(57)【要約】  一般式（Ｉ）ＣＲ１Ｒ２＝ＣＲ３Ｒ４（Ｉ）［式中、Ｒ１及びＲ２は等しいか又は異なり、各々が水素原子又は重合反応に有害ではない置換基を表し；Ｒ３及びＲ４各々が、水素原子又は重合反応に有害ではない置換基を表す（ただし、Ｒ３及びＲ４の両方が水素原子ではない）］の少なくとも１つのモノマーを、マクロ多孔性クリオゲル上に重合させることによって形成されるポリマー鎖をその上にグラフトされたマクロ多孔性クリオゲルが開示される。グラフト（共）重合による該マクロ多孔性クリオゲルの調製方法及び分離工程における該マクロ多孔性クリオゲルの使用もまた開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
一般式（Ｉ）
ＣＲ１Ｒ２＝ＣＲ３Ｒ４              （Ｉ）
［式中、Ｒ１及びＲ２は等しいか又は異なり、各々が水素原子又は重合反応にとって有害ではない置換基を表し；かつ
Ｒ３及びＲ４各々が、水素原子又は重合反応にとって有害ではない置換基を表す（ただし、Ｒ３及びＲ４の両方が水素原子ではない）］
の少なくとも１つのモノマーをマクロ多孔性（ｍａｃｒｏｐｏｒｏｕｓ）クリオゲル上に重合させることによって形成されるポリマー鎖をその上にグラフトされた、マクロ多孔性（ｍａｃｒｏｐｏｒｕｓ）クリオゲル。
【請求項２】
Ｒ１及びＲ２の両方が水素原子であるか、Ｒ１及びＲ２の一方が水素原子を表し、他方が、アルコール、有機酸、エーテル、エステルアミド及びそのＮ−置換アミド、アミン、Ｎ−置換アミン、複素環芳香族環並びにそれらの誘導体からなる群より選択される置換基を表す、請求項１記載のマクロ多孔性クリオゲル。
【請求項３】
Ｒ３及びＲ４の一方が水素原子又はアルキル基を表し、他方が、カルボキシル基並びにアルコール、有機酸、エーテル、エステル、アミド及びそのＮ−置換アミド、アミン、Ｎ−置換アミン、複素環芳香族環等のような誘導体からなる群より選択されるメンバーである、請求項１又は請求項２記載のマクロ多孔性クリオゲル。 
【請求項４】
該カルボキシル基の誘導体が、その誘導体に結合した親和性リガンドを含有する誘導体である、請求項３記載のマクロ多孔性クリオゲル。
【請求項５】
該一般式（Ｉ）の少なくとも１つのモノマーが、アクリル酸（ＡＡｃ）、メタクリル酸（ＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−アミノエチル−メタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、（２−（メタクリロイルオキシ）エチル）−トリメチルアンモニウムクロライド（ＭＥＴＡ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、Ｎ−ビニルイミダゾール（ＶＩ）、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、ヒドロキシ−エチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、アクリルアミド、メチレン−ビス−アクリルアミド（ＭＢＡＡ）ジアリルタルタルアミド（ＤＡＴＡｍ）、ジアリルアクリルアミド（ＤＡＡｍ）、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート（ＰＥＧ−Ｄ（Ｍ）Ａ）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧＥ）、３−（アクリルアミド）フェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）及びそれらの誘導体からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーである、請求項１記載のマクロ多孔性クリオゲル。
【請求項６】
マクロ多孔性クリオゲルが、アクリル酸及びその誘導体からなる群より選択されるモノマーを共重合させることによって調製されるクリオゲルであって、該モノマーの１つがアクリルアミドである、請求項１〜５のいずれかに記載のマクロ多孔性クリオゲル。
【請求項７】
マクロ多孔性クリオゲルが、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドとのラジカル共重合によって調製されるクリオゲルである、請求項６記載のマクロ多孔性クリオゲル。
【請求項８】
マクロ多孔性クリオゲルが、グルタルアルデヒドのような二官能性試薬によって架橋されたポリ（ビニルアルコール）クリオゲルであって、かつ該一般式（Ｉ）の少なくとも１つのモノマーが、全て重合可能な二重結合を含む、アルコール、有機酸、エーテル、エステルアミド及びそのＮ−置換アミド、アミン、Ｎ−置換アミン、複素環芳香族化合物からなる群より選択されるメンバーである、請求項１記載のマクロ多孔性ゲル。
【請求項９】
モノリスの形状である、請求項１〜８のいずれかに記載のマクロ多孔性クリオゲル。
【請求項１０】
一般式（Ｉ）
ＣＲ１Ｒ２＝ＣＲ３Ｒ４              （Ｉ）
［式中、Ｒ１及びＲ２は等しいか又は異なり、各々が水素原子又は重合反応にとって有害ではない置換基を表し；かつ
Ｒ３及びＲ４各々が、水素原子又は重合反応にとって有害ではない置換基を表し（ただし、Ｒ３及びＲ４の両方が水素原子ではない）］
の少なくとも１つのモノマーの、マクロ多孔性クリオゲル上へのグラフト（共）重合の方法であって、該方法が、上記一般式（Ｉ）の少なくとも１つのモノマーとマクロ多孔性ポリアクリルアミドクリオゲルとを、開始剤としてジペルヨーダトクプラートカリウムの存在下で反応させることを含む、方法。 
【請求項１１】
乾燥マクロ多孔性ポリアクリルアミドクリオゲルを、該一般式（Ｉ）の少なくとも１つのモノマーとジスペルヨーダトクプラート（ｄｉｓｐｅｒｉｏｄａｔｏｃｕｐｒａｔｅ）カリウムとのアルカリ水溶液と接触させる、請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
乾燥マクロ多孔性ポリアクリルアミドクリオゲルが、カラム中でジスペルヨーダトクプラートカリウムのアルカリ水溶液で飽和され、その後該一般式（Ｉ）の少なくとも１つのモノマーの水溶液又は水−有機溶液をカラムを通過させることによって該アルカリ水溶液がクリオゲルから置換され、その後グラフト（共）重合が進行することが可能となる、請求項１０記載の方法。
【請求項１３】
請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法で調製された、その上にポリマー鎖をグラフト化されたマクロ多孔性クリオゲルが、その上に親和性リガンドを導入する試薬とさらに反応させられる、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
アクリルアミド及びアクリル酸からなる群より選択されるモノマーをマクロ多孔性クリオゲル上にグラフト重合する方法であって、該方法が、重合反応のための開始剤及び活性剤からなる群より選択される少なくとも１つのメンバーの存在下で、該モノマーとマクロ多孔性ポリ（ビニルアルコール）クリオゲルとを反応させることを含む、方法。
【請求項１５】
分離工程における、請求項１〜９記載のいずれかに記載のマクロ多孔性クリオゲルの使用。
【請求項１６】
該マクロ多孔性クリオゲルが、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び（２−（メタクリロイルオキシ）エチル）−トリメチルアンモニウムクロライドからなる群より選択されるモノマーのポリアクリルアミドクリオゲルの表面上へのグラフト重合によって調製される三級及び四級アミノ基を保有するマクロ多孔性ポリアクリルアミドクリオゲルであり、かつ該マクロ多孔性クリオゲルがＲＮＡ及びｇＤＮＡのクロマトグラフィのために用いられる、該請求項１５記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はマクロ多孔性ハイドロゲル、その調製方法及びそのようなマクロ多孔性クリオゲルの使用に関する。より詳細には、本発明は、その表面上にポリマー鎖がグラフトされたマクロ多孔性ハイドロゲル及びそのようなマクロ多孔性ハイドロゲルの調製方法及びそのようなマクロ多孔性ハイドロゲルの分離工程における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイドロゲルは、大量の水を保持しつつ、同時にそれらの形状を維持する能力をもつ、物理的又は化学的に架橋された３次元のポリマーネットワークによって形成される。低い界面張力及び親水性の性質は、ハイドロゲルを高度に生体適合性にし、それらのクロマトグラフィの材料、分子及び細胞の固定化のための担体、電気泳動及び免疫拡散のための基質、微生物及び哺乳動物細胞の培養のための足場、インプラント並びに薬物送達系としての使用を含む、生物工学及び生物医学におけるそれらの数多くの適用を可能とする。異なる適用のためのハイドロゲルの増加する需要は、改良された性質をもつ新しいタイプのハイドロゲルの入手法を必要とする。ポリマー材料の骨格上へとポリマー鎖をグラフトすることは、ポリマー材料の性質を改良するための便利な方法として指摘されている。
【０００３】
末端に結合したポリマー鎖をもつハイドロゲル（グラフトされたハイドロゲル）は、いくつかの方法によって調製され得る。重合混合物がマクロモノマーを含有していた場合、又は事前に形成された可溶性グラフトコポリマーの架橋の結果、グラフトされたハイドロゲルが形成された。新たな温度及びｐＨ感受性ハイドロゲルが、この方法によって取得された。しかし、このアプローチは、時間を要し、かつ場合によってはかなり複雑である、マクロモノマー又はグラフトコポリマーの調製を必要とする。さらに、そのようなグラフトされたハイドロゲルにおいて、グラフトされたポリマー鎖の局在及び密度を制御するのは困難である。
【０００４】
一方で、ゲル表面へポリマーをグラフティングすることは、ゲル表面上の反応基と事前に形成されたポリマーの反応性末端基との間の化学結合を介して達成され得る（いわゆるグラフティング・トゥー（ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｔｏ））。ここでの明らかな利点は、グラフトされるポリマーの性質（分子量、ＭＷ分布）を事前に決定できることである。問題点は、ハイドロゲルは、グラフティングに適切な反応基を有すべきであり、グラフトされた鎖は、適した官能基をその端に保有すべきことである。グラフティング・トゥー法を用いて高いグラフティング密度を達成することは、既に結合したポリマー分子によるゲル表面における反応性部位の立体的な込み合いのために非常に困難である。さらに、グラフティング・トゥー法の効率はかなり低く、末端が修飾されたポリマーの明白な損失をもたらす。
【０００５】
表面に結合した開始剤を用いた表面開始重合（グラフティング・フロム（ｇｒａｆｔｉｎｇ  ｆｒｏｍ）ともまた呼ばれる）は、ポリマーブラシの密度及び厚さを制御するための、強力な代替法である。それは、ハイドロゲル形成ポリマーの骨格上の活性部位の形成を必要とし、望ましい重合は、これらの反応性部位から開始される。重合反応の間、ポリマー鎖は、表面から「育つ（ｇｒｏｗ）」。長鎖及び高密度のポリマーがグラフトされたグラフト型ハイドロゲルは、この方法で調製され得る。しかし、いくつかのグラフトされていないポリマーがまた、反応の間に溶液中に形成され、したがってグラフティング効率を低下させる。開始剤としてＣｅ（ＩＶ）を用いることは、ヒドロキシル基又はエポキシ基を含むハイドロゲル上へと種々のビニルモノマーをグラフト重合するために、幅広く用いられているアプローチである。担体表面上のヒドロキシル基の密度及び用いられる触媒の量が、グラフティングの密度を決定する。高いグラフト密度をもつハイドロゲルが、この方法を用いることによって調製された（Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｗ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．１９９０；５１０（１）：１３３−１４０．）。
【０００６】
グラフティング・フロムアプローチでは、ゲル相の内部のモノマーの分散が制限される（特に高いポリマー密度をもつゲルでは）ため、グラフティングは、ハイドロゲルと液相との界面にて主に起こることが期待される。したがって、ゲル相の高い密度によって、グラフティングは、ゲル−液界面にて主に起こる。
【０００７】
Ａｂｅｅｒ  Ａｂｄ  Ｅｌ−Ｈａｄｉ（Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３８（２００３）１６５９−１６６）は、マクロ多孔性ハイドロゲル、クリオゲルの調製法を開示し）、γ線照射による重合の結果、ＰＶＡクリオゲルの孔内におけるＮ−ＩＰＡＡｍ及びＨＥＭＡコポリマーの架橋ネットワークがもたらされた。この孔内部の架橋ネットワークの形成は、材料を通る液体の乏しい流れをもたらし、それは自然な選択であり得る生産された材料をもとのまま用いるのではなく、材料を小さな（直径２〜３ｍｍ）顆粒にカットする（１６６０ページ）という筆者らの選択を説明する。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
発明の概要
本発明によれば、グラフティング・フロムアプローチを用いてハイドロゲルへポリマー鎖をグラフティングする場合のグラフティング度は、該ハイドロゲルとしてマクロ多孔性クリオゲルを用いることによって改良され得ることが見出された。
【０００９】
本発明のグラフティング方法は、グラフトされたポリマーのブラシの、孔壁の表面での生成をもたらす。本発明のポリマーブラシでの孔壁の修飾は、多孔性材料を通る液体の流れを妨害せず、したがって、例えば、細胞懸濁物が材料を通過することを可能とする。本発明の方法は、ポリマーブラシの化学組成とは別にそれらの密度及び厚さの微調整を許容するのに対して、Ａｂｅｅｒ  Ａｂｄ  Ｅｌ−Ｈａｄｉによって開示された方法は、架橋されたポリマーネットワークの化学組成におけるバリエーションのみを許容する。本発明の方法によって生産された材料、及びＡｂｅｅｒ  Ａｂｄ  Ｅｌ−Ｈａｄｉによって開示された方法によって生産された材料は、異なる目的のために設計されている。Ａｂｅｅｒ  Ａｂｄ  Ｅｌ−Ｈａｄｉによって開示された方法によって生産された材料は、細胞が材料内に捕捉されることを保障して細胞を固定化するために用いられる一方で、本発明の方法に従って生産された材料は、細胞が孔を容易に通過して、ポリマーブラシと所定の方法で相互作用できることを保障して、タンパク質と細胞とを分離するために用いられる。
【００１０】
したがって、本発明の第一の態様によれば、マクロ多孔性クリオゲル上へ少なくとも１つのモノマーを重合することによって形成されるポリマー鎖がその上にグラフトされた、マクロ多孔性クリオゲルが提供される。
【００１１】
本発明の別の態様によれば、マクロ多孔性クリオゲル上へのモノマー（単数）又はモノマー（複数）のグラフト（共）重合の方法であって、開始剤としてジペルヨーダトクプラート（ｄｉｐｅｒｉｏｄａｔｏｃｕｐｒａｔｅ）カリウムが用いられる方法が提供される。
【００１２】
本発明のさらなる態様によれば、分離工程における本発明のマクロ多孔性クリオゲルの使用が提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
本発明の第一の態様によれば、一般式（Ｉ）
ＣＲ１Ｒ２＝ＣＲ３Ｒ４      （Ｉ）
［式中、Ｒ１及びＲ２は等しいか又は異なり、各々が水素原子又は重合反応にとって有害ではない置換基を表し；かつ
Ｒ３及びＲ４各々が、水素原子又は重合反応にとって有害ではない置換基を表す（ただし、Ｒ３及びＲ４の両方が水素原子ではない）］
の少なくとも１つのモノマーをマクロ多孔性クリオゲル上に重合することによって形成されるポリマー鎖がその上にグラフトされた、マクロ多孔性クリオゲルが提供される。
【００１４】
上記式（Ｉ）において、記号Ｒ１及びＲ２は、例えば、両者とも水素原子を表していてもよく、あるいはＲ１及びＲ２の一方が水素原子を表し、他方がアルコール、有機酸、エーテル、エステル、アミド及びそのＮ−置換アミド、アミン、Ｎ−置換アミン、複素環芳香族環並びにそれらの誘導体からなる群より選択される置換基を表す。
【００１５】
上記式（Ｉ）の記号Ｒ３及びＲ４については、Ｒ３及びＲ４の一方が水素原子又は１〜３個の炭素原子のアルキル基を表していてもよく、他方がカルボキシル基並びにアルコール、有機酸、エーテル、エステル、アミド及びそのＮ−置換アミド、アミン、Ｎ−置換アミン、複素環芳香族環等のような誘導体からなる群より選択されるメンバーである。
【００１６】
Ｒ３及びＲ４の１つの特に興味深い意味は、そこに結合した親和性リガンドを含む誘導体である。
【００１７】
式（Ｉ）のモノマーの好ましいクラスは、アクリル酸（Ｒ１＝Ｒ２＝Ｒ３＝Ｈ）及びメタクリル酸（Ｒ１＝Ｒ３＝Ｈ；Ｒ２＝ＣＨ３）（Ｒ４＝ＣＯＯＨ）並びに該酸のエステル及びアミドのような誘導体を含む。
【００１８】
本発明において用いられる一般式（Ｉ）のモノマーの例としては、アクリル酸（ＡＡｃ）、メタクリル酸（ＭＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチル−メタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）、（２−（メタクリロイルオキシ）エチル）−トリメチルアンモニウムクロライド（ＭＥＴＡ）、Ｎ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩＰＡＭ）、Ｎ−ビニルイミダゾール（ＶＩ）、グリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）、ヒドロキシ−エチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）、アクリルアミド、メチレン−ビス−アクリルアミド（ＭＢＡＡ）ジアリルタルタルアミド（ｄｉａｌｌｙｌｔａｒｔａｒａｍｉｄｅ）（ＤＡＴＡｍ）、ジアリル−アクリルアミド（ｄｉａｌｌｙｌａｃｒｙａｌａｍｉｄｅ）（ＤＡＡｍ）、ポリエチレングリコールジ（メタ）アクリレート（ＰＥＧ−Ｄ（Ｍ）Ａ）、ポリプロピレングリコールジグリシジルエーテル（ＰＥＧ−ＤＧＥ）、３−（アクリルアミド）フェニルボロン酸（ＡＰＢＡ）及びそれらの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。
【００１９】
マクロ多孔性クリオゲル及びそれらの調製の方法は、以前に記載されている。例えば、ＷＯ  ０３／０４１８３０  Ａ２が参照されてもよく、その開示は全体として、参照によって本明細書中に組み込まれるものとする。
【００２０】
ＷＯ  ０３／０４１８３０  Ａ２によれば、クリオゲルは： 
Ｎ−置換及び非置換（メタ）アクリルアミド；
Ｎ−アルキル置換Ｎ−ビニルアミド；
ヒドロキシアルキル（ｈｙｄｒｏｘｉａｌｋｙｌ）（メタ）アクリレート；
ビニルアセテート；
ビニルアルコールのアルキルエーテル；
環置換スチレン誘導体；
ビニルモノマー；
（メタ）アクリル酸及びその塩；
ケイ酸及び
重縮合を介してポリマーを形成する能力のあるモノマー；
からなる群より選択される１つ以上の水溶性モノマーの水溶液を、水性溶媒の結晶点より低い温度にて凍結下で重合させることによって、調製されてもよく、そこで系における溶媒は部分的に凍結し、クリオゲルが形成するまで、溶解した物質が溶媒の非凍結画分に濃縮される。
【００２１】
本発明のマクロ多孔性クリオゲルの好ましい実施形態によれば、その上へとモノマーを重合させることによってポリマー鎖をグラフトさせる基本のクリオゲルは、アクリル酸及びその誘導体からなる群より選択されるモノマーであって、該モノマーの１つがアクリルアミドであるモノマーを共重合させることによって調製されるクリオゲルである。好ましくは、該基本のマクロ多孔性クリオゲルは、アクリルアミドとＮ，Ｎ’−メチレン−ビス−アクリルアミドとのラジカル共重合によって調製されたクリオゲルである。
【００２２】
本発明のマクロ多孔性クリオゲルの別の実施形態によれば、その上へとモノマーを重合させることによってポリマー鎖をグラフトさせる基本のクリオゲルは、二官能性試薬（例、グルタルアルデヒド）によって架橋されたポリ（ビニルアルコール）クリオゲルであって、かつ該一般式（Ｉ）の少なくとも１つのモノマーが、全て重合可能な二重結合を含む、アルコール、有機酸、エーテル、エステル、アミド及びそのＮ−置換アミド、アミン、Ｎ−置換アミン、複素環芳香族化合物からなる群より選択されるメンバーである。
【００２３】
本発明のクリオゲルは、好ましくはモノリスの形状である。
【００２４】
本発明に従ってモノマーを重合させることによってその上へとポリマー鎖をグラフトさせる基本のクリオゲルのモノリスは、例えば、ＷＯ  ２００４／０８７２８５  Ａｌ中に開示されているような方法を用いることによって調製されてもよく、その開示は全体として、参照によって本明細書中に組み込まれるものとする。あるいは、クリオゲルモノリスは、管中に出発モノマーの水溶液を調製し、系における溶媒が部分的に凍結し、クリオゲルが形成されるまで溶解した物質が溶媒の非凍結画分中に濃縮されるように水性溶媒の結晶点より低い温度にて管を凍結することによって単に調製されてもよく、その後、そのように取得されたクリオゲル基質の解凍及び洗浄が行われる。
【００２５】
クリオゲルのモノリスはまた、市販もされている（例、Ｐｒｏｔｉｓｔａ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ＡＢ社，Ｌｕｎｄ，Ｓｗｅｄｅｎのポリアクリルアミドベースのクリオゲルモノリス）。
【００２６】
本発明の別の態様によれば、一般式（Ｉ）
ＣＲ１Ｒ２＝ＣＲ３Ｒ４              （Ｉ）
（式中、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＲ４は上記のとおりである）の少なくとも１つのモノマーの、マクロ多孔性クリオゲル上へのグラフト（共）重合の方法が提供され、その方法は、上記のとおりの該一般式（Ｉ）の少なくとも１つのモノマーを、開始剤としてジペルヨーダトクプラート（ｄｉｐｅｒｉｏｄａｔｏｃｕｐｒａｔｅ）カリウムの存在下でマクロ多孔性ポリアクリルアミドクリオゲルと反応させることを含む。
【００２７】
本発明の方法の１実施形態によれば、乾燥マクロ多孔性ポリアクリルアミドクリオゲルは、該一般式（Ｉ）の少なくとも１つのモノマーとジペルヨーダトクプラート（ｄｉｐｅｒｉｏｄａｃｔｏｃｕｐｒａｔｅ）とのアルカリ水性溶液と接触させられる。
【００２８】
本発明の方法の別の実施形態によれば、乾燥マクロ多孔性ポリアクリルアミドクリオゲルは、カラム中でジペルヨーダトクプラートカリウムのアルカリ水溶液で飽和され、その後該アルカリ水溶液は、該一般式（Ｉ）の少なくとも１つのモノマーの水溶液又は水−有機溶液をカラムに通過させることによって、クリオゲルから置換され、その後グラフト（共）重合が進行することが可能となる。
【００２９】
本発明の方法のこれらの実施形態において用いられるアルカリ水溶液は、好ましくはアルカリ金属水酸化物、好ましくは水酸化ナトリウムによってアルカリ性にされる。アルカリ金属水酸化物の濃度及びアルカリ金属水酸化物対モノマー比は、グラフティング度及びグラフトされたポリマー鎖の密度のようなグラフト重合パラメータに大いに影響することが見出された。したがって、グラフティング度及びグラフトされた鎖の密度は、アルカリ金属水酸化物：モノマー比を、グラフティング度及びグラフトされた鎖の密度の最大値を与える特定の比まで、又はグラフティング度及びグラフトされた鎖の密度がプラトーになる特定の比まで上昇させることによって、有意に上昇され得る。各具体的な場合における最適比は、用いられる系の具体的な構成要素（すなわち、アルカリ金属水酸化物、モノマー（単数）又はモノマー（複数）、及びグラフティングが行われるマクロ多孔性ポリアクリルアミドクリオゲル）に依存する。本発明の方法における使用のための有用な比は、過度の実験をすることなく、アルカリ金属水酸化物対モノマー比を変化させる一連の実験によって、容易に推定され得る。例えば、水酸化ナトリウムを含有するアクリル酸の水溶液から、アクリル酸をマクロ多孔性ポリアクリルアミドゲル上へとグラフティングすることを含む系の場合、本発明の方法において用いるための適当なＮａＯＨ：アクリル酸のモル比は、一般的に２：１〜８：１、好ましくは３：１〜７：１、より好ましくは４：１〜６：１の範囲内である。
【００３０】
グラフティング度はまた、用いられる反応温度に依存する。最大のグラフティング度が取得されるまで反応温度を上昇させることによって、グラフティング度を上昇させてもよい。反応温度におけるさらなる上昇は、グラフティング度及びグラフティングの密度の減少をもたらし、これはおそらくグラフトされたポリマー鎖の終結の率の上昇が原因である。最適反応温度は、用いられる具体的な系によって変化する。したがって、２５℃〜７５℃の範囲の異なる温度それぞれにて、アクリル酸をマクロ多孔性ポリアクリルアミドクリオゲル上へとグラフトした一連の実験においては、２５℃から４５℃まで温度を上昇させるとともにグラフティング度が上昇したが、その後の反応温度における上昇は、グラフティング度及びグラフティングの密度における減少をもたらした。
【００３１】
グラフティング度はまた、反応溶液の開始剤濃度を変化させることによって、影響され得る。従って、グラフティング度は、開始剤濃度を、グラフティング度がプラトーになる値まで上昇させるとともに、上昇するであろう。
【００３２】
本発明のさらなる態様によれば、分離工程における本発明のマクロ多孔性クリオゲルの使用が提供される。
【００３３】
グラフティング過程において用いられる異なるモノマー及びグラフティング後の鎖の可能な修飾に基き、本発明のマクロ多孔性ハイドロゲルは、基本のマクロ多孔性クリオゲルが用いられ得る全てのタイプの分離工程において用いられ得る。
【００３４】
特許請求されたマクロ多孔性クリオゲルが用いられ得る分離工程の例としては、タンパク質、封入体、プラスミドＤＮＡ、ウイルス、細胞小器官、微生物細胞及び哺乳類細胞の分離が挙げられるが、それらに限定されない。
【００３５】
本発明のこの態様の使用の実施形態によれば、本発明のマクロ多孔性クリオゲルは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭＡ）及び（２−（メタクリロイルオキシ）エチル）−トリメチルアンモニウムクロライドからなる群より選択されるモノマーを、ポリアクリルアミドクリオゲルの表面上へとグラフト重合させることによって調製される三級及び四級アミノ基を保有するマクロ多孔性クリオゲルであり、そこで該マクロ多孔性クリオゲルはＲＮＡ及びｇＤＮＡのクロマトグラフィに用いられる。
【００３６】
これから、本発明を幾つかの具体的な実施例によってさらに説明するが、これら実施例は、例示のみを目的としており、本発明を限定するものと解釈すべきではない。
【実施例】
【００３７】
実施例１  マクロ多孔性ポリアクリルアミド（ｐＡＡｍ）クリオゲル上へのアクリル酸のグラフト重合
Ａ．マクロ多孔性クリオゲルの調製
水溶液中で、Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−エチレンジアミン（ＴＥＭＥＤ）及び過硫酸アンモニウム（ＡＰＳ）の存在下、アクリルアミド（ＡＡｍ、９９，９％より高い純度）及びメチレン−ビス−アクリルアミド（ＭＢＡＡ）を、８：１のＡＡｍ／ＭＢＡＡ比で、ＡＡｍ＋ＭＢＡＡ＝溶液の６重量％の合計濃度で、かつＴＥＭＥＤ並びにＡＰＳを各１，２重量％（ＡＡｍ＋ＭＢＡＡｍの総重量に対して算出した）の量を用いて共重合させることによって、マクロ多孔性クリオゲルを、ガラス管中で調製した。管内の反応溶液を、−１２℃にて凍結させ、２０時間この温度にて保った。解凍及び水（２００ｍｌ）での洗浄後、そのように取得したゲル基質（ＡＡｍ−クリオゲルモノリス）を６０℃にて乾燥し、乾燥状態中にて保管した。
【００３８】
Ｂ．ジペルヨーダトクプラート（Ｃｕ（ＩＩＩ））カリウム溶液の調製
Ｃｕ（ＩＩＩ）溶液を、以下のように調製した；ＣｕＳＯ４  ５Ｈ２Ｏ（３．５４ｇ）、ＫＩＯ４（６．８２ｇ）、Ｋ２Ｓ２Ｏ８（２．２０ｇ）及びＫＯＨ（９．００ｇ）を、２００ｍｌの脱イオン水に添加した。混合物を、４０分間煮沸した。室温まで冷却後、混合物をろ過し、ろ液を２５０ｍｌまで脱イオン水で希釈した。Ｃｕ（ＩＩＩ）の最終濃度は、０．０５６２Ｍであった。
【００３９】
Ｃ．ポリアクリルアミド（ｐＡＡｍ）クリオゲルモノリス上へのアクリル酸（ＡＡｃ）のグラフト重合
適当量のアクリル酸（ＡＡｃ）及びＮａＯＨを混合し、Ｃｕ（ＩＩＩ）溶液を添加する前に、反応溶液を窒素で１０分間フラッシュした。総容積を、脱イオン水で１０ｍｌに調整した。上記セクションＡに従って調製した乾燥ｐＡＡｍ−クリオゲル（０．１５±０．０３ｇ）を、反応溶液中に浸した。重合を、２時間、規定の温度にて行った。グラフト共重合を、異なる濃度のＮａＯＨ、ＡＡｃ及び開始剤並びに異なる温度を用いて行った。反応が終了後、クリオゲルを、０．１Ｍ  ＨＣｌで洗浄し、引き続き過剰量の熱い脱イオン水で洗浄した。
【００４０】
Ｄ．ＡＡｃ−グラフト化ｐＡＡｍクリオゲルによるＣｕ（ＩＩＩ）及びリゾチームの結合
Ｃｕ（ＩＩ）結合を、異なるグラフティング度を有するＡＡｃグラフト化ｐＡＡｍクリオゲルを、０．２Ｍ  ＣｕＳＯ４の溶液で飽和させ、非結合のＣｕ（ＩＩ）イオンを水で洗浄し、結合したＣｕ（ＩＩ）イオンを０．１Ｍ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．３）で溶出することによって測定した。リゾチーム結合を、ＡＡｃグラフト化ｐＡＡｍクリオゲルをリゾチーム（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）中、１ｍｇ／ｍｌ）で飽和させ、非結合のリゾチームを洗浄し、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）中、１．５Ｍ  ＮａＣｌで溶出することによって測定した。
【００４１】
グラフティングは、グラフティング度（Ｇ）として示し、ＡＡｃグラフティングの密度（Ｄ）及びグラフティング重合のグラフティング収率（Ｅ）は、以下のように定義し、算出した：
Ｇ（％）＝［（Ｗ１−Ｗ０）／Ｗ０］×１００％、
Ｄ１（ｍｍｏｌ／ｇ）＝［（Ｗ１−Ｗ０）／Ｗ１］×（１０００／ＭＡＡｃ）、
Ｅ（％）＝（Ｗ１−Ｗ０）／Ｗ２×１００％、
ここで、Ｗ０及びＷ１は、最初のサンプル及びグラフト化したサンプルそれぞれの重量（ｇ）であり、Ｗ２は、添加したＡＡｃの重量（ｇ）である；ＭＡＡｃはＡＡｃの分子量、７２Ｄａである。あるいは、ＡＡｃグラフティングの密度、Ｄ２を、ＡＡｃのグラフトされたカルボキシル基のＮａＯＨでの滴定から算出し、乾燥クリオゲル１グラムあたりのカルボキシル基のｍｍｏｌｅとして決定した。
結果を、以下の表１〜６に報告する。
【００４２】
【表１】
2008540761.tif 000002
【００４３】
【表２】
2008540761.tif 000003
【００４４】
【表３】
2008540761.tif 000004
【００４５】
【表４】
2008540761.tif 000005
【００４６】
【表５】
2008540761.tif 000006
【００４７】
【表６】
2008540761.tif 000007
【００４８】
実施例２  マクロ多孔性ポリアクリルアミド（ｐＡＡｍ）クリオゲル上へのＮ，Ｎ−ジメチルアミノエチル−メタクリレート（ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅａ）（ＤＭＡＥＭＡ）のグラフト重合
この実験では、実施例１のセクションＡ及びＢそれぞれにおいて記載されているように調製したｐＡＡｍクリオゲルモノリス及びジペルヨーダトクプラートカリウム溶液を用いた。
【００４９】
Ａ．１工程技術を用いるグラフト重合
乾燥ｐＡＡｍクリオゲルモノリス（０．１５±０．０３ｇ）を、モノマーと開始剤［Ｃｕ（ＩＩＩ）  ０．００８Ｍ］との反応溶液１０ｍｌ中へと浸した。反応混合物を、Ｃｕ（ＩＩＩ）溶液を添加する前に、窒素で１０分間フラッシュした。重合を、２時間、４５℃にて行った。
【００５０】
Ｂ．２工程技術を用いるグラフト重合
上記セクションＡ中のような乾燥ｐＡＡｍクリオゲルモノリスをガラス管中に置き、１Ｍ  ＮａＯＨ中０．０３３ＭのＣｕ（ＩＩＩ）溶液５ｍｌで飽和させた。乾燥クリオゲルは、水溶液と接触後１分未満（ｌｅｓｓ  ｔｈｅｎ）以内に再水和し、モノリスの相互連結した多孔性の系を液体が通過するよう、ガラス管内を満たした。Ｃｕ（ＩＩＩ）で飽和させたサンプルを、４０℃にて３０分間インキュベートした。次いで、クリオゲル基質を４ｍｌ／ｍｉｎの流速にて通過させた８ｍｌの脱気モノマー溶液で、開始剤系をクリオゲルから置換した。流れはコルクで止めた。グラフト重合は、４０℃にて、１時間進行した。
【００５１】
上記セクションＡ及びＢ中の反応の終了後、クリオゲルを３０ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌで洗浄し、引き続き過剰量の脱イオン水で洗浄した。ホモポリマーを含有する洗液を収集し、残存しているモノマーを、３０時間水に対して透析することによって全て除去した。その間、水は４回交換した。次いで、最終的なホモポリマーを、恒量になるまで、減圧下で凍結乾燥した。
【００５２】
グラフト重合のグラフティング度（Ｇ）、グラフティング効率（ＥＧ）及びモノマー変換（Ｃ）を、以下のように定義し、算出した：
Ｇ（％）＝［（Ｗ１−Ｗ０）／Ｗ０］×１００％、
ＥＧ（％）＝（Ｗ１−Ｗ０）／［（Ｗ１−Ｗ０）＋Ｗ２］×１００％、
Ｃ（％）＝［（Ｗ１−Ｗ０）＋Ｗ２］／Ｗ３×１００％、
ここで、Ｗ０及びＷ１は、最初のサンプル及びグラフト化サンプルの重量（ｇ）であり、Ｗ２及びＷ３は、用いられたホモポリマー及びモノマーそれぞれの重量（ｇ）である。
【００５３】
反応溶液中、いくつかの異なる濃度のＤＭＡＥＭＡを用いることによって取得された結果を、以下の表７〜１０に報告する。
【００５４】
【表７】
2008540761.tif 000008
【００５５】
【表８】
2008540761.tif 000009
【００５６】
【表９】
2008540761.tif 000010
【００５７】
【表１０】
2008540761.tif 000011
【００５８】
上記表７〜１０より、ｐＡＡｍクリオゲル上で１１０％（ｗ／ｗ）までのＤＭＡＥＭＡグラフティングを達成することが可能であることが理解される。ＤＭＡＥＭＡでグラフトしたｐＡＡｍクリオゲルのグラフト密度は、表７から理解できるように、モノマー濃度を上昇させると共に上昇した。
【００５９】
乾燥ｐＡＡｍクリオゲルを開始剤及びモノマーを含有する反応混合物中に直接浸すこと（上記方法Ａ）によるｐＡＡｍクリオゲル上へのＤＭＡＥＭＡの直接的なグラフト重合は、多量のホモポリマーの形成を生じた（表１０Ａ）。ホモポリマーの量は、モノマー濃度を上昇させると共に上昇した。ジペルヨーダトクプラートカリウムをモノマー溶液に添加した際に集中的なホモポリマー形成があった（データ示さず）ことから、ジペルヨーダトクプラートカリウムもまた、ＤＭＡＥＭＡのホモ重合を開始させた。したがって、モノマー及び開始剤の溶液中に乾燥ｐＡＡｍクリオゲルを浸すことによるグラフト重合の間、ｐＡＡｍ骨格上へのラジカルの生成及び溶液中のラジカルの生成の両方が進行した。それが、グラフト重合の間の集中的なホモポリマー形成をもたらし、それによって、グラフト重合の効率を低下させた。総ポリマー形成に関するグラフト重合の効率は、６０〜７０％のモノマー変換で、たった１０％であった（表８Ａ）。モノマー含有反応混合物中への乾燥クリオゲルの浸漬による直接的なグラフト重合の間に形成された大部分はホモポリマーであった。
【００６０】
まずポリマー基質の活性化を介し、次いでモノマー溶液での飽和を介した２工程グラフト重合（上記方法Ｂ）は、グラフト重合の間の集中的なホモポリマー形成を回避することを可能とした（表１０Ｂ）。ラジカルは、ｐＡＡｍクリオゲル表面上にのみ生成される。ＤＭＡＥＭＡの重合は、活性中心からゲル表面上へと開始され、溶液中のホモポリマーの形成を制限し、グラフト重合の効率を５０％まで上昇させた（表８Ｂ）。しかし、重合のためのモノマーの利用は低下した。モノマー変換は、１工程直接グラフト重合の６０〜７０％（表９Ａ）と比較して、２工程手法ではたった１０〜１５％であった（表９Ｂ）。
【００６１】
２工程手法における活性化条件を、ラジカル生成の最大効率となるよう最適化した。しかし、最適条件下においても、直接グラフティングと比較して、グラフティングパーセンテージはより低かった（表７）。２工程グラフト重合のグラフト密度の低下は、おそらくモノマー溶液とｐＡＡｍ骨格上のより少ないラジカル部位との接触に起因し、これはクリオゲルがモノマー溶液と接触したときには既に開始剤が除去されていることと、モノマー溶液とともに流入した不純物及び酸素によってフリーラジカルが消光される可能性とのためである。
【００６２】
実施例３．ｐｏｌｙＡＡｍクリオゲル上へのＮ−イソプロピルアクリルアミド（ＮＩ−ＰＡＭ）及びＮ−ビニルイミダゾール（ＶＩ）のグラフト重合
ｐｏｌｙＡＡｍクリオゲルモノリスを、コモノマーの４．７％溶液（ＡＡｍ／ＭＢＡＡｍ＝４：１）を用いて調製した。Ｃｕ（ＩＩＩ）ストック溶液を、以下のように調製した：ＣｕＳＯ４（０．８８５ｇ）、ＫＩＯ４（１．７０５ｇ）、Ｋ２Ｓ２Ｏ８（０．５５ｇ）、ＫＯＨ（２．２５ｍｌ）を含有する５０ｍｌの脱イオン水を４０分間煮沸し、容積を６２．５ｍｌに調節した。３ｍｌのＣｕ（ＩＩＩ）ストック溶液を、異なる濃度のＮＩＰＡＭ（ｐｏｌｙＡＡｍクリオゲル上へのＮＩＰＡＭ−ＶＩのグラフト重合では、０．５ｍｌのＶＩを反応混合物に添加した）を含有する７ｍｌの脱イオン水と混合した。クリオゲルモノリスを、得られたＮＩＰＡＭ／開始剤溶液（２ｍｌを、各モノリスを通過させた）で平衡化し、２０又は３７℃にて一晩インキュベートし、０．１Ｍ  ＨＣｌ及び脱イオン水で洗浄し、６０℃にて乾燥させた。
【００６３】
以下のグラフティングパラメータを算出した：
グラフティングパーセンテージＧ％＝（Ｗ１−Ｗ０）／Ｗ０×１００％
グラフティング重合の効率Ｅ％＝（Ｗ１−Ｗ０）／Ｗ２×１００％、
ここでＷ０及びＷ１は、乾燥クリオゲルモノリスの最初のサンプル及びグラフトしたサンプルの重量（ｇ）であり、Ｗ２は、添加したＮＩＰＡＭの重量（ｇ）である。結果を表１１及び１２に示す。
【００６４】
ＮＩＰＡＭ−クリオゲルの流動性を、１ｍｌの液体が２０℃及び３７℃にてモノリスを通過するのに必要な時間を測定することによって推定した。
【００６５】
ＮＩＰＡＭ−クリオゲルの疎水性を、ＢＳＡのモノリスへの吸着を３７℃にて解析することによって推定した。２Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有するリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）（バッファーＡ）中のＢＳＡ溶液（２ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌを、３７℃にてバッファーＡで平衡化したモノリスへ適用し、引き続き１．５ｍｌの温かいバッファーＡで洗浄した。結合したタンパク質を、（ＮＨ４）２ＳＯ４を含有しないバッファーＡで、室温にて溶出した。溶出は、タンパク質のほぼ定量的な回収をもたらした。結果を表１１に示す。
【００６６】
酵母細胞の懸濁液（ＯＤ６００＝１．２１）を、２０℃及び３７℃にてリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．２）で平衡化したＮＩＰＡＭ−クリオゲルモノリスに適用した（モノリスあたり０．２ｍｌ）。非保持細胞を、４ｍｌのバッファーで洗浄した。結合した細胞の量を、適用した細胞の量と非結合細胞の量との間の差として算出した。適用した細胞の量を１００％とした。結果を表１１に示す。
【００６７】
【表１１】
2008540761.tif 000012
【００６８】
【表１２】
2008540761.tif 000013
【００６９】
実施例４．水−有機溶媒中でのグリシジルメタクリレート（ＧＭＡ）のグラフト重合
実施例１において説明したように調製した乾燥ｐｏｌｙＡＡｍクリオゲル（総容積２ｍｌ）を、ガラス管中に置き、２ｍｌのＣｕ（ＩＩＩ）ストック溶液（実施例３におけるように調製した）１ｍｌ蒸留水及び１ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＯＨあるいは１ｍｌ  ５Ｍ  ＮａＣｌ溶液からなる４ｍｌ混合物で飽和させた。サンプルを、４０℃にて、３０分間インキュベートした。サンプルを、４０℃にて、３０分間インキュベートした。次いで、７０％水性ＤＭＳＯ中の異なる濃度のＧＭＡ溶液５ｍｌを、流速２ｍｌ／ｍｉｎにてカラムを通過させた。ガラス管をコルクで封管し、８０℃にて４時間インキュベートした。
【００７０】
グラフティングパーセンテージ、Ｇ％を、実施例３中のように算出した。結果を表１３に示す。
【００７１】
【表１３】
2008540761.tif 000014
【００７２】
実施例５．（２−（メタクリロイルオキシ）エチル）トリメチル−アンモニウムクロライド（ＭＥＴＡ）のグラフト重合
ｐｏｌｙＡＡｍクリオゲル（総容積２ｍｌ）を、コモノマーの６％溶液（ＡＡｍ／ＭＢＡＡＭ＝８／ｌ）を用いて調製した。乾燥クリオゲルをガラス管中に置き、２ｍｌのＣｕ（ＩＩＩ）ストック溶液、１ｍｌ  Ｈ２Ｏ及び０．３５ｍｌの１０Ｍ  ＮａＯＨを含有した３．３５ｍｌの溶液で飽和させた。サンプルを、４０℃にて、３０分間インキュベートした。次いで、８ｍｌのＭＥＴＡ水溶液を、流速４ｍｌ／ｍｉｎでクリオゲルを通過させた。ガラス管をコルクで封管し、４０℃にて２時間、水浴中に置いた。次いで、クリオゲルを、０．１Ｍ  ＨＣｌ及び過剰量の水で洗浄した。グラフティングパーセンテージ、Ｇ％を、実施例３中のように算出した。結果を表１４に示す。
【００７３】
【表１４】
2008540761.tif 000015
【００７４】
乾燥クリオゲルを、モノマーを含有した８ｍｌの反応溶液、１．５ｍｌのＣｕ（ＩＩＩ）及び０．５ｍｌの１０Ｍ  ＮａＯＨに浸した。サンプルを、４０℃にて２時間インキュベートした。グラフティングパーセンテージ、Ｇ％を、実施例３中のように算出した。結果を表１５に示す。
【００７５】
【表１５】
2008540761.tif 000016
【００７６】
実施例６．ＡＡｃとＮＩＰＡＭとのグラフト共重合
実施例５中のように調製した乾燥クリオゲルを、ガラス管中に置き、２ｍｌのＣｕ（ＩＩＩ）ストック溶液（実施例３中のように調製した）、１ｍｌの水及び０．３５ｍｌの１０Ｍ  ＮａＯＨを含有した３．３５ｍｌで飽和させた。サンプルを、４０℃にて３０分間インキュベートした。次いで、８ｍｌの脱気したモノマー溶液（ＡＡｃ＋ＮＩＰＡＭ＝１Ｍ）を、クリオゲル基質を通過させた。ＡＡｃと等量のＮａＯＨを、モノマー溶液に添加し、モノマー溶液のｐＨをｐＨ７．０±０．５へと調整した。クリオゲルを通るモノマーの流れは、コルクで停止させた。グラフト重合は２時間進行した。反応の完了後、クリオゲルを、３０ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌで洗浄し、引き続き過剰量の脱イオン水で洗浄した。
【００７７】
グラフティングパーセンテージ、Ｇ％を、実施例３中のように算出した。結果を表１６に示す。
【００７８】
リゾチームのクロマトグラフィを、２７６ｎｍフィルターを備えたＬＫＢ  ＵＶＩ−ｃｏｒｄを用いてモニターした。グラフトされたクリオゲルのモノリスを、上部及び下部アダプターを備えたガラスカラム（内径１０ｍｍ、２ｍｌ容積）中へと入れた。リゾチーム溶液（ランニングバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０））中１ｍｇ／ｍｌ）をカラムに適用し、引き続き、溶出液の２７６ｎｍでの吸光度がベースラインに下がるまでランニングバッファーで洗浄した。溶出を、ランニングバッファー中１．５ＭのＮａＣｌで行った。３ｍｌずつの画分を採取し、２８０ｎｍでの吸光度を測定した。２８０ｎｍで確立したリゾチームの較正曲線（０．１〜１ｍｇ／ｍｌ）を用いて、リゾチーム含量を算出した。結果を表１６に示す。
【００７９】
【表１６】
2008540761.tif 000017
【００８０】
実施例７．ＮＩＰＡとジメチルアミノエチルメタクリレート（ＤＭＡＥＭ）とのグラフト共重合
実施例５中のように調製した乾燥クリオゲルを、ガラス管中に置き、２ｍｌのＣｕ（ＩＩＩ）ストック溶液（実施例３中のように調製した）、１ｍｌの水及び０．３５ｍｌの１０Ｍ  ＮａＯＨを含有した３．３５ｍｌで飽和させた。サンプルを４０℃にて３０分間インキュベートした。次いで、８ｍｌの脱気モノマー溶液（ＤＭＡＥＭＡ＋ＮＩＰＡ）を、クリオゲル基質を通過させた。クリオゲルを通るモノマーの流れを、コルクで止めた（方法Ｉ）。
【００８１】
あるいは、実施例５中のように調製した乾燥クリオゲルを、モノマーを含有した１０ｍｌの反応溶液及び３ｍｌのＣｕ（ＩＩＩ）ストック溶液（実施例３中のように調製した）中に浸した（方法ＩＩ）。サンプルを、４０℃にて２時間インキュベートした。反応の完了後、クリオゲルを３０ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌで洗浄し、引き続き過剰量の脱イオン水で洗浄した。
【００８２】
グラフティングパーセンテージ、Ｇ％を、実施例３中のように算出した。結果を表１７に示す。
【００８３】
ＢＳＡのクロマトグラフィを、２７６ｎｍフィルターを備えたＬＫＢ  ＵＶＩ−ｃｏｒｄを用いてモニターした。グラフトされたクリオゲルのモノリスを、上部及び下部アダプターを備えたガラスカラム（内径１０ｍｍ、２ｍｌ容積）中へと入れた。ＢＳＡ溶液（ランニングバッファー（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０））中１ｍｇ／ｍｌ）をカラムに適用し、引き続き、溶出液の２７６ｎｍでの吸光度がベースラインに下がるまでランニングバッファーで洗浄した。溶出を、ランニングバッファー中１．５ＭのＮａＣｌで行った。３ｍｌずつの画分を収集し、２８０ｎｍでの吸光度を測定した。２８０ｎｍで確立したリゾチームの較正曲線（０．１〜１ｍｇ／ｍｌ）を用いて、ＢＳＡ含量を算出した。
【００８４】
【表１７】
2008540761.tif 000018
【００８５】
実施例８．ヒドロキシエチルメタクリレート（ＨＥＭＡ）のグラフト重合
実施例５中のように調製した乾燥クリオゲルを、ガラス管中に置き、２ｍｌのＣｕ（ＩＩＩ）ストック溶液（実施例３中のように調製した）、１ｍｌの水及び０．３５ｍｌの１０Ｍ  ＮａＯＨを含有した３．３５ｍｌで飽和させた。サンプルを、４０℃にて異なる期間インキュベートした。次いで、８ｍｌの異なる濃度の脱気したＨＥＭＡ溶液を、クリオゲル基質を通過させた。クリオゲルを通るモノマーの流れを、コルクで停止させた。反応の完了後、クリオゲルを、３０ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌで洗浄し、引き続き過剰量の脱イオン水で洗浄した。次いでカラムを、９０％のエタノールに２０時間浸し、５０％のエタノール及び水で再び洗浄した。
【００８６】
グラフティングパーセンテージ、Ｇ％を、実施例３中のように算出した。結果を表１８に示す。
【００８７】
【表１８】
2008540761.tif 000019
【００８８】
イミノ二酢酸（ＩＤＡ）を、以下のようにＨＥＭＡグラフト化クリオゲルへ共有結合させた。ＨＥＭＡグラフト化クリオゲルを、０．０７ｇの水素化ホウ素ナトリウムを含有する２０ｍｌの１Ｍ  ＮａＯＨ中の２．２ｍｌのエピクロロヒドリンの懸濁液とともにインキュベートした。次いで、１Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３（ｐＨ１０）中０．５ＭのＩＤＡ溶液２０ｍｌを、クリオゲルカラムを通して一晩、１ｍｌ／ｍｉｎの流速にて再循環させた。Ｃｕ２＋を搭載した、調製されたＩＤＡ修飾ＨＥＭＡグラフト化クリオゲルカラムを、大腸菌の粗ホモジネート及び遠心によって清澄したホモジネートからの組換え（Ｈｉｓ）６−乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）の捕捉に用いた。ＯＤ６２０  ０．５をもつ細胞ホモジネートを、ランニングバッファーとして、２００ｍＭ  ＮａＣｌ及び２ｍＭ  イミダゾールを含む２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．０）中で、破過点（１５％）までカラムに適用した。溶出バッファーは、２０ｍＭ  ＥＤＴＡ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．０であった。溶出画分を、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．０）に対して透析した。クロマトグラフィを、２７６ｎｍフィルターを備えたＬＫＢ  ＵＶＩ−ｃｏｒｄを用いてモニターした。タンパク質濃度を、ＢＣＡ法を用いて推定した。結果を表１９に示す。
【００８９】
【表１９】
2008540761.tif 000020
【００９０】
実施例９
Ａ．クリオゲルビーズの作成
ポリ（ビニルアルコール）の溶液（ＰＶＡ、ＭＯＷＩＯＬ  ２０−９８、１００ｇ／Ｌ）を調製した。ＰＶＡ−クリオゲルビーズを、冷却造粒装備（ｓｅｔ−ｕｐ）を用いて形成させた。ＰＶＡの溶液を、液体ジェットヘッド中へと押し込み、そこで水と非混和性の溶媒（石油エーテル）の流れによって、ジェットを液滴へとスプリントさせた（ｓｐｌｉｎｔｅｄ）。懸濁液の液滴は、−２０℃まで冷却された同一の溶媒で満たされたカラム中へと落ち、凍結して球状のビーズを形成した。凍結ビーズを、カラム底部の採取装置（ｃｏｌｌｅｃｔｏｒ）中に集めた。ビーズを、−２０℃で一晩凍結して保ち、次いで０．０１℃／ｍｉｎの速度で解凍した。解凍したビーズを脱イオン水で洗浄後、それらを振動するテーブル上での１時間の振とう下、０．５％  グルタルアルデヒド（ｐＨ１．０）で架橋した。最後に、架橋されたｆ−クライオＰＶＡＧビーズを、洗浄水が中性になるまで、脱イオン水で洗浄した。
【００９１】
Ｂ．ＰＶＡ−クリオゲル上へのアクリルアミドのグラフト共重合、及びグラフト化ポリアクリルアミドのポリアクリル酸への加水分解
上記セクションＡからの２グラムのビーズを、１２ｍｌの蒸留水中に懸濁した。アクリルアミド（ＡＡｍ、０．３２３ｇ）を添加後、懸濁液をＮ２で２０分間流した。次いで、０．５ｍｌの硝酸セリウムアンモニウム（ＣＡＮ）溶液（０．２Ｍ  ＨＮＯ３中、０．１Ｍ）を添加し、グラフト重合を開始させた。反応は、一晩、室温にて、回転型テーブル上で進行させた。ポリ（アクリルアミド）がグラフトされたビーズを、アクリルアミド基のカルボキシル基への加水分解のために、０．１Ｍ  ＮａＯＨ溶液で一晩、室温にて、持続的な振とう下で処理した。グラフト化ＰＶＡ−クリオゲルビーズのカルボキシル含量のアッセイを、酸ベースの滴定（ｔｉｔｒｏｍｅｔｒｙ）によって決定した。ビーズを、ｐＨ７．０となるまで、過剰量の蒸留水で洗浄した。１グラムのビーズを、ビーカー中の、２Ｍ  ＮａＣｌを含有する０．１Ｍ  ＨＣｌ標準液（２５ｍｌ）へと移した。材料を２４時間、室温にて、周期的な撹拌下でインキュベートし、その後正確に測定された上清のサンプル（１０ｍｌ）を取り出し、ゆっくりとした撹拌にて、ｐＨ６．９〜７．３まで０．１Ｍ  ＮａＯＨで滴定した。
【００９２】
ＰＶＡ−クリオゲル上へのリゾチーム及びＣｕ＋２吸着のバッチ実験は、修飾されたサンプルが、ビーズの乾燥ポリマー０．１ｇあたり３．７ｍｇのタンパク質及び９．６μｍｏｌのＣｕ＋２を結合することを実証する（表２０）。さらに、十分なカルボキシル基の存在は、グラフト化ＰＶＡ−クリオゲルの膨潤度の上昇へとつながり（表２０）、それはビーズサイズの上昇として視覚的に観察される。
【００９３】
【表２０】
2008540761.tif 000021
【００９４】
実施例１０．アクリル酸又はグリシジルメタクリレートでエステル化したＰＶＡ−クリオゲルビーズ上へのアクリル酸のグラフト重合
実施例９Ａにしたがって調製した３グラムのＰＶＡ−クリオゲルビーズを、３０ｍｌの０．５Ｍ  ＨＣｌ溶液中で４．５ｍｌのアクリル酸（ＡＡｃ）と混合し、室温にて９６時間、シェーカーテーブル上での連続した撹拌下でエステル化反応を行った。
【００９５】
３グラムのＰＶＡ−クリオゲルビーズを、３０ｍｌの０．５Ｍ  ＨＣｌ溶液中で４．５ｍｌのＡＡｃと混合し、室温にて９６時間、シェーカーテーブル上での連続した撹拌下でエステル化反応を行った。あるいは、３ｇのＰＶＡ−クリオゲルビーズを、３０ｍｌの１．０Ｍ  Ｎａ２ＣＯ３溶液中で６ｍｌのアリルグリシジルエーテルと混合し、室温にて９６時間、シェーカーテーブル上での連続した撹拌下でエステル化反応を行った。
【００９６】
修飾したＰＶＡ−クリオゲルビーズ（１．５ｇ）を、１３ｍｌの脱気蒸留水中に懸濁した。次いで、２ｍｌのＡＡｃを添加した。３７６μｍｏｌのＴＥＭＥＤ及び３００ｍｇのＡＰＳを添加することによって、グラフト重合を開始させた。反応を、一晩、室温にて、振とう機上で進行させた。反応が完了後、クリオゲルビーズを、過剰量の水で洗浄した。
【００９７】
ポリアクリル酸でグラフトされたＰＶＡ−クリオゲルを、Ｃｕ＋２及びリゾチームの吸収によって解析した（表２１）。
【００９８】
【表２１】
2008540761.tif 000022
【００９９】
０．１Ｍ  ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ７．５）でのＣｕ＋２溶出のプロファイルを調査した。０．２Ｍ  ＣｕＳＯ４溶液をカラムへ適用する間、ＡＡｃ−グラフト化ＰＶＡビーズは収縮し、それらの容積は２回に分けて低下した。その条件では、カルボキシル基はＣｕ＋２イオンと相互作用するので、ポリアクリル酸の水和が低下する。０．１Ｍ  ＥＤＴＡでの溶出後、クリオゲル基質の膨潤度は、再び上昇した。
【０１００】
ポリアクリル酸がグラフトされたＰＶＡビーズで充填されたカラム上でのリゾチームの破過プロファイルを調査した。破過曲線は、リゾチーム溶液の適用の間の、不安定なクロマトグラフィの挙動を実証する。リゾチームのカラムへの吸着は、同じポンプスピードにおいて、背圧を発生させ、カラムを通る流速を低下させる結果をもたらした。同一の問題が、１．５Ｍ  ＮａＣｌ溶液での溶出を行った場合に観察された。実験の間、カラムを通る流速は、１分あたり１ｍｌから０．３ｍｌへと低下した。
【０１０１】
４０％破過にて保持されたリゾチーム容量は、１ｍｌのｇＰＶＡ−ＡＡｃあたり５０ｍｇであった。主に、タンパク質はクリオゲルビーズの表面上にグラフトされたポリアクリル酸鎖上に吸着され、第一画分中に溶出された。
【０１０２】
実施例１１．ＰＶＡ−クリオゲルモノリス上へのアクリル酸のグラフト重合（ｐｏｌｙｍｅｒｉｓａｔｉｏｎ）
５０ｍｌの０．５Ｍ  ＨＣｌ溶液を、流速１ｍｌ／ｍｉｎにてＰＶＡクリオゲルモノリス（２ｍｌ；ＰＣＴ／ＳＥ０２／０１８５７にしたがって作成した）を通過させ、引き続き０．５Ｍ  ＨＣｌ中２．０ＭのＡＡｃ溶液３０ｍｌを、流速１ｍｌ／ｍｉｎにて、一晩リサイクルモードで、室温にてカラムに適用した。次いで、カラム中の修飾されたクリオゲルを、ｐＨが中性になるまで水で洗浄した。次いで、２．０Ｍ  ＡＡｃ溶液を、流速０．２ｍｌ／ｍｉｎにて適用した。４０分ごとに、活性剤及び開始剤（５０μＬのＴＥＭＥＤ及び５０ｍｇのＡＰＳ）を注入した。反応は、５時間、室温にて進行した。
【０１０３】
グラフトされたＰＶＡ−クリオゲルモノリスは、クリオゲル１ｍｌあたり４０μｍｏｌのＣｕ＋２を吸着した。
【０１０４】
ｇＰＶＡ−ＡＡｃモノリス上におけるリゾチームの破過プロファイル及び溶出プロファイルを調査した。リゾチームの容量は、ｇＰＶＡ−ＡＡｃ１ｍｌあたり１５ｍｇであった。ビーズで典型的な背圧の創出及びカラムを通る流速の低下は、この場合には観察されなかった。
【０１０５】
実施例１２．ＮＩＰＡＭ及び３−（アクリルアミド）フェニルボロン酸）（ＡＰＢＡ）のグラフト共重合。
修飾のないクリオゲルモノリスを、コモノマー（ＡＡｍ／ＭＢＡＡＭ＝８／ｌ）の６％溶液を用いて調製した。乾燥ｐＡＡｍクリオゲル（０．０９〜０．１４ｇ）を、ガラス管中に置き、適当量のＮＩＰＡＭ及びＡＰＢＡ（ＮＩＰＡ／ＡＰＢＡ＝９／１（ｍｏｌｅ／ｍｏｌｅ））、０．０６ｍｌ  ＮａＯＨ（１０Ｍ）及び３ｍｌのＣｕ（ＩＩＩ）溶液（実施例３中のように調製した）を含有する１０ｍｌの反応溶液で飽和させた。クリオゲルを通るモノマーの流れを、コルクで停止させた。グラフト重合は、室温にて、２０時間進行した。
【０１０６】
反応の完了後、クリオゲルを３０ｍｌの０．１Ｍ  ＨＣｌで洗浄し、引き続き過剰量の脱イオン水で洗浄した。
【０１０７】
グラフティングパーセンテージ、Ｇ％を、実施例３中のように算出した。結果を表２２に示す。
【０１０８】
【表２２】
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【国際調査報告】
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