(57)【要約】  本発明は、式（１）のＮ6−（アミノイミノメチル）−Ｎ2−（３−メルカプト−１−オキソプロピル−Ｌ−リジルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−プロリル−Ｌ−システインアミド、環状（１→６）−ジスルフィドの改良された製造方法に関し、それは、固相樹脂上に適切な保護基を有するアミノ酸残基およびチオアルキルカルボン酸を組み上げ、このようにして得られたペプチドを樹脂から切断し、同時に、チオール部分のＡｃｍ保護基以外の側鎖保護基を除去して式（３）のペプチドアミドを得、保護されたチオール基を有する式（３）のペプチドアミドのリジン残基をグアニル化によりホモアルギニン残基に変換して式（４）のペプチドアミドを得、式（５）の銀ペプチドを製造し、続いて、その銀ペプチドを同時に脱保護および酸化して、式（１）の化合物を含む粗ペプチドアミドを得、最終的にクロマトグラフで精製することを含む。記載の方法は、簡単で、容易であり、環境に優しく、且つ費用効率が高い。【特許請求の範囲】
【請求項１】
固相上での式（１）：
【化１】
2008503597.tif 000030
のペプチドＮ6−（アミノイミノメチル）−Ｎ2−（３−メルカプト−１−オキソプロピル−Ｌ−リジルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−プロリル−Ｌ−システインアミド，環状（１→６）−ジスルフィドの製造方法であって、
ａ．カップリングしてペプチド結合により互いに直接連結させることにより、固体支持体樹脂上に６個のアミノ酸およびチオアルキルカルボン酸からなるペプチド鎖を必要な配列に組み上げて、下記の式（２）：
【化２】
2008503597.tif 000031
のペプチド結合樹脂を得、
ｂ．工程（ａ）の各々のカップリングの後に、遊離アミノ基を無水酢酸でキャッピングし、
ｃ．工程（ａ）のペプチドを樹脂から切断し且つＡｃｍ基以外の全ての基を脱保護して、下記の式（３）：
【化３】
2008503597.tif 000032
のペプチドアミドを得、
ｄ．有機溶媒中、ε−リジン−ＮＨ2で式（３）のペプチドをグアニル化し、続いて、他の溶媒で析出させて、下記の式（４）：
【化４】
2008503597.tif 000033
のペプチドを得、
ｅ．適切な溶媒中で式（４）のペプチドを重金属塩で処理し、続いて、有機溶媒を用いて重金属−ペプチド塩を析出させて、式（５）：
【化５】
2008503597.tif 000034
の重金属−ペプチド塩を得、
ｆ．適切な求核剤で、工程（ｅ）の重金属−ペプチドを酸化し且つ脱塩して、式（１）のペプチドを得、そして
ｇ．工程（ｆ）の粗ペプチドを、ＲＰＨＰＬＣで精製することを含む、その製造方法。
【請求項２】
化合物のアミノおよびカルボキシル等価体の反応が、そのペプチド結合を形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
保護された第一のアミノ酸のＣ−末端を、リンカーを介して固相に結合し、固相結合アミノ酸を得る、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
使用される固体支持体が任意のアミド樹脂、好ましくはＲｉｎｋアミド樹脂である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
第一の保護されたアミノ酸が、チオール保護Ｆｍｏｃシステインである、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
リンカーを有する樹脂の切断が、組み上げられたペプチドアミドの放出をもたらすものである、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ペプチドアミド化合物が、ペプチド結合により末端官能性の各々に連結された化合物であり、各々の末端官能性がアミノもしくはカルボン酸基またはそれらの誘導体である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
使用されるアミノ酸が、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｈａｒ、ＬｅｕおよびＧｌｕよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
使用されるチオアルキルカルボン酸が、２−チオプロピオン酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
アミノ酸の−ＮＨ2官能基の保護基がＦｍｏｃまたはＢｏｃである、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
−ＣＯＯＨ官能基の保護基が非保護または保護Ｏ−ｔＢｕエステルである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
ＳＨ−官能の保護基がＡｃｍ基である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ｃ）において、ペプチドが、ある規定の比率での反応剤ＴＦＡ、ＴＩＳ、ＥＤＴ、ＤＣＭ、フェノールおよび水、好ましくはＴＦＡ（８５〜９８％）：ＴＩＳ（０〜５％）：Ｈ2Ｏ（０〜５％）：ＥＤＴ（０〜５％）：フェノール（０〜５％）、より好ましくはＴＦＡ（９４．５〜９５．５％）：ＴＩＳ（０〜２．５％）：Ｈ2Ｏ（０〜３％）：ＥＤＴ（０〜２．５％）を用いて固体支持体樹脂から切断される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ｄ）において、グアニル化に使用される有機溶媒が、ＤＭＦ、エタノールおよびメタノールよりなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
工程（ｄ）において、式（４）のペプチドの析出が、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エーテル類、ペンタン、ヘキサンおよびこれらの混合物よりなる群から選択される溶媒を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
析出が、好ましくはアセトニトリルを使用して行われる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｇ）において、得られた式（１）のペプチドが、９９％より高い純度を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
固相合成による式（１）のペプチドの製造が、Ｆｍｏｃ化学を使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
アミノ酸の組み上げが、式（２）：
【化６】
2008503597.tif 000035
のペプチド結合樹脂を与える、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ｄ）において、式（３）のペプチドのグアニル化が、好ましくは、ＤＭＦ中の溶媒を使用することにより行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
式（４）のペプチドの精製が、ＲＰ−ＨＰＬＣにより行われ、達成される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
式（４）のペプチドの処理に使用される重金属塩が、ＴＦＡ中のトリフルオロメタンスルホン酸銀である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
式（５）：
【化７】
2008503597.tif 000036
の重金属ペプチド塩の析出が、好ましくはエーテル系溶媒、より好ましくはジイソプロピルエーテルを使用して行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
工程（ｆ）において、重金属ペプチド塩が、ＨＣｌとＤＭＳＯで処理されて、同時に重金属を除去し、且つ得られたペプチドを酸化して、式（１）の粗ペプチドアミドを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
式（１）の粗ペプチドアミドが、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製される、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
式（１）の粗ペプチドアミドの精製が、好ましくは、移動相として、メタノールおよび／またはアセトニトリルが単独でまたは水性ＴＦＡ（０〜０．５％）と組み合わせて使用される、Ｃ−４、Ｃ−８またはＣ−１８シリカまたはポリマー逆相カラムを使用するＲＰ−ＨＰＬＣで行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
式（２）：
【化８】
2008503597.tif 000037
の中間体ペプチド。
【請求項２８】
式（３）：
【化９】
2008503597.tif 000038
の中間体ペプチド。
【請求項２９】
式（４）：
【化１０】
2008503597.tif 000039
の中間体ペプチド。
【請求項３０】
式（５）：
【化１１】
2008503597.tif 000040
の中間体ペプチド塩。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、固相Ｆｍｏｃ化学を用いる、式（１）のＮ6−（アミノイミノメチル）−Ｎ2−（３−メルカプト−１−オキソプロピル−Ｌ−リジルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−プロリル−Ｌ−システインアミド，環状（１→６）−ジスルフィドの改良された製造方法に関する。
【０００２】
〔発明の背景および従来技術〕
米国特許第５３１８８９９号明細書には、血小板関連虚血疾患の治療および予防用の治療剤としての式（１）のＮ6−（アミノイミノメチル）−Ｎ2−（３−メルカプト−１−オキソプロピル−Ｌ−リジルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−プロリル−Ｌ−システインアミド，環状（１→６）−ジスルフィドが記載されている。それは、ヒト血小板の血小板受容体糖タンパク質（ＧＰ）に結合して、血小板凝集を阻害する。血小板凝集には、血小板膜の表面上のＧＰ複合体が介在する。それは、非活性形態においては、刺激されていない血小板の表面に存在する。血小板が付着および生理学的アゴニストにより活性化されたとき、ＧＰはまた、フィブリノーゲン、フォン・ヴィレブランド因子（ｖＷＦ）、およびフィブロネクチンの受容体となるように活性化される。しかしながら、生体内での血小板凝集および血栓生成の主な原因であると考えられているものは、フィブリノーゲンおよび／またはｖＷＦの結合である。このことは、フィブリノーゲンまたはｖＷＦのＧＰへの結合を特異的に阻害する物質は血小板凝集を阻害し、生体内での血栓生成を阻害する候補物質となりうることを教示している（Eric J. Topol, Tatiana V. Byzova, Edward F. Plow and The Lancet; Vol 353; January 16, 1999; pg 227-231）。この論文には、血小板凝集阻害活性を有する化合物が記載されているが、その分子を合成する方法は教示されていない。
【０００３】
血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａのアンタゴニストは、経皮的冠動脈形成術（ＰＣＩ）中の心筋損傷をもたらす血栓合併症の程度を軽減する上で、認められた役割を果たす。
【０００４】
式（１）の化合物は、６個のアミノ酸と１個のメルカプトプロピオニル（デスアミノシステイニル）残基を含む、ジスルフィドで輪になった環状ヘプタペプチドである。ジスルフィド架橋は、システインアミドとメルカプトプロピオニル部位の間で形成される。溶液相ペプチド合成により製造され、分取用逆相液体クロマトグラフィーにより精製されることが知られており、凍結乾燥される（www.fda.gov/cder/foi/label/1998/20718lbl.pdf）。
【０００５】
ペプチド合成法に関して、２つの主な合成手法が、現在の実施で優位を占めている。これらは、溶液（均一相）中での合成および固相（不均一相）上での合成である。しかしながら、溶液相ルートは、各々のカップリングの後、生成したペプチドを単離しなくてはならないので、固相ルートに比べて、より煩雑であり、一方、固相合成では、過剰の試薬および副生物は、簡単な濾過により洗い去られる。両者において、所望のペプチド化合物は、構築しているペプチド鎖にアミノ酸部分を段階的に付加することにより製造される。
【０００６】
米国特許第５９５８７３２号および第５３１８８９９号明細書には、式（１）のＮ6−（アミノイミノメチル）−Ｎ2−（３−メルカプト−１−オキソプロピル−Ｌ−リジルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−プロリル−Ｌ−システインアミド，環状（１→６）−ジスルフィドのようなペプチドを合成する組み換え技術がクレームされている。この組み換え法により得られるペプチドは、リジン残基をホモアルギニン残基に変換するために、溶液相合成により修飾される。これらの特許文献は、Ｂｏｃ化学を用いる固相合成をもクレームしており、これらの特許の主題は、根本的に本発明とは異なるものである。
【０００７】
Ｂｏｃ化学と比較して、Ｆｍｏｃ化学に基づく合成は、温和な手順を使用し、Ｆｍｏｃ基は塩基に不安定性であるため、酸に不安定な側鎖保護基が使用されて、直交保護を与える。保護基の使用原理は、保護基の結合を切断するエネルギーは、他のいかなる基よりも低いということにある。
【０００８】
特許ＵＳ５６８６５６６、ＵＳ５６８６５６７、ＵＳ５６８６５６９、ＵＳ５６８６５７０およびＵＳ５７５６４５１は、式（１）の化合物のそれらの塩または他の形態における異なるＰＡＩを取り扱っているが、Ｆｍｏｃ固相合成を使用するその製造方法を教示していない。
【０００９】
同様に、特許ＵＳ５７５９９９９、ＵＳ５７８６３３３、ＵＳ５７７０５６４、ＵＳ５８０７８２５、ＵＳ５８０７８２８、ＵＳ５８４３８９７、ＵＳ５９６８９０２およびＵＳ５９３５９２６には、血小板関連疾患の処置方法およびｂｏｃ化学を用いる式（１）のペプチドアミドの製造方法が記載されている。
【００１０】
特許ＵＳ５３４４７８３およびＵＳ５８５１８３９は、血小板凝集阻害剤（ＰＡＩ）を選択し、同定する方法に関し、そして式（１）のペプチドアミドの製造用のｂｏｃ化学を開示している。
【００１１】
ＵＳ特許５７８０５９５は、ＰＡＩに特異的な抗体をクレームしており、また、式（１）のペプチドアミドの製造用のｂｏｃ化学を開示している。
【００１２】
種々の他のペプチドの合成のＦｍｏｃルートは、従来技術で周知であり、いくつかの文献が、それらの製造に利用できる。しかしながら、経済的であり、最少の工程を含み、且つ環境に優しい、式（１）の化合物の製造方法を開発することが明らかに必要である。
【００１３】
先に説明したように、Ｆｍｏｃ化学をベースとする合成は、温和な手順を利用し、Ｆｍｏｃ基は塩基に不安定性であるため、酸に不安定な側鎖保護基が使用されて、直交保護を与える。Ｆｍｏｃ化学で使用される保護基は、ｔｅｒｔ−ブチル部分に基づく：Ｓｅｒ、Ｔｈｒに対してはｔｅｒｔ−ブチルエーテル、Ａｓｐ、Ｇｌｕに対してはｔｅｒｔ−ブチルエステル、およびＬｙｓ、Ｈｉｓに対してはＢｏｃ。ｔｒｔおよびａｃｍ基は、Ｃｙｓの保護に使用される。ＡｒｇおよびＨａｒのグアニジン基は、Ｍｔｒ、ＰｍｃまたはＰｂｆで保護される。Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体の多くは、市販されている。しかしながら、最終生成物を精製する前に、経費が増加し、最終生成物の純度および収率に影響を与える、別個の操作が必要であるので、ホモアルギニンを含有するペプチドおよびジスルフィド結合に基づく環状ペプチド化合物のようないくつかのアミノ酸類縁体の製造に対して、ある問題がこの分野に存在している。鎖の組み立てに使用するために商業的に購入した場合、Ｆｍｏｃ−ホモアルギニン残基は、高価なものとなる。あるいは、ペプチドの組み立てにおいて、Ｈａｒ単位は、α−ＮＨ2でリジン残基のグアニル化により構築され、それは、その生理学的活性の評価用のバソプレシン類縁体を得るために実証されている（Lindebergら、Int. J. Peptide Protein Res. 10, 1977, 240-244）。
【００１４】
ＷＯ０３／０９３３０２には、Ｆｍｏｃ−α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドシステインを使用する、式（１）のペプチドの合成が開示されている。そのチオール側鎖を介しての、析出した形態での第一のアミノ酸システインの固体支持体４−メトキシトリチルポリスチレン樹脂への付着と、引き続くα−窒素保護基の除去およびその窒素上でのペプチドの組み立てが記載されている。しかしながら、この方法では、一般的な市販の態様ではない固体支持体４−メトキシトリチルポリスチレン樹脂が使用されており、また、Ｆｍｏｃ−α−窒素保護Ｃα−カルボキサミドシステインは、市販されていない。これは、本発明の方法に対して、増大した数の工程を有する方法とし、また高価なものにする。切断条件は、エタンジオールを使用し、それは、その方法を、毒性が高く、環境に優しくないものとし、高価なスクラバーの使用を必要とする。鎖の組み立てにおいてＦｍｏｃ−ホモアルギニン残基の使用はまた、商業的に購入した場合、この方法を、非常に高価なものとする。全体として、この文献でクレームされている方法は、本発明でクレームされている方法とは異なる。さらに、ＷＯ０３／０９３３０２の方法には、ある制限が伴い、それは、本発明のプロセス工程において好適な修飾をもたらすことにより、克服される。
【００１５】
したがって、本発明の方法は、以下に記載のように、ＷＯ０３／０９３３０２−Ａ２特許公報中に記載のものに対して、改良された、有効な方法である。
１  不純物の生成をもたらす空気酸化に感受性で、最終生成物の精製および収率を妨げる、−ＳＨペプチドの製造を含まない。
２  ペプチド鎖を構築するための、アミノ酸に対する保護基の的確な選択。
３  アミノ酸のラセミ化を妨げる、適切な活性化反応剤を使用する、アミノ酸のカルボキシル官能の活性化。
４  −ＳＨペプチドを単離せずに、銀ペプチド塩中間体から式（１）のペプチドアミド中のジスルフィドループを得るための効率的な方法。
【００１６】
かなりの数の公知で天然由来の小型のおよび中型の環状ペプチドならびに所望の薬理学的特性を有するそれらの合成誘導体および類縁体のいくつかが合成されている。しかしながら、より広範囲な医学的な使用は、しばしば、それらの合成および精製が複雑であるために、妨げられている。したがって、これらの化合物を簡単に、より少ない工程で、しかもより少ないコストで製造する改良方法が望まれており、また、それは産業および人類の要求である。
【００１７】
ペプチドの純度および収率は、合成の全てのルートでの重要な観点である。最終生成物中における薬理学的に活性な化合物の相対的含有量で表される収率は、可能な限り高い必要がある。純度は、薬理学的に活性な不純物の存在の程度により表され、その不純物は、痕跡量しか存在しないが、ペプチドが治療剤として使用される場合にその有益な作用を妨害するかあるいは無効にさえしてしまうものである。薬理学的な面では、双方の観点が考慮される必要がある。一般には、精製は、より大きなペプチド分子であるほど、より困難になる。均一（溶液）相合成（これが、より大量のペプチドの工業生産で選択される現在の方法である）においては、個々の工程の間で必要とされる精製の繰り返しは、より純粋な生成物をもたらすが、収率は低い。そこで、合成の最終段階での収率および精製法の改良が必要である。本発明は、工業的に実施可能な固相合成であり、向上した収率で高純度の生成物を与える新規な方法である。
【００１８】
従来技術には、アミノ酸を活性化するためにＨＯＢｔおよびＤＩＣを使用することが記載されており、それは、ＯＢｔエステルの生成をもたらす。しかしながら、この手法を使用することの主な欠点は、ＯＢｔエステルそれ自体の製造は、約２０分を要し、また、反応を０℃で行う必要があることである。ＳＰＰＳ中でのＮα保護アミノ酸の段階的な導入は、通常、新たに入るアミノ酸の系中でのカルボキシル基の活性化または予め形成された活性化アミノ酸誘導体の使用を含む。近年、アミニウムおよびホスホニウム系誘導体（ＨＢＴＵ、ＴＢＴＵ、Ｐｙ Ｂｏｃ、およびＨＡＴＵ）が、系中でのカルボキシル活性化用の好ましいツールとなっている。それらは、カップリング効率および鏡像異性化抑制の双方の点で、優れた結果を与えることが示されている（Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis by Chan W.C. and White P. D., Oxford University Press, 2000, p. 41-74）。ＨＢＴＵの使用は、高収率および高純度をもたらす。それは、冷却を必要とせずに、活性化工程において時間を節約する。二重カップリングもまた、Ｍｐｒ（Ａｃｍ）−ＯＨについて必要としない。
【００１９】
Ｆｍｏｃ−アミノ酸誘導体の多くは市販されている。しかしながら、最終生成物を精製する前に、経費が増加し、最終生成物の純度および収率に影響を与える、別個の操作が必要であるので、ホモアルギニンを含有するペプチドおよびジスルフィド結合に基づく環状ペプチド化合物のようなある種のアミノ酸類縁体の製造に対して、ある問題がこの分野に存在している。ペプチド鎖の組み立てに使用するために商業的に購入した場合、Ｆｍｏｃ−ホモアルギニン残基は、非常に高価なものとなる。あるいは、ペプチド組み立ては、リジンを使用して構築され、続いて、α−ＮＨ2でリジン残基がグアニル化される（Lindebergら、Int. J. Peptide Protein Res. 10, 1977, 240-244）。
【００２０】
ジスルフィド構造の形成を伴う保護または非保護スルフヒドリル基の酸化的環化は、通常、最終合成工程として行われるが、その理由は、ジスルフィド結合がかなり熱的に及び化学的に不安定であるからである。数少ないケースでは、それはまた、固体支持体からペプチド分子を切断する前に行われる。例えばメタノールまたは酢酸中での、遊離のおよび／またはある種の保護されたスルフヒドリル基を含有する鎖状ペプチドのヨウ素での酸化は、CRC Handbook of Neurohypophyseal Hormone Analogs, Vol. 1, Part 1; Jost, K.,ら編、CRC Press, Boca Raton, Fla. 1987, p. 31にさらに説明されている。しかしながら、ヨウ素は、環化剤としては、欠点がないわけではない。例えば、ペプチド基質中に存在するトリプトファン部位は、ヨウ素化される危険があり、原料を完全に変換させることと副反応を最少にすることとのバランスはデリケートなものとなり、ひいては生成物の純度に影響を与える。Tam（Tam J. P.ら、1990, J. Am. Chem. Soc., Vol. 113, p. 6657）は、種々の緩衝液系中でのＤＭＳＯの２０〜５０％溶液の使用が、他の方法、例えば空気酸化に比べて、ジスルフィド結合の生成を非常に促進することを論証している。ＤＭＳＯはまた、他の酸化手法を使用すると生じるペプチドの凝集および析出を大きく減少させ、ある場合には、完全に抑止することが見出されている。そこで、ＤＭＳＯで酸化された、ジスルフィドで輪になったペプチドの収率および純度は、他の公知の方法に比べて、さらにより高い。本発明において、この点は、酸化的環化にヨウ素ルートを選択しないことにより、正しく対処されている。また、本発明においては、チオール基を含むペプチドアミドの代わりにペプチドアミドの銀塩を、ＳＨ−ペプチドを単離せずに酸化に付し、酸化反応中にオフサイド生成物の生成を回避している。したがって、本発明において採用される脱保護プロセス工程および引き続くグアニル化ペプチドアミドの酸化は、純度および収率が向上した式（１）の化合物を含む粗ペプチドアミドを与える。最終的に、粗ペプチドの精製は、最終純粋ペプチドの向上した収率をもたらす。
【００２１】
合成の公知のルートにおける他の複雑化の因子は、所望の環化ジスルフィドと、反応の終わりに過剰のヨウ素を還元するために使用される無機イオウ化合物、例えば亜ジチオン酸ナトリウムまたはチオ硫酸ナトリウムとの間の相互作用の可能性である。そのような還元性イオウ含有化合物は、一般に求核的攻撃に感受性であるジスルフィド結合と相互作用しうる。本発明の方法では、ヨウ素の使用が回避されるので、得られる生成物は、純度が高く、関連する不純物は検出されない。
【００２２】
本方法は、２，３の容易で単純な工程で達成される。固相合成の使用は、プロセスをより単純なものとし、Ｆｍｏｃ化学の使用は、ＨＦのようなきつい化学薬品の使用を排除し、これにより、生成物の安定性に影響を与えない。その方法は、中間体の精製をしなくてもすむようにし、それにより、収率が増大し、コストが減少する。工程（ｂ）および（ｅ）におけるスカベンジャーとしてのチオールの置換は、チオール用のスクラバーの使用が不要となることにより、方法をより環境に優しく、経済的なものとする。
【００２３】
方法の選択は、しばしば、治療用ペプチドの安定性に影響する。従来技術の方法に付随する制限を回避しうる、式（１）のペプチドを得るために長く待ち望まれていた要件がある。したがって、トリプトファン、ジスルフィドループ、ε−ＮＨ2側鎖等を含むペプチド合成の工業的方法は、ペプチド鎖を構築するための保護基および反応条件の適切な選択を要する。この目的は、ここに、出願人により、本出願に完全に記載の方法を開発することにより、成功裡に達成された。
【００２４】
明細書中で使用されている用語解説
ＡＡ            アミノ酸
Ａｃｍ          アセトアミドメチル
ＡＣＴ          活性化剤
ＡＤＰ          アデノシン二リン酸
ＡｇＯＴｆ      トリフルオロメタンスルホン酸銀
Ａｒｇ          アルギニン
Ａｓｐ          アスパラギン酸
Ｂｏｃ／ｂｏｃ  ｔｅｒｔ−ブチルオキシカルボニル
Ｃｙｓ          システイン
ＤＣＭ          ジクロロメタン
ＤＥＰ          脱保護反応剤
ＤＭＦ          ジメチルホルムアミド
ＤＭＳＯ        ジメチルスルホキシド
ＤＴＴ          ジチオトレイトール
ＥＤＴ          エタンジチオール
Ｆｍｏｃ        ９−フルオレニルメチルオキシカルボニル
Ｇｌｕ          グルタミン酸
Ｇｌｙ          グリシン
ＨＢＴＵ        ヘキサフルオロリン酸２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール１−イル）−
１，１，３，３−テトラメチルウロニウム
ＨＦ            フッ化水素
ＨＩＣ          疎水性相互作用クロマトグラフィー
Ｈｉｓ          ヒスチジン
ＩＥＣ          イオン交換クロマトグラフィー
ＬＣ−ＭＳ      液体クロマトグラフィー−質量分析
Ｌｙｓ          リジン
Ｍｐｒ          メルカプトプロピオン酸
Ｍｔｒ          ４−メトキシ−２，３，６−トリメチルベンゼンスルホニル
ＮＭＭ          Ｎ−メチルモルホリン
Ｏｂｕｔ        Ｏ−ｔ−ブチル
Ｐｂｆ          ２，２，４，６，７−ペンタメチルジヒドロベンゾフラン−５−
スルホニル
Ｐｍｃ          ２，２，５，７，８−ペンタメチルクロマン−６−スルホニル
ＰＰＰ          乏血小板血漿
Ｐｒｏ          プロリン
ＰＲＰ          多血小板血漿
ＲＰ−ＨＰＬＣ  逆相高速液体クロマトグラフィー
ＲＶ            反応容器
Ｓｅｒ          セリン
ＳＯＬＶ        溶媒
ＳＰ            合成ペプチド
ＴＥＡ          トリエチルアミン
ＴＦＡ          トリフルオロ酢酸
Ｔｈｒ          スレオニン
ＴＩＳ          トリイソプロピルシラン
Ｔｒｐ          トリプトファン
Ｔｒｔ          トリチル
【００２５】
〔発明の目的〕
本発明の主たる目的は、式（１）のＮ6−（アミノイミノメチル）−Ｎ2−（３−メルカプト−１−オキソプロピル−Ｌ−リジルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−プロリル−Ｌ−システインアミド、環状（１→６）−ジスルフィドを得るための改良方法を提供することである。
【００２６】
本発明の他の目的は、高収率且つ高純度の式（１）のペプチドアミドを得るための方法を開示することである。
【００２７】
本発明のさらに他の目的は、Ｆｍｏｃ化学を用いることによる、式（１）のペプチドアミドの固相合成の方法を開示することである。
【００２８】
本発明のさらなる他の目的は、溶液相合成に比べて、より少ない工程数の式（１）のペプチドの製造方法を開示することである。
【００２９】
本発明のさらに他の目的は、式（１）の化合物の従来技術の固相合成に付随する制限がない、式（１）のペプチドアミドの製造方法を設計することである。
【００３０】
本発明のさらなる他の目的は、向上した純度を有する、ジスルフィド部位を含む小型および中型ペプチドの製造方法を提供することである。
【００３１】
本発明のさらなる他の目的は、プロセス工程における随伴不純物の生成を最少にするために適切な保護基および反応剤を選択して、それにより収率を向上させ且つコストを軽減させることである。
【００３２】
〔発明の要約〕
本発明は、式（１）のＮ6−（アミノイミノメチル）−Ｎ2−（３−メルカプト−１−オキソプロピル−Ｌ−リジルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−プロリル−Ｌ−システインアミド、環状（１→６）−ジスルフィドの改良された製造方法に関し、それは、固相樹脂上に適切な保護基を有するアミノ酸残基およびチオアルキルカルボン酸を組み上げ、このようにして得られたペプチドを樹脂から切断し、同時にチオール部分のＡｃｍ保護基以外の側鎖保護基を除去して式（３）のペプチドアミドを得、保護されたチオール基を有する式（３）のペプチドアミドのリジン残基をグアニル化によりホモアルギニン残基に変換し、続いて、同時に脱保護して式（５）の銀ペプチドを得、そして銀ペプチドを酸化して式（１）の粗ペプチドアミドを得、最終的にクロマトグラフで精製することを含む。記載の方法は、簡単で、容易であり、環境にやさしく、且つ費用効率が高い。
【００３３】
〔発明の詳細な説明〕
したがって、本発明は、固相上での式（１）：
【化１２】
2008503597.tif 000002
のペプチドＮ6−（アミノイミノメチル）−Ｎ2−（３−メルカプト−１−オキソプロピル−Ｌ−リジルグリシル−Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−プロリル−Ｌ−システインアミド、環状（１→６）−ジスルフィドの製造方法であって、
ａ）カップリングしてペプチド結合により互いに直接連結させることにより、固体支持体樹脂上に６個のアミノ酸およびチオアルキルカルボン酸からなるペプチド鎖を必要な配列に組み上げて、下記の式（２）：
【化１３】
2008503597.tif 000003
のペプチドを得る工程、
ｂ）工程（ａ）の各々のカップリングの後に、遊離アミノ基を無水酢酸でキャッピングする工程、
ｃ）工程（ｂ）のペプチドを固体支持体樹脂から切断し且つＡｃｍ基以外の全ての基を脱保護して、下記の式（３）：
【化１４】
2008503597.tif 000004
のペプチドアミドを得る工程、
ｄ）有機溶媒中、ε−リジン−ＮＨ2で工程（ｃ）のペプチドをグアニル化し、続いて、他の溶媒で析出させて、下記の式（４）：
【化１５】
2008503597.tif 000005
のペプチドアミドを得る工程、
ｅ）適切な溶媒中で工程（ｄ）の式（４）のペプチドアミドを重金属塩で処理し、続いて、有機溶媒を用いて析出させて、式（５）：
【化１６】
2008503597.tif 000006
の重金属−ペプチド塩を得る工程、
ｆ）適切な求核剤で、工程（ｅ）の重金属−ペプチド塩を処理し、式（１）の粗ペプチドアミドを得る工程、そして
ｇ）工程（ｆ）の粗ペプチドアミドを、クロマトグラフィー法で精製する工程、を含むその製造方法を提供する。
【００３４】
本発明の実施態様は、そのペプチド結合を形成するための、化合物のアミノおよびカルボキシル等価体の反応を含む。
【００３５】
本発明の他の実施態様は、固相結合アミノ酸を得るための、リンカーを介して固相樹脂に結合された、保護された第一のアミノ酸のＣ−末端を提供する。
【００３６】
本発明のさらに他の実施態様は、任意のアミド樹脂、好ましくはＲｉｎｋアミド樹脂を有する固体支持体を使用する。
【００３７】
本発明のさらなる他の実施態様は、チオール保護Ｆｍｏｃシステインとして第一の保護されたアミノ酸を使用する。
【００３８】
本発明のさらに他の実施態様は、カップリング剤としてＨＢＴＵを使用する。
【００３９】
本発明のさらなる他の実施態様は、組み上げられたペプチドアミドの放出をもたらす、リンカーを有する樹脂の切断を提供する。
【００４０】
本発明のさらに他の実施態様は、アミノもしくはカルボン酸基またはそれらの誘導体である、末端官能性の各々に連結されることにより得られる式（１）のペプチドアミド化合物を提供する。
【００４１】
本発明のさらなる他の実施態様は、Ｃｙｓ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ａｓｐ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ａｒｇ、Ｈａｒ、ＬｅｕおよびＧｌｕよりなる群から選択されるアミノ酸を使用する。
【００４２】
本発明の実施態様は、チオアルキルカルボン酸、２−チオプロピオン酸を使用する。
【００４３】
本発明の他の実施態様は、ＦｍｏｃまたはＢｏｃである、アミノ酸のアミノ官能の保護基を使用することを提供する。
【００４４】
本発明のさらに他の実施態様は、非保護または保護Ｏ−ｔＢｕエステルである、カルボキシ官能を使用することを提供する。
【００４５】
本発明のさらなる他の実施態様は、Ａｃｍ基である、チオール官能の保護基を使用することを提供する。
【００４６】
本発明のさらに他の実施態様は、ある規定の比率での試薬ＴＦＡ、ＴＩＳ、ＥＤＴ、ＤＣＭ、フェノールおよび水、好ましくはＴＦＡ（８５〜９８％）：ＴＩＳ（０〜５％）：Ｈ2Ｏ（０〜５％）：ＥＤＴ（０〜５％）：フェノール（０〜５％）、より好ましくはＴＦＡ（９４．５〜９５．５％）：ＴＩＳ（０〜２．５％）：Ｈ2Ｏ（０〜３％）：ＥＤＴ（０〜２．５％）を用いての固体支持体樹脂からのペプチドの切断を提供する。
【００４７】
本発明の他の実施態様は、ＤＭＦ、エタノールおよびメタノールよりなる群から選択されるグアニル化のための有機溶媒を使用する。
【００４８】
本発明のさらに他の実施態様では、ペプチドのグアニル化が、好ましくは溶媒ＤＭＦを用いることにより行われる。
【００４９】
本発明のさらなる他の実施態様では、式（４）のペプチドアミドの析出が、アセトン、アセトニトリル、メタノール、エーテル類、ペンタン、ヘキサンおよびこれらの混合物よりなる群から選択される溶媒を使用して行われる。
【００５０】
本発明のさらなる他の実施態様では、析出が、好ましくはアセトニトリルを使用して行われる。
【００５１】
本発明の他の実施態様では、式（４）のペプチドの精製が、ＲＰ−ＨＰＬＣにより達成することができる。
【００５２】
本発明のさらに他の実施態様では、得られた式（１）のペプチドが、９９％より高い純度を有する。
【００５３】
本発明のさらなる他の実施態様では、固相合成法による式（１）のペプチドの製造が、Ｆｍｏｃ化学を使用して行われる。
【００５４】
本発明のさらなる実施態様では、トリフルオロメタンスルホン酸タリウム、酢酸水銀またはトリフルオロメタンスルホン酸銀から選択されるａｃｍ除去用の重金属塩、好ましくはトリフルオロメタンスルホン酸銀を使用する。
【００５５】
本発明の他の実施態様では、重金属ペプチド塩が、式（４）のペプチドを、ＴＦＡ中のトリフルオロメタンスルホン酸銀で処理することにより得られる。
【００５６】
本発明のさらに他の実施態様では、式（５）の重金属ペプチド塩の析出が、好ましくはエーテル系溶媒、より好ましくはジイソプロピルエーテルを使用して行われる。
【００５７】
本発明のさらなる他の実施態様では、重金属ペプチド塩が、ＨＣｌとＤＭＳＯで処理されて、同時に重金属を除去し、且つ得られたペプチドを酸化して、式（１）の粗ペプチドアミドを生成する。
【００５８】
本発明のさらなる他の実施態様では、式（１）の粗ペプチドアミドが、ＲＰ−ＨＰＬＣで精製される。
【００５９】
本発明の他の実施態様では、式（１）の粗ペプチドアミドの精製が、好ましくは、移動相として、メタノールおよび／またはアセトニトリルを水性ＴＦＡ（０〜０．５％）と組み合わせて使用される、Ｃ−４、Ｃ−８またはＣ−１８シリカまたはポリマー逆相カラムを使用するＲＰ−ＨＰＬＣで行われる。
【００６０】
本発明のさらなる他の実施態様は、方法を高価ではないものにできる、粗ペプチド精製用メタノール（ＡＲグレード）を用いる。
【００６１】
本発明のさらに他の実施態様は、以下の式（２）：
【化１７】
2008503597.tif 000007
の中間体ペプチドアミドの製造方法を提供する。
【００６２】
本発明のさらなる他の実施態様は、以下の式（３）：
【化１８】
2008503597.tif 000008
の中間体ペプチドアミドの製造方法を提供する。
【００６３】
本発明のさらなる他の実施態様は、以下の式（４）：
【化１９】
2008503597.tif 000009
のペプチドアミドの製造方法を提供する。
【００６４】
本発明のさらに他の実施態様は、以下の式（５）：
【化２０】
2008503597.tif 000010
の中間体ペプチドアミド銀塩の製造方法を提供する。
【００６５】
以下の実施例は、本発明を例証するものであり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００６６】
〔実施例〕
実施例（１）：鎖状ペプチドの化学合成
(Acm)Mpr-Lys(Boc)-Gly-Asp(OBut)-Trp-Pro-Cys(Acm)-樹脂
式（２）
一般的手順：
ペプチド鎖の組み上げは、以下の方法で行う。樹脂を、ペプチド合成装置［ＣＳ９３６、CS BIO, Calif. Peputide Synthesizer］のＲＶに移し、ペプチド合成装置上で、鎖状ペプチドを、１．５〜４．０倍モル過剰のアミノ酸誘導体を用いてその上で組み上げる。樹脂上のＦｍｏｃ基を脱保護し、続いて、ＮＭＭの存在下にＨＢＴＵで第一のアミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｃ）を活性化することにより、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｃ）を樹脂にカップリングする。次のアミノ酸、プロリンをカップリングするために、第一のアミノ酸、すなわちＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｃ）のα窒素を脱保護し、続いて、ＮＭＭの存在下にＨＢＴＵでＦｍｏｃ−Ｐｒｏを活性化する。完全な鎖状ペプチド鎖が固体支持体上に組み上げられるまで、このプロセスを、全てのアミノ酸で繰り返す。Ｍｐｒが、その最後に組み上げられる。各々のカップリングは、４５〜９０分の時間の範囲で行われる。カップリング工程には、３０〜６０分間の無水酢酸でのキャッピングが続く。カップリングが完了した後、樹脂を、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドンまたはＤＣＭの範囲から選択しうる有機溶媒、好ましくはＤＭＦと引き続くＤＣＭで洗浄し、次いで、真空下に乾燥させる。式（２）の鎖状ペプチドが得られる。
【００６７】
ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用いるｒｉｎｋアミド樹脂上での固相ペプチド合成技術により、ペプチドアミドとして合成された。
【００６８】
【表１】
2008503597.tif 000011
【００６９】
樹脂（１５．３８ｇ−ｒｉｎｋアミド、１０ｍｍｏｌ）をＣＳ９３６のＲＶに移し、ＤＭＦ中で膨潤させた。
【００７０】
（ｉ）Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）／ＨＢＴＵの樹脂へのカップリングによるＦｍｏｃ Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。予め膨潤させた樹脂（１０ｍｍｏｌ）をＤＭＦで２回洗浄し、続いて、２０％ピペリジンで２回処理してＦｍｏｃを除去した。樹脂を６回ＤＭＦで洗浄した。ＦｍｏｃＣｙｓ（Ａｃｍ）（２０ｍｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（アミノ酸と等モル）を０．４Ｍ ＮＭＭ中に溶解し、樹脂に加えた。カップリングを、６０分間、最適撹拌下に行った。樹脂を、再度、ＤＭＦで３回洗浄した。カップリングの後、遊離アミノ基を無水酢酸（２．５Ｍ）で４５分間キャッピングし、続いて、ＤＭＦで３回洗浄した。このＨＢＴＵ法は、エステルを単離しない一工程法である。
【００７１】
合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【表２】
2008503597.tif 000012
【００７２】
（ii）Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ／ＨＢＴＵをＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【００７３】
【表３】
2008503597.tif 000013
【００７４】
（iii）Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ／ＨＢＴＵをＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＦｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【００７５】
【表４】
2008503597.tif 000014
【００７６】
（iv）Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）／ＨＢＴＵをＦｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＦｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【００７７】
【表５】
2008503597.tif 000015
【００７８】
（ｖ）Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ／ＨＢＴＵをＦｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【００７９】
【表６】
2008503597.tif 000016
【００８０】
（vi）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）／ＨＢＴＵをＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【００８１】
【表７】
2008503597.tif 000017
【００８２】
（vii）Ｍｐｒ（Ａｃｍ）／ＨＢＴＵをＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＭｐｒ（Ａｃｍ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【００８３】
【表８】
2008503597.tif 000018
【００８４】
実施例（２）：鎖状ペプチドの化学合成
【００８５】
【化２１】
2008503597.tif 000019
【００８６】
一般的手順：
ペプチド鎖の組み上げは、以下の方法で行う。樹脂を、ペプチド合成装置［ＣＳ９３６、CS BIO, Calif. Peputide Synthesizer］のＲＶに移し、ペプチド合成装置上で、鎖状ペプチドを、１．５〜４．０倍モル過剰のアミノ酸誘導体を用いてその上で組み上げる。樹脂上のＦｍｏｃ基を脱保護し、続いて、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｃ）を活性化することにより、第一のアミノ酸、Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｃ）を樹脂にカップリングする。Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｃ）（１．３ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（２．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５．０ｍｌ）に溶解し、氷浴中で１０℃未満に冷却した。ＤＩＣ（１．７４ｍｍｏｌ）を、単一アリコートとして、反応混合物に加えた。次いで、混合物を、反応容器中の湿潤樹脂に加える前に、６分間撹拌した。カップリング反応は、６０分間行われる。
【００８７】
次のアミノ酸、プロリンをカップリングするために、第一のアミノ酸、すなわちＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｃ）のα窒素を脱保護する。これに続いて、上記のように冷条件でＤＩＣ／ＨＯＢｔでＦｍｏｃ−Ｐｒｏを活性化し、次いで、この混合物を反応容器に移す。完全な鎖状ペプチド鎖が固体支持体上に組み上げられるまで、このプロセスを、全てのアミノ酸で繰り返す。Ｍｐｒが、その最後に組み上げられる。各々のカップリングは、４５〜９０分の時間の範囲で行われる。Ｍｐｒのカップリングを繰り返す。カップリング工程には、３０〜６０分間の無水酢酸でのキャッピングが続く。カップリングが完了した後、樹脂を、ＤＭＦ、Ｎ−メチルピロリドンまたはＤＣＭの範囲から選択しうる有機溶媒、好ましくはＤＭＦと引き続くＤＣＭで洗浄し、次いで、真空下に乾燥させる。式（２）の鎖状ペプチドが得られる。
【００８８】
ペプチドは、Ｆｍｏｃ化学を用いるｒｉｎｋアミド樹脂上での固相ペプチド合成技術により、ペプチドアミドとして合成された。
【００８９】
【表９】
2008503597.tif 000020
【００９０】
樹脂（１ｇ−ｒｉｎｋアミド、０．６５ｍｍｏｌ）をＰＳ３のＲＶに移し、ＤＭＦ中で膨潤させた。
【００９１】
活性化Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）の樹脂へのカップリングによるＦｍｏｃ Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。予め膨潤させた樹脂（０．６５ｍｍｏｌ）をＤＭＦで２回洗浄し、続いて、２０％ピペリジンで２回処理してＦｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＦで６回洗浄した。Ｆｍｏｃ Ｃｙｓ（Ａｃｍ）（１．３ｍｍｏｌ）およびＨＯＢｔ（２．６ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（５．０ｍｌ）中に溶解し、氷浴中で１０℃未満に冷却した。ＤＩＣ（１．７４ｍｍｏｌ）を、単一アリコートとして、反応混合物に加えた。次いで、混合物を、湿潤樹脂に加える前に、６分間撹拌した。カップリングを、６０分間、最適撹拌下に行った。樹脂を、再度、ＤＭＦで３回洗浄した。カップリングの後、遊離アミノ基を無水酢酸（２．５Ｍ）で４５分間キャッピングし、続いて、ＤＭＦで３回洗浄した。このＤＩＣ／ＨＯＢｔ法は、手動方式で、多工程法である。
【００９２】
合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【表１０】
2008503597.tif 000021
【００９３】
（ii）活性化Ｆｍｏｃ−ＰｒｏをＦｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【００９４】
【表１１】
2008503597.tif 000022
【００９５】
（iii）活性化Ｆｍｏｃ−ＴｒｐをＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＦｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【００９６】
【表１２】
2008503597.tif 000023
【００９７】
（iv）Ｆｍｏｃ−ＡｓｐをＦｍｏｃ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＦｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【００９８】
【表１３】
2008503597.tif 000024
【００９９】
（ｖ）Ｆｍｏｃ−ＧｌｙをＦｍｏｃ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【０１００】
【表１４】
2008503597.tif 000025
【０１０１】
（vi）Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）をＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【０１０２】
【表１５】
2008503597.tif 000026
【０１０３】
（vii）Ｍｐｒ（Ａｃｍ）をＦｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂にカップリングすることによるＭｐｒ（Ａｃｍ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（Ｏｂｕｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−樹脂の合成。反応を、工程１と同様に行った。合成サイクルは、以下のようにプログラムされた：
【０１０４】
【表１６】
2008503597.tif 000027
【０１０５】
合成において、Ｍｐｒ（Ａｃｍ）のカップリングは、カップリング反応を完結させるために、２回行う必要があった。
【０１０６】
実施例（３）：樹脂からのペプチドの切断によるペプチドアミド（Ａｃｍ）Ｍｐｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＣＯＮＨ2（式（３））の生成
組み上げられたペプチド樹脂（実施例１または２よりのもの）を、ＣＳ９３６中で、ＴＦＡ（９５％）：ＴＩＳ（２．５％）：Ｈ2Ｏ（２．５％）：ＥＤＴ（０％）：フェノール（０％）からなる切断用混合物５００ｍｌでＲ．Ｔ．にて２時間処理した。反応混合物を、ＲＶを通して濾過し、ＴＦＡをＲｏｔａｖａｐ上でエバポレートした。ペプチドの析出を、−２０℃で、一定の撹拌をしながら、冷ジイソプロピルエーテル３００ｍｌを加えることにより、行った。溶媒中の粗ペプチド析出物を、−２０℃で１０時間放置する。ワットマン濾紙５番を通して濾過して単離し、続いて、冷溶媒で洗浄（１００ｍｌｘ３）して、切断用混合物中で使用したスカベンジャーを除去した。粗ペプチド析出物を、Ｐ2Ｏ5で真空乾燥し、ＲＰ−ＨＰＬＣで特徴付けした（図１および図２）。
実施例１                            実施例２
収率：５８．７３                    収率：４８．７３
ペプチドの％純度：９０％            ペプチドの％純度：７９．６８％
【０１０７】
実施例（４）：粗ペプチドのグアニル化による（Ａｃｍ）Ｍｐｒ−Ｈｏｍｏａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＣＯＮＨ2（式（４））の生成
ペプチド（１ｇ、１．１５７ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１５ｍｌに溶解し、ｐＨをＴＥＡで９．０に調整した。ＤＭＦ（１５ｍｌ）中の反応剤、硝酸３，５−ジメチルピラゾール−１−カルボキサミジン（９３１．５ｍｇ）を、ペプチドに加えた。反応混合物を、１倍過剰量の反応剤、硝酸３，５−ジメチルピラゾール−１−カルボキサミジンを多数回で添加しながら、３０℃で４日間撹拌した。
アセトニトリル（ＴＥＡでｐＨを８．０に調整）２８０ｍｌを加えることにより、ペプチドを反応混合物から析出させた。混合物を、さらに−２０℃で１０時間保持した。それを、ワットマン５番濾紙を通して濾過し、アセトニトリル（ｐＨ８．０）で３回洗浄し、続いて、手を加えていないアセトニトリルでｐＨを中和した。析出物を、一晩、高真空下に乾燥した。収率：８５％。ペプチドを、ＲＰ−ＨＰＬＣで特徴付けした（図２）。
【０１０８】
実施例（５）：グアニル化ペプチドの脱ＡＣＭと引き続く酸化による、式（１）：
【化２２】
2008503597.tif 000028
の生成
【０１０９】
ＴＦＡ（１３４．９ｍｌ）およびアニソール（２．７ｍｌ）を混合し、氷中で冷却し、実施例３からの予め冷却したペプチド６５８ｍｇに加え、窒素で飽和させた。続いて、ＡｇＯＴｆ（３．４７ｇ）を添加し、氷浴中で２時間撹拌した。ＴＦＡを高真空下に除去し、ペプチドの銀塩を、ジイソプロピルエーテル（〜４００ｍｌ）を加えて析出させた。反応混合物をＧ−４焼結ロートを通して濾過し、析出物（銀−ペプチド）をジイソプロピルエーテル（６０ｍｌｘ３）中に再懸濁し、上記と同様に洗浄し、真空下にＰ2Ｏ5で乾燥させた。
銀ペプチドの酸化は、氷冷条件で、銀−ペプチド塩１０ｍｇを５０％ＤＭＳＯ／ＩＭ ＨＣｌ１５．６ｍｌ中に溶解することにより行った。反応混合物を２５℃で３時間撹拌した。析出物を、Ｇ−４焼結ロートまたはHyfloベッドを通して濾過して、塩化銀を除去した。濾液を、酸化の完結についてチェックした（図４）。反応が完結すると、式（１）の粗ペプチドが得られた。純度百分率：８５％。
【０１１０】
実施例（６）：Ｓ−Ｓペプチドの精製
式（１）の粗ジスルフィドで輪になったペプチドを、ｐｒｅｐＣ−１８カラム（５０ｘ２５０ｍｍ、１００Å）に入れた。ペプチドを、グラジエントプログラムでＴＦＡ（０．１％）水溶液とメタノールを用いることにより精製した（図５）。続いて、コントローラー、２個のＬＣ８Ａポンプ、ＵＶ−Ｖｉｓ検出器よりなる島津分取用ＨＰＬＣシステム上で、上記の溶媒系を用いて定組成運転を行った。式（１）の精製ペプチドアミドを分析用ＲＰ−ＨＰＬＣで分析した（図６）。質量は、質量分析機で決定した（図７）。
【０１１１】
実施例（７）：Ｓ−Ｓペプチドの精製
メタノールの代わりにアセトニトリルを用いたこと以外は、実施例５と同様にして、精製を行い、式（１）のペプチドアミドを得た。
【０１１２】
実施例（８）：酢酸水銀（II）を用いるグアニル化ペプチドの脱ＡＣＭ
システインのＡｃｍ基保護を酢酸水銀（II）での処理によりグアニル化ペプチドから除去した以外は、実施例（４）と同様。
ペプチド（１３．４ｍｇ、ローリー法で確認、Ｃｙｓ−Ａｃｍの）を酢酸（１０％）４００μｌ中に溶解した。１０倍過剰量の酢酸水銀（II）（８２．９６ｍｇ）をそれに加え、反応物を渦撹拌し、Ｒ．Ｔ．で５時間保持した。１００倍過剰量のβ−メルカプトエタノール（１８１．３７μｌ）を加え、溶液を渦撹拌し、一晩、室温で放置した。反応混合物を４分間遠心分離し、上清を採集した。析出物を、遠心により、４００μｌｘ３の１０％酢酸で抽出した。濾液をプールし、ＲＰ−ＨＰＬＣで決定した純度百分率は５５％であった（図３）。
【０１１３】
実施例（９）：ヨウ素を用いるグアニル化ペプチドの脱ＡＣＭ
システインのＡｃｍ基保護をヨウ素での処理によりグアニル化ペプチドから除去した以外は、実施例（４）と同様。
ペプチド（９．１８ｍｇ、ローリー法で確認、Ｃｙｓ−Ａｃｍの）を酢酸（８０％）１７．８ｍｌ中に溶解し、Ｎ2で１５分間パージした。Ｉ2の１ｍＭ溶液（８０％酢酸中、〜４ｍｌ）を１時間かけて、黄色が持続するまでペプチド溶液に加えた。混合物をさらに３０分間撹拌し、続いて、１Ｎ Ｎａ2Ｓ2Ｏ3で、黄色が消失するまで、中和し、凍結乾燥した。‘ＳＨ’の確認をエルマン（ellman）試験で行ったが、ＡＣＭの除去が達成されなかったとを示す、陰性であった。
【０１１４】
実施例（１０）：脱ＡＣＭペプチドの精製
酢酸水銀（II）処理ペプチド試料およびヨウ素処理ペプチド試料を、hyperprep（２５０ｘ１０ｍｍ、１２μ、Ｃ−１８カラム）を用いて、ＲＰ−ＨＰＬＣにより脱塩した。
【０１１５】
実施例（１１）：式（１）の生物活性を調べるための血小板凝集阻害アッセイ
式（１）のペプチドの生物活性を、４Ｘレーザー血小板凝集計（ＥＭＡ）を使用して、血小板凝集阻害アッセイを用いて調べた。承諾を得たヒトの提供者からの新鮮な静脈血を取り、クエン酸緩衝液に入れた。多血小板血漿（ＰＲＰ）および乏血小板血漿を遠心分離により分離した。ＰＲＰ中の血小板数は、２〜３ｘ１０8個／ｍｌに調整した。基準凝集量をＰＰＰで調整した後、ＰＲＰを１０〜２０ｍＭ ＡＤＰで処理し、総凝集百分率を調べた。次いで、ＰＲＰをまず、種々の濃度の参照標準および式（１）の合成ペプチドと共にインキュベートした。その後、ＡＤＰを加えて、凝集の阻害を調べた。式１の合成ペプチドの生物活性の再現性を、数回確認し、参照標準と比較した。表１は、多くの実験のうちの一つを示す（１２回の実験から）。合成ペプチド（ＳＰ）についてのＩＣ50投与量は、市販の参照標準に比べて、１４０ｎＭ未満であった。ＳＰでのＡＤＰ誘起血小板凝集の５０％より多い阻害が、大多数の試料において見られ、結果は、市販の参照標準に匹敵するものであった。
【０１１６】
【表１７】
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【図面の簡単な説明】
【０１１７】
【図１】樹脂からのＨＢＴＵ−粗ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロフィール（カラム：ＰＥＰ３００；Ｃ−１８；５μ；１５０Ｘ３ｍｍ；流速：０．５ｍｌ／分；注入量：２０μｌ；溶媒系：Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｂ：１００％アセトニトリル）。
【図２】樹脂からのＤＩＣ−粗ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロフィール（カラム：ＰＥＰ３００；Ｃ−１８；５μ；１５０Ｘ３ｍｍ；流速：０．５ｍｌ／分；注入量：２０μｌ；溶媒系：Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｂ：１００％アセトニトリル）。
【図３】粗グアニル化ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロフィール（カラム：ＰＥＰ３００；Ｃ−１８；５μ；１５０Ｘ３ｍｍ；流速：０．５ｍｌ／分；注入量：２０μｌ；溶媒系：Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｂ：１００％アセトニトリル）。
【図４】ＳＨペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロフィール（カラム：ＰＥＰ３００；Ｃ−１８；５μ；１５０Ｘ３ｍｍ；流速：０．５ｍｌ／分；注入量：２０μｌ；溶媒系：Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｂ：１００％アセトニトリル）。ピークＡ−粗ＳＨペプチド。
【図５】粗環状ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロフィール（カラム：ＰＥＰ３００；Ｃ−１８；５μ；１５０Ｘ３ｍｍ；流速：０．５ｍｌ／分；注入量：２０μｌ；溶媒系：Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｂ：１００％アセトニトリル）。ピークＡ−粗環状ペプチド。
【図６】粗環状ペプチドの分取用ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロフィール（カラム：Phenomenex Luna；Ｃ−１８（２）；１０μ；２５０Ｘ５０ｍｍ；流速：５０ｍｌ／分；溶媒系：Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｂ：１００％メタノール）。
【図７】精製した環状ペプチドの分析用ＲＰ−ＨＰＬＣ溶出プロフィール（カラム：ＰＥＰ３００；Ｃ−１８；５μ；１５０Ｘ３ｍｍ；流速：０．５ｍｌ／分；溶媒系：Ａ：０．１％ＴＦＡ、Ｂ：１００％アセトニトリル）。ピークＡ−純粋ペプチド。
【図８】質量が８３２であり、不純物が９０３であることを示す純粋ペプチドのＭＳ分析。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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