(57)【要約】  遺伝子ＴＣＦ７Ｌ２中の多型が、２型糖尿病への感受性遺伝子であるべき関連解析により示されている。糖尿病への感受性、糖尿病への減少した感受性の診断、及び糖尿病に対する保護の方法が、２型糖尿病についての治療の方法として、記載されている。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における２型糖尿病への感受性を診断する方法であって、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連するマーカー又はハプロタイプについて該個体から得られた核酸サンプルを分析することを含み、該マーカー又はハプロタイプの存在が２型糖尿病への感受性を示す、該方法。
【請求項２】
該マーカー又はハプロタイプが、表６に記載されたマーカーから選択される少なくとも一つのマーカーを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
該マーカー又はハプロタイプがマーカーである、前記のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項４】
該マーカー又はハプロタイプが、２型糖尿病の増加した感受性を示す、前記のいずれかの請求項に記載の方法。
【請求項５】
該増加した感受性が、少なくとも１．３の相対リスク及び少なくとも１．４の相対リスクを含む、少なくとも１．２の相対リスクにより特徴付けられる、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
該マーカー又はハプロタイプが、２型糖尿病の減少した感受性示す、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
該減少した感受性が、０．７未満の相対リスクを含む、０．８未満の相対リスクにより特徴付けられる、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
該マーカーが、ＤＧ１０Ｓ４７８、ｒｓ１２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓｌ１１９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓｌ２２４３３２６及びｒｓ４５０６５６５から成る群より選択され、及びＤＧ１０Ｓ４７８中の非０アレル、ｒｓｌ２２５５３７２中のＴアレル；ｒｓ７８９５３４０中のＡアレル；ｒｓｌ１１９６２０５中のＣアレル；ｒｓ７９０１６９５中のＣアレル；ｒｓ７９０３１４６中のＴアレル；ｒｓ１２２４３３２６中のＣアレル；又はｒｓ４５０６５６５中のＴアレルの存在が、２型糖尿病への増加した感受性を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
該マーカーが、ＤＧｌ０Ｓ４７８及びｒｓ７９０３１４６から成る群より選択され、及びＤＧ１０Ｓ４７８中の非０アレル又はｒｓ７９０３１４６中のＴアレルの存在が２型糖尿病への増加した感受性を示す、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
該マーカーがＤＧｌ０Ｓ４７８であり、及びＤＧ１０Ｓ４７８０中の非０アレルの存在が２型糖尿病への増加した感受性を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
該マーカーがｒｓ７９０３１４６であり、及びｒｓ７９０３１４６中のＴアレルの存在が２型糖尿病への増加した感受性を示す、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
該マーカーが、ＤＧ１０Ｓ４７８、ｒｓ１２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓｌ１１９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓ１２２４３３２６及びｒｓ４５０６５６５から成る群より選択され、及びＤＧ１０Ｓ４７８０中の０アレル、ＳＮＰ  ｒｓｌ２２５５３７２中のＧアレル；ｒｓ７８９５３４０中のＧアレル；ｒｓｌ１１９６２０５中のＧアレル；ｒｓ７９０１６９５中のＴアレル；ｒｓ７９０３１４６中のＣアレル；ｒｓｌ２２４３３２６中のＴアレル；又はｒｓ４５０６５６５中のＡアレルの存在が２型糖尿病への減少した感受性を示す、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
該マーカーがＤＧ１０Ｓ４７８であり、及びＤＧ１０Ｓ４７８０中の０アレルの存在が２型糖尿病への減少した感受性を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
該マーカーがｒｓ７９０３１４６であり、及びｒｓ７９０３１４６中のＣアレルの存在が２型糖尿病への減少した感受性を示す、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
２型糖尿病への感受性を検出するために、個体からのサンプルをアッセイするキットであって、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連する一つ又はそれより多くのマーカーを検出するための、一つ又はそれより多くの試薬を含むキット。
【請求項１６】
該一つ又はそれより多くのマーカーが、ＤＧ１０Ｓ４７８、ｒｓ１２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓｌ１１９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓｌ２２４３３２６及びｒｓ４５０６５６５から成る群より選択される、請求項１５に記載のキット。
【請求項１７】
該一つ又はそれより多くのマーカーが、ＤＧ１０Ｓ４７８又はｒｓ７９０３１４６である、請求項１６に記載のキット。
【請求項１８】
該一つ又はそれより多くのマーカーが、マーカーＤＧ１０Ｓ４７８である、請求項１７に記載のキット。
【請求項１９】
該一つ又はそれより多くのマーカーが、マーカーｒｓ７９０３１４６である、請求項１７に記載のキット。
【請求項２０】
該マーカーがｒｓ７９０３１４６中のＣアレルである、請求項１９に記載のキット。
【請求項２１】
該一つ又はそれより多くの試薬が、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連する、少なくとも一つのマーカーを含む領域と完全に相補的である少なくとも一つの連続したヌクレオチド配列を含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項２２】
ＴＣＦ７Ｌ２療法剤への応答の可能性について個体を評価する方法であって、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連するマーカーを検出することを含み、該マーカーの存在がＴＣＦ７Ｌ２療法剤への陽性応答の可能性を示す、該方法。
【請求項２３】
該マーカーが、ＤＧ１０Ｓ４７８、ｒｓ１２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓ１１１９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓ１２２４３３２６、及びｒｓ４５０６５６５から成る群より選択される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
該マーカーがマーカーＤＧ１０Ｓ４７８であり、及びＤＧ１０Ｓ４７８中の非０アレルの存在がＴＣＦ７Ｌ２療法剤への陽性応答の可能性を示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
該マーカーがマーカーｒｓ７９０３１４６であり、及びｒｓ７９０３１４６中のＴアレルの存在がＴＣＦ７Ｌ２療法剤への陽性応答の可能性を示す、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
２型糖尿病の治療のための医薬の製造におけるＴＣＦ７Ｌ２療法剤の使用。
【請求項２７】
該ＴＣＦ７Ｌ２療法剤が、Ｗｎｔシグナル伝達経路又はカドヘリン経路の活性を改変する剤である、請求項２６に記載の使用。
【請求項２８】
該ＴＣＦ７Ｌ２療法剤が、剤表に示した群から選択される剤である、請求項２６に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
炭水化物の利用が減少し及び脂質及びタンパク質の利用が促進されているメタボリック疾患、糖尿病は、インシュリンの絶対的又は相対的欠乏により起こる。より重症例では、糖尿病は慢性高血糖、糖尿、水分及び電解液損失、ケトアシドーシス及び昏睡に特徴付けられる。長期合併症には、神経障害、網膜症、腎症、大血管及び微小血管における全般性変性変化、及び感染への増加した感受性の発生が含まれる。最も一般的な糖尿病の型は、インスリン分泌障害及び標的組織におけるインスリン耐性による高血糖により特徴付けられる２型インスリン非依存性糖尿病である。遺伝及び環境因子の両方が本疾患の原因となる。例えば、肥満は本疾患の発生に主要な役割を果たしている。２型糖尿病はしばしば、糖尿病の漸進的発症の軽症型である。
【０００２】
２型糖尿病の健康的意義は非常に大きい。１９９５年において、糖尿病を有する成人は世界中で１億３，５００万人であった。２０２５年中には３億人近くが糖尿病を有するであろうと見積もられている。(King H., et al, Diabetes Care, 21(9): 1414-1431 (1998)) 。アイスランドにおける成人人口の２型糖尿病有病率は２．５％であり(Vilbergsson, S., et al, Diabet. Med., 14(6): 491-498 (1997)) 、該疾患を有する３４歳以上のおよそ５，０００人が含まれる。該疾患の高い有病率及び罹患した集団の増加は、２型糖尿病に関与する遺伝因子を定義する、関連リスク因子をより正確に定義するという満たされていない医学的ニーズを示している。２型糖尿病の予防のための療法剤も必要とされている。
【発明の要旨】
【０００３】
本発明は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子（転写因子７様２（Ｔ細胞特異的、ＨＭＧボックス）、以前はＴＣＦ４遺伝子（Ｔ細胞転写因子４）と称されていた）に関する特定のマーカー又はハプロタイプを評価することによる、２型糖尿病への増加した感受性を診断する方法、ならびに２型糖尿病への減少した感受性を診断する又は２型糖尿病に対する保護を診断する方法に関する。本方法は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子のエクソン４ＬＤブロックに関連する遺伝子マーカーを検出することを含む。
【０００４】
第一の側面において、本発明は個体における２型糖尿病への感受性を診断する方法に関し、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連するマーカー又はハプロタイプについて個体から得られた核酸サンプルを分析することを含み、該マーカー又はハプロタイプの存在は、２型糖尿病への感受性を示す。一つの態様において、該マーカー又はハプロタイプは、表６に記載されたマーカーから選択される少なくとも一つのマーカーを含む。別の態様において、該マーカー又はハプロタイプはマーカーである。
【０００５】
一つの好ましい態様において、該マーカー又はハプロタイプは、２型糖尿病の増加した感受性を示す。該増加した感受性は、一つの態様において、少なくとも１．３の相対リスク及び少なくとも１．４の相対リスクを含む少なくとも１．２の相対リスクにより特徴付けられる。一つの態様において、該マーカーは、ＤＧ１０Ｓ４７８、ｒｓｌ２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓｌｌｌ９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓ１２２４３３２６及びｒｓ４５０６５６５から成る群より選択され、及びＤＧ１０Ｓ４７８中の非０アレル（例えば、−４、４、８、１２、１６、２０又は他の非０アレル）、ｒｓ１２２５５３７２中のＴアレル；ｒｓ７８９５３４０中のＡアレル；ｒｓｌ１１９６２０５中のＣアレル；ｒｓ７９０１６９５中のＣアレル；ｒｓ７９０３１４６中のＴアレル；ｒｓｌ２２４３３２６中のＣアレル；又はｒｓ４５０６５６５中のＴアレルの存在は、２型糖尿病への増加した感受性を示す。好ましい態様において、該マーカーはＤＧ１０Ｓ４７８及びｒｓ７９０３１４６から成る群より選択され、及びＤＧ１０Ｓ４７８０中の非０アレル又はｒｓ７９０３１４６中のＴアレルの存在は、２型糖尿病への増加した感受性を示す。さらに別の好ましい態様において、該マーカーはｒｓ７９０３１４６であり、及びｒｓ７９０３１４６中のＴアレルの存在は２型糖尿病への増加した感受性を示す。
【０００６】
別の好ましい態様において、該マーカー又はハプロタイプは２型糖尿病への減少した感受性を示す。該減少した感受性は、一つの態様において、０．７未満の相対リスクを含む０．８未満の相対リスクにより特徴付けられる。一つの態様において、該マーカーは、ＤＧ１０Ｓ４７８、ｒｓｌ２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓｌ１１９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓｌ２２４３３２６及びｒｓ４５０６５６５から成る群より選択され、ＤＧ１０Ｓ４７８０中の０アレル、ＳＮＰｒｓｌ２２５５３７２中のＧアレル；ｒｓ７８９５３４０中のＧアレル；ｒｓｌ１１９６２０５中のＧアレル；ｒｓ７９０１６９５中のＴアレル；ｒｓ７９０３１４６中のＣアレル；ｒｓｌ２２４３３２６中のＴアレル；又はｒｓ４５０６５６５中のＡアレルの存在は、２型糖尿病への減少した感受性を示す。好ましい態様において、該マーカーはＤＧ１０Ｓ４７８であり、及びＤＧ１０Ｓ４７８０中の０アレルの存在は、２型糖尿病への減少した感受性を示す。別の好ましい態様において、該マーカーはｒｓ７９０３１４６であり、及びｒｓ７９０３１４６中のＣアレルの存在は、２型糖尿病への減少した感受性を示す。
【０００７】
第二の側面において、本発明は２型糖尿病への感受性を検出するため、個体からのサンプルをアッセイするためのキットに関し、該キットはＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連する一つ又はそれより多くのマーカーを検出するための一つ又はそれより多くの試薬を含む。一つの態様において、一つ又はそれより多くの試薬は、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連する少なくとも一つのマーカーを含む領域と完全に相補的である少なくとも一つの連続したヌクレオチド配列を含む。一つの態様において、該一つ又はそれより多くのマーカーは、ＤＧ１０Ｓ４７８、ｒｓ１２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓｌ１１９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓｌ２２４３３２６及びｒｓ４５０６５６５から成る群より選択される。好ましい態様において、該一つ又はそれより多くのマーカーは、ＤＧ１０Ｓ４７８又はｒｓ７９０３１４６である。別の好ましい態様において、該マーカーはｒｓ７９０３１４６中のＣアレルである。
【０００８】
別の側面において、本発明は、ＴＣＦ７Ｌ２療法剤への応答の可能性について個体をアッセイする方法に関し、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連するマーカーを検出することを含み、該マーカーの存在はＴＣＦ７Ｌ２療法剤への陽性応答の可能性を示す。一つの態様において、該マーカーはＤＧ１０Ｓ４７８、ｒｓｌ２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓｌ１１９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓｌ２２４３３２６及びｒｓ４５０６５６５から成る群より選択される。別の態様において、該マーカーはマーカーＤＧ１０Ｓ４７８及びマーカーｒｓ７９０３１４６であり、及びＤＧ１０Ｓ４７８０中の非０アレル又はｒｓ７９０３１４６中のＴアレルの存在は、ＴＣＦ７Ｌ２療法剤への陽性応答の可能性を示す。
本発明の別の側面は、２型糖尿病の治療のための医薬の製造におけるＴＣＦ７Ｌ２療法剤の使用に関する。一つの態様において、該ＴＣＦ７Ｌ２療法剤は、Ｗｎｔシグナル伝達経路の又はカドヘリン経路の活性を改変する剤である。別の態様において、該ＴＣＦ７Ｌ２療法剤は、剤表（Agent Table）に示した群から選択される剤である。
【０００９】
発明の詳細な説明
本発明の好ましい態様の説明が以下に続く。
２型糖尿病に関連する座位
２型糖尿病は、インスリン分泌障害、末梢組織におけるインスリン耐性及び肝臓による増加したグルコース排出のような機構を介して生じることが可能である高血糖により特徴付けられる。ほとんどの２型糖尿病患者は、腎症、神経障害、網膜症及び心血管疾患の加速された発生を含む、慢性的高血糖の重篤な合併症に苦しんでいる。全世界の２型糖尿病の有病率は現在６％であるが、次の１０年で上昇すると予想されている（１）。２型糖尿病の有病率におけるこの増加は、人口の高齢化及び肥満の増加によるものである。
【００１０】
種々の人種グループ間の有病率相異（２、３）、二卵性双生児よりも一卵性双生児間でのより高い一致率（４、５）及び約３．５のヨーロッパ人集団における２型糖尿病についての同胞相対リスク（λｓ）（６）を含む、２型糖尿病に対するリスクの遺伝的成分についての証拠がある。
【００１１】
これまで二つのアプローチが、２型糖尿病に関連する遺伝子を探求するために使用されてきた。候補遺伝子内の一塩基変異多型（ＳＮＰｓ）が関連について試験され、一般に、２型糖尿病のリスクは再現されていないか又はわずかしか与えなかった−ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターガンマ遺伝子（ＰＰＡＲＧ２）中の保護的Ｐｒｏ１２ＡＩａ多型（７）及びカリウム内向き整流性チャネル、サブファミリーＪ、メンバー１１遺伝子（ＫＩＲ６．２）中のアットリスク多型（８）が最も広範に報告されている。
【００１２】
２型糖尿病の共通形態を有するファミリーにおける全ゲノム連鎖スキャンでいくつかの座位が得られており、国際研究コンソーシアムの第一焦点は、多くの集団で観察された染色体１、１２及び２０に当てられている（６）。これらの座位上の遺伝子はいつか明らかにすべきである。しかしながら、メキシコ系アメリカ人において、染色体２ｑ上の座位の中からカルパイン１０（ＣＡＰＮ１０）遺伝子が単離されており；これはポジショナルクローニングを介して現在までに同定されている２型糖尿病の共通形態についてのただ一つの遺伝子に相当している（９）。２型糖尿病の希なメンデルの法則に従った形態、即ち若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）では、ポジショナルクローニングにより６つの遺伝子が得られた（６）。
【００１３】
我々は以前に、アイスランド人集団における２型糖尿病について、染色体５ｑに対する全ゲノムでの有意な連鎖を報告した（１０）；同じ研究において、１０ｑ及び１２ｑへの示唆的連鎖も報告した。１０ｑ領域への連鎖はメキシコ系アメリカ人においても観察されている（１１）。
【００１４】
２型糖尿病に関連する転写因子７様２遺伝子（ＴＣＦ７Ｌ２）
本発明は、Ｔ細胞転写因子４（ＴＣＦ４−公式遺伝子記号ＴＣＦ７Ｌ２）をコードする遺伝子内の２型糖尿病関連ＬＤブロック（「ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック」）の同定に関する。マイクロサテライトＤＧ１０Ｓ４７８及びＳＮＰマーカーｒｓ７９０３１４６及びｒｓｌ２２５５３７２を含むＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック内のいくつかのマーカーが２型糖尿病と関連していることが観察された。アイスランド人コホートで最初に観察された、ＤＧ１０Ｓ４７８の関連の最初の観察結果（Ｐ＝１．３ｘ１０−９；相対リスク＝１．４５；人口寄与リスク＝２２．７％）が、続いてデンマーク人２型糖尿病コホート及び米国白人コホートにおいて再現された。ＤＧ１０Ｓ４７８は、１０ｑ２５．２上のＴＣＦ７Ｌ２遺伝子のイントロン３中、及びイントロン３の一部、エクソン４のすべて及びイントロン４の一部を包み込む７４．９ｋｂの明確に定義されたＬＤブロック内に位置する。ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子産物は、ＡＰＣ３／β−カテニン／ＴＣＦ経路としても知られているＷｎｔシグナル伝達経路において役割を果たしている高移動度群（ＨＭＧ）ボックス含有転写因子である。ＴＣＦ７Ｌ２は、Ｗｎｔ経路メンバーβ−カテニン及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ−３ベータを介してプログルカゴン遺伝子発現（血中グルコースホメオスターシスで重要な役割を果たしているもの）の細胞型特異的調節を仲介する（１２）。加えて、Ｗｎｔシグナル伝達は、脂肪生成転写因子ＣＣＡＡＴ／エンハンサー結合タンパク質アルファ（Ｃ／ＥＢＰアルファ）及びペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターガンマ（ＰＰＡＲガンマ）の阻害を介して未分化状態の前脂肪細胞を維持する（１３）。前脂肪細胞のＷｎｔシグナル伝達が、優性阻害ＴＣＦ７Ｌ２の過剰発現により妨げられた場合、これらの細胞は脂肪細胞に分化する（１３）。加えて、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路は、結腸癌細胞でβ−カテニンとＴＣＦ７Ｌ２との物理的相互作用を介してＰＰＡＲガンマ活性を標的とすることが報告されている（１４）。多機能β−カテニンタンパク質は、そのカドヘリンの結合を介した細胞接着を仲介するためにも重要である（１５）。
【００１５】
この発見の結果として、２型糖尿病への感受性の診断、ならびに２型糖尿病への減少した感受性の診断及び／又は２型糖尿病に対する保護についての方法が現在使用可能である。本発明の好ましい態様において、診断アッセイは、マーカーＤＧ１０Ｓ４７８中の０アレル（２型糖尿病への減少した感受性に関連し及び２型糖尿病に対して保護的であるアレルである）；マーカーＤＧ１０Ｓ４７８中の非０アレル（例えば、−４、４、８、１２、１６は２０又は他のアレル）（２型糖尿病への感受性に関連する）；ＳＮＰｒｓ１２２５５３７２中のＧアレル（２型糖尿病への減少した感受性に関連し及び２型糖尿病に対して保護的であるアレルである）：ＳＮＰｒｓｌ２２５５３７２中のＴアレル（２型糖尿病への感受性に関連する）；ＳＮＰｒｓ７８９５３４０中のＧアレル（２型糖尿病への減少した感受性に関連し及び２型糖尿病に対して保護的であるアレルである）；ＳＮＰｒｓ７８９５３４０中のＡアレル（２型糖尿病への感受性に関連する）；ＳＮＰｒｓｌ１１９６２０５中のＧアレル（２型糖尿病への減少した感受性に関連し及び２型糖尿病に対して保護的であるアレルである）；ＳＮＰｒｓｌ１１９６２０５中のＣアレル（２型糖尿病への感受性に関連する）；ＳＮＰｒｓ７９０１６９５中のＴアレル（２型糖尿病への減少した感受性に関連し及び２型糖尿病に対して保護的であるアレルである）；ＳＮＰｒｓ７９０１６９５中のＣアレル（２型糖尿病への感受性に関連する）；ＳＮＰｒｓ７９０３１４６中のＣアレル（２型糖尿病への減少した感受性に関連し及び２型糖尿病に対して保護的であるアレルである）；ＳＮＰｒｓ７９０３１４６中のＴアレル（２型糖尿病への感受性に関連する）；ＳＮＰｒｓｌ２２４３３２６中のＣアレル（２型糖尿病への感受性に関連する）；及びＳＮＰｒｓ４５０６５６５中のＴアレル（２型糖尿病への感受性に関連する）；を含む特定のアレルの存在を同定するために使用される。本発明の追加の態様において、本明細書に記載された方法を使用して同定された他のマーカー又はＳＮＰｓは、２型糖尿病への感受性の診断、及び２型糖尿病への減少した感受性の診断にも、又は２型糖尿病に対して保護的であるアレルの同定のために使用し得る。以下に示された診断アッセイは、これら特定のアレルの存在又は非存在を同定するために使用し得る。
【００１６】
診断アッセイ
本明細書に記載した核酸、プローブ、プライマー及び抗体は、２型糖尿病への感受性の診断の多様な方法において、ならびにキット（例えば、２型糖尿病への感受性の診断について有用である）において使用し得る。同様に、該本明細書に記載した核酸、プローブ、プライマー及び抗体は、２型糖尿病への減少した感受性の診断の方法において、ならびに２型糖尿病に対する保護の診断の方法において、及びキットにおいて使用し得る。一つの側面において、該キットは、目的のマーカーを増幅するために使用し得るプライマーを含む。
【００１７】
本発明の一つの側面において、２型糖尿病への感受性の診断は、本明細書に記載したＴＣＦ７Ｌ２核酸（例えば、マーカーＤＧ１０Ｓ４７８中の、又はＳＮＰｒｓｌ２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓｌ１１９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓｌ２２４３３２６、ｒｓ４５０６５６５中のアレル）中の多型を検出することにより行われる。該多型は、フレームシフトを生じる単一ヌクレオチド又は一つより多くのヌクレオチドの挿入又は欠失；コードされたアミノ酸の変化を生じる少なくとも一つのヌクレオチド変化；早発性の終止コドンの発生を生じる少なくとも一つのヌクレオチド変化；ヌクレオチドによりコードされた一つまたはそれより多くのアミノ酸の欠失を生じるいくつかのヌクレオチドの欠失；遺伝子のコード配列の中断を生じる、非等価組換え又は遺伝子変換によるような一つ又はいくつかのヌクレオチドの挿入；遺伝子のすべて又は一部の重複；遺伝子のすべて又は一部の転位；又は遺伝子のすべて又は一部の再構成；のようなＴＣＦ７Ｌ２核酸における変化であり得る。一つより多くのこうした変化が単一遺伝子に存在することができる。こうした配列変化はＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされるポリペプチドに相違を生じさせる。例えば、もし相違がフレームシフト変化であれば、該フレームシフトはコードされたアミノ酸の変化を生じ得、及び／又は早発性の終止コドンを生じ得、端が切断されたポリペプチドの発生を起こし得る。もしくは、疾患又は状態に関連する多型、又はＴＣＦ７Ｌ２核酸に関連する疾患又は状態への感受性は、一つまたはそれより多くのヌクレオチドにおける同義の変化であり得る（即ち、改変はＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの変化を生じない）。こうした多型は、スプライシング部位を改変し、ｍＲＮＡの安定性又は輸送に影響し、あるいはさもなければ遺伝子の転写又は翻訳に影響することができる。上記の変化又は改変のいずれかを有するＴＣＦ７Ｌ２核酸は、本明細書において「改変された核酸」と称される。
【００１８】
２型糖尿病への感受性を診断するための第一の方法において、サザン分析、ノーザン分析、又はインサイツハイブリダイゼーションのようなハイブリダイゼーション法を使用し得る（Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds, John Wiley & Sons、1999年からのすべての追補を含む、を参照されたい）。例えば、ゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡの試験対象（「試験個体」）からの生物学的サンプル（「試験サンプル」）は、２型糖尿病を有していると疑われる、に感受性である又はの素因となる、又は欠陥を運んでいる個体のような個体から得られる（ＲＮＡ及びｃＤＮＡはエクソンのマーカーとしてのみ使用し得る）。該個体は、成人、小児又は胎児であり得る。該試験サンプルは、例えば、血液サンプル、羊水のサンプル、脳脊髄液のサンプル又は皮膚、筋肉、頬又は結膜粘膜、胎盤、消化管又は他の器官からの組織サンプルのような、ゲノムＤＮＡを含有するいずれの起源からのものでもよい。胎児細胞又は組織からのＤＮＡの試験サンプルは、例えば、羊水穿刺又は絨毛膜サンプリングのような適切な方法で入手可能である。ＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡサンプルは次ぎに、ＴＣＦ７Ｌ２核酸中に多型が存在するかどうかを決定するため、及び／又はＴＣＦ７Ｌ２によりコードされたどのスプライシング変異体（単数又は複数）が存在するのかを決定するために試験する。多型又はスプライシング変異体（単数又は複数）の存在は、核酸プローブへのゲノムＤＮＡ、ＲＮＡ又はｃＤＮＡ中の遺伝子のハイブリダイゼーションにより示すことが可能である。本明細書で使用される「核酸プローブ」は、ＤＮＡプローブ又はＲＮＡプローブであり得；該核酸プローブは、例えば、ＴＣＦ７Ｌ２核酸中の少なくとも一つの多型を含有する、及び／又はＴＣＦ７Ｌ２核酸の特定のスプライシング変異体をコードする核酸を含有することが可能である。該プローブは、上記のいずれかの核酸分子（例えば、遺伝子又は核酸、断片、遺伝子又は核酸を含むベクター、プローブ又はプライマーなど）であり得る。
【００１９】
２型糖尿病への感受性診断するため、ＴＣＦ７Ｌ２核酸を含有する試験サンプルと少なくとも一つの核酸プローブを接触させることによりハイブリダイゼーションサンプルを形成する。ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを検出するための好ましいプローブは、本明細書に記載したｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡ配列にハイブリダイズすることができる標識核酸プローブである。該核酸プローブは、例えば、完全長核酸分子、又はストリンジェント条件下で適切なｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズするのに十分である、少なくとも１５、３０、５０、１００、２５０又は５００ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドのようなそれらの一部であり得る。本発明の診断アッセイにおける使用に適したプローブは上に記載されている（例えば、表題「本発明の核酸」で議論されたプローブ及びプライマーを参照されたい）。
【００２０】
ハイブリダイゼーションサンプルは、ＴＣＦ７Ｌ２核酸への該核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションを可能にするのに十分である条件下で維持する。本明細書で使用される「特異的ハイブリダイゼーション」とは、正確なハイブリダイゼーション（即ち、不適正塩基対のない）を示す。特異的ハイブリダイゼーションは、例えば、本明細書に記載した高ストリンジェンシー条件又は中ストリンジェンシー条件下で実行し得る。特定の好ましい側面において、該ハイブリダイゼーション条件は高ストリンジェンシーである。
【００２１】
特異的ハイブリダイゼーションは、もし存在するならば、次ぎに標準法を使用して検出する。もし特異的ハイブリダイゼーションが、該核酸プローブと試験サンプル中のＴＣＦ７Ｌ２核酸との間で起こったら、ＴＣＦ７Ｌ２は多型を有するか、又は該核酸プローブ中に存在するスプライシング変異体である。この方法においては同時に一つより多くの核酸プローブを使用し得る。核酸プローブのいずれか一つの特異的ハイブリダイゼーションはＴＣＦ７Ｌ２核酸中の多型、又はＴＣＦ７Ｌ２核酸をコードする特定のスプライシング変異体の存在を示し、そして２型糖尿病への感受性、又は２型糖尿病への減少した感受性（又は２型糖尿病に対する保護的アレルを示す）の診断であり得る。
【００２２】
ノーザン分析(Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F. et al., eds., John Wiley & Sons, 上記文献、を参照されたい）において、上記のハイブリダイゼーション法を、２型糖尿病への感受性に関連する又は２型糖尿病への減少した感受性に関連する多型又は特定のスプライシング変異体の存在を同定するために使用する。ノーザン分析のためには、ＲＮＡの試験サンプルを適切な手段により個体から得る。個体からのＲＮＡへの、上記のような核酸プローブの特異的ハイブリダイゼーションは、ＴＣＦ７Ｌ２核酸中の多型、又はＴＣＦ７Ｌ２核酸をコードする特定のスプライシング変異体の存在を示し、そしてそれ故、２型糖尿病への感受性、又は２型糖尿病への減少した感受性（又は２型糖尿病に対する保護的アレルを示す）の診断である。
【００２３】
核酸プローブの使用の代表的な例は、例えば、米国特許番号５,２８８,６１１及び４,８５１,３３０を参照されたい。
もしくは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）プローブを、上記のハイブリダイゼーション法の核酸プローブの代わりに使用し得る。ＰＮＡは、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシンユニットのような、ペプチド様無機主鎖を有し、メチレンカルボニルリンカーを介して該グリシン窒素に有機塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ又はＵ）が結合されているＤＮＡ模倣物である(例えば、Nielsen, P.E. et al, Bioconjugate Chemistry 5, American Chemical Society, p. 1 (1994) を参照されたい) 。ＰＮＡプローブは、ＴＣＦ７Ｌ２核酸に特異的にハイブリダイズするように設計し得る。ＴＣＦ７Ｌ２核酸へのＰＮＡプローブのハイブリダイゼーションは、２型糖尿病への感受性、又は２型糖尿病への減少した感受性（又は２型糖尿病に対する保護的アレルを示す）の診断であり得る。
【００２４】
本発明の別の方法において、もし、遺伝子中の改変（突然変異）又は多型が制限部位の創造又は除去を生じていたら、制限消化による改変分析を、遺伝子中の改変を検出するために使用することが可能である。ゲノムＤＮＡを含有する試験サンプルは個体から得る。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を、試験個体からのゲノムＤＮＡの試験サンプル中のＴＣＦ７Ｌ２核酸（及び、必要ならば隣接配列）を増幅するために使用し得る。ＲＦＬＰ分析は、記載されているごとく実施した(Current Protocols in Molecular Biology 、上記文献、を参照されたい）。関連ＤＮＡ断片の消化パターンは、ＴＣＦ７Ｌ２核酸中の改変又は多型の存在又は非存在を示し、それ故、２型糖尿病への感受性又は２型糖尿病への減少した感受性（又は２型糖尿病に対する保護的アレルを示す）の存在又は非存在を示す。
【００２５】
配列解析も使用することが可能であり、ＴＣＦ７Ｌ２核酸中の特異的多型を検出する。ＤＮＡ又はＲＮＡの試験サンプルは、試験個体から得る。遺伝子又は核酸、及び／又はもし望むならその隣接する配列を増幅するために、ＰＣＲ又は他の適切な方法を使用し得る。標準法を使用し、ＴＣＦ７Ｌ２核酸、又は該核酸の断片、又はｃＤＮＡ、又は該ｃＤＮＡの断片、又はｍＲＮＡ、又は該ｍＲＮＡの断片の配列を決定する。該核酸、核酸断片、ｃＤＮＡ、ｃＤＮＡ断片、ｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ断片の配列を、それぞれに見合った遺伝子又はｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの既知の核酸配列と比較する。ＴＣＦ７Ｌ２中の多型の存在は、個体が２型糖尿病への感受性又は２型糖尿病への減少した感受性（又は２型糖尿病に対する保護的アレルを示す）を有することを示す。
【００２６】
アレル特異的オリゴヌクレオチドも、増幅されたオリゴヌクレオチドとアレル特異的オリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）プローブのドット−ブロットハイブリダイゼーションの使用を介して、ＴＣＦ７Ｌ２核酸中の多型の存在を検出するために使用し得る(例えば、Saiki、 R. et al、 Nature、 324:163-166 (1986)を参照されたい) 。「アレル特異的オリゴヌクレオチド」（本明細書において「アレル特異的オリゴヌクレオチドプローブ」とも称される）は、ＴＣＦ７Ｌ２核酸に特異的にハイブリダイズし、２型糖尿病への感受性に関連した多型又は２型糖尿病への減少した感受性（又は２型糖尿病に対する保護的アレルを示す）に関連した多型を含有する、およそ１０〜５０塩基対、好ましくはおよそ１５〜３０塩基対のオリゴヌクレオチドである。ＴＣＦ７Ｌ２核酸中の特定の多型に特異的であるアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブは、標準法を使用して製造し得る(Current Protocols in Molecular Biology、 上記文献、を参照されたい) 。２型糖尿病に関連する遺伝子中の多型を同定するため、ＤＮＡの試験サンプルを個体から得る。ＰＣＲを、ＴＣＦ７Ｌ２核酸のすべて又は断片及びその隣接する配列を増幅するために使用し得る。増幅されたＴＣＦ７Ｌ２核酸（又は遺伝子又は核酸の断片）を含有するＤＮＡは、標準法を使用してドット−ブロットし（Current Protocols in Molecular Biology、 上記文献、を参照されたい）、そして該ブロットを該オリゴヌクレオチドと接触させる。増幅されたＴＣＦ７Ｌ２核酸へのプローブの特異的ハイブリダイゼーションの存在を次ぎに検出する。個体からのＤＮＡに対するアレル特異的オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、ＴＣＦ７Ｌ２核酸中の多型を示し、そしてそれ故、２型糖尿病への感受性を示すか、又は２型糖尿病への減少した感受性（又は２型糖尿病に対する保護的アレルを示す）を示す。
【００２７】
本発明はさらに、単一ヌクレオチド多型を含む遺伝子又は核酸の基準又は変異体アレルへ、又はそれらの相補体へハイブリダイズするアレル特異的オリゴヌクレオチドを提供する。これらのオリゴヌクレオチドはプローブ又はプライマーであり得る。
【００２８】
アレル特異的プライマーは、多型が重複する標的ＤＮＡ上の部位にハイブリダイズし、該プライマーが完全な相補性を示すアレル形の増幅のみを開始する。Gibbs, Nucleic Acid Res. 17, 2427-2448 (1989) 、を参照されたい。このプライマーは、遠位の部位にハイブリダイズする第二のプライマーと組み合わせて使用される。二つのプライマーから進行する増幅は、検出可能な生成物を生じ、それは特定のアレル形が存在することを示す。対照は通常プライマーの第二の対で実施され、その一つは多型部位での単一塩基ミスマッチを示し、及び他方は遠位の部位への完全な相補性を示す。単一塩基ミスマッチは増幅を妨害し、検出可能な生成物は形成されない。本方法は、ミスマッチが多型でアラインされたオリゴヌクレオチドの最も３’の位に含まれている場合に最もうまくゆき、なぜなら、この位置はプライマーからの伸長を最も不安定化するからである（例えば、ＷＯ９３／２２４５６を参照されたい）。
【００２９】
ロックト核酸（ＬＮＡ）のような類似体の添加により、プライマー及びプローブのサイズをわずか８塩基に減少させ得る。ＬＮＡは二環式ＤＮＡ類似体の新規クラスであり、フラノース環の２’及び４’位がＯ−メチレン（オキシＬＮＡ）、Ｓ−メチレン（チオＬＮＡ）又はアミノメチレン（アミノＬＮＡ）部分により結合されている。これらＬＮＡ変異体のすべてに共通していることは、相補的核酸に対する親和性であり、ＤＮＡ類似体について報告されている中で飛び抜けて高いことである。例えば、特定のすべてのオキシＬＮＡ九量体は、対応するＤＮＡ九量体についてＤＮＡ及びＲＮＡの両方が２８℃であるのに対し、相補的ＤＮＡ又はＲＮＡと複合体形成した場合、それぞれ６４℃及び７４℃の融解温度を有することが示されている。Ｔｍの実質的な増加は、ＬＮＡの単量体が標準ＤＮＡ又はＲＮＡ単量体と組み合わせて使用された場合にも得られる。プライマー及びプローブについては、どこにＬＮＡ単量体が含まれているかに依存して（例えば、３’末端、５’末端又は中央）、Ｔｍをかなり上昇させることができた。
【００３０】
別の側面において、個体からの標的核酸配列セグメントに相補的であるオリゴヌクレオチドプローブのアレイを、ＴＣＦ７Ｌ２核酸中の多型を同定するために使用し得る。例えば、一つの側面において、オリゴヌクレオチドアレイを使用し得る。オリゴヌクレオチドアレイは典型的には、異なった既知の位置で基質の表面に結合する複数の異なったオリゴヌクレオチドプローブを含む。「Genechips（商標）」とも記述されているこれらのオリゴヌクレオチドアレイは、当該技術分野で一般的に記載されている（例えば、米国特許番号5,143,854、ＰＣＴ特許出願番号WO90/15070及び92/10092）。これらのアレイは一般的には、機械的合成法又は光リソグラフ法及び固相オリゴヌクレオチド合成を取り込んだ光指向合成法を使用して製造される。Fodor,S. et al., Science、 251:767-777 (1991). Pirrung et al., 米国特許番号5,143,854（ＰＣＴ出願番号WO90/15070も参照されたい)及びFodor. S. et al., ＰＣＴ公開番号WO92/10092 及び米国特許番号5,424,186 を参照されたい；これらの各々の全教示が本明細書において援用される。機械的合成法を使用したこれらのアレイの合成のための技術については、例えば、米国特許番号5,384,261 に記載されている；全教示が本明細書において援用される。別の例においては、リニアアレイを利用し得る。
【００３１】
オリゴヌクレオチドアレイが製造されたら、目的の核酸を該アレイとハイブリダイズさせ、多型についてスキャンする。ハイブリダイゼーション及びスキャニングは一般に本明細書に記載した、及び、例えば、公開ＰＣＴ出願番号WO92/10092及びWO95/11995及び米国特許番号5,424,186 （全教示が本明細書において援用される）にも記載されている方法により実施する。簡単には、一つ又はそれより多くの以前に同定された多型マーカーを含む標的核酸配列を公知の増幅技術（例えば、ＰＣＲ）により増幅する。典型的には、このことは、多型から上流及び下流の両方の標的配列の二つの鎖に相補的であるプライマー配列の使用を含む。非対称ＰＣＲ技術も使用することができる。一般に標識を取り込んでいる増幅された標的を次ぎに、適切な条件下、該アレイとハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション及び洗浄が完了したら、該アレイをスキャンし、標的配列がハイブリダイズしたアレイ上の位置を決定する。該スキャンから得られたハイブリダイゼーションデータは、典型的にはアレイ上の位置の関数としての蛍光強度の形態である。
【００３２】
最初に、例えば、単一多型部位を検出するために単一検出ブロックに関して記載したけれども、アレイは多重検出ブロックを含むことが可能であり、そしてそれ故、多重特異的多型を解析することが可能である。別の側面において、アレイへの標的のハイブリダイゼーション間に使用することができる最適条件を変動できるように、検出ブロックを単一アレイ内で又は複数の別のアレイにグループ化することができることが一般的に理解される。例えば、Ａ−Ｔ富化セグメントに含まれる多型とは別に、ゲノム配列のＧ−Ｃ富化ストレッチに含まれる多型の検出を提供することがしばしば望まれるであろう。このことは、各状況についての別々のハイブリダイゼーション条件の最適化を可能にする。
【００３３】
多型検出のためのオリゴヌクレオチドアレイの追加の使用は、例えば、全教示が本明細書において援用される米国特許番号5,858,659 及び5,837,832 に見ることができる。核酸分析の他の方法を２型糖尿病遺伝子中の多型又は２型糖尿病遺伝子によりコードされた変異体を検出するために使用し得る。代表的な方法には、例えば、直接マニュアルシークエンシング（Church and Gilbert, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1991-1995 (1988);Sanger, F.,et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA,74:5463-5467(1977)；  Beavis、 et al.,米国特許番号5,288,6449 ）；自動化蛍光シークエンシング；一本鎖コンホメーション多型アッセイ（ＳＳＣＰ）；クランプト変性ゲル電気泳動（ＣＤＧＥ）；変性剤濃度勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）(Sheffield, V., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:232-236 (1989))、移動度シフト分析 (Orita, M., et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 86:2766- 2770 (1989))、制限酵素分析 (Flavell, R., et al, Cell, 15:25(1978); Geever, R., et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78:5081-5085 (1981))；ヘテロ二重鎖分析；化学ミスマッチ切断（ＣＭＣ）(Cotton, R., et al, Proc. Natl Acad. Sci USA, 85:4397-4401 (1985))；ＲＮａｓｅ保護アッセイ (Myers, R., et al, Science, 230:1242(1985))；大腸菌ｍｕｔＳタンパク質のようなヌクレオチドミスマッチを認識するポリペプチドの使用；及びアレル特異的ＰＣＲが含まれる。
【００３４】
本発明の一つの側面において、２型糖尿病への感受性、又は２型糖尿病への減少した感受性（又は２型糖尿病に対する保護的アレルを示す）の診断は、定量的ＰＣＲ（動力学的熱サイクリング）による発現解析によっても達成され得る。ＴａｑＭａｎ（登録商標）を利用するこの技術は、発現の改変又はＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの組成物、又はＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたスプライシング変異体の存在を評価し得る。ＴａｑＭａｎ（登録商標）プローブは、多型及び患者がホモ接合性又はヘテロ接合性であるかどうかの同定を可能にするためにも使用し得る。さらに、変異体の発現を物理的に又は機能的に異なったものとして定量し得る。
【００３５】
本発明の別の側面において、２型糖尿病への感受性、又は２型糖尿病への減少した感受性（又は２型糖尿病に対する保護的アレルを示す）の診断は、酵素連結免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降及び免疫蛍光法を含む多様な方法により、発現及び／又はＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドの組成を試験することにより行い得る。個体からの試験サンプルを、発現の改変及び／又はＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの組成の改変の存在、又はＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされた特定の変異体の存在について評価する。ＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの発現における改変は、例えば、定量的ポリペプチド発現における改変（即ち、産生されたポリペプチドの量）であり得る；ＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの組成における改変は、定量的ポリペプチド発現における改変である（例えば、改変されたＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチド又は異なったスプライシング変異体の発現）。好ましい側面において、２型糖尿病への感受性、又は２型糖尿病への減少した感受性の診断は、ＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされた特定のスプライシング変異体、又はスプライシング変異体の特定のパターンを検出することにより行い得る。
【００３６】
両方のこうした改変（定量的及び定性的）も存在し得る。本明細書で使用されるポリペプチド発現又は組成における「改変」は、対照サンプル中のＴＣＦ７Ｌ２核酸によるポリペプチドの発現又は組成と比較した、試験サンプル中の発現又は組成の変化を指す。対照サンプルは試験サンプルに対応するサンプルであり（例えば、同一タイプの細胞から）、２型糖尿病への感受性により影響されていない個体からのものである。対照サンプルと比較して、試験サンプル中のポリペプチドの発現又は組成における改変は、２型糖尿病への感受性を示す。同様に、対照サンプルと比較して、試験サンプル中の一つまたはそれより多くの異なったスプライシング変異体の存在、又は試験サンプル中の異なったスプライシング変異体の有意に異なった量の存在は、２型糖尿病への感受性を示す。分光法、比色分析、電気泳動、等電点電気泳動及びイムノブロッティングのようなイムノアッセイ(例えば、David et al., 米国特許番号4,376,110)を含む、ＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの発現又は組成を試験する多様な手段を使用し得る(例えば、Current Protocols in Molecular Biology 、特に第１０章、上記文献、を参照されたい)。例えば、一つの側面において、該ポリペプチド（例えば、上記の）に結合することが可能である抗体、好ましくは、検出可能な標識を有する抗体、を使用することが可能である。抗体はポリクローナルでもモノクローナルでもあり得る。無傷の抗体、又はそれらの断片（例えば、Ｆａｂ又は、Ｆ（ａｂ’）２）を使用し得る。プローブ又は抗体に関する用語「標識された」とは、プローブ又は抗体へ検出可能物質をカップリング（即ち、物理的連結）させることによるプローブ又は抗体の直接標識化、ならびに直接的に標識された別の試薬との反応性によるプローブ又は抗体の間接標識を包含することが意図される。間接標識の例には、蛍光標識二次抗体を使用する一次抗体の検出、及び蛍光性標識ストレプトアビジンで検出できるような、ビオチンによるＤＮＡプローブの末端標識が含まれる。
【００３７】
改変されたＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドへ特異的に結合する上記の抗体、又は非改変核酸によりコードされたポリペプチドへ特異的に結合する抗体を使用するウェスタンブロットを、試験サンプル中の特定のスプライシング変異体又は多型又は改変ＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの存在、又は試験サンプル中の特定のスプライシング変異体又は非多型又は非改変ＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの非存在を同定するために使用し得る。多型又は改変核酸によりコードされたポリペプチドの存在、又は非多型又は非改変核酸によりコードされたポリペプチドの非存在は、ＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされた特定のスプライシング変異体の存在（又は非存在）と同様に、２型糖尿病への感受性についての診断となる。
【００３８】
この方法の一つの側面において、試験サンプル中のＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドのレベル又は量が、対照サンプル中のＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドのレベル又は量と比較される。対照サンプル中のポリペプチドのレベル又は量よりも高い又は低い試験サンプル中のポリペプチドのレベル又は量は（相違が統計的に有意であるような）、ＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの発現における改変を示し、２型糖尿病への感受性についての診断となる。もしくは、試験サンプル中のＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの組成が、対照サンプル中のＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされたポリペプチドの組成と比較される（例えば、異なったスプライシング変異体の存在）。対照サンプル中のポリペプチドの組成と比較して、試験サンプル中のポリペプチドの組成の相違は、２型糖尿病への感受性についての診断となる。別の側面において、該ポリペプチドのレベル及び量の両方を試験サンプル中及び対照サンプル中で評価し得る。対照サンプルと比較して、試験サンプル中のポリペプチドのレベル又は組成の相違；対照サンプルと比較して、試験サンプルの組成の相違；又は量又はレベルの両方の相違、及び組成における相違は、２型糖尿病への感受性についての診断となる。
【００３９】
同様の方法を、対照（疾患）サンプルと比較した場合に、相違の存在を同定するために逆に使用し得る。対照からの相違は２型糖尿病への減少した感受性を示し、及び／又は２型糖尿病に対する保護的アレルを示す。
【００４０】
マーカー及びハプロタイプについての評価
遺伝的多様性を示している個体の集団は同一のゲノムを有していない。むしろ、ゲノムはゲノム中の多くの位置で、個体間の配列可変性を示し、言い換えると、集団内に多くの多型部位がある。いくつかの例において、基準アレルを選ぶことなく多型部位で異なったアレルへの基準が作製される。もしくは、基準配列が特定の多型部位について参照される。基準アレルは時には「野生型」アレルとして参照され、それは通常第一の配列決定されたアレルとして、又は「非罹患」個体（例えば、疾患又は異常な表現型を示さない個体）からのアレルとして通常選ばれる。基準と異なるアレルは「変異体」アレルと称される。
【００４１】
本明細書に記載した「マーカー」は、特定の変異体（即ち．多型部位）の特徴を示しているゲノム配列を指す。マーカーは、ゲノム中に観察されるいずれかの変異体タイプのいずれかのアレルであることができ、ＳＮＰｓ、マイクロサテライト、挿入、欠失、重複及び転座が含まれる。
【００４２】
本明細書で報告されているＳＮＰ命名は、National Center for Biotechnological Information（ＮＣＢＩ）により各々独特のＳＮＰに帰属された公式基準ＳＮＰ（ｒｓ）ＩＤ同定タグを指す。
【００４３】
本明細書に記載した「ハプロタイプ」は、セグメントに沿って配置された遺伝子マーカー（「アレル」）の特異的組み合わせにより特徴付けられる、ゲノムＤＮＡ鎖のセグメントを指す。特定の態様において、ハプロタイプは一つ又はそれより多くのアレル、二つ又はそれより多くのアレル、三つ又はそれより多くのアレル、四つ又はそれより多くのアレル、又は五つ又はそれより多くアレルを含み得る。遺伝子マーカーは、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連する「多型部位」での特定の「アレル」である。本明細書で使用される「ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック」とは、２型糖尿病への変異体の関連が観察されるＣｈｒ１０q上のＬＤブロックを指す。このＬＤブロックのＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３４位は１１４，４１３，０８４〜１１４，４８８，０１３ｂｐである。本明細書に記載される用語「感受性」は、増加した感受性及び減少した感受性の両方を包含する。それ故、本発明の特定のマーカー及び／又はハプロタイプは、１より大きな相対的リスクにより特徴付けられるように、２型糖尿病への増加した感受性が特徴であることができる。２型糖尿病の増加した感受性を与えるマーカー及び／又はハプロタイプはさらに、それらは疾患の増加したリスクをあたえるので「アットリスク（at-risk）」であると考えられる。もしくは、本発明の特定のマーカー及び／又はハプロタイプは、１未満の相対的リスクにより特徴付けられるように、２型糖尿病への減少した感受性が特徴である。
【００４４】
集団（天然集団又は合成集団、例えば、合成分子のライブラリー）中で一つより多くの配列が可能であるヌクレオチド位は、「多型部位」と本明細書では称される。多型部位が単一ヌクレオチド長である場合、部位は単一ヌクレオチド多型（「ＳＮＰ」）と称される。例えば、もし特定の染色体位において、集団の１人のメンバーがアデニンを有しているならば、集団の別のメンバーは同一位置にチミンを有し、この位置は多型部位であり、及びより具体的には、多型部位はＳＮＰである。本明細書に記述したＳＮＰマーカーのためのアレルは、用いられたＳＮＰアッセイ中の多型部位に存在する塩基Ａ、Ｃ、Ｇ又はＴを指す。反対の鎖をアッセイする又は読み取ることにより、各々の場合において相補的アレルを測定することが可能であることを当業者は認識するであろう。それ故、Ａ／Ｇ多型を含んでいる多型部位について、用いられるアッセイは可能な二つの塩基、即ち、Ａ及びＧのパーセンテージ又は比のどちらかを測定することができる。もしくは、ＤＮＡ鋳型上の反対の鎖を決定するアッセイを設計することにより、相補的塩基Ｔ／Ｃのパーセンテージ又は比を測定することができる。定量的には（例えば、相対的リスクに関して）、同一の結果がどちらかのＤＮＡ鎖（＋鎖又は−鎖）の測定でも得られるであろう。多型部位は置換、挿入又は欠失に基づいた配列の違いを可能にする。例えば、多型性マイクロサテライトは特定の部位に多数の小さな塩基の反復（ＣＡ反復のような）を有し、反復長の数が一般集団中で変化する。多型部位に関する配列の各バージョンが、多型部位の「アレル」として本明細書において称される。それ故、前の例において、ＳＮＰはアデニンアレル及びチミンアレルの両方を可能にする。２型糖尿病に関連していることが観察された、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック内に位置するＳＮＰｓ及びマイクロサテライトマーカーは表２〜７に記載されている。
【００４５】
典型的には、基準配列は特定の配列を指している。基準から異なるアレルは「変異体」アレルと称される。例えば、第１０染色体内の位置を指す、ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３４の１１４４１３０８４〜１１４４８８０１３位間の基準ゲノムＤＮＡ配列（７４９２９ｂｐ又は７４．９ｋｂと等しい）は、本明細書において配列番号：１と記載されている。本明細書において使用される変異体配列は、配列番号：１とは異なるが、その他の点では実質的に同じである。ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連するハプロタイプを作り上げる遺伝子マーカーは変異体である。さらなる変異体は、ポリペプチド、例えば、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子によりコードされたポリペプチドに影響する変化を含み得る。基準ヌクレオチド配列と比較した場合のこれらの配列相違は、単一ヌクレオチドの、又は一つより多くのヌクレオチドの挿入又は欠失を含み得る。こうした配列相違は、フレームシフト；コードされたアミノ酸の変化を起こすことができる、少なくとも一つのヌクレオチドの変化；早発性の終止コドンの発生を生じることができる、少なくとも一つのヌクレオチド変化；ヌクレオチドによりコードされた一つまたはそれより多くのアミノ酸の欠失を生じることができる、いくつかのヌクレオチドの欠失；読み取り枠のコード配列の中断を生じることができる、非等価組換え又は遺伝子変換によるような一つ又はいくつかのヌクレオチドの挿入；配列のすべて又は一部の重複；転座；又は本明細書に詳述したヌクレオチド配列の再編成、を含むことができる。こうした配列変化は、核酸によりコードされているポリペプチドを変化させる。例えば、もしヌクレオチド配列中の変化がフレームシフトを起こすとすれば、該フレームシフトはコードされたアミノ酸の変化を生じ得、及び／又は早発性の終止コドンを生じ得、端が切断されたポリペプチドの発生を起こす。もしくは、２型糖尿病又は２型糖尿病への感受性に関連する多型、又は癌への感受性は、一つまたはそれより多くのヌクレオチドの同義の変化であり得る（即ち、変化はアミノ酸配列の変化を生じさせない）。こうした多型は、例えば、スプライシング部位を変化し、ｍＲＮＡの安定性又は輸送に影響し、又はさもなくばコードされたポリペプチドの転写又は翻訳に影響し得る。それは、増幅又は欠失のような構造変化が腫瘍の体細胞レベルで生じる可能性を増加させるようにＤＮＡを変化させることもできる。基準ヌクレオチド配列によりコードされているポリペプチドは、特定の基準アミノ酸配列を有する「基準」ポリペプチドであり、及び変異体アレルによりコードされているポリペプチドは、変異体アミノ酸配列を有する「変異体」ポリペプチドと称される。
【００４６】
多型性マイクロサテライトは特定の部位に、２〜８ヌクレオチド長である多数の小さな塩基の反復（ＣＡ反復のような）を有し、反復長の数は一般集団中で変化する。インデルは多型の共通の形態であり、典型的にはほんのわずかだけのヌクレオチド長である小さな挿入又は欠失を含む。
【００４７】
本明細書に記載したハプロタイプは、多型部位に特定のアレルを有している多様な遺伝子マーカー、例えば、ＳＮＰｓ及びマイクロサテライトの組み合わせである。ハプロタイプは多様な遺伝子マーカーを含み得、それ故、ハプロタイプを検出することは、多型部位の配列を検出するための当該技術分野では公知の方法により達成し得る。例えば、ＳＮＰｓ及び／又はマイクロサテライトマーカーの存在について遺伝子型決定するための、例えば、蛍光に基づいた技術（Chen, X. et al., Genome Res. 9(5): 492-98 (1999)) 、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ネステッドＰＣＲ及び核酸増幅のための他の技術のような標準技術を使用し得る。これらのマーカー及びＳＮＰｓはアットリスクハプロタイプで同定し得る。関連するマーカー及びＳＮＰｓを同定する特定の方法には、連鎖不平衡（ＬＤ）及び／又はＬＯＤスコアの使用が含まれる。
【００４８】
本明細書に記載した特定の方法において、２型糖尿病に対してアットリスクである個体は、アットリスクマーカー又はハプロタイプが同定された個体である。一つの側面において、アットリスクマーカー又はハプロタイプは、２型糖尿病の有意に増加したリスク（又は感受性）を与えるものである。一つの態様において、マーカー又はハプロタイプに関連する有意性は相対リスクにより測定される。さらなる態様において、有意性はパーセンテージにより測定される。一つの態様において、有意に増加したリスクは、限定されるわけではないが、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８及び１．９を含む少なくとも約１．２の相対リスクとして測定される。さらなる態様において、リスクにおける有意な増加が少なくとも約１．７であるものが有意である。さらなる態様において、リスクにおける有意な増加は、限定されるわけではないが、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９８％を含む、少なくとも約２０％である。さらなる態様において、リスクにおける有意な増加は、少なくとも約５０％である。
【００４９】
本発明の他の態様において、該マーカー又はハプロタイプは、２型糖尿病の減少したリスク（減少した感受性）を与える。一つの態様において、有意に減少したリスクは、限定されるわけではないが、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５及び０．４を含む、０．９未満の相対リスクとして測定される。さらなる態様において、有意な相対リスクは０．７未満である。別の態様において、リスク（又は感受性）のリスクにおける減少は、限定されるわけではないが、約２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％及び９８％を含む少なくとも約２０％である。さらなる態様において、リスクにおける有意な減少は、少なくとも約３０％である。
【００５０】
用語「２型糖尿病への感受性」は、有意である量による、２型糖尿病の増加したリスク又は感受性又は減少したリスク又は感受性の両方を示し、特定のアレル、マーカー、ＳＮＰ又はハプロタイプが存在する場合；有意性は上に示したように測定される。本明細書で使用される用語「減少したリスク」、「減少した感受性」及び「に対する保護」とは、特定の他のアレル、マーカー、ＳＮＰ及び／又は特定の他のハプロタイプが存在する場合に応じて、相対リスクが減少していることを示す。しかしながら、リスクが医学的に有意であるかどうかは、特異的疾患、該マーカー又はハプロタイプ及びしばしば環境因子を含む、多様な因子にも依存してもよいことが理解される。
【００５１】
ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子中、又はＴＣＦ７Ｌ２遺伝子の一部を含むアットリスクマーカー又はハプロタイプは、健常個体（対照）中のその存在の頻度と比較して、２型糖尿病のリスクがある個体（患者）においてより頻度高く存在するマーカー又はハプロタイプであり、及び該マーカー又はハプロタイプの存在は２型糖尿病への感受性を示す。相関についての簡単な試験の例は２ｘ２分割表のフィッシャーの直接確率検定であろう。染色体のコホートを考えると、マーカー又はハプロタイプの両方、マーカー又はハプロタイプの一つを含むが、他方及びマーカー又はハプロタイプのどちらも含まない染色体の数から離れて２ｘ２分割表が構築される。
【００５２】
本発明の特定の側面において、アットリスクマーカー又はハプロタイプは、２型糖尿病と有意に相関するＴＣＦ７Ｌ２内又は近傍のアットリスクマーカー又はハプロタイプである。他の態様において、アットリスクマーカー又はハプロタイプ２型糖尿病への感受性と有意に相関するＴＣＦ７Ｌ２内又は近傍のアットリスクマーカー又はハプロタイプである。本発明の特定の態様において、該マーカー又はハプロタイプは、本明細書に記載したＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連している。
【００５３】
蛍光に基づいた技術（Chen, X. et al., Genome Res. 9(5): 492-98 (1999)) 、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ネステッドＰＣＲ及び核酸増幅のための他の技術のような標準技術を使用し得る。好ましい側面において、該方法は、個体におけるＴＣＦ７Ｌ２遺伝子内の、又はＴＣＦ７Ｌ２遺伝子の一部を含むＳＮＰｓ及び／又はマイクロサテライトの存在又は頻度を評価することを含み、健常対照個体と比較してＳＮＰｓ及び／又はマイクロサテライトの過剰の又はより高い頻度は、個体が２型糖尿病に対して感受性であることを示す。こうしたＳＮＰｓ及びマーカーは、スクリーニングツールとして使用することが可能なハプロタイプを形成し得る。これらのＳＮＰｓ及びマーカーは、アットリスクハプロタイプ中で同定し得る。例えば、アットリスクハプロタイプは、マーカーＤＧ１０Ｓ４７８及び／又はＳＮＰ  ｒｓｌ２２５５３７２、ｒｓ７８９５３４０、ｒｓｌ１１９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓｌ２２４３３２６又はｒｓ４５０６５６５のようなマイクロサテライトマーカー及び／又はＳＮＰｓを含み得る。アットリスクハプロタイプの存在は、２型糖尿病への増加した感受性を示し、及びそれ故、本明細書に記載した治療法についての標的集団内に含まれる個体を示す。
【００５４】
感受性変異体の同定
患者及び対照群中のハプロタイプの頻度は期待値最大化（expectation-maximization）アルゴリズム(Dempster A. et al., J. R. Stat. Soc. B, 39:1-38 (1977)) を使用して見積もることが可能である。失われた遺伝子型及びフェーズでの不確かさを取り扱うことが可能なこのアルゴリズムの実行を使用し得る。帰無仮説下、患者及び対照は同一の頻度を有すると仮定した。尤度アプローチを使用し、対立仮説を試験し、そこでは、本明細書に記載したマーカーを含むことができる候補アットリスクハプロタイプは対照よりも患者でより高い頻度にし、一方、他のハプロタイプの頻度は両群で同一とした。両方の仮説下で尤度を別々に最大化し、対応する１−ｄｆ尤度比統計を、統計的有意性を評価するために使用した。
【００５５】
連鎖領域内のアットリスク及び保護的マーカー及びハプロタイプを探すため、例えば、これらのマーカーが実行領域に広がっていると仮定して、遺伝子型決定したマーカーのすべての可能な組み合わせの関連を研究した。合併した患者及び対照群を、患者及び対照の本来の群に等しいサイズで、二つの組にランダムに分割することができる。マーカー及びハプロタイプ解析を次ぎに繰り返し、登録された最も有意なＰ値を決定した。このランダム化スキームを例えば、１００回以上繰り返すことができて、Ｐ値の実験的分布を構築した。好ましい態様において、＜０．０５のＰ値が有意なマーカー及び／又はハプロタイプの関連を示す。
【００５６】
ハプロタイプ解析の詳細な議論は以下のようである。
ハプロタイプ解析
ハプロタイプ解析の一つの一般的アプローチはネステッドモデル（ＮＥＭＯ）(Gretarsdottir S., et al., Nat. Genet.35:131-38 (2003))に応用した尤度に基づいた推論を使用することを含んでいる。該方法は、多くの多型マーカー、ＳＮＰｓ及びマイクロサテライトを許容するプログラムＮＥＭＯで実行される。方法及びソフトウェアーは、患者対照研究について具体的に設計され、異なったリスクを与えるハプロタイプ群を同定することが目的である。それはＬＤ構造を研究するためのツールでもある。ＮＥＭＯにおいて、最大尤度見積もり、尤度比及びＰ値は、観察されたデータについてそれを失われたデータ問題として取り扱う、ＥＭアルゴリズムの助けを借りて、直接的に計算される。
【００５７】
測定情報
フェーズの不確かさ及び失われた遺伝子型による情報損失を取り込んだ観察データを直接計算される尤度に基づいた尤度比試験は信頼できて、有効なＰ値を与えるが、不完全である情報のため、どのくらいの情報が失われていたかを知ることはそれでも興味あることであろう。ハプロタイプ解析についての情報量は、連鎖解析について定義された情報量の自然な流れとしてNicolae and Kong (Technical Report 537, Department of Statistics, University of Statistics, University of Chicago ; Biometrics, 60(2):368-75 (2004)) により記載されており、ＮＥＭＯで実行された。
【００５８】
統計解析
疾患への単一マーカー関連について、フィッシャーの直接確率検定を使用することができ、各個体アレルの両側Ｐ値を計算した。すべてのＰ値は特別に示されていない限り、複数比較のために調整されずに示されている。示された頻度（マイクロサテライト、ＳＮＰｓ及びハプロタイプについて）は、キャリアー頻度に対立するものとしてのアレル頻度である。連鎖解析のための家族として動員された患者の同系性による偏向を最小化するため、一等親及び二等親血縁者類は患者リストから除去し得る。さらに、Risch, N. & Teng, J.(Genome Res., 8: 1273-1288 (1998)) に記載されている分散調節法を拡大することにより、一般的家族関連性に適用できるように、及び比較のため調整及び未調整Ｐ値の両方に提示できるように同胞群についてＤＮＡをプール化することにより（前記文献）、患者間に残った同系性を補正して関連について試験を繰り返し得る。相違は、予測されたごとく一般的に非常に小さかった。多重試験のために補正された単一マーカー関連の有意性を評価するため、同一の遺伝子型データを使用してランダム化試験を実施し得る。患者及び対照のコホートをランダム化でき、関連解析を複数回（例えば、５００,０００回まで)やり直し、及びＰ値は、本来の患者及び対照のコホートを使用して観察されたＰ値より低いか又は等しい、いくつかのマーカーアレルについてのＰ値を生み出す反復の一部である。
【００５９】
単一マーカー及びハプロタイプ両解析について、相対リスク（ＲＲ）及び集団寄与リスク（ＰＡＲ）を乗法（multiplicative）モデル（ハプロタイプ相対リスクモデル）(Terwilliger, J.D. & Ott, J., Hum. Hered. 42:337-46 (1992) 及び Falk, CT. & Rubinstein, P, Ann. Hum. Genet. 51 (Pt 3):227-33 (1987)) 、即ち、二つのアレル／人が多数重なって運んでいるハプロタイプのリスク、を仮定して計算し得る。例えば、もしＲＲがａに対するＡの相対リスクであるとしたら、ホモ接合体ＡＡの人のリスクはヘテロ接合体ＡａのリスクのＲＲ倍であり、ホモ接合体ａａのそれのＲＲ２倍であろう。乗法モデルは、解析及び計算を単純化する素晴らしい特性を有する−罹患した集団内ならびに対照集団内でハプロタイプは独立している（即ち、Hardy-Weinberg平衡で）。その結果、罹患者及び対照のハプロタイプ計算は各々多項分布を有するが、対立仮説下では異なったハプロタイプ頻度を有する。具体的には、ｈｉ及びｈｊの二つのハプロタイプについて、リスク（ｈｉ）／リスク（ｈｊ）＝（ｆｉ/ｐｉ）/（ｆｊ/ｐｊ）、式中、ｆ及びｐは、各々、患者集団及び対照集団中の頻度を表す。もし真のモデルが乗法的でないとしたら、いくらかのパワーの損失があるが、該損失は極端なケースを除いて軽度である傾向がある。最も重要なことは、Ｐ値は帰無仮説に関して計算されるので、常に有効である。
【００６０】
ＮＥＭＯを使用する連鎖不平衡
マーカーの対間のＬＤは、Ｄ’及びＲ２の標準定義を使用して計算し得る(Lewontin, R., Genetics 49:49-67(1964); Hill, W.G. & Robertson, A. Theor. Appl Genet. 22:226-231 (1968)) 。ＮＥＭＯを使用し、二つのマーカーアレルの組み合わせを、最大尤度により見積もり、及び連鎖平衡からの逸脱を尤度比試験により評価した。Ｄ’及びＲ２の定義を、辺縁アレル確率により加重した二つのマーカーのすべての可能なアレル組み合わせについての値を平均することによりマイクロサテライトを含むように拡張した。特定の領域中のＬＤ構造を評価するためにすべてのマーカーの組み合わせをプロッティングする場合、Ｄ’を左上の隅に及びＰ値を右下隅にプロットした。ＬＤプロットにおいて、もし望むなら、マーカーはそれらの物理的位置に従うよりもむしろ等間隔にプロットし得る。
【００６１】
連鎖解析のための統計的方法
複数点、患者のみ、アレル共有法を連鎖についての証拠を評価するための解析に使用し得る。ＬＯＤスコア及びノンパラメトリック連鎖（ＮＰＬ）スコアの両方の結果は、プログラムAllegro(Gudbjartsson et al., Nat. Genet. 25:12-3 (2000)) を使用して得ることが可能である。われわれのベースライン連鎖解析はＳｐａｉｒｓスコアリング関数(Whittemore, A.S., Halpern、 J. Biometrics 50:118-27（1994); Kruglyak L. et al., Am. J. Hum. Genet. 55:1347-63 (1996)) 、指数アレル共有モデル(Kong, A. and Cox, N. J., Am. J. Hum. Genet. 61:1179-88 (1997)) 、及びログスケール上、各罹患（affected）対の等しい加重及び各家族の等しい加重の中間である家族加重スキームを使用した。我々が使用する情報量はAllegroプログラム出力の一部であり、情報値は、もしマーカー遺伝子型が完全に情報を与えなければ０に等しく、もし該遺伝子型が罹患血縁者間で家系により共有されているアレルの正確な量を決定していれば１に等しい(Gretarsdottir et al., Am. J. Hum. Genet,, 70:593-603 (2002)) 。Ｐ値は二つの異なった方法で計算され、より有意ではない結果が本明細書で報告されている。第一のＰ値は、多量サンプル理論に基づいて計算することができ；Ｚ１ｒ＝□（２［ｌｏｇｅ（１０）ＬＯＤ］）の分布は連鎖のない帰無仮説下での標準正規変数に近づく(Kong, A. and Cox, NJ., Am. J. Hum. Genet. 61:1179-88 (1997)) 。第二のP値は、帰無仮説下、観察されたＬＯＤスコアとその完全データサンプリング分布を比較することにより計算することができる(例えば、Gudbjartsson et al., Nat. Genet. 25:12-3 (2000)) 。データが数家族以上から成っている場合、これら二つのP値は非常に類似する傾向がある。
【００６２】
感受性座位のハプロタイプ及び「ハプロタイプブロック」定義
特定の態様において、マーカー及びハプロタイプ解析は「ハプロタイプブロック」（「ＬＤブロック」とも称される）に基づいた候補感受性座位を定義することを含んでいる。ヒトゲノムの一部はいくつかの共通のハプロタイプを含有する一連の別々のハプロタイプブロックに分解し得る；これらのブロックについて、連鎖不平衡データは組換えを示す証拠をほとんど示さない(例えば、Wall., J.D. and Pritchard, J.K., Nature Reviews genetics 4:587-597（2003); Daly, M. et al, Nature Genet. 29:229-232 (2001); Gabriel, S.B. et al., Science 296:2225- 2229 (2002); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548 (2002); Phillips, M.S. et al., Nature Genet. 33:382-387（2003) を参照されたい) 。これらのハプロタイプブロックを定義するための二つの主な方法がある；ブロックは限定されたハプロタイプ多様性を有するＤＮＡの領域として (例えば、Daly, M. et al, Nature Genet. 29:229-232 (2001); Patil, N. et al., Science 294:1719-1723 (2001); Dawson, E. et al., Nature 418:544-548 (2002); Zhang, K. et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 99:7335-7339 (2002) を参照されたい) 、又は連鎖不平衡を使用して同定される広範囲の歴史的組換えを有している移行帯間の領域として(例えば、Gabriel, S.B. et al, Science 296:2225-2229 (2002); Phillips、 M.S. et al., Nature Genet. 33:382-38７（2003); Wang, N. et al., Am. J. Hum. Genet. 71:1227-1234 (2002); Stumpf, M.P., and Goldstein, D.B., Curr. Biol. 13:1-8 (2003) を参照されたい) 、定義し得る。本明細書で使用される用語「ハプロタイプブロック」又は「ＬＤブロック」は、いずれかの特徴により定義されるブロックを含む。
【００６３】
ハプロタイプブロックの同定のための代表的方法が、例えば、米国公開特許出願番号２００３００９９９６４、２００３０１７０６６５、２００４００２３２３７及び２００４０１４６８７０に示されている。ハプロタイプブロックは表現型及びハプロタイプ状態間の関連を地図にするために容易に使用し得る。主ハプロタイプが各ハプロタイプブロックで同定し得、そして次ぎに「タグ付け」ＳＮＰｓ又はマーカーの組（ハプロタイプ間を区別するために必要とされる小さな組のＳＮＰｓ又はマーカー）を同定し得る。これらのタグ付けＳＮＰｓ又はマーカーは次ぎに、表現型とハプロタイプ間の関連を同定するため、個体の群からのサンプルの評価に使用することが可能である。もし望むなら、近隣のハプロタイプブロックもハプロタイプブロック間の連鎖不平衡に存在することができるので、それらを同時に評価し得る。
【００６４】
ハプロタイプ及び診断
本明細書に記載したように、こうしたマーカーを含む特定のマーカー及びハプロタイプは、２型糖尿病への感受性を決定するために有用であることが見いだされた−即ち、それらは２型糖尿病への感受性を診断するために有用であることが見いだされた。特定のマーカー及びハプロタイプは２型糖尿病のない個体よりも、２型糖尿病を有する個体においてより頻繁に観察された。それ故、これらのマーカー及びハプロタイプは、個体において２型糖尿病、又は２型糖尿病への感受性を検出するための予測的な意義を有する。特定のタグ付けされたマーカーを含むハプロタイプブロック（即ち、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック）は、２型糖尿病のない個体よりも、２型糖尿病を有する個体においてより頻繁に観察し得る。それ故、ハプロタイプブロック内のこれらの「アットリスク」タグ付けされたマーカーも、個体において２型糖尿病、又は２型糖尿病への感受性を検出するための予測的な意義を有する。ハプロタイプ又はＬＤブロック内の「アットリスク」タグ付けされたマーカーは、ハプロタイプ間を区別する他のマーカーも、これらの類似性が２型糖尿病、又は２型糖尿病への感受性を検出するための予測的な意義を有するので含み得る。ヒトゲノムのハプロタイプブロック構造の結果として、多数のマーカー又は変異体及び／又はハプロタイプブロック（ＬＤブロック）に関連するこうしたマーカー又は変異体を含むハプロタイプは、特定の形質及び／又は表現型と関連して観察することができる。それ故、本明細書で定義されたＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック内に属する、又はＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックと強いＬＤ（０．２より大きなｒ２により特徴付けられる）のマーカー及び／又はハプロタイプは、２型糖尿病と関連している（即ち、それらは２型糖尿病の増加した又は減少した感受性を与える）。これには本明細書（表６）に記載されているマーカーだけでなく、表６に記載された一つ又はそれより多くのマーカーと強いＬＤ（０．２より大きなｒ２により特徴付けられる）の他のマーカーも含むことができる。こうした追加の変異体の同定は、当業者には公知の方法、例えば、ＬＤブロックＡゲノム領域のＤＮＡ配列決定により達成することが可能であり、及び本発明はこうした追加の変異体も包含する。
【００６５】
本明細書に記載されたように、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック内の特定のマーカーは、２型糖尿病を有する個体で減少した頻度で見出され、及び表１３、２０及び２１に収載したマーカーの二つ又はそれより多くを含むハプロタイプも、２型糖尿病を有する個体で減少した頻度で存在していることが見出された。これらのマーカー及びハプロタイプはそれ故、２型糖尿病に対して保護的であり、即ち、これらのマーカー及び／又はハプロタイプを運んでいる個体が２型糖尿病を発生することに、減少したリスクを与える。
【００６６】
本明細書に記載したハプロタイプ及びマーカーは、いくつかのケースにおいて、多様な遺伝子マーカーの組み合わせ、例えば、ＳＮＰｓ及びマイクロサテライトである。それ故、ハプロタイプを検出することは、当該技術分野で既知の、又は多型部位の配列を検出するために本明細書に記載した方法により達成し得る。さらに、特定のハプロタイプ又はマーカーの組と疾患表現型間の相関は、標準技術を使用して確認し得る。相関のための単純な試験の代表的例は、２ｘ２分割表のフィッシャーの直接確率検定であろう。
【００６７】
具体的態様において、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連するマーカー又はハプロタイプは、健常な個体（対照）におけるその存在の頻度と比較して、２型糖尿病のリスクがある個体（患者）により頻繁に存在するマーカー又はハプロタイプであり、該マーカー又はハプロタイプの存在は２型糖尿病又は２型糖尿病への感受性を示す。他の態様において、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連する一つまたはそれより多くのマーカー又はハプロタイプと連鎖不平衡にあるハプロタイプブロック中のアットリスクタグ付けマーカーは、健常な個体（対照）におけるそれらの存在の頻度と比較して、２型糖尿病のリスクがある個体（患者）により頻繁に存在するタグ付けマーカーであり、該タグ付けマーカーの存在は２型糖尿病への感受性を示す。さらなる態様において、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連する一つまたはそれより多くのマーカー又はハプロタイプと連鎖不平衡にあるアットリスクマーカーは、健常な個体（対照）におけるそれらの存在の頻度と比較して、２型糖尿病のリスクがある個体により頻繁に存在するマーカーであり、該マーカーの存在は２型糖尿病への感受性を示す。さらなる態様において、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連する一つ又はそれより多くのマーカーと連鎖不平衡にあるアットリスクマーカーは、健常個体（対照）におけるそれらの存在の頻度と比較して、２型糖尿病についてアットリスクである個体においてより頻繁に存在するであり、該マーカーの存在は、２型糖尿病への感受性を示す。
【００６８】
本明細書に記載した特定的な方法において、２型糖尿病のリスクがある個体は、アットリスクマーカー又はハプロタイプが同定された個体である。一つの態様において、マーカー又はハプロタイプの関連の強度は、相対リスク（ＲＲ）により測定される。ＲＲは、該マーカー又はハプロタイプを運んでいない対象の中での該状態の発生率に対する、該マーカー又はハプロタイプの一つのコピーを運んでいる対象の中での該状態の発生率に対する比である。この比は該マーカー又はハプロタイプの一つのコピーを運ぶ対象の中での該状態の発生率に対する、該マーカー又はハプロタイプの二つのコピーを運ぶ対象の中での該状態の発生率の比に等しい。一つの態様において、該マーカー又はハプロタイプは少なくとも１．２の相対リスクを有する。他の態様において、該マーカー又はハプロタイプは、少なくとも１．３、少なくとも１．４、少なくとも１．５、少なくとも２．０、少なくとも２．５、少なくとも３．０、少なくとも３．５、少なくとも４．０、又は少なくとも５．０の相対リスクを有する。
【００６９】
本発明の他の方法において、２型糖尿病の減少したリスク（又は減少した感受性）を有する個体は、保護的マーカー又はハプロタイプが同定された個体である。このような場合において、相対リスク（ＲＲ）は１未満である。一つの態様において、該マーカー又はハプロタイプは０．９未満の相対リスクを有する。別の態様において、該マーカー又はハプロタイプは０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満又は０．４未満の相対リスクを有する。
【００７０】
遺伝子検査の有用性
２型糖尿病を発生するリスクを与える遺伝子変異体についての知識は、疾患を発生する増加したリスクを有する個体（即ち、アットリスク変異体のキャリアー）及び疾患を発生する減少したリスクを有する個体（即ち、保護的変異体のキャリアー）間を区別するための遺伝子検査を適用する機会を与える。上記の群の両方に属する個体についての遺伝子検査の中核的意義は、早期段階で疾患を診断することができる可能性であり、最も適切な治療を適用することが可能であるように疾患の予後／攻撃性について、臨床医に情報を提供することである。例えば、２型糖尿病についての遺伝子検査の適用は、早期段階での疾患の検出のための機会を提供することが可能であり、それは早期段階での治療手段の適用を導くことができ、そしてそれ故、２型糖尿病による症状の有害効果及び重大な健康上の影響を最小にし得る。
【００７１】
療法の方法
本発明の別の態様において、複数の方法を２型糖尿病の治療のために用い得る。本明細書において用語「治療」とは、２型糖尿病に関連する症状を寛解させるだけでなく、２型糖尿病の発症を防止する又は遅延させる；２型糖尿病の症状の重度又は頻度を軽減する；及び／又は２型糖尿病に関連する症状を寛解する他の薬剤での併用療法の必要性も軽減することを指す。一つの側面において、治療されるべき個体は、２型糖尿病に対して感受性（又は増加したリスク）を有する個体（例えば、マーカーＤＧ１０Ｓ４７８中のアレル以外のＯアレルの存在；ＳＮＰｒｓ１２２５５３７２中のＴアレルの存在；  ＳＮＰｒｓ７８９５３４０中のＡアレルの存在；ＳＮＰ  ｒｓ１１１９６２０５中のＣアレルの存在；ＳＮＰ  ｒｓ７９０１６９５中のＣアレルの存在；ＳＮＰ  ｒｓ７９０３１４６中のＴアレルの存在；ＳＮＰ  ｒｓ１２２４３３２６中のＣアレルの存在；又はＳＮＰ  ｒｓ４５０６５６５中のＴアレルの存在を有する個体）である。
【００７２】
本発明の追加の態様において、複数の方法をＴＣＦ７Ｌ２に関連する他の疾患又は状態の治療のために用い得る。ＴＣＦ７Ｌ２療法剤を、２型糖尿病の治療法、ならびにＴＣＦ７Ｌ２に関連する他の疾患又は状態の治療法の両方に使用し得る。
【００７３】
該治療法（予防的及び／又は療法的）はＴＣＦ７Ｌ２療法剤を利用する。「ＴＣＦ７Ｌ２療法剤」は直接的又は間接的に（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路又はカドヘリン経路（例えば、βカテニン）のタンパク質のような、ＴＣＦ７Ｌ２と相互作用するタンパク質の活性又は核酸発現を改変することを介して）、ポリペプチド活性及び／又はＴＣＦ７Ｌ２の核酸発現を改変する（例えば、増強する又は抑制する）剤である。特定の態様において、ＴＣＦ７Ｌ２療法剤はＴＣＦ７Ｌ２の活性及び／又は核酸発現を改変する。
【００７４】
ＴＣＦ７Ｌ２療法剤は、例えば、追加のＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドを提供することにより又はＴＣＦ７Ｌ２核酸の転写又は翻訳を上方調節することにより；又はＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドの翻訳後プロセッシングを改変することにより；ＴＣＦ７Ｌ２スプライシング変異体の転写を改変することにより；又はＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチド活性を妨害することにより（例えば、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドと結合することにより）、又はＴＣＦ７Ｌ２と相互作用する別のポリペプチドと結合することにより、ＴＣＦ７Ｌ２核酸の発現、転写又は翻訳を改変する（例えば、下方調節する）ことにより、又は活性を改変する（作動する又は拮抗する）ことによるような多様な手段により、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチド活性又は核酸発現を改変し得る。
【００７５】
代表的ＴＣＦ７Ｌ２療法剤には以下のものが含まれる：本明細書に記載した核酸又はそれらの断片又は誘導体、特に本明細書に記載したポリペプチドをコードするヌクレオチド及びこうした核酸（例えば、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸又はそれらの活性断片又は誘導体、又はオリゴヌクレオチド；又はそれらの相補体又はそれらの断片又は誘導体、及び／又は２型糖尿病核酸によりコードされた他のスプライシング変異体又はそれらの断片又は誘導体のような遺伝子、ｃＤＮＡ及び／又はｍＲＮＡ）を含むベクター；本明細書に記載したポリペプチド及び／又はＴＣＦ７Ｌ２核酸又はそれらの断片又は誘導体によりコードされたスプライシング変異体；他のポリペプチド（例えば、ＴＣＦ７Ｌ２レセプター）；ＴＣＦ７Ｌ２結合剤；又は活性に影響する（例えば、増加させる又は減少させる）剤、改変ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドに対する抗体のような抗体、又は非改変ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドに対する抗体、上記のＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされた特定のスプライシング変異体；ペプチド模倣薬；融合タンパク質又はそれらのプロドラッグ；リボザイム；他の小分子；及びＴＣＦ７Ｌ２核酸の発現を改変する（例えば、増強する又は抑制する）、又はＴＣＦ７Ｌ２スプライシング変異体の転写を調節する（例えば、どのスプライシング変異体が発現されるかに影響する、又は発現される各スプライシング変異体の量に影響する剤）その他の剤。追加の代表的ＴＣＦ７Ｌ２療法剤には、インシュリンシグナル伝達及び／又はグルカゴン、ＧＬＰ−１又はＧＩＰシグナル伝達に影響する化合物が含まれる。必要に応じ、一つ以上のＴＣＦ７Ｌ２療法剤を同時に使用し得る。
【００７６】
好ましい態様において、ＴＣＦ７Ｌ２療法剤は、例えば、βカテニン（例えば、Fasolini, et al, J. Biol. Chem 278(23):21092-06 (2003) を参照されたい）又は他のタンパク質とＴＣＦ７Ｌ２との結合又は相互作用を妨げる剤のような、ＴＣＦ７Ｌ２の活性を妨げる剤である。他のＴＣＦ７Ｌ２療法剤には、Ｗｎｔシグナル伝達経路に影響する剤、又はカドヘリン経路に影響する剤が含まれる。代表的剤には、例えば、ＤＫＫタンパク質のようなタンパク質；ＡＰＣ又はＡｘｉｎのβカテニン結合ドメイン；ＩＤＡＸ、ＡＸＡＭ及びＩＣＡＴのような因子；ビトラベン（Vitravene）の使用のようなアンチセンスオリゴヌクレオチド又はＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）；腫瘍退縮性ウイルスベクター；及び他の化合物（例えば、Luu et al, Current Cancer Drug Targets 4:6530671 (2004) を参照されたい）; 例えば、Lepourcelet et al（例えば、Lepourcelet et al., Cancer Call 5:91-102 (2004) を参照されたい）により記載されている、ＺＴＭ００９９０、ＰＫＦｌ１８−３１０、ＰＫＦｌ１８−７４４、ＰＫＦｌ１５−５８４、ＰＫＦ２２２−８１５、ＣＧＰＯ４９０９０、ＮＰＤＤＧ３９．０２４及びＮＰＤＤＧ１．０２４を含む、低分子拮抗剤; 米国特許第6,762,185号に記載されている化合物；米国特許出願第20040005313、20040072831、20040247593又は20050059628号に記載されている化合物；を含む癌療法のために使用される剤が含まれる。他の代表的ＴＣＦ７Ｌ２療法剤には、例えば、米国特許第6,057,117；6,153,618；6,417,185；6,465,231；6,489,344；6,512,102；6,608,063；6,716,624；6,800,632及び公開米国特許出願第20030008866；20030077798；20030130289；20030207883；2000092535；及び200500851号に記載されているものを含む、ｇｓｋ３阻害剤が含まれる。明細書に引用されたすべての参照文献、特許及び特許出願の全教示は、その全体が本明細書において援用される。
【００７７】
追加の代表的ＴＣＦ７Ｌ２療法剤は、下記の剤表に示されている。
【００７８】
【表１】
2008546403.tif 000002
【００７９】
【表２】
2008546403.tif 000003
【００８０】
ＴＣＦ７Ｌ２療法剤は、療法的に有効量（即ち、上記のように「治療」のために十分である量）で投与される。特定の個体の障害又は状態の治療において療法的に有効であろう量は、疾患の症状及び重篤度に依存し、標準臨床技術により決定し得る。加えて、至適投与量範囲の同定を助けるため、インビトロ又はインビボアッセイを随意に用いることができる。処方に用いられるべき正確な用量は、投与経路及び疾患又は障害の重篤度に依存するであろうし、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効な用量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから誘導される用量応答曲線から外挿することができる。
【００８１】
一つの態様において、核酸（例えば、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸）；又はＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチド又はスプライシング変異体をコードする別の核酸、それらの誘導体又は断片は、単独で又は上記の医薬組成物中で使用し得る。例えば、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子又は核酸又はＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドをコードするｃＤＮＡは、細胞が天然のＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドを産生するように、それ自身を又はベクター内に含ませて、細胞内に導入し得る（インビトロ又はインビボで）。もし必要なら、該遺伝子で形質転換されている細胞又はｃＤＮＡ又は、遺伝子、核酸又はｃＤＮＡを含むベクターを、疾患に冒された個体内に導入（又は再導入）し得る。それ故、本来は、自然のＴＣＦ７Ｌ２発現及び活性を欠く、又は改変されたＴＣＦ７Ｌ２発現及び活性を有する、又は疾患関連ＴＣＦ７Ｌ２スプライシング変異体の発現を有する細胞は、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチド又はＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドの活性断片（又はＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドの異なった変異体）を発現するように工学処理し得る。特定の態様において、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドをコードする核酸又はそれらの活性断片又は誘導体は、ウイルスベクターのような発現ベクター中に導入することが可能であり、及び該ベクターは動物の適切な細胞中に導入し得る。ウイルス及び非ウイルス導入システムを含む、他の遺伝子導入システムを使用し得る。もしくは、リン酸カルシウム共沈、機械的技術（例えば、マイクロインジェクション）；リポソームを介した膜融合仲介導入；又は直接ＤＮＡ取り込みのような非ウイルス遺伝子導入システムも使用し得る。
【００８２】
もしくは、本発明の別の態様において、本発明の核酸；本発明の核酸に相補的な核酸；こうした核酸の一部（例えば、下記のオリゴヌクレオチド）は、２型糖尿病遺伝子のｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）が投与されるか又は生体内原位置で発生される「アンチセンス」療法に使用し得る。該ｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡに特異的にハイブリダイズするアンチセンス核酸は、例えば、翻訳及び／又は転写を阻害することにより、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドの発現を阻害する。アンチセンス核酸の結合は、通常の塩基対相補性によるものであるか、又はＤＮＡ二重鎖への結合の場合、二重螺旋のメジャーグルーブでの特異的相互作用を介したものでもあり得る。
【００８３】
本発明のアンチセンス構築物は、例えば、上記の発現プラスミドとして送達し得る。該プラスミドが細胞中で転写された場合、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドをコードするｍＲＮＡ及び／又はＤＮＡの一部と相補的であるＲＮＡを産生する。もしくは、アンチセンス構築物は生体外で発生されて細胞内へ導入されるオリゴヌクレオチドプローブでもあり得る；それは次ぎにポリペプチドのｍＲＮＡ及び／又はゲノムＤＮＡとハイブリダイズすることにより発現を阻害する。一つの態様において、該オリゴヌクレオチドプローブは、内在性ヌクレアーゼ、例えば、エキソヌクレアーゼ及び／又はエンドヌクレアーゼに耐性であり、それによりインビボでそれらを安定化する修飾オリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドとして使用するための核酸分子の例は、ＤＮＡのホスホロアミダート、ホスホチオエート及びメチルホスホネート類似体である（米国特許第176,996; 5,264,564;及び5,256,775号を参照されたい）。加えて、アンチセンス療法に有用であるオリゴマーを構築するための一般的アプローチも、Van der Krol et al.,(BioTechniques 6:958-976 (1988));及びStein et al.,(Cancer Res. 48:2659-2668 (1988)) により記載されている。アンチセンスＤＮＡに関しては、翻訳開始部位から誘導されたオリゴデオキシリボヌクレオチドが好ましい。
【００８４】
アンチセンス療法を実施するには、オリゴヌクレオチド（ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ）は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子をコードするｍＲＮＡに相補的であるように設計される。アンチセンスオリゴヌクレオチドはＴＣＦ７Ｌ２  ｍＲＮＡ転写体に結合し、翻訳を妨げる。絶対的相補性、好ましいけれども必要とはされない。本明細書において記述された、ＲＮＡの一部への配列「相補性」とは、ＲＮＡとハイブリダイズでき、安定な二重鎖を形成するために十分な相補性を有する配列を示しており；二本鎖アンチセンス核酸の場合においては、二重鎖ＤＮＡの一本鎖を上述のように試験することができ、又は三重鎖形成をアッセイすることができる。ハイブリダイズする能力は、上に詳述したように、相補性の程度及びアンチセンス核酸の長さの両方に依存するであろう。一般的に、ハイブリダイズする核酸が長くなるほど、より多くの塩基ミスマッチを含むことができ、それでも安定な二重鎖（又は場合によっては三重鎖）を形成する。当業者は、標準法の使用により、許容できるミスマッチの程度を解明し得る。
【００８５】
アンチセンス療法で使用されるオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はキメラ混合物又はそれらの誘導体又は修飾体、一本鎖又は二本鎖であり得る。オリゴヌクレオチドは塩基部分、糖部分又はリン酸主鎖で、例えば、分子の安定性、ハイブリダイゼーションなどを改善するために修飾することが可能である。オリゴヌクレオチドは、ペプチド（例えば、インビボで宿主細胞レセプターを標的化するため）、又は細胞膜（例えば、Letsinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6553-6556 (1989); Lemaitre et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:648-652 (1987); ＰＣＴ国際公開番号：WO 88/09810 を参照されたい）又は血液脳関門（例えば、ＰＣＴ国際公開番号：WO89/10134 を参照されたい）を横切る輸送を容易にする剤、又はハイブリダイゼーション−タグ付け切断剤（例えば、Krol et al., BioTechniques 6:958-976 (1988) を参照されたい）、又はインターカレーティング剤（例えば、Zon, Pharm. Res. 5:539-549 (1988) を参照されたい）のような他の付加基を含み得る。この目的には、オリゴヌクレオチドを別の分子（例えば、ペプチド、ハイブリダイゼーションタグ付け架橋剤、運搬剤、ハイブリダイゼーション−タグ付け切断剤）とコンジュゲートさせることができる。
【００８６】
アンチセンス分子は、インビボでＴＣＦ７Ｌ２を発現する細胞へ送達される。アンチセンスＤＮＡ又はＲＮＡを細胞へ送達するために多くの方法を使用することが可能であり；例えば、アンチセンス分子を組織部位内に直接注入することができ、又は所望の細胞を標的にするように設計された修飾アンチセンス分子（例えば、標的細胞上に発現されたレセプター又は抗原に特異的に結合するペプチド又は抗体と連結されたアンチセンス分子）を全身的に投与し得る。もしくは、好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドが強力なプロモーター（例えば、ｐｏｌＩＩＩ又はｐｏｌＩＩ）の制御下に置かれた組換えＤＮＡ構築物を利用する。患者の標的細胞をトランスフェクトするためのこうした構築物の使用は、内在性ＴＣＦ７Ｌ２転写体と相補的塩基対を形成するであろう一本鎖ＲＮＡの十分な量の転写体を生じ、それにより、ＴＣＦ７Ｌ２  ｍＲＮＡの翻訳を防止する。例えば、ベクターが細胞により取り込まれそしてアンチセンスＲＮＡの転写を指示するように、ベクターをインビボで導入し得る。こうしたベクターは、エピソームとして残存できるか、又は染色体に組み込まれるようになり、その間、所望のアンチセンスＲＮＡを産生するように転写され得る。こうしたベクターは、当該技術分野では標準の及び上記の組換えＤＮＡ技術法により構築することが可能である。例えば、プラスミド、コスミッド、ＹＡＣ又はウイルスベクターを、組織部位内へ直接導入することが可能な組換えＤＮＡ構築物を調製するために使用し得る。もしくは、ウイルスベクターを所望の組織を選択的に感染させるために使用することが可能であり、この場合、投与は別の経路（例えば、全身的に）により達成することができる。
【００８７】
内在性ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチド発現は、標的化相同組換え（例えば、Smithies et al., Nature 317:230-234 (1985); Thomas & Capecchi, Cell 51:503-512 (1987); Thompson et al., Cell 5:313-321 (1989) を参照されたい）を使用し、遺伝子、核酸又はそのプロモーターを不活性化又は「ノックアウト」することによっても減少させ得る。例えば、内在性遺伝子又は核酸（核酸のコード領域又は調節領域）に相同的なＤＮＡが隣接する、改変非機能的遺伝子又は核酸（又は完全に非相関ＤＮＡ配列）が、インビボで遺伝子又は核酸を発現する細胞をトランスフェクトするために、選択可能マーカー及び／又はネガティブ選択可能マーカーと共に又はなしで、使用し得る。標的化相同的組換えを介したＤＮＡ構築物の挿入は、該遺伝子又は核酸の不活性化を生じる。組換えＤＮＡ構築物は、上記のように、適切なベクターを使用して、インビボで要求される部位へ直接投与する又は標的化することが可能である。もしくは、非改変遺伝子又は核酸の発現は同様の方法を使用して増加させ得る：標的化相同組換えを、上記のように、細胞中に改変ＴＣＦ７Ｌ２の代わりに非改変遺伝子又は核酸を含むＤＮＡ構築物を挿入するために使用し得る。別の態様において、標的化相同的組換えを、細胞中に存在するものとは異なった２型糖尿病ポリペプチド変異体をコードする核酸を含むＤＮＡ構築物を挿入するために使用し得る。
【００８８】
もしくは、内在性ＴＣＦ７Ｌ２核酸発現を、ＴＣＦ７Ｌ２核酸の調節領域（即ち、ＴＣＦ７Ｌ２プロモーター及び／又はエンハンサー）と相補的なデオキシリボヌクレオチド配列を標的とし、体内の標的細胞におけるＴＣＦ７Ｌ２核酸の転写を妨げる三重螺旋構造を形成させることにより減少させ得る。（一般的には、Helene, C, AntiCancer  Drug Des., 6(6): 569-84 (1991); Helene, C. et al., Ann. N.Y. Acad. Sci. 660:27-36 (1992); 及びMaher, L. J., Bioassays 14(12):807-15 (1992) を参照されたい）。同様に、本明細書に記載したアンチセンス構築物は、一つのＴＣＦ７Ｌ２タンパク質の正常生物学的活性と拮抗することにより、インビボ及びエキソビボ組織培養の両方で組織の操作、例えば、組織分化に使用し得る。さらに、アンチセンス技術（例えば、アンチセンス分子のマイクロインジェクション、又はその転写体が２型糖尿病ｍＲＮＡ又は遺伝子配列に関してアンチセンスであるプラスミドでのトランスフェクション）を、発生事象におけるＴＣＦ７Ｌ２の役割又はＴＣＦ７Ｌ２及びその結合剤との相互作用、ならびに成人組織におけるＴＣＦ７Ｌ２の又はＴＣＦ７Ｌ２及びその結合剤との相互作用の正常細胞機能を調べるために使用し得る。こうした技術は、細胞培養で利用できるのみでなく、トランスジェニック動物の創造においても使用し得る。
【００８９】
本発明のさらに別の態様において、本明細書に記載した他のＴＣＦ７Ｌ２療法剤を２型糖尿病遺伝子の治療においても使用し得る。該療法剤は、上記の組成物中で、又はそれら自身により送達し得る。それらは全身的に投与することも可能であり、又は特定の組織を標的とすることも可能である。該療法剤は、例えば、化学合成；組換え産生；インビボ産生（例えば、Meade et al. による米国特許第4,873,316号のようなトランスジェニック動物）を含む多様な手段により産生することが可能であり、及び本明細書に記載した標準法を使用して単離し得る。
【００９０】
上記の治療法のいずれかの組み合わせ（例えば、ＴＣＦ７Ｌ２の改変ｍＲＮＡを標的とするアンチセンス療法と組み合わされた非改変ポリペプチドの投与；ＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされた第二のスプライシング変異体を標的とするアンチセンス療法と組み合わされた、ＴＣＦ７Ｌ２核酸によりコードされた第一のスプライシング変異体の投与）も使用し得る。
【００９１】
ＴＣＦ７Ｌ２療法剤への応答の可能性を評価する方法
本発明はさらにＴＣＦ７Ｌ２療法剤への応答する個体の可能性を評価する方法に関する。該方法においては、２型糖尿病への感受性について個体を評価することに関して上に記載したように、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子に関係するマーカー又はハプロタイプを評価する。２型糖尿病についての感受性（増加したリスク）に関連するアレル、マーカー、ＳＮＰ又はハプロタイプ（例えば、マーカーＤＧ１０Ｓ４７８中の非０アレル；ＳＮＰ  ｒｓ１２２５５３７２中のＴアレル；ＳＮＰ  ｒｓ７８９５３４０中のＡアレル；ＳＮＰ  ｒｓ１１１９６２０５中のＣアレル；ＳＮＰ  ｒｓ７９０１６９５中のＣアレル；ＳＮＰ  ｒｓ７９０３１４６中のＴアレル；ＳＮＰ  ｒｓ１２２４３３２６中のＣアレル；ＳＮＰ  ｒｓ４５０６５６５中のＴアレル；ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連するアットリスクハプロタイプのようなＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロックに関連するマーカー）の存在は、ＴＣＦ７Ｌ２療法剤への陽性応答の可能性を示す。「陽性応答の可能性」は、個体が、本明細書に記載した２型糖尿病についての感受性（増加したリスク）に関連するアレル、マーカー、ＳＮＰ又はハプロタイプを有していない個体よりも、ＴＣＦ７Ｌ２療法剤に対する陽性応答を有する可能性が高いことを示す。ＴＣＦ７Ｌ２療法剤への「陽性応答」は、２型糖尿病の治療を示す、生理学的応答である。上記のように、「治療」は、２型糖尿病に関連する症状を寛解させるだけでなく、２型糖尿病の発症を防止する又は遅延させる；２型糖尿病の症状の重度又は頻度を軽減する；及び／又は２型糖尿病に関連する症状を寛解する他の薬剤での併用療法の必要性も軽減することを指す。
【００９２】
医薬組成物
本発明は、ＴＣＦ７Ｌ２活性を改変するか、又はさもなければＷｎｔシグナル伝達経路又はカドヘリン経路に影響するか、又はＴＣＦ７Ｌ２療法剤として使用し得る剤を含む医薬組成物にも関する。該医薬組成物は、薬学的に許容できる担体又は賦形剤と配合することができて、医薬組成物が製造される。担体及び組成物は滅菌し得る。製剤は投与の様式に適していなければならない。
【００９３】
適した薬学的に許容できる担体には、限定されるわけではないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、生理食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物性油脂、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、ラクトース、アミロース又はデンプンのような炭水化物、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘稠性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。医薬調製物は、もし望むなら、活性剤と有害な反応を起こさない助剤、例えば、滑剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩、緩衝液、着色剤、芳香付与剤及び／又は芳香物質などと混合し得る。
【００９４】
該組成物は、もし望むなら、少量の湿潤又は乳化剤、又はｐＨ緩衝化剤も含み得る。該組成物は液体溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤又は散剤であり得る。該組成物は、トリグリセリドのような慣用的結合剤及び担体とともに、座剤として製剤することも可能である。経口製剤は、医薬品質のマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどのような標準担体を含み得る。
【００９５】
これらの組成物の導入方法には、限定されるわけではないが、皮内、筋肉内、腹腔内、眼内、静脈内、皮下、局所、経口及び鼻腔内が含まれる。他の適した導入方法には、遺伝子療法（下記のような）、充電可能又は生分解可能デバイス、粒子加速デバイス（「遺伝子銃」）及び持続放出ポリマーデバイスも含まれ得る。本発明の医薬組成物は、他の剤とのコンビナトリアル療法の一部としても投与し得る。
【００９６】
該組成物は、ヒトへの投与に適合した医薬組成物として、日常的な手順に従って製剤し得る。例えば、静脈内投与のための組成物は典型的には、無菌等張水性緩衝液の液剤である。必要な場合、該組成物は、可溶化剤及び注射部位での疼痛を安らげるための局所麻酔剤も含むことができる。一般に、成分は別々に又は単一剤形で一緒に混合して、例えば、活性剤の量を示しているアンプル又はサシェ剤のような密封した容器中の凍結乾燥粉末又は水を含まない濃縮物として供給される。該組成物が注入により投与されるべき場合、それを無菌医薬品品質の水、生理食塩水又はデキストロース／水を含有する注入ボトルに分注し得る。該組成物が注射により投与されるべき場合、投与に先立って成分を混合できるように、注射のための無菌水又は生理食塩水のアンプルを提供し得る。
【００９７】
局所適用のためには、局所適用に適合し、好ましくは水よりも大きな動粘性を有する担体を含む、噴霧不可能形態、粘稠性から半固体又は固体形態を用い得る。適した製剤には、限定されるわけではないが、液剤、懸濁液、乳濁液、クリーム剤、軟膏剤、散剤、浣腸剤、ローション剤、ゾル剤、リニメント剤、塗布剤、エアロゾル剤などが含まれ、それらは、もし望むなら、滅菌され及び助剤、例えば、保存剤、安定化剤、湿潤剤、緩衝液又は浸透圧に影響を及ぼす塩などと混合される。剤は化粧品製剤に取り込むこともできる。局所適用のためには、活性成分が、好ましくは固体又は液体不活性担体材料と組み合わされて、スクイーズボトル又はに包装されている、又は加圧揮発性で通常はガス性噴霧剤（例えば、加圧空気）と混合されている、噴霧可能エアロゾル製剤も適している。
【００９８】
本明細書に記載された剤は、中性又は塩形態として配合し得る。薬学的に許容できる塩には、塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などから誘導された塩のような遊離アミノ基と形成された塩、水酸化ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム及び第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカインなどから誘導された塩のような遊離カルボキシル基と形成された塩が含まれる。
【００９９】
剤は、療法的に有効量で投与される。療法的に有効であろう量は、一部障害の性質及び症状の程度に依存し、標準臨床技術により決定し得る。加えて、至適投与量範囲の同定を助けるため、インビトロ又はインビボアッセイを随意に用いることができる。処方に用いられるべき正確な用量は、投与経路及び疾患又は障害の重篤度に依存するであろうし、医師の判断及び各患者の状況に従って決定されるべきである。有効な用量は、インビトロ又は動物モデル試験システムから誘導される用量応答曲線から外挿することができる。
【０１００】
本発明は、本発明の医薬組成物の一つ又はそれより多くの成分が充填された一つ又はそれより多くの容器を含む医薬パック又はキットも提供する。こうした容器に随意に関連するものは、医薬又は生物学的製品の製造、使用又は販売を規制している行政機関により指示された形式での通知であり、該通知はヒト投与についての製造、使用又は販売の該機関による承認を表示している。該パック又はキットは、投与様式、薬剤投与の系列（例えば、別々に、連続的に又は同時に）などに関する情報のラベルを付けることが可能である。該パック又はキットは、併用療法の単一単位剤形であることも可能であり、又は複数の単位剤形であることも可能である。特に、該剤は分離される、いずれかの組み合わせで一緒に混合される、単一バイアル又は錠剤中に存在することが可能である。ブリスター包装又は他の分配手段で構築された剤が好ましい。本発明の目的には、投薬単位は、各剤の個々の薬力学に依存している投薬量を意味することが意図され、標準経時的にＦＤＡ承認投薬量で投与する。
【０１０１】
スクリーニングアッセイ及びそれにより同定された剤
本発明は、ＴＣＦ７Ｌ２の活性を改変する（例えば、増加又させる又は減少させる）、さもなければＷｎｔシグナル伝達経路又はカドヘリン経路（例えば、βカテニン）のＴＣＦ７Ｌ２又は別のメンバーと相互作用する剤（例えば、融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド模倣体、プロドラッグ、レセプター、結合剤、抗体、小分子又は他の薬剤又はリボザイム）を同定するための方法も提供する。例えば、特定の態様において、こうした剤は、ＴＣＦ７Ｌ２に結合する；例えば、ＴＣＦ７Ｌ２の活性に刺激的又は抑制的効果を有する；又はＷｎｔシグナル伝達経路の他のメンバーと又はカドヘリン経路のメンバーと相互作用するＴＣＦ７Ｌ２の能力を変化させる（例えば、増強する又は抑制する）、又はＴＣＦ７Ｌ２の翻訳後プロセッシングを改変する剤であり得る。他の態様において、こうした剤は、Ｗｎｔシグナル伝達経路又はカドヘリン経路の活性又は機能を改変する剤であり得る。
【０１０２】
一つの態様において、本発明は、ＴＣＦ７Ｌ２タンパク質（又はそれらの生物学的に活性なタンパク質）に結合する又は活性を変調する候補又は試験剤をスクリーニングするためのアッセイ、ならびに該アッセイにより同定可能な剤を提供する。試験剤は当該技術分野では既知のコンビナトリアルライブラリー法のいずれか多数のアプローチを使用して得ることが可能であり、生物学的ライブラリー；空間的にアドレス可能な平行固相又は液相ライブラリー；デコンボリューションを必要とする合成ライブラリー法；「一ビーズ一化合物」ライブラリー法；及びアフィニティークロマトグラフィー選択を使用する合成ライブラリー法；が含まれる。生物学的ライブラリーアプローチはポリペプチドライブラリーに限定されているが、他の四つのアプローチは、化合物のポリペプチド、非ペプチドオリゴマー又は小分子ライブラリーに応用可能である（Lam, K.S., AntiCancer  Drug Des. 12:145 (1997)) 。
【０１０３】
一つの態様において、ＴＣＦ７Ｌ２の活性を改変する剤を同定するため、細胞、細胞可溶化物又は、ＴＣＦ７Ｌ２又はそれらの断片又は誘導体を含有する又は発現している溶液を、試験されるべき剤と接触させ得る；もしくは該タンパク質を試験されるべき剤と直接接触させ得る。ＴＣＦ７Ｌ２活性のレベル（量）を評価し（例えば、ＴＣＦ７Ｌ２活性のレベル（量）を測定し、直接的又は間接的）、対照における活性のレベル（即ち、試験すべき剤が存在しない場合の、ＴＣＦ７Ｌ２タンパク質又はそれらの活性断片又は誘導体の活性レベル）と比較する。該剤の存在下での活性のレベルが、該剤が存在しない場合の活性のレベルと、統計的に有意である量ほど異なっていれば、該剤は、ＴＣＦ７Ｌ２の活性を改変する剤である。対照と比較して活性のレベルの増加は、該剤が活性を増強する剤（アゴニスト）であることを示している。同様に、対照と比較して活性のレベルの減少は、該剤が活性を抑制する剤（アンタゴニスト）であることを示している。別の態様において、試験されるべき剤の存在下でのＴＣＦ７Ｌ２又はそれらの誘導体又は断片の活性のレベルを、以前に確立されている対照レベルと比較する。該剤の存在下での活性のレベルが、対照レベルと、統計的に有意である量ほど異なっていれば、該剤は、ＴＣＦ７Ｌ２の活性を改変する剤である。
【０１０４】
本発明は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子の発現を改変する、該遺伝子の発現（例えば、転写又は翻訳）を改変する（例えば、増加させる又は減少させる）、又はさもなければＴＣＦ７Ｌ２と相互作用する剤（例えば、アンチセンス核酸、融合タンパク質、ポリペプチド、ペプチド模倣体、プロドラッグ、レセプター、結合剤、抗体、小分子又は他の薬剤又はリボザイム）を同定するためのアッセイ、ならびに該アッセイにより同定可能な剤に関する。例えば、ＴＣＦ７Ｌ２をコードする核酸含有溶液を、試験されるべき剤と接触させることが可能である。該溶液は、例えば、核酸を含有する細胞又は核酸を含有する細胞溶解物を含むことが可能であり；もしくは、該溶液は核酸の転写／翻訳に必要な要素を含む別の溶液でもあり得る。もし望むなら、溶液に懸濁されていない細胞を用いることも可能である。ＴＣＦ７Ｌ２発現のレベル及び／又はパターン（例えば、異なったスプライシング変異体のレベル及び／又はパターンのような、ｍＲＮＡの又は発現されたタンパク質のレベル及び／又はパターン）を評価し、対照で発現されたレベル及び／又はパターン（即ち、試験すべき剤が存在しない場合のＴＣＦ７Ｌ２発現のレベル及び／又はパターン）と比較する。もし該剤の存在下での活性のレベル及び／又はパターンが、該剤が存在しない場合の活性のレベル及び／又はパターンと、統計的に有意である量ほど異なっていれば、該剤は、２型糖尿病遺伝子の発現を改変する剤である。ＴＣＦ７Ｌ２発現の増強は、該剤がＴＣＦ７Ｌ２活性のアゴニストであることを示している。同様に、ＴＣＦ７Ｌ２発現の抑制は、該剤がＴＣＦ７Ｌ２活性のアンタゴニストであることを示している。別の態様において、試験すべき剤の存在下、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチド（例えば、異なったスプライシング変異体）のレベル及び／又はパターンを、以前に確立されている対照レベル及び／又はパターンと比較する。該剤の存在下でのレベル及び／又はパターンが、対照レベル及び／又はパターンと、統計的に有意である量ほど異なっていれば、該剤はＴＣＦ７Ｌ２発現を改変することを示す。
【０１０５】
本発明の別の態様において、ＴＣＦ７Ｌ２の発現を改変するか、又はさもなければＴＣＦ７Ｌ２又はＷｎｔシグナル伝達経路又はカドヘリン経路の別のメンバーと相互作用する剤が、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子のプロモーター領域をコードする核酸又はレポーター遺伝子に機能可能であるように連結されている核酸を含有する細胞、細胞溶解物又は溶液を使用して同定し得る。試験すべき剤との接触後、レポーター遺伝子の発現のレベル（例えば、ｍＲＮＡ又は発現されたタンパク質のレベル）を評価し、対照中の発現のレベル（即ち、試験すべき剤が存在しない場合のレポーター遺伝子のレベル）と比較する。もし該剤の存在下でのレベルが、該剤が存在しない場合のレベルと、統計的に有意である量ほど異なっていれば、該剤は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子プロモーターに機能可能であるように連結されている遺伝子の発現を改変する能力により示されるように、ＴＣＦ７Ｌ２の発現を改変する剤である。レポーターの発現の増強は、該剤がＴＣＦ７Ｌ２活性のアゴニストであることを示している。同様に、レポーター発現の抑制は、該剤がＴＣＦ７Ｌ２活性のアンタゴニストであることを示している。別の態様において、試験すべき剤の存在下、レポーターの発現のレベルを、以前に確立されている対照レベルと比較する。該剤の存在下でのレベルが、対照レベルと、統計的に有意である量ほど異なっていれば、該剤は発現を改変することを示す。
【０１０６】
ＴＣＦ７Ｌ２によりコードされている異なったスプライシング変異体の量を改変する剤（例えば、第一のスプライシング変異体の活性を増強する、及び第二のスプライシング変異体の活性を抑制する剤）、ならびに第一のスプライシング変異体の活性のアゴニストであり、及び第二のスプライシング変異体の活性のアンタゴニストである剤は、上記のこれらの方法を使用して容易に同定し得る。
【０１０７】
本発明の他の態様において、アッセイを、ＴＣＦ７Ｌ２結合剤に関連するポリペプチドの活性に対する試験剤の影響力を評価するために使用し得る。例えば、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドと相互作用する化合物（以後「ＴＣＦ７Ｌ２結合剤」と称され、Ｗｎｔシグナル伝達経路のメンバー又はカドヘリン経路のメンバーのようなＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドと、直接的に又は間接的に相互作用するポリペプチド又は他の分子であり得る）を発現する細胞とＴＣＦ７Ｌ２を、試験剤の存在下で接触させ、ＴＣＦ７Ｌ２及びＴＣＦ７Ｌ２結合剤間の相互作用を改変する試験剤の能力を決定する。もしくは、ＴＣＦ７Ｌ２結合剤を含有する細胞可溶化物又は溶液を使用し得る。ＴＣＦ７Ｌ２又はＴＣＦ７Ｌ２結合剤へ結合する剤は、ＴＣＦ７Ｌ２結合剤へ結合する、会合する又はさもなければ相互作用するＴＣＦ７Ｌ２の能力を妨害する又は増強することにより相互作用を改変し得る。ＴＣＦ７Ｌ２又はＴＣＦ７Ｌ２結合剤へ結合する試験剤の能力を決定することは、例えば、ポリペプチドへの試験剤の結合を、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ又は３Ｈでの標識物を直接的又は間接的に検出すること、及び放射性同位元素を放射発光の直接計数又はシンチレーション計数により検出することにより決定できるように、試験剤を放射性同位元素又は酵素標識とカップリングさせて達成し得る。もしくは、試験剤を例えば、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ又はルシフェラーゼで酵素的に標識し、適切な基質の生成物への変換の決定により酵素標識を検出する。いずれの反応体の標識なしで、該ポリペプチドと相互作用する試験剤の能力を決定することも本発明の範囲内である。例えば、マイクロフィジオメーター（microphysiometer）を、試験剤、ＴＣＦ７Ｌ２又はＴＣＦ７Ｌ２結合剤をいずれも標識することなく、試験剤とＴＣＦ７Ｌ２又はＴＣＦ７Ｌ２結合剤との相互作用を検出するために使用し得る。McConnell, H.M. et al., Science 257: 1906-1912 (1992) 。本明細書で使用する「マイクロフィジオメーター」（例えば、Cytosensor（商標））は、光アドレス可能電位差測定センサー（ＬＡＰＳ）を使用して、細胞がその環境を酸性化する速度を測定する分析機器である。酸性化速度の変化は、リガンドとポリペプチド間の相互作用の尺度として使用し得る。
【０１０８】
それ故、これらのレセプターは、２型糖尿病への感受性を治療する又は研究することにおける使用について、アゴニスト又はアンタゴニストである化合物をスクリーニングするために使用し得る。薬剤はＴＣＦ７Ｌ２活性化を調節するために設計することが可能であり、それは順に、シグナル伝達経路及び下流遺伝子の転写事象を調節するために使用し得る。
【０１０９】
本発明の別の態様において、アッセイをＴＣＦ７Ｌ２と相互作用するポリペプチドを同定するために使用し得る。例えば、Fields and Song (Fields, S. and Song, O., Nature 340:245-246 (1989)) により記載されているような酵母２ハイブリッドシステムを、ＴＣＦ７Ｌ２と相互作用するポリペプチドを同定するために使用し得る。こうした酵母２ハイブリッドシステムにおいて、ベクターは、二つの機能性ドメイン（ＤＮＡ結合ドメイン及び転写活性化ドメイン）を有する転写因子の融通性に基づいて構築される。もし二つのドメインは分離されているが、お互いに相互作用する二つの異なったタンパク質に融合されていれば、転写活性化が達成され、及び特異的マーカーの転写（例えば、Ｈｉｓ及びＡｄｅのような栄養マーカー、又はｌａｃＺのような呈色マーカー）を、相互作用及び転写活性化の存在を同定するために使用し得る。例えば、本発明の方法において、ＤＮＡ結合ドメイン及びＴＣＦ７Ｌ２、スプライシング変異体又はそれらの断片又は誘導体もコードする核酸を含む第一のベクターが使用され、及び転写活性化ドメイン及びＴＣＦ７Ｌ２又はスプライシング変異体又はそれらの断片又は誘導体と相互作用する可能性のあるポリペプチドをコードする核酸も含む第二のベクターが使用される。適切な条件下（例えば、Clontech (Palo Alto, California, USA) からのMatchmaker（商標）システムで使用されるような接合条件）、第一のベクター及び第二のベクターを含有する酵母のインキュベーションは、目的のマーカーを発現するコロニーの同定を可能にする。これらのコロニーは、ＴＣＦ７Ｌ２又はそれらの断片又は誘導体と相互作用するポリペプチドの同定するために検査し得る。こうしたポリペプチドは、治療の方法に関して記載したように、ＴＣＦ７Ｌ２の発現の活性を改変する剤として使用し得る。
【０１１０】
本発明の上記アッセイ法の一つ以上の態様において、該タンパク質の一つ又は両方の複合体未形成形態から複合体形成形態の分離を容易にするため、ならびにアッセイの自動化に適応するため、固体支持体上にＴＣＦ７Ｌ２遺伝子、ＴＣＦ７Ｌ２タンパク質、ＴＣＦ７Ｌ２結合剤（例えば、Ｗｎｔシグナル伝達経路のメンバー又はカドヘリン経路のメンバー）、又はアッセイの他の成分を固定化するのが望ましいであろう。試験剤存在下及び非存在下での、タンパク質への試験剤の結合又はタンパク質と結合剤との相互作用は、反応体を含有するために適したいずれの容器中でも達成し得る。こうした容器の例には、マイクロタイタープレート、試験管及び微量遠心分離管が含まれる。一つの態様において、融合タンパク質（例えば、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ融合タンパク質）は、ＴＣＦ７Ｌ２、ＴＣＦ７Ｌ２タンパク質又はＴＣＦ７Ｌ２結合剤がマトリックス又は他の固体支持体へ結合されるのを可能にするドメインを加えて提供され得る。
【０１１１】
別の態様において、本発明の核酸分子の発現の変調剤が一つの方法において同定され、ＴＣＦ７Ｌ２を含有する細胞、細胞可溶化物又は溶液を試験剤と接触させ、及び細胞、細胞可溶化物又は溶液中の適切なｍＲＮＡ又はポリペプチド（例えば、スプライシング変異体）の発現を決定する。試験剤存在下での適切なｍＲＮＡ又はポリペプチド（例えば、スプライシング変異体）の発現のレベルを、試験剤非存在下での適切なｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現のレベルと比較する。試験剤は、この比較に基づいて発現の変調剤として同定され得る。例えば、試験剤非存在下でのｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現がその非存在下よりも多い（統計的に有意に多い）場合、試験剤は、ｍＲＮＡ又はポリペプチド発現の刺激剤又は増強剤として同定される。もしくは、試験剤非存在下でのｍＲＮＡ又はポリペプチドの発現がその非存在下よりも少ない（統計的に有意に少ない）場合、試験剤は、ｍＲＮＡ又はポリペプチド発現の阻害剤として同定される。細胞におけるｍＲＮＡ又はポリペプチド発現のレベルは、ｍＲＮＡ又はポリペプチドを検出することについて本明細書で記載した方法により決定し得る。
【０１１２】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより同定された新規剤に関する。従って、本明細書に記載された治療の方法において、本明細書に記載されたように同定された剤をさらに使用することも本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載したように同定された剤を、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子によりコードされたタンパク質の活性を改変するため、又は該タンパク質又は該核酸と本明細書に記載したように同定された剤とを接触させること（又は該タンパク質又は該核酸を含む細胞と接触させること）によりＴＣＦ７Ｌ２の発現を改変させるために使用し得る。
【０１１３】
本発明の核酸
ＴＣＦ７Ｌ２核酸、部分及び変異体
本発明はヒトＴＣＦ７Ｌ２を含む、単離された核酸分子にも関する。本発明のＴＣＦ７Ｌ２核酸分子は、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）又はＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ）であり得る。ＤＮＡ分子は、二本鎖又は一本鎖であり得；一本鎖ＲＮＡ又はＤＮＡは、コード、又はセンス鎖、又は非コード、又はアンチセンス鎖であり得る。該核酸分子は、遺伝子のコード配列のすべて又は一部を含むことが可能であり、及びさらにイントロン及び非コード３’及び５’配列（例えば、調節配列を含んで）のような追加の非コード配列を含むことが可能である。
【０１１４】
加えて、本発明の核酸分子は、マーカー配列、例えば、該ポリペプチドの単離又は精製を助けるためのポリペプチドをコードする配列に融合し得る。こうした配列には、限定されるわけではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合タンパク質をコードする配列及びインフルエンザからの赤血球凝集素Ａ（ＨＡ）ポリペプチドマーカーをコードする配列が含まれる。
【０１１５】
本明細書で使用される「単離された」核酸分子とは、通常は遺伝子又はヌクレオチド配列が隣接する核酸（ゲノム配列のように）から分離された及び／又は他の転写された配列から完全に又は部分的に精製された（例えば、ＲＮＡライブラリー中のように）ものである。例えば、本発明の単離された核酸は、それが自然に生じる複雑な細胞環境、又は組換え技術により産生された場合の培養培地、又は化学的に合成された場合の化学前駆体又は他の化学薬品に関して実質的に単離し得る。いくつかの例において、単離された物質は組成物（例えば、他の物質を含む粗抽出物）、緩衝液系又は試薬混合物の一部を形成するであろう。他の状況下では、該物質は、例えば、ＰＡＧＥ又はＨＰＬＣのようなカラムクロマトグラフィーにより決定されるように、本質的に均一にまで精製できる。好ましくは、本発明の単離された核酸分子は、存在するすべての巨大分子の少なくとも約５０、８０又は９０％（モルに基づいて）を含む。ゲノムＤＮＡに関しては、用語「単離された」は、ゲノムＤＮＡが天然に付随していた染色体から分離された核酸分子を指す。例えば、単離された核酸分子は、該核酸分子が由来した細胞のゲノムＤＮＡ中の該核酸分子に隣接する約５ｋｂ未満、限定されるわけではないが、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ又は０．１ｋｂ未満のヌクレオチドを含み得る。
【０１１６】
該核酸分子は、他のコード又は調節配列と融合することが可能であり、それでも単離されたと考えられる。それ故、ベクター中に含まれている組換えＤＮＡは、本明細書で使用した「単離された」の定義に含まれる。また、単離された核酸分子には、異種宿主細胞中の組換えＤＮＡ分子、ならびに溶液中の部分的に又は実質的に精製されたＤＮＡ分子も含まれる。「単離された」核酸分子は本発明のＤＮＡ分子のインビボ又はインビトロＲＮＡ転写体も包含する。単離された核酸分子は、化学的に合成された又は組換え手段による核酸分子又はヌクレオチド配列を含み得る。それ故、ベクター中に含有された組換えＤＮＡは、本明細書で使用する「単離された」の定義に含まれる。また、単離された核酸分子は、異種生物体中の組換え組換えＤＮＡ分子、ならびに溶液中の部分的に又は実質的に精製されたＤＮＡ分子を含む。本発明のＤＮＡ分子のインビボ及びインビトロＲＮＡ転写体も「単離された」核酸配列に包含される。こうした単離されたヌクレオチド配列は、例えば、コードされたポリペプチドの製造における、相同的配列（例えば、他の哺乳類種からの）を単離するためのプローブとして、遺伝子地図作製のために（例えば、染色体とのインサイツハイブリダイゼーションによる）、又はノーザンブロット分析又はサザンブロット分析のような組織中の（例えば、ヒト組織）遺伝子発現を検出するために有用である。
【０１１７】
本発明は、天然に観察される必要はないが、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチド又はＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドの他のスプライシング変異体又はそれらの多型変異体をコードする核酸分子にも関する。それ故、例えば、本発明は天然に存在するヌクレオチド配列とは異なるが、遺伝子コードの縮重によって本発明のＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドをコードする配列を含むＤＮＡ分子に関する。本発明は、ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドの一部（断片）をコードする、又は類似体又は誘導体のような変異体ポリペプチドをコードする核酸分子も包含する。こうした変異体は、アレル変異又は単一塩基多型の場合のように天然に存在し得、又は種々の変異原及び変異原性プロセスにより誘導されるもののように、非天然的に存在し得る。意図される変異には、限定されるわけではないが、付加、欠失、及び付加及び欠失を含む保存的又は非保存的アミノ酸変化を生じ得る一つ又はそれより多くのヌクレオチドの置換が含まれる。好ましくは、ヌクレオチド（及び／又は生じたアミノ酸）変化はサイレント又は保存的であり；即ち、それらはＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドの特性又は活性を改変しない。一つの側面において、該核酸配列は、一つ又はそれより多くの多型マイクロサテライトマーカーを含む断片である。別の側面において、該核酸配列は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子中に一つ又はそれより多くの一塩基変異多型を含む断片である。
【０１１８】
本発明の核酸分子の他の改変には、例えば、標識化、メチル化、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カーバメート）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート）のようなヌクレオチド間修飾、懸垂部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、ソラレン）、キレート剤、アルキル化剤及び修飾された結合（例えば、アルファアノマー核酸）が含まれる。水素結合及び他の化学的相互作用を介して設計された配列へ結合する能力において核酸分子を模倣する合成分子も含まれる。こうした分子には、例えば、分子の主鎖中のリン酸結合がペプチド結合で置換されているものが含まれる。
【０１１９】
本発明は、本明細書に記載したヌクレオチド配列に、選択的ハイブリダイゼーションのためのような高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする核酸分子にも関する（例えば、本明細書に記載したポリペプチドをコードするヌクレオチド配列に特異的にハイブリダイズし、及び該ポリペプチドの活性を有していてもよい核酸分子）。一つの側面において、本発明は、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下（例えば、選択的ハイブリダイゼーションについて）、アミノ酸配列又はそれらの多型変異体をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする、本明細書に記載した変異体を含む。別の側面において、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする変異体はＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドの活性を有する。
【０１２０】
こうした核酸分子は、特異的ハイブリダイゼーション（例えば、高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下）により検出及び／又は単離することが可能である。本明細書で使用する「特異的ハイブリダイゼーション」は、第一の核酸が第二の核酸以外のいずれの核酸ともハイブリダイズしないような様式での、第二の核酸にハイブリダイズする第一の核酸の能力を指す（例えば、第一の核酸が、ハイブリダイゼーションが実施されるべきサンプル中でいずれの他の核酸よりも第二の核酸に対してより高い類似性を有する場合）。ハイブリダイゼーションについての「ストリンジェンシー条件」は、当該技術分野の用語であり、インキュベーション及び洗浄条件、例えば、第二の核酸への特定の核酸のハイブリダイゼーションを可能にする温度条件及び緩衝液濃度、を指し；第一の核酸は第二の核酸と完全に（即ち、１００％）相補的でもよいし、又は第一及び第二の核酸は、完全未満である（例えば、７０％、７５％、８５％、９０％、９５％）、いくらかの程度の相補性を共有していてもよい。例えば、特定の高ストリンジェンシー条件を、完全に相補的核酸とより低い相補性を区別するために使用し得る。「高ストリンジェンシー条件」、「中ストリンジェンシー条件」及び「低ストリンジェンシー条件」ならびに核酸ハイブリダイゼーションの方法は、Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. et al, 「Current Protocols in Molecular Biology」, John Wiley & Sons, (1998)) のページ2.10.1-2.10.16 及びページ6.3.1-6.3.6 及びRraus, M. and Aaronson, S., Methods Enzymol, 200:546-556 (1991) 、に説明されている。
【０１２１】
二つのヌクレオチド又はアミノ酸配列のパーセント相同性又は同一性は、最適比較目的のために配列をアラインすることにより決定し得る（例えば、最適アラインメントのためギャップを第一の配列中に導入し得る）。対応する位置でのヌクレオチド又はアミノ酸を次ぎに比較し、二つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有されている同一位置の数の関数である（即ち、％同一性＝同一位置の数／位置の総数ｘ１００）。一つの配列中の一つの位置が他の配列中の対応する位置が同一のヌクレオチド又はアミノ酸で占められていたら、分子はその位置で相同的である。本明細書で使用される核酸又はアミノ酸「相同性」は、核酸又はアミノ酸「同一性」と均等である。特定の側面において、比較目的のためにアラインされた配列の長さは、基準配列の長さの少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、特定の側面において少なくとも６０％、及び他の側面において少なくとも７０％、８０％、９０％、又は９５％である。二つの配列の正確な比較は、例えば、数学的アルゴリズムを使用する公知の方法により達成し得る。好ましい数学的アルゴリズムの非制限例は、Karlin, S. and Altschul, S., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-5877 (1993) に記載されている。Altschul, S. et al, Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997) に記載されているように、こうしたアルゴリズムはＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメーターを使用し得る。一つの側面において、配列比較のためのパラメーターは、score=100、wordlength=12にセットし得るが、あるいは変化させることも可能である（例えば、W=5又はW=20）。
【０１２２】
配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非制限例は、Myers and Miller, CABIOS 4(1): 11-17 (1988) のアルゴリズムである。こうしたアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアーパッケージ(Accelrys, Cambridge, UK) の一部である、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、PAM120 weight residue table、12のgap length penalty及び４のgap penaltyを使用し得る。配列解析のためのさらなるアルゴリズムが当該技術分野で知られており、Torellis, A. and Robotti, C, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5 (1994)に記載されているＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ; 及びPearson, W. and Lipman, D., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 55:2444-48 (1988) に記載されているＦＡＳＴＡが含まれる。
【０１２３】
別の態様において、二つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Blossom 63 matrixか又はPAM250 matrix、及び１２、１０、８、６又は４のgap weight及び２、３又は４のlength weightを使用する、ＧＣＧソフトウェアーパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して達成し得る。さらに別の態様において、二つの核酸配列間のパーセント同一性は、５０のgap weight及び３のlength weightを使用するＧＣＧソフトウェアーパッケージ中のＧＡＰプログラムを使用して達成し得る。
【０１２４】
本発明は、高度にストリンジェントな条件下、ＴＣＦ７Ｌ２のヌクレオチド配列又はこうした配列の相補体にハイブリダイズする断片又は部分を含有する単離された核酸分子も提供し、及び高度にストリンジェントな条件下、アミノ酸配列又はそれらの多型変異体をコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする断片又は部分を含有する単離された核酸分子も提供する。本発明の核酸断片は、少なくとも約１５、好ましくは少なくとも約１８、２０、２３又は２５ヌクレオチドであり、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００、１０,０００又はそれ以上のヌクレオチド長でもあり得る。本明細書に記載した抗原性ポリペプチドをコードするより長い断片、例えば、３０又はそれ以上のヌクレオチド長は、以下に記載する抗体の発生のためには特に有用である。
【０１２５】
プローブ及びプライマー
関連する側面において、本発明の核酸断片は、本明細書に記載したアッセイにおいてプローブ又はプライマーとして使用される。「プローブ」又は「プライマー」は、核酸分子の相補鎖に塩基特異的様式でハイブリダイズするオリゴヌクレオチドである。こうしたプローブ及びプライマーには、Nielsen, P. et al, Science 254:1497-1500(1991) に記載されているポリペプチド核酸（ＰＮＡ）が含まれる。
【０１２６】
プローブ又はプライマーは、ＴＣＦ７Ｌ２又はそれらの多型変異体の連続したヌクレオチドを含む核酸分子の少なくとも約１５、例えば、約２０〜２５、及び特定の態様において約４０、５０又は７５の連続したヌクレオチドにハイブリダイズするヌクレオチド配列の領域を含む。他の側面において、プローブ又はプライマーは、１００又はより少ない；特定の態様において６〜５０ヌクレオチド、例えば、１２〜３０ヌクレオチドを含む。他の側面において、該プローブ又はプライマーは、該連続したヌクレオチド配列と、又は該連続したヌクレオチド配列の相補体と少なくとも７０％同一、例えば、少なくとも８０％同一、特定の側面において少なくとも９０％同一、及び他の側面において少なくとも９５％同一であり、又はさらに該連続したヌクレオチド配列に、又は該連続したヌクレオチド配列の相補体に選択的にハイブリダイズすることが可能である。しばしば、該プローブ又はプライマーはさらに、標識、例えば、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素、酵素補因子を含む。
【０１２７】
上記の本発明の核酸分子は、標準分子生物学技術及び本明細書に提供された配列情報を使用して同定する及び単離することが可能である。例えば、核酸分子はＴＣＦ７Ｌ２の配列又はこうした配列の相補体に基づいて設計された、又は本明細書に提供された一つ又はそれより多くのアミノ酸配列をコードする配列に基づいたヌクレオチドに基づいて設計された、合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応により増幅する及び単離することが可能である。一般的には、PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification (ed. H. A. Erlich, Freeman Press, NY, NY, 1992); PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications (Eds. Innis, et al, Academic Press, San Diego, CA, 1990); Mattila、 P. et al., Nucleic Acids Res., 19:4967-4973 (1991); Eckert, K. and Kunkel, T., PCR Methods and Applications,1:17-24 (1991); PCR (eds. McPherson et al, IRL Press, Oxford); 及び米国特許番号4,683,202 、を参照されたい。該核酸分子は、鋳型としてｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ又はゲノムＤＮＡを使用して増幅し、適切なベクター内にクローン化し、及びＤＮＡ配列分析により特徴付けることが可能である。
【０１２８】
他の適した増幅法には、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）(Wu and Wallace , Genomics, 4:560 (1989); Landegren, et al, Science, 241:1077 (1988) を参照されたい)、転写増幅 (Kwoh, et al, Proc. Natl. Acad. Sci USA, 86:1173（1989))、自己持続配列複製(Guatelli et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 87: 1874 (1990))及び核酸に基づいた配列増幅（ＮＡＳＢＡ）が含まれる。後者二つの増幅法には、増幅生成物として一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）及び二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）の両方をそれぞれ約３０及び１００〜１の比で生成する、等温転写に基づいた等温反応が含まれる。
【０１２９】
増幅されたＤＮＡは標識することができ（例えば、放射性標識）、及びヒト細胞、zap express 、ＺＩＰＬＯＸ又は他の適したベクターから誘導されるｃＤＮＡをスクリーニングするためのプローブとして使用する。対応するクローンを単離することが可能であり、ＤＮＡはインビボ切り出しに続いて得ることが可能であり、そしてクローン化した挿入物は当該技術分野で認識されている方法で片方又は両方の向きで配列決定できて、適切な分子量のポリペプチドをコードする正しい読み取り枠を同定する。例えば、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列の直接分析は、商業的に入手可能である公知の方法を使用して達成し得る。例えば、Sambrook et al,Molecular Cloning、 A Laboratory Manual (2nd Ed., CSHP, New York 1989); Zyskind et al, Recombinant DNA Laboratory Manual, (Acad. Press, 1988)) を参照されたい。加えて、蛍光法も核酸(Chen et al, Genome Res., 9:492(1999)) 及びポリペプチドを分析するために利用可能である。これら又は類似の方法を使用し、ポリペプチドをコードするＤＮＡを単離する、配列決定する及びさらに特徴付けることが可能である。
【０１３０】
本発明のアンチセンス核酸分子は、ＴＣＦ７Ｌ２のヌクレオチド配列及び／又は相補体又は一部を使用して設計し、及び当該技術分野で公知の手順を使用する化学合成及び酵素連結反応を使用して構築することが可能である。例えば、アンチセンス核酸分子(例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド）は、天然に存在するヌクレオチド、又は該分子の生物学的安定性を増加するように又はアンチセンス及びセンス核酸間に形成される二重鎖の物理的安定性を増加させるために設計された多様に修飾されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート誘導体及びアクリジン置換ヌクレオチドを使用し得る）を使用して化学的に合成し得る。もしくは、アンチセンス核酸分子を、核酸分子がアンチセンス配向にサブクローン化されている発現ベクターを使用して、生物学的に産生し得る（即ち、挿入された核酸分子からの転写体は、目的の標的核酸に対してアンチセンス配向であろう）。
【０１３１】
該核酸配列は、上記の一つ又はそれより多くの障害を同定するために患者の内在性ＤＮＡ配列と比較するために使用する、及び関連ＤＮＡ配列をハイブリダイズする及び発見するための、又はサンプルから既知の配列を差し引くためのプローブとして使用することも可能である。該核酸配列はさらに、遺伝子フィンガープリンティングのためのプライマーを誘導するため、ＤＮＡ免疫化技術を使用する抗ポリペプチド抗体を上昇させるため、及び抗ＤＮＡ抗体を上昇させる又は免疫応答を惹起するための抗体として使用し得る。本明細書で同定されたヌクレオチド配列の部分又は断片（及び対応する完全遺伝子配列）は、ポリヌクレオチド試薬として多数の様式で使用し得る。例えば、これらの配列は：（ｉ）染色体上のそれらそれぞれの遺伝子の地図作製；及びそれ故、遺伝疾患に関連した遺伝子領域の位置付けるため；（ｉｉ）微量の生物学的サンプルから個体を同定するため（組織分類）；及び（ｉｉｉ）生物学的サンプルの法医学的同定を助けるため；に使用し得る。加えて、本発明のヌクレオチド配列は、分析、特徴付け又は療法的使用のために、又は対応するポリペプチドが組織分化の間に構成的に又は疾患状態で発現される組織についてのマーカーとして、組換えポリペプチドを同定する及び発現するために使用し得る。該ヌクレオチド配列は、加えて本明細書に記載したスクリーニング及び／又は診断アッセイにおける試薬として使用することが可能であり、及び本明細書に記載したスクリーニング及び／又は診断アッセイで使用するためのキット（例えば、試薬キット）の成分として含ませ得る。
【０１３２】
診断の方法において有用なキット（例えば、試薬キット）は、例えば、本明細書に記載したハイブリダイゼーションプローブ又はプライマー（例えば、標識プローブ又はプライマー）、標識分子の検出のための試薬、制限酵素（例えば、ＲＦＬＰ分析のための）、アレル特異的オリゴヌクレオチド、改変又は非改変（天然）ＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドに結合する抗体、ＴＣＦ７Ｌ２核酸の核酸配列を分析するための、又は本明細書に記載したＴＣＦ７Ｌ２ポリペプチドのアミノ酸配列を分析するための手段、などを含む、本明細書に記載したいずれかの方法で有用な成分を含む。一つの側面において、２型糖尿病への感受性を診断するためのキットは、マーカーＤＧ１０Ｓ４７８、ＳＮＰ  ｒｓ１２２５５３７２、ｒｓ８９５３４０、ｒｓ１１１９６２０５、ｒｓ７９０１６９５、ｒｓ７９０３１４６、ｒｓ１２２４３３２６及び／又はｒｓ４５０６５６５又は２型糖尿病を有する又は２型糖尿病に対して感受性である個体中に最も頻繁に存在するアットリスクハプロタイプを含むＴＣＦ７Ｌ２核酸中の領域の核酸増幅のためのプライマーを含み得る。該プライマーは、２型糖尿病を示すＳＮＰｓに隣接する核酸の一部を使用して設計し得る。
【０１３３】
ベクター及び宿主細胞
本発明の別の側面は、本明細書に記載した核酸分子及びそれらの相補体（又はそれらの一部）を含有する核酸構築物に関する。該構築物は、本発明の配列がセンス又はアンチセンス配向で挿入されているベクター（例えば、発現ベクター）を含む。本明細書において使用する用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送可能である核酸分子指す。ベクターの一つの型は「プラスミド」であり、それは環状の二本鎖ＤＮＡループを指し、その中に追加のＤＮＡセグメントを連結し得る。ベクターの別の型はウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントはウイルスゲノム内に連結し得る。特定のベクターは、それが導入された宿主細胞中で自己複製可能である（例えば、細菌の複製起源を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳類ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳類ベクター）は、宿主細胞内への導入により宿主細胞のゲノム内へ組み込まれ、それにより宿主ゲノムとともに複製される。発現ベクターは、それらが機能可能であるように連結されている遺伝子の発現を指示することが可能である。一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターはしばしばプラスミドの形態である。しかしながら、本発明は、等しく機能するウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルス）のような、発現ベクターの他の形態も含むことが意図される。
【０１３４】
特定の側面において、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸分子の発現に適した形態の、本発明の核酸分子を含む。このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された一つ又はそれより多くの、発現されるべき核酸配列に機能可能であるように連結されている調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内に「機能可能であるように連結された」又は「機能可能的に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、該ヌクレオチド配列の発現を可能にする様式で調節配列（単数又は複数）に連結されていることを意味することが意図される（例えば、インビトロ転写／翻訳システム中又は宿主細胞内にベクターが挿入された場合の宿主細胞中で）。用語「調節配列」は、プロモーター、エンハンサー及び他の発現調節要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことが意図される。こうした調節配列は、例えば、Goeddel,「Gene Expression Technology」, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CＡ（1990) 、に記載されている。調節配列は、多くのタイプの宿主細胞中でのヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、及び特定の宿主細胞中でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択及び望まれるポリペプチド発現のレベルのような因子に依存し得ることを当業者は理解するであろう。本発明の発現ベクターは、宿主細胞に導入することが可能であり、それにより、本明細書に記載した核酸分子によりコードされたポリペプチド（融合タンパク質を含んで）を産生する。
【０１３５】
本発明の組換え発現ベクターは、原核又は真核細胞、例えば、大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）、酵母細胞又は哺乳動物細胞中で本発明のポリペプチドを発現するために設計し得る。適した宿主細胞は、Goeddel （上記文献）でさらに議論されている。もしくは、該組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写及び翻訳することが可能である。
【０１３６】
本発明の別の側面は、本発明の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」及び「組換え宿主細胞」は、本明細書において相互交換的に使用される。こうした用語は、特定の対象細胞のみでなく、こうした細胞の子孫又は予測される子孫も指すことを理解されたい。突然変異又は環境的影響のため、世代が進むにつれて特定の修飾が起こってもよいので、こうした子孫は、実際、親細胞とは同一でないかもしれないが、本明細書で使用する用語の範囲内にはそれでも含まれている。
【０１３７】
宿主細胞は任意の原核又は真核細胞であり得る。例えば、本発明の核酸分子は細菌細胞（例えば、大腸菌）、昆虫細胞、酵母又は哺乳動物細胞（例えばチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）又はＣＯＳ細胞）中で発現し得る。他の適した宿主細胞は当業者には公知である。
【０１３８】
ベクターＤＮＡは、慣用的形質転換又はトランスフェクション技術を介して原核又は真核細胞内に導入し得る。本明細書で使用する用語「形質転換」及び「トランスフェクション」は、宿主細胞内に外来核酸分子（例えば、ＤＮＡ）を導入するための、多様な当該技術分野で認められている技術を指し、リン酸カルシウム又は塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン仲介トランスフェクション、リポフェクション又はエレクトロポレーションが含まれる。宿主細胞を形質転換する又はトランスフェクションするために適した方法は、Sambrook, et al（上記文献）及び他の実験マニュアルに見ることができる。
【０１３９】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションは、使用された発現ベクター及びトランスフェクション技術に依存し、細胞の少しの分画のみが、外来ＤＮＡをそれらのゲノム内に組み込むことが知られている。これらの組み込み体を同定する及び選択するため、選択可能マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、目的の遺伝子と共に宿主細胞内へ一般に導入される。好ましい選択可能マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン及びメトトレキサートのような、薬剤への耐性を与えるものが含まれる。選択可能マーカーをコードする核酸分子は、本発明の核酸分子と同一のベクター上で宿主細胞内に導入することが可能であるか、又は別のベクター上で導入することも可能である。導入された核酸分子で安定にトランスフェクトされた細胞は、薬剤選択により同定し得る（例えば、選択可能マーカーを取り込んだ細胞は生き残るであろうが、一方、他の細胞は死滅する）。
【０１４０】
培養中の原核又は真核宿主細胞のような本発明の宿主細胞は、本発明のポリペプチドを産生（即ち、発現）するために使用し得る。従って、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用した、ポリペプチドを産生する方法を提供する。一つの側面において、本方法は、該ポリペプチドが産生されるような適した培地中、本発明の宿主細胞（その中に本発明のポリペプチドをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を培養することを含む。別の側面において、本方法はさらに、培地又は宿主細胞から該ポリペプチドを単離することを含む。
【０１４１】
本発明の抗体
遺伝子産物の一つの形態に特異的に結合するが、遺伝子産物の他の形態には結合しないポリクローナル抗体及び／又はモノクローナル抗体も提供される。変異体又は多型部位（単数又は複数）を含有する基準遺伝子産物の一部を結合する抗体も提供される。本明細書で使用する用語「抗体」は、免疫グロブリン分子及び免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、即ち、抗原を特異的に結合する抗原結合部位を含有する分子を指す。本発明のポリペプチドに特異的に結合する分子は、そのポリペプチド又はそれらの断片に結合するが、サンプル、例えば、天然に該ポリペプチドを含有する生物学的サンプル中の他の分子には実質的に結合しない分子である。免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分の例には、該抗体をペプシンのような酵素で処理することにより発生し得る、Ｆ（ａｂ）及びＦ（ａｂ’）２断片が含まれる。本発明は、本発明のポリペプチドに結合するポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を提供する。本明細書で使用する用語「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」は、本発明のポリペプチドの特定のエピトープと免疫反応することが可能である抗原結合部位のただ一つの種を含有する、抗体分子の集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、それ故典型的には、それが免疫反応する本発明の特定のポリペプチドに対する単一の結合親和性を示す。
【０１４２】
ポリクローナル抗体は、所望の免疫原、例えば、本発明のポリペプチド又はそれらの断片で、適した対象を免疫化することにより、上記のように調製し得る。免疫化対象中の抗体力価は、固定化ポリペプチドを使用する、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）のような標準技術により、時間を通してモニターし得る。もし望むなら、該ポリペプチドに対して方向付けられた抗体分子を、哺乳動物から（例えば、血液から）単離することが可能であり、そしてプロテインＡクロマトグラフィーのような公知の技術によりさらに精製できて、ＩｇＧ分画を得る。免疫化後の適切な時点で（例えば、抗体力価が最も高い時）、対象から抗体産生細胞を得ることが可能であり、Kohler and Milstein, Nature 256:495-497 (1975) により最初に記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術(Kozbor et al, Immunol. Today 4: 72 (1983))、ＥＢＶ−ハイブリドーマ技術 (Cole et al., Monoclonal Antibodys and Cancer Therapy, Alan R. Liss,1985, Inc., pp. 77-96) 及びトリオーマ技術のような標準的技術によりモノクローナル抗体を調製するために使用する。ハイブリドーマを産生するテクノロジーは公知である（一般的には、Current Protocols in Immunology (1994) Coligan et al (eds.) John Wiley & Sons, Inc., New York, NY を参照されたい）。簡潔には、不死細胞株（典型的には骨髄腫）を、上記のように免疫原で免疫した哺乳動物からのリンパ球（典型的には脾細胞）と融合させ、生じたハイブリドーマ細胞の培養上清を、本発明のポリペプチドに結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを同定するためにスクリーニングする。
【０１４３】
リンパ球及び不死細胞株を融合させるために使用される多くの公知のプロトコールのいずれもが、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体を発生させる目的に応用し得る（例えば、Current Protocols in Immunology, 上記文献; Galfre et al., Nature 266:55052 (1977); R.H. Kenneth, in Monoclonal Antibodies : A New Dimension In Biological Analyses, Plenum Publishing Corp., New York, New York (1980); 及び Lerner, YaIe J. Biol. Med. 54:387-402 (1981)を参照されたい）。さらに、当業者は、有用であろう、こうした方法の多くの変形があることを理解するであろう。
【０１４４】
モノクローナル抗体分泌ハイブリドーマを調製する代案として、本発明のポリペプチドに対するモノクローナル抗体は、該ポリペプチドを結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離するために該ポリペプチドで組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングすることにより同定する又は単離することが可能である。ファージディスプレイライブラリーを発生する及びスクリーニングするためのキットは商業的に入手可能である（例えば、Pharmacia Recombinant Phage  Antibody System, カタログ番号27-9400-01 ；及びStratagene SurfZAP（商標） Phage Display Kit, カタログ番号240612 ）。加えて、抗体ファージディスプレイライブラリーを発生する及びスクリーニングするために特に受け入れられる方法及び試薬の例は、例えば、米国特許第5,223,409号；ＰＣＴ公開番号WO92/18619；ＰＣＴ公開番号WO91/17271；ＰＣＴ公開番号WO92/20791；ＰＣＴ公開番号WO92/15679；ＰＣＴ公開番号WO93/01288；ＰＣＴ公開番号WO92/01047；ＰＣＴ公開番号WO92/09690；ＰＣＴ公開番号WO90/02809; Fuchs et al., Bio/Technology 9:1370-1372 (1991); Hay et al., Hum. Antibod. Hybridomas 3:81-85 (1992); Huse et al., Science 246: 1275-1281 (1989); 及び Griffiths et al, EMBO J. 12:725-734 (1993) に見ることができる。
【０１４５】
加えて、キメラ及びヒト化モノクローナル抗体のような組換え抗体は、ヒト及び非ヒト部分を含み、標準組換えＤＮＡ技術を使用して作製でき、本発明の範囲内である。こうしたキメラ及びヒト化モノクローナル抗体は、当該技術分野では既知の組換えＤＮＡ技術により製造し得る。
【０１４６】
一般に、本発明の抗体（例えば、モノクローナル抗体）は、アフィニティークロマトグラフィー又は免疫沈降のような標準技術による本発明のポリペプチドの単離に使用し得る。ポリペプチド特異的抗体は、細胞からの天然のポリペプチドの、又は宿主細胞中で発現された組換え的に産生されたポリペプチドの精製を容易にすることができる。さらに、本発明のポリペプチドに特異的な抗体は、該ポリペプチドの発現の存在量及びパターンを評価するため、該ポリペプチド（例えば、細胞溶解物、細胞上清又は組織サンプル中の）を検出することに使用し得る。抗体は、臨床試験法の一部として、例えば、所与の治療計画の効力を決定するために組織中のタンパク質レベルをモニターするように、診断的に使用し得る。該抗体はその検出を容易にするため、検出可能な物質に結合させることができる。検出可能な物質の例には、多様な酵素、補欠分子族、蛍光物質、化学発光物質、生物化学発光物質及び放射性物質が含まれる。適した酵素の例には、西洋わさびペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ又はアセチルコリンエステラーゼが含まれ、適した補欠分子族複合体の例には、ストレプトアビジン／ビオチン及びアビジン／ビオチンが含まれ；適した蛍光物質の例には、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル又はフィコエリトリン；適した化学発光物質の例にはルミノールが含まれ；生物化学発光物質の例には、ルシフェラーゼ、ルシフェリン及びエクオリンが含まれ、及び適した放射性物質の例には１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ又は３Ｈが含まれる。
【０１４７】
本発明はここで以下の実施例により例示され、それはいかようにも制限されることは意図されていない。
【実施例】
【０１４８】
本明細書に記載されているのは、１０ｑ座位内にあるマイクロサテライトマーカーの高密度セットを使用する単一点関連解析を介した、２型糖尿病のリスクを与える遺伝子としての転写因子７様２（ＴＣＦ７Ｌ２−以前はＴＣＦ４）の同定である。
【０１４９】
方法
アイスランドコホート
アイスランドのData Protection Authority及びアイスランドのNational Bioethics Committeeは本研究を承認した。本研究の全ての関与者にはインフォームドコンセントを与えた。血液サンプル、医療情報及び系統学に関連するすべての個人情報は、サードパーティー暗号化システムを使用して、Data Protection Authorityにより最初に暗号化された（１８）。
【０１５０】
この研究のため、過去３０年間にわたってIcelandic  Heart Association で行われた長期疫学調査により、又は過去１２年間にわたってレイキャビックの２つの主要な病院の１つで診断された、２４００人の２型糖尿病患者を同定した。これらの患者の３分の２は生存しており、現在のアイスランドにおける既知の２型糖尿病患者の集団の約半分を代表している。これらの患者の大多数とこの研究のために接触をはかり、８０％の割合を超える協力率であった。この研究の全ての関与者はIcelandic Heart Association を訪れ、そこで彼らは質問表に回答し、血液を採取され、及び空腹時血漿グルコース測定が行われた。診断時での薬物療法及び年齢についての質問が含まれていた。この研究における２型糖尿病患者は、我々の公開した連鎖研究（１０）に記載されているように診断された。手短に言えば、２型糖尿病の診断は、以前の医学記録、病歴及び／又は新規検査室測定を介して、研究医師により確認された。以前に診断された２型糖尿病患者については、経口血糖降下薬の使用を報告することで２型糖尿病を確認した。現在インシュリンで治療されている個体は、もし以前に使用した経口血糖降下薬も使用していれば又はいたら、２型糖尿病を有していると分類された。このコホートにおいて、薬物療法している患者の大多数が経口血糖降下薬を服用しており、一部のみが（９％）インシュリンを必要とする。これまで診断されていない個体については、２型糖尿病及び空腹時血糖異常（ＩＦＧ）の診断は、American Diabetes  Association (Expert Committee on the Diagnosis and Classification of Diabetes Mellitus 1997) により示された基準に基づいていた。この研究における２型糖尿病患者の平均年齢は６９．７歳であった。
【０１５１】
追試コホート
デンマーク研究グループはデンマークにおけるＰＥＲＦ（予測疫学的リスク因子）研究から選択された（１９）。２２８人の女性が２型糖尿病を有すると診断されており、及び／又は＞＝７ｍＭグルコースが測定された。対照として、５３９人の非罹患（２型糖尿病に関して）女性が同一研究コホートから無作為に選ばれた。
【０１５２】
米国におけるPENN CATH研究は、１９９８年７月から２００３年３月の間、University of Pennsylvania Medical Centerで心臓カテーテル法を受けた患者の連続コホートにおける、冠動脈硬化と生化学的及び遺伝的因子の関連の横断研究である。２型糖尿病は、空腹時血糖＞１２６ｍｇ／ｄｌ、食後２時間グルコース＞２００ｍｇ／ｄｌ、年齢４０歳より高齢な対象での経口血糖降下薬又はインシュリン及び経口血糖降下薬の使用の履歴として定義された。University of Pennsylvania Institutional Review Board は研究プロトコルを承認し、すべての対象者に書類によるインフォームドコンセントを与えた。民族性は自己報告を介して決定された。３６１人の白人２型糖尿病症例はこのコホートに由来する。５３０人の非罹患（２型糖尿病及び心筋梗塞に関して）白人対照は同一の研究から無作為に選ばれた。
【０１５３】
遺伝子型同定のために使用したＤＮＡは、GenomiPhi増幅キット（Amersham）の使用による、全ゲノム増幅の生成物、デンマーク及び米国の２型糖尿病患者及び対照の末梢血から単離されたＤＮＡ生成物であった。
【０１５４】
遺伝子型同定
新規配列反復（即ち、ジヌクレオチド、トリヌクレオチド及びテトラヌクレオチド反復）は、タンデムリピートファインダーソフトウェア（２０）を使用して同定され、及び９４人の対照中の多型性について試験した。ＣＥＰＨサンプル１３４７−０２（ＣＥＰＨゲノミクスレポジトリー）の下位アレルの塩基対のサイズをマイクロサテライトアンプリコンのサイズから差し引き、基準として使用した。ＳＮＰ遺伝子型同定は、直接ＤＮＡ配列決定（Applied BioSystems）又はCentaurus プラットフォーム(Nanogen) を使用して実施した。
【０１５５】
関連解析のための統計法
２型糖尿病への単一マーカー関連について、各アレルの両側ｐ値を計算するために尤度比検定を使用した。用いたマイクロサテライトについてのキャリア頻度よりむしろアレル頻度を示した。
【０１５６】
乗法（multiplicative）モデルを仮定し、相対リスク（ＲＲ）及び集団寄与リスク（ＰＡＲ）を計算した（１６、１７）。ＣＥＰＨ白人ＨａｐＭａｐデータについて、Ｄ’（２１）及びＲ２（２２）の標準定義を使用し、ＳＮＰｓの対間のＬＤを計算した。特定の領域中のＬＤ構造を解明するためにすべてのＳＮＰ組み合わせをプロッティングする場合、Ｄ’を上部左隅に及びｐ値を下部右隅にプロットした。示したＬＤプロットにおいて、マーカーはそれらの物理的位置に従うよりむしろ等距離的にプロットした。
【０１５７】
結果
全座位関連研究
我々は以前に、アイスランド人集団における、２型糖尿病についての染色体５ｑへの全ゲノム有意連鎖を報告した（１０）；我々は、１０ｑ及び１２ｑへの連鎖の示唆的証拠も報告した。１０ｑ座位を追跡するため、この座位に対応する１０．５Ｍｂ領域(NCBI Build 34: ChrlO:l14.2 - 124.7 Mb) にわたり、遺伝子型同定マイクロサテライトマーカーの高密度を用いる関連アプローチを使用した。２２８のマイクロサテライトマーカーを同定し、分類した――即ち、４６ｋｂ毎に一つのマーカーの平均密度（表１）。全マーカーを１１８５人のアイスランド人２型糖尿病患者及び９３１人の非相関集団対照で分類した。
【０１５８】
【表３】
2008546403.tif 000004
【０１５９】
【表４】
2008546403.tif 000005
【０１６０】
【表５】
2008546403.tif 000006
【０１６１】
【表６】
2008546403.tif 000007
【０１６２】
【表７】
2008546403.tif 000008
【０１６３】
【表８】
2008546403.tif 000009
【０１６４】
マイクロサテライトマーカーでの単一マーカー関連解析は、ＤＧ１０Ｓ４７８との関連を同定した（表２及び図１）。
【０１６５】
【表９】
2008546403.tif 000010
【０１６６】
このテトラヌクレオチド反復で６のアレルが観察され、アレル０、８及び１２で集団対照中の染色体の９８％を占めていた。アレル０は組み合わせた他のアレルと比較して保護的関連（相対リスク（ＲＲ）＝Ｏ．６７；Ｐ＝２．１ｘｌ０−９）を示した。このＰ値は両側であり、患者の幾人かはお互いに親戚であることを考慮に入れた。ＤＧ１０Ｓ４７８は１０ｑ２５．２上の転写因子７−様２（ＴＣＦ７Ｌ２−以前はＴＣＦ４）遺伝子のイントロン３に位置する。このマーカーはよく定義された７４．９ｋｂのＬＤブロック内であり（ＣＥＰＨ白人ＨａｐＭａｐ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩに基づいて）、イントロン３の一部、エクソン４の全体及びイントロン４の一部を包み込んでいる（図１）。
【０１６７】
ＤＧ１０Ｓ４７８がＣＥＰＨ白人ＨａｐＭａｐファミリーで遺伝子型同定された場合、ＳＮＰ  ｒｓ１２２５５３７２のＧアレルはＤＧ１０Ｓ４７８のアレル０とほとんど完全に相関していることが観察され（ｒ２＝０．９５、Ｐ＝５．５３ｘｌ０−３８）、及びｒｓｌ２２５５３７２のアレルＴは、ＤＧ１０Ｓ４７８の他のアレルと相関している。さらに、ＤＧ１０Ｓ４７８のアレル８及び１２により与えられるリスクは異なっていない（Ｐ＝０．３）。従って、ＤＧ１０Ｓ４７８の非０アレルのすべてを複合アレルに折り畳むのが自然であり、それはアレルＸと称されるであろう。アレルＸは、対照及び患者において、それぞれ２７．６％及び３６．４％の頻度を有する。乗法モデルを仮定し（１６、１７）、非キャリアについてリスクを比較すると、アレルＸは、運ばれているコピー当たり１．５０の予測ＲＲを有している。
【０１６８】
２型糖尿病へのＤＧ１０Ｓ４７関連の追試
２型糖尿病へのＤＧ１０Ｓ４７の関連を確認するため、２２８の症例及び５３９の対照のデンマーク２型糖尿病コホートにおいてマイクロサテライトを遺伝子型同定した。デンマーク人コホートはデンマークにおけるＰＥＲＦ（予測疫学的リスク因子）研究から選択された（１９）。この女性２型糖尿病コホートは、以前に２型糖尿病と診断されている。アイスランド人で観察された関連が追試された（表３）。
【０１６９】
【表１０】
2008546403.tif 000011
【０１７０】
複合アットリスクアレルＸは対照で２６．０％の及び２型糖尿病症例で３３．１％の頻度を有し、１．４１の予測ＲＲ（Ｐ＝０．００４８）を与えている。
続いて、マイクロサテライトを、PENN CATH研究からの３６１の症例及び５３０の対照の米国白人２型糖尿病コホートで遺伝子型同定した。この研究は、University of Pennsylvania Medical Centerで心臓カテーテル法を受けた患者の連続コホートにおける、冠動脈硬化と生化学的及び遺伝的因子の関連の横断研究である。２型糖尿病は、空腹時血糖＞１２６ｍｇ／ｄｌ、食後２時間グルコース＞２００ｍｇ／ｄｌ、年齢４０歳より高齢な対象での経口血糖降下薬又はインシュリン及び経口血糖降下薬の使用の履歴として定義された。アイスランド人で観察された関連がこの集団でも追試された（表４）。
【０１７１】
【表１１】
2008546403.tif 000012
【０１７２】
複合アットリスクアレルＸは対照で２５．３％の及び２型糖尿病症例で３８．５％の頻度を有し、１．４１の予測ＲＲ（Ｐ＝３．３ｘ１０−９）を与えている。Mantel-Haneszel モデル（注３）を使用して３コホートすべてからの結果を組み合わせると、全体で４．７ｘ１０−１８の両側ｐを得た。
【０１７３】
３つの集団における、２型糖尿病に対する複合アットリスクアレルの関連は、ＴＣＦ７ｌ２遺伝子の変異体が２型糖尿病のリスクに寄与していることの強力な証拠を組み立てる。
【０１７４】
２型糖尿病へのアレルＸの関連が疑う余地がないことを確立した後、我々は遺伝の様式をより密接に調査した。ヘテロ接合性キャリアは非キャリア（ｐ＜１ｘ１０−６）と比較して増加したリスク、及びホモ接合性キャリア（ｐ＜０．０００１）と比較して減少したリスクを明らかに有しているので、優性モデル及び劣性モデルを排斥し得る。乗法モデルはより良好な合致を提供するが、ヘテロ接合性キャリアと比較したホモ接合性キャリアのリスクが、非キャリアと比較したヘテロ接合性キャリアのリスクよりも大きいという証拠がある。表５は、非キャリアと比較したヘテロ接合性キャリア及びホモ接合性キャリアの相対リスクのモデルフリー予測を提供する。
【０１７５】
【表１２】
2008546403.tif 000013
【０１７６】
３つのコホートはアットリスクアレルについて類似の集団頻度を有するが、ＲＲ予測は変動する；最も強い影響が米国コホートで見られ、及びデンマーク人コホートで最も弱かった。ＲＲがコホートで同一であるべきという理由はないが、予測相対リスクにおける相違が統計的有意性に達していないこと（Ｐ＞０．０５）が注目される。共通の相対リスクを仮定してコホートからの結果を合わせると、非キャリアと比較して、ヘテロ接合性キャリア及びホモ接合性キャリアはそれぞれ１．４５及び２．４１の相対リスクを有すると推定される（表５）。アットリスクアレルについての２６％の集団頻度を仮定すると、ヘテロ接合性及びホモ接合性キャリアは、それぞれ集団の３８％及び７％となる。それ故、この変異体は、臨床使用するために十分な的中率値を有する。対応する集団寄与リスクは２１％であり、それは公衆衛生の観点から重要である。
【０１７７】
アレルＸが、空腹時血糖異常（ＩＦＧ）個体（６．１〜６．９ｍＭの空腹時血糖）で過度であることに注目すべきである。複合アットリスクアレルＸは、１３９３人の対照において２７．７％及び２７８人のＩＦＧ症例において３７．１％の頻度を有し、１．５４（Ｐ＝１．３６ｘ１０−５）の予測ＲＲを与えている。
【０１７８】
２型糖尿病のＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック内でのＳＮＰマーカーの関連
表６に、ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック内に位置するマイクロサテライト及びＳＮＰマーカーを収載した。該表は公的に利用可能なＳＮＰｓ、ならびに全ＬＤブロック領域の配列決定により発見されたＳＮＰｓを含んでいる。該表はさらに、ブロック内に位置する多型マイクロサテライトマーカーを提供する。
【０１７９】
【表１３】
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【０１８０】
【表１４】
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【０１８１】
【表１５】
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【０１８２】
【表１６】
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【０１８３】
【表１７】
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【０１８４】
【表１８】
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【０１８５】
【表１９】
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【０１８６】
【表２０】
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【０１８７】
【表２１】
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【０１８８】
【表２２】
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【０１８９】
【表２３】
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【０１９０】
【表２４】
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【０１９１】
ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック中の他のマーカーアレルがアレルＸよりも高い２型糖尿病との相関を示す可能性をさらに調べるため、ＨａｐＭａｐ  ＣＥＵサンプル中で発生したＤＧ１０Ｓ４７８遺伝子型同定データを使用した。ＤＧ１０Ｓ４７８に対して最も強い相関を有するＨａｐＭａｐ  Ｐｈａｓｅ  Ｉからの５つのＳＮＰｓは降順に、ｒｓｌ２２５５３７２（ｒ２＝０．９５）、ｒｓ７９０３１４６（ｒ２＝０．７８）、ｒｓ７９０１６９５（ｒ２＝０．６１）、ｒｓ１１１９６２０５（ｒ２＝０．４３）及びｒｓ７８９５３４０（ｒ２＝０．４２）であった。３つのコホートにおけるこれら５つのＳＮＰｓを遺伝子型同定し、５つのＳＮＰｓ及びＤＧ１０Ｓ４７８（後者はビアレルマーカーとして取り扱った）間の相関は、ＣＥＵサンプルで観察されたものと非常に類似していた。５つのＳＮＰｓすべてが２型糖尿病への関連を示した。一方、いくつかのＳＮＰｓはわずかにより高い予測相対リスク、及びコホートの１つ又は２つにおけるより低いｐ値を示し、３つすべてのコホートについての結果をMantel-Haenszel モデルを使用して合わせた場合、２型糖尿病に対してどれもより強い関連を示さなかった。しかしながら、アレルＸ（ＲＲ＝１．５６、Ｐ＝４．７ｘｌ０−１８）と比較して、ｒｓ１１１９６２０５及びｒｓ７８９５３４０は明らかにより弱い関連を有するが、ｒｓｌ２２５５３７２のアレルＴ（ＲＲ＝１．５２、Ｐ＝２．５ｘｌ０−１６）及びｒｓ７９０３１４６のアレルＴ（ＲＲ＝１．５４、Ｐ＝２．１ｘＩ０−１７）については、２型糖尿病への関連の強度は匹敵している。
【０１９２】
２００５年１１月のＨａｐＭａｐ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩの引き続いてのリリースに従うと、マイクロサテライトＤＧ１０Ｓ４７８への強い相関を示す、２つの追加のＳＮＰｓが同定された−ｒｓｌ２２４３３２６（ｒ２＝０．９６１）及びｒｓ４５０６５６５（ｒ２＝０．７１６）。２型糖尿病への感受性に関連するアレルは、ｒｓｌ２２４３３２６のＣ（Ｃ／Ｔ  ＳＮＰ）及びｒｓ４５０６５６５のＴ（Ａ／Ｔ  ＳＮＰ）であろう。
【０１９３】
これらの内、ｒｓ７９０３１４６のＣアレルを運ぶハプロタイプ、ｒｓ１０８８５４０６のＡアレルを運ぶハプロタイプは、ｒｓ１０８８５４０６のＧアレルを運ぶハプロタイプと比較して、１．０６の予測相対リスクを有するが、相違は統計的に有意ではなかった（Ｐ＝０．２２）ことに注目すべきである。
【０１９４】
２型糖尿病へのこの関連を追試する及び精緻化する試みにおいて、１１１１の症例及び２３１５の対照から成る大きな追加のデンマーク人コホートにおいて、及びアフリカ系アメリカ人糖尿病研究（２３）に由来する６１８の症例及び４３４の対照から成るより遺伝的に多様な西アフリカ人コホートにおいて、ＤＧ１０Ｓ４７８、ｒｓｌ２２５５３７２及びｒｓ７９０３１４６の遺伝子型同定を行った。デンマーク人において、３つ全ての変異体は、アイスランド人において以前に観察されたように、減少したリスクと強く関連していた。しかしながら、ｒｓ７９０３１４６のアレルＴ（相対リスク＝１．５３、Ｐ＝４．０６ｘｌ０−１４、ＰＡＲ＝２４．４％）の関連は、他の２つの変異体により提供されるよりも明らかにより強かった。西アフリカ人研究グループにおいては、同系性及び民族性起源について調節後、２型糖尿病へのｒｓ７９０３１４６のアレルＴの関連（相対リスク＝１．４５、９５％Ｃ．Ｉ．＝１．２０−１．７６、Ｐ＝０．０００１４６、ＰＡＲ＝２２．２％）を追試したが、他の２つの変異体の場合はそうではなかった。このことは、ｒｓ７９０３１４６のアレルＴは、それ自身がリスク変異体であるか、又は未同定リスク変異体の最も近い既知の関連要因であることを示唆している。西アフリカ人グループにおけるアットリスクマーカーとしてのマーカーＤＧ１０Ｓ４７８及びｒｓ１２２５５３７２の排除は、ｒｓ７９０３１４６Ｔアレルが、ＤＧ１０Ｓ４７８のアレルＸ及びｒｓ１２２５５３７２のアレルＴの両方を運んでいる染色体上にほとんど独占的に発生するヨーロッパ人祖先の集団とは異なるので可能であり、西アフリカ人では、ｒｓ７９０３１４６のＴアレルは、ＤＧ１０Ｓ４７８及びｒｓ１２２５５３７２の両方のアレルで発生する。このことは、Ｔはｒｓ７９０３１４６の祖先アレルであり、一方、ＤＧ１０Ｓ４７８ｎアレルＸ及びｒｓｌ２２５５３７２のアレルＴは、チンパンジー基準配列とは異なっているという観察と一致する。より一般的には、この発見は、西アフリカ人のような比較的多様な集団は、より均質な集団中の強い連鎖不平衡の領域で検出された関連シグナルを精緻化する手段を提供するという予想とも一致する。
【０１９５】
議論
この研究において、我々は、１０ｑ２５．２上の転写因子７−様２（ＴＣＦ７Ｌ２−以前はＴＣＦ４）をコードする、以前に報告した１０ｑ連鎖領域（１０）内の２型糖尿病についての新規候補遺伝子の同定を記述する。それはアイスランド、デンマーク及び米国において、類似の頻度及び相対リスクで、２型糖尿病のリスクを与えることが示された。該変異体は、２型糖尿病の家族性クラスター化の実質的分画は説明しないが、少なくとも２０％の集団寄与リスクは、公衆衛生の観点から重要である。非キャリアと比較して、アットリスク複合アレルのヘテロ接合性キャリア（集団のおよそ３８％）及びホモ接合性キャリア（集団のおよそ７％）の相対リスクは、それぞれ１．４５及び２．４１である。それ故、この変異体は、臨床使用するために十分な的中率値を有する。
【０１９６】
我々は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子の第三のイントロン内の、２型糖尿病関連マイクロサテライトとしての変異体、ＤＧ１０Ｓ４７８を報告する。ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子産物は、Ｗｎｔシグナル伝達経路において役割を果たしている高移動度群（ＨＭＧ）ボックス含有転写因子である。この経路は、細胞の鍵となる発生及び増殖調節機構の一つと考えられており；それは分泌された糖タンパク質により仲介され、Ｗｎｔとして知られており、Frizzled ファミリーのメンバー及びＬＤＬレセプターファミリーノメンバー、Ｌｒｐ５／６から成る、同族レセプター複合体への結合により標的細胞内の多くのシグナル伝達カスケードを開始させる（２４）。Ｗｎｔシグナル伝達は、この経路の中心的プレーヤー、β−カテニンを分解複合体から脱共役させ、及びそれを核へ転位置させ、それは過渡的にＴＣＦ因子を抑制剤から転写活性化因子へ変換する（２５）。β−カテニンタンパク質は、そのカドヘリンの結合を介して、細胞接着を仲介するためにも重要である（ｉ５）。
【０１９７】
ＴＣＦ７Ｌ２についてのＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑは１４のエクソンを含有する。しかしながら、Duval et al（２６）はＴＣＦ７Ｌ２が１７のエクソンを有することを示しており、その５つは代替物であり；加えて、３つの代替スプライスアクセプター部位が使用される。この研究は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子の３’末端中に位置する３つの連続的エクソンの代替使用は、最後のエクソンで使用される読み取り枠を変更し、短い、中程度の又は長いＣＯＯＨ−末端を有する多数のＴＣＦ７Ｌ２アイソフォームの合成を導くことも示している。
【０１９８】
ＴＣＦ７Ｌ２と同様に、２型糖尿病の希なMendelian 形態、即ち、若年発症成人型糖尿病（ＭＯＤＹ）についての６つの位置的クローン化遺伝子の５つは転写因子である（２７）。ペルオキシソーム増殖因子活性化レセプターガンマ（ＰＰＡＲγ）（７）及びフォークヘッド遺伝子ファミリー（２８、２９）を含む、追加の転写因子が２型糖尿病の発症原因に示唆されてきた。Noble et al は、１型糖尿病における関連ＴＣＦ７遺伝子中のミスセンス変異（Ｃ８８３Ａ）を記載している。しかしながら、ＴＣＦ７及びＴＣＦ７Ｌ２が糖尿病の発症原因に関して同一経路で作用するかどうかは明らかではない。
【０１９９】
（Ａ）９コード反復（エクソン１７）におけるＡの欠失（２６、３１〜３３）及び結腸直腸細胞株における多数の突然変異（２６）を含む、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子中の突然変異が記載されている。ＤＧ１０Ｓ４７８は、エクソン４及びエクソンに対して５’及び３’の隣接するイントロン配列を包み込む、明瞭に定義された７４．９ｋｂ  ＬＤブロック（ＣＥＰＨ白人ＨａｐＭａｐ  Ｐｈａｓｅ  ＩＩ）内に位置する。ＤＧ１０Ｓ４７８はそれ自身が原因となる変異体であることが可能であり；それは転写、スプライシング又はメッセージ安定性に影響する根底にある変異体の代理であることも可能である。こうした変異体は、ＤＧ１０Ｓ４７８と強いＬＤである可能性が高く、即ち、変異体はＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック内に位置する。
【０２００】
いくつかの証拠の流れは、２型糖尿病の発症原因おけるこの遺伝子の腸内分泌役割を示唆している。第一に、ＴＣＦ７Ｌ２は結腸直腸癌の発生に関係付けられており（５４）、及び発癌性ＴＣＦ／β−カテニンタンパク質の小分子アンタゴニストがすでに記載されている（３５）。加えて、生後２４時間以内で死亡するＴＣＦ７Ｌ２−／−マウスは、腸上皮幹細胞コンパートメントが欠如している（３６）。ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子の変異体は、腸管内分泌細胞におけるその発現がＴＣＦ７Ｌ２により転写的に調節されているプログルカゴン遺伝子によりコードされているペプチドの一つである、インシュリン分泌性ホルモングルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）のレベルを改変することを介して、２型糖尿病への感受性に影響することができる。インシュリンと協力して、ＧＬＰ−１は血中グルコースホメオスタシスに決定的効果を発揮する（１２）。ＧＬＰ−１類似体及びジペプチジルペプチダーゼＩＶの阻害剤は現在臨床開発中である。
【０２０１】
本発明は、それらの好ましい態様を参照して特定的に示され及び記載されてきたが、形態の多様な変化及び詳細を、付随する特許請求の範囲により包含される本発明の範囲から離れることなく行うことができることを当業者は理解するであろう。
【０２０２】
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【図面の簡単な説明】
【０２０３】
【図１】図１は、ＨａｐＭａｐプロジェクトＢｕｉｌｄ１６におけるＳＮＰｓの連鎖不平衡（ＬＤ）に関する目的のＴＣＦ７Ｌ２領域を描いている。２１５．９ｋｂ遺伝子は、転写の方向を示す、模式的な黒い矢印により示されているように（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑに基づいている）、７つのＬＤブロックにわたっており；エクソンが示されており、エクソン４が強調されている。ＤＧ１０Ｓ４７８は、ＴＣＦ７Ｌ２遺伝子のイントロン３中、１０番染色体上の１１４．４６Ｍｂに位置しており（ＮＣＢＩ  Ｂｕｉｌｄ  ３４）、７４．９ｋｂブロック内に、イントロン３の一部、エクソン４の全部及びイントロン４の一部を取り込んでいる（以後、「ＴＣＦ７Ｌ２のエクソン４ＬＤブロック」と称される）。ＳＮＰマーカーは、それらの物理的位置に従うよりもむしろ等間隔でプロットされている。図はＬＤの２つの尺度−即ち、Ｄ’（図の上部左部分）及びｒ２（図の下部右部分）を示している。
【図１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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