(57)【要約】本開示は、一般式５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’、好ましくは、一般式５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’の（サブ）配列を有するＬＮＡオリゴヌクレオチドに関するものであり、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上記で規定のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示す。このようなＬＮＡオリゴヌクレオチドはアンチセンス機構によるＳｕｒｖｉｖｉｎの発現の阻害に関して驚くほど良好な特性を示し、これによりインビボでの腫瘍形成の低減または阻害をもたらす。
2008518980.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性キャリア中にＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む液状薬学的組成物であって、該ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上記で規定したＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、括弧内のヌクレオチドユニットは各々任意のユニットを表し、
該水性キャリアが、ｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、かつ２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する、液状薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＬＮＡヌクレオチドアナログがすべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＬＮＡヌクレオチドが配列番号２を有する化合物である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
水性キャリア中に結合体を含む液状薬学的組成物であって、該結合体が、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分とからなり、
該水性キャリアが、ｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、かつ２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する、液状薬学的組成物。
【請求項７】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
薬学的に受容可能なキャリア中に、少なくとも１つのタキサン化合物と、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドとを含む薬学的組成物であって、
該組成物中の該タキサン化合物と該ＬＮＡオリゴヌクレオチドとの重量比が５０：１〜１：２５の範囲にある、薬学的組成物。
【請求項９】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
薬学的に受容可能なキャリア中に、少なくとも１つのタキサン化合物と結合体とを含む薬学的組成物であって、該結合体が、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分とからなり、
該組成物中の該タキサン化合物と該結合体のＬＮＡオリゴヌクレオチド部分との重量比が５０：１〜１：２５の範囲にある、薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
癌疾患に罹患しているかまたは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトの処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１３】
癌疾患に罹患しているかまたは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトの処置のための薬学的組成物の調製のための結合体の使用であって、該結合体が、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分とからなる、使用。
【請求項１４】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＬＮＡヌクレオチドアナログがすべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＬＮＡヌクレオチドが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される化合物である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＬＮＡヌクレオチドが配列番号２を有する化合物である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記薬学的組成物が請求項１〜１１のいずれか一項に記載の通りである、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記癌疾患が、急性骨髄性白血病、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ球性白血病、肝癌、腎癌、尿路癌および結腸直腸癌から選択される、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
癌疾患に罹患しているかまたは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトを処置するための方法であって、該方法が、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む第一の薬学的組成物の１以上の治療有効用量を該哺乳動物に投与する工程を包含する、方法。
【請求項２１】
癌疾患に罹患しているかまたは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトを処置するための方法であって、該方法が、結合体を含む第一の薬学的組成物の１以上の治療有効用量を該哺乳動物に投与する工程を包含し、該結合体が、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分とからなる、方法。
【請求項２２】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＬＮＡヌクレオチドアナログがすべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される化合物である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号２を有する化合物である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記癌疾患が、急性骨髄性白血病、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ球性白血病、肝癌、腎癌、尿路癌および結腸直腸癌から選択される、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）１以上の注射可能溶液用量の請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する第一の構成要素と、
（ｂ）１以上の注射可能溶液の１以上のタキサン化合物を含有する第二の構成要素と
を備えるキットであって、
該第二の構成要素の１溶液中の少なくとも１つのタキサン化合物と、該第一の構成要素の１溶液用量中の少なくとも１つのＬＮＡオリゴヌクレオチドとの重量比が５０：１〜１：２５の範囲であり、かつ／あるいは、
該ＬＮＡオリゴヌクレオチドの注射可能溶液用量が、ｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、かつ２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する、キット。
【請求項２８】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドの注射可能溶液用量が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物である、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
（ａ）固体形態の請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する第一の構成要素と、
（ｂ）該ＬＮＡオリゴヌクレオチドの再構成に適した生理食塩水または緩衝液を含有する第二の構成要素と
を備える、キット。
【請求項３０】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は癌の処置に有用な薬学的組成物に関する。当該組成物はＳｕｒｖｉｖｉｎの発現の阻害に関して優れた特性を有する特定のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む。本発明は癌を処置する方法および種々のキットにも関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
Ｓｕｒｖｉｖｉｎは最も魅力的な新規の癌標的の１つである。癌におけるＳｕｒｖｉｖｉｎの臨床的役割は、ほぼすべての腫瘍型における高レベルのこのタンパク質の検出により重要視されている。一般的に、腫瘍におけるＳｕｒｖｉｖｉｎの発現上昇は、予後不良、癌再発の増加並びに放射線および化学療法に対する治療抵抗性と関連する。Ｓｕｒｖｉｖｉｎの発現が少数の例外を除き、正常な成人組織に見出されないという事実がＳｕｒｖｉｖｉｎを極めて重要な癌遺伝子としている。
【０００３】
アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）Ｓｕｒｖｉｖｉｎは２つの主要な生物学的事象に関与している：（ｉ）細胞増殖（有糸分裂）の制御および（ｉｉ）プログラム細胞死（アポトーシス）の制御。加えて、Ｓｕｒｖｉｖｉｎは腫瘍血管新生に重要な役割を果たす。
【０００４】
Ｓｕｒｖｉｖｉｎを標的とするｓｉＲＮＡとタキソールの併用は、ｓｉＲＮＡおよびタキソール単独に比し、ＳＨＥＰ細胞におけるアポトーシスの誘導を増大させる（非特許文献１）。
【０００５】
非特許文献２。
【０００６】
本出願人の先願の特許文献１において、広範なアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドの可能性について述べた。しかし、本明細書に開示されるＬＮＡオリゴヌクレオチドの驚くほど良好な特性は、先行技術において未だ報告されていない。
【特許文献１】国際公開第２００４／０６９９９１号パンフレット
【非特許文献１】Ｚａｎｇｅｍｅｉｓｔｅｒ−Ｗｉｔｔｋｅ  ２００３；Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．１００２：９０−９４
【非特許文献２】Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｚｈｏｎｇｈｕａ  Ｘｕｅ  Ｙｅ  Ｚａ  Ｚｈｉ  ２４，３５１−５４．”Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ｔａｘｏｌ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ＨＬ−６０”
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
（発明の簡単な説明）
本発明の第一の主たる態様は、水性キャリア中のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む液状薬学的組成物に関するものであり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、
前記水性キャリアはｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する。
【０００８】
本発明の第二の主たる態様は、水性キャリア中の結合体を含む液状薬学的組成物に関するものであり、前記結合体はＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分からなり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、
前記水性キャリアはｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する。
【０００９】
本発明の第三の態様は、薬学的に受容可能なキャリア中の少なくとも１つのタキサン化合物およびＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物に関するものであり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、
前記組成物中のタキサン化合物とＬＮＡオリゴヌクレオチドの重量比は５０：１〜１：２５の範囲である。
【００１０】
本発明の第四の主たる態様は、薬学的に受容可能なキャリア中の少なくとも１つのタキサン化合物および結合体を含む薬学的組成物に関するものであり、前記結合体はＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分からなり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、
前記組成物中のタキサン化合物と当該結合体のＬＮＡオリゴヌクレオチド部分の重量比は５０：１〜１：２５の範囲である。
【００１１】
本発明の第五の主たる態様は、癌疾患に罹患し、あるいは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトの処置のための薬学的組成物の調製のためのＬＮＡオリゴヌクレオチドの使用に関するものであり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示す。
【００１２】
本発明の第六の主たる態様は、癌疾患に罹患し、あるいは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトの処置のための薬学的組成物の調製のための結合体の使用に関するものであり、前記結合体はＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分からなり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示す。
【００１３】
本発明の第七の主たる態様は、癌疾患に罹患し、あるいは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトを処置する方法に関するものであり、当該方法は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む１以上の治療有効量の第一の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示す。
【００１４】
本発明の第八の主たる態様は、癌疾患に罹患し、あるいは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトを処置する方法に関するものであり、当該方法は、結合体を含む１以上の治療有効量の第一の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、前記結合体はＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分からなり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示す。
【００１５】
本発明の第九の主たる態様は、
（ａ）１以上の注射可能溶液用量のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する第一の構成要素と、
（ｂ）１以上の注射可能溶液の１以上のタキサン化合物を含有する第二の構成要素と
を含むキットに関するものであり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、
第二の構成要素の１溶液中の少なくとも１つのタキサン化合物と、第一の構成要素の１溶液用量中の少なくとも１つのＬＮＡオリゴヌクレオチドの重量比は、５０：１〜１：２５の範囲である。
【００１６】
本発明の第十の主たる態様は、
（ａ）固体形態のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する第一の構成要素と、
（ｂ）前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドの再構成（例えば、溶解または懸濁）に適した緩衝液を含有する第二の構成要素と
を含むキットに関するものであり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示す。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１７】
（発明の詳細な説明）
本発明者らは、特定のクラスのＬＮＡオリゴヌクレオチドがアンチセンス機構によるＳｕｒｖｉｖｉｎの発現の阻害に関して驚くほど良好な特性を示すことを認めた。実施例から明らかであるように、この特定のクラスのＬＮＡオリゴヌクレオチド（単独あるいはタキサン化合物を併用）はＳｕｒｖｉｖｉｎの発現を阻害し、これによりインビボでの腫瘍形成の低減または阻害をもたらす。
【００１８】
本明細書で述べるＬＮＡオリゴヌクレオチドは、Ｓｕｒｖｉｖｉｎを標的とする強力なＬＮＡオリゴヌクレオチド配列番号２によって示される。この化合物はアポトーシスの誘導および増殖の阻害のような機能的情報によって測定されるＳｕｒｖｉｖｉｎｇ  ｍＲＮＡを標的とする他のＬＮＡオリゴヌクレオチドより優れている。また、主要候補物の配列番号２はトランスフェクションされた癌細胞株においてＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡおよびタンパク質をダウンレギュレートする点でも強力である。加えて、主要候補物の配列番号２は他のＬＮＡオリゴヌクレオチドと比較し、タキソールとの併用で優れたアポトーシスを誘導する。配列番号２並びに配列番号２３、配列番号２２および配列番号２１で得られたインビトロデータの概要を実施例２１に示す。
【００１９】
ヌードマウスにおけるインビボ異種移植試験では単剤処置マウスの腫瘍におけるＳｕｒｖｉｖｉｎの減少を示し、化学療法剤を併用して用いる際に腫瘍増殖を阻害する。Ｓｕｒｖｉｖｉｎを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドがインビボにてタキソールとの併用で効果を示すのは初めてである。ヒト・マウス前立腺癌異種移植モデルＰＣ３を用いて効力試験を行った。さらに、配列番号２は良好な毒性プロファイルを有し、カニクイザルにおける静脈内ＭＴＤ（最小中毒量）試験では顕著な臨床徴候は見出されなかった。
【００２０】
（ＬＮＡオリゴヌクレオチド）
有用なＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線（即ち、ＭｅＣおよびＧ）は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、また、括弧内のヌクレオチドユニット（即ち、（ＭｅＣｘ）、（Ｔｘ）、（Ｇｘ）および（ｃ））は各々任意のユニットを表す。
【００２１】
「本明細書で述べるＬＮＡオリゴヌクレオチド」、「本発明によるＬＮＡオリゴヌクレオチド」などの用語は上述の「ＬＮＡオリゴヌクレオチド」を指し、配列番号１および２８並びに以下に説明する実施形態、変形例、塩、プロドラッグなどを参照されたい。
【００２２】
ＬＮＡヌクレオチドアナログはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択される。これらの修飾ヌクレオチドアナログを次の図に示す：
【００２３】
【化１】
2008518980.tif 000003
ここで、Ｂはヌクレオ塩基、即ちアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、グアニン（Ｇ）またはメチルシトシン（ＭｅＣ）を示す。β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡではＲは環窒素原子上の置換基または水素である。Ｒは、例えば、水素、メチル、エチル、プロピル、ベンジルなどでよく、あるいは官能基への結合を表す。
【００２４】
一実施形態において、ＬＮＡヌクレオチドアナログはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡから選択される。別の実施形態において、ＬＮＡヌクレオチドアナログはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択される。現在最も好ましい実施形態において、ＬＮＡヌクレオチドアナログはすべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００２５】
本明細書で用いる場合、「ヌクレオチド」という用語は、その１番炭素原子を介して窒素含有塩基のアデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）またはグアニン（Ｇ）の１つに結合するとともに、その３番および５番炭素原子、あるいは３番または５番炭素原子を介してヌクレオシド間ホスホジエステル基またはホスホロチオエート基に結合した２−デオキシリボース（またはリボース）ユニットを意味する。
【００２６】
（サブ）配列番号２８は少なくとも１２個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有するが、当該（サブ）配列は少なくとも１３個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ、詳細には少なくとも１４個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログによって表されることが好ましい。上述のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、（サブ）配列番号２８に加え、１〜４個の付加ヌクレオチドおよびＬＮＡヌクレオチドアナログ、あるいは１〜４個の付加ヌクレオチドまたはＬＮＡヌクレオチドアナログ、詳細には１、２、３または４個の付加２−デオキシヌクレオチドのような付加ヌクレオチドを含み得る。従って、通常、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０または１３〜２０または１４〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１４〜１９、例えば、１４〜１８または１５〜１８または１６〜１８または１４〜１７または１５〜１７または１６〜１７個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有することが好ましい。最も好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号２８の化合物であり、即ち、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１４〜１６個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ、例えば、１４個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ、１５個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログまたは１６個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。
【００２７】
従って、括弧内のヌクレオチドユニットがすべて存在するとは限らない場合、１つの好ましい変形例は、５’末端における（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）が存在し、（ｉ）３’末端における（Ｇｘ）（ｃ）が存在せず（１４量体となる）、あるいは（ｉｉ）（Ｇｘ）は存在するが（ｃ）が存在せず（１５量体となる）、あるいは（ｉｉｉ）（Ｇｘ）（ｃ）の両方が存在する（１６量体となる）変形例である。別のより好ましい変形例は、３’末端における（Ｇｘ）（ｃ）が存在し、（ｉ）５’末端における（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）が存在せず（１４量体となる）、あるいは（ｉｉ）（Ｔｘ）は存在するが（ＭｅＣｘ）が存在しない（１５量体となる）変形例である。さらにより好ましい実施形態は、５’末端における（Ｔｘ）が存在し、３’末端における（Ｇｘ）が存在する（１４量体となる）実施形態である。
【００２８】
下線ユニットに関し、ＭｅＣｘはＬＮＡヌクレオチドアナログを示すことが好ましい。従って、ＭｅＣｘ，ＡおよびＧのすべてがＬＮＡヌクレオチドアナログを表し、あるいはＭｅＣｘはデオキシヌクレオチドを表し、ＡおよびＧはＬＮＡヌクレオチドアナログを表し得るといった具合である。
【００２９】
好ましい（サブ）配列番号１は１６個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。上述のＬＮＡオリゴヌクレオチドは、（サブ）配列番号１に加え、１〜４個の付加ヌクレオチドおよびＬＮＡヌクレオチドアナログ、あるいは１〜４個の付加ヌクレオチドまたはＬＮＡヌクレオチドアナログ、詳細には１、２、３または４個の付加２−デオキシヌクレオチドのような付加ヌクレオチドを含み得る。従って、通常、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１６〜１９、例えば、１６〜１８または１６〜１７個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有することが好ましい。最も好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号１の化合物であり、即ち、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１６個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。
【００３０】
配列番号２８のサブ配列ＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣおよび配列番号１のサブ配列ＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣは、完全にホスホロチオール化されたものとして示されており、下付き文字「ｓ」を参照されたい。現在のところ好ましくないが、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性を大きく損なうことなく、１つ、また、恐らく２つのホスホロチオエート結合を他の結合、詳細にはホスホロジエステル結合に置換し得ると考えられる。従って、１つまたは２つのホスホロチオエート結合が、例えば、ホスホロジエステル結合に置換されたこのような変形例も本発明の目的範囲内に含まれる。
【００３１】
配列番号２８および１の特定の（サブ）配列の具体例は表１に挙げられた配列番号２〜２０である。
【００３２】
【表１】
2008518980.tif 000004
表１において、大文字（上付き文字なし）はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログ（β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ）を示すが、大文字の後の上付き文字「α」（例えば、Ｇα）はＬＮＡヌクレオチドアナログがα−Ｌ−ＬＮＡヌクレオチドアナログ（α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）であることを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロジエステル結合を示す下付き文字はない。ＬＮＡ−Ｃモノマーはすべて５−メチル−Ｃ（ＭｅＣ）である。
【００３３】
興味を引く実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群、特に配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される（サブ）配列を含む。より詳細には、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群、特に配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される化合物である。
【００３４】
現在のところ最も好ましい実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは（サブ）配列番号２を含む。さらに好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号２を含む化合物である。
【００３５】
（ＬＮＡオリゴヌクレオチドの作製）
ＬＮＡヌクレオチドアナログの構成ブロック（β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）は、公開された手順およびその引用文献に従って作製することができ、例えば、以下を参照のこと：
【００３６】
【表１Ａ】
2008518980.tif 000005
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは実施例並びにＷＯ９９／１４２２６、ＷＯ００／５６７４６、ＷＯ００／５６７４８、ＷＯ００／６６６０４、ＷＯ００／１２５２４８、ＷＯ０２／２８８７５、ＷＯ２００２／０９４２５０およびＷＯ０３／００６４７５に述べられているように作製することができる。従って、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは有機化学技術の当業者には周知の核酸化学のオリゴマー化技術を用いて製造し得る。一般的に、ホスホルアミダイト手法の標準的なオリゴマー化サイクル（Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９３，４９，６１２３；Ｓ．Ｌ．Ｂｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｒ．Ｐ．Ｉｙｅｒ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９２，４８，２２２３）が用いられるが、例えば、Ｈ−ホスホネート化学、ホスホトリエステル化学も用いることができる。
【００３７】
一部のモノマーでは、より長い結合時間または反復結合またはより濃縮された結合試薬の使用、あるいはその組み合わせが必要であり、あるいは有益となり得る。
【００３８】
典型的には、用いるホスホルアミダイトは９５％を超える良好な段階的収率にて結合する。通常、リン（ＩＩＩ）からリン（Ｖ）の酸化は、例えば、ヨウ素／ピリジン／Ｈ２Ｏを用いて行われる。これにより脱保護後に天然のヌクレオシド間ホスホロジエステル結合が生じる。ヌクレオシド間ホスホロチオエート結合が作製される場合、ヌクレオシド間ホスホロジエステル結合の合成に用いられる通常の、例えば、ヨウ素／ピリジン／Ｈ２Ｏによる酸化をＡＤＴＴ試薬（水素化キサンタン（アセトニトリル：ピリジン  ９：１、ｖ／ｖ中０．０１Ｍ））を用いた酸化に換えてチオール化工程が行われる。ＢｅａｕｃａｇｅおよびＰＡＤＳのような他のチオール化試薬も使用可能である。ホスホロチオエートＬＮＡオリゴヌクレオチドは段階的結合収率が９８％以上と効率的に合成された。
【００３９】
また、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−ＬＮＡ、あるいはそのいずれかを含むＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ホスホルアミダイト処置を用いて段階的結合収率が９８％以上と効率的に合成することができる。
【００４０】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの精製は、使い捨て逆相精製カートリッジまたは逆相ＨＰＬＣまたはエタノール若しくはブタノールからの沈殿、あるいはその組み合わせを用いて実施できた。キャピラリーゲル電気泳動、逆相ＨＰＬＣ、ＭＡＬＤＩ−ＭＳおよびＥＳＩ−ＭＳを用いて合成ＬＮＡオリゴヌクレオチドの純度を検証した。
【００４１】
（塩）
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは種々の薬学的に受容可能な塩において用いることができる。本明細書で用いるように、この用語はＬＮＡオリゴヌクレオチドの所望の生物活性を保持するとともに、最小限の不要な毒性作用を示す塩を指す。このような塩の非限定的例は、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウム、ナトリウム、カリウムなどの金属カチオンまたはアンモニア、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレン−ジアミン、Ｄ−グルコサミン、テトラエチルアンモニウム若しくはエチレンジアミンから形成されるカチオンまたはその組み合わせにより形成される有機アミノ酸および塩基付加塩により形成することができ、例えば、タンニン酸亜鉛塩などがある。
【００４２】
このような塩はホスホロジエステル基およびホスホロチオエート基、あるいはホスホロジエステル基またはホスホロチオエート基を有するＬＮＡオリゴヌクレオチドから形成され、例えば、好適な塩基を有する塩である。これらの塩には、例えば、元素の周期系のＩａ，Ｉｂ，ＩＩａおよびＩＩｂ族の金属から得られる非毒性金属塩、詳細には好適なアルカリ金属塩、例えば、リチウム、ナトリウム若しくはカリウム塩またはアルカリ土類金属塩、例えば、マグネシウムまたはカルシウム塩が含まれる。塩にはさらに亜鉛およびアンモニウム塩、また、非置換またはヒドロキシル置換モノ−、ジ−若しくはトリアルキルアミンのような好適な有機アミン、特にモノ−、ジ−若しくはトリアルキルアミンにより、あるいは四級アンモニウム化合物により、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−エチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、モノ−、ビス−若しくはトリス−（２−ヒドロキシ−低級アルキル）アミン、例えば、モノ−、ビス−若しくはトリス−（２−ヒドロキシエチル）アミン、２−ヒドロキシ−ｔｅｒｔ−ブチルアミンまたはトリス（ヒドロキシメチル）メチルアミン、Ｎ，Ｎ−ジ−低級アルキル−Ｎ−（ヒドロキシ−低級アルキル）アミン、例えば、Ｎ，Ｎ−ジメチル−Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）アミンまたはトリ−（２−ヒドロキシエチル）アミンまたはＮ−メチル−Ｄ−グルカミンまたはテトラブチルアンモニウム塩のような四級アンモニウム化合物により形成される塩が含まれる。リチウム塩、ナトリウム塩、マグネシウム塩、亜鉛塩またはカリウム塩が好ましく、ナトリウム塩が特に好ましい。
【００４３】
（プロドラッグ）
一実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドはプロドラッグの形態でよい。オリゴヌクレオチドは利点として負の電荷を帯びたイオンである。細胞膜の親油性によってオリゴヌクレオチドの細胞取込は中性または親油性等価物に比し、減少する。この極性「阻害」はプロドラッグ手法を用いることにより回避できる（例えば、Ｃｒｏｏｋｅ，Ｒ．Ｍ．（１９９８）Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｖｏｌ．１３１，ｐｐ．１０３−１４０を参照されたい）。この手法ではＬＮＡオリゴヌクレオチドは投与時に中性となるように保護された様式にて作製される。これらの保護基はＬＮＡオリゴヌクレオチドが細胞に取り込まれると除去できるように設計される。このような保護基の例はＳ−アセチルチオエチル（ＳＡＴＥ）またはＳ−ピバロイルチオエチル（ｔ−ブチル−ＳＡＴＥ）である。これらの保護基はヌクレアーゼ耐性であり、細胞内にて選択的に除去される。
【００４４】
（結合体）
本発明の内容において、「結合体」という用語は、本明細書で述べるＬＮＡオリゴヌクレオチド（即ち、ヌクレオシドおよびＬＮＡヌクレオシドアナログの配列を含む化合物）の１以上の非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分への共有結合によって形成される異種分子を示すものとする。
【００４５】
従って、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは二量体または樹枝状構造にて配置され得るように、例えば、共有結合され、あるいはペプチド核酸（ＰＮＡ）、タンパク質（例えば、標的タンパク質に対する抗体）、巨大分子、低分子量薬剤物質、脂肪酸鎖、糖残基、糖タンパク質、ポリマー（例えば、ポリエチレングリコール）、ミセル形成基、抗体、炭水化物、受容体結合基、コレステロールのようなステロイド、ポリペプチド、アクリジン誘導体のような挿入剤、長鎖アルコール、デンドリマー、リン脂質や他の親油基またはこれらの組合せなどを含む非ヌクレオチドまたは非ポリヌクレオチド部分とキメラを形成し得る。ＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体は、活性薬剤物質、例えば、アスピリン、イブプロフェン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、化学療法化合物または抗生物質にも共有結合若しくはさらに共有結合され得る。
【００４６】
このように共有結合することにより、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの薬物動態特性に関し、有利な特性を付与する。詳細には、このように共有結合することにより、細胞取込の増大を果たす。
【００４７】
一実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは結合体を形成するためにリガンドに結合され、前記リガンドはアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドに対して結合体の細胞取込を増大させることを目的とする。この結合体は末端位置５’／３’−ＯＨにて生じるが、リガンドも糖および塩基、あるいは糖または塩基にて生じる。アンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドが結合され得る増殖因子はトランスフェリンまたは葉酸を含み得る。トランスフェリン−ポリリシン−オリゴヌクレオチド複合体または葉酸−ポリリシン−オリゴヌクレオチド複合体は、高レベルのトランスフェリンまたは葉酸受容体を発現する細胞による取込のために作製され得る。他の結合体／リガンドの例はコレステロール部分、アクリジンのような二本鎖挿入物質、ポリ−Ｌ−リシン、ホスホロモノチオアートのような１以上のヌクレアーゼ耐性結合基との「末端キャップ」などである。
【００４８】
細胞へのオリゴヌクレオチドの取込のキャリアとしてのトランスフェリンの作製は、Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７，３４１０−３４１４（１９９０）に報告されている。アンチセンスオリゴヌクレオチドの輸送を含む、葉酸受容体エンドサイトーシスを介した葉酸−巨大分子結合体の細胞輸送は、Ｌｏｗらによる米国特許第５，１０８，９２１号に説明されている。Ｌｅａｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８，５５７２（１９９１）も参照されたい。
【００４９】
（薬学的組成物）
本発明は、上述のＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体と薬学的に受容可能なキャリア、例えば、水性キャリアを含む薬学的組成物に関するものであるということを理解する必要がある。当該薬学的組成物は好ましくは注射に適する。
【００５０】
薬学的組成物の作製の指針は”Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”  ｂｙ  Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏおよび以下に見出すことができる。
【００５１】
結合剤およびアジュバントのような薬学的に受容可能なキャリアは薬学的組成物の一部である。カプセル、錠剤および丸剤などは、例えば、次の化合物を含有し得る：結合剤としての微結晶セルロース、ガムまたはゼラチン、賦形剤としてのデンプンまたはラクトース、潤滑剤としてのステアリン酸、種々の甘味剤または着香剤。カプセルでは投与単位は脂肪油のような液状キャリアを含有し得る。同様に、糖または腸溶剤のコーティングは投与単位の一部となり得る。薬学的組成物は活性医薬成分（ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む）の乳剤およびミセルエマルションを形成する脂質ともなり得る。
【００５２】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは所望の作用を損なわない任意の物質または所望の作用を補う物質と混合され得る。これらの物質には他のヌクレオシド化合物を含む他の薬剤が含まれ得る。
【００５３】
非経口、皮下、皮内または局所投与では、製剤は滅菌希釈剤（例えば、水）、緩衝剤、張度およびイオン強度の調整剤並びに抗菌剤を含み得る。活性化合物は、取込を促進し、分解を妨げ、あるいは体内からの速やかな除去を妨げるキャリアとともに調製され得て、これには制御放出特性を有する埋込剤またはマイクロカプセルが含まれる。静脈内投与では好ましいキャリアは生理食塩水（０．９％）またはリン酸塩緩衝生理食塩水である。
【００５４】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、処置される患者において重篤な副作用を引き起こすことなく治療有効量を患者に送達するのに十分な量にて、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤のような単位製剤に含まれることが好ましい。
【００５５】
薬学的組成物の好ましい実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは水性キャリア、詳細にはｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含むとともに２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する水性キャリアに製剤化される。
【００５６】
「水性キャリア」という用語は、当該の薬学的組成物が液状形態であり、液状キャリアが主に水からなり、即ち、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）または少なくとも９０％（ｗ／ｗ）またはさらに少なくとも９５％（ｗ／ｗ）のキャリアが水からなるということを意味する。他の液体成分を用いてもよく、例えば、エタノール、ＤＭＳＯ、エチレングリコールなどである。
【００５７】
水性キャリアはｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含むことが好ましい。緩衝液はｐＨを５．０〜８．０の範囲、例えば、６．０〜７．５の範囲に維持することが好ましい。
【００５８】
薬学的組成物のイオン強度／張度も重要である。従って、通常、液状薬学的組成物は２０〜２０００ｍＭの範囲、例えば、５０〜１５００ｍＭの範囲または１００〜１０００ｍＭの範囲のイオン強度を有する。
【００５９】
本発明の第一の主たる態様は、水性キャリア中のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む液状薬学的組成物に関するものであり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、
前記水性キャリアはｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する。
【００６０】
本発明の第二の主たる態様は、水性キャリア中の結合体を含む液状薬学的組成物に関するものであり、前記結合体はＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分からなり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、
前記水性キャリアはｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する。
【００６１】
第一および第二の主たる態様は、上述したＬＮＡオリゴヌクレオチド、結合体および薬学的組成物に関し、仕様および嗜好と有利に組み合わされる。次の実施形態は本発明の利点を十分に表すと考えられる。
【００６２】
一実施形態において、ＬＮＡヌクレオチドアナログはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびβ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡから、あるいはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択され、詳細には、ＬＮＡヌクレオチドアナログはすべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００６３】
前述と組み合わされ得る、さらなる実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１６〜１９、例えば、１６〜１８または１６〜１７、特に１６個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。あるいは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜１８、例えば、１３〜１８または１４〜１７、特に１４または１５個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。
【００６４】
前述と組み合わされ得る、よりさらなる実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群、特に配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される（サブ）配列を含む。より詳細には、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群、特に配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される化合物である。さらにより好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは（サブ）配列番号２を含み、最も好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号２を含む化合物である。
【００６５】
前述と組み合わされ得る、より一層さらなる実施形態において、当該組成物は少なくとも１つのタキサン化合物をさらに含む（さらなる詳細については下記項目「併用薬剤」を参照されたい）。詳細には、前記組成物中のタキサン化合物とＬＮＡオリゴヌクレオチド（結合体のＬＮＡオリゴヌクレオチド部分）の重量比は５０：１〜１：２５の範囲である。第二の態様では、少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分がタキサン化合物を含むと好ましい場合がある。
【００６６】
（併用薬剤）
薬学的組成物は化学療法化合物、抗炎症化合物、抗ウイルス化合物、細胞増殖阻害化合物、抗血管新生化合物、抗増殖化合物、アポトーシス誘導化合物、シグナル伝達モジュレータおよびキナーゼ阻害剤からなる群より選択される、さらなる作用物質も含み得る。
【００６７】
興味深い変法において、さらなる作用物質は少なくとも１つの化学療法化合物である。このような化学療法化合物の好適な例は、副腎皮質ステロイド、例えば、プレドニゾン、デキサメタゾンまたはデカドロン、アルトレタミン（ヘキサレン、ヘキサメチルメラミン（ＨＭＭ））、アミホスチン（エチヨル）、アミノグルテチミド（シタドレン）、アムサクリン（Ｍ−ＡＭＳＡ）、アナストロゾール（アリミデックス）、アンドロゲン、例えば、テストステロン、アスパラギナーゼ（ｅｌｓｐａｒ）、カルメット・ゲラン桿菌、ビカルタミド（カソデックス）、ブレオマイシン（ブレノキサン）、ブスルファン（マイレラン）、カルボプラチン（パラプラチン）、カルムスチン（ＢＣＮＵ、ＢｉＣＮＵ）、クロラムブシル（リューケラン）、クロロデオキシアデノシン（２−ＣＤＡ、クラドリビン、ロイスタチン）、シスプラチン（プラチノール）、シトシンアラビノシド（シタラビン）、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン（アクチノマイシン−Ｄ、コスメゲン）、ダウノルビシン（ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）、ドセタキセル（タキソテール）、ドキソルビシン（アドリアマイシン、エピルビシン、エストラムスチン（ｅｍｃｙｔ）、エストロゲン、例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、エトポシド（ＶＰ−１６、ＶｅＰｅｓｉｄ、ｅｔｏｐｏｐｈｏｓ）、フルダラビン（フルダラ）、フルタミド（ｅｕｌｅｘｉｎ）、５−ＦＵＤＲ（フロクスウリジン）、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ゲムシタビン（ジェムザール）、ゴセレリン（ゾラデックス）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ヒドロキシウレア（ハイドレア）、イダルビシン（イダマイシン）、イホスファミド、ＩＬ−２（ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ、アルデスロイキン）、インターフェロンα（イントロンＡ、ロフェロンＡ）、イリノテカン（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）、ロイプロリド（ルプロン）、レバミゾール（ｅｒｇａｍｉｓｏｌｅ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン（ｍｕｓｔａｒｇｅｎ、ナイトロジェンマスタード）、メルファラン（アルケラン）、メルカプトプリン（ｐｕｒｉｎｅｔｈｏｌ、６−ＭＰ）、メトトレキサート（ｍｅｘａｔｅ）、マイトマイシン−Ｃ（ｍｕｔａｍｙｃｉｎ）、ミトキサントロン（ノバントロン）、オクトレオチド（サンドスタチン）、ペントスタチン（２−デオキシコホルマイシン、ｎｉｐｅｎｔ）、プリカマイシン（ミトラマイシン、ｍｉｔｈｒａｃｉｎ）、プロカルバジン（ｍａｔｕｌａｎｅ）、ストレプトゾシン、タモキシフェン（ノルバデックス）、タキソール（パクリタキセル）、テニポシド（ｖｕｍｏｎ、ＶＭ−２６）、チオテパ、トポテカン（ハイカムチン）、トレチノイン（ベサノイド、全トランス型レチノイン酸）、ビンブラスチン（ｖｅｌｂａｎ）、ビンクリスチン（オンコビン）並びにビノレルビン（ナベルビン）からなる群より選択される化合物である。
【００６８】
一変法において、本発明は、（ａ）１以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドと、（ｂ）非アンチセンス機構により機能する１以上の他の化学療法化合物を含有する薬学的組成物を提供する。ＬＮＡオリゴヌクレオチドとともに使用される場合、このような化学療法化合物は個別に（例えば、ミトラマイシンとオリゴヌクレオチド）、逐次的に（例えば、一定時間はミトラマイシンとオリゴヌクレオチド、その後、別の薬剤とオリゴヌクレオチド）、あるいは１以上の他のこのような化学療法化合物と組み合わせて、あるいは放射線療法と組み合わせて用いられ得る。明示的に上述した化合物を含め、当業者に既知の化学療法化合物はすべて本発明による化合物との併用療法として本明細書に組み込まれる。
【００６９】
好ましい一実施形態において、薬学的組成物はタキサン化合物を併用して投与される。
【００７０】
「タキサン化合物」という用語はパクリタキセル（タキソール（登録商標））、パクリタキセル誘導体、ドセタキセル、タキソテール、修飾タキサンおよびタキソイドアナログを包含するものとする。パクリタキセル（タキソール（登録商標））は西洋（太平洋）イチイＴａｘｕｓ  ｂｒｅｖｉｆｏｌｉａの樹皮から分離されたジテルペンであり、タキサン環系を有する治療剤のクラスを表す。パクリタキセルとそのアナログはイチイの針葉および小枝から得られる前駆物質１０−デアセチルバッカチンＩＩＩからの半合成および全合成によって生産されている。Ｈｏｌｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：１５９７−１６０１（１９９４）およびＮｉｃｏｌａｏｕ，ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６７：６３０（１９９４）を参照されたい。パクリタキセルは臨床試験で複数のヒト腫瘍において有効性を実証している。ＭｃＧｕｉｒｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｉｎｔ．Ｍｅｄ．１１１：２３７−２７９（１９８９）、Ｈｏｌｍｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８３：１７９７−１８０５（１９９１）、Ｋｏｈｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．８６：１８−２４（１９９４）、およびＫｏｈｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  １２（１９９３）を参照されたい。修飾タキサンまたはタキソイドアナログは修飾側鎖を有するタキサン環を有する化合物である。これらのアナログの多くが向上した特性、例えば、天然起源のパクリタキセルより高い水溶性および安定性を有する。これらのアナログは当業者には既知であり、例えば、米国特許第５，２７８，３２４号、第５，２７２，１７１号、第５，２５４，５８０号、第５，２５０，６８３号、第５，２４８，７９６号、および第５，２２７，４００号に開示されており、これらの開示内容は参照して本明細書に組み込まれる。パクリタキセルおよびタキソテールはＷＯ９３／１８２１０、ＥＰ  ０  ２５３  ７３９、ＥＰ  ０  ２５３  ７３９およびＷＯ９２／０９５８９における方法によって調製することができ、これらの開示内容は参照して本明細書に組み込まれる。特定の実施形態において、タキサン化合物はパクリタキセルまたはタキソテールである。
【００７１】
通常、前記組成物中のタキサン化合物とＬＮＡオリゴヌクレオチドの重量比は５０：１〜１：２５の範囲、例えば、２５：１〜１：２５の範囲または１０：１〜１：２５の範囲または１：１〜１：２５の範囲または５０：１〜１：１０の範囲または１：１〜１：５０の範囲または２５：１〜１：１０の範囲である。
【００７２】
従って、本発明の第三の態様は、薬学的に受容可能なキャリア中の少なくとも１つのタキサン化合物およびＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む薬学的組成物に関するものであり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、
前記組成物中のタキサン化合物とＬＮＡオリゴヌクレオチドの重量比は５０：１〜１：２５の範囲である。
【００７３】
本発明の第四の主たる態様は、薬学的に受容可能なキャリア中の少なくとも１つのタキサン化合物および結合体を含む薬学的組成物に関するものであり、前記結合体はＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分からなり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、
前記組成物中のタキサン化合物と当該結合体のＬＮＡオリゴヌクレオチド部分の重量比は５０：１〜１：２５の範囲である。
【００７４】
第三および第四の主たる態様は、上述したＬＮＡオリゴヌクレオチド、結合体および薬学的組成物に関し、仕様および嗜好と有利に組み合わされる。次の実施形態は本発明の利点を十分に表すと考えられる。
【００７５】
一実施形態において、ＬＮＡヌクレオチドアナログはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびβ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡから、あるいはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択され、詳細には、ＬＮＡヌクレオチドアナログはすべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００７６】
前述と組み合わされ得る、さらなる実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１６〜１９、例えば、１６〜１８または１６〜１７、特に１６個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。あるいは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜１８、例えば、１３〜１８または１４〜１７、特に１４または１５個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。
【００７７】
前述と組み合わされ得る、よりさらなる実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群、特に配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される（サブ）配列を含む。より詳細には、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群、特に配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される化合物である。さらにより好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは（サブ）配列番号２を含み、最も好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号２を含む化合物である。
【００７８】
前述と組み合わされ得る、より一層さらなる実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチド（または結合体）およびタキサン化合物は水性キャリアに存在する。水性キャリアはｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有することが好ましい（緩衝液に関するさらなる詳細については上記も参照されたい）。
【００７９】
第四の態様では、少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分がタキサン化合物を含むと好ましい場合がある。
【００８０】
さらなる実施形態において、本発明の薬学的組成物は１以上のＬＮＡオリゴヌクレオチドと、第二の核酸標的を標的とする１以上の付加アンチセンス化合物を含み得る。２以上の組合せ化合物を同時に、あるいは逐次的に用い得る。
【００８１】
さらに、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む医薬品は放射線療法などと組み合わせて用いることも可能であり、試験の項目も参照されたい。
【００８２】
（処置の方法）
薬学的組成物は特に癌の処置に関係する。
【００８３】
本発明の薬学的組成物および方法は、癌によって生じる疾患に対する処置または予防、詳細には、肺、胸、結腸、前立腺、膵臓、肺、肝臓、甲状腺、腎臓、脳、精巣、胃（ｓｔｏｍａｃｈ）、腸（ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ）、腸（ｂｏｗｅｌ）、脊髄、洞、膀胱、尿路、卵巣、頭頸部、血液、皮膚、胃（ｇａｓｔｒｉｃ）または骨癌のような組織に発生し得る癌の処置に用いられることが好ましい。
【００８４】
本明細書で述べる本発明は、高用量のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含むがこれに限定されない治療有効量のＳｕｒｖｉｖｉｎ調節ＬＮＡオリゴヌクレオチドを、このような治療法を必要とするヒトに投与する工程を含む、癌を予防または処置する方法を包含する。本発明は、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ調節ＬＮＡオリゴヌクレオチドの短期間投与の使用をさらに包含する。正常な非癌細胞は特定の細胞種に特徴的な頻度で分裂する。細胞が癌状態に形質転換されると、無制御の細胞増殖および細胞死の減少が生じ、従って、不規則な細胞分裂または細胞増殖は癌細胞種の特徴である。癌の種類の例には、これらに限定されないが、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病（例えば、急性白血病、例えば、急性リンパ球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、多発性骨髄腫）、結腸癌、直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎細胞癌、肝癌、胆管癌、絨毛癌、子宮頸癌、精巣癌、肺癌、膀胱癌、黒色腫、頭頸部癌、脳腫瘍、原発部位が不明の癌、新生物、末梢神経系の癌、中枢神経系の癌、腫瘍（例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮腫、滑液膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉種、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、精上皮腫、胎生期癌、ウィルムス腫瘍、小細胞肺癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫、神経芽腫および網膜芽腫）、重鎖病、転移または無制御若しくは異常な細胞増殖を特徴とする任意の疾患若しくは障害が含まれる。
【００８５】
特に関係のある癌疾患は、急性骨髄性白血病、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ球性白血病、肝癌、腎癌、尿路癌および結腸直腸癌から選択される癌である。
【００８６】
「癌腫」という用語は上皮起源の悪性腫瘍を示すものとする。上皮組織は体内および体外の体表面を覆い、あるいは被覆する。上皮組織の例は、腸、膀胱、子宮などのような体腔および臓器を被覆する外皮および粘膜および漿膜である。また、上皮組織はより深い組織層に伸長して粘液分泌腺のような腺を形成し得る。「肉腫」という用語は、軟骨、脂肪、筋、腱および骨のような結合組織から増殖する悪性腫瘍を示すものとする。「神経膠腫」という用語は、本明細書で用いる場合、グリア細胞から発生する悪性腫瘍を含むものとする。
【００８７】
本発明の組成物は腫瘍に関連する癌形態の処置に特に適切であると考えられる。このような処置は放射線療法を併用し得る。
【００８８】
本発明の第五の主たる態様は、癌疾患に罹患し、あるいは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトの処置のための薬学的組成物の調製のためのＬＮＡオリゴヌクレオチドの使用に関するものであり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示す。
【００８９】
本発明の第六の主たる態様は、癌疾患に罹患し、あるいは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトの処置のための薬学的組成物の調製のための結合体の使用に関するものであり、前記結合体はＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分からなり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示す。
【００９０】
本発明の第七の主たる態様は、癌疾患に罹患し、あるいは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトを処置する方法に関するものであり、当該方法は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む１以上の治療有効量の第一の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示す。
【００９１】
本発明の第八の主たる態様は、癌疾患に罹患し、あるいは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトを処置する方法に関するものであり、当該方法は、結合体を含む１以上の治療有効量の第一の薬学的組成物を哺乳動物に投与する工程を含み、前記結合体はＬＮＡオリゴヌクレオチドおよび前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分からなり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示す。
【００９２】
第五、第六、第七および第八の主たる態様は、上述したＬＮＡオリゴヌクレオチド、結合体および薬学的組成物に関し、仕様および嗜好と有利に組み合わされる。従って、第五、第六、第七および第八の主たる態様において示された組成物は、項目「薬学的組成物」および「併用薬剤」で上述した薬学的組成物に対して明示された組成物であることが好ましい。次の実施形態は本発明の利点を十分に表すとさらに考えられる。
【００９３】
参照される疾患は上述の任意の疾患でよいが、急性骨髄性白血病、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ球性白血病、肝癌、腎癌、尿路癌および結腸直腸癌からなる群より選択されることが好ましい。
【００９４】
一実施形態において、ＬＮＡヌクレオチドアナログはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡおよびβ−Ｄ−アミノ−ＬＮＡから、あるいはβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択され、詳細には、ＬＮＡヌクレオチドアナログはすべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【００９５】
前述と組み合わされ得る、さらなる実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１６〜１９、例えば、１６〜１８または１６〜１７、特に１６個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。あるいは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜１８、例えば、１３〜１８または１４〜１７、特に１４または１５個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有する。
【００９６】
前述と組み合わされ得る、よりさらなる実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群、特に配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される（サブ）配列を含む。より詳細には、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９および２０からなる群、特に配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される化合物である。さらにより好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは（サブ）配列番号２を含み、最も好ましくは、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは配列番号２を含む化合物である。
【００９７】
前述と組み合わされ得る、第五および第六の主たる態様のより一層さらなる実施形態において、当該組成物は少なくとも１つのタキサン化合物をさらに含む（さらなる詳細については上記項目「併用薬剤」を参照されたい）。詳細には、前記組成物中のタキサン化合物とＬＮＡオリゴヌクレオチド（結合体のＬＮＡオリゴヌクレオチド部分）の重量比は５０：１〜１：２５の範囲である。第二の態様では、少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分がタキサン化合物を含むと好ましい場合がある。
【００９８】
前述と組み合わされ得る、第七および第八の態様のより一層さらなる実施形態において、少なくとも１つのタキサン化合物（さらなる詳細については上記項目「併用薬剤」を参照されたい）はＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体を併用して投与される。詳細には、投与されるタキサン化合物とＬＮＡオリゴヌクレオチド（結合体のＬＮＡオリゴヌクレオチド部分）の重量比は５０：１〜１：２５の範囲である。第八の態様では、少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分がタキサン化合物を含むと好ましい場合がある。
【００９９】
前述の実施形態を参照し、タキサン化合物はＬＮＡオリゴヌクレオチド（または結合体）を含む第一の薬学的組成物中に存在し得る。この場合、前記組成物中のタキサン化合物とＬＮＡオリゴヌクレオチド（または結合体のＬＮＡオリゴヌクレオチド部分）の重量比は５０：１〜１：２５の範囲であることが好ましい。あるいは、タキサン化合物はＬＮＡオリゴヌクレオチド（または結合体）を含まない第二の薬学的組成物中に存在し得る。この場合、第一の薬学的組成物と第二の薬学的組成物は同時に投与され、あるいは第一の薬学的組成物と第二の薬学的組成物は逐次的に投与され得る。
【０１００】
前述と組み合わされ得る、より一層さらなる実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチド（または結合体）およびタキサン化合物は水性キャリアに存在する。水性キャリアはｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有することが好ましい（緩衝液に関するさらなる詳細については上記も参照されたい）。
【０１０１】
第六および第八の態様では、少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分がタキサン化合物を含むと好ましい場合がある。
【０１０２】
（キット）
本発明は必要とする患者の医療処置に有用な種々のキットも提供する。
【０１０３】
一変形例において、キットは併用療法、即ち、ＬＮＡオリゴヌクレオチド（またはその結合体）と１以上のタキサン化合物を用いた処置に有用なセットを含む。
【０１０４】
従って、本発明の第九の主たる態様は、
（ａ）１以上の注射可能溶液用量のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する第一の構成要素と、
（ｂ）１以上の注射可能溶液の１以上のタキサン化合物を含有する第二の構成要素と
を含むキットに関するものであり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、
第二の構成要素の１溶液中の少なくとも１つのタキサン化合物と、第一の構成要素の１溶液用量中の少なくとも１つのＬＮＡオリゴヌクレオチドの重量比は、５０：１〜１：２５の範囲であり、かつ／あるいは、
ＬＮＡオリゴヌクレオチドの注射可能溶液用量はｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する。好ましい実施形態において、緩衝液、例えば、生理食塩水または緩衝生理食塩水は６．０〜８．０のｐＨおよび１００〜５００ｍＭのイオン強度を有する。最も好ましい実施形態において、生理食塩水または緩衝生理食塩水は７．０〜８．０のｐＨおよび１２０〜２５０ｍＭのイオン強度を有する。
【０１０５】
ＬＮＡオリゴヌクレオチドと非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分の結合体を含む同様のキットも、必要な変更を加えて本発明の態様を構成する。
【０１０６】
ＬＮＡオリゴヌクレオチド（またはＬＮＡオリゴヌクレオチドと非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分の結合体）およびタキサン化合物の注射可能溶液は、それぞれ「薬学的組成物」、「併用薬剤」の項目で上述した通りであることが好ましいということを理解する必要がある。
【０１０７】
液状形態の薬学的組成物がＬＮＡオリゴヌクレオチドの安定性を損なう条件に曝されるリスク下にある場合、ＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する最終製品を固形形態で、例えば、凍結乾燥物質として製造し、このような固形形態で製品を保存することが好ましい場合もある。その後、製品は投与前に再構成され得る（例えば、溶解または懸濁される）。
【０１０８】
従って、本発明の第十の主たる態様は、
（ａ）固体形態のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する第一の構成要素と、
（ｂ）前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドの再構成（例えば、溶解または懸濁）に適した生理食塩水または緩衝液（例えば、緩衝生理食塩水）を含有する第二の構成要素であって、好ましくは前記緩衝液が４．０〜８．５の範囲のｐＨおよび２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する第二の構成要素と
を含むキットに関するものであり、前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドは合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、好ましくは合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上述のＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示す。
【０１０９】
前述のキットは第一および第二の構成要素を併用するための指針文書を含むことも好ましい。
【０１１０】
（投与）
本発明の薬学的組成物は、局所処置または全身処置が望ましいのか、また、処置部位に依存し、多くの方法で投与され得る。投与は、（ａ）経口、（ｂ）肺内（例えば、粉末またはエアロゾルの吸入または吹送によるものであり、噴霧器によるものを含む）、気管内、鼻腔内、（ｃ）表皮、経皮、眼内を含み、また、粘膜には経膣および経直腸送達を含む局所あるいは（ｄ）静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内への注射または注入、若しくは頭蓋内、例えば、髄腔内または脳室内投与を含む非経口でよい。一実施形態において、ＬＮＡオリゴヌクレオチドは静脈内、腹腔内、経口、局所投与され、あるいはボーラス注射として投与され、あるいは標的臓器へ直接投与される。
【０１１１】
現在、最も適切な投与形態は静脈内注入または経口によるものと考えられる。
【０１１２】
（投与量）
投与は処置する病態の重症度および応答性並びに数日から数ヶ月継続する処置の経過あるいは治療効果がみられ、または病態の軽減が果たされるまでの期間に依存する。また、至適投与スケジュールは患者の体内薬物の測定または代理マーカーによって評価することができる。
【０１１３】
至適投与量は個々のオリゴヌクレオチドの相対的効力に依存し、変動し得る。一般的に、至適投与量はインビトロおよびインビボでの動物モデルにおいて有効であると見出されるＥＣ５０に基づいて推定され得る。概して、投与量は体重ｋｇあたり０．０１μｇ〜１ｇであり、１日、１週、１ヶ月または１年に１回以上あるいはさらに２〜１０年ごとに１回あるいは連続注入により数時間から数ヶ月まで投与され得る。投与の繰り返し率は、体液または体組織中の薬物の滞留時間および濃度の測定に基づいて推定することができる。良好な処置の後、病態の再発を防止するため、患者に維持療法を受けさせることが望ましい場合もある。最も適切な用量は体重ｋｇあたり０．０１ｍｇ〜１００ｍｇ、例えば、０．１ｍｇ〜４０ｍｇまたは０．５ｍｇ〜１０ｍｇである。このような用量は１日１回投与され得るが、より好ましくは頻度を低く、例えば、１〜４週の期間の間、１週あたり１〜３回とする。維持療法は継続する場合もあり、例えば、１ヶ月あたり１〜４回あるいは１年あたり１〜１０回のようにさらに頻度が低い。
【０１１４】
特定の理論に束縛されることなく、化学療法化合物と本発明によるＬＮＡオリゴヌクレオチドの併用効果（および相乗効果の可能性）は、化学療法化合物またはＬＮＡオリゴヌクレオチドまたはその両方の投与量を減少させることを可能にする。
【０１１５】
（さらなる用途）
本発明のＬＮＡオリゴヌクレオチドは診断、治療および予防用の研究試薬として利用することもできる。研究では、アンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドは細胞および実験動物におけるＳｕｒｖｉｖｉｎタンパク質の合成を特異的に阻害し、これにより標的の機能分析または治療的介入のための標的としてのその有用性の評価を容易にするために用いられ得る。診断では、アンチセンスオリゴヌクレオチドはノーザンブロット法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションまたは類似の技法によって細胞および組織におけるＳｕｒｖｉｖｉｎの発現を検出し、定量化するために用いられ得る。治療では、Ｓｕｒｖｉｖｉｎの発現を調節することによって処置可能な疾患または障害を有する疑いのある動物またはヒトが、本発明に従ってアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドを投与することにより処置される。
【０１１６】
治療有効量または予防有効量の１以上のアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体を投与することによって、Ｓｕｒｖｉｖｉｎの発現と関連する疾患または病状を有し、あるいはこれを起こしやすい疑いのある動物、詳細にはマウスおよびラットを処置し、ヒトを処置する方法をさらに提供する。
【０１１７】
本発明は、細胞および組織におけるＳｕｒｖｉｖｉｎの発現を調節する方法をさらに提供し、当該方法は、前記細胞および組織を本明細書で明示したＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体、詳細には本明細書で明示した薬学的組成物に接触させ、Ｓｕｒｖｉｖｉｎの発現が調節されるステップを含む。
【０１１８】
一層さらに、本発明は、遺伝子または遺伝子からのＲＮＡを本明細書で明示したＬＮＡオリゴヌクレオチドまたは結合体、詳細には本明細書で明示した薬学的組成物に接触させ、これにより遺伝子発現が調節されるステップを含む、癌疾患に関与する遺伝子の発現を調節する方法を提供する。遺伝子はＳｕｒｖｉｖｉｎ遺伝子であることが好ましい。
【０１１９】
本発明のさらなる態様は、細胞または細胞由来のＲＮＡを本明細書で明示した薬学的組成物に接触させ、これにより細胞のアポトーシスが誘導されるステップを含む、細胞のアポトーシスを誘導する方法に関する。アポトーシスの誘導はインビトロまたはインビボでよい。当該誘導は細胞アッセイにて、あるいは組織試料内で、あるいは生きている哺乳動物内で誘発され得る。
【０１２０】
本発明のさらなる態様は、細胞または細胞由来のＲＮＡを本明細書で明示した薬学的組成物に接触させ、これにより細胞増殖が防止または低下されるステップを含む、細胞増殖を防止または低下する方法に関する。増殖の防止または低下はインビトロまたはインビボでよい。当該防止は細胞アッセイにて、あるいは組織試料内で、あるいは生きている哺乳動物内で行われ得る。
【実施例】
【０１２１】
（実験）
本明細書で明示したＬＮＡオリゴヌクレオチドの現在のところ好ましい例は、ＬＮＡオリゴヌクレオチドの配列番号２である。次の実施例はこのＬＮＡオリゴヌクレオチドの驚くほど良好な特性を示すが、配列番号１または配列番号２８を含む（あるいは有する）他のＬＮＡオリゴヌクレオチドが同様に興味深い特性を有すると考えられる。
【０１２２】
（実施例１：モノマーの合成）
ＬＮＡモノマー構成ブロックとその誘導体を公開された手順およびそこでの引用文献に従って作製した。以下を参照のこと：
【０１２３】
【表１Ｂ】
2008518980.tif 000006
（実施例２：オリゴヌクレオチドの合成）
Ｅｘｐｅｄｉｔｅ  ８９００／ＭＯＳＳ合成装置（多重オリゴヌクレオチド合成システム）において１μｍｏｌまたは１５μｍｏｌスケールにて、ホスホルアミダイト手法を用いてオリゴヌクレオチドを合成した。より大きなスケールでの合成ではＡｅｋｔａ  Ｏｌｉｇｏ  Ｐｉｌｏｔを用いた。合成の終了時（ＤＭＴオン）、水性アンモニアを用いて室温で１〜２時間、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切断し、さらに６５℃で４時間、脱保護した。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によってオリゴヌクレオチドを精製した。ＤＭＴ基の除去後、ＡＥ−ＨＰＬＣ、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＣＧＥによってオリゴヌクレオチドを特徴付けし、ＥＳＩ−ＭＳによって分子質量をさらに確認した。さらなる詳細については下記を参照されたい。
【０１２４】
（ＬＮＡ固体支持体の作製：）
（ＬＮＡスクシニルヘミエステルの作製）
５’−Ｏ−ＤＭＴ−３’−ヒドロキシ−ＬＮＡモノマー（５００ｍｇ）、無水コハク酸（１．２ｅｑ．）およびＤＭＡＰ（１．２ｅｑ．）をＤＣＭ（３５ｍＬ）中に溶解した。反応物を室温で一晩撹拌した。ＮａＨ２ＰＯ４  ０．１Ｍ  ｐＨ５．５（２ｘ）および塩水（１ｘ）での抽出後、有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４でさらに乾燥させ、濾過し、蒸発させた。ヘミエステル誘導体を９５％の収率で得て、さらなる精製を行わずに使用した。
【０１２５】
（ＬＮＡ支持体の作製）
上記で作製したヘミエステル誘導体（９０μｍｏｌ）を最小量のＤＭＦ中に溶解し、ＤＩＥＡおよびＰｙＢＯＰ（９０μｍｏｌ）を加え、１分間混合した。この前活性化された混合物を手動合成装置にてＬＣＡＡ−ＣＰＧ（５００Å、８０〜１２０メッシュサイズ、３００ｍｇ）と混合し、撹拌した。室温で１．５時間後、支持体を濾取し、ＤＭＦ、ＤＣＭおよびＭｅＯＨで洗浄した。乾燥後、形成量は５７μｍｏｌ／ｇと測定された（Ｔｏｍ  Ｂｒｏｗｎ，Ｄｏｒｃａｓ  Ｊ．Ｓ．Ｂｒｏｗｎ．Ｍｏｄｅｒｎ  ｍａｃｈｉｎｅ−ａｉｄｅｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ．Ｉｎ：Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ｅｄｉｔｏｒ．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ  Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．Ｏｘｆｏｒｄ：ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９９１：１３−１４を参照されたい）。
【０１２６】
（オリゴヌクレオチドの伸長）
ホスホルアミダイト（Ａ（ｂｚ）、Ｇ（ｉｂｕ）、５−メチル−Ｃ（ｂｚ））またはＴ−β−シアノエチル−ホスホルアミダイトの結合は、アセトニトリル中０．１Ｍの５’−Ｏ−ＤＭＴ保護アミダイトおよび活性剤としてのアセトニトリル中ＤＣＩ（４，５−ジシアノイミダゾール）（０．２５Ｍ）の溶液を用いて行う。チオール化は塩化キサンタン（アセトニトリル中０．０１Ｍ：ピリジン１０％）を用いて行う。試薬のその他はオリゴヌクレオチド合成に通常用いられるものである。供給業者が提供するプロトコルは都合よく至適化した。
【０１２７】
（ＲＰ−ＨＰＬＣによる精製：）
カラム：Ｘｔｅｒｒａ  ＲＰ１８
流量：３ｍＬ／分
緩衝剤：０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ８）およびアセトニトリル
（略語）
ＤＭＴ：ジメトキシトリチル
ＤＣＩ：４，５−ジシアノイミダゾール
ＤＭＡＰ：４−ジメチルアミノピリジン
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＩＥＡ：Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン
ＰｙＢＯＰ：ベンゾトリアゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロホスファート
Ｂｚ：ベンゾイル
Ｉｂｕ：イソブチリル。
【０１２８】
（実施例３：ＬＮＡオリゴヌクレオチドの設計）
【０１２９】
【表２】
2008518980.tif 000007
表２において、大文字（上付き文字なし）はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオチドアナログ（β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ）を示すが、大文字の後の上付き文字「α」（例えば、Ｇα）はＬＮＡヌクレオチドアナログがα−Ｌ−ＬＮＡヌクレオチドアナログ（α−Ｌ−オキシ−ＬＮＡ）であることを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロジエステル結合を示す下付き文字はない。ＬＮＡ−Ｃモノマーはすべて５−メチル−Ｃ（ＭｅＣ）である。公開された配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１６８）を用いて、ヒトＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＲＮＡの異なる領域を標的とするように化合物を設計した。
【０１３０】
（実施例４：Ｔｍの測定）
化合物の融解温度（Ｔｍ）の測定：１０ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１ｎＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）中３μＭの配列番号２の溶液を、１０ｍＭリン酸ナトリウム／１００ｍＭ  ＮａＣｌ／０．１ｎＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．０）中のその相補的ＤＮＡ／ＲＮＡ３μＭと９０℃で１分間混合し、室温まで冷却させた。次に、温度を１℃／分にて２５〜９５℃に上昇させて２本鎖のＴｍを求めた。配列番号２のＴｍを実施例２１における表７に示す。
【０１３１】
（実施例５：ヒトおよびマウス血漿中の配列番号２の安定性）
３７℃で異なる時間分割：０、１、２、４、２４、４８および９６時間における、ヒトおよびマウス血漿（ヘパリンＬｉ（Ｔａｃｏｎｉｃ、Ｍ＆Ｂ））中の２０μＭの配列番号２および配列番号２４の安定性。市販のラダーも含めた（ＰＡＧＥにおいて１０および２０ｍｅｒが視認できる）（図１を参照）。
【０１３２】
（実施例６：インビトロモデル：細胞培養）
標的核酸の発現に対するアンチセンス化合物の作用は、標的核酸が測定可能なレベルで存在すれば、種々の細胞種のうち任意の細胞種において試験することができる。標的は内因的に、あるいは前記核酸をコードしている核酸の一過性または安定的トランスフェクションにより発現され得る。
【０１３３】
標的核酸の発現レベルは、例えば、ノーザンブロット分析、定量ＰＣＲ、リボヌクレアーゼ保護アッセイを用いてルーチンに求めることができる。例示目的のために以下の細胞種を提供するが、選択した細胞種において標的が発現されるのであれば、他の細胞種をルーチンに用いることができる。
【０１３４】
細胞を下述の適切な培地にて培養し、３７℃で湿度９５〜９８％および５％ＣＯ２にて維持した。毎週２〜３回、細胞を継代培養した。
【０１３５】
１５ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株１５ＰＣ３をオランダ、ＡＭＣ、Ｎｅｕｒｏｚｉｎｔｕｉｇｅｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤｒ．Ｆ．Ｂａａｓから寄贈され、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ＋ゲンタマイシン中で培養した。
【０１３６】
ＰＣ３：ヒト前立腺癌細胞株ＰＣ３をＡＴＣＣから購入し、グルタミン（Ｇｉｂｃｏ社）を含むＦ１２  Ｃｏｏｎ’ｓ培地＋１０％ＦＢＳ＋ゲンタマイシン中で培養した。
【０１３７】
５１８Ａ２：ヒト黒色腫癌細胞株５１８Ａ２をウィーン大学臨床薬理学部分子薬理学実験腫瘍学部門（Ｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ）のＤｒ．Ｂ．Ｊａｎｓｅｎから寄贈され、ＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）＋１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）＋Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ＋ゲンタマイシン中で培養した。
【０１３８】
（実施例７：インビトロモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置）
細胞培養およびトランスフェクション：１５ＰＣ３細胞を１２ウェルプレートに播種し、１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉおよびゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ中にて３７℃（５％ＣＯ２）で２日間増殖した。細胞が６０〜７０％コンフルエントになったとき、リポフェクタミン２０００（１０μｇ／ｍｌ）を用いて、異なる濃度のオリゴヌクレオチド（０．２〜２５ｎＭ）を繰り返して細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションは基本的にＤｅａｎら（１９９４，ＪＢＣ  ２６９：１６４１６−１６４２４）が報告しているように実施した。要するに、ＯｐｔｉＭＥＭ中のリポフェクタミンとともに１０分間、細胞をインキュベーションし、その後、オリゴヌクレオチドを加えて１ウェルあたり総容積０．５ｍｌのトランスフェクションミックスとなるようにした。４時間後、トランスフェクションミックスを取り出し、細胞を洗浄し、適切な増殖培地にて３７℃で約２０時間（ｍＲＮＡ分析）または１２〜７２時間（タンパク質分析）、増殖した。次に、タンパク質およびＲＮＡ分析のために細胞を採取した。
【０１３９】
（実施例８：インビトロモデル：ＲＮＡの抽出およびｃＤＮＡ合成）
（総ＲＮＡの単離）
ＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて総ＲＮＡを単離した。細胞をＰＢＳで洗浄し、１％メルカプトエタノールを添加した細胞溶解緩衝液（ＲＴＬ、Ｑｉａｇｅｎ社）を直接ウェルに加えた。数分後、製造業者の使用説明書に従って試料を処理した。
【０１４０】
（第一鎖合成）
製造業者の使用説明書（Ｑｉａｇｅｎ社）に従ってＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キットを用いて、第一鎖合成を行った。各試料に対し、総ＲＮＡ０．５μｇを１２μｌに調整し、ポリ（ｄＴ）１２−１８０．２μｌ（０．５μｇ／μｌ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｄＮＴＰミックス２μｌ（各５ｍＭ）、１０×ＲＴ緩衝液２μｌ、ＲＮＡｇｕａｒｄＴＭＲＮアーゼ阻害剤０．５μｌ（３３単位／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）およびＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素１μｌと混合し、その後、３７℃で６０分間インキュベーションし、９３℃で５分間熱不活化した。
【０１４１】
（実施例９：インビトロモデル：リアルタイムＰＣＲによるＳｕｒｖｉｖｉｎ、Ｂｃｌ−２またはＳｕｒｖｉｖｉｎスプライス変異体の発現のオリゴヌクレオチド阻害の分析）
オリゴヌクレオチド処置および未処置細胞における相対的Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡレベルを求めるため、作製したｃＤＮＡを、ＢｉｏＲａｄ社製のｉＣｙｃｌｅｒを用いて定量ＰＣＲ分析に用いた。ｃＤＮＡを５倍に希釈し、８μｌを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ定量ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ＵＤＧ  ２×ＰＣＲマスターミックス３０μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２０×Ｔａｑｍａｎプローブおよびプライマーミックス３μｌ（順方向プライマー：５’ＡＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡ（配列番号２９）（最終的に０．９μＭ）、逆方向プライマー：５’ＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＡＧＴ（配列番号３０）（最終的に０．６μＭ）およびＴａｑｍａｎプローブ：ＦＡＭ−ＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ（配列番号３１）（最終的に０．１μＭ））並びにＨ２Ｏ  １９μｌを含有するＴａｑｍａｎプローブ用マスターミックス５２μｌと混合した。この６０μｌを２つのウェル（９６ウェルプレート）に分散し、各ウェルに２５μｌとなるようにした。ヒトＢｃｌ−２ではＰＣＲプライマーは：
順方向プライマー：５’ＣＡＴＧＴＧＴＧＴＧＧＡＧＡＧＣＧＴＣＡＡ  ３’（アッセイにおける最終濃度、０．６μＭ）（配列番号３２）、逆方向プライマー：５’ＧＣＣＧＧＴＴＣＡＧＧＴＡＣＴＣＡＧＴＣＡ  ３’（アッセイにおける最終濃度、０．６μＭ）（配列番号３３）であり、ＰＣＲプローブは、５’ＦＡＭ−ＣＣＴＧＧＴＧＧＡＣＡＡＣＡＴＣＧＣＣＣＴＧＴ−ＴＡＭＲＡ  ３’（アッセイにおける最終濃度、０．１μＭ）（配列番号３４）であった。Ｓｕｒｖｉｖｉｎスプライス変異体のＰＣＲでは、次のプライマーおよび濃度を用いた。スプライス変異体１（完全）の順方向プライマー５’−ＧＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴ−３’（配列番号３５）（アッセイにおける最終濃度、０．６μＭ）、逆方向プライマー５’−ＴＧＣＴＴＴＴＴＡＴＧＴＴＣＣＴＣＴＡＴＧＧＧ−３’（配列番号３６）（アッセイにおける最終濃度、０．６μＭ）。スプライス変異体２（２Ｂ）の順方向プライマー５’−ＧＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴ−３’（配列番号３５）（アッセイにおける最終濃度、０．３μＭ）、逆方向プライマー５’−ＡＡＧＴＧＣＴＧＧＴＡＴＴＡＣＡＧＧＣＧＴ−３’（配列番号３７）（アッセイにおける最終濃度、０．３μＭ）。スプライス変異体３（ΔＥｘ３）の順方向プライマー５’−ＧＧＣＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴ−３’（配列番号３５）（アッセイにおける最終濃度、０．３μＭ）、逆方向プライマー５’−ＡＴＴＧＴＴＧＧＴＴＴＣＣＴＴＴＧＣＡＴＧ−３’（配列番号３８）（アッセイにおける最終濃度、０．３μＭ）。
【０１４２】
Ｔａｑｍａｎプローブ５’−ＦＡＭ−ＣＡＣＴＧＣＣＣＣＡＣＴＧＡＧＡＡＣＧＡＧＣＣＡＧＡＣＴ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３９）（アッセイにおける最終濃度、０．１μＭ）。
【０１４３】
プライマーおよびプローブはＰｒｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ（フランス）から得た。試料調製における差異を基準化するため、製造業者の使用説明書に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製（４３１０８８４Ｅ）の予め展開させたＴａｑｍａｎアッセイ試薬を用いて内因性ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを定量化した。アッセイの標準曲線を作成するため、未処置１５ＰＣ３細胞（ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＧＡＰＤＨの両方を発現）から合成したｃＤＮＡの２倍希釈液を用いた。ＰＣＲプログラムは以下の通りであった：５０℃で２分、９５℃で１０分、次に、９５℃で１５秒、６０℃で１分を４０サイクル。ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱリアルタイム検出システムソフトウェアを用いて、計算した閾値サイクルからＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡの相対量を求めた。図６Ｂ、６Ｃ、９および２Ｃを参照されたい。
【０１４４】
（実施例１０：インビトロ分析：Ｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質レベルのウェスタンブロット分析）
（ウェスタンブロット法：）
トランスフェクションされた細胞におけるＳｕｒｖｉｖｉｎタンパク質レベルに対するＳｕｒｖｉｖｉｎオリゴのインビトロ作用をウェスタンブロット法により求めた。
【０１４５】
細胞を採取し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社）を添加した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２．５％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび６Ｍ尿素中で溶解した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて総タンパク質濃度を測定した。総タンパク質５０μｇをＭＯＰＳ緩衝液中１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で泳動させ、製造業者の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に従ってＰＶＤＦ膜にブロットした。ブロッキング緩衝液（５％低脂肪粉乳を添加したＰＢＳ−Ｔ）中での一晩のインキュベーション後、当該膜を１：５００希釈率のポリクローナル抗Ｓｕｒｖｉｖｉｎ抗体Ｎｏｖｕｓ  ５００−２０１で一晩インキュベーションし、次に、１：１０００希釈率の抗Ｂｃｌ（ＤＡＫＯ社）で１時間インキュベーションした。次に、当該膜を二次抗体（ＤＡＫＯ社製の１：１０００希釈率のＨＲＰ結合二次抗体またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＡＰ結合抗体）でインキュベーションし、発色免疫検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）または化学ルミネッセンスＥＣＬ＋検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて、ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＢｃｌ２を可視化した。図２Ａを参照されたい。
【０１４６】
（実施例１１：インビトロ分析：Ｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質レベルのＥＬＩＳＡ分析）
採取細胞を溶解し、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社のヒトＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＤｕｏＳｅｔ  ＩＣ  ＥＬＩＳＡ（カタログ番号ＤＹＣ６４７）を用いて、製造業者の推奨に従ってアッセイした。図２Ｂを参照されたい。
【０１４７】
（実施例１２：インビトロ分析：アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いたヒトＳｕｒｖｉｖｉｎ発現のアンチセンス阻害）
本発明に従って、公開された配列（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００１１６８）を用いて、ヒトＳｕｒｖｉｖｉｎ  ＲＮＡの異なる領域を標的とするように一連のオリゴヌクレオチドを設計した。表２―ＬＮＡオリゴヌクレオチドを参照されたい。
【０１４８】
１５ＰＣ３細胞におけるＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡをノックダウンする可能性についてＬＮＡオリゴヌクレオチドを評価した。データは疑似トランスフェクション細胞に対するダウンレギュレーションのパーセントとして提示する。転写定常状態をリアルタイムＰＣＲによりモニタリングし、ＧＡＰＤＨ転写定常状態に基準化した。表３を参照されたい。ＬＮＡ  Ｃはすべて５−メチル−シトシンであることに留意されたい。
【０１４９】
【表３】
2008518980.tif 000008
試験は少なくとも３回実施した。括弧内の数字は標準偏差である。
【０１５０】
（実施例１３：アンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチドによるアポトーシス誘導および増殖阻害）
細胞の培養：３７℃、湿度９５％および５％ＣＯ２にて１０％ウシ胎仔血清、Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉおよびゲンタマイシンを含有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）で１５ＰＣ３を培養した。３７℃、湿度９５％および５％ＣＯ２にて１０％ウシ胎仔血清、Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉおよびゲンタマイシンを含有するＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ社）で子宮頸癌細胞株ＨｅＬａを培養した。６０〜７０％コンフルエントに達したとき、リポフェクタミン２０００（５μｇ／ｍｌ）を用いて細胞にトランスフェクションした。
【０１５１】
（活性化型カスパーゼ３／７活性の測定）
トランスフェクションの前日、ＤＭＥＭ中、白色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  １３６１０１）に１ウェルあたり細胞１００００個の密度にまで１５ＰＣ３細胞を播種した。翌日、細胞を予め加温したＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次に、５μｇ／ｍｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＯｐｔｉＭＥＭ７２μｌを加えた。細胞を７分インキュベーションし、その後、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈したオリゴヌクレオチド１８μｌを加えた。オリゴヌクレオチドの最終濃度は０．２ｎＭ〜１００ｎＭの範囲であった。４時間の処置後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、血清を含有するＤＭＥＭ１００μｌを加えた。オリゴヌクレオチド処置後、示した時間の間、細胞を回復させ、その後、ＣＯ２インキュベータから取り出し、１５分室温まで平衡化した。高感度カスパーゼ３／７−ＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１００μｌを直接細胞に加え、プレートを２０分インキュベーションした。Ｌｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ測定器（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社）でルミネッセンス（ルシフェラーゼ活性）を記録した。ルシフェラーゼ活性は１秒あたりの相対的光単位（ＲＬＵ／ｓ）として測定される。Ａｓｃｅｎｔソフトウェア２．４．２を用いてデータを解析した。ＭＳ  Ｅｘｃｅｌを用いて模擬物に対する誘導倍率のグラフを作成した。
【０１５２】
トランスフェクション細胞をカスパーゼ３／７阻害剤とインキュベーションすることにより、アポトーシス反応のカスパーゼ３／７特異性を実証した。スタウロスポリン、カンプトテシンまたはタキソール誘導細胞が陽性対照として機能した（図３、６Ａおよび表４に加えて実施例２１を参照されたい）。
【０１５３】
【表４】
2008518980.tif 000009
（アネキシンＶ−ＦＩＴＣフローサイトメトリー分析）
トランスフェクションの１日前にＴ２５フラスコに０．４×１０６個のＨｅＬａ細胞を播種した。トランスフェクションの当日、細胞を３７℃  ＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次に、５μｇ／ｍｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎ  ｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＯｐｔｉＭＥＭ２．８ｍｌを加えた。細胞を７分インキュベーションし、その後、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈したオリゴヌクレオチド７００μｌを加え、最終濃度を５ｎＭまたは２５ｎＭとした。疑似トランスフェクション細胞は対照として機能した。４時間の処置後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、培地３ｍｌを加えた。オリゴヌクレオチド処置後、細胞を４８時間回復させ、その後、剥離により採取し、ＰＢＳにて２回洗浄した。０．２×１０６個の細胞をアネキシンＶ−ＦＩＴＣ  ５μｌおよびヨウ化プロピジウム１０μｌ（ＰＩ−１０ｍｇ／ｍｌ）とインキュベーションし、暗室にて室温で１５分インキュベーションした。アネキシンＶ−ＦＩＴＣ添加前の精製組換えアネキシンＶとのトランスフェクション細胞のインキュベーションを用いて、染色の特異性および選択性を実証した。さらに、ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌ）誘導ＨｅＬａ細胞（０．５μｇ／ｍｌ）を陽性対照として用いた（図４を参照）。
【０１５４】
（ＭＴＳアッセイを用いた増殖性生細胞の測定）
トランスフェクションの前日、ＤＭＥＭ中、透明９６ウェルプレート（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ  ｎｏ．１４７２０３０１００）に１ウェルあたり細胞１００００個の密度にまで細胞を播種した。翌日、細胞を予め加温したＯｐｔｉＭＥＭで１回洗浄し、次に、５μｇ／ｍｌのリポフェクタミン２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含有するＯｐｔｉＭＥＭ７２μｌを加えた。細胞を７分インキュベーションし、その後、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈したオリゴヌクレオチド１８μｌを加えた。オリゴヌクレオチドの最終濃度は５ｎＭ〜１００ｎＭの範囲であった。４時間の処置後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、ＤＭＥＭを含有する血清１００μｌを加えた。オリゴヌクレオチド処置後、示した時間の間、細胞を回復させ、テトラゾリウム化合物［３−（４，５−ジメチル−２−イル）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム、内塩；ＭＴＳ］および電子カップリング試薬（フェナジンエトサルフェート、ＰＥＳ；ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ  ９６（登録商標）ＡＱｕｅｏｕｓ  Ｏｎｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ細胞増殖アッセイ、Ｐｒｏｍｅｇａ社）２０μｌを加えることにより生細胞を測定した。Ｐｏｗｅｒｗａｖｅ（Ｂｉｏｔｅｋ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ社）で４９０ｎｍおよび６５０ｎｍにて生細胞を測定した。
【０１５５】
１００％に設定した模擬物に対するオリゴヌクレオチド濃度に対して増殖阻害率ΔＯＤ（４９０〜６５０ｎｍ）／時をプロットした。ＭＴＳアッセイにおいて認められた増殖の最大阻害は７０％（最小３０％）であった（表５および図５）。
【０１５６】
【表５】
2008518980.tif 000010
（実施例１４：タキソールを併用した配列番号２によるアポトーシス誘導）
細胞培養：ヒト前立腺癌１５ＰＣ３細胞（オランダ、ＡＭＣ、Ｎｅｕｒｏｚｉｎｔｕｉｇｅｎ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＤｒ．Ｆ  Ｂａａｓから寄贈）をＴ７５フラスコ中８×１０Ｅ５細胞の密度まで播種し、１０％ＦＢＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘおよびゲンタマイシンを添加したＤＭＥＭ中で３７℃および５％ＣＯ２にて２日間増殖した。播種２日後、リポフェクタミンを用いて最終濃度７．５μｇ／ｍｌにて２〜１０ｎＭの配列番号２を細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションはＤｅａｎら（１９９４，ＪＢＣ  ２６９  ｐ．１６４１６  １６４２４）が報告しているように実施した。要するに、ＯｐｔｉＭＥＭで希釈したリポフェクタミンと７〜１０分間、細胞をインキュベーションし、その後、Ｔ７５フラスコ１本あたり８．７ｍｌの総容積になるまでオリゴヌクレオチドを加えた。トランスフェクションの４時間後、細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、２〜１００ｎＭタキソール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）の添加の有無を問わず、完全増殖培地において３７℃で１２〜９６時間増殖した。ｍＲＮＡ抽出、カスパーゼ３／７アッセイあるいは固定してＰＩで染色するために細胞を採取し、ＦＡＣＳ分析により分析した。
【０１５７】
カスパーゼ３／７アッセイ：２５００〜１００００個の範囲の等量の１５ＰＣ３細胞を示した時間にて遠心分離により採取し、ＤＭＥＭ中、白色９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ  １３６１０１）にて平板培養した。高感度カスパーゼ３／７−ＧｌｏＴＭ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社）１００μｌを９６ウェル中の細胞に直接加え、プレートを１時間インキュベーションし、その後さらに１分の遅延時間後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ社製のＬｕｍｉｎｏｓｋａｎ  Ａｓｃｅｎｔ測定器でルミネッセンス（ルシフェラーゼ活性）を記録した。ルシフェラーゼ活性は１秒あたりの相対的光単位（ＲＬＵ／ｓ）として測定される。Ａｓｃｅｎｔソフトウェア２．４．２でデータを処理し、模擬物に対する誘導倍率のグラフをｅｘｃｅｌで作成した。活性型カスパーゼ３／７活性を阻害するカスパーゼ３／７阻害剤とインキュベーションしたトランスフェクション細胞を用いて、アポトーシス反応の特異性を実証した。さらに、スタウロスポリン、カンプトテシンまたはタキソール誘導細胞が陽性対照として機能した。図６を参照されたい。
【０１５８】
（実施例１５：タキソールを併用した配列番号２による細胞周期の分析）
細胞培養およびトランスフェクション：実施例１３の通りである。
【０１５９】
固定およびＰＩ染色：細胞をＰＢＳで洗浄し、採取し、氷冷ＰＢＳ  １００μｌ中に再懸濁した。９００μｌの氷冷７０％を加え、使用時まで固定細胞を−２０に維持した。
【０１６０】
固定細胞を採取し、ＰＢＳ  ７００μｌ中に再懸濁した（室温）。ホスファート−クエン酸緩衝液（０．１９Ｍ  Ｎａ２ＰＯ４、４ｍＭクエン酸  ｐＨ７．８）３００μｌを加え、細胞を室温で５分インキュベーションした。再度、細胞を採取し、ＰＩ染色液（ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中１ｍｇ／ｍｌのＲＮアーゼＡ、３３ｍｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム、０．２％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）中で３０分インキュベーションした。
【０１６１】
Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒを用いてＦＡＣＳ分析を行った。
【０１６２】
配列番号２をトランスフェクションされた１５ＰＣ３細胞を様々な濃度のタキソールに曝露させ、ヨウ化プロピジウム染色および引き続いてのＦＡＣＳ分析により分析した（図７Ａ〜Ｃ）。このアッセイは、Ｇ２またはさらにはＧ４相に捕捉された細胞の増量により、配列番号２とタキソールの相加効果も示す。図７Ａおよび７Ｂに加えて実施例２１を参照されたい。
【０１６３】
（実施例１６：インビボモデル：アンチセンスオリゴヌクレオチドによる処置による、インビボで増殖したヒト腫瘍細胞の腫瘍増殖阻害）
モデル：０日目にＰＣ−３ヒト前立腺癌細胞（ＥＣＡＣＣ）をマトリゲルと混合し、Ｂａｌｂ／ｃＡ−ｎｕ雌マウスの両側腹部に皮下注射した。
【０１６４】
投薬：スケジュールに従った配列番号２の食塩水、２ｍｇ／ｍｌの希釈標準溶液、投与量１０ｍｌ／ｋｇのタキソールを臨床製剤に用いた。０日目に平均的な動物群の体重に従って動物に投与した。
【０１６５】
投与：すべてスケジュールに従った腹腔内（図８を参照）または腫瘍内（図９を参照）オリゴヌクレオチド、静脈内タキソール。
【０１６６】
所見：死亡率（毎日）、体重（１週間に２回）
腫瘍体積：試験の間、腫瘍体積を１週間に２回測定し、式（Ｌ×Ｄ２×０．５）に従って計算する。ここで、Ｌは最大径、ＤはＬ（ｍｍ）に垂直な腫瘍径を表す。
【０１６７】
抗腫瘍活性：処置腫瘍の平均腫瘍重量を対照群と比較する。
【０１６８】
試験の終了：頸部脱臼により動物を殺処分する。腫瘍、肝臓および脾臓を計量する。
【０１６９】
（腫瘍の分析）
総ＲＮＡの単離：１％メルカプトエタノールを添加したＲＴＬ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ社）４００μｌで約２０ｍｇの腫瘍組織を均質化した。製造業者の使用説明書に従ってＲＮｅａｓｙミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて総ＲＮＡを単離した。
【０１７０】
ｃＤＮＡの合成：製造業者の使用説明書（Ｑｉａｇｅｎ社）に従ってＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素キットを用いて、第一鎖合成を行った。各試料に対し、総ＲＮＡ０．５μｇを１２μｌに調整し、ポリ（ｄＴ）１２−１８０．２μｌ（０．５μｇ／μｌ）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）、ｄＮＴＰミックス２μｌ（各５ｍＭ）、１０×ＲＴ緩衝液２μｌ、ＲＮＡｇｕａｒｄＴＭＲＮアーゼ阻害剤０．５μｌ（３３単位／ｍｌ、Ａｍｅｒｓｈａｍ社）およびＯｍｎｉＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素１μｌと混合し、次に、３７℃で６０分間インキュベーションし、９３℃で５分間熱不活化した。
【０１７１】
２週間にわたり６回（５０μｌ容量）、腫瘍内に２５ｍｇ／ｋｇの配列番号２または食塩水を投与した。最終投与の２４時間後、サンプリングを行った。発現レベルはｍＲＮＡレベルにおいて９個の腫瘍（配列番号２）対８個の腫瘍（食塩水）に確定された。ウェスタンブロット法により個々の腫瘍におけるタンパク質レベルを分析した（図９を参照）。
【０１７２】
リアルタイムＰＣＲ分析：処置および未処置腫瘍の相対的Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡレベルを求めるため、作製したｃＤＮＡを、ＢｉｏＲａｄ社製のｉＣｙｃｌｅｒを用いて定量ＰＣＲ分析に用いた。ｃＤＮＡを５倍に希釈し、８μｌを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ定量ＰＣＲ  ＳｕｐｅｒＭｉｘ  ＵＤＧ  ２×ＰＣＲマスターミックス３０μｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）、２０×Ｔａｑｍａｎプローブおよびプライマーミックス３μｌ（順方向プライマー：５’−ＡＡＧＧＡＣＣＡＣＣＧＣＡＴＣＴＣＴＡＣＡ−３’（配列番号２９）（最終的に０．９μＭ）、逆方向プライマー：５’−ＣＣＡＡＧＴＣＴＧＧＣＴＣＧＴＴＣＴＣＡＧＴ−３’（配列番号３０）（最終的に０．６μＭ）およびＴａｑｍａｎプローブ：ＦＡＭ−５’−ＣＧＡＧＧＣＴＧＧＣＴＴＣＡＴＣＣＡＣＴＧＣＣ−ＴＡＭＲＡ−３’（配列番号３１）（最終的に０．１μＭ））並びにＨ２Ｏ  １９μｌを含有するＴａｑｍａｎプローブ用マスターミックス５２μｌと混合した。この６０μｌを２つのウェル（９６ウェルプレート）に分散し、各ウェルに２５μｌとなるようにした。プライマーおよびプローブはＰｒｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ、フランス、から得た。試料調製における差異を基準化するため、製造業者の使用説明書に従って、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社製（４３１０８８４Ｅ）の予め展開させたＴａｑｍａｎアッセイ試薬を用いて内因性ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを定量化した。アッセイの標準曲線を作成するため、未処置１５ＰＣ３（ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＧＡＰＤＨの両方を発現）から合成したｃＤＮＡの２倍希釈液を用いた。ＰＣＲプログラムは以下の通りであった：５０℃で２分、９５℃で１０分、次に、９５℃で１５秒、６０℃で１分を４０サイクル。ｉＣｙｃｌｅｒ  ｉＱリアルタイム検出システムソフトウェアを用いて、計算した閾値サイクルからＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡの相対量を求めた。図９を参照されたい。
【０１７３】
総タンパク質の単離およびウェスタンブロット法：プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社）を添加した５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１０％グリセロール、２．５％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＤＴＴおよび６Ｍ尿素中、Ｒｅｔｓｃｈホモジナイザーを用いて約５０ｍｇの腫瘍組織を均質化した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ社）を用いて総タンパク質濃度を測定した。総タンパク質５０μｇをＭＯＰＳ緩衝液中１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル上で泳動させ、製造業者の使用説明書（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に従ってＰＶＤＦ膜にブロットした。ブロッキング緩衝液（５％低脂肪粉乳を添加したＰＢＳ−Ｔ）中での一晩のインキュベーション後、当該膜を１：５００希釈率のポリクローナル抗Ｓｕｒｖｉｖｉｎ抗体Ｎｏｖｕｓ  ５００−２０１で一晩インキュベーションし、次に、１：１０００希釈率の抗Ｂｃｌ（ＤＡＫＯ社）で１時間インキュベーションした。次に、当該膜を二次抗体（ＤＡＫＯ社製の１：１０００希釈率のＨＲＰ結合二次抗体またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製のＡＰ結合抗体）でインキュベーションし、発色免疫検出キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）または化学ルミネッセンスＥＣＬ＋検出キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ社）を用いて、ＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＢｃｌ２を可視化した。図９を参照されたい。
【０１７４】
（実施例１７：Ｓｕｒｖｉｖｉｎアンチセンスオリゴヌクレオチドと放射線のインビトロでの併用）
アポトーシス阻害タンパク質（ＩＡＰ）Ｓｕｒｖｉｖｉｎの過剰発現と放射線抵抗性との間の相関を示す、科学文献におけるエビデンスが増加している。さらに、Ｓｕｒｖｉｖｉｎのダウンレギュレーションはインビトロで癌細胞株に放射線増感を引き起こすことが示されている。
【０１７５】
Ｓｕｒｖｉｖｉｎを標的とするリボザイムを発現する構築体を安定的にトランスフェクションされた黒色腫細胞株ＪＲ８およびＭ１４のトランスフェクションは、Ｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質の５０〜６０％ダウンレギュレーション、カスパーゼ３活性およびヨウ化プロピジウム染色によって測定されるアポトーシスの増加並びにクローン原性アッセイによって生存能の変化として評価されるガンマ線照射への感受性増加（Ｐｅｎｎａｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１２０，６４８−５４）を生じた。
【０１７６】
結腸直腸癌細胞株において、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ発現レベルと放射線増感との間の明らかな相関が示されている（Ｒｏｅｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｉｎｔ．Ｊ．Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｂｉｏｌ．Ｐｈｙｓ．５５，１３４１−４７）。放射線増感が最も低いＳＷ４８０細胞がＳｕｒｖｉｖｉｎの最大の自然発現を示した。実際、ＳＷ４８０細胞において、Ｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質は放射線照射の４８時間後、実にアップレギュレートされていた。逆に、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ発現は未処置群において低く、放射線増感が最も高い細胞株ＳＷ４８において照射後に増加しなかった。
【０１７７】
組換えＳｕｒｖｉｖｉｎを過剰発現する膵臓ＭＩＡＰａＣａ−２癌細胞は、非形質転換細胞より放射線増感が低い。一方、放射線抵抗性膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ−１はドミナントネガティブＳｕｒｖｉｖｉｎ変異体で形質転換されると、放射線増感およびカスパーゼ３活性を増大させる（Ａｓａｎｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，２００２；Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．９３，１０５７−６２）。
【０１７８】
Ｓｕｒｖｉｖｉｎアンチセンスオリゴヌクレオチドによる肺癌細胞株Ｈ４６０の処置は、インビトロで照射Ｈ４６０細胞の細胞生存能を低下させた（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ６４，２８４０−４５）。インビボにおいて、Ｓｕｒｖｉｖｉｎアンチセンスオリゴヌクレオチドと放射線照射を組み合わせて処置されたヌードマウスにおけるＨ４６０異種移植片での腫瘍増殖の遅延は、オリゴヌクレオチドまたは放射線照射単独によって処置されたマウスより大きかった（Ｃａｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００４；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２３，７０４７−５２）。
【０１７９】
これらのデータはＳｕｒｖｉｖｉｎが放射線抵抗性に重要な役割を果たすことを明示し、Ｓｕｒｖｉｖｉｎのダウンレギュレーションは癌の放射線治療の分野において治療的有益性をもたらし得る。放射線療法に対する癌細胞の増感は照射線量を減少させ、故に重度の副作用を低減し、さらには有効性を高め得る。
【０１８０】
配列番号２と放射線照射の併用は、Ｕ８７およびＵ３７３細胞（神経膠芽腫）、Ｈ４６０（ＮＳＣＬＣ）並びにＬＳ  １７４  Ｔ（結腸癌）細胞を含む種々の細胞株にオリゴヌクレオチドをトランスフェクションし、続いてこれらを放射線照射で処置することにより実施される。その効果は、放射線単独の効果を示す、同じ処置レジメンを受ける疑似トランスフェクション細胞に関係する。照射後、ＭＴＴおよびクローン原性アッセイを用いて生存能について細胞を分析する。アポトーシスはカスパーゼ３活性測定、ＴＵＮＥＬアッセイおよびＨｏｅｃｈｓｔ染色により評価する。
【０１８１】
（実施例１８：ヌードマウスにおける皮下Ｕ８７神経膠芽腫異種移植片でのＳｕｒｖｉｖｉｎアンチセンスオリゴヌクレオチド配列番号２と分割放射線療法のインビボでの併用）
インビトロで増殖させた２×１０６個のＵ８７細胞を６〜７週齢の雄ＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスの右側腹部に注入した。腫瘍が平均サイズ２００ｍｍ３に達したとき、配列番号２、負の対照のオリゴヌクレオチド配列番号２４または０．９％Ｎａｃｌ（食塩水）で腹腔内投与にて動物を処置した。オリゴヌクレオチドは２０ｍｇ／ｋｇ／処置日にて生理食塩水として注射した。
【０１８２】
各々マウス８匹を含む次の群を試験に含めた：
１．０．９％ＮａＣｌ  腹腔内
２．配列番号２  腹腔内
３．配列番号２４  腹腔内
４．配列番号２  腹腔内＋放射線療法
５．配列番号２４  腹腔内＋放射線療法
６．０．９％ＮａＣｌ  腹腔内＋放射線療法。
【０１８３】
下記の処置スキームに従って４日での４分割で、２つの対向側面照射野として前後に単回線量３Ｇｙとして放射線療法を行った。放射線療法の間、ｋｅｔａｌａｒおよびｒｏｍｐｕｎで動物を麻酔した。放射線療法を受けない動物を同様に麻酔した。
【０１８４】
【表６】
2008518980.tif 000011
ノギスを用いて２つの垂直測定値（ｄ１およびｄ２）により腫瘍増殖を測定した。次の式に従って腫瘍体積［Ｖ（ｔ）］を計算した。
Ｖ（ｔ）＝０．３５（ｄ１（ｔ）×ｄ２（ｔ））３／２
腫瘍増殖は腫瘍が１０００ｍｍ３サイズに達するまで測定した。
【０１８５】
全動物の体重は処置開始時に測定し、以後、１週間に１回測定した。
【０１８６】
（実施例１９：齧歯動物およびカニクイザルにおける配列番号２に関する前臨床ＧＬＰ毒性試験）
配列番号２では前臨床毒性試験において特に以下が見出された。
【０１８７】
マウスでの静注急性毒性試験において最大非致死量は１０００ｍｇ／ｋｇであることが見出された。
【０１８８】
ラットでの静注急性毒性試験において最小致死量は１０００ｍｇ／ｋｇであることが見出された。
【０１８９】
カニクイザルでの静注ＭＴＤ試験において、顕著な臨床徴候は認められなかったが、肝臓および腎臓毒性のエビデンスはすべての動物において明らかであった。２週間にわたり最大用量が１６０ｍｇ／ｋｇ×３（総用量９３０ｍｇ／ｋｇ）または１２０ｍｇ／ｋｇ×５となる用量漸増デザインで動物を処置した。
【０１９０】
カニクイザルでの静注４週反復投与毒性試験において、４週間で週２回、０、６、１５および６０ｍｇ／ｋｇ／回の用量で配列番号２を投与した。０、１５または６０ｍｇ／ｋｇ／回を投与される動物群において、処置を行わずに４週の回復期間の間、一部の動物を追跡調査した。
【０１９１】
肝臓および腎臓試料を含む組織を急速凍結し、引き続いての分析のために−７０℃で保存した。
【０１９２】
（実施例２０：カニクイザル組織におけるオリゴヌクレオチド含量）
試料調製：肝臓および腎臓組織からの抽出
化学物質／試薬：
プロテイナーゼＫ（２５．１ｍｇ／ｍｌ）：Ｓｉｇｍａ  Ｐ４８５０。
【０１９３】
１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ：８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡで飽和したフェノール−クロロホルム−イソアミル−アルコール（２５：２４：１（ｖ／ｖ／ｖ）：Ｓｉｇｍａ  Ｐ２０６９。
【０１９４】
Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０：Ｓｉｇｍａ、Ｉ８８９６。
【０１９５】
抽出緩衝液：０．５％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０（１Ｎ  ＮａＯＨで調製）
抽出緩衝液中１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ：各抽出前に精製。
【０１９６】
組織（約１００ｍｇ）を秤量する（秤量前後、組織はドライアイス上に維持する）。プロテイナーゼＫ（１ｍｇ／ｍｌ）を含有する抽出緩衝液５００μｌを加える。組織を機械的に均質化し、３７℃で一晩ホモジネートをインキュベーションする。
【０１９７】
配列番号２を適切な濃度範囲にて抽出緩衝液に溶解することにより、基準試料を調製する。未処置動物由来の肝臓組織１００ｍｇを正確に秤量する（秤量前後、ドライアイス上に維持）。基準物質を含有する抽出緩衝液（プロテイナーゼＫ、１ｍｇ／ｍｌを含有）を組織試料に加え、総容量０．５ｍｌとする。組織を機械的に均質化し、３７℃で一晩インキュベーションする。これらの試料からの配列番号２の検出シグナルを用いて、処置動物に見出される最小および最大濃度に及ぶ標準曲線を作成する。
【０１９８】
組織試料をネジキャップが付いた２ｍｌのマイクロチューブに移す。５分強く振盪した後、フェノール−クロロホルム−イソアミル−アルコール（２５：２４：１（ｖ／ｖ／ｖ）１ｍｌを加える。４０００ＲＰＭにて１５分の遠心分離により相分離がなされる。水相（上部相）を新たなチューブ（エバポレータと適合する）に移し、有機相（第一の抽出由来の残渣）にＭｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ２Ｏ  ５００μｌを加える。４０００ＲＰＭにて１５分の遠心分離後、再度５分チューブを強く撹拌する（１１５号室におけるＳＡＮ０３９）。水相（第一の抽出および洗浄からの水相）を貯留し、蒸発させて乾燥する（窒素下８０℃）。４０００ＲＰＭにて１５分の遠心分離後、残渣を２００μｌ  Ｍｉｌｌｉ−Ｑ水で再構成する。分析のために試料をＨＰＬＣバイアルに移す。
【０１９９】
肝臓および腎臓組織におけるオリゴヌクレオチドのＨＰＬＣ分析：抽出に続いてイオン交換ＨＰＬＣにより配列番号２を分析する。
【０２００】
カラム：Ｄｉｏｎｅｘ、ＤＮＡ  ｐａｃ  ＰＡ１００：２×５０ｍｍ（ガード）、２×２５０ｍｍ（分析）
カラム温度：４２℃
注入容量：５０μｌ
洗浄溶剤：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ２Ｏ
浄化溶剤：Ｍｉｌｌｉ−Ｑ−Ｈ２Ｏ
検出：紫外線、２６０ｎｍ
溶剤：
緩衝液Ａ：１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−Ｃｌ、１０ｍＭ  ＮａＣｌＯ４、ｐＨ：７．６（１Ｎ  ＮａＯＨ）
緩衝液Ｂ：１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−Ｃｌ、１Ｍ  ＮａＣｌＯ４、ｐＨ：７．６（１Ｎ  ＮａＯＨ）
図１０Ａおよび１０Ｂを参照されたい。
【０２０１】
（実施例２１：結果の概要）
【０２０２】
【表７】
2008518980.tif 000012
配列番号２はＢｃｌ−２のダウンレギュレーションをもたらすが、これは負の対照では見出されない。
【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、対照配列番号２５と比較したヒトおよびマウス血漿中の配列番号２の安定性を示す写真図である。３７℃で０、１、２、４、２４、４８または９６時間、濃度２０μＭにてオリゴヌクレオチドをインキュベーションした。いずれの血清中でも９６時間の消化後であっても配列番号２の分解産物は検出され得ない。
【図２Ａ】図２Ａは、配列番号２をトランスフェクションされた１５ＰＣ３前立腺癌細胞におけるＳｕｒｖｉｖｉｎタンパク質のダウンレギュレーションを示す写真図である。１５ＰＣ３細胞に１、１０および２５ｎＭの配列番号２をトランスフェクションし、ウェスタンブロット法によりＳｕｒｖｉｖｉｎタンパク質のダウンレギュレーションを１２、２４および４８時間の時点で解析した。配列番号２または疑似トランスフェクション細胞を採取し、Ｓｕｒｖｉｖｉｎタンパク質の発現を比較した。Ｂｃｌ−２タンパク質を同時モニタリングした。
【図２Ｂ】図２Ｂは、２４時間処理された負の対照配列番号２４および模擬物と比較した、配列番号２による１５ＰＣ３の処理後にＥＬＩＳＡ法を用いたＳｕｒｖｉｖｉｎタンパク質の定量化を示すグラフ図である。０．０４〜５ｎＭの範囲の４種類の濃度にて配列番号２を、あるいは５ｎＭにて負の対照配列番号２４を１５ＰＣ３細胞にトランスフェクションした。
【図２Ｃ】図２Ｃは、５ｎＭの配列番号２４または模擬物と比較した、５ｎＭの配列番号２による処置後の１５ＰＣ３細胞におけるＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡの３種類の異なるアイソフォーム（Ｓｕｒｖｉｖｉｎ全長、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ２ＢおよびＳｕｒｖｉｖｉｎΔｅｘ３）の発現を示すグラフ図である。発現はＧＡＰＤＨの発現に基準化され、疑似処置細胞における発現の平均に関連づけられる。配列番号２はヒトＳｕｒｖｉｖｉｎの発現したすべてのアイソフォームをダウンレギュレートできるが、負の対照配列番号２４はダウンレギュレートできないことは明らかである。
【図３】図３は、１５ＰＣ３細胞における配列番号２による１３〜７２時間の処置後にカスパーゼ３／７活性により誘導され測定されたアポトーシスを示すグラフ図である。配列番号２または負の対照配列番号２４を０．２〜１００ｎＭの範囲の５種類の濃度にて１５ＰＣ３細胞にトランスフェクションした。独立した３回の試験の平均値としての模擬物に対する誘導倍率を示す。各棒グラフ上に標準偏差を示す。
【図４】図４は、５ｎＭまたは２５ｎＭの配列番号２によるＨｅＬａ細胞の処置は、フローサイトメトリーにより分析されるアネキシンＶ−ＦＩＴＣ／ＰＩ染色によって測定される初期および後期アポトーシスの用量依存的誘導をもたらすことを示すグラフ図である。同濃度にて負の対照オリゴヌクレオチド配列番号２４はアポトーシスを誘導しない。
【図５】図５は、トランスフェクション後の配列番号２による１３〜７２時間の処置後の１５ＰＣ３前立腺癌細胞の増殖を示すグラフ図である。配列番号２または負の対照オリゴヌクレオチド配列番号２４を０．２、１、５、２５および１００ｎＭにて１５ＰＣ３細胞にトランスフェクションした。未処置疑似細胞と比較した生存細胞の相対数を示すグラフ図である。データは独立した３回の試験から得た。各棒グラフ上に標準偏差を示す。配列番号２は用量依存的増殖阻害をもたらすが、負の対照配列番号２４は用量依存的増殖阻害をもたらさない。
【図６Ａ】図６Ａは、１５ＰＣ３前立腺癌細胞における配列番号２２、配列番号２またはタキソールによる２４〜７２時間の処置後にカスパーゼ３／７活性により誘導され測定されたアポトーシスを示すグラフ図である。１０ｎＭでの配列番号２２または配列番号２によりタキソール（１０ｎＭまたは１００ｎＭ）を併用して細胞を処置し、０．１％ＤＭＳＯをビヒクルとして用いた。平均値としての模擬物に対する誘導倍率を示す。配列番号２とタキソールの併用は４８時間および７２時間後のアポトーシスの誘導に対する明らかな相乗作用を示す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、２ｎＭの配列番号２または１０ｎＭタキソールを併用した２ｎＭの配列番号２による処置の２４時間および４８時間後の１５ＰＣ３細胞におけるＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡ発現を示すグラフ図である。発現はｑＰＣＲにより分析され、ＧＡＰＤＨの発現に基準化され、疑似（０．１％ＤＭＳＯ）処置細胞における発現レベルに関連づけられる。Ｓｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡは両処置スケジュールおよび両時点においてダウンレギュレートされることが見出される。
【図６Ｃ】図６Ｃは、１０ｎＭの配列番号２６（Ｂｃｌ−２特異的）、１０ｎＭの配列番号２、１０ｎＭの対照配列番号２４、１０ｎＭの配列番号２７（配列番号２６に対する負の対照）または１０ｎＭの各オリゴヌクレオチドの併用による処置の２４時間後の１５ＰＣ３細胞におけるＳｕｒｖｉｖｉｎ  ｍＲＮＡおよびＢｃｌ−２  ｍＲＮＡの発現を示すグラフ図である。すべての発現はｑＰＣＲにより分析され、ＧＡＰＤＨ発現に基準化され、疑似処置細胞における発現レベルに関連づけられる。配列番号２６はＢｃｌ−２特異的であり、単剤としても対照化合物（配列番号２４または配列番号２７）を併用してもＳｕｒｖｉｖｉｎに対する作用を全く有さない。配列番号２は強力なアポトーシス誘導物質であり、単剤として、あるいは対照化合物（配列番号２４または配列番号２７）との併用でＳｕｒｖｉｖｉｎおよびＢｃｌ−２の発現に対する作用を有する。
【図７Ａ】図７Ａは、配列番号２およびタキソールで処置された１５ＰＣ３細胞における細胞周期分析を示すグラフ図である。１５ＰＣ３細胞に２ｎＭの配列番号２をトランスフェクションし、１５ＰＣ３細胞を１０ｎＭタキソール（０．１％ＤＭＳＯ中）またはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ中）に曝露した。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、２４時間および４８時間後（図７Ａ）にＦＡＣＳにより分析し、１０ｎＭの負の対照配列番号２４で同様に処置された１５ＰＣ３細胞と比較した。このアッセイは配列番号２単独およびタキソールとの併用の特異的効果を示す。細胞周期が停止したときに細胞画分はＧ２またはＧ４相でも増加している。配列番号２で処置された細胞は細胞周期が停止し、Ｇ１：Ｇ２比が疑似処置における１：０．２５に対して１：１となるが、負の対照配列番号２４は細胞周期に対して何らの作用も有さない。タキソールと配列番号２の併用ではＧ１：Ｇ２比が１：３と認められるように、さらなる停止をもたらす。
【図７Ｂ】図７Ｂは、配列番号２およびタキソールで処置された１５ＰＣ３細胞における細胞周期分析を示すグラフ図である。１５ＰＣ３細胞に２ｎＭの配列番号２をトランスフェクションし、１５ＰＣ３細胞を１０ｎＭタキソール（０．１％ＤＭＳＯ中）またはビヒクル（０．１％ＤＭＳＯ中）に曝露した。細胞をヨウ化プロピジウムで染色し、２４時間後（図７Ｂ）にＦＡＣＳにより分析し、１０ｎＭの負の対照配列番号２４で同様に処置された１５ＰＣ３細胞と比較した。このアッセイは配列番号２単独およびタキソールとの併用の特異的効果を示す。細胞周期が停止したときに細胞画分はＧ２またはＧ４相でも増加している。配列番号２で処置された細胞は細胞周期が停止し、Ｇ１：Ｇ２比が疑似処置における１：０．２５に対して１：１となるが、負の対照配列番号２４は細胞周期に対して何らの作用も有さない。タキソールと配列番号２の併用ではＧ１：Ｇ２比が１：３と認められるように、さらなる停止をもたらす。
【図８】図８は、配列番号２およびタキソールを併用した配列番号２のインビボ特性を示すグラフ図である。図の下部パネルに概述するように２種類の異なる投与スケジュール（ＡおよびＢ）にて化合物を投与した。タキソールを併用した配列番号２を投与される群と単剤処置群または食塩（疑似）群を２７日後に比較することにより、両方のスケジュールを用いて腫瘍重量の減少が認められる。
【図９】図９は、腫瘍の分析を示すグラフ図である。配列番号２の腫瘍内注入後、ｍＲＮＡおよびＳｕｒｖｉｖｉｎタンパク質のレベル低下を示す。２週間にわたり食塩または２５ｍｇ／ｋｇの配列番号２を腫瘍内に６回（５０μｌ容量）投与した。最終投与の２４時間後にサンプリングを行った。
【図１０Ａ】図１０Ａは、配列番号２のＰＢＳ緩衝製剤を用いた実施例１９による全身的処置後における霊長類のカニクイザルの肝臓中の配列番号２の含量を示すグラフ図である。回復した動物（Ｒ）は４週間未処置とし、この期間後に配列番号２が組織中に検出可能であったことを示す。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、図１０Ａと同様であるが肝臓ではなく腎臓中の配列番号２の含量を示すグラフ図である。
【図１】
2008518980.tif 000013
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2008518980.tif 000024
【図８】
2008518980.tif 000025
【図９】
2008518980.tif 000026
【図１０Ａ】
2008518980.tif 000027
【図１０Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年8月20日(2007.8.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水性キャリア中にＬＮＡオリゴヌクレオチドを含む液状薬学的組成物であって、該ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１２〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−（ＭｅＣｘ）（Ｔｘ）ＭｅＣｘＡｓＡｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘ（Ｇｘ）（ｃ）−３’（配列番号２８）
を含み、ここで、大文字はβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、β−Ｄ−チオ−ＬＮＡ、β−Ｄ−アミノ−ＬＮＡおよびα−Ｌ−オキシ−ＬＮＡから選択されるＬＮＡヌクレオチドアナログを示し、小文字はデオキシヌクレオチドを示し、下線は上記で規定したＬＮＡヌクレオチドアナログまたはデオキシヌクレオチドを示し、下付き文字「ｓ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合を示し、下付き文字「ｘ」は隣接するヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログ間のホスホロチオエート結合またはホスホロジエステル結合を示し、括弧内のヌクレオチドユニットは各々任意のユニットを表し、
該水性キャリアが、ｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、かつ２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する、液状薬学的組成物。
【請求項２】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＬＮＡヌクレオチドアナログがすべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、請求項１〜２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される化合物である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号２を有する化合物である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
水性キャリア中に結合体を含む液状薬学的組成物であって、該結合体が、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分とからなり、
該水性キャリアが、ｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、かつ２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する、液状薬学的組成物。
【請求項７】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
薬学的に受容可能なキャリア中に、少なくとも１つのタキサン化合物と、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドとを含む薬学的組成物であって、
該組成物中の該タキサン化合物と該ＬＮＡオリゴヌクレオチドとの重量比が５０：１〜１：２５の範囲にある、薬学的組成物。
【請求項９】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
薬学的に受容可能なキャリア中に、少なくとも１つのタキサン化合物と結合体とを含む薬学的組成物であって、該結合体が、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分とからなり、
該組成物中の該タキサン化合物と該結合体のＬＮＡオリゴヌクレオチド部分との重量比が５０：１〜１：２５の範囲にある、薬学的組成物。
【請求項１１】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
癌疾患に罹患しているかまたは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトの処置のための薬学的組成物の調製のための、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項１３】
癌疾患に罹患しているかまたは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトの処置のための薬学的組成物の調製のための結合体の使用であって、該結合体が、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分とからなる、使用。
【請求項１４】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項１２〜１３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＬＮＡヌクレオチドアナログがすべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１６】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される化合物である、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１７】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号２を有する化合物である、請求項１６に記載の使用。
【請求項１８】
前記薬学的組成物が請求項１〜１１のいずれか一項に記載の通りである、請求項１２〜１７のいずれか一項に記載の使用。
【請求項１９】
前記癌疾患が、急性骨髄性白血病、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ球性白血病、肝癌、腎癌、尿路癌および結腸直腸癌から選択される、請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の使用。
【請求項２０】
癌疾患に罹患しているかまたは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトを処置するための組成物であって、該組成物は、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含み、該組成物は、１以上の治療有効用量での投与に適している、組成物。
【請求項２１】
癌疾患に罹患しているかまたは癌疾患に罹患しやすい哺乳動物、特にヒトを処置するための組成物であって、該組成物が、結合体を含み、該結合体が、請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドと、該オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも１つの非ヌクレオチド／非ポリヌクレオチド部分とからなり、該組成物は、１以上の治療有効用量での投与に適している、組成物。
【請求項２２】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項２０〜２１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＬＮＡヌクレオチドアナログがすべてβ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、配列番号２、３、４、５、６、７、８、９および１０からなる群より選択される化合物である、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが配列番号２を有する化合物である、請求項２４に記載の組成物。
【請求項２６】
前記癌疾患が、急性骨髄性白血病、びまん性Ｂ細胞リンパ腫、急性リンパ球性白血病、肝癌、腎癌、尿路癌および結腸直腸癌から選択される、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２７】
前記組成物が請求項１〜１１のいずれか一項に記載の通りである、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
（ａ）１以上の注射可能溶液用量の請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する第一の構成要素と、
（ｂ）１以上の注射可能溶液の１以上のタキサン化合物を含有する第二の構成要素と
を備えるキットであって、
該第二の構成要素の１溶液中の少なくとも１つのタキサン化合物と、該第一の構成要素の１溶液用量中の少なくとも１つのＬＮＡオリゴヌクレオチドとの重量比が５０：１〜１：２５の範囲であり、かつ／あるいは、
該ＬＮＡオリゴヌクレオチドの注射可能溶液用量が、ｐＨを４．０〜８．５の範囲に維持するための緩衝液を含み、かつ２０〜２０００ｍＭのイオン強度を有する、キット。
【請求項２９】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドの注射可能溶液用量が、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物である、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
（ａ）固体形態の請求項１〜２のいずれか一項に記載のＬＮＡオリゴヌクレオチドを含有する第一の構成要素と、
（ｂ）該ＬＮＡオリゴヌクレオチドの再構成に適した生理食塩水または緩衝液を含有する第二の構成要素と
を備える、キット。
【請求項３１】
前記ＬＮＡオリゴヌクレオチドが、合計１６〜２０個のヌクレオチド／ＬＮＡヌクレオチドアナログを有し、かつ以下の（サブ）配列：
５’−ＭｅＣｘＴｘＭｅＣｘＡｓａｓｔｓｃｓｃｓａｓｔｓｇｓｇｓＭｅＣｘＡｘＧｘｃ−３’（配列番号１）
を含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
細胞または細胞由来のＲＮＡと請求項１〜１１のいずれか一項に記載の薬学的組成物とを接触させる工程を包含する、アポトーシスを誘導する方法であって、ここでアポトーシスが誘導される、方法。
【国際調査報告】
2008518980.tif 000029
2008518980.tif 000030
2008518980.tif 000031