(57)【要約】本発明は、Ｎｏｇｏレセプター（ＮｇＲ１）の機能モチーフに関する新規の単離および精製されたポリヌクレオチドおよびポリペプチド、ならびにＮｇＲ１リガンド（例えば、ミエリン結合糖タンパク質、希突起神経膠細胞ミエリン糖タンパク質、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−６６、Ｎｏｇｏレセプターに対する抗体、ＧＴ１ｂに対する抗体、ｐ７５ニュートロフィンレセプターに対する抗体およびＬｉｎｇｏ−１に対する抗体など）に対するアンタゴニストとしてこれらの機能モチーフを模倣するペプチドを使用することに関する。本発明はまた、模倣ペプチドアンタゴニストに対する抗体を提供する。本発明は、新規の治療および治療標的、ならびに軸策再生を必要とする処置（すなわち、ＮｇＲ１に結合するＮｇＲ１リガンドの効果（すなわち、軸策成長の阻害をもたらす）を逆転する）のための試験化合物をスクリーニングおよび評価する方法にさらに関する。
2008540339.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＫＦＲＧ、アミノ酸配列ＧＲＦＫ、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびこれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸を含むポリペプチドを含む、ＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニスト。
【請求項２】
前記アンタゴニストが、少なくとも１つのＤアミノ酸を含む、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項３】
前記ポリペプチドが環化されている、請求項１に記載のアンタゴニスト。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、ホモデティック環化を介して環化されている、請求項３に記載のアンタゴニスト。
【請求項５】
前記アンタゴニストが、少なくとも１つのＤアミノ酸を含む、請求項４に記載のアンタゴニスト。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、配列番号３７のアミノ酸配列またはその活性フラグメントを含む、請求項５に記載のアンタゴニスト。
【請求項７】
前記ポリペプチドが、ジスルフィド結合を介して環化されている、請求項３に記載のアンタゴニスト。
【請求項８】
前記ポリペプチドが、配列番号３１のアミノ酸配列、配列番号３２のアミノ酸配列、配列番号３３のアミノ酸配列、配列番号３４のアミノ酸配列、およびその活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、請求項７に記載のアンタゴニスト。
【請求項９】
前記アンタゴニストが、少なくとも１つのＤアミノ酸を含む、請求項８に記載のアンタゴニスト。
【請求項１０】
ＮｇＲ１のアンタゴニストと競合する化合物についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）ＮｇＲ１リガンドとアンタゴニストとを含むサンプルを化合物と接触させる工程であって、該アンタゴニストは、アミノ酸配列ＫＦＲＧ、アミノ酸配列ＧＲＦＫ、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびその活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む工程；および
（ｂ）該サンプル中のＮｇＲ１リガンドとアンタゴニストとの間の相互作用が、該化合物と接触していないサンプル中のＮｇＲ１リガンドとアンタゴニストとの間の相互作用と比較して低下するか否かを決定する工程
を含む方法であって、ここで該化合物と接触されたサンプル中のＮｇＲ１リガンドとアンタゴニストとの相互作用の低下は、該化合物を該アンタゴニストと競合するものとして同定する、
前記方法。
【請求項１１】
前記化合物が、少なくとも１つのＮｇＲ１リガンドをアンタゴナイズするものとしてさらに同定される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
サンプル中の軸策成長の阻害をアンタゴナイズする方法であって、
該サンプルを少なくとも１つのＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストと接触させる工程
を含む方法。
【請求項１３】
前記少なくとも１つのＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストが、ＮｇＲ１の機能モチーフを模倣するペプチドである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
サンプル中の軸策成長の阻害をアンタゴナイズする方法であって、
アミノ酸配列ＫＦＲＧ、アミノ酸配列ＧＲＦＫ、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびそれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むアンタゴニストと、サンプルとを接触させる工程を含む、サンプル中の軸策成長の阻害をアンタゴナイズする方法。
【請求項１５】
前記軸策成長の阻害が、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドによって媒介される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記軸策成長の阻害のアンタゴナイズが、軸策の再生をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストの有効量を該被験体に投与する工程
を含む、被験体において軸策成長の阻害をアンタゴナイズする方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストが、ＮｇＲ１の機能モチーフを模倣するペプチドである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
被験体において軸策成長の阻害をアンタゴナイズする方法であって、有効量のアンタゴニストを該被験体に投与する工程
を含み、該アンタゴニストが、アミノ酸配列ＫＦＲＧ、アミノ酸配列ＧＲＦＫ、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびそれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、
前記方法。
【請求項２０】
前記軸策成長の阻害が、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドによって媒介される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
軸策成長の阻害のアンタゴナイズが、軸策の再生をもたらす、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記被験体が、中枢神経系へ損傷を受けている、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記損傷が、脳卒中に起因するものである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記被験体が、神経変性疾患に罹患している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記神経変性疾患が、多発性硬化症、パーキンソン病、およびアルツハイマー病からなる群より選択される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
薬学的に許容可能なキャリアとアンタゴニストとを含有する医薬組成物であって、該アンタゴニストは、アミノ酸配列ＫＦＲＧ、アミノ酸配列ＧＲＦＫ、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびそれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、前記医薬組成物。
【請求項２７】
配列番号２のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列、およびそれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニスト。
【請求項２８】
前記ポリペプチドが、環化されている、請求項２７に記載のアンタゴニスト。
【請求項２９】
前記ポリペプチドが、ジスルフィド結合を介して環化されている、請求項２８に記載のアンタゴニスト。
【請求項３０】
配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７、およびそれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合し得る単離された抗体。
【請求項３１】
前記抗体が、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストを含む免疫原への応答において産生される、請求項３０に記載の抗体。
【請求項３２】
少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストに特異的に結合し得る単離された抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願）
本出願は、２００５年４月２９日出願の米国仮特許出願番号６０／６７５，９０２（これは、本明細書においてその全体が参考として援用される）の優先権の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、Ｎｏｇｏレセプター１（ＮｇＲ１）の機能モチーフおよびそれに関するペプチド模倣物（ｍｉｍｅｔｉｃ）に関し、そのうちのどちらもＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストとして使用され得、そして例えば、軸策再生の必要がある被験体を処置する際（例えば、このようなＮｇＲ１リガンドによって仲介される軸策成長の阻害をアンタゴナイズする（例えば、逆転する（reversing）、低下する（decreasing）、低減する（reducing）、妨げる（preventing）など）ため、およびＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストとしても作用してこのような阻害の逆転（reversal）を達成し得る化合物についてスクリーニングするため）に、有用であり得る。
【０００３】
（関連する背景分野）
中枢神経系は、損傷後の修復が非常に限定されている。このことは、軸策再生を妨げる、損傷を受けたミエリンと関連する阻害産物が存在することに、少なくとも部分的には起因すると仮定されている（Berry (1982) Bibl. Anat. 23:1-11：非特許文献１）。この分野の初期の研究から、ラット中枢ミエリン（central myelin）由来の阻害活性を含む２種のタンパク質画分が同定され（Caroni and Schwab (1988) Neuron 1(1): 85-96：非特許文献２）、そしてこれらの画分に対して惹起した抗体は、中枢ミエリンの非許容基質特性を中和し得ることが実証された（Caroni and Schwab (1988) J. Cell Biol. 106(4):1281-88：非特許文献３）。さらに、動物における抗体送達および免疫療法のストラテジーは、損傷を受けた中枢神経系内の再生が、ミエリンインヒビターの活性を打ち消すことによってある程度得られるということの「概念を証明する（proof-of- concept）」証拠を提供している（Bregman et al. (1995) Nature 378:498-501：非特許文献４； Schnell and Schwab (1990) Nature 343:269-72：非特許文献５）。
現在までに、以下の３種のミエリン分子が、軸策成長の強力なインヒビターであると報告されている：１）ミエリン結合糖タンパク質（ＭＡＧ）（McKerracher et al. (1994) Neuron 13(4):805-11：非特許文献６； Mukhopadhyay et al. (1994) Neuron 13(3):757- 67：非特許文献７）、２）Ｎｏｇｏ（例えば、Ｎｏｇｏ−Ａ（例えば、Ｎｏｇｏ−Ａの６６残基の細胞外ドメイン（Ｎｏｇｏ−６６））（Chen et al. (2000) Nature 403:434-39：非特許文献８; GrandPre et al. (2000) Nature 403:439-44：非特許文献９; Prinjha et al. (2000) Nature 403:383-84：非特許文献１０）、および３）希突起神経膠細胞ミエリン糖タンパク質（Wang et al. (2002) Nature 417:941-44：非特許文献１１）。Ｎｏｇｏレセプター１（ＮｇＲ１）を含むニューロン中のレセプター複合体（Domeniconi et al. (2002) Neuron 35(2):283-90：非特許文献１２； Fournier et al. (2001) Nature 409:341-46：非特許文献１３; Liu et al. (2002) Science 297:1190-93：非特許文献１４; Wang et al. (2002) Nature 420:74-78：非特許文献１５）、ガングリオシドＧＴ１ｂ（Collins et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(2): 1248-55：非特許文献１６; Vinson et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(23):20280-85：非特許文献１７）、低親和性ｐ７５ニューロトロフィンレセプター（ｐ７５ＮＴＲ）（Wang et al. (2002) Nature 420:74- 78：非特許文献１５; Wong et al. (2002) Nat. Neurosci. 5(12): 1302-08：非特許文献１８）、およびＬｉｎｇｏ−１（Mi et al. (2004) Nat. Neurosci. 7(3):221-28：非特許文献１９）は、全ての３種の阻害分子に対する反応の媒介に関係付けられている。重要なことに、レセプター複合体へ結合することが、各インヒビターが阻害活性を媒介するために必要とされる。
【０００４】
多くの研究が、潜在的な治療標的としてのＮｇＲ１の重要性を示している（McGee and Strittmatter (2003) Trends Neurosci. 26(4): 193- 98：非特許文献２０）。例えば、ＮｇＲ１の可溶性細胞外ドメインは、多くの範例においてミエリンの阻害活性をアンタゴナイズすることができ（Fournier et al. (2002) J. Neurosci. 22(20):8876-83：非特許文献２１）、Ｎｏｇｏ−Ａに由来するペプチド（例えば、Ｎｏｇｏ−６６のフラグメント（例えば、ＮＥＰ１−４０））もまた、おそらくレセプターを活性化するのではなくレセプターに結合することによって、軸策再生を促進する（GrandPre et al. (2002) Nature 417:547-51：非特許文献２２）。ＮｇＲ１は、顕著なロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインを有し、このドメインは９個の相同性の高いＬＲＲモジュラーをキャップ形成するアミノ酸末端およびカルボキシ末端のＬＲＲモジュラーで構成される。２つのグループが、最近、この結晶構造を決定している（Barton et al. (2003) EMBO J. 22(13):3291-302：非特許文献２３; He et al. (2003) Neuron 38(2): 177-85：非特許文献２４）。欠失分析の研究から、上記レセプターの完全なＬＲＲドメインは、Ｎｏｇｏ−６６、ＭＡＧ、およびＮｇＲ１がそれ自身と結合するのに重要であることが示唆されている。
【０００５】
１種以上のＮｇＲ１リガンド（このリガンドは、軸策成長インヒビターでもあり得る）とＮｇＲ１との相互作用および／またはより高次のレセプター−シグナル伝達複合体の形成に干渉する因子は、例えば、ＮｇＲ１リガンド媒介性の軸策成長阻害をアンタゴナイズする（例えば、逆転する、低下する、低減する、妨げる、など）ための治療上の可能性を有し得、および／または有用な生物学的なツールであり得る。この文脈において、機能モチーフがＮｇＲ１上で同定することができる場合、生物学的に活性なペプチド模倣物が、特異的なアンタゴニストとして開発され得るか、または薬物を見出すプロセスにおいて有用なツールとして役立つ場合がある（一般的には、例えば、Hruby (2002) Nat. Rev. Drug Discov. 1(11):847-58：非特許文献２５を参照のこと）。しかし、従来の欠失変異誘発によって小さい機能モチーフを同定する試みは、制限されている。なぜならば、ＮｇＲ１の全体的に「バナナ」のような形状の構造が、ロイシンリッチリピート内の変異によって簡単に乱される可能性があるからである。本発明は、欠失変異誘発分析によって直面する問題を回避し、ＮｇＲ１の機能モチーフを同定する。従って、本発明は、例えば、ＭＡＧ、希突起神経膠細胞ミエリン糖タンパク質、Ｎｏｇｏ−ＡなどのＮｇＲ１リガンド（これらはまた、軸策成長インヒビターでもある）に対するアンタゴニストとしてのペプチド模倣物を提供する。活性なペプチド模倣物（すなわち、アンタゴニスト薬物）は、例えば、脳卒中、いくつかの他の形態の外傷性脳損傷および／または脊髄損傷などに起因した、軸策発芽（axonal sprouting）または長い範囲の成長が機能を回復し得る種々の状態（例えば、損傷を受けた中枢神経系）に対する治療剤となることができる（例えば、Wiessner et al. (2003) J. Cereb. Blood Flow Metab. 23(2):154-65：非特許文献２６; Moon and Bunge (2005) J. Neurol. Phys. Ther. 29:55-69：非特許文献２７を参照のこと）。
【非特許文献１】Berry (1982) Bibl. Anat. 23:1-11
【非特許文献２】Caroni and Schwab (1988) Neuron 1(1): 85-96
【非特許文献３】Caroni and Schwab (1988) J. Cell Biol. 106(4):1281-88
【非特許文献４】Bregman et al. (1995) Nature 378:498-501
【非特許文献５】Schnell and Schwab (1990) Nature 343:269-72
【非特許文献６】McKerracher et al. (1994) Neuron 13(4):805-11
【非特許文献７】Mukhopadhyay et al. (1994) Neuron 13(3):757- 67
【非特許文献８】Chen et al. (2000) Nature 403:434-39
【非特許文献９】GrandPre et al. (2000) Nature 403:439-44
【非特許文献１０】Prinjha et al. (2000) Nature 403:383-84
【非特許文献１１】Wang et al. (2002) Nature 417:941-44
【非特許文献１２】Domeniconi et al. (2002) Neuron 35(2):283-90
【非特許文献１３】Fournier et al. (2001) Nature 409:341-46
【非特許文献１４】Liu et al. (2002) Science 297:1190-93
【非特許文献１５】Wang et al. (2002) Nature 420:74-78
【非特許文献１６】Collins et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(2): 1248-55
【非特許文献１７】Vinson et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(23):20280-85
【非特許文献１８】Wong et al. (2002) Nat. Neurosci. 5(12): 1302-08
【非特許文献１９】Mi et al. (2004) Nat. Neurosci. 7(3):221-28
【非特許文献２０】McGee and Strittmatter (2003) Trends Neurosci. 26(4): 193- 98
【非特許文献２１】Fournier et al. (2002) J. Neurosci. 22(20):8876-83
【非特許文献２２】GrandPre et al. (2002) Nature 417:547-51
【非特許文献２３】Barton et al. (2003) EMBO J. 22(13):3291-302
【非特許文献２４】He et al. (2003) Neuron 38(2): 177-85
【非特許文献２５】Hruby (2002) Nat. Rev. Drug Discov. 1(11):847-58
【非特許文献２６】Wiessner et al. (2003) J. Cereb. Blood Flow Metab. 23(2):154-65
【非特許文献２７】Moon and Bunge (2005) J. Neurol. Phys. Ther. 29:55-69
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
（発明の要旨）
本発明は、Ｎｏｇｏレセプター１（ＮｇＲ１）内の機能モチーフの同定に基づいている。本発明はまた、そのような機能モチーフを模倣するペプチドを使用して、軸策成長インヒビターでもあるＮｇＲ１リガンド（ＮｇＲ１Ｌ）（例えば、ミエリン結合糖タンパク質、希突起神経膠細胞ミエリン糖タンパク質、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−６６、Ｎｏｇｏレセプターに対する抗体、ＧＴ１ｂに対する抗体、ｐ７５ニュートロフィンレセプターに対する抗体およびＬｉｎｇｏ−１に対する抗体など）をアンタゴナイズすることに基づく。１つの実施形態において、ＮｇＲ１の推定上の機能モチーフおよび／または実際の機能モチーフは、ＹＮＥＰＫＶＴ（配列番号２および８）、ＬＱＫＦＲＧＳＳ（配列番号１４および１６）、ＳＬＰＱＲＬＡ（配列番号４）、ＮＬＰＱＲＬＡ（配列番号１０）およびＡＧＲＤＬＫＲ（配列番号６および１２）からなる群より選択されるアミノ酸配列を有する、ならびに／あるいは本質的にこれらのアミノ酸配列からなる。本発明の別の実施形態において、本発明のＮｇＲ１の推定上の機能モチーフおよび／または実際の機能モチーフのペプチド模倣物は、１以上のＮｇＲ１リガンド（ＮｇＲ１Ｌ）に対するアンタゴニストとして、すなわち、少なくとも１種のＮｇＲ１Ｌに対するアンタゴニストとして提供される。例えば、本発明は、ＹＮＥＰＫＶＴ（配列番号２および８）、ＬＱＫＦＲＧＳＳ（配列番号１４および１６）、ＳＬＰＱＲＬＡ（配列番号４）、ＮＬＰＱＲＬＡ（配列番号１０）、ＡＧＲＤＬＫＲ（配列番号６および１２）のアミノ酸配列およびその活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＮｇＲ１Ｌに対するアンタゴニスト（すなわち、少なくとも１種のＮｇＲ１Ｌに対するアンタゴニスト）を提供する。
【０００７】
１つの実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＫＦＲＧ、アミノ酸配列ＧＲＦＫ、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびその活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストを提供する。本発明のいくつかの実施形態において、ＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストは、アミノ酸配列ＬＱＫＦＲＧＳＳ（配列番号１４および１６）、ＫＦＲＧＳ（配列番号１８および２０）およびＱＫＦＲＧ（配列番号２２および２４）からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。他の実施形態において、本発明のアンタゴニストは、アセチル化および／またはアミドブロック化（amide blocked）されている。他の実施形態において、本発明のアンタゴニストは、（例えば、ホモデティック環化（homodetic cyclization）またはジスルフィド結合を介して）環化されている。例えば、１つの実施形態において、本発明は、アミノ酸配列ＫＦＲＧ（配列番号２６）を含むポリペプチドを含む、ＮｇＲ１Ｌに対するアンタゴニストを提供する。ここでこのポリペプチドは、例えばホモデティック環化によって環化されており、このホモデティック環化は上記環が真正ペプチド結合のアミノ酸残基のみからなる環化の形態である。別の実施形態において、上記アンタゴニストは、少なくとも１種のＤアミノ酸を含む。別の実施形態において、上記アンタゴニストは、ＳＧＲＦＫＱ（配列番号３７；ホモデティック環状ポリペプチド（c[ ]）を含む本発明のアンタゴニストの代替的な表示であって、Ｄ型の非天然のアミノ酸（小文字）を含む配列番号３７のアミノ酸配列、すなわちc[sGrfkq]を含む）またはその活性フラグメントのアミノ酸配列を含む。
【０００８】
他の実施形態において、本発明のアンタゴニストは、ジスルフィド結合によって環化されている。１つの実施形態において、本発明は、配列番号３１のアミノ酸配列、配列番号３２のアミノ酸配列、配列番号３３のアミノ酸配列、配列番号３４のアミノ酸配列およびその活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、ＮｇＲ１リガンドに対する環化アンタゴニストを提供する。１つの実施形態において、本発明は、ＣＬＱＫＦＲＧＳＳＣのアミノ酸配列（配列番号３１）を含むポリペプチドを含む、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドのアンタゴニストを提供する。別の実施形態において、上記アンタゴニストは、ＣＫＦＲＧＳＣのアミノ酸配列（配列番号３２）を含むポリペプチドを含む。別の実施形態において、上記アンタゴニストは、ＣＱＫＦＲＧＣのアミノ酸配列（配列番号３３）を含むポリペプチドを含む。別の実施形態において、上記アンタゴニストは、ＣＫＦＲＧＣのアミノ酸配列（配列番号３４）を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、本発明のアンタゴニストは、少なくとも１つのＤアミノ酸を含む。他の実施形態において、本発明のアンタゴニストは、アセチル化および／またはアミドブロック化されている。別の実施形態において、上に記載されたアンタゴニストは、ミエリン結合糖タンパク質、希突起神経膠細胞ミエリン糖タンパク質、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−６６、Ｎｏｇｏレセプターに対する抗体、ＧＴ１ｂに対する抗体、ｐ７５ニュートロフィンレセプターに対する抗体およびＬｉｎｇｏ−１に対する抗体からなる群より選択されるＮｇＲ１リガンドのＮｇＲ１結合フラグメントをアンタゴナイズする。
【０００９】
本発明はまた、本発明のアンタゴニストを使用する方法、例えば、他のアンタゴニスト（例えば、試験化合物）についてスクリーニングする方法、およびサンプルまたは被験体（例えば、ヒト被験体）中のＮｇＲ１リガンド媒介性の軸策成長阻害をアンタゴナイズする方法を提供する。１つの実施形態において、本発明は、ＮｇＲ１リガンドをアンタゴナイズする化合物についてスクリーニングする方法を提供し、この方法は、ＮＧＲ１リガンドと本発明のアンタゴニストとを含むサンプルを上記化合物と接触させる工程；およびそのサンプル中のＮｇＲ１リガンドと本発明のアンタゴニストとの間の相互作用が、上記化合物に接触されていないサンプル中のＮｇＲ１リガンドと本発明のアンタゴニストとの相互作用と比較して低下しているか否かを決定する工程を包含する。ここで上記化合物に接触されたサンプル中のＮｇＲ１リガンドと本発明のアンタゴニストとの相互作用が低下することによって、その化合物が本発明のアンタゴニストと競合するものであると同定される。これらの方法のいくつかの実施形態において、上記アンタゴニストは、アミノ酸配列ＫＦＲＧ、アミノ酸配列ＧＲＦＫ、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびこれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。さらに、幾つかの実施形態において、上記化合物は、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドをアンタゴナイズするものとしてさらに同定される。
【００１０】
本発明はまた、サンプル中のＮｇＲ１リガンド媒介性の軸策成長阻害をアンタゴナイズする方法を提供する。この方法は、上記サンプルと本発明のアンタゴニストを接触させる工程を包含する。１つの実施形態において、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストは、ＮｇＲ１の機能モチーフを模倣するペプチドである。本発明はまた、サンプル中の軸策成長の阻害をアンタゴナイズする方法を提供する。この方法は、上記サンプルを、アミノ酸配列ＫＦＲＧ、アミノ酸配列ＧＲＦＫ、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびこれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むアンタゴニストと接触させる工程を含む。いくつかの実施形態において、軸策成長の阻害は、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドによって媒介されている。さらに、いくつかの実施形態において、軸策成長の阻害のアンタゴナイズは、軸策の再生をもたらす。
【００１１】
１つの実施形態において、本発明は、被験体（例えば、ヒト被験体）において軸策を再生する方法および／または軸策成長の阻害をアンタゴナイズする方法を提供する。この方法は、本発明のアンタゴニストを上記被験体に投与する工程を含む。例えば、本発明は、被験体において軸策成長の阻害をアンタゴナイズする方法を提供する。この方法は、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストの有効量を上記被験体に投与する工程を含み、例えば、ここでその少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストは、ＮｇＲ１の機能モチーフを模倣するペプチドである。別の実施形態において、本発明は、被験体において軸策成長の阻害をアンタゴナイズする方法を提供する。この方法は、有効量のアンタゴニストを上記被験体に投与する工程を含み、このアンタゴニストは、アミノ酸配列ＫＦＲＧ、アミノ酸配列ＧＲＦＫ、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびこれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、軸策成長の阻害は、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドによって媒介される。他の実施形態において、軸策成長の阻害のアンタゴナイズは、軸策の再生をもたらす。別の実施形態において、被験体において軸策を再生する方法および／または軸策成長の阻害をアンタゴナイズする方法は、本発明のアンタゴニストを上記被験体に投与する工程を含む。ここでその被験体は、中枢神経系に対する損傷を受けており、例えば、その被験体は、脳卒中および／または外傷性の脳損傷および／または脊髄損傷などのいくつかの他の形態に罹患している。別の実施形態において、上記被験体は、神経変性疾患（例えば、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病など）に罹患しているか、神経変性疾患を罹患したことがある。
【００１２】
さらに、本発明は、本発明の方法において使用するための、本発明のアンタゴニストを含む医薬組成物およびそのような組成物を投与する経路を提供する。いくつかの実施形態において、本発明の医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリアと、アミノ酸配列ＫＦＲＧ、アミノ酸配列ＧＲＦＫ、配列番号１４のアミノ酸配列、配列番号１８のアミノ酸配列、配列番号２２のアミノ酸配列、配列番号３７のアミノ酸配列、およびこれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むアンタゴニストとを含有する。
【００１３】
本発明はまた、配列番号２のアミノ酸配列、配列番号４のアミノ酸配列、配列番号６のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列、およびこれらの活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドを含むＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストを提供する。いくつかの実施形態において、上記ポリペプチドは、（例えば、ジスルフィド結合などを介して）環化されている。
【００１４】
本発明はまた、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３７のアミノ酸配列およびその活性フラグメントのアミノ酸配列からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドに特異的に結合し得る単離された抗体を提供する。いくつかの実施形態において、上記抗体は、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストを含む免疫原に対する応答において産生される。また、少なくとも１種のＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストに特異的に結合し得る単離された抗体も提供される。
【００１５】
本発明はまた、本明細書において開示される方法の実践を助けるための本発明のアンタゴニストを含むキットを提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１６】
（発明の詳細な説明）
従来の欠失分析によって提示される制限は、Ｎｏｇｏレセプター１（ＮｇＲ１）中の推定上の機能モチーフおよび／または実際の機能モチーフを同定するための合理的なアプローチを採用することによって克服された（実施例２．１を参照のこと）。このアプローチに基づいて、ＮｇＲ１のＬＲＲ構造のカルボキシ末端領域において露出されたループを模倣する３つの独立した小さく束縛されたペプチド（small-constrained peptide）が同定された。これらのペプチドは、ＮｇＲ１リガンド（例えば、ミエリン結合糖タンパク質、希突起神経膠細胞ミエリン糖タンパク質、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−６６、Ｎｏｇｏレセプターに対する抗体、ＧＴ１ｂに対する抗体、ｐ７５ニュートロフィンレセプターに対する抗体およびＬｉｎｇｏ−１に対する抗体）に対するアンタゴニストとして作用し得る。すなわち、これらのペプチドは、ニューロン中のＮｇＲ１複合体に結合するＮｇＲ１リガンドの生物学的な結果（例えば、軸策成長の阻害（実施例２．２〜２．４）および／またはより高次のレセプター−シグナル伝達複合体の形成）をアンタゴナイズ（例えば、逆転する、低下する、低減する、妨げる、など）するように作用し得る。従って、本発明は、推定上の機能モチーフおよび／または実際の機能モチーフおよび／または模倣ペプチドアンタゴニストに関するポリヌクレオチドならびポリペプチドを提供する。
【００１７】
（ポリヌクレオチドおよびポリペプチド）
本発明は、Ｎｏｇｏレセプター１（ＮｇＲ１）の推定上の機能ドメインおよび／または実際の機能ドメインと相同な、新規の単離および精製されたポリヌクレオチドとポリペプチドとを提供する。ＮｇＲ１の推定上の機能ドメインおよび／または実際の機能ドメインに対するペプチド模倣物が、ＮｇＲ１リガンドに対するアンタゴニストとして、すなわちＮｇＲ１に結合するＮｇＲ１リガンドの生物学的効果を阻害するために使用することができることは、本発明の一部である。
【００１８】
例えば、本発明は、ＮｇＲ１リガンドアンタゴニストとして機能し得る３つの推定上のＮｇＲ１機能モチーフ（本明細書において「ＮＲＬ１」、「ＮＲＬ３」および「ＮＲＬ４」と称される）をコードする精製および単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列としては、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列ならびに化学的に合成されたＤＮＡ配列が挙げられる。
【００１９】
ヒトＮＲＬ１（ｈＮＲＬ１）、ヒトＮＲＬ３（ｈＮＲＬ３）およびヒトＮＲＬ４（ｈＮＲＬ４）をコードするｃＤＮＡ（ヒトｃＤＮＡと称される）のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号１、配列番号３および配列番号５に記載されている。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、ストリジェントな条件下で配列番号１、配列番号３もしくは配列番号５にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および／またはｈＮＲＬ１、ｈＮＲＬ３もしくはｈＮＲＬ４それぞれの実質的な生物学的活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはその相補体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、配列番号１、配列番号３または配列番号５に記載の配列の連続部分が挙げられる。
【００２０】
ｈＮＲＬ１、ｈＮＲＬ３およびｈＮＲＬ４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２、配列番号４および配列番号６に記載されている。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号２、配列番号４および配列番号６に記載の任意の配列の連続部分が挙げられ、少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号２、配列番号４および配列番号６に記載の任意の配列（その連続部分を含む）も挙げられ、上記ポリペプチドにおいて１以上のＬアミノ酸は、その対応するＤアミノ酸で置き換えられている。本発明のポリペプチドとしてはまた、全長のヒトｈＮＲＬ１、ｈＮＲＬ３およびｈＮＲＬ４それぞれの実質的な生物学的活性を保持する、配列番号２、配列番号４および配列番号６に記載の任意の配列の任意の連続部分（すなわち、活性フラグメント）が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を使用してアセチル化および／またはアミドブロック化することができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、上記に記載のヒト起源のポリヌクレオチドに加えて、配列番号２、配列番号４もしくは配列番号６に記載の任意のアミノ酸配列またはその連続部分（例えば、その活性フラグメント）をコードするポリヌクレオチドと、上記に記載のヒト起源のポリヌクレオチドとは周知の遺伝コードの縮重に起因してのみ異なるポリヌクレオチドとが挙げられる。
【００２１】
ラットＮＲＬ１（ｒＮＲＬ１）、ラットＮＲＬ３（ｒＮＲＬ３）およびラットＮＲＬ４（ｒＮＲＬ４）をコードするｃＤＮＡ（ラットｃＤＮＡと称される）のヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号７、配列番号９および配列番号１１に記載されている。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、ストリジェントな条件下で配列番号７、配列番号９もしくは配列番号１１にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および／またはｒＮＲＬ１、ｒＮＲＬ３もしくはｒＮＲＬ４それぞれの実質的な生物学的活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、あるいはその相補体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、配列番号７、配列番号９または配列番号１１に記載の配列の連続部分が挙げられ、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む。
【００２２】
ｒＮＲＬ１、ｒＮＲＬ３およびｒＮＲＬ４のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号８、配列番号１０および配列番号１２に記載されている。本発明のポリペプチドとしては、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２に記載の任意の配列の連続部分が挙げられ、少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２に記載の任意の配列（その連続部分を含む）も挙げられ、上記ポリペプチドにおいて１以上のＬアミノ酸は、その対応するＤアミノ酸で置き換えられている。本発明のポリペプチドとしてはまた、全長のｒＮＲＬ１、ｒＮＲＬ３およびｒＮＲＬ４それぞれの実質的な生物学的活性を保持する、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２に記載の任意の配列の任意の連続部分（すなわち、活性フラグメント）が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を使用してアセチル化および／またはアミドブロック化することができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、上記に記載のラット起源のポリヌクレオチドに加えて、配列番号８、配列番号１０および配列番号１２に記載の任意のアミノ酸配列またはその連続部分（例えば、その活性フラグメント）をコードするポリヌクレオチドと、上記に記載のラット起源のポリヌクレオチドとは周知の遺伝コードの縮重に起因してのみ異なるポリヌクレオチドとが挙げられる。
【００２３】
本発明はまた、ＮｇＲ１リガンドに対する模倣ペプチドアンタゴニストとして使用することができる新規なＮｇＲ１機能モチーフ（本明細書において「ＮＲＬ２」と称される）をコードする精製および単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列としては、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列ならびに化学的に合成されたＤＮＡ配列が挙げられる。
【００２４】
ヒトＮＲＬ２（ｈＮＲＬ２）をコードするｃＤＮＡ（ヒトｃＤＮＡと称される）のヌクレオチド配列は、配列番号１３に記載されている。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、ストリジェントな条件下で配列番号１３にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および／もしくはｈＮＲＬ２の実質的な生物学的活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、配列番号１３に記載の配列の連続部分が挙げられる。
【００２５】
ｈＮＲＬ２のアミノ酸配列は、配列番号１４に記載されている。本発明のポリペプチドとしてはまた、少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む、配列番号１４に記載の配列の連続部分が挙げられる。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号１４に記載の配列（その連続部分を含む）も挙げられ、上記ポリペプチドにおいて１以上のＬアミノ酸は、その対応するＤアミノ酸で置き換えられている。本発明のポリペプチドとしてはまた、全長のｈＮＲＬ２の実質的な生物学的活性を保持する配列番号１４に記載の配列の任意の連続部分（すなわち、活性フラグメント）（例えば、ＫＦＲＧ（すなわち、配列番号２６））が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を使用してアセチル化および／またはアミドブロック化することができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、上記に記載のヒト起源のポリヌクレオチドに加えて、配列番号１４に記載のアミノ酸配列またはその連続部分（例えば、その活性フラグメント）をコードするポリヌクレオチドと、上記に記載のヒト起源のポリヌクレオチドとは周知の遺伝コードの縮重に起因してのみ異なるポリヌクレオチドとが挙げられる。
【００２６】
ラットＮＲＬ２（ｒＮＲＬ２）をコードするｃＤＮＡ（ラットｃＤＮＡと称される）のヌクレオチド配列は、配列番号１５に記載されている。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、ストリジェントな条件下で配列番号１５にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および／もしくはｒＮＲＬ２の実質的な生物学的活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、配列番号１５に記載の配列の連続部分が挙げられる。
【００２７】
ｒＮＲＬ２のアミノ酸配列は、配列番号１６に記載されている。本発明のポリペプチドとしてはまた、少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む、配列番号１６に記載の配列の連続部分が挙げられる。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号１６に記載の配列（その連続部分を含む）も挙げられ、上記ポリペプチドにおいて１以上のＬアミノ酸は、その対応するＤアミノ酸で置き換えられている。本発明のポリペプチドとしてはまた、全長のｒＮＲＬ２の実質的な生物学的活性を保持する配列番号１６に記載の配列の任意の連続部分（すなわち、活性フラグメント）（例えば、ＫＦＲＧ（すなわち、配列番号２６））が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を使用してアセチル化および／またはアミドブロック化することができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、上記に記載のラット起源のポリヌクレオチドに加えて、配列番号１６に記載のアミノ酸配列またはその連続部分（例えば、その活性フラグメント）をコードするポリヌクレオチドと、上記に記載のラット起源のポリヌクレオチドとは周知の遺伝コードの縮重に起因してのみ異なるポリヌクレオチドとが挙げられる。
【００２８】
本発明はまた、ＮｇＲ１リガンドに対する新規な模倣ペプチドアンタゴニスト（本明細書において「ＮＲＬ２ａ」と称される）をコードする精製および単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列としては、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列ならびに化学的に合成されたＤＮＡ配列が挙げられる。
【００２９】
ヒトＮＲＬ２ａ（ｈＮＲＬ２ａ）をコードするｃＤＮＡ（ヒトｃＤＮＡと称される）のヌクレオチド配列は、配列番号１７に記載されている。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、ストリジェントな条件下で配列番号１７にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および／もしくはｈＮＲＬ２ａの実質的な生物学的活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、配列番号１７に記載の配列の連続部分が挙げられる。
【００３０】
ｈＮＲＬ２ａのアミノ酸配列は、配列番号１８に記載されている。本発明のポリペプチドとしてはまた、少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む、配列番号１８に記載の配列の連続部分が挙げられる。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号１８に記載の配列（その連続部分を含む）も挙げられ、上記ポリペプチドにおいて１以上のＬアミノ酸は、その対応するＤアミノ酸で置き換えられている。本発明のポリペプチドとしてはまた、全長のｈＮＲＬ２の実質的な生物学的活性を保持する配列番号１８に記載の配列の任意の連続部分（すなわち、活性フラグメント）（例えば、ＫＦＲＧ（すなわち、配列番号２６））が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を使用してアセチル化および／またはアミドブロック化することができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、上記に記載のヒト起源のポリヌクレオチドに加えて、配列番号１８に記載のアミノ酸配列またはその連続部分（例えば、その活性フラグメント）をコードするポリヌクレオチドと、上記に記載のヒト起源のポリヌクレオチドとは周知の遺伝コードの縮重に起因してのみ異なるポリヌクレオチドとが挙げられる。
【００３１】
ラットＮＲＬ２ａ（ｒＮＲＬ２ａ）をコードするｃＤＮＡ（ラットｃＤＮＡと称される）のヌクレオチド配列は、配列番号１９に記載されている。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、ストリジェントな条件下で配列番号１９にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および／またはｒＮＲＬ２ａの実質的な生物学的活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、配列番号１９に記載の配列の連続部分が挙げられる。
【００３２】
ｒＮＲＬ２ａのアミノ酸配列は、配列番号２０に記載されている。本発明のポリペプチドとしてはまた、少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む、配列番号２０に記載の配列の連続部分が挙げられる。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号２０に記載の配列（その連続部分を含む）も挙げられ、上記ポリペプチドにおいて１以上のＬアミノ酸は、その対応するＤアミノ酸で置き換えられている。本発明のポリペプチドとしてはまた、全長のｒＮＲＬ２ａの実質的な生物学的活性を保持する配列番号２０に記載の配列の任意の連続部分（すなわち、活性フラグメント）（例えば、ＫＦＲＧ（すなわち、配列番号２６））が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を使用してアセチル化および／またはアミドブロック化することができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、上記に記載のラット起源のポリヌクレオチドに加えて、配列番号２０に記載のアミノ酸配列またはその連続部分をコードするポリヌクレオチドと、上記に記載のラット起源のポリヌクレオチドとは周知の遺伝コードの縮重に起因してのみ異なるポリヌクレオチドとが挙げられる。
【００３３】
本発明はまた、ＮｇＲ１リガンドに対する別の新規な模倣ペプチドアンタゴニスト（本明細書において「ＮＲＬ２ｂ」と称される）をコードする精製および単離されたポリヌクレオチドを提供する。本発明の好ましいＤＮＡ配列としては、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列ならびに化学的に合成されたＤＮＡ配列が挙げられる。
【００３４】
ヒトＮＲＬ２ｂ（ｈＮＲＬ２ｂ）をコードするｃＤＮＡ（ヒトｃＤＮＡと称される）のヌクレオチド配列は、配列番号２１に記載されている。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、ストリジェントな条件下で配列番号２１にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および／もしくはｈＮＲＬ２ｂの実質的な生物学的活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、配列番号２１に記載の配列の連続部分が挙げられる。
【００３５】
ｈＮＲＬ２ｂのアミノ酸配列は、配列番号２２に記載されている。本発明のポリペプチドとしてはまた、少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む、配列番号２２に記載の配列の連続部分が挙げられる。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号２２に記載の配列（その連続部分を含む）も挙げられ、上記ポリペプチドにおいて１以上のＬアミノ酸は、その対応するＤアミノ酸で置き換えられている。本発明のポリペプチドとしてはまた、全長のｈＮＲＬ２ｂの実質的な生物学的活性を保持する配列番号２２に記載の配列の任意の連続部分（すなわち、活性フラグメント）（例えば、ＫＦＲＧ（すなわち、配列番号２６））が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を使用してアセチル化および／またはアミドブロック化することができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、上記に記載のヒト起源のポリヌクレオチドに加えて、配列番号２２に記載のアミノ酸配列またはその連続部分をコードするポリヌクレオチドと、上記に記載のヒト起源のポリヌクレオチドとは周知の遺伝コードの縮重に起因してのみ異なるポリヌクレオチドとが挙げられる。
【００３６】
ラットＮＲＬ２ｂ（ｒＮＲＬ２ｂ）をコードするｃＤＮＡ（ラットｃＤＮＡと称される）のヌクレオチド配列は、配列番号２３に記載されている。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、ストリジェントな条件下で配列番号２３にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および／もしくはｒＮＲＬ２ｂの実質的な生物学的活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、少なくとも１２個の連続するヌクレオチドを含む、配列番号２３に記載の配列の連続部分が挙げられる。
【００３７】
ｒＮＲＬ２ｂのアミノ酸配列は、配列番号２４に記載されている。本発明のポリペプチドとしてはまた、少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む、配列番号２４に記載の配列の連続部分が挙げられる。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号２４に記載の配列（その連続部分を含む）も挙げられ、上記ポリペプチドにおいて１以上のＬアミノ酸は、その対応するＤアミノ酸で置き換えられている。本発明のポリペプチドとしてはまた、全長のｒＮＲＬ２ｂの実質的な生物学的活性を保持する配列番号２４に記載の配列の任意の連続部分（すなわち、活性フラグメント）（例えば、ＫＦＲＧ（配列番号２６））が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を使用してアセチル化および／またはアミドブロック化することができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、上記に記載のラット起源のポリヌクレオチドに加えて、配列番号２４に記載のアミノ酸配列またはその連続部分をコードするポリヌクレオチドと、上記に記載のラット起源のポリヌクレオチドとは周知の遺伝コードの縮重に起因してのみ異なるポリヌクレオチドとが挙げられる。
【００３８】
本発明はまた、新規なＮｇＲ１機能モチーフおよび本発明の模倣ペプチドアンタゴニストをコードする精製および単離されたポリヌクレオチドを提供する（例えば、ＮＲＬ２、ＮＲＬ２ａおよびＮＲＬ２ｂならびに環化模倣ペプチド）。本発明の好ましいＤＮＡ配列としては、ゲノム配列およびｃＤＮＡ配列ならびに化学的に合成されたＤＮＡ配列が挙げられる。当業者は、本発明がまた、他の環化分子（例えば、ＮＲＬ１、ＮＲＬ３およびＮＲＬ４などに基づいた環化模倣ペプチド）を含むことを認識する。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を使用してアセチル化および／またはアミドブロック化することができる。
【００３９】
例えば、人工的に環化、アセチル化およびアミドブロック化したＮＲＬ２、ＮＲＬ２ａならびにＮＲＬ２ｂのアミノ酸配列が、それぞれ配列番号３１、配列番号３２および配列番号３３に記載されている。本発明のポリペプチドとしてはまた、少なくとも４個の連続するアミノ酸を含む、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３３に記載の配列の任意の連続部分が挙げられる。本発明のポリペプチドとしてはまた、全長のＮＲＬ２、ＮＬＲ２ａまたはＮＲＬ２ｂの実質的な生物学的活性をそれぞれ保持する、配列番号３１、配列番号３２または配列番号３２に記載の任意の配列の任意の連続部分（すなわち、活性フラグメント）（例えば、ＫＦＲＧ（配列番号２６））が挙げられる。本発明の別のポリペプチドは、人工的に環化、アセチル化およびアミドブロック化されたＫＦＲＧ（配列番号３４）である。他の例の場合、人工的に環化、アセチル化およびアミドブロック化されたＮＲＬ１（ヒトまたはラット）、ヒトＮＲＬ３、ラットＮＲＬ３およびＮＲＬ４（ヒトまたはラット）のアミノ酸配列が、それぞれ配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９および配列番号３０に記載されている。本発明のポリペプチドとしては、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４に記載の任意の配列（その連続部分を含む）が挙げられ、上記ポリペプチドにおいて１以上のＬアミノ酸は、その対応するＤアミノ酸で置き換えられている。
【００４０】
配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３または配列番号３４に提供されるアミノ酸配列に基づいて、当業者は、このようなペプチドの各々をコードする１以上のＤＮＡ配列を決定することができる。従って、本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３もしくは配列番号３４に記載のアミノ酸配列またはその連続部分をコードするポリヌクレオチド（例えば、ゲノム配列、ｃＤＮＡ配列および化学的に合成された配列）が挙げられる。
【００４１】
例えば、ＫＦＲＧをコードするヌクレオチド配列は、配列番号２５に記載されている。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、ストリジェントな条件下で配列番号２５にハイブリダイズするポリヌクレオチド、および／もしくはＫＦＲＧの実質的な生物学的活性を保持するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体が挙げられる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、少なくとも９個の連続するヌクレオチドを含む、配列番号２５に記載の配列の連続部分が挙げられる。
【００４２】
上記に記載したとおり、ＫＦＲＧのアミノ酸配列は、配列番号２６に記載されている。本発明のポリペプチドとしてはまた、少なくとも３個の連続するアミノ酸を含む、配列番号２６に記載の配列の連続部分が挙げられる。本発明のポリペプチドとしてはまた、配列番号２６に記載の配列（その連続部分を含む）が挙げられ、上記ポリペプチドにおいて１以上のＬアミノ酸は、その対応するＤアミノ酸で置き換えられている。本発明のポリペプチドとしてはまた、全長のヒトＫＦＲＧの実質的な生物学的活性を保持する配列番号２６に記載の配列の任意の連続部分（すなわち、活性フラグメント）（例えば、ＫＦＲ）が挙げられる。さらに、本発明のポリペプチドは、周知の方法を使用して環化、アセチル化および／またはアミドブロック化することができる。本発明のポリヌクレオチドとしてはまた、上記に記載のポリヌクレオチドに加えて、配列番号２６に記載のアミノ酸配列またはその連続部分（例えば、その活性フラグメント）をコードするポリヌクレオチドと、上記に記載のポリヌクレオチドとは周知の遺伝コードの縮重に起因してのみ異なるポリヌクレオチドとが挙げられる。
【００４３】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、開示されたポリヌクレオチドをコードする配列と同一の配列またはこれと類似した配列を有する核酸を同定および単離するためのハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとして使用することができる。核酸を同定および単離するためのハイブリダイゼーション方法としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、サザンハイブリダイゼーションおよびノーザンハイブリダイゼーションが挙げられ、これらは当業者に周知である。
【００４４】
ハイブリダイゼーション反応は、異なるストリジェンシーの条件下で実施することができる。ハイブリダイゼーション反応のストリジェンシーは、任意の２つの核酸分子が互いにハイブリダイズする場合の困難性を包含する。好ましくは、ハイブリダイズする各ポリヌクレオチドは、低ストリジェントな条件、より好ましくはストリジェントな条件、最も好ましくは高ストリジェントな条件の下で、対応するポリヌクレオチドにハイブリダイズする。ストリジェンシー条件の例を以下の表１に示す：高ストリジェントな条件とは、少なくとも例えば条件Ａ〜Ｆの程度にストリジェントである条件である；ストリジェントな条件とは、少なくとも例えば条件Ｇ〜Ｌの程度にストリジェントである条件である；そして低ストリジェントな条件とは、少なくとも例えば条件Ｍ〜Ｒの程度にストリジェントである条件である。
【表１−１】
2008540339.tif 000003
【表１−２】
2008540339.tif 000004
1ハイブリッドの長さは、ハイブリダイズするポリヌクレオチドのハイブリダイズ領域について予測したものである。未知配列の標的ポリヌクレオチドにポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、そのハイブリッドの長さは、ハイブリダイズするポリヌクレオチドの長さであることが想定される。既知配列のポリヌクレオチドをハイブリダイズさせる場合、そのハイブリッドの長さは、上記ポリヌクレオチドの配列を整列させて最適な配列相補性の領域を同定することによって決定することができる。
2ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＮａＨ2ＰＯ4、および１．２５ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．４）である）は、ハイブリダイゼーションおよび洗浄の緩衝液中のＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ  ＮａＣｌおよび１５ｍＭクエン酸ナトリウムである）と置換することができる；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後に１５分間実施される。
ＴB*−ＴR*：長さが５０塩基対未満であると予測されるハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、そのハイブリッドの融点（Ｔm）よりも５〜１０℃低くするべきである（Ｔmは、以下の式に従って決定される）。長さが１８塩基対未満のハイブリッドについては、Ｔm（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の＃）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の＃）である。長さが１８〜４９塩基対の間のハイブリッドについては、Ｔm（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ10Ｎａ+）＋０．４１（％Ｇ＋Ｃ）−（６００／Ｎ）である（Ｎは、ハイブリッド中の塩基の数であり、Ｎａ+は、ハイブリダイゼーション緩衝液中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣについてのＮａ+＝０．１６５Ｍ））。
ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションのためのストリジェンシー条件のさらなる例は、以下において提供される（これらは、本明細書において参考として援用される）：Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Chs. 9 & 11, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, およびAusubel et al., 編 (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Sects. 2.10 & 6.3-6.4, John Wiley & Sons, Inc.。
【００４５】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、開示されたポリヌクレオチドと相同的なポリペプチドをコードする配列を有するＤＮＡを同定および単離するためのハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとしても使用することができる。これらのホモログは、開示されたポリペプチドおよびポリヌクレオチドの種と異なる種から、または同じ種において単離されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドであって、開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドと顕著な配列類似性を有するものである。好ましくは、ポリヌクレオチドホモログは、開示されたポリヌクレオチドと少なくとも６０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも７５％の同一性、最も好ましくは少なくとも９０％の同一性）を有する一方、ポリペプチドホモログは、開示されたポリペプチドと少なくとも３０％の配列同一性（より好ましくは少なくとも４５％の同一性、最も好ましくは少なくとも６０％の同一性）を有する。好ましくは、開示されたポリヌクレオチドおよびポリペプチドのホモログは、哺乳動物種から単離されたものである。
【００４６】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドが発現する細胞および組織、ならびにそれらが発現する条件を同定するためのハイブリダイゼーションプローブおよびプライマーとしても使用することができる。
【００４７】
本発明の単離ポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの組換え産生のための発現制御配列（例えば、ｐＭＴ２およびｐＥＤ発現ベクター）に作動可能に連結することができる。組換えタンパク質を発現する一般的方法は、当該分野で周知である。
【００４８】
多くの細胞型が、本発明のポリペプチドの組換え発現のための適切な宿主細胞として働くことができる。哺乳動物宿主細胞としては、例えば、ＣＯＳ細胞、ＣＨＯ細胞、２９３細胞、Ａ４３１細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞、Ｊｕｒｋａｔ細胞、正常な二倍体細胞、初代組織および初代外植片のインビトロ培養物に由来する細胞株が挙げられる。
【００４９】
代替的には、酵母などの低級な真核生物または原核生物において、本発明のポリペプチドを組換え産生することも可能である場合がある。適する可能性のある酵母株としては、Saccharomyces cerevisiae、Schizosaccharomyces pombe、Kluyveromyces株およびCandida株が挙げられる。適する可能性のある細菌株としては、Escherichia coli、Bacillus subtilisおよびSalmonella typhimuriumが挙げられる。本発明のポリペプチドが酵母または細菌において産生される場合、機能性を得るために、例えば、適切な部位のリン酸化またはグリコシル化によって産生されたポリペプチドを改変することが必要な場合がある。このような共有結合は、周知の化学的方法または酵素的方法を使用することによって達成することができる。
【００５０】
本発明のポリペプチドはまた、１つ以上の昆虫発現ベクター（例えば、バキュロウイルスベクター）中の適切な制御配列に本発明の単離ポリヌクレオチドを作動可能に連結し、昆虫細胞発現系を利用することによっても、組換え産生することができる。バキュロウイルス／Ｓｆ９発現系についての材料および方法は、キット形態で市販されている（例えば、ＭａｘＢａｃ（登録商標）キット、Invitrogen, Carlsbad, CA）。
【００５１】
適切な宿主細胞において組換え発現させた後、次いで、本発明のポリペプチドは、公知の精製プロセス（例えば、ゲル濾過およびイオン交換クロマトグラフィー）を使用して培養培地または細胞抽出物から精製することができる。精製としてはまた、本発明のポリペプチドに結合することが知られている因子を用いたアフィニティークロマトグラフィーもが挙げられ得る。これらの精製プロセスもまた、天然の供給源から本発明のポリペプチドを精製するために使用することができる。
【００５２】
代替的には、本発明のポリペプチドは、精製を容易にする形態で組換え発現させることも可能である。例えば、上記ポリペプチドをマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）またはチオレドキシン（ＴＲＸ）などのタンパク質と共に融合体として発現させることができる。このような融合タンパク質を発現および精製するためのキットは、それぞれNew England BioLabs (Beverly, MA), Pharmacia (Piscataway, NJ)およびInvitrogen (Carlsbad, CA)から市販されている。本発明のポリペプチドは、小さなエピトープでタグをし、その後そのエピトープに対して特異的な抗体を使用して同定または精製することもできる。好ましいエピトープはＦＬＡＧエピトープであり、Eastman Kodak (New Haven, CT)から市販されている。
【００５３】
本発明のポリペプチドはまた、公知の従来の化学合成によって生成することもできる。本発明のポリペプチドを化学的に合成するための方法は、当該分野で周知である。このような化学的に合成されたポリペプチドは、天然の精製ポリペプチドと共通の生物学的特性を有し得、従って、天然ポリペプチドについての生物学的に活性な物質または免疫学的物質として利用され得る。
【００５４】
本発明のポリペプチドはまた、開示されたポリペプチドとは構造的に異なるが（例えば、わずかに変更された配列を有するもの）、開示されたポリペプチドと実質的に同じ生物学的特性を有する分子（例えば、機能的に必須でないアミノ酸残基のみが変更されているもの）も包含する。このような分子としては、天然に存在する対立遺伝子改変体および変質、置換（substitution）、置き換え（replacement）、挿入または欠失を含む意図的に処理された改変体が挙げられる。このような変質、置換、置き換え、挿入または欠失のための技術およびキットは、当該分野において周知である。
【００５５】
（抗体）
本発明のポリペプチドに特異的に結合し得る抗体分子は、当該分野で周知の方法によって生成することができる。例えば、モノクローナル抗体は、公知の方法に従ってハイブリドーマを作製することによって生成することができる。次いで、酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）などの標準方法を使用して、この方法で形成したハイブリドーマをスクリーニングし、本発明のポリペプチドに特異的に結合する抗体を産生する１以上のハイブリドーマを同定する。
【００５６】
本発明の全長ポリペプチドは、免疫原として使用してもよいし、代替的には、上記ポリペプチドの抗原性ペプチドフラグメントを使用してもよい。例えば、上記免疫原は、ＮｇＲ１の機能モチーフ（例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４および配列番号１６のアミノ酸配列のうちの１つ以上）および／または関連ペプチドもしくは環化ペプチド（例えば、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４および配列番号３７のアミノ酸配列のうちの１つ以上）であり得る。本発明のポリペプチドの抗原性ペプチドは、少なくとも４個の連続するアミノ酸残基を含み、そのペプチドに対して惹起された抗体が上記ポリペプチドと特異的な免疫複合体を形成するようなエピトープを包含する。好ましくは、上記抗原性ペプチドは、少なくとも４個のアミノ酸残基を含み、より好ましくは少なくとも７個のアミノ酸残基、そしてさらにより好ましくは少なくとも９個のアミノ酸残基を含む。
【００５７】
モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを調製するための代替法として、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを用いて組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリ（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリ）をスクリーニングすることによって、同定および単離することができ、それによって上記ポリペプチドに結合する免疫グロブリンライブラリメンバーを単離することができる。ファージディスプレイライブラリを作製およびスクリーニングするための技術ならびに市販キットは、当該分野において周知である。さらに、抗体ディスプレイライブラリを作製およびスクリーニングする際に使用するための、特に敏感に反応する方法および試薬の例は、文献において見出すことができる。
【００５８】
ポリクローナル血清およびポリクローナル抗体は、本発明のポリペプチドを用いて適切な被験体を免疫化することによって産生され得る。免疫化した被験体における抗体力価は、標準技術（例えば、固定化マーカータンパク質を使用するＥＬＩＳＡ）によって経時的にモニタリングすることができる。所望の場合、本発明のポリペプチドに対する抗体分子は、被験体または培養培地から単離することができ、そしてＩｇＧ画分を得るための周知の技術（例えば、プロテインＡクロマトグラフィー）によってさらに精製することができる。
【００５９】
本発明のポリペプチドに対する抗体のフラグメントは、当該分野で周知の方法に従って抗体を切断することによって生成することができる。例えば、免疫学的に活性なＦ（ａｂ’）フラグメントおよびＦ（ａｂ’）2フラグメントは、ペプシンなどの酵素で上記抗体を処理することによって作製することができる。
【００６０】
さらに、ヒト部分と非ヒト部分との両方を含む、本発明のポリペプチドに対するキメラ抗体、ヒト化抗体および一本鎖抗体は、標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して生成することができる。ヒト化抗体もまた、内因的な免疫グロブリンの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現する能力はないが、ヒトの重鎖遺伝子および軽鎖遺伝子を発現し得るトランスジェニックマウスを使用して生成することができる。
【００６１】
（試験化合物のスクリーニングアッセイおよび供給源）
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドはまた、ＮｇＲ１リガンドに対する他のアンタゴニスト（これは、軸策成長のＮｇＲ１Ｌ媒介性阻害をアンタゴナイズする（例えば、逆転する、低下する、低減する、妨げる、など）ために使用することができる）についての薬理学的因子またはリード化合物を同定するためのスクリーニングアッセイにおいても使用することができる。例えば、配列番号２、配列番号４、配列番号６、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１８、配列番号２２および配列番号２６〜配列番号３４からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドなどの本発明のアンタゴニストと、ＮｇＲ１リガンド（ＮｇＲ１リガンドのＮｇＲ１結合フラグメント（例えば、ＮＥＰ１〜４０）が挙げられる）とを含むサンプルは、複数の試験化合物（例えば、有機低分子または生物学的因子）のうちの１つと接触され得る。そして、各処理サンプル中の相互作用は、未処理サンプル中もしくは異なる試験化合物と接触させたサンプル中の本発明のアンタゴニストとＮｇＲ１リガンドとの相互作用と比較されて、いずれかの試験化合物がアンタゴニスト：ＮｇＲ１リガンド相互作用のレベルを実質的に低下させるかどうかを決定することができる。好ましい実施形態において、アンタゴニスト：ＮｇＲ１リガンド相互作用の活性を調節し得る試験化合物の同定は、ハイスループットスクリーニングアッセイを使用して実施される。これらのアッセイは、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（登録商標）（Biacore International AB, Uppsala, Sweden）によって提供されるもの、ＢＲＥＴ（生物発光共鳴エネルギー移動）アッセイおよびＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）アッセイ、ならびにＥＬＩＳＡである。当業者は、アンタゴニスト：ＮｇＲ１Ｌ相互作用のレベルを低下させ得る試験化合物が、ＮｇＲ１Ｌのアンタゴニストである可能性があり（例えば、それらがＮｇＲ１Ｌに結合してＮｇＲ１：ＮｇＲ１Ｌ相互作用を遮断するので）、またＮｇＲ１Ｌのアゴニストである可能性がある（例えば、それらが、例えばＫＦＲＧに結合して軸策成長の阻害を活性化するので）ことを認識する。次いで、上記に記載の様式でスクリーニングされるこのようなアンタゴニスト性試験化合物またはアゴニスト性試験化合物は、さらに識別することができ、例えば、その試験化合物がＮｇＲ１Ｌ媒介性の軸策成長阻害をアンタゴナイズする能力またはＮｇＲ１Ｌが媒介する軸策成長の阻害を促進する能力について、それぞれ周知の方法（例えば、実施例１．１に記載の神経突起伸長アッセイ）を使用して試験することができる。
【００６２】
本発明の試験化合物は、多くの供給源から得ることができる。例えば、分子コンビナトリアルライブラリが、スクリーニングのために利用可能である。このようなライブラリを使用して、何千もの分子を阻害活性についてスクリーニングすることが可能である。化合物の調製およびスクリーニングは、上記に記載のとおりに、または当該分野で周知の他の方法によってスクリーニングすることができる。このように同定された化合物は、従来の「リード化合物」として役立ち得るか、または実際の治療として使用することができる。
【００６３】
（処置の方法）
ＮｇＲ１の機能モチーフに関するペプチド模倣物、特にＫＦＲＧのアミノ酸配列を含むペプチドは、ＮｇＲ１リガンド（例えば、ミエリン結合糖タンパク質、希突起神経膠細胞ミエリン糖タンパク質、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−６６、Ｎｏｇｏレセプターに対する抗体、ＧＴ１ｂに対する抗体、ｐ７５ニュートロフィンレセプターに対する抗体およびＬｉｎｇｏ−１に対する抗体）の軸策成長阻害効果に対するアンタゴニストとして使用され得る。従って、本発明は、本発明のアンタゴニストを投与することを含む、軸策再生を必要とする処置について、予防方法および治療方法の両方を提供する。この処置とは、すなわち、軸策成長阻害をアンタゴナイズすること（例えば、逆転する、低下する、低減する、妨げる、など）である。当業者は、このような処置方法は、例えば、脳卒中、多発性硬化症、パーキンソン病、アルツハイマー病などによって引き起こされた脳損傷に罹患する可能性がある被験体、またはこれに罹患している被験体、またはこれに罹患したことがある可能性のある被験体において特に有用であるということを認識する。本方法は、有効量の本発明のアンタゴニストと細胞を接触させて（インビボ、インビトロまたはエキソビボのいずれか）、ＮｇＲ１リガンドの活性（例えば、ニューロン中のＮｇＲ１複合体に結合する１以上のＮｇＲ１リガンドの生物学的結果（例えば、軸策成長の阻害および／またはより高次のレセプター−シグナル伝達複合体の形成））をアンタゴナイズする（例えば、逆転する、低下する、低減する、妨げる、など）工程を含む。上記アンタゴニストは、ＮｇＲ１リガンドの活性をアンタゴナイズする任意の分子であり得、これらとしては低分子およびペプチドインヒビターが挙げられるが、これに限定されない。
【００６４】
例えば、ＮｇＲ１リガンド（例えば、ミエリン結合糖タンパク質、希突起神経膠細胞ミエリン糖タンパク質、Ｎｏｇｏ−Ａ、Ｎｏｇｏ−６６、Ｎｏｇｏレセプターに対する抗体、ＧＴ１ｂに対する抗体、ｐ７５ニュートロフィンレセプターに対する抗体およびＬｉｎｇｏ−１に対する抗体）の活性をアンタゴナイズする低分子（通常は有機低分子）は、例えば、ＮｇＲ１リガンド媒介性の軸策成長阻害を逆転するために使用することができる。新規のアンタゴニスト性低分子は、上記に記載のスクリーニング方法によって同定することができ、本明細書に記載の本発明の処置方法において使用することができる。
【００６５】
軸策再生を必要としているが、ＮｇＲ１リガンド媒介性の軸策成長阻害に苦しむ生体（またはそのリスクのある生体）、またはそのような生体に由来する関連細胞におけるＮｇＲ１リガンドの活性の低下は、ＮｇＲ１リガンドに結合し、その活性を阻害するペプチドインヒビター（例えば、本発明の模倣ペプチドアンタゴニスト）を使用して達成することもできる。ペプチドインヒビターとしては、ＮｇＲ１リガンドがＮｇＲ１と相互作用するのを妨げるペプチド偽基質（peptide pseudosubstrate）が挙げられる。ＮｇＲ１リガンドをアンタゴナイズするペプチドインヒビター、またはＮｇＲ１リガンドをアンタゴナイズし得るペプチドインヒビターは、模倣ペプチドアンタゴニストとして本明細書において開示されており、これらとしては、ＫＦＲＧ（配列番号２６）、ＬＱＫＦＲＧＳＳ（配列番号１４および配列番号１６）、ＫＦＲＧＳ（配列番号１８および配列番号２０）、およびＱＫＦＲＧ（配列番号２２および配列番号２４）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、これらのペプチドインヒビターは、ジスルフィド結合を介して環化されており（配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３および配列番号３４）、そのペプチドがアンタゴニストとして作用する能力を改善する（Williams et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(6):4007-12; Williams et al. (2000) Mol. Cell. Neurosci. 15(5):456-64を参照のこと）。環化および非環化のＮｇＲ１リガンドペプチドインインヒビターは、化学的に合成することができる。さらに、本発明のペプチドインヒビターは、周知の方法を使用して、アセチル化されていてもよいし、アミドブロック化されていてもよい。以下に記載の技術を使用して、インビボ、インビトロまたはエキソビボで、ペプチドインヒビターを細胞（例えば、ニューロン）に提供することもできる。
【００６６】
（投与）
本明細書に記載のいずれの化合物（好ましくは、本発明の模倣ペプチドまたは低分子アンタゴニスト）も、軸策成長の阻害のアンタゴナイズを必要とする処置（すなわち、軸策再生）のための医薬組成物の形態においてインビボで投与することができる。この医薬組成物は、あらゆる経路で投与され得、これらの経路としては、経口、経鼻、脳室内、直腸、局所、舌下、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内（intramedullary）、髄腔内、腹腔内、関節内または経皮の経路が挙げられるが、これらに限定されない。活性成分に加えて、上記医薬組成物は、薬学的に許容可能なキャリアを含有し得る。本明細書において記載の任意の化合物および許容可能なキャリアに加えて、このような組成物は、種々の希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定化剤、可溶化剤および当該分野で周知の他の物質を含有し得る。用語「薬学的に許容可能な」は、活性成分の生物学的活性の効果に干渉しない非毒性の物質を意味する。キャリアの特徴は、投与経路に依存する。
【００６７】
任意の化合物について、治療上有効な用量は、最初に細胞培養物または動物モデルのいずれかで見積もることができる。治療上有効な用量とは、状態またはその症状を改善する活性成分の量をいう。細胞培養物または動物モデルでの治療効能および毒性は、標準的な薬学的手順（例えば、ＥＤ50：集団の５０％において治療上有効な用量；ＬＤ50：その集団の５０％に対して致死的な用量）によって決定され得る。治療効果と毒性効果との間の用量比が治療指数であり、比ＥＤ50／ＬＤ50として表すことができる。高い治療指数を示す医薬組成物が好ましい。
【００６８】
次いで、細胞培養物および動物モデルから得たデータを使用して、哺乳動物（好ましくはヒト）において使用するための化合物についての投薬量の範囲を式で表すことができる。好ましくは、このような化合物の投薬量は、ほとんど毒性がないＥＤ50〜毒性がないＥＤ50を含む濃度の範囲内にある。上記投薬量は、使用した組成物形態および利用した投与経路に依存して、この範囲内を変動し得る。
【００６９】
本発明の別の局面は、ＮｇＲ１リガンドアンタゴニスト（例えば、本発明のペプチド模倣アンタゴニスト）を単独または別の治療化合物もしくは治療因子と一緒に投与するためのキットに関する。１つの実施形態において、上記キットは、薬学的に許容可能なキャリアと共に処方された１以上のＮｇＲ１リガンドアンタゴニストを含む。
【００７０】
本出願の全体にわたって引用された全ての文献、特許および公開特許出願の全内容は、これにより、本明細書において参考として援用される。
【実施例】
【００７１】
以下の実施例は、本発明の例示的実施形態を提供し、本発明を限定するものでは決してない。当業者は、多くの他の実施形態が、本発明の範囲内に包含されることを認識する。
【００７２】
（実施例１：材料および方法）
実施例１．１：神経突起伸長アッセイ
本質的には以前に記載されたとおりに（Williams et al. (1994) Neuron 13(3):583-94）、出生後２／３日のラットの子から単離した小脳ニューロンを３Ｔ３細胞の単層上で培養した（Doherty et al. (1991) Neuron 6(2):247- 58）。ポリ−Ｌ−リジンおよびフィブロネクチンでコーティングされた８つのチャンバー組織培養スライドの各チャンバーに約８０，０００個の細胞をまくことによって、単層を確立した。その細胞株および単層を、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を補充したＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地（Dulbecco's modified Eagle's medium）において維持した。この単層から培地を除去し、約６０００個の解離した小脳ニューロンを各ウェル（ＳＡＴＯ培地中）に播くことによって、同時培養を確立した。ＳＡＴＯ培地は、Doherty et al. (1990) Neuron 5(2):209-19から改変した；２％  ＦＢＳ、３３％ウシアルブミン、０．６２μｇ／ｍｌプロゲステロン、１６１μｇ／ｍｌプトレシン、４μｇ／ｍｌ  Ｌ−チロキシン、０．３８７μｇ／ｍｌセレンおよび３．３７μｇ／ｍｌトリヨードサイロニン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MOからの成分）をＤｕｌｂｅｃｃｏ改変Ｅａｇｌｅ培地に補充した。単層を２４時間定着させてニューロンを添加し、その培養物を約２３〜２７時間維持した。４％パラホルムアルデヒドで注意深く固定した後、ニューロンをＧＡＰ−４３抗体で免疫染色し、約１２０〜１５０個のニューロンについて、１個の細胞につき最も長い神経突起の平均の長さを測定した（Williams et al. (1994) Neuron 13(3):583-94に以前に記載されたとおり）。
【００７３】
実施例１．２：構造
分子モデリングの目的のために、フォン・ビルブラント因子との複合体中の１Ｍ１０（ｐｄｂ登録番号）糖タンパク質Ｉｂα（Huizinga et al. (2002) Science 297:1176-79）およびＮｇＲ１の１ＯＺＮ（ｐｄｂ登録番号）構造（He et al. (2003) Neuron 38(2): 177-85）を使用した。Swiss PDBソフトフェアパッケージを使用して、結晶の結合界面から種々のモチーフの構造を単離し、Accelrysソフトウェアを使用してイメージを作成した。
【００７４】
実施例１．３：試薬
合成ペプチドは、全て商業的な供給業者から得た（Multiple Peptide Systems, San Diego, CA）。逆相ＨＰＬＣによって全てのペプチドを最高程度まで精製し、最高レベルの純度で（＞９７％）で得た。全てのペプチドに関して、より大きい分子量の種は示されなかった。ペプチド配列に下線を引いた箇所は、所定のシステイン残基の間でジスルフィド結合を介して環化されているペプチドを表す。全てのペプチドをアセチル化し（例えば、「Ｎ−Ａｃ−」で表される）、アミドブロック化した（例えば、「−ＮＨ2」で表される）。組換えＭＡＧ−ＦｃキメラをR&D Systems (Minneapolis, MN)から得て、５〜２５μｇ／ｍｌの範囲の最終濃度で使用した。ＧＴ１ｂに対するモノクローナル抗体（クローンＧＭＲ５）をSeikagaku America (Falmouth, MA)から得て、２０μｇ／ｍｌの最終濃度で使用した。全ての試薬を培養培地に希釈し、一般的にはニューロンをプレーティングする直前に培地に添加した。
【００７５】
（実施例２：結果）
実施例２．１：ＮｇＲ１ループペプチドの設計
ＮｇＲ１の構造は決定されているが（Barton et al. (2003) EMBO J. 22(13):3291-302; He et al. (2003) Neuron 38(2):177-85）、リガンド／レセプター複合体の構成要素の構造は決定されていない。しかし、ロイシンリッチリピート（ＬＲＲ）ドメインを有するタンパク質は、リガンドと嵌合するための進化的に保存された機構を使用し得、１つのレセプター中の機能モチーフは、別のレセプター中の機能モチーフを同定して推定することができる。この仮説に基づいて、それらのリガンドを含むＬＲＲ分子の結晶構造に関するパブリックドメインを検索した。このような構造の１つは、フォン・ビルブラント因子との複合体中の糖タンパク質Ｉｂαの構造である（ｐｄｂ受託番号１Ｍ１０）（Huizinga et al. (2002) Science 297: 1176-79）。ＮｇＲ１は、糖タンパク質Ｉｂαと比較して１つ余分なＬＲＲモチーフを有するが、２つの構造はかなり類似している（示さず）。糖タンパク質Ｉｂαにおいて、Ｎ末端およびＣ末端の露出されたループが、リガンドとの相互作用に重要である。この分析に基づいて、図１に示すようなＮｇＲ１上の同等のループおよび多くの推定上の機能モチーフを仮定した。
【００７６】
実施例２．２：神経突起伸長に対する４つのＮｇＲ１ループペプチドの効果
タンパク質中の結合モチーフのペプチド模倣物は、多くの場合（特に、それらがジスルフィド結合によって束縛される（constrained）場合）、生物学的アッセイにおいてアンタゴニストとして機能する（例えば、Williams et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(6):4007-12; Williams et al. (2000) MoI. Cell. Neurosci. 15(5):456-64を参照のこと）。このことに基づいて、ＮｇＲ１上の４つの推定モチーフおよび／または実際のモチーフ（図１で強調されている）の環状ペプチド模倣物を設計した。これらのペプチドは、
【化１】
2008540339.tif 000005
をコードした。
【００７７】
ＭＡＧは、出生後のラット小脳ニューロンの神経突起伸長を阻害する能力に基づいて同定された、ミエリンの最初の阻害成分である（Mukhopadhyay et al. (1994) Neuron 13(3):757-67）。可溶性Ｆｃキメラとしてニューロンに提示された場合、ＭＡＧも神経突起伸長を阻害することができる（Tang et al. (1997) MoI. Cell. Neurosci. 9:333-46）。ＮｇＲ１機能は、神経突起伸長のＭＡＧ阻害のために必要とされる（Domeniconi et al. (2002) Neuron 35(2):283-90; Liu et al. (2002) Science 297:1190-93）。従って、模倣ペプチドがＮｇＲ１機能（例えば、軸策成長のＮｇＲ１リガンド媒介性阻害を逆転する）をアンタゴナイズ（例えば、逆転する、低下する、低減する、妨げる、など）し得るかどうかを決定するために、上記ペプチドが軸策成長のＭＡＧ媒介性阻害をアンタゴナイズする能力について、そのペプチドを試験した。出産後の日数２／３の小脳ニューロンを、３Ｔ３線維芽細胞の単層上で約２３〜２７時間培養した；これらの条件下で、ＭＡＧ−Ｆｃは、これらのサンプル中で神経突起伸長を用量依存的に阻害し（示さず）、２０μｇ／ｍｌにおいて強い阻害がみられた（図２）。軸策成長のＭＡＧ媒介性阻害をアンタゴナイズするＮＲＬペプチドの能力を、多くの独立した実験において試験した。コントロール培地（すなわち、ＭＡＧ−Ｆｃを含まない）において、神経突起伸長を顕著に阻害したペプチドはなく、従って、上記ペプチドは、ニューロンの生存能力または機能に対して、非特異的効果を有していないようであった（図２）。コントロール培地（すなわち、ＮＲＬペプチドを含まない）において、ＭＡＧ−Ｆｃ（２０μｇ／ｍｌ）は実質的に神経突起伸長を阻害した（図２）。同様に、ＮＲＬ１ペプチド、ＮＲＬ３ペプチドまたはＮＲＬ４ペプチドの存在下（１００μｇ／ｍｌ）において、ＭＡＧ−Ｆｃはまた、神経突起伸長も実質的に阻害した（図２）。しかし、ＭＡＧ−Ｆｃの阻害活性は、ＮＲＬ２ペプチドの存在によって広い範囲でアンタゴナイズ（すなわち、逆転、打消し（overcome）、妨げ、など）された（図２）。ＮＲＬ２ペプチドの効能を評価するために、種々の濃度のＮＲＬ２が２５μｇ／ｍｌの可溶性ＭＡＧ−Ｆｃキメラの阻害活性を打ち消す能力を試験した。少なくとも３つの独立した実験において得た結果をプールして、図３を作成している。これらの結果は、ＮＲＬ２が２００μｇ／ｍｌ以下で試験された場合、コントロール（すなわち、ＭＡＧ−Ｆｃを含まない）の神経突起伸長に対してほとんど影響を有さないということを確かめる。これらの結果はまた、上記ペプチドがＭＡＧ−Ｆｃが媒介する軸策成長の阻害を逆転する能力が用量依存的であり、約５０μｇ／ｍｌ（約４５μＭ）でプラトーに達するということを示す。
【００７８】
実施例２．３：ＮＲＬ２はＧＴ１ｂ抗体の機能を阻害する
ガングリオシドＧＴ１ｂは、ニューロンへ阻害シグナルを伝えるＮｇＲ１複合体の一部であるようであり（Yamashita et al. (2002) J. Cell. Biol. 157(4):565-70）、従って、ＧＴ１ｂに対する抗体は、ＭＡＧ−Ｆｃと類似の様式で神経突起伸長を阻害し得る（Vinson et al. (2001) J. Biol. Chem. 276(23):20280-85）。抗ＧＴ１ｂ抗体は、用量依存的に神経突起伸長を阻害した（図４）。抗ＧＴ１ｂの阻害効果はまた、１００μｇ／ｍｌのＮＲＬ２ペプチドの存在下において逆転され、抗ＧＴ１ｂを４０μｇ／ｍｌまで添加したときでさえ逆転された。これらのデータは、（低分子ペプチドによってアンタゴナイズすることができる点で）ＧＴ１ｂ抗体の効果は特異的であることを確かめ、ＮＲＬ２ペプチドが２つの独立したリガンドによってＮｇＲ１複合体の活性をアンタゴナイズし得る、すなわちＮｇＲ１リガンド媒介性の軸策成長阻害を逆転し得ること実証する。
【００７９】
実施例２．４：ＮＲＬ２配列における重要な機能アミノ酸の同定
ＮｇＲ１の構造分析から、ＮＲＬ２ペプチド配列内の最も特徴的な（conspicuous）アミノ酸は、プラスに帯電したリジン（Ｋ）およびアルギニン（Ｒ）であり；両方とも溶媒に露出される程度が高く、明らかに結合のために利用可能な側鎖を有していることが示される（データは示さず）。周囲のアミノ酸のうち、フェニルアラニン（Ｆ）は、構造中に埋もれているが、局所領域の安定化において役割を果たしている可能性がある。グリシンおよびセリンは、部分的に溶媒に露出されているが、結合相互作用を媒介する候補としての可能性は低いようにみえる。この分析に基づいて、ペプチド内に重要なリジンとアルギニンとの両方を有する２つの低分子ペプチドを設計した。これらは、ＮＲＬ２ａペプチド（Ｎ−Ａｃ−ＣＫＦＲＧＳＣ−ＮＨ2（配列番号３２））およびＮＲＬ２ｂペプチド（Ｎ−Ａｃ−ＣＱＫＦＲＧＣ−ＮＨ2（配列番号３３））である。これらのペプチドは、ＮｇＲ１ループ配列由来の共通の４個のアミノ酸モチーフ（ＫＦＲＧ（配列番号２６））を含むことに注意されたい。両方のペプチドは、コントロール培地（すなわち、ＭＡＧ−Ｆｃを含まない）において神経突起伸長に対して効果を有さなかった（示さず）；これらのペプチドがＮｇＲ１リガンド媒介性の軸策成長阻害をアンタゴナイズする能力、すなわちＭＡＧ−Ｆｃの存在下での成長を「促進する」能力を図５に示す。コントロール培地中での基礎の神経突起伸長は５７．４±１．１μｍ（ｎ＝１３）であり、ＭＡＧ−Ｆｃの存在下（２０μｍ／ｍｌ）においては、これが３５．５±１．７μｍ（ｎ＝８）に減少した（図５）。阻害環境のなかで、両方のペプチドは神経突起伸長を「促進し」、２５μｇ／ｍｌ（３０μＭ）において顕著な効果が、５０μｇ／ｍｌ（６０μＭ）において最大効果がみられた。このより高い濃度において、ＭＡＧ−Ｆｃの阻害活性が効果的にアンタゴナイズされた（すなわち、低下した、減少した、排除された（abolish）、妨げられた、など）。このことから、ＮＲＬ２配列内の機能活性は、ＫＦＲＧモチーフ内（そして、実際はおそらくＫＦＲモチーフ内）に存在することが示唆される。
【００８０】
実施例２．５：ＮＲＬ２ベースのホモデティック逆転写（Retro-inverso）模倣ペプチドアンタゴニスト
潜在的なＮｇＲアンタゴニストの効力およびインビボ安定性を増加させるため、ＮＲＬ２をベースにしたホモデティック逆転写模倣ペプチド（homodetic retro-inverso mimetic peptide）（ｈｒｉＮＲＬ２；配列番号３７）を構築した。このｈｒｉＮＲＬ２模倣ペプチドは、以下の点を除いてはＮＲＬ２と類似していた：１）末端のシステインを含まず、親Ｎｏｇｏレセプター配列の部分ではない、２）ホモデティック環化といわれる、より安定なペプチド結合によって環化されている、３）ＮＲＬ２ａ（Ａｃ−ＣＫＦＲＧＳＣ−ＮＨ2（配列番号３２））およびＮＲＬ２ｂ（Ａｃ−ＣＱＫＦＲＧＣ−ＮＨ2（配列番号３３））は、ＭＡＧ阻害のアンタゴナイズにおいてＮＲＬ２と同様に有効であることが立証されたので、ＮＲＬ２配列の２位のロイシンおよび９位のセリンを含まない、４）Ｌ型アミノ酸がそのキラルパートナー（具体的には、標準的なＤアミノ酸）によって置換されている、そして５）その配列を逆転し、側鎖の配向が保存されていること確認した。従って、ｈｒｉＮＲＬ２ペプチドの配列はｃ［ｓＧｒｆｋｑ］であり、ここでｃ［］は、ホモデティック環化を指し、小文字はＤ型アミノ酸を指す。グリシン（Ｇ）は側鎖を有さないので、グリシンはキラリティを有さないことに注意されたい。図６は、ｈｒｉＮＲＬ２がＮｇＲ１リガンド媒介性の軸策成長阻害をアンタゴナイズする能力（詳細には、３Ｔ３細胞上で神経突起伸長のＭＡＧ媒介性阻害を逆転する能力）を実証する。
【００８１】
（実施例３：考察）
本研究まで、ＮｇＲ１において公知の低分子結合モチーフは同定されていなかった。しかし、ＬＲＲタンパク質は、リガンドとかみ合うための進化的に保存された機構を使用し得、１つのレセプター中の機能モチーフは、第２のレセプター中の機能モチーフを同定して推定することができる。ＮｇＲ１に対する重要なミエリンリガンドの１つであるＭＡＧの阻害活性をアンタゴナイズする能力を検索するために、４つのＮｇＲ１露出ループのペプチド模倣物の試験を実施した。全てのペプチドをジスルフィド結合によって束縛させた。この手順は多くの場合、天然のタンパク質構造中の配列と構造的重複を共有するような配置にペプチド模倣物を結合することによって「ループ」ペプチド模倣物の効力を増加させる（Hruby (2002) Nat. Rev. Drug Discov. 1(11):847-58; Williams et al., 2000 J. Biol Chem 275:4007-12）。これらのペプチドのうち３つは、ほとんど活性がないか、または活性を有さなかった；しかし、これらの配列は適切でない様式に束縛されている機能モチーフを実際に留めている（harbor)可能性が依然として存在する。残りのペプチド模倣物ＮＲＬ２は、有効なＭＡＧアンタゴニストであり、約５０μｇ／ｍｌ（約４５μＭ）においてほぼ最大の阻害活性がみられた。このペプチドは、ＮｇＲ１複合体が活性化されていない場合には神経突起伸長に影響を持たず、このことは神経突起伸長に対する軽微な非特異的効果と相反するものであった。さらに、このペプチドは、阻害環境において有効に神経突起伸長を促進しており、このことは、軽微な機構によって説明することは困難である。実際、種々の分子に由来する数百個のペプチドを用いる実験において、神経突起伸長の刺激は、非特異的効果または軽微な効果として観察されていない（例えば、Williams et al. (1994) Neuron 13(3):583-94; Williams et al. (2000) J. Biol. Chem. 275(6):4007-12; Williams et al. (2000) MoI. Cell. Neurosci. 15(5):456-64; Williams et al. (2001) J Biol. Chem. 276(47):43879-86を参照のこと）。
【００８２】
ＮＲＬ２ペプチドのアンタゴニスト特性の特異的性質に対するさらなるサポートは、ＮｇＲ１内の配列の構造の実験から得られる。この構造内において、２個の正に帯電したアミノ酸は、溶媒に露出される程度が高いと考えることができ、従って、タンパク質−タンパク質相互作用に寄与する最も有望な候補であるようである。これら２つのアミノ酸を含む独立した２つのペプチド（Ｎ−Ａｃ−ＣＫＦＲＧＳＣ−ＮＨ2（配列番号３２）およびＮ−Ａｃ−ＣＱＫＦＲＧＣ−ＮＨ2（配列番号３３））を作製して、これらのペプチドが、ＭＡＧ応答の阻害において、より長い親ペプチドと同等に効果的であることを見出した。このことは、これらのペプチドの阻害活性アンタゴニズムが、４個のアミノ酸モチーフ（ＫＦＲＧ）に凝縮（distilled down）することができ、これらのアミノ酸の２個のみが天然構造のうち結合のために最適に利用可能であることを実証している。興味深いことに、神経成長因子（ＮＧＦ）および非荷電アミノ酸によって分けられる２つの正のアミノ酸を含むＮＧＦ由来の環化ペプチド（Ｎ−Ａｃ−ＣＴＤＩＫＧＫＥＣ−ＮＨ2（配列番号３５））は、ミエリンの阻害活性をアンタゴナイズしない（データは示さず）。
【００８３】
原理上、ＮＲＬ２ペプチドは、ＮｇＲ１へのリガンド結合および／または阻害分子−シグナル伝達複合体（例えば、ｐ７５ＮＲＴ）のＮｇＲ１と別の要素との間の相互作用を競合することによってＮｇＲ１機能を阻害することができる。少なくともＮＲＬ２は、ＧＴ１ｂへ結合する抗体によって誘導される阻害のアンタゴナイズにおいて有効であるので、上記複合体へのＭＡＧ結合の排他的阻害から、上記ペプチドの阻害活性を説明することはできない。
【００８４】
要約すると、本研究の結果は、ＮｇＲ１中のＫＦＲＧモチーフを推定上の結合モチーフおよび／または実際の結合モチーフとして同定している。このモチーフ、およびいくつかの側方にあるアミノ酸（ＬＷＡＷＬＱＫＦＲＧＳＳＳ（配列番号３６））は、ヒトとラットとの間で完全に保存されている。ヒトについての配列とラットについての配列との間の１００％同一性は、本明細書に開示されたアンタゴニスト性ペプチドがヒトを処置するためにも使用することができることを示している。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
【図１】４つの推定上の機能モチーフおよび／または実際の機能モチーフを示すＮｏｇｏレセプター１（ＮｇＲ１）のリボンの図が、図１に示される。
【図２】３〜１３の間の独立した実験（丸括弧で示される）からの結果をプールし、ペプチドの非存在下（コントロール）または１００μｇ／ｍｌのＮＲＬペプチド１〜４の存在下（ｘ軸）において、ＭＡＧ−Ｆｃを含まない培地（白色柱）またはＭＡＧ−Ｆｃ（２０〜２５μｇ／ｍｌ）を添加した培地（斜線柱）において確立された３Ｔ３細胞の単層上で２３〜２７時間培養した１００〜１２０個のニューロンから、最も長い小脳神経突起の平均の長さ（μｍ；ｙ軸）±ＳＥＭ（バー）を得た（図２）。
【図３】３〜１３の間の独立した実験（丸括弧で示される）からの結果をプールし、所定濃度（ｘ軸）の人工環化、アセチル化およびアミドブロック化ＮＲＬ２ペプチド（Ｎ−Ａｃ−ＣＬＱＫＦＲＧＳＳＣ−ＮＨ2（配列番号３１））の存在下において、コントロール培地（黒丸）またはＭＡＧ−Ｆｃ（２５μｇ／ｍｌ）を添加した培地（白丸）において確立された３Ｔ３細胞の単層上で培養した１２０〜１５０個のニューロンから、最も長い小脳神経突起の平均の長さ（μｍ；ｙ軸）±ＳＥＭ（バー）を得た（図３）。
【図４】３〜１３の間の独立した実験（丸括弧で示される）からの結果をプールし、ペプチドの非存在下（黒丸）またはＮＲＬ２ペプチド（Ｎ−Ａｃ−ＣＬＱＫＦＲＧＳＳＣ−ＮＨ2（配列番号３１））（１００μｇ／ｍｌ）の存在下（白丸）において、０〜４０μｇ／ｍｌの抗ＧＴ１ｂ抗体を含有する培地において確立された３Ｔ３細胞の単層上で培養した１００〜１２０個のニューロンから、最も長い小脳神経突起の平均の長さ（μｍ；ｙ軸）±ＳＥＭ（バー）を得た（図４）。
【図５】２０μｇ／ｍｌのＭＡＧ−Ｆｃ単独（０μｇ／ｍｌペプチド）を補充した培地、またはＮＲＬ２ａ（Ｎ−Ａｃ−ＣＫＦＲＧＳＣ−ＮＨ2（配列番号３２）；黒丸）もしくはＮＲＬ２ｂ（Ｎ−Ａｃ−ＣＱＫＦＲＧＣ−ＮＨ2（配列番号３３）；白丸）の増加濃度（μｇ／ｍｌ；ｘ軸）のもとで確立した３Ｔ３細胞の単層上で小脳ニューロンを３〜５つに独立して培養した。そのうちの約１００〜１２０個のニューロンから最も長い小脳神経突起の平均の長さ（μｍ；ｙ軸）±ＳＥＭ（バー）を得た（図５）。
【図６】コントロール培地（黒丸）または２０μｇ／ｍｌのＭＡＧ−Ｆｃを補充した培地（白丸）において、両方ともｈｒｉＮＲＬ２（Ｎ−Ａｃ  ｃ［ｓＧｒｆｋｑ］−ＮＨ2（配列番号３７））の濃度（μｇ／ｍｌ；ｘ軸）を増加させて確立した３Ｔ３細胞の単層上で小脳ニューロンを２つに独立して培養した。そのうちの約１００〜１２０個のニューロンから最も長い小脳神経突起の平均の長さ（μｍ；ｙ軸）±ＳＥＭ（バー）を得た（図６）。
【図２】
2008540339.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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