(57)【要約】  本発明は、植物成長促進剤、土壌改良剤、殺菌剤および殺虫剤、病気および有害昆虫防止剤として環境にやさしくしかも有効な、農業に使用できる製剤で有機農業に適した製剤を提供する。本発明の製剤は、モリンダシトリフォリア製品または抽出物を含む。本発明の製剤は、果実、野菜、葉菜、根菜、穀物、花および球根に適用でき、収量を増加させかつ収穫後の新鮮さを保持できる期間を長くする。さらに、本発明は、加工モリンダシトリフォリア製品ならびにこれらの加工製品およびモリンダシトリフォリアＬ植物由来の抽出物のさまざまな画分の抗真菌および抗菌活性に関し、かつ、平均阻害濃度決定のための関連方法に関する。特に、本発明は、モリンダシトリフォリアＬ由来のエタノール、メタノールおよび酢酸エチル抽出物と、一般的真菌類および細菌類に及ぼすそれらの阻害活性、ならびに平均阻害濃度の特定に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物上での真菌および微生物増殖を阻害するための製剤であって、約０．０１乃至９９．９９重量％の間の量で存在する少なくとも１種のモリンダシトリフォリア（Ｍｏｒｉｎｄａ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）製品を含む製剤。
【請求項２】
前記製剤が、モリンダシトリフォリアの果実、茎、種子、果皮、根樹皮、葉および根から構成されるリストから選択される抽出物または抽出物の混合物を含む請求項１記載の製剤。
【請求項３】
モリンダシトリフォリアの果実、茎、種子、果皮、根樹皮、葉および根から構成されるリストから選択される抽出物または抽出物の混合物が水で１−１００００倍（重量）希釈されたものである請求項２記載の製剤。
【請求項４】
前記製剤が、適切な担体物質で液体、顆粒、粉末、またはペースト剤に調製される請求項１記載の製剤。
【請求項５】
前記製剤が水に溶解されるかまたは分散されたものである請求項１記載の製剤。
【請求項６】
前記モリンダシトリフォリア製品が水で重量として１−１００００倍希釈されている請求項５記載の製剤。
【請求項７】
前記製剤がさらに、少なくとも１種の肥料成分を含む請求項１記載の製剤。
【請求項８】
前記肥料成分が、硫酸アンモニウム、尿素、カリウム、窒素および塩化アンモニウム、ニワトリ糞、ウシ糞、糞化石、ミミズの糞、昆虫の糞、のこぎりくず、コメぬか、にんにくオイル、魚油、バーミキュライト、モンモリロナイト、活性炭素、チャコール、珪藻土、タルク、アルファルファミールおよびペレット、窒素、リン、カリウム、ビートの乾燥し粉砕した残渣、とうもろこしグルテン、綿実ミール、数種のケルプまたは海草の抽出物または粉末化部分、大豆ミール、動物加工副産物、ブラッドミール、ボーンミール、コンポストまたは魚副産物から構成されるリストから選択される請求項１記載の製剤。
【請求項９】
前記加工製剤がさらにクエルセチンを含む請求項１記載の製剤。
【請求項１０】
さらに、前記クエルセチンと相乗的に作用して前記真菌および微生物増殖を阻害する付加的活性成分としてのルチンを含む請求項９記載の製剤。
【請求項１１】
前記ルチンが、約０．１乃至約１０重量％の間の量で存在する請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
植物上での真菌および微生物増殖を阻害するための製剤であって、モリンダシトリフォリアのｎ−へキサン画分を０．０１乃至１０重量％で含む製剤。
【請求項１３】
前記モリンダシトリフォリア画分はモリンダシトリフォリアＣＬ２ＣＬ２画分を含む請求項１２記載の製剤。
【請求項１４】
前記モリンダシトリフォリア画分はモリンダシトリフォリアＥＴＯＡｃ画分を含む請求項１２記載の製剤。
【請求項１５】
前記モリンダシトリフォリア画分はモリンダシトリフォリアｎ−ＢｕＯＨ画分を含む請求項１２記載の製剤。
【請求項１６】
前記製剤が、モリンダシトリフォリアの果実、茎、種子、果皮、根樹皮、葉および根から構成されるリストから選択される抽出物または抽出物の混合物を含む請求項１２記載の製剤。
【請求項１７】
前記製剤が、適用前または適用中に重量として１−１００００倍希釈される請求項１２記載の製剤。
【請求項１８】
前記製剤が、適切な担体物質で液体、顆粒、粉末、またはペースト剤に調製される請求項１２記載の製剤。
【請求項１９】
前記製剤が水に溶解されるかまたは分散されたものである請求項１２記載の製剤。
【請求項２０】
前記製剤がさらに、少なくとも１種の肥料成分を含む請求項１２記載の製剤。
【請求項２１】
前記肥料成分が、硫酸アンモニウム、尿素、カリウム、窒素および塩化アンモニウム、ニワトリ糞、ウシ糞、糞化石、ミミズの糞、昆虫の糞、のこぎりくず、コメぬか、にんにくオイル、魚油、バーミキュライト、モンモリロナイト、活性炭素、チャコール、珪藻土、タルク、アルファルファミールおよびペレット、窒素、リン、カリウム、ビートの乾燥し粉砕した残渣、とうもろこしグルテン、綿実ミール、数種のケルプまたは海草の抽出物または粉末化部分、大豆ミール、動物加工副産物、ブラッドミール、ボーンミール、コンポストまたは魚副産物から構成されるリストから選択される請求項２０記載の製剤。
【請求項２２】
前記加工製剤がさらにクエルセチンを含む請求項２１記載の製剤。
【請求項２３】
さらに、前記クエルセチンと相乗的に作用して前記真菌および微生物増殖を阻害する付加的活性成分としてのルチンを含む請求項２３記載の製剤。
【請求項２４】
前記ルチンが、約０．１乃至約１０重量％の間の量で存在する請求項２３記載の方法。
【請求項２５】
植物上での真菌および微生物活性を阻害する方法であって、約０．０１−９９．９９重量％の量で存在する加工モリンダシトリフォリア製品を含む製剤に前記植物を暴露することを含む方法。
【請求項２６】
前記植物が、全ての有害真菌および微生物および関連効果が改善されるまで繰り返し暴露される請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
前記製剤が、さらに、少なくとも１種の活性成分を含む請求項２５記載の方法。
【請求項２８】
前記活性成分が、クエルセチン、ルチン、ｎ−ヘキサン抽出物、ＣＬ２ＣＬ２抽出物、ＥＴＯＡｃ抽出物およびｎ−ＢｕＯＨ抽出物から構成されるリストから選択される請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
前記方法がさらに、果実、野菜、葉菜、根菜、穀物、花および球根から構成されるリストから選択される植物物質を暴露する段階を含む請求項２５記載の方法。
【請求項３０】
下記の方法：植栽前に土壌に前記製剤をスプレイするかまたは潅水すること；前記製剤を、植物成長時に土壌にスプレイするかまたは潅水すること；植物を切るとき、分割するときまたは再度植える時に前記植物を被覆すること；植栽時に種子または球根を被覆すること；しおれた花および潅木に被覆すること；水栽培植物に分散させること；細菌またはウイルスに感染した植物を被覆すること；採取後切り取った植物を被覆すること；または、収穫後作物および花に被覆すること、の少なくとも１種により前記製剤に植物を暴露する段階を含む請求項２５記載の方法。
【請求項３１】
前記製剤が、モリンダシトリフォリアの果実、茎、種子、果皮、根樹皮、葉および根から構成されるリストから選択される抽出物または抽出物の混合物を含む請求項２５記載の製剤。
【請求項３２】
モリンダシトリフォリアの果実、茎、種子、果皮、根樹皮、葉および根から構成されるリストから選択される抽出物または抽出物の混合物が、水で１−１００００倍（重量で）希釈される請求項３１記載の製剤。
【請求項３３】
前記製剤が、適切な担体物質で液体、顆粒、粉末、またはペースト剤に調製される請求項２５記載の製剤。
【請求項３４】
前記製剤が水に溶解されるかまたは分散されている請求項２５記載の製剤。
【請求項３５】
前記モリンダシトリフォリア製品が水で重量として１−１００００倍希釈される請求項２５記載の製剤。
【請求項３６】
前記製剤がさらに、少なくとも１種の肥料成分を含む請求項２５記載の製剤。
【請求項３７】
前記肥料成分が、硫酸アンモニウム、尿素、カリウム、窒素および塩化アンモニウム、ニワトリ糞、ウシ糞、糞化石、ミミズの糞、昆虫の糞、のこぎりくず、コメぬか、にんにくオイル、魚油、バーミキュライト、モンモリロナイト、活性炭素、チャコール、珪藻土、タルク、アルファルファミールおよびペレット、窒素、リン、カリウム、ビートの乾燥し粉砕した残渣、とうもろこしグルテン、綿種子食、数種のケルプまたは海草の抽出物または粉末化部分、大豆ミール、動物加工副産物、ブラッドミール、ボーンミール、コンポストまたは魚副産物から構成されるリストから選択される請求項３６記載の製剤。
【請求項３８】
植物上での有害な真菌および微生物活性を阻害する方法であって、
約０．０１−９９．９重量％の量で存在するモリンダシトリフォリア由来の抽出物を少なくとも１種含む製剤に前記植物を暴露すること；および前記製剤に前記植物を暴露することを定期的に繰り返すことを含むことを特徴とする方法。
【請求項３９】
前記加工モリンダシトリフォリア製品が、加工モリンダシトリフォリア果実ジュース、加工モリンダシトリフォリアピューレジュース、加工モリンダシトリフォリア食物繊維、加工モリンダシトリフォリアオイル、加工モリンダシトリフォリア果実ジュース濃縮物、加工モリンダシトリフォリアピューレジュース濃縮物、加工モリンダシトリフォリア葉、加工モリンダシトリフォリア根、加工モリンダシトリフォリア根樹皮、加工モリンダシトリフォリア茎、加工モリンダシトリフォリア種子、および加工モリンダシトリフォリアオイル抽出物から構成される群から選択される請求項３８記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業上利用して、真菌感染を低下させ、作物収穫量を上げ、収穫後の作物の新鮮さを保つのに役立つ、モリンダシトリフォリア（Ｍｏｒｉｎｄａ  Ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）に基づく組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
有機とは、食物および食物繊維を生産するために用いる農業上の生産システムを表す。農産物、穀物、肉、酪製品、卵、および綿のような繊維類，花卉および加工食品を含むさまざまな農産物が有機的に生産されている。有機農業経営は、天然のメカニズムを利用して、有害害虫のすみかを破壊し、さらに、土壌の肥沃性を意図的に維持しかつ保持している。有機農業従事者は、合成殺虫剤や肥料を使用しない。有機栽培者は、合成の農薬、放射線照射および遺伝子工学で作製した食物または成分を利用しない。人工的成分または保存剤なしで食物の完全性を保持するため、有機食品は可能な限り加工しない。有機農業従事者はこうしたやりかたに固執するため、有機食物は従来の食品よりも殺虫剤残留物を含む可能性が非常に低い。Ｂａｋｅｒ、Ｂ．Ｐ．ら、Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎ  ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ，ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ｐｅｓｔ  ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ（ＩＰＭ）−ｇｒｏｗｎ  ａｎｄ  ｏｒｇａｎｉｃ  ｆｏｏｄ：ｉｎｓｉｇｈｔｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｒｅｅ  ＵＳ  ｄａｔａ  ｓｅｔｓ，１９  ＦＯＯＤ  ＡＤＤＩＴＩＶＥＳ  ＡＮＤ  ＣＯＮＴＡＭＩＮＡＮＴＳ（従来の集約的害虫処理（ＩＰＭ）で栽培した有機食物中の殺虫剤残留物：３種の米国データ群からの洞察、食品添加物１９種および夾雑物）４２７−４４６（２００２）（長期持続性殺虫剤を除外すると、従来の農産物サンプルの７１％に対して有機農産物サンプルの１３％が殺虫剤残留物を含んでいた。）。
【０００３】
有機食物市場は、大きくかつ成長している。米国食料供給のおよそ２％が有機方法を用いて栽培されている。過去１０年にわたり、有機農産物の売り上げが少なくとも２０％の年度増加を示し、農業では最も早く成長する部門となっている。２００１年において、有機食物の卸売り売上高は、９３億と予測されていた（Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｏｎｓｕｍｅｒ  Ｔｒｅｎｄｓ  ２００１．Ｎａｔｕｒａｌ  Ｍａｒｋｅｔｉｎｇ  ＩｎｓｔｉｔｕｔｅがＯｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｄｅ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎと共同して公表，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｔａ．ｃｏｍ／ｃｏｎｓｕｍｅｒ  ｔｒｅｎｄｓ  ２００１．ｈｔｍ）。有機食物に対する世界市場もまた、成長している。特に、日本とドイツは、重要な世界的有機食物市場となっている。
【０００４】
有機食物のコストは従来の食物のコストよりも高く、その理由としては、有機農業従事者は、化学薬品の代わりに働き集中的管理を行うからである。そうする際、有機農業従事者は、これまでの農業のやりかたで外部的であった一部のコスト（例えば健康および環境コスト）を吸収している。有機農業に関連したコストには、汚染水の清浄および殺虫剤汚染の改善が含まれる。さらに、有機食物の価格には、栽培、収穫、移動および貯蔵のコストが含まれる。加工食物の場合には、加工コストと包装コストもまた、含まれる。
【０００５】
有機農業ではコストが高くなることに加えて、従来の農業技術よりも作物生産量が通常少ない。さまざまな作物についての１５４期の栽培時期データに基づけば、有機作物は、従来の、高投入条件下で栽培した作物の９５％の生産であった。
【０００６】
有機農業従事者は、土壌の生きた成分すなわち栄養物を放出し、変換しおよび移動させる生息微生物に栄養を与えることによって、健常な土壌を構築する。土壌の有機物は、良好な土壌構造と保水性に寄与している。有機農業従事者は土壌生物相に栄養を与え、土壌構造と保水性を構築する。有機農業従事者は、土壌生物層に栄養を与え、被覆作物、コンポスト、および生物学に基づく土壌改良物で土壌有機物を構築する。これらは、病気により耐えられる健康な植物を産生する。最後のよりどころとして、何らかの植物性であるかまたは他の合成されたものではない殺虫剤を適用することもできる。
【０００７】
従来の有機農業従事者は、食物の収量と品質を低下させる望ましくない微生物を改良するという難しい仕事に直面している。栽培過程で合成改良剤を使用することを避けるため、有機農業従事者は特に、生物学に基づく処理に依存しなければならない。何万という抗微生物化合物が存在しているにもかかわらず、微生物が最も新しくかつ強力な抗微生物化合物および処理に対しての抵抗力を持つようになる能力は、急速である。新規抗微生物剤に対する需要が高まっていることと歩調を合わせるためには、新規化合物が発見されることが重要である。これらのいくつかは、予測もしなかった起源から生じることもありうる（例えば、ペニシリンの開発を参照）。
【０００８】
モリンダシトリフォリア（Ｍｏｒｉｎｄａ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）由来のジュースは、多くの有用な性質を有しかつ多くの栄養要素を含んでいることが知られている。果実の成分のいくつかを利用して、ハーブ、健康食品、ペットフード、化粧品および他の製品が、開発されてきた。しかし、モリンダシトリフォリア由来のさまざまな産物を利用した農業組成物は、まだ知られていない。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
したがって、有機および従来の農業実態は、食物の収量を増加させその品質を向上させることによって、および有機農業の経費を削減することによって、改善することができる。本発明は、従来のおよび有機の農業従事者が利用して食物の収量と品質を向上させることができる組成物および方法を提供する。
【００１０】
本発明は、農業用途のためにモリンダシトリフォリアに基づく組成物を提供することを目的とし、それらは有効であるが、環境系に有害な影響を有さず、有機農業に適している。本発明は、モリンダシトリフォリアＬとして知られる植物由来のジュース、ピューレ、および他の抽出物または部分を利用することにより実施される。本発明の態様には農業用途のために設計した組成物が含まれ、その特定の組成物には、肥料、作物の成長促進剤、土壌改良剤、抗菌剤および防虫剤、抗微生物剤および病気や有害昆虫の防止剤が挙げられる。さらに、農業組成物は、作物成長促進、作物品質改良、病気および有害昆虫に対する抵抗力の改善、作物収量の向上、糖分および味の増強、および収穫後の新鮮さの向上などの効果を有する天然物質を含む。
【００１１】
本発明は、モリンダシトリフォリア由来のさまざまな成分単独でまたは他の成分との組み合わせで含む、農業用途のための組成物を提供する。本発明は、モリンダシトリフォリアに基づくさまざまな組成物を提供し、それらは、モリンダシトリフォリアの果実、葉、茎、種子の皮および／または根由来の抽出物または処理産物を含むことができる。本発明はまた、モリンダシトリフォリア由来のさまざまな要素と他の成分を組み合わせて、上記組成物の農業上の有用性を高めることができる。例えば、本発明の１つの態様は、モリンダシトリフォリアの果実、葉、茎、種子および／または根由来の抽出物を利用することを開示しており、それらは、水で１−１００００倍（重量として）に希釈される。本発明の組成物は、作物収量を高めかつ収穫後の作物の新鮮さを保持する能力を有している。
【００１２】
さらに、本発明は、モリンダシトリフォリアＬ由来抽出物の抗真菌および抗菌活性、および平均阻害濃度を求めるための関連方法に関する。特に、本発明は、モリンダシトリフォリアＬ由来のエタノール、メタノールおよび酢酸エチル抽出物、および通常の真菌および細菌に対するそれらの阻害活性と平均阻害濃度の同定に関する。
【００１３】
態様として示し本文で広く記載されるように、本発明は、１種以上の加工モリンダシトリフォリア製品から抽出され、およびその中に存在する活性化合物および／または成分を用いて、既存の有害真菌および微生物活性とその成長を阻害し、防止しかつ破壊するさまざまな方法を特徴とする。モリンダシトリフォリア製品は、好適には、望ましくない微生物活性を阻害するために設計した製剤に供給される。
【００１４】
加工したモリンダシトリフォリア製品はさまざまな種類で構成され、加工モリンダシトリフォリア果実ジュース、加工モリンダシトリフォリアピューレジュース、加工モリンダシトリフォリア食物繊維、加工モリンダシトリフォリアオイル、加工モリンダシトリフォリア果実ジュース濃縮物、加工モリンダシトリフォリアピューレジュース濃縮物、および加工モリンダシトリフォリアオイル抽出物を含むが、それらに限定されない。
【００１５】
本発明はさらに、真菌および微生物の活性と増殖を阻害しおよび処理する製剤を特徴とし、製剤は、少なくとも１種以上の加工モリンダシトリフォリア製品から構成される。加工モリンダシトリフォリア製品には、特異的に抗真菌および抗菌活性を示すモリンダシトリフォリア画分または抽出物がある。この製剤は、さらに、他の天然成分を含むこともできる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
本発明の農業用製剤および方法は、モリンダシトリフォリアの果実、葉、茎、種子および／または根から有効成分を抽出することによって、作製することができる。さらに、本発明は、通常の真菌類および細菌類に対するモリンダシトリフォリアＬ抽出物の活性と平均阻害濃度を求めるための方法に関する。特に、本発明は、モリンダシトリフォリアＬのエタノール、メタノールおよび酢酸エチル抽出物、さらにさまざまな画分に関し、また、製剤中に存在すると測定された平均阻害濃度と平均致死濃度に関連する抗真菌および抗菌効果に関し、それらの濃度はさまざまな実験研究に基づいている。
【００１７】
本文で一般的に記載される本発明の組成物および製剤は、バリエーションを含むものとする。従って、本発明の製剤および方法の態様についての下記の詳細な説明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではなく、本発明の現時点での好適な態様を単に示しているに過ぎない。
【００１８】
本開示および請求の範囲において、単数形“ひとつ（ａ）”、“ひとつ（ａｎ）”、および“その（ｔｈｅ）”は本文で他に明確に示している場合を除いて、複数の指示対象を含む。
【００１９】
本開示を説明しかつ請求の範囲を記載する際、下記の用語を下記に示した定義に従って用いる。本文では、用語“含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）”、“含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）”、“含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）”、“を特徴とする（ｃｈａｒａｃｔｒｉｚｅｄ  ｂｙ）”およびそれらの文法的等価物は、包括的すなわち開いた用語であり、追加の、記載されていない要素または方法段階を排除しないものとして使用する。本文では、句“から構成される（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）”およびその文法的等価物は、請求の範囲に特定されていない要素、段階、または成分を排除するものとして使用する。本文では、“有効量”とは、有益または所望の結果を得るために十分な量として使用する。有効量は、１回またはそれ以上の投与、適用または処理において投与することができる。たとえば、モリンダシトリフォリアに基づく組成物の有効量は、抗菌活性と改善された関連状態を付与するために十分な量である。このような有効量は、当業者が過度の実験をも行うことなく、決定できる。
【００２０】
本発明の下記の開示は３つの小項目、すなわち、“モリンダシトリフォリアの全般的説明と加工モリンダシトリフォリア製品を製造するために用いられる方法”、“投与のための農業製剤と方法”および“抗菌活性”に分かれている。小項目は読者にとっての便宜のためのみに使用し、いかなる意味でも限定することを意図していない。
【００２１】
１．モリンダシトリフォリアの全般的説明と加工モリンダシトリフォリア製品を製造するために用いられる方法
科学的にはモリンダシトリフォリアＬ（Ｍｏｒｉｎｄａ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ  Ｌ．，Ｍｏｒｉｎｄａ  ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａ）として知られるインディアン・マルベリー（ヤエヤマアオキ）すなわちノニ植物は、潅木または小型の樹木である。葉は対生であり、楕円形から卵形である。小さな白色の花が、肉厚の球状、頭様集団の中に含まれている。果実は大きく、肉厚でしかも卵形である。成熟すると、それらはクリーム色から白色となり食用となるが、不快な味と臭いを有している。この植物は東南アジア原産であり、初期にインドから東ポリネシアまで広い範囲に広まっていた。これは野生で無作為に成長し、植物園および小規模の個人栽培農園で栽培されてきた。モリンダシトリフォリアの花は、小さく、白色で、３乃至５枚の裂片を有しており、筒状で、芳香性があり、約１．２５ｃｍの長さである。花は、楕円形の、長円形または丸くて、塊だらけの本体に集合した多くの小さな核果から構成された集合果実となり、ワックス状の、白色乃至緑がかった白色または黄色の、半透明の表皮を有している。果実は、その表面に、馬鈴薯と類似した“目”を含んでいる。果実はジューシーで、苦くて、鈍い黄色または黄色がかった白色であり、多数の赤茶色の、硬くて、楕円形−三角形の、翼状部のある２細胞核を含んでおり、それぞれが、４個の種子を含んでいる。
【００２２】
この果実は十分に熟すると、酸敗したチーズのような目立つ匂いを有する。この果実は食料として数カ国の国民に食用とされているが、モリンダシトリフォリアの最も一般的な使用は、赤色および黄色の色素源としてであった。最近になって、モリンダシトリフォリア植物の栄養的および健康上への有益性に関心が向けられるようになり、それについては、さらに下記で説明する。
【００２３】
加工モリンダシトリフォリア果実ジュースは、熟したモリンダシトリフォリア果実のジュースおよび果肉から種子と皮を分離し；果肉をジュースからろ過して；ジュースを包装することによって調製できる。あるいは、ジュースを包装せずに、ジュースをすぐに他の製品の成分として含ませることができる。いくつかの態様においては、ジュースと果肉をピューレして均質の混合物とし、他の成分と混合することができる。他の加工には、果実とジュースを凍結乾燥することが含まれる。果実とジュースを、最終ジュース製品の製造中に再構成できる。さらに他の加工には、果実とジュースを風乾した後に粉々にすることが含まれる。
【００２４】
本発明はまた、モリンダシトリフォリア植物から抽出した果実ジュースおよび／またはピューレ果実ジュースの用途に関する。モリンダシトリフォリア果実ジュース製造の現在好適なプロセスにおいて、果実は、手でもぎ取るかまたは機械装置でもぎ取られる。果実は、少なくとも直径が１インチ（２−３ｃｍ）から１２インチ（２４−３６ｃｍ）になった時、収穫できる。果実は、好適には、暗緑色から黄緑色、さらに白色までの範囲の色のグラデーションを有する。果実を収穫後および加工を行う前に、よく洗浄する。
【００２５】
果実は０乃至１４日間成熟させまたは熟成させるが、ほとんどの果実は２乃至３日間保管する。果実を装置に入れて、地面に接触しないように成熟ないし熟成させる。好適には、熟成の間、布またはネット状のものでカバーするが、カバーなしでも熟成させることができる。さらに加工できる状態になったときは、果実の色は淡くなり、淡い緑、淡い黄色、白色または透明な色を有する。果実の傷を検査し、過度に緑色になっていないか硬くてがちがちしていないか、検査する。傷があって硬い緑色の果実は、良好な果実から分離する。
【００２６】
成熟しかつ熟成させた果実は、好適にはプラスチックで裏打ちした容器に入れ、さらに加工し運搬する。熟成果実の容器は、０乃至１２０日間保管することができる。ほとんどの果実容器は、加工前７乃至１４日間保管する。容器は、さらに加工するため、適宜、冷蔵条件下または周囲／室温条件で保管できる。果実を保管容器から取り出し、手動または機械的セパレータにより加工する。種子および皮は、ジュースおよび果肉から分離する。
【００２７】
ジュースと果肉は、保存および運搬のために容器に納めることができる。あるいは、ジュースと果肉をすぐに加工して最終ジュース製品としてもよい。容器は、冷蔵、冷凍または室温条件で保管できる。
【００２８】
モリンダシトリフォリアジュースおよび果肉は、好適には、混合し均質な混合物とし、その後、他の成分と混合することもできる。好適には、最終ジュース製品は加熱し、最低温度１８１°Ｆ（８３℃）またはそれ以上、最高２１２°Ｆ（１００℃）で低温殺菌する。
【００２９】
製造される別の製品は、モリンダシトリフォリアピューレとピューレジュースであり、濃縮物または希釈形態のいずれでもよい。ピューレは、基本的に、種子から分離した果肉であり、本文に記載の果実ジュース製品とは異なる。
【００３０】
各製品は、プラスチック、ガラスまたは処理温度に耐えられる別の適当な物質の最終容器に入れ密封する。容器は充填温度に保持するか、または、急速に冷却してその後発送容器に入れる。発送容器は、好適には、最終容器中の製品温度を保持しまたは制御するように梱包される。
【００３１】
ジュースおよび果肉は、さらに、果肉をジュースからろ過設備で分離することによって加工することもできる。ろ過設備は、好適には、遠心分離デカンター、０．０１ミクロンから２０００ミクロンまで、好適には５００ミクロン未満の大きさのスクリーンフィルター、フィルタープレス、逆浸透圧ろ過および他の任意の標準的市販ろ過装置から構成されるが、それらに限定されない。運転ろ過圧は、好適には、０．１ｐｓｉｇから最大約１０００ｐｓｉｇの範囲である。流速は、好適には、０．１ｇ．ｐ．ｍ．から１０００ｇ．ｐ．ｍ．までの範囲であり、さらに好適には、５乃至５０ｇ．ｐ．ｍ．の間である。湿った果肉を水洗いし少なくとも１回から最大１０回までろ過し、果肉からジュースを除去する。湿った果肉は、典型的には、１０乃至４０重量パーセントの繊維含量である。湿った果肉を、好適には、最低１８１°Ｆ（８３℃）の温度で殺菌し、その後、ドラム缶に入れさらに加工するか、または、高繊維製品に調製する。
【００３２】
加工したモリンダシトリフォリア製品はまた、繊維としても存在できる。さらに、加工モリンダシトリフォリア製品は、油状物としても存在できる。モリンダシトリフォリアオイルは、典型的には、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、およびリノール脂肪酸等の数種の脂肪酸と、より少量で存在する他の脂肪酸との混合物をトリグリセリドとして含む。さらに、オイルは、好適には抗酸化剤を含み、オイルの劣化を防ぐ。従来の食品等級の抗酸化剤が好適に使用される。
【００３３】
モリンダシトリフォリア植物は天然成分を豊富に含む。発見された成分には、（葉由来の）アラニン、アントラキノン、アルギニン、アスコルビン酸、アスパラギン酸、カルシウム、ベータ−カロチン、システイン、シスチン、グリシン、グルタミン酸、グリコシド、ヒスチジン、鉄、ロイシン、イソロイシン、メチオニン、ナイアシン、フェニルアラニン、リン、プロリン、レジン、リボフラビン、セリン、ベータ−シトステロール、チアミン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、ウルソール酸、およびバリン；（花由来の）アカセチン−７−ｏ−ベータ−ｄ（＋）−グルコピラノシド、５，７−ジメチル−アピゲニン−４´−ｏ−ベータ−ｄ（＋）−ガラクトピラノシド、および６，８−ジメトキシ−３−メチルアントラキノン−１−ｏ−ベータ−ラムノシル−グルコピラノシド；（果実由来の）酢酸、アスペルロシド、ブタン酸、安息香酸、ベンジルアルコール、１−ブタノール、カプリル酸、デカン酸、（Ｅ）−６−ドデセノ−ガンマ−ラクトン、（Ｚ，Ｚ，Ｚ）−８，１１，１４−エイコサトリエン酸、エライジン酸、エチルデカノアート、エチルヘキサノアート、エチルオクタノアート、エチルパルミテート、（Ｚ）−６−（エチルチオメチル）ベンゼン、オイゲノール、グルコース、ヘプタン酸、２−ヘプタノン、ヘキサナール、ヘキサンアミド、ヘキサン二酸、ヘキサン酸（ヘキサン酸）、１−ヘキサノール、３−ハイドロキシ−２−ブタノン、ラウリン酸、リモーネン、リノール酸、２−メチルブタン酸、３−メチル−２−ブテン−１−オール、３−メチル−３−ブテン−１−オール、メチルデカノアート、メチルエライデート、メチルヘキサノアート、メチル３−メチルチオ−プロパノアート、メチルオクタノアート、メチルオレアート、メチルパルミテート、２−メチルプロパン酸、３−メチルチオプロパン酸、ミリスチン酸、ノナン酸、オクタン酸（オクタン酸）、オレイン酸、パルミチン酸、カリウム、スコポレチン、ウンデカン酸、（Ｚ，Ｚ）−２，５−ウンデカジエン−１−オール、およびボミホル；（根由来の）アントラキノン、アスペルロシド（ルビクロル酸）、ダムナカンサール、グリコシド、モリンダジオール、モリンジン、モリンドン、粘着性物質、ノル−ダムナカンサール、ルビアジン、ルビアジンモノメチルエーテル、レジン、ソランジジオール、ステロール、およびトリハイドロキシメチルアントラキノン−モノメチルエーテル；（根樹皮由来の）アリザリン、クロロルビン、グリコシド（ペントース、ヘキソース）、モリンダジオール、モリンダニグリン、モリンジン、モリンドン、レジン性物質、ルビアジンモノメチルエーテル、およびソランジジオール；（木部由来の）アントラガロール−２，３−ジメチルエーテル；（組織培養物由来の）ダムナカンサール、ルシジン、ルシジン−３−プリメベロシドおよびモリドン−６ベータ−プリメベロシド；（植物由来の）アリザリン、アリザリン―アルファ―メチルエーテル、アントラキノン、アスペルロシド、ヘキサン酸、モリンダジオール、モリンドン、モリンドゲニン、オクタン酸、およびウルソール酸が含まれる。本発明は、Ｍ．シトリフォリア植物の全部分を単独でまたは互いに併用して、または他の成分と併用し���、利用することに関する。上記のＭ．シトリフォリア植物の部分は使用できる植物部分の網羅的リストではなく、単なる例示に過ぎない。したがって、上記では、Ｍ．シトリフォリア植物の部分の一部（例えば果実の種子、果実の果皮、樹皮または植物）は明示されていないが、本発明は、植物の部分全ての使用に関する。
【００３４】
モリンダシトリフォリアの葉、茎、種子および／または根から抽出物を得るため、最初に、これらの生の材料を刻む。次に、抽出方法を用いて目的とする成分を単離する。本発明の好適な態様において、５倍ないし１０倍の水を加えて９５℃の温度で加熱する高温水抽出方法、または、エタノール、メタノール、へキサン等の有機溶媒または水と有機溶媒の混合物を用いる抽出方法を適用することができる。さらに、通常のオートクレーブ設備を用いる湿潤圧および加熱プロセスも適用できる。さらに、セルロース加水分解酵素を用いる処理プロセスを上記プロセスに付加できる。所望ならば、葉、茎、種子および／または根から得られた抽出物からろ過により不溶性成分を除去した後、有機溶媒を除去し本発明の抽出物を得る。この抽出物は、必要であれば殺菌するか、または濃縮するかまたは乾燥させることができる。乾燥は、通常のスプレイドライまたは凍結乾燥を用いて、行うことができる。抽出物は、冷却または凍結条件下で保存できる。
【００３５】
さらに、種子からオイルを抽出することができる。オイルは、種子の乾燥、粉砕およびプレスによる種子の圧搾により得ることができる。へキサン溶液等を加えることにより、種子ケーキ残渣からより多くのオイルを得ることもできる。オイルは、リノール酸、オレイン酸、パルミチン酸およびステアリン酸等の脂肪酸をトリグリセリドの形で含む。
【００３６】
先に記載されるように、最近、モリンダシトリフォリアを含む製品の使用に起因する多くの健康上の利点が発見されてきた。モリンダシトリフォリアのひとつの利点は、ゼロニン（Ｘｅｒｏｎｉｎｅ）を単離し生産するその能力にあることがわかっている。ゼロニンは、植物、動物および微生物の事実上全ての正常細胞中に生ずる。モリンダシトリフォリアは無視可能な量の遊離ゼロニンしか含まないとしても、プロゼロニンと称されているゼロニン前駆体を相当な量で含む。さらに、モリンダシトリフォリアは不活性形状の酵素プロゼロナーゼを含み、これはプロゼロニンからゼロニンを放出する。ハワイ大学のＲ．Ｍ．Ｈｅｉｎｉｃｋｅによる“ノニの薬理学的活性成分”という標題の論文は、モリンダシトリフォリアが“プロゼロニンおよびプロゼロナーゼの構築ブロックのため、ゼロニン単離の用途に対して最善の出発材料”であることを示唆している。
【００３７】
ゼロニンは、タンパク質分子が細胞壁を通過し健常組織を形成するために用いられるように、その形状および柔軟性を保護しかつ維持する。これらの栄養物が細胞中に入らないと、細胞は、その仕事を効率的に実行できない。ゼロニンは、細胞膜孔の拡大を助ける。この拡大により、ペプチド（アミノ酸またはタンパク質）の大きな鎖が細胞中へ入ることができるようになる。これらの鎖は、使用されない場合には老廃物となる。さらに、プロゼロニンから作られるゼロニンは、孔の拡大を助けて、栄養物がより吸収されるようにする。その多くの利点により、モリンダシトリフォリアは、多くの事例的効果をもたらすことが知られている。
【００３８】
本発明は、好適には、モリンダシトリフォリアに基づく製剤を用いて、有害な環境影響をもたらす重大な傾向なしに、真菌および他の微生物活性または増殖を治療または阻害する方法を提供する。
【００３９】
本文では、モリンダシトリフォリアジュースとの用語は、インドマルベリすなわちモリンダシトリフォリアＬ植物の果実から加工したジュースを含む製品を称する。１つの態様において、モリンダシトリフォリアジュースは、フランスポリネシアの純粋なジュースピューレに由来する再構成果実ジュースを含む。少なくとも１種の加工モリンダシトリフォリア製品を含む組成物または製剤もまた、他の成分を含むことができる。別の態様において、モリンダシトリフォリアジュースは、乾燥または粉末化モリンダシトリフォリアから加工されたものではない。
【００４０】
２．投与のための製剤と方法
下記の節では、モリンダシトリフォリアに基づく製剤と、食物の収量と品質を改善するために、特に有害な微生物の増殖を阻害しかつ防止することによっておよび成長する植物に追加の栄養を与えることによって、農業状況で製剤を利用する方法の好適な態様をいくつか詳細に記載する。
【００４１】
本発明は、インドマルベリ植物に由来する１種以上の加工モリンダシトリフォリア製品を用いて調製した組成物を提供することによって、真菌および他の抗菌阻害剤を進歩させるものである。モリンダシトリフォリアは、農業用途に適したさまざまな担体または組成物に取り込ませる。
【００４２】
本発明の農業製剤は、上記操作を用いて得られたモリンダシトリフォリアの果実、茎、種子および／または根からの抽出物または抽出物混合物を、適当な担体物質とともに液体、顆粒、粉末またはペースト剤に調製することにより製造することができる。本発明の農業製剤は、水に溶解または分散させることによって、使用できる。さらに、本発明の製剤は、硫酸アンモニウム、尿素、カリウム、窒素および塩化アンモニウム、さまざまなコンポスト、さまざまな糞、ニワトリ糞、ウシ糞、糞化石、ミミズの糞、昆虫の糞、のこぎりくず、コメぬか、にんにくオイル、魚油、バーミキュライト、モンモリロナイト、活性炭素、チャコール、珪藻土、タルク、アルファルファミールおよびペレット、窒素、リン、カリウム、ビートの乾燥し粉砕した残渣、とうもろこしグルテン、綿実ミール、数種のケルプまたは海草の抽出物または粉末化部分、大豆ミール、動物加工副産物、ブラッドミール、ボーンミール、および魚副産物等の肥料成分と混合してもよい。
【００４３】
本発明の農業用活性化剤は、果実、野菜、葉菜、根菜、穀物、および花および球根にも適用できる。実際、下記の利用が提案できる：製剤を、植え付けまたは植物の成長中に土壌に散布するかまたは灌漑することができる；植物切断、分割または再度植え付け時に植物に被覆するかまたは分散させる；植え付け時に種子またはバルブに被覆するかまたは分散させる；しおれた花と潅木を被覆するかまたは分散させる；水栽培植物に分散させる；細菌またはウイルスに感染した植物に被覆するかまたは分散させる；収穫後切った花に被覆するかまたは分散させる；収穫後作物または花に被覆するかまたは分散させる。
【００４４】
１つの例示的態様において、本発明の組成物は、約０．０１乃至１００重量％、好適には０．０１および９５重量％の間の量で存在する加工モリンダシトリフォリア（例えば、モリンダシトリフォリア果実ジュースまたは果実ジュースまたはピューレジュース）製品の１種以上を含む。製剤のいくつかの実施態様を以下に示す。しかし、これらは、例示のためのみに示され、当業者は、加工モリンダシトリフォリア製品を含む他の製剤または組成物を理解するであろう。
【００４５】
加工モリンダシトリフォリア製品は、クエルセチンおよびルチン等の活性成分の少なくとも１種およびその他のものを含み、真菌活性阻害を発揮する。
【００４６】
加工モリンダシトリフォリア製品中の活性成分は、メタノール、エタノール、および酢酸エチル等のさまざまなアルコールまたはアルコール系溶液および他のアルコール系誘導体を用いて、当該技術で一般的に知られる操作とプロセスを用いて抽出できる。クエルセチンおよびルチンの活性成分は、製剤または組成物総計の０．０１−１０％範囲の重量で存在する。所望ならば、これらの量はより高い濃度に濃縮でき、この場合、それらは１０乃至１００％の範囲の量で存在する。
【００４７】
１つの例示的態様において、この方法は、（ａ）約０．０１乃至９５重量％の量で存在する加工モリンダシトリフォリア製品を一部として含む組成物を製剤化し、ここで、組成物はまた、水または精製水等の担体を含み、また、選択された肥料等の他の天然または人工的成分を含んでいてもよく；（ｂ）加工モリンダシトリフォリア製品が植物中に取り込まれるかまたは接触するように組成物を土壌または植物に投与し；（ｃ）上記段階を、同時に作物収量を増加させながら真菌および他の微生物活性または増殖を阻害および／または防止するのに必要な加工モリンダシトリフォリア製品の有効量を提供するために必要な回数繰り返すことを含む。当業者は、組成物の量および使用頻度はそれぞれの農業状況により変動することを理解するであろう。
【００４８】
下記の表は、本発明の好適な製剤または組成物のいくつかを例示または示している。記載されるように、これらは単なる例示的態様を意図したものであり、いかなる点でも限定するものと解釈してはならない。
【００４９】
製剤１
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリアピューレジュースまたは果実ジュース  １００％
【００５０】
製剤２
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実ジュース                        ８５−９９．９９％
水                                                        ０．０１−１５％
【００５１】
製剤３
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実ジュース                        ０．０１−１５％
水                                                        ８５−９９．９９％
【００５２】
製剤４
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実ジュース                        １５−８５％
水                                                        １５−８５％
【００５３】
製剤５
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実ジュース                        ２０−９０．８％
水                                                        ０．１−５０％
肥料                                                      ０．１−３０％
【００５４】
製剤６
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実ジュース                        ０．１−３０％
水                                                        ０．１−５０％
肥料                                                      ２０−９０．８％
【００５５】
製剤７
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実、果皮  茎、種子および／または
根からの抽出成分                                          １００％
【００５６】
製剤８
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実、果皮  茎、種子および／または
根からの抽出成分                                          ８５−９９．９９％
水                                                        ０．０１−１５％
【００５７】
製剤９
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実、果皮  茎、種子および／または
根からの抽出成分                                          ０．０１−１５％
水                                                        ８５−９９．９９％
【００５８】
製剤１０
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実、果皮  茎、種子および／または
根からの抽出成分                                          ５０−９０．９８％
水                                                        ０．０１−５０％
肥料                                                      ０．０１−３０％
【００５９】
製剤１１
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実、果皮  茎、種子および／または
根からの抽出成分                                          ０．１−３０％
水                                                        １−９９．９％
肥料                                                      １−９９．９％
【００６０】
製剤１２
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリアオイル                              ０．１−３０％
担体媒体                                                  ７０−９９．９％
他の成分（肥料等）                                        １−９５％
【００６１】
製剤１３
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア製品                                １０−８０％
担体媒体                                                  ２０−９０％
【００６２】
製剤１４
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア製品                                ５−８０％
担体媒体                                                  ２０−９５％
【００６３】
製剤１５
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリアオイルまたはオイル抽出物            ０．１−２０％
担体媒体                                                  ２０−９０％
【００６４】
製剤１６
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリアピューレジュースまたは果実ジュース  ０．１−８０％
モリンダシトリフォリアオイル                              ０．１−２０％
担体媒体                                                  ２０−９０％
【００６５】
製剤１７
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリアピューレジュース濃縮物または
果実ジュース濃縮物                                        １００％
【００６６】
製剤１８
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実ジュース濃縮物または
ピューレジュース濃縮物                                    ８５−９９．９９％
水                                                        ０．１−１５％
【００６７】
製剤１９
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリアピューレジュースまたは
果実ジュース画分                                          １００％
【００６８】
製剤２０
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実ジュース画分                    ８５−９９．９９％
水                                                        ０．１−１５％
【００６９】
製剤２１
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実ジュース画分                    ８５−９９．９９％
肥料                                                      ０．１−１５％
【００７０】
製剤２２
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリア果実ジュース画分                    ５０−９０％
水                                                        ０．１−５０％
肥料                                                      ０．１−３０％
【００７１】
製剤２３
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリアピューレジュース画分                ８５−９９．９９％
水                                                        ０．１−１５％
【００７２】
製剤２４
成分                                                      重量百分率
モリンダシトリフォリアジュース                            ０．１−８０％
モリンダシトリフォリア由来抽出成分                        ０．１−２０％
肥料                                                      ２０−９０％
【００７３】
いかなる意味でも限定することを意図しないが、１例において、有益なモリンダシトリフォリアは、ユタ州、オレム（Ｏｒｅｍ）のＭｏｒｉｎｄａ社が製造したＴＡＨＩＴＩＡＮ  ＮＯＮＩ（登録商標）ジュースに加工される。
【００７４】
例示的態様において、製剤は、約１０−８０重量％の間の重量で存在する加工モリンダシトリフォリア製品と約２０−９０重量％の重量で存在する担体媒体とを含む。
【００７５】
この態様において、加工モリンダシトリフォリア製品は、加工モリンダシトリフォリア果実ジュース、加工モリンダシトリフォリアピューレジュース、加工モリンダシトリフォリア果実またはピューレジュース濃縮物、モリンダシトリフォリア由来の抽出成分、および／または加工モリンダシトリフォリアオイル抽出製品の１種以上を含むことができる。
【００７６】
別の例示的態様において、製剤は、約０．１−８０重量％の間の重量で存在する加工モリンダシトリフォリア果実ジュースまたはピューレジュース；約０．１−２０重量％の重量で存在する加工モリンダシトリフォリアオイル；および約２０−９０重量％の量で存在する担体媒体を含むことができる。
【００７７】
上記の製剤に示される担体媒体は、植物組織中にまたはその上に導入可能でありかつ担体媒体を加工モリンダシトリフォリア製品に提供できる任意の成分を含むことができる。具体的な担体媒体製剤は当該技術で周知であり、本文では詳細に説明しない。担体媒体の目的は、上記に記載されるように、植物組織中にまたはその上に導入可能な製剤中で加工モリンダシトリフォリア製品を具体化する手段を提供することである。
【００７８】
３．抗菌活性
下記の実施例は、真菌活性に及ぼす加工モリンダシトリフォリア製品の予防および治療効果を記載し、示している。これらの実施例は、いかなる意味でも限定することを意図しておらず、モリンダシトリフォリア製品の有益性と利点、ならびにその改善効果を単に例示するものである。
【実施例１】
【００７９】
モリンダシトリフォリア由来のある種の抽出物の、一般的な真菌および細菌の活性に対する平均阻害濃度を求めるために、実験を行った。この実験では、“トップダウン”手法を用いてモリンダシトリフォリアの抗菌活性を同定することを試みた。再現性のあるアッセイを開発し、初期の研究はモリンダシトリフォリア由来の抗菌成分が抽出できることを示唆した。本研究では、モリンダシトリフォリアのエタノール、メタノールおよび酢酸エチル抽出物がスタフィロコッカス・アウレウス（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ），大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ），カンジダ・アルビカンス（Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ）、トリコファイトン・メンタグロファイテス（Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ）およびアスパラギラス・ニゲル（Ａ．ｎｉｇｅｒ）に対して試験した際、抗菌活性を示すことが明らかになった。
【００８０】
最近になって、新規抗菌化合物を見つけようとして、多くのさまざまな起源が探索されてきた。本研究では、平均阻害濃度（ＭＩＣ）プロトコールを開発し、次にそれを用いて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ６２７５）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ１０２３１）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（ＡＴＣＣ９５３３）、Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ２５９２２）に対する抗真菌および抗菌活性について、モリンダシトリフォリアのエタノール、メタノール、および酢酸エチル抽出物を試験した。
【００８１】
液体抽出物を取得し、マイクロタイターウェル中で二重検定した。６μｌから２００μｌ範囲の量の抽出物をウェルに入れ、乾燥させた。各生物のＭｃＦａｒｌａｎｄ  ０．５溶液を調製し、適切な培地中で１／１００懸濁液を調製した。この生物懸濁液を各ウェルに添加し、適切な温度で適切な時間インキュベーションした。次に、増殖についてプレートを調べ、ＭＩＣを求めた。１希釈物についての二重検定結果はすべて一致していた。酢酸エチル抽出物は最小の抗菌活性を示し、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓおよびＳ．ａｕｒｅｕｓに対して試験したときにのみ活性を示した。エタノール抽出物は、試験した全生物に対して抗菌活性を示した。この活性は、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓに対して試験した際の低値側の目盛外から、Ａ．ｎｉｇｅｒに対する目盛内の高値の範囲の値を示した。また、メタノール抽出物は、試験した全生物に対して活性を示し、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓに対して試験したときの低値側の目盛外から、Ａ．ｎｉｇｅｒに対する目盛内の高値の範囲の値であった。これらの結果は、モリンダシトリフォリアの少なくともある種の抽出物が抗菌活性を有していることを示唆している。本試験のさらに詳細な説明を下記に記載する。
【００８２】
本試験で使用した材料には、数種の培養微生物、すなわち、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ２９２１３、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＡＴＣＣ２５９２２、Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ１０２３１、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ  ＡＴＣＣ９５３３およびＡ．ｎｉｇｅｒ  ＡＴＣＣ６２７５が含まれていた。初期培養物は、製造業者の指示に従って作製した。試験前、Ｓ．ａｕｒｅｕｓとＥ．ｃｏｌｉは、トリプチカーゼ大豆寒天プレートに接種し、３７℃で１８−２４時間インキュベーションした。Ｃ．ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｔ．ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓおよびＡ．ｎｉｇｅｒは、サボロード（Ｓａｂｏｒａｕｄ）デキストロース寒天プレートに接種し、２５℃で４８−７２時間インキュベーションした。
【００８３】
微生物懸濁液については、微生物を用いて生理食塩水中０．５  ＭｃＦａｒｌａｎｄ懸濁液を調製した。細菌懸濁液１００μｌをトリプチカーゼ大豆培養液９．９ｍｌに加え、真菌懸濁液１００μｌをサボロードデキストロース培養液９．９ｍｌに加えた。
【００８４】
トレイ調製物については、モリンダシトリフォリアのエタノール、メタノール、および酢酸エチル抽出物を実験に用いた。モリンダシトリフォリア果実ジュース抽出物は、Ｍｏｒｉｎｄａ社から供給された。各抽出物を用いて、１列のマイクロタイタープレートウェルを作製した。ウェル１と６には、抽出物２００μｌを入れた；ウェル２と７には、抽出物１００μｌを入れた；ウェル３と８には、抽出物５０μｌを入れた；ウェル４と９には、抽出物２５μｌを入れた；ウェル５と１０には、抽出物１２．５μｌを入れた；そして、ウェル６と１２には、抽出物６．３μｌを入れた。この結果、各列が抽出物質を二重シリーズで含むこととなった。エタノール抽出物は、標準ミクロタイタートレイの列Ａ−Ｂに入れ、メタノール抽出物は、標準ミクロタイタートレイの列Ｃ−Ｄに入れ、酢酸エチル抽出物は、標準マイクロタイタートレイの列Ｅ−Ｆに入れた。列Ｇには、９５％エチルアルコール２００μｌを入れ、列Ｈには、何も入れなかった。次にトレイを３７℃で４８時間インキュベーションし、乾燥させた。
【００８５】
各微生物は、媒体中１／１００の微生物の懸濁液を用いて、異なるトレイに接種した。各ウェルには１００μｌを加えた。接種後、細菌単離物を３７℃で２４−４８時間インキュベーションした。真菌単離物は２５℃で７２時間インキュベーションした。インキュベーション後、増殖についてウェルを調べた。最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、増殖を阻害した最小濃度の抽出物を明らかにすることによって求めた。結果は、ＭＩＣを示すウェルの抽出物のマイクロリットルとして表した。列ＧおよびＨは、抽出物コントロールおよび増殖コントロールである。
【００８６】
このアッセイを開発する際に、いくつか問題を解決しなければならなかった。おそらく最も難しかったことは、接種後に再度可溶化できるように化合物を乾燥させる方法を完成させることであった。抗菌剤開発の歴史を検討すると、ペニシリン抽出物を乾燥させた初期実験では、活性が完全に失われたことを示している。この問題は、長時間にわたって低温を使用することにより解決した。
【００８７】
下記の表は、発見された活性を示す。活性は、増殖を阻害しうる乾燥抽出物の最小容量で表す。
【００８８】
【表１】
2008534595.tif 000002
【００８９】
【表２】
2008534595.tif 000003
【００９０】
【表３】
2008534595.tif 000004
【００９１】
【表４】
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【００９２】
【表５】
2008534595.tif 000006
【００９３】
【表６】
2008534595.tif 000007
【００９４】
【表７】
2008534595.tif 000008
【００９５】
【表８】
2008534595.tif 000009
【００９６】
試験の結果は、エタノール抽出物の活性が≦６．３μｌから２００μｌの範囲であること、メタノール抽出物の活性が≦６．３μｌから２００μｌの範囲であること、酢酸エチル抽出物の活性が５０μｌから２００μｌの範囲であること、およびエタノールおよびメタノール抽出物が試験した微生物全てに対して最も有効であることを示した。
【００９７】
この実験は、出発材料から新しい抗菌化合物を単離する第一段階を試みたものである。この“トップダウン”手法では、モリンダシトリフォリアの粗抽出物を用いた。結果は、エタノールおよびメタノールが、試験した全ての微生物に対して活性を示すことを示し、さらに、モリンダシトリフォリアの抗真菌活性を示した。
【００９８】
明らかとなった抗菌活性から、ここで示される抗菌活性に関与している少なくとも１種、おそらくは数種の化合物がモリンダシトリフォリア内部に存在しているということができる。したがって、これらを具体的に特定し単離するために他の試験および実験が必要となるであろう。おそらくは、将来の研究には、標準的分離技術を用いて本文に記載される抽出物を精製することが含まれ、これらの抽出物中に存在する無数の化合物のいくつかを明確にすることが含まれるであろう。いったん単離されれば、それぞれについて抗菌活性を試験することができる。
【実施例２】
【００９９】
この実験の目的は、選択されたモリンダシトリフォリア果実ジュース抽出物の、３種の一般的病原性真菌および２種の一般的細菌類に対する平均阻害濃度（ＭＩＣ）を求めることであった。
【０１００】
使用した生物は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ６２７５）、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ１０２３１）、Ｔｒｉｃｈｏｐｈｙｔｏｎ  ｍｅｎｔａｇｒｏｐｈｙｔｅｓ（ＡＴＣＣ９５３３）、Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３）およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ９５３３）であった。
【０１０１】
モリンダシトリフォリア果実ジュース抽出物については、エタノール、メタノール、酢酸エチルおよび水抽出物を、適当な溶媒を用いて調製した。
【０１０２】
無菌の培地調製物（１リットル）は、真菌用にはサボロードデキストロース培養液（ＳＤＢ）を含み、細菌用にはミュラーヒントン（Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｈｉｎｔｏｎ）培養液（ＭＨＢ）を含み、１２１℃で２０分間、オートクレーブ処理を行った。
【０１０３】
生物懸濁液の調製には、各生物を適当な培地上に接種し、インキュベーションし、同一性を確認し、各生物の０．５Ｍ  ＭｃＦａｒｌａｎｄ懸濁液を調製し、この生物０．１ｍｌを適切な培地（ＳＤＢまたはＭＨＢ）９．９ｍｌに加えた。
【０１０４】
モリンダシトリフォリアジュース抽出物を調製するためには、適切な培地を使用し、抽出物を乾燥させ、次に、最終濃度２ｍｇ／ｍｌに希釈した。次に抽出物を真菌接種の準備ができるまで−２０℃のフリーザーに貯蔵した。これらの２ｍｇ／ｍｌ最終容量を、モリンダシトリフォリア保存溶液として用いた。
【０１０５】
１３本の試験管に、下記表９に示したようにラベルを付けた。
【０１０６】
【表９】
2008534595.tif 000010
【０１０７】
モリンダシトリフォリア保存溶液１００μｌを試験管１／１に入れ、試験管１／２には１００μｌを入れた。無菌培地１００μｌを試験管１／２、１／４、１／８、１／１６、１／３２、１／６４、１／１２８、１／２５６，１／５１２、１／１０２４、増殖対照および非接種対照に入れた。
【０１０８】
試験管１／２をよく混合し、１００μｌを取り出し、試験管１／４に入れた。この２倍希釈操作を、試験管１／８、１／１６、１／３２、１／６４、１／１２８、１／２５６、１／５１２、１／１０２４にも対して続けた。試験管１／１０２４から１００μｌを捨てた。非希釈モリンダシトリフォリア溶液を、試験管ＧＣまたはＮＣに加えた。これらは対照試験管であった。この時点で、全ての試験管は、１００μｌを含んでいた。
【０１０９】
抽出物保存溶液２ｍｇ／ｍｌ（すなわち、２０００μｇ／ｍｌ）から出発したことがわかっているため、この２倍系列希釈の結果、下記の表１０に示されるモリンダシトリフォリア果実ジュース抽出物の濃度が得られた。
【０１１０】
【表１０】
2008534595.tif 000011
【０１１１】
接種時、生物懸濁液１００μｌを、非接種対照試験管（ＮＣ）を除いて全ての試験管に加えた。ＮＣにはさらに培地１００μｌを加えた。全ての試験管は適当な温度と時間、すなわち、真菌については２５℃で５−７日、細菌については３７℃で２４−４８時間インキュベーションした。
【０１１２】
結果は、濁度を観察することにより記録した。濁度の存在は増殖を示唆し、一方、濁度がないことは、増殖阻害を示した。全ての抽出物について、増殖対照試験管で濁度があり（すなわち、増殖）、非接種対照試験管では濁度がない（すなわち、増殖なし）場合にのみ、結果を有効とした。ＭＩＣは、シリーズ中濁度がない最終試験管（すなわち、最も希釈された試験管）として決定した。
【０１１３】
下記の表１１は、平均阻害濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。
【０１１４】
【表１１】
2008534595.tif 000012
【０１１５】
その結果、モリンダシトリフォリアのエタノールおよびメタノール抽出物は、試験した全微生物に対して意味ある活性を有することが示された。予備的乾燥試験は、エタノールおよびメタノール抽出物を用いた活性が５−１０ｍｇ／ｍｌの範囲であることを示した。酢酸エチル抽出物は、エタノールおよびメタノール抽出物に見られた量の１０％未満しか含んでいなかった。
【０１１６】
この初期の実験から、モリンダシトリフォリア果実ジュースまたはその抽出物が実質的な量の抗真菌活性を示すことを明らかに確立することができる。しかし、各抽出物は、数百種類の化合物を含んでいる。実際、１０００μｌ／ｍｌでは、１００種の化合物がそれぞれ１０μｌ／ｍｌの濃度で存在するであろう。すなわち、試験した抽出物は精製した抗菌化合物ではないため、非常に高いＭＩＣであっても意味を有するであろう。下記に示した後日の試験は、モリンダシトリフォリア果実ジュース濃縮物から分画または抽出したいくつかの特定の化合物を記載する。
【実施例３】
【０１１７】
下記の実験について、抗菌剤の最小阻害濃度（ＭＩＣ）は、試験微生物の増殖をなお阻害するであろう製品の最大希釈として定義される。抗菌剤の最小致死濃度（ＭＬＣ）は、試験生物を死滅させた製品の最大希釈として定義される。ＭＩＣ／ＭＬＣ値は、多数の標準試験操作により求めることができる。最も一般的に使用される方法は、試験管希釈法および寒天希釈法である。この製品については、ＭＩＣを決定するためには試験管希釈法が提唱され、希釈物からのアリコートを接種すると、増殖の阻害可能性が示され、ＭＬＣが決定される。製品の系列希釈は、細菌増殖培地中で作製した。試験生物を製品の希釈物に加え、インキュベーションし、増殖を点数化した。全試験は三重に行った。
【０１１８】
この操作は、抗菌剤についての標準アッセイである。この方法は、米国微生物学会（ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ（ＡＳＭ））が推奨する方法論の内容と意図を勘案したものである。試験管希釈法は、細菌増殖培地での試験製品の希釈、あらかじめ決定した試験菌濃度による接種、およびインキュベーション後の増殖の可視化を利用している。試験管希釈操作は、予測終点範囲内に増殖培地を沈殿させずまたは曇らせない製品に限定される。
【０１１９】
培養物調整法については、使用した試験生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ０１５７Ｈ７  ＡＴＣＣ＃４３８８８；Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  ＡＴＣＣ＃６５３８；Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ＡＴＣＣ＃１９６５９；Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ  ｓｅｒｏｔｙｐｅ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ  ＡＴＣＣ＃１３７０６；リステリア・モノサイトゲネス（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）ＡＴＣＣ＃１９１１１；Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ  ＡＴＣＣ＃１０２３１；およびストレプトコッカス・ミュータンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）ＡＴＣＣ＃２５１７５であった。
【０１２０】
試験生物を保存溶液から大豆カゼイン消化培養液（ＳＣＤＢ）に移し、細菌については３７±２℃で２４−４８時間、酵母については２０−２５℃でインキュベーションした。必要であれば、懸濁液を生理食塩水（ＰＨＳＳ）中で、可視濁度でｍＬ当たり約１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）に調節し、標準的プレート計数を行って、最初の力価を求めた。酵母培養物は、サボロード（Ｓａｂｏｕｒａｕｄ）デキストロース寒天（ＳＤＥＸ）に接種し、２０−２５℃で２−４日間インキュベーションし、Ｓ．ｍｕｔａｎｓは、３７±２℃で３−５日間インキュベーションし、他の全ての細菌は、３７±２℃で１８−２４時間インキュベーションした。
【０１２１】
平均阻害濃度（ＭＩＣ）試験操作のためには、試験製品をこの試験目的のために中性ｐＨに調節した。調節を行う前後にｐＨを記録した。各試験製品は、殺菌水で１：２系列希釈した。ＭＩＣ／ＭＬＣ終点を示すよう希釈率を選択した。各試験製品の評価は、各微生物について三重で行った。製品希釈物を等量の２×ＳＣＤＳに加え、さらに１：２希釈物を得た。３種の陽性対照試験管は、殺菌水を等量の２×ＳＣＤＢと混合することにより、各試験生物について調製した。３種の陰性対照試験管は、試験製品の最大試験希釈物を等量の２×ＳＣＤＢと混合することにより調製した。これらの試験管には試験生物を加えなかった。３種の培地対照試験管は、殺菌水を等量の２×ＳＣＤＢと混合することにより調製した。これらの試験管にも試験生物を加えなかった。
【０１２２】
約０．０５ｍＬの各試験生物懸濁液を、サンプルおよび陽性対照試験管に加えた。細菌試験管は、３７±２℃で１８−２４時間インキュベーションし、酵母試験管は、２０−２５℃で２−４日間インキュベーションした。インキュベーション後、各試験管について増殖を陰性（０）または陽性（＋）として点数化した。
【０１２３】
平均致死濃度（ＭＬＣ）試験操作については、増殖していないと疑われる試験管のみを試験した。アリコート１．０ｍＬを各試験管から取り出し、中和培養液で１／１０系列希釈物を１／１０００まで調製した。各希釈物のアリコートを中和寒天（ＮＵＡＧ）に接種した。陽性対照については、１０−１００  ＣＦＵをＮＵＡＧに接種した。陰性対照は、２×ＳＣＤＢをＮＵＡＧに接種することにより作製した。プレートは、酵母については２０−２５℃で２−４日間インキュベーションし、Ｓ．ｍｕｔａｎｓを除く全ての細菌については３７±２℃で１８−２４時間インキュベーションした。
【０１２４】
中和確認として知られるものに関しては、ＭＬＣについて試験した試験製品の最小希釈物を、各試験生物の中和起伏について試験した。３重検定において、最大濃度の試験製品のアリコート０．５ｍＬをＮＵＡＧに接種した。プレートには、各試験生物の１０−１００ＣＦＵをスパイクした。比較のため、それぞれの試験生物について試験製品を含まないＮＵＡＧ３個のプレートも同じ１０−１００ＣＦＵでスパイクした。
【０１２５】
Ｓ．ｍｕｔａｎｓを例外として、全ての生物は、１：２濃度における中和モリンダシトリフォリア濃縮物により阻害された。試験した希釈物はいずれも、いずれの生物に対しても致死性を示すことができなかった。Ｓ．ｍｕｔａｎｓに対して試験した場合、中和モリンダシトリフォリア濃縮物によって阻害または致死性のいずれも示されなかった。
【０１２６】
全ての生物についてのＭＩＣ結果を表１２−１８に要約する。各生物についてのＭＬＣの結果を表１９−２５に要約する。Ｓ．ｍｕｔａｎｓは試験のＭＩＣ部分について増殖がないとして点数を付けた希釈物を有していなかったため、この生物についてＭＬＣは行わなかった。
【０１２７】
全ての試験生物についての中和回復は、４０−９７％の範囲であった。各実験で使用した中和培地の中和回復を表２５に要約する。
【０１２８】
【表１２】
2008534595.tif 000013
【０１２９】
【表１３】
2008534595.tif 000014
【０１３０】
【表１４】
2008534595.tif 000015
【０１３１】
【表１５】
2008534595.tif 000016
【０１３２】
【表１６】
2008534595.tif 000017
【０１３３】
【表１７】
2008534595.tif 000018
【０１３４】
【表１８】
2008534595.tif 000019
【０１３５】
【表１９】
2008534595.tif 000020
【０１３６】
【表２０】
2008534595.tif 000021
【０１３７】
【表２１】
2008534595.tif 000022
【０１３８】
【表２２】
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【０１３９】
【表２３】
2008534595.tif 000024
【０１４０】
【表２４】
2008534595.tif 000025
【０１４１】
【表２５】
2008534595.tif 000026
【実施例４】
【０１４２】
体内に導入されたときに抗真菌活性の発揮に関与する、数種のモリンダシトリフォリア製品中に存在する１種以上の特定の化合物または画分を同定するために、実験を行った。
【０１４３】
モリンダシトリフォリア果実ジュースを分画して、モリンダシトリフォリアｎ−へキサン画分、モリンダシトリフォリアＣＬ２ＣＬ２画分、モリンダシトリフォリアＥＴＯＡｃ画分、およびモリンダシトリフォリアＢｕＯＨ画分を、それぞれ特定の濃度で得た。これらのそれぞれについて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ（ＡＴＣＣ６２７５）；Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ（ＡＴＣＣ１０２３１）；Ｓｔａｐｈｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＡＴＣＣ２９２１３）；およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（ＡＴＣＣ９５３３）生物を用いて、抗菌活性を測定した。他のモリンダシトリフォリア製品もまた、上記と同様にして分画することができる。
【０１４４】
調製に際しては、各抽出物をマイクロタイタートレイに一連の濃度で調製して試験した。各シリーズの最初のウェルには２００μｌを入れ、ウェル２には１００μｌを入れ、ウェル３には５０μｌを入れ、ウェル４には２５μｌを入れ、ウェル５には１２．５μｌを入れ、ウェル６には６．３μｌを入れた。トレイは、３５−３７℃で７２時間、インキュベーションした。この時点で、抽出物は全て乾燥していた。
【０１４５】
生物を調製するためには、ＡＴＣＣ単離物を適当な培地に接種し、インキュベーションした。インキュベーション後、生物の０．５  ＭｃＦａｒｌａｎｄ懸濁液を生理食塩水で調製した。この懸濁液１００μｌを適切な培地９．９ｍｌに加えた。生物懸濁液２００μｌをシリーズの各ウェルに加え、これを用いて試験物質を懸濁させた。空のウェルにも接種して増殖対照として使用し、１個のウェルには培地を接種して陰性対照として用いた。トレイは適当な温度で適当な時間インキュベーションした（細菌試料については、３５＋／−２℃で２４−４８時間であった。真菌については、２０−２５℃で５−７日間であった）。
【０１４６】
増殖対照ウェルは濁度の存在について観察し、陰性対照は、濁りがないかを観察した。増殖対照ウェル中で増殖があり、かつ非接種ウェルで増殖がない場合にのみ、結果を有効とした。この後、他のウェルのそれぞれについて、濁度の存在を観察した。結果を記録した。次にトレイをマルチスキャンプレートリーダーにおいた。５５０ｎｍにおける吸光度を記録した。
【０１４７】
最小阻害濃度（ＭＩＣ）は本シリーズの濁っていない最終試験管である。試験結果を下記の表に示し、活性はｍｇ／ｍｌとして表す。
【０１４８】
【表２６】
2008534595.tif 000027
【０１４９】
【表２７】
2008534595.tif 000028
【０１５０】
【表２８】
2008534595.tif 000029
【０１５１】
【表２９】
2008534595.tif 000030
【０１５２】
モリンダシトリフォリア画分および抽出物は、試験した生物に対して阻害および防止活性を示した。
【０１５３】
本実験で２つの問題に遭遇した。第１は、ＥＴＯＡｃ画分または抽出物のいくつかの高濃度溶液を得る際に問題が生じたことである。これらを読み取った結果、沈殿が観察された。この沈殿は目での読み取りを妨害しなかったが、吸光度測定値を妨害した。もう１つの問題は、ｎ−ヘキサン画分または抽出物が、マイクロタイタープレート中のプラスチックをエッチングするようであった。このこともまた、吸光度に関連する問題を引き起こしたが、目での読み取り値についてはそうではなかった。さらに、供給された化合物の不足のため、第４番目のトレイは全ての濃度を調製するための十分なｎＢｕＯＨを有していなかった。その結果、Ｅ．ｃｏｌｉの結果は、１２．５ｍｇ／ｍｌより高いと報告される。
【実施例５】
【０１５４】
モリンダシトリフォリア製品が真菌の増殖を阻害することを確認し、モリンダシトリフォリア製品が採取後スプレイとして使用できることを確認するために、実験を行った。１組の定性的実験において、加工したモリンダシトリフォリア製品を、イチゴ植物にスプレイした。モリンダシトリフォリアをスプレイしたイチゴは、対照群よりも新鮮さをより長く保持した。さらに、モリンダシトリフォリアをスプレイしたものの収量は、対照よりも大きかった。モリンダシトリフォリアをスプレイしたイチゴは、対照よりも甘かった（ブリックスが高い）。植物は、細胞内病原性（ＩＰ）と称される免疫様システムを有している。ＩＰは、健康植物に病原体耐性を与える基礎となる。本発明は、加工したモリンダシトリフォリア内に存在する化学物質がＩＰ経路を活性化する可能性を企図する。
【実施例６】
【０１５５】
もうひとつの実験では、収穫したイチゴに、モリンダシトリフォリア製品をスプレイした。イチゴ４群を処理した。１−３群には、加工モリンダシトリフォリアの系列希釈物をスプレイした（群１は未希釈であり、群２は、１：２００で希釈し、群３は、１：１０００で希釈した）。群４には、１：５００に希釈したベンレート（Ｂｅｎｌａｔｅ）をスプレイした。ベンレートは、日本国農林省に認定された人工的殺虫剤である。イチゴは、４日間観察した。定性的分析は、加工モリンダシトリフォリアをスプレイしたイチゴではカビ感染が防止されたことを示した。
【実施例７】
【０１５６】
別の実験において、スファエロセカ種（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｓｐｐ．）によりうどん粉病にかかっているイチゴのイチゴ農家が、このイチゴに加工モリンダシトリフォリア（水で１：４００に希釈）をスプレイした。真菌感染が低下した。イチゴは通常よりも大きくかつ甘くなった。本発明は、この加工モリンダシトリフォリアが細菌および真菌を直接死滅させおよび／または植物の免疫システムを賦活する可能性を企図する。さらに、本発明は、賦活された植物の免疫システムが、加工モリンダシトリフォリアの適用により、栄養物を供給しかつ土壌の正常な菌叢のバランスを取ることができる程度に影響を受けることを企図する。
【実施例８】
【０１５７】
別の実験においては、プランター４個を温室に設置した。イチゴ（Ｆｒａｇａｒｉａ  ａｎａｎａｓｓａ：トチオトメ変種）の苗１０個を各プランターに接種した。上段左のプランターには、加工モリンダシトリフォリアをスプレイした（群１）。上段右のプランターは、対照群であった（群２）。下段左のプランターは、対照群であった（群３）。下段右のプランターには、加工モリンダシトリフォリアをスプレイした（群４）。６ヶ月の間、植物には水のみを与え、加工モリンダシトリフォリアも真菌もスプレイしなかった。各プランターには水５００ｍｌを４日おきに与えた。花は見えた都度、取り去った。
【０１５８】
６ヶ月の水遣り期間の後１ヶ月間、植物には、上記の水遣り法に加えて真菌をスプレイした。イチゴの葉は真菌スファエロセカ・ヒュムリ・ブリル（Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｈｕｍｕｌｉ  ｂｕｒｒｉｌｌ）に感染させた。真菌を砕いて精製水４５０ｍｌに希釈し、水１００ｍｌを全群に対してスプレイした。真菌のスプレイは、４日おきに行った。
【０１５９】
実験の９ヶ月目から始めて、加工モリンダシトリフォリアジュース１ｍｌを精製水１９９ｍｌで希釈し、この溶液を群１と４にスプレイした。加工モリンダシトリフォリアを有していない精製水２００ｍｌを各対照群（群２と３）にスプレイした。加工モリンダシトリフォリアスプレイは、４日おきに行った。実験は、まだ実施中であるが、上記に記載したものと類似の結果が予測される。
【実施例９】
【０１６０】
モリンダシトリフォリアジュースを用いて、イチゴ温室で実験を行った。長さ３０ｍの畝が６個あり、トチオトメイチゴ植物８０株を各畝に植えた。各畝を２つの等しい部分に分け、希釈モリンダシトリフォリアジュースを片側に分散させ、一方、同量の水を他の部分に分散させ、これを対照として用いた。
【０１６１】
モリンダシトリフォリアジュースは水で希釈し、１回に１平方メートル当たり３リットルの水をイチゴに分散させた。分散は、イチゴ果実形成１２日前に始め、総計５回の分散を２日に一度行った。最初の３回の分散において、モリンダシトリフォリアジュースを水で２００倍容量に希釈し、最後の２回の分散においては３００倍容量に希釈した。イチゴ収穫後、対照群およびモリンダシトリフォリアジューススプレイ群について、収量、糖含量および新鮮さ保持を調べた。
【０１６２】
果実のガクから先端まで３．０ｃｍよりも長いイチゴのみを用い、収穫量をはかりを用いて重量で決定した。収量は、対照群では６００グラム（イチゴ３８個）であり、モリンダシトリフォリアジュースを分散した群では１４００グラム（イチゴ９６個）であった。この比較から、モリンダシトリフォリアジュースの塗布と分散はイチゴの成長を促進し、収穫基準３ｃｍにより早く到達したと結論づけられる。さらに、実験中、白色の粉末疾患が数株の植物で観察されたが、モリンダシトリフォリアの分散は、疾患の蔓延を防止した。
【０１６３】
糖含量は、京都電子工業株式会社製造のデジタル糖分メータ（測定精度は±０．２ＢＲＩＸ）を用いて測定した。ガクを除去した後、イチゴ１０個をブレンダー中に入れ、十分に攪拌した。生成したイチゴジュースを糖分メータに注ぎ、総計５回測定を行い、平均値を求めた。モリンダシトリフォリア分散を行った群の糖含量の平均値は８．０Ｂｒｉｘであり、対照群のそれは７．１Ｂｒｉｘであった。この実験から、イチゴ糖含量は、モリンダシトリフォリアジュースの分散により１３％増加したことが見いだされた。
【０１６４】
次に、収穫後の新鮮さ保持を調べるため、収穫したイチゴを冷蔵庫に１０日間保持し観察した。対照群の果物の一部は、収穫１０日後には白色のカビが生え腐っているのが見られたが、モリンダシトリフォリア群のイチゴについては、カビが全く見られず表面は硬かった。このことから、モリンダシトリフォリアジュースの植物への分散が、イチゴの新鮮期間を延長させ、カビ増殖を防止すると結論づけられた。
【０１６５】
本発明は、その精神すなわち基本的特徴から逸脱することなく、他の具体的態様においても実施できる。記載の態様は、全ての点で例示するためのみであり、制限ではないとみなすべきである。従って、本発明の範囲は、上述の説明ではなく添付の請求の範囲により示される。請求の範囲の等価物の意味と範囲にある全ての変更は、その範囲内に包含される。
【実施例１０】
【０１６６】
本発明にしたがって加工したモリンダシトリフォリア製品を、芝の手入れを促進するために用いた。さまざまな場合において、加工したモリンダシトリフォリア製品を芝に適用した。加工したモリンダシトリフォリアを適用したところ、芝での真菌感染が改善された。真菌感染は、芝を茶色に変色させる表現型を有している。さらに、モリンダシトリフォリアの適用は、それを適用した芝での真菌感染の再発をさらに防止した。
【手続補正書】
【提出日】平成19年11月27日(2007.11.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
植物上での真菌および微生物増殖を阻害するための製剤であって、モリンダシトリフォリアの果実、茎、種子、果皮、根樹皮、葉および根から構成されるリストから選択され、水で１−１００００倍（重量で）希釈された抽出物または抽出物の混合物を含む製剤。
【請求項２】
前記製剤がさらに、少なくとも１種の肥料成分を含む請求項２記載の製剤。
【請求項３】
前記肥料成分が、硫酸アンモニウム、尿素、カリウム、窒素および塩化アンモニウム、ニワトリ糞、ウシ糞、糞化石、ミミズの糞、昆虫の糞、のこぎりくず、コメぬか、にんにくオイル、魚油、バーミキュライト、モンモリロナイト、活性炭素、チャコール、珪藻土、タルク、アルファルファミールおよびペレット、窒素、リン、カリウム、ビートの乾燥し粉砕した残渣、とうもろこしグルテン、綿実ミール、数種のケルプまたは海草の抽出物または粉末化部分、大豆ミール、動物加工副産物、ブラッドミール、ボーンミール、コンポストおよび魚副産物から構成されるリストから選択される請求項１記載の製剤。
【請求項４】
前記加工製剤がさらにクエルセチンを含む請求項１記載の製剤。
【請求項５】
さらに、前記クエルセチンと相乗的に作用して前記真菌および微生物増殖を阻害する付加的活性成分としてのルチンを含む請求項４記載の製剤。
【請求項６】
前記ルチンが、約０．１乃至約１０重量％の間の量で存在する請求項５記載の製剤。
【請求項７】
植物上での真菌および微生物増殖を阻害するための製剤であって、モリンダシトリフォリアのｎ−へキサン画分を０．０１乃至１０重量％で含む製剤。
【請求項８】
前記モリンダシトリフォリア画分がＣＬ２ＣＬ２画分、ＥＴＯＡｃ画分、およびｎ−ＢｕＯＨ画分から構成されるリストから選択されるモリンダシトリフォリア画分を含む請求項７記載の製剤。
【請求項９】
前記製剤が、モリンダシトリフォリアの果実、茎、種子、果皮、根樹皮、葉および根から構成されるリストから選択される抽出物または抽出物の混合物を含む請求項７記載の製剤。
【請求項１０】
前記製剤が、適用前または適用中に重量として１−１００００倍希釈される請求項７記載の製剤。
【請求項１１】
前記製剤が、適切な担体物質で液体、顆粒、粉末、またはペースト剤に調製される請求項７記載の製剤。
【請求項１２】
前記製剤が水に溶解されているかまたは分散されている請求項７記載の製剤。
【請求項１３】
前記製剤がさらに、硫酸アンモニウム、尿素、カリウム、窒素および塩化アンモニウム、ニワトリ糞、ウシ糞、糞化石、ミミズの糞、昆虫の糞、のこぎりくず、コメぬか、にんにくオイル、魚油、バーミキュライト、モンモリロナイト、活性炭素、チャコール、珪藻土、タルク、アルファルファミールおよびペレット、窒素、リン、カリウム、ビートの乾燥し粉砕した残渣、とうもろこしグルテン、綿種子食、数種のケルプまたは海草の抽出物または粉末化部分、大豆ミール、動物加工副産物、ブラッドミール、ボーンミール、コンポストまたは魚副産物から構成されるリストから選択される少なくとも１種の肥料成分を含む請求項７記載の製剤。
【請求項１４】
前記加工製剤がさらにクエルセチンを含む請求項７記載の製剤。
【請求項１５】
さらに、前記クエルセチンと相乗的に作用して前記真菌および微生物増殖を阻害する付加的活性成分としてのルチンを含む請求項１４記載の製剤。
【請求項１６】
前記ルチンが、約０．１乃至約１０重量％の間の量で存在する請求項１５記載の製剤。
【請求項１７】
植物上での真菌および微生物活性を阻害する方法であって、
約０．０１−９９．９９重量％の量で存在する加工モリンダシトリフォリア製品を含む製剤に前記植物を曝すことを含み、前記製品が、モリンダシトリフォリアの果実、茎、種子、果皮、根樹皮、葉および根から構成されるリストから選択される抽出物または抽出物の混合物を含むことを特徴とする方法。
【請求項１８】
さらに、クエルセチン、ルチン、ｎ−ヘキサン抽出物、ＣＬ２ＣＬ２抽出物、ＥＴＯＡｃ抽出物およびｎ−ＢｕＯＨ抽出物から構成されるリストから選択される成分を含む請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
下記の方法：植栽前に土壌に前記製剤をスプレイするかまたは潅水すること；前記製剤を、植物成長時に土壌にスプレイするかまたは潅水すること；植物を切るとき、分割するときまたは再度植える時に前記植物を被覆すること；植栽時に種子または球根を被覆すること；しおれた花および潅木に被覆すること；水栽培植物に分散させること；細菌またはウイルスに感染した植物を被覆すること；採取後切り取った植物を被覆すること；または、収穫後作物および花に被覆すること；の少なくとも１種で前記製剤に植物を暴露させる段階を含む請求項１７記載の方法。
【請求項２０】
前記製剤が、適切な担体物質で液体、顆粒、粉末、またはペースト剤に調製される請求項１７記載の方法。
【請求項２１】
前記モリンダシトリフォリア製品が水で重量として１−１００００倍希釈される請求項１７記載の方法。
【請求項２２】
前記製剤がさらに、硫酸アンモニウム、尿素、カリウム、窒素および塩化アンモニウム、ニワトリ糞、ウシ糞、糞化石、ミミズの糞、昆虫の糞、のこぎりくず、コメぬか、にんにくオイル、魚油、バーミキュライト、モンモリロナイト、活性炭素、チャコール、珪藻土、タルク、アルファルファミールおよびペレット、窒素、リン、カリウム、ビートの乾燥し粉砕した残渣、とうもろこしグルテン、綿実ミール、数種のケルプまたは海草の抽出物または粉末化部分、大豆ミール、動物加工副産物、ブラッドミール、ボーンミール、コンポストまたは魚副産物から構成されるリストから選択される少なくとも１種の肥料成分を含む請求項１７記載の方法。
【国際調査報告】
2008534595.tif 000031