(57)【要約】  本発明は、任意の目的の核酸または核酸類似体（ターゲット）を検出するための方法に関し、この場合には、少なくとも一対の、リガンドで標識したオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体（プローブ）または少なくとも１つのリガンドで標識したプローブトリプレット（Sondenterzett）が遺伝的多形の検出に使用され、その際、上流のプローブは、比例して５′末端がターゲットにハイブリダイズし、３′末端が比例して下流のプローブの５′末端にハイブリダイズし、下流のプローブの３′末端は、再度比例してターゲットにハイブリダイズし、したがって結果として、三重構造が標的核酸とプローブ対との間に形成される。更に、本発明は、前記方法を実施するための試験キットに関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも一対の標識したオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体（プローブ）または少なくとも１つの標識したプローブトリプレットが使用され、その際、上流プローブは、比例して５′末端がターゲットにハイブリダイズし、３′末端が比例して下流プローブの５′末端にハイブリダイズし、下流プローブの３′末端は、再度比例してターゲットにハイブリダイズし、したがって結果として、三重構造が標的核酸とプローブ対との間に形成される、標的核酸または核酸類似体（標的）を検出するかまたは遺伝的多形を検出するための方法。
【請求項２】
標的へのプローブの十分なハイブリダイズは、プローブ対またはプローブトリプレットで行なわれるにすぎず、個別のプローブでは行なわれない、請求項１記載の方法。
【請求項３】
比例してターゲットのハイブリダイゼーションの能力を有する、上流プローブおよび下流プローブの配列区間は、ターゲットの隣接した配列にハイブリダイズし、同時に上流プローブの３′末端と下流プローブの５′末端との間で安定した「星形構造」を形成する、請求項１または２記載の方法。
【請求項４】
プローブの５′末端ならびに３′末端にリガンドを存在させることができ、したがって標識の種々の組合せに対して全部で４つの異なる座を提供する、請求項１または２記載の方法。
【請求項５】
上流プローブは、それぞれリポーターおよび消光剤として機能するリガンドで標識され、３′−ＯＨ阻止を全く有さず、一方、下流プローブは、標識されておらず、３′−ＯＨで阻止される、請求項１または２記載の方法。
【請求項６】
プローブトリプレットは、配列中で少なくとも１個の塩基で区別される、異なるリガンドで標識した２つの上流プローブまたは下流プローブと１つの属する上流プローブまたは下流プローブとからなり、この１つの属する上流プローブまたは下流プローブは、プローブトリプレットに属する、星形構造範囲内で相補的な上流プローブまたは下流プローブを有する星形構造を形成する能力を有し、この場合には、常に、プローブおよびターゲットの少なくとも１つのターゲットハイブリダイズするプローブ区間の間に十分な相補性が存在する場合にのみ上流プローブと下流プローブとターゲットとの間に加水分解可能な三重構造が形成される、請求項１または２記載の方法。
【請求項７】
プローブトリプレットの場合に、２つの上流プローブは、異なる波長で発光する、リポーターとして機能する２つのリガンドならびに消光剤として機能する１つのリガンドで標識され、３′ＯＨ阻止を有さず、一方で、下流プローブは、標識されず、３′ＯＨで阻止される、請求項６記載の方法。
【請求項８】
プローブ対とターゲットとの間に形成された三重構造は、直接にハイブリダイゼーション病原体のために測定信号を形成する能力を有するか、またはプローブ対の部分的な加水分解後に初めて、均一なアッセイで同時に含まれる酵素、特にポリメラーゼによって測定信号が発生される、請求項１記載の方法。
【請求項９】
上流プローブの５′末端が、ターゲットの部分配列に対して十分に相補的であり、当該プローブの３′末端が、下流プローブの５′末端に対して十分に相補的であり、下流プローブの３′末端が、再度上流プローブの５′末端に対して十分に相補的であり、当該プローブの３′末端が、再度ターゲットの他の部分配列に対して十分に相補的である、標的核酸（ターゲット）を検出するためのプローブ対。
【請求項１０】
１つかまたは２つのプローブが３′−ＯＨ阻止を有しない、請求項９記載のプローブ対。
【請求項１１】
部分配列５′−ＡＧＴＣＧＧＡＡＣＣＴＴ−３′および５′−ＡＡＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴ−３′または５′−ＡＧＴＣＧＧＡＡＣ−３′および５′−ＧＴＴＣＣＧＡＣＴ−３′、または他の適当な、星形構造を形成する部分配列を含む、請求項９または１０記載のプローブ対。
【請求項１２】
１つまたは２つのプローブが５′末端および／または３′末端に標識を有する、請求項９または１０記載のプローブ対。
【請求項１３】
標識のために蛍光染料および／または消光剤染料が使用されている、請求項１２記載のプローブ対。
【請求項１４】
上流プローブが３′末端でおよび下流プローブが５′末端でそれぞれ供与体染料および受容体染料で標識されている、請求項１２記載のプローブ対。
【請求項１５】
請求項９から１４までのいずれか１項に記載のプローブ対を製造する方法において、次の工程：
公知であるかまたは公知でない、特に１５〜４０個の塩基長の、ターゲットに適合しうるオリゴヌクレオチド−プローブ配列を２つの部分プローブ配列に分解する工程、
部分プローブ配列を、それぞれプローブ対のプローブ間に星形構造を形成する、請求項８記載の部分配列で補充する工程、
測定可能で、特に定量化可能な信号を蛍光、放射能、測色、重量測定、Ｘ線回折の形かまたは吸収、磁力、酵素活性または比較可能性の形で発生させることができるリガンドを個別のプローブに結合する工程（標識）を有することを特徴とする、請求項９から１４までのいずれか１項に記載のプローブ対を製造する方法。
【請求項１６】
標的にハイブリダイズする部分プローブ配列は、互いに同じＴm値を有し、ならびにプローブ対の完全なプローブは、それぞれ同じＴm値を有する、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
配列中で少なくとも１つの塩基だけが区別される２つの上流プローブまたは下流プローブおよび所属する上流プローブまたは下流プローブを含む、遺伝的多形を検出するためのプローブトリプレット。
【請求項１８】
２つの上流プローブが、異なる波長で発光する、リポーターとして機能する２つのリガンドならびに消光剤として機能する１つのリガンドで標識されており、３′ＯＨ阻止を有さず、一方で、下流プローブは、標識されず、３′ＯＨで阻止されているる、請求項１７記載のプローブトリプレット。
【請求項１９】
請求項６から１１までのいずれか１項に記載の少なくとも１つの標識したプローブ対またはプローブトリプレット、少なくとも１つのプライマー対、少なくとも１つのヘテロポリマー標的配列、少なくとも１つの酵素ならびに所属する試薬セットを含む、請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法を実施するための試験キット。
【請求項２０】
任意のヘテロポリマー標的核酸または核酸類似体を定性的および／または定量的に検出するため、または遺伝的多形を検出するための、請求項９から１４までのいずれか１項に記載のプライマー対および／または請求項１から８までのいずれか１項に記載の方法および／または請求項１９記載の試験キットおよび／または請求項１７または１８記載のプローブトリプレットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、任意の標的核酸または核酸類似体（標的）を検出するための方法に関し、この場合には、少なくとも一対の、リガンドで標識したオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体（プローブ）または少なくとも１つのリガンドで標識したプローブトリプレット（Sondenterzett）が遺伝的多形の検出に使用され、その際、上流プローブは、比例して５′末端が標的にハイブリダイズし、３′末端が比例して下流プローブの５′末端にハイブリダイズし、下流プローブの３′末端は、再度比例して標的にハイブリダイズし、したがって結果として、三重構造が標的核酸とプローブ対との間に形成される。更に、本発明は、前記方法を実施するための試験キットに関する。
【０００２】
本発明は、特に酵素的複製化後のヘテロポリマー核酸または核酸類似体または遺伝的多形を定性的または定量的に「リアルタイム」に検出するかまたは末端検出するためのヘテロポリマー標的配列を均一に検出するプローブ対およびプローブトリプレットに関する。可能な使用分野は、分子生物学、遺伝子、遺伝子発現、ウィルス性または細菌性の病原体、殊に個別化された医学的診断学のための食品における遺伝的に変化された有機体の定性的または定量的な分析、機能的なゲノム分析、臨床学的薬理学、薬物遺伝学、法科学、食品分析および環境分析ならびに免疫ＰＣＲによりタンパク質を超感応的に検出するための使用である。
【０００３】
定性的な遺伝子変化および多形の分子的診断ならびに殊に極端に僅かな分析物濃度の定量的な病原体診断のためには、しばしば酵素的増幅法が使用される。このための方法は、例えばポリメラーゼ鎖反応（PCR, 米国特許第４６８３１９５号明細書、米国特許第４６８３２０２号明細書、欧州特許出願公開第０２００３６２号明細書Ａ１、欧州特許出願公開第０２０１１８４号明細書Ａ１；HoffＭａｎn-La Roche）、リガーゼ鎖反応（LCR, Abbott Diagnostics, North Chicago, IL, USA）、ストランド置換増幅（SDA, Walker et. al. [1993], PCR Methods Appl. 3: 1-6, Becton-Dickinson Research Center）および転写−仲介増幅（TMA, Gen-Probe INC., San Diego, CA）である。全ての記載された方法は、測定すべき標的核酸を指数的に増殖（増幅）するための試験管内法である。
【０００４】
均一なアッセイは、試験管内でＰＣＲ生成物の合成を「リアルタイム」に、即ち直接にそれぞれ使用されるＰＣＲ反応容器中で測定することを可能にする。このために適した、現在の公知技術水準による方法は、なかんずく「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）」をベースとする「染料標識したオリゴヌクレオチド連結反応（ＤＯＬ）」法［Chen, X., Livak, K.J. & Kwok, P.Y. Genome Res. 8, 549-556 (1998), Landgren, U., Nilsson, M. & Kwok, P.Y. Genome Res. 8, 769-776 (1998). 米国特許第６０２７８８９号明細書；米国特許第６２６８１４８号明細書］、５′−エキソヌクレアーゼまたはTaqＭａｎアッセイ［Holland, P.M., Abramson, R.D., Watson, R. & Gelfand, D.H. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 88, 7276-7280 (1991), Didenko, V.V. Biotechniques 31, 1106-1 (2001);米国特許第５２１００１５号明細書；米国特許第５４８７９７２号明細書;欧州特許出願公開第０９１９５６５号明細書Ａ２：ＷＯ  ９２／０２６３８］ならびに「隣接ハイブリダイゼーションプローブ」またはデュアルプローブ法（米国特許第５５３２１２９号明細書；米国特許第５５６５３２２号明細書、米国特許第５９１４２３０号明細書、欧州特許出願公開第１３８９６３８号明細書Ａ１）である。所謂、ＦＲＥＴをベースとしない検出法には、例えば「分子標識（Molecular beacons）」［Kwiatkowski, R.W., Lyamichev, V., de Arruda, M. & Neri, B. Mol. Diagn. 4, 353-364 (1999),米国特許第５９８９８２３号明細書］、「セルフプライミングプローブ（Self priming probes）」（米国特許第５８６６３３６号明細書）、ライトアップ法（LightUp-Verfahren）（欧州特許第１３５７１８５号明細書Ａ１、米国特許第６４６１８７１号明細書Ｂ１）ならびにＰＣＲに依存しないインベーダーアッセイ（Invader-Assay）［Cooksey, R.C., Holloway, B.P., Oldenburg, M.C., Listenbee, S. & Miller, C.W. Antimicrob. Agents Chemother. 44, 1296-1301 (2000)］が属する。
【０００５】
核酸定量化反応には、極めて頻繁に均一で極めて確固とした５′−３′−エキソヌクレアーゼ−アッセイが使用される。この方法は、当業者に公知の常用のＰＣＲ原理に基づくものであり、この場合同時にバッチ量中に含有された、増幅産物（Amplicon）一本鎖は、相補的一本鎖ＤＮＡプローブをプライマー結合位置間で標的にハイブリダイズする。５′末端でリポーター染料が標識しかつ３′末端で消光剤染料が標識した前記プローブは、プライマーの拡大のためにＴａｑポリメラーゼの５′−３′−エキソヌクレアーゼ−活性によって加水分解され、この場合には、結果として消光効果は、相殺され、標的生成物の量に比例する蛍光信号が発生される。
【０００６】
上記方法は、本質的に標的配列と標識したプローブとの間での二重構造の形成に基づくものであり、酵素的に合成された増幅生成物１つにつき常に最大の蛍光測定インパルスが発生しうると言う欠点を有する。もう１つの欠点は、使用されたプローブ形式がデュアルプローブ法または５′−３′−エキソヌクレアーゼ−アッセイに適しているが、しかし、同時に２つの検出形式には適していないということにある。遺伝的多形の検出に適した、「隣接ハイブリダイゼーションプローブ」に基づく検出法は、当該方法で使用されるプローブが極めて長い（４０ｂｐを上廻る）ハイブリダイゼーション区域を必要とするという付加的な欠点を有し、このことは、特に超可変性の短い保存領域だけを含む、殊にＲＮＡ標的が検出される場合には、プローブの使用を困難にする。更に、欠点は、殊に極めて頻繁に使用されるＴａｑＭａｎ法は、殆んど確実なものではなく、殊にプローブ中の抑制物質に対して極めて故障し易いということである。ＴａｑＭａｎ法のもう１つの欠点は、遺伝的多形、殊に個々の不適正さの検出のために制限されてのみ適していることにある。それというのも、野生型対立遺伝子（ｗｔ）を明らかに突然変異された対立遺伝子（ｍｔ）と区別するために、しばしば個別的な塩基交換が検出に採用される相補的プローブ配列内では十分ではないからである。その上、多くの場合に上記の検出方法は、プローブの望ましくない延長をＰＣＲ法で阻止するために、使用されるプローブが高価な３′ＯＨ阻止修飾を有しなければならないという欠点を有する。
【０００７】
従って、本発明は、公知技術水準に記載された解決の欠点を排除するという課題に基づくものである。
【０００８】
この課題は、標的核酸または核酸類似体（標的）を検出するための方法によって解決されたが、この場合には、少なくとも一対の、リガンドで標識したオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体（プローブ）または少なくとも１つのリガンドで標識したプローブトリプレット（Sondenterzett）が遺伝的多形の検出に使用され、その際、上流プローブは、比例して５′末端が標的にハイブリダイズし、３′末端が比例して下流プローブの５′末端にハイブリダイズし、下流プローブの３′末端は、再度比例して標的にハイブリダイズし、したがって結果として、三重構造が目的の核酸とプローブ対との間に形成される。この場合、標的へのプローブの最適なハイブリダイゼーションは、プローブ対でのみ行なわれるが、しかし、個別のプローブでは行なわれない。それというのも、個別に使用されるプローブのハイブリダイゼーション区域は、標的相補的プローブ含分と標的との間での安定したハイブリダイゼーションには、短すぎるからである。比例して標的のハイブリダイゼーションの能力を有する、上流プローブおよび下流プローブの配列区間は、特に標的の隣接した配列にハイブリダイズし、同時に上流プローブの３′末端と下流プローブの５′末端との間で安定した「星形構造」を形成する。
【０００９】
本発明による方法は、双方のプローブの５′末端ならびに３′末端に標識を存在させることができ、したがって標識の種々の組合せに対して全部で４つの異なる座を提供するという利点を有する。特に好ましい種類の形式において、上流プローブは、それぞれリポーターおよび消光剤として機能するリガンドで標識されており、３′−ＯＨ阻止を全く有さず、一方、下流プローブは、標識されておらず、３′−ＯＨで阻止されている。
【００１０】
遺伝的多形を検出するための本発明によるプローブトリプレット（図２）は、配列中で少なくとも１個の塩基で区別される、２つの標識した上流プローブまたは下流プローブと１つの属する上流プローブまたは下流プローブとからなり、この１つの属する上流プローブまたは下流プローブは、プローブトリプレットに属する、２つの上流プローブまたは下流プローブを有する星形構造を形成する能力を有し、この場合には、常に、プローブおよび標的の少なくとも１つの標的ハイブリダイズするプローブ区間の間に十分な相補性が存在する場合にのみ上流プローブと下流プローブと標的との間に加水分解可能な三重構造が形成される。１つの特に好ましい形の形式において、２つの上流プローブは、異なる波長で発光する、リポーターとして機能する２つのリガンドならびに消光剤として機能する１つのリガンドで標識されており、３′ＯＨ阻止を有さず、一方で、下流プローブは、標識されておらず、３′ＯＨで阻止されている。
【００１１】
プローブ対と標的との間に形成された三重構造は、直接にハイブリダイゼーション病原体のために測定信号を形成する能力を有するか、またはプローブ対の部分的な加水分解後に初めて、例えば均一なアッセイで同時に含まれる酵素、特にポリメラーゼによって測定信号が発生される。
【００１２】
標的核酸（標的）または遺伝的多形を検出するための少なくとも１つのプローブ対またはプローブトリプレットは、本発明の対象に属し、この場合上流プローブの５′末端は、標的の部分配列に対して十分に相補的であり、当該プローブの３′末端は、下流プローブの５′末端に対して十分に相補的であり、下流プローブの３′末端は、再度上流プローブの５′末端に対して十分に相補的であり、当該プローブの３′末端は、再度標的の他の部分配列に対して十分に相補的である。
【００１３】
意外なことに、１つのプローブまたは２つのプローブは、公知技術水準とは異なり、３′ＯＨ阻止を有する必要がないことが判明した。
【００１４】
プローブ対またはプローブトリプレットとして、星形構造を形成する状態にある全てのオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体を使用することができる。例えば、星形構造は、部分配列５′−ＡＧＴＣＧＧＡＡＣＣＴＴ−３′および５′−ＡＡＧＧＴＴＣＣＧＡＣＴ−３′または５′−ＡＧＴＣＧＧＡＡＣ−３′および５′−ＧＴＴＣＣＧＡＣＴ−３′によって形成させることができる。プローブトリプレットのための星形構造は、プローブ対のための星形構造と同一であるが、例えば星形構造５′−ＡＧＴＣＧＧＡＡＣ−３′は、２つの上流プローブ中に含まれており、一方で星形構造５′−ＧＴＴＣＣＧＡＣＴ−３′は、唯一使用される下流プローブ中にのみ存在する。
【００１５】
本発明によれば、１つのプローブまたは２つのプローブは、５′末端および/または３′末端で標識を有する。標識として、例えば蛍光染料および/または消光剤染料は、使用されてよい。１つのプローブを３′末端でおよび別のプローブを５′末端でそれぞれ供与体染料および受容体染料で標識することも可能である。
【００１６】
それによって、ＦＲＥＴをベースとする数多くの検出方法に適しており、ヘテロポリマー標的配列を測定するための二重構造の形成の欠点を、プローブ−標的−複合体１個当たり２つまでの測定インパルスを発生させることができ、３′ＯＨ阻止が不要であり、ならびに「隣接ハイブリダイゼーションプローブ」法の欠点を十分に排除することによって排除し、今や、プローブハイブリダイゼーションのために保存された短いゲノム区間を利用可能にする、全般的に使用することができる確実なプローブ形式が開発されたが、このことは、殊に極めて変動可能な標的配列の検出を改善する。
【００１７】
プローブ対の本発明による製造法は、次の工程：
公知であるかまたは公知でない、特に１５〜４０個の塩基長の、標的に適合しうるオリゴヌクレオチド−プローブ配列を２つの部分プローブ配列に分解する工程、
部分プローブ配列を、それぞれプローブ対のプローブ間に星形構造を形成する、請求項８記載の部分配列で補充する工程、
測定可能で、特に定量化可能な信号を発生させることができる複合体のリガンド、分子または原子を化学結合する工程（標識）を含む。
【００１８】
特に、標的にハイブリダイズする部分プローブ配列は、互いに同じＴm値を有し、ならびにプローブ対のプローブは、それぞれ同じＴm値を有する。
【００１９】
標的核酸または核酸類似体（標的）を検出するための本発明による方法および本発明によるプローブは、同様に本発明の対象である試験キットに使用される。この試験キットは、少なくとも１つの本発明による標識したプローブ対またはプローブトリプレット、特異的なプライマーの少なくとも１つのセット、少なくとも１つのヘテロポリマー標的配列ならびに当業者に公知の所属する試薬セットを含む。付加的に、この試験キットは、なお少なくとも１つの酵素を含むことができる。
【００２０】
本発明によるプローブ対またはプローブトリプレットおよび/または標的核酸を検出するための方法および/または本発明による試薬セットは、任意のヘテロポリマー標的核酸または核酸類似体の定性的検出および/または定量的検出に適しているかまたは任意の遺伝的多形の検出に適している。
【００２１】
発明の原理
発明の原理は、図１に示されている。本発明によるプローブ対は、２つのプローブからなり、この場合には、それぞれ個々のプローブは、常に、２つの異なる機能的な配列区間、即ち標的配列の相補的なプローブ区間とプローブ対のそれぞれ所属する第２のプローブに対して星形構造を形成するプローブ区間とからなる。選択された反応条件下では、プローブの十分なハイブリダイゼーションは、プローブ対にだけ可能であるが、しかし、個別のプローブには不可能である。個別のプローブを使用する実験は、当該プローブが短縮されたハイブリダイゼーション領域にも拘わらず標的に結合し、酵素的に加水分解もされるが、しかし、明らかに僅かな蛍光信号（プローブ対と比較して最大５０％）だけを反応の飽和段階でもたらすことが判明した。
【００２２】
特に蛍光染料および/または消光剤染料での標識のために、プローブ対１個あたり、Ｍ１〜Ｍ４と呼称される、少なくとも４つの座が存在する。１つの好ましい種類の形式において、プローブ１またはプローブ２、またはプローブ１およびプローブ２は、それぞれ１つまたは２つのリポーター染料、例えばフルオレセイン染料またはローダミン染料ＦＡＭ、ＶＩＣ、ＪＯＢ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ヤキマイェロー（Yakima Yellow）、ＲＯＸ、Ｃｙ３、Ｃｙ５またはＤＹＸＬ、および１つまたは２つの消光剤染料、例えばＴＡＭＲＡ、ＤＡＢＣＹＬ、ＤＡＢＳＹＬ、エレクエンチャー（ElleQuencher）またはダークエンチャー（DarkQuencher）で標識されている。更に、好ましい種類の形式において、２つのプローブは、特に星形構造の領域（Ｍ２＋Ｍ３）内でそれぞれ供与体染料および受容体染料、例えばフルオレセイン、ＬＣＲｅｄ６４０またはＬＣＲｅｄ７０５で標識されている。第１表には、標識のための若干の組合せの可能性が示されている。
【００２３】
プローブ対の開発は、それぞれ選択された増幅系に適合する公知のオリゴヌクレオチド−プローブ配列、例えばＴａｑＭａｎプローブを、特に同じＴm値を有する２つの部分プローブ配列に分解し、この部分プローブ配列を、後の星形構造を形成する、適当な相補的部分配列に補充することにより行なわれる。プローブ対の製造は、常用のオリゴヌクレオチド固定相合成の当業者に公知の方法および引続く有利に使用される発色団リガンドの化学結合により行なわれる。
【００２４】
【表１】
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【００２５】
意外なことに、プローブ対を使用する場合には、公知技術水準の別のプローブ形式とは異なり、本発明によりプローブ対のプローブ１ならびにプローブ２には、３′ＯＨ阻止が必要であることが判明した。
【００２６】
１つの可能な形の使用は、当業者に公知の酵素的反応、例えばポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）における本発明によるプローブ対の使用である。
【００２７】
従って、本発明の本質は、公知の要素と新規の解決法との組合せにあり、これら公知の要素と新規の解決法は、相互に影響を及ぼし、新規の全作用において好ましい使用および得ようと努められた成果を生じ、この場合この成果は、任意に選択された核酸を感応的に均一に検出するためまたは生物学的物質中の任意の遺伝的多形を検出するための、標的配列を有する三重構造を構成するプローブ対を提供することにある。本発明によるプローブ対の使用は、特に生物学的試験物質中の標的配列ＤＮＡまたはＲＮＡの確認され標準化された検出のための使用であり、この場合個々のオリゴヌクレオチド、殊にプローブおよびプライマーは、当該系から別々に放出されてＰＣＲに依存しない酵素的増幅反応のために利用可能であってもよいし、場合には、別の検出技術に関連して利用可能であってもよい。
【００２８】
プローブトリプレットは、常に、野生型の特異的プローブと、プローブ特異的に２つの区別可能なリポーター染料（Ｒ１およびＲ２）および消光剤染料（Ｑ）で標識されている突然変異特異的なプローブと、野生型の特異的プローブならびに突然変異特異的なプローブと一緒に星形構造を形成する、標識されていないプローブとからなる。Ｒ１プローブまたはＲ２プローブの純粋な信号は、常に、検出すべき対立遺伝子がホモ接合的に野生型または突然変異体としてプローブ中に存在する場合にのみ検出可能である。これとは異なり、Ｒ１信号およびＲ２信号が同時に測定可能である場合、この測定可能であることは、ヘテロ接合的に対立遺伝子の組合せ、即ちプローブ中の野生型対立遺伝子および突然変異対立遺伝子のそれぞれの存在に対して言えることである。
【００２９】
図３〜８：Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を定量的ＰＣＲ（２Ｓ）により表面抗原遺伝子の配列区間に亘って測定するための本発明によるプローブ対の使用。同一の標的配列を使用しての類似の定量的ＴａｑＭａｎプロトコル（２Ｔ）との妥当性の比較。
【００３０】
２Ｓ１：本発明によるプローブ対を利用してのＨＢＶ標準ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅、飽和曲線。
【００３１】
２Ｓ２：本発明によるプローブ対を利用してのＨＢＶ標準ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅、標準参照曲線、傾き＝−３．４９８；切片＝４５．０２８、Ｒ２＝０．９９７．
２Ｓ３：本発明によるプローブ対を利用しての、先にＤＮＡが精製された臨床的ＨＢＶプローブのリアルタイムＰＣＲ増幅。
【００３２】
２Ｔ１：比較可能なＴａｑＭａｎプロトコルを利用してのＨＢＶ標準ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅、飽和曲線。
【００３３】
２Ｔ２：比較可能なＴａｑＭａｎプロトコルを利用してのＨＢＶ標準ＤＮＡのリアルタイムＰＣＲ増幅、標準参照曲線、傾き＝−３．２０９；切片＝４０．０４６、Ｒ２＝０．９９９。
【００３４】
２Ｔ３：比較可能なＴａｑＭａｎプロトコルを利用しての、先にＤＮＡが精製された臨床的ＨＢＶプローブのリアルタイムＰＣＲ増幅、飽和曲線。
【００３５】
ゲノムＤＮＡ中での第Ｖ因子（ＦＶ）ライデン突然変異の診断。
【００３６】
突然変異１６９１Ｇ→Ａの前類型化されたＤＮＡプロバンドプローブのための２つ（ヘテロ接合のｗｔプローブ、ホモ接合のｗｔプローブ）を本発明による方法を使用して実施例４により類型化した。ヘテロ接合のＤＮＡプロバンドプローブ（プローブ１）は、本発明によれば、ＦＡＭ（図９）中ならびにＪＯＢ（ＹＹ）チャンネル（図１０）中でＳ状飽和曲線（波線で描いた曲線）をもたらした。これは、プローブ１中にヘテロ接合の対立遺伝子の組合せが存在すること、即ち野生型対立遺伝子および突然変異対立遺伝子がそれぞれ存在することを証明する。これとは異なり、専らプローブ２のためのＦＡＭチャンネル中のＳ状の蛍光信号の測定は、プローブ２中に野生型対立遺伝子の組合せが存在すること、即ち２つの野生型対立遺伝子が存在することを証明する。
【００３７】
実施例
実施例１：表面抗原の配列区間上のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、ＨＢｓＡＧ遺伝子、を定量的ＰＣＲにより測定するための本発明によるプローブ対
使用されるオリゴヌクレオチド（遺伝子バンク受け入れ番号Ｍ２０９１９）：
2008532534.tif 000004
【００３８】
Ｔm値をオリゴプライマー分析ソフトウェア（Oligo Primer Analysis Software）バージョン６．２３（Molecular Biology Insights, Inc.）を用いて％ＧＣ規則により計算した。下線を引いた配列は、本発明によるプローブ対のそれぞれ相補的な、ステムを形成する区間を表わす。
【００３９】
増幅：
配列番号Ｎｏ．１および配列番号Ｎｏ．２により増幅された、ＨＢｓＡｇ遺伝子の領域は、長さ７３ｂｐの増幅産物（Amplicon）を生じた。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システムでの本発明によるプローブ対をリアルタイムＰＣＲ増幅に使用するために、ＰＣＲバッチ量２５μｌに次の最適化されたプロトコルを使用した（第２表）：
【表２】
2008532534.tif 000005
【００４０】
【表３】
2008532534.tif 000006
【００４１】
第２表からの試薬を最初にマスターミックスに添加して１２ＰＣＲバッチ量に対して十分に攪拌した。マスターミックスの２５μｌのアリコートを種々の濃度の標準ＨＢＶ−ＤＮＡで被覆された８個の反応容器（Roboscreen,ドイツ連邦共和国特許第１９８４０５３１号明細書）中ならびに標準ＨＢＶ−ＤＮＡで被覆されていない反応容器（ＰＣＲ空試験値）中にピペットで注入した。使用された標準の濃度は、第３表に示されている。ＰＣＲ産物の増幅および検出は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システム（Applied Biosystems社）を利用してリアルタイムに行なわれた。次のサーモプロファイルを選択した：
初期変性  ９５℃  １０：００分、
４０回のサイクル（３ステップＰＣＲ）  変性  ９５℃  ００:３０分、
急冷  ４５℃  ００：１１分、
拡張  ５７℃  ０１:１５分。
【００４２】
結果：
ＰＣＲ空試験値は、指数的な増幅信号をもたらさなかった、即ち検出系の汚染は、存在しなかったが、全ての標準ＨＢＶ−ＤＮＡで被覆された反応容器中で飽和曲線の形の望ましい増幅信号を検出することができた（図２  Ｓ１）。当該曲線の評価は、評価パラメーターの上昇（傾き）、縦座標経過（切片）および線形回帰（Ｒ２）に関連して当業者に公知の期待値に相当する標準参照曲線（図２Ｓ２）の形成を可能にした。当該データーは、実施例２で使用され確立されたＴａｑＭａｎ法と定性的に比較可能である（実施例１、図２Ｔ１および２Ｔ２）。
【００４３】
実施例２：表面抗原の配列区間上のＢ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）、ＨＢｓＡＧ遺伝子、を定量的ＰＣＲにより測定するためのＴａｑＭａｎ法
配列番号Ｎｏ．１および配列番号Ｎｏ．２（実施例１）以外に使用されるオリゴヌクレオチド（遺伝子バンク受け入れ番号Ｍ２０９１９）：
2008532534.tif 000007
【００４４】
Ｔm値をオリゴプライマー分析ソフトウェア（Oligo Primer Analysis Software）バージョン６．２３（Molecular Biology Insights, Inc.）を用いて％ＧＣ規則により計算した。
【００４５】
増幅：
配列番号Ｎｏ．１および配列番号Ｎｏ．２により増幅された、ＨＢｓＡｇ遺伝子の領域は、長さ７３ｂｐの増幅産物（Amplicon）を生じた。ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システムでの配列番号Ｎｏ．５による増幅産物（Amplicon）をリアルタイムに検出するために、ＰＣＲバッチ量２５μｌに次の最適化されたプロトコルを使用した（第４表）：
第４表からの試薬を最初にマスターミックスに添加して１２ＰＣＲバッチ量に対して十分に攪拌した。マスターミックスの２５μｌのアリコートを種々の濃度の標準ＨＢＶ−ＤＮＡで被覆された８個の反応容器（Roboscreen,ドイツ連邦共和国特許第１９８４０５３１号明細書）中ならびに標準ＨＢＶ−ＤＮＡで被覆されていない反応容器（ＰＣＲ空試験値）中にピペットで注入した。使用された標準の濃度は、第３表に示されている。ＰＣＲ産物の増幅および検出は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システム（Applied Biosystems社）を利用してリアルタイムに行なわれた。次のサーモプロファイルを選択した：
【表４】
2008532534.tif 000008
【００４６】
初期変性  ９５℃  １０：００分、
４０回のサイクル（２ステップＰＣＲ）  変性  ９５℃  ００:１５分、
急冷／拡張  ５９℃  ０１:１５分。
【００４７】
結果：
ＰＣＲ空試験値は、指数的な増幅信号をもたらさなかった、即ち検出系の汚染は、存在しなかったが、全ての標準ＨＢＶ−ＤＮＡ被覆された反応容器中で飽和曲線の形の望ましい増幅信号を検出することができた（図２  Ｔ１）。当該曲線の評価は、評価パラメーターの上昇（傾き）、縦座標経過（切片）および線形回帰（Ｒ２）に関連して当業者に公知の期待値に相当する標準参照曲線（図２Ｔ２）の形成を可能にした。
【００４８】
実施例３  ＨＢＶウィルスを含む臨床学的プローブによる本発明による方法と確立されたＴａｑＭａｎ法との実際の比較
臨床学的プローブ：
臨床学的ＨＢＶ陽性プローブとして、ポール−エールリッヒ−インスティテュート（Paul-Ehrlich-Institut）のＨＢＶ参照血漿（５００００ＩＵ／ｍｌ（Lot#1872/01、ゲノタイプＤ、サブタイプａｙｗ2/3））を使用した。このプローブをＨＢＶの健康な献血者のＨＢＶ陰性血漿で１０００ＩＵ／ｍｌに希釈した。陰性対照として、ＨＢＶ陰性血漿を使用した。
【００４９】
臨床学的プローブからの核酸の精製：
ＨＢＶ陽性プローブおよび陰性対照からのＤＮＡの精製のために、ＲＴＦ（登録商標）ＤＮＡ／ＲＮＡウィルスミニキット（Virus Mini Kit）（Roboscreen GmbH社）を製造業者の記載に従い使用した。抽出をＨＢＶ陽性血漿およびＨＢＶ陰性血漿それぞれ２００μｌずつからなる３倍のバッチ量中で行なった。精製されたＤＮＡの溶出をキット中に含まれている溶出緩衝液それぞれ６０μｌずつで行なった。
【００５０】
増幅：
配列番号Ｎｏ．１および配列番号Ｎｏ．２により増幅された、ＨＢｓＡｇ遺伝子の領域は、長さ７３ｂｐの増幅産物（Amplicon）を生じた。ＨＢＶコピーを本発明による方法およびＴａｑＭａｎ対照法により「リアルタイム」に定量化するために、実施例１および２に記載されたプロトコルを使用した。マスターミックスを第５表に提示された記載と同様に製造した。
【００５１】
第５表中の試薬を最初にマスターミックスに添加して１３ＰＣＲバッチ量に対して十分に攪拌し、２０μｌのアリコートで相応する数（それぞれ１２）の０．２ｍｌのＤＮＡ試料用反応容器（Roboscreen社）中にもたらした。ＨＢＶ陽性臨床学的プローブおよびＨＢＶ陰性臨床学的プローブを、２つの比較可能な方法でそれぞれ二重の測定で増幅し、即ち同一のプローブ（１０００ＩＵ／ｍｌ）を利用して方法ごとにそれぞれ６つの同一のＰＣＲバッチ量を製造した。ＰＣＲ産物の増幅および検出は、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ７０００配列検出システム（Applied Biosystems社）を利用してリアルタイムに行なわれた。サーモプロファイルを実施例１（プローブ対）および実施例２（ＴａｑＭａｎ）の記載と同様に選択した。
【００５２】
【表５】
2008532534.tif 000009
【００５３】
結果：
陰性対照およびＰＣＲ空試験値（ＰＣＲバッチ量中の精製されたＨＢＶ−ＤＮＡプローブの代わりにＰＣＲグレードＨ2Ｏ５μｌ）は、指数的な増幅信号をもたらさなかった、即ち検出系の汚染は、存在しなかったが、全てのＨＢＶ陽性プローブは、本発明による方法（図２Ｓ２）ならびにＴａｑＭａｎ比較法により明らかに増幅可能であった（図２Ｔ３）。定量的な分析（第６表）は、本発明によるプローブ対でのＨＢＶコピーの検出がＴａｑＭａｎ法と比較して約３３％だけ著しく効果的に行なわれた（１０００ＩＵ／ｍｌの平均４１７と比較して１０００ＩＵ／ｍｌの平均７４４）ことを示した。このための原因は、故障し易いとして公知のＴａｑＭａｎ法と比較して本方法のよりいっそう高い頑強さにある。
【００５４】
【表６】
2008532534.tif 000010
【００５５】
実施例４：本発明による方法を用いてのアンチセンスストランド上での第Ｖ因子ライデン多形（１６９１  Ｇ→Ａ）の検出
使用されるオリゴヌクレオチド（遺伝子バンク受け入れ番号Ｚ９９５７２）：
2008532534.tif 000011
＊プローブ対中のｍｔ／ｗｔ選択的塩基交換
【００５６】
臨床学的プロバンドプローブとして、保証された血栓検査キット（Thtombo-Check Kit）（Dia Tech s.r.I.社, イタリア国）による、第Ｖ因子（ＦＶ）ライデン突然変異（Ｇ→Ａ）の類型化されたヘテロ接合の遺伝子型を有する合成ＤＮＡ（プローブ１）およびｗｔ対立遺伝子キャリヤーとして前類型化されたプロバンドの精製されたＤＮＡ（プローブ２）を使用した。
【００５７】
臨床学的プローブからの核酸の精製：
プロバンドプローブからの化学的核酸抽出をChromczynskiによるＤＮＡｚｏｌ試薬（Chomczynski P. et. al., Bio Techniques 1997; 22: 550-553）により行なった。前記の合成ＤＮＡおよび前記プロバンドプローブからの、ＰＣＲ純粋なＨ2Ｏで１：１０で希釈されたゲノムＤＮＡから、ＰＣＲ反応ごとにそれぞれ２μｌを使用した。この反応に二重測定でピペット注入を行なった。
【００５８】
増幅：
配列番号Ｎｏ．６および配列番号Ｎｏ．７により増幅された、ヒトの凝固第Ｖ因子遺伝子の領域は、長さ１１８ｂｐの増幅産物（Amplicon）を生じた。本発明方法による、ＤＮＡ対向ストランド（即ち、Ｃ→Ｔ交換）に対する、第Ｖ因子ライデン突然変異１６９１Ｇ→Ａの「リアルタイム」の遺伝子の類型化には、次のプロトコルを使用した。マスターミックスを第７表に提示された記載と同様に製造した。
【００５９】
【表７】
2008532534.tif 000012
【００６０】
第７表からの試薬を最初にマスターミックスに添加してＰＣＲバッチ量に対して十分に攪拌した。前記のマスターミックスのアリコート２５μｌを相応する反応容器中にピペットで注入した。ＰＣＲ産物の増幅および検出をRotor-Gene 3000「リアルタイム」ＰＣＲ機器（Corbett Research社）を利用しながら「リアルタイム」に行なった。次のサーモプロファイルを選択した：
初期変性  ９５℃  １０：００分、
４５回のサイクル（３ステップＰＣＲ）  変性  ９５℃  ００:１５分、
急冷  ４５℃  ００：０１分、
拡張  ５９℃  ００:４０分。
【００６１】
結果：
図９および１０からは、本発明による方法がゲノムＤＮＡ中で第Ｖ因子ライデン突然変異１６９１  Ｇ→Ａを診断するために適していることを確認することができる。許容された試験キットによる突然変異１６９１Ｇ→Ａに関連しての前類型化されたＤＮＡプロバンドプローブ（ヘテロ接合のｗｔプローブ、ホモ接合のｗｔプローブ）を、本発明による方法を使用して明らかに一致するように類型化した。ＦＡＭ（図９）中ならびにＹＹチャンネル（図１０）中での指数的な蛍光信号の測定は、プローブ１中にヘテロ接合の対立遺伝子の組合せが存在すること、即ち野生型対立遺伝子および突然変異対立遺伝子がそれぞれ存在することを証明する。専らＦＡＭチャンネル中での蛍光信号の測定（図９）は、プローブ２中に野生型対立遺伝子の組合せが存在すること、即ち２つの野生型対立遺伝子が存在することを証明する。
【００６２】
更に、この結果は、既に上流プローブ中の重要な位置での不適正さ（例えば、プローブの５′末端の位置３でのＴ→Ｃ交換）が野生型対立遺伝子と突然変異対立遺伝子との間の選択性を許容することを示す。
【００６３】
定義
標識したオリゴヌクレオチド：
当業者であれば、標識したオリゴヌクレオチドとは本発明の実施に適した１つ以上の標識を有する核酸または核酸類似体であることを理解する。標識は、測定可能、特に定量化可能な信号を発生させることができる全ての分子または原子である。標識は、定義に対して、測定信号を蛍光、放射能、測色、重量測定、Ｘ線回折の形かまたは吸収、磁力、酵素活性または比較可能性の形で発生させる状態にあってよい。標識は、酵素基質、放射能原子、蛍光染料、発色団、化学発光化合物、電気化学発光化合物、特異的な結合パートナーを有するリガンドを含めて、これに限定されるものではないが、標識反応に必要とされる方法を含むか、或いは他の標識リガンドと相互作用しうる全ての別の種類の標識を含み、それによって測定信号の強化、減少または変化を実現させる。特に、例えばＰＣＲの場合に使用されるような高い温度でも安定性が維持されるような標識が使用される。
【００６４】
標的核酸（標的）
「標的核酸」、「標的」または「標的配列」の概念は、増幅されるか、検出されるか、或いは増幅されかつ検出される、ヘテロポリマー核酸または核酸類似体の配列区間に関連する。
【００６５】
上流プローブ：
プローブ対の上流プローブは、本明細書中で標的の３′末端に隣接している標的の部分配列に対して部分的な相補性を有するヘテロポリマー核酸または核酸類似体である。
【００６６】
下流プローブ：
プローブ対の下流プローブは、本明細書中で標的の５′末端に隣接している標的の部分配列に対して部分的な相補性を有するヘテロポリマー核酸または核酸類似体である。
【００６７】
三重構造：
本発明の範囲内の三重構造は、２つのヘテロポリマー一本鎖オリゴヌクレオチドプローブまたはオリゴヌクレオチド類似プローブならびに１つの一本鎖標的とから複合体であり、この場合には、プローブと標的との間ならびに互いにプローブの間でハイブリダイズ、即ち相補的塩基間での水素架橋結合の形成を生じる。
【００６８】
星形構造：
星形構造は、専らプローブ対のプローブ間で形成される三重構造内のハイブリダイズ構造のための特殊な呼称である。
【００６９】
プローブの最適なハイブリダイゼーション：
標的に対するプローブの最適なハイブリダイゼーションとは、複合体が本発明による方法を明細書の記載により実施することができるように安定性を有する形でのプローブ対と標的との間の複雑な三重構造の構成のことである。
【００７０】
十分な相補性：
プローブ対のプローブ間での十分な相補性ならびにプローブ対と標的との間の十分な相補性は、本発明による方法を実施するためにプローブ対と標的との間で安定した複合体が形成される場合に存在する。
【００７１】
３′−ＯＨ阻止：
均一な検出法に組み入れられた、プローブとして機能するオリゴヌクレオチドは、公知技術水準によれば、特にプライマーの性質を有しない、即ちプローブの３′末端は、プローブがプライマー拡張生成物（増幅産物（Amplicon））中に組み込まれることを阻止するために「ブロック化」されている。「ブロック化」は、非相補的塩基がプローブの３′末端に懸吊されるかまたは化学基、例えばビオチンまたはホスフェート基が最後のヌクレオチドの３′ヒドロキシルに結合されることにより達成される。更に、ブロック化は、３′−ＯＨが除去されるかまたは一般に３′−ＯＨを欠失しているヌクレオチド、例えばジデスオキシヌクレオチドが使用されることにより達成されうる。
【００７２】
Ｔm値：
ハイブリダイズする核酸重複（Nukleinsaeureduplizes）の安定性は、溶融温度または「融解温度」（Ｔm）につき測定される。特異的な核酸重複構造のＴmは、重複体内での塩基対の５０％が解離して存在する温度である。
【００７３】
ヘテロポリマー標的配列：
ヘテロポリマー標的配列は、天然の配列、例えばゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡに相当するか、或いは半合成または合成に由来する、任意の順序の塩基または塩基類似体を有する任意の標的である。
【００７４】
ヘテロポリマープライマー対：
ヘテロポリマープライマー対は、任意の順序の塩基または塩基類似体を有する任意のオリゴヌクレオチドの１対であり、当該オリゴヌクレオチドの１対は、天然に由来するか或いは半合成または合成の標的配列を有するか、或いは合成により製造され、天然配列、例えばゲノムＤＮＡまたはＲＮＡ、ｃＤＮＡに対して特異性を有する。プライマーは、当該プライマーが標的核酸に対して相補的プライマー拡張生成物の合成を許容するような触媒条件下で使用される場合に、長い相補的核酸ストランドの合成のための開始位置として使用される。同時に種々のデソキシリボヌクレオシドトリホスフェートおよび重合を誘発する薬剤、例えばＤＮＡポリメラーゼまたは逆転写酵素、適当なｐＨ、補助因子およびイオン強度を有する緩衝液、ならびに適当な反応温度が存在する場合に、前記条件は存在する。
【００７５】
不適正さ：
不適正さは、２つのハイブリダイズされた核酸間の少なくとも１つの塩基欠陥対である。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】本発明によるプローブ対の機能原理を示す略図。
【図２】遺伝的多形を検出するための本発明によるプローブトリプレットの機能原理を示す略図。
【図３】Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を定量的ＰＣＲ（２Ｓ）により表面抗原遺伝子の配列区間に亘って測定するための本発明によるプローブ対の使用に関連して、同一の標的配列を使用しての類似の定量的ＴａｑＭａｎプロトコル（２Ｔ）との妥当性の比較を示す線図。
【図４】Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を定量的ＰＣＲ（２Ｓ）により表面抗原遺伝子の配列区間に亘って測定するための本発明によるプローブ対の使用に関連して、同一の標的配列を使用しての類似の定量的ＴａｑＭａｎプロトコル（２Ｔ）との妥当性の比較を示す線図。
【図５】Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を定量的ＰＣＲ（２Ｓ）により表面抗原遺伝子の配列区間に亘って測定するための本発明によるプローブ対の使用に関連して、同一の標的配列を使用しての類似の定量的ＴａｑＭａｎプロトコル（２Ｔ）との妥当性の比較を示す線図。
【図６】Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を定量的ＰＣＲ（２Ｓ）により表面抗原遺伝子の配列区間に亘って測定するための本発明によるプローブ対の使用に関連して、同一の標的配列を使用しての類似の定量的ＴａｑＭａｎプロトコル（２Ｔ）との妥当性の比較を示す線図。
【図７】Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を定量的ＰＣＲ（２Ｓ）により表面抗原遺伝子の配列区間に亘って測定するための本発明によるプローブ対の使用に関連して、同一の標的配列を使用しての類似の定量的ＴａｑＭａｎプロトコル（２Ｔ）との妥当性の比較を示す線図。
【図８】Ｂ型肝炎ウィルス（ＨＢＶ）を定量的ＰＣＲ（２Ｓ）により表面抗原遺伝子の配列区間に亘って測定するための本発明によるプローブ対の使用に関連して、同一の標的配列を使用しての類似の定量的ＴａｑＭａｎプロトコル（２Ｔ）との妥当性の比較を示す線図。
【図９】ゲノムＤＮＡ中での第Ｖ因子（ＦＶ）ライデン突然変異の診断に関連して、ヘテロ接合のＤＮＡプロバンドプローブ（プローブ１）がＪＯＢ（ＹＹ）チャンネル（図１０）中でもたらしＳ状飽和曲線を示す線図。
【図１０】ゲノムＤＮＡ中での第Ｖ因子（ＦＶ）ライデン突然変異の診断に関連して、ヘテロ接合のＤＮＡプロバンドプローブ（プローブ１）がＪＯＢ（ＹＹ）チャンネル（図１０）中でもたらしたＳ状飽和曲線を示す線図。
【図１】
2008532534.tif 000013
【図２】
2008532534.tif 000014
【図３】
2008532534.tif 000015
【図４】
2008532534.tif 000016
【図５】
2008532534.tif 000017
【図６】
2008532534.tif 000018
【図７】
2008532534.tif 000019
【図８】
2008532534.tif 000020
【図９】
2008532534.tif 000021
【図１０】
2008532534.tif 000022
【国際調査報告】
2008532534.tif 000023
2008532534.tif 000024
2008532534.tif 000025
2008532534.tif 000026
2008532534.tif 000027
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