(57)【要約】受容体ＧＦＲα３に結合し、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する抗体および抗体フラグメントを開示する。また、細胞においてＲｅｔのリン酸化を阻害するため、および被験体において疾患を治療するために前記抗体および抗体フラグメントを使用する方法も開示する。本発明は、少なくとも一部には、ＧＦＲα３に結合して、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する抗体フラグメントの同定と特性決定に基づく。１つの態様では、本発明は、ＧＦＲα３に選択的に結合し、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを対象とする。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＦＲα３に選択的に結合して、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
ＧＦＲα３に選択的に結合して、抗体ＭＯＲ０２６８３の結合をクロスブロックする、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
抗体ＭＯＲ０２６８３と同じエピトープ上のＧＦＲα３に選択的に結合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
ＧＦＲα３に選択的に結合し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＨドメインを含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記ＶＨドメインが配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記ＶＨドメインが配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記ＶＨドメインが配列番号１のアミノ酸配列と同一である、請求項４に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
ＧＦＲα３に選択的に結合し、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＬドメインを含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記ＶＬドメインが配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記ＶＬドメインが配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記ＶＬドメインが配列番号２のアミノ酸配列と同一である、請求項８に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
ＧＦＲα３に選択的に結合し、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＨドメイン、および（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＬドメインを含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
（ｉ）前記ＶＨドメインが配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、かつ（ｉｉ）前記ＶＬドメインが配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
（ｉ）前記ＶＨドメインが配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、かつ（ｉｉ）前記ＶＬドメインが配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
（ｉ）前記ＶＨドメインが配列番号１のアミノ酸配列と同一であり、かつ（ｉｉ）前記ＶＬドメインが配列番号２のアミノ酸配列と同一である、請求項１２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
ＧＦＲα３に選択的に結合し、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨドメインを含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
前記ＶＨドメインが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第一重鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第二重鎖ＣＤＲ、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第三重鎖ＣＤＲを含む、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記ＶＨドメインが、配列番号３、配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
ＧＦＲα３に選択的に結合し、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
前記ＶＬドメインが、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第一軽鎖ＣＤＲ、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第二軽鎖ＣＤＲ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第三軽鎖ＣＤＲを含む、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
前記ＶＬドメインが、配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２２】
ＧＦＲα３に選択的に結合し、（ｉ）配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメイン、および（ｉｉ）配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２３】
（ｉ）前記ＶＨドメインが、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第一重鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第二重鎖ＣＤＲ、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第三重鎖ＣＤＲを含み、かつ（ｉｉ）前記ＶＬドメインが、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第一軽鎖ＣＤＲ、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第二軽鎖ＣＤＲ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第三軽鎖ＣＤＲを含む、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２４】
（ｉ）前記ＶＨドメインが配列番号３、配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列を含み、かつ（ｉｉ）前記ＶＬドメインが配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列を含む、請求項２２に記載の抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２５】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項１−２４のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２６】
前記抗体が完全ヒト抗体である、請求項１−２４のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２７】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項１−２４のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２８】
前記抗体が単鎖抗体である、請求項１−２４のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２９】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ＦｓｃフラグメントまたはＦｖフラグメントである、請求項１−２４のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３０】
請求項１−２９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する単離細胞。
【請求項３１】
前記細胞が、哺乳動物Ｂ細胞と骨髄腫細胞を融合することによって得られる融合細胞である、請求項３０に記載の細胞。
【請求項３２】
請求項１−２９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと、医薬的に許容される担体とを含有する、医薬組成物。
【請求項３３】
細胞におけるニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する方法であって、ＧＦＲα３を発現する細胞を、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害するために有効な量の請求項１−２９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む、方法。
【請求項３４】
細胞におけるＲｅｔリン酸化を阻害する方法であって、ＧＦＲα３を発現する細胞を、Ｒｅｔのリン酸化を阻害するために有効な量の請求項１−２９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む、方法。
【請求項３５】
被験体において癌を治療する方法であって、有効量の請求項１−２９のいずれかに記載の抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物を、その必要のある被験体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、受容体ＧＦＲα３に結合する抗体および抗体フラグメントに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
Ｒｅｔは、神経内分泌細胞およびある種の神経内分泌腫瘍において発現される膜貫通受容体チロシンキナーゼである。活性化Ｒｅｔ突然変異は、遺伝性癌症候群の多発性内分泌腫瘍２型においておよび関連する散在性腫瘍、甲状腺髄様癌および褐色細胞腫（どちらも神経内分泌組織に由来する）のサブセットで起こる。
【０００３】
Ｒｅｔは、神経栄養因子である、グリア細胞由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、ニューブラスチン（アルテミンおよびエノビンとしても知られる）およびペルセフィンについての受容体である。リガンド特性は、神経栄養因子が特定のＧＤＮＦファミリー受容体α（ＧＦＲα３）に結合することによって付与される。ＧＦＲα１−ＧＦＲα４補助受容体は、好ましい神経栄養因子に結合したときＲｅｔを活性する、グリコシル−ホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカー型タンパク質である。ＧＤＮＦはＧＦＲα１に選択的に結合し、ニュールツリンはＧＦＲα２に選択的に結合し、ニューブラスチンはＧＦＲα３（ＲｅｔＬ３としても知られる）に選択的に結合し、ペルセフィンはＧＦＲα４に選択的に結合する。
【０００４】
ひとたび活性化されると、Ｒｅｔは、生物学的応答を媒介する様々なシグナル伝達分子を動員する。Ｒｅｔは、ＲＡＳ／細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）、ホスファチジルイノシトール３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）／ＡＫＴ、ｐ３８マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、およびｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）経路などの、様々なシグナル伝達経路を活性化することができる。これらのシグナル伝達経路は、アダプタータンパク質が、それ自体のキナーゼ活性によってリン酸化されるＲｅｔの細胞内チロシン残基に結合することを通して活性化される。
【０００５】
ＧＦＲα３およびＲｅｔへのニューブラスチンの結合は、主として侵害受容感覚ニューロンに局在する（非特許文献１）、三元シグナル伝達複合体を形成する（非特許文献２；非特許文献３）。ニューブラスチンは、ドーパミン作用性ニューロンなどの末梢および中枢神経系のニューロンの生存を促進する（非特許文献２；非特許文献４）。それ故、ニューブラスチン、ＧＦＲα３およびＲｅｔは神経障害の治療、より詳細には神経因性疼痛の治療において適切である。
【非特許文献１】Ｏｒｏｚｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１３（１１）：２１７７
【非特許文献２】Ｂａｕｄｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１２７：４３３５
【非特許文献３】Ｂａｌｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｎｅｕｒｏｎ，２１：１２９１
【非特許文献４】Ｒｏｓｅｎｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５（２）：１９９
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本発明は、少なくとも一部には、ＧＦＲα３に結合して、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する抗体フラグメントの同定と特性決定に基づく。
【０００７】
１つの態様では、本発明は、ＧＦＲα３に選択的に結合し、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する単離抗体またはその抗原結合フラグメントを対象とする。
【０００８】
「単離」という用語は、その天然環境から実質的に切り離されている分子を指す。たとえば単離抗体は、それが由来する細胞または組織ソースからの細胞物質を実質的に含まない。この用語はまた、単離抗体が医薬組成物のために十分に純粋である、または少なくとも７０−８０％（ｗ／ｗ）純粋である、少なくとも８０−９０％（ｗ／ｗ）純粋である、  少なくとも９０−９５％（ｗ／ｗ）純粋である、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％（ｗ／ｗ）純粋である製剤を指す。
【０００９】
「抗体またはその抗原結合フラグメント」という用語は、少なくとも１つの免疫グロブリン可変領域、たとえば免疫グロブリン可変ドメインを与えるアミノ酸配列または免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むタンパク質を包含する。たとえばこの用語は、重（Ｈ）鎖可変領域（ここではＶＨと略する）および軽（Ｌ）鎖可変領域（ここではＶＬと略する）を有する抗原結合タンパク質を含む。もう１つの例では、この用語は、２つの重（Ｈ）鎖可変領域と２つの軽（Ｌ）鎖可変領域を含む抗原結合タンパク質を含む。この用語は、抗体の抗原結合フラグメント（たとえば単鎖抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｄフラグメント、ＦｖフラグメントおよびｄＡｂフラグメント）ならびに完全抗体、たとえばＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、ＩｇＭ型（ならびにそれらのサブタイプ）の無傷免疫グロブリンを包含する。免疫グロブリンの軽鎖はκまたはλ型であり得る。一部の実施形態では、抗体はグリコシル化されている。抗体は、抗体依存性細胞傷害および／または補体媒介性細胞傷害に関して機能性であり得るか、またはこれらの活性の一方または両方に関して非機能性でもよい。ＶＨおよびＶＬ領域は、「フレームワーク領域」（ＦＲ）と称される、より保存された領域が間に組み入れられた「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）と称される超可変性の領域にさらに細分することができる。ＦＲおよびＣＤＲの範囲は正確に定義されている（たとえばＫａｂａｔ，Ｅ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２；およびＣｈｏｔｈｉａ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７）。Ｋａｂａｔの定義をここで使用する。各々のＶＨおよびＶＬは、典型的には以下の順序でアミノ末端からカルボキシル末端に配置された３つのＣＤＲと４つのＦＲから成る：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。
【００１０】
「選択的に結合する」という用語は、生理的条件下で比較的安定な複合体を形成する２個の分子を指す。選択的結合は、通常は低い親和性と中から高結合容量を有する非特異的結合と区別される、高い親和性と低から中の結合容量によって特徴づけられる。典型的には、抗体が１０−６Ｍ未満のＫｄで結合するとき、結合は選択的とみなされる。必要な場合には、結合条件を変化させることによって選択的結合に実質に影響を及ぼすことなく非特異的結合を低減することができる。
【００１１】
また、ＧＦＲα３に選択的に結合し、抗体ＭＯＲ０２６８３の結合をクロスブロックする単離抗体またはその抗原結合フラグメントも開示される。
【００１２】
また、抗体ＭＯＲ０２６８３と同じエピトープ上のＧＦＲα３に選択的に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントも開示される。
【００１３】
また、ＧＦＲα３に選択的に結合し、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＨドメインを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントも開示される。一部の実施形態では、ＶＨドメインは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、ＶＨドメインは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、ＶＨドメインは配列番号１のアミノ酸配列と同一である。
【００１４】
また、ＧＦＲα３に選択的に結合し、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＬドメインを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントも開示される。一部の実施形態では、ＶＬドメインは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、ＶＬドメインは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、ＶＬドメインは配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
【００１５】
また、ＧＦＲα３に選択的に結合し、（ｉ）配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＨドメイン、および（ｉｉ）配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるＶＬドメインを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントも開示される。一部の実施形態では、（ｉ）ＶＨドメインは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であり、および（ｉｉ）Ｌドメインは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である。一部の実施形態では、（ｉ）ＶＨドメインは配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であり、および（ｉｉ）ＶＬドメインは配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である。一部の実施形態では、（ｉ）ＶＨドメインは配列番号１のアミノ酸配列と同一であり、および（ｉｉ）ＶＬドメインは配列番号２のアミノ酸配列と同一である。
【００１６】
また、ＧＦＲα３に選択的に結合し、配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨドメインを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントも開示される。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第一重鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第二重鎖ＣＤＲ、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第三重鎖ＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＨドメインは、配列番号３、配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
また、ＧＦＲα３に選択的に結合し、配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントも開示される。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第一軽鎖ＣＤＲ、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第二軽鎖ＣＤＲ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第三軽鎖ＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＬドメインは、配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
また、ＧＦＲα３に選択的に結合し、（ｉ）配列番号３、配列番号４または配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である重鎖ＣＤＲを含むＶＨドメイン、および（ｉｉ）配列番号６、配列番号７または配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である軽鎖ＣＤＲを含むＶＬドメインを含む単離抗体またはその抗原結合フラグメントも開示される。一部の実施形態では、（ｉ）ＶＨドメインは、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第一重鎖ＣＤＲ、配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第二重鎖ＣＤＲ、および配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第三重鎖ＣＤＲを含み、および（ｉｉ）ＶＬドメインは、配列番号６のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第一軽鎖ＣＤＲ、配列番号７のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第二軽鎖ＣＤＲ、および配列番号８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一である第三軽鎖ＣＤＲを含む。一部の実施形態では、（ｉ）ＶＨドメインは配列番号３、配列番号４および配列番号５のアミノ酸配列を含み、および（ｉｉ）ＶＬドメインは配列番号６、配列番号７および配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
一部の実施形態では、ここで述べる単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化抗体である。
【００２０】
一部の実施形態では、ここで述べる単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、完全ヒト抗体である。
【００２１】
一部の実施形態では、ここで述べる単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、モノクローナル抗体である。
【００２２】
一部の実施形態では、ここで述べる単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、単鎖抗体である。
【００２３】
一部の実施形態では、ここで述べる単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、ＦｓｃフラグメントまたはＦｖフラグメントである。
【００２４】
また、ここで述べる抗体またはその抗原結合フラグメントを産生する単離細胞も開示される。細胞は、たとえば哺乳動物Ｂ細胞と骨髄腫細胞を融合することによって得られる融合細胞であり得る。
【００２５】
また、（ｉ）ここで述べる抗体またはその抗原結合フラグメント、および（ｉｉ）医薬的に許容される担体を含有する医薬組成物も開示される。
【００２６】
また、ＧＦＲα３を発現する細胞を、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害するために有効な量のここで述べる抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む、細胞におけるニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する方法も開示される。
【００２７】
また、ＧＦＲα３を発現する細胞を、Ｒｅｔのリン酸化を阻害するために有効な量のここで述べる抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させることを含む、細胞におけるＲｅｔリン酸化を阻害する方法も開示される。
【００２８】
また、有効量のここで述べる抗体またはその抗原結合フラグメントを含有する医薬組成物をその必要のある被験体（たとえばヒト）に投与することを含む、被験体において癌を治療する方法も開示される。
【００２９】
ここで使用する、「治療する」および「治療」という用語は、病的状態を特徴づける症状またはパラメータを改良するまたは改善するため、病的状態を特徴づける症状またはパラメータの重症度を低減するため、病的状態の進行を予防する、緩慢化するまたは逆転させるため、あるいは病的状態の１またはそれ以上の症状またはパラメータを予防するために有効な量、方法および／または方式で治療薬を投与することを指す。
【００３０】
また、ＧＦＲα３およびＲｅｔを発現する細胞を提供すること；細胞をニューブラスチンと接触させること；ニューブラスチンの存在下で細胞をインキュベートすること；細胞をここで述べる抗体またはその抗原結合フラグメントと接触させること；細胞を前記抗体またはその抗原結合フラグメントの存在下でインキュベートすること；細胞に結合した抗体またはその抗原結合フラグメントの量を測定すること；および細胞上のＧＦＲα３およびＲｅｔに対するニューブラスチンの結合親和性を、測定された抗体またはその抗原結合フラグメントの結合の量の係数として決定すること、を含む、ニューブラスチンの結合親和性を決定する方法も開示される。
【００３１】
異なる定義がない限り、ここで使用するすべての技術的および学術的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。ここで述べるのと類似または等価の方法および材料が本発明の実施または試験において使用できるが、例示的な方法および材料を以下で説明する。ここで言及するすべての公表文献、特許出願、特許および他の参考文献はそれらの全体が参照によりここに組み込まれる。係争の場合には、定義を含む本出願に準拠する。材料、方法および実施例は例示であり、限定を意図しない。
【００３２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から明白である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３３】
詳細な説明
本発明は、ＧＦＲα３に結合し、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する抗体およびその抗体フラグメントを提供する。
【００３４】
抗体の作製
ＧＦＲα３に結合する抗体または抗体フラグメントは、たとえば動物を使用する、免疫によって、またはファージディスプレイなどのインビトロ法によって作製することができる。ＧＦＲα３の全部または一部を含むポリペプチドが、抗体または抗体フラグメントを作製するために使用できる。ヒト（配列番号９；ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号Ｏ６０６０９）、ラット（配列番号１０；ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号ＮＰ＿４４５８５０）およびマウス（配列番号１１；ＧｅｎＢａｎｋ（商標）アクセッション番号Ｏ３５１１８）ＧＦＲα３のアミノ酸配列のアラインメントを図１に示す（＊は、３つの種すべての間で保存されているアミノ酸残基を指示する）。配列番号９のアミノ酸１−３１は、ヒトＧＦＲα３の予測シグナル配列に対応する。一部の実施形態では、成熟ＧＦＲα３ポリペプチドの一部（たとえばＧＰＩ結合配列を欠く細胞外領域）を、ＧＦＲα３に対する反応性に関してスクリーニングできる抗体を作製するための免疫原として使用することができる。一部の実施形態では、ＧＦＲα３の全部または一部を発現する細胞を、抗体を作製するための免疫原として使用することができる。
【００３５】
一部の実施形態では、免疫された動物は、天然、ヒトまたは部分的ヒト免疫グロブリン遺伝子座を有する免疫グロブリン産生細胞を含む。一部の実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。たとえばマウス抗体産生を欠損し、ヒトＩｇ遺伝子座の大きなフラグメントを含むマウス系統を工作することが可能である。ハイブリドーマテクノロジーを使用して、所望特異性を備えた遺伝子に由来する抗原特異的モノクローナル抗体を生産し、選択することができる。たとえばＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）、米国特許出願第２００３−００７０１８５号、米国特許第５，７８９，６５０号および国際公開番号第ＷＯ９６／３４０９６号参照。
【００３６】
ＧＦＲα３に対する非ヒト抗体はまた、たとえばげっ歯動物において生産することができる。非ヒト抗体は、たとえば米国特許第６，６０２，５０３号、欧州特許第ＥＰ  ２３９  ４００号、米国特許第５，６９３，７６１号および米国特許第６，４０７，２１３号に述べられているように、ヒト化することができる。
【００３７】
欧州特許第ＥＰ  ２３９  ４００号（Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）は、ある種についてのＣＤＲを別の種からのＣＤＲで置換することによって（所与の可変領域内で）抗体を変化させることを述べている。ＣＤＲ置換抗体はかなり少ない非ヒト成分を含むので、真性キメラ抗体と比較するとヒトにおいて免疫応答を惹起する可能性がより低いと考えることができる。Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２，３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９，１５３４−１５３６参照。典型的には、マウス抗体のＣＤＲを、所望置換抗体をコードする配列を生産するために組換え核酸テクノロジーを使用することにより、ヒト抗体内の対応する領域に置換する。所望アイソタイプのヒト定常領域遺伝子セグメント（たとえばＣＨについてのγＩおよびＣＬについてのκ）を付加することができ、可溶性ヒト化抗体を生産するためにヒト化重および軽鎖遺伝子を哺乳動物細胞において共発現することができる。
【００３８】
国際公開番号第ＷＯ９０／０７８６１号は、もとのマウス抗体のＶ領域フレームワークとの最適のタンパク質配列相同性に関するコンピュータ解析によってヒトＶフレームワーク領域を選択すること、およびマウスＣＤＲと相互作用する可能性が高いフレームワークアミノ酸残基を視覚化するためにマウスＶ領域の三次構造をモデリングすることを含む工程を述べている。これらのマウスアミノ酸残基を、次に、相同なヒトフレームワークの上に重ねる。米国特許第５，６９３，７６２号；同第５，６９３，７６１号；同第５，５８５，０８９号；および同第５，５３０，１０１号も参照のこと。Ｔｅｍｐｅｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，２６６−２７１は、標準として、マウス残基の急進的な導入を伴わずに、ＣＤＲ移植のためにそれぞれＮＥＷＭおよびＲＥＩ重および軽鎖に由来するＶ領域フレームワークを使用している。ＮＥＷＭおよびＲＥＩに基づくヒト化抗体を構築するためにＴｅｍｐｅｓｔらのアプローチを使用することの利点は、ＮＥＷＭおよびＲＥＩ可変領域の三次元構造がｘ線結晶解析から公知であり、それゆえＣＤＲとＶ領域フレームワーク残基の間の特異的相互作用をモデリングできることである。
非ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列、たとえばコンセンサスヒトアミノ酸残基を、特定位置に、たとえば以下の位置の１またはそれ以上（好ましくは少なくとも５、１０、１２または全部）に挿入する置換を含むように修飾することができる：（軽鎖の可変ドメインのフレームワーク内の）４Ｌ、３５Ｌ、３６Ｌ、３８Ｌ、４３Ｌ、４４Ｌ、５８Ｌ、４６Ｌ、６２Ｌ、６３Ｌ、６４Ｌ、６５Ｌ、６６Ｌ、６７Ｌ、６８Ｌ、６９Ｌ、７０Ｌ、７１Ｌ、７３Ｌ、８５Ｌ、８７Ｌ、９８Ｌ、および／または（重鎖の可変ドメインのフレームワーク内の）２Ｈ、４Ｈ、２４Ｈ、３６Ｈ、３７Ｈ、３９Ｈ、４３Ｈ、４５Ｈ、４９Ｈ、５８Ｈ、６０Ｈ、６７Ｈ、６８Ｈ、６９Ｈ、７０Ｈ、７３Ｈ、７４Ｈ、７５Ｈ、７８Ｈ、９１Ｈ、９２Ｈ、９３Ｈおよび／または１０３Ｈ（Ｋａｂａｔナンバリングに従って）。たとえば米国特許第６，４０７，２１３号参照。
【００３９】
ＧＦＲα３に結合する完全ヒトモノクローナル抗体は、たとえば、Ｂｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４７，８６−９５によって述べられているように、インビトロでプライミングしたヒト脾細胞を用いて生産できる。それらは、Ｐｅｒｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：２４３２−２４３６またはＨｕａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌａｒ，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４１，２２７−２３６；また、米国特許第５，７９８，２３０号によって述べられているようにレパートリークローニングによって作製し得る。大きな非免疫ヒトファージディスプレイライブラリーも、標準ファージテクノロジー（たとえばＶａｕｇｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，  （１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ４：１−２０；およびＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  ２：３７１−８；米国特許出願第２００３−０２３２３３３号参照）を用いてヒト治療薬として開発できる高親和性抗体を単離するために使用し得る。
【００４０】
ここで使用する、「免疫グロブリン可変ドメイン配列」は、免疫グロブリン可変ドメインの構造を形成することができるアミノ酸配列を指す。たとえば配列は、天然に生じる可変ドメインのアミノ酸配列の全部または部分を含み得る。たとえば配列は、１、２またはそれ以上のＮまたはＣ末端アミノ酸、内部アミノ酸を欠如していてもよく、１またはそれ以上の挿入または付加末端アミノ酸を含んでもよく、または他の変化を含んでもよい。１つの実施形態では、免疫グロブリン可変ドメイン配列を含むポリペプチドは、標的結合構造（または「抗原結合部位」）、たとえばＧＦＲα３と相互作用する構造を形成するためにもう１つ別の免疫グロブリン可変ドメイン配列と結合することができる。
【００４１】
抗体のＶＨまたはＶＬ鎖は、それによってそれぞれ重または軽鎖免疫グロブリン鎖を形成する、重または軽鎖定常領域の全部または部分をさらに含むことができる。１つの実施形態では、抗体は、２本の重免疫グロブリン鎖と２本の軽免疫グロブリン鎖の四量体である。重および軽免疫グロブリン鎖はジスルフィド結合によって連結され得る。重鎖定常領域は、典型的には３つの定常ドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。軽鎖定常領域は、典型的にはＣＬドメインを含む。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の様々な細胞（たとえばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への抗体の結合を媒介する。
【００４２】
抗体の１またはそれ以上の領域は、ヒト、事実上ヒト、またはヒト化であり得る。たとえば可変領域の１またはそれ以上がヒトまたは事実上ヒトであり得る。たとえばＣＤＲ、たとえば重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ  ＣＤＲ２、ＨＣ  ＣＤＲ３、軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ  ＣＤＲ２およびＬＣ  ＣＤＲ３の１またはそれ以上がヒトであり得る。軽鎖ＣＤＲの各々がヒトであり得る。ＨＣ  ＣＤＲ３がヒトであり得る。フレームワーク領域（ＦＲ）、たとえばＨＣまたはＬＣのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の１またはそれ以上がヒトであり得る。一部の実施形態では、フレームワーク領域全部が、たとえばヒト体細胞、たとえば免疫グロブリンを産生する造血細胞または非造血細胞に由来する、ヒトである。１つの実施形態では、ヒト配列は、たとえば生殖細胞系核酸によってコードされる、生殖細胞系配列である。定常領域の１またはそれ以上は、ヒト、事実上ヒト、またはヒト化であり得る。もう１つの実施形態では、フレームワーク領域（たとえば集合的にＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３、または集合的にＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４）の少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５または９８％、または抗体全体がヒト、事実上ヒト、またはヒト化であり得る。たとえばＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３が集合的に、ヒト生殖細胞系セグメントによってコードされるヒト配列と少なくとも７０、７５、８０、８５、９０、９２、９５、９８または９９％同一であり得る。
【００４３】
「事実上ヒト」の免疫グロブリン可変領域は、免疫グロブリン可変領域が正常ヒトにおいて免疫原性応答を惹起しないように十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含む免疫グロブリン可変領域である。「事実上ヒト」の抗体は、抗体が正常ヒトにおいて免疫原性応答を惹起しないように十分な数のヒトアミノ酸位置を含む抗体である。
【００４４】
「ヒト化」免疫グロブリン可変領域は、修飾形態が、ヒトにおいて非修飾形態よりも少ない免疫応答を惹起するように修飾されている、たとえば免疫グロブリン可変領域が正常ヒトにおいて免疫原性応答を惹起しないように十分な数のヒトフレームワークアミノ酸位置を含むように修飾されている、免疫グロブリン可変領域である。「ヒト化」免疫グロブリンの説明は、たとえば米国特許第６，４０７，２１３号および米国特許第５，６９３，７６２号を含む。一部の場合、ヒト化免疫グロブリンは、１またはそれ以上のフレームワークアミノ酸位置に非ヒトアミノ酸を含み得る。
【００４５】
抗体の全部または部分は、免疫グロブリン遺伝子またはそのセグメントによってコードされ得る。例示的なヒト免疫グロブリン遺伝子は、κ、λ、α（ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）、γ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、δ、εおよびμ定常領域遺伝子、ならびに種々様々な免疫グロブリン可変領域遺伝子を含む。完全長免疫グロブリン「軽鎖」（約２５Ｋｄまたは２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端の可変領域遺伝子（約１１０アミノ酸）およびＣＯＯＨ末端のκまたはλ定常領域遺伝子によってコードされる。完全長免疫グロブリン「重鎖」（約５０Ｋｄまたは４４６アミノ酸）は、同様に可変領域遺伝子（約１１６アミノ酸）およびその他の前記定常領域遺伝子の１つ、たとえばγ（約３３０アミノ酸をコードする）によってコードされる。
【００４６】
完全長抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、対象標的（すなわちＧＦＲα３）に特異的に結合する能力を保持する、完全長抗体の１またはそれ以上のフラグメントを指す。完全長抗体の「抗原結合フラグメント」という用語に包含される結合フラグメントの例は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインから成る一価フラグメントである、Ｆａｂフラグメント；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド結合によって連結された２個のＦａｂフラグメントを含む二価フラグメントである、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント；（ｉｉｉ）ＶＨとＣＨ１ドメインから成るＦｄフラグメント；（ｉｖ）抗体の１本の腕のＶＬとＶＨドメインから成るＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインから成る、ｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；および（ｖｉ）機能性を保持する単離相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。さらに、Ｆｖフラグメントの２つのドメイン、ＶＬとＶＨは、別々の遺伝子によってコードされるが、それらを、ＶＬとＶＨ領域が一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成するように対合する一本のタンパク質鎖にすることができる合成リンカーによって、組換え法を用いて結合することができる。たとえばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２４２３−４２６；およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３参照。
【００４７】
ＭＯＲ０２６８３の変異体
以下の実施例で開示するように、「ＭＯＲ０２６８３」と称するＦａｂフラグメントは、ＧＦＲα３に結合し、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する。ＭＯＲ０２６８３の完全なアミノ酸配列（ならびにＶＨ領域、ＶＬ領域、ＣＤＲおよびフレームワーク領域のアミノ酸配列）を実施例１の表１に示す。
【００４８】
（ｉ）ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する能力を保持し、および（ｉｉ）可変領域内（たとえばＶＨ領域および／またはＶＬ領域）および／または定常領域内に、ここで開示するＭＯＲ０２６８３配列と比較して１またはそれ以上のアミノ酸付加、置換（たとえば保存的アミノ酸置換）および／または欠失を含む、ＭＯＲ０２６８３の変異体を作製することができる。たとえばＭＯＲ０２６８３の変異体は、１またはそれ以上のＣＤＲおよび／または１またはそれ以上のフレームワーク領域内に、ここで開示するＭＯＲ０２６８３と比較して１またはそれ以上のアミノ酸付加、置換および／または欠失を含み得る。
【００４９】
ＭＯＲ０２６８３の変異体は、様々な組換えＤＮＡ手法のいずれかを用いて作製できる。１つのそのような手法は、ＭＯＲ０２６８３配列内の１個のアミノ酸残基（または多数のアミノ酸残基）を変化させるために特定ヌクレオチド（１または複数）を変化させる、位置指定突然変異誘発である。市販の位置指定突然変異誘発キットの一例は、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）によって市販されている“Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｒ  Ｓｉｔｅ  Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ”である。
【００５０】
保存的置換は、類似の性質を有するもう１つ別のアミノ酸による１個のアミノ酸の置換である。保存的置換は以下の群内での置換を含む：バリン、アラニンおよびグリシン；ロイシン、バリンおよびイソロイシン；アスパラギン酸およびグルタミン酸；アスパラギンおよびグルタミン；セリン、システインおよびトレオニン；リシンおよびアルギニン；およびフェニルアラニンおよびチロシン。非極性疎水性アミノ酸は、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンを含む。極性中性アミノ酸は、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンを含む。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸は、アルギニン、リシンおよびヒスチジンを含む。負電荷を有する（酸性）アミノ酸は、アスパラギン酸およびグルタミン酸を含む。同じ群のもう１つ別の成員による上記極性、塩基性または酸性群の１個の成員の置換は、保存的置換とみなすことができる。
【００５１】
一部の実施形態では、ＭＯＲ０２６８３の変異体は、配列番号１と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるＶＨ領域および／または配列番号２と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一であるＶＬ領域を含む。
【００５２】
一部の実施形態では、ＭＯＲ０２６８３の変異体は、配列番号３と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である第一重鎖ＣＤＲ、配列番号４と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である第二重鎖ＣＤＲ、および／または配列番号５と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である第三重鎖ＣＤＲを含む。
【００５３】
一部の実施形態では、ＭＯＲ０２６８３の変異体は、配列番号６と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である第一軽鎖ＣＤＲ、配列番号７と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である第二軽鎖ＣＤＲ、および／または配列番号８と少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％同一である第三軽鎖ＣＤＲを含む。
【００５４】
アミノ酸配列の間の同一性パーセントはＢＬＡＳＴ２．０プログラムを使用して決定される。配列比較は、ギャップなしアラインメントを使用し、デフォルトパラメータ（Ｂｌｏｓｓｏｍ  ６２マトリックス、ギャップ存在コスト１１、１残基当たりのギャップコスト１、およびラムダ比率０．８５）を用いて実施される。ＢＬＡＳＴプログラムにおいて使用される数学的アルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５：３３８９−３４０２に述べられている。
【００５５】
抗ＧＦＲα３抗体および抗体フラグメントの生物活性
生物学的に活性な抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＧＦＲα３に結合し、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する。一部の実施形態では、抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントは、最初にＧＦＲα３配列に対して作製し、その後三元複合体形成を阻害するその能力に関してスクリーニングする。他の実施形態では、抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＭＯＲ０２６８３の変異体を合成し、ＭＯＲ０２６８３のように、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する変異体の能力を評価することによって作製される。
【００５６】
三元複合体アッセイにおいて、ニューブラスチンタンパク質はＲｅｔの細胞外ドメインおよびＧＦＲα３の細胞外ドメインと複合体を形成する。ＲｅｔおよびＧＦＲα３の可溶性形態は、融合タンパク質（たとえばＲｅｔの細胞外ドメインと胎盤アルカリホスファターゼの間の第一融合タンパク質（Ｒｅｔ−ＡＰ）およびＧＦＲα３の細胞外ドメインとヒトＩｇＧ１のＦｃドメインの間の第二融合タンパク質）として作製し、ニューブラスチンと組み合わせることができる。抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントが三元複合体の形成を阻害する能力を測定することができる。三元複合体アッセイの例は、国際公開番号ＷＯ００／０１８１５号および実施例２に述べられている。
【００５７】
成熟野生型ヒトニューブラスチンは１１３アミノ酸長であり、以下のアミノ酸配列を有する：
【００５８】
【数１】
2008546716.tif 000002
成熟野生型ラットニューブラスチンの配列は以下の実施例で述べる。
【００５９】
「ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する」という語句は、抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントの不在下で起こるものと比較したときの複合体形成の減少を指す。阻害は、必ずしも複合体形成の完全な排除を指示しない。阻害は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％またはそれ以上の減少であり得る。一部の実施形態では、抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントは、実施例２で述べる三元複合体アッセイによって測定したとき、１．０μｇ／ｍｌまたはそれ以下（たとえば０．５μｇ／ｍｌまたはそれ以下、０．２５μｇ／ｍｌまたはそれ以下、または０．１μｇ／ｍｌまたはそれ以下）のＥＣ５０でニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害する。
【００６０】
抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、ニューブラスチンシグナル伝達カスケードの開始をブロックするその能力を評価することによっても評価できる。たとえばキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイは、ニューブラスチン誘導のＲｅｔリン酸化をブロックする抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントの能力を評価するために使用できる（国際公開番号第ＷＯ００／０１８１５号およびＳａｄｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２３５（２）：２０７参照）。加えて、または選択的に、ニューブラスチンの投与後のＥＲＫのリン酸化状態を、この経路をブロックする抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントの能力を評価するために観測することができる。以下の実施例で詳述するように、抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントはまた（ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体形成を阻害することに加えて）、ニューブラスチン誘導のＲｅｔのリン酸化をブロックするおよび／またはニューブラスチン依存性のＥＲＫのリン酸化をブロックすることができる。
【００６１】
以下は、ＫＩＲＡアッセイを実施することができる条件の一例である。ＲｅｔおよびＧＦＲα３を発現する細胞を、２４穴プレートにおいてウエル当たり２×１０５細胞で、１０％ウシ胎仔血清を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中にプレートし、３７℃、５％ＣＯ２で１８時間培養する。その後細胞をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄し、ＤＭＥＭ  ０．２５ｍＬ中の抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントおよびニューブラスチンにより、３７℃、５％ＣＯ２で１０分間処理する。細胞をＰＢＳ１ｍＬで洗浄し、１０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５％Ｎｏｎｉｄｅｔ  Ｐ４０、０．２％デオキシコール酸ナトリウム、５０ｍＭ  ＮａＦ、０．１ｍＭ  Ｎａ３ＶＯ４、１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルの０．３０ｍＬにより、プレートを静かに揺り動かしながら４℃で１時間溶解する。溶解産物を、ピペットによる分注を繰り返すことによってさらに攪拌し、試料０．２５ｍＬを、５０ｍＭ炭酸塩緩衝液、ｐＨ９．６中５μｇ／ｍｌの抗Ｒｅｔモノクローナル抗体により４℃で１８時間被覆し、ブロック緩衝液（２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％正常マウス血清および３％ウシ血清アルブミンを含む０．１％トゥイーン−２０（ＴＢＳＴ））により室温で１時間ブロックした９６穴ＥＬＩＳＡプレートに移す。室温で２時間インキュベートした後、ウエルをＴＢＳＴで６回洗浄する。ウエルを、ブロック緩衝液中２μｇ／ｍｌのホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合抗ホスホチロシン４Ｇ１０抗体と共に室温で２時間インキュベートし、ＴＢＳＴで６回洗浄して、比色検出試薬で４５０ｎｍにてＨＲＰ活性を測定することにより、リン酸化Ｒｅｔを検出する。溶解産物または溶解緩衝液で処理したウエルからの吸光度値を測定し、バックグラウンド補正したシグナルを、混合物中に存在する抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントの濃度の関数としてプロットする。
【００６２】
抗体生産
抗体は原核および真核細胞において生産することができる。一部の実施形態では、抗体（たとえばｓｃＦｖ）は、ピキア属（Ｐｉｃｈｉａ）（たとえばＰｏｗｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２５１：１２３−３５）、Ｈａｎｓｅｕｌａまたはサッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）などの酵母細胞において発現される。
【００６３】
一部の実施形態では、抗体、特に完全長抗体、たとえばＩｇＧは哺乳動物細胞において生産される。組換え発現のための哺乳動物宿主細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（たとえばＫａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１の中で述べられているように、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に述べられているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、リンパ球細胞系、たとえばＮＳ０骨髄腫細胞およびＳＰ２細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２、およびトランスジェニック動物、たとえばトランスジェニック哺乳動物からの細胞を含む。たとえば細胞は哺乳動物上皮細胞であり得る。
【００６４】
免疫グロブリンドメインをコードする核酸配列に加えて、組換え発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製を調節する配列（たとえば複製起点）および選択マーカー遺伝子などの付加的な核酸配列を担持し得る。選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞の選択を容易にする（たとえば米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号および同第５，１７９，０１７号参照）。選択マーカー遺伝子の例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキセート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞での使用のため）およびｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択のため）を含む。
【００６５】
抗体（たとえば完全長抗体またはその抗原結合部分）の組換え発現のための例示的な系では、抗体重鎖と抗体軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを、リン酸カルシウムを介したトランスフェクションによってｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞に導入する。組換え発現ベクター内で、抗体重鎖および軽鎖遺伝子は、遺伝子の高レベルの転写を駆動するために各々エンハンサー／プロモーター調節エレメント（たとえばＣＭＶエンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントまたはＳＶ４０エンハンサー／ＡｄＭＬＰプロモーター調節エレメントなどの、ＳＶ４０、ＣＭＶ、アデノウイルス等に由来する）に作動可能に連結される。組換え発現ベクターはまた、メトトレキセート選択／増幅を使用して、ベクターでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞の選択を可能にするＤＨＦＲ遺伝子を担持する。選択された形質転換体宿主細胞を、抗体重鎖および軽鎖を発現させるために培養し、無傷抗体を培地から回収する。組換え発現ベクターを作製するため、宿主細胞をトランスフェクトするため、形質転換体を選択するため、宿主細胞を培養するため、および培地から抗体を回収するために標準分子生物学手法を使用する。たとえば一部の抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧによるアフィニティークロマトグラフィーによって単離できる。
【００６６】
抗体はまた、修飾、たとえばＦｃ受容体またはＣ１ｑまたはその両方との相互作用を低下させるまたは排除するために、たとえばＦｃ機能を変化させる修飾を含み得る。たとえばヒトＩｇＧ１定常領域を１またはそれ以上の残基で、たとえば米国特許第５，６４８，２６０号のナンバリングに従って、たとえば残基２３４および２３７の１またはそれ以上で、突然変異させることができる。他の例示的な修飾は、米国特許第５，６４８，２６０号に述べられているものを含む。
【００６７】
Ｆｃドメインを含む一部の抗体に関して、抗体生産系は、Ｆｃ領域がグリコシル化されている抗体を合成するように設計し得る。たとえばＩｇＧ分子のＦｃドメインは、ＣＨ２ドメイン内のアスパラギン２９７でグリコシル化される。このアスパラギンは二分岐型オリゴ糖による修飾のための部位である。このグリコシル化は、Ｆｃ受容体および補体Ｃ１ｑによって媒介されるエフェクター機能に関与する（Ｂｕｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｏｏｆ  （１９９２）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５１：１−８４；Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１６３：５９−７６）。Ｆｃドメインは、アスパラギン２９７に対応する残基を適切にグリコシル化する哺乳動物生産系において作製できる。Ｆｃドメインはまた、他の真核生物翻訳後修飾を含み得る。
【００６８】
抗体はまた、トランスジェニック動物によっても生産できる。たとえば米国特許第５，８４９，９９２号は、トランスジェニック哺乳動物の乳腺において抗体を発現するための方法を述べている。乳特異的プロモーターおよび対象抗体、たとえばここで述べる抗体をコードする核酸配列、および分泌のためのシグナル配列を含む導入遺伝子を構築する。そのようなトランスジェニック哺乳動物の雌性によって生産される乳は、その中に分泌される、対象抗体、たとえばここで述べる抗体を含む。抗体は、乳から精製することができ、あるいは一部の適用に関しては、直接使用できる。
【００６９】
抗体は、たとえば、その安定化および／または循環中、たとえば血液、血清、リンパ、気管支肺胞洗浄液または他の組織中での保持を、たとえば少なくとも１．５、２、５、１０または５０倍改善する部分で修飾することができる。
【００７０】
一例では、ＧＦＲα３結合抗体は、高分子、たとえばポリアルキレンオキシドまたはポリエチレンオキシドなどの実質的に非抗原性高分子と結合することができる。適切な高分子は重量によって実質的に異なる。約２００−約３５，０００ダルトンの範囲（または約１，０００−約１５，０００、および２，０００−約１２，５００）の平均分子量を有する高分子が使用できる。
【００７１】
もう１つの例では、ここで述べるＧＦＲα３結合抗体は、水溶性高分子、たとえば親水性ポリビニル系高分子、たとえばポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンに複合することができる。そのような高分子の非限定的なリストは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）またはポリプロピレングリコールなどのポリアルキレンオキシドホモポリマー、ポリオキシエチレン化ポリオル、それらのコポリマーおよび、ブロックコポリマーの水溶解度が維持されることを条件として、それらのブロックコポリマーを含む。さらなる有用な高分子は、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、およびポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ）などのポリオキシアルキレン；ポリメタクリレート；カルボマー；ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、または酸性ムコ多糖の多糖サブユニット、たとえばヒアルロン酸などのホモ多糖およびヘテロ多糖を含む、糖単量体Ｄ−マンノース、Ｄ−およびＬ−ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ−キシロース、Ｌ−アラビノース、Ｄ−グルクロン酸、シアル酸、Ｄ−ガラクツロン酸、Ｄ−マンヌロン酸（たとえばポリマンヌロン酸またはアルギン酸）、Ｄ−グルコサミン、Ｄ−ガラクトサミン、Ｄ−グルコースおよびノイラミン酸を含む分枝または非分枝多糖；ポリソルビトールおよびポリマンニトールなどの糖アルコールのポリマー；ヘパリンまたはヘパロンを含む。
【００７２】
医薬組成物
ここで述べる抗ＧＦＲα３抗体および抗体フラグメントは、哺乳動物被験体、たとえばヒトに、単独でまたは混合物中で投与することができる。たとえば抗体および抗体フラグメントは、生理食塩水などの医薬的に許容される賦形剤または担体の存在下で投与できる。賦形剤または担体は、投与の様式および経路に基づいて選択される。適切な医薬担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ）およびＵＳＰ／ＮＦ（米国薬局方および国民医薬品集）に述べられている。
【００７３】
医薬組成物は、その意図される投与経路と適合性であるように製剤される。投与経路の例は、たとえば静脈内、皮内、皮下、経口（たとえば吸入）、経皮（局所）、経粘膜および直腸投与を含む。非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液は以下の成分を含み得る：注射用蒸留水、塩類溶液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、ポリプロピレングリコールまたは他の合成溶媒などの滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート化剤；酢酸塩、クエン酸塩またはリン酸塩などの緩衝剤および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度調整剤。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基で調整できる。非経口製剤は、ガラスまたはプラスチック製の、アンプル、使い捨て注射器または多回投与バイアルに封入することができる。
【００７４】
医薬組成物は、ここで述べる抗体または抗体フラグメントの「治療有効量」または「予防有効量」を含み得る。ここで使用する、「治療有効量」は、所望治療結果を達成するために必要な投与回数および期間の、有効量を意味する。抗体または抗体フラグメントの治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、および個体において所望応答を惹起する抗体、抗体誘導体または抗原結合ポリペプチドの能力などの因子に従って異なり得る。治療有効量を投与するとき、抗体または抗体フラグメントの治療上の有益作用は毒性または有害作用を上回る。ここで使用する、「予防有効量」は、所望予防結果を達成するために必要な投与回数および期間の、有効量を意味する。
【００７５】
投与設計は、最適所望応答、たとえば治療または予防応答を与えるように調整できる。たとえば本発明の一部の実施形態では、単回ボーラスを投与する。他の実施形態では、いくつかに分割した用量を、時間をかけて投与する。状況の緊急性によって指示されるように、用量を比例的に減少または増加することができる。投与の容易さと用量の均一性のために非経口組成物を投与単位形態で製剤することは好都合である。ここで使用する、「投与単位形態」は、各々が、必要な医薬担体と共に所望治療効果を生じるように計算されたあらかじめ定められた量の有効成分を含有する、治療する哺乳動物被験体のための単位投与量として適切な物理的に分離した単位を意味する。
【００７６】
抗体または抗体フラグメントの治療または予防有効量についての例示的な非限定的範囲は、０．１−１００ｍｇ／ｋｇ、０．５−５０ｍｇ／ｋｇ、さらには１−２０ｍｇ／ｋｇ、および１−１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の値は、治療する状態の種類および重症度によって異なり得る。特定被験体に関して、詳細な投与設計は、個体の必要性および組成物を投与するまたは投与を監視する人物の専門的判断に従って経時的に調節することができる。ここで示す用量範囲は単なる例示であり、特許請求する本発明の範囲を限定することを意図しないことは了解されるべきである。
【００７７】
非経口注射投与は、皮下、筋肉内または静脈内注射および注入のために使用できる。加えて、非経口投与のための１つのアプローチは、参照によりここに組み込まれる、米国特許第３，７１０，７９５号によれば、一定レベルの用量を維持することを確実にする、徐放性または持続放出性システムの移植を用いる。
【００７８】
一般に、適切な被験体は、抗ＧＦＲα３抗体を投与し得る哺乳動物である。治療または予防のために特に意図される被験体は、ヒト、非ヒト霊長動物、ヒツジ、ウマ、ウシ、ヤギ、ブタ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット、ハムスター、アレチネズミ、ラットおよびマウスを含む。
【００７９】
結合アッセイおよび治療方法における使用
標識ニューブラスチンを使用する直接結合アッセイは、細胞表面への塩基性ニューブラスチンの非特異的結合のために実施が困難である。この問題に対する解決策として、ここで述べる抗ＧＦＲα３抗体およびその抗原結合フラグメントを、細胞表面上のＲｅｔ／ＧＦＲα３受容体へのニューブラスチンの特異的結合を検出するために使用できる。これらの抗ＧＦＲα３抗体および抗体フラグメントは、ニューブラスチンとの複合体ではないＧＦＲα３受容体にだけ結合するので、それらは、占有されていない（ｕｎｏｃｃｕｐｉｅｄ）ＧＦＲα３受容体をプローブし、それによって細胞表面上の受容体へのニューブラスチンの結合親和性を測定するために使用できる。ニューブラスチン結合親和性を測定するための競合結合アッセイの一例を実施例５で述べる。ここで述べる抗ＧＦＲα３抗体は、天然に生じる形態のニューブラスチン（たとえばここで述べる成熟形態のヒトニューブラスチン）またはそのフラグメントの生物活性変異体（たとえば国際公開番号第ＷＯ００／０１８１５号、同第ＷＯ０２／０６０９２９号または同第ＷＯ０４／０６９１７６号に述べられているニューブラスチンのフラグメントの変異体）の結合を検出するために使用できる。
【００８０】
Ｒｅｔは癌原遺伝子であり、いくつかのヒト癌の病因に関係づけられてきた。加えて、その補助受容体であるＧＦＲα３は一部の型の癌（たとえば小細胞肺癌）において上方調節され得る。ここで述べる抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントは、それ故、ＧＦＲα３を通してのＲｅｔシグナル伝達を中和し、被験体（たとえばヒト）において癌を治療するために使用できる。ここで述べる抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントで治療できる癌の例は、胃腸管の癌（たとえば食道癌または結腸癌）ならびに膀胱、乳房、結合組織、腎、肺（たとえば小細胞肺癌）、リンパ節、卵巣、皮膚、胃、精巣および子宮の癌を含む。
【００８１】
ここで述べる抗ＧＦＲα３抗体またはその抗原結合フラグメントはまた、神経または神経細胞の代謝、増殖、分化または生存を調節するためにも使用できる。特に、抗ＧＦＲα３抗体は、被験体において神経疾患を治療するまたは緩和するために使用できる。
【００８２】
ここで開示する抗ＧＦＲα３抗体（およびそれを含む医薬組成物）は、脊髄神経節内のニューロンを含む、感覚ニューロンまたは網膜神経節細胞への損傷によって特徴づけられる疾患を治療するための方法において使用できる。
【００８３】
一部の実施形態では、筋萎縮性側索硬化症（「ＡＬＳ」）および脊髄筋萎縮症などの運動ニューロン疾患を治療することができる。他の実施形態では、抗ＧＦＲα３抗体は、外傷後の神経回復を促進するために使用できる。あるいは、または加えて、抗ＧＦＲα３抗体を含むマトリックスによる神経ガイダンスチャネルが使用できる。そのような神経ガイダンスチャネルは、たとえば米国特許第５，８３４，０２９号に開示されている。
【００８４】
一部の実施形態では、抗ＧＦＲα３抗体（およびそれを含む医薬組成物）は、黄班変性、色素性網膜炎、緑内障および同様の疾患に罹患した患者における網膜内の光受容体喪失を含む、眼における様々な疾患の治療において使用される。
【００８５】
一部の実施形態では、抗ＧＦＲα３抗体（およびそれを含む医薬組成物）は、神経因性疼痛を治療するため、触覚異痛を治療するため、神経障害に関連する疼痛感受性の喪失を低減するため、ウイルス感染およびウイルス関連の神経障害を治療するため、および有痛性糖尿病性神経障害を治療するために使用される。
【００８６】
以下は本発明の実施の例である。それらは、いかなる意味においても本発明の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００８７】
実施例１：抗ＧＦＲα３  Ｆａｂ抗体フラグメントの作製
ＦａｂファージディスプレイライブラリーＨｕＣＡＬ（登録商標）ＧＯＬＤ（ＭｏｒｐｈｏＳｙｓ，Ｉｎｃ．，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、マウスＧＦＲα３の細胞外領域に由来する以下の配列に対してスクリーニングした：
【００８８】
【数２】
2008546716.tif 000003
ＧＦＲα３配列に結合したＦａｂフラグメントを特性決定した。ＭＯＲ０２６８３と命名した抗ＧＦＲα３  Ｆａｂフラグメントをさらなる検討のために選択した。
【００８９】
ＨＥＫ  ２９３  ＥＢＮＡ細胞を、空ベクター、ラットＧＦＲα１をコードするベクター、ラットＧＦＲα２をコードするベクター、またはラットＧＦＲα３をコードするベクターで一過性にトランスフェクトした。これらの細胞を、１０μｇ／ｍｌの抗ＧＦＲα３ポリクローナル抗体Ｒ１１（マウスＧＦＲα３配列およびそのカルボキシ末端に異種ＧＣ配列を含む、ペプチドＡＲＳＬＧＤＹＥＬＤＶＳＰＧＣ（配列番号１４）で免疫して作製したウサギポリクローナル抗体）または１０μｇ／ｍｌ  ＭＯＲ０２６８３で染色した。ＨＥＫ  ２９３  ＥＢＮＡ細胞はＧＦＲα３を内因性に発現するので、ベクターでトランスフェクトした細胞は非染色基線より上方にわずかにシフトした（図２Ａおよび２Ｂ）。ＧＦＲα３でトランスフェクトした細胞においてＲ１１およびＭＯＲ０２６８３によって認められたシフトは同等であり、どちらもＧＦＲα３受容体に対する強い親和性を示した（図２Ａおよび２Ｂ）。ベクターでトランスフェクトした細胞と比較して、ＧＦＲα１でトランスフェクトした細胞およびＧＦＲα２でトランスフェクトした細胞のシフトの欠如は、その密接なファミリー成員に比べてＧＦＲα３に対するＭＯＲ０２６８３の特異性を示唆した（図２Ａおよび２Ｂ）。
【００９０】
ＭＯＲ０２６８３を、空ベクター、マウスＧＦＲα□をコードするベクター、またはヒトＧＦＲα３をコードするベクターで一過性にトランスフェクトしたＨＥＫ  ２９３  ＥＢＮＡ細胞に関しても試験した。ＦＡＣＳ分析は、ＭＯＲ０２６８３がヒトおよびマウス形態のＧＦＲα３にも結合することを示した（図３）。
【００９１】
要約すると、ＭＯＲ０２６８３はマウス、ラットおよびヒトＧＦＲα３に結合するが、ラットＧＦＲα１またはラットＧＦＲα２には結合しないことが認められた。
【００９２】
Ｆａｂフラグメント、ＭＯＲ０２６８３の重鎖および軽鎖（κ３ファミリー）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下のとおりである：
重鎖ヌクレオチド配列
【００９３】
【数３】
2008546716.tif 000004
重鎖アミノ酸配列
【００９４】
【数４】
2008546716.tif 000005
軽鎖ヌクレオチド配列
【００９５】
【数５】
2008546716.tif 000006
軽鎖アミノ酸配列
【００９６】
【数６】
2008546716.tif 000007
ＭＯＲ０２６８３のＶＨおよびＶＬ領域、ならびに重鎖および軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を表１に詳細に示す。
【００９７】
【表１】
2008546716.tif 000008
実施例２
ＭＯＲ０２６８３はニューブラスチンシグナル伝達複合体の形成をブロックする
抗ＧＦＲα３  Ｆａｂフラグメント、ＭＯＲ０２６８３を、ニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体の形成を阻害するその能力に関して評価した。ヤギ抗ヒトＦｃを９６穴プレートに被覆した。ＭＯＲ０２６８３を、ラットＲｅｔ−アルカリホスファターゼ
【００９８】
【数７】
2008546716.tif 000009
馴化培地中で１時間、１μｇ／ｍｌのマウスＧＦＲα３−Ｉｇ
【００９９】
【数８】
2008546716.tif 000010
および５０ｎｇ／ｍｌのラットニューブラスチン（１１３アミノ酸形態；
【０１００】
【数９】
2008546716.tif 000011
【０１０１】
【数１０】
2008546716.tif 000012
と共にプレインキュベートした後、被覆したプレートにさらに１時間添加した。アルカリホスファターゼ（ＡＰ）を化学発光基質で視覚化し、プレートをルミノメーターで読み取った。ＭＯＲ０２６８３は、約０．２５μｇ／ｍｌのＥＣ５０でニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体形成を阻害することが認められた（図４）。
【０１０２】
実施例３
ＭＯＲ０２６８３はニューブラスチンが誘導するＲｅｔのリン酸化をブロックする
ＭＯＲ０２６８３を、Ｒｅｔリン酸化によって測定される、ニューブラスチンの下流シグナル伝達をブロックするその能力に関して評価するため、細胞ベースのキナーゼ受容体活性化（ＫＩＲＡ）アッセイを使用した。ニューブラスチンがＧＦＲα３に結合するとき（ブロッキング抗体の不在下で）、ＧＦＲα３はＲｅｔを動員し、Ｒｅｔはリン酸化される。ＫＩＲＡアッセイについての読み出しは、ニューブラスチン誘導のＲｅｔのリン酸化である。
【０１０３】
マウスＲｅｔを内因性に発現するＮＢ４１Ａ３細胞（マウス神経芽細胞腫細胞系；ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １４７）を、マウスＧＦＲα３をコードするベクターで安定にトランスフェクトした（ＮＢ４１Ａ３−Ｌ３と称する細胞系を作製するため）。ＦａｂフラグメントがＧＦＲα３と結合する機会を与えるためＭＯＲ０２６８３と共にプレインキュベートした。３μｇ／ｍｌのニューブラスチンを１０分間細胞に添加し、細胞を溶解して、溶解産物を、抗ラットＲｅｔ抗体（ハムスター抗ラットＲｅｔモノクローナルＡＡ．ＧＥ７．３；国際公開番号第ＷＯ９７／４４３５６号）で被覆しておいた新しいプレートに添加した。この工程は、溶解産物からのＲｅｔをプレート上に捕獲する。その後、プレートに結合したリン酸化Ｒｅｔに結合するＨＲＰ標識抗ホスホチロシン抗体（組換え４Ｇ１０−ＨＲＰ複合体；カタログ番号１６−１８４；Ｕｐｓｔａｔｅ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅｓｖｉｌｌｅ，ＶＡ）を添加した。ＨＲＰ標識抗ホスホチロシン抗体の結合をＨＲＰ基質で視覚化し、プレートの吸光度からデータを収集した。
【０１０４】
漸増濃度のニューブラスチンへの暴露によって誘導されるＲｅｔリン酸化の標準曲線は、アッセイが正しく機能したことを確認した（図５）。ＭＯＲ０２６８３の添加は、ニューブラスチン誘導のＲｅｔリン酸化を用量依存的に阻害することが認められ、約０．２５μｇ／ｍｌのＥＣ５０を示した（図６）。
【０１０５】
実施例４
ＭＯＲ０２６８３はニューブラスチン依存性のＥＲＫのリン酸化をブロックする
ＭＯＲ０２６８３を、下流シグナル伝達分子ＥＲＫのリン酸化によって測定される、ニューブラスチンの下流シグナル伝達をブロックするその能力に関して評価した。ＥＲＫのリン酸化は、ニューブラスチン／ＧＦＲα３／Ｒｅｔ複合体の活性化が引き金となる事象である。ＮＢ４１Ａ３−Ｌ３細胞（ＲｅｔとＧＦＲα３を発現する）を、０−２００ｎＭ  ＭＯＲ０２６８３の存在下に３７℃で１０分間、１ｎＭニューブラスチンで刺激した。ホスホ−ＥＲＫの量を測定した。ＥＲＫのリン酸化はＭＯＲ０２６８３によって阻害され（ＩＣ５０＝９．１ｎＭ）、ＭＯＲ０２６８３がニューブラスチン依存性のＥＲＫのリン酸化をブロックすることを示唆した（図７）。
【０１０６】
実施例５
ニューブラスチン競合結合アッセイ
ＮＢ４１Ａ３−Ｌ３細胞を種々の濃度のラットニューブラスチンと共に４℃で１０分間インキュベートした。インキュベーションの期間中、細胞表面のＧＦＲα３およびＲｅｔへのニューブラスチンの結合反応は平衡に達する。次に、細胞を高濃度（１０μｇ／ｍｌ）のビオチニル化ＭＯＲ０２６８３で２分間クエンチングした。ＭＯＲ０２６８３は、既にニューブラスチンによって占有されていないＧＦＲα３受容体だけに結合することができ、それ故非占有ＧＦＲα３受容体についてのプローブとして働く。クエンチング反応の短いインキュベーション時間中、ニューブラスチンとＭＯＲ０２６８３結合の間で再平衡は起こらない。その後、ＧＦＲα３に結合したＭＯＲ０２６８３の量を、ＰＥ−ストレプトアビジンを二次試薬として使用してＦＡＣＳ分析によって定量した。
【０１０７】
細胞表面上の受容体へのニューブラスチンの結合親和性を測定するためにニューブラスチンの競合結合を使用した。ＮＢ４１Ａ３−Ｌ３細胞を０−１０μＭのラットニューブラスチンと共に４℃で１０分間インキュベートした。次に、細胞を１０μｇ／ｍｌのビオチニル化ＭＯＲ０２６８３で２分間クエンチングした。ＧＦＲα３に結合したＭＯＲ０２６８３の量を、ＰＥ−ストレプトアビジンを二次試薬として使用してＦＡＣＳによって定量した。ニューブラスチン結合に干渉しない抗ＧＦＲα３  Ｆａｂ、ＭＯＲ０２６８２を対照として使用した。ＭＯＲ０２６８３のその後の結合にはニューブラスチン濃度依存的低下が認められたが、対照抗体ＭＯＲ０２６８２に関しては低下が認められなかった（図８）。双曲型方程式へのデータの当てはめは、受容体へのニューブラスチン結合に関して約２００ｎｍのＫｄを生じた。
【０１０８】
非ブロッキングＦａｂフラグメント、ＭＯＲ０２６８２の重鎖および軽鎖（λ２ファミリー）のヌクレオチドおよびアミノ酸配列は以下のとおりである：
重鎖ヌクレオチド配列
【０１０９】
【数１１】
2008546716.tif 000013
【０１１０】
【数１２】
2008546716.tif 000014
重鎖アミノ酸配列
【０１１１】
【数１３】
2008546716.tif 000015
軽鎖ヌクレオチド配列
【０１１２】
【数１４】
2008546716.tif 000016
軽鎖アミノ酸配列
【０１１３】
【数１５】
2008546716.tif 000017
【０１１４】
【数１６】
2008546716.tif 000018
ＭＯＲ０２６８２のＶＨおよびＶＬ領域、ならびに重鎖および軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を表２に詳細に示す。
【０１１５】
【表２】
2008546716.tif 000019
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と共に述べてきたが、前記の説明は例示を意図するものであり、付属の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を限定しない。他の態様、利点および修正は、以下の特許請求の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、ヒト、ラットおよびマウスＧＦＲα３のアミノ酸配列のアラインメントである。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、Ｒ１１ポリクローナル抗体（図１Ａ）またはＦａｂフラグメントＭＯＲ０２６８３（図１Ｂ）によるラットＧＦＲα３の発現の検出を描画したプロットである。
【図３】図３は、ＦａｂフラグメントＭＯＲ０２６８３によるヒトおよびマウスＧＦＲα３の発現の検出を描画したプロットである。
【図４】図４は、ＦａｂフラグメントＭＯＲ０２６８３によるニューブラスチン−ＧＦＲα３−Ｒｅｔ三元複合体形成の濃度依存的阻害を示すグラフである。
【図５】図５は、ニューブラスチンの濃度を上昇させることによるＲｅｔリン酸化の誘導を示すグラフである。
【図６】図６は、ＦａｂフラグメントＭＯＲ０２６８３による、ニューブラスチン誘導のＲｅｔリン酸化の濃度依存的阻害を示すグラフである。
【図７】図７は、ＦａｂフラグメントＭＯＲ０２６８３による、ニューブラスチン誘導のＥＲＫリン酸化の濃度依存的阻害を示すグラフである。
【図８】図８は、ブロック性抗ＧＦＲα３  Ｆａｂ  ＭＯＲ０２６８３（■）または非ブロック性抗ＧＦＲα３  Ｆａｂ  ＭＯＲ０２６８３（●）を適用したニューブラスチン競合結合アッセイにおける用量−反応曲線を示すグラフである。
【図１】
2008546716.tif 000020
【図２】
2008546716.tif 000021
【図３】
2008546716.tif 000022
【図４】
2008546716.tif 000023
【図５】
2008546716.tif 000024
【図６】
2008546716.tif 000025
【図７】
2008546716.tif 000026
【図８】
2008546716.tif 000027
【配列表】
2008546716000001.app
【国際調査報告】
2008546716.tif 000028