(57)【要約】  生物学的粒子とこれを含有する液体とを、少なくとも前記生物学的粒子がフィルタによって捕捉されるように分離したい生物学的粒子の性質に合わせた多孔度のフィルタを通して垂直濾過するステップを含んで精製または分析、場合によっては診断を目的に分離する方法であって、それぞれが限られた表面積を有する少なくとも1つの基本濾過ゾーンを含むフィルタを利用し、濾過すべき液体の性質、分離すべき生物学的粒子の性質及び濾過すべき液体の容積に応じてそれぞれの基本濾過ゾーンの表面積及び基本濾過ゾーン数を選択することを特徴とする方法。
2008537485.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
生物学的粒子とこれを含有する液体とを、精製または分析、場合によっては診断を目的に分離する方法であって、前記生物学的粒子がフィルタによって捕捉されるように分離したい生物学的粒子の性質に合わせた多孔度のフィルタを通して垂直濾過するステップを少なくとも含む方法において、それぞれが限られた表面積を有する少なくとも1つの基本濾過ゾーンを含むフィルタを利用し、濾過すべき液体の性質、分離すべき生物学的粒子の性質及び濾過すべき液体の容積に応じてそれぞれの基本濾過ゾーンの表面積及び基本濾過ゾーン数を選択し、それぞれの基本濾過ゾーンが0.6 cm乃至3 cmの直径を有する円板の表面積に等しい表面積を有し、基本濾過ゾーン数を、濾過される液体の容積と濾過面積との比が40 ml/cm2未満となるように選択することを特徴とする前記方法。
【請求項２】
それぞれの基本濾過ゾーンが0.8 cm以上の直径を有する円板の表面積に等しい表面積を有することを特徴とする請求項1に記載の方法。
【請求項３】
フィルタの目が3 μm乃至100 μmであり、目の密度が3 × 103乃至5 × 106ポア/cm2であることを特徴とする請求項2または請求項3に記載の方法。
【請求項４】
濾過が0.05 バール乃至1 バールの負圧、場合によっては1 バール未満の増圧下に行われることを特徴とする請求項1から請求項3までのいずれか1項に記載の方法。
【請求項５】
濾過を行うため、基本濾過ゾーンにおける濾過残渣を分析する手段と連携するバッジを形成するフィルタを使用することを特徴とする請求項1から請求項4までのいずれか1項に記載の方法。
【請求項６】
濾過を行うため、濾過すべき液体を収容する少なくとも1つのタンクを含み、使用に先立って滅菌またはDNA、RNAまたはタンパク質を消化する酵素を除去する処理を施すことができる濾過モジュールにフィルタを構成するバッジを組み込むことを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
濾過モジュールが使い捨てであることを特徴とする請求項6に記載の方法。
【請求項８】
分離すべき生物学的粒子が細胞であることを特徴とする請求項1から請求項7までのいずれか1項に記載の方法。
【請求項９】
細胞を含有する液体の濾過に先立って、生物学的液体または細胞培地のような細胞を含有する液体試料を分離すべき細胞の濃縮及び/または希釈することによって濾過すべき液体の試料を調製することを特徴とする請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
細胞を含有する液体が血液であり、フィルタの目が5 μm乃至25 μmであることを特徴とする請求項8または請求項9に記載の方法。
【請求項１１】
生物学的粒子が繊維素、赤血球、血小板凝集体または組織破片であることを特徴とする請求項1から請求項8までのいずれか1項に記載の方法。
【請求項１２】
生物学的粒子を含有する液体が尿であり、フィルタの目が8 μm乃至100 μmであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
【請求項１３】
例えば血液、尿、腹水、髄液、乳、胸膜浸出液、子宮頚洗浄液、生検、外科的方法、口腔洗浄による採取によって得られる細胞懸濁液等の生物学的液体中の例えば、腫瘍細胞、胎児細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞、探求細胞、菌株細胞、臓器細胞、前駆物質、造血細胞の診断のための検出、または動物または植物細胞の検出を目的とする請求項1から請求項7までのいずれかに記載した方法の利用。
【請求項１４】
少なくとも1つの孔(117)を含む底部(116)によって下部を閉鎖されている少なくとも1つのコンパートメント(113)を含むタンク・ブロック(11)と；
それぞれがタンク・ブロックの孔(117)と対向する少なくとも1つの孔(152)を含むフィルタ支持スライド(15)と；
タンク・ブロックの下面(110)と支持スライドの間にクランプされるフィルタ(13)
を含むようなタイプの請求項1から請求項12までのいずれか1項に記載された方法を実施するための濾過モジュール(1)であって、
タンク・ブロック底部におけるそれぞれの孔(117)の寸法とフィルタ支持スライダにおけるそれぞれの孔(152)の寸法は、タンク・ブロック底部のにおけるそれぞれの孔とこれと連携するフィルタ支持スライダにおける孔とから成る各々の対が限られた表面積の基本濾過ゾーンを画定することであり、それぞれのコンパートメントの有効容積がコンパートメント底部に存在する基本濾過ゾーン数に比例し、基本濾過ゾーンの表面積が0.6 cm乃至3 cmの直径を有する円板の表面積に等しく、それぞれのコンパートメント(113)の有効容積とコンパートメント底部が有する孔の総表面積との比が40ml/cm2未満であることを特徴とする前記濾過モジュール。
【請求項１５】
タンク・ブロック底部の少なくとも1つの孔(117)及びこれと対応するフィルタ支持スライドの孔(152)の寸法を、対応する基本濾過ゾーンの表面積が0.8 cmの直径を有する円板の面積よりも大きいか、またはこれと等しくなるように設定したことを特徴とする請求項14に記載の濾過モジュール。
【請求項１６】
少なくとも1つのコンパートメント(113)を取外し自在な少なくとも1枚の隔壁(119)によって部分コンパートメントに区分し、少なくとも1つの部分コンパートメントが少なくとも1つの孔を含むようにすることができ、前記部分コンパートメントの容積と部分コンパートメントの底部の孔の総表面積との比が40 ml/cm2未満であることを特徴とする請求項14または請求項15に記載の濾過モジュール。
【請求項１７】
タンク・ブロック(11)の底部(110)とフィルタ(13)との間に、タンク・ブロック底部の孔(117)に対応する少なくとも1つの孔(121)を有し、この孔を少なくとも1つの突出唇状部(122)が囲む溝付きパッキン(12)をも設けたことを特徴とする請求項14から請求項16までのいずれか1項に記載の濾過モジュール。
【請求項１８】
フィルタ(13)とフィルタ支持体(15)との間に、フィルタ支持体(15)の孔(152)と対向する少なくとも1つの孔(140)を有する板状パッキン(14)をも設けたことを特徴とする請求項14から請求項17までのいずれか1項に記載の濾過モジュール。
【請求項１９】
フィルタ(13)がバッジを構成し、バッジの中央部が少なくとも1つの多孔ゾーン(131、131A、131B)を有し、バッジの周縁部がフィルタ支持体上での位置を指示する手段を含むフレーム(132)を形成することを特徴とする請求項14から請求項18までのいずれか1項に記載の濾過モジュール。
【請求項２０】
方向指示手段が直径の異なる少なくとも2つの孔(133A、133B)であり、これらの孔がフィルタ支持体(15)に設けた対応の直径を有するピン(153A、153B)と協働することを特徴とする請求項19に記載の濾過モジュール。
【請求項２１】
フィルタの少なくとも1つの中央多孔部分が、目のサイズが3 μm乃至100 μmの孔を1cm2当たり3 × 103乃至5 × 108個含むことを特徴とする請求項14から請求項20までのいずれか1項に記載の濾過モジュール。
【請求項２２】
コンパートメント(113)の上部開口を閉鎖するための少なくとも1つの栓(17)をも含むことを特徴とする請求項14から請求項21までのいずれか1項に記載の濾過モジュール。
【請求項２３】
タンク・ブロック(11)がその下部に、外方へ延びて少なくとも1本の組立用ピン(16)と協働することによってフィルタ(13)をフィルタ支持体(15)とタンク・ブロック(11)との間に固定するフランジ(111)を有し、組立用ピン(16)がタンク・ブロックのフランジよりも上方へ延びる切断可能な端部を含むことを特徴とする請求項14から請求項22までのいずれか1項に記載の濾過モジュール。
【請求項２４】
すべての部品が滅菌可能な、またはRNA、DNAまたはタンパク質を排除できる材料から成ることを特徴とする請求項14から請求項23までのいずれか1項に記載の濾過モジュール。
【請求項２５】
請求項14から請求項24までのいずれか1項に記載した濾過モジュール(1)を濾過装置に固定するための濾過モジュールの支持ブロック(2)であって、解放位置とクランプ位置との間を移動可能であり、フィルタをフィルタ支持体とタンク・ブロックとの間に固定する機能を果すことを特徴とする前記支持ブロック。
【請求項２６】
濾過モジュールが切断可能な端部(163)を有する少なくとも1本の固定ピン(16)を有する場合、フィルタが少なくとも1つの偏心輪(204)によって固定されたら少なくとも1本の固定ピンの前記端部が切断されるように前記少なくとも1つの偏心輪が構成されていることを特徴とする請求項25に記載の支持ブロック。
【請求項２７】
濾過装置の一部を構成することを特徴とする請求項25または請求項26に記載の支持ブロック。
【請求項２８】
請求項25から請求項27までのいずれか1項に記載した支持ブロックの補完手段(203)と協働することによって支持ブロックに対する濾過モジュールの方向を強制する手段(114)を含むことを特徴とする請求項14から請求項24までのいずれか１項に記載の濾過モジュール。
【請求項２９】
請求項28に記載した濾過モジュールの手段(114)と協働することによって、支持ブロックに対する濾過モジュールの方向を決定する手段(203)を含むことを特徴とする請求項25から請求項27までのいずれか1項に記載の支持ブロック。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は液体中に含まれ、そのサイズに従って分離可能な生物学的粒子を、分離すべき粒子の性質に適合させたフィルタによる垂直濾過によって分離する方法及び装置に係わる。粒子は特に精製または分析、または場合によっては診断を目的として分離される。
【背景技術】
【０００２】
特に産科の分野における非侵襲的診断方法または特に癌研究の分野における早期診断方法を開発するため、仏国特許出願第2 782 730号及び仏国特許出願第2 824 144号は患者から採取された生物学的液体中に含まれる特定の希少な細胞の検出が提案されている。提案された方法においては、特に国際公開第91/11245号パンフレットに記載されている装置のようなISETタイプの濾過装置での濾過による濃縮処理によって検出したい細胞を発見する。これらの方法は、検出すべき細胞がフィルタ上に後に分析される濾過残渣を形成するように、目のサイズまたは多孔度を設定したフィルタで特殊な処理を施した生物学的液体を濾過する。フィルタの多孔度、生物学的液体の調製及び分析方法は対象としての細胞の機能と性質に応じて選択される。
【０００３】
これらの方法は当初、品質管理のためミルク中の粒子検出を目的に考案された濾過装置を利用して開発された。濾過すべき液体及び検出すべき粒子の性質に応じて必要な対応は行われたものの、これらの方法には問題点が残されていた。特に、血液は濾過し難い。
【０００４】
この液体の濾過が目詰まりによって妨げられ、液体が利用不能な状態に陥るケースは約30％にも達する。
【０００５】
さらにまた、濾過すべき液体試料を収容するのに使用される装置に含まれるシール機構の使い勝手が極めて悪い。
【０００６】
総合的に考察して、ラボラトリーにおける実験レベルでの使用には充分な濾過信頼度であっても、規模の大きい診断目的の使用には充分とはいえない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、液体中に含まれる細胞の垂直濾過による分離、より広義には、特に診断目的の使用に適応させるように生物学的粒子をこれを含有する液体から分離する処理の信頼度を高める手段を提供することによって上記問題点を解決することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上記課題を解決するため、本発明は生物学的粒子とこれを含有する液体とを、少なくとも前記生物学的粒子がフィルタによって捕捉されるように分離したい生物学的粒子の性質に合わせた多孔度のフィルタを通して垂直濾過するステップを含んで精製または分析、場合によっては診断を目的に分離する方法であって、それぞれが限られた表面積を有する少なくとも1つの基本濾過ゾーンを含むフィルタを利用し、濾過すべき液体の性質、分離すべき生物学的粒子の性質及び濾過すべき液体の容積に応じてそれぞれの基本濾過ゾーンの表面積及び基本濾過ゾーン数を選択することを特徴とする方法を提供する。
【０００９】
それぞれの基本濾過ゾーンは0.6 cm乃至3 cmの直径を有する円板の表面積に等しい表面積を有し、基本濾過ゾーン数を、濾過される液体の容積と濾過面積との比が40 ml/cm2未満、好ましくは0.14 ml/cm2超となるように選択する。
【００１０】
好ましくは、それぞれの基本濾過ゾーンが0.8 cm以上の直径を有する円板の表面積に等しい表面積を有する。
【００１１】
好ましくは、フィルタの目が3 μm乃至100 μmであり、目の密度が3 × 103乃至5 × 106ポア/cm2である。
【００１２】
好ましくは、濾過は0.05 バール乃至1 バールの負圧、場合によっては1 バール未満の増圧下に行われる。
【００１３】
濾過を行うため、基本濾過ゾーンにおける濾過残渣を分析する手段と連携するバッジを形成するフィルタを使用する。
【００１４】
好ましくは、濾過すべき液体を収容する少なくとも1つのタンクを含み、使用に先立って滅菌またはDNA、RNAまたはタンパク質を消化する酵素を除去する処理を施すことができる使い捨ての濾過モジュールにフィルタを構成するバッジを組み込む。
【００１５】
分離すべき生物学的粒子は、例えば、細胞である。この場合、細胞を含有する液体の濾過に先立って、生物学的液体または細胞培地のような細胞を含有する液体試料を分離すべき細胞の濃縮及び/または希釈することによって濾過すべき液体の試料を調製する。
【００１６】
細胞を含有する液体がは血液であってもよく、フィルタの目が5 μm乃至25 μmである。
【００１７】
生物学的粒子は繊維素であってもよい。
【００１８】
生物学的粒子を含有する液体は尿であり、フィルタの目は8 μm乃至100 μmである。
【００１９】
本発明の方法は、例えば血液、尿、腹水、髄液、乳、胸膜浸出液、子宮頚洗浄液、生検、外科的方法、口腔洗浄による採取によって得られる細胞懸濁液等の生物学的液体中の例えば、腫瘍細胞、胎児細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞、探求細胞、菌株細胞、臓器細胞、前駆物質、造血細胞の診断のための検出、または動物または植物細胞の検出を目的として利用することができる。
【００２０】
本発明は上記方法を実施するための濾過モジュールにも係わり、この濾過モジュールは
-少なくとも1つの孔を含む底部によって下部を閉鎖されている少なくとも1つのコンパートメントを含むタンク・ブロックと；
-それぞれがタンク・ブロックの孔と対向する少なくとも1つの孔を含むフィルタ支持スライドと；
-タンク・ブロックの下面と支持スライドの間にクランプされるフィルタ
を含む。
【００２１】
この濾過モジュールにおいて、タンク・ブロック底部におけるそれぞれの孔の寸法とフィルタ支持スライダにおけるそれぞれの孔の寸法は、タンク・ブロック底部のにおけるそれぞれの孔とこれと連携するフィルタ支持スライダにおける孔とから成る各々の対が限られた表面積の基本濾過ゾーンを画定することであり、それぞれのコンパートメントの有効容積がコンパートメント底部に存在する基本濾過ゾーン数に比例する。
【００２２】
好ましくは、基本濾過ゾーンの表面は0.6 cm乃至3 cmの直径を有する円板の表面積に等しく、それぞれのコンパートメントの有効容積とコンパートメント底部が有する孔の総表面積との比は40ml/cm2未満であり、さらに好ましくは、0.14ml/cm2以上である。
【００２３】
好ましくは、タンク・ブロック底部の少なくとも1つの孔及びこれと対応するフィルタ支持スライドの孔の寸法を、対応する基本濾過ゾーンの表面積が0.8 cmの直径を有する円板の面積よりも大きいか、またはこれと等しくなるように設定する。
【００２４】
好ましくは、少なくとも1つのコンパートメントを取外し自在な少なくとも1枚の隔壁によって部分コンパートメントに区分し、少なくとも1つの部分コンパートメントが少なくとも1つの孔を含むようにすることができ、前記部分コンパートメントの容積と部分コンパートメントの底部の孔の総表面積との比が40 ml/cm2未満であり、好ましくは、0.14ml/cm2以上である。
【００２５】
好ましくは、この濾過モジュールでは、タンク・ブロックの底部とフィルタとの間に、タンク・ブロック底部の孔に対応する少なくとも1つの孔を有し、この孔を少なくとも1つの突出唇状部が囲む溝付きパッキンをも設ける。
【００２６】
好ましくは、この濾過モジュールでは、フィルタとフィルタ支持体との間に、フィルタ支持体の孔と対向する少なくとも1つの孔を有する板状パッキンをも設ける。
【００２７】
フィルタは中央部が少なくとも1つの多孔ゾーンを有し、周縁部がフィルタ支持体上での位置を指示する手段を含むフレームを形成するバッジを構成することができる。
【００２８】
方向指示手段は、例えば、直径の異なる少なくとも2つの孔であり、これらの孔がフィルタ支持体に設けた対応の直径を有するピンと協働する。
【００２９】
好ましくは、フィルタの少なくとも1つの中央多孔部分が、目のサイズが3 μm乃至100 μmの孔を1cm2あたり3 × 103乃至5 × 108個含む。
【００３０】
好ましくは、濾過モジュールがコンパートメントの上部開口を閉鎖するための少なくとも1つ栓をも含む。
【００３１】
好ましくは、タンク・ブロックがその下部に、外方へ延びて少なくとも1本の組立用ピンと協働することによってフィルタをフィルタ支持体とタンク・ブロックとの間に固定するフランジを有し、組立用ピンがタンク・ブロックのフランジよりも上方へ延びる切断可能な端部を含む。
【００３２】
好ましくは、すべての部品が滅菌可能な、またはRNA、DNAまたはタンパク質を排除できる材料から成る。
【００３３】
最後に、本発明は濾過モジュールを濾過装置に固定するための濾過モジュール支持ブロックに係わり、この支持ブロックは解放位置とクランプ位置との間を移動可能であり、フィルタをフィルタ支持体とタンク・ブロックとの間に固定する機能を果す。
【００３４】
好ましくは、濾過モジュールが切断可能な端部を有する少なくとも1本の固定ピンを有する場合、フィルタが少なくとも1つの偏心輪によって固定されると、少なくとも1本の固定ピンの端部が切断されるように少なくとも1つの偏心輪が構成されている。
【００３５】
支持ブロックは濾過装置の一部を構成する。
【００３６】
好ましくは、濾過モジュールが支持ブロックの補完手段と協働することによって支持ブロックに対する濾過モジュールの方向を強制する手段を含み、支持ブロックが濾過モジュールの対応手段と協働することによって、支持ブロックに対する濾過モジュールの方向を決定する手段を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
液体中に含まれる生物学的粒子を分離する本発明の方法は、分離すべき粒子の性質に適応させたフィルタで液体を濾過するというものである。生物学的粒子としては、細胞、赤血球、血小板凝集体、繊維素または組織破片が考えられる。濾過される液体は特に、採取後、必要に応じて濾過による分離処理を容易にする予備処理を施して得られた液体である。詳しくは後述するこの予備処理は、特に分離すべき粒子が細胞である場合、下記の処理のいずれか1つまたは2つ以上を含むのが普通である：分離すべき細胞を予め濃縮化するための化学処理、希釈、分離すべき細胞の濾過による分離を容易にする化学処理。
【００３８】
濾過すべき液体試料を用意するには、発明者らは上記条件のほかに、検出すべき細胞の分離処理の信頼度を高めるためには、濾過される液体の容積に適合する特性のフィルタを使用することが必要であるとの所見を得た。具体的には、フィルタを、それぞれが0.6 cm乃至3 cm、好ましくは0.8 cm超、さらに好ましくは0.8 cm乃至1.5 cmの直径の円の表面積に相当する表面積を有する基本濾過ゾーンに分割しなければならない。基本濾過ゾーンは例えば円板の形状を有することができる。
【００３９】
さらにまた、それぞれの基本濾過ゾーンを通過しなければならない濾過すべき液体の容積は1 ml乃至100 ml、好ましくはこの容積は8 ml乃至15 mlでなければならない。
【００４０】
従って、所与の試料を濾過するためには、濾過すべき試料の容積に比例する個数の基本濾過ゾーンをフィルタに設けた装置を利用しなければならない。
【００４１】
一般に、濾過すべき試料の容積は最初に可能であった生物学的液体の採取量によって異なり、特に分離すべき生物学的粒子の性質に応じた希釈度によっても異なる。採取容積は特に採取される液体の性質及びこの液体を採取される患者の年齢に応じてもことなる。当業者は採取される液体の性質及び採取を受ける患者に応じて採取容積を決定することができる。
【００４２】
希釈度は特に、採取された液体中から発見できる単位容積当り粒子数に応じて異なる。即ち、好ましい条件下で濾過が行われる条件として、フィルタの目詰まりを避けるために、濾過される液体の単位容積当りの分離すべき粒子数が多過ぎてはならない。また、圧倒的多数の細胞中に混在する少数の特定細胞を検出することを目的とする場合には、単位容積中の細胞数が過度に少なくなることを避けて、フィルタ上に問題の細胞が発見される確率を高くしなければならない。対象となる液体の性質及び検出すべき細胞の種類に応じてこの希釈度を決定することも当業者のよく知るところである。
【００４３】
患者からの採取対象となる生物学的試料としては、例えば、血液、尿、腹水、脳脊髄液、乳、胸膜液が考えられる：子宮頸部の洗浄液または、患者からの生物学的試料採取の結果得られるその他の液体も対象となり得る。
【００４４】
この分析方法は患者から直接採取されたのではない試料、例えば、スミアテストまたは生検またはヒトまたは動物組織の採取から行われる細胞培養の培地またはヒトまたは動物の細胞系培養の培地中から採取された試料中からの細胞検出利用にも利用できる。
【００４５】
採取された生物学的液体が血液である場合、採取量は通常、1 ml乃至20 mlであり、血液を1：5乃至1：20の比に希釈することによって濾過すべき液体の試料とし、この状態で1個乃至20個の基本濾過ゾーンで濾過する。
【００４６】
その他の液体については、採取量が5 ml乃至10 mlであり、1：2乃至1：10の比に希釈し、場合によっては全く希釈しない。特に、採取量が10 ml、希釈度が1：10である場合、これらの試料を、5個以上に達する複数の基本濾過ゾーンで濾過する。
【００４７】
検出される可能性がある細胞の種類としては特に、腫瘍形成細胞、胎児細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、神経細胞、単球細胞、株細胞、臓器細胞（肝臓、腎臓、など）、前駆物質、造血細胞が挙げられる。これらはいずれも例として挙げたものであり、対象となる細胞はこれらに制限されない。
【００４８】
濾過に先立って、密度勾配処理または対象外細胞の溶解または免疫処理またはポジティブ及びネガティブのソーティング処理、または対象細胞の増殖刺激、などによって細胞を濃縮化することができる。
【００４９】
これらの方法に制限されるものではなく、検出すべき細胞の性質に合わせて予備濃縮化の方法を選択することは当業者のよく知るところである。
【００５０】
予備選別化処理のほかに、細胞を含有する液体試料を、検出すべき細胞の性質に応じた試薬で処理することによって濾過分離処理を容易にすることもできる。
【００５１】
処理の目的として、もし生物学的試料が血液を含有するなら、赤血球を溶解して凝血を防ぐ場合があり、例えば、サポニン及びETDAを添加する。
【００５２】
濾過の目的が固定細胞の分離にある場合、例えば、ホルムアルデヒドを添加することによる有核細胞の固定が処理の目的である場合もある。この場合、処理の結果として選別化が可能になる。
【００５３】
濾過の目的が非固定細胞の分離なら、生物学的試料を、試薬や生物学的膜を一時的に固化させるような条件（例えば、ポリサッカライドやDMSOの添加、冷却など）で処理すればよい。
【００５４】
検出したい細胞の性質に応じて、最適の方法を選択化するすべは当業者の熟知するところである。
【００５５】
所期の目的に適った濾過を可能にするために希釈されたり、濃縮化されたり、試薬処理された生物学的試料を、ポリカーボネート製またはこれと等価の材料からなり、分離すべき粒子の性質に合わせた1乃至100 μmのサイズで校正された孔を有するフィルタを通して濾過する。孔のサイズは、特に腫瘍形成細胞または上皮細胞を分離する場合には、好ましくは3 μm乃至25 μm,例えば約8 μmである。
【００５６】
孔の密度は分離すべき粒子の性質に合わせて設定される。フィルタの孔の密度は好ましくは5 × 103乃至5 × 106個/cm2、よりも好ましくは5 × 104乃至5 × 105個/cm2である。
【００５７】
濾過は好ましくは0.05バール乃至1バール、より好ましくは0.1バール程度の負圧下で行う。場合によってはフィルタの上方に位置する液体を軽く加圧することによって濾過を促進することができる。但し、この加圧が1バールを超えてはならない。このような条件は細胞の分離に特に好適である。
【００５８】
本発明の方法は、例えば、診断を可能にするためまたは溶液中の要素を好条件下で分析できるように液体を精製するなどのために、生物学的液体中に混在している希少な細胞を検出することなど、種々の目的に利用することができる。
【００５９】
細胞を検出し、これを分析するのにこの方法を利用する場合、液体の濾過に使用されたフィルタは、濾過ゾーンを正しく確認し、これら濾過ゾーンと濾過された試料との関連を明らかにして再生される。この場合、フィルタは濾過ゾーンにおいて再生することができた細胞を分析するのに利用される。
【００６０】
それ自体は公知であるこれらの分析方法として、例えば下記の方法が挙げられる：細胞学的着色（ヘマトキシリン、エオシン、など）、免疫マーキング（免疫組織化学、蛍光免疫測定）、PNA、FISH（蛍光インシトゥハイブリダイゼーション法）、PRINS（登録商標）、インシトゥPCRまたはその他の分子レベルの技術、分光測定、レーザー顕微鏡的解剖に続くDNAを標的とする分子分析（DNAの抽出、遺伝子型、量的PCR、突然変異の分析、CGH（比較ゲノム・ハイブリダイゼーション））、RNA（転写物のPCRによる抽出及び分析、量的PCR）及びタンパク質（タンパク質の抽出、ミクロシーケンシング、など）。
【００６１】
分子分析を実施する際には、フィルタに捕捉され、サザーン方法に似た方法でプレートに移し、フィルタからまたはプレートから所定の基準（それぞれ異なる性質がマーキングされている、またはマーキングされていない細胞の形態的特徴）に従って個々に顕微鏡解剖されて予備濃縮された細胞を、個別にまたはまとめて分子分析すればよい。
【００６２】
細胞はDNA、RNA及びタンパク質の抽出及び分析を可能にする適当なバッファで洗浄することによってフィルタから離脱させることもできる。
【００６３】
濾過によって分離された要素は顕微鏡で検査されることになるが、フィルタ上に得られる画像の分析は手動で、または自動手段、特に画像分析装置を利用して行うことができる。
【００６４】
分析したいDNAまたはRNAまたはタンパク質を溶液中に含有する例えば尿のような生物学的液体の精製にもこの方法を利用することができる。液体精製の目的は、この液体中に存在して分析を混乱させる恐れがあるすべての生物学的粒子を除去することにある。この場合、フィルタは保存されず、分析されるのは濾過された液体である。
【００６５】
試料調製方法及び分析方法と同様にこの濾過方法は上述したように、場合によって混在する極微量の特定細胞と関連する病因を検出する診断を目的に利用できる。特に、外科手術中に患者の血液中に放出された癌細胞を検出すのに利用できる。発見することによって何らかの病因を検知できる細胞は当業者の知るところである。
【００６６】
特に病院または医学分析ラボにおいて、信頼度の高い条件下でこのような分析が行うには、使用される装置が高い再現性と分析実施条件の高い信頼度を保証するものであることが望ましい。そのため、発明者は信頼度の高い条件下でこの分析を実施するのに好適な装置を開発した。
【００６７】
この装置を以下に説明する。
【００６８】
本発明をより詳細に、但し限定されることなく添付の図面について以下に説明する。
【００６９】
信頼度の高い条件下で分析を実施するため、濾過すべき液体が図1に参照番号1で示す好ましくは使い捨ての濾過モジュールに収容され、この濾過モジュール1が参照番号2で示す支持ブロックに取り付けられる。これらは（図面では全体が図示されていない）濾過機の構成部分である。
【００７０】
濾過を行うため、濾過モジュール1を支持ブロックに載置する。濾過が終了すると、濾過モジュール1を支持ブロック2から抜き取り、濾過モジュールからフィルタを取り除き、後述するように分析を行う。
【００７１】
図2に分解図で示す濾過モジュール1は上方から下方へタンク・ブロック11、溝付きパッキン12、フィルタ13、板状パッキン14及びフィルタ支持スライド15を含む積重体から成る。
【００７２】
フィルタ支持スライド15によってタンク・ブロック11の下面110にフィルタ13を被せ、フィルタ13とタンク・ブロック11との間の密封性を溝付きパッキン12で、フィルタ13とフィルタ支持スライド15との間の密封性を板状パッキン14でそれぞれ確立する。
【００７３】
これらの構成部分を組立てる時、フィルタ支持スライドの孔151を貫通し、タンク・ブロック11の下方フランジ111に設けた孔112と咬合して外方へ延びる2本の組立用ピン16によってフィルタ支持スライドをタンク・ブロック11と密着状態に保持する。
【００７４】
プラスチック材から成るタンク・ブロック11は、上部115において開口し、下部において直径が0.6 cm乃至2 cmの複数の円孔117を有する底部116によって閉鎖されている2つのコンパートメント113に区分された本体114を含む。底部はカラーを形成するフランジ111をも含み、カラー部分にはタンク・ブロックの両側縁に沿って組立用ピン16のフックと咬合する孔112が設けられている。コンパートメント113は取外し自在な栓17によって上部を閉鎖することができる。それぞれのコンパートメントの底部と隔壁との交差する隅部は濾過すべき粒子の滞留ゾーンが形成されないように丸みを持たせてある。
【００７５】
図3B から明らかなように、コンパートメント113には、コンパートメント113を容積の小さいコンパートメント部分に区分することを可能にする分離プレート119を嵌入させるための垂直溝118を含むことができる。溝118は分離プレート119が必ず2つの円孔117の間に位置するように設ける。
【００７６】
濾過が適正に行われるように、コンパートメントの容積を円孔117の個数に比例させ、コンパートメントの総容積、より正確にはコンパートメントが収容できる液体の最大量を0.14 ml/cm2乃至40 ml/cm2にコンパートメント底部に設けた円孔の面積総和を乗じた値となるように設定する。特に、コンパートメントの高さ及び底部の断面積を、上記条件がコンパートメント全体に当てはまるだけでなく、取外し自在な1枚または2枚以上の密閉隔壁によって区分される個々の部分コンパートメントにも当てはまるように設定する。特に、1つの円孔117が、2枚の、または1枚の取外し自在な可動隔壁119及びコンパートメント隔壁によって隔離され、その結果底部に円孔117が1つしか存在しないようになった場合、円孔117の上方に存在する容積を、最大限20 mlの濾過すべき液体を収容できるように設定する。例えば、それぞれのコンパートメントは110 mlの容積を有し、底部に5個の円孔を有することができる。
【００７７】
図8に示す変更実施態様においては、タンク・ブロック11は5個の基本濾過ゾーンを含むコンパートメント113、1個の基本濾過ゾーンを含むコンパートメント113A及びそれぞれ2個ずつの基本濾過ゾーンを含む2つのコンパートメント113Bを有する。それぞれのコンパートメントは取外し自在な栓17、17A、17Bを有する。この構成では、選択される基本濾過ゾーンを1乃至10に選択することができる。
【００７８】
タンク・ブロックの下面110には（図示しないが)直径の異なる2つの孔が対角線上に形成されており、これがフィルタ支持スライド15のピン153A及び153Bと協働することによってタンク・ブロックの底部に対するフィルタの位置を正確に整合させる。
【００７９】
タンク・ブロックの真下に配置される溝付きパッキン12は、タンク・ブロックの底部に設けた円孔117と整合する複数の孔121を有するシリコン成形パッキンであり、これら孔121は密封性を確実にする円形の唇状部、好ましくは二重の唇状部122に囲まれている。パッキンにはまた1列目の孔と2列目の孔とを分離する長手方向溝123を設けることによって、タンク・ブロックの第1コンパートメントと対向する孔と第2コンパートメントと対向する孔とを確実に分離することができる。このパッキンはそれぞれの孔を互いに隣接する孔と完全に遮断することにより、個々の孔を通過する液体が他の孔を通過する液体と混ざり合うのを防ぎ、2種類の異なる液体を同時に濾過することを可能にする機能を果す。突出する唇状部122は、場合によっては123も、タンク・ブロック11の下部と協働するパッキンの側124に形成される。フィルタ13と協働するパッキンの第2の側は平坦である。
【００８０】
ほぼ矩形のバッジ片を形成する扁平なフィルタ13は、100 μmの厚さと方法に適した多孔率を有するポリカーボネート細孔膜から成る中央濾過ゾーン131を含む。この中央部はバッジ片を固定すると共に参照データの記入に利用されるPVC製のフレーム132に生物学的接着剤を介して固定される。フレーム132はバッジ片の対角線上に位置する直径の異なる2つの孔133A及び133Bから成るバッジ片位置決め及び方向整合手段を含み、この２つの孔133A及び133Bはフィルタ支持体のピン153A及び153Bと協働する。整合用の孔133A及び133Bをこのように配置したから、孔133A及び133Bと補完関係にある整合ピンを有する支持体にバッジ片を配置する際の方向性は唯1つに限定される。従って、バッジ片を分離モジュールに配置する際にも、顕微鏡の下で着色又は観察するような分析装置に取り付ける際にもバッジ片を極めて正確に方向決定することができる。
【００８１】
図9に示す変更実施例では、バッジ片が互いに平行に配置され、多孔率の異なる膜から成る2つの中央濾過ゾーン131A、131Bを含む。
【００８２】
板状パッキン14は、溝付きパッキンの孔121及びタンク・ブロックの底部に設けられた孔117と対応する円孔140を有するシリコン製の扁平な板状パッキンである。フィルタの孔133A及び133Bと対応する直径の異なる孔141A及び141Bをも有する。
【００８３】
フィルタ支持スライド15は、フィルタとパッキンの集合体をタンク・ブロック11の下面110にクランプする上面150を含む射出成形されたプラスチック材から成る板である。このフィルタ支持スライドは、対応する板状パッキンの孔140、溝付きパッキンの孔121及びタンク・ブロックの孔117とそれぞれ整合する一連の孔152を含む。
【００８４】
フィルタ支持スライドの上面150は、フィルタ・バッジ13の整合用の孔133A及び133B、板状パッキン14の対応孔141A及び141B、及びタンク・ブロックの下面110に設けたセンタリング用の孔とそれぞれ協働するピン153A及び153Bをも有する。
【００８５】
図5Bから明らかなように、濾過された液体を通過させる孔152は漏斗状の上部と、下方へ延びてフィルタ支持スライド15の下面155から突出する短管154とから成る。フィルタ支持スライドの下面155から突出する短管154の機能は、濾過後の液体が円滑に流動して液滴を形成せず、従って、フィルタ支持体の下面が濡れないようにすることにある。尚、孔152の上部の直径は板状パッキンの孔140や溝付きパッキンの孔151の直径と同様に、タンク・ブロックの底部に設けた孔117の直径とほぼ同じであり、これによって、フィルタ上に対応の直径を有する基本濾過ゾーンが画定される。フィルタ支持スライド15はまたその両側縁に組立用ピン16を取り付けるための孔151をも有する。これらの孔151は濾過モジュール全体を組み付ける際に組立用ピンを導入して全体を位置固定できるような形状を有する。
【００８６】
組立用ピン16は、それぞれヘッド161と、その上方に延びる小直径軸部162と、フック163を形成する軸部の上端とから成る。組立用ピンの長さはフィルタ支持スライド、パッキン及びフィルタから成る積重体をタンク・ブロックに組み付ける際に、この積重体をクランプできるように寸法設定される。即ち、フィルタ支持スライドの孔151に挿通すると、タンク・ブロック11の下方フランジの孔112を貫通し、組立用ピンの端部に位置するフック163がタンク・ブロックのフランジ111の上面と咬合し、組立用ピン16のヘッド161がフィルタ支持スライド15の下面と協働してフィルタ支持スライドをタンク・ブロック11の底部にクランプされた状態に保持するのに充分な長さに組立用ピンを寸法設定する。
【００８７】
以上に述べた濾過モジュールは濾過作業中、濾過ブロック下面の孔全体と向合う中央開口201を含む当接面200と濾過モジュールの下部を支持ブロックの面200にクランプすると共にタンク・ブロック11をフィルタ支持スライだ15にクランプする2つの偏心輪204（図面では1つだけを示す）を操作するため軸203を中心に枢動するレバー202を有する濾過モジュール支持ブロック2に取り付けられる。
【００８８】
図8に示す好ましい実施例では、タンク・ブロックの下方フランジ111及び、場合によってはフィルタ支持スライだ15は一方の端部に、支持ブロック2の滑り溝204の拡張部203と協働して濾過モジュールの台座部分を嵌入させる拡張部114を含む。この構成は支持ブロックに対する濾過モジュールの適正な方向を確保することができる。
【００８９】
濾過モジュール1を支持ブロック２に組み付けると、偏心輪がタンク・ブロック11のフランジ111と対向し、レバーが開放位置に来ると、偏心輪がフランジ111から離脱して支持ブロックの上面を摺動し、レバーがクランプ位置に来ると、偏心輪がタンク・ブロック11のフランジ111と強く当接し、濾過ブロック、フィルタ、フィルタ支持体、及び連携するパッキンから成る集合体を濾過モジュール支持体の面200にクランプする。
【００９０】
それぞれの偏心輪は外方へ突出するパレット205をも含み、濾過モジュールのフランジがクランプされるとパレット205がフックを折るように対応の組立用ピン16の端部と協働し、クランプ完了と同時に組立用ピンのフックが折れる。このように構成されているから、濾過モジュールが偏心輪を介して支持ブロック2にクランプされると、集合体がクランプ手段によって保持され、偏心輪を緩めると、フックのヘッドが折れ、フィルタ支持ブロック及びタンク・ブロックは図7に示すように最早一体ではなくなる。従って、フィルタを取外すことができ、これと同時に、濾過モジュールを別の分析に使用できなくなる。即ち、濾過モジュールは使い捨てである。
【００９１】
切断可能なフックを含まないブロックを利用することもできる。このようなブロックは繰返し使用するのに利用でき、使い捨てよりも信頼度は低いが、場合によっては有利な点もある。
【００９２】
いずれも場合にも、使用前に濾過モジュールを上方栓で閉鎖し、滅菌する。分析用の試料を濾過したい場合には、滅菌された濾過モジュールを濾過装置の支持ブロックに取り付ける。クランプ・レバーによって濾過モジュールを濾過装置に固定して、フィルタ支持プレートをタンク・ブロックの底部に固定する。このように操作しながら、モジュールが使い捨ての場合には、組立用ピンのフックを含む端部を折る。次いで、コンパートメントの少なくとも1つに濾過すべき液体を導入するが、その場合、それぞれのコンパートメントにおいて、充填される液体とコンパートメント底部の孔の総表面積との比が0.14乃至40 ml/cm2となるようにする。そして、濾過が実行される。濾過が終了したら、クランプ・レバーを起こしてシステムをクランプを解除し、濾過モジュールを取外す。
【００９３】
この濾過モジュールにおいて、フィルタ支持プレートによって構成されている下方部分をタンク・ブロックから取外す。集合体を分解したら、次にフィルタを取外して観察用顕微鏡のステージに載置する。この場合、必要ならば、フィルタによって捕捉された細胞を観察し易いように試薬によって種々の予備処理を施す。
【００９４】
装置の残り部分、即ち、タンク、フィルタ支持体及びパッキングは再使用されないように廃棄する。使い捨て装置の長所は分析の安全性が確保されることにある。即ち、同じ装置が1回の採取試料の分析にだけ使用されるから、採取試料が同じ装置で分析された先行の採取試料によって汚染されるリスクが完全に避けられる。また、タンク底部に設けられる孔及びタンクの高さの幾何的特徴に照らして、装置によって濾過される液体の量は、フィルタの基本濾過ゾーンのそれぞれで濾過される量が信頼度の高い結果をもたらすべく本発明の濾過方法によって課せられる条件に適応する量となる。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】濾過モジュール支持ブロックと共に濾過モジュールを示す斜視図である。
【図２】濾過モジュールの分解斜視図である。
【図３Ａ】濾過モジュールのタンク・ブロックの断面図である。
【図３Ｂ】濾過モジュールのタンク・ブロックの断面図である。
【図４】溝付きシール接合部を一部断面で示す斜視図である。
【図５Ａ】フィルタ支持プレートを一部断面で示す斜視図である。
【図５Ｂ】フィルタ支持プレートを一部断面で示す斜視図である。
【図６Ａ】支持ブロックに載置された濾過モジュールの斜視図である。
【図６Ｂ】濾過モジュールの支持ブロックに載置された濾過モジュール底部の締付け手段の拡大斜視図である。
【図７】タンク・ブロックがフィルタを含むフィルタ支持プレートから分離されている、使用後の濾過モジュールの分解斜視図である。
【図８】濾過モジュールの他の実施例を示す斜視図である。
【図９】バッジフィルタの斜視図である。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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