(57)【要約】【解決手段】  本発明は発現ベクターに関し、この発現ベクタは、そのベクターに対してヌルである細胞を選択するために使用可能な１若しくはそれ以上の選択マーカー、及びそのようなヌル細胞に結合した１若しくはそれ以上の目的タンパク質をコードする核酸配列を有するものである。【選択図】      図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸配列と、選択マーカーをコードする少なくとも１つの核酸配列とを有するポリヌクレオチドベクター。
【請求項２】
請求項１記載のベクターにおいて、前記選択マーカーをコードする核酸配列は、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列の上流にあるものである。
【請求項３】
請求項１記載のベクターにおいて、前記組み換えタンパク質をコードする前記核酸配列は、選択マーカーをコードする核酸配列の上流にあるものである。
【請求項４】
請求項１記載のベクターにおいて、このベクターは、さらに、
１若しくはそれ以上の内部リボソーム進入部位を有するものである。
【請求項５】
請求項４記載のベクターにおいて、前記内部リボソーム進入部位は、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列と前記選択マーカーをコードする核酸配列との間に位置するものである。
【請求項６】
請求項１記載のベクターにおいて、このベクターは、少なくとも１つの核酸配列に作動するように結合した１若しくはそれ以上のプロモータを有するものである。
【請求項７】
請求項１記載のベクターにおいて、前記選択マーカーは、陰性選択マーカーである。
【請求項８】
請求項７記載のベクターにおいて、前記陰性選択マーカーは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ：ＨＳＶ−ＴＫ）またはその誘導体である。
【請求項９】
請求項８記載のベクターにおいて、前記陰性選択マーカーは、配列ＩＤ番号１の核酸配列によりコードされるものである。
【請求項１０】
請求項１記載のベクターにおいて、このベクターは、さらに、
陽性選択マーカーをコードする核酸配列をさらに有するものである。
【請求項１１】
請求項１記載のベクターにおいて、このベクターは、さらに、
少なくとも１つのポリアデニル化シグナルを有するものである。
【請求項１２】
請求項１１記載のベクターにおいて、前記ポリアデニル化シグナルは、前記選択マーカーをコードする核酸配列の下流にあるものである。
【請求項１３】
請求項１１記載のベクターにおいて、前記ポリアデニル化シグナルは、前記選択マーカーをコードする核酸配列の上流にあるものである。
【請求項１４】
請求項１１記載のベクターにおいて、前記ポリアデニル化シグナルは、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列の下流にあるものである。
【請求項１５】
請求項１１記載のベクターにおいて、前記ポリアデニル化シグナルは、前記組換えタンパク質をコードする核酸配列の上流にあるものである。
【請求項１６】
請求項６記載のベクターにおいて、前記プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または宿主特異的プロモーターである。
【請求項１７】
請求項１記載のベクターを有する細胞。
【請求項１８】
請求項１７記載の細胞において、この細胞は真核細胞である。
【請求項１９】
請求項１８記載の細胞において、この細胞は哺乳類細胞である。
【請求項２０】
所望の表現型を有する、単離された遺伝的に安定な細胞を産生する方法であって、
ａ）組換えポリペプチドを発現させる条件下で細胞を培養し、細胞ライブラリーを作成する、前記培養する工程と、
ｂ）新しい表現型を示す細胞ライブラリーからクローンを選択する工程と、
ｃ）前記選択されたクローンを増大させる工程と、
ｄ）前記組換えポリペプチドを発現していないクローンを選択する工程と
を有する、方法。
【請求項２１】
請求項２０記載の方法において、前記細胞は、組換えポリペプチドをコードする１若しくはそれ以上の核酸配列と、選択マーカーをコードする１若しくはそれ以上の核酸配列とを有するものである。
【請求項２２】
請求項２０記載の方法において、前記細胞は、
免疫グロブリン軽鎖をコードする少なくとも１つの核酸配列に作動するように結合した、プロモーターまたは内部リボソーム進入部位と、
少なくとも１つの内部リボソーム進入部位により免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列から分離された、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列と、
リボソーム内部進入部位またはプロモーターにより上流に配置された、少なくとも１つの選択マーカー配列と
を有するベクターを有するものである。
【請求項２３】
請求項２０記載の方法において、前記細胞は、
免疫グロブリン重鎖をコードする少なくとも１つの核酸配列に作動するように結合した、プロモーターまたは内部リボソーム進入部位と、
少なくとも１つの内部リボソーム進入部位により免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列から分離された、免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列と、
内部リボソーム進入部位またはプロモーターに上流に配置された、少なくとも１つの選択マーカー配列と
を有するベクターを有するものである。
【請求項２４】
請求項２１記載の方法において、前記選択マーカーは、陰性選択マーカーである。
【請求項２５】
請求項２１記載の方法において、前記ベクターは、さらに、
陽性選択マーカーを有するものである。
【請求項２６】
請求項２１記載の方法において、前記ベクターは、少なくとも１つの核酸配列に作動するように結合した１若しくはそれ以上のプロモーターを有するものである。
【請求項２７】
請求項２１記載の方法において、前記選択マーカーをコードする核酸配列は、組換えポリペプチドをコードする核酸配列の上流にあるものである。
【請求項２８】
請求項２１記載の方法において、前記組換えポリポリペプチドをコードする核酸配列は、前記選択マーカーをコードする核酸配列の上流にあるものである。
【請求項２９】
請求項２１記載の方法において、前記ベクターは、１若しくはそれ以上の内部リボソーム進入部位を有するものである。
【請求項３０】
請求項２９記載の方法において、前記内部リボソーム進入部位は、組換えポリペプチドをコードする核酸配列と、前記選択マーカーをコードする核酸配列との間に位置するものである。
【請求項３１】
請求項２３記載の方法において、前記陰性選択マーカーは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ：ＨＳＶ−ＴＫ）、またはその誘導体である。
【請求項３２】
請求項３１記載の方法において、前記陰性選択マーカーは、配列ＩＤ番号１の核酸配列によってコード化されるものである。
【請求項３３】
請求項２１記載の方法において、前記ベクターは、少なくとも１つのポリアデニル化シグナルを有するものである。
【請求項３４】
請求項３３記載の方法において、前記ポリアデニル化シグナルは、前記選択マーカーをコードする核酸配列の下流にあるものである。
【請求項３５】
請求項３３記載の方法において、前記ポリアデニル化シグナルは、前記選択マーカーをコードする核酸配列の上流にあるものである。
【請求項３６】
請求項３３記載の方法において、前記ポリアデニル化シグナルは、前記組換えポリペプチドをコードする核酸配列の下流にあるものである。
【請求項３７】
請求項３３記載の方法において、前記ポリアデニル化シグナルは、前記組換えポリペプチドをコードする核酸配列の上流にあるものである。
【請求項３８】
請求項２６記載の方法において、前記プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、組織特異的プロモーター、または宿主特異的プロモーターである。
【請求項３９】
請求項２１記載の方法において、前記ベクターは、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫである。
【請求項４０】
請求項２１記載の方法において、前記ベクターは、ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫである。
【請求項４１】
請求項２０記載の方法において、前記宿主は、哺乳類細胞である。
【請求項４２】
請求項２０記載の方法において、前記宿主は、植物細胞である。
【請求項４３】
請求項２０記載の方法において、前記宿主は、両生動物細胞である。
【請求項４４】
請求項２０記載の方法において、前記宿主は、昆虫細胞である。
【請求項４５】
請求項２０記載の方法において、前記宿主は、真菌細胞である。
【請求項４６】
請求項２０記載の方法において、この方法は、さらに、
前記培養工程中に突然変異生成を誘発する工程を有するものである。
【請求項４７】
請求項４６記載の方法において、前記突然変異生成を誘発する工程は、前記培養工程
中に突然変異原で前記細胞を処理する工程を有するものである。
【請求項４８】
請求項４６記載の方法において、突然変異生成を誘発する前記工程は、前記培養工程中に、前記細胞のミスマッチ修復を阻害する工程を有するものである。
【請求項４９】
請求項２０記載の方法により産生された細胞。
【請求項５０】
ベクターであって、
免疫グロブリン軽鎖をコードする少なくとも１つの核酸配列に作動するように結合した、プロモーターまたは内部リボソーム進入部位と、
少なくとも１つの内部リボソーム進入部位により免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列から分離された、免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列と、
内部リボソーム進入部位またはプロモーターにより上流に配置された、少なくとも１つの選択マーカー配列と
を有する、ベクター。
【請求項５１】
請求項５０記載のベクターにおいて、前記選択マーカーは、陰性選択マーカーである。
【請求項５２】
請求項５１記載のベクターにおいて、前記陰性選択マーカーは、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）またはその誘導体である。
【請求項５３】
請求項５２記載のベクターにおいて、前記選択マーカーをコードする核酸配列は、配列ＩＤ番号１のヌクレオチド配列を有するものである。
【請求項５４】
請求項５０記載のベクターにおいて、前記免疫グロブリン軽鎖は、配列ＩＤ番号５のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項５５】
請求項５０記載のベクターにおいて、前記免疫グロブリン軽鎖をコードする核酸配列は、配列ＩＤ番号４の核酸配列を有するものである。
【請求項５６】
請求項５０記載のベクターにおいて、前記免疫グロブリン重鎖は、配列ＩＤ番号７のアミノ酸配列を有するものである。
【請求項５７】
請求項５０記載のベクターにおいて、前記免疫グロブリン重鎖をコードする核酸配列は、配列ＩＤ番号６の核酸配列を有するものである。
【請求項５８】
請求項５０記載のベクターにおいて、このベクターは、少なくとも１つのポリアデニル化シグナルを有するものである。
【請求項５９】
請求項５０記載のベクターを有する細胞。
【請求項６０】
請求項５９記載のベクターにおいて、前記細胞は、真核細胞である。
【請求項６１】
細胞であって、第一核酸配列及び第二核酸配列に作動するように結合したプロモーターを有する組換え発現ベクターを含み、前記第一の配列は組換えｃＤＮＡまたは選択マーカー配列をコードするものであり、前記第二の配列は組換えｃＤＮＡまたは選択マーカー配列のいずれかをコードするものである、細胞。
【請求項６２】
請求項６１記載の細胞において、前記第一核酸配列は、組換え軽鎖および重鎖ｃＤＮＡをコードするものである。
【請求項６３】
請求項６２記載の細胞において、前記第一核酸配列は、選択マーカーをコードするものである。
【請求項６４】
請求項６１記載の細胞において、前記第一核酸配列は、内部リボソーム進入部位により第二核酸配列から分離されているものである。
【請求項６５】
請求項６１記載の細胞において、前記組換え発現ベクターは、ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫ、またはｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫである。
【請求項６６】
請求項６１記載の細胞において、この細胞は、真核細胞である。
【請求項６７】
請求項６１記載の細胞において、この細胞は、哺乳類細胞である。
【請求項６８】
請求項６１記載の細胞において、この細胞は、原核細胞である。
【請求項６９】
細胞におけるｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫの存在を決定する方法であって、
ａ．ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫを細胞を形質移入する工程と、
ｂ．前記ベクターを特異的に検出できる、プライマーまたはＤＮＡプローブを用いて工程（ａ）の細胞を分析する工程と
を有する方法。
【請求項７０】
細胞におけるｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫベクターの存在を決定する方法であって、
ａ．ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫを細胞に形質移入する工程と、
ｂ．前記ベクターを特異的に検出できるプライマーまたはＤＮＡプローブを用いて工程（ａ）の細胞を分析する工程と
を有する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本特許出願は、２００５年５月１６日付出願の米国特許仮出願番号第６０／６８１，４８８号および２００５年５月１８日付出願の米国特許仮出願番号第６０／６８２，０９５号に基づく優先権を主張するものであり、当該文献の全内容はこの参照により本願明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
本発明は発現ベクターに関し、この発現ベクターは、このようなベクターに対するヌル細胞を選択するために使用可能な１若しくはそれ以上の選択マーカーに結合した、およびこのようなヌル細胞に結合した１若しくはそれ以上の目的タンパク質をコードする核酸配列を含む。所望の表現型を有するヌル細胞は、薬物の発見および開発に有用である。
【背景技術】
【０００３】
成長因子、抗体、および治療用タンパク質等（これらに限らない）のタンパク質をコードする遺伝子を発現するレポーターベクターの使用は、例えば、タンパク質産生、薬物の発見および開発、および抗体または組換えタンパク質産生、細胞代謝、および／または増殖表現型に関与する経路を発見するための研究手段として、好ましい表現型を有する細胞を特定するためのスクリーニング方法の代表的なものである。このようなタンパク質をコードする核酸分子をもはや発現しない細胞を選択する能力は、その他の抗体またはタンパク質の発現について増強された表現型を示す細胞を生成する能力を示す。本願明細書では、組換え核酸分子を発現するが、当該ベクターに対するヌル細胞を取得する選択的条件下でのスクリーニング可能な発現ベクターシステム、およびそのように産生された細胞について記載する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の目的は、真核細胞または原核細胞での発現に望ましい組換えタンパク質または抗体をコードする核酸配列を有するベクターシステムの使用方法を提供することであり、ここで前記ベクターに対するヌル細胞は、選択的条件下で特定可能なものである。
【０００５】
本願明細書に記載された発明は、例えば、タンパク質の高力価を取得することができる細胞、所望の増殖特性を有する細胞、および／または所望の特性（例えば、翻訳後修飾、またはポリペプチドの折りたたみまたは切断等のプロセシング）を有するタンパク質を産生する細胞等、所望の表現型を有する細胞、および所望の特性（例えば、早い細胞増殖、少ない細胞の栄養必須条件、細胞結合の欠如）を有する細胞の特定に使用するために使用される発現ベクターシステムの開発を含む。
【０００６】
一部の実施形態において、前記システムは、１若しくはそれ以上の目的ポリペプチドをコードする１若しくはそれ以上の核酸配列、および１若しくはそれ以上の選択マーカーをコードする１若しくはそれ以上の核酸配列を有する。本発明のベクターとして、例えば、分泌または非分泌ポリペプチド、抗体、または抗体フラグメント（通常、「タンパク質」または「ポリペプチド」）をコードすることができる。このベクターは、好ましくは、少なくとも１つの陰性選択マーカーを有する。一部の実施形態において、前記ベクターは陽性選択マーカーを有する。陽性選択マーカーの存在により、前記ベクターを細胞内にうまく導入できたかを確認することができる。選択マーカーをコードする核酸配列は、目的ポリペプチドをコードする核酸配列の上流または下流にあってもよい。
【０００７】
本発明のベクターは、好ましくは、構成的、誘導性、宿主特異的、および／または組織特異的プロモーター等の１若しくはそれ以上のプロモータを有する。一部の実施形態において、プロモーターは、１若しくはそれ以上の目的ポリペプチドをコードする核酸配列の上流にある。一部の実施形態において、前記ベクターは、プロモータから下流に１若しくはそれ以上のクローニング部位を有し、このクローニング部位のそれぞれが、１若しくはそれ以上の目的ポリペプチドをコードする１若しくはそれ以上の核酸分子をクローン化するのに適したなポリリンカーを含む。前記プロモーターは、好ましくは、目的ポリペプチドをコードする核酸配列、および／または選択マーカーをコードする核酸配列に作動するように結合している。
【０００８】
一部の実施形態において、プロモーターは、１若しくはそれ以上の選択マーカーをコードする核酸配列の上流にある。一部の実施形態において、前記ベクターは、プロモーターから下流に、１若しくはそれ以上の選択マーカーをコードする核酸分子をクローン化するのに適したポリリンカーを含むクローニング部位を有する。
【０００９】
このようなシステムに使用可能な選択マーカーには、例えば、これらに限らないが、抗生物質耐性遺伝子、ＨＳＶ−ＴＫ、または細菌性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ等、正および陰性選択マーカーなどの当該技術分野で既知のものが挙げられる。
【００１０】
当該ベクターは、１若しくはそれ以上の内部リボソーム進入部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ（ｓ）：ＩＲＥＳ）を有する。好ましい実施形態において、前記ベクターは、目的のポリペプチドをコードする核酸配列またはそのクローニング部位と、選択マーカーをコードする核酸配列またはそのクローン部位との間にＩＲＥＳを含む。
【００１１】
一部の実施形態において、当該ベクターシステムは、上述のいずれの核酸配列の上流または下流にある１若しくはそれ以上のポリアデニル化部位を有する。
【００１２】
本発明の一部の実施形態によると、１若しくはそれ以上のタンパク質または抗体をコードし、下流に１若しくはそれ以上のＩＲＥＳ配列、続いて１若しくはそれ以上の選択マーカーをコードする核酸配列を含む発現ベクターが提供される。一部の実施形態において、前記発現ベクターは、下流で１若しくはそれ以上のＩＲＥＳに続く１若しくはそれ以上の選択マーカーをコードする核酸配列を有し、順番に下流に１若しくはそれ以上のタンパク質または抗体の核酸配列が続いている。好ましい実施形態においては、前記発現ベクターは、例えば、目的タンパク質または抗体の発現を引き起こすプロモーター／エンハンサーをさらに有する。この発現ベクターは、タンパク質または抗体をコードする核酸配列間、あるいは発現が望ましい核酸配列に先行するＩＲＥＳ配列を有していてもよい。
【００１３】
好ましい実施形態において、当該発現ベクターは、目的タンパク質、抗体、または抗体フラグメントをコードする第一核酸配列と、１若しくはそれ以上のＩＲＥＳにより第一核酸配列から分離している可能性のある、選択マーカーをコードする第二核酸配列とを含む。陽性選択マーカーは、薬剤耐性、蛍光性、または磁性を付与する核酸配列を有することができる。その他の陽性選択マーカーもまた、本願発明の発現ベクターへの使用に適している。
【００１４】
一部の実施形態において、当該ベクターシステムは、１若しくはそれ以上のポリアデニル化部位を有するものであっても良い。
【００１５】
本願明細書では、例えば、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫおよびｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫと称される２つのベクタープラスミドの開発および応用について説明する。前記ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫプラスミドは、分泌または非分泌ポリペプチドをコードし、続いて下流にＩＲＥＳシグナル、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子由来の陰性選択マーカーをコードする核酸分子を含む。前記ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫプラスミドは、全長または切断型の軽鎖または重鎖免疫グロブリンをコードし、続いてＩＲＥＳをコードする核酸分子と、全長または切断型の軽鎖または重鎖免疫グロブリンをコードし続いて第２のＩＲＥＳをコードする核酸分子と、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子由来の陰性選択マーカーをコードする核酸分子とを有する。これらのベクターは、真核細胞を形質移入した場合、機能性全長タンパク質またはそのフラグメントを産生する。
【００１６】
真核および原核細胞等の細胞は、本発明のベクターにより形質転換することが可能である。従って、本発明の別の実施形態によると、本発明の発現ベクターにより形質転換された宿主細胞が提供される。本発明の細胞としては真核または原核細胞が挙げられ、より好ましくは、植物または哺乳類細胞等の真核細胞が挙げられる。本発明の細胞として、真菌、細菌、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、昆虫、植物、齧歯動物、またはヒト起源の細胞が挙げられる。
【００１７】
本願明細書に記載のシステムは、１つ若しくはそれ以上のタンパク質をコードする１若しくはそれ以上の核酸配列の融合転写物の発現を可能にするものであり、組み換え型ポリペプチドをコードする核酸配列に対してヌルである細胞集団内において、クローンに選択に使用可能な選択マーカーをコードする核酸配列が続くまたは先行する。ヌル細胞は、好ましくは増強された表現型を有する。増強された表現型を有するヌル細胞は、その他のタンパク質の発現に好適である可能性がある。
【００１８】
タンパク質を産生するクローンが特定されると、その細胞株は更に、これらに限らないが、高力価発現、増強された増殖特性、および／または、例えばタンパク質修飾および／または改変された翻訳後修飾に起因する、所望の生化学的特性を有するタンパク質を与える能力等の、１若しくはそれ以上の所望の表現型を有するサブクローンを特定するために、スクリーニングされる。
【００１９】
このような表現型は、所定のサブクローンの固有の性質、あるいは突然変異生成による可能性がある。突然変異生成は、薬品、ＵＶ波長光、放射線照射、ウイルス、挿入性突然変異原、欠損ＤＮＡの修復、またはこれらの方法を併用して利用することで行うことができる。
【００２０】
１若しくはそれ以上の所望の特徴を有する抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを与える細胞株が特定されると、この細胞株は、目的のポリペプチドを含む核酸分子をもはや含まないクローンを特定するための選択条件下におくことができる。ヌル細胞は、その他のタンパク質、抗体、または抗体フラグメントの産生に使用可能である。前記ヌル細胞は、好ましくは、例えばタンパク質修飾および／または改変された翻訳後修飾に起因した、例えば高力価発現、増強された増殖特性、および／または所望の生化学的特性を有するタンパク質を与える能力等の所望の表現型を有する。
【００２１】
本発明の細胞は、発見および製品開発に有用である。
【００２２】
本発明は、分泌および非分泌ポリペプチド、抗体、および／または抗体フラグメントを産生できる選択可能な発現ベクター作成のためのシステムに関する。前記発現ベクターは、ヌル細胞株を得るための陰性選択、または形質転換体を特定するための陽性選択を可能にするために機能する。本発明は、このようなシステムの１つに関する開発について述べており、その利点は、以下の実施例および図においてさらに説明する。
【００２３】
本発明はまた、目的のポリペプチドをもはや発現しないサブクローン、またはそのような発現を保持しているサブクローンのいずれかを特定するために選択される、細胞、細胞株、細胞のライブラリーを作成する方法を提供する。本発明のこれらおよびその他の目的は、以下に記述されている１若しくはそれ以上の実施形態により提供される。
【００２４】
別の実施形態において、目的の組換えポリペプチドをコードする核酸配列に対してヌルである細胞を選択するための方法が提供される。一部の実施形態において、前記ヌル細胞は、本発明のベクターに対してヌルである。ポリペプチドまたは抗体をコードするベクターを標的細胞に導入し、この細胞株を陽性選択により、そのベクターの取り込みについて選択する。貯蔵物（ｐｏｏｌ）を作成し、目的のポリペプチドを発現し、１若しくはそれ以上の所望の表現型を示すサブクローンについて選択する。所望のサブクローンの選択の際、これらのサブクローンを増殖し、組換えポリペプチドまたは抗体をもはや発現しない（「ヌル」である）さらなるサブセットについて陰性選択を行う。前期ヌル細胞は、好ましくは１若しくはそれ以上の所望の表現型を有する。
【００２５】
本発明は、組換えタンパク質、抗体、または抗体フラグメントを発現する細胞株を得る方法を提供するものである。好ましい実施形態において、この方法は、本発明の発現ベクターによって宿主細胞を形質転換する工程と、形質転換した宿主細胞をその細胞株の新規の発現または増殖特性を促進する条件下で培養する工程と、新しい表現型を示すサブクローンについて選択またはスクリーニングする工程とを有する。本方法の好ましい用途において、形質転換された宿主細胞株は、新しい表現型を有する細胞を選択またはスクリーニングする第１工程と、所望の表現型を発現するが、組換えタンパク質または抗体ベクターをもはや発現または有していない細胞株のサブクローンを分離するために、選択マーカー配列の陰性選択を行うための第２工程との２つの選択工程でスクリーニングされる。好ましい実施形態において、前記陰性選択物質は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現する細胞に対して毒性を引き起こすことが確認されているプロドラッグである、ガンシクロビルである。
【００２６】
一部の実施形態において、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫまたはｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫベクター等の所望のタンパク質または抗体をコードする発現ベクターを有する細胞を突然変異原と共に培養し、前記細胞内の遺伝子変異の頻度を増加させてもよい。この突然変異原は、所望の改変された表現型を示す細胞の特定および選択またはスクリーニングの際に除去してもよく、所望の効果が、もともとの発現ベクターを有する細胞株を維持するか、あるいは除去するかに応じて、正または負のいずれかの選択を行うことができる。さらなる実施形態によると、目的の新しいポリペプチド、抗体、および／または抗体フラグメントをコードする核酸配列がヌル細胞に導入される。
【００２７】
従って、これらおよびその他の実施形態は、新規な発現ベクターを提供するものであり、この新規ベクターは、真核および原核細胞内でそのようなベクターをスクリーニングするために使用可能な選択マーカーに結合した抗体または治療用タンパク質をコードした核酸配列を有するものである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
本発明の目的は、真核または原核細胞での発現に望ましい組換えタンパク質または抗体をコードする核酸配列を有するベクターシステムの使用に関する方法を提供することであり、当該方法において、目的タンパク質に対してヌルである細胞を、選択条件下で特定することができる。本願明細書に記載された発明は、例えば、高力価のタンパク質を与えることのできる細胞、所望の増殖特性を有する細胞、および／または所望の特性（例えば、翻訳後修飾またはプロセシング）を有するタンパク質を産生する細胞など、所望の表現型を有する細胞を特定する際に使用するための発現ベクターシステムを含む。
【００２９】
発現ベクター
本願明細書に記載の発現ベクターは、１つもしくはそれ以上ののタンパク質をコードする１若しくはそれ以上の核酸配列の融合転写物の発現を可能にするものであり、目的のポリペプチドをコードする核酸配列または当該ベクターに対してヌルである細胞集団内において、クローンを選択するために使用可能な選択マーカーをコードする核酸配列がその後に続くか或いは先行する。ヌル細胞は、好ましくは、増強された表現型を有する。増強された表現型を有するヌル細胞は、他のタンパク質の発現に好ましいものであっても良い。
【００３０】
本発明の全開示にわたって使用される、タンパク質またはポリペプチドの用語は、２若しくはそれ以上のアミノ酸から成る分子を記載するのに使用される。
【００３１】
例えば、分泌タンパク質、非分泌タンパク質、全長抗体、または抗体フラグメントなど、目的のポリペプチドをコードする配列を含む組換え発現ベクター、および選択マーカーをコードする核酸配列が提供される。当該システムに使用可能な選択マーカーは、これらに限らないが、例えば抗生物質耐性遺伝子、ＨＳＶ−ＴＫ、ガンシクロビル選択的ＨＳＶ−ＴＫ誘導体（例えば、変性ＨＳＶ−ＴＫ、配列ＩＤ番号１）、または６−メチルプリン選択に対して細菌性プリンヌクレオシドホスホリラーゼ遺伝子（Ｇａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．７：１７３８−１７４３）等の、正および陰性選択マーカーを含む、当該技術分野で既知のものが挙げられる。さらに、前記ベクターは、形質転換された細胞の陽性選択を可能にする選択マーカー（例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子、テトラマイシン耐性遺伝子、およびペニシリン耐性遺伝子等の抗体耐性遺伝子）を有していてもよい。
【００３２】
選択マーカーまたはそのクローニング部位をコードする核酸配列は、目的のポリペプチドまたはそのためのクローニング部位をコードする核酸配列の上流または下流にあってもよい。
【００３３】
一部の実施形態において、当該ベクターは、構成的、誘導性、宿主特異性、および／または組織特異性のプロモーター等の、１若しくはそれ以上のプロモーターを有する。例えば、通常使用されるプロモーターおよびエンハンサーは、ヒトのサイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ：ＣＭＶ）、アデノウイルス２、サルウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０：ＳＶ４０）、およびポリオーマから誘導される。ウイルスゲノムプロモーター、制御および／またはシグナル配列は、適合可能な宿主細胞に依存する発現を誘発するために利用される。ハウスキーピング遺伝子由来のプロモーター（例えば、β−グロブリン、チミジンキナーゼ、およびＥＦ−１αプロモーター）も、ベクターが発現される細胞のタイプによって、使用することができる。Ｋｌｅｈｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）；Ｇｒｏｓｖｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ）。一部の実施形態においては、このベクターは、１若しくはそれ以上の目的のポリペプチドをコードする核酸配列の上流にある。一部の実施形態においては、プロモーターは、１若しくはそれ以上の目的のポリペプチドをコードする核酸配列の上流にある。一部の実施形態において、当該ベクターは、プロモーターの下流に１若しくはそれ以上のクローニング部位を有し、それぞれが１若しくはそれ以上の目的のペプチドをコードする１若しくはそれ以上の核酸分子をクローン化するのに適したポリリンカーを有する。
【００３４】
一部の実施形態において、プロモーターは、１若しくはそれ以上の選択マーカーをコードする核酸配列の上流にある。一部の実施形態において、当該ベクターは、このプロモーターの下流に、１若しくはそれ以上の選択マーカーをコードする核酸分子をクローン化するのに適したポリリンカーを有するクローニング部位を有する。
【００３５】
本発明のベクターは、１若しくはそれ以上の内部リボソーム進入部位（Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｒｉｂｏｓｏｍｅ  Ｅｎｔｒｙ  Ｓｉｔｅ（ｓ）：ＩＲＥＳ）を有する場合がある。融合ベクターがＩＲＥＳ配列を有することは、一部のタンパク質の発現を促進するのに有益である可能性がある。前記ＩＲＥＳ配列は、選択的圧力下では、遺伝子の発現を安定化するように見える（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）。しかしながら、前記ＩＲＥＳ配列は、下流の配列の高発現レベルを達成するためには必要ではない。内部リボソーム進入部位は、多数のウイルスおよび細胞ＲＮＡで発見される制御要素である（ＭｃＢｒａｔｎｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：９６１において概説）。ＩＲＥＳは、結合した発現カセットにおける下流の遺伝子産物の翻訳を促進するのに有用である（Ｋａｕｆｍａｎ  Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９：４４８５）。複数の転写物の発現に使用される内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を含む発現ベクターは、これまでにも記載されている。Ｋｉｍ  ａｎｄ  Ｗｏｌｄ  （１９８５）  Ｃｅｌｌ  ４２：１２９；Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）；Ｍｏｓｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）；Ｓｕｂｒａｍａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１：８５４。その他のＩＲＥＳ系ベクターとして、例えば、アデノウイルス三者間リーダーとＤＨＦＲｃＤＮＡとの間でクローン化した、マウスの脳心筋炎ウイルス由来のＩＲＥＳを含むｐＣＤＥベクター（Ｊａｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｍｍｅｒ，（１９９０）Ｇｅｎｅｓ  ａｎｄ  Ｄｅｖ．４：１５６０）が挙げられる。好ましい実施形態においては、このベクターは、目的のポリペプチドまたはそのクローニング部位をコードする核酸配列と、選択マーカーまたはそのためのクローニング部位をコードする核酸配列との間にＩＲＥＳを有する。
【００３６】
前記発現ベクターは、さらに、タンパク質、または抗体をコードする核酸配列間で、あるいは発現の望ましい核酸配列に先行して、ＩＲＥＳ配列を有することができる。
【００３７】
一部の実施形態においては、当該ベクターシステムは、前述のいずれの核酸配列の上流または下流にある可能性のある、１若しくはそれ以上のポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０）を含む。
【００３８】
目的のポリペプチドをコードする核酸配列の翻訳領域（ｏｐｅｎ  ｒｅａｄｉｎｇ  ｆｒａｍｅ：ＯＲＦ）は、好ましくは、選択マーカーをコードする核酸配を有するインフレームである。このベクター成分は、隣接して結合しているか、または遺伝子産物を発現するための最適スペーシングを与えるように（すなわち、ＯＲＦ間で「スペーサー」ヌクレオチドの導入により）配列、あるいは別の方法で位置づけされている可能性がある。ＩＲＥＳモチーフ等の制御要素を、発現のために最適な間隔を与えるように配列することもできる。
【００３９】
本発明のベクターは、好ましくは、陰性選択マーカーに加えて、陽性選択マーカーを有する。このようなプラスミドによって形質移入された細胞は、陽性選択条件下において選択され、その後組換えタンパク質発現についてスクリーニングすることができる。組換え正細胞は、増殖され、所望の表現型を示すサブクローンについてスクリーニングされる。
【００４０】
本発明の組換え発現ベクターは、好適な制御要素に作動するように結合した、少なくとも１つの組換えタンパク質および選択マーカーをコードする、合成、ゲノムの、またはｃＤＮＡ由来の核酸フラグメントを含む。このような制御要素は、転写プロモーター、好適なｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列、および転写および翻訳の終結を制御する配列を有することができる。発現ベクター、特に哺乳類の発現ベクターもまた、複製の開始点、発現する遺伝子に結合した適切なプロモーターおよびエンハンサー等の、１若しくはそれ以上の非転写要素、その他の５’または３’隣接非転写配列、（必要なリボソーム結合部位等の）５’または３’非翻訳配列、ポリアデニル化部位、スプライスドナー、および受容体部位、または転写終了配列も含む。宿主に複製能力を付与する複製起点も、組み込むことができる。
【００４１】
脊椎動物細胞の形質転換に使用される発現ベクター中の転写および翻訳制御配列は、ウイルス源により提供されるものであってもよい。典型的なベクターは、Ｏｋａｙａｍａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｇ（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０に記載されるように、構成される。
【００４２】
本発明の一部の実施形態は、１若しくはそれ以上のタンパク質または抗体をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供し、下流で１若しくはそれ以上の選択マーカーが続き、１若しくはそれ以上のＩＲＥＳ配列が下流で続く。一部の実施形態において、前記発現ベクターは、１若しくはそれ以上の選択マーカーをコードする核酸配列を有しており、下流に１若しくはそれ以上のＩＲＥＳが続き、これは順番に、下流で１若しくはそれ以上のタンパク質または抗体核酸配列が続く。好ましい実施形態において、前記発現ベクターは、さらに、例えば、目的タンパク質または抗体の発現を引き起こすプロモーター／エンハンサーを有する。
【００４３】
好ましい実施形態においては、前記発現ベクターは、目的タンパク質、抗体、または抗体フラグメントをコードする第１の核酸配列、および１若しくはそれ以上のＩＲＥＳで第１の核酸配列より分離されている、選択マーカーをコードする第２の核酸配列を有する。
【００４４】
特に、図１Ａおよび１Ｂに示すように、目的のポリペプチドおよび／または抗体と、ＨＳＶ−ＴＫ陰性選択マーカー（それぞれｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫおよびｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫ）とをコードする核酸配列を有するベクターである。前記ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫプラスミドは分泌または非分泌ポリペプチドをコードする核酸配列を含み、下流にＩＲＥＳシグナル、及び単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ：ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子由来の陰性選択マーカーとを有する。前記ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫプラスミドは、ＩＲＥＳが後に続く全長または切断型の軽鎖または重鎖免疫グロブリンをコードする核酸分子と、第２のＩＲＥＳがその後に続く全長または切断型の軽鎖または重鎖免疫グロブリンをコードする核酸分子と、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ＴＫ）遺伝子由来の陰性選択マーカーをコードする核酸分子とを有する。これらのベクターは、真核細胞に形質移入された場合、機能性全長タンパク質、またはそのフラグメントを産生する。本願明細書において開示される典型的なベクターは、因子ＩＸ（配列ＩＤ番号２および３）などの分泌ポリペプチド、抗体（配列ＩＤ番号４、５、６、および７）、およびＨＳＶ−ＴＫ遺伝子（配列ＩＤ番号１）をコードするｃＤＮＡ配列を用いて設計した。
【００４５】
ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子の配列、および所望の表現型を有する細胞をスクリーニングするために使用可能な組換え遺伝子の例は、以下のものを含む。
【００４６】
【表１−１】
2008539785.tif 000003
【００４７】
【表１−２】
2008539785.tif 000004
【００４８】
【表２】
2008539785.tif 000005
【００４９】
【表３】
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【００５０】
【表４】
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【００５１】
【表５】
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【００５２】
【表６】
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【００５３】
【表７】
2008539785.tif 000010
【００５４】
宿主細胞
真核および原核細胞を含む細胞は、本発明の発現ベクターを用いて形質転換することができる。従って、本発明の別の実施形態は、本発明の発現ベクターを用いて形質転換した宿主細胞を提供する。本発明の細胞は、好ましくは真核細胞であり、より好ましくは、植物、齧歯動物、ヒト起源であり、例えば、ＮＳＯ、ＣＨＯ、ｐｅｒＣ．６、Ｔｋ−ｔｓ１３、ＢＨＫ、またはＨＥＫ２９３細胞等である。
【００５５】
細胞における本発明のベクターの発現は、例えば、所望の増殖特性を示す細胞といった、１若しくはそれ以上の目的の表現型を有する細胞、または所望の表現型を有するタンパク質についてのスクリーニングを可能にする。このような所望の表現型には、とりわけ、高増殖速度、栄養また血清の少ない必要条件、低い凝集性、高密度での増殖、抑制されたアポトーシスを有する細胞、組換えタンパク質の高力価を与える細胞、プロセシングまたは切断により改変されたタンパク質型、改変された翻訳後部分、および／または改変された２次折りたたみアイソフォームを含む。新規の１つの表現型または複数の表現型を示す細胞が誘発されるとこの細胞が増殖し、例えば、選択によって、目的のポリペプチドをコードする組換え核酸配列をもはや発現しないサブクローンが選択される。この結果、この誘発細胞は、その他のタンパク質、抗体、または抗体フラグメントの発現に好適である。
【００５６】
「形質転換した宿主細胞」とは、本発明の発現ベクターが導入された細胞を意味する。形質転換した宿主細胞を作成するために、様々な細胞培養システムが利用でき、適切なベクターを発現できるすべての細胞株が使用可能である。好適な宿主哺乳類細胞株の例として、特に、Ｇｌｕｚｍａｎ（１９８１）Ｃｅｌｌ  ２３：１７５により記載されているようなサルの腎臓細胞のＣＯＳ−７株が挙げられ、その他の好適な細胞株として、特に、ＨＥＫ２９３（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）、Ｔ９８Ｇ，ＣＶ−１／ＥＢＮＡ、Ｌ細胞（Ｈｏｌｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８））、Ｃ１２７、３Ｔ３，チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（Ｗｅｉｄｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）），ＨｅＬａ，ＴＫ−ｔｓ１３（Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８））、ＮＳ１、Ｓｐ２／０骨髄腫細胞、およびＢＨＫ細胞株が挙げられる。
【００５７】
他の方法も処置した細胞または組織の十分なフラクションを、ポリヌクレオチドに取り込む範囲で適用できるが、一般に形質転換は、複数または単一細胞の懸濁液を用いて実行され、これによって形質転換した細胞を成長および利用することが可能となる。形質転換の手法はよく知られている。一部の形質転換手順は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｋａｕｆｍａｎ（１９８８）Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５：５３７を参照。当業者によって容易に理解されるように、適切な形質転換手順は、宿主細胞の種類、および目的の遺伝子の性質により決定される。このような手順の全ての基本要素として、目的タンパク質をコードする核酸配列を好適な宿主細胞に導入し、その後安定で発現可能な方法で、ベクターＤＮＡを取り込んだ宿主細胞を特定および単離することを含む。ポリヌクレオチドを導入する技術としては、これらに限らないが、電気穿孔法、形質導入、細胞融合、塩化カルシウムの使用、および目的細胞との融合のために、脂質とともにポリヌクレオチドをパッケージングすることが挙げられる。選択可能なマーカー遺伝子が複数の細胞世代に対して一定レベルで発現されるように、形質転換が安定であれば、株化細胞が得られる。
【００５８】
特に哺乳類細胞に形質移入するための１つの一般的な方法は、Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）に記載されているような、リン酸カルシウム沈殿である。別の方法は、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ：ＰＥＧ）誘導型の細菌プロトプラストの哺乳類細胞との融合である。Ｓｃｈａｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：２１６３。さらに別の方法は、例えば、Ｐｏｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：７１６１に記載されているように、宿主細胞の細胞質にＤＮＡを直接導入するのに使用される電気穿孔法である。
【００５９】
ＤＮＡの形質移入は、培養された細胞に適用する場合、核酸の細胞への取り込みを促進する脂質−核酸複合体（またはリポソーム）を形成する、リポフェクチン、リポフェクタミン（米国メリーランド州Ｇａｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬより入手可能）等のポリリポソーム試薬を使用して実行することも可能である。
【００６０】
細胞が形質移入されると、貯蔵（ｐｏｏｌ）が選択され、発現ベクターを取り込んだ細胞が特定される。有用な優性選択可能なマーカーとしては、これらに限らないがネオマイシン、カナマイシン、テトラマイシン、ハイグロマイシン、またはペニシリン等への耐性を与える抗体耐性遺伝子が挙げられる。
【００６１】
形質移入された細胞は、多くの方法によって選択される。当該ベクターが抗体耐性遺伝子も有する細胞については、この細胞は、当該ベクターを含む細胞について陽性選択を行う抗体耐性について選択することができる。別の実施形態において、前記細胞は、選択的な条件下で成長することができ、さらに突然変異原を用いて処理することにより変異速度を増大させることが可能であり、例えば目的の１つ若しくは複数の遺伝子の改変された表現型の特徴の存在に基づいて、或いは細胞株の特性に応じて選択することが可能である。一旦、目的の表現型を実現すると、この細胞は、ヌル細胞が得られるように陰性選択遺伝子に基づいて陰性選択を行うことができる。本開示全体に渡って使用される「ヌル細胞」の用語は、先に導入された組換えタンパク質をもはや発現しない細胞または細胞集団を意味する。発現欠失は、その組換えベクターの完全欠失、または組換えタンパク質がもはや産生されないようなベクターの部分的欠失による可能性がある。
【００６２】
タンパク質を産生するクローンが一旦特定されると、その細胞株は、高力価発現、増強された増殖特性、および／または、例えばタンパク質修飾、および／または改変された翻訳五修飾による、所望の生化学的特性を有するタンパク質を生じる能力等の、１若しくはそれ以上の所望の表現型を有するサブクローンを特定するために、さらにスクリーニングされる。
【００６３】
これらの表現型は、所定のサブクローン固有の特性または突然変異生成による場合がある。突然変異生成は、薬品、ＵＶ波長光、放射線放射、ウイルス、挿入性突然変異原、欠陥ＤＮＡの修復、またはこれら方法の組み合わせを使用することにより達成することができる。
【００６４】
１若しくはそれ以上の所望の特徴を有する抗体、抗体フラグメント、またはポリペプチドを与える細胞株が一旦特定されると、この細胞株は、目的のポリペプチドを含む核酸分子をもはや含まないクローンを特定するための選択条件下におくことができる。例えば、ＨＳＶ−ＴＫ選択マーカーを有する細胞は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現する細胞内で毒性ヌクレオシド類似体に変換されるプロドラッグであるガンシクロビル（ＧＣＶ）で処理される（Ｃａｒｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ９４：８１−８８）。目的のポリペプチドおよびＨＳＶ−ＴＫは、同じ転写物から産生されるため、ＧＣＶ処理で残存するクローンは、融合転写物を発現せず、目的のポリペプチドに対してヌルである。このヌル細胞は、他のタンパク質、抗体、または抗体フラグメントを産生するために使用可能である。このヌル細胞は、好ましくは、所望の表現型、例えば、高力価発現、増強された増殖特性、および／または、例えばタンパク質修飾および／または改変された翻訳後修飾により、所望の生化学的特性を有するタンパク質を与える能力を有する。
【００６５】
目的のポリペプチドをコードする融合転写物および選択マーカーの使用は、分泌ポリペプチド、非分泌ポリペプチド、および／または他のタンパク質または抗体産生物の産生に使用するための抗体を産生する細胞についてスクリーニングするために、組換え発現ベクターを使用する組換え法に対して有益である。
【００６６】
別の実施形態において、組換えペプチドをコードする核酸配列に対してヌルである細胞を特定するための方法が提供される。ポリペプチドまたは抗体をコードするベクターを標的細胞に導入し、細胞株を陽性選択により、当該ベクターの取り込みについて選択する。貯蔵物（ｐｏｏｌ）を作成し、目的のポリペプチドを発現し、１若しくはそれ以上の所望の表現型を示すサブクローンについて選択する。所望のサブクローンを選択する際に、これらのサブクローンを増殖し、その後、組換えポリペプチドまたは抗体をもはや発現しない（「ヌル」の）さらなるサブセットについて陰性選択を行う。このヌル細胞は、好ましくは所望の表現型を有する。
【００６７】
本発明は、組換えタンパク質、抗体、または抗体フラグメントの産生のための表現型を示す細胞株を得るための方法を提供する。この方法は、本発明の発現ベクターを宿主細胞を形質転換する工程と、形質転換した宿主細胞をその細胞株の新規の発現または増殖特性を促進する条件下で培養する工程と、新しい表現型を示すサブクローンについて選択またはスクリーニングする工程とを有する。本方法の好ましい応用においては、形質転換された宿主細胞株は、新しい表現型を有する細胞について選択またはスクリーニングする第１の工程と、所望の表現型を発現するが、組換えタンパク質または抗体ベクターをもはや発現または有していない細胞株のサブクローンを分離するための選択マーカー配列の陰性選択のための第２の工程から成る、２つの選択工程によりスクリーニングされる。最も好ましい実施形態においては、陰性選択薬は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子を発現する細胞に対して毒性を生じることが示されているプロドラッグである、ガンシクロビルである。
【００６８】
一部の実施形態において、例えばｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫまたはｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫベクター等の所望のタンパク質または抗体をコードする発現ベクターを有する細胞は、細胞内での遺伝子変異の頻度を増大させるために、突然変異原で培養することができる。前記突然変異原は、所望の変更された表現型を示す細胞の特定および選択またはスクリーニングの際に除去してもよく、所望の効果が元の発現ベクターを含む細胞株を維持または除去するための効果であるかによって、正または陰性選択のいずれかが行うことができる。さらなる実施形態においては、目的の新しいポリペプチド、抗体、および／または抗体フラグメントをコードする核酸配列をヌル細胞に導入する。
【００６９】
以下の参考文献は、関連する背景技術に関するさらなる情報を得るために閲覧され、これら参考文献の全内容はこの参照により本願明細書中に完全に組み込まれる。
【００７０】
１）Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８：１６３５−１６４１
２）Ｎｉｃｏｌａｉｄｅｓ，Ｎ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９４：１３１７５−１３１８０
３）Ｇｒａｓｓｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７３：２４０１６−１４０４
４）Ｇｒｏｓｖｅｌｄ，Ｆ．ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ５１：９７５−９８５
５）Ｈｏｌｓｔ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ５２：３５５−３６５
６）Ｋａｕｆｍａｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  ｒｅｓ．１９（１６）：４４８５−４４９０，１９９１
７）Ｋｌｅｈｒ，Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（１９３３）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ３０：１２６４−１２７０
８）ＭｃＢｒａｔｎｅｙ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．５：９６１−９６５
９）Ｗｅｇｎｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６５（２３）：１３９２５−１３９３２
１０）Ｗｅｉｄｌｅ，Ｕ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ６６：１９３−２０３
１１）Ｃｈｅｎ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２９５：４９−５６
１２）Ｙｏｏｎ，ＳＫ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｐｒｏｇ．２０：１６８３−１６８８
１３）Ｂｏｈｍ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．８８：６９９−７０６
１４）Ｇｒａｓｓｏ，Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  Ｉｎｔｌ．  ２：５８−６４
上記の開示内容は、本発明の特定の観点を一般的に記載しているものである。さらなる情報は、以下の具体的な実施例を参照することにより得ることができるが、これらは、本願明細書における説明目的のためのみに提供されるものであり、本発明の範囲を限定する意図はないものである。
【実施例１】
【００７１】
組換えタンパク質／陰性選択融合の操作
増殖および／産生に関して望ましい特性を有する宿主細胞についてスクリーニングするための組換えタンパク質／選択マーカー融合物の機能性を実証するために、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫおよびｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫベクターをそれぞれ作成した。下流で複数のポリリンカークローニング部位および１つのＳＶ４０ポリアデニル化シグナルに続く、ＣＭＶプロモーターを有するｐＣＭＶベクターを、優性の陽性選択可能なマーカーとして、構成的に発現されたネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子とともに主鎖として使用した。このｐＣＭＶカセットは、ポリリンカー領域内でクローン化された脳心筋炎ウイルス（ＥＣＭＶ）由来の内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）を有していた。因子ＩＸｃＤＮＡまたはその他のｃＤＮＡをコードする組換え遺伝子を、ＩＲＥＳ配列の上流にあるＥｃｏＲＩ−ＸｂａＩ部位へとクローン化した。修飾したＨＳＶ−ＴＫ遺伝子（配列ＩＤ番号１）をＩＲＥＳ配列の下流に挿入した。抗体産生を与えるために、組換え抗体配列ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫを、全長軽鎖ｃＤＮＡ（配列ＩＤ番号４）、およびＩＲＥＳにより分離された全長重鎖ｃＤＮＡ（配列ＩＤ番号６）を組換え遺伝子クローニング部位に導入することにより、作成した。このベクターは、他の抗体遺伝子の発現も生じた。図１は、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫ（図１Ａ）およびｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫ（図１Ｂ）を描く図である。
【実施例２】
【００７２】
組換え遺伝子／陰性選択融合ベクターからのタンパク質発現細胞の作成
陰性選択マーカーに融合した組換えタンパク質発現ベクターを、増強された表現型を示す細胞を選択する手段として使用できる能力を実証するため、全長抗体を有するｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫプラスミドを細胞株に形質移入した。１実施形態においては、哺乳類細胞を製造業者の仕様書に従って、電気穿孔法により形質移入した。形質移入した貯蔵（ｐｏｏｌ）は、発現ベクターを有するクローンを選択するため、０．４ｍｇ／ｍｌのＧ４１８（ネオマイシン類似体）中で１０〜１４日間選択した。次に、細胞を組換えタンパク質（免疫グロブリン、本願明細書においてはＩｇと称する）発現に関するウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡモニタリングにより、遺伝子発現について分析した。ウエスタンブロットについては、ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫ培養物由来の５０，０００個の細胞または対照試料を遠心分離し、その後１５０μｌの２ｘＳＤＳ緩衝液中に再懸濁した。その後、培養物をウエスタンブロットにより、抗体発現について分析した。ウエスタンブロットは、以下のようにして実施した。５０μｌのｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫを形質移入した、または空のベクター培養物を２ｘ溶解緩衝液（６０ｍＭトリス、ｐＨ６．８、２％ＳＤＳ，１０％グリセロール、０．１Ｍ  ２−メルカプトエタノール、０．００１％ブロモフェノールブルー）に直接溶解し、試料を５分間煮沸した。溶解物のタンパク質は、４〜２０％のトリスグリセリンゲル（Ｎｏｖｅｘ）上で電気泳動により分離した。ゲルを４８ｍＭトリス塩基、４０ｍＭグリシン、０．０３７５％ＳＤＳ，２０％メタノール中で、Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）上に電気ブロットし、トリス緩衝化生理食塩水に０．０５％Ｔｗｅｅｅｎ−２０および５％粉ミルクを加えた溶液中、４℃で一晩ブロッキングした。抗ヒトの免疫グロブリン（Ｉｇ）として作成されたモノクローナルマウス抗体、続いて、２次ヤギ抗マウス西洋ワサビ過酸化酵素結合型抗体で精査した。２次抗体をインキュベーションした後、ブロットを化学発光（Ｐｉｅｒｃｅ）で展開し、Ｉｇ発現を測定するためフィルムに曝した。これらのデータは、形質移入した細胞（図２、レーン２）および親細胞（図２、レーン２）由来のヒトＩｇの分泌についてＥＬＩＳＡモニタリングを実施することで確認した。ＥＬＩＳＡ法は、Ｇｒａｓｓｏら（２００４）の方法に従って実施した。簡潔に述べると、細胞を９６穴プレートに蒔き、２４〜７６時間成長させた。一定分量の上澄みを分離し、９６穴の試験用プレート中でインキュベートした。上澄みをマウス抗ヒトＩｇ抗体、続いてＨＲＰ結合型抗マウス抗体を検出に用いて、ＥＬＩＳＡで定量化した。Ｉｇ含量を、基質転換の関数として決定し、分光光度法によりとらえた。
【００７３】
親細胞またはｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫで形質移入した細胞のＥＬＩＳＡ分析は、ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫ形質移入細胞の強力な抗体レベルの産生能力をチャイニーズハムスター卵巣細胞において実証した。図２は、ＥＬＩＳＡによる親（レーン１）またはｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫ形質移入（レーン２）ＣＨＯ細胞の代表的なＩｇ値を示す。このデータは、ＯＤ単位で示している。
【実施例３】
【００７４】
組換え遺伝子／選択マーカー融合ベクター由来の陰性選択されたサブクローンの作成
実施例２に記載のようなＩｇを発現する選択されたクローンを増殖し、例えば高力価を発現、または好ましい成長プロファイルを示す所望のサブクローンを特定するために、単一細胞クローンとして成長させる。所望の表現型を示す細胞が特定されると、サブクローンを増殖し、最適化された細胞宿主由来の他のタンパク質または抗体を産生するために使用できる増強された表現型を有するクローンを与えて、その後発現ベクターに対してヌルである細胞について陰性選択を行う。
【００７５】
所望の表現型を示すヌル細胞の集団を得るためには、元の組換え遺伝子の発現を除去するか、あるいは完全に抑制することを望むであろう。例えば、ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫ培養物は、ＨＳＶ−ＴＫ遺伝子産生物を発現する細胞を殺すプロドラッグであるガンシクロビル（Ｓｉｇｍａ社）の存在下で５日間成長する。５日間の陰性選択後、９５％を越える細胞が死滅する成長培地のみで細胞をさらに１０日間成長させる。耐性クローンをその後取り出し、１０ｃｍのペトリ皿中で増殖させる。細胞を３週間成長させ、その後一部を、例えば、ウエスタンブロット、ＲＴ−ＰＣＲ，および／またはＰＣＲにより、組換えタンパク質発現について再分析する。ＤＮＡを、例えばＧｒａｓｓｏら（１９９８）によって記載された方法に従って、ｐＩＲＥＳベクターの存在または非存在を特異的に検出できるようなセットのプライマーを用いて、ＰＣＲにより、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫまたはｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫベクターの存在について分析する。
【００７６】
図３は、ガンシクロビル耐性細胞において観察される典型的な結果を示している。陰性選択したクローンの分析は、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫベクターの損失を示した（図３、レーン２）のに対し、ベクターの存在は無処置の培養物（図３、レーン１において矢印で示すように）で観察された。図３は、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫで形質移入された１つまたは複数の親細胞の分析を示しており、ヌル細胞産生能力を示している。図示されているのは、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫベクターを有するＣＨＯ細胞由来のＤＮＡのガンシクロビルによる陰性選択の前後での典型的な評価を示す。
【００７７】
ヌルのサブクローンのさらなる遺伝解析は、陰性選択の際に、得られるクローンは通常その全てのベクター配列を失い、これによって細胞がネオマイシン選択に対して（データー図示せず）再び過敏になっていることを実証している。これらの細胞は、現在組換えタンパク質、抗体、またはこれらの誘導体の産生のための全ての種類の発現ベクターの導入に好適である。本発明の発現ベクターの損失に続いて導入されるこの発現ベクターは、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫまたはｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫに対して示される構造を有するか、またはこれらのベクターの構成成分の一部のみ有しているか、あるいは全く異なる可能性がある。
【００７８】
本書類において引用または記載した各特許、特許出願、および出版物は、この参照により本願明細書に完全に組み込まれる。
【００７９】
当業者であれば、本発明の好ましい実施形態に多くの変更または修正を加えることが予測可能であり、このような変更および修正は本発明の要旨から逸脱せずに行うことが可能である。従って、添付の請求項はそのようなすべての同等な変形例を本発明の要旨の範囲内となるように網羅することを意味するものである。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】図１は、典型的な調節発現ベクターの概略図を示した図である。図１Ａは、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫを示す。図１Ｂは、ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫを示す。略語は以下の意味を有する。「ｐｒｏ」はプロモーター、「ｎｅｏ」は、Ｃ終端で融合したネオマイシンリン酸転移酵素遺伝子、「組み換えポリペプチド」はヒト因子ＩＸｃＤＮＡ、「Ｉｇ重鎖」は免疫グロブリン重鎖ｃＤＮＡのクローニング部位、「Ｉｇ軽鎖」は免疫グロブリン軽鎖ｃＤＮＡのクローニング部位、「ＲＥＳ」は内部リボソーム進入部位、「ｐＡ」は、ポリアデニル化部位、「ｎｅｇ  ｍｒｋ」は、修飾された単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子等の陰性選択マーカーを意味する。
【図２】図２は、親細胞（レーン１）と、陰性選択前に強い抗体レベルを発生する能力を示す、ｐＩＲＥＳ−ＭＡＢ−ＴＫで形質移入した細胞（レーン２）のＥＬＩＳＡ分析である。
【図３】図３は、陰性選択後に、ヌルｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫ細胞を産生する能力を示す、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫで形質移入した細胞のゲノム分析である。図において、ガンシクロビルによる陰性選択前後における、ｐＩＲＥＳ−ｐｒｏ−ＴＫベクターを有するＣＨＯ細胞由来のゲノムＤＮＡを示している。予備選択細胞由来のＤＮＡ（レーン１）は、ベクター特異性ＰＣＲフラグメントによって決定されるように、ベクターに対して正であるのに対し、陰性選択後に誘発された細胞は、当該ベクターに対してヌルであった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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