(57)【要約】質量分析法による、一つ以上のホルモンを同時または系列分析するための方法、システムおよびキットを開示する。本方法は、最小限のサンプル量と最小限の調製時間を提供する。本方法は、ホルモンのイオン化および質量分析法によるホルモン分析からなる。さらに、エレクトロスプレー源を使用したネガティブモードにおける遊離サイロキシン（ＦＴ４）および遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ３）ホルモンのイオン化からなる、（ＦＴ４）および（ＦＴ３）ホルモンの同時または系列分析するための方法、システムおよびキットを開示する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遊離サイロキシン（ＦＴ４）ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析のための方法であって、
（ａ）ＦＴ４ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルを提供するステップと、
（ｂ）ＦＴ４ホルモンを前記サンプルから分離するステップと、
（ｃ）ＦＴ４ホルモンを収集するステップと、
（ｄ）質量分析計を使用してＦＴ４ホルモンを分析するステップと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記サンプルからＦＴ４ホルモンを分離する前記ステップは、液体クロマトグラフ法、限外濾過装置を使用した遠心分離法、平衡透析法および前述の組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記サンプルからＦＴ４ホルモンを分離する前記ステップは、約３０，０００ＭＷのメッシュサイズを使用した限外濾過装置の使用を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルからＦＴ４ホルモンを分離する前記ステップは、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ  ＹＭ−３０ＴＭ限外濾過装置の使用を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＦＴ４ホルモンは、約２５℃で約１時間の遠心分離法により分離される、請求項３または４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
ＦＴ４ホルモンを含むかまたは含むと考えられる前記サンプルは、血液、血漿、血清、尿および唾液、またはそれらの任意の組み合わせから選択される生物学的サンプルから得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記生物学的サンプルが、血液である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的サンプルが、血漿である、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的サンプルが、血清である、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的サンプルが、尿である、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記生物学的サンプルが、唾液である、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
ＦＴ４ホルモンを含むかまたは含むと考えられる前記サンプルの量は、少なくとも約５００μＬである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サンプルから前記ＦＴ４ホルモンを分離する前記ステップは、オンライン抽出および内蔵された切替え弁をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計は、エレクトロスプレーイオン源を備える、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
質量分析計を使用した前記ＦＴ４ホルモンを分析する前記ステップは、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化および電子捕獲イオン化から選択されるイオン化技術を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記イオン化技術は、エレクトロスプレーイオン化である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記イオン化は、ネガティブモードで実施される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
質量分析計を使用した前記ＦＴ４ホルモンを分析する前記ステップは、多重反応のモニタリングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
質量分析計を使用した前記ＦＴ４ホルモンを分析する前記ステップは、選択されたイオンのモニタリングを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
ＦＴ４ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの分析を指示する方法であって、請求項１に記載のステップ（ｂ）および（ｃ）に従い前記サンプルを調製するよう指示を与えることと、請求項１に記載のステップ（ｄ）に従い前記サンプルからのＦＴ４ホルモンを分析することを含む、方法。
【請求項２２】
遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ３）ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析のための方法であって、
（ａ）ＦＴ３ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルを提供するステップと、
（ｂ）ＦＴ３ホルモンを前記サンプルから分離するステップと、
（ｃ）ＦＴ３ホルモンを収集するステップと、
（ｄ）質量分析計を使用してＦＴ３ホルモンを分析するステップと、
を含む、方法。
【請求項２３】
前記サンプルからＦＴ３ホルモンを分離する前記ステップは、液体クロマトグラフ法、限外濾過装置を使用した遠心分離法、平衡透析法および前述の組み合わせから選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルからＦＴ３ホルモンを分離する前記ステップは、約３０，０００ＭＷのメッシュサイズを使用した限外濾過装置の使用を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルからＦＴ３ホルモンを分離する前記ステップは、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ  ＹＭ−３０ＴＭ限外濾過装置の使用を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＦＴ３ホルモンは、約２５℃で約１時間の遠心分離法により分離される、請求項２４または２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
ＦＴ３ホルモンを含むかまたは含むと考えられる前記サンプルは、血液、血漿、血清、尿および唾液、またはそれらの任意の組み合わせから選択される生物学的サンプルから得られる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２８】
前記生物学的サンプルが、血液である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記生物学的サンプルが、血漿である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記生物学的サンプルが、血清である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
前記生物学的サンプルが、尿である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
前記生物学的サンプルが、唾液である、請求項２７に記載の方法。
【請求項３３】
ＦＴ３ホルモンを含むかまたは含むと考えられる前記サンプルの量は、少なくとも約５００μＬである、請求項２２に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプルから前記ＦＴ３ホルモンを分離する前記ステップは、オンライン抽出および内蔵された切替え弁をさらに含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３５】
前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項２２に記載の方法。
【請求項３６】
前記液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計は、エレクトロスプレーイオン源を備える、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
質量分析計を使用した前記ＦＴ３ホルモンを分析する前記ステップは、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化および電子捕獲イオン化から選択されるイオン化技術を含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項３８】
前記イオン化技術は、エレクトロスプレーイオン化である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記イオン化は、ネガティブモードで実施される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
質量分析計を使用した前記ＦＴ３ホルモンを分析する前記ステップは、多重反応のモニタリングを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４１】
質量分析計を使用した前記ＦＴ３ホルモンを分析する前記ステップは、選択されたイオンのモニタリングを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項４２】
ＦＴ３ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの分析を指示する方法であって、請求項２２に記載のステップ（ｂ）および（ｃ）に従い前記サンプルを調製するよう指示を与えることと、請求項２２に記載のステップ（ｄ）に従い前記サンプルからのＦＴ３ホルモンを分析することを含む、方法。
【請求項４３】
ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析のための方法であって、
（ａ）ＦＴ４およびＦＴホルモン３を含むかまたは含むと考えられるサンプルを提供するステップと、
（ｂ）ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを前記サンプルから分離するステップと、
（ｃ）ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを収集するステップと、
（ｅ）質量分析計を使用してＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを分析するステップと、
を含む、方法。
【請求項４４】
前記サンプルは、血液、血漿、血清、尿および唾液、またはそれらの任意の組み合わせから選択される生物学的サンプルから得られる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記生物学的サンプルが、血液である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物学的サンプルが、血漿である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記生物学的サンプルが、血清である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記生物学的サンプルが、尿である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
前記生物学的サンプルが、唾液である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを含むかまたは含むと考えられる前記サンプルの量は、少なくとも約５００μＬである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記サンプルから前記ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを分離する前記ステップは、液体クロマトグラフ法、限外濾過装置を使用した遠心分離法、平衡透析法および前述の組み合わせから選択される、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記サンプルから前記ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを分離する前記ステップは、約３０，０００ＭＷのメッシュサイズを使用した限外濾過装置の使用を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５３】
前記サンプルから前記ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを分離する前記ステップは、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ  ＹＭ−３０ＴＭ限外濾過装置の使用を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンは、約２５℃で、約１時間、遠心分離法により分離される、請求項５２または５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記サンプルから前記ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを分離する前記ステップは、オンライン抽出および内蔵された切替え弁をさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５６】
前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項４３に記載の方法。
【請求項５７】
前記液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計は、エレクトロスプレーイオン源を備える、請求項４３に記載の方法。
【請求項５８】
質量分析計を使用した前記ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを分析する前記ステップは、光イオン化、エレクトロスプレーイオン化、大気圧化学イオン化および電子捕獲イオン化から選択されるイオン化技術を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項５９】
前記イオン化技術は、エレクトロスプレーイオン化である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記イオン化は、ネガティブモードで実施される、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
質量分析計を使用した前記ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを分析する前記ステップは、多重反応のモニタリングを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項６２】
質量分析計を使用した前記ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを分析する前記ステップは、選択されたイオンのモニタリングを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項６３】
前記ホルモンは、同時に分析される、請求項４３に記載の方法。
【請求項６４】
前記ホルモンは、連続して分析される、請求項４３に記載の方法。
【請求項６５】
前記サンプルは、同位体希釈タンデム質量分析法により分析される、請求項４３に記載の方法。
【請求項６６】
ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの分析を指示する方法であって、請求項４３に記載のステップ（ｂ）および（ｃ）に従いサンプルを調製するよう指示を与えることと、請求項４３に記載のステップ（ｅ）に従いＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを分析することを含む、方法。
【請求項６７】
ＦＴ４を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析のためのシステムであって、
（ａ）内標準を含む、前記サンプルからＦＴ４を分離するための試薬と、
（ｂ）質量分析計を使用してＦＴ４ホルモンを分析するための試薬と、
（ｃ）質量分析計と、
を含む、システム。
【請求項６８】
前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項６７に記載のシステム。
【請求項６９】
ＦＴ３を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析のためのシステムであって、
（ａ）内標準を含む、前記サンプルからＦＴ３を分離するための試薬と、
（ｂ）質量分析計を使用してＦＴ３を分析するための試薬と、
（ｃ）質量分析計と、
を含む、システム。
【請求項７０】
前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項６９に記載のシステム。
【請求項７１】
ＦＴ４を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析で用いるためのキットであって、
（ａ）前記サンプルからＦＴ４を分離するための試薬と、
（ｂ）質量分析計を使用してＦＴ４を分析するための試薬と、
（ｃ）ＦＴ４の溶液と、
（ｄ）質量分析計を使用してＦＴ４を分析するための指示書と、
を含む、キット。
【請求項７２】
ＦＴ３を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析で用いるためのキットであって、
（ａ）前記サンプルからＦＴ３を分離するための試薬と、
（ｂ）質量分析計を使用してＦＴ３を分析するための試薬と、
（ｃ）ＦＴ３の溶液と、
（ｄ）質量分析計を使用してＦＴ３を分析するための指示書と、
を含む、キット。
【請求項７３】
ＦＴ３およびＦＴ４を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分光分析で用いるためのキットであって、
（ａ）前記サンプルからＦＴ３およびＦＴ４を分離するための試薬と、
（ｂ）質量分析計を使用してＦＴ３およびＦＴ４を分析するための試薬と、
（ｃ）ＦＴ３およびＦＴ４の溶液と、
（ｄ）質量分析計を使用してＦＴ３およびＦＴ４を分析するための指示書と、
を含む、キット
【請求項７４】
ＦＴ３、ＦＴ４または双方のホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルを分析するための質量分析計の使用。
【請求項７５】
前記質量分析計は、液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計である、請求項７３に記載の使用。
【請求項７６】
前記質量分析計は、ＡＰＩ４０００ＴＭである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記質量分析計は、ＡＰＩ５０００ＴＭである、請求項２２〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記質量分析計は、ＡＰＩ５０００ＴＭである、請求項４３〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で使用されるセクションの表題は、組織上の目的のみであり、あらゆる方法において、記載されている内容を制限するものであると解釈されるものではない。
【０００２】
分野
本発明は、質量分析法による遊離サイロキシン（ＦＴ４）および遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ３）を分析するための方法およびキットに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ホルモンは、生物学上のメッセンジャーである。これらは、特異的な組織（腺）により合成され、血液中に分泌される。血液は、ホルモンが標的細胞の活動を変更するために作用する標的細胞にホルモンを運搬する。
【０００４】
ホルモンは、化学的に多様であり、一般的に、（１）例えばサイロキシンなどのアミノ酸から派生した小分子、（２）インスリンおよび甲状腺刺激ホルモンなどのポリペプチドまたはタンパク質、および（３）例えばステロイドなどのコレステロールから派生した分子、の主に３グループに分類される。
【０００５】
ホルモンの重要な種類は甲状腺ホルモンである。甲状腺ホルモンの例は、サイロキシン（Ｔ４）、遊離サイロキシン（ＦＴ４）、トリヨードサイロニン（Ｔ３）および遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ３）である。Ｔ４およびＴ３は、細胞に進入し、細胞内部の受容体と結合し、そこで、ミトコンドリアおよびミトコンドリア酵素を増加することにより細胞の代謝機能を増大する。Ｔ４およびＴ３は、成長および発達、糖代謝、酸素消費、タンパク質合成および胎児の神経発達を含む、数多くの生物学上の過程を調節するのに重要である。全ての循環しているＴ４およびわずかな割合で循環しているＴ３の合成は、甲状腺内に位置するサイログロブリン分子上で生じる。血中に存在するＴ３の大半は、濾胞細胞および標的組織［１］の細胞に存在する特異的な細胞内部脱ヨウ素酵素-酵素により、Ｔ４のモノ脱ヨウ素化を介して酵素的に生成される。健康なヒト被験者から採取した血清において、全Ｔ４は、全Ｔ３より約６０倍高い濃度で存在する。Ｔ４は、活性ホルモンであるＴ３生成のための貯蔵所としてのホルモン前駆体として作用する。甲状腺ホルモン（ＴＨ）と関連する代謝活動は、標的細胞内の特異的な核内受容体と結合するＴ３により開始される。血中の甲状腺ホルモン濃度は、甲状腺機能の診断において必要不可欠な試験である。
【０００６】
ステロイドは、もう一つの重要なホルモンの種類を形成する。ステロイドホルモンの例は、エストロゲン、プロゲステロンおよびテストステロンを含む。エストロゲンは、主にエストロン、エストラジオールおよびエストリオールの三種類があるホルモン群の名称である。エストロゲンおよびプロゲステロンは、女性の二次性徴の発達をもたらし、生殖機能を発達させ、維持する。テストステロンは、男性の二次性徴を発達させ、維持し、精子の成長および形成を促進する。ステロイドは、標的細胞に進入し、細胞内部の受容体と結合した後、ステロイドにより誘発される変化を顕在化させるタンパク質のためにｍＲＮＡコーディングの生成を促す。
【０００７】
ホルモンの正確な分析および定量化は、より重要になっている。例えば、エストロゲンおよびエストロゲンの様な化合物は、ホルモン補充療法を通して現在の社会において、今までになく増大した役割を担っている。また、エストロゲンおよびエストロゲン様化合物の分析および定量化は、乳癌のようなエストロゲンに関連した疾患の治療に役立つ。さらに、Ｔ４およびＴ３の正確な分析および定量化は、当該分野に精通した者により認識される問題である。全Ｔ４およびＴ３イムノアッセイ（「ＩＡ」）に干渉する循環しているヨードサイロニン結合自己抗体の存在は、既知の現象である［２］、［３］、［４］。これらの自己抗体は、使用される検定の分離方法によるが、誤って高いまたは低い甲状腺ホルモン測定値を出す可能性があり、しばしば、臨床的特徴と一致しない［２］、［３］、［４］。血清遊離Ｔ４およびＴ３（ＦＴ４およびＦＴ３）測定は、そのような異常結合を補う一方法である。しかし、技術的に、遊離ホルモン濃度を測定するのは、濃度が非常に低いため難しい。全（遊離およびタンパク質結合）甲状腺ホルモンを測定するのは容易である。全ホルモン濃度は、ナノモルレベルで測定される一方、遊離ホルモン濃度は、ピコモルで測定され、有効であり、非常に高い全ホルモン濃度のため干渉されない。
【０００８】
現在、一般的なホルモンの分析方法は、イムノアッセイ技術である。表１は一般的なホルモンおよび現在のそれらの分析方法を挙げている。
【０００９】
例えば、エストリオールは、サンプル中の標識されていないエストリオールと競合で、放射標識された抗原（ヨウ素１２５）を使用した放射性イムノアッセイにより、既知の抗体量において分析される。本測定法は、ガンマカウンターを使用して判定される。
【００１０】
アンドロステンジオンは、西洋わさびペルオキシダーゼを含む酵素イムノアッセイを使用して分析される。サンプル中の標識されていない抗原は、抗体結合部位の固定された数の酵素標識された抗原と競合する。本測定法は、マイクロタイタープレート酵素免疫測定読取装置を使用して判定される。
【００１１】
いくつかのホルモンは、現在、化学発光イムノアッセイを使用して分析される。例えば、プロゲステロン、テストステロン、コルチゾルおよびＴ３は、本方法を使用して分析される。本測定法は、測定法特異の抗体被覆ビーズを使用する。本測定法は、フォトンカウンターを使用して判定される。
【００１２】
しかし、以下の理由により、現在のイムノアッセイは不利である。
（１）イムノアッセイは一つのホルモンに特定され、よって、全てのホルモンは個別に分析されなければならない。
（２）数多くのキットを購入しなければならなく、その工程も、分析する各ホルモンに対して学ばなければならない。
（３）イムノアッセイの結果を読むための多様な装置を購入しなければならない。例えば、サンプルからのエストリオールおよびプロゲステロンの分析には、ガンマカウンターおよびフォトカウンターの双方が必要である。
（４）検定キットは高価な可能性がある。
（５）現在のイムノアッセイは、特異性に欠け、異なる製造会社からのキットを使用することにより、結果が約１５倍の差異を示す可能性がある［５］。
（６）工程は、多くの段階を含み、非常に多くの時間を必要とする。
（７）放射性イムノアッセイの場合、放射性同位元素が関与するため注意が必要である。
【００１３】
イムノアッセイは、特異性の欠如を指摘するより多くの文献が発表されるごとに、不確実であると酷評されている［６〜１３］。表２は、使用される様々な抗体の特異性における差異を明らかに示す、甲状腺ホルモン試験の熟達度において、アメリカ病理学会プログラムにより報告された主な差異を示す。例えば、アメリカ病理学会熟達度試験（ＣＡＰ  ＰＴ）プログラムで報告された異なる方法間の平均結果を示す表２は、約二つの要因により変動する。妊娠、エストロゲン治療またはタンパク質結合の遺伝子異常などの要因も、Ｔ４およびＴ３におけるイムノアッセイを診断学的に不確実にすると報告されている［２］、［３］、［１４］、［１５］。現在、血清全Ｔ４（ＴＴ４）、遊離Ｔ４（ＦＴ４）および遊離Ｔ３（ＦＴ３）濃度は、イムノアッセイにより、主に測定される。最近、高性能液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）、ガスクロマトグラフィー質量分析（ＧＣ−ＭＳ）、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）、タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によるＴ４およびＴ３の定量化測定の報告が、いくつか発表された［１６〜２０］。これらの全方法は、非常に時間がかかる抽出、誘導体化および前クロマトグラフ的分離さえ必要とする［２１］、［２２］。
【００１４】
つい最近まで、ホルモンは質量分析法により分析および定量化されていた。しかし、これらの方法にはいくつかの不都合な点がある。
【００１５】
例えば、エレクトロスプレータンデム質量分析を使用した尿テストステロンおよびジヒドロテストステロングルクロニドの分析方法が記述されている［２３］。本方法は、高性能液体クロマトグラフ法（ＨＰＬＣ）および３カラム、２切替え弁を備えた複合システムを必要とする。欠点は、（ｉ）ホルモングルクロニドは、分析されるが、ホルモンはされなかった、（ｉｉ）本方法は、尿にのみ適用される、（ｉｉｉ）二つの分析物しか同時に分析されない、（ｉｖ）テストステロンの検出限界（ＬＯＤ）が２００ｐｇｍｌ−１であり、ジヒドロテストステロンの定量化限界が１０ｕｇＬ−１であった、および（ｖ）本方法は複雑である、という点を含む。
【００１６】
他の出版物では、イオン捕捉ガスクロマトグラフ−タンデム質量分析法によるウシの血漿中のエストラジオールの判定方法を開示している［２４］。欠点は、（ｉ）一つの分析物のみしか分析されない、（ｉｉ）４ｍｌの血漿が一つの分析物の分析に必要である、（ｉｉｉ）検出限界が５ｐｇｍｌ−１である、および（ｉｖ）本方法はガスクロマトグラフ法を使用するため、誘導体化が必要とされる、という点を含む。
【００１７】
ＨＰＬＣエレクトロスプレーイオン化タンデム質量分析法により、乾燥血こんからの１７−ヒドロキシプロゲステロンの分析方法も、記述されている［２５］。しかし、本方法は、一回に一つの分析物しか分析できず、完全にサンプルを抽出するだけでも５０分かかる、重労働で時間のかかる、液−液抽出を必要とする。
【００１８】
テストステロンおよびジヒドロステロンの生成速度を分析するためのガスクロマトグラフ質量分析法が開示されている［２６］。
【００１９】
最後に、質量分析法による遊離サイロキシン（ＦＴ４）または遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ３）の分析方法は知られていない。多くの研究室は、主な臨床化学プラットホーム上の一つで、類似体（直接）イムノアッセイアプローチを用いたＦＴ４試験を慣例的に実施している。本アプローチは、国際的に認められておらず、批判の対象となっている（２９）。本方法により得られるＦＴ４の結果の有効性が問われることが、多々ある。この理由により、全ての直接ＦＴ４＜２．５ｔｈ百分位数における「反射」試験は、しばしば、甲状腺機能低下症を診断するために行われる。これらは、平衡透析の現行の判断基準を用いたＦＴ４測定のために送られる。これは、直接ＦＴ４が＞９７．５ｔｈ百分位数で、ＴＳＨが正常である場合、サンプルに対しても行われる。平衡透析により測定された場合、これらのＦＴ４送付の約５０％が、正常な範囲内の結果であり、よって、直接ＦＴ４法では偽陽性である。しかし、平衡透析の工程は、時間がかかり、高価である。同様に、ＦＴ３も、現在、イムノアッセイにより測定される。
【００２０】
【表１】
2008534955.tif 000003
【００２１】
【表２】
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【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２２】
概要
出願者の教示は、質量分析法を使用したホルモン分析の速くて正確な方法および定量化を提供する。
【００２３】
複数のホルモンが同時または系列的に分析可能である。工程は、１００μＬのように非常に少量のサンプルの分析が可能である。さらに、最小限のサンプル調製時間を提供する。
【００２４】
出願者の教示は、例えば人体などの自然の中で発見されるような、複数の複合マトリックスでのホルモンの分析を可能にする。例えば、ホルモン分析は、血液、唾液、血清、血漿および尿のサンプルで実施可能である。
【００２５】
本教示にはいくつかの特徴がある。
（１）サンプル中のホルモンにおける全および特異的分析を提供する。本方法は、多くのホルモンの同時または系列的分析を可能にする。
（２）工程は、免疫沈降反応を必要としない。主な他のホルモン分析は、イムノアッセイを必要とする。イムノアッセイは高価で、特定の分析物に特異的であり、複数の工程を含む。
（３）本教示は、最小限のサンプル調製時間を要する。例えば、ホルモン分析のサンプル調製は、６分以内に完了することができる。
（４）工程は、大量のサンプルを必要としない。甲状腺ホルモンにおける血漿または血清サンプルは、１００μＬのように非常に少量である。ＦＴ４およびＦＴ３において、サンプルは、５００から６００μＬの間であってよい。質量分析法を使用するホルモン分析の現法は、４〜１５ｍＬの血漿を必要とする。
（５）本方法は、使用が簡易で高度に再現できる、単純な調製技術を使用する。
（６）本方法は、多様なサンプルの種類において実施できる分析を可能にする。
（７）本方法は、簡易なサンプル採取および分析のための診療所へのサンプルの遠隔依頼を可能にする唾液または尿のサンプル中のホルモンの分析を可能にする。以前の他の臨床方法において、サンプルは、診療所の患者から直接、侵襲的手段により採取される。
（８）質量分析法による分析は高精度である。さらに、本方法の工程は、非常に再現性が高い。
（９）本方法は、ホルモン濃度の広範囲の分析を可能にする。さらに、検出限界は、かなり低い。
【００２６】
つまり、（ａ）ＦＴ４ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの提供、（ｂ）ＦＴ４のサンプルからの分離、（ｃ）ＦＴ４ホルモンの収集、および（ｄ）質量分析法を使用してＦＴ４ホルモンの分析、のステップを含む、遊離サイロキシン（ＦＴ４）ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法の方法を提供する。
【００２７】
つまり、（ａ）ＦＴ３ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの提供、（ｂ）ＦＴ３のサンプルからの分離、（ｃ）ＦＴ３ホルモンの収集、および（ｄ）質量分析法を使用してＦＴ３ホルモンの分析、のステップを含む、遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ３）ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法の方法を提供する。
【００２８】
つまり、（ａ）ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの提供、（ｂ）ＦＴ４およびＦＴ３のサンプルからの分離、（ｃ）ＦＴ４およびＦＴ３ホルモンの収集、および（ｄ）質量分析法を使用してＦＴ４およびＦＴ３ホルモンの分析、のステップを含む、遊離サイロキシン（ＦＴ４）および遊離トリヨードサイロニン（ＦＴ３）ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法の方法を提供する。
【００２９】
ＦＴ４および／またはＦＴ３ホルモンを含むかまたは含むと考えられるサンプル分析の手順を提供する。本方法は、上述のように、サンプルを調製および分析する手順の提供を含む。
【００３０】
つまり、（ａ）内標準を含む、サンプルからＦＴ４を分離するための試薬、（ｂ）質量分析法を使用してＦＴ４ホルモンを分析するための試薬、および（ｃ）質量分析法を含む、ＦＴ４を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法におけるシステムを提供する。
【００３１】
つまり、（ａ）内標準を含む、サンプルからＦＴ３を分離するための試薬、（ｂ）質量分析法を使用してＦＴ３を分析するための試薬、および（ｃ）質量分析法を含む、ＦＴ３を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法におけるシステムを提供する。
【００３２】
つまり、（ａ）サンプルからＦＴ４を分離するための試薬、（ｂ）質量分析法を使用してＦＴ４ホルモンを分析するための試薬、（ｃ）ＦＴ４の溶液、および（ｄ）質量分析法を使用してＦＴ４を分析する手順を含む、ＦＴ４を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法で使用するキットを提供する。
【００３３】
つまり、（ａ）サンプルからＦＴ３を分離するための試薬、（ｂ）質量分析法を使用してＦＴ３を分析するための試薬、（ｃ）ＦＴ３の溶液、および（ｄ）質量分析法を使用してＦＴ３を分析する手順を含む、ＦＴ３を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法で使用するキットを提供する。
【００３４】
また、（ａ）サンプルからＦＴ４およびＦＴ３を分離するための試薬、（ｂ）質量分析法を使用してＦＴ４およびＦＴ３を分析するための試薬、（ｃ）ＦＴ４およびＦＴ３の溶液、および（ｄ）質量分析法を使用してＦＴ４およびＦＴ３を分析する手順を含む、ＦＴ４およびＦＴ３を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析法で使用するキットも提供する。
【００３５】
つまり、ＦＴ４、ＦＴ３または双方を含むかまたは含むと考えられるサンプルを分析するための質量分析法の使用を提供する。
【００３６】
これらと出願者の教示の他の特徴を、本明細書に記述する。
【００３７】
当該分野に精通した者は、以下に記述する図は、例示的目的であることを理解する。図は、いかなる手段において、出願者の教示の範囲を制限することを意図したものではない。
【００３８】
発明者に既知である最適なアプローチを含む本方法は、以下の図と組み合わせて、以下の説明を参照することにより、より理解されるであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３９】
様々な実施形態の説明
出願者の教示は、ホルモンの分析方法を提供する。ホルモンは、
デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡ）
硫酸デヒドロエピアンドロステロン（ＤＨＥＡＳ）
アルドステロン
コルチゾル
コルチコステロン
１１−デオキシコルチゾル
アンドロステンジオン
テストステロン
エストラジオール
１７−ＯＨプロゲステロン
プロゲステロン
アロプレグナノロン
１６−ＯＨエストロン
２−ＯＨエストロン
エストロン
エストリオール
ビタミンＤおよびその代謝物２５ヒドロキシビタミンＤおよび１，２５ジヒドロキシビタミンＤ
サイロキシン
遊離サイロキシン
トリヨードサイロニン
遊離取りヨードサイロニン
カテコールアミン
メタネフリン
他のステロイドホルモン
他の甲状腺ホルモン
他の小ペプチドホルモン
他のアミン類
サンプル
血液、血漿、血清、尿または唾液のサンプルを含む、ホルモンを含むかまたは含むと考えられるあらゆるサンプルが使用される。サンプルは、遊離および共役性の双方または結合ホルモンを含んでよい。サンプル量は、ホルモンにおいては、一般的に少なくとも約１００μＬ、ＡＰＩ３０００ＴＭを使用した場合のステロイドホルモンにおいては、少なくとも約７００μＬ、またはＡＰＩ４０００ＴＭまたはＡＰＩ５０００ＴＭを使用した場合のステロイドホルモンにおいては２００から５００μＬが使用される。ＦＴ４およびＦＴ３において５００から６００μＬのサンプル量が、ＡＰＩ４０００ＴＭまたはＡＰＩ５０００ＴＭを使用した場合、使用される。
【００４０】
除タンパク
サンプルは、除タンパクされてよい。これは、当該分野に精通した者に既知の従来の技術により行われてよい。例えば、サンプルは、内標準を含むアセトニトリルと除タンパクした後、ボルテックスおよび遠心分離を行ってよい。内標準は、例えば、重水素化ホルモンであってよい。
【００４１】
サンプルからのホルモンの分離
ホルモンは、当該分野に精通した者に知られる方法により分離される。例えば、ホルモンは、カラムを通して液体クロマトグラフ法により分離されてよい。多くの異なるカラムを使用してよい。例えば、カラムはＣ−１８カラム、または、例えば、Ｃ−８カラムであってよい。カラムは、Ｃ６、Ｃ４、Ｃ２または同等のカラムでもよい。当該分野に精通した者に既知であるように、炭素鎖が短いほど、滞留時間が短い。ホルモンは、引き続き、カラムから溶出される。
【００４２】
ホルモンは、遠心分離により分離されてもよい。例えば、ＦＴ４は、限外濾過装置を使用して遠心分離により、結合Ｔ４を含む他の化合物から分離されてよい。遠心分離後、限外濾過は、ＦＴ４を含むが、結合Ｔ４および他の化合物は、フィルターを通過することができない。代替的に、ホルモンは、平衡透析または当該分野で知られる他の方法により分離されてよい。
【００４３】
ホルモンの質量分析計への導入
ホルモンは、次に、質量分析計に導入される。任意に、分離ステップおよび質量分析計へのホルモンの導入は、併用液体クロマトグラフィー分析装置（ＬＣ／ＭＳ）を使用して組み合わせてよい。この工程は、サンプル注入のオンライン抽出に続いて、内蔵切替え弁を使用する質量分析計への導入に基づく。
【００４４】
同位体希釈タンデム質量分析法
本方法は、同位体希釈質量分析法を使用する。
【００４５】
装置およびイオン化技法
ホルモンは、イオン化の対象である。多様なイオン化技法を使用してよい。例えば、光イオン化、熱電気イオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）および電子捕獲イオン化を使用してよい。エレクトロスプレーイオン化は、甲状腺ホルモンを分析する場合に使用される。
【００４６】
次の質量分析法が使用できる。米国特許４，１２１，０９９；４，１３７，７５０；４，３２８，４２０；４，９６３，７３６；５，１７９，２７８；５，２４８，８７５；５，４１２，２０８；および５，８４７，３８６（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ／ＭＤＳ  ＳＣＩＥＸ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，Ｃａｌｉｆ．／Ｃｏｎｃｏｒｄ  Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）に記述されるＡＰＩ３０００ＴＭ質量分析計およびＡＰＩ４０００ＴＭ質量分析計などのハイブリッド４極子リニアイオン捕捉質量分析計および液体クロマトグラフ−タンデム質量分析計を含む、あらゆるタンデム分析装置。甲状腺ホルモンを分析する場合、ＡＰＩ２０００ＴＭおよびＡＰＩ３０００ＴＭ質量分析計などのターボスプレーイオン源を備えた分析装置が使用可能である。ＦＴ４を分析する場合、ＡＰＩ４０００ＴＭ質量分析計が使用可能である。ＦＴ３を分析する場合、ＡＰＩ５０００ＴＭ質量分析計が使用可能である。ＦＴ３およびＦＴ４を同時分析する場合、ＡＰＩ５０００ＴＭ質量分析計が使用可能である。
【００４７】
当該分野に精通した者に知られるように、特定のイオン形態を引き起こす特定の分析物の傾向にもよるが、イオン化は質量分析計を使用して、ネガティブまたはポジティブモードで実施されてよい。基本的に、甲状腺ホルモンにおいて、分析装置は、ネガティブモードで実施される。
【００４８】
ホルモンは、当該分野に精通した者に知られるように、分子イオンと断片イオンの質量電荷比を基準に同定される。ホルモンが液体クロマトグラフにより精製される場合、ホルモンは、その滞留時間によっても同定される。
【００４９】
ホルモンは、カウント／秒で質量分析計により測定されるように、その強度により定量化される。既知のホルモン濃度における校正曲線は、比較のために設定される。
【００５０】
キット
ＦＴ４、ＦＴ３または双方を含むかまたは含むと考えられるサンプルの質量分析に用いられるキットも提供する。本キットは、当該分野に精通した者に既知であるように、組み合わせられる。本キットは、例えば、サンプルからホルモンを分離するための試薬、質量分析計を使用してホルモンを分析するための試薬、ホルモンの溶液および説明書を含む。
実施例
出願者の教示の側面は、本教示の範囲を制限することを意図するものではないが、以下の実施例を参照することにより、より理解されるだろう。
１．甲状腺ホルモンのサンプルの分析
１００μＬの血漿のサンプルを使用した。タンパク質は、１５０μＬのアセトニトリルで沈殿させ、蓋をしてボルテックスにかけた。次に、サンプルを遠心分離し、２００μＬの上澄みをＳｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ−１８ＴＭモニタリングカラムを備えたＳｕｐｅｌｃｏ  ＬＣ−１８−ＤＢＴＭクロマトグラフカラム上に注入し、タンデム質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）と共役した。５ｍＭの酢酸アンモニウム中の２０％のメタノールで３分カラムを洗浄した。弁を切替え、サンプルを７５％から９５％のメタノールで溶出した。総実行時間は６分であった。当該分野に精通した者に周知であるように、記述される量、濃度および時間をわずかに調整してよい。
【００５１】
溶出液をイオンスプレー電離箱に入れ、ネガティブモードを用いてＡＰＩ２０００ＴＭ質量分析計で分析した。Ｔ４およびＴ３イオンの質量／電荷比は、それぞれ７７５．８と６５０であった。イオン化は、ターボイオンスプレー箱を使用してエレクトロスプレーにより行われてよい。
【００５２】
これは、ホルモン含有の分析における複雑な生体マトリックスを調製する簡単な方法およびＴ３とＴ４双方のホルモンの同時分析を可能にする高感度な分析方法を示す。
２．ホルモンを溶出するためにメタノール勾配を使用した甲状腺ホルモンの分析
１００μＬの血漿のサンプルを使用した。タンパク質は、重水素化されたＴ４の内標準を含有する１５０μＬのアセトニトリルで沈殿させ、ボルテックスにかけた。サンプルを遠心分離し、２００μＬの上澄みをタンデム質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）と共役したＣ−１８カラムに注入した。５ｍＭの酢酸アンモニウム中の２０％のメタノールで３分カラムを洗浄した。カラム上の弁を切替え、サンプルを２０％から１００％のメタノール勾配で溶出した。総実行時間は７分であった。当該分野に精通した者に既知であるように、記述される量、濃度および時間をわずかに調整してよい。
【００５３】
溶出液のサンプルをイオンスプレー電離箱に入れ、ネガティブモードを用いてＡＰＩ３０００ＴＭ質量分析計で分析した。イオン化は、ターボイオンスプレー箱を使用してエレクトロスプレーにより行われてよい。図１および図２は、Ｔ３およびＴ４に対して作成された質量スペクトルを示す。
【００５４】
これは、甲状腺ホルモン含有の分析における複雑な生体マトリックスを調製する簡単な方法および複数のホルモンの同時分析を可能にする高感度な分析方法を示す。
【００５５】
３．同位体希釈タンデム質量分析法を用いた甲状腺ホルモンの分析
本実施例は、血清中のＴ４およびＴ３の同時判定における同位体希釈タンデム質量分析法を説明する。本方法は、正確、特異的、精密（％ＣＶ：３．５と９．０の間）かつ簡単であり、抽出をする必要がなく、タンパク質の沈殿のみを必要とし、迅速である。例えば、これは７分以下で実行できる。
【００５６】
化学物質および試薬
Ｔ４およびＴ３の標準は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入された。安定した重水素標識された内標準、Ｌ−サイロキシン−ｄ２をＧｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｊ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔのＤｒ  Ｔｏｍａｓ  Ｃｌａｓｓによる文献［１６］、［１７］に記述された手順で合成した。ＨＰＬＣグレードメタノールをＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。他の全ての化学物質は、分析グレードのものであり、Ｓｉｇｍａから購入した。
【００５７】
溶液および標準
Ｔ３、Ｔ４の原液および内標準（ＩＳ）を、それぞれ１ｍｇ／ｍＬの濃度を得るため別々に調製した。メタノール中の４０％水酸化アンモニウム（ｖ／ｖ）を溶媒として使用した。分析物原液をメタノールで希釈してスパイク状溶液を得た。溶液は４℃で保管され、数ヶ月間使用可能とした。Ｔ３は０．３２５から５ｎｇ／ｍＬ、Ｔ４は１２．５から２００ｎｇ／ｍＬの範囲での校正曲線の標準は、分析物を３％のヒトγ−グロブリン（スパイク状溶液量＜２％最終量）に添加して調製された。低、中、高レベルの品質管理（ＱＣ）サンプル（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｒｐ．，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＵＳＡ）を使用した。メタノール中の５０−ｎｇ／ｍＬ  ｄ２−Ｔ４の溶液を内標準として使用した。
【００５８】
サンプルの調製
血清または血漿のサンプルを室温で解凍した。１５０μＬのＩＳ溶液を１００μＬの血清または血漿サンプルのアリコートに添加した。ボルテックスに３０秒かけた後、サンプルを室温で１０分間保管し、タンパク質の沈殿を完了した。サンプルを１５，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、１００μＬの上澄みをＬＣ−ＭＳ−ＭＳシステムに注入した。
【００５９】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ条件
ターボイオンスプレーを備えたＡＰＩ３０００ＴＭタンデム質量分析計（ＳＣＩＥＸ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）およびＳｈｉｍａｄｚｕ  ＨＰＬＣシステムを分析の実施に使用した。陰イオン多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを使用した。モニターへの移行は、Ｔ３にはｍ／ｚ  ６５０→１２７、Ｔ４にはｍ／ｚ  ７７６→１２７、ｄ２−Ｔ４にはｍ／ｚ  ７７８→１２７で選択された。窒素は、補助的なカーテンおよび衝突気体として用いられた。気体流量、供給源温度、イオンスプレー電圧および衝突エネルギーは、２０μＬ／分でのメタノール中の１μｇ／ｍＬの標準液注入およびＬＣ流量でのフロー注入分析（ＦＩＡ）により、各化合物に対して最適化された。質量分析計における主な作動パラメータは、表３に要約されている。データ処理は、Ａｎａｌｙｓｔ１．２ソフトウェアパッケージで実行された。
【００６０】
ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ手順
使用した手順は、注入されたサンプルのオンライン抽出／洗浄後に内蔵Ｖａｌｃｏ切替え弁を使用した質量分析計への移動に基づく。１００μｌのサンプルを、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ−１８（３．０ｍｍ）モニタリングカラムを備えたＳｕｐｅｌｃｏ  ＬＣ−１８−ＤＢ（３．３ｃｍｘ３．０ｍｍ，３．０μｍＩＤ）クロマトグラフカラムに注入した。ここで、サンプルは０．８ｍＬ／分の流量でｐＨ＝４．０の５ｍＭ酢酸アンモニウム中２０％（ｖ／ｖ）メタノールで洗浄される。３．５分の洗浄の後、切替え弁を作動させ、カラムを０．５ｍＬ／分の流量で水／メタノール勾配で洗い流し、サンプルを質量分析計に移動した。使用した勾配パラメータは、表４に示す。
【００６１】
Ｔ４およびＴ３のイムノアッセイ
製造会社の使用に従って、Ｔ４をＤａｄｅ  ＲｘＬ  ＤｉｍｅｎｓｉｏｎＴＭ（Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＤＥ）で、Ｔ３をＤＰＣ  ＩｍｍｕｌｉｔｅＴＭ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）で測定した。
【００６２】
結果
使用した質量分析計作動パラメータは、表３および４に示す。
【００６３】
複製セラをいくつかの濃度で日内および日間の双方で測定した。日内および日間の正確なデータを表５および６に示す。
【００６４】
Ｔ４およびＴ３の回復試験を表７および８に示す。示される全ての結果は、８つの複製の平均である。
【００６５】
図３は、Ｔ３およびＴ４に対して得た典型的なタンデム質量分析クロマトグラフを示す（Ｔ４ｍ／ｚ（７７６／１２７）；Ｄ２Ｔ４ｍ／ｚ（７７８／１２７）；Ｔ３ｍ／ｚ（６５０／１２７））。
【００６６】
被験物は、双方のイムノアッセイ（Ｔ３  ＤＰＣ  Ｉｍｍｕｌｉｔｅ，Ｔ４  Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  ＤｉｍｅｎｓｉｏｎＴＭ  ＲｘＬ）およびタンデム質量分析法により、Ｔ３およびＴ４に対して試験された。直線回帰相関（Ｐｒｉｓｍ）を図４および５に示す。
【００６７】
質量分析法の定量化の最低限界は、Ｔ３およびＴ４の双方において０．１５ｎｇ／ｍＬであった。検出限界は、ほぼ０．０６２ｎｇ／ｍＬであった。
【００６８】
考察
ＣＡＰ  ＰＴプログラムおよび異なる免疫測定を使用した小児参照範囲の双方から初めに集めた証拠は、Ｔ４およびＴ３免疫測定試験の特異性の欠如の可能性を示す。この現象を適切に評価するために、同位体希釈タンデム質量分析法を本実施例に示すように発達させた。血清Ｔ４およびＴ３検出法は、１９５０年代より様々な技術を通して発展した。甲状腺ホルモンを検出するために、放射性イムノアッセイ（ＲＩＡ）が１９７０年代に開発された。血清Ｔ４およびＴ３濃度は、現在、ほとんど非同位体で、酵素、蛍光または化学発光性分子をシグナルとして使用する比較イムノアッセイ（ＩＡ）により測定される［２７］。表２は、現在のＴ４およびＴ３におけるＩＡは、特異性に欠け、アメリカ病理学会熟達度試験（ＣＡＰ  ＰＴ）プログラムで、約二つの要因により異なる平均結果が得られることを明確に示している。全ホルモン測定法は、結合タンパク質からホルモンを剥離する置換剤（サリシレートなど）の含有を必要とする［２８］。そのような薬剤による血清タンパク質からのホルモン結合の置換は、現在の測定法に使用される大規模なサンプル希釈と共に、ホルモンの抗体試薬への結合を促進する。
【００６９】
血中のＴ４と比較してＴ３は、１０倍低い濃度のため、よって、より多くの試料量が使用されるにもかかわらず、技術的感度と精度問題の双方が存在する。信頼性の高い高域なＴ３測定が、甲状腺機能亢進症の診断に対して批判的であるが、信頼性の高い正常域の測定も、逆説的にＴ３値が甲状腺機能亢進症を示す可能性がある、病気入院中の患者の抗甲状腺薬量の調節および甲状腺機能亢進症の検知に重要である。
【００７０】
Ｔ４比較（０．９３１）における相関率は、Ｔ３比較（０．８４８）より格段に優れている（図４および５）。タンデム質量測定法によるＴ３は、ＤＰＣ  ＩｍｍｕｌｉｔｅＴＭにより得られたそれらよりわずかに高い結果を示した（図４）。これは子供には当てはまるが、妊娠していない女性と妊娠している女性における仮集計データは、両グループのＴ３において非常に低い相関性を示す（ｒ：０．４０７〜０．５７４間）（すなわち、ＤＰＣ  Ｉｍｍｕｌｉｔｅと妊娠していない女性および妊娠している女性の双方における現在の教示法間の相関性は低い。）
この理由は、明らかではないが、標準化の問題、異好抗体などを含む可能性がある。重要な娘イオンである１２７ｍ／ｚに欠けるリバースＴ３は、タンデム質量分析法では干渉しない。Ｋ／ｆＣＮ（甲状腺）凡用リガントプログラムのＣＡＰ  ＰＴサンプルに対するタンデム質量分析法の適用は、Ｔ３のイムノアッセイの約８５％が、本出願者の教示のタンデム質量分析法により得た平均より低いサンプルの平均を与え、１５％が高い平均を与えることを再度明らかにした。Ｔ４において、タンデム質量分析法は、イムノアッセイの平均より低い平均結果を生じた。
【００７１】
結論として、Ｔ４およびＴ３におけるイムノアッセイとタンデム質量分析法間の相関が示された。相関は、Ｔ３に対してよりＴ４に対して優れている。さらに、相関は、妊娠中はあまり際立たない。内標準として重水素化されたＴ４を使用したいくつかの異なるセラからの回復試験は、Ｔ４およびＴ３の双方において、一定（９０〜１０９％）の回復を示した（表７および８）。サンプル間に見られる回復差異は、Ｔ３に対してよりＴ４に対して驚くほど大きい。これは、Ｔ３内標準として重水素化されたＴ３を使用する必要がないことを示す。出願者の教示の同位体希釈タンデム質量分析法は、迅速（７分以下）、正確（回復試験により評価されるように、真の結果を提供する）、特異的（測定を主張する分析物のみを測定する）、精密（低い％ＣＶ）および実施が容易である。
【００７２】
【表３】
2008534955.tif 000005
【００７３】
【表４】
2008534955.tif 000006
【００７４】
【表５】
2008534955.tif 000007
【００７５】
【表６】
2008534955.tif 000008
【００７６】
【表７】
2008534955.tif 000009
【００７７】
【表８】
2008534955.tif 000010
４．遊離サイロキシンの分析（ＦＴ４）
多くの一般的な臨床化学サービス研究所は、週７日２４時間利用可能な類似体（直接）による遊離サイロキシン（ＦＴ４）の測定を提供する。にもかかわらず、類似体ＦＴ４イムノアッセイの有効性は、長い間、問題であり、本アプローチを使用した患者の結果は、しばしば臨床像を一致しない。これにより、２．５番目の分位数以下および９７．５番目の百分位数以上の直接遊離Ｔ４は、しばしば、ＦＴ４の現在の「判断基準」方法である平衡透析により、さらなる測定に送られた。これらの約５０％において、平衡透析によるＦＴ４が正常と見なされてきた。現法は、同位体希釈タンデム質量分析法を用いた迅速で信頼できる遊離Ｔ４法を教示し、類似体（直接）遊離Ｔ４と時間がかかり比較的高価な平衡透析法の双方を用いて、本方法により得られた結果を比較する。
方法：
化学物質および試薬
サイロキシン（ＴＡ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入された。安定した重水素標識された内標準、Ｌ−サイロキシン−ｄ２をＧｅｏｒｇｅｔｏｗｎ  Ｊ  ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙのＣｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔのＤｒ  Ｔｏｍａｓ  Ｃｌａｓｓによる文献（２９、３０）に記述された手順で合成した。ＨＰＬＣグレードメタノールをＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。他の全ての化学物質は、分析グレードのものであり、Ｓｉｇｍａから購入した。
【００７８】
溶液および標準
Ｔ４の原液および内標準（ＩＳ）は、メタノール中の４０％水酸化アンモニウム（ｖ／ｖ）を溶媒として、それぞれ１０ｍｇ／ｍＬの濃度を得るため別々に調製された。分析物原液をメタノールで希釈してスパイク状溶液を得た。溶液は−２０℃で保管され、数ヶ月間使用可能とした。２．５〜５０ｐｇ／ｍＬの範囲でのＴ４校正曲線の標準は、分析物を水に添加して調製された。メタノール中０．０５ｎｇ／ｍＬのｄ２−Ｔ４溶液を内標準として使用した。
【００７９】
サンプルの調製
血清または血漿のサンプルを、治験審査委員会（ＩＲＢ）により承認された試験で、４２人以上の健康な妊娠女性と２９人以上の妊娠していない女性から得、室温で解凍した。０．６ｍｌのサンプルを、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ温度制御遠心分離（モデル＃５７０２  Ｒ，Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ，ＡＧ，Ｈａｍｂｕｒｇ）を用い、２９００ｒｐｍで、１時間２５oの温度で、固定角ローターを使用した遠心分離により、Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅ  ＹＭ−３０限外濾過装置（３０，０００ＭＷ  ｃｕｔ−ｏｆｆ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を通して濾過した。１８０μＬのＩＳ［０．０５ｎｇ／ｍＬ］を３６０μＬの限外濾過物質に添加に、４００μＬがＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステムのＣ−１８カラム上に注入された。この限外濾過工程は、従来の平衡透析法の透析工程を置換える。限外濾過ステップは、３０，０００以上の分子量をもつ全タンパク質の除去を含む。液体クロマトグラフ工程は、ホルモンをさらに分離し精製するために使用してよい。
【００８０】
ＬＣ／ＭＳ／ＭＳセットアップ
ターボイオンスプレーおよびＡｇｉｌｅｎｔ１１００ＨＰＬＣシステムを備えたＡＰＩ４０００ＴＭタンデム質量分析計（ＳＣＩＥＸ，Ｔｏｒｏｎｔｏ，Ｃａｎａｄａ）を分析の実施に使用した。陰イオン多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードを使用した。モニターへの移行が選択され、Ｔ４はｍ／ｚ  ７７５．９→１２６．９、ｄ２−Ｔ４はｍ／ｚ  ７７７．９→１２６．９であった。窒素は、補助、カーテンおよび衝突気体として用いられた。気体流量、供給源ｔo、イオンスプレー電圧および衝突エネルギーは、２０μＬ／分でのメタノール中のｌμｇ／ｍＬの標準液注入およびＬＣ流量でのフロー注入分析（ＦＩＡ）により、各化合物に対して最適化された。使用された質量分析計の主な作動パラメータは、表９に要約されている。データ処理は、Ａｎａｌｙｓｔ１．４．１ソフトウェアパッケージで実行された。ネガティブモードが本実施例で使用されたが、ポジティブモードが使用可能であるが感度が低い。
【００８１】
ＬＣ−ＭＳ−ＭＳ手順
使用した手順は、注入されたサンプルのオンライン抽出／洗浄後に内蔵Ｖａｌｃｏ切替え弁を使用した質量分析計への移動に基づく。４００μｌのサンプルを、Ｓｕｐｅｌｃｏ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ−１８（３．０ｍｍ）モニタリングカラムを備えたＳｕｐｅｌｃｏ  ＬＣ−１８−ＤＢ（３．３ｃｍｘ３．０ｍｍ，３．０μｍＩＤ）クロマトグラフカラムに注入した。ここで、サンプルは０．８ｍＬ／分の流量でｐＨ＝４．０の５ｍＭ酢酸アンモニウム中の２０％（ｖ／ｖ）メタノールで洗浄される。４分の洗浄の後、切替え弁を作動させ、カラムを０．６ｍＬ／分の流量で水／メタノール勾配で洗い流し、サンプルを質量分析計に移動した。使用した勾配パラメータは、表１０に示す。遊離Ｔ４クロマトグラフは図６に示す。
【００８２】
平衡透析法
Ｎｉｃｈｏｌｓ遊離Ｔ４キット（Ｎｉｃｈｏｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ＃３０−０６５２，Ｓａｎ  Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ）を製造者により提供された手順により使用した。平衡透析法とタンデム質量分析法の比較は、患者のサンプル（ｎ＝６８）で実施された。
類似体／直接遊離Ｔ４
Ｄａｄｅ  ＲｘＬ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎを直接遊離Ｔ４法に対して使用した（Ｄａｄｅ−Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｇｌａｓｇｏｗ，ＤＥ）。患者のサンプルにおける結果は、タンデム質量分析法（ｎ＝１５４）を使用して得た値と比較した。
【００８３】
日間および日内変動
日間および日内変動を三つの異なる濃度で評価した（表１２）。
【００８４】
結果および考察
表９および１０は、タンデム質量分析法を用いた分析パラメータを表す。図６は、上述した方法を使用したタンデム質量分析法により測定した遊離Ｔ４の典型的なクロマトグラフを示す。急勾配は、約６分にこれを短くするが、分析毎の時間は、約８．５分である。Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ遠心分離は、３０のチューブの遠心分離を同時に行えるので、２５℃で使用した３０人の患者のサンプルの総実行時間は、１時間プラス３時間１５分、または４時間１５分である。限外濾過プラスＬＣ／ＭＳ／ＭＳ測定は、時間のかかる平衡透析法より非常に速い。後者は、３７℃で１６〜１８時間の透析の後、免疫測定を必要とするため、応答時間は数日に及ぶ。また、北米のほとんどの研究所は、平衡分析アプローチを提供しない。ＦＴ４濃度は、温度に依存する（３１）。Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｆｒｅｅチューブの遠心分離が、２５℃で生じる場合（図７および表１１を参照）、タンデム質量分析法により得られた結果は、３７℃の温度で行われる平衡透析法により得られる結果と密接に関わる。この１２℃の温度の醒は、多分、平衡透析法と遠心分離法で用いられた異なる膜の結果である。新しい同位体希釈タンデム質量分析法と従来の判断基準である平衡透析法の間の相関は、良好である。平衡分析法＝０．９７１質量分析法＋０．０４１、ｎ＝６８、Ｓｙｘ＝１．３８１、ｒ＝０．９５４（図８）。対照的に、相関性の低さが、類似体（直接）ＦＴ４法で示された（イムノアッセイ＝０．３２６質量分析法＋６．２７、ｎ＝１５４、Ｓｙｘ＝１．９６、ｒ＝０．４５９、図９）。日内および日間変動は、試験された全濃度が、７．１％以下の変動（Ｃｖ）率であることを示した。本結果は、異なる平衡透析法を使用して得られたものより優れている。検出最低限度（ベースラインのノイズに対して三つの標準偏差以上を読取る）は、２．５ｐｇ／ｍＬである。
【００８５】
これらの研究は類似体工程が、遊離Ｔ４において不良な結果を生じることを確証する。これは、正常甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）値も有する、２．５番目の百分位数以下の全ＦＴ４と９７．５番目の百分位数以上の全ＦＴ４の反射試験が行われることにより、さらに支持される。近似的に、Ｄａｄｅ  ＲｘＬ  ＤｉｍｅｎｓｉｏｎＴＭまたはＤＰＣ  ＩｍｍｕｌｉｔｅＴＭのいずれかで実行されるこれらの遊離Ｔ４の５０％は、平衡透析法により実行される場合、正常な結果を示す。最後に、今回の研究において、タンデムＭＳによる９６．７番目の百分位数以上のＦＴ４の８０％は、１．０ｕＩＵ／ｍＬ以下のＴＳＨと関係するが（後者は、Ｄａｄｅ  ＲｘＬ  ＤｉｍｅｎｓｉｏｎＴＭにより測定された）、同一の患者縦断において、直接ＩＡにより測定された９６．７番目の百分位数以上のＦＴ４の４０％が、１．０ｕＩＵ／ｍＬ以下のＴＳＨを有する。
【００８６】
血漿限外濾過でタンデム質量分析法を使用する前に、ＲＩＡキット（Ｎｉｃｈｏｌｓ）、Ｄａｄｅ  ＲｘＬＴＭおよびＤＰＣ  ＭＭＵＬＩＴＥＴＭプラットホームを含むいくつかのアプローチを使用して、ＩＡにより限外濾過でＦＴ４を測定する試みがなされたことにも留意するべきである。全ての場合において、これが実行可能な選択肢ではないことを示す、きわめて低い結果であった。
【００８７】
結論として、限外濾過を用いたＦＴ４測定のための新しい同位体希釈質量分析法が、開発された。工程はきわめて精密であり、判断基準と良好に比較できる。これらの魅力的な特徴に基づき、ＦＴ４の測定法は、臨床現場において、広い応用性を有するだろう。
【００８８】
【表９】
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【００８９】
【表１０】
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【００９０】
【表１１】
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【００９１】
【表１２】
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これは、質量分析法によるＦＴ４の調製と検出のための簡単な方法を示す。
【００９２】
５．甲状腺ホルモンおよびステロイドホルモンの分析
５００から１０００μＬの血漿をサンプルとして使用した。タンパク質は、１５０μＬのアセトニトリルで沈殿させ、ボルテックスにかけた。サンプルを遠心分離し、２００μＬの上澄みをタンデム質量分析計（ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ）に結合したＣ−１８カラムに注入した。カラムを５ｍＭの酢酸アンモニウム中の２０％メタノールで３分間洗浄した。カラムの弁を切替え、サンプルを２０から１００％のメタノール勾配で溶出した。総実行時間は、１０分である。当該分野に精通した者に周知であるように、記述される量、濃度および時間をわずかに調整してよい。
【００９３】
溶出物のサンプルをイオンスプレー電離箱に入れ、サンプル中の甲状腺ホルモンに対してネガティブモードを使用し、ＡＰＩ３０００ＴＭ質量分析計により分析した。サンプル中のステロイドホルモンは、分析装置をネガティブまたはポジティブモードにして、光イオン化によりイオン化する。ポジティブモードでの分析は、基本的に、ＤＨＥＡ、アルドステロン、コルチゾル、１１−デオキシコルチゾル、アンドロステンジオン、テストステロン、エストラジオール、１７−ＯＨプロゲステロン、プロゲステロン、アロプレグナノロン、ビタミンＤ、２５，ヒドロキシルビタミンＤ、１，２５ジヒドロキシビタミンＤ、コルチコステロンおよびアルドステロンに対してなされ、ネガティブモードでの分析は、基本的に、１６−ＯＨエストロン、２−ＯＨエストロン、エストリオールおよびＤＨＥＡＳに対してなされる。しかし、陽性またはネガティブモードのいずれかであらゆるホルモンを分析することが可能である。
【００９４】
これは、ステロイドおよび甲状腺ホルモンの含有の可能性がある分析に対して、複合生体マトリックスを調製する簡単な方法を示す。ネガティブモードで実行されるステロイドホルモンは、甲状腺ホルモンと同時に実行してよい。
【００９５】
結果は、本技術が、ヒトの血漿および唾液中の甲状腺ホルモンの低レベルの同定および特徴づけを可能にすることを示す。
【００９６】
６．ＦＴ３ホルモンの分析
ＦＴ３は、全Ｔ３の同遷移イオンの分析およびＡＰＩ５０００ＴＭＴＭ質量分析計の使用を除き、ＦＴ４（実施例４）と同様の方法で分析された。
【００９７】
７．ＦＴ４およびＦＴ３の同時分析
甲状腺機能亢進症および甲状腺機能低下症の患者は、ＦＴ４およびＦＴ３濃度の測定を通して甲状腺機能の評価を頻繁に必要とする。さらに、甲状腺を切断した患者は、ｓｙｎｔｈｒｏｉｄなどの甲状腺補充治療を必要とする。これらの患者のＦＴ４およびＦＴ３濃度の測定は、調剤処方の判定に重要である。つまり、ＦＴ４およびＦＴ３の同時分析の効果的な測定法が有益である。
【００９８】
ＡＰＩ５０００ＴＭ質量分析計を使用することを除き、ＦＴ４およびＦＴ３を実施例４と類似した方法で同時分析をおこなった。内標準Ｔ４−ｄ２を混ぜたＴ３（２５ｐｇ／ｍＬ）とＴ４（１ｎｇ／ｍＬ）の混合液１００μＬを自動サンプラーでカラムに注入し、カラムを２０％のＭｅＯＨ緩衝液で２分間洗浄した。Ｖａｌｃｏ弁を２分間作動させた後、２０％ＭｅＯＨから１００％ＭｅＯＨへ２分間勾配溶出を開始させ、次に、２分間１００％を維持した。滞留時間は、Ｔ３で４．３４分、Ｔ４で４．６０分、Ｔ４−ｄ２で４．６１分であった。図１０は、分析物の質量スペクトルを示す。ＦＴ３（１〜２５ｐｇ／ｍｌ）およびＦＴ４（５〜５０ｐｇ／ｍｌ）の標準曲線は、サンプルの分析中に実行可能である。
【００９９】
出願者の教示は、多様な実施形態と併用して説明されるが、出願者の教示は、そのような実施形態に制限されるものではない。逆に、出願者の教示は、当該分野に精通した者に理解されるように、様々な代替例、修正例および同等例を含む。
【０１００】
参考文献
本明細書に列挙されるすべての参考文献は、その全体が参考として援用される。
【０１０１】
【表１３】
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【０１０２】
【表１４】
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【０１０３】
【表１５】
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【図面の簡単な説明】
【０１０４】
【図１】図１は、Ｔ４およびＴ３を含む血漿のサンプルの質量スペクトルである。
【図２】図２は、Ｔ４およびＴ３を含むグロブリン標準の質量スペクトルである。
【図３】図３は、血漿サンプルのＴ４およびＴ３に対して得た、典型的なタンデム質量分析クロマとグラムである。Ｔ４ｍ／ｚ（７７６／１２７）；Ｄ２Ｔ４ｍ／ｚ（７７８／１２７）；Ｔ３ｍ／ｚ（６５０／１２７）。
【図４】図４は、同位体希釈タンデム質量分析法対イムノアッセイにより測定したＴ３を示すグラフである。ＩＡ＝０７５ＭＳ＋０．２１；ｒ＝０．８４８；Ｓｙ，ｘ＝０．１９５６；ｎ＝４９。
【図５】図５は、同位体希釈タンデム質量分析法対イムノアッセイにより測定したＴ４を示すグラフである。ＩＡ＝Ｉ．１３ＭＳ−８．９９；ｒ＝０．９３１；Ｓｙ，ｘ＝９．５４；ｎ＝５０。
【図６】図６は、遊離Ｔ４（１１．２ｐｇ／ｍＬ）および希釈した内標準の典型的なクロマトグラフを示すグラフである。
【図７】図７は、タンデム質量分析法および限外濾過装置によるＦＴ４の温度の高価を示すグラフである。
【図８】図８は、遊離Ｔ４測定におけるタンデム質量分析法と平衡透析法の比較を示したグラフである。
【図９】図９は、遊離Ｔ４の測定におけるＤａｄｅ  ＲｘＬ元でのタンデム質量分析法と直接イムノアッセイの比較を示すグラフである。
【図１０ａ】図１０ａ、ｂおよびｃは、ＡＰＩ５０００ＴＭを使用したＦＴ４（ａ）、ＦＴ３（ｂ）およびＦＴ４−ｄ２（ｃ）の分析を示す一連の質量スペクトルである。
【図１０ｂ】図１０ａ、ｂおよびｃは、ＡＰＩ５０００ＴＭを使用したＦＴ４（ａ）、ＦＴ３（ｂ）およびＦＴ４−ｄ２（ｃ）の分析を示す一連の質量スペクトルである。
【図１０ｃ】図１０ａ、ｂおよびｃは、ＡＰＩ５０００ＴＭを使用したＦＴ４（ａ）、ＦＴ３（ｂ）およびＦＴ４−ｄ２（ｃ）の分析を示す一連の質量スペクトルである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【国際調査報告】
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