(57)【要約】本発明は、向上した有効性を示す超多価ペプチドに関するものである。超多価化合物は、レセプター標的に結合して、大型のポリマー担体ユニットに結合される、複数の少なくとも２価のペプチドユニットを含む。標的分子に結合し：ｉ）少なくとも２個のペプチドユニットであって、標的への結合能力を備えた少なくとも２個のドメイン（それゆえ少なくとも２個のモノマー結合ユニット）を含むペプチドユニットと、ｉｉ）少なくとも１個のポリマー担体ユニットと；を含み、前記ペプチドユニットが前記ポリマー担体ユニットに結合される化合物を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）それぞれ標的への結合能力を備えた２個のドメインを含む、少なくとも２個のペプチドユニットと；
（ｉｉ）少なくとも１個のポリマー担体ユニットと；
を含み、該ペプチドユニットが該ポリマー担体ユニットに結合されている、標的分子へ結合する化合物。
【請求項２】
前記標的分子がレセプター分子であり、好ましくは膜貫通レセプターである、請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
前記ペプチドユニットが前記レセプターと結合して、レセプターアンタゴニストまたはレセプターアゴニストのいずれかとして作用する、請求項２に記載の化合物。
【請求項４】
前記ペプチドユニットがアミノ酸約２００個以下の、アミノ酸約１５０個以下の、アミノ酸約１００個の、またアミノ酸約５０個以下の長さを有する、請求項１〜３の一項に記載の化合物。
【請求項５】
前記ポリマーユニットがペプチドユニット約５０個以下、ペプチドユニット２５個以下、ペプチドユニット１５個以下、ペプチドユニット１０個以下、好ましくはペプチドユニット２〜６個を有する、請求項１〜４の一項に記載の化合物。
【請求項６】
前記担体ユニットが少なくとも１つの天然または合成分岐、樹状または直鎖ポリマーであるか、少なくとも１つの天然または合成分岐、樹状または直鎖ポリマーを含み、好ましくはポリグリセリン、ポリシアリン酸、デキストラン、ポリサッカライド、デンプンまたはポリエチレングリコールから成る群より、あるいは他の生物不活性水溶性ポリマーから選択される、請求項１〜５の一項に記載の化合物。
【請求項７】
前記ポリマー担体ユニットが分岐ユニットを含み、該分岐ユニットは好ましくはグリセロールまたはポリグリセロールを含む、請求項１〜６の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項８】
前記担体分子が少なくとも５ｋＤ、好ましくは２０〜２００または４０００ｋＤの分子量を有し、ポリエチレングリコールなどのより小さい担体が使用される場合には２０〜８０ｋＤの分子量を有する、先行請求項１〜７の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項９】
前記担体ユニットが少なくとも２個のポリマーサブユニットより構成され、該ポリマーサブユニットが少なくとも１個の生分解性共有結合リンカー構造を介して結合される、先行請求項１〜８の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項１０】
第１の生分解性担体ユニットを含み、ペプチドユニットおよび第２のポリマー担体ユニットが該第１のポリマー担体ユニットに結合される、請求項１〜９の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項１１】
前記第２の担体ユニットは前記第１の担体ユニットよりも小さい分子量を有し、好ましくはＨＥＳである該第１の担体ユニットの結合部位の約２０〜５０％が、好ましくは分子量約３〜１０ｋＤのＰＥＧである該第２の担体ユニットによって占有される、請求項１０に記載の化合物。
【請求項１２】
修飾ポリマー担体ユニットが使用される、請求項１〜１１の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項１３】
前記ペプチドユニットが共有結合を介して前記ポリマー担体ユニットに結合され、結合が該ペプチドユニットの反応性アミノ酸、Ｎ末端アミノ基および／またはＣ末端カルボン酸を介して発生し、該反応性アミノ酸が好ましくは、リジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニンおよびチロシンから成る群より選択され、
該ポリマー担体ユニットが適切な反応性カップリング基を持たない場合、カップリングユニットが該ポリマー担体ユニットを修飾するために使用され、
該カップリングユニットが好ましくは、該ペプチドユニットのアミノ基と反応するアシル化基、該ペプチドユニットにおけるスルフヒドリル（メルカプト）、チオメチル、イミダゾまたはアミノ基と反応するアルキル化基、最も好ましくはマレイミド基、タンパク質のカルボキシル基と反応するエステルおよびアミド形成基、該ペプチドユニットのスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基、たとえば５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンゾアート）基、オルトピリジルジスルフィドおよびアルキルメルカプタン基、ジカルボニル基、たとえばシクロヘキサンジオン基、ならびに該ペプチドユニットのグアニジン部分と反応する他の１，２−ジケトン基；該ペプチドにおけるフェノール性基と反応するジアゾ基；該ペプチドユニットのアミノ基と反応する、臭化シアノゲンと前記ポリマー担体ユニットとの反応からの反応性基から成る群より選択される；
請求項１２に記載の化合物。
【請求項１４】
前記反応性アミノ基がシステインであり、前記カップリング基がマレイミドである、請求項１３に記載の化合物。
【請求項１５】
前記ペプチドの少なくとも１つがホモダイマーレセプターまたはマルチマーレセプターに結合し、好ましくはエリスロポエチンレセプター（ＥＰＯＲ）、トロンボポエチンレセプター（ＴＰＯＲ）、顆粒球コロニー刺激因子レセプター（Ｇ−ＣＳＦＲ）、成長ホルモンレセプター（ＧＨＲ）、およびプロラクチンレセプター（ＰｒＲ）を含む、多数のクラスＩサイトカインレセプターに結合する、請求項１〜１４の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項１６】
前記ペプチドユニットの少なくとも１つが、ヘテロダイマーまたはマルチマーレセプター、たとえばインターロイキンレセプターに結合する、請求項１〜１４の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項１７】
前記ペプチドユニットがＥＰＯレセプターに結合して、ＥＰＯレセプターを活性化し、ＥＰＯ模倣ペプチドから成る群より選択される、請求項１〜１４の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項１８】
前記ペプチドユニットの少なくとも１つが以下のアミノ酸配列：
【化１】
2008546732.tif 000056
（式中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され；
Ｘ６は、Ｃ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的交換であり；
またはＸ９およびＸ１０は、単一のアミノ酸によって置換され；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、ＴまたはＡであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、Ｃ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、Ｘ３またはＸ８が、Ｃまたはｈｏｃであるという条件である）によって特徴付けられた結合ドメインを含む、請求項１７に記載の化合物。
【請求項１９】
前記ペプチドユニットの少なくとも１つが次のアミノ酸配列：
【化２】
2008546732.tif 000057
式中、各アミノ酸は標準文字省略形によって示され、そしてＸ６はＣであり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、ＬまたはＷであり；
Ｘ８は、Ｍ、ＦまたはＩであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的交換であり；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸から独立して選択され；
Ｘ１２は、Ｔであり；
Ｘ１３は、Ｗであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、Ｃであり；
またはＸ９およびＸ１０は、単一のアミノ酸によって置換される）によって特徴付けられた結合ドメインを含む、請求項１７に記載の化合物。
【請求項２０】
前記ペプチドユニットの前記結合ドメイン（モノマー結合ユニット）がリンカー構造、好ましくは連続ペプチドリンカーを介して内部結合される、先行請求項１〜１９の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項２１】
前記ペプチドユニットの少なくとも１つが次のペプチドの群：
【化３】
2008546732.tif 000058
【化４】
2008546732.tif 000059
（式中、Ｘは、１−ナフチルアラニンであり、Ｕは、２−ナフタレンであり、ここで５−アミノレブリン酸は：
【化５】
2008546732.tif 000060
である）より選択される結合ドメインを含む、先行請求項１７〜２０の少なくとも一項に記載の化合物。
【請求項２２】
製薬組成物の調製のための、請求項１〜２１の少なくとも一項に記載の化合物の使用。
【請求項２３】
エリスロポエチンの欠乏あるいは少ないまたは欠陥のある赤血球集団を特徴とする障害の予防または治療用の、そして特に貧血および脳卒中のいずれの種類の治療用の製薬組成物の調製のための、ＥＰＯレセプターに結合して、ＥＰＯレセプターを活性化するペプチドユニットを保持する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物の使用。
【請求項２４】
トロンボポエチンの欠乏を特徴とする障害の予防または治療用の、そして特に血小板減少症、顆粒球減少症および貧血を含む血液疾患の治療用の製薬組成物の調製のための、ＴＰＯレセプターに結合して、ＴＰＯレセプターを活性化するペプチドユニットを保持する、請求項１〜２１の少なくとも一項に記載の化合物の使用。
【請求項２５】
請求項１〜２１の少なくとも一項に記載の化合物および場合により製薬的に許容される担体を含む、製薬組成物。
【請求項２６】
（ｉ）少なくとも２個のペプチドユニットであって、それぞれ標的への結合能力を備えた少なくとも２個のドメインを含むペプチドユニットを生成するステップと；
（ｉｉ）少なくとも１個のポリマー担体ユニットを生成するステップと；
（ｉｉｉ）前記ペプチドユニット前記ポリマー担体ユニットに結合させるステップと；
を含む、請求項１〜２１の少なくとも一項に記載の化合物を産生する方法。
【請求項２７】
前記ペプチドユニットが連続ペプチド鎖として合成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
少なくとも１個の化学基をその上に有するポリマー担体ユニットが使用され、該少なくとも１個の化学基が前記ペプチドユニット上の利用可能な化学基と反応して、次に反応性ポリマー担体ユニットおよびペプチドユニットを共に反応させて、ポリマー担体ユニットの化学基を利用するその共有結合された錯体を形成することができる、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ポリマー担体が、酸化されている修飾デンプン分子であり、アミノ基が該デンプン主鎖に導入されており、前記アミノ基がリンカー基、好ましくはマレイミド基の導入によって修飾される、請求項２６〜２８に記載の方法。
【請求項３０】
酸化が、デンプン分子にオキソアンモニウムを産生する試薬を酸化剤の存在下で接触させることによって、または開始物質に反応性種、オキソアンモニウムイオンを直接接触させることによって達成される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
酸化剤が次亜塩素酸および次亜臭素酸ナトリウムなどの次亜ハロゲン化物または過酸化水素などの化学酸化剤あるいは酸化酵素である、請求項３０に記載の化合物。
【請求項３２】
オキサアンモニウムイオンを産生する試薬が、好ましくはニトロキシル化合物、さらに好ましくはジ−ｔｅｒｔ−ニトロキシル化合物、たとえば２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）またはその誘導体である、請求項３０または３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はペプチド化合物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
タンパク質に関する研究の発展に伴い、各種の生物的および製薬的活性を有する非常に多くのペプチドが見出されている。これらのペプチドのいくつかは、たとえばレセプター分子（たとえばサイトカインレセプター）などの標的分子への結合を介してその作用を実行する。
【０００３】
造血成長因子（ＨＧＦ）は臨床的に好結果の治療法であることが判明している；しかしながらそのサイズ（１５〜７０ｋＤａ）、立体配座不安定性、タンパク質分解に対する感受性、不十分な膜透過、抗原性、高い製造コスト、および好ましくない薬物動態は、それらを理想的な薬物候補とはほど遠くしうる。さらに未変性タンパク質の不十分な生物学的利用能は、それらが非経口的に投与されることを必要とする。しかしながらそのポリペプチド対照物と等効力であるが、大型タンパク質の固有の欠点の一部を欠いている、ＨＧＦレセプターの小型分子アゴニスト（およびアンタゴニスト）を開発することが好都合である。サイトカインレセプターに結合して、サイトカインレセプターを活性化させるより小型のペプチドの同定および検査も、リガンド−レセプター相互作用のより優れた知識を提供する。この情報は、経口的に利用可能な小型分子サイトカイン模倣薬を合理的に設計するために使用される。成長因子およびサイトカインの膜貫通レセプターの活性化は、リガンドがレセプターの特異的領域に結合するときに発生し、それにより立体配座変化を誘発し、レセプター鎖のダイマー化またはオリゴマー化を引き起こす。リガンド結合時に、クラスＩサイトカインレセプターの複数のメンバは、エリスロポエチンレセプター（ＥＰＯＲ）、トロンボポエチンレセプター（ＴＰＯＲ）、顆粒球コロニー刺激因子レセプター（Ｇ−ＣＳＦＲ）、成長ホルモンレセプター（ＧＨＲ）、およびプロラクチンレセプター（ＰｒＲ）を含むホモダイマーを形成する。ダイマー化インタフェースの正確な詳細および非リガンド型レセプターがダイマーとして存在する程度を見出すことに対して行われる複数の研究が報告されている。これらの研究の結果は、クラスＩサイトカインレセプター間の構造的および機能的類似点を示している。研究は、レセプターダイマー化単独では、細胞間シグナル伝達には必要であるが、シグナル伝達を生成するには不十分であることも示している。最近の報告は、小型分子およびペプチドの両方がホモダイマーサイトカインに結合して、アゴニストとして作用し、天然タンパク質の効果を模倣することによってホモダイマーサイトカインを活性化させうること報告している（非特許文献１：非特許文献２を参照）。しかしながらその生物活性は天然分子に劣ることが多い。結果として、模倣分子の生物活性を改善する試みが行われる。
【０００４】
そのようなペプチドの好結果の例としては、エリスロポエチンレセプターを結合してエリスロポエチンの機能を模倣するペプチドおよびトロンボポエチンレセプターを結合してトロンボポエチンの機能を模倣するペプチドが挙げられる。
【０００５】
ホルモンエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、１６５個のアミノ酸によって構成され、４個のグリコシル化部位を有する糖タンパク質である。ＥＰＯは有糸分裂および赤血球前駆細胞の分化を刺激し、それゆえ赤血球の産生を確実にする。ＥＰＯおよび組換えＥＰＯの使用は免疫原性反応を含む複数の欠点を有するので、ＥＰＯとの配列相同性または構造的関係を一切共有しないが、いずれにしてもＥＰＯ−Ｒと結合および相互作用する合成ペプチドが使用される（たとえばＷｒｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照）。ＥＰＯの活性を模倣する合成ペプチド（「ＥＰＯ模倣ペプチド」）は今のところ、到達水準で周知である（たとえば特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８を参照）。
【０００６】
ＥＰＯおよびＥＰＯ模倣ペプチドは、レセプターの細胞外ドメインを結合して、おそらく２個のレセプターモノマーをレセプター錯体にダイマー化して、それによりシグナル伝達を開始することによって、ＥＰＯレセプターを活性化する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。ＥＭＰ１（周知のＥＰＯ模倣ペプチド）に結合したＥＰＯレセプターの結晶構造は、２個のレセプターモノマーに結合した２個のペプチドより成るレセプターペプチド錯体の形成を明らかにした。それゆえ単一の分子内のこれらの結合ドメインの厳密に２個の組合せが活性を非常に上昇させて、単一の結合ドメインを持つペプチドが活性の同じ定性的パターンを示し、それと同時に結合ドメイン結合部の２個が共にはるかに低いＥＤ５０（有効用量５０％、活性の尺度）を示すという結果に至ることは、それほど驚きではない。
【０００７】
たとえばＥＰＯまたはＴＰＯ模倣ペプチドの各ペプチドダイマーの調製方法も到達水準で周知であり、たとえばＰＥＧ化によるダイマー化からジスルフィド架橋またはリジン側鎖の範囲にあたる（たとえば特許文献１；特許文献２；特許文献３；特許文献４；特許文献５；特許文献６；特許文献７；特許文献８，Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；特許文献９）。これらのすべての方法は、活性ダイマーまたはなおマルチマーレセプター錯体の形成を促進する所望のダイマーまたはなおマルチマー分子を得るために、リンカー構造を介してモノマーペプチドを結合する。
【０００８】
モノマーユニットを結合するための同様の概念は、他の結合分子についても既知である（たとえば特許文献１０を参照）。各ダイマーまたはマルチマーレセプター錯体と相互作用可能である分子を産生するために、本出願は、各レセプター錯体との相互作用を可能にする（およびたとえばレセプターのダイマー化またはトリマー化を誘発する）空間関係でモノマーレセプター結合ドメインを連結する目的で小型支持構造を使用することを教示する。
【０００９】
しかしながらモノマーペプチドユニットのダイマー化（またはマルチマーレセプターの場合にはマルチマー化さえ）が通常、各モノマーペプチドに対する活性を改善しても、活性をさらに向上させることが所望である。たとえばダイマーＥＰＯ模倣ペプチドさえ、細胞機構の活性化に関してはＥＰＯ分子よりも、なおはるかに強力ではない。
【００１０】
到達水準では、１個以上の親水性担体ユニット（たとえばＰＥＧ）をペプチドにカップリングすることも既知である。ペプチドが親水性ポリマーによって誘導体化されるときに、その溶解性および循環半減期が上昇して、その免疫原性が低下することが見出されている（たとえば特許文献９を参照）。しかしながら、そのような親水性担体の結合が生物活性を低下させうることも報告されている。生物活性の上昇は報告されていない。
【特許文献１】国際公開第９６／４０７７２号パンフレット
【特許文献２】国際公開第９６／４０７４９号パンフレット
【特許文献３】国際公開第０１／３８３４２号パンフレット
【特許文献４】国際公開第０１／０９１７８０号パンフレット
【特許文献５】国際公開第２００４／１０１６１１号パンフレット
【特許文献６】国際公開第２００４／１００９９７号パンフレット
【特許文献７】国際公開第２００４／１０１６００号パンフレット
【特許文献８】国際公開第２００４／１０１６０６号パンフレット
【特許文献９】国際公開第９８／２５９６５号パンフレット
【特許文献１０】国際公開第２００４／０１４９５１号パンフレット
【非特許文献１】Ｌａｂｅｒ，Ｅ．Ｇ．（２００４）．Ｓｍａｌｌ−Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ａｎｄ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ａｇｏｎｉｓｔｓ
【非特許文献２】Ｇ．  Ｍｏｒｓｔｙｎ，Ｍ．Ｆｏｏｔｅ  ａｎｄ  Ｇ．Ｊ．Ｌｉｅｓｃｈｋｅ  Ａ  Ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗ．Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ−Ｂａｓｉｃ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．：６５−８０
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
より強力な候補を同定するために、たとえばアミノ酸配列の変異によってペプチドの活性を上昇させるための複数の手法が実施された。しかしながらこれまで、ペプチド、特にＥＰＯまたはＴＰＯ模倣ペプチドの活性を向上させるための適切な溶液は到達水準では知られていない。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
それゆえ本発明の目的は、レセプター標的に結合して、上昇した活性を有するペプチド化合物を供給することである。
【００１３】
該目的は、標的分子に結合し：
ｉ）少なくとも２個のペプチドユニットであって、標的への結合能力を備えた少なくとも２個のドメイン（それゆえ少なくとも２個のモノマー結合ユニット）を含むペプチドユニットと、
ｉｉ）少なくとも１個のポリマー担体ユニットと；
を含み、前記ペプチドユニットが前記ポリマー担体ユニットに結合される、化合物によって解決される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
驚くべきことに、ポリマー支持体上の２個以上の２価または多価ペプチドは、２価（またはなお多価）ペプチドが、通常はレセプター分子である各標的を結合する有効性を相加的にというだけではなく、過剰相加的にさえ大幅に向上させていることが見出されている。それゆえ結合有効性に対する相乗効果が観察される。
【００１５】
「２価の」という用語は、本発明の目的で使用するように、通常はレセプターである標的への結合能力を備えた２個のドメインを含むペプチドとして定義される（それゆえ以下ではこの語が使用されるであろう）。「２価の」という用語は、「ダイマーの」という用語と互換的に使用される。したがって「多価」または「マルチマー」ペプチドは、複数の各結合部位およびそれゆえモノマー結合部位を有する。「ペプチド」および「ペプチドユニット」という用語がサイズに関するいずれの制限も含まず、タンパク質と同様にオリゴおよびポリペプチドを含むことは自明である。しかしながら、担体ユニットに結合されたペプチドユニットは、アミノ酸約２００個以下の、またはアミノ酸約１５０個以下の、さらに好ましくはアミノ酸約１００個の、またなおアミノ酸５０個以下の長さを有する。
【００１６】
ポリマー担体ユニットに結合された２個以上の２価または多価ペプチドユニットを含む化合物は、本発明の文脈では「超多価（ｓｕｐｒａｖａｌｅｎｔ）」と命名される。超多価分子は、到達水準で既知のダイマーまたはマルチマー分子と大きく異なる。到達水準は、ダイマーまたはマルチマーを作るために複数の単なるモノマーペプチドユニットを結合させる。これに対して超多価分子は、すでに（少なくとも）２価のペプチドユニットをポリマー担体ユニットに連結させて、それにより複数のダイマーまたはマルチマーペプチドユニットを持つ超多価分子を生成することによって産生される（本概念の例証された例を図１３〜１５に与える）。それによりダイマーまたはマルチマーペプチドの全体の活性および有効性は大幅に向上して、それゆえＥＣ５０用量を低下させる。
【００１７】
これまで、到達水準で既知のダイマーまたはマルチマー分子と比較した超多価分子の高い効力の理由は完全に理解されていない。それは到達水準で既知のダイマー分子（たとえばダイマーＥＰＯ模倣ペプチド）が、化合物分子当たり１個の活性レセプター結合ユニットそれぞれにただ１個の標的を与えるという事実によるものでありうる。それゆえただ１個の（ダイマー）レセプター錯体がダイマー化合物の結合時に産生され、それにより細胞内でただ１つのシグナル伝達プロセスを誘発する。たとえば２個のモノマーＥＰＯ模倣ペプチドがＰＥＧによって連結されてペプチドダイマーを生成し、それによりシグナル伝達に必要なレセプターモノマーのダイマー化を促進する（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７）。
【００１８】
これに対して本発明による超多価化合物は、複数のすでにダイマーまたはマルチマーレセプター結合部位を含む。本発明による超多価化合物はそれゆえ、複数の（２価または多価）レセプター結合ユニットを持つ。担体に結合された各ダイマーまたはマルチマーペプチドユニットは、１個のレセプター結合ユニットを表す。これは化合物分子当たり細胞表面上での複数のレセプター錯体の産生を可能にして、それにより複数のシグナル伝達を誘発（またはアンタゴニストの場合には遮断）して、それによりペプチドユニットの活性を過剰相加的に強化する。超多価化合物の結合は、細胞表面でのレセプター錯体のクラスター形成を引き起こしうる。
【００１９】
本発明によるペプチドユニットは、同種または異種のどちらかであり、同一または異なるペプチドユニットのどちらかがポリマー担体に結合されることを意味する。同じことが同種または異種でありうるペプチドユニットの結合ドメインにも当てはまる。同種結合ドメイン（モノマー）は、同一のタンパク質サブユニットより構成される標的レセプター（たとえばホモダイマーＥＰＯレセプター）が結合されている場合に好ましい。しかしながら同種結合ドメインのアミノ酸配列は、それらが同じレセプター標的を結合する（そしてそれゆえ機能的に同種である）場合でも、なお変化しうる。異種結合ドメイン（モノマー）は、異なるタンパク質サブユニットより構成される標的レセプター（たとえばヘテロダイマーインターロイキンレセプター）が結合されている場合に好ましい。好ましくは担体ユニットに結合した２価または多価が同じレセプター標的を結合する。しかしながらそれらはもちろんそのアミノ酸配列がなお異なりうる。２価または多価ペプチドユニットのモノマー結合ユニットは、直鎖または環式のどちらかでありうる。環式分子はたとえば分子内システイン架橋の形成によって生成されうる。
【００２０】
ポリマー担体ユニットは、少なくとも１つの天然または合成分岐、直鎖または樹状ポリマーを含む。ポリマー担体ユニットは好ましくは水および体液に溶解性であり、好ましくは製薬的に許容されるポリマーである。水溶性ポリマー部分としては、これに限定されるわけではないが、たとえばＰＥＧ、ＰＥＧホモポリマー、ｍＰＥＧ、ポリプロピレングリコールホモポリマー、エチレングリコールとプロピレングリコールのコポリマーを含み、前記ホモポリマーおよびコポリマーが非置換であるか、または１端にてたとえばアシル基によって置換される、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体；ポリグリセリンまたはポリシアル酸；炭水化物、ポリサッカライド、メチルセルロースおよびカルボキシメチルセルロースを含むセルロースおよびセルロース誘導体；デンプン（たとえばヒドロキシアルキルデンプン（ＨＡＳ）、特にヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）およびデキストリン、ならびにその誘導体；硫酸デキストラン、架橋デキストリン、およびカルボキシメチルデキストリンを含むデキストランおよびデキストラン誘導体；キトサン（直鎖ポリサッカライド）、ヘパリンおよびヘパリンの断片；ポリビニルアルコールおよびポリビニルエチルエーテル；ポリビニルピロリドン；アルファ、ベータ−ポリ［（２−ヒドロキシエチル）−ＤＬ−アスパルタミド；ならびにポリオキシエチル化ポリオールが挙げられる。担体ユニットの一例は、たとえばポリエチレングリコールのホモ２官能性ポリマー（ビスマレイミド、ビスカルボキシ、ビスアミノなど）が挙げられる。
【００２１】
本発明によるペプチドユニットに結合されるポリマー担体ユニットは、本発明と併せて適切である異なるポリマーの異なる性質のために、広範囲の分子量を有しうる。それゆえサイズ制限はない。しかしながら分子量が少なくとも３ｋＤ、好ましくは少なくとも１０ｋＤ、おおよそ約２０〜５００ｋＤ、より好ましくは約３０〜１５０あるいは６０または８０ｋＤであることが好ましい。担体ユニットのサイズは、選択されたポリマーに依存し、それゆえ変化しうる。たとえば特にヒドロキシエチルデンプンなどのデンプンが使用されるとき、分子量は相当により高くなりうる。そして平均分子量は、約１００〜４０００ｋＤに配置されるが、またはなお高くなりうる。しかしながらＨＥＳ分子の分子量が約１００〜３００ｋＤ、好ましくは約２００ｋＤであることが好ましい。担体ユニットのサイズは好ましくは、各ペプチドユニットがその各レセプター分子を結合するためにそれぞれ最適に配置されうるように選択される。
【００２２】
これを促進するために、本発明の一実施形態は分岐ユニットを含む担体ユニットを使用する。本実施形態により、たとえばＰＥＧなどのポリマーは分岐ユニットに結合され、それゆえ多数のペプチドユニットの包含を可能にする大型担体分子を生じさせる。適切な分岐ユニットの例はグリセロールまたはポリグリセロールである。たとえば参照により本明細書に組み入れられているＨａａｇ  ２０００によって教示されたような樹状分岐ユニットも使用されうる。ＨＥＳ担体も分岐形で使用されうる。これはたとえばアミロペクチンから高い割合で得られる。
【００２３】
好ましくはモノマー結合ユニットをペプチドユニットに結合する（頭−頭、頭−尾、または尾−尾のいずれか）ことによってペプチドユニットが生成された後に、ポリマー担体ユニットはペプチドユニットに連結／カップリングされる。ポリマー担体ユニットは共有または非共有（たとえば配位）結合によってペプチドユニットに連結される。しかしながら共有結合の使用が好ましい。
【００２４】
結合はペプチドの反応性アミノ酸、たとえばリジン、システイン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、トレオニン、チロシンまたはＮ末端アミノ基およびＣ末端カルボン酸を介して生じうる。ペプチドが各反応性アミノ酸を持たない場合、そのようなアミノ酸はアミノ酸配列中に導入されうる。カップリングは、標的への結合が阻害されない、または少なくとも可能な限り少なく阻害されるように選択すべきである。ペプチドユニットの高次構造に応じて、反応性アミノ酸はペプチド配列の始点、終点または内部のいずれかにある。
【００２５】
ポリマー担体ユニットが適切なカップリング基を持たない場合、ポリマーがペプチドユニットの少なくとも１個の反応性基と反応して超多価化合物を形成できるようにポリマーを適切に修飾するために、複数のカップリング物質／リンカーが使用されうる。ポリマーを修飾するために使用されうる適切な化学基はたとえば次の通りである：
タンパク質のアミノ基と反応するアシル化基、たとえば酸無水物基、Ｎ−アシルイミダゾール基、アジド基、Ｎ−カルボキシ無水物基、ジケテン基、ジアルキルピロカーボネート基、イミドエステル基、およびカルボジイミド活性化カルボキシル基。上の基はすべて、タンパク質／ペプチドのアミノ基と反応して、アシルまたは同様の連結を形成することが既知である；
ペプチドユニットのスルフヒドリル（メルカプト）、チオメチル、イミダゾまたはアミノ基と反応するアルキル化基、たとえばハロカルボキシ基、マレイミド基、活性化ビニル基、エチレンイミン基、アリールハライド基、２−ヒドロキシ５−ニトロ−ベンジルブロミド基；ならびに還元剤と共にペプチドのアミノ基と反応する脂肪族アルデヒドおよびケトン基；
ペプチドのカルボキシル基と反応するエステルおよびアミド形成基、たとえばジアゾカルボキシラート基、ならびに同時にカルボジイミドおよびアミノ基；
タンパク質のスルフヒドリル基と反応するジスルフィド形成基、たとえば５，５’−ジチオビス（２−ニトロベンアゾアート）基、オルトピリジルジスルフィドおよびアルキルメルカプタン基（ヨウ素などの酸化剤の存在下でペプチドのスルフヒドリル基と反応する）；
シクロヘキサンジオン基などのジカルボニル基、およびタンパク質のグアニジン部分と反応する他の１，２−ジケトン基；
ペプチドのフェノール性基と反応するジアゾ基；
タンパク質のアミノ基と反応する、シアノゲンブロミドとポリサッカライドとの反応による反応性基。
【００２６】
それゆえ要約すると、本発明の化合物は場合により、最初にペプチドユニットの利用可能なまたは導入された化学基と反応できる少なくとも１個の化学基をその上に有するポリマー担体を産生するために、ポリマー担体を化学的に修飾するステップと、次に必要ならば修飾されたポリマーの化学基を利用してその共有結合錯体を形成するために、場合により修飾されたポリマーおよびペプチド単位を共に反応させるステップとによって作製されうる。
【００２７】
ペプチドの遊離ＳＨ基を介してカップリングが発生する場合、ポリマー中のマレイミド基の使用が好ましい。
【００２８】
定義された分子を生成するために、ペプチドユニットをポリマーユニットへ結合させるための標的化手法を使用することが好ましい。適切なアミノ酸が所望の結合部位に存在しない場合、適切なアミノ酸をぺプチド単位に包含させるべきである。部位特異的ポリマー結合では、複数の異なるポリマー分子の集合を含む異種混合物をもたらすペプチドでの制御されないカップリング反応を回避するために、独自の反応性基、たとえばペプチドユニットの末端にある特異性アミノ酸が好ましい。
【００２９】
ペプチドユニットのポリマー担体ユニット、たとえばＰＥＧまたはＨＥＳへのカップリングは、当業者にたいてい既知である反応を使用して実施される。たとえば当業者が利用できる多数のＰＥＧおよびＨＥＳ結合方法がある（たとえばさらなる参考文献を与えるＷＯ  ２００４／１００９９７、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；ＵＳ  ４，０６４，１１８；ＥＰ  １  ３９８  ３２２；ＥＰ  １  ３９８  ３２７；ＥＰ  １  ３９８  ３２８；ＷＯ  ２００４／０２４７６１を参照；すべて参照により本明細書に組み入れられている）。
【００３０】
本明細書に記載された超多価の概念がＰＥＧ化またはＨＥＳ化の既知の概念とは異なることを理解することが重要である。到達水準において、たとえばＰＥＧ化は、ペプチドダイマーを産生するために、または１個以上のＰＥＧユニットをペプチドに結合させることによって薬理動態的パラメータを改善するために、のどちらかのみに使用される。しかしながら上で概説したように、２個以上の少なくとも２価のペプチドユニットの、ポリマー担体ユニットとしてのたとえばＨＥＳへの結合も有効性を大幅に上昇させる（それゆえＥＣ５０用量を低下させる）。それゆえ本発明の概念は、到達水準で既知のＰＥＧ化またはＨＥＳ化概念の場合と同様に、薬理動態的パラメータに対してだけでなく、薬力学的パラメータに対して強い効果を有する。しかしながらもちろん、ポリマー担体ユニットとしてのたとえばＰＥＧまたはＨＥＳの包含も、薬物動態学に関して既知の利点を有する。
【００３１】
ＰＥＧ化は通常、ペプチドの生物薬剤学的特性を改善するために行われる。ＰＥＧコンジュゲーション後のタンパク質分子の最も妥当な改変は、サイズ拡張、タンパク質表面およびグリコシル化機能マスキング、電荷変更ならびにエピトープ遮蔽である。特にサイズ拡張は、受動的強化透過および保持機構により、腎臓限外濾過を減速して、透過性組織内への蓄積を促進する。タンパク質遮蔽は、重要な排出経路であるタンパク質分解および免疫系認識を低下させる。タンパク質物理化学的および生物学的特性に対するＰＥＧ化の特異的効果は、タンパク質およびポリマー特性によってはもちろんのこと、採用されたＰＥＧ化方法によっても厳密に決定される。
【００３２】
しかしながら、ＰＥＧまたは他の非生分解性ポリマーの使用は新たな問題を引き起こしうる。
【００３３】
生体内利用の間、臨床状況での投薬間隔は薬物の効果の消失によって引き起こされる。日常的な投薬量および投薬間隔は、効果が投薬間隔中に消失しないように調整される。非生分解性の大型ポリマーユニット（たとえばＰＥＧ部分）に結合したペプチドが、支持体分子が体によって排出されうるよりも高速で分解されうるという事実により、担体の蓄積のリスクが発生しうる。そのような蓄積のリスクは、薬物の有効な半減期が薬物事態またはその成分／代謝産物の１つの排出半減期よりも短いときに、常に発生する。それゆえペプチドは通常、非常に大型のＰＥＧ部分（〜２０〜４０ｋＤ）によってＰＥＧ化され、それゆえ低速の腎臓排出を示すので、担体分子の蓄積は、特に長期治療では回避すべきである。ペプチド部分自体は酵素分解を受け、ペプチドを不活性化するためには部分開裂ですら十分であろう。
【００３４】
本潜在的な問題への解決策を見出すために、本発明の一実施形態は、少なくとも２個のサブユニットより構成されるポリマー担体ユニットの使用を教示する。ポリマーサブユニットは、生分解性共有リンカーまたは構造を介して連結される。本実施形態により、大型担体分子の分子量（たとえば４０ｋＤ）が、生分解性リンカーによって結合される複数の小型または中型サブユニット（たとえば５〜１０ｋＤの分子量を有する各サブユニット）によって生成される。モジュラーサブユニットの分子量は合計され、それにより担体分子の所望の分子量を生じる。しかしながら生分解性リンカー構造は、体内で分解して、それにより小型の担体サブユニット（たとえば５〜１０ｋＤ）を放出しうる。より小型の担体サブユニットは、全体の分子量（たとえば４０ｋＤ）を有するポリマー分子よりも良好な腎クリアランスを示す。例証する例を図１６に与える。
【００３５】
リンカー構造は、既知の分解特性および体液中での分解のタイムスケールに従って選択される。分解性構造はたとえば、加水分解によって開裂されうるアミド／ペプチド結合またはエステルなどのカルボン酸誘導体のような開裂性基を含有する（たとえば参照により本明細書に組み入れられているＲｏｂｅｒｔｓ，２００２を参照）。ＰＥＧスクシンイミジルエステルも、生理学的ｐＨにおける分解速度を制御するためにＰＥＧ主鎖中の各種のエステル連結によって合成されうる（参照により本明細書に組み入れられているＺｈａｏ，１９９７）。ベンジルウレタンのジスルフィドのような他の分解性構造は、細胞のエンドソームコンパートメントにおいてなどの軽度の還元環境下で開裂可能であり（Ｚａｌｉｐｓｋｙ，１９９９）、それゆえまた適切である。適切なリンカーの選択のための他の基準は、高速（頻繁には酵素）分解または低速（頻繁には非酵素分解（ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ））分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）に関する選択である。体液中でのこれらの２つの機構の組合せも可能である。この高度に好都合な概念は、本明細書で記載または言及された特定のペプチドユニットに限定されず、同じ蓄積問題が発生するＰＥＧ分子などの大型ポリマーユニットに結合された他の製薬的分子にも当てはまることが明らかである。
【００３６】
一実施形態により、ヒドロキシアルキルデンプンおよび好ましくはＨＥＳはポリマー担体ユニットとして使用される。ＨＥＳは複数の重要な利点を有する。第一に、ＨＥＳは生分解性である。さらにＨＥＳの生分解性は、ヒドロキシエチル基の比によって制御可能であり、それゆえ影響を及ぼされうる。０．４〜０．８のモル置換度（平均でグルコースユニットの４０〜８０％がヒドロキシエチル基を含有する）は、本発明の目的に十分適している。生分解性のために、上述の蓄積問題はＰＥＧと併せては通常発生しない。さらにＨＥＳはたとえば血漿増量剤として内科療法で長期にわたって使用されている。それゆえその無害性が認められている。
【００３７】
さらにＨＥＳの加水分解生成物の誘導体はガスクロマトグラフィーによって検出されうる。ＨＥＳ−ペプチドコンジュゲートは、ペプチドユニットがなお安定である条件下で加水分解されうる。これは分解生成物の定量化および監視を可能にして、活性ペプチドの評価および標準化を可能にする。
【００３８】
さらなる実施形態により、ポリマー担体ユニットの第１の種類が使用され、ペプチドユニットが装填される。この第１の担体は好ましくは、たとえばＨＥＳと同様に容易に生分解可能である。しかしながら第１の担体のすべての結合点ではなく、たとえば約２０〜５０％のみがペプチドユニットによって占有される。使用されたポリマーのサイズに応じて、数百個のペプチドユニットが担体分子にカップリングされうる。しかしながら使用されたペプチドに応じて、通常はより少ないペプチドユニット（２〜５０、２〜２０、２〜１０または３〜５）がカップリングされる。残存する結合点の残り（または少なくとも一部）は、異なる担体、たとえば第１の担体よりも低い分子量を有する小型ＰＥＧユニットによって占有される。本実施形態は、超多価組成物が、好ましくは３〜５または１０ｋＤまでのＰＥＧユニットによって構成される第２の担体の存在のためにしかしながら非常に耐久性である第１の担体のために生成されるという利点を有する。しかしながら全体の実体は、第１の担体（たとえばＨＥＳ）およびペプチドユニットが生分解性であり、第２の担体、たとえばＰＥＧが体から容易に排除されるのに十分な小ささであるために、非常に良好に分解性である。
【００３９】
ペプチドユニットの結合ドメインを構成するモノマーは、標的の結合部位を認識する。結合ドメインという用語は、標的の結合に関与するモノマーペプチドの結合部分を指す。ペプチドに応じて、結合ドメインは、ペプチドの三次元高次構造で結合ドメインを定義するペプチドの異なる構造モチーフ（たとえばベータシート、アルファらせん、ベータターン）より構成されうる。
【００４０】
一実施形態に従って、ペプチドユニットは膜貫通レセプターに結合する。成長因子およびサイトカインの膜貫通レセプターの活性化は一般に、リガンドがレセプターの特異的領域に結合するときに発生し、それにより立体配座変化を誘発する、および／あるいはレセプター鎖のダイマー化またはオリゴマー化を引き起こす。リガンド結合時に、クラスＩサイトカインレセプターの複数のメンバは、エリスロポエチンレセプター（ＥＰＯＲ）、トロンボポエチンレセプター（ＴＰＯＲ）、顆粒球コロニー刺激因子レセプター（Ｇ−ＣＳＦＲ）、成長ホルモンレセプター（ＧＨＲ）、およびプロラクチンレセプター（ＰｒＲ）を含むホモダイマーを形成する。これらのクラスＩサイトカインレセプターは、相互の中で構造的および機能的類似性を示す。一実施形態に従って、ペプチドユニットはそれらがこれらのクラスＩサイトカインレセプターに結合するように選択される。
【００４１】
概説するように、ホモダイマーレセプターは、２個の非共有的に結合された同一のタンパク質サブユニットによって構成されるいずれかの生物標的タンパク質である。そのようなレセプターは通常、両方のサブユニットがホモダイマー形で結合されている場合は単に機能性である。ホモダイマーレセプターであることの後者の特性は、ＥＰＯレセプターおよびたとえば関連するＴＰＯレセプターを多くの他のサイトカインレセプターから区別する。サイトカインレセプターの他の大半の場合で、レセプターはヘテロダイマー（多くのインターロイキンレセプター）またはヘテロトリマー（たとえばＩＬ−２）ですらある。
【００４２】
少なくとも２個のモノマー結合ドメインを含む本発明によるペプチドユニットは、その標的を結合し、好ましくは標的をダイマー化、それぞれマルチマー化および／または標的を従って安定化することができ、それによりシグナル伝達誘発錯体を生成する。ペプチドユニットは好ましくは、好ましくはサイトカインレセプターであるホモダイマー標的分子を有する（上を参照）。
【００４３】
上で概説したように、超多価分子を生成するために使用されるペプチドユニットは、標的レセプターを結合する。一実施形態により、ペプチドユニットはレセプターアゴニストとして作用する。アゴニストという用語は、その相補性生物活性レセプター（標的）に結合して、レセプターで生物反応を引き起こすか、またはレセプター（標的）の既存の生物活性を向上させるかのどちらかのために相補性生物活性レセプターを活性化させる、生物活性ペプチドを指す。各種の実施形態により、ペプチドユニットはレセプターアンタゴニストとして作用する。アンタゴニストもその相補性生物活性レセプター（標的）に結合する。しかしながらアンタゴニストは、レセプター（標的）の生物活性を誘起または向上させない。
【００４４】
モノマーペプチドユニットをダイマー化またはマルチマー化するための複数の方法が到達水準で既知である。これらの方法は、本発明によるペプチドユニットを生成するために使用されうる。ダイマー化手法の後の有力な解決策は、
ａ）結合ドメインが最初に、たとえばステップｂの準備での反応性基の結合によって修飾されうる、１価またはモノマーペプチドとして個別に合成されるという事実、
ｂ）第２の反応ステップにおいて、２個の、大半の場合では同じ結合ドメインが、２個のダイマー化ドメイン間に通常挿入されているリンカー分子も含む、独立したダイマー化反応において結合されること、
によって特徴付けられる。
【００４５】
そのようなダイマーは、２価（ダイマー）ペプチドの例であり、本質的にモノマーと同じ生物機能を示すが、レセプターとのより良好な相互作用のために向上した生物活性を示す。
【００４６】
本発明の教示に従っても利用されうるモノマーをダイマー化またはオリゴマー化する複数の技法が、当業者に既知である。モノマーは、たとえばリンカーへの共有結合的結合によってダイマー化されうる。リンカーは、本発明のポリペプチドユニット間に共有結合を生成する接合分子である。ポリペプチドユニットは、ＥＰＯレセプターへの結合が改善されるような方法でリンカーを介して結合されうる（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｗｒｉｇｈｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）。それはさらにＷｒｉｇｈｔｏｎらによって記載されたタンパク質担体分子との非共有結合的相互作用によるモノマービオチン化ペプチドのマルチマー化に関連している。ビオチン／ストレプトアビジン系、すなわちペプチドのＣ末端のビオチン化および続いてのビオチン化ペプチドのストレプトアビジンによるインキュベートを使用することも可能である。あるいはジケトピペラジン構造を形成することによってダイマー化を達成することも既知である。当業者に既知の本方法は、たとえばＣａｖｅｌｉｅｒらに記載されている（ｉｎ：Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ｔｈｅ  ｗａｖｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｔｕｒｅ；Ｍｉｃｈａｌ  Ｌｅｂｌ  ａｎｄ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ａ．Ｈｏｕｇｈｔｅｎ（ｅｄｓ）；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００１）。ダイマー化および非共有結合的マルチマー化に関するこれらの文書の開示は、参照により本明細書に組み入れられている。従来技術より既知のペプチドダイマーを得るための別の代わりの方法は、２官能性活性化ジカルボン酸誘導体を、Ｎ末端アミノ基と反応して、それにより最終ダイマーペプチドを形成する後のリンカー部分の反応性前駆体として使用することである（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，１９９７）。モノマーは、リンカーへの共有結合的結合によってもダイマー化されうる。好ましくは、リンカーはＮＨ−Ｒ−ＮＨを含み、ここでＲは、別の分子部分への結合を可能にするカルボキシル基またはアミノ基などの官能基によって置換される低級アルキレンである。リンカーは、リジン残基またはリジンアミドを含有しうる。またＰＥＧはリンカーとして使用されうる。リンカーは、２個のカルボン酸を含有し、１個以上のＰＥＧ分子に結合されうるアミンなどの官能基によって１個以上の原子において場合により置換されうる分子でありうる。リンク部分によるペプチドのオリゴマー化およびダイマー化の考えられるステップの詳細な説明は、ＷＯ  ２００４／１０１６０６にも与えられている。
【００４７】
機能的にも十分であり、それゆえ本発明の教示に従って利用可能であるが、ダイマー分子を合成する従来技術の手法は、あるペプチドについてある欠点を有しうる。
【００４８】
１つの潜在的な欠点は、連結されるモノマーが最初に個別に合成されるという欠点で認められうる。ダイマー化反応中のモノマーペプチドの確率論的対形成のために、本手法によるヘテロダイマー２価ペプチドを（選択的および意図的に）得ることは特に困難である。少なくともこれは、特殊な意図されたヘテロダイマーの収率に大幅な損失をもたらす。２個以上のわずかに異なるモノマー結合ドメインを内包する２価ペプチドは、そのヘテロダイマー性質のために、ヘテロダイマーレセプターへの結合を維持、またはなお増加させながら、最終的な２価ペプチドにおけるその相互作用を安定化できる、２個のドメイン間の特殊な相互作用が導入されうるので、非常に望ましい。しかしながら従来技術の「確率論的ダイマー化反応」に関連する収率の高い損失のために、これは通常は経済的に魅力的な手法ではない。
【００４９】
ダイマー化に従来技術の手法を利用することは、技術的に適切であるとしても、上述した異種結合ドメインを持つこれらのペプチドを供給する一部の経済的な欠点をそれゆえ有する。それゆえ好ましくは、異種結合ドメインさえ含有しうる非常に活性の２価ペプチドユニットを得るためのより有効な方法が使用される。
【００５０】
本ダイマー化方法の核となる概念は、ダイマー化またはマルチマー化の前に２価ペプチドの一部を形成するモノマーペプチドを合成することを回避するが、少なくとも２個の結合ドメインを有する最終ペプチドユニットを１ステップで単一のペプチドとして、たとえば単一の固相反応で合成することである。それゆえ到達水準によって教示されるような独立したダイマー化またはマルチマー化ステップはもはや必要ない。本態様は大きな利点、すなわち最終ペプチドユニット内の各配列位置に対する完全で独立した制御を与える。該方法は、各配列位置に対する独立した制御のために、ペプチドユニット内に少なくとも２個の異なるレセプター特異性結合ドメインを容易に内包できるようにする。
【００５１】
本実施形態により、（「リンカー領域」である）結合ドメイン間の最終ペプチドの配列がアミノ酸のみから構成され、それゆえ単一の連続ペプチドユニットをもたらす。本発明の好ましい実施形態において、リンカーは、高次構造上の高い柔軟性を可能にする天然または非天然アミノ酸より構成される。この点で、ねじれに関してその高い柔軟性のために既知であるグリシン残基を連結アミノ酸として使用することが好都合でありうる。しかしながら他のアミノ酸、たとえばアラニンまたはベータアラニン、あるいはその混合物も使用されうる。使用されたアミノ酸の数および選択はそれぞれの立体的な状況に依存する。本実施形態は、生物活性立体配座のひずみを回避して、それゆえレセプターユニットとの完全な一致を可能にするために、分子モデリングにより適切なリンカーのカスタムメイド設計を可能にする。アミノ酸３〜５個で構成されるリンカーが特に好ましい。
【００５２】
ペプチドユニットの（モノマーユニットとも呼ばれる）機能性結合ドメイン間のリンカーが、ペプチドの特徴的な部分でありうること、あるいはモノマー結合ドメインの一部であるアミノ酸より全部または一部が構成されうることのどちらかが注目に値する。それゆえ「リンカー」という用語は、アミノ酸がリンカーユニットの一部はもちろんのこと、モノマー結合サブユニットの一部も形成しうるので、構造的というよりもむしろ機能的に定義される。
【００５３】
上記のように、２価ペプチドの合成中に最終ペプチド内の各配列位置は制御下にあり、それゆえ正確に決定されうるので、リンカーを含むペプチドユニットあるいはその特異的領域またはドメインをカスタムメイドまたはテーラーメイドすることが可能である。このことは、それがポリマーの特異的結合部位の生成および望ましくない分子内相互作用によるペプチドユニットの生物活性高次構造のひずみの回避を可能にするために、特別な利点である。ひずみのリスクは、分子モデリングによって合成の前に評価されうる。このことは特にモノマードメイン間のリンカーの設計に適用される。
【００５４】
本発明による連続２価／多価ペプチドは、対応するモノマーペプチドよりもはるかに高い活性を示し、それゆえ有効性の上昇が２価ペプチド概念に関連するという他のダイマーペプチドより既知の観察を裏付けている。
【００５５】
好ましい実施形態により、すべてのペプチドユニット（ここで各ユニットは１個のレセプター結合ユニットと見なされる）は同じ標的レセプターを結合する。しかしながらそれらは異種であり、それゆえそのアミノ酸配列が異なりうる。
【００５６】
好ましい一実施形態により、前記ペプチドユニットはＥＰＯレセプターを結合し、それによりＥＰＯレセプター錯体をダイマー化する。好ましくは、それらはシグナル伝達を誘発して、それゆえＥＰＯアゴニストである。ペプチドユニット、それぞれペプチドユニットを生成するモノマー結合ドメインは、ＥＰＯ模倣ペプチドの群より選択されうる。適切なＥＰＯ模倣ペプチドは、到達水準で周知であり、本発明に関連して使用されうる（たとえばＷＯ  ９６／４０７７２；ＷＯ  ９６／４０７４９；ＷＯ  ０１／３８３４２；ＷＯ  ０１／０９１７８０；ＷＯ  ２００４／１０１６１１；ＷＯ  ２００４／１００９９７；ＷＯ  ２００４／１０１６００；ＷＯ  ２００４／１０１６０６を参照）。
【００５７】
本発明により使用されうるさらに適切なＥＰＯ模倣ペプチドユニットは、ＥＰＯレセプターに結合する、長さが少なくともアミノ酸１０個の結合ドメインを含む。それらは好ましくは、ＥＰＯ模倣ペプチドの位置１０として一般に呼ばれる位置にプロリンを含まないが（ナンバリングについては、Ｗｒｉｇｈｔｏｎら、１９９６およびＪｏｈｎｓｏｎ、１９９８を参照）、正に帯電したアミノ酸を含む。これらのＥＰＯ模倣ペプチドは、ベータターン構造に特徴的なアミノ酸モチーフを持ち（Ｗｒｉｇｈｔｏｎら）、ここで本実施形態によるペプチドユニットの結合ドメインは、位置１０にて前記ベータターンモチーフ内にプロリンを含まないが、正に帯電したアミノ酸、好ましくはＫまたはＲを含む。また他の塩基性アミノ酸、特に非天然アミノ酸、たとえばホモアルギニンが使用されうる。ＥＰＯ模倣結合ドメインの位置９および１０は、５−アミノレブリン酸（５−Ａｌｓ）によって占有されうる。ペプチドドメインは位置１７にＲも持ちうる。
【００５８】
一実施形態により、ペプチドユニットのＥＰＯレセプター結合ドメインの少なくとも１つは、次のアミノ酸配列を含む：
【００５９】
【化６】
2008546732.tif 000002
式中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され、
Ｘ６は、Ｃ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテル（ｈｓｍ）またはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的交換であり；
あるいはＸ９またはＸ１０は、単一のアミノ酸によって置換され；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸より独立して選択され；
Ｘ１２は、ＴまたはＡであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｌ  またはＶであり；
Ｘ１５は、Ｃ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、Ｘ６またはＸ１５が、Ｃまたはｈｏｃであるという条件である。
【００６０】
前記ペプチドユニットの１個の結合ドメインの長さは好ましくは、アミノ酸１０〜４０個、あるいは５０〜６０個である。好ましい実施形態において、ペプチドコンセンサスは、少なくともアミノ酸１０、１５、１８または２０個の長さを示す。もちろんそれらはより長い配列によって埋め込まれ、それぞれ含まれうる。上述のモノマーペプチド配列は、ＥＰＯレセプターの結合ドメインとして認められる。ＥＰＯ模倣ペプチドとして、それらはＥＰＯレセプターに結合して活性化することができる。
【００６１】
１つまたはいくつかの実施形態により、両方のプロリンは他の天然または非天然アミノ酸によって置換されうるが、これらのペプチドがＥＰＯ模倣活性を示すことは、非常に驚くべきであった。実際に本発明によるペプチドは、プロリン含有ペプチドに匹敵する活性を有する。しかしながらプロリン残基を置換するアミノ酸が保存的交換を示さないが、代わりに非保存的交換を示すことは注目に値する。好ましくは、正に帯電したアミノ酸、塩基性アミノ酸、たとえばＫ、ＲおよびＨならびに特にＫは置換に使用される。置換に使用される非保存的アミノ酸も非天然アミノ酸であることが可能であり、好ましくは正に帯電した側鎖を備えた非天然アミノ酸である。上記のアミノ酸の各類似体も含まれる。非天然アミノ酸の適切な例はホモアルギニンである。一実施形態により、ペプチドは天然アミノ酸のアルギニンを除いて、正に帯電したアミノ酸を位置１０に持つ。本実施形態により、プロリン１０はそれゆえＫ、Ｈまたは非天然正荷電アミノ酸、たとえばホモアルギニンより選択されるアミノ酸によって置換される。ペプチドは位置１０にリジンまたはホモアルギニンを示すことが好ましい。上記のように、位置１７のプロリンも非保存的アミノ酸によって置換されうる。この点で、前記非保存アミノ酸が正に帯電した側鎖、たとえばＫ、Ｒ、Ｈを持つアミノ酸またはそれぞれの非天然アミノ酸、たとえばホモアルギニンであることも好ましい。本実施形態の下位実施形態により、ペプチドは天然アミノ酸のアルギニンを除いて、正に帯電したアミノ酸を位置１７に持つ。本実施形態により、プロリン１７はそれゆえＫ、Ｈまたは非天然正帯電アミノ酸、たとえばホモアルギニンより選択されるアミノ酸によって置換される。ペプチドは位置１７にリジンまたはホモアルギニンを示すことが好ましい。  ＥＰＯ−Ｒ結合ドメインはさらに、次のアミノ酸配列を含む：
【００６２】
【化７】
2008546732.tif 000003
式中、各アミノ酸は標準文字省略形によって示され、そして
Ｘ６はＣであり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、ＬまたはＷであり；
Ｘ８は、Ｍ、ＦまたはＩであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的交換であり；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸より独立して選択され；
Ｘ１２は、Ｔであり；
Ｘ１３は、Ｗであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５はＣである。
【００６３】
さらにＸ７はセリンであり、Ｘ８はｈｓｍまたはノルイソロイシンであり、そしてＸ１３は１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦでもありうる。ペプチドコンセンサスの長さは好ましくは、アミノ酸１０〜４０個あるいは５０または６０個である。好ましい実施形態において、ペプチドコンセンサスは、少なくともアミノ酸１０、１５、１８または２０個を含む。
【００６４】
本発明によるペプチドユニットを生成するために使用されうるさらにＥＰＯ模倣ペプチドは、次のペプチドコンセンサス配列によって定義される：ＥＰＯレセプターを結合することができるペプチドであって：
−次のアミノ酸コンセンサス配列：
【００６５】
【化８】
2008546732.tif 000004
（式中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され；
Ｘ６は、共有結合を形成できる側鎖官能基を備えたアミノ酸またはＡまたはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、ＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的交換であり（あるいは別の実施形態により、プロリンまたはプロリンの保存的交換）；
あるいはＸ９およびＸ１０は、単一のアミノ酸によって置換され；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非帯電極性アミノ酸またはＡであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成できる側鎖官能価を備えたアミノ酸またはＡまたはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である）を含むペプチド；
−ＥＰＯ模倣活性を示し、プロリンの非保存的交換（あるいは別の実施形態により、プロリンまたはプロリンの保存的交換）を構成するアミノ酸を位置Ｘ１０に有し、あるいはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸によって置換される、上のコンセンサス配列によって定義されたペプチドの機能的に同等の断片、誘導体または変異体；
から成る群より選択されるペプチド。
【００６６】
第１の態様のコンセンサス配列により、Ｘ６およびＸ１５は、共有結合を形成できる側鎖官能価を持つアミノ酸を示す。これらのアミノ酸はそれゆえ、架橋ユニット形成できる。一実施形態により、位置Ｘ６およびＸ１５のアミノ酸は、それらが相互の間に共有結合を形成することによってペプチド内に分子内架橋を形成できるように選択される。分子内架橋を形成することは、ペプチドの環化を引き起こしうる。たとえば適切な架橋ユニットは、ジスルフィド架橋およびジセレニド架橋である。その側鎖内に官能価を形成するそのような架橋を示すアミノ酸の適切な例は、たとえばシステインおよびシステイン誘導体、たとえばホモシステインまたはセレノシステインだけでなく、チオリジンもである。たとえば２個のセレノシステイン残基間のジセレニド架橋の形成さえ、システインブリッジに勝る利点を有する。セレニド架橋としてのこれは、還元環境ではより安定である。ペプチドの高次構造はそれゆえ困難な条件下でも保存される。
【００６７】
しかしながらアミノ酸も位置Ｘ６およびＸ１５において適切であることが明らかであり、官能化を持つ側鎖が異なる共有結合、たとえば正に帯電した側鎖を有するアミノ酸（たとえばタンパク新生アミノ酸Ｋ、Ｈ、Ｒまたはオルニチン、ＤＡＰまたはＤＡＢ）と負に帯電した側鎖を有するアミノ酸（たとえばタンパク新生アミノ酸ＤまたはＥ）との間のアミド結合の形成を可能にすることを示す。さらなる例は、アミドおよびチオエーテル架橋である。
【００６８】
長さが少なくともアミノ酸１０個のペプチドであって、次の選択肢：
（ａ）次のアミノ酸コア配列：
【００６９】
【化９】
2008546732.tif 000005
（式中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され、ここで；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的交換であり（あるいは別の実施形態により、プロリンまたはプロリンの保存的交換）；
あるいはＸ９およびＸ１０は、単一のアミノ酸によって置換され；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非帯電極性アミノ酸またはＡであり；
Ｘ１３は、ナフチルアラニンである）
を含む、ペプチド。
（ｂ）次のアミノ酸配列：
【００７０】
【化１０】
2008546732.tif 000006
（式中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され；
Ｘ６は、Ｃ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹあるいはＲ、Ｈ、Ｌ、Ｗ、ＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１０は、プロリンの非保存的交換であり；
あるいはＸ９およびＸ１０は、単一のアミノ酸によって置換され；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、ＴまたはＡであり；
Ｘ１３は、１−ｎａｌ、２−ｎａｌであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、Ｃ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、Ｘ６またはＸ１５が、Ｃまたはｈｏｃであるという条件である）
を含む、ＥＰＯレセプターに結合できるペプチド。
（ｃ）ＥＰＯ模倣活性を示し、プロリンの非保存的交換（あるいは別の実施形態により、プロリンまたはプロリンの保存的交換）を構成するアミノ酸を位置Ｘ１０に有し、あるいはＸ９およびＸ１０が単一のアミノ酸およびナフチルアラニンによって位置Ｘ１３で置換される、上のコンセンサス配列によって定義されたペプチドの機能的に同等の断片、誘導体または変異体；
から選択される、ＥＰＯレセプターに結合可能である、ペプチド。
【００７１】
長さが少なくともアミノ酸１０個のペプチドであって、ＥＰＯレセプターに結合可能であり、アゴニスト活性を含み：
−次のアミノ酸コア配列：
【００７２】
【化１１】
2008546732.tif 000007
（式中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸より選択され、ここで位置Ｘ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも１つが負に帯電したアミノ酸であり、ここで
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非帯電極性アミノ酸またはＡ、好ましくはトレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、Ｌ  またはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成できる側鎖官能価を備えたアミノ酸またはＡまたはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ１６は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴより独立して選択され；
Ｘ１８は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＬまたはＱより独立して選択される）の少なくとも１つを含むペプチド；
ＥＰＯ模倣を活性を示し、位置Ｘ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも１つがが負に帯電したアミノ酸である、上のコンセンサス配列によって定義されたペプチドの機能的に同等の断片、誘導体または変異体；
から成る群より選択される、ペプチド。
【００７３】
Ｘ１０、Ｘ１７またはＸ１９の少なくとも１つに負に帯電したアミノ酸を有するＥＰＯ模倣ペプチドも、次の拡大コンセンサス配列：
【００７４】
【化１２】
2008546732.tif 000008
によって記載され、式中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され、ここで；
Ｘ６は、共有結合を形成できる側鎖官能価を備えたアミノ酸またはＡまたはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｈ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１０が負に帯電したアミノ酸でない場合に、Ｘ１０は、プロリン、プロリンの保存的交換またはプロリンの非保存的交換あるいは
Ｘ９およびＸ１０は、単一のアミノ酸によって置換され；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、非帯電極性アミノ酸またはＡ；好ましくはトレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成できる側鎖官能基を備えたアミノ酸またはＡまたはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ１６は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、ＨａｒまたはＴより独立して選択され；
Ｘ１７が負に帯電したアミノ酸でない場合、Ｘ１７は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｙまたは正に帯電した天然、非天然または誘導体化アミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈ、オルニチンまたはホモアルギニンより選択され；
Ｘ１８は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＬまたはＱより独立して選択され；
Ｘ１９が負に帯電したアミノ酸でない場合、Ｘ１９は、いずれかのアミノ酸、好ましくは正に帯電したアミノ酸、たとえばＫ、Ｒ、Ｈ、オルニチンまたはホモアルギニンより独立して選択され；
Ｘ１０、Ｘ１７またはＸ１９のいずれか１つが負に帯電したアミノ酸であるという条件である。
【００７５】
長さが少なくともアミノ酸１０個のペプチドであって、ＥＰＯレセプターに結合可能であり、アゴニストを含み、次の：
（ａ）次のアミノ酸コア配列：
【００７６】
【化１３】
2008546732.tif 000009
（式中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され、ここで；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸より選択され；
Ｘ１２は、非帯電極性アミノ酸またはＡ；好ましくはトレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、ナフチルアラニン、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成できる側鎖官能基を備えたアミノ酸またはＡまたはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸である）を含むペプチドはもちろんのこと、ＥＰＯ模倣活性を示す、上のコンセンサス配列によって定義されたペプチドの機能的に同等の断片、誘導体または変異体であって、位置Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９のいずれか１つが、リジンと比較して伸長された側鎖を有する、正に帯電した非タンパク新生アミノ酸を示す、ペプチド；
（ｂ）特にＥＰＯレセプターを結合可能なペプチドであって、次のアミノ酸配列：
【００７７】
【化１４】
2008546732.tif 000010
（式中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され；
Ｘ６は、Ｃ、Ａ、Ｅ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１０は、Ｈａｒであり；Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸から選択され；
Ｘ１２は、ＴまたはＡであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、Ｃ、Ａ、Ｋ、α−アミノ−γ−ブロモ酪酸またはホモシステイン（ｈｏｃ）であり、
Ｘ６またはＸ１５が、Ｃまたはｈｏｃであるという条件である）を含む、ペプチド；
（ｃ）ペプチドであって、次のアミノ酸配列：
【００７８】
【化１５】
2008546732.tif 000011
（式中、Ｘ６〜Ｘ１５は、変異体（ｂ）の上の意味を有し、ここで
Ｘ３は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶより独立して選択され；
Ｘ４は、Ｙであり；
Ｘ５は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩより独立して選択され；
Ｘ１６は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴより独立して選択され；
Ｘ１７は、ホモアルギニンであり；
Ｘ１８は、いずれかのアミノ酸より独立して選択される）を含むペプチド；
のペプチドの群より選択される、ペプチド。
【００７９】
これらのペプチドは、次のアミノ酸コア配列：
【００８０】
【化１６】
2008546732.tif 000012
によっても記載され、式中、各アミノ酸は、天然または非天然アミノ酸から選択され、ここで；
Ｘ６は、共有結合を形成できる側鎖官能基を備えたアミノ酸またはＡまたはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ７は、Ｒ、Ｈ、Ｌ、ＷまたはＹまたはＳであり；
Ｘ８は、Ｍ、Ｆ、Ｉ、Ｙ、Ｈ、ホモセリンメチルエーテルまたはノルイソロイシンであり；
Ｘ９は、ＧまたはＧの保存的交換であり；
Ｘ１０が、リジンと比較して伸長される側鎖を有する正に帯電した非タンパク新生アミノ酸でない場合、Ｘ１０は、プロリン、プロリンの保存的交換またはプロリンの非保存的交換、あるいはＸ９およびＸ１０は、単一のアミノ酸によって置換され；
Ｘ１１は、いずれかのアミノ酸より選択され；
Ｘ１２は、非帯電極性アミノ酸またはＡ；好ましくはトレオニン、セリン、アスパラギンまたはグルタミンであり；
Ｘ１３は、Ｗ、１−ｎａｌ、２−ｎａｌ、ＡまたはＦであり；
Ｘ１４は、Ｄ、Ｅ、Ｉ、ＬまたはＶであり；
Ｘ１５は、共有結合を形成できる側鎖官能基を備えたアミノ酸またはＡまたはα−アミノ−γ−ブロモ酪酸であり；
Ｘ１６が、リジンと比較して伸長される側鎖を有する正に帯電した非タンパク新生アミノ酸でない場合、Ｘ１６は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴより独立して選択され；
Ｘ１７が、リジンと比較して伸長される側鎖を有する正に帯電した非タンパク新生アミノ酸でない場合、Ｘ１７は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｙまたは正に帯電した天然、非天然または誘導体化アミノ酸、好ましくはＫ、Ｒ、Ｈまたはオルニチンより選択され；
Ｘ１８は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＬまたはＱより独立して選択され；
Ｘ１９が、リジンと比較して伸長される側鎖を有する正に帯電した非タンパク新生アミノ酸でない場合、Ｘ１９は、いずれかのアミノ酸、好ましくは正に帯電したアミノ酸、たとえばＫ、Ｒ、Ｈまたはオルニチンより独立して選択され；
Ｘ１０、Ｘ１６、Ｘ１７またはＸ１９のいずれか１つが、リジンと比較して伸長される側鎖を有する正に帯電した非タンパク新生アミノ酸であるという条件である。
【００８１】
その少なくとも２個が１個のペプチドユニットを構築するモノマーＥＰＯ模倣ペプチドは、アミノ酸残基Ｘ９およびＸ１０を置換する単一のアミノ酸を含みうる。好ましくは両方の残基が１つの非天然アミノ酸、たとえば５−アミノレブリン酸または５−アミノ吉草酸によって置換される。
【００８２】
さらなる実施形態において、ペプチドユニットで使用された結合ドメインは次の配列：
【００８３】
【化１７】
2008546732.tif 000013
を有し、式中、Ｘ６〜Ｘ１５は上の意味を有し、ここで
Ｘ４は、Ｙであり；
Ｘ５は、いずれかのアミノ酸より独立して選択され、好ましくはＡ、Ｈ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、ＴまたはＩである。
【００８４】
結合ドメインは拡張されることがあり、コンセンサス配列
【００８５】
【化１８】
2008546732.tif 000014
を含むことがあり、式中、Ｘ４〜Ｘ１５は上の意味を有し、ここで
Ｘ３は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＤ、Ｅ、Ｌ、Ｎ、Ｓ、ＴまたはＶより独立して選択され；
Ｘ１６は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＧ、Ｋ、Ｌ、Ｑ、Ｒ、ＳまたはＴ、さらに好ましくはＫ、Ｒ、ＳまたはＴより独立して選択され；
Ｘ１７は、いずれかのアミノ酸、好ましくはＡ、Ｇ、Ｐ、Ｒ、Ｋ、Ｙまたは正に帯電した側鎖を持つ非天然アミノ酸、さらに好ましくはＲ、Ｋまたは非天然アミノ酸、たとえばホモアルギニンより独立して選択され；
Ｘ１８は、いずれかのアミノ酸より独立して選択される。
【００８６】
本発明のさらなる実施形態において、ペプチドが、Ｘ６をＣ、Ｅ、Ａまたはｈｏｃ、好ましくはＣとして、および／またはＸ７をＲ、ＨまたはＹとして、および／またはＸ８をＦまたはＭとして、および／またはＸ９をＧまたはＡ、好ましくはＧとして、および／またはＸ１０をＫとして、および／またはＸ１１をＶ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｅ、Ａ、Ｔまたはノルイソロイシンとして、および／またはＸ１２をＴとして、および／またはＸ１３をＷとして、および／またはＸ１４をＤまたはＶとして、および／またはＸ１５をＣまたはｈｏｃ、好ましくはＣとして、および／またはＸ１７をＰ、ＹまたはＡとして含むことが好ましい。しかしながら、Ｘ１７が、Ｋまたは正に帯電した側鎖を持つ非天然アミノ酸、たとえばホモアルギニンであることも好ましい。
【００８７】
図１９は、ＥＰＯ模倣活性を示すさらなる新規の適切なペプチドを開示する。本発明と併せて、それらは本発明によるペプチドを生成するために適切な結合ドメイン（モノマー）として使用されうる。さらにそれらは、上述のようにモノマーまたはマルチマーＥＰＯ模倣ペプチドとして使用されうる。
【００８８】
結合モノマーの始まり（Ｎ末端）および終わり（Ｃ末端）において、最大５個のアミノ酸が除去および／または付加されうる。
【００８９】
ペプチドの唯一の機能的特性として、ここではＥＰＯレセプターに結合する能力、ＥＰＯレセプターアゴニストの場合にＥＰＯレセプターを活性化する能力が決定的である。ペプチドユニットの正確なアミノ酸配列は変化しうる。上には一般的な概念を裏付けるために、ＥＰＯ模倣ペプチドの適切な例のみ与えている。しかしながら異なるアミノ酸配列を持つ他のＥＰＯ模倣ペプチドも本発明と併せて使用されうる。
【００９０】
別の実施形態により、前記ペプチドユニットはＴＰＯレセプターを結合し、それによりＴＰＯレセプター錯体をダイマー化する。好ましくは、それらはシグナル伝達を誘発して、それゆえＴＰＯアゴニストである。ペプチドユニット、それぞれペプチドユニットを生成するモノマー結合ドメインは、ＴＰＯ模倣ペプチドの群より選択されうる。適切なＴＰＯ模倣ペプチドは到達水準で周知であり、本発明と関連して使用されうる。適切な例は、たとえばＷＯ  ９８／２５９６５、ＵＳ５９３２５４６、ＷＯ００２４７７０、Ｃｗｉｒｌａ，Ｓ．Ｅ．，Ｐ．Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｄ．Ｊ．Ｄｕｆｆｉｎ，Ｃ．Ｒ．Ｗａｇｓｔｒｏｍ，Ｃ．Ｍ．Ｇａｔｅｓ，Ｓ．Ｃ．Ｓｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｍ．Ｄａｖｉｓ，Ｒ．Ｌ．Ｔａｎｓｉｋ，Ｌ．Ｃ．Ｍａｔｔｈｅａｋｉｓ，Ｃ．Ｍ．Ｂｏｙｔｏｓ，Ｐ．Ｊ．Ｓｃｈａｔｚ，Ｄ．Ｐ．Ｂａｃｃａｎａｒｉ，Ｎ．Ｃ．Ｗｒｉｇｈｔｏｎ，Ｒ．Ｗ．ＢａｒｒｅｔｔおよびＷ．Ｊ．Ｄｏｗｅｒ（１９９７）“Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｇｏｎｉｓｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｓ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｓ  ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ．”Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６（５３１９）：１６９６−１６９９、ＵＳ６０８３９１３、ＵＳ６４６５４３０、ＵＳ５８６９４５１、ＵＳ６１２１２３８、ＵＳ６２５１８６４、Ｄｏｗｅｒ，Ｗ．Ｊ．，Ｓ．Ｅ．Ｃｗｉｒｌａ，Ｐ．Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｐ．Ｊ．Ｓｃｈａｔｚ，Ｄ．Ｐ．ＢａｃｃａｎａｒｉおよびＲ．Ｗ．Ｂａｒｒｅｔｔ（１９９８）．“Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｇｏｎｉｓｔｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｉｅｔｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．”Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  １６  Ｓｕｐｐｌ  ２：２１−２９、ＷＯ０５０２３８３４、ＷＯ００２４７７０に記載されており、ＴＰＯ模倣ペプチドの構造／アミノ酸配列に関するすべての文書の開示は参照により完全に組み入れられる。
【００９１】
本発明によるペプチドユニットは、Ｌ−アミノ酸または立体異性Ｄ−アミノ酸以外に、非天然／非在来アミノ酸、たとえばアルファ、アルファ−分散アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸または乳酸、たとえば１−ナフチルアラニン、２−ナフチルアラニン、ホモセリン−メチルエーテル、β−アラニン、３−ピリジルアラニン、４−ヒドロキシプロリン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−メチルグリシン（サルコシン）、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−アセチルグリシン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリルシン、ノルリジン、５−アミノレブリン酸または５−アミノ吉草酸を含みうる。Ｎ−メチルグリシン（ＭｅＧ）およびＮ−アセチルグリシン（ＡｃＧ）の使用は、特に末端位置にて特に好ましい。定義したペプチドのレトロ、インベルソおよびレトロ／インベルソペプチドであるペプチドおよび完全にＤ−アミノ酸より成るそのようなペプチドも、本発明の範囲内である。
【００９２】
ペプチドの誘導体、たとえばメチオニンの酸化生成物、または脱アミド化グルタミン、アルギニンおよびＣ末端アミドも使用されうる。
【００９３】
ここで大文字としての１文字コードの省略形は、非天然アミノ酸の付加により拡張される、標準ポリペプチド命名法の省略形である。
【００９４】
【化１９】
2008546732.tif 000015
【００９５】
【化２０】
2008546732.tif 000016
ペプチドユニットは、たとえば単一のアミノ酸の保存的交換によって修飾されうる。そのような交換は、結合分子の構造および機能を変化させるが、大半の場合でわずかである。保存的交換では、１個のアミノ酸が同様の特性を持つ群内の別のアミノ酸によって置換される。該当する群の例は：
−非極性側鎖を有するアミノ酸Ａ、Ｇ、Ｖ、Ｌ、Ｉ、Ｐ、Ｆ、Ｗ、Ｍ
−極性側鎖を有する非帯電アミノ酸：Ｓ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、Ｙ、Ｎ、Ｑ
−芳香族側鎖を有するアミノ酸：Ｆ、Ｙ、Ｗ
−正に帯電したアミノ酸：Ｋ、Ｒ、Ｈ
−負に帯電したアミノ酸：Ｄ、Ｅ
−置換するアミノ酸の分子量が元のアミノ酸の分子量から最大＋／−２５％（または＋／−２０％、＋／−１５％、＋／−１０％）逸脱する、同じサイズまたは分子量のアミノ酸。
【００９６】
さらに詳細にはＷｒｉｇｈｔｏｎら（ＵＳ−Ｐａｔｅｎｔ  ５，７７３，５６９、および関連特許）は、活性を維持しながらＥＰＯ模倣ペプチドのアミノ酸が置換されうるファージ提示技法を使用して詳細に調査した。彼らはまた、所与のポリマーペプチドの考えられる切断、すなわち最小長に関するデータを研究および発表した。
【００９７】
本発明の一実施形態に従って、下に与える配列番号２、４〜９から成る群より選択されるモノマーは、少なくとも２価ペプチドユニットの形成に使用される。良好な活性は、配列番号２のように位置１０にＫおよび位置１７にＫを持つペプチドを示す。
【００９８】
【化２１】
2008546732.tif 000017
５−アミノレブリン酸（Ａｌｓ）の包含：
【００９９】
【化２２】
2008546732.tif 000018
【０１００】
【化２３】
2008546732.tif 000019
一実施形態に従って、ペプチドユニットは、上に与えたような配列番号２および４〜９またはその修飾によるモノマーに基づいて形成される。ペプチドはたとえば、単一のアミノ酸の保存的交換によって修飾可能であり、そこで好ましくは１、２または３個までのアミノ酸が交換される。好ましくはこれらのペプチドは、Ｎ末端にてＡｃＧに関して、Ｃ末端にてＭｅＧに関して修飾される。
【０１０１】
ＥＰＯレセプターをダイマー化するための適切なペプチド単位のある例を次に挙げる。結合ドメイン上の横棒は、任意であるが好ましい分子内ジスルフィド架橋を表す：
【０１０２】
【化２４】
2008546732.tif 000020
これらの２価構造内のリンカーは、生物活性高次構造のひずみを回避するために、分子モデリングによってカスタムメイドされる（図１）。
配列番号１２
リンカー配列は、１個のグリシン残基によって短縮されうる。本配列はたとえば、同時に結合ドメインの一部を形成するグリシン残基によって構成されたリンカーでもある（配列番号２を参照）。
【０１０３】
【化２５】
2008546732.tif 000021
本配列は、２個のわずかに異なる（異種）結合ドメインを内包する連続２価ペプチドユニットを表す。そのような２価ペプチドは、従来技術のダイマー化手法によって経済的に入手できない（上を参照）。逸脱するアミノ酸（現在、Ｃ末端にてＫおよびＤ）が相互作用して、それによりダイマーを安定化させるという本へテロダイマー分子の利点は、そこに存在する。それゆえ分子モデリングによって分子内にそれぞれの安定化修飾を包含することが好都合である。
【０１０４】
さらなる例は
【０１０５】
【化２６】
2008546732.tif 000022
である。
【０１０６】
さらなる実施形態に従って、ペプチドは場合により、追加のアミノ酸、好ましくはたとえば次の配列においてなどの、Ｎ末端にシステインなどの反応性側鎖を持つアミノ酸を持つ。
【０１０７】
【化２７】
2008546732.tif 000023
システインの反応性側鎖は、たとえばポリマー担体ユニットの結合のための連結タイとして作用しうる。ペプチドはさらに場合により、第１および第２ならびに／または第３および第４システインの間にジスルフィド架橋を含む。
【０１０８】
配列番号２、４〜９および１２、１３および１５、１５ａによって例示されるようなモノマーユニットは、好ましくはペプチドユニットに結合されうる。
【０１０９】
ペプチドユニットのモノマーに利用されているダイマー化方法の例は（これに限定されるわけではないが）以下が挙げられる：
１．前記モノマーペプチドの一方のＣ末端が他方のＣ末端に共有結合される、Ｃ末端からＣ末端への結合を介したダイマー化。モノマー間のリンカー／スペーサは、ジケトピペラジンユニットを含有しうる。好ましいＧｌｙ−Ｇｌｙジケトピペラジン骨格は、Ｃ末端グリシンモノマーを活性化することによって達成されうる。本原理は、Ｃ末端ダイマー化を形成するためにも使用されうる。
【０１１０】
【化２８】
2008546732.tif 000024
次の式および例は、分子モデリングによって最適化されるカスタマイズされた４つの例を表す：
（ａ）配列番号２に基づくダイマー（ダイマー高次構造を図２に示す）：
【０１１１】
【化２９】
2008546732.tif 000025
（ｂ）１個のグリシンによって短縮されたリンカーを持つ、配列番号２に基づくダイマー：高次構造を図３に示す。
【０１１２】
【化３０】
2008546732.tif 000026
（ｃ）ベータ−アラニンによって置換されたグリシンを持つ、配列番号２に基づくダイマー（図４）。モノマー（配列番号１６）もＥＰＯ模倣ペプチドとして利用できる。
【０１１３】
【化３１】
2008546732.tif 000027
（ｄ）ベータ−アラニンによって置換された代わりのグリシンを持つ、配列番号２に基づくダイマー（図５）。モノマー（配列番号１７）もＥＰＯ模倣ペプチドとして利用できる。
【０１１４】
【化３２】
2008546732.tif 000028
２．前記モノマーペプチドの一方のＮ末端が他方のＮ末端に共有結合され、それによりスペーサユニットが好ましくはジカルボン酸構成要素を含有する、Ｎ末端からＮ末端への結合を介したダイマー化。
【０１１５】
【化３３】
2008546732.tif 000029
（ａ）一実施形態において、１個のグリシン残基によりＮ末端にて伸長された配列番号２に基づいて得られたダイマー（配列番号１８）は、ヘキサンジオイルユニットをリンカー／スペーサとして含有する（図６）：
【０１１６】
【化３４】
2008546732.tif 000030
（ｂ）代わりの実施形態において、ダイマー化はオクタンジオイルユニットをリンカー／スペーサとして使用することによって達成されうる（図７）：
【０１１７】
【化３５】
2008546732.tif 000031
３．前記モノマーペプチドの１個のアミノ酸側鎖が他方のペプチドのアミノ酸側鎖に、２個のペプチドモノマーを結合する適切なスペーサ分子の包含によって共有結合される、側鎖によるダイマー化。
【０１１８】
【化３６】
2008546732.tif 000032
これは：
（ａ）アミド結合を介した結合。
【０１１９】
【化３７】
2008546732.tif 000033
（ｂ）またはジスルフィド架橋を介した結合：
【０１２０】
【化３８】
2008546732.tif 000034
を含みうる。
【０１２１】
Ｘは、それぞれのペプチド結合の形成に関与する、それぞれのアミノ酸の主鎖コアを示す。
【０１２２】
異なる方法に従って、ペプチドモノマーを相互に結合させて、それによりペプチドユニットを形成する共有架橋は、第１モノマーペプチドのＣ末端アミノ酸および第２ペプチドモノマーのＮ末端アミノ酸の側鎖間に形成される。それゆえ本ダイマー化方法に従って、ダイマー化されるモノマーペプチドがＮまたはＣ末端のどちらかに架橋形成官能価を備えたアミノ酸を持ち、それにより第１ペプチドの最後のアミノ酸と第２ペプチドの最初のアミノ酸との間での共有結合の形成を可能にすることが好ましい。ダイマーを生成する結合は、好ましくは共有結合性である。各架橋の適切な例はたとえば、ジスルフィド架橋およびジセレニド架橋である。しかしながら正および負に帯電したアミノ酸の間のアミド結合または他の共有連結結合、たとえばチオエーテル結合は連結部分として適切である。
【０１２３】
最終ペプチドユニットを形成するためにモノマー結合ユニット間に各結合架橋を形成するのに適切な好ましいアミノ酸はたとえば、システイン、システイン誘導体、たとえばホモシステインまたはセレノシステインまたはチオリジンである。それらはジスルフィド架橋か、またはアミノ酸を含有するセレニウムの場合、ジセレニド結合のどちらかを形成する。
【０１２４】
例としてＥＰＯ模倣ペプチドを使用してそれぞれ生成されたペプチドユニットダイマーの適切な例を下に与える：
【０１２５】
【化３９】
2008546732.tif 000035
【０１２６】
【化４０】
2008546732.tif 000036
【０１２７】
【化４１】
2008546732.tif 000037
さらなる発展に従って、ペプチドダイマー（それゆえダイマーの始まりまたは終わりのどちらかに位置している各モノマーペプチドユニット）のＮまたはＣ末端に余分のアミノ酸を含み、超多価化合物を生成するためにＨＥＳなどのポリマー担体のカップリングを可能にする。結果として、導入されたアミノ酸は、たとえばＳＨ基などの各カップリング官能価を保持する。そのようなアミノ酸の１つの一般的な例は、システインである。しかしながら共有結合の形成を可能にする官能基を備えた他のアミノ酸（たとえばすべての負および正に帯電したアミノ酸）も適切である。
【０１２８】
【化４２】
2008546732.tif 000038
横棒は、共有分子内架橋；この場合はジスルフィド架橋を表す。
【０１２９】
さらなる発展に従って、モノマーユニットをダイマーに結合するための共有結合架橋の形成に関与するＣおよび／またはＮ末端のアミノ酸は、帯電基、たとえばＣＯＯ−またはＮＨ３＋基を示す。この特徴は、分子内架橋の構造の好ましい安定化をもたらす：
【０１３０】
【化４３】
2008546732.tif 000039
４．連続２価または多価ペプチドを形成することによるダイマー化はすでに上で概説した。
【０１３１】
【化４４】
2008546732.tif 000040
本方法の核となる概念は、ダイマー化またはマルチマー化の前に独立した反応で多価または２価ペプチドのモノマーペプチド形成部を合成することを回避するが、最終２価または多価ペプチドを１ステップで単一のペプチドとして；たとえば単一の固相反応で合成することである。それゆえ独立したダイマー化またはマルチマー化ステップはもはや不要である。本態様は大きな利点、すなわち最終ペプチドユニット内の各配列位置に対する完全で独立した制御を与える。該方法は、各配列位置に対する独立した制御のために、ペプチドユニット内に少なくとも２個の異なるレセプター特異性結合ドメインを容易に内包できるようにする。
【０１３２】
モノマーおよびダイマーまたはマルチマーペプチドに関しては、連続２価／多価ペプチドは、たとえばアセチル化またはアミド化によって修飾されうるか、あるいはＣ末端またはＮ末端位置にて伸長されうる。
【０１３３】
すべての考えられる修飾は、リンカーを修飾することにも当てはまる。特に溶解性ポリマー部分、たとえばＰＥＧ、デンプンまたはデキストランなどをリンカーに結合させることも好都合でありうる。
【０１３４】
本発明による最終多価または２価ペプチドの合成は好ましくは、結合ドメインそれぞれの中にジスルフィド結合または他の分子内結合の２つの連続および独立した形成も含みうる。それによりペプチドも環化されうる。
【０１３５】
ペプチドの反応性側鎖は、さらなる修飾のために連結タイとして作用しうる。ペプチドユニットはさらに、たとえばシステインなどの、側鎖官能価を形成する架橋を有するアミノ酸間に分子内架橋を場合により含む。
【０１３６】
ペプチドは、たとえばアセチル化またはアミド化によって修飾されうるか、あるいはＣ末端またはＮ末端位置にて伸長されうる。たとえばポリマー担体の結合部位の準備のための２個の末端の一方（ＮまたはＣ）における１個以上のアミノ酸による伸長は、連続ペプチドとして最も良好に製造されうるヘテロダイマー２価ペプチドをもたらすことが多い。
【０１３７】
担体をタンパク質およびペプチドにカップリングするために、複数のアミノ酸が到達水準で既知である。好ましいカップリングアミノ酸は、ＮまたはＣ末端にカップリングされうるか、あるいはペプチド配列内に導入されうるかのどちらかである、システインである。しかしながらカップリング方向は、かなりの相違を生じることがあり、それゆえペプチドユニットに対して慎重に選択されるべきである。これはＥＰＯ模倣ペプチドの次の例に基づいて証明されるものとする：
次の２つのダイマーが使用される：
【０１３８】
【化４５】
2008546732.tif 000041
４１マーＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４およびＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４は、同じコア配列を所有する。ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４のアミノ酸１〜４０は、ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４のアミノ酸２〜４１に等しい。唯一の相違は、ｔＢｕ保護システインの位置である。このアミノ酸は、レセプター薬物相互作用に関与するが、最終コンジュゲート中のポリマー担体に対する連結基として作用するように定められている。ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４の場合、ｔＢｕ保護システインはＣ末端に結合され、ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４の場合、それはＮ末端に結合される。結合棒はシステイン架橋を表す。
【０１３９】
ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４にはＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４に勝る２つの利点がある。
【０１４０】
第１の利点は、その合成利便性である。ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４は、ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４よりも高い全収率で単離されうる。ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４の直鎖配列の合成において、ＣＩＺ−２２マー（ＣＩＺ−ＲＧＧＧＴＹＳＣＨＦＧＫＬＴ−１−Ｎａｌ−ＶＣＫＫＱＲＧ−ＮＨ２、ＣＩＺ：２−クロロベンジルオキシカルボニル基）が副生成物として観察される。逆相高圧液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）による直鎖配列の精製中、それはＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４の直鎖前駆体としての同様のクロマトグラフィー挙動を示し、したがって、それから分離されることが困難となり、所望の生成物の全収率の損失をもたらす。ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４の場合、類似化合物が見出される。
【０１４１】
ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４に勝るＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４の第２の利点は、脱保護ペプチドとポリマー担体との最終コンジュゲートの分析のより容易な実施に存する。ペプチドコンジュゲートの分析のための１つの方法は、エンドプロテアーゼを用いた開裂によるコンジュゲートの選択的分解である。理想的にはペプチド全体は、酵素加水分解中にポリマー担体から放出される。これらのペプチド断片は、すなわちＵＶまたはＭＳ検出などを備えたＨＰＬＣなどの標準分析技法によって同定および定量されうる。
【０１４２】
ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４の場合、開裂は、帯電したアミノ酸のアルギニンおよびリジンのＣ末端にある高度に選択的なペプチド結合を開裂させることが既知であるエンドプロテアーゼである、トリプシンによって影響されうる（Ｆ．Ｌｏｔｔｓｐｅｉｃｈ，Ｈ．Ｚｏｒｂａｓ（Ｈｒｓｇ．），“Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｋ”，Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ａｋａｄｅｍｉｓｃｈｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，１９９８）。これはＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４のコンジュゲートに利用されて、担体分子に結合された元のペプチドのアミノ酸４１個中３８個を含む断片を放出させるであろう。ＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４の場合、アミノ酸４１個中２１個のみの断片がトリプシン消化によって放出される：
【０１４３】
【化４６】
2008546732.tif 000042
活性製薬的成分の分析はその開発中に主要な課題であるため、ＡＧＥＭ４００Ｃ６Ｃ４はＡＧＥＭ４０Ｃ６Ｃ４に勝る明らかな利点を有する。
【０１４４】
それゆえ、開裂部位はモノマーの位置Ｘ１９におけるアルギニンのせいでポリマーの前のかなり右側であるため、ほぼ完全なペプチド断片を産生することが可能であるので、正に帯電したアミノ酸が各位置に配置される場合、連結アミノ酸（ここではシステイン）をＣ末端に包含することが非常に好ましい。
上述のような各構築方法も、ペプチドユニットとしてのマルチマーの調製に使用されうる。
【０１４５】
各同種または異種２価または多価ペプチドユニットを形成するために、本明細書に記載した結合ドメインすべても単独で、または２価ペプチドの一部として、１個以上の他の同一または異なるペプチドドメインのどちらかと結合されうることが指摘される。
【０１４６】
該ペプチドユニットは、Ｎ末端にてＡｃＧに関して、Ｃ末端にてＭｅＧに関して場合により修飾される。
【０１４７】
ペプチドユニットは、たとえばアセチル化またはアミド化によって修飾されうるか、あるいはＣ末端またはＮ末端位置にて伸長されうる。特にポリマー担体ユニット結合の準備のための、２個の末端の一方のみにおける１個以上のアミノ酸による伸長は、連続ペプチドとして最も良好に製造されうるヘテロダイマー２価ペプチドユニットをもたらすことが多い（上を参照）。
【０１４８】
本発明による最終多価または２価ペプチドの合成は好ましくは、結合ドメインそれぞれの中にジスルフィド結合または他の分子内結合の２つの連続および独立した形成も含みうる。
【０１４９】
本発明は、ペプチドユニットが各担体ユニットに結合される、各化合物の産生方法をさらに含む。本発明の化合物は、ヒトおよび獣医用製薬組成物の調製に好都合に使用されうる。適応症はそれに結合されるペプチドユニットに依存する。
【０１５０】
ＥＰＯ模倣ペプチドのカップリングの場合、本発明による化合物は、特にエリスロポエチンと同じ適応症に適切である。それゆえ本発明は、エリスロポエチンアゴニスト活性を含むペプチドユニットを持つ本発明の化合物の治療的有効用量または量を患者に投与するステップを含む、エリスロポエチンアゴニストによる治療に感受性である障害に苦しんでいる患者を治療する方法も提供する。
【０１５１】
エリスロポエチンは、サイトカインスーパーファミリの一員である（上を参照）。導入部に記載した刺激効果以外に、エリスロポエチンが幹細胞を刺激することも見出された。本明細書に記載したＥＰＯ模倣薬はそれゆえ、幹細胞関連の影響によって引き起こされたすべての適応症に適切である。非制限的な例は、神経系に関連する疾患の予防および／治療である。例は、神経損傷、疾患または障害、たとえばパーキンソニズム、アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、ゴーシェ病、テイ−ザックス病、ニューロパチー、末梢神経損傷、脳腫瘍、脳損傷、脊髄損傷または脳卒中損傷である。本発明によるＥＰＯ模倣ペプチドは、心不全に苦しむ、または苦しむ危険性のある患者の予防的および／または治癒的治療にも有用である。例は、心筋梗塞、冠動脈疾患、心筋炎、化学療法治療、アルコール依存、心筋症、高血圧、僧帽弁閉鎖不全症または大動脈弁狭窄症を含む弁心臓病、および甲状腺の障害、慢性および／または急性冠不全症候群である。さらにＥＰＯ模倣薬は、内皮前駆細胞の生理的可動化、増殖および分化の刺激に、血管形成の刺激に、内皮前駆細胞の障害に関連する疾患の治療に、そのような疾患の治療のための製薬組成物および前記ペプチドを含む製薬組成物および内皮前駆細胞の刺激に適切な他の薬剤の産生に使用されうる。そのような疾患の例は、高コレステロール血症、真性糖尿病、内皮介在慢性炎症疾患、細網内皮症を含む内皮症、アテローム性動脈硬化、冠動脈心疾患、心筋虚血、狭心症、加齢性心血管疾患、レイノー病、妊娠性高血圧症、慢性または急性腎不全、心不全、創傷治癒および二次疾患である。ＥＰＯ模倣ぺプチド単位を持つ化合物は、エリスロポエチンの欠乏あるいは少ないまたは欠陥のある赤血球集団を特徴とする障害の治療に、そして特に貧血および脳卒中のいずれの種類の治療に特に有用である。このような製薬組成物は、組成物を目的の投与手順に採用するために製薬的に許容される担体を場合により含みうる。適切な送達方法は担体および添加剤と同様に、たとえば参照により本明細書に組み入れられているＷＯ  ２００４／１０１６１１に記載されている。
【０１５２】
ＴＰＯ模倣ペプチドを持つ（アゴニスト活性を有する）化合物の場合、化合物はトロンボポエチンとしてすべての適応症に使用されうる。それゆえ該化合物は、ＴＰＯによって媒介される疾患、たとえば血小板減少症、顆粒球減少症および貧血を含む血液疾患の予防および治療に、そして血液悪性腫瘍の治療に有用である。それゆえ本発明は、トロンボポエチンアゴニスト活性を含むペプチドユニットを持つ本発明の化合物の治療的有効用量または量を患者に投与するステップを含む、トロンボポエチンアゴニストによる治療に感受性である障害に苦しんでいる患者を治療する方法も提供する。
【実施例】
【０１５３】
Ａ．超多価化合物の概念の例証
超多価分子の概念は、実施例によって説明されるものとする。図１３は、本発明による簡単な超多価分子の例を示す。連続２価ペプチドは、マレイミド基を持つ２官能性ＰＥＧ部分によってＮ末端で結合されている。システインは、ＰＥＧ担体ユニットのための反応性結合部位として選択された。
【０１５４】
しかしながら超多価分子は、２個を超える連続２価または多価ペプチドユニットを含みうる。図１４は、中央グリセロールユニットを分岐ユニットとして備えた担体ユニットに基づき、３個の連続２価ペプチドを含む例を与える。再び、システインは結合に使用された。図２０は、ポリマー担体ユニットとしてＨＥＳを使用する例を示す。ＨＥＳは、ＨＥＳがペプチドユニットのＳＨ基と反応するマレイミド基を持つように修飾された。本例に従って、すべての結合部位はペプチドユニットに結合される。しかしながら小型のＰＥＧユニット（たとえば３〜１０ｋＤ）も、結合部位の少なくとも一部を占有可能であった。
【０１５５】
上で説明したように、超多価概念は、樹状および／またはポリマー担体ユニットが多数の連続２価ペプチドの結合されている多価樹状ポリマーにも拡張されうる。たとえば樹状分岐ユニットは、ポリグリセロールに基づきうる（参照により本明細書に組み入れられている、Ｈａａｇ  ２０００を参照）。
【０１５６】
６個の連続２価ペプチドを含有する樹状分岐ユニットを備えた担体ユニットに基づく超多価分子の例を図１５に示す。
【０１５７】
超多価分子の他の例は、多数のアルデヒド官能基を内包するためにたとえば過ヨウ素酸を使用して酸化されるデンプンまたはデキストランを備えた担体ユニットを含む。第２ステップにおいて、多くの２価ぺプチドが担体ユニットに結合され、共に最終分子を形成する。数百個（たとえば５０〜１０００個、好ましくは１５０〜８００個、さらに好ましくは２５０〜７００個）のペプチドユニットすら、たとえばＨＥＳである担体分子にカップリングされうることに注目する。しかしながら図に示すように、特にＥＰＯ模倣ペプチドがカップリングされる場合は、はるかに少ないペプチドユニットもＨＥＳ分子に結合されうる。カップリングされるペプチドユニットの平均数は、ペプチドおよび結合されるレセプターに応じて、約２〜１０００、２〜５００、２〜１００、２〜５０、好ましくは２〜２０、最も好ましくは２〜１０から選択されうる。
【０１５８】
図１６は、簡単な生分解性超多価分子の概念を示す。２個の連続２価ペプチドは、中間開裂位置を有する生分解性リンカーを介して結合される２個の２官能性ＰＥＧ部分によってＮ末端で結合される。リンカーは、サブユニット中での大型のＰＥＧユニットの分解を可能にして、それにより腎クリアランスを促進する。
【０１５９】
超多価効果に関連する利点は非常に驚くべきであり、予想外であった。最初に、巨大分子へのコンジュゲーションが有効性を低下させうることが懸念された。この予想は、より大型の分子による拡散速度低下のために結合速度での仮定された欠点に基づいていた。別の予想は、担体に結合した複数のペプチドＡＰＩから、同時結合の立体的問題のために、または巨大分子担体の拡張によって達成されうるレセプターの数が制限されており、おそらくペプチドＡＰＩの数よりも少ないために、すべてがレセプターに潜在的に結合できるわけではないことであった。それゆえ本発明の超多価概念で見られるようなペプチドＡＰＩ（活性製薬的成分）の効力の上昇は、予想されなかった。
【０１６０】
これに対して、巨大分子担体が導入できる著しい薬物動態学的変化のために、生体内効力は全ペプチド／担体錯体のより長い半減期のために改善可能であった。本現象は、超多価効果が別個に決定する必要のある薬力学的実体であるため、超多価効果を生体内で決定することが困難であるという効果も有する。それゆえ試験管内アッセイは、超多価効果を明確に証明するための、十分であるだけでなく、唯一の有用な方法でありうる。
【０１６１】
本発明で記載したような超多価効果は、ペプチドＡＰＩのモル量の比較（担体にコンジュゲート対非コンジュゲート）によって証明されうる。
【０１６２】
試験管内でのＥＰＯ様活性の決定のために、ヨーロッパ薬局方によって推奨される標準ＴＦ−１細胞アッセイで実験を実施した（下も参照）。基本的にＴＦ−１細胞（その増殖はＥＰＯ様活性の存在に依存する）は、各種の濃度のＥＰＯまたはＥＰＯ模倣物質の存在下で培養される。生じた細胞数は、比色ＭＴＴアッセイおよび測光測定を使用して定量される。これらのデータに基づいて、各所与の物質について正規化された用量反応関係を決定することが可能である。
【０１６３】
本アッセイにおいて、ＥＰＯと、既知のＥＰＯ模倣活性を備えた連続２価ペプチドであるペプチドＡＧＥＭ４０（下を参照）を使用した。
【０１６４】
ＡＧＥＭ４０は、非コンジュゲートペプチドとして、そして巨大分子担体にコンジュゲートされたペプチド（この場合、平均分子量１３０ｋＤのヒドロキシエチルデンプン；販売元は薬局であり、代用血漿としてのＶｏｌｕｖｅｎ）として使用された。本コンジュゲートの構成要素サイズはほぼ４０ｋＤであり、これは平均ＨＥＳ分子が約２〜５個の、好ましくは３〜４個のペプチド部分を持つことを意味する。ＨＥＳ２００／０．５も使用されうる。１３０ｋＤＨＥＳの修飾後、ＡＧＥＭ４０の約４個のペプチドがコンジュゲートされた（コンジュゲートされた分子の分子量：１５０ｋＤ）。分子量２００ｋＤのＨＥＳが使用されたとき、この量は、ＨＥＳにコンジュゲートされた約５個のペプチドユニットに相当する（コンジュゲート分子の分子量：２２０ｋＤ）。
【０１６５】
図３３に示す比較は、ペプチドがコンジュゲートされているかいないかにかかわらず、ペプチド濃度のモル比較に基づいている。驚くべきことに、効力は上昇し（ＥＣ５０は低下し、用量依存曲線は非コンジュゲートペプチドより左に位置する）、それにより巨大分子担体への複数価（ｏｌｉｇｏｖａｌｅｎｔ）コンジュゲーションの正の薬力学的影響を証明する。
【０１６６】
それゆえ予想された薬力学的改善とは無関係に、本発明によるコンジュゲーション概念は、全体の活性製薬的成分（ＡＰＩ）、それゆえその有効性を明らかに上昇させる。
【０１６７】
これは、ＥＰＯレセプターに対処するペプチドに、しかし潜在的には他の膜結合薬理学的標的、特にトロンボポエチン、Ｇ−ＣＳＦ、インターロイキン、およびその他のレセプターなど（上を参照）の他のサイトカインレセプターに確実に使用されうる新たな機構である。
【０１６８】
Ｂ．ペプチドユニットをヒドロキシエチルデンプンにコンジュゲートするための概念
上で概説したように、一実施形態に従って、ヒドロキシアルキルデンプン、好ましくはヒドロキシエチルデンプンなどのポリサッカライドは、ペプチドユニットのポリマー担体として使用される。ペプチドユニットを担体にコンジュゲートできるようにするために、適切な連結基をデンプン分子内に導入してカップリングを促進することが可能である。一実施形態に従って、アミノ基はデンプン（以下、例のヒドロキシルエチルデンプンに基づいて記載）主鎖上に導入される。従うことができる各種の方法がある。そのうち３つを以下でより詳細に説明し、これらの方法の概略を図３４に与える。
【０１６９】
１．２ステッププロセス：アルデヒド基が酸化により導入され、還元的アミノ化が続く。
【０１７０】
ＨＥＳ分子の酸化は、複数の酸化剤、すなわち過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ４）、および２−ヨードキシ安息香酸（ＩＢＸ）によって達成されうる。ＮａＩＯ４による酸化は長時間および周知であり、サッカライド環の開環によってアルデヒドをもたらす。
【０１７１】
ＩＢＸ
【０１７２】
【化４７】
2008546732.tif 000043
は、サッカライド環を開環せずに第１級アルコール基をアルデヒドに変換するために化学量論的に使用されうる（図３６を参照、総説についてはＶ．Ｖ．Ｚｈｄａｎｋｉｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００５，２，１２１−１４５および引用文献を参照）。水により良好に溶解する誘導体は、文献に記載されている（Ｔｈｏｔｔｕｍｋａｒａ，Ａ．Ｐ．；Ｖｉｎｏｄ．Ｔ．Ｋ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，２００２，４３（４），５６９）。
【０１７３】
各種の手法に従って、炭水化物（好ましくはＨＡＳなどのデンプン分子）は、炭水化物（好ましくはＨＡＳなどのデンプン分子）を含有する開始物質にオキソアンモニウムイオンを産生する試薬を酸化剤の存在下で接触させることによって、または開始物質に直接、反応性種であるオキソアンモニウムイオンを接触させることによって酸化される。
【０１７４】
酸化剤はたとえば、次亜塩素酸および次亜臭素酸ナトリウムなどの次亜ハロゲン化物または過酸化水素などのたとえば化学酸化剤である。あるいは酸化酵素が酸化剤として使用されうる（たとえば参照により本明細書に組み入れられているＷＯ  ９９／２３２４０を参照）。
【０１７５】
オキソアンモニウムイオンを産生する試薬は、好ましくはニトロキシル化合物、さらに好ましくはジ−ｔｅｒｔ−ニトロキシル化合物、たとえば２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル（ＴＥＭＰＯ）またはその各誘導体である。適切な共酸化試薬、すなわち次亜塩素酸ナトリウム（ＮａＯＣｌ）の化学量論的量の存在下でのＴＥＭＰＯのどちらかの触媒量による酸化は、サッカライド環の開環を伴わずに第１級アルコール基のアルデヒドへの酸化を主にもたらす（図３５を参照、ＨＥＳの場合は、ヒドロキシエチル基の位置６または末端Ｃ原子のどちらかがアルデヒドに変換される）（文献：Ｐ．Ｌ．  Ｂｒａｇｄ，Ｈ．ｖａｎ  Ｂｅｋｋｕｍ，Ａ．Ｃ．Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，２００４，２７，１−４；ｒｅｖｉｅｗ：Ｗ．Ａｄａｍ，Ｃ．Ｒ．Ｓａｈａ−Ｍｏｌｌｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｇａｎｅｓｈｐｕｒｅ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００１，  １０１，３４９９−３５４８および引用文献、Ａ．Ｅ．Ｊ．ｄｅ  Ｎｏｏｙ，Ａ．Ｃ．Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｈ．ｖ．Ｂｅｋｋｕｍ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２６９，８９、ＥＰ  １  ０９３  ４６７、ＥＰ  １  １７３  ４０９、ＷＯ  ００／５０６２１、ＥＰ  １  ０７７  ２２１、ＥＰ  １  １４９  ８４６）。
【０１７６】
あるいはＴＥＭＰＯの触媒量の代わりに、活性種のオキソアンモニウム化合物の化学量論的量が使用されうる（文献：Ｊ．Ｍ．Ｂｏｂｂｉｔｔ，Ｎ．Ｍｅｒｂｏｕｈ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ，２００５，８２，８０）。他のＴＥＭＰＯ誘導体（すなわち４−アセトアミド、４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯ）も、反応物のｐＨおよび水への溶解性に関して特に適切である。
【０１７７】
酸化後に、得られたアルデヒド基は還元的アミノ化によってアミンに変換される。還元剤、たとえばシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはボラン−ジメチルアミン錯体（または他の錯体ボラン化合物）が使用されうる。アミン化合物として、たとえば塩化アンモニウムまたはジアミン、たとえば１，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノプロパン−２−オール、またはリジンは、好ましくはやや酸性のｐＨ値で使用されうる。ジアミンの使用は、ＨＥＳ主鎖とペプチド薬との間のスペーサ長および還元的アミノ化の収率を増進する。
変換されたアルデヒド基は、開始時の第１級アルコールに再度還元されることはない。
【０１７８】
ＩＢＸ酸化の修飾はＮ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下でＤＭＳＯ中で行われうる（図３９）。この場合、ウロン酸の対応する活性化エステルが直接形成される。この種は、すなわちジアミン、すなわち１，３−ジアミノプロパンによってアミノ化ＨＥＳに直接変換されうる（文献：Ｒ．Ｍａｚｉｔｓｃｈｅｋ，Ｍ．Ｍｕｌｂａｉｅｒ，Ａ．Ｇｉａｎｎｉｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００２，１１４，２１，４２１６−４２１８；Ａ．Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ａ．Ｇｉａｎｎｉｓ，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００４，３４６，２５２−２５６）。
【０１７９】
２．ＨＥＳが「カップリング」試薬によって活性化され、過剰な２官能性アミンと反応する２ステッププロセス。
【０１８０】
複数の方法が、ポリサッカライド、すなわち１，１’−カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）（文献：Ｇ．Ｓ．Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．Ａｙｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．Ｗ．Ｈｅａｒｎ，Ｗ．Ｓ．Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８１，２１９，３６１−３７２）、エピブロモヒドリン（１−ブロモ−２，３−エポキシプロパン、あるいはエピクロロヒドリン、それぞれ１−クロロ−２，３−エポキシ−１−クロロ−２，３−エポキシ−プロパン）（文献：Ｈ．Ｄoｂｅｌｉ，Ｅ．Ｈｕｃｈｕｌｉ，Ｐａｔｅｎｔ，０２５３３０３  Ｂ１）、２，２，２−トリフルオロエタン−スルホニルクロライド（塩化トレシル）（文献：Ｈ．Ｐ．Ｊｅｎｎｉｓｓｅｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎ．，１９９５，８，１１６−１２４）、ブロモシアニド（ＢｒＣＮ）（文献：Ｇ．Ｓ．Ｂｅｔｈｅｌｌ，Ｊ．Ｓ．Ａｙｅｒｓ，Ｍ．Ｔ．Ｗ．Ｈｅａｒｎ，Ｗ．Ｓ．Ｈａｎｃｏｃｋ，Ｊ．ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ，１９８１，２１９，３６１−３７２；Ｈ．Ｐ．Ｊｅｎｎｉｓｓｅｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｒｅｃｏｇｎ．，１９９５，８，１１６−１２４，Ｈ．Ｄoｂｅｌｉ，Ｅ．Ｈｕｃｈｕｌｉ，Ｐａｔｅｎｔ，ＥＰ０２５３３０３  Ｂ１）の活性化について記載されている。すべての試薬は、非常に反応性であり、第２ステップにおいてアミン、すなわち塩化アンモニウム（すべての活性化試薬に適切なわけではない）またはジアミン、すなわち１，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノプロパン−２−オール、またはリジンなどの２官能性求核試薬の過剰量と反応されうる、官能基を導入することで共通している。
【０１８１】
３．ＨＥＳが適切なアミン前駆体の添加によって活性化される１ステッププロセス。
【０１８２】
適切なアミン前駆体は、たとえばハロゲノアルキルアミン（すなわちその塩、すなわち臭化ブロモエチルアンモニウム）または反応性アザ環、すなわちアザリジン、すなわちリチウムＬ−アザリジン−２−カルボキシラートである。
【０１８３】
記載した３つの方法はすべて、アミノ基のヒドロキシエチルデンプンへの導入後に、これらのアミノ基が適切なリンカーの適切な例としてマレイミドに変換されることで共通している。これはたとえば、すなわち活性化ω−マレイミドカルボン酸、すなわち３−（マレイミド）プロピオン酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルまたは４−（マレイミド）酪酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって達成されうる。生じたマレイミドは、遊離チオール基を持つペプチドとのカップリングのための最終活性官能基に相当する。
【０１８４】
１．２ステッププロセス：アルデヒド基が酸化により導入され、還元的アミノ化が続く。
【０１８５】
１．１．第１級アルコールのアルデヒドへの酸化
ヒドロキシエチルデンプン中での第１級アルコールの、より精密にはグルコースのＣ６−ＯＨ基およびヒドロキシエチル基の直接酸化によって、アルデヒド基が形成されうる。これらの酸化生成物は、ＴＥＭＰＯまたはＩＢＸ（たとえばＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＡｃｒｏｓ）などの市販の酸化剤によって行われる。
ａ）過ヨウ素酸塩による酸化
この方法は、Ｃの実験節でさらに詳細に記載されている（下を参照）。
ｂ）ＴＥＭＰＯによる酸化
２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシ（ＴＥＭＰＯ）あるいはその誘導体、たとえば４−アセトアミド−ＴＥＭＰＯまたは４−ヒドロキシ−ＴＥＭＰＯおよび次亜塩素酸ナトリウムなどの共酸化剤を臭化カリウムとの混合物（モル比ＴＥＭＰＯ：ＮａＯＣｌ：ＫＢｒたとえば１：４０：２０）中で使用することによって、第１級アルコールは、約６０分の短い反応時間で、６〜８のｐＨ範囲のリン酸緩衝液中で酸化することが可能であり、それにより、より高いｐＨは反応速度を上昇させる。酸化混合物、特に共酸化剤の異なるモル濃度によって、形成されるアルデヒドの数が制御されうる。結果として、アンカー基の量、それゆえ担体に対するペプチド薬物の量はこの第１ステップによって制御される。
【０１８６】
最適化は、アルデヒドのみと紫色付加体を形成する試薬Ｐｕｒｐａｌｄおよびヨウ素／デンプン錯体による残りの次亜塩素酸塩の酸化還元滴定によって監視された。
【０１８７】
ワークアップは、異なる分子量カットオフのＰＥＳ膜を使用する限外濾過技法と、続いての凍結乾燥によって実施した（文献：Ｐ．Ｌ．Ｂｒａｇｄ，Ｈ．ｖａｎ  Ｂｅｋｋｕｍ，Ａ．Ｃ．Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｃａｔａｌｙｓｉｓ，２００４，２７，１−４；総説：Ｗ．Ａｄａｍ，Ｃ．Ｒ．Ｓａｈａ−Ｍｏｌｌｅｒ，Ｐ．Ａ．Ｇａｎｅｓｈｐｕｒｅ，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２００１，１０１，３４９９−３５４８および引用論文；Ａ．Ｅ．Ｊ．ｄｅ  Ｎｏｏｙ，Ａ．Ｃ．Ｂｅｓｅｍｅｒ，Ｈ．ｖ．Ｂｅｋｋｕｍ，Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９５，２６９，８９）。
【０１８８】
図３５は、第１級アルコールのＴＥＭＰＯ媒介酸化機構を例証する概要を示す。カルボキシラートへのさらなる酸化は、酸化試薬の過剰な使用によってのみ発生する。
ｃ）ＩＢＸによる酸化
酸化試薬２−ヨードキシ安息香酸（ＩＢＸ）またはその誘導体を使用することによって、ＨＥＳは溶媒としてのＤＭＳＯ中で酸化されうる。１〜２時間の反応時間後、ＩＢＸは水を添加することによって（１０回）除去でき、沈殿したＩＢＸは濾過により除去される。ワークアップは、異なる分子量カットオフのＰＥＳ膜を使用する限外濾過技法と、続いての凍結乾燥によって実施した。
【０１８９】
ＩＢＸの異なるモル濃度によって、形成されるアルデヒドの数が制御されうる。その濃度によって、アンカー基の量、そして担体に対するペプチド薬物の量も同様に制御されうる。
【０１９０】
最適化は、アルデヒドのみと紫色付加体を形成する試薬Ｐｕｒｐａｌｄによって監視した（総説については：Ｖ．Ｖ．Ｚｈｄａｎｋｉｎ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２００５，２，１２１−１４５および引用論文を参照）。
【０１９１】
図３６は、ＴＥＰＭＯまたはＩＢＸによる第１級アルコールの酸化と、それに続く還元的アミノ化に関する図式概要を与える。
【０１９２】
図３７は、マレイミド基の導入およびペプチド薬物とのコンジュゲーションを示す。
【０１９３】
１．２  還元的アミノ化
ａ）塩化アンモニウムによる還元的アミノ化
この方法は、Ｃの実験節でさらに詳細に記載されている（下を参照）。
ｂ）ジアミンリンカーによる還元的アミノ化
ＨＥＳ主鎖とペプチド薬との間のスペーサ長および還元的アミノ化の収率を増進するために、アミノ源としての１，３−ジアミノプロパン、１，３−ジアミノプロパン−２−オールまたはリジンなどのジアミンおよび各種の還元剤、すなわちシアノ水素化ホウ素ナトリウムまたはボラン−ジメチルアミン錯体を用いて反応が実施されうる。
例：１，３−ジアミノプロパンによる還元的アミノ化
酸化ＨＥＳの還元的アミノ化は、１Ｍリン酸緩衝液中、ｐＨ＝５で、前のステップで使用された酸化試薬と比較して１０倍過剰の１，３−ジアミノプロパンを用いて実施する。約９０分間の平衡の後、過剰量のシアノ水素化ホウ素ナトリウム（Ｎａ［ＣＮ］ＢＨ３）を複数回に分けて添加する。ワークアップは、異なる分子量カットオフのＰＥＳ膜を使用する限外濾過技法と、続いての凍結乾燥によって実施した。最適化されたＨＥＳ誘導体から、１００ｋＤａを超えるモル質量範囲のみ使用した。
【０１９４】
図３８は、１，３−ジアミノプロパンなどのジアミンによる還元的アミノ化と、それに続く過ヨウ素酸塩酸化ＨＥＳの例によるマレイミド基の導入を例証する概要を与える。
【０１９５】
第１級アルコールの活性化エステルへの直接酸化
ヒドロキシエチルデンプン中での第１級アルコール、より精密にはグルコースのＣ６−ＯＨ基およびヒドロキシエチル基の直接酸化による。これらの酸化では、一般に市販されている酸化剤ＩＢＸ（たとえばＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈまたはＡｃｒｏｓ）がＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）の存在下でアルコールがＯＳｕ−エステルに酸化され、ＯＳｕ−エステルはジアミンを使用することによって直接アミンに変換されうる。
ＨＯＳｕの存在下でのＩＢＸによる酸化−アミンへの直接変換
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドの存在下で酸化試薬２−ヨードキシ安息香酸（ＩＢＸ）またはその誘導体を使用することによって、ＨＥＳは溶媒としてのＤＭＳＯ中で酸化されうる。１〜２時間後、酸化は終了し、形成されたＯＳｕ−エステルに大幅に過剰（１０倍）のジアミン、たとえば１，３−ジアミノプロパンを添加する。
【０１９６】
ワークアップは、異なる分子量カットオフのＰＥＳ膜を使用する限外濾過技法と、続いての凍結乾燥によって実施した。最適化されたＨＥＳ誘導体から、１００ｋＤａを超えるモル質量範囲のみ使用した（文献については：Ｒ．Ｍａｚｉｔｓｃｈｅｋ，Ｍ．Ｍｕｌｂａｉｅｒ，Ａ．Ｇｉａｎｎｉｓ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．２００２，１１４，２１，４２１６−４２１８；Ａ．Ｓｃｈｕｌｚｅ，Ａ．Ｇｉａｎｎｉｓ，Ａｄｖ．Ｓｙｎｔｈ．Ｃａｔａｌ．２００４，３４６，２５２−２５６を参照）。
【０１９７】
図３９は、第１級アルコールのＯＳｕ−エステルへの酸化と、それに続くジアミンによる直接変換を示す。
【０１９８】
２．ＨＥＳが「カップリング」試薬によって活性化され、過剰な２官能性アミンと反応する２ステッププロセス。
【０１９９】
アミン基をＨＥＳ主鎖に導入するために、複数の代案が利用されうる。一部の例：
ａ）カルボニルジイミダゾール（ＣＤＩ）による修飾
無水ＨＥＳを無水アセトンに１時間懸濁させる。ＣＤＩを添加して、混合物を１時間撹拌する。あるいはある塩、たとえばヨウ化カリウムは活性化物質／共求核試薬として添加されうる。ＨＥＳを遠心沈殿させる（２０００Ｕ／分、＞１０分）。デカンテーションの後、新しいアセトンを添加し、ＨＥＳを再度遠心沈殿させる。アセトンで３回洗浄した後、ＨＥＳを１Ｍ炭酸塩緩衝液、ｐＨ１０に取り、１，３−ジアミノプロパン（ｐＨ１１）を添加して、混合物を１時間撹拌した。ＨＥＳを限外濾過（ＭＷＣＯ  １００ｋＤ）とそれに続く凍結乾燥によってワークアップする。
【０２００】
図４０は、カルボニルジイミダゾールと、続いてのアミン基を導入するためのジアミンによる修飾を示す。
ｂ）エピブロモヒドリン（Ｅｐｉ）による修飾
ＨＥＳを多少のＤＭＦに溶解して、エピブロモヒドリンを添加し（あるいはある塩、たとえばヨウ化カリウムは活性化物質／共求核試薬として添加されうる）、混合物を一晩撹拌する。ＨＥＳを水（１０倍）で希釈して、限外濾過（ＭＷＣＯ  ５０または１００ｋＤ）とそれに続く凍結乾燥によってワークアップする。生成物を１Ｍリン酸緩衝液、ｐＨ＝７に溶解させて、１，３−ジアミンプロパンを添加し、混合物を１時間撹拌する。ＨＥＳを限外濾過（ＭＷＣＯ  ５０または１００ｋＤ）とそれに続く凍結乾燥によってワークアップする。
【０２０１】
図４１は、エピクロロヒドリン、続いてのアミン基を導入するためのジアミンによる修飾を示す。
【０２０２】
３．ＨＥＳが適切なアミン前駆体の添加によって活性化される１ステッププロセス。
ａ）２−アミノエチルブロミドヒドロブロミドによる修飾
ＨＥＳをＤＭＳＯに溶解させて、２−ブロモエチルアミンヒドロブロミドを添加し（あるいはある塩、たとえばヨウ化カリウムは活性化物質／共求核試薬として添加されうる）、一晩撹拌する（多少の加熱も使用されうる）。ＨＥＳを水（１０倍）で希釈して、限外濾過（ＭＷＣＯ  ５０または１００ｋＤ）とそれに続く凍結乾燥によってワークアップする。
【０２０３】
図４２は、アミン基を導入するための２−アミノエチルブロミドヒドロクロライドによる修飾を示す。
ｂ）リチウムＬ−アジリジン−２−カルボキシラートによる修飾
ＨＥＳをＤＭＳＯまたは緩衝水溶液に溶解させ、２−リチウムＬ−アジリジン−２−カルボキシラートを添加し（あるいはある塩、たとえばヨウ化カリウムは活性化物質／共求核試薬として添加されうる）、一晩撹拌する。混合物を水（１０倍）で希釈して、限外濾過（ＭＷＣＯ  ５０または１００ｋＤ）とそれに続く凍結乾燥によってワークアップする。
【０２０４】
図４３は、アミン基を導入するためのＬ−アジリジン−２−カルボキシラートによる修飾を示す。
【０２０５】
Ｃ．本発明の実施形態の詳細な例
Ｉ．モノマーのペプチド合成
手動合成
合成は、Ｄｉｓｃｏｖｅｒマイクロオーブンシステム（ＣＥＭ）を使用して、ＰＬ−Ｒｉｎｋアミド樹脂（置換速度０．４ｍｍｏｌ／ｇ）または事前に装填されたＷａｎｇ樹脂を０．４ｍｍｏｌ規模で用いて実施する。Ｆｍｏｃ基の除去は、ピペリジン／ＤＭＦ（１：３）３０ｍｌの添加および１００Ｗで３ｘ３０秒の照射によって達成される。アミノ酸のカップリングは、５倍過剰量のＤＭＦ中アミノ酸、カップリング添加剤としてのＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡの添加および５０Ｗで５ｘ３０秒の照射によって達成される。すべての照射サイクル間で、溶液は氷浴を用いて手動で冷却する。脱保護およびカップリングの後、樹脂をＤＭＦ  ３０ｍｌで６回洗浄する。最後のアミノ酸の脱保護の後、一部のペプチドを、キャッピング溶液１．２６８ｍｌ（ＤＭＳＯ  １００ｍｌ中無水酢酸４．７３ｍｌおよびＤＩＥＡ  ８．７３ｍｌ）による５分間のインキュベーションによってアセチル化する。開裂前に、次に樹脂をＤＭＦ  ３０ｍｌによって６回、ＤＣＭ  ３０ｍｌによって６回洗浄する。粗ペプチドの開裂は、不活性雰囲気中でのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）５ｍｌによる１２０分間の処理によって達成される。この溶液を冷エーテル４０ｍｌ中へ濾過する。沈殿物をアセトニトリル／水（１／１）に溶解させて、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ）によって精製する。
【０２０６】
自動化合成
合成は、Ｏｄｙｓｓｅｙマイクロオーブンシステム（ＣＥＭ）を使用して、ＰＬ−Ｒｉｎｋアミド樹脂（置換速度０．４ｍｍｏｌ／ｇ）または事前に装填されたＷａｎｇ樹脂を０．２５ｍｍｏｌ規模で用いて実施する。Ｆｍｏｃ基の除去は、ピペリジン／ＤＭＦ（１：３）１０ｍｌの添加および１００Ｗで１０ｘ１０秒の照射によって達成される。アミノ酸のカップリングは、５倍過剰量のＤＭＦ中アミノ酸、カップリング添加剤としてのＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡの添加および５０Ｗで５ｘ３０秒の照射によって達成される。すべての照射サイクル間に、溶液は反応混合物に窒素を通気することによって冷却する。脱保護およびカップリングの後、樹脂をＤＭＦ  １０ｍｌで６回洗浄する。最後のアミノ酸の脱保護の後、一部のペプチドを、キャッピング溶液０．７９３ｍｌ（ＤＭＳＯ  １００ｍｌ中無水酢酸４．７３ｍｌおよびＤＩＥＡ  ８．７３ｍｌ）による５分間のインキュベーションによってアセチル化する。開裂前に、次に樹脂をＤＭＦ  １０ｍｌによって６回、ＤＣＭ  １０ｍｌによって６回洗浄する。粗ペプチドの開裂は、不活性雰囲気中でのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）５ｍｌによる１２０分間の処理によって達成される。本溶液を冷エーテル４０ｍｌ中へ濾過して、沈殿物をアセトニトリル／水（１／１）に溶解させ、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ）によって精製する。
【０２０７】
精製
すべてのペプチドはＮｅｂｕｌａ−ＬＣＭＳシステム（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して精製した。すべてのペプチドの粗物質をアセトニトリル／水（１／１）に溶解させて、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ）によって精製した。流速は２０ｍｌ／分であり、ＬＣＭＳ分割比は１／１０００であった。
【０２０８】
ＩＩ．分子内ジスルフィド架橋の形成
Ｋ３［（ＦｅＣＮ６）による環化
溶液１：ペプチド１０ｍｇを０．１％ＴＦＡ／アセトニトリルに溶解させ、０．５ｍｇ／ｍｌの濃度に到達するまで水で希釈する。約８のｐＨに達するように、固体重炭酸アンモニウムを添加する。
【０２０９】
溶液２：第２のバイアルで、０．１％  ＴＦＡ／アセトニトリル１０ｍｌを水１０ｍｌで希釈する。８のｐＨに達するまで固体重炭酸アンモニウムを添加し、Ｋ３［（ＦｅＣＮ６）］０．１Ｍ溶液１滴を添加する。
【０２１０】
溶液１および２をアセトニトリル／水の混合物（１／１；ｐＨ＝８）に３時間の期間にわたって滴加する。混合物を室温で一晩インキュベートして、混合物を濃縮して、ＬＣＭＳによって精製する。
【０２１１】
ＣＬＥＡＲ−ＯＸ（商標）樹脂による環化
アセトニトリル／水（１／１；０．１％  ＴＦＡ）１００ｍｌに、８のｐＨに達するまで固体重炭酸アンモニウムを添加する。この溶液にアルゴンを３０分間通気することによって脱気する。ここでＣＬＥＡＲ−ＯＸ（商標）樹脂１００ｍｇを添加する。１０分後、ペプチド１０ｍｇを固体として添加する。２時間のインキュベーションの後、溶液を濾過して、濃縮し、ＬＣＭＳによって精製する。
【０２１２】
環式ペプチドの精製
すべてのペプチドはＮｅｂｕｌａ−ＬＣＭＳシステム（Ｇｉｌｓｏｎ）を使用して精製した。すべてのペプチドの粗物質をアセトニトリル／水（１／１）またはＤＭＳＯに溶解させて、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ）によって精製した。流速は２０ｍｌ／分であり、ＬＣＭＳ分割比は１／１０００であった。
【０２１３】
ＩＩＩ．モノマーによる試験管内アッセイ
ＢｒｄＵ包含によるＴＦ−１細胞による増殖アッセイ
対数増殖期のＴＦ−１細胞（〜２．１０５〜１．１０６細胞／ｍｌ；ＲＰＭＩ培地；２０％ウシ胎児血清；ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを添加；０．５ｎｇ／ｍｌインターロイキン３）を洗浄し（５分間、１５００ｒｐｍ遠心分離して、５００，０００細胞／ｍｌにてＩＬ３を含まないＲＰＭＩ完全に懸濁）、ＩＬ−３なしで２４時間にわたってアッセイの開始前に事前培養する。翌日、通常、少なくとも６つの濃度および試験される薬剤につき少なくとも１０，０００細胞／ウェルを含有する、濃度ごとの４個のウェルを用いて、細胞を２４または９６ウェルプレートに播種する。各実験は、正の対照薬剤としての組換えＥＰＯと、負の対照薬剤としてのサイトカインの添加なしのウェルとを含む対照を含む。ペプチドおよびＥＰＯ対照は、培地で所望の濃度まで事前希釈して、細胞に添加し、標準培養条件（３７℃、気相中５％二酸化炭素、水で飽和された雰囲気）下で３日間の培養期間を開始する。濃度は常に、この３日間の培養期間中のウェルにおける薬剤の最終濃度を指す。本培養期間の終わりに、ＦｄＵを８ｎｇ／ｍｌ培地の最終濃度まで添加して、培養を６時間継続する。次にＢｒｄＵ（ブロモデオキシウリジン）およびｄＣｄ（２−デオキシシチジン）をその最終濃度（１０ｎｇ／ｍｌＢｒｄＵ；８ｎｇ／ｍｌ  ｄＣＤ；培地中最終濃度）まで添加して、培養をさらに２時間継続する。
【０２１４】
本インキュベーションおよび培養期間の終わりに、細胞を、１．５％  ＢＳＡを含有するリン酸緩衝生理食塩水で１回洗浄して、最少量の液体に再懸濁させる。この懸濁物から、細胞を−２０℃の７０％エタノール中に滴加する。ここから細胞を氷上で１０分間インキュベートして、次に直接分析するか、あるいは分析前に４℃にて貯蔵することができる。
【０２１５】
分析前に、細胞を遠心分離によってペレット化して、上清を捨て、細胞を残りの流体の最小量に再懸濁させる。細胞を次に２Ｍ  ＨＣｌ／０．５％  ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００  ０．５ｍｌに懸濁させて、１０分間インキュベートする。次にそれらを再度ペレット化して、残りの流体の最少量に再懸濁させて、これを細胞の中間再ペレット化の前に０．１Ｎ  Ｎａ２Ｂ４Ｏ７、ｐＨ８．５  ０．５ｍｌによって希釈する。最後に細胞をリン酸緩衝生理食塩水（１．５％  ＢＳＡ）４０μｌに再懸濁させて、それぞれ細胞懸濁物２０μｌを含有する２個の反応管に分割する。抗ＢｒｄＵ−ＦＩＴＣ（ＤＡＫＯ、クローンＢｕ２０ａ）２μｌを一方の管に添加し、対照ｍＩｇＧ１−ＦＩＴＣ（Ｓｉｇｍａ）２μｌを第２の管に添加して、室温での３０分間のインキュベーション期間を開始する。次にリン酸緩衝生理食塩水０．４ｍｌおよびヨウ化プロピジウム１０μｇ／ｍｌ（最終濃度）を添加する。フローサイトメータでの分析は、４Ｃ細胞またはより高い倍数性の細胞ならびにＢｒｄＵ陽性細胞の画分に適用されるため、それゆえ細胞周期の関連する段階の細胞の画分を決定する。
【０２１６】
ＭＴＴによるＴＦ−１細胞を用いた増殖アッセイ
対数増殖期のＴＦ−１細胞（〜２．１０５〜１．１０６細胞／ｍｌ；ＲＰＭＩ培地；２０％ウシ胎児血清；ペニシリン、ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミンを添加；０．５ｎｇ／ｍｌインターロイキン３）を洗浄し（５分間、１５００ｒｐｍ遠心分離して、５００，０００細胞／ｍｌにてＩＬ３を含まないＲＰＭＩ完全に懸濁）、ＩＬ−３なしで２４時間にわたってアッセイの開始前に事前培養する。翌日、通常、少なくとも６つの濃度および試験される薬剤につき少なくとも１０，０００細胞／ウェルを含有する、濃度ごとの４個のウェルを用いて、細胞を２４または９６ウェルプレートに播種する。各実験は、正の対照薬剤としての組換えＥＰＯと、負の対照薬剤としてのサイトカインの添加なしのウェルとを含む対照を含む。ペプチドおよびＥＰＯ対照は、培地で所望の濃度まで事前希釈して、細胞に添加し、標準培養条件（３７℃、気相中５％二酸化炭素、水で飽和された雰囲気）下で３日間の培養期間を開始する。濃度は常に、この４日間の培養期間中のウェルにおける薬剤の最終濃度を指す。
【０２１７】
第４日に、分析の開始前に、ＴＦ−１細胞の既知数の希釈系列が多数のウェルで調製される（１００μｌ培地中０／２５００／５０００／１００００／２００００／５００００細胞／ウェル）。これらのウェルは、試験ウェルと同じ方法で処理され、細胞数を決定できる校正曲線を後で与える。これらの基準ウェルを設定し、ＭＴＴ増殖キット（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６水性非放射性細胞増殖アッセイ）からのＭＴＳおよびＰＭＳを３７℃水浴で解凍して、ＰＭＳ溶液１００μｌをＭＴＳ溶液２ｍｌに添加する。本混合物２０μｌをアッセイプレートの各ウェルに添加して、３７℃にて３〜４時間インキュベートする。ＥＬＩＳＡリーダでの測定Ｅ４９２の前に、１０％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液２５μｌを各ウェルに添加する。
【０２１８】
プログラムＧｒａｐｈＰａｄを使用する用量依存関係の計算に基づく図１７および１８に示すグラフ評価を使用して、次のＥＣ５０値をＭＴＴアッセイデータに基づいて決定した：
次の表は、ある例示的なペプチドモノマーのＥＣ５０値を示す：
【０２１９】
【化４８】
2008546732.tif 000044
ＩＶ．２価ＥＰＯ模倣ペプチドユニットの合成
直鎖配列番号１１の自動化合成（ＡＧＥＭ１１）
合成は、Ｌｉｂｅｒｔｙマイクロオーブンシステム（ＣＥＭ）を使用して、Ｒｉｎｋアミド樹脂（置換速度０．１９ｍｍｏｌ／ｇ）を０．２５ｍｍｏｌ規模で用いて実施する。Ｆｍｏｃ基の除去は、ピペリジン／ＤＭＦ（１：３）１０ｍｌの添加および５０Ｗで１０ｘ１０秒の照射による二重処理によって達成される。アミノ酸のカップリングは、４倍過剰量のＤＭＦ中アミノ酸、カップリング添加剤としてのＰｙＢＯＰ／ＨＯＢＴ／ＤＩＰＥＡの添加および５０Ｗで５ｘ３０秒の照射による二重処理によって達成される。すべての照射サイクル間に、溶液は反応混合物に窒素を通気することによって冷却する。脱保護およびカップリングの後、樹脂をＤＭＦ  １０ｍｌで６回洗浄する。二重カップリングサイクルの後に、すべての未反応アミノ基を１０倍過剰量のＮ−（２−クロロベンジルオキシカルボニルオキシ）スクシンイミド（０．２Ｍ  ＤＭＦ溶液）および５０Ｗで３ｘ３０秒の照射による処理によって遮断する。最後のアミノ酸の脱保護の後、ペプチドを、キャッピング溶液０．７９３ｍｌ（ＤＭＳＯ  １００ｍｌ中無水酢酸４．７３ｍｌおよびＤＩＥＡ  ８．７３ｍｌ）による５分間のインキュベーションによってアセチル化する。開裂前に、次に樹脂をＤＭＦ  １０ｍｌによって６回、ＤＣＭ  １０ｍｌによって６回洗浄する。粗ペプチドの開裂は、不活性雰囲気中でのＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ（９４／１／２．５／２．５）５ｍｌによる１２０分間の処理によって達成される。本溶液を冷エーテル４０ｍｌ中へ濾過して、沈殿物をアセトニトリル／水（１／１）に溶解させ、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ）によって精製する。
【０２２０】
直鎖ＡＧＥＭ１１の精製スキーム、Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍおよび５０分間の５％〜５０％アセトニトリル（０．１％  ＴＦＡ）のそれに使用した勾配を、図８および９に示す。
【０２２１】
直鎖ＡＧＥＭ１１の環化
【０２２２】
【化４９】
2008546732.tif 000045
直鎖ペプチド３０ｍｇを溶液Ａ  ６０ｍｌに溶解させる。本溶液およびＤＭＳＯ  ６０ｍｌを溶液Ａ  ６０ｍｌに滴加する（添加の総時間：３時間）。４８時間後に溶媒を蒸発によって除去して、残りの残渣をＤＭＳＯ／水３０ｍｌ（１／１）に溶解させる。酢酸３０ｍｌおよびヨウ素１７ｍｇ（ＤＭＳＯ／水（１／１）に溶解を添加し、溶液を室温にて９０分間混合する。その後、アスコルビン酸２０ｍｇを添加して、溶媒を蒸発によって除去する。粗混合物をアセトニトリル／水（２／１）に溶解させて、ペプチドをＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍ）によって精製する。
【０２２３】
溶液Ａ：０．１％  ＴＦＡを含有するアセトニトリル／水（１／１）。ｐＨは重炭酸アンモニウムの添加により８．０に調整する。
【０２２４】
環式ＡＧＥＭ１１の精製パラメータを図１０および１１に与える（スキーム：環式ＡＧＥＭ１１の精製、Ｋｒｏｍａｓｉｌ  １００  Ｃ１８  １０μｍ、２５０ｘ４．６ｍｍおよび５０分間の５％〜３５％アセトニトリル（０．１％  ＴＦＡ）の勾配）。
【０２２５】
Ｖ．ＥＰＯ活性を決定するための試験管内増殖アッセイ
対数増殖期のＴＦ１細胞（２０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）および０．５ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−３を含むＲＰＭＩ中で培養した２．１０５〜１．１０６細胞／ｍｌ）をカウントして、アッセイを実施するのに必要な数の細胞を遠心分離して（５分間、１５００ｒｐｍ）、５％  ＦＣＳを含み、ＩＬ−３を含まないＲＰＭＩ中に３０００００細胞／ｍｌで再懸濁させる。細胞は、ＩＬ−３を含まない本（飢餓）培地で事前に４８時間培養した。アッセイを開始する前に、細胞を再度カウントした。
【０２２６】
アッセイ開始の直前に、ペプチドおよびＥＰＯのアッセイストック溶液を調製する。ペプチドを秤量して、５％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩに１ｍＭ、４６７μＭまたは２００μＭの濃度まで溶解させた。ＥＰＯストック溶液は１０ｎＭまたは２０ｎＭであった。これらのストック溶液２９２μｌを９６ウェル培養プレートの１個のウェルにピペットで移した−１枚のプレートを試験される各物質に使用した。５％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ  ２００μｌを各プレートの１７個の他のウェルにピペットで移した。ストック溶液９２μｌを、培地２００μｌを含有するウェルにピペットで移した。内容物を混合して、このウェルから９２μｌを次に移すなどであった。このようにして各物質の希釈系列（１８希釈）を、各連続ウェルにおいて濃度がその前のウェルの濃度の１：√１０であるように調製した。各ウェルから３ｘ５０μｌを３個の空のウェルに移した。このようにして物質の濃度を４通り測定した。各プレートのウェルの最も上のラインおよび最も下のラインは空にしておくことに注目する。
【０２２７】
事前処理した（飢餓）細胞を遠心分離にかけ（５分、１５００ｒｐｍ）、５％  ＦＣＳを含むＲＰＭＩ中に２０００００細胞／ｍｌの濃度で再懸濁させた。細胞懸濁物５０μｌ（１００００細胞を含有）を各ウェルに添加した。細胞の添加のために、ウェル中の物質の最終濃度は元の希釈範囲の濃度の半分であったことに注目する。プレートを５％  ＣＯ２中で３７℃にて７２時間インキュベートした。評価を開始する前に、ウェル中へのＴＦ−１の既知の量の希釈範囲を調製した：０／２５００／５０００／１００００／２００００／５００００細胞／ウェル（１００μｌ＋ＲＰＭＩ＋５％  ＦＣＳ中）をピペットで４通り移した。
【０２２８】
ウェル当たりの生細胞の数を測定するために、使用準備済みのＭＴＴ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ，ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ）を３７℃水浴で解凍した。ウェルごとにＭＴＴ試薬２０μｌを添加し、プレートを５％  ＣＯ２中で３７℃にて１〜２時間インキュベートした。１０％  ＳＤＳ溶液２５μｌを添加し、プレートをＥＬＩＳＡリーダ（Ｇｅｎｉｏｓ，Ｔｅｃａｎ）で測定した。データはスプレッドシード（Ｅｘｃｅｌ）で処理して、Ｇｒａｐｈｐａｄでプロットした。
【０２２９】
データを図１２にまとめる。
【０２３０】
【化５０】
2008546732.tif 000046
ＶＩ．拡張ペプチドアッセイ
拡張アッセイでは、約２００のペプチド配列をそのＥＰＯ模倣活性について試験した。
【０２３１】
ペプチドは、ＬＩＰＳ−Ｖａｒｉｏ合成機システムでペプチドアミドとして合成した。合成は、専用のＭＴＰ合成プレートで実施して、規模はペプチド当たり２μｍｏｌであった。合成は、ＨＯＢＴを活性化試薬として使用する標準Ｆｍｏｃプロトコルに従った。カップリングステップは、４倍カップリングとして実施した。各カップリングステップは２５分間を要し、ステップ当たりの過剰なアミノ酸は２．８であった。ペプチドの開裂および脱保護は、９０％  ＴＦＡ、５％  ＴＩＰＳ、２．５％  Ｈ２Ｏおよび２．５％  ＤＤＴを含有する開裂溶液によって実施した。樹脂に結合した完成ペプチドを含有する合成プレートは、深型９６ウェルプレートの上で貯蔵した。開裂溶液５０μｌを各ウェルに添加して、開裂を１０分間実施し、この手順を３回反復した。開裂したペプチドは、深型ウェルプレートへの重力流により開裂溶液２００μｌを用いて溶出させた。側鎖官能基の脱保護は、深型ウェルプレート内でさらに２．５時間実施した。その後、ペプチドを氷冷エーテル／ヘキサンによって沈殿させて、遠心分離した。ペプチドを中性水溶液に溶解させて、環化を４℃にて一晩インキュベートした。ペプチドは凍結乾燥させた。
【０２３２】
図１９は、合成および試験したペプチドモノマーに関する概要を与える。ペプチドは、試験管内増殖アッセイでそのＥＰＯ模倣活性について試験した。アッセイはＶに記載されたように実施した。各アッセイ日に、３８個の試験ペプチド、１個の基準例、およびＥＰＯの試験管内活性を平行して測定するために４０枚のマイクロタイタープレートを準備した。ＥＰＯストック溶液は２０ｎＭであった。
【０２３３】
データを図１９に与える。結果からわかるように、本発明のコンセンサスを満足しない試験済みのペプチドは、ＥＰＯ模倣活性を示さなかった。
【０２３４】
ＶＩＩ．過ヨウ素酸塩酸化を使用するペプチドＨＥＳ−コンジュゲートの合成
主反応スキームを図２１に示す。
【０２３５】
記載した方法の目的は、穏やかな水性反応条件下でチオール基と選択的に反応する、本例のＨＥＳによるデンプンの誘導体の産生である。これの選択性はマレイミド基によって到達される。
【０２３６】
ＨＥＳは最初にアミノ基によって官能化され、その後、各マレイミド誘導体に変換される。反応バッチは限外濾過膜を介して低分子反応物質から放出される。生成物、中間生成物はもちろんのこと、抽出物もすべて多分散系である。
【０２３７】
修飾ＨＥＳの合成
ヒドロキシエチルデンプン（Ｖｏｌｕｖｅｎ（登録商標）１３０／０．４またはＳｅｒｕｍｗｅｒｋ  Ｂｅｍｂｕｒｇ  ２００／０．５）は、ダイアフィルトレーションおよび続いての凍結乾燥によって得られた。平均分子量は約１３０ｋＤａであり、モル置換度は０．４、それぞれ２００ｋＤ、ＭＳ＝０．５であった。
【０２３８】
合成は、参照により本明細書に組み入れられている、Ｊａｃｏｂ  Ｐｉｅｈｌｅｒの論文、“Ｍｏｄｉｆｉｚｉｅｒｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｏｂｅｒｆｌａｃｈｅｎ  ｆｕｒ  ｄｉｅ  ｔｈｅｒｍｏｄｙｎａｍｉｓｃｈｅ  ｕｎｄ  ｋｉｎｅｔｉｓｃｈｅ  Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ  ｂｉｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅｒ  Ｅｒｋｅｎｎｕｎｇ  ｍｉｔ  ｏｐｔｉｓｃｈｅｎ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｅｒｎ”１９９７でアミノデキストランについて記載された合成に従って実施した。ＨＥＳは、Ｆｌｏｏｒら（１９８９）に記載されているように、過ヨウ素酸ナトリウムを用いたジオール性ヒドロキシル基のアルデヒド基への部分選択的酸化によって活性化した。アルデヒド基は、アンモニアの存在下でシアノ水素化ホウ素ナトリウム（ＮａＣＮＢＨ３）による還元的アミノ化によって、アミノ基に変換した（Ｙａｌｐａｎｉ  ａｎｄ  Ｂｒｏｏｋｓ，１９９５）。
【０２３９】
１．１  第１級アルコールのアルデヒドへの酸化
ａ）過ヨウ素酸塩酸化／開環
水中の過ヨウ素酸ナトリウムによるサッカライド中の１，２−ジオールの穏やかな酸化によって、アルデヒド基が導入される。酸化剤の各種のモル濃度を使用することによって、担体に対する利用可能なアンカー基の数、そしてペプチド薬物の量が制御される。プロトコルを最適化するために、酸化は、アルデヒドのみと紫色付加体を形成する試薬Ｐｕｒｐａｌｄによって監視した。反応時間は８〜１８時間まで短縮できる。過ヨウ素酸塩の使用量は、グルコース構成要素の数の２０％に相当する（１８０ｇ／ｍｏｌのグルコース構成要素質量、ＤＳ＝０．４を適用）。ワークアップは、限外濾過および凍結乾燥によって実施した。各ポリマー生成物の精製は、異なる分子量カットオフのＰＥＳ膜を使用する限外濾過技法と、続いての凍結乾燥によって実施した。最適化されたＨＥＳ誘導体から、１００ｋＤａを超えるモル質量範囲のみ使用した。
【０２４０】
アルデヒド分析
定性的／半定量的：利用可能なアルデヒド基のＰｕｒｐａｌｄ反応
１．２  還元的アミノ化
ａ）塩化アンモニウムによる還元的アミノ化
下のステップでは、導入されたアルデヒド基を、シアノ水素化ホウ素ナトリウムによってやや酸性のｐＨ値の塩化アンモニウムの飽和溶液中での還元的アミノ化によってアミンに変換した。
プロトコルを最適化するために、開始物質のアルデヒド基は、Ｐｕｒｐａｌｄ試薬およびＴＮＢＳにより形成されたアミンによって追跡した。これらの実験は、イミン中間体の形成が開始期間後に平衡にあり、添加された還元剤がアルデヒドよりもイミンを優先することを示した。そこで最適反応は還元剤の数回の添加により、総反応時間２４時間で実施されることが見出せた。  生成物の沈殿または限外濾過によるワークアップ。
【０２４１】
アミン分析
定性的：ニンヒドリン反応（カイザー試験）
定量的：アミノデキストランと比較して、２，４，６−トリニトロベンゾールスルホン酸（ＴＮＢＳ）による。
【０２４２】
達成された置換グレードは、約２．８％であった。これは、約６４００ｇ／ｍｏｌの、１個のアミノ基を持つ１個の構成要素のモル質量を生じる。
【０２４３】
マレイミドプロピオニル−アミノ−ヒドロキシエチルデンプン（「ＭａＩＰＡ−ＨＥＳ」）の合成
アミノ基が導入された後（複数の異なる方法が存在する、たとえば上を参照）、アンカー基マレイミドはω−マレイミドアルキル（またはアリール）酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルによって導入される。
【０２４４】
合成
マレイミド基のＨＥＳへの最終導入は、３−マレイミドプロピオン酸−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＭａＩＰＡ−ＯＳｕ）によって実施される。やや酸性の緩衝液中で過剰量（５〜１０倍）を使用するとき、変換は定量的である（５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ６または７、２０％  ＤＭＦ、一晩）。限外濾過および凍結乾燥された生成物を−１８℃にて貯蔵する。
【０２４５】
分析
アミノ基の反応は、ニンヒドリンおよびＴＮＢＳによって検証した。導入されたマレイミド基の数は、グルタチオン（ＧＳＨ）の反応およびエルマン試薬（ＤＮＴＢ）による過剰なチオール基の検出によって、そして７００ＭＨｚ  １Ｈ−ＮＭＲ分光法によって証明される。
達成された置換グレードは約２％であり、マレイミド構成要素当たり８５００ｇ／ｍｏｌに相当する（１８０ｇ／ｍｏｌグルコース構成要素質量、ＭＳ＝０．４）。
【０２４６】
図２２は、マレイミド修飾ＨＥＳの１Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ２Ｏ、７００ＭＨｚ）を示す。マレイミドプロトン（６．８ｐｐｍ）のアノマーＣ−Ｈ（４．８〜５．６ｐｐｍ）に対する比は、約６，９００ｇ／ｍｏｌの構成要素サイズを与える（比較：ＧＳＨ／ＤＮＴＢ試験は７，３００ｇ／ｍｏｌを与えた）。
【０２４７】
マレイミド基、そして構成要素サイズは、ＧＳＨによる飽和およびＤＮＴＢによる反応によって測定されうる。生成された黄色は顕著であり、容易に定量されうる。これらの値は、使用した開始材料、それぞれ酸化ステップにおける過ヨウ素酸塩の量に応じて５，０００〜１００，０００ｇ／ｍｏｌの信頼できる構成要素サイズを与える。この方法は、生成物の１Ｈ  ＮＭＲ分光法によって検証されている。ＮＭＲでは、マレイミド基の含量は、すべてのアノマーＣ−Ｈシグナルおよびマレイミド環プロトンの比より定量されうる。
【０２４８】
【化５１】
2008546732.tif 000047
ペプチド−ヒドロキシエチルデンプン−コンジュゲート（Ｐｅｐ−ＡＨＥＳ）
合成
遊離（Ｐｅｐ−ＩＡ）またはビオチン化（Ｐｅｐ−ＩＢ）Ｎ末端のどちらかを有するシステイン含有ペプチドを使用した。Ｐｅｐ−ＩＡ／Ｂの４：１混合物を過剰量（約６当量でＭａＩＰＡ−ＨＥＳによって、リン酸緩衝液、５０ｍＭ、ｐＨ６．５／ＤＭＦ  ８０：２０中で一晩変換させた；ワークアップは限外濾過および凍結乾燥によって行った。
【０２４９】
分析
ＵＶ吸収は２８０ｎｍにて決定され、マレイミド基の残りの含量はＧＳＨ／ＤＮＴＢによって決定された。
【０２５０】
ペプチド収率はほぼ定量的であった。遊離マレイミド基はほとんど検出できなかった。
【０２５１】
ペプチド薬のコンジュゲーションのためのペプチドドメイン
【０２５２】
【化５２】
2008546732.tif 000048
は、
【０２５３】
【化５３】
2008546732.tif 000049
におけるように、遊離チオール基を導入することによって（たとえばＮ末端にシステイン残基を導入することによって）ペプチドユニットを生成するために使用される。
【０２５４】
脱保護ペプチドの１０〜５０％過剰量は、やや酸性の緩衝液中で１〜２時間コンジュゲートされる。一方ではＨＥＳ主鎖、マレイミド基およびジスルフィド架橋が安定であることを確認するために、他方では定量的変換を観察するために、条件が最適化されている。異なるマレイミド官能化ＨＥＳ化合物を使用することによって、ＡｐｌａＧｅｎは、試験管内で超多価効果を示す多数の超多価ＥＰＯ模倣ペプチドを合成できた。一部の例が下に与えられている。
【０２５５】
【化５４】
2008546732.tif 000050
【０２５６】
【化５５】
2008546732.tif 000051
表２：異なるペプチド含量のＡＧＥＭ４０の超多価ＥＰＯ模倣ペプチドコンジュゲート
超多価ＥＰＯ模倣ペプチドコンジュゲートの容易な化学分析は２つのステップで実現された。第１に、ＨＥＳ主鎖の軽度の加水分解後にペプチド含量をＨＰＬＣによって定量し、第２に、硫酸による完全加水分解後にポリサッカライドの量をフェノールによる比色試験によって測定した。
【０２５７】
図２３は、超多価ＥＰＯ模倣ペプチドコンジュゲートＡＧＥＭ４０−ＡＨＥＳ  Ａ２のＴＦＡ／水加水分解のＨＰＬＣクロマトグラム（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣ）を示す。ある時間の後、すべてのペプチド含有種のＵＶ吸収は最大値にて一定であり、遊離ペプチドとの比較により、３７％のペプチド含量が計算された（理論値：３９％）。
【０２５８】
ＶＩＩＩ．さらなる試験管内実験
後述する実験の多くは、すでに上述した。しかしながら下の詳細事項は、記載した試験および結果に関する要約的な概要である。主にヒト細胞培養および骨髄アッセイが議論される。
【０２５９】
一方では、高速細胞系ベースアッセイを使用して、最適化の初期段階を通じての最適化ペプチド配列の効力について点検した。これらの細胞培養アッセイは、新たなペプチドまたは新たなバッチの有効性の高速試験と同様に、なお有効である。細胞系ＴＦ−１（ヒト細胞）に使用された２つの終点は、増殖（ここでは通例、定義された時点での生細胞の数として決定）およびＴＦ−１細胞中のヘモグロビン産生としてマークされた分化である。
【０２６０】
加えて、一次細胞（ヒト骨髄幹細胞）は、生体内状況に非常に近いＣＦＵアッセイに使用した。それらは、ペプチドユニットとしてＥＰＯ模倣ペプチドを使用する場合、はるかに生体内様方式でエリスロポエチン活性に対する答えを与える。しかしながらそれらは細胞培養アッセイよりも、より精密に、そしてアッセイごとにより長い時間で扱われることになっている。
【０２６１】
ヒトＴＦ−１細胞を使用するアッセイ
ＴＦ−１は、ＩＬ３またはＥＰＯなどのあるサイトカインのみに応答して増殖するヒト赤白血病細胞系である。加えてＴＦ−１細胞は、ＥＰＯに応答して赤血球表現型に向かって分化しうる。ＴＦ−１細胞は、ＤＳＭＺ（Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）より入手した。製品シートは、ＤＳＭＺウェブサイトｄｓｍｚ．ｄｅ．で入手できる。ＴＦ−１は、ヨーロッパ薬局方によってＥＰＯ活性評価のために推奨される細胞系である。
【０２６２】
我々の維持培養のための内部培養プロトコル：
培地：ＲＰＭＩ＋Ｐ／Ｓ＋ＡｍｐｈｏＢ＋Ｌ−Ｇｌｕｔ．＋２０％ＦＣＳ＋ｈ−ＩＬ−３
１．−５００ｍｌ  ＲＰＭＩ＋５ｍｌ  Ｐ／Ｓ＋５ｍｌ  ＡｍｐｈｏＢ
２．−２００ｍｌ  ＲＰＭＩ＋ＰＳ／ＡｍｐｈｏＢ＋２．５ｍｌ  Ｌ−グルタミン＋５０ｍｌ  ＦＣＳ＝完全培地（１ヶ月４℃）
３．−４５ｍｌ完全培地＋２２．５ｕｌ  ｈ−ＩＬ−３（１週間４℃）
培養：２００，０００〜１，０００，０００細胞／ｍｌで維持
・３日間、２ｘ１０５／ｍｌ
・２日間、３ｘ１０５／ｍｌ
・１日間、５ｘ１０５／ｍｌ
ＴＦ−１増殖アッセイの設計
ＴＦ−１増殖アッセイでは、ＴＦ−１細胞を多ウェルプレート内にＥＰＯまたはＥＰＯ模倣ペプチドの各種の濃度で播種して、数日間培養した。
【０２６３】
最適な結果のために、ＴＦ−１細胞は、アッセイ開始前にすべてのサイトカインの非存在下で（飢餓）２日間培養すべきである。アッセイ開始の３日後、生細胞の数をアッセイすることによって細胞増殖を間接的に測定する。
【０２６４】
着色ホルマザンへと還元される、ＭＴＳと呼ばれるテトラゾリウム試薬を添加する。本反応はＮＡＤＨおよびＮＡＤＰＨに依存し、言い換えればミトコンドリア活性に依存する。ホルマザンの量を分光光度法によって測定する。校正のために既知の細胞数の範囲を使用すると、各条件下で存在する生細胞の絶対数を決定することが可能である。主要な設計も図２４に示す。
【０２６５】
本アッセイにおけるある試薬の活性は：
１．本薬剤がある濃度にて生細胞の数の増加を引き起こすかどうかを評価すること、および
２．本薬剤がどの濃度で最大半量効果を及ぼすか（ＥＣ５０の決定）によって決定される。
【０２６６】
ＴＦ−１増殖アッセイの結果
概論として、すべてのＥＰＯ模倣ペプチド（ＥＭＰ１および上記のプロリン修飾ペプチド）が本アッセイで部分アゴニストとして作用する、すなわち最大応答がＥＰＯによって見られる応答よりも弱いことに触れる必要がある。それにもかかわらず、アッセイは正規化プロットで右方／左方移動を判定するために、それゆえ最適化の結果を判定するために使用されうる。
【０２６７】
最初のグラフは、正規化なしの絶対応答でのこの効果を示す。他のすべてのグラフは、曲線からＥＣ５０値の決定を可能にする正規化プロットを示す。
本アッセイでは、２つの基準物質を使用した：
１）ＥＭＰ１、既知のＥＰＯ模倣特性を持つ、公表されたペプチド配列（Ｊｏｈｎｓｏｎら，１９９７）。
【０２６８】
２）組換えヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）は、Ｏｒｔｈｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈ製品Ｅｐｏｅｔｉｎ  ａｌｆａ（商標名：Ｅｒｙｐｏ（登録商標））として薬局で購入した。
【０２６９】
これらの物質のプロットは、ＥＰＯは連続した黒線、ＥＭＰ１は黒点線として与える。
【０２７０】
プロリン修飾ＥＰＯ模倣ペプチドは、次の図で着色された連続線として示す。これらの修飾ペプチドは、次の配列を示す：
１）ＢＢ４９
【０２７１】
【化５６】
2008546732.tif 000052
ＥＭＰ１と同じ範囲で有効性および効力を示す
２）ＢＢ６８
【０２７２】
【化５７】
2008546732.tif 000053
ＥＭＰ１およびＢＢ４９よりもなお有効である
３）ＡＧＥＭ４０
【０２７３】
【化５８】
2008546732.tif 000054
改良された特徴を示すＢＢ６８の配列に基づいて設計された、２価連続ペプチドである。
４）ＡＧＥＭ４０＿ＨＥＳ、本発明の超多価原理によるＨＥＳ化された、進歩した非常に有効および強力なペプチド（ＡＧＥＭ４０）である
これらの配列は、特に超多価原理の利益を例証するために例として使用した。
【０２７４】
図２５は、ＥＰＯと比較したモノマーＥＰＯ模倣ペプチドの結果を示す。図２５は、本アッセイでの一般のペプチドとＥＰＯとの間の絶対差を実証する実際の吸収データのプロットを含む。
【０２７５】
図２６は、適合させた正規化プロットから計算したＥＣ５０値を与える。
【０２７６】
図２７は、ＢＢ４９と比較したＢＢ６８の改善された効果を示す。最適化ＢＢ６８を本発明によるペプチドユニットを生成するための構成要素として使用すると、効果はさらに２桁改善された。これは図２７で実証され、対応する表を図２８に示す。
【０２７７】
ダイマーペプチドユニットは次に巨大分子担体ＨＥＳに最適化密度にてカップリングされる。生じたＡＰＩは、モル比較でＥＰＯと少なくとも等効力であり、質量比較でＥＰＯに非常に近い（下の図２９および図３０を参照）。
【０２７８】
図３０ならびに前の図および表は、超多価概念の大きな効力を明確に証明している。細胞培養アッセイによって達成されうる精度に留意して、達成されたＡＰＩは試験管内では少なくともＥＰＯと等効力である。それゆえそれは超多価外面を利用しないいずれの既知のＥＰＯ模倣ペプチドＡＰＩよりも優れている。
【０２７９】
骨髄アッセイ
骨髄は、自己複製する、およびあらゆる種類の血液細胞へ発生する潜在性を備えた造血幹細胞を含有する。加えて骨髄は、１つまたは複数の血液細胞系統へ発生することができる関与する前駆細胞を含有する。これらの前駆細胞のうち、一部は赤血球へ発生する（赤芽球前駆細胞）。
【０２８０】
前駆細胞は、骨髄細胞をメチルセルロースベース半固体培地へ蒔くことによって証明されうる。適切なサイトカインカクテルの存在下で、前駆細胞は増殖および分化して、ある系統の細胞のコロニーを生じる。骨髄前駆細胞は、顆粒球コロニー（ＣＦＵ−Ｇから由来）、単球コロニー（ＣＦＵ−Ｍから）、または混合顆粒球−単球コロニー（ＣＦＵ−ＧＭから）へと発生する。赤血球前駆細胞は、赤血球（赤血球、ｒｅｄ  ｃｅｌｌ）のコロニーへと発生する。赤血球コロニーのサイズに応じて、前駆細胞は、ＢＦＵ−Ｅ（２００細胞以上のコロニーを生じる）またはＣＦＵ−Ｅ（２００細胞未満のコロニーを生じる）と呼ばれる。関係づけのより早期の段階における前駆細胞は、混合顆粒球−赤血球−単球−巨核球コロニーへと発生しうる。これらの早期前駆細胞は、ＣＦＵ−ＧＥＭＭと呼ばれる。
【０２８１】
ＥＰＯは、ある異なるサイトカインが同様に存在する場合、ＢＦＵ−ＥまたはＣＦＵ−Ｅからの赤血球コロニーの発生を刺激する。ＥＰＯがないと、赤血球コロニーは発生できない。したがってメチルセルロース中の骨髄細胞の同種バッチからの赤血球コロニーの増殖は、ＥＰＯ活性の尺度である。
【０２８２】
上述のプロセスは生体内で骨髄にて発生するプロセスと同じでない場合は非常に似ているため、それらはＥＰＯ様活性の優れた前兆である。
【０２８３】
骨髄アッセイの設計
ヒト骨髄細胞（Ｃｒｙｏｓｙｓｔｅｍｓより市販、血清学的に点検）は冷凍バイアルから解凍して、サイトカインの所与のバックグラウンドを持つ（しかしＥＰＯを含まない）メチルセルロース培地に固定細胞濃度で蒔く。ＥＰＯまたはＥＰＯ模倣ペプチドは、可変濃度で添加される。培養物は３７℃にて１２〜１４日間インキュベートする。次に骨髄および赤血球コロニーの数は、顕微鏡検査によってカウントされる。
骨髄アッセイの終点：
１．前提：ＥＰＯを含まない培養物は、赤血球（赤色）コロニーではなく、骨髄（白色）コロニーのみを生じるはずである。ＥＰＯを含む培養物は、赤血球コロニーでは濃度依存性の上昇を、赤血球コロニーのサイズでは濃度依存性の上昇を生じるはずである。
２．ペプチドは、赤血球コロニーでは濃度依存性の上昇を、赤血球コロニーのサイズでは濃度依存性の上昇を生じる場合に、ＥＰＯ模倣活性を示す。しかしながら、ペプチドは得られた骨髄コロニーの数を妨害しないはずである。
【０２８４】
骨髄アッセイの結果
上述のプロリン修飾ＥＰＯ模倣ペプチドは、骨髄コロニーの形成を刺激しなかったが、赤血球コロニーの形成に対して著しい活性を示した。定性的には、これは図３１の培養プレートの写真で示されており、同時にコロニーのカウントが図３２に実証されている。
【０２８５】
【化５９】
2008546732.tif 000055
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】記載なし。
【図２】記載なし。
【図３】記載なし。
【図４】記載なし。
【図５】記載なし。
【図６】記載なし。
【図７】記載なし。
【図８】記載なし。
【図９】記載なし。
【図１０】記載なし。
【図１１】記載なし。
【図１２】記載なし。
【図１３】記載なし。
【図１４】記載なし。
【図１５】記載なし。
【図１６】記載なし。
【図１７】記載なし。
【図１８】記載なし。
【図１９−１】記載なし。
【図１９−２】記載なし。
【図１９−３】記載なし。
【図１９−４】記載なし。
【図１９−５】記載なし。
【図１９−６】記載なし。
【図１９−７】記載なし。
【図２０】記載なし。
【図２１】記載なし。
【図２２】記載なし。
【図２３】記載なし。
【図２４】記載なし。
【図２５】記載なし。
【図２６】記載なし。
【図２７】記載なし。
【図２８】記載なし。
【図２９】記載なし。
【図３０】記載なし。
【図３１】記載なし。
【図３２】記載なし。
【図３３】記載なし。
【図３４】記載なし。
【図３５】記載なし。
【図３６】記載なし。
【図３７】記載なし。
【図３８】記載なし。
【図３９】記載なし。
【図４０】記載なし。
【図４１】記載なし。
【図４２】記載なし。
【図４３】記載なし。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図１９−４】
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【図１９−５】
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【図１９−６】
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【図１９−７】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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