(57)【要約】  幹細胞ならびに胚形成および発癌に特異的な他の細胞を同定し、組織試料を分類し、前癌および癌またはアテローム硬化症病変を診断し、制癌剤の価値を検査し、特定の細胞型で特異的に発現される高分子を発見し、回復組織療法において幹細胞を使用する方法、ならびに異形性核形態型がインタクトであるように組織試料を調製する方法が、開示される。
2008503726.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）組織試料中いたるところに分布する細胞の核を視覚化する工程であって、ここで組織試料は約50ミクロンまでの最大直径を有する核における核構造の完全性を実質的に保存する方法によって調製される、工程；ならびに
ｂ）一つまたは複数の種類の核形態型の存在および／または非存在を決定する工程であって、ここで核形態型が発生または病理の段階と関連する、工程
を含み、それによって一つまたは複数の特定の種類の核形態型の存在または非存在に基づいて組織試料を特徴付ける、組織試料の発生または病理の段階を特徴付ける方法。
【請求項２】
組織試料が外科的切除によって得られる、請求項１記載の方法。
【請求項３】
組織試料が物理的または化学的に固定される、請求項１記載の方法。
【請求項４】
組織試料が凍結される、請求項３記載の方法。
【請求項５】
組織試料が、アルコール、アルデヒド、有機酸およびそれらの組合せからなる群より選択される1つ以上の化学的固定剤で処理される、請求項３記載の方法。
【請求項６】
固定剤がメタノールおよび酢酸を含有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
組織試料が核の細胞性分解の前に固定される、請求項３記載の方法。
【請求項８】
組織試料の細胞が、組織の浸軟および伸展によって部分的に解離する、請求項１記載の方法。
【請求項９】
組織試料の細胞または高分子が染色され、それによって核の視覚化が可能になる、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
DNAが染色され、それによって核の視覚化が可能になる、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
組織試料が30分の外科的除去のうちに固定される、請求項２記載の方法。
【請求項１２】
組織試料が多細胞動物から得られる、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
多細胞動物が脊椎動物である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
脊椎動物が哺乳動物である、請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
哺乳動物が、霊長類、齧歯動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ブタ、ヒツジ、ウシおよびウサギからなる群より選択される、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
哺乳動物がヒトである、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
発生の段階が、発生の胚形成期、胎児期、新生児期、幼若期および成体期の段階からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
1つまたは複数の特定の種類の核形態型の存在または非存在が、正常、新生物発生前、新生物および転移からなる群より選択される組織試料の指標である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
核形態型の1つまたは複数の種類が、ベル形、葉巻形、凝縮した球形、球形、楕円形、ソーセージ形、腎臓形および弾丸形からなる群より選択される、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
ｃ）組織試料内の1つ以上の種類の核形態型の空間的または数的分布を決定する工程
をさらに含む請求項１記載の方法であって、ここで1つ以上の種類の核形態型の空間的または数的分布が組織試料をさらに特徴付ける、方法。
【請求項２１】
特定の空間的または数的分布が、正常、新生物発生前、新生物または転移組織の指標である、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
核が多核合胞体または単核細胞に含まれる、請求項１記載の方法。
【請求項２３】
ベル形、葉巻形または弾丸形の核の存在が、新生物発生前、新生物または転移の指標である、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
多核合胞体の出現が新生物または転移の指標である、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
無糸対称核分裂の指標である構造が、新生物または転移の指標である、請求項２３記載の方法。
【請求項２６】
ベル形の核の存在、無糸対称核分裂の非存在および多核合胞体の非存在が新生物発生前の指標である、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
血管壁組織中の非球形および非楕円形の核の存在が初期のアテローム硬化症状態の指標である、請求項１記載の方法。
【請求項２８】
目的の細胞または目的の多核合胞体を同定する方法であって、ここで細胞または合胞体は細胞培養物もしくは組織試料から得られるか、または細胞培養物もしくは組織試料に含まれ、目的の細胞または目的の合胞体は、核形態型を視覚化することによって同定され、目的の細胞または合胞体は異形性核形態型を含む、方法。
【請求項２９】
細胞または多核合胞体が組織試料から単離される、請求項２８記載の方法。
【請求項３０】
細胞または多核合胞体が圧力支持レーザー顕微解剖によって単離される、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
細胞または多核合胞体が、培養物中の細胞の集団において同定される、請求項２８記載の方法。
【請求項３２】
細胞または多核合胞体が組織試料において同定される、請求項２８記載の方法。
【請求項３３】
細胞または合胞体が、1つ以上の無糸核分裂複合体を含む、請求項２８記載の方法。
【請求項３４】
細胞が、細胞の多細胞集合体内に存在する、請求項２８記載の方法。
【請求項３５】
細胞が、多細胞集合体のクラスター内に存在する、請求項２８記載の方法。
【請求項３６】
異形性核形態型形状の種類が、ベル形、葉巻形、凝縮した球形、球形、楕円形、ソーセージ形、腎臓形および弾丸形からなる群より選択される、請求項２８記載の方法。
【請求項３７】
請求項２８記載の方法によって単離される、目的の細胞または合胞体。
【請求項３８】
請求項３７記載の細胞に特異的な1つ以上の高分子マーカーを同定する方法であって、ここでマーカーが、発生または病理の特定の段階の指標である、方法。
【請求項３９】
高分子マーカーが抗原、細胞表面マーカー、核酸、タンパク質、リン酸化タンパク質またはグリコサミノグリカンである、請求項３８記載の方法。
【請求項４０】
請求項３９記載の方法によって同定される1つ以上の高分子マーカーの同定を含む、新生物発生前または新生物を診断する方法であって、ここで成体組織における1つ以上の高分子マーカーの同定が新生物発生前または新生物の指標である、方法。
【請求項４１】
ａ）腫瘍を有する哺乳動物を、1つ以上の候補薬剤で処理する工程；
ｂ)該哺乳動物から得られた腫瘍試料内に含まれる細胞の核形態型を決定する工程；および
ｃ)候補抗腫瘍形成剤で処理した哺乳動物由来の細胞の核形態型を、腫瘍を有するが候補抗腫瘍形成剤で処理していない哺乳動物から得られた細胞と比較する工程
を含み、ここで新生物の核形態型を含む細胞の排除が、薬剤の抗腫瘍形成剤としての有効性の指標である、1つ以上の抗腫瘍形成剤を同定する方法。
【請求項４２】
新生物の核が、ベル形の核、葉巻形の核および弾丸形の核からなる群より選択される、請求項４１記載の方法。
【請求項４３】
核形態型の変化が、ベル形の核の排除を含む、請求項４２記載の方法。
【請求項４４】
哺乳動物が齧歯動物である、請求項４１記載の方法。
【請求項４５】
齧歯動物がラットまたはマウスである、請求項４４記載の方法。
【請求項４６】
核が合胞体中に配置され、新生物の核形態型の排除が合胞体の破壊を含む、請求項４１記載の方法。
【請求項４７】
培養された腫瘍組織または細胞試料を1つ以上の候補薬剤で処理する工程、および試料中に含まれる細胞の核形態型を評価する工程を含み、ここで細胞が異形性核形態型を含み、抗腫瘍形成剤の非存在下では培養された腫瘍細胞はその異形性核形態型を維持し、新生物の核形態型の排除が薬剤の抗腫瘍形成剤としての有効性の指標であり、新生物発生前の核形態型の排除が腫瘍予防剤の指標である、1つ以上の抗腫瘍形成剤を同定する方法。
【請求項４８】
変化した核形態型が、ベル形の核、葉巻形の核および弾丸形の核からなる群より選択される1つ以上の核形態型の排除を含む、請求項４７記載の方法。
【請求項４９】
核形態型の変化がベル形の核の排除を含む、請求項４８記載の方法。
【請求項５０】
核が合胞体中に配置され、新生物の核形態型の排除が合胞体の破壊を含む、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
ａ）組織試料の細胞シートの細胞接着を破壊する工程；および
ｂ）破壊された接着を有する細胞を硬い表面に伸展させる工程
を含み、ここで細胞の核の構造的完全性がインタクトであり続け、そのため試料を異形性核形態型細胞の同定に適切にさせる、約50ミクロンまでの最大直径を有する核を含む細胞の同定に適切な哺乳動物組織試料を調製する方法。
【請求項５２】
組織試料が層に区分され、ここで、得られる層が細胞の厚さを超える、請求項５１記載の方法。
【請求項５３】
組織試料が、約0.5ミリメートルの顕微鏡スライド上に層を形成する、請求項５２記載の方法。
【請求項５４】
組織試料が、約50ミクロンより大きい層を形成する、請求項５２記載の方法。
【請求項５５】
細胞接着が化学的に破壊される、請求項５１記載の方法。
【請求項５６】
細胞接着の化学的破壊が、45％酢酸での処理を含む、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
組織試料がヒト組織試料である、請求項５１記載の方法。
【請求項５８】
細胞シートが面積約1 mm2である、請求項５１記載の方法。
【請求項５９】
硬い表面が顕微鏡スライドである、請求項５１記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本願は、2004年6月17日出願の米国仮出願第60/580,575号の恩恵を主張する。上記出願の全教示は、参照によって本明細書中に援用される。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
動物の胚、胎児、新生児および幼若期の成長および分化につながる過程は、腫瘍に先立ちかつ腫瘍を作り出す細胞型の成長および分化につながる過程と、ある種の特徴を共有している。腫瘍および胎児における抗原分子を認識する方法によって、成体器官では観察されないが胎児および腫瘍の両方で観察できる多くの分子があることが示されている。19世紀には、腫瘍は成体に残った胚細胞から生じ得ると主張されていた。現在の意見では、胚性幹細胞から腫瘍を生じさせる腫瘍幹細胞を作り出す成体幹細胞までの直系の遺伝において遺伝子の変化が生じる、自己再生する幹細胞の存在が指摘されている。議論を要約すると、単一の正常な組織幹細胞は、次には腫瘍を発足させる幹細胞を生じさせ、次にはクローン転移および腫瘍の移植を発足させる幹細胞を生じさせる、新生物発生前病変の前駆体であり得る。新生物発生前病変、腫瘍および転移における組織学的に区別し得る細胞型の明確な存在に基づき、および発生学的成長および発生への類似性によって、組織、新生物発生前病変、腫瘍および転移の起源となる幹細胞は、分化ならびに自己再生成長することができるに違いないと推論される。腫瘍成長の幹細胞説が正しければ、腫瘍幹細胞を同定、分取、分類および操作する、はなはだしい必要性がある。しかしながら、かかる細胞の同定または単離は、当該分野において、説明されていない。
【０００３】
（発明の概要）
本発明は、細胞培養物、組織、新生物発生前病変または腫瘍試料中の器官特異的および／または腫瘍幹細胞ならびに他の特異的細胞形態を、同定する過程および分類する方法から引き出される。本発明は、細胞培養物、組織、新生物発生前病変または腫瘍試料中の全ての細胞の間の、多細胞集合体および多核合胞体における、核形態型、核分裂の様式、および特定の形態型の核の関与を決定する過程、ならびに、特定の核形態型のみに基づく器官特異的または腫瘍幹細胞の同定に関する。結腸陰窩または肝実質等の正常な成体組織にはない、胎児組織、新生物発生前病変（結腸の腺腫）および新生物病変または腫瘍（結腸の腺癌、膵臓の癌腫）中の複数の形態（核形態型）の、明確で再現性のある非球形の核が観察された。本明細書中に開示されるこれらの核形態型は、ヒト組織の組織学または病理学の史上でこれまでに報告されていない大きさおよび形状の核を含んでいた。
【０００４】
胎児および新生物組織における核の形態または形態型は、成体組織で一般に見られる球形および楕円形の核形態を含んでいたが、大きさが40ミクロンの「ソーセージ形」からより短い（約8〜20ミクロン）の「葉巻形」、「弾丸形」および「腎臓形」、直径約4ミクロンの「凝縮した球形」の核までの範囲である、多様な組の再現性のある形態型も呈した。ある注目すべき、これまでに報告されていない核形態型は、「ベル形」と名づけられた、開いた「口」を有するカップまたはベルの形態を有していた。これらのベル形の核は、2つの積み重ねた紙のカップの分離に似た、対称核分裂において観察された。
【０００５】
これらの「カップからカップ」の分裂はまた、これらが無糸分裂であり、例えば有糸分裂におけるような全てのヒト染色体の凝縮および分離を伴わない点においても、注目すべきであった。これらは、2つの見かけ上同一なベル形の核がカップからカップの分裂の結果として生じる限りにおいては、対称核分裂であった。これらのベル形の核はまた、ベル形の核が他の核形態型のうちの1つの囲まれた核を生じさせると思われる、無糸非対称核分裂を経ることが観察された。この元々のベル形の核および異なる形態型の核の生成は、非対称核分裂の、第一の公知の視覚化である。ベル形の核を伴う非対称無糸細胞分裂におけるベル形の核と異なる異形性核形態型の出現は、本明細書中に開示されており、ベル形の核を有する細胞の表現型と異なる異形性核形態型を有する細胞を、明確に定義する。
【０００６】
非対称核分裂は、正常な発生における幹細胞の必要な特徴として広く認められている。胎児組織、新生物発生前および新生物の両方に共通する核形態型の発見は、腫瘍が胚の表現型、具体的には誘導された分化した細胞表現型を有するクローン集団を形成する幹細胞の再発現であるという仮説に関係がある。幹細胞を同定する核形態型は、染色されたDNA像がDNA含有構造で完全に覆われた核を示す胎児組織または腫瘍試料中で、染色されたDNAが全ての他の核形態型から容易に分化する中空構造を作り出す、ベルまたはカップ形の核として出現する。
【０００７】
さらなる観察によって、腺癌および胚が、有糸分裂装置の出現がないベル形の核の対称および非対称核分裂の同一な過程と思われるものから生じる、種類の異なる核形態型を有する細胞の系統を部分的に共有しているという発見が確認され、拡張された。初期胚から胎児および幼若期までの成長、成体器官へのこれらの核形態の出現および消失ならびに発癌における再出現の図式は不完全であるが、癌の予防および療法におけるこれらの研究結果の潜在的な価値は明らかに重要であり、癌、および同じくゆっくりと増殖するモノクローナルコロニーから生じるアテローム硬化症等の他の疾患の、診断および治療に利益を提供する。例えば複雑な組織および器官の回復推進療法等の適用のために、これらのベル形の核を独立して成長させることから、利益が期待される。
【０００８】
正常および腫瘍組織においてその核形態型、核分裂の様式および／または多核構造への関与によって、これまで幹細胞として認識されていなかったこれらの細胞を特異的に同定する、本明細書中に記載される過程の価値は、明らかである。特許請求される過程は、幹細胞ならびに他の胎児および腫瘍特異的核形態型を特異的に認識することを可能にし、それらの単離および研究を可能にし、多くの信頼できそうな癌の予防または治療養生法のいずれが効果的であるかを発見する検査におけるそれらの使用を提供する。本明細書中に記載される方法はまた、ヒト組織および器官の再生および移植療法（例えば、組織修復療法）のための特異的幹細胞を発見する手段も提供する。
【０００９】
ある態様において、本発明は、ａ）組織試料のいたるところに分布した細胞の核を視覚化する工程であって、ここで、実質的に全ての約50ミクロンまでの最大直径を有する核の構造の完全性が実質的に保存される方法によって組織試料が調製される、工程；およびｂ）一つまたは複数の種類の核形態型の存在および／または非存在を決定する工程であって、ここで特定の種類の存在または非存在が発生または病理の段階指標である、工程、を含む、発生または病理の段階に関連する核構造に基づいて細胞または組織試料を特徴付ける（例えば、分類する）方法に関する。ある態様において、組織試料は、外科的切除によって得られる。特定の態様において、組織試料は、物理的（例えば、凍結される）または化学的に固定される（例えば、アルコール、アルデヒド、有機酸、ならびに例えばメタノールおよび酢酸等のそれらの組み合わせからなる群より選択される、1つ以上の化学的固定剤で処理される）。特定の態様において、組織試料は、核の細胞性分解の前に固定される。別の態様において、組織試料の細胞は、組織の浸軟および伸展によって部分的に解離する。ある態様において、組織試料の細胞または高分子が染色され、それによって、核の視覚化が可能になる。別の態様において、DNAが染色され、それによって核の視覚化が可能になる。別の態様において、組織試料は、30分の外科的切除のうちに固定される。
【００１０】
別の態様において、組織試料は、多細胞動物（例えば、脊椎動物、例えば、哺乳動物、例えば霊長類、齧歯動物、イヌ科動物、ネコ科動物、ブタ、ヒツジ、ウシおよびウサギ）から得られる。特定の態様において、哺乳動物はヒトである。
【００１１】
特定の態様において、一つまたは複数の特定の種類の核形態型の存在または非存在は、発生の特定の段階（例えば、発生の胚形成期、胎児期（器官発生）、新生児期、幼若期および成体期）の指標である。別の態様において、一つまたは複数の特定の種類の核形態型の存在または非存在は、正常、新生物発生前、新生物および転移からなる群より選択される組織試料の指標である。核形態型の一つまたは複数の種類は、ベル形、葉巻形、凝縮した球形、球形、楕円形、ソーセージ形、腎臓形および弾丸形からなる群より選択される。
【００１２】
別の態様において、本発明の方法は、組織試料内の1つ以上の種類の核形態型の空間的または数的分布を決定する工程をさらに含み、ここで1つ以上の種類の核形態型の空間的または数的分布は、組織試料をさらに特徴付ける。特定の空間的または数的分布は、正常、新生物発生前、新生物または転移組織の指標である。
【００１３】
本発明の別の態様において、核は、多核合胞体中または単核細胞中に含まれ、ここで組織試料は成体組織である。ある態様において、ベル形、葉巻形または弾丸形の核の存在は、新生物発生前、新生物または転移の指標である。別の態様において、多核合胞体の出現は、新生物または転移の指標である。ある態様において、無糸対称核分裂を示す構造が、新生物または転移の指標である。別の態様において、ベル形の核の存在および多核合胞体の非存在は、新生物発生前の指標である。さらに別の態様において、血管壁組織中の非球形および非楕円形の核の存在は、初期のアテローム硬化症状態の指標である。
【００１４】
別の態様において、本発明は、細胞培養物または組織試料中の目的の細胞または目的の多核合胞体を同定する方法に関し、ここで、目的の細胞または目的の合胞体は、核形態型を視覚化することによって同定され、ここで目的の細胞は異形性核形態型を含む。特定の態様において、細胞または多核合胞体は、組織試料から単離される。別の態様において、細胞または多核合胞体は、顕微解剖、例えば圧力支持レーザー顕微解剖によって単離される。ある態様において、目的の細胞または多核合胞体は、培養物中の細胞の集団において同定される。別の態様において、目的の細胞、または多核合胞体は、組織試料において同定される。別の態様において、目的の細胞または目的の合胞体は、1つ以上の無糸核分裂複合体を含む。さらに別の態様において、目的の細胞は、細胞の多細胞集合体内に存在する。特定の態様において、目的の細胞は、多細胞集合体のクラスター内に存在する。
【００１５】
別の態様において、本発明は、本明細書中に開示される方法によって単離または同定された目的の細胞に関する。ある態様において、本発明は、本明細書中に開示される方法によって単離または同定された目的の細胞を使用して、目的の細胞に特異的な1つ以上の高分子マーカーを同定する方法に関し、ここでマーカーは発生または病理の特定の段階の指標である。特定の態様において、高分子マーカーは、抗原、細胞表面マーカー、核酸、タンパク質、リン酸化タンパク質またはグリコサミノグリカンである。
【００１６】
別の態様において、本発明は、1つ以上の高分子マーカーの同定を含む、新生物発生前または新生物を診断する方法に関し、ここで成体組織における1つ以上の高分子マーカーの同定は、新生物発生前または新生物の指標である。
【００１７】
別の態様において、本発明は、ａ）腫瘍を有する哺乳動物を、1つ以上の候補薬剤で処理する工程；ｂ）該哺乳動物から得られた腫瘍試料内に含まれる細胞の核形態型を決定する工程；およびｃ）候補抗腫瘍形成剤で処理した哺乳動物由来の細胞の核形態型を、腫瘍を有する哺乳動物由来だが候補抗腫瘍形成剤で処理していない細胞と比較する工程を含む、1つ以上の抗腫瘍形成剤を同定する方法に関し、ここで、新生物の核形態型を含む細胞の排除が薬剤の抗腫瘍形成剤としての有効性の指標である。特定の態様において、新生物の核は、ベル形の核、葉巻形の核および弾丸形の核からなる群より選択される。別の態様において、核形態型の変化は、ベル形の核の排除を含む。ある態様において、哺乳動物は齧歯動物（例えば、ラットまたはマウス）である。特定の態様において、核は合胞体中に配置され、新生物の核形態型の排除は合胞体の破壊を含む。
【００１８】
別の態様において、本発明は、培養された腫瘍組織または細胞試料を、1つ以上の候補薬剤で処理する工程および腫瘍組織に含まれる細胞の核形態型を評価する工程を含む、1つ以上の抗腫瘍形成剤を同定する方法に関し、ここで、細胞は異形性核形態型を含み、抗腫瘍形成剤の非存在下では培養された腫瘍細胞はその異形性核形態型を維持し、新生物の核形態型の排除は薬剤の抗腫瘍形成剤としての有効性の指標であり、新生物発生前の核形態型の排除は腫瘍予防剤の指標である。特定の態様において、変化した核形態型は、ベル形の核、葉巻形の核および弾丸形の核からなる群より選択される1つ以上の核形態型の排除を含む。ある態様において、核形態型の変化は、ベル形の核の排除を含む。ある態様において、核は合胞体中に配置され、新生物の核形態型の排除は、合胞体の破壊を含む。
【００１９】
別の態様において、本発明は、ａ）組織試料の細胞シートの細胞接着を破壊する工程；およびｂ）破壊された接着を有する細胞を硬い表面に伸展させる工程を含む、約50ミクロンまでの最大直径を有する核を含む細胞の同定に適切な哺乳動物組織試料を調製する方法に関し、ここで、細胞の核の構造的完全性はインタクトなままであり、そのため試料が、異形性核形態型細胞の同定に適切になる。ある態様において、組織試料は層に区分され、ここで、得られる層は細胞の厚さを超える。別の態様において、組織試料は、約0.5ミリメートルの顕微鏡スライド上に層を形成する。特定の態様において、組織試料は、約50ミクロンより大きい層を形成する。別の態様において、組織試料の細胞接着は、化学的に破壊される（例えば、45％酢酸での処理によって）。特定の態様において、固定された、化学的に破壊された拡散前の組織試料は、面積が約1 mm2である。特定の態様において、組織試料は、ヒト組織試料である。特定の態様において、細胞シートは、面積が約1 mm2である。別の態様において、硬い表面は、顕微鏡スライドである。
【００２０】
（図面の簡単な説明）
特許または出願の資料は、カラーで製作された、少なくとも1つの図面を含む。カラーの図面を含むこの特許または特許出願の刊行物のコピーは、要請および必要な料金の支払いに応じて、官庁によって提供されよう。
【００２１】
（発明の詳細な説明）
本発明は、胎児腸（5〜7週齢）、結腸腺腫および腺癌における、そのいくつかは正常な（非新生物）成体結腸には存在しない、種類の異なる形態を有する大きな細胞核の、予想されなかった発見に関する。これらの「異形性核形態型」（例えば、成体器官の細胞の正常に球形または楕円形の核とは異なる核形態型）は、胚組織において観察され、成体組織においてはめったにしか観察されなかった。ある注目すべき核形態型は、中空のベルのような形状の核を有する（高さおよそ10〜15ミクロンおよびベル開口部直径およそ7〜12ミクロン）。これらのベル形の構造は、2つの紙カップの分離に似た無糸分裂の過程によって、対称に分裂するようである。さらに、少なくとも7つの他の核形態が非対称無糸分裂におけるベル形の核から現れるのが観察された。これらの誘導された核形態を含む細胞は、続いて、胚、腺腫および腺癌において同一な核形態型のクローン集団を形成する有糸分裂によって分裂する。ベル形の核を有する細胞は、このように、胚腸、腺腫および腺癌における正味の成長および分化の両方の原因となっているようであり、胚形成および発癌における、発生の、多型潜在能のある幹細胞のための要件を満たすようである。成体組織とは異なり、胚／胎児組織試料における、正味の幹細胞の成長および分化に理論的に必要とされる対称および非対称無糸分裂の両方を実証する細胞におけるベル形の核の、特異的な他と異なる発生によって、顕微鏡組織学／病理学の分野の当業者は、細胞を、それらの核形態に従って幹細胞または非幹細胞として分類できるようになる。
【００２２】
発生学および腫瘍学の両方が共有する概念は、細胞分裂が2つの同一な前駆体「幹」細胞を生じる対称細胞分裂による正味の成長および1つの前駆体「幹」細胞および1つの分化した細胞を生じる非対称細胞分裂による分化が可能な前駆体「幹」細胞から生じた特定の器官に由来する器官および腫瘍において、複数の細胞型が観察されるということである。この分化した細胞は、次いでさらなる回数分裂して、結果として分裂しない最終段階およびそれに続くプログラムされた細胞死に達する、多数の分化した細胞を作り出す。より高度に分化した2つの細胞に細胞が分化する場合、「消滅」分裂が起こる。
【００２３】
用語「幹細胞」は、科学文献において、多くの異なるレベルの定義を有する。一般に、これは、未分化または部分的に分化した表現型を維持する細胞の組を含むよう意図されるが、特定の環境においては異なる表現型を有する細胞を生じさせ得る。一般的な用語および本明細書中で使用されるより特殊な用語の使用は、幹細胞の型を、本明細書中に開示される教示を含む科学的観察に基づいて区別する。
【００２４】
用語「胚性幹細胞」は、本明細書中で使用される場合、通常の有糸分裂によって分裂し、子宮環境に移植した際に完全な胎盤および胎児を生じさせ得る、初期哺乳動物胚における細胞の組を含む。これらはそのため、「多能性」として特徴付けられる。かかる細胞は、エクスビボで培養され得、有糸分裂によって分裂し、それぞれが胎盤および胎児を生じさせることができる非常に多くの胚性幹細胞を形成する。任意の胚性幹細胞が、成長する哺乳動物の胎児、新生児、幼若または成体動物においてそのまま存続するかどうかは知られていない。成体哺乳動物における組織のいたるところに見られる未分化な細胞のある種のクラスターが、多能性胚性幹細胞のコロニーを呈することが可能である。核形態型に関して、この形態の幹細胞は、球形または球形に近い核を含む。
【００２５】
用語「胎児〜幼若幹細胞」は、本明細書中で使用される場合、妊娠の5週目までにヒト胎児において、ならびにベル形の核を含むヒト新生物発生前、新生物および転移病変において観察される、細胞および多核合胞体の組を含む。本明細書中で使用される場合、「合胞体」は、細胞の隔膜を欠いた多核構造である。複数の核が存在するが、それらは膜によって合胞体内の個々の区画に分離されていない。胎児幼若幹細胞は、2つの同一なベル形の核を作り出す対称核分裂、ならびに1つのベル形の核、および例えば腎臓形、葉巻形、ソーセージ形、楕円形または球形の核等の、次いで有糸分裂によって数が増加する、組織および腫瘍試料において観察されるいくつかの異形性核形態型のうちの1つの核を作り出す非対称核分裂の両方を経る。ベル形の核の、対称および非対称核分裂の両方は、ゲノムの染色体としての一般的な凝縮がなく、有糸分裂の紡錘の形成がなく、1世紀以上にわたって観察されてこれまでは哺乳動物細胞（哺乳動物の腫瘍を含む）における核分裂に関連性のある唯一の形態であると考えられていたような前期、中期、後期および終期におけるような染色体の凝縮または分離がない限りは、無糸分裂である。対称分裂は、胎児〜幼若幹細胞の正味の成長を可能にし、おそらく一生のうちの胎児、新生児期および幼若期を通して組織および器官の成長を占める。胎児〜幼若幹細胞の非対称分裂は、代わりの表現型を有する細胞の生成を可能にし、おそらく発生および成長中の器官の実質を含む分化した細胞型を占める。核形態型が細胞および／または核の認識可能な特徴である限りは、核形態型の異なる細胞は、核形態型以外の特徴を参照することなく、細胞または核の表現型が異なるとして特徴付けられ得る。
【００２６】
用語「成体維持幹細胞」は、本明細書中で使用される場合、規則的な非対称細胞分裂、それに続く有糸分裂および最終的にはプログラムされた細胞死によって、例えば結腸陰窩等の分化した細胞組織の分化したターンオーバー単位を定義する、最初の移行細胞を生じる細胞の理論的な形態を含む。成体維持幹細胞の同じ非対称分裂もまた、新しい成体維持幹細胞を作り出す。陰窩の基部における観察される胎児〜幼若幹細胞に特徴的なベル形の核を有する結腸陰窩はごくわずかしか観察されていないので、胎児〜幼若幹細胞核は幼若器官の正味の成長の休止および一生のうちの成体期の開始を区分する変態を経ると結論付けるのが妥当である。成体維持幹細胞の非対称分裂が実際は有糸分裂か無糸分裂かは知られていない。
【００２７】
用語「新生物発生前幹細胞」は、本明細書中で使用される場合、腺腫結腸陰窩の基部に見られる、観察されるベル形の核を含む単核細胞を説明する。これらの細胞は、同一の核形態型の細胞の小さい集合体、クラスターを作り出す各集合体が同じ形態型の核を含み、異なる集合体が異なる形態型の核を含むかかる集合体の大きいクラスター、および結腸新生物発生前病変の小領域において、観察される。これらの細胞は、「肩から肩」の関係で配置された核を有し得る。ベル形の核を含む合胞体はヒト結腸新生物発生前病変において観察されておらず、およそ由来する幼若組織の成長速度での新生物発生前病変の遅い成長と一致していると解釈される状態である対称核分裂においても個々のベル形の核は観察されていない。
【００２８】
用語「新生物幹細胞」または「腫瘍幹細胞」は、本明細書中で使用される場合、癌性腫瘍、例えばヒト結腸の腺癌、結腸腫瘍の転移およびヒト膵臓の腫瘍で見られるベル形の核を含む。これらの新生物幹細胞は、観察される新生物発生前の多細胞集合体の全てにそれらが存在することによって、新生物発生前幹細胞から分化するが、また、多核管状合胞体における無糸対称核分裂によって分裂することが、見つかっており、わかっている。腫瘍に見られる合胞体は、初期胎児腸組織において観察されるものよりも範囲が狭いが、対称核分裂を経る合胞体およびベル形構造は、新生物発生前および新生物の組織を明らかに識別する特徴であるように思われる。
【００２９】
本明細書中に記載される異形性核形態型はまた、例えば組織試料、または培養物中で成長した細胞由来の、細胞および合胞体においても見ることができる。本明細書中に記載される方法を任意の組織試料に適用して、異形性核形態型を含む細胞または合胞体を同定し得る。特に、腫瘍組織試料を用いて、異形性核形態型を同定および数えることができる。
【００３０】
本明細書中で使用される場合、「腫瘍」は、保有者に有益な生理学的機能を果たさない細胞の進行性の増殖から生じる、組織の異常な成長をいう（「新生物」ともいう）。「良性」腫瘍は、周囲の組織の侵襲のない、原発の部位に限定された腫瘍である。良性腫瘍は侵襲も転移もしないが、悪性腫瘍は、周囲の組織の侵襲および転移によって拡散し得るか、拡散するものである。本明細書中で使用される場合、「新生物」は、良性か悪性かにかかわらず、致死的な腫瘍を生じさせる急速な正味の細胞成長の、細胞の状態をいう。新生物細胞は、必ずしも侵襲性または転移性の腫瘍ではないが、腫瘍につながる。「癌」は、身体機能に干渉することによって死を引き起こす、細胞の1つ以上の急速に成長するコロニーの疾患をいう。癌細胞は、原発腫瘍から離脱し得、リンパ管または血管に浸透し得、血流を介して循環し得、身体の他の場所の正常な組織における新しい部位で成長（転移）し得る。
【００３１】
本明細書中で使用される場合、「前癌状態」は、抑制されなければ癌を生じさせる可能性のある、ゆっくりと成長するコロニーとして特徴付けられる（例えば、新生物腫瘍）。この状態は、例えば、例えば結腸におけるポリープまたは成体組織試料内のベル形の核等の、異常な1つまたは複数の顕微解剖学的構造の存在によって特徴付けられる。
【００３２】
「正味の幹細胞成長速度」は、組織、器官または生物の正味の成長を占める、対称な胎児〜幼若幹細胞分裂の速度（単位時間あたりの分裂）である。一般に、幹細胞正味成長速度は、胎児期、新生児期および幼若期の生活から成体におけるゼロまで、生物の発生が増すにつれて減少する。
【００３３】
腫瘍は、例えば結腸の腺癌における結腸陰窩等の複雑な多細胞構造の形成を含む、それが由来する成体の器官／系の特徴の多くを提示する。腫瘍が、正味の成長および分化の両方の能力を有する単一の前駆細胞に由来する限りは、「腫瘍幹細胞」は存在し、器官特異的幹細胞（特異的器官細胞および組織を生じさせることができる、部分的に未分化な細胞）と多くの特徴を共有するに違いないと推論されてきた。例えば、白血球を生じる骨髄の細胞の場合、ある種の抗原が、移植に際して完全な血液細胞系を生じさせることができる1つまたは少数の細胞を含む骨髄細胞部分集団の同定を可能にすると認識されてきた。同様に、腫瘍細胞の細画分は、一部の腫瘍細胞によって発現される特異的抗原によって認識され得る。この論理によると、そのように認識された部分集団のうちの1つの細胞は、腫瘍細胞の混合物の実験的移植に際して、新しい分化した腫瘍を生じさせる。この理論付けを続けると、「器官特異的幹細胞」および「腫瘍幹細胞」は、部分集団を発現するかかる抗原のうちに存在する。これらの抗原を用いて、少なくとも1つの多能性（pluripotent）幹細胞を含む細胞集団が同定および単離されるが、幹細胞として機能し得ない大多数の細胞もまた同定されるであろう。単離されたこれらの集団の細胞のいずれも、真の幹細胞または器官および腫瘍の「おきて」と考えられている非対称細胞分裂を経ることがわかっていない。
【００３４】
かかる細胞に富む器官または腫瘍の細画分とは異なり、実際に「器官特異的幹細胞」または「腫瘍幹細胞」である細胞を同定する方法が、本明細書中に提供される。この同定は、本明細書中に記載される異形性核形態型および核分裂および／または配置に基づく。これらの方法を用いて、器官の再生を可能にする細胞を単離すること、前癌病変の成長を妨げることおよび／または特異的に腫瘍成長および療法における試みの後の再出現の原因となる細胞を死滅させることを目的として、かかる幹細胞を単離することおよびそれらの特異的な生化学的特徴および分子生物学を発見することが可能であろう。
【００３５】
かかる器官特異的および腫瘍幹細胞はさらに、2つの特異的な、これまでに報告されていない、顕微鏡によって可視である形態の核分裂における種類としての、それらの関与によって、胎児器官、腫瘍および腫瘍転移において同定される。これらの2つの形態の核分裂のうちの第一のものには、染色体の一般的な凝縮および有糸分裂装置の形成がない；代わりに、1つのベル形の核が現れて、2つの紙カップの分離と同様に、同一なベル形の核を生じさせる。この対称な無糸分裂によって、胎児および腫瘍試料における幹細胞の正味の成長が提供される。幹細胞特異的核分裂の第二の形態でも、染色体の一般的な凝縮および有糸分裂装置の形成がない；代わりに、1つのベル形の核が現れて、ベル形の核、および胎児組織および腫瘍試料において観察されるいくつかの核形態型のうちの1つを有する核の核を生じさせる（図３）。この非対称な無糸分裂によって、胎児組織および腫瘍における幹細胞によって分化した細胞の生成が提供される。ベル形の核がない核の有糸分裂は、胎児組織および腫瘍試料において観察され、かかる試料における全ての細胞の大多数を作り出す。このようにして、幹細胞の同定の過程によって、いずれも器官特異的および腫瘍特異的幹細胞としての分類に必要な、対称および非対称核分裂の両方を経るベル形の核を有する細胞の直接の観察が可能になる。
【００３６】
かかる器官特異的および腫瘍幹細胞はさらに、積み重ねたカップの組におけるように頭からつま先の関係を維持している一連の分離した紙カップに似た様式でベル形の核が規則的に配列された長い管に似た、特異的でこれまでに報告されていない多核構造における種類としてのそれらの関与によって、胎児器官、腫瘍および腫瘍転移において同定される。
【００３７】
これらの幹細胞特異的核形態型（ベル形）、核分裂の特異的形態（対称および非対称無糸核分裂）および多核構造における関与の特異的形態（長い多核の管）は、本質的に成体器官には存在しない。しかしながら、幹細胞特異的核形態型は、新生物発生前病変の細胞のうちで、およびまれに単一の核として成体器官中に広く分散して、観察されている（例えば、成体結腸陰窩の200万個の核のうちの1つよりも少ないいくらかのものがベル形の核であることがわかっている）。
【００３８】
これらの異形性核形態型、ならびに幹細胞、正常成体組織および腫瘍組織におけるそれらの分化の発生の予想されなかった発見によって、当業者は、細胞を、それらの核形態型に従って分類することが可能になる。また、幹細胞は、その核形態型に基づいて単離され得、腫瘍特異的形態型の出現または消失に基づいて抗腫瘍形成剤をスクリーニングまたは同定し得、組織の細胞中に存在する形態型を決定することによって組織試料を分類（例えば、正常または異常；新生物または非新生物）し得る。この細胞分類の結果として、個体が癌または前癌病変を有するかどうかに関して、診断を行い得る。実施例において、特定の方法（下記参照）を用いてこれらの新規の形態型の視覚化が可能になるが、核形態型の同定および評価を可能にする任意の方法が、細胞、組織および試料の分類、ならびにそれに続く、疾患の診断に適切であり、抗腫瘍形成剤（例えば、腫瘍を形成する細胞成長を阻害するか、または減少させるのに効果的な薬剤）の同定に用いられるアッセイのための基礎を提供する。かかる方法としては、位相差顕微鏡法、共焦点顕微鏡法、二電子または二波長顕微鏡法および小角度散乱フローサイトメトリーが挙げられる。
【００３９】
本発明の目的のために、正常成体ヒト結腸上皮、結腸腺腫、結腸腺癌および胎児腸の、厚い、約0.5 mmの切片を、下記の実施例に記載されるように、顕微鏡観察のために調製した。組織シート層の厚さは、少なくともインタクトな細胞の厚さ（かつ細胞の単なる切片または薄片ではない）であるべきである。図１に要約されるように、大きい球状および非球状の核形態の配列が、全ての試料において現れた。試料の全ては、成体結腸陰窩の組織学的切片において通常観察される、球状および楕円形の核を含んでいたが、異常な、これまでに報告されていない核形態型もまた、含んでいた。胚組織は、ベル、先細りの葉巻、インゲンマメ、ソーセージおよび小さい球のような形状の核を含んでいた。正常成体結腸陰窩は、陰窩基部に時折ベル形の核を含んでいたが、大多数は大きな球形および楕円形の構造であった。いくつかの視野においては、陰窩基部近くの細胞核は「円板状」のようである。腺腫および腺癌において、核の形状は、球形および楕円形の核に加えて、先細りの葉巻、および「弾丸形」と称する、端が噛み切られた葉巻のように見えるさらなる形状を含んでいた。
【００４０】
陰窩構造は、準備手順によって保存され、正常結腸、腺腫および腺癌においてはっきりと観察された。使用された約0.5 mmの試料切片は、長さ約40ミクロンであった、観察された最も大きい核形態であるソーセージ形よりも、ずっと厚かった。4ミクロンの「凝縮した球形の核」を除く核構造の全ては、病理学的評価において通常使用される5ミクロンの切片より長い、少なくとも1つの内軸を有していた。さらに、「ベル形」または「葉巻形」等として分類され得る核の間には、かなりの程度の形態学的変形があり、独立した系統および生理学的機能性が示唆される。
【００４１】
本明細書中に記載される、ベル形の核、それらの無糸分裂の対称および非対称形態、または成体、新生物発生前、新生物および胚組織における核形態型の集合の現象は、これまでに報告されていない（実施例２参照）。胚および腺癌において線状に配列したベル形の核が管状に包まれることもまた、明らかに、新しい観察である。それらがこれまでに観察されていない理由は、標準的な組織学的慣例と、本明細書中で使用および開示されるものとの間の違いにあり得る。2つのはっきりとした手順上の違いが明らかである。一つ目に、固定のための全ての組織は、短い時間（例えば、30分以内）の外科的除去の間に薄片にされ、固定される。注意深い組織調製によって分解は予防され得るが、30分後の調製では、核形態の分解が見られ始め得る。二つ目は、医学病理学において実施される薄い切片の手順と本明細書中に開示される厚い切片固定プロトコールとの間の違いである（これらの核形状を維持する構造／状態を、後者は保存し、前者は明らかに破壊する）。
【００４２】
無糸分裂は、現象として、多くの原生動物および原始的後生動物において報告されている（Orias, E., 1991, J. Protozool., 38: 217-221; Precott, D., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92: 136-140）。しかしながら、これらの無糸分裂は、原生動物の無糸核分裂が核の割れ目の形成および2つの分離したおよそ等しい核の切り取りによって起こった限りでは、本明細書中に報告されるものとは異なっていた（Fujiu, K.およびNumata, O., 2000, Cell Motil. Cytoskeleton, 46: 17-27）。しかしながら、多くの種々の腫瘍において、原生動物で見られるものと同様の種類の無糸分裂が報告されている（Okuyama, S., 1991, Tohoku J. Exp. Med., 164: 247-249; Okuyama, S., 1992, Tohoku J. Exp. Med., 168: 445-448; Elias, H.およびFong, B., 1978, Hum. Pathol., 9: 679-684; Elias, H.およびHyde, D., 1982, Hum. Pathol., 3: 635-639）。
【００４３】
有糸分裂細胞の前期初期の核における染色体の配置が間期の核の形状を維持することを示す観察もまた、注目に値する。異なる染色体が、細胞の表現型の決定において重要な意義を有し得る高度に構造化されたモザイクを形成するようである。間期の核における染色体の空間的配置と細胞の生理機能との間の関係は、探求の盛んな領域である（Misteli, T., 2001, Science, 291: 843-847; Thomas, C.ら、2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 99: 1972-1977; Parada, L.ら、2004, Exp. Cell Res., 296: 64-70）。
【００４４】
以下に引用する観察に基づいて、ベル形の核を有する細胞は、例えば結腸腫瘍、腺腫および腺癌等の、発生および成長する腫瘍および新生物発生前病変の、発生上の細胞を呈する多能性細胞である。このように、ベル形の核形態型は、多能性幹細胞の指標であり、成体組織試料における新生物発生前および新生物組織の診断基準として使用され得る。また、ベル形の核の（例えば、管様構造またはクモの巣様構造への）組織化は、さらに腫瘍発達（例えば、新生物または転移腫瘍）の進行の指標であり得る。
【００４５】
ベル形の核の多能性は、非対称無糸分裂においてベル形の核から現れる核の複数の形態の像によって実証される。卵、ソーセージ、腎臓、弾丸および葉巻形の核がベル形の核から現れるのが観察され、他の核形態は観察されない限りは、それらは、それらが存する組織が存続するのに必要な機能の組を呈する。観察されるベル形の核のうちの形態学的変形から示唆されるように、実際に、ベル形の核を有する細胞の複数の形態があり得る。
【００４６】
ベル形の核を有する細胞の数および対称無糸分裂頻度は、この仮説の発生上の要素と一致する。それらは、胚で多数観察されるが、新生物がない正常成体結腸においてはめったに観察されず、数立方ミリメートルの腺腫では少数（例えば、約1,000個）、および数立方センチメートルの腺癌では多数（例えば、約1,000,000個未満）存在する。胚および腺癌におけるそれらの分裂速度は、結腸腺癌の見積もりの正味の成長速度と一致する、1年あたりおよそ20分裂と見積もられる（Herrero-Jimenez, P.ら、1998, Mutat. Res., 400: 553-578）。腺腫におけるそれらの対称無糸分裂の分率（fraction）は、1/1000未満であり、現在までのところ見られたものはない。この否定的な観察は、それ自体重要である。発生上の細胞、またはヒト結腸新生物発生前病変における「促進の危険性のある細胞」の細胞分裂の頻度は、計算によって、6年あたり約1回と見積もられてきた（Herrero-Jimenez, P.ら、2000, Mutat. Res., 447: 73-116）。無糸分裂が3時間の間認識され得ると仮定すると、6/100,000未満の頻度が期待される。このように、腺腫の非常に低い対称無糸分裂速度は、結腸新生物発生前の発生上の細胞についての期待値と一致する。
【００４７】
ベル形の核を有する細胞が、幼若期成長の終わりに、段階的に取り除かれることが可能である。幼児期初期に網膜芽細胞が段階的に網膜細胞に組み込まれ、網膜芽細胞腫遺伝子ヘテロ接合体における網膜芽細胞腫の危険性を除去する（Knudson, A., 1971, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 68: 820-823）。APC等の遺伝子における突然変異による結腸腫瘍「開始」によって、この段階的に取り除く過程が防がれることがあり得る。そうであれば、ベル形の核は、新生児および幼若期の結腸陰窩の基部に見られるはずである。
【００４８】
胎児および発癌組織におけるベル形の核の出現から、胚形成と発癌との間の関係が推論され得る。癌の研究者は、1世紀以上にわたって、腫瘍は胚の特徴を反映すると考えてきた。Erenpresia, J.およびHelmtrud, I.（1999, Mech. Aging and Develop., 108: 227-238）は、J. Cohnheim（1875, Virchows Arch., 65: 64; 1877-1880, Vorelesungen uber allgemeine Pathologie. Ein Handbuch fur Artzte und Studierende. Berlin, Hirchswald 1-2 691S）を、腫瘍は成体組織に不適切に存続する胎児細胞から生じると最初に仮説を立てたとして引用した。腫瘍における癌胎児性抗原の発現、ならびに、胚においても見られる広範な遺伝子産物、mRMAおよびタンパク質の腫瘍における出現によって、腫瘍形成が胚様の特質を有する細胞の出現を伴うという幅広い仮説が強化された。腺癌および胚結腸における、形態、無糸分裂および有糸分裂の性質が本質的に同一な形態学的細胞型の発見は、Cohnheimの密接な繰り返しならびにより最近の議論および腫瘍幹細胞の存在を示す実験による論証の使用に関して、癌胎児仮説の、より具体的な新たな陳述を必要とする（Pardalら、2003, Nature Rev., 3: 895-902）。
【００４９】
過去130年の癌の研究および観念の主要部に統合されたこれらの新しい観察から、開始の遅い結腸腺腫および腺癌の起源および特徴についての単純な仮説が示唆される：腫瘍開始突然変異、例えばAPC遺伝子不活性化が、ベル形の核を有する細胞において、この細胞の形態が幼若期の間または終わりに段階的に取り除かれる前に起こる。ベル形の核を有するかかる開始された細胞は、単純に、幼若期にしていたのと同じ速度で分裂し続け、新しい結腸陰窩を作り出し続ける（Herrero-Jimenez, P.ら、1998, Mutat. Res., 400: 553-578; Herrero-Jimenez, P.ら、2000, Mutat. Res., 447: 73-116）。結果として生じる局所的な群集化によって、「ポリープ」が作り出される。さらなる1つまたは複数の遺伝子の変化（遺伝子刷り込みにおける変化を含む）によって能動的に、または成長する腺腫内で起こる生化学的変化によって受動的にのいずれかで、ベル形の核を有する単一の細胞が、より初期の胚の状態に復帰し、胚におけるように、胚組織と殆ど見分けがつかない、急速に成長する細胞の配列を生じさせる。処置しない場合、この継続した成長は、結腸閉塞および／または転移および死につながる。
【００５０】
最も一般的な意味において、これらの観察は、遅いが一定の幼若期の成長速度を保存する腺腫における、ならびに胚形成の間に観察される細胞型および成長速度の秩序だった全体的調和を再現する腺癌における、明確に無秩序でない性質が観察される、発癌の高度に規則的な性質を指摘している。存在する生物学的形態が（「全ての組合せを試す」）無数の退化した可能性から選択されたという意味で、ヒトにおける発癌が、まれだが単純に幼若期の成長を停止できないこと、およびそれに続く、まれに秩序だった胚細胞状態に回帰することを呈し得ることは、驚くべきことではないのかもしれない。
【００５１】
これらの観察から、ベル形の核を有する細胞は、より特異的な、したがってより効果的な形態の、腫瘍の予防および療法の標的であろうことが示唆される。新生物発生前コロニーの正味の成長速度を50％落とすことが可能であれば、最も開始の遅い癌の型は、100年のヒトの寿命の間に現れないであろう（Herrero-Jimenez, P.ら、1998, Mutat. Res., 400: 553-578; Herrero-Jimenez, P.ら、2000, Mutat. Res., 447: 73-116）。例えばベル形の核等の異形性核形態型を有する細胞は、結腸の腺腫および腺癌において、腫瘍幹細胞であると考えるのが妥当であり、正味の成長の対称分裂、または有糸分裂によって分裂する細胞を提供し、腫瘍塊体の大部分を提供する非対称分裂のいずれかにおける、DNAの合成および分離での、その特殊な特徴を与える機構を標的とし得る。これらの細胞型または管状にされたベル形の核が種々の生化学的法則の下に機能することがあり得、これらはまた、理解されれば、腫瘍の予防および／または療法に利用され得ることがあり得る（例えば、胚、成体器官および癌組織の間の、ミトコンドリアの生化学的特徴の著しい違いを発見した、Otto Warburgの研究結果参照（Warburg, O., 1956, Science, 123: 309-314; Warburg, O.ら、1960, Z. Naturforsch B., 15B: 378-379）。
【００５２】
無脊椎動物に関する基礎的なテキストを参照することによって、大きいソーセージ形の核が、縁毛ツリガネムシ等の繊毛原生動物のうちに存在することが示され、異毛の「ラッパムシは、数珠つなぎのビーズに似た、注目すべき型の大きい核を有する・・・」（Buchsbaum, R.ら、1971, Animals Without Backbones, 第三版、University of Chicago Press, Chicago, IL）。核変態のこれらの特色は、進化の時間のうちに、それらが、新血管新形成の前には酸素が不十分と予想される局所的環境で胚、腺腫および腺癌において成長するように思われる限りは、有酸素以前の環境を生き残った細胞の生化学的特徴と関連もしているのかもしれない。胚および腫瘍においてATP生成の相当物を減少させる酸素をアミノ酸が提供するというWarburgの発見から、酸素を限定的な栄養分として扱う表現型の選択が示唆される。
【００５３】
異形性核形態型（例えば、ベル形の核）は、このように、進化生物学、胚形成および腫瘍形成を併せもつ、三重の生理学的な結びつきを呈するようである。減数分裂および有糸分裂の遺伝子のサイクルに、受精後の期間の有糸分裂と動物の細胞塊体の殆どを作り出す有糸分裂との間の直系遺伝の対称および非対称無糸分裂段階が、今や加えられるべきである。
【００５４】
本発明は、特に、核形態型、対称および非対称無糸分裂へのそれらの関与、ならびに多細胞集合体におけるそれらの関連に基づいて、細胞型を分類する方法に関する。例えば、哺乳動物から得られた組織試料を、異形性核形態型（例えば、ベル形の核、葉巻形の核および弾丸形の核）の存在または非存在に基づいて分類し得る。図１が示すように、異形性核形態型は、発生の種々の段階、および腫瘍発達の種々の段階にも、存在する。例えば、ベル形の核は、胎児試料に見られ、成体試料にはめったに見られず、腺腫および腺癌試料に広く見られる。これは、異形性核形態型を用いて胎児幼若幹細胞、ならびに成体組織における新生物幹細胞を同定し得るという意見を支持する。これらの結果から、これまでに文書で証明されていない、胎児幹細胞と癌幹細胞との間の関連が実証される。このように、胎児における胎児幼若幹細胞の指標である異形性核形態型はまた、成体組織における癌幹細胞の指標でもある。
【００５５】
また、図２Ａ〜２Ｃは、異形性核形態型が管様構造に整列することを示す。これらの管様構造は胎児試料に存在し、異形性核形態型（例えば、ベル形の核、葉巻形の核および弾丸形の核）を含むので、管様構造自体を、胎児幼若幹細胞、または成体組織における新生物（例えば、腫瘍または癌）幹細胞のしるしとして、用い得る。
【００５６】
あるいは、図５Ａ〜５Ｅに示されるように異形性核形態型が合胞体に配列することは、腺腫と腺癌との間の違いの指標である。したがって、組織試料中の多核構造における核形態型の配置を用いて、疾患の異なる段階の新生物試料を区別し得る。
【００５７】
異形性核形態型は他の成体組織および腫瘍試料（例えば肝臓）において観察されてきたので、当業者は、新生物発生前または新生物病変を、任意の成体組織において、異形性核形態型の存在に基づいて認識するであろう。
【００５８】
本発明はまた、新生物発生前または新生物組織に特異的に関連した異形性核形態型（例えば、ベル形の核、葉巻形の核、および弾丸形の核）の出現または消失に基づいて抗腫瘍形成剤を同定する方法に関する。候補抗腫瘍形成剤は、例えば、インビボで、具体的には動物モデル（例えば、哺乳動物モデル、例えば、例えばマウスまたはラット等の齧歯動物）において、スクリーニングされ得る。候補抗腫瘍形成剤は、例えば試験養生法が実際に、腫瘍中の細胞の99％より多くを占める非幹細胞集団とは異なって腫瘍幹細胞成分を破壊するかどうかを発見する臨床的研究においてスクリーニングされ得る。本明細書中に記載される過程を用いて、ヒト腫瘍から実験動物の移植または実験動物においてデノボで生じた腫瘍を用いた実験動物において、候補抗腫瘍形成剤または腫瘍予防剤がスクリーニングされ得る。このようにして、細胞培養物中のベル形の核を有する細胞の対称または非対称分裂を死滅させるかまたは干渉する薬剤が、患者における腫瘍の予防または療法のための候補として認識されよう。
【００５９】
あるいは、抗腫瘍形成剤は、インビトロまたはエクスビボ（例えば、核形態が維持される、培養された試料中）でスクリーニングされ得る。長期の間初代培養物中で組織を保存する方法は、当該分野で公知である。抗腫瘍形成剤は、異形性核形態型が保存される、培養された試料中で同定され得る。このようにして、かかる培養された試料が候補抗腫瘍形成剤で処理されて、異形性核形態型の普及率が減少した場合、この候補抗腫瘍形成剤は、患者における腫瘍をインビボで治療するのに有用であると予想される。
【００６０】
以下の非限定的な実施例を参照しながら、本発明をさらに説明する。本明細書中に引用される全ての特許、特許出願ならびに他の全ての刊行物およびウェブサイトの教示は、その全体が、参照によって援用される。
【００６１】
実施例
実施例1：実験手順
細胞及び組織の供給源
全ての成体組織及び腫瘍標本を、マサチューセッツ総合病院の病理科及びMGH癌研究センターでの外科的廃棄物として入手した。各組織切片を新鮮な氷冷固定液に直ちに置換し、さらなる解析のためにMIT細胞遺伝学実験室に移送した。匿名の廃棄された切片の使用は、MGH及びMITの両方の施設内倫理委員会によって承認されていた。解析された胎児の腸切片を、この研究のために入手したのではなく、1985年にウクライナ、チェルノブイリでの原子炉の炉心溶融後に、発生中の胎児及び子供における遺伝子の放射線損傷の兆候を発見する任務を担当したチェルノブイリ科学遠征の保管スライドコレクションから得た。癌に関係のない手術の後に廃棄された2つの正常成体結腸（2つのFAPC結腸、4つの結腸腫瘍、1つの膵臓腫瘍および2人の患者からの肝臓のいくつかの独立した直腸結腸転移の、直径約2〜10mmの5つのポリープ）を解析した。
【００６２】
組織摘出、固定、伸展及びDNA染色
手順として、顕微鏡スライド上で順序立った組織の伸展を可能にする程度まで細胞接着を化学的に破壊する、厚さ約0.5mmの固定及び染色組織切片を使用する。この技術によって、細胞が、その核の構造の完全性を維持することを可能にする。組織伸展において、固有のいくつかの最小の湾曲を有する、染色された核のような小さな形態学的構造および結腸陰窩のようなより大きな構造が、たとえそうでなくとも、なお観察され得る。
【００６３】
特に結腸の外科的廃棄物が、切除後直ちに提供される場合、核の形態型が認識できる（例えば、切除後1時間未満、より好ましくは切除後約30分または30分未満）。細長い結腸粘膜のシート（約1cm2）または腺腫もしくは腺癌の厚さ1mmの切片を解剖した際、新しく調製した4℃カルノア固定液（3:1、メタノール：氷酢酸）に直ちに置いた。固定液の体積は、組織試料の体積の少なくとも3倍である。新しい固定液を、全固定の3時間について45分ごとに3回置換する。カルノア固定液を次に、4℃の70%メタノールに置換し、-40℃で一年まで保存し得る。
【００６４】
約1mm2断片（切片の厚さとは別の長さ×幅）を、伸展およびDNA染色のための全固定組織試料から摘出する。各断片を、蒸留水で洗浄し、高分子およびDNA脱プリン化の部分加水分解のために正確に8分間、60℃の2mＬの1N  HCｌ中に置く。冷蒸留水中で迅速な洗浄によって加水分解を終了する。洗浄した試料を、15〜30分間、45％酢酸（室温）中で浸漬する。この最終工程は、植物の細胞遺伝学において、その後の組織細胞伸展および顕微鏡スライド上で温和な圧力での植物組織切片の観察を可能にする「組織の浸軟」として公知である（Gostev, A. およびAsker, S., 1978, Hereditas, 101: 98-104; Gostjeva, E., 1998, Genetika, 32:17-21）。この「浸軟した」固定組織試料を、顕微鏡スライド上での伸展のために直ちに使用する。それぞれ約1mm2の解離した切片を、固定、解離した組織の2つの、約0.5×1mm断片を形成するように二等分する。各断片を、新しい顕微鏡スライド上の約5μLの酢酸に移し、22×22mmカバースリップで覆う。縁を持ってカバースリップを保持しながら、スライドの中央に置くために、少しの圧力を組織試料に適用する。
【００６５】
伸展工程のために、5層のフィルター紙を折りたたみ、カバースリップを動かさないように極度に注意しながら、カバースリップ上に置く。ピンセットの柄を、わずかでかつ均一な圧力でカバースリップを覆うフィルター紙に沿って、1方向に着実に動かす。「わずか」は、染色体「押しつぶし」に用いられる圧力よりも顕著に低い圧力を意味する。伸展の質を、それぞれの個々の試料についての倍率20×の位相差対物レンズを用いて、確認する。優れた結腸の組織伸展の表示は、陰窩が本質的に陰窩の形態学的完全性を保存する単層に押し込まれる一方で、全体の組織伸展の縁に損傷した核がないことである。それぞれの十分に伸展した試料スライドを、ドライアイス表面に直ちに置く。2分後、伸展組織試料が完全に凍結された場合、カミソリ刃が、穏やかに持ち上げられるカバースリップの一端の下に挿入される。1時間以上の間、塵のない環境でスライドを乾燥させる。
【００６６】
染色手順を室温で行なう。スライドをCoplin壺に置き、シッフ試薬（Art.9033, Merck）で満たし、核の脱プリン化したDNAを部分的に染色する。スライドを、1時間、染色液に浸漬し、2×SSC（クエン酸三ナトリウム8.8 g/L、塩化ナトリウム 17.5 g/L）中で、30秒間1回およびすばやく1回の2回、同じCoplin壺で洗浄する。スライドを、次に蒸留水で洗浄する。この段階でのスライドは、定量的画像解析によって核または凝縮した染色体におけるフォイルゲンDNA量の測定を含む核中のDNAの分布の観察に適している（Hardie, D.ら、2002, J. Histochem. Cytochem., 50:735-749）。
【００６７】
優れた解像度および間期の核の画像を達成するために、スライドはさらにギムザで染色され得る。2×SSC中で洗浄した直後に、スライドを1%ギムザ溶液（Giemsa, Art. 9204, Merck）に5分間置き、次に最初にSoerenssenバッファー（リン酸水素化二ナトリウム二水和物11.87g/L, リン酸二水素化カリウム9.07g/L）ですばやく洗浄し、次に蒸留水で洗浄した。染色の侵食を防止するために、まるで温度計を振るように水滴をスライドから振り落とす。スライドを、塵のない環境に置き、室温で1時間乾燥させる。それらを次に、脂肪を除去するために少なくとも3時間キシレンで満たしたCoplin壺中に置く。カバースリップを、DePexマウンティングメディウムを用いてスライドに付け、高解像度スキャニングのために準備する3時間、それらを乾燥させる。
【００６８】
顕微鏡および画像プロセッシングシステム
A KS-400 Image Analysis SystemsTM,Version 3.0, (Zeiss, Germany)を用いて、核の寸法およびDNA含有量の将来の定量的解析のための画像を観察および記録した。システムは、モニターされる光学顕微鏡AxioscopeTM、パーソナルコンピューターに連結されるカラーCCDカメラ、AxioCamTM(Zeiss, Germany)から成る。フォイルゲン染色のみを用いる場合、可視光および560nm（緑）のフィルターを用いて、1.4／100倍の平面アポクロマート対物レンズでの顕微鏡から画像を転送した。フォイルゲン−ギムザ染色を用いる場合、フィルターは用いなかった。それぞれのスキャニングセッションの前に、フレームグラバーおよび最適な露光量を調節した。ピクセルサイズ0.0223×0.0223μｍで、核の画像を記録した。拡大、解像度および露光量のようなスキャニングパラメーターを、同じスライドの再現可能なスキャンを可能にするために保存した。
【００６９】
実施例２：胚性後腸のベル形の核の検出
本明細書に記載される観察は、図.1, 2A〜2Cおよび3A〜3Fに示される2つの独立した、胚性腸の切片由来である。3つの観察を行なった。第一に、図.1に要約される、7つの明瞭な核形態型の配列があった。第二に、図.2A〜2Cに示される長い（直径約20〜50ミクロン）管に組織されたベル形の核の、秩序だった線状の頭からつま先の配置があった。第三に、図.3A〜3Fに示されるベル形の核を含む対称および非対称の無糸分裂の異常な形態があった。
【００７０】
同一の後腸切片の位相差画像（左フレーム、図.2B）および染色された核画像（中央フレーム、図.2B）を重ねた場合（右フレーム、図.2C）、線状に方向付けられた核が、それ自体が直径約20〜50ミクロンである、以前に未報告の管様構造に含まれることを示した。倍率280倍の核（中央フレーム、図.2B）は、これらの非球形の核がカップまたはベルの形態で存在しているように見えることを示す。高解像度画像（1400×）の線状に配列する核は、明らかに中空である再現可能なベルの形状を有することを示す。「頭からつま先」のベルの配置は、平行する管が局所的に平行でない配置のベル形の核を有し得るような、前後に蛇行する管以外の、観察された全ての胚性の管に保存されていた。
【００７１】
ベル形の核が、管様構造内のみで対称または非対称の無糸分裂を行なっていることが観察された。ベル形の核の対称の無糸分裂は、2つの、積み重なった紙コップの単純な分離と相似していた。最も高い解像度で、ベルに分離したこれらの上の縁に、図.3Aおよび3Bに示されるように、ベルの外縁の推定3/4を取り巻く、1対の凝縮または部分的に凝縮した染色分体（図.1、矢印参照）を有するように見えた。様々の異なるベル形は、様々な管内に見られ、これらの形態学的変化は、図.3Aの対称の無糸分裂において、忠実に再現された。
【００７２】
ベル形の核の無糸核分裂の、以前に発見されていないこの形態は、もちろん、驚きであった。しかし、胎児切片は、これよりも多くの驚きを有した。腸切片を通じて、管状構造内のベル形の核は、明らかに「誕生した」核に見られた。胎児の切片に見られ、かつ図.1に示される核形状の全形態の例示はベル形の核から誕生していたことが発見された。これらの異常の、無糸の非対称形態の核分裂を、図.3Cに示す。
【００７３】
ベル形以外の核の形態型に関して、全てが、同一の核形態型の局所コロニーを形成する有糸分裂をするように見えた。これらの有糸分裂は常に、ベル形の核を含む長い管の外側に生じた。奇妙にも、特定の核形態は、前期に保存され、図.1にも示されるように、有糸分裂終期の後期における染色体の結合でまさに再形成された。
【００７４】
正常結腸上皮
核の特に明瞭な画像を作り出すためのDNA特異的染色と組み合わせた、約0.5mmの切片、組織の浸軟（下記参照）および温和な伸展の組み合わせが、3次元特徴の認識を可能にした。陰窩における全ての、またはほとんど全ての核が、陰窩の基底から管腔表面に観察され得た。それぞれの核形状が認識され得るように、多くの陰窩は、割れているか、または伸びているかのいずれかであった。楕円形または球形の核を有する細胞が、基底のちょうど上から管腔へ伸びる上皮の陰窩に並ぶ。しかしながら、陰窩の基底自体の最初の約25個の細胞において、「円板」（約2〜3ミクロンの厚さおよび約10ミクロンの直径）として特徴付けられ得る核の形態型が優勢であった。細胞が十分に分離した1％未満の陰窩の基底において、ベル形の核が円板の核の中で認識された。類似する低頻度のベル形の核が、成体の肝臓の調製物に観察されている。新生物または新生物発生前の如何なる示唆もない成体の結腸において、他の核形態学バリアントは、約800ウェルの伸展された陰窩の細胞毎のスキャンにおいて観察されなかった。
【００７５】
腺腫
腺腫は、正常な結腸陰窩と識別ができず、それぞれが約2000個の細胞を有する、多くの陰窩を含んだ。これらは、図.5Aに示されるように分枝状の形態でしばしば見られた。同じ球状および楕円形の核が、正常の結腸陰窩におけるように、陰窩の壁に存在していたが、陰窩の基底で１つまたは2つのベル形の核をしばしば示した。不規則な陰窩様構造はまた、約8000個までの細胞を含んで観察され、組織の浸軟でより容易に伸展された（図.5B）。加えて、多くの多様な細胞および集団が、陰窩および陰窩様構造の中で散在していた（図.5C）。いくつかの構造が、約250、約500または約1000個の細胞を含む標準サイズの正常陰窩に成長しているように見えた（使用された伸展技術は、数百までの細胞の構造において、正確な細胞カウントを一般に可能とした。）。多くの細胞集団が、正確に8、16、32、64および128個の細胞それぞれの「リング」として見られた（図.5D）。より高倍率の観察によって、陰窩様構造の壁の細胞のほとんどが、正常の成体結腸陰窩におけるように球または楕円の核を有する一方で、楕円形、葉巻形または弾丸形の核のいずれかを有する細胞のコロニーが、陰窩壁の裂け目に見られた。楕円および葉巻形の核を有するコロニーは、胎児の腸に観察されていたが、「弾丸形」の核形態型は、腺腫および腺癌のみに見られた（図.5E）。
【００７６】
「弾丸形」の核形態型はまた、最初に生じる不規則の末端（「かじる」）を有する非対称の無糸分裂によって、ベル形の核から生じるように見えた。弾丸形の核を有する細胞の小さなコロニーが見られ、通常の有糸分裂をする細胞を含むこれらのコロニーによって、奇妙な核形態が、有糸分裂前期の初期から有糸分裂終期を通じて維持されていたという興味深い事実が保存される。
【００７７】
ベル形の核は、正常の成体結腸では稀であるが、腺腫において、明らかに重要な役割を果たしていた。それらは、多くの腺腫で見られた。図.5Dに示すように陰窩様構造の中の空間において、いくつかは1〜10以上の「ベル」として見られた。他のものは、多細胞リング構造における単一の「ベル」として見られ、該構造中のあるベルの核は、図.5Cおよび5Dのように球形または他の形態の2n-1個の細胞を有するリングにおいて常に見られた。正常の結腸陰窩が凝集するような伸展条件下で凝集する、より小さい構造から標準構造において、ベルの核は単一のベルとして、よりしばしば1対のベルまたは陰窩様構造の基底カップ内で時折4もしくは8個のベルとして見えた。かなり大きい不規則な陰窩様構造において、ベル形の核は他の核形態の細胞と混ざった異常な構造の壁の中に解剖学的に統合されていた。これらのより大きな、不規則な陰窩様構造は、それぞれがそれ自身の核形態型を有する、多くの異なる種類のクラスターのモザイクであるかのように見えた。
【００７８】
胎児の切片で見られる対称の無糸分裂の形態で見られている任意の腺腫における単一のベル形の核ではなく、1000より多くのベル形の核がそれぞれの腺腫に観察されたが、腺腫のベル形の核は、別の顕著な方法で他の核の形態型および胚におけるベル形の核とは異なっていた。核濃縮として記載され得る状態におけるベル形の核が、スキャンされた腺腫の中で観察されたことも注目される。すべての他の形態学的形態の核は、全体の切片をスキャンした場合、およそ同等の頻度（約1〜5/1000個の全体の核）で有糸分裂または核濃縮にしばしば見られた。小さな副次切片が有糸分裂および核濃縮カウントに関して、大いに変化した。本明細書で使用される場合、「核濃縮」とは、死にかけている細胞を示す不規則な凝縮における核の破裂および染色質の凝縮の状態をいう。
【００７９】
腺癌
腺癌は、より大きな塊、および温和な圧力で伸展に耐える多くの各切片を有するが、一方で、陰窩、より大きな不規則な陰窩様構造ならびに16、32、64および128個の細胞のリングの陰窩内の存在の混合は、より小さな腺腫と本質的に同じであった。陰窩様構造の壁における裂け目は、3次元分布の凝縮した有糸分裂前期の染色体に維持される同一の核形態を有する細胞のコロニーと関連していた。ベル形の核は、陰窩の基底カップにおいて、シングレット、1対またはより多数としてなお見られ、より大きく異常な、陰窩様構造の壁における複雑な螺旋に埋め込まれていた。図.6A〜6Cは、一連のこれらのベル形の核が腺癌で見られるものに全ての典型的であることを示す。腺癌における核形態型の組は、腺腫で見られる組と一致するように見える。具体的に、胎児切片または成体結腸で観察されない「弾丸形」の核形態型が、しばしば観察された。
【００８０】
腺腫と腺癌との間で認識できる差異は、陰窩様構造の方向が腫瘍表面について、明らかに、ランダムに方向付けられ、基底から管腔の方向にはでたらめであったということであった。陰窩および不規則な陰窩様構造はまた、腫瘍内にしばしば見られず、無秩序の集団ではなく、折衷の集団のより小さな、局所的に組織された構造としてより特徴付けられ得る。これらの散在した、異なる核形態を有する細胞のコロニーは、共生共同体を示すことが可能である。
【００８１】
腺癌が腺腫と異なる重要な特徴は、数百のベル形の核の明らかに組織された集団の頻繁な出現であり、多くは対称の無糸分裂をしばしば（約1％）伴った。低倍率で、これらは陰窩様構造の間の空間に見られ、くもの巣または葉脈骨格のように見えた。高倍率で、細い「脈」は、軸から90°の同じ方向、肩から肩に方向付けられた「口」を有するという、奇妙な特徴を有するベル形の核を有する細胞の部分的に並んだ鎖として見られた。さらに、腺癌の多くの切片を通してのスキャンは、腺腫ではなく胎児の腸に観察される「頭からつま先」の方向におけるベル形の核を含まなかった。これらの線状に配列された核はまた、胎児に見られる管構造（合胞体）に含まれた。ベル形の核の中での対称の無糸分裂よりずっと低い頻度であるが、時々、ベル形の核であり得た核濃縮像が観察された。
【００８２】
さらなる観察
肝臓における結腸腫瘍の転移は、外観上では腺癌と区別できない、核の形態型、陰窩および陰窩様構造のパターンを再現する。成体ヒト肝臓の切片のスキャニング切片は、時々、成体の結腸の陰窩に観察されるようなベル形の核を明らかにした。成体マウス結腸のスキャンは、成体ヒトにおけるような陰窩基底におけるベル形の核を有する細胞を同様に明らかにした。ベル形の核を有する培養細胞の増殖および研究のための潜在的に重要な観察において、低い頻度の、約1/10,000個の細胞は、幹細胞様の挙動が対称および対称的な細胞分裂動態学に関して、仮定および研究されているマウスの細胞培養で見つかっている（Sherley, J.ら、1995, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:136-140; Merok, J.ら、2002, Cancer Res., 62:6791-6795）。
【００８３】
実施例３．
胎児結腸の胚性後期を組織する幹細胞が、開口、ベル形の核形態型によって特異的に同定された。これらの特有の核は、通常の染色体凝縮がない対称および非対称の核分裂の両方を行なう。成体維持幹細胞への最終変態以前の胎児、新生および若年期を通じて、核分裂が正味の成長および分化を行なう。これらのベル形の核形態型は、成体結腸の陰窩基底にまれに見られるが、新生物発生前および新生物において主に再出現し、結腸腺腫、腺癌および転移における正味の成長および分化をするように見える。
【００８４】
歴史的で、年齢特異的な結腸直腸癌化速度、現在の年齢特異的な結腸腺腫罹患率およびヒト組織における遺伝的変化の直接測定の分析由来の推論とこれらの観察の組み合わせが、結腸およびおそらくは他の部位での遅発性癌のための初期仮説を提案する：その特有のDNA生化学および分離の様式のため、腫瘍の開始に必要な腫瘍変異が、成体維持幹細胞より、幼若幹細胞において顕著により高い割合で生じる。より高い幼若変異率が腫瘍の開始事象を幼若期に限定する効果を有する。開始が起こった幼若幹細胞は、結腸においてポリープとして全体的に観察される幼若組織の局所斑点を創り続け、これらの細胞は幼若細胞に帰する「突然変異誘発遺伝子」の表現形を維持する。新生物発生前コロニーの避けがたい増殖ではなく、緩やかな増殖の間の、更なる腫瘍変異および／または局所の生化学状態が、新生物発生前「幼若」幹細胞の1つを、致死の腫瘍塊を急速に創る胎児幹細胞の表現形へと転換する。
【００８５】
器官発生
器官発生は、対称分裂における自己複製によって正味の成長が可能で、かつ幹細胞を生じる非対称分裂によって分化の原因となる幹細胞の段階的カスケードならびに代替の細胞形態によって達成されるという概念が、発生生物学者によって一般に考えられている。混乱が生じるのは、細胞の種々の形態および潜在能力の同一性および機能を、移植で生存可能な胚を生じさせ得る胚胞盤の初期胚性幹細胞および造血系を再増殖し得る動物の骨髄およびおそらくは他の器官から単離されたもののような幹細胞と区別するために、試行を行った場合である。成体幹細胞または維持幹細胞は、結腸のような、器官でターンオーバーする多くの組織要素の再増殖の原因となるために、置かれている。成体において、必要に応じて組織および器官を再増殖し得る幹細胞の小さな置き場を想像し得る。第二の移行細胞から分化した終末細胞までの以後の二分裂によって失われる、第一の移行細胞を生み出す、断続する非対称分裂によってクローンのターンオーバー単位を規定する、成体維持幹細胞の異なる形態も想像し得る。
【００８６】
対称および非対称の核分裂の両方を行なうように見える、容易に同定され得る核形態を含む構造が、本明細書中に開示される。これらの形態は、成体の結腸陰窩の1％よりもいくらか低く、基底頂端に見られるが、5〜7週の胎児におけるヒト腸の全ての核の約30％を含む、それらのベル形の核形態型によって同定される。
【００８７】
発癌
発癌は、対称分裂における自己複製による正味の成長が可能で、かつ腺癌で証明される不均一性を創り出すための非対称分裂による分化の原因となる幹細胞の段階的カスケードによって達成されるという概念が、広くではないが考えられる。初期の胚発生で発現されるもののような外観上は遺伝子のランダムな発現が続く「細胞制御の損失」としての発癌の概念が、かなり広まっている。しかしながら、白血球形成における器官に維持される幹細胞の物理的存在を示すものと類似する、希釈および移植実験が、様々な細胞型を含む増殖腫瘍を生じる可能性を有する、非常に小さな画分の腫瘍細胞の存在を確立した。腫瘍幹細胞の存在というこれらの実際的な示唆は、大いに縮退状態としての癌の概念への反映を要求し、器官発生等が、正常幹細胞から腫瘍幹細胞の経路を規定する特定の変化の発現であるという可能性を証明する。この流れに関連する考えは、結腸ポリープ（腺腫、新生物発生前病変）および腫瘍（腺癌、新生物形成）の両方ならびに続く転移の中で、結腸の胚発生に見られるものと同一のベル形の核の発見である。これらの核形態の準備した一覧表および対称の核分裂の頻度が、新生物発生前の期待される低い分裂速度および新生物の急速な分裂との比較を可能にする。
【００８８】
年齢特異的癌化速度に対する幹細胞生物学の関係
開始が起こった幹細胞は、ほぼ胎児の速度で成長し、致死腫瘍を形成する新生物幹細胞を避けがたくも生じる、ほぼ幼若の速度で成長し、新生物発生前コロニー（腺腫、ポリープ）を形成するという仮説を考えることは妥当である。新生物が胎児表現形の再発現であるという仮説は、独自ではなく、Cohnheimのような19世紀中期の病理学者に帰する（1875, Virchows Arch., 65:64; 1877-1880, Vorelesungen uber allgemeine Pathologie. Ein Handbuch fur Artzte und Studierende. Berlin, Hirchswald 1-2 691S）。ヒト結腸における新生物発生前、腺腫またはポリープは、幼若結腸の表現形の単なる続きであるという仮説が生じる。
【００８９】
新生物発生前の成長割合についてのデータ及び由来の推測が、年齢の機能としての子供の体重の成長割合についての偶然の発見によって増大された：男女の幼児は、指数関数的に、女児で、約1.5歳から14.5歳、男児で、約1.5歳〜16.5歳の約6年の2倍の期間で平均体重が増大する。これらの年齢の期間の成長速度は、男性について0.158、女性について0.167である。体重の成長速度に対する結腸の成長速度の関係は、結腸新生物発生前の成長速度について推定されるものに等価の、体重2/3または本ケースにおいて、約0.162/3〜0.11として成長する、大きくなる球内の円筒表面積のモデリングを必要とした。
【００９０】
結腸の新生物発生前病変の推定成長速度が幼若型結腸の推定成長速度とほぼ同等である場合、仮説により、前新形成物が何らかの方法で幼若型成長の状態を再現するということが展開された（Herrero-Jimenez et al., 2000）。幼若型幹細胞の正味の成長が幼若型組織の成長に必要とされると推定される場合、非成長性成体型陰窩のバックグラウンドにおいて、多くの組織化された結腸の組織学的特性を含有する腺腫は幼若型組織の拡大斑点と実際に同等であり得るという考えが生じた。この仮説は、最大体重量の年齢に対する開始の年齢を制限する計算によって試験され、開始の過程が幼若期に限られる場合、年齢特異的な結腸直腸癌化速度に従った一連のパラメータを導き出すことは実際に可能であるということがこの仮説により見出された。開始が５歳以下に限られる場合、実際のパラメータは癌化速度のデータに適合するように導かれ得る。かかる計算により、幼若期間中についての開始の制限の仮説は年齢特異的な癌化速度のデータに一致することが示されるが、仮説の正当性は示されない。
【００９１】
腺腫の年齢特異的な検出
試験し得ない仮説の領域に残るこれらの理論的な構築は、腫瘍の開始が幼若期に結び付けられるという仮説を直接的に提示するような一連の重要な臨床的観察のためではなかった。潜在的な新生物結腸腺腫を検出、除去するための直腸検査法の最適な年齢および数を規定するように設計された試験において、柔軟なS字結腸鏡により検出可能な腺腫を有するヒトの画分は、約６０歳で安定最大値に達することが発見された。一定して腺腫検出の高い記録を持つ直腸専門医による観察が解析された際に、約１５％の男性および約１０％の女性は平均して一つより多くの何らかの腺腫を有した。これらの臨床データから、以下のことを推測することは妥当である。まず、徐々に成長する新生物発生前腺腫は生涯において６０歳よりもかなり早くにその起源を有していたに違いなかった（１歳で開始が起こった、０．１１の成長速度を有する組織幹細胞が、６３歳までに２７＝１２８個のみの新生物発生前幹細胞に増加し得た。かかる腺腫中の全細胞数はおよそ１００万の全細胞数よりもかなり多くなり得た。）；第二に、約１５％のポリープを有する男性の画分と１８〜２０％の結腸癌の生涯リスクがある男性（1890年代コホート）の推定最小画分との間の類似性により、６０歳で腺腫を有する個体と生涯リスクがあるものとは同一であり得るということが示される（この推測がさらなる解析によって確証される場合、（a）結腸における新生物発生前病変の新生物病変への最終的な形質転換における遺伝的または発生学的危険因子に関する任意の役割を除去する、および（b）結腸直腸癌に共有される危険因子を伴う死亡率の競合形態に関する任意の重要な役割を除去する、という二つの理由が重要である）；第三に、ポリープを有するヒトにおける平均で一つより多いポリープの出現により、男性集団が、腫瘍開始および新生物発生前成長が生じる約２０％の部分集団、ならびに腫瘍開始および／または新生物発生前成長のいずれも生じない別の異なる約８０％の部分集団からなることが示される；第四に、男性および女性における新生物発生前の成長速度の計算が同一の結果を生じる限り、６０歳以上のポリープを有するヒトの男／女比、およびポリープ／ポリープを有する個体の平均における性差により、感受性が高い幼若期または前幼若期を通じて生じた開始を起こした結腸幹細胞数において、完全に癌化速度における性差が原因であるという仮説が容認される（例えば、腫瘍変異速度が男性と女性で同一である場合、幼若期に生じたと予想される新生物発生前コロニーの割合は単純に、女性で約１４．５歳および男性で約１６．５歳での成熟までに経験された幹細胞年齢の割合であり得る）。
【００９２】
組織病理学
２０世紀を通じて、分子的、生化学的および組織病理学的解析方法が並行して利用されてきたが、腫瘍および胚の研究は独立していた。得られた豊かで広範囲なデータより、多くの正常な個体発生の特性は、生涯のかなり後で異常な病理学的成長すなわち癌として再現されるヒトの成長および発生に関するということが示された。２１世紀の始めに科学者は、胚と腫瘍（起源において両方がモノクローナル、細胞集団の明確な異種性において両方が明らかである）の間の類似性は、胚全体、胚ならびに大きな腫瘍の器官および組織を生じ得る、幹細胞のような非常に特異的な細胞である一つの点により説明され得る、という仮説を提唱した。
【００９３】
表１は、ヒト発生初期における幹細胞の階層を示す。在胎齢２週（胚盤胞および原腸形成の段階）および５〜１２週（器官形成の段階）の間に、初期胎児発生のそれぞれの特定の段階に対応するような幹細胞のカスケードがある。
【００９４】
【表１】
2008503726.tif 000003
【００９５】
個体発生的に異なる幹細胞間を区別することの重要性は、ヒトの胎児型および成体型組織の開示される細胞遺伝学的評価に由来する。
【００９６】
胚盤葉上層の胚性幹細胞は、前もって着床した胚の何らかのものに拘束されず、有糸分裂で分裂し、その核は単純な球形である細胞である。それらは細胞または核の保持可能な極性の形跡を有さない。ボディプランおよび器官形成の仕上げの段階において、細胞は、ヒトの左右対称な体を作るため、体腔の内部器官の位置のアウトラインを作成するために、空間的に「方向付けられた」細胞および細胞層の移動を開始するのに必要であると思われる極性を必要とする。
【００９７】
消化器系の全ての主要な器官が生じる時期から、腸の器官形成（５〜７週）の中期ではただの球形ではないが、多様な核形態型を有する核を含有する細胞を含有する。いくつかの細胞の核は、明らかな極性を有し、有糸分裂ではないが「カップからカップ（cup-from-cup）」のような核分裂（図８）にさらに関係のある過程によって分裂する。この特異的な観察により、器官形成の幹細胞は胚の割球において観察されるものとは全く異なり得るという結論が導かれる。
【００９８】
出生後の子供の成長および幼若期の後期の成長において、二つの特徴が成体の生涯を通じて維持される器官特異的な大きさに達するまで、上皮組織は器官当りのターンオーバー単位数、およびターンオーバー単位当りの細胞数を増加させるために幹細胞の増殖により成長を続ける。この事項に関して、幼若期の器官の成長および機能を担う幹細胞は幼若期の幹細胞のように胎児期成長および発生時の幹細胞と区別すべきである。胚性、胎児性および成体型幹細胞はその能力において異なり：胚性幹細胞は、異なる細胞系譜を組み合わせることにより全器官または組織を作り出し得（多能性（pluripotency））、一方成体型幹細胞は、「組織に拘束された」ターンオーバー単位の特定の細胞にしかなることができない（多能性（multipotency））。
【００９９】
「癌性幹細胞と腫瘍型の分化段階の間の関係」のSellの仮説が正しい場合、「成体型」、「幼若型」、「胎児型」または「胚性」形態の単一の幹細胞を同定する能力は、癌の定量的および定性的な特性の解析において意味のある進歩である（Sell, S., 2004．Crit. Rev. Oncol. Hematol., 51:1-28）。試験管内で同一の型の幹細胞の純粋な集団を同定および採集するための技術的ツールは明らかに有用である。
【０１００】
発生中の胎児型の腸の細胞中の核は中空のベルのように組織化され得る（図８：a, b）。このような核を有する細胞が胎児型の腸に約３０％で存在するだけでなく、それらは腸組織において非常に独特な配列パターンを有する：核は「ベルの上に重なったベル（bell upon the bell）」のように一方向に指向される。また、それらは管状合胞体に似た構造にも包含される。成体型結腸上皮の正常な陰窩において、ベル形の核を有する細胞はまれであり、それらが存在する場合、それらの数は陰窩当り１以下である。同一のベル形の核を有する細胞は、より多数で、正常または異常な全ての陰窩（図８：g, h参照）の腺腫中に見られ、次いで高頻度で腺癌中の異常な陰窩および腫瘍塊中に再び出現する（表１を参照）。
【０１０１】
ベル形の核を有する細胞が胎児中に多数観察され、新形成物を有さない正常な成体型結腸にはまれであり、数ミリメートル立方体中の腺腫中には少数（１０００未満）であり、数センチメートル立方体中の腺癌中には多数（１，０００，０００より多い）である。
【０１０２】
これらの細胞が幹細胞であり得るという主張は別の、通常見られないベル形の核分裂の観察により支持される。まるでゼロックスコピーの「テンプレート」オブジェクトのように、管状合胞体中のベル形の核は、驚くべきことにそれ自身の３Ｄコピーと同一になった。有糸分裂染色体および典型的な有糸分裂装置を形成するための核凝集が見られないので、本明細書中で「核分裂」と言われるベル形の核の結果的な分離（二つの紙コップの分離のような）の全ての段階が検出された（図８：ｄ）。この発見に続いて、以前に発生中のヒトの腸で発見された、常にベルの「口」の外側に一方向のベル形の核から現れるような全部で７種の核の形態型（図８：e, i）の観察がある。異なる核形態型を有する細胞は、表現型的に異なり、異なる核形態型を有する細胞間での遺伝子発現およびタンパク質合成プロフィルの差を検出することが予期し得る。
【０１０３】
胚の割球の細胞は、中空のベル形の核を含有せず；それらは球形の核を有し、「胚性幹細胞」である。同時に中空のベル形の核は、妊娠の５週目ほど早くに既に観察される。ベル形の核を有する細胞が大量に再び出現する、胎児性腸発生後のヒトの生涯における次の段階は、成体結腸の病理学的状態：結腸腺腫である。核の形態型の明確な多様性もまた、結腸腫瘍において観察され得、胎児性結腸と非常に類似している。細胞および核の形態型の多様性は、腫瘍における細胞の「不均一性」の別の反映である。また、腫瘍は未熟な細胞を含むという点で組織病理学者に特徴付けられる。腫瘍の発生の異なる段階で、新生物発生前における単一の幼若型幹細胞および新生物における単一の胎児性幹細胞は、未熟細胞の異なる画分を伴うが二つの不均一な表現型に貢献し得る（表２）。
【０１０４】
【表２】
2008503726.tif 000004
【０１０５】
実施例４
細胞および合胞体のベル形の核における核構造、DNA含有量および染色体の空間的分布を、定量的イメージサイトメトリーおよび／または共焦点顕微鏡により特徴付けるための方法が本明細書中に記載される。これらの方法により、形態、腫瘍型（結腸対膵臓）および腫瘍中のニッチが異なるベル形の核の間でDNA含有量および／または染色体分布が変化することの発見を可能にする。また、それらは、対称性の核分裂および非対称性の核分裂のいくつかの形態の際のベル形の核において、DNA合成の経過および有糸分裂に関係のあるタンパク質の存在を特徴付けることを可能にする。
【０１０６】
均一な試料として、ベル形の核を有する細胞および合胞体の単離に有用な方法も本明細書中に記載される。かかる方法には、代謝物および高分子の解析に利用され得る核の形態型が均一な細胞の試料を作成するために、「カタパルト」圧力活性化レーザー顕微解剖（"catapult" pressure activated laser micro-dissection）の使用が含まれる。ベル形の核を有する生体細胞および合胞体の均一な調製物をエクソビボで研究し得るように、単一細胞を単離するための方法により、固定されていない腫瘍調製物中の核形態を認識するための手段の発見が可能となる。次いで、独特なDNA合成および分離メカニズムをよりよく理解するため、および癌治療においてこれらの過程を妨害する手段を示すために、生体のベル形の核またはそれを含む細胞を研究し得た。
【０１０７】
ベル形の核がどのように空間的に組織化されるか、核中でクロマチンがどのように分散するのか、特定の染色体が核ラミナの内部を通って特定の領域を占有するかどうか、ということがより特異的な治療標的の研究を示し得、核の形態型（形状）と遺伝子発現の関係のさらなる理解を提供し得、この説明が本明細書中に記載される。免疫細胞化学、分子生物学および関連する科学の方法が存在することでこのような説明がなされ得る。
【０１０８】
ベル形の核由来の非対称核分裂の最初から生じるが、続いて有糸分裂により分裂し、アポトーシスにより死ぬように思われる胎児性の後腸、結腸腺腫および腺癌において、明らかに閉じた核の形態のアレイが見られた。成体組織には存在しない、胎児および腫瘍において共有される一連の核形態型により、腫瘍が成体型器官における「胚性」成長であるという１９世紀の仮説が支持される（図９）。コンピューターに基づく画像解析およびレーザー支持顕微解剖と結びつけたこれらの発見により、特定の核の可能性のある形態を有する多数の細胞の認識および採集がなされる。ベル形の核を有する細胞および腫瘍に独特な他の核形態型を有する細胞の、分子的および生化学的組成物のアレイの特徴づけにより、これまでに予想されなかった潜在的な治療標的の組が提供される。
【０１０９】
個体発生と同様の発癌は、拡張した幹細胞の組を通る直系の系統で進行するように思われる。ヒトの腫瘍由来のほんの小さな断片の細胞は、免疫抑制されたげっ歯類における異種移植片のように、新しい腫瘍を形成する能力を有する。限界希釈異種移植片実験により、推定上の腫瘍形成細胞が、さらなる幹細胞を含む新しい腫瘍を形成し得、起源の腫瘍中に存在する表現型的に混合された細胞の集団を再生し得る点で、幹細胞様の特性を表したことが示されている（Singh, S. et al., 2004. Oncogene, 23:7267-7273；Clarke, M., 2005. Biol. Blood Marrow Transplant., 11:14-26）。
【０１１０】
遅発型癌のほぼ全ての形態は新生物発生前の延長された期間を通過し、これらの新生物発生前コロニーはモノクローナルであり、一つより多い胚性DNA由来の遺伝的変異から生じる。２１世紀の始めまで、移植／希釈実験のために幹細胞を有する腫瘍細胞集団を濃縮する直接的な試みは、組織幹細胞のみが前新形成物の起源同様のの細胞ではなく、腫瘍自身も幹細胞に包含されることを示した（Pardal, R. et al., 2003. Nature Rev., 3:895-902）。腫瘍が実際に適当で、十分に組織化された不均一な胎児性構造であるという仮説の現在の新たな陳述は、検討され拡大されている（Sell, S., 2004. Crit. Rev. Oncol. Hematol., 51:1-28）。「癌胚性」幹細胞は、数の上で増加し、腫瘍塊中で非常に不均一なニッチを構成する分化した細胞型を生じると予想される。
【０１１１】
幹細胞の分野で用いられる種々の抗原性マーカーが、しばしば高い頻度で組織または腫瘍を形成し得る細胞の濃縮に使用されているが、これらの濃縮された集団中の細胞は、幹細胞として印をつけるような顕微鏡下での任意の形態学的細胞特性を示さない。腫瘍が単一の幹細胞から生じるということが真実ならば、それらを同定し、分子および生化学的分析物の解析に十分な幹細胞の均一な集団としてこれらを採集するための手段が必要である。
【０１１２】
本目的に達するためのある方法は、高分子アレイ解析に必要であり、腫瘍幹細胞を同定する顕微組織学的性質に関して均一な細胞の数万の細胞を選択し、採集する、レーザー捕捉顕微解剖（LCM）に依存している。あるいは、腫瘍の幹細胞関連表面マーカーを有する分散した細胞は、不均一な細胞集団からのフローサイトメトリーおよびセルソートにより濃縮される（Morrison, S. et al., 1999. Cell, 96:737-749；Suzuki, A. et al., 2004. Diabetes, 53:2143-2152）。
【０１１３】
癌治療の現存する方法の主要な標的は、細胞周期を移行させる細胞である（Gomez-Vidal, J. et al., 2004. Curr. Top. Med. Chem., 4:175-202；Fischer, P.およびGianella-Borradori, A., 2005. Expert Opin. Investig. Drugs, 14:457-477）。プログラム細胞死によって失われる最終的な細胞の消失および腫瘍幹細胞を補うために、移行細胞を提供するように分裂する成体型維持幹細胞間の移行において、細胞間に違いはない。患者を死なせることなく全腫瘍幹細胞を殺すが、胎児性幹細胞のような腫瘍幹細胞が迅速な正味の細胞成長に関連のある定義によって存在しながら、成体型維持幹細胞が理論的に正味のゼロ細胞成長（zero net cell growth）の特性を有することが期待される摂生法の小さな窓を、治療は目指す。成体型維持幹細胞の分裂は、新しい維持幹細胞および最初の分化した移行細胞を天然に生じ、必然的に非対称であると思われる。腫瘍幹細胞は、正味の腫瘍成長を支持するために連続的な対称核分裂を必要とする。腫瘍中で対称な「カップからカップ」のような核分裂を行なうベル形の核の発見において、細胞増殖抑制性または細胞殺傷性治療に関する特異的な標的が同定された。
【０１１４】
このことについての支持を援助するある理論は、新血管形成を阻害することにより腫瘍を窒息させ得るという理論である（Folkman, J.およびIngber, D., 1992. Sem. Cancer Biol., 3:88-96）。低酸素状態を作り出すことにより、腫瘍幹細胞が関する限り初期胚発生の状態を再び作り出し得、抗新血管形成戦略の治療効果ではなく緩和効果について説明し得る。腫瘍の分化を阻害することにより、望ましくない結果を伴う正常組織の分化を阻害し得る。該幹細胞が短期間のうちに再び腫瘍の集団を構成し得るために、現在の癌治療は最小の効果のみであるということの理解は、成体型維持幹細胞に対抗するような、腫瘍幹細胞に独特の分子的および生化学的な特徴づけに関する研究の力強い刺激となる。かかる分子および／または生化学的な腫瘍幹細胞の特徴づけは、癌治療の標的を提供する。
【０１１５】
かかる理論を試験し、新生物幹細胞および他の新生物細胞型を特徴づける（分子および生化学的特性）重要な局面は、定量的な化学および生化学的解析を可能とするのに十分な数および純度を有するそれらの単離である。かかる細胞単離物を得るためにいくつかの手段が用いられ得る。例えばレーザー捕捉顕微解剖は、当業者が結腸および膵臓腫瘍の未分化ニッチから、１０，０００のベル形の核の一群を手動で選択し、顕微解剖することを可能にする当該分野に公知の方法である。受け取りバイアル中で「カタパルト化」された細胞を顕微鏡スライドガラス上に広げ、形態学に基づいて「ベル形」、「非ベル形」または「不確定」として点数を付ける。濃縮の適当なレベルに達した際に（「ベル形」として点数を付けられた単離された核の７５％より多く）、さらなる解析のために手順を変え、mRNA、タンパク質等を保存する。
【０１１６】
生体結腸上皮細胞を単離するための現存するプロトコルは、構造および機能的特徴を保存する細胞培養物において継続的に観察されるために適合される（Stich, M. et al., 2003. Pathol. Res. Pract., 199:405-409；Micke, P, et al., 2004. J. Pathol., 202:130-138）。ベル形の核を有する単離された細胞またはシンシチウムは、ゆっくりと攪拌された、初期胚および未血管形成腫瘍ニッチ中で予想される酸素レベルを模倣するような種々の酸素濃度の微細担体フラスコに移され得る。グルタミンを十分に供給しているが、「標準」細胞培養メディウム製剤よりも低いグルコースを有するメディウムも、制御された研究室条件下で研究され得るので、これらのベル形の核を有する細胞および合胞体の成長を促進するために使用される。これらの方法論的適用は、核の形態、分裂の様式および／または多細胞集合体もしくは合胞体の特別な形態の存在に関して均一な細胞調製物を産生するように適当に予想される。これらの細胞も、細胞または組織培養物中で増殖および研究され得るような様式で単離され得る。
【０１１７】
本発明は特に参照を伴ってその好ましい態様について示され、記載されるが、形態および詳細において種々の変形が、付属の請求項に包含される本発明の範囲を逸脱することなく、本明細書中になされ得ることを当業者は理解しよう。
【図面の簡単な説明】
【０１１８】
【図１】図１は、ヒト胚腸、正常結腸粘膜、腺腫および腺癌における間期および前期初期（E.P.）の細胞において観察される核形態型を示す。*ベル形の核は、成体結腸においてめったに観察されない。スケールバー、5μm。
【図２．Ａ】図２Ａは、胚腸の顕微鏡像を示す。図２Ａは、低倍率（140 x）での、5〜7週齢の胎児腸を示し、染色された核（左側の像）および異なる腸切片の位相差顕微鏡／自己蛍光像（右側の像）である。明らかに、非球形の核が、位相差顕微鏡像において「管様」構造によって定義される、線状の秩序で配置されているようである（破線で示される）。これらの管様構造は、観察される腸切片のいたるところに現れるが、他の細胞のグループ分けは管内に散在する。スケールバー、低倍率で100μmおよび高倍率で5μm。
【図２．Ｂ】図２Ｂは、胚腸の顕微鏡像を示す。図２Ｂは、同一の腸切片の、重ねられた（右側）位相差顕微鏡像（左側の枠）および染色された核の像（中央）を示し、見かけ上線状の方向付けの核が、実際は、それ自体直径約50ミクロンの管様構造によって束縛されていることを実証する。核の拡大図（280 x）（中央の枠）は、これらの非球形の核がカップまたはベルの形態と思われることを示す。スケールバー、低倍率で100μmおよび高倍率で5μm。
【図２．Ｃ】図２Ｃは、胚腸の顕微鏡像を示す。図２Ｃは、線状の配列の核の、拡大像（1400 x）を示す。これらの配列された核は、見かけ上中空である、再現性のあるベル形状を有する。「頭からつま先」の方向付けのベルは、観察される全ての胚管において保存されているが、管は、平行な管が局所的に逆平行なベル形の核の方向付けを有し得るように、前後にくねっている。スケールバー、低倍率で100μmおよび高倍率で5μm。
【図３．Ａ】図３Ａは、ベル形の核の胚腸の無糸分裂を示す。図３Ａ：対称無糸分裂：ベル形の核が、見かけ上、ベル形の核から現れる。様々なベル形形態型が観察されるが、それらの無糸分裂は、これらの3つの例に示されるように、ベルの口の幅／長さ比等の、見分けがつかないベル形形態型の特徴を示す；スケールバー、5μm。
【図３．Ｂ】図３Ｂは、ベル形の核の胚腸の無糸分裂を示す。図３Ｂ：非対称無糸分裂：均質な核の形態が、見かけ上、ベル形の核内から現れる。球形の凝縮した核がベルの奥深くに形成されるのが見られ、完全に分離する前に見かけ上ベルへの核質の連絡を有して現われる、4つの像が示される；スケールバー、5μm。
【図３．Ｃ】図３Ｃは、ベル形の核の胚腸の無糸分裂を示す。図３Ｃ：ベル形の核の口から出てくる球形の凝縮していない核；スケールバー、5μm。
【図３．Ｄ】図３Ｄは、ベル形の核の胚腸の無糸分裂を示す。図３Ｄ：ベルから現れる卵形（「楕円」）の核；スケールバー、5μm。
【図３．Ｅ】図３Ｅは、ベル形の核の胚腸の無糸分裂を示す。図３Ｅ：ベルから現れる豆形（「腎臓形」）の核；スケールバー、5μm。
【図３．Ｆ】図３Ｆは、ベル形の核の胚腸の無糸分裂を示す。図３Ｆ：ベルから現れる葉巻形の核。スケールバー、5μm。
【図４．Ａ】図４Ａは、正常な成体結腸陰窩を示す。図４Ａは、陰窩の底部（右角：核の拡大像）に位置する認識可能なベル形の核（左下角の矢印）を時折（＜1/100）含んでいた、約2000個の球形および楕円形の核の陰窩を示す。スケールバー、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図４．Ｂ】図４Ｂは、正常な成体結腸陰窩を示す。図４Ｂは、基部に特有の他の核形態型の間の、別のベル形の核を有する陰窩基部を示す。スケールバー、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図４．Ｃ】図４Ｃは、正常な成体結腸陰窩を示す。図４Ｃは、十分分散した陰窩の壁および管腔表面の間期および有糸分裂の核の様々な形態型を示す。拡大像は、（i）球形および楕円形の間期核、（ii、ii）球形および楕円形の核の前期初期、ならびに（iv）後終期の核を示す。スケールバー、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図５．Ａ】図５Ａは、腺腫の拡大像を示す。図５Ａは、腺腫に特徴的な、大きな分枝している陰窩を示す。陰窩基部および管腔開口部は、正常な結腸切片と同様に規則正しく配置されている。スケールバー、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図５．Ｂ】図５Ｂは、腺腫の拡大像を示す。図５Ｂは、腺腫試料のいたるところに同様に見られる、不規則な陰窩様構造を示す。これらの大きい（＞4000個の細胞）不規則な陰窩の基部で、典型的には2つ、時々は1つ、4つまたは8つものベル形の核（挿入）が現われる。スケールバー、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図５．Ｃ】図５Ｃは、腺腫の拡大像を示す。図５Ｃは、1つのベル形の核を含む、同様の核形態型の細胞のクラスターを示す。これらの単純なクラスターは、合計16、32、64および128個の細胞を含む。左側のパネル：フォイルゲン−ギムザ染色。右側のパネル：位相差顕微鏡自己蛍光像。スケールバー、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図５．Ｄ】図５Ｄは、腺腫の拡大像を示す。図５Ｄは、腺腫においてベル形の核が現れる、異なる前後関係を示す：（i）31個の楕円形の核および1つのベル形の核を含むクラスター、（ii）「肩から肩」の配置の複数のベル形の核、（iii）より大きい「円」において、「肩から肩」のパターン（矢印）で配置されたベル形の核、（iii）発生期の陰窩基部を連想させるいくつかのベル形の核が腺腫のいたるところに散在しているのがわかる約250個の核の不規則な混合物。スケールバー、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図５．Ｅ】図５Ｅは、腺腫の拡大像を示す。図５Ｅは、基部に1つのベル形の核（矢印）を有する、5つの異なる核形態型の見かけ上細胞のクローンの斑点を含む、不規則な陰窩様構造を示す。スケールバー、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図６．Ａ】図６Ａは、腺癌の拡大像を示す。図６Ａは、区切り点が頻繁にある分枝を有する、非常に大きい（＞8000個の細胞）陰窩様構造を示す。これらの構造の基部は、腺腫におけるような2つの（典型的には）ベル形の核の存在を除いて、正常なクローンの陰窩のものと見分けがつかなかった。腺腫で保存されている陰窩様構造の基部から管腔の方向付けは、陰窩の方向付けがランダムと思われる腺癌では観察されない。矢印は、腫瘍の表面近くで一般に見られる、小さい、約250個の細胞の陰窩様構造を示す。スケール、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図６．Ｂ】図６Ｂは、腺癌の拡大像を示す。図６Ｂは、腫瘍内部のいたるところに見られるベル形の核の、肩から肩のグループ分けを示す。スケール、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図６．Ｃ】図６Ｃは、腺癌の拡大像を示す。図６Ｃは、肩から肩の配置および頭からつま先の配置の両方に局所的に方向付けられたベル形の核の複数の例を含む、内部の腫瘍塊を示す。頭からつま先の方向付けは、腫瘍内部にのみ見られ、肩から肩の方向付けは、陰窩様構造の間で、内部および腫瘍表面近くの両方に見られる。ベル形の核は、腫瘍内部における全ての核の約0.2％を占める。スケール、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図７．Ａ】図７Ａは、腺癌における無糸分裂を描写する拡大像である。図７Ａは、不規則な陰窩における、種類の異なる形態型の2つのベル形の核を作り出す対称無糸分裂を示す。左側の像の矢印は、新しく生じた核のベルの底部を示す。スケール、5μm。
【図７．Ｂ】図７Ｂは、腺癌における無糸分裂を描写する拡大像である。図７Ｂは、球形の核を作り出す非対称無糸分裂を示す。スケール、5μm。
【図７．Ｃ】図７Ｃは、腺癌における無糸分裂を描写する拡大像である。図７Ｃは、楕円形の核を作り出す非対称無糸分裂を示す。スケール、5μm。
【図７．Ｄ】図７Ｄは、腺癌における無糸分裂を描写する拡大像である。図７Ｄは、「葉巻」形の核を形成する対称無糸分裂を示す。スケール、5μm。
【図７．Ｅ】図７Ｅは、腺癌における無糸分裂を描写する拡大像である。図７Ｅは、ベル形の核のへりの凝縮した染色体と思われるもの（下の矢印）とは種類の異なる奇異な暗い染色要素（上の矢印）を有する「ソーセージ」形の核を作り出す、非対称無糸分裂を示す。スケール、5μm。
【図８】図８は、ヒト結腸上皮のフォイルゲン−DNA染色した核を示す：ａ、ｂ：胚腸のベル形の核；ｃ：結腸腺腫のベル形の核；ｄ：腸における、ベル形の核の対称核分裂；ｅ：非対称核分裂；ｆ：結腸腺癌における非対称核分裂（凝縮した球形の核が、ベル形の核から現れる）；ｇ：正常に見える陰窩の底部のベル形の核（矢印）およびｈ：腺腫の「初期の」陰窩のいたるところ；ｉ：腸における核形態型の多様性。腺腫（ｋ）および結腸腺癌（ｌ）から得られた細胞の広がりにおける、矢印の「葉巻」形の核。「ｊ」に、成体の正常結腸陰窩に典型的な、球形の形態の核を示す。バーのサイズは5μmである。
【図９】図９は、重要な像の要旨を示す。（ａ）ヒト胎児腸、正常結腸粘膜、腺腫および腺癌の間期、および前期初期（E.P.）の細胞において観察される、核形態型の例。（Ｈ−ベル形の核は、成体の結腸においてめったに観察されない）。（ｂ）胎児腸の、高解像度像（1400 x）のベル形の核。凝縮したDNAが、中空のベル構造への開口部を維持する輪を作り出すようである。スケールバー、5μm。
【図１０】図１０は、5〜7週齢の胚腸の切片を示す：（ａ）位相差顕微鏡像（左側の枠）および染色された核の像（中央）ならびに合併した像（右側）は、約50ミクロンの範囲の直径の管状合胞体内の、核の線状の配列を示す；（ｂ）核の高解像度像は、中空のベル形構造を示す。ベルの「頭からつま先」の方向付けが、観察される全ての胚管において保存されているが、管は、平行な管が局所的に逆平行なベル形の核の方向付けを有し得るように、前後にくねっている。スケールバー、低倍率で50μmおよび高倍率で5μm。
【図１１】図１１は、胎児腸における、ベル形の核の核分裂を示す。ａ、ｂ：対称核分裂：ベル形の核が、同様の形状のベル形の核から現れる。ｃ、ｄ：非対称核分裂：ベル形の核から現れる、球形の核および葉巻形の核。スケールバー、5μm。
【図１２】図１２は、正常な成体の結腸陰窩を示す：（ａ）約2000個の球状、球形または円板状の核の陰窩は、時折（＜1/100）、陰窩の底部に位置する、認識可能なベル形の核（矢印）を含んでいた；（ｂ）別のベル形の核を示す陰窩基部；（ｃ）十分分散した陰窩の壁および管腔表面の、間期および有糸分裂の核の形態型。拡大像は、[i]球形および楕円形の間期の核、[ii、iii]球形および楕円形の核の前期初期、ならびに[iv]後〜終期の核を示す。スケールバー、低倍率像で100μmおよび高倍率像で5μm。
【図１３】図１３は、腺腫を示す。（ａ）腺腫の、特徴的な大きい分枝陰窩。（ｂ）腺腫のいたるところに見られる不規則な陰窩様構造。典型的には2つだが、時々1、4またはさらには8個のベル形の核（挿入）が、これらの大きい（＞4000個の細胞）の不規則な陰窩様構造の基部に現れる。（ｃ）1つのベル形の核を含む、同様の核形態型の細胞のクラスター。これらの形態のクラスターは、正確に合計16、32、64および128個の細胞を含む。左側のパネル、フォイルゲン−ギムザ染色。右側のパネル、位相差顕微鏡自己蛍光像。（ｄ）腺腫においてベル形の核が現れる前後関係：（ｉ）31個の楕円形の核および1つのベル形の核を含むクラスター、（ii）肩から肩の配置である、複数のベル形の核、（iii）並んだパターンで配置されたベル形の核（矢印）、（iii）発生期の陰窩基部を連想させるいくつかのベル形の核を含む、約250個の核の、不規則な混合物。（ｅ）基部の1つのベル形の核（矢印）を含む5つの異なる核形態型の細胞の見かけ上クローンの斑点を含む、不規則な陰窩様構造。スケールバー、100μm（「ａ、ｂ」において）および5μm（「ｅ」において）。
【図１４】図１４は、腺癌を示す。（ａ）頻繁な区切り点のある分枝を有する、非常に大きい陰窩様構造（＞8000個の細胞）。矢印は、主に腫瘍の表面近くで見られる、約250個の細胞の陰窩様構造の例を示す。（ｂ）複数のベル形の核を有する、内部の腫瘍塊（全ての核形態型の2×10-3）。（ｃ）頭からつま先の合胞体および非合胞体の並んだ配置で方向付けられた、（ｂ）におけるベル形の核。（ｄ）腺癌における対称核分裂。（ｅ）腺癌における、葉巻形の核を作り出すベルの非対称核分裂。肝臓への結腸の転移において、同様の構造が観察されている。スケールバー、5um。
【図１５】図１５は、（ａ）胚腸、（ｂ）、結腸腺癌、（ｃ）結腸腫瘍の肝臓転移、（ｄ）膵臓腫瘍のヒト組織で明らかにされているように、ベル形の核の形態学的類似性を示す（紫色でフォイルゲンDNA染色されている）。「ｄ」でベルの下半分に見られる凝縮したクロマチンのすじは、膵臓由来の全てのベル形の核に見られるが、結腸腫瘍では全く見られない。バースケール、5ミクロン。
【図１６】図１６は、本明細書中に開示される組織学的手順（フォイルゲン染色）によって容易に検出されるが5ミクロンの切片のミクロトーム切片を作成する標準的な組織学的手順（ヘマトキシリン−エオシン染色（H&E））ではめったに（今までのところでは単なる例）検出されないベル形の核を示す。同じ腫瘍、切除の30分以内の固定。：（ａ）非対称に分裂している多くの細胞（矢印の先）を含む膵臓腫瘍の端にコロニーとして存在する、葉巻形の核を生じさせるベル形の核（左に対するx 100拡大像）。（ｂ）最近の非対称核分裂を示唆する、並置して標準的な組織切片スライド上で可視のベル形および楕円形の核の、現在のところ見つかっている単一の例。ベル形の核は、依然として楕円形の核（矢印）に結合させる、クロマチン鎖を有するようである。（ｃ）この解釈を示す、元々の写真の漫画。
【図１７】図１７は、腫瘍における、非分裂中および分裂中のベル形の核を調査するFISHの適用における、「目的の標的」の実例である：（ａ）核における1平方ミクロン当たりのより高い濃度のDNAのためにより暗く染色されたクロマチンは、2つの平行な環として配置された前期の染色体に似たベル形の形態の一部として独特の構造を作り出す。図面（上方）に説明されたこれらの環は、特定の染色体が、結腸腫瘍におけるベル形の核のこの特異的な部位で見られるかもしれないという予想を示す、（ｂ）クロマチンの分布および特異的な染色体の配置が、ベル形の核の非対称分裂を通して起こる想像上の変形（ここでは、ベル形から楕円形の核へ）として変化する。
【図１８】図１８は、TK-6ヒト細胞の球形の核における第11染色体の蛍光インサイチューハイブリダイゼーションの結果を示す。（ａ）前期染色体の広がりにおける2対の染色体、（ｂ）球形の核DAPI核染色、（ｃ）FITC蛍光プローブとハイブリダイズした同じ染色体対、（ｄ）DAPIおよびFITC間期染色体染色の、併合した像。
【図１９】図１９は、レーザー圧力捕捉システムによる回収における「標的」としてのベル形の核を示す（「レーザー圧力顕微解剖」）：（ａ）細胞の広がりが、顕微鏡に連結されたパルスにされたUV-Aレーザーの前に配置された、顕微鏡スライド。（ｂ）視野におけるベル形の核を有する結腸腫瘍組織の細胞の広がりに関して示されているように、単一の核を、顕微鏡を介して見ることができる；（ｃ）染色されていないスライドにおける、認識可能な形態のベルを有する、同じ核。
【図１】
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【図２】
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【図７】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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