(57)【要約】微小管安定化剤の投与を含む癌の治療法に治療的に応答するであろうまたは治療的に応答している哺乳動物を同定する方法に有用なバイオマーカー。一つの態様において、癌は乳癌であり、微小管安定化剤はエポチロンまたはそのアナログまたはその誘導体、またはイクサベピロンである。
2008532481.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小管安定化剤の投与を含む癌の治療法に哺乳動物が治療的に応答するか否かを予測する方法であって、
（ａ）表１および表２のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し、
（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料を該微小管安定化剤に暴露し、
（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、
その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの上昇が、
該少なくとも一つのバイオマーカーが表１からのものであるときに該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答するであろうことを予測するものであり、
該少なくとも一つのバイオマーカーが表２からのものであるときに該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答しないであろうことを予測するものである
ことを特徴とする方法。
【請求項２】
該微小管安定化剤がエポチロンまたはそのアナログまたはその誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該微小管安定化剤がイクサベピロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
該微小管安定化剤がタキサンである、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
微小管安定化剤の投与を含む癌の治療法に哺乳動物が治療的に応答するか否かを予測する方法であって、
（ａ）該哺乳動物からの生物学的試料を該微小管安定化剤に暴露し、
（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１および表２のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、
その際、該微小管安定化剤に暴露していない哺乳動物における該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの上昇が、
該少なくとも一つのバイオマーカーが表１からのものであるときに該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答するであろうことを予測するものであり、
該少なくとも一つのバイオマーカーが表２からのものであるときに該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答しないであろうことを予測するものである
ことを特徴とする方法。
【請求項６】
該微小管安定化剤がエポチロンまたはそのアナログまたはその誘導体である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
該微小管安定化剤がイクサベピロンである、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
該微小管安定化剤がタキサンである、請求項５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、2004年11月30日に出願された米国仮特許出願第60/631,993号および2005年11月29日に出願された米国非仮（Non-Provisional）特許出願第 号の利益を主張する（その内容を参照のためその全体を本明細書に引用する）。
【０００２】
配列表
“Copy 1”のラベルを付したコンパクトディスクは配列表を10338 PCT.ST25.txtとして含む。この配列表はサイズが1686KBであり、2005年11月30日に記録された。このコンパクトディスクは2のコンパクトディスクのうちの1である。このコンパクトディスクの複製は“Copy 2”のラベルを付してあり、2のコンパクトディスクのうちの2である。コンパクトディスクおよび複製は同一の内容であり、参照のため本願に引用する。
【０００３】
本発明は一般にファーマコゲノミクスの分野に関し、さらに詳細には、個性化された遺伝子プロファイルの同定を可能にすべく患者の薬剤感受性を決定する方法および手順に関し、このような個性化された遺伝子プロファイルは疾患および障害を治療するうえで役立つものである。
【背景技術】
【０００４】
癌は組織臨床的な異質さの大きな疾患である。従来の組織学的および臨床的な特徴が予後と関連付けられているけれども、同じみかけの予後タイプの腫瘍が治療に対する応答性および患者のその後の生存において大きく異なっている。
【０００５】
各患者について治療の個性化を容易にする新たな予後および予測マーカーが、臨床において小分子や生物学的分子医薬などの治療に対する患者の応答を正確に予測するために必要である。この問題は、治療に対する患者の感受性をより良く予測できる新たなパラメーターの同定により解決することができる。患者試料の分類は癌の診断および治療の重要な側面である。治療に対する患者の応答と分子および遺伝マーカーとの関連付けは、非応答患者における治療の開発の新たな機会を開くことができ、あるいは有効性における一層高い確実さの故に他の治療選択のうちで治療の適応症を識別することができる。さらに、医薬、薬物、または組合せ療法に良く応答する傾向のある患者を前もって選択することは、臨床研究において必要な患者の数を減らし、臨床開発プログラムを完成するのに必要な時間を短縮することができる（M. Cockettら、Current Opinion in Biotechnology, 11:602-609 (2000)）。
【０００６】
患者において薬物感受性を予測することができることは特に興味深いことである、なぜなら、薬物応答性は標的細胞にとって内生の特性のみならず、宿主の代謝特性をも反映するものだからである。遺伝情報を用いて薬物感受性を予測しようとする努力は、多剤耐性遺伝子mdr1およびmrp1などの広い作用を有する個々の遺伝子に主として向けられてきた（P. Sonneveld, J. Intern. Med., 247:521-534 (2000)）。
【０００７】
遺伝子ｍＲＮＡ発現パターンの大スケールの特徴付けのためのマイクロアレイ法の開発は、分子マーカーを体系的に探索すること、および伝統的な組織病理学的方法では明らかではなかった別個のサブグループに癌を分類することを可能にした（J. Khanら、Cancer Res., 58:5009-5013 (1998); A.A. Alizadehら、Nature, 403:503-511 (2000); M. Bittnerら、Nature, 406:536-540 (2000); J. Khanら、Nature Medicine, 7(6):673-679 (2001); T.R. Golubら、Science, 286:531-537 (1999); U. Alonら、P. N. A. S. USA, 96:6745-6750 (1999)）。そのような技術および分子ツールは、分子集団内での多数の転写物の発現レベルをいかなる所定の時点においてもモニターすることを可能にした（たとえば、Schenaら、Science, 270:467-470 (1995); Lockhartら、Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Blanchardら、Nature Biotechnology, 14:1649 (1996)；Ashbyらの米国特許第5,569,588号を参照）。
【０００８】
最近の研究は、ヒト腫瘍のマイクロアレイ分析によって生成した遺伝子発現情報が臨床結果を予測し得ることを示している（L. J. van't Veerら、2002, Nature, 415:530-536；M. Westら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:11462-11467；T. Sorlieら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98:10869-10874；M. Shippら、2002, Nature Medicine, 8(1):68-74）。これら知見は、治療に対する個々の腫瘍の応答をより良く予測することにより癌の治療が大きく改善されるであろうとの希望をもたらす。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
個性化された遺伝子プロファイルの開発を可能にすべく患者の薬物感受性を決定する新たな別の方法および手順が必要とされており、このような個性化された遺伝子プロファイルは患者の分子レベルでの応答に基づいて疾患および障害を治療するのに必要である。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明は、１またはそれ以上の微小管安定化剤（microtubule-stabilizing agents）に対する患者の感受性を決定するための方法および手順を提供する。本発明はまた、癌などの疾患状態の治療を必要とする個体が、治療を投与する前に該治療に応答するか否かを決定または予測する方法であって、該治療が１またはそれ以上の微小管安定化剤を含むものである方法をも提供する。
【００１１】
一つの側面において、本発明は、微小管安定化剤の投与を含む癌の治療法に対して治療的に応答する哺乳動物を同定する方法であって、（ａ）表１および表２のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し、（ｂ）該哺乳動物からの生物学的試料を該微小管安定化剤に暴露し、（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの上昇が、該バイオマーカーが表１からのものであるときに該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答するであろうことを示すものであり、該バイオマーカーが表２からのものであるときに該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答しないであろうことを示すものである方法を提供する。
【００１２】
他の側面において、本発明は、哺乳動物が微小管安定化剤に対して治療的に応答するか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物を該微小管安定化剤に暴露し、ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１および表２のバイオマーカーから選択した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、該微小管安定化剤に暴露していない哺乳動物における該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの上昇が、該バイオマーカーが表１からのものであるときに該哺乳動物が該微小管安定化剤に対して治療的に応答していることを示すものであり、該バイオマーカーが表２からのものであるときに該哺乳動物が該微小管安定化剤に対して応答していないことを示すものである方法を提供する。
【００１３】
他の側面において、本発明は、哺乳動物が微小管安定化剤の投与を含む癌の治療法に対して治療的に応答するか否かを予測する方法であって、（ａ）該哺乳動物からの生物学的試料を該微小管安定化剤に暴露し、（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１または表２のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該生物学的試料において測定することを含み、その際、該微小管安定化剤に暴露していない哺乳動物における該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの上昇が、該バイオマーカーが表１からのものであるときに該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答するであろうことを予測するものであり、該バイオマーカーが表２からのものであるときに該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答しないであろうことを予測するものである方法を提供する。
【００１４】
他の側面において、本発明は、ある薬剤が微小管を安定化するか否か、および哺乳動物において腫瘍細胞などの迅速に増殖する細胞または他の過増殖細胞性疾患（hyperproliferative cellular disease）に対して細胞障害活性を有するか否かを決定する方法であって、（ａ）該哺乳動物を該薬剤に暴露し、ついで（ｂ）工程（ａ）の暴露後、表１および表２のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定することを含み、その際、該薬剤に暴露していない哺乳動物における該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｂ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの上昇が、該バイオマーカーが表１からのものであるときに該薬剤が微小管を安定化し、迅速に増殖する細胞に対して細胞障害活性を有することを示すものであり、該バイオマーカーが表２からのものであるときに該薬剤が微小管を安定化せず、迅速に増殖する細胞に対して細胞障害活性を有しないことを示すものである方法を提供する。
【００１５】
本明細書において、治療的な応答とは、癌の緩和または廃棄をいう。このことは、癌を罹患した個体の平均余命が増すこと、または癌の１またはそれ以上の徴候が低減または改善されることを意味する。この語は、癌様の細胞増殖または腫瘍容積の低減を包含する。哺乳動物が治療的に応答するか否かは、ＰＥＴ造影などの当該技術分野でよく知られた多くの方法によって測定することができる。
【００１６】
本発明の実施において測定した少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの上昇の量は、当業者により容易に決定することができる。一つの側面において、バイオマーカーのレベルの上昇は、バイオマーカーのレベルにおける少なくとも２倍の差違、少なくとも３倍の差違、または少なくとも４倍の差違である。
【００１７】
哺乳動物は、たとえば、ヒト、ラット、マウス、イヌ、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ウシ、ウマ、ネコ、霊長類、またはサルであってよい。
【００１８】
本発明の方法は、たとえば、インビトロの方法であってよく、その際、哺乳動物において少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを測定する工程は、該哺乳動物から生物学的試料を採取し、ついで該生物学的試料中のバイオマーカーのレベルを測定することを含む。生物学的試料は、たとえば、新鮮な全血、末梢血単核細胞、凍結した全血、新鮮な血漿、凍結した血漿、尿、唾液、皮膚、毛包、または腫瘍組織の少なくとも１つであってよい。
【００１９】
少なくとも一つのバイオマーカーのレベルは、たとえば、バイオマーカーのタンパク質および／またはｍＲＮＡ転写物のレベルであってよい。
【００２０】
本発明はまた、表１および表２のバイオマーカーから選択される単離されたバイオマーカーをも提供する。本発明のバイオマーカーは、表１および表２および配列表にて提供されるヌクレオチド配列およびアミノ酸配列から選択される配列、並びにその断片および変異体を含む。
【００２１】
本発明はまた、表１および表２のバイオマーカーから選択される２またはそれ以上のバイオマーカーを含むバイオマーカーセットをも提供する。
【００２２】
本発明はまた、１またはそれ以上の微小管安定化剤を含む治療に対してある患者が感受性であるかまたは耐性であるかを決定または予測するキットをも提供する。患者は、たとえば、乳癌または腫瘍などの癌または腫瘍を罹患していてよい。
【００２３】
一つの側面において、本発明のキットは、本発明の１またはそれ以上の特別のマイクロアレイを入れた適当な容器、患者の組織生検または患者の試料からの細胞を試験するのに用いる１またはそれ以上の微小管安定化剤、および使用の指示書を含む。キットはさらに、バイオマーカーセットの発現をｍＲＮＡまたはタンパク質レベルでモニターするための試薬または材料を含んでいてよい。
【００２４】
他の側面において、本発明は、表１および表２のバイオマーカーから選択される２またはそれ以上のバイオマーカーを含むキットを提供する。
【００２５】
さらに他の側面において、本発明は、表１および表２のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーの存在を検出するための抗体および核酸の少なくとも一つを含むキットを提供する。一つの側面において、該キットはさらに、微小管安定化剤の投与を含む癌の治療法に対して哺乳動物が治療的に応答するか否かを決定するための指示書を含む。他の側面において、該指示書は、（ａ）表１および表２のバイオマーカーから選択される少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定し、（ｂ）該哺乳動物を該微小管安定化剤に暴露し、（ｃ）工程（ｂ）の暴露後、該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルを該哺乳動物において測定する工程を含み、その際、工程（ａ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルと比較した工程（ｃ）で測定した該少なくとも一つのバイオマーカーのレベルの相違が、該バイオマーカーが表１からのものであるときに該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答するであろうことを予測するものであり、該バイオマーカーが表２からのものであるときに該哺乳動物が該癌の治療法に対して治療的に応答しないであろうことを予測するものである。
【００２６】
本発明はまた、１またはそれ以上の微小管安定化剤による治療に対して患者が感受性または耐性であるか否かを決定するためのスクリーニングアッセイをも提供する。
【００２７】
本発明はまた、疾患を罹患した患者の治療をモニターする方法であって、該疾患が１またはそれ以上の微小管安定化剤の投与を含む方法により治療されるものをも提供する。
【００２８】
本発明はまた、分子レベルでの患者の応答に基づいて疾患および障害を治療するのに必要な個性化された遺伝子プロファイルをも提供する。
【００２９】
本発明はまた、１またはそれ以上の微小管安定化剤に対する感受性かまたは耐性のいずれかと相関関係のある発現プロファイルを有する１またはそれ以上のバイオマーカーを含む、特別なマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイをも提供する。
【００３０】
本発明はまた、本発明の１またはそれ以上のバイオマーカーに対して向けられたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む抗体をも提供する。
【００３１】
本発明は、添付の図面と関連して考察しながら発明の詳細な説明を読むとより理解されるであろう。
【００３２】
カラーの図面である図４、図６および図１０を含む、２００５年１１月２９日に出願した対応の米国非仮出願第 号の図面が、参照のため本明細書に引用される。
【００３３】
本発明は、微小管安定化剤感受性または耐性と相関関係を有するバイオマーカーを提供する。これらバイオマーカーは、１またはそれ以上の微小管安定化剤に対する応答を予測するのに用いることができる。一つの側面において、本発明のバイオマーカーは、表１、表２および配列表（ポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両配列を含む）にて提供するバイオマーカーである。
【００３４】
表１にて提供するバイオマーカーは、配列番号１〜１００のヌクレオチド配列および配列番号２０１〜２９９のアミノ酸配列を含む。
【００３５】
表１：バイオマーカー（感受性）
【表１】
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【００３６】
【表２】
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【００３７】
【表３】
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【００３８】
【表４】
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【００３９】
【表５】
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【００４０】
【表６】
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【００４１】
【表７】
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【００４２】
【表８】
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【００４３】
【表９】
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【００４４】
【表１０】
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【００４５】
【表１１】
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【００４６】
【表１２】
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【００４７】
【表１３】
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【００４８】
【表１４】
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【００４９】
【表１５】
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【００５０】
【表１６】
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【００５１】
【表１７】
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【００５２】
【表１８】
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【００５３】
【表１９】
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【００５４】
【表２０】
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【００５５】
【表２１】
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【００５６】
表２にて提供するバイオマーカーは、配列番号１０１〜２００のヌクレオチド配列および配列番号３００〜３９５のアミノ酸配列を含む。
【００５７】
表２：バイオマーカー（耐性）
【表２２】
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【００５８】
【表２３】
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【００５９】
【表２４】
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【００６０】
【表２５】
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【００６１】
【表２６】
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【００６２】
【表２７】
2008532481.tif 000029
【００６３】
【表２８】
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【００６４】
【表２９】
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【００６５】
【表３０】
2008532481.tif 000032
【００６６】
【表３１】
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【００６７】
【表３２】
2008532481.tif 000034
【００６８】
【表３３】
2008532481.tif 000035
【００６９】
【表３４】
2008532481.tif 000036
【００７０】
【表３５】
2008532481.tif 000037
【００７１】
【表３６】
2008532481.tif 000038
【００７２】
【表３７】
2008532481.tif 000039
【００７３】
【表３８】
2008532481.tif 000040
【００７４】
【表３９】
2008532481.tif 000041
【００７５】
【表４０】
2008532481.tif 000042
【００７６】
【表４１】
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【００７７】
【表４２】
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【００７８】
ある種のバイオマーカーは特別の興味がもたれた。微小管関連タンパク質タウは、耐性マーカーの一つとして同定され、TaxolRが結合する微小管の部位の近傍に結合することが示されている。TaxolRは微小管とタウとの相互作用を妨害すると考えられているが、タウの相互作用はTaxolRより耐性であると思われる（R. Dyeら、J. Biological Chem., 268, 6847-6850 (1993)）。それゆえ、このことは、イクサベピロンは微小管中のTaxolRと同じ部位に結合するのでタウ発現細胞はイクサベピロン処置に対して一層耐性であるとの観察をさらに確認するものである。
【００７９】
他の興味深い耐性マーカーは、エストロゲン受容体である。一般に、エストロゲン−受容体の状態はホルモン処置に対する耐性を予測するものである（J. C. Changら、Lancet, 362, 362-369 (2003)）。しかしながら、エストロゲン受容体をイクサベピロンに対する耐性の強力なマーカーとして観察することは興味深いことであった。ERは、これまで化学療法への患者の応答の予測マーカーとして示唆されたことはなかった。さらに興味深いことに、微小管関連タンパク質タウはエストロゲンにより誘発される（M. Westら、P. N. A. S. USA, 98, 11462-11467 (2001)）。ERおよびタウはまたTaxolRの分析における耐性マーカーとしても見出されており（データは示していない）、このことは、タウおよびERの両者がイクサベピロンおよびTaxolRなどの微小管安定化剤の耐性マーカーでありそうなことを示唆している。
【００８０】
トランスポーター遺伝子（ATP-結合カセット、サブファミリーG (WHITE)、成員1およびATP-結合カセット、サブファミリーA (ABC1)、成員3）、ミドライン（Midline）1（C. Bertiら、BMC Cell Biol., Feb 29;5(1):9 (2004))、LMP7等を含む幾つかの他の遺伝子が、潜在的マーカーとして有望であると思われる。これらバイオマーカーの差異的発現パターンは、細胞株の２つの表現型（感受性および耐性）で顕著である。加えて、これらバイオマーカーの生物学的機能は、薬剤耐性メカニズムに関与しているか、または微小管の機能と関連している。さらに、腫瘍内で観察されるこれらバイオマーカーの差異的発現パターンは、応答マーカーとしてのその可能性を支持している。
【００８１】
微小管安定化剤
微小管安定化剤として作用する薬剤は当該技術分野においてよく知られている。これら薬剤は、腫瘍細胞などの迅速に増殖する細胞または他の過増殖細胞性疾患に対して細胞障害活性を有する。
【００８２】
一つの態様において、微小管安定化剤は、エポチロン、またはそのアナログまたは誘導体である。エポチロンは、そのアナログおよび誘導体も含めて、パクリタキセル（TaxolR）と同様の微小管安定化作用を奏すること、それゆえ腫瘍細胞などの迅速に増殖する細胞または他の過増殖細胞性疾患に対して細胞障害活性を奏することがわかっている。
【００８３】
適当な微小管安定化剤は、たとえば、以下のＰＣＴ公報（参照のため本明細書に引用する）に開示されている：WO93/10121; WO98/22461; WO99/02514; WO99/58534; WO00/39276; WO02/14323; WO02/72085; WO02/98868; WO03/07170; WO03/77903; WO03/78411; WO04/80458; WO04/56832; WO04/14919; WO03/92683; WO03/74053; WO03/57217;  WO03/22844; WO03/103712; WO03/07924; WO02/74042; WO02/67941; WO01/81342; WO00/66589; WO00/58254; WO99/43320; WO99/42602; WO99/39694; WO99/16416; WO 99/07692; WO99/03848; WO99/01124;およびWO 98/25929。
【００８４】
他の側面において、微小管安定化剤はイクサベピロンである。イクサベピロンは、微小管にパクリタキセルと同じ部位に結合するが微小管との異なった相互作用をする天然産物エポチロンＢの半合成アナログである（P. Giannakakouら、P. N. A. S. USA, 97, 2904-2909 (2000)）。
【００８５】
他の側面において、微小管安定化剤はタキサンである。タキサンは当該技術分野でよく知られており、たとえば、パクリタキセル（TaxolR）やドセタキセル（TaxotereR）を含む。
【００８６】
バイオマーカーおよびバイオマーカーセット
本発明は、微小管安定化および／または腫瘍細胞などの迅速に増殖する細胞または他の過増殖細胞性疾患に対して細胞障害活性が重要である疾患領域において、たとえば、癌または腫瘍において、診断および予後の両者で価値を有する個々のバイオマーカーおよびバイオマーカーセットを含む。バイオマーカーセットは、複数のバイオマーカー、たとえば、表１および表２に示す、１またはそれ以上の微小管安定化剤に対する耐性または感受性
と高度の相関関係を有する複数のバイオマーカーを含む。
【００８７】
本発明のバイオマーカーセットは、種々の生物学的系においてまたは細胞応答について１またはそれ以上の微小管安定化剤の起こりそうな効果を予測または妥当に予告することを可能にする。バイオマーカーセットは、被験細胞による微小管安定化剤応答のインビトロアッセイに用いてインビボでの結果を予測することができる。本発明によれば、本明細書に記載する種々のバイオマーカーセット、またはこれらバイオマーカーセットと他のバイオマーカーまたはマーカーとの組合せを、たとえば、癌患者が１またはそれ以上の微小管安定化剤による治療的介入に対してどのように応答するかを予測するのに用いることができる。
【００８８】
細胞が１またはそれ以上の微小管安定化剤に暴露された後の細胞の感受性または耐性と相関関係を有する細胞の遺伝子発現パターンのバイオマーカーセットは、該微小管安定化剤で治療する前に１またはそれ以上の腫瘍試料をスクリーニングするための有用なツールを提供する。このスクリーニングは、バイオマーカーセットの発現結果に基づき、腫瘍、それゆえ腫瘍を罹患した患者が微小管安定化剤を用いた治療に応答するか否かについて、１またはそれ以上の微小管安定化剤に暴露された腫瘍試料の細胞の予測を可能にする。
【００８９】
バイオマーカーまたはバイオマーカーセットはまた、本明細書に記載するように、微小管安定化剤が関与する疾患の治療を受けている患者において疾患の治療または療法の進行をモニターするのに用いることができる。
【００９０】
バイオマーカーはまた、疾患の治療のための療法の開発のための標的とすることができる。そのような標的は、乳癌や乳腫瘍の治療に特に応用することができる。実際、これらバイオマーカーは感受性細胞および耐性細胞において異なって発現されるので、その発現パターンは微小管安定化剤を用いた治療に対する細胞の相対的な内生の感受性と相関関係がある。従って、耐性の細胞において高度に発現されるバイオマーカーは、微小管安定化剤に対して耐性の腫瘍の新たな療法の開発のための標的となり得る。
【００９１】
バイオマーカータンパク質および／またはｍＲＮＡのレベルは、当業者によく知られた方法を用いて決定することができる。たとえば、タンパク質の定量は、ＥＬＩＳＡ、二次元ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ウエスタンブロット、免疫沈降、免疫組織化学、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）、またはフローサイトメトリーなどの方法を用いて行うことができる。ｍＲＮＡの定量は、ＰＣＲ、アレイハイブリダイゼーション、ノーザンブロット、インシトゥハイブリダイゼーション、ドットブロット、Taqman、またはＲＮアーゼ保護アッセイなどの方法を用いて行うことができる。
【００９２】
マイクロアレイ
本発明はまた、１またはそれ以上の微小管安定化剤に対する感受性かまたは耐性のいずれかと相関関係のある発現パターンを示す１またはそれ以上のバイオマーカーを含む、特別のマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイをも包含する。そのようなマイクロアレイは、腫瘍生検からの被験細胞においてバイオマーカーの発現レベルを評価し、これら被験細胞が微小管安定化剤に対して耐性または感受性でありそうか否かを決定するためのインビトロアッセイに用いることができる。たとえば、特別のマイクロアレイは、本明細書に記載し表１および表２に示すバイオマーカーの全てまたはそのサブセットを用いて調製することができる。組織または器官生検からの細胞を単離し、１またはそれ以上の微小管安定化剤に暴露することができる。未処理細胞および処理細胞の両者から単離した核酸を１またはそれ以上の特別のマイクロアレイに適用した後、被験細胞の遺伝子発現パターンを決定し、マイクロアレイ上でバイオマーカーセットを作成するのに用いた細胞のコントロールパネルからのバイオマーカーパターンのものと比較することができる。試験に供した細胞からの遺伝子発現パターンの結果に基づき、該細胞が遺伝子発現の耐性または感受性プロファイルのいずれを示すかを決定することができる。ついで、組織または器官生検からの被験細胞が１またはそれ以上の微小管安定化剤に応答するか否か、および治療または療法の方針を、特別のマイクロアレイ分析の結果から収集した情報に基づいて決定または評価することができる。
【００９３】
抗体
本発明はまた、１またはそれ以上のポリペプチドバイオマーカーに対して向けられたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を含む抗体をも包含する。そのような抗体は様々な仕方で用いることができ、たとえばインビトロおよびインビボ両者での診断、検出、スクリーニング、および／または治療法を含めて、本発明のバイオマーカーを精製、検出、およびターゲティングするのに用いることができる。
【００９４】
キット
本発明はまた、１またはそれ以上の微小管安定化剤を含む治療に対して患者が感受性であるかまたは耐性であるかを決定または予測するためのキットをも包含する。患者は、癌または腫瘍、たとえば乳癌または乳腫瘍を罹患していてよい。そのようなキットは、患者の生検腫瘍もしくは癌試料を試験するのに使用するため、たとえば患者の腫瘍または癌が微小管安定化剤を用いた所定の治療または療法に対して耐性であるかまたは感受性であるかを決定または予測するために臨床場面において有用であろう。そのようなキットは、以下のものを入れた適当な容器を含む：微小管安定化剤、患者の組織生検または患者の試料からの細胞を試験するのに使用する１またはそれ以上の微小管安定化剤に対する耐性および感受性と相関関係のあるバイオマーカーを含む１またはそれ以上のマイクロアレイ、たとえば、オリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはｃＤＮＡマイクロアレイ；および使用の指示書。さらに、本発明によって包含されるキットは、本明細書においてさらに記載するように、当該技術分野で実施されている他の技術および系、たとえば、ＲＴ−ＰＣＲアッセイ（本明細書に記載する１またはそれ以上のバイオマーカーに基づいてデザインしたプライマーを使用する）、酵素結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）などのイムノアッセイ、イムノブロッティング、たとえば、ウエスタンブロッティング、またはインシトゥハイブリダイゼーションなどを用い、たとえば、本発明のバイオマーカーの発現をｍＲＮＡまたはタンパク質のレベルでモニターするための試薬または材料をさらに含んでいてよい。
【００９５】
バイオマーカーおよびバイオマーカーセットの応用
バイオマーカーおよびバイオマーカーセットは種々の応用に用いることができる。バイオマーカーセットは、種々の生物学的系においていかなる微小管安定化剤の起こりそうな効果についての予測をも可能とすべく、表１および表２に列記したバイオマーカーのいかなる組合せからも構築することができる。本明細書に記載する様々なバイオマーカーおよびバイオマーカーセットは、たとえば、疾患管理における診断または予後の指標として、微小管安定化剤を用いた治療的介入に対して癌患者がどのように応答するかを予測するため、および微小管安定化および／または腫瘍細胞などの迅速に増殖する細胞または他の過増殖細胞性疾患に対する細胞障害活性に影響を及ぼす治療的介入に対して患者がどのように応答するかを予測するために用いることができる。
【００９６】
本発明のバイオマーカーは、微小管安定化および／または腫瘍細胞などの迅速に増殖する細胞または他の過増殖細胞性疾患に対する細胞障害活性が重要である疾患領域において、診断および予後の両者において価値を有する。
【００９７】
本発明によれば、患者の組織試料からの細胞、たとえば腫瘍または癌生検をアッセイして、１またはそれ以上の微小管安定化剤で治療する前に１またはそれ以上のバイオマーカーの発現パターンを決定することができる。一つの側面において、腫瘍または癌は乳癌である。治療の成功または失敗は、被験組織からの細胞（被験細胞）、たとえば腫瘍または癌生検のバイオマーカーの発現パターンに基づき、１またはそれ以上のバイオマーカーのコントロールセットの発現パターンと比べて同様であるか異なるかで決定することができる。それゆえ、もしも被験細胞が、微小管安定化剤に対して感受性の細胞のコントロールパネルでのバイオマーカーのものに対応するバイオマーカー発現プロファイルを示すなら、該患者の癌または腫瘍は該微小管安定化剤を用いた治療に良好に応答するであろうことの蓋然性が非常に高いあるいは予測される。対照的に、もしも被験細胞が、微小管安定化剤に対して耐性の細胞のコントロールパネルのバイオマーカーのものに対応するバイオマーカー発現パターンを示すなら、該患者の癌または腫瘍は該微小管安定化剤を用いた治療には応答しないであろうことの蓋然性が非常に高いあるいは予測される。
【００９８】
本発明はまた、１またはそれ以上の微小管安定化剤によって治療できる疾患を罹患した患者の治療をモニターする方法をも提供する。患者の組織試料、たとえば、腫瘍生検または腫瘍試料からの単離被験細胞を微小管安定化剤に暴露する前および暴露後に１またはそれ以上のバイオマーカーの発現パターンを決定することができる。その結果得られた治療の前および治療後の被験細胞のバイオマーカー発現プロファイルを、微小管安定化剤に対して耐性または感受性のいずれかである細胞のコントロールパネルで高度に発現されるべき本明細書に記載し示した１またはそれ以上のバイオマーカーのものと比較する。それゆえ、もしも患者の応答が１またはそれ以上のバイオマーカーの発現プロファイルの相関関係に基づいて微小管安定化剤による治療に対して感受性であるなら、該患者の治療予後は良好であると認定され、治療を続行することができる。また、もしも微小管安定化剤を用いた治療の後に被験細胞が該微小管安定化剤に感受性の細胞のコントロールパネルに対応するバイオマーカー発現プロファイルに変化を示さないなら、このことは現在行っている治療を修正、変更、あるいは中止さえすべきであるとの指標となり得る。このモニタリングプロセスは微小管安定化剤を用いた患者の治療の成功または失敗を指摘することができ、必要に応じてまたは所望により、そのようなモニタリングプロセスを繰り返すことができる。
【００９９】
本発明のバイオマーカーは、生物学的系について何らかの知見を得る前に結果を予測するのに用いることができる。本質的に、バイオマーカーは統計的なツールであると考えることができる。バイオマーカーは主として生物学的系を分類するのに用いる表現型を予測するうえで有用である。
【０１００】
現在のところバイオマーカーの全ての完全な機能が知られているわけではないが、バイオマーカーのあるものは直接または間接に微小管安定化および／または迅速に増殖する細胞に対する細胞障害活性に関与しているようである。さらに、バイオマーカーのあるものは試験した微小管安定化剤に特異的な代謝的または他の耐性経路で機能しているかもしれない。それにも拘わらず、バイオマーカーの機能についての知見は本発明の実施に従ってバイオマーカーの正確さを決定するための要件ではない。
【０１０１】
実施例
実施例１：バイオマーカーの同定
方法
細胞株および細胞障害アッセイ
23の乳癌細胞株をイクサベピロンに対する感受性についてアッセイした。各細胞株をイクサベピロンに72時間暴露し、増殖の抑制をCellTiter 96R Aqueous Non-Radioactive Cell proliferation Assay（Promega）によりIC50測定でアッセイした。ついで、50%増殖抑制に必要なイクサベピロンの濃度をIC50として計算した。各実験条件について、少なくとも３の測定を各細胞株について行った。23の細胞株をIC50測定で２回アッセイし、これら２つの別個のIC50データセットを以下の分析のために用いた。
【０１０２】
トレーニングセット選択（Training Set Selection）
分析のため、トレーニング細胞株を以下のようにして選択した。23の細胞株をIC50値を用いて「感受性」かまたは「耐性」のクラスに割り当て、log(IC50)値を全23の細胞株についての各IC50データセットの平均および標準偏差（SD）に基づいて正規化した（J.E. Stauntonら、P. N. A. S. USA. 98, 10787-10792 (2001)）。正規化したlog(IC50)値がlog(IC50)の平均未満である細胞株は感受性として分類し、超える細胞株は耐性として分類した。引き続き、細胞株の分類を２つの別々の実験で比較し、一貫したIC50および分類を示した18の細胞株をその後のマーカー分析のためのトレーニングセットとして選択した。一貫しないIC50および分類を示した5の細胞株は中間とし、分析から排除した。
【０１０３】
ＲＮＡ抽出および遺伝子発現データ
23の乳癌細胞株を、FBS10%を含むRPMI培地中、37℃および5%CO2にて50-70%コンフルエンスまで増殖させた。ＲＮＡをRNeasy Miniキット（Qiagen）を用い、製造業者の指示に従って単離した。Affymetrixプロトコールに記載されているように、10ugの全ＲＮＡを用いてビオチン化ｃＤＮＡ標的を調製した。標的を、〜32,000の遺伝子を含む44,000のプローブからなるAffymetrix high-density HU133 AおよびBセットにハイブリダイズさせた。チップをGeneChipRの推奨手順を用いて洗浄および染色した。発現値をGeneChipRソフトウエアを用いることにより計算し、1500まで調整した（scaled）。
【０１０４】
ｋ近傍法（k-Nearest Neighbors；ＫＮＮ）分析
マーカー遺伝子を見出すため、GeneClusterソフトウエアを用いた。まず、100の平均差違を超える遺伝子を濾過した。ついで、遺伝子が全18のトレーニング細胞株で２倍および1000の平均差違未満で変わる場合には、その遺伝子は排除した。引き続き、強度単位（intensity units）を全細胞株で各遺伝子について平均および偏差に正規化した。遺伝子をその発現レベルとトレーニング細胞株の感受性および耐性プロファイルとの相関関係に従って順位付けした。マーカー遺伝子選択プロセスを、遺伝子に標的クラスとのより高い相関関係のみを提供するＫＮＮアルゴリズムにより行った。ＫＮＮアルゴリズムは、データポイントのクラスをｋ最近傍トレーニングセットサンプルに現れる主要クラスに設定する。このマーカー選択は、相関関数として記載されるsignal-to-noise統計、[μ1(g) -μ2(g)]／[σ1(g) + σ2(g)]（式中、[μ1(g) -μ2(g)]および[σ1(g) + σ2(g)]は、それぞれクラス１および２におけるサンプルについての遺伝子ｇの発現レベルの平均およびＳＤを表す）による遺伝子の選別により行う。相関関係値の大きさは、遺伝子発現とクラス識別との相関関係の強度を示す。
【０１０５】
Leave-one-outクロス確認（Cross-Validation）分析およびランダム分類
トレーニングセットのクロス確認のために1-250遺伝子を有するプレディクターを用いた。各プレディクターについてクロス確認を全トレーニングセットで行い、一つの細胞株を除き、分類子を残りの細胞株でトレーニングし、ついで、差し控えた（withheld）該細胞株を分類する能力について試験した。この手順をトレーニングセット中の各細胞株について繰り返した。ランダム分類については、GeneClusterを用いてランダムクラスベクターを生成し、誤差率を計算した。
【０１０６】
Clustering and Tree View
遺伝子発現データをソフトウエアCluster and TreeViewにより分析した。
【０１０７】
乳腫瘍および遺伝子発現データ
外科手術で切除した175の乳腫瘍から抽出したＲＮＡをKarolinska Institute（ストックホルム、スウェーデン）から得た。これらＲＮＡ試料をAffymetrix Human U133セットを用いてプロファイリングし、それら遺伝子発現データを分析に用いた。
【０１０８】
結果
薬剤感受性データ（IC50）を耐性または感受性としての細胞株の表現型を決定するための鋳型として用いた。最初に、２つの別個のIC50データセットを23の乳癌細胞株について生成した。分析の第一ステップとして、log(IC50)値を各細胞株について計算し、各IC50データパネルにおける全細胞株についてlog(IC50)値の平均およびSDに基づいて正規化した（J.E. Stauntonら、P. N. A. S. USA. 98, 10787-10792 (2001)）。ついで、細胞株を以下の方法を用いて２つのクラスに分けた；平均を超える正規化したlog(IC50)は耐性であり、未満のものは感受性である（図１）。２つのデータセットにおける細胞株の分類を比較した後、２つの別々の実験において一貫した分類およびIC50値を示した18の細胞株を選択し、マーカー選択のために用いた。
【０１０９】
引き続き、18の細胞株の遺伝子発現データを分析して、感受性または耐性とされた観察された表現型と高度の相関関係のあった遺伝子を同定した。GeneCluster分析から、250までの相関のある遺伝子からなる分類子を選択し、以下のようにしてleave-one outクロス確認で試験した；一つの細胞株を外し、残りの細胞株についてトレーニングし、差し控えた該細胞株のクラスを予測し、ついでこのサイクルをトレーニングセット中の各細胞株について繰り返すことによって。各遺伝子を、その遺伝子発現レベルと感受性−耐性クラス識別とのトレーニングセットにおける相関関係に従って順位付けした。この分析から同定した各分類子を、図２に示すように誤差率で評価した。分類子が偶然によって観察することができるか否かについて評価するため、ランダム分類から計算した誤差率を調べた。一例として図３に示すように、ランダム分類から得た誤差率はIC50ベースの分類からのものより有意に高かった。
【０１１０】
GeneCluster分析から、200の遺伝子（表１および表２）が同定され、その発現レベルはＫＮＮ分析およびｔ検定に基づいて感受性−耐性クラス識別と高度の相関関係を有していた。これら遺伝子のうちから、感受性−耐性クラス識別と最も相関関係の大きかった50のマーカー候補（表１の最初の25の感受性マーカーおよび表２の最初の25の耐性マーカー）をさらなる分析のために選択した。
【０１１１】
図４に示すように、これら50の遺伝子は、感受性細胞株および耐性細胞株との間で顕著な発現パターンを示した。たとえば、図４に示すように、感受性と相関関係を有する上位25のマーカー（そのうちの一つは、プロテアソームサブユニット、ベータ、8型（LMP7）であった）は、感受性細胞株において高度に発現されたが（赤色で示す）、耐性細胞株では低レベルであった（青色で示す）。対照的に、これら遺伝子と反対の発現パターンを示した耐性と相関関係を有する上位25のマーカーは、耐性細胞株において高度に発現されたが、感受性細胞株では低レベルであった。
【０１１２】
同定した200の遺伝子のうちで、エストロゲン受容体（ER）が耐性マーカーの一つであることを見出したことは興味深いことである。図４に示すように、ER発現レベルはイクサベピロンに対する耐性と高度の相関関係を有していた。ERは耐性細胞株では高度に発現されたが、その発現は感受性細胞株では非常に低かった。ERの耐性メカニズムは明らかではないが、このデータはERが微小管安定化剤と関連する薬剤耐性に関与しているかもしれないことを示唆している。実際、ERはまた、本発明者らのパクリタキセルの分析においても耐性マーカーとして見出された（データは示していない）。ERに加えて、微小管関連タンパク質タウもまた、耐性マーカーの一つとして同定された。このタンパク質は、β−チューブリン上のTaxolR結合部位の近傍に結合し、TaxolRと同様の仕方で微小管を安定化させることが提唱されている（S. Karら、EMBO J., 22, 70-77. (2003)）。それゆえ、タウは、微小管に結合したTaxolR、およびおそらくは同様の仕方でイクサベピロン（イクサベピロンはβ−チューブリン上のパクリタキセルと同じ部位で結合するので）に影響を及ぼすと思われる。興味深いことには、タウはエストロゲン誘発性である（M. Westら、P. N. A. S. USA, 98, 11462-11467 (2001)）。明らかに、ERに対するタウ発現レベルのプロットにおいて示されるように（図５）、ERおよびタウはともに制御されているようである。それらの相関計数値は0.7である。
【０１１３】
同定した感受性マーカーのうち、LMP7はとりわけ興味深い、なぜなら、それはタウの機能と関連しているように思われるからである。一般に、プロテアソームは、細胞周期の制御やプログラムされた細胞死すなわちアポトーシスにとって重要なタンパク質を含む大抵の細胞内タンパク質の分解を担う多触媒プロテイナーゼ複合体である（P. Voorheesら、Clin. Cancer Res., 9, 6316-6325 (2003)）。タウは、20Sプロテアソームによりインビトロでユビキチン非依存的に分解される（D. Davidら、J. of Neurochemistry, 83, 176-185 (2002)）。このことはLMP7が感受性マーカーの一つであることを支持するものである、なぜなら、LMP7は、タウを分解しイクサベピロンを微小管に一層接近可能とすることによってイクサベピロンと微小管との相互作用を容易にすると推定されているからである。
【０１１４】
薬剤耐性メカニズムの一つのタイプは、流出メカニズムにより抗癌剤の細胞内蓄積を防ぐことのできる一群の輸送体タンパク質の機能に基づく（F. Leonessaら、Endocr. Relat. Cancer., 10, 43-73 (2003)）。幾つかの輸送体遺伝子が、耐性細胞株において高度に発現されているので潜在的な耐性マーカーとして同定された。これら遺伝子には、ATP-結合カセット、サブファミリーG（WHITE）、成員1およびATP-結合カセット、サブファミリーA（ABC1）、成員3が含まれる。それらは脂質輸送に関与するＡＴＰ依存性の輸送体であり、それぞれ化学療法剤の流出ポンプとして作用する（M. Gottesmanら、Nat. Rev. Cancer., Jan;2(1):48-58 (2002)）。
【０１１５】
さらに、微小管の機能に関連する遺伝子は特に興味深い、というのはイクサベピロンは微小管安定化剤だからである。微小管は細胞骨格の必須成分であり、細胞の運動および輸送、および細胞の形状の維持に関与している。重合および脱重合する微小管の能力の動的性質は、有糸分裂の際の染色体の分離に必須である（C. Bodeら、Biochemistry, 41, 3870-3874 (2002)）。それゆえ、それら機能に関連するミドライン1（C. Bertiら、BMC Cell Biol., Feb 29;5(1):9 (2004)）およびアネキシンA1（L.C. Alldridgeら、Exp. Cell Res., Oct 15;290(1):93-107 (2003)）などのマーカー遺伝子は、薬剤耐性のメカニズムに関与し得る。バイオマーカーは、表１および表２においてその生物学的機能により類別してある。
【０１１６】
これら遺伝子の応答予測マーカーとしてのインビボでの用途を研究するため、Karolinska Instituteから得た175の乳癌生検におけるこれら50の遺伝子の発現パターンを調べた。50の遺伝子を用いて腫瘍の発現パターンをクラスタリングした。図６に示すように、これら腫瘍は、細胞株の研究において認められるようにこれら腫瘍の別個のグループへのサブ分類を可能とする発現のパターンを示すことがわかった。多くの遺伝子の中から、タウおよびERを腫瘍において調べ、細胞株からの耐性マーカーとして同定された。図７に示すように、タウおよびERが細胞株の研究において認められるように相関関係を有すると思われるという傾向がある。実際、両遺伝子は腫瘍のサブセットにおいて高度に発現される。これら腫瘍は、イクサベピロン処置に対して非レスポンダーであると推定される。
【０１１７】
実施例２：ERおよびタウバイオマーカーのさらなる評価
エストロゲン受容体（ER）およびタウ（Tau）は、その発現パターンがイクサベピロンに対する耐性と高度の相関関係を有するのでバイオマーカーとして同定した。さらに、前臨床候補マーカーを用いた経路分析に基づき、ER経路がイクサベピロンに対する耐性について最も関連のある生物学的ネットワークであることがわかった（図９および図１０）。興味深いことに、最近、タウは乳癌患者におけるT/FACネオアジュバント（neoadjuvant）処置に対する病理学的完全応答と最も相関関係のある遺伝子として同定された（M. Ayersら、J. Clin. Oncol., 22(12):2284-93 (2004); R. Rouzierら、P.N.A.S., Jun 7;102(23):8315-20 (2005)）。この報告に続き、パクリタキセルに関する本発明者らの前臨床研究は、パクリタキセル感受性の新規なメディエーターとしてのタウの臨床知見を支持した（P. Wagnerら、Cell Cycle, Sep;4(9):1149-52 (2005)）。ERおよびタウをCA163-080試験においてイクサベピロンに対する応答の予測性について評価した。
【０１１８】
方法
CA163-080研究
CA163-080は、診査ゲノムフェーズII研究であり、これをネオアジュバント処置としてイクサベピロンを投与された乳癌患者において行った。この研究の主たる目的は、処置前乳癌生検の遺伝子発現プロファイリングによりイクサベピロンに対する応答の予測マーカーを同定することであった。侵襲段階IIA-IIIBの乳腺癌（腫瘍サイズ≧3cm直径）を罹患する患者に40mg/m2のイクサベピロンを第１日目の3時間の点滴としての投与の21日サイクルを４回まで行い、ついで化学療法の完了の3-4週間内に外科手術した。合計164人の患者がこの研究に登録されていた。遺伝子発現分析のための生検を処置前および処置後の両方で得た。患者から生検を単離後、試料を液体窒素中でかちかちに凍結させるか（snap frozen）あるいはRNAlater溶液中に一夜入れ、ついでRNAlater溶液から取り出した。試料はすべて使用のときまで-70℃に保持した。
【０１１９】
病理学的応答の評価
病理学的応答をSataloff分類系（D. Sataloffら、J. Am. Coll. Surg., 180(3):297-306 (1995)）を用いて評価し、ファーマコゲノミクス分析の終点として用いた。以下のようにしてベースラインと比較して組織変化を評価することにより、病理学的応答を一次腫瘍部位において処置の終わりでかつ外科手術の前に評価した。一次腫瘍部位において、細胞の修飾を浸潤腫瘍成分および可能な管成分（ductal component）の両者で評価し、生きた残留浸潤成分（全腫瘍質量の％）、残留管成分（全腫瘍質量の％）、分裂指数を決定した。乳癌のみにおける病理学的完全応答（Pathologic Complete Response (pCR)）は、T-A、すなわち、一次部位における完全またはほぼ完全な治療効果として定義した。この基準に基づき、レスポンダーにはpCRを有する患者が含まれ、一方、非レスポンダーにはpCRを示すことのできなかった患者が含まれた。応答率は、処置患者の数で除したレスポンダーの数として定義した。
【０１２０】
遺伝子発現プロファイリング
RNeasy Miniキット（Qiagen）を用い、Karolinska Institute（ストックホルム、スウェーデン）による製造業者の指示に従って全ＲＮＡを単離した。品質の良好な1μgを超える全ＲＮＡを有する合計134人の患者が最終ゲノム分析のためのデータセットに含まれていた。試料を無作為化した順序でバッチによりプロファイリングして実験的偏りを最小にした。各バッチは、約15の被験者試料、およびHeLa細胞から抽出したＲＮＡを用いた2の実験対照からなっていた。各バッチにおける２つの組織回収法（RNAlaterおよび液体窒素）、２つのｍＲＮＡ調製法（標準およびＤＮＡ上清）、組織回収部位、およびＲＮＡ試料調製の時間からの試料の数のバランスをとる努力をしつつ、完全な無作為化後に発現プロファイリングを行った。各被験者からのｍＲＮＡ試料をAffymetrixプラットホーム上のHG-U133A 2.0 GeneChipRアレイで処理し（processed）、GeneChipR Operating Software (GCOS) V1.0 (Affymetrix)で定量した。HG-U133A 2.0 GeneChipRアレイは約22,276のプローブセットからなり、それぞれ、特定の遺伝子配列からの約15の完全マッチングおよび対応のミスマッチ25merオリゴヌクレオチドプローブを含んでいた。
【０１２１】
遺伝子発現データプロセシング
遺伝子発現データを、２を底とする対数を用いて変換した。Robust Multichip Average (RMA)法（C. Clopperら、Biometrika, 26:404-13 (1934)）を用いて実験生データを正規化した。各遺伝子の遺伝子発現測定値を０を中心として揃え（centered at zero）、1-単位標準偏差を有するようにリスケールした（rescaled）。
【０１２２】
腫瘍生検における基質効果
腫瘍生検の分子プロファイルを調べるため、階層的クラスタリング分析を行った（図１０）。２つの最も高いレベルのクラスターのうち、３つのロシアサイト（サイト番号16、24および25）からの腫瘍試料の大部分は第一のクラスター中にクラスタリングされた（Fisherの正確確率検定、p-値<0.01）。MHC、CD抗原およびIgGなどのリンパ球機能と関連する遺伝子がこのクラスターに富んでいると思われた。それゆえ、このことは、３つのロシアサイトからの腫瘍が他のサイトに比べて基質（stroma）を多く含んでおり、それゆえ腫瘍組織のみの遺伝子発現に関してＲＮＡ試料が汚染されているとの懸念に導いた。さらに、３つのロシアサイト（16、24および25）からの平均腫瘍サイズは、他のサイトからのものよりも大きかった（平均5.43vs平均4.55、t-検定、p-値=0.022）。このことは、３つのロシアサイトからの腫瘍が他のものとは異なることを示唆していた。それゆえ、３つのロシアサイトを排除したサブグループ分析をも行った。
【０１２３】
統計分析
ロジスティック回帰（F. Hsiehら、Stat. Med., 17(14):1623-34 (1998)）を用いて遺伝子の発現とイクサベピロンに対する応答との間の関係を調べた。以下のモデルを各遺伝子について別々に適合させた：
【数１】
2008532481.tif 000045
（式中、Y=1はレスポンダーを表し、Xは遺伝子発現の測定値を表す）。各遺伝子について、評価がb1=0であるかの両側スコア検定（two-tailed Score test）からの確率を用い、さらなる検討のために最も興味のもたれる遺伝子を順位付けた。eb1は、被験者の試料についての平均発現と比較した遺伝子発現の１単位の増加についての非レスポンダーたるオッズ比である。オッズ比および95%信頼限界が報告された。
【０１２４】
被験者をそれぞれレスポンダーグループおよび非レスポンダーグループのため等しいサイズのトレーニングセット（n=67）または試験セット（n=67）に無作為に割り当てた。ERおよびタウの遺伝子発現は、応答の潜在的なプレディクターと考えられた。シングルロジスティック回帰（SLR）を用いてトレーニングセットに基づく予測モデルを構築し、モデル性能を試験セットで評価した。SLRモデルの予測誤差、感度、特異性、PPV（陽性的中率（positive predictive value)）、およびNPV（陰性的中率（negative predictive value)）並びに95%信頼区間を評価した。
【０１２５】
結果
エストロゲン受容体（ER）およびタウ
ERについては、レスポンダーであるとの予測された確率が0.3を超える患者はレスポンダーと分類した。SLRモデルのER予後感度、特異性、PPV、NPV、およびその95%信頼区間は、それぞれ、0.64（0.35, 0.85）、0.79（0.66, 0.87）、0.37（0.19, 0.59）、および0.92（0.80, 0.97)である。タウについては、レスポンダーであるとの予測された確率が0.25を超える患者はレスポンダーと分類した。SLRモデルのタウ予後感度、特異性、PPV、NPV、およびその95%信頼区間は、それぞれ、0.55（0.28, 0.79）、0.73（0.60, 0.83）、0.29（0.14, 0.50）、および0.89（0.77, 0.95）である。
【０１２６】
ロシアサイト16、24および25を除くエストロゲン受容体（ER）およびタウ
ERおよびタウについて別々に、レスポンダーであるとの予測された確率が0.5を超える患者はレスポンダーと分類した。SLRモデルのエストロゲン受容体1予後感度、特異性、PPV、NPV、およびその95%信頼区間は、それぞれ、0.67（0.35, 0.88）、0.83（0.69, 0.92）、0.46（0.23, 0.71）、および0.92（0.79, 0.97）である。SLRモデルのタウ予後感度、特異性、PPV、NPV、およびその95%信頼区間は、それぞれ、0.44（0.19, 0.73）、0.88（0.75, 0.95）、0.44（0.19, 0.73）、および0.88（0.75, 0.95）である。
【０１２７】
結論／検討
合計164人の患者がCA163-080研究に登録されていた。処置前生検から得たＲＮＡ試料の品質および量は、134人の患者（85%）が>1μgの良好な品質（遺伝子発現プロファイリングのためにさらなる増幅が必要でなかった）を有するＲＮＡ試料を有していたので、極めて良かった。腫瘍生検における基質汚染（stromal contamination）は、分析のための潜在的な問題として増大した。階層的クラスタリング分析に基づき、３つのロシアサイト16、24および25は、他に比べて試料中により多くの基質組織を有すると思われた。さらに、これらの３つのロシアサイトからの腫瘍は、他に比べてベースラインにおいてより大きかった。この仮説を確認するためさらなる分析が必要であるが、それは本来的に異質である臨床試料を分析するための重要な問題を提起した。
【０１２８】
前臨床候補マーカーのうち、ERおよびタウをCA163-080においてその予測可能性を調べた。本発明者らの前臨床研究において、ERおよびタウは、その発現パターンがイクサベピロンに対する耐性と高度の相関関係を有していたため、バイオマーカーとして同定された。CA163-080において、ERは、３つのロシアサイトが分析に含まれているか否かに拘わらず、pCRを良好に予測した。しかしながら、これらのサイトを排除したときには最も高いPPVが得られた。パクリタキセル、 5-フルオロウラシル、アドリアマイシンおよびシクロホスファミドの併用化学療法に対する応答の予測マーカーを見出すための他の研究において、ER制御遺伝子タウが応答の最良のプレディクターとして同定された（M. Ayersら、J. Clin. Oncol., 22(12):2284-93 (2004)）。このグループによって行われた研究はまた、スモールインテーフェアリングＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を用いたタウレベルのノックダウンがパクリタキセル処置に対する乳癌細胞株の感受性を増大させることをインビトロで証明した（R. Rouzierら、P.N.A.S., Jun 7;102(23):8315-20 (2005)）。提唱されているメカニズムは、高レベルのタウがβ-チューブリン上のタキサン結合部位へのパクリタキセルの結合を抑制するというものである。それゆえ、タウ遺伝子発現もイクサベピロンへの応答を予測する能力について調べた。この遺伝子のPPV（0.44）は、３つのロシアサイトを除いたサブセットにおけるER（0.46）のものと同様であった。
【０１２９】
それゆえ、ERおよびタウは、イクサベピロンに対する応答についてのプレディクターとしての有用性を示し、イクサベピロンに対するpCRレスポンダーを同定するためのバイオマーカーとして用いることができる。
【０１３０】
実施例３：バイオマーカーに対する抗体の製造
バイオマーカーに対する抗体は種々の方法により調製することができる。たとえば、バイオマーカーポリペプチドを発現している細胞を動物に投与して、該発現されたポリペプチドに対して向けられたポリクローナル抗体を含む血清の産生を動物に誘発することができる。一つの側面において、当該技術分野で一般に行われている技術を用い、バイオマーカータンパク質を調製および単離し、あるいは精製して天然の混入物を実質的に含まないようにする。ついで、発現され単離されたポリペプチドに対してより高い比活性を有するポリクローナル抗血清を製造するため、そのような調製物を動物に導入する。
【０１３１】
一つの側面において、本発明の抗体はモノクローナル抗体（またはそのタンパク質結合フラグメント）である。バイオマーカーポリペプチドを発現する細胞はいずれかの適当な組織培養培地にて培養できるが、10%ウシ胎仔血清（約56℃で不活化したもの）を含むように補充し、約10g/lの非必須アミノ酸、約1,00U/mlのペニシリン、および約100μg/mlのストレプトマイシンを含むように補充したEarle改変Eagle培地で細胞を培養するのが好ましい。
【０１３２】
免疫した（およびブースター投与した）マウスの脾細胞を抽出し、適当なミエローマ細胞株と融合することができる。いずれの適当なミエローマ細胞株をも本発明に従って用いることができるが、ＡＴＣＣ（マナサス、バージニア）から入手可能な親ミエローマ細胞株（ＳＰ２／０）を用いるのが好ましい。融合後、Wandsら（1981, Gastroenterology, 80:225-232）によって記載されているように、得られたハイブリドーマ細胞をＨＡＴ培地で選択的に維持し、ついで限界希釈によりクローニングする。ついで、そのような選択により得られたハイブリドーマ細胞をアッセイして、ポリペプチド免疫原またはその部分に結合することのできる抗体を分泌する細胞クローンを同定する。
【０１３３】
別法として、抗イディオタイプ抗体を用いる２工程法においてバイオマーカーポリペプチドに結合することのできるさらなる抗体を製造することができる。そのような方法は、抗体自身が抗原であること、それゆえ第二の抗体に結合する抗体を得ることができるとの事実を用いるものである。この方法によれば、タンパク質特異的抗体を用いて動物、好ましくはマウスを免疫することができる。ついで、そのような免疫した動物の脾細胞を用いてハイブリドーマ細胞を製造し、ハイブリドーマ細胞をスクリーニングしてタンパク質特異的抗体に結合する能力が該ポリペプチドによって阻止され得る抗体を産生するクローンを同定する。そのような抗体はタンパク質特異的抗体に対する抗イディオタイプ抗体を含み、動物を免疫してさらなるタンパク質特異的抗体の生成を誘発するのに用いることができる。
【０１３４】
実施例４：免疫蛍光アッセイ
以下の免疫蛍光プロトコールを、たとえば、細胞上のバイオマーカータンパク質発現を確認するため、または、たとえば、細胞の表面に発現されたバイオマーカーに結合する１またはそれ以上の抗体の存在についてチェックするために用いることができる。簡単に説明すると、カルシウムおよびマグネシウムを含むDPBS（DPBS++）中の10μg/mlのウシコラーゲンII型でLab-Tek IIチャンバスライドを4℃にて一夜コーティングする。ついで、スライドを冷DPBS++で２回洗浄し、全容量125μlの8000 CHO-CCR5または CHO pC4トランスフェクション細胞を播種し、95%酸素/5%二酸化炭素の存在下、37℃でインキュベートする。
【０１３５】
培地を吸引により穏やかに除去し、吸着した細胞をDPBS++で周囲温度にて２回洗浄する。スライドを0.2%BSA（ブロッキング剤）を含有するDPBS++で0-4℃にて1時間ブロッキングする。ブロッキング溶液を吸引により穏やかに除去し、125μlの抗体含有溶液（抗体含有溶液は、たとえば、ハイブリドーマ培養上澄み液（通常、希釈せずに用いる）、または血清／血漿（通常、希釈する、たとえば約1/100の希釈）であってよい）を加える。スライドを0-4℃にて1時間インキュベートする。ついで、抗体溶液を吸引により穏やかに除去し、細胞を400μlの氷冷ブロッキング溶液で５回洗浄する。つぎに、ブロッキング溶液中のローダミン標識二次抗体（たとえば、抗ヒトＩｇＧ）（125μl、1μg/ml）を細胞に加える。再び、細胞を0-4℃にて1時間インキュベートする。
【０１３６】
ついで、二次抗体を吸引により穏やかに除去し、細胞を400μlの氷冷ブロッキング溶液で３回、ついで冷DPBS++で５回、洗浄する。ついで、細胞をDPBS++中の3.7%ホルムアルデヒド（125μl）で周囲温度にて15分間固定化する。その後、細胞を400μlのDPBS++で周囲温度にて５回洗浄する。最後に、細胞を50%水性グリセリンに入れ、ローダミンフィルターを用いて蛍光顕微鏡で観察する。
【図面の簡単な説明】
【０１３７】
【図１】図１は、イクサベピロン（ixabepilone）処置に対して測定したIC50値に基づく乳癌細胞株の分類を示す。細胞株をlog(IC50)値の平均（点線）に基づいて正規化し、感受性および耐性として２群に分けた。左側の細胞株はlog(IC50)値の平均未満であるので感受性とされ、右側の細胞株はlog(IC50)値の平均を超えているので耐性とされる。
【０１３８】
【図２】図２は、同定した各分類子（classifier）から得られた誤差率を示す。GeneCluster分析から、250までの遺伝子を含む分類子を決定した。同定した各プレディクターをleave-one out cross validation法により計算した誤差率で評価した。図２に示すように、分類子（8-250の遺伝子）の誤差率はゼロにて最小に維持される。
【０１３９】
【図３】図３は、ランダム順列（permutation）に基づく誤差率の計算を示す。ソフトウエアGeneClusterを用いてランダム分類（ランダム1-11）の幾つかの例から得られた誤差率を、250までの遺伝子を含むプレディクターセットに対してプロットした。このプロットに示されるように、IC50ベースの分類に基づいて計算した誤差率は、ランダム分類に基づく誤差率よりも有意に低い。
【０１４０】
【図４】図４は、イクサベピロンに対する感受性と相関関係を有する上位50の遺伝子を示す。赤色および青色のマトリックスは、細胞株全体で各遺伝子についての正規化した発現パターンを表す（最も明るい赤色は最高の相対発現を示し、最も暗い青色は最低の相対発現を示す）。
【０１４１】
【図５】図５は、微小管関連タンパク質タウおよびエストロゲン受容体（本明細書で「エストロゲン受容体１」、「ER」および「ER1」とも称する）の遺伝子発現レベルを示す。タウとERとの関係を調べるため、これら２つの遺伝子発現レベルを各細胞株に対してプロットしてある。タウ発現レベルは棒グラフで、ERは折れ線グラフで示してある。
【０１４２】
【図６】図６は、175の一次乳腫瘍における上位50の遺伝子の発現パターンを示す。赤色および緑色のマトリックスは、175の一次乳腫瘍全体で各遺伝子についての正規化した発現パターンを表す（最も明るい赤色は最高の相対発現を示し、緑色は最低の相対発現を示す）。青色ボックス中の腫瘍のサブセットは、感受性細胞株で高度に発現した上位25の遺伝子の相対的に高い発現を示す。一方、マゼンタ（赤紫色）ボックス中の腫瘍は、耐性細胞株で上昇レベルで発現した25の遺伝子の相対的に高い発現を示す。
【０１４３】
【図７】図７は、乳腫瘍におけるMAPタウおよびERの発現を示す。腫瘍内でのタウおよびERの発現パターンを解析するため、それらの発現レベルを一緒にプロットしてある。タウは折れ線グラフで、ERは棒グラフで示してある。腫瘍をタウ発現レベルが増大する順で配置してある。これらの遺伝子を高度に発現する腫瘍のサブセットが存在すると思われ、このことはこれらがイクサベピロンに対する非リスポンダーであることを示唆している。
【０１４４】
【図８】図８は、200の前臨床候補マーカーを用いたIngenuityR経路分析により決定したイクサベピロンに対する耐性のメカニズムで暗示される生物学的ネットワークを示す。その有意性スコアで上位に示された９つの主要なネットワークが存在する。示されているように、ER経路は最も関連性が示唆される（the most implicated）ネットワークである。
【０１４５】
【図９】図９は、最も関連性が示唆されるERネットワークを示し、ERとタウとの間の機能的結合性（connectivity）を示す。
【０１４６】
【図１０】図１０は、134の患者腫瘍の固有の分子プロファイルを示す。低発現および低分散遺伝子を排除後の約9800の遺伝子を用い、階層的クラスタリングを行った。行：遺伝子、列：腫瘍。腫瘍を２つの主要なクラスターに分類し、興味深いことに、３つのロシアサイトからの試料の大部分は第一のクラスター中にクラスタリングされた。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年7月30日(2007.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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