(57)【要約】  配列番号２のアミノ酸１−274に関連するプロテアーゼ、すなわちスブチリシンCarlsbergとも呼ばれる、バチルス・リケニホルミス由来のセリンプロテアーゼの、任意にはリパーゼ及び/又はアミラーゼと組合しこの医薬使用に関する。医学的兆候の例は、消化異常、膵臓の外分泌不十分（PEI）、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸１−274に対して少なくとも50％の同一性を有する、薬剤としての使用のためのプロテアーゼ。
【請求項２】
ａ）前記プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成り；そして/又は
ｂ）前記プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸配列の変異体であり、ここで前記変異体は、25個以下のアミノ酸により、それぞれのアミノ酸配列とは異なり、そして
（i）前記変異体は、前記それぞれのアミノ酸配列に比較して、１又は複数のアミノ酸の少なくとも１つの置換、欠失及び/又は挿入を含んで成り、そして/又は
（ii）前記変異体は、前記それぞれのアミノ酸配列に比較して、少なくとも１つの小さな欠失を含んで成り、そして/又は
（iii）前記変異体は、前記それぞれのアミノ酸配列に比較して、少なくとも１つの小さなN-又はC-末端延長を含んで成り；そして/又は
（ｃ）前記プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸を有するプロテアーゼの対立遺伝子変異体であり、そして/又は
（ｄ）前記プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸を有するプロテアーゼのフラグメントである、請求項１記載のプロテアーゼ。
【請求項３】
前記プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸配列を有する請求項２記載のプロテアーゼ。
【請求項４】
薬剤としての使用のために、リパーゼ又はアミラーゼと組合わせての、請求項１〜３のいずれか１項記載のプロテアーゼ。
【請求項５】
薬剤としての使用のために、リパーゼ及びアミラーゼと組合わせての、請求項１〜３のいずれか１項記載のプロテアーゼ。
【請求項６】
（i）前記リパーゼが配列番号15のアミノ酸１−269を有するリパーゼに対して少なくとも70％の同一性を有し；そして
（iii）前記アミラーゼが、
ａ）配列番号16のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、
ｂ）配列番号17のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及び
ｃ）配列番号18のアミノ酸１−483を有するアミラーゼ、
から成る群から選択されたアミラーゼに対して少なくとも70％の同一性を有する、請求項４又は５記載のリパーゼ及び/又はアミラーゼと組合わせてのプロテアーゼ。
【請求項７】
i）前記プロテアーゼが配列番号２のアミノ酸1−274を有し、
ii) 前記リパーゼが配列番号15のアミノ酸２−269を含んで成り、そして
iii)前記アミラーゼが、
ａ）配列番号16のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、
ｂ）配列番号17のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及び
ｃ）配列番号18のアミノ酸１−483を有するアミラーゼから成る群から選択されたアミラーゼである、請求項４又は５記載のリパーゼ及び/又はアミラーゼと組合わせてのプロテアーゼ。
【請求項８】
消化異常、膵臓の外分泌不十分、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理のための薬剤の製造のためへの請求項１〜３のいずれか１項記載のプロテアーゼの使用。
【請求項９】
リパーゼ又はアミラーゼの使用をさらに含んで成る請求項８記載の使用。
【請求項１０】
リパーゼ及びアミラーゼの使用をさらに含んで成る請求項８記載の使用。
【請求項１１】
前記リパーゼ及び/又はアミラーゼが請求項６又は７に定義される通りである請求項９又は10記載の使用。
【請求項１２】
少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤材料と共に、請求項１〜３のいずれか１項記載のプロテアーゼを含んで成る医薬組成物。
【請求項１３】
リパーゼ又はアミラーゼをさらに含んで成る請求項12記載の組成物。
【請求項１４】
リパーゼ及びアミラーゼをさらに含んで成る請求項12記載の組成物。
【請求項１５】
前記リパーゼ及び/又はアミラーゼが請求項６又は７に定義される通りである請求項13又は14に記載の組成物。
【請求項１６】
治療的有効量の請求項１〜３のいずれか１項記載のプロテアーゼを投与することによる、消化異常、膵臓の外分泌不十分、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理方法。
【請求項１７】
治療的有効量のリパーゼ又はアミラーゼを投与することをさらに含んで成る請求項16記載の方法。
【請求項１８】
治療的有効量のリパーゼ及びアミラーゼを投与することをさらに含んで成る請求項16記載の方法。
【請求項１９】
前記リパーゼ及び/又はアミラーゼが請求項６又は７に定義される通りである請求項17又は18記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意には、リパーゼ及び/又はアミラーゼと組合わせての、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）に由来するセリンプロテアーゼ（配列番号２のアミノ酸１−274）に関連するプロテアーゼの医薬使用に関する。医学的適応の例は、消化異常、膵臓の外分泌不十分（PEI）、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理である。
【背景技術】
【０００２】
膵臓酵素サプリメントの形でのいくつかの市販の薬剤は、膵臓外分泌不十分の処理のために知られている。それらの製品中の活性成分は、膵臓において通常、生成され、そして小腸の上方部分（十二指腸）に排泄される消化酵素、主にアミラーゼ、リパーゼ及びプロテアーゼである。そのような薬剤に使用される酵素はウシ又はブタ膵臓に由来するが、しかしながら、微生物酵素に関しての市販の製品、例えばリゾパス・オリザエ（Rhizopus oryzae）からのリパーゼ、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）からのプロテアーゼ、及びアスペルギラス・オリザエからのアミラーゼを含む製品Nortase（商標）が存在する。
【０００３】
アメリカ特許第5614189号（EP600868号）は、嚢胞性線維症を有する患者の処理における膵臓酵素置換療法へのヒューミコラ・ラヌギノサ（Humicola lanuginose）由来のリパーゼの使用を記載する。このリパーゼは、ヒューミコラ・ラヌギノサDSM4109からであり、そして配列番号14のアミノ酸1−269のアミノ酸配列を有する。
WO00/54799号は、I型及びII型糖尿病の処理における脂肪分解、タンパク質分解及びデンプン分解活性を有する生理学的に許容できる酵素混合物の使用を記載する。
【０００４】
WO02/060474号は、リゾパス・デレマー（Rhizopus delemar）からの濃縮されたリパーゼ、アスペルギラス・メレウス（Aspergillus melleus）からの中性プロテアーゼ、及びアスペルギラス・オリザエからのアミラーゼの消化不良の処理への使用を記載する。
【０００５】
WO01/62280号は、多官能架橋剤、プロテアーゼ及びアミラーゼにより架橋された非菌類リパーゼ結晶の使用を記載し、ここで前記リパーゼ結晶は、哺乳類における胃腸障害を処理するか又は予防するために約2.0〜9.0の範囲のpHで活性的である。好ましいリパーゼは、シュードモナス（Pseudomonas）からであり、好ましいアミラーゼは、バチルス又はアスペルギラスからであり、好ましいプロテアーゼはブロメライン、パパイン又はフィシンである。
【０００６】
EP0828509号は、膵臓外分泌不十分の処理への一定の酸安定性アミラーゼと、任意には一定の酸安定性リパーゼ及び/又はプロテアーゼとの組合わせての使用を記載する。好ましいアミラーゼはアスペルギラス・ニガー（Aspergillus niger）からであり、そして好ましいリパーゼはリゾパス・アルヒザス（Rhizopus arrhizus）又はリゾパス・ジバニカス（Rhizopus javanicus）からである。
WO91/00345号は、洗剤組成物への使用のための多くのセリンスブチリシンプロテアーゼ及び改良されたその変異体を記載する。
【０００７】
WO2005/115445号（本出願の優先日の後に公開された）は、任意には、リパーゼ及び/又はアミラーゼと組合わせてのノカルジオプシス（Nocardiopsis）sp. NRRL18262からのプロテアーゼ（このプロテアーゼは、この参照にしておいて配列番号１のアミノ酸１−188のアミノ酸配列を有する）の医薬的使用を記載する。この医学的表示は、本発明におけるのと同じである。
WO02/077187号は、変更されたT−細胞エピトープを有するデンプン液化バチルス・スブチリシンの変異体及びその種々の使用を開示する。医薬組成物が請求されている。
【０００８】
WO01/12795号は、タンパク質分解酵素組成物の医薬使用を開示する。好ましいプロテアーゼは、アスペルギラス・オリザエ（Aspergillus oryzae）、A. ニガー（A. niger）、A. ソジャエ（A. sojae）、A. フラバス（A. flavus）、A. アワモリ（A. awamori）又はバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）からである。
【０００９】
WO2004/078773号は、要求に基づいて外部シグナルにより活性化され得る不活性状態でのプロテアーゼ、例えばスブチリシンプロテアーゼをいかにして維持するかを開示する。他の使用の中で、創傷清浄配合物へのプロ−スブチリシンの使用、及び活性スブチリシンがいかにして形成されるかを開示する。好ましいプロテアーゼ酵素は、ProD−スブチリシン又はProD−負荷されたスブチリシンである（Yabutaなど., J. Biol. Chem. 278:15246-51 , 2003）。
【００１０】
US2002/0081703号は、非ヒトタンパク質のアレルギー性を低めるための方法を開示し、ここでエピトープが同定され、そしてヒトスブチリシンの類似する領域により置換される。ヒトスブチリシンを含んで成る医薬組成物が請求されている。
医薬使用、特に上記に言及される医学的徴候のための他の好ましく改良された酵素についての必要性が当業界に存在する。
【発明の開示】
【００１１】
発明の要約：
本発明は、医薬使用のための、特に消化異常、膵臓の外分泌不十分（PEI）、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理のための他の好ましく改良された酵素を供給する。新規酵素は、プロテアーゼ、アミラーゼ及びリパーゼである。好ましくは、本発明の使用のための酵素は、インビボ及び/又はインビトロでの改良された効能；改良されたpH−安定性プロフィール；改良されたpH−活性プロフィールを有し；プロテアーゼによる分解に対して安定し；胆汁塩の存在下で安定し；そして/又は低められたアレルギー性を有する。
【００１２】
本発明は、任意にはリパーゼ及び/又はアミラーゼと組合わせての、配列番号２のアミノ酸１−274に対して少なくとも50％の同一性のプロテアーゼに関する。
本発明はまた、消化異常、PEI、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理のための薬剤の製造のためへのそのようなプロテアーゼの使用にも関し、それらの使用はさらに、リパーゼ及び/又はアミラーゼの使用を包含する。
【００１３】
本発明はさらに、少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤材料、任意にはリパーゼ及び/又はアミラーゼと共にそのようなプロテアーゼを含んで成る医薬組成物に関する。
本発明はまた、治療的有効量のそのようなプロテアーゼを、任意にはリパーゼ及び/又はアミラーゼと共に投与することによる、消化異常、PEI、膵炎（急性及び/又は慢性）、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理方法に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
発明の特定の記載：
酵素：
本発明は、配列番号２のアミノ酸１−274のプロテアーゼに対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ、すなわちスブチリシンCarlsbergとも呼ばれる、バチルス・リケニホルミス由来のセリンプロテアーゼの医薬使用に関する。本発明はまた、消化異常、PEI、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理のための薬剤の製造のためへのそのようなプロテアーゼの使用にも関する。本発明はさらに、少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤材料と共にそのようなプロテアーゼを含んで成る医薬組成物、並びに治療的有効量のそのようなプロテアーゼを、上記言及された疾病の処理方法に関する。
【００１５】
続いて、本発明の組成物、方法及び使用への使用のためのプロテアーゼは、“本発明のプロテアーゼ”として言及される。
【００１６】
好ましい態様においては、本発明のプロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸1−274に対して少なくとも51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 又は少なくとも60%の程度の同一性を有する。他の好ましい態様においては、本発明のプロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸1−274に対して少なくとも61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69% 又は少なくとも70%の程度の同一性を有する。さらに好ましい態様においては、本発明のプロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸1−274に対して少なくとも71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% 又は少なくとも80%の程度の同一性を有する。
【００１７】
さらに好ましい態様においては、本発明のプロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸1−274に対して少なくとも81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%又は少なくとも90%の程度の同一性を有する。最も好ましい態様においては、本発明のプロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸1−274に対して少なくとも91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%又は少なくとも99％の程度の同一性を有する。
【００１８】
用語“プロテアーゼ”とは、本明細書においては、ペプチド結合を加水分解する酵素として定義される。それは、EC3.4酵素グループ（その13種の亜綱の個々を包含し、それらの酵素は“EC3.4.-.-酵素グループに属する”として言及される）に属するいずれかの酵素を包含する。EC番号は、それぞれ、Eur. J. Biochem. 1994,223, 1-5; Eur. J. Biochem. 1995,232, 1-6; Eur. J. Biochem. 1996,237, 1-5; Eur. J. Biochem. 1997,250, 1-6; and Eur. J. Biochem. 1999,264, 610-650に公開されている付録を包含する、NC-IUBMB, Academic Press, San Diego, Californiaからの酵素命名法1992を言及する。命名法は定期的に補充され、そして更新されている：http://www. chem. qmw. ac. uk/iubmb/enzyme/index. HtmlでのWorld Wide Web (WWW)を参照のこと。
【００１９】
プロテアーゼは、それらの触媒機構に基づいて、次のグループに分類される：セリンプロテアーゼ（S）、システインプロテアーゼ（C）、アスパラギン酸プロテアーゼ（A）、金属プロテアーゼ（M）及び未知の又はまだ分類されていないプロテアーゼ（U）。Handbook of Proteolytic Enzymes, A. J.Barrett, N. D. Rawlings, J. F. Woessner (eds), Academic Press (1998)、（次に“ハンドブック”として言及される）、特に一般的な概論部分を参照のこと。
【００２０】
もう１つの態様においては、本発明のプロテアーゼは、セリンプロテアーゼである。用語、セリンプロテアーゼとは、ハンドブック、特にチャプター1−175に定義されるように、セリンペプチダーゼ類及びそれらの派生物を言及する。セリンプロテアーゼは、その触媒機構がペプチド結合を攻撃する求核物質として作用するセリン残基のヒドロキシル基に依存するペプチダーゼである。
【００２１】
さらなる態様においては、本発明は、スブチリシンであり、そして/又はスブチリシンファミリーに由来する。用語、スブチリシン又はスブチリシンファミリーとは、すべてのClan SBセリンプロテアーゼ、特にそのファミリーS8を包含する（Clan SBは、前記ハンドブックのチャプター93に取り扱われている）。所定のプロテアーゼがスブチリシンであるか、否かを決定するためには、前記ハンドブック及びそこに示される原理を参照のこと。そのような決定は、すべてのタイプのプロテアーゼ、すなわち天然に存在するか又は野生型プロテアーゼ、又は遺伝子的に構築された又は合成プロテアーゼについて行われ得る。
【００２２】
特定の態様においては、本発明のプロテアーゼにおける触媒三元体の順序は、Asp-His-Serである。もう１つの特定の態様においては、本発明のプロテアーゼの三次構造は、α−へリックス及びβ−シートの両者を包含する。Clan SBは、エンドペプチダーゼ及びエキソペプチダーゼを包含する。さらなる特定の態様においては、本発明のプロテアーゼはエンドペプチダーゼである。エンドペプチダーゼは、問題のプロテアーゼの特異性のために適切である、N−及びC−末端ブロックされたペプチド基質に対して活性を示す。
【００２３】
特定の態様においては、本発明のプロテアーゼは、ProD−スブチリシン又はProD−負荷されたスブチリシンではない（Yabuta など., J. Biol. Chem. 278:15246-51 , 2003）。もう１つの特定の態様においては、本発明のプロテアーゼは、野生型バチルス・スブチリシンではなく、そして/又はバチルス・サブチリスに由来しない。
従って、第１の観点においては、本発明のプロテアーゼは、（ａ）EC3.4. . .酵素グループに属するプロテアーゼ；（ｂ）セリンプロテアーゼ；（ｃ）ペプチダーゼClan SBのスブチリシンプロテアーゼ；及び（ｄ）ファミリーSBのスブチリシンプロテアーゼから成る群から選択される。
【００２４】
第２の観点においては、本発明のプロテアーゼは、微生物、例えば菌類、又は細菌に由来する。細菌の例は、バチルスの株、例えば次のバチルス株：バチルス・アルカロフィラス（Bacillus alkalophilus）、バチルス・アミロリケファシエンス（Bacillus amyloliquefaciens）、バチルス・ブレビス（Bacillus brevis）、バチルス・クラウジ（Bacillus clausii）、バチルス・サーキュランス（Bacillus circulans）、バチルス・コアギュランス（Bacillus coagulans）、バチルス・ラウタス（Bacillus lautus）、バチルス・レンタス（Bacillus lentus）、バチルス・リケニホルミス（Bacillus licheniformis）、バチルス・メガテリウス（Bacillus megaterium）、バチルス・メセンテリカス(Bacillus mesentericus)、バチルス・ナットウ(Bacillus natto)、バチルス・プミラス(Bacillus pumilus)、バチルス sp.、バチルス・ステアロサーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）、バチルス・サブチリス  varナットウ、又はバチルス・スリンジエンシス（Bacillus thuringiensis）；特に次の株：バチルス・アミロリケファシエンス、バチルス・クラウジ、バチルス・レンタス、バチルス・リケニホルミス、バチルス・メセンテリカス、バチルス・ナットウ、バチルス・プミラス、バチルス sp.、バチルス・ステアロサーモフィラス、バチルス・サブチリス又はバチルス・サブチリス  varナットウ；好ましくはバチルス・リケニホルミス株である。
【００２５】
本明細書において、用語“〜に由来する”とは、野生型株から得ることができるか又はそれから得られた酵素；及び好ましくは、少なくとも１つのアミノ酸残基の少なくとも1つの置換、挿入及び/又は欠失を有するその変異体を包含する。用語、変異体とはまた、シュフラント（shufflant）、ハイブリッド、キメラ酵素及びコンセンサス酵素を包含する。変異体は、当業界において知られているいずれかの方法、例えば特定の部位の突然変異誘発、ランダム突然変異誘発、コンセンサス誘導方法（EP897985号）及び遺伝子シャフリング（WO95/22625号、WO96/00343号）、等により生成されて来た。
【００２６】
次のものは、バチルス株に由来し、そして配列番号２のアミノ酸１−274のプロテアーゼに関連する本発明のプロテアーゼの例である：Swissprot subt bacli 受託番号P00780 (バチルス・リケニホルミスに由来する, 配列番号5のアミノ酸 1-274); Swissprot subn bacna 受託番号P35835 (バチルス・ナットウに由来する, 配列番号6のアミノ酸 1-275); Swissprot subt bacpu 受託番号P07518 (バチルス・プミラスに由来する, 配列番号7アミノ酸 1-275); Swissprot subt bacsu 受託番号P04189 (バチルス・サブチリスに由来する, 配列番号8のアミノ酸 1-275); Swissprot subt bacst 受託番号P29142 (バチルス・ステアロサーモフィラスに由来する, 配列番号9のアミノ酸 1- 275); Swissprot subt bacam 受託番号P00782 (バチルス・アミロリケファシエンスに由来する, 配列番号10のアミノ酸 1-275); Swissprot subs bacle 受託番号P29600 (バチルス・レンタスに由来する, 配列番号11のアミノ酸 1-269); Swissprot elya baccs 受託番号P41362 (バチルス・クラウジに由来する, 配列番号12のアミノ酸 1-269 );及びSwissprot elya bacya 受託番号P20724 (バチルス sp.に由来する, 配列番号13のアミノ酸 1-268f)；並びに上記で定義されるようなそれらの変異体。
【００２７】
本発明の追加の特定の例は、次の市販の製品で得られるプロテアーゼである：Purafect MA, Purafect, Purafect Ox (変異体M222S), Purafect Prime (Y217L), Properase (S87N + S101 G + V104N), FN3 (N76D + S103A + V104I), FN4 (S101G + S103A + V104I + G159D + A232V + Q236H + Q245R + N248D + N252K) - すべては好ましくは、配列番号10の成熟部分の変異体であり、そしてGenencor/Daniscoから市販されている; Blap (S99D + S101 R + S103A + V104I + G160Sを有する配列番号11の成熟部分), BLAP R (S3T + V4I + V199M + V205I + L217Dを有するBlap), 及びBLAP X (S3T + V4I + V205Iを有するBlap) - すべては Henkel/Kemiraからである; 及び Kao からのKAP (A230V + S256G + S259N)。
【００２８】
第３の観点においては、本発明のプロテアーゼは、配列番号２のプロテアーゼの変異体であるか、又はその変異体として見出され得、すなわちそれは、配列番号２のアミノ酸1−274の１又は複数のアミノ酸の少なくとも置換、欠失及び/又は挿入を包含する。好ましくは、アミノ酸変化は、タンパク質の折りたたみ及び/又は活性に対して実質的に影響を与えない、保存性アミノ酸置換又は挿入であるマイナーな性質；小さな欠失；小さなアミノ−又はカルボキシル−末端延長、例えばアミノ末端メチオニン残基の延長；小さなリンカーペプチド；又は実効電荷又は他の機能、例えばポリ−ヒスチジン路、抗原性エピトープ又は結合ドメインを変更することにより精製を促進する小さな延長のものである。
【００２９】
これに関して、用語、“小さな”とは独立して、25個まで数のアミノ酸残基を表す。好ましい態様においては、用語“小さな”とは独立して、24, 23, 22, 21又は20個までのアミノ酸残基を表す。さらなる好ましい態様においては、用語、“小さな”とは独立して、19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 , 又は10個までのアミノ酸残基を表す。さらなる好ましい態様においては、用語、“小さな”とは独立して、9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2,又は1個までのアミノ酸残基を表す。他の態様においては、用語“小さな”とは独立して、40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 , 30, 29, 28, 27, 又は26個までのアミノ酸残基を表す。
【００３０】
保存性置換の例は、保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（セリン、トレオニン、グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。
【００３１】
他方では、保存性置換の例は、塩基性アミノ酸（アルギニン、リシン及びヒスチジン）、酸性アミノ酸（グルタミン酸及びアスパラギン酸）、極性アミノ酸（グルタミン及びアスパラギン）、疎水性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン及びバリン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、トリプトファン及びチロシン）、及び小さなアミノ酸（グリシン、アラニン、セリン、トレオニン及びメチオニン）のグループ内である。比活性を変更しないアミノ酸置換は当業界において知られており、そして例えば、H. Neurath and R.L. Hill, 1979, The Proteins, Academic Press, New York により記載されている。最も通常生じる交換は次のものである： Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/ Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu及びAsp/Gly。
【００３２】
配列番号5−13のいずれかの成熟プロテアーゼ部分、例えば配列番号13のアミノ酸1−268の好ましい変異体は、配列番号２のアミノ酸1−274の変異体について上記で説明されるように、１又は複数のアミノ酸の少なくとも１つの置換、欠失及び/又は挿入を含んで成る（親、原種、酵素、例えば配列番号13のアミノ酸1−268に比較して）。より好ましくは、それらの変異体は、配列番号２のアミノ酸1−274の変異体について上記に詳細に説明されるように、保存性アミノ酸置換又は挿入、小さな欠失、小さな延長を有する。本発明のプロテアーゼ変異体の特定の例は、配列番号11の変異体99aEである（例４を参照のこと）。
【００３３】
第４の観点においては、本発明のプロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸1−274とは、25, 24, 23, 22, 21 , 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 又は11以下のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有するか、又はそれは、10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 又は 1以下のアミノ酸により、配列番号２のアミノ酸1−274と異なる。他の態様においては、本発明のプロテアーゼは、配列番号２のアミノ酸とは、40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31 , 30, 29, 28, 27, 又は 26以下のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有する。
【００３４】
配列番号5−13のいずれかの成熟プロテアーゼ部分、例えば配列番号７のアミノ酸1−275の好ましい変異体は、配列番号5−13のいずれか１つの成熟部分、例えば配列番号７のアミノ酸1−275とは、25, 24, 23, 22, 21 , 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 又は11以下のアミノ酸により異なるアミノ酸配列を有するか、又はそれらは、配列番号5−13のいずれか１つの成熟部分、例えば配列番号７のアミノ酸1−275とは、10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2,又は1以下のアミノ酸により異なる。
【００３５】
第５の観点においては、本発明のプロテアーゼは、配列番号２の対立遺伝子変異体（好ましくは、その成熟部分の対立遺伝子変異体）、配列番号5−13のいずれか１つの対立遺伝子変異体（好ましくは、その成熟部分のいずれか１つの対立遺伝子変異体）、又はプロテアーゼ活性を有するそれらのいずれかのフラグメントである。用語“対立遺伝子変異体とは、同じ染色体遺伝子座を占める遺伝子の複数の二者択一形のいずれかを示す。対立遺伝子変異体は、突然変異を通して天然において発生し、そして集団内での多形現象をもたらすことができる。遺伝子突然変異はサイレントであり得（コードされるポリペプチドにおける変更がない）、又は変更されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。ポリペプチドの対立遺伝子変異体は、遺伝子の対立遺伝子変異体によりコードされるポリペプチドである。
【００３６】
用語フラグメントは、配列番号２のアミノ酸1−274のアミノ及び/又はカルボキシル末端、又は配列番号5−13のいずれか１つのアミノ及び/又はカルボキシル末端、好ましくはそれらの成熟部分から欠失された１又は複数のアミノ酸を有するポリペプチドとして、本明細書においては定義される。好ましくは、少数のアミノ酸が欠失されており、ここで少数とは上記で説明されたように定義される。より好ましくは、フラグメントは、少なくとも244, 245, 246, 247, 248, 249, 又は250個のアミノ酸残基を含む。最も好ましくは、フラグメントは、少なくとも251 , 252, 253, 254, 255, 256, 257, 258, 259, 260, 261, 262, 263, 264, 265, 266, 267, 268, 269, 270, 271 , 272, 又は 273個のアミノ酸残基を含む。
【００３７】
要約すると、本発明の１つの態様は、医薬使用のためのプロテアーゼに関し、ここで
ａ）前記プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成り；そして/又は
【００３８】
ｂ）前記プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸配列の変異体であり、
【００３９】
ここで前記変異体は、25個以下のアミノ酸により、それぞれのアミノ酸配列とは異なり、そして（i）前記変異体は、前記それぞれのアミノ酸配列に比較して、１又は複数のアミノ酸の少なくとも１つの置換、欠失及び/又は挿入を含んで成り、そして/又は（ii）前記変異体は、前記それぞれのアミノ酸配列に比較して、少なくとも１つの小さな欠失を含んで成り、そして/又は（iii）前記変異体は、前記それぞれのアミノ酸配列に比較して、少なくとも１つの小さなN-又はC-末端延長を含んで成り；そして/又は
【００４０】
（ｃ）前記プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸を有するプロテアーゼの対立遺伝子変異体であり、そして/又は
【００４１】
（ｄ）前記プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸を有するプロテアーゼのフラグメントである。
【００４２】
特に、本発明は、プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸を有する、医薬使用のためのプロテアーゼに関する。
【００４３】
もう１つの特定の態様においては、本発明のプロテアーゼは、追加のプロテアーゼと組合わせて使用され得る。追加のプロテアーゼの例は、哺乳類プロテアーゼ及び微生物プロテアーゼである。好ましい哺乳類プロテアーゼは、ブタ又は雄牛からの膵臓抽出物、例えばパンクレアチンである。パンクレアチンは、被覆されていない（生の）生成物の形で、又は配合された生成物（腸溶性被覆された（胃酸に対する耐性を付与するために）、又は非機能的に被覆された（被覆されているが、しかし胃酸に対する耐性は付与しない））の形で使用され得る。
【００４４】
パンクレアチンは実質的に、さらなる酵素活性成分、例えば膵臓リパーゼ、BSSL（胆汁塩刺激されたリパーゼ）、及び/又は膵臓アミラーゼを含んで成る。好ましい微生物プロテアーゼは、細菌又は菌類株、例えばアスペルギラス、例えばスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・メレウス株、特にAmano Pharmaceuticals, Japanから市販されているProzyme 6th (中性、アルカリ性プロテアーゼEC 3.4.21.63)に由来する。
任意には、本発明のプロテアーゼは、さらに下記に説明されるように、リパーゼ及び/又はアミラーゼと組合わせて使用される。
【００４５】
本明細書においては、リパーゼは、カルボン酸エステルヒドロラーゼEC3.1.1‐を意味し、それは活性、例えばEC3.1.1.3トリアシルグリセロールリパーゼ、EC3.1.1.4ホスホリパーゼA1, EC3.1.1.5リソホスホリパーゼ、EC3.1.1.26ガラクトリパーゼ、EC3.1.1.32ホスホリパーゼA1, EC3.1.1.73フェルロイルエステラーゼを含む。特定の態様においは、リパーゼは、EC3.1.1.3トリアシルグリセロールリパーゼである。
【００４６】
特定の態様においては、リパーゼは哺乳類リパーゼ、例えばブタ又は雄牛からの膵臓抽出物、例えばパンクレアチンである。パンクレアチンは、被覆されていない（生の）生成物の形で、又は配合された生成物（上記のように、腸溶性被覆された、又は非機能的に被覆された）の形で使用され得る。パンクレアチンは実質的に、さらなる酵素活性成分、例えば膵臓リパーゼ、BSSL（胆汁塩刺激されたリパーゼ）、及び/又は膵臓アミラーゼを含んで成る。リパーゼはまた、細菌又は菌類株、例えばバチルス、シュードモナス、アスペルギラス又はリゾパスに由来する細菌リパーゼでもあり得る。リパーゼは特に、リゾパス株、例えばリゾパス・ジャバニカス（Rhizopus javanicus）、リゾパス・オリザエ（Rhizopus oryzae）、又はリゾパス・デレマー（Rhizopus delemar）に由来し、例えばAmano Pharmaceuticals, Japanから市販される製品Lipase D Amano 200TM (Lipase D2TMとも呼ばれる)である。
【００４７】
さらなる特定の態様においては、リパーゼは、組換え的に生成された微生物リパーゼ、例えば菌類、例えばヒューミコラ又はリゾムコル由来の、酵母、例えばカンジダ由来の、又は細菌、例えばシュードモナス由来のリパーゼである。好ましい態様においては、リパーゼは、ヒューミコラ・ラヌギノサ又はリゾムコル・ミエヘイの株に由来する。
【００４８】
ヒューミコラ・ラヌギノサ（サーモミセス・ラヌギノサスと類似物）リパーゼ（配列番号14）は、EP305216号に記載されており、そして特定のリパーゼ変異体は例えばWO 92/05249号, WO 92/19726号, WO 94/25577号, WO 95/22615号, WO 97/04079号, WO 97/07202号, WO 99/42566号, WO 00/32758号, WO 00/60063号, WO 01/83770号, WO 02/055679号, 及び WO 02/066622号に記載されている。
【００４９】
好ましいヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼ変異体は、配列番号15のアミノ酸1−269、又は2−269、例えば次のものを含んで成るリパーゼ；及びそれらの変異体である：（i）配列番号15のアミノ酸＋1−＋269、（ii）配列番号15のアミノ酸-5−＋269、（iii）配列番号15のアミノ酸-4−＋269、（iv）配列番号15のアミノ酸-3−＋269、（v）配列番号15のアミノ酸-2−＋269、（vi）配列番号15のアミノ酸-1−＋269、（vii）配列番号15のアミノ酸＋2−＋269、及び（viii）（i）−（vii）の複数のリパーゼのいずれかの混合物、並びにそれらの変異体。特定の態様においては、リパーゼは、（i）、（ii）、及び（i）及び（ii）のいずれかの混合物のリパーゼから選択される。（i）及び（ii）の好ましい混合物は、DK特許出願2005/00929号からの優先権主張されるPCT出願の例５に記載されるように、Edman方法を用いてN−末端配列決定により、その％が決定される場合、少なくとも5％、好ましくは少なくとも10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%又は少なくとも95％のリパーゼ（i）を含んで成る。
【００５０】
他の好ましい混合物は、（ａ）35−75％、好ましくは40−70％、より好ましくは45−65％のリパーゼ（ii）を含んで成る組成物；（ｂ）20−60％、好ましくは25−55％、より好ましくは30−50％、最も好ましくは35−47％のリパーゼ（i）を含んで成る組成物；（ｃ）30％までの、好ましくは25％までの、より好ましくは20％までの、最も好ましくは16％までのリパーゼ（vii）を含んで成る組成物；及び（ｄ）（ａ）、（ｂ）及び/又は（ｃ）のいずれかの組合せ、例えば45−65％のリパーゼ（ii）、35−47％のリパーゼ（i）及び16％までのリパーゼ（vii）を含んで成る組成物である。
【００５１】
配列番号14及び15のリパーゼは例えば、アメリカ特許第5,869,438号（このアメリカ特許における配列番号１は、配列番号14のリパーゼをコードするDNA配列である）に記載のようにして調製され得る。配列番号15のリパーゼは例えば、前記アメリカ特許の配列番号１の修飾（この修飾は、配列番号14と15との間のアミノ酸差異に影響を及ぼす）であるDNA配列の適切な宿主細胞における組換え発現により調製され得る。
【００５２】
菌類リパーゼのさらなる例は、EP785994号に記載されるヒューミコラ・インソレンスからのクチナーゼ、及びEP869167号に記載されるフサリウム・オキシスポラムからのホスホリパーゼである。酵母リパーゼの例は、カンジダ・アンタルクチカ（Candida antarctica）からのリパーゼA及びBであり、ここでリパーゼAはEP652945号に記載されており、そしてリパーゼBは例えば、Uppenbegなど。Structure, 2(1994)由来のリパーゼである。
【００５３】
好ましい態様においては、リパーゼは、配列番号15のリパーゼ、好ましくはそのアミノ酸1−269に対して少なくとも70％同一である。さらなる好ましい態様においては、配列番号15、好ましくはそのアミノ酸1−269に対する同一性の程度は、少なくとも71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81 %, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%、又は少なくとも99％である。他の態様においては、配列番号15、好ましくはそのアミノ酸1−269に対する同一性の程度は、少なくとも約50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 又は69%である。
【００５４】
さらなる好ましい態様においては、哺乳類膵臓リパーゼは、１，３−位置特異的リパーゼである。
任意には、上記のようなリパーゼと共に又はそれを伴わないでの本発明のプロテアーゼは、アミラーゼと組合わせて使用される。
【００５５】
本明細書においては、アミラーゼは、澱粉及び他の線状及び枝分かれ鎖のオリゴ−多糖の末端−加水分解を触媒する酵素である。澱粉のアミロース部分は、１，４−α−グルコシド結合に富んでおり、そしてアミロペクチン部分は、１，４−α−のみならず、また、１，６−α−グルコシド結合を含む枝分かれ鎖である。特定の態様においては、アミラーゼは、EC3.2.1.1グループに属する酵素である。
【００５６】
特定の態様においては、アミラーゼは哺乳類アミラーゼ、例えばブタ又は雄牛からの膵臓抽出物、例えばパンクレアチンである。パンクレアチンは、被覆されていない（生の）生成物の形で、又は配合された生成物（上記のように、腸溶性被覆された、又は非機能的に被覆された）の形で使用され得る。パンクレアチンは実質的に、さらなる酵素活性成分、例えば膵臓プロテアーゼ、BSSL、及び/又は膵臓リパーゼを含んで成る。アミラーゼはまた、細菌又は菌類株、例えばバチルス、シュードモナス、アスペルギラス又はリゾパスに由来する細菌アミラーゼでもあり得る。
【００５７】
アミラーゼは特に、アスペルギラス株、例えばアスペルギラス・ニガー、アスペルギラス・オリザエ又はアスペルギラス・メレウス由来のもの、例えばAmano Pharmaceuticals, Japanから市販されているアスペルギラス・オリザエ由来のもの、例えばAmano Pharmaceuticals, Japanから市販されているアスペルギラス・オリザエ由来の製品Amylase A1TM、又はExtract−Chemie, Germanyから市販されているアスペルギラス・メレウス由来のAmylase ECTMであり得る。
【００５８】
菌類アミラーゼの他の例は、WO89/01969号の例３にまた記載されるアスペルギラス・ニガーアミラーゼ（SWISSPROT P56271）、及びアスペルギラス・オリザエアミラーゼである。アスペルギラス・オリザエアミラーゼの変異体の例が、WO01/34784号に記載されている。
【００５９】
バチルス・リケニホルミス由来のα−アミラーゼは、細菌α−アミラーゼの例である。このアミラーゼは、例えばバチルス・アミロリクエファシエンス及びバチルス・ステアロサーモフィラス由来の他の類似する細菌α−アミラーゼ、及びその変異体と共に、WO99/19467号に記載されている。追加のアミラーゼ変異体の例は、アメリカ特許第4,933,279号；EP722490号及びEP904360号に記載されているそれらである。
【００６０】
好ましいアミラーゼは、配列番号16のアミノ酸1−481（例えば、そのアミノ酸1−481、1−484又は1−486）、配列番号17のアミノ酸1−481、及び/又は配列番号18のアミノ酸1−483を含んで成るアミラーゼである。好ましい態様においては、アミラーゼは、（i）配列番号16のアミノ酸1−481、（ii）配列番号17のアミノ酸1−481、及び/又は（iii）配列番号18のアミノ酸1−483のいずれかに対して少なくとも70％同一である。配列番号16−18のアミラーゼは例えば、“医薬使用のためのアミラーゼ”の名称の及びSolvay Pharmaceuticals GmbH and Novozymes A/Sにより2005年6月24日に出願された同時継続DK出願番号2005/00931号に記載のようにして調製され得る。
【００６１】
（i）、（ii）又は（iii）のいずれかの追加の好ましい態様においては、配列番号16, 17又は18のそれぞれの部分に対する同一性の程度は、少なくとも71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%、又は少なくとも99％である。他の態様においては、配列番号16, 17又は18のそれぞれの部分に対する同一性の程度は、少なくとも約50%, 51 %, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%、又は少なくとも69％である。
【００６２】
本発明に関しては、特に好ましい酵素の組合せは、次の通りである：（i）配列番号15のアミノ酸を含んで成るリパーゼと組合わせての配列番号２のアミノ酸1−274のプロテアーゼ；（ii）配列番号16のアミノ酸1−481（例えば、そのアミノ酸1−481、1−484、又は1−486）を含んで成るアミラーゼと組合わせての配列番号２のアミノ酸1−274のプロテアーゼ；（iii）配列番号17のアミノ酸1−481を有するアミラーゼと組合わせての配列番号２のアミノ酸1−274のプロテアーゼ；（iv）配列番号18のアミノ酸1−483を有するアミラーゼと組合わせての配列番号２のアミノ酸1−274のプロテアーゼ；（v）配列番号16のアミノ酸1−481（例えば、そのアミノ酸1−481、1−484、又は1−486）を含んで成るアミラーゼと組合わせての配列番号２のアミノ酸1−274のプロテアーゼ；（vi）配列番号17のアミノ酸1−481を有するアミラーゼ及び配列番号15のアミノ酸１−269又は2−269を含んで成るリパーゼと組合わせての配列番号２のアミノ酸1−274のプロテアーゼ；及び（vii）配列番号18のアミノ酸1−483を有するアミラーゼ及び配列番号15のアミノ酸１−269又は2−269を含んで成るリパーゼと組合わせての配列番号２のアミノ酸1−274のプロテアーゼ。
【００６３】
従って、本発明の１つの態様は、医薬使用のための、リパーゼ及び/又はアミラーゼと組合わせてのプロテアーゼに関し、ここでi）前記プロテアーゼが本明細書において定義されるようなプロテアーゼであり、ii) 前記プロテアーゼが配列番号15のアミノ酸２−269を含んで成り、そしてiii)前記リパーゼが、ａ）配列番号16のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、ｂ）配列番号17のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及びｃ）配列番号18のアミノ酸１−483を有するアミラーゼから成る群から選択されたアミラーゼである。
【００６４】
特に、本発明は、医薬使用のための、リパーゼ及び/又はアミラーゼと組合わせてのプロテアーゼに関し、ここでi）前記プロテアーゼが配列番号２のアミノ酸1−274を含んで成るか、又は好ましくは、それであり、又は有し、ii) 前記プロテアーゼが配列番号15のアミノ酸２−269を含んで成り、そしてiii)前記リパーゼが、ａ）配列番号16のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、ｂ）配列番号17のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及びｃ）配列番号18のアミノ酸１−483を有するアミラーゼから成る群から選択されたアミラーゼである。
【００６５】
他の酵素の好ましい組合せは次の通りである：
【００６６】
（i）配列番号15のアミノ酸1−269に対して少なくとも50％の同一性を有するリパーゼと組合わせての配列番号2のアミノ酸1−274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ；
【００６７】
（ii）配列番号16のアミノ酸1−481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合わせての配列番号2のアミノ酸1−274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ；
【００６８】
（iii）配列番号17のアミノ酸1−481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合わせての配列番号2のアミノ酸1−274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ；
【００６９】
（iv）配列番号18のアミノ酸1−481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼと組合わせての配列番号2のアミノ酸1−274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ；
【００７０】
（v）配列番号16のアミノ酸1−481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼ及び配列番号15のアミノ酸1−269に対して少なくとも50％同一性を有するリパーゼと組合わせての配列番号２のアミノ酸1−274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ；
【００７１】
（vi）配列番号17のアミノ酸1−481に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼ及び配列番号15のアミノ酸1−269に対して少なくとも50％同一性を有するリパーゼと組合わせての配列番号２のアミノ酸1−274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ；
【００７２】
（vii）配列番号18のアミノ酸1−483に対して少なくとも50％の同一性を有するアミラーゼ及び配列番号15のアミノ酸1−269に対して少なくとも50％同一性を有するリパーゼと組合わせての配列番号２のアミノ酸1−274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ。
【００７３】
（i）- (vii)の好ましい態様においては、個々の同一性の程度は独立して、少なくとも51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61 %, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%、又は少なくとも99％である。
【００７４】
従って、本発明の１つの態様は、医薬使用のための、リパーゼ及び/又はアミラーゼと組合わせてのプロテアーゼに関して、ここで（i）前記プロテアーゼは、次のプロテアーゼの群から選択される：
ａ）配列番号２のアミノ酸1−274に対して少なくとも50％の同一性を有するプロテアーゼ；
ｂ）配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸配列を含んで成るプロテアーゼ；
【００７５】
ｃ）配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸配列の変異体であるプロテアーゼ、ここで前記変異体は、25個以下のアミノ酸により、それぞれのアミノ酸配列とは異なり、そして（i）前記変異体は、前記それぞれのアミノ酸配列に比較して、１又は複数のアミノ酸の少なくとも１つの置換、欠失及び/又は挿入を含んで成り、そして/又は（ii）前記変異体は、前記それぞれのアミノ酸配列に比較して、少なくとも１つの小さな欠失を含んで成り、そして/又は（iii）前記変異体は、前記それぞれのアミノ酸配列に比較して、少なくとも１つの小さなN-又はC-末端延長を含んで成り；
【００７６】
ｄ）配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸を有するプロテアーゼの対立遺伝子変異体であるプロテアーゼ；
【００７７】
ｅ）配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸を有するプロテアーゼのフラグメントであり；及び
【００７８】
ｆ）前記プロテアーゼが、配列番号２のアミノ酸１−274、配列番号５のアミノ酸１−274、配列番号６のアミノ酸１−275、配列番号７のアミノ酸１−275、配列番号８のアミノ酸１−275、配列番号９のアミノ酸１−275、配列番号10のアミノ酸１−275、配列番号11のアミノ酸１−269、配列番号12のアミノ酸１−269、及び配列番号13のアミノ酸１−268から成る群から選択されたアミノ酸配列を有するプロテアーゼ；ii)前記リパーゼは、配列番号15のアミノ酸1−269を有するリパーゼに対して少なくとも70％の同一性を有し；そしてiii)前記アミラーゼは、ａ）配列番号16のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、ｂ）配列番号17のアミノ酸１−481を有するアミラーゼ、及びｃ）配列番号18のアミノ酸１−483を有するアミラーゼから成る群から選択されたアミラーゼに対して少なくとも70％の同一性を有する。
【００７９】
一般的に、プロテアーゼ、リパーゼ及びアミラーゼ酵素（この後、“酵素”、すなわち本発明の酵素）は、中性又は野生型酵素（動物、特に哺乳類、例えばヒト又はブタ酵素から；植物から；又は微生物から得られる）であり得るが、しかしまた、所望する酵素活性を示すいずれかの変異体、フラグメント、等、並びに合成酵素、例えばシャフリングされた、ハイブリッド又は、キメラ酵素、及びコンセンサス酵素であり得る。
【００８０】
特定の態様においては、酵素は、動物、たとえばヒトに暴露される場合、低い免疫原応答をもたらすよう企画された低アレルギー性変異体である。免疫学的応答は、酵素に暴露される動物の免疫系によるいずれかの応答として理解されるべきである。１つのタイプの免疫学的応答は、暴露された動物における高められたレベルのIgEを導くアレルギー応答である。低アレルギー性変異体は、当業界において知られている技法を用いて調製され得る。例えば、酵素は、免疫学的応答に関与する酵素の一部又はエピトープを保護するポリマー成分により接合され得る。
【００８１】
ポリマーによる接合は、WO96/17929号、WO98/30682gou、WO98/35026号及び/又はWO99/00489号に記載のように、酵素へのポリマーのインビトロ化学的カップリングを包含する。接合は、さらに又は他方では、酵素へのポリマーのインビボカップリングを包含する。そのような接合は、酵素をコードするヌクレオチド配列を遺伝的に構築し、酵素における追加のグリコシル化部位をコードするコンセンサス配列を挿入し、そして酵素をグリコシル化できる宿主において酵素を発現することによって達成され得る。例えば、WO00/26354号を参照のこと。
【００８２】
低アレルギー性変異体を供給するもう１つの手段は、酵素モノマーが他の酵素モノマーのエピトープを保護し、そしてそれにより、オリゴマーの抗原性を低める、酵素の自己オリゴマー化を引き起こすために、酵素をコードするヌクレオチド配列の遺伝的構築である。そのような生成物及びそれらの調製法は、例えばWO96/16177号に記載されている。免疫学的応答に関与するエピトープは、種々の方法、例えばWO00/26230号に記載されるファージ表示法、又はEP561907号に記載されるランダムアプローチにより同定され得る。エピトープが同定されると、そのアミノ酸配列は、既知の遺伝子操作技法、例えば特定部位の突然変異誘発により酵素の変更された免疫学的性質を生成するために変更され得（例えば、WO00/26230号、WO00/26354号及び/又はWO00/22103号を参照のこと）、そして/又はポリマーの接合がエピトープを保護するために、ポリマーのためのエピトープに十分に接近して行われ得る。
【００８３】
特定の態様においては、酵素は、（i）pH2−8、好ましくはまた、pH3−7、より好ましくはpH4−6で安定性であり；(ii)pH4−9、好ましくは4−8で活性的であり；（iii）ペプシン及び他の消化プロテアーゼ（例えば、膵臓プロテアーゼ、すなわち主にトリプシン及びキモトリプシン）による分解に対して安定性であり；そして/又は胆汁塩の存在下で活性的である。
【００８４】
好ましくは、本発明のプロテアーゼは、酸安定性であり、これは、純粋なプロテアーゼ酵素が、酸環境への連続した暴露の後でさえ、活性的であることを意味する。好ましくは、残存する活性は、医薬目的のためにすでに知られている比較できるプロテアーゼの残存する活性よりも、1.1, 1.2, 1.3, 1.5, 1.6, 1.8, 2.0, 2.5及び3.0倍、高い。
【００８５】
さらなる特定の態様においては、酸−安定性とは、A280＝1に対応する希釈溶液において、及び次の緩衝液（100mMの琥珀酸、100mMのHEPES、100mMのCHES、100mMのCABS、1mMのCaCl2、150mMのKCl、0.01％のTriton（商標）X−100、pH3.5）における37℃での２時間のインキュベーションに続く純粋なプロテアーゼ酵素のプロテアーゼ活性が、WO01/58276号の例2Cに記載されるアッセイ（基質：Suc-AAPF-pNA、pH9.0、25℃）を用いて測定される場合、対照活性の少なくとも40％（又は少なくとも45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95、又は少なくとも97％）であることを意味する。
【００８６】
用語“対照活性”とは、次の緩衝液（100mMの琥珀酸、100mMのHEPES、100mMのCHES、100mMのCABS、1mMのCaCl2、150mMのKCl、0.01％のTriton（商標）X−100、pH9.0）中、5℃での２時間の、A280＝1.0に対応する希釈溶液における純粋な形でのインキュベーションに続いて、同じプロテアーゼのプロテアーゼ活性（前記活性は、上記のようにして決定される）を言及する。用語A280＝1.0とは、緩衝液ブランクに対して1cm進路長のキュベットにおいて280nmでの1.0の吸光度を生ぜしめる前記純粋なプロテアーゼのそのような濃度（希釈度）を意味する。
【００８７】
用語“純粋なプロテアーゼ”とは、1.70以上が又はそれに等しいA280/A260比を有し（W001/58276号の例2Eを参照のこと）、そしてクーマシー染色されたSDS−PAGEゲルの走査によれば、前記プロテアーゼに対応するバンドにおけるその走査強度の少なくとも95％を有することが測定される（WO01/58276号の例2Aを参照のこと）サンプルを言及する。
【００８８】
用語“〜と組合わせて”とは、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼの本発明に従っての組合された使用を言及する。組合された使用は、同時であり、重複し、又は連続的であり得、それらの３種の用語は一般的に、医師により行われる処方により中断される。
用語“同時”とは、酵素が、それらが１又は複数の別々の医薬製品と同時に投与される場合、又はそれらが１つの及び同じ医薬組成物において投与される場合、同時に活性的である環境を言及する。
【００８９】
用語“連続的”とは、1及び/又は２種の酵素が第１、及び第２、及び/又は第３の酵素と連続的に作用する、そのような情況を言及する。連続的作用は、別々の医薬配合物として又問題の酵素を所望する間隔で投与するか、又は問題の酵素が、異なった開放時間を得、改良された生成物安定性を付与し、又は酵素投与量を最適化するために、異なって配合されている（区分された）、１つの医薬組成物として投与することにより得られる。
【００９０】
用語“重複”とは、酵素活性期間が完全に同時でも又は完全に連続的でもなく、すなわち酵素が両者とも、又はすべて活性的である一定の期間が存在するそのような情況を言及する。
用語“１つの（ａ）”とは、例えば本発明の酵素に関して使用される場合、少なくとも１種を意味する。特定の態様においては、“１つの”とは、１，２，３，４，５、等を再び意味する、“１つ又はそれ以上”又は“少なくとも１つ”を意味する。
【００９１】
２種のアミノ酸配列間の関係は、パラメーター“同一性”により記載される。
本発明のためには、２種のアミノ酸配列は、EMBOSSパッケージ (http://emboss.org)バージョン2.8.0からのNeedleプログラムを用いることにより決定される。このNeedle−プログラムは、Needleman, S. B. and Wunsch, C. D. (1970) J. MoI. Biol. 48, 443-453に記載される世界的一列整列アルゴリズムを実行する。使用される置換マトリックスはBLOSUM62であり、ギャップ開放ペナルティーは10であり、そしてギャップ延長ペナルティーは0.5である。
【００９２】
本発明のアミノ酸配列（“発明の配列”、例えば配列番号２のアミノ酸１−274）と、異なったアミノ酸配列（“外来性配列”、例えばWO2005/115445号の配列番号１のアミノ酸１−188）との間の同一性の程度は、“発明の配列”の長さ、又はいずれにせよ、最も短い“外来性配列”の長さにより割り算された、２種の配列一列整列での正確な適合の数として計算される。結果は、％同一性で表される。
【００９３】
正確な適合は、“発明の配列”及び“外来性配列”がオーバーラップの同じ位置において同一のアミノ酸残基を有する場合、発生する（下記一列整列の例においては、これは“|”により表される）。配列の長さは、配列におけるアミノ酸残基の数である（例えば、配列番号２の長さは274である）。
下記純粋に推定的な一列整列の例においては、オーバーラップは、配列１のアミノ酸配列“HTWGER-NL”又は配列番号２のアミノ酸配列“NGWGEDANL”である。この例においては、ギャップは、“−”により示される。
【００９４】
【化１】
2008546395.tif 000002
【００９５】
従って、配列２に対する配列１の同一性の％は、6/12＝0.5であり、50％に対応する。
特定の態様においては、配列番号２のアミノ酸１−274に対するポリペプチドのアミノ酸配列の同一性の％は、i)２種のアミノ酸を、BLOSUM62置換マトリックス、10のギャップ開放ペナルティー及び0.5のギャップ延長ペナルティーを伴って、Needleプログラムを用いて、一列整列し；ii)前記一列整列における正確な適合の数を計数し；iii)２種のアミノ酸配列の最短の長さにより前記正確な適合の数を割り算し；そしてiv) iii)の割り算の結果を％に転換することにより決定される。
【００９６】
一方では、２種のアミノ酸配列間の同一性の程度は、Needleman-Wunsch一列整列（すなわち、包括的な一列整列）であるプログラム“align”により決定される。配列は、デフォールト評点マトリックスBLOSUM50を用いて、前記プログラムにより一列整列される。ギャップの最初の残基についてのペナルティーは、12であり、そしてギャップのさらなる残基のためのペナルティーは、２である。Needleman-Wunschアルゴリズムは、Needleman, S.B. and Wunsch, CD., (1970), Journal of Molecular Biology, 48: 443-453に記載されており、そしてAlignプログラムはMyers and W. Miller ： Optimal Alignments in Linear Space" CABIOS (computer applications in the biosciences) (1988) 4:11-17により記載されている。“Align”は、FASTAパッケージバージョンv20u6の一部である（W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988),"Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85 : 2444-2448,及び W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP and FASTA, "Methods in Enzymology 183: 63-98を参照のこと）。
【００９７】
本発明のいずれかの酵素のサンプル又は試験配列と、特定される配列との間の同一性の程度は、次の通りにして決定され得る：２種の配列が、プログラム“align”を用いて一列整列される。その一列整列における完全な適合（“N−完全−適合”）の数が決定される（完全な適合は、一列整列の同じ位置における同じアミノ酸残基を意味する）。２種の一列整列された配列の共通する長さがまた決定され、すなわち存在するなら（“N−オーバーラップ”）、一列配列により創造される追跡及び先導ギャップを包含する、一列整列（オーバーラップ）におけるアミノ酸の合計数が決定される。同一性の程度は、“N−完全−適合”と“N−オーバーラップ”との間の比率（％同一性への転換のためには、100により掛け算される）として計算される。
【００９８】
サンプル又は試験配列と特定される配列との間の同一性の程度はまた、次の通りにして決定され得る：配列が、プログラム“align”を用いて一列整列される。その一列整列における完全な適合（“N−完全−適合”）の数が決定される（完全な適合とは、一列整列の同じ位置における同じアミノ酸残基を意味する）。サンプル配列の長さ（アミノ酸残基の数）が決定される（“N−サンプル”）。同一性の程度が、“N−完全−適合”と“N−サンプル”との間の比として計算される（％同一性に転換するために、100により掛け算される）。
【００９９】
サンプル又は試験配列と特定される配列との間の同一性の程度はまた、次の通りにして決定され得る：配列が、プログラム“align”を用いて一列整列される。その一列整列における完全な適合（“N−完全−適合”）の数が決定される（完全な適合とは、一列整列の同じ位置における同じアミノ酸残基を意味する）。特定される配列の長さ（アミノ酸残基の数）が決定される（“N−特定される”）。同一性の程度が、“N−完全−適合”と“N−特定される”との間の比として計算される（％同一性に転換するために、100により掛け算される）。
【０１００】
好ましくは、重複は、特定された配列の少なくとも20％（上記に定義されたような“N−重複”×100/特定された配列（“N−特定された”）におけるアミノ酸の数）、より好ましくは、少なくとも25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 又は95%である。これは、サンプル配列が特定された配列に対して一列整列される場合、特定された配列のアミノ酸の少なくとも20％（好ましくは、25〜95％）が重複に包含されて終結することを意味する。
【０１０１】
他においては、重複は、特定された配列の少なくとも20％（上記に定義されたような“N−サンプル”×100/特定された配列（“N−特定された”）におけるアミノ酸の数）、より好ましくは、少なくとも25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 又は95%である。これは、特定された配列に対して一列整列される場合、特定された配列のアミノ酸の少なくとも20％（好ましくは、25〜95％）が重複に包含されて終結することを意味する。
【０１０２】
本発明の酵素の活性は、いずれかの適切なアッセイを用いて測定され得る。一般的に、アッセイ−pH及びアッセイ−温度が、問題の酵素に適合され得る。アッセイ−pH−値の例は、pH2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 又は12である。アッセイ−温度の例は、30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 80, 90, 又は95℃である。好ましいpH値及び温度は、生理学的範囲において、4, 5, 6, 7又は8のpH値及び30, 35, 37又は40℃の温度である。
【０１０３】
例えば、プロテアーゼ活性はいずれかのアッセイを用いて測定され得、ここで問題のプロテアーゼの特異性について適切なポリペプチド結合を包含する基質が使用される。
適切な酵素アッセイの例は、実験部分に包含され、特に例２を参照のこと。他の例は、リパーゼ及びアミラーゼ活性についてのph. Enr.アッセイである。
【０１０４】
薬剤：
本明細書においては、用語“薬剤”とは、疾病の徴候を処理し、予防し、そして/又は軽減する；好ましくは疾病の徴候を処理し、そして/又は軽減する、化合物、又は化合物の混合物を意味する。薬剤は、医者により処方され得るか、又はそれは店頭取引製品であり得る。
【０１０５】
医薬組成物：
本発明の酵素の単離、精製及び濃縮は、従来の手段により実施され得る。例えばそれらは、当業界において知られている種々の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング及びサイズ排除）、電気泳動方法（例えば、分離用等電点電気泳動）、示差溶解性（例えば、硫酸アンモニウム沈殿）、SDS−PAGE又は抽出（但し、それらだけには限定されない）により精製され得る（例えば、Protein Purification, J.C. Janson and Lars Ryden, editors, VCH Publlishers, New York, 1989を参照のこと）。
【０１０６】
本発明の純粋なプロテアーゼの調製は本明細書における例１に記載されている。この例においては、いわゆる成分Cプロテアーゼをコードする遺伝子（配列番号４、配列番号3によりコードされる）が、当業界において知られているように、特定部位の突然変異誘発により、バチルス・リケニホルミス生成株から欠失される。この遺伝子の欠失へのもう１つのアプローチは、アメリカ特許第4,266,031号に記載されるように、例えば従来の突然変異誘発であり、好ましくは高処理量スクリーニング方法により組合され得る。
【０１０７】
例１においては、配列番号2のプロテアーゼを発現する細胞が、野生型バチルス・リケニホルミス、すなわちATCCから公的に入手できる菌株ATCC14580から誘導される。本発明のプロテアーゼをコードする遺伝子、例えば配列番号２のアミノ酸1−274をコードする遺伝子の１つ又は複数の追加のコピーを、この細胞に挿入することが好ましい。これは、WO99/43835号に記載されるプロモーターを用いて、WO02/00907号に記載のようにして行われ得る。
【０１０８】
特定の態様においては、個々の酵素の濃縮された固体又は液体調製物は、別々に調製される。それらの濃縮物はまた、下記により詳細に説明されるように、少なくとも一部、別々に配合され得る。
さらなる特定の態様においては、酵素は、固体濃縮物の形で、本発明の医薬組成物に導入される。酵素は、当業界において知られているように、種々の方法により固体状態にされる。例えば、固体状態は、酵素が高度な規則形で配置されている結晶、又は酵素分子が低い程度の規則形か又は不規則な形で配置されている沈殿物のいずれかであり得る。
【０１０９】
結晶化は例えば、EP691982号に記載されているように酵素のpIに近いpHで、及び例えば10mS/cm又はそれ以下の低い導電率で行われ得る。
種々の沈殿方法、例えば塩、例えば硫酸アンモニウム及び/又は硫酸ナトリウムによる；有機溶媒、例えばエタノール及び/又はイソプロパノールによる；又はポリマー、例えばPEG（ポリエチレングリコール）による沈殿が当業界において知られている。他においては、酵素は、当業界において知られている種々の方法、例えば凍結乾燥、蒸発（例えば、減圧下で）、及び/又は噴霧乾燥により、溶媒（典型的には、水）を除去することにより、溶液から沈殿され得る。
【０１１０】
さらなる特定の態様においては、酵素の固体濃縮物は、その固体濃縮物の合計タンパク質用量に対して、少なくとも50％（w/w）の含有率の活性酵素のタンパク質を有する。さらなる特定の態様においては、固体濃縮物の合計タンパク質含有率に対して、活性酵素のタンパク質の含有率は、少なくとも55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 又は95%(w/w)である。タンパク質含有率は、Rocheから市販されている、市販のキット、例えばProtein Assay ESL（注文番号1767003）を用いて、又はWO01/58276号の例８に記載される方法に基づいて、クーマシー染色されたSDS−PAGEゲルの濃度計走査により、当業界において知られているようにして測定され得る。
【０１１１】
好ましくは、プロテアーゼ酵素タンパク質は、クーマシー染色されたSDS−PAGEゲルの濃度計走査により測定される場合、少なくとも50％、より好ましくは少なくとも55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 92, 94, 95, 96, 又は97%の本発明への使用のための固体プロテアーゼ濃縮物のタンパク質範囲を構成する。
本発明の医薬組成物は、少なくとも１つの医薬的に許容できる助剤、又は補助材料、例えば（i）少なくとも１つのキャリヤー及び/又は賦形剤；又は（ii）少なくとも１つのキャリヤー、賦形剤、希釈剤及び/又はアジュバントと共に、好ましくは濃縮された酵素調製物、好ましくは固体の濃縮物の形で、酵素を含んで成る。任意の他の成分の非制限的な例（すべては医薬的に許容できる）は、砕解剤及びビークルである。
【０１１２】
一般的に、問題の医学的徴候に依存して、本発明の組成物は、当業界において知られているすべての投与の態様、好ましくは例えば、腸内投与（消化管を通して）のために企画され得る。従って、組成物は、固体、半固体、液体又は気体形、例えば錠剤、カプセル、粉末、顆粒、微小球体、軟骨、クリーム、発泡体、液体、坐剤、注射、吸入、ゲル、ローション及びエアロゾルの形であり得る。医者は、最も適切な投与路を選択し、そしてもちろん、危険な又は他方では、不都合な投与路を実質的に回避することを知っているであろう。
【０１１３】
従って、次の方法及び補助材料は単なる例示であり、そして制限的ではない。
固体経口制剤に関しては、酵素は、ペレット、微小ペレット、錠剤、微小錠剤、粉末、顆粒又はカプセルを製造するために、単独で、又は例えば従来のキャリヤー、例えば結晶性又は微結晶性セルロース、セルロース誘導体、アカシア、トウモロコシ澱粉又はゼラチン；砕解剤、例えばトウモロコシ澱粉、ジャガイモ澱粉又はナトリウムカルボキシメチルセルロース；滑剤、例えばカルナバ蝋、ホワイト蝋、セラック、水を含まないコロイド状シリカ、ポリエチレングリコール（PEG, またマクロゲルとして知られている）1500〜20000、特にPEG4000, PEG6000, PEG8000, ボビドン、タルク、モノレイン又はステアリン酸マグネシウム；及び所望には、希釈剤、アジュバント、緩衝剤、保湿剤、保存剤、例えばメチルパラヒドロキシペンゾエート（E218）、着色剤、例えば二酸化チタン（E171）と共に、適切な添加剤と組合わせて使用され得る。経口製剤は、PEIの医学的徴候の処理のための好ましい製剤の例である。
【０１１４】
酵素はまた、一般的には、水性溶媒、例えば水、又は非水性溶媒、例えば植物油又は他の類似する油、合成脂肪酸グリセリド、高脂肪酸のエステル、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばPEG4000又は低級アルコール、例えば線状又は枝分かれC1-C4アルコール、例えば２−プロパノール；及び所望には、従来の補助材料又は添加剤、例えば溶解剤、アジュバント、希釈材、等張剤、沈殿防止剤、乳化剤、安定剤及び保存剤に、それらを溶解し、懸濁し、又は乳化することにより、液体経口製剤に配合され得る。
【０１１５】
さらに、酵素は一般的に、種々の塩基と共に混合し、例えば塩基又は水溶性塩基を乳化することにより、直腸投与のための坐薬に製造され得る。坐薬は、室温で固化されるが、体温で溶融する、ビークル、例えばココアバター、カルボワックス及びポリエチレングリコールを含むことができる。
【０１１６】
供給ビークルとしてのリポソームの使用は、可能性ある一般的な興味のもう１つの方法である。脂質は、既知のリポソーム形成脂質、例えばカチオン性又は両性イオン脂質、例えばホスファチジルコリンのいずれかの有用な組合せであり得る。残る脂質は通常、中性又は酸性脂質、例えばコレステロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジルグリセロール及び同様のものであろう。リポソームを調製するためには、Kato et al. (1991 ) J. Biol. Chem. 266:3361により記載される方法が使用され得る。
【０１１７】
経口又は直腸投与のための単位用量形、例えばシロップ、エリキシル、粉末及び懸濁液が供給され得、ここで個々の用量単位、例えばカプセル、錠剤又は坐剤は、予定された量の組成物を含む。同様に、注射のための単位用量形は、無菌水、通常の塩溶液又はもう１つの医薬的に許容できるキャリヤーに溶液としての組成物に酵素を含んで成ることができる。
【０１１８】
用語“単位用量形”とは、本明細書において使用される場合、ヒト及び動物対象のための単位用量として適切な、生理学的に別々の単位を言及し、個々の単位は、所望する効果を生成するのに十分な量で、予測される量の酵素を含む。
特定の態様においては、本発明の医薬組成物は、腸、好ましくは経口投与のためである。
【０１１９】
さらなる特定の態様においては、経口組成物は、（i）酵素結晶を含む液体組成物；（ii）(高く)精製された酵素の沈殿物の液体懸濁液；（iii）固体形又は溶解された形で酵素を含むゲル：（iv）固定された酵素又は粒子及び同様のものに吸着された酵素の液体懸濁液；又は（v）酵素含有の粉末、ペレット、顆粒又は微小球の形、所望には、酸安定性被膜により任意に被覆される、錠剤、カプセル又は同様のものの形での固体組成物である。
組成物のもう１つの特定の態様においては、酵素は区分され、すなわち分離用被膜によりお互い分離される。
【０１２０】
組成物のさらなる特定の態様においては、プロテアーゼは、組成物中の他の酵素成分、例えばリパーゼ及び/又はアミラーゼから分離される。
酵素の投与量は、投与される特定の酵素、投与の頻度、投与の態様、徴候の重症度、及び副作用に対する対象の感受性、及び同様のものに依存して、広く変化することであろう。特定の酵素のいくつかが、他のものより有能であり得る。
【０１２１】
本発明の酵素の固体経口製剤の例は、（i）配列番号２のアミノ酸1−274に対して少なくとも50％の同一性を有するアミノ酸配列を含んで成る本発明のアプロテアーゼ；（ii）配列番号15のアミノ酸1−269を有するリパーゼに対して少なくとも70％の同一性を有するリパーゼ；及び（iii）ａ）配列番号16のアミノ酸1−481を有するアミラーゼ、ｂ）配列番号17のアミノ酸1−481を有するアミラーゼ、及びｃ）配列番号18のアミノ酸1−483を有するアミラーゼから成る群から選択されたアミラーゼに対して少なくとも70％の同一性を有するアミラーゼを含んで成り；ここで好ましくは、（i）, (ii)及び（iii）の酵素の予測される毎日の臨床学的投与量は次の通りである（すべては、mg酵素タンパク質/kg体重（bw）である）：（i）のプロテアーゼに関しては、0.005-500, 0.01-250, 0.05-100,又は 0.1-50mg/kg（bw）；（ii）のリパーゼに関しては、0.01-1000, 0.05-500, 0.1-250,又は 0.5-100mg/kg（bw）；（iii）のアミラーゼに関しては、0.001-250, 0.005-100, 0.01-50, 又は0.05-10mg/kg（bw）である。
【０１２２】
本発明の酵素の固体経口製剤の好ましい例は、（i）配列番号２のアミノ酸1−274を含んで成る、好ましくは有するプロテアーゼ；（ii）配列番号15のアミノ酸2−269を含んで成るリパーゼ；及び/又は（iii）配列番号16のアミノ酸1−481を含んで成るアミラーゼを含んで成る。
【０１２３】
予測される毎日の臨床学的投与量は次の通りである（すべては、mg酵素タンパク質/kg体重（bw）である）：（i）のプロテアーゼに関しては、0.05-100, 0.1-50, 又は 0.5-25 mg/kg（bw）；（ii）のリパーゼに関しては、0.1-250, 0.5-100, 又は1-50mg/kg（bw）；（iii）のアミラーゼに関しては、0.01-50, 0.05-10, 又は0.1-5mg/kg（bw）である。
アミド（ペプチド）結合、及びアミノ及びカルボキシ末端は、経口投与に対してより高い安定性に修飾され得る。カルボキシ末端はアミド化され得る。
【０１２４】
消化異常、PEI、膵炎、嚢胞性線維症、I型及びII型糖尿病の処理のための適切な本発明の医薬組成物の特定の態様は、本発明の酵素をペレット中に導入することにより調製され得る。ペレットは一般的に、10〜90％（w/w, 得られるペレットの乾量に対して）の生理学的に許容できる有機ポリマー、10〜90％（w/w, 得られるペレットの乾量に対して）のセルロース又はセルロース誘導体、及び80〜20％（w/w, 得られるペレットの乾量に対して）の酵素を含んで成り、ここで前記有機ポリマー、セルロース誘導体及び酵素の合計量は、それぞれの場合、100％に近づく。
【０１２５】
生理学的に許容できる有機ポリマーは、ポリエチレングリコール1500、ポリエチレングリコール2000、ポリエチレングリコール3000、ポリエチレングリコール4000、ポリエチレングリコール6000、ポリエチレングリコール8000、ポリエチレングリコール10000、ポリエチレングリコール20000、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリオキシエチレン、ポリオキシエチレン/ポリオキシプロピレンのコポリマー、及び前記有機ポリマーの混合物から成る群から選択され得る。ポリエチレングリコール4000が、生理学的に許容できる有機ポリマーとして好ましい。
【０１２６】
セルロース又はセルロース誘導体は、セルロース酢酸セルロース、セルロース脂肪酸エステル、硝酸セルロース、セルロースエーテル、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、メチルエチルセルロース、及びメチルヒドロキシプロピルセルロースから選択され得る。セルロース、特に微晶性セルロースが、セルロース又はセルロース誘導体として好ましい。
【０１２７】
得られるペレットは、適切な腸溶性被膜、他の非機能的被膜により被覆されるか、又はそのような被膜なしに、直接的に使用され得る。さらに、得られるペレットは、上記に詳細に記載されたように、障害又は疾病の治療のために適切なサイズのカプセル、例えばハードゼラチンカプセル又はゼラチンフリーのカプセル中に充填され得る。本発明の態様においては、異なった酵素型、特にリパーゼ、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼから生成されたペレットが、前記カプセル中に充填され得る。異なった酵素型によりカプセルを充填したが、単一酵素型（すなわち、リパーゼ、プロテアーゼ又はアミラーゼ）の用量が、特定された量のいずれかのリパーゼ、プロテアーゼ及び/又はアミラーゼをカプセルに添加することにより、一定の徴候グループ又は一定の患者サブグループの特定の必要性に適合され得、すなわちリパーゼ：プロテアーゼ：アミラーゼのそれらの特定の比率で変化するカプセルが生成され得る。
【０１２８】
本発明のリパーゼの好ましい医薬組成物、特に本明細書において言及された好ましい賦形剤を含んで成る配合物が、WO2005/092370号に記載されている。特に好ましい態様においては、医薬組成物は、モノ−、ジ−及びトリ−アシルグリセルド及びポリエチレングリコール（PEG）のマイクロゲルグリセリド混合物、脂肪族C6-C22 カルボン酸のモノ−及びジ−エステル、及びまた、たぶん低割合のグリセロール及び遊離ポリエチレングリコールを含んで成る。
マイクロゲルグリセリド混合物に含まれるポリエチレングリコール（PEG）は好ましくは、分子当たり平均して６〜多くとも40の酸化エチレン単位、又は200〜2000の分子量を有するPEGである。
【０１２９】
本発明のもう１つのさらなる観点は、界面活性剤、補助−界面活性剤及び親油性相から成る、10以上から又は10に等しいHLB値（親水性−親油性バラシス）及び30℃以上か又は30℃に等しい融点を有するシステムを含んで成る、本発明の酵素の医薬組成物を提供する。好ましい態様においては、前記システムは、10〜16好ましくは12〜15のHLB値を有し、そして30〜600℃の融点を有する。
【０１３０】
特に、HLB値及び融点により特徴づけられるシステムは、モノ−、ジー及びトリグリセリド及びポリエチレングリコール（PEG）のモノ−及びジエステルと、8〜24、好ましくは8〜18個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸との混合物であり、それにより、前記ポリエチレングリコールは、好ましくは、分子当たり約６〜約32の酸化エチレン単離を有し、そして前記システムは任意には、遊離グリセリン及び/又は遊離ポリエチレングリコールを含む。そのようなシステムのHLB値は好ましくは、PEGの鎖長により調節される。そのようなシステムの融点は、脂肪酸の鎖長、PEGの鎖長及び脂肪酸鎖の飽和の程度、及び従って、マクロゲルグリセリド混合物の調製のための出発油により調節される。
【０１３１】
“脂肪族C8-C18カルボン酸”とは、カプリル酸（C8）、カプリン酸（C10)、ラウリン酸（C12), ミリスチン酸（C14）、パルミチン酸（C16）及びステアリン酸（C18）が、それらの酸が飽和化される場合、有意な及び種々の割合で含まれる混合物、及びその対応する不飽和C8-C18カルボン酸を表す。それらの脂肪酸の割合は、出発油に従って変化できる。
【０１３２】
モノ−、ジ−及びトリアシルグリセリド及びポリエチレングリコール（PEG）のモノ−及びジエステルと、８〜18個の炭素原子を有する脂肪族カルボン酸とのそのような混合物は、例えば200〜1500の分子量を有するポリエチレングリコールと出発油との間の反応により得られ、ここで前記出発油はカプリル酸、カプリン酸、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸及びリノレン酸を、個々に含むか又は混合物として含む群から選択される脂肪酸とのトリグリセリド混合物から成る。任意には、そのような反応の生成物はまた、低い割合のグリセリン及び遊離ポリエチレングリコールを含むことができる。
【０１３３】
そのような混合物は、商品名Gelucire（商標）として市販されている。本発明の１つの好都合な態様は、商品名Gelucire（商標）として知られている製品のうち、特に“Gelucire（商標）50/13”及び/又は“Gelucire（商標）44/14”が本発明の医薬製剤への使用のための適切な混合物を表すことを提供する。
【０１３４】
Gelucire（商標）50/13は、モノ−、ジ及びトリグリセリド及びポリエチレングリコールのモノ−及びジエステルと、それぞれ結合された脂肪酸の主要割合を生成する、40％〜50％及び48％〜58％でのパルミチル酸（C15）及びステアリン酸（C18）との混合物である。カプリ酸（C8）及びカプリン酸（C10）の割合は個々の場合、３％以下であり、そしてラウリン酸（C12）及びミリスチン酸（C14）の割合は個々の場合、５％以下である。
【０１３５】
Gelucire（商標）44/14は、モノ−、ジ−及びトリアシルグリセリド及びポリエチレングリコールのモノ−及びジエステルの混合物であり、パルミチン酸（C16）のそれぞれの割合は４〜25％であり、ステアリン酸（C18）は５〜35％であり、カプリル酸（C8）は15％以下であり、カプリン酸（C10）は12％以下であり、ラウリン酸（C12）は30〜50％であり、そしてミリスチン酸（C14）は５〜25％である。Gelucire（商標）44/14は、例えばヤシ油及びポリエチレングリコール1500を用いてのアルコール分解/エステル化反応により調製され得る。
【０１３６】
本発明の好ましい態様は、モノ、ジ−及びトリグリセリド及びポリエチレングリコールの混合物、脂肪酸C8-C18カルボン酸のモノ−及びジエステル、及びまた、たぶん低い割合のグリセリン及び遊離ポリエチレングリコールを含むシステムを含んで成る、本発明の酵素の医薬組成物を提供し、ここで前記システムは、40℃〜55℃の融点及び12〜15の範囲のHLG値を有する。より好ましくは、システムは、44℃〜50℃の融点及び13〜14の範囲のHLB値を有する。他方では、システムは、約44℃の融点及び14のHLB値を有し、又はシステム約50℃の融点及び13のHLB値を有する。
【０１３７】
処理方法：
本発明のプロテアーゼは、任意には、リパーゼ及び/又はアミラーゼ（本発明の酵素）と組合わせて、動物における種々の疾病又は障害及び/又は予防処理において有用である。用語、動物とは、すべての動物及び特にヒトを包含する。動物の例は、非反芻動物、及び反芻動物、例えば、羊、ヤギ、及び牛、例えば蓄牛、及び乳牛及び子牛を包含する。特定の態様においては、動物は非反芻動物である。非反芻動物は、単一の胃を有する動物、例えば馬、ブタ（子ブタ、成長しているブタ及び雌ブタを包含するが、但しそれらだけには限定されない）；家禽類、例えば七面鳥、鴨及び鶏（ブロイラー鶏、産卵鶏を包含するが、但しそれらだけには限定されない）；子牛；ペット、例えばネコ及び犬；及び魚（サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及び鯉を包含するが、但しそれだけには限定されない）；及び甲殻類（小エビ及び車えびを包含するが、但しそれだけには限定されない）を包含する。特定の態様においては、動物は哺乳類、より特定にはヒトである。
【０１３８】
例えば、酵素は、消化障害、例えば胃及び膵臓から通常分泌される消化酵素の胃腸管への不十分な生成及び/又は分泌により、しばしば引起される消化不良の処理において有用である。
【０１３９】
さらに、酵素PEIの処理において特に有用である。PEIは、Borgstrom 試験 (JOP. J Pancreas (Online) 2002; 3(5): 116-125)を用いて確かめられ得、そしてそれは、疾病及び病状、例えば膵癌、膵臓及び/又は胃の手術、例えば膵臓の全体的又は部分的切開、胃切除、後胃腸バイパス手術（例えば、Billroch II胃腸切断）；慢性膵炎；Shwachman Diamond症候群；膵臓又は通常の胆管の管閉塞（例えば、新形成からの）；及び/又は嚢胞性繊維症（濃粘液が膵臓の管を阻止する固有の疾病）により引起され得る。酵素はまた、急性膵炎の処理においても有用である。
【０１４０】
消化障害に対する酵素の効果は、EP0600868号に一般的に記載のようにして、測定され、ここで例２は胃の条件下でのリパーゼ安定性試験を測定するためのインビトロ消化試験を記載し、そして例３は胆汁塩の存在下でのリパーゼ活性についてのインビトロ消化試験を記載する。対応する試験がプロテアーゼのために構築され得る。また、WO02/060474号は、適切な試験、例えば（１）ブタ試験飼料における脂質消化を測定するためのインビトロ試験、及び（２）脂肪、タンパク質及び澱粉の消化が測定される、膵臓不十分ブタによるインビボ試験を開示する。
【０１４１】
特定の態様においては、本発明のプロテアーゼの効果が、例３のプロテアーゼ効率についてのインビボスクリーニング試験を用いて測定される。
もう１つの例として、酵素は、I及び/又はII型糖尿病の処理において、特に後での合併症を低める観点から、通常この疾病に付随する消化障害の糖尿病治療における補助処理のために有用である。
【０１４２】
酵素の糖尿病に対する効果が、WO00/54799号に記載される１又は複数の方法により、例えばグリコシル化されたヘモグロビンのレベル、血液グルコースレベル、低血糖攻撃、脂溶性ビタミン、例えばビタミンA、D及びEの状態、インスリンの必要とされる毎日の用量、体重の基準及び高血糖期間を調節することにより決定され得る。
特定の態様においては、本発明のプロテアーゼは、デブリドマン剤としての使用のためではなく、そして/又は創傷治癒への使用のためでもない。
【０１４３】
本明細書に記載される発明は、本明細書に開示される特許の態様により範囲を限定されるものではない。何故ならば、それらの態様は本発明のいくつかの観点を例示するものである。いずれかの同等の態様が本発明の範囲内で意図される。実際、本明細書に示され、そして記載されるそれらの修飾の他に、本発明の種々の修飾は、前述の記載から当業者に明らかになるであろう。そのような修飾はまた本発明の範囲内にある。
種々の文献が本明細書に引用されており、それらの開示は引用により本明細書に組み込まれている。
【実施例】
【０１４４】
例１：精製されたバチルス・リケニホルミスプロテアーゼの調製：
配列番号１のアミノ酸1−274のバチルス・リケニホルミスプロテアーゼの純粋な調製物を、次の通しにして調製した：
材料/及び方法：
TYブイヨン：トリプトン 20 g/l, 酵母抽出物 5 g/l, FeCl2・4H2O 7 mg/l, MnCl2・4H2O 1 mg/l,MgSO4・7H2O 15 mg/l, pH 7.3。
PS−１ブイヨン：スクロース 100 g, 大豆ミール 40 g, Na2HPO4・12H2O (Merck 6579) 10 g, CaCO3 5g, Pluronic PE 6100 (BASF) 0.1 ml, 水道水を添加し、 1000 mlにする。
【０１４５】
発酵：
もう１つのプロテアーゼをコードする遺伝子（配列番号３）の欠失によりバチルス・リケニホルミスATCC14580から誘導された株を、TY寒天培地（２％寒天により固化されたTYブイヨン）上で37℃で一晩、増殖し、そして100mlのPS−１ブイヨンを含む振盪のフラスコ中に接種した。振盪フラスコを、225rpmの振盪速度下で37℃で90時間、インキュベートした。
【０１４６】
精製：
発酵ブイヨンを凝固し、そして細胞を遠心分離により、酵素含有液体から分離した。上清液のSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動は、所望するプロテアーゼに対応する約31kDaの相対分子量の強いバンドを示した。上清液における強いプロテアーゼ活性の存在をまた、１％脱脂粉乳寒天プレート（pH7及び9）上での大きな透明な領域の存在により確かめた。次の段階として、遠心分離機からの液体を濾過し、残留する懸濁された固形物を除去し、そして次に、プロテアーゼのサイズ以下のカットオフ値を有する適切な膜を用いて限外濾過により濃縮した。最終的に、濃縮物は細菌濾過された。
【０１４７】
100mlの細菌濾過された液体濃縮物を、100mMのH3BO3, 10mMの琥珀酸/NaOH、2mMのCaCl2, pH7.0において10倍に希釈した。得られるプロテアーゼ溶液のpHは7.0であった。その120mlを、100mMのH3BO3, 10mMの琥珀酸/NaOH、2mMのCaCl2, pH7.0により平衡化された100mlのバシトラシシン−アガロースカラム（UpFront Chromatography, カタログ番号 600-0100）に適用した。平衡化緩衝液によるカラムの十分な洗浄の後、カラムを100mMのH3BO3, 10mMの琥珀酸/NaOH、2mMのCaCl2, 1 M NaCl, pH 7.0, 25% (v/v) のイソプロパノールにより段階的に溶出した。バシトラシン−シリカ段階を、７回（合計８回）、反復した。すべての溶出物を組合し（420ml）、そして溶出物を脱イオン水により15Lに希釈した。
【０１４８】
希釈されたプロテアーゼのpHを、20％CH3COOHにより6.0に調節し、そして50mMのH3BO3、5mMの琥珀酸/NaOH、1mMのCaCl2、pH6.0により平衡化された400mlのSP−セファロースFFカラムに通用した。カラムを平衡化緩衝液により十分に洗浄し、そしてカラムを、３カラム体積上での洗浄NaClグラジエント（0〜0.5M）により溶出した。溶出されたプロテアーゼピーク（200ml）を、1.4LのG25セファデックスカラム上での緩衝液交換により、20mMのHEPES/NaOH, 100m MのNaCl, 1mMのCaCl2, pH7.0に移した（HEPESは、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンスルホン酸である）。緩衝液交換されたプロテアーゼ（340ml）を、0.22μのフィルターユニット（例えばCorning, カタログ番号431097）上で濾過した。
【０１４９】
例２：酵素アッセイ：
プロテアーゼSuc-AAPF-pNAアッセイ：
基質：Suc-AAPF−pＮA（Sigma（商標） S-7388）.
アッセイ緩衝液：10OmM の琥珀酸, 10OmMの HEPES (Sigma H-3375), 10OmMの CHES (Sigma C-2885), 10OmMの CABS (Sigma C-5580), 1 mMの CaCl2, 15OmMの KCI, 0.01 % Triton（商標） X-100、HCI 又は NaOHによりpH 9.0に調節された。
【０１５０】
アッセイ温度：25℃。
300μlの希釈されたプロテアーゼサンプルを、1.5mlのアッセイ緩衝液と共に混合し、そして活性反応を、1.5mlのpNA基質を添加することにより開始し（50mgを1.0mlのDMSOに溶解し、そしてさらに、0.01％のTriton（商標）X-100により45倍に希釈した）、そして混合の後、A405の上昇を、プロテアーゼ活性の測定として、分光計によりモニターした。プロテアーゼサンプルを、すべてのアッセイ測定値がアッセイについての用量−応答曲線の直線部分以内にあることを確認するために、活性測定の前、希釈した。
【０１５１】
プロテアーゼFIPアッセイ：
プロテアーゼ活性をまた、FIPアッセイ（Federation Internationale Pharmaceutique）、1FIP−ユニット＝1Ph.Eur.−ユニット（ヨーロッパ薬局方）を用いて決定することができる。このアッセイは、他のFIPアッセイと共に次に記載されている：Federation Internationale Pharmaceutique, Scientific Section: 医薬酵素の標準化のためのInternational Commission, a) "Pharmaceutical Enzymes," Editors: R. Ruyssen and A. Lauwers, E. Story Scientia, Ghent, Belgium (1978), b) European Pharmacopoeia。また、Deemester など ： Lauwers A, Scharpe S (eds): Pharmaceutical Enzymes, New York, Marcel Dekker, 1997, p. 343-385も参照のこと。このアッセイを、パンクレアチンにおけるプロテアーゼ活性を決定するために使用した。微生物プロテアーゼのパンクレアチンにおけるプロテアーゼ活性を決定するために使用した。微生物プロテアーゼのFIP活性を決定するために、エンテロキナーゼを添加することによる活性化段階を削除した。
【０１５２】
原理：基質カゼインを、pH7.5及び35℃の温度でプロテアーゼにより加水分解する。反応を、トリクロロ酢酸の添加により停止し、そして分解されなかったカゼインを濾過した。溶液に残存するペプチドの量を、275nmでの分光計により決定する。
活性の定義：プロテアーゼ活性を、既知FIP活性の膵臓参照粉末（プロテアーゼ参照標準）に対する参照により、トリクロロ酢酸の5.0％（w/v, すなわち5.0g/100ml）溶液により沈殿されないペプチドの量として決定する。
【０１５３】
材料及び方法：
カゼイン溶液：1.25gのカゼイン（乾燥物質）、例えばCalbiochem番号218680を、実質的に透明な溶液が得られるまで、水に懸濁する。pHを8.0に調節し、そしてその溶液を水により希釈し、100mlの最終体積にする。ここで、水は脱イオン水を意味する。
硼酸緩衝液pH7.5：2.5gの塩化ナトリウム、2.85gの四硼酸二ナトリウム及び10.5gの硼酸を、900mlの水に溶解し、pH7.5+/-0.1に調節し、そして水により1000mlに希釈する。
【０１５４】
フィルター紙：125mmの直径の折りたたまれたフィルター、例えばSchleicher & Schuell番号1574 1/2。フィルター紙の試験：フィルターを通して5mlの5.0％トリクロロ酢酸を濾過する。濾液の275nmでの吸光度は、ブランクとして濾過されていないトリクロロ酢酸溶液を用いて、0.04以下であるべきである。
【０１５５】
プロテアーゼ参照標準：International Commission on Pharmaceutical Enzymes, Centre for Standards, Harelbekestraat 72, B-9000 Ghent, Belgiumから市販されているプロテアーゼ（膵臓）。標準はFIP/Ph. Eur.−単離/gで、ラベルされた活性（A）を有する。約130プロテアーゼ−FIP/Ph. Eur.−単位に対応する量を正確に計重する。ヘラの先端の海砂を添加し、数滴の氷冷却された0.02Mの塩化カルシウム（pH6.0−6.2）により湿潤し、そして平らな先端のガラス棒によりすべてを粉砕する。約90mlの同じ氷冷却された塩化カルシウム溶液により希釈し、そしてその懸濁液を氷槽において15〜30分間、撹拌する。pHを6.1に調節し、そしてその体積を、同じ塩化カルシウム溶液により100mlに調節する。5.0mlのこの懸濁液を、硼酸緩衝液（pH7.5）により希釈し、100mlにする。活性試験のために、1.0、2.0及び3.0mlのこの溶液を対照として使用する（標準のためにSI, S2及びS3と命名する）。
【０１５６】
試験懸濁液：約260FIP/ph. Eur.−単位に等しいサンプル量を用いて、プロテアーゼ参照対照について上記に記載のようにして、サンプルの懸濁液を調製する。pH6.1に調節し、そして水を添加し、100mlにする。5.0mlのこの溶液を、5mlの塩化カルシウム溶液と共に混合する。5mlのこの希釈溶液を、硼酸緩衝液により100mlにさらに希釈する。アッセイのために2.0mlのこの溶液を使用する（サンプルを、番号nの未知の活性のサンプルをUnと命名する）。
【０１５７】
アッセイ方法（活性試験）：このアッセイを、３種の参照懸濁液（S1, S2, S3）及びサンプル懸濁液（Un）に対して、三重反復して行う。サンプル当たり１つのブランクが十分である（それぞれ、S1b, S2b, S3b及びUnbと命名する）。ブラインド（B）を、分光計のための補正液体としてサンプル/標準を伴わないで調製する。硼酸緩衝液を次の通りに管に添加する：それぞれ、ブラインド（B）3.0ml；サンプル（Un）1.0ml；標準（S1, S2及びS3）2.0, 1.0及び0ml。プロテアーゼ参照対照を、S1, S2及びS3に、次の通りにして添加する：それぞれ、1.0、2.0及び3.0ml。試験懸濁液を、サンプル管に次の通りに添加する（Un）：2.0ml。5mlのトリクロロ酢酸をすべてのブラインドに添加し（S1b, S2b, S3b, Unb及びB）、続いてすぐに混合する。すべての管を、ガラスストッパーにより停止し、そして一定温度（35±0.5℃）での水槽において基質溶液と共に配置する。
【０１５８】
温度が平衡に達した場合、時間0で、2.0mlのガセイン溶液を、管S1, S2, S3及びUnに添加し、続いてすぐに混合する。正確に30分後、5.0mlのトリクロロ酢酸を、個々の管S1, S2, S3及びUnに添加し、続いてすぐに混合する。管を水槽から取り出し、そして20分間、室温で放置し、タンパク質の沈殿を完結する。個々の管の内容物を、同じフィルターを通して２度、濾過し、そして濾液の吸光度を、補正液体として管Bからの濾液を用いて、275nmで測定する。FIP単位でのサンプル（Un）の活性を、標準（S1, S2, S3）の既知のラベルされた活性（A）に対して計算する。吸光度−それぞれのブラインド（例えばS1の吸光度−S1bの吸光度）は、0.15〜0.60の間隔に存在すべきである。
【０１５９】
プロテアーゼAUアッセイ：
変性されたヘモグロビン（ウレア含有の6.7mMのKH2PO4/NaOH緩衝液（pH7.50）中、0.65％（w/w））を、25℃で10分間、プロテアーゼにより分解し、そして分解されていないヘモグロビンを、トリクロロ酢酸（TCA）により沈殿せしめ、そして濾過により除去する。濾液中、TCA可溶性ヘモグロビン分解性生物を、Folin & Ciocalteuのフェノール試薬（2体積の脱イオン水に対する１体積のFolin−Ciocalteuフェノール試薬Merck9001.0500）により決定し、これは、いくつかのアミノ酸により青色を付与する（750nmで測定される）。
【０１６０】
活性単位（AU）を測定し、そして標準への参照により定義する。変性されたヘモグロビン基質を次の通りにして調製する：1154gのウレア（Hamstoff, Merck 8487）を、1000mlの脱イオン水に溶解し、240.3gのNaOHを添加し、そして次に、63.45gのヘモグロビン（Merck 4300）をゆっくり添加し、続いて315.6gのKH2PO4及び3260gの脱イオン水を添加する。pHを7.63に調節する。より詳細及び適切なアルカラーゼ標準は、必要に応じて、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmark (assay no. EB-SM-0349.01 )から入手できる。
【０１６１】
リパーゼpNPアッセイ：
基質：パラ−ニトロ−フェニル（pNP）バレレート：
アッセイpH：7.7。
アッセイ温度：40℃
反応時間：25分。
黄色の消化された生成物は、405nmでの特徴的な吸光度を有する。その量を分光計により決定する。１リパーゼ単位は、所定のアッセイ条件下で１分当たり1μモルの粉砕できる酪酸を開放する酵素の量である。より詳細なアッセイの記載AF95/6−GBは、必要に応じて、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから入手できる。
【０１６２】
リパーゼLUアッセイ：
このアッセイにおいては、pH7.00及び30℃（±1℃）での0.16Mのトリブチリン（グリセロールトリブチレート、Merck 1.01958.000）のリパーゼ触媒された分解に続いて、0.025Mのガス抜きされた、CO2フリーの水酸化ナトリウム（水酸化ナトリウムチトリソール、Merck9956）による開放される酪酸のpH−安定滴定を行う。滴定液の消費を、時間の関数として記録する。
【０１６３】
基質を、0.6％w/vのアラビアガム乳化剤により乳化する（20.0gのアラビアガム、89.5gのNaCl, 2.05gのKH2PO4に水を添加し、1.5Lにし、完全に溶解するまで放置し、2700mlのグリセロールを添加し、pHを4.5に調節し、90mlのトリブチリンを、300mlのアラビアガム乳化剤及び1410mlの脱イオン水と共に混合し、そして例えば7000rpmでのSilverson乳化機L4RTを用いて３分間、均質化し、そして次にpH4.75に調節する）。リパーゼサンプルを、まず、0.1Mのグリシン緩衝液（pH10.8）に希釈し、次の脱イオン水に希釈し、1.5−4.0LU/mlの活性レベルを定める。15mlの乳化された基質溶液を、滴定容器中に注ぐ。1.0mlのサンプル溶液を添加し、そしてpHを、滴定の間、7.0で維持する。一定のpHを維持するために１分当たり添加される滴定液の量を測定する。活性の計算は、滴定曲線の線状範囲の平均傾斜に基づかれる。既知活性の標準を、レベルを調べるために使用することができる。
【０１６４】
より詳細なアッセイの記載EB-SM-0095.02は、必要に応じて、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから入手できる。
【０１６５】
リパーゼpH安定アッセイ：
このアッセイは、0.65mMの胆汁塩の存在下でオリーブ油エマルジョンからの脂肪酸のリパーゼ触媒された開放に基づかれている。基質を、乳化剤としてのアラビアガムと共に乳化する（175gのオリーブ油を、630mlのアラビアガム溶液（4000mlの水中、474.6gのアラビアガム、64gの塩化カルシウム）と共にブレンダーにおいて15分間、乳化し；室温への冷却の後、pHを、4MのNaOHを用いて、pH6.8−7.0に調節する）。
【０１６６】
決定するために、19mlのエマルジョン及び10mlの胆汁塩溶液（492mgの胆汁塩を水に溶解し、そして500mlまで満たす）を、反応容器において混合し、そして36.9℃〜37.5℃まで加熱する。反応を、1.0mlの酵素溶液の添加により開始する。開放された酸を、0.1Mの水酸化ナトリウムの添加により、合計5分間、pH7.0で自動的に滴定する。活性を、第１回目と第５回目との間の滴定曲線の傾斜から計算する。検量のために、標準を、３種の異なった活性レベルで測定する。
【０１６７】
アミラーゼ：
基質：Phadebas錠剤（Pharmacla Diagnostics：ウシ血清アルブミン及び緩衝物質と共に混合される不溶性の青色に着色された澱粉ポリマーを架橋し、そして錠剤に製造する）。
アッセイ温度：37℃。
アッセイpH：4.3（又は、7.0、所望により）。
反応時間：20分。
【０１６８】
水における懸濁の後、澱粉をα−アミラーゼにより加水分解し、可溶性青色フラグメントを得る。620nmで測定される、その得られる青色溶液の吸光度は、α−アミラーゼ活性の関数である。１菌類αアミラーゼ単位（1FAU）は、標準のアッセイ条件下で、１時間当たり5.26gの澱粉（Merck, Amylum solubile Erg. B. 6, Batch 9947275）を分解する酵素の量である。より詳細なアッセイ説明APTSMYQI−3207は、Novozymes A/S, Krogshoejvej 36, DK-2880 Bagsvaerd, Denmarkから必要に応じて入手できる。
【０１６９】
例３：バチルス・リケニホルミスプロテアーゼのインビボスクリーニング試験：
例１の精製されたバチルス・リケニホルミスプロテアーゼを、基準としてパンクレアチンを用いて、雌Gottingenミニブタ（Ellegaard）において試験した。膵臓外分泌不十分（PEI）を、膵管の連結によりミニブタにおいて誘発し、そしてそれらをまた、回腸−盲腸再入カニューレにより固定し、すべてはハロタン麻酔下で及び約25kgの体重で、次に記載のようにして実施された：Tabeling など., J. 1999, Studies on nutrient digestibilities (pre-caecal and total) in pancreatic duct-ligated pigs and the effects of enzyme substitution, J. Anim. Physiol. A. Anim. Nutr. 82: 251-263 (この後"Tabeling 1999"として言及される); 及びGregoryなど., J. 1999. Growth and digestion in pancreatic duct ligated pigs, Effect of enzyme supplementation in "Biology of the Pancreas in Growing Animals" (SG Pierzynowski & R. Zabielski eds), Elsevier Science BV, Amsterdam, pp 381-393 (この後"Gregory et al 1999"として言及される)。
【０１７０】
研究が開始される前、少なくとも４週後、手術から回復した。研究の開始の前、個々のブタのPEI状態を、便キモトリプシン試験（lmmundiagnostik AG, Wiesenstrasse 4, D-64625 Bensheim, Germany,カタログ番号K 6990から市販されている）により確認した。
【０１７１】
研究の間、ブタは、12：12時間の明暗サイクルに基づいて変更された代謝ケージに収容され、そして水へは自由に接近でき、そして１日２回の飼料が与えられた。プロテアーゼ効能を評価するために、ブタは、1Lの水、0.625gのCr2O3(酸化クロムマーカー)と共に混合され、そして異なった量のプロテアーゼ（0, 1000, 2500, 6000FIP Uプロテアーゼ/飼料（プロテアーゼFIP単位、例２を参照のこと））が、摂取する直前、混合されている、250gの試験試料を与えられた。試験飼料は、21.4％のタンパク質、51.9％の澱粉、2.6％の脂肪を含み、そして次の組成を有した（g/100g乾燥物質）：フィシュミール3.5、家禽ミートミール10.2、小麦粉29.5、穀を有する米14、ジャガイモ澱粉11、トウモロコシ澱粉14、カゼイン5.9、セルロース粉末4.3、ビタミン、穀物及び微量元素7.6を含んだ（ブタについての栄養必要条件に関しては、WO01/58276号の表Aを参照のこと）。
【０１７２】
回腸キームスを、回腸におけるミールマーカーの最初の出現（緑色キームス）の後、合計８時間、氷上に集め、そして分析の前、−20℃で貯蔵した。別々の測定間で、少なくとも１日の洗浄を可能にした。
【０１７３】
手短に言及すれば、凍結されたサンプルを、凍結乾燥し、そして乾燥物質（DM）及び粗タンパク質について分析した。DMを、凍結乾燥、続く103℃での８時間のインキュベーションの後、重量により評価した。粗タンパク質を、Animal Nutrition, 4th edition, Chapter 13 (Eds. P. McDonald, R. A. Edwards and J. F. D. Greenhalgh, Longman Scientific and Technical, 1988, ISBN 0-582-40903-9)に言及されるように、因子6.25により掛け算された窒素（N）として、すなわち粗タンパク質（g/kg）＝N（g/kg）×6.25として計算した。窒素含有率を、Kjeldahl方法(Naumann and Bassler, 1993, Die chemische Untersuchung von Futtermitteln. 3 edition VDLUFA-Verlag, Darmstadt, Germany (VDLUFA = Verband Deutscher Landwirtschaftlicher Untersuchungs- und Forschungsanstalten)により決定した。
【０１７４】
見掛けの前盲腸タンパク質消化率の計算を、次の式に従って行った：
見掛け消化率（％）＝100−[（飼料における％Cr2O3・サンプルにおける％タンパク質）・100/（サンプルにおける％Cr2O3・飼料における％タンパク質）]
ここでCr2O3及びタンパク質は、g/100gの乾燥物質として表された。Cr2O3の量を、当業界において知られている方法、好ましくはPetry and Rapp： Zeitung fur Tierphysiologie (1970), vol. 27, p. 181-189により記載されるようにして、クロメートへの酸化及び365nmでの消衰の測定により決定することができる。この研究の結果は、表１に示される。
【０１７５】
【表１】
2008546395.tif 000003
【０１７６】
表１における結果から、本発明の配列番号２のプロテアーゼが既知のパンクレアチン製剤と同じ活性を遂行することが明白である。本発明のプロテアーゼは、試験された最低用量で高い効率の改良性をすでに示すので、タンパク質消化率に対して強く且つ用量依存の改良性を引起した。
【０１７７】
例４：プロテアーゼのインビトロ試験：
種々のプロテアーゼを、消化−刺激条件下で、タンパク質を分解するそれらの能力についてインビトロで試験した。
プロテアーゼ：
本発明の次のスブチリシンプロテアーゼを試験した：配列番号１のアミノ酸１−274のバチルス・リケニホルミスプロテアーゼ；配列番号10のアミノ酸１−275のバチルス・アミロリケファシエンスプロテアーゼ；及び配列番号11のアミノ酸１−269のバチルス・レンタスの変異体99aE (E(Glu)が、配列番号11のアミノ酸１−269におけるアミノ酸残基番号99、S（Ser）の後に挿入されている)。
【０１７８】
比較のために、本発明以外のいくつかのスブチリシンプロテアーゼ、すなわちバチルス・ハルマパラス（Bacillus halmapalus）NCIB12513（WO88/01293号及びWO98/012005号（配列番号42、バチルスsp. JP170）に記載される）、及びバチルスsp. NCIMB40339 (バチルスsp. TY145としてWO92/017577号に記載される)がまた包含される。それらのプロテアーゼはすべて、50％以下の配列番号１のアミノ酸１−27に対する％同一性を有する。さらに、WO2005/115445号に記載される非スブチリシンノカルジオプシスプロテアーゼ（配列番号１のアミノ酸1−188）が、比較のために包含された。プロテアーゼはまた、配列番号１のアミノ酸１−274に対して50％以下の同一性を有する。最終的に、パンクレアチンが正の対照として包含された。
【０１７９】
プロテアーゼはすべて、酵素タンパク質に基づいて同等に、すなわち250gのミール当たり、72, 36, 18及び9mgの酵素タンパク質（EP）の用量で投与される。プロテアーゼ酵素タンパク質の量を、S.C.Gill & P.H. von Hippel, Analytical Biochemistry 182, 319-326, (1989)に概略される原理を用いて、A280値及びアミノ酸配列（アミノ酸組成物）に、基づいて計算した。
【０１８０】
材料及び方法：
胆汁塩（すなわち、LGC promochemから市販されている、ph. Eur. 又はFIPからのタウロコール酸ナトリウム、500g/モル）、ペプシン（Merck, VL 317492 437 (1.07192)）、パンクレアチン（Solvay Pharmaceuticalsからの）。プロテアーゼ規定食：51.9％の澱粉、21.3％のタンパク質及び2.6％の脂肪/脂質。
【０１８１】
インビトロモデル：
プロテアーゼ規定食を、0.1MのHClに溶解し、0.2gの規定食/mlの濃度にした。Phを、３に調節した（胃の状態に類似する）。100μlの規定食スラリー、20μlのペプシン（脱イオン水中、70mg/lの最終濃度）（Milli−Q）及び30μlのプロテアーゼ（又は、非酵素対照におけるMilli−Q）を、マイクロタイタープレート（MTP）中の個々のウェルに添加した。これを、37℃、700rpmで１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの最後で、pHは、3.4であることが測定された。6.0にpHを上げるために（腸の状態に類似する）、25μlの混合されたpH5/9緩衝液（0.8MのMES、0.8Mのイミダゾール、0.8Mの酢酸ナトリウム、pH5.0又はpH9.0；40％ pHS及び60％ pH9緩衝液）を、個々のウェルに添加した。さらに、25μlの胆汁塩（5mMの最終濃度）を添加し、そしてこれを、37℃、700rpmで２時間インキュベートした。インビトロインキュベーションの後、MTPを、2700rpm（1500g）、4℃で10分間、遠心分離し、そして上清液を、さらなる調査のために集めた。
【０１８２】
遊離アミノ基（OPA）の決定：
インビトロ消化物の上清液を、OPA（0−フタルジアルデヒド）との反応による遊離アミノ基の決定により分折した。OPA決定の方法は次の通りであった：20μlの希釈されたインビトロ上清液を、新しいMTPに移し、そして200μlのOPA試薬を添加した（80mgのOPAを、2mlの96％エタノールに溶解し；3.81gの四硼酸二ナトリウム・10H2O, 1mlの10％SDS、88mgのDTT及びOPA−エタノール溶液を、Milli−Q水により100mlにした）。吸光度を340nmで測定した。セリン標準の並び（0.5mg/ml〜0.0078mg/ml）が、その決定に包含された。
【０１８３】
下記表２は、加水分解されるmMのアミノ基としての結果を示す。結果は、二重反復された決定値の平均値であり、そして標準偏差（s.d.）がまた示される。ミール当たり72mgの酵素タンパク質に関する結果のみが、この試薬において、低い酵素用量に関する結果が酵素間での新しい差別を可能にしなかったので、示される。
【０１８４】
【表２】
2008546395.tif 000004
【０１８５】
表２の結果は、本発明のプロテアーゼ（配列番号１，10）がこのインビトロモデルにおいて非常に良く遂行することを示す。これは、本発明の部分ではないプロテアーゼJP170及びTY145についての場合ではない。実際、非常に異なったタイプのプロテアーゼであり、そして本発明に包含されないノカルジオプシスプロテアーゼを無視すると、本発明の配列番号１に対する％同一性と、このモデルにおける性能との間に相互関係が存在する（％同一性が高いほど、性能はより良好である）。
【０１８６】
上記のようにして行われる別々の実験において、本発明者は、ノカルジオプシスプロテアーゼの比較のためにまた包含する、本発明のバチルス・レンタスプロテアーゼとの比較のためにまた包含する、本発明のバチルス・レンタスプロテアーゼ変異体（配列番号11の変異体）のインビトロ性能を試験した。用量−応答結果が下記表３に示されている。
【０１８７】
【表３】
2008546395.tif 000005
【０１８８】
第１に、それらの結果は良好な用量−応答関係を示す。第２に、本発明のプロテアーゼ（配列番号11の変異体）が特に72mgのEP/ミールの用量で非常に良く遂行することが注目されるべきである。配列番号11の変異体は、配列番号１に対する％同一と、上記に言及される性能（両実験に包含されるノカルジオプシスプロテアーゼに対して）との間の相互関係に十分に適合すると思われる。
【０１８９】
例５：医薬プロテアーゼ組成物：
（A）高い強度のペレット：
配列番号１のアミノ酸１−274のプロテアーゼの細菌濾過された液体濃縮物を、例１に記載のようにして調製し、そして噴霧乾燥した。噴霧乾燥されたプロテアーゼ粉末の測定されたプロテアーゼタンパク質含有率は、58.5％であった。粉末形での1125gの噴霧乾燥されたプロテアーゼを、市販のミキサーにおいて、微晶性セルロース（450g）及びポリエチレングリコール4000（MacrogolTM4000；675g）と共に乾燥プレ−混合した。イソプロピルアルコール（460g；100％）を添加し、そして得られる湿潤塊状物を、室温で十分に混合し続けた。
【０１９０】
次に、均質化された塊状物を、0.8mmの穴の直径を有する穴開用ダイを備えた市販の押出し機において押出し、円柱上のペレットを形成した。ビース温度は、押出しの間、50℃を越さなかった。生成される押出し物を、必要な量のイソプロピルアルコール（100％；54.5g）を添加することにより、市販の真空乾燥機（Voetschからの）において、約40℃の生成物温度で乾燥した。生成物温度は45℃を越えなかった。次に、乾燥されたペレットを、0.7及び14mmのスクリーンを有する機械的篩機械を用いることにより分離した。0.7mm〜1.4mmの篩画分を集め、そしてサイズ２のカプセルにそれぞれ200mgのペレットの部分を充填した。得られる乾燥ペレットのプロテアーゼ濃度は、約29.3％（w/w）であった。
【０１９１】
（B）低い強度のペレット：
上記（A）に提供される例に類似して、薬剤物質として低い含有率のプロテアーゼを有するペレットを、粉末形での562.5gの噴霧乾燥されたプロテアーゼ（58.5％の測定されたプロテアーゼタンパク質含有率を有する）、微晶性セルロース（1125g）、ポリエチレングリコール4000（562.5g）、湿潤のためのイソプロピルアルコール（700g）及び球状化のためのイソプロピルアルコール（61.2g）を用いて、2250gのバッチサイズで生成した。得られる乾燥ペレットのプロテアーゼ濃度は、約14.6％（w/v）であった。
【０１９２】
例（A）及び（B）からの得られるペレットを、活性化段階が除去されている改良を伴っての膵臓粉末からのプロテアーゼについてのFIP方法を適用することにより、タンパク質分解活性について試験した。タンパク質加水分解についての損失は、出発の粉末プロテアーゼ材料に関して、個々の場合、ペレットに見出されなかった。
【０１９３】
例（A）及び（B）からの得られるペレットを、Pharm. Eur. 2.9.1（“錠剤及びカプセルの砕解”のセクション）にしたがって、砕解について試験した（試験溶液：水−500ml、37℃）。
例（A）からのペレットの砕解を３分以内で完結した。例（B）からのペレットの砕解を11分以内に完結した。
【０１９４】
例６：プロテアーゼ及びアミラーゼの医薬組成物：
アミラーゼ及びプロテアーゼを含む高い強度のペレットを次の通りにして調製した：
配列番号16のアミノ酸１−486を有するアミラーゼの液体濃縮物を、DK2005/00931号（細菌濾過された限外濾過物）に記載のようにして調製した。その液体濃縮物を噴霧乾燥した。噴霧乾燥されたアミラーゼ粉末の測定されたアミラーゼタンパク質包含率は37％であった。乾燥形での噴霧乾燥されたアミラーゼ（398，5g）を、例５に記載のようにして調製された噴霧乾燥されたプロテアーゼ粉末（746.5g；58.5％の測定されたプロテアーゼタンパク質含有率を有する）、微晶性セルロース（458g）及びポリエチレングリコール4000（MacrogolTM4000；687g）と共に乾燥プレ−混合した。イソプロピルアルコール（460g；100％）を添加し、そして得られる湿潤塊状物を、室温で十分に混合し続けた。
【０１９５】
次に、均質化された塊状物を、0.8mmの穴の直径を有する穴開用ダイを備えた市販の押出し機において押出し、円柱上のペレットを形成した。ビース温度は、押出しの間、50℃を越さなかった。生成される押出し物を、必要な量のイソプロピルアルコール（100％；58g）を添加することにより、市販の真空乾燥機（Voetschからの）において、約40℃の供給温度で乾燥した。生成物温度は45℃を越えなかった。次に、乾燥されたペレットを、0.7及び14mmのスクリーンを有する機械的篩機械を用いることにより分離した。0.7mm〜1.4mmの篩画分を集め、そしてサイズ２のカプセルにそれぞれ200mgのペレットの部分を充填した。得られる乾燥ペレットのプロテアーゼ濃度は、約19.1％（w/w）であり、そして得られる乾燥ペレットのアミラーゼ濃度は約6.4％（w/w）であった。
【０１９６】
得られるペレットを、上記に概略されるような方法に従って、タンパク質加水分解及びデンプン分解活性について試験した。タンパク質加水分解又はデンプン分解活性についての損失は、それぞれ、出発の粉末プロテアーゼ又はアミラーゼ材料に関して、個々の場合、ペレットに見出されなかった。
【０１９７】
例７：プロテアーゼの存在下でのリパーゼのインビボ安定性及び効力：
本発明のプロテアーゼ（配列番号１のアミノ酸１−274を有する）の存在下での配列番号15のヒューミコラ・ラヌギノサリパーゼの安定性及び効力を次の通りに試験した：
精製されたリパーゼを、DK出願番号2005/00929号からの優先権主張されたPCT出願の例２に一般的に記載のようにして、インビボ試験において試験した（但し、投与量は、この引例に記載される膵臓FIPアッセイにおいて評価されたリパーゼ単位に従った）。消化値（脂肪吸収の係数；CFA）を、前記引用された特許出願にまた記載のようにして評価した。
【０１９８】
リパーゼを、単独で、及び種々の用量の組合せでのプロテアーゼと組合わせて試験した。プロテアーゼ活性を、膵臓FIPアッセイを用いて決定した（例１における引例を参照のこと）。
結果は、平均CFA（％）値及び標準偏差（sd）の表示と共に、下記表４に示される。
【０１９９】
【表４】
2008546395.tif 000006
【０２００】
試験される２種のリパーゼ用量の個々について、２種の異なった用量において、プロテアーゼを伴わないでの結果と、プロテアーゼを伴っての結果との間に有意な差異は存在しなかった。従って、プロテアーゼはインビボでリパーゼに対して悪影響を与えなかったことが結論づけられ得る。
【配列表】
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【国際調査報告】
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