(57)【要約】  本発明は、宿主細胞中の目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列の単離のための改善された発現クローニング法において非常に適したプロモーターＤＮＡ配列と、このプロモーターが使用される改善された発現クローニング法とに関する。単離したＤＮＡ配列は、目的のタンパク質を産生するための方法において有用である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４に存在するＤＮＡ配列、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列に対して少なくとも５０％相同のＤＮＡ配列、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ配列のいずれかの変異体、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれかの部分配列
などのプロモーターＤＮＡ配列。
【請求項２】
選択可能な形質を与えるレポーター遺伝子、好ましくは選択マーカー遺伝子と作用的に関連する請求項１に記載のプロモーターＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物。
【請求項３】
前記ＤＮＡ構築物が宿主細胞のゲノム中の所定の標的座位のＤＮＡ配列と相同であるＤＮＡ断片を含み、好ましくは、前記所定の標的座位が高発現遺伝子を含む、請求項２に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
【請求項４】
前記ＤＮＡ構築物が宿主細胞中で自律的な維持能力があり、好ましくは、前記ＤＮＡ構築物がＡＭＡ１−配列を含む、請求項２に記載のＤＮＡ構築物を含む発現ベクター。
【請求項５】
請求項２に記載のＤＮＡ構築物もしくは請求項３または４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項６】
１つまたは複数の目的のタンパク質を産生することができると考えられる生物体からのＤＮＡライブラリーに由来するコード配列を含むＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物をさらに含む請求項５に記載の宿主細胞。
【請求項７】
前記宿主細胞が、原核生物または真核生物である請求項５または６に記載の宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞が、以下のリスト：バシラス、酵母または糸状菌、好ましくはアスペルギルス、ペニシリウムまたはトリコデルマ種から選択される請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記アスペルギルスが、アスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・ソーヤまたはアスペルギルス・オリゼー種である請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
宿主細胞中の目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を単離するため方法であって、
（ａ）選択可能な形質を与えるレポーター遺伝子と作用的に関連するプロモーターＤＮＡ配列を含む第１のＤＮＡ構築物を調製するステップであって、前記ＤＮＡ構築物が宿主細胞中に存在する場合、そして目的のタンパク質、好ましくは目的の分泌タンパク質が宿主細胞によって産生される場合に前記プロモーターＤＮＡ配列が誘発されるステップと、
（ｂ）１つまたは複数の目的のタンパク質を産生することができると考えられる生物体からのＤＮＡライブラリーに由来する目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を含む第２のＤＮＡ構築物を調製するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）およびステップ（ｂ）において調製されたＤＮＡ構築物の両方で宿主細胞を形質転換するステップと、
（ｄ）ＤＮＡライブラリー中に存在する目的のタンパク質の産生に寄与する条件下で、ステップ（ｃ）において得られた形質転換宿主細胞の全てを培養するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において産生されたタンパク質の分析によって、目的のタンパク質を産生する形質転換宿主細胞をスクリーニングするステップと
を含む方法。
【請求項１１】
前記宿主細胞が、初めにステップ（ａ）において調製されたＤＮＡ構築物で形質転換され、引き続きステップ（ｂ）において調製されたＤＮＡ構築物で形質転換される請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ａ）において使用される前記プロモーターが、請求項１に記載のプロモーターである請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
目的のタンパク質を産生することができると考えられる前記生物体が、真核生物または原核生物である請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記目的のタンパク質が酵素である請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
［発明の分野］
本発明は、発現クローニングによって目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を同定するための方法において使用されるのに非常に適したプロモーターに関する。
【０００２】
［発明の背景］
発現クローニングに基づくスクリーニング方法の数が増大していることは、既に知られている。このような方法は、これまで、例えばバシラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）（米国特許第４，４６９，７９１号明細書、国際公開第２００５／３８０２４号パンフレットを参照）および大腸菌（例えば、国際公開第９５／１８２１９号パンフレットおよび国際公開第９５／３４６６２号パンフレット）において、原核生物の遺伝子産物を同定するためにうまく使用されている。国際公開第２００５／３８０２４号パンフレットには、組換えバシラス細胞を分泌するタンパク質をスクリーニングする方法が記載されている。しかしながら、この方法は、高処理自動検出技術が欠けている。また酵母は、真核生物遺伝子の発現クローニングのための宿主として使用されている。ストラッサー（Ｓｔｒａｓｓｅｒ）ら（Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８９年）１８４：６９９−７０６頁）は、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における真菌ゲノムＤＮＡの発現クローニングによる真菌α−アミラーゼの同定について報告している。同様に、国際公開第９３／１１２４９号パンフレットには、Ｓ．セレビシエにおける真菌ｃＤＮＡの発現クローニングによる真菌セルラーゼの同定が報告される。最後に、糸状菌における発現クローニング法が記載されている（国際公開第９９／３２６１７号パンフレット）。
【０００３】
これら全ての方法において、多数の形質転換体は、目的の特性を有するタンパク質を分泌する形質転換体が単離される前にスクリーニングされる必要があり得る。従って、分泌タンパク質をコードするＤＮＡ配列を検出する機会を最適化し得る発現クローニング法が必要とされている。
【０００４】
［発明の説明］
プロモーターＤＮＡ配列
本発明の第１の態様によると、
（ａ）以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４に存在するＤＮＡ配列、
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができるＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列に対して少なくとも５０％相同のＤＮＡ配列、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ配列のいずれかの変異体、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれかの部分配列
などのプロモーターＤＮＡ配列が提供される。
【０００５】
好ましい実施形態によると、本発明のプロモーター配列は、
（ａ）以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４に存在する１つのＤＮＡ配列
（ｂ）（ａ）のＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができる１つのＤＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）のＤＮＡ配列に対して少なくとも５０％相同の１つのＤＮＡ配列、
（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のＤＮＡ配列のいずれかの１つの変異体、または
（ｅ）（ａ）〜（ｄ）のＤＮＡ配列のいずれかの１つの部分配列
などの１つのプロモーターＤＮＡ配列である。
【０００６】
本出願との関連では、プロモーターＤＮＡ配列は、このプロモーターＤＮＡ配列がコード配列と作用的に関連する場合にこのコード配列の発現を制御することができるＤＮＡ配列である。「作用的に関連する」という用語は、本明細書では、プロモーターＤＮＡ配列がコード配列によりコードされたポリペプチドの産生を指示するように、プロモーターＤＮＡ配列がコード配列に対する位置に適切に配置された立体配置であると定義される。
【０００７】
「コード配列」という用語は、本明細書では、適切な制御配列の制御下に置かれたときにポリペプチドに翻訳されるｍＲＮＡに転写される核酸配列であると定義される。コード配列の境界は一般に、通常はｍＲＮＡの５’末端におけるオープンリーディングフレームの開始点であるＡＴＧ開始コドンと、ｍＲＮＡの３’末端におけるオープンリーディングフレームのすぐ下流側に位置する転写ターミネーター配列とによって決定される。コード配列は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成、合成および組換えの核酸配列を含むことができるが、これらに限定されない。好ましくは、プロモーターＤＮＡ配列は、それに関連するコード配列の上流側に位置するＤＮＡ配列であることによって、そしてこのコード配列の発現を制御可能であることによって定義される。
【０００８】
より具体的には、「プロモーター」という用語は、本明細書では、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、ポリペプチドをコードするコード配列の正しい下流側転写開始部位へポリメラーゼを方向付けて、転写を開始させるＤＮＡ配列であると定義される。ＲＮＡポリメラーゼは、コード領域の適切なＤＮＡ鎖に相補的なメッセンジャーＲＮＡの構築を有効に触媒する。また、「プロモーター」という用語は、ｍＲＮＡへの転写後の翻訳のための５’非コード領域（プロモーターと翻訳開始点との間）、エンハンサーなどのシス作用性の転写制御要素、および転写因子と相互作用をすることができる他のヌクレオチド配列を含むと理解されるであろう。
【０００９】
好ましい実施形態では、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４に由来するＤＮＡ配列である。
【００１０】
もう１つの好ましい実施形態によると、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、以下のリスト：配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４に存在するＤＮＡ配列とハイブリダイズすることができ、それでもプロモーター活性を保持し得るＤＮＡ配列である。
【００１１】
プロモーター活性は、好ましくは、プロモーターと作用的に関連するコード配列の発現の結果として産生されるタンパク質の濃度を測定することによって決定される。あるいは、プロモーター活性は、プロモーターと作用的に関連するコード配列によってコードされるタンパク質の酵素活性を測定することによって決定される。好ましい実施形態によると、プロモーター活性（およびその強度）は、ｌａｃＺレポーター遺伝子のコード配列の発現を測定することによって決定される（ルオ（Ｌｕｏ）、Ｇｅｎｅ  １６３（１９９５年）１２７−１３１頁またはパーキンス（Ｐｅｒｋｉｎｓ）およびヤングマン（Ｙｏｕｎｇｍａｎ）（１９８６年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：１４０頁、またはバグネル（Ｖａｇｎｅｒ）ら（１９９８年）Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４４：３０９７頁）。もう１つの好ましい実施形態によると、プロモーター活性は、コード配列として緑色蛍光タンパク質を用いることによって決定される（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、１９９９年３月、１４５（Ｐｔ３）：７２９−３４頁、サンテール・ヘンリクセン（Ｓａｎｔｅｒｒｅ  Ｈｅｎｒｉｋｓｅｎ）ＡＬ、エベン（Ｅｖｅｎ）Ｓ、ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）Ｃ、パント（Ｐｕｎｔ）ＰＪ、バン・デン・ホンデル（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）ＣＡ、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）Ｊ．スタディ（Ｓｔｕｄｙ））。細菌細胞において、ＧＦＰおよび他の蛍光タンパク質は、発現および（動的）タンパク質局在化の研究のために広範囲にわたって使用されている（サウスワード（Ｓｏｕｔｈｗａｒｄ）およびサレット（Ｓｕｒｅｔｔｅ）（２００２年）Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：１１９１頁においてレビューされる）。さらに、プロモーター活性は、プロモーターの制御下で発生される転写物のｍＲＮＡレベルを測定することによって決定することができる。ｍＲＮＡレベルは、例えば、ノーザンブロット、ジーンチップ（ＧｅｎｅＣｈｉｐ）ＴＭ（アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ））またはスポット状アレイ技術または定量的（リアルタイム）ＰＣＲによって測定することができる（Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、２００１年、分子クローニング、実験室マニュアル、第３版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク）。最も好ましくは、プロモーター活性は、ノーザンブロットを用いるｍＲＮＡ分析によって決定される。
【００１２】
好ましくは、本発明の（単離）プロモーターＤＮＡ配列は、非常に低いストリンジェンシー条件下、より好ましくは低いストリンジェンシー条件下、より好ましくは中程度のストリンジェンシー条件下、より好ましくは中程度〜高いストリンジェンシー条件下、さらにより好ましくは高いストリンジェンシー条件下、そして最も好ましくは非常に高いストリンジェンシー条件下において、同一条件下で
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４、もしくは
（ｉｉ）（ｉ）の部分配列、もしくは
（ｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）の相補鎖
とハイブリダイズする核酸プローブとハイブリダイズする。
【００１３】
相補鎖という用語は当業者には知られており、（Ｊ．サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）、Ｅ．Ｆ．フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ）、およびＴ．マニアティス（Ｍａｎｉａｔｕｓ）、１９８９年、分子クローニング、実験室マニュアル、第２版、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク）に記載されている。配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４の部分配列は、２０ヌクレオチドと、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のそれぞれのコード領域の上流側の全配列との間の範囲であり得る（配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４の対応するコード領域はそれぞれ、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９で与えられる）。
【００１４】
配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４の核酸配列もしくはその部分配列（前の段落で定義されたとおり）を使用して、当該技術分野においてよく知られている方法に従って様々な属または種の菌株からＤＮＡプロモーターを同定およびクローン化するための核酸プローブを設計することができる。特に、このようなプローブは、その中の対応する遺伝子を同定および単離するために、標準サザンブロッティング手順に従って目的の属または種のゲノムまたはｃＤＮＡとのハイブリダイゼーションのために使用することができる。このようなプローブは全体の配列よりもかなり短くてよいが、少なくとも１５、好ましくは少なくとも２５、そしてより好ましくは少なくとも３５ヌクレオチドの長さでなければならない。さらに、このようなプローブは、ＰＣＲによってＤＮＡプロモーターを増幅するために使用することができる。より長いプローブも使用することができる。ＤＮＡ、ＲＮＡおよびペプチド核酸（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｄ  Ａｃｉｄ、ＰＮＡ）プローブも使用することができる。プローブは通常、対応する遺伝子を検出するために標識化される（例えば、３２Ｐ、３３Ｐ、３Ｈ、３５Ｓ、ビオチン、またはアビジンまたは蛍光マーカーによる）。このようなプローブは、本発明によって包含される。
【００１５】
従って、このような他の生物体から調製されるゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーは、上記のプローブとハイブリダイズしてポリペプチドをコードするＤＮＡについて、スクリーニングされ得る。このような他の生物体からのゲノムまたは他のＤＮＡは、アガロースまたはポリアクリルアミドゲル電気泳動法、あるいは他の分離技術によって分離することができる。ライブラリーからのＤＮＡまたは分離されたＤＮＡは、ニトロセルロースまたは他の適切な担体材料に移されて固定化され得る。配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４もしくはこれらの部分配列と相同であるクローンまたはＤＮＡ配列を同定するために、担体材料はサザンブロットにおいて使用され得る。本発明の目的のために、ハイブリダイゼーションは、ＤＮＡ配列が、非常に低いないし非常に高いストリンジェンシー条件下で、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４において示されるＤＮＡ配列、前記ＤＮＡ配列の相補鎖、もしくは前記ＤＮＡ配列の部分配列に相当する標識核酸プローブとハイブリダイズすることを示す。これらの条件下で核酸プローブがハイブリダイズする分子は、例えばＸ線フィルムを用いて検出される。検出のために蛍光、そして支持体としてガラス面および／またはＤＮＡマイクロアレイを用いる技法など、他のハイブリダイゼーション技法を使用することもできる。ＤＮＡマイクロアレイハイブリダイゼーション検出の一例は、ＦＥＭＳ  Ｙｅａｓｔ  Ｒｅｓ．２００３年１２月、４（３）：２５９−６９頁（ダラン−ラピュエイド（Ｄａｒａｎ−Ｌａｐｕｊａｄｅ）Ｐ、ダラン（Ｄａｒａｎ）ＪＭ、コッター（Ｋｏｔｔｅｒ）Ｐ、プティ（Ｐｅｔｉｔ）Ｔ、パイパー（Ｐｉｐｅｒ）ＭＤ、プロンク（Ｐｒｏｎｋ）ＪＴ。「オリゴヌクレオチドマイクロアレイを用いるサッカロミセス・セレビシエ実験用菌株Ｓ２８８ＣおよびＣＥＮ．ＰＫ１１３−７Ｄの比較遺伝子型同定」）において与えられる。さらに、ハイブリダイゼーションのためのＰＮＡマイクロアレイの使用は、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３年１０月１日、３１（１９）：ｅ１１９（ブラント（Ｂｒａｎｄｔ）Ｏ、フェルドナー（Ｆｅｌｄｎｅｒ）Ｊ、ステファン（Ｓｔｅｐｈａｎ）Ａ、シュローダー（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）Ｍ、シュノルザー（Ｓｃｈｎｏｌｚｅｒ）Ｍ、アーリングハウス（Ａｒｌｉｎｇｈａｕｓ）ＨＦ、ホエイゼル（Ｈｏｈｅｉｓｅｌ）ＪＤ、ジェイコブ（Ｊａｃｏｂ）Ａ．非標識化ＤＮＡサンプルのハイブリダイゼーションのためのＰＮＡマイクロアレイ）に記載されている。
【００１６】
好ましい実施形態では、核酸またはＤＮＡプローブは、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のＤＮＡ配列である。もう１つの実施形態では、核酸プローブは、配列番号１のヌクレオチド１００〜１５０を有するＤＮＡ配列、または配列番号２のヌクレオチド１７０〜２２０を有するＤＮＡ配列である。
【００１７】
もう１つの好ましい実施形態では、核酸プローブは、
配列番号２０のヌクレオチド９９６〜２７９７、配列番号２１のヌクレオチド９９６〜３５６１、配列番号２２のヌクレオチド９９７〜３５３６、配列番号２３のヌクレオチド１０３４〜３１７５、または配列番号２４のヌクレオチド１０８０〜４０５４を有するＤＮＡ配列であり、より好ましくは、
配列番号２０のヌクレオチド１４９６〜２４９７、配列番号２１のヌクレオチド１４９６〜３２６１、配列番号２２のヌクレオチド１４９７〜３２３６、配列番号２３のヌクレオチド１５３４〜２８７５、または配列番号２４のヌクレオチド１５８０〜３７５４を有するＤＮＡ配列であり、さらにより好ましくは、
配列番号２０のヌクレオチド１８９６〜２１９７、配列番号２１のヌクレオチド１８９６〜２８６１、配列番号２２のヌクレオチド１８９７〜２９３６、配列番号２３のヌクレオチド１９３４〜２５７５、または配列番号２４のヌクレオチド１９８０〜３４５４を有するＤＮＡ配列であり、そして最も好ましくは、
配列番号２０のヌクレオチド１９９６〜２１００、配列番号２１のヌクレオチド１９９６〜２３００、配列番号２２のヌクレオチド１９９７〜２４００、配列番号２３のヌクレオチド２０３４〜２１００、または配列番号２４のヌクレオチド２０８０〜２８００を有するＤＮＡ配列である。
【００１８】
もう１つの好ましい実施形態によると、プローブは、コード配列の上流側に位置する配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のＤＮＡ配列の一部である。配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４の対応するコード領域はそれぞれ、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９で与えられる。
【００１９】
少なくとも１００ヌクレオチドの長さである長いプローブについては、非常に低い〜非常に高いストリンジェンシー条件は、標準サザンブロッティング手順に従って、５×ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、２００マイクログラム／ｍｌのせん断および変性したサケ精子ＤＮＡ、そして、非常に低いおよび低いストリンジェンシーの場合には２５％ホルムアミド、中程度および中程度〜高いストリンジェンシーの場合には３５％ホルムアミド、または高いおよび非常に高いストリンジェンシーの場合には５０％ホルムアミドのいずれかの中で、摂氏４２度におけるプレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションであると定義される。少なくとも１００ヌクレオチドの長さである長いプローブについては、担体材料は、最後に、好ましくは少なくとも摂氏４５度（非常に低いストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも摂氏５０度（低いストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも摂氏５５度（中程度のストリンジェンシー）、より好ましくは少なくとも摂氏６０度（中程度〜高いストリンジェンシー）、さらにより好ましくは少なくとも摂氏６５度（高いストリンジェンシー）、そして最も好ましくは少なくとも摂氏７０度（非常に高いストリンジェンシー）において、２×ＳＳＣ、０．２％ＳＤＳを用いて１５分間ずつ３回洗浄される。
【００２０】
約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの長さである短いプローブについては、ストリンジェンシー条件は、標準サザンブロッティング手順に従って、０．９ＭのＮａＣｌ、０．０９ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．６、６ｍＭのＥＤＴＡ、０．５％ＮＰ−４０、１×デンハート溶液、１ｍＭのピロリン酸ナトリウム、１ｍＭの一塩基性リン酸ナトリウム、０．１ｍＭのＡＴＰ、および１ｍｌあたり０．２ｍｇの酵母ＲＮＡ中で、ボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）およびマッカーシー（ＭｃＣａｒｔｈｙ）（１９６２年、全米科学アカデミー紀要４８：１３９０頁）に従う計算を用いて計算されるＴｍよりも摂氏５度〜摂氏１０度低い温度におけるプレハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション、および洗浄ポストハイブリダイゼーションであると定義される。約１５ヌクレオチド〜約７０ヌクレオチドの長さである短いプローブについては、担体材料は、計算Ｔｍよりも摂氏５度〜摂氏１０度低い温度において、６×ＳＣＣおよび０．１％ＳＤＳ中で１５分間を１回、６×ＳＳＣを用いて１５分間ずつ２回洗浄される。
【００２１】
もう１つの好ましい実施形態によると、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４に由来する本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、初めに、それと作用的に関連する天然遺伝子、コード配列またはその一部をクローン化するために使用される。これは、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４、もしくは前に定義したこれらの部分配列のいずれかから始まり、この配列をプローブとして用いて行うことができる。プローブは、本出願で定義される所与の宿主、バシラス、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）または他の宿主のいずれかのｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーとハイブリダイズされる。天然遺伝子またはその一部がクローン化されたら、次にそれ自体をプローブとして使用し、本明細書中に記載されるハイブリダイゼーション実験によって、他の宿主に由来するこれらの相同遺伝子をクローン化することができる。これに関連して、相同遺伝子は、天然遺伝子に対して少なくとも５０％相同の遺伝子を意味する。好ましくは、相同遺伝子は、天然遺伝子に対して少なくとも５５％相同であり、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、さらにより好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９７％相同である。
【００２２】
相同遺伝子のコード配列の上流側の配列は、本発明によって包含されるプロモーターである。あるいは、本発明のプロモーターと作用的に関連する天然遺伝子、コード配列またはその一部の配列は、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９もしくは前に定義したこれらの部分配列を用いることによって同定され、例えば、本明細書中に記載されるアライメントまたはＢＬＡＳＴアルゴリズムを用いてゲノムデータベースを探索することができる。次に、この同定した配列を用いて、本出願において定義される他の任意の真菌宿主におけるオルソログまたは相同遺伝子を同定することができる。同定したオルソログまたは相同遺伝子のコード配列の上流側の配列は、本発明によって包含されるプロモーターである。
【００２３】
もう１つの好ましい実施形態によると、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４に由来し、前に定義したプロモーター活性を依然として有する（単離）ＤＮＡ配列である。
【００２４】
もう１つの好ましい実施形態によると、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のいずれかに由来する（単離）ＤＮＡ配列であり、これらはそれぞれ、それぞれのコード領域（配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８または配列番号２９）の上流側に位置するそれぞれの対応するＤＮＡ配列、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９の少なくとも一部に対して少なくとも５０％相同である。好ましくは、由来されるＤＮＡ配列は、それぞれの対応するコード領域の上流側に位置する配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９の少なくとも一部に対して少なくとも５５％相同であり、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも６５％、より好ましくは少なくとも７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、好ましくは約８０％、より好ましくは約９０％、さらにより好ましくは約９５％、そして最も好ましくは約９７％相同である。
【００２５】
本発明の目的のために、２つの核酸配列の間の相同性の度合いは、好ましくは、アイデンティティー表および以下のマルチプルアライメントパラメータ：ギャップペナルティ１０およびギャップ長ペナルティ１０を有するＬＡＳＥＲＧＥＮＥ．ＴＭ．、ＭＥＧＡＬＩＧＮ．ＴＭ．ソフトウェア（ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ社）を用いて、ウィルバー−リップマン（Ｗｉｌｂｕｒ−Ｌｉｐｍａｎ）法（ウィルバーおよびリップマン、１９８３年、全米科学アカデミー紀要８０：７２６−７３０頁）によって決定される。ペアワイズアライメントパラメータは、Ｋｔｕｐｌｅ＝３、ギャップペナルティ＝３、およびウィンドウ＝２０であった。
【００２６】
もう１つの好ましい実施形態によると、本発明のプロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９、もしくはそれぞれの対応するコード領域の上流側に位置する配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９の一部のいずれかの変異体である（単離）ＤＮＡ配列に由来する。「変異プロモーター」という用語は、本明細書では、親プロモーターの１つまたは複数のヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入を含むヌクレオチド配列を有するプロモーターであると定義され、ここで変異プロモーターは、対応する親プロモーターよりも多いまたは少ないプロモーター活性を有する。また「変異プロモーター」という用語は、天然変異体、ならびに古典的な変異誘発、部位特異的変異誘発、およびＤＮＡシャッフリングなどの当該技術分野においてよく知られている方法を用いて得られるインビトロ発生変異体も包含し得る。変異プロモーターは、１つまたは複数の突然変異を有し得る。それぞれの突然変異は、ヌクレオチドの独立した置換、欠失、および／または挿入である。ヌクレオチドの置換、欠失、および／または挿入のプロモーターへの導入は、古典的な変異誘発、部位特異的変異誘発、またはＤＮＡシャッフリングなどの当該技術分野において既知の方法のいずれかを用いて達成され得る。特に有用なのは、所望の突然変異を含有する目的の挿入断片および２つの合成プライマーを有する高次コイルの二本鎖ＤＮＡベクターを用いる手順である。ベクターの反対の鎖にそれぞれ相補的なオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼを用いる温度サイクリングの間に伸長する。プライマーの取り込みにおいて、ねじれ型ニックを含有する突然変異プラスミドが発生される。温度サイクリングに続いて、産物は、メチル化およびヘミメチル化ＤＮＡに特異的であるＤｐｎＩで処理され、親の鋳型ＤＮＡを消化して、突然変異を含有する合成ＤＮＡを選択する。当該技術分野において既知の他の手順が使用されてもよい。他の手順の例は、クイックチェンジ（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ）ＴＭ、部位特異的変異誘発キット（カリフォルニア州ラ・ホーヤのストラタジーン・クローニング・システムズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、「アルタード・サイト（Ｔｈｅ  Ａｌｔｅｒｅｄ  Ｓｉｔｅｓ）（登録商標）ＩＩインビトロ変異誘発システム」（プロメガ・コーポレーション（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））であるか、あるいはＧｅｎｅ．１９８９年４月１５、７７（１）：５１−９頁、（ホー（Ｈｏ）ＳＮ、ハント（Ｈｕｎｔ）ＨＤ、ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）ＲＭ、プーレン（Ｐｕｌｌｅｎ）ＪＫ、ピース（Ｐｅａｓｅ）ＬＲ「ポリメラーゼ鎖反応を用いる重複伸長による部位特異的変異誘発」）に記載されるＰＣＲを用いる、または分子生物学：現状の革新および将来の動向（Ａ．Ｍ．グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）およびＨ．Ｇ．グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）編、ＩＳＢＮ１−８９８４８６−０１−８  １９９５年  ホライズン・サイエンティフィック・プレス（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐ���ｅｓｓ）、英国ノーフォーク州ワイモンダム  ＰＯ  Ｂｏｘ１）に記載されるＰＣＲを用いる重複伸長によるものである。好ましい実施形態によると、変異プロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９に最初に由来するプロモーター配列と比較して少なくとも１つの変更された調節部位を有するプロモーターである。このような調節部位はその完全性が除去されているか、あるいは上記のように特異的に突然変異されている可能性がある。従って、このようなプロモーター変異体の調節は、例えば、もはやグルコースにより誘発されないように変更される。このようなプロモーター変異体の例、およびこれらを得るための方法に関する技術は、ＥＰ６７３４２９Ｂ号明細書または国際公開第９４／０４６７３号パンフレットに記載されている。
【００２７】
プロモーター変異体は、対立遺伝子変異体でもあり得る。対立遺伝子変異体は、同じ染色体位置を占有する遺伝子の２つ以上の代替形態のいずれかを示す。対立遺伝子変異は、突然変異によって自然に発生し、その結果、集団内に多型をもたらし得る。変異プロモーターは、以下のステップ（ａ）および（ｂ）：
（ａ）非常に低い、低い、中程度、中〜高い、高い、または非常に高いストリンジェンシー条件下でＤＮＡ配列を、
（ｉ）配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９、もしくは
（ｉｉ）（ｉ）の部分配列、もしくは
（ｉｉｉ）（ｉ）、（ｉｉ）の相補鎖、
とハイブリダイズするステップと、
（ｂ）変異プロモーターをＤＮＡ配列から単離するステップと
を含む方法によって得ることができる。ストリンジェンシーおよび洗浄条件は、本明細書において定義される。
【００２８】
変異プロモーターは、プロモーター配列と、ポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域との連結を容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーがその配列に提供され得るプロモーターであり得る。
【００２９】
もう１つの好ましい実施形態では、プロモーターＤＮＡ配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９の部分配列に由来する。部分配列は、好ましくは、これに関連して、既に定義されたそれぞれの対応するコード配列の上流側に位置する配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９の一部であると定義される。
【００３０】
部分配列は、好ましくは、少なくとも約５０ヌクレオチド、または好ましくは少なくとも約１００ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも約２００ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約２３０ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも約２５０ヌクレオチド、そして最も好ましくは少なくとも約２９０ヌクレオチドを含有する。
【００３１】
もう１つの好ましい実施形態によると、部分配列は、５’および／または３’末端からの１つまたは複数のヌクレオチドが欠失しているという事実によって、前の文中で定義したものとは異なるが、それでも前記ＤＮＡ配列は、前に定義したプロモーター活性を有する。
【００３２】
もう１つの好ましい実施形態では、プロモーター部分配列は、翻訳開始点からおよび／または転写開始点からの「トリムされた」部分配列である。プロモーターをトリムし、それを機能的に分析することの例は、Ｇｅｎｅ．１９９４年８月５日、１４５（２）：１７９−８７頁：アスペルギルス・ニガーのグルコアミラーゼコード化遺伝子の発現に対する上流領域の多重コピーの影響、ベルドーズ（Ｖｅｒｄｏｅｓ）ＪＣ、パント（Ｐｕｎｔ）ＰＪ、ストウサメア（Ｓｔｏｕｔｈａｍｅｒ）ＡＨ、バン・デン・ホンデル（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｈｏｎｄｅｌ）ＣＡ）に記載されている。
【００３３】
本明細書で提供される配列情報は、誤って同定された塩基の包含を必要とするためにあまり狭く解釈されてはならない。本明細書において開示される特異的な配列は、糸状菌、特にアスペルギルス・ニガーからの本来のＤＮＡ配列を単離するために、容易に使用され、そして最終的にさらなる配列分析を受けることができ、それにより配列決定エラーが同定される。
【００３４】
別途指示されない限り、本明細書においてＤＮＡ分子の配列決定により決定される全てのヌクレオチド配列は、自動ＤＮＡ配列決定装置を用いて決定した。従って、この自動アプローチにより決定されるＤＮＡ配列について当該技術分野において知られているように、本明細書において決定されるヌクレオチド配列はどれも、いくらかのエラーを含有し得る。自動化により決定されるヌクレオチド配列は、配列決定されるＤＮＡ分子の実際のヌクレオチド配列に対して、典型的には少なくとも約９０％同一であり、より典型的には少なくとも約９５％から少なくとも約９９．９％同一である。実際の配列は、当該技術分野においてよく知られている手動ＤＮＡ配列決定法を含む他のアプローチによってより正確に決定することができる。
【００３５】
当業者は、このような誤って同定された塩基を同定することができ、このようなエラーを補正する方法を知っている。
【００３６】
機能性核酸等価物は、通常、それが含有するプロモーターの生物学的機能を変更しない突然変異を含有し得る。「機能性等価物」という用語は、Ａ．ニガーＤＮＡ配列のオルソログも包含する。Ａ．ニガーＤＮＡ配列のオルソログは、他の菌株または種属から単離することができるＤＮＡ配列であり、類似または同一の生物活性を有する。
【００３７】
相同（類似または同一）配列は、「配列比較アルゴリズム」を用いることによって決定することもできる。比較のための最適な配列アライメントは、例えば、スミス（Ｓｍｉｔｈ）＆ウォーターマン（Ｗａｔｅｒｍａｎ）、Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２頁（１９８１年）の局所相同性アルゴリズムによって、ニードルマン（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ）＆ウンシュ（Ｗｕｎｓｃｈ）、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３頁（１９７０年）の相同性アライメントアルゴリズムによって、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）＆リップマン（Ｌｉｐｍａｎ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４頁（１９８８年）の類似性検索方法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実行（ウィスコンシン・ジェネティクス・ソフトウェア・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ、ジェネティクス・コンピューター・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ）、ウィスコンシン州マディソン５７５サイエンス・ドライブ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．））によって、あるいは目視検査によって行なうことができる。配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの一例はＢＬＡＳＴアルゴリズムであり、アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０頁（１９９０年）において記載されている。あるいは、本明細書において前に記載した配列アライメントのために他のプログラムを使用することもできる。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センター（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列内の同じ長さのワードとアライメントさせたときにある正の値のしきい値スコアＴと一致するか、あるいは満足させるクエリー配列内の長さＷのショートワードを同定することによって、スコアの高い配列対（ＨＳＰ）を同定することを含む。これらの最初の近隣ワードヒットは、これらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための出発点としての役割を果たす。ワードヒットは、累積アライメントスコアが増大され得る限りは、比較している２つの配列のそれぞれに沿って両方向に拡張される。累積アライメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ低下するか、累積スコアがゼロまたはそれ以下になるか、あるいはいずれかの配列の端部が到達されると、ワードヒットの伸長は停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）＆ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５頁（１９８９年）を参照）の５０のアライメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を用いる。次に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計的分析を実行する（例えば、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）＆アルチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：５８７３−５７８７頁（１９９３年）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は最小和の確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の一致が偶然に発生し得る確率の表示を提供する。例えば、試験アミノ酸配列とプロテアーゼなどのタンパク質のアミノ酸配列との比較における最小和の確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満であれば、アミノ酸配列はプロテアーゼなどのタンパク質と同様であると考えられる。
【００３８】
好ましくは、変異プロモーターの類似性は、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を有するＤＮＡ配列のうちの１つに対して少なくとも４０％相同である。より好ましくは、類似性は、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９を有するＤＮＡ配列に対して少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも６０％、より好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、そしてより好ましくは少なくとも９５％または少なくとも９８％相同である。
【００３９】
プロモーター配列の天然に存在する対立遺伝子変異体に加えて、当業者は、配列番号１、配列番号２、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８または配列番号１９に由来するプロモーター配列への突然変異によって、実質的にそのプロモーター機能を変更することなく変化が導入され得ることを認識するであろう。
【００４０】
本発明のプロモーター配列は、任意の属の微生物から得ることができる。本発明の目的のために、所与のソースに関連して本明細書で使用される「から得られる」という用語は、ポリペプチドがそのソースによって、あるいはそのソースからの遺伝子が挿入された細胞によって産生されることを意味するものとする。好ましくは、微生物は原核生物である。好ましい原核生物は、バシラスおよび大腸菌である。好ましいバシラスは、バシラス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バシラス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バシラス・リシェニフォルミス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バシラス・アルカロフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、バシラス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）、バシラス・サーキュランス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｉｒｃｕｌａｎｓ）、バシラス・ファーマス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｉｒｍｕｓ）、バシラス・プミリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｐｕｍｉｌｉｓ）、バシラス・ステアロサーモフィラス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、バシラス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）、バシラス・レンタス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｅｎｔｕｓ）、またはバシラス・スリンジェンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）である。
【００４１】
あるいは、プロモーター配列は、真核生物、好ましくは真菌源から得られ、より好ましくはカンジダ、ハンゼヌラ、クルイベロミセス、ピキア、サッカロミセス、シゾサッカロミセス、またはヤロウイア株などの酵母株から、あるいはより好ましくはアクレモニウム、アスペルギルス、アウレオバシディウム、クリプトコッカス、フィリバシジウム、フザリウム、フミコラ、マグナポルテ、ムコール、ミセリオフトーラ、ネオカリマスティクス、ニューロスポラ、ペシロマイセス、ペニシリウム、ピロミセス、シゾフィラム、タラロマイセス、サーモアスカス、チエラビア、トリポクラジウム、またはトリコデルマ株などの糸状菌株から得られる。
【００４２】
好ましい実施形態では、プロモーター配列は、サッカロミセス・カールスベルゲンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・ディアスタテッカス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ）、サッカロミセス・ダグラシイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｏｕｇｌａｓｉｉ）、サッカロミセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロミセス・ノルベンシス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ）、サッカロミセス・オビフォーミス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｏｖｉｆｏｒｍｉｓ）、サッカロミセス・バヤヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ）、サッカロミセス・バヤヌス、ｖａｒ．ウバルム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ，ｖａｒ．ｕｖａｒｕｍ）またはサッカロミセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）株から得られる。
【００４３】
もう１つの好ましい実施形態では、プロモーター配列は、アスペルギルス・アキュリエタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・アワモリ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・フォエティダス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｏｅｔｉｄｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニカス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、Ａ．ニデュランス（ｎｉｄｕｌａｎｓ）、Ａ．ニガー、好ましくはＡ．ニガーＣＢＳ５１３．８８、Ａ．ソーヤ（ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・オリゼー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）（Ａ．オリゼー）、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、フミコラ・ラヌギノサ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａ）、ムコール・ミーヘイ（Ｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）、ミセリオフトーラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・パープロゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｐｕｒｐｕｒｏｇｅｎｕｍ）、トリコデルマ・ハルジアナム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）、トリコデルマ・コニンギ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｋｏｎｉｎｇｉｉ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）、またはトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｖｉｒｉｄｅ）株から得られる。
【００４４】
もう１つの好ましい実施形態では、プロモーター配列は、フザリウム・バクトリジオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｂａｃｔｒｉｄｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・セレアリス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｅｒｅａｌｉｓ）、フザリウム・クルークウェレンス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｒｏｏｋｗｅｌｌｅｎｓｅ）、フザリウム・カルモラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｃｕｌｍｏｒｕｍ）、フザリウム・グラミネアラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ）、フザリウム・グラミナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｇｒａｍｉｎｕｍ）、フザリウム・ヘテロスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｈｅｔｅｒｏｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・ネグンジ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｎｅｇｕｎｄｉ）、フザリウム・オキシスポラム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）、フザリウム・レティクラタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｍ）、フザリウム・ロゼウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｒｏｓｅｕｍ）、フザリウム・サムバシナム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｍｂｕｃｉｎｕｍ）、フザリウム・サルコクロウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓａｒｃｏｃｈｒｏｕｍ）、フザリウム・スポロトリキオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・スルフレウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｕｌｐｈｕｒｅｕｍ）、フザリウム・トルロサム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｓｕｍ）、フザリウム・トリコテシオイデス（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｔｒｉｃｈｏｔｈｅｃｉｏｉｄｅｓ）、フザリウム・ベネナタム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）株から得られる。
【００４５】
上記の種属について、これらが知られている種属の名前にかかわらず、本発明が完全および不完全な状態ならびに他の分類学的等価物、例えば無性世代を包含することは理解されるであろう。当業者は、適切な等価物の同一性を容易に認識するであろう。これらの種属の菌株は、米国微生物系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物保存機関（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ）（ＤＳＭ）、菌株保存機関（Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ）（ＣＢＳ）、および農業研究部特許菌株保存機関（Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、北部地方研究センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ）（ＮＲＲＬ）などの多数の培養菌保存機関において公に容易に入手可能である。
【００４６】
さらに、このような核酸配列は、上記のプローブを用いて、自然（例えば、土壌、堆肥、水など）から単離される微生物を含む他のソースから同定および入手され得る。自然の生息環境から微生物を単離するための技法は、当該技術分野においてよく知られている。核酸配列は、次に、別の微生物のゲノムＤＮＡライブラリーを同様にスクリーニングすることによって誘導され得る。プロモーターをコードする核酸配列がプローブにより検出されたら、その配列は当業者に知られる技法を用いて単離またはクローン化され得る（例えば、上記のサムブルックら、１９８９年を参照）。
【００４７】
本発明において、プロモーターＤＮＡ配列は、本発明の１つまたは複数のプロモーターの一部か、本発明のプロモーターの一部および別の既知のプロモーターの一部、例えば１つのプロモーターのリーダー配列および他のプロモーターからの転写開始部位か、あるいは本発明の１つまたは複数のプロモーターの一部および１つまたは複数の他のプロモーターの一部を含むハイブリッドプロモーターでもよい。他のプロモーターは、変異、切断、およびハイブリッドプロモーターを含む一般に好まれる宿主細胞において転写活性を示すどんなプロモーター配列でもよく、宿主細胞に対して相同または異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られる。他のプロモーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して天然でも外来性でもよく、細胞に対して天然でも外来性でもよい。
【００４８】
好ましい実施形態として、同定されたプロモーターの重要な調節部分配列は、他の「基本」プロモーターに融合されて、そのプロモーター活性を高めることができる（例えば、Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１９９４年５月、１２（３）：４７９−９０頁、アスペルギルス・ツビゲンシス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）のキシラナーゼをコードするｘｌｎＡ遺伝子の調節、デ・グラーフ（ｄｅ  Ｇｒａａｆｆ）ＬＨ、バン・デン・ブルーク（ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｒｏｅｃｋ）ＨＣ、バン・オオイエン（ｖａｎ  Ｏｏｉｊｅｎ）ＡＪ、ビサー（Ｖｉｓｓｅｒ）Ｊに記載）。
【００４９】
本発明のプロモーターとのハイブリッドプロモーターの構築において有用な他のプロモーターの他の例には、Ａ．オリゼーのＴＡＫＡアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ（Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉ）のアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーの酸安定性α−アミラーゼ、Ａ．ニガーまたはアスペルギルス・アワモリのグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ａ．ニガーのｇｐｄＡ、Ａ．ニガーのグルコースオキシダーゼｇｏｘＣ、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ、Ａ．オリゼーのアルカリプロテアーゼ、Ａ．オリゼーのトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａ．ニデュランスのアセトアミダーゼ、およびフザリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼ（国際公開第９６／００７８７号パンフレット）の遺伝子から得られるプロモーター、そしてＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａ．ニガーの中性α−アミラーゼおよびＡ．オリゼーのトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエのガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、サッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびサッカロミセス・セレビシエの３−ホスホグリセレートキナーゼ、ならびにこれらの突然変異、切断、およびハイブリッドプロモーターが含まれる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、ロマノス（Ｒｏｍａｎｏｓ）ら、１９９２年、Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８頁によって記載されている。細菌細胞のための他の有用なプロモーターは、以下の遺伝子、Ｂ．サブチリスのアルカリプロテアーゼ（ａｐｒ）、Ｂ．サブチリスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒ）、Ｂ．アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ（ａｍｙＱ）、Ｂ．アミロリケファシエンスのアルカリプロテアーゼ（ａｐｒ）およびＢ．アミロリケファシエンスの中性プロテアーゼ（ｎｐｒ）のプロモーターである。
【００５０】
本発明において、プロモーターＤＮＡ配列は、「タンデムプロモーター」でもよい。「タンデムプロモーター」は、本明細書では、そのそれぞれがコード配列と作用的に関連し、コード配列のｍＲＮＡへの転写を仲介する２つ以上のプロモーター配列であると定義される。
【００５１】
タンデムプロモーターは２つ以上の本発明のプロモーターを含むか、あるいは１つまたは複数の本発明のプロモーターと、ハイブリッドプロモーターの構築に有用な上記に例示されたものなどの１つまたは複数の他の既知のプロモーターとを含む。タンデムプロモーターの２つ以上のプロモーター配列は、核酸配列の転写を同時に促進してもよい。あるいは、タンデムプロモーターの１つまたは複数のプロモーター配列は、細胞の成長の異なる段階で、あるいは真菌宿主の場合には、菌糸の形態的に異なる部分、またはバシラスなどの細菌の胞子形成における胞子の発達中に異なる細胞区画で、核酸配列の転写を促進してもよい。
【００５２】
本発明において、プロモーターは、コード配列および／または宿主細胞に対して外来性であり得る。本発明の変異、ハイブリッド、またはタンデムプロモーターは、たとえ野生型プロモーターがコード配列または宿主細胞に対して天然であっても、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列に対して外来性であることが理解されるであろう。
【００５３】
本発明の変異、ハイブリッド、またはタンデムプロモーターは、配列番号１、配列番号２、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４に由来する、前に定義したプロモーターの少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約４０％、より好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約１００％、さらにより好ましくは少なくとも約２００％、最も好ましくは少なくとも約３００％、そしてさらに最も好ましくは少なくとも約４００％のプロモーター活性を有する。プロモーター活性は、好ましくは、前に定義したように決定される。最も好ましくは、プロモーター活性は、ノーザンブロットを用いるｍＲＮＡ分析によって決定される。
【００５４】
ＤＮＡ構築物
第２の態様によると、本発明は、選択可能な形質を与えるレポーター遺伝子と作用的に関連する、前のセクションで定義した本発明のプロモーターＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物を提供する。レポーター遺伝子は、選択可能な形質を適切な宿主に与える任意の遺伝子であり得る。好ましくは、レポーター遺伝子は選択マーカー遺伝子である。
【００５５】
「ＤＮＡ構築物」は、本明細書では、天然に存在する遺伝子から単離されるか、あるいは自然には存在し得ない形で結合および並置された核酸のセグメントを含有するように修飾された一本鎖または二本鎖のいずれかの核酸分子であると定義される。
【００５６】
ＤＮＡ構築物という用語は、ＤＮＡ構築物がコード配列またはレポーター遺伝子およびコード配列またはレポーター遺伝子の発現に必要とされる全ての制御配列を含有する場合には、発現カセットという用語と同義である。本出願との関連では、「ＤＮＡ構築物」という用語は、「単離ＤＮＡ構築物」という用語と交換可能に使用され、両方の用語は同義であると解釈される。
【００５７】
ＤＮＡ構築物は選択マーカー遺伝子を含むことができ、これにより、形質転換宿主細胞の容易な選択が可能になる。ＤＮＡ構築物が２つの選択マーカー遺伝子を含む場合には、当業者は、これらの２つの選択マーカー遺伝子が同一ではなく、本発明のプロモーターと関連される第１の選択マーカー遺伝子は本発明のスクリーニング法において使用され、ＤＮＡ構築物に存在する第２の選択マーカー遺伝子は形質転換宿主細胞の標準的な選択を可能にすることを理解するであろう。
【００５８】
レポーター遺伝子は、レポーター遺伝子が所与の宿主細胞においてプロモーターＤＮＡ配列の制御下で発現されるように、本発明のプロモーターＤＮＡ配列と作用的に関連する。レポーター遺伝子によってコードされるポリペプチドは、宿主細胞および／またはプロモーターＤＮＡ配列に対して天然でも異種でもよい。
【００５９】
これに関連して、単数形（「ａ」）は、「少なくとも１つ」を意味する。従って、ＤＮＡ構築物は、少なくとも１つのレポーター遺伝子を含む。宿主は、少なくとも２つのＤＮＡ構築物（１つは選択マーカーを含み、もう１つはレポーター遺伝子と関連する本発明のプロモーターを含む）で同時形質転換され得る。
【００６０】
あるいは、そしてより好ましい実施形態に従って、ＤＮＡ構築物に含まれるレポーター遺伝子は、第１のレポーター遺伝子の少なくとも一部と、第２のレポーター遺伝子の少なくとも一部とを含むハイブリッドレポーター遺伝子であり、第１および第２のレポーター遺伝子のコード配列は互いにインフレームで結合されており、前記ハイブリッドレポーター遺伝子は、本発明のプロモーターに作用可能に連結している。第１および／または第２のレポーター遺伝子は、選択可能な形質を適切な宿主に与える任意の遺伝子でよい。真菌のための好ましいハイブリッドレポーター遺伝子は、ストレプトアロテイクス・ヒンダスタニス（Ｓｔｒｅｐｔｏａｌｌｏｔｅｉｃｈｕｓ  ｈｉｎｄｕｓｔａｎｉｓ）のＧＦＰ遺伝子およびフレオマイシン耐性遺伝子（ＢＬＥ）を含む（ドロコート（Ｄｒｏｃｏｕｒｔ）ら、１９９０年３月）。
【００６１】
選択マーカーまたは選択可能なマーカーは遺伝子であり、その産物は殺生物性またはウィルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求体に対する原栄養性などを提供する。原核生物宿主細胞のための適切な選択可能なマーカーには、カナマイシン、ネオマイシン、エリスロマイシンおよび他のＭＬＳ型マーカー（マクロライド−リンコサミド−ストレプトグラミンＢ）、クロラムフェニコール、アンピシリン、テトラサイクリン、ストレプトマイシンおよびスペクチノマイシンが含まれるが、これらに限定されない。酵母宿主細胞のための適切なマーカーは、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１、およびＵＲＡ３である。糸状菌宿主細胞において使用するための選択可能なマーカーには、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｙｇＢ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニレートシンターゼ）、ならびにこれらの等価物が含まれるが、これらに限定されない。例えばフレオマイシン、ハイグロマイシンＢまたはＧ４１８に対する耐性を与えるマーカーを使用することもできる。アスペルギルス細胞において使用するのに好ましいのは、Ａ．ニデュランスまたはＡ．オリゼーのａｍｄＳおよびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにストレプトミセス・ハイグロスコピクス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ）のｂａｒ遺伝子である。ａｍｄＳマーカー遺伝子は、好ましくは、ＥＰ６３５５７４Ｂ号明細書または国際公開第９７／０６２６１号パンフレットに記載される技法を適用して使用される。好ましい選択マーカー遺伝子は、Ａ．ニデュランスのｇｐｄＡプロモーターに融合されたＡ．ニデュランスのａｍｄＳコード配列である（ＥＰ６３５５７４Ｂ号明細書）。他の糸状菌からのａｍｄＳ遺伝子が使用されてもよい（国際公開第９７／０６２６１号パンフレット）。
【００６２】
もう１つの好ましい実施形態によると、レポーター遺伝子は、本明細書において上記で記載した原核生物、酵母および／または糸状菌の細胞のための選択可能なマーカーをコードする。あるいは、レポーター遺伝子は、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、エクオリン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）およびこれらの変異体（赤色、シアン、黄色−蛍光タンパク質）、ルシフェラーゼ、ラックス（ｌｕｘ）、ヘム（ｈｅｍｅ）、β−ラクタマーゼ、またはアルカリホスファターゼのようなレポータータンパク質をコードする。より好ましくは、レポーター遺伝子は、ＧＦＰ、ＹＦＰ、およびＣＦＰ（それぞれ、緑色、黄色およびシアン蛍光タンパク質）などの蛍光レポータータンパク質をコードする遺伝子であるか、あるいはこれらを含むが、これらに限定されない。形質転換体は蛍光を示し、高感度細胞分取技術（ＦＡＣＳ、蛍光活性化細胞分取（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ））を用いて非発現クローンから分離することができる。この方法の重要な利点は、形質転換混合物のプレーティングが必要でないこと（スクリーニング手順の処理量をかなり増大させる）、そして更なる自動処理のために陽性のクローンをＭＴＰフォーマット直接に配列できることである。あるいは、レポーター遺伝子は、抗体が産生され得る（トランス）膜タンパク質または細胞壁タンパク質をコードする。前記膜タンパク質を示す形質転換体は、磁気細胞分取技術（ＭＡＣＳ（登録商標）、磁気細胞分取（Ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ）、ｗｗｗ．ｍｉｌｔｅｎｙｉｂｉｏｔｅｃ．ｃｏｍ）を用いて非発現形質転換体から分離することができる。
【００６３】
制御要素
ＤＮＡ構築物は、プロモーターＤＮＡ配列に加えて、１つまたは複数の制御配列をさらに含むことができ、これは、適切な宿主細胞において制御配列に適合性の条件下でレポーター遺伝子の発現を指示する。発現は、転写、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾、および分泌を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与するステップを含むことが理解されるであろう。１つまたは複数の制御配列は、レポーター遺伝子または宿主に対して天然でよい。あるいは、１つまたは複数の制御配列は、宿主細胞におけるレポーター遺伝子の発現を改善するために核酸配列に対して外来性の１つまたは複数の制御配列で置換されてもよい。
【００６４】
「制御配列」という用語は、本明細書では、レポーター遺伝子などのコード配列の発現のために必要または有利な本発明のプロモーターを含む全ての成分を含むと定義される。各制御配列は、ポリペプチドをコードするコード配列に対して天然でも外来性でもよい。このような制御配列には、リーダー、最適翻訳開始配列（コザック（Ｋｏｚａｋ）、１９９１年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１９８６７−１９８７０頁に記載）、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、上流活性化配列、その変異体、断片、ハイブリッドおよびタンデムを含む本発明のプロモーター、ならびに転写ターミネーターが含まれるが、これらに限定されない。最小限では、制御配列は、転写および翻訳停止シグナル、ならびに本発明のプロモーター（の一部）を含む。制御配列は、制御配列と、ポリペプチドをコードするレポーター遺伝子などのコード配列との連結を容易にする特異的な制限部位を導入するためのリンカーを備えていてもよい。
【００６５】
制御配列は、適切な転写ターミネーター配列、転写を終結するために宿主細胞により認識される配列でもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするコード配列の３’末端と作用的に関連する。一般に好まれる宿主細胞において機能的であるターミネーターはどれも本発明において使用することができる。
【００６６】
当業者には、配列の５’末端および３’末端はそれぞれのコード配列ごとに定義されることが分かるであろう。所与のターミネーター配列および所与のコード配列について、当業者はこれらをどのようにして作用的に関連させるか分かるであろう。
【００６７】
糸状菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、Ａ．オリゼーのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ、Ａ．ニデュランスのアントラニレートシンターゼ、Ａ．ニガーのα−グルコシダーゼ、ｔｒｐＣ遺伝子、およびフザリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【００６８】
酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ、サッカロミセス・セレビシエのチトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびサッカロミセス・セレビシエのグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、上記のロマノス（Ｒｏｍａｎｏｓ）ら、１９９２年によって記載されている。制御配列は、適切なリーダー配列、宿主細胞による翻訳のために重要なｍＲＮＡの非翻訳領域でもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端と作用的に関連する。一般に好まれる宿主細胞において機能的であるリーダー配列はどれも本発明において使用することができる。
【００６９】
糸状菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、Ａ．オリゼーのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニデュランスのトリオースリン酸イソメラーゼおよびＡ．ニガーのグルコアミラーゼの遺伝子から得られる。
【００７０】
酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、サッカロミセス・セレビシエのエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、サッカロミセス・セレビシエの３−ホスホグリセレートキナーゼ、サッカロミセス・セレビシエのα−因子、およびサッカロミセス・セレビシエのアルコールデヒドロゲナーゼおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２およびＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【００７１】
制御配列は、ポリアデニル化配列、核酸配列の３’末端と作用的に関連する配列でもよい。糸状菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、Ａ．オリゼーのＴＡＫＡアミラーゼ、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼ、Ａ．ニデュランスのアントラニレートシンターゼ、フザリウム・オキシスポラムのトリプシン様プロテアーゼ、およびＡ．ニガーのα−グルコシダーゼの遺伝子から得られる。
【００７２】
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、グオ（Ｇｕｏ）およびシャーマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）、１９９５年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １５：５９８３−５９９０頁によって記載されている。
【００７３】
また、宿主細胞の成長に関するレポーター遺伝子の発現の調節を可能にする調節配列を追加することが望ましいこともある。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的な刺激に応答してレポーター遺伝子の発現をオンまたはオフするものである。原核生物系における調節系には、大腸菌のｌａｃ、およびｔｒｐオペレーター系、ならびにＢ．サブチリスのｓｐａｃ、ｘｙｌ、ｓａｃＢ、およびｃｉｔＭ系が含まれる（「タンパク質発現技術、現状および将来の動向」（Ｆ．バニクス（Ｂａｎｅｙｘ）編）、英国ノーフォーク州ワイモンダムのホライズン・バイオサイエンス（Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、１９９−２５２頁において、メイマ（Ｍｅｉｍａ）ら（２００４年）バシラスにおける発現系でレビューされる）。バシラスにおける制御された発現のために有用な他のプロモーターは、ＰｈｏレギュロンおよびＴｎｒＡ／ＧｌｎＲ系（それぞれリン酸塩および窒素の制御下である）などの栄養飢餓条件下で誘発されるものである。酵母では、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が使用され得る。糸状菌では、米国特許第５，５０３，９９１号明細書に記載されるように、ＴＡＫＡα−アミラーゼプロモーター、Ａ．ニガーのグルコアミラーゼプロモーター、Ａ．オリゼーのグルコアミラーゼプロモーター、Ａ．ツビンゲンシス（ｔｕｂｉｎｇｅｎｓｉｓ）のエンドキシナラーゼ（ｘｌｎＡ）プロモーター、Ａ．ニガーの硝酸還元酵素（ｎｉａＤ）プロモーター、トリコデルマ・リーゼイのセロビオヒドロラーゼプロモーターおよびＡ．ニデュランスのアルコールおよびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（それぞれ、ａｌｃＡおよびａｌｄＡ）プロモーターが、調節配列として使用され得る。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらには、メトトレキセートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子、および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が含まれる。これらの場合、ポリペプチドをコードする核酸配列は、調節配列と作用的に関連し得る。
【００７４】
本発明のプロモーターＤＮＡ配列中に存在する内在性の調節配列は除去されてもよく、例えば、ｃｒｅＡ結合部位の除去（以前にＥＰ６７３４２９Ｂ号明細書において記載されたような炭素異化産物の抑制）、ｐａｃＣおよびａｒｅＡの変化（ｐＨおよび窒素調節のため）である。Ｂ．サブチリスでは、炭素異化産物の抑制（ＣＣＲ）は、ＣｃｐＡタンパク質のｃｒｅ要素への結合を含む。ｃｒｅ要素は、発現系の発生のためにキシロース誘発性ｘｙｌプロモーターと組み合わせて使用され、目的の遺伝子の二重制御を可能にした（バブサー（Ｂｈａｖｓａｒ）ら（２００１年）Ａｐｐｌ  Ｅｎｖｉｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ６７：４０３頁）。
【００７５】
好ましくは、ＤＮＡ構築物は、本発明からのプロモーターＤＮＡ配列と、前記プロモーターＤＮＡ配列と作用的に関連するレポーター遺伝子と、
以下の配列リスト：ＴＡＡＧ、ＴＡＧＡおよびＴＡＡＡから選択される、好ましくはＴＡＡＡである５’から３’への方向に位置が定められた１つの翻訳終結配列、および／または
以下の配列リスト：
【化１】
2008532535.tif 000002
から選択され、好ましくは
【化２】
2008532535.tif 000003
である５’から３’への方向に位置が定められた１つの翻訳開始コード配列、および／または
ヌクレオチド：ｍ（Ａ／Ｃ）、ｗ（Ａ／Ｔ）、ｙ（Ｃ／Ｔ）、ｋ（Ｇ／Ｔ）、ｈ（Ａ／Ｃ／Ｔ）のための多義性コードを用いて以下の配列リスト：
【化３】
2008532535.tif 000004
から選択され、好ましくは
【化４】
2008532535.tif 000005
である１つの転写開始配列
などの翻訳制御配列とを含む。
【００７６】
本発明との関連では、「翻訳開始コード配列」という用語は、ＤＮＡコード配列のオープンリーディングフレームのイニシエーターまたは開始コドンのすぐ下流側の９ヌクレオチドであると定義される。イニシエーターまたは開始コドンは、ＡＡメチオニンをコードする。開始コドンは通常ＡＴＧであるが、ＧＴＧなどの任意の機能性開始コドンであってもよい。
【００７７】
本発明との関連では、「翻訳終結配列」という用語は、オープンリーディングフレームまたはヌクレオチドコード配列の３’末端で翻訳終止コドンから始まり、５’から３’への方向に位置が定められた３または４ヌクレオチドであると定義される。
【００７８】
本発明との関連では、「翻訳開始配列」という用語は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列のオープンリーディングフレームのイニシエーターまたは開始コドンのすぐ上流側の１０ヌクレオチドであると定義される。イニシエーターまたは開始コドンは、ＡＡメチオニンをコードする。開始コドンは通常ＡＴＧであるが、ＧＴＧなどの任意の機能性開始コドンであってもよい。ウラシル、ＵがＲＮＡのデオキシヌクレオチドチミン、Ｔを置換することは当該技術分野においてよく知られている。
【００７９】
原核生物のための好ましい制御配列は、ＥＰ２８４１２６Ａ号明細書において既に記載されている。
【００８０】
本発明は、レポーター遺伝子と作用的に関連する本発明のプロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む組換え発現ベクターにも関する。上記の様々なレポーター遺伝子および制御配列は一緒に結合されて、１つまたは複数の便利な制限部位を含み得る組換え発現ベクターを生じることができ、該部位におけるプロモーターおよび／またはレポーター遺伝子の挿入または置換を可能にする。あるいは、レポーター遺伝子およびプロモーターの融合は、例えば、Ｇｅｎｅ．１９８９年４月、１５、７７（１）：５１−９頁、ホー（Ｈｏ）ＳＮ、ハント（Ｈｕｎｔ）ＨＤ、ホートン（Ｈｏｒｔｏｎ）ＲＭ、プーレン（Ｐｕｌｌｅｎ）ＪＫ、ピース（Ｐｅａｓｅ）ＬＲ、「ポリメラーゼ鎖反応を用いる重複伸長による部位特異的変異誘発」）に記載されるようなＰＣＲを用いる配列重複伸長（ＳＯＥ−ＰＣＲ）によって、あるいはゲートウェイ（Ｇａｔｅｗａｙ）ＴＭクローニング系（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を用いるクローニングによって行うことができる。
【００８１】
組換え発現ベクターは、宿主細胞を形質転換することができるどのベクターでもよい。ベクターの選択は通常、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存し得る。ベクターは、直鎖状または閉環状のプラスミドであり得る。ベクターは、組込みまたは自己複製ベクターであり得る。
【００８２】
ベクターは、自己複製ベクター、すなわち染色体外の実体、例えばプラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体として存在するベクターでよく、その複製は染色体の複製とは無関係である。自己複製ベクターは、自己複製を確実にする手段を含有することができる。ベクターは、宿主細胞内に導入されたときに、ゲノムに組み込まれて、組み込まれた染色体と一緒に複製されるものでもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入されるべき全ＤＮＡ、またはトランスポゾンを一緒に含有する単一のベクターまたはプラスミド、もしくは２つ以上のベクターまたはプラスミドが使用されてもよい。自律的に維持されるクローニングベクターの一例は、ＡＭＡ１−配列を含むクローニングベクターである。ＡＭＡ１は、Ａ．ニデュランスから単離される６．０ｋｂのゲノムＤＮＡ断片であり、アスペルギルスにおける自律的な維持が可能である（例えば、アレクセンコ（Ａｌｅｋｓｅｎｋｏ）およびクラッターバック（Ｃｌｕｔｔｅｒｂｕｃｋ）（１９９７年）、Ｆｕｎｇａｌ  Ｇｅｎｅｔ．Ｂｉｏｌ．２１：３７３−３９７頁を参照）。Ｂ．サブチリスおよびＢ．アミロリケファシエンスなどのグラム陽性細菌における発現に有用な自己複製ベクターの例は、ブドウ球菌ベクターｐＵＢ１１０（マッケンジー（ＭｃＫｅｎｚｉｅ）ら、（１９８６）Ｐｌａｓｍｉｄ  １５：９３頁）、ならびに内在性Ｂ．サブチリスプラスミドｐＴＡ１０１５、ｐＴＡ１０４０およびｐＴＡ１０６０そしてこれらに由来するベクター（例えば、ｐＨＢ２０１、ブロン（Ｂｒｏｎ）ら、（１９９８年）Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ６４：３頁）である。
【００８３】
本発明のベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノム内へのベクターの安定な組込み、またはゲノムとは無関係の細胞内でのベクターの自己複製を可能にする要素を含有する。
【００８４】
宿主細胞ゲノムへの組込みについて、ベクターは、相同または非相同の組換えによるゲノムへのベクターの安定した組込みのために、プロモーター配列および／またはレポーター遺伝子配列またはベクターの他の任意の要素に依存し得る。ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを指示するためのさらなる核酸配列を含有してもよい。さらなる核酸配列は、ベクターが染色体の正確な位置で宿主細胞ゲノムに組み込まれるのを可能にする。正確な位置での組込みの可能性を増大させるために、組込み要素は、好ましくは、２０〜５０、好ましくは５５〜９５、好ましくは１００〜１，５００塩基対、好ましくは４００〜１，５００塩基対、より好ましくは８００〜１，５００塩基対、そして最も好ましくは少なくとも２ｋｂなど、宿主細胞のゲノム中の所定の標的座位におけるＤＮＡ配列に相同である十分な数の核酸を含有すべきである。組込み要素は、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列でよい。さらに、組込み要素は、非コード化またはコード化核酸配列であり得る。標的の組込みを促進するために、クローニングベクターは、好ましくは、宿主細胞の形質転換の前に直線化される。直線化は、好ましくは、クローニングベクターの少なくとも一方であるが好ましくは両方の末端が、標的座位と相同である配列によってフランキングされるように実施される。
【００８５】
好ましくは、標的座位と相同である発現ベクター内の組込み要素は高発現座位に由来し、これは、これらが宿主細胞において高発現レベルが可能である遺伝子に由来することを意味する。高発現レベルが可能な遺伝子、すなわち高発現遺伝子は、本明細書では、例えば誘発条件下でそのｍＲＮＡが少なくとも全細胞性ｍＲＮＡの０．５％（ｗ／ｗ）を構成することができる遺伝子、あるいはその遺伝子産物が全細胞性タンパク質の少なくとも１％（ｗ／ｗ）を構成することができる、または、分泌遺伝子産物の場合には、少なくとも０．１ｇ／ｌのレベルまで分泌されることができる遺伝子であると定義される（ＥＰ３５７１２７Ｂ１号明細書に記載される）。例として、アスペルギルスまたはトリコデルマからのアミラーゼ、グルコアミラーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、キシラナーゼ、グリセルアルデヒド−リン酸デヒドロゲナーゼまたはセロビオヒドロラーゼ遺伝子などの多数の好ましい高発現真菌遺伝子が与えられる。これらの目的のために最も好ましい高発現遺伝子は、グルコアミラーゼ遺伝子、好ましくはＡ．ニガーのグルコアミラーゼ遺伝子、Ａ．オリゼーのＴＡＫＡ−アミラーゼ遺伝子、Ａ．ニデュランスのｇｐｄＡ遺伝子、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９の座位、好ましくは配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９のＡ、ニガー座位、もしくはトリコデルマ・リーゼイのセロビオヒドロラーゼ遺伝子である。
【００８６】
あるいは、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【００８７】
あるいはおよび／または上記の実施形態と組み合わせて、本発明のプロモーターと作用的に関連するレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物は、本発明のステップ（ｅ）で目的のタンパク質の産生、好ましくは分泌について細胞がスクリーニングされた後、宿主細胞から欠失され得る。ステップ（ｅ）は以下に説明される。これにより、宿主細胞がレポーター遺伝子および／または選択可能なマーカー遺伝子を含むことなく、宿主細胞が目的のタンパク質の産生のために直接使用されることが可能になる。本発明のＤＮＡ構築物の欠失を可能にするために、ＤＮＡ構築物は、好ましくは、レポーター遺伝子およびＤＮＡ反復間の双方向性の選択可能なマーカー遺伝子の両方を含む。ＤＮＡ反復は、染色体内の相同組換えによって、ＤＮＡ構築物の欠失を可能にする。この方法は、ＥＰ０６３５５７４Ｂ１号明細書に記載される「マーカー−遺伝子フリー」アプローチに類似している。
【００８８】
自己複製のために、ベクターはさらに、ベクターが問題の宿主細胞において自律的に複製できるようにする複製開始点を含むことができる。酵母宿主細胞において使用するための複製開始点の例は、２ミクロンの複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組み合わせ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組み合わせである。複製開始点は、宿主細胞においてその機能性を温度感受性にする突然変異を有するものでもよい（例えば、アーリック（Ｅｈｒｌｉｃｈ）、１９７８年、全米科学アカデミー紀要７５：１４３３頁を参照）。
【００８９】
本発明のＤＮＡ構築物の２つ以上のコピーが宿主細胞に挿入されてもよい。これは、好ましくは、ＤＮＡ配列をそのゲノムコピーへ組み込むことによって、より好ましくは高発現座位、好ましくはグルコアミラーゼ座位、または配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８および配列番号２９の座位におけるＤＮＡ配列の組込みを標的とすることによって行うことができる。あるいはこれは、核酸配列を有する増幅可能な選択可能なマーカー遺伝子を含むことにより行うことができ、この場合、適切な選択可能な試薬の存在下で細胞を培養することによって、選択可能なマーカー遺伝子の増幅されたコピー、そしてそれにより核酸配列のさらなるコピーを含有する細胞を選択することができる。過剰発現すべきＤＮＡ配列のコピー数をさらにより増大させるために、国際公開第９８／４６７７２号パンフレットに記載されるような遺伝子変換技法が使用されてもよい。
【００９０】
上記の要素を連結して本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者によく知られている（例えば、上記のサムブルックら、１９８９年を参照）。
【００９１】
宿主細胞
本発明はさらに、レポーター遺伝子と作用的に関連する本発明のプロモーターＤＮＡ配列を含む上記のセクションで定義されたＤＮＡ構築物で形質転換された組換え宿主細胞に関する。好ましくは、形質転換宿主細胞はさらに、目的の特性を有する１つまたは複数のタンパク質を産生することができると考えられる生物体からのＤＮＡライブラリーに由来するコード配列を含むＤＮＡ配列を含むさらなるＤＮＡ構築物を含む。
【００９２】
このような細胞は、次のセクションで記載される発現クローニング法において有利に使用することができる。レポーター遺伝子と作用的に関連する本発明のプロモーターＤＮＡ配列を含む発現ベクターは、宿主細胞内に導入される。宿主細胞はさらに、ＤＮＡライブラリーに由来するコード配列を含むＤＮＡ配列を含むＤＮＡ構築物または発現ベクターで形質転換される。前に記載したように、ＤＮＡ構築物または発現ベクターは両方とも、染色体組込み体として、または自己複製染色体外ベクターとしてのいずれかで維持される。宿主細胞の選択は、ＤＮＡライブラリーが作製された生物体および／または使用されるプロモーターＤＮＡ配列の起源にかなりの程度で依存し得る。
【００９３】
宿主細胞は任意の微生物でよい。好ましくは、宿主細胞は、ＤＮＡライブラリーが作製されたもの、および／または本明細書において前に定義したように本発明のプロモーターが由来するものと同じ生物体である。好ましい実施形態によると、宿主細胞は、原核生物または真核生物である。より好ましい実施形態によると、本発明の方法において有用な宿主細胞は原核生物であり、より好ましくはプロモーターのセクションにおいてプロモーターのソースとして定義した原核生物である。より好ましくは、原核生物宿主細胞は、好ましくはバシラス・サブチリス、バシラス・リシェニフォルミスおよび／またはバシラス・アミロリケファシエンスの種属のバシラス宿主細胞である。
【００９４】
もう１つのより好ましい実施形態によると、本発明の方法において有用な宿主細胞は、真菌である。
【００９５】
宿主細胞は、野生型の糸状菌宿主細胞、もしくは変異体、突然変異体または遺伝子改変された糸状菌宿主細胞でもよい。本発明の好ましい実施形態では、宿主細胞は、プロテアーゼ欠損またはプロテアーゼマイナス株である。これは、「ａｌｐ」という名前のアルカリプロテアーゼ遺伝子が欠失されたプロテアーゼ欠損株アスペルギルス・オリゼーＪａＬ１２５（国際公開第９７／３５９５６号パンフレットまたはＥＰ４２９４９０号明細書に記載される）、または国際公開第９６／１４４０４号パンフレットに開示されるＡ．ニガーのトリペプチジル−アミノペプチダーゼ（ＴＰＡＰ）欠損株でよい。さらに、国際公開第０１／６８８６４号パンフレットに記載されるように、転写活性化剤（ｐｒｔＴ）の産生が低下した宿主細胞も本発明に従って考慮される。もう１つの特に考慮される宿主株は、アスペルギルス・オリゼーＢＥＣｈ２であり、ここで、親株ＩＦ０４１７７中に存在する３つのＴＡＫＡアミラーゼ遺伝子は不活性化されている。さらに、２つのプロテアーゼ、アルカリプロテアーゼおよび中性メタロプロテアーゼ１１は、遺伝子破壊により破壊されている。代謝産物シクロピアゾン酸およびコウジ酸を形成する能力は、突然変異により破壊されている。ＢＥＣｈ２は国際公開第００／３９３２２号パンフレットに記載されており、ＪａＬ２２８（国際公開第９８／１２３００号パンフレットに記載）に由来する。これは、もう一度言うと、Ａ１５６０として米国特許５，７６６、９１２号明細書に記載されるＩＦ０４１７７の突然変異体であった。
【００９６】
任意で、糸状菌宿主細胞は、目的のポリペプチドの産生能力を高めるために、野生型細胞と比較して上昇した非折り畳みタンパク質応答（ＵＰＲ）を含んでもよい。ＵＰＲは、米国特許出願公開第２００４／０１８６０７０Ａ１号明細書および／または米国特許出願公開第２００１／００３４０４５Ａ１号明細書および／または国際公開第０１／７２７８３Ａ２号パンフレットおよび／または国際公開第２００５／１２３７６３号パンフレットに記載される技法によって増大され得る。より具体的には、ＨＡＣ１および／またはＩＲＥ１および／またはＰＴＣ２のタンパク質レベルは調節されており、および／またはＳＥＣ６１タンパク質は、上昇したＵＰＲを有する宿主細胞を得るために操作されている。
【００９７】
あるいは、または上昇したＵＰＲと組み合わせて、宿主細胞は遺伝子改変されて、目的のポリペプチドの産生能力を高めるために野生型細胞と比較して低いプロテアーゼの発現および／またはプロテアーゼの分泌を示す表現型を得ることができる。このような表現型は、プロテアーゼの発現の転写制御因子の欠失および／または修飾および／または不活性化によって得ることができる。このような転写制御因子は、例えばｐｒｔＴである。ｐｒｔＴの調節によるプロテアーゼの発現の低下は、米国特許出願公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書およびＥＰ２００５／０５５１４５号明細書に記載される技法によって実施され得る。
【００９８】
あるいは、もしくは上昇したＵＰＲおよび／またはより低いプロテアーゼの発現および／またはプロテアーゼの分泌を示す表現型と組み合わせて、宿主細胞は、目的のポリペプチドの産生の収率を高めるために、シュウ酸欠損表現型を示すことができる。シュウ酸欠損表現型は、国際公開第２００４／０７００２２Ａ２号パンフレットおよび／または国際公開第２０００／５０５７６号パンフレットに記載される技法によって得ることができる。
【００９９】
あるいは、もしくは上昇したＵＰＲおよび／またはより低いプロテアーゼの発現および／またはプロテアーゼの分泌および／またはシュウ酸欠損を示す表現型と組み合わせて、宿主細胞は、目的のポリペプチドの産生の収率を高めるために野生細胞と比較した表現型の差異の組み合わせを示すことができる。これらの差異は、グルコアミラーゼおよび／または中性α−アミラーゼＡおよび／または中性α−アミラーゼＢ、α−１、６トランスグルコシダーゼ、プロテアーゼ、およびシュウ酸ヒドロラーゼの低下した発現を含むことができるが、これらに限定されない。宿主細胞によって示される前記表現型の差異は、米国特許出願公開第２００４／０１９１８６４Ａ１号明細書に記載される技法に従って遺伝子改変によって得ることができる。
【０１００】
あるいは、または本明細書において上記で記載される表現型と組み合わせて、相同組換えによる宿主細胞のゲノムへの核酸構築物の標的組込み、すなわち所定の標的座位における組込みの効率は、好ましくは、宿主細胞の増強した相同組換え能力によって増大され得る。細胞のこのような表現型は、好ましくは、国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットに記載されるような欠損ｈｄｆＡまたはｈｄｆＢ遺伝子を含む。国際公開第２００５／０９５６２４号パンフレットには、増大した効率の標的組込みを含む糸状菌細胞を得るための好ましい方法が開示されている。
【０１０１】
より好ましくは、本発明の宿主細胞は、以下のリスト：バシラス、酵母および糸状菌、好ましくはアスペルギルス、ペニシリウムまたはトリコデルマ種から選択される。さらにより好ましくは、アスペルギルス宿主細胞は、アスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・ソーヤまたはアスペルギルス・オリゼー種である。
【０１０２】
また本発明は、本発明の２つ以上のプロモーターＤＮＡ配列を含み、各プロモーターがレポーター遺伝子と作用的に関連する組換え宿主細胞にも関する。このような宿主細胞は、次のセクションにおいて記載される発現クローニング法において有利に使用され得る。細菌細胞は、化学的に誘発された受容能（例えばＣａＣｌ２）またはエレクトロポレーション（サムブルックら、（１９８９年）「分子クローニング：実験室マニュアル」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク）、プロトプラスト形質転換（チャン（Ｃｈａｎｇ）およびコーエン（Ｃｏｈｅｎ）（１９７９年）Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  １６８：１１１頁）、そしていくつかのバシラス種の場合には、自然の受容能（スピジィツェン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）（１９５８年）、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ４４：１０７２頁）を含む様々な方法によって形質転換され得る。真菌細胞は、それ自体は知られている方法でプロトプラスト形成、プロトプラストの形質転換、および細胞壁の再生を含む方法によって形質転換され得る。アスペルギルス宿主細胞の形質転換のための適切な手順は、ＥＰ２３８０２３号明細書およびイエルトン（Ｙｅｌｔｏｎ）ら、１９８４年、全米科学アカデミー紀要８１：１４７０−１４７４頁に記載されている。アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）を用いるアスペルギルスおよび他の糸状菌宿主細胞の形質転換のための適切な手順は、例えば、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９９８年９月、１６（９）：８３９−４２頁、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １９９８年１１月、１６（１１）：１０７４頁における誤植、アグロバクテリウム・ツメファシエンス仲介の糸状菌の形質転換、デ・グルート（ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ）ＭＪ、バンドック（Ｂｕｎｄｏｃｋ）Ｐ、ホーイカース（Ｈｏｏｙｋａａｓ）ＰＪ、ベイジャースベルゲン（Ｂｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ）ＡＧ、オランダ、フラールディンゲンのユニリーバ・リサーチ・ラボラトリー（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載されている。フザリウム種を形質転換するための適切な方法は、マラルディエ（Ｍａｌａｒｄｉｅｒ）ら、１９８９年、Ｇｅｎｅ  ７８：１４７−１５６頁および国際公開第９６／００７８７号パンフレットによって記載されている。酵母は、ベッカー（Ｂｅｃｋｅｒ）およびグアレンテ（Ｇｕａｒｅｎｔｅ）によるアベルソン（Ａｂｅｌｓｏｎ）Ｊ．Ｎ．およびサイモン（Ｓｉｍｏｎ）Ｍ．Ｉ．編、酵母遺伝学および分子生物学の入門書、酵素学における方法、第１９４巻、１８２−１８７頁、アカデミック・プレス社（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）ニューヨーク、イトウ（ｌｔｏ）ら、１９８３年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １５３：１６３頁、およびヒンネン（Ｈｉｎｎｅｎ）ら、１９７８年、全米科学アカデミー紀要７５：１９２０頁において記載される手順を用いて形質転換され得る。原核生物の形質転換は、ＥＰ２８４１２６Ａ号明細書に記載されるように実施することができる。
【０１０３】
発現クローニング法
さらなる態様によると、本発明は、宿主細胞中の目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を単離するための方法を提供し、前記方法は、
（ａ）選択可能な形質を与えるレポーター遺伝子と作用的に関連するプロモーターＤＮＡ配列を含む第１のＤＮＡ構築物を調製するステップであって、前記ＤＮＡ構築物が宿主細胞中に存在する場合、そして目的のタンパク質、好ましくは目的の分泌タンパク質が宿主細胞によって産生される場合に前記プロモーターＤＮＡ配列が誘発されるステップと、
（ｂ）１つまたは複数の目的のタンパク質を産生することができると考えられる生物体からのＤＮＡライブラリーに由来する目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を含む第２のＤＮＡ構築物を調製するステップと、
（ｃ）ステップ（ａ）および（ｂ）において調製されたＤＮＡ構築物の両方で宿主細胞を形質転換するステップと、
（ｄ）ＤＮＡライブラリー中に存在する目的のタンパク質の産生に寄与する条件下でステップ（ｃ）において得られた形質転換宿主細胞の全てを培養するステップと、
（ｅ）ステップ（ｄ）において産生されたタンパク質の分析によって、目的のタンパク質を産生する形質転換宿主細胞をスクリーニングするステップと、
を含む。
【０１０４】
ステップ（ａ）
選択可能な形質を与えるレポーター遺伝子と作用的に関連するプロモーターＤＮＡ配列を含む第１のＤＮＡ構築物が調製され、前記プロモーターＤＮＡ配列は、ＤＮＡ構築物が宿主細胞中に存在する場合と、目的のタンパク質、好ましくは目的の分泌タンパク質が宿主細胞によって産生される場合に誘発される。
【０１０５】
第１のＤＮＡ構築物中に存在するプロモーターは、目的のタンパク質、好ましくは目的の分泌タンパク質が宿主細胞によって産生される場合に誘発されるプロモーターである。
【０１０６】
本発明において、「誘発される」という用語は、同じ培養条件下で対応する対照宿主細胞において目的のタンパク質が（過剰）産生されない場合のプロモーターの活性と比較して、目的のタンパク質が宿主細胞によって（過剰）産生される、好ましくは分泌される場合の本発明のプロモーターのプロモーター活性の増大であると定義される。好ましくは、目的のタンパク質が宿主細胞において（過剰）産生される、好ましくは分泌される場合、同じ培養条件下で目的のタンパク質が（過剰）産生されない対応する対照宿主細胞と比較して、プロモーター活性は少なくとも約１．５倍増大し、より好ましくは少なくとも約２倍、より好ましくは少なくとも約３倍、より好ましくは少なくとも約４倍、より好ましくは少なくとも約５倍、さらにより好ましくは少なくとも約６倍、さらにより好ましくは少なくとも約８倍、さらにより好ましくは少なくとも約１０倍、さらにより好ましくは少なくとも約２０倍、さらにより好ましくは少なくとも約５０倍、そして最も好ましくは少なくとも約１００倍増大する。より好ましくは、プロモーター活性の増大は無限大である。すなわち、目的のタンパク質が（過剰）産生されない場合には、プロモーター活性は検出されないか、あるいはプロモーターは不活性であり、目的のタンパク質が（過剰）産生される場合にプロモーターが誘発される。プロモーター活性は、好ましくは、既に定義されたように決定される。最も好ましくは、プロモーター活性は、ノーザンブロットを用いるｍＲＮＡ分析によって決定される。
【０１０７】
このようなプロモーターは、目的のタンパク質を産生する細胞の遺伝子発現プロファイルと、前記タンパク質を産生しない対照株の遺伝子発現プロファイルとを比較することによって同定することができる。好ましくは、このような発現プロファイルは、確立されたＤＮＡマイクロアレイ分析を用いて比較される。あるいは、発現プロファイルは、ノーザンブロットまたは定量的ＰＣＲ分析などの当業者に知られた他の方法を用いて比較することもできる。発現プロファイルを比較するための最も好ましい方法は、まずＤＮＡマイクロアレイ分析によって発現プロファイルを比較した後、次にマイクロアレイの結果をノーザンブロットにより確実にすることによって実施される。好ましい実施形態によると、プロモーターは、プロモーターのセクションで記載された本発明のプロモーターＤＮＡ配列である。
【０１０８】
もう１つの好ましい実施形態によると、宿主細胞がバシラス細胞である場合、プロモーターは、列挙される以下のゲノムＤＮＡ配列：ｈｔｒＡ（配列番号１）またはｈｔｒＢ（配列番号２）に由来する。好ましくは、プロモーターＤＮＡ配列は、開始コドンの上流側に位置するこれらのうちの１つのゲノムＤＮＡ配列の非コード部分または上流側に位置する前記ゲノム配列の一部に由来する。より好ましくは、使用されるプロモーターは、配列番号１または配列番号２のいずれかのＤＮＡ配列である。
【０１０９】
もう１つの好ましい実施形態によると、宿主細胞が糸状菌細胞である場合、プロモーターは、列挙される以下のゲノムＤＮＡ配列：配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、または配列番号２４に由来する。好ましくは、プロモーターＤＮＡ配列は、開始コドンの上流側に位置するこれらのうちの１つのゲノムＤＮＡ配列の非コード部分または上流側に位置する前記ゲノム配列の一部に由来する。より好ましくは、使用されるプロモーターは、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、または配列番号１９のいずれかのＤＮＡ配列、またはその誘導体である。
【０１１０】
ステップ（ａ）において調製される第１のＤＮＡ構築物は対応する「ＤＮＡ構築物」セクションにおいて既に記載されており、好ましくは、「ＤＮＡ構築物」セクションに記載されるように、選択可能な形質を与えるレポーター遺伝子を含む。
【０１１１】
ステップ（ｂ）
ステップ（ｂ）において調製されるＤＮＡ構築物は、１つまたは複数の目的のタンパク質を産生することができると考えられる生物体からのＤＮＡライブラリーに由来する目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むＤＮＡ配列を含む。通常１つまたは複数の目的のタンパク質を産生すると考えられる生物体は、原核生物または真核生物である。好ましい原核生物および真核生物の例は、本発明のプロモーターの起源に関連して本明細書において既に定義されている。１つの好ましい実施形態によると、生物体はバシラス、より好ましくはプロモーターのセクションで定義されたバシラス種である。もう１つの好ましい実施形態によると、生物体は真核生物、より好ましくは真菌、その中で最も好ましくは糸状菌である。
【０１１２】
ステップ（ｂ）において調製されるＤＮＡ構築物は、好ましくは、「ＤＮＡ構築物」および「制御要素」セクションで定義されたような調節配列を含む。
【０１１３】
本発明に従う方法では、１つまたは複数の目的のタンパク質を産生すると考えられる生物体からのＤＮＡ断片のライブラリーは、ゲノムライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーであり得る。しかしながら真核生物ドナーの場合、真菌宿主生物体におけるプロモーターまたはスプライスシグナルの認識に関する問題を回避するために、好ましくはｃＤＮＡライブラリーが使用される。ｃＤＮＡライブラリーは、好ましくは、目的のタンパク質の発現に寄与する条件下で成長された場合にソース生物体から単離されたｍＲＮＡから作製される。
【０１１４】
本発明に従う方法は、宿主細胞により発現されたときにタンパク質の検出に利用することができるアッセイがあれば、目的の任意のタンパク質またはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の単離に適用することができる。
【０１１５】
ステップ（Ｃ）
両方のＤＮＡ構築物で形質転換される宿主細胞の同一性は、宿主細胞のセクションで既に記載された。形質転換の方法は、同じセクションで既に記載された。１つの実施形態によると、宿主細胞は、ステップ（ａ）および（ｂ）において調製された構築物で同時に形質転換される。あるいは、そしてもう１つの実施形態によると、宿主細胞は、まずステップ（ａ）において調製されたＤＮＡ構築物で形質転換され、引き続きステップ（ｂ）において調製されたＤＮＡ構築物で形質転換される。
【０１１６】
好ましい実施形態によると、宿主細胞は原核生物、好ましくはバシラス細胞であり、より好ましくはバシラス・サブチリスであり、さらにより好ましくはｈｔｒＡ遺伝子欠損バシラス・サブチリス（ここで、ｈｔｒＡ遺伝子のコード領域の少なくとも一部が欠失および／または置換されており、そして／またはｈｔｒＡ遺伝子の非コード領域は前記バシラス細胞のゲノム中にまだ存在している）であり、最も好ましくは、バシラス・サブチリスＢＶ２００３が使用される（ヒリライネン（Ｈｙｙｒｙｌａｉｎｅｎ）ら（２００１年）Ｍｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  ４１：１１５９頁）。
【０１１７】
あるいは、または前の好ましい実施形態と組み合わせて、宿主細胞はバシラス細胞であり、レポーター遺伝子は、ＤＮＡ構築物のセクションで定義された蛍光レポータータンパク質、最も好ましくはＧＦＰをコードする。
【０１１８】
あるいは、または前の好ましい実施形態と組み合わせて、宿主細胞がバシラス細胞である場合には、プロモーターは、以下のリスト：ｈｔｒＡ（配列番号１）またはｈｔｒＢ（配列番号２）で提示されるゲノムＤＮＡ配列に由来する。好ましくは、プロモーター配列は、開始コドンの上流側に位置するこれらの２つのうちの１つのゲノムＤＮＡ配列の非コード部分または上流側に位置する前記配列の一部に由来する。より好ましくは、使用されるプロモーターは、配列番号１または配列番号２のいずれかに由来するものである。最も好ましい実施形態によると、使用されるプロモーターおよび使用されるレポーター遺伝子は、配列番号１と作用的に関連するＧＦＰまたは配列番号２と作用的に関連するＧＦＰのいずれかである。
【０１１９】
もう１つの好ましい実施形態によると、生物体は真核生物、より好ましくは真菌、その中で最も好ましくは糸状菌である。好ましくは、糸状菌はアスペルギルス、ペニシリウムまたはトリコデルマ種である。さらにより好ましくは、アスペルギルス宿主細胞は、アスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・ソーヤまたはアスペルギルス・オリゼー種である。最も好ましい宿主細胞はＡ．ニガーであり、好ましくはＣＢＳ５１３．８８またはその誘導体である。
【０１２０】
あるいは、または前の好ましい実施形態と組み合わせて、宿主細胞は糸状菌細胞であり、レポーター遺伝子は、ＤＮＡ構築物のセクションで定義された蛍光レポータータンパク質、最も好ましくはＧＦＰをコードする。あるいは、レポーター遺伝子は、選択可能なマーカーをコードする。より好ましくは、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質および選択可能なマーカーのハイブリッドレポーター遺伝子である。最も好ましくは、ハイブリッドレポーター遺伝子は、ＧＦＰおよびストレプトアロテイクス・ヒンダスタニスのフレオマイシン耐性遺伝子（ＢＬＥ）を含む（ドロコート（Ｄｒｏｃｏｕｒｔ）ら、ＮＡＲ、１９９０年）。
【０１２１】
あるいは、または前の好ましい実施形態と組み合わせて、宿主細胞が糸状菌細胞である場合には、プロモーターは、以下のリスト：配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４で提示されるゲノムＤＮＡ配列に由来する。好ましくは、プロモーター配列は、開始コドンの上流側に位置する列挙されたうちの１つのゲノムＤＮＡ配列の非コード部分または上流側に位置する前記配列の一部に由来する。より好ましくは、使用されるプロモーターは、実施例３〜７において使用されるものの１つであり、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４のいずれかに由来する。最も好ましい実施形態によると、使用されるプロモーターおよび使用されるハイブリッドレポーター遺伝子は、プロモーター配列番号１５と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥ（配列番号６１）、プロモーター配列番号１６と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥ、プロモーター配列番号１７と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥ、プロモーター配列番号１８と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥ、またはプロモーター配列番号１９と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥのいずれかである。
【０１２２】
ステップ（ｄ）
両方のＤＮＡ構築物による宿主細胞の形質転換の後、ＤＮＡライブラリー中に存在する目的のタンパク質の産生に寄与する条件下で、得られた形質転換宿主細胞クローンの全てが培養される。目的のタンパク質の検出に必要とされるアッセイに依存して、形質転換クローンは増殖され、寒天プレートなどの固体培地または液外培地にコロニーとして貯蔵され、それによって個々のライブラリークローンが成長され、貯蔵され、そして／またはマイクロタイタープレートのウェルにおいてアッセイされる。
【０１２３】
当業者は、当該技術分野において既知のクローニング法への通常の適応が本発明の方法にも同様に適用できることを理解するであろう。適応には、例えば、ライブラリークローンのプールのスクリーニング、多数の異なる目的のタンパク質に対して同じライブラリーをスクリーニングすること、ならびにより正確な結果を保証するために陽性クローンの再スクリーニング、再単離および再クローニングが含まれるがこれらに限定されない。
【０１２４】
スクリーニング法で同定された形質転換宿主細胞から目的のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を単離するため、および単離されたＤＮＡ配列を次に特徴づけするために、当業者は様々な方法を利用することができる。
【０１２５】
ステップ（ｅ）
ステップ（ｄ）に続いて、形質転換宿主細胞は、産生されたタンパク質の分析によって、目的のタンパク質の産生、好ましくは分泌についてスクリーニングされる。ステップ（ｅ）の間、第１のＤＮＡ構築物中に存在するプロモーターＤＮＡ配列によって誘発された産生依存性、好ましくは分泌依存性のレポーター発現をモニターすることによって、目的のタンパク質を産生、好ましくは分泌する形質転換宿主細胞についてスクリーニングする。
【０１２６】
好ましい実施形態によると、宿主細胞がバシラス細胞である場合、第１のＤＮＡ構築物中に存在するプロモーターＤＮＡ配列によって誘発された産生依存性、好ましくは分泌依存性のレポーター発現をモニターすることにより目的のタンパク質を産生、好ましくは分泌する形質転換宿主細胞を同定するためのスクリーニングは、好ましくは、蛍光に基づく細胞分析アッセイ、例えば蛍光活性化細胞走査、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）または蛍光定量分析を用いて実施される。より好ましくは、宿主細胞は、第１のＤＮＡ構築物を含むバシラス細胞であり、前記ＤＮＡ構築物は、配列番号１またはその誘導体もしくは配列番号２またはその誘導体などのプロモーターを含み、前記ＤＮＡ構築物はさらに、蛍光レポーターをコードするレポーター遺伝子を含み、スクリーニングは、蛍光に基づく細胞分析アッセイを用いて実施される。さらにより好ましくは、宿主細胞はバシラス細胞であり、第１のＤＮＡ構築物は、
−  ＧＦＰと作用的に関連するプロモーターＤＮＡ配列、配列番号１またはその誘導体か、もしくは
−  ＧＦＰと作用的に関連するプロモーターＤＮＡ配列、配列番号２またはその誘導体
を含み、スクリーニングは、ＦＡＣＳを用いて実施される。あるいは、または前の実施形態と組み合わせて、スクリーニングは、例えば比色分析アッセイを用いて、または選択的培養条件を用いて実施されてもよい。当業者は、使用されるレポーター遺伝子に依存して、選択的培養条件はそれに応じて選択されるべきであることを理解するであろう。選択的培養条件の例は、殺生物剤の使用、抗生物質の使用、少なくとも１つの栄養物、原栄養性の制限であるが、これらに限定されない。
【０１２７】
もう１つの好ましい実施形態によると、宿主細胞が糸状菌細胞である場合、本発明の第１のＤＮＡ構築物中に存在するプロモーターＤＮＡ配列によって誘発された産生依存性、好ましくは分泌依存性のレポーター発現をモニターすることにより目的のタンパク質を産生、好ましくは分泌する形質転換宿主細胞を同定するためのスクリーニングは、好ましくは、選択的培養条件下における培養によって実施される。当業者は、使用されるレポーター遺伝子に依存して、選択的培養条件はそれに応じて選択されるべきであることを理解するであろう。選択的培養条件の例は、殺生物剤の使用、抗生物質の使用、少なくとも１つの栄養物、原栄養性の制限であるが、これらに限定されない。あるいは、または前の実施形態と組み合わせて、スクリーニングは、例えば、比色分析、蛍光定量（ＦＡＣＳなど）または酵素活性に基づくアッセイを用いて実施されてもよい。より好ましい実施形態によると、宿主細胞は、本発明の第１のＤＮＡ構築物を含む糸状菌細胞であり、スクリーニングは、選択的培養条件を用いて実施される。より好ましくは、宿主細胞は、本発明の第１のＤＮＡ構築物を含む糸状菌細胞であり、前記ＤＮＡ構築物は、配列番号１５またはその誘導体、配列番号１６またはその誘導体、配列番号１７またはその誘導体、配列番号１８またはその誘導体、配列番号１９またはその誘導体のリストから選択されるプロモーターを含み、前記ＤＮＡ構築物はさらに、選択可能なマーカーをコードするレポーター遺伝子を含み、スクリーニングは、選択的培養条件を用いて実施される。さらにより好ましくは、宿主細胞は、本発明の第１のＤＮＡ構築物を含む糸状菌細胞であり、前記ＤＮＡ構築物は、配列番号１５またはその誘導体、配列番号１６またはその誘導体、配列番号１７またはその誘導体、配列番号１８またはその誘導体、配列番号１９またはその誘導体のリストから選択されるプロモーターを含み、前記ＤＮＡ構築物はさらに、配列番号６１などのハイブリッドレポーター遺伝子を含み、スクリーニングは選択的培養条件を用いて実施される。
【０１２８】
もう１つのより好ましい実施形態によると、宿主細胞は、本発明の第１のＤＮＡ構築物を含むＡ．ニガー細胞であり、スクリーニングは選択的培養条件を用いて実施される。より好ましくは、宿主細胞は、本発明の第１のＤＮＡ構築物を含むＡ．ニガー細胞であり、前記ＤＮＡ構築物は、配列番号１５またはその誘導体、配列番号１６またはその誘導体、配列番号１７またはその誘導体、配列番号１８またはその誘導体、配列番号１９またはその誘導体のリストから選択されるプロモーターを含み、前記ＤＮＡ構築物はさらに、選択可能なマーカーをコードするレポーター遺伝子を含み、スクリーニングは選択的培養条件を用いて実施される。さらにより好ましくは、宿主細胞は、本発明の第１のＤＮＡ構築物を含むＡ．ニガー細胞であり、前記ＤＮＡ構築物は、配列番号１５またはその誘導体、配列番号１６またはその誘導体、配列番号１７またはその誘導体、配列番号１８またはその誘導体、配列番号１９またはその誘導体のリストから選択されるプロモーターを含み、前記ＤＮＡ構築物はさらに、配列番号６１などのハイブリッドレポーター遺伝子を含み、スクリーニングは選択的培養条件を用いて実施される。さらにより好ましくは、宿主細胞はＡ．ニガー細胞であり、第１のＤＮＡ構築物は、
−  プロモーター配列番号１５と作用的に関連するハイブリッドレポーター遺伝子ＧＦＰ−ＢＬＥ（配列番号６１）、もしくは
−  プロモーター配列番号１６またはその誘導体と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥもしくは
−  プロモーター配列番号１７またはその誘導体と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥ、もしくは
−  プロモーター配列番号１８またはその誘導体と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥ、もしくは
−  プロモーター配列番号１９またはその誘導体と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥを含み、スクリーニングは、選択的な薬剤として抗生物質、好ましくはフレオマイシンを含む選択的培養条件を用いて実施される。
【０１２９】
上記のように本発明のスクリーニング法により単離されたＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列によりコードされる目的のタンパク質の産生を生じるため、または改善するために使用される。有利に、上記のスクリーニング法において単離される形質転換宿主細胞は、目的のタンパク質の産生、好ましくは分泌に寄与する条件下で形質転換宿主細胞を培養し、任意でタンパク質を回収することによって、目的のタンパク質の産生のための工程において直接使用される。
【０１３０】
好ましい実施形態によると、宿主細胞がレポーター遺伝子および／または選択可能なマーカー遺伝子を含むことなく、宿主細胞が目的のタンパク質の産生のために直接使用されることが可能になる。従って、本発明のプロモーターと作用的に関連するレポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物は、細胞が目的のタンパク質の産生、好ましくは分泌についてスクリーニングされた後に宿主細胞から欠失される。本発明のＤＮＡ構築物の欠失を可能にするために、ＤＮＡ構築物は、好ましくは、レポーター遺伝子およびＤＮＡ反復間の双方向性の選択可能なマーカー遺伝子の両方を含む。ＤＮＡ反復は、染色体内の相同組換えによって、ＤＮＡ構築物の欠失を可能にする。この方法は、ＥＰ０６３５５７４Ｂ１号明細書に記載される「マーカー−遺伝子フリー」アプローチに類似している。
【０１３１】
多くの場合、本発明のスクリーニング法で単離される最初の形質転換宿主細胞は、スクリーニングの目的では満足できるが、経済的な産生のためには大幅に改善され得る発現レベルを有するであろう。このために、ＤＮＡ配列は発現ベクターに挿入され、これは次に、適切な宿主細胞を形質転換するために使用される。発現ベクター内で、ＤＮＡ配列は、プロモーター、任意でシグナル配列およびターミネーターなどの適切な発現シグナルに作用可能に結合され、これらは、「ＤＮＡ構築物」および「制御要素」セクションで定義されたように、宿主生物体内でタンパク質の発現を指示することができる。タンパク質の産生のための適切な宿主細胞は、原核生物または真核生物細胞のいずれでもよく、好ましくは真正細菌、酵母または糸状菌である。好ましい細菌宿主細胞は、プロモーターのセクションで定義したようなバシラス属から選択される。もう１つの好ましい実施形態によると、宿主細胞は、「宿主細胞」のセクションで既に定義したような酵母または糸状菌である。好ましい酵母宿主細胞は、サッカロミセス属、クルイベロミセス属、ヤロウイア属、ピキア属、およびハンゼヌラ属からなる群から選択される。好ましい糸状菌宿主細胞は、スクリーニング法のために好ましい宿主細胞として上記で列挙した属と同じ属から選択される。より好ましくは、糸状菌はアスペルギルス、ペニシリウムまたはトリコデルマ種である。さらにより好ましくは、アスペルギルス宿主細胞は、アスペルギルス・ニガーまたはアスペルギルス・ソーヤまたはアスペルギルス・オリゼー種である。最も好ましい宿主細胞はＡ．ニガー、好ましくはＣＢＳ５１３．８８またはその誘導体である。
【０１３２】
適切な宿主細胞は、当業者が利用できる様々なプロトコルのいずれかによって、発現ベクターで形質転換される。形質転換宿主細胞は、次に、タンパク質をコードするＤＮＡ配列の発現に寄与する条件下で形質転換宿主細胞を培養し、任意でタンパク質を回収することによって目的のタンパク質を産生するための工程において使用される。
【０１３３】
好ましくは、目的のタンパク質は酵素である。
【０１３４】
従って、本発明は、発現クローニング法における本発明のプロモーターの使用に関する。
【０１３５】
本発明はさらに、本発明のプロモーターの他の使用に関する。好ましくは、本発明のプロモーターは、前のセクションで全て定義されたＤＮＡ構築物または発現ベクター中の任意のコード配列と作用的に関連し得る。このようなＤＮＡ構築物または発現ベクターは、「宿主細胞」セクションにおいて定義したような任意の宿主細胞内に導入されて、所与の価値のある化合物の発現のために使用され得る。このような価値のある化合物の例は代謝産物またはポリペプチドであるが、これらに限定されない。好ましくは、本発明のプロモーターと作用的に関連するコード配列は、価値のある化合物をコードする。あるいは、そして本発明のもう１つの好ましい実施形態によると、本発明のプロモーターと作用的に関連するコード配列は価値のある化合物の産生に関与する。
【０１３６】
あるいは、そして本発明のプロモーターのもう１つの好ましい使用によると、本発明のプロモーターは不活性化または置換構築物に組み込まれ、所与の宿主細胞内に形質転換され、そして標的遺伝子を不活性化または置換するために使用される。
【０１３７】
本発明はさらに、以下の実施例によって説明される。
【実施例】
【０１３８】
材料および方法
一般的な手順
サムブルックら、（２００１年）「分子クローニング：実験室マニュアル、第３版」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨークおよびイニス（Ｉｎｎｉｓ）ら、（１９９０年）「ＰＣＲプロトコル、方法および用途の入門書」アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、サンディエゴによって記載されるように、ＤＮＡ単離、ゲル電気泳動法、核酸の酵素制限修飾、ノーザン分析、大腸菌形質転換などの標準分子クローニング技法を実施した。合成オリゴデオキシヌクレオチドは、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（オランダ、ブレダ）から入手した。室温は摂氏２０度±２度である。
【０１３９】
アスペルギルス・ニガーの形質転換
Ａ．ニガーの形質転換は、ティルバーン（Ｔｉｌｂｕｒｎ）Ｊ．ら（１９８３年）Ｇｅｎｅ  ２６、２０５−２２１頁およびケリー（Ｋｅｌｌｙ）Ｊ．＆ハインズ（Ｈｙｎｅｓ）Ｍ．（１９８５年）ＥＭＢＯ  Ｊ．、４、４７５−４７９頁によって記載される方法に従って、以下の点を変更して実施した。
【０１４０】
アスペルギルス最少培地（１００ｍｌ）において、３００ｒｐｍのロータリーシェーカー内に入れた振とうフラスコ中、摂氏３０度で１６時間、胞子を発芽および培養した。アスペルギルス最少培地は、１リットルあたり、６ｇのＮａＮＯ３、０．５２ｇのＫＣｌ、１．５２ｇのＫＨ２ＰＯ４、１．１２ｍｌの４ＭのＫＯＨ、０．５２ｇのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１０ｇのグルコース、１ｇのカザミノ酸、２２ｍｇのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１１ｍｇのＨ３ＢＯ３、５ｍｇのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７ｍｇのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．６ｍｇのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、５ｍｇのＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．５ｍｇのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、５０ｍｇのＥＤＴＡ、２ｍｇのリボフラビン、２ｍｇのチアミン−ＨＣｌ、２ｍｇのニコチンアミド、１ｍｇのピリドキシン−ＨＣＬ、０．２ｍｇのパントテン酸、４ｇのビオチン、１０ｍｌのペニシリン（５０００ＩＵ／ｍｌ）ストレプトマイシン（５０００ＵＧ／ｍｌ）溶液（ギブコ（Ｇｉｂｃｏ））を含有する。
−  プロトプラストの調製のために、ヘリカーゼの代わりにノボザイム（Ｎｏｖｏｚｙｍ）２３４ＴＭ（ノボ・インダストリーズ（Ｎｏｖｏ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ））を使用した。
−  プロトプラスト形成（６０〜９０分）の後、ＫＣ緩衝液（０．８ＭのＫＣｌ、９．５ｍＭのクエン酸、ｐＨ６．２）を４５ｍｌの最終体積まで添加した。揺動バケットローターにおいて摂氏４度、３０００ｒｐｍで１０分間、プロトプラスト懸濁液を遠心分離した。プロトプラストを２０ｍｌのＫＣ緩衝液中に再懸濁させ、続いて２５ｍｌのＳＴＣ緩衝液（１．２Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＣａＣｌ２）を添加した。揺動バケットローターにおいて摂氏４度、３０００ｒｐｍで１０分間プロトプラスト懸濁液を遠心分離し、ＳＴＣ−緩衝液中で洗浄し、ＳＴＣ−緩衝液中に１０Ｅ８のプロトプラスト／ｍｌの濃度で再懸濁させた。
−  ２００マイクロリットルのプロトプラスト懸濁液に、１０マイクロリットルのＴＥ緩衝液（１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、０．１ｍＭのＥＤＴＡ）および１００マイクロリットルのＰＥＧ溶液（２０％のＰＥＧ４０００（メルク（Ｍｅｒｃｋ））、０．８Ｍのソルビトール、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＣａＣｌ２）中に溶解したＤＮＡ断片を添加した。
−  室温で１０分間のＤＮＡ−プロトプラスト懸濁液のインキュベーションの後、管を繰り返し混合しながら、１．５ｍｌのＰＥＧ溶液（６０％ＰＥＧ４０００（メルク）、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．５、５０ｍＭのＣａＣｌ２）をゆっくり添加した。室温で２０分間のインキュベーションの後、懸濁液を５ｍｌの１．２Ｍのソルビトールで希釈し、反転させて混合し、室温で１０分間、４０００ｒｐｍで遠心分離した。プロトプラストを１ｍｌの１．２Ｍのソルビトール中に静かに再懸濁させ、リボフラビン、チアミン．ＨＣＬ、ニコチンアミド、ピリドキシン、パントテン酸、ビオチン、カザミノ酸およびグルコースを含まないいずれかのアスペルギルス最少培地からなる固体の選択再生培地にプレーティングした。アセトアミド選択の場合、培地は、唯一の窒素源としての１０ｍＭのアセトアミドおよび浸透圧調節物質およびＣ−源としての１Ｍのスクロースを含有した。あるいは、１〜５０マイクログラム／ｍｌのフレオマイシンおよび浸透圧調節物質としての１Ｍのスクロースが追加されたＰＤＡ（ポテトデキストロース寒天、オキソイド（Ｏｘｏｉｄ））にプロトプラストをプレーティングした。２％の寒天（寒天Ｎｏ．１、オキソイド（Ｏｘｏｉｄ）Ｌ１１）を用いて再生プレートを凝固させた。摂氏３０度で６〜１０日間のインキュベーションの後、２％グルコースおよび１．５％アガロース（インビトロジェン）を有するアスペルギルス選択培地（アセトアミド選択の場合には唯一の窒素源としてのアセトアミドを含有する最少培地、またはフレオマイシン選択の場合には１〜５０マイクログラム／ｍｌのフレオマイシンが追加されたＰＤＡ）からなるプレートに形質転換体の分生胞子を移し、摂氏３０度で５〜１０日間インキュベートした。単一の形質転換体を単離してこの選択的精製ステップを一回繰り返し、精製した形質転換体を貯蔵した。
【０１４１】
アスペルギルス・ニガーのマイクロタイタープレート発酵およびサンプリング
Ａ．ニガーの胞子を得るために、供給元の使用説明書に従って調製した、１５０マイクロリットルの固体ＰＤＡ培地（ポテトデキストロース寒天、オキソイド）を充満したマイクロタイタープレートに菌糸を移植した。摂氏３０度で３〜７日間の成長（静止）の後、胞子が形成された。続いて、１００マイクロリットルの液体発酵培地（７０ｇ／ｌのグルコース・Ｈ２Ｏ、２５ｇ／ｌのペプトン（カゼインから）、１２．５ｇ／ｌの酵母抽出物（ディフコ（Ｄｉｆｃｏ））、２ｇ／ｌのＫ２ＳＯ４、１ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０３ｇ／ｌのＺｎＣＬ２、０．０２ｇ／ｌのＣａＣＬ２、９ｍｇ／ｌのＭｎＳＯ４・Ｈ２Ｏ、３ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、４ＮのＨ２ＳＯ４でｐＨ５．６に調整）をそれぞれのウェルに添加した。発酵培地をピペットで２０回上下させて、培地中の胞子を単離した。接種した発酵培地を別のマイクロタイタープレートに移し、オービタルマイクロタイタープレートシェーカー（インフォース（Ｉｎｆｏｒｓ）ＨＴ）において、摂氏３４度、５５０ｒｐｍおよび８０％湿度で６日間インキュベートした。６日目に、上澄みを採取し、分泌タンパク質の検出のために使用した。
【０１４２】
マススペクトロメトリー分析
ウルトラセル（Ｕｌｔｒａｃｅｌ）ろ過プレート（米国マサチューセッツ州ビルリカのミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ））において、上澄みを遠心力によって限外ろ過した。限外ろ過は、製造業者により提供されるプロトコルに従って実施した。限外ろ過した上澄みに、１０マイクロリットルの２００ｍＭの重炭酸アンモニウム、ｐＨ７．８（独国ゼールツェのリーデル−デ・ハーン社（Ｒｉｅｄｅｌ−ｄｅ  Ｈａｅｎ  ＡＧ））および１マイクロリットルの２５０マイクログラム／ｍｌのトリプシン（米国ニュージャージー州レークウッドのワージントン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ））を添加した。上澄みを摂氏３７度で３時間消化した。消化した上澄みを、１０ミリグラム／ｍｌの再結晶化α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（？ＣＨＣＡ）（仏国ソフィア・アンティポリス・セデックスのレーザー・バイオ・ラブズ（Ｌａｓｅｒ  Ｂｉｏ  Ｌａｂｓ））溶液と１：１の割合で混合し、これらの混合物から、１マイクロリットルをＭＡＬＤＩターゲットにスポッティングした。スポッティングしたサンプルを、ＭＡＬＤＩ  ＬＴＱ質量分析計（米国フロリダ州オーランドのサーモ・エレクトロン（Ｔｈｅｒｍｏ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ））においてＭＡＬＤＩ  ＭＳおよびＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳで分析した。
【０１４３】
得られたＭＳ／ＭＳスペクトルをペプチド配列に変換して、予め作成したＦＡＳＴＡタンパク質データベースの利用可能なタンパク質配列と比較し、個々の酵素を同定した。
【０１４４】
ＲＮＡの単離
ペトリ皿において、２０ｍｌの液体の選択再生培地（６ｇ／ｌのＮａＮＯ３、０．５２ｇ／ｌのＫＣｌ、１．５２ｇ／ｌのＫＨ２ＰＯ４、０．２５ｇ／ｌのＫＯＨ、０．５２ｇ／ｌのＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２２ｍｇ／ｌのＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１１ｍｇ／ｌのＨ３ＢＯ３、５ｍｇ／ｌのＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１．７ｍｇ／ｌのＣｏＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１．６ｍｇ／ｌのＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、５ｍｇ／ｌのＭｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１．５ｍｇ／ｌのＮａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏ、５０ｍｇ／ｌのＥＤＴＡ、３４１ｇ／ｌのスクロース、１０ｍｌのペニシリン（５０００ｌＵ／ｍｌ）ストレプトマイシン（５０００ＵＧ／ｍｌ）溶液（ギブコ））で形成されたアスペルギルス・ニガー菌糸を収集し、脱塩水で洗浄し、ペーパータオルの間で圧迫して過剰の水を除去した。菌糸を液体窒素中で直ちに凍結し、乳鉢および乳棒を用いて細かい粉末に粉砕した。得られた粉末を無菌の５０ｍｌの管に移して秤量し、粉砕した菌糸１〜１．２ｇごとに１０ｍｌのＴＲＩｚｏｌ試薬（インビトロジェン）を添加した（管あたり最大２５ｍｌ）。激しく攪拌する（１分間のボルテックス）ことによって菌糸粉末を直ちに可溶化し、その後時々混合しながら５分間の室温インキュベーションを行った。０．２（初めのＴＲＩｚｏｌ）体積のクロロホルム（従って、初めに使用したＴＲＩｚｏｌ１０ｍｌごとに２ｍｌ）を添加し、ボルテックスし、室温で１０分間放置した。続いて、摂氏４度、６０００ｇで３０分間混合物を遠心分離した。上部の水相を新しい管に移し、０．５（初めのＴＲＩｚｏｌ）体積の１００％イソプロピルアルコール（従って、初めに使用したＴＲＩｚｏｌ１０ｍｌごとに５ｍｌのイソプロピルアルコール）の添加によって全ＲＮＡを沈殿させた。室温で１０分間の沈殿後、６０００ｇで３０分間の遠心分離によってＲＮＡを回収した。上澄みを除去して、ＲＮＡペレットを１（初めのＴＲＩｚｏｌ）体積の７０％エタノールで洗浄した。エタノールを除去した後、ＲＮＡペレットを空気乾燥した。乾燥したＲＮＡペレットを３ｍｌのＧＴＳ（１００ｍＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、４Ｍのチオシアン酸グアニジウム、０．５％ラウリルサルコシン酸ナトリウム）緩衝液中に溶解した。ＲＮＡのさらなる精製は、供給元のマニュアルに従ってＲｎｅａｓｙ  Ｍａｘｉ  Ｋｉｔ（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を用いて実施した。１０マイクロリットルのＲＮＡ溶液を用いて、核酸の品質および濃度を決定した。
【０１４５】
アスペルギルス・ニガー株
Ａ．ニガーＷＴ−１：
このＡ．ニガー株は、グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、真菌アミラーゼおよび酸アミラーゼをコードする遺伝子の欠失を含むＣＢＳ５１３．８８である。Ａ．ニガーＷＴ１は、ＥＰ０６３５５７４Ｂ１号明細書に記載される「マーカー−遺伝子フリー」アプローチを用いることにより構築した。この特許では、ＣＢＳ５１３．８８のゲノムにおけるｇｌａＡ特異性ＤＮＡ配列を欠失する方法が広範囲にわたって記載されている。最初の手順で、最終的に外来性のＤＮＡ配列を全く所有しないマーカー−遺伝子フリー？ｇｌａＡ組換えＡ．ニガーＣＢＳ５１３．８８株が得られた。続いて、ＥＰ０６３５５７４Ｂ１号明細書に記載される方法によって、真菌アミラーゼおよび酸アミラーゼをコードする遺伝子をＡ．ニガーＷＴ−１のゲノムから欠失させた。図７〜９および１１〜１４に描かれる所望の構築物のクローニングのために使用されるベクターは、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットにおいて以前に記載された基幹の特徴を含有する。
【０１４６】
Ａ．ニガーＷＴ−ＧＦＰ：
このＡ．ニガー株は、よく知られた緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）チャルフィ（Ｃｈａｌｆｉｅ）Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４年）２６３（５１４８）：８０２−８０５頁）をコードする遺伝子（を含有する図７に描かれる発現ベクターｐＧＢＦＩＮＧＦＰ−２を用いて、グルコアミラーゼプロモーターによって駆動されるＡ．ニガーＷＴ−１の形質転換によって入手した。選択培地における精製の後、ＰＣＲ分析に基づいて単一コピー組込み体を選択した。
【０１４７】
Ａ．ニガーＷＴ−ＰＨＹ：
このＡ．ニガー株は、フィターゼ遺伝子ＰＨＹ（国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに既に記載されたＦｙｔＡと同一）を含有する図８に描かれる発現ベクターｐＧＢＦＩＮ−３２を用いて、グルコアミラーゼプロモーターによって駆動されるＡ．ニガーＷＴ−１の形質転換によって入手した。選択培地における精製の後、ＰＣＲ分析に基づいて単一コピー組込み体を選択した。
【０１４８】
Ａ．ニガーＷＴ−ＰＨＹ−２：
このＡ．ニガー株は、フィターゼ遺伝子ＰＨＹ（国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに既に記載されたＦｙｔＡと同一）を含有する図８に描かれる発現ベクターｐＧＢＦＩＮ−３２を用いて、グルコアミラーゼプロモーターによって駆動されるＡ．ニガーＷＴ−１の形質転換によって入手した。選択培地における精製の後、ＰＣＲ分析に基づいてマルチコピー組込み体を選択した。
【０１４９】
Ａ．ニガーＷＴ−ベクター：
このＡ．ニガー株は、図９に描かれる空の制御ベクターｐＧＢＦＩＮ−４０を用いて、Ａ．ニガーＷＴ−１株の形質転換によって入手した。空の制御ベクターｐＧＢＦＩＮ−４０は、図８に描かれるｐＧＢＦＩＮ−３２のＸｈｏＩ消化、および最大の断片の再連結によって構築し、それにより、グルコアミラーゼプロモーターおよびフィターゼ遺伝子ＰＨＹの５’部分が除去された。ＰＣＲ分析によって単一コピー組込み体を選択した。
【０１５０】
実施例１
バシラスレポータープラスミドおよびレポーター株の構築
１．１  レポータープラスミドｐＰｈｔｒＡ−ｇｆｐ−ａｍｙＥおよびｐＰｈｔｒＢ−ｇｆｐ−ａｍｙＥの構築
最初に、レポータープラスミドｐＰｈｔｒＡ−ｇｆｐ−ａｍｙＥを以下のように構築した。ＧＦＰの最適化バージョンをコードする遺伝子、ｇｆｐｍｕｔ−１（Ｐ．コーマック（Ｃｏｒｍａｃｋ）、Ｒ．Ｈ．バルディビア（Ｖａｌｄｉｖｉａ）、およびＳ．ファルコー（Ｆａｌｋｏｗ）、１９９６年、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のＦＡＣＳ−最適化突然変異体、Ｇｅｎｅ  １７３、３３）を、以下のプライマー：ＲＮ−ｌａｃＺ−ｒｖ（配列番号３）
【化５】
2008532535.tif 000006
およびｇｆｐ−ターミネーター−ｒｖ（配列番号４）
【化６】
2008532535.tif 000007
と共に、ｐＳＧ１１５１（Ｐ．Ｊ．ルイス（Ｌｅｗｉｓ）およびＡ．Ｌ．マーストン（Ｍａｒｓｔｏｎ）、１９９９年、バシラス・サブチリスにおけるタンパク質融合物の制御された発現および二重標識化のためのＧＦＰベクター、Ｇｅｎｅ  ２２７、１０１）を鋳型ＤＮＡとして用いてＰＣＲにより増幅し、ｇｆｐｍｕｔ−１の上流側および下流側にそれぞれ、ＫｐｎＩおよびＢｐｕ１１０１Ｉ（太字）部位が得られた。９１３ｂｐＰＣＲ産物を、ＫｐｎＩおよびＢｐｕ１１０１Ｉ部位を用いて、ｐＤＬ（部位特異的組換えのためのａｍｙＥ座位の相同のフランキング領域を含有する）（Ｇ．ユアン（Ｙｕａｎ）およびＳ．Ｌ．ワン（Ｗｏｎｇ）、１９９５年、バシラス・サブチリスにおけるｇｒｏＥ発現の調節：シグマＡ様プロモーターの関与および逆方向反復配列の役割（ＣＩＲＣＥ）、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７７、５４２７）内に連結して、ｐＧＦＰ−ａｍｙＥが得られた。ｈｔｒＡのプロモーター（ＰｈｔｒＡ）（配列番号１）を、Ｂ．サブチリス１６８（バシラス遺伝子ストックセンターＩＤ：１Ａ１）の染色体ＤＮＡを鋳型ＤＮＡとして用いるＰＣＲによって増幅した。使用したプライマーは、ＰｈｔｒＡ−ｆｗ（配列番号５）
【化７】
2008532535.tif 000008
およびＰｈｔｒ−ｒｖ（配列番号６）
【化８】
2008532535.tif 000009
であり、それぞれ、ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（太字）を導入した。ＫｐｎＩおよびＨｉｎｄ３による消化の後、５３１ｂｐＰＣＲ産物を、ｇｆｐ遺伝子の上流側でｐＧＦＰ−ａｍｙＥ内に連結し、レポータープラスミドｐＰｈｔｒＡ−ｇｆｐ−ａｍｙＥが得られた。このプラスミドのマップは、図１に描かれる。上記と同様の方法でプラスミドｐＰｈｔｒＢ−ｇｆｐ−ＡｍｙＥを構築した。ｈｔｒＢのプロモーター（ＰｈｔｒＢ）（配列番号２）の増幅のために使用したプライマーは、ＰｈｔｒＢ−ｆｗ（配列番号７）
【化９】
2008532535.tif 000010
およびＰｈｔｒＡ−ｒｖ（配列番号８）
【化１０】
2008532535.tif 000011
であった。
【０１５１】
１．２  バシラスレポーター株ＶＴ２１０ＡおよびＶＴ２１０Ｂの構築
得られたプラスミドｐＰｈｔｒＡ−ｇｆｐ−ａｍｙＥおよびｐＰｈｔｒＢ−ｇｆｐ−ａｍｙＥを、Ｂ．サブチリスＤＢ１０４、ＤａｐｒＥ、ＤｎｐｒＥ二重突然変異体（Ｆ．カワムラ（Ｋａｗａｍｕｒａ）およびＲ．Ｈ．ドイ（Ｄｏｉ）、１９８４年、細胞外アルカリおよび中性プロテアーゼが欠損したバシラス・サブチリス二重突然変異体の構築、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６０、４４２）内に導入した。クロラムフェニコール耐性の形質転換体に、染色体ＤＮＡにおけるＰＣＲによって、ａｍｙＥ座位におけるダブルクロスオーバーによる部位特異的組込みの検査をした。ＰｈｔｒＡのＨｔｒＡによる負のフィードバック調節を低減するために（Ｄ．ヌーン（Ｎｏｏｎｅ）、Ａ．ハウエル（Ｈｏｗｅｌｌ）、Ｒ．コレリー（Ｃｏｌｌｅｒｙ）、およびＫ．Ｍ．デバイン（Ｄｅｖｉｎｅ）、２００１年、バシラス・サブチリスにおけるＹｋｄＡおよびＹｖｔＡ、ＨｔｒＡ−様セリンプロテアーゼは、ｙｋｄＡおよびｙｖｔＡ遺伝子発現の負の自己調節および相互の交差調節に関与する、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８３、６５４）、ｐＭｕｔｉｎ２の組込みにより分裂されたｈｔｒＡ遺伝子を有するＢ．サブチリスＢＶ２００３の染色体ＤＮＡで、新しい株を形質転換した（Ｈ．Ｌ．ヒリライネン（Ｈｙｙｒｙｌａｉｎｅｎ）、Ａ．ボルフイス（Ｂｏｌｈｕｉｓ）、Ｅ．ダルモン（Ｄａｒｍｏｎ）、Ｌ．ムッコネン（Ｍｕｕｋｋｏｎｅｎ）、Ｐ．コスキ（Ｋｏｓｋｉ）、Ｍ．ビティカイネン（Ｖｉｔｉｋａｉｎｅｎ）、Ｍ．サーバス（Ｓａｒｖａｓ）、Ｚ．プレイガイ（Ｐｒａｇａｉ）、Ｓ．ブロン（Ｂｒｏｎ）、Ｊ．Ｍ．バン・ディール（ｖａｎ  Ｄｉｊｌ）、およびＶ．Ｐ．コンティネン（Ｋｏｎｔｉｎｅｎ）、２００１年、厳しい分泌ストレスに耐えるためのバシラス・サブチリスにおける新規の２成分調節系、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４１、１１５９）。形質転換体をエリスロマイシン耐性について選択し、ｈｔｒＡ破壊について染色体ＤＮＡにおいてＰＣＲにより検査した。得られた株をＶＴ２００ＡおよびＶＴ２００Ｂと名付けた。
【０１５２】
ＶＴ２００Ａ株の形質転換効率を増大するために、ＢｓｕＭＲ破壊構築物を設計した。ＢｓｕＭＲ系は、ＢｓｕＭＲの機能のためにそれぞれが必須である３つの遺伝子、ｙｄｉＲ、ｙｄｉＳおよびｙｄｊＡからなるオペロンによって形成される（Ｐ．Ｊ．ルイス（Ｌｅｗｉｓ）およびＡ．Ｌ．マーストン（Ｍａｒｓｔｏｎ）、１９９９年、バシラス・サブチリスにおけるタンパク質融合物の制御された発現および二重標識化のためのＧＦＰベクター、Ｇｅｎｅ  ２２７、１０１）。以下のプライマー：ｆｌｒＢｓｕ１Ｆ、（配列番号９）
【化１１】
2008532535.tif 000012
およびｆｒｌ１ＢｓｕＲ、（配列番号１０）
【化１２】
2008532535.tif 000013
ならびに鋳型としてのＢ．サブチリスの染色体ＤＮＡを用いて、ｙｄｉＲのフランキング領域１（ｆｌｒ１）、７５６ｂｐ領域を増幅した。ｐＤＧ１７２６（Ａ．Ｍ．ゲロート−フリュリー（Ｇｕｅｒｏｕｔ−Ｆｌｅｕｒｙ）、Ｋ．シャザンド（Ｓｈａｚａｎｄ）、Ｎ．フランセン（Ｆｒａｎｄｓｅｎ）、およびＰ．ストレイジャー（Ｓｔｒａｇｉｅｒ）、１９９５年、バシラス・サブチリスのための抗生物質耐性のカセット、Ｇｅｎｅ  １６７、３３５）を鋳型ＤＮＡとして用いて、以下のプライマー：ｓｐｅｃＢｓｕ−Ｆ（配列番号１１）
【化１３】
2008532535.tif 000014
およびｓｐｅｃＢｓｕ−Ｒ（配列番号１２）
【化１４】
2008532535.tif 000015
と共に、スペクチノマイシン耐性マーカーを増幅した。第２のＰＣＲでは、１３１９ｂｐのＰＣＲ産物およびｆｌｒＢｓｕ１断片を用い、両方の断片が、プライマーｆｌｒＢｓｕ１−ＲおよびｓｐｅｃＢｓｕ−Ｆ（太字）により導入されたその相同端部の組換えにおいて１つの鋳型としての機能を果たした。プライマーｆｌｒＢｓｕ１−ＦおよびｓｐｅｃＢｓｕ−Ｒを用いて、２０７５ｂｐＰＣＲ断片、ｆｌｒ１−ｓｐｅｃｒを得て、これをｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ（インビトロジェン）においてサブクローニングし、ｐＣＴ−ＸＬ−ＴＯＰＯ−ｆｌｒ１−ｓｐｅｃが得られた。プライマーｆｌｒＢｓｕ２−Ｆ（配列番号１３）
【化１５】
2008532535.tif 000016
およびプライマーｆｌｒＢｓｕ２−Ｒ（配列番号１４）
【化１６】
2008532535.tif 000017
ならびに鋳型としてのＢ．サブチリスの染色体ＤＮＡを用いて、フランキング領域２、ｙｄｉＳの３’末端の２４ｂｐを包含する７３９ｂｐ領域（ＤＮＡエンドヌクレアーゼをコードする）および隣接するｙｄｊＡの大部分（未知の機能）を増幅した。ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯにおいてＰＣＲ産物をクローニングして、ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ−ｆｌｒ２が得られた。ｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯベクターの多重クローニング部位を使用して、ＸｈｏＩおよびＮｓｉｌを用いてｆｌｒ１−ｓｐｅｃｒをｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ−ｆｌｒ１から制限し、ＸｈｏＩおよびＰｓｔＩ（ＮｓｉＩに適合性）で消化されたｐＣＲ−ＸＬ−ＴＯＰＯ−ｆｌｒ２内に連結した。この結果、株ＶＴ２００Ａ内に導入された欠失構築物ｐＴＯＰＯ−ｆｌｒ１−ｓｐｅｃｒ−ｆｌｒ２が得られた。染色体ＤＮＡにおけるＰＣＲによって、スペクチノマイシン耐性形質転換体をｙｄｉＳ欠失について検査した。得られた最終のレポーター株をＶＴ２１０ＡおよびＶＴ２１０Ｂと名付け、さらなる実験のために使用した。これらの株の構築の一般的な概要は、図２に描かれる。
【０１５３】
１．３  発現ベクターｐＵＢｎｐｒ２およびｐＵＢＢＡＧの構築：
プラスミドｐＵＢ１１０の構築およびその配列は以前に記載されている（マッケンジー（ＭｃＫｅｎｚｉｅ）Ｔ．、ホシノ（Ｈｏｓｈｉｎｏ）Ｔ．、およびスエオカ（Ｓｕｅｏｋａ）、Ｎ．、１９８６年。ｐＵＢ１１０のヌクレオチド配列、複製およびその調節に関するいくつかの顕著な特徴、Ｐｌａｓｍｉｄ  １５：９３−１０３頁）。ｐＵＢ１１０におけるバシラス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙＱ（ジェンバンク受入番号Ｊ０１５４２）のクローニングは、以前に記載されたようにプラスミドｐＫＴＨ１０をもたらす（パルバ（Ｐａｌｖａ）Ｉ．１９８２年、バシラス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子の分子クローニングおよびＢ．サブチリスにおけるその発現、Ｇｅｎｅ  １９：８１−８７頁）。
【０１５４】
いずれもバシラス・アミロリケファシエンスからの中性プロテアーゼ遺伝子ｎｐｒ（ジェンバンク受入番号Ｋ０２４９７）およびβ−グルカナーゼ遺伝子ｂａｇ（ジェンバンク受入番号Ｍ１５６７４）のベクターｐＵＢ１１０へのクローニングは、本質的に、ａｍｙＱのクローニングのために使用される方法に従って実施し、図３および４に描かれるようなプラスミドｐＵＢｎｐｒ２およびｐＵＢＢＡＧが得られた。
【０１５５】
１．４  発現構築物ｐＫＴＨ１０、ｐＵＢｎｐｒ２およびｐＵＢＢＡＧのバシラスレポーター株ＶＴ２１０Ａへの形質転換
バシラス・サブチリス株ＶＴ２１０Ａの形質転換は、本質的に、以前に記載されたようにこの生物体の自然の受容能を使用して実施した（アナグノストプーロス（Ａｎａｇｎｏｓｔｏｐｏｕｌｏｓ）Ｃ．およびスピジツェン（Ｓｐｉｚｉｚｅｎ）Ｊ．１９６１年、バシラス・サブチリスにおける形質転換の必要条件、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  ８１：７４１−７４６頁）。ＤＮＡインキュベーションの後、０．１％デンプンおよび形質転換のための選択試薬としての抗生物質カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含有する２×ＴＹ寒天上に細胞を広げた。プレートを摂氏３７度で一晩インキュベートした。プラスミドｐＫＴＨ１０が形質転換に関与した場合には、コロニーをルゴール溶液で被覆して、アミラーゼ分泌細胞を検出した。
【０１５６】
実施例２
蛍光活性化細胞アッセイによる分泌ストレス細胞の分析
２．１  蛍光活性化細胞分取による分泌ストレス細胞の選択：
バシラス・サブチリス株ＶＴ２１０Ａの同時形質転換のために、プラスミドｐＵＢ１１０（空の制御ベクター）およびｐＫＴＨ１０（バシラス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙＱをコードする）を１：２０の割合で用いた。細胞の一部分を選択ＴＹ寒天プレートに広げ、他の部分にはカナマイシンを含有する２×ＴＹブロスを添加し、細胞を一晩培養した。同時形質転換の場合と同じ操作を行って別個のプラスミドを同様に形質転換した。次の日、熟練したオペレーターにより、フローサイトメーター型ＦＡＣＳ（ダコ−サイトメーション（Ｄａｋｏ−ｃｙｔｏｍａｔｉｏｎ）のＭｏ−ＦＩｏ）でＧＦＰ蛍光について培養物を分析した。８０ｍＷａｔｔおよび４８８ｎｍの青色レーザーを使用した。典型的なＦＡＣＳ実験は、２０，０００事象（細胞）の分析を含んだ。最初に、ＶＴ２１０Ａ、ｐＵＢ１１０の細胞（分泌ストレスなし）およびＶＴ２１０Ａ、ｐＫＴＨ１０の細胞（α−アミラーゼＡｍｙＱの過剰産生による分泌ストレス）の蛍光シグナルを別々に（図５Ａおよび５Ｂ）、そして混合物として（図５Ｃ）分析した。これらの結果に基づいて、細胞分取限界よりも高いＧＦＰ蛍光を表示する細胞が分取されるように、細胞分取限界を手動で設定した（図５Ｄの点線）。同時形質転換培養物をフローサイトメーターに適用させ、分取した細胞を管に採取した。分取した蛍光集団ではα−アミラーゼ分泌細胞が濃縮されていることを立証するために、異なる希釈の採取細胞を、デンプンを含有する選択寒天上に広げた。ＦＡＣＳにより分取していない元の一晩インプット培養物についても同じことを行った。成長後、コロニーをルゴール溶液で被覆し、α−アミラーゼ活性により生じるハロ形成を視覚化した。表１に示されるように、約９０％の分取細胞はα−アミラーゼを実際に分泌したが、インプット培養物ではわずか０．５〜０．７％の細胞がα−アミラーゼを分泌した。この結果により、通常の細胞と分泌によるストレスのある細胞との間の蛍光シグナルの識別を用いてタンパク質分泌細胞を単離することによる本発明の強力な選択手段が明白に実証される。
【０１５７】
【表１】
2008532535.tif 000018
【０１５８】
２．２  蛍光細胞走査による分泌ストレス細胞の選択：
プラスミドｐＵＢ１１０（空の制御ベクター）およびｐＫＴＨ１０（バシラス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙＱをコードする）を別々にバシラス・サブチリス株ＶＴ２１０Ｂに形質転換した。細胞の一部分を選択ＴＹ寒天プレートに広げ、他の部分にはカナマイシンを含有する２×ＴＹブロスを添加し、細胞を一晩培養した。熟練したオペレーターにより、フローサイトメーター（コールター・エピックス（Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｅｐｉｃｓ）ＸＬ−ＭＣＬ、ベックマン・コールター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ））において培養物を分析した。典型的な実験は、２０，０００事象（細胞）の分析を含んだ。ＦＩＴＣ−フィルターを用いて蛍光シグナルを検出し、光電子増倍管電圧の設定は、７００ボルトと８００ボルトの間であった。通常の細胞と分泌によるストレスのある細胞との間の蛍光シグナルの差は、図６に描かれる。
【０１５９】
２．３  蛍光光度計を用いる分泌ストレスＶＴ２１０Ａ細胞の選択
形質転換レポーター株細胞をカナマイシンの存在下で２×ＴＹブロス中に接種し、摂氏３７度で一晩成長させた。プラスミドｐＵＢ１１０、ｐＫＴＨ１０、ｐＵＢｎｐｒ２およびｐＵＢＢＡＧの形質転換のために使用したＤＮＡは等量であった。静止期まで成長させた後、９６ウェルのマイクロタイタープレートフォーマットにおいて、４つの形質転換の培養細胞を等しい体積で８つに分割した。蛍光光度計（モレキュラー・デバイシーズ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、スペクトラ・マックス・ジェミニ（Ｓｐｅｃｔｒａ  ＭＡＸ  Ｇｅｍｉｎｉ）型）においてウェルを蛍光について分析した。励起は４９０ｎｍ、発光は５１０ｎｍ、そしてカットオフは４９５ｎｍである。不等分散を仮定した標準ｔ−テストを実施した。表２は、非ストレス細胞（ｐＵＢ１１０）が、蛍光シグナルの明白に著しい（Ｐ両側＜０．０５）差異によってストレス細胞（ｐＫＴＨ１０、ｐＵＢｎｐｒ２およびｐＵＢＢＡＧ）とは区別されたことを実証する。
【０１６０】
【表２】
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【０１６１】
実施例３
分泌誘発プロモーターを同定するためのＡ．ニガーのゲノム全体での発現の分析
Ａ．ニガーＷＴ−ＰＨＹにおいて高発現であり、そしてＡ．ニガーＷＴ−ＧＦＰ、Ａ．ニガーＷＴ−ベクターおよびＡ．ニガーＷＴ−１において発現を示さないか、または低発現であるプロモーター配列を同定するためにゲノム全体での発現の分析を実施した。将来の応用実験をシミュレートするために、Ａ．ニガーＷＴ−１、Ａ．ニガーＷＴ−ＧＦＰ、Ａ．ニガーＷＴ−ＰＨＹおよびＡ．ニガーＷＴ−ベクター株のプロトプラストを得た。Ａ．ニガーＷＴ−ＧＦＰ、Ａ．ニガーＷＴ−ＰＨＹおよびＡ．ニガーＷＴ−ベクターの場合には５０ｍｇ／ｌのフレオマイシン（インビトロジェン）が追加される２０ｍｌの量の液体選択再生培地に、ペトリ皿において、１００マイクロリットル１０Ｅ７／ｍｌのプロトプラストを接種した。摂氏３０度で３日間の成長（静止）の後、全ＲＮＡ単離のために使用した液体培地の表面に菌糸ペレットが形成された。アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）Ａ．ニガー・ジーンチップス（ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ）ＴＭにおけるｃＤＮＡ合成、ｃＤＮＡの標識化およびハイブリダイゼーションは、供給元のプロトコルに従って実施した。次の発現分析により、Ａ．ニガーＷＴ−ＰＨＹ株では、Ａ．ニガーＷＴ−１、Ａ．ニガーＷＴ−ＧＦＰおよびＡ．ニガーＷＴ−ベクターにおける基礎発現レベルの少なくとも８．５倍の発現レベルを有する５つの遺伝子の同定が得られた。発見を確認するために、ノーザンブロット分析を実施した。
【０１６２】
実施例４
ノーザン分析
アフィメトリクス（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）Ａ．ニガー・ジーンチップス（ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ）ＴＭ実験の結果を確認するために、ノーザンブロット分析を実施した。このために、Ａ．ニガー株ＷＴ−１、ＷＴ−ＧＦＰ、ＷＴ−ＦＹＴおよびＷＴ−ベクターから全ＲＮＡを単離した。ＲＮＡを変性させ、１％アガロースゲルにおけるゲル電気泳動法によって分離し、製造業者の使用説明書に従ってキャピラリーブロッティングによりナイロン膜（ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｎ＋、アマシャム・バイオサイエンシーズ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））へ移した。ＧＳ・ジーン・リンカー（ＧＳ  Ｇｅｎｅ  Ｌｉｎｋｅｒ）ＴＭ（バイオラド（ＢｉｏＲａｄ）、Ｃ３セッティング、１５０ミリジュール）において、ＲＮＡをナイロン膜へＵＶ架橋した。鋳型としてＡ．ニガーＷＴ−１のゲノムＤＮＡを使用し、表３に列挙されるプライマー（配列番号５０〜５９）を用いるＰＣＲによって、３２Ｐ−標識化ＤＮＡプローブの生成のためのＤＮＡを単離した。供給元の使用説明書（ラッドプライム（ＲａｄＰｒｉｍｅ）ＤＮＡラベリングシステム、インビトロジェン）に従ってノーザンブロットを、分泌誘発遺伝子（配列番号２０〜２４）を表すランダムに刺激された３２Ｐ−標識化ＤＮＡプローブとハイブリダイズした。ノーザン分析の結果は、図１０に示される。ノーザンブロットのハイブリダイゼーションパターンにより、アフィメトリクスＡ．ニガー・ジーンチップス（ＧｅｎｅＣｈｉｐｓ）ＴＭデータの発現分析で得られたデータ：Ａ．ニガー株ＷＴ−１、ＷＴ−ＧＦＰ、ＷＴ−ベクターにおける分泌誘発遺伝子の低発現、およびＡ．ニガーＷＴ−ＰＨＹにおける高発現が確認される。
【０１６３】
【表３】
2008532535.tif 000020
【０１６４】
実施例５
ＧＦＰ−ＢＬＥ分泌誘発レポーター構築物のクローニング
ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質（チャルフィ（Ｃｈａｌｆｉｅ）Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４年）２６３（５１４８）：８０２−８０５頁）およびフレオマイシン結合タンパク質（ＢＬＥ、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに既に記載されたｐＧＢＦＩＮ−１４中に存在）の融合物をＰＣＲにより構築した。配列番号６２および配列番号６３からなるプライマーセットを用いるＰＣＲによりＧＦＰ断片を増幅した。鋳型としてのｐＧＢＦＩＮ−１４と共に配列番号６４および配列番号６５からなるプライマーセットを用いるＰＣＲにより、ＢＬＥ断片を増幅した。得られた重複ＰＣＲ断片は、プライマー配列番号６２および配列番号６５との融合ＰＣＲにおいて使用し、ＰＣＲ融合産物ＧＦＰ−ＢＬＥ（配列番号６１）が得られた。ＧＦＰ−ＢＬＥ融合物を制限酵素ＰａｃＩおよびＡｓｃＩで消化し、ＰａｃＩ、ＡｓｃＩ直線化クローニングベクターｐＧＢＦＩＮ−２中に連結し（国際公開第９９／３２６１７号パンフレットおよびＥＰ９８／０８５７７号明細書に記載）、それにより、ＧＦＰ−ＢＬＥ融合物を、グルコアミラーゼプロモーターの制御下に置いた。得られるベクターｐＧＢＦＩＮＢＬＥ−２は、図１１に描かれる。
【０１６５】
鋳型としてＡ．ニガーＷＴ−１からのゲノムＤＮＡ、そして表４に示されるプライマーを用いるＰＣＲによって、分泌誘発遺伝子のプロモーター配列を単離した。
【０１６６】
【表４】
2008532535.tif 000021
【０１６７】
得られたＰＣＲ断片（配列番号３５〜３９）を制限酵素ＸｈｏＩおよびＰａｃＩで消化し、図１１に描かれるようなＸｈｏＩ、ＰａｃＩ直線化クローニングベクターｐＧＢＦＩＮＢＬＥ−２中に連結し、それによりＰｇｐｄＡ−ａｍｄＳが除去され、それぞれの分泌誘発性プロモーター、Ｐｉｎｄでグルコアミラーゼプロモーターが置換され、ｐＧＢＦＩＮＧＦＰＢＬＥ−１〜５が得られた。ｐＧＢＦＩＮＧＦＰＢＬＥ−１は図１２に描かれ、ｐＧＢＦＩＮＧＦＰＢＬＥ−２〜５の代表である。ｐＧＢＦＩＮＧＦＰＢＬＥ−１のＸｈｏＩおよびＦｓｅｌ消化によって、それぞれの誘発性プロモーターのＧＦＰ−ＢＬＥとの融合構築物を単離し、次に、図１３に描かれるＸｈｏＩ、Ｆｓｅｌ直線化Ａ．ニガー発現ベクターｐＧＢＴＯＰＳＥＬ−１中に連結した。得られた分泌レポーター構築物、ｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−１〜５は、それぞれ分泌誘発性プロモーターＰ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４、Ｐ５の制御下で、ＧＦＰ−ＢＬＥの融合物を含有する。図１４には、ｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−１〜５の代表としてｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−１が描かれる。これらのベクターを用いて、実施例６および７においてＡ．ニガーＷＴ−１を形質転換した。
【０１６８】
実施例６
細胞外タンパク質の過剰発現はＧＦＰ−ＢＬＥレポーター構築物を発現するＡ．ニガーにフレオマイシン耐性を与える。
分泌レポーター構築物ｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−１〜５の、分泌タンパク質フィターゼを過剰発現するＡ．ニガーＷＴ−ＰＨＹ−２への形質転換は、材料および方法に記載される手順に従って実施した。選択試薬として様々な量のフレオマイシン（０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０マイクログラム／ｍｌ）を追加した選択再生プレートにおいて、形質転換体を選択した。５つのレポーター構築物は全て、フレオマイシン含有プレートにおける形質転換体の直接的な選択を可能にしたが、ネガティブコントロール、ＷＴ−ＰＨＹ−２、野生型は、フレオマイシンを含有するプレートのいずれにおいても成長することができなかった。分泌レポーター構築物ｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−１〜５はそれぞれ５０、３５、５０、３５、２５マイクログラム／ｍｌのフレオマイシンにおける成長を可能にした。それによって、これらの構築物の分泌誘発性プロモーターは機能性であり、形質転換後にフレオマイシンにおける直接選択が可能であることが実証される。
【０１６９】
実施例７
ｃＤＮＡライブラリーおよびＧＦＰ−ＢＬＥレポーター構築物の同時形質転換後に細胞外タンパク質を発現するＡ．ニガークローンの選択
５０の細胞外タンパク質および５０の細胞内タンパク質をコードする定義したＡ．ニガーｃＤＮＡライブラリーと組み合わせて分泌レポーター構築物ｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−１〜５を用いて、アスペルギルス・ニガーＷＴ−１を同時形質転換した。コロニーＰＣＲによって、同時形質転換事象を確認した。発現ライブラリー構築物と組み合わせて分泌レポーター構築物を含有する同時形質転換体の胞子を、様々な量のフレオマイシン（０、５、２５、５０、１００、１７５マイクログラム／ｍｌ）を追加した選択プレートにおいて成長させた。細胞外のタンパク質をコードするライブラリー構築物と組み合わせて分泌レポーター構築物を含有する同時形質転換体について、細胞内タンパク質をコードするライブラリー構築物と組み合わせて分泌レポーター構築物を有する形質転換体と比較して、フレオマイシン耐性の平均の増大を実証した。分泌感受性プロモーターＰ４およびＰ５についてのこれらの結果を示すグラフは、図１５および１６に示される。これらの結果は、少なくとも２０倍までのフレオマイシン耐性の増大が達成されたことを実証する。
【０１７０】
細胞外タンパク質をコードするライブラリー構築物と組み合わせてプロモーターＰ１またはＰ３を含む分泌レポーター構築物を含有する同時形質転換体により産生される細胞外タンパク質の多様性が実証された。同時形質転換体をマイクロタイタープレート中で個々に成長させ、６日目に、Ｅ−ＰＡＧＥＴＭハイ−スループット・プレ−キャスト・ゲル・システム（Ｈｉｇｈ−Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｐｒｅ−Ｃａｓｔ  Ｇｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍ）（インビトロジェン）およびマススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ  ＭＳ／ＭＳ）によって、これらの培養物の上澄みにタンパク質分析を行った。
【０１７１】
Ｅ−ＰＡＧＥＴＭ９６、６％ゲル（インビトロジェン）は、マイクロタイタープレートフォーマットの９６のサンプルレーンおよびタンパク質分離のための８のマーカーレーンを含有する。上澄みおよびマーカー（Ｅ−ＰＡＧＥＴＭシーブルー（ＳｅｅＢｌｕｅ）（登録商標）着色標準（インビトロジェン））を供給元のマニュアルに従ってゲルに負荷した。ゲルの電気泳動の後、供給元のマニュアルに従って、着色のためにシンプリーブルー（ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅＴＭ）セーフステイン（Ｓａｆｅｓｔａｉｎ）（インビトロジェン）を使用した。マイクロタイタープレートフォーマットのタンパク質サンプルをアライメントさせるインビトロジェンにより提供されるＥ−エディタープログラムによって、Ｅ−ＰＡＧＥＴＭゲルの走査を編集した。分泌感受性プロモーターＰ１およびＰ３との同時形質転換体により産生される細胞外タンパク質は、図１７および１８に示され、表５に要約される。これらの結果は、分析したフレオマイシン耐性コロニーの７７％までが、Ｅ−ＰＡＧＥにより検出可能な量のタンパク質を分泌したことを実証する。ゲル上で観察されたタンパク質断片のサイズに基づいて、定義したライブラリーで形質転換されたクローンの多様性が評価される。これらの結果は、Ｅ−ＰＡＧＥ分析に基づいて３５％までの多様性が観察され得ることを実証する。
【０１７２】
マススペクトロメトリー結果は表５に示される。分析したフレオマイシン耐性コロニーの５８％までが、マススペクトロメトリーにより検出可能な量のタンパク質を分泌した。多様性は、検出されたペプチド配列の同一性に基づいて評価した。これらの結果は、マススペクトロメトリーを用いて１００％までの多様性が観察され得ることを実証する。
【０１７３】
【表５】
2008532535.tif 000022
【図面の簡単な説明】
【０１７４】
【図１】ｐＰｈｔｒＡ−ｇｆｐ−ａｍｙＥが描かれる。この分泌レポーターベクターは、ＧＦＰと作用的に関連するＢ．サブチリスのｈｔｒＡプロモーターを含む。このベクターは、ｐＰｈｔｒＢ−ｇｆｐ−ａｍｙＥの代表である。
【図２】分泌ストレスのためのＢ．サブチリスレポーター株の構築。ｈｔｒプロモーターをＧＦＰ遺伝子に融合し、最終的にプラスミドｐＰｈｔｒＡ−ｇｆｐ−ａｍｙＥおよびｐＰｈｔｒＢ−ｇｆｐ−ａｍｙＥが得られた。得られたプラスミドを、対応するｈｔｒ座位における単一の交差組換えによってバシラス宿主細胞の染色体内に組み込み、ＶＴ２１０ＡおよびＶＴ２１０Ｂ細胞が得られた。Ｃｍｒはクロラムフェニコール耐性遺伝子を表す。
【図３】バシラス・アミロリケファシエンスからの中性プロテアーゼ遺伝子ｎｐｒ（ジェンバンク受入番号Ｋ０２４９７）を含むｐＵＢｎｐｒ−２が描かれる。
【図４】バシラス・アミロリケファシエンスからのβ−グルカナーゼ遺伝子ｂａｇ（ジェンバンク受入番号Ｍ１５６７４）を含むｐＵＢＢＡＧが描かれる。
【図５ａ】プラスミドｐＵＢ１１０（空の制御ベクター）またはプラスミドｐＫＴＨ１０（バシラス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙＱをコードする）のいずれかで形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ａ細胞の、蛍光活性化細胞分取を用いる分析が描かれる。ｙ軸には観察された事象の量が示され、ｘ軸には相対蛍光が示される。パネルＡには、空のベクターｐＵＢ１１０で形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ａ細胞の分析が描かれる。パネルＢには、ａｍｙＱベクターｐＫＴＨ１０で形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ａ細胞の分析が描かれる。パネルＣには、１：２０の割合のｐＵＢ１１０およびｐＫＴＨ１０で形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ａ細胞の混合集団の分析が描かれる。パネルＤには、ｐＵＢ１１０およびｐＫＴＨ１０の両方で形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ａ細胞の混合集団の細胞分取が描かれる。垂直の点線により細胞分取限界が示される。この限界よりも高い蛍光を示す細胞を分取した。
【図５ｂ】プラスミドｐＵＢ１１０（空の制御ベクター）またはプラスミドｐＫＴＨ１０（バシラス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙＱをコードする）のいずれかで形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ａ細胞の、蛍光活性化細胞分取を用いる分析が描かれる。ｙ軸には観察された事象の量が示され、ｘ軸には相対蛍光が示される。パネルＡには、空のベクターｐＵＢ１１０で形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ａ細胞の分析が描かれる。パネルＢには、ａｍｙＱベクターｐＫＴＨ１０で形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ａ細胞の分析が描かれる。パネルＣには、１：２０の割合のｐＵＢ１１０およびｐＫＴＨ１０で形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ａ細胞の混合集団の分析が描かれる。パネルＤには、ｐＵＢ１１０およびｐＫＴＨ１０の両方で形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ａ細胞の混合集団の細胞分取が描かれる。垂直の点線により細胞分取限界が示される。この限界よりも高い蛍光を示す細胞を分取した。
【図６】プラスミドｐＵＢ１１０（空の制御ベクター）またはプラスミドｐＫＴＨ１０（バシラス・アミロリケファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子ａｍｙＱをコードする）のいずれかで形質転換されたバシラス・サブチリスＶＴ２１０Ｂ細胞の混合集団の分析が描かれる。分析は蛍光活性化細胞走査によって実施した。ｙ軸には観察された事象の量が示され、ｘ軸には相対蛍光が示される。
【図７】Ａ．ニガーにおける緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、チャルフィ（Ｃｈａｌｆｉｅ）Ｍら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４年）２６３（５１４８）：８０２−８０５頁）の発現のために使用されるｐＧＢＦＩＮＧＦＰ−２ベクターが描かれる。描かれたＦＩＮベクターの基幹の特徴は、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットにおいて以前に記載されている。
【図８】Ａ．ニガーにおけるフィターゼ（ＰＨＹ）（国際公開第９９／３２６１７号パンフレットに記載されるＦｙｔＡと同一であるフィターゼ遺伝子ＰＨＹ）の発現のために使用されるｐＧＢＦＩＮ−３２ベクターが描かれる。
【図９】フィターゼ遺伝子のより大きい部分およびグルコアミラーゼプロモーター全部が除去されたｐＧＢＦＩＮ−４０ベクターが描かれており、このベクターは、Ａ．ニガーＷＴ−ベクター株の構築のための空の制御ベクターとして使用される。
【図１０】分泌誘発プロモーターの同定を確認するために実施されるノーザンブロット分析が描かれる。
【図１１】Ａ．ニガーにおける遺伝子発現のために使用されるベクターが描かれる。このベクターは、分泌誘発Ａ．ニガーレポーター構築物の構築における基幹として使用される。
【図１２】ｐＧＢＦＩＮＧＦＰＢＬＥ−１クローニングベクターが描かれる。この分泌誘発性レポーター構築物は、本発明の分泌誘発性プロモーター１と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥレポーター融合遺伝子を含む。構築物は、ｐＧＢＦＩＮＧＦＰＢＬＥ−２、ｐＧＢＦＩＮＧＦＰＢＬＥ−３、ｐＧＢＦＩＮＧＦＰＢＬＥ−４、およびｐＧＢＦＩＮＧＦＰＢＬＥ−５の代表である。
【図１３】ｐＧＢＴＯＰＳＥＬ−１が描かれており、このベクターは、最終の分泌誘発性レポータープラスミドの構築のための基幹として使用される。描かれたベクターの基幹の特徴は、国際公開第９９／３２６１７号パンフレットにおいて以前に記載された。
【図１４】最終の分泌レポーター構築物ｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−１が描かれる。この分泌誘発レポーターベクターは、本発明の分泌誘発性プロモーター１と作用的に関連するＧＦＰ−ＢＬＥレポーター構築物を含む。ベクターは、ｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−２、ｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−３、ｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−４、およびｐＧＢＴＯＰＧＦＰＢＬＥ−５の代表である。
【図１５】細胞内タンパク質（黒い点で表される）または細胞外タンパク質（黒い四角で表される）のいずれかをコードするライブラリー構築物と組み合わせて分泌誘発性プロモーターＰ４を有するレポーター構築物を含有するＡ．ニガー同時形質転換体のフレオマイシン耐性の差異が描かれる。
【図１６】細胞内タンパク質（黒い点で表される）または細胞外タンパク質（黒い四角で表される）のいずれかをコードするライブラリー構築物と組み合わせて分泌誘発性プロモーターＰ５を有するレポーター構築物を含有するＡ．ニガー同時形質転換体のフレオマイシン耐性の差異が描かれる。
【図１７】Ｅ−ＰＡＧＥＴＭゲルが描かれており、ここで各レーンは、細胞外タンパク質をコードするライブラリー構築物と組み合わせて分泌誘発性プロモーターＰ１を有するレポーター構築物を含む同時形質転換Ａ．ニガークローンを表す。Ｍは、Ｅ−ＰＡＧＥシーブルー（ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標））着色標準（英国インビトロジェン）を表す。
【図１８】Ｅ−ＰＡＧＥＴＭゲルが描かれており、ここで各レーンは、細胞外タンパク質をコードするライブラリー構築物と組み合わせて分泌誘発性プロモーターＰ３を有するレポーター構築物を含む同時形質転換Ａ．ニガークローンを表す。Ｍは、Ｅ−ＰＡＧＥシーブルー（ＳｅｅＢｌｕｅ（登録商標））着色標準（英国インビトロジェン）を表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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