(57)【要約】システム及び方法は、神経精神障害における病因学的因子の逐次的同定、優先順位付与、確認及び有効化を目的とした包括的な高スループットの試行法を提供し、その一部はこれらの疾患のバイオマーカーとして利用することもできる。システム及び方法は種々の実験及び非実験の条件下において種々のサンプルに由来する種々の組織における遺伝子発現のパターンを測定し、そして、これらの条件下において観察された遺伝子発現プロファイルの間の相違及び同様性を使用することにより、神経精神障害の危険性及び治療の個別の遺伝子発現プロファイルを明確化する。
2008532495.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記工程：
神経精神障害を有さない第１の対照セットから得られた脳組織において発現された遺伝子データの第１のセット、及び神経精神障害を有する個体の第１のセットから得られた中枢神経系組織において発現された遺伝子データの第２のセットについて統計学的分析を実施して、示差的に発現された遺伝子１つ以上の第１のセットを同定すること；
神経精神障害を有さない第２の対照セットから得られた血液において発現された遺伝子データの第３のセット、及び神経精神障害を有する個体の第２のセットから得られた血液において発現された遺伝子データの第４のセットについて統計学的分析を実施して、示差的に発現された遺伝子１つ以上の第２のセットを同定すること；ならびに
示差的に発現された遺伝子１つ以上の前記第１のセットを、示差的に発現された遺伝子１つ以上の前記第２のセットと比較して、示差的に発現された遺伝子１つ以上の共通のセットを同定すること
を含む、方法。
【請求項２】
示差的に発現された遺伝子の前記共通のセットに関連する遺伝子オントロジー１つ以上を同定することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記遺伝子オントロジーの１つ以上が、生物学的プロセス、分子機能又は細胞内構成要素からなる群より選択される、請求項２記載の方法。
【請求項４】
神経精神障害を有さない前記対照セットから得られた前記血液及び前記神経精神障害を有する個体の前記セットから得られた前記血液中の遺伝子発現の第２の測定を用いて、示差的に発現された遺伝子１つ以上の前記第２のセットを評価することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
遺伝子発現の前記第２の測定が、定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応を含む、請求項４記載の方法。
【請求項６】
神経精神障害を有さない前記対照セットから得られた前記中枢神経系組織、及び前記神経精神障害を有する前記個体のセットから得られた前記中枢神経系組織中の遺伝子発現の第３の測定を用いて、示差的に発現された遺伝子１つ以上の前記第２のセットを評価することを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項７】
遺伝子発現の前記第３の測定が、免疫組織化学を含む、請求項６記載の方法。
【請求項８】
前記中枢神経系組織が脳組織を含む、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記脳組織が前頭前野背外側部（ＤＬＰＦＣ）組織を含む、請求項８記載の方法。
【請求項１０】
前記血液が末梢血球を含む、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
システムであって、以下：
統計学的分析システムであって、
神経精神障害を有さない対照セットから得られた中枢神経系組織において発現された遺伝子データの第１のセット、及び神経精神障害を有する個体のセットから得られた中枢神経系組織において発現された遺伝子データの第２のセットを受容し、示差的に発現された遺伝子１つ以上の第１のセットを作製する；
神経精神障害を有さない前記対照セットから得られた血液において発現された遺伝子データの第３のセット、及び神経精神障害を有する前記個体のセットから得られた血液において発現された遺伝子データの第４のセットを受容し、示差的に発現された遺伝子１つ以上の第２のセットを生成する；
ように作動可能である、統計学的分析システム；ならびに
示差的に発現された遺伝子１つ以上の前記第１のセットを、示差的に発現された遺伝子１つ以上の前記第２のセットと比較し、そして、示差的に発現された遺伝子１つ以上の共通のセットを作製するように作動可能なコンパレータ
を含む、システム。
【請求項１２】
示差的に発現された遺伝子の前記共通のセットに関連する遺伝子オントロジー１つ以上を作製するように作動可能なオントロジー同定システムを更に含む、請求項１１記載のシステム。
【請求項１３】
前記オントロジーが、生物学的プロセス、分子機能又は細胞内構成要素からなる群より選択される、請求項１２記載のシステム。
【請求項１４】
前記オントロジー同定システムが、ＭＡＤＣＡＰオントロジー同定システムの実行を含む、請求項１２記載のシステム。
【請求項１５】
前記統計学的分析システムがＣＯＲＧＯＮ統計学的分析システムの実行を含む、請求項１１記載のシステム。
【請求項１６】
前記中枢神経系組織が脳組織を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１７】
前記脳組織が前頭前野背外側部（ＤＬＰＦＣ）組織を含む、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記血液が末梢血球を含む、請求項１１記載の方法。
【請求項１９】
方法を実施するためのコンピューター実行可能な指示を有するコンピューター読み取り可能な媒体であって、前記方法が下記工程：
神経精神障害を有さない第１の対照セットから得られた脳組織において発現された遺伝子データの第１のセット、及び神経精神障害を有する個体の第１のセットから得られた中枢神経系組織において発現された遺伝子データの第２のセットについて統計学的分析を実施して、示差的に発現された遺伝子１つ以上の第１のセットを同定すること；
神経精神障害を有さない第２の対照セットから得られた血液において発現された遺伝子データの第３のセット、及び神経精神障害を有する個体の第２のセットから得られた血液において発現された遺伝子データの第４のセットについて統計学的分析を実施して、示差的に発現された遺伝子１つ以上の第２のセットを同定すること；ならびに
示差的に発現された遺伝子１つ以上の前記第１のセットを、示差的に発現された遺伝子１つ以上の前記第２のセットと比較して、示差的に発現された遺伝子１つ以上の共通のセットを同定すること
を含む、コンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項２０】
前記方法が、示差的に発現された遺伝子の前記共通のセットに関連する遺伝子オントロジー１つ以上を同定することを更に含む、請求項１９記載のコンピューター読み取り可能な媒体。
【請求項２１】
前記遺伝子オントロジーの１つ以上が、生物学的プロセス、分子機能又は細胞内構成要素からなる群より選択される、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
第１の哺乳動物の生理学的サンプル中の細胞におけるセレン結合タンパク質発現の量又はレベルを検出又は決定することを含む神経精神障害を診断する方法であって、精神病的心的障害を有さない哺乳動物の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルに相対比較した場合の前記第１の哺乳動物の前記細胞におけるセレン結合タンパク質発現の量又はレベルの増加が前記第１の哺乳動物における精神病的心的障害を示す上記方法。
【請求項２３】
前記哺乳動物がヒトである、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記生理学的サンプルが生理学的流体サンプルである、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
前記生理学的流体サンプルが血液である、請求項２４記載の方法。
【請求項２６】
前記細胞が末梢血球である、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記障害が統合失調症である、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
セレン結合タンパク質の量又はレベルを検出又は決定する、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
セレン結合タンパク質ＲＮＡの量又はレベルを検出又は決定する、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
セレン結合タンパク質−１発現の量又はレベルを検出又は決定する、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
第１の哺乳動物の生理学的サンプル中の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルを、以前の時点における前記第１の哺乳動物の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルと、又は、神経精神障害を有さない哺乳動物の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルと比較することを含む、神経精神障害の危険性を有する哺乳動物を決定する方法であって、経時的な、又は、神経精神障害を有さない哺乳動物と相対比較した場合の、前記第１の哺乳動物の前記細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルの増加が前記第１の哺乳動物が、神経精神障害の危険性を有することを示す、方法。
【請求項３２】
前記哺乳動物がヒトである、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
前記生理学的サンプルが生理学的流体サンプルである、請求項３１記載の方法。
【請求項３４】
前記生理学的流体サンプルが血液である、請求項３３記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞が末梢血球である、請求項３１記載の方法。
【請求項３６】
前記障害が統合失調症である、請求項３１記載の方法。
【請求項３７】
セレン結合タンパク質の量又はレベルを検出又は決定する、請求項３１記載の方法。
【請求項３８】
セレン結合タンパク質ＲＮＡの量又はレベルを検出又は決定する、請求項３１記載の方法。
【請求項３９】
セレン結合タンパク質−１発現の量又はレベルを検出又は決定する、請求項３１記載の方法。
【請求項４０】
神経精神障害を有する哺乳動物に由来する生理学的サンプル中の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルを、以前の時点における前記哺乳動物に由来する細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルと比較することを含む、哺乳動物における神経精神障害の進行の危険性を決定する方法であって、経時的なセレン結合タンパク質発現の量又はレベルの増加が、前記哺乳動物が前記神経精神障害の進行の危険性を有することを示す、方法。
【請求項４１】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４０記載の方法。
【請求項４２】
前記生理学的サンプルが生理学的流体サンプルである、請求項４０記載の方法。
【請求項４３】
前記生理学的流体サンプルが血液である、請求項３３記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞が末梢血球である、請求項４０記載の方法。
【請求項４５】
前記障害が統合失調症である、請求項４０記載の方法。
【請求項４６】
セレン結合タンパク質の量又はレベルを検出又は決定する、請求項４０記載の方法。
【請求項４７】
セレン結合タンパク質ＲＮＡの量又はレベルを検出又は決定する、請求項４０記載の方法。
【請求項４８】
セレン結合タンパク質−１発現の量又はレベルを検出又は決定する、請求項４０記載の方法。
【請求項４９】
下記工程：
ａ）薬剤を哺乳動物に投与すること；および
ｂ）前記哺乳動物の生理学的サンプル中の細胞中のセレン結合タンパク質発現を薬剤が阻害するかどうか検出又は決定すること
を含む、哺乳動物の細胞におけるセレン結合タンパク質発現を薬剤が阻害するかどうかを決定する方法。
【請求項５０】
下記工程：
ａ）神経精神障害を有する哺乳動物に薬剤を投与すること；および
ｂ）前記哺乳動物の生理学的サンプル中の細胞中のセレン結合タンパク質発現を薬剤が阻害するかどうか検出又は決定すること；
を含む、薬剤が神経精神障害を阻害又は治療するかどうかを決定する方法であって、前記細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルの低下が、薬剤が、前記神経精神障害を阻害又は治療するために有用であることを示す、方法。
【請求項５１】
前記哺乳動物がヒトではない、請求項５０記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２００５年２月１５日に出願された米国仮特許出願第６０／６５３，２１７号の利益を主張する。この仮特許出願は、参考として本明細書に援用される。
【０００２】
分野
本発明の実施形態はバイオマーカーの検出及びバイオマーカーの使用に関する。より詳しくは、実施形態は神経精神障害に関するバイオマーカーを検出するためのシステム及び方法、及び、バイオマーカーとしてのセレン結合タンパク質１（ＳＥＬＥＮＢＰ１）の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
神経精神障害は病因論的に複雑であり異種性であり、そのため、特定の神経精神障害に関する危険因子を同定することが困難となっている。マイクロアレイ手法は統合失調症（ＳＺ）のような神経精神障害に関する危険因子を同定する場合には高度に信頼できるが、試験の間の方法論的相違及びＩ型推定誤差の高危険性の為に広範に再現性のある結果をもたらしていない。
【０００４】
統合失調症は多大な遺伝的根拠を有しているが、その生物学的基礎は大半が未知のままである。血液及び死後の脳の組織中の特定の神経物質の発現のプロファイルを調べる初期の試みでは、最終的には立証できなかったＳＺに関する幾つかの信頼できる候補となる危険因子が検出された。ヒトゲノムのマッピングにおけるその後の進歩により候補遺伝子関連の試験の実行可能性が増大した。殆どの候補遺伝子は疾患において広範に関与が示唆されている系（例えばドーパミン及びグルタメート神経伝達物質の系）内のその発現に基づいてターゲティングされており、そしてこの試行法はこれらの認識された候補の経路内における機能不全の性質を明確化するために使用されるが；これらの系の外部での追加的な新しい危険因子の同定のためには最適とはいえない。
【０００５】
全ての発現されたヒトゲノムの探索が行えるマイクロアレイの登場により、障害における数千の遺伝子の役割を同時に調べることが可能となった。既存の疾患モデルにおいて予測された伝統的な候補遺伝子試験と相対比較して、マイクロアレイ分析は他の態様では試験対象とならない新規な危険遺伝子の同定を支援する低制約型の方策である。遺伝子発現は遺伝子及び環境の両方の影響を反映する場合があるため、多くの遺伝子及び環境の要因が相互作用している多因性で多因子の病因を有すると考えられているＳＺのような複雑な障害に関する危険因子を同定するためには特に有用である。しかしながら、数千もの従属変数を同時に考慮することは、擬似陽性結果の尤度も増大させる。慨すれば、マイクロアレイはＳＺの病因論的因子を同定することに関しては高い信頼性を有するが、過剰に自由であること、及び、再現性のある結果を提供できないことの危険を呈する。
【０００６】
幾つかのグループが、疾患における機能不全として一貫して同定されている脳の前頭前野背外側部（ＤＬＰＦＣ）に由来する死後組織におけるＳＺの遺伝子発現プロファイルを特性化している。これらの試験はＧタンパク質シグナリング、代謝、ミトコンドリア機能、髄鞘形成及びニューロン発生を包含する幾つかのドメインにおける調節不全遺伝子発現の可変パターンを指摘している。しかしながら、これらの試験の全てが各ドメイン内の顕著な改変を報告しているわけではない。方法論的な相違、例えば民族的及び人工統計学的な不一致、対立的なマイクロアレイプラットホーム及び多様なデータ分析方法並びに擬陽性のハイリスク性がこのような変動性に恐らくは寄与している要因であるとされている。
【０００７】
結果として、既存の方法により形成された遺伝子発現プロファイルは擬陽性結果又は診断予測目的のためには殆ど有用性を有さない危険因子を同定しやすい。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
要旨
本発明の実施形態は神経精神障害における病因学的因子の逐次的同定、優先順位付与、確認及び有効化を目的とした包括的な高スループットの試行法を提供するシステム及び方法を包含し、その一部はこれらの疾患のバイオマーカーとして利用することもできる。システム及び方法は種々の実験及び非実験の条件下において種々のサンプルに由来する種々の組織における遺伝子発現のパターンを測定し、そして、これらの条件下において観察された遺伝子発現プロファイルの間の相違及び同様性を使用することにより、神経精神障害の危険性及び治療の個別の遺伝子発現プロファイルを明確化する。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００９】
詳細な説明
以下の詳細な説明において、本明細書の部分を形成する添付図面を参照するが、これにおいては本発明の要件を実施してよい特定の実施形態が説明のために示されている。これらの実施形態は当業者がこれらを実施できるように十分詳細に説明され、そして、他の実施形態も利用してよく、そして構造的、論理的及び電気的な変化を本発明の要件の範囲から逸脱することなく行ってよいと理解しなければならない。本発明の要件のこのような実施形態は、単に簡便のため、そして１つより多くを実際に開示した場合に如何なる単一の発明又は発明的概念に本出願の範囲を故意に限定することを意図せず、個々に、及び／又は総称して、本明細書においては「発明」という用語で称するものとする。
【００１０】
従って、以下の説明は限定的な意味と捕らえてはならず、そして本発明の要件の範囲は添付の請求項により定義される。
【００１１】
図面において、複数の図面に出現する同一の構成要素を指すために全体を通じて同じ参照番号を使用する。シグナル及びコネクションは同じ参照番号又はラベルにより言及され、そして実際の意味は説明の文脈におけるその使用から明確となるはずである。
【００１２】
本明細書に記載する関数又はアルゴリズムは実施形態においてハードウエア及び／又はソフトウエアにおいて実行される。ソフトウエアはメモリ又は他の格納デバイスのようなコンピューター読み取り可能な媒体上に格納されたコンピューター実行可能な指示を含む。「コンピューター読み取り可能な媒体」という用語はソフトウエア送信キャリア波を表すためにも使用する。更に又、このような関数はソフトウエア、ハードウエア、ファームウエア又は何れかのこれらの組合せであるモジュールに相当する。所望により１つ以上のモジュール内で複数の関数が実施され、記載した実施形態は単なる例である。デジタル信号プロセッサ、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサ又はシステム上で作動するプロセッサの何れかの他の型、例えばパーソナルコンピューター、サーバー、ルーター又はデータを処理することができる何れかの他のデバイス、例えばネットワーク相互連結デバイスがソフトウエアを実施する。
【００１３】
一部の実施形態は、２つ以上の特定の相互連結されたハードウエアモジュール又はデバイスにおいて、モジュール間に渡って通信される、又は、アプリケーション特異的な集積回路としての、関連する制御及びデータ信号により機能を実行する。即ち例示されるプロセスフローはソフトウエア、ファームウエア及びハードウエアの実行に適用される。
【００１４】
以下に示す特定の範囲、数値及び実施形態は説明を目的としているのみであり、請求項により定義される本発明の範囲を他の態様において制限するものではない。
【００１５】
本明細書においては、「セレン結合タンパク質」とは、ＮＣＢＩアクセッション番号ＣＡＧ３３１３３、ＣＡＨ７０３２８、ＡＡＨ３２９９７、Ｑ１３２２８、Ｐ１７５６３、ＡＡＨ１１２０２、ＮＰ００３９３５、ＮＰ０３３１７６、ＡＡＨ７４００８、ＮＰ９５６８６４、ＮＰ５４３１６８、ＡＡＸ４３６３５、ＡＡＸ３１９６５、ＡＡＨ５６５９０又はＡＡＨ０９０８４を有する配列に少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％、９０％、９５％以上のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチド及びこれらのポリペプチドをコードする核酸配列を包含する。１つの実施形態において、セレン結合タンパク質はセレン結合タンパク質−１、例えばヒト、げっ歯類、例えばウサギ、マウス、ラット、ミンク又はモルモット又は非ヒト霊長類のセレン結合タンパク質−１である。
【００１６】
図１は本発明の実施形態による潜在的バイオマーカーを検出するためのシステム１００を示す。一部の実施形態においては、システム１００は統計学的分析システム１２０、コンピューター１４０及びオントロジー同定システム１６０を包含する。一部の実施形態においては、統計学的分析システム１２０は各々が遺伝子発現データを含有する２入力ファイルを受け取るコンピューター化システムであり、２ファイルの統計学的分析を実施し、そして２入力ファイルの間に示差的に発現された遺伝子を示す遺伝子データを含有する出力ファイルを発生する。一般的に、入力ファイルの一方（例えばファイル１０２又は１１２）は目的の神経精神障害を有さない対照群に関する遺伝子発現データを含有し、そして他方の入力ファイル（例えばファイル１０４又は１１４）は目的の神経精神障害を有すると診断されている群に関する遺伝子発現データを含有する。更に又、入力ファイルは一般的に対照群及びサンプル群において同じソース型から得られた遺伝子発現データを含有する。例えば遺伝子発現データは対照群及びサンプル群由来の中枢神経系組織から、又は、対照群及びサンプル群から得られた血液サンプルから得られてよい。
【００１７】
一部の実施形態における統計学的分析システム１２０は加法ではなく乗法のノイズを想定したモデルを使用する。更に、一部の実施形態においては、統計学的分析システムは統計学的に有意なアウトライアーを排除するように設計される。更に、一部の実施形態において使用される統計学的モデルはミスマッチ及びパーフェクトマッチのプローブの強度の両方から推定された均一なバックグラウンドを想定する。上記した通り、統計学的分析システム１２０の出力は２入力ファイル中の示差的に発現された遺伝子に関する遺伝子データを含有するファイルである。
【００１８】
特定の実施形態においては、統計学的分析システム１２０はＣＯＲＧＯＮ生物統計学的分析システムである。ＣＯＲＧＯＮ生物統計学的分析システムの作動に関する更なる詳細は参照により本明細書に組み込まれるＳａｓｉｋ，Ｒ．，Ｃａｌｖｏ，Ｅ．＆Ｃｏｒｂｅｉｌ，Ｊ．”Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｒｒａｙｓ：Ａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃａｔｉｖｅ  Ｎｏｉｓｅ  Ｍｏｄｅｌ”  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １８，１６３３−１６４０（２００２）に記載されている。
【００１９】
更に又、一部の実施形態は示差的に発現された遺伝子の同定が閾値Ｐ＝０．０５を超えたその統計学的有意性に基づいているアルゴリズムを使用する。これらの実施形態においては、各遺伝子のＰ値は各遺伝子のサンプル標識の１００，０００順列の両側未調節順列試験により決定される。各順列につきｔ統計値を対数（表示）値から計算し、そしてｔ統計値の絶対値が未順列のｔ統計値の絶対値以上となるような順列の分数としてＰ値を推定する。特定の実施形態においては、ＦＯＣＵＳアルゴリズムの実施を用いる。ＦＯＣＵＳアルゴリズムについての更なる詳細はＣｏｌｅ，Ｓ．Ｗ．，Ｇａｌｉｃ，Ｚ．＆Ｚａｃｋ，Ｊ．Ａ．”Ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｆａｌｓｅ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｅｒｒｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ：ａ  ＰＲＩＭ  ａｐｐｒｏａｃｈ”（２００３）Ｂｉｏｉｎｆｏｍａｔｉｃｓ  １９，１８０８−１８１６に記載されている。
【００２０】
上記した一部の実施形態において使用される統計学的モデルと組み合わせたＦＯＣＵＳアルゴリズムの適用はＩ型誤差（擬陽性）の発生を低減する場合に有用である。
【００２１】
作動中は目的の神経精神障害に関わるバイオマーカーを決定するためには、統計学的分析システム１２０を２回、即ち２サンプル型である中枢神経系組織及び血液の各々に対して１回ずつ実行する。即ち、１実行において、対照群から得られた中枢神経系組織サンプル由来の遺伝子発現データを有する入力ファイル１０２、及び、神経精神障害を有する個体から得られた中枢神経系組織サンプル由来の遺伝子発現データを有する第２の入力ファイル１０４を統計学的分析システム１２０に適用することにより、２入力群の脳組織サンプル中の示差的に発現された遺伝子を有する出力ファイル１３２を作製する。一部の実施形態においては、入力ファイル１０２及び１１２はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｂｒａｉｎデータバンク（ＮＢＤ）ウェブサイトから得た細胞強度（ＣＥＬ）ファイルであってよい。
【００２２】
種々の形態の中枢神経系組織を使用してよい。一部の実施形態においては、ＤＬＰＦＣ組織を使用してよい。別の実施形態においては、他の脳の領域に由来する他の組織サンプルを使用することにより遺伝子発現データを得てよい。更に別の実施形態においては、脳脊髄液を使用することにより遺伝子発現データを得てよい。本発明の実施形態は特定の中枢神経系の構成要素に限定されない。
【００２３】
第２の実行において、統計学的分析システム１２０は神経精神障害を有さない対照群から得られた血液サンプル由来の遺伝子発現データを有する入力ファイル１１２及び神経精神障害を有する個体から得られた血液サンプル由来の遺伝子発現データを有する第２の入力ファイル１１４を受け取り、そして２つの入力群の血液サンプル中の示差的に発現された遺伝子のデータを有する出力ファイル１３４を作製する。一部の実施形態においては、血液試料は末梢血球を含む。
【００２４】
コンパレータ１４０は示差的に発現された遺伝子データを有する２ファイルを比較して脳組織サンプル及び血液サンプルの両方に共通である示差的に発現された遺伝子のセットを含む出力ファイル１５０を作製するソフトウエアを含む。一部の実施形態においては、コンパレータソフトウエアは比較を実施するためにエントリを分類して順序付けるスプレッドシート型のプログラムであってよい。そのようなプログラムの例はＲｅｄｍｏｎｄ  ＷａｓｈｉｎｇｔｏｎのＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎより入手可能なＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌスプレッドシートプログラムである。
【００２５】
オントロジー同定システム１６０は示差的に発現された遺伝子データ１５０の共通のセットを受け取り、そして、それらの遺伝子にリンクしているオントロジー（生物学的プロセス、分子機能及び細胞内構成要素）を同定するために生物情報分析アルゴリズムを適用する。一部の実施形態においては、同定された遺伝子を標準化遺伝子オントロジー（ＧＯ）用語、例えばＧＯコンソーシアムにより認識され、そして、”Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ：ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｕｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｌｏｇｙ”，Ｔｈｅ  Ｇｅｎｅ  Ｏｎｔｏｌｏｇｙ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．２５：２５−２９において定義されている用語を用いて出力１７０に入れる。一部の実施形態においては、オントロジー同定システム１６０は統計学的分析システム１２０及びコンパレータ１４０により同定された示差的に発現された遺伝子のリストをマイクロアレイ上の全遺伝子のリストと比較し、そして標準化ＧＯ用語のどれが、全マイクロアレイ中に表示される遺伝子に基づいて偶然により期待されるよりも頻繁に表示されるかを決定する。更に又、一部の実施形態においては、オントロジー同定システム１６０は条件付のＰ値を計算し、これにより有意な用語は小サイズであっても同定可能となる。
【００２６】
特定の実施形態においては、オントロジー同定システム１６０はマイクロアレイデータ特性化及びプロファイリング（ＭＡＤＣＡＰ）アルゴリズムの実行を含む。ＭＡＤＣＡＰアルゴリズムに関する更なる詳細は参照により本明細書に組み込まれるＬｏｚａｃｈ，Ｊ．，Ｓａｓｉｋ，Ｒ．，Ｏｇａｗａ，Ｓ．，Ｇｌａｓｓ，Ｃ．Ｋ．”ＭＡＤＣＡＰ：ＭｉｃｒｏＡｒｒａｙ  Ｄａｔａ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．Ａ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｌｉｓｔｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅｓ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ”（２００３）ｉｎ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  ｄｅ  ｌａ  Ｒｅｃｈｅｒｃｈｅ  Ａｇｒｏｎｏｍｉｑｕｅ，Ｐａｒｉｓ），ｐ．ＧＥ２４に記載されている。
【００２７】
上記したシステムの作動に関しては図２を参照しながら以下に更に詳細に説明する。図２は神経精神障害に関するバイオマーカーを決定するための方法のフローダイアグラムを説明している。作動環境により実施されるべき方法はコンピューター実施可能な指示よりなるコンピュータープログラムを包含してよい。フローチャートを参照しながら方法を説明することにより、当業者はそのような指示を包含するそのようなプログラムを開発して適当なコンピューター（プロセッサ又はコンピューター読み取り可能な媒体、例えばＲＯＭ、ＲＡＭ、ハードドライブ、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ−ＲＯＭ、フラッシュメモリ等に由来する指示を実行するコンピューターのプロセッサ）上で方法を実施することができる。
図２に示す方法は本発明の例示される実施形態を実行する作動環境により行われる作用を包含する。方法を更に説明するために方法の実行の非限定的な例を以下に記載する。
【００２８】
方法は対照群の脳組織から、そして、神経精神障害を有する群の脳組織から得られた遺伝子発現データに対して統計学的分析を実施して、示差的に発現された遺伝子の第１のセットを得ることにより開始される（ブロック２０２）。一部の実施形態においては、脳組織はＤＬＰＦＣであってよいが、実施形態は特定の型の脳組織に限定されない。
【００２９】
特定の実施形態においては、遺伝子発現データはＨａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＨＢＴＲＣ）により維持されているＮａｔｉｏｎａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（ＮＢＤ）中の１９ＳＺ患者及び２７非精神病対照対象由来の新鮮凍結死後ＤＬＰＦＣ組織サンプル（５０ｍｇ）のｃＲＮＡマイクロアレイから得た。患者及び対照は性別（６８％ｖｓ７０％男性；Ｐ＝０．８８７）及び平均年齢（５７ｖｓ５６歳；Ｐ＝０．９５５）に関して緊密にマッチしており、そしてＤＬＰＦＣ試料は側方性（５８％ｖｓ５２％右半球；Ｐ＝０．８７５）、平均ｐＨ（６．４ｖｓ６．４；Ｐ＝０．９８１）及び平均死後時間（２１ｖｓ２０ｈ；Ｐ＝０．７３９）において極めて近似していた。Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ＤＳＭ−ＩＶ）基準によるこれらの対象の確認及び診断、脳組織の調製、ＲＮＡの抽出、精製及びハイブリダイゼーション、ｃＲＮＡマイクロアレイ上の発現レベルの定量及び品質管理の操作法は全て標準的方法によりＨａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて実施された。
【００３０】
Ｈａｒｖａｒｄ  Ｂｒａｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて、約５０ｍｇの新鮮凍結脳組織を各対象のＤＬＰＦＣより採取し、ＴｏｔａｌｌｙＲＮＡキット（Ａｍｂｉｏｎ，Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ）を用いてＲＮＡを抽出した。次にＲＮＡサンプルをＲＮｅａｓｙキット（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて精製した。各サンプルのＲＮＡの品質はＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）上のゲル電気泳動により２８Ｓ及び１８ＳリボソームＲＮＡの状態を調べることによりハイブリダイゼーションの前に確認した。ＲＮＡの品質は幾つかの指標、例えば平均２８Ｓ：１８ＳＲＮＡ比（１．１１ｖｓ１．０７；Ｐ＝０．７９０）及びハウスキーピング遺伝子Ｇ３ＰＤＨのＲＮＡ転写物の平均３’：５’比（１．５７ｖｓ１．４４；Ｐ＝０．４０７）及びＡＣＴＢ（２．４２ｖｓ２．３３；Ｐ＝０．７２８）により判断したところ、ＳＺ患者及び対照対象由来のサンプルの間で極めて近似していた。
【００３１】
精製され、そして品質確認された各々のＲＮＡサンプル（８μｇ）をＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔＩＩ２本鎖ｃＤＮＡ合成キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて逆転写することにより相補ｃＤＮＡとし、次にこれをＥｎｚｏ−ＩＶＴキット（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてインビトロで転写及び増幅することにより脳組織サンプル中に存在する全ｍＲＮＡのビオチン標識ｃＲＮＡとした。次にｃＲＮＡのサンプルをフラグメント化し、ＧｅｎｅＣｈｉｐヒトゲノムＵ９５Ａ又はＵ１３３Ａアレイ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）にハイブリダイズし、これＧｅｎｅＣｈｉｐ  Ｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｓｔａｔｉｏｎ４００（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）中で染色し、ＤＮＡマイクロアレイスキャナ２５００（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中で２回スキャンした。次にスキャンを目視により人為的状態、例えばエッジ効果又はスクラッチが無いかどうか調べたところ、それらはサンプルの＜５％において検出された。そのような人為的状態を伴ったサンプルはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｂｒａｉｎ  Ｄａｔａｂａｎｋ（ＮＢＤ）データベースから除外した。
【００３２】
次にマイクロアレイスイート５．０ソフトウエア（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）を用いてスキャンの品質を評価した。３５％未満のプローブ検出率を有するアレイについてはＲＮＡ抽出工程より先の全実験操作を反復した。プローブ検出率が３５％より高値に改善しなかった場合は、そのサンプルに関する遺伝子発現データはＮＢＤデータベースに参入させなかった。本発明者等がＮＢＤより入手したサンプルに関するプローブ検出率は統合失調症（ＳＺ）患者の群及び対照対象（４５．８ｖｓ４５．９％存在；Ｐ＝０．９１３）の間で本質的に同等であり、３５％未満のプローブ検出率を有するサンプルは無かった。
【００３３】
一部の実施形態においては、統計学的分析により示差的に発現されたものとして同定された全ての遺伝子の発現レベルを、次に、抗精神病薬及び他の医薬の使用に関連して検討することにより、患者内のそのような曝露の頻度上昇が遺伝子発現における群差を説明するかどうか調べた。
【００３４】
抗痙攣、抗鬱及び不安緩解の医薬は、独立したサンプルについてｔ検定により投与及び未投与の群において観察された遺伝子発現レベルを比較することにより調べてよい。このスキームを超えて前進する場合、抗精神病の医薬は、一般的な尺度（例えば最大有効用量）に一日当たり用量を変換すること、及び、この一日当たり用量の指数と示差的に発現された遺伝子の各々の発現レベルとの間の相関を調べることにより、より定量的な態様において評価してよい。各医薬品クラス内の複数の試験に関する高度に保存された家族に関する補正はＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉ補正を用いて行ってよい。
【００３５】
更に又、方法を実行するシステムは対照群由来の血液試料から、及び、神経精神障害を有する群由来の血液試料から得られた遺伝子発現データに対する統計学的分析を実施することにより、示差的に発現された遺伝子の第２のセットを得る（ブロック２０４）。
【００３６】
実施形態の実行においては、末梢全血サンプル（１０ｍｌ）を３０ＳＺ患者及び２４非精神病対照対象の個別のセットから入手した。患者及び対照は性別において同様（４０％ｖｓ５８％男性；Ｐ＝０．１８０）であったが、平均年齢（３４ｖｓ４２歳；Ｐ＝０．０１４）において異なっていた。全ての血液サンプルはＫ３ＥＤＴＡを含有する滅菌バイオレットキャップＶａｃｕｔａｉｎｅｒ試験管（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）中に採取し、一時的に４℃で保存し、そして採取後６時間以内に処理した。Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｎｔａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ（ＤＳＭ−ＩＶ、参考文献１２）基準によるこれらの対象の確認及び診断；血液サンプルの採取及び調製；末梢血球（ＰＢＣ）の分離及び溶解；ＲＮＡの抽出、精製及びハイブリダイゼーション；ｃＲＮＡマイクロアレイ上の発現レベルの定量；及び品質管理の操作法は全て標準的方法により実施した。
【００３７】
一部の実施形態については、遠心分離により血漿、バフィコート及び赤血球層を分離することにより各サンプルを処理した。血漿を廃棄し、赤血球を溶解緩衝液で破壊し、各混合物を再度遠心分離し、得られた白血球ペレットを溶解緩衝液中で短時間洗浄した。次にＴＲＩｚｏｌ（１ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を適用することによりＲＮＡを抽出し、これをＤＬＰＦＣサンプルに関して上記した通り精製し、品質について評価した。
【００３８】
各々の精製され品質確認されたＲＮＡサンプル（５μｇ）をマイクロアレイ用に調製し、ＧｅｎｅＣｈｉｐヒトゲノムＵ１３３Ａ又はＵ１３３Ｐｌｕｓ２．０アレイにハイブリダイズし、そして、生成元の公開するプロトコル（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）に従ってＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐスキャナ及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘｇｅｏｓソフトウエアＶｅｒ．１．１．１を用いて一回スキャンした。
【００３９】
次に血液試料に関する遺伝子発現データを脳組織サンプルの場合と同様の態様において上記した統計学的分析システム１６０により分析した。
【００４０】
システムは示差的に発現された遺伝子の第１及び第２のセットを比較して、示差的に発現された遺伝子の共通のセットを同定する（ブロック２０６）。例えばこれらの患者及び対照の血液中に示差的に発現された遺伝子のリストをＮＢＤのＳＺ患者及び対照のＤＬＰＦＣ中に示差的に発現されたものとして予め同定されている遺伝子のリストと比較してよい。遺伝子発現レベルに対する医薬の作用はＤＬＰＦＣサンプルン関して上記した通り調べてよく、年齢（患者と対照で異なっていた）の影響も同様に相関により評価してよい。
【００４１】
次にシステムは示差的に発現された遺伝子の共通のセットから遺伝子オントロジーを同定する（ブロック２０８）。一部の実施形態においては、これはＭＡＤＣＡＰアルゴリズムを使用するシステムを包含するオントロジー同定システム１６０により実施してよい。ＭＡＤＣＡＰは統計学的分析システムにより同定された示差的に発現された遺伝子のリストをマイクロアレイ上の全遺伝子のリストと比較し、そして標準化ＧＯ用語のどれが、全マイクロアレイ中に表示される遺伝子に基づいて偶然により期待されるよりも頻繁に表示されるかを決定する。
【００４２】
一部の実施形態においては、遺伝子は遺伝子オントロジーコンソーシアム（ＧＯＣ）により認識される標準化遺伝子オントロジー用語に従って分類してよい。ＧＯＣにより確立され維持されている遺伝子オントロジー（ＧＯ）分類システムは生物学的プロセス、細胞内構成要素及び分子機能を包含する３つのドメインにおいて遺伝子産物を記載している。オントロジーの次元に基づいた遺伝子のグループ分けは、機能的に関連する遺伝子のファミリー又は疾患状態の同調性が変化する拡張された遺伝子系の内部に存在してその活性に影響する遺伝子に関して、真の陽性結果を同定する尤度を更に増大させる。
【００４３】
オントロジー分類及び遺伝子の関連性は、ＧＯＣの３つの個別のＧＯ下の遺伝子リストの非管理統計学的分析のための手段であるマイクロアレイデータ特性化及びプロファイリング（ＭＡＤＣＡＰ）アルゴリズムにより分析してよい。アルゴリズムは全ての統計学的に有意なオントロジー「用語」（ＧＯＣにより認識される＞１８，０００の用語のうち）及びそれらを表す遺伝子を同定し、そして有意な用語をハイライト化したオントロジーのグラフ出力を作製する（図４Ａ及び４Ｂを参照）。ＭＡＤＣＡＰへの入力は遺伝子の２リスト、即ち比較対照リスト及び選択されたリストよりなる。比較対照リストは典型的にはＣＯＲＧＯＮ分析マイクロアレイデータセット内で発現されたものとして検出された全遺伝子を含有する。選択された遺伝子リストは何らかの基準に従って比較対照リストから選択された遺伝子のより小さい群を示し、一部の実施形態においては、ＳＺ患者及び対照対象のＤＬＰＦＣにおいて有意に示差的に発現されたものとして統計学的分析システムにより同定された遺伝子である。次にＭＡＤＣＡＰはどの遺伝子の選択されたセット内で有意に表示されている生物学的プロセス、細胞内構成要素及び分子機能があればそれがどれかを同定する。各遺伝子は直接、又はドーターＧＯ用語を介して、幾つかのオントロジー用語にリンクさせることができる。比較対照遺伝子リストはオントロジー用語への個々の遺伝子の関係及び用語の他の用語への関係により決定される比較対照オントロジーグラフを決定する。選択された遺伝子は比較対照グラフのサブグラフを決定する。選択された遺伝子により表示される生物学的プロセスを同定するために、ＭＡＤＣＡＰは選択された遺伝子の異常に高値の数にリンクされた用語を検索する。特に、サブグラフのルート用語から出発し、既知グラフ構造を使用しながら、本発明者等は同じ数の遺伝子を無作為に比較対照リストから選択した場合よりも多くの選択された遺伝子にリンクする各々の直属のドーター用語に関する確立（Ｐ値）を計算する。選択された遺伝子が無作為ではなくある特定の生物学的プロセスにより選択されている場合は、そのプロセス自身が選択された遺伝子の異常な多数により検出され得る。
【００４４】
一部の実施形態において、方法は対照群と神経精神障害を有する群の血液サンプルから得られた示差的に発現された遺伝子データのセットを確認することを包含する（ブロック２１０）。
【００４５】
特定の実施形態の実行においては、最も強力な候補バイオマーカー遺伝子（ＳＥＬＥＮＢＰ１、これはＳＺにおけるＤＬＰＦＣおよびＰＢＣの両方において有意のアップレギュレートされた）のｍＲＮＡの発現のレベルをＲＴ−ＰＣＲによりＰＢＣ中で定量した。ＲＴＩｚｏｌ法により単離した総血液ＲＮＡを１００μｌの反応液中、高容量ｃＤＮＡアーカイブキット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて一本鎖ｃＤＮＡ内に逆転写した。次に各ｃＤＮＡサンプル（２ｎｇ）をＳＹＢＲグリーンマスターミックス（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）及びプライマーと２０μｌ反応容量中で混合した。フォワード及びリバースプライマーはＰＲＩＭＥＲＱＵＥＳＴ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）を用いて設計した。ＰＣＲ増幅はＤＮＡＥｎｇｉｎｅＯｐｔｉｏｎ（ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いることにより実施した。自動計算融点解離曲線を調べることにより特異的ＰＣＲ増幅及び各ウェルにプライマー−２量体形成が生じないことを確保した。比較Ｃｔ等式（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて患者と対照サンプルの間の相対的倍率変化を計算した。慨すれば、遺伝子発現レベルを２−ＤΔＣで表し、式中ＤΔＣ＝｛［ΔＣｔ（単一のサンプル）］−［平均ΔＣｔ（対照サンプル）］｝、ΔＣｔ＝｛［Ｃｔ（標的遺伝子）］−［Ｃｔ（ＡＣＴＢ）］｝、そして、ＡＣＴＢはβアクチンに対してコーディングするハウスキーピング遺伝子である。
【００４６】
一部の実施形態においては、方法は対照群及び神経精神障害を有する群の脳組織から得られた示差的に発現された遺伝子データのセットを確認することを包含する（ブロック２１２）。一部の実施形態においては、確認はサンプルの免疫組織化学的分析を包含する。
【００４７】
特定の実施形態を実行する場合、パラフィンワックス包埋ＤＬＰＦＣ脳組織切片（１０μｍ）をクエン酸塩緩衝液で処理し、１０分間マイクロ波処理し、そしてマウス抗セレン結合タンパク質モノクローナル抗体（１：２５０希釈；ＭＢＬ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）に４℃で２４時間曝露した。抗体はマウスモノクローナルＶｅｃｔａｓｔａｉｎＡＢＣキット及びヘ゜ルオキシダーゼに対する３，３’ジアミノベンジジン基質（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を用いて検出した。切片はヘマトキシリンで逆染色し、Ｚｅｉｓｓ顕微鏡で可視化し、そしてＩＭＡＧＥ−ＰＲＯＰＬＵＳソフトウエア（Ｍｅｄｉａ  Ｃｙｂｅｒｎｅｔｉｃｓ，Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｉｒｉｎｇ，ＭＤ）を用いて分析した。
【００４８】
特定の実施形態の実行の結果
ＤＬＰＦＣ中の遺伝子発現。上記したＣＯＲＧＯＮ及びＦｏｃｕｓアルゴリズムをＮＢＤの１９ＳＺ患者及び２７対照対象由来の脳遺伝子発現に適用したところ、２群のＤＬＰＦＣにおいて示差的に発現された１７７遺伝子が同定された。これらのうち、ＳＺにおいては１１１遺伝子がアップレギュレートされ、６６がダウンレギュレートされた。各々の示差的に発現された遺伝子のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ数、アクセッション番号、遺伝子符号、遺伝子産物及び染色体座、並びに、ＳＺ患者と対照対象の間の発現の倍率変化の差、及び相当するＰ値を以下の表４に示す。抗痙攣剤投与対象は未投与対象と相対比較して６遺伝子において有意なダウンレギュレーション及び１遺伝子におけるアップレギュレーションを示したのに対し、不安緩解剤投与は２遺伝子において発現を増大させ、他の２遺伝子において発現を低減した。抗欝剤投与は多くの遺伝子の発現に影響し、投与により１０遺伝子は有意なアップレギュレーションを、７遺伝子は有意なダウンレギュレーションを示した。抗精神病剤の一日当たり用量は１３遺伝子の発現に対しては有意な正の影響を有していたが、何れの遺伝子のダウンレギュレーションにも有意に関連していなかった。これらの薬剤の作用の全ての有意性は多重試験に関するＢｏｎｆｅｒｒｏｎｉの補正によれば消失した。
【００４９】
次に１７７の示差的に発現された遺伝子をマイクロアレイデータ特性化及びプロファイリングによりプロファイリングしたところ、２５遺伝子が１つ以上の過剰表示されたオントロジーにリンクしていた。２５遺伝子のうち１３は６つの生物学的プロセスのＧＯ用語を示していた。図４ＡはＳＺのＤＬＰＦＣにおいて示差的に発現された遺伝子中で過剰表示されたものとして同定された生物学的プロセスのオントロジー用語の間の関係を示すグラフである。このオントロジーのうち最も定着していた用語はエネルギー経路（Ｐ＝０．００７）であり、これは以下の表１において示す６遺伝子の関与を説明していた。更に又、１２分子機能ＧＯ用語が１８遺伝子により表示された。図４ＢはＳＺにおけるＤＬＰＦＣ中に示差的に発現された遺伝子内で過剰表示されたものとして同定された分子機能オントロジー用語の関係を示すグラフである。このオントロジーにおいて最も定着していた用語はオキシドレダクターゼ活性（Ｐ＝０．０３１）であり、これは７遺伝子の機能を説明しており、そして以下の表２において示されている。これらの遺伝子の３つ（ＮＤＵＦＡ２、ＮＤＵＦＢ５及びＮＤＵＦＣ１）はまたＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ活性を有するものとしても分類された。生物学的プロセス及び分子機能オントロジーの両方において用語を表示していた遺伝子はＡＣＯＸ１、ＣＯＸ７Ｃ、ＣＯＸ１７、ＣＮＮ３、ＮＤＵＦＡ２及びＮＭＴ１を包含し、これらのうち３遺伝子（ＡＣＯＸ１、ＣＯＸ７Ｃ及びＮＤＵＦＡ２）はエネルギー経路内にオキシドレダクターゼ活性を有していた。残余の１５２の示差的に発現された遺伝子は有意に過剰表示されなかったＧＯ用語にリンクされた。
【００５０】
ＰＢＣにおける遺伝子発現。台湾の３０ＳＺ患者及び２４対照対象の個別サンプル由来の遺伝子発現データに対してＣＯＲＧＯＮ及びＦｏｃｕｓアルゴリズムを適用したところ２群由来のＰＢＣ中示差的に発現された１２３遺伝子が同定された。これらのうち、ＳＺにおいて６７遺伝子がアップレギュレートされ、５６遺伝子がダウンレギュレートされた。各々の示差的に発現された遺伝子のＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘプローブ数、アクセッション番号、遺伝子符号、遺伝子産物及び染色体座、並びに、ＳＺ患者と対照対象の間のその発現の倍率変化の差、及び相当するＰ値を以下の表５に示す。発現レベルにおいては、年齢と共に有意に８遺伝子が増大し、１０遺伝子が低減した。抗痙攣剤投与対象はアップレギュレートされた僅か１遺伝子の発現においてのみ未投与対象と異なっていたが；抗欝剤の投与は１５遺伝子で有意なアップレギュレーション及び他の２遺伝子において有意なダウンレギュレーションを伴っていた。年齢及びこれらのクラスの医薬投与の作用は複数試験に関する補正後は有意性を留めていなかった。明らかに、不安緩解剤投与は３４遺伝子の優位なアップレギュレーション及び別の４０遺伝子のダウンレギュレーションを伴っていた。これらの遺伝子のうち１２遺伝子の示差的に発現［ＣＳＤＡ、ＥＰＢ４２、ＦＢＸＯ９、ＦＫＢＰ８、ＧＳＫ３ＡＨＢＡ１（２転写物）、ＨＢＡ２、ＨＢＢ（２転写物）、ＨＬＡ−Ｂ及びＵＢＢを包含する］は複数試験に関する補正後もなお有意であった。抗精神病剤の一日当たり用量は僅か１遺伝子（Ｇ０Ｓ２）の発現に一次的に関連しており、これは複数試験に関する補正を適用した後にもなお統計学的に有意であった。
【００５１】
ＰＢＣにおいて示差的に発現された１２３遺伝子のリストとＤＬＰＦＣから得られたものを比較したところ、両方に共通な６遺伝子が同定された。これらの６遺伝子を以下の表３において詳述する。ＢＴＧ１、ＨＲＮＰＡ３及びＳＦＲＳ１はＳＺのＤＬＰＦＣにおいては有意にアップレギュレートされたが、ＳＺ患者の他のサンプルから得られたＰＢＣ中では有意にダウンレギュレートされており；逆のパターンの示差的発現がＧＳＫ３Ａについて観察され、これはこれら６遺伝子中唯一向精神薬投薬（即ち抗痙攣剤）の使用と有意な関係を示していた。これとは対照的に、ＳＥＬＥＮＢＰ１はＳＺ患者の２サンプル由来の組織両方において有意にアップレギュレートされていた。ＨＬＡ−ＤＲＢ１はＳＺのＤＬＰＦＣ及びＰＢＣの両方で有意にダウンレギュレートされていたが；異なるプローブセット（同じ遺伝子の異なる転写物に相当）は２組織の疾患に関連していた。
【００５２】
ＳＥＬＥＮＢＰ１は同一プローブセットがＳＺにおける脳と血液の両方において同様の方向の有意な示差的発現を示した同一のプローブセットの唯一の遺伝子であったことから、それはＳＺにおいて示差的に発現された全遺伝子のうち最も強力な候補バイオマーカーとして同定された。この有意なアップレギュレーションはマイクロアレイ分析によりプロファイリングされた同じＳＺ患者（ｎ＝２１）及び対照（ｎ＝１８）の無作為に選択されたサブセットに由来するＰＢＣにおけるＲＴ−ＰＣＲにより立証された。ＳＥＬＥＮＢＰ１の高度に有意な（Ｐ＝０．００３）２．２倍増大がＲＴ−ＰＣＲによりＳＺ患者のＰＢＣにおいて観察され、これはマイクロアレイにより観察された遺伝子の有意な２．０倍アップレギュレーションに緊密に相応していた。
【００５３】
ＤＬＰＦＣにおけるタンパク質発現。  ＳＥＬＥＮＢＰ１タンパク質の顆粒原形質染色が４対照対象及び４ＳＺ患者の各々に由来するＤＬＰＦＣ組織中のニューロン及び神経膠のある割合において観察された。対照において観察された抗体染色パターンの代表例を図３Ａに示し、そして患者において観察された抗体染色パターンの代表例を図３Ｂに示す。矢印３１０及び３２０は異なる細胞型における原形質の抗体染色を示し、矢印３１０は神経膠、矢印３２０はニューロンを示す。対照組織と比較して、神経膠／ニューロンのＳＥＬＥＮＢＰ１抗体染色の強度及び比は４ＳＺ患者の少なくとも３人に由来するＤＬＰＦＣ組織においては顕著に増大していた。ＳＺ患者由来のサンプル中のＳＥＬＥＮＢＰ１抗体の増強された神経膠内染色は増大した発現の核周囲の辺縁において最も顕著であった。一次抗体を省略した場合は何れの細胞にも染色は観察されなかった。
結果の分析
一部の実施形態においては、遺伝子発現マイクロアレイデータの分析及び解釈のためのプロトコルはＩ型誤差を制限するためのＣＯＲＧＯＮ及びＦｏｃｕｓアルゴリズム及び示差的に発現された遺伝子により表示されたオントロジーを同定するためのマイクロアレイデータ特性化及びプロファイリングを用いることを包含する。ＳＺにおけるＤＬＰＦＣ由来の遺伝子発現データへの実施形態の適用により、遺伝子関連分析及び仮説駆動機能試験のための高優先順位の標的とみなしてよい１７７遺伝子、６生物学的プロセス及び１２分子機能が同定された。これらの遺伝子のうち２８は更にリンケージ分析（表４）によりＳＺにおいて強力に関与が示唆された染色体座をコードしており、従って特に興味深い候補である。これらはやはり有意に過剰表示されたＧＯ用語にリンクされている４遺伝子（ＡＣＯＸ１、ＮＤＵＦＡ２、ＳＵＣＬＧ１及びＴＡＰＢＰ）及びＳＺにおけるＤＬＰＦＣ及びＰＢＣの両方において示差的に発現されたＳＦＲＳ１及びＨＬＡ−ＤＲＢ１を包含する。これらの遺伝子は推定ＳＺリスク遺伝子座の精密マッピング及び位置クローニングのための参照点を提供する。
【００５４】
本発明の実施形態の適用により、ＳＺにおいて典型的には関与が示唆されていない神経伝達物質系（例えばＧＡＢＡ受容体活性）、ある所定の神経伝達物質系に特異的ではないニューロン過程（例えば活動電位の調節）又は神経系に特異的ではない生物学的プロセス（例えば、エネルギー経路）に一般的に関連する、本発明におけるＤＬＰＦＣにおいて過剰表示されたＧＯ用語が得られた。より詳細には、エネルギー代謝に関連する遺伝子はＳＺにおけるＤＬＰＦＣにおいて示差的に発現されたもので優勢であった。更に又、上記した結果に関与が示唆された遺伝子の少なくとも４つが電子伝達に関与しており、これらのうち３つが更に、より内部のミトコンドリア膜に位置するＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ複合体の部分でもあった。これらのデータは特定の経路又は過程内にあるが必ずしも特定の遺伝子内ではない機能不全がＳＺの病因において重要であることを示唆している。
【００５５】
更に又、ＳＺ患者のＤＬＰＦＣにおいて示差的に発現された１７７遺伝子の各々が信頼性の高い候補リスク遺伝子である。またそのような患者に由来するＰＢＣ中で示差的に発現された１２３遺伝子は疾患の推定バイオマーカーであると考えることができる。ＰＢＣにおいて上記同定された推定バイオマーカー遺伝子のうち６つはＳＺの脳においても示差的に発現された。それに属するものは、細胞増殖を調節するＢＴＧ１及びＲＮＡスプライシング及び転写を調節する３遺伝子（ＧＳＫ３Ａ、ＨＮＲＰＡ３及びＳＦＲＳ１）である。上記した遺伝子はＳＥＬＥＮＢＰ１及びＨＬＡＤＲＢ１に対する二次的な候補ＳＺバイオマーカーであると考えられ、これらはＤＬＰＦＣ及びＰＢＣの両方において同じ方向の改変発現を示している（それぞれアップ及びダウンレギュレーション）。更に又、ＨＬＡ−ＤＲＢ１はＳＺに関する第１の候補遺伝子座である染色体６ｐ２１．３上のＭＨＣ領域にマッピングされ（２２）、ＳＥＬＥＮＢＰ１はゲノムワイドのリンケージ試験の殆どではないが一部においてＳＺに強力にリンクされている遺伝子座である染色体ｌｑ２１−２２にマッピングされている。
【００５６】
更に又、潜在的な末梢バイオマーカーとしてのＳＥＬＥＮＢＰ１の利用性はＰＢＣ中のそのアップレギュレーションのＲＴ−ＰＣＲ確認により立証されている。ＤＬＰＦＣ及びＰＢＣにおいて測定されたＳＥＬＥＮＢＰ１転写物の改変されたレベルはまた、ＳＥＬＥＮＢＰ１タンパク質の発現がＳＺのＤＬＰＦＣの神経膠でより緻密でありニューロンでは低密度であることが分析により示唆されているため、機能的レベルにおける観察可能な結果と解釈されている。
【００５７】
即ち、本発明の種々の実施形態は種々の方法においてＳＥＬＥＮＢＰ１を使用する。例えば一部の実施形態においては、神経精神障害を診断する方法は第１の哺乳動物の生理学的サンプル中の細胞におけるセレン結合タンパク質発現の量又はレベルを検出又は決定することを含む。精神病的心的障害を有さない哺乳動物の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルに相対比較した場合の第１の哺乳動物の細胞におけるセレン結合タンパク質発現の量又はレベルの増加は第１の哺乳動物における精神病的心的障害を示す。生理学的サンプルは血液、例えば末梢血球であってよい。
【００５８】
別の実施形態において、神経精神障害の危険性を有する哺乳動物を決定する方法は、第１の哺乳動物の生理学的サンプル中の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルを、以前の時点における第１の哺乳動物の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルと、又は、神経精神障害を有さない哺乳動物の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルと比較することを含む。経時的な、又は、神経精神障害を有さない哺乳動物と相対比較した場合の、第１の哺乳動物の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルの増加は、第１の哺乳動物が神経精神障害の危険性を有することを示す。生理学的サンプルは血液、例えば末梢血球であってよい。
【００５９】
更に別の実施形態においては、哺乳動物における神経精神障害の進行の危険性を決定する方法は、神経精神障害を有する哺乳動物に由来する生理学的サンプル中の細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルを以前の時点における哺乳動物に由来する細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルと比較することを含む。経時的なセレン結合タンパク質発現の量又はレベルの増加は哺乳動物が神経精神障害の進行の危険性を有することを示す。生理学的サンプルは血液、例えば末梢血球であってよい。
【００６０】
更に別の実施形態において、哺乳動物の細胞におけるセレン結合タンパク質発現を薬剤が阻害するかどうかを決定する方法は、下記工程：
ａ）薬剤を哺乳動物に投与すること；ならびに
ｂ）哺乳動物の生理学的サンプル中の細胞中のセレン結合タンパク質発現を薬剤が阻害するかどうか検出又は決定すること；
を含む。
【００６１】
さらに別の実施形態において、薬剤が神経精神障害を阻害又は治療するかどうかを決定する方法は、下記工程：
ａ）神経精神障害を有する哺乳動物に薬剤を投与すること；ならびに
ｂ）哺乳動物の生理学的サンプル中の細胞中のセレン結合タンパク質発現を薬剤が阻害するかどうか検出又は決定すること；
を含む。細胞中のセレン結合タンパク質発現の量又はレベルの低下は神経精神障害を阻害又は治療するために有用な薬剤であることを示す。
【００６２】
上記した実施形態は神経精神障害に関する潜在的バイオマーカーを検出するための遺伝子発現マイクロアレイデータの分析のため、及び、分析の結果として検出されたバイオマーカーを使用するためのシステム及び方法を提供する。実施形態の適用により、ＤＬＰＦＣにおいて１７７の推定ＳＺリスク遺伝子が得られ、そのうち２８遺伝子は疾患にリンクする染色体の遺伝子座にマッピングされ；疾患において特に破壊されると考えられる６生物学的プロセス及び１２分子機能が明確化され、；ＰＢＣ中に１２３の推定ＳＺバイオマーカーが同定され、そのうち６遺伝子がＤＬＰＦＣにおける相当する示差的発現を有し；ＰＢＣにおいて最も強力な候補ＳＺバイオマーカー（ＳＥＬＥＮＢＰ１）のアップレギュレーションが確認され；そして、ＳＺのＤＬＰＦＣにおいてＳＥＬＥＮＢＰ１タンパク質の発現の改変されたパターンが明らかになった。上記した考察はＳＺに着目していたが、当業者の知る通り、ＳＺ及び他の神経精神障害に関する高信頼性で再現性のある候補リスク遺伝子及びバイオマーカーの同定を容易に行うためには、上記したシステム及び方法を、他の脳の領域（例えば偏在的及び領域特異的な変化を同定するために関与が示唆される及び示唆されない構造の両方）及び集団（例えば疾患特異的変化を確立するための双極性障害患者）に適用してよい。
【００６３】
上記した詳細な説明において、開示内容を簡素化する目的の為に種々の特徴を共に単一の実施形態に割り付けた。開示した本方法は請求項に記載した実施形態が各請求項内に明記したものを超えた特徴を有するという意図を反映すると解釈してはならない。即ち、以下の請求項は本明細書においては詳細な説明に組み込まれるものであり、そして各請求項は別個の実施形態としてそれ自体存在する。
【００６４】
本発明の特定の実施形態の上記説明は解説及び説明の目的の為に提示している。提示した実施形態は網羅的であること、又は、開示した特定の形態に本発明を限定することを意図していない。当業者の知る通り、詳細な説明の教示は本明細書に開示していないがなお本発明の範囲内にある種々の変更及び改変を可能にするものである。従って、本発明の範囲は実施形態の説明によるよりはむしろ、添付の請求項及びその等価物により定義されることを意図している。
【００６５】
３７ＣＦＲセクション、１．７２（ｂ）に準拠して要約を示すことにより技術的開示の性質及び要点を読者に迅速に確認できるようにした。要約は請求項の範囲を限定するために使用してはならないという理解と共に提出されている。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
【表２】
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【００６８】
【表３】
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【００６９】
【表４−１】
2008532495.tif 000006
【００７０】
【表４−２】
2008532495.tif 000007
【００７１】
【表４−３】
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【００７２】
【表４−４】
2008532495.tif 000009
【００７３】
【表４−５】
2008532495.tif 000010
【００７４】
【表４−６】
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【００７５】
【表４−７】
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【００７６】
【表４−８】
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【００７７】
【表５−１】
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【００７８】
【表５−２】
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【００７９】
【表５−３】
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【００８０】
【表５−４】
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【００８１】
【表５−５】
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【００８２】
【表５−６】
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【図面の簡単な説明】
【００８３】
【図１】図１は、本発明の実施形態による神経精神障害に関するバイオマーカーを検出するためのシステムの主要構成要素を示す。
【図２】図２は、本発明の実施形態による神経精神障害に関するバイオマーカーを検出するための例示される方法を示すフローチャートである。
【図３Ａ】図３Ａ及び図３Ｂは、対照対象及び統合失調症を有すると診断された患者のＤＬＰＦＣにおけるＳＥＬＥＮＢＰ１タンパク質の発現を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ及び図３Ｂは、対照対象及び統合失調症を有すると診断された患者のＤＬＰＦＣにおけるＳＥＬＥＮＢＰ１タンパク質の発現を示す。
【図４Ａ】図４Ａ及び図４Ｂは、ＳＺにおけるＤＬＦＰＣにおいて示差的に発現された遺伝子の間で過剰表示された本発明の実施形態により同定されたオントロジー用語の間の関係を示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ａ及び図４Ｂは、ＳＺにおけるＤＬＦＰＣにおいて示差的に発現された遺伝子の間で過剰表示された本発明の実施形態により同定されたオントロジー用語の間の関係を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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