(57)【要約】  本発明は、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の種の抗原を用いて、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対するブタの免疫化に関連している。
2008546658.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対するワクチンを製造するための、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の１以上の細菌種から得られた１以上の抗原調製物を含有している組成物の使用。
【請求項２】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記種が、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの１６ＳｒＲＮＡの配列に少なくとも９３％の配列同一性のある１６ＳｒＲＮＡの配列を有している細菌種である、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記種が、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・サロモニス、ヘリコバクター・ヘイルマニ（タイプ２）、ヘリコバクター・シノガストリカス、ヘリコバクター・ピロリ、またはヘリコバクター・ビゾゼローニからなる群から選択される、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記組成物が、ヘリコバクター・シノガストリカス、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・フェリス、もしくはヘリコバクター・ビゾゼローニからなる群から選択される、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の細菌種から得られた抗原調製物を含有している、請求項１〜３の何れか１項に記載の使用。
【請求項５】
前記抗原調製物が、完全に殺された細菌を含んでいる、請求項１〜４の何れか１項に記載の使用。
【請求項６】
前記抗原調製物が、弱毒化された細菌を含んでいる、請求項１〜５の何れか１項に記載の使用。
【請求項７】
前記抗原調製物が、処理された細菌調製物、および／または、人工の細菌調製物を含んでいる、請求項１〜６に記載の使用。
【請求項８】
前記抗原調製物が、細菌溶解物を含んでいる、請求項１〜７の何れか１項に記載の使用。
【請求項９】
前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでいる、請求項１〜８の何れか１項に記載の使用。
【請求項１０】
前記ワクチンが、経鼻投与されるためのワクチンである、請求項１〜９の何れか１項に記載の使用。
【請求項１１】
前記ワクチンが、皮下投与されるためのワクチンである、請求項１〜９の何れか１項に記載の使用。
【請求項１２】
前記ワクチンが、予防のために投与されるワクチンである、請求項１〜１１の何れか１項に記載の使用。
【請求項１３】
前記ワクチンが、治療のために投与されるワクチンである、請求項１〜１１の何れか１項に記載の使用。
【請求項１４】
１以上の細菌種から得られた１以上の抗原調製物の組成物を含有している、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対する免疫化のためのワクチンであって、前記細菌種がカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の種である、ワクチン。
【請求項１５】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記細菌種が、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの１６ＳｒＲＮＡの配列に少なくとも９３％の配列同一性のある１６ＳｒＲＮＡの配列を有している細菌種である、請求項１４に記載のワクチン。
【請求項１６】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記種が、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・サロモニス、ヘリコバクター・ヘイルマニ（タイプ２）、ヘリコバクター・シノガストリカス、ヘリコバクター・ピロリ、もしくはヘリコバクター・ビゾゼローニからなる群から選択される、請求項１４または１５に記載のワクチン。
【請求項１７】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記種が、ヘリコバクター・フェリス、もしくはヘリコバクター・ビゾゼローニである、請求項１４〜１６の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項１８】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記種が、ヘリコバクター・シノガストリカスである、請求項１４〜１６の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項１９】
前記抗原調製物が、完全に殺された細菌を含んでいる、請求項１４〜１８の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項２０】
前記抗原調製物が、弱毒化された細菌を含んでいる、請求項１４〜１９の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項２１】
前記抗原調製物が、処理された細菌調製物、および／または、人工の細菌調製物を含んでいる、請求項１４〜２０の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項２２】
前記抗原調製物が、細菌溶解物を含んでいる、請求項１４〜２１の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項２３】
前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んできる、請求項１４〜２２の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項２４】
１以上の細菌種から得られた１以上の抗原調製物を含有しているワクチンを動物に投与する工程を含んでいる、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの感染に対するワクチンを動物に接種するための方法であって、前記細菌種がカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁である、方法。
【請求項２５】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記細菌種が、カンジダタス・ヘリコバククター・スイスの１６ＳｒＲＮＡの配列に少なくとも９３％の配列同一性のある１６ＳｒＲＮＡの配列を有している細菌種である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記種が、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・サロモニス、ヘリコバクター・ヘイルマニ（タイプ２）、ヘリコバクター・シノガストリカス、ヘリコバクター・ピロリ、もしくはヘリコバクター・ビゾゼローニからなる群から選択される、請求項２４または２５に記載の方法。
【請求項２７】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記種が、ヘリコバクター・フェリス、もしくはヘリコバクター・ビゾゼローニである、請求項２４〜２６の何れか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗原調製物が、完全に殺された細菌を含んでいる、請求項２４〜２７の何れか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記抗原調製物が、弱毒化された細菌を含んでいる、請求項２４〜２８の何れか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記抗原調製物が、処理された細菌調製物、および／または、人工の細菌調製物を含んでいる、請求項２４〜２９の何れか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記抗原調製物が、細菌溶解物を含んでいる、請求項２４〜３０の何れか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでいる、請求項２４〜３１の何れか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ワクチンが、経鼻投与される、請求項２４〜３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ワクチンが、皮下投与、もしくは筋肉内投与される、請求項２４〜３２の何れか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ワクチンが、予防のために投与される、請求項２４〜３４の何れか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ワクチンが、治療のために投与される、請求項２４〜３４の何れか１項に記載の方法。
【請求項３７】
実験動物、または、モデル動物において、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの感染のための動物モデルを得るための方法であって：
ａ）カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに感染したブタの胃壁から細胞を分離する工程、
ｂ）前記細胞のホモジェネートを作製する工程、および、
ｃ）前記ホモジェネートを、前記実験動物、もしくはモデル動物の胃内に感染させる工程
を含んでいる方法。
【請求項３８】
登録番号ＬＭＧ Ｐ‐２３１００に基づいて寄託された、ヘリコバクター・シノガストリカス種の分離された細菌。
【請求項３９】
ワクチンの調製物の中にある、ヘリコバクター・シノガストリカス種の抗原調製物の使用。
【請求項４０】
ヘリコバクター・シノガストリカス種の分離株の抗原調製物を調製する工程を含有している、ワクチンを製造するための方法。
【請求項４１】
動物において、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの感染を検出するためのインビトロの方法であって：
ａ）前記動物の糞便試料を提供する工程、
ｂ）前記糞便試料からＤＮＡを分離する工程、
ｃ）カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の断片を増幅する工程、および、
ｄ）増幅された断片の存在を検出する工程
を含んでいる方法。
【請求項４２】
前記断片が、４００ｂｐよりも短い断片である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記増幅が、配列番号１および配列番号２を有しているプライマーを用いて実施される、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
〔発明の分野〕
本発明は、ヘリコバクター種による感染に対する動物の免疫化のためのツール、および方法に関するものである。
【０００２】
〔発明の背景〕
ヒトにおけるヘリコバクター（Ｈ．）・ピロリ（H. pylori）の感染は、胃潰瘍、十二指腸潰瘍、および胃癌の主な原因である。プロトンポンプ阻害物質、クラリスロマイシン、アモキシシリンによる３剤併用が、一次治療として推奨されている。これらの標準的な３剤併用は、特にヘリコバクター・ピロリが固有種である地域において、抗生物質に対する耐性、および感染症の再発という問題にますます直面している。動物モデルにおける様々な研究が、ヘリコバクター・ピロリに対する予防のためのワクチン接種と治療のためのワクチン接種との両方が実現可能であることを明らかにした（Del Guidice(2001) Annu. Rev. Immunol. 19, 523‐563 ;Sanchezら(2001)FEMS Immunol Med Microbiol.30, 157‐165）。感染されたマウスに発現し、このため、マウスの免疫システムに曝されているヘリコバクター・ピロリのタンパク質は、ヒトの感染において検出されるものと同様であると考えられる。このことは、マウスモデルが抗原候補を前臨床スクリーニングするのに適していることを示唆している（Bumann ら(2002)Inf. Imm. 70, 6494‐6498）。組換え型ウレアーゼを用いた免疫化は、局所的な血清免疫反応を誘発して、ヘリコバクター・ピロリの感染から防御することが発見された（Kleanthousら(1998) Inf. Imm. 66, 2879‐2886）。
【０００３】
ヘリコバクター・ピロリはヒトの胃粘膜にコロニー形成することができる病原菌だけではない。「ヘリコバクター・ヘイルマニ（H. heilmannii）」は、胃生検のおおよそ０．９６％において実際に観察された。前記ヘリコバクター・ヘイルマニは胃炎と強く関連しているが、消化性潰瘍、胃腺癌、および、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）リンパ腫とも関連している。
【０００４】
いくつかの研究は、超音波処理されたヘリコバクター・ピロリ抗原溶液による免疫化の後に、ヘリコバクター・フェリス（H. felis）の病原体接種に対する防御が引き起こされるのに、十分なヘリコバクター・フェリスとヘリコバクター・ピロリとの間の抗原交差反応を明らかにした（Lee&Chen(1994) Inf. Imm. 62, 3594‐3597; Michetttiら.(1994) Gastroenterology 107, 1002‐1011）。１つの研究は、ヘリコバクター・ヘイルマニ感染が、ヘリコバクター・ヘイルマニＵｒｅＢとヘリコバクター・ピロリＵｒｅＡＢとの両方によるワクチン接種によって予防できることを明らかにした。前記研究によって、ヘリコバクターの感染に対する防御免疫反応を、相同の、および異種のヘリコバクター・ウレアーゼによって誘発できることが、立証された。（Dieterichら(1999) Inf. Imm. 67, 6206‐6209）。
【０００５】
近年、ヘリコバクター・ヘイルマニは、単種を表すのではなく、同様の螺旋形態を有している異なる細菌種のグループを表していることが明らかになった。なお、上記細菌種の大部分は、おそらく人畜共通感染症が起源である。１６ＳｒＲＮＡ配列を基準にして、「ヘリコバクター・ヘイルマニ」は２つのタイプに分類されている（Solnickら(1993) J. Infect. Dis.168, 379‐385）。「ヘリコバクター・ヘイルマニ」タイプ２は、仮に同一でなければ、イヌ科、およびネコ科のヘリコバクター（Helicobacter spp.）、すなわちヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ビゾゼローニ（H. bizzozeronii）、およびヘリコバクター・サロモニスに密接に近縁である。しかしながら、ヒトにおける「ヘリコバクター・ヘイルマニ」の５０％を上回る感染は、「ヘリコバクター・ヘイルマニ」タイプ１によるものである。「ヘリコバクター・ヘイルマニ」タイプ１は、６０％よりも多い屠場豚（slaughterpigs）の胃にコロニー形成する螺旋形状の細菌であり、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス（Candidatus H. suis）」と同一であるということが、現在認められている（O’Rourkeら(2004) Int J Syst Evol Microbiol.54, 2203‐2212; De Grooteら(1999) Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 1769‐1777）。
【０００６】
文献において、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」のような、非プロリヘリコバクター株に対する、ワクチン誘導された防御の可能性に関する情報はほとんどない。「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」のインビトロでの培養は、現在は可能ではないが、マウスの接種を用いて、感染した豚の粘膜において、２年間よりも長くこの細菌を生きた状態で成長させること、および維持させることができる。（上記のMendesら(1991);Dickら(1989) J. Med. Microbiol. 29, 55‐62; Parkら(2003) J. Comp. Pathol. 129, 154‐160）。
【０００７】
〔発明の要旨〕
本発明は、ヘリコバクター種、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対するワクチンを動物に接種するための、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の種の抗原調製物の使用に関連している。
【０００８】
従って、本発明の第１の態様は、ヘリコバクター種、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対するワクチンを製造するための、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の１以上の種から得られた１以上の抗原調製物を含有している組成物の使用に関連している。より好ましくは、本発明の背景内に予見されたカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の細菌種は、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの１６ＳｒＲＮＡの配列に少なくとも９３％の配列同一性のある１６ＳｒＲＮＡの配列を有している細菌種である。特定の実施の形態によれば、用いられる組成物は、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・サロモニス、ヘリコバクター・ヘイルマニ（タイプ２）、ヘリコバクター・シノガストリカス、ヘリコバクター・ピロリ、またはヘリコバクター・ビゾゼローニからなる群から選択される、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の１以上の種から得られた１以上の抗原調製物を含有している。
【０００９】
本発明の特定の実施の形態によれば、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の種は、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ビゾゼローニ、ヘリコバクター・シノガストリカスから選択される。本発明のさらなる実施の形態は、ヘリコバクター種、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対する、ワクチンの調製物におけるヘリコバクター・シノガストリカスの抗原調製物の使用と関係している。
【００１０】
従って、本発明のさらなる態様は、ヘリコバクター（種）（Helibacter spp.）、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対する、動物のワクチン接種において、使用するためのワクチンを提供する。より好ましくは、本発明の背景内に予見されたカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の１以上の細菌種から得られた１以上の抗原調製物を含有している本発明のワクチンは、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの１６ＳｒＲＮＡの配列に少なくとも９３％の配列同一性のある１６ＳｒＲＮＡの配列を有している細菌種である。特定の実施の形態によれば、ワクチンは、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・サロモニス、ヘリコバクター・ヘイルマニ（タイプ２）、ヘリコバクター・シノガストリカス、ヘリコバクター・ピロリ、またはヘリコバクター・ビゾゼローニからなる群から選択されるカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の１以上の種から得られた１以上の抗原調製物を含有している。前記ワクチンはアジュバント、および／または、薬学的に許容可能な担体を必要に応じてさらに含んでもよい。
【００１１】
本発明のワクチンは、予防のための免疫化または治療のための免疫化のいずれかに使用することができる。また、適切なワクチン接種経路には、経鼻免疫、皮下免疫、および筋肉内免疫が含まれるが、これらに限定されない。適切なワクチン接種経路には、組み合わせた投与（例えば、経口／筋肉内の投与）が含まる。
【００１２】
本発明の特定の実施の形態によれば、ワクチンの調製物に用いられた抗原調製物は、細菌溶解物を含有している。代替案の実施の形態には、抗原調製物に、完全に殺された細菌、もしくは弱毒化された細菌が含有されているワクチンが含まれる、。さらに、もしくはもう代替案として、本発明のワクチンは、処理された細菌調製物、および／または、人工の細菌調製物を含んでいる抗原調製物を含有している。
【００１３】
本発明のさらなる態様は、ヘリコバクター（Helicobacter spp.）の感染、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスの感染に対するワクチンを、動物に接種するための方法であって、（予防のためのワクチン接種のために）感染が同定される前か、もしくは、（治療のためのワクチン接種として）感染が同定された後において、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の１以上の種から得られた１以上の抗原調製物を含有している組成物を、動物に投与する工程を含んでいる方法に関する。前記抗原調製物はアジュバント、および／または、薬学的に許容可能な担体と一緒に、必要に応じて投与される。本発明の方法の具体的な実施の形態は、ヘリコバクター・フェリス、および／またはヘリコバクター・ビゾゼローニ、および／またはヘリコバクター・シノガストリカスの調製物を含有している抗原調製物に関連している。さらに具体的には、用いられる前記抗原調製物は１以上のこれら細菌溶解物を含有しているが、他の実施の形態は、弱毒化された細菌、または処理された細菌調製物、および／もしくは人工の細菌調製物を含有している抗原調製物を含んでいる。本発明の方法は、本発明のワクチンの経鼻投与、もしくは皮下投与を含んでいてもよい。
【００１４】
本発明のさらなる１つの態様は、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの感染に関する動物モデル、より好ましくはマウスモデルに関連している。このモデルは、自然宿主以外の動物において、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスのインビボでの繁殖を行うことができる。このモデルは、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに感染された材料をマウスを感染させることによって、本発明に従って得られる。より好ましくは、このことは、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに感染したブタの胃壁から細胞を分離する工程、前記細胞のホモジェネートを必要に応じて作成する工程、および、前記細胞もしくは前記ホモジェネートをマウスの胃内に感染させる工程を含んでいる。マウスにおける感染、およびワクチン接種の効果を、糞便のＰＣＲによって経過観察することができる。
【００１５】
本発明のさらなる態様は、登録番号ＬＭＧ Ｐ‐２３１００に基づいて、寄託されたヘリコバクター・シノガストリカス種の分離された細菌に関連する。また、本発明は、ワクチンの製造における、ヘリコバクター・シノガストリカスの使用に関連している。
【００１６】
〔発明の詳細な説明〕
本発明は、特定の実施の形態、および特定の図を参照して記載されている。本発明は、請求項によってのみ限定されるものであって、それらに限定されない。
【００１７】
本発明はヘリコバクター（Helicobacter spp.）、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対するワクチン、およびワクチン接種方法に関連している。本発明は、ヘリコバクター（Helicobacter spp）、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに感染されやすい動物（特に家畜（牛、羊、馬など）、より好ましくはブタ、最も好ましくは養殖ブタ）にワクチンを接種するための特定のヘリコバクター種の抗原、および抗原調製物の使用に関連している。また、ヘリコバクター（Helicobacter spp）、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに感染されやすい、ヒト、サル、ウサギ、げっ歯類、ネコ、イヌなどの他の動物も、本発明の抗原調製物を用いてワクチン接種することができる。
【００１８】
本明細書に述べているような「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」は、「ヘリコバクター・ヘイルマニ」タイプ１として既知の細菌である（Trebesiusら(2001) J Clin Microbiol. 39, 1510‐1516）。前記「ヘリコバクター・ヘイルマニ」タイプ１は、６０％よりも多い屠場豚の胃にコロニー形成する螺旋形状の細菌であり、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」と同一であるということが、現在認められている（O’Rourkeら(2004) Int J Syst Evol Microbiol. 54, 2203‐2212; De Grooteら(1999) Int. J. Syst. Bacteriol. 49, 1769‐1777）。また、前記カンジダタス・ヘリコバクター・スイスは、分子レベルにおいて、ジェンバンク登録番号のＡＦ１２７０２８（上記D. De Grooteら（1999））およびＡＦ５０６７８８‐９２（上記O’Rourke（2004））の１６ＳｒＲＮＡ配列、ならびに、ジェンバンク登録番号ＡＦ５０８０１３‐ＡＦ５０８０１４（O’Rourkeら (2004) Int J Syst Evol Microbiol. 54, 2203‐2211）に示されるウレアーゼ遺伝子の配列を含有するヘリコバクター種としても定義されている。
【００１９】
本発明の目的に適した細菌種は、ヘリコバクター属のカンジダタス・ヘリコバクター・スイス以外の細菌、最も好ましくは、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスと同一ではないが、近縁の種である。
【００２０】
細菌種の背景において、「近縁の」というこの句は、好ましくは、分子生物学的パラメーターによって表される、系統発生関係を示すために、ここでは用いられている。さらに一般的に、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の細菌は、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの１６ＳｒＲＮＡ配列に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９５％、９８％、９９％の配列同一性のある１６ＳｒＲＮＡ配列を有している。もしくは代替案において示された、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の細菌は、ＤＮＡレベルにおいて、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスのウレアーゼ配列に少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％の配列同一性のある配列を有しているウレアーゼのコード配列を含有している。上述の基準（カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに少なくとも約９３％〜９９％間の配列同一性を持つ１６ＳｒＲＮＡ配列を有している）に基づいて、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに密接に近縁である」として同定された種を、それでもなお、他の基準（例えば、ここに述べられているような、全細胞のタンパク質のプロフィールなど）に基づいて、異なった種として同定することができる。カンジダス・ヘリコバクター・スイスの１６ＳｒＲＮＡ配列の照会は、ジェンバンク登録番号ＡＦ１２７０２８の１６ＳｒＲＮＡ配列に相当する。
【００２１】
本発明の背景において、用いられる「抗原調製物」は、動物に投与された際に、免疫反応を引き起こす、少なくとも１つのタンパク質、もしくはその断片（以下、「抗原」と記載する。）を含有している組成物に関連する。本発明の背景において、ワクチンとしての使用に関して、抗原調製物は、完全に殺された細菌、弱毒化された（弱った）細菌、または、処理された細菌調製物、および／もしくは人工の細菌調製物、あるいはそれらを組み合わせたものが含まれてもよい。処理された細菌調製物は、部分的に、もしくは、完全に精製された、および／もしくは前処理された細菌タンパク質の調製物を含有している。人工の細菌調製物は、例えば、合成の、もしくは組換えの方法によって、部分的に、もしくは完全に得られたタンパク質調製物を含有している。
【００２２】
特定の実施の形態によれば、本発明に従ってワクチン接種のために用いられる抗原調製物は、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の異なるヘリコバクター種から得られた１以上の抗原を含有している。適した抗原は、例えば、ウレアーゼ酵素、熱ショックタンパク質、ｃａｇＡおよびｖａｃＡを含有しているが、これらに限定されない。
【００２３】
本明細書に用いられている「ワクチン」は、本明細書に述べられた抗原調製物のような組成物のことをいう。前記抗原調製物は、その作用物質に起因して病気からヒトを守ることになる免疫反応を刺激するために投与される。本発明のワクチンは、治療のための（治癒のための）のワクチン（すなわち、疾患の悪化を減らすもしくは抑止することを意図して、感染後の動物に投与するためのもの）として、および防止のための（予防のための）ワクチン（初期（および／または再発）感染を防止することを意図して、感染の前に動物に投与する）としての両方の使用が意図されている。もう1つ別の他の種から得られた抗原を用いてある種に対する防御をするワクチン接種のことを、「交差ワクチン接種（cross‐vaccination）」、または「異種ワクチン接種（heterologous vaccination）」という。
【００２４】
本発明は、ヘリコバクター・ピロリＳＳ１、もしくはヘリコバクター・フェリスＣＳ１から得られた異種抗原を用いた、粘膜、および非経口のワクチン接種が、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の病原体接種に対する殺菌免疫ではなく、細菌負担における有意な減衰を誘発したという観察に基づいている。系統発生的に、ヘリコバクター・フェリスは、ヘリコバクター・ピロリよりも「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」により密接に近縁であるので（上述したDe Grooteら（１９９９））、異種のヘリコバクター・フェリスの免疫化において、より良好な結果を得ることを期待することができる。本発明は、これら二つのグループ間の防御レベルにおいて、重要ではないわずかな違いのみが観察されたということを実証する。
【００２５】
従って、本発明は異種ワクチンに関連する。すなわち、ヘリコバクター（Helicobacter spp.）、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスによる感染に対する防御を得るために、カンジダス・ヘリコバクター・スイスに近縁の種の抗原調製物の使用に関連する。
【００２６】
本発明に従って、ワクチン、および、当該ワクチンを用いたワクチン接種の目的は、ヘリコバクター（Helicobacter spp.）、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対する、完全な防御（殺菌免疫）を動物において得ることを包含している。しかし、前記目的は、（i）ワクチン接種の前と比較して、ならびに／または、(ii)本発明のワクチンを受けいれていない動物、および、同じ感染因子にさらされた／さらされていた動物と比較して、少なくとも２５％、４０％、６０％、８０％だけ、ヘリコバクター（Helicobacter spp.）、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスの細菌負担を減少させることも包含している。最も好ましくは、本発明は、長期間（例えば、少なくとも４、６、１０、１２週間、もしくは１２週間以上の間）の減少した細菌負担、または、防御効果を確実にする、ワクチン、およびワクチン接種の戦略に関連する。
【００２７】
動物における、そのような感染および／または細菌負担の同定と定量とは、さまざまな方法で実施されることができる。このことは、古典的に、体液、尿、または糞便の試料における、感染因子の存在、または、タンパク質、もしくは、ＤＮＡの配列を測定することによってなされる。その代替案としては、免疫システムの反応（例えば、感染因子のための抗体の存在）を測定することができる。本発明の特定の実施の形態によれば、ヘリコバクターの感染の正確な診断および定量は、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスＤＮＡの（例えば、先行技術（Fox and Lee (1997) Lab. Anim. Sci.47, 222‐255）に記載のＰＣＲによる）同定によって得られる。「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」はこれまでに培養できてないため、定量的ウレアーゼ試験が、前記カンジダタス・ヘリコバクター・スイスを定量するのに用いられていた。先行技術において、このアッセイは、マウスの免疫化の研究において、ヘリコバクター・ヘイルマニ、ヘリコバクター・フェリス、およびヘリコバクター・ピロリの感染に用いられた（Michettiら (1994) Gastroenterology 107: 1002‐1011; Kleanthous (2001) Vaccine 19, 4883‐4895; Saldingerら(1998) Gastroenterology 115, 891‐897）。このウレアーゼ試験は、培養後の細菌の数を決定するよりも感度が少ないということが分かった。
【００２８】
第１の態様によれば、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の１以上の種の抗原調製物が、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対する予防のための免疫、もしくは治療のための免疫を得るために用いられる。より好ましくは、本発明は、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対する１６ＳｒＲＮＡ、もしくはウレアーゼタンパク質の配列において、少なくとも９３％の配列同一性を持つ１以上の種の抗原調製物に関連している。本発明の特定の実施の形態によれば、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の種は、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ビゾゼローニ、ヘリコバクター・フェリス、およびヘリコバクター・サロモニから成る群から選択される種である。他の適切なヘリコバクター種は、ヘリコバクター・ビリス（H. bilis）、ヘリコバクター・フェネリアエ（H. fenelliae）、ヘリコバクター・パメテンシス（H. pametensis）、ヘリコバクター・ネメストリナエ（H. nemestrinae）、ヘリコバクター・ネメストリナエ、ヘリコバクター・パメテンシス（H. pametensis）、ヘリコバクター・アシノニチス（H. acinonychis）、ヘリコバクター・プロラム（H. pullorum）、ヘリコバクター・ムステラエ（H. mustelae）、ヘリコバクター・ヘパチカス（H. hepaticus）、ヘリコバクター・シナエディ（H. cinaedi）、およびヘリコバクター・カニス（H. canis）である。
【００２９】
また、本発明は、カンジダタス・ヘリコバクター・スイス（すなわち、本明細書の実施例において述べられているヘリコバクター・シノガストリカス）に対するワクチン接種に有用な株の特定の実施の形態を提供する。
【００３０】
特定の実施の形態よれば、抗原調製物は細胞の溶解物であり、すなわち、細菌細胞の溶解により得られた混合物である。細菌の細胞溶解物の特定の例は、超音波処理された細菌培養物の溶解画分（例えば、ろ過後に得られる溶解画分）である。その代替案として、もしくはさらに、細菌を、高圧力のホモジナイザー（例えば、Avestin model EmulsiFlexC5）を用いて断片化することができる。必要に応じて、前記細胞溶解物は、ホルマリン、もしくは同等の薬剤を用いて処理することによってさらに不活性化される。一般的に、溶解物中の全てタンパク質が、免疫反応を誘発するわけではない。その代替案として、本発明による抗原調製物は、濃縮された、または、精製された抗原の組成物を得るために、溶解物、もしくは細菌培養液から、１以上のタンパク質を分画、および／または精製することによって得られる。抗原調製物として使用される組換えタンパク質、もしくはその組換えタンパク質の断片が、本発明のコンセプトの範囲に含まれる。本発明の背景において、単離された、精製された、および／または、組換えられた細菌タンパク質の最も好ましい例は、熱ショックタンパク質、および／もしくはウレアーゼタンパク質である。
【００３１】
本発明のワクチンは、必要に応じて、本発明の抗原調製物のみを含んでいる。その代替案として、本発明のワクチンは、本発明の抗原調製物に加えて、適したアジュバントを含有していてもよい。アジュバントの種類は、抗原調製物の種類、および用いられる投与経路によって、変化する。本発明の特定の実施の形態によれば、超音波処理された抗原溶液の抗原調製物は、アジュバントとしてのコレラ毒素（ＣＴ）と一緒に経鼻投与されるか、または、アジュバントとしてのサポニンと一緒に皮下投与される。技術的に公知の任意のアジュバントが、ワクチン組成物に用いられてもよい。当該アジュバントには、油性のアジュバント（例えば、完全フロインドアジュバント、および不完全フロイントアジュバント）、ミコラーテ性のアジュバント（例えば、トレハロース・ジミコラーテ）、細菌性リポ多糖（ＬＰＳ）、ペプチドクリカン（すなわち、ムレイン、ムコペプチド、または糖タンパク質（Ｎ‐Ｏｐａｃａ、ムラミル・ジペプチド［ＭＤＰ］、もしくはＭＤＰ類似体など））、プロテオグリカン（例えば、クレブシエラ菌肺炎から抽出されたもの）、連鎖球菌調製物（例えば、ＯＫ４３２）、バイオスチム（Ｂｉｏｓｔｉｍ（登録商標））（例えば、０１Ｋ２）、欧州特許第１０９ ９４２号明細書、欧州特許第１８０ ５６４号明細書、および欧州特許第２３１ ０３９号明細書に記載の「イスコムス（Iscoms）」、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥ‐デキストラン、中性油（例えば、ミグリヨル（miglyol））、植物油（例えば、ラッカセイ油）、リポソーム、プルロニック（Pluronic）（登録商標）が含まれる。アジュバントには、特に限定されないが、ＲＩＢＩアジュバントシステム（Ribi Inc.）、ミョウバン、水酸化アルミニウムゲル、コレステロール、水中油型乳剤、油中水乳剤（例えば、完全フロインドアジュバント、および不完全フロイントアジュバント）、ブロック・コポリマー（Block co‐polymer）（CytRx, AtlantaGA）、ＳＡＦ‐Ｍ（カイロン（Chiron）、Emeryville CA）、ＡＭＰＨＩＧＥＮ（登録商標）アジュバント、サポニン、ＱｕｉｌＡ、ＱＳ‐２１（Cambridge Biotech Inc.、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）, GPI‐0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.、バーミンガム、アラバマ州)、もしくは他のサポニンの画分、モノホスホリル脂質Ａ、アブリジン・脂質アミンアジュバント、大腸菌から得られた（組換え、またはその他の）易熱性エンテロトキシン、コレラ毒素、あるいはムラミル・ジペプチドが含まれる。特定の実施の形態によれば、大腸菌の易熱性毒素の組換え突然変異体は、動物に注入される前の抗原調製物に加えられる。
【００３２】
他の態様によれば、本発明は、本明細書に述べられたようなヘリコバクター（Helicobacter spp.）、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対する予防のための免疫、もしくは治療のための免疫を得るための本発明のワクチンの使用に関する。
【００３３】
第１の実施の形態によれば、本発明は、ヘリコバクター（Helicobacter spp.）、より好ましくはカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対する、一過性よりも長い防御を確実にする予防のためのワクチン接種において使用するための、抗原調製物を提供する。予防のために免疫されたマウスの一過性感染は、ヘリコバクター・ピロリのモデルにおいて一度報告されただけである（Garhartら2002, Infect.Immun.70:3529‐3538）。本発明は、長期の防御という発展を明示した。このことは、糞便の試料において、感染を検出するための方法（特に、検出のために発達した方法）によって行われる。ＰＣＲは、後の時点に収集された糞便の試料に対して解析され、これにより、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」が存在する胃において、コロニー形成の痕跡がわかる。ＰＣＲ反応は、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の小さな断片に対して行われる。通常は、前記断片の長さは、４００ｂｐよりも短い（例えば、２００〜４００ｂｐの断片、２００〜１００ｂｐの断片、もしくは１００〜５０ｂｐの断片である。より好ましくは前記断片は、ＰＣＲ増幅に関する、種特異的な配列を含有している。これによって、糞便の試料における、特異的なヘリコバクター種の低下した１６ＳｒＲＮＡの検出が可能になる。１６ｒＲＮＡのより長い断片または全長（胃の試料において検出されるようなもの（上述のDe Grootteら（2000））など）は、ブタの糞便の試料において検出されないことがある。免疫されていないマウスと比較して、免疫されたマウスにおける感染後の１週間後から、ヘリコバクターのＤＮＡの排出が減少すること、および、免疫されたマウスにおけるコロニー形成は、免疫されていないマウスにおけるコロニー形成と同じレベルに決して達しないということが、本明細書で実証された。
【００３４】
もう１つ別の態様において、本発明は、生物が自身の利益のために、宿主の免疫反応にすでに適応しているときの、治療的免疫化のための方法に関連している。
【００３５】
本発明の抗原調製物またはワクチンを、（例えば、粘膜（経鼻）投与、非経口投与、もしくは筋肉内投与、経口投与、皮膚内投与、腹腔内投与、静脈内投与、または皮下投与による）任意の適した経路を介して投与することができる。適切なワクチン接種経路もまた、投与の組み合わせ（例えば、経口／筋肉内投与）を包含している。本発明の特定の実施の形態によれば、治療のための免疫化は、本発明の抗原調製物の非経口投与によって実行される。非経口的な免疫化は、ヘリコバクター感染によって、１つの所定の指示により抗原刺激されている、全身に由来する細胞を結集することができる（Guyら (1999) Vaccine 17, 1130‐1135）。本発明のもう１つ別の特定の実施の形態によれば、筋肉内投与が、効率的なワクチン接種のために用いられる。
【００３６】
本発明における抗原を、単一で、もしくは適した薬学的担体と一緒に投与することができるし、固体、もしくは液体（タブレット、カプセル、粉末、溶液、懸濁液、または乳濁液など）にすることができる。
【００３７】
固体の単位用量形態は、従来の形式であってもよい。固体の形態は、カプセル、および担体であってもよい。カプセルには本発明のタンパク質もしくはペプチド、抗体、または、本発明のそれらが結合している部分、および、担体を含有している普通のゼラチンの形式である。上記担体としては、例えば、潤滑油、不活性充填剤（例えば、ラクトース、スクロース、もしくはデンプン）が挙げられる。もう１つ別の実施の形態において、これらの化合物は、接着剤、崩壊剤および潤滑油と組み合わせられた、従来の錠剤基剤によって錠剤化されている。前記接着剤には、アカシア、コーンスターチ、またはゼラチンが含まれている。前記崩壊剤には、コーンスターチ、片栗粉、もしくはアルギン酸が含まれている。前記潤滑油には、ステアリン酸もしくはステアリン酸マグネシウムが含まれている。従来の錠剤基剤には、例えばラクトース、スクロース、もしくはコーンスターチが含まれている。
【００３８】
また、本発明の抗原は、薬学的担体を有する生理学的に許容可能な希釈剤中にある、これら材料の溶液もしくは懸濁液によって、注入可能な用量で投与されてもよい。前記担体は、界面活性剤および薬学的に許容可能な他のアジュバントが添加されているか、または、されていない、無菌液（水および油など）を含んでいる。上記油は、例えば、石油、動物、植物、もしくは、合成に由来するものであり、ピーナッツ油、大豆油、もしくは、鉱油などである。一般的に、水、生理食塩水、水性Ｄ型グルコース、および、関連砂糖水、ならびに、グリコール（プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコール）が、特に注入可能な溶液のための、好ましい液体の担体である。
【００３９】
エアゾールとしての使用について言えば、溶液もしくは懸濁液中にある本発明の抗原は、従来のアジュバントと、適した高圧ガス（例えば、プロパン、ブタン、もしくはイソブタンのような炭化水素高圧ガス）と一緒に、加圧されたエアゾール容器に詰め込まれてもよい。本発明の材料もまた、ネブライザー、もしくはアトマイザーのような加圧されていない形態において投与されてもよい。
【００４０】
本発明のさらにもう１つ別の態様によれば、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスによる感染のための、インビボの動物モデルが提供される。本発明は、実験動物、またはモデル動物（マウスなど）において、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの感染を得るための方法を提供する。上記方法は、感染した動物（より好ましくは感染したブタ）の胃壁から得られた細胞のホモジェネートを、実験動物またはモデル動物に、胃内に接種する工程を含んでいる。特定の実施の形態によれば、細胞層の上部、および粘液は、幽門からかき落され、そして、均質化される。さらなるもう１つ別の特定の実施の形態によれば、感染された動物の胃壁から得られた材料は、凍結乾燥の培地（２ボリュームのウマ血清、１ボリュームのＢＨＩブロス、および１０％グルコース）（ＬＹＭ）中に均質化される。必要に応じて、より大きい粒子は、遠心分離法によって取り除かれる。特定の実施の形態によれば、感染された、実験動物、もしくはモデル動物からそのようにして得られた胃は、同じ動物モデルにおいて、少なくともさらに２回の処理（passage）するために、再び切り裂かれ、そして、均質化される。感染は、本明細書に述べられたような糞便ＰＣＲによって、必要に応じて経過観察される。
【００４１】
〔図面の簡単な説明〕
以下に示す図は、本発明を説明する実施の形態を示す。
【００４２】
図１は、本発明の１つの実施の形態に従って、マウスから得られたカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに感染されたブタ（ｎ＝５）、および、対照（ｎ＝５）から得られた、異なる位置の胃組織（噴門、胃底、幽門）に対する、定量的ウレアーゼアッセイを示す図である。
【００４３】
図２は、本発明の１つの実施の形態に従って、「カンジダダス・ヘリコバクター・スイス」に感染してから１‐１６週間後の、免疫されていないマウス（▲）と比較した、ヘリコバクター・ピロリ抗原（◆）、もしくはヘリコバクター・フェリス抗原（◇）を経鼻免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの糞便における「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ＤＮＡの排出を示す図である。前記排出は、グループ当たりのＰＣＲにおける陽性のマウスの比率として表わした。
【００４４】
図３は、本発明の１つの実施の形態に従って、「カンジダダス・ヘリコバクター・スイス」に感染してから１‐１６週間後の、免疫されていないマウス（▲）と比較した、ヘリコバクター・ピロリ抗原（◆）、もしくはヘリコバクター・フェリス抗原（◇）を皮下免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの糞便における「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ＤＮＡの排出を示す図である。前記排出は、グループ当たりのＰＣＲにおける陽性のマウスの比率として表わした。
【００４５】
図４は、本発明の１つの実施の形態に従って、ヘリコバクター・ピロリ抗原、もしくはヘリコバクター・フェリス抗原によって経鼻免疫されたマウスから得られた胃組織における定量的なウレアーゼ活性を示す図である。上記ウレアーゼ活性は、ＯＤ値（５５０ｎｍ）として表されている。実線は、実験された各グループに対する相乗平均を表している。（Ｃｓ）は、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」に感染した病原体接種の動物を表し、（Ｃｐ）はヘリコバクター・ピロリに感染した病原体接種の動物を表し、（Ｃｆ）は、ヘリコバクター・フェリスに感染した病原体接種の動物を表し、（ＩＮ，ｐ）は、ヘリコバクター・ピロリ抗原による経鼻的な免疫化を表し、（ＩＮ，ｆ）はヘリコバクター・フェリス抗原による経鼻的な免疫化を表す。
【００４６】
図５は、本発明の１つの実施の形態に従って、ヘリコバクター・ピロリ（ＳＣｐ）抗原、もしくはヘリコバクター・フェリス（ＳＣｆ）抗原によって皮下内に免疫されたマウスから得られた胃組織における定量的なウレアーゼ活性を示す図である。上記ウレアーゼ活性は、ＯＤ値（５５０ｎｍ）として表されている。実線は、実験された各グループに対する相乗平均を表している。各ヘリコバクター（Helicobacter sp.）に対する免疫された病原体接種の動物と免疫されていない病原体接種の動物との有意差（Ｐ＜０．０５）は、文字「ａ」で示されている。（Ｃｓ）は、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」に感染した、病原体接種の動物を表す。
【００４７】
図６は、本発明の特定の実施の形態に従って、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の病原体接種から３週間後に、ヘリコバクター・フェリスＣＳ１抗原、もしくはヘリコバクター・ビゾゼローニ抗原によって経鼻免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの糞便における「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ＤＮＡの排出を示す図である。前記排出は、ＰＣＲにおける陽性のマウスの比率として表わした。実験の条件の違いは、表１に詳細に示されている。
【００４８】
図７は、胃組織における、定量的なウレアーゼ活性を示す図である。上記ウレアーゼ活性はＯＤ値（５５０ｎｍ）として表されている。実線は、実験された各グループに対する相乗平均を表している。免疫されておらず、病原体接種された動物（グループ９）と免疫された動物とのウレアーゼ活性における有意差（Ｐ＜０．０５）は、グループ１、およびグループ２に観察され、それぞれ「ａ」で示されている。グループ１とグループ２との両方は、超音波処理されたヘリコバクター・フェリス抗原溶液、もしくはヘリコバクター・ビゾゼローニ抗原溶液によって経鼻的に免疫されている。実験の条件の違いは、表１に詳細に示されている。
【００４９】
図８Ａは、ヘリコバクター・フェリス抗原（ブタにおける血清学データ）（グループ１：■、２：◆、３：▲）、およびヘリコバクター・ビゾゼローニ抗原（グループ４：●）（アジュバントのみ：＿）によるワクチン接種後のヘリコバクター・フェリス抗原に対する血清転換（serumconvertion）（ｓ／ｐ値）を示す図である。Ｐｒｅは免疫化前を表し、１Ｘは最初の免疫化から３週間後を表し、２Ｘは２回目の免疫化から２週間後を表す。
【００５０】
図８Ｂは、ヘリコバクター・フェリス抗原（グループ３：▲）、およびヘリコバクター・ビゾゼローニ抗原（グループ４：●）（アジュバントのみ：＿）によるワクチン接種後のヘリコバクター・ビゾゼローニ抗原に対する血清転換（ｓ／ｐ値）を示す図である。Ｐｒｅは免疫化前を表し、１Ｘは最初の免疫化から３週間後を表し、２Ｘは２回目の免疫化から２週間後を表す。
【００５１】
図９Ａは、ヘリコバクター・シノガストリカス、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ビゾゼローニ、ヘリコバクター・サロモニス（H. salomonis）、およびヘリコバクター・フェリスの参考株の全細胞タンパク質のプロフィール（Ｂ）の数値解析に由来する系統図（Ａ）を示す図である。
【００５２】
図９Ｂは、１６ＳｒＲＮＡ配列の比較に基づく類似性の行列を示す図である。
【００５３】
図１０は、１６ＳｒＲＮＡ配列の類似性に基づく、２５株のヘリコバクター種に関する系統樹を示す図である。縮尺目盛は、任意の２つの種につながっている水平線の長さを測ることによって測定されたときの、ヌクレオチド配列における１０％の違いを表す。
【００５４】
図１１は、ヘリコバクター・シノガストリカスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のゲノム配列を示す図である。
【００５５】
本発明は以下の実施例に説明されているが、それらに限定されない。
【００５６】
〔実施例〕
[一般的手法]
（マウス）
動物を含め、全ての実験は、Ghent大学獣医学部病理学科のthe Animal Care and Ethics Committeeによって承認されている。５週齢の雄のＳＰＦ  ＢＡＬＢ／ｃマウスを、認可されているブリーダー（HARLAN、ホルスト、オランダ）から購入した。オートクレーブ滅菌されており、フィルターでふたされているケージの中で、動物を個別に飼育し、市販の餌（TEKLAD, HARLAN）および水を適宜与えた。１週間の適応期間の後、動物を実験に用いた。
【００５７】
（ワクチン接種のための抗原）
１０％のウマ血液、５ｍｇ／ｍｌのアンフォテリシンＢ、１０ｍｇ／ｍｌのバンコマイシン、５ｍｇ／ｍｌの乳酸トリメトプリム、および、２５００ｕｎｉｔｓ／ｌのポリミキシンＢ（Skirrow,カンピロバクター選抜補助剤, Oxoid）ならびにVitox supplement (Oxoid)が添加されているブレインハートインヒュージョン（brain heart infusion）（BHI, Oxoid, 英国）寒天培地上で、ヘリコバクター・ピロリSS1、ヘリコバクター・フェリス CS1 (ATCC 49179)およびヘリコバクター・ビゾゼローニ (CCUG 35545)を培養した。プレートを、微好気性３７℃の条件下でインキュベートした。免疫化に用いる抗原は、３日目の培養物を、無菌のリン酸緩衝生理食塩水に回収することにより調製した。細菌の懸濁液を超音波破壊した（５０％出力にて、３０秒を８回、Misonix, Incorporated、米国）。遠心（５０００ｇ、５分、４℃）後、０．２２−μｍの孔サイズのフィルター（Schleisser Schuell, Dassel, ドイツ）を用いて、上清をろ過し、−７０℃にて保存した。その後、タンパク質の濃度をローリー法（Lowryら(1951) J. Biol. Chem. 193, 265-275）によって決定した。
【００５８】
寒天培地上の細菌培養物を、０．２％のスキロウ（Skirrow）、０．６％のビトックス（Vittox）および１０％のウマ血清が補充されているＢＨＩブロスに移して、ホルマリン不活化した細菌培養物を調製した。３７℃で２４時間インキュベートした後、０．５％のホルムアルデヒドを添加し、さらに３７℃でインキュベートした。添加してから２４時間後、培養液を４℃に冷却し、無傷の細菌がいるかどうかを顕微鏡下でチェックした。２０％の０．１６６Ｍ  亜硫酸水素ナトリウムを添加して、ホルムアルデヒドを中和した。その後、タンパク質の濃度をローリー法によって決定した。
【００５９】
（経鼻免疫化）
４５匹のマウスを、１グループ６匹の動物からなる７つのグループ（グループ１−７）および、３匹の動物からなる１つのグループ（グループ８）に分けた。グループ１および３の全ての動物に対してヘリコバクター・フェリスＣＳ１を経鼻免疫し、グループ２および４の全ての動物に対してヘリコバクター・ピロリＳＳ１を経鼻免疫した。免疫化は、３週間の間隔をおいて２回おこなった。経鼻免疫化は、５μｇのコレラ毒素（List、キャンベル、カリフォルニア州、米国）を混合した、超音波破壊抗原１００μｇを含む溶液１００μｌを、麻酔していないマウスの外鼻腔に投与することによっておこなった。グループ５、６、７および８のマウスには免疫しなかった。最後の接種から４週間後、グループ２および５の全ての動物、ならびにグループ１および６の全ての動物に、ヘリコバクター・ピロリまたはヘリコバクター・フェリスを、それぞれ病原体接種した。病原体接種試験は、０．３ｍｌの細菌懸濁液を胃内接種することによりおこなった。この同種ワクチン接種の実験は、対照の役割を果たす。同時に、グループ３、４および７の全ての動物に、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」を胃内接種した。このために、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の冷凍ストックを、３７℃で１５分間保持した。
【００６０】
細菌のＤＮＡが存在するか調べるために、病原体接種から１、２、４、５、６、７、９、１１、１３、および１５週目の間に、連続した３日間、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」を接種したそれぞれのマウスから糞便を回収した。後述するように、糞便試料についてＰＣＲをおこなった。
【００６１】
病原体接種から１６週間後、全ての動物をイソフルレン麻酔（IsoFLo, Abbot、イリノイ州、米国）した後、頚椎脱臼により安楽死させた。後述するように、全ての動物について、胃の半分を定量的ウレアーゼ試験（上記で引用したCorthesy-Theulazら(1995)）に使用した。もう半分から、胃底部の２ｍｍ２の組織試料を凍結（−２０℃）し、後述するように、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」（グループ３、４および７からの試料）、ヘリコバクター・フェリス（グループ１および６からの試料）、またはヘリコバクター・ピロリ（グループ２および５からの試料）に特異的なＰＣＲに使用した。
【００６２】
（皮下免疫化）
２１匹のマウスを、１グループ６匹の動物からなる３つのグループ（グループ１‐３）、および３匹の動物からなる１つのグループ（グループ４）に分けた。グループ１および２の動物に対して、ヘリコバクター・ピロリまたはヘリコバクター・フェリスをそれぞれ免疫した。免疫化は、３週間の間隔をおいて３回おこなった。このために、超音波破壊した細菌抗原１００μｇを含んだ溶液１００μｌを同量のサポニンアジュバントと混合し、それを動物の背下部に皮下注射した。最後の接種から４週間後、グループ１、２および３の動物に、プロトコール１の手法により、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」を感染させた。グループ４の動物は、免疫しなかったか、または病原体接種しなかった。実験期間中、グループ１、２および３からの糞便のサンプリングをプロトコール１の手法によりおこない、調査の最後に、全ての動物からの胃物質のサンプリングをプロトコール１の手法によりおこなった。
【００６３】
（病原体接種実験に使用するための、インビボシステムでのカンジダタス・ヘリコバクター・スイスの調製物）
食肉処理場からブタの胃を３０個得た。この胃を開いて、残存している食べ物を、オートクレーブ滅菌した水道水（３７℃）で洗い流した。「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」がいるかどうかを調べるために、洞（幽門隆起（torus pyloricus）から１ｃｍ）からの粘膜の断片を採取した。この断片の半分を、迅速ウレアーゼ試験（CUT, Temmler Pharma, Marbug、ドイツ、３７℃で１時間）に用いた。残りの半分を凍結（−２０℃）し、ウレアーゼ試験の確認のための、ＰＣＲによる「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の特異的検出（De Grooteら(200) J. Clin. Microbiol. 38, 1131-1135）に使用した。ウレアーゼ試験によって最も速く陽性結果がでる胃について、第一段階に進めた。したがって、上部細胞層および粘膜を洞から削り取った。削り取ったものを凍結乾燥の溶媒（２倍量のウマ血清、１倍量のＢＨＩブロス、および１０％グルコース）（ＬＹＭ）中で均質化した。ついで、大きな粒子を取り除くために、ホモジェネートを遠心（５０００ｇ、５分）した。上清をＬＹＭで１／１０に希釈し、３匹のＢＡＬＢ／ｃマウスに胃内接種した。２週間後、３匹のマウスを安楽死させ、胃の中を空にし、迅速ウレアーゼ試験のために胃底部の組織試料を採取した。ウレアーゼ陽性の胃を、ＬＹＭ（５ｍｌ ＬＹＭ／胃）中で均質化した。この第一の処理（passage）の後、さらに２度のマウスの処理（passage）をおこなった。最終的に、感染した１５匹のマウスの胃のホモジェネートを−７０℃で凍結した。
【００６４】
（病原体接種実験に使用するためのヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスの調製物）
ヘリコバクター・ピロリＳＳ１またはヘリコバクター・フェリスＣＳ１を、ＢＨＩ寒天培地上、微好気性３７℃の条件下で静かに培養した。３日後、細菌を回収し、０．２％のスキロウ、０．６％のビトックスおよび１０％のウマ血清が補充されているＢＨＩブロスに移し、微好気性３７℃の条件下で静かに２４時間インキュベートした。吸光度（４５０ｎｍ）が１．５のヘリコバクター・ピロリ細菌懸濁液、および吸光度（６６０ｎｍ）が１．５のヘリコバクター・フェリス細菌懸濁液を、結果的としてＢＨＩブロスに調製した。力価測定して確かめたところによれば、これは、約１０７ｃｆｕ／ｍｌのヘリコバクター・ピロリ、および約１０８ｃｆｕ／ｍｌのヘリコバクター・フェリスに相当する。
【００６５】
（統計分析）
ＰＣＲによって決定した糞便中の細菌の存在を、一般混合モデルを用いて処理グループの間で比較した。一般混合モデルでは、ＰＣＲの確実性をバイナリ応答変数（binary response variable）とし、時間および処理をカテゴリー固定効果（categorical fixed effects）とし、マウスをランダム効果（random effect）とした。免疫していないグループと、ヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスを免疫したグループとの間でのペアワイズ比較を、全体の有意水準を５％、comparison wise有意水準を１．３％（３群の比較のボンフェローニ法（Bonferroni's technique）によって調整）としておこなった。
【００６６】
「ＯＤ値」を応答変数として、「処理グループ」を固定効果として、固定効果モデル（fixed-effect model）を用いて定量的ウレアーゼ試験の比較をおこなった。処理グループの間でのペアワイズ比較を、多重比較のためのボンフェローニ法を再び用いて、全体の有意水準を５％としておこなった。
【００６７】
図７に示す定量的ウレアーゼ試験について、ステゥーデントのｔ検定により処理グループ間での比較をおこなった。
【００６８】
〔実施例１  ブタのカンジダタス・ヘリコバクター・スイスへの感染実験〕
５週齢のブタ（ｎ＝１０）を、カンジダタス・ヘリコバクター・スイス陰性である特定病原体未感染（ＳＰＦ）の繁殖ユニットから購入し、各グループ５匹になるように、対照グループ（グループＡ）と感染グループ（グループＢ）とにランダムに分けた。１週間の適応期間の後に、ブタを実験に用いた。病原体を接種する前に、全てのブタに対して、胃酸の産生を減少させるために６０ｍｇ／ｋｇのシメチジンを筋肉注射し、麻酔をおこなった。グループＡは対照グループであり、にせの物質（感染していないＢＡＬＢ／ｃマウスのウレアーゼ陰性の胃からの接種材料）を、７日目、１４日目、２１日目に接種した。グループＢは、カンジダタス・ヘリコバクター・スイス（カンジダタス・ヘリコバクター・スイスが感染しているマウスの胃のホモジェネート）を、７日目、１４日目、２１日目に接種した。細菌懸濁物が十二指腸を通過するのを遅らせるため、マウスの胃のホモジェネートを投与する直前および投与した直後に、１０％のウシ胎仔血清および０．７５％の寒天が補充されたブルセラブロス（Becton Dickinson, Erembodegem、ベルギー）をブタの胃内に接種した。胃粘膜が細菌に曝される時間が引き延ばされることにより、胃がヘリコバクター菌のコロニー形成の影響を受けやすくなると考えられる。
【００６９】
３回目の接種から５週間後に全ての動物を安楽死させ、すぐに死体解剖をおこなった。死体解剖において、胃を摘出した。食道部（Pars oesophagea）の粘膜面を肉眼により検査し、Hessingら(1992)の方法を用いて、傷害を０‐５の基準によりスコアにした。（スコア０＝無傷の粘膜、スコア１＝軽度の角質増殖（＜５０％の表面積）、スコア２＝重度の角質増殖（５０％またはそれ以上の表面積）、スコア３＝角質増殖、および少数の小さな腐食（５未満で、２．５ｃｍ未満）、スコア４＝角質増殖、および大きな腐食（５以上の腐食、および／または、２．５ｃｍ以上）、スコア５＝角質増殖、および巨大な腐食（１０以上の腐食、または、５ｃｍ以上）および／または潰瘍。
【００７０】
「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」を接種したグループＢにおいては、３匹の動物についてスコア３の障害があり、１匹の動物にスコア４、１匹の動物にスコア５の障害があった。対照グループにおいては、障害のスコアは２（１匹の動物）、３（２匹の動物）および４（２匹の動物）だった。「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」が感染している動物と、対照動物との間の障害スコアの差異は、有意なものではなかった（Ｐ＝０．３６）。
【００７１】
スコアを調べた後に、ＰＣＲ、定量的ウレアーゼ試験、および組織学のために、それぞれの胃について、腺性粘膜（０．５ｃｍ２）を３つの部位からサンプリングした。これらの３つの部位は、噴門（プリカタス縁（margo plicatus）に直接隣接している箇所）、胃底部、幽門洞（幽門隆起から１ｃｍ離れた箇所）に相当する。
【００７２】
「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の胃組織への感染を特異的に検出するＰＣＲ
DNeasy Tissue Kit (Qiagen、ヒルデン、ドイツ)を用いてＤＮＡを抽出した。上記したDe Grooteら(2000)に記載の方法により、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」を特異的に検出するＰＣＲをおこなった。全ての対照動物の試料は陰性だった。グループＢの、全ての胃底部および洞の試料、ならびに噴門の試料の３／５は、ＰＣＲでは陽性だった。
【００７３】
上記したCorthesy-Theulazら(1995)に記載の方法により、ウレアーゼ試験をおこなった。それぞれのサンプリング部位における平均ＯＤ値を図１に示す。胃底部および洞由来の全ての組織試料について、対照動物と「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」感染動物との間に有意な差（Ｐ＜０．０５）が検出された（噴門、Ｐ＝０．０６７６；胃底部、Ｐ＝０．００３８；幽門洞  Ｐ＝０．００１１）。感染動物において、異なるサンプリング部位間での平均ＯＤ値には、有意差は見られなかった（噴門ｖｓ胃底部  Ｐ＝０．２２８０；噴門ｖｓ幽門洞  Ｐ＝０．１７３３、胃底部ｖｓ幽門洞  Ｐ＝０．７８２４）。
【００７４】
De Groote ら (2000)に記載の方法により、ポリクローナルヤギ抗ヘリコバクター・ピロリ抗体を用いて組織学的検査をおこなった。「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」陽性の動物は、主に幽門粘膜（antral mucosa）に障害があった。５匹全ての動物において、この胃の領域には、粘膜に病巣リンパ形質細胞性の細胞浸潤が見られた。感染動物の３／５において、胚芽中心を有する幽門のリンパ濾胞（antral lymphoid follicles）が見られた。濾胞の大きさのため、これらは胃腺の転移および消失に関連していた。感染動物の２／５では、幽門粘膜には濾胞が検出されなかったが、これらの動物では、固有層においてリンパ球および形質細胞の凝集が見られた。「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」感染動物の胃底部では、軽度な、散在したリンパ球の浸潤のみがあった。洞では、表層上皮の上に横たわっている粘膜、および表層小窩（foveola）にコロニー形成が見られたが、胃小窩の深部には広がっていなかった。胃底部粘膜における「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」のコロニー形成が、腺小窩（glandular foveola）に検出され、胃小窩の半分まで広がっていた。細菌は、胃上皮細胞、すなわち、粘液産生細胞および壁細胞、と非常に近い位置に見つかった。対照動物の胃には細菌は見られなかった。対照動物は、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」については陰性である（グループＡ）。
【００７５】
〔実施例２．カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の種による比較免疫化の実験構成〕
同時におこなった実験として、ヘリコバクター・フェリスまたはヘリコバクター・ビゾゼローニの超音波破壊物、ヘリコバクター・ビゾゼローニまたはヘリコバクター・フェリスのホルマリン不活化物、および対照アジュバントの、経鼻免疫経路または皮下免疫経路による免疫化の効果について試験した。６０匹のマウスを、以下に示すように、１グループ６匹の動物からなる１０のグループに分けた。
【００７６】
【表１】
2008546658.tif 000003
【００７７】
グループ１、２および３は、３週間の間隔をおいて２回経鼻免疫した。したがって、５μｇのコレラ毒素（List、キャンベル、カリフォルニア、米国）と混合した１００μｇのヘリコバクター・フェリスまたはヘリコバクター・ビゾゼローニ超音波破壊タンパク質を、麻酔していないマウスの外鼻腔に投与した。
【００７８】
グループ４−７は、３週間の間隔をおいて３回皮下免疫した。そのために、１００μｇの超音波破壊抗原溶液を等量のサポニンアジュバントと混合した。注射の直前に、大腸菌の易熱性毒素（ＬＴＲ１９２Ｇ、J. Clementsによる提供）の組み換え変異体を１μｇ加え、そして、抗原調製物を動物の背下部に皮下注射した。
【００７９】
グループ８の動物に、ＬＴＲ１９２Ｇを含むサポニンアジュバントのみを皮下免疫した。グループ９および１０の動物は免疫しなかった。
【００８０】
最後の免疫化から４週間後、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の凍結ストックを３７℃で１５分間保持した。グループ１‐９の全ての動物に、０．３ｍｌの「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ストックを、胃内接種により病原体接種した。
【００８１】
病原体接種からの第３週目の間、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の存在を調べるために、それぞれ個々のマウスから、連続した４日間糞便を回収した。後述するように、糞便試料についてＰＣＲをおこなった。
【００８２】
病原体接種から６週間後、全ての動物をイソフルレン麻酔（IsoFLo, Abbot、イリノイ州米国）した後、頚椎脱臼により安楽死させた。全ての動物について、後述するように定量的ウレアーゼ試験（上記したCorthesy-Theulazら  1995)に胃の半分を使用した。もう半分から、胃底部領域の２ｍｍ２の組織試料を凍結（−２０℃）し、後述するようにカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに特異的なＰＣＲに使用した。
【００８３】
〔実施例３：免疫したマウスおよび免疫していないマウスの糞便における「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ＤＮＡの糞便排出〕
[糞便試料中の「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ＤＮＡの検出]
「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ＤＮＡの排出を評価するために、糞便試料を用いてＰＣＲをおこなった。QIAamp（登録商標） DNA Stool Mini Kit（Qiagen, Hilden, ドイツ）を用いてＤＮＡを抽出した。「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子に相補的な、プライマーＨＳ５８６ gggaggacaagtcaggtgtgaa（配列番号１）およびプライマーＨＳ６４１ tctcccacactccagaaggatag（配列番号２）を、７９ｂｐの断片を増幅させるために使用した。プライマーセットの特異性は、他の１７種のヘリコバクターおよびカンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）（表２）から抽出したＤＮＡについて、試験されている。糞便の対照試料にクローン化１６ＳｒＲＮＡを加えることにより、感度をアッセイした。対照試料におよそ１００、０００コピーを添加した場合に、ＤＮＡ単離およびＰＣＲの後、断片が得られた。
【００８４】
【表２】
2008546658.tif 000004
【００８５】
ＰＣＲ反応混合液（２５μｌ）には、５０ｐｍｏｌの各プライマー（Invitrogen Life Technologies, Merelbeke, ベルギー）、２００μＭの各デオキシヌクレオシドトリリン酸（Amersham Pharmacia Biotech, Puurs, ベルギー）、０．０３Ｕ／μｌのTaq platinum、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、および１×ＰＣＲバッファー（Invitrogen Life Technologies）が含まれている。５０ｎｇ／ｍｌのエチジウムブロマイドを含む１．５％のアガロースゲルを用いてＰＣＲ産物を泳動した。１６０Ｖで１時間泳動した後、ＵＶトランスイルミネーターを用いて産物を可視化した。「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の増幅断片は、８０ｂｐの長さである。表２に示したいずれの種からもＰＣＲ断片は得られなかった。
【００８６】
[統計解析]
ＰＣＲによって決定した糞便中の細菌の存在を、一般混合モデルを用いて処理グループの間で比較した。一般混合モデルでは、ＰＣＲの確実性をバイナリ応答変数とし、時間および処理をカテゴリー固定効果とし、マウスをランダム効果とした。免疫していないグループと、ヘリコバクター・ピロリおよびヘリコバクター・フェリスを免疫したグループとの間におけるペアワイズ比較を、全体の有意水準を５％、comparison wise有意水準を１．３％（３群の比較のボンフェローニ法によって調整）としておこなった。
【００８７】
ＰＣＲアッセイにより決定し、グループごと、サンプリングの週ごとに計算した糞便試料中の細菌の存在を、実験１および実験２について、それぞれ、図２および図３に表している。全体として、免疫していない動物と、ヘリコバクター・ピロリ超音波破壊抗原溶液およびヘリコバクター・フェリス超音波破壊抗原溶液を免疫した動物との間に、糞便排出に有意差が見られた（Ｐ＜０．０００１）。経鼻免疫したマウスは、免疫せずに「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」を病原体接種した動物に比べ、より少ない「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ＤＮＡを糞便中に排出した。経鼻免疫した二つのグループ間での排出の差は有意ではなかった（Ｐ＝０．０２４１）。
【００８８】
免疫していないマウスとヘリコバクター・ピロリ超音波破壊抗原溶液を皮下免疫したマウスとの間には、有意差が見られた（Ｐ＝０．０００１）。免疫していないマウスとヘリコバクター・フェリス超音波破壊抗原溶液を皮下免疫したマウスとの間の差は、Ｐ＝０．０１７５で有意である。皮下免疫した二つのグループの間には有意差はなかった（Ｐ＝０．２４４５）。
【００８９】
表１に示した実験について、病原体接種から３週間後の糞便中に「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」のＤＮＡを排出したマウスの数に関する実験結果を図６に示している。免疫せずに「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」を病原体接種した動物と比較すると、経鼻免疫化により排出が低下する。皮下免疫したグループでは、グループ４でのみ免疫効果が検出できている。グループ４は、ヘリコバクター・フェリス CS1超音波破壊抗原溶液を免疫した動物に対応する。
【００９０】
〔実施例４：胃組織における定量的ウレアーゼ〕
[胃組織の定量的ウレアーゼ試験]
胃試料を５００μｌのＣＵＴｅｓｔに浸し、３７℃で３時間インキュベートした。遠心（５分、１００ｇ）後、上清を、５５０ｎｍのＯＤを用いた分光光度計による定量に用いた。アッセイは、Corthesy-Theulazら(1995) Gastroenterol. 109, 115-121の記載にしたがっておこなった。
【００９１】
同種経鼻免疫化では（図４）、免疫していない動物と、ヘリコバクター・ピロリＳＳ１およびヘリコバクター・フェリスＣＳ１の両方を免疫した動物との間に、ウレアーゼ活性に有意な減少が見られた（Ｐ＜０．０５）。「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の病原体接種前にヘリコバクター・ピロリＳＳ１またはヘリコバクター・フェリスＣＳ１の超音波破壊抗原溶液を動物に免疫すると、免疫せずに病原体接種したグループと比較して、ウレアーゼ活性に有意な減少が生じた（Ｐ＜０．０００１）。
【００９２】
ヘリコバクター・ピロリまたはヘリコバクター・フェリス抗原を皮下免疫（図５）すると、免疫せずに病原体接種したグループと比較して、ウレアーゼ活性に有意な減少が生じた（Ｐ＜０．０００１）。
【００９３】
表１の実験において、免疫しておらず、病原体接種していないマウスからの平均ＯＤ値は０．１０３だった。免疫せずに「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」を病原体接種したマウスからの平均ＯＤ値は２．０３８だった。グループ１およびグループ２において、免疫せずに病原体接種した動物（グループ９）と免疫した動物との間でのウレアーゼ活性の有意差（Ｐ＜０．０５）が見られた。グループ１は、ヘリコバクター・フェリス CS1超音波破壊抗原溶液の経鼻免疫化を表しており、グループ２は、ヘリコバクター・ビゾゼローニ超音波破壊抗原溶液の経鼻免疫化を表している。皮下免疫した何れのグループも、グループ９と比較してウレアーゼ活性の有意な減少は見られなかった。統計解析においては、ヘリコバクター・ビゾゼローニ超音波破壊抗原溶液を皮下免疫したグループである、グループ７が最も低いＰ値（Ｐ＝０．０８５）を示した。
【００９４】
〔実施例５：胃組織のＰＣＲ解析〕
[胃組織のＰＣＲ解析]
DNeasy Tissue Kit (Qiagen)を用いて、胃試料のＤＮＡを抽出した。「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」、ヘリコバクター・フェリスまたはヘリコバクター・ピロリを検出するＰＣＲを、すでに記載されている手法（上記したDe Grooteら(2000)、およびDe Groote (2001) J. Clin. Microbiol. 39, 1197-1199）によりおこなった。
【００９５】
ヘリコバクター・フェリス CS1超音波破壊抗原溶液を経鼻免疫し、ヘリコバクター・フェリスを病原体接種した動物は、いずれの動物も「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」のＤＮＡを保持していなかった。これに対して、ヘリコバクター・ピロリ SS1を免疫し、同種病原体接種したものは全て、胃試料の中に「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」のＤＮＡが存在することを示していた。マウスに、ヘリコバクター・ピロリ抗原またはヘリコバクター・フェリス抗原を異種経鼻免疫および異種皮下免疫し、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」を病原体接種した後には、全ての胃試料に、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」のＤＮＡが含まれていた。
【００９６】
表１に示した実験では、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」に特異的なＰＣＲ試験においては、グループ１０の全ての動物は陰性だった。病原体接種した動物ではグループ７の１匹の動物のみがＰＣＲ試験において陰性だった。
【００９７】
〔実施例６：ヘリコバクター・フェリスまたはヘリコバクター・ビゾゼローニを免疫したブタのセロコンバージョン〕
５週齢の従来のブタ（Agrivet Merelbeke）３０匹を、６匹のグループに分けた。全てのグループは、０．５ｍｇの抗原（細菌溶解物）を用いて（グループ１‐４）、またはアジュバンスのみを用いて（グループ５）、３週間の間隔をおいた２回の筋肉注射により免疫した。０．１、０．５および１ｍｇの抗原調製物を用いた予備実験では、０．５ｍｇの量のときが、最も大きい免疫反応を引き起こした。
【００９８】
【表３】
2008546658.tif 000005
【００９９】
前血清を全ての動物から回収した。最初の免疫化から２週間後であり第２の免疫化の前に、血液を回収した。第２の免疫化から１、２および３週間後に、さらに血液を回収した。
【０１００】
ＥＬＩＳＡプレートを細菌溶解液でコートし、血清のインキュベーションに使用した。アルカリリン酸塩でラベルしたポリクローナルヤギ抗ブタ抗体によって、結合抗原を検出した。
【０１０１】
結果を図８ａおよび８ｂに示しており、ＥＬＩＳＡの結果は、ヘリコバクター・フェリスおよびヘリコバクター・ビゾゼローニによってコートしたそれぞれのプレートについて表している。
【０１０２】
ヘリコバクター・フェリスがコートされているＥＬＩＳＡプレートを用いると、ヘリコバクター・フェリス抗原を免疫しているマウスにのみ、血清変換が示された。ヘリコバクター・ビゾゼローニがコートされているプレートの場合には、ヘリコバクター・ビゾゼローニに対して血清変換が示された。
【０１０３】
〔実施例７：ヘリコバクター シノガストリカスの同定〕
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁で、ワクチンの調製に適しているヘリコバクター種として、新奇なヘリコバクター種であるヘリコバクター シノガストリカス（本発明においては、ＪＫＭ４Ｔ株とも呼ぶ）があり、これは、グラム陰性、微好気性らせん形状の桿菌である。
【０１０４】
[ＪＫＭ４Ｔの単離]
ベルギーのGhent大学獣医学部において、安楽死させたイヌの胃の洞および胃底部領域から、ヘリコバクター株（ＪＫＭ４Ｔ）を単離した。試料は、Gruntarら(2003) Int J Med MicroBiol 293, 65に記載のように扱った。１０％（ｖｏｌ/ｖｏｌ）のウマ血液、５ｍｇ／ｌのアンフォテリシンＢ（Fungizone; Bristol-Myers Squibb、エペルノン、フランス）、Campylobacter選抜補助剤（スキロウ, Oxoid; １０ｍｇ／ｌのバンコマイシン、５ｍｇ／ｌの乳酸トリメトプリム、および２５００Ｕ／ｌのポリミキシンＢを含む）、およびビトックス補助剤 (Oxoid)が含まれているブレインハートインヒュージョン（BHI； Oxoid, LTD., 英国）寒天上で、細菌を培養した。通常の大気の８０％を抜き、８％のＣＯ２、８％のＨ２および８４％のＮ２を混合した気体を導入することにより作り出した閉鎖回路（closed circuit）中において、最高３７℃、加湿微好気条件下で、ふたを閉じてプレートをインキュベートした。
【０１０５】
プレートを一日おきにチェックし、プレートがすっかり乾いてしまわないように、寒天の表面にＢＨＩブロスを添加した。一次増殖は、インキュベーションの１０日後に、寒天培地を覆っているブロスの油性の様相として生じた。光学顕微鏡下でのブロスの検査により、らせん形状の運動性の菌がいることがわかった。グラム染色により、単離体の、グラム陰性およびらせん形状が示された。湿った寒天プレート上に広がった層として、継代培養の細菌増殖がおこった。乾燥した寒天の表面に大量の細菌を移すと、ピンポイント（pinpoint）のコロニーが観察された。乾燥した寒天上で培養した細菌は、細菌のらせん状の形態がほとんど消失し、球状形に変化していた。
【０１０６】
典型的ならせん形態である細菌をＢＨＩブロスに回収し、７．５ｇのグルコース、２５ｍｌのＢＨＩ（Oxoid）および７５ｍｌの滅菌した不活性のウマ血清を含む培地の中で、−７０℃において保管した。単離したＪＫＭ４Ｔ株は新奇なヘリコバクター種、ヘリコバクター シノガストリカス（下記参照）であり、Katleen van den Bulckによって、２００５年６月６日に、登録番号ＬＭＧ  Ｐ２３−１００として、Belgian Coordinated Collections of Micro-organisms (BCCM（登録商標）/LMG)[Laboratorium voor Microbiologie Universiteit Gent (RUG), K.L. Ledeganckstraat 35, 9000 Gent, ベルギー]に寄託されている。
【０１０７】
[表現型解析]
走査型電子顕微鏡観察および透過型電子顕微鏡観察のために、２．５％グルタールアルデヒド、およびカコジル酸バッファー（０．１Ｍ、ｐＨ７．３）に溶解した２％パラホルムアルデヒドを用いて、細菌培養物を固定した。蒸留水に溶解した１％（ｗ／ｖｏｌ）四酸化オスミウムを用いて、固定した細菌を後固定した。走査型電子顕微鏡用の試料を、次の液化炭酸ガス中での臨界点乾燥のためにアルコールおよびアセトン中で脱水し、カーボンセメントを用いてアルミニウムのスタブ上に接着し、金層をスパッタし、そして、Philips 501 SEMを用いて観察した。透過型電子顕微鏡観察用の試料を、蒸留水に溶解した２％（ｗｔ／ｖｏｌ）酢酸ウラニルを用いてブロック染色し、エタノールで脱水した。これらを、Epon-Spurr's（１：１）溶媒に埋め込んだ。細菌が現れている試料から超薄切片を切り出し、クエン酸鉛によって染色し、Philips EM 208Sを用いて観察した。ヘリコバクター属の新種を記載するために、Dewhirstら(2000) Int J Syst Evol Microbiol 50, 2231-2237に推奨されている方法により、生化学試験および耐性試験をおこなった。単離体について、オキシダーゼ活性、カタラーゼ活性（３％の過酸化水素を含む）および迅速ウレアーゼ活性、ならびにインドキシル酢酸の加水分解を試験した。細菌について、API Campy test strips (Biomerieux SA, Marcy-l'Etolie, フランス)もおこなった。これには、ウレアーゼ活性、硝酸還元酵素活性、エステラーゼ活性、馬尿酸加水分解、ガンマグルタミルペプチド転移酵素活性、アルカリフォスファターゼ活性、塩化トリフェニルテトラゾリウム（ＴＴＣ）還元、ピロリドニルアリールアミラーゼ活性、Ｌ−アルギニンアリールアミラーゼ活性およびＬ−アスパラギン酸アリールアミラーゼ活性の試験も含まれている。
【０１０８】
カンピロバクター属およびヘリコバクター用のケープタウンプロトコールに推奨されている方法により、１０％のウマ血液を補充したトリプシン血液寒天塩（Oxoid）上で、１％グリシン（Merck、ダルムシュタット、ドイツ）および１．５％ＮａＣｌ（Merck）に対する耐性を試験した。塩を加えていないMacConkey寒天（Oxoid）上に細菌をプレーティングすることにより、ウシ胆汁に対する耐性を試験した。
【０１０９】
メトロニダゾール、アンピシリン、クラリスロマイシン、テトラサイクリン、エンロフロキサシン、リンコマイシン、チロシン、ネオマイシン、スペクチノマイシンおよびゲンタマイシンに対する感受性を、１０％のウマ血液を補充したミュラーヒントン（Mueller-Hinton）寒天（Oxoid）を用いて、すでに記載（Van den Bulckら (2005b) Antimicrob Agents Chemother 49, 2997-3000）されているように、寒天希釈法により試験した。エンロフロキサシンを除く全ての抗生物質は、Sigma (セントルイス、ミズーリ州、米国)から供給されたものであり、既知の有効性を有する標準粉末である。エンロフロキサシンは、Bayer (ブリュッセル、ベルギー)より購入した。増殖試験調製物および耐性試験調製物の全てを、３７℃の微好気性大気中において７日間インキュベートした。
【０１１０】
ＢＨＩ血液寒天、Brucella血液寒天（Oxoid）およびミュラーヒントン血液寒天を用いて、生物の増殖について試験した。ＢＨＩ血液寒天上で、２５、３０、３７、４２℃における増殖を決定した。これらの培地を３７℃の微好気性大気中において７日間インキュベートした。さらに、血液を補充したＢＨＩ寒天上での増殖を、好気性環境下、５％ＣＯ２を含む好気性環境下、微好気性環境下および嫌気性環境化において試験した。
【０１１１】
全細胞タンパク質のアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）をおこなうために、ＪＫＭ４Ｔ株（ヘリコバクター シノガストリカス）を、５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のウマ血液を補充したミュラーヒントン寒天（Oxoid）上で培養し、およそ５％のＯ２、３．５％のＣＯ２、７．５％のＨ２および８４％のＮ２を含む微好気性大気中において３７℃でインキュベートした。全細胞のタンパク質抽出物を調製し、既に記載の方法（Potら (1994) J Appl Bacteriol 77, 362-369）により、ドデシル硫酸ナトリウムＰＡＧＥをおこなった。ヘリコバクター・ビゾゼローニ、ヘリコバクター・サロモニスおよびヘリコバクター・フェリス参照株の全細胞のタンパク質プロフィール、ならびに、他のヘリコバクター種の原型および参照株の全細胞のタンパク質プロフィールは、以前の研究から入手可能である。
【０１１２】
GelComparソフトウェアパッケージバージョン４．２（Applied Maths, Sint Martens Latem, ベルギー）を用いて、デンシトメトリー解析、タンパク質プロフィールのノーマライゼーションおよびインターポレーション（interpolation）、ならびに数値解析をおこなった。類似性のパーセンテージとして示されるピアソンの積率相関係数により、トレースした全ての対における類似性が表された。
【０１１３】
[遺伝子型解析]
DNeasy Tissue kit (Qiagen、フェンロ、オランダ）を用いて、製造者の説明書に従って、ゲノムＤＮＡを抽出した。
【０１１４】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の保存された末端に相補的なプライマーを用いて、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。既に記載されている（Baeleら(2001) J Appl Microbiol 91, 488-491）ように、コンセンサスプライマー  アルファ‐ベータ‐ＮＯＴ（5'-TCA AAC TAG GAC CGA GTC）（配列番号３）およびオメガ‐ＭＢ（5'-TAC CTT GTT ACT TCA CCC CA）（配列番号４）を用いた。１６ＳｒＲＮＡの一部（図１１）をコードしている１５００ｂｐの単位複製配列（配列番号５）を増幅し、別のところに記載されている（Coenyeら(1999) Int J Syst Evol Microbiol 49, 405-413）ように、プライマーｐＤ（5'-GTA TTA CCG CGG CTG CTG-3'）（配列番号６）、プライマーガンマ＊（5'-CTC CTA CGG GAG GCA GCA GT-3'）（配列番号７）、プライマー３（5'-GTT GCG CTC GTT GCG GGA CT-3'）（配列番号８）およびプライマーＯ＊（5'-AAC TCA AAG GAA TTG ACG G-3'）（配列番号９）を用いて塩基配列決定をおこなった。塩基配列解析は、ABI Prism（登録商標） 3100 Genetic Analyzer（Applied Biosystems, Lennik, ベルギー）を用いておこない、ＢＬＡＳＴアルゴリズムによって、塩基配列を、ジェンバンクのデータと比較した。系統解析は、ＫＯＤＯＮ（Applied Maths, Sint-Martens-Latem, ベルギー）を用いておこなった。ペアワイズアラインメントの相同を計算し、近隣結合法により、樹状図を構築した。
【０１１５】
ウレアーゼ遺伝子を検出するために、プライマーＵ４３０ｆ（5'-ckgawttgat gcaagaagg-3'）（配列番号１０）およびプライマーＵ１７３５ｒ（5'-cttcgtgrat tttaarrccaat-3'）（配列番号１１）を用いたＰＣＲをおこなった。このＰＣＲにより、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ビゾゼローニ、ヘリコバクター・サロモニスおよびカンジダタス・ヘリコバクター・ヘイルマニ（O'Rourkeら(2004) Int J Syst Evol Microbiol 54, 2203-2211）において、１２２４ｂｐの増幅産物が得られた。カンジダタス・ヘリコバクター・ヘイルマニ”のウレアーゼ遺伝子を特異的に増幅するプライマーＨｈ２ｆおよびＨｈ２ｒを用いたＰＣＲも利用した（上記したO'Rourke ら (2004)）。カンジダタス・ヘリコバクター・ヘイルマニのＤＮＡはポジティブ対照としての役割を果たし、一方、精製度の高い水を、ネガティブ対照として含めた。既に記載されている方法（Baeleら(2004) J Clin Microbiol 42, 1115-1122）により、ＰＣＲ産物をゲル電気泳動によって分離した。さらに、カンジダタス・ヘリコバクター・ヘイルマニおよびＪＫＭ４Ｔ（ヘリコバクター・シノガストリカス）から得られたＰＣＲ産物について、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer, Applied Biosystems)を用いて、ABI Prism（登録商標） 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)により塩基配列の決定をおこなった。電気泳動図（Electropherogram）をＫｏｄｏｎ（Applied Biosystems）にエクスポートして変換し、塩基配列を、ＢＬＡＳＴによりＧｅｎＢａｎｋのデータと比較した。
【０１１６】
以前に記載（上記したBaeleら, 2004）のように、コンセンサスプライマーＴ３Ｂ（5'-AGG TCG CGG GTT CGA ATC C-3'）（配列番号１２）（蛍光マーカーＴＥＴによりラベル）、および、ヘリコバクター種のｔＲＮＡインタージェニックスペーサに相補的な特異的プライマーである、プライマーＨＴ１３５Ｒ（5'-ACC AAC TGG GCT AAG CGA CC-3'）（配列番号１３）を用いて、ｔＲＮＡインタージェニック長多型解析（ｔＤＮＡ‐ＰＣＲ）をおこなった。ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・サロモニスおよびヘリコバクター・ビゾゼローニの純培養から抽出したＤＮＡはポジティブ対照としての役割を果たし、一方、精製度の高い水を、ネガティブ対照として含めた。ABI Prism（登録商標） 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)を用いて、キャピラリー電気泳動法によりＰＣＲ産物を分離した。GeneScan 500 ROX (Applied Biosystems）およびGeneScan 400-HD ROX (Applied Biosystems）の内部サイズスタンダード混合物を挟むことにより、GeneMapper (Applied Biosystems)を用いて、長さを決定した。
【０１１７】
イヌおよびネコにおいて新しいヘリコバクター種がどれほど行き渡っているかを調べるために、さまざまな品種を含む、１１０匹のイヌ（雄６５匹、雌４５匹、生後１日から１８歳までの年齢幅）および４３匹のネコ（雄２５匹、雌１８匹、生後７週から１８歳）のコーパス部位（corpus region）から胃試料を回収した。これらのイヌおよびネコは、２００１年１１月から２００３年９月の間に、病理学科(Ghent大学獣医学部)に、さまざまな病状で検視解剖にきたものである。DNeasy tissue kit (Qiagen)を用いて、製造者の説明書に従って、ネコ科の動物およびイヌ科の動物からＤＮＡを抽出した。これらのＤＮＡ試料をｔＲＮＡインタージェニック長多型解析に供した。
【０１１８】
（表現型解析）
新しい単離体を他のイヌ科胃ヘリコバクター属から見分ける主要な試験を表４に記載している。
【０１１９】
【表４】
2008546658.tif 000006
【０１２０】
ＪＫＭ４Ｔ株（ヘリコバクター シノガストリカス）の超微細構造の研究から、１０から１８μｍの細胞長でおよそ１μｍの幅の細胞であり、１細胞当たり３から８のらせんを有する巨大ならせん状細胞であることがわかった。全ての細菌細胞には、一つのペリプラズム原繊維があり、らせんの外部側面に沿って走っている。１２を上限とした鞭毛鞘が各細胞の両端に見つかり、これらの鞭毛は、わずかに中心から外れていた。鞭毛は平滑末端であり、末端の直径は、鞭毛ボディの平均の直径よりも大きかった。より長時間培養したものには、球状形の細胞が見られた。この生物の超微細構造の特徴を、複数回の継代培養の後に複数回調べたが、どの調査においても同じであった。
単離体は、オキシダーゼ、ウレアーゼおよびカタラーゼ活性を示したが、インドキシル酢酸を加水分解しなかった。この生物は、硝酸およびＴＴＣを還元することができ、エステラーゼ、ガンマ−グルタミルペプチド転移酵素、Ｌ−アルギニンアリールアミダーゼおよびアルカリフォスファターゼ試験については陽性であるが、馬尿酸加水分解、ピロリドニルアリールアミダーゼおよびＬ−アスパラギン酸アリールアミダーゼ試験については、陰性であった。この細菌は、血液補充ＢＨＩ、ブルセラおよびミュラーヒントン寒天培地上でよく増殖した。
【０１２１】
０．０３から０．２５μｇ／ｍｌまでの範囲の低いＭＩＣ値によって示されるように、この細菌は、全ての抗菌薬試験において感受性を示した。これらは、１．５％のＮａＣｌ、１％の胆汁、または１％のグリシンを含む培地上では増殖しなかった。これらは、３７℃および３０℃で増殖できたが、２５℃および４２℃では増殖しなかった。嫌気性条件下および微好気性条件下の両方の条件下で増殖することができるが、一方で、通常レベルの酸素を含む大気、または、単にＣＯ２を増加させた大気は、細菌の培養には適していなかった。
【０１２２】
ＪＫＭ４Ｔ株（ヘリコバクター シノガストリカス）の全細胞のタンパク質プロフィールは、対照株とした他のヘリコバクター種におけるプロフィールと大幅に異なっていた（図９Ａ）。他のヘリコバクター参照株のタンパク質プロフィールに対する相関レベルは、いずれも０．８０より小さく、ＪＫＭ４Ｔが新奇ヘリコバクター種であることを示している。図９Ｂは、ＪＫＭ４Ｔ株（ヘリコバクター シノガストリカス）のタンパク質プロフィールの数値解析の結果、および系統学的に最も近縁な種を表している。
【０１２３】
[遺伝子型解析]
ＪＫＭ４Ｔ（ヘリコバクター シノガストリカス）の１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ビゾゼローニ、ヘリコバクター・サロモニスおよび“カンジダタス・ヘリコバクター・ヘイルマニ”の配列と＞９７％の相同性を示したが、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の配列とは３％以上異なるものであった（図９Ｂ）。これら全ての種が形成するクラスターに新しい単離体が含まれることが、系統樹から明らかになった（図１０）。
【０１２４】
プライマーＵ４３０ｆ（5'-gckgawttgatgcaagaagg-3'）（配列番号１４、およびプライマーＵ１７３５ｒ（5'-cttcgtgrattttaarrccaat-3'）（配列番号１５）を用いた、ＪＫＭ４Ｔ（ヘリコバクター シノガストリカス）のゲノムＤＮＡのＰＣＲにより、一連の非特異的な（aspecific）断片が生じ、予想していた１２２４ｂｐの断片は生じなかった。「カンジダタス・ヘリコバクター・ヘイルマニ」に特異的なプライマーＨｈ２ｆおよびＨｈ２ｒを用いたＰＣＲでは、３２０ｂｐの断片が生じ、これは、「カンジダタス・ヘリコバクター・ヘイルマニ」のＤＮＡから生じる予想していた３８０ｂｐの断片とは、常に異なるものであった。ＰＣＲ産物の塩基配列解析から、Ｇｅｎｂａｎｋにあるいずれの塩基配列ともマッチしない、独自の配列であることが明らかになった。
【０１２５】
ｔＤＮＡ‐ＰＣＲにおける、新しい単離体のＤＮＡから生じたＰＣＲ産物の解析では、ヘリコバクター・フェリス（１３７ｂｐ）、ヘリコバクター・ビゾゼローニ（１３６ｂｐ）およびヘリコバクター・サロモニス（１３４ｂｐ）のｔＤＮＡ−増幅産物とは異なる１３６．６ｂｐの増幅産物が、常に現れていた。同じサイズの断片は、１匹のネコ（２．３％）および２３匹のイヌ（２０．９％）から見つかった。
【０１２６】
本実施例は、第四の培養可能なヘリコバクター種であり、イヌ科動物の胃の中でコロニー形成が可能な種の存在を明らかにしている。
【０１２７】
１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の解析から、以前に単離された肉食性の３種のヘリコバクター種と高度に相同性のあることが分かった。
【０１２８】
ウレアーゼ遺伝子は、近年、ヘリコバクター種間を区別するものとして認められている。ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・ビゾゼローニおよびヘリコバクター・サロモニスのウレアーゼ遺伝子を検出するプライマーを用いた、単離体ＪＫＭ４Ｔ（ヘリコバクター シノガストリカス）のゲノムＤＮＡのＰＣＲでは、非特異的な断片のみが生じた。“カンジダタス・ヘリコバクター・ヘイルマニ”特異的ＰＣＲにより、一つのＰＣＲ断片が生じたが、カンジダタス・ヘリコバクター・ヘイルマニ”の配列とは異なる配列を持つものであった。
【０１２９】
さらに、本発明の新奇種におけるｔＤＮＡ‐ＰＣＲのＰＣＲ増幅産物は、他のヘリコバクターの増幅産物とは異なるものであった。これらの結果は、他のヘリコバクター種のパターンとは異なるパターンであったタンパク質プロフィールの結果とともに、単離したＪＫＭ４Ｔは、発明者らがヘリコバクター シノガストリカスと命名した、明らかに新奇なヘリコバクター種であることを示している。
【図面の簡単な説明】
【０１３０】
【図１】本発明の１つの実施の形態に従って、マウスから得られたカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに感染されたブタ（ｎ＝５）、および、対照（ｎ＝５）から得られた、異なる位置の胃組織（噴門、胃底、幽門）に対する、定量的ウレアーゼアッセイを示す図である
【図２】本発明の１つの実施の形態に従って、「カンジダダス・ヘリコバクター・スイス」に感染してから１‐１６週間後の、免疫されていないマウス（▲）と比較した、ヘリコバクター・ピロリ抗原（◆）、もしくはヘリコバクター・フェリス抗原（◇）を経鼻免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの糞便における「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ＤＮＡの排出を示す図である。
【図３】本発明の１つの実施の形態に従って、「カンジダダス・ヘリコバクター・スイス」に感染してから１‐１６週間後の、免疫されていないマウス（▲）と比較した、ヘリコバクター・ピロリ抗原（◆）、もしくはヘリコバクター・フェリス抗原（◇）を皮下免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの糞便における「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ＤＮＡの排出を示す図である。
【図４】本発明の１つの実施の形態に従って、ヘリコバクター・ピロリ抗原、もしくはヘリコバクター・フェリス抗原によって経鼻免疫されたマウスから得られた胃組織における定量的なウレアーゼ活性を示す図である。
【図５】本発明の１つの実施の形態に従って、ヘリコバクター・ピロリ（ＳＣｐ）抗原、もしくはヘリコバクター・フェリス（ＳＣｆ）抗原によって皮下内に免疫されたマウスから得られた胃組織における定量的なウレアーゼ活性を示す図である。
【図６】本発明の特定の実施の形態に従って、「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」の病原体接種から３週間後に、ヘリコバクター・フェリスＣＳ１抗原、もしくはヘリコバクター・ビゾゼローニ抗原によって経鼻免疫されたＢＡＬＢ／ｃマウスの糞便における「カンジダタス・ヘリコバクター・スイス」ＤＮＡの排出を示す図である。
【図７】胃組織における、定量的なウレアーゼ活性を示す図である。
【図８Ａ】ヘリコバクター・フェリス抗原（ブタにおける血清学データ）（グループ１：■、２：◆、３：▲）、およびヘリコバクター・ビゾゼローニ抗原（グループ４：●）（アジュバントのみ：＿）によるワクチン接種後のヘリコバクター・フェリス抗原に対する血清転換（serumconvertion）（ｓ／ｐ値）を示す図である。
【図８Ｂ】ヘリコバクター・フェリス抗原（グループ３：▲）、およびヘリコバクター・ビゾゼローニ抗原（グループ４：●）（アジュバントのみ：＿）によるワクチン接種後のヘリコバクター・ビゾゼローニ抗原に対する血清転換（ｓ／ｐ値）を示す図である。
【図９ａ】ヘリコバクター・シノガストリカス、ヘリコバクター・ピロリ、ヘリコバクター・ビゾゼローニ、ヘリコバクター・サロモニス（H. salomonis）、およびヘリコバクター・フェリスの参考株の全細胞タンパク質のプロフィール（Ｂ）の数値解析に由来する系統図（Ａ）を示す図である。
【図９ｂ−１】１６ＳｒＲＮＡ配列の比較に基づく類似性の行列を示す図である。
【図９ｂ−２】１６ＳｒＲＮＡ配列の比較に基づく類似性の行列を示す図である。
【図１０】１６ＳｒＲＮＡ配列の類似性に基づく、２５株のヘリコバクター種に関する系統樹を示す図である。
【図１１】ヘリコバクター・シノガストリカスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子のゲノム配列を示す図である。
【図１】
2008546658.tif 000007
【図２】
2008546658.tif 000008
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008546658.tif 000013
【図８Ａ】
2008546658.tif 000014
【図８Ｂ】
2008546658.tif 000015
【図９ａ】
2008546658.tif 000016
【図９ｂ−１】
2008546658.tif 000017
【図９ｂ−２】
2008546658.tif 000018
【図１０】
2008546658.tif 000019
【図１１】
2008546658.tif 000020
【配列表】
2008546658000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年12月18日(2007.12.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１以上の細菌種から得られた１以上の抗原調製物の組成物を含有している、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに対する免疫化のためのワクチンであって、前記細菌種がカンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の種である、ワクチン。
【請求項２】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記細菌種が、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの１６ＳｒＲＮＡの配列に少なくとも９３％の配列同一性のある１６ＳｒＲＮＡの配列を有している細菌種である、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記種が、ヘリコバクター・フェリス、ヘリコバクター・サロモニス、ヘリコバクター・ヘイルマニ（タイプ２）、ヘリコバクター・シノガストリカス、ヘリコバクター・ピロリ、もしくはヘリコバクター・ビゾゼローニからなる群から選択される、請求項１または２に記載のワクチン。
【請求項４】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記種が、ヘリコバクター・フェリス、もしくはヘリコバクター・ビゾゼローニである、請求項１〜３の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項５】
カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに近縁の前記種が、ヘリコバクター・シノガストリカスである、請求項１〜３の何れか１項に記載のワクチン。
【請求項６】
実験動物、または、モデル動物において、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの感染のための動物モデルを得るための方法であって：
ａ）カンジダタス・ヘリコバクター・スイスに感染したブタの胃壁から細胞を分離する工程、
ｂ）前記細胞のホモジェネートを作製する工程、および、
ｃ）前記ホモジェネートを、前記実験動物、もしくはモデル動物の胃内に感染させる工程
を含んでいる方法。
【請求項７】
登録番号ＬＭＧ Ｐ‐２３１００に基づいて寄託された、ヘリコバクター・シノガストリカス種の分離された細菌。
【請求項８】
ワクチンの調製物の中にある、ヘリコバクター・シノガストリカス種の抗原調製物の使用。
【請求項９】
ヘリコバクター・シノガストリカス種の分離株の抗原調製物を調製する工程を含有している、ワクチンを製造するための方法。
【請求項１０】
動物において、カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの感染を検出するためのインビトロの方法であって：
ａ）前記動物の糞便試料を提供する工程、
ｂ）前記糞便試料からＤＮＡを分離する工程、
ｃ）カンジダタス・ヘリコバクター・スイスの１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の断片を増幅する工程、および、
ｄ）増幅された断片の存在を検出する工程
を含んでいる方法。
【請求項１１】
前記増幅が、配列番号１および配列番号２を有しているプライマーを用いて実施される、請求項１０に記載の方法。
【国際調査報告】
2008546658.tif 000021
2008546658.tif 000022
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