(57)【要約】  本発明は、次の工程を含む、Ｗｎｔ（ウィント）−ファミリータンパク質の分泌を抑制し又は促進する物質のスクリーニング方法である。  ａ）塩基配列の配列表の配列番号１、２、３、又は７の核酸分子と、候補物質とを、前記核酸分子への前記候補物質の結合を許容する条件の下で接触させる工程、又は、  ｂ）アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子と、候補物質とを、前記核酸分子への前記候補物質の結合を許容する条件の下で接触させる工程、又は、  ｃ）Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌を生じさせる、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドの一部をコードする断片への候補物質の結合を許容する条件の下で、ａ）又はｂ）に記載の核酸分子の断片と候補物質とを接触させる工程、又は、  ｄ）誘導体への候補物質の結合を許容する条件の下で、ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子の核酸分子の誘導体、又はｃ）に記載の断片の誘導体と候補物質とを接触させる工程、又は、  ｅ）ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子、ｃ）に記載の断片、若しくはｄ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも５０％相同である核酸分子、断片、若しくは誘導体と候補物質とを接触させる工程、  ｆ）候補物質が、Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌の活性を抑制するか、若しくは活性を促進するかを、検出する。
2008537484.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の工程を含む、Ｗｎｔ（ウィント）−ファミリータンパク質の分泌を抑制し又は促進する物質のスクリーニング方法。
ａ）塩基配列の配列表の配列番号１、２、３、又は７の核酸分子と、候補物質とを、前記核酸分子への前記候補物質の結合を許容する条件の下で接触させる工程、又は、
ｂ）アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子と、候補物質とを、前記核酸分子への前記候補物質の結合を許容する条件の下で接触させる工程、又は、
ｃ）Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌を生じさせる、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドの一部をコードする断片への候補物質の結合を許容する条件の下で、ａ）又はｂ）に記載の核酸分子の断片と候補物質とを接触させる工程、又は、
ｄ）誘導体への候補物質の結合を許容する条件の下で、ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子の核酸分子の誘導体、又はｃ）に記載の断片の誘導体と候補物質とを接触させる工程、又は、
ｅ）ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子、ｃ）に記載の断片、若しくはｄ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも５０％相同である核酸分子、断片、若しくは誘導体と候補物質とを接触させる工程、
ｆ）候補物質が、Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌の活性を抑制するか、若しくは活性を促進するかを、検出する。
【請求項２】
ｅ）工程の下での前記核酸分子、断片、若しくは誘導体が、ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子、ｃ）に記載の断片、ｄ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも８８％相同であり、好ましくは少なくとも８９％相同であり、より好ましくは少なくとも９０％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９１％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９２％相同であることを特徴とする請求項１記載の方法。
【請求項３】
次の工程を含む、Ｗｎｔ（ウィント）−ファミリータンパク質の分泌を抑制し又は促進する物質のスクリーニング方法。
ａ）アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドと、候補物質とを、前記（ポリ）ペプチドへの前記候補物質の結合を許容する条件の下で接触させる工程、又は、
ｂ）Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌を生じさせる、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドの一部を構成する、（ポリ）ペプチドの断片への候補物質の結合を許容する条件の下で、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドの断片と候補物質とを接触させる工程、又は、
ｃ）誘導体への候補物質の結合を許容する条件の下で、ａ）に記載の（ポリ）ペプチドの誘導体、又はｂ）に記載の（ポリ）ペプチドの断片の誘導体と候補物質とを接触させる工程、又は、
ｄ）ａ）に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）に記載の（ポリ）ペプチドの断片、若しくはｃ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも５０％相同である（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体と候補物質とを接触させる工程、及び
ｅ）候補物質が、Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌の活性を抑制するか、若しくは活性を促進するか、又は、候補物質が、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドとＷｎｔ（ウィント）タンパク質間の結合の活性を抑制するか、若しくは活性を促進するかを、検出する。
【請求項４】
ｄ）工程の下での前記（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチド断片、若しくは誘導体が、ａ）に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）に記載の（ポリ）ペプチド断片、若しくはｃ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも８８％相同であり、好ましくは少なくとも８９％相同であり、より好ましくは少なくとも９０％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９１％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９２％相同であることを特徴とする請求項３記載の方法。
【請求項５】
請求項３のａ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、請求項３のｂ）工程に記載の（ポリ）ペプチドの断片、請求項３のｃ）工程に記載の誘導体、又は請求項３のｄ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体、又はアミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドのドメイン、好ましくはＷｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌物に含有され、若しくはＷｎｔ（ウィント）タンパク質と結合する（ポリ）ペプチドのドメインと特異的に結合する抗体。
【請求項６】
アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子の断片である標的配列、好ましくは配列表の配列番号９又は１０の標的配列を有するｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
薬剤としての使用のための、請求項５記載の抗体若しくは請求項６記載のｓｉＲＮＡ、請求項１のａ）若しくはｂ）工程に記載の核酸分子、請求項１のｃ）工程に記載の断片、請求項１のｄ）工程に記載の誘導体、若しくは請求項１のｅ）工程に記載の核酸分子、断片、若しくは誘導体、又は請求項３のａ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、請求項３のｂ）工程に記載の（ポリ）ペプチドの断片、若しくは請求項３のｃ）工程に記載の誘導体、又は請求項３のｄ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体。
【請求項８】
請求項５記載の抗体若しくは請求項６記載のｓｉＲＮＡ、請求項１のａ）若しくはｂ）工程に記載の核酸分子、請求項１のｃ）工程に記載の断片、請求項１のｄ）工程に記載の誘導体、若しくは請求項１のｅ）工程に記載の核酸分子、断片、若しくは誘導体、又は請求項３のａ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、請求項３のｂ）工程に記載の（ポリ）ペプチドの断片、若しくは請求項３のｃ）工程に記載の誘導体、又は請求項３のｄ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体の、Ｗｎｔ（ウィント）シグナルに関連する疾患、たとえば癌、骨若しくは関節の疾患、若しくは発達障害の処置のための医薬準備のための使用。
【請求項９】
請求項５記載の抗体若しくは請求項６記載のｓｉＲＮＡ、請求項１のａ）若しくはｂ）工程に記載の核酸分子、請求項１のｃ）工程に記載の断片、請求項１のｄ）工程に記載の誘導体、若しくは請求項１のｅ）工程に記載の核酸分子、断片、若しくは誘導体、又は請求項３のａ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、請求項３のｂ）工程に記載の（ポリ）ペプチドの断片、若しくは請求項３のｃ）工程に記載の誘導体、又は請求項３のｄ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体を含む医薬組成物。
【請求項１０】
増加されたか、減少されたか、３ＬＳ表現ではないか、若しくは、変異された３ＬＳ表現の（ポリ）ペプチドが少なくとも１つの組織若しくは器官に示される、
好ましくはヒトセルラインシステムであるセルラインシステムか、
ショウジョウバエ、マウス、ラット、うさぎ、鶏、蛙、豚、羊、Ｃ．エレガント等のワーム、ゼブラフィッシュ等の魚、からなる群から選択される脊椎動物若しくは無脊椎動物等の有機体か、
の利用を含む薬剤のスクリーニング、
又は
改変されたＷｎｔ（ウィント）分泌物による誘起された疾患のための検査。
【請求項１１】
前記器官は、トランス遺伝子として配列表の配列番号１〜３、７に記載された核酸分子の少なくとも１つからなる、３ＬＳ遺伝子を表現することを特徴とする、請求項１０記載の検査。
【請求項１２】
前記３ＬＳ遺伝子が、欠失、点変異、挿入、及び逆位からなる群から選択される変異を含むことを特徴とする、請求項１０記載の検査。
【請求項１３】
次の工程からなる、細胞のＷｎｔ（ウィント）分泌物の改変のための方法。
細胞と、Ｗｎｔ（ウィント）タンパクの分泌を抑制し若しくは促進する物質とを接触させる。
【請求項１４】
前記物質が、請求項５記載の抗体若しくは請求項６記載のｓｉＲＮＡ、請求項１のａ）若しくはｂ）工程に記載の核酸分子、請求項１のｃ）工程に記載の断片、請求項１のｄ）工程に記載の誘導体、若しくは請求項１のｅ）工程に記載の核酸分子、断片、若しくは誘導体、又は請求項３のａ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、請求項３のｂ）工程に記載の（ポリ）ペプチドの断片、若しくは請求項３のｃ）工程に記載の誘導体、又は請求項３のｄ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体であることを特徴とする、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
細胞中のＷｎｔ（ウィント）シグナル経路の調節、好ましくは細胞の運命の決定を調節し、又は幹細胞の発達を調節するための、請求項１のａ）若しくはｂ）工程に記載の核酸分子、請求項１のｃ）工程に記載の断片、請求項１のｄ）工程に記載の誘導体、若しくは請求項１のｅ）工程に記載の核酸分子、断片、若しくは誘導体、又は請求項５記載の抗体若しくは請求項６記載のｓｉＲＮＡの使用。
【請求項１６】
細胞中のＷｎｔ（ウィント）シグナル経路の調節、好ましくは細胞の運命の決定を調節し、又は幹細胞の発達を調節するための、請求項３のａ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、請求項３のｂ）工程に記載の（ポリ）ペプチドの断片、請求項３のｃ）工程に記載の誘導体、若しくは請求項３のｄ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
脊椎動物及び無脊椎動物のＷｎｔ（ウィント）遺伝子は、システインに富む大きなファミリー分泌タンパク質をコードする。そのタンパク質は、生物的過程の多様性において、細胞間のシグナル分子として重要な役割を果たす（Wodarz及びNusse 1998を広く参照のこと）。最初のＷｎｔ遺伝子であるマウスＷｎｔ−１は、乳癌におけるマウスの乳癌のウィルスの統合によって活性化された最初の腫瘍形成遺伝子として発見された（Nusse及びVarmus 1982）。その結果、癌におけるＷｎｔ（ウィント）シグナル経路の関わりは、大いに研究された。
【０００２】
Ｗｎｔ−１相同染色体としてのショウジョウバエの極性遺伝子ウィングレス（wingless）
の同一性（Cabrera, Alanso et al. 1987; Perrimon and Mahowald 1987; Rijsewijk, Schuermann et al. 1987）で、Ｗｎｔ遺伝子が重要な発生の調節遺伝子であることが明らかになった。このように、先ず、胚形成と発癌のような、異種の似ていない生物的過程の双方が、同一のシグナル経路を経て細胞コミュニケーションに依存する。
【０００３】
標準的なＷｎｔ経路の最近のモデルにおいて、分泌されたＷｎｔタンパク質は、Frizzle細胞表面の受容体に結合し、細胞質のタンパク質Dishevelled（Ｄｓｈ）を活性化する。そこで、Ｄｓｈは、プロテインキナーゼ、Shaggy（Ｓｇｇ）／ＧＳＫ３、骨格タンパク質アキシン及びβ−カテニン、脊椎動物のアルマジロ（Armadillo）の相同染色体を含む数種のタンパク質の複合体にシグナルを伝達する。
【０００４】
この複合体において、β−カテニンは、Ｓｇｇによって加リン酸反応が生じた後の、分解のための標的とされる。Ｗｎｔシグナル及びその結果としてのＳｇｇ活性の調節下降の後、β−カテニン（又はそのショウジョウバエ相同染色体アルマジロ（Armadillo））は、分解から逃れ、細胞質内に集まる。遊離細胞質β−カテニンは、未だ知られていないメカニズムによって核へ移動し、転写因子のＴｃｆ／Ｌｅｆファミリーの結合を通じて、遺伝子の転写を調節する（Grosschedl R 1999）。β−カテニンにおける突然変異、ＡＰＣ、及びアキシンは、標準的なＷｎｔ経路の本質的な活性化が、ヒトの発癌に寄与することを示唆する、数種のヒトｃ癌において発見された（Uthoff SM，Eichenberger MR，McAuliffe TL，Hamilton Cl and Galandiuk S.（2001）. Mol. Carcinog., 31,56-62）。
【０００５】
Ｗｎｔリガンドのそれらの受容体への結合は、また非標準的な経路の活性化を誘発し、カルシウム融解、ｃ−Ｊｕｎ ＮＨ2−末端キナーゼ、及びＧタンパク質を通じてシグナルを送ることができる、β−カテニンの独立的なシグナルを送る、Ｗｎｔシグナルとして言及する。これらの経路は、標準的な、Ｗｎｔリガンド上昇調節によって特徴づけられる腫瘍における、β−カテニンの依存経路と平行して活性化することができた（Huguet EL, McMahon JA, McMahon AP, Bicknell R and Harris AL(1994). Cancer Res., 54, 2615-2621.; Dale TC, Weber-Hall SJ, Smith K, Huguet EL, Jayatilake H, Gusterson BA, Shuttleworth G, O'Hare M and Harris AL.（1996）．Cancer Res., 56, 4320-4323; Vider BZ, Zimber A, Chastre E, Prevot S, Gespach C, Eslein D, Wolloch Y, Tronick SR, Gazit A and Yaniv A.(1996). Oncogene,12, 153-158; Smith K, Bul TD, Poulsom R, Kaklamanis L, Williams G and Harris AL.(1999). Br. J. Cancer,81,496-502）。
【０００６】
たとえば、Ｗｎｔ−２の自由な上昇調節は、ヒトの結腸、直腸ガンや胃ガンにおいて報告された（Katoh M.(2001). Int. J, Oncol., 19, 1003-1007. ）。さらに、Holcombe 等（Holcombe RF, Marsh JL, Waterman ML, Lin F, Milovanovic T and Truong T. (2002). Mol. Pathol., 55, 220-226）は、近年において、インサイチューハイブリダイゼーションによって、ヒトの結腸ガンや悪性のメラノーマにおける特異的なＷｎｔ遺伝子の発現を分析した。そして、それらの結果は、Ｗｎｔ−２の過剰な発現が、ヒトの発癌においても関連していることを示唆した（Pham K, Milovanovic T, Barr RJ, Truong T and Holcombe RF. (2003). Mol. Pathol., 56, 280-285.）。
【０００７】
発癌における役割に加えて、Ｗｎｔシグナルは、またスケレトゲネシス(skeletogenesis)、骨形成、フラクチュアリピア（fracture repair）における役割も果たす（Hartmann (2000), Holmen (2005)）。たとえばＷｎｔタンパク質の上昇調節は、リューマチ関節炎や変形性関節炎の経路生物学に相互に関係するように示された(Sen et al. (2000), Nakamura (2005), Holmen (2005))。
【０００８】
近年、β−カテニンの転写活性化を直接的に抑制することによってのみならず、Ｗｎｔリガンドによって経路の活性化をも抑制することによって、Ｗｎｔ経路を効果的に抑制する治療薬が知られている。これは、部分的には、その十分な活性化や核移行のために要求される多くの特殊な成分が、未だ知られていないという事実に基づく。従って、これらの高い悪性の疾患に対して有効な薬剤を開発するために、この経路について一層の理解が求められる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
Ｗｇ／Ｗｎｔシグナル経路の活性化のために要求される新しい成分の同定のために、本発明者等は、ｓｅｖ−ｗｇ表現型（ショウジョウバエのメラノガスター（ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）の劣性のサプレッサー（抑制遺伝子）をスクリーニングする手法を用いた。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この手法において、遺伝子ＣＧ６２１０によってコードされる３Ｌ３と称されるタンパク質が見出された。前記遺伝子は、すべての後性動物において相同染色体を有しており、さらに興味深いことには、それぞれの種において、このファミリーの１つの遺伝子のみが十中八九存在している。遺伝学的手段によって、Ｗｇ／Ｗｎｔシグナル経路、特にすべてのＷｎｔタンパク質のＷｇ／Ｗｎｔの分泌経路において、３Ｌ３が明確な役割を果たしていることが確かとなった。さらに、３Ｌ３が、物理的にＷｎｔタンパク質に相互作用することが示された。それ故に、３Ｌ３タンパク質は、Ｗｎｔタンパク分泌物の上昇調節又は下降調節を行い、標準的及び非標準的なＷｎｔ経路の双方を抑制するような開発薬剤のための非常に有望な標的である。
【００１１】
本発明は、次の工程を含む、Ｗｎｔ（ウィント）−ファミリータンパク質の分泌を抑制し又は促進する物質のスクリーニング方法に関するものである。
【００１２】
ａ）塩基配列の配列表の配列番号１、２、３、又は７の核酸分子と、候補物質とを、前記核酸分子への前記候補物質の結合を許容する条件の下で接触させる工程、又は、
ｂ）アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子と、候補物質とを、前記核酸分子への前記候補物質の結合を許容する条件の下で接触させる工程、又は、
ｃ）Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌を生じさせる、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドの一部をコードする断片への候補物質の結合を許容する条件の下で、ａ）又はｂ）に記載の核酸分子の断片と候補物質とを接触させる工程、又は、
ｄ）誘導体への候補物質の結合を許容する条件の下で、ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子の核酸分子の誘導体、又はｃ）に記載の断片の誘導体と候補物質とを接触させる工程、又は、
ｅ）ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子、ｃ）に記載の断片、若しくはｄ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも５０％相同である核酸分子、断片、若しくは誘導体と候補物質とを接触させる工程、
ｆ）候補物質が、Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌の活性を抑制するか、若しくは活性を促進するかを、検出する。
【００１３】
前記ｄ）における誘導体は、任意の分子と接触するａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子、若しくはｃ）に記載の断片であり、前記候補物質は、対応する改変されていない核酸分子若しくは誘導体間の親和性に比べて、多くとも５０％増加若しくは減少する、前記誘導体との親和性を示す。
【００１４】
次の（ポリ）ペプチドの配列に関する相同率（％）は、配列が直線に整列され、間隙が持ち込まれた後、もし必要であれば、配列表と同一の最大限の百分率を達成するために、そして、配列の同一性の一部としていかなるアミノ酸の保存的な代用を考慮することなく、配列表の配列番号が４、５、６、及び８のアミノ酸残基と同一である候補物質におけるアミノ酸残基の百分率として定義される。このようにして用いられる同一性の数値の％は、（Tatusova TA 1999）から得られたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２によって発生させることができる。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、ほとんどが不履行の数値にセットされた数種の調査パラメータを用いる。
【００１５】
同様の方法により、配列表の配列番号が１、２、３、及び７の核酸分子の相同率（％）は、前記核酸の配列におけるヌクレオチド残基と同一である候補物質におけるヌクレオチド残基の百分率として定義される。このようにして用いられる同一性の数値は、不履行のパラメータにセットされたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴモジュールを用いて発生させることができる。
【００１６】
配列表の配列番号１、２、３、及び７の核酸分子によってコードされた、配列表の配列番号が４、５、６、及び８の（ポリ）ペプチドは、それぞれが、たとえばショウジョウバエ、ヒル、ナメクジ、カタツムリ、ミミズ等の無脊椎動物、及び脊椎動物、たとえばヒト、無尾猿（エイプ）、猿（モンキー）、犬、猫、うさぎ、ヤギ、豚、ハムスター、牛、馬、羊、マウス、ラットを含む哺乳類に存在する新規なファミリータンパク質の代表（典型）である。
【００１７】
配列表の配列番号が４、５、６、及び８の（ポリ）ペプチドは、３Ｌ３又はＷＬＳ（Ｗｎｔ
のない）タンパク質として以下に言及されている。これらのタンパク質は、Ｗｇ／Ｗｎｔシグナル経路において、及びそのようなフォーメーション、空間的な整列の維持、発達途上にある組織の増殖において、及びそのフォーメーション、多くのヒトの腫瘍の成長において、特殊な役割を果たす。
【００１８】
配列表の配列番号４の（ポリ）ペプチドは、配列表の配列番号８（３Ｌ３−ＰＢ）の（ポリ）ペプチドと同様に、ショウジョウバエ（３Ｌ３−ＰＡ）の３Ｌ３タンパク質である。配列表の配列番号５及び６の（ポリ）ペプチドは、それぞれcaenorhabditis（カエノルハブジット）（Ｃ．）エレガンス及びヒトの３Ｌ３タンパク質である。それらの３Ｌ３タンパク質は、ショウジョウバエの３Ｌ３タンパク質と構造的及び機能的に相同である。
【００１９】
本発明の１つの実施形態において、前記ｅ）工程の下での前記核酸分子、断片、若しくは誘導体が、ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子、ｃ）に記載の断片、若しくはｄ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも５０％相同であり、好ましくは少なくとも５５％相同であり、より好ましくは少なくとも６０％相同であり、さらに好ましくは少なくとも６５％相同であり、さらに好ましくは少なくとも７０％相同である。
【００２０】
他の好ましい実施形態において、ｅ）工程の下での核酸分子、断片、若しくは誘導体が、ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子、ｃ）に記載の断片、若しくはｄ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも７５％相同であり、好ましくは少なくとも８０％相同であり、より好ましくは少なくとも８５％相同であり、さらに好ましくは少なくとも８６％相同であり、さらに好ましくは少なくとも８７％相同である。
【００２１】
さらに好ましい実施形態においては、ｅ）工程の下での核酸分子、断片、若しくは誘導体が、ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子、ｃ）に記載の断片、若しくはｄ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも８８％相同であり、好ましくは少なくとも８９％相同であり、より好ましくは少なくとも９０％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９１％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９２％相同である。
【００２２】
さらに好ましい実施形態においては、ｅ）工程の下での核酸分子、断片、若しくは誘導体が、ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子、ｃ）に記載の断片、若しくはｄ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも９３％相同であり、好ましくは少なくとも９４％相同であり、より好ましくは少なくとも９５％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９６％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９７％相同である。
【００２３】
さらに好ましい実施形態においては、ｅ）工程の下での核酸分子、断片、若しくは誘導体が、ａ）若しくはｂ）に記載の核酸分子、ｃ）に記載の断片、若しくはｄ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも９８％相同であり、好ましくは少なくとも９９％相同である。
【００２４】
さらに本発明は、次の工程を含む、Ｗｎｔ（ウィント）−ファミリータンパク質の分泌を抑制し又は促進する物質のスクリーニング方法に関するものである。
【００２５】
ａ）アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドと、候補物質とを、前記（ポリ）ペプチドへの前記候補物質の結合を許容する条件の下で接触させる工程、又は、
ｂ）Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌を生じさせる、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドの一部を構成する、（ポリ）ペプチドの断片への候補物質の結合を許容する条件の下で、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドの断片と候補物質とを接触させる工程、又は、
ｃ）誘導体への候補物質の結合を許容する条件の下で、ａ）に記載の（ポリ）ペプチドの誘導体、又はｂ）に記載の（ポリ）ペプチドの断片の誘導体と候補物質とを接触させる工程、又は、
ｄ）ａ）に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）に記載の（ポリ）ペプチドの断片、若しくはｃ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも５０％相同である（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体と候補物質とを接触させる工程、及び
ｅ）候補物質が、Ｗｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌の活性を抑制するか、若しくは活性を促進するか、又は、候補物質が、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドとＷｎｔ（ウィント）タンパク質間の結合の活性を抑制するか、若しくは活性を促進するかを、検出する。
【００２６】
前記ｃ）における誘導体は、Ｎ末端若しくはＣ末端、又はアミノ酸側鎖と接触する任意の分子を持つ、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、若しくは８の（ポリ）ペプチド、又はｂ）に記載の（ポリ）ペプチドの断片であり、候補物質は、対応する改変されていない（ポリ）ペプチド若しくは（ポリ）ペプチドの誘導体間の親和性に比べて、多くとも５０％増加若しくは減少する、前記誘導体との親和性を示す。
【００２７】
本発明の１つの実施形態において、ｄ）工程の下での（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチド断片、若しくは誘導体が、ａ）に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）に記載の（ポリ）ペプチド断片、若しくはｃ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも５２％相同であり、好ましくは少なくとも５５％相同であり、より好ましくは少なくとも６０％相同であり、さらに好ましくは少なくとも６５％相同であり、さらに好ましくは少なくとも７０％相同である。
【００２８】
他の好ましい実施形態において、ｄ）工程の下での（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチド断片、若しくは誘導体が、ａ）に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）に記載の（ポリ）ペプチド断片、若しくはｃ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも７５％相同であり、好ましくは少なくとも８０％相同であり、より好ましくは少なくとも８５％相同であり、さらに好ましくは少なくとも８７％相同である。
【００２９】
さらに好ましい実施形態においては、ｄ）工程の下での（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチド断片、若しくは誘導体が、ａ）に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）に記載の（ポリ）ペプチド断片、若しくはｃ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも８８％相同であり、好ましくは少なくとも８９％相同であり、より好ましくは少なくとも９０％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９１％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９２％相同である。
【００３０】
さらに好ましい実施形態においては、ｄ）工程の下での（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチド断片、若しくは誘導体が、ａ）に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）に記載の（ポリ）ペプチド断片、若しくはｃ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも８８％相同であり、好ましくは少なくとも８９％相同であり、より好ましくは少なくとも９０％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９１％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９２％相同である。
【００３１】
さらに好ましい実施形態においては、ｄ）工程の下での（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチド断片、若しくは誘導体が、ａ）に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）に記載の（ポリ）ペプチド断片、若しくはｃ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも９３％相同であり、好ましくは少なくとも９４％相同であり、より好ましくは少なくとも９５％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９６％相同であり、さらに好ましくは少なくとも９７％相同である。
【００３２】
さらに好ましい実施形態においては、ｄ）工程の下での（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチド断片、若しくは誘導体が、ａ）に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）に記載の（ポリ）ペプチド断片、若しくはｃ）に記載の誘導体に対して、それぞれ少なくとも９８％相同であり、好ましくは少なくとも９９％相同である。
【００３３】
さらに本発明は、ａ）工程の（ポリ）ペプチド、ｂ）工程の（ポリ）ペプチドの断片、ｃ）工程の誘導体、又はｄ）工程の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体、又はアミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドのドメイン、好ましくはＷｎｔ（ウィント）タンパク質の分泌物に含有され、若しくはＷｎｔ（ウィント）タンパク質と結合する（ポリ）ペプチドのドメインと特異的に結合する抗体に関するものである。
【００３４】
さらに本発明は、アミノ酸配列の配列表の配列番号４、５、６、又は８の（ポリ）ペプチドをコードする核酸分子の断片である標的配列、好ましくは配列表の配列番号９又は１０の標的配列を有するｓｉＲＮＡに関するものである。
【００３５】
さらに本発明は、前記抗体若しくは前記ｓｉＲＮＡ、前記スクリーニング方法のａ）若しくはｂ）工程の核酸分子、ｃ）工程の核酸の断片、ｄ）工程の核酸の誘導体、ｅ）工程に記載の核酸分子、断片、若しくは誘導体、前記スクリーニング方法のａ）工程の（ポリ）ペプチド、ｂ）工程の（ポリ）ペプチドの断片、ｃ）工程の（ポリ）ペプチドの誘導体、ｄ）工程の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体の、薬剤としての使用に関するものである。
【００３６】
本発明は、前記抗体若しくは前記ｓｉＲＮＡ、前記スクリーニング方法のａ）若しくはｂ）工程の核酸分子、ｃ）工程の核酸の断片、ｄ）工程の核酸の誘導体、若しくはｅ）工程の核酸分子、断片、若しくは誘導体、又は前記スクリーニング方法のａ）工程の（ポリ）ペプチド、ｂ）工程の（ポリ）ペプチドの断片、若しくはｃ）工程の誘導体、又はｄ）工程の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体の、Ｗｎｔ（ウィント）シグナルに関連する疾患、たとえば癌、骨若しくは関節の疾患、若しくは発達障害の処置のための医薬準備のための使用に関するものである。
【００３７】
好ましい癌の種類は、Ｗｎｔ依存型の癌、結腸直腸癌、肺癌、咽頭癌、好ましくはＷｎｔ−２依存の咽頭癌、小さな腸の悪性腺腫、胃底腺ポリープ、胃癌、胃の腺腫(関連する悪性腺腫のない)、胃腸のカルチノイド腫瘍、esophageal悪性腺腫; Wilmの膵臓(非ductal腺房細胞癌)の少年のnasopharyngeal angiofibromas、黒色腫、pilamatricomas、肺の悪性腺腫、卵巣癌、子宮頚部、子宮のendometrial、胸のfibromatoses、前立腺、甲状腺癌、hepatoblastoma、肝細胞癌、C型肝炎に関連している肝細胞癌、髄芽細胞腫、desmoid腫瘍、腫瘍(腎臓)、pancreatoblastoma、及び滑膜肉腫等である。
【００３８】
骨又は関節の疾患の好ましいタイプ（類型）は、それぞれ変形性関節症、又はリューマチ関節炎である。
【００３９】
さらに本発明は、前記抗体若しくは前記ｓｉＲＮＡからなる医薬組成物に関する。
【００４０】
さらに本発明は、増加されたか、減少されたか、３ＬＳ表現ではないか、若しくは、変異された３ＬＳ表現の（ポリ）ペプチドが少なくとも１つの組織若しくは器官に示される、
好ましくはヒトセルラインシステムであるセルラインシステムか、ショウジョウバエ、マウス、ラット、うさぎ、鶏、蛙、豚、羊、Ｃ．エレガント等のワーム、ゼブラフィッシュ等の魚、からなる群から選択される脊椎動物若しくは無脊椎動物等の有機体か、の利用を含む薬剤のスクリーニング、又は改変されたＷｎｔ（ウィント）分泌物による誘起された疾患のための検査に関するものである。
【００４１】
その検査の好ましい実施形態において、前記器官は、トランス遺伝子として配列表の配列番号１〜３、７に記載された核酸分子の少なくとも１つからなる、３ＬＳ遺伝子を表現（発現）するものである。
【００４２】
その検査の他の好ましい実施形態において、前記３ＬＳ遺伝子が、欠失、点変異、挿入、及び逆位からなる群から選択される変異からなるものである。
【００４３】
さらに本発明は、次の工程からなる、細胞のＷｎｔ（ウィント）分泌物の改変のための
方法である。細胞を、Ｗｎｔタンパク質の分泌を抑制し、若しくは促進する物質と接触させる。
【００４４】
その方法の好ましい実施形態において、前記物質は、前記抗体若しくは前記ｓｉＲＮＡ、ａ）若しくはｂ）工程の核酸分子、ｃ）工程の断片、ｄ）工程の誘導体、若しくはｅ）工程の核酸分子、断片、若しくは誘導体、又はａ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）工程の（ポリ）ペプチドの断片、若しくはｃ）工程の誘導体、又はｄ）工程の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体である。
【００４５】
本発明は、細胞中のＷｎｔ（ウィント）シグナル経路の調節、好ましくは細胞の運命の決定を調節し、又は幹細胞の発達を調節するための、のａ）若しくはｂ）工程に記載の核酸分子、ｃ）工程に記載の断片、ｄ）工程に記載の誘導体、若しくはｅ）工程に記載の核酸分子、断片、若しくは誘導体、又は抗体若しくはｓｉＲＮＡの使用に関する。
【００４６】
細胞中のＷｎｔ（ウィント）シグナル経路の調節、好ましくは細胞の運命の決定を調節し、又は幹細胞の発達を調節するための、ａ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、ｂ）工程に記載の（ポリ）ペプチドの断片、ｃ）工程に記載の誘導体、若しくはｄ）工程に記載の（ポリ）ペプチド、（ポリ）ペプチドの断片、若しくは誘導体の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１ａ】CustalWタンパク質配列は、ショウジョウバエの３Ｌ３タンパク質と、C．エレガンスと、ヒトと間の高い相同性を示す。 推定のシグナル配列は、配列上に線によって示され、経膜的なドメインは、下線が付される(TMHMM予測)。
【図１ｂ】図１ａと同じである。
【図１ｃ】図１ａと同じである。
【図２】A) コントロールとしての正常成人pharates（ファラテス）。          B) 知覚力のその触鬚を見せる３Ｌ３のための成人pharates homozygous変異体は、すべての３脚の組のrudimental発達である。         C) 知覚力のその触鬚を見せる３Ｌ３のための成人pharates homozygous変異体は、すべての３脚の組のrudimental発達と、翼から背板への変化(5-10 %の場合に観測される)。germlineクローン表現型を示す胚。          D)及びE)、: 正常な分割パターンを示す野生型状態。          F)及びG) 及びセグメント(「小歯の芝生」表現型)のＷｇ機能の損失表現型を示す３Ｌ３のための胚の変異体。  これらの３Ｌ３の突然変異の胚が、セグメントの融合や、典型的なＷｇ又はＨｈの機能のロス（図２のＤ−Ｇ）を示すことが観察された。この結果からは、３Ｌ３が、Ｗｇ／Ｗｎｔ又はＨｈのシグナル経路の決定的な成分であることが導かれる。
【図３】A) 野生型ディスクの末端の、より少ないLacZ表現。          B) Distalless-LacZ表現は3L3変異体組織で抑えられる。          E) Bと同じであることで、クローンマージンだけが示されます。          D) 野生型ディスクの無意味なタンパク質表現。          C) 無意味なタンパク質表現は３Ｌ３変異体で抑圧されます。          F) Bと同じであることで、クローンマージンだけが示される。
【図４】A) 野生型ディスクのWgタンパク質表現。          B) これらの変異細胞の中では、Wgが蓄積するのを示して、Wgタンパク質表現は３Ｌ３変異体組織で増加される。          C) Bと同程度、クローンマージンだけが示される。          D) 細胞外 Wgタンパク質発現はないか、または３Ｌ３変異体組織で少し増加されているだけである。B-Cで見られたWgの蓄積が主に細胞内であることが示唆されている。         E) 同様に、Bとして、クローンマージンだけが示される。
【図５】TOP Flash Luciferaseを含む。 Wnt3A-V5とsiRNA−h3L3 cotransfectedセルは見せかけのコントロールとしてのWntのシグナルの依存するLuciferaseレポーターの遺伝子の誘導を全く示さない。(空のベクトル(pcDNA3)はsiRNA#GFPと共に遺伝子でcotransfectedされた)。 しかしながら、Wnt3A-V5とsiRNA#GFP cotransfectedセルはaを示した。  レポーターの遺伝子の２倍の誘導は見せかけのコントロールと比較された。
【図６】共同免疫沈降反応、IP: α-HA、 α-V5h3L3-HAはWnt3A-V5(レーン1)。   負の制御: CD2-HAとWnt3A-V5(レーン2)の間で相互作用を全く観測することができない。そして、EGFP transfectedセル(レーン3)の中にバンドを全く検出することができない。
【図７】３Ｌ３のC.．エレガンス相同染色体に対するsiRNA。 A) a wt虫３Ｌ３に対するsiRNAの性腺は性腺(B)と、欠陥への末端のチップ細胞移動(C)におけるOocytesの異常なアレンジメントに通ずる。
【図８】TOP Flash Renilla Luciferaseを含む。 GFP RNAiと比べて、WLS RNAiは明確なWgの分泌を示した。
【図９Ａ−Ｂ】Wnt3aの分泌はhWLSのノックダウンで損なわれる。          A) HEK-293Tセルについて表面に浮かぶWnt3a-V5のレベルはhWLSの減少で強く減少する。          B) sihWLSはCOS-7セルの媒体の中にWntl-HAの分泌を撤廃する。
【図９Ｃ】siGFPと比べて、sihWLSのアプリケーションはWnt5a-HAの分泌を強く減少させる。
【図１０】B-I) HEK-293Tセルのセルの表面stainings。 Wnt3a-V5はsihWLS(B)と共に共同transfectedされたセルのセルの表面に達することができない。siGFPのcotransfectionはセルの表面(C)でWnt3a-V5の検出可能なレベルに通じる。 どちらもsihWLS(D)と共に治療されたセルの表面で検出可能ではない。Wnt3aC77A-V5、または、siGFP(E)。 (F-I) CD2-HAが検出されていない間、HA-CD2はセルの表面(F、G)に検出される(H、I); 従来の汚損(目立たない)で容易にCD2-HAを検出することができる。 HA-CD2の表面レベルはsihWLSによって影響されない。
【図１１】C．エレガンス WLS ortholog表現型模写に対してRNAi ABarは母性のオリエンテーション欠陥を紡錘形にする。そして、母性−３変異体肺は左と腹に前方で見せられる。     (A) 野生型肺、ABarスピンドル(黄色)はABprのスピンドルに垂直であって(青い)、すなわち、見せられた光学セクションに垂直な状態で(黄色いドットで、示される)適応する。     (B)  RNAi(母性−２)の注入された動物、2個のスピンドルでは、オリエンテーションが平行となる。     (C、D) RNAi(R06B9.6)肺(D)のABarとABprスピンドルと同様に初期の母性−3(or78)変異体段階(C)に、オリエンテーションが平行にある。
【図１２】Wnt3aの分泌はhWLSのノックダウンで損なわれる。        A) コントロール(siGFP)と比べて、ShhとsihWLSと共にcotransfectedされたHEK-293Tセルのライセートと培地はShhの生産と分泌における変更を全く示さない。        Ｂ) WLSの減少でSSHA-dTNFΔN(TNF-FLAG)の分泌は影響されない。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４８】
Ｗｎｔ（ウィント）シグナリングカスケードは、脊椎動物及び無脊椎動物の双方の発生のために重要であり、腫瘍形成に影響を与えてきた。ショウジョウバエのＷｎｔ遺伝子は、百以上の遺伝子を含んでいる、Ｗｎｔタンパクファミリーのなかでも最も特徴的なものの１つである。ショウジョウバエの胚において、Ｗｇは、parasegment boundaries（パラセグメント境界）の形成、及び近接した細胞におけるengrailed(ed)（エングレイルド）の発現の維持に必要である。Ｗｇ機能における胚の表皮の欠陥は、不全の分割しか示さない。それは、異常な表皮のパターンに反映される。野性型幼虫の腹の表皮が、裸の領域と交替する歯状ベルトを示している間、Wg変異体幼虫の表皮は歯状物で完全に覆われている。
【００４９】
成虫のディスクの発育の間、Ｗｇは、dorso-vental（dorso腹）の位置の情報を制御する。脚のディスクでは、Ｗｇは、腹の運命(Struhl and Basler 1993)の誘導によって、今後の脚をパター（patter）する。Ｗｇの活性が減退している動物においては、腹の脚の半分は、背面のミラーイメージ（mirror image）(ベイカー1988)内で発育する。従って、減退したＷｇの活性は、notal組織への翼の変化につながり、結果として遺伝子の名前(Sharma and Chopra 1976).につながっている。目のディスクでは、Ｗｇは、頭部の表皮の発育のために、ommatidial分化を抑制し、目の領域を横切って、dorso腹の軸を設立するのにかかわる(Heberlein、Borod et al. 1998)。
【００５０】
付加的な遺伝子は、Ｗｇシグナリングの分泌、受容、又は解釈に関係してきた。たとえばショウジョウバエの遺伝学的研究は、Ｗｇシグナリングにおけるfrizzled (Dfz)、 Dishevelled (dsh)、shaggy/zeste-white-3 (sgg/zw-3)、armadillo (arm)、adenomatous polyposis coli (E-apc), axin（アキシン）、及び pangolin (pan)との関わりを示した。これらのトランスデューサー（transducer）の遺伝的な指令は、ＷｇがＤｓｈを通じてＳｇｇを抑制する作用をし、従って、ＳｇｇによるＡｒｍの抑圧を和らげ、その結果、Ａｒｍの細胞質での蓄積、及びその核への移行をもたらす。核内では、Ａｒｍは、標的遺伝子の転写を活性化するために、Ｐａｎと相互作用をする。脊椎動物の相同染色体は、すべてのこれらの成分のために同定され（最新の論評を参照のこと（Peifer and Polakis 2000)）、ショウジョウバエのシグナル経路の、新規な同定されたメンバーが、脊椎動物の相対物を持つかもしれないことを示唆した。
【００５１】
Ａｒｍ、β−カテニンの哺乳類の相同染色体の核への蓄積、及びＷｇ／Ｗｎｔ経路の重要な活性化に導かれた変異は、直腸癌、乳癌、メラノーマ（黒色腫）、肝細胞癌、卵巣癌、子宮内膜癌、髄芽細胞腫、毛基質細胞腫、及び前立腺癌を含む、多くの種類の癌に観測された。現在では、Ｗｎｔシグナリングの統制解除が、これらの悪性腫瘍に発生において重要な事象であることが明らかとなっている。しかしながら、Ｗｎｔ経路を効果的に抑制する治療薬が未だ知られていないばかりか、β−カテニンの転写の活性化を直接的に抑制する治療薬、或いはＷｎｔリガンドによる経路の活性化を抑制する治療薬すらも知られていない。これは、十分な活性が要求される多くの特殊な成分が、未だ知られていないという事実に基づくものである。
【００５２】
Winglessの活性化のために要求される新しい成分を同定するために、本発明者等はショウジョウバエ遺伝子の手法を用い、ショウジョウバエのメラノガスター（melanogaster）のsev-wg表現型の劣性のサプレッサーのためのスクリーンを行った。この手法において、３Ｌ３として下記に引用されているタンパク質が見出された。このタンパク質は、遺伝子ＣＧ６２１０によってコードされている。前記遺伝子は、すべての後生動物において相同物を有し、さらに興味深いことには、それぞれの種において、十中八九は、このファミリーの１つの遺伝子しか存在しない。遺伝学的手段により、本発明者等は、Ｗｇ／Ｗｎｔシグナル経路の決定的な成分としての３Ｌ３の役割を確信し、特にＷｎｔタンパク質の分泌物における、その重要
性を確信した。さらに、３Ｌ３とＷｎｔが物理的に相互作用することを、鋭意研究によって見出した。
【００５３】
sev-wg表現型の劣性のサプレッサーのためのスクリーンでは、本発明者等は、３Ｌ３の近縁種の群から３つの異なる対立遺伝子を見出した。２つの対立遺伝子が、今までのところ、特徴的でない遺伝子ＣＧ６２１０の変異を有している。ＣＧ６２１０は、Ｎ末端側がシグナル配列で構成され、推定で７個の経膜的なドメインを有するタンパク質をコードする。３Ｌ３の近縁種の群の１つの対立遺伝子であるｓｕ２０．５３は、シグナル配列の最後のアミノ酸残基と、時期尚早の終止コドンにおけるフレームシフトに導かれる、４７ｂｐ欠失を含んでいる。他のサプレッサーｓｕ２０．５４は、最初の経膜的なドメインにおいて、プロリンをセリンに変換するアミノ酸残基に導く点変異を有する。異なる生命情報工学プログラムは、このタンパク質が、知られていない機能のタンパク質のファミリーに属し、また興味深いことに、種ごとには、常にこのファミリーの１つのタンパク質しか存在しないという結論を導いた。さらに、そのタンパク質は、異なる種において非常にうまく保存されており、特に、細胞外での数種の配列や、経膜的で橋架けされたドメイン（図１ａ−ｃ）の機能が特殊であり、且つ保存されていることを示している。
【００５４】
ショウジョウバエの胚は、数種の遺伝子の局在化された活性によって、反復セグメントへ、累進的に再分化される。Wingless（Ｗｇ）及びHedgehog（Ｈｈ）は、いわゆるセグメント極性遺伝子グループの最も重要な遺伝子であり、Ａ／Ｐ軸を、セグメントを未だ形成しておらず将来セグメントとなる、１４−１５のストライプ（stripes）へ均等に分配する。結果として、Ｗｇ又はＨｈの機能のロスは、胚の腹部の横の反復された外骨格構造のフォーメーションの分裂を生じさせる。これは、セグメント極性遺伝子の活性の、最も明白な表現型の結論である。
【００５５】
「germline clones（微生物ラインクローン）」と称される遺伝的な実験は、（３Ｌ３の場合のように）興味あるタンパク質が完全に欠乏しているショウジョウバエの突然変異の胚を、通常のものにすることを発明者に許容し、そして分割のパターンを研究することを許容する。特に「germline clones（微生物ラインクローン）」は、多くの遺伝子のために、胚にときどき存在する母性の成分を除去するのに必要である。
【００５６】
これらの３Ｌ３の突然変異の胚が、セグメントの融合や、典型的なＷｇ又はＨｈの機能のロス（図２のＤ−Ｇ）を示すことが観察された。この結果からは、３Ｌ３が、Ｗｇ／Ｗｎｔ又はＨｈのシグナル経路の決定的な成分であることが導かれる。
【００５７】
また、Ｗｇは、触覚、脚、羽根等の、ショウジョウバエの成虫の付属肢の発育に中枢的な役割を果たす。それ故に、発明者等は、孵化前に飛ぶことを意味する成虫のファラテス（pharates）の３Ｌ３の突然変異の表現型を研究した。発育がＷｇに依存するすべての付属肢が異常であることが観察された（図２Ａ−Ｃ）。特に、触覚の端刺が見当たらず、脚が短く、分割の不足が認められ、いわゆる「羽根から胸背板」の５％に変形が観察された。この変形は、Ｗｇの機能のロスのために、病徴的なものである。これらが見出されたことで、
３Ｌ３がＷｇ／Ｗｎｔシグナル経路における決定的な成分であるという明白な結論が得られる。
【００５８】
たとえば羽根や脚のような成虫の付属肢は、"imaginal discs（イマジナルディスク、成虫ディスク）"と称されるsack-like 上皮において組織（器官）形成されたimaginal細胞によって幼虫において形成される。特に、羽根のimaginal discは、それが胚の発育過程で形成され、幼虫の時期に75000個の細胞のディスクを一般化するために、3つの幼虫の齢の間、増殖するとき、２０個の細胞の周囲に配置されている。これらのimaginal discs（イマジナルディスク）において、Wingless(ウイングレス)は、空間的濃度が変化し、細胞が異なる閾値の濃度において、異なって応答するモルフォゲンとしてふるまう。
【００５９】
本発明者等は、たとえばＷｇによって活性化される遺伝子のような標的遺伝子の抑圧上の３Ｌ３突然変異組織の効果の研究するために、羽根のimaginal discs（イマジナルディスク）を実験において用いた。２種の標的遺伝子は、羽根のimaginal discs（イマジナルディスク）において区別される。一方、低いＷｇ濃度でも発現し、それ故にＷｇの根源から数種の細胞直径距離で発現するDistallessのような「長い範囲の標的遺伝子」がある。他方、
発現のためにモルフォゲンの高いレベルを必要とする（Senseless）のような、「短い範囲の標的遺伝子」と称される標的遺伝子がある。
【００６０】
羽根のimaginal disc（イマジナルディスク）において、３Ｌ３の突然変異のクローンの形態を含んだ後、長い範囲の標的遺伝子のためのマーカーとしてのDistalless-lacZの発現及び
短い範囲の標的遺伝子（図３Ａ−Ｆ）のためのマーカーとしてのSenselessの発現が研究された。この実験において、Distalless-acZ及びSenselessの発現の減少が観察されたが、突然変異の組織が、Ｗｇの産生細胞を含んだ。これらの結果により、３Ｌ３が、Ｗｇのモルフォゲンの産生において、十中八九、重要な役割を果たすことが明白である。
【００６１】
Ｗｇ産生における３Ｌ３の重要性を確かめるために、我々は、Ｗｇ産生細胞において、３Ｌ３のみを選択的に発現する昆虫を釈放することを試みた。動物の休息は、３Ｌ３のための相同的な突然変異であった。その結果は、完全な釈放であり、３Ｌ３の機能が、Ｗｇ産生細胞においてのみ必要であるという結論に言及する。
【００６２】
さらに、羽根のimaginal discs（イマジナルディスク）におけるＷｇタンパク質の発現での３Ｌ３突然変異組織の効果が研究された（図４Ａ−Ｅ）。３Ｌ３突然変異クローンにおいて、Ｗｇの発現量に増加があることが観察された。この結果を良好に特徴づけるために、本発明者等は、類似の実験を遂行し、ＷｇのｍＲＮＡの転写のレベルを現すwg-lacZの発現を見た。３Ｌ３突然変異組織におけるwg-lacZの発現の増加が全くないという事実は、突然変異組織におけるＷｇのための、増加するstainingが、Post−転写過程に基づくという推定を正当化する。
【００６３】
最後に、Ｗｇの蓄積が細胞内又は細胞外で生じさせるか、区別するために、本発明者等は細胞外タンパク質の検出を許容する異なったプロトコル（protocol）を用いてＷｇの分配（distribution）を試験した。しかし、３Ｌ３突然変異クローンにおける細胞外Ｗｇの蓄積は、検出されなかった。これらの結果は、その機能のロスが、Ｗｇ産生細胞の内側でのＷｇの蓄積を導くので、Ｗｇの分泌における３Ｌ３のための役割を示唆する。
【００６４】
Ｗｎｔシグナリングにおいて、３Ｌ３のヒト相同染色体が含まれているか否かを試験するために、Ｗｎｔレポーター（reporter）遺伝子assay（検査）（TOP-flash)が行われた。これは、luciferase（ルシフェラーゼ）遺伝子の前に位置して結合している５ＴＣＦを伴うassay（検査）に基礎をおくluciferase（ルシフェラーゼ）である。Ｗｎｔシグナル経路は、luciferase（ルシフェラーゼ）の蛍光によって測定することができる。以前に（preceding）議論した結果から、ショウジョウバエのＷｎｔ産生細胞において３Ｌ３が重要であることが知られていた。
【００６５】
Ｗｎｔの産生及び受容細胞を擬態するために、１バッチのヒト２９３Ｔ細胞が、ｈ３Ｌ３に対向するｍＷｎｔ３Ａ−Ｖ５及びｓｉＲＮＡでトランスフェクト（Transfect）された。別のバッチの細胞は、TOP-flash reporter constructでトランスフェクトされた。トランスフェクトがされた後、２４時間経過した時、これらの２つの細胞のバッチが混合され、さらに２４時間培養した後、luciferase（ルシフェラーゼ）活性が測定された。もし３Ｌ３に対向するｓｉＲＮＡが、「産生」細胞においてＷｎｔ３Ａでコトランスフェクトされたならば、luciferase（ルシフェラーゼ）活性のレベルは、もし空のベクトル（Ｗｎｔ３Ａの代用の）及びＧＦＰに対向するｓｉＲＮＡがトランスフェクトされたならば、同程度に低かった。他方、もしＧＦＰに対向するＷｎｔ３Ａ及びｓｉＲＮＡがトランスフェクトされたならば、レポーター遺伝子の明確な誘起が観察された（図５）。これらの結果は、ヒト（ｈ）３Ｌ３が、シグナルの受容ではなく、産生において含まれたＷｎｔ経路の決定的な成分であることを示している。
【００６６】
３Ｌ３は、Ｗｎｔ産生細胞において重要であるので、ｈ３Ｌ３−ＨＡがマウス（ｍ）のＷｎｔ３Ａ−Ｖ５と相互作用すると、調べられた。Co-immunoprecipitation  試験が行われ、その結果は、ｈ３Ｌ３−ＨＡがｍＷｎｔ３Ａ−Ｖ５と相互作用することを示唆し、ＣＤ２−ＨＡを伴うネガティブコントロールや、他の膜−スパニング（membrane-spanning）タンパク質は、ｍＷｎｔ３Ａ−Ｖ５と相互作用しなかった（図６）。
【００６７】
ショウジョウバエの羽根ディスク（discs）におけるwntless（ＷＬＳ）突然変異細胞のクローンにおいて、Ｗｇ産生細胞におけるＷｇの蓄積が観察された。Ｋｃ細胞において、我々は、培地へのＷｇの分泌物を測定するための検査（assay）を開発した。Renilla luciferase
遺伝子は、ＷｇのＮ末端に融合し、Ｋｃ細胞へトランスフェクトした。同時に、その細胞は、ＷＬＳ又はＧＦＰのｄｓＲＮＡで扱われた。ＷＬＳのＲＮＡｉは、ＧＦＰのＲＮＡｉと比べてＷｇ分泌物の明らかな下降調節を示した（図８）。
【００６８】
この分泌物の欠乏が、ＲＮＡｉによるＷＬＳのヒトの組織培養実験デプレション（depletion）において、Ｗｎｔシグナルカスケードを活性化することができない結果となった理由であったかどうかを決定するために、我々は、Ｗｎｔ分泌細胞の培地を分析した。ＨＥＫ２９３Ｔは、ｓｉＲＮＡのみならず、Ｗｎｔ３Ａ−Ｖ５、Ｗｎｔ１−ＨＡ、又はＷｎｔ５ａ−ＨＡでもコトランスフェクトした。すべてのこれらのＷｎｔ分泌物は、ＷＬＳに対するｓｉＲＮＡがＧＦＰに対するｓｉＲＮＡと比較してコトランスフェクトされたとき、かなり減少した。これらの結果は、ＷＬＳが消耗されたとき、ＨＥＫ２９３細胞において、Ｗｎｔ分泌物が大幅に減少することを示すものである。（図９；２つの異なるｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡｈＷＬＳ−Ａ，ｓｉＲＮＡｈＷＬＳ−Ｂ）が、ＨＥＫ２９３細胞におけるendogenousｈＷＬＳ遺伝子の発現をノックダウンするのに効果的なことのために、ＲＴ−ＰＣＲによって有効にさせた。双方の独立したトランスフェクションは、結果として、ｈＷＬＳの転写の８５％減少をさせた（示されていない；ｓｉＲＮＡｈＷＬＳ−Ｂは、ほとんど用いられた。そして、ｓｉｈＷＬＳとして言及されている。しかし、ｓｉＲＮＡｈＷＬＳ−Ａは、同じ効果を示した。）。ｓｉｈＷＬＳを持つレスポンダー細胞の取り扱い、又はＧＦＰに対するｓｉＲＮＡを持つプロデューサー細胞の取り扱いは、Ｗｎｔシグナリング検査（assay）の結果にさほど影響を与えなかった。
【００６９】
ＷＬＳが下降調節されるとき、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において、ＷＮＴ３ａが細胞外表面に到達することができるか否かを試験するために、我々は、ｓｉＲＮＡ及びＷｎｔ３Ａ−Ｖ５をコトランスフェクトし、Ｗｎｔ３ａの細胞外分裂のみをステイン（stain）した。コントロールとして、我々は、Ｎ末端(細胞外)又はＣ末端(細胞内)の一方にＨＡ−ｔａｇを有するＣＤ２を用いた。我々が用いた細胞外 staining protocolで、我々は、Ｎ末端のＨＡ−ｔａｇで、ＣＤ２のみを欠乏させることができた。ＷＬＳに対するＲＮＡｉは、細胞外表面にＣＤ２の分泌物の影響を与えなかった。対照的に、Ｗｎｔ３ａ−Ｖ５の表面のstainingは、ＷＬＳに対するｓｉＲＮＡでコトランスフェクトされた細胞において破壊された。それ故に、我々は、細胞表面へのＷＮＴ３ａ（及びおそらくは他のＷｎｔも同様に）の好適な分泌のためにＷＬＳが必要であることを結論づける（図１０）。
【００７０】
ショウジョウバエの羽根のディスクにおいて、処分されたクローンは、Ｈｈリガンドの明らかな蓄積を示したが、明確な対比で、ＷＬＳのクローンにおいては、Ｈｈの蓄積は観察することができなかった。さらに、ＷＬＳの突然変異の昆虫は、ｗｇ−Ｇａ１４：：ＵＡＳ−ＷＬＳ構造で釈放された。ｗｇ産生細胞におけるＷＬＳのみの発現は、致死性を救済し、ＷＬＳがＷｇシグナリングのために特異的（specific）であるという我々の見解を支持するのに十分であった。
【００７１】
ヒト組織の培養において、Ｗｎｔの分泌物のみが影響を受けたが、上述のように、ＣＤ２の分泌物は、ＷＬＳ  ＲＮＡｉによって影響を受けなかった。重要なことは、Ｓｈｈの分泌物のみならず、培地へのＴＮＦの分泌物も、ＷＬＳ  ＲＮＡｉによって影響を受けなかった（図１２）。これらの結果は、ＷＬＳのヒトのorthologueが、Ｗｎｔシグナリングのために特異的なものであることを示す。
【００７２】
我々の結果は、また、Ｗｎｔの小さなサブセットがＷＬＳの機能のロスに敏感であるばかりでなく、すべてのＷｎｔがＷＬＳから独立しているわけではないことを示している。Ｃ．エレガンスにおいて、ＭＯＭ−３は、初期のblastomere polarization (Rocheleau, Thorpe)、VPC specification (Eisenmann and Kim)、及びQ neuroblast migration (Harris)のような、多くの異なる標準的及び非標準的なＷｎｔ経路に含まれていることが示されてきた。これらの過程は、３つの異なるＷｎｔ（経路）、ＭＯＭ−２(Rochelau, Thorpe)、ＬＩＮ−４４
(Jiang and Sternberg)及びＥＧＬ２０(Harris)に依存する。
【００７３】
Ｃ．エレガンスにおいては、異なる発育過程においてpostembryonically活性である標準的経路と、胚の発育においてのみ観察することができる非標準的経路との、２つのＷｎｔシグナル経路が区別されることができる。非標準的Ｗｎｔシグナリングは、ＥＭＳの決定のorientation及びendodermの運命を調節する（ＥＭＳ細胞は、将来のendoderm及びmesodermのprecursor 細胞のprecursorである）。非標準的Ｗｎｔシグナリングのロスは、endodermのロスや、mesodermの発育を導く。この非標準的Ｗｎｔシグナリングの数種の成分は、記載されてきた。それらの１つであるｍｏｍ−３（more mesoderm-3）は、geneticallyに特徴づけられてきたが、ｍolecularlyには、so far同定されていない(Eisenmann and Kim 2000; Thorpe, Schlesinger et al. 1997).。配列によると、３Ｌ３（ｃ３Ｌ３）の相同染色体における変異は、異なるｍｏｍ−３のallelesにおいて見出された。さらに、ｃ３Ｌ３に対するＲＮＡｉは、
【００７４】
distal tip細胞移動における欠乏や、胚のlethality.のような標準的及び非標準的なＷｎｔ表現型の典型的なロスを導いた。また、これらの結果は、ｃ３Ｌ３がｍｏｍ−３の表現型のために応答可能であること、及びｃ３Ｌ３に対するＲＮＡｉは、ｍｏｍ−３の表現型のロスを擬態することを示している。
【００７５】
Ｃ．エレガンスにおけるＷｎｔシグナリングは、多くの異なる発育過程において含まれている。知られている最初の過程は、mitotic spindlesのＭＯＭ−２の発育オリエンテーションであり、胚細胞は４個から８個に分割される。ｍｏｍ−３ワームは、wntless orthologue  R06B9.6における突然変異であるので、我々はＲ０６Ｂ９．６のｄｓＲＮＡを、ｗｔhermaphroditesの生殖線に注入した。上述のように、分析されたすべての胚には、Ｒ０６Ｂ９．６のｄｓＲＮＡが注入され、或いはｍｏｍ−２又はｍｏｍ−３の突然変異alleleの運搬は、Abar spindle から ABpr spindleへの平行オリエンテーションを示した。対照的に、Ｗｎｔ胚は、垂直に定位された２つのスピンドル（spindle）を有していた（図１１）。
【００７６】
要約すると、本発明者等は、遺伝子ＣＧ６２１０によってコードされる３Ｌ３と名付けられたリペプチドを見出した。遺伝的手法により、３Ｌ３が、Ｗｇ／Ｗｎｔシグナル経路、特に、Ｗｎｔタンパク質のＷｇ／Ｗｎｔ分泌経路において、役割を果たしていることが確かめられた。さらに、３Ｌ３は、物理的にＷｎｔタンパク質と相互作用することが示された。それ故、３Ｌ３タンパク質は、Ｗｎｔリガンドの分泌物を調節することによって、Ｗｎｔ経路を正又は負に調節する薬剤の開発のために、非常にpromisingな標的である。
【実施例】
【００７７】
（実施例１）
［ｓｅｖ−ｗｇ表現型の受容サプレッサーのためのスクリーン］
目において、Ｗｇを発現するｓｅｖ−ｗｇトランス遺伝子は、スクリーンにおいて、表現型マーカー(Brunner et al., 1997)として観察される、ラフな目の表現型に導く。左の腕でＦＲＴ８０を運び、右の腕で３番目の染色体のｓｅｖ−ｗｇを運ぶ雄は、１２時間の間、２１ｍＭのエチルメタンスルフォネート（ＥＭＳ）で養育された。ＥＭＳを適用させた後、２４時間経過後に、雄は、Ｘ染色体上のeyeless-flp recombinaseである雌と交尾し、３番目の染色体上に、ＦＲＴ８０Ｍｗ+を運搬した。ey-flpと両方のＦＲＴ染色体でoffspringされた雄は、ラフな目の表現型の抑圧のためにスクリーンされた。異なる対立遺伝子間でのComplementation分析は、２つのallelesを構成するグループ３Ｌ３の決定に導いた。
with the ey-flp and both FRT chromosomes were screened for a suppression of the rough eye phenotype. Complementation analysis between different alleles led to the complementation group 3L3 consisting of two alleles.
【００７８】
（実施例２）
［すべてのメタゾンにおける相同染色体］
Blast search (blastp)によって、すべての配列のメタゾン有機体において、知られていない機能１１７１（ＤＵＦ１１７１）のドメインを運搬する、この新しいタンパク質ファミリーの１つのコピーのみが存在した。
【００７９】
（実施例３）
［ドメインspanningする膜］
ＴＭＨＭＭ  ＴＯＰは、１つのＮ末端シグナル配列と、ＣＧ６２１０−ＰＢのための７つの推定の経膜的なドメインを予想した。
【００８０】
（実施例４）
［Germline  クローン］
興味あるタンパク質の完全な不在において、ショウジョウバエの胚の表現型であるメラノガスターの研究に用いられる実験的なprocedureである。
３番目のinstar larvaeをＦＲＴの１つの染色体上に運搬し、推定の変異を同じＦＲＴの相同染色体上及びovoD 変異に運搬する雌は、１．５時間、３８℃で熱ショックを受けた。ハッチングの後、雄が同じ推定の変異及びＦＲＴを運搬し、交尾した。
【００８１】
雌は、寒天プレート上で、１夜、産卵し、胚が集積された。これを３分間、ブリーチし、タップ（tap）水で洗浄した。胚は、２４時間、水に注入された。vitellumを遊離させるために、メタノールとヘプタンを等量ずつ含むbiphasic溶液で浸とうした。胚は、メタノールで４回洗浄され、０．１％のトリトンＸ−１００で４回洗浄された。ＲＴで６時間培養した後、最後に胚をHoyer-lactateでスライド上に集積し、６０℃でダイジェストタンパク質に１２−２４ＪＩＫＡＮＮ培養した。表皮は光学顕微鏡で試験された。
【００８２】
（実施例５）
［標的遺伝子の発現に、３Ｌ３突然変異組織の効果を研究するための、羽根イマジナルディスク］
イマジナルディスクは、metamorphosisの間、成虫の構造を作る細胞のhollow sacsである。
これらは、胚ectodermにおけるポケットとして上昇し、幼虫がさなぎになるまで体コウの内側に成長し、そのポイントで体壁と付属物を形成するために、「"evaginate"」を内側に戻す。
【００８３】
［イマジナルディスクの抗体staining］
幼虫は、氷の上で、リンガー（Ringer）溶液中でdissectedされ、ＰＥＭ 200μlで200μl管に固定された。５％のホルムアルデヒド 10.7μlと、０．０５％のトリトンＸ−１００とを２０分間攪拌した。４回洗浄し、１時間追加し、２−３回、ＰＥＪＴとＮａ−Ａｚｉｄを加えて培養した。一次抗体（ＰＢＴとＮａ−Ａｚｉｄでdilutedしたもの）で一昼夜、４℃でインキュベートした。Larvaeは、ＰＢＴ、Ｎａ−Ａｚｉｄ、１％のＨＩＮＧＳで３０分、５回洗浄し、ＲＴに、ＰＢＴとＮａ−Ａｚｉｄでdilutedした二次抗体で、２時間インキュベートした。Larvaeは、２時間で５回ＰＢＴとＮａ−Ａｚｉｄで洗浄し、ディスクはＰＰＤＡに集積された。羽根のディスクにおけるStainingは、焦点顕微鏡で分析された。
【００８４】
（実施例６）
［羽根のイマジナルディスクにおける３Ｌ３突然変異クローンのフォーメーションの誘起、及びDistalless-lacZ (wg-lacZ)の発現の研究］
羽根のイマジナルディスクにおける突然変異クローンは、興味あるタンパク質のための変異である細胞のグループをrepresentする。ショウジョウバエのメラノガスター（melanogaster）において、熱ショックプロモーター(hs- flp)によって操作される、yeast-specific recombinase flippase (flp)を用いて、mitotic recombinationによって遂行される。
【００８５】
y w hsp-flp; allele 20.53 FRT80 / TM6b fliesは、y w hsp-flp; πMyc [w+] Minute Pfy+J FRT80 / TM6b,によって交尾され、雌は、２日間、産卵する。
３７．０℃で６０分間の熱ショックで、２４−７２時間、ＡＥＦが形成され、さらに４時間後に、幼虫が切開された。
【００８６】
Distalless-lacZの場合においては、一次抗体にβ−ガラクトシダーゼ（１：2000ラビット、ポリクローナル抗体、Cappel（登録商標））を用いた。
wg-lacZの場合においては、抗体に、α−Ｗｇ（４Ｄ４）（１：1000マウス、モノクローナル抗体、ＤＳＨＢ）を用いた。
【００８７】
（実施例７）
［Ｗｇ産生細胞において３Ｌ３のみを発現する羽根をrescueするのを試みる手段としての、Ｗｇ生産物における３Ｌ３の重要性の確立］
トランス遺伝子wg-GAL4 (the transcriptional activator GAL4 は、Ｗｇを発現する細胞内でのみ発現される。) で運搬される３Ｌ３heterozygous mutant fliesは、３Ｌ３heterozygous mutantであるfliesで交尾され、トランス遺伝子ＵＡＳ−３Ｌ３（ＧＡＬ４タンパク質のためのＵＡＳ結合サイトは、３Ｌ３の転写を活性化する。）
【００８８】
（実施例８）
［Ｗｇ分割の試験］
このプロトコル（protocol）は、一次抗体でのstainingが、ＰＢＳ中で４℃（endocytosisをブロックするために）で３０−６０分間行われ、固定が、一次抗体でのstaining後、ＰＢＳ、４％のホルムアルデヒドで、４℃で２０−３０分間(Strigini and Cohen, 2000)行われるという事実において、通常のprotocolとは異なる細胞外Ｗｇを見るために用いた。
【００８９】
（実施例９）
［ＴＯＰフラッシュアッセイ］
細胞は、リン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。トランスフェクト後、１６時間細胞を洗浄し、２４時間混合した。混合後、細胞はPromega からIxPLB でlysed し、分析した。
【００９０】
（実施例１０）
［Co-immunoprecipitation］
細胞は、リン酸カルシウム法によってトランスフェクトした。トランスフェクト後、３６時間、細胞はＲＩＰＡバッファーによって、４０℃で１時間３０分間、lysedした。Lysateは、４℃で３０分間、centrifugedされ、その後、タンパク質ＧSepharoseビーズ及びラビットα−ＨＡで一昼夜インキュベートした。ビーズは、ＴＢＳで４回洗浄し、タンパク質は、９５℃で１０分間、ビーズからＳＤＳ−Loadingバッファーでelutedした。マウスα−Ｖ５抗体でウエスタンブロットを行った。
【００９１】
（コンストラクト）
ｍＷｎｔ３Ａ  ｃＤＮＡ配列は、Ｖ５−ｔａｇ及びＨｉｓ−ｔａｇによってｐｃＤＮＡ３にクローンされた。ｈ３ＬＡ  ｃＤＮＡは、ＨＡ−ｔａｇによってｐｃＤＮＡ３にクローンされた。QiagenＣＤ２によって一般化された３Ｌ３及びＧＦＰに対するｓｉＲＮＡは、Ｃ末端ＨＡ−ｔａｇでｐｃＤＮＡ３にクローンされた。
【００９２】
（参考文献）
Baker, N. E. (1988). 'Transcription of the segment-polarity gene wingless in the imaginal discs of Drosophila, and the phenotype of a pupal-lethal wg mutation." Development 102(3): 489-97.
Cabrera, C. V., M. C. Alonso, et al. (1987). "Phenocopies induced with antisense RNA identify the wingless gene." Cell 50(4): 659-63.
Eisenmann, D. M., Kim, S. K. (2000). "Protruding vulva mutants identify novel loci and Wnt signaling factors that function during Caenorhabditis elegans vulva development." Genetics 156(3): 1097-116.
Grosschedl R, E. Q. (1999). "Regulation of LEF-ITCF transcription factors by Wnt and other signals." Current Opinion in Cell Biology 11: 233-240.
Harris, J., Honigberg, L., Robinson, N., and Kenyon, C. (1996). Neuronal cell migration in C. elegans: regulation of Hox gene expression and cell position. Development 122, 3117-3131.
Hartmann, C. and Tabin, C. J. (2000). ,,Dual roles of Wnt signaling during chondrogenesis in the chicken limb." Development, 127(14), 3141-3159.
Heberlein, U., E. R. Borod, et al. (1998). "Dorsoventral patterning in the Drosophila retina by wingless." Development 125(4): 567-77.
Holmen, S. L. et al. (2005), ,,Essential role of beta-catenin in postnatal bone acqusition." The Journal of Biological Chemistry, 280 (22), 21162-21168.
Jiang, L. I., and Sternberg, P. W. (1999). Socket cells mediate spicule morphogenesis in Caenorhabditis elegans males. Dev Biol 211, 88-99.
Morin, P. J. (1999). "β-catenin signaling and cancer." Bioessays 21(12): 1021-30.
Nakamura, Y., Nawata, M., Wakitani, S. (2005). "Expression profiles and functional analyses of Wnt-related genes in human joint disorders". American Journal of Pathology, 167(1), 97- 105.
Nusse, R. and H. E. Varmus (1982). "Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus contain a provirus integrated in the same region of the host genome." Cell 31(1): 99- 109.
Perrimon, N. and A. P. Mahowald (1987). "Multiple functions of segment polarity genes in Drosophila." Dev Biol 119(2): 587-600.
Peifer, M. and P. Polakis (2000). "Wnt signaling in oncogenesis and embryogenesis--a look outside the nucleus." Science 287(5458): 1606-9.
Polakis, P., M. Hart, et al. (1999). "Defects in the regulation of β-catenin in colorectal cancer." Adv Exp Med Biol 470: 23-32.
Potter, J. D. (1999). "Colorectal cancer: molecules and populations." Journal of the National Cancer Institute 91(11): 916-32.
Rijsewijk, F., M. Schuermann, et al. (1987). 'The Drosophila homolog of the mouse mammary oncogene int-1 is identical to the segment polarity gene wingless." Cell 50(4): 649-57.
Rocheleau, C. E., Downs, W. D., Lin, R., Wittmann, C, Bei, Y., Cha, Y. H., AIi, M., Priess, J. R., and MeIIo, C. C. (1997). Wnt signaling and an APC-related gene specify endoderm in early C. elegans embryos. Cell 90, 707-716.
Roose, J. and H. Clevers (1999). 1TCF transcription factors: molecular switches in carcinogenesis." Biochimica et Biophysica Acta 1424 (2-3): M23-37.
Sen, M., Lauterbach, K., El-Gabalawy, H., Firestein, G. S., Corr, M. Carson, D. A. (2000). ,,Expression and function of wingless and frizzled homologs in rheumatoid arthritis." PNAS, 97 (6), 2791-2796. 
Sharma, R. P. and V. L. Chopra (1976). "Effect of the Wingless (wgl) mutation on wing and haltere development in Drosophila melanogaster." Dev Biol 48(2): 461-5.
Strigini, M., and. Cohen, S.. M. (2000). Wingless gradient formation in the Drosophila wing. Curr. Biol. 10, 293-300.
Struhl, G. and K. Basler (1993). "Organizing activity of wingless protein in Drosophila." Cell 72(4): 527-40.
Tatusova TA, M. T. (1999). "Blast 2 sequences-a new tool for comparing protein and nucleotide sequences." FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250.
Thorpe, CJ. , Schlesinger, A., et al (1997). "Wnt signaling polarizes an early C. elegans blastomere to distinguish endoderm from mesoderm." Cell;90(4): 695-705.
Thorpe, C. 1, Schlesinger, A., and Bowerman, B. (2000). Wnt signalling in Caenorhabditis elegans: regulating repressors and polarizing the cytoskeleton. Trends Cell Biol 10, 10-17.
Waltzer, L. and M. Bienz (1999). 'The control of β-catenin and TCF during embryonic development and cancer." Cancer & Metastasis Reviews 18(2): 231-46.
Wodarz, A. and R. Nusse (1998). "Mechanisms of Wnt signaling in development." Annual Review of Cell & Developmental Biology 14: 59-88.
【図１ａ】
2008537484.tif 000003
【図１ｂ】
2008537484.tif 000004
【図１ｃ】
2008537484.tif 000005
【図２】
2008537484.tif 000006
【図３】
2008537484.tif 000007
【図４】
2008537484.tif 000008
【図５】
2008537484.tif 000009
【図６】
2008537484.tif 000010
【図７】
2008537484.tif 000011
【図８】
2008537484.tif 000012
【図９Ａ−Ｂ】
2008537484.tif 000013
【図９Ｃ】
2008537484.tif 000014
【図１０】
2008537484.tif 000015
【図１１】
2008537484.tif 000016
【図１２】
2008537484.tif 000017
【配列表】
2008537484000001.app
【国際調査報告】
2008537484.tif 000018
2008537484.tif 000019
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