(57)【要約】【課題】新規なマイクロＲＮＡ及びそれを阻害する方法の提供。【解決手段】配列番号１〜９４、２８１〜３７４、４６７〜４８１、４９７〜５２２又は５４９のいずれかに示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、塩基の最高１０％が非相補的であってもよい）を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。更に、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子、単離された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子及び単離されたマイクロＲＮＰ分子。更に、細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜９４のいずれかに示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、塩基の最高１０％が非相補的であってもよい）を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
【請求項２】
更に５’末端に及び／又は３’末端に、配列番号９５〜１８７に示されるヘアピン前駆体配列のいずれか１つ又はそのフラグメントに存在する塩基配列を含む、請求項１記載の単離された分子。
【請求項３】
前記ヘアピン前駆体の配列が、マイクロＲＮＡに存在する配列である、請求項２記載の単離された分子。
【請求項４】
前記マイクロＲＮＡがベクターに組み込まれている、請求項１記載の単離された分子。
【請求項５】
ＤＮＡ分子である、請求項１記載の単離された分子。
【請求項６】
ＲＮＡ分子である、請求項１記載の単離された分子。
【請求項７】
更にキャップを含む、請求項１記載の単離された分子。
【請求項８】
前記キャップが逆向きのヌクレオチドキャップである、請求項７記載の単離された分子。
【請求項９】
前記キャップが化学キャップである、請求項７記載の単離された分子。
【請求項１０】
実質的に、配列番号１〜９４に示されるマイクロＲＮＡの配列のいずれか１つを含む、請求項１記載の単離された分子。
【請求項１１】
実質的に、配列番号１〜１８７に示される配列のいずれか１つを含む、請求項１に記載の単離された分子。
【請求項１２】
修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号１〜９４に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せであってもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子。
【請求項１３】
更に、配列番号９５〜１８７に示されるヘアピン前駆体配列のいずれか１つ又はそのフラグメントに存在する塩基配列を、その５’末端及び／又は３’末端に含む、請求項１２記載の分子。
【請求項１４】
前記ヘアピン前駆体配列がマイクロＲＮＡを有する配列である、請求項１３記載の分子。
【請求項１５】
修飾されてヌクレアーゼ耐性が増加している、請求項１２記載の分子。
【請求項１６】
単離された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号１〜９４に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せであってもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、マイクロＲＮＰ活性を阻害できる、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子。
【請求項１７】
前記マイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置の部分が非相補的である、請求項１６記載の分子。
【請求項１８】
前記隣接する部分の最高５％がマイクロＲＮＡの塩基の隣接する配列と非相補的であってもよい、請求項１６記載の分子。
【請求項１９】
非相補的な部分が付加、欠失、ミスマッチ又はそれらの組合せによるものである、請求項１８記載の分子。
【請求項２０】
表Ｆに示されるアンチ−マイクロＲＮＡ配列のいずれか１つを有する、請求項１６に記載の分子。
【請求項２１】
前記部分のうちの少なくとも１つが、修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項１６記載の分子。
【請求項２２】
前記修飾されたデオキシリボヌクレオチドがホスホロチオネートデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項２１記載の分子。
【請求項２３】
前記修飾されたデオキシリボヌクレオチドがＮ’３−Ｎ’５  ホスホロアミデートデオキシリボヌクレオチド部分である、請求項２１記載の分子。
【請求項２４】
前記部分のうちの少なくとも１つが、修飾されたリボヌクレオチド部分である、請求項１６記載の分子。
【請求項２５】
前記修飾されたリボヌクレオチドが２’の位置で置換されている、請求項２４記載の分子。
【請求項２６】
前記２’の位置の置換基が、炭素数１〜４のアルキル基である、請求項２５記載の分子。
【請求項２７】
前記アルキル基がメチル基である、請求項２６記載の分子。
【請求項２８】
前記アルキル基がアリル基である、請求項２８記載の分子。
【請求項２９】
前記２’の位置の置換基が、（炭素数１〜４のアルコキシ）−（炭素数１〜４のアルキル）基である、請求項２５記載の分子。
【請求項３０】
前記（炭素数１〜４のアルコキシ）−（炭素数１〜４のアルキル）基がメトキシエチル基である、請求項２９記載の分子。
【請求項３１】
前記修飾されたリボヌクレオチドが、２’−酸素原子及び４’−炭素原子の間のメチレン架橋を有する、請求項２４記載の分子。
【請求項３２】
前記部分のうちの少なくとも１つが、ペプチド核酸部分である、請求項１６記載の分子。
【請求項３３】
前記部分のうちの少なくとも１つがＴ−フルオロミボヌクレオチド部分である、請求項１６記載の分子。
【請求項３４】
前記部分のうちの少なくとも１つが、モルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分である、請求項１６記載の分子。
【請求項３５】
前記部分のうちの少なくとも１つが、トリシクロヌクレオチド部分である、請求項１６記載の分子。
【請求項３６】
前記部分のうちの少なくとも１つが、シクロヘキセンヌクレオチド部分である、請求項１６に記載の分子。
【請求項３７】
キメラ分子である、請求項１６に記載の分子。
【請求項３８】
少なくとも１つの修飾された部分を含むことによりヌクレアーゼ耐性が増加している、請求項１６記載の分子。
【請求項３９】
前記ヌクレアーゼがエキソヌクレアーゼである、請求項３８記載の分子。
【請求項４０】
前記分子が５’末端に少なくとも１つの修飾された部分を含む、請求項３９記載の分子。
【請求項４１】
前記分子が５’末端に少なくとも２つの修飾された部分を含む、請求項３９記載の分子。
【請求項４２】
前記分子が３’末端に少なくとも１つの修飾された部分を含む、請求項３９記載の分子。
【請求項４３】
前記分子が３’末端に少なくとも２つの修飾された部分を含む、請求項３９記載の分子。
【請求項４４】
前記分子が５’末端に少なくとも１つの修飾された部分、及び３’末端に少なくとも１つの修飾された部分を含む、請求項３９記載の分子。
【請求項４５】
前記分子が５’末端に少なくとも２つの修飾された部分、及び３’末端に少なくとも２つの修飾された部分を含む、請求項３９記載の分子。
【請求項４６】
前記分子が５’末端、３’末端又はその両末端にキャップを含む、請求項３９記載の分子。
【請求項４７】
前記分子が化学キャップを含む、請求項４６記載の分子。
【請求項４８】
前記分子が逆向きヌクレオチドキャップを含む、請求項４６記載の分子。
【請求項４９】
前記ヌクレアーゼがエンドヌクレアーゼである、請求項１６記載の分子。
【請求項５０】
前記分子が５’末端と３’末端の間に少なくとも１つの修飾された部分を含む、請求項４９記載の分子。
【請求項５１】
前記分子が５’末端と３’末端の間に化学キャップを含む、請求項４９記載の分子。
【請求項５２】
前記部分の全てがヌクレアーゼ耐性である、請求項１６記載の分子。
【請求項５３】
細胞内でマイクロＲＮＡの活性を阻害する方法であり、前記マイクロＲＮＡがマイクロＲＮＡ分子を含み、前記方法が請求項１６記載の一本鎖のアンチマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含み、前記アンチマイクロＲＮＡが前記マイクロＲＮＡと相補的である方法。
【請求項５４】
マイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置のアンチマイクロＲＮＡ分子の部分が非相補的である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１に記載の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項５６】
請求項１２に記載の単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項５７】
配列番号２８１〜３７４のいずれかに示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％がゆらぎ塩基であり、塩基の最高１０％が非相補的であってもよい）を有する少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
【請求項５８】
配列番号４６７〜４８１のいずれかに示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％がゆらぎ塩基であり、塩基の最高１０％が非相補的であってもよい）を有する少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
【請求項５９】
配列番号４９７〜５２２のいずれかに示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％がゆらぎ塩基であり、塩基の最高１０％が非相補的であってもよい）を有する少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
【請求項６０】
配列番号５４９に示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％がゆらぎ塩基であり、塩基の最高１０％が非相補的であってもよい）を有する少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子。
【請求項６１】
修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号２８１〜３７４に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せであってもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子。
【請求項６２】
修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号４６７〜４８１に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せであってもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子。
【請求項６３】
修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号４９７〜５２２に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せであってもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子。
【請求項６４】
修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号５４９に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せであってもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子。
【請求項６５】
修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号２８１〜３７４に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せであってもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、マイクロＲＮＰ活性を阻害できる、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子。
【請求項６６】
修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号４６７〜４８１に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せであってもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、マイクロＲＮＰ活性を阻害できる、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子。
【請求項６７】
修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号４９７〜５２２に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せであってもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、マイクロＲＮＰ活性を阻害できる、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子。
【請求項６８】
修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、少なくとも１０の隣接する塩基が配列番号５４９に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％はそれについて付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せであってもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、マイクロＲＮＰ活性を阻害できる、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子。
【請求項６９】
細胞内でマイクロＲＮＡの活性を阻害する方法であって、前記マイクロＲＮＡがマイクロＲＮＡ分子を含み、前記方法が請求項６５の一本鎖のアンチマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含み、前記アンチマイクロＲＮＡが前記マイクロＲＮＡと相補的である方法。
【請求項７０】
細胞内でマイクロＲＮＡの活性を阻害する方法であって、前記マイクロＲＮＡがマイクロＲＮＡ分子を含み、前記方法が請求項６６の一本鎖のアンチマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含み、前記アンチマイクロＲＮＡが前記マイクロＲＮＡと相補的である方法。
【請求項７１】
細胞内でマイクロＲＮＡの活性を阻害する方法であり、前記マイクロＲＮＡがマイクロＲＮＡ分子を含み、前記方法が請求項６７の一本鎖のアンチマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含み、前記アンチマイクロＲＮＡが前記マイクロＲＮＡと相補的である方法。
【請求項７２】
細胞内でマイクロＲＮＡの活性を阻害する方法であって、前記マイクロＲＮＡがマイクロＲＮＡ分子を含み、前記方法が請求項６８の一本鎖のアンチマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含み、前記アンチマイクロＲＮＡが前記マイクロＲＮＡと相補的である方法。
【請求項７３】
請求項５７に記載の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項７４】
請求項５８に記載の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項７５】
請求項５９に記載の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項７６】
請求項６０に記載の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項７７】
請求項６１に記載の単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項７８】
請求項６２に記載の単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項７９】
請求項６３に記載の単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【請求項８０】
請求項６４に記載の単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子を含む、単離されたマイクロＲＮＰ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）本特許出願は、米国特許仮出願第６０／７１４５１９号（２００５年４月２９日に出願）の優先権を主張し、その全開示内容は本願明細書に参照により援用される。本明細書に記載されている本発明は、国立衛生研究所／ＮＩＧＭＳの承認番号１  Ｐ０１  ＧＭ０７３０４７−０１及び１  Ｒ０１  ＧＭ０６８４７６−０１による資金によりなされたものである。ゆえに米国政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００２】
（技術分野）本発明は、新規なマイクロＲＮＡ及びそれを阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
マイクロＲＮＡは、典型的には小さいＲＮＡ分子、すなわち一般に長さ約１９〜２５ヌクレオチド長のＲＮＡ分子である。これらのマイクロＲＮＡは、ヘアピン前駆体が分裂して生じるノンコーディングＲＮＡである。幾つかのマイクロＲＮＡは、広範囲にわたる多細胞生物のゲノムにおいて同定されている。
【０００４】
動物のマイクロＲＮＡは、多くのゲノム部位で見出されている。一般的に、大部分のマイクロＲＮＡは遺伝子間領域にコードされている。他のマイクロＲＮＡは、ｍＲＮＡのイントロン中、又は非コーディングＲＮＡ転写物内に存在する。
【０００５】
多くのマイクロＲＮＡは、近縁でない生物種間でもその配列が保存されており、組織特異的又は発生の各段階において、特徴的な発現を呈する。生物種間の配列の保存は、マイクロＲＮＡが生物学的プロセスにおいて、重要な役割を果たすことを示唆する。
【０００６】
マイクロＲＮＡは、標的遺伝子のｍＲＮＡの３’側のノンコーディング領域に部分的にハイブリダイズした後に翻訳をブロックすることが報告されている。前記マイクロＲＮＡの標的となる遺伝子は未だ解明すべき部分が残されている。
【０００７】
しかしながら、マイクロＲＮＡは多様な疾病や症状を発症させることを示唆する証拠が揃いつつある。例えば、ショウジョウバエ・マイクロＲＮＡは、アポトーシスに関係する標的遺伝子に示された。例えば、ショウジョウバエのマイクロＲＮＡは、アポトーシスに関連する遺伝子を標的としていることが明らかとされ、またＢ細胞慢性リンパ性白血病は、２つのマイクロＲＮＡの欠失が関与していることが明らかとされている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
以上より、多くの疾病及び疾患の調節において一定の役割を果たす遺伝子調節機構を解明することは重要である。上記に鑑み、例えばマイクロＲＮＡのような多くの疾病及び疾患の調節因子の機能を解明する一助となり得る材料及び方法が求められている。
【０００９】
更に、マイクロＲＮＡはＲＮＡ分解を誘発するか又は重要なタンパク質をコードするｍＲＮＡの翻訳を抑制する能力を有するため、標的ｍＲＮＡのマイクロＲＮＡにより誘発された裂開又は翻訳抑制を阻止する新規な分子が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
本発明の一実施態様は、配列番号１〜９４のいずれかに示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、塩基の最高１０％が非相補的である場合を除く）を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。
【００１１】
本発明の他の実施態様は、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号１〜９４に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、隣接する塩基の最高１０％においてその付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せを有してもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００１２】
本発明の他の実施態様は、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号１〜９４に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、隣接する塩基の最高１０％においてその付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せを有してもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、マイクロＲＮＰ活性を阻害できる、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子に関する。
【００１３】
本発明の他の実施態様は、細胞内でマイクロＲＮＡの活性を阻害する方法であって、前記マイクロＲＮＡはマイクロＲＮＡ分子を含み、前記方法は請求項１８の一本鎖のアンチマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入する工程を含み、前記アンチマイクロＲＮＡが前記マイクロＲＮＡと相補的である方法に関する。
【００１４】
本発明の他の実施態様は、本発明に従って単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子を含む単離されたマイクロＲＮＰに関する。
【００１５】
本発明の他の実施態様は、本発明に係る単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子からを含んでなる単離されたマイクロＲＮＰに関する。
【００１６】
本発明の他の実施態様は、配列番号２８１〜３７４のいずれかに示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％が非相補的であってもよい）を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。
【００１７】
本発明の他の実施態様は、配列番号４６７〜４８１のいずれかに示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％が非相補的であってもよい）を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。
【００１８】
本発明の他の実施態様は、配列番号４９７〜５２２いずれかに示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％が非相補的であってもよい）を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。
【００１９】
本発明の他の実施態様は、配列番号５４９に示されるマイクロＲＮＡの塩基配列（ただし、塩基の最高３０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％がゆらぎ塩基であり、隣接する塩基の最高１０％が非相補的であってもよい）を有する、少なくとも１０の隣接する塩基を含む、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。
【００２０】
本発明の他の実施態様は、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号２８１〜３７４に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％においてその付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せを有してもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００２１】
本発明の他の実施態様は、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号４６７〜４８１に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％においてその付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せを有してもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００２２】
本発明の他の実施態様は、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号４９７〜５２２に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％においてその付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せを有してもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００２３】
本発明の他の実施態様は、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号５４９に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と同じ配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、また隣接する塩基の最高１０％においてその付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せを有してもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない、修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００２４】
本発明の他の実施態様は、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号２８１〜３７４に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、隣接する塩基の最高１０％においてその付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せを有してもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、マイクロＲＮＰ活性を阻害できる、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子に関する。
【００２５】
本発明の他の実施態様は、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号４６７〜４８１に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、隣接する塩基の最高１０％においてその付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せを有してもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、マイクロＲＮＰ活性を阻害できる、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子に関する。
【００２６】
本発明の他の実施態様は、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号４９７〜５２２に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、隣接する塩基の最高１０％においてその付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せを有してもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、マイクロＲＮＰ活性を阻害できる、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子に関する。
【００２７】
本発明の他の実施態様は、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子であって、その基本分子上に最低１０の部分、最高５０の部分が含まれ、前記基本分子が基本単位を含み、各々の部分が基本単位に結合した塩基を含み、各塩基が相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成し、少なくとも１０の隣接する塩基は、配列番号５４９に示されるマイクロＲＮＡ分子の塩基の隣接する配列と相補的な配列（ただし塩基対の最高３０％がゆらぎ塩基対で、隣接する塩基の最高１０％においてその付加、欠失、ミスマッチ又はその組合せを有してもよい）を有し、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む部分が隣接する部分の５０％を越えず、マイクロＲＮＰ活性を阻害できる、修飾された一本鎖アンチマイクロＲＮＡ分子に関する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２８】
マイクロＲＮＡ分子
本発明の一実施態様は、単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００２９】
別の実施形態では、本発明は配列番号２８１−３７４のいずれか１つを有する単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００３０】
更に別の実施形態では、本発明は配列番号４６７−４８１のいずれか１つを有する単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００３１】
更なる実施形態では、本発明は配列番号４９７−５２２のいずれか１つを有する単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００３２】
更なる実施形態では、本発明は配列番号５４９のいずれか１つを有する単離された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。
【００３３】
マイクロＲＮＡ分子は、従来技術において周知である（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ，２００４，１１６，２８１−２９７）。ＢａｒｔｅｌによるマイクロＲＮＡ分子に関する定義及び特徴は本願明細書に援用される。この種の分子は、ゲノムの染色体位置に由来し、特定のマイクロＲＮＡ遺伝子から生じる。
【００３４】
成熟したマイクロＲＮＡ分子は、部分的にヘアピン構造を形成する前駆体転写物からプロセシングされる。前記ヘアピン構造はＤｉｃｅｒとして公知の酵素によって適当に切断される。Ｂａｒｔｅｌの上記文献を参照のこと。
【００３５】
通常、マイクロＲＮＡデュプレックスの２本鎖のうちの１本は、マイクロＲＮＡリボ核タンパク複合体（マイクロＲＮＰ）で包まれる。例えば、ヒトのマイクロＲＮＰはタンパク質ｅＩＦ２Ｃ２、ヘリカーゼＧｅｍｉｎ３及びＧｅｍｉｎ４を含む。Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質ファミリー（例えばＡｇｏｌ３及び４）の他のメンバーもまたマイクロＲＮＡと結合してマイクロＲＮＰを形成する。
【００３６】
ヒトにおいて、Ａｇｏ２を含んでいるマイクロＲＮＰは典型的には、標的ＲＮＡ配列のマイクロＲＮＡ裂開を誘導する。他のＡｇｏタンパク質（例えばＡｇｏ１、３及び４）を含んでいるマイクロＲＮＰ複合体は通常、標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制する。
【００３７】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号１〜９４に示される配列及びそれの均等物を有する少なくとも１０の隣接する塩基を含んでなる、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。好ましくは、前記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、少なくとも１３、好ましくは少なくとも１５、更に好ましくは少なくとも２０の隣接する塩基を含んでなる。
【００３８】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号２８１〜３７４に示される配列及びそれの均等物を有する少なくとも１０の隣接する塩基を含んでなる、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。好ましくは、前記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、少なくとも１３、好ましくは少なくとも１５、更に好ましくは少なくとも２０の隣接する塩基を含んでなる。
【００３９】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号４６７〜４８１に示される配列及びそれの均等物を有する少なくとも１０の隣接する塩基を含んでなる、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。好ましくは、前記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、少なくとも１３、好ましくは少なくとも１５、更に好ましくは少なくとも２０の隣接する塩基を含んでなる。
【００４０】
更なる態様では、本発明は、表Ａ６の配列番号４９７−５２２に示される配列及びその均等物を有する少なくとも１０の隣接する塩基を含んでなる、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。好ましくは、前記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、少なくとも１３、好ましくは少なくとも１５、更に好ましくは少なくとも２０の隣接する塩基を含んでなる。
【００４１】
１つの実施形態では、本発明は、配列番号５４９に示される配列及びそれの均等物を有する少なくとも１０の隣接する塩基を含んでなる、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子に関する。好ましくは、前記の単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、少なくとも１３、好ましくは少なくとも１５、更に好ましくは少なくとも２０の隣接する塩基を含んでなる。
【００４２】
表Ａ：マイクロＲＮＡ配列
【表１】
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【００４３】
表Ａ１：マイクロＲＮＡヘアピン前駆体配列
【表２】
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【００４４】
表Ａ２：マイクロＲＮＡ配列
【表３】
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【００４５】
表Ａ３：マイクロＲＮＡヘアピン前駆体配列
【表４】
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【００４６】
表Ａ４：マイクロＲＮＡ配列
【表５】
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【００４７】
表Ａ５：マイクロＲＮＡヘアピン前駆体配列
【表６】
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【００４８】
表Ａ６：マイクロＲＮＡ配列
【表７】
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【００４９】
表Ａ７：マイクロＲＮＡヘアピン前駆体配列
【表８】
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【００５０】
表Ａ８：マイクロＲＮＡ配列及びヘアピン前駆体配列
【表９】
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【００５１】
本願明細書において、塩基とは、天然のＤＮＡ又はＲＮＡで見られるヌクレオチドの塩基のいずれか１つのことを指す。前記塩基は、プリン又はピリミジンである。前記プリン塩基の例としては、アデニン（Ａ）と、グアニン（Ｇ）が含まれる。前記ピリミジン塩基の例としては、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が含まれる。アデニンは、２，６−ジアミノプリンと置換されてもよい。
【００５２】
本願明細書において、開示される未修飾の核酸分子の配列は、ウラシル塩基を有して示される。ウラシル塩基は、未修飾のＲＮＡ分子中で生じる。本発明には、未修飾のＤＮＡ分子も含まれる。ＤＮＡ分子ではウラシル塩基がチミン塩基で置換されている以外は、ＤＮＡ分子の塩基配列はＲＮＡ分子と同様である。
【００５３】
配列中の各々の塩基は、相補的な塩基とワトソン−クリック塩基対を形成できる。すなわち：アデニン及びチミン（Ａ−Ｔ）、アデニン及びウラシル（Ａ−Ｕ）、シトシン及びグアニン（Ｃ−Ｇ）の塩基対である。
【００５４】
均等物とは、少なくとも１０の隣接する塩基のうち、最高３０％がゆらぎ塩基であり、また最高１０％、更に好ましくは最高５％までの隣接する塩基が非相補的である状態の分子を指す。
【００５５】
本発明では、ゆらぎ塩基とは、分子の配列中における、１）ウラシルによるシトシンの置換、又は２）グアニンによるアデニンの置換を指す。これらのゆらぎ塩基置換は一般に、ＵＧ又はＧＵゆらぎと呼ばれる。表３は、隣接する塩基の数及び分子のゆらぎ塩基の最大数を示す。
【００５６】
表Ｂ：隣接塩基数及び最大ゆらぎ塩基数
【表１０】
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【００５７】
本願明細書において、「非相補的」とは、付加、欠失、ミスマッチ又はそれらの組合せを指す。付加とは、何らかの塩基が上記隣接する配列に挿入されることを指す。欠失とは、隣接する配列に存在する何らかの部分が除去されることを指す。ミスマッチとは、隣接する配列の塩基のうちの１つが異なる塩基に置換されることを指す。
【００５８】
付加、欠失又はミスマッチは、例えば隣接する配列のいずれの端部又は分子中の隣接する配列の中間部分で生じてもよい。典型的には、例えば、隣接する配列が約１０〜約１５塩基長と比較的短い場合、付加、欠失又はミスマッチは隣接する配列の末端付近にて生じる。隣接する配列が比較的長い場合、例えば、最低１６塩基の隣接する配列である場合は、付加、欠失又はミスマッチは隣接する配列のどこでも生じ得る。
【００５９】
例えば、隣接塩基数が１０〜１９であるときは、隣接塩基のうちの０又は１つが付加、欠失又はミスマッチであってもよく、また隣接する塩基数が２０〜２３であるときは、０、１又は２つの塩基の付加、欠失又はミスマッチが許容範囲となる。
【００６０】
単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子はまた、マイクロＲＮＡの少なくとも１０の隣接するヌクレオチドに加えて、１つ以上のヌクレオチドを追加してもよい。なお、前記の追加ヌクレオチド数に上限はない。典型的には、最高５００ヌクレオチド、好ましくは最高３００ヌクレオチドを、マイクロＲＮＡの少なくとも１０の隣接する塩基に追加してもよい。
【００６１】
いかなるヌクレオチドを追加してもよい。前記のヌクレオチド追加は上記のいずれの塩基により行ってもよい。したがって、例えば追加ヌクレオチドはＡ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵのいずれか１つ又は２つ以上でもよい。
【００６２】
１つの実施形態では、マイクロＲＮＡはヘアピン前駆体配列又はそのフラグメントの一部である。例えば、適切なヘアピン前駆体配列を配列番号９５〜１８７に示す。更にヘアピン前駆体を、表Ａ３の配列番号３７５〜４６６、表Ａ５の配列番号４８２〜４９６、表Ａ７の配列番号５２３〜５４８、及び表Ａ８の配列番号５５０として示す。
【００６３】
前記フラグメントは、その５’末端及び／又は３’末端にて、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５、好ましくは最低２０のヌクレオチド含む、ヘアピン前駆体配列のいかなるフラグメントであってもよい。好ましくは、前記ヌクレオチドの配列はマイクロＲＮＡが存在するヘアピン前駆体に存在する。
【００６４】
マイクロＲＮＡ又はヘアピン前駆体は、例えば組換えベクターなどに挿入できる。典型的には、マイクロＲＮＡ配列を含むヘアピン前駆体配列をベクターに挿入してマイクロＲＮＡ含有組換えベクターを構築する。例えば、Ｃｈｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２００４，３０３：８３−８６を参照。
【００６５】
組換えベクターは、例えばプラスミド、コスミド又はファージ等のいかなる組換えベクターでもよい。組換えベクターは、一般に複製開始点を有する。ベクターとしては、例えばアデノウイルスベクター又はアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）等のウイルスベクターが使用可能である。例えばＬｅｄｌｅｙ  １９９６，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ１３：１５９５−１６１４、Ｖｅｒｍａら、Ｎａｔｕｒｅ  １９９７，３８７：２３９−２４２を参照。
【００６６】
ベクターに更に選択マーカーを含めてもよい。適切な選択マーカーとしては、例えばテトラサイクリン又はゲンタマイシンなどの薬剤耐性マーカー、又は例えばβ−ガラクトシダーゼ又はルシフェラーゼのような検出可能な遺伝子マーカーが使用可能である。
【００６７】
好ましい実施形態では、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、実質的に配列番号１〜１８７に示されるマイクロＲＮＡ配列又はヘアピン前駆体配列のいずれか１つからなる。
【００６８】
好ましい実施形態では、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、実質的に配列番号２８１〜４６６に示されるマイクロＲＮＡ配列又はヘアピン前駆体配列のいずれか１つからなる。
【００６９】
好ましい実施形態では、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、実質的に配列番号４６７〜４９６に示されるマイクロＲＮＡ配列又はヘアピン前駆体配列のいずれか１つからなる。
【００７０】
好ましい実施形態では、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、実質的に配列番号４９７〜５４８に示されるマイクロＲＮＡ配列又はヘアピン前駆体配列のいずれか１つからなる。
【００７１】
好ましい実施形態では、単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子は、実質的に配列番号５４９〜５５０に示されるマイクロＲＮＡ配列又はヘアピン前駆体配列のいずれか１つからなる。
【００７２】
本願明細書において「単離された」とは、分子が他の核酸を実質的に含まないことを指す。他の核酸を本質的に含まないとは、分子が少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも約９８％の純度で他の核酸を含まないことを指す。
【００７３】
なお、それは前記分子が他の核酸を含まないという意味の他に、前記分子の合成及び単離において、使用する他の材料を含まないという意味も含まれる。合成において使用する材料は、例えば酵素である。単離において使用する材料は、例えばゲル類（例えばＳＤＳ−ＰＡＧＥ用）である。前記分子は、少なくとも約９０％、好ましくは少なくとも９５％、更に好ましくは少なくとも約９８％の純度でこれらの材料を含まない。
【００７４】
マイクロＲＮＡ又はヘアピン前駆体の塩基の配列は、高度に保存されている。そのため、いかなる哺乳類の細胞由来の配列でも使用可能である。哺乳類の例としては、イヌ及びネコなどの愛玩動物、ウシ、ウマ及びヒツジなどの家畜、ネズミ、マウス及びウサギのような実験動物、サル及びヒトのような霊長類が挙げられる。前記哺乳類は好ましくはヒト又はマウスである。
【００７５】
修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子：
他の実施形態では、本発明は修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子に関する。修飾された一本鎖マイクロＲＮＡ分子は上記のマイクロＲＮＡ分子、そのヘアピン前駆体分子若しくは均等物のいずれであってもよいが、但し当該修飾された分子が少なくとも１つの修飾部分を含んでなる（すなわち、少なくとも１つの部分が未修飾デオキシリボヌクレオチド部分又は未修飾リボヌクレオチド部分でない）。この実施形態では、前記の修飾されたマイクロＲＮＡ分子は、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１３、好ましくは少なくとも１５、更により好ましくは少なくとも１８、最も好ましくは少なくとも２１の部分を含む。
【００７６】
修飾されたマイクロＲＮＡ分子は、多くとも５０、好ましくは多くとも４０、好ましくは多くとも３０、更に好ましくは多くとも２５、最も好ましくは多くとも２３の部分を含む。前記部分の最小数及び最大数の適切な範囲は、上記のいずれかの最小数及びいずれかの最大数を組み合わせて設定してもよい。
【００７７】
各々の修飾された部分は、基本単位に結合する塩基を含む。前記基本単位は、安定して塩基と結合して、オリゴマー鎖を形成できるいかなる分子単位でもあってもよい。本願明細書において、修飾された部分の基本単位には、天然のＤＮＡ又はＲＮＡ分子に通常存在する基本単位は包含されない。
【００７８】
このように修飾されたマイクロＲＮＡ分子は、ヌクレアーゼ耐性が増加している。したがって、未修飾リボヌクレオチド部分のみ、未修飾デオキシリボヌクレオチド部分のみ、又はそれらの両方を有する配列と比較し、前記分子のヌクレアーゼ耐性は増加している。このような修飾された部分は、例えばＫｕｒｒｅｃｋ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０，１６２８−１６４４（２００３）により公知技術である。
【００７９】
エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼ又はその両方のヌクレアーゼに対する耐性が得られる。エキソヌクレアーゼは３’→５’エキソヌクレアーゼ又は５’→３’エキソヌクレアーゼのいずれでもよい。３’→５’ヒトエキソヌクレアーゼの例としては、ＰＮＰＴ１、ワーナー症候群ヘリカーゼ、ＲＲＰ４０、ＲＲＰ４１、ＲＲＰ４２、ＲＲＰ４５、ＲＲＰ４６が挙げられる。５’→３’エキソヌクレアーゼの例としては、ＸＲＮ２及びＦＥＮ１が挙げられる。エンドヌクレアーゼの例としては、Ｄｉｃｅｒ、Ｄｒｏｓｈａ、ＲＮａｓｅ４、リボヌクレアーゼＰ、リボヌクレアーゼＨ１、ＤＨＰ１、ＥＲＣＣ−Ｉ及びＯＧＧ１が挙げられる。エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼとして機能するヌクレアーゼの例としては、ＡＰＥ１及びＥＸＯ１が挙げられる。
【００８０】
修飾された部分を、マイクロＲＮＡ分子のいかなる位置に設けてもよい。例えば、マイクロＲＮＡ分子を３’→５’エキソヌクレアーゼから保護する場合、分子中の３’末端に少なくとも１つの修飾された部分を、好ましくは３’末端に少なくとも２つの修飾された部分を設けてもよい。分子を５’→３’エキソヌクレアーゼから保護する場合、好ましくは、マイクロＲＮＡ分子の５’末端に少なくとも１つの修飾された部分、好ましくは少なくとも２つの修飾された部分を設けてもよい。マイクロＲＮＡ分子の５’末端と３’末端の間に、少なくとも１つの好ましくは少なくとも２つの修飾された部分を設けてもよく、それによりエンドヌクレアーゼ耐性を増加させることができる。好ましくは、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２５％、より好ましくは少なくとも約５０％、更により好ましくは少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９５％の部分が修飾される。１つの実施形態では、部分の全てが修飾された（例えばヌクレアーゼ耐性）分子である。
【００８１】
修飾されたマイクロＲＮＡ分子の１つの実施形態では、前記分子は少なくとも１つの修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分を含む。適切な修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分は、従来技術において公知である。この種の修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分は、例えば基本単位としてチオリン酸デオキシリボース基を含む（図１の構造式１を参照）。図１中の構造式１を参照のこと。ホスホロチオエートデオキシリボヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド分子は、一般にホスホロチオエート（ＰＳ）ＤＮＡと呼ばれている。エクスタイン、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１０、１１７−１２１（２０００）を参照。
【００８２】
修飾されたデオキシリボヌクレオチド部分の他の適用可能な例としては、Ｎ’３−Ｎ’５ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分が挙げられる。図１中の構造式２を参照のこと。ホスホロアミダートデオキシリボヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド分子は、一般にホスホロアミダート（ＮＰ）ＤＮＡと呼ばれている。例えばＧｒｙａｚｎｏｖら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６，３１４３−３１４４（１９９４）を参照のこと。
【００８３】
修飾されたマイクロＲＮＡ分子の他の実施形態では、前記分子は１つ以上の修飾されたリボヌクレオチド部分を含む。修飾されたリボヌクレオチド部分の適用可能な例は、その２’位置で置換されたリボヌクレオチド部分である。前記２’位置における置換基は、例えばＣ１−Ｃ４アルキル基であってもよい。前記Ｃ１−Ｃ４アルキル基は、飽和又は不飽和であってもよく、また直鎖状又は分岐型であってもよい。Ｃ１−Ｃ４アルキル基の幾つかの例としては、エチル、イソプロピル及びアリル基が挙げられる。前記の望ましいＣ１−Ｃ４アルキル基は、メチル基である。図１中の構造式３を参照のこと。その２’位置をＣ１−Ｃ４アルコキシで置換されたリボヌクレオチド部分を含むオリゴリボヌクレオチド分子は、一般には２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）ＲＮＡ例えば２’−Ｏ−メチルＲＮＡ（ＯＭｅＲＮＡ）と呼ばれる。
【００８４】
修飾されたリボヌクレオチド部分の２’位置における置換基の他の適用可能な例は、（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）基である。前記Ｃ１−Ｃ４アルコキシ（アルキルオキシ）及びＣ１−Ｃ４アルコキシ基は、上記のアルキル基のいかなるものを含めてもよい。前記の望ましい（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）基はメトキシエチル基である。図１中の構造式４を参照のこと。１つ以上のリボヌクレオチド部分を含み、その２’位置を（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル）基で置換されたオリゴヌクレオチド分子は、２’−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ４アルコキシ）−（Ｃ１−Ｃ４アルキル基）ＲＮＡ、例えば２’−Ｏ−メトキシエチルＲＮＡ（ＭＯＥ  ＲＮＡ）と呼ばれる。
【００８５】
修飾されたリボヌクレオチド部分の他の適切な例は、２’−酸素原子と４’−炭素原子との間でメチレン架橋を有するリボヌクレオチドである。図１中の構造式５を参照のこと。２’−酸素原子と４’−炭素原子との間でメチレン架橋を有するリボヌクレオチド部分を含むオリゴリボヌクレオチド分子は一般にロックされた核酸（ＬＮＡ）と呼ばれる。例えば、Ｋｕｒｒｅｃｋその他、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３０（１９１１−１９１８（２００２））；Ｅｌａｙａｄｉその他、Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｒｕｇｓ  ２、５５８−５６１（２００１）；Ｏｒｕｍｕその他、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．３、２３９−２４３（２００１）；Ｋｏｓｈｉｋｉｎその他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ５４、３６０７−３６３０（１９９８）；Ｏｂｉｋａその他、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３９、５４０１−５４０４（１９９８）を参照のこと。ロックされた核酸は、Ｐｒｏｌｉｇｏ社（Ｐａｒｉｓ，Ｆｒａｎｃｅ  ａｎｄ  Ｂｏｕｌｄｅｒ，Ｃｏｌｏｒａｄｏ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００８６】
修飾されたリボヌクレオチド部分の他の適切な例は、フルオロ基により２’位置を置換されたリボヌクレオチドである。そのような２’−フルオロリボヌクレオチド部分は当業者に公知である。２’−フルオロリボヌクレオチド部分を含む分子を、本発明において２’−フルオロリボ核酸（ＦＡＮＡ）と称する。図１中の構造式７を参照のこと。またＤａｍｈａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，１２９７６−１２９７７（１９９８）を参照のこと。
【００８７】
修飾されたマイクロＲＮＡ分子の他の実施形態では、前記分子はアミノ酸残基に結合する１つ以上の塩基を含む。アミノ酸残基に結合する１つ以上の塩基を含む部分は、本発明において以下ペプチド核酸（ＰＮＡ）部分と記す。そのような部分はヌクレアーゼ耐性であり、当業者に公知である。ＰＮＡ部分を有する分子は一般にペプチド核酸と呼ばれる。図１中の構造式６を参照のこと。Ｎｉｅｌｓｏｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．３１３，１５６−１６４（１９９９）；Ｅｌａｙａｄｉら、ｉｄ．；Ｂｒａａｓｃｈら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４１，４５０３−４５０９（２００２），Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５４，１４９７−１５００（１９９１）を参照のこと。
【００８８】
上記アミノ酸はいかなるアミノ酸であってもよい。天然アミノ酸としては、通常タンパク質中に存在する２０の一般的なアミノ酸である、アラニン（Ａｌａ）、アルギニン（Ａｒｇ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、システイン（Ｃｙｓ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、グリシン（Ｇｌｙ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、リジン（Ｌｙｓ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、プロリン（Ｐｒｏ）、セリン（Ｓｅｒ）、トレオニン（Ｔｈｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）チロシン（Ｔｙｒ）及びバリン（Ｖａｌ）が挙げられる。
【００８９】
人工のアミノ酸としては、例えばアルキル、アリール又はアルキルアリール基含有アミノ酸が挙げられる。アルキルアミノ酸の例としては、α−アミノブチル酸、β−アミノブチル酸、γ−アミノブチル酸、δ−アミノバレリン酸及びε−アミノカプロン酸が挙げられる。アリールアミノ酸の若干の実施例としては、オルト−、メタ−、パラ−アミノ安息香酸が挙げられる。アルキルアリールアミノ酸の若干の実施例としては、オルト−、メタ−、パラ−アミノフェニル酢酸及びγ−フェニルβ−アミノブチル酸が挙げられる。
【００９０】
人工アミノ酸にはまた、天然アミノ酸の派生物も包含される。前記天然アミノ酸の派生物には、例えば１つ又は複数の化学基を付加した天然アミノ酸が包含される。
【００９１】
例えば、１つ又は複数の化学基を、フェニルアラニン又はチロシン残基の芳香環の２’、３’、４’、５’若しくは６’の位置、又はトリプトファン残基のベンゼン環の４’、５’、６’若しくは７’の位置の１つ又は複数に付加させることができる。前記基は、芳香族環に付加できるいかなる化学基であってもよい。そのような基の例としては、ヒドロキシル、Ｃ１−Ｃ４アルコキシ、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、ニトロ、ハロ（すなわちフルオロ、クロロ、ブロモ又はヨード）又は分岐若しくは直鎖状のＣ１−Ｃ４アルキル（例えばメチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル又はｔ−ブチル）が挙げられる。
【００９２】
人工アミノ酸の他の例としては、ノルバリン（Ｎｖａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）及びヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）などを含む天然アミノ酸の派生物が挙げられる。
【００９３】
前記アミノ酸は、同一であってもよく、又はそれぞれ異なるものであってもよい。塩基は前記アミノ酸単位に分子結合により結合する。結合の例としては、メチレンカルボニル、エチレンカルボニル及びエチル結合が挙げられる。これらのＰＮＡ部分の詳細については、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｕｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  −Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ１−１９の図５を参照のこと。ＰＮＡ部分のアミノ酸残基の一例としては、Ｎ−（２−アミノエチル）−グリシンが挙げられる。
【００９４】
更に、ＰＮＡ部分の例としては、シクロヘキシルＰＮＡ、レトロ−インベルソＰＮＡ、フォスフォンＰＮＡ、プロピオニルＰＮＡ及びアミノプロリンＰＮＡが挙げられる。これらのＰＮＡ部分の詳細については、Ｎｉｅｌｓｅｎら、Ｐｅｐｕｔｉｄｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  −Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，ｐａｇｅｓ１−１９の図５を参照のこと。前記Ｎｉｅｌｓｅｎらの文献の７ページの図５は本発明に援用される。
【００９５】
ＰＮＡは、公知の方法、例えば修飾Ｆｍｏｃ又はｔＢｏｃペプチド合成プロトコルにより化学的に合成できる。前記ＰＮＡは多くの望ましい特性、例えば高い溶融温度（Ｔｍ）、核酸及び非荷電の基本分子との高い塩基対形成特異性を有する。更に、前記ＰＮＡは前記標的ＲＮＡにＲＮＡａｓｅＨ感受性を与えず、また一般に良好な代謝安定性を有する。
【００９６】
ペプチド核酸はまた、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００９７】
修飾されたマイクロＲＮＡ分子の他の例において、前記分子は１つ以上のモルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分を含む。モルフォリノホスホロアミダートヌクレオチド部分を含む分子は一般にモルフォリノ（ＭＦ）核酸と呼ばれている。図１中の構造式８を参照のこと。Ｈｅａｓｍａｎ、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．２４３，２０９−２１４（２００２）を参照のこと。モルフォリノオリゴヌクレオチドは、Ｇｅｎｅ  Ｔｏｏｌｓ  ＬＬＣ（Ｃｏｒｖａｌｌｉｓ，Ｏｒｅｇｏｎ，ＵＳＡ）から購入可能である。
【００９８】
修飾されたマイクロＲＮＡ分子の更なる例では、前記分子は１つ以上のシクロヘキセンヌクレオチド部分を含む。シクロヘキセンヌクレオチド部分を含む分子はシクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）と呼ばれる。図１中の構造式１０を参照のこと。Ｗａｎｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２２，８５９５−８６０２（２０００）、Ｖｅｒｂｅｕｒｅら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２９，４９４１−４９４７（２００１）を参照のこと。
【００９９】
最後に、修飾されたマイクロＲＮＡ分子の例として、前記ＤＮＡウイルスのマイクロＲＮＡ分子は１つ以上のトリシクロヌクレオチド部分を含む。トリシクロヌクレオチド部分を含む分子は一般的にトリシクロ核酸（ｔｃＤＮＡ）と呼ばれる。図１中の構造式９を参照のこと。Ｓｔｅｆｆｅｎｓら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１９，１１５４８−１１５４９（１９９７）、Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２４，５９９３−６００２（２００２）を参照のこと。
【０１００】
分子はキメラ修飾されたマイクロＲＮＡ分子であってもよい。また前記部分のいずれかの混成物を含むキメラ分子は公知であり、公知の方法によって調製できる。上記の文献及びＷａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９６，１３９８９−１３９９４（１９９９）；Ｌｉａｎｇら、Ｅｕｒ．Ｊ．ｉｏｃｈｅｍ．２６９，５７５３−５７５８（２００２）；Ｌｏｋら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ４１，３４５７−３４６７（２００２）及びＤａｍｈａら、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２０，１２９７６−１２９７７（２００２）を参照のこと。
【０１０１】
本発明の修飾されたマイクロＲＮＡ分子は、配列番号１〜９４、配列番号２８１〜３７４、配列番号４６７〜４８１、配列番号４９７〜５２２又は配列番号５４９に示される天然のマイクロＲＮＡ分子の隣接する塩基配列のいずれかを有する、少なくとも１０、好ましくは少なくとも１３、好ましくは、少なくとも１５、更により好ましくは少なくとも２０の隣接する塩基を含んでなり、当該修飾された分子は少なくとも１つの修飾部分を含んでなる。好ましい実施形態では、修飾されたマイクロＲＮＡ分子は、配列番号１−９４、配列番号２８１−３７４、配列番号４６７−４８１、配列番号４９７−５２２又は配列番号５４９に示されるマイクロＲＮＡ分子のいずれかの全配列を含んでなる。
【０１０２】
分子中の部分の総数が５０を上回らない限り、いかなる塩基配列を有するいかなる数の付加的な部分（最高４０の部分）も、隣接する塩基配列を有する部分に追加できる。前記の追加部分は、隣接する配列の５’末端、３’末端又はその両方の端に追加してもよい。前記の追加部分としては、マイクロＲＮＡを有するヘアピン前駆体又はそのフラグメントに存在する３’末端及び／又は５’末端の塩基配列が挙げられる。分子中の前記付加的な部分は、必要に応じて上記のいかなる修飾又は未修飾の部分であってもよい。
【０１０３】
前記の修飾されたマイクロＲＮＡ分子には、その均等物も包含される。均等物には、上記のようなゆらぎ塩基及び非相補的な塩基包含される。
【０１０４】
更に、隣接する部分の５０％以下、好ましくは３０％以下が、デオキシリボヌクレオチド基本単位を含むのが望ましい。表Ｃ及び表Ｄは各々の数の隣接する塩基におけるデオキシリボヌクレオチド基本単位の最大数を示す。
【０１０５】
別の実施形態では、上記のゆらぎ塩基対及び非相補的な塩基に加えて、天然のマイクロＲＮＡ配列の位置１１に対応する部分が付加、欠失又はミスマッチであってもよい。
【０１０６】
修飾されたマイクロＲＮＡ分子は、上記の通り単離、更には精製されているのが望ましい。
【０１０７】
表Ｃ：デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む隣接部分の５０％数：
【表１１】
2008539699.tif 000027
【０１０８】
表Ｄ：デオキシリボヌクレオチド基本単位を含む隣接部分の３０％数：
【表１２】
2008539699.tif 000028
【０１０９】
更に別の実施形態では、キャップを分子の一端、両方の端及び／又は両端の間に結合させ、それにより本発明に係る上記の修飾されたマイクロＲＮＡ分子、又は未修飾の単離されたＤＮＡ若しくはＲＮＡのヌクレアーゼ耐性を増加させることができる。例えば、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに対する耐性を増加させるのが望ましい。ヌクレアーゼ耐性を増加させるのに通常用いられる公知のいかなるキャップを使用してもよい。
【０１１０】
この種のキャップの例としては、逆向きヌクレオチドキャップ及び化学修飾キャップが挙げられる。逆向きヌクレオチドキャップは５’及び／又は３’端に結合させることができる。化学修飾キャップは、分子の一端、両端及び／又は両末端の間に結合させることができる。
【０１１１】
逆向きヌクレオチドキャップとは、修飾されたマイクロＲＮＡ分子又は未修飾ＤＮＡ又はＲＮＡ分子の５’及び／又は３’末端に付着する、３’→５’の核酸配列を指す。その標的ｍＲＮＡにマイクロＲＮＡ分子又は単離されたＤＮＡ又はＲＮＡ分子の結合に干渉しない限り、前記逆向きキャップのヌクレオチドの数には特に上限がない。いかなるヌクレオチドも、逆向きヌクレオチドキャップに使用できる。通常、前記ヌクレオチドキャップは、約４０未満のヌクレオチド長、好ましくは約３０未満のヌクレオチド長、好ましくは約２０未満のヌクレオチド長、更に好ましくは約１０未満のヌクレオチド長である。典型的には、逆向きヌクレオチドキャップは１ヌクレオチド長である。逆向きキャップ構造に用いられるヌクレオチドは通常チミンであるが、他のいかなるヌクレオチド（例えばアデニン、グアニン、ウラシル又はシトシン）でもよい。
【０１１２】
化学修飾キャップは、核酸のヌクレアーゼ耐性を増加させる公知のあらゆる化学基のことを指す。そのような化学修飾キャップの例としては、ヒドロキシアルキル基（アルキルヒドロキシド）又はアミノアルキル基（アルキルアミン）が挙げられる。ヒドロキシアルキル基はしばしばアルキルグリコシル基（例えばエチレングリコール）と呼ばれる。アミノアルキル基はしばしばアミノリンカーと呼ばれる。
【０１１３】
ヒドロキシアルキル基又はアミノアルキル基中の前記アルキル鎖は直鎖状若しくは分岐状のいずれでもよい。前記アルキル鎖中に存在させる最小の炭素原子数は１であり、好ましくは少なくとも２であり、より好ましくは少なくとも約３である。
【０１１４】
前記アルキル鎖に存在させる最大炭素原子数は約１８、好ましくは約１６、より好ましくは１２である。典型的な前記アルキル基としては、メチル、エチル及びプロピル基が挙げられる。前記アルキル基は、１つ以上の水酸基及び／又はアミノ基で更に置換されてもよい。
【０１１５】
表６にリストとして挙げられている前記アミノリンカーは、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ．）から購入可能である。
【０１１６】
単離されたマイクロＲＮＰ：
本発明の別の形態は、上記の単離されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は上記の修飾されたマイクロＲＮＡ分子のいずれかを含んでなる、単離されたマイクロＲＮＰの提供に関する。マイクロＲＮＰ中の、上記の単離されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は修飾されたマイクロＲＮＡ分子は、タンパク質と結合していてもよい。
【０１１７】
かかるタンパク質の例としては、Ａｇｏファミリーに属するタンパク質が挙げられる。Ａｇｏファミリーのタンパク質の例としては、Ａｇｏ１、２、３及び４が挙げられる。典型的には、Ａｇｏ２タンパク質及びマイクロＲＮＡ複合体はＲＮＡｉの標的ｍＲＮＡ裂開を誘導し、一方Ａｇｏ１、３及び４は標的ｍＲＮＡの翻訳を抑制する。
【０１１８】
アンチマイクロＲＮＡ分子：
別の形態では、本発明はアンチマイクロＲＮＡ分子の提供に関する。アンチマイクロＲＮＡ分子は上記の単離されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は上記の修飾されたマイクロＲＮＡ分子であってもよく、但し当該アンチマイクロＲＮＡ分子の塩基配列は、単離されたＤＮＡ若しくはＲＮＡ分子、又は修飾されたマイクロＲＮＡ分子の塩基配列と相補的である。
【０１１９】
アンチマイクロＲＮＡ分子の配列の実施例は、表７及び８に示される。
【０１２０】
表Ｅ：ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のアミノリンカー
【表１３】
2008539699.tif 000029
【０１２１】
表Ｆ：表ＡのマイクロＲＮＡに対するアンチマイクロＲＮＡ配列
【表１４】
2008539699.tif 000030
2008539699.tif 000031
2008539699.tif 000032
【０１２２】
表Ｆ１：表Ａ２のマイクロＲＮＡに対するアンチマイクロＲＮＡ配列
【表１５】
2008539699.tif 000033
2008539699.tif 000034
2008539699.tif 000035
【０１２３】
表Ｆ２：表Ａ４のマイクロＲＮＡに対するアンチマイクロＲＮＡ配列
【表１６】
2008539699.tif 000036
【０１２４】
表Ｆ３：表Ａ６のマイクロＲＮＡに対するアンチマイクロＲＮＡ配列
【表１７】
2008539699.tif 000037
【０１２５】
表Ｆ４：表Ａ８のマイクロＲＮＡに対するアンチマイクロＲＮＡ配列
【表１８】
2008539699.tif 000038
【０１２６】
アンチマイクロＲＮＡ分子は、修飾されたマイクロＲＮＡ分子への使用のために、上記のように修飾されてもよい。一実施態様では、アンチマイクロＲＮＡ分子の隣接部分は、それに対応するマイクロＲＮＡ分子と相補的である。前記アンチマイクロＲＮＡの相補性の程度は、付加、欠失及びミスマッチに関する規定と同様に、ゆらぎ塩基対に関する規定を含め、上記の修飾したマイクロＲＮＡ分子に対する規定と同じ規定に従う。
【０１２７】
好ましい実施形態では、アンチマイクロＲＮＡ分子が未修飾の部分のみを含む場合、アンチマイクロＲＮＡ分子は、少なくとも１０の隣接する塩基中に少なくとも１つの塩基（それはマイクロＲＮＡと非相補的）及び／又は化学キャップを含む。
【０１２８】
他の好ましい実施形態では、アンチマイクロＲＮＡ分子に存在する隣接する少なくとも１０の塩基が、マイクロＲＮＡ分子と完全に（すなわち１００％）相補的である場合は、アンチマイクロＲＮＡ分子は、少なくとも１０の隣接する塩基当たり少なくとも１つの修飾された部分及び／又は化学キャップを含む。
【０１２９】
更に別の実施態様では、天然のマイクロＲＮＡの位置１１に対応する位置の、アンチマイクロＲＮＡ分子における部分は非相補的である。天然のマイクロＲＮＡの位置１１に対応するアンチマイクロＲＮＡ分子の部分は、上記の通り付加、欠失又はミスマッチの導入によって非相補的とすることができる。
【０１３０】
用途：
本発明のマイクロＲＮＡ分子及びアンチマイクロＲＮＡ分子は、非常に多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏの用途に使用可能である。
【０１３１】
例えば、本発明のマイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入し、マイクロＲＮＡの機能を解析してもよい。
【０１３２】
一実施形態では、細胞のマイクロＲＮＡは適切なアンチマイクロＲＮＡ分子により阻害される。あるいは、細胞のマイクロＲＮＡ分子の活性は、１つ以上の追加的なマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入することによって強化することもできる。マイクロＲＮＡの機能は、細胞のマイクロＲＮＡの活性の抑制及び／又は強化に関連する変化を観察することにより推定できる。
【０１３３】
本発明の一形態は、本発明は、細胞のマイクロＲＮＰ活性の阻害方法に関する。細胞のマイクロＲＮＰ活性の阻害方法は、細胞内に一本鎖のアンチマイクロＲＮＡ分子を導入する工程を含んでなる。マイクロＲＮＰにはマイクロＲＮＡ分子が含まれる。上記の規定を前提として、アンチマイクロＲＮＡ分子がマイクロＲＮＰに存在するマイクロＲＮＡに相補的である限り、いかなるアンチマイクロＲＮＡ分子も、細胞のマイクロＲＮＰ活性を阻害する方法に用いることができる。
【０１３４】
本発明のアンチマイクロＲＮＡ分子を宿主細胞のマイクロＲＮＰのマイクロＲＮＡと結合させることによって、マイクロＲＮＰ活性を阻害してもよい。なお、マイクロＲＮＰ活性とは、標的配列の裂開又は翻訳の抑制を指す。前記標的配列は、マイクロＲＮＡの塩基配列と部分的に又は完全に相補的ないかなる配列でもよい。
【０１３５】
例えば、本発明のマイクロＲＮＡ分子及びアンチマイクロＲＮＡ分子は、それらのアンチマイクロＲＮＡ分子又はマイクロＲＮＡと少なくとも部分的に相補的である遺伝子の発現モジュレータとして使用することもできる。例えば、特定のマイクロＲＮＡが細胞の生存に有益である場合、本発明の適当な単離されたマイクロＲＮＡを細胞に導入し、生存を促進することができる。あるいは、特定のマイクロＲＮＡが有害である（例えばアポトーシス誘導、癌誘発など）場合、適切なアンチマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入し、マイクロＲＮＡの活性を阻害してその毒性を軽減することができる。
【０１３６】
マイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチマイクロＲＮＡ分子はいかなる公知の方法によっても細胞に導入できる。例えば、マイクロインジェクションのような方法によりマイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチマイクロＲＮＡ分子を直接細胞に注入できる。あるいは、好ましくは輸送システムの補助を伴いながら前記分子を細胞と接触させることができる。
【０１３７】
使用可能な輸送システムとしては、例えばリポソーム及び荷電した脂質が挙げられる。リポソームは典型的には、それらの中心の水相中にオリゴヌクレオチド分子を封入する。荷電した脂質は、反対の電荷を持つ結果、一般に脂質−オリゴヌクレオチド分子複合体を形成する。
【０１３８】
これらのリポソーム−オリゴヌクレオチド分子複合体又は脂質−オリゴヌクレオチド分子複合体は、通常エンドサイトーシスにより細胞内に取り込まれる。リポソーム又は荷電した脂質は一般に、エンドソームの膜を崩壊してオリゴヌクレオチド分子を放出するヘルパー脂質を含む。
【０１３９】
マイクロＲＮＡ分子又はアンチマイクロＲＮＡを細胞に導入する他の方法としては、例えばデンドリマー、生分解性ポリマー、アミノ酸ポリマー、糖ポリマー及びオリゴヌクレオチド結合性ナノ粒子などの輸送手段の使用法が挙げられる。更に、貯蔵手段としてプルロニック（登録商標）のゲルを用い、長期間にわたるアンチマイクロＲＮＡのオリゴヌクレオチド分子の輸送を可能にしてもよい。上記方法は、例えば、Ｈｕｇｈｅｓら、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｔｏｄａｙ  ６，３０３−３１５（２００１）；Ｂｅｃｋｅｒら、Ｉｎ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｅｓｌｉｅ，Ｒ．Ａ．，Ｈｕｎｔｅｒ，Ａ．Ｊ．＆Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｈ．Ａ．，ｅｄｓ），ｐｐ．１４７−１５７，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓに記載されている。
【０１４０】
特定の細胞に対するマイクロＲＮＡ分子又はアンチマイクロＲＮＡ分子のターゲティングは、いかなる公知の方法によって行ってもよい。例えば、マイクロＲＮＡ分子又はアンチマイクロＲＮＡ分子は、特に細胞上のレセプタによって認識される抗体又はリガンドとコンジュゲートすることができる。
【０１４１】
当該分子はいかなる公知の方法で哺乳類に投与してもよい。適切な投与方法の若干の例としては、経口投与と全身投与とが挙げられる。全身投与は腸内又は非経口的な投与方法が可能である。液体又は固体状（例えば錠剤、ゼラチンカプセル）の製剤を使用できる。
【０１４２】
分子の非経口投与としては、例えば静脈、筋肉、又は皮下への注射が挙げられる。例えば、公知の徐放性投与によって、哺乳類に当該分子を投与してもよい。徐放性投与とは、一定期間にわたり一定の投薬レベルを維持させる薬剤輸送方法である。
【０１４３】
他の投与のルートとしては、経口、局所、気管支内又は鼻腔内への投与が挙げられる。経口投与の場合、液体又は固体状の製剤としてもよい。経口投与に適している製剤の若干の例としては錠剤、ゼラチンカプセル、ピル、トローチ、エリキシル、サスペンション、シロップ及びウェーハが挙げられる。気管支内投与の場合は吸入器スプレーを使用できる。また、本発明の分子の鼻腔内投与による投与は、ネビュライザ又は液霧によって行うことができる。
【０１４４】
本発明の分子を、適切な医薬用の担体中に含有させてもよい。本発明における医薬用担体とは、従来技術において当業者により理解されている賦形剤（ｖｅｈｉｃｌｅ又はｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）と同義であると解される。担体の例としては、澱粉、牛乳、糖、特定の種類の粘土、ゼラチン、ステアリン酸若しくはその塩、ステアリン酸のマグネシウム又はカルシウムによる塩、タルク、植物性脂肪若しくは油、ガム及びグリコールが挙げられる。
【０１４５】
医薬用担体には、安定化剤、界面活性剤（好ましくは非イオン系界面活性剤）、任意に塩及び／又はバッファーのうちの１つ又は２つ以上を含有させてもよい。
【０１４６】
安定化剤としては、グリシンなどのアミノ酸、蔗糖、テトラロース、ラクトース又はデキストランなどのオリゴ糖類が使用可能である。あるいは、前記安定化剤は糖アルコールであってもよく、例えばマンニトール又はその組合せであってもよい。好ましくは、安定化剤の重量は分子の重量に対して約０．１〜約１０重量％である。
【０１４７】
界面活性剤は、好ましくは非イオン系界面活性剤（例えばポリソルベート）である。ポリエチレングリコール又はプルロニックＦ−６８などのポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールを約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約１０％（ｗ／ｖ）含有させるのが望ましい。
【０１４８】
塩又はバッファー試薬としては、それぞれ、例えば塩化ナトリウム又はナトリウム／リン酸カリウムのようないかなる塩又はバッファー試薬も使用可能である。バッファー試薬は、本発明の分子のｐＨを約５．５〜約７．５の範囲で維持するものが望ましい。塩及び／又はバッファー試薬はまた、浸透圧レベルを哺乳類への投与に適する態様に維持するのに有用である前記塩又はバッファー試薬は、約１５０ｍＭ〜約３００ｍＭの範囲でほぼ等張となる態様で添加するのが望ましい。
【０１４９】
前記医薬用担体は、１つ又は２つ以上の従来公知の添加剤を追加的に含有させてもよい。かかる添加剤の例としては、可溶化剤（例えばグリセロール）、酸化防止剤（例えばベンザルコニウム塩化物（第四アンモニウム化合物（「クォート」として公知）の混合物）、ベンジルアルコール、クロレトン又はクロロブタノール、麻酔薬（例えばモルヒネ誘導体）又は等張剤（上記）などが挙げられる。酸化又は他の損傷に対する更なる予防措置として、当該分子は、非浸透性のストッパーでシールしたバイアル中で窒素ガス充填下で充填するのが望ましい。
【０１５０】
本発明のマイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチマイクロＲＮＡ分子の別のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの用途は、診断ツールとしての用途である。この場合には、マイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチマイクロＲＮＡ分子を標識してもよい。
【０１５１】
本発明の分子は、当該技術分野において公知のいかなる方法に従って標識することが可能である。例えば、オリゴヌクレオチドの標識方法は、例えばＬｅａｒｙら、１９８３．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ８０：４０４５；Ｒｅｎｚ及びＫｕｒｚ  １９８４．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３４３５；Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ及びＧｕｍｐｏｒｔ  １９８３．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１１：６１６７；Ｓｍｉｔｈら、１９８５．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：２３９９；Ｍｅｉｎｋｏｔｈ及びＷａｈｌ，Ａｎａｌ．１９８４．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１３８：２６７；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら、（Ｅｄｓ．）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９９の方法に従い行うことができる（各々の開示内容を本願明細書に参照により援用する）。
【０１５２】
放射性標識を行ってもよい。有用な放射性ラベルの例としては、３２Ｐ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ及び３Ｈが挙げられる。放射性ラベルの使用は、英国特許第２０３４３２３号、米国特許第４３５８５３５号及び第４３０２２０４号に記載されている。
【０１５３】
非放射性標識の例としては、酵素及びクロモフォアが挙げられる。有用な酵素標識としては、基質を検出可能な態様に変化させる酵素が挙げられる。有用な酵素とその基質の組合せとしては、例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ（ピロガロール及びｏ−フェニレンジアミン）、β−ガラクトシダーゼ（フルオレセインβ−Ｄ−ガラクトピラノシド）及びアルカリホスファターゼ（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルリン酸塩／ニトロブルーテトラゾリウム）が挙げられる。酵素標識の使用は、英国特許第２０１９４０４号、欧州特許第６３８７９号、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、Ｒｏｔｍａｎ  １９６１．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｄ．ＵＳＡ  ４７：１９８１−１９９１及びＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）に記載されている。
【０１５４】
有用なクロモフォアとしては、例えば蛍光、化学発光及び、生物発光分子並びに色素が挙げられる。本発明において有用なクロモフォアとしては、例えばフルオレセイン、ローダミン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、テキサスレッド、フィコエリトリン、ウンベリフェロン、ルミノールなどが挙げられる。
【０１５５】
公知技術を用いて、本発明の分子に上記標識分子を結合させることができる。分子上の官能基を介して標識を直接させてもよい。プローブは、この種の官能基を含有してもよく、又は含有するに至ってもよい。適切な官能基の一部の例としては、例えばアミノ、カルボキシル、スルフヒドリル、マレイミド、イソシアネート、イソチオシアネートが挙げられる。
【０１５６】
あるいは、酵素及びクロモフォア分子のようなラベルを、カップリング剤（例えばジアルデヒド、カルボジイミド、ジマレイミドなど）を介して分子と結合させてもよい。上記ラベルは、上記の方法によって分子に結合させたリガンドと、ラベルに結合するリガンドに対するレセプタとの相互作用を利用して、分子に結合させてもよい。周知のリガンド−レセプタの組合せのいずれを用いてもよい。例えば、適切なリガンド−レセプタの組合せとしては、ビオチン−アビジン若しくはストレプトアビジン、及び抗体−抗原の組合せが挙げられる。ビオチン−アビジンの組合せが好適である。
【０１５７】
一部のマイクロＲＮＡは、特定の組織又は細胞中で発現させる。様々な組織における本発明のマイクロＲＮＡの発現に関して、表Ｇ及び表Ｇ１に示す。表Ｇ及び表Ｇ１は、ライブラリごとに同定されたマイクロＲＮＡの総数に対する、相対的なクローニング頻度（％）を示す。マイクロＲＮＡの発現に関する表Ｇ及び表Ｇ１を、複数ページにわたり記載する。
【０１５８】
マイクロＲＮＡの発現は、その発現が、他の組織若しくは細胞タイプにおける発現量の約３倍超、好ましくは約４倍超、より好ましくは約５倍超である場合、当該組織若しくは細胞タイプにおいて増強されたと解される。例えば、マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ｍｉｒ−２０ｂは、Ｂ細胞由来のリンパ腫ＢＬ４１（０．０５％の発現）、胚性細胞系／腫瘍ＮＴ２／Ｄ１（０．３７％の発現）、ＮＣＣＩＴ（０．７２％の発現）及びＨｅｋ（０．１３％の発現）において、小細胞副腎癌細胞系ＳＷ１３（黄熱ウイルス感染あり・なし、それぞれ２．０１％及び２．９３％の発現）、延性乳癌ＨＣＣ３８（０．０９％の発現）において発現する。マイクロＲＮＡ  ｈｓａ−ミール−２０ｂの発現は、小細胞副腎癌細胞系ＳＷ１３におけるその発現が他の組織及び細胞タイプのその発現量の約３倍に超えた場合に、増強されたと解される。
【０１５９】
すなわち、例えば本発明のアンチマイクロＲＮＡ分子は、特定の組織若しくは細胞種を検出するプローブとして用いることも可能である。
【０１６０】
例えば、本発明のマイクロＲＮＡ分子及び／又はアンチマイクロＲＮＡ分子を細胞に導入し、マイクロＲＮＡの機能を解析することも可能である。本発明の分子は、適切な医薬用担体中に含有させてもよい。マイクロＲＮＡを含有するサンプルを添加し、そのハイブリダイゼーション形成を検出することができる。例えば、マイクロアレイ技術を用いて癌患者の臨床検体中のマイクロＲＮＡ発現を解析し、特定の癌タイプの危険評価のための診断及びステージングを行うこともできる。
【０１６１】
表Ｇ：各ライブラリにおける、同定されたマイクロＲＮＡの総数に対する相対クローニング頻度（％）
【表１９】
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【０１６２】
表Ｇ１：各ライブラリにおける、同定されたマイクロＲＮＡの総数に対する相対クローニング頻度（％）
【表２０】
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【実施例】
【０１６３】
＜実施例１＞材料及び方法全ＲＮＡ単離、クローニング及びアノテーション
上記の通り全ＲＮＡ１００〜２００μｇから小分子ＲＮＡを単離し、クローニングした。アノテーションは、ＧｅｎＢａｎｋ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｇｅｎｂａｎｌｃ／）、ヒトｔＲＮＡ配列のデータセット（ｈｔｔｐ：／／ｒｎａ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／ＧｔＲＤＢ／Ｈｓ／Ｈｓ−ｓｅｑｓ．ｈｔｍｌ）、ヒトｓｎ／ｓｎｏＲＮＡ配列のデータセット（ｓｎｏＲＮＡ−ＬＢＭＥ−ｄＢはｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ−ｓｎｏｒｎａ．ｂｉｏｔｏｕｌ．ｆｒ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐから、及び非コードｖ１はｈｔｔｐ：／／ｍｂｃｒ．ｂｃｍ．ｔｍｃ．ｅｄｕ／ｓｍａｌｌＲＮＡ／Ｄａｔａｂａｓｅ、ｈｔｔｐ：／／ｎｏｎｃｏｄｅ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｏｒｇ．ｃｎ／から入手）、マイクロＲＮＡレジストリ５．１版及びヒトゲノムアセンブリ１７版の繰り返しエレメントのアノテーション（ＵＣＳＣ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｅ．ｅｄｕ））からの情報に基づいて作成した。細胞系及び脳下垂体組織を、親類の書面による同意の後、死後２時間において解剖した。人の身元はプライバシー保護の理由から明らかにしなかった。ヒトの乳癌細胞系ＭＣＦ７及びＳｋＢｒ３を、Ｄｒ．Ｎｅａｌ  Ｒｏｓｅｎ（Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ−Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ，ＮＹ）から贈与され、それをＤＭＥ：１００単位／ｍｌペニシリン添加Ｆ１２培地の１：１混合液中で維持し、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、４ｍＭのグルタミン及び１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、５％のＣＯ２、３７℃の条件においてインキュベートした。ヒト神経芽細胞腫細胞ＢＥ（２）−Ｍ１７（ＡＴＣＣ：ＣＲＬ−２２６７）を、ＯｐｔｉＭｅｍ：Ｆ１２培地の１：１混合液中で維持し、非必須アミノ酸を添加し、１０％の熱不活性化ウシ胎児血清、５％のＣＯ２、３７℃の条件においてインキュベートした。
【０１６４】
＜実施例２＞新規ｍｉＲＮＡ遺伝子の予測
保存性フィルタ、並びにヘアピンの構造特性及びフォールディングエネルギーを用いて、マイクロＲＮＡ前駆体を予測した。これらの予測されたシーケンスをヒトの組織及び細胞系からのクローニング結果、並びに他の哺乳類で実験的に検査したマイクロＲＮＡの配列と比較した。類似性を考察する際、我々はＲｆａｍ（ヒトのエントリーの４５％以上が他の哺乳類のマイクロＲＮＡとの類似性でサポートされている）に従った。表１は立証された予測部分を示す。図２Ａは、ヒトの組織からのクローニングにより立証された追加メンバーを含む、ｍｉＲ−２００のクラスタの範囲を示し、ｍｉＲ−２００ａから約１０００ヌクレオチド下流に位置する（表１）。図２ＢはｍｉＲ−３６９の付近における更に２つのマイクロＲＮＡ遺伝子の同定を示し、１つはクローニングによって立証され、もう１つはマウスホモロク（以下の表１）との配列類似性でサポートされている。
【０１６５】
表１：周知のマイクロＲＮＡの付近の、予測されたマイクロＲＮＡ遺伝子の裏づけとなる証拠
【表２１】
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１．前駆体の座標を列記する。予測されたｍｉＲＮＡがすでに周知のｍｉＲＮＡクラスタの付近に存在するとき、全集団の座標を、第１のｍｉＲＮＡの前駆体の第１の座標から最後のｍｉＲＮＡの前駆体の端座標の順で列記する。
２．染色体番号、ストランド及び座標は、２００３年７月の、ＵＣＳＣからのヒトゲノムアセンブリ  ビルド３４（ｈｇ１６）（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）から得た。
３．予測されたｍｉＲＮＡｓの座標が、周知のクラスタメンバーと同じ染色体及びストランドに存在する。
４．クローニングされた４つのｍｉＲＮＡｓに新規な名称を付与した。前駆体の両ステムからのｍｉＲＮＡｓを同定して我々の予測とマッチしたとき、３ｐ及び５ｐとして示した。
５．類似性に基づく裏付けには３種類存在する。
【図面の簡単な説明】
【０１６６】
【図１】本発明に係る修飾されたヌクレオチド単位を示す。Ｂは、核酸塩基のアデノシン、シチジン、グアノシン、チミン又はウリジンのいずれか１つを意味する。
【図２Ａ】周知の及び予測されたヒトマイクロＲＮＡの保存性パターン。保存性パターンは、ＵＣＳＣ  ｐｈａｓｔＣｏｎｓスコア（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ）に基づく。両側部に更に３０００のフランキングヌクレオチドを有するマイクロＲＮＡの染色体領域を示す。染色体座標は、ＵＣＳＣ（ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｏｍｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／）からのヒトゲノムのビルド３４アセンブリ（ｈｇｌ６）に従う。説明の簡略化のため、Ｘ軸は相対位置を示す。周知のマイクロＲＮＡは、「ｈｓａ」接頭辞を省略してそれらのＲｆａｍ名により示す。予測されたマイクロＲＮＡを、次の２つのカテゴリに分類する。（１）立証された予測：これらの予測は本試験において実験的に立証されているもの。（２）新規な予測：これらの予測は試験を行っていない。マイクロＲＮＡの方向を矢印で示す。周知の一対のクラスタにわたるマイクロＲＮＡ予測の例。
【図２Ｂ】新規なマルチメンバークラスタの解析を示す。図は、一定の比率でプロットされていないため、保存領域の幅は示された領域の長さの関数であり、より長い領域の場合ではより狭いプロフィールとなって表れる）。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【手続補正書】
【提出日】平成20年4月1日(2008.4.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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