(57)【要約】  本発明は、線維形成状態、例えば肝臓、腎臓及び肺の線維症、並びに身体の他の組織の線維形成状態の治療方法を目的とする。本発明の方法は、このような治療を必要とする患者に治療的有効な量のＢ細胞アンタゴニストが投与されることを含んでなるる。本発明の方法の実施に用いることができる例示的なＢ細胞アンタゴニストには、Ｂ細胞表面抗原に対する抗体(例えばＣＤ２０に対する抗体)、及びＢＡＦＦアンタゴニストが含まれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
線維形成状態の治療方法であって、このような治療を必要とする患者に治療上有効な量のＢ細胞アンタゴニストが投与されることを含んでなる方法。
【請求項２】
前記Ｂ細胞アンタゴニストがＢ細胞表面抗原に対する抗体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｂ細胞表面抗原がＣＤ２０である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記Ｂ細胞表面抗原がＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５、ＣＤ８６、ＴＬＲ-７、ＴＬＲ-９、ＣＸＣＲ３、ＡＰＲＩＬ、ＢＲ３、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
前記抗体がモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記抗体がＣＤ２０に対するモノクローナル抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
前記抗体がＣＤ２０に対するキメラのマウス／ヒトモノクローナル抗体である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＣＤ２０に対する前記モノクローナル抗体がリツキシマブ(RITUXAN(登録商標))である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記抗体がヒト化抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が完全なヒト抗体である、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
さらに、前記患者に治療上有効な量のＢＡＦＦアンタゴニストが投与されることを含んでなる、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＢＡＦＦアンタゴニストが、ECFDLLVRAWVPCSVLK(配列番号：１５)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(配列番号：１６)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(配列番号：１７)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(配列番号：１８)、及びECFDLLVRHWVACGLLR(配列番号：１９)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＢＡＦＦアンタゴニストは、ＢＡＦＦレセプター一部と免疫グロブリンの定常領域の一部を少なくとも含む可溶性融合タンパク質を含んでなる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記患者が自己免疫性疾患に罹っていない、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記患者が自己免疫性疾患に罹るリスクを持たない、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記Ｂ細胞アンタゴニストにより、該Ｂ細胞アンタゴニストの前記患者への投与の２４時間以内に該患者の末梢Ｂ細胞の２０％が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記Ｂ細胞アンタゴニストにより、該Ｂ細胞アンタゴニストの前記患者への投与の２４時間以内に該患者の末梢Ｂ細胞の６０％が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｂ細胞アンタゴニストにより、該Ｂ細胞アンタゴニストの前記患者への投与の２４時間以内に該患者の末梢Ｂ細胞の８０％が減少する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
肺線維症の治療方法であって、このような治療を必要とする患者に治療上有効な量のＢ細胞アンタゴニストが投与されることを含んでなる方法。
【請求項２０】
前記Ｂ細胞アンタゴニストがＣＤ２０に対する抗体である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記抗体がＣＤ２０に対するキメラのマウス／ヒトモノクローナル抗体である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ２０に対する前記抗体がリツキシマブ(RITUXAN(登録商標))である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｂ細胞アンタゴニストが前記患者に投与された後に、該患者が、該Ｂ細胞アンタゴニストの投与前と比較して、一又は複数の線維症のマーカーの減少を表す、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記の一又は複数の線維症のマーカーが、平滑筋アクチン沈着又はコラーゲン沈着である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記Ｂ細胞アンタゴニストが前記患者に投与された後に、該患者の一又は複数の組織に観察される平滑筋アクチン染色の範囲が、該Ｂ細胞アンタゴニストの投与前の該患者の一又は複数の同じ組織に観察される平滑筋アクチン染色の範囲より少なくとも５％以上狭い、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記Ｂ細胞アンタゴニストが前記患者に投与された後に、該患者の一又は複数の組織に観察される平滑筋アクチン染色の範囲が、該Ｂ細胞アンタゴニストの投与前の該患者の一又は複数の同じ組織に観察される平滑筋アクチン染色の範囲より少なくとも２５％以上狭い、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記Ｂ細胞アンタゴニストが前記患者に投与された後に、該患者の一又は複数の組織に観察される平滑筋アクチン染色の範囲が、該Ｂ細胞アンタゴニストの投与前の該患者の一又は複数の同じ組織に観察される平滑筋アクチン染色の範囲より少なくとも５０％以上狭い、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記Ｂ細胞アンタゴニストが前記患者に投与された後に、該患者の一又は複数の組織に観察されるコラーゲン染色の範囲が、該Ｂ細胞アンタゴニストの投与前の該患者の一又は複数の同じ組織に観察されるコラーゲン染色の範囲より少なくとも５％以上狭い、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記Ｂ細胞アンタゴニストが前記患者に投与された後に、該患者の一又は複数の組織に観察されるコラーゲン染色の範囲が、該Ｂ細胞アンタゴニストの投与前の該患者の一又は複数の同じ組織に観察されるコラーゲン染色の範囲より少なくとも２５％以上狭い、請求項２４に記載の方法。
【請求項３０】
前記Ｂ細胞アンタゴニストが前記患者に投与された後に、該患者の一又は複数の組織に観察されるコラーゲン染色の範囲が、該Ｂ細胞アンタゴニストの投与前の該患者の一又は複数の同じ組織に観察されるコラーゲン染色の範囲より少なくとも５０％以上狭い、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
肝線維症の治療方法であって、このような治療を必要とする患者に治療的有効な量のＢ細胞アンタゴニストが投与されることを含んでなる方法。
【請求項３２】
前記Ｂ細胞アンタゴニストがＣＤ２０に対する抗体である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記抗体がＣＤ２０に対するキメラのマウス／ヒトモノクローナル抗体である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
ＣＤ２０に対する前記抗体がリツキシマブ(RITUXAN(登録商標))である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
腎臓線維症の治療方法であって、このような治療を必要とする患者に治療的有効な量のＢ細胞アンタゴニストが投与されることを含んでなる方法。
【請求項３６】
前記Ｂ細胞アンタゴニストがＣＤ２０に対する抗体である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記抗体がＣＤ２０に対するキメラのマウス／ヒトモノクローナル抗体である、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
ＣＤ２０に対する前記抗体がリツキシマブ(RITUXAN(登録商標))である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
線維形成状態の治療方法であって、このような治療を必要とする患者に治療的有効な量のＢ細胞アンタゴニストと治療的有効な量のインテグリンレセプターアンタゴニストが投与されることを含んでなる方法。
【請求項４０】
前記インテグリンレセプターアンタゴニストがインテグリンレセプターに特異的な抗体である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記インテグリンレセプターが、αｖβ６、αｖβ５、α５β１、α１β１、α４β１及びα４β７からなる群から選択される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記インテグリンレセプターがα４β１又はα４β７インテグリンレセプターである、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記インテグリンレセプターアンタゴニストはナタリズマブ(TYSABRI(登録商標))である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記患者が自己免疫性疾患に罹っていない、請求項３９に記載の方法。
【請求項４５】
前記患者が自己免疫性疾患に罹るリスクを持たない、請求項３９に記載の方法。
【請求項４６】
線維形成状態の治療方法であって、このような治療を必要とする患者に治療的有効な量のリツキシマブ(RITUXAN(登録商標))と治療的有効な量のナタリズマブ(TYSABRI(登録商標))が投与されることを含んでなる方法。
【請求項４７】
線維形成状態の予防方法であって、一又は複数の線維形成状態が発達するリスクを有する患者に治療的有効な量のＢ細胞アンタゴニストが投与されることを含んでなる方法。
【請求項４８】
前記の一又は複数の線維形成状態が発達するリスクを有する患者が、肺、肝臓又は腎臓の線維形成のリスクを増やすことが知られている一又は複数の環境条件に曝されたことがある、請求項４７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の開示】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、線維症又は線維形成状態の治療のための方法に関する。より具体的には、本発明は、線維形成状態を治療するための、Ｂ細胞アンタゴニスト又は枯渇化(depleting)薬剤の使用に関する。
【０００２】
(関連技術)
組織障害は、感染、自己免疫応答及び物理的な損傷を含む様々な慢性ないしは急性の刺激から生じうる。治癒過程は、通常、結合組織が実質組織を置き換える段階を伴う。(Wynn, Nature Reviews 4:583-594 (2004))。しかしながら、この過程が抑制されないでいると、永続的な瘢痕組織の形成は生じ得、場合によっては、最終的に臓器不全及び死につながりうる。
線維形成状態は、組織障害後の線維形成材料(例えば細胞外基質)の異常な及び／又は過剰な蓄積に特徴がある病的状態である。線維形成状態は、循環器病、大脳疾患及び末梢血管性疾患などの血管性疾患と関係する線維増殖性疾患、並びに皮膚、腎臓、肺、腸及び肝臓を含むすべての主要組織及び臓器系の線維増殖性疾患を含む。(Wynn, Nature Reviews 4:583-594 (2004))。線維形成状態は多様な種類の病理であるにもかかわらず、ほとんどの線維形成状態において、線維形成組織蓄積を引き起こす一般的なメカニズムは多くの共通する因子を有すると考えられる。
【０００３】
線維形成状態の治療のための多くの治療法は、一般的に線維症の発達に働くと思われる炎症応答を標的とする。(Wynn, Nature Reviews 4:583-594 (2004))。線維形成状態を治療するための薬剤方策の例には、免疫抑制剤、例えば、副腎皮質ステロイド、他の従来の免疫抑制薬又は細胞障害性剤及び抗線維剤が含まれる。それにもかかわらず、当分野では、線維形成状態の治療のための新規でより特異的なターゲティング手法が求められいている。
【０００４】
(発明の概要)
本発明は、Ｂ細胞を欠いている又は薬理的にＢ細胞が減少しているマウスにおいて、実験的に誘発された線維形成障害の範囲が実質的に低減しているという驚くべき発見に少なくともある程度関係しており、それによって、動物のＢ細胞の枯渇又はＢ細胞活性の障害が線維形成状態を治療するための有効な方法であることが示される。
したがって、本発明は線維形成状態の治療方法を包含する。本発明の方法は、線維形成状態の治療を必要とする患者に治療上有効な量のＢ細胞アンタゴニストが投与されることを含んでなる。
線維形成は伴う特定の組織を問わず同様の生体分子メカニズムにより起こると考えられているので、本発明は患者の何れかの組織に影響を及ぼす任意の線維形成状態を治療するために用いてもよい。例えば、本発明は、肺(肺性)、腎臓(腎性)、肝臓(肝性)、皮膚、血管、腸及び角膜組織の線維形成の治療、減縮又は、遅延のために用いてもよい。本方法は、感染、自己免疫応答、物理的な損傷、化学製品、糖尿病、高血圧などから生じる組織障害を含む任意の種類の組織障害から生じる線維形成状態を治療するために用いてもよい。本発明の方法を用いて治療されうる特定の例示的な線維形成状態は、本明細書中の他の場所に記述される。
【０００５】
また、本発明の方法は、線維形成状態が発達するリスクを有する患者において、線維形成状態を発達させるのを防止するために用いてもよい。線維形成状態が発達するリスクを有する患者には、例えば、肺、腎臓又は肝臓の瘢痕組織蓄積を引き起こすか又は刺激することが知られている一又は複数の環境要因にさらされたことがある患者が含まれる。例示的な環境要因には、例えば、煙曝露、粉塵曝露、アスベスト曝露、過剰なアルコール消費、放射線被曝、ブレオマイシン、二酸化ケイ素、細菌、ウイルスなどへの曝露が含まれる。また、ある実施態様では、線維形成状態が発達するリスクを有する患者には、例えば、糖尿病、慢性喘息、狼瘡、強皮症、関節リウマチ、血管系疾患、緑内障、ＩｇＡ神経障害、アルポート症候群を有する個体、並びに肺移植及び／又は腎臓移植を経た個体が含まれる。
【０００６】
本発明の方法の実施に用いられうる例示的なＢ細胞アンタゴニストには、Ｂ細胞(免疫グロブリンの分泌を含む)の成長、生存、増殖又は機能を阻害又は障害しうる、もしくは、Ｂ細胞の死又は破壊を引き起こしうる任意の分子又は化合物(ポリペプチド、リガンド、融合タンパク質、抗体、小分子など)が含まれる。本発明によるＢ細胞アンタゴニストは、必ずではないが、Ｂ細胞を減少させるように機能しうる。本発明の選択された好ましい実施態様は、抗体依存性細胞障害活性(ＡＤＣＣ)、補体依存性細胞障害活性(ＣＤＣ)又はアポトーシスにより、循環Ｂ細胞又はその他のＢ細胞の少なくとも一部が枯渇するＢ細胞アンタゴニストの使用を含んでなる。本明細書のために、このようなアンタゴニストはＢ細胞枯渇化薬剤(B-cell depleting agents)と称されうる。
【０００７】
本発明のある実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニスト又は枯渇化薬剤はＢ細胞表面抗原に対する抗体である。特に好ましい実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストはＣＤ２０に対する抗体である。本発明の方法の実施に用いられうる抗ＣＤ２０抗体の例はリツキシマブ(RITUXAN(登録商標))である。
本発明の他の実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストはＢＡＦＦ又はＢＡＦＦレセプター(ＢＲ３、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩ)のアンタゴニストであり、それはＢ細胞に発現される。当分野の技術者は、特に自己応答性Ｂ細胞が病原性になりやすい時期に骨髄から脾臓へ移行するので、ＢＡＦＦがＢ細胞の強力な生存因子であると認識するであろう。ゆえに、ＢＡＦＦとＢＲとの相互作用を阻止するためにＢＡＦＦアンタゴニストを使用することにより、自己応答性になりうるＢ細胞の生成を下方制御するか、阻害するか又は抑制できる。この点で、有用なアンタゴニストには、抗ＢＡＦＦ抗体(例えばベリムマブ)、抗ＢＲ抗体、ＢＡＦＦないしはＢＲと相互作用する小分子、又はリガンドベースのポリペプチドアンタゴニストが含まれうる。特に好ましい実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストは、免疫グロブリン定常領域に連結されるＢＡＦＦレセプターの全部又は一部を含んでなる可溶性分子である。特定の例示的なポリペプチドＢＡＦＦアンタゴニストは、以下で更に詳細に述べられる。
【０００８】
本発明は、複数のＢ細胞アンタゴニストの投与を含んでなる方法を更に含む。例えば、特定の実施態様では、ＣＤ２０に対する抗体(例えばリツキシマブ)は、ＢＡＦＦアンタゴニストとともに患者に投与される。
また、本発明は、一又は複数のＢ細胞アンタゴニストと、一又は複数の線維形成状態を治療するために有用である一又は複数の更なる薬剤の投与を含んでなる方法を包含する。また、例えば、本発明は、一又は複数のＢ細胞アンタゴニストと一又は複数のインテグリンレセプターアンタゴニストの投与を含んでなる方法を包含する。当分野の技術者は、インテグリンレセプターアンタゴニストには、ペプチド、抗体、可溶性リガンド、又はインテグリンないしはインテグリンレセプターの機能を阻害する小分子、例えばαｖβ６、αｖβ５、αｖβ８、α５β１、α１β１、α４β１(ＶＬＡ-４)、α４β７などに対する抗体が包含されていることを理解するであろう。α４β１インテグリンレセプターに特異的に結合する抗体及び、本発明において、線維形成状態を治療するためにＢ細胞アンタゴニストと組み合わして用いられうる抗体の例は、ナタリズマブ(Tysabri(登録商標))である。
【０００９】
また、本発明は、一又は複数のＢ細胞アンタゴニストと一又は複数のＴＧＦ-β経路阻害薬、例えばＴＧＦ-βリガンドアンタゴニスト又はＴＧＦ-βレセプターアンタゴニスト(例えばモノクローナル抗体、可溶性ＴＧＦ-β ＲII-Ｆｃ融合タンパク質、ＬＡＰ-Ｆｃ融合タンパク質、ＴＧＦ-βＲI又はＲIIキナーゼ阻害薬、小分子阻害薬など)の投与を含んでなる方法を包含する。
熟練した当業者は、本明細書中の教示に適合する他の抗線維形成薬剤を認識することが可能であろう。
本発明の他の目的、特徴及び利点は、以下の好適な例示的実施態様の詳細な説明の検討から、当業者に明らかであろう。
【００１０】
(発明の詳細な説明)
本発明は、線維症又は線維形成状態を治療するか、寛解するか、軽減するか又は予防するための方法を目的とする。本発明の方法は、このような治療を必要とする患者に治療上有効な量のＢ細胞アンタゴニストが投与されることを含んでなる。
本明細書中で用いられる「線維形成状態」なる表現は、線維形成組織、瘢痕組織、結合組織及び／又は細胞外基質(ＥＣＭ)構成成分が組織障害(例えば、感染、自己免疫応答、物理的な損傷、化学的な損傷、糖尿病、高血圧など)に応答して体内の一又は複数の臓器に又は臓器内に蓄積する任意の状態を意味することを意図する。本明細書中で用いられる「線維形成状態」なる表現及び「線維性状態」は同じ意味を有することを意図する。
【００１１】
例示的な線維形成状態には、以下のものが含まれるが、これらに限定するものではない。
(I) 線維形成と関連する肺疾患、例えば突発性肺線維形成、放射線誘発性線維形成、慢性閉塞性肺疾患(ＣＯＰＤ)、強皮症、ブレオマイシン誘発性肺線維症、慢性喘息、珪肺症、アスベスト誘発性肺線維形成、急性肺障害及び急性呼吸困難(細菌性肺炎誘発性、外傷誘発性、ウイルス肺炎誘発性、人工呼吸器誘発性、非肺敗血症誘発性、及び吸引誘発性を含む)、
(II) 障害／線維形成(腎線維症)と関連する慢性腎症、例えば狼瘡、糖尿病、強皮症、腎糸球体腎炎、局所性分節性腎糸球体硬化症、ＩｇＡ腎症(ネフロパシー)、高血圧、同種異系移植片、ループス、及びアルポート、
(III) 腸線維症、例えば強皮症、及び放射線誘発性腸線維症、
(IV) 肝線維症、例えば肝硬変、アルコール誘発性肝線維形成、非アルコール性脂肪性肝炎(ＮＡＳＨ)、胆汁導管障害、原発性胆管萎縮症、感染又はウイルス誘発性肝線維形成(例えば、慢性ＨＣＶ感染)、及び自己免疫性肝炎、
(V) 頭頸部線維症、例えば放射線誘発性のもの、
(VI) 角膜瘢痕化、例えばＬＡＳＩＸ、角膜移植片及び柵状織切除、
(VII) 肥大性瘢痕化及びケロイド、例えば熱傷誘発性及び外科的なもの、そして、
(VIII) その他の線維形成性疾患、例えばサルコイドーシス、強皮症、脊髄障害／線維形成、骨髄線維症、血管性再狭窄、アテローム性動脈硬化、ベゲナー肉芽腫症、混合性結合組織病及びペロニー病。
【００１２】
本明細書中で用いられる「このような治療を必要とする患者」なる表現は、例えば、一又は複数の線維形成状態、例えば上記に挙げた何れかの線維形成状態について治療を必要とするヒトないし非ヒト動物を意味することを意図する。「このような治療を必要とする患者」は、体内の一又は複数の臓器上に又は臓器内に、線維形成組織、瘢痕組織及び／又は細胞外基質材料(例えばコラーゲン、ビメンチン、アクチンなど)の蓄積を有するヒトないし非ヒト動物であってもよい。「このような治療を必要とする患者」は、必ずではないが、一又は複数の線維形成状態の臨床診断を受けたヒトないし非ヒト動物であってもよい。「このような治療を必要とする患者」は、線維形成状態の一又は複数の症状を表すヒトないし非ヒト動物であってもよい。(Khalil及びO'Connor, Canadian Medical Journal 171:153-160 (2004))。例えば、「このような治療を必要とする患者」は、以下の一又は複数の症状を表すヒトないし非ヒト動物であってもよい：肝臓の線維形成状態(例えばウイルス性肝炎、アルコール乱用、ドラッグ、鉄ないしは銅の過負荷による代謝病、肝細胞ないしは胆管上皮の自己免疫性攻撃、又は先天的な異常によって、引き起こされる肝臓組織障害又は瘢痕化など) (Friedman, J. Biol. Chem. 275:2247-2250 (2000))、肺の線維形成状態(例えば、突発性間質性肺炎を含む刺激現象に対する肺の炎症性応答による又はこれに関連する肺組織障害又は瘢痕化など) (Garantziotis等, J. Clin. Invest. 114:319-321 (2004))、皮膚又は他の臓器(一又は複数)の強皮症(Trojanowska, Frontiers Biosci. 7: d608-618 (2002))、及び／又は腎臓の線維形成状態(例えば糸球体硬化症又は管状間質性線維形成に関連する腎臓組織障害又は瘢痕化など) (Negri, J. Nephrol. 17:496-503 (2004))。
【００１３】
特定の実施態様によると、「このような治療を必要とする患者」は、自己免疫性疾患を有さない及び／又は、自己免疫性疾患を有するリスクにない。例えば、「このような治療を必要とする患者」は、必ずではないが、一又は複数の自己免疫性疾患の臨床診断を受けていない患者であってもよい。「このような治療を必要とする患者」は、必ずではないが、一又は複数の自己免疫性疾患の一又は複数の症状を表さない患者であってもよい。本明細書中に用いられる「自己免疫性疾患」なる用語は、個体自身(自己)の抗原及び／又は組織から生じる、並びにそれらに対する非悪性の疾患ないしは疾病を意味する。(例として米国公開特許第２００５／００９５２４３号参照)。ゆえに、本発明の特定の例示的な実施態様では、「このような治療を必要とする患者」は、以下の一又は複数の自己免疫性疾患の臨床診断を受けていない、又は以下の一又は複数の自己免疫性疾患の一又は複数の症状を表さない患者である：関節リウマチ、若年性慢性関節リウマチ、全身性エリテマトーデス(ＳＬＥ)、ウェゲナー病、炎症性腸疾患、特発性血小板減少性紫斑病(ＩＴＰ)、血栓性血小板減少性紫斑病(ＴＴＰ)、自己免疫性血小板減少症、多発性硬化症、乾癬、ＩｇＡ腎症、ＩｇＭ多発性神経炎、重症筋無力症、血管炎、真正糖尿病、レイノー症候群、シェーグレン症候群又は糸球体腎炎。
非ヒト動物には、例えば、家庭動物及び酪農動物、並びに動物園動物、スポーツ動物及びペット動物(例えばネコ、イヌ、ウマ、ウシなど)が含まれる。
【００１４】
本明細書中で用いられる「治療的に有効な量」なる表現は、問題の線維形成状態の症状を予防、寛解、治療又は改善させるために有効なＢ細胞アンタゴニストないしはアンタゴニストの量を指す。例えば、本明細書中で用いられる、Ｂ細胞アンタゴニストの治療的に有効な量は、線維形成状態の一又は複数のマーカーの減少を引き起こすために十分なＢ細胞アンタゴニストの量であってもよい。線維形成状態の例示的なマーカーには、例えば、コラーゲン沈着、平滑筋アクチン沈着などが含まれる。本発明のある実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストの治療的に有効な量は、Ｂ細胞アンタゴニストの投与前に観察されるコラーゲン沈着のレベルと比較して、コラーゲン沈着の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％又は１００％の減少を引き起こすために十分なＢ細胞アンタゴニストの量である。本発明のある実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストの治療的に有効な量は、Ｂ細胞アンタゴニストの投与前に観察される平滑筋アクチン沈着のレベルと比較して、平滑筋アクチン沈着の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％又は１００％の減少を引き起こすために十分なＢ細胞アンタゴニストの量である。更に他の実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストの治療的に有効な量は、Ｂ細胞アンタゴニストの投与前に観察される臓器機能と比較して、臓器機能(例えば肝機能、肺機能、腎機能)の５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％又は１００％の改善を引き起こすために十分なＢ細胞アンタゴニストの量である。
【００１５】
Ｂ細胞アンタゴニスト又は枯渇化薬剤
本明細書中で用いられる「Ｂ細胞アンタゴニスト」なる表現は、(Ｂ細胞により誘発される体液性応答を低減又は阻害することによって、)Ｂ細胞の成長、生存、増殖又は機能を阻害、障害、遅延、寛解又は下方制御する、又はすべてないしは一部のＢ細胞集団の死ないしは破壊を引き起こす任意の物質又は薬剤を意味することを意図する。後者の場合、このようなＢ細胞アンタゴニストは、Ｂ細胞枯渇化薬剤と称されうる。Ｂ細胞アンタゴニストは、Ｂ細胞表面抗原と結合するか又は相互作用するか、又はＢ細胞機能を阻害するために細胞内シグナル伝達分子と相互作用する、合成ないしは天然配列のペプチド及び小分子であってもよい。いくつかの実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストは細胞障害性剤と融合又はコンジュゲートしてもよい。本発明の更なる他の実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストは、融合タンパク質(例えばＢＲ-Ｆｃ)又は抗体、例えば一又は複数のＢ細胞表面抗原に対する抗体である。
【００１６】
上記したように、Ｂ細胞アンタゴニストは、Ｂ細胞アンタゴニストの患者への投与の際又は、その投与の後にＢ細胞を減少させる薬剤であってもよい。例えば、Ｂ細胞アンタゴニストは、Ｂ細胞アンタゴニストの投与の２４〜１００時間以内に、２％〜１００％のＢ細胞が枯渇しうる。
例えば、Ｂ細胞アンタゴニストは、該Ｂ細胞アンタゴニストの投与の２４時間以内に、末梢Ｂ細胞の２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％が枯渇しうる(例として米国特許第６３９９０６１号に記載)。
【００１７】
あるいは、Ｂ細胞アンタゴニストは、該Ｂ細胞アンタゴニストの投与の４８時間以内に、末梢Ｂ細胞の２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％が枯渇しうる。
他の実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストは、該Ｂ細胞アンタゴニストの投与の７２時間以内に、末梢Ｂ細胞の２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２２％、２４％、２６％、２８％、３０％、３２％、３４％、３６％、３８％、４０％、４２％、４４％、４６％、４８％、５０％、５２％、５４％、５６％、５８％、６０％、６２％、６４％、６６％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、９４％、９６％、９８％、又は１００％が枯渇しうる。
【００１８】
Ｂ細胞アンタゴニスト又は枯渇化薬剤の線維形成状態を治療する能力は、一又は複数のインビトロ又はインビボの線維形成モデルを用いて検定されてもよい。例示的な線維形成モデルには、例えば外傷誘発性線維形成モデル(例えば、外科的な外傷又は臓器移植、熱傷、胆管閉塞、片側性尿管閉塞、虚血性再灌流、人工呼吸器誘発性肺障害、血管性バルーン障害、腎摘出、照射、外傷性大動脈大静脈異常導管及び急速性心室ペーシング)、毒素又はドラッグ誘発性線維形成モデル(例えば、ブレオマイシン、アスベスト、二酸化ケイ素、卵白アルブミン、アセトアルデヒド、四塩化炭素、コンカナバリンＡ、塩化ビニル、トリニトロベンゼンスルホン酸、オキサゾロン、シクロスポリンＡ、硫酸ニッケル、及びセルレイン)、自己免疫性疾患又は機能不全性免疫関連線維形成モデル(例えば、抗体及び免疫複合体病モデル、臓器移植拒絶反応、タイト-スキン(Ｔｓｋ)マウスモデル(tight skin mouse model)、虚血性再灌流障害、移植片対宿主誘発性、及び関節リウマチ)、慢性感染病誘発性線維形成モデル(住血吸虫類種又は慢性ウイルス性肝炎、アスペルギルスフミガタス、結核菌、及びクルーズトリパノソーマ)、及び、遺伝子操作されたマウスモデル又はウイルス感染したマウス(例えば、トランスフォーミング増殖因子-β(ＴＧＦ-β)又はＴＧＦ-β-レセプタートランスジェニックマウス及びノックアウトマウス、シグナル伝達分子欠失マウス(例えば、マザーアゲインストデカペンタプレジックホモログ３(ＳＭＡＤ３)-欠失マウス)、Ｃｏｌ４Ａ３の欠失マウス(Alport)、ＴＧＦ-β活性化に作用する分子に欠失のあるマウス(例えば、α１インテグリン又は基質メタロプロテイナーゼ９)、及びサイトカイン-遺伝子トランスジェニックマウス、ウイルス感染マウス及びノックアウトマウス(例えば、腫瘍壊死因子、インターロイキン４(ＩＬ-４)、ＩＬ-１３又はＩＬ-１０))が含まれる。(Wynn, Nature Reviews 4:583-594)。本発明のＢ細胞アンタゴニストには、例えば、線維症の症状を改善すること、又は線維性障害の範囲を減少、遅延、障害及び／又は寛解すること、又は線維性障害の一又は複数のマーカーを減少することが上述した線維形成モデルの何れかに示される、Ｂ細胞アンタゴニストが含まれる。上述した線維形成モデルの何れか一において、線維性障害の範囲を減少するため、又は線維症の症状を改善するための能力についてＢ細胞アンタゴニストを含む薬剤をアッセイすることは、当分野の通常の技術者の技術及び知識の範囲内である。
【００１９】
抗体
本発明のＢ細胞アンタゴニスト又は枯渇化薬剤は抗体であってもよい。本明細書中で用いられる「抗体」なる用語には、例えば、天然の抗体、インタクトなモノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、抗体断片(例えば、一又は複数の抗原に結合する及び／又は一又は複数の抗原を認識する抗体断片)、その他の多価抗体コンストラクト、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体(Jakobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551 (1993)、Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993)、Bruggermann等, Year in Immunol. 7:33 (1993)；米国特許第５５９１６６９号及び同第５５４５８０７号)、抗体ファージライブラリーから単離された抗体及び抗体断片(McCafferty等, Nature 348:552-554 (1990)；Clackson等, Nature 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)；Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Waterhouse等, Nucl. Acids Res. 21: 2265-2266 (1993))が含まれる。抗体を製作し使用するための方法は当分野で公知である。(国際公開第００／６７７９６号及びここに引用される文献を参照のこと)。
【００２０】
本発明と組み合わせてＢ細胞アンタゴニストないしは枯渇化薬剤として特に有用である２つの抗体は、マウス／ヒトキメラ抗体であるリツキシマブと、マウスのＣＤＲを含んでなるヒト化抗体である２Ｈ７である。リツキシマブは米国特許第６３９９０６１号に開示されており、２Ｈ７及びその変異体は国際公開第０４／０５６３１２号に開示されている。これら文書のそれぞれは出典明記によって、その全体が本明細書中に援用される。
【００２１】
本明細書中の教示に適する他の抗ＣＤ２０抗体には、「Ｙ２Ｂ８」又は「Ibritumomab Tiuxetan」(ゼバリン(登録商標))と命名されるイットリウム-[90]-標識２Ｂ８マウス抗体、Biogen-Idecから市販(米国特許第５７３６１３７号も参照、出典明記によって本明細書中に援用される)；場合によっては１３１Ｉ-Ｂ１３８抗体(BEXXARＴＭ)を生成するために１３１Ｉで標識されうる「Tositumomab」とも呼称されるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」(米国特許第５５９５７２１号も参照、出典明記によって本明細書中に援用される)；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Press等 Blood 69:584-591 (1987)及びそれらの変異体、例として「フレームワークパッチ」又はヒト化１Ｆ５(国際公開第２００３／００２６０７号)；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-９６４５０)；ＨｕＭａｘＴＭ-ＣＤ２０(完全なヒトＩｇＧ１抗体、米国公開特許第２００４／１６７３１９号；国際公開第０４／０３５６０７号、Genmab, Denmark)、ＡＭＥ-１３３(最適化したＣＤＲ移植抗体、米国公開特許第２００５／０２５７６４；国際公開第０４／１０３４０４、Applied Molecular Evolution)、ＨｕｍａＬｙｍＴＭ(完全なヒト抗体、Intracel)、及びｈＡ２０ (ヒト化ＩｇＧ１抗体、米国公開特許第２００３／０２１９４３３号；国際公開第００／７４７１８号、Immunomedics)；及びthe International Leukocyte Typing Workshopより入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-ＣＩ又はＮＵ-Ｂ２ (Valentine等, Leukocyte Typing III (McMichael, 編集, p. 440, Oxford University Press (1987))が含まれる。
【００２２】
本明細書中で用いる「抗体断片」なる用語は、インタクト抗体の一部、好ましくはその抗原結合又は可変領域を含む分子である。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ'、Ｆ(ａｂ')２、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ(ｓｃＦｖ)断片、ドメイン欠失抗体、ダイアボディ、線形抗体、一本鎖抗体分子、及び抗体断片から形成された多特異性抗体が含まれる。
本明細書中で用いる「天然抗体」なる用語は、２つの同一の軽(Ｌ)鎖及び２つの同一の重(Ｈ)鎖からなる、約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質を意味することを意図する。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中でばらつきがある。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(ＶＨ)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(ＶＬ)を、他端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
【００２３】
「可変」なる用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布する必要はない。可変性は軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中している。可変ドメインのより高度に保存された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたＰシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabatら, Sequence of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、抗体依存性細胞媒介性障害活性(ＡＤＣＣ)への抗体の関与などの種々のエフェクター機能を表す。
【００２４】
抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗体結合断片を生成し、その各々は単一の抗原結合部位を持ち、残りは容易に結晶化する能力を反映して「Ｆｃ」断片と命名される。ペプシン処理はＦ(ａｂ')２断片を生じ、それは２つの抗原結合部位を持ち、抗原を交差結合することができる。
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの３つの高頻度可変領域は相互に作用してＶＨ-ＶＬ二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、６つの高頻度可変領域が抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な３つの高頻度可変領域のみを含むＦｖの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
【００２５】
またＦａｂ断片は、軽鎖の定常ドメインと重鎖の第一定常領域(ＣＨ１)を有する。Ｆａｂ'断片は、抗体ヒンジ領域からの一又は複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基が付加している点でＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ'-ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が少なくとも一つの遊離チオール基を担持しているＦａｂ'に対するここでの命名である。Ｆ(ａｂ')２抗体断片は、その間にヒンジシステインを有するＦａｂ'断片の対として生産された。また、抗体断片の他の化学結合も知られている。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の何れかに分類される。
【００２６】
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体は異なるクラスに分類される。インタクト抗体には５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、及びＩｇＡ２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれうる。抗体の異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られている。
本明細書中で用いる「一本鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片なる表現は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインが単一のポリペプチド鎖に存在する抗体断片を意味することを意図する。好ましくは、ＦｖポリペプチドはＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを更に含み、それはｓｃＦｖが抗原結合に望まれる構造を形成するのを可能にする。(Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg及びMoore編, Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994))。
【００２７】
本明細書中で用いる「ダイアボディ」なる用語は、２つの抗原結合部位を持つ小さい抗体断片を指し、その断片は同一のポリペプチド鎖内で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に重鎖可変ドメイン(ＶＨ)が結合してなる(ＶＨ−ＶＬ)。非常に短いために同一鎖上で２つのドメインの対形成が可能であるリンカーを使用して、ドメインを他の鎖の相補的なドメインと強制的に対形成させ、２つの抗原結合部位を作製する。(欧州特許第４０４０９７号；国際公報９３／１１１６１；及びHollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:6444-6448 (1993))。
【００２８】
ポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを複数回皮下(ｓｃ)又は腹腔内(ｉｐ)注射することにより動物内で産生される抗体を含む。免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えばキーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシン阻害剤に関連抗原を、二官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基によるコンジュゲート)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基による)、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、又はＲとＲ１が異なったアルキル基であるＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲによりコンジュゲートされうる。
ポリクローナル抗体を生成するために、動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、抗原、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫化する。１か月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。好ましくは、動物は、同じ抗原のコンジュゲートであるが、異なったタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なった架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートで追加免疫する。コンジュゲートはまたタンパク融合として組換え細胞培養中で調製することもできる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。
【００２９】
本明細書中で使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する。例えば、集団を構成する個々の抗体は、天然に生じる可能性のある突然変異又は存在しうる少量の翻訳後突然変異を除いて実質的に同一である。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。更に、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的には含む従来の(ポリクローナル)抗体調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は抗原の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体はハイブリドーマ培養により合成され、他の免疫グロブリンの混入がないという利点がある。「モノクローナル」との修飾語句は、実質的に均一な抗体の集団から得たものとしての抗体の性質を表すものであり、抗体が何か特定の方法による生成を必要として構築したものであることを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は、最初にKohler等, Nature, 256:495 (1975)に記載されたハイブリドーマ法によって作ることができ、あるいは組換えＤＮＡ法によって作ることができる(例えば米国特許第４８１６５６７号を参照のこと)。また「モノクローナル抗体」は、例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628 (1991)及びMarks等, J. Mol. biol. 222: 581-597 (1991)に記載された技術を用いてファージ抗体ライブラリーから作製することもできる。
【００３０】
本明細書中で用いる「モノクローナル抗体」なる用語は、特に「キメラ」抗体(免疫グロブリン)を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部を含むものであり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種(例えばマウス又はラット)由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体が持つ配列に一致する又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrisonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。ここで対象とするキメラ抗体には、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、アカゲザル又はカニクイザルなどの旧世界サル)由来の可変ドメイン抗原結合配列とヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体を含む(米国特許第５６９３７８０号)。
【００３１】
本明細書中で用いられるように、非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体を指す。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)由来の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲがヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも１又は一般的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の一部、一般的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。(Jones等, Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)；国際公開第００／６７７９６号)。
【００３２】
本明細書中で用いる「高頻度可変領域」なる用語は、抗原結合に寄与する抗体のアミノ酸残基を意味する。高頻度可変領域は一般には「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」のアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２４−３４(Ｌ１)、５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７(Ｌ３)、及び重鎖可変ドメインの３１−３５(Ｈ１)、５０−６５(Ｈ２)及び９５−１０２(Ｈ３)；Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest,５版, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD.(1991))及び／又は「高頻度可変ループ」のアミノ酸残基(例えば、軽鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｌ１)、５０−５２(Ｌ２)及び９１−９６(Ｌ３)及び重鎖可変ドメインの残基２６−３２(Ｈ１)、５３−５５(Ｈ２)及び９６−１０１(Ｈ３)；Chothia及びLesk J.Mol.Biol. 196:901-917 (1987))を含む。「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基はここで定義するように高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００３３】
Ｂ細胞表面抗原
本発明のある実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストはＢ細胞表面抗原に対する抗体である。本明細書中に用いられる「Ｂ細胞表面抗原」なる表現は、Ｂリンパ球の表面に発現される任意の抗原を意味することを意図する。本発明のいくつかの実施態様では、「Ｂ細胞表面抗原」は健康な個体のＢ細胞の表面に発現される抗原である。他の実施態様では、「Ｂ細胞表面抗原」は、疾患状態に罹っている個体のＢ細胞の表面上に発現される抗原である。更なる他の実施態様では、「Ｂ細胞表面抗原」は、健康な個体及び疾患状態に罹っている個体の両方のＢ細胞の表面上に発現される抗原である。本発明のいくつかの実施態様では、Ｂ細胞表面抗原は、非Ｂ細胞上よりも広い範囲で(例えば、２×広く、３×広く、４×広く、５×広く、１０×広く、１００×広く又はより広く)Ｂ細胞上に発現される。あるいは、ある実施態様では、Ｂ細胞表面抗原は、非Ｂ細胞上と同じ範囲か又は非Ｂ細胞上よりも狭い範囲でＢ細胞上に発現されてもよい。特定のＢ細胞表面抗原は、本質的に非Ｂ細胞上に発現されてもよく及び／又は活性化されたＢ細胞上に発現されてもよい。本発明のある実施態様では、Ｂ細胞表面抗原はＢ細胞上だけに発現される。
【００３４】
例示的なＢ細胞表面抗原には、ＣＤ１０、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２１、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ２４、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ５２、ＣＤ５３、ＣＤ７２、ＣＤ７３、ＣＤ７４、ＣＤｗ７５、ＣＤｗ７６、ＣＤ７７、ＣＤｗ７８、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８０、ＣＤ８１、ＣＤ８２、ＣＤ８３、ＣＤｗ８４、ＣＤ８５及びＣＤ８６白血球表面マーカーが含まれる。その他の例示的なＢ細胞表面抗原には、ｔｏｌｌ様レセプター(例えばＴＬＲ-７及びＴＬＲ-９)、ケモカインレセプター(例えばＣＸＣＲ３)、及びＡＰＲＩＬが含まれる (Medema等, Cell Death Differ. 10:1121-1125 (2003))。また、ＢＡＦＦレセプター(ＢＡＦＦＲ／ＢＲ３、ＢＣＭＡ及びＴＡＣＩ)は、本開示内容のためのＢ細胞表面抗原と考えられてもよい。
本発明のある実施態様では、Ｂ細胞表面抗原はＣＤ１９である。「ＣＤ１９」抗原は、例えばＨＤ２３７-ＣＤ１９又はＢ４抗体により同定される９０ｋＤａ以下の抗原を指す(Kiesel等, Leukemia Research II 12:1119 (1987))。ＣＤ１９は、幹細胞段階からプラズマ細胞への終末分化の直前の時期までの系統分化の期間の全体にわたって細胞上にみられる。ＣＤ１９へのＢ細胞表面抗原の結合により、ＣＤ１９抗原の内部移行が生じうる。
【００３５】
Ｂ細胞アンタゴニストは、例えば、Ｂ細胞を認識するＩｇＧ２ａ抗体であるＬｙｍ-１；ＣＤ２１抗原に対する抗体であるＢ２；ＣＤ２２抗原に対する抗体であるＢ３；又は、ＣＤ１０抗原に対する抗体であるＪ５であってもよい(米国特許第５８４３３９８号)。本発明に関してＢ細胞アンタゴニストとして有用な抗ＣＤ２２抗体は、例えば、米国特許第５４８４８９２号、同第５７８９５５７号及び同第５７８９５５４号、国際公開第９８／４２３７８号、国際公開第００／２０８６４号及び国際公開第９８／４１６４１号、及びCampana, D.等, J. Immunol. 134:1524 (1985)、Dorken等, J. Immunol. 150:4719 (1993)及びEngel等, J. Immunol. 150:4519 (1993)に記載されている。この点に関しては、抗ＣＤ２２抗体であるエピラツズマブは本発明で特に有用である。
本発明に関してＢ細胞アンタゴニストとして用いることができる付加的な例示的ＣＤ２２抗体は、例えば、米国特許第５４８４８９２号、同第５７８９５５７号及び同第６８４６４７６号、及び国際公開第９８／４２３７８号、国際公開第００／２０８６４同及び国際公開第９８／４１６４１号に記載されている。
【００３６】
本発明のある実施態様では、Ｂ細胞表面抗原はＣＤ２３である。ＣＤ２３はＩｇＥの低親和性レセプターである。ＣＤ２３は、細胞接着を媒介し、ＩｇＥ及びヒスタミン放出を制御して、アポトーシスからＢ細胞を救い、骨髄細胞増殖を制御することが知られている。例としてConrad, Annu Rev Immunol 8:623-645 (1990)；Delespesse等, Adv. Immunol. 49: 149-191 (1991)；Bonnefoy等, Curr Opin Immunol 5:944-947 (1993)を参照のこと。ＣＤ２３に特異的な抗体及びその使用は、例えば、Rector等, Immunol. 55:481-488 (1985)；Suemura等, J. Immunol 137:1214-1220 (1986)；Noro等, J. Immunol 137:1258-1263 (1986)；Bonnefoy等, J. Immunol 138:2970- 2978 (1987)；Flores-Romo等, Science 261:1038-1046 (1993)；Sherr等, J. Immunol. 142: 481-489 (1989)；Pene等, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 85:6880-6884 (1988)；Bonnefoy等 (国際公開第８７／０７３０２号)；Bonnefoy等 (国際公開第９６／１２７４１号)；Bonnefoy等, Eur. J. Immunol. 20:139-144 (1990)；Sarfati等, J. Immunol. 141:2195-2199 (1988)及びWakai等, Hybridoma 12:25-43 (1993)において検討されている。また、米国特許第７００８６２３号、同第６８９３６３８号、及び同第６０１１１３８号を参照のこと。
【００３７】
本発明のある実施態様では、Ｂ細胞表面抗原はＣＤ８０である。ＣＤ８０(「Ｂ７.１」とも称される)は免疫応答の生成において、重要であることが示されている。(Azuma等, J. Exp. Med. 177: 845-850 (1993)；Freeman等, J. Immunol. 143:2714-2722 (1989)；Hathcock等, Science 262:905-911 (1993)；Hart等, Immunol. 79:616-620 (1993))。例えば、「ＩＤＥＣ-１１４」と称されるヒトＣＤ８０に特異的な霊長類化ＩｇＧ１抗体を含め、ＣＤ８０に特異的な抗体は記載されている(米国特許第５７３６１３７号；同第６１１３８９８号)。
特定の本発明の好ましい実施態様では、Ｂ細胞表面抗原はＣＤ２０である。「ＣＤ２０」抗原は、末梢血液又はリンパ系臓器の９０％以上のＢ細胞の表面上にみられる、３５ｋＤａ以下の、非グリコシル化リンタンパク質である。ＣＤ２０は、初期のプレＢ細胞発達の間に発現され、プラズマ細胞分化まで残る。ＣＤ２０は正常なＢ細胞並びに悪性のＢ細胞上に存在する。文献内でのＣＤ２０の他の名称には「Ｂリンパ球限局抗原」及び「Ｂｐ３５」が含まれる。ＣＤ２０抗原は、例えばClark等, Proc. Natl. Acad. Sci. 82: 1766 (1985)に記載される。
【００３８】
ＣＤ２０に対する抗体
本発明のＢ細胞アンタゴニストはＣＤ２０に対する抗体であってもよい。Ｂ細胞アンタゴニストとして機能する当分野で公知のＣＤ２０に対する任意の抗体が、本発明において、用いられてもよい。(例として米国特許第６６８２７３４号、同第６５３８１２４号、同第６５２８６２４号、同第６４５５０４３号、同第６４１０３９１号、同第６３９９０６１号、同第６３６８５９６号、同第６２８７５３７号、同第６２４２１９５号、同第６２２４８６６号、同第６１７１５８６号、同第６１９４５５１号、同第６１２０７６７号、同第６０１５５４２号、同第６０９０３６５号、同第５８４９８９８号、同第５８４３４３９号、同第５８４３３９８号、同第５７７６４５６号、同第５７３６１３７号、同第５７２１１０８号、同第５６７７１８０号、同第５５９５７２１号、同第５５００３６２号、同第４８６１５７９参照、米国公開特許第２００５／００６９５４５号、同第２００５／００５３６０２号、同第２００５／００２５７６４号、同第２００４／０１６７３１９号、同第２００４／００９３６２１号、同第２００３／０２１９４３３号、同第２００３／０１５７１０８号、同第２００３／０１４７８８５号、同第２００３／０１３３９３０１号、同第２００３／０１０３９７１号、同第２００３／００９５９６３号、同第２００３／００８２１７２号、同第２００３／００６８６６４号、同第２００３／００２６８０１号、同第２００３／００２１７８１号、同第２００２／０１９７２５６号、同第２００２／０１９７２５５号、同第２００２／０１２８４４８号、同第２００２／００５８０２９号、同第２００２／００４１８４７号、同第２００２／００１２６６５号、同第２００２／０００９４４４号、同第２００２／０００６４０４号、同第２００２／０００４５８７、国際特許出願公開第００／０９１６０号、国際公開第００／２７４２８号、国際公開第００／２７４３３号、国際公開第００／４４７８８号、国際公開第０１／１０４６２号、国際公開第０１／１０４６１号、国際公開第０１／１０４６０号、国際公開第０２／０４０２１号、国際公開第０１／７４３８８号、国際公開第０１／８０８８４号、国際公開第０１／９７８５８号、国際公開第０２／３４７９０号、国際公開第０２／０６０９５５号、国際公開第２／０９６９４８号、国際公開第０２／０７９２５５号、国際公開第９８／５６４１８号、国際公開第９８／５８９６４号、国際公開第９９／２２７６４号、国際公開第９９／５１６４２号、国際公開第００／４２０７２号、国際公開第００／６７７９６号、国際公開第０１／０３７３４号、国際公開第０１／７７３４２号、国際公開第００／２０８６４号、国際公開第０１／１３９４５号、国際公開第００／６７７９５号、国際公開第００／７４７１８号、国際公開第００／７６５４２号、国際公開第０１／７２３３３号、国際公開第０２／１０２３１２号、国際公開第０３／００２６０７号、国際公開第０４９６９４号、国際公開第０３／０６１６９４号、国際公開第９５／０３７７０、及び欧州特許第３３０１９１号及び同第３３２８６５号を参照のこと)。
【００３９】
ＣＤ２０に対する例示的な抗体は、例えば米国公開特許第２００５／００５３６０２号に記載されており、「リツキシマブ」(「リツキサン(登録商標)」)と呼称される「Ｃ２Ｂ８」(米国特許第５７３６１３７号)；「Ｙ２Ｂ８」又は「Ibritumomab Tiuxetan」(ゼバリン(登録商標))と命名されるイットリウム-[90]-標識２Ｂ８マウス抗体(米国特許第５７３６１３７号)；場合によっては「１３１Ｉ-Ｂ１」抗体(ヨードＩ１３１ Tositumomab、BEXXARＴＭ)を生成するために１３１Ｉで標識した「Tositumomab」とも呼称されるマウスＩｇＧ２ａ「Ｂ１」(米国特許第５５９５７２１号)；マウスモノクローナル抗体「１Ｆ５」(Press等 Blood 69:584-591 (1987))、及び「フレームワークパッチ」又はヒト化１Ｆ５(国際公開第２００３／００２６０７号)；ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ-９６４５０；マウス２Ｈ７及びキメラ２Ｈ７抗体(米国特許第５６７７１８０号)；ヒト化２Ｈ７；ｈｕＭａｘ-ＣＤ２０(Genmab, Denmark)；ＡＭＥ-１３３(Applied Molecular Evolution)；及びthe International Leukocyte Typing Workshopより入手可能なモノクローナル抗体Ｌ２７、Ｇ２８-２、９３-１Ｂ３、Ｂ-Ｃ１又はＮＵ-Ｂ２ (Valentine等, Leukocyte Typing III, McMichael編集, p. 440, Oxford University Press (1987))が含まれる。
【００４０】
ここで「リツキシマブ」又は「リツキサン(登録商標)」なる用語は、一般的にＣＤ２０抗原に対する、米国特許第５７３６１３７号において「Ｃ２Ｂ８」と命名された遺伝子操作キメラマウス／ヒトモノクローナル抗体であり、ＣＤ２０に結合する能力を保持するその断片を含むものを意味する。
特定の実施態様では、抗ＣＤ２０抗体はヒト及び霊長類のＣＤ２０に結合する。特定の実施態様では、ＣＤ２０を結合する抗体はヒト化又はキメラである。ＣＤ２０結合抗体には、リツキシマブ(リツキサン(登録商標))、ｍ２Ｈ７(マウス２Ｈ７)、ｈｕ２Ｈ７(ヒト化２Ｈ７)、及び限定するものではないが、ｈｕ２Ｈ７．ｖ１６(ｖは型を表す)、ｖ３１、ｖ７３、ｖ７５、ｖ１１４、ｖ５１１並びにフコース欠乏性変異体を含むその全ての機能的変異体が含まれる。ｈｕ２Ｈ７変異型抗体の幾つかの配列を、出典明記によってその全体が本明細書中に援用される国際公開第０４／０５６３１２号に記載され、Ｎ末端アミノ酸配列の成熟ポリペプチドでは取り除かれるリーダー配列を太字で以下に示す：
【００４１】
ｈｕ２Ｈ７.ｖ１６ Ｌ鎖[２３２ａａ](配列番号１)：
2008540678.tif 000002
ｈｕ２Ｈ７.ｖ１６ Ｈ 鎖[４７１ａａ](配列番号２)：
2008540678.tif 000003
ｈｕ２Ｈ７.ｖ３１ Ｈ 鎖[４７１ａａ](配列番号３)：
2008540678.tif 000004
ｖ３１のＬ鎖は上記のｖ１６のもの、すなわち配列番号１と同じである。
【００４２】
本明細書中で用いる「ヒト化２Ｈ７ｖ.１６」なる用語は、可変軽鎖配列を含んでなるインタクトな抗体又は抗体断片を意味する：
2008540678.tif 000005
及び可変重鎖配列：
2008540678.tif 000006
【００４３】
ヒト化２Ｈ７ｖ.１６抗体がインタクト抗体の場合、好ましくはｖ１６軽鎖アミノ酸配列を含む：
2008540678.tif 000007
及びｖ１６重鎖アミノ酸配列：
2008540678.tif 000008
【００４４】
特定の示した位置のアミノ酸置換を除き、ｖ１６のアミノ酸配列を含んでなる例示的なヒト化２Ｈ７抗体変異体を以下の表１にまとめる。特に示さなければ、２Ｈ７変異体はｖ１６と同じＬ鎖を有するであろう。
2008540678.tif 000009
【００４５】
前述のヒト化２Ｈ７ｍＡｂの変異型は上記配列番号６と同じＬ鎖配列と以下のＨ鎖アミノ酸配列を有する２Ｈ７ｖ.３１である：
2008540678.tif 000010
マウス抗ヒトＣＤ２０抗体ｍ２Ｈ７は、ＶＨ配列：
2008540678.tif 000011
及びＶＬ配列
2008540678.tif 000012
を有する。
【００４６】
他の好適なヒト化２Ｈ７抗体は、２Ｈ７.ｖ５１１可変軽鎖ドメイン配列：
2008540678.tif 000013
及び２Ｈ７.ｖ５１１可変重鎖ドメイン配列：
2008540678.tif 000014
を含んでなる。
ヒト化２Ｈ７.ｖ５１１抗体がインタクト抗体である場合、軽鎖アミノ酸配列：
2008540678.tif 000015
及び配列番号７の重鎖アミノ酸配列又は：
2008540678.tif 000016
を含んでなる。
特に示さない限り、ここに開示したヒト化２Ｈ７ｖ.１６及びその変異体の配列は、成熟ポリペプチド、すなわちリーダー配列を持たないものである。(米国公開特許第２００５／００９５２４３号)。
【００４７】
ＢＡＦＦアンタゴニスト、ＢＡＦＦレセプターアンタゴニスト及びその他のＢ細胞アンタゴニスト
ＢＡＦＦ(ＢＬｙＳ、ＴＡＬＬ-１、ＴＨＡＮＫ、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ又はｚＴＮＦ４としても知られている)は、Ｂ細胞生存及び成熟のために必須であるＴＮＦ１リガンドスーパーファミリーの一つである。トランスジェニックマウスにおけるＢＡＦＦ過剰発現により、Ｂ細胞の異常増殖及び重度の自己免疫性疾患の発症が生じる(Mackay等 (1999) J. Exp. Med. 190, 1697-1710；Gross等 (2000) Nature 404, 995-999；Khare等 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 3370-33752-4)。ＢＡＦＦは、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ及びＢＲ３(ＢＡＦＦ-Ｒとしても知られる)の３つのＴＮＦレセプタースーパーファミリーに結合することによってＢ細胞に作用する(上掲のGross等；Thompson, J. S.等, (2001) Science 293, 2108-2111；Yan, M.等, (2001) Curr. Biol. 11, 1547-1552；Yan, M.等, (2000) Nat. Immunol. 1, 37-41；Schiemann, B.等, (2001) Science 293, 2111-2114)。３つのＢＡＦＦレセプターの中でＢＲ３だけはＢＡＦＦに特異的であり、また、他の２つは関連したＴＮＦファミリーメンバーであるＡＰＲＩＬを結合する。ＢＲ３は、Ｂ細胞の表面上に発現される１８４残基のIII型膜貫通タンパク質である。(米国公開特許第２００５／００９５２４３号)。
【００４８】
本発明のある実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストは、ＢＡＦＦアンタゴニスト又はＢＡＦＦレセプターアンタゴニストである。本明細書中で用いられる「ＢＡＦＦアンタゴニスト」なる用語には、天然配列のＢＡＦＦポリペプチドを結合する、会合する及び／又は相互作用する任意の分子、及び天然配列のＢＡＦＦシグナル伝達を部分的又は完全に阻止する、阻害する、又は中和する任意の分子が含まれる。選択された実施態様では、本発明には、ＢＡＦＦと結合するか又は関連する抗体ないしはその断片の使用を含む。当業者は、天然配列のＢＡＦＦポリペプチドシグナル伝達が、とりわけ、Ｂ細胞生存及びＢ細胞成熟を促進すると理解するであろう。例えば、生物学的に活性なＢＡＦＦリガンドは、インビトロ又はインビボでの以下の事象の何れか一又はこれらの組合せを増強する：(i) Ｂ細胞の生存の増加、(ii) ＩｇＧ及び／又はＩｇＭレベルの増加、(iii) プラズマ細胞の数の増加、及び、(iv) 脾臓Ｂ細胞のＮＦ-κＢ２／１００のｐ５２ ＮＦ-κＢへのプロセシング(例えば、Batten等, J. Exp. Med. 192: 1453-1465 (2000)；Moore,等, Science 285:260-263 (1999)；Kayagaki等, Immunity 17:515-524 (2002)。ゆえに、ＢＡＦＦシグナル伝達の阻害、遮断又は中和により、とりわけ、Ｂ細胞の数が減少する。したがって、本発明のある態様でのＢＡＦＦアンタゴニストは、インビトロ又はインビボでのＢＡＦＦポリペプチドの一又は複数の生物学的活性を、部分的ないしは完全に遮断、阻害又は中和して、これによって、Ｂ細胞活性を低減又は阻害するであろう。ＢＡＦＦアンタゴニストを試験するために有用ないくつかのアッセイは、米国公開特許第２００５／００９５２４３号に記載される。
【００４９】
ＢＡＦＦアンタゴニストとして有用なペプチドには、例えば、国際公開第０２／０９２６２０号において、ＴＡＬＬ-１ １２-３と称されるペプチドが含まれ、以下のアミノ酸配列を有する：
2008540678.tif 000017
このペプチド、並びに国際公開第０２／０９２６２０号において開示される他の例示的なペプチドは、ＢＡＦＦと結合して、ＢＡＦＦがそのレセプターであるＢＲ３、ＴＡＣＩ及びＢＣＭＡに結合するのを阻害する。ある実施態様では、国際公開第０２／０９２６２０号に記載されるＢＡＦＦペプチドアンタゴニストは、例えばＦｃ又はＰＥＧに連結されてもよい。
【００５０】
更なるＢＡＦＦペプチドアンタゴニストには、ECFDLLVRAWVPCSVLK(配列番号：１５)、ECFDLLVRHWVPCGLLR(配列番号：１６)、ECFDLLVRRWVPCEMLG(配列番号：１７)、ECFDLLVRSWVPCHMLR(配列番号：１８)、及びECFDLLVRHWVACGLLR(配列番号：１９)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドないしはポリペプチド、及び、配列番号：１５、１６、１７、１８又は１９の何れか一に少なくとも４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性があるアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが含まれる。
本発明の方法の実施に用いることができる更なるＢＡＦＦペプチドアンタゴニストには、米国公開特許第２００５／００９５２４３号に記載の式I、式II又は式IIIのアミノ酸配列を含んでなるポリペプチドが含まれる。
【００５１】
本発明のいくつかの実施態様では、ＢＡＦＦアンタゴニストは、抗ＢＡＦＦ抗体、イムノアドヘシン又は小分子である。ある実施態様では、イムノアドヘシンは、可溶性コンストラクトの形態でＢＡＦＦレセプターのＢＡＦＦ結合領域(例えばＢＲ３、ＢＣＭＡ又はＴＡＣＩの細胞外ドメイン)を含んでなる。特に好適な実施態様では、イムノアドヘシンはＢＲ３-Ｆｃ又は配列番号：１５、１６、１７、１８又は１９の何れか一の配列を有するポリペプチドである(米国公開特許第２００２／００３７８５２号、同第２００３／００５９９３７号、同第２００５／００９５２４３号及び同第２００５／０１６３７７５号に記載)。他の実施態様では、イムノアドヘシンは、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡの可溶型(例えばＴＡＣＩ-Ｆｃ又はＢＣＭＡ-Ｆｃ)である。
さらに、当業者は、ＢＡＦＦに特異的に結合するか又はＢＡＦＦと会合する抗体ないしその断片もまた、本明細書中の教示と矛盾しておらず、例えば米国公開特許第２００３／００５９９３７号にあるように当分野で公知であることを理解するであろう。本発明の態様に記載の例示的な抗体は、特異的に認識してＢＡＦＦの生物活性を阻害するヒトモノクローナル抗体であるＬｙｍｐｈｏＳｔａｔ-ＢＴＭ(ベリムマブ(belimumab)) (Human Genome Sciences, Inc.)である。
【００５２】
本発明の特定の他の実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストはＢＡＦＦレセプターアンタゴニストである。本明細書中で用いられる「ＢＡＦＦレセプターアンタゴニスト」なる用語には、天然配列のＢＡＦＦレセプター(例えばＢＲ３、ＴＡＣＩ又はＢＣＭＡ)ポリペプチドを結合又は会合する任意の分子、及び／又はそのレセプターを介する天然配列のＢＡＦＦシグナル伝達を部分的ないしは完全に遮断、阻害又は中和する任意の分子が含まれる。ゆえに、本発明の選択された実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストは、Ｂｔｋ、ＴＡＣＩ、ＢＣＭＡ(米国公開特許第２００２／００８１２９６号)又はＢＡＦＦ-Ｒ(米国公開特許第２００２／０１６５１５６号)と特異的に結合又は会合する抗体ないしその断片、ポリペプチド又は小分子を含んでなる。他の例示的なＢ細胞アンタゴニストには、例えば、Ｉｇ-α／Ｉｇ-βのＩＴＡＭモチーフとそれらの標的との相互作用を阻害する抗体、ポリペプチド又は小分子、典型的又は選択的にＮＦκＢ活性化経路を阻害する抗体、ポリペプチド又は小分子、及びＯＣＡ-Ｂ、ＣＤ４０、ＬＴ-βを阻害する抗体、ポリペプチド又は小分子などが含まれる。
【００５３】
Ｂ細胞アンタゴニストのコンジュゲート及び他の修飾
本発明の特定の実施態様によると、Ｂ細胞アンタゴニストは細胞障害性剤とコンジュゲートされる。
Ｂ細胞アンタゴニスト-細胞障害性剤コンジュゲートの生成に有用な化学療法剤は当分野で周知である。
また、Ｂ細胞アンタゴニストと一又は複数の小分子毒素、例えばカリケアマイシン(calicheamicin)、メイタンシン(maytansine)(米国特許第５２０８０２０号)、トリコテン(trichothene)及びＣＣ１０６５のコンジュゲートもここにおいて考慮される。本発明の一実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストは、一又は複数のメイタンシン(maytansine)分子(例えば、Ｂ細胞アンタゴニスト当たり約１から約１０のメイタンシン分子)とコンジュゲートしている。メイタンシンは、例えばＭａｙ-ＳＨ３へ還元されるＭａｙ-ＳＳ-Ｍｅへ変換され、修飾されたＢ細胞アンタゴニスト(Chari等，Cancer Research 52：127-131(1992))と反応してメイタンシノイド(maytansinoids)-Ｂ細胞アンタゴニストコンジュゲートを生成する。
【００５４】
あるいは、Ｂ細胞アンタゴニストは、一又は複数のカリケアマイシン分子にコンジュゲートする。抗生物質のカリケアマイシンファミリーは、サブピコモル濃度で、二重鎖ＤＮＡの割れ目を作ることができる。使用されるであろうカリケアマイシンの構造類似体は、限定されるものではないが、γ１Ｉ、α２Ｉ、α３Ｉ、Ｎ-アセチル-γ１Ｉ、ＰＳＡＧ及びθＩ１(Hinman等, Cancer Research 53：3336-3342(1993)及びLode等，Cancer Research 58：2925-2928(1998))を含む。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa)由来)、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンシン(dianthin)タンパク質、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)阻害剤、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリス阻害剤、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(Restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日に公開の国際公開第９３/２１２３２号を参照のこと。また、メイタンシノイドはＢ細胞アンタゴニストにコンジュゲートしうる。
【００５５】
本発明は、更に、核酸分解性活性を有する化合物(例えば、リボムクレアーゼ又はＤＮＡエンドヌクレアーゼ、例えばデオキシリボヌクレアーゼ；ＤＮＡ分解酵素)とコンジュゲートされたＢ細胞アンタゴニストを考慮する。
種々の放射性同位元素が放射性コンジュゲートＢ細胞アンタゴニストの生成に利用できる。具体例にはＡｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２及びＬｕの放射性同位元素が含まれる。
【００５６】
Ｂ細胞アンタゴニストと細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオール)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシインミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-Ｉ-カルボキシレート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣｌ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ヒス-アジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製される。例えば、リシン免疫毒素は、Vitettaら, Science 238：1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)がＢ細胞アンタゴニストに放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４/１１０２６号を参照されたい。リンカーは、細胞内で細胞毒性薬剤の放出を容易にする「切断可能なリンカー」でもよい。例えば、酸性の易動性リンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカー(Chari等 Cancer Research 52： 127-131(1992))を用いてもよい。
【００５７】
あるいは、Ｂ細胞アンタゴニスト及び細胞障害性剤を含んでなる融合タンパク質を、例えば組換え技術又はペプチド合成によって製造してもよい。
他の実施態様では、予備標的化で使用するために、Ｂ細胞アンタゴニストは「レセプター」(ストレプトアビジン等)にコンジュゲートされてもよく、該Ｂ細胞アンタゴニスト-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)にコンジュゲートされた「リガンド」(アビジン等)を投与する。
また、本発明のＢ細胞アンタゴニストを、プロドラッグ(例えばペプチジル化学療法剤、国際公開第８１/０１１４５号を参照)を活性な薬剤に転化させるプロドラッグ活性化酵素にコンジュゲートさせてもよい。例えば国際公開第８８/０７３７８号及び米国特許第４９７５２７８号を参照されたい。そのようなコンジュゲートの酵素成分には、より活性な細胞毒形態に転化するように、プロドラッグに作用し得る任意の酵素が含まれる。
【００５８】
この発明の方法に有用な酵素には、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアルカリ性ホスファターゼ；スルファート含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なアリールスルファターゼ；非毒性５-フルオロシトシンを抗癌剤５-フルオロウラシルに転化するのに有用なシトシンデアミナーゼ；プロテアーゼ、例えばセラチアプロテアーゼ、サーモリシン、サブチリシン、カルボキシペプチダーゼ及びカテプシン(例えば、カテプシンＢ及びＬ)で、ペプチド含有プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なもの；Ｄ-アミノ酸置換基を含むプロドラッグの転化に有用なＤ-アラニルカルボキシペプチダーゼ；炭水化物切断酵素、例えばグリコシル化プロドラッグを遊離の薬剤に転化するのに有用なノイラミニダーゼ及びＯガラクトシダーゼ；Ｐラクタムで誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化させるのに有用なＰラクタマーゼ；及びペニシリンアミダーゼ、例えばそれぞれフェノキシアセチル又はフェニルアセチル基で、それらのアミン性窒素において誘導体化された薬剤を遊離の薬剤に転化するのに有用なペニシリンＶアミダーゼ又はペニシリンＧアミダーゼが含まれる。あるいは、「アブザイム」としてもまた知られている酵素活性を有する抗体を、遊離の活性薬剤に本発明のプロドラッグを転化させるために使用することもできる(例えば、Massey, Nature 328：457-458(1987)を参照)。Ｂ細胞アンタゴニスト-アブザイムコンジュゲートは、ここで記載されているようにして、細胞集団又は組織にアブザイムを送達するために調製することができる。
【００５９】
酵素は、当該分野においてよく知られている技術、例えば上で検討したヘテロ二官能性架橋試薬を使用することにより、Ｂ細胞アンタゴニストに共有的に結合させることができる。あるいは、本発明のＢ細胞アンタゴニストの少なくとも抗原結合領域を酵素の少なくとも機能的に活性な部位に結合せしめてなる融合タンパク質を、当該技術においてよく知られている組換えＤＮＡ技術を使用して作成することができる(例えばNeuberger等, Nature 312：604-608(1984)参照。
Ｂ細胞アンタゴニストの他の修飾がここで考慮される。例えば、Ｂ細胞アンタゴニストは、様々な非タンパク質性(nonproteinaceous)のポリマー、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン類、又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールのコポリマーのいずれかに結合させてもよい。
【００６０】
Ｂ細胞アンタゴニストへの結合のために用いることができる例示的なポリマーは、ポリアルキレングリコール(ＰＥＧ)である。ＰＥＧ成分、例えば１、２、３、４又は５つのＰＥＧポリマーは各々のＢ細胞アンタゴニストに結合して、Ｂ細胞アンタゴニスト単独と比較して血清半減期を増加しうる。ＰＥＧ成分は非抗原性で、基本的に生物学的に不活性である。本発明の実施に用いられるＰＥＧ成分は、分枝状又は非分枝状であってもよい。
Ｂ細胞アンタゴニストに付着するＰＥＧ成分の数及び個々のＰＥＧ鎖の分子量は異なりうる。一般に、ポリマーの分子量が高ければ高いほど、ポリペプチドに付着するポリマー鎖が少なくなる。通常、Ｂ細胞アンタゴニストに付着する総ポリマー量は、２０ｋＤａから４０ｋＤａである。ゆえに、１つのポリマー鎖が付着される場合、鎖の分子量は一般に２０〜４０ｋＤａである。２つの鎖が付着される場合、各々の鎖の分子量は一般に１０〜２０ｋＤａである。３つの鎖が付着される場合、分子量は一般に７〜１４ｋＤａである。
【００６１】
ポリマー、例えばＰＥＧは、ポリペプチド上の任意の好適な露出した反応基を介してＢ細胞アンタゴニストに連結されうる。露出した反応基(一又は複数)は、例えば、Ｎ末端アミノ基又は内部リジン残基のεアミノ基、又はその両方であってもよい。活性化されたポリマーは反応して、Ｂ細胞アンタゴニスト上の任意の遊離アミノ基で共有結合してもよい。また、(利用可能であれば)Ｂ細胞アンタゴニストの遊離したカルボン酸基、最適に活性化されたカルボニル基、ヒドロキシル、グアニジル、イミダゾール、酸化炭化水素成分及びメルカプト基は、ポリマー付着のための反応基として用いることができる。
コンジュゲート反応において、ポリペプチドの濃度によって、典型的にはポリペプチドの１モルにつきおよそ１．０からおよそ１０モルの活性化されたポリマーが用いられる。通常、Ｂ細胞アンタゴニストの所望の薬理活性を損ないうる副作用(しばしば非特異的なもの)を最小限に抑えながら反応を最大限にするバランスを表す比率を選択する。好ましくは、Ｂ細胞アンタゴニストの少なくとも５０％の生物活性(例えば本明細書又は当分野で公知の何れかのアッセイにおいて、示される)が保持され、最も好ましくはほぼ１００％が保持される。
【００６２】
ポリマーは、従来の化学反応を用いてＢ細胞アンタゴニストにコンジュゲートされうる。例えば、ポリアルキレングリコール成分は、Ｂ細胞アンタゴニストのリジンεアミノ基にカップリングしてもよい。リジン側鎖への結合は、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)活性エステル、例として、ＰＥＧスクシンイミジルスクシナート(ＳＳ-ＰＥＧ)及びスクシンイミジルプロピオン酸(ＳＰＡ-ＰＥＧ)により行われうる。適切なポリアルキレングリコール成分には、例えば、カルボキシメチル-ＮＨＳ及びノルロイシン-ＮＨＳ, ＳＣが含まれる。これらの試薬は市販されている。更なるアミン反応性ＰＥＧリンカーは、スクシンイミジル成分と置換されてもよい。これらには、例えば、イソチオシアネート、ニトロフェニルカルボネート(ＰＮＰ)、エポキシド、ベンゾトリアゾールカルボネート、ＳＣ-ＰＥＧ、トレシレート(tresylate)、アルデヒド、エポキシド、カルボニルイミダゾール及びＰＮＰカルボネートが含まれる。条件は、通常、反応の選択性及び程度を最大にするために最適化される。反応条件のこのような最適化は、当分野の通常の技術の範囲内である。
【００６３】
ＰＥＧ化(PEGylation)は、当分野で公知の何れかのＰＥＧ化により行われうる。例として、Focus on Growth Factors, 3: 4-10, 1992及び欧州特許第０１５４３１６号及び欧州特許第０４０１３８４号を参照のこと。ＰＥＧ化は、反応性ポリエチレングリコール分子(又は、類似した反応性水溶性ポリマー)とのアルキル化反応又はアシル化反応を用いて行われてもよい。
一般に、アシル化によるＰＥＧ化は、ポリエチレングリコールの活性なエステル誘導体の反応を伴う。ＰＥＧ化に任意の反応性ＰＥＧ分子が用いられうる。Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(ＮＨＳ)にエステル化されるＰＥＧは、頻繁に使われる活性化されたＰＥＧエステルである。本明細書中で用いられる「アシル化」には、治療的タンパク質とＰＥＧなどの水溶性ポリマーとの結合の以下の種類：アミド、カルバメート、ウレタンなどがあるが、これらに限定するものではない。例としてBioconjugate Chem. 5: 133-140, 1994を参照のこと。反応パラメーターは、通常、Ｂ細胞アンタゴニストを障害するか又は不活性化する温度、溶媒及びｐＨ条件を避けるために選択される。
【００６４】
通常、連結結合はアミドであり、典型的に、結果として生じる生成物の少なくとも９５％はモノ-、ジ-又はトリ-ＰＥＧ化されている。しかしながら、高い程度のＰＥＧ化を有するいくつかの種は、使用する特定の反応条件に依存した量で形成されうる。場合によって、精製されＰＥＧ化された種は、従来の精製方法、例えば透析、塩析、限外濾過、イオン交換クロマトグラフィ、ゲル濾過クロマトグラフィ、疎水性交換クロマトグラフィ及び電気泳動によって、混合物、特に反応していない種から分離される。
一般に、アルキル化によるＰＥＧ化は、還元剤の存在下において、本発明のＢ細胞アンタゴニストとＰＥＧの終末アルデヒド誘導体との反応を伴う。加えて、実質的にＢ細胞アンタゴニストのＮ末端アミノ基にのみＰＥＧ化を働かせるように反応条件を操作してもよい。これはすなわちモノ-ＰＥＧ化されたタンパク質である。モノ-ＰＥＧ化又はポリ-ＰＥＧ化のいずれかの場合、ＰＥＧ基は、一般的に-ＣＨ２-ＮＨ-基を介してタンパク質に付着される。特に-ＣＨ２-基に関して、この種の結合は「アルキル」結合として知られている。
【００６５】
Ｎ末端を標的とするモノ-ＰＥＧ化された生成物を産生するために還元型のアルキル化による誘導体化は、誘導体化に利用可能な異なる種類の第一アミノ基(Ｎ末端に対するリジン)の差動的反応性を利用する。反応は、リジン残基のε-アミノ基とタンパク質のＮ末端アミノ基のものとのｐＫａ差動を利用し得るｐＨで行われる。このような選択的な誘導体化によって、アルデヒドなどの反応基を含有する水溶性ポリマーのタンパク質への付着は制御される。ポリマーとのコンジュゲートがタンパク質のＮ末端で主に起こり、リジン側鎖アミノ基などの他の反応基の有意な修飾は起こらない。
【００６６】
アシル化手法及びアルキル化手法に用いられるポリマー分子は、水溶性ポリマーの中から選択される。本方法で示されるように重合の程度が制御されうるように、選択されるポリマーは一般的に、アシル化のための活性なエステル又はアルキル化のためのアルデヒドなどの単一の反応基を有するように修飾される。例示的な反応性ＰＥＧアルデヒドはポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドであり、水安定性であるか、又はモノＣ１-Ｃ１０アルコキシ基又はそのアリールオキシ誘導体である(例としてHarris等、米国特許第５２５２７１４号を参照)。ポリマーは、分枝状か又は非分枝状でもよい。アシル化反応のために、一般的に選択されるポリマー(一又は複数)は、単一の反応性エステル基を有する。還元性アルキル化のために、一般的に選択されるポリマー(一又は複数)は、単一の反応性アルデヒド基を有する。一般に、水溶性ポリマーは、通常哺乳類組み換え発現系によって、都合よく作製されるので、天然に生じるグリコシル残基から選択されないであろう。
【００６７】
一般に、本発明のＰＥＧ化されたＢ細胞アンタゴニストの調製方法は、(ａ) 分子が一又は複数のＰＥＧ基に付着するような条件下で本発明のＢ細胞アンタゴニストとポリエチレングリコール(例として、ＰＥＧのアルデヒド誘導体又は反応性エステル)とを反応させる、そして(ｂ) 反応生成物(一又は複数)を得る工程を含む。一般に、アシル化反応のための最適反応条件は、既知のパラメーター及び所望の結果に基づいて個別的に決定されるであろう。例えば、一般に、タンパク質に対してＰＥＧの比率が大きければ、ポリ-ＰＥＧ化された生成物の割合が大きくなる。
一般に、実質的に均一なモノ-ポリマー／Ｂ細胞アンタゴニストの集団を生成するための還元性アルキル化は、(ａ) ＮｇＲのＮ末端アミノ基の選択的な修飾をペンニット(pen-nit)するために好適なｐＨで、還元性アルキル化条件下で反応性ＰＥＧ分子と本発明のＢ細胞アンタゴニストとを反応させる。そして、(ｂ) 反応生成物(一又は複数)を得る工程を含んでなる。
【００６８】
実質的に均一なモノ-ポリマー／Ｂ細胞アンタゴニストの集団について、還元性アルキル化反応条件は、本発明のＢ細胞アンタゴニストのＮ末端への水溶性ポリマー成分の選択的な付着を可能にするものである。このような反応条件により一般に、リジン側鎖アミノ基とＮ末端アミノ基との間のｐＫａ差が生じる。本発明の目的を達成するために、ｐＨは、通常、３〜９、典型的には３〜６の範囲である。
本発明のＢ細胞アンタゴニストはｔａｇ、例えばタンパク質分解に引き続いて放出されうる成分、を含んでもよい。ゆえに、リジン成分は、まず、リジンとＮ末端の両方と反応するであろうトラウト試薬(Pierce Chemical Company, Rockford, IL)などの低分子量のリンカーにより修飾されたＨｉｓ-タグを反応させて、次いでＨｉｓタグを放出することによって、選択的に修飾できる。次いで、ポリペプチドは、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基又は遊離ないしは保護されたＳＨなどのチオール反応性頭基を含有するＰＥＧによって、選択的に修飾されうる遊離型ＳＨ基を含有するであろう。
【００６９】
トラウト試薬は、ＰＥＧ付着に特異的な部位を提供する任意のリンカーにより置換されてもよい。例えば、トラウト試薬は、ＳＰＤＰ、ＳＭＰＴ、ＳＡＴＡ又はＳＡＴＰ (Pierce Chemical Company, Rockford, IL)により置換されてもよい。同様に、マレイミド(例えばＳＭＣＣ、ＡＭＡＳ、ＢＭＰＳ、ＭＢＳ、ＥＭＣＳ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、ＫＭＵＳ又はＧＭＢＳ)、ハロアセテート基(ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ)又はビニルスルホン基を挿入するアミン反応性のリンカーとタンパク質とを反応させ、遊離型ＳＨを含有するＰＥＧと結果として生じる生成物とを反応させることもできる。
いくつかの実施形態では、ポリアルキレングリコール成分は、Ｂ細胞アンタゴニストのシステイン基にカップリングする。カップリングは、例えば、マレイミド基、ビニルスルホン基、ハロアセテート基又はチオール基を用いて行ってもよい。
【００７０】
場合によって、Ｂ細胞アンタゴニストは、不安定な結合によってポリエチレングリコール成分にコンジュゲートされる。不安的な結合は、例えば生化学的加水分解、タンパク質分解又はスルフヒドリル切断において切断されうる。例えば、この結合はインビボ(生理学的な)条件下で切断されうる。
反応基がＮ末端のαアミノ基上にある場合、反応は、不活性ポリマーと生物学的に活性な材料を反応させるために用いる任意の適切な方法によって、一般におよそｐＨ５〜８、例えばｐＨ５、６、７又は８で起こる。通常、この過程には、活性化されたポリマーを調製して、その後活性化されたポリマーとタンパク質を反応させて製剤に適切な可溶性タンパク質を生産することが伴う。
【００７１】
また、ここに開示する抗体はリポソームとして調製してもよい。Ｂ細胞アンタゴニストを含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985)；Hwang等, Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び第４５４４５４５号；及び国際公開第９７／３８７３１号に記載されたような、当分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第５０１３５５６号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成されうる。リポソームは、所定の孔径のフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームにコンジュゲートされ得る。化学治療薬は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst., 81(19): 1484 (1989)参照。
【００７２】
ここで記載のタンパク質又はペプチドＢ細胞アンタゴニストのアミノ酸配列の修飾を考察する。例えば、Ｂ細胞アンタゴニストの結合親和性及び／又は他の生物学的特性が改善されることが望ましい。
Ｂ細胞アンタゴニストのアミノ酸配列変異体は、適当なヌクレオチド変化をＢ細胞アンタゴニストコード化核酸に導入することにより、又はペプチド合成により調製される。そのような修飾は、例えば、Ｂ細胞アンタゴニストのアミノ酸配列内の残基の欠失、及び／又は挿入及び／又は置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせは、最終コンストラクトに達するまでなされるが、その最終コンストラクトは所望の特徴を有する。また、アミノ酸変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化などのＢ細胞アンタゴニストの翻訳後過程を変更しうる。
【００７３】
突然変異のための好ましい位置にあるＢ細胞アンタゴニストの特定の残基又は領域の同定のために有用な方法は、Cunningham及びWells , Science 244: 1081-1085 (1989)に記載されているように「アラニンスキャンニング突然変異誘発」と呼ばれる。ここで、標的残基の残基又は基が同定され(例えば、arg, asp, his, lys,及びglu等の荷電残基)、中性又は負荷電アミノ酸(最も好ましくはアラニン又はポリアラニン)に置換される。次いで置換に対する機能的感受性を示すこれらのアミノ酸の位置は、置換部位において又はそれに対して更に又は他の置換を導入することにより精密にされる。即ち、アミノ酸配列変異を導入する部位は予め決定されるが、変異自体の性質は予め決める必要はない。例えば、与えられた部位における変異の性能を分析するために、ａｌａスキャンニング又はランダム突然変異誘発を標的コドン又は領域で実施し、発現されたＢ細胞アンタゴニスト変異体を所望の活性についてスクリーニングする。
【００７４】
アミノ酸配列挿入は、１残基から１００以上の残基を含むポリペプチドの長さの範囲のアミノ-及び／又はカルボキシル末端融合物、並びに一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入物を含む。末端挿入物の例は、Ｎ-末端メチオニル残基を持つＢ細胞アンタゴニスト又は細胞障害ポリペプチドに融合したＢ細胞アンタゴニストを含む。Ｂ細胞アンタゴニストの他の挿入変異体は、Ｂ細胞アンタゴニストの血清半減期を向上させるポリペプチド又は酵素のＢ細胞アンタゴニストのＮ-ないしはＣ-末端への融合物を含む。
他の種類の変異体はアミノ酸置換変異体である。これらの変異体は、異なる残基によって置換されたＢ細胞アンタゴニスト分子に少なくとも一つのアミノ酸残基を有する。抗体Ｂ細胞アンタゴニストの置換突然変異の最も対象となる部位は高度可変領域を含むが、ＦＲ変化も考慮される。
保存的置換は、「好ましい置換」と題して以下の表２に示す。これらの置換により生物学的活性に変化が生じる場合、表２に「例示的置換」と称した又はアミノ酸の分類を参照して以下に更に記載するような、より実質的な変化を導入し、生成物をスクリーニングしてよい。
【００７５】
表２
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【００７６】
Ｂ細胞アンタゴニストの生物学的性質における実質的な修飾は、(ａ)置換領域のポリペプチド骨格の構造、例えばシート又はヘリックス配置、(ｂ)標的部位の分子の電荷又は疎水性、又は(ｃ)側鎖の嵩を維持するそれらの効果において実質的に異なる置換を選択することにより達成される。天然に生じる残基は共通の側鎖特性に基づいて群に分けることができる：
(１)疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(２)中性の親水性：cys、ser、thr；
(３)酸性：asp、glu；
(４)塩基性：asn、gln、his、lys、arg；
(５)鎖配向に影響する残基：gly、pro； 及び
(６)芳香族：trp、tyr、phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。
【００７７】
Ｂ細胞アンタゴニストの適切な高次構造を維持するために関与しない任意のシステイン残基も、一般的には、セリンと置換して、分子の酸化的安定性を改善して、異常な交差を防いでもよい。逆に、システイン結合をＢ細胞アンタゴニストに付加して、その安定性を改善してもよい(特にこの場合、Ｂ細胞アンタゴニストはＦｖ断片などの抗体断片である)。
特に好ましい型の置換変異体は、親抗体の一又は複数の高頻度可変領域残基の置換を含む。一般的に、さらなる開発のために選択され、得られた変異体は、それらを生成した親抗体と比較して向上した生物学的特性を有するであろう。そのような置換変異体を作製する簡便な方法には、ファージディスプレイを使用する親和性突然変異がある。簡潔に言えば、幾つかの高頻度可変領域部位(例えば６−７部位)を突然変異させて各部位における全ての可能なアミノ酸置換を生成させる。このように生成された抗体変異体は、繊維状ファージ粒子から、各粒子内に充填されたＭ１３の遺伝子III産物への融合物として一価様式でディスプレイされる。ついで、ファージディスプレイ変異体は、ここに開示されるようなそれらの生物学的活性(例えば、結合親和性)についてスクリーニングされる。修飾のための候補となる高頻度可変領域部位を同定するために、アラニンスキャンニング突然変異誘発を実施し、抗原結合に有意に寄与する高頻度可変領域残基を同定することができる。別法として、又はそれに加えて、抗原-抗体複合体の結晶構造を分析して抗体と抗原の接点を特定するのが有利である場合もある。このような接触残基及び隣接残基は、ここに述べた技術に従う置換の候補である。そのような変異体が生成されると、変異体のパネルにここに記載するようなスクリーニングを施し、一又は複数の関連アッセイにおいて優れた特性を持つ抗体を更なる開発のために選択する。
【００７８】
Ｂ細胞アンタゴニストのアミノ酸変異の他の型は、Ｂ細胞アンタゴニストの元のグリコシル化パターンを変更する。変更とは、Ｂ細胞アンタゴニストに見い出される一又は複数の糖鎖部分の欠失、及び／又はＢ細胞アンタゴニストに存在しない一又は複数のグリコシル化部位の付加を意味する。
ポリペプチドのグリコシル化は、典型的には、Ｎ結合又はＯ結合の何れかである。Ｎ結合とは、アスパラギン残基の側鎖への炭水化物部分の結合を意味する。アスパラギン-Ｘ-セリン及びアスパラギン-Ｘ-スレオニン(ここでＸはプロリンを除く任意のアミノ酸)のトリペプチド配列は、アスパラギン側鎖への糖鎖部分の酵素的結合のための認識配列である。従って、ポリペプチド中にこれらのトリペプチド配列の何れかが存在すると、潜在的なグリコシル化部位が作出される。Ｏ結合グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、最も一般的にはセリン又はスレオニンに、Ｎ-アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースなどの糖類の一つが結合することを意味するが、５-ヒドロキシプロリン又は５-ヒドロキシリジンもまた用いられる。
【００７９】
Ｂ細胞アンタゴニストへのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を、それが一又は複数の上述したトリペプチド配列(Ｎ結合グリコシル化部位のもの)を含むように変化させることによって簡便に達成される。該変化は、元のＢ細胞アンタゴニストの配列への一又は複数のセリン又はスレオニン残基の付加、又はこれによる置換によってもなされる(Ｏ-結合グリコシル化部位の場合)。
【００８０】
抗体がＦｃ領域を含有する場合、それに接着する炭水化物を変更してもよい。例えば、抗体のＦｃ領域に接着するフコースを欠損する成熟炭水化物構造の抗体は、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号に記載される。抗体のＦｃ領域に接着した炭水化物内のＮ-アセチルグルコサミン(ＧｌｃＮＡｃ)を二分する抗体は、国際公開第０３／０１１８７８号、及び米国特許第６６０２６８４号に参照されている。抗体のＦｃ領域に接着するオリゴサッカライド内の少なくとも一のガラクトース残基を有する抗体は、国際公開第９７／３００８７号に報告される。また、抗体のＦｃ領域に接着する変更された炭水化物を有する抗体については、国際公開第９８／５８９６４号及び国際公開第９９／２２７６４号も参照のこと。
【００８１】
Ｂ細胞アンタゴニストのアミノ酸配列変異体をコードする核酸分子は、この分野で知られた種々の方法によって調製される。これらの方法は、限定するものではないが、天然源からの単離(天然に生じるアミノ酸配列変異体の場合)又は初期に調製されたＢ細胞アンタゴニストの変異体又は非変異体のオリゴヌクレオチド媒介(又は部位特異的)突然変異誘発、ＰＣＲ突然変異誘発、及びカセット突然変異誘発による調製を含む。
エフェクター機能に関して、例えばＢ細胞アンタゴニストの抗原依存性細胞媒介性細胞毒性(ＡＤＣＣ)及び／又は補体依存性細胞毒性(ＣＤＣ)を向上させるために、本発明のＢ細胞アンタゴニストを修飾することが望ましい。このことは、抗体Ｂ細胞アンタゴニストのＦｃ領域に一又は複数のアミノ酸修飾を導入することで達成される。あるいは又は加えて、Ｆｃ領域にシステイン残基を導入することによってこの領域での鎖間のジスルフィド結合形成が起こりうる。故に、生成されたホモ二量体抗体は内部移行能を向上及び／又は補体媒介性細胞障害及びＡＤＣＣを増強する。Caron等, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) 及びShopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992)を参照。抗線維形成活性が亢進されたホモ二量体抗体もまた、Wolff等, Cancer Research 53:2560-2565 (1993)に記載されているような異種性二機能性交差結合を用いて調製されうる。又は、抗体を二重のＦｃ領域を持つように操作して、それによって補体媒介性溶解及びＡＤＣＣ能を亢進した。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989)を参照。国際公開第００／４２０７２号は、抗体がそのＦｃ領域内にアミノ酸置換を含有する場合のヒトエフェクター細胞の存在下で改善されたＡＤＣＣ機能を有する抗体を述べる。
【００８２】
変更したＣ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞障害活性(ＣＤＣ)を有する抗体については、国際公開第９９／５１６４２号、米国特許第６１９４５５１号Ｂ１、米国特許第６２４２１９５号Ｂ１、米国特許第６５２８６２４号Ｂ１及び米国特許第６５３８１２４号 に記載される。抗体は、そのＦｃ領域のアミノ酸位置２７０、３２２、３２６、３２７、３２９、３１３、３３３及び／又は３３４の一以上にアミノ酸置換を含有する。
Ｂ細胞アンタゴニストの血清半減期を延長するために、例として米国特許第５７３９２７７号に記載されているようにＢ細胞アンタゴニスト(特に抗体断片)内にサルベージレセプター結合エピトープを組み込む方法がある。ここで用いる、「サルベージレセプター結合エピトープ」は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期延長に関与するＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４)のＦｃ領域のエピトープを表す。また、Ｆｃ領域内に置換を有し、血清半減期が延長された抗体は国際公開第００／４２０７２号に記載される。
３つ以上(好ましくは４つ)の機能的抗原結合部位を有する遺伝的に操作した抗体もまた考慮される(米国公開特許第２００２／０００４５８７号)。
【００８３】
Ｂ細胞アンタゴニストの製剤と投与
本発明のＢ細胞アンタゴニストは治療用製剤の形態で患者に投与されるのが好ましい。本発明に関連して使用されるＢ細胞アンタゴニストの治療的剤形は、所望の純度を有するＢ細胞アンタゴニストを選択的に薬剤的許容可能な担体、賦形剤、安定剤と混合して凍結乾燥の剤形又は液状溶液の形態の貯蔵に適するものである(Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980))。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる用量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド；ヘキサメトニウムクロライド；ベンズアルコニウムクロライド；ベンズエトニウムクロライド；フェノール；ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾールなど)；低分子量(約１０残基未満)ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物ＥＤＴＡ等のキレート剤、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質錯体)又はTWEENTM、PLURONICSTM、又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。
【００８４】
例示的抗ＣＤ２０抗体の剤形は国際公開第９８／５６４１８号に記載されており、出典明記により特別に本明細書中に援用される。この公報は、２−８℃で２年間の最小限の貯蔵期間を持つように、リツキシマブ４０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍＭ酢酸塩、１５０ｍＭトレハロース、０．９％ベンジルアルコール、及び０．０２％ポリソルベート２０, ｐＨ５．０を含む液状複数回用量の剤形である。他の抗ＣＤ２０剤形は、リツキシマブ１０ｍｇ／ｍＬ、塩化ナトリウム９．０ｍｇ／ｍＬ、クエン酸ナトリウム二水和物７．３５ｍｇ／ｍＬ、ポリソルベート８０ ０．７ｍｇ／ｍＬ、及び注入用の滅菌水を含むｐＨ  ６．５のものである。
凍結乾燥剤形は米国特許第６２６７９５８号に記載されるように、皮下的投与に適する。そのような凍結乾燥剤形は適当な希釈剤で高いタンパク質濃度に再編成されるかもしれない、また再編成された剤形はここで治療される患者に皮下注射されうる。
【００８５】
また、本明細書中の製剤は、治療される特定の徴候のための必要に応じて、一以上の活性な化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない補完的な活性を有するものを含有してもよい。例えば、細胞障害性剤、化学療法剤、サイトカイン、ＴＧＦβ経路の阻害剤(例えば、ＴＧＦβ活性化のモノクローナル抗体、ペプチド、小分子アンタゴニスト、阻害剤)、インテグリンレセプターアンタゴニスト、又は免疫抑制剤(例えば、Ｔ細胞に作用するもの、例としてＴ細胞を結合する抗体又はシクロスポリン、例えばＬＦＡ-１を結合するもの)を更に供給するのが望ましい。このような他の薬剤の有効量は、製剤に存在するＢ細胞アンタゴニストの量、疾患又は疾病又は治療の種類、及び他の要因に依存する。
また、Ｂ細胞アンタゴニストは、例としてコアセルべーション技術又は界面重合化により調製したマイクロカプセル、例として、コロイド状のドラッグデリバリーシステム(例として、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)又はマクロエマルジョン中のそれぞれ、ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メチルメタサイクリン)マイクロカプセル中に包まれているかもしれない。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示されている。
【００８６】
Ｂ細胞アンタゴニストの持続性徐放剤が調製される。持続性徐放剤の好適な例は、Ｂ細胞アンタゴニストを含む固形疎水性ポリマーの準透過性基質を含むものであり、基質は、造形品、例としてフィルム、又はマイクロカプセルの形である。持続性徐放基質の例として、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリ乳酸(米国特許第３７７３９１９号), L-グルタミン酸及びエチルＬグルタミン酸の共重合体、非分解性のエチレンビニール酢酸塩、分解性の乳酸グリコール酸共重合体、例としてLUPRON DEPOTTM(乳酸-グリコール酸共重合体及びロイプロリド酢酸塩で構成された注入可能ミクロスフェア)、及びポリＤ-(−)-３ヒドロキシブチリン酸を含む。
インビボ投与のために使用される製剤は無菌でなければならない。これは濾過滅菌メンブレンによる濾過によって容易に達成されうる。
【００８７】
Ｂ細胞アンタゴニストは、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内を含む任意の適切な方法により投与されうる。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、又は皮下投与が含まれる。加えて、Ｂ細胞アンタゴニストは、例えばＢ細胞アンタゴニストを漸減しながらパルス注入によって、適切に投与されてもよい。好ましくは、投薬は、投与が短期のものであるか長期のものであるかにある程度依存して、注射、最も好ましくは静脈内注射又は皮下注射により行われる。
【００８８】
本発明の特定の例示的実施形態では、Ｂ細胞アンタゴニストは、(例えば、静脈内に) １ｍｇ／ｍ２から５００ｍｇ／ｍ２の用量で患者に投与される。例えば、Ｂ細胞アンタゴニストは、１ｍｇ／ｍ２、２ｍｇ／ｍ２、３ｍｇ／ｍ２、４ｍｇ／ｍ２、５ｍｇ／ｍ２、１０ｍｇ／ｍ２、１５ｍｇ／ｍ２、２０ｍｇ／ｍ２、２５ｍｇ／ｍ２、３０ｍｇ／ｍ２、３５ｍｇ／ｍ２、４０ｍｇ／ｍ２、４５ｍｇ／ｍ２、５０ｍｇ／ｍ２、５５ｍｇ／ｍ２、６０ｍｇ／ｍ２、６５ｍｇ／ｍ２、７０ｍｇ／ｍ２、７５ｍｇ／ｍ２、８０ｍｇ／ｍ２、８５ｍｇ／ｍ２、９０ｍｇ／ｍ２、９５ｍｇ／ｍ２、１００ｍｇ／ｍ２、１０５ｍｇ／ｍ２、１１０ｍｇ／ｍ２、１１５ｍｇ／ｍ２、１２０ｍｇ／ｍ２、１２５ｍｇ／ｍ２、１３０ｍｇ／ｍ２、１３５ｍｇ／ｍ２、１４０ｍｇ／ｍ２、１４５ｍｇ／ｍ２、１５０ｍｇ／ｍ２、１５５ｍｇ／ｍ２、１６０ｍｇ／ｍ２、１６５ｍｇ／ｍ２、１７０ｍｇ／ｍ２、１７５ｍｇ／ｍ２、１８０ｍｇ／ｍ２、１８５ｍｇ／ｍ２、１９０ｍｇ／ｍ２、１９５ｍｇ／ｍ２、２００ｍｇ／ｍ２、２０５ｍｇ／ｍ２、２１０ｍｇ／ｍ２、２１５ｍｇ／ｍ２、２２０ｍｇ／ｍ２、２２５ｍｇ／ｍ２、２３０ｍｇ／ｍ２、２３５ｍｇ／ｍ２、２４０ｍｇ／ｍ２、２４５ｍｇ／ｍ２、２５０ｍｇ／ｍ２、２５５ｍｇ／ｍ２、２６０ｍｇ／ｍ２、２６５ｍｇ／ｍ２、２７０ｍｇ／ｍ２、２７５ｍｇ／ｍ２、２８０ｍｇ／ｍ２、２８５ｍｇ／ｍ２、２９０ｍｇ／ｍ２、２９５ｍｇ／ｍ２、３００ｍｇ／ｍ２、３０５ｍｇ／ｍ２、３１０ｍｇ／ｍ２、３１５ｍｇ／ｍ２、３２０ｍｇ／ｍ２、３２５ｍｇ／ｍ２、３３０ｍｇ／ｍ２、３３５ｍｇ／ｍ２、３４０ｍｇ／ｍ２、３４５ｍｇ／ｍ２、３５０ｍｇ／ｍ２、３５５ｍｇ／ｍ２、３６０ｍｇ／ｍ２、３６５ｍｇ／ｍ２、３７０ｍｇ／ｍ２、３７５ｍｇ／ｍ２、３８０ｍｇ／ｍ２、３８５ｍｇ／ｍ２、３９０ｍｇ／ｍ２、３９５ｍｇ／ｍ２又は４００ｍｇ／ｍ２の用量で投与されてもよい。
【００８９】
Ｂ細胞アンタゴニストは、多種多様な投薬計画に従って投与されてもよい。(例として米国特許出願公開第２００６／０００２９３０号を参照)。例えば、Ｂ細胞アンタゴニストは、予め決められた期間(例えば４〜８週又はそれ以上)の間１日に１回、又は、週ごとの計画(例えば１週につき１日、１週につき２日、１週につき３日、１週につき４日、１週につき５日、１週につき６日又は１週につき７日)に従って、予め決められた期間(例えば４〜８週又はそれ以上)の間、投与されてもよい。「１週間に１回」の投薬計画の具体的な例は、治療期間の１日目、８日目、１５日目及び２２日目のＢ細胞アンタゴニストの投与である。代替的な実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストは、数か月にわたって間欠的に投与されてもよい。例えば、Ｂ細胞アンタゴニストは、半年ごとに連続する３週間の間毎週)投与されてもよい(すなわち、６か月ごとに週１回の投薬を繰り返す)。このような投薬計画は、初期治療によって、生じる有益な治療効果を維持するために、延長して(年単位で)続けられてもよい。更なる他の実施態様では、このような維持療法は、線維形成状態の即時型の症状を低減するように設定された急性期投薬措置の後に行われてもよい。
治療期間中のそれぞれの時期に投与されるＢ細胞アンタゴニストの量は同じでもよい。これに対して、治療期間中のそれぞれの時期に投与される量は、異なっていてもよい(例えば、ある時点に投与される量はその前に投与された量より多くても少なくてもよい)。例えば、維持療法の間に投与される用量は、治療の急性期の間に投与される量より少なくてもよい。特定の状況に応じて適切な投薬計画は、当業者に明らかであろう。
【００９０】
患者へのタンパク質Ｂ細胞アンタゴニストの投与の他に、本出願は、遺伝子治療によるＢ細胞アンタゴニストの投与を考慮する。Ｂ細胞アンタゴニストをコードする核酸のこのような投与は、「治療的有効量のＢ細胞アンタゴニストがこの治療を必要とする患者に投与される」という表現により包含される。例として、細胞内抗体を生成するための遺伝子治療の使用に関しては、国際公開第９６／０７３２１号を参照のこと。
患者の細胞内への核酸(場合によって、ベクターに含まれている)の取り込みには２つの主な手法があり、それはインビボとエクスビボである。インビボ運搬のために、通常患者のＢ細胞アンタゴニストが必要である部位に核酸が直接注入される。エクスビボ治療のために、患者の細胞が取り除かれ、核酸がこれら単離した細胞内に導入され、変更した細胞が直接又は、例えば、患者内に着床される多孔性膜内に被包して患者に投与される(例として米国特許第４８９２５３８号および同第５２８３１８７号を参照)。核酸を生きた細胞に導入するために有用な様々な技術がある。技術は、核酸が対象とする宿主の細胞内にインビボで移入されるか、又はインビトロで培養細胞に形質移入されるかの何れかによって、異なる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に適する技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法、などの使用が含まれる。遺伝子のエクスビボ運搬のために一般的に用いられるベクターはレトロウィルスである。
【００９１】
例示的なインビボ核酸移入技術には、ウイルスベクター(例として、アデノウイルス、単純ヘルペスＩウイルス又はアデノ関連ウイルス)及び脂質ベースのシステム(遺伝子の脂質が媒介する移入に有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)を用いる形質移入が含まれる。場合によっては、標的細胞を標的とする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターに対するリガンドなどにより核酸供給源を提供するのが好ましい。リポソームを用いる場合、エンドサイトーシスに関係する細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質、例えば、特定の種類の細胞に対するキャプシドタンパク質ないしはその断片、循環への内部移行を起こすタンパク質に対する抗体、並びに、細胞内局在化を標的とするタンパク質及び細胞内半減期を上げるタンパク質は、ターゲティングのため及び／又は取込を促すために用いられてもよい。レセプターが媒介するエンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)、Wagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:3410-3414 (1990)に記載されている。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコールの概要については、Anderson等, Science 256:808-813 (1992)を参照のこと。また、国際公開第９３／２５６７３号及びそこに引用される文献を参照のこと。
【００９２】
Ｂ細胞アンタゴニストと他の薬剤との併用
本発明の特定の実施態様では、複数の種類のＢ細胞アンタゴニストは他と組み合わされて、一又は複数の線維形成状態を治療するために患者に投与される。例えば、本発明は、出典明記によって、本明細書中にその全体が援用される米国特許出願公開第２００５／００９５２４３号及び本明細書中の他の箇所に記載されるＢＡＦＦアンタゴニストとＣＤ２０に対する抗体(例えばリツキシマブ)の治療的に有効な量が患者に投与されることを含む、線維形成状態の治療方法を包含する。複数のＢ細胞アンタゴニストが患者に投与される場合、異なるＢ細胞アンタゴニストは単一の医薬組成物中に合わせて投与されてもよいく、好ましくは、何れかの順番で異なる投与で続けて投与されてもよい。
【００９３】
また、本発明は、第一薬剤と第二薬剤を含む組合せが必要とする患者に投与されることを含み、このときの該第一薬剤がＢ細胞アンタゴニストであり、該第二薬剤が、一又は複数の線維形成状態を治療するために有用であるが、必ずしもＢ細胞アンタゴニストではない薬剤である、線維形成状態の治療方法を包含する。例えば、本発明の特定の実施態様によると、Ｂ細胞アンタゴニストは、一又は複数のインテグリンレセプター(例えば、α１β１、αｖβ６、αｖβ８、αｖβ５、α５β１、α４β１、α４β７など)のアンタゴニスト、例えば、一又は複数のインテグリンレセプター(例えば、α１β１、αｖβ６、αｖβ８、αｖβ５、α５β１、α４β１、α４β７など)に特異的な抗体、ポリペプチドアンタゴニスト及び／又は小分子アンタゴニストとともに、患者に投与される。(米国特許第６６５２８５６号及び同第６６９２７４１号、及び米国特許出願公開第２００４／０２４８８３７号、同第２００４／０２０８８７８号、同第２００２／０００４４８２号、同第２００５／０２５５１０２号、及び同第２００５／０２２６８８５号)。本発明において、α４β１インテグリンレセプターに特異的に結合し、線維形成状態の治療のためにＢ細胞アンタゴニストと組み合わせて用いられうる抗体の例は、米国公開特許第２００５／０２７６８０３号に記載のナタリズマブ(Tysabri(登録商標))である。
【００９４】
本発明の態様の特定の実施態様では、Ｂ細胞アンタゴニストとともに投与される第二薬剤は、例えばステロイド、細胞障害性剤、コルヒチン、酸素、抗酸化剤(例えば、Ｎ-アセチルシステイン)、金属キレーター(例えば、テラチオモリブデート)、ＩＦＮ-γ又はαアンチトリプシンである。特定の実施態様では、第二薬剤は、例えばＢｔｋの小分子阻害剤を含むＢｔｋの阻害剤であってもよい。特定の実施態様では、第二薬剤は、例えばＴＷＥＡＫの抗体及び小分子阻害剤を含むＴＷＥＡＫの阻害剤であってもよい。さらに他の実施態様では、第二薬剤は、ＬＴＢＲアンタゴニスト(例えば可溶性融合タンパク質又は抗体)、米国特許第７０３００８０号及び同第７００１９２１号を参照、又は、ＴＲＡＩＬ-Ｒ２のアンタゴニストを含んでもよい。
【００９５】
本発明の態様の特定の実施態様によると、Ｂ細胞アンタゴニストとともに投与される第二薬剤は、例えば、ＴＧＦ-β経路阻害剤であってもよい。本発明において、用いられうる例示的なＴＧＦ-β経路阻害剤は、ＴＧＦ-βシグナル伝達経路の一又は複数の構成因子、例えばＡｎｇ II、ＩＬ-１、ＩＬ-４、ＩＬ-１０、ＩＬ-１３、ＭＩＦ、ＰＤＧＦ、ＲＡＧＥ、ＡＧＥ、ＴＮＦ-α、トロンボスポンジン-１、ＶＬＡ-Ｉ、ＳＭＡＤ-２、ＳＭＡＤ-３(米国公開特許第２００３／０１３９３６６号)、ＳＭＡＤ-４、ＥＲＫ、ｐｌ５、Ｉｎｋ４ｂ、ｐ２１  Ｗａｆ１、ｐ２７Ｋｉｐ１、ｐ-３８、ＣＴＧＦ(米国公開特許第２００４／０２４８２０６号)、ＰＡＩ-１、ＰＴＨｒＰ、エンドセリン-１、ファルネソイドＸ、ＨＧＦ、ＩＧＦ-１、ＭＭＰ-１、ＭＭＰ-９、ＰＧＥ２、プロピルヒドロキシラーゼ、プロコラーゲン、フィブリリン、ＴＩＭＰ、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＲ２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ-７及びＣＣＬ-２２を阻害又は中和する抗体、合成ないしは天然の配列ペプチド及び小分子を含むが、これに限定されるものではない。本発明において、用いられうる他の例示的なＴＧＦ-β経路阻害剤は、例えば、ＴＧＦ-βリガンド及びレセプターアンタゴニスト、例えば抗体、可溶性ＴＧＦ-βＲII-Ｆｃ融合タンパク質、ＬＡＰ-Ｆｃ融合タンパク質、ＴＧＦ-βＲI又はＲIIキナーゼ阻害剤及びＴＧＦ-βＲIIの下流の小分子阻害剤を含むが、これに限定されるものではない。
【００９６】
本発明においてＢ細胞アンタゴニストとともに投与されうる更なる薬剤は、例えばピルフェニドン、エンドセリンアンタゴニスト、ＴＮＦ-α阻害剤、ＰＤＧＦ阻害剤、ＣＴＧＦ阻害剤、ＣＤ４０リガンドアンタゴニスト(米国特許第６５０６３８３号)、ＢＣＭＡ-Ｉｇ、Ｐ３８ ＭＡＰキナーゼ阻害剤、プレドニゾン、チトキサン及びアザチオプリンを含む。
本発明において線維形成状態を治療するためにＢ細胞アンタゴニストと組み合わせて用いられうる特定の例示的な臨床製品は、表３に挙げるものを含む。
【００９７】
表３
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【００９８】
キット
また、本発明は線維形成状態を治療するためのキットを包含する。本発明のキットは、少なくとも１つの容器がＢ細胞アンタゴニストを含む、一又は複数の容器を具備する。本明細書中の他の箇所に記載されるＢ細胞アンタゴニストの何れかが本発明のキットに内包されていてもよい。また、本発明のキットは、線維形成状態を治療するためにＢ細胞アンタゴニストと組み合わせて投与されうる一又は複数の付加的な薬剤を含んでなる一又は複数の容器を具備してもよい。このような付加的な薬剤は、本明細書の他の箇所に記載される。場合によって、キットは、線維形成状態を治療するための指示書の一又は複数を具備してもよい。指示書は、とりわけ、患者に投与される他の薬剤及び／又はＢ細胞アンタゴニストの量に関する情報、投与のタイミング及び頻度、考えられる投与の手段、及びＢ細胞アンタゴニスト及び／又は他の薬剤が投与されなければならない患者により表される特徴及び／又は症状が含まれうる。
【００９９】
本明細書中に記載される方法及び施行に対するの他の適切な変更及び応用は明らかであり、本発明又はその任意の実施態様の範囲から逸脱しないものであろう。ここで、本発明を詳細に記載しているので、以下の実施例を参照することで同じことがより明確に理解されるであろう。この実施例は、例示の目的で本明細書中に包含されており、本発明を限定するためのものではない。
【実施例】
【０１００】
実施例１  Ｂ細胞非存在下における肝線維症の減弱
序論
慢性肝疾患、例として、アルコール誘発性肝臓変性、Ｃ型肝炎感染、非アルコール誘発性脂肪性肝炎の特徴は、慢性炎症、細胞性障害、再生及び線維症である。これらの特徴の全ては、度重なる四塩化炭素(ＣＣｌ４)誘発性の肝障害により惹起されうる。(Jungermann及びKatz, Physiol. Rev. 69: 708-764 (1989)；Friedman, Semin. Liver Dis. 19: 129-140 (1999))。この実施例では、ＣＣｌ４-誘発性線維形成を、野生型マウス及びＢ細胞欠失マウスにおいて評価した。
代替モデルにおいて、肝障害は胆汁毒素α-ナフチルイソチオシアナート(ＡＮＩＴ)により誘発され、胆汁肝硬変及び硬化性胆管炎と類似した症状を呈する。(Tjandra等, Hematology 31:280-290 (2000))。ＣＣｌ４に類似のＡＮＩＴは炎症及び線維形成応答に続いて非免疫性の細胞標的肝毒性を引き起こすが、ＣＣｌ４と比べてその場所は肝解剖学的に異なる場所であった。
ＣＣｌ４治療の６週間後、組織化学的分析によると、同じように治療された野生型マウスと比較してＢ細胞欠失マウスではコラーゲン沈着が減少していた。加えて、Ｂ細胞の数は正常であるがＴ細胞を欠いているマウスを分析することによって、Ｂ細胞がＴ細胞非依存的な様式で線維形成に関与することが確認された。ＡＮＩＴ処置ＪＨ-／-マウスはコラーゲン沈着に関して同じような結果を示した。
【０１０１】
材料及び方法
マウス
特に明記しない限り、マウスは、Biogen Idec (Cambridge, MA)の特定病原体不在のマウス施設で飼育された。すべての動物の手続きは、Biogen Idecの施設内動物管理及び利用委員会の承認を得た。表４に挙げる系統の雄マウスは、研究に用いられるためには体重２０ｇ以上、少なくとも６週齢でなければならない。
表４
2008540678.tif 000020
【０１０２】
ＣＣｌ４及びＡＮＩＴ障害モデル
ミネラルオイル(Sigma-Aldrich Corp.)とＣＣｌ４(Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO)の混合物は、２０ゲージの動物給餌針によって０．２ｍｌの用量を超えないで強制飼養により与えた。３．５ｍｇ／ｋｇ又は１．７５ｍｇ／ｋｇ用量のＣＣｌ４を用いて実験を行った。高用量と比較して、羅病率／死亡率を減らし、なおかつ血清アラニンアミノトランスフェラーゼ(ＡＬＴ)レベルとコラーゲン沈着の変化を引き起こしたので、後者の用量を選択した。長期実験のため、マウスは、６週間、週に一度強制飼養により与えた。短期実験には１回のＣＣｌ４投与が含まれた。
ＡＮＩＴ(１-ナフチルイソチオシアネート、Sigma- Aldrich Corp.)は、３０ｍｇ／ｍｌでミネラルオイル(Sigma- Aldrich Corp.)に溶解した。マウスに８週間、週に２回、５０ｍｇ／ｋｇを強制飼養により与えた。
ＣＣｌ４投与の２４時間後に血清ＡＬＴレベルを測定した。第６週目の強制飼養後１週間又は単回強制飼養後の示した日に、マウスを屠殺し、それぞれのマウスから３つの異なる肝臓葉を採取し、４％のＰＦＡを含むＰＢＳ中で２日間インキュベートして、更なる免疫組織化学分析のために包埋した。
【０１０３】
肝臓リンパ球単離
ＣＯ２吸入によってマウスを安楽死させた。肝門脈は、２５Ｇの針で挿管して、１０ｍｌの冷却されたＰＢＳで灌流した。胆嚢の除去の後、肝臓を切片にし、５０ｍｌの氷温のＲＰＭＩ／５％ＦＢＳにて７０μｍ孔径の細胞濾過器(BD Falcon, Bedford, MA)に通した。肝臓懸濁液を、１つの肝臓当たり５０ｍｌのチューブにて３００ｇで１０分間遠心分離した。ペレットを１０ｍｌの０．０２％コラゲナーゼＩＶ(Sigma- Aldrich Corp.)を含むＲＰＭＩ１６４０に再懸濁して、３７℃に４５分間放置した。３０ｍｌの氷温のＲＰＭＩ／５％ＦＢＳを各チューブに加えて、３０ｇで３分間遠心分離した。ペレットを廃棄した。上清を４０℃、３００ｇで１０分間遠心分離した。細胞ペレットを６ｍｌの氷温のＲＰＭＩ１６４０(又は４５％パーコール(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)に再懸濁し、２４％メトリザミド(Sigma- Aldrich Corp.)を含むＰＢＳ(又は、それぞれ、７０％パーコール含むＰＢＳ)を下層にした。その後、４０℃、１０００ｇで２分間遠心分離を行った。境界面のリンパ球を回収し、ＲＰＭＩ７５％ＦＢＳにて洗浄して、更なる分析のために用いた。
ＮＫ-Ｔ細胞の肝特異的な増加と、血液Ｂ細胞のＶ-Ｄ及びＤ-Ｊ接合部(４．５及び３．４、結果を参照)と比較して、肝内Ｂリンパ球のＶ-Ｄ及びＤ-Ｊ接合部でのＮヌクレオチド挿入の比率が異なる(３．５及び４．４)ことが結果から示されたので、血液リンパ球による肝内リンパ球混入の程度は低い。
【０１０４】
脾臓、血液及び腹腔からのリンパ球の単離
脾臓をナイロンメッシュ(Cell Strainer；BD Falcon, Bedford, MA)により細かく切り刻んで、ＤＭＥＭ、５％ＦＣＳ及び２ｍＭ Ｌ-グルタミン中の細胞浮遊液を得た。赤血球は、溶解バッファ(１４０ｍＭ ＮＨ４Ｃｌ、１７ｍＭ トリス-ＨＣｌ、ｐＨ７．６５)中で氷上で３分間インキュベートすることによって溶解した。血液は、ＥＤＴＡを含有しているチューブ(BD Pharmingen, San Diego, CA)に集めた。血液リンパ球を単離するために、２００μｌの血液をFicoll-Paque(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)の上層に置き、室温、１０００ｇにて２０分間遠心分離した。リンパ球を境界面から回収した。腹腔(ＰＣ)を５ｍｌのＤＭＥＭ、５％ＦＣＳ及び２ｍＭ Ｌ-グルタミンにて洗浄して、ＰＣ白血球を回収した。これらの手順の後、リンパ球は、４０℃、３００ｇの遠心分離によって、ＤＭＥＭ、５％ＦＣＳ及び２ｍＭ Ｌ-グルタミンにて２回洗浄し、フローサイトメトリー分析のためにＰＢＳ／ＢＳＡ／アジドに、又は、増殖試験のために細胞培養液に再懸濁した。
【０１０５】
フローサイトメトリ
過去に記載されているように蛍光染色を行った。(Forster及びRajewsky, Eur. J. Immunol. 17:521-528 (1987))。ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＣＤ１９、ＣＤ２３、ＣＤ５、ＣＤ６９、ＣＤ８６、Ｂ２２０、ＭＨＣII、ＣＤ４３、Ｍａｃ-１、ＣＤ４、ＣＤ８ (BD Pharmingen, San Diego CA)又はＣＤ２１ (Ebioscience, San Diego, CA )に特異的なアネキシンＶ、７ＡＡＤ及び抗体を用いた。抗体は、ＦＩＴＣ、ＰＥ、ＡＰＣ、ＰｅｒＣＰ、Ｃｙ-クロム又はビオチンにコンジュゲートした。ビオチン化した抗体は、ＰｅｒＣＰにコンジュゲートされたストレプトアビジンによって、検出した。染色した細胞を固定して、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ(BD Biosciences, San Jose, CA)を用いて分析した。
【０１０６】
ＣＦＳＥ標識Ｂ細胞のインビトロ刺激
原液を生成するために、ＣＦＳＥ (Molecular Probes, Eugene, OR)をＤＭＳＯ ５ｍＭに溶解し、−８０℃で保存した。脾臓Ｂ細胞は、製造業者の指示に従って、ＬＳ磁気カラム(Miltenyi Biotec)上の抗Ｂ２２０ Ａｂ(Miltenyi Biotec, Auburn, CA)にカップリングされたＭＡＣＳビーズによる濃縮によってＭＡＣＳで精製した。次いで細胞をＲＰＭＩ１６４０にて２回洗浄して、５ｍＭの濃度のＣＳＦＥを含む暖めたＲＰＭＩ１６４０にて５×１０７細胞／ｍｌに再懸濁して３７℃に１０分間置いた。次いで、細胞を、氷温のＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＣＳにて３回洗浄して、ＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＣＳ／βＭＥ／Ｌ-グルタミンにて２×１０５／１００μｌに再懸濁して、１００μｌ／ウェルを平底９６ウェルプレートに移した。さらに１００μｌのＲＰＭＩを添加して、２倍の終濃度で刺激試薬を含むようにした。純粋なＦ(ａｂ')２断片ヤギ抗マウスＩｇＭ(２.５μｇ／ｍｌ、Jackson Immunoresearch, West Grove, PA)、ＩＬ-４(２５Ｕ／ｍｌ、R&D Systems, Minneapolis, MN)、抗マウスＣＤ４０ Ａｂ(０．２５μｇ／ｍｌ、Ebioscience)、抗ＲＰ１０５Ａｂ(１０．５μｇ／ｍｌ、Ebioscience)、ＬＰＳ(２０μｇ／ｍｌ、Sigma-Aldrich Corp.)を刺激として用いた。
【０１０７】
免疫組織化学法
α平滑筋アクチンに特異的な抗体(クローン１Ａ４、DakoCytomation, Carpinteria, CA)を１:５０に希釈して３０分間インキュベーションをした。組織切片の熱誘導されたエピトープ回復前処置は、１０ｍＭのクエン酸バッファ、ｐＨ６．０中にて１２５℃で３０秒間行い、９０℃に１０秒間置き、室温にまで冷ましてさらに２０分間置き、免疫染色を行った。組織成分への第一抗体の結合は、３,３'-ジアミノベンジジン(ＤＡＢ)基質と、ＭＭビオチン化キット(Biocare Medical, Walnut Creek, CA)を用いて検出した。スライドは、マイヤーのヘマトキシリンにて１分間、対比染色した。
Ｆ４／８０特異的抗体(クローンＣＬＡ３-１、Serotec Inc., Raleigh, NC)を２０μｇ／ｍｌの濃度で３０分間用いた。組織切片は、プロテイナーゼＫ(DakoCytomation, Glostrup, Denmark)にて、室温で５分間前、処理した。第一抗体の結合は、ＤＡＢ基質と、ベクターエリートＡＢＣキット(Vector Laboratories, Burlingame, CA)を用いて検出した。スライドは、マイヤーのヘマトキシリンにて１分間、対比染色した。
【０１０８】
製造者の指示に従って、ＡｐｏｐＴａｇインサイツアポトーシス検出キット(Chemicon International, Temecula, CA)を用いてＴＵＮＥＬ染色を行った。標識されたアポトーシス細胞はＤＡＢ／塩化ニッケルを基質として用いて検出した。スライドは、メチルグリーン(Vector Laboratories, Burlingame, CA)にて５分間対比染色した。
コラーゲン繊維は、シリウスレッド染色を用いて検出した(Luna, Histopathologic Methods and Color Atlas of Special Stains and Tissue Artifacts: American HistoLabs, Incorporated. 767 pp. (1992))。他の文献に記載のように(Luna, Manual of Histologic Staining Methods of the Armed Forces Institute of Pathology. New York: McGraw-Hill Book Company (1968))、Ｈ＆Ｅ染色を行った。
【０１０９】
ＰＣＲ及びＩｇ遺伝子再構成分析
ゲノムＤＮＡ単離キット(Qiagen, Valencia, CA)の製造業者のプロトコールに従って、ＣＤ１９＋磁気ビーズ(Miltenyi Biotec,)上に陽性選択された細胞からＤＮＡを抽出した。ＤＮＡ(２μｌ、およそ１０３個のＢ細胞の相当物)を、ＶＤＪ結合部の増幅のために用いた。Ｊ５５８Ｌ、Ｑ５２及び７１８３のＶＨファミリーに特異的なＶＨＡ、ＶＨＢ及びＶＨＥの５'プライマーと、１回目の増幅にはＪＨ４Ｅの３'プライマー(１６)を、２回目の増幅にはＪＨ１又はＪＨ４Ａの３'プライマーを用いて、２回の増幅を行った。ＡＵプライマーはBiogen Ideeで合成されたものである。１回目では２０サイクル行った(９５℃で１分、６０℃で１分及び７２℃で１．５分)、２回目では３０サイクル行った(９５℃で１分、６３℃で１分及び７２℃で１．５分)。２μｌの１回目の反応生成物を鋳型として用いた。予想される０．４ｋｂの断片をゲルから精製して、ｐＣＲ４-ＴＯＰＯベクター(Invitrogen, Carlsbad, CA)にサブクローニングした。個々のコロニーからＤＮＡを調製して、標準的なベクター特異的プライマーを用いて配列決定した。
【０１１０】
間質性コラーゲン定量化
各々の動物の肝臓からの合計３つの切片(各々異なる葉から)を染色した。シリウスレッド染色の白黒の画像は、５×拡大、偏光下で作製した。画像は、肝臓組織がカメラで捕らえた全領域をカバーするように作製し、各々の画像(１動物につき４〜１０の画像)においてすべての画像領域が一致することを確認した。恒常的にコラーゲンを含有している脈管は、各々の画像から電子的に取り除いた。次に、白い染色(間質性コラーゲン)の量は、ＭｅｔａＭｏｒｐｈ画像分析ソフトウェア(Universal Imaging Corporation, Downingtown, PA)によって、定量化した。定量化は、任意の単位で表した(１は１０００ピクセルに相関)。シリウスレッド染色の強度によって異なるので、白い領域の絶対的な量は各々の実験間で直接比較することはできない。
【０１１１】
結果
Ｂ細胞は肝臓において主要なリンパ球集団である
Ｂ細胞は、発生中の胚の主な造血部位である胚性肝臓において広く研究されている。しかしながら、成体肝臓の肝性Ｂ細胞についてはほとんど知られていない。この実施例において、肝内(ＩＨ)Ｂ細胞を表現型的及び機能的に特徴付けた。
ＰＢＳ灌流肝臓からリンパ球集団を濃縮した後、Ｂ系統特異的なマーカーであるＣＤ１９を染色することによってＩＨＢ細胞の割合を定量した。ＢＡＬＢ／ｃ及びＣ５７ＢＬ／６マウスでは、Ｂ細胞はＩＨリンパ球のおよそ５０％に相当した(範囲３０〜６０％、図１Ａ及びデータは未掲載)。肝臓から単離されたＢ細胞の絶対数は２×１０６以下であった。ＣＤ１９＋ＩＨＢ細胞は、その脾臓相対物と同じレベルでＩｇＭ、ＩｇＤ、Ｂ２２０、ＭＨＣＩＩ及びＣＤ６２Ｌを発現することが示された(図１Ａ及びＢ、データは未掲載)。ＩＨＢ細胞は、Ｂ-１又は未成熟Ｂ細胞の代表的なマーカーであるＣＤ４３及びＭａｃ-１を発現しなかった(データは未掲載)。ＩＨＢ細胞は、血液Ｂ細胞で検出されるよりも高いが、ＰＣ Ｂ細胞で観察されるよりも低いレベルでＣＤ５を発現する(図１Ｂ)。ＣＤ５レベルが高いほど通常のＢ細胞活性化を表す。(Cong等, Int. Immunol. 3:467- 476 (1991))。ＩＨＢ細胞は、ＣＤ２３を発現するが、脾臓又は血液Ｂ細胞より低いレベルである。また、ＣＤ２１表面発現は、脾臓Ｂ細胞よりＩＨＢでわずかに低いが、血液Ｂ細胞よりも高い(図１Ｂ)。まとめると、これらのマーカーの発現に関して、肝臓Ｂ細胞は濾胞性脾臓Ｂ細胞と最も類似していた。
【０１１２】
肝Ｂ細胞は機能的に十分である
肝臓は死につつあるリンパ球の送り先として認識されているので(Crispe等, Immunol. Rev. 174: 47-62 (2000))、細胞がアポトーシスを経る際に細胞膜の内側から外側へ転移するリン脂質ホスファチジルセリン(ＰＳ)へ結合するアネキシンＶを用いて、ＩＨＢ細胞がアポトーシス前にあるかどうかが決定される。アネキシンＶは、１５％以下の脾臓Ｂ細胞に対して３０％以下の肝Ｂ細胞に結合した(図１Ｃ、データは未掲載)。ゆえに、ほとんどの肝臓Ｂ細胞はアポトーシスの素因を示さず、脾臓に比べて肝臓にアポトーシス細胞の数が多いことはリンパ球単離の違いに関連があるかもしれない。
分裂促進及びＢ細胞レセプター架橋に応答するＢリンパ球の増殖力は、Ｂ細胞サブセットごとに実質的に異なる重要な機能的特徴である。(Morris及びRothstein, J. Exp. Med. 177: 857-861 (1993)；Philips等, Immunol. Cell. Biol. 76:332-342 (1998)；Erickson等, 2001. J. Immunol. 166:1531-1539 (2001))。肝臓及び脾臓のＢ細胞を、様々な刺激に応答したときの、ＣＤ８６(Ｂ７.２)及びＭＨＣIIなどの共刺激分子の上方制御及び増殖の程度について比較した。興味深いことに、ＩＨＢ細胞の増殖応答は、脾臓Ｂリンパ球のものと非常に類似していた(図１Ｄ)。Ｔｏｌｌ様レセプター４、ＲＰ１０５及びＣＤ４０刺激に対する応答は同じであるのに対して、ＩｇＭ架橋への応答はＩＬ-４の非存在下では大きく、ＩＬ-４の存在下では小さかった。ＩｇＭ架橋に対してのみ増殖応答がより大きいことは、外来性生存因子様ＩＬ-4を含まない培養物中でＩＨＢ細胞がより良好に生存することを示し得、ＣＤ５上方制御により示されるＩＨＢ細胞の活性化状態と一致している(図１Ｂ)。試験されるすべての刺激によるＭＨＣII、ＣＤ８６及びＣＤ５の上方制御の程度は、肝臓及び脾臓のＢ細胞に関して非常に類似していた(図１Ｂ及びＤ、データは未掲載)。
【０１１３】
ＩＨＢ細胞は脾臓Ｂ２細胞と類似しており、胚性肝臓起源のものではない
成体肝臓のＢ細胞は胚性肝臓の残渣肝臓Ｂ細胞世代を表しうる。あるいは、成体中の脾臓Ｂ細胞のように、ＩＨＢ細胞は骨髄(ＢＭ)由来であるかもしれない。肝内Ｂ細胞の起源を調べるために、そのＶＤＪ再編成を遺伝的に分析した。胚性肝臓において、生成される新生児のＢ細胞のＶＤＪ接合部では鋳型でない(Ｎ、Ｐ)ヌクレオチドはほとんどみられない。これは、Ｂ１細胞について報告されたことと類似している。(Feeney, J. Exp. Med. 172: 1377-1390 (1990)；Gu等, EMBO J. 9:2133-2140 (1990)；Meek, Science 250:820-823 (1990))。それに対して、成体脾臓及び血液Ｂ細胞は、多くの鋳型でないヌクレオチドが付加している。(Kantor等, J. Immunol. 158:1175-1186 (1997)；Kepler等, J. Immunol. 157: 4451-4457 (1996))。プールされた成体肝臓リンパ球から得られるＣＤＲ３配列を、２日齢のマウスの脾細胞又は成体マウスの血液Ｂ細胞から得られるものと比較した。成体ＩＨＢ細胞は、新生児Ｂ細胞と顕著に異なり、そのＶＤＪ接合部配列が脾臓Ｂ２細胞又は再循環血液Ｂ細胞に似ている。新生児Ｂ細胞におけるＮ，Ｐヌクレオチドの平均数は、ＶＤ接合部では０．５であり、ＤＪ接合部では０．１である。これは、成体肝臓(又は血液)中のＢ細胞のＶＤ接合部の３．５(又は４．５)及びＤＪ接合部の４．４(又は３．４)と顕著に異なる。興味深いことに、成体肝臓及び血液のＢ細胞も、そのＶＤ及びＤＪ接合部の長さが異なるようである。この相違は、統計学的に有意な、ｐ＝０．１、スチューデントｔ検定の境界にある。ＩＨＢ細胞はそのＤＪ接合部よりもＶＤ接合部のＮ，Ｐヌクレオチドが少なく、従来の成体Ｂ２細胞について報告されたことに反する。(Kantor等, J. Immunol 158:1175-1186 (1997))。ＩＨＢ及び成体血液Ｂ細胞のＮ５Ｐ挿入の長さの相違は、肝内Ｂ細胞選別の結果であるかもしれない。さらに、この違いにより、肝臓Ｂ細胞が末梢血液Ｂ細胞と有意に混合しないで真性の肝内集団を表すという概念が強化される。
【０１１４】
肝線維形成におけるＢ細胞の役割
Ｂ細胞が肝臓において、果たしうる生理学的役割を調べるために、肝疾患を誘発し、疾患の進行をＢ細胞欠失マウスと野生型動物とで比較した。ＣＣｌ４投与のたびに生じる顕著な壊死炎症性肝障害の後に慢性の修復応答が生じる、ＣＣｌ４誘発性肝障害モデルを用いた。免疫系の特定の部分を先天的にターゲティングするよりも、毒性侵襲により一般的な肝毒性が誘発されるので、このモデルは、多くの広く利用される肝障害モデル(例えば住血吸虫、ＬＰＳ、ＣｏｎＡ)より有利であると考えた。さらに、興味深いことに、肝臓のＢ細胞はＣＣｌ４投与に特に感受性があることが明らかとなった。他の肝内リンパ球(ＮＫ-Ｔ、Ｔ細胞)はこの時点では変化がなかったのに対して、ＩＨＢ細胞数はＣＣｌ４処置の１日後におよそ１０分の１に下がった(データは未掲載)。ＣＣｌ４注射の５日後までに、Ｂ細胞数は回復した(データは未掲載)。
Ｂ細胞が肝障害及び修復において、役割があるかどうかを試験するために、ＣＣｌ４誘発性肝毒性試験にＢ細胞欠失マウスを用いた。分析に選んだＢ細胞欠失マウス系統は免疫グロブリン重鎖遺伝子のＪＨ領域に目的の欠失がある。この遺伝子はコード化重鎖遺伝子の集合(アセンブリ)を除去して、Ｂ細胞及び抗体産生を阻害する。(Chen等, Int. Immunol. 5:647-656 (1993))。これらのＢ細胞欠失マウスは、本明細書においてＪＨ-／-マウスと称する。
【０１１５】
ＣＣｌ４処置の２４時間後に血清に放出される肝細胞特異的な酵素であるＡＬＴにより評価される、ＣＣｌ４誘発性肝細胞障害の程度は、ＪＨ-／-及びＷＴ ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて、同程度であった(図２Ａ)。また、組織学的分析からも明らかであった(図３及び下記を参照)。しかしながら、興味深いことに、コラーゲン繊維の蓄積量に大きな差があった。第６週目の１．７５又は３．５ｍｇ／ｋｇのＣＣｌ４投与の１週間後には、ＪＨ-／-マウスの間質性コラーゲン沈着が、野生型マウスのおよそ６〜８分の１であった(図２Ｂ及び２Ｃ)。６回のＣＣｌ４治療後には、Ｆ４／８０＋マクロファージの数又は位置と筋線維芽細胞を産生する平滑筋アクチンに有意な変化は観察されなかった(データは未掲載)。ゆえに、Ｂ細胞は、ＣＣｌ４への応答の際に肝臓が線維形成変化を発達させるために必要となる重複性のない細胞群を構成するようである。
【０１１６】
Ｂ細胞機能がＣＣｌ４誘発性の障害の特異的な場合に限定されるのか、又は肝臓の組織修復において、より一般的な役割を果たすのかを試験するために、ＣＣｌ４により誘発された場合と異なるメカニズムによって肝臓を破壊する１-ナフチルイソチオシアナート(ＡＮＩＴ)によって、肝毒性を誘発した。ＡＮＩＴにより誘発される肝毒性は、胆管上皮細胞及び肝実質細胞の好中球依存性壊死として現れる。(Hill等, Toxicol. Sci. 47:118-125 (1999))。８週のＡＮＩＴ処置の後、ＪＨ-／-はＷＴマウスのおよそ７分の１のコラーゲン沈着であったことが明らかとなった。ゆえに、線維形成は、少なくとも２つのモデル系においてＢ細胞の非存在下で減少した。
標準を超えるＢ細胞数の増加により、より顕著な線維形成が生じるかどうかを試験するために、B細胞数の２０〜３０％の増加を示すＢＡＦＦ-ｔｇマウス(Mackay等, J. Exp. Med. 190: 1697-1710(1999))を対応するＣ５７Ｂ１／６  ＷＴコントロールマウスと比較した。６回のＣＣｌ４処置の後、ＢＡＦＦ-ｔｇ及びＣ５７Ｂ１／６コントロールにおいて線維形成が発達した。この線維形成は、ＢＡＬＢ／ｃマウスに顕著に見られるより少ないコラーゲン繊維沈着によって特徴付けられた(データは未掲載、Shi等, Proc. Natl. Acad. Sci USA 94:10663-10668 (1997))。しかしながら、興味深いことに、ＢＡＦＦトランスジェニックマウスは、コラーゲン沈着の量がそのＷＴ  Ｃ５７Ｂ１／６相対物のおよそ２倍であった(図２Ｄ)。
【０１１７】
Ｂ細胞欠失マウス及びＷＴマウスは単回のＣＣｌ４誘発性障害に対して異なる応答をした
６週の処置の後、どんな急性の効果がコラーゲン沈着の変化を誘発するかについて理解するために、単回ＣＣｌ４抗原投与の１日、３日及び５日後のＢ細胞欠失マウス及びコントロールマウスの肝臓切片において、組織変化の動態を分析した。興味深いことに、アポトーシス細胞を検出するＴＵＮＥＬ染色では、１日目には初めの障害が同等であったにもかかわらず、ＷＴマウスでは障害の５日後でさえも死んでゆく細胞がいくらか検出される一方で、ＪＲ-／-マウスは３日目までに完全にアポトーシス細胞がないことが示された(図３)。組織マクロファージ特異的なマーカーＦ４／８０について切片を染色した場合、１日目という早い時期に、ＷＴマウスと比較してＪＨ-／-のマクロファージ数はわずかに増加しており、３日目及び５日目までにかなりの量になった(図３)ことが明らかとなった。ゆえに、Ｂ細胞の非存在下では、むしろマクロファージが死にゆく肝細胞を除去しうるようである。コラーゲン繊維の主要な細胞性供与源が筋線維芽細胞の集団であるので(Rockey等, Clin. Liver. Dis. 4: 319- 355 (2000))、障害した肝臓の筋線維芽細胞を示す平滑筋アクチンもモニターした。３日目に初めて、筋線維芽細胞は、Ｂ細胞欠失マウス及びコントロールマウスにおいて同じレベルで検出される。しかしながら、５日目までに、ＷＴマウスは、より多くの筋線維芽細胞を示す(図３)。繰り返す障害について、マクロファージが効率的に死にゆく肝細胞を取り除くことができないために、筋線維芽細胞の過剰刺激が引き起こされ、その結果、長期間の障害の際に見られるコラーゲンの沈着がより大きくなるかもしれない。近年の研究では(Duffield等, J. Clin. Invest. 115:56-65 (2005))、マクロファージは、肝障害及び修復の間に、異なった、相反する役割を果たすことが示された。Ｂ細胞の非存在下では、炎症性瘢痕化から回復するために関与するマクロファージが優先して活性化されるようである。
【０１１８】
ＣＤ４＋、ＣＤ８＋又はγδＴ細胞は有意には肝線維形成に影響しない
また、Ｔ細胞を欠失しているマウスが線維形成を欠失しているかどうかを判断するために、Ｂ及びＴ細胞をともに欠失しているマウス(ＲＡＧ２-／-)、ＣＤ４＋Ｔ細胞を欠失しているマウス(Ａβ-／-)、ＣＤ８＋Ｔ細胞を欠失しているマウス(β２ｍ-／-)、又はγδＴ細胞を欠失しているマウス(ＴＣＲδ-／-)を用いて一連のＣＣｌ４誘発性肝障害実験を行った。すべてのマウス突然変異株について、同じ遺伝的背景のコントロール株を用いた(材料及び方法を参照)。これらの中で、ＲＡＧ２-／-マウスのみは、好適なＷＴ相対物と比較して、ＣＣｌ４による長期処置後にコラーゲン沈着の量が異なった(図４及びデータは未掲載)。そのレセプターを集合化(アセンブリ)するためにＤＮＡ再編成を必要とするすべてのリンパ球を欠失しているＲＡＧ２-／-マウスは、ＷＴマウスと比較して間質性コラーゲン蓄積がおよそ３〜４分の１に減少する(図４Ｂ)。この結果は、Ｂ細胞だけを欠失しているマウスにおいて得られた結果と非常に類似しており、肝臓線維形成のＣＣｌ４モデルにおいてＴ細胞の顕著な役割を示唆するものではない。
【０１１９】
肝臓線維形成でのＢ細胞の役割は抗体依存性である
Ｂ細胞は、抗原提示、サイトカイン放出、及び／又は共刺激分子により調節される細胞-細胞接触、及び抗体による長期間作用などの局所作用を媒介しうる。Ｔ細胞欠失動物(上記参照)はコラーゲン沈着に全く違いがないので、Ｔ細胞に対するＢ細胞抗原提示は肝臓線維形成に影響しそうにない。
肝臓線維形成のＢ細胞調節に免疫グロブリンが必要であるかどうかを決定するために、正常数のＢ細胞を有するが、血清のＩｇを欠いているかＩｇレベルが非常に低い２つのマウス系統を用いた。ＩｇＨ遺伝子座のＪエレメントの位置に組み込まれる遺伝子(ＤＨＬＭＰ２ａ対立遺伝子(Casola等, Nat. Immunol. 5:317-327 (2004))からエプスタインバーウイルス誘導タンパク質ＬＭＰ２ａを発現するマウスは表面免疫グロブリン及び循環免疫グロブリンを欠失しているのに対して、ＪＨ-／-バックグラウンドにｍＩｇＭ導入遺伝子を発現するマウスは表面免疫グロブリンをコードするが、分泌型免疫グロブリンはコードしない。(Chan等, J. Exp. Med. 189: 1639- 1648 (1999))。
【０１２０】
図５Ａに示すように、１．７５ｍｇ／ｋｇのＣＣｌ４の６週間の処置後に、エプスタインバーウイルス誘導ＬＭＰ２ａタンパク質を発現するマウス及びそのＷＴ ＢＡＬＢ／ｃＡｎＮＣｒｌＢｒコントロールにおいて、同レベルのコラーゲン沈着がみられた。さらに、表面Ｉｇを発現するが分泌型Ｉｇを発現しないｍＩｇＭ  ｔｇ(ＪＨ-／-)マウス(Chan等, J. Exp. Med. 189: 1639-1648 (1999))は、ＣＣｌ４誘発肝臓線維形成の程度がＷＴコントロールＢＡＬＢ／ｃマウスと同じであった(図５Ｂ)。ゆえに、ＣＣｌ４誘発肝臓線維形成の病理に対するＢ細胞効果は抗体非依存性である。これらの実験におけるＷＴ ＢＡＬＢ／ｃマウスの線維形成の程度が、潜在的にこれらの動物の異なる収容条件及び／又は同時感染のため、以前のもの(図２、４、５)より低いことは注目に値する：ＬＭＰ２ａ及びｍＩｇＭマウスのコロニーはいずれもヘリコバクター・ヘパティカスについて陽性であった。したがって、これらのマウス並びに対応するＷＴ系統は隔離施設で飼育した。
【０１２１】
考察
この実施例において、肝内Ｂ細胞が従来のＢ２細胞と似た表現型及び機能的特徴を有する大きい集団を表すことが示された。ＩＨＢ細胞は従来のＢ２細胞よりいくらか高いレベルでＣＤ５を発現し、インビトロでＩＬ-４を添加することなくＩｇＭ架橋に応答してより良好に増殖する(図１)。このことからＩＨＢ細胞の活性化状態が示唆される。成体肝臓が多系列白血球を引き起こしうるｃ-ｋｉｔ＋造血多能性幹細胞を含有することが知られているにもかかわらず(Watanabe等, J. Exp. Med. 184: 687-693 (1996)；Taniguchi等, Nat. Med. 2: 198-203 (1996))、自己増殖性胚性肝臓由来のＢ１系統細胞とは対照的に、成体肝臓のほとんどのＢ細胞はＢＭ由来であるようである。(Herzenberg, Immunol. Rev. 175: 9-22 (2000))。ＩＨＢ細胞はおそらくＢＭ起源のものである。肝内Ｂ細胞のＶＤＪ接合部は、広範囲なＮヌクレオチド挿入を含有して、従来のＢ２細胞と同程度の総平均長となっている。特に、Ｎヌクレオチド挿入を担う酵素である末端デオキシリボヌクレオチド転移酵素(ＴｄＴ)の発現は成人肝臓において、研究されていなかった(Benedict等, Immunol. Rev. 175: 150-157 (2000))ので、成人肝臓Ｂ細胞がＴｄＴ-依存性の様式で肝臓において生成されるという可能性は、理論上考えられるが実際は低い。
【０１２２】
この実施例では、局所のＢ細胞機能におそらく依存している他の疾患モデルに加え、Ｂ細胞が、肝臓線維形成の発達において重要な抗体依存性の役割を果たすことが示される。また、Ｂ細胞の必須の役割は、非肥満性糖尿病(ＮＯＤ)マウスの自己免疫性糖尿病について示されている。Ｂ細胞欠失ＮＯＤ.Ｉｇμヌルマウス及びＢ細胞減少ＮＯＤマウスは膵島炎又はインシュリン依存性真正糖尿病を発達させなかった。このことからＢ細胞が自己応答性Ｔ細胞の惹起及び／又は活性化に重要であるという考えが示唆される。(Serreze等, J. Exp. Med. 184: 2049-2053 (1996)；Noorchashm等, Diabetes 46:941-946 (1997))。また、Ｂ細胞は、全身性自己免疫状態の多遺伝子性、ｆａｓ-インタクト及びｆａｓ-欠失性のＭＲＬモデルのループス腎炎に必要であることが示された。(Chan等, J. Exp. Med. 189:1639-1648 (1999)；Chan等, J. Immunol. 160:51-59 (1998)；Chan等, J. Immunol. 163:3592-3596 (1999))。両方の場合において、抗体非依存性のメカニズムはＢ細胞関与に重要であることが明らかとなった。(Chan等, J. Exp. Med. 189: 1639-1648 (1999)；Wong等, Diabetes 53:2581-2587 (2004))。
この実施例では、Ｂ細胞を本質的に欠失しているマウスを用いて、線維形成病理学的にＢ細胞関与を調べた。全体の生理機能が正常であるにもかかわらず、Ｂ細胞欠失マウスは、濾胞性樹状ネットワーク(Fu等, J. Exp. Med. 187: 1009- 1018 (1998)；Gonzalez等, J. Exp. Med. 187: 997-1007 (1998)；Endres等, J. Exp. Med. 189: 159-168 (1999))、腸パイエル板の濾胞性関連上皮(Golovkina等, Science 286:1965-1968 (1999))及びＮＫ-Ｔ細胞の非標準サブセットを欠いている。(Treiner等, Nature 422:164-169 (2003))。また、Ｂ細胞のないマウスは、ＣＤ４＋Ｔ細胞機能を欠いており(Baumgarth等, Proc. Natl Acad. Sci. USA 97:4766-4771 (2000))、おそらくいくつかの他のまだ記されていない発生上／機能的な欠損を有するであろう。ゆえに、Ｂ細胞欠失マウスにより得られた結果から、Ｂ細胞が間接的に肝臓線維形成の病因に作用することが示される。
【０１２３】
Ｔ細胞欠失マウスが肝臓線維形成の発達において全く相違を示さないので(データは未掲載)、ＣＤ４＋Ｔ細胞欠失はＪＨ-／-マウスで観察される非常に低減した肝臓線維形成を説明するものではないようである。しかしながら、マウスの肝臓に存在する(Shimamura等, FEBS Lett. 516:97-100 (2002))、変化しないＴＣＲを含有するＶα１９を発現するＢ細胞依存性ＮＫ-Ｔ細胞サブセット(Treiner等, Nature 422:164- 169 (2003))は、Ｂ細胞欠失マウスにみられる低減した線維形成に関与するかもしれない。ＮＫ-Ｔ細胞は、急速な様式で応答し、ＴＨ１及びＴＨ２の両方のタイプのサイトカインを産生する能力について知られている。(Godfrey等, J. Clin. Invest. 114:1379-1388 (2004))。このような特性によって、ＮＫ-Ｔ細胞は免疫応答調節機能に関与できる。(Godfrey等, J. Clin. Invest. 114:1379-1388 (2004))。従来のＶα１４ ＴＣＲ ＮＫ-Ｔ細胞を欠失しているＣＤ１-／-マウスの肝臓線維形成発達に違いがないことが明らかとなった(データは未掲載)。残念なことに、肝臓線維形成における標準的でないＶα１９不変ＮＫ-Ｔ細胞の役割を調べるために利用可能なマウス変異体がない。それにもかかわらず、ＲＡＧ-／-動物は、Ｂ細胞欠失マウスと同じ程度に線維形成を阻害するので、発達のために遺伝子再編成を必要とする細胞型(様々な系統のＢ及びＴ細胞)の役割を示唆する。ゆえに、総して、データから、発達のためにＢ細胞を必要とする非ＣＤ１限局性ＮＫ-Ｔ細胞(Treiner等, Nature 422:164-169 (2003))とＢ細胞自主的機能のいずれかがＣＣｌ４誘発肝毒性モデルに特徴的な線維形成に役割があることが示唆される。
【０１２４】
免疫グロブリン産生に欠陥のある２つの既に作製されたマウス系統(ＬＭＰ２ａ挿入マウス及びｍＩｇＭ-Ｔｇマウス)を用いて、抗体がＣＣｌ４誘発肝臓線維形成を発達させるために必要でないことが示された。ＬＭＰ２ａマウスは、正常なＢ細胞数を有し、分泌抗体と免疫グロブリンの表面発現の両方を欠失している。(Casola等, Nat. Immunol. 5:317-327 (2004))。ＬＭＰ２ＡはＢＣＲシグナル伝達を模倣するだけでなく、更なるシグナル伝達経路を誘発する(Ikeda等, J. Virol. 77:5529-5534 (2003)；Portis及びLongnecker, J. Virol. 77:105-114 (2003)）。したがって、導入遺伝子性表面ＢＣＲを発現し、正常なマウスと比較して３００〜５００分の１に低減した抗体力価を有する(Chan等, J. Exp. Med. 189: 1639- 1648 (1999))、ｍＩｇＭ-Ｔｇ(ＪＨ-／-)マウスにおける線維形成を評価した。両マウス系統は、コントロールと同程度に肝臓線維形成を発達させた。ゆえに、肝臓線維形成病理学でのＢ細胞の役割は抗体非依存性であるようである。これは、生物体の他の箇所に位置するＢ細胞により媒介される長期間となりうる作用に反して、局所のＢ細胞の機能(例えばサイトカイン分泌及び／又は細胞-細胞接触)により媒介されることを示唆する。従来のＴ細胞に欠陥のあるマウスがそのＷＴ相対物に類似した線維形成を示すので、Ｂ細胞に対する抗原提示の役割は肝臓線維形成において、有意な役割を果たすようではない。さらに、ＬＭＰ２ａ Ｂ細胞は、その表面上にＢ細胞レセプターを欠失しており、ＷＴマウスに類似のコラーゲン沈着を示すので、抗原結合、抗原内部移行及び抗原提示の能力を持たない。総して、これらのデータから、肝臓組織修復が、本明細書において定めるＩＨＢ細胞によって部分的に媒介されうる局所のＢ細胞機能により作用されることが示唆される。形式的に、Ｂ細胞は肝臓のクリアランスメカニズム(一又は複数)を破壊する可能性がある。しかしながら、Ｂ細胞数は肝細胞数と比較して非常に少ない。
【０１２５】
この実施例で示された結果は、ＣＣｌ４に応答する肝障害の程度が、偽手術ラットと比較した場合の脾臓摘出したラット(Chen等, Chin. Med. J. (Engl) 111: 779-783 (1998))、及び適切なコントロールと比較した場合のＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのＳＣＩＤマウスにおいて、有意により軽度であったという報告と一致する。(Shi等, Proc. Natl. Acad. ScL USA 94:10663-10668 (1997))。しかしながら、マンソン住血吸虫寄生虫により誘発される肝臓線維形成は、コントロールマウスと比較してＢ細胞欠失マウスにおいて、増加する。(Ferru等, Scand. J. Immunol. 45:233-240 (1998))。反復する肝細胞障害(ＣＣｌ４及びＡＮＩＴの場合のように)又は、低レベルの虫感染による線維形成誘発メカニズムの相違によりこの矛盾を説明できる。
また、Ｂ細胞機能は、マウス及びヒトの皮膚の線維形成と関係していた。タイト-スキン(ＴＳＫ／＋)マウス並びに全身性硬化症個体において、増大したＣＤ１９発現から生じる慢性のＢ細胞活性化により皮膚線維形成と自己免疫性が引き起こされる。(Saito等, J. Clin. Invest. 109: 1453-1462 (2002))。さらに、強皮症患者の肺組織から樹立されたＢ細胞株は、線維形成変化に至るかもしれない増大した増殖と炎症応答を示す。(Kondo等, Cytokine 13:220-226 (2001))。
つまり、この実施例は、成人肝臓Ｂ細胞群の単離及び特徴づけを記述して、直接、肝障害後の組織修復におけるＢ細胞の役割を示す。さらに、この実施例は、Ｂ細胞が線維形成状態の病理に関与することを示す。ゆえに、ここで示される結果は、Ｂ細胞アンタゴニストが線維形成状態を治療する際に有効であることを証明しうるものである。
【０１２６】
実施例２  Ｂ細胞欠失マウスモデルにおける肺線維症
序論
肺線維症は、ブレオマイシンへの曝露によって動物モデルにおいて誘発できる。齧歯動物へのブレオマイシンの気管内投与は、最も広く用いられる肺線維形成のモデルである。ブレオマイシンは、ある程度、フリーラジカルの生成及び炎症性サイトカインの誘発によって、内皮及び上皮の障害を引き起こす細胞障害性剤である。(Sleijfer, Chest 120:617-624 (2001))。線維芽細胞は活性化され、２週間までに肺に有意な線維形成及びコラーゲン沈着が生じる。この実施例において、Ｂ細胞欠失マウスは、ブレオマイシンへの持続性全身曝露の後に、同じように処置された野生型マウスと比較して生存率の向上と肺線維形成の減少を示した。
【０１２７】
材料及び方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：正常なＢ細胞機能をもつ野生型マウス、
Ｂ６.１２９Ｓ２-ｌｇｈ-６ｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊ：Ｂ細胞欠失マウス。
持続性ブレオマイシン曝露
０日目、生理食塩水(ｎ＝７、ｗｔ、ｎ＝５、ｋｏ)又は６０ｍｇ／ｋｇの用量レベルのブレオマイシン溶液(ｎ＝１２、ｗｔ、ｎ＝１０、ｋｏ)ないしは１００ｍｇ／ｋｇの用量レベルのブレオマイシン溶液(ｎ＝８、ｗｔ、ｎ＝１０、ｋｏ) (７日間かけて総用量を供給)を含有する皮下投与用７日用Ａｌｚｅｔ(登録商標)浸透圧ミニポンプを野生型マウス又はＢ細胞欠失マウスに無菌的に移植した。
測定値
体重及び臨床徴候を１か月間、モニターした。２８日目にマウスを安楽死させ、肺を取り出し、１０％の中性緩衝ホルマリンを滴下して固定した。既存のコラーゲン／線維形成を識別するためにマッソントリクロームによって肺を染色して、αアクチンについて免疫組織化学を行い、今後の線維形成の可能性の程度を同定した。コラーゲン又はアクチンにより占有される組織領域の割合を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ(登録商標)ソフトウェアを使用して組織形態計測して決定した。
【０１２８】
結果
６０ｍｇ／ｋｇ／７日のブレオマイシンの投与により、２８日目までにわずかばかりのα-アクチン蓄積が生じた。野生型及びＢ細胞ノックアウトマウスは同程度のα-アクチンレベルを示した。(図６)。
１００ｍｇ／ｋｇ／７日のブレオマイシンの投与により、２８日目までに中程度から広範囲なα-アクチン蓄積にが生じた。野生型動物は生存率の低下を示し、Ｂ細胞ノックアウトマウスより統計学的に高いα-アクチンレベルであった。(図６、７及び８)。
これらの実験結果から、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおいてＢリンパ球の欠如により肺線維形成の範囲が低減し、持続性のブレオマイシン曝露の後に生存率が向上することが示された。したがって、さらにこれらの結果から、線維形成状態、特に、肺系の線維形成状態を治療するためのＢ細胞アンタゴニストの使用が示唆される。
【０１２９】
実施例３  Ｂ細胞欠失マウスモデルにおける腎臓線維形成
序論
片側性尿管閉塞(ＵＵＯ)は、進行性組織圧迫、管状変性及び間質性及び糸球体性の線維形成を産生する閉塞性腎症のモデルである。(Miyajima等, Kidney International 55:2301-2313 (2000))。この実施例において、Ｂ細胞欠失マウスは野生型マウスと比較して、ＵＵＯに応答した腎臓線維形成が少なかった。
【０１３０】
材料及び方法
マウス
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ：正常なＢ細胞機能をもつ野生型マウス、
Ｂ６.１２９Ｓ２-ｌｇｈ-６ｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊ：Ｂ細胞欠失マウス。
片側性尿管閉塞
０日目に、ケタミン／キシラジン麻酔下にて無菌的に、野生型マウス(ｎ＝１０)又はＢ細胞欠失マウス(ｎ＝１０)の結紮間で左尿管を単離し、結紮して、切片化した。また、手術していない野生型マウス(ｎ＝５)又はＢ細胞欠失マウス(ｎ＝５)を正常なコントロールとした。
測定値
体重及び臨床徴候は、疾患が最大となるまでの１０日間の進行の間、モニターした。１０日目にマウスを安楽死させて、両腎臓を取り出し、１０％の中性緩衝ホルマリンに固定した。既存のコラーゲン／線維形成を識別するためにマッソントリクロームによって、腎臓を染色して、αアクチンについて免疫組織化学を行い、今後の線維形成の可能性の程度を同定した。コラーゲン又はアクチンにより占有される組織領域の割合を、Ｍｅｔａｍｏｒｐｈ(登録商標)ソフトウェアを使用して組織形態計測して決定した。
【０１３１】
結果
ＵＵＯの後、野生型相対物と比較して、Ｂ細胞欠失マウスはαアクチン染色が統計学的に有意に２９％減少しており(図９Ａ)、間質性コラーゲンの蓄積は統計学的に有意に６２％減少していた(図９Ｂ)。これらの病的状態が、線維形成状態の定量化及び測定のための２つの典型的なマーカーとなることは理解されるであろう。
また、ＵＵＯの後、Ｂ細胞欠失マウスは、尿細管拡張が有意に減少しており(図９Ｃ)、正常な尿細管染色が有意に増加していた(図９Ｄ)。増加した正常な尿細管染色は、障害がない場合でもＢ細胞欠失マウスに観察された(図９Ｄ、また図１０も参照)。
これらの実験結果から、Ｂリンパ球の欠如によりＵＵＯ誘発性の障害後の腎臓線維形成の範囲が減少することが示された。
複数のモデル系の実験的に誘発された線維形成障害の程度は、Ｂ細胞を欠失するマウスにおいて実質的に減少するという所見(実施例１〜３を参照)は、炎症性／線維形成病理が関与する様々な疾患徴候を治療するためのＢ細胞アンタゴニストの使用を強く支持するものである。
【０１３２】
実施例４  抗ＣＤ２０モノクローナル抗体はブレオマイシン処置によって生じる肺及び脾臓のＢ細胞の増加を抑える
序論
実施例２に示すように、肺線維形成はブレオマイシンへの曝露によって、動物モデルにおいて誘発され、そのブレオマイシン誘発性肺線維形成の程度はＢ細胞欠失マウスでは小さい。この実施例では、ブレオマイシンで処置したマウスは、その肺においてＢ細胞の増加を表し、重要なことに、Ｂ細胞のこのブレオマイシン誘発性の増加は抗ＣＤ２０抗体により治療されるマウスにおいて有意に少ないことが示された。これらの結果から、線維形成状態を治療するためのＢ細胞アンタゴニストの使用がさらに支持された。
【０１３３】
材料及び方法
この実施例では、９週齢のＣ５７Ｂ１／６雄マウスを実験に用いた。０日目に、マウスをケタミン／キシラジンの腹腔内投与によって、麻酔し、ＰｅｎｎＣｅｎｎｔｕｒｙ噴霧器を用いて５０μｌ容量ＩＴのブレオマイシン０．０２５単位を投与した。ＰｅｎｎＣｅｎｎｔｕｒｙ噴霧器は、口から気管内に挿入する。−７日目(ブレオマイシン投与の７日前)と７日目に、抗マウスＣＤ-２０モノクローナル抗体(Biogen Idec、米国特許第６０／７４１４９１号で開発され「１８Ｂ１２」と称される)及びＰＢＳのいずれかをマウスに腹腔内投与した。異なるグループのマウスにＰＢＳのみを与え(intrachacheally)、他のマウスは処置を行わなかった。
９日目に、ＣＯ２にて動物を安楽死させ、肺及び脾臓を回収した。肺及び脾臓ははさみで断片化し、次いでホモジナイズして、５０ｍｌの遠心管へ移した。４０ｍｌの氷温のＲＰＭＩ１６４０／５％ＦＢＳをチューブに添加し、４℃、３００×ｇ(標準的なローターによるＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ ８Ｒで１２００回転数／分)で１０分間遠心分離し、細胞片を沈降して減らした。ペレットは、１０ｍｌの消化培養液に再懸濁して、３７℃で４０〜６０分間置いた。
【０１３４】
リンパ球濃縮細胞群を単離するために、３０ｍｌの氷温の無血清ＲＰＭＩ１６４０を各チューブに添加して終容量４０ｍｌとした。チューブは、４℃、３００×ｇ(ＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ ８Ｒで１２００回転数／分)で１０分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを氷温の４５％パーコールを含む無血清ＲＰＭＩ１６４０に６ｍｌの終容量で再懸濁し、７０％パーコールを含むＰＢＳにより傾斜をつけて勾配を得た。
境界面を回収して、１０容量の氷温の無血清ＲＰＭＩ１６４０を添加して、チューブを４℃で４００×ｇ(ＩＥＣ Ｃｅｎｔｒａ ８Ｒで１５００回転数／分)で１０分間遠心分離した。ＣＤ５及びＣＤ１９を発現する細胞をＦＡＣＳを用いて分析した。(図１１、１２及び１３)。
【０１３５】
結果
図１１及び１３に示すように、ブレオマイシンで処置したマウスは肺のＢ細胞(ＣＤ１９＋)の増加を表し、この増加はブレオマイシンに加えて抗ＣＤ２０抗体を投与したマウスにおいて有意に減少していた。図１２に示すように、抗ＣＤ２０抗体による処置においても効果的に脾臓のＢ細胞が減少した。上記の実施例２にて強調したように、肺性線維形成は、ブレオマイシンへの曝露によって、動物モデルにおいて誘発できる。したがって、これらの結果から、Ｂ細胞アンタゴニスト、例えば抗ＣＤ２０抗体が線維形成状態の治療に有効であるという結論が支持される。
【０１３６】
実施例５  抗ＣＤ２０モノクローナル抗体はＣＣｌ４誘発性肝臓線維形成に対する保護薬である
序論
実施例１に示すように、肝臓線維形成はＣＣｌ４への曝露によって、動物モデルにおいて誘発され、そのＣＣｌ４誘発性肝臓線維形成の程度はＢ細胞欠失マウスでは小さい。この実施例では、ＣＣｌ4誘発性肝臓線維形成は、抗ＣＤ２０抗体で処置されるマウスにおいて有意に少ないことが示された。これらの結果は、線維形成状態を治療するためのＢ細胞アンタゴニストの使用をさらに証明するものである。
【０１３７】
材料及び方法
抗マウスＣＤ２０ Ｂ細胞減少抗体(Biogen Idec、米国特許第６０／７４１４９１号で開発され「１８Ｂ１２」と称される)を、化学四塩化炭素(ＣＣｌ４)を投与することにより誘発された肝臓線維形成のマウスモデルにおいて試験した。ミネラルオイルにて調製した１．７５ｍｌ／ｋｇ用量のＣＣｌ４を６週間、週に１度マウスに投与し、同時にＰＢＳ単独、２５０μｇの抗ＣＤ２０モノクローナル抗体、又は２５０μｇのアイソタイプコントロールモノクローナル抗体にて処置した(腹腔内投与)。ＣＣｌ４の初回投与の１週間前と、続くＣＣｌ４の各投与の１日前に、マウスにＰＢＳ及び抗体を注射した。６回目のＣＣｌ４投与の７日後にマウスを屠殺し、肝臓を取り出し、線維形成のマーカーである平滑筋アクチンの発現について免疫染色した。
【０１３８】
結果
図１４に示すように、抗ＣＤ２０抗体にて処置した動物の肝臓線維形成の程度(平滑筋アクチン染色により示されるもの)は、ＰＢＳを投与したコントロールマウスよりおよそ２０％少なく、コントロールモノクローナル抗体を投与した動物よりもおよそ２８％少なかった。また、この実施例は、特に肝臓の線維形成状態の発生又は進行を治療するか、遅延させるか又は予防する際への本発明の方法の適応を示す。
【０１３９】
実施例６  線維形成状態の治療方法
線維形成状態の一又は複数の症状と診断された患者をこの実施例に従って治療する。本明細書において治療される線維形成状態の例には、例えば障害／線維形成と関連する肺疾患、障害／線維形成と関連する慢性腎症(腎臓線維形成)、腸線維形成、肝臓線維形成(例えば肝硬変を含む)、頭頸部線維形成、角膜瘢痕化、血管性疾患、及び線維形成と関係する自己免疫性疾患、例えば強皮症、狼瘡及び移植片対宿主病が含まれる。
患者は、リツキシマブないしはヒト化２Ｈ７、又はリツキシマブないしはヒト化２Ｈ７の断片(例えば、Ｆａｂ、Ｆ(ａｂ').ｓｕｂ.２、Ｆｖ、ｓｃＦｖ又はダイアボディ)により治療する。
好ましくは、抗体は、以下のいずれかの投薬計画に従って患者に静脈内投与(ＩＶ)される：
(Ａ) １日目に５０ｍｇ／ｍ２、８、１５及び２２日目に１５０ｍｇ／ｍ２、
(Ｂ) １日目に１５０ｍｇ／ｍ２、８、１５及び２２日目に３７５ｍｇ／ｍ２、又は
(Ｃ) １、８、１５及び２２日目に３７５ｍｇ／ｍ２。
ＣＤ２０抗体にて治療される患者は、線維形成状態の症状の改善を表すであろう。
代替的な投薬計画においては、患者は、上記のスケジュールＡに記載のようにリツキシマブと、出典明記によって、本明細書中にその全体が援用される米国特許第６３１６６０１号に記載のαｖβ６に対する抗体により治療される。やはり患者は、線維形成状態の症状の改善を表すであろう。
他の代替的な投薬計画においては、患者は、スケジュールＢに記載のようにリツキシマブにより治療される。
患者の末梢Ｂ細胞のレベルを、対象とする臓器のコラーゲン沈着の量としてモニターする。８か月後に、患者の再構成されたＢ細胞免疫応答及び／又はコラーゲン沈着の量が予想したレベルに達するので、患者はスケジュールＡに従ってリツキシマブにて再治療される。
【０１４０】
ここで、明確に理解するために図及び実施例によっていくらか詳細に本発明を記載しているので、本発明及び本発明のいずれかの具体的な実施態様の権利範囲を侵すことなく、条件、製剤及び他のパラメーターの広く均等な範囲内で本発明を修飾又は変更することによって同じことを行うことができること、及びそのような修飾及び変更が掲げる特許請求の範囲内に包含されることを意図することは、当分野の通常の技術者に明らかであろう。
本明細書において、言及されるすべての刊行物、特許及び特許出願は、この発明が関係する当業者の技術のレベルを表すものであり、個々の刊行物、特許又は特許出願が出典明記により援用されるために具体的かつ個別に示されるのと同じ程度に、出典明記によって本明細書中に援用される。
【図面の簡単な説明】
【０１４１】
【図１Ａ】成体マウスの脾臓、腹腔(ＰＣ)及び肝臓のＢ細胞集団を示す。リンパ球は単離して、抗ＩｇＤ抗体(Ｘ軸)及び抗ＩｇＭ(Ｙ軸)にて染色した。リンパ球の中のＩｇＤ＋、ＩｇＭ＋細胞の割合をプロット線で示す。
【図１Ｂ】脾臓、血液、ＰＣ及び肝臓から単離したＢ細胞のＣＤ２１、ＣＤ２３及びＣＤ５の発現レベルを示す。
【図１Ｃ】肝性Ｂ細胞及び脾臓Ｂ細胞に結合したアネキシンＶの量を示す。
【図１Ｄ】様々な刺激に応答したときのＣＦＳＥ及びＣＤ８６(Ｂ７.２)の上方制御と肝内Ｂ細胞及び脾臓Ｂ細胞の増殖の範囲を示す。
【図２Ａ】Ｂ細胞欠失マウス(ＪＨ-／-)及び野生型マウス(ＢＡＬＢ／ｃ)の、単回ＣＣｌ４投与の２４時間後に血清に放出される肝細胞特異的酵素であるＡＬＴによって、評価した、肝障害の程度を示す。
【図２Ｂ】第６週目のオイル(コントロール)又はＣＣｌ４の何れかの投与後１週間の、Ｂ細胞欠失マウス(ＪＨ-／-)及び野生型マウス(ＢＡＬＢ／ｃ)のコラーゲン特異的な染料シリウスレッドにて染色された肝臓組織の組織学的な分析を示す。
【図２Ｃ】３回の代表的実験におけるコラーゲン特異的シリウスレッド染色(任意の単位)の量を示す。実験例１及び２(図２Ｃ)は３．５ｍｇ／ｋｇのＣＣｌ４の第６週目の投与１週間後の間質性コラーゲン沈着の範囲を示す。
【図２Ｄ】３回の代表的実験におけるコラーゲン特異的シリウスレッド染色(任意の単位)の量を示す。実験３(図２Ｄ)は１．７５ｍｇ／ｋｇのＣＣｌ４の第６週目の投与１週間後の間質性コラーゲン沈着の範囲を示す。一連のドットは１匹の動物からの一連の切片を表す。平均値を棒で示す。
【図３】単回ＣＣｌ４投与後１日目、３日目及び５日目の、Ｂ細胞欠失マウス(ＪＨ-／-)及び野生型マウス(ＢＡＬＢ／ｃ)の肝臓切片の組織学的分析を示す。アポトーシス特異的ＴＵＮＥＬ染色(上の２列)、平滑筋アクチン染色(αＳＭＡ)(真ん中の２列)又はマクロファージ特異的Ｆ４／８０染色(下の２列)の何れかに切片を用いた。
【図４Ａ】長期ＣＣｌ４処置後の、Ｂ細胞及びＴ細胞の両方を欠失しているマウス(ＲＡＧ２-／-)及び野生型マウスの、肝臓組織中のコラーゲン沈着の組織学的分析を示す。
【図４Ｂ】長期ＣＣｌ４処置後の、ＲＡＧ２-／-マウス及び野生型マウスの、肝臓組織中の間質性コラーゲン沈着の定量化を示す。
【図５Ａ】第６週目の１．７５ｍｇ／ｋｇのＣＣｌ４処置後の、エプスタインバーウイルス由来のＬＭＰ２ａタンパク質を発現しているマウス及び野生型マウスの、肝臓組織中の間質性コラーゲン沈着の定量化を示す。
【図５Ｂ】第６週目の１．７５ｍｇ／ｋｇのＣＣｌ４処置後の、表面Ｉｇを発現しているｍＩｇＭ  ｔｇマウス及び野生型マウスの、肝臓組織中の間質性コラーゲン沈着の定量化を示す。
【図６】６０ｍｇ／ｋｇ／７日又は１００ｍｇ／ｋｇ／７日の何れかのブレオマイシン投与２８日間後の、野生型「Ｂ６ＢＷＴ」(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ)及びＢ細胞欠失「Ｂ６ＢＫＯ」(Ｂ６.１２９Ｓ２-Ｉｇｈ-６ｔｍｌＣｇｎ／Ｊ)マウスのα-平滑筋アクチンの割合を示す。
【図７】１００ｍｇ／ｋｇ／７日のブレオマイシン又は生理食塩水の何れかの投与２８日間後の、野生型(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ)及びＢ-細胞欠失(Ｂ６.１２９Ｓ２-ｌｇｈ-６ｔｍｌＣｇｎ／Ｊ)マウスの肺組織の免疫組織化学分析を示す。
【図８】２８日の期間にわたる１００ｍｇ／ｋｇ／７日のブレオマイシン投与後の、野生型マウス(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、■)及びＢ細胞欠失マウス(Ｂ６.１２９Ｓ２-ｌｇｈ-６ｔｍｌＣｇｎ／Ｊ、□)のパーセント生存率を示す。
【図９】片側性尿管閉塞(Ｏｐ)に罹っている又は未処置(Ｕｎｏｐ)のＢ細胞欠失「Ｂ６Ｂｋｏ」(Ｂ６.１２９Ｓ２-ｌｇｈ-６ｔｍｌＣｇｎ／Ｊ)マウス及び野生型「Ｂ６Ｂｗｔ」(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ)マウスにおける、α-平滑筋アクチン(図９Ａ)、間質性線維形成(図９Ｂ)、拡張した尿細管(図９Ｃ)及び健康な尿細管(図９Ｄ)のパーセントを示す。
【図１０】片側性尿管閉塞(Ｏｐ)に罹っている又は未処置(Ｕｎｏｐ)のＢ細胞欠失(Ｂ６.１２９Ｓ２-ｌｇｈ-６ｔｍｌＣｇｎ／Ｊ)マウス及び野生型(Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ)マウスから得た、トリクローム染色された腎臓組織の組織学的分析を示す。
【図１１】ブレオマイシンなし(コントロール)、ブレオマイシン、ブレオマイシンと抗ＣＤ２０モノクローナル抗体にて処置されるマウスの肺のＢ細胞計数を示す。
【図１２】ブレオマイシンなし(コントロール)、ブレオマイシン、ブレオマイシンと抗ＣＤ２０モノクローナル抗体にて処置されるマウスの脾臓のＢ細胞計数を示す。
【図１３】未処置のマウス、又はブレオマイシン滴下後９日後にＢ細胞枯渇化抗ＣＤ２０モノクローナル抗体ないしはＰＢＳで処理したマウスの肺から単離したＢ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図１４】第６週目の１．７５ｍｇ／ｋｇのＣＣｌ４の処置後に、Ｂ細胞枯渇化抗ＣＤ２０抗体、アイソタイプコントロール抗体又はＰＢＳにて処置したマウスの肝臓組織における平滑筋アクチン免疫染色の定量化を示す。◆、■、△及び●は示したように処置された個々のマウスについて得られた結果を表す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
2008540678000001.app
【国際調査報告】
2008540678.tif 000043