(57)【要約】本発明のヒト化抗体は、マウスモノクローン抗体の免疫反応の誘導を最小化し、本来のマウスモノクローン抗体のＨＢＶ Ｓ−表面抗原に対する反応性を維持するので、慢性Ｂ型肝炎患者の治療、肝移植患者の感染予防及びＢ型肝炎ウイルスに感染された産婦から胎児への垂直感染予防等に効果的に用いられる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）相補性決定部位（ＣＤＲ）に配列番号３８〜４０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
ｂ）ＣＤＲに配列番号４１〜４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
ｃ）ヒト抗体の重鎖不変領域と同一の重鎖不変領域；及び
ｄ）ヒト抗体の軽鎖不変領域と同一の軽鎖不変領域；
を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＳ−表面抗原に対するヒト化抗体。
【請求項２】
重鎖可変領域または軽鎖可変領域におけるＣＤＲを除いた骨格領域が、ヒト抗体の重鎖領域または軽鎖領域により置換されていることを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項３】
ヒト化抗体の抗原結合親和度（Ｋａ）が６×１０７〜５×１０８Ｍ-１であることを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項４】
重鎖可変領域が配列番号３５のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項５】
重鎖可変領域が配列番号３２の塩基配列を含むポリヌクレオチドによってコードされることを特徴とする請求項４に記載のヒト化抗体。
【請求項６】
軽鎖可変領域が配列番号３６または配列番号３７のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載のヒト化抗体。
【請求項７】
軽鎖可変領域が配列番号３３または配列番号３４の塩基配列を有するポリヌクレオチドによってコードされていることを特徴とする請求項６に記載のヒト化抗体。
【請求項８】
配列番号３５の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とする、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ−表面抗原に特異的なヒト化抗体の重鎖可変領域の発現ベクター。
【請求項９】
発現ベクターがｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ ＨＦであることを特徴とする請求項８に記載の重鎖発現ベクター。
【請求項１０】
配列番号３６または配列番号３７の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含むことを特徴とするＢ型肝炎ウイルスのＳ−表面抗原に特異的なヒト化抗体の軽鎖可変領域の発現ベクター。
【請求項１１】
前記発現ベクターがｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ ＬＦまたはｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ＬＦであることを特徴とする請求項１０に記載の軽鎖発現ベクター。
【請求項１２】
第８項または第１０項の発現ベクターで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ細胞。
【請求項１３】
Ｅ．ｃｏｌｉ細胞がＴＯＰ１０Ｆ’／ｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ １０５３３ＢＰ）、ＴＯＰ１０Ｆ’／ｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ＬＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ １０５３２ ＢＰ）、またはＴＯＰ１０Ｆ’／ｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ ＬＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ １０５５３ ＢＰ）であることを特徴とする請求項１２に記載の大膓菌細胞株。
【請求項１４】
第１項乃至第７項に記載のヒト化抗体のいずれかを含むことを特徴とするＢ型肝炎ウイルスに関連する疾患の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ、以下“ＨＢＶ”という）のＳ−表面抗原に対するヒト化抗体（ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）、その製造方法及びそれを含むＨＢＶ関連疾患治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型肝炎ウイルスはデーン粒子（Ｄａｎｅ ｐａｒｔｉｃｌｅ）として知られている約４２ｎｍの球形粒子であって、外側のエンべロープ（ｏｕｔｅｒ ｅｎｖｅｌｏｐｅ）およびヌクレオカプシドよりなる。ヌクレオカプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）を取り囲んでいる外側のエンべロープは多量のＢ型肝炎表面抗原（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｓｕｒｆａｃｅ ａｎｔｉｇｅｎｓ）を含んでおり、約１８０個のＢ型肝炎コア蛋白質（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ ｃｏｒｅｐｒｏｔｅｉｎｓ）を含むヌクレオカプシド（ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）はＨＢＶ構造遺伝子、ポリメラーゼ等をコードする数種の遺伝子を含む。
（Ｓｕｍｍｅｒｓ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、７２、４５７９、１９７５；Ｐｉｅｒｒｅ Ｔｉｏｌｌａｉｓ ｅｔ ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２１３、４０６−４１１、１９８１）。
【０００３】
ＨＢＶ表面抗原の遺伝子コード領域は３個のインフレ−ム（in−frame）開始部位を含んでおり、これらは全てＳ−ドメイン（Ｓ−ｄｏｍａｉｎ）末端の終了コドンを共有している。従って、ＨＢＶ表面抗原は３つの群に分けられる：（ｉ）Ｓ−ドメインのみを含む小さいＨＢＶ表面抗原（Ｓｍａｌｌ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ、以下「Ｓ−表面抗原」という）、（ｉｉ）Ｓ−ドメイン及び５５個のアミノ酸よりなるＰｒｅ−Ｓ２を含むミドルＨＢＶ表面抗原（Ｍｉｄｄｌｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ、以下「Ｍ−表面抗原」という）、（ｉｉｉ）Ｓ−ドメイン、Ｐｒｅ−Ｓ２及びｐｒｅ−Ｓ１を含む大ＨＢＶ表面抗原（Ｌａｒｇｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｂ Ｖｉｒｕｓ Ｓｕｒｆａｃｅ Ａｎｔｉｇｅｎ、以下「Ｌ−表面抗原」という）。Ｓ−表面抗原は発現される全体表面抗原の約８０％以上を占める。
【０００４】
現在慢性肝炎治療剤としては、インターフェロンアルファ（ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ａ）とラミブジン（ｌａｍｉｖｕｄｉｎ）が広く用いられているが（Ｃ．Ｌ．Ｌａｉ、Ｐ．Ｃ．Ｗｕ、Ｈ．Ｋ．Ｍ．Ｊ、３、２８９−９６、１９９７）、インターフェロンアルファは生体内ウイルスに対する免疫反応にもかかわらず毒性が強い。一方、核酸誘導体として作用するラミブジンは、ＤＮＡポリメラーゼを阻害することにより抗ウイルス活性を示す。経口投与用ラミブジンは治療效果が高いが、長期服用の場合、ラミブジンに対する耐性を有する突然変異体が出現する可能性が高い（ＤａｒｙｌＴ．−Ｙ．Ｌａｕ ｅｔ ａｌ、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ３２、８２８−３４、２０００）。更に、ヒト血漿から分離した抗ＨＢＶポリクローン抗体は肝移植及び垂直伝染からのＨＢＶ感染を防止するために用いられている。しかしながら、この抗体も、それが抗原に対する特異性が低くかつ人の血液から分離しなければならない等の問題を有している。
【０００５】
前記問題点を解決するためにＨＢＶ表面抗原に対するマウスモノクローン抗体を用いる方法が開発されたが、マウスモノクローン抗体を長期間使用すると、マウス抗体に対するヒト抗体が形成される免疫反応が発生するという問題がある（Ｄｉｍａｇｇｉｏ Ｊ．Ｊ．、ＳｃｈｅｉｎｂｅｒｇＤ.Ａ.ｅｔａｌ.、Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ.Ｂｉｏｌ.Ｒｅｓｐｏｎｓｅ Ｍｏｄｉｆ.１１、１７７−２０３、１９９０）。
【０００６】
マウスモノクローナル抗体の望ましくない性質を克服するため、抗原と結合する部位を除いたフレームワークをヒト抗体に置換することによりヒト化抗体が開発された。そのようなヒト化抗体を製造するのに現在用いられている方法は、マウス抗体と最も近い配列類似性を示すヒト抗体をコードする遺伝子を選定し、マウス抗体の相補性決定領域ＣＤＲ部位のみをヒト抗体でＣＤＲグラフティング法により置換する工程を含む。ヒト化抗体はインビボ免疫反応を軽減させるという長所がある（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ.、Ｎａｔｕｒｅ、３３２、３２３、１９８８；Ｎａｋａｔａｎｉ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、４３５、１９９４）。しかし、マウス抗体の抗原と結合するＣＤＲ部位のみをヒト抗体に移植した場合、高い選択性と反応性を喪失する場合が頻繁に発生する（Ｃａｒｔｅｒ Ｐ ｅｔ ａｌ．、Ｐｒｏｃ. Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ＵＳＡ、８９；４２８５−４２８９、１９９２）。
そこで本発明者は従来のヒト化抗体のそのような問題を克服するために努力し、Ｂ型肝炎ウイルスのＳ−表面抗原に対するマウスモノクローン抗体の抗体特異性はそのまま維持し、かつマウスモノクローン抗体の可変地域をヒト抗体遺伝子で置換してマウスモノクローン抗体に対する免疫反応を最小化したＢ型肝炎ウイルスのＳ−表面抗原に対するヒト化抗体を開発した。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、本発明の目的はＢ型肝炎ウイルスのＳ−表面抗原に対するヒト化抗体及びその製造方法を提供することである。
本発明の他の目的は、前記ヒト化抗体を有效成分として含むＢ型肝炎ウイルスに関連する疾患の治療用薬学組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の一態様によれば、
ａ）相補性決定部位（ＣＤＲ）に配列番号３８〜４０のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；
ｂ）相補性決定部位に配列番号４１〜４３のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域；
c）ヒト抗体の重鎖不変領域と同一の重鎖不変領域；及び
d）ヒト抗体の軽鎖不変領域と同一の軽鎖不変領域
を含むＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＳ−表面抗原に対するヒト化抗体を提供する。
【発明の効果】
【０００９】
本発明のヒト化抗体は、マウスモノクローン抗体と類似する抗原結合能力を示し、かつ免疫誘発能力が顕著に低いヒト化抗体であって、慢性Ｂ型肝炎患者の治療、肝移植患者の感染予防及びＢ型肝炎ウイルスに感染された産婦から胎児への垂直感染予防等に有用である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１０】
本発明は重鎖可変領域または軽鎖可変領域におけるその相補性決定部位がマウスモノクローン抗体に由来し、抗体分子の骨格領域がヒト抗体に由来するヒト化抗体を開示する。ヒト化抗体は、抗原結合親和度（Ｋａ）が７ｘ１０７Ｍ-１〜１ｘ１０８Ｍ-１であることが好ましい。
本発明のヒト化抗体はマウスモノクローナル抗体Ａ９−１１−５（寄託番号ＫＴＣＣ  １８０２０ＰおよびＫＴＣＣ１８０２１Ｐ）から、ＣＤＲグラフティング法により製造でき、マウスモノクローナル抗体Ａ９−１１−５の重鎖可変領域は配列番号３８〜４０の３つのＣＤＲ領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号４１〜４３の３つのＣＤＲ領域を含む。
【００１１】
まず、前記マウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の軽鎖及び重鎖可変領域のアミノ酸配列をジーンバンクデータベース（Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ ｄａｔａ ｂａｓｅ）におけるヒト配列と比較し、マウス抗体Ａ９−１１−５重鎖と最大の配列類似性を有するカバット（Ｋａｂａｔ）により定義されたヒト重鎖可変領域サブグループ２（Ｈｈ２）、およびマウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５軽鎖と最大の類似性を有するジーンバンクＩｇブラストのヒトＩｇラムダ生殖系Ｖ遺伝子（Ｉｇ ｌａｍｄａ ｇｅｒｍｌｉ Ｖ ｇｅｎｅｓ of Ｇｅｎｅ ｂａｎｋ Ｉｇ ｂｌａｓｔの）のヒト軽鎖可変領域サブグループ７（ｈＶ７）またはＶ３を選択する。（Ｋａｗａｓａｋｉ Ｋ．ｅｔ ａｌ、１９９７）。
【００１２】
ヒト化抗体重鎖および軽鎖をコードする遺伝子はこのように選定されたヒト遺伝子を鋳型として用いることにより増幅できる。この方法では、ヒト化抗体の重鎖及び軽鎖をコードするヌクレオチド配列のそれぞれを、よく知られた遺伝子研究および抗体構造分析の情報を基にして修飾し得る。マウスモノクローナル抗体のあるヌクレオチド配列が抗原結合親和性に影響を及ぼすか、抗体構造に重要であるなら、それらは配列で置換することなく保存される。（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ．ｅｔ ａｌ．、Ｄ．Ｈ．Ｈ．Ｓ．、９１−３２４２、１９９１；Ｃｈｏｔｈｉａ Ｃ．ｅｔ ａｌ．、Ｎａｔｕｒｅ、３４２、８７７−８８３、１９８９；Ｇａｒｙ Ｍ．Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ．ｅｔａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、７、８０５−８１４、１９９４；Ｌｉｎｄａ Ｈａｒｒｉｓ、ａｎｄ Ｂａｊｏｒａｔｈ、Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ、４、３０６−３１０、１９９５）。
【００１３】
ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子は、ＨＢＶ Ｓ−表面抗原を特異的に認識するマウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の重鎖可変領域をコードする遺伝子の抗原結合部位を除いたフレームワークをヒト抗体の重鎖サブグループ２（Ｈｈ２）で置換することによって製造される。ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードするそのような遺伝子は、マウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の重鎖をコードする遺伝子を鋳型として用いて、マウスモノクローナル抗体をヒト化させるプライマーを選定し、対応するプライマーを用いてポリメラーゼ連鎖反応（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を行った後、増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素及びＤＮＡリガーゼ（ｌｉｇａｓｅ）を用いて連結する工程によって製造することができる。このように製造したヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子をＨＦＷ１４１（配列番号３２）と名付け、これは配列番号３５のアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする（図１参照）。
【００１４】
ヒト化重鎖可変領域をコードする遺伝子を含む、ヒト化抗体の重鎖全体をコードする遺伝子を製造するために、遺伝子ＨＦＷ１４１をＰＣＲベクターに挿入して、ｐＣＲ−ＨＦＷ１４１を製造する。この時、ヒト化抗体の重鎖リーダー配列の前方にコザック配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５、８１２５−８１４８、１９８７）を挿入し、重鎖リーダー配列のいくつかのコドンを動物細胞において使用頻度の高い他のコドンで置換する。そのことはヒト化抗体の重鎖可変領域の発現効率を増加させる（配列番号１）。ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子断片は発現ベクターｐＣＲ−ＨＦＷ１４１から単離し、ヒト抗体の重鎖不変領域をコードする遺伝子をコードする遺伝子を含む発現ベクターＨＡＢ−ＨＣ（寄託番号:ＫＣＴＣ １０２２９ＢＰ、大韓民国特許公開番号第２００４−１２２６６号）に挿入し、ヒト化抗体の重鎖の発現ベクターを得る。このように製造された発現ベクターをｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ １０５３３ＢＰ）と名付けた。ヒト化抗体の重鎖全体をコードする遺伝子は重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ ＨＦから分離することができ、ＨＦＷ１４１ ＨＦと名付けた。
【００１５】
前記ヒト化重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ ＨＦで形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ'形質転換体を２００３年１０月２９日付でKorean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）（住所：Korea Research Insitute of Bioscience and Biotechnology, (KRIBB),#52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon,305-333,韓国）に、寄託番号:ＫＣＴＣ １０５３３ＢＰで、ブタペスト条約に従って寄託した。
【００１６】
ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子は、ＨＢＶ Ｓ−表面抗原を特異的に認識するマウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の軽鎖可変領域をコードする遺伝子の抗原結合部位を除いたフレームワーク領域をヒト抗体の軽鎖サブグループ７（ｈＶ７）または軽鎖ラムダ生殖細胞系Ｖ３で置換することによって製造し得る。ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードするそのような遺伝子はマウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の軽鎖をコードする遺伝子を鋳型として用いてマウスモノクローナル抗体をヒト化するプライマーを設計し、対応するプライマーを用いてＰＣＲを行った後、制限酵素及びＤＮＡリガーゼ（Ｌｉｇａｓｅ）を用いて各ＰＣＲ産物を互いに連結する工程により製造しうる。このように製造したヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子をそれぞれＬＦＷ２２−３１（配列番号３３）及びＬＦＷ２２−３１２（配列番号３４）と名付けた。それらは配列番号３６及び配列番号３７のヌクレオチド配列を有するポリペプチドをそれぞれコ−ドする（図２参照）。
【００１７】
ヒト化軽鎖可変領域をコードする遺伝子を含むヒト化抗体の軽鎖全体をコードする遺伝子を製造するために遺伝子ＬＦＷ２２−３１またはＬＦＷ２２−３１２をＰＣＲベクターに挿入してｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１またはｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１２を製造する。この時、ヒト化抗体の軽鎖リーダー配列の前方にコザック配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｎｕｃ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．１５、８１２５−８１４８、１９８７）を挿入し、軽鎖リーダー配列遺伝子のいくつかのコドンを動物細胞で高い頻度で使用される他のコドンで置換することがヒト化抗体の軽鎖可変領域の高発現のために好ましい（配列番号１３）。ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子断片は発現ベクターｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１またはｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１２から分離し、ヒト抗体の軽鎖定常領域をコードする遺伝子を含む発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＣ（寄託番号:ＫＣＴＣ １０２３１ＢＰ、大韓民国特許公開番号第２００４−１２２６７号）に挿入し、ヒト化抗体軽鎖の発現ベクターを得る。このように構築した発現ベクターをそれぞれｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ ＬＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ １０５３２ＢＰ）及びｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ ＬＦ（寄託番号:ＫＣＴＣ １０５５３ＢＰ）と名付けた。ヒト化抗体の軽鎖全体をコードする遺伝子は軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ ＬＦ及びｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ ＬＦからを分離することができ、それぞれＬＦＷ２２−３１ ＬＦ及びＬＦＷ２２−３１２ＬＦと名付けた。
【００１８】
ヒト化軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ ＬＦＷ２２−３１ＬＦおよびｐＨＡＢ ＬＦＷ２２−３１２ ＬＦのそれぞれで形質転換したＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ’は２００３年１０月２９日付及び２００３年１１月２５日付でKorean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）（住所：Korea Research Insitute of Bioscience and Biotechnology, (KRIBB),#52, Oun-dong, Yusong-ku, Taejon,305-333,韓国）にブタペスト条約に従って寄託番号ＫＣＴＣ １０５３２ ＢＰ及びＫＣＴＣ １０５５３ＢＰで寄託した
【００１９】
ジーンポーター（ＧｅｎｅＰＯＴＥＲ）のような適切な形質転換溶液を用いてヒト化重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ ＨＦ及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ ＬＦでＣＨＯ細胞を形質転換し、ＨＢＶ Ｓ−表面抗原を特異的に認識するヒト化抗体を生産する形質転換体を製造することができ、形質転換体をＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１３と名付けた。更に、他の形質転換体をヒト化重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ ＨＦ及びヒト化軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ ＬＦを用いて前記と同様な方法で形質転換体を製造することができ、これをＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１５と名付けた。
【００２０】
形質転換体細胞系から本発明のヒト化抗体を精製するために、形質転換体ＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１３またはＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１５を適当な培地で培養し培養上清を、プロテインＡ（ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓｗｅｄｅｎ）またはヤギ抗−ヒト免疫グロブリンＧ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、Ｚｙｍｅｄ社）を用いるカラムクロマトグラフィ−に付す。このように精製したヒト化抗体をそれぞれＹＨＢ１１１０−１３及びＹＨＢ１１１０−１５と名付けた。
【００２１】
ＨＢＶ Ｓ−表面抗原を特異的に認識するヒト化抗体ＹＨＢ１１１０−１３及びＹＨＢ１１１０−１５は、６×１０７〜５×１０８Ｍ-１の抗原結合親和度を示し、これは本発明のヒト化抗体が以前に報告されたマウスモノクローン抗体と類似する抗原結合能力を維持するが、免疫誘発能力は顕著に減少し、Ｂ型肝炎ウイルスに関連する疾患の治療に副作用なしに效果的に用いられる。
【００２２】
このような目的で、本発明のヒト化抗体を薬学的組成物において有效成分として用い、ＨＢＶに関連する病気を治療できる。薬学的組成物は即時の、または延長された放出のため経口あるいは非経口用量形として製剤化できる。その組成物は希釈剤、充填剤、崩壊制、甘味制、潤滑剤、芳香剤等の薬学製品に通常用いられる非活性成分を含み得る。薬学組成物はボーラス注入または持続ドリップによる静脈投与のため、または移植カプセルからの放出のため好ましくは製剤化される。静脈投与の典型的な製剤は希釈剤として食塩水を用いる。
治療用投与のための抗体の製剤は当業者に知られていると考えられる。
【００２３】
患者のための用量は、用いられる具体的な抗体、体重、患者の年齢、性別、健康状態、食餌、投与期間および組成物の製剤、投与経路、処置すべき病気等によって変化する。典型的な用量は０．０１ｍｇ／ｋｇ／日〜１，０００ｍｇ／ｋｇ／日である。より典型的には用量は０．１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。
本発明の組成物は、患者に対する本発明の抗体の投与のために、治療剤として抗体が投与できる臨床的適応症、用量およびスケジュール、および／または禁忌を記載した印刷物を含むことができる。
【実施例１】
【００２４】
以下、本発明を実施例によりより詳しく説明する。但し、下記の実施例は、本発明を例示するためであり、本発明を限定するものではない。
実施例１
ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子の構築
ＨＢＶ Ｓ−表面抗原に対するマウス抗体Ａ９−１１−５（寄託番号:ＫＣＴＣ １８０２０Ｐ及びＫＣＴＣ １８０２１Ｐ）の重鎖可変領域をコードする遺伝子を鋳型として、プライマー対配列番号１と配列番号１２を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行うことによって、リーダー配列が含まれたヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子Ａを増幅した。増幅されたＰＣＲ産物はアガローズゲル電気泳動及びキアゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社、米国）を用いて回収した。
【００２５】
次に、精製された遺伝子Ａを、鋳型として配列番号１と配列番号３のプライマー対または配列番号２と配列番号１２のプライマー対を用いてＰＣＲに付した。それぞれの増幅されたＰＣＲ産物を制限酵素Ｓｔｕ Ｉ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて３７℃で２時間反応させて切断した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で１時間反応させて重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｂを製造した。
【００２６】
次に前記重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｂを鋳型として配列番号４と配列番号１２のプライマー対または配列番号１と配列番号５のプライマー対を用いてＰＣＲを行った。増幅されたＰＣＲ産物のそれぞれを制限酵素Ｐｓｔ Ｉ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて３７℃で２時間反応させて切断した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で1時間反応させて重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｃを製造した。
【００２７】
前記と同様な方法で、遺伝子Ｃを鋳型として、配列番号６と配列番号１２、または配列番号１と配列番号７のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した後、制限酵素ＳａｌＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）で切断して重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｄを得た。前記重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｄを配列番号８と配列番号１２のプライマー対、または配列番号１と配列番号９のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した後、制限酵素ＤｒａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）で切断して重鎖可変領域をコードする遺伝子Ｅを得た。前記重鎖可変遺伝子Ｅを配列番号１０と配列番号１２、または配列番号１と配列番号１１のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した後、制限酵素ＸｂａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて切断した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で１時間反応させて重鎖可変領域をコードする遺伝子Ａ９Ｖ７ＦＷ４２ＨＶを製造した。
【００２８】
また、前記と同様な方法で、重鎖可変領域をコードする遺伝子Ａ９Ｖ７ＦＷ４２ＨＶを再び鋳型として、配列番号２３と配列番号２５、または配列番号１と配列番号２４のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅を行なった。それぞれの増幅されたＰＣＲ産物を１：１モル比で混合した後、配列番号１と配列番号２５を用いて９５℃で２分、５８℃で２分、７２℃で２分の条件で３０回繰り返して重畳ＰＣＲ増幅を行い、最終的にヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子を製造し、これをＨＦＷ１４１と名付けた。
【００２９】
それぞれのＰＣＲ反応に用いられた塩基及びＰＣＲ条件は下記の表１に記述した。
それぞれのＰＣＲ反応は９５℃で５分間前処理した後、下記の表１の各条件により３０回繰り返して行った後、７２℃で１０分間最終延長を行った。
【表１】
2008501312.tif 000003
【００３０】
実施例２
ヒト化抗体の重鎖全体遺伝子の構築及びその発現ベクターの製造
ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子の高発現のためにヒト化抗体の重鎖リーダー配列の前方にコザック配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５、８１２５−８１４８、１９８７）を挿入し、重鎖リーダー配列４番目のアミノ酸であるロイシン（Ｌｅｕｃｉｎ）の塩基コドンを既存のＴＴＡから、動物細胞において使用頻度の高いコドンであるＣＴＧで置換して発現效率が高いプライマーを製作した。前記のように置換されたヒト化抗体の重鎖リーダー配列を下記の表２に記述した。
【表２】
2008501312.tif 000004
実施例１で製造したヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子ＨＦＷ１４１をＰＣＲベクターに挿入し、これをｐＣＲ−ＨＦＷ１４１と名付けた。
また、ヒト化抗体の重鎖全体遺伝子を製造するために、ヒト抗体の重鎖不変領域をコードする遺伝子が挿入されたｐＨＡＢ−ＨＣ（ＫＣＴＣ １０２２９ＢＰ、大韓民国特許公開番号第２００４−１２２６６号）発現ベクターを用いた。
【００３１】
まず、ヒト化抗体の重鎖可変領域をコードする遺伝子ＨＦＷ１４１を発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＣに挿入するため、前記で製造したｐＣＲ−ＨＦＷ１４１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて３７℃で２時間反応させて切断した後、１．５％アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド（ｅｔｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ、ＥｔＢｒ）染色を通じて約４５０ｂｐの遺伝子断片を確認した。
【００３２】
同様に発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＣを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩで切断して約６．５Ｋｂの切断された発現ベクターを確認した。その後、それぞれの遺伝子断片をキアゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ、Ｑｉａｇｅｎ社、米国）を用いて回収した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて１６℃で一晩反応させた後、大腸菌ＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換させて形質転換体を得た。得られた形質転換体を１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で一晩培養しプラスミドを回収した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｐａＩで切断して、約１．４Ｋｂのヒト化抗体の重鎖全体遺伝子を電気泳動を通じて分離した。
前記のような方法によって製造したヒト化抗体の重鎖全体をＨＦＷ１４１ ＨＦと名付けた。また、前記ヒト化抗体の重鎖全体遺伝子ＨＦＷ１４１ ＨＦが挿入されたヒト化抗体の重鎖発現ベクターをｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦと名付け（図３参照）、これを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換させた細胞株を２００３年１０月２９日付でKorean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）遺伝子バンクに寄託した（寄託番号:ＫＣＴＣ １０５３３ＢＰ）。
【００３３】
実施例３
ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子の構築
ＨＢＶ Ｓ−表面抗原を認識するマウスモノクローン抗体Ａ９−１１−５の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を鋳型として、配列番号１３と配列番号２２のプライマー対を用いてＰＣＲを行うことにより、リーダー配列が含まれた軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ａ’を増幅した。これをアガローズゲル電気泳動及びエチジウムブロマイド（ＥｔＢｒ）染色を通じて確認し、キアゲル抽出キット（ＱＩＡｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ）を用いて回収した。
【００３４】
次に精製された遺伝子Ａ’を鋳型として、配列番号１４と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号１５のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した。増幅された遺伝子を制限酵素ＫｐｎＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて３７℃で２時間反応させて切断した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で１時間反応させて軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｂ’を製造した。
一方、前記軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｂを鋳型として配列番号１６と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号１７のプライマー対を用いてＰＣＲ増幅した。増幅された遺伝子を制限酵素Ｍｓｃ Ｉ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて３７℃で２時間反応させて切断した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で１時間反応させて連結して軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｃ’を製造した。
【００３５】
前記と同様な方法で、軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｃ’を配列番号１８と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号１９のプライマー対を用いて増幅した後、制限酵素ＡｐａＬＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて切断し軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ｄ’を得、これを鋳型として配列番号２０と配列番号２２のプライマー対または配列番号１３と配列番号２１のプライマー対を用いてＰＣＲを行い、制限酵素ＳｍａＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて切断した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて常温で１時間反応させて軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ａ９Ｖ７ＬＶを製造した。
【００３６】
また、軽鎖可変領域をコードする遺伝子Ａ９Ｖ７ＬＶを鋳型として配列番号２６と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号２７のプライマー対を用いて下記の表３の条件でＰＣＲを行った。それぞれ増幅されたＰＣＲ産物を１：１モル比で混合した後、配列番号１３と配列番号２２を用いて、９５℃で２分、５８℃で２分、７２℃で２分の条件で３０回繰り返して重畳ＰＣＲ増幅を行って、最終的にヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を製造し、それをＬＦＷ２２と名付けた。
【００３７】
また、前記と同様な方法で、製造されたＬＦＷ２２を再び鋳型として配列番号２８と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号２９のプライマー対を用いて表３の条件でＰＣＲ増幅を行った。それぞれ増幅されたＰＣＲ産物を１：１モル比で混合した後、配列番号１３と配列番号２２を用いて、９５℃で２分、５８℃で２分、７２℃で２分の条件で３０回繰り返して重畳ＰＣＲ増幅を行い、最終的にヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を製造し、それをＬＦＷ２２−３１と名付けた。
【００３８】
また、前記と同様な方法で、製造されたＬＦＷ２２−３１を再び鋳型として配列番号３０と配列番号２２のプライマー対、または配列番号１３と配列番号３１のプライマー対を用いて表３の条件でＰＣＲ増幅を行った。それぞれ増幅されたＰＣＲ産物を１：１モル比で混合した後、配列番号１３と配列番号２２を用いて、９５℃で２分、５８℃で２分、７２℃で２分の条件で３０回繰り返して重畳ＰＣＲ増幅を行い、最終的にヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子を製造し、それをＬＦＷ２２−３１２と名付けた。
前記のＰＣＲ反応で用いられた塩基及びＰＣＲ条件を下記の表３に記述した。
それぞれのＰＣＲ反応は９５℃で５分間前処理した後、下記の表３の各条件によって３０回繰り返して行った後、７２℃で１０分間最終延長を行った。
【表３】
2008501312.tif 000005
【００３９】
実施例４
ヒト化抗体の軽鎖全体遺伝子の構築及びその発現ベクターの製造
ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子の高発現のために、ヒト化抗体の軽鎖リーダー配列の前方にコザック配列（Ｋｏｚａｋ、Ｍ．Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１５、８１２５−８１４８、１９８７）を挿入し、軽鎖リーダー配列遺伝子のうち８番目のアミノ酸を既存のフェニルアラニン（Ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ）から動物細胞において発現效率の高いロイシンで置換し、６番目のロイシンを暗号化するＣＴＴをＣＴＧに、７番目のイソロイシンを暗号化するＡＴＡをＡＴＣで置換して軽鎖の発現效率の高いプライマーを製作した。前記のように置換されたヒト化抗体の軽鎖リーダー配列を下記の表４に記述した。
【表４】
2008501312.tif 000006
【００４０】
実施例３で製造したヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子ＬＦＷ２２−３１をＰＣＲベクターに挿入し、これをｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１と名付けた。
【００４１】
また、ヒト化抗体の軽鎖全体遺伝子を製造するために、ヒト抗体の軽鎖不変領域をコードする遺伝子が挿入されたｐＨＡＢ−ＬＣ（ＫＣＴＣ１０２３１ＢＰ、大韓民国特許公開番号第２００４−１２２６７号）発現ベクターを用いた。
【００４２】
まず、ヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子ＬＦＷ２２−３１を発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＣに挿入するために、前記で製造したｐＣＲ−ＬＦＷ２２−３１を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩを用いて３７℃で２時間反応させ切断した後、１．５％アガロースゲル電気泳動とエチジウムブロマイド染色を行って約４００ｂｐの遺伝子断片を確認した。
【００４３】
同様に発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＣを制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＡｖｒＩＩで切断し、約５．６Ｋｂの切断された発現ベクターを確認した。その後、それぞれの遺伝子断片をキアゲル抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ社．米国）を用いて回収した後、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅ、ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）を用いて１６℃で一晩反応させた後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換させて形質転換体を得た。得られた形質転換体を１００ｕｇ／ｍｌのアンピシリンが含有されたＬＢ培地で一晩培養し、プラスミドを回収した後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ／ＮｏｔＩ（ＢｉｏＬａｂｓ社、米国）で切断して、約０．７Ｋｂのヒト化抗体の軽鎖全体遺伝子を、電気泳動を通じて確認した。
【００４４】
前記のような方法によって製造したヒト化抗体の軽鎖全体をコードする遺伝子をＬＦＷ２２−３１ＬＦと名付けた。また、前記遺伝子ＬＦＷ２２−３１ＬＦが挿入されたヒト化抗体の軽鎖発現ベクターをｐＨＡＢＬＦＷ２２−３１ＬＦと名付け （図４参照）、これを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換させた細胞株を２００３年１０月２９日付でKorean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）に寄託した（寄託番号:ＫＣＴＣ １０５３２ＢＰ）。
【００４５】
同様に、実施例３で製造したヒト化抗体の軽鎖可変領域をコードする遺伝子ＬＦＷ２２−３１２に対しても前記と同様な方法によって、ヒト抗体の軽鎖不変領域をコードする遺伝子が連結されたヒト化抗体の軽鎖全体をコードする遺伝子を製造し、これをＬＦＷ２２−３１２ ＬＦと名付けた。また、前記遺伝子ＬＦＷ２２−３１２ ＬＦが挿入されたヒト化抗体の軽鎖発現ベクターをｐＨＡＢＬＦＷ２２−３１２ ＬＦと名付け（図４参照）、これを用いてＥ．ｃｏｌｉ  ＴＯＰ１０Ｆ'を形質転換させた細胞株を２００３年１１月２５日付でKorean Collection for Type Cultures（ＫＣＴＣ）に寄託した（寄託番号:ＫＣＴＣ １０５５３ＢＰ）。
【００４６】
実施例５
ヒト化抗体のＣＨＯ細胞への形質転換
動物細胞でのヒト化抗体の活性を測定するために、前記実施例２及び実施例４でそれぞれ製造した重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ＨＦ及び軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ ＬＦを用いて、ＣＨＯ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６、米国）を形質転換させた。
【００４７】
まず、ＣＨＯ細胞を培養するために、ＤＭＥＭ／Ｆ１２培地（ＪＲＨ社、米国）に１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム（Ｓｏｄｉｕｍ Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ、Ｓｉｇｍａ社、米国）、１０％子牛血清（ｈｅａｔ ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ ＦＢＳ、Ｇｉｂｏ ＢＲＬ、米国）を添加した培養培地を利用した。５％二酸化炭素が供給された３７℃培養器（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で２日〜３日間前記細胞を培養した後、常温（２５℃）で１，２００ｒｐｍで５分間遠心分離して細胞を回収した。次に回収したＣＨＯ細胞を０．４％トリパンブルー（ｔｒｙｐａｎ ｂｌｕｅ、Ｇｉｂｏ ＢＲＬ、米国）溶液で染色し、ヘマトサイトメーター（ｈｅｍａｔｏｃｙｔｏｍｅｔｅｒ）を用いて細胞の数を測定し、約６ｘ１０６個の細胞をＴ−２２５フラスコ（または、Ｔ−７５フラスコ）に移して再び継代培養した。
【００４８】
前記継代培養したＣＨＯ細胞をフラスコ表面の約６０−９０％を占めるまで充分に増殖させた後、形質転換する遺伝子１０ｕｇと形質転換溶液であるジンポーター（ＧｅｎｅＰｏｔｅｒ）溶液４０μｌをＤＭＥＭ／Ｆ１２（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ ｍｅｄｉｕｍ、無血清）培地５ｍｌに混ぜて混合した。前記混合液を常温で１０乃至４５分間放置した後、培養液を除去した細胞とともに３７℃の培養基（ｈｕｍｉｄｉｆｉｅｄ ＣＯ２ ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で約３乃至５時間培養して、形質転換体を得、これをＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１３と名付けた。
【００４９】
同様に、前記実施例２及び実施例４でそれぞれ製造した重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ ＨＦ及び軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ＬＦを前記と同様な方法によって、ＣＨＯ細胞を形質転換させて形質転換体を得、これをＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１５と名付けた。
【００５０】
実施例６
ヒト化抗体の精製
前記実施例５で得た形質転換体ＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１３を培養してヒト化抗体遺伝子を発現させた。具体的に、細胞培養はＴ−７５フラスコに２ｘ１０６個の細胞を接種し、１０％子牛血清が含有されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地で培養した。前記の細胞培養液を回収して遠心分離した後、濾過して抗体が含まれた培養液のみを精製した。
【００５１】
また、培養液から抗体のみを精製するために、蛋白質−Ａ（ｐｒｏｔｅｉｎＡ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）とヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ（ｇｏａｔ−ａｎｔｉｈｕｍａｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ、Ｚｙｍａｄ社）が結合されているセファロ−ス４Ｂ（ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ）を用いた。抗体を蛋白質−Ａと結合させるために抗体が発現された前記の細胞培養液を蛋白質−Ａが結合されたカラム（ｃｏｌｕｍｎ）に通過させた後、ｐＨ２．５のグリシン（ｇｌｙｃｉｎｅ）緩衝液をカラムに導入しヒト化抗体を溶出した。その後、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ ８．０）緩衝液を前記抗体回収液の１／１０体積で添加して溶出液を中和した。中和した溶出液をヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧが結合されているセファロ−ス４Ｂ前記に適用し、ヒト化抗体蛋白質を特異的に捕獲した。
【００５２】
ヒト化抗体は、前記蛋白質−Ａカラムクロマトグラフィ−を用いる同様な方法を用いてヒト化抗体をさらに精製し、ＹＨＢ１１１０−１３と名付けた。
【００５３】
同様に、前記と同様な方法によって実施例５で得た形質転換体ＣＨＯ−ＹＨＢ１１１０−１５を培養し、培養上清から抗体を精製することによりヒト化抗体ＹＨＢ１１１０−１５を得た。
【００５４】
精製されたヒト化抗体のタンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動を行った結果、５０キロダルトン（ＫＤａ）および２５キロダルトン（ＫＤａ）バンドが観察され、それらは、それぞれヒト化抗体の重鎖および軽鎖として同定された（図５参照）。
【００５５】
実施例７
ヒト化抗体のＨＢＶ Ｓ−表面抗原に対する抗原結合親和力測定
実施例６で精製したヒト化抗体をサンドイッチＥＬＩＳＡ（ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡ）方法を用いて定量し、Ｓ−表面抗原（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｅｎｚｙｍｅ社、米国）エイデ−アル型（ａｄｒ ｔｙｐｅ）を用いて、その抗原結合活性を分析した。抗体を定量するために、マイクロプレート（Ｄｙｎａｔｅｃｈ社、米国）の各ウェルにヤギ抗ヒト免疫グロブリンＧ．Ａ．Ｍ（ｇｏａｔ−ａｎｔｉｈｕｍａｎ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ．Ａ．Ｍ、Ｚｙｍｅｄ社、米国）を１００ｎｇずつ入れて４℃で一晩反応させコーティングした。この時、マウスモノクローン抗体（Ａ９−１１−５）を対照として用いた。
【００５６】
次に、ＨＢＶ Ｓ−表面抗原に対する抗体の親和力を測定するために様々な濃度（１０-１１乃至１０-６Ｍ）の抗原溶液（各１００μｌ）に５ｎｇのマウスモノクローン抗体（Ａ９−１１−５）、ヒト化抗体ＹＨＢ１１１０−１３及びＹＨＢ１１１０−１５をそれぞれ混ぜた後、３７℃で１時間反応させ、０.５ｕｇの抗原がコーティングされているプレートの各ウェルに添加して３７℃で約２時間放置した。次に、各ウェルに西洋わさび過酸化分解酵素（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合されたヤギ抗−ヒトポリクローン抗体（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＢｉｏＲａｄ社、米国）を１，０００倍希薄して１００μｌずつ加えて３７℃で１時間反応させた後、西洋わさび過酸化分解酵素基質キット（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｋｉｔ、ＢｉｏＲａｄ社、米国）で発色させて吸光度を測定した。
【００５７】
前記で測定した吸光度から、抗原に結合した抗体と結合していない抗体の濃度を換算して抗体の抗原に対する親和度を測定し（Ｆｒｉｇｕｅｔ、ｅｔ ａｌ．１９８５、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．７７、３０５−３１９）、その結果を表５に示した。
【表５】
2008501312.tif 000007
【００５８】
上記の表５に記述されたように、本実施例のヒト化抗体ＹＨＢ１１１０−１３の抗原結合親和度はマウスモノクローン抗体（Ａ９−１１−５）の抗原結合親和度とほぼ同等な水準であることを確認した（図６参照）。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】ＨＢＶ Ｓ−表面抗原に対するマウスモノクローン抗体の重鎖（Ａ９−１１−５）、ヒト化抗体の重鎖（ＨＦＷ１４１）及びヒト抗体の重鎖サブグループ２番（Ｈｈ２）のアミノ酸配列を比較して示した図である。
【図２】ＨＢＶ Ｓ−表面抗原に対するマウスモノクローン抗体の軽鎖（Ａ９−１１−５）、ヒト化抗体の軽鎖（ＬＦＷ２２−３１及びＬＦＷ２２−３１２）及びヒト抗体の軽鎖サブグループ７番（ｈＶ７）のアミノ酸配列を比較して示した図である。
【図３】ヒト化抗体重鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＨＦＷ１４１ ＨＦを製造する過程を図式化した図である。
【図４】ヒト化抗体軽鎖発現ベクターｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１ＬＦ及びｐＨＡＢ−ＬＦＷ２２−３１２ＬＦを製造する過程の図式化した図である。
【図５】動物細胞で生産及び精製された本発明によるヒト化抗体のＳＤＳポリアクリルアマイドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ｐｏｌｙａｃｙｌａｍｉｄｅ ｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）結果を示す。レーン１はマウス抗体；レーン２はＹＨＢ−１１１０−１３；レーン３はＹＨＢ−１１１０−１５を示す。
【図６】本発明によるヒト化抗体ＹＨ１１１０−１３及びＹＨＢ１１１０−１５のＨＢＶ Ｓ−表面抗原に対する抗原結合親和度を示したグラフである。
【表６】
2008501312.tif 000008
【表７】
2008501312.tif 000009
【表８】
2008501312.tif 000010
【図１】
2008501312.tif 000011
【図２】
2008501312.tif 000012
【図３】
2008501312.tif 000013
【図４】
2008501312.tif 000014
【図５】
2008501312.tif 000015
【図６】
2008501312.tif 000016
【配列表】
2008501312000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成18年12月11日(2006.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008501312000001.app
【国際調査報告】
2008501312.tif 000033
2008501312.tif 000034
2008501312.tif 000035