(57)【要約】患者サンプル中の卵巣癌を同定するための方法および組成物が提供される。本発明の方法は、身体サンプル中での少なくとも１つのバイオマーカーの過剰発現を検出する工程を包含し、ここでバイオマーカーは卵巣癌において選択的に過剰発現される。好ましい実施形態において、身体サンプルは血清サンプルである。本発明のバイオマーカーは、卵巣癌において選択的に過剰発現される任意の遺伝子またはタンパク質を含む。本発明のある態様において、目的のバイオマーカーの過剰発現が、バイオマーカー特異的抗体を使用してタンパク質レベルにて、または核酸ハイブリダイゼーション技法を使用して核酸レベルにて検出される。本発明の方法を実施するためのキットも提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者の卵巣癌を診断する方法であって、該方法は、身体サンプル中で少なくとも１つのバイオマーカーの過剰発現を検出する工程を包含し、ここで、該バイオマーカーの過剰発現の該検出は、卵巣癌を示すサンプルを特異的に同定し、該バイオマーカーは、急性期反応物質、リポタンパク質、補体系の調節に関与するタンパク質、アポトーシスのレギュレータ、ヘモグロビン、ヘム、または鉄に結合するタンパク質、細胞構造タンパク質、代謝性副生成物を解毒する酵素、成長因子、およびホルモントランスポータから成る群より選択される、方法。
【請求項２】
前記バイオマーカーがα−１−アンチトリプシン、ＡＭＢＰ、カルグラヌリンＢ、カルボニックアンドラーゼ、クラステリン、コフィリン（非筋肉アイソフォーム）、フィコリン２、フィコリン３、ゲルソリン、ハプトグロビン、ハプトグロビン関連バイオマーカー、ヘモペキシン、インター−α−トリプシンインヒビター、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ、血漿グルタチオンペルオキシダーゼ、血小板塩基性タンパク質、セロトランスフェリン、血清アミロイドＡ４タンパク質、テトラネクチン、トランスサイレチン、ビトロネクチン、および亜鉛−α−２−糖タンパク質から成る群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
患者の卵巣癌を診断する方法であって、該方法が身体サンプル中で少なくとも２つのバイオマーカーの過剰発現を検出する工程を包含し、該バイオマーカーの過剰発現の該検出が卵巣癌を示すサンプルを特異的に同定する、方法。
【請求項４】
前記バイオマーカーの過剰発現の前記検出が卵巣癌を示すサンプルを、良性増殖を示すサンプルから識別する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記方法が初期段階の卵巣癌の検出を可能にする、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記バイオマーカーが初期段階の卵巣癌で選択的に過剰発現される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記バイオマーカーが急性期反応物質、リポタンパク質、補体系の調節に関与するタンパク質、アポトーシスのレギュレータ、ヘモグロビン、ヘム、または鉄に結合するタンパク質、細胞構造タンパク質、代謝性副生成物を解毒する酵素、成長因子、およびホルモントランスポータから成る群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記バイオマーカーがα−１−アンチトリプシン、ＡＭＢＰ、カルグラヌリンＢ、カルボニックアンドラーゼ、クラステリン、コフィリン（非筋肉アイソフォーム）、フィコリン２、フィコリン３、ゲルソリン、ハプトグロビン、ハプトグロビン関連バイオマーカー、ヘモペキシン、インター−α−トリプシンインヒビター、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ、血漿グルタチオンペルオキシダーゼ、血小板塩基性タンパク質、セロトランスフェリン、血清アミロイドＡ４タンパク質、テトラネクチン、トランスサイレチン、ビトロネクチン、および亜鉛−α−２−糖タンパク質から成る群より選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記サンプルが血清サンプルである、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記バイオマーカーの過剰発現の前記検出がバイオマーカータンパク質発現を検出する抗体を使用する工程を包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記バイオマーカーの過剰発現の前記検出が核酸ハイブリダイゼーションを包含する、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
患者の卵巣癌を診断する方法であって、該方法は、以下：
ａ）身体サンプルを該患者から入手する工程と；
ｂ）該サンプルを少なくとも１つの抗体と接触させる工程であって、ここで、該抗体は、卵巣癌で選択的に過剰発現されるバイオマーカータンパク質に特異的に結合し、該バイオマーカーは、急性期反応物質、リポタンパク質、補体系の調節に関与するタンパク質、アポトーシスのレギュレータ、ヘモグロビン、ヘム、または鉄に結合するタンパク質、細胞構造タンパク質、代謝性副生成物を解毒する酵素、成長因子、およびホルモントランスポータから成る群より選択される、工程と；
ｃ）該抗体の該バイオマーカータンパク質への結合を検出する工程と；
を包含する方法。
【請求項１３】
前記バイオマーカーがα−１−アンチトリプシン、ＡＭＢＰ、カルグラヌリンＢ、カルボニックアンドラーゼ、クラステリン、コフィリン（非筋肉アイソフォーム）、フィコリン２、フィコリン３、ゲルソリン、ハプトグロビン、ハプトグロビン関連バイオマーカー、ヘモペキシン、インター−α−トリプシンインヒビター、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ、血漿グルタチオンペルオキシダーゼ、血小板塩基性タンパク質、セロトランスフェリン、血清アミロイドＡ４タンパク質、テトラネクチン、トランスサイレチン、ビトロネクチン、および亜鉛−α−２−糖タンパク質から成る群より選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
患者の卵巣癌を診断する方法であって、該方法は、以下：
ａ）身体サンプルを該患者から入手する工程と；
ｂ）該サンプルを少なくとも２つの抗体と接触させる工程であって、該抗体のそれぞれが卵巣癌で選択的に過剰発現される別個のバイオマーカータンパク質に特異的に結合する、工程と；
ｃ）該抗体の該バイオマーカータンパク質への結合を検出する工程と；
を包含する方法。
【請求項１６】
前記バイオマーカーが急性期反応物質、リポタンパク質、補体系の調節に関与するタンパク質、アポトーシスのレギュレータ、ヘモグロビン、ヘム、または鉄に結合するタンパク質、細胞構造タンパク質、代謝性副生成物を解毒する酵素、成長因子、およびホルモントランスポータから成る群より選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記バイオマーカーがα−１−アンチトリプシン、ＡＭＢＰ、カルグラヌリンＢ、カルボニックアンドラーゼ、クラステリン、コフィリン（非筋肉アイソフォーム）、フィコリン２、フィコリン３、ゲルソリン、ハプトグロビン、ハプトグロビン関連バイオマーカー、ヘモペキシン、インター−α−トリプシンインヒビター、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ、血漿グルタチオンペルオキシダーゼ、血小板塩基性タンパク質、セロトランスフェリン、血清アミロイドＡ４タンパク質、テトラネクチン、トランスサイレチン、ビトロネクチン、および亜鉛−α−２−糖タンパク質から成る群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記抗体が前記サンプルに、個別の抗体試薬として連続して、または抗体カクテルとして同時に接触させられる、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記サンプルを少なくとも２つの抗体に接触させる工程が、第１の捕獲抗体および第２の標識化検出抗体を使用する工程を包含し、該捕獲抗体および該検出抗体のそれぞれが卵巣癌で選択的に過剰発現されるバイオマーカータンパク質の別個の抗原部位に特異的に結合し、該捕獲抗体が固体支持体に固定化される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも１つの抗体を含むキットであって、ここで、該抗体は、卵巣癌で選択的に過剰発現されるバイオマーカータンパク質に特異的に結合し、該バイオマーカーは、急性期反応物質、リポタンパク質、補体系の調節に関与するタンパク質、アポトーシスのレギュレータ、ヘモグロビン、ヘム、または鉄に結合するタンパク質、細胞構造タンパク質、代謝性副生成物を解毒する酵素、成長因子、およびホルモントランスポータから成る群より選択される、キット。
【請求項２１】
前記バイオマーカーがα−１−アンチトリプシン、ＡＭＢＰ、カルグラヌリンＢ、カルボニックアンドラーゼ、クラステリン、コフィリン（非筋肉アイソフォーム）、フィコリン２、フィコリン３、ゲルソリン、ハプトグロビン、ハプトグロビン関連バイオマーカー、ヘモペキシン、インター−α−トリプシンインヒビター、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ、血漿グルタチオンペルオキシダーゼ、血小板塩基性タンパク質、セロトランスフェリン、血清アミロイドＡ４タンパク質、テトラネクチン、トランスサイレチン、ビトロネクチン、および亜鉛−α−２−糖タンパク質から成る群より選択される、請求項２０に記載のキット。
【請求項２２】
少なくとも２つの抗体を含むキットであって、該抗体のそれぞれが卵巣癌で選択的に過剰発現される別個のバイオマーカータンパク質に特異的に結合する、キット。
【請求項２３】
第１の捕獲抗体および第２の標識化検出抗体を含むキットであって、該捕獲抗体および該検出抗体のそれぞれが卵巣癌で選択的に過剰発現されるバイオマーカータンパク質の別個の抗原部位に特異的に結合する、請求項２２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、卵巣癌の検出のための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
卵巣癌は、世界中の人口の著しい罹患率および死亡率の原因となっている。米国癌協会のデータによると、米国だけで１年間に推定で２３，４００件の卵巣癌の新規症例がある。加えて、年間１３，９００件の卵巣癌関連死があり、米国の女性の主要な癌死因の５位となっている。卵巣癌を発症する女性の８０％〜９０％が該疾患の家族歴を持たないため、研究の取り組みは、該疾患の初期段階の間に卵巣癌を検出するスクリーニングおよび診断プロトコルを開発することに集中している。しかしながら、今日までに開発されたスクリーニング試験は、卵巣癌死亡率の低下を示していない。
【０００３】
癌の分類は、適切な処置を決定し、予後の決定を補助する。卵巣癌は、認識されたグレードおよびステージシステムを使用して、組織学（すなわち「グレーディング」）および該疾患の程度（すなわち「ステージング」）に従って分類される。グレードＩでは、腫瘍組織は十分に分化している。グレードＩＩでは、腫瘍組織は中程度に十分に分化している。グレードＩＩＩでは、腫瘍組織は不十分に分化している。グレードＩＩＩは、グレードＩまたはＩＩのどちらかよりも、あまり好ましくない予後と相関している。ステージＩは一般に、嚢に囲まれた一方（ステージＩＡ）または両方（ステージＩＢ）の卵巣内に限定されるが、一部のステージＩ（すなわちステージＩＣ）癌では、悪性細胞は腹水中、腹膜すすぎ液中、または卵巣表面上に検出され得る。ステージＩＩは、一方または両方の卵巣から他の骨盤構造への腫瘍の拡張または転移を含む。ステージＩＩＡでは、腫瘍は子宮、輸卵管、またはその両方に拡張または転移している。ステージＩＩＢは、腫瘍の骨盤への転移を含む。ステージＩＩＣは、悪性細胞が腹水中、腹膜すすぎ液中、または卵巣表面上に検出され得る追加の要件を伴うステージＩＩＡまたはＩＩＢである。ステージＩＩＩでは、腫瘍は小腸または網への少なくとも１つの悪性の拡張を含み、微視的（ステージＩＩＩＡ）または巨視的（＜直径２センチメートル、ステージＩＩＩＢ；＞直径２センチメートル、ステージＩＩＩＣ）サイズの骨盤外腹膜インプラントを形成したか、あるいは腹膜後または鼠径部リンパ節へ転移している（ステージＩＩＩＣの代替インジケータ）。ステージＩＶでは、腫瘍の遠隔（すなわち非腹膜）転移が検出され得る。
【０００４】
卵巣癌の各種のステージの正確な期間は未知であるが、それぞれ少なくとも約１年であると考えられる（非特許文献１）。予後は、上昇するステージ等級と共に低下する。たとえばステージＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶの卵巣癌と診断された患者の５年生存率はそれぞれ、８０％〜９５％、５７％、２５％、および８％である。現在、卵巣癌の約６０％超が、予後が最悪であるステージＩＩＩまたはステージＩＶにて診断される。
【０００５】
卵巣癌の高い死亡率は、卵巣癌の初期ステージの患者間に特定の症状が欠如していることに起因しており、それにより早期診断が困難になっている。卵巣癌に罹患した患者はたいてい、異常膣出血、胃腸症状、尿路症状、下腹痛、および汎発性腹部膨満などの不特定の愁訴を示す。このような患者は、腫瘍随伴症の症状または卵巣癌を明確に示す症状を示すことはまれである。早期警告徴候が存在しないために、卵巣癌に罹患した患者のうちステージＩ癌またはステージＩＩ癌を示す患者は、約４０％未満である。処置が一般にはるかに有効であるより初期のステージにおいて疾患を検出できれば、卵巣癌の管理は著しく向上するであろう。
【０００６】
卵巣癌は、一部は、患者から日常的な病歴を収集することによって、そして健康診断、Ｘ線検査、ならびに化学検査および血液検査を実施することによって診断できる。卵巣癌を示しうる血液検査は、ＣＡ１２５タンパク質およびＤＦ３タンパク質の血清レベルの分析ならびにリゾホスファチジン酸（ＬＰＡ）の血漿レベルの分析を含む。卵巣の触診および超音波技法（特に経膣超音波およびカラードップラー血流超音波技法が挙げられる）は、卵巣腫瘍の検出および良性卵巣嚢胞からの卵巣癌の識別を補助できる。しかしながら卵巣癌の確定診断は通例、試験開腹の実施を必要とする。
【０００７】
卵巣癌の診断マーカーとしての血清ＣＡ１２５レベルのこれまでの使用は、この方法が一般スクリーニング法として使用するための特異性を不十分にしか呈さないことを示した。患者から得た連続した遡及的サンプルにおいてＣＡ１２５レベルを解釈するための改良アルゴリズムの使用は、卵巣癌の検出を初期段階に移動させることなく、該方法の特異性を改善した（非特許文献２）。卵巣癌を含む婦人科癌を検出するためのＬＰＡのスクリーニングは、約９６％の感受性および約８９％の特異性を示した。しかしながらＣＡ１２５ベースのスクリーニング方法およびＬＰＡベースのスクリーニング方法は、卵巣癌以外の状態に罹患した患者の血清中のＣＡ１２５およびＬＰＡそれぞれの存在によって妨害される。たとえば血清ＣＡ１２５レベルは、月経、妊娠、胃腸および肝臓状態（たとえば結腸炎および肝硬変）、心膜炎、腎疾患、および各種の非卵巣悪性腫瘍と関連することが公知である。血清ＬＰＡはたとえば、非卵巣婦人科悪性腫瘍の存在によって影響を受けることが公知である。ＣＡ１２５およびＬＰＡに関する現在のスクリーニング方法よりも、卵巣癌に対して高い特異性を有するスクリーニング方法は、初期段階の卵巣癌についての集団規模のスクリーニングを提供できる。
【０００８】
卵巣癌のための信頼性の高いスクリーニング方法としての経膣超音波検査の効果のなさも、臨床試験で証明されている。たとえば１４，４６９名の無症候女性での超音波スクリーニングの有効性を評価する試験において、検出された侵襲性癌の各症例で、平均５２００回の超音波を行った（非特許文献３）。別の試験において、Ｌｉｅｄｅらは経膣超音波法およびＣＡ１２５の両方を利用して、卵巣癌についてハイリスクの女性をスクリーニングした（非特許文献４）。Ｌｉｅｄｅらは、複合スクリーニング法が卵巣癌による罹患率または死亡率を低下させるのに有効でないと結論付けた。結果として、米国予防医療専門委員会は、定期検査から卵巣癌の慣用的スクリーニングを除外することを勧告した（非特許文献５）。
【０００９】
さらに最近では、腫瘍ｍＲＮＡを正常組織ｍＲＮＡと比較して、癌組織中のアップレギュレートされた遺伝子（すなわち卵巣癌マーカー）を、ｃＤＮＡマイクロアレイを使用して同定した。プロスタシン、オステオポンチン、ＨＥ４および各種の他のマーカーは、この技法によって同定されている。しかしながらｃＤＮＡマイクロアレイ手法の限界は、腫瘍の転写活性がタンパク質レベルまたは組織中のタンパク質の活性を必ずしも正確に反映しないことである。たとえば肺癌腫瘍中の遺伝子のごくわずかなパーセンテージのみしか、ｍＲＮＡおよびその対応するタンパク質のレベル間の統計的に有意な相関を示さなかった（非特許文献６）。加えて、ＲＮＡレベルの変化において反映されていないタンパク質において、多数の翻訳後改変が生じうる。
【非特許文献１】Ｒｉｃｈａｒｔら，Ａｍ．Ｊ．Ｏｂｓｔｅｔ．Ｇｙｎｅｃｏｌ．，１９６９年，第１０５巻，ｐ．３８６
【非特許文献２】Ｓｋａｋｅｓ，Ｃａｎｃｅｒ，１９９５年，第７６巻，ｐ．２００４
【非特許文献３】Ｖａｎ  Ｎａｇｅｌｌ，ら，Ｇｙｎｅｃｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．，２０００年，第７７巻，ｐ．３５０−３５６
【非特許文献４】Ｌｉｅｄｅら，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．，２００２年，第２０巻，ｐ．１５７０−１５７７
【非特許文献５】Ｇｏｆｆ，ら，ＪＡＭＡ，２００４年，第２２巻，ｐ．２７１０
【非特許文献６】Ｃｈｅｎ，ら，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，２００２年，第８巻，ｐ．２２９０−２３０５
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
卵巣癌を検出する公知の方法の費用ならびに制限された感受性および特異性のために、集団規模スクリーニングは現在実施されていない。加えて、卵巣癌の徴候が陽性としてスクリーニングされる患者の卵巣癌を診断するための開腹術を実施する必要性は、集団規模スクリーニングの望ましさを制限している。それゆえ遺伝子の発現をベースとしたより感受性および特異性を有するスクリーニングならびに診断方法またはタンパク質卵巣癌マーカーの開発への切実な要求が存在する。
【００１１】
要約すると、卵巣癌がより早期に検出されれば、生存率および患者の生活の質は改善する。それゆえ卵巣癌、特に初期段階の卵巣癌を検出する感受性および特異性を有する方法への火急の要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の要旨）
卵巣癌を診断するための組成物および方法が提供される。本発明の方法は、身体サンプル中での少なくとも１つのバイオマーカーの過剰発現を検出する工程を包含し、ここで、このバイオマーカーの過剰発現の検出は、卵巣癌を示すサンプルを特異的に同定する。本方法は、卵巣癌を示すサンプルを、良性増殖を示すサンプルから区別する。それゆえ本方法は、卵巣癌状態で選択的に過剰発現されるが、正常細胞や臨床疾患を示さない細胞では過剰発現されないバイオマーカーの検出に基づく。詳細な実施形態において、本発明の方法は、初期段階の卵巣癌の診断を促進できる。
【００１３】
本発明のバイオマーカーは、卵巣癌で選択的に過剰発現されるタンパク質および／または遺伝子である。特に興味深いのは、初期段階の卵巣癌で過剰発現されるバイオマーカーである。バイオマーカーはたとえば、急性期反応物質（たとえばプロテアーゼインヒビターおよび炎症性タンパク質）、リポタンパク質、補体系の調節に関与するタンパク質、アポトーシスのレギュレータ、ヘモグロビン、ヘム、または鉄に結合するタンパク質、細胞構造タンパク質、代謝性副生成物を解毒する酵素、成長因子、およびホルモントランスポータを含む。本発明のバイオマーカー遺伝子またはタンパク質の過剰発現の検出は、正常細胞または臨床疾患を示さない細胞（たとえば良性増殖）からの卵巣疾患を示すサンプルの識別を可能にする。
【００１４】
バイオマーカー過剰発現は、タンパク質または核酸レベルにおいて評価できる。ある実施形態において、患者血清サンプル中のバイオマーカータンパク質の過剰発現を検出するために抗体を利用する免疫化学技法が提供される。本発明のこの態様において、目的の特異的バイオマーカーに向けられた少なくとも１つの抗体が使用される。過剰発現は、たとえばハイブリダイゼーションを含む核酸ベース技法によって検出することもできる。本発明の方法を実施するための試薬を含むキットがさらに提供される。
【００１５】
本発明の方法は、従来の婦人科診断技法および血液診断技法、たとえば経膣超音波スクリーニングおよびＣＡ１２５血清レベルの分析と組合せて使用することもできる。それゆえたとえば、本明細書で示す免疫化学方法は、従来方法からのすべての情報が保存されるように、ＣＡ１２５分析および経膣超音波試験と組合せることができる。この方法では、卵巣癌で選択的に過剰発現されるバイオマーカーの検出が、他のスクリーニング方法で見られる高い「偽陽性」および「偽陰性」率を低下させることができ、大量自動化スクリーニングを促進できる。
【００１６】
（発明の詳細な説明）
本発明は、卵巣癌、特に初期段階の卵巣癌を同定または診断するための組成物および方法を提供する。該方法は、卵巣癌で選択的に過剰発現される特異的バイオマーカーの過剰発現の検出を包含する。すなわち本発明のバイオマーカーは、正常サンプルおよび臨床疾患（たとえば良性増殖）を特徴としないサンプルから、卵巣癌を示すサンプルを識別できる。卵巣癌を診断する方法は、患者からの身体サンプル、特に血清サンプルにおいて卵巣癌を示す少なくとも１つのバイオマーカーの過剰発現を検出する工程とを含む。本発明のある態様において、方法は、初期段階の卵巣癌の検出を可能にする。詳細な実施形態において、抗体および免疫化学技法は、目的のバイオマーカーの発現を検出するために使用される。本発明の方法を実施するキットがさらに提供される。
【００１７】
「卵巣癌を診断すること」は、たとえば卵巣癌の存在を診断するかまたは検出すること、疾患の進行をモニタリングすること、卵巣癌を示す細胞またはサンプルを同定または検出することを包含するものとする。卵巣癌を診断する、検出する、および同定するという用語は、本明細書では互換的に使用される。「卵巣癌」とは、試験後開腹によって、前癌病態，悪性病態、および癌（ＦＩＧＯステージＩ〜ＩＶ）として分類された状態を指す。「初期段階の卵巣癌」は、ステージＩ癌種またはステージＩＩ癌種として分類された疾患状態を指す。卵巣癌の早期検出は、５年生存率を著しく向上させる。
【００１８】
上述のように、従来の診断方法によって誤診されたかなりのパーセンテージの患者が実際に卵巣癌を有する。それゆえ本発明の方法は、このような「偽陽性」および「偽陰性」症例を含めて、すべての患者集団における卵巣癌の正確な診断を可能にして、卵巣癌の早期検出を促進する。疾患の初期段階での卵巣癌の検出は、患者の予後および生活の質を改善する。診断は、ＣＡ１２５および経膣超音波状態とは独立して行うことができるが、本発明の方法はこのような従来の診断スクリーニング技法と併せて使用することもできる。
【００１９】
本明細書で開示する方法は、ＣＡ１２５分析または経膣超音波スクリーニングと比較して卵巣癌の優れた検出を提供して、初期段階の卵巣癌の検出を可能にし得る。本発明の詳細な態様において、本方法の感受性および特異性は、ＣＡ１２５スクリーニングまたは経膣超音波スクリーニングと等しいか、より高い。本明細書で使用されるように、「特異性」は、本発明の方法が試験開腹によって非悪性（すなわち真陰性）として確認されたサンプルを正確に同定できるレベルを指す。すなわち特異性は、試験陰性である疾患陰性の割合である。臨床試験において、特異性は、真陰性の数を真陰性および偽陽性の和で割ることによって計算される。「感受性」は、本発明の方法が卵巣癌について陽性であると開腹確認された（すなわち真陽性）であるサンプルを正確に同定できるレベルを指す。それゆえ感受性は、試験陽性である疾患陽性の割合である。感受性は、臨床試験において、真陽性の数を真陽性および偽陰性の和で割ることによって計算される。開示した方法の卵巣癌検出に関する感受性は、少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またそれ以上である。さらに本方法の特異性は好ましくは、少なくとも約７０％、さらに好ましくは少なくとも約８０％、最も好ましくは少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である。
【００２０】
本発明のバイオマーカーは、遺伝子およびンパク質を含む。そのようなバイオマーカーは、バイオマーカーをコードする核酸配列の全体配列または部分配列を含むＤＮＡ、あるいはそのような配列の補体を含む。バイオマーカー核酸はまた、目的の核酸配列のいずれかの全体または部分配列を含むＲＮＡを含む。バイオマーカータンパク質は、本発明のＤＮＡバイオマーカーにコードされる、または本発明のＤＮＡバイオマーカーに対応するタンパク質である。バイオマーカータンパク質は、バイオマーカータンパク質またはポリペプチドのいずれかの全体アミノ酸配列または部分アミノ酸配列を含む。
【００２１】
「バイオマーカー」は、組織または細胞での発現レベルが、正常または健常である細胞または組織での発現レベルと比較して変化している、任意の遺伝子またはタンパク質である。本発明のバイオマーカーは、卵巣癌に関して選択的である。「卵巣癌で選択的に過剰発現された」とは、目的のバイオマーカーが卵巣癌で過剰発現されるが、非悪性、良性、および臨床疾患と見なされない他の状態として分類された状態で過剰発現されないことを指す。それゆえ本発明のバイオマーカーの検出は、正常サンプルならびに非悪性増殖および良性増殖を示すサンプルからの卵巣癌を示すサンプルの区別を可能にする。この方法では、本発明の方法は、従来の診断方法、たとえば経膣超音波スクリーニングにより誤って正常、非悪性、または良性として分類された（すなわち「偽陰性」）症例においてすら、卵巣癌の正確な同定を可能にする。
【００２２】
本発明のバイオマーカーは、本明細書の上で定義したような、卵巣癌で選択的に過剰発現される任意の遺伝子またはタンパク質を含む。そのようなバイオマーカーは、前癌、悪性、または明らかに癌性の卵巣疾患と関連する患者サンプル内で遺伝子またはタンパク質を同定できる。卵巣癌を示すどのバイオマーカーも本発明で使用できるが、好ましい実施形態では、バイオマーカーは急性期反応物質（たとえばプロテアーゼインヒビターおよび炎症性タンパク質）、リポタンパク質、補体系の調節に関与するタンパク質、アポトーシスのレギュレータ、ヘモグロビン、ヘム、または鉄に結合するタンパク質、細胞構造タンパク質、代謝性副生成物を解毒する酵素、成長因子、およびホルモントランスポータから成る群より選択される。さらに詳細な実施形態では、バイオマーカーはα−１−アンチトリプシン、ＡＭＢＰ、カルグラヌリンＢ、カルボニックアンドラーゼ（ｃａｒｂｏｎｉｃ  ａｎｙｄｒａｓｅ）、クラステリン、コフィリン（非筋肉アイソフォーム）、フィコリン２、フィコリン３、ゲルソリン、ハプトグロビン、ハプトグロビン関連バイオマーカー、ヘモペキシン、インター−α−トリプシンインヒビター、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ、血漿グルタチオンペルオキシダーゼ、血小板塩基性タンパク質、セロトランスフェリン、血清アミロイドＡ４タンパク質、テトラネクチン、トランスサイレチン、ビトロネクチンおよび亜鉛−α−２−糖タンパク質から成る群より選択される。
【００２３】
特に興味深いのは、初期段階の卵巣癌で選択的に過剰発現されるバイオマーカーである。「初期段階の卵巣癌で選択的に過剰発現される」とは、目的のバイオマーカーがステージＩまたはステージＩＩの卵巣癌状態で過剰発現されるが、正常サンプルまたは非悪性、良性、および臨床疾患と見なされない他の状態として分類される状態で過剰発現されないことを指す。当業者は、ステージＩまたはステージＩＩの卵巣癌でのみ過剰発現されるバイオマーカーと同様に、初期段階の卵巣癌バイオマーカーが、ステージＩまたはステージＩＩで最初に過剰発現され、その過剰発現が疾患の進行ステージを通して持続する卵巣癌を示す遺伝子およびタンパク質を含むことを認識するであろう。初期段階の卵巣癌で選択的に過剰発現されるバイオマーカーの検出は、卵巣癌の早期検出および診断を可能にして、したがって患者予後を改善する。
【００２４】
急性期反応物質タンパク質は、目的のバイオマーカーであり、たとえばプロテアーゼインヒビターおよび炎症性タンパク質を含む。アルファ−１−アンチトリプシンは、プロテアーゼインヒビター、特にセリンプロテアーゼインヒビターである。この酵素の欠乏は、気腫および肝疾患と関連している。アルファ−１−アンチトリプシンはエラスターゼの強力なインヒビターであり、また、プラスミンおよびトロンビンに対する中程度の親和性をも有する。該タンパク質は、第１４染色体の遠位長アームに位置する遺伝子（ＰＩ）によってコードされる。
【００２５】
ＡＭＢＰ、すなわちアルファ−１−ミクログロブリン／ビクニン前駆物質は、急性期反応物質であり、血漿、尿、および脳脊髄液を含む多くの生理的流体に見出される。ＡＭＢＰは、遊離モノマーとして、そしてまたＩｇＡおよびアルブミンと複合されて存在する。
【００２６】
インター−アルファトリプシンインヒビター４（血漿カリクレイン感受性糖タンパク質）もまた、急性期反応物質であると思われる。このタンパク質は、Ｋｕｎｉｔｚ型プロテアーゼインヒビターのファミリーに属する。このタンパク質ファミリーの他のメンバー（たとえばＨ１、Ｈ２およびＨ３）とは異なり、インター−アルファトリプシンインヒビター４には、ビクニン鎖が欠如している。
【００２７】
カルグラヌリンＢは、炎症性サイトカインと関連しており、浸潤単球および顆粒球で発現される。カルグラヌリンＢは、Ｓ１００タンパク質ファミリーのメンバーである。Ｓ１００遺伝子は、２ＥＦ−ハンドカルシウム結合モチーフを含有し、少なくとも１３のファミリーメンバーは同定されており、クラスターとして染色体ｌｑ２１に配置される。カルグラヌリンＢは、カゼインキナーゼの阻害において機能することが多く、このタンパク質の発現の変化は、嚢胞性線維症で見出されている。
【００２８】
詳細な実施形態において、本発明のバイオマーカーは、タンパク質の脂質分解、交換、または輸送に関与するタンパク質を含む。アポリポタンパク質Ｌ１は、アポリポタンパク質Ａ−Ｉに結合する分泌高密度リポタンパク質である。このアポリポタンパク質Ｌファミリーメンバーは、脂質交換で役割を果たし得、末梢細胞から肝臓までの逆コレステロール輸送と同様に、全身を通って輸送する。この遺伝子の２つの異なるアイソフォームをコードする少なくとも３つの転写改変体が同定されている。
【００２９】
亜鉛−アルファ−２−糖タンパク質は、脂肪細胞における脂質分解を刺激して、一部の進行癌に関連する大規模な脂肪損失を引き起こす。該タンパク質は、多不飽和脂肪酸をも結合できる。
【００３０】
血清アミロイドＡタンパク質および血清アミロイドＡ−４タンパク質は、主要な急性期反応物質およびＨＤＬ複合体のアポリポタンパク質である。どちらのタンパク質も肝臓によって発現され、血漿中で分泌される。補体系またはアポトーシス経路を調節するタンパク質もまた、興味深い。補体成分Ｃ３は、補体系の活性化で中心的な役割を果たす。Ｃ３の活性化は、古典的補体活性化経路および代替補体活性化経路の両方に必要である。Ｃ３欠乏を示す患者は、細菌感染に対する敏感性の上昇を示す。補体因子Ｈ関連タンパク質２は、補体系の調節にも関与できる。補体因子Ｈ関連タンパク質２は、リポタンパク質と関連でき、脂質代謝で役割を果たし得る。
【００３１】
タンパク質のフィコリンファミリーは、レクチン経路を通じて補体系を活性化する。タンパク質のフィコリンファミリーは、リーダーペプチド（すなわち短Ｎ末端セグメント）の存在を、次にコラーゲン様領域およびＣ末端フィブリノゲン様ドメインを特徴とする。フィコリンタンパク質のコラーゲン様ドメインおよびフィブリノゲン様ドメインは、また、他のタンパク質、たとえば補体タンパク質Ｃ１ｑ、テネイシン、およびコレクチンとして公知のＣ型レクチンにおいて見出される。ヒト血清において、２種類のフィコリンがある。ＦＣＮ２によってコードされるフィコリン２は、肝臓で主に発現され、炭水化物結合およびオプソニン活性を有することが示されている。フィコリン２の異なるアイソフォームの選択的スプライシングおよびコーディングによって発生する、ＦＣＮ２の４つの転写改変体が説明されている。スプライス改変体ＳＶ０が最も支配的である。肝臓におけるＦＣＮ２遺伝子転写は、３１３アミノ酸のタンパク質をコードして、最長フィコリン２アイソフォームを表す。フィコリン３は熱不安定性ベータ−２−マクロ糖タンパク質であり、フィコリン／オプソニンｐ３５レクチンファミリーのメンバーである。全身性エリテマトーデスの患者による血清とのその反応性に基づいて最初に同定された該タンパク質は、カルシウムから独立したレクチン活性を有することが示されている。該タンパク質は、ＭＡＳＰおよびｓＭＡＰと関連する補体経路を活性化でき、それによりレクチン経路の活性化を通じて宿主防御を補助する。選択的スプライシングはこの座位で起こり、それぞれ別個のアイソフォームをコードする２つの改変体が同定された。
【００３２】
クラステリンの機能はなお明らかでないが、しかしながらプログラムされた細胞死（アポトーシス）と関連している。クラステリンは各種の組織において発現され、細胞、膜、および疎水性タンパク質に結合できる。
【００３３】
ヘム、ヘモグロビン、または鉄に結合するバイオマーカータンパク質も興味深い。ハプトグロビンは肝臓で発現され、遊離血漿ヘモグロビンと結合する。ハプトグロビンは腎臓を通じて鉄の損失を防止して、ヘモグロビンによる損傷から腎臓を保護しながら、ヘモグロビンを分解酵素に接近できるようにもする。ハプトグロビン関連タンパク質前駆物質も初期段階の卵巣癌で選択的に過剰発現される。
【００３４】
ヘモペキシンは、分解および鉄回収のためにヘムを肝臓に輸送するヘム結合タンパク質であり、その後に遊離ヘモペキシンは循環中に戻される。ヘモペキシンは、肝臓によって発現され、血漿に分泌される。
【００３５】
セロトランスフェリンは、鉄を小腸、細網内皮系、および肝臓実質細胞から体内のすべての増殖細胞に輸送する、鉄結合糖タンパク質である。それは７６．５ｋＤａのおおよその分子量を有し、相同Ｃ末端ドメインおよびＮ末端ドメインを有し、そのそれぞれが第２鉄の１つのイオンに結合する。鉄輸送でのその役割に加えて、セロトランスフェリンは、血清からのある有機物質／アレルゲンの除去に関与する顆粒球／花粉結合タンパク質（ＧＰＢＰ）として、生理的役割も果たすことができる。細胞骨格を含む、あるいは細胞の細胞構造の維持、制御、または調節に関与するバイオマーカータンパク質（すなわち細胞構造タンパク質）も、本発明の実施に使用される。そのような細胞構造タンパク質は、これに限定されるわけではないが、アクチン細胞骨格タンパク質、非コラーゲン性マトリクスタンパク質、および適正なタンパク質折畳みに関与するタンパク質を含む。コフィリンは、フィラメント状Ｆ−アクチンを結合および脱重合して、ｐＨ依存方法でモノマー性Ｇ−アクチンの重合を阻害する、広範に分布した細胞内アクチン調節タンパク質である。コフィリンは、アクチン−コフィリン複合体の細胞質から核への転位置に関与する。
【００３６】
ゲルソリンは、カルシウムによって制御される、アクチン調節タンパク質であり、アクチンモノマーまたはフィラメントのプラス（または反やじり）端に結合して、ブロッキングまたはキャッピングによってモノマー交換を防止する。ゲルソリンは、すでに形成された切断（ｓｅｖｅｒ）フィラメントと同様に、モノマーのフィラメントへの組立て（核形成）を促進する。
【００３７】
テトラネクチンおよびビトロネクチンは、非コラーゲン性マトリクスタンパク質である。テトラネクチンは、プラスミノゲンおよび単離クリングル４に結合して、エキソサイトーシスされることになっている分子のパッケージングに関与し得る。ビトロネクチンは血清および組織の両方に見出され、細胞接着および拡散を促進して、末端細胞溶解補体経路の膜破損効果を阻害して、幾つかのセルピンセリンプロテアーゼインヒビターに結合する。ビトロネクチンは分泌タンパク質であり、単鎖形態またはジスルフィド結合によって一緒に挟まれた２鎖形態のどちらかとして存在する。
【００３８】
ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡは、オリゴペプチドにおけるプロリンイミドペプチド結合のシス−トランス異性化を触媒して、タンパク質折畳みを加速する。それはペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼ（ＰＰＩａｓｅ）ファミリーのメンバーである。異なる染色体に位置する多数の偽遺伝子が報告されている。２つの異なるアイソフォームをコードする、３つの選択的にスプライシングされた転写改変体が観察されている。
【００３９】
代謝性副生成物の解毒を触媒する酵素も、本発明のバイオマーカーに含まれる。カルボニックアンヒドラーゼＩは、二酸化炭素の可逆的水和を触媒する、亜鉛金属酵素（すなわちカルボニックアンヒドラーゼ（ＣＡ））の大規模なファミリーに属する。ＣＡは、呼吸、石灰化、酸−塩基バランス、骨再吸収、ならびに房水、脳脊髄液、唾液、および胃酸の形成を含む、多様な生物プロセスに関与する。ＣＡは、組織分布およびその細胞内局在化において広範囲に亘る多様性を示す。ＣＡ１は第８染色体上のＣＡ２およびＣＡ３遺伝子に密接に結合し、そして、ＣＡ１は赤血球で主に発現されるサイトゾルタンパク質をコードする。代替のポリＡ部位を利用するＣＡ１の転写改変体も述べられている。
【００４０】
血漿グルタチオンペルオキシダーゼは、還元グルタチオンによって過酸化水素、有機ヒドロペルオキシド、および過酸化脂質の還元を触媒して、酸化的損傷に対する細胞の保護において機能する。ヒト血漿グルタチオンペルオキシダーゼは、セレニウム含有酵素であることが示されており、発現は組織特異性であると思われる。
【００４１】
また、目的のバイオマーカーとしては、成長因子およびホルモン結合タンパク質も挙げられる。血小板塩基性タンパク質は、ＣＸＣケモカインファミリーに属する血小板由来成長因子である。この成長因子は、強力な化学誘引物質であり、そして好中球のアクチベータである。血小板塩基性タンパク質は、たとえばＤＮＡ合成、有糸分裂、解糖、細胞内ｃＡＭＰ蓄積、プロスタグランジンＥ２分泌、ならびにヒアルロン酸および硫酸化グリコサミノグリカンの合成を含む、各種の細胞プロセスを刺激することが示されている。それは滑膜細胞によるプラスミノゲンアクチベータの形成および分泌も刺激する。トランスサイレチンはホルモン結合タンパク質であり、さらに詳細にはおそらくチロキシンを血流から脳へ輸送する甲状腺ホルモン結合タンパク質である。
【００４２】
上でバイオマーカーを詳細に議論したが、卵巣癌で過剰発現される任意のバイオマーカーを本発明の実施で使用できる。詳細な実施形態において、目的のバイオマーカーは、本明細書の上で定義したように初期段階の卵巣癌で選択的に過剰発現される。
【００４３】
本発明の方法は、卵巣癌の検出のために患者サンプル中での少なくとも１つのバイオマーカーの検出を必要とするが、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個以上のバイオマーカーを使用して本発明を実施できる。身体サンプル中での１つを超えるバイオマーカーの検出を使用して、卵巣癌の例を同定できることが認識される。したがって一部の実施形態において、２つ以上のバイオマーカーが使用され、さらに好ましくは２つ以上の相補性バイオマーカーが使用される。「相補性の」とは、身体サンプル中でのバイオマーカーの組合せの検出が、バイオマーカーを１つのみ使用した場合に同定されるよりも、より高いパーセンテージの症例で卵巣癌の正しい同定をもたらすことを意味する。それゆえ一部の症例では、卵巣癌のより正確な判定を、少なくとも２つのバイオマーカーを使用して行うことができる。したがって少なくとも２つのバイオマーカーが使用される場合、別個のバイオマーカータンパク質に向けられた少なくとも２つの抗体を使用して、本明細書で開示された免疫化学方法が実施されるであろう。該抗体を身体サンプルに同時にまたは連続的に接触させることができる。
【００４４】
詳細な実施形態において、本発明の診断方法は、身体サンプルを患者から収集する工程と、サンプルに目的のバイオマーカーに対して特異的である少なくとも１つの抗体を接触させる工程と、抗体結合を検出する工程とを包含する。本発明のバイオマーカーの過剰発現を示すサンプルは、抗体結合の検出によって判定されたように、卵巣癌に関して陽性であると考えられる。好ましい実施形態において、身体サンプルは血清サンプルである。本発明の一部の態様において、サンプルは血漿サンプルである。
【００４５】
「身体サンプル」とは、バイオマーカーの発現を検出できる、細胞、組織、または体液の任意のサンプリングを意味する。そのような身体サンプルの例は、これに限定されるわけではないが、血液、リンパ液、尿、婦人科体液、生検、および発汗を含む。身体サンプルは、患者から、たとえばある範囲の削り取りまたは拭取り、あるいは体液を吸引するための針の使用を含む、各種の技法によって得ることができる。各種の身体サンプルを収集する方法は、当分野で周知である。好ましい実施形態において、身体サンプルは血清を含む。１つの実施形態において、ＢＤ  Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ（登録商標）ＳＳＴＴＭチューブを使用して、血清分析のために患者の血液を収集できる。凝血塊アクチベータ添加剤と患者の血液との混合を確実にするために、血液を含有する該チューブを反転させて、得られた血清は３０分以内に準備が整う。
【００４６】
バイオマーカーの同定または検出のための、当分野で利用できるいずれの方法も本明細書に含まれる。本発明のバイオマーカーの過剰発現は、核酸レベルまたはタンパク質レベルで検出できる。過剰発現を判定するために、検査される身体サンプルを、健常者に由来する対応する身体サンプルと比較できる。すなわち発現の「正常」レベルは、卵巣癌に罹患していないヒト被験体または患者からの身体サンプル中のバイオマーカーの発現レベルである。そのようなサンプルは、標準化された形で表され得る。一部の実施形態において、バイオマーカー過剰発現の判定は、身体サンプルと健常者に由来する対応する身体サンプルとの間の比較を必要としない。この状況では、目的のバイオマーカーは、健常者に由来する対応する身体サンプルとの比較の必要性を排除するような程度まで過剰発現される。
【００４７】
本発明のバイオマーカーを検出する方法は、核酸レベルまたはタンパク質レベルのどちらかでバイオマーカーの量または存在を決定する任意の方法を含む。そのような方法は当分野で周知であり、これに限定されるわけではないが、ウェスタンブロット、ノザンブロット、サザンブロット、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降、免疫蛍光検査、フローサイトメトリー、ビーズベース免疫化学、免疫化学、分子インプリンティング法、核酸アプタマー、核酸ハイブリダイゼーション技法、核酸逆転写方法、および核酸増幅方法を含む。詳細な実施形態において、バイオマーカーの過剰発現は、たとえば特異的バイオマーカータンパク質に対して向けられた抗体を使用してタンパク質レベルで検出される。このような抗体は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、または免疫沈降技法などの各種の方法で使用できる。
【００４８】
１つの実施形態において、バイオマーカータンパク質に対して特異性を有する抗体は、身体サンプル中のバイオマーカータンパク質の過剰発現を検出するために使用される。該方法は、身体サンプルを患者から採取する工程と、身体サンプルに卵巣癌で選択的に過剰発現されるバイオマーカーに向けられた少なくとも１つの抗体に接触させる工程と、バイオマーカーが患者サンプル中で過剰発現されるかどうかを判定するために抗体結合を検出する工程とを含む。上で示したように、卵巣癌のさらに正確な診断は、一部の症例において、患者サンプル中で１つを超えるバイオマーカーを検出することによって得られ得る。したがって詳細な実施形態において、２つの別個のバイオマーカーに向けられた少なくとも２つの抗体を使用して卵巣癌を検出する。１つを超える抗体を使用する場合、これらの抗体を個別の抗体試薬として連続して単一のサンプルに添加してもよく、または抗体カクテルとして同時に単一のサンプルに添加してもよい。あるいは各個別の抗体を同じ患者からの独立したサンプルに添加して、得られたデータをプールしてもよい。当業者は、本明細書で述べた免疫化学方法が手動で、または自動化方式で実施できることを認識するであろう。
【００４９】
本発明の好ましい免疫化学方法において、２つの抗体または「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡを使用して、患者サンプル中でのバイオマーカー過剰発現を検出できる。そのような「サンドイッチ」または「２部位」イムノアッセイは当分野で公知である。たとえばＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．Ｉｎｄｉｒｅｃｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓａｎｄｗｉｃｈ  ＥＬＩＳＡ  ｔｏ  Ｄｅｔｅｃｔ  Ｓｏｌｕｂｌｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９１を参照。本発明のこの態様において、単一バイオマーカーの２つの別個の抗原部位に対して特異性を有する２つの抗体を使用する。「別個の抗原部位」とは、一方の抗体の結合がバイオマーカータンパク質への他方の抗体の結合を著しく妨害しないように、該抗体が目的のバイオマーカータンパク質の異なる部位に対して特異性を有することを意味する。「捕獲抗体」として公知である第１の抗体は、固体支持体に固定化または結合される。たとえば目的のバイオマーカーに向けられた捕獲抗体は、マイクロタイタープレートウェル、ビーズ、キュベット、または他の反応容器に共有結合または非共有結合できる。好ましい実施形態において、捕獲抗体はマイクロタイタープレートウェルに結合される。抗体を固体支持体に結合させる方法は、当分野で公知である。身体サンプル、特に血清サンプルは、固体支持体と接触して、結合した捕獲抗体と複合される。未結合サンプルは除去され、「検出抗体」として公知の第２の抗体が固体マトリクスに添加される。検出抗体は、目的のバイオマーカーの別個の抗原部位に対して特異性を有し、検出可能なシグナルを供給する物質に結合されるか、それによって標識される。そのような抗体標識は当分野で周知であり、各種の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射性物質を含む。検出抗体とのインキュベーションの後、未結合サンプルを除去して、バイオマーカー発現レベルを固体支持体に結合した標識検出抗体の定量によって決定する。当業者は、捕獲抗体および検出抗体を身体サンプルに、上述のように連続して、または同時に接触させ得ることを認識するであろう。さらにサンプルに固定化捕獲抗体を接触させる前に、検出抗体を最初に身体サンプルとインキュベートしてもよい。
【００５０】
検出可能な標識の使用によって抗体結合を検出する技法は、当分野で周知である。たとえば抗体結合は、抗体結合のレベル（したがってバイオマーカータンパク質発現のレベル）に一致する検出可能なシグナルを発生する化学試薬の使用によって検出できる。一部の実施形態において、検出抗体は酵素、特に抗原−抗体結合部位において色原体の析出を触媒する酵素に結合される。特に興味深い酵素は、これに限定されるわけではないが、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）を含む。市販の抗体検出系も本発明を実施するために使用できる。
【００５１】
一般に任意の免疫化学方法および形式が本発明で使用できることが理解されるので、上述の免疫化学方法および形式は例示であるものとし、これに制限されない。
【００５２】
「抗体」および「複数の抗体」という用語は、抗体の天然に存在する形態および組換え抗体、たとえば単鎖抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体ならびに多特異性抗体、ならびに、上述のすべてのフラグメントおよび誘導体を幅広く含み、該フラグメントおよび誘導体は、少なくとも１つの抗原結合部位を有する。抗体誘導体は、抗体に結合体化したタンパク質または化学部分を含むことができる。
【００５３】
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造特徴を有する糖タンパク質である。抗体は抗原に対して結合特異性を示すが、免疫グロブリンは、抗原特異性を欠いた抗体および他の抗体様分子の両方を含む。後者の種類のポリペプチドはたとえば、リンパ系によって低レベルで、そして骨髄腫によって上昇したレベルで生成される。
【００５４】
「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、完全に集合した抗体、抗原を結合できる抗体フラグメント（たとえばＦａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、ディアボディ（ｄｉａｂｏｄｙ））、および上述を含む組換えペプチドを包含する。
【００５５】
「モノクローナル抗体」は本明細書で使用するように、実質的に同種の抗体の集合から得られた抗体を指し、すなわち集合を含む個別の抗体は、微量で存在しうる天然で存在する変異の可能性を除いて同一である。
【００５６】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体の部分、好ましくはインタクトな抗体の抗体結合領域または可変領域を含む。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖフラグメント；ディアボディ；直鎖抗体（Ｚａｐａｔａら．（１９９５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２）；単鎖抗体分子；および抗体フラグメントから形成された多特異性抗体を含む。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」フラグメントと呼ばれ、それぞれ単一抗体結合部位、および残留「Ｆｃ」フラグメントを備えた２つの同一の抗体結合フラグメントを生成し、その名前は３５をただちに結晶化する能力を反映している。ペプシン処理は、２個の抗原結合部位を有し、なお抗原を架橋できるＦ（ａｂ’）２フラグメントを生じる。
【００５７】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識部位および抗原結合部位を含有する最小抗体フラグメントである。２鎖Ｆｖ種において、この領域は、堅く非共有結合した、１個の重鎖可変ドメインおよび１個の軽鎖可変ドメインのダイマーより成る。単鎖Ｆｖ種において、１個の重鎖可変ドメインおよび１個の軽鎖可変ドメインは、軽鎖および重鎖が２鎖Ｆｖ種と類似した「ダイマー」構造で結合できるように、可動性のあるペプチドリンカーによって共有結合できる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面上に抗体結合部位を規定するのは、この構造においてである。全体で、６個のＣＤＲが、抗体に抗原結合特異性を与える。しかしながら単一の可変ドメイン（または抗原に対し特異性を有するＣＤＲを３個のみ含むＦｖの半分）さえ、結合部位全体よりも低い親和性であるが、抗原を認識および結合する能力を有する。
【００５８】
Ｆａｂフラグメントは、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）も含有する。Ｆａｂフラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１個以上のシステインを含む、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での２、３個の残基の添加により、Ｆａｂ’フラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書では、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’の呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体フラグメントは本来、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ’フラグメントの対として生成される。
【００５９】
ポリクローナル抗体は、適切な被験体（たとえばニワトリ、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳類）をバイオマーカータンパク質免疫原によって免疫化することによって調製できる。免疫化した被験体の抗体力価は、標準技法によって、たとえば固定化バイオマーカータンパク質を使用するＥＬＩＳＡによって経時的にモニタリングできる。免疫化後の適切な時間に、たとえば抗体力価が最高であるとき、抗体産生細胞を、被験体から得ることができ、そしてこれを使用して、モノクローナル抗体を以下のような標準技法によって調製し得る：たとえばＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７によって最初に述べられたハイブリドーマ技法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技法（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ４：７２）、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技法（Ｃｏｌｅら（１９８５）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ＲｅｉｓｆｅｌｄおよびＳｅｌｌ編（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ），ｐｐ．７７−９６）またはトリオーマ技法。ハイブリドーマを生成する技術は、周知である（一般にＣｏｌｉｇａｎら，編（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）；Ｇａｌｆｒｅら（１９７７）Ｎａｔｕｒｅ  ２６６：５５０５２；Ｋｅｎｎｅｔｈ（１９８０）Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．，ＮＹ；ならびにＬｅｒｎｅｒ（１９８１）Ｙａｌｅ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．，５４：３８７−４０２を参照）。
【００６０】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代案として、モノクローナル抗体は、組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（たとえば抗体ファージディスプレイライブラリ）をバイオマーカータンパク質によってスクリーニングすることによって同定および単離され得、それによりバイオマーカータンパク質に結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離できる。ファージディスプレイライブラリを産生およびスクリーニングするキットは市販されている（たとえばＰｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２７−９４００−０１；およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰＳ  Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ，Ｃａｔａｌｏｇ  Ｎｏ．２４０６１２）。加えて抗体ディスプレイライブラリの産生およびスクリーニングへの使用に特に従う方法および試薬の例は、たとえば米国特許第５，２２３，４０９号；ＰＣＴ公報ＷＯ  ９２／１８６１９；ＷＯ  ９１／１７２７１；ＷＯ  ９２／２０７９１；ＷＯ  ９２／１５６７９；９３／０１２８８；ＷＯ  ９２／０１０４７；９２／０９６９０；および９０／０２８０９；Ｆｕｃｈｓら（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：１３７０−１３７２；Ｈａｙら（１９９２）Ｈｕｍ．Ａｎｔｉｂｏｄ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ３：８１−８５；Ｈｕｓｅ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４６：１２７５−１２８１；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４に見出すことができる。
【００６１】
モノクローナル抗体を調製する代案として、初期段階の卵巣癌と関連するタンパク質が、プロテオミクス技法によって同定された後に生じ得る。同定の後に、そのタンパク質の選択的転写物が存在するかどうかを判定するために、発現された配列タグ情報についてＤＮＡデータベースを検索する。従来の核酸ハイブリダイゼーション方法または増幅方法は、腫瘍組織中の遺伝子転写物の存在を検証するために使用できる。タンパク質はプロテオミクス技法によってすでに同定されているので、遺伝子転写物が腫瘍組織中に存在する可能性は高い。目的の遺伝子は、その存在が検証されると、適切な細胞発現系でクローニングおよび発現させることができ、得られた特異性タンパク質を均一になるまで精製する。シグナル配列はバイオマーカータンパク質の分泌および単離を促進するために使用できる。シグナル配列は通例、分泌の間に１つ以上の開裂事象において一般に成熟タンパク質から開裂される疎水性アミノ酸のコアを特徴とする。１つの実施形態において、シグナル配列をコードする核酸配列は、発現ベクター内で目的のタンパク質、たとえばバイオマーカータンパク質またはそのセグメントに作動可能に連結させることができる。シグナル配列は発現ベクターが形質転換される真核宿主などからのタンパク質の分泌を指示し、その後、または同時に、シグナル配列は開裂される。次にタンパク質は、細胞外培地から当分野で認識された方法によってただちに精製できる。あるいは、精製を促進する配列を使用して（たとえばＧＳＴドメインによって）、シグナル配列を目的のタンパク質に連結させることができる。
【００６２】
本明細書で上述したように、抗体結合の検出は、抗体を検出可能な物質に結合させることによって促進できる。検出可能な物質の例は、各種の酵素、補欠分子団、蛍光物質、発光物質、生体発光物質、および放射性物質を含む。適切な酵素の例は、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼを含む。適切な補欠分子団複合体の例は、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンを含む。適切な蛍光物質の例は、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、ダンシルクロライドまたはフィコエリトリンを含む。発光物質の例は、ルミノールを含む。生体発光物質の例は、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンを含む。そして適切な放射性物質の例は、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈを含む。
【００６３】
本発明を実施するために使用される抗体は、目的のバイオマーカータンパク質への高い特異性を有するように選択される。抗体を作製するための、そして適切な抗体を選択するための方法は、当分野で公知である。たとえばその全体が本明細書に参考として援用されている、Ｃｅｌｉｓ，編（印刷中）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ＆  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，第３版（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照。一部の実施形態において、特異的バイオマーカータンパク質に向けられた市販の抗体を使用して、本発明を実施できる。好ましい実施形態において、該抗体は結合特異性について、最終サンプル型（たとえば血清調製物）を念頭に置いて選択される。
【００６４】
本発明の一部の態様において、目的の特異的バイオマーカーに向けられた抗体は、多工程スクリーニングプロセスを介して選択および精製される。詳細な実施形態において、ポリドーマは特異性および感受性について所望の特性を有するバイオマーカー特異的抗体を同定するためにスクリーニングされる。「ポリドーマ」は、多重ハイブリドーマを指す。本発明のポリドーマは通例、マルチウェル組織培養プレートで提供される。最初の抗体スクリーニング工程において、複数の正常サンプル、グレードＩ（十分に分化した）サンプル、グレードＩＩ（中程度によく分化した）サンプル、グレードＩＩＩ（不十分に分化した）サンプルを含む腫瘍組織マイクロアレイが産生される。方法および機器、たとえば１枚のスライドガラス上に複数の組織のアレイを産生するためのＣｈｅｍｉｃｏｎ（登録商標）Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｒｒａｙｅｒは当分野で公知である。たとえば米国特許第４，８２０，５０４号を参照する。ポリドーマを含有する各ウェルからの未希釈上清は、陽性染色について、標準免疫組織化学技法を使用してアッセイされる。この最初のスクリーニング工程において、バックグラウンドの非特異的結合は本質的に無視される。陽性結果を生じるポリドーマが選択され、抗体スクリーニングの第２相で使用される。
【００６５】
第２のスクリーニング工程において、陽性ポリドーマは制限希釈プロセスを受ける。生じた未スクリーニング抗体をグレードＩサンプル、グレードＩＩサンプルまたはグレードＩＩＩサンプルの陽性染色について、標準免疫組織化学技法を使用してアッセイする。この段階では、バックグラウンド染色は関連しており、異常細胞（すなわち癌細胞）に関してのみ陽性に染色される候補ポリドーマがさらなる分析のために選択される。
【００６６】
卵巣癌を示すサンプル（すなわちグレードＩおよび上記）から正常サンプルを区別できる抗体を同定するために、疾患パネル組織マイクロアレイが産生される。この組織マイクロアレイは通例、複数の正常サンプルおよびグレードＩサンプル、グレードＩＩサンプルおよびグレードＩＩＩサンプルを含む。標準免疫組織化学技法は、卵巣癌疾患のみを示すサンプル（すなわちグレードＩサンプルおよび上記）の特異的陽性染色に関して候補ポリドーマをアッセイするために利用される。陽性結果および最小バックグラウンド染色を生成するポリドーマをさらなる分析用に選択する。
【００６７】
個別の候補モノクローナル抗体を選択するために、陽性染色培養物を個別のクローンとして調製する。個別のクローンを単離する方法は当分野で周知である。未精製抗体を含む各クローンからの上清を本明細書で上述した腫瘍および疾患パネル組織マイクロアレイを使用して、グレードＩサンプル、グレードＩＩサンプルおよびグレードＩＩＩサンプルの特異的染色に関してアッセイする。卵巣疾患サンプル（すなわちグレードＩおよび上記）の陽性染色、他の細胞タイプ（すなわち正常サンプル）の最小染色、およびごくわずかなバックグラウンドを示す候補抗体が精製およびさらなる分析用に選択される。親和性吸着クロマトグラフィーによって抗体を精製する方法は、当分野で公知である。
【００６８】
卵巣癌サンプルの最大特異的染色、および血清サンプルにおける最小のバックグラウンド（非特異的染色）を示す抗体を同定するために、上の免疫組織化学ベーススクリーニングプロセスで単離および精製した候補抗体を、本発明の免疫化学技法、特に本明細書で上述した「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡを使用してアッセイする。
【００６９】
特に興味深い精製抗体を使用して、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩおよびステージＩＶの卵巣癌患者からの統計的に有意な数の血清サンプルをアッセイする。サンプルを本明細書で述べた免疫化学方法によって分析して、特定のバイオマーカーの陽性抗体染色に基づいて、卵巣癌に関して陽性、陰性、または中間として分類する。各抗体の感受性、特異性、陽性予測値、および陰性予測値を計算する。本発明では、卵巣癌血清サンプルの最大特異的染色を最小バックグラウンドと共に（すなわち最大シグナル対雑音比を）示す抗体が選択される。
【００７０】
適切な抗体の同定は、シグナル対雑音比の上昇およびアッセイの臨床有用性の上昇をもたらす。使用されるアッセイ形式およびサンプル型は、適切な抗体の選択において重要な要素である。免疫組織化学形式で最大シグナル対雑音比を生成するバイオマーカー抗体は、免疫化学アッセイ、たとえばＥＬＩＳＡアッセイにおいて同様に作用できない。たとえば分泌バイオマーカータンパク質は、血清中の同じタンパク質のレベルを正確に反映するレベルにて組織サンプル中に存在できない。加えて、血清サンプルは、目的のバイオマーカーへの抗体結合を妨害する多くのタンパク質を含み得、これらの妨害タンパク質に関連する潜在的な問題を抗体選択の間に考慮する必要がある。それゆえ抗体選択は、使用されるアッセイ形式および最終サンプル型を早期に検討する必要がある。
【００７１】
当業者は、特定の抗体のシグナル対雑音比を最大化するために、抗体力価および検出化学の最適化が必要であることを認識するであろう。本発明のバイオマーカーへの特異的結合を最大化して、非特異的結合（または「バックグラウンド」）を最小化する抗体濃度が決定されるであろう。詳細な実施形態において、患者からの血清調製物で使用するための適切な抗体力価は、ホルマリン固定パラフィン包埋した正常組織サンプルおよび卵巣癌組織サンプルに対して各種の抗体希釈物を最初にテストすることによって決定される。最適抗体濃度および検出化学条件を、ホルマリン固定パラフィン包埋した卵巣組織サンプルについて最初に決定する。抗体力価および検出条件を最適化するアッセイの設計は標準的であり、当業者の普通の能力の範囲内である。固定組織サンプルの最適条件を決定した後に、次に各抗体を同じ条件の下で血清調製物中で使用する。一部の抗体は、バックグラウンド染色を低減するために、および／または血清サンプル中の染色の特異性および感受性を上昇させるために、さらに最適化を必要とする。
【００７２】
さらに当業者は、本発明の方法を実施するために使用される特定の抗体の濃度が、結合のための時間、バイオマーカータンパク質に対する抗体の特異性のレベル、そしてテストした身体サンプルのタイプなどの因子によって変化することを認識するであろう。その上、複数の抗体を使用するとき、抗体がサンプルに適用される順序によって（すなわちカクテルとして同時に利用されるか、または個別の抗体試薬として連続的に利用されるかによって）、必要な濃度が影響を受けることがある。さらに目的のバイオマーカーへの抗体結合を可視化するために使用される検出化学も、所望のシグナル対雑音比を生成するために最適化する必要がある。
【００７３】
他の実施形態において、目的のバイオマーカーの発現は、核酸レベルで検出される。発現を評価するための核酸ベース技法は当分野で周知であり、たとえば身体サンプル中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを決定することを含む。多くの発現検出方法が単離されたＲＮＡを使用する。ｍＲＮＡの単離に対して選択しない任意のＲＮＡ単離技法を、卵巣細胞からのＲＮＡの精製に利用できる（たとえばＡｕｓｕｂｅｌら，編，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７−１９９９を参照）。加えて多数の組織サンプルは、たとえばＣｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの１工程ＲＮＡ単離プロセス（１９８９，米国特許第４，８４３，１５５号）などの当業者に周知の技法を使用してただちに処理できる。
【００７４】
「プローブ」という用語は、特別に意図された標的生体分子（たとえばバイオマーカーにコードされたかまたはバイオマーカーに対応するヌクレオチド転写物あるいはタンパク質）に、選択的に結合できる任意の分子を指す。プローブは当業者が合成できるか、または適切な生体調製物から誘導できる。プローブは標識されるように特別に設計できる。プローブとして利用できる分子の例は、これに限定されるわけではないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子を含む。
単離ｍＲＮＡは、これに限定されるわけではないが、サザン分析またはノザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイを含む、ハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用できる。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの方法は、単離したｍＲＮＡに、検出されている遺伝子によってコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）を接触させる工程を包含する。核酸プローブは、たとえば全長ｃＤＮＡ、またはその部分、たとえば長さが少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００ヌクレオチドで、厳密条件下で本発明のバイオマーカーをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分なオリゴヌクレオチドでありうる。プローブによるｍＲＮＡのハイブリダイゼーションは、問題のバイオマーカーが発現されていることを示す。
【００７５】
１つの実施形態において、ｍＲＮＡを固体表面上に固定化して、たとえば単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上に泳動して、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜へ移動させることによって、プローブと接触させる。代替の実施形態において、プローブを固体表面に固定化して、ｍＲＮＡを（たとえばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ遺伝子チップアレイ内の）プローブと接触させる。当業者は、本発明のバイオマーカーによってコードされるｍＲＮＡのレベルの検出に使用するために公知のｍＲＮＡ検出方法をただちに改良することができる。
【００７６】
サンプル中のバイオマーカーｍＲＮＡのレベルを決定する代替の方法は、核酸増幅のプロセス、たとえばＲＴ−ＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ，１９８７，米国特許第４，６８３，２０２号に述べられている実験実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−１９３）、自律的配列複製（Ｇｕａｔｅｌｌｉら，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅系（Ｋｗｏｈら，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉら，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル型複製（Ｌｉｚａｒｄｉら，米国特許第５，８５４，０３３号）または任意の他の核酸増幅方法を含み、その後、当業者に周知の技法を使用する増幅分子の検出が続けられる。これらの検出スキームは、そのような分子が非常に少ない数で存在する場合、核酸分子の検出では特に有用である。本発明の詳細な態様において、バイオマーカー発現は、定量的フルオジェニックＲＴ−ＰＣＲ（すなわちＴａｑＭａｎ（登録商標）Ｓｙｓｔｅｍ）によって評価される。
【００７７】
ＲＮＡのバイオマーカー発現レベルは、膜ブロット（ノザン、サザン、ドットなどのハイブリダイゼーション分析で使用されるような）、あるいはマイクロウェル、サンプルチューブ、ゲル、ビーズまたはファイバー（または結合核酸を含む任意の固体支持体）を使用してモニタリングできる。本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，７７０，７２２号、第５，８７４，２１９号、第５，７４４，３０５号、第５，６７７，１９５号および第５，４４５，９３４号を参照。バイオマーカー発現の検出は、溶液中の核酸プローブを使用することも含む。
【００７８】
本発明の１つの実施形態において、マイクロアレイがバイオマーカー発現を検出するために使用される。マイクロアレイは、異なる実験間での再現性のために、特にこの目的に十分に適している。ＤＮＡマイクロアレイは、多数の遺伝子の発現レベルを同時測定するために１つの方法を提供する。各アレイは、固体支持体に結合された捕獲プローブの再現可能なパターンより構成される。標識ＲＮＡまたはＤＮＡはアレイ上の相補性プローブにハイブリダイズされ、次にレーザスキャンによって検出される。アレイ上の各プローブについてのハイブリダイゼーション強度が決定され、相対的な遺伝子発現レベルを表す定量値に変換される。本明細書中で参考として援用される、米国特許第６，０４０，１３８号、第５，８００，９９２号および第６，０２０，１３５号、第６，０３３，８６０号、ならびに第６，３４４，３１６号を参照。高密度オリゴヌクレオチドアレイは、サンプル中の多数のＲＮＡの遺伝子発現プロフィールを決定するために特に有用である。
【００７９】
機械的合成方法を使用するこれらのアレイを合成する技法は、たとえば米国特許第５，３８４，２６１号（すべての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される）に述べられている。平面状アレイ表面が好ましいが、アレイは実質的に任意の形状の表面上に、または複数の表面上にさえ製造できる。アレイは、ビーズ、ゲル、ポリマー表面、光ファイバーなどのファイバー、ガラスまたは任意の他の適切な基質上のペプチドまたは核酸であり得、すべての目的のためにその全体が本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，７７０，３５８号、第５，７８９，１６２号、第５，７０８，１５３号、第６，０４０，１９３号および第５，８００，９９２号を参照できる。アレイは、診断または包括的デバイスの他の操作を可能にするような方法でパッケージできる。たとえば本明細書中で参考として援用される、米国特許第５，８５６，１７４号および米国特許第５，９２２，５９１号を参照。
【００８０】
１つの手法において、サンプルから単離されたｍＲＮＡ全体が標識ｃＲＮＡに変換されて、次にオリゴヌクレオチドアレイにハイブリダイズされる。各サンプルは独立したアレイにハイブリダイズされる。相対的転写物レベルは、アレイ上およびサンプル内に示された適切な対照を参照することによって計算できる。
【００８１】
本発明の方法を実施するためのキットもさらに提供される。「キット」とは、本発明のバイオマーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも１つの試薬（たとえば抗体、核酸プローブなど）を含む任意の製品（たとえばパッケージまたはコンテナ）を意味する。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして販促、配布または販売できる。加えてキットは、キットおよびその使用方法を説明するパッケージ挿入物を含有できる。キット試薬のいずれかまたはすべては、それらを外部環境から保護するコンテナに、たとえば密封コンテナまたはパウチに入れて提供できる。
【００８２】
詳細な実施形態において、本発明の免疫細胞化学キットはさらに、少なくとも２つの別個のバイオマーカーの発現を特異的に検出するための少なくとも２つの試薬（たとえば抗体）を含む。各抗体は、個別の試薬として、あるいは目的の各種のバイオマーカーに向けられた抗体のすべてを含む抗体カクテルとしてキット内に提供され得る。
【００８３】
好ましい実施形態において、本発明の免疫化学方法、特に「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡ技法を実施するためのキットが提供される。そのようなキットは、手動および自動化免疫化学技法の両方に適合する。これらのキットは、目的のバイオマーカーに向けられた少なくとも１つの一次捕獲抗体と、バイオマーカー上の別個の抗原部位に対して特異性を有する標識二次検出抗体と、バイオマーカーへの抗体結合を検出するための化学薬品とを含む。一次捕獲抗体は、その後の固体支持体への結合のために溶液中に提供できる。あるいは捕獲抗体は、固体支持体、たとえばビーズまたはマイクロタイタープレートのウェルにすでに結合されたキット内に提供できる。本発明の実施には、抗原−抗体結合を検出する任意の化学薬品を使用できる。一部の実施形態において、二次検出抗体は基質の比色変換を触媒する酵素に結合体化される。そのような酵素および抗体結合の検出でそれらを使用する技法は、当該分野で周知である。好ましい実施形態において、キットはＨＲＰに結合する二次検出抗体を含む。結合体化酵素（たとえばＨＲＰ標識二次検出抗体の場合はテトラメチルベンジジン）および酵素反応を停止させる溶液、たとえば硫酸と適合性である基質、特に色原体がさらに提供され得る。詳細な実施形態において、抗体結合の検出のための化学薬品は、市販の試薬およびキットを含む。
【００８４】
別の実施形態において、本発明の「サンドイッチ」ＥＬＩＳＡキットは、少なくとも２つの異なる目的のバイオマーカーの検出のための抗体を含む。そのようなキットは、別個のバイオマーカーに向けられた少なくとも２つの一次捕獲抗体および２つの二次検出抗体を含む。捕獲抗体は、個別の試薬として、あるいは各種の目的のバイオマーカーに向けられた抗体すべての混合物として提供できる。
【００８５】
正および／または負の対照は、本発明によって利用される試薬の活性および正しい用途を検証するためにキットに含めることができる。対照は、目的のバイオマーカーの存在に関して陽性または陰性のどちらかであることが公知であるサンプル、たとえば組織切片、ガラススライドに固定された細胞などを含むことができる。詳細な実施形態において、正の対照は、目的のバイオマーカータンパク質を含む溶液である。対照の設計および使用は標準的であり、当業者の普通の能力の範囲内である。
【００８６】
他の実施形態において、核酸レベルでバイオマーカー過剰発現を検出する工程を包含する卵巣癌の同定のためのキットがさらに提供される。そのようなキットはたとえば、バイオマーカー核酸またはそのフラグメントに特異的に結合する少なくとも１つの核酸プローブを含む。詳細な実施形態において、キットは別個のバイオマーカー核酸によってハイブリダイズする少なくとも２つの核酸プローブを含む。
【００８７】
当業者は、本発明の方法の任意またはすべての工程が、人手によって実施できるか、あるいは自動化方式で実施できることを認識するであろう。それゆえ身体サンプル調製、サンプル染色、およびバイオマーカー発現の検出の工程は自動化できる。一部の実施形態において、本発明の方法は、従来の卵巣癌スクリーニング技法と組合せて使用できる。たとえば本発明の免疫化学技法は従来のＣＡ１２５血清分析または経膣超音波スクリーニングと組合せることができるため、従来方法からの情報すべてが保存される。この方法では、バイオマーカーの検出は、ＣＡ１２５スクリーニングの高い偽陽性率を低下させ、経膣超音波スクリーニングの高い偽陰性率を低下させることができ、大量の自動化スクリーニングを促進できる。さらに本発明の方法は、慣用的な集団規模スクリーニングの助けとなる診断テストを提供することによって、卵巣癌のより早期の検出を可能にする。
【００８８】
冠詞「ａ」および「ａｎ」は本明細書では、１つまたは１つを超える（すなわち少なくとも１つの）冠詞の文法的対象を指すために使用される。一例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（１つの要素）」は、１つ以上の要素を意味する。
【００８９】
明細書を通じて、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」あるいは「ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ」または「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」などの変形は、記載された要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群の包含を指すが、任意の他の要素、整数または工程、あるいは要素、整数または工程の群の除外は指さないことが理解されるであろう。
【実施例】
【００９０】
以下の実施例は、限定するためではなく、例示のために提供する：
（実験）
（実施例１：卵巣癌を示すバイオマーカーの同定のための血清サンプルのＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ分析）
（材料および方法：）
Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓプロトコルおよびＣｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓによる血清分画キット、Ｋ１００−０００７、ならびに凍結正常ヒト血清（ＮＨＳ  Ｐｏｏｌ  １）、および卵巣癌血清（ＯＣＳ  ｐｏｏｌ  ２）より成るプールされたサンプルを使用して、血清サンプルの手動分画を実施した（個々の血清サンプルデータは表１を参照）。
【００９１】
血清を分画するために、ＮＨＳ  Ｐｏｏｌ  １およびＯＣＳ  ｐｏｏｌ  ２を解凍して、周囲温度にして、低温室（４℃）にて２０分間遠心分離にかけた（１４，０００×ＲＣＦ）。各サンプルの４×２０μｌ分割量をＮｕｎｃマイクロタイタープレート＃２４９９５２の４×Ｖ底ウェルに移した。各ウェルにＵ９緩衝液（９Ｍ尿素、２％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９）３０μｌを移して、次にプレートを２０分間、４℃にて、ＩＫＡ−ＭＴＳミキサー（６００設定）によって振とうした。振とう後、処理したサンプル５０μｌをＶ底プレートウェルから濾過プレートの独立したウェル（Ｎｕｎｃ，Ｓｉｌｅｎｔ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｐｌａｔｅ、リプロダイン膜付き、＃２５５９８０）に水和Ｑ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ吸着樹脂と共に移した。次にＶ底プレートのウェルを洗浄緩衝液１（０．１％オクチルグルコピラノシドを含む、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９）５０μｌで迅速に洗浄して、最初の処理済みサンプル５０μｌを入れた同じ濾過プレートの対応するウェルに移した。濾過プレートを３０分間、４℃にて混合した。次に真空マニホールドを用いて、画分１サンプル（各サンプル型で４×１００μｌ）を収集プレートに収集した。新しい洗浄緩衝液１（１００μｌ）を濾過プレート内の樹脂に添加して、混合を室温にて１０分間続けた。次に各緩衝液１洗浄サンプルを真空により、洗浄緩衝液１の最初の１００μｌを入れた同じ収集プレートウェル内に収集した。これらの画分１サンプルは、合せたフロースルーおよびｐＨ９溶出液を表す。
【００９２】
画分２は、最初に洗浄緩衝液２（０．１％  ＯＧＰを含む５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７）１００μｌを樹脂ウェルに添加して、１０分間室温にて混合し、その後、上で使用した独立収集プレートへ真空収集によって収集した。この同じ樹脂ウェルに、洗浄緩衝液２  １００μｌを再び添加して、その後、真空下で、最初の洗浄緩衝液２  １００μｌを入れた同じウェルに混合し、そして収集した。これらの画分２サンプルはｐＨ７溶出液を含有している。
【００９３】
画分２についての上のプロセスを以下の緩衝液を用いて反復した：
画分３、洗浄緩衝液３（０．１％  ＯＧＰを含む１００ｍＭ  酢酸Ｎａ、ｐＨ５）
画分４、洗浄緩衝液４（０．１％  ＯＧＰを含む５０ｍＭ  酢酸Ｎａ、ｐＨ４）
画分５、洗浄緩衝液５（０．１％  ＯＧＰを含む５０ｍＭ  クエン酸Ｎａ、ｐＨ３）
画分６、洗浄緩衝液６（３３．３％イソプロパノール／１６．７％アセトニトリル／０．１％  ＴＦＡ）
結合分析の前に、画分１〜６を含む収集プレートを−８０℃にて一晩保管した。
【００９４】
（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ結合分析）
４つのＮＨＳおよび４つのＯＣＳサンプルについての各画分１〜６の、ＣＭ−１０、固定化金属親和性捕獲（ＩＭＡＣ）−３０およびＨ５０チップ（８アレイ）への結合をバイオプロセッサにて評価した。それゆえ各チップタイプについて８のシングルアレイを各画分に使用した（すなわち４／ＮＨＳ画分、４／ＯＣＳ画分）。ＩＭＡＣ−３０チップを最初に１００ｍＭ  ＣｕＳＯ４によって１０分間活性化し、続いてＨＰＬＣ等級の水で３回洗浄した。次にアレイを特異的結合緩衝液によって洗浄（３回）してから、画分に暴露させた（すなわちＣＭ−１０、１００ｍＭ  酢酸Ｎａ、ｐＨ４；ＩＭＡＣ−３０、１００ｎＭ  リン酸Ｎａ、ｐＨ７＋０．５Ｍ  ＮａＣｌ；Ｈ５０、１０％アセトニトリル（ＡＣＮ）＋０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ））。各チップスポットに、そのそれぞれの結合緩衝液７５μｌ、続いて特異的画分１〜６（１／４希釈）２５μｌを入れた。バイオプロセッサをシェーカー上に１時間配置した。
【００９５】
アレイは各洗浄工程で、そのそれぞれの結合緩衝液１５０μｌによって１０分間振とうしながら３回洗浄した。最後に、アレイをＨＰＬＣ  Ｈ２Ｏで迅速に洗浄して、空気乾燥させた。シナピン酸を５０％  ＡＣＮおよび０．０５％  ＴＦＡ中で新たに調製して、各チップ表面に１．５μｌをスポットし、乾燥させて、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  ＳＥＬＤＩ装置でただちに分析した。装置設定は次の通りであった：２００ｋＤａまでの高質量；レーザ強度２００；検出器感度１０ｋＤａにて質量偏向器を用いて９。タンパク質標準（Ｃ１００−０００７）を自動校正モードで流して、サンプル分子量の参照として使用した。
【００９６】
（結果）
（ＣＭ−１０（弱カチオン交換機）タンパク質プロファイリング）
画分４および６は、このチップに結合したタンパク質に関して最も興味深かった。特に画分４は、ＮＨＳよりもＯＣＳにおいて上昇を示した、分子量（ＭＷ）が２８ｋＤａおよび１３．９ｋＤａの２つの重要な種を有していた（データを示さず）。加えてＯＣＳサンプルはまた、ＭＷが１７．４ｋＤａ、１５．８ｋＤａおよび１５．１ｋＤａにおいて上昇した、より突出の低いピークを有していた（データを示さず）。カリクレインタンパク質の範囲における２８ｋＤＡの質量に注目する。画分６は、ＮＨＳとＯＣＳとの間に見られるタンパク質の相違がすべて＜１０ｋＤａのＭＷ範囲にあるという点で注目に値した（データを示さず）。加えてこのプロフィールでは、６６ｋＤａにおけるサンプルヒト血清アルブミンのピーク（すなわち１価および２価種の両方）は、ＮＨＳおよびＯＣＳサンプルの両方でおおよそ同等であった。
【００９７】
（ＩＭＡＣ−３０タンパク質プロファイリング）
画分６はこのチップでは、５６．３ｋＤａ、２８．１〜２８．３ｋＤａおよび１４〜１４．１ｋＤａのＭＷを有するタンパク質のディファレンシャルディスプレイ（ＯＣＳにおいてアップレギュレートされる）で最も注目に値した（データを示さず）。約５６、２８および１４ｋＤａのＭＷは、マーカーＦＬＪ１０５４６、カリクレインおよびＨＥ４それぞれのサイズ範囲内である。ヒト血清アルブミンは６６ｋＤａにて両方のサンプルに見られる。
【００９８】
（Ｈ５０（疎水性）タンパク質プロファイリング）
このチップ表面によってディファレンシャルディスプレイされたすべてのタンパク質は、また２８ｋＤａおよび１７．５ｋＤａピーク（ＯＣＳにおいてアップレギュレートされる）（データを示さず）を示した画分４を除いて、大部分が低いＭＷ（すなわち＜１０ｋＤａ）であった。２つのタンパク質（７．０および７．５ｋＤａ）は、ＮＨＳと比較してＯＣＳにおいてダウンレギュレートされ、これに対して３つのタンパク質（６．４、６．６、６．８ｋＤａ）は、ＮＨＳと比較してＯＣＳにおいてアップレギュレートされる。８．１ｋＤａにおける１つのタンパク質は、ＮＨＳおよびＯＣＳの両方で同じレベルであるように見える（データを示さず）。
【００９９】
（実施例２：プロテオミクス技法を使用する、血清サンプル中の卵巣癌バイオマーカーの同定）
（材料および方法）
正常および卵巣癌患者血清サンプルを複数の販売元（Ｕｎｉｇｌｏｂｅ，Ｒａｓｅｄａ，カリフォルニア州；Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｕｐｐｏｒｔ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ウェストヤーマス、マサチューセッツ州；Ｉｍｐａｔｈ−ＢＣＰ，フランクリン、マサチューセッツ州；ＰｒｏＭｅｄＤｘ，ノートン、マサチューセッツ州）から入手して、使用するまで−８０℃にて保管した。表２に、血清サンプルの販売元、ならびに個別のドナー人口統計学的情報および卵巣癌患者疾患ステージもまとめる。血清プールは、各プールを構成する個別の血清サンプルを同量組合せて調製した（表１を参照）。血清サンプルの複雑さを、標準キット（ＰｒｏｔｅｏＰｒｅｐ  Ｂｌｕｅアルブミン除去キット、Ｓｉｇｍａ−  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｏ．，セントルイス、ミズーリ州）を使用したアルブミンおよびＩｇＧの除去、またはアニオン交換樹脂であるＱ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆビーズを使用した分画（血清分画キットＫ１００−０００７、Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，フレモント、カリフォルニア州）のどちらかによって低減させた。ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ（Ｃｉｐｈｅｒｇｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）によって、卵巣および正常（対照）血清間でディファレンシャルマスフィンガープリンティングを示したアニオン交換画分を、４倍の体積の冷アセトンを使用したタンパク質沈降にさらに供した。２−Ｄゲル電気泳動用のサンプルは、アセトン沈降タンパク質ペレットの再構成によって、または８Ｍ尿素、２％  ＣＨＡＰＳ、５０ｍＭジチオスレイトール、０．２％  ａｍｐｈｌｏｙｔｅｓ、およびブロモフェノールブルーを含有する標準緩衝液（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，ハーキュリーズ、カリフォルニア州）中へのアルブミン／ＩｇＧ除去血清の希釈によって調製した。緩衝液中の尿素が著しく希釈された場合は、固体チオ尿素を添加して、合せた尿素／チオ尿素濃度を８モルに戻した。
【０１００】
実施例１で述べたように、血清画分は２−Ｄゲル電気泳動の前に、ＣＭ−１０（弱カチオン交換機）、ＩＭＡＣ−３０（金属キレーター；ＣｕＳＯ４によって活性化）、およびＨ５０（疎水性表面）チップを用いて、ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳによって分析した。血清画分の結合後、チップを洗浄、空気乾燥して、次に５０％  ＡＣＮおよび０．０５％  ＴＦＡで調製したシナピン酸によってコーティングした。次にチップをＳＥＬＤＩ−ＴＯＦによって分析した。シトクロムＣ、ミオグロビン、カルボニックアンディドラーゼ、エノラーゼ、ＢＳＡ、およびウシＩｇＧを含有する溶液をピーク分子量決定のための標準として使用した。
【０１０１】
２−Ｄゲル電気泳動：等電点電気泳動（ＩＥＦ）では、処理済み血清サンプルを等電点電気泳動ストリップ（固定化ｐＨ勾配（ＩＰＧ）ストリップ、ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）上で、低電圧下で１２時間に亘って、Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＥＦセル（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用して能動的に装填した。ＩＰＧストリップは、長さが１１または１７ｃｍのどちらかであり、３〜１０または４〜７のｐＨ範囲を有していた。再水和して装填されたＩＰＧストリップを次に、プリセット線形電圧上昇プログラムを使用して等電点電気泳動した。５００ボルト保持工程は、等電点電気泳動されたタンパク質の拡散を防止するために、実際の等電点電気泳動工程の終りにただちに操作されなかったＩＰＧストリップに使用した。等電点電気泳動したストリップを０．５％アガロースオーバーレイに埋め込み、次に小型のプレキャスト４〜２０％または１０〜２０％アクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ「Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ」ゲル）あるいは大型のプレキャスト１０％アクリルアミドゲル（ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ「Ｐｒｏｔｅａｎ  ＩＩ」ゲル）上で二次元電気泳動した。電気泳動は、約４５分間に亘って２００Ｖの一定電圧（小型ゲル）、または約４．５時間に亘って２５ｍＡ／ゲルの一定電流（大型ゲル）のどちらかにおいて、室温にて実施した。ゲルを固定して、市販の銀染色キット（Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｔａｉｎ  Ｐｌｕｓ，ＢｉｏＲａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）を使用して染色した。
【０１０２】
２−Ｄゲル画像比較および切り出し用スポットの選択：ゲルをライトボックス上に置いて、Ｏｌｙｍｐｕｓ  Ｃａｍｅｄｉａ  Ｃ−４０００  ＺＯＯＭデジタルカメラを使用して撮像した。デジタル画像をサイズに関して正規化して、着色して（正常血清プールは赤色および卵巣癌血清プールは青色）、ｈｐデスクジェット６１２７プリンタ（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）を使用して、ｈｐプレミアムインクジェット透明フィルムに印刷した。透明フィルムをオーバーヘッドプロジェクタ上に手動で重ねて、スポット（タンパク質）分布およびパターンの変化について目視検査した。強度が変化したり、一方のサンプルに存在して、他方のサンプルには存在しなかったりした対応するスポットをゲルプラグとして切り出し、外部研究所（Ｊａｎ  Ｅｎｇｈｉｌｄ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ａａｒｈｕｓ，デンマーク）に送付して、タンパク質種の同定のために以下で概説するように処理した。１）卵巣サンプルに存在して、正常サンプルに存在しないスポット、または２）卵巣サンプルにおいて明らかに強度が高いスポットのどちらかを主に重要視した。
【０１０３】
ＭＡＬＤＩまたはＭＳ／ＭＳによる、切り出したスポットタンパク質の同定：切り出したゲルスポットをトリプシンによって、３７℃にて一晩消化した。ペプチドを抽出し、次に脱塩してから、ＭＡＬＤＩ標的に適用して分析した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳまたはＭＳ／ＭＳデータは、Ｑ−Ｔｏｆ  Ｕｌｔｉｍａ  Ｇｌｏｂａｌ装置（Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ／Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，マンチェスター、英国）を使用して得た。ポリエチレングリコール混合物（１．７ｍｇ／ｍｌ  ＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、およびＰＥＧ２０００、および５０％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中の０．２８ｍｇ／ｍｌＮａＩ）を使用して、ｍ／ｚ５０〜３０００の範囲で質量分析計を校正した。各スペクトルは、ｇｌｕ−ｆｉｂｒｉｎｏｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂ（ＭＷ＝１５７０．６７７４）（Ｓｉｇｍａ）を固定質量（ｌｏｃｋ  ｍａｓｓ）として使用して校正した。
【０１０４】
ペプチドフィンガープリンティングでは、質量スペクトルは、陽イオンモードで８００〜３０００ｍ／ｚの範囲に亘って得られる。ペプチドの質量リストを使用して、ローカルＭａｓｃｏｔサーバのＳｗｉｓｓＰｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬまたはＮＣＢＩｎｒタンパク質データベースを、サーチエンジンＭａｓｃｏｔソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ロンドン、英国）（ＲＥＦ＿１）を用いて検索した。検索は、５０ｐｐｍのペプチド質量許容値、システイン残基のカルバミドメチル修飾を用いて実施し、１個のトリプシン開裂消失が許容された。Ｍａｓｃｏｔ確率分析によって、そしてペプチド質量の少なくとも５つの一致を用いて定義された有意なヒットのみ受け入れた。通例、ペプチド質量精度は１０ｐｐｍ以内であった。
【０１０５】
ペプチドフィンガープリンティングによって同定されないタンパク質には、タンデム質量分析を実施した。豊富なＭＳ前駆物質イオンが選択され、ＭＳ／ＭＳデータが得られた。アルゴンを衝突ガスとして使用して、断片化に必要な衝突エネルギーは、ペプチド質量によって５０〜１２０ボルトの範囲であった。ＭＳ／ＭＳデータは、ＭＳ前駆物質イオンをＭＳから得たそのｍ／ｚに固定することによって校正した。断片化ペプチドの得られた質量リストを使用してタンパク質データベースを、サーチエンジンＭａｓｃｏｔソフトウェア（Ｍａｔｒｉｘ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ロンドン、英国）（ＲＥＦ＿１）を用いて検索した。検索は、２Ｄａのペプチド質量許容値、０．８ＤａのＭＳ／ＭＳイオン質量許容値、システイン残基のカルバミドメチル修飾、および１個までの開裂消失を用いて実施した。すべての同定にヒトタンパク質データベースを使用した。
【０１０６】
（結果）
得られたデータを５つの異なるセットに分割した。この分類は、分析した血清プールの同一性および各セットに使用したサンプルの複雑さを低減する方法に基づいていた（表２）。
【０１０７】
全体として、多数のタンパク質を、切り出したゲルスポットのトリプシン消化から同定した。多数の機能分類が示されたが、同定したタンパク質の圧倒的多数が、ヒト血清および血漿中に通例、中程度に豊富であると見なされる。このことは、電気泳動前にアルブミンおよび免疫グロブリンＧ画分が除去された血清の２−Ｄ分析から予想できることと一致する。
【０１０８】
陽性と同定されたタンパク質スポットのリストから、卵巣癌でアップレギュレートされると見なされたスポットを表３に示す。個別のアップレギュレートされたタンパク質スポットは、各データセットからの正常および卵巣サンプル間の２−Ｄゲル画像比較で可視化した（データを示さず）。
【０１０９】
（表）
（表１  個別の血清サンプルデータ）
【０１１０】
【表１】
2008506123.tif 000002
ＵＮＫ−不明
Ｎ／Ａ−適用せず
（表２  ゲルデータセット）
【０１１１】
【表２】
2008506123.tif 000003
ＡＥＸ−Ｑ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆビーズを使用するアニオン交換
（表３  ２−Ｄゲル電気泳動によって卵巣癌でアップレギュレートされたとして同定されたタンパク質）
【０１１２】
【表３】
2008506123.tif 000004
明細書で挙げたすべての刊行物および特許出願は、本発明が属する技術分野の当業者の水準を示す。すべての刊行物および特許出願は、個別の刊行物および特許出願それぞれが具体的および個別に本明細書中で参考として援用されることが示されているかのように、同じ程度まで本明細書中で参考として援用される。
【０１１３】
上記発明は、理解を明瞭にする目的で例証および実施例の形である程度詳細に説明されているが、添付した実施形態の範囲内で変更および改良を実施できることが明らかであろう。
【配列表】
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【国際調査報告】
2008506123.tif 000005
2008506123.tif 000006
2008506123.tif 000007
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