(57)【要約】  本発明は、固相合成法及びポストアセンブリ液相合成法の組み合わせによる、Ｃ末端アミド誘導体であるペプチドの調製のための方法に関する。Ｃ末端誘導体であるペプチドは、酢酸ペプチドへと更に変換される。本発明は、純粋な酢酸ペプチド及び保護ペプチド誘導体にも関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）保護又は非保護の、Ｃ末端において超酸性不安定型樹脂に結合したアミノ酸を調製すること； 
ｂ）当該アミノ酸を、カップリング試薬の存在下で、保護又は非保護の別のアミノ酸とカップリングすること；
ｃ）段階ｂ）を繰り返して、ペプチドを得ること、ここで、当該ペプチドは、樹脂からの切断の際にペプチド上に残る少なくとも１つの保護基で保護される；
ｄ）弱酸性溶液と混合することにより、樹脂から当該保護ペプチドを切断すること；及び
ｅ）段階ｄ）で得られた保護ペプチドを適切なアミンでアミド化すること
を含んで成る、Ｃ末端アミド誘導体であるペプチドを調製する方法。
【請求項２】
段階ｅ）のアミド化が、塩基の存在下である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
塩基がジイソプロピルエチルアミンである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
超酸性不安定型樹脂が、クロロトリチル樹脂、Ｒｉｎｋ酸樹脂、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴ樹脂、及びＨＭＰＢ−ＡＭ樹脂から成る群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
カップリング試薬が、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＢＴＵ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
段階ｄ）の弱酸性溶液が、有機不活性溶媒中の約０．１％〜約５％のＴＦＡ、又は酢酸のトリフルオロエタノール及びＤＣＭとの混合物を含んで成る溶液である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
段階ｄ）で得られる樹脂に結合した保護ペプチドを、段階ｅ）の前に単離する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
単離が、沈殿、結晶化、抽出、又はクロマトグラフィーによる、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
単離が、沈殿による、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
段階ｄ）で得られる保護ペプチドが、配列：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１）を有するアミノ酸から成る保護ロイプロリド前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
配列：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１）を有するアミノ酸から成る保護ロイプロリド前駆体。
【請求項１２】
段階ｅ）のアミド化が、段階ｄ）で得られた保護ペプチドを、ＤＭＦ中のエチルアミン及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、配列：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１）を有するアミノ酸から成る保護ロイプロリドを得ることを含んで成る、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
ａ）保護ロイプロリドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；
ｂ）ＭＴＢＥを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るロイプロリドの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１）；及び
ｃ）ロイプロリドを単離すること
を更に含んで成る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
段階ｄ）で得られる保護ペプチドが、配列：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号４）を有するアミノ酸を含んで成る保護ゴセレリン前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
配列：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号４）を有するアミノ酸から成る保護ゴセレリン前駆体。
【請求項１６】
段階ｅ）のアミド化が、段階ｄ）で得られる保護ペプチドを、ＤＭＦ／水中のセミカルバジド及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、配列：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＨＮＮＨＣＯＮＨ２（配列番号４）を有するアミノ酸から成る保護ゴセレリンを得ることを含んで成る、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）保護ゴセレリンを、水素化分解条件下で処理すること；
ｂ）ＭＴＢＥを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るゴセレリンの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＨＮＮＨＣＯＮＨ２（配列番号４）；及び
ｃ）ゴセレリンを単離すること
を更に含んで成る、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
段階ｄ）で得られる保護ペプチドが、配列：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２）を有するアミノ酸を含んで成る、保護トリプトレリン前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
配列：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２）を有するアミノ酸を含んで成る、保護トリプトレリン前駆体。
【請求項２０】
段階ｅ）のアミド化が、保護ペプチドを、ＤＭＦ中のアンモニア及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、配列：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号２）を有するアミノ酸から成る保護トリプトレリンを得ることを含んで成る、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
ａ）保護トリプトレリンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴと反応させること；
ｂ）ＭＴＢＥを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るトリプトレリンの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号２）；及び
ｃ）トリプトレリンを単離すること
を更に含んで成る、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
段階ｄ）で得られる保護ペプチドが、配列：Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号７）を有するアミノ酸から成る保護エプチフィバチド前駆体である、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
配列：Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号７）を有するアミノ酸から成る、保護エプチフィバチド前駆体。
【請求項２４】
段階ｅ）のアミド化が、保護ペプチドを、ＤＭＦ中のＣｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ2の存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、配列：Ｍｐａ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＨ2（配列番号７）を有するアミノ酸から成る保護エプチフィバチドを得ることを含んで成る、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
ａ）保護エプチフィバチドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴと反応させること；
ｂ）エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状エプチフィバチドの沈殿を得ること：Ｍｐａ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＨ2（配列番号７）；
ｃ）非環状エプチフィバチドを環化すること；及び
ｄ）以下の配列を有するアミノ酸から成るエプチフィバチドを単離すること：Ｍｐａ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（配列番号７）環状（１−７）ジスルフィド
を更に含んで成る、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
単離が、沈殿により実施される、請求項１３、１７、２１、及び２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
沈殿が、メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル及びそれらの混合物から成る群から選択される溶媒からである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
溶媒が、メタノール、エタノール又はアセトニトリルと混合される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
ａ）ロイプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン及びエプチフィバチドから成る群から選択されるペプチドを、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製し、同時にペプチドの対イオンを酢酸で置換し、酢酸ペプチドを得ること；及び
ｂ）酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸トリプトレリン及び酢酸エプチフィバチドから成る群から選択される酢酸ペプチドの溶液を乾燥させること
を更に含んで成る、請求項１３、１７、２１、及び２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
乾燥が、凍結乾燥又は噴霧乾燥による、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
約０．１％未満のＤ−Ｓｅｒ4−ロイプロリドを含む、酢酸ロイプロリド。
【請求項３２】
約０．２％未満のＤ−Ｈｉｓ2−ロイプロリドを含む、酢酸ロイプロリド。
【請求項３３】
約０．１％未満のＤ−ｐＧｌｕ1−ロイプロリドを含む酢酸ロイプロリド。
【請求項３４】
約０．１％以下の任意の他の不純物を含む酢酸ロイプロリド。
【請求項３５】
約０．５％未満の任意の他の不純物を含む酢酸ゴセレリン。
【請求項３６】
約０．５％未満の任意の他の不純物を含む酢酸トリプトレリン。
【請求項３７】
ＨＰＬＣ法により測定した場合に、少なくとも約９９．０％の純度を有する、酢酸ロイプロリド、酢酸トリプトレリン、酢酸ブセレリン、酢酸ゴセレリン、酢酸デスモプレシン、酢酸カルシトニン（サケ）、酢酸ランレオチド、酢酸バブレオチド、酢酸アトシバン、酢酸テルリプレシン、酢酸フェリプレシン 、酢酸オルニプレシン、酢酸バソプレッシン、酢酸オキシトシン、酢酸シンカリド、酢酸エンフビルチド、酢酸エクセナチド、酢酸エプチフィバチド、酢酸エルカトニン、ブタ酢酸セクレチン、ヒト酢酸セレクチン、及び酢酸ジコノチド、から成る群から選択される酢酸ペプチド。
【請求項３８】
請求項２９に記載の方法により生成される酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸トリプトレリン及び酢酸エプチフィバチドから成る群から選択される酢酸ペプチド、及び少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤を含んで成る、医薬組成物。
【請求項３９】
請求項２９に記載の方法により生成される酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸トリプトレリン及び酢酸エプチフィバチドから成る群から選択される酢酸ペプチドを、少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤と混合することを含んで成る、医薬製剤を調製するための方法。
【請求項４０】
医薬組成物の製造のための、請求項２９に記載の方法により生成される酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸トリプトレリン及び酢酸エプチフィバチドから成る群から選択される酢酸ペプチドの使用。
【請求項４１】
請求項１に記載のＣ末端アミド誘導体であるペプチドを得ること、得られたＣ末端アミド誘導体であるペプチドを、酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸トリプトレリン、及び酢酸エプチフィバチドから成る群から選択される酢酸ペプチドに変換することを含んで成る、酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸トリプトレリン及び酢酸エプチフィバチドから成る群から選択される酢酸ペプチドを調製するための方法。
【請求項４２】
請求項４１で得られる酢酸ペプチドを、少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤と混合することを含んで成る、医薬製剤を調製するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２００５年５月３日付けで出願された米国特許仮出願第６０／６７７，５８２号の利益を主張するものであり、引用文献により本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、Ｃ末端アミド誘導体であるペプチドを調製する方法及びその生成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
ペプチド合成は、固相合成法（ＳＰＰＳ）又は液相合成法のいずれかであることができ、一般的にＣ末端又はＮ末端から開始する。ペプチド鎖のカルボキシ末端における誘導体化により特徴付けられる、ペプチド及びペプチド模倣化合物のいくつかのグループが存在する。
【０００４】
Ｃ末端において誘導体化されたペプチドのカテゴリーの中で、医薬品の最も重要なファミリーの１つは、ＬＨ−ＲＨ類似体である。このファミリーは、様々なペプチド、例えばロイプロリド、トリプトレリン、ブセレリン、ゴセレリン、及び他の類似体から成る。
【０００５】
酢酸ロイプロリドは、天然のゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ又はＬＨ−ＲＨ）の合成非ペプチド類似体である。その化学名は、５−オキソ−Ｌ−プロリル−Ｌ−ヒスチジル−Ｌ−トリプトフィル−Ｌ−セリル−Ｌ−チロシル−Ｄ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−アルギニル−Ｎ−エチル−Ｌ−プロリンアミドであり、その一次配列は、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１）である。ロイプロリドは、その天然のホルモンより大きな可能性を有する。雄性においては、ロイプロリドは、テストステロンの産生を阻害することにより作用し、これは、前立腺癌の成長において重要な役割を果たす。雌性においては、これはエストロゲンの産生を減少させ、子宮内膜症及び子宮筋腫の対処において用いられる。子供においては、これは、思春期早発症の処置に用いられる。それは、アメリカ合衆国において、ＶＩＡＤＵＲ（登録商標）の名前の移植として、又はＬＥＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（登録商標）の名前の注射として市販されている。
【０００６】
ペプチド中のアミノ酸の小さな変更が、ペプチドの生理活性を著しく減少させることが見出された（Ｓｃｈａｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，４，（３６６（１９７２））。
【０００７】
誘導体化ペプチドの合成は、通常、固相ペプチド合成法（ＳＰＰＳ）又は液相合成法により実施される。ＳＰＰＳは、通常、誘導体化ペプチドが足場とする樹脂の使用を伴う。液相合成法は、通常、フラグメント縮合に基づいている。
【０００８】
ＳＰＰＳは、ＢＥ８４１１８０及び米国特許第４，００２，７３８号に記載されている。この手順により、保護基としてアミノ基上にｔ−ブチルオキシ−カルボニル−置換基（Ｂｏｃ−）を有するプロリンを、Ｓｔｅｗａｒｔ等の「ＳＯＬＩＤ  ＰＨＡＳＥ  ＰＥＰＴＩＤＥ  ＳＹＮＴＨＥＳＩＳ」（Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙにより１９６９年に発行）に記載されている方法を用いて、クロロメチル化ジビニルベンゼン−スチレン共重合体（メリフィールド樹脂）との結合によりエステル化する。この合成は、自動合成装置において連続的に継続して、Ｂｏｃ化学を所望の非ペプチドの合成に適用する。Ｂｏｃ基の脱保護は、４Ｎの塩酸／ジオキサンによりなされた。カップリングは、２．９倍過剰のジクロロメタン中のジシクロヘキシルカルボジイミドの使用により達成された。最後に、この手順により得られたペプチド樹脂は、２００ｍｌの５％のトリエチルアミン／メタノール中に懸濁し、そこに、１００ｍｌの蒸留エチルアミンを添加した。２４時間後に、樹脂をろ過により除去し、溶液を蒸発させて固体を得た。この固体を、氷酢酸中に溶解し、シリカゲルカラム上で精製し、３−保護非ペプチドを得た（Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、及びＡｒｇにおいて保護基を有する）。最後の脱保護は、無水フッ化水素により実施した。粗生成物を、最後に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５カラム上のクロマトグラフィーにより精製した（Ｐｈａｒｍａｃｉａ（Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）により市販）。
【０００９】
ＳＰＰＳの別の例は、米国特許第４，００５，０６３号に見出される。
【００１０】
一般的に、ペプチドは、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ，８５，２１４９（１９６３）においてＭｅｒｒｉｆｉｅｌｄにより記載されたＳＰＰＳを用いて作製することができる。より具体的には、Ｎ保護プロリンは、クロロメチル化ジビニルベンゼンスチレン共重合体にエステル化される。脱保護後、イミノ−Ｎ上の不安定な保護基を有するＮγ保護アルギニンは、プロリンエステルの遊離イミノ基に結合し、脱保護後に、カップリングと脱保護段階のこの順序は、所望のペプチドの配列中の他のアミノ酸を用いて繰り返される。全てのアミノ酸は、化学式でＤ−アミノ酸として同定されるアミノ酸を除いて、Ｌ型で用いられる。全てのこれらのアミノ酸が、保護基を有するアルギニン、チロシン、セリン及び任意にヒスチジンにより、上記の配列で結合された後、非ペプチドは、エステル交換／アンモノリシスにより樹脂から除去され、それにより樹脂結合は、エチルアミド末端により置換される。その後、既知の方法による処理は、全ての保護基を除去し、実質的に純粋な形態で且つ許容される収率においてペプチドを生成する。
【００１１】
欧州特許出願ＥＰ０５１８６５６Ａ２は、ヒドラジンに対して不安定な結合による、樹脂上のゴセレリン配列のＳＰＰＳについて記載している。ペプチドの樹脂からの切断は、ヒドラジド誘導体を生じさせ、これはａｚａ−Ｇｌｙ末端残基に変換され得る。側鎖の保護は、以下の保護基の使用により達成され：Ｔｙｒに対するＢｒＺ、Ｈｉｓに対するＦｍｏｃ、及び６位のＤ−Ｓｅｒに対するｔＢｕ、４位のＳｅｒの保護を回避する。
【００１２】
別の欧州特許出願ＥＰ０５１８６５５Ａ２は、ＡｚａＧｌｙ基礎単位をあらかじめ組み込んだ樹脂により出発するＳＰＰＳについて記載している。４位のＴｙｒ及びＳｅｒ側鎖に対する非保護が用いられる。最終的なペプチドは、ヒドラジンにより処理され、遊離の形態で組み込まれるアシル化アミノ酸側鎖を有する可能な副生成物を加水分解する。
【００１３】
欧州特許出願ＥＰ１１７９５３７は、別の酸処理により後に除去され得る側鎖保護基を保持しながら、ペプチドを樹脂から除去することができるように、超酸性不安定型保護基及び別のタイプの超酸性不安定型樹脂を順次用いて実施される、ペプチド配列のＳＰＰＳについて記載する。アザ−グリシン又はエチルアミンのようなＣ末端基は、標準的なアミド形成方法により、保護ペプチド鎖に結合される。この方法の主な不利点は、固有の高価な保護ストラテジーを適用する必要があることである。
【００１４】
別の方法論は、国際公開公報ＷＯ９９／０７８７４に記載されているフラグメント縮合に基づいた液相合成法である。この方法により、必要とされるペプチドは、以下の一般式ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−ＯＲ1により表されるペプチドフラグメント（式中、Ｒ1は、低級アルキルを表す）を、以下の一般式Ｈ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｘ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｙにより表される別のペプチドフラグメントと、キモトリプシン又はキモトリプシン様酵素の存在下で反応させることにより得ることができる。
【００１５】
別のバリエーションのラグメント縮合方法は、米国特許第４，００８，２０９号に開示されている。この特許においては、非ペプチドアミド誘導体は、試薬（Ａ）−−Ｌ−ピログルタミン酸又はＮ末端にピログルタミン酸単位（すなわち、（Ｐｙｒ）Ｇｌｕ−）を有するペプチドフラグメントであって、同時に、そこから所望のアミノ酸配列を含んで成るものを、試薬（Ｂ）−−非ペプチドアミド誘導体のバランスに対応するアミン成分と縮合する方法により生成され、２つの試薬（Ａ）及び（Ｂ）は、保護基により任意に保護され、その後、その保護基は（もしあれば）除去される。
【００１６】
同一の液相合成アプローチ（ロシア特許出願ＲＵ２０７４１９１）においては、Ｃｂｚ化学及び側鎖非保護Ａｒｇ残基を適用する、２＋［２＋（４＋１）］フラグメント化スキームにより、合成が実施される。
【００１７】
別の実施例（国際公開公報ＷＯ９７／４８７２６）においては、ペプチド鎖は、２＋４＋３フラグメント結合ストラテジーにより構築される。Ｃｂｚ保護化学が適用され、そして、中間体の１つは結晶化により精製され、同時に、最終的なペプチドは、イオン交換クロマトグラフィーにより精製される。
【００１８】
米国特許第４，１００，２７４号は、アルギニンに対する保護基としての−ＮＯ2、チロシンに対する保護基としての−Ｂｚｌ（両方とも、水素化分解に対して不安定である）を含む３つの予備成形フラグメントの縮合による、ゴセレリンを得る方法について記載している。この方法においては、アザグリシン残基は、Ｃ末端トリペプチドに導入され、これは、その後、Ｚ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｎ3に結合してフラグメントを得、Ｚ基が除去されたら、Ｐｙｒ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｎ3に結合して、ゴセレリンを得る。この最後の反応は、Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）に属しているものを除いた、全ての非保護の側鎖を用いて実施される。
【発明の開示】
【００１９】
発明の概要
１つの実施態様において、本発明は、以下の段階：保護又は非保護の、Ｃ末端において超酸性不安定型樹脂に結合したアミノ酸を調製すること；当該アミノ酸を、カップリング試薬の存在下で、保護又は非保護の別のアミノ酸とカップリングすること；このカップリング段階を繰り返して、ペプチドを得ること、ここで、当該ペプチドは、樹脂からの切断の際にペプチド上に残る少なくとも１つの保護基で保護される；弱酸性溶液と混合することにより、樹脂から当該保護ペプチドを切断すること；及び、得られた保護ペプチドを適切なアミンでアミド化すること、を含んで成る、Ｃ末端アミド誘導体であるペプチドを調製する方法を提供する。
【００２０】
別の実施態様において、本発明は、約０．１％未満のＤ−Ｓｅｒ4−ロイプロリドを含む酢酸ロイプロリドを提供する。
【００２１】
更に別の実施態様において、本発明は、約０．２％未満のＤ−Ｈｉｓ4−ロイプロリドを含む酢酸ロイプロリドを提供する。
【００２２】
１つの実施態様において、本発明は、約０．１％未満のＤ−ｐＧｌｕ4−ロイプロリドを含む酢酸ロイプロリドを提供する。
【００２３】
別の実施態様において、本発明は、約０．１％以下の任意の他の不純物を含む酢酸ロイプロリドを提供する。
【００２４】
更に別の実施態様において、本発明は、約０．５％未満の任意の他の不純物を含む酢酸ゴセレリンを提供する。
【００２５】
１つの実施態様において、本発明は、約０．５％未満の任意の他の不純物を含む酢酸トリプトレリンを提供する。
【００２６】
別の実施態様において、本発明は、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１）（保護ロイプロリド前駆体）を提供する。
【００２７】
更に別の実施態様において、本発明は、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号４）（保護ゴセレリン前駆体）を提供する。
【００２８】
１つの実施態様において、本発明は、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２）（保護トリプトレリン前駆体）を提供する。
【００２９】
別の実施態様において、本発明は、Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号７）（保護エプチフィバチド前駆体）を提供する。
【００３０】
更に別の実施態様において、本発明は、以下のものから成る群から選択される酢酸ペプチドを提供する：ＨＰＬＣ法により測定した場合に、少なくとも約９９．０％の純度を有する、酢酸ロイプロリド、酢酸トリプトレリン、酢酸ブセレリン、酢酸ゴセレリン、酢酸デスモプレシン、酢酸カルシトニン（サケ）、酢酸ランレオチド、酢酸バブレオチド、酢酸アトシバン、酢酸テルリプレシン、酢酸フェリプレシン 、酢酸オルニプレシン、酢酸バソプレッシン、酢酸オキシトシン、酢酸シンカリド、酢酸エンフビルチド、酢酸エクセナチド、酢酸エプチフィバチド、酢酸エルカトニン、ブタ酢酸セクレチン、ヒト酢酸セレクチン、及び酢酸ジコノチド。
【００３１】
１つの実施態様において、本発明は、本発明の方法の１つにより生成された酢酸ペプチド及び少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤を含んで成る医薬組成物を提供する。
【００３２】
別の実施態様において、本発明は、本発明の方法の１つにより生成された酢酸ペプチドを、少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤と混合することを含んで成る医薬製剤を調製するための方法を提供する。
【００３３】
更に別の実施態様において、本発明は、医薬組成物の製造のための、本発明の方法の１つにより生成された酢酸ペプチドの使用を提供する。
【００３４】
１つの実施態様において、本発明は、本発明の方法によりＣ末端アミド誘導体であるペプチドを得ること、得られたＣ末端アミド誘導体であるペプチドを以下のものから成る群から選択される酢酸ペプチド：酢酸ロイプロリド、酢酸トリプトレリン、酢酸ブセレリン、酢酸ゴセレリン、酢酸デスモプレシン、酢酸カルシトニン（サケ）、酢酸ランレオチド、酢酸バブレオチド、酢酸アトシバン、酢酸テルリプレシン、酢酸フェリプレシン 、酢酸オルニプレシン、酢酸バソプレッシン、酢酸オキシトシン、酢酸シンカリド、酢酸エンフビルチド、酢酸エクセナチド、酢酸エプチフィバチド、酢酸エルカトニン、ブタ酢酸セクレチン、ヒト酢酸セレクチン、及び酢酸ジコノチド、に変換することを含んで成る、以下のものから成る群から選択される酢酸ペプチド：酢酸ロイプロリド、酢酸トリプトレリン、酢酸ブセレリン、酢酸ゴセレリン、酢酸デスモプレシン、酢酸カルシトニン（サケ）、酢酸ランレオチド、酢酸バブレオチド、酢酸アトシバン、酢酸テルリプレシン、酢酸フェリプレシン 、酢酸オルニプレシン、酢酸バソプレッシン、酢酸オキシトシン、酢酸シンカリド、酢酸エンフビルチド、酢酸エクセナチド、酢酸エプチフィバチド、酢酸エルカトニン、ブタ酢酸セクレチン、ヒト酢酸セレクチン、及び酢酸ジコノチド、を調製するための方法を提供する。
【００３５】
別の実施態様において、本発明は、本発明の方法により得られる酢酸ペプチドを、少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤と混合することを含んで成る、医薬製剤を調製するための方法を提供する。
【００３６】
発明の詳細な説明
本明細書中で用いる場合、用語「ＡＣＮ」は、アセトニトリルを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「Ｂｏｃ」は、ｔ−ブチルオキシカルボニルを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「Ｂｚｌ」は、ベンジルを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「Ｃｂｚ」は、ベンジルオキシカルボニルを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ＤＣＭ」は、ジクロロメタンを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ＤＩＥＡ」は、ジイソプロピルエチルアミンを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ＤＭＦ」は、ジメチルホルムアミドを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ＥＤＴ」は、エタンジチオールを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「Ｆｍｏｃ」は、９−フルオレニルメトキシカルボニルを指す。 
本明細書中で用いる場合、用語「ＨＢＴＵ」は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロリン酸塩を指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ＨＯＢｔ」は、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾールを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「Ｐｂｆ」は、ペンタメチルジヒドロベンゾフランスルホニルを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ＳＰＰＳ」は、固相ペプチド合成を指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ＴＢＴＵ」は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩を指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ｔＢｕ」は、ｔｅｒｔ−ブチルを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ＴＦＡ」は、トリフルオロ酢酸を指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ＴＩＳ」は、トリイソプロピルシランを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「Ｔｒｔ」は、トリチルを指す。
本明細書中で用いる場合、用語「ＲＴ」又は「室温」は、約１８〜２５℃、好ましくは約２０〜２２℃の温度を指す。
本明細書中で用いる場合、用語「弱酸性溶液」は、ペプチドの樹脂からの切断の際に、保護基がペプチドに残るような濃度で、不活性有機溶媒中に酸を含んで成る溶液を指す。
本明細書中で用いる場合、用語「カップリング試薬」は、保護ペプチドフラグメントのカルボキシル基を活性化する任意の生成物を指す。
【００３７】
本発明は、カルボン酸Ｃ末端を有する保護ペプチドを得るための、固形担体として樹脂を用いる固相合成法（ＳＰＰＳ）、及びＣ末端のアミド化のための液相合成を組み合わせることを含んで成る、Ｃ末端アミド誘導体であるペプチドを調製するための方法に関する。本発明は、更に、保護ペプチド前駆体、及びＨＰＬＣ法により測定した場合に、少なくとも約９９．０％の純度を有する酢酸ペプチドに関する。
【００３８】
本発明の方法における全ての段階は、穏和な条件下で実施され、それにより、低含量の副生成物、高い収率及び高い純度の最終生成物を提供する。更に、本発明の方法は、標準的な市販の保護アミノ酸を必要とする。
【００３９】
本発明は、以下の段階：保護又は非保護の、Ｃ末端において超酸性不安定型樹脂に結合したアミノ酸を調製すること；当該アミノ酸を、カップリング試薬の存在下で、保護又は非保護の別のアミノ酸とカップリングすること；このカップリング段階を繰り返して、ペプチドを得ること、ここで、当該ペプチドは、樹脂からの切断の際にペプチド上に残る少なくとも１つの保護基で保護される；弱酸性溶液と混合することにより、樹脂から当該保護ペプチドを切断すること；及び、得られた保護ペプチドを適切なアミンでアミド化すること、を含んで成る、Ｃ末端アミド誘導体であるペプチドを調製する方法を提供する。
【００４０】
任意に、アミド化段階は、塩基を添加することを含んで成る。好ましくは、塩基はジイソプロピルエチルアミンである。
【００４１】
好ましくは、超酸性不安定型樹脂は、以下のものから成る群から選択される：クロロトリチル樹脂、Ｒｉｎｋ酸樹脂、ＮｏｖａＳｙｎ ＴＧＴ樹脂、及びＨＭＰＢ−ＡＭ樹脂。
【００４２】
好ましくは、カップリング試薬は、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテトラフルオロホウ酸塩（ＴＢＴＵ）である。
【００４３】
好ましくは、弱酸性溶液は、有機不活性溶媒中の約０．１％〜約５％のＴＦＡ、又は酢酸のトリフルオロエタノール及びＤＣＭとの混合物を含んで成る溶液である。
【００４４】
好ましくは、アミド化の前に、保護ペプチドは単離される。好ましくは、単離は、沈殿、結晶化、抽出、又はクロマトグラフィーによる。より好ましくは、単離は、沈殿による。
【００４５】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ロイプロリド前駆体である：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１）。好ましくは、アミド化は、保護ロイプロリド前駆体を、ＤＭＦ中のエチルアミン及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ロイプロリドを得ることを含んで成る：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ロイプロリドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；ＭＴＢＥを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るロイプロリドの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１）；及び、ロイプロリドを単離すること。
【００４６】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ゴセレリン前駆体である：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号４）。好ましくは、アミド化は、保護ゴセレリン前駆体を、ＤＭＦ／水中のセミカルバジド及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ゴセレリンを得ることを含んで成る：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＨＮＮＨＣＯＮＨ２（配列番号４）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ゴセレリンを、水素化分解条件下で処理すること；ＭＴＢＥを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るロイプロリドの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＨＮＮＨＣＯＮＨ２（配列番号４）；及び、ゴセレリンを単離すること。
【００４７】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ブセレリン前駆体である：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号３）。好ましくは、アミド化は、保護ブセレリン前駆体を、ＤＭＦ中のエチルアミン及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ブセレリンを得ることを含んで成る：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号３）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ブセレリンを、水素化分解条件下で処理すること；ＭＴＢＥを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るブセレリンの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＨＮＥｔ（配列番号３）；及び、ブセレリンを単離すること。
【００４８】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護トリプトレリン前駆体である：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２）。好ましくは、アミド化は、保護トリプトレリン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニア及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護トリプトレリンを得ることを含んで成る：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号２）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護トリプトレリンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；ＭＴＢＥを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るトリプトレリンの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号２）；及び、トリプトレリンを単離すること。
【００４９】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護デスモプレシン前駆体である：Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号５）。好ましくは、アミド化は、保護デスモプレシン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニア及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護デスモプレシンを得ることを含んで成る：Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号５）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護デスモプレシンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状デスモプレシンの沈殿を得ること：Ｍｐａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号５）（非環状デスモプレシン）；非環状デスモプレシンを環化すること；及び、以下の構造を有するデスモプレシンを単離すること：
【化１】
2008534628.tif 000002
【００５０】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護カルシトニン前駆体である：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｄ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号６）。好ましくは、アミド化は、保護カルシトニン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニア及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護カルシトニンを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号６）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護カルシトニンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状カルシトニンの沈殿を得ること：Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号６）；非環状カルシトニンを環化すること；及び、以下の配列を有するアミノ酸から成るカルシトニンを単離すること：Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号６）、環状１−７ジスルフィド。
【００５１】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護デスロレリン（Ｄｅｓｌｏｒｅｌｉｎ）前駆体である：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号８）。好ましくは、アミド化は、保護デスロレリン前駆体を、ＤＭＦ中のエチルアミン及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護デスロレリンを得ることを含んで成る：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号８）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護デスロレリンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るデスロレリンの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ；及び、デスロレリンを単離すること。
【００５２】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護フェルチレリン前駆体である：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号９）。好ましくは、アミド化は、保護フェルチレリン前駆体を、ＤＭＦ中のエチルアミン及びジイソプロピルエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護フェルチレリンを得ることを含んで成る：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護フェルチレリンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るフェルチレリンの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号９）；及び、フェルチレリンを単離すること。
【００５３】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ゴナドレリン前駆体である：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１０）。好ましくは、アミド化は、保護ゴナドレリン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ゴナドレリンを得ることを含んで成る：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号１０）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ゴナドレリンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るゴナドレリンの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号１０）；及び、ゴナドレリンを単離すること。
【００５４】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ヒステレリン（Ｈｉｓｔｅｒｅｌｉｎ）前駆体である：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１１）。好ましくは、アミド化は、保護ヒステレリン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ヒステレリンを得ることを含んで成る：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号１１）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ヒステレリンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るヒステレリンの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号１１）；及び、ヒステレリンを単離すること。
【００５５】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ナファレリン前駆体である：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１２）。好ましくは、アミド化は、保護ナファレリン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ナファレリンを得ることを含んで成る：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号１２）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ナファレリンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るナファレリンの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号１２）；及び、ナファレリンを単離すること。
【００５６】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護プラルモレリン前駆体である：Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｄ）−ＯＨ（配列番号１３）。好ましくは、アミド化は、保護プラルモレリン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護プラルモレリンを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｄ）−ＮＨ２（配列番号１３）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護プラルモレリンを、水を含むＴＦＡ溶液を含んで成る酸組成物と反応させ、エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るプラルモレリンの沈殿を得ること：Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１３）；及び、プラルモレリンを単離すること。
【００５７】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護セトロレリクス前駆体である：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ（配列番号１４）。好ましくは、アミド化は、保護セトロレリクス前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護セトロレリクスを得ることを含んで成る：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（配列番号１４）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護セトロレリクスを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るセトロレリクスの沈殿を得ること：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（配列番号１４）；及び、セトロレリクスを単離すること。
【００５８】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護テベレリクス前駆体である：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）-Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ（配列番号１５）。好ましくは、アミド化は、保護テベレリクス前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護テベレリクスを得ることを含んで成る：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（配列番号１５）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護テベレリクスを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るテベレリクスの沈殿を得ること：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（配列番号１５）；及び、テベレリクスを単離すること。
【００５９】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護アボレリン（Ａｖｏｒｅｌｉｎ）前駆体である：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＤＴｒｐ（２−Ｍｅ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１６）。好ましくは、アミド化は、保護アボレリン前駆体を、ＤＭＦ中のエチルアミンの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護アボレリンを得ることを含んで成る：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＤＴｒｐ（２−Ｍｅ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１６）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護アボレリンを、水を含むＴＦＡ溶液を含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るアボレリンの沈殿を得ること：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＴｒｐ（２−Ｍｅ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１６）；及び、アボレリンを単離すること。
【００６０】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ランレオチド前駆体である：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（配列番号１７）。好ましくは、アミド化は、保護ランレオチド前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ランレオチドを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＮＨ2（配列番号１７）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ランレオチドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状ランレオチドの沈殿を得ること：Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−ＮＨ2（配列番号１７）；非環状ランレオチドを環化すること；及び、以下の配列を有するアミノ酸から成るランレオチドを単離すること：Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−ＮＨ2環状（２−７）（配列番号１７）ジスルフィド。
【００６１】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護バプレオチド前駆体である：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−ＯＨ（配列番号１８）。好ましくは、アミド化は、保護バプレオチド前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護バプレオチドを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−ＮＨ2（配列番号１８）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護バプレオチドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るバプレオチドの沈殿を得ること：Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−ＮＨ2；非環状バプレオチドを環化すること；及び、以下の配列を有するアミノ酸から成るバプレオチドを単離すること：Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｒｐ−ＮＨ2（配列番号１８）環状（２−６）ジスルフィド。
【００６２】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護アトシバン前駆体である：Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｅｔ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号１９）。好ましくは、アミド化は、保護アトシバン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護アトシバンを得ることを含んで成る：Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｅｔ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号１９）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護アトシバンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状アトシバンの沈殿を得ること：Ｍｐａ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｅｔ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号１９）；非環状アトシバンを環化すること；及び、以下の配列を有するアミノ酸から成るアトシバンを単離すること：Ｍｐａ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｅｔ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号１９）環状（１−６）ジスルフィド。
【００６３】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護テルリプレッシン前駆体である：Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２０）。好ましくは、アミド化は、保護テルリプレッシン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護テルリプレッシンを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２０）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護テルリプレッシンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状テルリプレッシンの沈殿を得ること：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２０）；非環状テルリプレッシンを環化すること；及び、以下の配列を有するアミノ酸から成るテルリプレッシンを単離すること：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−ＧＩｙ−ＣｙＳ−ＴｙＴ−ＰｈＣ−ＧＩｎ−ＡＳｎ−ＣｙＳ（ＡＣｍ）−ＰｒＯ−ＬｙＳ−ＧＩｙ−ＮＨ2（配列番号２０）環状（４−９）ジスルフィド。
【００６４】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ランレオチド前駆体である：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２１）。好ましくは、アミド化は、保護ランレオチド前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ランレオチドを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２１）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ランレオチドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状ランレオチドの沈殿を得ること：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２１）；非環状ランレオチドを環化すること；及び、以下の配列を有するアミノ酸から成るランレオチドを単離すること：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２１）環状（１−６）ジスルフィド。
【００６５】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護オルニプレッシン前駆体である：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２２）。好ましくは、アミド化は、保護オルニプレッシン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護オルニプレッシンを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２２）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護オルニプレッシンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状オルニプレッシンの沈殿を得ること：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（ＡＣｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２２）；非環状オルニプレッシンを環化すること；及び、以下の配列を有するアミノ酸から成るオルニプレッシンを単離すること：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２２）環状（１−６）ジスルフィド。
【００６６】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護バソプレッシン前駆体である：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２３）。好ましくは、アミド化は、保護バソプレッシン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護バソプレッシンを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２３）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護バソプレッシンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状バソプレッシンの沈殿を得ること：Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２３）；非環状バソプレッシンを環化すること；及び、Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２３）環状（１−６）ジスルフィドを単離すること。
【００６７】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護オキシトシン前駆体である：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２４）。好ましくは、アミド化は、保護オキシトシン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護オキシトシンを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２４）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護オキシトシンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状オキシトシンの沈殿を得ること：Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２４）；非環状オキシトシンを環化すること；及び、以下の配列を有するアミノ酸から成るオキシトシンを単離すること：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２４）環状（１−６）ジスルフィド。
【００６８】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護シンカリド前駆体である：Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ＳＯ3Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−ＯＨ（配列番号２５）。好ましくは、アミド化は、保護シンカリド前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護シンカリドを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ＳＯ3Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号２５）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護シンカリドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るシンカリドの沈殿を得ること：Ｈ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ3Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号２５）；及び、シンカリドを単離すること。
【００６９】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護エンフビルチド前駆体である：Ｎ−アセチル−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＯＨ（配列番号２６）。好ましくは、アミド化は、保護エンフビルチド前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護エンフビルチドを得ることを含んで成る：Ｎ−アセチル−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号２６）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護エンフビルチドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るエンフビルチドの沈殿を得ること：Ｎ−アセチル−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号２６）；及び、エンフビルチドを単離すること。
【００７０】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護エルカトニン前駆体である：Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号２７）。好ましくは、アミド化は、保護エルカトニン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護エルカトニンを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号２７）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護エルカトニンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るエルカトニンの沈殿を得ること：Ｈ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号２７）；及び、エルカトニンを単離すること。
【００７１】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ヒトセクレチン前駆体である：Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＶａＩ−ＯＨ（配列番号２８）。好ましくは、アミド化は、保護ヒトセクレチン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ヒトセクレチンを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＶａＩ−ＮＨ2（配列番号２８）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ヒトセクレチンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るヒトセクレチンの沈殿を得ること：Ｈ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2（配列番号２８）；及び、ヒトセクレチンを単離すること。
【００７２】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ブタセクレチン前駆体である：Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号２９）。好ましくは、アミド化は、保護ブタセクレチン前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ブタセクレチンを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2（配列番号２９）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ブタセクレチンを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るブタセクレチンの沈殿を得ること：Ｈ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−ＶａＩ−ＮＨ2（配列番号２９）；及び、ブタセクレチンを単離すること。
【００７３】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ジコノチド前駆体である：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（配列番号３０）。好ましくは、アミド化は、保護ジコノチド前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護ジコノチドを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ2（配列番号３０）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護ジコノチドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状ジコノチドの沈殿を得ること：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（配列番号３０）；非環状ジコノチドを環化すること；及び、以下の配列を有するアミノ酸から成るジコノチドを単離すること：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（配列番号３０）（環状１−１６、８−２０、１５−２５）。
【００７４】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護エプチフィバチド前駆体である：Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号７）。好ましくは、アミド化は、保護エプチフィバチド前駆体を、ＤＭＦ中のＣｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ2の存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護エプチフィバチドを得ることを含んで成る：Ｍｐａ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＨ2（配列番号７）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護エプチフィバチドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成る非環状エプチフィバチドの沈殿を得ること：Ｍｐａ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＨ2（配列番号７）；非環状エプチフィバチドを環化すること；及び、以下の配列を有するアミノ酸から成るエプチフィバチドを単離すること：Ｍｐａ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（配列番号７）環状（１−７）ジスルフィド。
【００７５】
任意に、樹脂からの切断の後に得られるペプチドは、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護エクセナチド前駆体である：Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（配列番号３１）。好ましくは、アミド化は、保護エクセナチド前駆体を、ＤＭＦ中のアンモニアの存在下で、カップリング試薬を用いて処理し、以下の配列を有するアミノ酸から成る保護エクセナチドを得ることを含んで成る：Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＮＨ2（配列番号３１）。好ましくは、アミド化の後に、本方法は以下の段階を含んで成る：保護エクセナチドを、水を含むＴＦＡ溶液、ＴＩＳ及びＥＤＴを含んで成る酸組成物と反応させること；エーテルを添加して、以下の配列を有するアミノ酸から成るエクセナチドの沈殿を得ること：Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＮＨ2（配列番号３１）；及び、エクセナチドを単離すること。
【００７６】
好ましくは、ペプチドの単離は沈殿による。
【００７７】
好ましくは、沈殿は、以下のものから成る群から選択される溶媒からである：メチル−ｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、ジエチルエーテル、ジイソプロピルエーテル及びそれらの混合物。好ましくは、溶媒は、メタノール、エタノール又はアセトニトリルと混合される。
【００７８】
好ましくは、ペプチドの単離の後、本方法は、更に以下の段階を含んで成る：以下のものから成る群から選択されるペプチド：ロイプロリド、ゴセレリン、トリプトレリン及びエプチフィバチドを、ＨＰＬＣクロマトグラフィーにより精製し、同時にペプチドの対イオンを酢酸で置換し、酢酸ペプチドを得ること；及び以下のものから成る群から選択される酢酸ペプチド：酢酸ロイプロリド、酢酸ゴセレリン、酢酸トリプトレリン及び酢酸エプチフィバチドの溶液を乾燥させること。好ましくは、乾燥は、凍結乾燥又は噴霧乾燥による。
【００７９】
好ましくは、乾燥酢酸ロイプロリドは、約０．１％未満のＤ−Ｓｅｒ4−ロイプロリドを含む。
【００８０】
好ましくは、乾燥酢酸ロイプロリドは、約０．２％未満のＤ−Ｈｉｓ2−ロイプロリドを含む。
【００８１】
好ましくは、乾燥酢酸ロイプロリドは、約０．１％未満のＤ−ｐＧｌｕ1−ロイプロリドを含む。
【００８２】
好ましくは、乾燥酢酸ロイプロリドは、約０．１％以下の任意の他の不純物を含む。
【００８３】
好ましくは、乾燥酢酸ゴセレリンは、約０．５％未満の任意の他の不純物を含む。
【００８４】
好ましくは、乾燥酢酸トリプトレリンは、約０．５％未満の任意の他の不純物を含む。
【００８５】
本発明は、約０．１％未満のＤ−Ｓｅｒ4−ロイプロリドを含む酢酸ロイプロリドを提供する。
【００８６】
本発明は、約０．２％未満のＤ−Ｈｉｓ2−ロイプロリドを含む酢酸ロイプロリドを提供する。
【００８７】
本発明は、約０．１％未満のＤ−ｐＧｌｕ1−ロイプロリドを含む酢酸ロイプロリドを提供する。
【００８８】
本発明は、約０．１％以下の任意の他の不純物を含む酢酸ロイプロリドを提供する。
【００８９】
本発明は、約０．５％未満の任意の他の不純物を含む酢酸ゴセレリンを提供する。
【００９０】
本発明は、約０．５％未満の任意の他の不純物を含む酢酸トリプトレリンを提供する。
【００９１】
本発明の別の側面は、保護ペプチド前駆体に関し、本発明は、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１）（保護ロイプロリド前駆体）も提供する。
【００９２】
本発明は、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号４）（保護ゴセレリン前駆体）も提供する。
【００９３】
本発明は、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２）（保護トリプトレリン前駆体）も提供する。
【００９４】
本発明は、Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号７）（保護エプチフィバチド前駆体）も提供する。
【００９５】
本発明は、以下のものから成る群から選択される酢酸ペプチドを提供する：ＨＰＬＣ法による決定した場合に、少なくとも約９９．０％の純度を有する、酢酸ロイプロリド、酢酸トリプトレリン、酢酸ブセレリン、酢酸ゴセレリン、酢酸デスモプレシン、酢酸カルシトニン（サケ）、酢酸ランレオチド、酢酸バブレオチド、酢酸アトシバン、酢酸テルリプレシン、酢酸フェリプレシン 、酢酸オルニプレシン、酢酸バソプレッシン、酢酸オキシトシン、酢酸シンカリド、酢酸エンフビルチド、酢酸エクセナチド、酢酸エプチフィバチド、酢酸エルカトニン、ブタ酢酸セクレチン、ヒト酢酸セレクチン、及び酢酸ジコノチド。
【００９６】
本発明は、本発明の方法により生成された酢酸ペプチド及び少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤を含んで成る医薬組成物を提供する。
【００９７】
本発明は、本発明の１つの方法により生成された酢酸ペプチドを、少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤と混合することを含んで成る、医薬製剤を調製するための方法を提供する。
【００９８】
本発明は、医薬組成物の製造のための、本発明の方法の１つにより生成された酢酸ペプチドの使用を提供する。
【００９９】
本発明は、本発明の方法によりＣ末端アミド誘導体であるペプチドを得ること、得られたＣ末端アミド誘導体であるペプチドを以下のものから成る群から選択される酢酸ペプチド：酢酸ロイプロリド、酢酸トリプトレリン、酢酸ブセレリン、酢酸ゴセレリン、酢酸デスモプレシン、酢酸カルシトニン（サケ）、酢酸ランレオチド、酢酸バブレオチド、酢酸アトシバン、酢酸テルリプレシン、酢酸フェリプレシン 、酢酸オルニプレシン、酢酸バソプレッシン、酢酸オキシトシン、酢酸シンカリド、酢酸エンフビルチド、酢酸エクセナチド、酢酸エプチフィバチド、酢酸エルカトニン、ブタ酢酸セクレチン、ヒト酢酸セレクチン、及び酢酸ジコノチド、に変換することを含んで成る、以下のものから成る群から選択される酢酸ペプチド：酢酸ロイプロリド、酢酸トリプトレリン、酢酸ブセレリン、酢酸ゴセレリン、酢酸デスモプレシン、酢酸カルシトニン（サケ）、酢酸ランレオチド、酢酸バブレオチド、酢酸アトシバン、酢酸テルリプレシン、酢酸フェリプレシン 、酢酸オルニプレシン、酢酸バソプレッシン、酢酸オキシトシン、酢酸シンカリド、酢酸エンフビルチド、酢酸エクセナチド、酢酸エプチフィバチド、酢酸エルカトニン、ブタ酢酸セクレチン、ヒト酢酸セレクチン、及び酢酸ジコノチド、を調製するための方法を提供する。
【０１００】
本発明は、本発明の方法により得られる酢酸ペプチドを、少なくとも１つの医薬として許容される賦形剤と混合することを含んで成る、医薬製剤を調製するための方法を提供する。
【０１０１】
本発明の医薬組成物の投与方法は、患者の年齢、性別、及び症状に依存して、様々な調製物において投与することができる。医薬組成物は、例えば錠剤、ピル、粉末、液体、懸濁液、エマルジョン、顆粒、カプセル、坐剤、注射用調製物（溶液及び懸濁液）などとして投与することができる。
【０１０２】
本発明の医薬組成物は、任意に、本発明において得られる酢酸ペプチド及び他の活性成分と混合することができる。更に、本発明の医薬組成物は、不活性成分、例えば希釈剤、担体、充填剤、バルキング剤、結合剤、崩壊剤、崩壊阻害剤、吸収促進剤、湿潤剤、潤滑剤、流動促進剤、界面活性剤、着香料などを含むことができる。
【０１０３】
希釈剤は、固形医薬組成物の嵩を増大させ、当該組成物を含む医薬製剤を、患者及び介護者が取り扱うのを容易にし得る。固形組成物のための希釈剤としては、例えば微結晶性セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））、超微粒セルロース、ラクトール、デンプン、アルファ化デンプン、炭酸カルシウム、硫酸カルシウム、糖質、デキストレート、デキストリン、デキストロース、第二リン酸カルシウム二水和物、第三リン酸カルシウム、カオリン、炭酸マグネシウム、酸化マグネシウム、マルトデキストリン、マンニトール、ポリメタクリル酸塩（例えば、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標））、塩化カリウム、粉末化セルロース、塩化ナトリウム、ソルビトールなどが挙げられる。
【０１０４】
製剤、例えば錠剤中に圧縮された固形医薬組成物は、機能として圧縮後に活性成分と他の賦形剤を結合させるのを助けることが挙げられる賦形剤を含むことができる。固形医薬組成物のための結合剤としては、アカシア、アルギン酸、カーボマー（例えば、カーボポール）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、デキストリン、エチルセルロース、ゼラチン、グアーガム、硬化植物油、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、メトセル）、液状グルコース、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、マルトデキストリン、メチルセルロース、ポリメタクリル酸塩、ポビドン（例えば、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）、Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標））、アルファ化デンプン、アルギン酸ナトリウム及びデンプンが挙げられる。
【０１０５】
圧縮された固形医薬組成物の、患者の胃の中における溶解速度は、当該組成物への崩壊剤の添加により増大され得る。崩壊剤としては、アルギン酸、カルボキシメチルセルロースカルシウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム（例えば、Ａｃ−Ｄｉ−Ｓｏｌ（登録商標）、Ｐｒｉｍｅｌｌｏｓｅ（登録商標））、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン（例えば、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標））、グアーガム、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、メチルセルロース、微結晶性セルロース、ポラクリリンカリウム、粉末状セルロース、アルファ化デンプン、アルギン酸ナトリム、デンプングリコール酸ナトリウム（例えば、Ｅｘｐｌｏｔａｂ（登録商標））及びデンプンが挙げられる。
【０１０６】
流動促進剤は、非圧縮固形組成物の流動性及び用量の正確性を向上させるために添加することができる。流動促進剤として機能し得る賦形剤としては、コロイド状二酸化ケイ素、三ケイ酸マグネシウム、粉末状セルロース、デンプン、タルク及び第三リン酸カルシウムが挙げられる。
【０１０７】
錠剤などの製剤が、粉末化組成物の圧縮により作製される場合、当該組成物は、穿孔器及び色素からの圧力にかけられる。いくつかの賦形剤及び活性成分は、穿孔器及び色素の表面に付着する傾向を有し、これは生成物の孔食及び他の表面のでこぼこを引き起こし得る。潤滑剤は、組成物に添加して、付着を減少させ、そして生成物の色素から放出を容易にすることができる。潤滑剤としては、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウム、モノステアリン酸グリセリン、パルミトステアリン酸グリセリン、硬化ヒマシ油、硬化植物油、鉱油、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムステアリルフマル酸塩、ステアリン酸、タルク及びステアリン酸亜鉛が挙げられる。
【０１０８】
着香料及び調味料は、製剤を、患者に対してより口当たり良くする。本発明の組成物中に含まれ得る医薬品ための一般的な着香料及び調味料としては、マルトール、バニリン、エチルバニリン、メントール、クエン酸、フマル酸、エチルマルトール及び酒石酸が挙げられる。
【０１０９】
固形及び液状組成物は、任意の医薬として許容される着色剤を用いて着色し、それらの外観を改善し、そして／或いは製品及び単位用量レベルの患者の識別を容易にすることもできる。
【０１１０】
本発明の液状医薬組成物中では、酢酸ペプチド及び任意の他の固形賦形剤は、液状担体、例えば水、植物油、アルコール、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール又はグリセリン中に溶解又は懸濁される。
【０１１１】
液状医薬組成物は、液状担体中で溶解性しない活性成分又は他の賦形剤を、組成物全体に均一に分散させるための乳化剤を含むことができる。本発明の液状組成物中で有用であり得る乳化剤としては、例えばゼラチン、卵黄、カゼイン、コレステロール、アカシア、トラガカント、ツノマタ、ペクチン、メチルセルロース、カーボマー、セトステアリルアルコール及びセチルアルコールが挙げられる。
【０１１２】
本発明の液状医薬組成物は、生成物のマウス・フィール（ｍｏｕｔｈ−ｆｅｅｌ）を改善し、そして／或いは胃腸管粘膜を被覆するために粘度促進剤を含むことができる。このような粘度促進剤としては、アカシア、アルギン酸ベントナイト、カーボマー、カルボキシメチルセルロースカルシウム若しくはナトリウム、セトステアリルアルコール、メチルセルロース、エチルセルロース、ゼラチングアーガム、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、マルトデキストリン、ポリビニルアルコール、ポビドン、炭酸プロピレン、プロピレングリコールアルギン酸塩、アルギン酸ナトリウム、ナトリウムデンプングリコール酸塩、デンプントラガカント及びキサンタンガムが挙げられる。
【０１１３】
甘味料、例えばソルビトール、サッカリン、サッカリンナトリウム、スクロース、アスパルテーム、フルクトース、マンニトール及び転化糖は、味を改善するために添加することができる。
【０１１４】
防腐剤及びキレート剤、例えばアルコール、安息香酸ナトリウム、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソール及びエチレンジアミン四酢酸塩は、貯蔵安定性を向上させるために、摂取に安全な濃度で添加することができる。
【０１１５】
本発明によると、液状組成物は、緩衝液、例えばグルコン酸（ｇｕｃｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、乳酸、クエン酸又は酢酸、グルコン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｇｕｃｏｎａｔｅ）、乳酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム又は酢酸ナトリウムを含むこともできる。用いる賦形剤及びその量の選択は、経験、並びに標準的な手順及びその分野の参考資料の考慮に基づいて、製剤科学者により容易に決定され得る。
【０１１６】
注射用（非経口）医薬組成物を調製する場合、溶液及び懸濁液は滅菌し、好ましくは血液に対して等張にする。注射用調製物は、当業界で一般的に知られた担体を用いることができる。例えば、注射用調製物のための担体としては、水、エチルアルコール、プロピレングリコール、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシル化（ｐｏｌｙｏｘｙｌａｔｅｄ）イソステアリルアルコール、及びポリオキシエチレンソルビタンの脂肪酸エステルが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、注射用調製物を等張にするのに必要な塩化ナトリウム、グルコース、又はグリセリンの量を、少しの又は全く実験せずに、容易に決定することができる。追加の成分、例えば溶解剤、緩衝剤、及び鎮痛剤を添加することができる。
【０１１７】
本発明の固形組成物としては、粉末、顆粒、凝集及び圧縮組成物が挙げられる。製剤としては、経口、口腔、直腸、非経口（例えば、皮下、筋肉内、及び静脈内）、吸入及び点眼投与に適した製剤が挙げられる。任意の所定の場合において最も適した投与は、処置する状態の性質及び重度に依存するが、本発明の最も好ましい経路は、経口である。製剤は、通常、単位投与形態で与えられ、医薬分野において周知の任意の方法で調製することができる。
【０１１８】
製剤としては、錠剤、粉末、カプセル、坐剤、サッシェ（ｓａｃｈｅ）、トローチ及びロゼンジ（ｌｏｓｅｎｇｅ）、並びに液状シロップ、懸濁液及びエリキシル剤のような固形製剤が挙げられる。
【０１１９】
本発明の製剤は、本発明の組成物、好ましくは粉末化又は粒状固形組成物を含むカプセルであることができる。そのカプセル殻は、ゼラチンから作られ、可塑剤、例えばグリセリン及びソルビトール、及び乳白剤又は着色剤を任意に含むことができる。
【０１２０】
活性成分及び賦形剤は、当業界で既知の方法により組成物及び製剤中に配合することができる。
【０１２１】
錠剤又はカプセル充填のための組成物は、湿式造粒法により調製することができる。湿式造粒法においては、いくつかの又は全ての粉末形態の活性成分及び賦形剤を混合し、その後、液体、典型的な水の存在下で更に混合し、粉末を顆粒へと凝集させる。顆粒は、選別及び／又は製粉し、乾燥させ、その後、所望の粒径に選別及び／又は選別する。顆粒は、その後、錠剤化することができ、或いは、錠剤化の前に、他の賦形剤、例えば流動促進剤及び／又は潤滑剤を添加することができる。
【０１２２】
錠剤化組成物は、通常、乾式混合により調製することができる。例えば、活性成分及び賦形剤の混合組成物は、スラッグ又はシートへと圧縮し、その後圧縮された顆粒へと粉末状にすることができる。圧縮顆粒は、その後、錠剤へと圧縮することができる。
【０１２３】
乾式造粒の代わりとして、混合組成物を、直接的な圧縮技術を用いて、圧縮製剤へと直接的に圧縮することができる。直接的な圧縮は、造粒をせずに、より均一な錠剤を生成する。直接的な圧縮錠剤化に特に良く適した賦形剤としては、微結晶性セルロース、噴霧乾燥ラクトース、リン酸二カルシウム二水和物及びコロイド状シリカが挙げられる。直接的な圧縮錠剤化における、これらの及び他の賦形剤の適切な使用は、特に直接的な圧縮錠剤の製剤化チャレンジにおける経験と技術を有する当業者に知られている。
【０１２４】
本発明のカプセル充填は、錠剤化に関して記載した任意の上記の混合物及び顆粒を含んで成ることができるが、それらは最終的な錠剤化段階にかけられていない。
【０１２５】
本発明の固形組成物は、粉末、顆粒、凝集体及び圧縮組成物を含む。製剤としては、経口、口腔、直腸、非経口（例えば、皮下、筋肉内、及び静脈内）、吸入及び点眼投与に適した製剤が挙げられる。任意の所定の場合において最も適した経路は、処置する状態の性質及び重度に依存するが、本発明の最も好ましい経路は、経口である。製剤は、通常、単位投与形態で与えられ、医薬分野において周知の任意の方法で調製することができる。
【０１２６】
本発明は、特定の実施例及び好ましい実施態様に関して記載されるが、本発明のこれらの実施例に限定されないことが理解される。従って、特許請求される本発明は、当業者に明らかであるように、本明細書中で記載される特定の実施例及び好ましい実施態様からのバリエーションを含む。
【０１２７】
装置
ＨＰＬＣ
以下のＨＰＬＣ法は、欧州薬局方（ｐｈａｒｍａｃｏｐｉａ）に従う：
ロイプロリドに対するＨＰＬＣ法：
関連物質。液体クロマトグラフィー（２．２．２９）：標準化手順を用いる。
試験溶液（ａ）。試験する物質を、移動相に溶解し、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。
試験溶液（ｂ）。１．０ｍｌの試験溶液（ａ）を、移動相で２０．０ｍｌまで希釈する。
標準溶液（ａ）。ロイプロレリンＣＲＳを、移動相に溶解し、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。
標準溶液（ｂ）。１．０ｍｌの標準溶液（ａ）を、移動相で２０．０ｍｌまで希釈する。
分離溶液。５．０ｍｌの標準溶液（ａ）を、水Ｒで希釈する。５ｍｌの当該溶液に、１００μｌの１Ｍの水酸化ナトリウムを添加し、勢いよく振盪する。オーブンの中で１００℃において６０分間加熱して、直ちに冷却し、５０μｌの希釈リン酸Ｒを添加する。勢いよく振盪する。
カラム：
−サイズ：ｌ＝０．１０ｍ、Φ＝４．６ｍｍ、
−固定相：クロマトグラフィーＲのためのオクタデシルシリルシリカゲル（３μｍ）。
移動相：約１５．２ｇのトリエチルアミンＲを、８００ｍｌの水Ｒに溶解し、リン酸ＲでｐＨ３．０に調整し、１０００ｍｌの水Ｒで希釈する。８５０ｍｌのこの溶液を、２倍量のプロパノールＲと３倍量のアセトニトリルＲの１５０ｍｌの混合物に添加する。
流速：１．０〜１．５ｍｌ／分。
検出：２２０ｎｍにおける分光光度計。
注入：２０μｌの試験溶液（ａ）及び分離溶液。
実行時間：９０分。
ロイプロレリンに関する保持比（保持時間＝４１〜４９分）：
不純物Ｅ＝約０．７；不純物Ｆ＝約０．７；不純物Ｈ＝約０．７８；
不純物Ａ＝約０．８；不純物Ｂ＝約０．９；不純物I＝約０．９４；
不純物Ｊ＝約１．０９；不純物Ｃ＝約１．２；不純物Ｇ＝約１．３；
不純物Ｋ＝約１．３１；不純物Ｄ＝約１．５。
系適合性：分離溶液：
−分離：不純物及びロイプロレリンによるピークの間の１．５分。
限界：
−不純物Ｄ：最大１０パーセント、
−不純物Ａ、Ｂ、Ｃ：各不純物に対して、最大０．５パーセント、
−任意の他の不純物：各不純物に対して、最大０．５パーセント、
−合計：最大２．５パーセント、
−無視限界：０．１パーセント。
【０１２８】
ゴセレリンに対するＨＰＬＣ法
関連物質。液体クロマトグラフィー（２．２．２９）。
試験溶液。試験する物質を水Ｒに溶解し、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。
標準溶液（ａ）。ゴセレリンＣＲＳのバイアルの内容物を、水Ｒに溶解し、１．０ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。
標準溶液（ｂ）。１．０ｍｌの試験溶液を、水Ｒで１０ｍｌに希釈する。
標準溶液（ｃ）。１．０ｍｌの試験溶液を、水Ｒで１０．０ｍｌに希釈する。
分離溶液（ａ）。４−Ｄ−Ｓｅｒ−ゴセレリンのバイアルの内容物を、水Ｒに溶解し、０．１ｍｇ／ｍｌの濃度を得る。等しい体積の当該溶液と標準溶液（ｃ）を混合する。
分離溶液（ｂ）。ゴセレリン有効性混合物ＣＲＳのバイアルの内容物を、１．０ｍｌの水Ｒで溶解する。
カラム：
−サイズ：ｌ＝０．１５ｍ、Φ＝４．６ｍｍ、
−固定相：１２．５ｍｍポアサイズを有する、オクタデシルシリルアモルファス有機シリカポリマーＲ（３．５μｍ）、
−温度：５０〜５５℃。
移動相：トリフルオロ酢酸Ｒ、クロマトグラフィーＲ用のアセトニトリル、水Ｒ（０．５：２００：８００ Ｖ／Ｖ／Ｖ）。
流速：０．７〜１．２ｍｌ／分。
検出：２２０ｎｍにおける分光光度計。
注入：１０μｌの試験溶液（ａ）、標準溶液（ｂ）及び分離溶液。
実行時間：９０分。
ゴセレリンに関する保持比：不純物Ａ＝約０．６７；
不純物Ｃ＝約０．７８；不純物Ｂ＝約０．７９；不純物Ｄ＝約０．８５；
不純物Ｅ＝約０．８９；不純物Ｆ＝約０．９２；不純物Ｇ＝約０．９４；
不純物Ｈ＝約０．９８；不純物Ｉ＝約１．４３；不純物Ｊ＝約１．５３；
不純物Ｋ＝約１．６７；不純物Ｌ＝約１．７７。
系適合性：
−保持時間：分離溶液（ｂ）で得られたクロマトグラムにおいて、ゴセレリン＝４０分〜５０分；必要であれば、移動相の流速を調整する；流速の調整が、第一ピークの正しい保持時間をもたらさない場合は、移動相中のアセトニトリルの組成物を変え、ゴセレリンに対する要求される保持時間を得る；
−分離：分離溶液（ａ）で得られるクロマトグラムにおいて、不純物Ａとゴセレリンによるピークの間で最小７．０分；
−対称性因子：分離溶液（ａ）で得られるクロマトグラムにおいて、不純物Ａとゴセレリンによるピークに対して０．８〜２．５；
−分離溶液（ｂ）で得られるクロマトグラムは、ゴセレリン有効性混合物ＣＲＳにより提供されるクロマトグラムに類似する。第一ピークの前に溶出し、不純物Ｅ及び不純物Ｇに対応する２つのピークは、明確に視認できる。第一ピークの後に溶出する３つのピークは、明確に視認できる。
限界：
−不純物Ｅ：標準溶液（ｂ）で得られるクロマトグラムにおいて、第一ピークの面積以下（０．１パーセント）、
−任意の他の不純物：各不純物に対して、標準溶液（ｂ）で得られるクロマトグラムにおいて、第一ピークの面積の０．５倍以下（０．５パーセント）、
−合計：標準溶液（ｂ）で得られるクロマトグラムにおいて、第一ピークの面積の２．５倍以下（２．５パーセント）、
−無視限界：標準溶液（ｂ）で得られるクロマトグラムにおいて、第一ピークの面積の０．０５倍（０．０５パーセント）。
【実施例】
【０１２９】
実施例１：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１）（ロイプロリド前駆体）の調製
保護ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨの２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−Ｃｌ樹脂への導入から出発する段階的なＦｍｏｃＳＰＰＳ（固相ペプチド合成）手順により実施した。樹脂（２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−Ｃｌ樹脂、１ｋｇ）を、洗浄後に、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ（４７０ｇ）の溶液と共に、ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、２時間撹拌した。樹脂の洗浄後に、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。残留試薬の洗浄後に、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））を導入し、第一のカップリング段階を開始した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いてその場で活性化し、その後５０分間樹脂に結合させた。カップリングの間、ジイソプロピルエチルアミンを有機塩基として用いた。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆された。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去した。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返した。配列中の最後のアミノ酸（ｐＧｌｕ）を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されていた。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されていた：Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、及びＨｉｓ（Ｔｒｔ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いた。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、２１５０ｇの乾燥ペプチド−樹脂を得た。
【０１３０】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ中の１％のＴＦＡ溶液を用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断した。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和した。溶媒を減圧下で蒸発させ、保護ペプチドを、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、１０７０ｇの粉末を得た。これは、ＭＳによりｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１）として同定された。
【０１３１】
実施例２：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１）の調製
実施例１に記載のように調製したｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１）の粗ペプチド（１０７０ｇ）を、ＤＭＦに溶解したエチルアミンと反応させた。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施した。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いた。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察した。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させた。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥し、ＭＳによりｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１）として同定した。
【０１３２】
実施例３：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１）の調製
ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１）（実施例２で得られた約１０００ｇ）からの保護基を、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴの溶液を用いて、２時間、室温で除去した。生成物を、１０倍量のＭＴＢＥの添加により沈殿させ、ろ過し、減圧下で乾燥させて、６８０ｇの生成物を得た。
【０１３３】
粗ペプチドを、アセトニトリルの水溶液に溶解した。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９９．０％の純度でロイプロリド塩を含む画分を得た。対イオンを酢酸で置換するＲＰ−ＨＰＬＣ上での処理の後、ペプチドを含む画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（２８６ｇ、４２％の収率）を得た（＞９９．０％の純度（ＨＰＬＣ））。このペプチドは、０．１％未満のＤ−Ｓｅｒ4−ロイプロリド、０．４％未満のＤ−Ｈｉｓ2−ロイプロリド、０．１％未満のＤ−ｐＧｌｕ1−ロイプロリド、及び０．１％以下の任意の他の不純物を含んでいた。
【０１３４】
上記と類似の方法で処理する、実施例１に類似した別の調製において、ペプチドは、＞９９．５％の純度が得られ、０．１％未満のＤ−Ｓｅｒ4−ロイプロリド、０．２％未満のＤ−Ｈｉｓ2−ロイプロリド、０．１％未満のＤ−ｐＧｌｕ1−ロイプロリド、及び０．１％以下の任意の他の不純物を含んでいた。
【０１３５】
実施例４：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号４）（ゴセレリン前駆体）の調製
保護ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨの２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−Ｃｌ樹脂への導入から出発する段階的なＦｍｏｃＳＰＰＳ（固相ペプチド合成）手順により実施した。樹脂（２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−Ｃｌ樹脂、１００ｇ）を、洗浄後に、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨの溶液と共に、ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、２時間撹拌した。樹脂の洗浄後に、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。残留試薬の洗浄後に、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（ＮＯ2））を導入し、第一のカップリング段階を開始した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いてその場で活性化し、その後５０分間樹脂に結合させた。カップリングの間、ジイソプロピルエチルアミンを有機塩基として用いた。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆された。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去した。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返した。配列中の最後のアミノ酸（ｐＧｌｕ）を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されていた。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されていた：Ｄ−Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ａｒｇ（ＮＯ2）、Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）、及びＨｉｓ（Ｆｍｏｃ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いた。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、２１０ｇの乾燥ペプチド−樹脂を得た。
【０１３６】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ中の１％のＴＦＡ溶液を用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断した。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和した。溶媒を減圧下で蒸発させ、保護ペプチドを、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、９８ｇの粉末を得た。これは、ＭＳによりｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号４）として同定された。
【０１３７】
実施例５：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＨＮＮＨＣＯＮＨ２（配列番号４）の調製
実施例４に記載のように調製したｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｎ０２）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号４）の粗ペプチド（９８ｇ）を、ＤＭＦ／水に溶解したセミカルバジド塩酸塩と反応させた。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施した。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いた。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察した。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させた。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥し、ＭＳによりｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＨＮＮＨＣＯＮＨ２（配列番号４）として同定した。
【０１３８】
実施例６：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＨＮＮＨＣＯＮＨ２（配列番号４）の調製
実施例５で得られたｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＨＮＮＨＣＯＮＨ２（配列番号４）（１０２ｇ）からの保護基を、ＤＭＦ中の５％のＰｄ／Ｃ上での水素化分解により除去した。生成物を、１０倍量のＭＴＢＥの添加により沈殿させ、ろ過し、減圧下で乾燥させて、９１ｇの生成物を得た。
【０１３９】
粗ペプチドを、アセトニトリルの水溶液に溶解した。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９９．０％の純度でゴセレリン塩を含む画分を得た。対イオンを酢酸で置換するＲＰ−ＨＰＬＣ上での処理の後、ペプチドを含む画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（３２ｇ）を得た（＞９９．０％の純度（ＨＰＬＣ））。不純物の合計は１．０％未満であり、各不純物は０．５％未満である。
【０１４０】
実施例７：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号３）（ブセレリン前駆体）の調製
実施例４に記載のように調製したｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号３）の粗ペプチド（１００ｇ）を、ＤＭＦに溶解したエチルアミンと反応させた。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施した。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いた。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察した。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させた。これを、ろ過により分離し、乾燥し、ＭＳによりｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号３）として同定した。
【０１４１】
実施例８：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｓｅｒ−（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＨＮＥｔ（配列番号３）の調製
実施例７で得られたｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）−Ｄ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＮＯ２）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号４）（９８ｇ）からの保護基を、ＤＭＦ中の５％のＰｄ／Ｃ上での水素化分解により除去した。生成物を、１０倍量のＭＴＢＥの添加により沈殿させ、ろ過し、減圧下で乾燥させて、８４ｇの生成物を得た。
【０１４２】
粗ペプチドを、アセトニトリルの水溶液に溶解した。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９９．０％の純度でブセレリン塩を含む画分を得た。対イオンを酢酸で置換するＲＰ−ＨＰＬＣ上での処理の後、この画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（２８ｇ）を得た（＞９９．０％の純度（ＨＰＬＣ））。不純物の合計は１．０％未満であり、各不純物は０．５％未満である。
【０１４３】
実施例９：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２）（トリプトレリン前駆体）の調製
保護ペプチドの合成は、Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−Ｃｌ樹脂への導入から出発する段階的なＦｍｏｃＳＰＰＳ（固相ペプチド合成）手順により実施した。樹脂（２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−Ｃｌ樹脂、１００ｇ）を、洗浄後に、ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨの溶液と共に、ジイソプロピルエチルアミンの存在下で、２時間撹拌した。樹脂の洗浄後に、Ｆｍｏｃ保護基を、ＤＭＦ中の２０％のピペリジンで処理することにより除去した。残留試薬の洗浄後に、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ）を導入し、第一のカップリング段階を開始した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔ（Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール）を用いてその場で活性化し、その後５０分間樹脂に結合させた。カップリングの間、ジイソプロピルエチルアミンを有機塩基として用いた。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆された。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去した。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返した。配列中の最後のアミノ酸（ｐＧｌｕ）を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されていた。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されていた：Ｓｅｒ（ｔ−Ｂｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、及びＨｉｓ（Ｔｒｔ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いた。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、２３６ｇの乾燥ペプチド−樹脂を得た。
【０１４４】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ中の１％のＴＦＡ溶液を用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断した。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和した。溶媒を減圧下で蒸発させ、保護ペプチドを、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、１３３ｇの粉末を得た。このペプチドは、ＭＳによりｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２）として同定された。
【０１４５】
実施例１０：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号２）の調製
ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２）の粗ペプチド（実施例９に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させた。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施した。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いた。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察した。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させた。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥し、ＭＳによりｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号２）として同定した。
【０１４６】
実施例１１：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号２）の調製
実施例１０で得られたｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号２）（１２２ｇ）からの保護基を、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴの溶液を用いて、２時間、室温で除去した。生成物を、１０倍量のＭＴＢＥの添加により沈殿させ、ろ過し、減圧下で乾燥させて、８５ｇの生成物を得た。
【０１４７】
粗ペプチドを、アセトニトリルの水溶液に溶解した。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９９．０％の純度でトリプトレリン塩を含む画分を得た。対イオンを酢酸で置換するＲＰ−ＨＰＬＣ上での処理の後、この画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥酢酸トリプトレリン（２７ｇ）を得た（＞９９．０％の純度）。不純物の合計は１．０％未満であり、各不純物は０．５％未満である。
【０１４８】
類似の手順により、トリプトレリン溶液をＲＰ−Ｃ１８樹脂上に導入し、その対イオンをパモ酸塩で置換した。得られた溶液を凍結乾燥してパモ酸トリプトレリンを得た（＞９９．０％の純度）。不純物の合計は１．０％未満であり、各不純物は０．５％未満である。
【０１４９】
実施例１２：Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号５）（デスモプレシン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の置換を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。配列中の最後の構成要素（Ｔｒｔ−Ｍｐａ）を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、及びＣｙｓ（Ａｃｍ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０１５０】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、乾燥粉末を得る。このペプチドは、Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号５）として同定される。
【０１５１】
実施例１３：Ｍｐａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号５）の調製
ＭＰａ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号５）の粗ペプチド（実施例１２に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥し、ＭＳによりＭｐａ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＮＨ２（配列番号５）として同定する。
【０１５２】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗生成物を得る（Ｍｐａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ2）（配列番号５）。
【０１５３】
実施例１４：デスモプレシンの調製
【化２】
2008534628.tif 000003
Ｍｐａ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号５）粗ペプチド（実施例１３に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈する。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和する。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でデスモプレシン塩を含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る、１４．９ｇ（＞９９．０％の純度）。
【０１５４】
実施例１５：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号６）（カルシトニン（サケ）前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．５ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）及びＣｙｓ（Ａｃｍ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、及びＬｙｓ（Ｂｏｃ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０１５５】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０１５６】
実施例１６：Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号６）の調製
粗ペプチド（実施例１５に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗半保護（ｓｅｍｉ−ｐｒｏｔｅｃｔｅｄ）ペプチドを得る（Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2）（配列番号６）。
【０１５７】
実施例１７：カルシトニン（サケ）の調製
Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号６）粗ペプチド（実施例１６に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈する。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和する。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でカルシトニン塩を含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０１５８】
実施例１８：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号８）（デスロレリン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、及びＳｅｒ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０１５９】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０１６０】
実施例１９：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号８）
粗保護ペプチド（実施例１８に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したエチルアミンと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０１６１】
実施例２０：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号８）
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号８）。
【０１６２】
粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９８．５％の純粋な生成物を含む画分を混合し、酢酸とのイオン交換のために、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に再び導入する。対イオンの交換の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（＞９９．０％の純度）を得る。
【０１６３】
実施例２１：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号９）（フェルチレリン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、及びＳｅｒ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０１６４】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０１６５】
実施例２２：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号９）
粗保護ペプチド（実施例２１に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したエチルアミンと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０１６６】
実施例２３：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号９）
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号９）。
【０１６７】
粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９８．５％の純粋な生成物を含む画分を混合し、酢酸とのイオン交換のために、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に再び導入する。対イオンの交換の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（＞９９．０％の純度）を得る。
【０１６８】
実施例２３：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号１０）（ゴナドレリン前駆体）
粗保護ペプチド（実施例２１に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０１６９】
実施例２４：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号１０）
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号１０）。
【０１７０】
粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９８．５％の純粋な生成物を含む画分を混合し、酢酸とのイオン交換のために、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に再び導入する。対イオンの交換の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（＞９９．０％の純度）を得る。
【０１７１】
実施例２５：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１１）（ヒステレリン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）及びＤ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、及びＳｅｒ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０１７２】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０１７３】
実施例２６：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号１１）
粗保護ペプチド（実施例２５に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０１７４】
実施例２７：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号１１）
実施例２６からの保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｈｉｓ（Ｂｚｌ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号１１）。
【０１７５】
粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９８．５％の純粋な生成物を含む画分を混合し、酢酸とのイオン交換のために、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に再び導入する。対イオンの交換の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（＞９９．０％の純度）を得る。
【０１７６】
実施例２８：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１２）（ナファレリン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、及びＳｅｒ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０１７７】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０１７８】
実施例２９：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号１２）
粗保護ペプチド（実施例２８に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０１７９】
実施例３０：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号１２）
実施例２９からの保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨ２（配列番号１２）。
【０１８０】
粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９８．５％の純粋な生成物を含む画分を混合し、酢酸とのイオン交換のために、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に再び導入する。対イオンの交換の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（＞９９．０％の純度）を得る。
【０１８１】
実施例３１：Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨの調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＯＨ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−ＯＨ）を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。最後のアミノ酸（Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ）を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０１８２】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０１８３】
実施例３２：Ｂｏｃ−Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−ＮＨ2（配列番号１３）
粗保護ペプチド（実施例３１に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０１８４】
実施例３３：Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１３）
実施例３２からの上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、Ｄ−Ａｌａ−Ｄ−２−Ｎａｌ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２（配列番号１３）。
【０１８５】
粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９８．５％の純粋な生成物を含む画分を混合し、酢酸とのイオン交換のために、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に再び導入する。対イオンの交換の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（＞９９．０％の純度）を得る。
【０１８６】
実施例３４：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ（配列番号１４）（セトロレリクス前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、及びＳｅｒ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。最後のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｎａｌ）の添加、及びＦｍｏｃ保護基の除去の後に、Ｎ末端を無水酢酸によりアセチル化する。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０１８７】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０１８８】
実施例３５：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（配列番号１４）
粗保護ペプチド（実施例３４に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０１８９】
実施例３６：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（配列番号１５）
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ２（配列番号１５）。
【０１９０】
粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９８．５％の純粋な生成物を含む画分を混合し、酢酸とのイオン交換のために、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に再び導入する。対イオンの交換の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（＞９９．０％の純度）を得る。
【０１９１】
実施例３７：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＯＨ（配列番号１５）（テベレリクス前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ａｌａ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｔｙｒ（ｔＢｕ）及びＳｅｒ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、Ｎ末端のＦｍｏｃ基を除去し、アミノ基を無水酢酸によりアセチル化する。ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０１９２】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０１９３】
実施例３８：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（配列番号１５）
粗保護ペプチド（実施例３７に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０１９４】
実施例３９：Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（配列番号１５）
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、Ａｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｄ−Ｃｐａ−Ｄ−Ｐａｌ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｃｉｔ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（イソプロピル）−Ｐｒｏ−Ｄ−Ａｌａ−ＮＨ2（配列番号１５）。
【０１９５】
粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９８．５％の純粋な生成物を含む画分を混合し、酢酸とのイオン交換のために、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に再び導入する。対イオンの交換の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（＞９９．０％の純度）を得る。
【０１９６】
実施例４０：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＤＴｒｐ（２−Ｍｅ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号１６）（アボレリン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ−ＯＨ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−ＯＨ）を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。最後のアミノ酸（ｐＧｌｕ）を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、及びＡｒｇ（Ｐｂｆ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０１９７】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０１９８】
実施例４１：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−ＤＴｒｐ（２−Ｍｅ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１６）
粗保護ペプチド（実施例４０に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したエチルアミンと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０１９９】
実施例４２：ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＴｒｐ（２−Ｍｅ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ（配列番号１６）
実施例４１からの保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、ｐＧｌｕ−Ｈｉｓ−Ｔｒｐ−Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−ＤＴｒｐ（２−Ｍｅ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−ＮＨＥｔ。
【０２００】
粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９８．５％の純粋な生成物を含む画分を混合し、酢酸とのイオン交換のために、ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に再び導入する。対イオンの交換の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（＞９９．０％の純度）を得る。
【０２０１】
実施例４３：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（配列番号１７）（ランレオチド前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ））は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）及びＣｙｓ（Ａｃｍ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、及びＬｙｓ（Ｂｏｃ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２０２】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２０３】
実施例４４：Ｈ−Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−ＮＨ2（配列番号１７）の調製
粗保護ペプチド（実施例４３に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。これを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２０４】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、半保護ペプチドを得る、Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−ＮＨ2（配列番号１７）。
【０２０５】
実施例４５：ランレオチドの調製
Ｄ−Ｎａｌ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｈｒ−ＮＨ2（配列番号１７）粗ペプチド（実施例４４に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈する。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和する。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でトリフルオロ酢酸ランレオチドを含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２０６】
実施例４６：Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−ＯＨ（配列番号１８）（バプレオチド前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。最後のアミノ酸（Ｂｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ）を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）及びＣｙｓ（Ａｃｍ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、及びＬｙｓ（Ｂｏｃ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２０７】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２０８】
実施例４７：Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−ＮＨ2（配列番号１８）
粗ペプチド（実施例４６に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２０９】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗半保護ペプチドを得る、Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−ＮＨ2（配列番号１８）。
【０２１０】
実施例４８：バンプレチドの調製
Ｈ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｄ−Ｔｒｐ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｒｐ−ＮＨ2（配列番号１８）粗ペプチド（実施例４７に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈する。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和する。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でトリフルオロ酢酸バンプレチドを含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２１１】
実施例４９：Ｍｐａ（Ｔｒｔ）−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｅｔ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号１９）（アトシバン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｃｙｓ（Ａｃｍ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、及びＯｒｎ（Ｂｏｃ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２１２】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２１３】
実施例５０：Ｍｐａ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｅｔ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号１９）
粗ペプチド（実施例４９に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２１４】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗半保護ペプチドを得る、Ｍｐａ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｅｔ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号１９）。
【０２１５】
実施例５１：アトシバンの調製
ＭＰａ−Ｄ−Ｔｙｒ（Ｅｔ）−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号１９）粗ペプチド（実施例５０に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈する。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和する。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でトリフルオロ酢酸アトシバンを含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２１６】
実施例５２：Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２０）（テルリプレシン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃ−Ｇｌｙとして用いる最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）及びＣｙｓ（Ａｃｍ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、及びＬｙｓ（Ｂｏｃ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２１７】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２１８】
実施例５３：Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２０）
粗ペプチド（実施例５２に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２１９】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗半保護ペプチドを得る、Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号１９）。
【０２２０】
実施例５４：テルリプレシンの調製
Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２０）粗ペプチド（実施例５３に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈する。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和する。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でトリフルオロ酢酸テルリプレシンを含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２２１】
実施例５５：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２１）（フェリプレシン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃで保護される最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）及びＣｙｓ（Ａｃｍ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、及びＬｙｓ（Ｂｏｃ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２２２】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２２３】
実施例５６：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２１）
粗ペプチド（実施例５５に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗半保護ペプチドを得る、Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２１）。
【０２２４】
実施例５７：フェリプレシンの調製
Ｈ−Ｃｙｓ−Ｐｈｅ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２１）粗ペプチド（実施例５６に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈する。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和する。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でトリフルオロ酢酸フェリプレシンを含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２２５】
実施例５８：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２２）（オルニプレシン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｏｒｎ（Ｂｏｃ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃで保護される最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）及びＣｙｓ（Ａｃｍ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、及びＯｒｎ（Ｂｏｃ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２２６】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２２７】
実施例５９：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２２）
粗ペプチド（実施例５８に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２２８】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗半保護ペプチドを得る、Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２２）。
【０２２９】
実施例６０：オルニプレシンの調製
Ｈ−Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｐｒｏ−Ｏｒｎ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２２）粗ペプチド（実施例５９に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈する。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和する。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でトリフルオロ酢酸オルニプレシンを含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２３０】
実施例６１：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２３）（バソプレシン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃで保護される最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）及びＣｙｓ（Ａｃｍ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、及びＡｒｇ（Ｐｂｆ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２３１】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２３２】
実施例６２：Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２３）
粗ペプチド（実施例６１に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗半保護ペプチドを得る、Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２３）。
【０２３３】
実施例６３：バソプレシンの調製
Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ−Ｐｈｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２３）粗ペプチド（実施例６２に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈する。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和する。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でトリフルオロ酢酸バソプレシンを含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２３４】
実施例６４：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ（配列番号２４）（オキシトシン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｇｌｙ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ）を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃで保護される最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）及びＣｙｓ（Ａｃｍ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、及びＡｓｎ（Ｔｒｔ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２３５】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２３６】
実施例６５：Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２４）
粗ペプチド（実施例６４に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗半保護ペプチドを得る、Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２４）。
【０２３７】
実施例６６：オキシトシンの調製
Ｈ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−Ｔｙｒ−Ｉｌｅ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＮＨ2（配列番号２４）粗ペプチド（実施例６５に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製する。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈する。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和する。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でトリフルオロ酢酸オキシトシンを含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２３８】
実施例６７：Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ＳＯ３Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−ＯＨ（配列番号２５）（シンカリド前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ａｓｐ（ｔＢｕ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃで保護される最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ａｓｐ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２３９】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２４０】
実施例６８：Ｈ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ3Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号２５）
粗ペプチド（実施例６５に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２４１】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、Ｈ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ3Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号２５）。粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製して、＞９８．５％の純度でシンカリド溶液を含む画分を得る。対イオンのアンモニアによる交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２４２】
実施例６９：Ｎ−アセチル−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＯＨ（配列番号２６）（エンフビルチド前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｈｅ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ）を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ｇｌｕ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、及びＡｓｐ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２４３】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２４４】
実施例７０：Ｎ−アセチル−Ｔｙｒ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号２６）
粗ペプチド（実施例６９に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２４５】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る。粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製して、＞９８．５％の純度でエンフビルチド溶液を含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２４６】
実施例７１：Ｂｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｎ（Ｔｒｔ）−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｒｏ−ＯＨ（配列番号２７）（エルカトニン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃで保護される最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ａｓｎ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、及びＡｓｐ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２４７】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２４８】
実施例７２：Ｈ−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｔｈｒ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−ＮＨ2（配列番号２７）
粗ペプチド（実施例６９に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２４９】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、Ｈ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ3Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号２５）。粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製して、＞９８．５％の純度でペプチド溶液を含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２５０】
実施例７３：Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号２８）（ヒトセクレチン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ）を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃで保護される最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｕ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、及びＡｓｐ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２５１】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２５２】
実施例７４：Ｈ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2（配列番号２８）（ヒトセクレチン）
粗ペプチド（実施例７３に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２５３】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、Ｈ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ3Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号２５）。粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製して、＞９８．５％の純度でペプチド溶液を含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２５４】
実施例７５：Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ（Ｔｒｆ）−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＯＨ（配列番号２９）（ブタセクレチン前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｖａｌ）は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｅｕ）を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃで保護される最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｕ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、及びＡｓｐ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２５５】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２５６】
実施例７６：Ｈ−Ｈｉｓ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＮＨ2（配列番号２９）（ブタセクレチン）
粗ペプチド（実施例７５に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２５７】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る、Ｈ−Ａｓｐ−Ｔｙｒ（ＳＯ3Ｈ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｍｅｔ−Ａｓｐ−Ｐｈｅ−ＮＨ2（配列番号２５）。粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製して、＞９８．５％の純度でペプチド溶液を含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【０２５８】
実施例７７：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＯＨ（配列番号３０）（ジコノチド前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ））は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ））を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃで保護される最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）、Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）、Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｙｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、及びＡｓｐ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２５９】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２６０】
実施例７８：Ｂｏｃ−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｃｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ2（配列番号３０）
粗ペプチド（実施例７７に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２６１】
実施例７９：Ｈ−Ｃｙｓ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−Ｓｅｒ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｔｙｒ−Ａｓｐ−Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｃｙｓ−Ａｒｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（配列番号３０）環状（１−１６）、（８−２０）、（１５−２５）トリス（ジスルフィド）
実施例７８からの保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る。粗ペプチドを、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製し、＞９５．０％の純度で非環状ペプチドの溶液を含む画分を得る。酢酸アンモニウム緩衝液によりｐＨを約７〜８に調整後、グルタチオンを添加して、空気を溶液に２４時間通気して、粗環状ペプチドを得る。粗環状ペプチドを、調製用ＲＰ−ＨＰＬＣにより精製し、＞９８．５％の純度の画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチド（＞９９．０％の純度）を得る。
【０２６２】
実施例８０：Ｍｐａ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＨ2（配列番号７）（エプチフィバチド前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−樹脂（５０ｇ）から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ（固相ペプチド合成）手順により実施した。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）は、先の段階において、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得た。樹脂の洗浄後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ）を導入して、第一のカップリング段階を開始した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、５０分間樹脂に結合させた。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いた。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆された。樹脂の洗浄後、α−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去した。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返した。配列中の最後の構成要素（Ｔｒｔ−Ｍｐａ）を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎα保護されていた。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されていた：Ａｓｐ（ｔＢｕ）及びＨａｒ（Ｐｂｆ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いた。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、８０ｇの乾燥ペプチド−樹脂を得た。
【０２６３】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ中の１％のＴＦＡの溶液を用いる３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断した。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。得られた溶液を、ＤＩＰＥＡの添加により中和し、約１０％のペプチド含量まで濃縮した。Ｃ末端の修飾は、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔによるカルボキシ末端の活性化及びＤＭＡ中のＣｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＨ2溶液を用いたカップリングにより達成した。溶媒を除去した後に、保護ペプチドをエーテル中で沈殿させ、乾燥させた。保護基は、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴの溶液を用いて、２時間、室温で除去した。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、３０ｇの生成物を得た。
【０２６４】
実施例８１：エプチフィバチドの調製
【化３】
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Ｍｐａ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（Ａｃｍ）−ＮＨ2（配列番号７）粗ペプチド（３０ｇ、実施例８０に記載のように調製した）を、調製用Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製した。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈した。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和した。得られた溶液を、Ｃ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でトリフルオロ酢酸エプチフィバチドを含む画分を得た。この画分を混合し、対イオン交換のためのＣ18ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入した。最後に、対イオン交換後の画分を凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得た、６．９ｇ（＞９９．０％の純度）。
【０２６５】
実施例８２：Ｍｐａ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（配列番号７）（エプチフィバチド前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−樹脂（５０ｇ）から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ（固相ペプチド合成）手順により実施した。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）は、先の段階において、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得た。樹脂の洗浄後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｔｒｐ）を導入して、第一のカップリング段階を開始した。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、５０分間樹脂に結合させた。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いた。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆された。樹脂の洗浄後、□−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去した。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返した。配列中の最後の構成要素（Ｔｒｔ−Ｍｐａ）を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎ□保護されていた。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されていた：Ａｓｐ（ｔＢｕ）。Ｈａｒは、側鎖基上の保護をせずに用いた。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いた。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、７８ｇの乾燥ペプチド−樹脂を得た。
【０２６６】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ中の１％のＴＦＡの溶液を用いる３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断した。得られた溶液を、ＤＩＰＥＡの添加により中和し、約１０％のペプチド含量まで濃縮した。Ｃ末端の修飾は、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔによるカルボキシ末端の活性化及びＤＣＭ中のＣｙｓ（Ｔｒｔ）−ＮＨ2溶液を用いたカップリングにより達成した。溶媒を除去した後に、保護ペプチドを水中で沈殿させ、乾燥させた。保護基は、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴの溶液を用いて、２時間、室温で除去した。生成物を、１０倍量のＭＴＢＥを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、３２ｇの生成物を得た。
【０２６７】
実施例８３：エプチフィバチドの調製
【化４】
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Ｍｐａ−Ｈａｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｔｒｐ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ−ＮＨ2（配列番号７）粗ペプチド（３０ｇ、実施例８０に記載のように調製した）を、調製用Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製した。＞９５％の純度の生成物を含む画分を混合し、約１ｇ／Ｌの濃度に希釈した。酢酸中の等モル量のイオジンを、室温で勢いよく混合しながら添加し、その後、過剰のイオジンを、少量のアスコルビン酸により中和した。得られた溶液を、Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入し、精製して、＞９８．５％の純度でトリフルオロ酢酸エプチフィバチドを含む画分を得た。この画分を混合し、対イオン交換のためのＣ１８ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上に導入した。最後に、対イオン交換後の画分を凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得た、７．１ｇ（＞９９．０％の純度）。
【０２６８】
実施例８４：Ｂｏｃ−Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ（Ｐｂｆ）−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ（ｔＢｕ）−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）−Ａｓｐ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ）−ＯＨ（配列番号３１）（エクセナチド前駆体）の調製
ペプチドの合成は、２−Ｃｌ−Ｔｒｔ−塩化物樹脂から出発する、通常の段階的なＦｍｏｃ ＳＰＰＳ手順により実施される。第一のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｓｅｒ（ｔＢｕ））は、先の実施例で説明したように、樹脂上に導入し、約０．７ｍｍｏｌ／ｇのアミノ酸／樹脂の導入を得る。樹脂の洗浄及びピペリジン／ＤＭＦでの処理によるＦｍｏｃ基の除去の後、第二のアミノ酸（Ｆｍｏｃ−Ｐｒｏ）を導入して、配列伸長を続ける。Ｆｍｏｃ保護アミノ酸を、ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔを用いてその場で活性化し、その後、約５０分をかけて樹脂に結合させる。カップリングの間に、有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミン又はコリジンを用いる。カップリングの完了は、ニンヒドリン試験により示唆される。樹脂の洗浄後、□−アミン上のＦｍｏｃ保護基を、２０分間ＤＭＦ中の２０％のピペリジンにより除去する。ペプチド配列に従って、別のアミノ酸を添加するたびに、これらの段階を繰り返す。Ｂｏｃで保護される最後のアミノ酸を除いて、用いる全てのアミノ酸は、Ｆｍｏｃ−Ｎ□保護されている。三官能性アミノ酸は、以下のように側鎖保護されている：Ｓｅｒ（ｔＢｕ）、Ｔｈｒ（ｔＢｕ）、Ｇｌｕ（ｔＢｕ）、Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）、Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）、Ａｒｇ（Ｐｂｆ）、及びＡｓｐ（ｔＢｕ）。活性化アミノ酸の３つの同等物を、カップリング反応において用いる。合成の最後に、ペプチド−樹脂を、ＤＭＦ、その後ＤＣＭで洗浄し、減圧下で乾燥させて、乾燥ペプチド−樹脂を得る。
【０２６９】
上記のように調製したペプチドを、ＤＣＭ溶液中の１％のＴＦＡを用いて、３回の繰り返し洗浄（それぞれ１５分）により、室温で樹脂から切断する。酸性ペプチド溶液を、ＤＩＰＥＡにより中和する。生成物を、１０倍量の水を添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチド粉末を得る。
【０２７０】
実施例８５：Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｌｅｕ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｍｅｔ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ−ＮＨ2（配列番号３１）（エクセナチド）
粗ペプチド（実施例８４に記載のように調製した）を、ＤＭＦに溶解したアンモニアと反応させる。ＴＢＴＵ／ＨＯＢｔの反応混合物への添加により、ペプチドのカルボキシル基の活性化をその場で実施する。有機塩基として、ジイソプロピルエチルアミンを用いる。反応の完了を、ＨＰＬＣ分析により観察する。反応の最後に、ＤＭＦ溶液を水にゆっくりと添加し、粗保護ペプチドを、オフホワイト色の固体として沈殿させる。このペプチドを、ろ過により分離し、乾燥させる。
【０２７１】
上記の保護ペプチドを、９５％のＴＦＡ、２．５％のＴＩＳ、２．５％のＥＤＴを含む混合物を用いて、２時間、室温で処理する。生成物を、１０倍量のエーテルを添加することにより沈殿させ、ろ過し、そして減圧下で乾燥させて、粗ペプチドを得る。粗ペプチドを、調製用Ｃ１８ ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上で精製して、＞９８．５％の純度でペプチド溶液を含む画分を得る。対イオンの酢酸による交換（ＲＰ−ＨＰＬＣカラム上での）の後、画分を回収し、凍結乾燥して、最終的な乾燥ペプチドを得る（＞９９．０％の純度）。
【配列表】
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【国際調査報告】
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