(57)【要約】  本発明は、新規および改良された生体アミンＧＰＣＲモジュレーター；その調製方法；それらを特徴付ける方法；それらの調製および／またはスクリーニングのためのキット；およびそれらを用いる診断または治療のための方法を提供する。例えば、ノルエピネフリンといった生体アミン受容体を調整する化合物は、アスコルビン酸塩、モルヒネ、またはＥＤＴＡなどの化合物に共有結合している。【特許請求の範囲】
【請求項１】
生体アミンＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断部分と結合している、生体アミンＧＰＣＲリガンドまたはそのリガンド類似体を含んでなる、連結化合物。
【請求項２】
前記Ｅ１−ＴＭ３結合もしくは遮断部分が三水素相互作用（ＴＨＩ）化合物残基である、請求項１に記載の連結化合物。
【請求項３】
前記Ｅ１−ＴＭ３結合もしくは遮断部分が、アスコルビン酸塩、モルヒネ、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸塩類似体、モルヒネ類似体、またはＥＤＴＡ類似体のうちのいずれか１つである、請求項１に記載の連結化合物。
【請求項４】
前記ＧＰＣＲリガンドがアミン作動性化合物である、請求項１に記載の連結化合物。
【請求項５】
前記生体アミンＧＰＣＲリガンドが、前記化合物の中でＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断部分から約３ｎｍ以内に位置される、請求項１に記載の連結化合物。
【請求項６】
生体アミンＧＰＣＲアゴニストもしくはアンタゴニスト活性と、Ｅ１−ＴＭ３調整活性との両方を示すＧＰＣＲモジュレーターである、請求項１に記載の連結化合物。
【請求項７】
連結化合物の調製方法であって、
（Ａ）  共有結合に有用な第１の反応基を含む生体アミンＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断化合物と、共有結合に有用な第２の反応基を含む生体アミンＧＰＣＲリガンドもしくはその類似体とを提供し、かつ
（Ｂ）  前記第１の反応基と第２の反応基とが反応して共有結合を形成する結合反応を行い、それにより連結化合物を得る
ことを含んでなる、方法。
【請求項８】
前記方法が共有結合に有用な第３の反応基および第４の反応基を含むリンカーを提供することをさらに含み、前記結合反応が、共有結合を形成するように前記第３の反応基および前記第４の反応基を反応させることをさらに含み、得られた連結化合物がリンカーを含み、前記リンカーがその反応基の残基の１つを通じてＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断化合物と結合し、かつ、前記リンカーの反応基の残基の他のものを通じて生体アミンＧＰＣＲリガンドもしくは類似体と結合する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
ＧＰＣＲモジュレーターの調製方法であって、
（Ａ）  請求項７または８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの連結化合物を提供し、かつ
（Ｂ）  １または複数の前記連結化合物をスクリーニングして、生体アミンＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３ペプチド、生体アミンＧＰＣＲリガンド結合部位、またはその両方に対する結合特異性を示す少なくとも１つを同定し、それにより少なくとも１つのＧＰＣＲモジュレーターを得る
ことを含んでなる、方法。
【請求項１０】
前記スクリーニングが、生細胞上の、生体アミンＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３ペプチド、生体アミンＧＰＣＲリガンド結合部位、またはその両方への前記連結化合物の結合によって起こる少なくとも１つの生物学的作用を同定することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記スクリーニングが、連結化合物がリガンド単独、Ｅ１−ＴＭ３結合部分化合物単独、またはその両方よりも、より強いアゴニスト、アンタゴニスト、リガンド遮断、リガンド強化、リガンド強化抵抗性、またはリガンド強化遮断作用を示すかどうかを同定することを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１つの連結化合物が、複数の連結化合物を含むライブラリーを有する、請求項９に記載の方法。
【請求項１３】
１または複数の前記ＧＰＣＲモジュレーターをスクリーニングして、無毒性または最大限でも実用上許容される程度の毒性のいずれかを示す少なくとも１つを同定することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１４】
実用上許容される程度の毒性が医薬上許容される程度の毒性であり、このため、前記ＧＰＣＲモジュレーターがＧＰＣＲモジュレーター薬剤である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項９〜１４のいずれか一項に記載の方法により調製される、生体アミンＧＰＣＲモジュレーター。
【請求項１６】
生体アミンＧＰＣＲの調製方法であって、
請求項１５に記載の実用上有効量のＧＰＣＲモジュレーターを提供し、かつ
生体アミンＧＰＣＲと前記ＧＰＣＲモジュレーターとを接触させる
ことを含む、方法。
【請求項１７】
前記の接触させることが、前記モジュレーターを生物学的存在に投与することを含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記生物学的存在が、生体アミンＧＰＣＲを含むin vitroサンプルである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記in vitroサンプルが生細胞を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記生物学的存在が生物である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記生物がヒトまたは脊索動物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記生物がヒトまたは脊椎動物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記生物がヒトまたは哺乳類の動物である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
（Ａ）  （１）  生体アミンＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断部分と結合している、生体アミンＧＰＣＲリガンドもしくはそのリガンド類似体を有する連結化合物、
（２ａ）  そのような連結化合物の構築に有用なリンカー、
（２ｂ）  そのような連結化合物の構築に有用なＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断化合物、、または
（２ｃ）  そのような連結化合物の構築に有用な生体アミンＧＰＣＲリガンドもしくはその類似体
のいずれか１以上と；
（Ｂ）  （Ａ）（２ａ）、（Ａ）（２ｂ）、および／または（Ａ）（２ｃ）の１以上のみが提供される場合に、（Ａ）（２ａ）、（Ａ）（２ｂ）、および／または（Ａ）（２ｃ）の成分を用いる連結化合物の調製に関する説明書と；
（Ｃ）  提供された連結化合物、または提供された（Ａ）（２ａ）、（Ａ）（２ｂ）、および／または（Ａ）（２ｃ）の成分を用いて調製された連結化合物の使用説明書であって、
（１）（ａ）キット中で提供されているか、またはキットのユーザーにより提供される、in cyto、in vivo、またはin vitro生体アミンＧＰＣＲまたはそのＥ１−ＴＭ３ペプチド含有部分と、連結化合物とを接触させること、および（ｂ）結果として得られる結合特性を測定すること、および／または結果としてもたらされたＧＰＣＲ変換生物活性を測定することを含むアッセイ法、または
（２）生物におけるin vivo法
における使用説明書と
を含んでなる、キット。
【請求項２５】
前記in vivo法が診断法である、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
前記in vivo法が治療法である、請求項２４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
関連出願の参照
本願は、米国特許法第１１９条の下で、２００５年４月１５日出願の米国仮出願第６０／６７２，２２４号、および２００５年８月０５日出願の米国仮出願第６０／７０６，２４９号、および２００５年１１月１８日出願の米国仮出願第６０／７３８，２９４号に対して優先権を主張する。上記出願の開示内容は引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００２】
配列表
配列表は、コンパクトディスク上にある。４枚の複製コンパクトディスクが提出され、これらはそれぞれ、コピー１、コピー２、コピー３、およびコピー４とラベルされている。これら４枚のコンパクトディスクにはそれぞれ、「Ascorbate Binding Peptide.ST25.txt」という名前の１４０ＫＢのファイル中に２０７の配列を含む同一の配列表が収められており、２００６年４月１４日に作成された。これらのコンパクトディスクに記録されたデータは、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０００３】
緒言
本発明は、Ｇタンパク質共役型生体アミン受容体の新規モジュレーター、およびその使用に関する。
【０００４】
生体アミン受容体は、Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のロドプシン様受容体クラスのファミリーに属している。この生体アミン受容体ファミリーは、アドレナリン受容体、ドーパミン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、オクトパミン受容体、セロトニン受容体、および微量アミン受容体の７つのサブファミリーを包含する。ＧＰＣＲ生体アミン受容体は広範囲にわたって分布し、ヒトおよび総ての主要な動物群で確認されている。それらは非常に広範囲にわたる機能を果たす。
【０００５】
アドレナリン受容体またはアドレノレセプターは、生体アミン受容体の実例である。アドレノレセプターはヒトまたは動物の体中の組織に位置している。アドレナリン受容体により仲介される機能の多様性から、それらの活性をアゴナイズまたはアンタゴナイズする薬剤が、例えば、高血圧症、ショック、心不整脈、喘息、アレルギー、心不全、およびアナフィラキシーなどの様々な障害の治療に有用なものになっている。
【０００６】
アドレナリン受容体およびアドレナリン作動薬は、例えば、（１）皮膚および粘膜に分布する血管などのある種の平滑筋、ならびに唾液腺および汗腺などの腺細胞に対する末梢の興奮性作用；（２）腸壁、気管支樹、および骨格筋に分布する血管などのある種の他の種類の平滑筋に対する末梢の阻害作用；（３）心拍数および収縮力の増大に関与する心臓興奮作用；（４）肝臓および筋肉におけるグリコーゲン分解、ならびに脂肪組織からの遊離脂肪酸の放出の速度増大などの代謝作用；（５）インスリン、レニン、および下垂体ホルモンの分泌の調整などの内分泌作用；（６）呼吸刺激、ならびに、一部のアドレナリン作動薬では覚醒状態、精神運動活性の亢進、および食欲減退などのＣＮＳ作用；ならびに（７）ノルエピネフリンおよびアセチルコリンなどの神経伝達物質の放出の阻害または促進のいずれかをもたらすシナプス前作用といった全身作用を制御している。Goodman and Gilman’s, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Edition (1990)を参照のこと。
【０００７】
多様なアドレナリン受容体の用途にもかかわらず、アドレナリン受容体と仲介に関する科学的知見は、まだ不足している。アドレナリン受容体と薬物に関して知られている情報の大部分は、構造比較および機能的類似性により十分に特徴付けられた類似の分子であるロドプシンの研究を通して得られたものである。アドレナリン受容体に特有の機能、結合、活性化、および不活性化の知識がなければ、投与がいくつかの異なる身体機能に影響を与える可能性があるため、アドレナリン作動性化合物の臨床上の使用は複雑なものとなりうる。さらに、アドレナリン作動性化合物に対する生体組織の反応は、化合物の直接作用のみならず、生物の恒常性維持反応によっても検出される。副作用が稀ではないために、用いる特定のアドレナリン作動性化合物、およびそれを投与する用量レベルは慎重に選択しなくてはならない。例えば、プロプラノロールなどの非選択的β遮断薬は、β−２受容体を遮断することにより気管支収縮を引き起こし、喘息患者にリスクを与えうる。
【０００８】
アドレナリン受容体と同様に、他の主要な生体アミン受容体ファミリー（ドーパミン受容体、ヒスタミン受容体、ムスカリン受容体、アセチルコリン受容体、およびセロトニン受容体）もまた、様々な疾患、障害、および状態に広く関与している。これらの例としては、特に：パーキンソン病および運動障害（例えば、ジスキネジア）；痙攣または嘔吐障害；双極性疾患、統合失調症、および他の精神病；他のＣＮＳ疾患、および障害；鬱病、およびパニック障害；強迫神経症、過食症、および大食症；依存症；肥満症；学習、記憶、および認知機能障害；神経血管障害、および片頭痛；急性および慢性疼痛；ホルモンおよび神経伝達物質放出障害；涙液、唾液、および胃液分泌障害；喘息、アレルギー、および炎症；ならびに、例えば、腸、膀胱、および他の平滑筋収縮に関連する副交感神経作用障害が挙げられる。これらの受容体はそのための治療を仲介するために同じ様に利用することができ、また、アドレナリン受容体により仲介される治療に関して上述されたものと同様の問題がこれらの受容体ファミリーに関しても存在する。
【０００９】
カテコールアミン医薬組成物および方法についてのRoot-Bernstein et al.の米国特許公報第２００３／０２１６４１３号（２００３年１１月２０日；明示的に、引用することによりその全文が本明細書の一部とされる）では、アドレナリン作動性のＧＰＣＲ活性化の程度または持続時間を増大させるための、例えば、アスコルビン酸塩とアドレナリン作動性化合物の同時投与が記載されている。しかしながら、このような方法による生体アミンリガンドの作用の促進は、一般にアスコルビン酸塩の全身送達(system delivery)に伴って起こり、これは非アドレナリン作動性の生体アミンＧＰＣＲも同様に活性化しうる。さらに、送達が全身(system)である場合には、ＧＰＣＲ活性化の所望の程度または持続時間を得るために、多くの場合、比較的大量または高濃度の、例えばアスコルビン酸塩が投与されうる。
【００１０】
アスコルビン酸塩、および少なくとも一部の他のＧＰＣＲ促進化合物の場合、大量の全身投与は望ましくない薬の副作用を起こしうる。例えば、アスコルビン酸塩は以下に示す作用を示すことがわかっている。（１）２５ｍｇ／ｋｇアスコルビン酸塩と同時投与された場合、イソプロテレノールの投与により、著しい血圧低下を伴う心拍数および脈圧の大幅な増加(subtantial increase)；JB Houston et al., Potentiation of isoproterenol by ascorbic acid, Res. Commun. Chem. Pathol. & Pharmacol. 14(4):643-50 (1976)参照。（２）ドブタミン処理した組織に５００ｍｇのアスコルビン酸塩を注入した場合、心臓の心室収縮性の著しい増加；S Mak & GE Newton, Vitamin C augments the inotropic response to dobutamine in humans with normal left ventricular function, Circulation 103(6):826-30 (2001)参照。（３）フェニレフリンまたはプロスタグランジンにより収縮した組織へのアスコルビン酸塩投与による静脈拡張の大幅な増加；M Grossmann et al., Ascorbic acid-induced modulation of venous tone in humans, Hypertension 37(3):949-54 (2001)参照。および（４）アスコルビン酸塩の血清濃度が１ｍＭとなるまで注入された被験体における心迷走神経のBRSの著しい増加；KD Monahan et al., Ascorbic acid increases cardiovagal baroreflex sensitivity in healthy older men, Am. J Physiol.-Heart & Circ. Physiol. 286(6):H2113-2117 (Jun 2004), doi:10.1152/ajp heart.0154.2003 (February 12, 2004)参照。
【００１１】
アドレナリン作動性および他の生体アミン受容体の機能、結合および活性化の理解を深めることが望ましいであろう。また、受容体活性を仲介または調整する新規化合物を提供することも望ましいであろう。さらに、生体アミン受容体の構造、設計、および受容体の活性および受容体へのリガンドの結合を仲介または調整するメカニズムに関する高度な知識を役立てることが望ましい。現在利用可能なアドレナリン作動性および他のＧＰＣＲ仲介薬の有効性を高め、既存の薬物治療の副作用を軽減し、新規療法を設計するためには、上記の進展が望ましいであろう。
【発明の概要】
【００１２】
本発明は、生体アミンＧＰＣＲリガンド結合部位と結合もしくは遮断できる生体アミンＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）リガンドもしくはその類似体と安定に結合しているＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断部分を含む連結化合物（tethered compound）；その調製法；それらを特徴付ける方法；およびそれらを利用する診断または治療のための方法を提供する。従って、本発明は以下に示すものを提供する：
【００１３】
生体アミンＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断部分（biogenic amine GPCR E1-TM3 binding or blocking moiety）と結合している、生体アミンＧＰＣＲリガンドもしくはそのリガンド類似体を含む、連結化合物；および生体アミンＧＰＣＲリガンドが、前記化合物の中で前記Ｅ１−ＴＭ３結合もしくは遮断部分から約３ｎｍ以内に位置するような化合物；
【００１４】
連結化合物を調製するための方法であって、：（Ａ）共有結合に有用な第１の反応基を含む生体アミンＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断化合物と、共有結合に有用な第２の反応基を含む生体アミンＧＰＣＲリガンドもしくはその類似体とを提供し、かつ、（Ｂ）第１の反応基と第２の反応基とが反応して共有結合を形成する結合反応を行い、それにより連結化合物を得ることを含む方法であり；かつ、そのような方法が共有結合に有用な第３の反応基および第４の反応基を含むリンカーを提供することをさらに含み、前記結合反応が、共有結合を形成するように前記第３の反応基および前記第４の反応基を反応させることをさらに含み、得られた連結化合物がリンカーを含み、前記リンカーがその反応基の残基の１つを通じてＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断化合物と結合し、かつ、前記リンカーの反応基の残基の他のものを通じて生体アミンＧＰＣＲリガンドまたは類似体と結合する、方法；
【００１５】
ＧＰＣＲモジュレーターを調製するための方法であって、（Ａ）請求項７または８のいずれか一項に記載の少なくとも１つの連結化合物を提供し、かつ、（Ｂ）生体アミンＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３ペプチド、生体アミンＧＰＣＲリガンド結合部位、またはその両方に対する結合特異性を示す少なくとも１つを同定するために前記連結化合物または複数の前記連結化合物をスクリーニングし、それにより少なくとも１つのＧＰＣＲモジュレーターを得ることを含む、方法；
【００１６】
上記の方法で調製された生体アミンＧＰＣＲモジュレーター；実用上有効量のかかる生体アミンＧＰＣＲモジュレーターを提供し、かつ、それと生体アミンＧＰＣＲとを接触させることを含む、生体アミンＧＰＣＲを調整するための方法；ならびに、
【００１７】
（Ａ）（１）生体アミンＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断部分と結合している、生体アミンＧＰＣＲリガンドもしくはそのリガンド類似体を有する連結化合物、
（２ａ）そのような連結化合物の構築に有用なリンカー、
（２ｂ）そのような連結化合物の構築に有用なＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断化合物、または
（２ｃ）そのような連結化合物の構築に有用な生体アミンＧＰＣＲリガンドもしくはその類似体、のいずれか１以上と；
（Ｂ）（Ａ）（２ａ）、（Ａ）（２ｂ）、および／または（Ａ）（２ｃ）の１以上のみが提供される場合に、（Ａ）（２ａ）、（Ａ）（２ｂ）、および／または（Ａ）（２ｃ）の成分を用いる連結化合物の調製に関する説明書と；
（Ｃ）提供された連結化合物、または提供された（Ａ）（２ａ）、（Ａ）（２ｂ）、および／または（Ａ）（２ｃ）成分を用いて調製された連結化合物の使用説明書であって、（１）（ａ）キット中で提供されているか、またはキットのユーザーにより提供される、in cyto、in vivo、またはin vitro生体アミンＧＰＣＲまたはそのＥ１−ＴＭ３ペプチド含有部分と、連結化合物とを接触させること、および（ｂ）結果として得られる結合特性を測定すること、および／または結果としてもたらされたＧＰＣＲ変換生物活性を測定することを含むアッセイ法、または（２）生物におけるin vivo法
における使用説明書と
を含む、キット。
【００１８】
本発明の組成物および方法は、受容体の構造、機能、およびメカニズムの１以上の高度な知識；増大および標的化された、受容体の仲介および活性化；ならびに改良された試験方法および薬物設計など、当技術分野で公知のアドレナリン作動薬療法に比べて優れていることが見出されている。本発明のさらなる使用、利益、および実施形態は、本明細書に示される説明から明らかである。
【発明の具体的説明】
【００１９】
以下の定義および非限定的なガイドラインは、本明細書に示される本発明の説明を検討するにあたって考慮されなくてはならない。本明細書で用いられる、見出し（「緒言」および「概要」など）ならびに小見出し（「方法」など）は、本発明の開示の主題の一般的な構成のみを意図し、本発明の開示またはそのいかなる態様をも限定することを意図しない。特に、「緒言」に開示されている対象は、本発明の範囲内の技術の態様を含んでよく、また、先行技術を列挙しなくてもよい。「概要」に開示されている対象は、本発明の全範囲またはその実施形態の包括的または完全な開示ではない。本明細書の一部のうちの材料の、際立った有用性を有するものとしての分類または考察は、便宜のためになされたものであり、また、前記材料が任意の所与の組成物において使用される場合に、本明細書におけるその分類に従って必然的に機能するはずだと断定を下すべきではない。さらに、本発明は、例えば、アドレナリン受容体またはドーパミン受容体といった特定の種類の生体アミンＧＰＣＲを参照することにより説明または例示されるが、そのような特定の説明は例示であり、本発明の範囲を限定するものではない。
【００２０】
本明細書における参照文献の引用は、それらの参照文献が先行技術である、または本明細書に開示されている本発明の特許性に関連性があると承認するものではない。緒言で引用された参照文献の内容の考察はいずれも、参照文献の著者によりなされた主張の一般的な概要を提供することのみを意図し、そのような参照文献の内容の正確性に関して承認するものではない。本明細書の説明の部分で引用された総ての参照文献は、引用することによりその全文が本明細書の一部とされる。
【００２１】
説明および特定の実施例は、本発明の実施形態を示すが、例示のみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。さらに、上記の特徴を有する複数の実施形態の列挙は、さらなる特徴を有する他の実施形態、または上記の特徴の異なる組合せを組み込んだ他の実施形態の除外を意図するものではない。特定の実施例は、本発明の組成物および方法の作製および使用法の例示の目的で提供され、特に明記されない限り、所与の本発明の実施形態が作製または試験されたということ、あるいは作製または試験されていないということを示すものではない。
【００２２】
本明細書において、「好ましい」および「好ましくは」という言葉は、本発明の実施形態がある特定の状況下で一定の利益を与えることをさす。しかしながら、同じまたは他の状況下では、他の実施形態もまた好ましい可能性もある。さらに、１以上の好ましい実施形態の列挙は、他の実施形態が有用ではないことを意味するものではなく、本発明の範囲から他の実施形態を除外することを意図するものではない。
【００２３】
本明細書において、「含む」およびその変形の言葉は、限定しないことを意図し、そういうものとして、リスト中の項目の列挙は、本発明の材料、組成物、装置、および方法においても有用である他の同様の項目を除外するものではない。
【００２４】
本明細書で述べられるように、特に断りのない限り、総ての組成率は組成物の総重量に対するものである。
【００２５】
本明細書において、ウイルスという用語は、任意の形態のカプシドに包まれたウイルスをさし、それにはカプシドに包まれたヒト、動物、および植物ウイルス、ならびに例えば、「ヘルパー」ウイルス、ファージ、およびサテライトウイルスが含まれる；また、本明細書において用いられるように、用語「ウイルス様粒子」は、カプシドがポリペプチドベースである、任意の形態の、任意の他のカプシドに包まれた実体を含む。
【００２６】
本明細書において、用語「ペプチド」とは、モノマーが、α−アミノ基と１−カルボキシ基の縮合により得られるアミド結合により連結されているポリ−アミノアシルポリアミドをさす。モノマーは、独立にＤ−またはＬ−構造のいずれかであり、当技術分野で公知の任意の側鎖修飾を示す、２０より大きい任意の通常のα−アミノ酸（ＣｉｔおよびＯｒｎを含む）でありうる。「ペプチド」は、例えば：直線状；骨格アミド、側鎖と側鎖、または側鎖と末端との結合を介する環状；二次構造による立体配座的に制限された形態；さらなる化学的部分またはペプチドと結合している部分の存在により立体配座的に制限された形態（環状を含む）；および／または所望の１以上のさらなる構造と結合しうる形態といった当技術分野で公知の任意の形態で提供されうる。
【００２７】
本明細書において、用語「ペプチド類似体」とは、所与のペプチドにおいて提供されるアミノ酸残基側鎖の配列と同じ化学的部分の配列（好ましくは、天然の長さまたは延長された長さのアミノ酸残基側鎖の配列）を含む分子であり、前記部分がアミノ酸残基の前記ペプチドの配列と大体同じ間隔となるよう配置され、その部分において、前記分子が前記ペプチドと結合する物質と、前記ペプチドと少なくとも実質的に同じ方法または程度で結合することが可能である分子をさす。従って、「ペプチド類似体」の例には、限定されるものではないが：擬似ペチドス(pseudopepetides)；例えば、−ＣＨ（Ｒ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＨ−アミド構造の代わりに−ＣＨ（Ｒ）ＣＨ２ＮＨ−をもつアミン−骨格類似体といった骨格が修飾された類似体；アミド構造が、例えば、−ＣＨ（Ｒ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＨ−、−ＣＨ（Ｒ）ＣＨ２Ｓ（＝Ｏ）−、−ＣＨ（Ｒ）ＣＨ２Ｓ（＝Ｏ）２−、または−ＣＨ（Ｒ）ＣＨ２Ｓ−により置換されている他のアミド−置換骨格類似体；およびペプトイド、すなわち、α−Ｎ−結合された側鎖を有するポリグリシンが含まれる。
【００２８】
本明細書において、用語「薬学上許容される」は、正しい医学的判断において重要であると考えられているように、被験体の生存力および他の健康要因に関して評価された妥当なリスク／便益比に相応する、過度の副作用（毒性、刺激作用、およびアレルギー反応など）がない、ヒトおよび／または動物被験体もしくは組織における使用、それらへの使用、それらでの使用に適していることを意味する。この点において、「医薬品」とは、１以上の、例えば、予防、治療、苦痛緩和、栄養、美容（例えば、バイオコスメティック、ニューロコスメティック）、または診断目的に対して、直接的であれ間接的であれ有用性を提供する材料および方法をさす。間接的な医薬品の有用性を示す例には、限定されるものではないが、例えば、外科治療と併せて用いられる麻酔または筋肉麻痺誘発剤、または放射線療法で標的化される密集体を局在化または可視化するために用いられる検出剤、または治療計画のコンプライアンスを確認するための、投与された処方物中に存在する標識もしくはトレーサーといった他の治療の補助として使用される材料および方法が含まれる。「薬学上許容される」賦形剤（例えば、担体および他の添加剤）はさらに、本発明の医薬処方物などの混合物の有効成分の生物活性の有効性に干渉することのない材料でありうる。
【００２９】
用語「機能上許容される」とは、所望の機能、すなわち、所望の目的に対する所与の方法または材料の妥当性をさす。この用語は「薬学上許容される」よりも広義であり、また他の（例えば、薬学上許容されない）種類の方法および材料を包含する。このような他の「機能上許容される」種類の例には、限定されるものではないが：
・殺菌上許容される（例えば、動物／昆虫またはヒトの殺菌および／または毒性誘発目的）；
・バイオスタティック上許容される（例えば、動物／昆虫またはヒトの幼若化、不妊誘発、および／または避妊目的）；
・抑制上許容される（例えば、動物／昆虫またはヒトの忌避性、刺激性、炎症誘発性、および／または発痛性目的関連）；
・および鎮静上または運動抑制上許容される（例えば、動物／昆虫またはヒト中枢神経系の抑制が所望される非医療目的関連、１以上の例えば、鎮静−催眠薬、抗不安薬、麻酔薬、オピオイド鎮痛薬、骨格筋弛緩薬、筋麻痺薬、および鎮静、弛緩、または運動抑制を誘発できる他の薬剤を用いるものを含む）が含まれる。そのような目的の特定の例には、例えば、犯罪の阻止または拘束、群衆整理、野生動物および昆虫防除（例えば、抑止、忌避）、ならびに動物／昆虫個体群の成長制御などが含まれる。場合によっては、材料または方法は複数の目的に対して許容されうる；例えば、バイオスタティック許容される薬剤はまた、薬学上許容されうる。
【００３０】
本明細書において、用語「ｌｏｇＰ」とは、所与の物質に対するオクタノール−水（octanol-water）分配係数の対数をさす。これはまた、ｌｏｇＰｏｗとも呼ばれ、当技術分野で公知の方法により測定または計算することができる。
【００３１】
本明細書において、以下に示す反応性塩を表す用語は、括弧内に示された意味を有する：トシル酸塩（ｐ−トルエンスルホン酸）、メシル酸塩（メタンスルホン酸）、ノシル酸塩（ｐ−ニトロ−ベンゼンスルホン酸）、ブロシル酸塩（４−ブロモベンゼンスルホン酸）、ノナフル酸塩（ノナフルオロブタンスルホン酸）、トリフル酸塩（トリフルオロメタンスルホン酸）、およびトレシル酸塩（２，２，２−トリフルオロエタンスルホン酸）
【００３２】
本明細書において、用語「連結化合物」とは、生体アミンＧＰＣＲリガンド（すなわち、アゴニスト、アンタゴニスト、またはＧＰＣＲリガンド結合部位をふさぐか、アクセスを遮断しうるアゴニストもしくはアンタゴニスト類似体、例えば、アゴニストまたはアンタゴニストの少なくとも実質的に不活性なエナンチオマーまたはジアステレオマーである類似体）が、生体アミンＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断部分、すなわち、アスコルビン酸塩、モルヒネまたはＥＤＴＡへの結合に関与するＥ１−ＴＭ３セグメントの少なくとも一部と結合できるか、または結合を遮断できる化学物質、と結合している化合物をさす。そのような結合部分には、以下にさらに定義されるように、アスコルビン酸塩、モルヒネ、ＥＤＴＡ、ならびにアスコルビン酸塩、モルヒネ、およびＥＤＴＡ類似体が含まれる。本明細書で有用なさらなるそのような結合部分は、２００５年４月１５日に出願されたRoot-Bernstein et al.のアスコルビン酸塩結合ペプチドに関する米国仮特許出願第６０／６７２，２２４号に記載の通り、化合物をＥ１−ＴＭ３結合活性に関しておよび／または得られたＧＰＣＲ調整活性に関してスクリーニングすることにより同定されるものである。
【００３３】
好ましくは、前記結合は、安定な結合、すなわち、その生物学的作用を及ぼすのに十分な時間標的環境下で存続しうるものでありうる；好ましくは、前記結合は共有結合でありうる；前記連結は、十分な所望の時間の経過後に例えば、in vivo環境といった標的環境により、または解離させることのできる物理的、化学的、もしくは生化学的薬剤の導入または活性化により、例えば、加水分解できるといった解離性を有するように選択されうる。本発明の連結化合物の好ましい実施形態では、前記結合部分は、平均分子量が約２０００ダルトン以下の小分子結合部分であってよい。
【００３４】
解離性の安定な結合の例には、直接的な、または炭化水素もしくはヘテロ炭化水素鎖を含むリンカーを介した共有結合が含まれ、そこで直接的な共有結合は、例えば、加水分解性であり、リンカー鎖は少なくとも１つの切断可能な部位を含んでいる。例えば、前記リンカーはエンドリパーゼの作用により切断可能な直鎖炭化水素、またはエンドペプチダーゼの作用により切断可能なポリアミドを含みうる。
【００３５】
好ましい実施形態では、化合物の中で生体アミンＧＰＣＲリガンドはＥ１−ＴＭ３結合部分から約３ｎｍ以内に位置するか、または約２．５ｎｍ以内、約２ｎｍ以内、約１．５ｎｍ以内、約１ｎｍ以内、もしくは約０．５ｎｍ以内に位置してよい（距離は総て平均である）。好ましい実施形態では、化合物の中で生体アミンＧＰＣＲリガンドはＥ１−ＴＭ３結合部分から平均で約０．５ｎｍに位置してもよい。
【００３６】
好ましい実施形態では、リンカーは生物学的に中性（例えば、非免疫原性、非反応性）の化学種、：均一な脂肪族鎖(homoaliphatic chains)；アルキレンジオールのオリゴマー、好ましくは、Ｃ１−Ｃ６ジオール（好ましくは、Ｃ１−Ｃ６アルキレングリコール）；シラン；シロキサン；ポリスルホン；アクリレートポリマー（例えば、メタクリレートおよびエタクリレートポリマーならびにコポリマー、シロキサニルアルキルアクリレートおよびメタクリレートのコポリマー、フルオロアクリレートおよびメタクリレートのコポリマーなど）；フルオロカーボンポリマーおよび他の生物学的に中性の(biologically neutal)ポリマー；ならびに、当技術分野で公知の他の生物学的に中性の(biologically neutal)化合物などを含んでよい。
【００３７】
オリゴマーのリンカーは、少なくとも２ユニットを含んでよい；好ましい実施形態では、リンカー用の化学種は、約１２以下の、または８以下のユニットを含んでよい；好ましい実施形態では、約４以下のユニットを含んでよい。オリゴマーではない、１ユニットのリンカーもまた、使用してよい。１つの実施形態では、リンカー用の生物学的に中性なオリゴマーの化学種は、：オリゴ−メチレン、−エチレン、−プロピレン、または−ブチレン；あるいはオリゴ−メチレン−、−エチレン−、−プロピレン−、または−ブチレン−グリコールのホモマーまたはヘテロマーであってよい。
【００３８】
リンカーとして使用するための化学種は、ＧＰＣＲリガンドまたはＥ１−ＴＭ３結合化合物との結合を形成するために反応しうる少なくとも１つの基を含んでよい；そのような反応基がただ１つしかリンカー化学種に存在しない場合、それをもって反応した後に、Ｅ１−ＴＭ３結合化合物またはＧＰＣＲリガンドそれぞれとの結合に使用する少なくとも１つのさらなる反応基を、そこへ加えるために、またはその上に露出するために処理してもよい。１つの好ましい実施形態では、リンカー化学種はＥ１−ＴＭ３結合／遮断化合物と反応しうる１つの基と、ＧＰＣＲリガンドと反応しうるもう１つの基の、２つの反応基を含んでよい。１つの好ましい実施形態では、本明細書でリンカーとして使用するためのアルキレングリコール化学種は、例えば、ビス−トシル酸塩または類似の塩、メチレングリコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、またはブチレングリコールの塩といった反応性塩の形態で提供されてよい。その１つの実施形態では、オリゴ（エチレングリコール）−ジ−ｐ−トシル酸塩を使用してよい。好ましい実施形態では、テトラ（エチレングリコール）−ジ−ｐ−トシル酸塩を使用してよい。
【００３９】
２以上のＧＰＣＲリガンドおよび／または２以上のＥ１−ＴＭ３結合（または遮断）部分は、本連結化合物に存在してよい。１つの実施形態では、前記連結化合物は、ただ１つのＧＰＣＲリガンドと、ただ１つのＥ１−ＴＭ３結合（または遮断）部分を含んでよい。
【００４０】
好ましい実施形態では、リンカーを含む連結化合物を形成するために、生体アミンＧＰＣＲリガンドをＥ１−ＴＭ３結合部分につなぐのに用いられるリンカーは、１００未満の主鎖原子、好ましくは約７０以下、約６０以下、約５０以下、約４０以下、約３０以下、約２５以下、約２０以下、約１８以下、約１６以下、約１４以下、約１２以下、または約１０以下の主鎖原子を含んでよい。好ましい実施形態では、そのようなリンカーのｌｏｇＰは約１以下、好ましくは約−４〜約１、または約−２〜約１であってよい。１つの実施形態では、そのようなリンカーのｌｏｇＰは約０．５であってよい。
【００４１】
共有結合は、当技術分野で公知のいずれの共有結合化学を用いて行われてもよい。好ましい共有結合化学の例には、アミン、アミド、エステル、エーテル、および例えば、スルホンアミド、チオエーテルなどといったそれらのヘテロ原子同族体が含まれる。一般に、連結される各物質対は、その対の各メンバーに１ずつ存在する一組の反応基（各求核試薬と求電子試薬など）を共有構成しうる。そのような物質対は、例えば：ＧＰＣＲリガンドおよびリンカー対；ＧＰＣＲリガンドおよびＥ１−ＴＭ３結合部分対；またはＥ１−ＴＭ３結合部分およびリンカー対でありうる。反応基はすでにリガンド、リンカー、またはＥ１−ＴＭ３結合部分の一部として既に存在するか、または結合反応を行う前に、反応によりそこに加えることもできる。共有結合の形成に使用するための好ましい求核試薬および求電子試薬群の限定されない例を、表１に示す。
【００４２】
【表１】
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【００４３】
一般に、共有結合された化学物質は、例えば、水性メタノール、水性エタノール、アセトニトリル、ジメチルホルムアミド、アセトン、ジメチルスルホキシド、またはそれらの組合せなどの適当な溶媒中に、一般に約ｐＨ７〜約ｐＨ１０の適当なｐＨおよび約１０℃〜約４０℃の温度にて懸濁または溶解されてよい。
【００４４】
中性から塩基性のｐＨが通常用いられ、これは多くの場合、反応媒質へ塩基を添加することによりもたらされる。この目的に好ましい塩基の例には、無機塩基および有機窒素塩基が含まれる。無機塩基のうち金属水酸化物、炭酸塩、および重炭酸塩が好ましく、好ましくは、アルカリ金属水酸化物、炭酸塩、ならびに重炭酸塩、およびそれらの組合せである。好ましい無機塩基の例には、炭酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸カリウム、水酸化リチウム、炭酸リチウム、水酸化カリウム、およびそれらの組合せが含まれる。
【００４５】
好ましい有機窒素塩基は、第３級アミン、すなわち、Ｒ−Ｎ（Ｒ’）（Ｒ”）、およびイミン、すなわちＲ−Ｎ＝Ｒ’（アザ芳香族化合物を含む）を含み、そのＲ、Ｒ’、およびＲ”はそれぞれ水素以外であり、かつホモ−またはヘテロ−有機基と同じであるか、または異なってよい。好ましい(Perferred)第３級アミン塩基の例には、例えば：トリヒドロカルビルアミン、Ｎ−ヒドロカルビル−シクロアミン、およびＮ−ヒドロカルビレン−架橋シクロアミン（後者のタイプは多環式アミン、好ましくは二環式アミンを表す）が含まれる。
【００４６】
Ｎ−ヒドロカルビル−シクロアミンの好ましい例には、例えば、Ｎ−エチルピペリジンおよびＮ，Ｎ’−ジエチルピペラジンといったＮ−アリファチルアザン（N-aliphatyl azanes）およびＮ，Ｎ’−ジアリファチルジアザンが含まれる。Ｎ−ヒドロカルビレン−架橋シクロアミンの好ましい例には、例えば、１，４−エチレンピペリジンおよび１，４−エチレンピペラジンといったＮ−アリファチレン−架橋アザン（N-aliphatylene-bridged azanes）およびＮ，Ｎ’−アリファチレン−架橋ジアザン；すなわち、それぞれ１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン（キヌクリジン）および１，４−ジアザビシクロ［２．２．２］オクタンが含まれる。
【００４７】
有用なイミン有機塩基には、脂肪族イミン、脂環式イミン、芳香族イミン、およびアザ芳香族化合物が含まれる。好ましい脂肪族イミンの例には、例えば、Ｎ−メチルメチレンイミン、Ｎ−エチルメチレンイミン、Ｎ−メチルエチレンイミン、およびＮ−エチルエチレンイミンといったＮ−アルキル−アルキレンイミンが含まれる。芳香族イミンおよびアザ芳香族化合物、および脂環式イミンの好ましい例には：Ｎ−アリファチルベンジリデンイミンおよびＮ−ベンジルアリファチレンイミン、ならびにピリジンおよびジアジン；ならびに、例えば、２Ｈ−ピロール、３Ｈ−ピロール、２Ｈ−イミダゾール、４Ｈ−イミダゾール、および１−ピロリンといったピロールおよびジアゾールが含まれる。
【００４８】
好ましい実施形態では、トリヒドロカルビルアミンを使用してもよい；これは、好ましくは、トリアリファチルアミンのいずれかであってよく、より好ましくはトリアルキルアミンのいずれかであり、その有機基は、独立に、Ｃ３０以下、好ましくはＣ２４以下、より好ましくはＣ１８以下、さらに好ましくはＣ１２以下、およびさらに好ましくは、Ｃ６以下である、ホモ−およびヘテロ−ヒドロカルビル基のうちのいずれか１つである。１つの実施形態では、有機アミン塩基の有機基は、独立に、Ｃ１、Ｃ２、Ｃ３、およびＣ４ホモ−またはヘテロ−ヒドロカルビル基のいずれかであってよく、好ましくは、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、および／またはイソブチルであってよい。従って、好ましいトリヒドロカルビルアミン塩基の例には：トリメチルアミン、トリエチルアミン、ジメチルエチルアミン、ジエチルメチルアミン、およびジメチルプロピルアミンが含まれる。第３級アミンにおける使用に好ましい同じ炭化水素基のサイズ範囲はまた、イミン塩基の場合においても好ましい。
【００４９】
本明細書での使用のための有機窒素塩基は、２以上の第３級アミン窒素、２以上のイミン窒素、またはそれらの組合せを含んでもよい。好ましくは、本明細書での使用のための有機窒素塩基中の総ての窒素は、第３級アミン窒素、イミン窒素、またはそれらの組合せであってよい。
【００５０】
反応を行った後に、目的生成物は、また好ましい実施形態では、反応混合物から所望の等級の純度に回収してよい。例えば、Ｃ−１８逆相カラムクロマトグラフィーといったクロマトグラフ法、または他のいずれの有用な分離技術を用いてもよい。選択された共有結合手順に多段階の方法が用いられる場合、例えば、リンカーを最初にＧＰＣＲリガンドと結合させ、次にＥ１−ＴＭ３結合部分に結合させる場合、ＧＰＣＲリガンド−リンカー−Ｅ１−ＴＭ３結合部分連結化合物を生成するための第２の反応を行う前に、所望により第１の反応の生成物を回収してもよい。
【００５１】
場合によっては、単一の反応から２以上の連結化合物を得てもよい。例えば、生体アミンＧＰＣＲリガンド、リンカー、またはＥ１−ＴＭ３結合部分化合物上に２以上の求核または求電子基が存在してもよく、そのような場合、異なる立体構造、変化した共有結合部位等の、様々な異なる連結化合物を生成することができる。
【００５２】
Ｅ１−ＴＭ３結合部分との共有結合部位は、前記部分上のいずれの反応基において選択されてもよい。非限定的な、説明に役立つ実例として、アスコルビン酸塩および多くのその類似体の場合、アスコルビン酸塩型環のＣ３（例えば、フラン型環の４位）と結合しているヒドロキシル（またはチオールもしくはアミン）基を用いてもよく、あるいはアスコルビン酸塩型環のＣ４と直接的に結合しているか、またはアスコルビン酸塩型環のＣ４と結合している基の一部として間接的に結合している類似の基を用いてもよい；あるいは、例えば、ヘテロ炭化水素鎖もしくは環状構造中のホスファ基またはアザ基を使用してもよい。
【００５３】
Ｅ１−ＴＭ３結合部分上に存在する、または導入されたいずれの反応基も、本発明の連結化合物の形成に用いてよいが、Ｅ１−ＴＭ３結合部分が由来するＥ１−ＴＭ３結合化合物の調整特性をＥ１−ＴＭ３結合部分が保持する連結化合物の調製には、ＧＰＣＲリガンド活性のアロステリック調整にあずかる、例えば、水素結合および／または酸化還元活性基が保存されているように、より制限された一連の反応部位を利用してもよい。同様に、生体アミンＧＰＣＲリガンドのアゴニストまたはアンタゴニスト活性が本発明の連結化合物において保持される場合は、連結化合物形成に有用な反応部位は、より制限された一連の部位から選択される。生体アミンリガンドに関しては、連結化合物がリガンドのアゴニストまたはアンタゴニスト活性を保持するためには、前記部位は未反応の状態で保持しなくてはならないことは、例えば、A.G. Gilman et al.(eds.), Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed.(1990) (Pergamon Press)（本明細書では以後「Goodman and Gilman」と記載）などの周知の医薬参照文献を検討することにより、当業者により容易に確認されることである。
【００５４】
要するに、リガンド活性（ＧＰＣＲアゴニストまたはアンタゴニスト活性）およびＥ１−ＴＭ３調整活性の両方を保持するそれらの連結化合物に対して、生体アミンＧＰＣＲリガンドは、リガンドおよび前記部分の両方の活性を保持するような方法で、直接的に、またはリンカーを介してＥ１−ＴＭ３結合部分（モジュレーター）に結合させることができる。好ましい実施形態では、前記結合は、リガンドおよび部分の構造および空間的関係を、最大のリガンド活性および最大のＥ１−ＴＭ３調整を可能にするような方法で行ってよい。また、この同じ原理は、Ｅ１−ＴＭ３結合／遮断部分がＥ１−ＴＭ３調整を増強または抑制しないが遮断する、それらの連結化合物にも同様に(in paralle to)あてはまる。従って、そのような本発明の連結化合物の構築には：１）活性リガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）の選択；２）Ｅ１−ＴＭ３結合部分(moeity)の選択；３）もし存在するならば、リンカーの選択；４）リガンドとＥ１−ＴＭ３結合部分を連結するために使用する化学の選択、および連結された実施形態におけるリンカーの選択；ならびに５）リガンド上およびＥ１−ＴＭ３結合化合物上、ならびにもし存在する場合には、結合に使用するためのリンカー上の、反応部位の選択が含まれる。さらに、連結化合物は、例えば、Ｅ１−ＴＭ３ペプチド、単離ＧＰＣＲ、in vitro細胞、または試験生物に対する活性に関してin vitroまたはin vivo試験によりスクリーニングされる。
【００５５】
Ｅ１−ＴＭ３結合化合物の場合、調整活性を保持するために以下に示す典型的な反応部位は保存されなくてはならない。レダクトン基を保持するアスコルビン酸塩およびその類似体に関しては、その基の一部である、カルボニルと、それに近接する少なくともヒドロキシルは、未反応の状態で保持しなくてはならない；１つの実施形態では、レダクトンヒドロキシルおよびレダクトンカルボニルの両方を、未反応の状態で保持してもよい。モルヒネに関しては、１つの好ましい実施形態では、３、４（または５）および６位のヒドロキシル、エーテル／エポキシ、およびヒドロキシル基をそれぞれ、未反応の状態で保持してもよい；１つの実施形態では、３および４（または５）位の基を未反応の状態で保持してもよい；１つの実施形態では、４（または５）および６位の基を未反応の状態で保持してもよい。モルヒネ類似体の場合、官能基は主として３、６および１７位における変化により決定される(Goodman and Gilman, 1990, Table 21-2)、また、モルヒネに関連する鎮痛薬のクラス全体は、１、２、３、４、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、および１７位の炭素を保存する共通の構造を有している(Goodman and Gilman, 1990, figure and text p. 489)。ＥＤＴＡおよびその類似体の場合、好ましい実施形態では、例えば、好ましくは少なくとも３つのカルボキシル、２つのカルボキシル、および１つのヒドロキシル、２つのカルボニルおよび１つのヒドロキシル、２つのヒドロキシルおよび１つのカルボニル、または２つのヒドロキシルおよび１つのカルボキシルといった一連の少なくとも３つの酸素含有基を未反応の状態で保持してもよい。
【００５６】
Ｅ１−ＴＭ３調整活性を保持する連結化合物の構築のためのＥ１−ＴＭ３結合化合物に有用な一連の反応基に対する同様の制限は、アスコルビン酸塩、モルヒネ、およびＥＤＴＡに共通のＥ１−ＴＭ３調整活性は、アスコルビン酸、モルヒネおよびＥＤＴＡに共通する化学的に類似する基の共通パターン、すなわち、２００５年４月１５日に出願されたRoot-Bernstein et al.のアスコルビン酸塩結合ペプチドに関する米国仮特許出願第６０／６７２，２２４号に記載の、一連の３つの構造的に制約された電子受容体および供与体に起因する可能性があることを理解することにより、知ることができる。
【００５７】
本発明の連結化合物のうち、特にリガンド活性およびＥ１−ＴＭ３調整活性の両方を保持している連結化合物は、以下に示すような利点をもたらす。リガンドおよびＥ１−ＴＭ３結合化合物／モジュレーターと安定に結合することにより、モジュレーターとリガンドを別々に送達することにより観察されるものと同じ増強効果を単一の化合物で達成できる。これは、言い換えると：１）連結していることにより、各化合物を別々に送達する場合に比べて、エンハンサーおよびリガンドの両方が受容体上の適切な位置に存在しうる可能性が高まる；２）そのような化合物は、相互作用するための２つの結合部位を有するために、一度結合すると受容体上により長くとどまる可能性が高い；３）連結化合物を用いて特定の受容体サブタイプに送達された単一の化合物の活性を増強することが可能であるが、それに対し、エンハンサーを薬物と共に全身に送達する場合、一般にあまり望ましくない他の内因性化合物（内因性エピネフリン、ノルエピネフリン、およびヒスタミンなど）の増強を引き起こす可能性がある；４）エンハンサー化合物単独の一般的な全身投与では、投与されるＧＰＣＲリガンドに関して所望の程度の増強作用をもたらすためには、望ましくない高濃度のエンハンサーを使用する可能性があるため、多くの場合、リガンドと結合しているＥ１−ＴＭ３結合化合物（例えば、モルヒネなどのエンハンサー）の送達は、使用されるエンハンサー化合物の量を大幅に減少させる；５）Ｅ１−ＴＭ３結合部分を含む連結化合物の、ＧＰＣＲ上での滞留時間の延長は、リガンド（例えば、アゴニストまたはアンタゴニスト）部分が受容体の持続的な活性化または阻害を示すことを可能にし、それにより有用なレベルの活性を与えるためには弱いリガンドでさえも、使用が可能になる；６）場合によっては、連結化合物の形態でリガンドを提供すること、および／または連結化合物の形態でＥ１−ＴＭ３結合／遮断部分を提供することは、例えば、生物学的条件下におけるそれらの安定性を高めること可能にする；ならびに７）そのような連結化合物は新規クラスの化合物を代表するものであるため、それらはこれまで全く研究されていなかった薬剤開発のための全く新しい分野を提供する、などの利点を提供する。
【００５８】
生体アミンＧＰＣＲモジュレーター結合ペプチド
本発明を支持する研究以前は、ＧＰＣＲ膜貫通ドメインとは違って、それらの膜貫通ドメインをつないでいるループの間に重要な共通のアミノ酸相同性はないことが一般に認められていた。例えば、J Ballesteros & K Palczewski, "G protein-coupled receptor drug discovery: implications from the crystal structure of rhodopsin," Curr. Opin. Drug Discov. & Dev. 4(5):561-574 (Sep 2001)参照。１つには、膜貫通ドメインのアミノ酸配列とは違って、ループのアミノ酸配列は、その総てがαへリックスを形成する能力を共通して持っているためである；また、少なくとも生体アミンＧＰＣＲの場合、リガンドは、ＴＭ３−ＴＭ７により形成された結合クレフトの深部の、ある保存された残基上でＧＰＣＲ膜貫通へリックスと相互作用することにより、それらの受容体に結合するからである。U Gether, "Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors," Endocr. Rev. 21(1):90-113 (2000)。膜貫通ドメインのこれらの保存された構造的および機能的特性とは対照的に、細胞外ループは、一般に保存された二次構造を欠く（単一の保存されたＥＬ２  Ｃｙｓ残基は別として）柔らかい糸状に見え、膜貫通ドメインを一緒に物理的につなぎ、特徴的な「マルチヘリックス束」三次構造へのそれらのつながりを促進するために役立つ。一部の研究においては、Ｅ１ループは、ＧＰＣＲ細胞外ループのアミノ酸同一性の保存が最少であると特徴付けられている。A. L. Parrill, GPCR Modeling: Residue Conservation (Plot), available at the University of Memphis (TN, USA) Chemistry Department webpage http://chemistry.chem.memphis.edu/parrrill/chem4315/GPCRmodeling/img009.gif.参照。さらに、ループＥ１に関してはそれ以上の特別な機能は報告されていない。
【００５９】
それに対して、本発明に至るまでの研究、および２００５年４月１５日に出願されたRoot-Bernstein et al.のアスコルビン酸塩結合ペプチドに関する米国仮特許出願第６０／６７２，２２４号では、生体アミンＧＰＣＲのＥ１ループはリガンド結合クレフトの細胞外進入路の近くに位置するアスコルビン酸塩結合部位を含むことが確認されている。一部の実施形態ではまた、隣接するまたは周辺のＴＭ３残基（および／または、場合によっては、周辺の残基）が参加しうる、この結合部位への結合に際して、アスコルビン酸塩、モルヒネ、およびＥＤＴＡは、ＧＰＣＲリガンド結合を調整することができる（こうした状況の下では、周辺とは、好ましくは、アスコルビン酸塩が結合する場合、残基の最も近い原子から測定して約５Å以下を意味する）。例えば、アドレナリン、ドーパミン、およびヒスタミンＧＰＣＲの場合、アスコルビン酸塩、モルヒネ、およびＥＤＴＡは：１）受容体でのリガンドの絶対活性を最大値まで高めること；または２）リガンドの活性持続時間を延長することのいずれかまたは両方により、リガンド作用を増強しうる。
【００６０】
同様に、本明細書に記載の何百ものヒトおよび動物生体アミンＧＰＣＲのＥ１ループは、類似性を共有する１つの不変Ｔｒｐ残基および他の残基（すなわち、保存されたまたは半保存された残基として）などの保存されたアミノ酸配列相同性を含むことが思いがけなくも発見されている。理論にとらわれるものではないが、結果として、これらのループはアスコルビン酸塩、モルヒネ／オピオイド、ならびにそれらの類似体および、例えば、ＥＤＴＡとその類似体といったポリカルボン酸キレート剤などの模倣体に対して結合親和性を示すアミノ酸配列を含むと考えられている。ＧＰＣＲ生体アミン受容体のＥ１ループへのそのような化合物の結合は、アゴニスト、アンタゴニスト、または他の結合部位リガンドによる結合に対するＧＰＣＲの反応を、例えば、アロステリックに強化する／増強する、または抑制する／弱めるというようにアロステリックに調整することができる。Ｅ１ループへの結合によりそのような調整をもたらす化合物は、本明細書ではＧＰＣＲの「アロステリックモジュレーター」として言及されている。
【００６１】
同様に、そのような調整をもたらさずにＥ１ループに結合するが、アロステリックモジュレーターによりＥ１ループ結合を阻害する化合物は、本明細書では「アロステリック調整阻害薬」として言及されている。
【００６２】
ＧＰＣＲ  Ｅ１ドメインの化合物への結合能力は、場合によっては、少なくとも１つの第１の部分が、例えば、アスコルビン酸塩またはオピオイド／モルヒネ類似体もしくは模倣体といったＥ１ループ結合成分であり、第１の部分のＥ１ループへの結合に際して受容体結合部位へのアクセスを立体的に遮断する第２の部分と結合している、少なくとも２つの部分を含む化合物を投与することによるように、リガンドのＧＰＣＲへの結合を阻害するために利用することができる。Ｅ１ループへの結合によりＧＰＣＲリガンド結合部位へのアクセスを立体的に遮断する化合物（部分的または完全に；または安定に、一時的、もしくは断続的に）は、本明細書ではＧＰＣＲの「ステリックモジュレーター(steric modulator)」として言及されている；好ましい実施形態では、ステリックモジュレーターは、結合部位へのアクセスを安定な様式で、すなわち、Ｅ１ループへ結合している間中ずっと遮断する。
【００６３】
場合によっては、Ｅ１ループの化合物への結合能力は、ＧＰＣＲ結合分子が結合するＧＰＣＲの反応を調整させるように利用することができる。そのような実施形態では、少なくとも２つの部分を含む化合物は、ＧＰＣＲ受容体結合部位のリガンド（直接アンタゴニストまたはアゴニスト）である第２の部分と結合している、少なくとも１つのＥ１ループ結合アロステリックモジュレーター部分を有していてもよい。そのような化合物は、本明細書では「自己調整リガンド」として言及されている。同様に、少なくとも２つの部分を含む化合物は、ＧＰＣＲを調整することなしにＥ１ループに結合する（すなわち、アロステリック調整阻害薬として機能する）か、Ｅ１ループアロステリック調整結合部位へのアクセスを立体的に遮断する（部分的または完全に；または安定に、一時的、もしくは断続的に）、第２の部分と結合している、ＧＰＣＲ受容体結合部位のリガンド（直接アンタゴニストまたはアゴニスト）である少なくとも１つの部分を有していてもよい。そのような化合物は、本明細書では「調整抵抗性リガンド」として言及され、Ｅ１結合調整抵抗性リガンドおよびＥ１遮断調整抵抗性リガンドを含む。
【００６４】
本明細書に記載されているように、本発明のペプチドは、Ｅ１ペプチド（すなわち、生体アミンＧＰＣＲ  Ｅ１ループ、ＴＭ３ドメイン、またはＥ１−ＴＭ３部分のアミノ酸配列を有するアスコルビン酸塩結合ペプチド）に結合する化合物のスクリーニングのために使用してよい。これらは、アロステリックモジュレーター、アロステリック調整阻害薬、ステリックモジュレーター、自己調整リガンド、またはＥ１結合調整抵抗性リガンドであってよい。アスコルビン酸塩、モルヒネ、ならびにそれらの類似体および模倣体のようなアロステリックモジュレーターの結合部位としてのＥ１ペプチドの同定もまた、本発明のＥ１型ペプチドを含むポリペプチドを、Ｅ１遮断調整抵抗性リガンドを同定するために、リガンド結合部位を構成するのに十分な追加の天然ＧＰＣＲ構造とともに使用することを可能にする。
【００６５】
ステリックモジュレーター、自己調整リガンド、または調整抵抗性リガンドの同定に有用なポリペプチドの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲの少なくともＴＭ２からＴＭ７部分を含んでもよい。そのようなポリペプチドを、アロステリックモジュレーターまたはアロステリック調整阻害薬のスクリーニングに使用してもよい。１つの実施形態では、ステリックモジュレーター、自己調整リガンド、またはアロステリックモジュレーターのスクリーニングは、完全な天然ＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列よりも短いものを含むポリペプチド；好ましくは、天然ＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列またはそれより短いものの、ＴＭ２からＴＭ３部分；好ましくはＥ１ペプチドのみ、と候補化合物を接触させることを含んでよい。１つの実施形態では、そのようなスクリーニングは、完全な天然ＧＰＣＲポリペプチドアミノ酸配列よりも短いものを含むポリペプチドを用いる第１のスクリーニングを含んでよく、その後に、より大きな部分、例えば、ＴＭ２−ＴＭ７部分、好ましくは、全ＧＰＣＲを用いることにより、結合した化合物を特徴づけるためのさらなるスクリーニングが続く。
【００６６】
本発明の方法において、生体アミン受容体の７つのサブファミリーのいずれかのメンバー、またはＥ１ループもしくはそのＥ１−ＴＭ３ペプチド含有部分を使用してもよい。１つの実施形態では、受容体は、アドレナリン、ドーパミン、ヒスタミン、ムスカリン、アセチルコリン、セロトニン、および／または微量アミン受容体サブファミリーのメンバー；あるいはアドレナリン、ドーパミン、ヒスタミン、ムスカリン、アセチルコリン、および／またはセロトニンサブファミリーのメンバー；あるいはアドレナリン、ドーパミン、および／またはヒスタミンサブファミリーのメンバーであってよい。
【００６７】
さらに、そのようなＥ１ループのアミノ酸配列を含むポリペプチドを用いるスクリーニングは、Ｅ１ループ結合またはＥ１ループ結合阻害活性を示し、そのためにin vivo（またはin cyto）アロステリックモジュレーター、アロステリック調整阻害薬、ステリックモジュレーター、自己調整リガンド、または調整抵抗性リガンド活性を示しうるか、または少なくとも示しうる可能性がある化合物の同定に有用である。
【００６８】
好ましい実施形態では、Ｅ１アミノ酸配列に結合する能力についての化合物のスクリーニングに使用されるポリペプチドは、天然生体アミンＧＰＣＲ  Ｅ１ループのアミノ酸配列、またはその不変トリプトファン（ＧＰＣＲＤＢ番号方式によればＴｒｐ１１８、あるいは、典型的なBallesteros-Weinstein番号方式によればＴｒｐ２．３０またはＴｒｐ３．１８のいずれか）残基を保持するその保存的置換変異体を含んでもよい。１つの好ましい実施形態では、ポリペプチドはまた、この天然型配列セグメントの一部として、隣接する膜貫通ドメイン（ＴＭ２およびＴＭ３）に属するとして分類される１以上のフランキングアミノ酸残基、またはその保存的置換変異体を含んでもよい。そのような「フランキングＴＭ残基」ペプチドが３以上のＴＭ３のＥ１隣接残基を含む場合、天然型配列セグメントは、その不変システイン（ＧＰＣＲＤＢ番号方式によればＣｙｓ１２５、あるいは、典型的なBallesteros-Weinstein番号方式によればＣｙｓ３．２５）残基を含んでもよい。ＧＰＣＲＤＢ番号方式は、インターネット上のwww.gpcr.org/7tm/で利用可能なＧＰＣＲデータベースにおいて用いられているものである。Ballesteros-Weinstein（ＢＷ）番号方式は、JA Ballesteros & H Weinstein, Methods Neurosci. 25:366-428(1995)に記載されている。
【００６９】
そのような「フランキングＴＭ残基」ペプチドが１０以上のＴＭ３のＥ１隣接残基を含む場合、天然型配列セグメントは、その不変アスパラギン酸（ＧＰＣＲＤＢ番号方式によればＡｓｐ１３２、あるいはＢＷ番号方式によればＡｓｐ３．３２）残基を含んでもよい。一部の好ましい実施形態では、本発明の方法または組成物において使用されるペプチドは、そのＧＰＣＲセグメントとして、ＴＭ３不変Ｃｙｓ１２５およびＡｓｐ１３２残基（すなわちＧＰＣＲＤＢ番号方式ではＣ１２５−Ｄ１３２、あるいはＢＷ番号方式ではＣｙｓ３．２５−Ａｓｐ３．３２のアミノ酸配列）を保持するＧＰＣＲのＥ１隣接または近位下流部分のアミノ酸配列のみを含んでもよい。保存されたＴｒｐ１１８、Ｃｙｓ１２５、およびＡｓｐ１３２は、以下に示す変異体の位置決めとともに、配列番号：１４〜２０７にＴｒｐ２２、Ｃｙｓ２９、およびＡｓｐ３６として示され、それらはまた、本明細書におけるこれらのＴｒｐ２２、Ｃｙｓ２９、およびＡｓｐ３６残基の列挙にも含められる：配列番号３３、７５、７７、９４、２０３、および２０５におけるＴｒｐ２３、Ｃｙｓ３０、およびＡｓｐ３７（これらの列挙はまた、例えば、単一の残基欠失および単一の残基挿入突然変異体などにおいて、その番号づけが変わる場合（配列番号２９、３０、７１、７２、１１４、１４０、１４１、および１９９におけるＸａａ１９の欠失、または配列番号４０、８１、１４８、および１７６におけるＸａａ２７の欠失など）でも、これらの保存された残基に対する参照も含む）。本明細書の保存されたＴｒｐ２２、Ｃｙｓ２９、およびＡｓｐ３６残基のそのような列挙はまた、それぞれ、典型的なＢＷ番号づけスキームによるＷ２．３０またはＷ３．１８（本明細書で等価物として使用される代替物）、Ｃ３．２５、およびＤ３．３２をさし、その列挙と同義としてみなされる。
【００７０】
本発明の生体アミンＧＰＣＲペプチドは、ＧＰＣＲ  Ｅ１ループの、または少なくともその部分の、および隣接するＴＭドメインの少なくとも一部の、すなわち、ＴＭ２もしくはＴＭ３ドメインまたは両方（すなわち、結合したＴＭ２−Ｅ１領域、Ｅ１−ＴＭ３領域、またはＴＭ２−Ｅ１−ＴＭ３領域に見いだされる配列）の、アスコルビン酸塩−、モルヒネ−、またはＥＤＴＡ−と結合している、連続したアミノ酸配列を含んでもよい。
【００７１】
１つの好ましい実施形態では、ポリペプチドはＥ１ループ残基に加えてＴＭ２およびＴＭ３のＥ１−隣接残基の総てまたはほとんど総てを含んでよく、すなわち、ポリペプチドは、ＴＭ２−Ｅ１−ＴＭ３ポリペプチドの少なくともほとんど総て、または不変Ｔｒｐ１１８および／またはＣｙｓ１２５および／またはＡｓｐ１３２（ＧＰＣＲＤＢ番号づけ）を保持しているその保存的置換変異体を含んでよい。他の高度に保存されたＴＭ２およびＴＭ３残基もまた、および好ましくは、例えば、Ｌ９４／Ｌ２．４６、Ａ９５／Ａ２．４７、Ｄ９８／Ｄ２．５０、Ｌ１４３／Ｌ３．４３、Ｅ１４９／Ｅ３．４９、Ｒ１５０／Ｒ３．５０、Ｙ１５１／Ｙ３．５１、および／またはＶ１５４／３．５４（ＧＰＣＲＤＢ／ＢＷの番号づけで示す）といったＴＭ２およびＴＭ３配列中に保持されていてよい。
【００７２】
１つの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、Ｅ１ループの総てまたは少なくとも重要な部分を含む生体アミンＧＰＣＲ  Ｅ１断片（標準ＧＰＣＲＤＢの番号づけによれば、このループのＮ末端に近位する半分（例えば、残基１１５−１２０）もしくは３分の１（例えば、残基１１５−１１８）を含む断片など）のアミノ酸配列を含んでもよい。これは、その上流に、隣接するＴＭ２ドメインに由来する連続した残基をさらに含むペプチド中に含まれてよい。従って、一部の実施形態では、Ｅ１含有ペプチドは、例えば、標準ＧＰＣＲＤＢの番号づけによれば、生体アミンＧＰＣＲの残基１０８−１３２、１０８−１２６、１０８−１２５、１０８−１２０、もしくは１０８−１１８、または１１５−１３２、１１５−１２６、１１５−１２５、１１５−１２０、もしくは１１５−１１８から得られる生体アミンＧＰＣＲアミノ酸配列を含んでもよい。様々な実施形態では、そのようなアミノ酸配列を含むペプチドは、約１０アミノ酸残基以上の長さであってよい。例えば、標準ＧＰＣＲＤＢ番号づけによれば、ヒトβアドレナリンペプチド、Ｂ２ＡＲ８９−９９は、Ｅ１ループ配列に隣接しているＴＭ２の一部のアミノ酸配列を含む残基１０８−１１８（すなわち、配列番号２７の残基１２−２２）を含む。
【００７３】
１つの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１−１０またはそのＴｒｐ５およびＣｙｓ１２を保持しているその保存的変異体のうちのいずれか１つを含んでもよい：これらは上述の不変ＴｒｐおよびＣｙｓ残基である。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列表に記載のとおり、配列番号１−１０のうちのいずれか１つの置換変異体を含んでもよい。配列番号１−１０のいずれか１つの変異体または保存的変異体の好ましい実施形態では、置換の数は、好ましくは、１２以下であってよい；１つの実施形態ではそれらは１０以下であってよい；１つの実施形態では、それらは８以下であってよい；１つの実施形態では、それらは６以下であってよい；１つの実施形態では、それらは少なくとも２または少なくとも３または少なくとも４であってよい；１つの実施形態では、それらは２〜１２または３〜１０または４〜８であってよい。
【００７４】
１つの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｗ−ＸＸＸＸＸ−ＣまたはＷ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｃ（式中、ＷおよびＣはそれぞれ、保存されたＥ１−ＴＭ３残基Ｔｒｐ３．１８（ＢＷ）／Ｔｒｐ１１８（ＧＰＣＲＤＢ）およびＣｙｓ３．２５（ＢＷ）／Ｃｙｓ１２５（ＧＰＣＲＤＢ）を表し、各残基Ｘは独立に、天然生体アミンＧＰＣＲ、好ましくは脊椎動物または哺乳類ＧＰＣＲ中のその残基の対応する位置に見出されるアミノ酸から選択されるアミノ酸である；好ましくは、示されたＷおよびＣ残基の間に位置するＸは、そのような天然生体アミンＧＰＣＲの対応する位置に見出される集合的なアミノ酸配列である）を含んでもよい。
【００７５】
１つの好ましい実施形態では、ポリペプチドは、アミノ酸配列Ｃ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｄ（式中、ＣおよびＤはそれぞれ、保存されたＴＭ３残基Ｃｙｓ３．２５（ＢＷ）／Ｃｙｓ１２５（ＧＰＣＲＤＢ）およびＡｓｐ３．３２（ＢＷ）／Ａｓｐ１３２（ＧＰＣＲＤＢ）を表し、各残基Ｘは独立に、天然生体アミンＧＰＣＲ、好ましくは脊椎動物または哺乳類ＧＰＣＲ中のその残基の対応する位置に見出されるアミノ酸から選択されるアミノ酸である；好ましくは、示されたＣおよびＤ残基の間に位置するＸは、天然生体アミンＧＰＣＲの対応する位置に見出される集合的なアミノ酸配列である）を含んでもよい。
【００７６】
上述の式は、例えばＸＸＸＸ−Ｗ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｃ−ＸＸＸまたはＸＸＸＸ−Ｗ−ＸＸＸＸＸ−Ｃ−ＸＸＸ、およびＷ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｃ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｄ、またはＷ−ＸＸＸＸＸ−Ｃ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｄ、およびＸＸＸＸ−Ｗ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｃ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｄ、またはＸＸＸＸ−Ｗ−ＸＸＸＸＸ−Ｃ−ＸＸＸＸＸＸ−Ｄのような、より大きい、定義された式の一部であってよい。そのような大きな式において、示された残基に対して同じ定義が適用される。
【００７７】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４−２０７、またはそのＴｒｐ２２、Ｃｙｓ２９、およびＡｓｐ３６を保持しているその保存的変異体のうちのいずれかのアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲＤＢ残基９７−１４１（ＢＷ残基２．４９−３．４１）のアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４−２０７のうちのいずれかの残基１−４４のアミノ酸配列を含んでもよい（すなわち、配列番号３３、７５、７７、９４、２０３、および２０５の残基１−４５の配列のうちのいずれかであってよい）。
【００７８】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲＤＢ残基１０８−１２９（ＢＷ残基２．６０−３．２９）のアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４−２０７のうちのいずれかの残基１２−３３のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００７９】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲＤＢ残基１１４−１２８（ＢＷ残基２．６６−３．２８）のアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４−２０７のうちのいずれかの残基１８−３２のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００８０】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲＤＢ残基１１５−１２６（ＢＷ残基２．６７−３．２６）のアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４−２０７のうちのいずれかの残基１９−３０のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００８１】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲＤＢ残基１１８−１２５（ＢＷ残基３．１８−３．２５）のアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４−２０７のうちのいずれかの残基２２−２９のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００８２】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲＤＢ残基１１４−１３２（ＢＷ残基２．６６−３．３２）のアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４−２０７のうちのいずれかの残基１８−３６のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００８３】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲＤＢ残基１２５−１３２（ＢＷ残基３．２５−３．３２）のアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４−２０７のうちのいずれかの残基２９−３６のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００８４】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＧＰＣＲＤＢ残基１１８−１３２（ＢＷ残基３．１８−３．３２）のアミノ酸配列を含んでもよい。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１４−２０７のうちのいずれかの残基２２−３６のアミノ酸配列を含んでもよい。
【００８５】
かかるＥ１、ＴＭ３、およびＥ１−ＴＭ３ペプチドは、単にアスコルビン酸塩、モルヒネ、またはＥＤＴＡ結合配列のみで構成されてもよく、あるいはその生体アミン配列は、そのような結合配列（またはそのような配列のコンカテマー）に限定されてもよい。１つの好ましい実施形態では、本発明の方法において使用するためのペプチドは、そのような結合配列およびさらに生体アミンＧＰＣＲ中でそれに隣接して見出されるＥ１、ＴＭ３および／またはＴＭ２配列の両方を含んでもよい。１つの好ましい実施形態では、ペプチドは、生体アミンＧＰＣＲの少なくとも実質的に総てのＴＭ２−ＴＭ３配列部分を含んでもよい。１つの好ましい実施形態では、ペプチドは、生体アミンＧＰＣＲの少なくとも実質的に総てのＴＭ２−ＴＭ７配列部分を含んでもよい。１つの好ましい実施形態では、ペプチドは、生体アミンＧＰＣＲの少なくとも実質的に総ての配列を含んでもよい。
【００８６】
ペプチドは、溶液または懸濁液で提供されてよい。あるいは、および好ましくは、ペプチドは、支持材料に直接的にまたはリンカーを通して共有結合または非共有結合することにより、支持材料中または支持材料上に存在してよい。好ましい実施形態では、支持材料は、合成ポリマーまたはゲルビーズもしくはアレイメンバー（例えば、マイクロアレイスポット）などの非タンパク性の固体または半固体材料であってよい。１つの実施形態では、支持材料は、ペプチドを、微生物細胞により、またはウイルス性もしくはＶＬＰ核酸に関しては発現宿主細胞により合成された表面結合分子として提示する、微生物細胞、ウイルス、またはウイルス様粒子（ＶＬＰ）であってよい。
【００８７】
好ましい実施形態では、支持材料は、有機−水性流体の界面であってよい。１つの実施形態では、ペプチドは、親油性相と親水性相の界面の表面に存在してもよい。１つの実施形態では、ペプチドは、脂質膜に存在してもよい。１つの実施形態ではペプチドは、ミセルまたはリポソームの表面に存在してもよい。１つの実施形態では、ペプチドは、それが合成される脊椎動物または哺乳類細胞の表面に存在してもよい。親油性相−親水性相の界面、または膜への結合は、界面領域に存在する膜または分子の成分へペプチドを結合させることにより達成してもよい。あるいは、ペプチドは、膜貫通ドメインまたは、例えば界面活性剤部分と結合しているか、または含んでもよく、それにより、その界面領域中へ、または界面領域を貫いて前記部分を挿入することにより、ペプチドは膜または界面と結合することができる。この目的のために、一般に当技術分野で公知のいずれの方法を用いてもよい。１つの好ましい実施形態では、ペプチドは、生体アミンＧＰＣＲのＴＭ２−ＴＭ７領域の少なくとも実質的に完全な配列を含んでもよく、また、脊椎動物または哺乳類細胞、好ましくは、それが合成された細胞の表面に存在してもよい。１つの好ましい実施形態では、ペプチドは、生体アミンＧＰＣＲの全配列を含んでもよい。
【００８８】
「Ｅ１」結合化合物を同定する方法に有用なペプチド（本発明のＥ１、ＴＭ３、および／またはＥ１−ＴＭ３配列ペプチドのいずれかと結合している化合物を含む）は、前記方法において有用な検出可能な標識とさらに結合してもよい。検出可能な標識とは、当技術分野で周知の方法によるように、着色、蛍光、または発光されているか、あるいは着色、蛍光、または発光させることができる任意の部分である。
【００８９】
配列表中の配列で、アミノ酸配列が部分的にしか利用可能ではない場合、すなわち、配列番号１２３、１２４、および２０４の場合、上記のうちのいずれか１つにおいて定義されているような配列を提供するその一部が使用される（すなわち、配列番号１２４に対して）。上記で定義されたように配列を提供するのに不十分なものは、対応するコード配列に関してＧｅｎｂａｎｋを検索するために使用してもよく、それらの総てはその時に報告され、このコード配列は、ＧＰＣＲポリペプチドをコードする、より長いコード配列または全長コード配列、従って、上記の配列を提供するために十分なアミノ酸配列を得るために、ルーチンのＤＮＡ合成方法により構築され、標準ＰＣＲおよび増幅産物のＤＮＡ塩基配列決定法とともに、ルーチンのハイブリダイゼーションプロービング法、例えば、ｃＤＮＡハイブリダイゼーションにおいて使用されうる、オリゴヌクレオチドの核酸配列を提供するために使用してよい。
【００９０】
抗体
本発明はさらに、アスコルビン酸塩結合ペプチドに対する抗体を提供する。本明細書において、用語「抗体」は、生体アミンＧＰＣＲのアスコルビン酸塩結合ペプチド、ならびにかかるアスコルビン酸塩結合ペプチド抗体に対する抗イディオタイプおよび抗アロタイプ抗体に対する結合親和性を有する任意のクラスの免疫グロブリンを含む；抗体にはさらに一本鎖抗体が含まれる。本明細書において、抗体フラグメントは、本発明の抗体の結合ドメイン（すなわち、ＣＤＲ）から得られるアミノ酸配列を有し、親抗体により特異的に結合される標的抗原に特異的に結合する能力を保持している、任意の単一または複数のポリペプチド構築物である。これには、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２などの標準的な抗体フラグメント、ならびに一本鎖Ｆｖなどのそのような断片に近似する一本鎖構築物、および例えばドメイン欠失抗体といった他の組換え構築物が含まれる。ポリクローナルおよびモノクローナル抗体を含む抗体は、本発明のアスコルビン酸塩結合ペプチドから、当技術分野で一般に公知のいずれの方法によっても調製することができる。
【００９１】
ペプチドのスクリーニング使用および典型的な試験化合物
本発明のアスコルビン酸塩−、モルヒネ−、および／またはＥＤＴＡ−結合ペプチド（すなわち、Ｅ１、ＴＭ３、およびＥ１−ＴＭ３アスコルビン酸塩結合ペプチド）は、それに結合できるアスコルビン酸塩様、モルヒネ様、ＥＤＴＡ様、および他の化合物を同定するために、または比較的高い親和性でそれに結合する化合物を同定するために使用してもよい。かかる結合化合物の同定により、例えば、in vivo結合に基づく生体アミンＧＰＣＲの調整を示す可能性のある化合物の効率的な選択が可能となる。これらのペプチドを用いる、かかる化合物を同定するためのスクリーニング法において、スクリーニングされる化合物は「候補結合化合物」と呼んでもよい。１つの実施形態では、候補結合化合物は三水素相互作用（tri-hydrogen-interacting）（ＴＨＩ）化合物であってよい。
【００９２】
ＴＨＩ化合物。本明細書において、：（１）１つの実施形態では、用語「ＴＨＩ」化合物とは、水素と相互作用できる少なくとも３つの表面アクセス可能な基を有し、前記の基の少なくとも３つは順に、水素供与体、水素受容体、および水素受容体であり、この３つの基は、好ましくは、非水素供与基／受容基（例えば、芳香族または脂肪族メチレンもしくはメチリデン基）の１個から約５個の連続する分子内の原子により分離されており、従って、一連の３つの水素相互作用基を形成しており、化合物の三次元構造中におけるそれらの平均相対位置において、３つの基は独立に、１つの基から次の基まで約１〜約１０オングストロームの間隔で配置されており、かつこれら３つの水素相互作用基はその中で実質的に直線から約２４０°の角度の配列を形成している、化合物をさす；
【００９３】
（２）もう１つの実施形態では、用語「ＴＨＩ」化合物とは、水素と相互作用できる少なくとも３つの表面アクセス可能な基を有し、前記の基の少なくとも３つは順に、水素受容体、水素供与体、および水素供与体であり、この３つの基は、好ましくは、非水素供与基／受容基（例えば、芳香族または脂肪族メチレンもしくはメチリデン基）の１個から約５個の連続する分子内の原子により分離されており、従って、一連の３つの水素相互作用基を形成しており、化合物の三次元構造中におけるそれらの平均相対位置において、３つの基は独立に、１つの基から次の基まで約１〜約１０オングストロームの間隔で配置されており、またこれら３つの水素相互作用基はその中で実質的に直線から約２４０°の角度の配列を形成している、化合物をさす；
【００９４】
１つの実施形態では、ＴＨＩ化合物の３つの連続している水素相互作用基は、化合物の三次元構造中におけるそれらの平均相対位置において、独立に、１つの基から次の基まで約１〜約８オングストロームの間隔で配置されてよい；または、それらは独立に、１つの基から次の基まで約２〜約６オングストロームの間隔で配置されてよい；または、それらは独立に、１つの基から次の基まで約２〜約５オングストロームの間隔で配置されてよい。
【００９５】
本明細書では、「水素相互作用」および「水素と相互作用する」とは、水素の共有または移動に関与し、イオンおよび／または水素結合相互作用により形成される、基の間、好ましくは、分子間基の間に形成された結合という意味で用いられる。これに関連して用いられる用語「水素受容体」および「水素供与体」とは、それぞれ、イオンまたは水素結合を形成する際に水素を受け取ることができる基、およびイオンまたは水素結合を形成する際に水素を提供することのできる基を示す。
【００９６】
水素供与基の実例は：ヒドロキシル、セレノール、およびテルロール基；モノ−およびジ−置換アミノ（例えば、アミド、イミド、イミノを含む）基、および同族の有機−リン、−ヒ素、−アンチモン、および−ビスマス基、例えば、ホスフィン、アルシン、スチビン、およびビスムチン基（例えばＸ（III）に基づくＲＸＨ２、Ｒ２ＸＨ、ＲＸ（Ｒ’）Ｈ、またはＲ＝ＸＨ、式中、Ｘ＝Ｐ、Ａｓ、Ｓｂ、またはＢｉ、かつＲおよびＲ’は有機部分である）；ならびにスルフヒドリル（チオールを含む）基である。水素受容基の実例は：オキソ（例えば、カルボニル、ホスホキシを含む）、オキサ、オキシド基、および同族のセレンおよびテルル基、例えば、セロン（Ｒ＝Ｓｅ）、セレニド（Ｒ−Ｓｅ−Ｒ）、およびテルリド（Ｒ−Ｔｅ−Ｒ）基；アミノ基（例えば、アミド、イミド、イミノを含む）基、および同族のホスフィン、アルシン、スチビン、およびビスムチン基；ならびにチオ（例えば、チオカルボニル、チオンを含む）、チア、スルフィド基である。
【００９７】
１つの実施形態では、ＴＨＩ化合物は平均分子量が約２０００ダルトン以下；または約１５００ダルトン以下、または約１０００ダルトン以下；または約７５０ダルトン以下であってよい。１つの実施形態では、ＴＨＩ化合物は平均分子量が約７５ダルトン以上、または約１００ダルトン以上、または約１５０ダルトン以上、または約２００ダルトン以上であってよい。１つの実施形態では、ＴＨＩ化合物はアスコルビン酸塩、モルヒネ、ＥＤＴＡ、アスコルビン酸塩類似体、モルヒネ類似体、またはＥＤＴＡ類似体であってよい。それらのうち、アスコルビン酸塩、モルヒネ、またはＥＤＴＡの類似体であるＴＨＩ化合物は、Ｅ１−ＴＭ３結合部位に結合することにより、アスコルビン酸塩、モルヒネ、またはＥＤＴＡと同様の方法で生体アミンＧＰＣＲを調整する能力を保持しているものであり、そのような能力を保持しない他のものは、その代わりとして、調整しないで結合するか、または部位などへの結合を立体的に遮断することにより、結合部位への結合を遮断する働きをする。本発明の連結化合物中の「Ｅ１−ＴＭ３」結合部分のように、ＧＰＣＲリガンドと結合している後者のタイプのＴＨＩ化合物であるアスコルビン酸塩／モルヒネ／ＥＤＴＡ類似体は、Ｅ１−ＴＭ３結合部位を調整から保護するために使用してもよい。
【００９８】
１つの実施形態では、ＴＨＩ化合物は、アスコルビン酸塩類似体であってよい。アスコルビン酸は、１，２−ジヒドロキシエチル−置換２，５−ジヒドロ−３，４−ジヒドロキシ−フラン−２−オンである；すなわち、アスコルビン酸は、５Ｈ−３，４−ジヒドロキシ−フラン−２−オンに基づいている（本明細書において１つの分子を説明するために用いる、「ｎ−ヒドロ」または「ｎＨ」を「ｎ−オキソ」または「ｎ−オン」と組み合わせたような用語の使用（「ｎ」は同じ数である）は、不飽和ケトン化合物における二重結合の配置を特定するために使用され、水素原子が必ずしもオキソ基を有する炭素原子に結合していることを意味するわけではない）。アスコルビン酸はまた、いくつかある同義語のなかで特に、５−（１，２−ジヒドロキシエチル）−３，４−ジヒドロキシ−５Ｈ−フラン−２−オンまたは２−（１，２−ジヒドロキシエチル）−４，５−ジヒドロキシ−フラン−３−オンとも呼ばれている。本発明のペプチドへのアスコルビン酸塩の少なくとも１つの結合様式はまた、アスコルビン酸異性体および誘導体といった多くのアスコルビン酸塩類似体、ならびに多くのアスコルビン酸塩−類似のフラノン、ピラノン、およびベンゾピラノン(benozpyranone)誘導体によっても共有されると考えられている。従って、本明細書においてその用語が使用されているように、これらは「アスコルビン酸塩類似体」の中に含められる；その代表的な例には、アスコルビン酸塩類似体群Ｉのメンバーが含まれる：
【００９９】
・２，５−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−フラン−２−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、４−ＯＨ、４−ＯＲ、または４−Ｒを含み、アスコルビン酸塩以外であり、その例にはエリソルビン酸塩が含まれる；
・４，５−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−フラン−４−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、２−ＯＨ、２−ＯＲ、または２−Ｒを含む；
・３−ヒドロキシ−４Ｈ−ピラン−４−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、２−ＯＨ、２−ＯＲ、または２−Ｒを含む；
・５，６−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−４Ｈ−ピラン−４−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、２−ＯＨ、２−ＯＲ、または２−Ｒを含む；
・５，６−ジヒドロ−４−ヒドロキシ−２Ｈ−ピラン−５−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、３−ＯＨ、３−ＯＲ、または３−Ｒを含む；
・３−ヒドロキシ−２Ｈ−ピラン−２−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、４−ＯＨ、４−ＯＲ、または４−Ｒを含む；
・５，６−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−２Ｈ−ピラン−２−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、４−ＯＨ、４−ＯＲ、または４−Ｒを含む；
・５−ヒドロキシ−４Ｈ−１，３−ジオキセン−４−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、６−ＯＨ、６−ＯＲ、または６−Ｒを含む；
・３−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、４−ＯＨ、４−ＯＲ、または４−Ｒを含む；
・ジ−、テトラ−、またはヘキサ−ヒドロ−（４ａ、５、６、７、８、８ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）−３−ヒドロキシ−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、４−ＯＨ、４−ＯＲ、または４−Ｒを含む；
・３−ヒドロキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、２−ＯＨ、２−ＯＲ、または２−Ｒを含む；ならびに
・ジ−、テトラ−、またはヘキサ−ヒドロ−（４ａ、５、６、７、８、８ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）−３−ヒドロキシ−４Ｈ−１−ベンゾピラン−４−オン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体、好ましくは、２−ＯＨ、２−ＯＲ、または２−Ｒを含む；フラボノールなどのその誘導体とともに、限定されるものではないが、代表的な有用な生合成の例が表２に挙げられている：
【０１００】
【表２】
2008537961.tif 000003
【０１０１】
ジ−、テトラ−、またはヘキサ−ヒドロ−（４ａ、５、６、７、８、８ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）と表現されている、上記のベンゾピラノン型アスコルビン酸塩類似体のうち、１つの実施形態では、４ａ、８ａ−ジヒドロであるものが好ましい。
【０１０２】
２−、３−、４−、または６−ＯＨ、−ＯＲ、もしくは−Ｒと表現されている、上記のアスコルビン酸塩類似体のうち、１つの実施形態では、それぞれ２−、３−、４−、または６−ＯＨもしくは−ＯＲであるものが好ましい；１つの実施形態では、それぞれ２−、３−、４−、または６−ＯＨであるものが好ましい。
【０１０３】
上記アスコルビン酸塩類似体に関して、１つの実施形態では、上記のＲ基の好ましい例には：Ｃ１−Ｃ８アリファチル；Ｃ１−Ｃ８ヒドロキシアリファチル；飽和、不飽和、または芳香族シクロペンチルおよびシクロヘキシル（およびその置換誘導体）；ならびに飽和、不飽和、または芳香族ヒドロキシシクロペンチルおよびヒドロキシシクロヘキシル（およびその置換誘導体）が含まれる。例えば、「ヒドロキシアリファチル」といったヒドロキシル含有基である、それらの有機Ｒ基においては、ヒドロキシ基の数は、好ましくは１〜４；好ましくは１〜３；好ましくは１または２である。前記のＯＲ基もまた、薬学上許容される任意の有機または無機エステル基であってよく、その実例にはそれぞれ：１）Ｃ１−Ｃ１８オキソ酸エステル基、好ましくはＣ１−Ｃ１６、Ｃ１−Ｃ１４、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−１０、Ｃ１−Ｃ８、Ｃ１−Ｃ６、またはＣ１−Ｃ４オキソ酸エステル基、およびそれらのチオ酸等価体；ならびに２）ホスホオキソおよびスルフオキソエステル基、好ましくはリン酸塩、ホスホン酸塩、およびスルホン酸エステル基が含まれる。上記の環状構造および置換基はまた、例えば、一重または二重結合したアザ、ボラ、またはホスファ置換体といった少数の環炭素の代わりにヘテロ原子を含んでもよい；１ヘテロ原子置換された実施形態では、その置換体はアザであってよい。アスコルビン酸塩類似体群Ｉに含められるものとしてはまた、例えば、デヒドロアスコルビン酸といった先に挙げた任意の群のメンバーにin vivoで変換可能な前駆体、および上記化合物のいずれかの、例えば、in vivo加水分解性の、薬学上許容されるエーテルおよびエステルがある。前述のいずれかの化合物の薬学上許容される塩もまた、群の中に含められる。
【０１０４】
アスコルビン酸塩類似体に含められるものとしてはまた、アスコルビン酸塩類似体群IIのメンバーがあり、それは、上記の環の１組または複数組の炭素（および／またはアザ、ボラ、もしくはホスファ）原子を介してそこに縮合しているか、ジイルまたはイリデン部分によりそこに架橋しているか、あるいは１または２の一重結合もしくは二重結合により直接的にそれに結合している、１以上の上記アスコルビン酸塩類似体群Ｉの環状構造（および／またはアスコルビン酸塩環状構造）を含む、より大きな環状化合物で構成されている。
【０１０５】
１つの実施形態では、２，５−ジヒドロ−３−ヒドロキシ−フラン−２−オンアスコルビン酸塩類似体は、５−置換−３，４−ジヒドロキシ−５Ｈ−フラン−２−オンであってよい。かかる実施形態のための置換基の好ましい例には、アルコールおよびポリオール置換基が含まれる。１つの実施形態では、アスコルビン酸塩類似体は５−（アルカノリル）−３，４−ジヒドロキシ−５Ｈ−フラン−２−オンのうちのいずれかであってよく、ここで、アルカノール置換基は、好ましくは、例えば、ヒドロキシエチル、ヒドロキシプロピル、またはヒドロキシブチル基といったＣ１−Ｃ８、Ｃ１−Ｃ６、またはＣ１−Ｃ４アルコールであり、その１つの好ましい実施形態は５−（ヒドロキシメチル）−３，４−ジヒドロキシ−５Ｈ−フラン−２−オン、すなわち、エリトロアスコルビン酸である。
【０１０６】
１つの実施形態では、アスコルビン酸塩類似体はアスコルビン酸塩以外のいずれの５−（ポリオリル）−３，４−ジヒドロキシ−５Ｈ−フラン−２−オンであってよく、ここで、ポリオール置換基は任意のポリオールであり、すなわち、用語ポリオールは、例えば、グリコールといったジオール、および、例えばグリセロールといったトリオールを含む。ポリオール置換基は、好ましくは、少なくとも２つのヒドロキシル基を有し、かつ好ましくは、ヒドロキシル基の数の炭素原子の数に対する比が約１：４またはそれ以上、好ましくは約１：３またはそれ以上、あるいは約１：２またはそれ以上である、Ｃ１−Ｃ１８、Ｃ１−Ｃ１６、Ｃ１−Ｃ１４、Ｃ１−Ｃ１２、Ｃ１−Ｃ１０、Ｃ１−Ｃ８、Ｃ１−Ｃ６、またはＣ１−Ｃ４ポリオールであってよい。好ましい実施形態では、ポリオールは末端ヒドロキシル基を有してもよい。好ましい実施形態では、ポリオールのヒドロキシル基：炭素原子比は約１：１であってよい。ポリオール置換基の好ましい例には、ジヒドロキシエチル、ジ−およびトリ−ヒドロキシプロピル、ジ−、トリ−、およびテトラ−ヒドロキシブチル基が含まれる。ジヒドロキシエチル−置換化合物の１つの好ましい例は、５−（１，２−ジヒドロキシエチル）−３，４−ジヒドロキシ−５Ｈ−フラン−２−オン、すなわちエリソルビン酸である。
【０１０７】
ヒドロキシル基：炭素原子比が１：１であるようなポリオール置換アスコルビン酸塩類似体の１つの実施形態では、ポリオール基は、ポリ（ヒドロキシメチレン）基であってよい。１つの実施形態では、ポリオール置換基として使用されるポリ（ヒドロキシメチレン）基は、２〜約８ヒドロキシメチレンユニット、または２〜約６、または２〜約４のかかるユニットを有してもよい。好ましい実施形態では、ポリ（ヒドロキシメチレン）基は、ｎ−ポリ（ヒドロキシメチレン）基であってよい。１つの実施形態では、ポリオールは、グリシトール、すなわち、アルドースまたはケトースと同族のそれぞれアルジトールまたはケトールであってよい。グリシトールクラスの例には、テトリトール、ペンチトール、へキシトール、ヘプチトール、およびオクチトールが含まれる。好ましいグリシトールの例には、エリトリトール、トレイトール、アラビニトール、リキシトール、リビトール、キシリトール、アリトール、アリトリトール、ガラクチトール、グルシトール（ソルビトール）、グリトール、イジトール、マンニトール、タガトールおよびタリトールが含まれる。１つの実施形態では、アスコルビン酸塩類似体は、前述ののいずれかの５−（アルコリルまたはポリオリル）−３，４−ジヒドロキシ−５Ｈ−チオフラン−２−オン変異体であってよい。
【０１０８】
１つの実施形態では、アスコルビン酸塩類似体は、例えば、クロコン酸、すなわち４，５−ジヒドロキシ−４−シクロペンテン−１，２，３−トリオン；４，５−ジヒドロキシ−４−シクロペンテン−［（１，３）または（２，３）］−ジオン；４，５−ジヒドロキシ−４−シクロペンテン−１−（モノ−またはポリ−ヒドロキシアルキル）−２，３−ジオン；および４，５−ジヒドロキシ−４−シクロペンテン−１−（モノ−またはポリ−ヒドロキシアルキル）−３−オンを含む、４，５−ジヒドロキシ−４−シクロペンテン−３−オンのいずれかであってよい。そのようなアスコルビン酸塩類似体の好ましい実施形態では、類似体は、４，５−ジヒドロキシ−４−シクロペンテン−１−（モノ−またはポリ−ヒドロキシアルキル）−２，３−ジオンまたは４，５−ジヒドロキシ−４−シクロペンテン−１−（モノ−またはポリ−ヒドロキシアルキル）−３−オンであってよい；好ましくは、ここで、モノ−またはポリ−ヒドロキシアルキル置換基は、それぞれ、前節に記載のヒドロキシアルキルまたはポリオール基のいずれかである；好ましくは、それは４，５−ジヒドロキシ−４−シクロペンテン−１−（モノ−またはポリ−ヒドロキシアルキル）−３−オンであってよい。
【０１０９】
本明細書で使用しうるさらなる類似体としては、例えば、環状１−オキサ−２−オキソ−３，４−ジヒドロキシ−３−エン（式中の数字は互いに相対的なものである）などのこれらの４，５−ジヒドロキシ−４−シクロペンテン−３−オンの同族体、好ましくは、かかる環状１−オキサ−２−オキソ−３，４−ジヒドロキシ−５−（モノ−またはポリ−ヒドロキシアルキル）−３−エンが含まれる。上記に挙げられたクロコン酸の同族体およびその関連構造を使用してもよく、またこれらの例には、デルチック酸(deltic)、スクアリン酸、およびロジゾン酸、ならびにそれらの関連１−オキソ−２，３−ジヒドロキシ−２−シクロブテン、１−オキサ−２−オキソ−３，４，−ジヒドロキシ−３−シクロブテン、１−オキソ−２，３−ジヒドロキシ−２−シクロヘキセン、および例えば、２，３−ジ−および２，３，５，６−テトラ−ヒドロキシキノンといった１−オキサ−２−オキソ−３，４，−ジヒドロキシ−３−シクロヘキセン構造が含まれる。
【０１１０】
これらの好ましいアスコルビン酸塩類似体構造の総ては、レダクトン基、すなわち、シス−１，２−エンジオール基に近接する（隣接および結合した）カルボニル基を含む少なくとも１つの環を有する；そのような構造の好ましい実施形態の例は、カルボニルも同じ環の環オキサ原子に近接している。従って、好ましい実施形態では、類似体はレダクトンであってよい。レダクトンの好ましい例には糖類レダクトンが挙げられ、それらのうちで好ましいのは、テトロース、テトルロース、ペントース、ペンツロース、ヘキソース、ヘキスロース、ヘプトース、およびヘプツロースレダクトンのいずれかのような単糖類レダクトンである。
【０１１１】
１つの実施形態では、アスコルビン酸塩類似体は、前述のいずれかの２−チオ４，５−ジヒドロキシ−４−シクロペンテン−３−オン変異体であってよい。本明細書に記載の他のアスコルビン酸塩類似体は同様に、例えば、ピランまたはフラン環酸素原子または環エポキシ基酸素原子などの環酸素原子のチオ置換体を含んでもよい。アスコルビン酸塩類似体はまた、他のアスコルビン酸塩類似体（同じかまたは異なる）または、例えば、ビス−アスコルビン酸塩化合物もしくはジ−アスコルビン酸塩（例えば、バナジウムジアスコルビン酸塩）の同族体などのアスコルビン酸塩とともに、アスコルビン酸塩類似体の２ユニット以上を包含する化合物、複合体、および塩も含む；モルヒネおよび以下に記載されたキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）類似体は、同様に２以上のかかるユニットを含んでもよい。
【０１１２】
さらなるアスコルビン酸塩類似体は、例えば、環のオキサ原子におけるアザまたはアゾ置換といったアザまたはアゾ置換を含み、環がそれにより環状イミンとなる実施形態を含む、アスコルビン酸塩類似体およびデヒドロアスコルビン酸塩を含む。そのような類似体はまた、デヒドロレダクトン（デヒドロアスコルビン酸がそのメンバーである）、アミノレダクトン、およびスコルバミック酸(scorbamic)を含む。アスコルビン酸塩（またはその他の類似体）の前駆体はまた、例えば、２−ケト−Ｌ−グロノラクトンおよびＬ−ガラクトノ−１，４−ラクトンといった有用なアスコルビン酸塩類似体である。（例えば、モルヒネ前駆体といった他のＥ１−ＴＭ３結合化合物の前駆体もまた、従って類似体として有用である）
【０１１３】
モルヒネは、Ｎ−メチル−５，６，９，１０，１３，１４−ヘキサヒドロ−３，６−ジヒドロキシ−４，５−エポキシ−９，１３−イミノエタノ−フェナントレン（標準的なモルヒネの番号づけプロトコールによる）であり、また、あるいは、Ｎ−メチル−３，４，９，１０，４ａ，１０ａ−ヘキサヒドロ−３，６−ジヒドロキシ−４，５−エポキシ４ａ，１０−イミノエタノ−フェナントレンとも書かれる。モルヒネの本発明のペプチドへの少なくとも１つの結合様式はまた、多くのモルヒネ異性体および誘導体、ならびに多くの、モルヒネに類似のフェナントレン、フルオレン、およびインダセン誘導体によっても共有されると考えられている。従って、これらは本明細書において使用されている用語「モルヒネ類似体」の中に含められる；その代表的な例には、モルヒネ類似体群Ｉのメンバーが含まれる：
【０１１４】
・モルヒネ異性体および誘導体、その例には、限定されるものではないが、以下のものが含まれる：ノルモルヒネ、ジヒドロモルヒネ；ヒドロモルホン、モルホン、ナロキソン、ナルトレキソン、ノルオキシモルホン、オキシモルホン；
・３，６−ジヒドロキシ−４，５−エポキシ−フェナントレン、ならびにそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体；
・ジ−、テトラ−、ヘキサ−、またはオクタ−ヒドロ−（５、６、７、８、９、１０、１３、１４位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）−３，６−ジヒドロキシ−４，５−エポキシ−フェナントレン、ならびにそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体；
・ジ−、テトラ−、ヘキサ−、またはオクタ−ヒドロ−（５、６、７、８、９、１０、１３、１４位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）−［５，６−または６，７−ジヒドロ］−３−ヒドロキシ−６−オキソ−４，５−エポキシ−フェナントレン；
・１，８−ジヒドロキシ−９−オキサ−９Ｈ−フルオレン、ならびにそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体；
・ジ−、テトラ−、またはヘキサ−ヒドロ−（４ｂ、５、６、７、８、８ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）−１，８−ジヒドロキシ−９−オキサ−９Ｈ−フルオレン、ならびにそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体；
・ジ−、テトラ−、またはヘキサ−ヒドロ−（４ｂ、５、６、７、８、８ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）−［７，８−または８，８ａ−ジヒドロ］−１−ヒドロキシ−８−オキソ−９−オキサ−９Ｈ−フルオレン、ならびにそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体；
・１，７−ジヒドロキシ−８−オキサ−７Ｈ，８Ｈ−（ｓ）−インダセン、ならびにそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体；
・ジ−、テトラ−、またはヘキサ−ヒドロ−（３ａ、４、４ａ、５、６、７ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）−１，７−ジヒドロキシ−８−オキサ−７Ｈ，８Ｈ−（ｓ）−インダセン、ならびにそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体；
・１−ヒドロキシ−７−オキソ−８−オキサ−７Ｈ，８Ｈ−（ｓ）−インダセン、ならびにそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体；ならびに
・ジ−、テトラ−、またはヘキサ−ヒドロ−（３ａ、４、４ａ、５、６、７ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）−１−ヒドロキシ−７−オキソ−８−オキサ−７Ｈ，８Ｈ−（ｓ）−インダセン、およびそれらのモノ−およびポリ−置換誘導体。
【０１１５】
ジ−、テトラ−、ヘキサ、またはオクタ−ヒドロ−（５、６、７、８、９、１０、１３、１４位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）と定義される、上記のフェナントレン型モルヒネ類似体のうち、１つの実施形態では、５、６、９、１０、１３、１４位のうちの任意の隣接する１組または複数組において、ジ−、テトラ−、またはヘキサ−ヒドロであるものが好ましく、もう１つの実施形態では、５、６、１３、１４位のうちの任意の隣接する１組または複数組において、ジ−またはテトラ−ヒドロであるものが好ましい。
【０１１６】
ジ−、テトラ−、またはヘキサ−ヒドロ−（４ｂ、６、７、８、８ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）と定義される、上記のフルオレン型モルヒネ類似体のうち、１つの実施形態では、４ｂ、５、８、８ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において、ジ−またはテトラ−ヒドロであるものが好ましい。
【０１１７】
ジ−、テトラ−、またはヘキサ−ヒドロ−（３ａ、４、４ａ、５、６、７ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において）と定義される、上記のインダセン型モルヒネ類似体のうち、１つの実施形態では、３ａ、４、４ａ、７ａ位のうちの任意の隣接する１組または複数組において、ジ−またはテトラ−ヒドロであるものが好ましく、もう１つの実施形態では、４ａ、７ａ−ジヒドロであるものが好ましい。
【０１１８】
上記の環状構造および置換基はまた、例えば、一重または二重結合したアザ、ボラ、またはホスファ置換体といった、少数の環炭素の代わりにヘテロ原子を含んでもよい；１ヘテロ原子置換された実施形態では、その置換体はアザであってよい。モルヒネ類似体群Ｉに含められるものとしてはまた、例えば、それらの化合物を生成するためにin vivoで加水分解性の、その薬学上許容されるエーテルおよびエステルなどの、先に挙げた任意の群のメンバーにin vivoで変換可能な前駆体がある；そのような前駆体の例には：ヘロイン、すなわち、３−Ｏ，６−Ｏ−ジアセチルモルヒネ；モルヒネ−６−Ｏ−リン酸塩；およびモルフォン−３−Ｏ−硫酸塩が含まれる。モルヒネ類似体はまた、モルヒネ類似体群IIのメンバーも含み、それは、上記の環の１組または複数組の炭素（および／またはアザ、ボラ、もしくはホスファ）原子を介してそこに縮合しているか、ジイルまたはイルイリデン部分によりそこに架橋しているか、あるいは１または２の一重結合もしくは二重結合により直接的にそれに結合している１以上の上記モルヒネ似体群Ｉの環状構造（および／またはアスコルビン酸塩環状構造）を含む、より大きな環状化合物で構成されている。
【０１１９】
Ｅ１結合化合物は、本発明のＥ１ペプチド（Ｅ１、ＴＭ３、およびＥ１−ＴＭ３結合ペプチドを含む）に結合する任意のものである；その例には、上述のようにアスコルビン酸塩、モルヒネ、およびＥＤＴＡ、ならびにそのようなアスコルビン酸塩、モルヒネ、およびＥＤＴＡ類似体が含まれる。１つの実施形態では、アスコルビン酸塩、モルヒネ、またはＥＤＴＡ類似体のｌｏｇＰ値は約４以下の正の値であってよく、好ましくは、それは約１〜約４である。１つの実施形態では、アスコルビン酸塩、モルヒネ、またはＥＤＴＡ類似体のｌｏｇＰ値は約１以下、好ましくは約−４〜約１であってよい。１つの実施形態では、アスコルビン酸塩類似体のｌｏｇＰ値は約−４〜約０、好ましくは約−２〜約０、または約−２〜約−１であってよい；１つの実施形態では、モルヒネ類似体のｌｏｇＰ値は、約−２以上、好ましくは約−１〜約４、または約０〜約２であってよい；１つの実施形態では、ＥＤＴＡ類似体のｌｏｇＰ値は、約−４〜約０、好ましくは約−４〜約−２であってよい。Ｅ１結合化合物は、天然もしくは合成、または直接的もしくは間接的に作用する、１以上のアミン作動性化合物、すなわち１以上の生体アミン受容体アゴニストまたはアンタゴニストと同時に投与されてよい。例えば、アドレナリン受容体の場合、Ｅ１結合化合物は、治療時、あるいはＧＰＣＲ調整、連結、または調整もしくは連結阻害活性についての化合物の試験時に、アドレナリン作動性化合物と同時投与されてよい。
【０１２０】
ＥＤＴＡは、その従来の命名によればエチレン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸である。本明細書での使用のためのＥＤＴＡの類似体には、他の酸キレート剤、ヒドロキシ酸キレート剤、メルカプト酸キレート剤、およびＮ−ヒドロキシアミドキレート剤が含まれる。好ましい実施形態では、ＥＤＴＡ類似体は、酸、ヒドロキシ酸、またはメルカプト酸キレート剤であってよい。これらのうち好ましいのは、複数の酸基を含む類似体、すなわち、少なくとも２つの酸基または少なくとも１つの酸基と、少なくとも１つのヒドロキシル、チオール、またはセレニル基を含むポリ酸キレート剤である。好ましくは、酸基は、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、および／またはホスホン酸基を含んでもよい；好ましくは、カルボキシル基を含んでもよい；好ましいアミドは、そのような酸基から形成される。他の基はまた、例えばカルボニル（ケトンまたはアルデヒドなど）、チオン、ヒドロキシル、チオール、またはセレニル基といった類似体中に存在してもよい。好ましい実施形態では、ＥＤＴＡ類似体は脂肪族分子、好ましくは環状脂肪族分子（ヘテロ脂肪族および複素環式などの脂肪族、好ましい例には、主鎖または環炭素がアザ、オキサ、チア、および／またはボラと置換されている分子が含まれる）であってよい。好ましい実施形態では、脂肪族分子は主鎖が飽和しているものであってよい。
【０１２１】
従って、ＥＤＴＡ類似体の好ましい例には：エチレングリコール−Ｏ，Ｏ’−ビス（２−アミノエチル）−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）；ヘキサエチレンジアミン四酢酸（ＨＤＴＡ）；１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）−エタン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）；ジアミノジエチルエーテル四酢酸（ＤＤＥＴＡ）；ジエチレントリアミン五酢酸（ＤＴＰＡ）；およびトリエチレンテトラアミン六酢酸（ＴＴＨＡ）；ヒドロキシエチルエチレンジアミン三酢酸（ＨＥＤＴＡ）；デスフェリオキサミン（ＤＦＯ）；シクロヘキサン−１，２−ジアミン−Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＣＤＴＡ）；およびエチレンジアミンテトラメチレンホスホン酸（ＥＤＴＭＰ）が含まれる。
【０１２２】
有用な生体アミンＧＰＣＲリガンド（アゴニストおよびアンタゴニスト；アミン作動性化合物）、有用なアスコルビン酸塩、モルヒネ、およびＥＤＴＡ類似体、および有用なＧＰＣＲのＥ１−ＴＭ３ペプチドはまた、２００５年４月１５日に出願されたRoot-Bernstein et al.のアスコルビン酸塩結合ペプチドに関する米国仮特許出願第６０／６７２，２２４号に記載されており、引用することによりその全文が本明細書の一部とされる。
【０１２３】
アミン作動性化合物
本明細書で有用なアミン作動性化合物（aminergic cmoupound）は、生体アミン受容体を直接的または間接的にアゴナイズまたはアンタゴナイズする、薬学上許容される化合物である。１つの実施形態では、アミン作動性化合物は、受容体結合部位リガンド、すなわち直接アゴニストまたはアンタゴニストであってよい。非常に幅広い種類のアミン作動性化合物が当技術分野で公知である；アミン作動性化合物の実例は、アドレナリン作動性、ドーパミン作動性、ヒスタミン作動性、ムスカリン作動性、およびセロトニン作動性化合物の主要なクラスに関して以下に与えられる。本発明のアミン作動性化合物には、その薬学上許容される塩およびエステル、およびその混合物、ならびにin vivoでそれに変換可能なその前駆体が含まれることが理解される。以下に示すアミン作動性化合物のいずれもを、本発明の連結化合物の構築のためにリガンドとして使用してもよい。
【０１２４】
アドレナリン作動性化合物
本明細書で有用なアドレナリン作動性化合物（adrenergic cmoupound）は、α−またはβ−アドレナリン受容体を直接的または間接的にアゴナイズまたはアンタゴナイズして交感神経刺激反応を誘発する、薬学上許容される化合物である。１つの実施形態では、アドレナリン作動性化合物は、受容体結合部位リガンド、すなわち、直接アゴニストまたはアンタゴニストであってよい。Goodman and Gillman's, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th Edition （1990）（引用することにより本明細書の一部とされる）に記載されているものを含め、多くのアドレナリン作動性化合物が当技術分野で公知である。本明細書で有用なアドレナリン作動性化合物には、アルブテロール、アマンタジン、アンフェタミン、アチパメゾール、ベンゼフェタミン(benzephetamine)、ビトルテロール、クロルプロマジン、クロニジン、コルテロール、デキストロアンフェタミン、ジエチルプロピオン、ドブタミン、ドーパミン、エフェドリン、エピネフリン、エチルノルエピネフリン、フェンフルラミン、フェノテロール、グアナベンズ、グアンファシン、ヒドロキシアンフェタミン、イソエタリン、イソプロテレノール、レボドパ、メフェンキセルミン(mephenxermine)、メタプロテレノール、メタラニノール（metaraninol）、メタンフェタミン、メトキサミン、メチルドパ、メチルフェンデート(methylphendate)、ノルエピネフリン、オキシメタゾリン、ペモリン、フェンジメトラジン、フェンメトラジン、フェンテルミン、フェニレフリン、フェニルエチルアミン、フェニルプロパノールアミン、ピルブテロール、プレナルテロール、プロクロルペラジン、プロピルヘキセドリン、プソイドエフェドリン、リトドリン、テルブタリン、テオフィリン、チラミン、ヨヒンビン、およびそれらの誘導体、それらの薬学上許容される塩およびエステル、およびそれらの混合物からなる群から選択されるものが含まれる。
【０１２５】
ドーパミン作動性化合物
本明細書で有用なドーパミン作動性化合物は、ドーパミン受容体を直接的または間接的にアゴナイズまたはアンタゴナイズする薬学上許容される化合物である。１つの実施形態では、ドーパミン作動性化合物は、受容体結合部位リガンド、すなわち直接アゴニストまたはアンタゴニストであってよい。多くのドーパミン作動性化合物のうち当技術分野で公知のものは、例えば、置換ドーパミン誘導体、キンピロール、２−アミノ−５，６−ジヒドロキシ−１，２，３，４−テトラヒドロナフタレン、ペルゴリド、アポモルヒネ、ハロペリドール、ドンペリドン、メタクロプラミド、フルフェナジン、フルペンチキソール、スルピリド、フェノチアジン（例えば、チオリダジン）、ナロキソン、およびブロモクリプチンである。ドーパミン作動性化合物の前駆体の１つの例は、Ｌ−ドーパ（Ｌ−３，４−ジヒドロキシフェニルアラニン）である。
【０１２６】
ヒスタミン作動性化合物
本明細書で有用なヒスタミン作動性化合物は、ヒスタミン受容体を直接的または間接的にアゴナイズまたはアンタゴナイズする薬学上許容される化合物である。１つの実施形態では、ヒスタミン作動性化合物は、受容体結合部位リガンド、すなわち直接アゴニストまたはアンタゴニストであってよい。多くのヒスタミン作動性化合物のうち当技術分野で公知のものは、例えば、置換ヒスタミン誘導体、４−メチルヒスタミン、Ｎ−α−メチルヒスタミン、Ｒ−α−メチルヒスタミン、２−フェニルヒスタミン（例えば、２−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ヒスタミン、Ｎ−α−メチル−２−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］ヒスタミン）；２−（２−ピリジル）エチルアミン、ヒスタプロジフェン（２−［２−（３，３−ジフェニルプロピル）−１Ｈ−イミダゾール−４−イル］エチルアミン）、Ｎ−メチル−ヒスタプロジフェン、Ｎ−α−２−［（１Ｈ−イミダゾール−４−イル）エチル］ヒスタプロジフェン；（６−［２−（４−イミダゾリル）エチルアミノ］−Ｎ−（４−トリフルオロメチルフェニル）ヘプタンカルボキサミド）；デクスクロルフェニラミン、ジフェンヒドラミン；アムタミン(amthamine)、クロザピン、クロベンプロピット、ジマプリット、イメティット、インメピップ、インプロミジン；（＋）−クロルフェニラミン、シメチジン、シプロキシファン、クロベンプロピット、ピリラミン／メピラミン、ラニチジン、チオペラミド、チオチジン、およびトリプロリジンである。
【０１２７】
ムスカリン作動性化合物
本明細書で有用なムスカリン作動性化合物は、ムスカリンアセチルコリン受容体を直接的または間接的にアゴナイズまたはアンタゴナイズする薬学上許容される化合物である。１つの実施形態では、ムスカリン作動性化合物は、受容体結合部位リガンド、すなわち直接アゴニストまたはアンタゴニストであってよい。多くのムスカリン作動性化合物のうち当技術分野で公知のものは、例えば、置換アセチルコリン誘導体、アセクリジン、アレコリン、アトロピン、ベンズヘキソール、ベンズトロピン、セビメリン、２−エチル−８−メチル−２，８−ジアザスピロ（４．５）デカン−１，３−ジオン、Ｒ−（Ｚ）−（＋）−α−（メトキシイミノ）−１−アザビシクロ［２．２．２］オクタン−３−アセトニトリル、ミラメリン、オキソトレモリン、ピロカルピン、ピレンゼピン、スコポラミン、タルサクリジン、テレンゼピン、トリヘキシフェニジル、およびキサノメリンである。
【０１２８】
セロトニン作動性化合物
本明細書で有用なセロトニン作動性化合物は、セロトニン受容体を直接的または間接的にアゴナイズまたはアンタゴナイズする薬学上許容される化合物である。１つの実施形態では、セロトニン作動性化合物は、受容体結合部位リガンド、すなわち直接アゴニストまたはアンタゴニストであってよい。多くのセロトニン作動性化合物(seratoninergic compounds)のうち当技術分野で公知のものは、例えば、５−メトキシトリプタミン、ａ−メチル−５−ヒドロキシトリプタミン、５−カルボキサミドトリプタミン、２−エチル−５−メトキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチルトリプタミンといった置換５−ヒドロキシ−トリプタミン誘導体；例えば、２，５−ジメトキシ−４−ハロアンフェタミン、２，５−ジメトキシ−４−メタンフェタミンといったアンフェタミン；例えば、リゼルギン酸ジエチルアミド、ジヒドロエルゴタミンといったエルゴタミンおよびリゼルギン酸誘導体；アルモトリプタン、ブスピロン、クロルプロマジン、クロザピン、シサプリド、シアノピンドロール、シプロヘプタジン、デクスフェンフルラミン、デキストロメトルファン、ドラセトロン、ドニトリプタン、エレトリプタン、エルトプラジン、フェンフルラミン、フルオキセチン、フルボキサミン、ゲピロン、グラニセトロン、ケタンセリン、ロキサピン、メペリジン、メスレルギン、メチオテピン、メテルゴリン、メチセルギド、メトクロプラミド、ミアンセリン、ナラトリプタン、１−ナフチルピペラジン、ネファゾドン、オランザピン、オンダンセトロン、パロキセチン、ピンドロール、プロプラノロール、リスペリドン、リタンセリン、リザトリプタン、スピペロン、セルトラリン、スマトリプタン、トロピセトロン、ゾルミトリプタン、８−ヒドロキシ−ジプロピルアミノテトラリン、および２−（２−メチル−４−クロロフェノキシ）プロパン酸がある。
【０１２９】
スクリーニング試験の形式
ＧＰＣＲ  Ｅ１結合剤は、本発明のペプチドを使用することにより同定できる。本明細書において、ＧＰＣＲ  Ｅ１結合剤は、本明細書に記載の生体アミンＧＰＣＲのアスコルビン酸塩結合ペプチド（アスコルビン酸塩−結合Ｅ１ペプチド、ＴＭ３ペプチド、およびＥ１−ＴＭ３ペプチドのいずれかを含む）に結合する任意の化合物である。ＧＰＣＲ  Ｅ１結合剤はまた、「Ｅ１結合剤」とも呼ばれる。クリーニング試験は、Ｅ１アロステリックモジュレーター、Ｅ１アロステリック調整阻害薬、Ｅ１ステリックモジュレーター、Ｅ１自動調整リガンド、またはＥ１調整抵抗性リガンドとしてin vivoで作用するか、作用する可能性のある化合物を同定するために使用することができる。
【０１３０】
本発明のスクリーニング法において、化合物−ペプチド結合を検出するための試験の形式は、アスコルビン酸塩−結合ペプチド（すなわち、Ｅ１、ＴＭ３、またはＥ１−ＴＭ３の配列を有する）に結合する化合物の直接試験または間接試験いずれでもよい。直接試験の形式の例には、例えば、ペプチドがそのＧＰＣＲ部分としてＧＰＣＲアスコルビン酸塩結合配列のみを有している場合に、化合物が結合したペプチドを検出する形式、または化合物が結合したペプチドを検出し、さらに結合位置がアスコルビン酸塩結合部分（Ｅ１、ＴＭ３、またはＥ１−ＴＭ３配列）上にあることを示しもする形式がある；後者の形式は、ペプチドがＧＰＣＲアスコルビン酸塩結合部分よりも大きなＧＰＣＲ配列を有する実施形態において好ましい。間接試験の形式の例は、例えば、結合試験の反応媒質中で試験化合物と共に存在している既知のアスコルビン酸塩−結合−ペプチド結合化合物（例えば、アスコルビン酸塩、モルヒネ、またはＥＤＴＡ）の結合の減少を検出するものである。
【０１３１】
本発明のスクリーニングアッセイは、in vitro、in vivo、またはin cytoにおいて行ってよい。１つの好ましい実施形態では、第１の、または初期のスクリーニングはin vitroで行ってよい；in vitroアッセイの１つの実施形態では、使用される結合ペプチドは、約８残基長、または約１５残基長、または約２０、３０、もしくは４０残基長であってよい；in vitroアッセイの１つの実施形態では、使用される結合ペプチドは、ＧＰＣＲの少なくとも実質的に総てのＴＭ２−Ｅ１−ＴＭ３部分であってよく、またはそのＧＰＣＲ配列部分のようなアミノ酸配列を有してよく、またペプチドは細胞膜の表面に存在してもよい。第１の、または初期のスクリーニングがin vitroで行われ、アスコルビン酸塩結合ペプチドへ結合する化合物を同定する場合は、好ましくは化合物のさらなるスクリーニングは次に、生体アミンＧＰＣＲの少なくとも実質的に完全なＴＭ２−ＴＭ７部分、または全ＧＰＣＲ配列を含むより大きなペプチドを用いて行ってもよい。第２のスクリーニングは、in cytoまたはin vivoで行うのが好ましい。生体アミンＧＰＣＲの少なくとも実質的に完全なＴＭ２−ＴＭ７部分、または全ＧＰＣＲ配列を有するペプチドを用いるin cytoまたはin vivo試験の１つの好ましい実施形態では、試験に細胞のＧタンパク質共役型反応の測定を含めてもよい。
【０１３２】
本明細書に記載のように、Ｅ１アロステリックモジュレーターは生体アミンＧＰＣＲのアスコルビン酸塩結合部分に結合し、それによりリガンド結合または既に結合しているリガンドに対するＧＰＣＲの反応を調整する化合物である；Ｅ１アロステリック調整阻害薬は、同様に結合するがＧＰＣＲの調整作用を及ぼさず、それによりモジュレーターによる結合を阻害する化合物である。Ｅ１ステリックモジュレーターは同様に結合するが、ＧＰＣＲリガンドによるリガンド部位アクセスを阻害するさらなる部分を含んでいる。Ｅ１自動調整リガンドは同様に結合するが、リガンド結合部位に結合するさらなる部分を含んでおり、それによりＧＰＣＲ反応の活性化および調整の両方を行う；Ｅ１調整抵抗性リガンドはリガンド結合部位に結合するが、Ｅ１アロステリックモジュレーターまたはＥ１アロステリック調整阻害薬によるアスコルビン酸塩結合部位への結合を阻害する（ＧＰＣＲに調整作用を及ぼすことなく、Ｅ１ループに近接して位置しているか、結合している部分により）さらなる部分を含んでいる。
【０１３３】
既知のアスコルビン酸塩−結合−ペプチド結合化合物が本発明のスクリーニングアッセイに用いられる場合、それは好ましくは、アスコルビン酸塩、モルヒネ、またはＥＤＴＡであってよい。既知の生体アミンＧＰＣＲリガンド（アゴニストまたはアンタゴニスト）が本発明のスクリーニングアッセイに用いられる場合、それは好ましくは、アミン作動性化合物であってよい。典型的なアミン作動性化合物は以下に記載されている。本発明のスクリーニングアッセイの１つの好ましい実施形態では、試験化合物は、以下に示されるアスコルビン酸塩、モルヒネ、またはＥＤＴＡ類似体のいずれかであってよい。１つの好ましい実施形態では、試験化合物は、アスコルビン酸塩、モルヒネ、もしくはＥＤＴＡ、またはアスコルビン酸塩、モルヒネ、もしくはＥＤＴＡ類似体がアミン作動性化合物と共有結合している状態で提供されてよい；かかる「２−部分」の試験化合物の１つの好ましい実施形態では、化合物の１つは「既知の」アスコルビン酸塩−結合−ペプチド結合化合物、または「既知の」ＧＰＣＲリガンドであってよい。
【０１３４】
アドレナリン作動性化合物の補体
本発明の組成物および方法のアドレナリン作動性化合物の補体は、アドレナリン作動性化合物に対する補体である化合物を含む。好ましい「補体」は、所与の組成物または方法において、前記の組成物または方法に用いられるアドレナリン作動性化合物に結合する化合物である。かかる「結合」は、補体とアドレナリン作動性化合物の物理化学的相互作用を介する複合体の形成であり、介するとは、共有結合以外を意味する。かかる結合は、以下に示す論文に記載されており、引用することにより本明細書の一部とされる：Root-Bernstein and Dillon, "Molecular Complementarity I: The Complementarity Theory of the Origin and Evolution of Life." J. Theoretical Biology 188: 447-449 (1997);およびRoot-Bernstein, "Catecholamines Bind to Enkephalins, Morphiceptin, and Morphine," Brain Research Bulletin 18: 509-532 (1987); およびRoot-Bernstein and Dillon, "Fostering Venture Research: A Case Study of the Discovery that Ascorbate Enhances Adrenergic Drug Activity," Drug Research Development 57:58-74 (2002)。かかる結合、および本明細書で有用な補体は、２００２年４月４日公開のRoot-Bernstein et al.のＰＣＴ特許公報ＷＯ０２／２６２３３に記載されている。
【０１３５】
好ましい補体には、アスコルビン酸塩、その誘導体、それらの薬学上許容される塩およびエステル、ならびにそれらの混合物が含まれる。「薬学上許容される塩」は、任意の酸性（例えば、カルボキシル）基で形成された陽イオン塩、または任意の塩基性（例えば、アミノ）基で形成された陰イオン塩である。１９８７年９月１１日公開のJohnston et al.の国際特許公報８７／０５２９７に記載されている（引用することにより本明細書の一部とされる）ように、多くのそのような塩は当技術分野で公知である。好ましい陽イオン塩には、アルカリ金属塩（ナトリウムおよびカリウムなど）、およびアルカリ土類金属塩（マグネシウムおよびカルシウムなど）が含まれる。好ましい陰イオン塩には、ハロゲン化物（塩化物など）が含まれる。「薬学上許容されるエステル」は、基本的に本明細書で使用される化合物の活性を阻害しないエステル、またはヒトまたは下等動物被験体により容易に代謝されて活性化合物を生じるエステルである。
【０１３６】
アスコルビン酸塩には、アスコルビン酸ならびにその医薬品誘導体および代謝産物が含まれる。好ましいアスコルビン酸塩には、アスコルビン酸、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸カルシウム、Ｌ−アスコルビン酸、Ｌ−アスコルビン酸塩、デヒドロアスコルビン酸、デヒドロアスコルビン酸塩、２−メチル−アスコルビン酸、２−メチル−アスコルビン酸塩、アスコルビン酸２−リン酸塩、アスコルビン酸２−硫酸塩、Ｌ−アスコルビン酸カルシウム２水和物、Ｌ−アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビルエステル、およびそれらの混合物が含まれる。アスコルビン酸は、特に好ましいアスコルビン酸塩である。
【０１３７】
他の好適な補体には、オピオイドおよびポリカルボン酸キレート剤が含まれる。オピオイドには、オピエートおよびその合成誘導体が含まれる。好ましいオピオイドには、モルヒネ、アポモルヒネ、コデイン、モルヒセプチン、ダイノルフィン、ナロキソン、キョートルフィン、メタドン、ナルトレキソン、フェンタニル、ペンタゾクリン(pentazocrine)、ブトルファノール、レボルファノール、レバロルファン、マルブフィン(malbuphine)、ブプレノルフィン、ナロルフィン、ベンゾモルファン、ヘロイン、ヒドロモルホン、オキシモルフォン、ヒドロコドン、オキシコドン、ナルメフェン、ナルブフィン、エンケファリン、エンドルフィン、（Ｍｅｔ−エンケファリンおよびＬｅｕ−エンケファリンなど）、およびそれらの混合物が含まれる。ポリカルボン酸キレート剤には、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ジエチレントリアミン五酢酸、それらの薬学上許容される塩、およびそれらの混合物が含まれる。Ｌ−リボースおよびアデノシン誘導体には、Ｌ−リボース、アデノシン三リン酸、アデノシン一リン酸、サイクリックＡＭＰ、およびその混合物が含まれる。
【０１３８】
Ｇタンパク質共役型受容体
Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）は、細胞内ヘテロトリメトリックＧタンパク質の活性を回復させ、調節する。Ｇタンパク質共役型受容体は多様性があり、光、におい、および味などの外因性刺激とともに、生体アミン、ペプチド、糖タンパク質、脂質、ヌクレオチド、イオン、およびプロテアーゼなどの一連の内因性リガンドと相互作用しうる。図１に示されたように、総てのＧＰＣＲは、細胞外側２０に位置するアミノ末端１８および細胞内側２４上のカルボキシ末端２２とともに、細胞内ループ１４（ｉ１、ｉ２およびｉ３）および細胞外ループ１６（ｅ１、ｅ２およびｅ３）により交互につながっている７回膜貫通αヘリカルセグメント１２（ＴＭＩ、ＴＭII、ＴＭIII、ＴＭIV、ＴＭＶ、ＴＭVIおよびＴＭVII）の構造的特徴を共有している。１つはｅ１中、およびもう１つはｅ２中の２つのシステイン残基は、大部分のＧＰＣＲにおいて保存されており、７回膜貫通へリックスの多くの構造のパッキングおよび安定化に重要なジスルフィド結合を形成する（Bockaert, J. and Pin, J. P., Molecular Tinkering of G Protein-Coupled Receptors: An Evolutionary Success, European Molecular Biology Organization Journal, 18 no. 7 (1999) 1723-1729; および Gether, U., Uncovering Molecular Mechanisms Involved in Activation of G Protein Coupled Receptors, Endocrine Reviews, 21 no. 1 (2000) 90-113参照）。
【０１３９】
アドレナリン受容体
アドレナリン受容体（ＡＲ）すなわち、アドレノレセプターは、内因性カテコールアミンであるエピネフリンおよびノルエピネフリンと結合するＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）のメンバーである。本明細書において、「カテコールアミン」はホルモンまたは神経伝達物質としての役割を果たす、チロシンに由来する化合物である。カテコールアミンには、限定されるものではないが、アルブテロール、ドーパミン、エフェドリン、レバドパ(leva dopa)、ノルエピネフリン、オキシメタゾリン、フェニレフリン、フェニルプロパノールアミン、プソイドエフリン、テオフィリン、およびそれらの混合物が含まれる。
【０１４０】
アドレナリン受容体は、ファミリーＡまたはクラスＡロドプシン様受容体に属し、それはαアドレナリン受容体（α−１およびα−２）およびβアドレナリン受容体を含む。前記受容体はさらに９つのサブタイプに分けられる：α−１−Ａ／Ｄ、α−１−Ｂ、α−１−Ｃ、α−２Ａ、α−２Ｂ、α−２Ｃ、β−１、β−２およびβ−３。９つのサブタイプの間には顕著な不均一性が存在し、それぞれは別々の遺伝子によりコードされ、また固有の薬物相互作用および調節特性を示す。
【０１４１】
ある種のアドレナリン受容体が本明細書に例示されるが、患者の病気または状態によって、本発明の実施形態は任意のアドレナリン受容体のタイプおよび働きに適合するように調整してよい。実施形態の選択の検討には、受容体の位置および作用を含めてもよく、例えば、α−１受容体は皮膚上および胃腸系に存在し、主として血管中で作用し、血管収縮を引き起こす；α−２受容体はシナプス前神経終末上に位置する；β−１受容体は心臓組織に存在し、心臓のペースメーカー細胞に作用することにより心拍数の増加を引き起こす；β−２受容体は骨格筋の血管中に存在し、血管拡張を引き起こしてより多くの血液を筋肉へ流入させ、全末梢血管抵抗を低下させる；ならびにβ−３受容体は、脂肪組織中に存在し、代謝を調節する役割を有する。
【０１４２】
様々な実施形態では、アドレナリン受容体はその天然の立体構造の状態に保つことが好ましい。天然の立体構造の状態には二次構造および三次構造が含まれ、構造の折りたたみは非共有結合性相互作用により安定化される。改変されたアドレナリン受容体を用いる実施形態では、改変された分子の三次構造が天然に存在する種類の分子の構造と同じになるように、適切な非共有結合性相互作用を有するように受容体を改変してもよい。
【０１４３】
アドレナリン受容体上の結合ポケット
ＧＰＣＲと同様に、ロドプシン、いくつかの膜貫通タンパク質ドメインは、アドレナリン作動性および他の生体アミン受容体の活性化に利用される。１つはｅ１中、およびもう１つはｅ２中の、ＧＰＣＲの２つの保存されたシステイン残基は、分子構造のパッキングおよび安定化に重要なジスルフィド結合を形成する。ロドプシンにおいて、他の遊離スルフヒドリル基とともにＣｙｓ１１０およびＣｙｓ１８７はロドプシン活性化およびリガンド結合において不可欠である。β−２アドレナリン作動性および他の生体アミンＧＰＣＲにおいて、配列番号１〜１０のＣｙｓ１２または配列番号１４〜２０７のＣｙｓ２９（配列番号：１４〜２０７の中リストに記載されている挿入変異体においてＣｙｓ３０として番号づけされている）として示される、ｅ１Ｃｙｓ残基を含む、Ｃｙｓ残基の等価なペアは、同様の重要性を有する。いくつかの生体アミンＧＰＣＲにおいて、さらなるＣｙｓ残基はまた、受容体活性化およびリガンド結合に重要なものとして関与しているとされ、例えば、リストに記載された微量アミン受容体配列またはラット生体アミンＧＰＣＲコンセンサス配列に示されているように、このＣｙｓが配列番号１〜１０の４位の残基または配列番号：１４−２０７の２１位の残基を占有する。Rubenstein, L. A. and Lanzara, R.G., Activation of G Protein-Coupled Receptors Entails Cysteine Modulation of Agonist Binding, Journal of Molecular Structure (Theochem) 430 (1998) 57-71; and Piascik, MT. and Perez, D. M., α1-Adrenergic Receptors: New Insights and Directions, The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 298 no. 2 (2001) 403-410.参照。
【０１４４】
クラスＡのＧＰＣＲリガンドは、ＴＭ−III、ＴＭIV、ＴＭＶ、ＴＭVIおよびＴＭVIIにより形成された空洞中に結合する。α−１受容体へのアゴニストの結合に関与する残基には、ＴＭIII、IV、Ｖ、VI、およびVIIが含まれる。β−２−アドレナリン受容体へのアゴニストおよびアンタゴニストの結合に関与する残基は、ＴＭIII、Ｖ、VI、およびVIIに見出されている。
【０１４５】
アドレナリン受容体のそれぞれのサブタイプのなかには、いくつかの非システイン残基もまた、受容体活性化および結合部位の力学に影響を及ぼす。例えば、α−１アドレナリン受容体において、アゴニスト結合において４回膜貫通領域中に８つの残基が同定されており、それには：Ａｓｐ１０６（ＴＭIII）、Ｐｈｅ１６３（ＴＭIV）、Ｓｅｒ１９２（ＴＭＶ）、Ｓｅｒ１８８（ＴＭＶ）、Ｐｈｅ１８７（ＴＭＶ）、Ｖａｌ１８５（ＴＭVI）、Ｐｈｅ２８８（ＴＭVI）、およびＭｅｔ２９２（ＴＭVI）が含まれる。β−２アドレナリン受容体において、ＴＭVII中のアスパラギンはある種のアンタゴニストと特異的に相互作用することが示されている。β−２アドレナリン作動性ポケットの重要な要素は、高親和性結合部位を形成するための第２の細胞外ループのポケットの中への折りたたみにより形成される（Shi L, Javitch JA. Annual Rev Pharmacol Toxicol 42, 437-467 （2002））。さらにもう１つの例は、ＴＭIII中のアスパラギン酸であり、それはアドレナリン作動性アゴニストおよびアンタゴニスト両方のための共通の相互作用ポイントとしての役割を果たす。
【０１４６】
本明細書で有用なペプチドのいくつかの代表的な例は、本明細書で有用な核酸によりコードされうるアミノ酸配列の例も提供するが、限定されるものではないが：ヒトＳＶＣＴ１残基４００−４３９（配列番号１１）、ヒトＳＶＣＴ２残基４５９−４９８（配列番号１２）、ヒトアドレナリン受容体α−１Ａ残基７１−１１５（配列番号２０）、およびヒトアドレナリン受容体β−２残基７８−１２２（配列番号２７）；ならびに以下に示すそれらのペプチド断片が含まれる。
【０１４７】
１つの実施形態では、関連のある結合化合物を同定するための結合試験に有用なペプチド断片は、ヒトＳＶＣＴ１残基のアミノ酸配列のうちのいずれかを有するアスコルビン酸輸送体ペプチドであってよい：４００−４２５（配列番号１１の残基１−２６）；４０５−４３９（配列番号１１の残基６−４０）；４０３−４２５（配列番号１１の残基４−２６）；４０３−４１２（配列番号１１の残基４−１３）；４１０−４１９（配列番号１１の残基１１−２０）；４１５−４３９（配列番号１１の残基１６−４０）；４１５−４２５（配列番号１１の残基１６−２６）；または４２３−４３３（配列番号１１の残基２４−３４）。
【０１４８】
１つの実施形態では、関連のある結合化合物を同定するための結合試験に有用なペプチド断片は、ヒトＳＶＣＴ２残基のアミノ酸配列のうちのいずれかを有するアスコルビン酸輸送体ペプチドであってよい：４５９−４８４（配列番号１２の残基１−２６）；４６４−４９８（配列番号１２の残基６−４０）；４６１−４８３（配列番号１２の残基３−２５）；４６１−４７０（配列番号１２の残基３−１２）；４６８−４７７（配列番号１２の残基１０−１９）；４７４−４９８（配列番号１２の残基１６−４０）；４７４−４８５（配列番号１２の残基１６−２７）；または４８３−４９３（配列番号１２の残基２５−３５）。
【０１４９】
１つの実施形態では、関連のある結合化合物を同定するための結合試験に有用なペプチド断片は、ヒトα−１Ａアドレナリン受容体残基のアミノ酸配列のうちのいずれかを有するアミン作動性のＧＰＣＲペプチドであってよい：８１−１０５（配列番号２０の残基１１−３５）；８１−９１（配列番号２０の残基１１−２１）；８９−９８（配列番号２０の残基１９−２８）。１つの実施形態では、関連のある結合化合物を同定するための結合試験に有用なペプチド断片は、ヒトβ−２アドレナリン受容体残基のアミノ酸配列のうちのいずれかを有するアミン作動性のＧＰＣＲペプチドであってよい：８９−１１３（配列番号２７の残基１２−３６）；８９−９９（配列番号２７の残基１２−２２）；または９７−１０６（配列番号２７の残基２０−２９）。
【０１５０】
キット
本発明のもう１つの態様は、アドレナリン受容体に有用であるアッセイに関連する。様々な実施形態では、前記キットは；
（ａ）任意の１以上の：１）連結化合物；２Ａ）連結化合物の構築に有用なリンカー；２Ｂ）連結化合物の構築に有用なＥ１−ＴＭ３結合もしくは遮断化合物；または２Ｃ）連結化合物の構築に有用な生体アミンＧＰＣＲリガンドもしくはその類似体；
（ｂ）１以上の（ａ）２Ａ、（ａ）２Ｂ、および／または（ａ）２Ｃのみが提供される場合、（ａ）２Ａ、（ａ）２Ｂ、および／または（ａ）２Ｃ成分を用いる連結化合物の調製に関する説明書；
（ｃ）提供された連結化合物、または提供された（ａ）２Ａ、（ａ）２Ｂ、および／または（ａ）２Ｃ成分を用いて調製された連結化合物の使用説明書であって：
ｉ．（１）キット中で提供されている、またはキットのユーザーにより提供される、in cyto、in vivo、またはin vitro生体アミンＧＰＣＲまたはそのＥ１−ＴＭ３ペプチド含有部分と連結化合物とを接触させること、および（２）結果として生じる結合特性を測定することおよび／または結果としてもたらされたＧＰＣＲ変換生物活性を測定することを含むアッセイ、または
ii．診断法もしくは治療法
における使用説明書
を含む。
【０１５１】
キットの構成成分は、別々の容器に包装し、グループ化されうる。かかるアッセイにおいて有用な、生体アミンＧＰＣＲのためのリガンドおよび／またはＥ１−ＴＭ３結合化合物（例えば、アスコルビン酸塩）の溶液または懸濁液などの競合結合剤が提供されうる。
【０１５２】
生体アミン受容体は天然の立体構造の状態であることが好ましいが、キットは、かかる受容体または有用なそのＥ１−ＴＭ３ペプチド含有断片をコードする、様々な供給源由来の核酸を、高度に精製されたものも、最小限に精製されたか、または未精製のものも含みうる。これらは、適当な転写および翻訳調節配列に機能しうる形で結合されたコード配列を含む適当な発現ベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされた宿主細胞において発現されうる。ＧＰＣＲポリペプチドは、単独で、または他のタンパク質と融合した形で発現されうる。核酸は、コード配列、適当な転写および翻訳調節配列に機能しうる形で結合されたコード配列を含む発現可能配列、および／またはそれらを含む発現もしくはクローニングベクターの形態で提供されうる。かかる核酸は、例えば、裸の、タンパク質と結合した、安定化させた、またはクローニングもしくは発現宿主細胞中に含まれた形態といった任意の有用な形態で提供されうる。
【０１５３】
発現ベクターは、通常は、所望の抗原遺伝子またはその断片を含む自己複製ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物であり、ほとんどの場合、好適な宿主細胞中に認識される好適な遺伝子制御エレメントに機能しうる形で連結されている。これらの制御エレメントは、好適な宿主中で発現を引き起こすことができる。発現を引き起こすために必要な制御エレメントの特定のタイプは、用いられる最終的な宿主細胞に依存しうる。一般に、遺伝子制御エレメントは、原核生物のプロモーター系または真核細胞のプロモーター発現制御系が含まれてよく、また一般に転写プロモーター、転写の開始を制御する任意のオペレーター、ｍＲＮＡ発現レベルを高める転写エンハンサー、好適なリボソーム結合部位をコードする配列、ならびに転写および翻訳を終結させる配列を含みうる。発現ベクターはまた、通常、ベクターが宿主細胞とは独立に複製することを可能にする複製起点も含む。
【０１５４】
本明細書において、ベクターは、プラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、組み込み可能なＤＮＡ断片、および宿主のゲノム中へのＤＮＡ断片の組み込みを可能にする他のビヒクルを含む。発現ベクターは、機能しうる形で連結された遺伝子の発現を引き起こす遺伝子制御エレメントを含む、特化したベクターである。プラスミドは、最も多く用いられるベクターの形態であるが、同等の機能を果たす当技術分野で公知の、または当技術分野で公知となる他の形態のベクター総ては、本明細書での使用に好適である。例えば、Pouwels et al. (1985 and Supplements) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, N.Y., and Rodriquez et al. (1988)(eds.) Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Buttersworth, Boston, Mass.参照。これらは引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１５５】
形質転換細胞には、通常、遺伝子組換え技術を用いて構築されたアドレナリン受容体を含むベクターを用いて形質転換またはトランスフェクトされた細胞、好ましくは哺乳類細胞が含まれる。
【０１５６】
一般に、試験化合物は、アドレナリン受容体またはアドレナリン受容体結合部位に近い領域と相互作用する能力のある任意の化合物である。本明細書において、「相互作用」とは、例えば、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、タンパク質−小分子、小分子−核酸、タンパク質−大分子、および大分子−自然の核酸などの分子間の検出可能な相互作用を含むことが意図されている。本明細書において、「小分子」（small molecule）は、分子量が約５ｋＤ未満の組成物である。小分子には、限定されるものではないが、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質、または他の有機もしくは無機分子、またはそれらの混合物が含まれる。小分子にはまた、真菌、細菌または藻類抽出物の単独または生物学的混合物も含まれうる。本明細書において、「大分子」（large molecule）とは、約５ｋＤよりも分子量の大きい分子を含み、核酸、ペプチド、ポリペプチド、ペプチド模倣体、炭水化物、脂質、または他の有機もしくは無機分子、またはそれらの混合物を含む。大分子にはまた、真菌、細菌、または藻類抽出物、プラスミド、ベクター、または５ｋＤより大きい他の細胞の、単独もしくは生物学的混合物も含まれうる。
【０１５７】
２以上の任意の成分が包装中に提供される実施形態では、成分を異なるものにすることは本発明の範囲を逸脱するものではない。２以上のアドレナリン受容体または試験化合物が提供される実施形態では、いくつかの受容体または試験化合物を一緒に、個々に、または一連の個別容器中に包装しうる。化合物の使用に関する説明書には、受容体を試験化合物と接触させること、および結合親和性を測定することが含まれる。
【０１５８】
方法
本発明の実施形態は、様々な方法およびアドレナリン受容体の使用を含む。１つの実施形態では、アドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体との結合を仲介する化合物の同定方法が提供される。本明細書において、「調整」または「仲介」、およびその変形とは、例えば、アゴナイズすることによるアップレギュレーション（すなわち：活性化または刺激）；および例えば、生物活性（例えば、遺伝子の発現）をアンタゴナイズすることによるダウンレギュレーション（すなわち：阻害または抑制）の両方をさす。そのような実施形態は、一般に、アドレナリン受容体の結合ドメインを含むポリペプチドを提供する。様々な実施形態には、好ましくは、上述した細胞外ループ１および／または２の結合ドメインも含まれうる。
【０１５９】
好ましくは、アドレナリン受容体はαアドレナリン受容体である。αアドレナリン受容体を利用する実施形態では、アドレナリン受容体には、受容体領域全体および／またはその受容体領域のＥ１ループ含有断片が含まれうる。いずれの断片またはサンプルにもαアドレナリン受容体の残基７１〜１１５が含まれることが好ましく、より好ましくは、残基８８〜９９が含まれる。
【０１６０】
もう１つの好ましい実施形態では、アドレナリン受容体はβ−２Ａアドレナリン受容体、好ましくはヒトβ−２Ａアドレナリン受容体である。β−２Ａアドレナリン受容体を利用する実施形態では、受容体には受容体領域全体および／またはその受容体領域の断片が含まれうる。いずれの断片またはサンプルにもヒトβ−２Ａアドレナリン受容体の残基７８〜１２２が含まれることが好ましく、より好ましくは、その残基９７〜１０６、または非ヒトβ−２Ａアドレナリン受容体の同種領域が含まれる。
【０１６１】
ポリペプチドをアドレナリン作動性化合物および試験化合物と接触させる。ポリペプチドをアドレナリン作動性化合物および試験化合物と接触させることで化合物の相互作用が生じる。上記の通り、相互作用には、例えば、タンパク質−タンパク質、タンパク質−核酸、タンパク質−小分子、小分子−核酸、タンパク質−大分子、および大分子−自然の核酸などの分子間の検出可能な相互作用が含まれる。
【０１６２】
結合親和性の測定
続いて、アドレナリン作動性化合物の結合親和性を、試験化合物の存在下で測定する。アドレナリン作動性化合物の結合の減少は、試験化合物がアドレナリン作動性化合物のその受容体との結合を阻害するということを示し、結合の増加は、試験化合物がアドレナリン作動性化合物のアドレナリン受容体との結合を促進または増強するということを示す。記載のとおり、アスコルビン酸塩のアドレナリン受容体との結合は、第１の細胞外ループおよびその隣接した膜貫通領域に由来するペプチドに対して特異的に起こる。そのような結合は、薬物候補を、アドレナリン受容体のアスコルビン酸塩結合領域を活性化（増強）するか、または不活性化（遮断）するそれらの可能性についてスクリーニングする手段を提供する。
【０１６３】
スクリーニングは、アドレナリン受容体自体に関して；細胞外ループの構築物（必要に応じて、隣接した膜貫通領域を含む）；そのループに由来するアスコルビン酸塩結合ペプチド；またはアスコルビン酸塩結合を保存もしくは増強するこれらの任意のものの誘導体もしくは修飾されたものに関して行うことができる。そのようなスクリーニングは、当技術分野で公知のいずれの技術によっても行うことができ、それらの技術としては、限定されるものではないが：任意の形態のアフィニティー精製、アフィニティー捕捉、または結合技術（カラム、ピン、ゲル、ビオチン化など）；任意の束一性（浸透圧、蒸気圧、電解質伝導度など）の測定、任意の分離技術（ペーパー、ゲル、およびキャピラリー電気泳動；ペーパー、ゲル、シリカ、または高圧液体クロマトグラフィー；タンデム質量分析など）；任意の分光技術（紫外、赤外、可視光、円偏光二色性、核磁気共鳴、光散乱などを含む）；任意の免疫学的技術（例えば、アスコルビン酸塩−結合ペプチド、アドレナリン受容体領域への抗体結合の干渉など）が挙げられる。結合親和性を測定する好適な方法は、２００１年６月５日に発行されたFreire, et al.の米国特許第６，２４２，１９０号；２０００年９月１２日に発行されたNeri, et al.の米国特許第６，１１７，９７６号；および１９９４年６月２８日に発行されたFodor et al.の米国特許第５，３２４，６３３号で参照される。
【０１６４】
さらに、本明細書におけるアスコルビン酸塩結合ペプチドに対して結合特異性を示す本発明の抗体または抗体フラグメント、または別の同様に特異的な結合分子、例えば、そのような特異的結合を示すアプタマーを用いて、ＧＰＣＲに関連しなくとも、さらなる、少なくとも可能性のあるアスコルビン酸塩結合ペプチドを同定することができる。従って、本発明に従ってさらなる、少なくとも可能性のあるアスコルビン酸塩結合ペプチドを同定する方法は、抗アスコルビン酸塩結合ペプチド抗体、抗体フラグメント、またはアプタマーを少なくとも１つの試験ポリペプチドと、それらの間に特異的結合が起こり、それにより結合対が形成されうる条件下で接触させること、それにより形成された結合対の存在を検出すること、および試験ポリペプチドがまだ同定されていない場合には、その試験ポリペプチドを同定するためにその試験ポリペプチドをさらに特徴付けることを含む。
【０１６５】
本発明の様々な方法には、アミン作動性化合物の生体アミン受容体との結合を阻害するか、または増強する化合物を作製するための方法が含まれる。アミン作動性化合物の生体アミンＧＰＣＲとの結合を調整する化合物を上記の手段または他の好適な手段のいずれかにより同定した後、その同定された化合物を、投与のために製造するか、または各々のＧＰＣＲに対するリガンドと安定に結合させて、連結化合物を提供し、この連結化合物を投与のために製造する。化合物の製造には、研究および予備目的での一般的研究室合成または大量または限られた量のいずれかでの商業生産が含まれうる。
【０１６６】
他の新規薬物も、Computer Aided Drug Design（CADD）またはComputer Assisted Molecular Modeling（ＣＡＭＭ）プログラムなどのコンピューターソフトウェアを用いてde novo設計することができる。好適なプログラムとしては、Accelrys製のＣｅｒｉｕｓ２、Cambridge Soft製のＣｈｅｍ３Ｄ  Ｐｒｏ、Schroedinger, Inc.製のMacroModel、Tripos製のＳｙｂｙｌ、またはAccelrys製のＴＳＡＲが挙げられる。
【０１６７】
医薬組成物
本発明は、その中に含まれる連結化合物のヒトまたは他の動物被験体への投与のための特定の新規組成物および方法の設計を包含する。従って、本発明に用いる特定の化合物および組成物は、薬学上許容されるものでなければならない。
【０１６８】
本発明の方法は、好ましくは、連結化合物の被験体への投与を含む。そのような方法は、リガンド（アゴニストまたはアンタゴニストもしくは類似体）の作用の程度または持続時間を増大し、例えば、低下したモル投与量レベルを用いてもなお、治療下の疾患または状態への等価な有益な作用を提供する治療を提供しうる。
【０１６９】
本発明の組成物は、好ましくは単位投与形で提供される。本明細書において、「単位投与形」とは、適正な医療に従うヒトまたは下等動物被験体への単回投与での投与に適した連結化合物の量を含む本発明の組成物である。
【０１７０】
アドレナリン作動性化合物の用量：
本発明の方法に有用な組成物は、安全で効果的な量のアドレナリン作動性化合物と、安全で効果的な量の、前記アドレナリン作動性化合物に対する補体である化合物を含む。好ましい補体はアスコルビン酸塩であり、アスコルビン酸が非常に好ましい。１つの実施形態では、本発明の好ましい組成物は準有効量(subefficacious amount)のアドレナリン作動性化合物を含む。所与のアドレナリン作動性化合物の「準有効量」とは、本発明の組成物または方法によりヒトまたは他の動物被験体に投与する場合には安全で効果的であるが、前記アドレナリン作動性化合物の補体を伴わずに投与したならば、臨床的に無意味な作用しかないと思われる量である。アドレナリン作動性化合物の「安全で効果的な」量とは、本発明のように用いるときに妥当なリスク／便益比に相応する、過度の副作用（毒性、刺激作用、またはアレルギー反応など）がなく、ヒトまたは下等動物被験体において所望の治療効果をもたらすのに十分な量である。アドレナリン作動性化合物の具体的な、安全で効果的な量は、治療下の特定の状態、患者の健康状態、（もし行うのであれば）併用療法の性質、用いる具体的なアドレナリン作動性化合物、投与の具体的な経路および投与形、用いる担体、ならびに所望の投与計画のような要因によって変化しうる。
【０１７１】
投与形および選択材料：
本発明の連結化合物は、（例えば）経口、直腸、局所または非経口投与に適した様々な形態のいずれであってよい。所望の投与経路に応じて、当技術分野で周知の様々な薬学上許容される担体を用いることができる。これらの担体としては、固体または液体増量剤、希釈剤、屈水性誘発物質、表面活性剤、およびカプセル封入物質が挙げられる。アドレナリン作動性化合物の活性を実質的に阻害しない選択の医薬活性物質を含めることができる。アドレナリン作動性化合物および補体化合物と併せて用いる担体の量は、単位用量当たりの投与に、物質の実用的な量を提供するのに十分なものである。本発明の方法に有用な投与形を作製するための技術および組成物は以下の参照文献に記載されており、総ては引用することにより本明細書の一部とされる：7 Modern Pharmaceutics, Chapters 9 and 10 (Banker & Rhodes, editors, 1979)； Lieberman et al., Pharmaceutical Dosage Forms: Tablets (1981)；およびAnsel, Introduction to Pharmaceutical Dosage Forms 2d Edition (1976)；ならびに１９９７年７月８日に発行されたWhite et al.の米国特許第５，６４６，１３９号。
【０１７２】
特に、全身投与のための薬学上許容される担体としては、糖、デンプン、セルロースおよびその誘導体、麦芽、ゼラチン、タルク、硫酸カルシウム、植物油、合成油、ポリオール、アルギン酸、リン酸バッファー、乳化剤、等張食塩水、ならびにパイロジェンフリー水が挙げられる。非経口投与に好ましい担体としては、プロピレングリコール、オレイン酸エチル、ピロリドン、エタノール、およびゴマ油が挙げられる。好ましくは、非経口投与のための組成物における薬学上許容される担体は、組成物総量の少なくとも約９０重量％を構成する。
【０１７３】
様々な経口投与形を用いることができ、それらの経口投与形としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、およびバルク粉末のような固形が挙げられる。錠剤は、好適な結合剤、滑沢剤、希釈剤、崩壊剤、着色剤、香味剤、流動誘起剤、および融解剤を含む、圧縮錠、粉薬錠剤、腸溶錠、糖衣、フィルムコート錠、または多重圧縮錠でありうる。液体経口投与形としては、好適な溶媒、防腐剤、乳化剤、沈殿防止剤、希釈剤、甘味料、融解剤、着色剤、および香味剤を含む、水性液剤、乳剤、懸濁剤、非発泡顆粒剤から再構成された溶液および／または懸濁液、ならびに発泡顆粒剤から再構成された発泡調製物が挙げられる。経口投与に好ましい担体としては、ゼラチン、プロピレングリコール、綿実油、およびゴマ油が挙げられる。
【０１７４】
本発明の組成物は、被験体に局所的に、すなわち、被験体の表皮または上皮組織上にその組成物を直接置くことによりまたは塗布することにより投与することもできる。そのような組成物としては、例えば、ローション剤、クリーム剤、液剤、ゲル剤、および固形剤が挙げられ、それらは、例えば、経皮的にまたは鼻腔内、肺（例えば、気管支内吸入により）、眼、もしくは他の粘膜送達により局所または全身投与することができる。皮膚への局所投与に適した担体は、皮膚上で連続薄膜として同じ場所でにとどまり、発汗または浸水による離脱に耐えることが好ましい。一般に、担体は自然の有機物であり、そこにアドレナリン作動性化合物および補体化合物を分散または溶解することが可能である。担体には、薬学上許容される皮膚軟化剤、乳化剤、増粘剤、および溶媒が含まれうる。
【０１７５】
本発明の特定の実施形態のための医薬担体は、吸入による投与に使用することが可能である。吸入による粘膜投与に適した処方物としては、当技術分野で公知のもののうち吸入装置によって投薬することができる形態のアドレナリン作動性、補体化合物(the adrenargic complement compounds)の組成物が挙げられる。そのような処方物には、好ましくは、噴霧療法および気管支内使用に適した液体または粉末組成物、または定量式エアゾール装置を介して投与されるエアゾール組成物が含まれる。好適な液体組成物は、水性の、薬学上許容される吸入剤用溶媒、例えば、等張食塩水または静菌水中に有効成分を含む。それらの液剤はポンプもしくはスクイズ式霧状化スプレーディスペンサーを用いて、または必要な用量の液体組成物を肺に吸入させるか、または肺への吸入を可能にするためのいずれの他の従来の手段によっても投与される。医薬組成物の送達に用いられる装置としては、限定されるものではないが、ネブライザー、吸引器、吸入器、および鼻腔スプレーが挙げられる。
【０１７６】
ネブライザー（nebulizer）は、エアゾールを形成することまたはバルク液体を呼吸に適したガス中に浮遊する小液滴へと変換することにより機能する。特に、本明細書での使用のためのネブライザーは、本明細書で提供される組成物の液体製剤を霧状化する。ネブライザーは、限定されるものではないが、圧縮空気、超音波、または振動を含む当技術分野で公知のいずれの方法によっても霧状ミストを作り出すことができる。ネブライザーに内部バッフルがさらに備わっていてもよい。内部バッフルは、ネブライザーのハウジングとともに、衝突によりミストから大液滴を選択的に除去し、その液滴をレザバーに戻すことを可能にする。そのように作り出された微細エアゾール液滴は、吸い込む空気／酸素により肺まで同伴される（２００３年１２月２３日に発行されたBanerjee, et al.の米国特許第６，６６７，３４４号；２００２年１月２２日に発行されたElkinsの米国特許第６，３４０，０２３号；１９９６年１２月２４日に発行されたHillardの米国特許第５，５８６，５６１号；１９９４年１０月１８日に発行されたRiggs, et al.の米国特許第５，３５５，８７２号；１９９３年２月１６日に発行されたRiggs, et al.の米国特許第５，１８６，１６６号；および１９８９年９月１２日に発行されたLaanel et al.の米国特許第４，８６５，０２７号参照）。
【０１７７】
典型的な吸入器としては、定量吸入器および乾燥粉末吸入器が挙げられる。定量吸入器、すなわちＭＤＩは、液化噴射剤中に溶解された医薬組成物または液化噴射剤中に浮遊する微粉化粒子などの製品が充填された耐圧キャニスターまたは容器である。医薬組成物の正確な用量が患者のオロファルニキス(oropharnyx)に送達される。（１９９６年８月１３日に発行されたJewett et al.の米国特許第５，５４４，６４７号）
【０１７８】
乾燥粉末吸入器は、極小容量に圧縮された医薬組成物の乾燥粉末粒子を作り出すための圧搾空気供給源を用いて操作可能なシステムである。吸入のために、そのシステムには複数のチャンバーまたはブリスターが備わっており、その各々には医薬組成物の単回投与量と単回投与量を放出するための選択要素が含まれている（２００３年１１月４日に発行されたAlfonso, et al.の米国特許第６，６４２，２７５号；２００３年９月３０日に発行されたGenova, et al.の米国特許第６，６２６，１７３号；１９９７年１２月９日に発行されたAbrams, et al.の米国特許第５，６９４，９２０号；１９９１年７月２３日に発行されたCocozzaの米国特許第５，０３３，４６３号参照）。
【０１７９】
好適な粉末組成物としては、例として、気管支内投与に許容されるラクトースまたは他の不活性粉末と完全に混合した有効成分の粉末調製物が挙げられる。粉末組成物は、エアゾールディスペンサーを介して投与することができるし、または破壊可能なカプセル（このカプセルは、患者によって、カプセルに穴を開け、粉末を吸入に適した一定した流れに噴出させる装置に挿入されうる）に入れることもできる。
【０１８０】
組成物には噴射剤、界面活性剤、および補助溶媒を含めることができ、好適な定量バルブにより閉鎖される従来のエアゾール容器に充填することができる。鼻腔スプレーも本発明の実施形態に適している。好ましい鼻腔スプレーは、組成物成分の特性に応じて水性溶液もしくは懸濁液、油性溶液もしくは懸濁液、またはエマルジョンなどの液体形態で存在する。選択成分により最小限の刺激、適切なスプレー組成物、および十分な送達を確保する。クエン酸塩、リン酸塩、およびグリシンのようなバッファーにより鼻腔スプレーのｐＨを調整して、鼻への刺激を防ぐ。プロピレングリコールおよびグリセリンなどの保湿剤も鼻腔スプレーにおいて有用である。他の選択成分、例えば、ポリホスホエステル、ポリエチレングリコール、高分子量ポリ乳酸、ミクロスフェア被包、例えば、ポリビニルピロリドン、ヒドロイプロピルセルロース(hydroypropyl cellulose)、キトサン、およびスルホン酸ポリスチレンは、組成物の保持時間を向上させる。鼻腔スプレーは、定量のアドレナリン作動性、補体(the adrenargic complement)を供給する非加圧ディスペンサーにより送達される。
【実施例】
【０１８１】
実施例１：  直接的に結合された連結化合物：アドレナリン作動性リガンドのアスコルビン酸塩との結合
Ｅ１−ＴＭ３結合部位およびＧＰＣＲリガンド結合部位と同時に結合することができるものを同定するために、連結化合物を合成し、スクリーニングする。これらの実施例では、それがリガンドのアドレナリン作動性アゴニスト活性およびアスコルビン酸塩の調整（増強）活性の両方を保持することが望ましい。
【０１８２】
公知のアドレナリン作動性アゴニストの薬理学によれば、エピネフリンの場合、そのアミノ基を除く総ての部位は未反応のままであるはずである。例えば、引用することにより本明細書の一部とされるA. G. Gilman et al. （eds.）, Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 8th ed. （1990） （Pergamon Press）（以後「Goodman and Gilman」と記載）, 表 10-1, 11-1, 11-2, および 21-2、ならびにそのｐ．４８９の図および本文参照。（さらに、必要に応じて、エピネフリンのさらなる反応部位、例えば、３つのヒドロキシルのうちのいずれかをアッセイして、エピネフリン部分がそのアゴニスト活性を保持する程度を測定することができる。）
【０１８３】
同様に、公知のアドレナリン作動性アンタゴニストの薬理学（例えば、Goodman and Gilman, 1990, Table 11-1 and 11-2参照）によれば、Ｅ１−ＴＭ３結合／遮断部分を、本質的にそれらのいずれかと、例えば、アミノ基を通じて結合させることができる。βアンタゴニストは、例えば、総てが、直接的に、またはリンカーを介してＥ１−ＴＭ３結合／遮断部分と結合するための反応部位として機能しうる遊離アミノ基を有する（Goodman and Gilman, 1990, Table 11-2）。リガンド活性を増強するＥ１−ＴＭ３モジュレーターの場合、例えば、アドレナリン受容体に対してより高い親和性を示す連結化合物を作出するためにこれは行われうる。
【０１８４】
「共有結合性化合物＃１」と呼ばれる化合物の調製のための手順は以下のとおりである：ノルエピネフリン（０．１７ｇ）を、約０．０５Ｍ炭酸水素ナトリウムを含有する水とメタノール２：１比のもの１０ｍＬ中のアスコルビン酸（０．１８ｇ）と反応させる。この混合物を４０℃で１６時間加熱し、その後、濃縮乾固する。この反応は以下のスキームに従って進行する。
【化１】
2008537961.tif 000004
【０１８５】
反応後、その生成物を、水で平衡化しておいたＣ−１８逆相カラムにかけ、水４Ｘ１０ｍＬ、水およびメタノールの４：１混合物４Ｘ１０ｍＬ、そして水およびメタノールの２：１混合物４Ｘ１０ｍＬを用いて溶出を行う。様々な画分を濃縮し、それらの内容物をＮＭＲ分光法により評価した。この生成物は独特の青紫色を呈し、純水画分により溶出した。共有結合性化合物＃２〜＃５は同様の方法で調製される。
【０１８６】
実施例２：  連結された連結化合物：アドレナリン作動性リガンドのアスコルビン酸塩との連結
ノルエピネフリンと連結されたアスコルビン酸塩の連結化合物を合成し、（「４ユニットテザー」の場合）「４ＵＴ」と名づける。４ＵＴ化合物の調製のための手順は以下のとおりである。アスコルビン酸（０．１８ｇ）を、２モル当量の炭酸水素ナトリウムを含有するメタノール：水  ２：１比のもの１０ｍＬ中、オリゴマーエチレングリコールジトシレート、本明細書では、テトラ−エチレングリコールジトシレート（０．５ｇ）とともに室温で１２時間攪拌する。その後、得られたアスコルビン酸塩−リンカー化合物とノルエピネフリン（０．１８ｇ）を、それらを一緒に、さらに１２時間攪拌しながら混合することにより反応させる。この反応は以下のスキームに従って進行する。
【化２】
2008537961.tif 000005
【０１８７】
この反応スキームでは、ｎは好ましくは２〜３、より好ましくは２であり、従って、エチレングリコール四量体がもたらされる。示されるとおり、第１のトシル酸塩基はアスコルビン酸塩に置換され、そのβ−エノールはそれによりアルキル化されて、エーテルリンケート(an ether linkate)を形成する。その後、第２のトシル酸塩はアミンリガンドのアミノ基、本明細書ではノルアドレナリンのアミノ基で置換されうる。この生成物は以下のとおり単離される。
【０１８８】
反応混合物をミックスベッドイオン交換樹脂に通し、次いで、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２カラム（Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USAのポリ（アクリルアミド−コ−Ｎ，Ｎ′−メチレン−ビス−アクリルアミド）ビーズゲルクロマトグラフィーカラム）に通す。画分のＵＶ評価を基にして第１の溶出画分を回収する。さらなる精製を、水で平衡化しておいたカラムを用いたＣ−１８逆相クロマトグラフィーにより行う。それを水４Ｘ１０ｍＬ、水およびメタノールの４：１混合物４Ｘ１０ｍＬ、そして水およびメタノールの２：１混合物４Ｘ１０ｍＬを用いて溶出する。様々な画分を濃縮し、それらの内容物をＮＭＲ分光法により評価する。逆相カラムを通過しなかった物質について生物学的試験を行う。
【０１８９】
共有結合性化合物＃２、＃３、および＃４それぞれを作製するため、同様の反応条件セットの下で、モノ−エチレングリコールジトシレート、ジ−エチレングリコールジトシレート、およびトリ−エチレングリコールジトシレートを別々に用いて、ノルエピネフリンをアスコルビン酸塩と連結した。ＣＣ＃３およびＣＣ＃４の構造は、上記反応スキームで示される４ＵＴ生成物の図形（ｎ＝０またはｎ＝１それぞれの場合）で表される。
【０１９０】
実施例３：  化合物＃１および４ＵＴの構造の特徴付け
共有結合性化合物＃１および４ＵＴの構造を特徴付け、それらが以下の立体配置を有することが判明した。
【０１９１】
４ＵＴ：
【化３】
2008537961.tif 000006
琥珀色の化合物
【０１９２】
ＣＣ＃１：
【化４】
2008537961.tif 000007
紫／青色の化合物
【０１９３】
実施例４：  共有結合性化合物および４ＵＴの活性の特徴付け
ウサギ大動脈平滑筋調製物において共有結合性化合物＃１〜＃５および連結された化合物４ＵＴをアドレナリン作動性活性について、具体的に言えば、ウサギ大動脈輪の収縮を誘発するそれらの能力をアッセイすることにより、および誘発された収縮を増強するアスコルビン酸塩の能力をアッセイすることにより試験する。非常に優れた候補は、ノルエピネフリン様活性を保持し、かつ追加のアスコルビン酸塩に対して弱い増強でしか応答しないものであると考えられる。これらの判定基準によれば、その化合物はアドレナリン受容体と結合し、活性化する；かつその受容体のＥ１−ＴＭ３アスコルビン酸塩結合部位は、追加のアスコルビン酸塩の作用が最小限であるように連結化合物によって占有される。
【０１９４】
平滑筋収縮試験プロトコールは以下のとおりである。材料−溶液類。生理食塩水（ＰＳＳ）は以下を含む：ＮａＣｌ（１１６ｍＭ）；ＫＣｌ（５．４ｍＭ）；ＮａＨＣＯ３（１９ｍＭ）；ＮａＨ２ＰＯ４（１．１ｍＭ）；ＣａＣｌ２（２．５ｍＭ）；ＭｇＳＯ４（１．２ｍＭ）；およびグルコース（５．６ｍＭ）。ＰＳＳに９５％Ｏ２プラス５％ＣＯ２をエアレーションして、ｐＨ７．４を維持し、３７℃に加温した後、組織用バスに入れる。総ての試験において抵抗１７ＭΩ（メガオーム）の蒸留および濾過した水を用いる。等浸透圧性の高Ｋ＋−ＰＳＳは、ＮａＣｌ濃度を４６ｍＭに低下させ、ＫＣｌ濃度を７５．４ｍＭに高めることにより調製する。エピネフリンはSigma Chem. Corp. （St. Louis, MO, USA）より入手する。アスコルビン酸塩はAldrich Chem Co. （Milwaukee, WI, USA）より入手する。連結化合物のアスコルビン酸塩部分およびエピネフリン部分の分子量、ならびに連結化合物のテザー長の推定値に基づき、総ての化合物に対して推定分子量４５０ｇ／モルを用いる。＃１−５では、ｍｇ単位で質量を用いて、３ｍＭ保存溶液を調製する。４ＵＴでは、得られる質量５ｍｇと推算し、３ｍＭ保存溶液を調製する。アスコルビン酸塩、各連結化合物、およびエピネフリンの溶液は、各試験において各投与（各収縮誘導）の１０分前に、濃縮し、冷却された保存溶液をＰＳＳで連続希釈して、３７℃に加温するように、試験当日に新たに調製する(prepared fresh)。使えるように収縮刺激剤を調製するために、混合し、予め温めたチャンバーに加えるまで、総ての成分を別々に保存し、冷却する。
【０１９５】
材料−組織。使用する総てのウサギは、試験に使用するまで大学認可施設で飼育され、試験を通じて研究における動物の使用に関する承認された、合法的、愛護的な大学ポリシーおよび方法に従う。雌雄両性の成体New Zealand Whiteウサギを、筋肉内投与される５５ｍｇ／ｋｇケタミンによりリラックスさせる。１５分後、それらのウサギに、腹膜内投与される５０ｍｇ／ｋｇ  NEMBUTAL （Abbott Labs Corp., Abbott Park, IL, USAのペントバルビタール）により麻酔をかける。それらのウサギが足指ピンチに反応しないときに、腹部を切開し、腹部大動脈を露出する。大動脈を大静脈から掻き裂き、吻端および尾方端の両方にクランプをかける。外科用はさみを用いて大動脈を摘出し、４℃の生理食塩水中に入れる。大動脈クランプを外して、安楽死させる。大動脈の過剰の結合組織を創傷清拭し、残留する血液を流し、新しいＰＳＳに入れる。片刃かみそりを用いて３ｍｍの大動脈輪を切断し、大動脈輪を新しいＰＳＳに入れる。はさみによる切断端は用いない。
【０１９６】
フラットで真直ぐな中央部分を有する１対のステンレス鋼ループを各大動脈輪の内腔に通す。上方および下方ループをステンレス鋼スクリューでプレキシガラス−ステンレス鋼クランプに固定する。その下方クランプは、長さを調整するためにマイクロメーター(Newport Corp., Irvine, CA, USA)に取り付ける。その上方クランプは、金鎖を有する５０ｇ力変換器（Kulite Semiconductor Prods., Inc., Leonia, NJ, USA）と接続する。その力変換器は８チャンネル信号コンディショナーおよびレコーダー(Gould Instrument Systems, Valley View, OH, USA)と連動させる。大動脈輪を、通気式でジャケット付きの２０または２５ｍＬの組織用バス(Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)中に浸漬し、Ｈａａｋｅサーキュレーター(Thermo Electron Corp., Wobum, MA, USA)を用いて３７℃で維持する。固定後、活性化前に２時間、各大動脈輪を５ｇまで引き伸ばし、応力緩和させる。応力緩和が０ｇに達したら、大動脈輪を再び２ｇまで引き伸ばし、静止張力が安定するまで応力緩和させる。引き伸ばされた大動脈輪の直線的な長さは３〜４ｍｍである。この手順により大動脈輪をＬ０（力の発生に最適なそれらの長さ）付近にする。
【０１９７】
組織用バス中のＰＳＳを予め温めた刺激剤含有ＰＳＳに取り替えることにより個々に収縮を発生させる。各大動脈輪では初期Ｋ＋収縮がアドレナリン作動性収縮の前に起こる。各収縮は、予め温めたＰＳＳを用いて、収縮液を洗い流している間、少なくとも１０分続く。基準力への緩和には、一般に１０分かかる。この試験の最後に、大動脈輪をバスから取り出し、ふき取り、０．１ｍｇ単位までのＭｅｔｔｌｅｒ  ｂａｌａｎｃｅ(Mettler-Toledo, Inc., Columbus, OH, USA)で重量を測定する。これらの試験における８つの大動脈輪では、平均湿重量（単位ｍｇ）（±ＳＤ）は７．４±０．８ｍｇである。用量反応曲線において比較率によって生じうる誤差を最小限に抑えるために、収縮も大動脈輪の重量に対して標準化する（ｇ  力／ｍｇ  組織）。
【０１９８】
統計学。スチューデントの両側ｔ検定を用いることにより異なるサンプル間の比較をする。ｐ値＜０．０５で有意差を示すと考える。力／ｍｇ  組織±１５０μＭアスコルビン酸塩の結果を表３（ピーク時の力について）および表４（１０分時点での力について）に示す。４ＵＴおよびエピネフリンの持続収縮についてのチャート記録を図４に示す。４ＵＴ、エピネフリン、および＃４の低収縮力についてのチャート記録を図５に示す。
【０１９９】
【表３】
2008537961.tif 000008
【０２００】
【表４】
2008537961.tif 000009
【０２０１】
これらのデータは、これらの化合物の最も活性なものはノルエピネフリン単独よりも約１００倍活性が低いが、プソイドエフェドリンおよびアルブテロール（サルブタモール）のような、医薬として現在用いられている他のアドレナリン作動薬よりは活性が高いことを示している。このデータは、一部の連結化合物が、アスコルビン酸を添加することによりなお有意に高められ得ることも示し、これらの化合物がアドレナリン受容体を、その受容体のアスコルビン酸塩結合部位と強く結合することなく活性化することも示唆している。
【０２０２】
これらの化合物のうちの２つ、「共有結合性化合物＃１」および「４ＵＴ」は、追加のアスコルビン酸塩の存在下においてあまり高まりを示さず、それらがアドレナリン作動性の結合部位を十分に活性化するだけでなく、その上Ｅ１−ＴＭ３  アスコルビン酸塩部位と強固に結合することを示唆する。さらなる観察により、「４ＵＴ」化合物が増強されたアドレナリン作動薬としての使用基準を満たすことを確認する。ノルエピネフリンおよび他のアドレナリン作動性化合物にある、Ｅ１−ＴＭ３結合部分モジュレーター（アスコルビン酸塩など）を増強する作用の１つは、平滑筋におけるそれらの作用の持続時間を延長することである。表３に示されるように、「４ＵＴ」によって生じた１０分時点での力は、他のいずれの試験化合物による場合よりもそのピーク時の力に著しく近いままであり、「４ＵＴ」の１０分時点での力は、アスコルビン酸塩をノルエピネフリンと別々に添加する場合にもたらされる延長された持続時間に匹敵する。従って、「４ＵＴ」はアドレナリン作動性結合部位およびＥ１−ＴＭ３  アスコルビン酸塩結合部位の両方を活性化して、別々の化合物としてのアスコルビン酸塩とノルエピネフリンの混合物によって生じる、同様の持続時間の延長をもたらす。
【０２０３】
３μＭ  ４ＵＴ（上部波形）または３０ｎＭエピネフリン（Ｅｐｉ；下部波形）により誘発された持続収縮のチャート記録を図４に示す。１μＭ  ４ＵＴ（上部波形）、１０ｎＭエピネフリン（Ｅｐｉ；中間の波形）、または１００ｎＭ共有結合性化合物＃４（下部波形）により、１５０μＭアスコルビン酸塩（Ａｓｃ）不在下（左側のピーク）および存在下（右側のピーク）で誘発された低収縮力のチャート記録を図５に示す。
【０２０４】
図４は、同様の力をもたらす収縮において、Ｅｐｉは、エピネフリン（Ｅｐｉ）用量反応曲線の中間点より上で収縮を維持することはできないことを示している。４ＵＴを受けた収縮は、Ｅｐｉ収縮のように減衰せず持続性である。４ＵＴ収縮は、Ｅｐｉと１５０μＭアスコルビン酸塩の場合の収縮と同様である（図５参照）。共有結合しているアスコルビン酸塩部分を有する化合物４ＵＴは、アスコルビン酸塩をＥｐｉと別々に投与した場合に起こるように、エピネフリンにより誘発される収縮の減衰に対して抵抗を示す。
【０２０５】
図５では、アスコルビン酸塩を用いない３つの処置総てにおいて示された同様の初期力は、アスコルビン酸塩によって著しい収縮増強がもたらされうるエピネフリン用量反応曲線の下端にある。Ｅｐｉおよび共有結合性化合物＃４のいずれにおいても１５０μＭアスコルビン酸塩によって収縮を大きく増大されることが示されるが、４ＵＴは、同時投与されるアスコルビン酸塩によって程度が著しく低い増強を示す。これは、既に影響を及ぼしている４ＵＴのアスコルビン酸塩による増強、またはアスコルビン酸塩のＧＰＣＲ  Ｅ１−ＴＭ２結合部位への到達の４ＵＴによる阻害（場合によっては、アスコルビン酸塩によってもたらされる増強の阻害が望ましく、別の場合では、連結化合物によるそのような増強（すなわち、自己増強）が望ましいため、それらの作用はいずれも異なる所望の処置計画に有用である）のいずれかに一致する。
【０２０６】
総合すれば、図４および５から、連結化合物、４ＵＴが、エピネフリンのリガンド作用とアスコルビン酸塩のＧＰＣＲ増強作用の両方を示すということが示され、それによりＧＰＣＲリガンドとＥ１−ＴＭ３結合部位の両方が占有され、そのアスコルビン酸塩部分が後者部位と結合し、エピネフリン収縮への増強作用を及ぼすことが示される。これらのデータから、連結化合物の合成およびスクリーニングのための上記の手順により薬物使用に望ましい性質を有する活性化合物が得られうるということが証明される。結果として、本発明に従って調製される、生体アミンＧＰＣＲリガンドがＥ１−ＴＭ３結合部分と結合している連結化合物は、リガンド結合クレフトに隣接するアスコルビン酸結合部位を含む受容体構造の共通したパターンを共有し、総てのものがそれらのリガンドへのアスコルビン酸添加により増強されることから、これらはアドレナリン、ドーパミン、ヒスタミン、および他の生体アミンＧＰＣＲのアゴニストまたはアンタゴニストである改良された医薬品を開発するための新規ルートを提供する。従って、対処するためにそのような連結薬物の設計が見込まれる治療適応症の範囲には、例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患、心不全、ショック、卒中、高血圧症、低血圧症、クローン病(Crone's disease)、パーキンソン病、鼻閉（充血除去薬）、アレルギー、鼻炎、感冒、インフルエンザ症状、胃潰瘍、およびアドレナリン、ヒスタミン、ドーパミン、または他の生体アミンＧＰＣＲアゴニストもしくはアンタゴニストで治療される任意の他の状態が含まれる。
【０２０７】
実施例５：  連結化合物を調製するための第１の方法と第２の方法の比較
本発明の実施形態に従う幅広い種類の連結化合物に適用できる、連結化合物を調製するための第１の方法は、上記に記載した。この方法の概要は以下のとおりである。１〜４ユニットのエチレンオキシドテザーを有するアスコルビン酸塩−アミン作動性連結化合物の調製は、以下のとおり、アスコルビン酸塩およびノルエフィネフリン(norephinephrine)の場合では、テザーを第１にアスコルビン酸塩に付けることにより行われる。アスコルビン酸塩（０．１８ｇ）を、２モル当量の炭酸水素ナトリウムを含有するメタノール：水  ２：１比のもの１０ｍＬ中、適切なユニ−またはポリ−エチレングリコールジトシレート（０．５ｇ）とともに室温で１２時間攪拌する。その後、ノルエピネフリン（０．１８ｇ）を加え、その混合物をさらに１２時間攪拌する。それをミックスベッドイオン交換樹脂に通し、次いで、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ  Ｐ−２カラム(Bio-Rad； Hercules, CA, USA)に通して、画分のＵＶ評価を基にして第１の溶出画分を回収する。さらなる精製を、水で平衡化しておいたカラムを用いたＣ−１８逆相クロマトグラフィーにより行う。それを水４Ｘ１０ｍＬ、水およびメタノールの４：１混合物４Ｘ１０ｍＬ、そして水およびメタノールの２：１混合物４Ｘ１０ｍＬを用いて溶出する。様々な画分を濃縮し、それらの内容物をＮＭＲ分光法により評価する。これらの連結化合物を＃２〜５および４ユニットテザーと呼ぶ（４ＵＴ、以下に示す）。
【０２０８】
【化５】
2008537961.tif 000010
逆相カラムを通過しなかった物質について生物学的試験を行う。
【０２０９】
本発明の実施形態に従う幅広い種類の連結化合物に適用できる、連結化合物を調製するための第２の方法は、以下のとおりである。上記実施例１５で用いた条件を使用する。この方法では、およそ等モル濃度のアスコルビン酸塩とノルエピネフリン（または他のアミン作動性化合物；例えば、各０．５ｇのアスコルビン酸塩およびアミン作動性物質）をともに蒸留水に溶かす。次いで、ポリ−エチレングリコールジトシレート（例えば、０．５ｇの１〜４−エチレン−オキシド−ユニット  ＰＥＧ）を加え、その反応を１２時間進行させる。精製を、カラム、逆相クロマトグラフィー、および当技術分野で公知の他の適当な方法を用いることにより行う。この適当な生成物を質量分析および／またはＮＭＲ技術を用いて同定する。
【０２１０】
実施例６：  連結化合物を調製するための代替方法
本発明の実施形態に従う幅広い種類の連結化合物に適用できる、連結化合物を調製するための代替方法は、以下のとおりであり、各末端に異なる反応基を有するリンカー（テザー）を使用することを必要とする。例はスクシンイミジル−３−（ブロモアセトアミンド）プロピオネート(succinimidyl-3-（bromoacetamindo）propionate)、Ｎ−（マレイミドウンデカン酸）ヒドラジド、およびエチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）である。これらのリンカーは、アミン作動性化合物により示されうるようなアミノ基に特異的な１つの官能性と、アスコルビン酸塩、ＴＨＩ化合物、または類似体により示されうるような硫黄基またはヒドロキシル基に特異的な別の官能性を有する。アミン作動性物質（ノルエピネフリン、ヒスタミン、または他のアミン作動性薬物）を適当な条件および試薬を用いてリンカーと反応させる。この生成物をこの時点で精製してもよいし、またはこの混合物を、そのリンカーに適当な条件および試薬を用いてアスコルビン酸塩（または他のエンハンサー）をそのリンカーのもう一方の末端に付加することを含む次の工程に用いてもよい。これらの反応は順序を逆にして行うこともできる（第１にエンハンサー、その後にアミン）。この生成物を適当なカラムおよび逆相クロマトグラフィーを用いることにより精製し、この適当な物質を質量分析および／またはＮＭＲにより同定する。
【０２１１】
実施例７：  連結化合物４ＵＴのＧＰＣＲ  Ｅ１との結合の特徴付け
４ＵＴ連結化合物のヒトβアドレナリン受容体Ｅ１ペプチド  アスコルビン酸塩結合部位との結合を以下のとおりアッセイする。ｐＨ７．４  リン酸バッファー中の、上記に記載した連結化合物、４ＵＴの１０−４Ｍ保存溶液をｐＨ７．４  リン酸バッファー中１０−５Ｍまで希釈し、０．１ｍＬを様々な濃度のヒトβアドレナリン受容体ペプチド溶液に加える。２．６ｍｇのβアドレナリン受容体ペプチド８９−９９（ＭＷ約１３００）を２．０ｍＬリン酸バッファー、ｐＨ７．４に溶かして、１０−３Ｍ保存溶液を得る。次いで、この８９−９９ペプチド保存溶液を用いて、３分の１で連続希釈物を作る。０．１ｍＬの様々な希釈物を、クリスタル９６ウェルプレートにおいて０．１ｍＬの４ＵＴ溶液（１０−５Ｍ）と、または０．１ｍＬのリン酸バッファーと混合し、４ＵＴ溶液の入った一連の３つのウェルも対照として０．１ｍＬバッファーと混合する。それぞれの組合せは３連で作る。混合物作製後３０分かけて、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓ分光器およびＳｏｆｔＭａｘ  Ｐｒｏソフトウェア（いずれもMolecular Device Corp.製; Sunnyvale, CA, USA）を用いて、総ての組合せに対して紫外スペクトルを集め、１ｎｍ増分で１９０〜３００ｎｍに制御する。それらのデータを解析し、ＳｉｇｍａＰｌｏｔソフトウェア（SYSTAT Software Inc.製； Point Richmond, CA, USA）を用いてプロットする。結果を図１６に示す。
【０２１２】
得られたデータは、４ＵＴがβアドレナリン受容体ペプチド８９−９９と結合定数約６ｘ１０−５Ｍで結合することを示しており、これはアスコルビン酸塩のこのペプチドとの結合に関する結合定数に極めて近い。他のデータ（示さず）と併せて、このことは、４ＵＴがβアドレナリン受容体を活性化すること、およびその作用がさらなるアスコルビン酸塩の添加により増強されないことも示している。従って、これらの結合データは４ＵＴがβアドレナリン受容体のアスコルビン酸塩結合領域と結合するということのさらなる証明となる。これらのデータから、βアドレナリン受容体とのアスコルビン酸塩様結合についてのスクリーニングの手段としての結合領域のペプチドの使用も実証される。
【図面の簡単な説明】
【０２１３】
【図１】Ｇタンパク質共役型受容体を示す図である。
【図２】ヒトβ−２−アドレナリン受容体の最初の５つの膜貫通領域の二次構造を示す図であり、アスコルビン酸塩分子が接触する可能性のある、表面のアクセス可能なＴＭ２、Ｅ１ループ、およびＴＭ３残基のおおよその範囲を例示している（中央の黒いバー参照）。
【図３】生体アミンＧＰＣＲの三次元構造のモデルを示す図である；３Ａは上部が細胞外環境の側面図を示し、３Ｂは細胞外環境からリガンドクレフトの中を見下ろした図を示している；ＴＭ３−ＴＭ７により形成されている生体アミン結合部位クレフトの底部には３つのダイヤ印が付けられ、これらの５つのＴＭドメインの上部表面には斜線が施されている；Ｅ１ループおよび膜貫通ドメインが記入されている。
【図４】ウサギ大動脈輪平滑筋において３μＭ  ４ＵＴ（上部波形）および３０ｎＭエピネフリン（Ｅｐｉ；下部波形）により誘発された収縮力のチャート記録を示す。
【図５】ウサギ大動脈輪平滑筋において１μＭ  ４ＵＴ（上部波形）、１０ｎＭエピネフリン（Ｅｐｉ；中間の波形）、および１００ｎＭ共有結合性化合物＃４（下部波形）により、１５０μＭアスコルビン酸塩（Ａｓｃ）不在下（左側のピーク）および存在下（右側のピーク）で誘発された収縮力のチャート記録を示す。
【図６】ノルエピネフリンがリンカーを介してアスコルビン酸塩と共有結合している連結化合物「４ＵＴ」によるペプチドへの結合に関する、ヒトβアドレナリン受容体ペプチド８９−８８の、溶液濃度に対する吸光度の変化を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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