7、R7aは、独立して水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、低級アルキレン又は置換された低級アルキレンであり、又は隣接の炭素原子について2つのR2、R2a、R3、R3a、R5、R5a、R7、R7aの基が共に結合して共有結合を形成することができ、又は同じ炭素原子について2つのR2、R2a、R3、R3a、R5、R5a、R7、R7aの基が2価のペンダント基に二重結合を形成することができ; R2とR3は、共に酸素、窒素又はイオウを含有する5又は6員複素環を形成することができ; R6は、-CH2-、-NR11-、ここで、R11は置換された又は置換されていない低級アルキル、又は低級アルキレンである; 又はR6は、共有結合であり; R8は、-(CH2)2CO2R12であり、ここで、R12は置換された又は置換されていない低級アルキル、低級アルキレン又は-NH2である。)を有する。
【００２０】
通常は、R1、R2a、R3、R3a、R4、R5、R5a、R7、R7a、R8、R9、R10、R11又はR12の少なくとも1つが、約800〜約900nmの波長で蛍光を発する色素で置換されている。蛍光色素は、結合体を800〜約900nmの波長で優先的に発光させる(蛍光を発する)あらゆる非毒性色素であってもよい。このような色素は、通常は、共役二重結合、芳香族炭素環、共鳴複素環、又はそれらの組合わせの中間共鳴構造によって共に接続される少なくとも2つの共鳴環構造、しばしば発色団を有する。
【００２１】
このような色素の例としては、ビスインドール色素が挙げられ、ここで、2つのインドール環構造又は変性インドール環構造は、前述したように中間共鳴構造によってそれぞれ炭素原子32と21で共に接続される。このような色素は、トリカルボシアニン色素として一般に知られる。このような色素は、ほとんど常に、色素を水溶性にする少なくとも1つ、通常は少なくとも2つの親水性置換基を有する。このような水溶性は、生物体やその細胞組織への構造に入ることを促進し、脂肪組織の貯蔵が減少すると共に系からの除去が速いことから毒性の可能性を減少させる。中間共鳴構造は、通常は共役二重結合である通常は複数の二重結合炭素原子を含有し、不飽和炭素環又は複素環を含有することもできる。このような環は、中間構造の共鳴をほとんど妨害せずにポルフィリン構造に結合させることを可能にする。
【００２２】
本発明は、更に、生物体に注入することにより腫瘍を検出するために本発明の化合物を用い、腫瘍組織への優先的吸収を充分な時間可能にし、吸収された化合物を優先的吸収波長の光にさらし、優先的に吸収された化合物から発光の位置を検出して、腫瘍組織を位置決めするための方法を含み、生物体への注入によって腫瘍組織を処理し、腫瘍組織への優先的吸収を充分な時間可能にし、吸収された化合物を優先的吸収波長の光にさらし、腫瘍組織を破壊させる方法を含んでいる。本発明による腫瘍組織の破壊が検出のための方法の一部で達成させることができることは理解すべきである。
ここで、本発明の種類と操作方式を、添付の図面と用いられる以下の発明の詳細な説明においてより充分に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２３】
“約660〜900nmの波長における優先的電磁吸収”は、約300〜900nmのUVバンドの範囲内でバンドの範囲内の他のあらゆるピーク吸光度の少なくとも2倍、通常は少なくとも3倍であるピーク吸光度が660〜900nmにあることを意味する。“少なくとも+30nm、好ましくは少なくとも+50nmだけ優先的吸収から移動した波長における蛍光”は、優先的吸収波長の励起から得られた、発光(蛍光)波長が、少なくとも30、好ましくは少なくとも50nmだけピーク吸光度波長から上方に移動することを意味する。本発明によれば不可欠でないが、化合物は、更に好ましくは、優先的吸収波長の光にさらされる場合に吸収される腫瘍組織を破壊する。このことは、化合物が優先的に吸収される癌組織内で一重項酸素の形成が局在するために起こると考えられる。
【００２４】
前述のように、本発明の好ましい実施態様においては、化合物は、蛍光色素と腫瘍親和性テトラピロール化合物の結合体である。このような色素としては、特に、ジインドール、約300〜900nmのUV波長範囲と約600〜約900nmの発光で又はその前後に好ましい吸光度を有するトリカルボシアニン型色素、例えば、インドシアニン色素が挙げられる。このような色素の一例は、インドシアニングリーンである。他の適切なジインドール型色素の一般構造は、以下の通りである。
【００２５】
【化３】
2008506694.tif 000004
【００２６】
(式中、R1d、R2d、R3d、R4dは、水素、スルホニル、アミノ、カルボキシ、ヒドロキシ又はアルキルであり; 但し、R1dとR3d、R2dとR4dは共に結合してシクロアルケニル、芳香族又は複素環構造を形成することができ; R5d、R6dは、独立して水素、アルキル、又は置換アルキルであり、ここで、置換基はカルボキシ、スルホニル、ヒドロキシル、アミド、アミノ、アルキルエステル、又はハロ又は酸性塩である; R7dは、共役二重結合の炭素鎖、又はアリール、不飽和シクロアルキル、及び共鳴不飽和複素環からなる群より選ばれる共鳴環であり、共鳴環は、ハロ、アミノ、又はカルボキシ基で置換されてもよく、nは、0〜3の整数である。)
上記構造の好ましい色素においては、R7dは、
【００２７】
【化４】
2008506694.tif 000005
【００２８】
であり、ここで、Xはハロゲンである。
本発明に従って用いられるタイプの色素の個々の例は以下の通り: インドシアニングリーン(ジインドール、即ち、トリカルボシアニン、色素); インドシアニングリーン820nm類似体CAS172616-80-7 (R7dは
【００２９】
【化５】
2008506694.tif 000006
【００３０】
である); ファストグリーンFCF(FD&Cグリーン3、トリフェニルメタン色素); スルファンブルー(トリフェニルメタン色素)、メチレンブルー(チアジン染料)である。
腫瘍親和性テトラピロール化合物は、通常はクロリン、バクテリオクロリン及びバクテリオプルプリンからなる群より選ばれる、好ましくはポルフィリン誘導体(実際にポルフィリンから誘導されてもされなくてもポルフィリン関連化合物を含む)である。好ましいポルフィリン誘導体は、通常は下記一般式:
【００３１】
【化６】
2008506694.tif 000007
【００３２】
(式中、R1は、置換された又は置換されていない、-CH=CH2、-CHO、COOH、又は
【００３３】
【化７】
2008506694.tif 000008
【００３４】
であり、ここで、R9 =-OR10、ここで、R10は炭素原子1〜8個の低級アルキルである、又は-(CH2-O)nCH3であり; R2、R2a、R3、R3a、R4、R5、R5a、R7、R7aは、独立して水素、低級アルキル、置換された低級アルキル、低級アルキレン又は置換された低級アルキレンであるか又は隣接の炭素原子について2つのR2、R2a、R3、R3a、R5、R5a、R7、R7aの基が共に結合して共有結合形成を形成してもよく又は同じ炭素原子について2つのR2、R2a、R3、R3a、R5、R5a、R7、R7aの基が2価のペンダント基に二重結合を形成してもよく; R2とR3は、共に酸素、窒素又はイオウを含有する5又は6員複素環を形成してもよく; R6は、-CH2-、-NR11-であり、ここで、R11は置換された又は置換されていない、低級アルキル又は低級アルキレンである; 又はR6は、共有結合であり; R8は、-(CH2)2CO2R12、ここで、R12は水素又は置換された又は置換されていない、低級アルキル、低級アルキレン、アルカリ又はアルカリ土類金属イオンである、又は約300〜900nmのUV波長範囲と約600〜約900nmの発光で又はその前後に好ましい吸光度を有する色素部分であるか、又はR8は、-(CH2)2COR12aであり、ここで、R12aは-NR2R2aであり、ここで、R2とR2aは前述した通りである、また、約300〜900nmのUV波長範囲と約600〜約900nmの発光で又はその前後に好ましい吸光度を有する色素部分を含んでもよい。)
【００３５】
通常はR1、R2a、R3、R3a、R4、R5、R5a、R7、R7a、R8、R9、R10、R11又はR12の少なくとも1つは、約800〜約900nmの波長で蛍光を発する色素部分で置換される。このような置換は、一般に、R12が水素、-NH2、又は-NHR13である場合、R8で起こり、ここで、R13は炭素原子1〜6個の低級アルキルである。
【００３６】
本発明は、更に、生物体に注入することによって腫瘍を検出するために本発明の化合物を用い、腫瘍組織への優先的吸収を充分な時間可能にし、吸収された化合物を優先的吸収波長の光にさらし、腫瘍組織を位置決めするために優先的に吸収された化合物からの発光の位置を検出するための方法を含み、生物体に注入することによって腫瘍組織を処理し、腫瘍組織への優先的吸収を充分な時間可能にし、吸収された化合物をその優先的吸収波長の光にさらして、腫瘍組織を破壊させる方法を含む。本発明による腫瘍組織の破壊は、検出のための方法の付属として達成することができることは理解すべきである。
【００３７】
本発明の化合物は、本質的に背景技術で上述したプルプリン、クロリン、バクテリオクロリンを含むポルフィリンのいずれかから容易に製造することができるが、このような化合物は、上述した適切な色素構造との結合に適した、遊離カルボン酸基又は遊離カルボン酸エステル基又は遊離カルボン酸塩基(まとめて“カルボキシ官能性”)を有する。発明の背景で述べた大部分のポルフィリンは、このような基を有する。また、色素は、望ましくは、色素が本発明のポルフィリン結合体を形成するためにカルボキシ官能性と遊離アミンで反応することができるように蛍光を発する特性に重要でない反応性アミン部位を有するか又は有するように修飾される。このような色素はまた、ポルフィリン構造上の基本的置換基と反応することができる反応性酸性部位を、例えば、スルホン酸又はカルボン酸部分の形で有することができ又は任意に有してもよい。
本発明の多くの結合体の一般式は、
【００３８】
【化８】
2008506694.tif 000009
【００３９】
(式中、R13は水素又はメチルであり; R8は、-COR17であり、ここで、R17は-OH、-ORn-NHRnであり、ここで、Rnは炭素原子1〜8個の低級アルキルである、又はR17は、前述したように色素部分であり; R14、R15、R16は、独立して水素、メチル又はエチルであり; R1、R2は、独立して-R9、-OR9、-C(R12)(O)、-C(R12)2OR9、-CH=CHR9、又は-(CH2)R10であり; R3は、-R9、-OR9、-C(R12)(O)、-C(R12)2OR9、-CH=CHR9、又は-(CH2)R10であるか又はR3と結合して=Oであり; R2aは、-R9、-OR9、-C(R12)(O)、-C(R12)2OR9、-CH=CHR9、又は-(CH2)R14であるか又はR3aと結合して化学結合であり; R3aは、-R9、-OR9、-C(R12)(O)、-C(R12)2OR9、-CH=CHR9、又は-(CH2)R10であるか又はR2aと共に結合して化学結合であるか又はR3と結合して=Oであり; R4は、R9、又は-OR9であり; R9は、各々の存在で独立して炭素原子1〜約10個の水素又は低級アルキル又は前述したように色素部分であり; R10は、アミノ酸残基であり; R11は、-R9、-R10、又は-C(O)NHR9であり; R4aとR4bは、各々の存在で独立して水素又は炭素原子1〜約4個の低級アルキルであり得るし、共に-C(R9)2C(Y)-、-C(O)O(O)C、-C(NR9)O(O)C、又は-C(O)N(R11)-C(O)-であってもよく、Yは、=O、=S又は2H-である; 但し、化合物は前述したように少なくとも1つの色素部分を含有する。)
である。
本発明の好ましい化合物は、以下の式:
【００４０】
【化９】
2008506694.tif 000010
【００４１】
(式中、置換基は前述のとおりである。)
で表すことができる。
前述したように、本発明による HPPHとインドシアニングリーン820nm類似体(1)を用いた好ましい化合物の調製を示す概略図の一例は、以下の通りであり、ここで、炭素原子a-d、f-g、m-oについての置換基は通常水素であるが、低級アルキルであってもよい。
【００４２】
【化１０】
2008506694.tif 000011
【００４３】
本発明の個々の好ましい化合物は、
【００４４】
【化１１】
2008506694.tif 000012
【００４５】
である。
本発明の一般的に多くの好ましい化合物は、以下の通り簡単に表すことができる。
【００４６】
【化１２】
2008506694.tif 000013
【００４７】
光感受性物質: ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、拡張ポルフィリン
R = 可変炭素単位をもつ炭素鎖を含有するアルキル基、スルホン酸基又はカルボキシル基
R2 = フッ素化置換基をもった又はもっていない種々の芳香族系
本発明の他の好ましい光感作性化合物は、以下の通り表すことができる。
【００４８】
【化１３】
2008506694.tif 000014
【００４９】
R = COOH
R1 = CONH-(CH2)n-光感受性物質
R = R1 = CONH-(CH2)n-光感受性物質
光感受性物質: ポルフィリン、クロリン、バクテリオクロリン、フタロシアニン、拡張ポルフィリン
R2 = ハロゲン
R3 = 可変炭素単位をもつ炭素鎖を含有するアルキル基、スルホン酸基又はカルボキシル基
R = CONH(CH2)nNH-葉酸
【００５０】
図1に見られるように、結合体5のUV可視部吸収スペクトルは、ピロフェオホルビド-a(HPPH)4の3-(1'-ヘキシルオキシエチル)誘導体と変性長波長吸収色素3にそれぞれ対応する408、660、830nmの特性吸収帯を示し、図2に最良に見られるように、665、710、860nmで広い発光バンドを示し、2つの発色団(HPPHと色素)を含有する結合体が単一分子のようにふるまっていることを表している。
【００５１】
結合体5の腫瘍の取込みは、生体内反射分光学によって求めた。これらの実験のために、RIF腫瘍をもつC3Hマウスに5.0μモル/kgの結合体5を注入し、生体内吸収スペクトルを種々の時間間隔で取った。図3からわかるように、結合体5は、注入24時間後の皮膚より腫瘍により著しい取込みを示す。注入3-4日後(図4)、結合体は、腫瘍濃度が著しく低下せずに皮膚から取り除かれた。対照的に、本明細書でICGと呼ぶインドシアニングリーン類似体(1)は単独で同じ用量(5.0μモル/kg)において腫瘍(腫瘍をもつC3Hマウス)が皮膚のより高い取込みを生じ、HPPH-ICG結合体5に匹敵し、ICG類似体単独は腫瘍取込みがかなり少なかった(図5)。ICG色素(1)は、注入4-5時間で腫瘍と皮膚から急速に取り除かれることがわかった。これらの結果は、結合体5において、HPPHが腫瘍に必要とされた光物理特性を有する色素を送達する賦形剤として役立つだけではなく、色素又は光感受性物質単独と比較して明らかに共役分子の全体の薬物動態学的特徴を変えることによって腫瘍の色素を保持する際の賦形剤としても役立つことが示されることは明らかである。
【００５２】
結合体5の生体内蛍光スペクトルは、可変濃度(10、5.0、2.5μモル/kg)での生体内蛍光分光法によって求めた。結果は、図6にまとめられている。典型的な実験において、結合体5を、各々のマウス(RIF腫瘍をもつ3匹のマウスのグループにおける)に10、5.0、2.5μモル/kgの用量で注入した。注入24時間後、660nmの吸収ピークが励起され、最長波長発光(830-890nmの幅広いバンド)が記録された。可変濃度において、飽和効果のために得られた蛍光は等しい強度が可能である。
【００５３】
光感作性効率を測定するために、5-7週間目の雌C3Hマウスの腋窩にRIF腫瘍を皮下注入した。腫瘍の大きさが約4〜5mm3に成長したとき、結合体5を可変量(0.5、1.0、1.5、2.5μモル/kg)で注入した。注入24時間後に、腫瘍を665nm (HPPHの生体内吸収バンド)の波長の135J/cm2のエネルギーの光によって処理し、マウスを毎日観察した。図7にまとめた結果から、結合体5が、2.5μモル/kg(腫瘍イメージング量)の用量で、100％の腫瘍治癒を生じたことがわかる。より低用量で、限られた光感作性効力が見られた。
【００５４】
一般に、ポルフィリンベースの化合物は、少なくとも幾分構造、親油性及び電荷によっては多様なパターンの局在を示した。リソソームとミトコンドリアの局在は、優性であることが報告された。しかしながら、ミトコンドリアにおいて主に局在する光感受性物質は、一般的にはより有効であることがわかった。それ故、HPPH-ICG結合体5 (2.5μモル/kg)の局在部位は、24時間インキュベートした後の既知のミトコンドリアプローブ(RIF腫瘍細胞(周知腫瘍細胞系)においてMITO-TRACKER(登録商標)グリーン(400nM)に匹敵した。図8に示される結果から、結合体5が、ミトコンドリア、光線力学療法(PDT)の細胞損傷により感受性がある部位に局在することが示されることは明らかである。図8のAは、ミトコンドリアにおける化合物5の局在を示す写真である。図8のBは、既知のミトコンドリアプローブの局在を示し、Cは、AとBをさかねたものを示す写真である。
【００５５】
結果から、腫瘍親和性ポルフィリンベースの光感受性物質が腫瘍特異的でない腫瘍に色素を送達するための賦形剤として用いることができるが、スペクトルのIR領域に強い発光を示すことがわかる。特イソシアニン誘導体と結合したHPPHは、露光した際に腫瘍を破壊する特性をなお保ちつつ蛍光によって検出を可能にする腫瘍が局在することがわかった。この結果は、同様の吸収特性と発光特性を有する他の色素によって結合した他のポルフィリンベースの光感受性物質の特性が予測される。従って、方法は、光感受性部分が、700-800nmの範囲の長波長吸収を示す一連の長波長腫瘍親和性光感受性物質に置き換えることができる種々の結合体を生じるための手段を提供する。化合物5と比較して、これらの他の結合体は、より長い波長吸収(700-800nm、HPPHの660nmの代わりに)で分子を励起すると共に860nmを超える波長で発光を検出する能力を示す。このことは、本発明の結合体によって与えられるユニークな利点である。更に、本発明の化合物は、適切な波長で光を送達するためにより少しの繊維を注入することによってより大きな腫瘍を処理するという利点がある。
【００５６】
本発明による物質腫瘍親和性光学イメージング剤の開発は、本質的に著しい進歩であるが、初めて本発明の二元機能の性質の化合物が診断続いて標的の光線力学療法の機会を提示し、2つの方式が単一のコスト効果的な“見て治療する”方法に組合わせられる。
以下の実施例は、本発明の化合物の合成のための好ましい方法を具体的に説明するものである。
【００５７】
ICG類似体3の合成:
市販の色素1(60mg)と4-アミノチオフェノール2(60mg)を乾燥DMFに溶解し、一晩撹拌した。溶媒を除去した後、残留物を溶離溶媒としてMeOH/CH2Cl2(1:3)を用いるシリカカラムクロマトグラフィによって精製し、中間体3を〜60％収量で得た。UV-vis: 830nm (MeOH中)(ε= 207,000). 1H NMR (CHCl3), δ (ppm) 9.0 (d, 2H, H-a), 8.2 (d, 2H, H-b), 8.0 (t, 4H, H-c), 7.62 (d, 4H, H-d), 7.48 (三重項に重なった2d, 2H, H-e), 7.12 (d, 2H, H-f), 6.70 (d, 2H, H-g), 6.35 (d, 2H, H-h), 4.30 (t, 4H, H-i), 2.95 (t, 4H, H-j), 2.80 (m, 4H, H-k), 2.00 (m, 10H, H-1の4H ), m, n, oの6H), 1.90 (s, 12H, H-p), 1.30 (s, H-q)。3(C52H56N3NaO6S3)のMS分析: 937, 実測値: 938
HPPH-ICG結合体5の合成:
【００５８】
ピロフェオホルビド(HPPH)のヘキシルエーテル誘導体4 (100mg)とDCCI (110mg)をDMF (1ml)に溶解した。10分間撹拌した後、DMF(2ml)中の3 (60mg)とDMAP (10mg)の溶液を添加した。反応混合物を24時間撹拌した後、ジクロロメタン(100ml)で希釈し、水洗(2×100ml)した。有機相を、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。ろ液から溶媒を除去した後に得られる残留物を溶離溶媒としてMeOH/CH2Cl2(1:3)を用いたクロマトグラフィによって精製し、所望の結合体5を〜65％収量で得た。UV-vis/H2O: 848 nm (ε = 975,47), 664 nm (ε = 53,800), 413 nm (ε = 101'456). UV-vis/MeOH: 833 nm (ε = 207, 455), 660 nm (ε = 53,856), 408 nm (ε = 95,222). 1H NMR (CHCL3), δ (ppm): 9.47 (s, 1H, HPPH部分のメソ-H), 8.46 (s, 1H, HPPH部分のメソ-H), 8.35 (br-s, 3H, HPPH部分のメソ-Hの1H, H-aの2H), 7.50 (m, 5H, H-bの1H, H-cの4H), 7.30 (m, 3H, H-bの1, Heの２H), 7.20 (s, 2H, H-f), 7.05 (s, 4H, H-d), 6.85 (s, 2H, H-g), 6.61 (s, 2H, H-h), 5.70 (br, 3H, H-31の1H, H-17の1H, H-18の1H), 4.54 (br-二重項, 1H, H-132), 4.22 (br, 2H, H-i), 3.66 (br, 2H, H-i), 3.52 (br, 1H, H-132), 3.20 (br, 9H, HPPH部分の5H: 7-CH3の3H, 31-OCH2(CH2)4CH3の2H, H-jの4H), 3.03 (m, 4H, H-k), 2.90 (s, 1H, -CONH-), 2.72 (br, 7H, 8-CH2CH3の2H, 17-CH2CH2CO-の2H, 2-CH3の3H), 2.55 (br, 5H, 17-CH2CH2CO-の2H, 12-CH3の3H), 1.88 (br, 3H, 3-CHCH3), 1.72-0.72 (多くの多重, 36プロトン,色素部分の22H: H-pの12H, H-1の4H, H-m, n, oの6H; HPPH部分の14 H: 18-CH3の3H, 8-CH2CH3の3H, 31-OCH2(CH2)4CH3の8H), 0.62 (m, 3H, 31-OCH2(CH2)4CH3. 結合体5(C91H102N7NaO9S3)のMS: 1555.7,実測値: 1556.7.
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】結合体5のUV可視スペクトルのグラフである。
【図２】660nmで励起されたときの結合体5の試験管内蛍光スペクトルである。
【図３】相対的蛍光による注入24時間後の腫瘍と皮膚による結合体5の相対的取込みを示すグラフである。
【図４】注入3-4日後の結合体5の相対的取込みを示すグラフである。
【図５】インドクザニン?類似体単独に相対する結合体5の腫瘍取込みを示すグラフである。
【図６】注入24時間後の種々の注入濃度での結合体5の生体内蛍光を示すグラフである。
【図７】種々の濃度で結合体5を用いた光力学的治療によって腫瘍治療の有効性を示すグラフである。
【図８】既知のミトコンドリアプローブと相対するミトコンドリアにおける結合体5の光感受性物質の局在を示す写真である。
【図９】注入24時間後、可変量でRIF腫瘍を移植した結合体5の生体内有効性を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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