(57)【要約】  本発明は、サンプル中の分析物の存在および必要に応じての分析物の濃度を測定する比色分析ライトアップセンサーを提供する。また、該センサーの使用方法および該センサーを含むキットも提供する。該センサーは、侵襲性DNAを使用して、核酸酵素、基質および粒子を含む凝集物の上記分析物依存性解離を助長させる。【選択図】  なし
2008518633.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸酵素；
第１のポリヌクレオチドを含む、前記核酸酵素に対する基質；
第２のポリヌクレオチドを含む第１の粒子(第２のポリヌクレオチドは第１の粒子に結合しており、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補性である)；および、
第４のポリヌクレオチドを含む侵襲性DNA(第４のポリヌクレオチドは第１のポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補性である)
を含むことを特徴とする、分析物検出用のセンサー系。
【請求項２】
第３のポリヌクレオチドを含む第２の粒子をさらに含み、該第３のポリヌクレオチドは5'末端で該粒子に結合しており；前記第２のポリヌクレオチドが3'末端において前記第１の粒子に結合しており、前記第１のポリヌクレオチドが第３のポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補性である、請求項１記載のセンサー。
【請求項３】
前記核酸酵素がDNAを含む、請求項１〜２のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項４】
前記第１の粒子群が、金属、半導体、磁化可能物質およびこれらの組合せからなる群から選ばれる物質を含む、請求項１〜３のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項５】
前記第１の粒子群と前記第２の粒子群が金を含む、請求項１〜４のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項６】
前記第１の粒子群が5nm〜70nmの平均直径を有する、請求項１〜５のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項７】
前記第１の粒子群が10nm〜15nmの平均直径を有する、請求項１〜６のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項８】
前記分析物が、核酸酵素を活性化または不活化させる、請求項１〜７のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項９】
前記分析物が、Ag(I)、Pb(II)、Hg(II)、As(III)、Fe(III)、Zn(II)、Cd(II)、Cu(II)、Sr(II)、Ba(II)、Ni(II)、Co(II)、As(V)、U(VI)およびCr(VI)からなる群から選ばれる、請求項１〜８のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項１０】
前記分析物が、+2形式酸化状態を有する金属イオンを含む、請求項１〜９のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項１１】
前記分析物がPb(II)を含む、請求項１〜１０のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項１２】
前記核酸酵素が、SEQ ID NO：26〜44およびこれらの保存的修飾変異体からなる群から選ばれる配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１１のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項１３】
前記核酸酵素が、SEQ ID NO：1およびその保存的修飾変異体の配列を有するポリヌクレオチドを含み；前記第１のポリヌクレオチドが、SEQ ID NO：3およびその保存的修飾変異体の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１２のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項１４】
前記第４のポリヌクレオチドが少なくとも２本の異なるストランドを含み、該ストランドの各々が、前記基質を前記核酸酵素によって開裂したとき、開裂基質ストランドの少なくとも１個の末端塩基に対して相補性である少なくとも１個の末端塩基を有する、請求項１〜１３のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項１５】
前記第４のポリヌクレオチドが少なくとも２本の異なるストランドを含み、該ストランドの各々が、前記基質を前記核酸酵素によって開裂したとき、完全相補性ストランドよりも2〜10個少ない、開裂基質ストランドとハイブリッド化し得る塩基を有する、請求項１〜１４のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項１６】
前記第４のポリヌクレオチドが少なくとも２本の異なるストランドを含み、該ストランドの各々が、前記基質を前記核酸酵素によって開裂したとき、完全相補性ストランドよりも6個少ない、開裂基質ストランドとハイブリッド化し得る塩基を有する、請求項１〜１５のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項１７】
前記第４のポリヌクレオチドが、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25およびこれらの保存的修飾変異体からなる群から選ばれたポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１６のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項１８】
前記第４のポリヌクレオチドが、SEQ ID NO：12およびその保存的修飾変異体並びにSEQ ID NO：13およびその保存的修飾変異体の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜１７のいずれか１項記載のセンサー。
【請求項１９】
下記の工程：
凝集物、サンプルおよび侵襲性DNAを混合する工程；および、
分析物対する色変化を検出する工程；
を含み
該凝集物は、第１のポリヌクレオチドを含む基質と、第２のポリヌクレオチドを含む第１の粒子(第２のポリヌクレオチドは第１の粒子に結合しており、第１のポリヌクレオチドは第２のポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補性である)とを含む
ことを特徴とする、分析物の検出方法。
【請求項２０】
前記サンプルのイオン強度を調整する工程をさらに含む、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルおよび侵襲性DNAを凝集物に添加する、請求項１９〜２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
前記凝集物を前記サンプルおよび侵襲性DNAに添加する、請求項１９〜２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記凝集物が第３のポリヌクレオチドを含む第２の粒子をさらに含み、該第３のポリヌクレオチドは5'末端において前記粒子に結合しており、第２のポリヌクレオチドは、3'末端で第１の粒子に結合し、前記第１のポリヌクレオチドは前記第３のポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補性である、請求項１９〜２２のいずれか１項記載の方法。
【請求項２４】
前記粒子が金を含む、請求項１９〜２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
前記凝集物が、分析物に対する結合部位を含むエンドヌクレアーゼをさらに含み；該エンドヌクレアーゼが、前記基質に対して少なくとも部分的に相補性である、請求項１９〜２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
前記エンドヌクレアーゼが核酸酵素を含む、請求項１９〜２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
前記核酸酵素が、SEQ ID NO：26〜44およびこれらの保存的修飾変異体からなる群から選ばれた配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９〜２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸酵素が、SEQ ID NO：1およびその保存的修飾変異体の配列を有するポリヌクレオチドを含み；前記第１のポリヌクレオチドが、SEQ ID NO：3およびその保存的修飾変異体の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９〜２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
前記侵襲性DNAが、核酸酵素と拮抗して前記基質とハイブリッド化する、請求項１９〜２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
色変化が、前記凝集物、前記サンプルおよび前記侵襲性DNAの混合後５分間で、少なくとも95％完了する、請求項１９〜２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
前記混合が20〜30℃で生じる、請求項１９〜３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
前記凝集物が、前記分析物に応答して解離する、請求項１９〜３１のいずれか１項記載の方法。
【請求項３３】
前記応答が、サンプル中の分析物の量に比例する、請求項１９〜３２のいずれか１項記載の方法。
【請求項３４】
前記分析物が、前記核酸酵素を活性化または不活化させる、請求項１９〜３３のいずれか１項記載の方法。
【請求項３５】
前記分析物が、Ag(I)、Pb(II)、Hg(II)、As(III)、Fe(III)、Zn(II)、Cd(II)、Cu(II)、Sr(II)、Ba(II)、Ni(II)、Co(II)、As(V)、U(VI)およびCr(VI)からなる群から選ばれる、請求項１９〜３４のいずれか１項記載の方法。
【請求項３６】
前記分析物がPb(II)を含む、請求項１９〜３５のいずれか１項記載の方法。
【請求項３７】
前記第４のポリヌクレオチドが少なくとも２本の異なるストランドを含み、該ストランドの各々が、開裂基質ストランドの少なくとも１個の末端塩基に対して相補性である少なくとも１個の末端塩基を有する、請求項１９〜３６のいずれか１項記載の方法。
【請求項３８】
前記第４のポリヌクレオチドが少なくとも２本の異なるストランドを含み、該ストランドの各々が、完全相補性ストランドよりも2〜10個少ない、開裂基質ストランドとハイブリッド化し得る塩基を有する、請求項１９〜３７のいずれか１項記載の方法。
【請求項３９】
前記第４のポリヌクレオチドが少なくとも２本の異なるストランドを含み、該ストランドの各々が、完全相補性ストランドよりも６個少ない、開裂基質ストランドとハイブリッド化し得る塩基を有する、請求項１９〜３８のいずれか１項記載の方法。
【請求項４０】
前記第４のポリヌクレオチドが、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25およびこれらの保存的修飾変異体からなる群から選ばれたポリヌクレオチドを含む、請求項１９〜３９のいずれか１項記載の方法。
【請求項４１】
前記第４のポリヌクレオチドが、SEQ ID NO：12およびその保存的修飾変異体並びにSEQ ID NO：13およびその保存的修飾変異体の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１９〜４０のいずれか１項記載の方法。
【請求項４２】
前記サンプルが生物学的源に由来する、請求項１９〜４１のいずれか１項記載の方法。
【請求項４３】
前記サンプルが産業廃棄物流に由来する、請求項１９〜４２のいずれか１項記載の方法。
【請求項４４】
前記サンプルが、水をヒト消費用に汲み上げる水源に由来する、請求項１９〜４３のいずれか１項記載の方法。
【請求項４５】
色変化を定量することをさらに含む、請求項１９〜４４のいずれか１項記載の方法。
【請求項４６】
以下を含む分析物の検出用のキット：
第１のポリヌクレオチドを含むa、第２のポリヌクレオチドを含む第１の粒子を含む凝集物を形成する系(前記第２のポリヌクレオチドは前記第１の粒子に結合しており、前記第１のポリヌクレオチドは前記第２のポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補性である)；
前記凝集物形成性系を収容する少なくとも１つの第１の容器；
第４のポリヌクレオチドを含む侵襲性DNA(該第４のポリヌクレオチドは前記第１のポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補性である)；
前記侵襲性DNAを収容する少なくとも１つの第２の容器(サンプルは、前記第１の容器、前記第２の容器および第３の容器を含む群から選ばれる容器に添加し得る)。
【請求項４７】
前記系が第３のポリヌクレオチドをさらに含み、該第３のポリヌクレオチドが、5'末端において前記粒子に結合し；前記第２のポリヌクレオチドが、3'末端において第１の粒子に結合しており、前記第１のポリヌクレオチドが、前記第３のポリヌクレオチドに対して少なくとも部分的に相補性である、請求項４６記載のキット。
【請求項４８】
前記サンプルのイオン強度を改変するための試薬をさらに含む、請求項４６〜４７のいずれか１項記載のキット。
【請求項４９】
サンプルのpHを改変するための試薬をさらに含み、該試薬が、酸および塩基からなる群から選ばれる、請求項４６〜４８のいずれか１項記載のキット。
【請求項５０】
凝集物を形成するための使用説明書をさらに含む、請求項４６〜４９のいずれか１項記載のキット。
【請求項５１】
前記サンプルのイオン強度を改変するための使用説明書をさらに含む、請求項４６〜５０のいずれか１項記載のキット。
【請求項５２】
前記分析物に対する結合部位を含むエンドヌクレアーゼをさらに含み、該エンドヌクレアーゼが、前記基質に対して少なくとも部分的に相補性である、請求項４６〜５１のいずれか１項記載のキット。
【請求項５３】
前記エンドヌクレアーゼが、核酸酵素を含む、請求項４６〜５２のいずれか１項記載のキット。
【請求項５４】
前記核酸酵素が、SEQ ID NO：26〜44およびその保存的修飾変異体からなる群から選ばれた配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項４６〜５３のいずれか１項記載のキット。
【請求項５５】
前記第４のポリヌクレオチドが少なくとも２本の異なるストランドを含み、該ストランドの各々が、前記基質を前記核酸酵素によって開裂したときに、開裂基質ストランドの少なくとも１個の末端塩基に対して相補性である少なくとも１個の末端塩基を有する、請求項４６〜５４のいずれか１項記載のキット。
【請求項５６】
前記第４のポリヌクレオチドが少なくとも２つの異なるストランドを含み、該ストランドの各々が、前記基質を前記核酸酵素によって開裂したときに、完全相補性ストランドよりも2〜10個少ない、開裂基質ストランドとハイブリッド化し得る塩基を有する、請求項４６〜５５のいずれか１項記載のキット。
【請求項５７】
前記第４のポリヌクレオチドが少なくとも２つの異なるストランドを含み、該ストランドの各々が、前記基質を前記核酸酵素によって開裂したときに、完全相補性ストランドよりも6個少ない、開裂基質ストランドとハイブリッド化し得る塩基を有する、請求項４６〜５６のいずれか１項記載のキット。
【請求項５８】
第４のポリヌクレオチドが、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：25およびこれらの保存的修飾変異体からなる群から選ばれたポリヌクレオチドを含む、請求項４６〜５７のいずれか１項記載のキット。
【請求項５９】
前記第４のポリヌクレオチドが、SEQ ID NO：12およびその保存的修飾変異体並びにSEQ ID NO：13およびその保存的修飾変異体の配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項４６〜５８のいずれか１項記載のキット。
【請求項６０】
前記凝集物の解離に応答しての色変化を定量する装置をさらに含む、請求項４６〜５９のいずれか１項記載のキット。
【請求項６１】
前記装置が、分光光度計および比色計からなる群から選ばれる、請求項４６〜６０のいずれか１項記載のキット。
【請求項６２】
前記分析物に対して応答性のライトダウンセンサー系をさらに含む、請求項４６〜６１のいずれか１項記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
(政府委託研究開発)
本出願の主題は、次の研究助成および協定において１部見出され得る：DOE Grant No. DEFG02-01-ER63179、NSF CTS-0120978、およびNSF DMR-0117792。米国政府は、本発明における権利を有する。
【０００２】
（技術背景）
サンプル中の分析物の存在を判定する能力は、有意の利益を有する。例えば、鉛、水銀、カドミウム、クロムおよびヒ素のような多くの金属および金属イオンは、飲用水源（water supply）中に存在するとき、有意の健康上のリスクをもたらす。飲用水および他の水源の汚染を防止するには、水処理プラントへ放出する前の産業廃棄流を試験することが一般的である。また、血液および身体組織に由来する液体のような生体液も各種分析物について試験して、身体が有害な因子に暴露されているかどうかまたは疾病症状が存在するかどうかを判定することができる。例えば、最近では、各種サンプル中の痕跡量の炭疽菌および他の生物学的有害因子を検出する必要が存在する。
比色分析法は、土壌、水、廃棄物流、生物学的サンプル、体液等中の金属およびイオンの検出において一般的に使用されている。原子吸光分析法のような分析法をベースとする計器と対比して、比色分析法は、迅速性を有し且つ装置または使用者熟練性の形での要求が殆どなされない傾向にある。例えば、増分濃度の硝酸(NO3-)イオンを含有する水性サンプルに添加したときに暗色のピンクを変色させる比色分析試験は、水槽管理者にとって利用可能である。この方法において、比色分析試験は、硝酸塩のような興味ある分析物がサンプル中に存在することを明らかにし、さらにまた、発生した色の特定の色合によってサンプル中の分析物の量の指標を提供し得る。
比色分析試験は、極めて有用であるが、限られた群の分析物に対しての存在でしかあり得ず、多くの場合、極めて少量または痕跡量の分析物を検出し得ず、サンプルの性質にもよるが、許容し得ないレベルの偽陽性または偽陰性結果を発生させ得る。偽陽性は、比色分析用試薬が、分析物が存在しないときに、分析物の存在に関連する色を発生させる場合に生じ；一方、偽陰性は、興味ある分析物はサンプル中に存在するが予測した色が発生しない場合に生じる。偽陽性は、多くの場合、比色分析試験が興味ある分析物と識別できないサンプル中の構成成分の結果である。偽陰性は、多くの場合、分析物と関連する色を発色する化学反応を干渉するサンプル構成成分に由来する結果である。
上記の説明から理解し得るように、痕跡量のより広い範囲の分析物を同定し得る比色分析試験が継続的に求められている。さらにまた、偽陽性および/または偽陰性結果のより低い発生率を有する比色分析試験は、有意の利益を提供するであろう。
【０００３】
（発明の開示）
本発明の１つの局面においては、核酸酵素、該核酸酵素に対する基質、第１の粒子、および侵襲性DNAを含むセンサー系を開示する。上記基質は第１のポリヌクレオチドを含み得、上記第１の粒子は上記第１の粒子と結合する第２のポリヌクレオチドを含み得る。上記侵襲性DNAは、第４のポリヌクレオチドを含み得る。第１のポリヌクレオチドは、第２および第４のポリヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性である。また、上記センサー系は、第１のポリヌクレオチドと少なくとも部分的に相補性である第３のポリヌクレオチドを含む第２の粒子も含み得る。
本発明のもう１つの局面においては、凝集物、サンプル、および侵襲性DNAを結合させて分析物に対する変色応答を検出することを含む分析物の検出方法を開示する。上記凝集物は、基質および第１の粒子を含み得る、また、上記凝集物は、第２の粒子およびエンドヌクレアーゼを含み得る。
本発明のもう１つの局面においては、第１のポリヌクレオチドおよび第１の粒子を含む凝集物を形成する系を含有する第１の容器と、侵襲性DNAを含有する第２の容器とを含む分析物の検出用キットを開示する。
【０００４】
本明細書および特許請求の範囲の明確且つ一貫した理解を提供するために、以下の定義を示す。
用語“サンプル”または“試験サンプル”とは、分析に供する、興味ある分析物を含有する疑いのある組成物として定義する。典型的には、分析用のサンプルは液体形であり、好ましくは、サンプルは水性混合物である。サンプルは、廃棄物流由来の産業的サンプル、或いは血液、尿または唾液のような生物学的サンプルのような任意の源に由来し得る。サンプルは、抽出物、希釈物、濾液または再構築沈降物のような産業的または生物学的サンプルの由来物である。
用語“分析物”とは、サンプル中に潜在的に存在する１種以上の物質として定義する。上記分析方法は、サンプル中に存在する分析物の存在、量または濃度を測定する。
用語“比色分析”とは、上記センサー系を構成する単数または複数の試薬が分析物の存在または不存在下に色変化を発生させる分析方法として定義する。
用語“感度”とは、センサー系が分析物を検出し得る下限濃度を称する。即ち、センサー系が分析物に対して感受性が高いほど、その系は、低濃度の分析物を検出するのに良好である。
用語“選択性”とは、センサー系が所望の分析物を他の種の存在において検出する能力を称する。
用語“ハイブリッド化”とは、第１のポリヌクレオチドが低緊縮条件下において少なくとも１種の第２のヌクレオチドと少なくとも１個の水素結合を形成する能力を称する。
【０００５】
（発明を実施するための最良の形態）
本発明は、添付図面および以下の説明を参照することによって、さらに良好に理解し得るであろう。添付図面中の各構成要素は必ずしも尺度合わせしていなく、また、分子またはその相互作用を正確に示すものではないが、代りに、本発明の原理を例証することに重点を置いている。
2002年5月10日に出願され、“Simple catalytic DNA biosensors for ions based on color changes”と題する関連出願の米国特許出願第10/144,679号においては、１つの局面において、加熱を使用して凝集物の分析物触媒性解離を促進させる比色分析センサーを開示している。この従来のセンサー系においては、サンプルをDNAザイム/基質/粒子凝集物に混合している。その後、混合物を加熱して、サンプルが選択した分析物を含む場合に、凝集物の解離を生じさせている。
本発明は、DNA-RNAザイム/基質/粒子凝集物への侵襲性DNAの添加により、上記凝集物の解離が加熱なしで促進され得るという発見を使用する。この方法において、選択した分析物に応答しての所望の色変化を室温において受け、それによって、米国特許出願第10/144,679号に開示されたセンサー系の欠点を克服するライトアップ(light-up)比色分析センサーを提供する。
図１は、サンプル１０２ (図示せず)中の分析物１０５の存在および必要に応じての該分析物の濃度を測定する比色分析方法１００を示す。１１０において、方法１００によりその存在/濃度を測定する分析物１０５を選択する。
１つの局面においては、分析物１０５は、以下でさらに説明するように、開裂反応において共同因子として作用し得る任意のイオンであり得る。+1形式酸化状態(I)（+1 formal oxidation state (I)）を有する好ましい１価の金属イオンとしては、Li(I)、Tl(I)およびAg(I)がある。+2形式酸化状態(II)を有する好ましい２価の金属イオンとしては、Mg(II)、Ca(II)、Mn(II)、Co(II)、Ni(II)、Zn(II)、Cd(II)、Cu(II)、Pb(II)、Hg(II)、Pt(II)、Ra(II)、Sr(II)、Ni(II)およびBa(II)がある。+3(III)、+4(IV)、+5(V)または+6(VI)の形式酸化状態を有する好ましい３価以上の金属イオンとしては、Co(III)、Cr(III)、Ce(IV)、As(V)、U(VI)、Cr(VI)、およびランタノイドイオンがある。より好ましい分析物イオンとしては、これらのイオンの生活生物体に対する毒性故の、Ag(I)、Pb(II)、Hg(II)、U(VI)およびCr(VI)がある。現時点において、とりわけ好ましい分析物イオンは、Pb(II)である。
【０００６】
分析物１０５を１１０で選択した時点で、１２０において、定向進化法(directed evolution)１２２を実施して、分析物の存在下に基質開裂を触媒作用し得るDNAザイム１２４またはRNAザイム１２６のような核酸酵素を分離し得る。定向進化法１２２は、好ましくは、分子をその他の構成成分と相互作用する能力に基づいて選択する生体外選択方法の１つのタイプである。定向進化法１２２の手順は、選択した分析物１０５の存在下に基質開裂の増強を示すDNA-RNAザイムが得られるように選定し得る(それによって、センサー感度が得られる)。また、上記手順は、選択した分析物の存在下で開裂示すがサンプル１０２中に存在する選択していない分析物および/または他の種の存在下でも開裂をさらに示すDNA-RNAザイムを除外するようにも選定し得る(それによって、センサー感度が得られる)。
定向進化法１２２は、所望の感度と選択性を有する所望の分析物の存在下に基質の開裂を触媒作用する核酸酵素を得る任意の選択定番法である。１つの局面においては、定向進化法１２２は、大収集量の、各々が種々の塩基変異体を有するストランド(例えば、1016配列変異体)を含むDNAライブラリーによって開始し得る。ホスホラミダイト(phosphoramidite)化学を使用してストランドを産生させ得る。その後、DNAライブラリーを、分析物に結合するストランドについてスクリーニングする。これらのストランドを分離し、PCRによるようにして増幅させる。その後、増幅ストランドを変異体化して変異を再導入する。次いで、これらのストランドを、分析物により効率的に結合するストランドについてスクリーニングし得る。選択、増幅および変異体シークエンスを、選択に必要な結合効率量を増大させながら繰返しことによって、分析物により効率的に結合し、それよってより高い感度を与えるストランドを産生させ得る。
１つの局面においては、生体外選択および進化と称する方法を使用して定向進化法１２２を実施し得る。この方法に関する詳細は、Breaker, R. R., Joyce, G. F., “A DNA enzyme with Mg2+-dependent RNA phosphoesterase activity.,” Chem. Biol. 1995, 2:655-660；およびJing Li, et al., “In Vitro Selection and Characterization of a Highly Efficient Zn(II)-dependent RNA-cleaving Deoxyribozyme.,” Nucleic Acids Res. 28, 481-488 (2000)において見出し得る。
【０００７】
もう１つの局面においては、特異的分析物に対するより高い選択性を有する核酸酵素は、定向進化法１２２に陰性選択法を導入することによって得ることができる。分析物に対する高選択性を有するストランドを選択した後、同様な選択、増幅および変異シークエンスを応用するが、選択するには、ストランドは、密接に関連する分析物に結合してはならない。
例えば、Pb(II)に特異的に結合するが、Mg(II)、Ca(II)、Co(II)または他の拮抗性金属イオンには特異的に結合しないDNAザイムを選択し得る。１つの局面においては、この選択を、Pb(II)に結合するDNAザイムを分離し、次いで、Mg(II)、Ca(II)またはCo(II)に結合するあらゆるDNAザイムを除去することによって達成し得る。もう１つの局面においては、Mg(II)、Ca(II)またはCo(II)に結合するDNAザイムを先ず廃棄し、次いで、Pb(II)に結合するDNAザイムを分離する。この方法において、DNAザイムの選択性を増強させ得る。DNAザイム選択性を増強させる方法に関する詳細は、Bruesehoff, P.J., et al., “Improving Metal Ion Specificity During In Vitro Selection of Catalytic DNA,” Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening, 5, 327-355 (2002)において見出し得る。
【０００８】
DNA-RNAザイム１２４、１２６は、共同因子の存在下に、加水分解性開裂のような化学反応を触媒作用する能力を有する核酸酵素である。DNAザイム１２４はデオキシリボヌクレオチドを含み、一方、RNAザイム１２６はリボヌクレオチドを含む。DNA-RNAザイム１２４１２６を構成するヌクレオチドは、天然、非天然または修飾核酸であり得る。また、ポリアミド主鎖とヌクレオシド塩基を含むペプチド核酸(PNA)(例えば、マサチューセッツ州ベッドフォードのBiosearch社から入手し得る)も有用であり得る。
下記の表は、特異的分析物、該分析物を開裂共同因子として利用する相応の核酸酵素配列を見出し得る添付図面、並びに各核酸酵素配列が記載されている文献(１以上)を記載している。図１０A〜１０Dおよび１０Gは、+2形式酸化状態を有する金属イオンに対して特異性であるトランス-作用性核酸酵素を示している。図１０K〜１０Lは、これも適切な核酸酵素として作用し得るトランス-作用性核酸酵素を示している。図１０E〜１０Fおよび１０H〜１０Jは、+2形式酸化状態を有する金属イオンに対して特異性であるシス-作用性核酸酵素を示している。図１０M〜１０Sは、これも適切な核酸酵素として作用し得るシス-作用性核酸酵素を示している。好ましくは、シス-作用性核酸酵素を、酵素１０M〜１０Qの右側に存在するGAAAループを開裂させることによるようにして、２本のストランド(切断型)に切断して、触媒系を得ることができる。任意のこれらおよび他の核酸配列を、DNA-RNAザイム１２４、１２６として使用するのに適合させ得る。トランス-およびシス-作用性酵素は、さらに図２Aに関連して説明する。
【０００９】
2008518633.tif 000003
2008518633.tif 000004
【００１０】
DNAザイムとRNAザイムは、共に、下記で説明する基質１３４のようなDNA系基質と二本鎖(duplex)を形成し得るものの、RNAザイム/基質二本鎖の方が、DNAザイム/基質二本鎖よりも低安定であり得る。さらに、DNAザイムは、そのRNAザイム対応物よりも合成するのが容易であり且つ堅牢である。
DNA１２４および相補性基質ストランド１３４のデオキシリボヌクレオチドは、これらの相応するリボヌクレオチドで置換し、それによってRNAザイム１２６を得ることができる。例えば、１個以上のリボシトシンでシトシンを置換し得、１個以上のリボグアニンでグアニンを置換し得、１個以上のリボアデノシンでアデノシンを置換し得、１個以上のウラシルでチミジンを置換し得る。この方法において、DNA塩基、RNA塩基またはその双方を含む核酸酵素を、個々に、DNA塩基、RNA塩基またはその双方を含む相補性基質ストランドとハイブリッド化させ得る。
１２０において適切な核酸酵素(１種以上)を選択した後、凝集物１３２を１３０において形成させ得る。凝集物１３２は、上記核酸酵素；基質１３４；およびオリゴヌクレオチド官能化粒子１３６を含む。その構成成分の物理的サイズを考慮すれば、凝集物１３２は、全く大きくあり得る。事実、透過電子顕微鏡(TEM)試験は、個々の凝集物が100nm〜1ミクロンの範囲にあり得、凝塊化してより大きめの構造体を形成し得ることを示唆している。
基質１３４は、分析物１０５の存在下の上記核酸酵素とハイブリッド化し得、また、上記核酸酵素によって開裂し得る任意のオリゴヌクレオチドであり得る。該オリゴヌクレオチドは、上記核酸酵素による上記基質の２つのフラグメントへの開裂を可能にする開裂種によって修飾し得る。１つの局面においては、基質１３４は、上記核酸酵素に対して相補性のストランドであり、延長させて各末端上に12量体オーバーハングを形成させ、オリゴヌクレオチド官能化粒子１３６とハイブリッド化させ得る。例えば、オリゴヌクレオチド官能化粒子が5'-CACGAGTTGACAの塩基配列を有する場合、基質における適切なオーバーハング配列は、3'-GTGCTCAACTGTであり得る。
【００１１】
粒子１３６は距離依存性光学特性を示すので、該粒子は、凝集物１３２に緊密に保持されている場合は１つの色であり、粒子間の距離が増大したとき色変化を受ける。例えば、粒子１３６が金ナノ粒子である場合、凝集物１３２は水溶液中では青色を呈し、この色は、解離が進行するにつれて赤色に変化する。解離は、官能化粒子１３６を一緒に保持している基質１３４を開裂させたときに生じ、それによって粒子を凝集物１３２から分離せしめる。粒子１３６が凝集物１３２から離散するにつれ、溶液は、青から赤に変化する。
粒子１３６は、距離依存性光学特性を示し且つ当該センサー系の操作と適合し得る任意の種であり得る。適切な粒子としては、金、銀、銅および白金のような金属；CdSe、CdS、およびZnSでコーティーングしたCdSまたはCdSeのような半導体；および、Josephson, Lee, et al., Angewandte Chemie, International Edition (2001), 40(17), 3204-3206に記載されている材料のような磁性コロイド状材料があり得る。特定の有用な粒子としては、ZnS、ZnO、TiO2、AgI、AgBr、HgI2、PbS、PbSe、ZnTe、CdTe、In2S3、In2Se3、Cd3P2、Cd3As2、InAsおよびGaAsがあり得る。
好ましい局面においては、上記粒子は、金(Au)ナノ粒子であり、5〜70ナノメートル(nm)または10〜50nmの平均直径を有する。現時点におけるとりわけ好ましい局面においては、10〜15nmの平均直径を有する金ナノ粒子をオリゴヌクレオチドに対して官能化させる。
金官能化オリゴヌクレオチドを調製するためのさらに詳細な処理については、米国特許第6,361,944号；Mirkin, et al., Nature (London) 1996, 382, 607-609；Storhoff, et al., J. Am. Chem. Soc. 1998, 20, 1959-1064；およびStorhoff, et al., Chem. Rev. (Washington, D. C.) 1999, 99, 1849-1862を参照されたい。金ナノ粒子が現在のところ好ましいが、距離依存性色変化を受ける染料、無機結晶体、量子ドット等のような他のフルオロフォアもオリゴヌクレオチドに結合させて使用し得る。
【００１２】
１４０において、１３０からの凝集物１３２を、サンプル１０２および侵襲性DNA１４４と結合させ得る。１５０において、サンプル１０２を色変化についてモニターする。色変化が生じなかった場合、分析物１０５は、サンプル１０２中に存在しない。色変化が１６０において生じた場合、分析物１０５は、サンプル１０２中に存在する。即ち、当該分析方法１００は、色変化が分析物１０５の存在下に生じるので、“ライトアップ”センサー系を提供する。
上記色変化は、分析物１０５が、オリゴヌクレオチド官能化粒子１３６とハイブリッド化している基質１３４の開裂を触媒作用する適切な共同因子であることを意味する。この開裂は、基質１３４を２つのフラグメントに分割し、それによって粒子１３６を凝集物１３２からサンプル１０２の溶液中に離散させるものと信じている。基質１３４のこの開裂は室温で進行すると信じられるが、基質の各開裂部分を形成する9個の塩基対の有意の部分は核酸酵素とハイブリッド化したままであることが教示されている。従って、解離が生じるためには、このハイブリッド形成を破壊することが好ましい。
侵襲性DNA１４４は、凝集物１３２を“侵襲”し、開裂基質フラグメントの放出を助長するものと信じている。何ら特定の理論によって拘束することは望まないけれども、平衡力により、基質１３４の開裂部分の部位に対する拮抗が上記核酸酵素と侵襲性DNA１４４との間に生じるものと信じている。この平衡は基質１３４と侵襲性DNA１４４とのハイブリッド化に有利に作用するので、基質１３４の開裂部分は、核酸酵素から引離され、それによって解離を促進させる。基質１３４の開裂部分が侵襲性DNA１４４とハイブリッド化するとき、結合粒子１３６は、凝集物１３２から離散し、所望の色変化をもたらす。用語“侵襲性DNA”を本明細書および特許請求の範囲の全体に亘って一貫して使用しているけれども、基質１３４がリボヌクレオチドを含む場合、侵襲性DNA１４４もリボヌクレオチドを含み得る。
【００１３】
侵襲性DNA１４４は、基質１３４の開裂フラグメントに対して少なくとも部分的に相補性である任意のオリゴヌクレオチドであり得るけれども、好ましくは、侵襲性DNA１４４は、比較的短いDNA片を含む。１つの局面においては、侵襲性DNA１４４は、各々が２つの開裂基質フラグメントの１つに対して少なくとも部分的に相補性である少なくとも２つのタイプのDNAストランドを含む。もう１つの局面においては、開裂基質フラグメントの各々の少なくとも１個の末端塩基は、侵襲性DNAストランドの各々の少なくとも１個の末端塩基に対して相補性である。さらにもう１つの局面においては、侵襲性DNA１４４は、各々が２つの開裂基質フラグメントの１つに対して十分に相補性である少なくとも２つのタイプのDNAストランドを含む。さらにもう１つの局面においては、侵襲性DNA１４４は、2〜10個または4〜8個(2、4、6または8個のような)少ない、相応する開裂基質フラグメントとハイブリッド化し得る塩基を有する。現時点においては、とりわけ好ましい侵襲性DNAストランドは、相応する開裂基質フラグメントよりも6個少ない相補性塩基を有する。
分析物１０５に応答しての色変化の度合は、１７０において、当業者にとって既知の比色分析定量法によって定量し得る。コロラド州ラブランドのHach社またはメリーランド州テェスタータウンのLaMotte社から入手し得るホイールのような各種の比色系ホイールを本発明における使用に適合させ得る。既知量の選択分析物を含有する標準サンプルを、試験サンプルに加えて分析して比較の精度を向上させ得る。高めの精度を所望する場合、種々のタイプの分光光度計を使用して、所望濃度範囲におけるビアー(Beer's)曲線をプロットし得る。その後、試験サンプルの色を、測定した試験サンプル中に存在する分析物の曲線および濃度と比較し得る、適切な分光光度計としては、Hewlett-Packard 8453およびBausch & Lomb Spec-20がある。
【００１４】
さらにもう１つの局面においては、方法１００は、分析物１０５を検出するための核酸酵素のようなエンドヌクレアーゼの感度および選択性を判定するように修正し得る。この局面においては、凝集物を、１３０において、基質１３４と粒子１３６から、DNA-RNAザイム１２４，１２６を含ませないで調製する。この凝集物を、１４０において、興味ある分析物および侵襲性DNAと結合させる。その後、定向進化法１２２によって産生させたもののようなエンドヌクレアーゼを添加する。該エンドヌクレアーゼが分析物１０５の存在下に所望の感度および選択性でもって基質１３４を開裂し得る場合、該エンドヌクレアーゼは、比色分析センサー系において分析物１０５について分析するのに使用し得る。この局面においては、上記エンドヌクレアーゼまたは核酸酵素も分析物とみなし得る。この方法において、定向進化法１２２により産生させた複数のエンドヌクレアーゼを、比色分析センサー系における使用について試験し得る。
図２Aは、共同因子としてのPb(II)に依存して触媒活性を示すDNAザイム２２４を示している。各塩基対から理解し得るように、DNAザイム２２４は、リボ-アデノシン２３５のような開裂種を含む相補性基質ストランド２３４にハイブリッド化し得る。リボ-アデノシン２３５開裂種を除いて、図示した相補性基質ストランド２３４は、デオキシリボヌクレオシドから形成されている。DNAザイムおよび相補性基質ストランドにおいて１つの塩基配列を示しているけれども、各塩基を双方のストランドにおいて変更してもその対合を維持し得る。例えば、いずれかのストランド上の任意のCは、対合塩基をGからAに変更する限り、Tに変更し得る。
DNAザイム２２４および相補性基質ストランド２３４の塩基対合領域は、十分な塩基が存在して基質の所望の開裂を維持する限りは、延長または切断し得る。酵素および基質に対する多くの修飾が可能であるが、酵素の触媒性コア領域に対してなされた修飾は、酵素の触媒有効性および分析物特異性に対して有意の効果を有し得る。そのような修飾および触媒活性に対して得られる効果のさらに詳細な説明は、Brown, A., et al., “A Lead-dependent DNAzyme with a Two-Step Mechanism,” Biochemistry, 42, 7152-7161 (2003)において見出し得る。
【００１５】
リボ-アデノシン(rA)２３５は開裂部位２３７を与え、この部位において、DNAザイム２２４は、図２Bに示すように、共同因子の存在下に基質２３４を加水分解的に開裂させるものと信じている。この開裂反応は、図２Bに示すように、3'および5'フラグメントに分割される基質２３４を生じる。リボ-アデノシン２３５以外に、これもDNAザイム２２４のようなDNAザイムと一緒に使用する開裂種としては、リボ-シトシン(rC)、リボ-グアニン(rG)およびウラシル(U)があり得る。同様に、核酸酵素がRNAザイムである場合(図示していない)、適切な開裂種としては、この場合も、rA、rC、rGおよびUがあり得る。
DNAザイム２２４と相補性基質ストランド２３４は、図２Aに示すように、別個のストランドであり得、或いは上記DNAザイムと上記基質は、同じ核酸ストランドの１部であり得る。上記DNAザイムと上記相補性基質が異なる核酸ストランドである場合、上記DNAザイムは、“トランス-作用性酵素”と称し得る。トランス-作用性酵素は、複数の相補性基質を開裂し得るという利点を有する。上記DNAザイムと上記相補性基質が、例えば、図１０Eに示しているような同じ核酸ストランドの１部である場合、上記DNAザイムは、“シス-作用性酵素”と称し得る。
図３Aは、Pb(II)分析物３０５および侵襲性DNA３４４の存在下での凝集物３３２の解離を示している。凝集物３３２は、3'および5'チオール-オリゴヌクレオチド官能化粒子３３６および３３７にそれぞれハイブリッド化しているDNAザイム３２４および基質ストランド３３４から形成されている。基質ストランド３３４は、3'-および5'-末端の双方において12個の塩基で延長されて、12量体DNA官能化粒子３３６、３３７とのハイブリッド化を可能にしていた。DNAザイム３２４の触媒性コアは、Pb(II)カチオンの存在下に高活性を示す“8〜17”DNAザイムモチーフを含む。
【００１６】
侵襲性DNA３４４は、3'ストランド３８７および5'ストランド３８６を含む。分析物３０５並びに侵襲性ストランド３８６および３８７の存在下において、青色凝集物３３２は、解離し始めて部分的凝集物３９０を形成する。この部分的解離は、粒子が凝集物３３２から離散するにつれ、青色溶液に赤色が加わり、それによって紫色溶液を生じる。十分量の分析物３０５がサンプル中に存在する場合、反応は、凝集物３３２が完全に解離して３９５を生じるまで続く。これによって、ナノ粒子間のより大きい距離故の赤色溶液を生じさせる。
粒子相互のアラインメント(尾部-尾部または頭部-尾部)は、凝集物を形成する成分が如何に緊密に一緒に結合するかに影響を与え得る。図３Aおよび３Bは、凝集物３３２をDNAザイム３２４および基質ストランド３４４から形成させて、３３６および３３７のような官能化粒子が尾部-尾部(図３B)配列で基質ストランド３４４とハイブリッド化し得ることを示している。尾部-尾部または頭部-尾部(図３C)ハイブリッド化は、粒子を結合させるオリゴヌクレオチドの末端を逆にすることによって選定し得る。即ち、頭部-尾部アラインメントは、３３７のような単一チオール修飾DNAストランドの使用により選定し得、一方、尾部-尾部アラインメントにおいては、3'-および5'-チオール修飾DNAストランドの双方を粒子にカップリングさせ得る。
現在のところ、図３Aおよび３Bの尾部-尾部ハイブリッド化配列の方が、図３Cの頭部-尾部ハイブリッド化配列はDNAザイムの触媒活性を立体的に妨げる凝集物を生成し得るので好ましい。しかしながら、この立体障害は、例えば、粒子の平均直径を小さくすることにより或いは長めの基質を使用することにより減じ得る。
【００１７】
サンプルのイオン強度は、凝集物を形成する成分が如何に緊密に一緒に結合するかに影響を与え得る。高めの塩濃度は凝集に有利に作用し、従って、センサー応答を示すが、低めの塩濃度は、凝集物を維持するのに必要なイオン強度を欠如し得る。１つの局面においては、サンプルは、30mＭ以上の１価金属イオン濃度を含み得、或いはそのような１価金属イオン濃度を含ませるように試薬によって改変し得る。サンプルのイオン強度は、例えば、Na+イオンにより改変し得る。好ましい局面においては、凝集物を含有するサンプルの１価金属イオン濃度は、28〜40mMである。現時点においてが、とりわけ好ましい１価金属イオン濃度は、約30mMである。また、pHも、おそらくは低pHでのポリヌクレオチド塩基対のプロトン化に起因して、凝集物結合性に影響を与え得る。１つの局面においては、およそ中性のpHが好ましい。
即ち、センサーの性能は、サンプルを凝集物と結合させる前に、サンプルのイオン強度およびpHを調整することによって改良し得る。サンプルによるが、サンプルまたは分析物を、凝集物を含有する溶液(イオン強度およびpHを調整し得る)に添加すること或いはその逆が好ましい。
上記基質、オリゴヌクレオチド官能化粒子および侵襲性DNAを含むセンサー系は、キットの形で提供し得る。１つの局面においては、キットは、基質に対して少なくとも部分的に相補性である所望の分析物特異性エンドヌクレアーゼまたは核酸酵素を含む。もう１つの局面においては、キットはエンドヌクレアーゼ/核酸酵素を除外し、その場合、エンドヌクレアーゼ/核酸酵素は使用者が調製するか或いは別途提供する。この局面においては、キットは、選択した分析物に対する種々のエンドヌクレアーゼの特異性および/または選択性を判定するのにも使用し得る。即ち、キットは、分析物の検出に加え、適切なエンドヌクレアーゼを選択するのにも使用し得る。さらにもう１つの局面においては、キットは、DNAザイム、相補性基質、オリゴヌクレオチド官能化粒子および侵襲性DNAを入れる外部パッケージを含む。
これらの成分の１以上を個々の容器に別々にしてもよく、或いはこれらの成分をその凝集状態で提供してもよい。別々にする場合、凝集物は、サンプルを導入する前に調製し得る。侵襲性DNAは、別個の容器中で保持し得、凝集物との結合前にサンプルに添加するようにし得る。さらに、緩衝液および/またはpH改良剤もキット中で提供してサンプルのイオン強度およびpHを調整し得る。
【００１８】
容器は、部分的にまたは全体的にプラスチック、ガラス、紙、ホイル、MYLARR、ワックス等から形成し得るボトル、小型容器、小袋、封筒、チューブ、アンプル等の形状であり得る。容器は、当初は容器の１部であり得るか或いは機械的、接着または他の手段により容器に取付け得る全体的にまたは部分的に脱着可能な蓋を備え得る。また、容器は、シリンジ針による内容物へのアクセスを可能にするストッパーを備え得る。１つの局面においては、外部パッケージは紙またはプラスチックから製造し得、一方、容器はガラスアンプルである。
外部パッケージは、各構成成分の使用に関する使用説明書を含み得る。また、比色計；分析物の10μm溶液のような標準分析物溶液；並びに、薄層クロマトグラフィー(TLC)プレート、試験管およびキュベットのような目視助材も含ませ得る。取外して混合を可能にする膜によって分離された２以上のコンパートメントを有する容器も含ませ得る。また、外部パッケージは、分析用のサンプルの調製を可能にするフィルターおよび希釈用試薬を含み得る。
もう１つの局面においては、本発明のセンサー系以外に、キットは、分析物測定の信頼度をさらに高めるための、また、使用者誤操作の可能性を減じるための複数のセンサー系も含ませ得る。１つの局面においては、本発明に従う複数のライトアップセンサー系を含ませ得る。もう１つの局面においては、“ライトダウン(light-down)”センサー系を、本発明のライトアップセンサー系と一緒に含ませ得る。
【００１９】
本発明で特許請求しているセンサー系は、色変化(青色から赤色へ)が分析物の存在下に生じるので、ライトアップセンサーとみなし得る。逆に、ライトダウンセンサー系においては、色変化は、分析物の存在下において観測されない。即ち、ライトアップ系が、分析物が存在しないときに、ライトアップにより偽結果を示し得るのに対し、ライトダウンセンサー系は、分析物が存在するとき、色変化を受けない。ライトダウン化学を使用するセンサー系を本発明で特許請求しているライトアップセンサーと組合せることにより、不正確な分析物測定の可能性を減じ得る。
本発明で特許請求しているキットに含ませるための適切なライトダウンセンサーは、選択した分析物の存在下で形成されないDNAザイム/基質/粒子凝集物に依存し得る。即ち、これらのセンサーにおいては、凝集物形成による色変化は、選択した分析物がサンプル中に存在しないときに観測される。１つの局面においては、これらのライトダウンセンサーは、約43nmの平均直径を有するナノ粒子と結合させた尾部-尾部粒子配列に依存して、分析物の不存在下に室温で凝集を生じさせ得る。本発明で特許請求するキットに含ませるための適切な、ライトダウンセンサー系のさらに詳細な説明は、例えば、2004年1月13日に出願され、“Biosensors Based on Directed Assembly of Particles”と題する米国特許出願第10/756,825号において見出される；該米国特許出願は、参考として本明細書に合体させる。
上記の説明は、本発明の範囲を説明した好ましい実施態様に限定するものではなくて、むしろ当業者が本発明を実施し使用することを意図する。同様に、以下の実施例も、特許請求の範囲またはその等価物を限定するものとして解釈すべきでなく、単なる例として提示する。多くの変更が下記の手順に対してなされ得、これらの変更は、特許請求の範囲およびその等価物に属するものと理解すべきである。
【００２０】
（実施例）
DNAサンプルは、全て、アイオワ州コーラルビルのIntegrated DNA Technology社から購入した。基質およびDNAザイムの酵素部分は、使用前に、HPLCによって精製した。13nmの平均直径を有する金ナノ粒子を製造し、例えば、Storhoff, J., et al., “One-pot colorimetric differentiation of polynucleotides with single base imperfections using gold particle probes,” JACS 120: 1959-1964 (1998)に開示されている手法のような文献手法に従い、12量体チオール修飾DNAにより官能化した。金ナノ粒子の平均直径は、透過型電子顕微鏡(JEOL 2010)により検証した。
【００２１】
実施例１
青色凝集物の調製
酵素(17E、400nM)、基質(35SubAu、100nM)、3´DNAAu (6nM)および5´DNAAu (6nM)を、25mM Tris酢酸緩衝液、pH 8.2、300mM NaClと混合した。混合物(通常、1mL容量で)を65℃に3分間加熱し、室温におよそ4時間でゆっくり冷却させた。青色ナノ粒子凝集物が生じ、沈降した。必要に応じて、凝集物を卓上遠心分離機によりさらに沈降させて、上清を除去した。沈降凝集物を、100mM NaClおよび25mM tris酢酸を含有する緩衝液(pH 8.2)で3回洗浄し、200μLの新鮮25mM tris酢酸緩衝液(100mM NaClを含む)中に再分散させた。
この未希釈混合物中の凝集物濃度を、10μLの上記凝集物含有混合物を80μLの脱イオン水に添加して凝集物を分散させることによって標準化した。その後、この9倍希釈混合物の消光を522nmで測定した。この測定から、522nmで1の消光値を得るのに必要な緩衝溶液の量を未希釈混合物について算出した。その後、100mMのNaClを含有する緩衝液の適切量を未希釈混合物に添加した。この方法において、緩衝溶液中の凝集物濃度を、解離したとき、混合物が522nmで9倍希釈後に~9または~1の消光をもたらすように調整した。
5'DNAAu (SEQ ID NO：4)および 3'DNAAu (SEQ ID NO：5)オリゴヌクレオチド官能化金ナノ粒子にハイブリッド化させた17E DNAザイム (SEQ ID NO：1)および12個塩基35SubAu (SEQ ID NO：3；rは１個のリボンヌクレオチドを示す)により各末端において延長した17DS基質(SEQ ID NO：2；rは１個のリボンヌクレオチドを示す)の各配列を下記の表１に示す。
【００２２】
【表１】
2008518633.tif 000005
【００２３】
実施例２
分析物および侵襲性DNAの添加
21mMのNaCl、25mMのtirs酢酸塩(pH 8.2)、2.25μMの侵襲性DNA、および試験サンプル中で所望するよりも12.5%高い濃度のPb(OAc)2を含む80μLの溶液を、実施例１からの凝集物を含有する10μLの100mM NaCl溶液と混合した。得られた試験サンプルは、30mM NaCl、2 μM 侵襲性DNAおよび所望Pb(II)濃度の濃度を有していた。溶液の色変化を、約5分後、〜22℃で判定した。
【００２４】
実施例３
センサー性能のモニタリング
実施例２からのサンプルの色変化をUV-vis消光分光測定によってモニターした。図４は、解離中のサンプルから特定波長で得られた消光比に関するグラフである。図４における点線は、分離した13nmのナノ粒子が示す、深赤色を呈する522nmでの強い消光ピークを示している。図４における実線から理解し得るように、凝集時においては、522nmピークは、強度的に低下し、より長めの波長へシフトしているが、700nm領域での消光は増大し、赤色-青色変化をもたらしている。従って、522〜700nmでの高めの消光比は、分離ナノ粒子の赤色に関連し、一方、低消光比は、凝集ナノ粒子の青色に関連している。この消光比を使用してナノ粒子の凝集状態をモニターした。
図５Aは、侵襲性DNA (Inva)およびPb(II)を含有するサンプル(○)、侵襲性DNA (Inva)を含有するがPB(II)を含まないサンプル(▲)、およびPb(II)を含有するが侵襲性DNAを含まない対照サンプル(■)における経時的消光比の変化を示すグラフである。図５Bは、Inva-AストランドをInvaストランドの代りに使用した同様なグラフである。消光比は、侵襲性DNA/Pb(II)サンプルにおいて時間と共に急速に増大し、青から赤への急速色変化およびPb(II)分析物の存在を示していた。しかしながら、侵襲性DNAのみのサンプルにおいては、青から赤への色変化は、消光比の遅い増大によって示される遅い速度で生じていた。この試験により、望ましくない色変化がInvaまたはInva-Aのいずれかの侵襲性DNAストランド単独により生じ得ることを確証した。即ち、“侵襲性”過ぎるDNAは、分析物(共同因子)なしで凝集物の解離をもたらし得、色変化の偽陽性または望ましくない背景値を生じ得る。侵襲性DNAおよびPb(II)を含まない対照は、消光比の極めて遅い増大を示し、色変化を殆ど示さなかった。
これらの試験は、分析物を検出するに当ってのセンサー系の有用性を実証したが、侵襲性DNAの適切な侵襲性の選定が、背景色変化を減じ且つ偽陽性を生じる性向を減じたセンサーを提供し得ることを示唆していた。
【００２５】
実施例４
侵襲性DNAの侵襲性の純化
侵襲性の低いDNAを見出すために、減少数の塩基対合を有しDNA基質の開裂フラグメントを含む１連の侵襲性DNAストランドを以下のようにして試験した。合成石英UV-vis分光光度計セル(ドイツのHellma社)を、ブランクとして、60.3μLの25mM tris酢酸(pH 8.2)、17μLの100mM NaCl-25mM tris酢酸(pH 8.2)、1.8μLの0.1mM 侵襲性DNAおよび1μLの1mM Pb(OAc)2を混合することによって準備した。ベースライン測定後、10μLの実施例１からの凝集物混合物をセルに添加した。この添加により、各DNAストランドにおいて、30mMの最終NaCl濃度および2μMの最終侵襲性DNA濃度を得た。最終Pb(II)濃度は、10μMであった。Pb(II)分析物を含まないサンプルも、60.3μLの代りに61.3μLの25mM tris酢酸(pH 8.2)緩衝液を添加してサンプル容量を構築した以外は、同様にして調製した。
上記で該略したようにして調製した好ましい塩基対合低減侵襲性DNAストランドは、下記の表２に、Inva-2 (SEQ ID NO：8およびSEQ ID NO：9,、それぞれ、左から右)、Inva-4 (SEQ ID NO：10およびSEQ ID NO：11)、Inva-6 (SEQ ID NO：12およびSEQ ID NO：13)、およびInva-8 (SEQ ID NO：14およびSEQ ID NO：15)として記載している。Invaは、図５Aにおけるデータを生じるように使用した22量体侵襲性DNAストランド(SEQ ID NO：6およびSEQ ID NO：7)を称する。好ましい配列の基礎をなす初期Invaストランドは、基質の開裂フラグメントに対して完全相補性である。
【００２６】
【表２】
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【００２７】
試験したさらなる塩基対合低減侵襲性ストランドは、下記の表３に、Inva-2A (SEQ ID NO：18およびSEQ ID NO：19、それぞれ、左から右)、Inva-4A (SEQ ID NO：20およびSEQ ID NO：21)、Inva-6A (SEQ ID NO：22およびSEQ ID NO：23)、およびInva-8A (SEQ ID NO：24およびSEQ ID NO：25)として記載している。Inva Aは、実施例３において使用し図５Bにおけるデータを生じさせるための23および21量体侵襲性DNAストランド(SEQ ID NO：16およびSEQ ID NO：17)を称する。上記さらなる配列の基礎をなす初期Inva-Aストランドは、基質の各開裂フラグメントに対し部分的に相補性であり、各ストランドは１個の塩基によって“オフセット”である。即ち、23量体侵襲性Inva-Aストランドは1個の“余分”な塩基を含むのに対し、21量体侵襲性Inva-Aストランドは、開裂基質フラグメントよりも１個少ない塩基を含む。この方法において、“不整合”を侵襲性Inva-Aストランドと開裂基質フラグメント間に生じさせる。
【００２８】
【表３】
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【００２９】
図６Aおよび６Bは、Pb(II)分析物を含むまたは含まない短縮された(原InvaまたはInva-Aストランドに対して)侵襲性DNAストランドの各々における、時間の関数としての消光比の変化をプロットしたグラフである。各ストランドが短縮し、基質の開裂部分を含む塩基対合数が減少するにつれて、Pb(II)分析物の不存在下での色変化速度は低下していた。色変化の速度は、同じ侵襲性DNAにおいては、Pb(II)分析物の存在下において常に速く、従って、分析物を検出するセンサーの能力が確証された。
好ましいInva DNA配列は、開裂基質の２つのフラグメントの各々に対して完全に相補性であり、一方、さらなるInva-A DNA配列は、部分的に相補性であり、1個の塩基により不整合型である。完全相補性Invaストランドまたは不整合型Inva-Aストランドにおいて塩基対合数を減少させることにより、DNAの全体的侵襲性は低下し、分析物不存在下で背景色変化レベルの望ましい低下がもたらされるものの、塩基低減Inva-6ストランドは、分析物の存在下において迅速な解離速度を維持していた。
即ち、基質の開裂部分よりも６個少ない塩基を有するInva-6ストランドを、分析物に応答しての色変化の速度と侵襲性DNA単独解離に起因する背景色変化レベル間の最良の妥協物として選択した。これらの理由により、Inva-6ストランドを使用してセンサーの感度および選択性を試験した。
何ら特定の理論によって拘束することは望まないが、相補性塩基対合数は、侵襲性に対しより大きな効果(熱力学的制御)を有し；一方、解離速度は、開裂基質フラグメントの各末端の侵襲性DNAストランドと初期にハイブリッド化する能力(動的制御)により強く依存しているものと信じている。侵襲性DNAのこれらのパラメーターを改変することにより、背景レベルおよび色変化速度は、特定のDNA-RNAザイムおよび/または分析物において最適にし得る。
侵襲性DNAストランドの塩基数を開裂基質フラグメントと対比して減少させることによって相補性を低下させること以外に、他の相補性低下方法も使用し得る。例えば、侵襲性DNAストランドは、開裂基質フラグメントの塩基と有効にはハイブリッド化しない塩基を含み得る。もう１つの局面においては、基質と侵襲性DNAを集合させる塩基を、他の塩基対と対比して弱くハイブリッド化するように選定する。また、当業者にとって既知であるような、開裂基質フラグメントと侵襲性DNAストランド間のハイブリッド化強度の他の低下方法も使用し得る。
【００３０】
実施例５
センサーの選択性および感度の確認
合成石英UV-vis分光光度計セル(ドイツのHellma社)内で、60.3μLの25mM tris酢酸(pH 8.2)、17μLの100mM NaCl-25mM tris酢酸(pH 8.2)、1.8μLの0.1mM Inva-6侵襲性DNAおよび1μLの金属塩含有0.5mM溶液を混合した。以下の金属塩を含む各サンプルを調製した：Pb(OAc)2、CoCl2、ZnCl2、CdCl2、NiCl2、CuCl2、MgCl2、およびCaCl2。ベースライン測定後、10μLの実施例１からの凝集物混合物を各セルに添加した。この添加により、30mMの最終NaCl濃度、各DNAストランドにおける2μMの最終Inva-6侵襲性DNA濃度、および各試験金属における5μMの最終金属イオン濃度を得た。完全分散後、522nmでの消光は、〜1であった。
各金属イオンにおける分散速度を、Hewlett-Packard 8453分光光度計を使用して時間の関数としてモニターした。図７Aは、時間の関数としてプロットした522および700nmでの消光比を示すグラグである。各プロットから理解し得るように、Pb(II)のみが時間の関数としての消光比の有意の増大を示したが、他の金属イオンZn(II)、Co(II)、Cd(II)、Mg(II)、Cu(II)、Ni(II)およびCa(II)は、背景と一致した色変化を生じていた。従って、センサーの高選択性は、確認された。
図７Bは、凝集5分後の、センサー系の色変化において観測した消光比とPb(II)分析物の濃度間の相関を示すグラフである。センサー系の例外的な直線性は、約0.1〜約2μMから明白である。図７Cは、Inva-6による10分間に亘っての複数のPb(II)分析物濃度における消光比を示すグラフである。該グラフは、センサー系の種々の分析物濃度を数分以内で有効に識別する能力を実証している。即ち、センサー系の正確な定量的情報を提供する能力が確証された。
図７Bの機器による方法以外に、当該センサーによって発色させた色は、センサー溶液をアルミナTLCプレート上に点滴することによっても好都合に観測された。青色から赤色への色進行は、Pb(II)の濃度が0から10μMに増大したときに観測された。他の金属イオンは、背景と同様な色を呈した。
【００３１】
実施例６
センサーにおける好ましいイオン強度環境の測定
実施例１からの凝集物の急速分散を容易にするため、凝集物をNaCl含有緩衝液中に懸濁させて凝集物を安定化させ得る最低NaCl濃度を測定した。図８は、凝集物のNaCl依存安定性を示すグラフである。データは、Hewlett-Packard 8453分光光度計において獲得した。緩衝液は、20、25、30および40mMのNaCl濃度を有する25 mM Tris酢酸、pH 7.6であった。サンプル容器が96ウェルプレートの代りに石英UV-visセルであったため、消光比は、前の実施例において得られた値と異なっている。半時間以内で、凝集物は、NaCl濃度が約30mMおよびそれ以上であったときに安定であった。従って、30mM NaCl溶液を、センサー応答時間に対し実質的な悪影響を有しないで凝集物を安定化させる適切なイオン強度を有するものとして選定した。
実施例７
凝集物の特性決定
図９は、DNAザイム集合化13mm金ナノ粒子凝集物の透過電子顕微鏡(TEM)画像である。スケール棒は、200nmに相当する。この画像から、凝集物が実質的数の金ナノ粒子を含有することが明白である。
【００３２】
当業者であれば、上記の説明、図面および実施例から、本発明の好ましい実施態様に対する修正および変更が、特許請求の範囲において定義した本発明の範囲およびその等価物から逸脱することなくなし得ることは、承知であろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】サンプル中の分析物の存在および必要に応じての分析物の濃度を測定する比色分析方法を示す。
【図２Ａ】共同因子としてのPb(II)に依存して触媒活性を示すDNAザイムを示す。
【図２Ｂ】DNAザイムによるDNA系基質の開裂を示す。
【図３Ａ】Pb(II)分析物および侵襲性DNAの存在下での凝集物の解離を示す。
【図３Ｂ】オリゴヌクレオチド官能化粒子によるDNA系基質の尾部-尾部ハイブリッド化を示す。
【図３Ｃ】オリゴヌクレオチド官能化粒子によるDNA系基質の頭部-尾部ハイブリッド化を示す。
【図４】凝集(実線)および解離(点線)金ナノ粒子によってサンプルから発出した光の波長に対する消光比に関するグラフである。
【図５Ａ】侵襲性DNA (Inva)およびPb(II)を含有するサンプル(○)、侵襲性DNA (Inva)を含有するがPB(II)を含まないサンプル(▲)、およびPb(II)を含有するが侵襲性DNAを含まない対照サンプル(■)における経時的消光比の変化を示すグラフである。
【図５Ｂ】侵襲性DNA (Inva-A)およびPb(II)を含有するサンプル(○)、侵襲性DNA (Inva-A)を含有するがPb(II)を含まないサンプル(▲)、およびPb(II)を含有するが侵襲性DNAを含まない対照サンプル(■)における経時的消光比の変化を示すグラフである。
【図６Ａ】Pb(II)分析物を含むまたは含まない短縮された(原Invaストランドに対して)好ましい侵襲性DNAストランドの各々における、時間の関数としての消光比の変化をプロットしたグラフである。
【図６Ｂ】Pb(II)分析物を含むまたは含まない短縮された(原Invaストランドに対して)別の侵襲性DNAストランドの各々における、時間の関数としての消光比の変化をプロットしたグラフである。
【図７Ａ】複数の金属カチオンにおける時間の関数としてプロットした522および700nmでの消光比を示すグラグである。
【図７Ｂ】5分後の、センサー系の色変化において観測した消光比とPb(II)分析物の濃度間の相関を示すグラフである。
【図７Ｃ】Inva-6による10分間に亘っての複数のPb(II)分析物濃度における消光比を示すグラフである。
【図８】金ナノ粒子凝集物のNaCl依存安定性を示すグラフである。
【図９】DNAザイム集合化13mm金ナノ粒子凝集物のTEM画像写真である。
【図１０Ａ−１０Ｓ】各々、触媒開裂反応における共同因子として特定の分析物を使用した核酸酵素を示す。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【図１０Ｈ】
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【図１０Ｉ】
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【図１０Ｊ】
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【図１０Ｋ】
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【図１０Ｌ】
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【図１０Ｍ】
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【図１０Ｎ】
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【図１０Ｏ】
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【図１０Ｐ】
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【図１０Ｑ】
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【図１０Ｒ】
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【図１０Ｓ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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