(57)【要約】  本発明は、細胞内での負の免疫調節因子の阻害を用いて免疫細胞の免疫能力を増強させるための組成物及び方法を含む。本発明は、負の免疫調節因子の阻害を通して抗原提示が増強されるワクチン及び療法を提供する。本発明はまた、自己腫瘍抗原の提示に依存する腫瘍ワクチン接種方法における自己寛容を破壊するための機序をも提供している。
2008546775.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる、免疫細胞の免疫能力を増強させるための組成物であって、前記インヒビターが前記細胞内の前記負の免疫調節因子に干渉し、前記負の免疫調節因子が分子安定性に関与するタンパク質及びＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、又はその任意の組合せよりなる群から選択される、上記組成物。
【請求項２】
分子安定性に関与するタンパク質がＡ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、ＳＵＭＯ４）及びその任意の変異体よりなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制するか又はＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発する前記転写因子が、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｔｗｉｓｔ−２、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ及びその任意の変異体よりなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランス優性負突然変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチド及び小分子よりなる群から選択される請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記インヒビターがｓｉＲＮＡである請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡが２本鎖オリゴヌクレオチド、１本鎖オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドよりなる群から選択される請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記ｓｉＲＮＡが化学的に合成される請求項５に記載の組成物。
【請求項８】
生理学的に許容可能な担体をさらに含んでなる請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記生理学的に許容可能な担体がリポソームである請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記インヒビターが、発現ベクター内にクローニングされた単離ポリヌクレオチドによりコードされる請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記発現ベクターが、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、細菌ベクター及び哺乳動物ベクターよりなる群から選択される請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記発現ベクターが、宿主細胞のゲノム内への前記単離ポリヌクレオチドの組込みを容易にする組込みシグナル配列をさらに含んでなる請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
エピトープが哺乳動物の体内で免疫応答を惹起する能力を有する、少なくとも１つのエピトープを有する抗原をさらに含んでなる請求項１に記載の組成物。
【請求項１４】
前記抗原が発現ベクターにより発現される請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記抗原が単離ポリペプチドである請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記少なくとも１つのエピトープが哺乳動物体内のＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発する請求項１３に記載の組成物。
【請求項１７】
前記少なくとも１つのエピトープが哺乳動物体内のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する請求項１３に記載の組成物。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのエピトープが哺乳動物体内でＢ細胞応答を誘発する請求項１３に記載の組成物。
【請求項１９】
前記抗原が１つの疾患に関連している請求項１３に記載の組成物。
【請求項２０】
前記疾患が、感染性疾患、癌及び自己免疫疾患よりなる群から選択される請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記抗原が感染性疾患に関連している請求項１３に記載の組成物。
【請求項２２】
前記感染性疾患がウイルス、細菌、真菌及び原生動物よりなる群から選択された病原性微生物によってひき起こされる請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
前記抗原がウイルス遺伝子によりコードされる請求項１３に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ウイルス遺伝子が、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、乳頭腫ウイルス及びヘルペスウイルスよりなる群から選択されたウイルスから誘導される請求項２３に記載の組成物。
【請求項２５】
前記抗原が、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子及びＢ型肝炎ウイルスコア抗原遺伝子よりなる群から選択されたウイルス遺伝子によりコードされる請求項２３に記載の組成物。
【請求項２６】
前記抗原が、ヒト免疫不全ウイルスＥｎｖ  ｇｐ１６０遺伝子、Ｇａｇ遺伝子、Ｐｏｌ遺伝子、Ｒｅｖ遺伝子、Ｔａｔ遺伝子、Ｖｉｆ遺伝子及びＮｅｆ遺伝子よりなる群から選択されたウイルス遺伝子によりコードされる請求項２３に記載の組成物。
【請求項２７】
前記抗原が、乳頭腫ウイルスＥ７遺伝子及び乳頭腫ウイルスＥ６よりなる群から選択されたウイルス遺伝子によりコードされる請求項２３に記載の組成物。
【請求項２８】
前記抗原が、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス７型及びヒトヘルペスウイルス８型よりなる群から選択されたヘルペスウイルスから誘導されたウイルス遺伝子によりコードされる請求項２３に記載の組成物。
【請求項２９】
前記抗原が癌に関連している請求項１３に記載の組成物。
【請求項３０】
前記癌が、乳癌、子宮頸癌、黒色腫、腎臓癌及び前立腺癌よりなる群から選択される請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
前記抗原が、過剰発現された腫瘍関連抗原、睾丸腫瘍抗原、突然変異腫瘍関連抗原、分化腫瘍関連抗原チロシナーゼ、ＭＡＲＴ、ｔｒｐ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ１００、ＨＥＲ−２、Ｒａｓ及びＰＳＡよりなる群から選択された腫瘍関連抗原である請求項２９に記載の組成物。
【請求項３２】
前記腫瘍関連抗原がＢＣＲ−ＡＢＬ、ＣＡＳＰ、ＣＤＫ、Ｒａｓ、ｐ５３、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＭＵＣ、ＴＷ１、ＰＡＰ、スルビビン、テロメラーゼ、ＥＧＦＲ、Ｐ
ＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ、ＴＲＰ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ／ＮＹ−ＥＳＯ、ＲＡＧＥ、ＳＳＸ−２、ＣＤ１９及びＣＤ２０よりなる群から選択される請求項３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記疾患が、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬及びクローン病よりなる群から選択される請求項１３に記載の組成物。
【請求項３４】
サイトカインをさらに含んでなる請求項１３に記載の組成物。
【請求項３５】
前記サイトカインが、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−７、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＩＬ−２３よりなる群から選択される請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
さらにＴｏｌｌ様レセプタ（ＴＬＲ）アゴニストである請求項１３に記載の組成物。
【請求項３７】
さらに前記インヒビターが抗原レセプタシグナリングの阻害を抑制する請求項１に記載の組成物。
【請求項３８】
細胞の免疫能力を増強させるための組成物であって、前記細胞内の負の免疫調節因子に干渉するインヒビターをコードし、前記負の調節因子が分子安定性に関与するタンパク質及びＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、又は任意の組合せよりなる群から選択される第１のポリヌクレオチドと、少なくとも１つのエピトープをもつ抗原をコードし前記少なくとも１つのエピトープが哺乳動物体内で免疫応答を誘発する第２のポリヌクレオチドとを含んでなるベクターを含んでなる組成物。
【請求項３９】
分子安定性に関与する前記タンパク質がＡ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、ＳＵＭＯ４）及びその任意の変異体よりなる群から選択される請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制するか又はＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発しＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する前記転写因子が、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｔｗｉｓｔ−２、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ及びその任意の変異体よりなる群から選択される請求項３８に記載の組成物。
【請求項４１】
前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランス優性負突然変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチド及び小分子よりなる群から選択される請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記ベクターが、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、細菌ベクター及び哺乳動物ベクターよりなる群から選択される請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
細胞の免疫能力を増強させるための組成物であって、前記細胞内の負の免疫調節因子に干渉するインヒビターをコードし、前記負の調節因子が分子安定性に関与するタンパク質及びＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、又はその任意の組合せよりなる群から選択される第１のポリヌクレオチドと、少なくとも１つのサイトカイン又はＴｏｌｌ様レセプタ（ＴＬＲ）アゴニストをコードする第２のポリヌクレオチドとを含んでなるベクターを含んでなる組成物。
【請求項４４】
分子安定性に関与する前記タンパク質がＡ２０及びＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２
、ＳＵＭＯ３、ＳＵＭＯ４）よりなる群から選択される請求項４３に記載の組成物。
【請求項４５】
ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制するか又はＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発しＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する前記転写因子が、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｔｗｉｓｔ−２、Ｆｏｘｊ１及びＦｏｘｏ３ａよりなる群から選択される請求項４３に記載の組成物。
【請求項４６】
前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランス優性負突然変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチド及び小分子よりなる群から選択される請求項４３に記載の組成物。
【請求項４７】
サイトカインをコードする前記第２のポリヌクレオチドが、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−７、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＩＬ−２３よりなる群から選択される請求項４３に記載の組成物。
【請求項４８】
負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる細胞であって、前記負の免疫調節因子が分子安定性に関与するタンパク質及びＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、又は任意の組合せよりなる群から選択される細胞。
【請求項４９】
分子安定性に関与する前記タンパク質がＡ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、ＳＵＭＯ４）及びその任意の変異体よりなる群から選択される請求項４８に記載の細胞。
【請求項５０】
ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制するか又はＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発しＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する前記転写因子が、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｔｗｉｓｔ−２、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ及びその任意の変異体よりなる群から選択される請求項４８に記載の細胞。
【請求項５１】
前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランス優性負突然変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチド及び小分子よりなる群から選択される請求項４８に記載の細胞。
【請求項５２】
前記細胞がＡＰＣ、樹状細胞、単球／マクロファージ、Ｔ細胞及びＢ細胞よりなる群から選択された免疫細胞である請求項４８に記載の細胞。
【請求項５３】
前記Ｔ細胞が、細胞傷害性Ｔ細胞、ヘルパーＴ細胞及び調節Ｔ細胞である請求項５２に記載の細胞。
【請求項５４】
エピトープが哺乳動物の体内で免疫応答を惹起する能力を有する、少なくとも１つのエピトープを有する抗原をさらに含んでなる請求項４８に記載の細胞。
【請求項５５】
サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターをさらに含んでなる請求項４８に記載の細胞。
【請求項５６】
負の免疫調節因子のインヒビターと細胞を接触させる工程を含んでなる、サイレンシング化された細胞を生成する方法であって、前記負の免疫調節因子が分子安定性に関与するタンパク質及びＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子又は任意の組合せよりなる群から選択される、上記方法。
【請求項５７】
分子安定性に関与する前記タンパク質がＡ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、
ＳＵＭＯ３、ＳＵＭＯ４）及びその任意の変異体よりなる群から選択される請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
ＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する前記転写因子が、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｔｗｉｓｔ−２、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ及びその任意の変異体よりなる群から選択される請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記インヒビターが、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランス優性負突然変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチド及び小分子よりなる群から選択される請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
サイレンシング化及びパルスを受けた細胞を生成する方法において、ｉ）負の免疫調節因子のインヒビターと細胞を接触させる工程であって、前記負の免疫調節因子が分子安定性に関与するタンパク質及びＮＦκＢのインヒビター発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子又はその任意の組合せよりなる群から選択される工程と、ｉｉ）少なくとも１つのエピトープを有する抗原と前記細胞をさらに接触させる工程であって、前記エピトープが哺乳動物体内で免疫応答を惹起させる能力を有している工程とを含んでなる、上記方法。
【請求項６１】
哺乳動物の体内で免疫応答を惹起させる方法であって、それを必要とする哺乳動物の体内に前記負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる組成物を投与する工程を含んでなり、前記負の免疫調節因子が分子安定性に関与するタンパク質、ＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、又はその任意の組合せよりなる群から選択される、上記方法。
【請求項６２】
哺乳動物の体内で免疫応答を惹起させる方法であって、その哺乳動物の体内の腫瘍中に前記負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる組成物を投与する工程を含んでなり、前記負の免疫調節因子が分子安定性に関与するタンパク質、ＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、又はその任意の組合せよりなる群から選択される、上記方法。
【請求項６３】
哺乳動物の体内の免疫応答を惹起する方法であって、負の免疫調節因子のインヒビターをコードし、前記負の免疫調節因子が分子安定性に関与するタンパク質及びＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、又は任意の組合せよりなる群から選択される第１のポリヌクレオチドと、少なくとも１つのエピトープをもつ抗原をコードし前記少なくとも１つのエピトープが哺乳動物体内で免疫応答を誘発する第２のポリヌクレオチドとを含んでなるベクターを含んでなる組成物を投与する工程を含んでなる、上記方法。
【請求項６４】
哺乳動物の体内で免疫応答を惹起させる方法であって、それを必要とする哺乳動物の体内にサイレンシング化された細胞を含んでなる組成物を投与する工程を含んでなり、前記サイレンシング化された細胞が負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなり、前記負の免疫調節因子が分子安定性に関与するタンパク質、ＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、又はその任意の組合せよりなる群から選択される、上記方法。
【請求項６５】
それを必要とする哺乳動物の体内に前記サイレンシング化された細胞を投与する前にインビトロで抗原と前記サイレンシング化された細胞を接触させる請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
それを必要とする哺乳動物の体内に前記サイレンシング化された細胞を投与した後でインビボで抗原と前記サイレンシング化された細胞を接触させる請求項６４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
ヒトにおける先天及び適応免疫における不適切な抗原提示及び活性化は結果として、数多くの病原性感染及び悪性細胞成長を制御し一掃するヒト免疫系に障害をもたらす。慢性感染症及び癌に対する有効な治療用ワクチン及び免疫療法は、その病理学に関連する攻撃的抗原を制御し一掃する能力をもつ活発な免疫応答を誘発する効率のよい手段に対する新しいアプローチの開発に依存している。
【０００２】
抗原を認識するＴ細胞の能力は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）Ｉ又はＭＨＣＩＩタンパク質のいずれかと抗原の会合に左右される。例えば、細胞傷害性Ｔ細胞は、ＭＨＣ−Ｉタンパク質と会合した状態で提示される抗原に応答する。かくしてウイルスの感染した細胞を殺すべき細胞傷害性Ｔ細胞は、その細胞が適切なＭＨＣ−Ｉタンパク質を発現しない場合その細胞を殺さなくなる。ヘルパーＴ細胞はＭＨＣ−ＩＩを認識する。ヘルパーＴ細胞の活性は、一般に、抗原提示細胞上の抗原の認識及び「自己」ＭＨＣ−ＩＩタンパク質のこれらの細胞上の存在の両方に左右される。自己ＭＨＣタンパク質と会合状態にある抗原の認識に対する必要条件は、ＭＨＣ制限と呼ばれている。ＭＨＣ−Ｉタンパク質は、ほぼ全ての有核細胞の表面上に見出される。ＭＨＣ−ＩＩタンパク質は、皮膚のランゲルハンス細胞及び脾臓の樹状細胞、Ｂ細胞及びマクロファージを含めた或る種の細胞の表面上に見出される。
【０００３】
哺乳動物内で免疫応答を開始させる上での決定的な工程は、ＭＨＣ−ＩＩ制限された外因性抗原を認識するＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞の活性化である。これらの抗原は、樹状細胞（ＤＣ）などの抗原提示細胞内の細胞エンドソーム経路の中で捕捉されプロセッシングされる。エンドソーム及びリソソーム内では、抗原は、抗原−ＭＨＣ−ＩＩ複合体を形成するべくゴルジ画分内のＭＨＣ−ＩＩ上で複合化される小抗原ペプチドへとプロセシングされる。これらの複合体は細胞表面上で発現され、この発現は、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化を誘発する。
【０００４】
哺乳動物内の有効な免疫応答の誘発におけるその他の決定的な事象には、ＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞の活性化が関与する。ＣＤ８＋細胞は、ＭＨＣ−Ｉ抗原と複合化されるプロセッシング済みタンパク質として細胞表面上に提示されるような形で細胞を通して所望のタンパク質が送られた時点で活性化される。Ｂ細胞は、ＭＨＣタンパク質を必要とせずに表面免疫グロブリン（ＩｇＭ及びＩｇＤ）を介して抗原と相互作用できる。しかしながら、ＣＤ４＋Ｔ細胞の活性化は、免疫系の全てのアームを刺激する。活性化時点でＣＤ４＋Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）はインターロイキンを産生する。これらのインターロイキンは免疫系のその他の腕を活性化するのを助ける。例えば、ヘルパーＴ細胞は、Ｂ細胞が抗体を産生するのを助けるインターロイキン−４（ＩＬ−４）及びインターロイキン−５（ＩＬ−５）；ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞を活性させるインターロイキン−２（ＩＬ−２）；及びマクロファージを活性化させるガンマインタフェロンを産生する。ＭＨＣ−ＩＩ制限を受けた抗原を認識するヘルパーＴ細胞は、細胞傷害性Ｔ細胞、マクロファージ、ナチュラルキラー細胞及びＢ細胞の活性化及びクローン拡張において中心的な役割を果たすことから、抗原に応答してヘルパーＴ細胞を活性化させるという初期事象は、その抗原に対抗して向けられた有効な免疫応答の誘発にとって決定的である。リソソーム膜貫通タンパク質から誘導された配列を用いてヘルパーＴ細胞活性を刺激するための試みが報告されている。しかしながら、これらの試みは、テスト対象の哺乳動物の体内でＣＤ８＋Ｔ細胞及びＢ細胞に関する有効な免疫応答の誘発を結果としてもたらさなかった。
【０００５】
免疫応答においてＴ細胞が果たす決定的な役割に加えて、ＤＣも同等に重要である。Ｄ
Ｃは、自己抗原に対する寛容の維持及び先天免疫及び適応免疫の活性化において主要な調節の役目を果たす専門の抗原提示細胞である（非特許文献１、非特許文献２）。ＤＣが微生物産物などの前炎症性刺激に遭遇した場合、細胞の成熟プロセスは、細胞表面で発現された抗原ペプチド負荷されたＭＨＣ分子及び共同刺激分子をアップレギュレートすることによって開始される。成熟及び局所リンパ節への帰還の後、ＤＣは免疫学的シナプスを形成することによりＴ細胞との接触を確立し、ここでＴ細胞レセプタ（ＴＣＲ）及び共同刺激分子は接着分子がとり囲む中心部域内に集合する（非特許文献３）。ひとたび活性化された時点で、ＣＤ８＋Ｔ細胞は数世代にわたり自律的に増殖し、さらなる抗原刺激無く細胞傷害機能を獲得する（非特許文献４、非特許文献５）。従って、ＤＣにより提供されるペプチドＭＨＣ複合体（シグナル１）及び共同刺激分子（シグナル２）のレベル及び持続時間は、抗原特異的Ｔ細胞応答の規模及び運命を判定するために不可欠である（非特許文献６、非特許文献７）。
【０００６】
樹状細胞（ＤＣ）及びマクロファージなどの抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、先天及び適合免疫の活性化ならびに免疫学的寛容の維持において重要な役割を果たす。ＡＰＣが病原菌を検知し免疫応答を開始させる機序は、過去数年間にわたり充分に研究されてきた。ＡＰＣは、リポ多糖類（ＬＰＳ）、未メチル化細菌ＤＮＡ（ＣｐＧ）及びＲＮＡなどの保存された病原菌構造を認識するために、トール様レセプタ（ＴＬＲ）などのパターン認識レセプタを使用する。ＴＬＲは、ＴＩＲ（トール／インターロイキン−１（ＩＬ−１）レセプタ）スーパーファミリに属し、このスーパーファミリは２つの主要亜群すなわちＩＬ−１レセプタ及びＴＬＲに細分される。ＴＬＲは１１のメンバー（ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１１）からなる。このスーパーファミリ−の全てのメンバーは、共通のシグナリング経路、特に転写因子核因子−κＢ（ＮＦκＢ）及びストレス活性化タンパク質キナーゼの活性化を導くシグナリング経路を活性化する保存されたサイトゾルＴＩＲドメインの存在に起因して同様にシグナリングする。ＮＦ−κＢ活性化は、腫瘍壊因子（ＴＮＦ）、ＩＦＮ、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２などの前炎症性サイトカインを分泌することによってか又はＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０などの共同刺激分子を発現することによって、免疫応答の触媒として作用する。ＴＮＦα及びＣＤ４０ＬなどのＴＮＦファミリーのメンバーは、そのレセプタ又はリガンドと相互作用し、同様にＮＦ−κＢを活性化させる。
【０００７】
腫瘍ワクチンを開発する大きな研究努力が、抗腫瘍免疫を増強させる一手段としてＤＣの成熟及び共同刺激を促進する目的で試みられてきた。しかしながら、自己腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に対抗する免疫の誘発は、固有の阻害機序により制限されており、これらの機序の多くがいまだに定義づけされていない。ＤＣ又はその他の細胞上のＢ７ファミリー分子との細胞−細胞接触を介してエフェクタＴ細胞活性の規模を制御するべくＴ細胞上の細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）及びそれに関連する分子により、既知の阻害機序が利用されている。ＤＣ成熟は、自己寛容の維持から免疫誘発への臨界スイッチとして役立つ。しかしながら、成熟点を超えて適合免疫の規模及び持続時間を制御できるようにするような負の免疫調節機序を成熟抗原提示ＤＣが有するか否かはいまだに不明である。
【０００８】
前炎症性シグナリングについては多くの注目が集められてきたが、炎症を抑制しかつ消散させる機序についてはほとんど知られていない。ＴＬＲが開始させる免疫応答の規模及び持続時間は、前炎症性シグナリングの強度と持続時間及びシグナル伝達経路の調節によって決定づけられる。転写因子ＮＦ−κＢのＴＬＲ誘発型活性化は、多数の前炎症性遺伝子の転写にとって不可欠であることから、敗血性ショックなどの過度の免疫応答から宿主を保護するため多数のレベルでＴＬＲシグナリングを負に調節するため、及び腸内微環境などの慢性的病原菌曝露の状態で免疫ホメオスタシスを維持するために、数多くの機序が利用されている。ＴＬＲシグナル経路の負の免疫調節因子としては、ＩＲＡＫ−Ｍ、ＭｙＤ８８ｓ、ＰＩ３Ｋ、ＴＯＬＬＩＰ、Ａ２０、ＴＲＩＡＤ３Ａ、ＮＯＤ２、可溶性ＴＬＲ
２／４及びＳＩＧＲＲ及びＳＴ２などのＴＩＲドメインを含有する膜結合分子が含まれる（非特許文献８）。
【０００９】
サイトカインは、多数の免疫細胞機能の調節に決定的に関与している（非特許文献９、非特許文献１０）。ＤＣは、核因子−κＢ（ＮＦ−κＢ）シグナリング経路を活性化することによりＤＣ成熟を促進するため、リポ多糖類（ＬＰＳ）などの保存された病原菌構造を認識するトール様レセプタ（ＴＬＲ）を使用する（非特許文献１１）。ＮＦ−κＢメンバーはこのときＩＬ−１２などの前炎症性サイトカインの発現を媒介する（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３）。ＤＣ成熟の後、サイトカイン産生及び細胞内シグナリング経路は、過度の自己免疫活性化を制限する一方で外来性抗原に対する有益な免疫応答を促進するように綿密に調節されると思われる。しかしながら、これらの経路についての特異的フィードバック阻害機序の重要性及びその結果としての自己抗原特異的免疫応答の制御は、いまだにほとんど定義づけされていないままである。
【００１０】
ＳＯＣＳ１は、インターフェロン（ＩＦＮ）−g、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２及びＩＬ−１５を含めたさまざまなサイトカインによるシグナリングの誘発可能な負のフィードバック調節因子である（非特許文献１４、非特許文献１５）。ＳＯＣＳ１は、偽基質インヒビターとして上流側ヤーヌスキナーゼ（ＪＡＫ）の活性化ループ結合しかつ／又はプロテアソーム分解についてＪＡＫをターゲティングすることによって転写（ＳＴＡＴ）シグナリング経路の多重シグナルトランスデューサ及び活性化因子を抑制する（非特許文献１４、非特許文献１５）。ＳＯＣＳ１は同様に、そのＳＯＣＳボックス領域を通ってユビキチン媒介型タンパク質分解についてｐ６５タンパク質をターゲティングすることによりＮＦ−κＢシグナリングを遮断する（非特許文献１６）。ＳＯＣＳ１欠損（−／−）マウスは、主として抑制のきかないサイトカインシグナリングの結果として、Ｔ及びＮＫＴ細胞の異常活性化及び重大な全身的炎症を伴って、新生児として死亡する（非特許文献１７、非特許文献１８、非特許文献１９）。ＤＣにおけるＳＯＣＳ１の機能についてはほとんど知られていないが、最近の研究から、抗原提示細胞（ＡＰＣ）内でのシグナリングを制御する上でのＳＯＣＳ１の役割が示唆されている（非特許文献１４、非特許文献２０）。マクロファージ内でのＳＯＣＳ１の発現はＬＰＳ又はＣｐＧ−ＤＮＡの刺激によって誘発され、ＳＯＣＳ１−／−マウスは、その野生型同腹子に比べてよりＬＰＳ誘発型ショックに対し感受性が高い（非特許文献２１、非特許文献２２、非特許文献２３、非特許文献２４）。その上ＳＯＣＳ１発現がＳＯＣＳ１−／−バックグラウンド上のＴ及びＢ細胞内で回復されているマウスに由来するＳＯＣＳ１−／−ＤＣは、ＩＦＮγ及びＬＰＳに対し過反応性であり、同種異型細胞拡張を開始させ、Ｂ細胞の異常拡張及び自己反応性抗体の産生を誘発する（非特許文献２０）。
【００１１】
ＤＣ内でのＳＯＣＳ１の役割についてはほとんど知られていないが、最近の研究から、サイトカインシグナル伝達経路を調節する上でのＳＯＣＳ１の役目が実証された。例えば、ＳＯＣＳ１−／−ＤＣがより成熟した表現型を示し、シグナリングのためにトール様レセプタ（ＴＬＲ）４と相互作用するリポ多糖類（ＬＰＳ）に過反応性を有することが観察された、ということが実証されている。同様に観察されたのは、ＳＯＣＳ１−／−ＤＣが自己反応性抗体産生を誘発するということであった。これらの観察事実は、場合によってＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路及びＴＬＲ／ＮＦ−κＢ経路を制御することによるＤＣの負の調節におけるＳＯＣＳ１の考えられる役割の可能性を示唆していた。
【００１２】
【非特許文献１】バンシュロー（Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ）ら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ第３９２号：２４５〜５２頁
【非特許文献２】スタインマン（Ｓｔｅｉｎｍａｎ）ら、２００３年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２１号：６８５〜７１１頁
【非特許文献３】ダスティン（Ｄｕｓｔｉｎ）ら、２０００年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１号：２３〜９頁
【非特許文献４】ケッフ（Ｋａｅｃｈ）ら、２００１年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２号：４１５〜２２頁
【非特許文献５】ファン・スティプドンク（ｖａｎ  Ｓｔｉｐｄｏｎｋ）ら、２００１年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２号：４２３〜９頁
【非特許文献６】ランザヴェッキア（Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ）ら、２００１年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２号：４８７〜９２頁；
【非特許文献７】ゲット（Ｇｅｔｔ）ら、２００３年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４号：３５５〜６０頁
【非特許文献８】Ｎａｔ  Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第５号：４４６頁、２００５年
【非特許文献９】カートシンガー（Ｃｕｒｔｓｉｎｇｅｒ）ら、２００３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１９７号：１１４１〜５１頁；
【非特許文献１０】バレンズエラ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａ）ら、２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６９号：６８４２〜９頁
【非特許文献１１】アキラ（Ａｋｉｒａ）ら、２００４年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４号：４９９〜５１１頁
【非特許文献１２】ボイトラー（Ｂｅｕｔｌｅｒ）ら、２００３年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第３号：１６９〜７６頁
【非特許文献１３】ジェーンウェイ（Ｊａｎｅｗａｙ）ら、２００２年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２０号：１９７〜２１６頁
【非特許文献１４】クボ（Ｋｕｂｏ）ら、２００３年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４号：１１６９〜７６年
【非特許文献１５】アレキサンダーら、２００４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２２号：５０３〜２９頁
【非特許文献１６】リョー（Ｒｙｏ）ら、２００３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．第１２号：１４１３〜２６頁
【非特許文献１７】マリーン（Ｍａｒｉｎｅ）ら、１９９９年、Ｃｅｌｌ第９８号：６０９〜１６頁
【非特許文献１８】アレキサンダー（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ）ら、１９９９年、Ｃｅｌｌ第９８号：５９７〜６０８頁
【非特許文献１９】ナカ（Ｎａｋａ）ら、２００１年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１４号：５３５〜４５頁
【非特許文献２０】ハナダ（Ｈａｎａｄａ）ら、２００３年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１９号：４３７〜５０貢
【非特許文献２１】クレスポ（Ｃｒｅｓｐｏ）ら、２０００年、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．第３４９号：９９〜１０４頁
【非特許文献２２】ダルプケ（Ｄａｌｐｋｅ）ら、２００１年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６６号：７０８２〜９頁
【非特許文献２３】ナカザワ（Ｎａｋａｇａｗａ）ら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１７号：６７７〜８７頁
【非特許文献２４】キンジョウ（Ｋｉｎｊｙｏ）ら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１７号：５８３〜９１頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
哺乳動物の体内で免疫応答を刺激するべく免疫療法においてＤＣを使用するための数多くの試みが行なわれてきた。これらの研究努力においては、ＤＣは、抗原をそれに負荷しエクスビボ状況下でそれらを成熟させかくしてそれが癌患者の体内で抗腫瘍免疫を刺激するようにすることによって操作された。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を撲滅するための免疫療法の使用に関しては、有効なヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ワクチンはまだ全
く現われていない。従って、当該技術分野では、哺乳動物において疾病の治療のための免疫応答を惹起する効率のよい直接的な手段に対するニーズが長年にわたって認識されている。本発明はこのニーズを満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、免疫細胞の免疫能力を増強させるための組成物を包含する。好ましくは、本組成物は、負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる。一態様においては、負の免疫調節因子は、ユビキチン化、脱ユビキチン化及びスモ化（ｓｕｍｏｙｌａｔｉｏｎ）により分子安定性に関与するタンパク質及びＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発するか又はＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、又はその任意の組合せよりなる群から選択される。
【００１５】
一態様においては、ユビキチン化、脱ユビキチン化及びスモ化により分子安定性に関与する負の免疫調節因子はＡ２０及びＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、ＳＵＭＯ４）よりなる群から選択される。もう１つの態様においては、ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制するか又はＮＦκＢのインヒビターの発現を誘発しＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子のファミリーの一部を成す負の免疫調節因子は、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｔｗｉｓｔ−２、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ及びそれらの変異体よりなる群から選択される。
【００１６】
本発明はまた、負の免疫調節因子が（ＳＯＣＳ）をシグナリングするサイトカインのサプレッサであり、さらに、ＳＯＣＳはＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びサイトカイン誘発性ＳＨ２−ドメイン含有タンパク質（ＣＩＳ）よりなる群から選択される、負の免疫調節因子のインヒビターをも含む。
【００１７】
もう１つの態様においては、本発明はＳＨ２含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）のインヒビターであって、ＳＨＰがＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２よりなる群から選択されるインヒビターを含む。
【００１８】
さらなる態様においては、本発明は、活性化されたＳＴＡＴ（ＰＩＡＳ）のタンパク質インヒビターであって、ＰＩＡＳが、ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙよりなる群から選択されるインヒビターを含む。
【００１９】
一態様においては、負の免疫調節因子は、Ａ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、及びＳＵＭＯ４）、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７、及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などよりなる群から選択される。
【００２０】
特定の一実施形態においては、インヒビターは、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランス優性負突然変異体をコードする発現ベクター、細胞内抗体、ペプチド及び小分子よりなる群から選択される。好ましくは、インヒビターはｓｉＲＮＡである。
【００２１】
さらなる態様においては、ｓｉＲＮＡが２本鎖オリゴヌクレオチド、１本鎖オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドよりなる群から選択される。
【００２２】
さらにもう１つの態様においては、ｓｉＲＮＡは化学的に合成されている。
【００２３】
本発明のもう１つの実施形態は、負の免疫調節因子のインヒビターを含む組成物であって、生理学的に許容可能な担体をさらに含んでなる組成物を含む。好ましくは、生理学的に許容可能な担体は、リポソームである。
【００２４】
もう１つの実施形態においては、負の免疫調節因子のインヒビターは、発現ベクター内にクローニングされた単離ポリヌクレオチドによりコードされる。発現ベクターは、プラスミドＤＮＡ、ウイルスベクター、細菌ベクター及び哺乳動物ベクターよりなる群から選択される。もう１つの態様においては、発現ベクターは、宿主細胞のゲノム内への単離ポリヌクレオチドの組込みを容易にする組込みシグナル配列をさらに含んでなる。
【００２５】
本発明はまた、免疫細胞の免疫能力を増強するための組成物であって、少なくとも１つのエピトープをさらに含んでなる組成物をも含む。好ましくは、エピトープは哺乳動物の体内で免疫応答を惹起する能力をもつ。もう１つの態様においては、エピトープは、哺乳動物の体内でＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘発する。さらにもう１つの態様においては、エピトープは、哺乳動物の体内でＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘発する。さらなる態様では、エピトープは哺乳動物の体内でＢ細胞応答を誘発する。
【００２６】
もう１つの実施形態においては、抗原は発現ベクターにより発現される。さらなる態様においては、抗原は単離ポリペプチドである。
【００２７】
さらにもう１つの実施形態においては、抗原は１つの疾患に関連している。好ましくは、疾患は、感染性疾患、癌及び自己免疫疾患よりなる群から選択される。
【００２８】
一態様においては、感染性疾患はウイルス、細菌、真菌及び原生動物よりなる群から選択された病原性微生物によってひき起こされる。
【００２９】
もう１つの実施形態においては、抗原はウイルス遺伝子によりコードされる。好ましくは、ウイルス遺伝子は、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、乳頭腫ウイルス及びヘルペスウイルスよりなる群から選択されたウイルスから誘導されている。
【００３０】
一態様においては、抗原は、Ｂ型肝炎ウイルスｅ抗原遺伝子、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原遺伝子及びＢ型肝炎ウイルスコア抗原遺伝子よりなる群から選択されたウイルス遺伝子によりコードされている。
【００３１】
もう１つの態様においては、抗原は、ヒト免疫不全ウイルスＥｎｖ  ｇｐ１６０遺伝子、Ｇａｇ遺伝子、Ｐｏｌ遺伝子、Ｒｅｖ遺伝子、Ｔａｔ遺伝子、Ｖｉｆ遺伝子及びＮｅｆ遺伝子よりなる群から選択されたウイルス遺伝子によりコードされている。
【００３２】
さらなる態様においては、抗原は、乳頭腫ウイルスＥ７遺伝子及び乳頭腫ウイルスＥ６よりなる群から選択されたウイルス遺伝子によりコードされている。
【００３３】
さらにもう１つの態様においては、抗原は、１型単純ヘルペスウイルス、２型単純ヘルペスウイルス、エプスタイン・バーウイルス、サイトメガロウイルス、ヒトヘルペスウイルス６型、ヒトヘルペスウイルス７型及びヒトヘルペスウイルス８型よりなる群から選択されたヘルペスウイルスから誘導されたウイルス遺伝子によりコードされる。
【００３４】
１つの実施形態においては、抗原は癌に関連しており、ここで、癌は、乳癌、子宮頸癌、黒色腫、腎臓癌及び前立腺癌よりなる群から選択される。
【００３５】
さらなる態様においては、腫瘍関連抗原は、過剰発現された腫瘍関連抗原、睾丸−腫瘍抗原、突然変異腫瘍関連抗原、分化腫瘍関連抗原チロシナーゼ、ＭＡＲＴ、ｔｒｐ、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−２、ＭＡＧＥ−３、ｇｐ１００、ＨＥＲ−２、Ｒａｓ及びＰＳＡよりなる群から選択される。
【００３６】
さらにもう１つの態様においては、腫瘍関連抗原は、ＢＣＲ−ＡＢＬ、ＣＡＳＰ、ＣＤＫ、Ｒａｓ、ｐ５３、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＣＥＡ、ＭＵＣ、ＴＷ１、ＰＡＰ、スルビビン、テロメラーゼ、ＥＧＦＲ、ＰＳＭＡ、ＰＳＡ、ＰＳＣＡ、チロシナーゼ、ＭＡＲＴ、ＴＲＰ、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ、ＭＡＧＥ、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＬＡＧＥ／ＮＹ−ＥＳＯ、ＲＡＧＥ、ＳＳＸ−２、ＣＤ１９及びＣＤ２０よりなる群から選択される。
【００３７】
もう１つの実施形態においては、抗原は、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、乾癬及びクローン病よりなる群から選択される疾患に関連している。
【００３８】
本発明はまた、免疫応答を惹起する能力をもつ少なくとも１つのエピトープを有する抗原及び負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなり、しかもさらにサイトカインを含んでなる組成物をも含む。好ましくは、サイトカインは、単離されたポリペプチドである。もう１つの態様においては、サイトカインは、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−７、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＩＬ−２３よりなる群から選択される。
【００３９】
本発明はまた、免疫応答を惹起する能力をもつ少なくとも１つのエピトープを有する抗原及び負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなり、かつさらにトール様レセプタ（ＴＬＲ）アゴニストを含んでなる組成物をも含む。一態様においては、ＴＬＲアゴニストは発現ベクターにより発現される。好ましくは、ＴＬＲアゴニストは単離ポリペプチドである。
【００４０】
本発明はまた、負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる組成物であって、インヒビターがヤーヌスキナーゼ（ＪＡＫ）シグナリングの阻害を抑制する、組成物をも含む。
【００４１】
もう１つの実施形態においては、負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる組成物は、トール様レセプタ（ＴＬＲ）シグナリングの阻害を抑制する。
【００４２】
さらにもう１つの実施形態においては、負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる組成物はＮＦ−κＢシグナリングの阻害を抑制する。
【００４３】
本発明は、細胞の免疫能力を増強させるための組成物であって、前記細胞内の負の免疫調節因子を阻害するインヒビターをコードする第１のポリヌクレオチド及び哺乳動物の体内で免疫応答を誘発する少なくとも１つのエピトープを有する抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含んでなる組成物をも含む。
【００４４】
本発明はまた、細胞の免疫能力を増強させるための組成物であって、前記細胞内の負のＩＲＭを阻害するインヒビターをコードする第１のポリヌクレオチド及びサイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含んでなる組成物をも含む。好ましくは、サイトカインをコードする第２のポリヌクレオチドは、ＩＬ−１２、ＴＮＦα、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＩＬ−７、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１及びＩＬ−２３よりなる群から選択される。
【００４５】
本発明はまた、負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる細胞をも含む。好ましく
は、細胞はＡＰＣ、樹状細胞、単球／マクロファージ、Ｔ細胞及びＢ細胞よりなる群から選択された免疫細胞である。
【００４６】
もう１つの態様においては、細胞はさらに、少なくとも１つのエピトープを有する抗原を含んでなり、ここで少なくとも１つのエピトープは、哺乳動物の体内で免疫応答を惹起する能力をもつ。
【００４７】
さらにもう１つの態様においては、細胞はさらに、サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターを含んでなる。
【００４８】
本発明はまた、負の免疫調節因子のインヒビターと細胞を接触させる工程を含んでなるサイレンシング化された細胞を生成する方法をも含む。
【００４９】
もう１つの実施形態においては、本発明は、サイレンシング化及びパルスを受けた細胞を生成する方法であって、細胞を負の免疫調節因子と接触させる工程及びさらに細胞を、哺乳動物の体内で免疫応答を惹起する能力をもつ少なくとも１つのエピトープを有する抗原と接触させる工程を含んでなる方法を含む。
【００５０】
本発明はまた、哺乳動物の体内で免疫応答を惹起する方法であって、それを必要としている哺乳動物の体内に負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる組成物を投与する工程を含んでなる方法をも含む。
【００５１】
本発明のもう１つの実施形態は、哺乳動物の体内で免疫応答を惹起する方法であって、それを必要としている哺乳動物の体内にサイレンシング化された細胞を含んでなる組成物を投与する工程を含んでなる方法であって、サイレンシング化された細胞が負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる方法をも含む。好ましくは、サイレンシング化された細胞は、それを必要とする哺乳動物の体内にサイレンシング化された細胞を投与する前にインビトロで抗原と接触させられる。もう１つの態様においては、それを必要としている哺乳動物内へのサイレンシング化された細胞の投与の後にインビボで抗原とサイレンシング化された細胞接触させることもできる。
【００５２】
本発明を例示する目的で、図面中には、本発明のいくつかの実施形態が描かれている。しかしながら、本発明は、図面中に描かれている実施形態の精確な配置及び手段に限定されるわけではない。
【詳細な記述】
【００５３】
本発明は、免疫細胞内の負の免疫調節因子を変調（ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ）させることによる免疫細胞の免疫能力の増強に関する。本発明は、負の免疫調節因子を変調させることにより免疫細胞内の抗原提示を変調させるための組成物及び方法を提供する。負の免疫調節因子は、シグナル伝達に関与するタンパク質の阻害性相同体（例えば可溶性デコイＴＬＲ、阻害性ＴＩＲ相同体、阻害性シグナリング分子イソ型、阻害性サイトカイン相同体など）、分子安定性に関与するタンパク質、シグナリング分子複合体の阻害性構成要素、シグナリング分子リン酸化反応の調節に関与するタンパク質、ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、ＲＮＡ翻訳及び安定性の調節に関与するタンパク質、サイトカインシグナリング調節因子などを含む（ただしこれらに限定されるわけではない）異なるタンパク質ファミリーに属することができる。
【００５４】
本発明は、負の免疫調節因子の変調によって免疫細胞の免疫能力が増強されているワクチン及び療法を提供する。さらに、本発明は、同様に腫瘍ワクチン接腫における自己寛容を破るための機序をも提供している。従って本発明は、細胞の免疫刺激能力を増強するこ
とにより免疫細胞内でＴＬＲ−、ＴＮＦＲ−媒介型シグナリング及びサイトカインレセプタ媒介型ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリングなどの前炎症性シグナル伝達経路の負の免疫調節因子に干渉することのもつ治療上の恩恵を提供している。
【００５５】
定義
本書で使用される通り、以下の用語の各々は、本節で関連づけされているその意味を有している。
【００５６】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本書では、その物品の文法的目的語の１つ又は２つ以上（すなわち少なくとも１つ）を意味するように用いられている。一例としては、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ（要素）」というのは１要素又は２つ以上の要素を意味する。
【００５７】
「約」という用語は、当業者により理解されるものであり、それが用いられる文脈に応じて幾分か変動することになる。
【００５８】
「同種異系」という用語は、同じ種の異なる動物に由来する移植片を意味する。
【００５９】
「アロ抗原」というのは、レシピエントにより発現される抗原とは異なる抗原である。
【００６０】
本書で使用される「抗原」という用語は、抗原上で特定のエピトープに特異的に結合することのできる免疫グロブリン分子を意味する。抗体は、天然供給源又は組換え型供給源に由来する無傷の免疫グロブリンであり得、無傷の免疫グロブリンの免疫活性部分であり得る。抗体は標準的には免疫グロブリン分子の四量体である。本発明における抗体は、例えばポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、Ｆｖ、Ｆａｂ及びＦ（ａｂ）２ならびに１本鎖抗体及びヒト化抗体を含めたさまざまな形態で存在し得る（ハーロウ（Ｈａｒｌｏｗ）ら、１９８８年；ハウストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ）ら、１９８８年；バード（Ｂｉｒｄ）ら、１９８８年）。
【００６１】
本書で使用される「抗原」又は「Ａｇ」という用語は、免疫応答をひき起こす分子として定義される。この免疫応答には抗体産生及び免疫学的にコンピテントな細胞又はその両方が関与する。当業者であれば、ほぼ全てのタンパク質又はペプチドを含むあらゆる巨大分子が抗原として役立ち得るということを理解するであろう。さらに、抗原は組換え型又はゲノムＤＮＡから誘導され得る。当業者であれば、かくして免疫応答を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分的ヌクレオチド配列を含んでなるあらゆるＤＮＡが、本書で使用される通りの「抗原」をコードするということを理解することだろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の全長ヌクレオチド配列のみによりコードされる必要がないということも理解するであろう。本発明が２つ以上の遺伝子の部分的ヌクレオチド配列の使用を含むがこれに限定されるわけではないということ、そしてこれらのヌクレオチド配列が所望の免疫応答を惹起するためにさまざまな組合せで配置されていることは、直ちに明らかである。その上、当業者であれば、抗原が「遺伝子」によりコードされる必要が全くないことを理解するだろう。抗原を合成した形で生成することができ、そうでなければ生体試料から誘導することもできるということは直ちに明らかである。このような生体試料としては、組織試料、腫瘍試料、細胞又は体液が含まれ得るがこれに限定されるわけではない。
【００６２】
「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）は、Ｔ細胞を活性化する能力をもつ細胞であり、単球／マクロファージ、Ｂ細胞及び樹状細胞（ＤＣ）を含むがこれに限定されるわけではない。
【００６３】
「樹状細胞」又は「ＤＣ」という用語は、リンパ系組織又は非リンパ系組織の中に発見される形態学的に類似の細胞型のさまざまな集団の任意のメンバーを意味する。これらの
細胞は、その独特の形態、高レベルの表面ＭＨＣ−クラスＩＩ発現によって特徴づけされる。ＤＣは、数多くの組織供給源から単離され得る。ＤＣは、ＭＨＣ制限されたＴ細胞を感作させるための高い能力を有し、インサイチュでＴ細胞に対し抗原を提示する上できわめて有効である。抗原は、Ｔ細胞の発達及び寛容中に発現される自己抗原及び、通常の免疫プロセス中に存在する外来性抗原であり得る。
【００６４】
本書で使用されているように、「活性化されたＤＣ」は、抗原でのパルスを受け免疫細胞を活性化させる能力をもつＤＣである。
【００６５】
本書で使用されている「成熟ＤＣ」という用語は、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）分子を発現する樹状細胞として定義される。これとは対照的に、未成熟樹状細胞は低レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＣＤ８０（Ｂ７．１）及びＣＤ８６（Ｂ７．２）分子を発現するが、抗原を取り込む大きな能力を有する。
【００６６】
「抗原負荷を受けたＡＰＣ」又は「抗原パルスを受けたＡＰＣ」には、抗原に曝露され抗原により活性化されたＡＰＣが含まれる。例えばＡＰＣは、例えば抗原の存在下での培養中にインビトロでＡｇ負荷を受けた状態となり得る。ＡＰＣは同様に、抗原に対する曝露によりインビボで負荷され得る。
【００６７】
「抗原を負荷されたＡＰＣ」は、従来次の２つの方法のうちの１つにおいて調製される：（１）抗原ペプチドとして知られる小ペプチドフラグメントが、ＡＰＣの外側に直接「パルスされる；又は（２）ＡＰＣが全タンパク質又はタンパク質粒子とインキュベートされ、これらのタンパク質がその後ＡＰＣにより取り込まれる。これらのタンパク質はＡＰＣにより小ペプチドフラグメントへと消化され、場合によってはＡＰＣ表面上に提示される。さらに、抗原を負荷されたＡＰＣは、細胞内に抗原をコードするポリヌクレオチドによっても生成され得る。
【００６８】
本書で使用する「サイレンシング化されたＡＰＣ」又は「サイレンシング化されたＤＣ」という用語は、（別途負の免疫調節因子を阻害するものとして知られている）負の免疫調節因子のインヒビターに曝露され、かくして負の免疫調節因子が免疫応答の調節に関連することになるＡＰＣ又はＤＣをそれぞれ意味している。インヒビターはＴＬＲ、ＲＰ１０５、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＴ２、ＮＯＤ２、ＭｙＤ８８ｓ、ＩＲＡＫ（ＩＲＡＫＭ、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２）、ＩＲＦ−４、ＦＬＮ２９、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＩＡＤ３Ａ、ＣＹＬＤ、Ｃｂｌ、Ａ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、及びＳＵＭＯ４）、ＩkＢタンパク質、ＭＫＰｓ、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、Ｒｏｑｕｉｎ、Ｄｏｋ（Ｄｏｋ−１、Ｄｏｋ−２）、ＰＩ３Ｋ、プロスタグランジン、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、アレスチン、ＴＯＬＬＩＰ、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などを含む（ただしこれに限定されるわけではない）本書で開示されている任意の負の免疫調節因子を阻害する能力をもつ。サイレンシング化されたＡＰＣは、負の免疫調節因子のインヒビターで処理されていないその他の点では同一のＡＰＣに比べて増強された免疫能力を有する。
【００６９】
「アンチセンス」というのは特に、ポリペプチドをコードする２本鎖ＤＮＡ分子の非コーディング鎖の核酸配列、又は非コーディング鎖と実質的に相同である配列を意味する。本書で定義されている通り、アンチセンス配列は、ポリペプチドをコードする２本鎖ＤＮＡ分子の配列に相補的である。アンチセンス配列はＤＮＡ分子のコーディング鎖のコーディング部分のみに相補的である必要はない。アンチセンス配列は、コーディング配列の発現を制御する、ポリペプチドをコードするＤＮＡ分子のコーディング鎖上で特定された調節配列に相補的である。
【００７０】
本書で使用される「自己免疫疾患」という用語は、自己免疫応答の結果としてもたらされる障害として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切な及び過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例としては、アジソン病、円形脱毛症、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（Ｉ型）、栄養障害性表皮水泡症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、脈管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎などが含まれるがこれに限定されるわけではない。
【００７１】
本書で使用される「自己移植性（ａｕｔｏｌｏｇｏｕｓ）」という用語は、後にその個体に再導入されるべき同じ個体に由来するあらゆる材料を意味するものとされている。
【００７２】
「癌」という用語は、本書では、異常細胞の急速な及び無制御の成長により特徴づけされる疾患として定義される。癌細胞は、局所的に又は血流及びリンパ系を通して、体の他の部分に蔓延し得る。さまざまな癌の例としては乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、直腸結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、リンパ腫、白血病、肺癌などが含まれるが、これに限定されるわけではない。
【００７３】
「サイトカインシグナリング調節因子」又は「サイトカインシグナリングの調節因子」又は「サイトカインシグナル伝達の調節因子」という語は、１つの細胞内でサイトカインシグナリング伝達経路を負に調節する能力をもつタンパク質を意味する。サイトカインシグナル伝達の調節因子は、サイトカインシグナル伝達のサプレッサ（ＳＯＣＳ１−ＳＯＣＳ７、サイトカイン誘発可能ＳＨ２−ドメイン含有タンパク質（ＣＩＳ））、ＳＨＳ含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）、及び活性化されたＳＴＡＴのタンパク質インヒビター（ＰＩＡＳ）を含むが、これに限定されるわけではない。
【００７４】
本書で使用する「ＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸として定義される。
【００７５】
「ドナー抗原」というのは、レシピエント内に移植すべきドナー組織により発現される抗原を意味する。
【００７６】
「レシピエント抗原」という用語は、ドナー抗原に対する免疫応答のための標的を意味する。
【００７７】
本書で使用する「エフェクタ細胞」というのは、抗原に対抗する免疫応答を媒介する細胞を意味する。エフェクタ細胞の一例としてはＴ細胞及びＢ細胞が含まれるが、これに限定されるわけではない。
【００７８】
「コードする」という用語は、遺伝子、ｃＤＮＡ又はｍＲＮＡなどのポリヌクレオチド内のヌクレオチドの特定の配列が有する、定義されたヌクレオチド配列（すなわちｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ及びｍＲＮＡ）又は定義されたアミノ酸配列のいずれかを有するその他のポリマー及び巨大分子の生物学的プロセス中の合成のために鋳型として役立つという固有の特性、及びその結果としてもたらされる生物学的特性を意味する。かくして、１つの遺伝子は、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が細胞又はその他の生体系の中でタンパク質を産生する場合に、そのタンパク質をコードする。ｍＲＮＡ配列と同一でかつ通常配列のリスト中に提供されているヌクレオチド配列を有するコーディング鎖及び遺伝子又はｃＤＮＡの転写のための鋳型として使用される非コーディング鎖の両方共が、その遺
伝子又はｃＤＮＡのタンパク質又はその他の産物をコードするものとして言及され得る。
【００７９】
本書で使用する「内因性」というのは、生体、細胞、組織又は系由来の又はそれらの内部で産生されるあらゆる材料を意味する。
【００８０】
本書で使用する「外因性」という用語は、生体、細胞、組織又は系の外部から導入される又はそれらの外部で産生されるあらゆる材料を意味する。
【００８１】
本書で使用する「エピトープ」という用語は、免疫応答を惹起して、Ｂ及び／又はＴ細胞応答を誘発することのできる抗原上の小化学分子として定義される。抗原は１つもしくはそれ以上のエピトープを有することができる。大部分の抗原は数多くのエピトープを有する。すなわち多価である。一般に、エピトープは、サイズ的におおよそアミノ酸５個及び／又は糖である。当業者は、一般に分子の特定的線形配列よりもむしろ全体的に３次元の構造が抗原特異性の主たる基準であり、従ってこれがエピトープ同士を区別するということを了解している。
【００８２】
本書で使用する「発現」という用語は、そのプロモータにより駆動される特定のヌクレオチド配列の転写及び／又は翻訳として定義される。
【００８３】
本書で使用する「発現ベクター」という用語は、転写可能な遺伝子産物の少なくとも一部分についてコードする核酸配列を含有するベクターを意味している。場合によっては、ＲＮＡ分子は次にタンパク質、ポリペプチド又はペプチドへと翻訳される。その他の場合には、これらの配列は、例えばアンチセンス分子、ｓｉＲＮＡ、リボザイムなどの産生において翻訳されない。発現ベクターは、特定の宿主生体内での作動的に連結されたコーディング配列の転写及び場合によってはその翻訳にとって必要な核酸配列を意味するさまざまな制御配列を含み得る。転写及び翻訳を支配する制御配列に加えて、ベクター及び発現ベクターは、その他の機能にも役立つ核酸配列を含有し得る。
【００８４】
本書で用いられる「ヘルパーＴ細胞」という用語は、その他のＢ及びＴリンパ球及び／又はマクロファージの活性化及び機能を促進することを主たる機能とするエフェクタＴ細胞として定義される。ほとんどのヘルパーＴ細胞はＣＤ４Ｔ細胞である。
【００８５】
本書で用いられる「非相同な」という用語は、異なる種から誘導されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列又はタンパク質として定義される。
【００８６】
本書で用いられる「相同な」という語は、２つのポリマー分子間例えば２つの核酸分子、例えば２つのＤＮＡ分子又は２つのＲＮＡ分子の間又は２つのポリペプチド分子の間のサブユニット配列類似性を意味する。２つの分子の両方においてサブユニット位置が同じモノマーサブユニットにより占有されている場合、例えば２つのＤＮＡ分子の各々の中の１つの位置がアデニンにより占有されている場合、それらはその位置において相同である。２つの配列の間の相同性は、整合する又は相同な位置の数に正比例し、例えば２つの化合物配列内の位置の半分（例えば長さ１０サブユニットのポリマー内の５位置）が相同である場合、２つの配列は５０％相同であり、９０％の位置、例えば１０中９位が整合しているか相同である場合、その２つの配列は９０％の相同性を共有する。例を挙げると、ＤＮＡ配列３’ＡＴＴＧＣＣ５’と３’ＴＡＴＧＧＣは５０％の相同性を共有する。
【００８７】
本書で使用されている「相同性な」というのは、「同一性」と同義で用いられる。
【００８８】
本書で使用されている「免疫原」というのは、哺乳動物の体内で液性抗体及び／又は細胞媒介型免疫応答を刺激又は誘発することのできる物質を意味する。
【００８９】
本書で使用されている「免疫グロブリン」又は「Ｉｇ」という用語は、抗体として機能する１種類のタンパク質として定義される。このタンパク質クラスの中に含まれている５つのメンバーは、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ及びＩｇＥである。ＩｇＡは、唾液、涙液、母乳、胃腸分泌物及び呼吸管及び尿生殖路の粘腋分泌などの身体の分泌物の中に存在する一次抗体である。ＩｇＧは、最も一般的な循環抗体である。ＩｇＭは、大部分の哺乳動物の体内で一次免疫応答において産生される主要な免疫グロブリンである。それは、凝集反応、補体固定及びその他の抗体応答において最も効率の良い免疫グロブリンであり、細菌及びウイルスに対する防御において重要である。ＩｇＤは、既知の抗体機能をもたないものの抗原レセプタとして役立ち得る免疫グロブリンである。ＩｇＥは、アレルゲンに対する暴露の時点でマスト細胞及び好塩基球からメディエータを放出させることにより即時型過敏性を媒介する免疫グロブリンである。
【００９０】
本書で使用されている「負の免疫調節因子」又は「負の調節因子」又は「免疫応答の負の調節因子」というのは、細胞中の免疫シグナリング形質導入経路を負に調節する能力をもつタンパク質を意味する。好ましくは、負の免疫調節因子は、前炎症性シグナル伝達経路を負に調節する。本書で開示されている負の免疫調節因子には、ｓＴＬＲ、ＲＰ１０５、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＴ２、ＮＯＤ２、ＭｙＤ８８ｓ、ＩＲＡＫ（ＩＲＡＫＭ、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２）、ＩＲＦ−４、ＦＬＮ２９、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＩＡＤ３Ａ、ＣＹＬＤ、Ｃｂｌ、Ａ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及びＳＵＭＯ４）、ＩkＢタンパク質、ＭＫＰｓ、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、Ｒｏｑｕｉｎ、Ｄｏｋ（Ｄｏｋ−１、Ｄｏｋ−２）、ＰＩ３Ｋ、プロスタグランジン、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、アレスチン、ＴＯＬＬＩＰ、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などが含まれるが、これに限定されるわけではない。負の免疫調節因子は、シグナル伝達に関与するタンパク質の阻害性相同体（例えば可溶性デコイＴＬＲ、阻害性ＴＩＲ相同体、阻害性シグナリング分子イソ型、阻害性サイトカイン相同体など）、分子安定性に関与するタンパク質、シグナリング分子複合体の阻害性構成要素、シグナリング分子のリン酸化反応の調節に関与するタンパク質、ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、ＲＮＡ翻訳及び安定性の調節に関与するタンパク質、サイトカインシグナリング調節因子などを含む（ただしこれに限定されるわけではない）異なるタンパク質ファミリーに属し得る。一態様においては、免疫細胞内の１つもしくはそれ以上の負の免疫調節因子を阻害することが、細胞の免疫能力を増強させるのに役立つ。
【００９１】
「単離核酸」というのは、天然に発生する状態でそれがフランキングする配列から分離された核酸セグメント又はフラグメントすなわち通常そのフラグメントに隣接している配列つまりそれが内部で天然に発生するゲノム中でそのフラグメントに隣接している配列から除去されたＤＮＡフラグメントを意味する。用語は同様に、天然に核酸に随伴しているその他の構成要素すなわち細胞内で天然にそれに随伴しているＲＮＡ又はＤＮＡ又はタンパク質から実質的に精製された核酸にもあてはまる。従ってこの用語は、例えば、ベクター内、自己複製プラスミド又はウイルス内、又は原核生物又は真核生物のゲノムＤＮＡ内に取込まれる組換え型ＤＮＡ、又はその他の配列とは独立して別の分子として（すなわちＰＣＲ又は制限酵素消化により産生されるｃＤＮＡ又はゲノム又はｃＤＮＡフラグメントとして）存在する組換え型ＤＮＡを含む。これには又、付加的なポリペプチド配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え型ＤＮＡも含まれる。
【００９２】
本発明に関連して、一般に発生する核酸塩基について以下の略号が用いられる。すなわち「Ａ」はアデノシンを意味し、「Ｃ」はシトシンを意味し、「Ｇ」はグアノシンを意味し、「Ｔ」はチミジンを意味しかつ「Ｕ」はウリジンを意味する。
【００９３】
本書で使用されている「主要組織適合複合体」又は「ＭＨＣ」という用語は、その多くが、組織適合性の最も重要な決定因子の中に入る抗原提示に関与する進化的に関連性ある細胞表面タンパク質をコードするものである、特定の遺伝子クラスタとして定義されている。クラスＩＭＨＣ、又はＭＨＣ−Ｉは主としてＣＤ８Ｔリンパ球に対する抗原提示において機能する。クラスＩＩＭＨＣ、又はＭＨＣ−ＩＩは主としてＣＤ４Ｔリンパ球に対する抗原提示において機能する。
【００９４】
本書で使用されている「変調する」という用語は、生物学的状態の何らかの変化すなわち増加、減少などを意味するものとされている。例えば、「変調する」という用語は、所望の負の免疫調節因子ｍＲＮＡの転写、所望の負の免疫調節因子ｍＲＮＡの安定性、所望の負の免疫調節因子ｍＲＮＡの翻訳、所望の負の免疫調節因子ポリペプチドの安定性、所望の負の免疫調節因子の翻訳後修飾又はそれらの任意の組合せを含む（ただしこれに限定されるわけではない）負の免疫調節因子の発現又は活性を正又は負に調節する能力を意味する。さらに、「変調する」という用語は、樹状細胞の免疫能力に関連している所望の負の免疫調節因子の活性を含む（ただしこれに限定されるわけではない）活性の増大、減少、マスキング、改変、オーバーライド又は復元を意味するものとして使用することができる。「変調する」という用語は、ｓＴＬＲ、ＲＰ１０５、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＴ２、ＮＯＤ２、ＭｙＤ８８ｓ、ＩＲＡＫ（ＩＲＡＫＭ、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２）、ＩＲＦ−４、ＦＬＮ２９、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＩＡＤ３Ａ、ＣＹＬＤ、Ｃｂｌ、Ａ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及びＳＵＭＯ４）、ＩkＢタンパク質、ＭＫＰｓ、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、Ｒｏｑｕｉｎ、Ｄｏｋ（Ｄｏｋ−１、Ｄｏｋ−２）、ＰＩ３Ｋ、プロスタグランジン、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、アレスチン、ＴＯＬＬＩＰ、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などを含めた（ただしこれに限定されるわけではない）本書に開示されているあらゆる負の免疫調節因子にあてはまる。相反する規定のないかぎり、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いの縮重バージョンであり同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質又はＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という語句は同様に、タンパク質が一部のバージョンでイントロンを含有し得るかぎりにおいて、イントロンをも含み得る。
【００９５】
本書で使用されている「ポリヌクレオチド」という用語は、ヌクレオチドの鎖として定義される。さらに、核酸はヌクレオチドのポリマーである。かくして、本書で使用されている核酸及びポリヌクレオチドは互換性がある。当業者は、核酸がモノマー「ヌクレオチド」へと加水分解され得るポリヌクレオチドであるという一般的知識を有している。モノマーヌクレオチドはヌクレオシド内に加水分解され得る。本書で使用されているポリヌクレオチドには、組換え体手段、すなわち通常のクローニング技術及びＰＣＲＴＭなどを用いた組換え体ライブラリ又はセルゲノムからの核酸配列のクローニング、及び合成手段を限定的意味なく含めた当該技術分野において利用可能なあらゆる手段によって得られる全ての核酸配列が含まれるが、これに限定されるわけではない。
【００９６】
本書で使用されている「ポリペプチド」という用語は、通常は確定した配列を有するアミノ酸残基の鎖として定義づけされる。本書で使用されているポリペプチドという用語は、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語と相互に包含し合う。
【００９７】
「増殖」というのはここでは、例えば細胞の増幅といった類似の形態の実体の複製又は繁殖を意味する。すなわち、増殖には、より多くの細胞の産生が包含され、これは、なかでも、単に細胞数を計数すること、細胞内への３Ｈ−チミジンの取り込みを測定すること
などによって測定され得る。
【００９８】
本書で使用されている「プロモータ」という用語は、細胞の合成機構により認識されるか、又は合成機構により導入される、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要とされるＤＮＡ配列として定義される。
【００９９】
本書で使用されている「プロモータ／調節配列」というのは、プロモータ／調節因子配列に対して作動的に連結された遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列を意味する。場合によっては、この配列はコアプロモータ配列であり得、その他の場合には、この配列は、遺伝子産物の発現のために必要とされるエンハンサ配列及びその他の調節要素をも内含し得る。プロモータ／調節配列は、例えば、組織特異的に遺伝子産物を発現するものであり得る。
【０１００】
「構成性」プロモータは、遺伝子産物をコードするか又は特定するポリヌクレオチドと作動的に連結された時点で、遺伝子産物を細胞の大部分の又は全ての生理学的条件下でその細胞内で産生させるヌクレオチド配列である。
【０１０１】
「誘発性」プロモータは、遺伝子産物をコードするか又は特定するポリヌクレオチドと作動的に連結された時点で、プロモータに対応するインデューサが細胞内部に存在する場合にのみ実質的に細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【０１０２】
「組織特異的」プロモータは、遺伝子産物をコードするか又は特定するポリヌクレオチドと作動的に連結された時点で、その細胞がプロモータに対応するタイプの組織型の細胞である場合にのみ実質的に細胞内で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【０１０３】
本書で使用されている「ＲＮＡ」という用語はリボ核酸として定義される。
【０１０４】
本書で使用されている「組換え型ＤＮＡ」という用語は、異なる供給源からのＤＮＡの小片を接合させることにより産生されるＤＮＡとして定義される。
【０１０５】
本書で使用されている「組換え型ポリペプチド」は、組換え型ＤＮＡ方法を用いることによって産生されたポリペプチドとして定義される。
【０１０６】
本書で使用されている「自己抗原」という用語は、宿主細胞又は組織によって発現される抗原として定義される。自己抗原は腫瘍抗原であるが、一部の実施形態においては、正常な細胞及び腫瘍細胞の両方において発現される。当業者であれば、自己抗原が細胞内で過剰発現され得るということを容易に理解するものと思われる。
【０１０７】
本書で使用されている「実質的に精製された」細胞というのは、基本的にその他の細胞型を含まない細胞である。実質的に精製された細胞は同様に、それがその天然に発生する状態において通常会合されるその他の細胞型から分離された細胞をも意味する。場合によっては、実質的に精製された細胞の集団というのは、相同な細胞集団を意味する。その他の場合には、この用語は単純に、それがその天然の状態で天然に会合されている細胞から分離された細胞のことを意味している。一部の実施形態では、細胞はインビトロ培養である。その他の実施形態では、細胞はインビトロで培養されない。
【０１０８】
本書で使用されている「Ｔ細胞」という用語は、さまざまな細胞媒介型免疫反応に参加する胸腺由来の細胞として定義される。
【０１０９】
本書で使用されている「Ｂ細胞」という用語は、骨髄及び／又は脾臓に由来する細胞と
して定義される。Ｂ細胞は、抗体を産生するプラズマ細胞へと発達し得る。
【０１１０】
本書で使用されている「治療上有効な量」というのは、組成物が投与される哺乳動物に対し有益な効果をもたらすのに充分な治療用組成物の量である。
【０１１１】
本書で使用されている「トランスフェクションを受けた」又は「形質転換を受けた」又は「形質導入を受けた」という用語は、外因性核酸を宿主細胞内に転移又は導入させるプロセスを意味する。「トランスフェクションを受けた」又は「形質転換を受けた」又は「形質導入を受けた」細胞は、外因性核酸でのトランスフェクション、形質転換又は形質導入を受けた細胞である。細胞には、一次対象細胞及びその後代が含まれる。
【０１１２】
本書で使用される「転写制御下の」又は「作動的に連結された」という語句は、プロモータが、ＲＮＡポリメラーゼによる転写及びポリヌクレオチドの発現の開始を制御するべくポリヌクレオチドとの関係において正しい場所及び配向にあることを意味する。
【０１１３】
本書で使用されている「ワクチン」という用語は、哺乳動物に対して材料を投与した後に免疫応答をひき起こすのに用いられる材料として定義される。
【０１１４】
本書で使用されている「変異体」という用語は、それぞれ基準核酸配列又はペプチド配列と配列が異なっているものの基準分子の基本的特性を保持する核酸配列又はペプチド配列である。核酸変異体の配列の変化は、基準核酸によりコードされるペプチドのアミノ酸配列を改変しないかもしれず、又そうでなければ、アミノ酸の置換、付加、欠失、融合及び切断を結果としてもたらす可能性がある。ペプチド変異体の配列の変化は、標準的には制限されるか又は保存的であり、かくして、基準ペプチド及び変異体の配列は、全体的に類似しており、かつ数多くの領域で同一である。変異体及び基準ペプチドは、任意の組合せでの１つもしくはそれ以上の置換、付加、欠失によりアミノ酸配列において異なっている可能性がある。核酸又はペプチドの変異体は、対立遺伝子変異体などの天然に発生するものであり得、そうでなければ天然に発生するものとして知られていない変異体であり得る。核酸及びペプチドの天然に発生しない変異体は、突然変異誘発技術又は直接合成により作ることができる。
【０１１５】
「ベクター」は、単離核酸を含みかつ細胞の内部に単離核酸を送達するために使用可能である物質の組成物である。線形ポリヌクレオチド、イオン又は両親媒性化合物と会合されたポリヌクレオチド、プラスミド及びウイルスを含めた（ただしこれに限定されるわけではない）数多くのベクターが当該技術分野において知られている。かくして、「ベクター」という用語には、自己複製プラスミド又はウイルスが含まれている。用語は同様に、例えばポリリシン化合物、リポソームなどの細胞内への核酸の移入を容易にする非プラスミド及び非ウイルス化合物を含むものとみなされるべきである。ウイルスベクターの例としては、アデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが含まれる。
【０１１６】
本書で使用されている「ウイルス」という用語は、全細胞内で複製する能力をもつ、外部脂質エンベロープを伴う又は伴わないタンパク膜内に封入された核酸（ＲＮＡ又はＤＮＡ）からなる粒子として定義される。
【０１１７】
「異種の」というのは、異なる種の動物に由来する移植片を意味する。
【０１１８】
記述
哺乳動物の体内の免疫応答に応答した無制御のシグナル伝達は、生物学的に破滅的な結果をもたらし得る。従って、異なるレベルでシグナリング経路が綿密に制御される。さま
ざまなタイプの免疫応答調節因子が存在する。免疫応答を調節する１つの方法は、負の免疫調節因子を通したものである。従って、本発明は、細胞の免疫能力を増強するべく免疫細胞内の負の免疫調節因子を阻害することに関する。
【０１１９】
負の免疫調節因子は、シグナル伝達に関与するタンパク質の阻害性相同体（例えば可溶性デコイＴＬＲ、阻害性ＴＩＲ相同体、阻害性シグナリング分子イソ型、阻害性サイトカイン相同体など）、分子安定性に関与するタンパク質、シグナリング分子複合体の阻害性構成要素、シグナリング分子のリン酸化反応の調節に関与するタンパク質、ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、ＲＮＡ翻訳及び安定性の調節に関与するタンパク質、サイトカインシグナリング調節因子などを含む（ただしこれに限定されるわけではない）異なるタンパク質ファミリーに属し得る。負の免疫調節因子の例としてはｓＴＬＲ、ＲＰ１０５、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＴ２、ＮＯＤ２、ＭｙＤ８８ｓ、ＩＲＡＫ（ＩＲＡＫＭ、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２）、ＩＲＦ−４、ＦＬＮ２９、ＴＷＥＡＫ、ＴＲＩＡＤ３Ａ、ＣＹＬＤ、Ｃｂｌ、Ａ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、及び  ＳＵＭＯ４）、ＩkＢタンパク質、ＭＫＰｓ、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、Ｒｏｑｕｉｎ、Ｄｏｋ（Ｄｏｋ−１、Ｄｏｋ−２）、ＰＩ３Ｋ、プロスタグランジン、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、アレスチン、ＴＯＬＬＩＰ、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などが含まれるが、これに限定されるわけではない。
【０１２０】
一態様においては、負の免疫調節因子は、サイトカインシグナル伝達のサプレッサ（ＳＯＣＳ）、ＳＨ２含有ホスファターゼ（ＳＨＰ）及び活性化されたＳＴＡＴのタンパク質インヒビター（ＰＩＡＳ）を含むサイトカインシグナリングの調節因子であり、これらを（ただしこれに限定されるわけではない）含む。
【０１２１】
サイトカインシグナリングの誘発性インヒビターは、サイトカインシグナリング（ＳＯＣＳ）タンパク質のサプレッサであり、その中にはＳＯＣＳ１〜ＳＯＣＳ７及びサイトカイン誘発性ＳＨ２ドメイン含有タンパク質（ＣＩＳ）という８つのファミリーメンバーが存在する。ＳＯＣＳタンパク質は、サイトカインレセプタ又は付随するＪＡＫを認識し、シグナリングでの直接的干渉及びユビキチン媒介型プロテアソーム分解についてレセプタ複合体をターゲティングすることの両方によって、シグナル伝達を減衰させる。
【０１２２】
（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）を含む（ただしこれに限定されるわけではない）ＳＨＰタンパク質は、構成的に発現され、ヤーヌスキナーゼ（ＪＡＫ）及びそのレセプタなどの脱リン酸化シグナリング中間体によりサイトカインシグナル伝達を減衰させることができる。ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙを含むもののこれに限定されるわけではない活性化されたＳＴＡＴのタンパク質インヒビター（ＰＩＡＳ）ファミリーのメンバーも又、構成的に発現され、ＳＴＡＴ活性を抑止することによりシグナル伝達を減衰させる。スモ化プロセスは、ＳＴＡＴ活性のＰＩＡＳ媒介型抑止に関与してきた。
【０１２３】
本発明は、負の免疫調節因子の阻害が哺乳動物に対して治療上の利益を提供するという発見に関係する。すなわち、免疫細胞内の負の免疫調節因子の阻害は、細胞内の免疫能力と結びつけられたシグナリング経路の増強に役立つ。一態様においては、シグナル伝達に関与するタンパク質の阻害性相同体（例えば可溶性デコイＴＬＲ、阻害性ＴＩＲ相同体、阻害性シグナリング分子イソ型、阻害性サイトカイン相同体など）、分子安定性に関与するタンパク質、シグナリング分子複合体の阻害性構成要素、シグナリング分子のリン酸化反応の調節に関与するタンパク質、ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、ＲＮＡ翻訳及び安定性の調節に関与するタンパク質、サイトカインシグナリング調節因子又はそれらの任意の組合せの阻害が、哺乳動物に対して治療上の利益を提供する。
【０１２４】
かくして、本発明は、免疫細胞内の負の免疫調節因子を阻害して免疫細胞の免疫能力を増強するための組成物及び方法を含んでなる。好ましくはＡ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及びＳＵＭＯ４）、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などよりなる群から選択された１つもしくはそれ以上の負の免疫調節因子を阻害することで、治療上の利益が得られる。
【０１２５】
さらなる態様においては、サイトカインシグナル調節因子からの任意の１つもしくはそれ以上のメンバーの阻害が、治療上の利益を提供する。かくして本発明は、免疫細胞内のサイトカインシグナリング調節因子を変調させて免疫細胞内の免疫能力を増強するための組成物及び方法を含んでなる。
【０１２６】
阻害すべき所望の負の免疫調節因子の如何に関わらず、細胞の免疫能力を増強する本発明の組成物は、負の免疫調節因子のインヒビター（例えばインヒビターは所望の負の免疫調節因子に対応するｓｉＲＮＡである）、抗原、サイレンシング化された免疫細胞、パルスを受けた細胞、抗原でのパルスを受けたサイレンシング化された細胞、サイトカインなどのうちの少なくとも１つもしくはそれ以上のものの任意の組合せを含む。組成物は、インビボ免疫化及び／又はエクスビボ療法のためのワクチンであり得る。
【０１２７】
本発明は、ＡＰＣ内の臨界制御点を無効化することによりワクチンの効能を増強するための包括的手段としてのサイレンシング化されたＡＰＣを提供する。本発明のサイレンシング化されたＡＰＣ又は負の免疫調節因子のインヒビターでのワクチン接種は、負の免疫調節因子のサイレンシング化により抗原提示免疫原性ＡＰＣがインビボで持続的に抗原特異的Ｔ細胞を刺激できるようになることから、抗原特異的免疫を増強する。本発明の一実施形態においては、サイレンシング化されたＡＰＣは、調節Ｔ細胞抑制を阻害する前炎症性サイトカインの産生及びＡＰＣの成熟を増強することによって、調節Ｔ細胞をオフ切換えする能力をもつ。
【０１２８】
サイレンシング化されたＡＰＣを生成することに加えて、本発明は、同様に、サイレンシング化された細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をも含む。本開示は、本発明の方法を用いてサイレンシング化されたＣＴＬが増強した細胞溶解活性を示すことを実証している。増強した細胞溶解活性は、細胞療法及び／又はワクチン接種において治療上の利益を提供する。
【０１２９】
負の免疫調節因子の阻害：
本書で提示されている開示に基づき、本発明は、負の免疫調節因子を阻害しかくして負の免疫調節因子が免疫応答の調節と関係しているという包括的概念を包含している。負の免疫調節因子は異なるタンパク質ファミリーに属し得る。負の免疫調節因子の各ファミリーは、免疫応答を調節するための異なる戦略を有する。異なるファミリーには、シグナル伝達に関与するタンパク質の阻害性相同体（例えば可溶性デコイＴＬＲ、阻害性ＴＩＲ相同体、阻害性シグナリング分子イソ型、阻害性サイトカイン相同体など）、分子安定性に関与するタンパク質、シグナリング分子複合体の阻害性構成要素、シグナリング分子のリン酸化反応の調節に関与するタンパク質、ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制する転写因子、ＲＮＡ翻訳及び安定性の調節に関与するタンパク質、サイトカインシグナリング調節因子などが含まれるが、これに限定されるわけではない。本書で提示されている開示に基づくと、免疫細胞内の負の免疫調節因子を阻害することでこの細胞中の免疫能力は増強される。
【０１３０】
一部の態様においては、免疫細胞内の負の免疫調節因子を阻害することで、細胞内のトール様レセプタ（ＴＬＲ）及び腫瘍壊死因子レセプタ（ＴＮＦＲ）は増強される。細胞内のＴＬＲ及びＴＮＦＲを増強した結果として、その細胞の免疫能力は増大する。
【０１３１】
シグナル伝達に関与するタンパク質の阻害性相同体
有効な免疫応答は、病原性感染に応答したＤＣの活性化に起因する。この活性化には、ＴＬＲなどの病原体認識レセプタを通したシグナリングが含まれる。ＴＬＲのメンバーは、共通のシグナリング経路特にＮＦ−κＢ及びストレス活性化を受けたタンパク質キナーゼの活性化を導く経路を活性化する保存されたサイトゾルトール／インターロイキン−１レセプタ（ＴＩＲ）ドメインの存在に起因して、同様にシグナリングする。ＮＦ−κＢ活性化は、ＴＮＦ、ＩＦＮ、インターロイキン１（ＩＬ−１）、ＩＬ−６、及びＩＬ−１２などの前炎症性サイトカインを分泌することによって、及びＣＤ８０、ＣＤ８６及びＣＤ４０などの共同刺激分子を発現することにより、免疫応答の触媒として作用する。
【０１３２】
細胞内のＴＬＲシグナリングに基づき免疫応答を調節するための頻繁に使用されている戦略は、ＴＬＲの細胞外部分で刺激活性をもたないその非機能的相同体又はイソ型によって主要なシグナリング分子を競合的に阻害することである。負の免疫調節因子のこのファミリー内のタンパク質としては、可溶性デコイＴＬＲ（ｓＴＬＲ）が含まれるが、これに限定されるわけではない。ｓＴＬＲは、病原性産物（例えば病原菌産物）とＴＬＲの相互作用を抑制する。例えば、可溶性デコイＴＬＲ２は、対応する病原菌リガンドとの相互作用についてＴＬＲ２と競合する。別の場合には、可溶性デコイＴＬＲ４はＭＤ２と相互作用し、ＭＤ２−ＴＬＲ４複合体の形成を阻害し、かくしてＴＬＲ４によるＬＰＳ媒介型シグナリングを遮断する。
【０１３３】
本開示に基づくと、当業者であれば本発明が負の免疫調節因子を阻害するための組成物及び方法であって、負の免疫調節因子がシグナリング分子の非機能的相同体である組成物及び方法を含むことを認識するものと思われる。好ましくは、シグナリング分子の非機能的相同体は可溶性デコイＴＬＲである。シグナリング分子の非機能的相同体を阻害すること（又はｓＴＬＲをその他の形で阻害すること）は、シグナリング分子上の非機能的相同体の阻害効果を阻害するのに役立つ。
【０１３４】
可溶性デコイＴＬＲを阻害することに加えて、ＴＬＲシグナリングを増強するもう１つの戦略は、ＴＬＲの細胞質領域で非機能的ＴＩＲ相同体又はイソ型を含有するタンパク質を阻害することにある。これらのタンパク質は、いかなる刺激活性ももたないＴＩＲドメインを含有する膜結合非機能的ＴＩＲ相同体（別途非機能的レセプタとしても知られているもの）を共有するタンパク質のファミリーのメンバーである。かかるタンパク質には、ＳＴＧＩＲＲ（単一免疫グロブリンＩＬ−ＩＲ−関連分子）、ＳＴ２及びＲＰ１０５が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０１３５】
いずれかの特定の理論により束縛されることは望まないが、これらのタンパク質は、ＴＬＲがその対応するシグナリング分子に結合するのを阻害するか又は封鎖することにより、ＴＬＲシグナリングを抑制する。例えば、ＳＩＧＩＲＲは、シグナリング分子と相互作用するべくＴＬＲ４と競合することによりＴＬＲ４シグナリングを減衰させる。かくして、本発明は、負の免疫調節因子を阻害する組成物及び方法であって、負の免疫調節因子が免疫細胞内のＴＬＲシグナリングを増強するための膜結合非機能的ＴＩＲ相同体である組成物及び方法を含む。この戦略は、免疫細胞の免疫能力を増強するべく負の免疫調節因子を阻害するという一般的概念に対する裏づけを提供する。
【０１３６】
ＴＬＲシグナリングは、同様に、ＮＯＤ２によっても調節され得る。ＮＯＤ２は、細菌
産物ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）を認識できるヌクレオチド結合オリゴマー化ドメインファミリの一員である。ＮＯＤ２はＴＬＲ２シグナリングの負の調節因子である。本書に提示される本開示に基づくと、免疫細胞内でＮＯＤ２を阻害することにより、細胞内のＴＬＲシグナリングに対するＮＯＤ２の阻害効果は抑制される。従って、免疫者の体内でＮＯＤ２を阻害すると、その細胞の免疫能力は増強される。
【０１３７】
ＴＬＲシグナリングを調節するもう１つの戦略は、ＭｙＤ８８及びＩＲＡＫなどの細胞質シグナリングタンパク質を調節することにある。細胞質シグナリング分子を阻害する負の免疫調節因子は、ＴＬＲシグナリングにおける主要なシグナリング分子の非機能性イソ型（又は別途シグナリング分子イソ型としても知られている）であるものとみなされる。非機能的イソ型であるとみなされる負の免疫調節因子の一例としては、中間ドメインが欠如したＭｙＤ８８の交互にスプライシングされた短い変異体がある。ＭｙＤ８８と表示されるＭｙＤ８８のこのスプライス変異体は、ＴＬＲシグナリングを抑制することがわかっている。例えば、ＭｙＤ８８は、ＬＰＳ誘発されたＮＦ−κＢ活性を阻害する。ＭｙＤ８８は、ＩＲＡＫ４に結合しＩＲＡＫ１リン酸化を促進する能力をもたないことから、ＬＰＳ誘発型ＮＦ−κＢ活性を阻害するものと考えられている。本書に提示されている開示に基づくと、１つの細胞内の非機能的イソ型（例えばＭｙＤ８８）である負の免疫調節因子を阻害することで、細胞内のＴＬＲシグナリングを増強しかくしてその細胞の免疫能力を増強するための手段が提供される。
【０１３８】
シグナル伝達に関与するタンパク質の阻害性相同体のファミリーに属するタンパク質のもう１つの例はＩＲＡＫである。キナーゼのＩＲＡＫファミリーは４つのメンバーすなわちＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４及びＩＲＡＫＭを含んでなる。さらに、ＩＲＡＫＭにはキナーゼ活性が欠如しており、それは細胞内のＴＬＲシグナリングの包括的な負の免疫調節因子として機能する。従って、ＩＲＡＫＭなどの非機能的イソ型である負の免疫調節因子を阻害することにより、免疫細胞内の負の免疫調節因子を阻害して細胞の免疫能力を増強するという一般的概念に対する裏づけが提供される。
【０１３９】
ＴＬＲシグナリングのその他の負の免疫調節因子には、転写因子のＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）ファミリーのメンバー、ＦＬＮ２９（新規インターフェロン及びＬＰＳ誘発型遺伝子）及びＴＷＥＡＫが含まれるがこれに限定されるわけではない。従って、これらの負の免疫調節因子のうちの１つもしくはそれ以上のものを阻害することにより、免疫応答に対する各々の負の免疫調節因子の阻害効果を妨げることができる。従って、これらの負の免疫調節因子のうちのいずれか１つもしくはそれ以上のものを阻害することにより、細胞内でＴＬＲシグナリングを増強しかくして細胞の免疫能力を増強するための手段が提供される。
【０１４０】
分子安定性：
負の免疫調節因子の１つのファミリーは、シグナリング分子の安定性を調節する戦略を利用する。この戦略は、ユビキチン化／脱ユビキチン化により主要シグナリング分子の安定性を調節すること、そしてスモ化及びその他の機序によりシグナリング分子複合体の阻害構成要素の安定性を増大することと結びつけられている。ＴＲＩＡＤ３Ａ、Ｃｙｌｄ、Ｃｂｌ、Ａ２０及びＳＵＭＯなどのこれらの負の免疫調節因子の多くは、標的ＴＬＲ及びシグナリング分子を修飾しその分解を促進してＴＬＲシグナル伝達を減衰させる２ビキチン修飾酵素である。場合によっては、これらの負の免疫調節因子は、同様にＴＮＦＲシグナル伝達をも減衰できる。従って、本書に提示されている開示に基づくと、当業者であれば、免疫細胞内のこれらの負の免疫調節因子のうちの１つもしくはそれ以上のものを阻害することにより細胞内のＴＬＲ及び／又はＴＮＦＲシグナリングが増強されるということを認識するであろう。細胞内のＴＬＲの増強及び／又はＴＮＦＲシグナリングの結果は、細胞の免疫能力の増大である。
【０１４１】
分子安定性を調節することに関与するその他の負の免疫調節因子としては、アレスチンファミリーが含まれる。本開示に基づくと、当業者であれば、免疫細胞内のアレスチンファミリーメンバーを阻害することにより、ＮＦ−κＢの活性化に対するアレスチンファミリーメンバーの阻害効果が抑制されるということを認識するであろう。従ってアレスチンファミリーメンバーの阻害は細胞の免疫能力を増大させる。
【０１４２】
分子複合体をシグナリングする阻害性構成要素
シグナリング分子複合体の阻害性構成要素のファミリーのメンバーである負の免疫調節因子には、ＩκＢタンパク質が含まれる。ＩκＢα、ＩκＢβ及びＩκＢεを含むＩκＢタンパク質は、細胞質内のＮＦ−κＢタンパク質を封鎖しかくして、ＮＦ−κＢをその正常な機能から阻害する。ＩκＢタンパク質は、ＮＦ−κＢサブユニット上の核局在化配列（ＮＬＳ）をマスキングすることによって細胞質内のＮＦ−κＢを保持する。
【０１４３】
ＮＦ−κＢの活性化における重要な事象は、ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体によるＩκＢのリン酸化である。ＩＫＫ複合体は、ＴＬＲ、リガンド及びＴＮＦを含めたさまざまな刺激によるＮＦ−κＢの活性化のための合流点である。ＩＫＫ複合体は、２つの触媒サブユニットＩＫＫα及びＩＫＫβを含有し、ＮＦ−κＢ転写因子の活性化を制御する。ＩＫＫβは、前炎症性サイトカイン及び病原菌産物に応答したＮＦ−κＢ活性化を媒介する。ＮＦ−κＢの活性化を制御する上でのＩＫＫαについての負の調節という役目が観察されてきた。ＩＫＫαは、ＮＦ−κＢサブユニットＲｅｌＡ及びｃＲｅｌの分解及び前炎症性遺伝子プロモータからのＲｅｌＡ及びｃ−Ｒｅｌの除去の両方を加速することによりＮＦ−κＢ活性の抑制に寄与する。
【０１４４】
本書に提示されている開示に基づくと、ＮＦ−κＢを負に調節するか又はその他の形でＮＦ−κＢの活性化を防止するタンパク質は、細胞の免疫能力を増強するべく本書に開示されている方法を用いるターゲティングされた阻害のための候補である。当業者であれば、ＩκＢタンパク質ＩＫＫα、ＩＫＫβ又は任意の組合せを阻害することにより、ＮＦ−κＢ活性化に対するこれらのタンパク質の阻害効果を抑制することができるということを認識するであろう。
【０１４５】
シグナリング分子のリン酸化の調節
ＭＡＰＫシグナリング経路は、免疫応答の活性化と結びつけられる。ＭＡＰＫ経路は、ホスファターゼがＭＡＰＫ経路の活性化の後に誘発されることから、ＭＡＰＫホスファターゼ（ＭＫＰ）によるフィードバック阻害を受ける。本書で提示されている開示に基づくと、ＭＫＰ（例えばＭＫＰ５及びＭＫＰ６）を阻害することは、その対応するＭＡＰＫ経路に対するＭＫＰの阻害効果を抑制するのに役立つ。ＭＫＰ５及びＭＫＰ６は、そのそれぞれのＭＡＰＫ標的の活性を阻害することによりＴ細胞活性化を負に調節することが示されてきた。
【０１４６】
本書で提示されている開示に基づくと、当業者であれば、ＭＫＰ（例えばＭＫＰ５及びＭＫＰ６）を阻害することによりＭＡＰＫシグナル経路に対するホスファターゼの阻害効果を抑制できるということを認識することだろう。免疫細胞内のＭＫＰを阻害することにより、細胞の免疫能力を増強することが可能である。
【０１４７】
標的遺伝子転写の調節
免疫応答を調節するためのもう１つの戦略は、ＮＦκＢ標的遺伝子の転写を抑制するか又はシグナリング分子複合体中の負の構成要素の転写を増強することにある。かかる戦略には、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｔｗｉｓｔ−２、Ｆｏｘｊ１、及びＦｏｘｏ３ａを含む（これに限定されるわけではない）負の免疫調節因子を抑制することが包含されている。本書で提
示されている開示は、これらのタンパク質のうちの少なくとも１つのタンパク質のレベルを抑制することで細胞の免疫能力を増強することができるということを実証している。
【０１４８】
Ｆｏｘｏ３ａ及びＦｏｘｊ１は、ＮＦ−κＢの負の調節に活発に関与するフォークヘッド転写因子ファミリーのメンバーである。Ｔｗｉｓｔは、ＮＦ−κＢのもう１つの負の免疫調節因子である。Ｔｗｉｓｔは、サイトカインプロモータの中のＥボックスに結合し、隣接するκＢ部位に結合されたＮＦ−κＢの活性を阻害する。
【０１４９】
負の免疫調節因子を阻害する方法
本書の開示に基づくと、本発明は、細胞の免疫能力を増強するべくその細胞内の負の免疫調節因子を阻害するための包括的概念を含む。好ましくは、本発明は、Ａ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及びＳＵＭＯ４）、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などよりなる群から選択された１つもしくはそれ以上の負の免疫調節因子を阻害する工程を含む。
【０１５０】
一実施形態においては、本発明は免疫細胞の免疫能力を増強するための組成物を含んでなる。好ましくは、組成物は、Ａ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及びＳＵＭＯ４）、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などよりなる群から選択された１つもしくはそれ以上の負の免疫調節因子を阻害するインヒビターを含んでなる。
【０１５１】
負の免疫調節因子のインヒビターを含んでなる組成物は、小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンス核酸、リボザイム、トランス優性遺伝子負突然変異体、細胞内抗体、ペプチド及び小分子よりなる群から選択される。
【０１５２】
当業者であれば、本書で提供されている開示に基づき、１つの細胞内のサイトカインシグナリング調節因子などの負の免疫調節因子のｍＲＮＡ及び／又はタンパク質レベルを減少させるための１つの方法が、調節因子をコードする核酸の発現を削減又は阻害することによるものである、ということを認識するであろう。かくして、細胞内の負の免疫調節因子のタンパク質レベルは、例えばアンチセンス分子又はリボザイムなどの遺伝子発現を阻害するか又は削減する分子又は化合物を用いても低減させることができる。
【０１５３】
好ましい一実施形態においては、変調配列は、プラスミドベクターにより発現されるアンチセンス核酸配列である。アンチセンス発現ベクターは、哺乳動物細胞又は哺乳動物自体をトランスフェクトし、かくして所望の負の免疫調節因子の削減された内因性発現をひき起こすために使用される。しかしながら、本発明は、アンチセンス分子での細胞のトランスフェクションにより負の免疫調節因子の発現を阻害することに限定されるものとして解釈されてはならない。むしろ本発明は、リボザイムの使用、非機能的負免疫調節因子（すなわちトランス優性負突然変異体）の発現及び細胞内抗体の使用を含めた（ただしこれに限定されるわけではない）細胞内のタンパク質の発現又は活性を阻害するための当該技術分野において既知のその他の方法を包含している。
【０１５４】
アンチセンス分子及び遺伝子発現を阻害するためのそれらの使用は、当該技術分野において周知である（例えば、コーエン（Ｃｏｈｅｎ）、１９８９年、「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ
Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」、ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ中を参照のこと）。アンチセンス核酸は、その用語が本書の他の場所で定義されている通り、少なくとも特異的ｍＲＮＡ分子の一部分に相補的であるＤＮＡ又はＲＮＡ分子である（ワイントラウブ（Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ）、１９９０年、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ第２６２号：４０頁）。細胞内では、アンチセンス核酸は対応するｍＲＮＡに対しハイブリッド形成し、２本鎖分子を形成して遺伝子の翻訳を阻害する。
【０１５５】
遺伝子の翻訳を阻害するためのアンチセンス方法の使用は、当該技術分野において既知であり、例えばマーカス−サクラ（Ｍａｒｃｕｓ−Ｓａｋｕｒａ）（１９８８年、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．第１７２号：２８９頁）の中で記述されている。このようなアンチセンス分子は、イノウエ（Ｉｎｏｕｅ、１９９３年、米国特許第５，１９０，９３１号明細書）により教示されている通りアンチセンス分子をコードするＤＮＡを用いて遺伝子発現を介して細胞に提供され得る。
【０１５６】
あるいは、本発明のアンチセンス分子は合成的に作製しその後細胞に提供され得る。約１０〜約３０、より好ましくは約１５個のヌクレオチドのアンチセンスオリゴマーは、容易に合成され標的細胞に導入されることから好まれる。本発明により考慮されている合成アンチセンス分子には、未修飾オリゴヌクレオチドに比べて改善された生物活性を有する当該技術分野において既知のオリゴヌクレオチド誘導体が含まれる（米国特許第５，０２３，２４３号明細書参照）。
【０１５７】
遺伝子発現を阻害するためのリボザイム及びそれらの使用も同様に当該技術分野において周知である（例えば、チェフ（Ｃｅｃｈ）ら、１９９２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２６７号：１７４７９〜１７４８２頁；ハンペル（Ｈａｍｐｅｌ）ら、１９８９年、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ第２８号：４９２９〜４９３３頁；エックスタイン（Ｅｃｋｓｔｅｉｎ）ら、国際公開第ＷＯ９２／０７０６５号パンフレット；アルトマン（Ａｌｔｍａｎ）ら、米国特許第５，１６８，０５３号明細書を参照のこと）。リボザイムは、ＤＮＡ制限エンドヌクレアーゼと同様にその他の１本鎖ＲＮＡを特異的に分割する能力を有するＲＮＡ分子である。これらのＲＮＡをコードするヌクレオチド配列の修飾を通して、ＲＮＡ分子内の特異的ヌクレオチド配列を認識しそれを分割するように分子を工学処理することができる（チェフ、１９８８年、Ｊ．Ａｍｅｒ．Ｍｅｄ．Ａｓｓｎ．第２６０号：３０３０頁）。このアプローチの主たる利点は、リボザイムが配列特異的である、という事実にある。
【０１５８】
リボザイムには２つの基本型、すなわちテトラヒメナ型（ハッセルホッフ（Ｈａｓｓｅｌｈｏｆｆ）、１９８８年、Ｎａｔｕｒｅ第３３４号：５８５頁）及びハンマーヘッド型がある。テトラヒメナ型リボザイムは、４塩基の長さをもつ配列を認識し、一方ハンマーヘッド型リボザイムは、長さが１１〜１８塩基の塩基配列を認識する。配列が長くなるほど、配列が標的ｍＲＮＡ種内で専ら発生することになる確率は大きくなる。その結果として、特異的ｍＲＮＡ種を不活性化するためには、テトラヒメナ型リボザイムよりもハンマーヘッド型リボザイムの方が好ましく、さまざまな無関係のｍＲＮＡ分子の内部で無作為に発生し得る比較的短い認識配列よりも、１８塩基の認識配列が好ましい。
【０１５９】
負の免疫調節因子の発現を阻害するのに有用なリボザイムは、所望の負の免疫調節因子のｍＲＮＡ配列に相補的である基本的リボザイム構造の中に標的配列を取込むことにより設計可能である。所望の負の免疫調節因子をターゲティングするリボザイムは、市販の試薬を用いて合成され得（アプライド・バイオシステムズ社（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州フォスターシティー（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ））、そうでなければ、それらをコードするＤＮＡから遺伝学的に発現され得る。
【０１６０】
本発明のもう１つの態様においては、所望の負の免疫調節因子を不活性化及び／又は封鎖することにより、負の免疫調節因子を阻害することができる。従って、トランス優性負突然変異体を使用することにより、負の免疫調節因子の効果の阻害を達成することができる。あるいは、その他の点では負の免疫調節因子に対するアンタゴニストとして知られている所望の負の免疫調節因子に特異的な細胞内抗体を使用することが可能である。一実施形態においては、アンタゴニストは、負の免疫調節因子の結合パートナーと相互作用しかくして対応する野生型負免疫調節因子と競合するという所望の特性をもつタンパク質及び／又は化合物である。もう１つの実施形態においては、アンタゴニストは、負の免疫調節因子と相互作用しかくして負の免疫調節因子を封鎖するという所望の特性を有するタンパク質及び／又は化合物である。
【０１６１】
小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）
小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、問題の遺伝子又はポリヌクレオチドに対しターゲティングされている１組のヌクレオチドを含んでなるＲＮＡ分子である。本書で使用される通り、「ｓｉＲＮＡ」という用語は、（ｉ）２本鎖ＲＮＡポリヌクレオチド、（ｉｉ）１本鎖ポリヌクレオチド及び（ｉｉｉ）１、２、３、４個以上のヌクレオチド改変又は置換を内部に有する（ｉ）又は（ｉｉ）のいずれかのポリヌクレオチドを含めた（ただしこれに限定されるわけではない）全ての形態を包含する。
【０１６２】
２本鎖ポリヌクレオチドの形態をしたｓｉＲＮＡは、長さ約１８塩基対、約１９塩基対、約２０塩基対、約２１塩基対、約２２塩基対、約２３塩基対、約２４塩基対、約２５塩基対、約２６塩基対、約２７塩基対、約２８塩基対、約２９塩基対又は約３０塩基を含んでなる。２本鎖ｓｉＲＮＡは、負の免疫調節因子の発現及び／又は活性に干渉する能力をもつ。
【０１６３】
１本鎖ｓｉＲＮＡは、問題の遺伝子又はポリヌクレオチドにターゲティングされているＲＮＡポリヌクレオチド配列の一部分を含んでなる。１本鎖ｓｉＲＮＡは長さがヌクレオチド約１８個、ヌクレオチド約１９個、ヌクレオチド約２０個、ヌクレオチド約２１個、ヌクレオチド約２２個、ヌクレオチド約２３個、ヌクレオチド約２４個、ヌクレオチド約２５個、ヌクレオチド約２６個、ヌクレオチド約２７個、ヌクレオチド約２８個、ヌクレオチド約２９個又はヌクレオチド約３０個のポリヌクレオチドを含んでなる。１本鎖ｓｉＲＮＡは、Ａ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、及びＳＵＭＯ４）、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などの標的ポリヌクレオチドの発現及び／又は活性に干渉する能力をもつ。１本鎖ｓｉＲＮＡは同様に、相補的配列にアニールして負の免疫調節因子の発現及び／又は活性に干渉する能力をもつｄｓＲＮＡをもたらす能力も有している。
【０１６４】
さらにもう１つの態様においては、ｓｉＲＮＡは、２本鎖又は１本鎖のいずれかのポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオチドを含んでなり、ここでｓｉＲＮＡは内部に１、２、３、４個以上のヌクレオチド改変又は置換を有している。
【０１６５】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、一般に転写後の遺伝子サイレンシング化機序を介して発生すると考えられているＲＮＡ活性に干渉するＲＮＡ核酸分子である。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは好ましくは、２本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含んでなるが、そのように限定されることを意図されておらず、１本鎖ＲＮＡを含んでなっていてよい（例えば、マルチネス（Ｍａｒｔｉｎｅｚ）ら、２００２年、Ｃｅｌｌ第１１０号：５６３〜７４頁を参
照のこと）。本発明中に含まれるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、本書で提供されているようなヌクレオチド（リボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチド又は両方の組合せ）及び／又はヌクレオチド類似体（例えば、標準的に５’〜３’中のリン酸ジエステル連結中のオリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドなど）のその他の天然に発生する、組換え型、又は合成１本鎖又は２本鎖ポリマーをも含んでなり得る。従って、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの転写を導く能力をもつＤＮＡ配列などの本書に開示されているいくつかの配列例は同様に、相補性ヌクレオチド塩基対合の充分に立証済みの原理を考慮して、対応するＲＮＡ配列及びその補体を記述するためにも意図されているということがわかるだろう。
【０１６６】
ＲＮＡポリメラーゼプロモータのためのプロモータを含有するＤＮＡ（ゲノム、ｃＤＮＡ、又は合成）を鋳型として用いて、ｓｉＲＮＡを転写することができる。例えば、プロモータはＵ６プロモータ又はＨＩＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモータであり得る。あるいは、ｓｉＲＮＡは合成的に誘導されたＲＮＡ分子であり得る。一部の実施形態においては、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは平滑末端を有し得る。いくつかのその他の実施形態においては、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの少なくとも１つのストランドが、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドのいずれかのストランドの３’末端において「オーバーハングし」（すなわち相対するストランドの中の相補的塩基と塩基対合しない）少なくとも１つ、好ましくは２つのヌクレオチドを有している。本発明の好ましい実施形態においては、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド２重鎖の各ストランドは、３’末端で２ヌクレオチドオーバーハングを有する。２−ヌクレオチドオーバーハングは好ましくはチミジンジヌクレオチド（ＴＴ）であるが、同様にその他の塩基例えばＴＣジヌクレオチド又はＴＧジヌクレオチド又はその他のあらゆるジヌクレオチドを含んでなり得る。オーバーハングジヌクレオチドは同様に、干渉のためにターゲティングされているポリヌクレオチドの配列の５’末端にある２つのヌクレオチドに対しても相補的であり得る。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの３’末端の論述については、例えば国際公開第０１／７５１６４号パンフレットなどを参照のこと。
【０１６７】
好ましいｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、約１８〜３０ヌクレオチド塩基対、好ましくは約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６又は約２７塩基対の２本鎖ポリヌクレオチドを含んでなり、その他の好ましい実施形態においては、約１９、約２０、約２１、約２２又は約２３塩基対、或いは約２７塩基対を含んでなり、かくして、「約」という用語の使用は、一部の実施形態において及び一部の条件下で、選択されたポリペプチドの発現に干渉する能力をもつ機能的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを発生させ得る前進する連続的分割工程が絶対的に効果的でない可能性がある、ということを標示している。従って、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡのプロセッシング、生合成又は人工的合成における可変性の帰結として、長さが１、２、３、４塩基対以上異なる（例えばヌクレオチド挿入又は欠失による）１つもしくはそれ以上のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド分子を内含し得る。本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは同様に、特定の配列からの１、２、３、又は４個のヌクレオチドにおいて異なることによって（例えば塩基転位又は塩基転換を含めたヌクレオチド置換による）可変性を示すポリヌクレオチド配列を含んでなることもできる。これらの差は、２本鎖ポリヌクレオチドのセンス又はアンチセンスストランドのいずれの中にあるかに関わらず、分子の長さに応じて特定のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列のヌクレオチド位置のいずれかで発生可能である。ヌクレオチド差は、２本鎖ポリヌクレオチドの１本のストランド上に発見され得、ここで代替ヌクレオチドと共に水素結合塩基対合を標準的に形成することになる相補的ヌクレオチドは必ずしも対応する形で置換され得ない。好ましい実施形態においては、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、特異的ヌクレオチド配列との関係において相同である。
【０１６８】
一部の実施形態では、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含んでなるポリヌクレオ
チドは、標準的にはスペーサ配列により分離された、１本鎖オリゴヌクレオチドフラグメント（例えば約１８〜３０ヌクレオチドの）及びその逆補体を含んでなる１本鎖ポリヌクレオチドから誘導され得る。或る種のこのような実施形態に従うと、スペーサの分割が１本鎖オリゴヌクレオチドフラグメント及びその逆補体を提供し、かくして、これらはアニールして、場合によりいずれかの又は両方のストランドの３’末端及び／又は５’末端からの１、２、３又は４個以上のヌクレオチドの付加又は除去を結果としてもたらすさらなるプロセッシング工程を伴って、本発明の２本鎖ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを形成することができる。一部の実施形態においては、スペーサは、その分割に先立ってかつ場合により、いずれか又は両方のストランドの３’末端及び／又は５’末端からの１、２、３、４個以上のヌクレオチドの付加又は除去を結果としてもたらし得る後続するプロセッシング工程の前に、フラグメント及びその逆補体がアニールし２本鎖構造（例えばヘアピンポリヌクレオチドのようなもの）を形成できるようにする長さを有している。従って、スペーサ配列は、２本鎖核酸内にアニールされた時点でｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを結果としてもたらす２つの相補的ポリヌクレオチド配列領域の間にある本書で提供されている通りのあらゆるポリヌクレオチド配列であり得る。好ましくは、スペーサ配列は少なくとも４つのヌクレオチドを含んでなる。一部の実施形態においては、スペーサは５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１〜２５、２６〜３０、３１〜４０、４１〜５０、５１〜７０、７１〜９０、９１〜１１０、１１１〜１５０、１５１〜２００個又はそれ以上のヌクレオチドを含んでなり得る。１つのスペーサにより分離された２つの相補的ヌクレオチド配列を含んでなる単一のヌクレオチドストランドから誘導されるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの例が記述されてきた（例えば、ブルンメルカンプ（Ｂｒｕｍｍｅｌｋａｍｐ）ら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２９６号：５５０頁；パディソン（Ｐａｄｄｉｓｏｎ）ら、２００２年、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖｅｌｏｐ．第１６号：９４８頁；ポール（Ｐａｕｌ）ら、２００２年、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．第２０号：５０５〜５０８頁；グラバレク（Ｇｒａｂａｒｅｋ）ら、２００３年、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ第３４号：７３４〜４４頁）。
【０１６９】
ポリヌクレオチド変異体は、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの活性が実質的に減少しないような形で１つもしくはそれ以上の置換、付加、欠失及び／又は挿入を含有し得る。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの活性に対してヌクレオチド含有量の何らかのこのような改変が有する効果は一般に、本書の他の箇所で記述されているように査定可能である。変異体は、好ましくは未変性Ａ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及びＳＵＭＯ４）、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などをコードするポリヌクレオチド配列の一部分に対し、好ましくは少なくとも約７５％、７８％、８０％、８５％、８７％、８８％又は８９％の同一性、そしてより好ましくは少なくとも約９０％、９２％、９５％、９６％又は９７％の同一性を示す。同一性百分率は、当業者にとっては周知のコンピュータアルゴリズムを用いることを含めた任意の方法を用いて、標的ポリヌクレオチドの対応する部分とポリヌクレオチドの配列を比較することによって容易に判定可能である。これらのアルゴリズムとしては、Ａｌｉｇｎ又はＢＬＡＳＴアルゴリズムが含まれる（アルトシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）、１９９１年、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２１９号：５５５〜５６５頁；ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）及びヘニコフ、１９９２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８９号：１０９１５〜１０９１９頁）。
【０１７０】
一部のｓｉＲＮＡポリヌクレオチド変異体は、標的ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドの一部分と実質的に相同であり得る。これらのポリヌクレオチド変異体から誘導された１本鎖ポリヌクレオチドは、中程度にストリンジェントな条件下で、標的ポリペプチドをコードする天然に発生するＤＮＡ又はＲＮＡ配列に対しハイブリッド形成する
能力を有する。中程度にストリンジェントな条件下で標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列に対し検出可能な形でハイブリッド形成するｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが、特定の標的ポリヌクレオチドに対し相補的である少なくとも１０個の連続するヌクレオチド配列、より好ましくは１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個の連続するヌクレオチドを有し得る。一部の好ましい実施形態においては、このようなｓｉＲＮＡ配列（又はその補体）は、発現との干渉が望まれている標的ポリペプチドをコードする単一の特定のポリヌクレオチドに固有のものとなり得る。一部のその他の実施形態においては、配列（又はその補体）は、ポリペプチド発現との干渉が望まれている標的ポリペプチドをコードする２つ以上の関係するポリヌクレオチドによって共有され得る。
【０１７１】
適切な中程度にストリンジェントな条件としては、例えば、５×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ、１．０ｍＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）の溶液中でポリヌクレオチドを予備洗浄すること；５０℃〜７０℃で、５×ＳＳＣで１〜１６時間（例えば一晩中）ポリヌクレオチドをハイブリッド形成すること；そしてその後に、各々０．０５〜０．１％のＳＤＳを含有する２×、０．５×及び０．２×のＳＳＣのうちの１つもしくはそれ以上のもので２０〜４０分間２２〜６５℃で１回又は２回ポリヌクレオチドを洗浄することが含まれる。さらなるストリンジェンシーについては、ハイブリダイゼーション条件は、１５〜４０分間５０〜６０℃で０．１×ＳＳＣ及び０．１％ＳＤＳ中での付加的な洗浄を含む。当業者であれば、予備ハイブリダイゼーション、ハイブリダイゼーション及び洗浄工程のために用いられる溶液の濃度及び／又は温度、時間を改変することによってハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーの変動を達成できるということを理解することだろう。適切な条件は同様に、使用されるプローブ及びブロッティングされたプロバンド核酸試料の特定の核酸配列によっても一部左右され得る。従って、或る種のその他の発端者配列にはハイブリッド形成しない一方で１つもしくはそれ以上の或る種のプロバンド配列にはハイブリッド形成するその能力に基づいて、ポリヌクレオチドの所望の選択性が同定された時点で、過度に実験せずに、適切にストリンジェントな条件を容易に選択することができるということがわかるだろう。
【０１７２】
本発明の配列特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、複数の基準のうちの１つもしくはそれ以上のものを用いて設計可能である。例えば、問題のポリペプチドをコードする配列と同一の約２１個の連続するヌクレオチドを有するｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを設計するためには、以下の特徴のうちの１つもしくはそれ以上のものを有する約２１の塩基配列という長さにわたりポリヌクレオチド配列の読取り枠を走査することができる：すなわち（１）約１：１、ただし２：１又は１：２以下のＡ＋Ｔ／Ｇ＋Ｃ比；（２）５’末端にあるＡＡジヌクレオチドもしくはＣＡジヌクレオチド；（３）５５℃未満の内部ヘアピンループ融解温度；（４）３７℃未満のホモ二量体融解温度（（３）及び（４）で記述されている融解温度計算は、当業者にとっては既知のコンピュータソフトウェアを用いて決定可能である）；（５）その他の何らかの既知のポリヌクレオチド配列内に存在しているものとして同定されていない少なくとも１６個の連続するヌクレオチドの配列。あるいは、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列は、例えば、オリゴエンジン（ＯｌｉｇｏＥｎｇｉｎｅ）ＴＭ（ワシントン州シアトル（Ｓｅａｔｔｌｅ，Ｗａｓｈ．））；ダーマコン社（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）（コロラド州ラファイエット（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．））；アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ  Ｉｎｃ．）（テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．））；及びキアゲン社（ＱＩＡＧＥＮ，Ｉｎｃ．）（カリフォルニア州バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．））などのさまざまな供給メーカーから市販されているコンピュータソフトウェアを用いて設計及び選択され得る。エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）ら、２０００年、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ第１５号：１８８〜２００頁；エルバシールら、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ第４１１号：４９４〜９８頁も同じく参照のこと。このときｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、当該技術分野におい
て既知であり本書の他の場所で記述されている方法に従って、標的ポリペプチドの発現に干渉する能力についてテストされ得る。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの有効性の判定には、標的ポリペプチドの発現に干渉するその能力の考慮のみならずｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが宿主細胞に対して毒性をもつか否かが含まれる。例えば、所望のｓｉＲＮＡはＲＮＡ干渉活性を示すと同時に、望ましくない生物学的帰結を示さないと思われる。望ましくない生物学的帰結の例としては、宿主細胞内へのｓｉＲＮＡの導入の結果としてのその細胞死が望まれていない細胞のアポトーシスがある。
【０１７３】
本開示に基づくと、本発明のｓｉＲＮＡが異なる度合で標的ポリペプチド発現のサイレンシング化をもたらし得ることがわかるはずである。かくしてｓｉＲＮＡはまずその有効性についてテストされなくてはならない。一定の与えられたｓｉＲＮＡがもつ標的ポリペプチドの発現に干渉するか又はこれを変調する能力に基づいてそこからｓｉＲＮＡが選択される。従って、所望の標的ポリペプチドの発現に干渉する能力をもつ特異的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列の同定には、各ｓｉＲＮＡの産生及び試験が必要である。本発明において使用するための適切なｓｉＲＮＡの選択及び各ｓｉＲＮＡの試験のための方法は、本書の実施例中で充分に記されている。タンパク質発現に干渉する全てのｓｉＲＮＡが生理学的に重要な効果を有することにはならないことから、本開示は同様に、本発明のｓｉＲＮＡを用いた標的タンパク質発現との干渉レベルが臨床的に関連する意義を有するか否かを判定するためのさまざまな生理学的に関連する検定についても説明している。
【０１７４】
当業者であれば、遺伝コードの縮重の結果として、数多くの異なるヌクレオチド配列が同じポリペプチドをコードし得るということを容易に認識することになる。すなわち、アミノ酸は、複数の異なるコドンの１つによってコードされ得、当業者であれば、１つの特定のヌクレオチド配列は互いに異なり得るもののポリヌクレオチドは実際同一のアミノ酸配列をもつポリペプチドをコードすることができるということを容易に判定できる。従って、本発明では、コドン使用法が異なっているために変動するポリヌクレオチドが特定的に考慮されている。
【０１７５】
ｓｉＲＮＡのポリヌクレオチドは、特定的に望まれるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの調製のために有用であるさまざまな技術のうちのいずれかを用いて調製可能である。例えば、適切な細胞又は組織型から調製されたｃＤＮＡからポリヌクレオチドを増幅することができる。かかるポリヌクレオチドはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を介して増幅可能である。このアプローチを用いて、本書に提供されている配列に基づき配列特異的プライマが設計され、これは購入することもできるし又直接合成することもできる。プライマの増幅された部分を用いて、周知の技術を使用して適切なＤＮＡライブラリから全長遺伝子又はその所望の一部分を単離することが可能である。ライブラリ（ｃＤＮＡ又はゲノム）が、増幅に適した１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチドプローブ又はプライマを用いてスクリーニングされる。好ましくは、ライブラリは、より大きいポリヌクレオチド配列を含むようにサイズ選択される。遺伝子の５’及びその他の上流領域を同定するためにもランダムプライミングされたライブラリが好まれる可能性がある。イントロンを獲得し５’配列を拡張するためには、ゲノムライブラリが好ましい。本発明で考慮されているｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを同様に、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列のライブラリから選択することも可能である。
【０１７６】
ハイブリダイゼーション技術のためには、周知の技術を用いて、部分的ポリヌクレオチド配列を（例えばニック翻訳又は３２Ｐでの末端標識により）標識することができる。このとき、標識されたプローブを伴う変性細菌コロニーを含有するフィルタ（又はファージプラークを含有するローン）に対するハイブリダイゼーションにより、細菌又はバクテリオファージライブラリをスクリーニングすることができる（例えば、サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍａｎｕａｌ」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．）、２００１年を参照）。ハイブリッド形成用コロニー又はプラークが選択され拡張され、ＤＮＡはさらなる分析を目的として単離される。
【０１７７】
あるいは、部分的ｃＤＮＡ配列から全長コーディング配列を獲得するため、数多くの増幅技術が当該技術分野において知られている。このような技術の範囲内で、一般にＰＣＲを介して増幅が実施される。このような１つの技術は、「ｃＤＮＡ末端の高速増幅」又はＲＡＣＥとして知られている（例えば、サンブルックら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリーズ、ニューヨーク州コールド・スプリング・ハーバー、２００１年を参照）。
【０１７８】
標的ポリペプチド発現に干渉するために有用な一定数の特定的ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド配列が本書中の実施例、図面及び配列リストの中で提示されている。ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは一般に、例えば固相化学合成などを含めた当該技術分野において既知のあらゆる方法によって調製可能である。ポリヌクレオチド配列内の修飾も同様に、オリゴヌクレオチド指向の部位特異的突然変異誘発などの標準的な突然変異誘発技術を用いて導入され得る。さらに、ｓｉＲＮＡをその他の分子で化学的に修飾するか又はそれと接合させて、その安定性及び／又は送達特性を改善させることもできる。本発明の一態様として含まれているのは、本書で記述されている通りの、１つもしくはそれ以上のリボース糖が除去されたｓｉＲＮＡである。
【０１７９】
あるいは、そのＤＮＡが適切なＲＮＡポリメラーゼプロモータ（例えばＴ７、Ｕ６、Ｈ１又はＳＰ６、ただしその他のプロモータも同等に有用であり得る）と共にベクター内に取込まれることを条件として、適切なＤＮＡ配列（例えば標的ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列又はその所望の一部分）のインビトロ又はインビボ転写により、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチド分子を生成することができる。さらに、所望のｓｉＲＮＡがインビボで生成されるような形で転写（及び場合により該当するプロセッシング工程）を裏づけるＤＮＡ配列（例えば本書で提供されているような組換え型核酸構成体）がそうであり得るように、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを哺乳動物に投与することが可能である。
【０１８０】
一実施形態においては、標的ポリペプチドの発現に干渉する能力をもつｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを、サイレンシング化された細胞を生成する目的で使用することができる。一定の時間生物学的供給源と接触させられた時点で標的ポリペプチドの発現の大幅な減少を結果としてもたらすあらゆるｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが本発明に含まれる。好ましくは、減少は、ｓｉＲＮＡの不在下で検出される標的ポリペプチドの発現レベルとの関係において約１０％超、より好ましくは約２０％超、より好ましくは約３０％超、より好ましくは約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％又は約９８％超である。好ましくは、細胞内のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在により、例えば内部でのアポトーシスがＲＮＡ干渉の所望の効果ではない１つの細胞の死又はアポトーシスなどの何らかの望ましくない毒性効果が結果としてもたらされること又はひき起こされることはない。
【０１８１】
もう１つの実施形態においては、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、一定の時間生物学的供給源と接触させられた時点で標的ポリペプチドの発現の大幅な減少を結果としてもたらす。好ましくは、減少は、ｓｉＲＮＡの不在下で検出される標的ポリペプチドの発現レベルとの関係において約１０％〜２０％、より好ましくは約２０％〜３０％、より好ましくは約３０％〜４０％、より好ましくは約４０％〜５０％、より好ましくは約５０％〜６０
％、より好ましくは約６０％〜７０％、より好ましくは約７０％〜８０％、より好ましくは約８０％〜９０％、より好ましくは約９０％〜９５％、より好ましくは約９５％〜９８％である。好ましくは、細胞内のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在により望ましくない何らかの毒性効果が結果としてもたらされるか又はひき起こされるわけではない。
【０１８２】
さらにもう１つの実施形態においては、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、一定の時間生物学的供給源と接触させられた時点で標的ポリペプチドの発現の大幅な減少を結果としてもたらす。好ましくは、減少は、ｓｉＲＮＡの不在下で検出される標的ポリペプチドの発現レベルとの関係において約１０％以上、より好ましくは約２０％以上、より好ましくは約３０％以上、より好ましくは約４０％以上、より好ましくは約５０％以上、より好ましくは約６０％以上、より好ましくは約７０％以上、より好ましくは約８０％以上、より好ましくは約９０％以上、より好ましくは約９５％以上、より好ましくは約９８％以上である。好ましくは、細胞内のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの存在により望ましくない何らかの毒性効果が結果としてもたらされるか又はひき起こされるわけではない。
【０１８３】
従って、本発明は配列番号１〜３、２１〜２３及び２８〜５７の中で例示されている通りのｓｉＲＮＡのようなｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含む。配列番号１〜３及び２１〜２３は、それぞれＳＯＣＳ１のためのマウス及びヒトｓｉＲＮＡ候補配列の配列である。配列番号２８〜３３、３４〜３９、４０〜４５、４６〜５１及び５２〜５７はそれぞれＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ、ＰＩＡＳｙ及びＳＨＰ−１のためのヒトｓｉＲＮＡ候補配列の配列である。ｓｉＲＮＡの配列は、図３０の中で描かれている。
【０１８４】
本発明に包含されているその他のｓｉＲＮＡ配列としては、マウスＡ２０  ｓｉＲＮＡ：５’−ＣＡＡＡＧＣＡＣＵＵＡＵＵＧＡＣＡＧＡ−３’、配列番号５８；マウスＳＵＭＯ−１  ｓｉＲＮＡ：５’−ＧＡＵＧＵＧＡＵＵＧＡＡＧＵＵＵＡＵＣ−３’、配列番号５９；マウスＦｏｘｊ１  ｓｉＲＮＡ：５’−ＡＧＡＵＣＡＣＵＣＵＧＵＣＧＧＣＣＡＵ−３’、配列番号６０；及びマウスＴｗｉｓｔ−２  ｓｉＲＮＡ：５’−ＧＣＧＡＣＧＡＧＡＵＧＧＡＣＡＡＵＡＡ−３’、配列番号６１（Ｔｗｉｓｔ−２ｓｉＲＮＡ１）及び５’−ＣＡＡＧＡＡＡＵＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＵ−３’、配列番号６２（Ｔｗｉｓｔ−２ｓｉＲＮＡ２）が含まれる。
【０１８５】
もう１つの態様においては、本発明は所望の負の免疫調節因子にターゲティングされたｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含んでなる。好ましくは、ｓｉＲＮＡはＡ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、ＳＵＭＯ４）、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｔｗｉｓｔ−２、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ及びそれらの変異体よりなる群から選択された負の免疫調節因子にターゲティングされる。Ａ２０、ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、ＳＵＭＯ４、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｔｗｉｓｔ−２、Ｆｏｘｊ１及びＦｏｘｏ３ａのための標的配列の例はそれぞれ配列番号６３〜８４、８５〜９２、９３〜１０５、１０６〜１１２、１１３〜１２８、１２９〜１３６、１３７〜１４９、１５０〜１６１及び１６２〜１８５内で例示されている。これらのｓｉＲＮＡ標的配列の配列は図５３に描かれている。
【０１８６】
さまざまな負の免疫調節因子のためのポリヌクレオチド及びポリペプチド配列は、当業者にとって既知のコンピュータ化されたデータベースで見出すことができる。このような１つのデータベースは、米国立バイオテクノロジー情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎｂａｎｋ及びＧｅｎＰｅｐｔデータベースである。これらの既知の遺伝子についての核酸配列は、増幅され、本書に開示されている配列と組み合わされ（例えばライゲートされる）、かつ／又は本書で開示されている技術を用いて又は当業者にとって既知であると思われるあらゆる技術によって発現され得る（例えばサンブルックら、２００１年）。核酸はインビトロ発現系の中で発現され得るが、好ましい実施形態においては、核酸はインビボ
複製及び／又は発現のためのベクターを含んでなる。
【０１８７】
ｓｉＲＮＡの修飾
本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドの生成の後、当業者であれば、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドが治療用組成物としてｓｉＲＮＡを改善するように修飾され得る或る種の特徴を有することになるということを理解するだろう。従って、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドはさらに、ホスホロチオアート又はその他の連結、メチルホスホナート、スルホン、スルファート、ケチル、ホスホロジチオアート、ホスホルアミダート、リン酸エステルなどを含むようにそれを修飾することによって分解に耐えるように設計され得る（例えば、アグルワル（Ａｇｒｗａｌ）ら、１９８７年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第２８号：３５３９〜３５４２頁；ステック（Ｓｔｅｃ）ら、１９８５年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．第２６号：２１９１〜２１９４頁；  ムーディ（Ｍｏｏｄｙ）ら、１９８９年、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．第１２号：４７６９〜４７８２頁；エックスタイン、１９８９年、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．第１４号：９７〜１００頁；スタイン（Ｓｔｅｉｎ）、「Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ」中、コーエン編、Ｍａｃｍｉｌｌａｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｌｏｎｄｏｎ、９７〜１１７頁（１９８９年）参照のこと）。
【０１８８】
本発明の任意のポリヌクレオチドをさらに修飾してインビボでのその安定性を増大させることができる。考えられる修飾としては、５’及び／又は３’末端でのフランキング配列の添加；主鎖の中でのホスホジエステルではなくホスホロチオアート又は２’Ｏ−メチルの使用；及び／又はイノシン、キューオシン及びワイブトシンなどといった非伝統的塩基ならびにアセチル−、メチル−、チオ−及びその他の修飾された形態のアデニン、シチジン、グアニン、チミン及びウリジンが含まれるが、これに限定されるわけではない。
【０１８９】
ベクター
その他の関連する態様では、本発明は、インヒビターをコードする単離され核酸において、好ましくは核酸によりコードされるタンパク質の発現を導く能力を核酸がもつような形でプロモータ／調節配列を含む核酸に作動的に連結された負の免疫調節因子をインヒビター好ましくはｓｉＲＮＡが阻害する、単離核酸を含む。かくして、本発明は、サンブルックら、（２００１年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク）中及びアウスベル（Ａｕｓｕｂｅｌ）ら、（１９９７年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ）、ニューヨーク）の中で記述されているもののような細胞内の外因性ＤＮＡの同時発現を伴う細胞内への外因性ＤＮＡの導入のための発現ベクター及び方法を含む。
【０１９０】
もう１つの態様においては、本発明はｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを含んでなるベクターを含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、標的ポリペプチドの発現を阻害する能力をもち、ここで標的ポリペプチドはＡ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及びＳＵＭＯ４）、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）またはそれらの任意の組合せよりなる群から選択される。ベクター内への所望のポリヌクレオチドの取込み及びベクターの選択は例えばサンブルックら（前掲書）及びアウスベルら（前掲書）の中で記述されている通り、当該技術分野において周知である。
【０１９１】
ｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは数多くのタイプのベクターの中にクローニングされ得る。しかしながら、本発明は、いずれかの特定のベクターに限定されるものとみなされるべきではない。むしろ本発明は、当該技術分野において容易に利用可能でありかつ／又は周知である多数のベクターを包含するものと解釈されるべきである。例えば、本発明のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドは、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含めた（ただしこれに限定されるわけではない）ベクター内にクローニングされ得る。特に有利なベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター及び配列決定ベクターが含まれる。
【０１９２】
特定の実施形態においては、発現ベクターは、ウイルスベクター、細菌ベクター及び哺乳動物細胞ベクターよりなる群から選択される。上述の組成物の少なくとも一部分又は全てを含む数多くの発現ベクター系が存在する。ポリヌクレオチド又はその同族ポリペプチドを産生するのに本発明と共に使用する目的で、原核生物及び／又は真核生物ベクターをベースとした系を利用することができる。数多くのこのような系が市販され広く利用可能である。
【０１９３】
さらに、ウイルスベクターの形で細胞に対し発現ベクターを提供することができる。ウイルスベクター技術は当該技術分野において周知であり、例えばサンブルックら、（２００１年）中、及びアウスベルら（１９９７年）中及びその他のウイルス学及び分子生物学マニュアルの中で記述されている。ベクターとして有用であるウイルスとしては、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれるが、これに限定されるわけではない。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生体の中で機能する複製起点、プロモータ配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカーを含有する（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット；国際公開第０１／２９０５８号パンフレット；及び米国特許第６，３２６，１９３号明細書参照）。
【０１９４】
ｓｉＲＮＡの発現については、各プロモータ内の少なくとも１つのモジュールが、ＲＮＡ合成のための開始部位を位置づけするように機能する。これの最高の既知の例はＴＡＴＡボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモータ及びＳＶ４０遺伝子のためのプロモータなどの、ＴＡＴＡボックスが欠如している一部のプロモータ内では、開始部位自体の上にある離散的要素が、開始場所を定める働きをする。
【０１９５】
付加的なプロモータ要素すなわちエンハンサは、転写開始頻度を調節する。標準的には、これらは開始部位の上流側３０〜１１０ｂｐの領域に場所設定されるが、数多くのプロモータが開始部位の下流側にも機能的要素を含有することが近年示されてきた。プロモータ要素間の間隔どりは往々にして融通性があり、従って、要素が互いとの関係において逆転されるか又は移動された時点でプロモータ機能が保たれるようになっている。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモータにおいては、プロモータ要素間の間隔どりは、活性が衰え始める前に５０ｂｐ離隔するまで増大させることができる。プロモータに応じて、転写を活性化させるために個々の要素が協働的に又は独立して機能できると思われる。
【０１９６】
プロモータは、コーディングセグメント及び／又はエキソンの上流側にある５’非コーディング配列を単離することにより得ることができるような、遺伝子又はポリヌクレオチド配列と天然に会合されたものであり得る。このようなプロモータは「内因性」プロモータと呼ぶことができる。同様にして、エンハンサは、その配列の下流側又は上流側のいずれかに位置設定されたポリヌクレオチド配列と天然に会合されたものであり得る。あるいは、通常はその天然の環境においてポリヌクレオチド配列と会合されていないプロモータを意味する組換え型又は非相同プロモータの制御下にコーディングポリヌクレオチドセグ
メントを位置づけすることによって、一部の利点が得られることになる。組換え型又は非相同エンハンサは同様に、通常はその天然の環境においてポリヌクレオチド配列と会合されていないエンハンサを意味する。このようなプロモータ又はエンハンサとしては、その他の遺伝子のプロモータ及びエンハンサ、及びその他のあらゆる原核生物、ウイルス又は真核生物細胞から単離されたプロモータ又はエンハンサ、及び「天然発生の」ものでない、すなわち異なる転写調節領域の異なる要素及び／又は発現を改変させる突然変異を含有するプロモータ又はエンハンサが含まれ得る。プロモータ及びエンハンサの核酸配列を合成的に産生させることに加えて、本書で開示されている組成物と関連させてＰＣＲＴＭを含めた組換え体クローニング及び／又は核酸増幅技術を用いて配列を産生させることも可能である（米国特許第４，６８３，２０２号明細書、米国特許第５，９２８，９０６号明細書）。さらに、ミトコンドリア、葉緑体などといった非核オルガネラの内部での配列の転写及び／又は発現を導く制御配列も同様に利用可能であると考えられている。
【０１９７】
当然のことながら、発現のために選ばれた細胞型、オルガネラ及び生体内でＤＮＡセグメントの発現を有効に導くプロモータ及び／又はエンハンサを利用することが重要になる。分子生物学の当業者は一般に、タンパク質の発現のためのプロモータ、エンハンサ及び細胞型の組合せをいかに使用するかを知っている。例えばサンブルックら、（２００１年）を参照のこと。利用されるプロモータは、組換え型タンパク質及び／又はペプチドの大規模産生において有利であるような、導入されたＤＮＡセグメントの高レベル発現を導くために適切な条件下で有用でありかつ／又は構成性、組織特異的、誘発型であり得る。プロモータは非相同的又は内因性であり得る。
【０１９８】
本書に提示されている実験例の中で例示されているプロモータ配列は、初前期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ配列である。このプロモータ配列は、作動的に連結されたあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動する能力をもつ強い構成性プロモータ配列である。しかしながら、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）早期プロモータ、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長末端反復（ＬＴＲ）プロモータ、モロニーウイルスプロモータ、トリ白血病ウイルスプロモータ、エプスタイン・バーウイルス初前期プロモータ、ラウス肉腫ウイルスプロモータならびにヒト遺伝子プロモータ例えば（ただしこれに限定されるわけではない）アクチンプロモータ、ミオシンプロモータ、ヘモグロビンプロモータ及び筋肉クレアチンプロモータを含めた（ただしこれに限定されるわけではない）その他の構成性プロモータ配列も同様に使用可能である。さらに、本発明は、構成性プロモータの使用に限定されるべきではない。本発明の一部分として誘発性プロモータも同様に考慮されている。本発明における誘発性プロモータの使用は、発現が望まれる場合に作動的に連結されているポリヌクレオチド配列の発現をオンに切換え、発現が望ましくない場合発現をオフに切換えることのできる分子スイッチを提供する。誘発性プロモータの例としては、メタロチオニンプロモータ、グルココルチコイドプロモータ、プロゲストロンプロモータ及びテトラサイクリンプロモータが含まれるが、これに限定されるわけではない。さらに、本発明は、所望の組織内のみで活性である組織特異的プロモータの使用を含む。組織特異的プロモータは、当該技術分野において周知であり、ＨＥＲ−２プロモータ及びＰＳＡ関連プロモータ配列がこれに含まれるが、これに限定されるわけではない。
【０１９９】
ｓｉＲＮＡの発現を査定するため、１つの細胞中に導入すべき発現ベクターは同様に、ウイルスベクターの同定及び選択を容易にするべく選択可能なマーカー遺伝子又はリポータ遺伝子のいずれか又はその両方をも含有することができる。その他の実施形態においては、選択可能なマーカーは、別のＤＮＡ片上に担持され、同時トランスフェクション手順内で使用され得る。選択可能なマーカー及びリポータ遺伝子の両方共が、宿主細胞内での発現を可能にするため適切な調節配列でフランキングされ得る。当該技術分野においては有用な選択可能なマーカーが知られており、例えばｎｅｏなどといった抗生物質耐性遺伝
子が含まれる。
【０２００】
潜在的にトランスフェクションを受けた細胞を同定するため及び調節配列の機能性を評価するために、リポータ遺伝子が使用される。容易に検定可能なタンパク質についてコードするリポータ遺伝子は当該技術分野において周知である。一般に、リポータ遺伝子は、レシピエント生体又は組織の中に存在しないか又はそれらにより発現されず、例えば酵素活性などのいくつかの容易に検出可能な特性によってその発現が明らかになるタンパク質をコードする遺伝子である。リポータ遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞内に導入されてから適切な時間後に検定される。
【０２０１】
適切なリポータ遺伝子としては、ルシフェラーゼ、ベーターガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌されたアルカリホスファターゼをコードする遺伝子又は緑色螢光タンパク質遺伝子が含まれ得る（例えば、ウイ・テイ（Ｕｉ−Ｔｅｉ）ら、２０００年、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．第４７９号：７９〜８２頁参照）。適切な発現系は周知であり、周知の技術を用いて調製されるか又は商業的に入手可能である。内部欠失構成体は、固有内部制限部位を用いて、又は非固有制限部位の部分的消化より生成され得る。構成体はこのとき、高レベルのｓｉＲＮＡポリヌクレオチド及び／又はポリペプチド発現を標示する細胞内にトランスフェクトされ得る。一般に、リポータ遺伝子の最高レベルの発現を示す最小限の５’フランキング領域を伴う構成体は、プロモータとして同定される。このようなプロモータ領域はリポータ遺伝子に連結され、プロモータ駆動型転写を変調させる能力について作用物質を評価するのに用いられ得る。
【０２０２】
サイレンシング化された免疫細胞の生成
一実施形態においては、本発明は、細胞内に負の免疫調節因子のインヒビターを発現させるための細胞ベースの系を提供している。細胞ベースの系は、「サイレンシング化された細胞」を意味し、細胞とインヒビターを発現するための発現ベクターを含んでなる。しかしながら、本発明は、発現ベクターを含んでなる細胞に限定されず、むしろ本発明のサイレンシング化された細胞は、本発明のあらゆるタイプのインヒビター、すなわち化学合成されたｓｉＲＮＡで修飾された細胞を含むものとして解釈されるべきである。いずれにせよ、インヒビターを含んでなるサイレンシング化された細胞は、その他の点では同一であるもののこのようにインヒビターでのサイレンシング化を受けていない細胞に比べて高い免疫能力を有している。サイレンシング化された細胞は、単独で又はその他の療法と組合せた形で、哺乳動物のレシピエントに投与するのに適している。
【０２０３】
本発明は、負の免疫調節因子のインヒビターを含む細胞を含む。一態様においては、インヒビターは、Ａ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及びＳＵＭＯ４）、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２）などのうちの少なくとも１つを阻害する能力を有する。一態様においては、細胞は、インヒビターをコードするポリヌクレオチドを含んでなるベクターでのトランスフェクションを受けることができる。ポリヌクレオチドは細胞内に組込まれている必要はない。もう１つの態様においては、細胞がベクターによるトランスフェクションを受けている必要は全くなく、むしろ、細胞はベクターから発現されないインヒビターに曝露される。かかるインヒビターの一例は、化学的に合成されたｓｉＲＮＡである。
【０２０４】
発現ベクターに関連して、ベクターは、当該技術分野のいずれかの方法により、例えば哺乳動物、細菌、酵母又は昆虫の細胞といった宿主細胞内に容易に導入され得る。例えば発現ベクターは、物理的、化学的又は生物学的手段により宿主細胞内に移入され得る。本
発明のポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターの導入が、負の免疫調節因子との関係においてサイレンシング化された細胞を生み出すということは容易に理解できる。
【０２０５】
宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈降、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、電気穿孔などが含まれる。ベクター及び／又は外因性核酸を含んでなる細胞を産生するための方法は、当該技術分野において周知である。例えばサンブルックら、（２００１年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク）及びアウスベルら、（１９９７年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク）中を参照のこと。
【０２０６】
宿主細胞内に有利なポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法としては、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用が含まれる。ウイルスベクター特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物例えばヒトの細胞内に遺伝子を挿入するための最も広く用いられている方法となっている。その他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス及びアデノ関連ウイルスなどから誘導可能である。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書及び第５，５８５，３６２号明細書を参照のこと。
【０２０７】
宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段には、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含めた脂質ベースの系などのコロイド分散系が含まれる。インビトロ及びインビボでの送達ビヒクルとして使用するための好ましいコロイド系が、リポソーム（すなわち人工膜小胞）である。かかる系の調製及び用途は、当該技術分野において周知である。
【０２０８】
宿主細胞内へ外因性核酸を導入するか又はその他の形で細胞を本発明のインヒビターに曝露して宿主細胞内の組換え型ＤＮＡ配列の存在を確認するのに用いられる方法の如何に関わらず、さまざまな検定を実施することができる。かかる検定には、例えば、サザン及びノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲなどの当業者にとって周知の「分子生物学」検定；例えば本発明の範囲内に入る作用物質を同定するための本書で記述された検定によってか又は免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット）によって特定のペプチドの有無を検出することなどの「生化学的」検定が含まれる。
【０２０９】
サイレンシング化された細胞を生成するためには、インビトロ又はインビボで免疫細胞まで所望のｓｉＲＮＡポリヌクレオチドを移送するべく、任意のＤＮＡベクター又は送達ビヒクルを利用することができる。非ウイルス送達系が利用される場合、好ましい送達ビヒクルはリポソームである。従って、上述の送達系及びプロトコルは、「Ｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、第２版、１〜３５頁（２００２年）及び「Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ」、第７巻、マリー（Ｍｕｒｒａｙ）編、８１〜８９頁（１９９１年）の中に見出すことができる。
【０２１０】
宿主細胞内に（インビトロ、エクスビボ又はインビボで）本発明の負の免疫調節因子のインヒビターを導入するために、脂質処方物の使用が考慮されている。本発明の特定の実施形態においては、インヒビターを脂質と会合させることが可能である。脂質と会合したインヒビターは、リポソームの水性内部の中にカプセル化されるか、リポソームの脂質２重層内に散在させられるか、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの両方と会合させられた連結用分子を介してリポソームに付着させられるか、リポソーム内に取り込まれるか、リ
ポソームと複合されるか、脂質を含有する溶液中に分散されるか、脂質と混合されるか、脂質と組み合わされるか、脂質内に懸濁物として含有されるか、ミセルと共に含有されるか複合されるか複合されるか又はその他の形で脂質と会合させられ得る。本発明の脂質、脂質／ｓｉＲＮＡ又は脂質／発現ベクター会合組成物は、溶解状態の任意の特定の構造に限定されない。例えば、２重層構造内で、ミセルとして、又は「崩壊した」構造を伴って存在し得る。これらは又単に溶液中に散在させられ、場合によってはサイズ的又は形状的に均一でない凝集体を形成し得る。
【０２１１】
脂質は、天然発生の又は合成の脂質であり得る脂肪性物質である。例えば、脂質には、細胞質内に天然に発生する脂肪性液滴ならびに、長鎖脂肪族炭化水素及びその誘導体を含有する、当業者にとって周知の化合物の種類、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール及びアルデヒトが含まれる。
【０２１２】
本発明に係るリポソームを調製するために、リン脂質を使用することができ、これは、正味の正電荷、負電荷又は中性電荷を担持し得る。リポソーム上に負電荷を付与するためにはリン酸ジアセチルを利用することができ、リポソーム上に正電荷を付与するためには、ステアリルアミンを使用することができる。リポソームは、１つもしくはそれ以上のリン脂質からできている可能性がある。
【０２１３】
中性荷電脂質は、無電荷の脂質、実質的に非荷電の脂質又は正と負の電荷を同数有する脂質混合物を含んでなり得る。適切なリン脂質には、当業者にとって周知であるホスファチジルコリン及びその他は含まれる。
【０２１４】
本発明に従って用途に適した脂質は、商業的供給源から入手可能である。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）はシグマ・ケミカル・カンパニー（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）（ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から入手可能であり、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）はＫアンドＫラボラトリーズ（Ｋ  ＆  Ｋ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（ニューヨーク州プレインビュー（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ））から入手され；コレステロール（「Ｃｈｏｌ」）はカルビオケム・ベーリング（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｂｅｈｒｉｎｇ）から入手され；ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）及びその他の脂質はアヴァンティ・ポーラー・リピズ社（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．）（アラバマ州バーミングハム（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＡＬ））から入手され得る。クロロホルム又はクロロホルム／メタノール中の脂質の原液は約−２０℃で貯蔵できる。好ましくは、メタノールよりも容易に蒸発することから、クロロホルムが唯一の溶媒として用いられる。
【０２１５】
卵又は大豆ホスファチジルコリン、脳ホスファチジン酸、脳又は植物ホスファチジルイノシトール、心臓カルジオリピン及び植物又は細菌ホスファチジルエタノールアミンなどの天然供給源由来のリン脂質は、結果として得られるリポソームが不安定であり漏出しやすいことから、一次ホスファチドすなわち全ホスファチド組成物の５０％以上を構成するホスファチドとしては好ましくは使用されない。
【０２１６】
「リポソーム」というのは、封入された脂質２重層又は凝集体の生成によって形成されるさまざまな単一及び多重膜脂質ビヒクルを包含する包括的用語である。リポソームは、リン脂質２重層膜及び内部水性媒質を伴う小胞状構造をもつものとして特徴づけされ得る。多重膜リポソームは、水性媒質により分離された多重脂質層を有する。これらは、リン脂質が過剰な水溶液中に懸濁させられている場合に自然に形成する。脂質構成要素は、閉鎖構造の形成前に自己再配置を受け、脂質２重層の間に水及び溶解した溶質をカプセル化する（ゴッシュ（Ｇｈｏｓｈ）及びバチャワット（Ｂａｃｈｈａｗａｔ）、１９９１年）。しかしながら、本発明はまた、通常の小胞状構造と異なる溶解状態の構造を有する組成
物をも包含する。例えば、脂質は、ミセル構造をとることもでき、又単に脂質分子の不均一な凝集体として存在することもできる。同様に考慮されているのは、リポフェクタミン−核酸複合体である。
【０２１７】
リン脂質は、脂質対水のモル比に応じて、水中に分散された場合にリポソーム以外のさまざまな構造を形成することができる。低い比率では、リポソームは好ましい構造である。リポソームの物理的特徴は、ｐＨ、イオン強度及び／又は２価のカチオンの存在に左右される。リポソームはイオン及び／又は極性物質に対する低い浸透性を示し得るが、高温では、その浸透性を著しく改変する相転移を受ける。相転移には、ゲル状態として知られる密に詰まった秩序構造から流体状態として知られる緩く詰まったあまり秩序立っていない構造までが関与する。これは、特徴的な相転移温度で起こり、かつ／又はイオン、糖及び／又は薬物への浸透性の増加を結果としてもたらす。
【０２１８】
リポソームは、４つの異なる機序すなわちマクロファージ及び／又は好中球などの細網内皮系の食細胞によるエンドサイトーシス；非特異的弱疎水性及び／又は静電気力、及び／又は細胞−表面構成要素との特異的相互作用のいずれかによる細胞表面への吸着；細胞質内へのリポソームの中味の同時放出を伴う、原形質膜内へのリポソームの脂質２重層の挿入によるプラズマ細胞膜との融合；及び／又はリポソームの中味の会合無しの、細胞及び／又は細胞内膜へのリポソーム脂質の移送及び／又はその逆によるもの、といった機序を介して細胞と相互作用する。リポソーム処方を変動させることにより、どの機序が作動状態にあるかを改変させることができるが、２つ以上が同時に作動することもできる。
【０２１９】
インビトロでの外来性ＤＮＡの発現及びリポソーム媒介型オリゴヌクレオチド送達はきわめて好首尾であった。ウォン（Ｗｏｎｇ）ら、（１９８０年）は、培養されたニワトリ胚、ＨｅＬａ及びヘパトーマ細胞内での外来性ＤＮＡの発現及びリポソーム媒介型送達の実現可能性を実証した。ニコラウ（Ｎｉｃｏｌａｕ）ら、（１９８７年）は、静脈注射後にラット内でリポソーム媒介型遺伝子移入の成功を収めた。
【０２２０】
本発明の一部の実施形態においては、脂質は、センダイウイルス（ＨＶＪ）と会合され得る。これは、細胞膜との融合を容易にし、リポソームカプセル化ＤＮＡの細胞進入を促進するということが示されてきた（カネダ（Ｋａｎｅｄａ）ら、１９８９年）。その他の実施形態においては、脂質は、核非ヒストン染色体タンパク質（ＨＭＧ−１）と複合又は併用され得る（カトー（Ｋａｔｏ）ら、１９９１年）。さらにもう１つの実施形態においては、脂質は、ＨＶＪ及びＨＭＧ−１の両方と複合されるか又は併用され得る。このような発現ベクターがインビトロ及びインビボでのオリゴヌクレオチドの移入及び発現においてうまく利用されてきたことから、今度はそれらを本発明のために応用することができる。細菌プロモータがＤＮＡ構成体において利用される場合には、リポソーム内部に適切な細菌ポリメラーゼを含み入れることも望ましくなる。
【０２２１】
本発明に従って用いられるリポソームは、異なる方法で作ることができる。リポソームのサイズは、合成方法によって変動する。水溶液中に懸濁されたリポソームは一般に、脂質２重層分子の１つもしくはそれ以上の同心層を有する球形小胞の形をしている。各層は、Ｘが親水性部分でありＹが疎水性部分であるものとして構造式ＸＹで表わされる分子の平行な列からなる。水性懸濁液中では、同心層は、親水性部分が水相と接触した状態にとどまる傾向をもちかつ疎水性領域が自己会合する傾向をもつように配置されている。例えば、リポソーム内部及びリポソーム限外の両方で水相が存在する場合、脂質分子は、ＸＹ−ＹＸという配置のラメラとして知られる２重層を形成し得る。２つ以上の脂質分子の親水性及び疎水性部分が互いに会合状態となった時点で、脂質凝集体が形成し得る。これらの凝集体のサイズ及び形状は、溶媒の性質及び溶液中のその他の化合物の存在などの数多くの異なる変数により左右されることになる。
【０２２２】
本発明の範囲内に入るリポソームは、既知の実験室技術に従って調製可能である。１つの好ましい実施形態においては、例えばガラス、梨形フラスコといったコンテナの中で溶媒中にリポソーム脂質を混合することにより、リポソームが調製される。コンテナは、予想されるリポソーム懸濁液の体積より１０倍大きい体積を有するべきである。回転蒸発器を用いて、負の圧力下にて約４０℃で溶媒が除去される。溶媒は通常、リポソームの所望の体積に応じて約５分乃至２時間以内に除去される。組成物は、さらに真空下のデシケータ内で乾燥され得る。乾燥された脂質は一般に、経時的に劣化する傾向があることから、約一週間後に処分される。
【０２２３】
乾燥した脂質は、全ての脂質薄膜が再懸濁させられるまで振とうすることにより、無菌で発熱物質を含まない水中で約２５〜５０ｍＭのリン脂質にて水和させることができる。このとき、リポソーム水をアリコートに分離し、各々バイアル内に置き、凍結乾燥させ、真空下で密封することができる。
【０２２４】
代替案としては、リポソームをその他の既知の実験室手順、すなわちその内容が本発明に参照により援用されているバンガム（Ｂａｎｇｈａｍ）ら、（１９６５年）の方法；その内容が本発明に参照により援用されている「Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ」、Ｇ．グレゴリアディス（Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ）編、（１９７９年）、２８７〜３４１頁に記述されている通りのグレゴリアディスの方法；その内容が本発明に参照により援用されている「ｔｈｅ  ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  Ｄｅａｍｅｒ  ａｎｄ  Ｕｓｔｅｒ」、１９８３年；及びスゾカ（Ｓｚｏｋａ）及びパパハジョポウロス（Ｐａｐａｈａｄｊｏｐｏｕｌｏｓ）、１９７８年により記述されている通りの逆相蒸発方法に従って調製することができる。上述の方法は、水性材料を封入するそのそれぞれの能力及びそのそれぞれの水空間対脂質比に関して異なっている。
【０２２５】
上述の通りに調製された凍結乾燥されたリポソーム又は乾燥した脂質は、脱水され阻害性ペプチドの溶液中で戻され、適当な溶媒、例えばＤＰＢＳで適切な濃度まで希釈され得る。次に、混合物は、渦流ミキサー内で激しく振とうされる。未封入の核酸は、２９，０００×ｇでの遠心分離により除去され、リポソームペレットは、洗浄される。洗浄されたリポソームは、例えば約５０〜２００ｍＭといった適切な総リン脂質濃度で再懸濁される。封入された核酸の量は、標準的な方法に従って決定可能である。リポソーム調製物中に封入された核酸の量を判定した後、リポソームを適切な濃度まで希釈し、使用まで４℃で貯蔵することができる。
【０２２６】
活性化（パルス）を受けた免疫細胞の生成
本発明は、曝露されるか又はその他の形で抗原での「パルスを受け」、抗原により活性化された細胞を含む。例えば、ＡＰＣは抗原の存在下でのエクスビボ培養によってインビトロで又は抗原に対する曝露によりインビボでＡｇ負荷された状態となり得る。
【０２２７】
当業者であれば同様に、ＡＰＣの表面上でのその抗原の提示を促進するのに充分な時間ＡＰＣを抗原に曝露するような形でＡＰＣを「パルス」することができる、ということも容易に理解するものと思われる。例えば、ＡＰＣは、抗原ペプチドとして知られる小ペプチドフラグメントが直接ＡＰＣの外側に「パルス」されるような形で抗原に曝露され得（メヘタ・ダマニ（Ｍｅｈｔａ−Ｄａｍａｎｉ）ら、１９９４年）；そうでなければＡＰＣは、後でＡＰＣにより摂取されることになる全タンパク質又はタンパク質粒子と共にインキュベートされ得る。これらの全タンパク質は、ＡＰＣにより小ペプチドフラグメント内に消化され、場合によってはＡＰＣ表面まで搬送されその上に提示される（コーエンら、１９９４年）。ペプチド形態の抗原が、本書で記述されている標準的「パルス」技術によって細胞に対し曝露され得る。
【０２２８】
特定の理論により束縛されることは望まないが、外来性の抗原又は自己抗原の形をした抗原は、抗原の免疫原性形態を保持する目的で、本発明のＡＰＣによりプロセッシングされる。抗原の免疫原性形態は、例えばＴ細胞といった免疫細胞により認識され得この細胞を刺激する抗原の一形態を産生する目的でのフラグメント化を通した抗原のプロセッシングを暗に意味している。好ましくは、かかる外来性又は自己抗原は、ＡＰＣによりペプチドへとプロセッシングされるタンパク質である。ＡＰＣにより産生される関連性あるペプチドは、免疫原性組成物として使用するために抽出され精製され得る。ＡＰＣによりプロセッシングされたペプチドは同様に、ＡＰＣによりプロセッシングされたタンパク質に対する寛容を誘発するのに使用することもできる。
【０２２９】
自己免疫疾患は、自己抗原として別途知られている「自己タンパク質」すなわち、１つの個体の中に存在する又はその中で内因性である自己抗原に対し免疫応答が向けられていることの結果としてもたらされると考えられている。自己免疫応答において、これらの「自己タンパク質」はＴ細胞に提示され、こうしてＴ細胞は「自己反応性」を付与される。本発明の方法に従うと、ＡＰＣは、関連性ある「自己ペプチド」を産生するべく抗原でのパルスを受ける。関連性ある自己ペプチドは、ＭＨＣ産物がきわめて多型であり各々の個々のＭＨＣ分子が異なるペプチドフラグメントと結合する可能性があることから、各個体について異なっている。このとき「自己ペプチド」及びサイトカインシグナリングのインヒビターのアゴニストを用いて、競合するペプチドを設計するか又は治療を必要とする個体の中で自己タンパク質に対する寛容を誘発することができる。
【０２３０】
本発明の「パルスを受けたＡＰＣ」としても別途知られている抗原活性化されたＡＰＣは、インビトロ又はインビボのいずれかで抗原に対してＡＰＣを曝露することによって産生される。ＡＰＣがインビトロでパルスを受ける場合、ＡＰＣは、培養皿上で平板固定され、抗原がＡＰＣに結合できるのに充分な時間、充分な量で抗原に曝露される。ＡＰＣに対する抗原の結合を達成するのに必要な量及び時間は、当該技術分野において既知の又は本書中にその他の形で開示されている方法を使用することにより判定され得る。抗原に対する曝露の後のＡＰＣ上の抗原の存在を検出するために、例えば免疫検定又は結合検定といった当業者にとって既知のその他の方法を使用することも可能である。
【０２３１】
本発明のさらなる実施形態においては、ＡＰＣによる特異的タンパク質に発現を可能にするベクターでＡＰＣをトランスフェクトすることができる。このとき、ＡＰＣにより発現されるタンパク質をプロセッシングし、ＭＨＣレセプタ上の細胞表面上で提示することができる。トランスフェクションを受けたＡＰＣはこのとき、ベクターによりコードされたタンパク質に対する免疫応答を生成するための免疫原性組成物として使用することができる。
【０２３２】
本書のその他の場所で論述されているように、ベクターは、免疫原性応答が望まれるタンパク質をコードし発現する特異的ポリヌクレオチドを含むように調製され得る。好ましくは、細胞を感染させるために、レトロウイルスベクターが使用される。より好ましくは、細胞を感染させるためにアデノウイルスベクターが使用される。
【０２３３】
本発明のもう１つの実施形態においては、ＡＰＣ上のレセプタにより認識されるタンパク質又はその一部分をコードするべくウイルスベクターを修飾することによってベクターをＡＰＣにターゲティングすることができ、かくしてベクターによるＡＰＣレセプタの占有はウイルスベクターの核酸によりコードされる抗原のプロセッシング及び提示を可能にすることになる。ウイルスにより送達される核酸は、ＡＰＣ上にて発現された時点でウイルスタンパク質をコードしこれらのウイルスタンパク質が次にプロセッシングされＡＰＣのＭＨＣレセプタ上で提示されることになるようなウイルスに天然のものである。
【０２３４】
本書の他の箇所で論述した通り、宿主細胞内にポリヌクレオチドをトランスフェクトするためにさまざまな方法を使用することができる。本方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、電気穿孔、コロイド分散系（すなわち、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ及び水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含めた脂質ベース系）が含まれるがこれに限定されるわけではない。
【０２３５】
もう１つの態様においては、抗原をコードするポリヌクレオチドを発現ベクター内にクローニングでき、ベクターをＡＰＣ内に導入してその他の形で活性化ＡＰＣを生成することができる。細胞内に核酸を導入するさまざまなタイプのベクター及び方法が、本書の中の他の箇所で論述されている。例えば、当該技術分野におけるあらゆる方法により宿主細胞内に、抗原をコードするベクターを導入することができる。例えば、物理的、化学的又は生物学的手段により宿主細胞内に発現ベクターを移入することができる。例えばサンブルックら、（２００１年、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー、ニューヨーク）、及びアウスベルら、（１９９７年、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」、ジョン・ウィリー・アンド・サンズ、ニューヨーク）中を参照のこと。抗原をコードするポリヌクレオチドを含んでなる発現ベクターの導入が、パルスを受けた細胞を生み出す、ということは容易に理解される。
【０２３６】
本発明は、タンパク質、ｃＤＮＡ又はｃＲＮＡの形をした全抗原をＡＰＣに負荷することを含めた（ただしこれに限定されるわけではない）、ＡＰＣをパルスするためのさまざまな方法を含む。しかしながら、本発明は、ＡＰＣをパルスするために用いられる抗原の特定の形態に限定されるものとして解釈されるべきではない。むしろ、本発明は、抗原負荷されたＡＰＣを生成するための当該技術分野において既知のその他の方法をも包含している。好ましくは、ＡＰＣは、規定された抗原をコードするｍＲＮＡでのトランスフェクションを受ける。その配列が既知である遺伝子産物に対応するｍＲＮＡは、適切なプライマ及び転写反応と合わせた逆転写酵素−ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を用いてインビトロで急速に生成することが可能である。ｍＲＮＡでのＡＰＣのトランスフェクションは、パルスを受けたＡＰＣを生成するためのその他の抗原負荷技術に比べて１つの利点を提供する。例えば、微細な量の組織すなわち腫瘍組織からＲＮＡを増幅する能力は、数多くの患者に対するワクチン接種向けにＡＰＣの用途を拡大する。
【０２３７】
抗原は、ウイルス、真菌又は細菌に由来するものであり得る。抗原は、感染性疾患、癌、自己免疫疾患よりなる群から選択された疾病に結びつけられた抗原又は自己抗原であり得る。
【０２３８】
１つの抗原組成物がワクチンとして有用であるためには、その抗原組成物は、細胞、組織又は哺乳動物（例えばヒト）の中で抗原に対する免疫応答を誘発しなければならない。本書で使用される「免疫学的組成物」は、抗原（例えばペプチド又はポリペプチド）、抗原をコードする核酸（例えば抗原発現ベクター）、抗原又は細胞組成物を発現又は提示する細胞を含んでなる。特定の実施形態においては、抗原組成物は、本書に記述されているあらゆる抗原の全て又は一部分又はその免疫学的機能的等価物を含んでなるか又はコードする。その他の実施形態においては、抗原組成物は、付加的な免疫刺激性作用物質又はかかる作用物質をコードする核酸を含んでなる混合物の中にある。免疫刺激性作用物質には、付加的な抗原、免疫調節薬、抗原提示細胞又はアジュバンドが含まれるが、これに限定されるわけではない。その他の実施形態においては、付加的な作用物質のうちの１つもしくはそれ以上のものは、あらゆる組合せで抗原又は免疫刺激性作用物質に共有結合されている。一部の実施形態においては、抗原組成物はＨＬＡアンカーモチーフアミノ酸に接合
されるか又はこれを含んでなる。
【０２３９】
本発明のワクチンは、その核酸及び／又は細胞組成物の組成において変動し得る。限定的意味のない例においては、抗原をコードする核酸を、アジュバンドと共に処方することもできる。当然のことながら、本書で記述するさまざまな組成物がさらに付加的な組成物を含み得るということも理解できるだろう。例えば、脂質又はリポゾームの中には、１つもしくはそれ以上のワクチン組成物が含まれ得る。もう１つの限定的な意味のない例では、ワクチンが１つもしくはそれ以上のアジュバンドを含んでなる可能性がある。本発明のワクチン及びそのさまざまな構成要素は、本書で開示されているあらゆる方法によって、又は本開示に照らして当業者にとって既知のものとなるように、調製及び／又は投与可能である。
【０２４０】
本発明の抗原組成物は、固相合成による化学合成及びＨＰＬＣによる化学反応のその他の生成物からの精製、又はインビトロ翻訳系内又は生きた細胞内での本発明の抗原を含むペプチド又はポリペプチドをコードする核酸配列（例えばＤＮＡ配列）の発現による産生を含めた（ただしこれに限定されるわけではない）当該技術分野において周知の方法により作ることができるということがわかっている。さらに、抗原組成物は、生体試料から単離された細胞組成物を含んでなり得る。好ましくは、抗原組成物は、単離され１つもしくはそれ以上の望ましくない低分子量分子を除去するべく大規模に透析されかつ／又はより容易に所望のビヒクルへと処方されるよう凍結乾燥される。さらに、ワクチン組成物中で作られる（行なわれる）付加的なアミノ酸、突然変異、化学的修飾などがある場合、これらは、好ましくはエピトープ配列の抗体認識と実質的に干渉しないということもわかっている。
【０２４１】
本発明の１つもしくはそれ以上の抗原決定因子に対応するペプチド又はポリペプチドは、一般に長さが少なくとも５個又は６個のアミノ酸でなければならず、最高約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５又は約５０個などの残基を含有し得る。ペプチド配列は、例えばアプライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州フォスターシティー）から入手可能なものなどの自動ペプチド合成機を用いたペプチド合成などの当業者にとっては既知の方法によって合成可能である。
【０２４２】
組換え型手段などにより、さらに長いペプチド又はポリペプチドを調製することもできる。一部の実施形態においては、例えば、本発明のさまざまな組成物及び方法のためにインビトロ又はインビボで抗原組成物を生産する目的で、本書に記述されている抗原組成物及び／又は構成要素をコードする核酸を使用することが可能である。例えば、一部の実施形態では、抗原をコードする核酸が、例えば組換え型細胞内のベクター内に含まれる。抗原配列を含んでなるペプチド又はポリペプチドを産生するために核酸を発現することが可能である。ペプチド又はポリペプチドは細胞から分泌され得るか又は細胞の一部として又は細胞の内部に含まれ得る。
【０２４３】
一部の実施形態においては、抗原をコードする核酸で哺乳動物をトランスフェクトするか又は接種することにより、免疫応答を促進することができる。このとき、標的哺乳動物の内部に含まれた１つもしくはそれ以上の細胞が、哺乳動物に対する核酸の投与後核酸によりコードされる配列を発現する。ワクチンは同様に、例えば１つの抗原のペプチド又はポリペプチド配列の全て又は一部分をコードする核酸（例えばｃＤＮＡ又はＲＮＡ）の形をしていてもよい。核酸によるインビボでの発現は例えば、プラスミド型ベクター、ウイルスベクター又はウイルス／プラスミド構成体ベクターによるものであり得る。
【０２４４】
好ましい態様では、核酸は、適切な抗原をコードする配列の全て又は一部分をコードするコーディング領域又はその免疫学的に機能的な等価物を含んでなる。当然のことながら
、核酸は、１つもしくはそれ以上の免疫調節薬又はアジュバンドを含んでなるものを含めた（ただしこれに限定されるわけではない）付加的な配列を含んでなるかつ／又はコードすることができる。
【０２４５】
腫瘍関連抗原
本発明に関連して「腫瘍抗原」又は「過剰増殖性障害抗原」又は「過剰増殖性障害と結びつけられる抗原」という用語は、特定の過剰増殖性障害に共通の抗原を意味する。一部の態様においては、本発明の過剰増殖性障害抗原は、原発性又は転移性悪性黒色腫、胸腺腫、リンパ腫、肉腫、肺癌、肝臓癌、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、白血病、子宮癌、子宮頚癌、膀胱癌、腎臓癌及び腺癌、例えば乳癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌などを含めた（ただしこれに限定されるわけではない）癌に由来する。
【０２４６】
一実施形態においては、本発明の腫瘍抗原は、哺乳動物の癌腫瘍に由来する腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）によって免疫学的に認識される１つもしくはそれ以上の抗原癌エピトープを含んでなる。
【０２４７】
悪性腫瘍は、免疫攻撃のための標的抗原として役立ち得る一定数のタンパク質を発現する。これらの分子は、黒色腫におけるＭＡＲＴ−１、チロシナーゼ及びＧＰ−１００及び前立腺癌における前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）及び前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）などの組織特異的抗原を含むが、これに限定されるわけではない。その他の標的分子は、癌遺伝子ＨＥＲ−２／Ｎｅｕ／ＥｒｂＢ−２などの形質転換関連分子のグループに属する。さらにもう１つの標的抗原グループは、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの腫瘍胎児抗原である。Ｂ細胞リンパ腫においては、腫瘍特異的イディオタイプ免疫グロブリンは個々の腫瘍に固有の真に腫瘍特異的な免疫グロブリン抗原を構成する。ＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ３７などのＢ細胞分化抗原は、Ｂ細胞リンパ腫における標的抗原のためのその他の候補である。これらの抗原のいくつか（ＣＥＡ、ＨＥＲ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、イディオタイプ）が、モノクローナル抗体での受動免疫療法のための標的として使用され、或る程度の成功を収めた。
【０２４８】
腫瘍抗原及びその抗原癌エピトープは、一次臨床分離株、細胞系列などといった天然の供給源から精製及び単離され得る。癌ペプチド及びその抗原エピトープは、当該技術分野において既知の化学合成又は組換え型ＤＮＡ技術によっても得られ得る。化学合成のための技術はスチュワード（Ｓｔｅｗａｒｄ）ら、（１９６９年）；ボダンスキー（Ｂｏｄａｎｓｋｙ）ら、（１９７６年）；マイエンホッファー（Ｍｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）（１９８３年）；及びシュローダー（Ｓｃｈｒｏｄｅｒ）ら、（１９６５年）の中で記述されている。さらに、レンクヴィスト（Ｒｅｎｋｖｉｓｔ）ら、（２００１年）の中で記述されているように、当該技術分野においては数多くの抗原が知られている。以下の表は、腫瘍抗原によってコードされるＴ細胞で確定されたエピトープを記述しており、Ｔ細胞により認識される腫瘍抗原（細胞傷害性ＣＤ８＋又はヘルパーＣＤ４＋のいずれか）のみが列挙されている。類似体又は人工的に修飾されたエピトープは列挙されていないものの、当業者であれば、当該技術分野における標準的な手段によりこれらをいかに獲得又は生成するかを認識する。抗体により同定されＳｅｒｅｘ法（サヒン（Ｓａｈｉｎ）ら、（１９９７年）及びチェン（Ｃｈｅｎ）ら、（２０００年）参照））により検出されるその他の抗原は、ルードゥイング・インスティチュート・フォー・キャンサー・リサーチ（Ｌｕｄｗｉｇ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）のデータベース内で同定される。
【０２４９】
病原菌抗原
病原菌抗原は、ウイルス、細菌又は真菌由来であり得る。感染性ウイルスの例としては、レトロウイルス科（例えばヒト免疫不全ウイルス例えばＨＩＶ−１（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
、ＬＡＶ又はＨＴＬＶ−ＩＩＩ／ＬＡＶ、又はＨＩＶ−ＩＩＩ）とも呼ばれる：及びその他の分離株例えばＨＩＶ−ＬＰ；ピコルナウイルス科（Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばポリオウイルス（ｐｏｌｉｏ  ｖｉｒｕｓ）類、肝炎Ａウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ａ  ｖｉｒｕｓ）；エンテロウイルス（ｅｎｔｅｒｏｖｉｒｕｓ）類；ヒトコクサッキーウイルス（ｈｕｍａｎ  ｃｏｘｓａｃｋｉｅ  ｖｉｒｕｓ）類、ライノウイルス（ｒｈｉｎｏｖｉｒｕｓ）類、エコーウイルス（ｅｃｈｏｖｉｒｕｓ）類）；カルシウイルス科（Ｃａｌｃｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば胃腸炎を起こす株）；トガウイルス科（Ｔｏｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えばウマ脳炎ウイルス（ｅｑｕｉｎｅ  ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）類、風疹ウイルス（ｒｕｂｅｌｌａ  ｖｉｒｕｓ）類）；フラビウイルス科（Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、デング熱ウイルス（ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ）類、脳炎ウイルス（ｅｎｃｅｐｈａｌｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）類、黄熱病ウイルス（ｙｅｌｌｏｗ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）類）；コロナウイルス科（Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、コロナウイルス（ｃｏｒｏｎａｖｉｒｕｓ）類）；ラブドウイルス科（Ｒｈａｂｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、水疱性口内炎ウイルス（ｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ  ｖｉｒｕｓ）類、狂犬病ウイルス（ｒａｂｉｅｓ  ｖｉｒｕｓ）類）；フィロウイルス科（Ｆｉｌｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばエボラウイルス（ｅｂｏｌａｖｉｒｕｓ）類）；パラミクソウイルス科（Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、パラインフルエンザウイルス（ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）類、流行性耳下腺炎ウイルス（ｍｕｍｐｓ  ｖｉｒｕｓ）、麻疹ウイルス（ｍｅａｓｌｅｓ  ｖｉｒｕｓ）、呼吸器合抱体（ＲＳ）ウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ））；オルソミクソウイルス科（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、インフルエンザウイルス（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ  ｖｉｒｕｓ）類）；ブンガウイルス科（Ｂｕｎｇａｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、ハンターンウイルス（Ｈａｎｔａａｎ  ｖｉｒｕｓ）類、ブンガウイルス（ｂｕｎｇａ  ｖｉｒｕｓ）類、フレボウイルス（ｐｈｌｅｂｏｖｉｒｕｓ）類およびナイロウイルス（Ｎａｉｒｏ  ｖｉｒｕｓ）類）；アレナウイルス科（Ａｒｅｎａ  ｖｉｒｉｄａｅ）（出血性熱ウイルス（ｈｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）類）；レオウイルス科（Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えば、レオウイルス（ｒｅｏｖｉｒｕｓ）類、オルビウイルス（ｏｒｂｉｖｉｒｕｓ）類およびロタウイルス（ｒｏｔａｖｉｒｕｓ）類）；ビルナウイルス科（Ｂｉｒｎａｖｉｒｉｄａｅ）；ヘパドナウイルス科（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｉｄａｅ）（Ｂ型肝炎ウイルス（Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ））；パルボウイルス科（Ｐａｒｖｏｖｌｒｉｄａｅ）（パルボウイルス（ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓ）類）；パポバウイルス科（Ｐａｐｏｖａｖｉｒｉｄａｅ）（乳頭腫ウイルス（ｐａｐｉｌｌｏｍａ  ｖｉｒｕｓ）類、ポリオーマウイルス（ｐｏｌｙｏｍａｖｉｒｕｓ）類）；アデノウイルス科（Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ）（大部分のアデノウイルス（ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ）類）；ヘルペスウイルス科（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｄａｅ）（単純ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｓｉｍｐｌｅｘ  ｖｉｒｕｓ  （ＨＳＶ））１および２、水痘帯状疱疹ウイルス（ｖａｒｉｃｅｌｌａ  ｚｏｓｔｅｒ  ｖｉｒｕｓ）、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ（ＣＭＶ））、ヘルペスウイルス（ｈｅｒｐｅｓ  ｖｉｒｕｓ）類）；ポックスウイルス科（Ｐｏｘｖｉｒｉｄａｅ）（痘瘡ウイルス（ｖａｒｉｏｌａ  ｖｉｒｕｓ）類、ワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ）類、ポックスウイルス（ｐｏｘ
ｖｉｒｕｓ）類）；およびイリドウイルス科（Ｉｒｉｄｏｖｉｒｉｄａｅ）（例えばブタコレラウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ））；未分類ウイルス（例えば、海綿状脳症（Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ  ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ）の病因病原体、デルタ肝炎の病原体（Ｂ型肝炎ウイルスの不完全付随体と考えられているもの）、非Ａ、非Ｂ型肝炎の病原体（クラス１＝経口感染、クラス２＝非経口感染（すなわち、Ｃ型肝炎））；ノーウォーク（Ｎｏｒｗａｌｋ）および関連ウイルス、およびアストロウイルス（ａｓｔｒｏｖｉｒｕｓ）類）が含まれる。
【０２５０】
感染性細菌の例としては、ヘリコバクターピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌ
ｏｒｉｓ）、ボレリア・ブルグドルフェリＢｏｒｅｌｉａ  ｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ、レジオネラ・ニューモフィリア（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ）、ミコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ）種（例えば結核菌（Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、トリ結核菌（Ｍ．ａｖｉｕｍ）、Ｍ．イントラセルラレ（Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、Ｍ．カンサイ（Ｍ．ｋａｎｓａｉｉ）、Ｍ．ゴルドナイ（Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ））、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ
ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、リステリア菌（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）、化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）（Ａ群連鎖球菌）、ストレプトコックス・アガラクティアイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）（Ｂ群連鎖球菌）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（ヴィリダンス群（ｖｉｒｉｄａｎｓ  ｇｒｏｕｐ））、糞便連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、ストレプトコックス・ボビス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｏｖｉｓ）、連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）（嫌気性種）、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、病原性カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）種、腸球菌（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ）種、インフルエンザ菌（Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｒａｃｉｓ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、コリネバクテリウム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）種、ブタ丹毒菌（Ｅｒｙｓｉｐｅｌｏｔｈｒｉｘ  ｒｈｕｓｉｏｐａｔｈｉａｅ）、ウェルシュ菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）、破傷風菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ
ｔｅｔａｎｉ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、肺炎桿菌（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、パスツレラ・ムルトチダ（Ｐａｓｔｕｒｅｌｌａ  ｍｕｌｔｏｃｉｄａ）、バクテロイド（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ）種、フゾバクテリウム・ヌタレアツム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、ストレプトバチラス・モニリフォルミス（Ｓｔｒｅｐｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、フランベジアトレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐｅｒｔｅｎｕｅ）、レプトスピラ属（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ）およびイスラエル放線菌（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｉｓｒａｅｌｌｉ）が含まれる。
【０２５１】
感染性真菌の例としては、クリプトコックス・ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラズマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミティス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストミセス・デルマティティディス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、トラコーマ病原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、口瘡カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が含まれる。その他の感染性生体（すなわち原生生物）には、熱帯性マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）およびトキソプラズマ・ゴンジ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）が含まれる。
【０２５２】
サイレンシング化された及びパルスを受けた免疫細胞
もう１つの実施形態においては、細胞を培養、組織、臓器又は生体から単離し、細胞ワクチンとして哺乳動物に投与することが可能である。かくして、本発明は「細胞ワクチン」を考慮している。当然のことながら、細胞は、免疫調節薬又はアジュバンドなどの１つもしくはそれ以上の付加的なワクチン構成要素を発現することもできる。ワクチンは、細胞の全て又は一部を含んでなっていてよい。好ましい実施形態においては、本発明の細胞ワクチンは、ヒトＡＰＣを含んでなり、さらに好ましい実施形態においては、ＡＰＣはＤＣである。
【０２５３】
細胞ワクチンは、その免疫能力を増強するため本発明に従ってサイレンシング化されたＡＰＣを含んでなり得る。サイレンシング化されたＡＰＣはこのとき、抗原負荷された細胞を生成するべく抗原をコードする核酸でのトランスフェクションを受けることができる。もう１つの態様においては、抗原負荷細胞を生成するべく抗原を含む免疫刺激タンパク質で、サイレンシング化されたＡＰＣをパルスすることができる。本開示に基づくと、サイレンシング化されたＡＰＣは、抗原を負荷するためにあらゆるタイプの抗原を利用してあらゆる方法でパルス可能である。さらに、本発明のインヒビターでのＡＰＣのサイレンシング化の前、又はそれと同時に又はその後に、任意の方法によりＡＰＣをパルスすることができる。
【０２５４】
本書の他の箇所で開示されているように、さまざまな方法を用いて抗原で細胞をパルスすることができる。本発明の抗原は、少なくとも１つのエピトープを含有し、ここで前記エピトープは哺乳動物内で免疫応答を惹起する能力を有する。一実施形態においては、抗原は発現ベクターにより発現される。もう１つの実施形態においては、抗原は単離されたポリペプチドである。好ましくは、抗原は、感染性疾患、癌及び自己免疫疾患よりなる群から選択された１疾患と結びつけられる。本発明の細胞をパルスする上で有用な一定数の好ましい抗原が本書の他の箇所で開示されている。抗原は、腫瘍溶解物、タンパク質、ペプチド、ｍＲＮＡ、ベクターから発現されたＤＮＡ、リポソームなどのうちの少なくとも１つもしくはそれ以上の形をとり得る。
【０２５５】
負の免疫調節因子のインヒビターでのサイレンシング化されたＡＰＣは、増大した免疫能力を有し、従って増強された免疫応答すなわち抗原を提示しそれに対する免疫応答を活性化させる増強された能力を惹起する。本発明に従ってサイレンシング化及びパルスを受けたＡＰＣは、エフェクタＴ細胞を刺激し、サイレンシング化を受けていないその他の点では同一であるＡＰＣに比べて、それに対する抗原に対して改善された免疫応答を惹起する。
【０２５６】
治療的応用
本発明は、ＡＰＣなどの免疫細胞の免疫能力を増強するのに有用な組成物を含む。ＡＰＣにより提示される抗原に対する応答は、当該技術分野において周知の方法を用いて細胞溶解性Ｔ細胞応答、ヘルパーＴ細胞応答及び／又は抗原に対する抗体応答の誘発を監視することによって測定可能である。
【０２５７】
本発明は、抗原組成物と１つもしくはそれ以上のリンパ球を接触させる工程を含んでなる哺乳動物の体内の免疫応答を増強する方法において、抗原がＡＰＣなどの免疫細胞により提示される方法を含む。本開示に基づくと、ＡＰＣは、負の免疫調節因子のインヒビターに対する曝露によってサイレンシング化され得、かくしてインヒビターに対する曝露はＡＰＣの免疫能力を増強する。ＡＰＣは、その他の形でＡＰＣをパルスするべく、抗原組成物にＡＰＣを曝露する前、又はそれと同時又はその後に本書で開示されている方法を用いてサイレンシング化され得る。
【０２５８】
増強された免疫応答は、能動又は受動免疫応答であり得る。応答は、樹状細胞、Ｂ細胞又は単球／マクロファージといったＡＰＣが哺乳動物（例えば患者）から得られ、その後（その他の形で免疫細胞をサイレンシング化するべく負の免疫調節因子のインヒビターに対し細胞を曝露する前、又はそれと同時又はその後に）抗原組成物を含んでなる組成物でパルスされ、次に必要としている哺乳動物に対しＡＰＣを投与する養子免疫療法アプローチの一部であり得る。
【０２５９】
組成物は、負の免疫調節因子、抗原、サイレンシング化された免疫細胞、パルスを受けた細胞、そして同じく抗原でのパルスも受けたサイレンシング化された免疫細胞のうちの
少なくとも１つもしくはそれ以上のもののあらゆる組合せを含む。組成物は、哺乳動物内のエクスビボ免疫化及び／又はインビボ療法のためのワクチンであり得る。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【０２６０】
エクスビボ免疫化に関連して、哺乳動物内に細胞を投与する前にインビトロで以下のもののうちの少なくとも１つが起こる。すなわち、ｉ）細胞のサイレンシング化、ｉｉ）細胞のパルス又は  ｉｉｉ）細胞のサイレンシング化及びパルス。本発明の免疫細胞を、免疫細胞をパルスするべく抗原でＡＰＣを処理する前、それと同時又はその後に本書の他の箇所で開示された方法を用いて、本発明の免疫細胞（すなわちＡＰＣ）をサイレンシング化することができる、ということを充分に理解すべきである。
【０２６１】
もう１つの実施形態においてはサイレンシング化されたＡＰＣを、抗原に予めインビトロで曝露することなく、必要としている患者に対し投与することが可能である。すなわち、本発明は、患者の体内でインビボで細胞のパルスが発生する、患者に対するサイレンシング化されたＡＰＣの投与を包含している。
【０２６２】
さらにもう１つの実施形態においては、パルスを受けたＡＰＣを、負の免疫調節因子のインヒビターに対する細胞の事前のインビトロ曝露無く、それを必要とする患者に対して投与することができる。すなわち、本発明は、細胞のサイレンシング化が患者の体内においてインビボで起こる、患者に対するパルスを受けたＡＰＣの投与を包含している。
【０２６３】
エクスビボ手順は当該技術分野において周知であり、以下でさらに詳述されている。簡単に言うと、細胞が哺乳動物（好ましくはヒト）から単離され、負の免疫調節因子のインヒビターを発現するベクター又は本書で開示されている任意のその他の形態の負の免疫調節因子（すなわち化学的に合成されたｓｉＲＮＡ）でサイレンシング化（すなわちインビトロで形質導入又はトランスフェクション）される。サイレンシング化された細胞は、治療上の利益を提供するべく哺乳動物レシピエントに投与され得る。哺乳動物レシピエントはヒトであり得、このようにサイレンシング化された細胞はレシピエントとの関係において自己移植性であり得る。あるいは、細胞はレシピエントとの関係において同種異系、同系又は異種のものであり得る。
【０２６４】
本発明に参照により援用されている米国特許第５，１９９，９４２号明細書の中で記述された造血幹及び前駆細胞のエクスビボ拡張のための手順を本発明の細胞に適用することができる。その他の適切な方法も当該技術分野において既知であり、従って本発明は細胞のエクスビボ拡張のいずれか特定の方法に限定されるわけではない。簡単に言うと、エクスビボ培養及びＤＣの拡張には、（１）末梢血の収穫物又は骨髄外植体から哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹及び前駆細胞を収集する工程及び（２）かかる細胞をエクスビボで拡張させる工程が含まれる。米国特許第５，１９９，９４２号明細書に記述されている細胞成長因子に加えて、ｆｌｔ３−Ｌ、ＴＬ−１、ＩＬ−３及びＣ−ｋｉｔリガントなどのその他の因子を、細胞の培養及び拡張のために使用することができる。
【０２６５】
細胞集団からＣＤ３４＋造血幹又は前駆細胞を同定しかつ分離するためのさまざまな細胞選択技術が知られている。例えば、幹及び前駆細胞上に見られるマーカータンパク質又は表面抗原タンパク質に結合するように、モノクローナル抗体（又はその他の特異的細胞結合タンパク質）を使用することができる。造血幹細胞のためのいくつかのかかるマーカーまたは細胞表面抗原（すなわち、ｆｌｔ−３、ＣＤ３４、Ｍｙ−１０およびＴｈｙ−１）は、当該技術分野において既知である。
【０２６６】
収集されたＣＤ３４＋細胞は適切なサイトカインと共に培養される。その後ＣＤ３４＋細胞は、分化して樹状系統の細胞に対応することができるようになる。これらの細胞は次
に、ＣＤ１ａ、ＨＬＡ  ＤＲ、ＣＤ８０及び／又はＣＤ８６などの樹状細胞に特徴的であるマーカーを用いて、フローサイトメトリ又は類似の手段によってさらに精製される。ＤＣの培養の単離後、細胞を本発明の方法に従って修飾することができる。あるいは、ＤＣ様の細胞に分化される前に前駆細胞を修飾することができる。
【０２６７】
エクスビボ免疫化に関して細胞ベースのワクチンを使用することに加えて、本発明はまた、患者の体内の抗原に対し向けられた免疫応答を惹起するためのインビボ免疫化用の組成物及び方法をも提供している。
【０２６８】
インビボ免疫化に関し、本発明は、ＡＰＣ内の臨界制御点を無効にすることによりワクチンの効能を増強するための包括的手段としての負の免疫調節因子のインヒビターの使用を提供している。従って、インビボ免疫化にとって有用なワクチンは、少なくとも負の免疫調節因子を阻害することのできるインヒビター構成要素を含んでなる。もう１つの態様では、ワクチンは、インヒビター構成要素と抗原構成要素の両方を含んでなり、抗原構成要素は哺乳動物の体内で免疫応答を惹起する能力をもつ。
【０２６９】
インビボ免疫化に関しては、患者から得られた細胞は、サイレンシング化された細胞をその他の形で生成するべくインビボでトランスフェクト又は形質導入される。細胞はインビボで、サイトカインレギュレータのインヒビターを発現するベクターでサイレンシング化される。あるいは、細胞は、（化学的に合成されたｓｉＲＮＡである）ベクターにより発現されない本書で開示された負の免疫調節因子のその他の任意の形のインヒビターを用いてサイレンシング化される。インビボでサイレンシング化された細胞を生成する方法については、本書のその他の箇所で論述されている。
【０２７０】
ワクチンのもう１つの態様は、インビボで細胞をパルスするのに有用な抗原構成要素を含む。本発明の負の免疫調節因子のインヒビターと組み合わせて、任意の抗原を投与することができる。インヒビターを含んでなるワクチンでの細胞のサイレンシング化の前に、又はそれと同時に又はその後に、本書のその他の箇所で論述されている通りのあらゆる方法を用いて細胞をパルスすることができる。細胞を同時にパルスしサイレンシング化すべきである場合には、インヒビター及び抗原を両方共含んでなる単一のワクチンで哺乳動物を免疫化できるということが容易にわかる。あるいは、インヒビターを含んでなるもの及び抗原を含んでなる第２のワクチンという２つの別々のワクチンで哺乳動物を免疫化することが可能である。
【０２７１】
本発明は、癌及び感染性疾患のためのインビボ免疫化を包含する。一実施形態においては、患者の体内の抗原に対抗する免疫応答を生成するべく抗原と組合せた形で又は単独でｓｉＲＮＡをインビボで投与することにより、障害又は疾患を治療することができる。本開示に基づくと、負の免疫調節因子のインヒビター（例えばＡ２０、ＳＵＭＯ（ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及びＳＵＭＯ４）、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＴＷＩＳＴ（Ｔｗｉｓｔ１、Ｔｗｉｓｔ２）、ＳＯＣＳ（ＳＯＣＳ１、ＳＯＣＳ２、ＳＯＣＳ３、ＳＯＣＳ４、ＳＯＣＳ５、ＳＯＣＳ６、ＳＯＣＳ７及びＣＩＳ）、ＰＩＡＳ（ＰＩＡＳ１、ＰＩＡＳ３、ＰＩＡＳｘ及びＰＩＡＳｙ）、ＳＨＰ（ＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２のためのｓｉＲＮＡ又はそのいずれかの組合せ）を抗原処方物と組合せた形で投与することにより、負の免疫調節因子のインヒビターを使用することなくその他の点では同一であるワクチン接種プロトコルの効能が増強される。何らかの特定の理論により束縛されることを望んではいないが、患者の体内の抗原に対する免疫応答は、（１）投与されたｓｉＲＮＡ組成物、（２）投与の持続時間、用量及び頻度、（３）患者の全身状態、そして該当する場合には（４）投与される抗原組成物により左右されると考えられている。
【０２７２】
一実施形態においては、哺乳動物は、腫瘍特異的抗原を発現するタイプの癌を有してい
る。本発明に従うと、腫瘍特異的抗原配列構成要素を含んでなる免疫刺激タンパク質を作ることができる。このような場合、負の免疫調節因子のインヒビターは、それを必要とする患者に対し免疫刺激タンパク質との組合せの形で投与され、その結果、例えば腫瘍特異的抗原を発現する中実腫瘍又は癌細胞の成長の減速又は減少或いは癌細胞の総数又は総全身腫瘍組織量の低減によって証明される、患者にとっての治療成果の改善がもたらされる。
【０２７３】
関連する実施形態においては、患者は、例えばウイルス抗原といった特定の抗原の発現と結びつけられるウイルス、細菌、真菌又はその他のタイプの感染を有するとの診断を受けている。本発明に従うと、例えばＨＩＶ特異的抗原などの抗原からなる配列構成要素を含んでなる免疫刺激タンパク質を作ることができる。このような場合には、負の免疫調節因子のインヒビターが、それを必要とする患者に対して免疫刺激タンパク質と組合せた形で投与され、その結果、患者の体内の原因感染物質の成長の減速及び／又は特定の感染性疾患に標準的に付随する検出可能な症候群の低減又は除去により証明されるような患者にとっての治療成果の改善がもたらされる。
【０２７４】
いずれの状況下でも、障害又は疾患は、それを必要とする患者に対する抗原と組合せた形での負の免疫調節因子のインヒビターの投与により治療され得る。本発明は、患者の体内で抗原に対する防御的ＤＣ誘発型免疫応答を生成するための手段を提供する。本開示に基づいて、当業者であれば、負の免疫調節因子ワクチンのインヒビターの効能を増強するため、本書に開示された治療計画に対し炎症性サイトカイン（すなわち、ＩＬ−１２、ＴＮＦa、ＩＦＮa、ＩＦＮb、ＩＦＮgなど）を添加することができるということがわかるだろう。
【０２７５】
投薬量及び処方（薬学組成物）
本発明は、治療薬例えばｓｉＲＮＡの投与により哺乳動物の体内のＨＩＶ感染、癌などの疾患を治療することを想定している。本発明に係る治療薬の投与は、例えば患者の生理学的身体条件、投与の目的が治療か予防か、そして専門の医師にとって既知であるその他の要因に応じて、連続的又は間欠的であってよい。本発明の作用物質の投与は、基本的に、予め選択された期間にわたり連続的であり得、そうでなければ一連の間隔どりされた用量の形をとり得る。局所的及び全身的投与の両方が考慮される。投与される量は、選択された組成物、特定の疾患、哺乳動物の体重、身体条件及び年令、及び予防又は治療のいずれを達成すべきかを含めた（ただしこれに限定されるわけではない）さまざまな要因によって変動することになる。かかる要因は、当該技術分野において周知である動物モデル又はその他のテスト系を利用する臨床医により、容易に判定可能である。
【０２７６】
ｓｉＲＮＡの投与は、ｓｉＲＮＡをコードする核酸分子の投与を通して達成され得る（例えば、フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、米国特許第５，５８０，８５９号明細書、パルドール（Ｐａｒｄｏｌｌ）ら、１９９５年；スティーブンソン（Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ）ら、１９９５年；モーリング（Ｍｏｌｌｉｎｇ）１９９７年；ドネリー（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ）ら、１９９５年；ヤン（Ｙａｎｇ）ら、ＩＩ；アブダラ（Ａｂｄａｌｌａｈ）ら、１９９５年を参照）。例えば、フェルグナーら（前掲書）の中などで、核酸の薬学処方物、投薬量及び投与経路が一般的に開示されている。
【０２７７】
以下で論述されているように場合により持続的放出のために処方され得る（例えばマイクロカプセル化を用いたもの、その開示が本発明に参照により援用されている国際公開第９４／０７５２９号パンフレット及び米国特許第４，９６２，０９１号明細書を参照）本発明の治療薬を有する１つもしくはそれ以上の適切な単位剤形を、静脈内及び筋肉を含めた非経口経路ならびに罹患組織内への直接注入を含むさまざまな経路で投与することができる。例えば、治療薬を直接腫瘍内に注射することが可能である。処方物は、該当する場
合、個別の単位剤形で便利な体裁をとり得、薬学では周知の方法のいずれかにより調製可能である。かかる方法は、液体担体、固体マトリクス、半固体担体、細分した固体担体又はそれらの組合せと治療薬を会合させ、その後必要であらば製品を所望の送達系内に導入又は整形する工程を含み得る。
【０２７８】
本発明の治療薬が投与のために調製される場合、これらは好ましくは、薬学処方物又は単位剤形を形成するため薬学的に許容可能な担体、希釈剤又は賦形剤と組み合わされる。かかる処方物中の総活性成分は、０．１〜９９．９重量％の処方物を含む。「薬学的に許容可能な」というのは、処方物のその他の成分と適合可能でありそのレシピエントに有害でない担体、希釈剤、賦形剤及び／又は塩である。投与のための活性成分は、粉末又は顆粒として、溶液、懸液又はエマルジョンとして存在し得る。
【０２７９】
本発明の治療薬を含有する薬学的処方物は、周知の及び容易に入手可能な成分を用いて当該技術分野において既知の手順により調製可能である。本発明の治療薬は、非経口投与、例えば筋肉、皮下又は静脈内経路による投与に適した溶液としても処方可能である。
【０２８０】
本発明の治療薬の薬学処方物は同様に、水溶液又は無水溶液又は分散の形、あるいはエマルジョン又は懸濁液の形をとることもできる。
【０２８１】
かくして、治療薬は、非経口投与（例えば注入、例えばボーラス注入又は持続注入による投与）のために処方され得、アンプル、薬剤充填済み注射器、少量注入器又は防腐剤が添加された多回用量コンテナに入った単回剤形の体裁をとり得る。活性成分は、油性又は水性ビヒクル中の懸濁液、溶液又はエマルジョンの形をとり得、懸濁、安定化及び／又は分散剤などの処方用作用物質を含有し得る。あるいは、活性成分は、使用前に滅菌で発熱物質を含まない水といった適切なビヒクルで構成するように、溶液からの凍結乾燥により又は滅菌固体の無菌単離によって得られる粉末形態であってもよい。
【０２８２】
各剤形の個々のエアロゾル用量中に含有されている活性成分の単位含有量は、複数の剤形の投与によって必要な有効量を達成することが可能であるため、それ自体で特定の適応症又は疾病を治療するための１有効量を構成する必要はない、ということがわかるだろう。その上、剤形中の用量より少ない量を個別に又は一連の投与の中で用いることにより、有効量を達成することも可能である。
【０２８３】
本発明の薬学処方物は、任意の成分として、薬学的に許容可能な担体、希釈剤、可溶化剤又は乳化剤、及び当該技術分野において周知であるタイプの塩を内含し得る。本発明の薬学処方物において有用である担体及び／又は希釈剤の限定的な意味のない特定の例としては、水及び生理学的に許容可能な緩衝生理食塩溶液、例えばｐＨ７．０〜８．０のリン酸緩衝生理食塩溶液が含まれる。
【０２８４】
本発明の発現ベクター、形質導入された細胞、ポリヌクレオチド及びポリペプチド（活性成分）は、生体の体内でその作用物質の作用部位と活性成分の接触を作り出すあらゆる手段によりさまざまな疾病状態を治療するように処方及び投与可能である。これらは、個々の治療用活性成分としてか又は治療用活性成分の組合せの中で、調合薬と併用する利用可能なあらゆる従来の手段によって投与され得る。これらは単独で投与され得るが、一般に、標準的な薬学的実践方法及び選択された投与経路に基づいて、薬学的担体と共に投与される。
【０２８５】
一般に、非経口溶液のためには、水、適切な油、食塩水、水性デキストロース（グルコース）、及び関連する糖溶液及びプロピレングリコール又はポリエチレングリコールといったグリコールが適切な担体である。非経口投与のための溶液は、活性成分、適切な可溶
化剤、そして必要に応じて緩衝物質を含有する。重硫酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸などの酸化防止剤が、単独であれ、組み合わされた形であれ、適切な安定化剤である。同様に使用されるのはクエン酸及びその塩、そしてエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）である。さらに、非経口溶液は、塩化ベンザルコニウム、メチル又はプロピルパラベン及びクロロブタノールなどの防腐剤を含有し得る。適切な薬学的担体が、この分野での標準的な参考書である「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｎｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」の中で記述されている。
【０２８６】
本発明の活性成分は、哺乳動物特にヒトにおいて使用するのに適した薬学的に許容可能な組成物の中で懸濁されるように処方可能である。このような処方物は、米国特許第４，０８２，７３５号明細書；同第４，０８２，７３６号明細書；同第４，１０１，５３６号明細書；同第４，１８５，０８９号明細書；同第４，２３５，７７１号明細書；及び同第４，４０６，８９０号明細書の中で記述されているムラミルジペプチド誘導体（ＭＤＰ）又は類似体などのアジュバンドの使用を含む。有用なその他のアジュバンドには、ミョウバン（ピアス・ケミカル・カンパニー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．））、脂質Ａ、トレハロースジミコレート及び臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム（ＤＤＡ）、フロインドアジュバンド及びＩＬ−１２が含まれる。その他の構成要素としては、ポリオキシプロピレン−ポリオキシレンブロックコポリマー（プルロニック（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）（登録商標））、非イオン性界面活性剤及びスクアレンなどの代謝性油（米国特許第４，６０６，９１８号明細書）が含まれ得る。
【０２８７】
さらに、標準的な薬学的方法を利用して作用持続時間を制御することが可能である。これらの方法は、当該技術分野において周知であり、制御放出調製物を内含し、例えばポリマー、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニル、ピロリドン、エチレンビニルアセタート、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース又は硫酸プロタミンといった適切な巨大分子を含み得る。巨大分子の濃度ならびに取込み方法は、放出を制御するために調整可能である。さらに、ポリエステル、ポリアミノ酸、ヒドロゲル、ポリ（乳酸）又はエチレン酢酸ビニルコポリマーなどの作用物質をポリマー材料の粒子中に取込むことができる。取込まれることに加えて、これらの作用物質は、マイクロカプセル内に化合物を捕捉するのにも使用可能である。
【０２８８】
従って、本発明の薬学組成物は、特定の効果を達成するべく哺乳動物の体内のさまざまな部位に対しさまざまな経路を介して送達可能である（例えば、ローゼンフェルド（Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ）ら、１９９１年；ローゼンフェルドら、１９９１年ａ；ジャフェ（Ｊａｆｆｅ）ら、上掲書；バークナー（Ｂｅｒｋｎｅｒ）、上掲書を参照）。当業者であれば、投与のために２つ以上の経路を用いることができるものの、特定の経路が、もう一方の経路に比べより即刻のかつより効果的な反応を提供する可能性がある、ということを認識するだろう。体腔内への処方物の点滴又は塗布、エアロゾルの吸入又は吹送又は、筋肉、静脈内、腹腔内、皮下、皮内ならびに局所的投与を含んでなる非経口導入を含んでなる投与により、局所的又は全身的送達を達成することが可能である。
【０２８９】
本発明の活性成分は、例えば茶さじ一杯、錠剤、溶液又は座薬などの各投薬量単位が、単独で又はその他の活性作用物質と適切に組合せた形で、予め定められた量の組成物を含有している、単位剤形の形で提供され得る。本書で使用する「単位剤形」という用語は、ヒト及び哺乳動物の対象のための単一の投薬量として適切でかつ、各々該当する場合薬学的に許容可能な希釈剤、担体又はビヒクルと会合した状態で、所望の効果を生み出すのに充分な量で計算された、その他の活性作用物質と組合せた形又は単独の予め定められた数量の本発明の組成物を含有している、標準的に個別の単位を意味する。本発明の単位剤形のための仕様は、達成すべき特別な効果及び特定の宿主の中で薬学組成物に付随する特別な薬物力学によって左右される。
【０２９０】
本書で記述されているこれらの方法は、決して包括的ではなく、当業者には特定の利用分野に適したさらなる方法が明らかになることだろう。その上、組成物の有効量は、所望の効果を及ぼすものとして知られている化合物に対する類推を通してさらに近似され得る。
【０２９１】
遺伝子療法の投与
当業者であれば、細胞内にベクターを投与するために異なる送達方法を利用できることを認識する。例としては、（１）物理的手段、例えば電気穿孔（電気）、遺伝子統（物理的力）又は大量の液体（圧力）の付加を用いた方法、及び（２）リポソーム、凝集タンパク質又はトランスポータ分子などのもう１つの実体に対して前記ベクターを複合させる方法、が含まれる。
【０２９２】
さらに、実際の用量及び計画は、その組成物がその他の薬学組成物と組合せて投与されているか否か又は薬物動態、薬物挙動及び代謝における個体間差に応じて変動し得る。同様に、量はインビトロ利用分野において、利用される特定の細胞系列に応じて（例えば細胞表面上に存在するベクターレセプタの数、又はその細胞系列内で複製する遺伝子移送に利用された特定のベクターの能力に基づく）変動し得る。さらに、細胞１個あたりの付加すべきベクターの量は、ベクター内に挿入された治療用遺伝子の長さ及び安定性ならびに配列の性質に応じて変動する確率が高く、特に経験的に判定される必要のあるパラメータであり、本発明の方法に固有の因子（例えば合成に付随するコスト）に起因して改変され得る。当業者であれば、特定の状況の要件に従って、任意の必要な調整を容易に行なうことができる。
【０２９３】
治療薬を含有する細胞は同様に、自殺遺伝子すなわち細胞を破壊するのに使用可能な産物をコードする遺伝子をも含有し得る。数多くの遺伝子療法の状況下で、宿主細胞内で治療目的で遺伝子を発現できることのみならず意のままに宿主細胞を破壊する能力をもつことができることも望ましい。治療薬は、アクチベータ化合物の不在下でその発現が活性化されない自殺遺伝子に連結され得る。作用物質及び自殺遺伝子の両方が導入された細胞の死滅が望まれる場合、アクチベータ化合物は、その細胞に対し投与され、かくして自殺遺伝子の発現を活性化し、細胞を死滅させる。使用可能な自殺遺伝子／プロドラッグの組合せの例としては、単純ヘルペスウイルス−チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）及びガンシクロビル、アシクロビル；オキシドレダクターゼ、及びシクロヘキシミド；シトシンデアミナーゼ及び５−フルオロシトシン；チミジンキナーゼチミジラートキナーゼ（Ｔｄｋ：：Ｔｍｋ）及びＡＺＴ；及びデオキシシチジンキナーゼ及びシトシンアラビノシドがある。
【０２９４】
本書で記述されているこれらの方法は、決して包括的ではなく、特定の利用分野に適したさらなる方法が当業者には明らかとなるであろう。その上、所望の効果を及ぼすものとして知られている化合物に対する類推を通して、組成物の有効量をさらに近似することが可能である。
【実施例】
【０２９５】
本発明についてここで以下の実施例を参考にしながら記述する。これらの実施例は、あくまで例示を目的として提供されており、本発明はこれらの実施例に限定されず、むしろ本書で提供されている教示の結果として明白である全ての変形形態を包含する。
【０２９６】
本書で開示されている実験は、さまざまな癌及び感染性病原体に対する有効なワクチンを開発する目的でＤＣを活用するためＤＣによる抗原提示の調節を探索するべく実施された。本書で開示されている結果は、免疫細胞内での負の免疫調節因子の阻害として別途知
られている負の免疫調節経路との干渉が、その免疫刺激能力を増強する、ということを実証している。細胞の免疫能力を強化するために負の免疫調節因子を阻害するという概念は、より効果的なワクチンを開発する新規の方法として役立つ。
【０２９７】
本書で開示されている実験において利用される材料及び方法についてここで記述する。
【０２９８】
ｓｉＲＮＡオリゴによるＤＣのトランスフェクション
２１、２６又は同等の塩基対ｓｉＲＮＡオリゴスクレオチドで、骨髄ＤＣをトランスフェクトした。例えば、メーカーのプロトコルに従いジーンポーター（ＧｅｎｅＰｏｒｔｅｒ）（ゲンランティス（Ｇｅｎｌａｎｔｉｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ（Ｓａｎ
Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を用いて、ＤＣをＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ３（５’−ＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＴ−３’；配列番号３）でトランスフェクトした。ただし、本書の他の箇所で論述されているいずれのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでも、本書で論述されている方法を用いてＤＣ内にトランスフェクト可能である。簡単に言うと、２０μＭのオリゴヌクレオチドの溶液３μｌを３μｌのジーンポーター試薬及び９４μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０に添加した。３０分間２５℃で混合物をインキュベートし、その後、１００μｌのジーンポーター／オリゴヌクレオチドの混合物を骨髄−ＤＣの各ウェルに添加し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後、２０％のＦＢＳで捕足された５００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０を骨髄ＤＣに添加した。
【０２９９】
骨髄由来のＤＣのレンチウイルスベクターによる形質導入
マウスの骨髄由来のＤＣを、当該技術分野において既知の方法を用いて調製した。簡単に言うと、マウス骨髄を四肢から洗い流し、ナイロンメッシュを通し、塩化アンモニウムで赤血球を枯渇させた。ＲＰＭＩ−１６４０での広範な洗浄の後、細胞を、１０％のＦＢＳ、ｍＧＭ−ＣＳＦ／ｍｌ（２０ｎｇ／ｍｌ）及び組換え型マウスＩＬ−４（２０ｎｇ／ｍｌ：ペプロテック社（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ．Ｉｎｃ．）ニュージャージー州ロッキーヒル（Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ））で補足された２．５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０と共に培養した。培養２日目と４日目に、上清を除去し、２０ｎｇ／ｍｌのｒｍＧＭ−ＣＳＦ及び２０ｎｇ／ｍｌのｒｍＩＬ−４を含有する新鮮な培地と交換した。５％加湿したＣＯ２中で３７℃で全ての培養をインキュベートした。４８時間の培養の後、非接着性顆粒球を除去し、新鮮培地を添加した。７日間の培養後、８０％を超える細胞が、ＦＡＣＳにより決定される通り、特徴的なＤＣ特異的マーカーを発現した。マウス骨髄由来のＤＣの形質導入（培養５日目〜７日目）を、５μｇ／ｍｌのポリブレン（Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ）（シグマ、ミズーリ州セントルイス）の添加により、２４ウェルのプレート上で実施した。ＤＣを洗浄し、４００μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０中２×１０５細胞／ウェルの濃度で２４ウェルのプレート内にプレート固定した。５×１０５細胞／ｍｌという細胞密度で、異なる感染多重度（ＭＯＩ）をもつレンチウイルスベクターに細胞を曝露した。８時間の形質導入の後、細胞をＰＢＳで洗浄し、さらに新鮮な組織培地内でインキュベートした。
【０３００】
サイトカイン及びウェスタンブロット法
メーカーの指示に従って、ＥＬＩＳＡ分析（ＢＤバイオサイエンシーズ（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ニュージャージー州リンカーンパーク（Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｐａｒｋ，ＮＪ））を用いて細胞培養の上清を使用してさまざまなサイトカインレベルを定量化した。ウェスタンブロット分析のためには、ＳＯＣＳ１、Ａ２０、Ｆｏｘｊ１、ＳＵＭＯ及びＴｗｉｓｔ２−ｓｉＲＮＡ又は対照ｓｉＲＮＡ（例えばＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）を含めた（ただしこれに限定されるわけではない）所望のｓｉＲＮＡを発現するｐＳＵＰＥＲベクター及び対応するタグ付き発現ベクターで、２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクトした。
【０３０１】
例えば、２９３Ｔ細胞を、１０：１の比のマウスＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ又は無関係のＧＦＰ−ｓｉＲＮＡとＦＬＡＧタグ付きＳＯＣＳ１ベクターで同時トランスフェクトした
。細胞を４８時間後に収穫し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。Ｈｙｂｏｎｄ−Ｐ膜（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）、イリノイ州アーリントンハイツ（Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＩＬ））への移送の後、試料を、抗Ｆｌａｇ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）又はアクチン（（サンタクルス・バイオテクノロジー社（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州サンタクルス（Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ，ＣＡ）））抗体でのウェスタンブロット法とそれに続くＥＣＬ−Ｐｌｕｓ試薬（アマシャム、イリノイ州アーリントンハイツ）での検出により分析した。フィルムをデンシトメータ（Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）ＳＩで走査し、ＳＯＣＳ−１／アクチンバンドをイメージ・クアント（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ）ソフトウエア（モレキュラー・ダイナミクス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）、ニュージャージー州ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ））で定量した。ＳＯＣＳ１バンドの強度をベータアクチンバンドの強度に正規化した。
【０３０２】
ＳＯＣＳ１の定量ＲＴ−ＰＣＲ分析
トランスフェクションを受けたマウスＢＭ−ＤＣ内のＳＯＣＳ１の相対的発現を、定量的実時間ＰＣＲにより評価した。トリゾール試薬（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））を用いて３．５〜５×１０５ＢＭ−ＤＣから、全ＲＮＡを抽出した。各試料についての全ＲＮＡ１．０μｇをランダム六量体プライマ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて逆転写した。鋳型として反応一回につき５ｎｇの出発ＲＮＡ材料の当量を用い２０μｌの四重反応中のＡＢＩ７９００ＨＴシーケンス・デテクション・システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）上で、実時間５’−ヌクレアーゼ螢光性ＰＣＲ分析を実施した。マウスＳＯＣＳ１（６ＦＡＭ）及び１８Ｓリボソーム対照（ＶＩＣ）のための予め開発されたプライマ／プローブセットをアプライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州フォスターシティー）（ＳＯＣＳ１のためのプライマ、５’−ＡＣＣＴＴＣＴＴＧＧＴＧＣＧＣＧＡＣ−３’；配列番号１２及び５’−ＡＡＧＣＣＡＴＣＴＴＣＡＣＧＣＴＧＡＧＣ−３’；配列番号１３及びハイブリダイゼーションプローブ、６ＦＡＭ−ＴＣＧＣＣＡＡＣＧＧＡＡＣＴＧＣＴＴＣＴＴＣＧ−ＴＡＭＲＡ；配列番号１４）から購入した。ＰＣＲパラメータは、ＳＯＣＳ１及び１８Ｓ反応を別々の管で実施して、タクマン・ユニバーサルＰＣＲマスター・ミックス・キット（ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｋｉｔ）（アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）のために推奨された通りであった。ＳＯＣＳ１レベルを１８ＳｒＲＮＡに正規化した。モックトランスフェクション及び刺激を受けたＢＭ−ＤＣの対照値との関係におけるＳＯＣＳ１発現を、コンパラティブ（Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ）Ｃｔ方法（ライバック（Ｌｉｖａｋ）ら、２００１年、Ｍｅｔｈｏｄｓ第２５号：４０２〜４０８頁）を用いて計算した。
【０３０３】
Ａ２０、Ｆｏｘｊ１及びＳＵＭＯ１の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
定量的実時間ＰＣＲにより、トランスフェクションを受けたマウスＢＭ−ＤＣ内のＡ２０、Ｆｏｘｊ１及びＳＵＭＯ１の相対的発現を評価した。全ＲＮＡを、トリゾール試薬（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて３．５〜５×１０５ＢＭ−ＤＣから抽出した。各試料についての全ＲＮＡ１．０μｇをランダム六量体プライマ及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキット（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて逆転写した。鋳型として反応一回につき５ｎｇの出発ＲＮＡ材料の当量を用い２０μｌの四重反応中のＡＢＩ７９００ＨＴ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）上で、実時間５’−ヌクレアーゼ螢光性ＰＣＲ分析を実施した。マウスＡ２０、Ｆｏｘｊ１及びＳＵＭＯ１及び１８Ｓリボソ
ーム対照（ＶＩＣ）のための予め開発されたプライマ／プローブセットをアプライド・バイオシステムズ社（カリフォルニア州フォスターシティー）から購入した（Ａ２０のためのプライマ、５’−ＧＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＡＣＣＴＧＴＴＴＣ’−３；配列番号１８６及び５’−ＧＡＣＡＧＧＡＧＧＣＡＧＧＧＡＴＡ−３’；配列番号１８７及びハイブリダイゼーションプローブ：５’−ＡＣＴＡＣＡＧＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＣ−３’；配列番号１８８；Ｆｏｘｊ１のためのプライマ、５’−ＧＣＣＡＴＧＣＡＡＧＣＣＡＧＣＡＡ−３’；配列番号１８９及び５’−ＧＣＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＣＧＴＧＡＴＣＣＡ−３’；配列番号１９０；及びハイブリダイゼーションプローブ：５’−ＡＡＧＡＴＣＡＣＴＣＴＧＴＣＧＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＡ−３’；配列番号１９１；ＳＵＭＯ１のためのプライマ、５’−ＧＡＡＧＧＴＣＡＧＡＧＡＡＴＴＧＣＴＧＡＴＡＡＴＣＡＴ−３’；配列番号１９２及び５’−ＣＣＣＣＧＴＴＴＧＴＴＣＣＴＧＡＴＡＡＡＣＴ−３’；配列番号１９３、及びハイブリダイゼーションプローブ：５’−ＴＣＣＧＡＡＡＧＡＡＣＴＧＧＧＡＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡ−３’；配列番号１９４）。ＰＣＲパラメータは、本書の他の箇所で論述されたものに従った。
【０３０４】
ＯＴ−Ｉ細胞のインビトロ検定
ＯＴ−Ｉマウスから脾臓を収穫し、プールし、単一の細胞懸濁液を得るべく分断した。ＭＡＣＳＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（ミルテニー・バイオテク社（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州オウバーン（Ａｕｂｕｒｎ，ＣＡ））を用いて負の選択によりＣＤ８＋ＯＴ−ＩＴ細胞を収集した。簡単に言うと、細胞を、ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）、ＣＤ４５Ｒ（Ｂ２２０）、ＤＸ５、ＣＤ１１ｂ（Ｍａｃ−１）及びＴｅｒ−１１９に特異的なビオチン標識された抗体でコーティングした。抗ビオチン磁気ミクロビーズ（ＭｉｃｒｏＢｅａｄｓ）（ミルテニー・バイオテク社、カリフォルニア州オウバーン）を細胞に添加し、これらを、ＭＡＣＳ磁石に取付けられた分離カラム全体に通過させた。カラムに結合しなかった細胞を収集し、それはＦＡＣＳにより判定されるとき９５％超のＣＤ８＋であった。１０％のＦＣＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及びストレプトマイシン、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ及び５μＭの２−ＭＥで補足された２００μｌのＲＰＭＩ１６４０培地の中で丸底９６ウェルのマイクロタイタープレートの各ウェル内に、合計５×１０４個の精製済みＣＤ８＋ＯＴ−ＩＴ細胞及び５×１０３の未熟なＤＣを入れた。最後の８時間の培養中、１ウェルあたり１μのＣｉ［３Ｈ］ＴｄＲを添加することにより２日後に増殖を測定した。３重判定を行ない、これは３通りの実験に相当する。ＯＴ−Ｉ／ＤＣ同時培養内のサイトカイン分泌を、指示されたサイトカインについてＥＬＩＳＡ分析を用いて判定した（ＢＤバイオサイエンシーズ、カリフォルニア州サンノゼ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ））。
【０３０５】
フローサイトメトリ分析
ＦＣγレセプタを予め遮断した後、０．１％のＮａＮ３及び２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ中のＦＩＴＣ、ＰＥ、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）又はＰｅｒＣＰ接合型ｍＡｂｓで細胞を染色した。ラットＣＤ４（ＲＭ４−５）、ＣＤ８（５３−６．７）、ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、ＣＤ４０（３／２３）、ＣＤ８０（１６−１０Ａ１）、ＣＤ８６（ＧＬ１）に特異的なラットｍＡｂｓ及び整合したイソタイプ対照をＢＤバイオサイエンシーズ（カリフォルニア州サンノゼ）から購入した。染色した細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）、ニュージャージー州リンカーンパーク）フローサイトメーター及びセルクエスト（ＣＥＬＬＱｕｅｓｔ）ソフトウエア上で分析した。
【０３０６】
四量体染色
オボアルブミン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するためにＨ２−Ｋｂ／オボアルブミン四量体検定を使用した。免疫化したマウスに由来する脾細胞又はＴ細胞を、ＤＣ免疫化から異なる日数後に抗ＣＤ８α−ＦＩＴＣ及びＨ２−Ｋｂ／オボアルブミン（ＳＩＩＮＦＥＫ
Ｌ）−ＰＥ四量体；配列番号１１（ベックマン・カルター・イムノミクス（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｍｉｃｓ）、カリフォルニア州サンディエゴ）で２重染色した。メーカーの指示に従って、細胞１０６個あたり１μｇの抗ＣＤ８α及び１０μｌのオボアルブミン四量体で１時間４℃で四量体染色を行なった。
【０３０７】
酵素連結型イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）
ＣＴＬペプチドをＣＤ８＋Ｔ細胞刺激のために使用した。負の対照として、ヒトＣＤ２０分子からの無関係なペプチドも使用した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、ＭＡＣＳ  ＣＤ４（Ｌ３Ｔ４）又はＭＡＣＳ  ＣＤ８（Ｌｙ−２）マイクロビーズ（ミルテニー・バイオテク社、カリフォルニア州オウバーン）
を用いることで脾細胞から単離した。
【０３０８】
ＣＴＬ及びＮＫ検定
標的細胞を溶解するインビトロ再刺激された脾細胞の能力を測定する標準クロム放出検定でＣＤ８＋ＣＴＬ応答を評価した。免疫化されたマウスからプールした脾細胞を、４〜６日間ペプチドを含有するＲＰＭＩ−１６４０内でインビボで再刺激した。標的細胞及び対照細胞を９０分間、５１Ｃｒクロム酸ナトリウム溶液で標識した。異なる数のエフェクタ細胞を、３７℃で３時間９６ウェルのＶ字底プレート（２００μｌ／ウェル）の中で一定数の標的細胞（１×１０４／ウェル）と共にインキュベートした。三重培養からの上清（１００μｌ）を収集した。（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００として溶解百分率を計算した。５００Ｕ／ｍｌの組換え型マウスＩＬ−２で１×１０６細胞／ｍｌを培養することにより、マウスの脾細胞からＮＫ細胞を生成した。ＮＫ細胞による溶解をきわめて受けやすいＹＡＣ−１細胞を３７℃で１時間５１Ｃｒでインキュベートし、洗浄し、１０５細胞／ｍｌで再懸濁した。異なるＥ：Ｔ細胞比を得るため、標的細胞に対し三重にＮＫ細胞を添加した。インキュベーションの後、プレートを遠心分離に付し、ガンマ計数器で上清流体中の放射能を計数した（ベックマン・カルター社（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州フラートン（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ））。
【０３０９】
ＤＣ免疫化及び腫瘍モデル
ＳＯＣＳ１、Ａ２０、Ｆｏｘｊ１、Ｆｏｘｏ３ａ、ＳＵＭＯ、Ｔｗｉｓｔ−１及びＴｗｉｓｔ−２−ｓｉＲＮＡを含む（ただしこれに限定されるわけではない）所望のｓｉＲＮＡを発現するレンチウイルスで、骨髄由来のＤＣ（骨髄培養５日目）を形質導入した。例えば、骨髄由来のＤＣを、５のＭＯＩでＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ又はＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで形質導入した。その後ＤＣを８時間ＴＲＰ２ペプチド又はオボアルブミンタンパク質でパルスし、ＰＢＳで３回洗浄し、培養中で、さらに３６時間後、免疫化のために使用した。一部の実験については、抗原パルスを受けたＤＣを２４時間ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ、シグマ、ミズーリ州セントルイス）で刺激し、ＰＢＳで洗浄し、その後Ｃ５７ＢＬ／６マウス（ジャクソン・ラボラトリー）に足蹠から注入した。治療モデルにおいて、ＥＧ７又はＢ１６腫瘍細胞（２．５〜５×１０５）を同系Ｃ５７ＢＬ／６マウスの右脇腹内に皮下（ｓ．ｃ．）注射した。腫瘍接種から異なる日数後で、マウスをランダムにグループに分け、５０μｌの抗原パルスを受け形質導入されたＤＣ又はＰＢＣ対照を注入した。一部のマウスにおいて、ワクチン接種から指示された日数後にＬＰＳを腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。キャリパで一週間に２〜３回、腫瘍体積を測定した。
【０３１０】
統計学的分析
統計学的分析のためには、スチューデントｔ検定が使用され、Ｐ＜０．０５と定義づけされる９５％の信頼性限界が有意なものとされた。結果は標準的に、平均±標準誤差として提示される。
【０３１１】
本実施例で提示されている実験の結果について、ここで記述する。
【０３１２】
実施例１：マウスＳＯＣ−１ｓｉＲＮＡの同定と分析
ＳｉＲＮＡ配列ターゲティングマウスＳＯＣＳ１：ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ１（ＣＣＴＴＣＣＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＧＡ；配列番号１）、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ２（ＣＡＧＴＣＧＣＣＡＡＣＧＧＡＡＣＴＧＣ；配列番号２）及びＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ３（ＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＴ；配列番号３）を選択するためにコンピュータプログラムを使用した。その他の既知の遺伝子に対する相同性の欠如を確認するために、全ての標的配列をＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔクエリに付した。９ｎｔのスペーサで分離されたセンス及びアンチセンス１９ｎｔ標的配列をコードするために順方向及び逆方向オリゴを設計した。このコアｓｉＲＮＡ配列は、Ｈ１ＲＮＡ転写開始及び５Ｔターミネータ配列によってフランキングされ、アニーリングの時点で５’Ｂｇ１ＩＩ及び３’ＨｉｎｄＩＩＩ相溶性オーバーハングを取込んだ。ＤＮＡベースのｓｉＲＮＡ発現ベクターｐＳＵＰＥＲ（ブルンメルカンプら、２００２年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２９６号：５５０〜５５３頁）は、ｓｉＲＮＡのデノボ合成を導くためにＨ１−ＲＮＡプロモータを使用する。合成されアニールされたオリゴヌクレオチド対を、Ｂｇ１ＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩで消化されたｐＳＵＰＥＲベクター内にクローニングした。制限消化物により正のクローンを同定し、ＤＮＡ配列決定により確認した。
【０３１３】
マウスＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡのためのレンチウイルスベクターの生成及び産生
本研究において使用されたＨＩＶ移入ベクターは、内部サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータを含んでなり、かつ転写活性のある配列を除去する３’長末端反復（ＬＴＲ）のＵ３領域内に４００ｂｐの欠失をもつ自己不活性化ベクター（ＳＩＮベクター）である、ｐＴＲＩＰ△Ｕ３  ＣＭＶ  ｅＧＦＰであった。レンチウイルス移入ベクターｐＴＲＩＰ△Ｕ３  ＣＭＶ  ＧＦＰは、もとのｐＨＲ’主鎖の固有のＣｌａＩ部位の中に中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）及び中央終結配列（ＣＴＳ）を包含する１７８ｂｐのフラグメントを含有する。ｐＴＲＩＰΔＵ３  ＣＭＶ  ＧＦＰは、Ｈ１  ＲＮＡプロモータからのｓｉＲＮＡの発現及びビシストロンブラスチシジン耐性／ｅＹＥＰ選択マーカーの同時発現のために修飾された。クローニングに対処し未変性ＣＭＶプロモータを除去するために、クローニングのための５’−ＥｃｏＲＩ及び３’−ＢａｍＨＩ部位を挿入するべくプライマ（５’−ＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣＡＣＡＡＡＴＧＧＣ−３’；配列番号４及び５’−ＣＴＡＧＧＧＡＴＣＣＡＴＣＧＣＣＣＣＡＡＡＧＴＧＧ−３’；配列番号５）を用いて、ｐＴＲＩＰベクターの中央ポリプリントラクト／中央終結配列（ｃＰＰＴ／ＣＴＳ）をＰＣＲ増幅した。その後、ｃＰＰＴ−ＣＴＳＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩで消化し、ＥｃｏＲＩ／ＢａｍＨＩ消化済みｐＴＲＩＰΔＵ３  ＣＭＶ  ＧＦＰベクターの中に再挿入した。ウッドチャック転写後調節要素（ｗＰＲＥ）配列を、プライマ（５’−ＧＡＴＣＣＴＣＧＡＧＧＴＣＧＡＣＡＡＴＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡ−３’；配列番号６及び５’−ＧＡＴＣＧＧＴＡＣＣＣＡＧＧＣＧＧＧＧＡＧＧ−３’；配列番号７）を用いてｐＢＳ−ＳＫ−ＷＰＲＥからＰＣＲ増幅して、５’−ＸｈｏＩ／ＳａｌＩ及び３’ＫｐｎＩ部位を添加した。その後、ＸｈｏＩ／ＫｐｎＩでＷＰＲＥフラグメントを消化し、修飾済みのｐＴＲＩＰΔＵ３  ＣＭＶ  ＧＦＰ主鎖の中に挿入してｐＴＲＩＰ−Ｗを生成した。ｓｉＲＮＡ及びビシストロン選択マーカーカセットをまず、ｐＴＲＩＰ−Ｗ内への移送のためにｐＳＵＰＥＲ主鎖内で組立てた。ビシストロン選択マーカーＣＭＶ−ＢｌａｓｔｉＲ−ＩＲＥＳ−ｅＹＦＰ（ＢＹ）をプライマ（５’−ＣＡＧＴＡＴＣＧＡＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＣＡＡＴＡＴＴＧＧＣＣＡＴＴＡＧ−３’；配列番号８及び５’−ＣＡＧＴＧＴＣＧＡＣＴＴＡＡＴＴＡＡＧＴＧＧＣＣＧＣＴＴＴＡＣＴＴＧ−３’；配列番号９）を用いてプラスミドＰＹＡＰ６からＰＣＲ増幅して、５’−ＣｌａＩ及び３’−ＳａｌＩ部位を取込んだ。ＰＣＲ産物をＣｌａＩ及びＳａｌＩで消化し、次にＣｌａＩ／ＳａｌＩ消化したｐＳＵＰＥＲベクター内にライゲートさせて、Ｈ１−ＲＮＡプロモータ及びｐＳＵＰＥＲＭＣＳの３’末端でＢＹマーカーを添加し、ｐＳＵＰＥＲ−ＢＹを生成させた。その後、
ｐＳＵＰＥＲ−ＢＹをＢａｍＨＩ／ＳａｌＩ消化し、ｐＴＲＩＰ−Ｗ主鎖内にライゲートさせて、ｐＴＲＩＰ−Ｈ１−ＢＹ−Ｗを生成させた。
【０３１４】
ｈｒＧＦＰ又はＳＯＣＳ１（３）ｓｉＲＮＡヘアピン配列を含有する後続するｐＳＵＰＥＲベクターを、ｐＴＲＩＰ−Ｈ１−ＢＹ−Ｗ内への挿入のためにＢｓｔＢ１及びＣｌａＩで消化して、ｐＴＲＩＰ−ｈｒＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＢＹ−Ｗ（ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）、及びｐＴＲＩＰ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＢＹ−Ｗ（ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ）を生成させた。最後の３９０ｂｐのスペーサーフラグメントを、最終ベクターのＣｌａＩ部位で挿入して、ＣＭＶプロモータの最初からｓｉＲＮＡの終結配列を離隔させた。全てのベクターをＤＮＡ配列決定によって確認した（ローン・スター・ラブス（Ｌｏｎｅ  Ｓｔａｒ  Ｌａｂｓ）、米国テキサス州ヒューストン（Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ））。
【０３１５】
２９３Ｔ細胞内への３つのプラスミドの同時トランスフェクションにより、組換え型シュードタイプレンチウイルスベクターを生成した。ＨＩＶ由来のパッケージング構成体ｐＣＭＶ△Ｒ８．９は、ＨＩＶ−１ｇａｇ、及びｐｏｌ前駆物質ならびに調節タンパク質ｔａｔ及びｒｅｖをコードする。水疱性口内炎ウイルスの糖タンパク質Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ）が、プラスミドｐＭＤ．Ｇから発現された。ｐＣＭＶ△Ｒ８．９、ｐＭＤ．Ｇ及びレンチウイルスｐＴＲＩＰｓｉＲＮＡ移入ベクターでの２９３Ｔ細胞の過渡的リン酸カルシウム同時トランスフェクションによりシュードタイプレンチウイルスを産生させた。トランスフェクションから６０〜７２時間後に、４℃で２時間５０、０００×ｇで超遠心分離により上清を濃縮させた。ウイルスペレットをＲＰＭＩ内で再懸濁し、さらなる研究のため−８０℃で凍結させた。濃縮ウイルスの段階希釈物及び８μｇ／ｍｌのポリブレンと共に６時間２９３Ｔ細胞をインキュベートしその後、７２〜９６時間後にｅＹＥＰ−陽性細胞を判定するべく蛍光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）分析を行なうことによって、ウイルス力価を決定した。ベクター力価を次のように計算した：力価＝Ｆ×２×Ｃ０／Ｖ×Ｄ（なお式中Ｄはウイルス希釈因子、Ｖは接種材料の体積、ＦはｅＹＦＰ陽性２９３Ｔ細胞の頻度、そしてＣ０は播種の時点での標的細胞の数である）。
【０３１６】
実施例２：ジーンポーターでのＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡを伴うマウスＢＭ−ＤＣのトランスフェクション及びＳＯＣＳ１ｍＲＮＡダウンレギュレーション
ＤＣによる抗原提示のＳＯＣＳ１調節を調査するために、特異的にＳＯＣＳ１をダウンレギュレートする短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を以下で記述する通りに同定した。
【０３１７】
合成ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖を、８３％のトランスフェクション効率でジーンポーターにより、顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びＩＬ−４の存在下でエクスビボでマウス骨髄細胞に由来するＤＣの中に効率良くトランスフェクトさせた。簡単に言うと、メーカーのプロトコルに従ってジーンポーターを用いて２１の塩基対ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド（５’−ＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＴ−３’；配列番号３）で骨髄ＤＣをトランスフェクトした。３μｌのジーンポーター試薬及び９４μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０に対し３μｌの２０μＭオリゴヌクレオチドを添加し、３０分間２５℃でインキュベートし、その後１００μｌのジーンポーター／オリゴヌクレオチド混合物を骨髄−ＤＣの各ウェルに添加して３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの後、２０％のＦＢＳで補足された５００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ１６４０を骨髄ＤＣに添加した。本開示に基づくと、生理学的に許容可能な担体という状況下で合成ｓｉＲＮＡオリゴが細胞に送達され得る。許容可能な担体の例としてはリポソームがある。
【０３１８】
図１Ａは、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡを発現するベクターで形質導入された細胞の中でＳＯＣＳ１がダウンレギュレートされることを立証している。簡単に言うと、ジーンポーターを用いて１０：１の比でマウスＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ又は無関係なＧＦＰ−ｓｉＲＮ
Ａを発現するｐＳＵＰＥＲ（ｐＳＵＲ）ベクター及びＦＬＡＧタグ付きｍＳＯＣＳ１発現ベクターで２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクトし、４８時間後にウェスタンブロット法に付した。ＳＯＣＳ１バンドの強度をベータアクチンバンドのものに正規化し、相対的強度（比）を示している。ＳＯＣＳ−ｓｉＲＮＡと呼ばれるＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ３（５’−ＣＴＡＣＣＴＧＡＧＴＴＣＣＴＴＣＣＣＣＴＴ−３’；配列番号３）を後続する研究で使用した。
【０３１９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ検定によって確認される通り、ＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションを受けた全ＤＣ集団中のＳＯＣＳ１ｍＲＮＡのレベルは、ＳＯＣＳ１（図１Ｂ）をダウンレギュレートできないＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡ突然変異体でのトランスフェクションを受けたＤＣ中のレベルと比べて約６０％だけ特異的に減少した。さらに、インビトロでの骨髄のＤＣ培養中及び成熟の後、ＳＯＣＳ１発現はさらに高いものであることが観察された。
【０３２０】
同様に、刺激の時点でのＳＴＡＴ１、Ｉ−κＢ及びＪＮＫのリン酸化の増強及びＩＬ−６及びＴＮＦ−α（図２）などの前炎症性サイトカインの分泌の増強によって示されるように、ｓｉＲＮＡ突然変異体を伴うＤＣよりもＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションを受けたＤＣの方がＬＰＳ又はＩＦＮ−γに対しより高い応答性を有するということも観察された。図１Ｂは、３つの独立した実験の１つからの、２４時間ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ）又はＩＦＮ−γ（１０ｎｇ／ｍｌ）に応答してｓｉＲＮＡオリゴ−又はモック−トランスフェクションを受けたＤＣが分泌するサイトカインのレベルを描いている。ＳｉＲＮＡ突然変異体（５’−ＡＣＴＡＴＣＴＡＡＧＴＴＡＣＴＡＣＣＣＣＴＴ−３’；配列番号１０）は、ＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡ３配列中に４つの突然変異を含有する。
【０３２１】
これらのデータは、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路及びＴＬＲ／ＮＦ−κＢ経路の調節にＳＯＣＳ１が関与するという報告と一致している（ハナダら、２００３年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１９号：４３７〜４５０頁；チョン（Ｃｈｏｎｇ）ら、２００３年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１８号：４７５〜４８７頁）。ＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションを受けたＤＣは、ＩＦＮ−γ及びＬＰＳ刺激の前後いずれかでのｓｉＲＮＡ−ＤＣ突然変異体よりもわずかに成熟度の高い表現型を示した。トランスフェクションを受けた両方のＤＣ共、モックトランスフェクションを受けたＤＣよりも成熟度が高かったが、このことはｓｉＲＮＡによるＩＦＮ遺伝子の非特異的活性化の効果を反映しているかもしれない。
【０３２２】
実施例３：ウイルスベクターでのマウスＢＭ−ＤＣのトランスフェクション
ＳＯＣＳ１がインビボでＤＣ抗原提示を負に調節するか否かを評価するために、ＤＣを安定した形で形質導入する能力をもつレンチウイルスベクター（ＬＶ）内に、ＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡ又は対照緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｓｉＲＮＡをクローニングして（ルビンソンら、２００３年、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．第３３号：４０１〜４０６頁；スクロアーら、２００４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２４６号：４５１〜４５９頁）、ＳＯＣＳ１サイレンシング化の効果をより高い信頼性で査定できるようにした。本書の他の箇所で記述された方法に従って黄色螢光タンパク質（ＹＦＰ）マーカー（図３）を共に含有するＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ及びＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡという２つの構成体を生成した。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ又はＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡベクターのいずれかでの骨髄由来のＤＣの形質導入（８０％超のＣＤ１１ｃ＋）は、日常的に、ＹＦＰについて陽性の培養細胞の５８〜６３％を生成した。ｓｉＲＮＡオリゴトランスフェクションを受けたＤＣに関する先行する観察と一致して、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣと比べＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの刺激の時点で、形質導入を受けた全ＤＣ集団内のＳＯＣＳ１ｍＲＮＡのレベルの低下及び前炎症性サイトカインの分泌の増強が観察された。形質導入を受けたＤＣ中のＳＯＣＳ１ｍＲＮＡレベルを判定するために、螢光活性化細胞分類（ＦＡＣＳ）を用いてＹＦＰ＋での形質導入を受けたＤＣを単離し、その
後、実時間定量的ＰＣＲにより、ＳＯＣＳ１ｍＲＮＡの相対的発現を判定した。ＹＥＰ＋ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ集団中のＳＯＣＳ１ｍＲＮＡのレベルは、モック形質導入されたＤＣ内のレベルと比べて約９０％低いことが観察された。ＬＰＳ刺激を伴う又はこれを伴わないＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ及びＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡでの形質導入を受けたＤＣは、比敵するレベルのＣＤ８６及びＣＤ４０発現を示した。いずれかの特定の理論により束縛されることは望まないが、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが結果としてモックＤＣよりも高いレベルのＣＤ８６及びＣＤ４０をもたらしたという観察事実は、ｓｉＲＮＡ及びレンチウイルス形質導入による非特異的活性化の効果に起因するものである確率が高いと考えられている。
【０３２３】
実施例４：マウスＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘発されるＯＶＡ特異的ＣＴＬ及び抗腫瘍活性
特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のＤＣ刺激がＳＯＣＳ１により調節されるか否かをテストするために、次の一連の実験を実施した。成熟に至るまでさらに刺激されなかった未成熟のＳＯＳＣ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ又はｓｉＲＮＡ突然変異体ＤＣをオボアルブミンＩ−ペプチド（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号１１）でパルスされ、オボアルブミン特異的ＴＣＲＴ細胞（ＯＴ−Ｉ）と同時培養させた時点で、ＯＴ−Ｉ細胞は、ｓｉＲＮＡ−ＤＣ突然変異体同時培養中よりもＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ同時培養中で多く増殖した（図４Ａ）。これらのデータと一致して、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ同時培養中で、より高いレベルの前炎症性サイトカインが分泌された（図４Ｂ）。さらに、これらの細胞のＣＴＬ検定は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣとの同時培養の後オボアルブミン＋同系ＥＧ７細胞に対するより活性な細胞傷害性を示し、このことは、ＳＯＣＳ１が抗原特異的Ｔ細胞のＤＣ刺激の調節に貢献することを実証している。
【０３２４】
インビボで抗原特異的応答をプライミングされるＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの能力を次に、エクスビボでの成熟の不在下でオボアルブミンでのパルスを受けた形質導入されたＤＣでマウスを直接免疫化することによって、テストした。四量体染色は、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ又はモックＤＣで免疫化されたマウスにおいてはそれぞれ０．６４％及び０．４３％にすぎなかった（図５Ａ）のに比べ、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスでは、全ＣＤ８＋Ｔ細胞の２．３％がオボアルブミン−四量体について陽性であることを示した。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ又はＬＶ−ＧＦＰｓｉＲＮＡ−ＤＣ間では表面成熟マーカーにわずかしか差異がなかったことから、これらのデータは、増大したＤＣ成熟だけがＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの機能的効能に貢献する要因ではなかったということを示唆している。免疫化されたマウスの体内のＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的状態を、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴ検定を用いてさらに評価した。未成熟なＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスは、それぞれに未成熟モックＤＣ又はＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣを与えられたものにおける１及び１８スポットに比べて、２×１０５のＣＤ８＋Ｔ細胞あたり６８のＩＦＮγ＋スポットを有していた（図５Ｂ）。これらの結果は、未成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが与えられたマウスからの脾細胞のオボアルブミン＋標的細胞に対するより強力な細胞傷害性を示しているＣＴＬ検定と一致していた（図５Ｃ）。未成熟ＬＶ−ＳＯＣ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化は同様に、観察可能な強力な抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー応答をも誘発した。かくして、ＳＯＣＳ１サイレンシング化は、未成熟抗原提示ＤＣが、インビボで抗原特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ応答をプライミングさせる能力をもつ免疫原性状態に達することができるようにした。何らかの特定の理論により束縛されることは望まないが、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは先行する成熟無く適応免疫をプライミングすることから、ＳＯＣＳ１は、ＤＣの寛容原性状態を維持する上で調節の役目を果たすと考えられる。
【０３２５】
インビボでの成熟ＤＣのＳＯＣＳ１媒介型調節
以下の実験は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによるＣＴＬ応答のプライミングが、内因性の環境刺激に応答したＤＣの増強された成熟の結果としてもたらされたか否かを調査するために実施された。２４時間エクスビボでＬＰＳでオボアルブミンパルスを受けたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣを最初に成熟させ、次にマウスの体内にそれらを投与する前に３回洗浄した。ＬＰＳ−成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、成熟ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣのものに匹敵する成熟表現型を示し、エクスビボ成熟の不在下でのＤＣに比べ、両ＤＣ共、ＣＴＬをより強力にプライミングした。しかしながら、成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣはなお、オボアルブミン四量体染色により実証される通り（図５Ａ）、抗原特異的ＣＴＬを誘発する上で明らかに成熟ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣよりも優れていた。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定は同様に、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおける増強されたオボアルブミン特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答をも示し、ＳＯＣＳ１サイレンシング化が内因性環境刺激に対する成熟ＤＣのより大きな応答性を可能にし、ＣＴＬ応答の増大を導くことを示唆している。
【０３２６】
さらなるインビボ試験においては、１日前に未成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスに一回ＬＰＳを注射した。この刺激は、未成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス内でのＣＴＬ応答を有意に（Ｐ＜０．０１）高めた（ＣＤ８＋Ｔ細胞内で７．８７％のオボアルブミン四量体＋）が、未成熟ＤＣ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡマウス内ではその効果は低いものであった（ＣＤ８＋Ｔ細胞内で０．６４％のオボアルブミン−四量体＋）（図６Ａ）。インビボＬＰＳ刺激後の未成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス中のオボアルブミン特異的ＣＴＬ応答の増強は、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定によって確認された（図６Ｂ）。
【０３２７】
環境刺激に応答した成熟ＤＣのシグナリングがＴ細胞プライミングにおいて役割を果たすか否かをテストするために、一日前にエクスビボ成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスに一度又は反復的にＬＰＳを注射した。ＬＰＳ注射は、成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおけるＣＴＬ応答を有意に（Ｐ＜０．０１）高め、Ｔ細胞応答をプライミングするための成熟ＤＣのシグナリングの重要性を示した（図６Ｃ及び６Ｄ）。その上、ＬＰＳ注射は、成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化したマウスにおけるオボアルブミン特異的ＣＴＬ応答を高める上でさらに有効であった。
【０３２８】
反復されたＬＰＳ刺激に対するＤＣ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡの応答性を直接調べるため、インビトロで内毒素寛容を発達させるＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ及びＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力を評価した。高レベルの前炎症性サイトカインを産生することによる反復的ＬＰＳ刺激に対しＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣはなおも強く応答したがＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは強く応答せず、このことは、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが刺激に対し連続して応答することを示唆している。さらに、天然の危険な分子として機能する熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）などの内因性刺激に対するＤＣ応答性の閾値は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化によって低減された。
【０３２９】
合わせて考慮するとこれらのデータは、ＤＣ内のＳＯＣＳ１のサイレンシング化が、ＤＣ応答性の閾値を低減させる確率が高く、未成熟及び成熟抗原提示ＤＣが内因性刺激に対して連続的に応答し、結果として抗原特異的ＣＴＬ応答をもたらすことを可能にする、ということを表わしている。この機序は、成熟ＤＣによる抗原提示の範囲、ひいては適応免疫の規模の制御におけるＳＯＣＳ１のきわめて重要な役割を強調するものである。
【０３３０】
インビボ刺激によるＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの免疫化の増強
サイトカイン又はトール様レセプタ（ＴＬＲ）アゴニストでのインビボ刺激がＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの効力をさらに増強できるか否かを調査するために、ＯＶ
Ａパルスを受けたＤＣ−ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡで免疫化されたマウスに、連続３日間一日一回腹腔内でＬＰＳ（３０μｇ／マウス）、ＣｐＧ（６０μｇ／マウス）、ＰｏｌｙＩ：Ｃ（５０μｇ／マウス）、抗ＣＤ４０（１００μｇ／マウス）又はＩＦＮ−ｇ（１μｇ／マウス）を注射した。これらの刺激がＤＣ−ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡマウスにより誘発されたＣＴＬ応答を優先的に高めるということが観察された（図６Ｅ）。これらの結果は、数多くの刺激がＬＰＳに加えてさらに、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの免疫化の効力を増強し得るということを表わしている。
【０３３１】
ＤＣ内のＳＯＣＳ１サイレンシング化による抗腫瘍免疫の増強
ＤＣ抗原提示におけるＳＯＣＳ１の調節機能が観察されたことで、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣがより強力な抗原特異的抗腫瘍免疫を誘発し、かくして事前準備された腫瘍成長の制御を導くか否かの調査が促されることになった。エクスビボ成熟の不在下でのオボアルブミンでパルスされたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化は、エクスビボ成熟の不在下でオボアルブミンパルスを受けたＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ又はモックＤＣを与えられたマウスにおける腫瘍成長の控えめな減少とは対照的に、テスト対象の全てのマウスにおいて事前準備されたオボアルブミン＋ＥＧ７腫瘍の成長を完全に遮断した（図７Ａ）。インビボ抗体遮断実験は、抗ＣＤ４ではなく抗ＣＤ８抗体遮断が、オボアルブミンパルスを受けたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘発される抗腫瘍活性を無効にする（図７Ｂ）ことを立証しており、このことは、抗腫瘍応答におけるＣＤ８＋ＣＴＬの極めて重要な役割を示している。
【０３３２】
ＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡのオリゴ２重鎖トランスフェクションを受けたＤＣが、抗腫瘍活性の増強を示した否かをテストするため、ＤＣをＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖又は対照オリゴ２重鎖でトランスフェクトした。その後マウスのグループを、ＯＶＡ又はＴＣ−１腫瘍リゼイトでパルスされた、トランスフェクションを受けたＤＣを用いて免疫化した。パルスされたＤＣでのマウスの免疫化の後、マウスをインビボで３回ＬＰＳ（３０μｇ／マウス）で刺激した。ＤＣ免疫化から２週間後に、ＯＶＡ＋ＥＧ７腫瘍又はＴＣ−１腫瘍を用いて、免疫化済みマウスに抗原投与した。ＥＧ７及びＴＣ−１の両方の腫瘍モデル（図７Ｃ及び７Ｄ）の中で、抗腫瘍活性の増強が観察された（図７Ｃ及び７Ｄ）。その上ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定は、ＴＣ−１腫瘍リゼイトでパルスされたＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡオリゴ−ＤＣで免疫化されたマウスにおける腫瘍特異的ＣＴＬ応答の増強を示した（図７Ｅ）。
【０３３３】
ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが自己腫瘍関連抗原に対する免疫応答を増強できるか否かがさらにテストされた。これらの実験のためには、弱免疫原性のＢ１６黒色腫細胞の中で天然に発現されるマウス黒色腫分化抗原チロシナーゼ関連タンパク質（ＴＲＰ）２を使用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６腫瘍細胞を接腫し、３日後にＬＰＳでエクスビボで刺激された、ＴＲＰ２ペプチドでのパルスを受けた成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ又はＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣを用いて一回これらのマウスを処置した。成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、事前準備されたＢ１６腫瘍の成長を有効に遮断し、一方成熟ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣはいかなる阻害効果も有していなかった（図８Ａ）。増強された抗腫瘍活性は、ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ及びＣＴＬ検定により検出される通り（図８Ｂ及び８Ｃ）、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおける強力なＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答と相関した。成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが与えられたマウスにおいてのみ、活発なＮＫ活性が検出された。オボアルブミン＋ＥＧ７腫瘍での結果とは対照的に、未成熟ＴＲＰ２パルスを受けたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化は、Ｂ１６腫瘍に対する有意な（Ｐ＞０．０５）阻害効果を生み出すことができず、このことは、有効な抗腫瘍免疫を生成するためにはＤＣの完全成熟及び成熟後の連続的シグナリングが必要とされる、ということを示唆している。外来性抗原（オボアルブミン）に対するＣＴＬ応答に及ぼすＧＦＰｓｉＲＮＡ形質導入の非
特異的な刺激効果は一貫して観察された。しかしながら、非特異的刺激効果は、自己抗原（ＴＲＰ２）に対するＣＴＬ応答を増強するのに不充分であった。
【０３３４】
ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化により誘発されると考えられる不利な自己免疫病変を検討した。ＴＲＰ２でパルスされたＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣで免疫化したマウスの脱色（白斑）が観察された。しかしながら、免疫化から３ヵ月目までは、オボアルブミン又はＴＲＰ２でパルスされたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化された２００匹超のマウスにおいて、その他の明らかな毒性は全く観察されなかった。免疫化を受けたマウスの主要な臓器及び組織の全ての組織学的分析は、病理学的炎症を全く明らかにせず、免疫組織化学的染色は、腎臓内のＩｇＧ又はＩｇＭ被着物を全く示さなかった。ＩｇＧ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ）及び抗−ｄｓＤＮＡのレベルは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ及びモックＤＣマウスにおいても匹敵するものであった。これらのデータは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ免疫化がマウスの体内で病的炎症をひき起こさないことを示唆している。いずれかの特定の理論により束縛されることは望まないものの、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは、事前準備された弱免疫原性の腫瘍の成長を遮断することのできる有効で抗原特異的な抗腫瘍免疫を誘発する大幅に増強された能力を有するものと考えられる。
【０３３５】
ＳＯＣ１のサイレンシング化が、ＤＣによる抗原提示及び抗原特異的抗腫瘍免疫を増強させる
本書で提示されている結果は、ＤＣの刺激能力及び適応免疫の規模がＤＣ中のＳＯＣＳ１により決定的に調節されるということを実証している。抗原提示ＤＣ内でＳＯＣＳ１をサイレンシング化することは、抗原特異的抗腫瘍免疫を大幅に増強する。ＳＯＣＳ１は、ＤＣによる抗原提示及び適応免疫の規模を定性的及び定量的に制御するための阻害的機序を表わす。
【０３３６】
本開示は、成熟したＤＣによる抗原提示の範囲を調節する上でのＳＯＣＳ１の決定的な役割を実証し、かくして適応免疫の規模及び持続時間をＤＣが制御できるようにする調節機序を実証している。ＤＣの寛容原性状態を維持する上でのＳＯＣＳ１の重要性は、本書において、野生型ＤＣとは対照的に、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣがエクスビボ成熟の必要性が無い状態でインビボでＴ細胞応答をプライミングするための刺激性抗原提示能力に恵まれている、という点で例示されている。何らかの特定の理論により束縛されることは望まないが、ＤＣ内のＳＯＣＳ１が適応免疫の規模を制御する精確な機序には、サイトカイン、病原菌産物そして又恐らくは細胞と細胞の接触での刺激に応答した抗原性ペプチド提示、共同刺激／同時阻害及びサイトカイン産生に関する成熟ＤＣのシグナリング及び産出量の調節が関与する、と考えられている。
【０３３７】
成熟ＤＣは一般に、限られた数の研究に基づいて、寿命が短かい。しかしながら、信頼性の高い遺伝的方法を用いた最近の研究は、成熟抗原提示ＤＣの寿命が以前に推定されたものよりもはるかに長く、インビボで２週間持続するということを実証しており、成熟ＤＣにより抗原提示の範囲を調節することの必要性及び重要性を裏づけている。
【０３３８】
本発明は、ＤＣ内の決定的な抑制を無効にすることにより、腫瘍ワクチンの効力を増強するための遺伝的手段としてＤＣ内でＳＯＣＳ１をサイレンシング化する新規の原理に関する。ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣでのワクチン接種は、ＳＯＣＳ１のサイレンシング化により抗原提示免疫原性ＤＣがインビボで抗原特異的Ｔ細胞を持続的に刺激できるようになるため、抗原特異的抗腫瘍免疫を大幅に増強する。ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは、調節Ｔ細胞抑制を阻害するＩＬ−６などの前炎症性サイトカインの産生及びＤＣ成熟を増強することにより、調節Ｔ細胞をオフに切換えることができる。
【０３３９】
Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４の遮断は、寛容性を有効に破るが、患者の体内で重大な非特異的自己免疫炎症をひき起こす。抗原提示レベルでＤＣ内でＳＯＣＳ１をターゲティングすることにより、より抗原特異的な抗腫瘍応答を達成することが可能である。第１に、腫瘍関連抗原が豊富に負荷されているＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣでの免疫化は、正常な腫瘍組織に対する自己反応性Ｔ細胞を不可避的に活性化させるアプローチである、エフェクタＣＴＬ上でのＣＴＬＡ−４のターゲティングとは対照的に、抗原特異的免疫を誘発することになる。第２に、残留ＳＯＣＳ１レベルを伴う部分的にＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの使用は、ヘテロ接合ＳＯＣＳ１＋／−マウスが全く又は穏やかにしか自己免疫炎症の徴候を示さないことから、重大な自己免疫炎症をひき起こさない可能性があると思われる。さらに、ＳＯＣＳ１−／−マウスにおいて見られる重大な自己免疫炎症は、ＤＣ内のみならずＴ及びＮＫＴ細胞などのその他の免疫細胞系統においてもＳＯＣＳ１の完全な欠損を必要とする。本書で提示されている結果は、抗原提示及び適応免疫の定性的及び定量的調節を理解するためのみならず、ＤＣの刺激潜在力を増強することによる癌及び感染性疾患に対する有効なワクチンの開発のためにも、見識を提供する。
【０３４０】
実施例５：マウスＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘発されるＴＲＰ２特異的ＣＴＬ及び抗腫瘍活性
本開示は、成熟ＤＣにおいてＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡで低減されたＳＯＣＳ１発現を発現するレンチウイルスベクターが、自己抗原特異的ＣＴＬ応答の規模を増大できるということを実証している。この研究のためには、モデル自己抗原として、マウスメラニン細胞分化抗原であるチロシナーゼ関連タンパク質２（ＴＲＰ２）が使用された。正常なメラニン細胞及び弱免疫原性のＢ１６黒色腫細胞の両方の中で天然に発現されていること、そしてＴＲＰ２内で数多くのクラスＩＭＨＣエピトープが同定されていることから、ＴＲＰ２が使用された（ファン・エルサス（ｖａｎ  Ｅｌｓａｓ）ら、２００１年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１９４号：４８１〜９頁）。
【０３４１】
この実施例中で提示されている実験において用いられる材料及び方法についてここで記述する。
【０３４２】
マウス／動物モデル
４〜６週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６、ＣＤ４ＫＯ、ＣＤ８ＫＯ又はｐ３５（ＩＬ−１２）ＫＯマウスをジャクソン・ラボラトリーズ（米国メーン州バーハーバー（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｍａｉｎ））から購入し、機関の指針に従ってベイラー・カレッジ・オブ・メディシン（Ｂａｙｌｏｒ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ）（米国テキサス州ヒューストン）で無菌のマウス施設の中に維持した。
【０３４３】
ペプチド
Ｈ２−Ｋｂ制限されたＴＲＰ２ａ（ＶＹＤＦＦＶＷＬ；配列番号１５）及びＴＲＰ２ｂ（ＳＶＹＤＦＦＶＷＬ；配列番号１６）（ファン・エルサスら、２００１年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１９４号：４８１〜９頁）及び対照Ｈ２−Ｋｂ制限されたＯＶＡ−Ｉ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号１１）を合成し、ジーンメッド・シンセシス社（Ｇｅｎｅｍｅｄ
Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｉｎｃ．）（米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ（Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ））により９５％超の純度までＨＰＬＣにより精製した。内毒素を含まないＰＢＳ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）中での最終希釈の前にＤＭＳＯ中で全てのペプチドを溶解させた。
【０３４４】
レンチウイルスベクターでのＢＭ由来のＤＣの形質導入
組換え型レンチウイルスベクター（ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ及びＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）を、本書の他の箇所で記述されている通りに産生し、滴定しＤＣを形質導入するのに使用した。
【０３４５】
サイトカインＥＬＩＳＡ及び酵素連結型イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）検定
提示された時点で指示された刺激を用いてメーカーの指示に従って、ＥＬＩＳＡ分析用のＤＣ培養の上清（ＢＤバイオサイエンシーズ、ニュージャージー州リンカーンパーク）を用いて様々な前炎症性サイトカインのレベルを定量した。フアン（Ｈｕａｎｇ）ら、２００３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６３号：７３２１〜９頁の中で記述されているように、単離されたＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検定を実施した。マウスＣＤ８＋Ｔ細胞刺激のためには、Ｈ２−Ｋｂ／ＴＲＰ２クラスＩペプチドを使用した。ＯＶＡからの無関係のペプチドも、負の対象として使用した。ＭＡＣＳ  ＣＤ８（Ｌｙ−２）マイクロビーズ（ミルテニー・バイオテク社、カリフォルニア州オウバーン）を用いることにより、脾細胞からＣＤ８＋Ｔ細胞を単離した。
【０３４６】
フローサイトメトリ分析
細胞を、０．１％のＮａＮ３及び２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ中のＦＩＴＣ又はＰＥｍＡｂｓで染色した。マウスのＣＤ８（５３−６．７）、ＣＤ１１ｃ（ＨＬ３）、ＣＤ４０（３／２３）、ＣＤ８０（１６−１０Ａ１）、ＣＤ８６（ＧＬ１）、ＯＸ４０Ｌ（ＲＭ１３４Ｌ）又はＰＤＬ１（ＭＩＨ５）及び整合したイソタイプ対照に特異的な抗体を、ＢＤファーミンゲン（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）（ニュージャージー州フランクリンレイクス（Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ，ＮＪ））又はイーバイオサイエンス（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）（カリフォルニア州サンディエゴ）から購入した。染色した細胞をＦＡＣＳ  Ｃｓｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン、ニュージャージー州リンカーンパーク、ニュージャージー州フランクリンレイクス）フローサイトメトリ上で分析した。
【０３４７】
四量体染色
ＴＲＰ２特異的マウスＣＤ８＋Ｔ細胞を検出するために、Ｈ２−Ｋｂ／ＴＲＰ２−ＰＥ四量体検定を使用した。べイラー・カレッジ・オブ・メディシン、テトラマー・コアー・ファシリティー（Ｔｅｔｒａｍｅｒ  Ｃｏｒｅ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）（米国、テキサス州ヒューストン）でＴＲＰ２−四量体を合成した。免疫化したマウス由来の脾臓を抗−ＣＤ８a−ＦＩＴＣ／抗−ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ及びＨ２−Ｋｂ／ＴＲＰ２−ＰＥで同時染色した。四量体染色は、メーカーの指示に従い、１０６個の細胞につきＴＲＰ２−ＰＥ四量体の１：１００希釈物及び抗−ＣＤ８α−Ｆｉｔｃの１μｇを用いて１時間４℃で行なった。
【０３４８】
ＤＣ免疫化及び腫瘍マウス研究
本書の他の個所で記述されている通り、５というＭＯＩでＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ又はＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを用いてＢＭ由来のＤＣ（ＢＭ培養４〜５日目）を形質導入した。簡単に言うと、ＤＣを２０時間ペプチドでパルスし、ＰＢＳで３回洗浄し、２４時間ＬＰＳ（１００ｎｇ／ｍｌ、シグマ、ミズーリ州セントルイス）又はＴＮＦa（５００ｎｇ／ｍｌ、アールアンドディー・システムズ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、ミネソタ州ミネアポリス（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ））で刺激し、ＰＢＳで３回洗浄し、次にＣ５７ＢＬ／６、ＣＤ８ＫＯ、ＣＤ４ＫＯ又はｐ３５ＫＯマウスの体内に後足蹠から注射した。治療モデルにおいて、Ｂ１６腫瘍細胞（２．５×１０５）を、同系マウスの右脇腹に皮下（ｓ．ｃ）注射して、腫瘍モデルを確立した。腫瘍接種の後３日目に、マウスをランダムにグループ分けし、３０μｌのペプチドパルスされたＤＣ（５０μｇ／ｍｌ）、形質導入されたＤＣ（１．５×１０６）又はＰＢＳ対照を注射した。一部のマウスにおいては、ＤＣワクチン接種から指示された日数後に、ＬＰＳ（３０μｇ／マウス）又は組換え型マウスＩＬ−１２タンパク質（１mｇ／マウス、ぺプロテック、ニュージャージー州ロッキーヒル）を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。実験が完了するまで２日に一度、キャリパで腫瘍体積を測定した。
【０３４９】
ＣＴＬ検定
標的細胞を溶解するインビトロ再刺激された脾細胞の能力を測定する標準クロム放出検定で、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答を査定した（ホアンら、２００３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６３号：７３２１〜９頁）。２〜３匹の免疫化したマウスからプールした脾細胞を、４〜６日間、Ｈ２−Ｋｂ／ＴＲＰ２ペプチドを含有するＲＰＭＩ−１６４０中でインビトロで再刺激した。ＴＲＰ２＋標的Ｂ１６細胞（Ｈ２−Ｋｂ）及び対照ＥＧ７細胞（ＡＴＣＣ、バージニア州マナサス（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ））を、振とうさせながら３７℃で、９０分間５１Ｃｒクロム酸ナトリウム溶液で標識した。異なる数のエフェクタ細胞を３７℃で４時間、９６ウェルのＵ字底平板（２００μｌ／ウェル）内で、一定数の標的細胞（５×１０４／ウェル）と共にインキュベートした。３重培養から上清を収集し、分析した。（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００として溶解百分率を計算した。
【０３５０】
統計学的分析
統計学的分析のためには、スチューデントｔ検定が使用され、Ｐ＜０．０５と定義づけされる９５％の信頼性限界が有意なものとされた。結果は標準的に、平均±標準誤差として提示される。
【０３５１】
本実施例で提示されている実験の結果について、ここで記述する。
【０３５２】
ＳＯＣＳ１により制限された成熟ＤＣ内のシグナリングが特異的ＣＴＬ応答及び寛容を制御する
ＬＰＳで、エクスビボで成熟させられたＴＲＰ２ペプチドパルスを受けた形質導入されたＤＣを用いて、Ｃ５７ＢＬ／６マウスを免疫化した。免疫化したマウスを次にＬＰＳの存在下又は不在下で１回又は３回インビボで刺激し、四量体分析を用いてＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答を測定した。誘発する前炎症性サイトカインの数が多く、その多くがＳＯＣＳ１により調節されていること、ならびに、ＮＦ−κＢ（ｐ６５）シグナリングの直接的調節におけるＳＯＣＳ１の役割が立証されていることを理由として、インビボ刺激のためにはＬＰＳが選択された（リョーら、２００３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．第１２号：１４１３〜２６頁）。インビボＬＰＳ刺激の不在下で、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウス内では３．１％にすぎなかったのに比べ、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスにおいては、ＴＲＰ２−四量体について総ＣＤ８＋Ｔ細胞の５．１％が陽性であった（図９Ａ）。１回又は３回のインビボＬＰＳ刺激で、ＴＲＰ２−四量体について陽性であるＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスにおいて実質的に増大し（それぞれ９．７％及び１９．４％）、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスにおいては概して変化がなかった（それぞれ３．０％及び４．０％）（図９Ａ）。これと一致して、ＣＴＬ検定（図９Ｃ）及びインターフェロンγ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴは類似の結果を示した。その上、免疫化から３ヵ月後に、ＬＰＳが同時注入され（図９Ｂ）、ＴＲＰ２ペプチドパルスを受けたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ
ＤＣで免疫化されたマウスの大部分に、白斑（外被の明色化、脱色及び／又は脱毛）がはっきりと見え、このことは、宿主メラニン細胞内で通常発現されるＴＲＰ２に対する自己寛容の破壊を表わしていた。これとは対照的に、反復的にインビボでＬＰＳを投与した場合でさえＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ  ＤＣで免疫化されたマウスのいずれにも全く白斑が観察されず、これは、自己抗原に対する寛容を維持するためのＤＣ内のＳＯＣＳ１の決定的な役割を示唆していた。これらの結果は、成熟抗原提示ＤＣ内でのシグナリングがＣＴＬ応答及び自己寛容の規模を制御すること、そして成熟ＤＣのシグナリングがＳＯＣＳ１により厳格に制限されることを実証している。
【０３５３】
ＳＯＣＳ１−制限されたシグナリングが、自己寛容を破断し有効な抗腫瘍免疫を誘発するＤＣの能力を制御する
腫瘍ワクチン接種の第１の目的は、腫瘍細胞上で優先的に発現される自己抗原に対する強い適応免疫応答を誘発することにより自己寛容を破断することにある。自己抗原特異的ＣＴＬ応答及び自己寛容の規模を調節する上でのＳＯＣＳ１の役割が観察されたことから、有効な抗腫瘍免疫を誘発する成熟ＤＣの能力がＳＯＣＳ１発現により制御されるか否かの調査が促されることになった。これをテストするために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスをＢ１６腫瘍細胞で皮下接種し、３日後に、ＬＰＳによりエクスビボで成熟させたＴＲＰ２パルスされ形質導入されたＤＣで一回免疫化した。図１０Ａは、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＣ免疫化だけで、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ免疫化と比べたＢ１６腫瘍の成長を著しく阻害することができた（Ｐ＜０．０１）ということを示している。しかしながら、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化したマウスの５０％は、腫瘍接種から３０日後に１，５００ｍｍ３を上回る全身腫瘍組織量のため最終的に死亡した。前炎症性シグナルを増強することによりＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化したマウスにおけるマウス生存率を改善できるか否かを判定するために、マウスをＤＣ免疫化から一日後にＬＰＳによりインビボで一回刺激した。免疫化プロトコルに対するＬＰＳ刺激の付加は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化したマウスにおけるＢ１６腫瘍の成長を実質的に遮断した（図１０Ｂ）。このことは、ＬＰＳ刺激を受けていないマウスに比べて全身腫瘍組織量の減少を全く示さなかったＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ及びモック形質導入を受けたＤＣ対照と好対照を成していた（図１０Ａと１０Ｂを比較のこと）。ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化とＬＰＳ抗原投与の組合せは同様に、マウスの生存率を６０日超の間１００％まで大幅に増大させた（図１０Ｃ）。抗腫瘍活性の増強は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスの体内の強力なＴＲＰ２特異的ＣＴＬ活性と相関された（図１０Ｄ）。ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでＣＤ４及びＣＤ８ノックアウト（ＫＯ）マウスを免疫化することにより、免疫化されたＣＤ４ＫＯマウスにおいては弱い抗腫瘍活性しか観察されなかったものの、抗腫瘍活性がＣＤ８＋及びＣＤ４＋細胞の両方を必要とすることがさらに実証された（図１０Ｂ−１０Ｄ）。集合的に、これらの結果は、成熟ＤＣにおけるＳＯＣＳ１で制限されたシグナリングが、寛容を破断し有効な抗腫瘍免疫を誘発するそれらの能力を制御すること、そして通常ＳＯＣＳ１により調節される付加的な前炎症性シグナルが、事前準備された全身腫瘍組織量を制御する誘発された抗腫瘍免疫応答の能力をさらに増大し得ることを表わしている。
【０３５４】
自己寛容及び抗腫瘍免疫の制御におけるＳＯＣＳ１で制限されたシグナル３の決定的役割
ＳＯＣＳ１は、抗原ペプチド／ＭＨＣ提示／共同刺激及び／又はサイトカインシグナリング及び分泌を調節することにより、成熟ＤＣのシグナリング及び産出量に影響を及ぼす確率が高い。以下の実験は、自己抗原特異的ＣＴＬ応答及び抗腫瘍免疫の制御のためにこれらの３つのシグナルのうちのどれが主としてＳＯＣＳ１により調節されるかを調査するために着手された。
【０３５５】
まず第１に、ＳＯＣＳ１サイレンシング化が、共同刺激分子の発現に影響を及ぼすか否かがテストされた（シグナル２）。フローサイトメトリ検定により、ＬＰＳ誘発型成熟の前後両方で、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ上に比べＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ上には検出不能な又はわずかにしか増強されていない共同刺激／阻害分子（Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０又はＰＤＬ１）表面レベルが存在する、ということが一貫して観察された（図１１Ａ）。匹敵するレベルのＭＨＣ−Ｉ及びＩＩ分子がＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ及びＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ上でも検出された。
【０３５６】
抗腫瘍免疫を誘発する上でのＣＤ８＋Ｔ細胞の重要性のため、ＭＨＣ−Ｉ制限型ペプチド免疫原性（ＴＣＲ親和性）がインビボでのＳＯＣＳ１制限型抗原提示において重要な役割を果たすか否かがさらに調査された。高親和性形態（ＴＲＰ２ｂ）及び低親和性形態（ＴＲＰ２ａ）のＴＲＰ２ＣＴＬペプチドが以前に同定された（ファン・エルサス（ｖａｎ
Ｅｌｓａｓ）ら、２００１年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１９４号：４８１〜９頁）こと
から、抗腫瘍免疫応答を誘発する形質導入済みＤＣの能力に対しシグナル１の強度が影響を及ぼし得るか否かをテストするために、両方のＴＲＰ２ペプチドを使用した。図１１Ｂは、ＴＲＰ２ｂペプチドで負荷されたＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣはほんの少しの抗腫瘍活性（統計学的には重要でない）しか示さなかったものの低（ＴＲＰ２ａ）又は高（ＴＲＰ２ｂ）親和性ペプチドのいずれかが負荷された成熟ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣはインビボＬＰＳ刺激でＢ１６腫瘍の退行を誘発できなかったということを示している。これとは対照的に、低又は高親和性ＴＲＰ２ペプチドのいずれかで負荷されたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは両方共、腫瘍の成長を有効に遮断した。免疫化されたマウスにおけるＴＲＰ２特異的ＣＴＬ活性も同様に、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ検定を用いて調査された。図１１Ｃは、高親和性ペプチドで負荷されたＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが低親和性ペプチドで負荷されたＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣよりも強いＩＦＮγ応答を誘発したことを示している。しかしながら、低又は高親和性ペプチドのいずれかで負荷された両方のＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣグループが、高親和性ペプチドで負荷されたＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣよりもはるかに強いＩＦＮγ応答を誘発しており（Ｐ＜０．０１）、このことは観察された抗腫瘍活性と一致している（図１１Ｂ）。さらに、低又は高親和性ペプチドで負荷されたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが類似のＩＦＮγ応答を誘発した（図１１Ｃ）。
【０３５７】
これらの実験の結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化が、成熟の存在下又は不在下でＤＣ上の共同刺激／阻害性分子（シグナル２）及びＭＨＣ−Ｉ及びＩＩ分子の発現に対し有意な影響を及ぼさないこと、そしてＳＯＣＳ１がサイレンシング化されないかぎり、高親和性又は低親和性ＴＲＰ２ペプチド（シグナル１）で負荷された成熟ＤＣが強力なＩＦＮγ応答を誘発する上で有効でないこと、を実証している。
【０３５８】
実施例６：マウスのＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘発されたＣＴＬ及び抗腫瘍活性のインビボＩＬ−１２増強
樹状細胞（ＤＣ）による細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）応答の開始は充分に研究されてきているものの、自己寛容の維持又は破断を調節するための機序はなおも充分に定義されていないままである。この実施例では、成熟野生型ＤＣではなく、サイトカインシグナリング（ＳＯＣＳ）１のサプレッサが内部でシグナリングされた成熟ＤＣが、特に病原菌産物又はＩＬ−１２によりインビボで刺激された場合に、自己寛容を破断する上で有効である、ということが実証されている。本書で開示される実験は、抗原提示ＤＣにより提供される（抗原親和性（シグナル１）及び共同刺激分子レベル（シグナル２）ではなく）ＳＯＣＳ１制限されたシグナル３（ＩＬ−１２）が自己寛容を制御することを実証している。さらに、本開示は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが自己抗原に対する強力な免疫応答を誘発し、事前準備されたＢ１６腫瘍の成長を遮断することを実証している。その上、ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは、溶解エフェクタ機能で自己抗原特異的ヒトＣＴＬを完全に活性化するさらに優れた能力を有し、このＳＯＣＳ１サイレンシング化アプローチの翻訳上の潜在性を暗示している。
【０３５９】
自己抗原特異的ＣＴＬ活性化及び寛容の制御においてＳＯＣＳ１で制限されたシグナル３が重要である確率が高いことから、成熟ＤＣにおいてＳＯＣＳ１により調節される主要なサイトカインの同定が促された。ＣＴＬ活性化に影響を及ぼすものとして知られている複数の前炎症性サイトカイン候補の重要性は、当初、ＳＯＣＳ１サイレンシング化と組合せた形でのＤＣワクチン接種のために遺伝子的にホモ接合性の異なるＫＯマウスに由来するＤＣを用いることによってテストされた。ＩＬ−１２（ｐ３５−／−）ＫＯマウス由来のＤＣが免疫化のために使用された場合、ＴＲＰ２ペプチドで負荷されたｐ３５−／−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、もはやＢ１６腫瘍を阻害しないことが観察され（図１２Ａ−１２Ｂ）、このことは、腫瘍の退行のためにＳＯＣＳ１制限されＤＣ産生されたＩＬ−１２の決定的役割を示唆していた。ＳＯＣＳ１制限されたＤＣの機能におけるＩＬ−１２の役割をさらに判定するため、ｐ３５−／−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘発
されたＣＴＬ応答がさらに査定された。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ及びＣＴＬ検定を用いて、野生型ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣに比べ、ｐ３５−／−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣのＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答を誘発する能力が著しく減少していたことが観察された（図１２Ｃ及び１２Ｄ）。さらにＬＰＳでのインビボ刺激は、ＴＲＰ２−四量体分析により測定される通り、ｐ３５−／−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘発されるＣＴＬ応答を高めることができなかった（図９Ａ）。興味深いことに、抗原提示ＤＣによって産生されたＩＬ−１２の基本的な役割とは対照的に、野生型ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたＩＬ−１２（ｐ３５−／−）ＫＯマウスは、活発な抗腫瘍免疫及びＣＴＬ応答をも誘発することが観察され、このことは、自己抗原特異的ＣＴＬ応答の誘発のために常在宿主細胞により産生されたＩＬ−１２は必要とされないということを示していた（図１２Ａ−１２Ｂ）。合わせて考えた場合これらの結果は、抗原提示ＤＣにより産生されたＳＯＣＳ１制限型ＩＬ−１２が、強力なＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答及びＢ１６腫瘍の根絶を誘発する上で重要であることを表わしている。
【０３６０】
ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによるＩＬ−１２及びＩＬ−１２誘発型サイトカインの持続的かつ増強された産生とｗｔＤＣによる過渡的で低い産生の関係
ＤＣは、ＬＰＳ及びＣＤ４０ライゲーションなどの病原菌産物に応答して有意な量のＩＬ−１２を産生する（シュルツ（Ｓｃｈｕｌｚ）ら、２０００年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１３号：４５３〜６２頁）。ＤＣによるＩＬ−１２の産生は、成熟の誘発後の短い期間（８〜１６時間）に綿密に制限され（ランゲンカンプ（Ｌａｎｇｅｎｋａｍｐ）ら、２０００年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１号：３１１〜６頁）、ＳＯＣＳ１により調節される（アイルズ（Ｅｙｌｅｓ）ら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７７号：４３７３５〜４０頁）。適応免疫の調節におけるＳＯＣＳ１制限型ＩＬ−１２の重要な役割が識別されたことから、免疫寛容を破断しＴＲＰ２に対する有効な抗腫瘍免疫応答を誘発するＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力に密に関係し得るＤＣによるＩＬ−１２産生の強度及び持続時間に対するＳＯＣＳ１サイレンシング化の効果が検討された。
【０３６１】
図１３Ａは、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ及びモック形質導入を受けたＤＣに比べて、７２時間にわたるＬＰＳ及び抗ＣＤ４０ｍＡｂでの連続的刺激に応答してＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣによって著しく増大したレベルのＩＬ−１２（ｐ７０）が産生されたということを示している。次に、２４時間にわたりＬＰＳ／抗−ＣＤ４０で刺激し次にＬＰＳを含まない新鮮な培地の中のＤＣを新しい培養平板に移すことにより、もとの刺激の除去にも関わらずＩＬ−１２レベルを維持するＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力を検討した。図１３Ｂは、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ及びモック形質導入を受けたＤＣが刺激時点で過渡的にのみＩＬ−１２を産生し、一方ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは刺激の除去に関わらずはるかに高いレベルのＩＬ−１２を持続的に産生したことを示している。何らかの特定の理論により束縛されることを望まないが、ＬＰＳ／抗ＣＤ４０の除去の後のＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣによるＩＬ−１２の長時間にわたる増強した産生は、ＩＬ−１２又はその他のＤＣが分泌した前炎症性サイトカインによる場合によって自己分泌／傍分泌の刺激及び／又はもとの刺激によって誘発されるシグナリング経路の長時間にわたる活性化に起因する可能性がある。これらの結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化によりＤＣが刺激に応答して持続的な増加したレベルのＩＬ−１２を産生でき、これが、寛容を破断し事前準備された腫瘍を根絶するＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの能力の原因であり得る、ということを示している。
【０３６２】
ＳＯＣＳ１は、ＩＬ−１２及びその他のサイトカインのシグナリングを媒介するＪａｋ／Ｓｔａｔ経路の決定的調節因子であることから（クボら、２００３年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４号：１１６９〜７６頁；アレキサンダーら、２００４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２２号：５０３〜２９頁）、互いの間及び場合によってはその他の近傍のＤＣの間でのサイトカインフィードバックループの発達を通してＤＣ内のＳＯＣ
Ｓ１サイレンシング化がサイトカインの産生を増大させるか否かをテストするために、次の実験セットに着手した。これに対応するため、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣによる腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）α及びＩＬ−６の産生を測定した。かかるサイトカインはＩＬ−１２刺激により誘発されるものとして知られていることから、（ＴＮＦ）α及びＩＬ−６をテストした（トリンキエリ（Ｔｒｉｎｃｈｉｅｒｉ）ら、２００３年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第３号：１３３〜４６頁）。
【０３６３】
図１３Ｃは、過渡的に低レベルのＴＮＦα及びＩＬ−６を産生したにすぎないＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ及びモック形質導入を受けたＤＣとは異なり、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣがもとの刺激の除去後も持続的により高いレベルのＴＮＦα及びＩＬ−６を産生したことを示している。フィードバックループの発達のためのＩＬ−１２の重要性をさらに判定するために、ｐ３５−／−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ及びｗｔＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣによるＴＮＦα及びＩＬ−６の産生を比較した。図１３Ｄは、ｐ３５−／−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣかもはや増大した長時間にわたる量のＴＮＦα及びＩＬ−６を産生することができなかったということを示しており、これは、ＩＬ−１２のフィードバックがＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣによるＴＮＦα及びＩＬ−６産生の主要な誘発因子であることを表わしている。これらのデータは、ＳＯＣＳ１サイレンシング化がＤＣ中の決定的なシグナリング抑制を無効化し、従ってこれらが増強されたフィードバックループを介して連続的にＩＬ−１２のみならずＩＬ−１２誘導型前炎症性サイトカインに対しても応答しこれを産生することができるようにしている、ということを表わしている。本書で開示されている結果は、白斑及びＢ１６腫瘍細胞に対する有効な抗腫瘍免疫の両方を誘発するＴＲＰ２負荷されたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力を説明する確立の高い機序を提供している。
【０３６４】
自己寛容を破断するＤＣの能力を制御するためのＳＯＣＳ１制限型ＩＬ−１２シグナリングの重要性
自己腫瘍関連抗原に対する強力なＣＴＬ応答を誘発するＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化戦略の治療適応用を示唆する。患者の体内での刺激としてのＬＰＳの臨床的使用には過度に毒性があるため、ＳＯＣＳ１によりシグナリングが調節されているＩＬ−１２がＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの効能を高める上でも有効であるか否かを査定した。
【０３６５】
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６腫瘍細胞を接種し、３日後に、組換え型マウスＴＮＦαによりエクスビボで成熟させられたＴＲＰ２パルスを受け形質導入されたＤＣで一度、マウスを免疫化した。ＤＣ免疫化の後、レシピエントマウスをインビボで３回、低用量の組換え型マウスＩＬ−１２（マウス一匹あたり１μｇ）で刺激した。図１４Ａは、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウス内のＢ１６の腫瘍の成長が効率よく遮断されたことを示している。これとは対照的に、ＩＬ−１２を用いたインビボ投与を伴うＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化は、ＰＢＳ対照に比べて腫瘍の効果に対しほとんど効果をもたらさなかった。抗腫瘍活性は、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ検定により示される通り、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスにおけるＴＲＰ２特異的ＣＴＬ活性の増大と相関された（図１４Ｂ）。先の観察事実（図１０Ａ）と一致して、インビボでのＩＬ−１２刺激の不在下でのＴＲＰ２パルス、ＴＮＦα成熟を受けたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化は、同様に、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ対照に比べて増大した抗腫瘍活性をも示した。
【０３６６】
これらの結果は、おそらくはＩＬ−１２及びＩＬ−１２誘発型サイトカインの増強されたシグナリングに由来して、ＩＬ−１２のインビボ投与は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの免疫刺激能力を著しく増強するものの野生型ＤＣのものは増強しないということを示している。これらの結果はさらに、ＩＬ−１２などのサイトカインの全身的濃度
ではなく抗原提示ＤＣ内のＳＯＣＳ１制限型サイトカインシグナリングが、自己腫瘍関連抗原に対する有効な抗腫瘍免疫を誘発するために重要である、ということを暗示している。
【０３６７】
白斑以外のいかなる明白な毒性も、免疫化から６ヵ月までは、ＬＰＳ又はＩＬ−１２のいずれかが同時注射されたＴＲＰ２パルスを受けたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおいて観察されなかった。免疫化されたマウスの全ての主要な器官及び組織の組織学的分析は、いかなる病的炎症も明らかにしなかった。ＩｇＧ及び抗ｄｓＤＮＡのレベルは、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ及びモックＤＣマウスにおいて比較可能なものであった。これらのデータは、ＴＲＰ２パルスを受けたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化が、マウスにおいて病的炎症をひき起こさないということを示唆している。
【０３６８】
ＳＯＣＳ１制限型シグナル３の強度は、ＣＴＬ活性化、寛容及び抗腫瘍免疫を制御する
本書に開示されている結果は、腫瘍ワクチンの開発に深いかかわりを有するはずである成熟ＤＣによるＣＴＬ応答の調節への新たな見識を提供する。成熟は未成熟の寛容原性状態から成熟した免疫原性状態へのＤＣ遷移のための制御点であることが知られている（バンシュローら、１９９８年、Ｎａｔｕｒｅ第３９２号：２４５〜５２頁；スタインマンら、２００３年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２１号：６８５〜７１１頁）。抗原提示ＤＣ及びＴ細胞の間の初期接触（シグナル１及び２）の強度は、成熟ＤＣが限られた数の研究に基づいて短命であると考えられていることから、ＣＴＬ応答の規模及び命運を決定すると考えられている（ポルガドール（Ｐｏｒｇａｄｏｒ）ら、１９９８年、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ第１８８号：１０７５〜８２頁；インガリ（Ｉｎｇｕｌｌｉ）ら、１９９７年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８５号：２１３３〜４１頁；リュードル（Ｒｕｅｄｌ）ら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６５号：４９１０〜６頁）。しかしながら、成熟抗原提示ＤＣの寿命は以前に推定されたものよりもはるかに長く、インビボで２週間持続するということが、信頼性の高い遺伝子方法を用いたさらに近年の研究により実証されており（ガルグ（Ｇａｒｇ）ら、２００３年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４号：９０７〜１２頁）、このことはＴ細胞との初期係合の後に成熟ＤＣが調節の役割を果たすことを示唆している。
【０３６９】
この結果は、ＳＯＣＳ１により綿密に制限される成熟ＤＣ内での前炎症性シグナリングが、自己抗原特異的ＣＴＬ反応の規模を決定的に制御することを実証している。このことは、ＣＴＬ応答が少なくとも２つのレベル、すなわち、ＳＯＣＳ１発現によりその規模が調節される、ＣＴＬ反応の開始に必要なＤＣ成熟及び自らと及びＣＴＬとの成熟ＤＣの進行中のサイトカインシグナリングというレベルでＤＣにより制御されるということを表わしている。当該結果は、さらに、さまざまな免疫細胞のＤＣ及びその周囲環境とサイトカイン及び病原菌産物の組成及び濃度の間の動的相互作用を暗示しており、これが集合的に、自己寛容の維持又は破断、ひいては自己抗原特異的ＣＴＬ反応の命運を決定している。
【０３７０】
本書で開示されている結果は、自己寛容の維持又は破断を調節するための新規の機序を明らかにしている。ＤＣにより提供される（ペプチド親和性及び共同刺激分子レベルではなく）ＳＯＣＳ１制限型シグナル３（ＩＬ−１２）が自己寛容を決定的に制御することが発見された。自己免疫疾患（バンシュローら、２００４年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第２０号：５３９〜５０頁）及びその他のモデル（カートシンガーら、２００３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１９７号：１１４１〜５１頁；バレンズエラら、２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６９号：６８４２〜９頁）の数多くの研究において、Ｔ細胞のＤＣ媒介型活性化又は過剰活性化のためのサイトカインの重要性が暗示されてきた。
【０３７１】
ｗｔＤＣによるＩＬ−１２といったサイトカインの産生は、過渡的であり、本書で及び他の研究（ランゲカンプら、２０００年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１号：３１１〜６
頁）内で実証されている通り、刺激時点でＳＯＣＳ１により阻害される。ｗｔＤＣとは対照的に、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは、この経路の誘発可能なフィードバックインヒビターを無効化した後、ＤＣ内のＪａｋ／Ｓｔａｔシグナリング経路を通って入り組んだ自己分泌（そして場合によっては傍分泌も）シグナリングループを形成することにより、初期刺激に応答して、著しく増強したＩＬ−１２及びＩＬ−１２誘発型サイトカインレベルを連続的に産生することができるということが観察された。これと一致して、低用量のＩＬ−１２でのインビボ投与は、自己寛容を破断する（ｗｔＤＣではなく）ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの能力を有効に増強することが発見された。
【０３７２】
集合的にこれらの結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより産生されたＩＬ−１２及びＩＬ−１２誘発型サイトカインの連続的かつ増強された産生及びシグナリングが、自己寛容の破断及び抗腫瘍ＣＴＬ反応の増強において主要な役割を果たす確率が高い、ということを表わしている。これらの結果はさらに、ＤＣ内のＳＯＣＳ１による刺激性シグナリングの細胞内阻害が自己寛容の維持に寄与することを示唆している。ＳＯＣＳ１は、そのＳＯＣＳボックス領域を通してのユビキチン媒介型タンパク質分解のためにｐ６５タンパク質をターゲティングすることによりＮＦ−κＢシグナリングを直接遮断することが発見された（リョーら、２００３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．第１２号：１４１３〜２６頁）が、ギングラらは、ＳＯＣＳ１が、Ｉ型ＩＦＮのシグナリングを阻害することによってＬＰＳ誘発型毒性についてのマクロファージ内のＴＬＲ  シグナリングを間接的に調節することを報告した（ギングラ（Ｇｉｎｇｒａｓ）ら、２００４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７９号：５４７０２〜７頁）。Ｉ型ＩＦＮシグナリングを通したＬＰＳ誘発型毒性とは異なり、本書中の結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより誘発されたＣＴＬ応答がＩＬ−１２により主として媒介されることを実証している。本書中の結果は同様に、ＬＰＳに応答したＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによるＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２などのさまざまなサイトカインの産生の増強をも実証している。
【０３７３】
本研究は、自己腫瘍関連抗原に対する有効な抗腫瘍免疫を誘発するためにＤＣ内でＳＯＣＳ１をサイレンシング化することの必要性を実証している。ＤＣワクチンは、近年において１０００人超の患者が関与した９８件の公表されたＤＣワクチン治験において証明されているように、腫瘍ワクチン接種のための最も見込みある戦略の１つと考えられている（ローゼンバーグ（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ）ら、２００４年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第１０号：９０９〜１５頁）。主として多様なアプローチによりＤＣの成熟及び抗原提示を促進することを目的としたこれらの試みは、目標の臨床反応奏功率がきわめて低く、大いに失望させるものである（ローゼンバーグら、２００４年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第１０号：９０９〜１５頁）。本書中のデータは、高親和性ペプチドで負荷されたｗｔＤＣが、ＬＰＳ又はＩＬ−１２でのインビボ刺激の後でさえ自己寛容を破断することがなおもできなかったということを実証している。従って、本書中の結果は、現在記述されている腫瘍ワクチン（ローゼンバーグら、２００４年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第１０号：９０９〜１５頁）の全般的無効性を説明することができ、ＤＣ抗原の提示及び成熟を促進する現行の戦略と組合せた形でＳＯＣＳ１といった決定的なシグナリングインヒビターをサイレンシング化させることを介してさらに有効な腫瘍ワクチンを開発するための新たな途を提供する（ギルボア（Ｇｉｌｂｏａ）、２００４年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ第４号：４０１〜１１頁；ユー（Ｙｏｕ）ら、２０００年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６５号：４５８１〜４５９２頁；ソイファー（Ｓｏｉｆｆｅｒ）ら、２００３年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．第２１号：３３４３〜５０頁；パルドール（Ｐａｒｄｏｌｌ）、２００２年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２号：２２７〜３８頁）。
【０３７４】
抗原負荷されたＤＣにより誘発される抗原特異的免疫応答を特異的に増強する能力をもつこのＳＯＣＳ１サイレンシング化アプローチは同様に、主要組織又は器官に対するもの
を含めた自己反応性Ｔ細胞を差別なく過剰活性化する、エフェクタＴ細胞上でＣＴＬＡ４を全身的に遮断するアプローチよりもさらに魅力的なものでもある（ホッジ（Ｈｏｄｉ）ら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第１００号：４７１２〜７頁；ファン（Ｐｈａｎ）ら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第１００号：８３７２〜７頁）。要約すると、腫瘍ワクチンを増強するための集約的な努力が抗原親和性／用量及び共同刺激の改善に焦点を合わされてきたことから、本研究の中で見出されるＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの増強された免疫刺激能力及び自己寛容を調節するための新しい機序は、腫瘍に対する自己寛容制限を破断する一般的に応用可能な新規のワクチン接種戦略を提供するはずである。
【０３７５】
実施例７：マウスＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘発されるＨＩＶ、特異的抗体及びＣＴＬ応答
この例は、宿主の天然免疫インヒビターを阻害することにより抗ＨＩＶ免疫応答を誘発するための代替的戦略を実証している。本研究は、ＤＣ内のＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の負の免疫調節因子であるＳＯＣＳ１がＨＩＶ特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）のみならず抗体応答をも制御することを実証している。ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは、ＨＩＶエンベロープ媒介型抑制に対する耐性を有し、マウスの体内でバランスのとれたメモリーＨＩＶエンベロープ特異的抗体及びＣＴＬ応答を有効に誘発する。本開示は、宿主の免疫インヒビターを阻害することによりＨＩＶ特異的抗体及びＣＴＬ応答を惹起する最初の試みである。
【０３７６】
この実施例中で提示される実験において使用される材料及び方法についてここで記述する。
【０３７７】
レンチウイルスベクターでのＢＭ由来のＤＣの形質導入
組換え型レンチウイルスベクター、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ及びＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡを、本書の他の箇所で記述されている通りに産生し、滴定しＤＣを形質導入するのに使用した。
【０３７８】
サイトカイン及び抗体ＥＬＩＳＡ検定
細胞培養上清中のサイトカインレベルを、メーカーの指示に従ってＥＬＩＳＡ分析（ＢＤバイオサイエンシーズ、ニュージャージー州リンカーンパーク）により定量化した。Ｇｐ１２０特異的抗体及びサブクラスの力価を判定するためｇｐ１２０タンパク質（炭酸塩緩衝液中５μｇ／ｍｌ[ｐＨ９．６]）を４℃で一晩コーティングし、室温で１時間、壁にＰＢＳ−５％ＦＢＳ中の血清の１２倍階段希釈物を添加した。８回の洗浄後、ビオチニル化した抗マウス抗体（抗マウスＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ又はＩｇＧ３）を室温で１時間ウェルに添加した。ペルオキシダーゼ基質としてストレプトアビジン−ＨＲＰを使用した。５０μｌの２ＭのＨ２ＳＯ４を添加することにより、反応を停止させた。バイオアッセイリーダー（Ｂｉｏ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｄｅｒ）上にて４５０ｎｍで光学密度を読み取った。χ軸目盛がその対数であるものとして、χ軸に希釈物−１をｙ軸に光学密度（ＯＤ）値をとった散布図から判定した相互終点力価として、結果を表現している。データをプロットした後、個々の希釈系列の各々に対し対数曲線フィットを適用し、曲線フィットが正負カットオフ値と交差する点を決定した。対照マウスの血清由来の全ての希釈物の平均（＋３ＳＤ）として各抗体イソタイプについてカットオフ値を計算した。各実験中でテストした全ての試料を同時に検定した。
【０３７９】
Ｔ細胞酵素連結型イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）検定
単離されたＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞のＥＬＩＳＰＯＴ検定を、本書の他の個所で記述されている通りに実施した。
【０３８０】
Ｂ細胞単離及びｇｐ１２０抗体産生Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ検定
完全ＲＰＭＩ１６４０培地内で脾臓から調製された単細胞懸濁液を、５％のＣＯ２中で、３７℃で１時間プラスチック皿の上で平板固定して、接着性マクロファージを除去した。非接着性細胞を抗Ｔｈｇ１．２及びウサギ補体で３７℃で４５分間処置してＴ細胞を溶解させた。残りのＢ細胞の純度は通常９０％を超えていた。前述のような修正された方法により、Ｂ細胞ＥＬＩＳＰＯＴ検定を実施した（（ル・ボン（Ｌｅ  Ｂｏｎ）ら、２００１年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１４号：４６１〜７０２３頁））。簡単に言うと、９６ウェルのニトロセルロースベース平板（ミリポアマルチスクリーンＰＩ）を一晩ＰＢＳ中のｇｐ１２０でコーティングした。平板を６回ＰＢＳで洗浄し、２時間３７℃で１０％のＦＢＳを含有するＲＰＭＩ１６４０で遮断した。単離したＢ細胞をウェル内に播種し（５×１０５細胞／ウェル）、５％のＣＯ２中で、３７℃で２０時間インキュベートした。その後、ＰＢＳ０．５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０（シグマ、ミズーリ州セントルイス）で６回洗浄して細胞を除去した。０．５％のＦＢＳを含むＰＢＳ内で１μｇ／ｍｌまで希釈させたビオチニル化抗マウスＩｇＧ（ＢＤファーミンゲン）を添加し、混合物を２時間３７℃でインキュベートした。アビジン：ビオチニル化酵素複合体（ＡＢＣ、ベクター・ラボラトリーズ社（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州バーリンゲーム（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ））をさらに１時間添加した。ＡＥＣ（３−アミノ−９−エチルカバゾール；シグマ、ミズーリ州セントルイス）で４分間反応させた後、抗ｇｐ１２０ＩｇＧを検出した。ＫＳＥＬＩＳＰＯＴ４．３ソフトウエアを用いて、自動ＥＬＩＳＰＯＴ読取り機システム（カール・ツァイス社（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ，Ｉｎｃ．）、ニューヨーク州ソーンウッド（Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ，ＮＹ））で、ゼルネット・コンサルティング社（ＺｅｌｌＮｅｔ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ  Ｉｎｃ．）（ニューヨーク州ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ））が結果を評価した。
【０３８１】
ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬの定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
トランスフェクションを受けたマウスＢＭ−ＤＣ中のＳＯＣＳ１の相対的発現を定量的実時間ＰＣＲによって評価した。トリゾール試薬（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、全ＲＮＡをＤＣから抽出し、ランダム六量体プライマ及びスーパー・スクリプト・ファースト・ストランド・シンセシス・キット（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ）（インビトロジェン、カリフォルニア州カールズバッド）を用いて、各試料について１．０μｇの全ＲＮＡを逆転写させた。鋳型として１回の反応につき５ｎｇの出発ＲＮＡ材料の当量を用いて２０μｌの４重反応でＡＢＩ７９００ＨＴ  シーケンス・デテクション・システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ）（アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）上で、実時間５’−ヌクレアーゼ蛍光発生ＰＣＲ分析を実施した。ＢＡＦＴ及びＡＰＲＩＬのためには次のプライマを使用した：ＢＡＦＦ、センス５’−ＴＧＣＴＡＴＧＧＧＴＣＡＴＧＴＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号１７）及びアンチセンス５’−ＧＧＣＡＧＴＧＴＴＴＴＧＧＧＣＡＴＡＴＴＣ−３’（配列番号１８）；ＡＰＲＩＬ、センス５’−ＴＣＡＣＡＡＴＧＧＧＴＣＡＧＧＴＧＧＴＡＴＣ−３’（配列番号１９）及びアンチセンス５’−ＴＧＴＡＡＡＴＧＡＡＡＧＡＣＡＣＣＴＧＣＡＣＴＧＴ−３’（配列番号：２０）。１８Ｓのための順方向及び逆方向プライマであるＴａｇ  Ｍａｎプローブを、タックマン・ローデント（Ｔａｑｍａｎ  Ｒｏｄｅｎｔ）１８Ｓ対照試薬（アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）から得た。ＰＣＲパラメータは、タックマン・ユニバーサル・ＰＣＲ・マスター・ミックス・キット（ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  ｋｉｔ）（アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州フォスターシティー）のために推奨されたものであり、ＢＡＦＦ、ＡＰＲＩＬ及び１８Ｓ反応は別々の管内で行なった。ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬのレベルを１８ＳｒＲＮＡに正規化し、一方ＢＡＦＦ又はＡＰＲＩＬ発現（モックトランスフェクションを受けたシミュレーションされたＤＣの対照値との関係におけるもの）は、コンパラティブＣｔ方法（ライバックら、２００１年、Ｍｅｔ
ｈｏｄｓ第２５号：４０２〜８頁）により計算した。
【０３８２】
ＣＴＬ検定
標的細胞を溶解するインビトロ再刺激された脾細胞の能力を測定する本書の他の個所で記述されている通りの標準クロム放出検定で、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答を査定した。免疫化したマウスからプールした脾細胞を、４〜６日間、ｇｐ１２０タンパク質（２０μｇ／ｍｌ）を含有するＲＰＭＩ−１６４０中でインビトロで再刺激した。一晩２０μｇ／ｍｌのｇｐ１２０タンパク質でパルスした標的細胞を９０分間５１Ｃｒクロム酸ナトリウム溶液で標識した。異なる数のエフェクタ細胞を３７℃で３時間、９６ウェルのＶ字底平板（２００μｌ／ウェル）内で、一定数の標的細胞（１×１０４／ウェル）と共にインキュベートした。３重培養から上清（１００μｌ）を収集した。（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００として細胞溶解百分率を計算した。
【０３８３】
Ｔ及びＢ細胞増殖検定
本書の他の個所で記述されている通りに単離したＣＤ４＋又はＣＤ８＋Ｔ細胞（１ウェルにつき１×１０６個）及びＢ細胞（１ウェルにつき１×１０５個）を、さまざまな刺激の存在下又は不在下で９６ウェル平板の３重ウェルの中で完全培地内で培養した。培養４日目に、ウェルを１６時間、１μのＣｉ［３Ｈ］−チミジンでパルスした。その後平板を収獲し、ミクロ・ベータ（Ｍｉｃｒｏ  Ｂｅｔａ）シンチレーションカウンタ（トップ・カウント（Ｔｏｐ  Ｃｏｕｎｔ）ＮＸＴ、パッカード（Ｐａｃｋａｒｄ））を用いて、取込まれた［３Ｈ］−チミジンを測定した。
【０３８４】
ＤＣ免疫化
本書の他の個所で記述されている通りの５のＭＯＩで、骨髄由来のＤＣ（ＢＭ培養５日目）をＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ又はＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで形質導入した。
【０３８５】
この実施例で提示されている実験の結果についてここで記述する。
【０３８６】
ＤＣ中のＳＯＣＳ１のサイレンシング化が、ＨＩＶＥｎｖ特異的抗体応答を増強する
抗ＨＩＶ抗体を誘発するＤＣの能力に対するＳＯＣＳ１サイレンシング化の効果についてまず調査した。ＨＩＶＥｎｖは、細胞及び中和抗体の両方の応答を誘発できることから、この研究ではこれを使用した。本書の他の個所で記述されている通り、トランスフェクションを受けた細胞内でＳＯＣＳ１ｍＲＮＡの約９０％をダウンレギュレートする能力をもつＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡを発現する組換え型レンチウイルスベクター（ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ）及び対照ベクター（ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ）を生成した。マウス骨髄（ＢＭ）由来のＤＣをＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ又はＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで形質導入し、組換え型ＨＩＶｇｐ１２０タンパク質を負荷し、ＬＰＳによりエクスビボで成熟させた。マウスのグループを次に週間隔で２回、形質導入されたＤＣで免疫化し、続いて各ＤＣ免疫化の後にインビボでＬＰＳ刺激を行なった。本書の他の個所で記述されている通り、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによって誘発された腫瘍関連抗原に対するＣＴＬ応答をさらに増強することができるという観察事実に基づき、インビボ刺激が使用された。図１５Ａは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが、対照のＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣよりも著しく頑強なｇｐ１２０特異的ＩｇＭ及びＩｇＧ反応を惹起したということを示している。
【０３８７】
そのプロファイルが全く異なる免疫学的状態を表わしている異なる抗体サブクラスの産生は、ＣＤ４＋Ｔ−ヘルパー（Ｔｈ）１及びＴｈ２−分極サイトカイン及びＴｈ細胞の機能によって左右される（アーレン（Ａｌｌｅｎ）ら、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ第１８号：３８７〜９２頁）。図１５Ｂは、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス内の対応するサブクラスに比べた、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスにおける全てのＩｇＧサブクラス内のＨＩＶＥｎｖ特異的抗体力価の大幅な増加
を示す。Ｅｎｖ特異的抗体サブクラスのプロファイルは、Ｔｈ２応答の産物であるＩｇＧ１とＴｈ１応答と結びつけられたサブクラスであるＩｇＧ２ａの混合応答を標示し、これは、Ｔｈ１−及びＴｈ２−依存性免疫応答の両方がＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘発されたということを表わす。反復実験においても、類似の結果が得られた。マウスはＨＩＶ中和抗体の信頼性の高い試験のために適した種でないことから、中和検定は実施しなかった（（バートン（Ｂｕｒｔｏｎ）ら、２００４年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第５号：２３３〜６頁））。さらに、ＳＯＣＳ１サイレンシング化が、ＨＩＶＥｎｖタンパク質のその他の株及びオボアルブミン（ＯＶＡ）といった抗原に対する抗体反応を増強することが観察された。これらの結果は、全てのＩｇＧサブクラスを包含するＨＩＶＥｎｖ特異的抗体応答が、ＤＣ内のＳＯＣＳ１のサイレンシング化によって大幅に増強されることを実証しており、このことは、抗原特異的抗体応答を制御する上でのＤＣ内のＳＯＣＳ１の決定的役割を暗示している。
【０３８８】
ＤＣ内のＳＯＣＳ１のサイレンシング化はＨＩＶｇｐ１２０特異的ＣＴＬ応答を増強する
以下の実験は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化がＨＩＶＥｎｖ特異的ＣＴＬ応答を増強できるか否かを査定するために実施された。免疫化されたマウスの体内のＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的状況をテストするために、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ、細胞内サイトカイン染色及びＣＴＬ検定を使用した。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス体内でのｇｐ１２０パルスされた標的細胞に対するＣＴＬ活性は、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおけるものと比べはるかに強力であった（Ｐ＜０．０１）（図１５Ｃ）。これらの検定において検出されたＣＴＬ活性は、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来の脾細胞に、ｇｐ１２０パルスを受けていない標的細胞に対する明白なあらゆるＣＴＬ活性が欠如していたことから、ｇｐ１２０特異的であった。これと一致して、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスにおいては、それぞれ、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおける１９１スポットに比べ、５×１０５のＣＤ８＋Ｔ細胞あたり３６３のＩＦＮγ＋スポットが検出された（図１５Ｄ）。ＩＦＮ−γでの脾細胞の細胞内染色は同様に、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス内のＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞のさらに高い百分率を示した。これらの結果を合わせて考慮すると、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣで免疫化されたマウスにおけるＨＩＶＥｎｖに対するバランスのとれた増強された抗体及びＣＴＬ応答が実証され、このことは、ＤＣ中のＳＯＣＳ１が液性免疫及び細胞性免疫の両方を決定的に調節することを示唆している。
【０３８９】
ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより誘発された混合型の増強されたＴｈ１及びＴｈ２応答
何らかの特定の理論により束縛されることは望まないが、Ｔｈ１対Ｔｈ２応答をプログラミングする上でのサイトカインの役目からみて（マクドナルド（ＭａｃＤｏｎａｌｄ）ら、２００２年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６８号：３１２７〜３０頁；ゴール（Ｇｏｒ）ら、２００３年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４号：５０３〜５頁）、ＳＯＣＳ１サイレンシング化が、ＤＣによるサイトカインの産生を調節することによってＣＴＬ及び抗体応答に影響を及ぼす可能性があると考えられている。図１６Ａは、ＬＰＳでの刺激の後のＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣと比べた、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより産生されたＴｈ１分極された応答を促進するＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦαのレベルの著しい増大を実証している。興味深いことに、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣ内でも、Ｔｈ２分極された応答を促進するＩＬ−４、ＩＬ−６及びＩＬ−１０の著しい応答が見られた（Ｐ＜０．０１）。ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより産生されたＴｈ１及びＴｈ２促進サイトカインの両方のより高いレベルによって、ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＴＬ及び抗体応答の両方を誘発するＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの能力増強を説明することができる。
【０３９０】
これらの結果に基づくと、ＤＣの中のＳＯＣＳ１サイレンシング化は、抗体及びＣＴＬ
の応答を明らかに促進した。以下の実験は、抗体及びＣＴＬ応答の誘発に密接に関与するＨＩＶＥｎｖ特異的ＣＤ４＋Ｔｈ応答がＳＯＣＳ１サイレンシング化によっても増強されるか否かに注目している。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４＋マイクロビーズを用いて、免疫化されたマウスから単離され、さまざまな検定を用いて分析された。図１６Ｂで描かれているように、ｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度は、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス内よりもＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス内で著しく高いものであった。３Ｈ−チミジン取込み検定は、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ由来のＣＤ４＋Ｔ細胞が、ｇｐ１２０パルスを受けたＤＣでの刺激に応答してＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのものに比べより活発に増殖することを示した（図１６Ｃ）。ｇｐ１２０パルスを受けたＤＣでの刺激の後にＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣから単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞が生成したサイトカインプロファイルの分析は、Ｔｈ１分極（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＴＮＦα）及びＴｈ２分極（ＩＬ−４及びＩＬ−１０）の両方のサイトカインの増大したレベルを明らかにした（図１６Ｄ）。これらの結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが、ＨＩＶＥｎｖに対する増強した混合型Ｔｈ１及びＴｈ２応答を誘発することを示しており、これは、図１５Ｂ中の混合型ｇｐ１２０特異的ＩｇＧサブクラスプロファイルと一致している。
【０３９１】
ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによる増強されたｇｐ１２０特異的Ｂ細胞の活性化
ＤＣは、ＴＮＦスーパーファミリのメンバーであるＡＰＲＩＬ（増殖誘発リガンド）及びＢＡＦＦ（ＢＬｙＳとしても知られているＢ−リンパ球刺激因子）を産生することによりＢ細胞増殖、成熟及びクラススイッチ組換えを直接誘発することが示されてきた（バラーシ（Ｂａｌａｚｓ）ら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１７号：３４１〜５２頁；リチンスキー（Ｌｉｔｉｎｓｋｉｙ）ら、２００２年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第３号：８２２〜９頁；マクレナン（ＭａｃＬｅｎｎａｎ）ら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１７号：２３５〜８頁）。従って実時間ＲＴ−ＰＣＲを用いたＤＣによるＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦの産生に対するＳＯＣＳ１サイレンシング化の効果を査定した。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、ＳＯＣＳ１−／−ＤＣにおけるＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬの発現の増加と一致して、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣよりも高いレベルのＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦｍＲＮＡをＬＰＳ刺激時点で発現した（図１７Ａ）（ハナダら、２００３年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１９号：４３７〜５０頁）。
【０３９２】
ｇｐ１２０特異的Ｂ細胞の活性化を増強するべくＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの能力をテストするために、免疫化されたマウスの体内の抗ｇｐ１２０ＩｇＧ産生Ｂ細胞の頻度を直接検討するべく、抗ｇｐ１２０ＩｇＧ特異的Ｂ細胞Ｅｌｉｓｐｏｔ検定を使用した。抗ｇｐ１２０ＩｇＧ産生Ｂ細胞の頻度は、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスよりもＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおいて著しく高いものであった（Ｐ＜０．０１）（図１７Ｂ）。ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来のＢ細胞と比べてより高い百分率のＢ細胞が、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおいて高レベルのＣＤ６９、ＣＤ４０及びＣＤ８６で特徴づけされる活性化済み表現型を示した。さらに、免疫化されたマウスの脾臓に由来するＢ細胞を精製し、さまざまな刺激物で刺激させた。図１７Ｃは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来のＢ細胞が、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来のＢ細胞に比べ、抗ＣＤ４０及びＩＬ−４で同時刺激した際にさらに激しく増殖したことを示している。興味深いことに、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来のものではなくＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来のＢ細胞がＩＬ−４又は抗−ＣＤ４０のみに対し強く応答しており、このことは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化により増大した数のＢ細胞がインビボですでに活性化されたということを示唆している。同様に、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスからのＢ細胞がさまざまな刺激に応答してＩＬ−６、ＩＬ−２及びＴＮＦ−αを含めたさまざまなサイトカインをより高いレベルで産生することも観察された（図１７
Ｄ）。集合的に、これらの結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが、増強したレベルのＢ−リンパ球刺激因子（ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ）及びＴｈ２分極サイトカインを産生し、ＨＩＶＥｎｖ特異的Ｂ細胞及びＴｈ細胞のより効果的な活性化を導くということを示唆している。
【０３９３】
ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより誘発された長期ＨＩＶＥｎｖ特異的ＣＴＬ及び抗体応答
ＤＣ内でのＳＯＣＳ１サイレンシング化は一次的ＨＩＶＥｎｖ特異的ＣＴＬ及び抗体応答を増強するということを示してきたが、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣがメモリーＨＩＶ特異的ＣＴＬ及び抗体応答を誘発することになるか否かということもさらに査定した。図１８Ａは、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスが免疫化から６カ月後にきわめて低レベルのｇｐ１２０特異的抗体を有し、一方ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスはなおもその血清中にｇｐ１２０特異的ＩｇＧ１及びＩｇＧ２抗体を有意な力価で保持していたということを示している。追加免疫化から１週間目に、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスは強いリコール抗体応答を示し、抗ｇｐ１２０ＩｇＧ１の平均力価は２×１０５及び抗ｇｐ１２０ＩｇＧ２の平均力価は１×１０５であり、一方、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスは低いリコール抗体応答を示し、ＩｇＧ１の平均力価は３×１０３、ＩｇＧ２は４×１０２であった。これらのデータは、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣがＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣに比べてそれぞれＩｇＧ１及びＩｇＧ２ａの抗体の力価の約６４倍及び２５５倍の増加を示すことを表わしている。
【０３９４】
メモリーＨＩＶ特異的ＣＴＬ及びＴｈの維持を、ＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ検定でｇｐ１２０特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を検査することによって査定した。図１８Ｂは、免疫化から６カ月目に、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスではなくＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスの体内で強いｇｐ１２０特異的ＣＴＬ応答が検出されたということを示している（（ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスの体内でＣＤ８＋Ｔ細胞５×１０５個あたりＩＦＮγスポット２４９個対ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスの体内でＩＦＮγスポット３個））。ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおける勢いのよいｇｐ１２０特異的ＣＴＬ応答が追加免疫化によって急速に誘発されたが、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス内では誘発されなかった（（追加免疫後７日目にＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスの体内でＣＤ８＋Ｔ細胞５×１０５個あたりＩＦＮγスポット４４６個対ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスの体内でＩＦＮγスポット１６個）（図１８Ｂ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面ＣＤ４４メモリーマーカー及び細胞内ＩＦＮ−γの同時染色も又、免疫化から６カ月後にＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスと比べて、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスの体内でより高い百分率のＣＤ４４ｈｉ及びＩＦＮg＋ＣＤ８＋Ｔ細胞を示した（図１８Ｃ）。同様にして、免疫化から６カ月目に、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス内でｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋Ｔｈ応答が維持され急速に誘発された（追加免疫後７日目にＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスの体内でＣＤ４＋Ｔ細胞５×１０５個あたりＩＦＮγスポット３９１個対ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスの体内でＩＦＮγスポット３７個）（図１８Ｄ）。かくして、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣでの免疫化は、長期ＨＩＶ  Ｅｎｖ特異的ＣＴＬ、Ｔｈ及び抗体応答を有効に誘発する。
【０３９５】
免疫化から７カ月目までは、ｇｐ１２０でパルスされたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスの体内には明白な毒性は全く観察されなかった。免疫化されたマウスの全ての主要器官及び組織の組織学的分析が、病的炎症を全く、明らかにしなかった。ＩｇＧ及び抗ｄｓＤＮＡのレベルは、ＤＣ−ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ及びモックＤＣマウス内で匹敵するものであった。これらのデータは、ｇｐ１２０パルスを受けたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの免疫化がマウスの体内で病的炎症をひき起こさ
ないということを示唆している。
【０３９６】
ＨＩＶＥｎｖ媒介型免疫抑制に対するＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの耐性
ｇｐ１２０タンパク質を含むＨＩＶウイルスは、前炎症性サイトカインを産生しＴ細胞を刺激するＤＣの能力を抑制することができる（ファントゥッジ（Ｆａｎｔｕｚｚｉ）ら、２００４年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７８号：９７６３〜７２頁；グラネッリ・ピペルノ（Ｇｒａｎｅｌｌｉ−Ｐｉｐｅｒｎｏ）ら、２００４年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．第１０１号：７６６９〜７４頁；バロン（Ｂａｒｒｏｎ）ら、２００３年、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．第１８７号：２６〜３７頁；パカノウスキー（Ｐａｃａｎｏｗｓｋｉ）ら、２００１年、Ｂｌｏｏｄ第９８号：３０１６〜２１頁）。ＳＯＣＳ１サイレンシング化によるＤＣの増強された活性化がＤＣのサイトカイン産生及び免疫刺激能力に対するｇｐ１２０タンパク質の阻害効果を克服できるか否かを査定するために、以下の実験に着手した。ＤＣ由来のＩＬ−１２は、Ｔｈ１の発達を駆動することならびに液性応答を発生させるためにＢ細胞を直接シグナリングすることという２重の役割を果たすことが発見されたことから、これらの実験のための代表的サイトカインとしてＩＬ−１２が選択された（デュボア（Ｄｕｂｏｉｓ）ら、１９９８年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６１号：２２２３〜３１頁；デュボアら、１９９７年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８５号：９４１〜５１頁；スコック（Ｓｋｏｋ）ら、１９９９年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１６３号：４２８４〜９１頁）。
【０３９７】
図１９Ａに示されているように、ｇｐ１２０タンパク質の存在下でのＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣは、ＬＰＳに応答する能力を保持していた。これとは対照的に、ＬＰＳ刺激に対するＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの応答は、ｇｐ１２０タンパク質の存在によりひどく低下した。ｇｐ１２０媒介型抑制に対するＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの感受性をさらにインビボで調査した。ｇｐ１２０タンパク質のエクスビボでの予備処置を伴って又は伴わずに、ＯＶＡでのパルスを受けた形質導入されたＤＣでマウスを免疫化した。ｇｐ１２０タンパク質に対する予備曝露は、ＯＶＡ特異的抗体応答を誘発するＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力に対する明白な効果をもたず（図１９Ｂ及び１９Ｃ）ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘発されるＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及びＣＤ４＋Ｔｈ応答を低下させることもなかった（Ｐ＞０．０５）（図１９Ｄ及び１９Ｅ）。しかしながら、このような予備処置は、ＯＶＡ特異的抗体及びＣＴＬ応答を誘発するＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力を著しく低減させた（Ｐ＜０．０５）（図１９Ｂ〜１９Ｅ）。これらの結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化が、おそらくは増強されたサイトカイン産生及びＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの過剰活性化状態に起因して、ＤＣにＨＩＶｇｐ１２０媒介型抑制に対する耐性を付与する、ということを表わしている（ハナダら、２００３年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、第１９号：４３７〜５０頁）。
【０３９８】
実施例８：ＨＩＶ特異的抗体及びＣＴＬ応答を増強するためのインビボＤＮＡワクチン接種
本実施例は、ＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡ発現ＤＮＡでの同時免疫化によりＨＩＶＤＮＡワクチン接種の効力が著しく増強されるということを実証している。この研究は、宿主の免疫インヒビターを阻害することによりＨＩＶ−特異的抗体及びＣＴＬ応答を惹起する最初の試みを表わしており、これは、より有効なＨＩＶワクチンを開発するための新たな途を提示している。
【０３９９】
本実施例の中で提示されている実験において使用される材料及び方法についてここで記述する。
【０４００】
ＤＮＡワクチン接種
先に本書の他の個所で記述されている通りに、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ
発現ベクターを生成した。ＨＩＶＥｎｖレトロゲン発現ベクターを生成するためには、ＨＩＶＥｎｖの分泌を促進するべくＨＩＶｇｐ１６０のｇｐ１２０／ｇｐ４１切断部位及びｇｐ４１の融合ドメイン（コドン使用頻度最適化されたＪＲＦＬ）を欠失させることにより、ｇｐ１４０ＣＦプラスミドをまず構築した。結果として得たｐＣＭＶ／Ｒ−ｇｐ１４０ＣＦ−Ｆｃレトロゲンベクタは、ＣＭＶプロモータの制御下でＩｇＧＦｃフラグメントに融合されたｇｐ１４０ＣＦ遺伝子を含有している。ＣＨＯ細胞から組換え型ｇｐ１２０（ＪＦＲＬ）タンパク質が産生され、これは、ＮＩＨＡＩＤＳ研究参照プログラムによって提供された。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キットで内毒素を含まないＤＮＡを調製し、１μｇ／μｌの最終濃度で、内毒素を含まないＰＢＳ（シグマ、ミズーリ州セントルイス；アルドリッチ社、ミズーリ州セントルイス）の中に再懸濁させ、注入のために使用するまで−２０℃で保管した。ワクチン接種予定日に、５０μｇのｇｐ１４０ＣＦ−ＦｃＤＮＡ又は、ｇｐ１４０ＣＦ−ＦｃＤＮＡ（５０μｇ）とｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡエクスプレッサＤＮＡ（１５０μｇ）の混合物２００μｇを各マウスの大腿四頭筋内に筋内注射した（ハウザー（Ｈａｕｓｅｒ）ら、２００４年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第１１号：９２４〜３２頁；ユーら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第６１号：３７０４〜１１頁）。免疫化したマウスをその後、各々のＤＮＡ免疫化の後１、３及び５日目に３回ＬＰＳ（３０μｇ／マウス）（ＩＰ）で処置した。
【０４０１】
本実施例中に提示された実験の結果についてここで記述する。
【０４０２】
ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡでの同時免疫化により増強されたＨＩＶＤＮＡワクチンの効能
ＨＩＶＥｎｖ特異的ＣＴＬ及び抗体の両方の応答を増強するＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの能力は、ＨＩＶＤＮＡワクチン接種の効能を改善する上でこのＳＯＣＳ１サイレンシング化アプローチが有用であり得るということを示唆していた。抗原のＤＣターゲティング及びＭＨＣ提示を増強するためにレセプタ媒介型エンドサイトーシスを用いる「レトロゲン」免疫化戦略を、ハウザー（Ｈａｕｓｅｒ）ら、２００４年、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．第１１号：９２４〜３２頁及びユーら、２００１年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第６１号：３７０４〜１１頁に従って使用した。簡単に言うと、ｇｐ１２０／ｇｐ４１分割部位及びｇｐ４１の融合ドメインが欠失されているｇｐ１４０ＣＦ遺伝子に対してＩｇＧＦｃフラグメントを枠内融合させることによってｇｐ１４０ＣＦレトロゲンを産生させた。結果として得られたｇｐ１４０ＣＦ−Ｆｃ融合タンパク質を発現させ、ｇｐ１４０ＣＦ−Ｆｃベクターでのトランスフェクションを受けた細胞から分泌させた。
【０４０３】
ＤＮＡワクチン接種の時点でのＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡの効果をテストするために、ｇｐ１４０ＣＦ−ＦｃＤＮＡのみで又はｇｐ１４０ＣＦ−ＦｃＤＮＡとｐ  Ｓｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ発現ＤＮＡの混合物を一週間に一回３週間にわたりマウスに注射し、次に一週間後のＨＩＶＥｎｖ特異的免疫応答についてマウスを監視した。ＨＩＶＥｎｖ特異的抗体力価の増強は、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡで同時免疫化されたマウスにおいて明白であった（図２０Ａ）。ＣＴＬ及びＥＬＩＳＰＯＴ検定（図２０Ｂ及び２０Ｃ）により実証されているように、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ
ＤＮＡの同時注射により、ＨＩＶＥｎｖ特異的ＣＴＬ応答を著しく増強させた。その上、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＮＡの同時注入により、ＨＩＶＥｎｃ特異的ＣＤ４＋Ｔｈ応答を増強させた（図２０Ｄ）。サイトカインでの細胞内染色も同様に、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡで同時免疫化されたマウス内のｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の増強を示した。これらの結果は、免疫化されたマウスの体内での同時トランスフェクションを受けた抗原提示細胞の免疫刺激能力の増強に起因して、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡの同時免疫化がＨＩＶＤＮＡワクチン接種の効能を増強することを表わしている。かくして、本書で提示されているＳＯＣＳ１サイレンシング化戦略は、エクスビボＤＣベースの及びインビボワクチン接種の設定に応用可能である。
【０４０４】
ＤＣ内の天然免疫インヒビターの阻害に基づく代替的かつ有効なＨＩＶワクチン接種アプローチ
本開示は、ＤＣ中の負のシグナリング調節因子ＳＯＣＳ１のサイレンシング化が、マウスの体内のＨＩＶ  Ｅｎｖ−特異的抗体及びＣＴＬ応答の両方の大幅な増強を結果としてもたらすということを実証している。ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより誘発されたＨＩＶ  Ｅｎｖ−特異的抗体及びＣＴＬ応答の両方が長く持続することが観察された。さらに、結果は、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＮＡでの同時免疫化が、ＨＩＶＤＮＡワクチン接種の効能を著しく増強するということを実証した。かくして、ＨＩＶに対するバランスのとれたメモリー液性及び細胞応答がＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣで誘発され得、このＳＯＣＳ１サイレンシング化戦略は、治療的及び予防的ＨＩＶワクチン接種という両方の設定に応用可能である。
【０４０５】
液性応答の誘発におけるＤＣの役割は伝統的に、Ｔ細胞とＢ細胞の間の同族相互作用のためのＣＤ４＋Ｔｈプライミングの当然の結果と考えられてきた。しかしながら、液性応答の刺激におけるＤＣの直接的役割は、インビトロ及びインビボで実証されてきた（デュボアら、１９９７年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８５号：９４１〜５１３８頁；イナバ（Ｉｎａｂａ）ら、１９８３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第８０号：６０４１〜５頁）。特に、ＤＣは、ＣＤ４０で活性化されたＢ細胞の増殖及び抗体産生の両方を強く増強することが発見された（デュボアら、１９９７年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１８５号：９４１〜５１頁）。抗原で負荷されたＤＣでの免疫化は、防御的液性応答を誘発することができる（フラマンド（Ｆｌａｍａｎｄ）ら、１９９４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２４号：６０５〜１０頁））。本書の結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣで免疫化されたマウスの中で見られる増強されたＴｈ及びＢ細胞活性化の原因である確率の高い、Ｔｈ２分極サイトカインならびにＢ−リンパ球刺激性サイトカイン（ＢＡＦＦ及びＡＰＲＩＬ）の産生を増強する、ということを実証している。この知見は、ＳＯＣＳ１−／−ＤＣがＢ細胞の異常な拡張及び自己反応性抗体産生を誘発するという以前の報告（（ハナダら、２００３年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１９号：４３７〜５０頁））により裏づけされている。従って、本研究は、ＨＩＶ特異的抗体応答を制御する上でのＤＣ中のＳＯＣＳ１の決定的役割を実証しており、ＳＯＣＳ１のサイレンシング化を包括的に用いてＨＩＶＥｎｖ以外の抗原に対する抗体応答を高めることができるということを暗示している。
【０４０６】
本研究の重要な知見は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが、ＨＩＶ感染を予防又は制御するために望ましい可能性のあるバランスのとれたメモリーＨＩＶ−Ｅｎｖ−特異的抗体及びＣＴＬ応答で誘発するということにある（（バートン（Ｂｕｒｔｏｎ）ら、２００４年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第５号：２３３〜６頁；マクマイケル（ＭｃＭｉｃｈａｅｌ）ら、２００３年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第９号：８７４〜８０頁；Ｎａｂｅｌ、２００１年、Ｎａｔｕｒｅ第４１０号：１００２〜７頁；レトビン（Ｌｅｔｖｉｎ）ら、２００２年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２０号：７３〜９９頁；Ｚｏｌｌａ−Ｐａｚｎｅｒ、２００４年、ＮａｔＲｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４号：１９９〜２１０頁；イマイ（Ｉｍａｍｉ）ら、２００２年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７６号：９０１１〜２３頁；レトビンら、２００３年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第９号：８６１〜６頁））。何らかの特定の理論により束縛されることは望まないが、ＳＯＣＳ１サイレンシング化がバランスのとれたメモリー液性及び細胞性応答を誘発する機序には、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣ及びｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＴｈ１及びＴｈ２分極サイトカインの混合パターンの産生が関与し得る。これらの結果は、ウイルスなどの数多くの病原体に対して天然に生成される混合型抗体及びＣＴＬ応答と一貫性をもつものであり（アーレン（Ａｌｌｅｎ）ら、１９９７年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ第１８号：３８７〜９２頁）、Ｔｈ１及びＴｈ２分極が互いに排他的でないことを表わしている（ゴール（Ｇｏｒ）
ら、２００３年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４号：５０３〜５頁；コロナ（Ｃｏｌｏｎｎａ）、２００１年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２号：８９９〜９００頁））。
【０４０７】
ＳＯＣＳ１は、さまざまなサイトカインにより用いられるＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング経路のフィードバックインヒビターとして機能し、直接的又は間接的にＴＬＲシグナリング経路を調節することに関与している（ベッツ（Ｂａｅｔｚ）ら、２００４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７９号：５４７０８〜１５頁；ギングラら、２００４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７９号：５４７０２〜７頁）。本書中の結果は、ＬＰＳに応答した、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによるＴＮＦ−α、ＩＬ−６及びＩＬ−１２などのさまざまなサイトカインの産生の増強を、一貫して標示している。ＬＰＳ−ＴＬＲシグナリングは、自己分泌及び傍分泌に機能することのできる数多くの炎症性サイトカインを含めた豊富なＮＦ−κβ応答性遺伝子を活性化する（ベッツら、２００４年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７９号：５４７０８〜１５頁；グローマン（Ｇｒｏｈｍａｎｎ）ら、１９９８年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第９号：３１５〜２３頁；パン（Ｐａｎ）ら、２００４年、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔ．第９４号：１４１〜５１頁）。ＳＯＣＳ１がＴＬＲＳＧＬを間接的に減衰させるのに関与しているという事実を考慮すると、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路の臨界的抑制を無効化にすることでサイトカインが自己分泌又は／及び傍分泌刺激ループを確立できるようになるはずであり、こうしてサイトカイン産生の削減ではなく増強が導かれることになる。サイトカイン及びサイトカインレセプタノックアウトマウスの使用が関与する本書に開示されている結果は、自己分泌サイトカイン刺激ループがＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによるサイトカインの過剰産生に貢献することを示唆している。
【０４０８】
ＨＩＶ感染した個体においては、ＤＣの機能的欠陥及び枯渇が一般的であり、漸進的な免疫不全に寄与する確率が高い。ＨＩＶｇｐ１２０タンパク質は、前炎症性サイトカインを産生しＴ細胞を刺激するＤＣの能力を抑制することができる（ファントゥッジら、２００４年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７８号：９７６３〜７２頁；カルボネイル（Ｃａｒｂｏｎｎｅｉｌ）ら、２００４年、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第１７２号：７８３２〜４０頁）。ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは、前炎症性サイトカインの産生の増強及びＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの過剰活性化状態のため、ＨＩＶｇｐ１２０媒介型抑制に耐える、ということが実証された（(ハナダら、２００３年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１９号：４３７〜５０頁)）。この知見は、免疫抑制されたＨＩＶ感染個体の中で使用されると思われる治療用ＨＩＶワクチンの開発と特に関連性が高い（リュー（Ｌｕ）ら、２００４年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第１０号：１３５９〜１３６５頁）。
【０４０９】
ここで記述されているワクチン接種戦略は、ＤＣ内で宿主の免疫インヒビターを阻害することにより抗ＨＩＶ免疫応答を増強するための最初の努力である。自然免疫はＨＩＶ−１感染を制御するのに有効でないことから、宿主の免疫インヒビターを無効化することは、有効な抗ＨＩＶ免疫応答を生成するのに決定的であり得る。しかしながら、ＨＩＶ特異的免疫応答の増強だけでは防御的ＨＩＶ抗体及びＣＴＬ応答の誘発を導き得ない。この点において、当該戦略は、ＤＮＡワクチンとＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡＤＮＡの同時免疫により実証されるように、現在利用可能なワクチンとの組合せ免疫化の機会を提供する。改良されたＨＩＶ免疫原と送達系（（バートンら、２００４年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第５号：２３３〜６頁；ヤン（Ｙａｎｇ）ら、２００２年、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．第７６号：４６３４〜４２頁））と共に使用された場合、このワクチン接種アプローチは、弱防御免疫応答を増強するか又は優性エピトープに対してのみならず弱免疫原性又は潜在性でしかも防御的なエピトープに対してもより広くより強い応答を生成する新たな途を提供し得る。要約すると、本開示は、ＨＩＶ特異的抗体及びＣＴＬ応答の両方を増強するべくＤＣ内の宿主のシグナリングインヒビターを阻害するという原則を実証しサルそして究極的にはヒトにおいてこの戦略により防御的抗ＨＩＶ応答を誘発できるか否かを判定するためにさらな
る調査を要請している。さらにこのＳＯＣＳ１サイレンシング化戦略は、その他の病原体に対する免疫応答を増強するために使用することができると思われる。
【０４１０】
実施例９：ヒトＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡの同定及び分析
ヒトＳＯＣＳ１：ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ１（ＣＡＣＧＣＡＣＵＵＣＣＧＣＡＣＡＵＵＣ．ｄＴ．ｄＴ；配列番号２１）、ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ２（ＵＵＣＣＧＵＵＣＧＣＡＣＧＣＣＧＡＵＵ．ｄＴ．ｄＴ；配列番号２２）及びｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ３（ＧＡＧＣＵＵＣＧＡＣＵＧＣＣＵＣＵＵＣ．ｄＴ．ｄＴ；配列番号２３）をターゲティングするｓｉＲＮＡ配列を選択するためにはコンピュータプログラムを使用した。全ての標的配列は、その他の既知の遺伝子に対する相同性の欠如を確認するためにＮＣＢＩＢｌａｓｔクエリに付した。「．ｄＴ．ｄＴ」という呼称は、ｓｉＲＮＡ標的配列のすぐ下流側のポリｄＴ配列を意味する。
【０４１１】
実施例１０：ジーンポーターでのヒト単球−ＤＣのトランスフェクション
ヒトＤＣの調節におけるヒトＳＯＣＳ１の役目を調査するために、ヒトＳＯＣＳ１を特異的にダウンレギュレートする能力をもつ小型干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）がまず同定された。ヒトＳＯＣＳ１及び２９３Ｔ細胞をターゲティングするｓｉＲＮＡ配列を選択するために、コンピュータプログラムが使用された。その後、各々の合成ヒトＳＯＣＳ−１−ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド２重鎖を、２９３Ｔ細胞へとジーンポータートランスフェクション試薬を用いて１０：１の比でフラグでタグ付けされたヒトＳＯＣＳ１発現と共に同時トランスフェクトさせた。トランスフェクションから４８時間後に、細胞を採取し、本書の他の個所で記述されている通りに、ウェスタンブロット法により分析した。
【０４１２】
図２１Ａは、ヒトＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡ１がヒトＳＯＣＳ１発現を効率良くダウンレギュレートしたことを示している。ｓｉＲＮＡによるヒトＳＯＣＳ１ｍＲＮＡダウンレギュレーションの特異性は、スクランブルされたｓｉＲＮＡ１オリゴヌクレオチドがＳＯＣＳ１ｍＲＮＡをダウンレギュレートすることができないことによって確認された。従って、ヒトＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡ１が、さらなる調査のために選択された。合成ｓｉＲＮＡ２重鎖がジーンポーターにより、８５．５％のトランスフェクション効率で、ヒト単球に由来するＤＣ内にトランスフェクトされた（図２１Ｂ）。定量的ＲＴ−ＰＣＲ検定によって確認される通り、ｈＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡ２重鎖でのトランスフェクションを受けた全ＤＣ集団内のｈＳＯＣＳ１ｍＲＮＡのレベルは、モックトランスフェクションを受けたＤＣ内でのレベルと比べて約６０％だけ特異的に減少した（図２１Ｃ、Ｐ＜０．０１）。ｓｉＲＮＡの効率及びＳＯＣＳ１ＲＮＡの減少は、全マウス骨髄由来ＤＣ集団内のマウスＳＯＣＳ１をターゲティングする合成ｓｉＲＮＡ２重鎖を用いた実験において観察されたものと類似している。
【０４１３】
ヒトＤＣにおけるヒトＳＯＣＳ１の相対的発現を、本書の他の個所で記述されている通りに定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲによって評価した。カリフォルニア州フォスターシティーのアプライド・バイオシステムズ社製のヒトＳＯＣＳ１用予め開発されたプライマ／プローブセット（プライマ、５’−ＴＴＴＴＴＣＧＣＣＣＴＴＡＧＣＧＧＧＡＡ−３’；配列番号２４及び５’−ＣＴＧＣＣＡＴＣＣＡＧＧＴＧＡＡＡＧＣ−３’；配列番号２５、及びプローブ、６ＦＡＭ−ＡＴＧＧＣＣＴＣＧＧＧＡＣＣＣＡＣＧＡＧ−ＴＡＭＲＡ；配列番号２６）を使用した。
【０４１４】
ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの特徴づけ
ヒトＳＯＣＳ１がフローサイトメトリ分析によってＤＣ上の共同刺激分子の発現を調節するか否かを査定するために、次の実験セットを実施した。本書の他の個所で記述されている通りに、マウスＳＯＣＳ１を査定する上で使用されたものに従って、ヒトＳＯＣＳ１のためのフローサイトメトリ分析を進めた。マウスＤＣにおける観察事実と一致して、ｈ
ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションを受けたＤＣ及び対照のｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ突然変異体でのトランスフェクションを受けたＤＣが、ＬＰＳ誘発型成熟の前後に代表的な同時刺激性分子のそれらの発現における差異をわずかしか示さないということが観察された（図２２Ａ）。ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＣ及び突然変異体−ｓｉＲＮＡＤＣ上では、比較可能なレベルのＭＨＣ−Ｉ及びＩＩ分子も検出された。これとは対照的に、ＩＬ−１２、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αなどの前炎症性サイトカインの大幅に増強された分泌によって示されているように、ｈＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションを受けたＤＣは、ｓｉＲＮＡ突然変異体でのトランスフェクションを受けたヒトＤＣよりもＬＰＳでの刺激に対する応答性が高いということが観察された（図２２Ｂ及び２２Ｃ）。
【０４１５】
ヒトＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡを発現する組換え型アデノウイルスベクターの生成
アドイージ・システム（ＡｄＥａｓｙ  ｓｙｓｔｅｍ）（Ｅ１及びＥ３を削除したＡｄ（５）；カンタム・バイオテクノロジーズ社（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．）、カリフォルニア州パロアルト（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））を用いて、複製欠損アデノウイルスを構築し生成した。アドイージーベクターの中にＨ１−ヒトＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＮＡフラグメントを挿入することによってシャトルベクターＡｄ−ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡを、構築した（図２８）。ヒトＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡの挿入をＤＮＡ配列決定によって確認した。その後、メーカー（カンタム・バイオテクノロジーズ社、カリフォルニア州パロアルト）の指示に従って、組換え型アデノウイルスＡｄ−ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡを生成した。メーカー（カンタム・バイオテクノロジーズ社、カリフォルニア州パロアルト）の指示に従って、組換え型アデノウイルスを２９３個の細胞中で産生させ滴定した。組換え型Ａｄ（５）がヒト単球由来のＤＣをトランスフェクトできるということが観察された。
【０４１６】
実施例１１：ヒトＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＣによりプライミングされたＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬ応答
ヒトＤＣの免疫刺激能力を調節する上でのヒトＳＯＣＳ１の役割を調査するために以下の実験に着手した。この実施例で提示されている結果は、ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが病原菌産物での刺激に対し過剰反応し、自己抗原特異的ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をプライミングする増強された、刺激能力を有することを実証している。重要なことに、野生型ＤＣではなく、ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは、天然の抗原発現ヒト腫瘍細胞に対する活発な溶解活性を有するＣＴＬを完全に活性化する能力をもつ。同様に、ＣＴＬをプライミングするヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの能力は、ＩＬ−１２産生及びシグナリングのＳＯＣＳ１制限によって制御される確率が高いと考えられている。これらの結果は、ヒトＤＣを負に調節する上でのヒトＳＯＣＳ１の決定的な役割を標示し、ヒトの患者のためのより有効な腫瘍ワクチンを開発するためのこのＳＯＣＳ１サイレンシング化アプローチの翻訳潜在能力が関係するとみなしている。
【０４１７】
本書で開示されている実験において利用される材料及び方法についてここで記述する。
【０４１８】
ペプチド
ジーンメッド・シンセシス社（米国カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）により、ＨＰＬＣを用いて９５％超の純度までＨＬＡ−Ａ２−制限されたＭＡＧＥ３  ＣＴＬペプチド（ＦＬＷＧＰＲＡＬＶ；配列番号２７）（ファン・デル・ブルゲン（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｂｒｕｇｇｅｎ）ら、１９９４年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第２４号：３０３８〜４３頁）及び対照Ｈ−２Ｋｂ−制限されたＯＶＡ−Ｉ（ＳＩＩＮＦＥＫＬ；配列番号１１）が合成され精製された。内毒素を含まないＰＢＳ中での最終希釈の前に、ペプチドをＤＭＳＯ中で溶解させた（シグマ、ミズーリ州セン
トルイス）。
【０４１９】
ヒトＳＯＣＳ１発現のウェスタンブロット分析
２９３Ｔ細胞を、本書の他の個所で記述されている通りにジーンポーター試薬を用いて１０：１の比で合成ヒトＳＯＣＳ−１−ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチド２重鎖（２１ｂｐ）又は無関連オリゴ２重鎖及びフラグタグ付きヒトＳＯＣＳ１発現ベクター（ｐＣＭＶ−ｈＳＯＣＳ１）と同時トランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、細胞を採取し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに付した。ハイボンド（Ｈｙｂｏｎｄ）−Ｐ膜（アマシャム、イリノイ州アーリントンハイツ）への移送の後、抗−Ｆｌａｇ（シグマ、ミズーリ州セントルイス）又はアクチン（サンタクルス・バイオテクノロジー社、カリフォルニア州サンタクルス）抗体でのウェスタンブロット法に続けて、ＥＣＬ−Ｐｌｕｓ試薬（アマシャム、イリノイ州アーリントンハイツ）での検出により試料を分析した。薄膜を密度計ＳＩで走査し、ＳＯＣＳ−１／アクチンバンドをイメージ・クアントソウトウェア（モレキュラー・ダイナミクス、ニュージャージー州ピスカタウェイ）で定量した。ＳＯＣＳ１バンドの強度をベータアクチンバンドの強度に正規化した。
【０４２０】
ヒトＳＯＣＳ１発現の定量的ＲＴ−ＰＣＲ分析
ヒトＤＣ中のヒトＳＯＣＳ１の相対的発現を、本書の他の個所で記述されている通り、定量的実時間ＲＴ−ＰＣＲにより評価した。
【０４２１】
ヒト単球由来のＤＣのトランスフェクション及びヒトＴ細胞のインビトロプライミング
スクロアース（Ｓｃｈｒｏｅｒｓ）ら、２００３年、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃａｎ．Ｒｅｓ．第９号：４７４３〜４７５５頁；及びスクロアースら、２００４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２４６号：４５１〜９頁に記述されている通りに、ＰＢＭＣに由来するヒトＤＣを生成し培養した。ＨＬＡ−Ａ２＋の健康なボランティアからヘパリン化された血液を収集した。ＰＣＲ−ＳＳＰ−ＤＮＡベースの手順によりＨＬＡ分類を実施した（メソジスト・ホスピタル（Ｔｈｅ  Ｍｅｔｈｏｄｉｓｔ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ）、テキサス州ヒューストン）。無血清ＤＣ培地（セルジェニックス（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）、イリノイ州アンティアック（Ａｎｔｉｏｃｈ，Ｉｌ））の中にＰＢＭＣを再懸濁させ、加湿した５％ＣＯ２中で３７℃でインキュベートした。プラスチックに接着した細胞画分を、１０００ＩＵ／ｍｌの組換え型ヒトＧＭ−ＣＳＦ（ｒｈＧＭ−ＣＳＦ；アールアンドディー・システムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）及び１０００ＩＵ／ｍｌ  ｒｈＩＬ−４（アールアンドディー・システムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を伴う無血清ＤＣ培地内で培養させた。５日目又は６日目に、メーカーの指示に従ってジーンポーターを用いて１２０ｎＭのｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドで単球由来のＤＣをトランスフェクトした。その後、トランスフェクションを受けたＤＣを一晩ＭＡＧＥ３ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）でパルスした。２４ウェルの平板の１ウェルあたり合計１×１０６のヒトＴ細胞を、５％ＡＢヒト血清、ｒｈＩＬ−２（５０Ｕ／ｍｌ）、及びＴＮＦa（１０ｎｇ／ｍｌ、アールアンドディー・システムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）で補足された０．５ｍｌのＲＰＭＩ−１６４０中で、５×１０４個のＭＡＧＥ３パルスされたトランスフェクションを受けたＤＣと同時培養させた（２０：１）。同時培養したＴ細胞を、同時培養７日目に、自己移植性ＭＡＧＥ３パルスされたトランスフェクションを受けたＤＣで一回再刺激した。一部の実験については、３日に一度ＤＣとＴ細胞の同時培養の中に抗−ヒトＩＬ−１２（ｐ７０）抗体（２０mｇ／ｍｌ、アールアンドディー・システムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）を添加した。２週間の同時培養の後、Ｔ細胞を免疫検定のために使用した。
【０４２２】
サイトカインＥＬＩＳＡ及び酵素連結型イムノスポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）検定
メーカーの指示に従い、指示された時点で指示された刺激物で、ＥＬＩＳＡ分析（ＢＤバイオサイエンシーズ、ニュージャージー州リンカーンパーク）のためのＤＣ培養の上清を用いてさまざまな前炎症性サイトカインのレベルを定量化した。ヒト末梢リンパ球のＥ
ＬＩＳＰＯＴ検定を、本書の他の個所で記述されている通りに実施した。
【０４２３】
フローサイトメトリ分析
０．１％のＮａＮ３及び２％のＦＣＳを含有するＰＢＳ中のＦＩＴＣ又はＰＥｍＡｂｓを用いて、細胞を染色した。ヒトＣＤ４０、ＣＤ８０及びＣＤ８６に特異的な抗体及び整合したイソタイプ対照をＢＤバイオサイエンシーズ（カリフォルニア州サンノゼ）から購入した。染色した細胞をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（ベクトン・ディッキンソン、ニュージャージー州リンカーンパーク）フローサイトメーター上で分析した。
【０４２４】
四量体染色
ベイラー・カレッジ・オブ・メディシン・テトラマー・コア・ファシリティー（米国テキサス州ヒューストン）において、ヒトＭＡＧＥ３／ＨＬＡ−Ａ２四量体が合成された。同時培養中のリンパ球又はヒト末梢血リンパ球を抗−ｈＣＤ８a−ＦＩＴＣ／抗−ｈＣＤ３−ＰｅｒＣＰ及びＭＡＧＥ３−ＰＥ三量体と同時染色した。四量体染色を４℃で１時間、メーカーの指示に従い、１０６個の細胞あたり１μｌの抗ＣＤ８α及びＭＡＧＥ３−ＰＥ四量体の１：１００希釈物を用いて行なった。
【０４２５】
ＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウスのＤＣ免疫化
４〜６週令の雌のＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子導入マウスをジャクソン・ラボラトリー（米国メーン州）から購入し、制度的指針に従ってベイラー・カレッジ・オブ・メディシン（米国テキサス州ヒューストン）において無菌のマウス施設内に維持した。本書の他の個所で記述されている通りマウスＢＭ由来のＤＣを、ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子導入マウスから調製し、５のＭＯＩで組換え型レトロウイルスベクターＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ又はＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡで形質導入した。その後ＤＣを２０時間、ＭＡＧＥ３ペプチドでパルスし、ＰＢＳで３回洗浄し、ＴＮＦαで２４時間刺激した（５００ｎｇ／ｍｌ、アールアンドディー・システムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）。その後ＤＣを、後足蹠を介してＨＬＡ−Ａ２遺伝子導入マウス内に注入した。一部のマウスにおいて、ＤＣワクチン接種から指示された日数後に、ＬＰＳ（３０μｇ／マウス）又は組換え型マウスＩＬ−１２（１μｇ／マウス、ペプロテック社、ニュージャージー州ロッキーヒル）を腹腔内（ｉ．ｐ．）投与した。
【０４２６】
ＣＴＬ検定
本書の他の個所で記述されている通り標的細胞を溶解するインビトロ再刺激された脾細胞の能力を測定する標準クロム放出検定で、ＣＤ８＋ＣＴＬ応答を査定した（フアンら、２００３年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．第６３号：７３２１〜９頁）。２〜３匹の免疫化したマウスからプールした脾細胞を、４〜６日間、ＭＡＧＥ３ペプチドを含有するＲＰＭＩ−１６４０中でインビトロで再刺激した。ヒトＭＡＧＥ３＋、ＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞（ＳＫ−Ｍｅｌ−３７）及び対照ヒトＭＡＧＥ３＋、ＨＬＡ−Ａ２−黒色腫細胞（ＮＡ−６−Ｍｅｌ）を３７℃で９０分間５１Ｃｒクロム酸ナトリウム溶液で標識した。異なる数のエフェクタ細胞を３７℃で４時間、９６ウェルのＵ字底平板（２００μｌ／ウェル）内で、一定数の標的細胞（５×１０４／ウェル）と共にインキュベートした。３重培養から上清を収集し、分析した。（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）×１００として溶解百分率を計算した。
【０４２７】
本実施例で提示されている実験の結果について、ここで記述する。
【０４２８】
抗原特異的ＣＴＬ応答をプライミングするためのヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの増強された免疫刺激性効能
サイレンシング化されたヒトＳＯＣＳ１が自己抗原特異的ＣＴＬをプライミングする上でヒトＤＣの刺激効能を増強し得るか否かを査定するために、次の実験セットに着手した
。成人のヒトの睾丸及び黒色腫細胞の中で発現されるものとして知られている胚芽腫抗原であるヒトＭＡＧＥ３由来のＨＬＡ−Ａ２制限されたペプチド（ファン・デル・ブルゲンら、１９９４年、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第２４号：３０３８〜４３頁）を、モデルヒト自己抗原として用いた。ＨＬＡ−Ａ２＋の健康なボランティアからのヒト単球由来ＤＣをｈＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドでトランスフェクトし、次に一晩ＭＡＧＥ３ペプチド（２０μｇ／ｍｌ）でパルスした。ＴＮＦα（成熟刺激物）（１０ｎｇ／ｍｌ、アールアンドディー・システムズ社、ミネソタ州ミネアポリス）の存在下で５×１０４個のＭＡＧＥ３パルスされたトランスフェクションを受けたＤＣと、１ウェルあたり合計１×１０６個の自己移植性ヒトＴ細胞を同時培養した（２０：１）。同時培養したＴ細胞を、同時培養７日目に、自己移植性ＭＡＧＥ−３パルスされたトランスフェクションを受けたＤＣで一回再刺激した。２週間の同時培養後、免疫検定のためにＴ細胞を用いた。ＭＡＧＥ３ペプチドでパルスされたｈＳＯＣＳｓｉＲＮＡでのトランスフェクションを受けたＤＣとの同時培養中では、ＭＡＧＥ３でパルスされたｍｕｔ−ｓｉＲＮＡＤＣ又はモックＤＣとの同時培養中でそれぞれ５．４％及び４．３％にすぎなかったのに比べて、１３．９％のＣＤ８＋Ｔ細胞がＭＡＧＥ３−四量体について陽性であった（図２３Ａ）。同じドナーからの実験未使用の（刺激を受けていない）一次ヒトリンパ球の四量体染色は、低レベルの陽性ＭＡＧＥ３四量体染色を示した（０．５％のＣＤ８＋Ｔ細胞）。これと一致して、細胞内ＩＦＮγ染色（図２３Ｂ）は、ＭＡＧＥ３ペプチドパルスを受けたｍｕｔ−ｓｉＲＮＡＤＣ（６．９％のＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）又はモックＤＣ（５．７％のＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞）に比べて、ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＣがＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬ応答を実質的に改善する（１１．１８％のＩＦＮγ＋ＣＤ８Ｔ細胞）ことを示した。さらに、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ検定（図２３Ｃ）は、ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＣにより、増大した数のＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬが活性化されることを示した。ＨＬＡ−Ａ２＋ドナーからの繰り返しの実験は同様の結果を示した。一次ヒトＴ細胞の大部分は、抗原でパルスされていないＤＣとの２週間の同時培養後死滅した。集合的に、これらの結果は、ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが自己抗原特異的ＣＴＬをプライミングする増強された免疫刺激能力を有することを表わしている。
【０４２９】
ＣＴＬプライミングにおけるＳＯＣＳ１制限されたＩＬ−１２の決定的役割
ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは、病原菌産物での刺激に応答してＣＴＬ応答の活性化における主要なサイトカインであるＩＬ−１２を増強された量だけ産生すること（トリンキエリ、２００３年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第３号：１３３〜４６頁）そしてＩＬ−１２シグナリングがＳＯＣＳ１により制限されていること（アイルズら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７７号：４３７３５〜４０頁））から、ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによりＣＴＬをプライミングする上でのＩＬ−１２の役割を検査した。従って、Ｔ細胞とＭＡＧＥ３でパルスされたトランスフェクションを受けたＤＣの同時培養に対して抗ヒトＩＬ−１２抗体を３日に１度添加した。図２３Ａ〜２３Ｃは、抗ＩＬ１２（ｐ７０）抗体を用いたＩＬ−１２の阻害が、四量体染色、細胞内ＩＦＮ−γ染色及びＥＬＩＳＰＯＴ検定により実証される通り、ＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬを刺激するｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＣの増強した能力を無効にしたということを示している。
【０４３０】
ヒト化されたＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子導入マウスを用いて、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより誘発された増強されたＣＴＬ応答におけるＩＬ−１２の役割をさらにテストした。マウスＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡを発現する組換え型レンチウイルスベクター（ＬＶ−ｍＳＯＣ１ｓｉＲＮＡ）又は対照のベクターＬＶ−ＧＦＰｓｉＲＮＡで、ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子導入マウスＢＭ由来ＤＣを形質導入し、Ａ２制限ＭＡＧＥ３ペプチドでパルスした。ＴＮＦαでの成熟の後、一週間に一度の間隔で、ＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子導入マウスの体内に２回足蹠から形質導入されたＤＣを投与した。各々のＤＣ免疫化の後、
マウスを、ＬＰＳか又は低用量の組換え型ＴＬ−１２サイトカインで、３回インビボで刺激した。ＬＰＳは多数の前炎症性サイトカインを誘発し、その多くがＳＯＣＳ１により調節されていること、そしてＮＦ−κＢ（ｐ６５）シグナリングの調節におけるＳＯＣＳ１の直接的役割が可能であることから、ＬＰＳが使用された（リョーら、２００３年、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ、第１２号：１４１３〜２６頁）。インビボのＩＬ−１２刺激で、ＭＡＧＥ３でのパルスを受けたＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスの体内では２×１０５個のＴ細胞あたりわずか１０ＩＦＮγ＋スポットであるのに比べ、ＭＡＧＥ３パルスを受けたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスにおいては、２×１０５個のＴ細胞あたり２３９のＩＦＮγ＋スポットが検出された（図２４）。インビボでのＬＰＳ刺激は同様に、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣｓ（ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス中Ｔ細胞２×１０５個あたりＩＦＮγ＋スポット６３個対ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスの体内でＴ細胞２×１０５個あたりＩＦＮγ＋スポット２４個）により誘発されたＣＴＬ応答を優先的に増強した（図２４）。しかしながらＩＬ−１２刺激は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスにおけるＭＡＧＥ３特異的ＣＴＬ応答を高めるために、ＬＰＳ刺激よりもさらに有効であった（Ｐ＜０．０１）。ＩＬ−１２のこのさらに優れた刺激能力は、Ｊａｋ／Ｓｔａｔ経路を通してＩＬ−１２刺激を直接的に調節するＳＯＣＳ１の能力、ならびに、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスの体内で活性化されたＣＴＬに対するＩＬ−１２の直接的効果（（トリンキエリ、２００３年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第３号：１３３〜４６頁））に起因している確率が高い。合わせて考慮すると、これらの結果は、ＳＯＣＳ１が抗原提示細胞内でＩＬ−１２のシグナリングを制限することのさらなる証拠を提供する。これらの結果は同様に、サイトカインベースの腫瘍療法の効き目を判定する上でのサイトカインシグナリングの重要性をも強調している。
【０４３１】
野生型ＤＣによってではなく、ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより活性化されたヒトＣＴＬは、腫瘍溶解エフェクタ機能を有する
自己腫瘍関連抗原ＭＡＧＥ３に特異的な活性化されたＴ細胞が腫瘍溶解エフェクタ機能を有するか否かを判定するため、ＣＴＬ検定のための標的細胞として、天然ＭＡＧＥ３＋ヒト腫瘍細胞を使用した。ＭＡＧＥ３パルスを受けたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ又はｍｕｔ−ｓｉＲＮＡＤＣによって活性化されたヒトＴ細胞は、ＭＡＧＥ３ペプチドパルスされたＭＡＧＥ３＋ＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞（ＳＫ−Ｍｅｌ−３７）を容易に殺した。しかしながら、ＭＡＧＥ３パルスを受けたｍｕｔ−ｓｉＲＮＡＤＣは、ＭＡＧＥ３でパルスされていない天然ＳＫ−Ｍｅｌ−３７細胞に対しては弱い細胞溶解活性しか示さなかった（図２５）。これとは対照的に、ＭＡＧＥ３−パルスを受けたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣによって活性化されたこれらのＴ細胞は、ＭＡＧＥ３でパルスされていない天然のＳＫ−Ｍｅｌ−３７細胞に対し強い細胞溶解活性をなおも有していた（図２５）。ｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣとの同時培養中でのＴ細胞の腫瘍溶解活性は、抗ｈＩＬ−１２抗体処置により著しく低下させられた。ＭＡＧＥ３パルスを受けたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより活性化されたヒトＴ細胞のみがＨＬＡ−Ａ２−陰性、ＭＡＧＥ３＋黒色腫細胞（ＮＡ−６−Ｍｅｌ）に対する背景細胞溶解活性を有していたことから、腫瘍細胞溶解活性はＣＴＬにより特異的に媒介された。異なるドナーからの反復実験が、類似の結果を示した。
【０４３２】
以上の観察事実を確認するために、ＭＡＧＥ３パルスされたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ又はＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたＨＬＡ−Ａ２．１遺伝子導入マウス由来のＴ細胞の腫瘍溶解活性をテストした。図２６は、ＭＡＧＥ３パルスされたｍＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化された遺伝子導入マウスに由来するＴ細胞が、天然のＭＡＧＥ３＋ＨＬＡ−Ａ２陽性黒色腫細胞ＳＫ−Ｍｅｌ−３７に対する活発な細胞溶解活性を有していたことを示している。これとは対照的に、ＭＡＧＥ３でのパルスを受けたＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化された遺伝子導入マウス由来のＴ細胞のみが、図２５に示さ
れた結果と一致して、天然黒色腫細胞に対する弱い細胞溶解活性を有していた。さらに、低用量の組換え型ＩＬ−１２でのインビボ刺激が、ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣではなくＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘発されたＣＴＬ応答を著しく増強することも観察された（図２６）。合わせて考えると、本書中の結果は、おそらくは抗原提示細胞によるＩＬ−１２の増強された産生及びシグナリングに起因して、天然腫瘍細胞に対する活発な溶解エフェクタ機能を有するＣＴＬを完全に活性化させる固有の能力を、ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが有することを示している。
【０４３３】
ヒトのＳＯＣＳ−サイレンシング化されたＤＣによる自己抗原特異的ヒトＣＴＬの完全な活性化
本開示は、ヒトＤＣ中でのヒトＳＯＣＳ１の調節の役割を実証しており、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナリング経路のインヒビターをサイレンシング化することによりヒトＤＣの免疫刺激効能を増強する代替的戦略を提供している。本書で開示している結果は、抗原特異的ＣＴＬをプライミングするヒトＤＣの免疫刺激能力を負に調節する上でのヒトＳＯＣＳ１の決定的な役割を実証している。ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは、天然の抗原発現腫瘍細胞に対する頑強な溶解機能を有するヒトＣＴＬを完全に活性化する固有の能力を有する。ＣＴＬをプライミングするヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの能力は、ＩＬ−１２の産生及びシグナリングのＳＯＣＳ１制限により制御される確率が高い。かくして、本開示は、より有効な腫瘍ワクチンを開発するためのこの一般的に応用可能なＳＯＣＳ１シグナリングアプローチの翻訳潜在能力を実証している。
【０４３４】
本発明のＳＯＣＳ１シグナリングアプローチは、腫瘍関連抗原が負荷されたＤＣにより誘発された抗原特異的免疫応答を増強する能力を有する。過去１０年間に、腫瘍免疫学における主要な進歩は、ヒト腫瘍特異的又は関連抗原を数多く同定し認証したということにあった（（ファン・デン・アインデ（Ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｅｙｎｄｅ）ら、１９９７年、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ第９号：６８４〜９３頁））。かくして、腫瘍関連抗原で負荷されたＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣでのワクチン接種は、抗原特異的抗腫瘍応答を誘発するのに、ＣＴＬ上でのＣＴＬＡ４の遮断よりもさらに魅力的なものであると思われる。ヘテロ接合のＳＯＣＳ１＋／−マウスが自己免疫炎症の徴候を全く又は軽度にしか示さないことから、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは重大な自己免疫炎症をひき起こさないかもしれないという点で、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣ免疫化の使用は、付加的な治療上の利点を提供する。その上、ＳＯＣＳ１−／−マウスの体内にみられる重大な自己免疫炎症には、ＤＣ中のみならずＴ及びＮＫＴ細胞といった免疫細胞のその他の系統においてもＳＯＣＳ１の完全な欠損が必要である（クボら、２００３年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４号：１１６９〜７６頁；アレキサンダーら、２００４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２２号：５０３〜２９頁；メトカーフ（Ｍｅｔｃａｌｆ）ら、２００３年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ第１００号「８４３６〜４１頁；チョン（Ｃｈｏｎｇ）ら、２００３年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１８号：４７５〜８７頁；ハナダら、２００３年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１９号：４３７〜５０頁；キンジョーら、２００２年、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ第１７号：５８３〜９１頁）。
【０４３５】
腫瘍ワクチンの効能を増強する大規模な研究努力は、腫瘍関連抗原の親和性／用量（シグナル１）及び共同刺激分子媒介型シグナル２のレベルの改善に焦点があてられてきた（ギルボア、２００４年、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ第４号：４０１〜１１頁；ローゼンバーグら、２００４年、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．第１０号：９０９〜１５頁）。本開示は、抗原特異的ＣＴＬをプライミングするヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣのより優れた能力が、ＩＬ−１２の増強された産生及びシグナリングに起因する確率が高い（シグナル３）ということを示している。この結論は、以下の観察事実に基づいている。すなわち、１）ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣは、病原菌産物での刺激に応答
して、増強されたレベルのＩＬ−１２を産生する；２）ＩＬ−１２の抗体遮断は、ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの免疫刺激能力を低下させる、そして３）低用量のＩＬ−１２のインビボ投与は、野生型ＤＣではなく、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより誘発された抗原特異的ＣＴＬ応答を大幅に増強する。これらの結果は、アイルズ（Ｅｙｌｅｓ）Ｊ．Ｌ、ら（アイルズら、２００２年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．第２７７号；４３７３５〜４０頁）によるＩＬ−１２シグナリングのマウスＳＯＣＳ１調節の知見及び本書の他の箇所で開示されている結果によって裏づけされている。
【０４３６】
サイトカインは、ＣＴＬを活性化するためＤＣにより提供される第３のシグナルとして提案されてきた（カートシンガーら、２００３年、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．第１９７号：１１４１〜５１頁）。サイトカインの産生及びシグナリングは、過度の自己免疫活性化を制限する一方で外因性抗原に対する免疫応答を活性化するために綿密に調節される（ダーネル（Ｄａｒｎｅｌｌ）ら、１９９４年、Ｓｃｉｅｎｃｅ第２６４号：１４１５〜２１頁）。サイトカインは一般にＪＡＫを活性化し、これは次にサイトカインレセプタの細胞質ドメインをリン酸化して、シグナリング物質及び転写活性化剤（ＳＴＡＴ）のメンバーのドッキング部位を作り上げる(アレキサンダーら、２００４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２２号：５０３〜２９頁)。サイトカインは同様に、フィードバックインヒビターとしてＳＯＣＳ１の発現をアップレギュレートし、このことが次にＤＣによる前炎症性サイトカインの産生及びシグナリングをオフ切換えし、かくして進行中の免疫応答を減衰させ自己寛容を維持する（アレキサンダーら、２００４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２２号：５０３〜２９頁）。ＳＯＣＳ１は、そのＳＨ２ドメインを介して偽基質インヒビターとしてＪＡＫ活性ループに特異的に結合すること及びユビキチン依存性タンパク質分解のためのＪＡＫ２をターゲティングすることにより、ＳＴＡＴを抑制する（クボら、２００３年、Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第４号：１１６９〜７６頁; アレキサンダーら、２００４年、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．第２２号：５０３〜２９頁）。合わせて考えると、本書で開示されている結果は、ＣＴＬ応答の規模を決定する上で抗原提示細胞内のＳＯＣＳ１により制限されるＩＬ−１２の産生及びシグナリングの決定的重要性を表わしている。
【０４３７】
本研究の１つの有意な知見は、ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣが活発な溶解エフェクタ機能で自己反応性Ｔ細胞を完全に活性化させる固有の能力を有するということにある。臨床及び実験室研究において、四量体染色及びＥＬＩＳＰＯＴ検定などのさまざまな免疫検定によって決定されるように、自己抗原特異的Ｔ細胞がＤＣワクチン接種又はインビトロ感作によって活性化され得るということが、頻繁に観察されてきた。しかしながら、このような活性化されたＴ細胞は、自己抗原を発現するように遺伝子修飾された人工的な抗原パルスを受けた腫瘍細胞を有効に殺すことができるものの、通常、天然腫瘍細胞に対する弱い細胞溶解活性を示し、これが現行の腫瘍ワクチンの効き目の低さの主たる理由である（ザックス（Ｚａｋｓ）ら、１９９８年、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ第５８号：４９０２〜８頁；ユー（Ｙｕ）ら、２００２年、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．第１１０号：２８９〜９４頁）。本書で開示されている結果は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより提供される持続的かつ増強された抗原提示／刺激が、自己反応性の低親和性Ｔ細胞を完全に活性化するため及び天然の腫瘍細胞に対する活発な溶解エフェクタ機能をそれらに与えるために必要とされ得るということを示唆している。
【０４３８】
実施例１２：ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖がタンパク質免疫化を増強する
ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖でのインビボ免疫化がタンパク質免疫化を増強できるか否かをテストするために、１）ＢＣＧを伴うＯＶＡタンパク質での免疫化により誘発されるＣＴＬ応答を、２）ＢＣＧを伴うＯＶＡタンパク質及びＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖リポソームでの同時免疫化、と比較した。マウスのグループを、一週間間隔で２回足蹠を介して、ＯＶＡタンパク質とＢＣＧの混合物、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡオリ
ゴ２重鎖−リポソーム及びＯＶＡタンパク質とＢＣＧの混合物で免疫化させるか又は、ＯＶＡタンパク質とＢＣＧ及びＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖−リポソームの混合物を同時注入した。２回目の免疫化から２週間後に、細胞内サイトカイン染色及びＥＬＩＳＰＯＴ検定（ＩＦＮγ）から、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖で同時免疫化されたマウスの中により強力なＯＶＡ特異的ＣＴＬ応答が誘発されることがわかる、ということが観察された（図２７Ａ及び図２７Ｂ）。
【０４３９】
実施例１３：ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＣＴＬは増強された細胞溶解活性を有する
Ｔ細胞内のＳＯＣＳ１がＣＴＬ活性を調節する上で１つの役割を果たすか否かを調査するために、ＯＴ−Ｉ遺伝子導入マウスから単離されたＯＶＡエピトープに特異的な遺伝子導入ＴＣＲを有するＣＤ８＋ＯＴ−Ｉ細胞（ジャクソン・ラボラトリー、メーン州バーハーバー）を、ジーンポーターを用いてＳＯＣＳ１又は突然変異体ｓｉＲＮＡオリゴでトランスフェクトした。トランスフェクションを受けたＯＴ−Ｉ細胞を、さらなる刺激無しでＣＴＬ検定のために使用した。ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡオリゴのトランスフェクションを受けたＯＴ−Ｉは、突然変異体ｓｉＲＮＡ−オリゴでのトランスフェクションを受けたＯＴ−Ｉ細胞と比較して同系のＯＶＡ陽性ＥＧ７細胞に対する増強した細胞溶解活性を有することが観察された（図２９）。この結果は、Ｔ細胞中のＳＯＣＳ１シグナリングがそれらの細胞溶解活性を増強することを示している。
【０４４０】
実施例１４：Ａ２０を変調させることによる免疫細胞の免疫能力の増強
Ａ２０は、多数の細胞型によって発現されるジンクフィンガータンパク質である。Ａ２０は、ＴＬＲ４リガンド及びＴＮＦによって急速に誘発される。Ａ２０は、ＮＦ−κＢシグナリングに決定的に関与するシグナリングタンパク質のユビキチン化と脱ユビキチン化の調節において２重の機能を有している。Ａ２０は、タンパク質中に見出される脱ユビキチン化酵素ドメインを通して脱ユビキチン化に参加する。このドメインは、ＴＮＦレセプタ複合体の重要な構成要素であるレセプタ相互作用性タンパク質（ＲＩＰ）からＫ６３連結型ユビキチン鎖を除去することができる。Ａ２０によるＲＩＰ上でのＫ６３連結型ユビキチン鎖の除去は、ＲＩＰ分解を導く。その上、Ａ２０のカルボキシル末端にあるジンクフィンガーは、プロテアソーム分解のためにＲＩＰとＫ４８連結型ユビキチン鎖を接合させることによってユビキチンリガーゼとして役立つ。従って、ＲＩＰからのＫ６３ユビキチン鎖の除去及びＡ２０によるＫ４８連結型ユビキチン鎖の付加が、ＲＩＰの分解に導く。
【０４４１】
さらに、Ａ２０は同様に、ＴＲＡＦ６中でＫ６３連結型ユビキチン鎖を脱ユビキチン化し、これがＴＲＡＦ６の分解という結果をもたらす。ＴＲＡＦ６がＴＬＲファミリーの全メンバーによって共有されている共通のシグナル構成要素であるという事実を考えると、Ａ２０は、ＭｙＤ８８依存性及びＭｙＤ８８非依存性ＴＬＲシグナリング経路の両方を抑制することができる固有の負の免疫調節因子である。
【０４４２】
以下の実験及び結果の組合せが、免疫細胞中でＡ２０を変調させることで細胞の免疫能力がもたらされることを実証している。
【０４４３】
ジーンポーターを用いたＡ２０ｓｉＲＮＡオリゴでのマウスＢＭ−ＤＣのＡ２０ｍＲＮＡダウンレギュレーション
ＤＣによる抗原提示のＡ２０調節を調査するため、Ａ２０を特定的にダウンレギュレートする小さな干渉性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を最初に以下に記述する通りに同定した。
【０４４４】
合成ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖を、約８３％のトランスフェクション効率でジーンポーターを用い、顆粒球・マクロファージ・コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及びＩＬ−４の
存在下で、エクスビボでマウス骨髄細胞由来のＤＣ内にトランスフェクトした。簡単に言うと、ジーンポーターを用い、メーカーのプロトコルに従って、２１塩基対ｓｉＲＮＡオリゴヌクレオチドで骨髄ＤＣをトラスフェクトした。３μｌの２０μＭオリゴヌクレオチドを３μｌのジーンポーター試薬及び９４μｌの無血清ＲＰＭＩ１６４０に添加し、３０分間２５℃でインキュベートし、その後１００μｌのジーンポーター／オリゴヌクレオチド混合物を骨髄−ＤＣの各ウェルに添加して、３７°Ｃで４時間インキュベートした。インキュベーション後、２０％ＦＢＳで補足された１ウェルあたり５００μｌのＲＰＭＩ１６４０を骨髄ＤＣに添加した。本開示に基づき、合成ｓｉＲＮＡオリゴは、生理学的に許容可能な担体という状況下で細胞に対して送達することが可能である。許容可能な担体の一例としては、リポソームがある。
【０４４５】
図３１は、Ａ２０がＡ２０−ｓｉＲＮＡオリゴで形質導入を受けた骨髄−ＤＣ中でダウンレギュレートされたことを実証している。定量的ＲＴ−ＰＣＲ検定により判定された通り、２０ｓｉＲＮＡ−２オリゴでのトランスフェクションを受けた全ＤＣ集団中のＡ２０ｍＲＮＡレベルは、Ａ２０をダウンレギュレートすることができないＡ２０ｓｉＲＮＡ突然変異体でのトランスフェクションを受けた骨髄−ＤＣ中のレベルと比較しておよそ７０％だけ減少した。マウスＡ２０ｓｉＲＮＡ配列は、５’−ＣＡＡＡＧＣＡＣＵＵＡＵＵＧＡＣＡＧＡ−３’；配列番号５８であった。
【０４４６】
マウスＡ２０ｓｉＲＮＡオリゴＤＣによって誘発された、増強された抗原特異的Ｔ細胞応答
抗原特異的細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）及びＣＤ４＋ＴヘルパーのＤＣ刺激がＡ２０によって調節されたか否かをテストするために一連の実験を実施した。Ａ２０ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖でのトランスフェクションを受けたＤＣが、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する増強された効能を有する否かをテストするために、Ａ２０ｓｉＲＮＡ−２オリゴ２重鎖又は対照オリゴ２重鎖でＤＣをトランスフェクトした。次に、マウスのグループを、ＯＶＡでパルスされたトランスフェクトを受けたＤＣで免疫化した。パルスを受けたＤＣを用いたマウスの免疫化の後、インビボで３回ＰｏｌｙＩ：Ｃ（５０μｇ／マウス）を伴って又は伴わずにマウスを刺激した。ＤＣ免疫化から２週間後に、免疫化されたマウス体内の免疫応答を検査した。四量体染色及びＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ検定は、インビボＰｏｌｙＩ：Ｃ刺激を伴って又は伴わずにＡ２０ｓｉＲＮＡオリゴ−ＤＣで免疫化されたマウスの体内で増強されたＯＶＡ特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示した（図３２〜３４を参照）。これと一致して、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ検定は、インビボＰｏｌｙＩ：Ｃ刺激を伴って又は伴わずにＡ２０ｓｉＲＮＡオリゴ−ＤＣで免疫化されたマウスの体内で増強されたＴＲＰ２−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した（図３５）。
【０４４７】
マウスＡ２０ｓｉＲＮＡオリゴＤＣにより誘発された増強された抗腫瘍応答
抗腫瘍免疫を誘発するその能力に関してＤＣ中においてＡ２０を阻害することの影響をテストするために、ＤＣをＡ２０ｓｉＲＮＡ−２オリゴ２重鎖又は対照オリゴ２重鎖でトランスフェクトした。マウスのグループを、ＯＶＡ抗原でパルスされたトランスフェクトを受けたＤＣで免疫化した。パルスを受けたＤＣを用いたマウスの免疫化の後、インビボで３回ＣｐＧ（５０μｇ／マウス）を伴って又は伴わずにマウスを刺激した。ＤＣ免疫化から２週間後に、免疫化されたマウスにＯＶＡ＋ＥＧ７腫瘍で抗原投与した。インビボ刺激を伴って又は伴わずに免疫化されたマウスの体内で、増強された抗腫瘍活性が観察された（図３６及び３７）。ｓｉＡ２０オリゴ−トランスフェクトしたＤＣを受けた免疫化が、インビボで事前準備されたＥＧ．７腫瘍を根絶する観察された。
【０４４８】
マウスＡ２０ｓｉＲＮＡオリゴＤＣによって誘発された増強された抗体応答
Ａ２０ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖トランスフェクションを受けたＤＣが、抗原特異的抗体応答を誘発する増強された効能を有するか否かをテストするために以下の実験を設計した
。簡単に言うと、ＤＣをＡ２０ｓｉＲＮＡ−２オリゴ２重鎖又は対照オリゴ２重鎖を用いてトランスフェクトした。次にマウスのグループを、ＯＶＡでパルスされたトランスフェクションを受けたＤＣで免疫化した。パルスを受けたＤＣを用いたマウスの免疫化の後、マウスを、インビボで３回ＰｏｌｙＩ：Ｃ（５０μｇ／マウス）で刺激した。ＤＣ免疫化から２週間後に、免疫化されたマウスの体内の抗体応答を検査した。ＥＬＩＳＡ検定は、Ａ２０ｓｉＲＮＡオリゴ−ＤＣで免疫化したマウスの体内の増強されたＯＶＡ特異的抗体応答を示した（図３８）。さらに、ＳＵＭＯ１ｓｉＲＮＡオリゴ−ＤＣ及びＦｏｘｊ１  ｓｉＲＮＡオリゴ−ＤＣも同様に、免疫化されたマウスの体内でＯＶＡ−特異的抗体応答を誘発する増強された効能を示した（図３８）。
【０４４９】
ウイルスベクターでの形質導入を受けたマウスＢＭ−ＤＣの増強された免疫刺激効能
Ａ２０がインビボでのＤＣ抗原提示を負に調節するか否かを評価するために以下の実験を設計した。簡単に言うと、Ａ２０ｓｉＲＮＡ又は対照緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｓｉＲＮＡをレンチウイルスベクター（ＬＶ）中にクローニングした。レンチウイルスベクターは、ＤＣを安定した形で形質導入する能力をもち（ルビンソン（Ｒｕｂｉｎｓｏｎ）ら、２００３年、Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．第３３号：４０１〜４０６頁；スクロアースら、２００４年、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．第２４６号：４５１〜４５９頁）、そのためＡ２０サイレンシング化の効果をより高い信頼性で評価し得ると考えられることから選択された。本書中の他の個所で記述されている方法に従い、共に黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）マーカーを含むＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ及びＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡという２つの構成体が生成された（図３３）。ＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ又はＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡベクターのいずれかを用いた骨髄由来のＤＣの形質導入（＞８０％ＣＤ１１ｃ＋）は、ＹＦＰについて陽性である約５８〜６３％の培養細胞を日常的に生成した。ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの場合と比較してＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの刺激時点で、形質導入を受けた全ＤＣ集団中のより低いレベルのＡ２０ｍＲＮＡ及び増強された前炎症性サイトカインの分泌が観察された。
【０４５０】
次の実験セットは、ＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが増強された免疫応答誘発能力を有するか否かをテストするように設計された。マウスのグループを、ＯＶＡ又はＴＲＰ２でパルスを受けたＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化した。パルスを受けたＤＣを用いたマウスの免疫化の後に、インビボ刺激の不在下でマウスを刺激した。ＤＣ免疫化から２週間後に、免疫化されたマウス体内の免疫応答を検査した。細胞内ＩＦＮγ染色は、ＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスにおいて、増強されたＴＲＰ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞又はＯＶＡ特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示した（図３９及び４０）。
【０４５１】
抗腫瘍応答を誘発するＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力をテストするために、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞を接種した。３日後、マウスを、ＬＰＳでエクスビボ刺激されたＯＶＡ−パルスを受けた成熟ＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ又はＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで１回処置した。ＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが事前準備されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍の成長を効果的に遮断することが観察された（図４１及び４２）。ＬＶ−Ｆｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが抗腫瘍応答の誘発において効果的であることも同様に観察された。
【０４５２】
ＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより誘発される、増強されたＨＩＶ特異的Ｔ細胞応答
Ａ２０ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖トランスフェクションを受けたＤＣが、ＨＩＶに対する免疫応答を誘発する増強された効能を有するか否かをテストするために以下の実験を設計した。簡単に言うと、ＤＣを、ＬＶ−Ａ２０ｓｉＲＮＡ−２又は対照でトランスフェクトした。次にマウスのグループを、ＨＩＶｇｐ１２０でパルスを受けた形質導入されたＤＣで免疫化した。パルスを受けたＤＣを用いてマウスを免疫化した後、マウスを、インビボで３回ＰｏｌｙＩ：Ｃ（５０μｇ／マウス）で刺激した。ＤＣ免疫化から２週間後に、免
疫化されたマウス体内の免疫応答を検査した。細胞内ＩＦＮγ染色は、Ａ２０ｓｉＲＮＡオリゴ−ＤＣで免疫化したマウスにおいて、増強されたＨＩＶｇｐ１２０−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した（図４３）。
【０４５３】
実施例１５：Ｆｏｘｊ１−サイレンシング化されたＤＣの増強された免疫刺激効能
何らかの特定の理論に束縛されることは望まないが、ＩκＢ発現の誘発は、ＤＣの免疫刺激効能を調節すると考えられている。ＩκＢの発現は動的制御下にあり、ＩκＢは活性化シグナルが無くても定常代謝回転を受け、新しいＩκＢ分子の合成を通して恒常的に補充されて、ＮＦ−κＢが活性化されないようにしている。Ｆｏｘｏ３ａ及びＦｏｘｊ１は、ＩκＢ転写の活性化因子として近年同定されたフォークヘッド転写因子ファミリーのメンバーである。Ｆｏｘｊ１及びＦｏｘｏ３ａは、ＮＦ−κＢの負の調節に積極的に寄与する。ｆｏｘｊ１遺伝子のノックアウトは、子宮内早期死亡に導く。ＲＡＧ-／-バックグラウンド中にｆｏｘｊ１-／-リンパ系を伴うキメラ動物は、多臓器全身性炎症、ＴＨ１サイトカイン産生の上昇及びＴ細胞過剰増殖を示すことが分かった。これはＮＦ−κＢシグナリング経路の調節異常が原因であると考えられている。
【０４５４】
ＩκＢの１つの主要なイソ型であるＩκＢβは、ｆｏｘｊ１欠損Ｔ細胞中には不在であり、このことが、休止状態のｆｏｘｊ１−／−Ｔ細胞中のＮＦ−κＢの過剰活性化及びＴＣＲ刺激に対するこれらの細胞の過敏性を説明している。Ｆｏｘｏ３ａ−欠損Ｔ細胞は、ｆｏｘｊ１−／−Ｔ細胞中の場合のようなＩκＢβ、そしてＩκＢεという２つのＩκＢイソ型の発現の欠落のためにＮＦ−κＢ活性の高い基底レベルを有し、このことはＦｏｘｏ３ａが、Ｆｏｘｊ１と同様に、休止状態のＴ細胞中におけるＩκＢの産生に求められることを示している。Ｆｏｘｏ３ａ欠損Ｔ細胞は、ＴＣＲシグナリング後に過剰増殖とＴＨ１サイトカイン及びＴＨ２サイトカインの両方の実質的上昇を示した。Ｆｏｘｊ１及びＦｏｘｏ３ａは、重複するものの、完全に冗長ではない機能を有するように思われる。ＩκＢαの存在は、ｆｏｘｊ１−／−及びｆｏｘｏ３ａ−／−マウスの両方におけるＮＦ−κＢアップレギュレーションに対して観測可能な影響は及ぼさず、このことはＮＦ−κＢ活性の基底レベル制御において３つのＩκＢタンパク質中に機能的冗長性が欠落していることを示している。
【０４５５】
抗原提示の調節におけるＦｏｘｊ１の役割を検査するために以下の実験セットを設計した。図４４は、Ｆｏｘｊ１が、Ｆｏｘｊ１ｓｉＲＮＡオリゴ（５’−ＡＧＡＵＣＡＣＵＣＵＧＵＣＧＧＣＣＡＵ−３’；配列番号６０）でトランスフェクトされた細胞中でダウンレギュレートされたことを実証している。簡単に言うと、ジーンポーターを用いて１０：１の比で、Ｆｏｘｊ１  ｓｉＲＮＡオリゴとＦＬＡＧ−タグ付きｍＦｏｘｊ１発現ベクターで、２９３Ｔ細胞を同時トランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、細胞を処理し、対応する細胞溶解物をウェスタンブロット法に付した。ウェスタンブロット法は、ベータアクチンバンドの強度に正規化されたＦｏｘｊ１バンドの強度を示している。（後続の研究ではＦｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡと呼称されている）Ｆｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡ２オリゴでのトランスフェクションを受けたＤＣが、例えばＩＬ−６のような、前炎症性サイトカインの分泌の増強が示す通り、ｓｉＲＮＡ突然変異体でのトランスフェクトを受けたＤＣと比較して、ＩＬ−６ＬＰＳに対する応答性がより高いことが観察された（図４５）。
【０４５６】
Ｆｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡオリゴがＩＬ−６の分泌の増強において効果的であったという事実に基づき、形質導入を受けたＤＣの免疫刺激効能を増強させるＬＶ−Ｆｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡの能力を査定するために組換え型ＬＶ−Ｆｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡを生成した。ＬＶ−Ｆｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡ又はＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡベクターのいずれかを用いたＤＣ形質導入（ＣＤ１１ｃ＋８０％超）は、ＹＦＰについて陽性である６０％の培養細胞を日常的に生成した。形質導入を受けたＤＣを、ＬＶ−Ａ２０−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが増強
された免疫応答誘発能力を有するか否かをテストするために用いた。
【０４５７】
次にマウスのグループを、例えばＴＲＰ２又はＨＩＶｇｐ１２０といった所望の抗原でのパルスを受けたＬＶ−Ｆｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化した。パルスを受けたＤＣを用いたマウスの免疫化の後、マウスをインビボ刺激無しで刺激した。ＤＣ免疫化から２週間後に、免疫化されたマウス体内の免疫応答を検査した。細胞内ＩＦＮγ染色は、ＬＶ−Ｆｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化したマウスの体内で増強されたＴＲＰ２特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した（図４６）。さらに、細胞内ＩＦＮγ染色は、ＬＶ−Ｆｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化したマウスで、増強されたＨＩＶｇｐ１２０特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を示した（図４７）。
【０４５８】
実施例１６：Ｔｗｉｓｔ２−サイレンシング化されたＤＣの増強された免疫刺激効能
何らかの特定の理論に束縛されることは望まないが、ＮＦ−κＢ標的遺伝子発現の阻害は、ＤＣ免疫刺激効能をもたらすと考えられている。Ｔｗｉｓｔは、ＮＦ−κＢシグナリングの負の免疫調節因子である。哺乳動物中にはＴｗｉｓｔ−１とＴｗｉｓｔ−２の２つのｔｗｉｓｔタンパク質が存在し、広範囲の生後組織中において低レベルで発現される。ｔｗｉｓｔ−２遺伝子の欠損は、結果としての悪液質及び成長障害を伴う多組織中の増強された前炎症性サイトカイン遺伝子発現という結果をもたらす。この表現型は、ｔｗｉｓｔ−１及びｔｗｉｓｔ−２複合ヘテロ接合体中で反復され、サイトカイン発現の阻害におけるこれらの遺伝子の冗長性及び投薬量依存性を反映している。ｔｗｉｓｔ−２ノックアウトマウスの表現型は、Ｔｗｉｓｔが通常はＮＦ−κＢのｐ６５と結びつきサイトカインプロモータを抑制する負のフィードバックループの喪失を反映しているように思われる。Ｔｗｉｓｔは、サイトカインプロモータ中のＥボックスに結合し、隣接するＮＦ−κＢ部位に結合したＮＦ−κＢの活性を阻害する。Ｔｗｉｓｔは、ｐ６５とのタンパク質−タンパク質コンタクトを通して、ＤＮＡ結合とは独立して標的プロモータのＮＦ−κＢ−媒介型活性化も同様に阻害することができる。
【０４５９】
抗原提示の調節におけるＴｗｉｓｔ２の役割を検査するために以下の実験セットを設計した。図４８は、Ｔｗｉｓｔ２が、Ｔｗｉｓｔ２ｓｉＲＮＡオリゴでトランスフェクトされた細胞中においてダウンレギュレートされることを実証している。簡単に言うと、ジーンポーターを用いて１０：１の比で、Ｔｗｉｓｔ２ｓｉＲＮＡオリゴ及びＦＬＡＧ−タグ付きＴｗｉｓｔ２発現ベクターで２９３Ｔ細胞を同時にトランスフェクトした。トランスフェクションから４８時間後に、細胞を処理し、対応する細胞溶解物をウェスタンブロットに付した。ベータアクチンバンドの強度にＴｗｉｓｔ２バンドの強度を正規化し、相対的強度（比）を示す（図４８）。Ｔｗｉｓｔ発現は、Ｔｗｉｓｔ−２ｓｉＲＮＡオリゴ（５’−ＧＣＧＡＣＧＡＧＡＵＧＧＡＣＡＡＵＡＡ−３’；配列番号６１及び５’−ＣＡＡＧＡＡＡＵＣＧＡＧＣＧＡＡＧＡＵ−３’；配列番号６２）によってダウンレギュレートされた。
【０４６０】
Ｔｗｉｓｔ２ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖でのトランスフェクションを受けたＤＣが、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する増強された効能を有するか否かをテストするために、Ｔｗｉｓｔ２ｓｉＲＮＡ−２オリゴ２重鎖又は対照オリゴ２重鎖をＤＣにトランスフェクトした。次にマウスのグループを、ＯＶＡでのパルスを受けたトランスフェクトされたＤＣで免疫化した。パルスを受けたＤＣを用いたマウスの免疫化の後に、インビボで３回ＰｏｌｙＩ：Ｃ（５０μｇ／マウス）を用いてマウスを刺激した。ＤＣ免疫化から２週間後に、免疫化されたマウス体内の免疫応答を検査した。四量体染色及びＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ検定は、インビボＰｏｌｙＩ：Ｃ刺激を伴うＴｗｉｓｔ２ｓｉＲＮＡオリゴ−ＤＣでの免疫化を受けたマウスの体内で、増強されたＯＶＡ−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した（図４９及び５０）。
【０４６１】
実施例１７：ＳＵＭＯ１サイレンシング化されたＤＣの増強された免疫刺激効能
ＳＵＭＯタンパク質は、その輸送、位置づけ及び安定性（別途ＳＵＭＯ化（ＳＵＭＯｙｌａｔｉｏｎ）としても知られている）を改変することによってその結合パートナーを負に調節する。ＳＵＭＯは、脊椎動物種中においてＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３及びＳＵＭＯ４という４つのメンバーを有している。ＳＵＭＯ１は、ユビキチンリガーゼによってＫ４８−連結型ユビキチン鎖と接合させることのできる部位であるＫ２１上でＩκＢαをＳＵＭＯ化することによってＮＦ−κＢシグナリングを負に調節する。ＳＵＭＯによるＩκＢαの修飾は、ＩκＢαをユビキチン媒介型分解から保護し、かつその結果としてＮＦ−κＢの活性化を阻害する。さらに、保存されたメチオニン（Ｍｅｔ５５）が内部でバリン残基（Ｍ５５Ｖ）によって置換されているＳＵＭＯ４の機能的変異体が、ＮＦ−κＢ活性化に対するＳＵＭＯ４の阻害効果を低減させかつＩ型糖尿病に関連することが発見された。
【０４６２】
抗原提示の調節におけるＳＵＭＯ１の役割を検査するために以下の実験セットを設計した。ＳＵＭＯ１ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖でのトランスフェクションを受けたＣが、抗原特異的Ｔ細胞応答を誘発する増強された効能を有するか否かをテストするために、ＤＣを所望のＳＵＭＯ１ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖（５’−ＧＡＵＧＵＧＡＵＵＧＡＡＧＵＵＵＡＵＣ−３’；配列番号５９）でトランスフェクトした。次にマウスのグループを、ＯＶＡでのパルスを受けたトランスフェクトされたＤＣで免疫化した。パルスを受けたＤＣでのマウスの免疫化の後に、インビボで３回ＬＰＳ（３０μｇ／マウス）によりマウスを刺激した。ＤＣ免疫化から２週間後に、免疫化されたマウス体内の免疫応答を検査した。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ検定は、インビボＰｏｌｙＩ：Ｃ刺激を伴うＳＵＭＯ１ｓｉＲＮＡオリゴ（２及び３）−ＤＣでの免疫化を受けたマウスの体内で、増強されたＯＶＡ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示した（図５１）。さらに、１００ｎｇ／ｍｌＬＰＳでの刺激の時点でＳＵＭＯ１ｓｉＲＮＡオリゴ（３）でのトランスフェクションを受けたＤＣ中に観測可能なＩＫβαのリン酸化反応の増大が存在した（図５２）。
【０４６３】
実施例１８：分子安定性の調節に関連する遺伝子の阻害
様々な負の免疫調節因子によって頻繁に利用される戦略は、ユビキチン化／脱ユビキチン化によって主要なシグナリング分子の安定性を調節すること及びＳＵＭＯ化及びその他の機序によってシグナリング分子複合体の阻害構成要素の安定性を増大させることである。これらの負の免疫調節因子の多くのもの、例えばＴＲＩＡＤ３Ａ、Ｃｙｌｄ、ＳＵＭＯ、Ｃｌｂ及びＡ２０などは、標的Ｔｏｌｌ様レセプタ（ＴＬＲ）及びシグナリング分子を修飾し、かつそれらの分解を促進してＴＬＲ及び腫瘍壊死因子レセプタ（ＴＮＦＲ）シグナル伝達を減衰させるユビキチン修飾酵素である。
【０４６４】
ＴＲＩＡＤ３Ａは、ＴＲＩＡＤ３ファミリーのＲＩＮＧフィンガーＥ３ユビキチンリガーゼである。ＴＲＩＡＤ３Ａは、ＴＬＲ４とＴＬＲ９の細胞質ドメインを結合させかつユビキチル化することができ、これがそれらの分解という結果をもたらす。ＴＲＩＡＤ３Ａの過剰発現は、ＬＰＳ及びＣｐＧＤＮＡに応答した、ＴＬＲ４及びＴＬＲ９媒介型のＮＦ−κＢの活性化を低減させる。従って、本開示に基づくと、本書中に開示されている方法を用いたＴＲＩＡＤ３Ａ発現レベルのダウンレギュレーションは、ＴＬＲ発現の増強及びインビトロでのＬＰＳ及びＣｐＧに対する応答の増大を導き得る。従って、本発明は、ＴＲＩＡＤ３Ａを阻害することよって免疫細胞の免疫能力を増強させることを含む。
【０４６５】
タンパク質の安定性調節に関与するもう一つの遺伝子はＣＹＬＤである。ＣＹＬＤは、９５６個のアミノ酸でタンパク質をコードする腫瘍サプレッサ遺伝子である。早期終結又はフレームシフト改変を含むＣＹＬＤ遺伝子の突然変異は、多数の良性皮膚付属器腫瘍に付随する疾病である円柱腫症中で発見された。ＮＦ−κＢシグナリングカスケード中において、ＴＲＡＦ２及びＩＫＫγは、リジン６３（Ｋ６３）連結型ポリユビキチン鎖と接合
される。プロテアソーム分解のためのＫ４８ポリユビキチン鎖によるタンパク質の通常のユビキチン化とは異なり、ＴＲＡＦ２、ＩＫＫγ及び場合によってはＴＲＡＦ６のＫ６３ユビキチン化は、ＩＫＫ複合体の組立て及び活性化のために必要である。ＣＹＬＤは、ＴＲＡＦ２及びＩＫＫγ上で、Ｋ６３ポリユビキチン鎖を脱ユビキチン化する能力をもち、ＩＫＫ複合体の分解及びＮＦ−κＢ活性化の阻害という結果をもたらす。突然変異ＣＹＬＤの脱ユビキチン化活性の喪失は、ＮＦ−κＢの持続的活性化と相関している。従って、本書中に開示されている方法を用いた免疫細胞中でのＣＹＬＤの阻害は、細胞の免疫能力を増強する。
【０４６６】
分子の安定性に関与するもう一つの遺伝子は、Ｃｂｌ（Ｃａｓｉｔａｓ  Ｂリンパ腫に相当）である。Ｃｂｌタンパク質ファミリーは３つのメンバー、すなわちＣｂｌ、Ｃｂｌ−ｂ及びＣｂｌ−ｃを有している。Ｃｂｌタンパク質ファミリーのシグネチュアモチーフは、チロシンキナーゼ結合（ＴＫＢ）ドメイン及びユビキチン接合酵素（Ｅ２）と相互作用するＲＩＮＧフィンガードメインという、２つの高度に保存されたＮ−末端ドメインである。これら２つのドメインは、合わさって、活性化されたチロシンキナーゼに向けられたユビキチンリガーゼであるＣｂｌタンパク質の基本的機能ユニットを画定している。本書中に提示されている開示に基づくと、Ｃｂｌを阻害することは、活性化されたチロシンキナーゼ、好ましくは免疫応答の増強に関連するチロシンキナーゼが分解されるのを予防するのに役立つ。従って、本書中に開示されている方法を用いて免疫細胞中のＣｂｌを阻害することによって、細胞の免疫能力は増強される。
【０４６７】
アレスチンファミリーは、分子安定性の調節に関連するタンパク質のもう一つのファミリーである。アレスチンファミリーは、４つのメンバー、すなわちβ−アレスチン１、β−アレスチン２、ｘ−アレスチン及びｓ−アレスチンを含む。β−アレスチン１及びβ−アレスチン２の１つの機能は、β２−アドレナリン作動性レセプタにより媒介されるセカンドメッセンジャーシグナリングを脱感作することにある。β−アレスチン１及びβ−アレスチン２のもう一つの機能は、ＩκＢαリン酸化反応／分解に対する対策に由来する、ＮＦ−κＢのシグナル誘発型活性化を消滅させることにあると考えられている。β−アレスチンは、ＩκＢαのカルボキシ末端と結合し、ＩＫＫはＩκＢαのＰＥＳＴドメインにアクセスできないことになり、ＰＥＳＴドメインのリン酸化反応がＩκＢα分解を促進することから、ＩκＢαタンパク質の安定化が導かれる。従って、本書中に開示されている方法を用いて免疫細胞中でアレスチンファミリーのメンバーを阻害することによって、細胞の免疫能力は増強される。
【０４６８】
ＴＯＬＬＩＰ（Ｔｏｌｌ相互作用性タンパク質）は、ＩＲＡＫ１のユビキチン化及び後続するその分解を容易にする。ＴＯＬＬＩＰはＩＲＡＫ１と相互作用し、ＩＲＡＫ１の自己リン酸化反応のレベルは、ＴＯＬＬＩＰの存在下で減少する。ＴＯＬＬＩＰの過剰発現は、ＴＬＲ２及びＴＬＲ４媒介型ＮＦ−κＢ活性化の阻害という結果をもたらす。本書中に提示されている本開示に基づくと、本書中に開示されている方法を用いて免疫細胞中のＴＯＯＬＩＰを阻害することで、細胞の免疫能力は増強される。
【０４６９】
実施例１９：その非機能的相同体によるシグナリング分子の阻害
Ｔｏｌｌ様レセプタ（ＴＬＲ）及び腫瘍壊死因子レセプタ（ＴＮＦＲ）のシグナリングを調節するためのもう一つの戦略は、刺激活性を全く有していない非機能的相同体又はイソ型によって主要シグナリング分子を競合的に阻害することにある。ＲＰ１０５、ＳＴ２、ＳＩＧＩＲＲ、ＩＲＡＫ−２、ＩＲＡＫ−Ｍ、ｓＭｙＤ８８及びｓＴＬＲといった負の免疫調節因子がこの戦略を例示している。
【０４７０】
可溶性デコイＴＬＲ（ｓＴＬＲ）は、ＴＬＲと病原菌産物の相互作用を抑制する。可溶性ＴＬＲ２は、病原菌リガンドとの相互作用についてＴＬＲ２と競合することができる。
可溶性ＴＬＲ４はＭＤ２と相互作用し、ＭＤ２−ＴＬＲ４複合体の形成を阻害することができ、かくしてＴＬＲ４によるＬＰＳ媒介型シグナリングを遮断する。
【０４７１】
何らかの特定の理論に束縛されることは望まないが、本書中に開示されている方法を用いて免疫細胞中で、ＲＰ１０５、ＳＴ２、ＳＩＧＩＲＲ、ＩＲＡＫ−２、ＩＲＡＫ−Ｍ、ｓＭｙＤ８８及びｓＴＬＲといった負の免疫調節因子を阻害することにより、細胞の免疫能力が増強されると考えられている。
【０４７２】
非機能的ＴＩＲ相同体
免疫細胞の免疫刺激効能を増強するためのもう一つの戦略は、ＳＩＧＩＲＲ、ＳＴ２及びＲＰ１０５といった、ＴＩＲドメインを含有しかつ刺激活性を有していない膜結合非機能的ＴＩＲ相同体と結びつけられたタンパク質を阻害することにある。これらのタンパク質は、ＴＬＲシグナリングを抑制することができる。ＲＰ１０５はＴＬＲ４の相同体であり、ＡＰＣ上で発現される。ＲＰ１０５はＭＤ−１と複合体を形成し、これがＴＬＲ４−ＭＤ−２と直接相互作用し、ＬＰＳに対するＴＬＲ４−ＭＤ−２複合体の結合を阻害する。ＲＰ１０５は、一次樹状細胞におけるＴＬＲ４シグナリング及びインビボでの内毒素に対する応答の生理学的調節因子である。
【０４７３】
ＳＩＧＩＲＲ欠損マウスは、ＬＰＳにより誘発される内毒素ショックに対して非常に感受性が高いことが分かった。ＳＩＧＩＲＲは、シグナリング分子と相互作用するべくＴＬＲ４と競合することによってＴＬＲ４シグナリングを減衰させる。同様にして、ＳＴ２欠損マウスは、ＬＰＳに応答した炎症性サイトカインの産生の増大とＬＰＳ寛容の誘発不良を示した。ＳＴ２がＭｙＤ８８及びＴＩＲＡＰと会合しこれらを封鎖したことから、ＳＴ２の過剰発現は、ＮＦ−κＢの活性化を阻害すると考えられている。
【０４７４】
シグナリング分子イソ型
ＭｙＤ８８及びＩＲＡＫといった主要シグナリング分子のいくつかの非機能的イソ型は、ＴＬＲシグナリングを抑制することが分かっている。中間ドメインが欠如しているＭｙＤ８８の代替的にスプライシングされた短い変異体であるＭｙＤ８８ｓは、ＬＰＳで刺激された場合に単球内で誘発される。ＭｙＤ８８ｓは、ＩＲＡＫ４に対しての結合しＩＲＡＫ１のリン酸化反応を促進することができないことから、ＬＰＳ誘発型ＮＦ−κＢ活性化を阻害する。
【０４７５】
ＩＲＡＫ−Ｍはキナーゼ活性が欠如し、ＡＰＣｓ中においてＴＬＲシグナリングの包括的な負の免疫調節因子として機能する。キナーゼのＩＲＡＫファミリーは、ＩＲＡＫ１、ＩＲＡＫ２、ＩＲＡＫ４及びＩＲＡＫＭという４つのメンバーを含んでなる。偏在的に発現されるその他のＩＲＡＫと異なり、非刺激性ＩＲＡＫ−Ｍの発現は、単球及びマクロファージに制限され、かつＴＬＲリガンドでの刺激の後に誘発可能な形で発現される。ＩＲＡＫ−Ｍ−欠損マウスは、ＴＬＲリガンドに応答した炎症性サイトカイン産生の増大及びＬＰＳ寛容誘発の欠損を示した。ＩＲＡＫ−Ｍは、ＩＲＡＫ１及びＩＲＡＫ４のリン酸化反応を阻害すること、又はＴＬＲ−ＭｙＤ８８−ＩＲＡＫ４複合体を安定化させることのいずれかによって、ＩＲＡＫ１−ＩＲＡＫ４複合体のＭｙＤ８８からの解離を予防し、かくしてＩＲＡＫ１−ＴＲＡＦ６複合体の形成を予防する。
【０４７６】
ＩＲＡＫ２は、マウスの体内で、ＩＲＡＫ２ａ、ＩＲＡＫ２ｂ、ＩＲＡＫ２ｃ及びＩＲＡＫ２ｄという４つのスプライス変異体を有する。ＩＲＡＫ２ｃ及びＩＲＡＫ２ｄには、全長ＩＲＡＫ２中及びＩＲＡＫ２ａ及びＩＲＡＫ２ｂイソ型中に見出される死ドメインが欠如し、かつＬＰＳ刺激の後にマクロファージ中において誘発可能な形で発現される。ＩＲＡＫ２ｃ及びＩＲＡＫ２ｄの過剰発現が、ＬＰＳで誘発されたＮＦ−κＢの活性化を、用量非依存的に阻害し、これにはシグナリングに対する負のフィードバック効果が関与す
ることが示された。
【０４７７】
転写因子のＩＦＮ調節因子（ＩＲＦ）ファミリーの２つのメンバーであるＩＲＦ−５及びＩＲＦ−７は、ＭｙＤ８８と相互作用し、それぞれ前炎症性サイトカイン及びＩ型ＩＦＮｓを誘発させる。しかしながら、ＩＲＦ−４は同様にＭｙＤ８８とも相互作用し、ＴＬＲシグナリングの負の免疫調節因子として作用する。ＩＲＦ−４ｍＲＮＡはＴＬＲ活性化によって誘発され、ＩＲＦ−４はＭｙＤ８８相互作用のためにＩＲＦ−５と競合する。前炎症性サイトカインのＴＬＲ依存性誘発は、Ｉｒｆ４遺伝子欠損マウス由来の腹腔マクロファージ中において顕著に増強され、一方、誘発はマクロファージ細胞系統中ＩＲＦ−４の異所性発現によって阻害される。インビボでのＴＬＲシグナリングにおけるＩＲＦ−４の機能の決定的な機能は、Ｉｒｆ４−欠損マウスが、高い血清前炎症性サイトカインレベルを伴って、ＤＮＡ誘発性のショックに対して過敏性を示すという観察事実によって強調されている。
【０４７８】
ＦＬＮ２９は、ＴＲＡＦ６関連ジンクフィンガーモチーフ及びＴＡＮＫ（ＴＲＡＦファミリーのメンバー関連ＮＦカッパＢ活性化因子）関連配列を含有する新規のインターフェロン及びＬＰＳ誘発性遺伝子である。マクロファージ様ＲＡＷ細胞中でのＦＬＮ２９の発現は、ＴＬＲ媒介型ＮＦ−カッパＢ及びＭＡＰキナーゼ活性化の抑制という結果をもたらし、一方小分子干渉性ＲＮＡによるＦＬＮ２９の発現の低減は、ＬＰＳシグナリングのダウンレギュレーションを部分的に無効にした。さらにＴＲＡＦ６及びＴＡＢ２によって誘発されたＮＦ−カッパＢ活性化は、ＦＬＮ２９の同時発現によって損なわれたことが実証されており、このことは、ＦＬＮ２９がＴＲＡＦ６の下流側で調節し得ることを表している。ＦＬＮ２９はＴＬＲシグナリングの負のフィードバック調節因子であると考えられている。
【０４７９】
シグナリング分子複合体の負の構成要素
ＮＦ−κＢタンパク質は、ＩκＢα、ＩκＢβ及びＩκＢεを含むＩκＢタンパク質とのその会合の結果として不活性形態で細胞質中に封鎖されている。ＩκＢタンパク質は、ＮＦ−κＢサブユニット上の核局在化配列（ＮＬＳ）をマスキングすることによって、又は核及び細胞質の間の核内輸送プロセスよりも核外輸送プロセスの方をより効果的に促進することによって、細胞質中にＮＦ−κＢを保持している。ＩκＢαは、過渡的ＮＦ−κＢ活性化を調節し、ＩκＢβは、持続的なＮＦ−κＢ活性化を維持する。ＩκＢαは、刺激物に応答して急速に分解され、かつそのプロモータ中にＮＦ−κＢ応答要素が存在するために急速に再合成される。これとは対照的に、ＩκＢβはＩκＢαに比べて刺激物誘発型分解に対する反応性が低い。遺伝学研究は、ＮＦ−κＢ活性化を制御する上でのＩκＢα、ＩκＢβ及びＩκＢεの全く異なる機能及び冗長性のある機能の両方を示した。ＩκＢαの欠損は、造血組織内における高いＮＦ−κＢ活性という結果をもたらす。
【０４８０】
ＮＦ−κＢの活性化における決定的な事象は、ＩＫＫ複合体により媒介されるＩκＢｓのリン酸化反応である。ＩＫＫ複合体は、ＴＬＲリガンド及びＴＮＦを含む様々な刺激物によるＮＦ−κＢ活性化の合流点である。ＩκＢキナーゼ（ＩＫＫ）複合体は、２つの触媒サブユニットＩＫＫα及びＩＫＫβを含有し、ＮＦ−κＢ転写因子の活性化を制御する。ＩＫＫβは、前炎症性サイトカイン及び病原菌産物に応答してＮＦ−κＢ活性化を媒介する。
【０４８１】
ＩＫＫαは、ＮＦ−κＢ活性化の制御において負の免疫調節の役割に関与することが実証された。ＩＫＫαは、ＮＦ−κＢサブユニットＲｅｌＡ及びｃ−Ｒｅｌの分解並びに前炎症性遺伝子プロモータからのＲｅｌＡ及びｃ−Ｒｅｌの除去の両方を加速することによって、ＮＦ−κＢ活性の抑制に寄与する。マウスの体内でのＩＫＫαの不活性化は、炎症及び細菌クリアランスを増強する（Ｌａｗｒｅｎｃｅら、２００５年Ｎａｔｕｒｅ第４３
４号：１１３８頁）。
【０４８２】
何らかの特定の理論によって拘束されることは望まないが、本書中で論述されている何らかの遺伝子又はそれらの組合せを阻害することは、インヒビターを阻害する方法として役立つ。本開示に基づくと、免疫者の体内で負の免疫調節因子を阻害することによって細胞の免疫能力を増強することができる。
【０４８３】
実施例２０：シグナリング分子リン酸化反応の調節
ＭＡＰＫ経路は、ＭＡＰＫホスファターゼ（ＭＫＰｓ）によるフィードバック阻害を受ける。ＭＫＰｓは、ＭＡＰＫ経路の活性化後に誘発される。ＭＫＰｓ、ＭＫＰ５及びＭＫＰ６のうちの２つは、そのそれぞれのＭＡＰＫ標的の活性を阻害することによってＴ細胞活性化を負に調節する。
【０４８４】
ＭＫＰ５は当初、ＪＮＫ及びｐ３８上で優先的に作用するホスファターゼとして特徴づけされた。Ｍｋｐ５ノックアウト動物は、ＪＮＫ活性のアップレギュレーション及びその結果としての先天免疫及び適応免疫の両方の応答の調節異常を示した。ＭＫＰ６は、ＣＤ２８コレセプタの細胞質テールと相互作用するタンパク質として同定された。
【０４８５】
ＭＫＰ６はＣＤ２８が一次ヒトＴ細胞を同時刺激した際に誘発される。ＭＫＰ６の優性阻害形態のレトロウイルス駆動型異所性発現は、ＴＣＲ及びＣＤ２８の同時刺激に応答してＩＬ−２の発現を増大させる。ＩＬ−２産生の増大は同様に、ＭＫＰ６ともはや相互作用することができない突然変異体ＣＤ２８コレセプタを用いることによって得られた。合わせて考えれば、ＭＫＰ６が、ＣＤ２８同時刺激に応答したＭＡＰＫ経路の負の調節に関与するということをこれらの観察が実証している。
【０４８６】
何らかの特定の理論によって拘束されることは望まないが、ホスファターゼが免疫応答シグナル伝達経路に関与するキナーゼの阻害に関連している１細胞の中でホスファターゼを阻害することは、細胞の免疫能力を増強する１つの方法として役立つ。
【０４８７】
実施例２１：その他の調節因子機序
Ｄｏｋ−１及びＤｏｋ−２
Ｄｏｋ−１及びＤｏｋ−２が元来多数のタンパク質チロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の基質として同定された（シノハラ（Ｓｈｉｎｏｈａｒａ）ら、２００５年、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．第３号：３３３−３３９）。Ｄｏｋ−１及びＤｏｋ−２は、ＰＴＫの下流側でＲａｓ−Ｅｒｋシグナリングを負に調節するアダプタータンパク質である。ＬＰＳは、Ｄｏｋ−１及びＤｏｋ−２のアダプター機能及びチロシンリン酸化反応を急速に誘発した。Ｄｏｋ−１又はＤｏｋ−２が欠如したマウス由来のマクロファージのＬＰＳによる刺激は、高いＥｒｋ活性化を誘発したが、その他のＭＡＰキナーゼ又はＮＦ−κＢを誘発せず、ＴＮＦ−α及び酸化窒素の過剰産生という結果をもたらした。さらに、突然変異体マウスは、ＴＮＦ−αの過剰産生とＬＰＳに対する過敏性を示した。マクロファージ中のＤｏｋ−１又はＤｏｋ−２何らかの強制発現は、ＬＰＳ−誘発型Ｅｒｋ活性化及びＴＮＦ−α産生を阻害した。従って、Ｄｏｋ−１及びＤｏｋ−２は、ＴＬＲ４シグナリングの負の免疫調節因子とみなされている。
【０４８８】
ＮＯＤ２
ＮＯＤ２は、細菌産物ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）を認識することのできるヌクレオチド結合オリゴマー化ドメインファミリのメンバーである。ＮＯＤ２欠損マウス由来の脾細胞は、ＴＬＲ２アゴニスへの暴露に応答して高いＴＨ１細胞応答を発生させたが、その他のＴＬＲリガンドに応答してはこれを発生させなかった。従って、ＮＯＤ２は、ＴＬＲ２シグナリングの負の免疫調節因子であるとみなされる。これと一致して、クローン病を
患う患者は、ＮＯＤ２遺伝子ロイシンリッチ反復領域中に突然変異を担持し、これがＭＤＰ認識障害という結果をもたらす。さらに、ＮＯＤ２機能障害は、ＴＬＲ２刺激での単核細胞の刺激後に前炎症性サイトカインのバイアスという結果をもたらす。
【０４８９】
ＰＩ３Ｋ
ＰＩ３Ｋは、ｐ８５調節サブユニット及びｐ１１０触媒鎖で構成されるヘテロ二量体である。ＰＩ３Ｋは、大半の細胞よって構成的に発現され、数多くの細胞内事象中で早期シグナルとして機能する。ｐ８５欠損マウスは、増強されたＴＬＲシグナリング及び優性なＴＨ１細胞応答を示した。ＰＩ３Ｋ欠損マウス由来の樹状細胞によるＩＬ−１２合成は、それぞれＴＬＲ４、ＴＬＲ２及びＴＬＲ９リガンドＬＰＳ、ペプチドグリカン及びＣｐＧＤＮＡに応答して顕著に増大した。インビボで、感受性の高いＢＡＬＢ／ｃバックグラウンドのＰＩ３Ｋ欠損マウスは、プロトタイプのＴＨ２媒介型寄生虫病であるリーシュマニア・メジャーによる感染に対して野生型マウスよりも耐性が高かった。これらの結果は、ＰＩ３ＫがＴＬＲシグナリングの有効な負の免疫調節因子であり、それがＩＬ−１２合成の阻害という結果をもたらし、かつＴＨ１応答の過剰発現を予防することを示している。何らかの特定の理論に束縛されることは望まないが、ＰＩ３ＫがＴＬＲシグナリングを阻害する機序には、ｐ３８、ＪＮＫ、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２及びＮＦ−κＢの抑制が関与していると考えられている。
【０４９０】
プロスタグランジン
ｃｙＰＧ１５−デオキシ−D１２，１４−プロスタグランジンＪ２（１５ｄ−ＰＧＪ２）は、天然のリガンド及びシクロペンテノンプロスタグランジンのアゴニストである。１５ｄ−ＰＧＪ２は、シクロオキシゲナーゼ代謝産物プロスタグランジンＤ２の脱水及び異性化から誘発される。ペルオキソーム増殖因子活性化レセプタγ（ＰＰＡＲγ）の活性化は、ＮＦ−κＢの転写活性に拮抗する可能性がある。１５ｄ−ＰＧＪ２は、ＩＫＫβのキナーゼ活性の阻害を通してＩＢαのリン酸化反応並びに分解を阻害する。１５ｄ−ＰＧＪ２及びその代謝産物の特徴的な構造は、求電子反応性α，β不飽和カルボニル基を含有するシクロペンテノン環にある。１５ｄ−ＰＧＪ２のシクロペンタノン環構造によって同様に、ＮＦ−κＢのＤＮＡ結合活性を損なうｐ５０及びｐ６５サブユニット内のシステイン残基の共有結合による修飾を説明することもできる。
【０４９１】
ＴＲＡＩＬ−Ｒ
ＴＲＡＩＬに対するレセプタであるＴＲＡＩＬ−Ｒは、ＴＩＲドメインを有しておらず、ＴＮＦスーパーファミリに属している。ＴＲＡＩＬ欠損及びＴＲＡＩＬＲ欠損マウスは、マウスサイトメガロウイルス感染のクリアランスの増強を示し、これはＩＬ−１２、ＩＦＮ−β及びＩＦＮ−γのレベルの増大と相関関係を有していた。さらに、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３及びＴＬＲ４リガンドによるマクロファージの刺激は、ＴＲＡＩＬＲ欠損細胞中においてより高レベルのＴＲＡＩＬアップレギュレーションと増強されたサイトカイン産生という結果をもたらした。これらの結果は、ＴＲＡＩＬＲシグナリングが、ＴＬＲの選択的な負の免疫調節因子であることを示している。
【０４９２】
ロキン（Ｒｏｑｕｉｎ）（Ｒｃ３ｈ１）
ロキンは、ＲＩＮＧ型Ｅ３ユビキチンリガーゼタンパク質ファミリーの高度に保存されたメンバーである。ロキンタンパク質は、ＲＮＡ−結合タンパク質中に見出されるＣＣＣＨジンクフィンガーの存在及びそのシトゾールＲＮＡ顆粒への局在化によって特徴づけされる。ロキンは、メッセンジャーＲＮＡの翻訳と安定性の調節に関与していると考えられている。何らかの特定の理論に束縛されることは望まないが、成熟Ｔ細胞内のロキン遺伝子の突然変異（そうでなければロキンの阻害）は、過剰な数の濾胞性ヘルパーＴ細胞及び胚中心を形成させる原因であると考えられている。本開示に基づくと、ロキンを阻害することは、免疫細胞の免疫能力を増強するのに役立ち得る。
【０４９３】
本書中に引用されている各々及び全ての特許、特許出願及び公開の開示は、その全体が本明細書に参照により援用されている。
【０４９４】
特定の実施形態を参照しながら本発明を開示してきたが、当業者であれば本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明のその他の実施形態及び変形形態も考案し得ることは明白である。添付の特許請求の範囲は、かかる全ての実施形態及び等価の変形形態を包含するように解釈されるものである。
【図面の簡単な説明】
【０４９５】
【図１】図１Ａ及び１Ｂを含んでなるこの図はＳＯＣＳ１の発現がＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡによってダウンレギュレートされることを実証する一連の図表である。図１ＡはマウスＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡで同時トランスフェクションを受けた２９３Ｔ細胞のウェスタンブロット検定を描いている。図１Ｂは、ＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡでのオリゴトランスフェクションを受けたＤＣの定量的ＲＴ−ＰＣＲ検定を描いている。
【図２】ＩＬ−６及びＴＮＦ−αといった前炎症性サイトカインの増強された分泌によって標示されるようにｓｉＲＮＡ突然変異体に比べてＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションを受けたＤＣがＬＰＳ又はＩＦＮ−γに対してさらに高い反応性を有していたことを実証する図表である。
【図３】組換え型レンチウイルスベクター、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ及びＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡの概略的表現である。
【図４】図４Ａ及び４Ｂを含んでなる図４は、ＳＯＣＳ１がインビトロで抗原特異的ＣＴＬを刺激するＤＣの能力を負に調節することを実証する一連の図表である。図４Ａは、オボアルブミン特異的ＴＣＲＴ細胞（ＯＴ−Ｉ）がｓｉＲＮＡ−ＤＣ突然変異体同時培養中よりもＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ同時培養中でより多く増殖したという事実を描いている。これらのデータと整合して、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ同時培養中でより高いレベルの前炎症性サイトカインが分泌された（図４Ｂ）。
【図５】図５Ａ〜図５Ｃを含んでなる図５は、ＳＯＣＳ１がインビトロで抗原特異的Ｔ細胞応答をプライミングするＤＣの能力を負に調節することを実証する一連の図表である。図５Ａは、合計ゲーテッドＣＤ８＋Ｔ細胞集団内のＨ２−Ｋｂ／オボアルブミン−ＰＥ四量体＋Ｔ細胞の百分率を標示する。図５Ｂは、インターフェロン−γ（ＩＦＮγ）ＥＬＩＳＰＯＴ検定を描いている。図５Ｃは、未成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣを与えられたマウス由来の脾細胞のオボアルブミン＋標的細胞に対するより強力な細胞傷害性を実証するＣＴＬ検定を描いている。
【図６】図６Ａ〜６Ｅを含んでなる図６は、ＳＯＣＳ１−サイレンシング化されたＤＣにより誘発されるＣＴＬ応答を、インビボＬＰＳ刺激が強力に増強することを実証する一連の図表である。図６は、ゲーテッドされたＣＤ８＋Ｔ細胞内のオボアルブミン−ＰＥ四量体陽性Ｔ細胞の百分率を描いている。図６Ｂは、インビボＬＰＳ刺激が後続する、ＬＰＳ誘発型成熟無しの、オボアルブミンパルスを受けたＤＣ、形質導入を受けたＤＣ又はモックＤＣで免疫化されたマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数を描いている。図６Ｃ及び図６Ｄは、インビボＬＰＳ刺激が後続する、成熟ＤＣで免疫化されたマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のそれぞれオボアルブミン−ＰＥ四量体＋百分率及びＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ数を描いている。図６Ｅは、さまざまなサイトカイン及びＴＬＲアゴニストでのインビボ刺激が、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによるＣＴＬ応答（ＥＬＩＳＰＯＴ）を増強することを実証している。
【図７】図７Ａ〜７Ｅを含んでなる図７は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより誘発される増強された抗腫瘍免疫を実証する一連の図表である。図７Ａは、事前準備されたオボアルブミンパルスを受けたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣでの免疫化が、事前準備されたオボアルブミン＋ＥＧ７腫瘍の成長を遮断するという事実を描いている。図７Ｂは、抗ＣＤ８抗体がオボアルブミンパルスを受けたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘発された抗腫瘍活性を無効にするものの抗−ＣＤ４抗体はそれをしなかったという事実を描いている。図７Ｃ〜７Ｅは、マウス体内のＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡのオリゴ２重鎖トランスフェクションを受けたＤＣによる増強した抗腫瘍活性を描いている。
【図８】図８Ａ〜８Ｃを含んでなる図８は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによる自己腫瘍関連抗原に対する増強したＣＴＬ応答を実証する一連の図表である。図８は、成熟ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが、事前準備されたＢ１６腫瘍の成長を有効に遮断した一方で、成熟ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが、観察可能な阻害効果を全く有していなかったという事実を描いている。図８Ｂ及び図８Ｃは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおける強力なＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答の、それぞれＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ及びＣＴＬ検定を描いている。
【図９】図９Ａ〜９Ｃを含んでなる図９は、ＳＯＣＳ１により制限されている成熟ＤＣシグナリングが自己抗原及び抗腫瘍免疫に対抗するＣＴＬ応答を制御することを実証する一連の画像である。図９Ａは、免疫化から２週間後のマウスにおける脾細胞のＣＤ８＋Ｔ細胞内のＨ２−Ｋｂ−ＴＲＰ２−ＰＥ四量体陽性Ｔ細胞の百分率を描いている。図９Ｂは、免疫化から３ヶ月後に１回又は３回、インビボＬＰＳ刺激を受けるＴＲＰ２ａパルスを受けたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＣ免疫化済みマウスにおける代表的白斑を描いている。図９Ｃは、免疫化されたマウスのグループからプールされた脾細胞のＴＲＰ２＋Ｂ１６（上部図版）に対する、及びＴＲＰ２ａペプチドでのインビトロ再刺激の後にＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡＤＣで免疫化された野生型マウスの脾細胞のＴＲＰ２−ＥＧ．７標的細胞（下部図版）に対する細胞傷害性を描いている。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄを含んでなる図１０は、ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣ免疫化による事前準備されたＢ１６腫瘍の根絶を実証する一連の図表である。図１０Ａ及び１０Ｂは、それぞれＬＰＳインビトロ刺激を伴わない及びそれを伴う野生型マウスにおける腫瘍成長曲線を描いている。図１０Ｃは、６０日間監視したマウスの生存百分率を描いている。図１０Ｄは、ＬＰＳの同時注入を受け、ＴＲＰ２ａペプチドでの刺激に付された免疫化済みマウスのプールされた脾細胞から単離されたＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ検定を描いている。
【図１１】図１１Ａ〜１１Ｃを含んでなる図１１は、低又は高親和性ペプチドのいずれかでのパルスを受けたＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより誘発された強力なＣＴＬ応答及び抗腫瘍活性を実証する一連の図表である。図１１Ａは、ＬＰＳ刺激を伴わない（図１１Ａ−１）又は伴う（図１１Ａ−２）形質導入されたＤＣ上の共同刺激／阻害分子のフローサイトメトリ分析を描いている。図１１Ｂは、低及び高親和性ペプチドでのパルスを受けたＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣによる事前準備されたＢ１６腫瘍の根絶を描いている。図１１Ｃは、ＴＲＰ２ａ又はＴＲＰ２ｂペプチドで刺激されたＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ検定により測定される通りの抗原特異的ＣＴＬ応答の比較を描いている。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄを含んでなる図１２は、ＩＬ−１２ＫＯＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡ−ＤＣによる有効な抗腫瘍応答の誘発の欠如を実証する一連の図表である。図１２Ａ及び図１２Ｂは、それぞれに腫瘍体積及び生存率を描いている。図１２Ｃは、ＴＲＰ２ａペプチドでのインビトロ刺激後のＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴ検定を描いている。図１２Ｄは、ＴＲＰ２＋Ｂ１６標的細胞を用いたＴＲＰ２ａペプチドでのインビトロ刺激の後のＣＴＬ検定を描いている。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｄを含んでなる図１３は、ＳＯＳＣ１が、ＤＣによるＩＬ−１２及びＩＬ−１２誘発型サイトカインの産生を制御することを実証する一連の図表である。図１３Ａは、ＬＰＳ及び平板コーティングされた抗−ＣＤ４０ｍＡｂでの連続的刺激に応答してＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡＤＣにより分泌されたＩＬ−１２のレベルを描いている。図１３Ｂは、ＩＬ−１２レベルとそれに続く最初の２４時間の刺激の後のこれらの刺激物の除去を描いている。図１３Ｃは、２４時間のＬＰＳ及び平板コーティングされた抗ＣＤ４０ｍＡｂでの刺激とそれに続く刺激の除去に応答した、ＳＯＣＳ１  ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより分泌されるＴＮＦα及びＩＬ−６のレベルを描いている。図１３Ｄは、ＬＰＳ及び平板コーティングされた抗−ＣＤ４０ｍＡｂでの連続的刺激に応答してｐ３５−／−又はｗｔＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ  ＤＣにより分泌されたＴＮＦα及びＩＬ−６のレベルを描いている。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂを含んでなる図１４は、インビボＩＬ−１２投与がＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの免疫化を増強することを実証する一連の図表である。図１４Ａは、インビボＩＬ−１２投与により増強される抗腫瘍活性を描写している。図１４Ｂは、ＩＬ−１２によるＴＲＰ２特異的ＣＴＬ応答を描いている。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｄを含んでなる図１５は、ｇｐ１２０特異的抗体及びＣＴＬ応答がＤＣ内のＳＯＣＳ１のサイレンシング化によって増強されることを実証する一連の図表である。図１５Ａは、対照のＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣに比べて、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣが、はるかに強固なｇｐ１２０特異的ＩｇＭ及びＩｇＧ応答を惹起したことを例示している。図１５Ｂは、対応するＬＶ−ＧＦＰｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス内のサブクラスと比べた、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウス内の全てのＩｇＧサブクラスにおけるＨＩＶＥｎｖ−特異的抗体力価の大幅な増大を示している。図１５Ｃは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおけるｇｐ１２０パルスを受けた標的細胞に対するＣＴＬ活性がＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおけるものよりもはるかに強力であったことを示している。図１５Ｄは、ＬＶ−ＳＯＣＳ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおけるＩＦＮ−γ＋Ｔ細胞のより高い百分率を示している。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄを含んでなる図１６は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによるＴｈ１及びＴｈ２分極の両方のサイトカインの増強された産生を実証する一連の図表である。図１６Ａは、ＬＰＳでの刺激の後のＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣに比べた、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより産生されたＩＬ−１２、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦαのレベルを描いている。図１６Ｂはｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度を描いている。図１６Ｃは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来のＣＤ４＋Ｔ細胞が、ｇｐ１２０パルスを受けたＤＣでの刺激に応答してＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来のものよりも活発に増殖したことを例示している。図１６Ｄは、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにおけるＴｈ１分極（ＩＦＮ−γ、ＩＬ−２及びＴＮＦα）及びＴｈ２分極（ＩＬ−４及びＩＬ−１０）の両方のサイトカインの増大したレベルを示している。
【図１７】図１７Ａ〜図１７Ｄを含んでなる図１７は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣによる増強されたｇｐ１２０特異的Ｂ細胞活性化を実証する一連の図表である。図１７Ａは、ＬＰＳ刺激の時点でのＡＰＲＩＬ及びＢＡＦＦｍＲＮＡの発現レベルを描写している。図１７Ｂは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣ及びＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス内の抗−ｇｐ１２０ＩｇＧ産生Ｂ細胞の頻度を描いている。図１７Ｃは、抗ＣＤ４０及びＩＬ−４で共同刺激された場合に、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来のＢ細胞がＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来のＢ細胞に比べてより激しく増殖したということを描いている。図１７Ｄは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス由来のＢ細胞が、さまざまな刺激物に応答してＩＬ−６、ＩＬ−２、及びＴＮＦ−αを含めたさまざまなサイトカインをより高いレベルで産生した、ということを描いている。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｂを含んでなる図１８は、ＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣにより誘発される長期ｇｐ１２０特異的抗体及びＣＴＬ応答を実証する一連の図表である。図１８Ａは、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウスと比べたＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣで免疫化されたマウス内のｇｐ１２０特異的抗体を描いている。図１８Ｂは、ＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスと比べたＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス体内のｇｐ１２０特異的ＣＴＬ応答を例示している。図１８Ｃは、免疫化から６カ月目におけるＬＶ−ＧＦＰ−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスと比べた、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウス内のＣＤ４４ｈｉ及びＩＦＮγ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を例示している。図１８Ｄは、免疫化から６カ月目のＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣマウスにおいて、ｇｐ１２０特異的ＣＤ４＋Ｔｈ応答が維持され急速に誘発されたということを例示している。
【図１９】図１９Ａ〜１９Ｅを含んでなる図１９は、ＨＩＶＥｎｖ媒介免疫抑制に対するＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの耐性を実証する一連の図表である。図１９Ａは、ｇｐ１２０タンパク質の存在下にあるＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣがＬＰＳに応答する能力を保持していたことを例示している。ｇｐ１２０タンパク質に対する後曝露は、ＯＶＡ特異的抗体応答を誘発するＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣの能力に対し明らかな効果をもたず（図１９Ｂ及び１９Ｃ）、ＬＶ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより誘発されたＯＶＡ特異的ＣＤ８＋ＣＴＬ及びＣＤ４＋Ｔｈ応答を危うくすることもなかった（図１９Ｄ及び１９Ｅ）。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｄを含んでなる図２０は、ＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡによるＨＩＶＤＮＡワクチンの増強を実証する一連の図表である。図２０Ａは、ｐＳｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＮＡで同時免疫化されたマウスにおけるＨＩＶＥｎｖ−特異的抗体力価の増強を描いている。図２０Ｂ及び２０Ｃは、ＨＩＶＥｎｖ特異的ＣＴＬ応答が、それぞれに、ＣＴＬ及びＥＬＩＳＰＯＴ検定により実証されているように、ｐ  Ｓｕｐｅｒ−ＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＮＡの同時注入により著しく増強させられた、ということを例示している。図２０Ｄは、ＨＩＶＥｎｖ特異的ＣＤ４＋Ｔｈ応答がＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＮＡの同時注入により増強されたという事実を描いている。
【図２１】図２１Ａ〜図２１Ｃを含んでなる図２１は、ヒト単球由来のＤＣの中のヒトＳＯＣＳ１のサイレンシング化を実証する一連の図表である。図２１Ａは、ヒトＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡがヒトＳＯＣＳ１発現を効率良くダウンレギュレートしたことを例示している。図２１Ｂは、ヒト単球から誘導されたＤＣ内への合成ｓｉＲＮＡ２重鎖のトランスフェクション効率を例示している。図２１Ｃは、ｈＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡ２重鎖でのトランスフェクションを受けた総ＤＣ集団内のｈＳＯＣ１ｍＲＮＡのレベルを描いている。
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｃを含んでなる図２２は、ヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣを特徴づけする一連の図表である。図２２Ａは、標示されたヒトＳＯＣＳ１についてのフローサイトメトリ分析を描いている。図２２Ｂ及び２２Ｃは、ｓｉＲＮＡ突然変異体でのトランスフェクションを受けたヒトＤＣと比較した、ｈＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡでのトランスフェクションを受けたＤＣにおけるＩＬ−１２、ＩＬ−６及びＴＮＦ−αなどの前炎症性サイトカインの分泌レベルを例示している。
【図２３】図２３Ａ〜２３Ｃを含んでなる図２３は、抗原特異的ＣＴＬ応答をプライミングするヒトのＳＯＣＳ１サイレンシング化されたＤＣの増強された免疫刺激効能を実証する一連の図表である。異なるＨＬＡ−Ａ２＋ドナーを用いた４回の独立した実験の１つから、ＭＡＧＥ３−ＰＥ四量体＋Ｔ細胞百分率（図２３Ａ）、ゲーテッドＣＤ３＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞集団内の細胞内ＩＦＮγ＋Ｔ細胞百分率（図２３Ｂ）、及びＩＦＮ−γ＋ＥＬＩＳＰＯＴ数（図２Ｃ）が示されている。
【図２４】ヒト化ＨＬＡ−Ａ２，１トランスジェニックマウスにおける増強されたヒトＭＡＧＥ３−特異的ＣＴＬ応答を描いた図表である。
【図２５】図２５Ａ及び２５Ｂを含んでなる図２５は、ヒトＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡ−ＤＣにより活性化されたヒトＣＴＬの腫瘍溶解活性を実証する一連の図表である。４回の独立した実験から、抗ヒトＩＬ−１２抗体の不在下又は存在下での自己Ｔ細胞及びＭＡＧＥ３パルスを受けたｈＳＯＣＳ１−ｓｉＲＮＡＤＣ又は対照ＤＣの２週間の同時培養の後のヒトＭＡＧＥ３＋、ＨＬＡ−Ａ２＋黒色腫細胞（ＳＫ−Ｍｅｌ−３７）（図２５Ａ）及び対照ヒトＭＡＧＥ３＋、ＨＬＡ−Ａ２−黒色腫細胞（ＮＡ−６−Ｍｅｌ）（図２５Ｂ）に対する細胞溶解活性が示されている。
【図２６】図２６Ａ及び図２６Ｂを含んでなる図２６は、免疫化されたＨＬＡ−Ａ２．１トランスジェニックマウスの活性化されたＣＴＬの腫瘍溶解活性を実証する一連の図表である。３つの実験のうちの１つから、５日間ＭＡＧＥ３ペプチドでのインビトロ再刺激の後に、ヒトＳＫ−Ｍｅｌ−３７細胞（図２６Ａ）及び対照ヒトＨＬＡ−Ａ２−ＮＡ−６−Ｍｅｌ細胞（図２６Ｂ）に対する細胞傷害性が決定され、提示されている。
【図２７】図２７Ａ及び２７Ｂを含んでなる図２７は、ＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖での同時免疫化がインビボでのタンパク質免疫化を増強することを実証する一連の図表である。
【図２８】ヒトＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡを発現する複製欠損アデノウイルスベクターの概略図を描いた図表である。図２８は同様に、Ａｄ−ヒトＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡによるヒトＤＣのトランスフェクションをも実証している。
【図２９】Ｔ細胞のＳＯＣＳ１ｓｉＲＮＡオリゴ２重鎖トランスフェクションによる増強されたＣＴＬ活性を描く図表である。
【図３０】ｓｉＲＮＡ候補の核酸配列を描く図表である。
【図３１】Ａ２０−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＡ２０）でのトランスフェクションを受けたＢＭ−ＤＣ内のＡ２０ｍＲＮＡの発現が、定量的ＲＴ−ＰＣＲ検定を用いて測定されるようにｓｉＡ２０オリゴによりダウンレギュレートされることを実証する図表である。
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｄを含んでなる図３２は、ＯＶＡパルスを受けｓｉＡ２０オリゴトランスフェクションを受けたＢＭ−ＤＣのインビボでの増強された免疫刺激効能を実証する一連の図表である。図３２Ａ〜３２Ｄは、それぞれ突然変異体ｓｉＲＮＡＤＣ（ＣｐＧ不在下）、Ａ２０−２ｓｉＲＮＡＤＣ（ＣｐＧ不在下）、突然変異体ｓｉＲＮＡＤＣ（ＣｐＧ不在下）及びＡ２０−２ｓｉＲＮＡＤＣ（ＣｐＧ不在下）で免疫化されたマウスの体内のゲーテッドを受けた総ＣＤ８＋Ｔ細胞集団内のＨ２−Ｋｂ／オボアルブミン−ＰＥ四量体＋Ｔ細胞の百分率を描いている。
【図３３】図３３Ａ及び３３Ｂを含んでなる図３３は、それぞれＰｏｌｙＩ：Ｃ刺激の存在下及び不在下でのインビボのＯＶＡパルスを受けたｓｉＡ２０オリゴトランスフェクションを受けたＢＭ−ＤＣ内の抗−ＯＶＡＣＤ８Ｔ細胞応答の増強を実証する一連の図表である。
【図３４】図３４Ａ及び３４Ｂを含んでなる図３４は、それぞれＰｏｌｙＩ：Ｃ刺激の存在下及び不在下でのインビボのＯＶＡパルスを受けたｓｉＡ２０オリゴトランスフェクションを受けたＢＭ−ＤＣ内の抗−ＯＶＡＣＤ４Ｔ細胞応答の増強を実証する一連の図表である。
【図３５】図３５Ａ及び３５Ｂを含んでなる図３５は、インビボのＴＲＰ２パルスを受けたｓｉＡ２０オリゴトランスフェクションを受けたＢＭ−ＤＣ内の抗−ＴＲＰ２ＣＤ８Ｔ細胞応答の増強を実証する一連の図表である。図３５Ａ及び３５Ｂは、それぞれＰｏｌｙＩ：Ｃ刺激の存在下及び不在下でのＴＲＰ２パルスを受けた、トランスフェクションを受けた又はモックＤＣで免疫化されたマウスにおけるＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴの数を描いている。
【図３６】ＣｐＧインビボ刺激の不在下でのＯＶＡパルスを受けたｓｉＡ２０オリゴトランスフェクションを受けたＤＣ免疫化による、事前準備されたＥＧ．７腫瘍の根絶を実証する腫瘍成長曲線の図表である。
【図３７】ＣｐＧインビボ刺激の不在下でのＯＶＡパルスを受けたｓｉＡ２０オリゴトランスフェクションを受けたＤＣ免疫化による、事前準備されたＥＧ．７腫瘍の根絶を実証する腫瘍成長曲線の図表である。
【図３８】ＤＣ内のＳＯＣＳ１、Ａ２０、ＳＵＭＯ１又はＦｏｘｊ１のサイレンシング化によってＯＶＡ特異的抗体応答が増強されることを実証する図表である。
【図３９】ＴＲＰ２−パルスを受けた、ＬＶ−ｓｉＡ２０−形質導入を受けたＤＣで免疫化されたマウスの体内のＣＤ８Ｔ細胞のＴＲＰ２特異的ＩＦＮ−γ＋百分率を描く図表である。
【図４０】ＯＶＡパルスを受けたＬＶ−ｓｉＡ２０−形質導入を受けたＤＣで免疫化されたマウスの体内のＣＤ４＋Ｔ細胞のＯＶＡ特異的ＩＦＮ−γ＋百分率を描く図表である。
【図４１】ＯＶＡパルスを受けた、ＬＶ−ｓｉＡ２０又はｓｉＦｏｘｊ１−形質導入を受けたＤＣの免疫化による事前準備されたＢ１６−ＯＶＡ腫瘍の阻害を実証するグラフである。
【図４２】ＯＶＡパルスを受けた、ＬＶ−ｓｉＡ２０−形質導入を受けたＤＣ又はｓｉＦｏｘｊ１形質導入を受けたＤＣで免疫化されたマウスの生存率を描くグラフである。
【図４３】ＨＩＶｇｐ１２０パルスを受けた、ＬＶ−ｓｉＡ２０−形質導入を受けたＤＣで免疫化されたマウスの体内での、増強されたＨＩＶｇｐ１２０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を実証する図表である。
【図４４】Ｆｏｘｊ１発現ＤＮＡ及びＦｏｘｊ１−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＦｏｘｊ１）オリゴで同時トランスフェクションされた２９３個の細胞内のＦｏｘｊ１タンパク質のダウンレギュレーションを立証するウェスタンブロット検定の画像である。
【図４５】ｓｉＦｏｘｊ１オリゴでのトランスフェクションを受けたＤＣは、ＩＬ−６分泌の増強により標示される通り、ｓｉＲＮＡ突然変異体でのトランスフェクションを受けたＤＣに比べＬＰＳ刺激に対する応答性が高かったということを実証する図表である。
【図４６】ＴＲＰ２パルスを受け、形質導入を受けたＤＣで免疫化されたマウスの体内でのＴＲＰ２特異的ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞を実証する図表である。
【図４７】ＨＩＶｇｐ１２０パルスを受け、形質導入を受けたＤＣで免疫化されたマウスの体内でのＨＩＶｇｐ１２０特異的ＣＤ８及びＣＤ４Ｔ細胞を実証する図表である。
【図４８】Ｔｗｉｓｔ２−ｓｉＲＮＡ（ｓｉＴｗｉｓｔ２）オリゴと組み合わされた状態でＴｗｉｓｔ１及びＴｗｉｓｔ２の発現ＤＮＡでの同時トランスフェクションを受けた２９３個の細胞内のＴｗｉｓｔ２タンパク質のダウンレギュレーションを実証するウェスタンブロット検定の図表である。
【図４９】インビボでのＯＶＡパルスを受け、ｓｉＴｗｉｓｔ２オリゴトランスフェクションを受けたＢＭ−ＤＣの免疫刺激効能の増強を実証するＯＴ−Ｉ四量体染色の図表である。
【図５０】インビボでのＯＶＡパルスを受けｓｉＴｗｉｓｔ２オリゴトランスフェクションを受けたＢＭ−ＤＣの免疫刺激効能をＴｗｉｓｔ２サイレンシング化が増強することを実証するＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ検定のグラフである。
【図５１】インビボでのｓｉＳＵＭＯ１（ＳＵＭＯ１−２及びＳＵＭＯ１−３）オリゴトランスフェクションを受けたＢＭ−ＤＣの免疫刺激効能をＳＵＭＯ１サイレンシング化が増強することを実証するグラフである。図５１は、インビボＰｏｌｙＩ：Ｃ刺激を伴うオボアルブミンパルスを受けた、トランスフェクションを受けたＤＣ又はモックＤＣで免疫化されたマウスの体内でのＣＤ８＋Ｔ細胞のＩＦＮγ−ＥＬＩＳＰＯＴ検定を描いている。
【図５２】ＳＵＭＯ１ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＵＭＯ１）でのトランスフェクションを受けたＤＣ内でのＩＫβαの活性化の増強を実証するウェスタンブロット検定の画像である。
【図５３】Ａ２０、ＳＵＭＯ１、ＳＵＭＯ２、ＳＵＭＯ３、ＳＵＭＯ４、Ｔｗｉｓｔ−１、Ｔｗｉｓｔ−２、Ｆｏｘｊ１及びＦｏｘｏ３ａのためのｓｉＲＮＡターゲティングされた配列を描く図表である。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ−１】
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【図１１Ａ−２】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１５Ｄ】
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【図１６Ａ−１】
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【図１６Ａ−２】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図１９Ｄ】
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【図１９Ｅ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２１Ｃ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５３−３】
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【図５３−４】
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【配列表】
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