(57)【要約】  菌類材料、固体基質及び生体高分子組成物を含む組成物及び製造方法が開示されている。同組成物は、少なくとも７ヶ月間の間保存した場合、安定であり、かつ通常の菌類組成物では起こり得るようなダストによる損失が低減されることが開示されている。害虫及び雑草の処理を含む、同組成物の使用方法が開示されている。
2008539754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料と、
（ｂ）少なくとも一つの固体基質と、
（ｃ）生体高分子組成物と、を含む、組成物。
【請求項２】
前記組成物は２０℃にて少なくとも７ヶ月間安定した状態で保管される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
分生子の損失率が約４０％から約５％まで低減される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記菌類材料は、裸胞子又は分生子の生成により特徴づけられる線菌網に分類される菌類から選択される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記菌類材料は、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ属、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｃｅｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属、Ｍｅｔａｒｈｉｚｕｍ属、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記菌類材料は、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａなる種である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記生体高分子組成物は水と少なくとも一つの増粘剤を含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記増粘剤は、多糖類ガムである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記増粘剤は、キサンタンガム、アカシアガム、グアーガム、ジェランガム、ローカストビーンガム、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生体高分子は界面活性剤を更に含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））又はその組み合わせから選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記固体基質は、粒子又は顆粒中に形成されるとともに菌類接種材料に成長のための栄養素を提供する実質的に固体の材料を含む、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記固体基質は、米粒、穀物粒、デンプン化合物、砂、砂利、ゼオライト、軽石及びそれらの混合物から選択される、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記固体基質は米粒である、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記米粒は、全粒状態と、破断した状態と、粉砕した状態と、全粒状態、破断した状態及び／又は粉砕した状態の組み合わせと、のいずれかである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記穀物粒は小麦、大麦、キビ、トウモロコシ及びそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記デンプンはタピオカデンプンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
菌類材料、少なくとも一つの固体基質及び生体高分子組成物を含む組成物であって、２０℃にて安定であるとともに、ダスト形成の形態において分生子の損失が低減され、かつ本明細書に記載され、試験及び図面にて参照される、組成物。
【請求項１９】
安定した菌類組成物を製造する方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも一つの固体基質と、胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料の接種材料と、を混合する工程と、
（ｂ）菌類接種材料を成長させる工程と、
（ｃ）前記（ｂ）の工程時に固体基質から成長した菌類材料を分離する工程と、
（ｄ）前記（ｃ）の工程に回収された菌類材料を多孔性の固体基質と混合する工程と、
（ｅ）前記菌類材料及び多孔性の固体基質を生体高分子組成物内に少なくとも部分的に封入する工程と、を含む、方法。
【請求項２０】
前記工程（ｅ）において、前記菌類材料及び多孔性の固体基質はいずれも、前記生体高分子組成物内に完全に封入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程（ｄ）にて得られる前記多孔性の固体基質及び前記菌類材料は、前記工程（ｅ）を実施する前に乾燥される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
安定した菌類組成物を製造する方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも一つの固体基質と、胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料の接種材料と、を混合する工程と、
（ｂ）前記菌類接種材料をより多くの菌類材料に成長させる工程と、
（ｃ）前記（ｂ）の工程時に得られた固体基質及び成長した菌類材料を生体高分子組成物内に少なくとも部分的に封入する工程と、を含む方法。
【請求項２３】
前記工程（ｃ）において、前記固体基質及び前記成長した菌類材料はいずれも、前記生体高分子組成物内に完全に封入される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程（ｂ）にて得られる前記固体基質及び前記成長した菌類材料は、前記工程（ｃ）を実施する前に乾燥される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法の工程（ｂ）において、前記接種材料及び基質混合物は密封された環境内に封入される、請求項１９乃至２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記密封された環境はプラスチックバッグである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記工程（ｂ）は１乃至４週間後に完了する、請求項１９乃至２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記封入は、前記菌類材料及び固体基質を生体高分子組成物でコーティングするために緩やかに混合することにより実施される、請求項１９乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
本明細書に記載され、かつ試験及び図面により参照される、安定した菌類組成物を製造する方法。
【請求項３０】
請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の組成物を害虫の抑制に使用する方法。
【請求項３１】
前記害虫は、土壌中に生息するコガネムシ、カブトムシ及びゾウムシの成虫及び幼虫、毛虫、セミ、カリバチ、アリ及びシロアリを含む、請求項３０に記載の使用方法。
【請求項３２】
請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の組成物を雑草の抑制に使用する方法。
【請求項３３】
前記雑草は、ハーブ牧草の雑草、ハーブ作物の雑草、上質の芝生及びアメニティエリアのハーブ雑草、放牧領域及び天然領域の低木の雑草、野生の木を含む、請求項３２に記載の使用方法。
【請求項３４】
請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の安定した菌類組成物を使用する方法であって、本明細書に記載され、かつ試験及び図面により参照される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、菌類材料を安定化させる方法に関する。より詳細には、本発明は、生体高分子組成物を使用して、菌類胞子、菌糸体及び／又は担胞子体の安定した形態を形成する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
胞子、担胞子体及び菌糸体のような菌類材料は、害虫及び雑草を抑制するためのバイオ農薬及び菌類除草剤の用途において現在のところ使用されている。菌類からなる処理剤は、化学的な処置にとって代わる環境に好ましい代替物を提供することから製造業者及び使用者にとって価値のあるものである。
【０００３】
生物防除剤組成物において使用される典型的な菌類は、ほんの数例を挙げると、以下の分類に属する菌類である：Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ及びＦｕｓａｒｉｕｍ。
【０００４】
そのような用途において使用するための菌類材料を製造する既存の第一の方法は、（ａ）固体基質、例えば成長のための栄養素を提供する米粒上にて菌類を成長させる工程と、（ｂ）菌類が生長したら、米粒と胞子とを含む混合物を振盪機に入れて、菌類の胞子を米粒から振るい落として回収し、又は洗浄することにより両者を分離する工程と、（ｃ）菌糸の汚染又は成長を阻止するために密封したバッグ又は容器にて胞子を保持する工程と、からなる。
【０００５】
一つの代替例において、菌類は胞子を形成せずに、菌糸が回収される。これは、前胞子膜を形成する担胞子体を含み得る。
上記工程及び混合の理想的な条件を仮定すると、菌類は、同菌類及び保存状態に応じて６ヶ月までの期間、この方法にて生存し続けているかもしれない。
【０００６】
しかしながら、上述の方法には、一定期間にわたる菌類の生存能力に関する問題と、作業及び取り扱いに関する問題との間に大きな隔たりがあるという問題が存在している。生存能力に関わる問題としては、以下の事実が含まれる：（１）幾らかの場合において、既存の方法は、生存を維持するために菌類製品を冷蔵する必要がある。（２）乾燥した胞子は非常に軽量で、かつ空気の移動により容易に撹乱される。（３）菌類製品は含水性であるので、製品を入念に密封し、かつ密封容器に収納されていない場合には湿気に露出させることを回避するべく取り扱いを慎重にしなければならない。（４）固体基質から分離する際、穀類を過剰に振盪すると菌類材料の生存能力が低減するので、取り扱いを非常に穏やかに行う必要がある。
【０００７】
生存能力が低減した場合には、バイオ農薬のような製品における胞子の商業的な有用性が劇的に低減することを理解すべきである。
作業及び取り扱いに関する問題としては、以下の事実が含まれる：（１）分離工程時には非常に慎重に取り扱う必要がある。（２）製品は、少なくとも部分的に湿潤状態にある微粉末製品であるために十分な流動性を備えていない。（３）全工程を滅菌状態にて取り扱う必要がある。（４）菌類の固体基質からの分離時に、回収された菌類胞子の固体基質の部分による「汚染」を回避することが比較的困難である。（５）胞子と、他の菌類又は細菌類と、の混入を裂けるために負圧の環境下にて工程を実施する必要がある。（６）製品が粉末の状態であるために、分離工程を実施するヒトが菌類製品からのダストを吸入する恐れが存在する。
【０００８】
既存の方法に伴う更なる問題点は、商業的な規模にて製造された製品にはかろうじて利益が得られるのみであるという点にある。一例を挙げると、牧畜業において使用されるＢｅａｕｖｅｒｉａ属からなるバイオ農薬は、製品価格が１ヘクタールあたり４０ドル以上である場合には商業的には実施できないが、同バイオ農薬を製造する費用は、その他の費用が加算される前で、１ヘクタール当たり３０ドルであり、儲けが殆どない状態となる。
【０００９】
菌類製品に対する方法論に関する文献が多く存在している（本明細書の末尾に列挙された文献を参照されたい）。また多くの特許が製造方法を概説している（例えば、特許文献１、２及び３）。しかしながら、そのような文献の関心は、胞子を捕捉して、より効果的な様式にて保存するという製造の最終段階を如何に実施するかという問題よりは、むしろ胞子の成長を増大させるための栄養素のような材料の投入を扱う点にある。全ての場合において、混入を解決するということは依然として主要な問題である。
【特許文献１】米国特許第４５１２１０３号
【特許文献２】米国特許第４５３０８３４号
【特許文献３】米国特許第６１４３５４９号
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は上述の問題点を扱うこと、又は少なくとも有用な選択肢を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明の一態様に従って組成物が提供され、同組成物は、（ａ）胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料と、（ｂ）少なくとも一つの固体基質と、（ｃ）生体高分子組成物と、を含む。
【００１２】
本発明の更なる態様に従って、安定した菌類組成物を製造する方法が提供され、同方法は、（ａ）少なくとも一つの固体基質と、胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料の接種材料と、を混合する工程と、（ｂ）菌類接種材料を成長させる工程と、（ｃ）（ｂ）の工程時に固体基質から成長した菌類材料を分離する工程と、（ｄ）（ｃ）の工程に回収された菌類材料を多孔性の固体基質と混合する工程と、（ｅ）菌類材料及び多孔性の固体基質を生体高分子組成物内に少なくとも部分的に封入する工程と、を含む。
【００１３】
本発明の更なる態様に従って、安定した菌類組成物を製造する方法が提供され、同方法は、（ａ）少なくとも一つの固体基質と、胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料の接種材料とを混合する工程と、（ｂ）菌類接種材料をより多くの菌類材料に成長させる工程と、（ｃ）（ｂ）の工程時に得られた固体基質及び成長した菌類材料を生体高分子組成物内に少なくとも部分的に封入する工程と、を含む。
【００１４】
本発明の更なる態様に従って、害虫を抑制するための組成物の使用方法が提供され、同組成物は、（ａ）胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料と、（ｂ）少なくとも一つの固体基質と、（ｃ）生体高分子組成物と、を含む。
【００１５】
本発明の更なる態様に従って、雑草を抑制するための組成物の使用方法が提供され、同組成物は、（ａ）胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料と、（ｂ）少なくとも一つの固体基質と、（ｃ）生体高分子組成物と、を含む。
【００１６】
上記組成物、方法及び使用方法は、同組成物が室温（２０℃）のような標準的な大気条件にて数ヶ月間にわたり保管しても安定であるという結果が本発明の発明者らによって見出された。安定性が維持される期間は、そのような条件下では通常は生存能力が低下するか、又は消失する大部分の組成物と比較してかなり長い。本明細書に記載された方法は、当業者によって明らかにされるべきその他多くの利点を有し、そのうちの一つとしては、菌類を固体基質から分離する必要がなく、かつ本発明の組成物がダストの形成を阻止できることからダストによる損失が低減できるという点がある。
【００１７】
更なる記載の目的のために、菌類の胞子に関して参照する。非限定的ではあるが分生子、菌糸体、担胞子体等を含むその他の再生可能な細胞性材料が本発明によって回収されかつ生存が維持され得ることが評価されるべきであるので、これは、上記胞子に関する参照のみに限定されるべきではない。
【００１８】
本発明の発明者らの実験において、安定化された菌類材料の生存能力は、２０℃にて少なくとも７ヶ月間保存された場合に一定に維持された。
本発明の発明者らは、本発明の形成されるダストの量を低減できるという優れた利点を明記した。ダストの形成が低減されることによる健康上及び取り扱い上の観点のほかに、組成物からの菌類材料の損失もまた低減され得る。これは、形成されたダストが主として菌類の分生子であることによる。これらの損失を低減することにより、組成物は、分生子がダストとして除去されてきたこれまでの場合よりも、使用時の効率がより大きくなる。より詳細には、分生子の損失率は、菌類材料及び基質を封入するために生体高分子組成物を使用していない従来の方法と比較して、約４０％から約５％までに低減された。
【００１９】
好ましくは、菌類材料は、裸胞子又は分生子の生成により特徴づけられる線菌網に分類される菌類から選択され得る。しかしながら、本発明は、無性的に再生される任意の菌類に適用され得ることは当業者に理解されるべきである。
【００２０】
より好ましくは、菌類の属としては、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ属、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｃｅｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属、Ｍｅｔａｒｈｉｚｕｍ属、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。より好ましくは、菌類は、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａなる種であり得る。記載された属及び種は例示のみの目的にて提供されたものであり、有用な特性を有し、かつ安定化が必要とされるその他の属も記載されたように本発明の範囲内に包含され得る。本発明の発明者らによって予測された特定の実施形態は、農業的な用途にて使用するために雑草及び害虫の成長を抑制する菌類の選択を含む。
【００２１】
好ましくは、菌類によって抑制される害虫は、土壌中に生息するコガネムシ、カブトムシ及びゾウムシの成虫及び幼虫、毛虫、セミ、カリバチ、アリ及びシロアリを含む。
好ましくは、菌類によって抑制される雑草は、ハーブ牧草の雑草、ハーブ作物の雑草、上質の芝生及びアメニティエリアのハーブ雑草、放牧領域及び天然領域の低木の雑草、野生の木が含まれる。
【００２２】
好ましくは、ハーブ牧草の雑草は、ジャイアントバターカップ、セイヨウヒルガオ及びサワギクである。
好ましくは、ハーブ作物の雑草は、作物であるエンドウ豆に影響を及ぼす毒ナスである。
【００２３】
好ましくは、上質の芝生及びアメニティエリアのハーブ雑草は、タンポポ、ブタナ、ホークビット（ｈａｗｋｂｉｔ）及びホークスブレッド（ｈａｗｋｓｂｒｅａｄ）である。
好ましくは、放牧領域及び天然領域の低木の雑草は、ハリエニシダ及びエニシダである。
【００２４】
好ましくは、野生の木は、ヤナギ及びポプラである。
好ましくは、生体高分子組成物は、水及び少なくとも一つの増粘剤を含む。より好ましくは、生体高分子組成物は界面活性剤も含む。
好ましくは、水は蒸留水及び実質的に滅菌された水である。
好ましくは、増粘剤は、多糖類ガムである。より好ましくは、増粘剤は、キサンタンガム、アカシアガム、グアーガム、ジェランガム、ローカストビーンガム、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【００２５】
好ましくは、界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））及びその組み合わせからなる群より選択される。一実施形態において、界面活性剤は、０．０１重量％乃至０．１重量％の範囲の希釈濃度にある。より好ましくは、濃度は約０．０５重量％である。使用される界面活性剤の量は、菌類材料、及び選択される固体基質又は使用される蒸留水のようなその他の態様に依存して変更され得る。
【００２６】
好ましくは、固体基質は、粒子又は顆粒状に形成されるとともに菌類接種材料に成長のための栄養素を提供する実質的に固体の材料を含む。より好ましくは、固体基質は、米粒、穀物粒、デンプン化合物、砂、砂利、ゼオライト、軽石及びそれらの混合物からなる群より選択され得る。
【００２７】
米粒が固体基質として使用される場合、好ましくは、それらは乾燥した状態又は湿潤した状態であり得る。更に、米粒は、全粒状態と、破断した状態と、粉砕した状態と、全粒状態、破断した状態及び／又は粉砕した状態の組み合わせと、のいずれかであり得る。
【００２８】
穀物粒が固体基質として使用される場合、好ましくは、それらは小麦、大麦、キビ、トウモロコシ及びそれらの組み合わせからなる穀物群から選択され得る。
デンプン粒が固体基質として使用される場合、好ましくは、デンプンはタピオカデンプンである。
【００２９】
方法の工程（ｂ）の間、好ましくは、接種材料と基質との混合物は密封された環境内にて封入され得る。好ましくは、密封された環境はプラスチックバッグである。
好ましくは、工程（ｂ）は、胞子、担胞子体及び／又は菌糸体が所望のレベルに到達した場合に完了する。本発明の発明者らの実験において、この時間はおおよそ１乃至４週間であるが、この時間は、当然のことながら、菌類の種類、使用される固体基質及び温度のような環境条件を含む種々の要因に依存して変更され得る。
【００３０】
一実施形態において、工程（ｂ）からの固体基質及び成長した菌類は工程（ｃ）が完了する前に乾燥される。乾燥は、好ましくは、空気中にて、約２５℃の温度にて、約２乃至２４時間の期間により完了する。
【００３１】
好ましくは、方法の工程（Ｃ）の間、固体基質及び成長した菌類材料は同基質及び菌類材料を生体高分子組成物でコーティングすることにより完全に封入される。好ましくは、コーティングは緩やかに混合することにより実施されるが、ダストの放出を最小限にするとともに胞子の生存性を確実にするために取り扱いを非常に丁寧にする必要のある既存の方法とは異なり、特別な取り扱いを必要としないことは予測され得る。
【００３２】
当然のことながら、上述の記載から、通常は迅速な劣化を伴うような条件にて保存された場合でも、胞子のような菌類の再生可能な材料を長期間にわたり生存した状態にて維持可能な組成物を製造する方法が提供される。
【００３３】
生成された組成物はまた、既存の処方と比較して、優れた流動性及びダスト形成の低減という利点を有する。これは、取り扱いを容易にし、菌類製品を扱う人がダストを吸入するという安全性の問題を回避できるので特に有用である。これはまた、使用した場合に組成物が最大限の生存能力及び効果を有することを確実にする。
【００３４】
上記方法の更なる利点は、いくらかの処理工程が省略できるので、作業時間及び処理に伴う複雑さ及び費用が低減できる点にある。当然のことながら、上記のように費用の低減された処理は、より商業的に価値のある製品を製造できるという利点を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
本発明の更なる態様は、例示のみの目的にて与えられ、かつ添付された図面を参照した、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
【００３６】
本明細書において引用された任意の特許又は特許出願を含む全ての参考文献は、本明細書にて参照により援用される。いかなる参考文献も従来技術を構築することを許可されていない。参考文献の論旨は、その著者が主張することを記載しており、出願人は同引用された文献の正確性及び妥当性を厳密に調べる権利を保有する。種々の従来技術の文献が本明細書において参照されているが、この文献は、ニュージーランド又はその他の国における当該技術分野の通常の知識の一部を構築する許可を構成していないことは理解されるべきである。
【００３７】
用語「からなる（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は、変更する司法権の下では、排他的な意味又は包括的な意味のいずれかに寄与するものと認識されている。本明細書の目的に対して、特に明記されていない限り、用語「からなる」は包括的な意味を有する。即ち、直接参照により列記された成分のみならず、その他の特定されていない成分又は要素も含むものとしてみなされるであろう。この論理は、用語「ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ」或いは「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」が、方法又は過程の一つ以上の工程に関して使用された場合においても同様に使用されるであろう。
【００３８】
本発明の更なる態様及び利点は、例示のみの目的にて与えられた以下の詳細な説明から明らかになるであろう。
本明細書において、用語「安定な（ｓｔａｂｌｅ）」、「安定性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）」、「生存可能な（ｖｉａｂｌｅ）」及び「生存能力（ｖｉａｂｉｌｉｔｙ）」は、相互に変換可能なものとして使用され、胞子の生存能力が通常では低下しているような状態（温度、ｐＨ、酵素反応等）において胞子の生存能力及び細胞の完全性を維持することを参照する。
【００３９】
本発明は、生存菌類材料を生成かつ維持する種々の方法の効果を決定するために実施された一連の実験を参照して以下に記載される。
［背景］
胞子がコーティングされた顆粒（試験１）又は胞子の封入物（試験２）のいずれかである２種類の異なる製剤を調製した。乾燥の必要性、及び破断した基質対全粒基質について（試験３及び４）、並びに胞子の生存能力について（試験５）も試験した。更なる試験（試験６乃至１１）は以下の通りである；（６）その他の菌類に対する本発明の方法の作用を示す；（７）その他の種類の多糖類の使用可能性を示す；（８）製品の安定性の更なるデータ；（９）その他の種類の基質への組み込み；（１０）製品を雑草及び害虫の抑制に使用した結果；（１１）処置を実施した場合と実施しなかった場合のダストの損失の程度を決定する測定結果。
【００４０】
試験１乃至４の製剤はガス透過可能なバッグ（ＧＴバッグ）にて保存した。保管時の寿命は、標準的な大気条件下（即ち、大気圧下、極端に湿気が存在しない状態）、かつ２０℃にてモニタリングした。
【００４１】
蛍光染料試験はまた、細胞の生存能力を確認するために実施した（試験５）。
［試験１］
ゼオライトは吸収特性を有する多孔性の粘土材料である。この試験では、当該分野における菌類材料の安定性及び応用を助けるために、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ属の胞子に対する担体としてゼオライトを使用する可能性を試験した。
【００４２】
［方法］
滅菌したゼオライト顆粒（約２乃至４ｍｍの直径）を、以下に示されるようにＢｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ胞子とともにコーティングした。
製剤は以下のように調製した：（ａ）１５８ｍｌの蒸留水と４グラムのキサンタンガムとを混合して生体高分子ゲルを形成する；（ｂ）２０グラムの採取されたＢ．ｂａｓｓｉａｎａ胞子（１×１０１２／ｃｆｕ／ｇ）を、ポリトロン（Ｐｏｌｙｔｒｏｎ）を使用して、０．０５％のＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標）界面活性剤を含む１６３ｍｌの滅菌蒸留水とともにホモジナイズした；（ｃ）生体高分子ゲル及びホモジナイズした胞子の混合物を合わせて、胞子−ゲルを形成する；（ｄ）混合鉢中にて滅菌したゼオライト顆粒（８４５ｇ）中に胞子−ゲルを加える一方、混合器は、最終的な製剤を製造するために運転状態とした。
【００４３】
次に、製剤を２０℃にて保存し、生存細胞の数を測定するために、プレート計数試験を使用して、一ヶ月間隔にてサンプルを計数することにより生存数を決定した。
ゼオライト顆粒及び生成物の写真を図１に示す。
［結果］
製剤を調製した直後の生存コロニー形成単位数、即ちｃｆｕｓ数（理論的に胞子に相当すべきである）は、顆粒１グラム当たり７．２×１０８ｃｆｕｓであった。これは、適用された胞子の理論上の数の約８０％に当たり、処理時における生存能力の損失が殆どないことを示している。顆粒における生存ｃｆｕｓの数は、図２に示されるように試験したそれ以後の７ヶ月の試験期間にわたり安定に維持され続けた。
【００４４】
サンプリング時間の間における胞子の数に関する変動は、生存胞子のカウントにおける変化というよりはむしろサンプル間の不均一性の変動を示唆するものと本願の発明者らは理解している。
【００４５】
更なる注目すべき観察結果は、ゼオライト顆粒上へのＢｅａｕｖｅｒｉａ胞子のコーティングは、良好に流動し、かつダストを殆ど形成しない取り扱いが容易な製品を生ずる点である。しかしながら、この方法において明記されるべき欠点は、胞子の抽出処理に要するコストが、所望であるコストよりも高いことである。
【００４６】
［試験２］
胞子を米粒から採取又は分離する必要性を排除することが可能かどうかを決定するために直接封入法を試験した。
［方法］
既存の方法を使用して成長させた胞子を有する米粒を乾燥し、生体高分子ゲルを使用して封入した。
【００４７】
生体高分子ゲルは４８ｍｌの滅菌蒸留水中に２グラムのキサンタンガム（Ｇｒｉｎｄｓｔｅｄ＠ＸａｎｔｈａｎＥａｓｙＲｈｏｄｉｏｇｅｌＥａｓｙ（登録商標））を混合することにより調製され、４％のゲル強度を与える。
【００４８】
次に、生体高分子ゲルを、低速度にて稼働する混合器中に２％の割合（米粒１ｋｇ当たり２０グラムのゲル）にて乾燥米粒に加えた。効率的に混合するために、ゲルの均一な分散のために、洗浄したプラスチック製のへらを用いて粒子を断続的に混合した。ゲル及び胞子にてコーティングされた米粒を、約２５℃の温度にて２時間、清潔なプラスチック製のトレイ上にて風乾させた。
【００４９】
［結果］
得られた製品を図３に示す。ダストの殆ど形成されていない、良好な流動特性が示されている。
米粒における生存ｃｆｕｓの最初の数は、８．０×１０８ｃｆｕ／ｇと測定された。製剤の保管寿命は、２０℃にて保存されたサンプルのプレート数を一ヶ月間隔にて測定することにより試験した。保管寿命に関するデータの結果（図４に示されている）は、測定された２ヶ月間にわたりｃｆｕｓのカウントが最小限の変化であることを示している。
【００５０】
上記方法の利点は、生体高分子を粒子コーティング上に直接組み込むことにより、同方法が、胞子の分離工程における取り扱い上に起こり得る問題及びそれに伴う費用（労力及び胞子数の低減）を回避することができる点にある。
【００５１】
［試験３］
４乃至１０％のゲル強度である生体高分子は、胞子形成後、未乾燥又は乾燥した状態にある米粒上に２乃至１０％の割合にて封入された。これらのオプションは、胞子形成後の乾燥工程を省略することができるか否かに関する可能性を調べるために試験した。
【００５２】
［方法］
両方の米粒のサンプル（乾燥したもの及び未乾燥のもの）に対し、５グラムのキサンタンガム（ＲｈｏｄｉｇｅｌＥａｓｙ（登録商標））を約０．０５重量％のＴｗｅｅｎ８０（登録商標））界面活性剤を含む４５ｍｌの滅菌蒸留水とともに混合した。乾燥した米粒（清潔なプラスチックトレイ上にて２５℃にて２４時間乾燥したもの）及び未乾燥の米粒（製品バッグから直接取り出したもの）のいずれも２％ゲル／米粒の割合にてコーティングした。製剤をガス透過可能なバッグに充填し、プレート計数を測定することにより、保管時の寿命を、２０℃にて１ヶ月間隔にてモニタリングした。
【００５３】
［結果］
未乾燥及び乾燥米粒サンプルの最初の生存数のコロニー形成単位（ｃｆｕｓ）は、それぞれ、８．４×１０８ｃｆｕ／ｇ及び５．６×１０８ｃｆｕ／ｇであった。結果（図５に示される）は、４ヶ月にわたるｃｆｕ計数により測定した場合、生存能力が殆ど損失しなかったことを示す。
【００５４】
結果は、製造工程の最後に米粒を乾燥させたか又は未乾燥のままであったかは問題ではなかったことを示している。生体高分子は米粒胞子混合物を効果的に脱水しているものと本発明の発明者らは理解している。未乾燥の米粒に対して生体高分子を使用すると、更なる処理工程が省略でき、かつエネルギー及び労力に係るコストを節約でき、かつ工程を簡略化できるので、有利である。
【００５５】
［試験４］
粒子の形状が生存能力に影響を与えるか否かを決定するために、胞子の形成を破断した米粒に対して試験した。
［方法］
調製方法は試験２（上述の記載参照）の方法と同じであるが、図２に記載された全粒の代わりに破断した米粒を使用した点が異なる。
【００５６】
［結果］
最終製品を図６に示す。その他の製品と同様に、ダストの低減及び良好な流動特性を含む良好な取り扱い特性が明らかとなった。
破断した米粒製品における最初の生存ｃｆｕｓ数は、６．３×１０８ｃｆｕ／ｇであった。２０℃にて保存された製剤の保管上の寿命は一ヶ月間隔にて試験され、図７に示した。２ヶ月後、保管上の寿命は１０８ｃｆｕ／ｇ以上に維持されており、破断した米粒を使用することによる生存能力に対する影響はなかった。
【００５７】
破断した米粒の製品及び製剤システムは、これまでに記載したシステムと比較して種々の利点を有しているように思われる。ダストの低減及び生存性の改善に加えて、一定した生存能力の結果により示されるように、破断した米粒製品ではより大きな均一性が達成される。均一性は、必要数の胞子を土壌に送達するには望ましい。
【００５８】
［試験５］
製剤中の胞子の生存能力は、ＳＴＹＯ／ＰＩ染料（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅ社）を使用した染色後の蛍光顕微鏡検査法により確認した。図８乃至１０に示されるように、生存細胞は緑色（図面の印Ａ）にて示される一方、死滅した細胞は、ヨウ化プロピジウムの侵入により赤く染まっている（図面の印Ｂ）。この試験は、このサンプル中では殆どの胞子が死滅していないことを確認し、試験１乃至３での結果を証明することになる。
【００５９】
［試験結果の要約］
２０℃にて保存されたＢｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａ製剤に対する保管寿命のデータ（ｃｆｕ／ｇ）は、以下の表１に示される。
【００６０】
【表１】
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［試験６］
更なる試験は、米にて成長させ、かつ生体高分子にてコーティングした４種類の菌類を使用して実施した。試験した菌種は、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｃａｌｅｄｏｎｉｃａ、Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ  ｖａｒ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅ及びＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅであった。短期間の保管寿命試験は、本発明の方法がその他の菌類に対しても有効であるかを決定するために２０℃にて実施した。得られた結果を表２に示す。
【００６１】
【表２】
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上述の結果は、生存能力が種々の菌類に対しても経時的に維持され、かつこれらの結果からその他の菌類もまた同様の結果となり得ることが明らかであることが示された。異なる種類の菌類によるダストのレベルも、生体高分子による処置を実施していない場合に予測されるレベルと比較してより低いレベルに維持されていたことも本発明の発明者らによって明らかにされたことを明記したい。
【００６２】
［試験７］
上述の試験は、生体高分子としてキサンタンガムを使用して実施した。当然のことながら、その他の多糖類も使用可能であり、以下の試験は、代替的な多糖類の使用を示すために実施した。
【００６３】
この試験において、２０℃にて７日間保管した後のジェラン生体高分子コーティング中の菌類分生子の生存性を試験した。結果を以下の表３に示す。
【００６４】
【表３】
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結果は、本発明の方法が、ジェランのような代替的な生体高分子を使用した場合に期待されるように実施され得ることを示す。
【００６５】
［試験８］
Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａと共に生体高分子でコーティングされた米の長期間にわたる安定性の評価を試験し、非常に再生的であることが明らかとなった。得られた結果を図１１に示す。分生子の生存能力は、７ヶ月にわたり一定に維持された。分生子の生存能力の低減は、生体高分子でコーティングされた米（図の四角形及びダイヤモンド形）と比較して生体高分子でコーティングされていない米（図の三角形）ではより大きかった。これは、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａと共に生体高分子でコーティングされた米の保管寿命は期待されたように高められることを示唆している。
【００６６】
［試験９］
種々の更なる固体基質を、分生子胞子を使用して試験した。
小麦、大麦及びその他の穀類
Ｂｅａｕｖｅｒｉａ種及びＭｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ種は、出願人により、小麦及び大麦のいずれにおいても良好に成長した。
生体高分子／ゼオライト顆粒を使用した製剤
高密度の胞子粉体を生成するために胞子を米から抽出した。胞子粉体を生体高分子に組み込んで、ゼオライト顆粒上に良好にコーティングした。
【００６７】
［試験１０］
安定化された菌類材料が雑草及び害虫を抑制するために、実際に期待通りに作用することを確認するために更なる試験を実施した。
生体高分子で安定化された材料は、害虫であるクローバールートゾウムシ（Ｃｌｏｖｅｒ  Ｒｏｏｔ  Ｗｅｅｖｉｌ）及びフラーバラゾウムシ（Ｆｕｌｌｅｒ  Ｒｏｓｅ  Ｗｅｅｖｉｌ）を抑制する試験を実施するために、畑にて使用した。
【００６８】
クローバールートゾウムシ（ＣＲＷ）
クローバールートゾウムシであるＳｉｔｏｎａ  ｌｅｐｉｄｕｓの幼虫個体群に対するＢｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａの効果を試験するために二つの畑での試験で確認した。一方の試験は、乳剤及び粘土ベースの顆粒製剤に対して生体高分子でコーティングされた米及び胞子の製剤を比較した。土壌プレートによる持続性の測定（コロニー形成単位）は、新規な製剤が全ての試験において適切な数にて確認できたことを示し、土壌１ｇ当たり約１０３乃至１０４分生子というＢｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａの安定した確立を示唆し、この値は幼虫の感染を発生させるのに効果的であると評価されるべきである。
【００６９】
第二の試験では、小放牧場スケールでの試験が確立され、同試験では、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａが米及び生体高分子製剤として適用され、ＣＲＷの幼虫を、クロ−バー根の供給領域にて標的とした。生体高分子−米製剤は取り扱いが非常に容易で、かつ市販の農場用の設備を使用して適用できた。製品をバッグから種まき機に移す際にも発生するダストは最小限であり、作業者にとって取り扱いが容易であり、かつ好ましいものであった。製品は非常に安定であり、６週間（試験は６週間にて完了した）にわたり、胞子の負荷及び生存能力に変化は無かった。畑のサンプリングから、Ｂ．ｂａｓｓｉａｎａは、処置後１２週間になるまで実験箇所の全てから回収された。土壌負荷量は約２×１０４ＣＦＵ／ｇにて安定化されているようであり、かつ感染された死骸は、処置された箇所から回収され、効果的に使用できることが証明された。
【００７０】
フラーバラゾウムシ
顆粒製剤として適用されたＢｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａの確立を三つのキーウィフルーツ果樹園にて評価した。顆粒は７０ｇ／ｍ２の割合にて適用した。
３ヶ月後、Ｂ．ｂａｓｓｉａｎａは、処置された箇所から土壌１ｇ当たり、１０３ＣＦＵまでの割合にて単離され、未処置の箇所から単離されたＣＦＵの数より有意に高かった。その結果は、キーウィフルーツ果樹園の土壌中にて持続するべくＢｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａの顆粒製剤の良好な可能性を示した。
【００７１】
［試験１１］
上記したように、本発明の主たる利点は、本発明の方法が、最小限のダストのみを発生する取り扱いが容易な製品を製造することができる点にある。試験はダスト形成の程度を示すために実施した。
【００７２】
生体高分子でコーティングされた米は、取り扱い時に分生子の置換によりダストの形成を回避できる。これは図１２に明瞭に示されており、製剤化された米を示す図１２Ａ（矢印２０にて示されている）と比較して、白いろ紙は、製剤化されていない米を示す図１２Ｂ（矢印２１にて示されている）では緑色の分生子で覆われている。
【００７３】
Ｍｅｔａｒｈｉｚｉｕｍ  ａｎｉｓｏｐｌｉａｅの分生子でコーティングされた米粒及びコーティングされていない米粒の製剤は、Ｄｕｎｃａｎ種まき機中に種子箱より供給され、プラスチックバッグに回収された。次にサンプルを秤量し、胞子を０．０１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００中にて米から洗い流した。米が種まき機を通過する前及び後の両方において、米１グラム当たりの分生子の数を分析するために血球計数器のカウントを使用した。得られた結果より、本発明の方法を使用した場合、分生子の消失率が４０％から５％まで低減したことが明らかとなった。これは、生体高分子の使用、並びに選択的に菌類材料を固体基質から分離する必要のないことの両方による結果であると理解される。結果の更なる例を以下の表４に示す。
【００７４】
【表４】
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上記試験は、通常は迅速な劣化を伴う条件下にて保存された場合でも、長期間にわたり胞子等の再生可能な菌類材料を生存状態にて維持する組成物を製造する方法を本発明が提供することを示すと評価されるべきである。製造された組成物はまた、優れた流動性と、既存の製剤よりもダストの産生が低減できると、いう利点を有する。これは特に、取り扱いが容易であり、かつ安全性の問題も回避できるので有用である。上記方法の更なる利点は処理工程が省略でき、労力、処理に関する複雑性及び処理にかかるコストを低減できる点にある。
【００７５】
本発明の態様を、例示のみの目的にて記載してきたが、添付した特許請求の範囲に定義されたように本発明の範囲を逸脱することなく修正及び追加がなされることは理解されるべきである。
【００７６】
【表５】
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【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】菌類及び生体高分子組成物がコーティングされているゼオライト顆粒の写真である。
【図２】ゼオライト顆粒について、時間の経過に対する胞子の生存能力を示すグラフである。
【図３】菌類が生体高分子組成物により封入された乾燥米粒の写真である。
【図４】乾燥した米粒について、時間の経過に対する胞子の生存能力を示すグラフである。
【図５】未乾燥の米粒と比較した乾燥米粒について、時間の経過に対する胞子の生存能力を示すグラフである。
【図６】菌類が生体高分子組成物により封入された破断した乾燥米粒の写真である。
【図７】菌類が生体高分子組成物により封入された破断した乾燥した米粒について、時間の経過に対する胞子の生存能力を示すグラフである。
【図８】ＳＴＹＯ／ＰＩ染料で染色した後の、蛍光顕微鏡検査法により示される顆粒処方物からの胞子の顕微鏡画像である。
【図９】ＳＴＹＯ／ＰＩ染料で染色した後の、蛍光顕微鏡検査法により示される米粒からの胞子の顕微鏡画像である。
【図１０】ＳＴＹＯ／ＰＩ染料で染色した後の、蛍光顕微鏡検査法により示される生体高分子でコーティングされた米粒からの胞子の顕微鏡画像である。
【図１１】生体高分子でコーティングされた米粒（四角形及びダイヤモンド形）、及び生体高分子コーティングのなされていない乾燥した米粒（三角形）の長期間にわたる安定性を示すグラフである。
【図１２】処方化された米粒（１２Ａ）及び処方化されていない米粒（１２Ｂ）からの取り扱いにより損失した分生子を図示する二つの写真を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年3月6日(2007.3.6)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料と、
（ｂ）少なくとも一つの固体基質と、
の混合物を含む組成物であって、前記組成物は生体高分子組成物でコーティングされていることを特徴とする、組成物。
【請求項２】
前記組成物は２０℃にて少なくとも７ヶ月間安定した状態で保管される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
分生子の損失率が約４０％から約５％まで低減される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記菌類材料は、裸胞子又は分生子の生成により特徴づけられる線菌網に分類される菌類から選択される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記菌類材料は、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ属、Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ属、Ｃｅｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ属、Ｍｅｔａｒｈｉｚｕｍ属、Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ属、Ｐａｅｃｉｌｏｍｙｃｅｓ属、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ属、Ｆｕｓａｒｉｕｍ属及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
前記菌類材料は、Ｂｅａｕｖｅｒｉａ  ｂａｓｓｉａｎａなる種である、請求項１乃至３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
前記生体高分子組成物は水と少なくとも一つの増粘剤を含む、請求項１乃至６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記増粘剤は、多糖類ガムである、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記増粘剤は、キサンタンガム、アカシアガム、グアーガム、ジェランガム、ローカストビーンガム、及びそれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記生体高分子は界面活性剤を更に含む、請求項１乃至９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記界面活性剤は、ｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノール（ＴｒｉｔｏｎＸ−１００（登録商標））、ポリオキシエチレンソルビタン（Ｔｗｅｅｎ８０（登録商標））又はその組み合わせから選択される、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記固体基質は、粒子又は顆粒中に形成されるとともに菌類接種材料に成長のための栄養素を提供する実質的に固体の材料を含む、請求項１乃至１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
前記固体基質は、米粒、穀物粒、デンプン化合物、砂、砂利、ゼオライト、軽石及びそれらの混合物から選択される、請求項１乃至１２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記固体基質は米粒である、請求項１乃至１３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
前記米粒は、全粒状態と、破断した状態と、粉砕した状態と、全粒状態、破断した状態及び／又は粉砕した状態の組み合わせと、のいずれかである、請求項１４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記穀物粒は小麦、大麦、キビ、トウモロコシ及びそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記デンプンはタピオカデンプンである、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
菌類材料、少なくとも一つの固体基質及び生体高分子組成物を含む組成物であって、２０℃にて安定であるとともに、ダスト形成の形態において分生子の損失が低減され、かつ本明細書に記載され、試験及び図面にて参照される、組成物。
【請求項１９】
安定した菌類組成物を製造する方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも一つの固体基質と、胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料の接種材料と、を混合する工程と、
（ｂ）菌類接種材料を成長させる工程と、
（ｃ）前記（ｂ）の工程時に固体基質から成長した菌類材料を分離する工程と、
（ｄ）前記（ｃ）の工程に回収された菌類材料を多孔性の固体基質と混合する工程と、
（ｅ）前記菌類材料及び多孔性の固体基質を生体高分子組成物内に少なくとも部分的に封入する工程と、を含む、方法。
【請求項２０】
前記工程（ｅ）において、前記菌類材料及び多孔性の固体基質はいずれも、前記生体高分子組成物内に完全に封入される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記工程（ｄ）にて得られる前記多孔性の固体基質及び前記菌類材料は、前記工程（ｅ）を実施する前に乾燥される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
安定した菌類組成物を製造する方法であって、前記方法は、
（ａ）少なくとも一つの固体基質と、胞子、担胞子体、菌糸体及びそれらの混合物から選択される菌類材料の接種材料と、を混合する工程と、
（ｂ）前記菌類接種材料をより多くの菌類材料に成長させる工程と、
（ｃ）前記（ｂ）の工程時に得られた固体基質及び成長した菌類材料を生体高分子組成物内に少なくとも部分的に封入する工程と、を含む方法。
【請求項２３】
前記工程（ｃ）において、前記固体基質及び前記成長した菌類材料はいずれも、前記生体高分子組成物内に完全に封入される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記工程（ｂ）にて得られる前記固体基質及び前記成長した菌類材料は、前記工程（ｃ）を実施する前に乾燥される、請求項２２又は２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記方法の工程（ｂ）において、前記接種材料及び基質混合物は密封された環境内に封入される、請求項１９乃至２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記密封された環境はプラスチックバッグである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記工程（ｂ）は１乃至４週間後に完了する、請求項１９乃至２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記封入は、前記菌類材料及び固体基質を生体高分子組成物でコーティングするために緩やかに混合することにより実施される、請求項１９乃至２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
本明細書に記載され、かつ試験及び図面により参照される、安定した菌類組成物を製造する方法。
【請求項３０】
請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の組成物を害虫の抑制に使用する方法。
【請求項３１】
前記害虫は、土壌中に生息するコガネムシ、カブトムシ及びゾウムシの成虫及び幼虫、毛虫、セミ、カリバチ、アリ及びシロアリを含む、請求項３０に記載の使用方法。
【請求項３２】
請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の組成物を雑草の抑制に使用する方法。
【請求項３３】
前記雑草は、ハーブ牧草の雑草、ハーブ作物の雑草、上質の芝生及びアメニティエリアのハーブ雑草、放牧領域及び天然領域の低木の雑草、野生の木を含む、請求項３２に記載の使用方法。
【請求項３４】
請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の安定した菌類組成物を使用する方法であって、本明細書に記載され、かつ試験及び図面により参照される、方法。
【請求項３５】
請求項１乃至１８のいずれか一項に記載の組成物であって、前記組成物は少なくとも一つのガス透過可能なバッグに保存されている、組成物。
【国際調査報告】
2008539754.tif 000021
2008539754.tif 000022
2008539754.tif 000023