(57)【要約】水をニンニク汁から除去することによってニンニク汁から得られる液体濃縮物を含む農薬または忌避剤。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ニンニク汁から水を除去することによってニンニク汁から得られる液体濃縮物を含む農薬または忌避剤。
【請求項２】
水が減圧蒸留によって４０℃未満の温度で除去される、請求項１に記載の農薬または忌避剤。
【請求項３】
濃縮物が６０〜８０のブリックス値を有する、請求項１または請求項２に記載の農薬または忌避剤。
【請求項４】
濃縮物中の総ポリスルフィドが２〜４％ｗ／ｗの範囲にある、先行する請求項のいずれか一項に記載の農薬または忌避剤。
【請求項５】
式：ＲＳＲ、ＲＳ２Ｒ、ＲＳ３ＲおよびＲＳ４Ｒ（式中、Ｒ＝アリル基）のジアリルスルフィドが、存在する総ポリスルフィドの６６％±１０重量％を占める、先行する請求項のいずれか一項に記載の農薬または忌避剤。
【請求項６】
ジアリルスルフィド：ジアリルジスルフィド：ジアリルトリスルフィド：ジアリルテトラスルフィドが、存在する総ポリスルフィドの重量％として、約４％〜５％：５％〜８％：３１％〜３８％：１９％〜２２％の比率で存在する、先行する請求項のいずれか一項に記載の農薬または忌避剤。
【請求項７】
水が逆浸透によって抽出される、先行する請求項のいずれか一項に記載の農薬または忌避剤。
【請求項８】
ポリスルフィド含量を強化するために、さらなるポリスルフィドが加えられる、先行する請求項のいずれか一項に記載の農薬または忌避剤。
【請求項９】
ポリスルフィドがニンニク油の形で加えられる、請求項８に記載の農薬または忌避剤。
【請求項１０】
ニンニクを粉砕するステップ、
生成した液体から固形物を分離するステップ、
液体を低温殺菌するために液体に対して加熱段階を実行するステップ、
および減圧蒸留により、約４０℃の温度で、液体から水を除去するステップ、
によってニンニクから得られる液体濃縮物の形態をした農薬または忌避剤の製造方法。
【請求項１１】
水が２５℃未満の温度および適当な減圧下で液体から除去される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
水が逆浸透によって抽出されることを特徴とする、請求項１０または請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれかに記載の農薬または忌避剤を含浸させた木粉ベースの顆粒を含むことを特徴とする農薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜９または請求項１３のいずれかに記載の液体濃縮物または含浸顆粒を含む農薬組成物を用いた殺昆虫剤。
【請求項１５】
請求項１〜９または請求項１３のいずれかに記載の液体濃縮物または含浸顆粒を含む農薬組成物を用いた殺線虫剤。
【請求項１６】
請求項１〜９または請求項１３のいずれかに記載の液体濃縮物または含浸顆粒を含む忌避剤組成物を用いた鳥類忌避剤。
【請求項１７】
請求項１〜９または請求項１３のいずれかに記載の液体濃縮物または含浸顆粒を含む忌避剤組成物を用いたウサギ忌避剤。
【請求項１８】
請求項１〜９または請求項１３のいずれかに記載の液体濃縮物または含浸顆粒を含む忌避剤組成物を用いた昆虫忌避剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、殺昆虫剤、殺線虫剤および殺貝剤としての物質の使用に関し、より具体的には、ニンニクから得られる濃縮物をこれらの目的に使用することに関する。
【０００２】
出願人に既知の技術の概説
欧州連合による農薬活性成分の再検討では、現在承認されている６６％を超える活性物質が２００７年までに取り除かれることになると予想される。したがって、より環境に優しい新しい農薬が必要とされている。
【０００３】
鳥類忌避剤としてのニンニク油の使用は、先に、Ｅｒｉｃ  Ｂｌｏｃｋらによって、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第５巻，第８号，２１９２−２１９６頁に報告されている（１）。昆虫忌避活性を示すニンニク由来調製物、ならびに蚊および他の昆虫の幼虫に対するニンニクの毒性も報告されている。Ｅ  Ｂｌｏｃｋら，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．１９９２，３１，１１３５−１１７８（２）；Ｋａｄｏｔａ，Ｙ．「Ｉｎｓｅｃｔ  ｒｅｐｅｌｌｅｎｔｓ  ｍａｄｅ  ｆｒｏｍ  ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ｈｅｒｂ  ｅｘｔｒａｃｔｓ」ＪＰ  ２００３１９２５１６，２００３（Ｃｈｅｍ．Ａｂｓｔｒ．２００３，１３９，４８６５４）（３）；およびＢｈｕｙａｎ，Ｍ．；Ｓａｘｅｎａ，Ｂ．Ｎ．；Ｒａｏ，Ｋ．Ｍ．「Ｒｅｐｅｌｌｅｎｔ  Ｐｒｏｐｅｒｔｙ  ｏｆ  Ｏｉｌ  Ｆｒａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇａｒｌｉｃ，Ａｌｌｉｕｍ  Ｓａｔｉｖｕｍ  Ｌｉｎｎ」Ｉｎｄ．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１９７４，１２，５７５−６（４）参照。文献（１）では、小動物に対する忌避活性を有するニンニク由来調製物や、ニンニクの局所外用が産卵鶏におけるトリサシダニ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｆｏｗｌｍｉｔｅ）の外寄生を減少させたことも言及されている。ニンニクからの抽出物であるアリシンの殺線虫活性も、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｅｓｔ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ，１９９３，３９（４），３９０−３９２に報告されている（５）。ニンニクの殺貝性も報告されている。Ｄ．Ｋ．ＳｉｎｇｈおよびＡ．Ｓｉｎｇｈ「Ａｌｌｉｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ  （ｇａｒｌｉｃ），Ａ  ｐｏｔｅｎｔ  ｎｅｗ  ｍｏｌｌｕｓｃｉｃｉｄｅ」Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，第９巻，第２号（６）。アリシンの抗微生物性に関する総説は、Ｓ．ＡｎｋｒｉおよびＤ．Ｍｉｒｅｌｍａｎにより、Ｍｉｃｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，１９９９，１２５−１２９に発表されている（７）。
【０００４】
Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ  ａｎｄ  Ａｒｏｍａｔｉｃ  Ｐｌａｎｔ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ２００３，２５，ｐｐ．１０２４−１０３８に掲載された「Ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  Ｇａｒｌｉｃ（ニンニクの殺虫性）」と題する論文で、Ｓｉｎｇｈらは、水抽出、溶媒抽出などの、ニンニク抽出物を製造するための様々な従来法を詳述し、水蒸気蒸留を使ってニンニク油を得る方法も詳述している。
【０００５】
Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １９８０，５０，ｐｐ．５０７−５１０に掲載された「Ｅｘｔｒａｃｔｓ  ｏｆ  ｇａｒｌｉｃ  ａｓ  ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｏｆ  ｉｎｓｅｃｔｉｃｉｄｅｓ」と題する論文には、ハスモンヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｌｉｔｕｒａ）、ドクガ属（Ｅｕｐｒｏｃｔｉｓ  ｓｐ．）およびイエカ属（Ｃｕｌｅｘ  ｓｐ．）に対する殺昆虫剤としての、細断ニンニク小鱗茎から水蒸気蒸留によって得られるニンニク油の使用、ニンニクのメタノール抽出物の使用、および細断ニンニクを一枚のモスリンを通して圧搾した時に得られる水およびエーテル抽出物の使用が詳述されている。
【０００６】
Ｉｎｄ．Ｊ．Ｎｅｍａｔｏｌｏｇｙ  １９９１，２１，ｐｐ．１４−１８（Ｇｕｐｔａら）に掲載された論文の抄録は、殺線虫性を有するニンニクの水性抽出物の使用に言及している。線虫幼虫に対して毒性であるとされるニンニクの蒸留油画分の使用にも言及している。さらにまた、この抄録には、殺線虫剤としての小鱗茎粉末の使用も詳述されている。
【０００７】
米国特許出願第ＵＳ５，７３３，５５２号特許には、蚊を忌避する手段として、草、低木および高木に対する希釈ニンニク汁の使用が詳述されている。
【０００８】
欧州特許出願第ＥＰ０９４５０６６Ａ１号は、改良された殺昆虫剤／殺真菌剤を得るために精油と組み合わせたニンニク油またはニンニク抽出物の混合物の使用に関する。
【０００９】
ニンニク油の製造には課題が伴う。天然汁から油を分離する必要があるからである。通常、これには、ニンニクを粉砕し、水蒸気蒸留を行うために１００℃に加熱する必要がある。次に、冷却すると、ニンニク油が水相から分離される。
【００１０】
ニンニク油の使用にも固有の課題がある。室温のニンニク油は、希釈することが困難な粘稠液体であり、希釈剤として使用する液体とも混和する必要がある担体溶媒の使用を必要とするからである。そのような担体溶媒の使用により、有機農業におけるニンニク油の使用は制限され、健康面および安全面で、そのような溶媒の使用に付随する他の問題を持ち込むことにもなる。
【００１１】
したがって、上述のようにニンニクから油を単離するのではなく、ニンニクを単に粉砕し、そのようにして製造された汁を直接使用するのであれば有利である。残念ながら、この方法で単離されたニンニク汁は、化学的分解と微生物学的活性との組み合わせによる分解を受けやすい。ニンニク汁の硫黄成分はおそらく二酸化硫黄／硫黄に酸化され、有機成分はケトン類に酸化／加水分解されるか、呼吸によって二酸化炭素に分解される。したがって、抽出ニンニク汁を使用しようとする場合は、農薬／殺生物剤としての最大効力を確保するために、それをニンニクから新鮮に単離し、ほとんど直ちに使用しなければならない。貯蔵後に保たれている忌避剤としての物質の活性レベルは、著しく低下している。
【００１２】
したがって、様々な生き物に対するその忌避性および農薬としてのその作用に関して、ニンニク油／新鮮ニンニク抽出物に付随する性質を有するが、ニンニク油の単離に伴う水蒸気蒸留段階を必要としない物質を提供することができれば、有利である。本明細書には、そのような物質を、その物質の製造方法と共に記述する。
【背景技術】
【００１３】
上述したニンニク油およびニンニク抽出物の性質は、粉砕工程でニンニクの細胞壁を破砕した後に生成するアリルポリスルフィドの存在に由来すると考えられる。この工程では、アリインがアリナーゼ（ａｌｌｉｎａｓｅ）と呼ばれる酵素によってアリシンに変換される。次に、アリシンが分解して、スキーム１に示すようにポリスルフィドを形成する。
【００１４】
【表１】
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スキーム１
【００１５】
ニンニク抽出物およびニンニク油にその生物学的活性および忌避性を与えると考えられるのは、このアリルポリスルフィドである。ニンニクのこの生物学的活性は、酵素阻害剤、金属封鎖剤、細胞膜上で活性な溶媒、呼吸阻害剤および一般抗生物質として作用するアリルポリスルフィドによるものと考えられる。
【発明の開示】
【００１６】
本発明は、その最も広い態様として、ニンニク汁から水を除去することによってニンニク汁から得られる液体濃縮物を含む農薬を提供する。本明細書に開示する濃縮物は、様々な生き物に対するその忌避性および農薬としてのその作用に関して、ニンニク油／新鮮ニンニク抽出物に付随する性質を有するが、ニンニク油の単離に伴う蒸留段階を必要とせず、さらにまた、長期間貯蔵しても安定であって、物質の活性が低下しない。この安定性は、少なくとも一つには、抽出した汁から水を除去することによるものである。これにより、ニンニク汁にその生物学的活性を与えるニンニク汁の構成要素の破壊を通常担っている生物にとって利用することのできる水をほとんど含まないか全く含まない濃縮物が得られる。
【００１７】
好ましくは、減圧蒸留により、４０℃未満の温度で水を除去する。本方法により、ニンニク抽出物の濃縮時に、その構成要素の分解が最小限に抑えられる。
【００１８】
好ましくは、本濃縮物は、６０〜８０のブリックス値を有する。本明細書に開示される本発明の濃縮物に関して観察された安定性をもたらすこの範囲のブリックス値を濃縮物に与えるのが水の除去である。
【００１９】
好ましくは、濃縮物中の総ポリスルフィドは、２〜４％ｗ／ｗの範囲にある。
【００２０】
好ましくは、式：ＲＳＲ、ＲＳ２Ｒ、ＲＳ３ＲおよびＲＳ４Ｒのジアリルスルフィドが、存在する総ポリスルフィドの６６％±１０重量％を占める（式中、Ｒ＝アリル基）。好ましくは、ジアリルスルフィド：ジアリルジスルフィド：ジアリルトリスルフィド：ジアリルテトラスルフィドが、存在する総ポリスルフィドの重量％として、約４％〜５％：５％〜８％：３１％〜３８％：１９％〜２２％の比率で存在する。これらの成分をこれらの比率で含有する濃縮物は、ニンニク鱗茎の自然変動によっても得られるかもしれない一貫した生物学的活性を有する農薬になる。ある範囲の供給原料から得られる濃縮物を配合することで、この組成を容易に達成することができる。
【００２１】
好ましくは、逆浸透によって水を抽出する。このようにして、濃縮物を単離するのに費やされるエネルギーが最少量であるような方法が得られる。そしてまた、その結果、濃縮物がさらされる加熱のレベルは最小限に抑えられるので、濃縮物は農薬として最大の効力を有することになる。
【００２２】
好ましくは、ポリスルフィド含量を強化するために、さらなるポリスルフィドを加える。そのようなポリスルフィドの添加は、その混合物の農薬または忌避剤としての性能を改善すると予想され、そしてまた、野外条件下で施用した場合に、その混合物の滞留時間も改善すると予想される。
【００２３】
好ましくは、ポリスルフィドをニンニク油の形で加える。ニンニク油は、その油中に水を含まないので、強化目的に使用されるポリスルフィドの特に好ましい形態である。水を含有する物質の添加は、濃縮物のマトリックスを不安定化して、その物質の安定性を減じる。
【００２４】
本発明の第２の広い態様では、
・  ニンニクを粉砕するステップ、
・  生成した液体から固形物を分離するステップ、
・  液体を低温殺菌するために液体に対して加熱段階を実行するステップ、
および
・  減圧蒸留により、約４０℃の温度で、液体から水を除去するステップ、
によってニンニクから得られる液体濃縮物の形態をした農薬の製造方法が提供される。このようにしてニンニク汁を単離し濃縮することにより、農薬として最大の効力を有すると共に、ニンニク油の製造に通常使用される高温蒸留に伴うエネルギー消費を回避する濃縮物が得られる。
【００２５】
より好ましくは、水を、２５℃未満の温度および適当な減圧下で、液体から除去する。このようにして、製造される物質の農薬としての効力を、さらに最適化することができる。
【００２６】
特に好ましい態様では、逆浸透によって水を抽出する。このようにして、濃縮物を単離するために費やされるエネルギーが最少量であるような方法が得られる。そしてまた、その結果、濃縮物がさらされる加熱のレベルは最小限に抑えられるので、濃縮物は農薬として最大の効力を有することになる。
【００２７】
第３の広い態様では、上述の液体ニンニク濃縮物を含浸させた木粉ベースの顆粒を含むことを特徴とする農薬組成物が提供される。したがって、ニンニク中に天然に存在する物質に完全に基づく農薬が提供され、その農薬の使用によって残される唯一の残留物は、リーキまたはニンニクの作物の栽培によって残る残留物と同じである。しかし、ここに開示する農薬の使用は、リーキおよびニンニク作物の栽培によって観察される残留物よりもはるかに低レベルの残留物しか残さない。さらにまた、このようにして木粉顆粒に含浸させることにより、濃縮物が効率よくさらに乾燥され、その結果、濃縮物がその活性を維持する期間が改善されることになるとも考えられる。また、物質の取り扱い易さや、圃場におけるその寿命も改善される。
【００２８】
上述の液体濃縮物または濃縮物含浸顆粒の形態をした農薬組成物は、殺昆虫剤として特に有用である。ここに開示する濃縮物または含浸顆粒は、タマナバエ（ｃａｂｂａｇｅ  ｒｏｏｔ  ｆｌｙ）の防除に有効であること、ならびに蚊幼虫および他の幼虫に対して毒性であることが示されている。はるかに広範な既知の害虫である昆虫に対して、これらの物質が有効であることをこれらの結果は実証していると考えられる。
【００２９】
上述の液体濃縮物または濃縮物含浸顆粒の形態をした農薬組成物は、殺線虫剤として特に有用である。ここに開示するニンニク濃縮物および含浸顆粒は、線虫に対して特に有効であることが見出されている。
【００３０】
上述の液体濃縮物または濃縮物含浸顆粒の形態をした農薬組成物は、鳥類忌避剤として特に有用である。ニンニクに基づく製品は、鳥類に対する忌避剤として有効であることが先に記述されている。したがって、本明細書に開示する液体濃縮物および／または濃縮物含浸顆粒もそのような活性を示すが、さらにまた、濃縮物マトリックスによって付与される安定性という利点も有すると推定することは、合理的である。
【００３１】
上述の液体濃縮物または濃縮物含浸顆粒の形態をした農薬組成物は、ウサギ忌避剤として、特に有用である。本開示に記載する結果は、濃縮物含浸顆粒がウサギに対する忌避剤として作用することを示し、したがって本濃縮物が同じ活性を示すと推定することは合理的である。
【００３２】
上述の液体濃縮物または濃縮物含浸顆粒の形態をした農薬組成物は、昆虫忌避剤として使用することができる。
【００３３】
液体ニンニク油を含浸させた木粉ベースの顆粒を含むことを特徴とする農薬組成物。本明細書に開示する結果は、本開示のニンニク濃縮物を含浸させた顆粒の有効性を示しているので、木粉ベースの顆粒に含浸させたニンニク油が同様の活性を示すと推測することは、合理的である。そのような顆粒にニンニク油を含浸させることにより、ニンニク油の取り扱いが簡単になり、ニンニク油の分散液に用いられる溶媒を使用する必要もなくなる。
【００３４】
新鮮粉砕ニンニクから抽出された液体を含浸させた木粉ベースの顆粒を含むことを特徴とする農薬組成物。本明細書に開示する結果は、本開示のニンニク濃縮物を含浸させた顆粒の有効性を示しているので、木粉ベースの顆粒に含浸させた、新鮮粉砕ニンニクから抽出された液体が、同様の活性を示すと推測することは、合理的である。さらにまた、木紛上に含浸させた抽出汁は、ある程度の水が木粉と結びつき、さらなる水が本明細書に開示する乾燥工程によって除去されることになるので、分解に対して改善された安定性を有する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３５】
以下の方法に従って濃縮ニンニク汁を製造する。
１）新鮮なニンニクを洗浄する；
２）ニンニクを粉砕する；
３）液体から固形分を分離するために圧搾を実行する；
４）ニンニク汁を濾過する（この濾過は通常５０ミクロンフィルターを使って行われる）；
５）低温殺菌ステップを実行する。汁を９０℃の温度に約３０秒間加熱するか、それより低い６０℃の温度を、それより長い時間、最長２分間まで使用することができる；
６）次に、液体中の懸濁物を全て除去するために、清澄化ステップを実行してもよい；
７）次に、減圧蒸留によって水を除去する。
【００３６】
これにより、濃縮ニンニク抽出物が粘稠な褐色の液体として得られる。
【００３７】
水は、減圧蒸留により、４０℃未満の温度で除去される。これによってニンニク濃縮物の成分の分解が防止されるからであり、より好ましくは、水の除去が２５℃で実行できるような点まで、圧力を下げる。
【００３８】
水が単に減圧蒸留によってニンニク汁から除去されるようなニンニク汁濃縮物の形成を詳しく述べた先行技術はないことに注目することが重要である。本出願人に既知の先行技術は全て、水抽出を使って、または標準的な溶媒抽出技法によって、または水蒸気蒸留を使って、ニンニク油を得る、標準的な抽出技法を用いるニンニク汁からの活性成分の単離を詳述している。
【００３９】
上記の方法によって製造された濃縮物を分析すると、以下の範囲の分析データが得られる。
乾物（ブリックス）；60〜80
ｐＨ（１０％溶液）：4.0〜5.0
酸性度（ｍｅｑ／ｋｇ）：300〜400（2.1〜2.8％のクエン酸一水和物に相当）
可用性糖質：45〜55％
濃縮物１ｋｇは新鮮ニンニク約７ｋｇに相当する
【００４０】
ＨＰＬＣ分析
濃縮物中に存在するジアリルポリスルフィドの相対比を決定するための好ましい分析方法はＨＰＬＣである。使用するＨＰＬＣ法およびそれらの基礎をなす文献法の詳細を補遺１に記載する。補遺１に記載する三番目の方法（ＲＢＳＵＬＦ３）は、平衡化時間を長くしたＲＢＳＵＬＦ１法に相当し、好ましいＨＰＬＣ分析方法である。ニンニク油黄金標準（Ｇａｒｌｉｃ  Ｏｉｌ  Ｇｏｌｄ  ｓｔａｎｄａｒｄ）試料から得られるクロマトグラム（クロマトグラム１）を記載して、クロマトグラムの主要ピークを同定する。クロマトグラム２もニンニク標準のクロマトグラムである。ニンニク汁濃縮物（ニンニク製品と表示）の試料クロマトグラムも示す（クロマトグラム３）。
【００４１】
ＨＰＬＣによる濃縮物の分析によって、存在する総ポリスルフィドは２．４〜３．６％ｗ／ｗの範囲にあることが示される。これらのポリスルフィドのうち、式：ＲＳＲ、ＲＳ２Ｒ、ＲＳ３ＲおよびＲＳ４Ｒ（Ｒ＝式：−ＣＨ２ＣＨＣＨ２のアリル基）のジアリルスルフィドは、存在する総ポリスルフィドの重量％として、およそ４％〜５％：５％〜８％：３１％〜３８％：１９％〜２２％の比率で存在する。ＨＰＬＣによると、これらのポリスルフィドは、全体として、濃縮物中に存在する全有機硫黄分子種の約６６％±１０％を占める。
【００４２】
したがって、上述の方法によって製造される濃縮物は、単に新鮮ニンニクを粉砕し加工することによって製造される液体中に見出されるこれらの物質中に存在するポリスルフィドに対して、そしてまたニンニク油中に存在するものに対して、高い化学的類似度を有する。
【００４３】
本明細書に記載するニンニク濃縮物の生物学的活性は、ジアリル−およびメチルアリル−ポリスルフィドのこの特有の比率によるものであると考えられる。
【００４４】
上述のように水を除去して、長期間貯蔵した場合もその安定性が維持されるニンニク濃縮物を得ることには、ニンニク油を単離するために用いられる方法と比較して、または単に新鮮ニンニクを粉砕することによって得られる汁と比較して、明らかな利点がある。上記の方法によって製造される濃縮物は、以下に述べるように、非濃縮ニンニク汁よりもはるかに長い期間、少なくとも３年間は、活性を維持すると考えられる。濃縮物の試料を、典型的な工業的「温度苛酷」条件下で貯蔵した後に、重要な活性成分について分析したところ、以下の結果を得た。
濃縮期間 総ポリスルフィド濃縮
３年１０月                ２．９６（％ｗ/ｗ）
３年  ２月                ２．７４（％ｗ/ｗ）
２年  ９月                ２．６７（％ｗ/ｗ）
１年  ４月                ３．６１（％ｗ/ｗ）
【００４５】
これらの分析結果の一貫性は、本製品の長期安定性を実証している。
【００４６】
抽出した液体を６０〜９０℃の温度に短期間加熱すると、ニンニク抽出物中のアリシンが本明細書に記載する特有のジアリルポリスルフィド比を有するポリスルフィドに変換されるという変換が起こると考えられ、この比率は後述の用途に特に有効であることが分かっている。
【００４７】
ニンニク濃縮物を含浸させた顆粒の製造
本発明者らは顆粒状のニンニク濃縮物も開発した。この顆粒は、上述のニンニク濃縮物を木粉に含浸させた製剤であり、これには結合剤も下記の表２に示す比率で存在する。別段の表示がない限り、ニンニク濃縮物を含浸させた木粉顆粒とは、表２に示す組成の顆粒を指す。
【００４８】
表２：ニンニク濃縮物を含浸させた顆粒の組成
【表２】
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【００４９】
カルボキシメチルセルロースナトリウム、木粉およびニンニク濃縮物を、それらが直径１ｍｍ〜２ｍｍのほぼ球状のペレット／顆粒に凝集するように混合する。このようにして製造した顆粒は、色が黄褐色であり、極めて強いニンニク臭／硫黄臭を有する。
【００５０】
次に、約６０℃の温風を使って、最長２時間にわたって、顆粒を乾燥する。次に、顆粒内に含有される濃縮物のＨＰＬＣ分析により、式：ＲＳＲ、ＲＳ２Ｒ、ＲＳ３ＲおよびＲＳ４Ｒ（Ｒ＝式：ＣＨ２ＣＨＣＨ２のアリル基）の四つのアリルスルフィドの相対量が、濃縮物で行った分析によって見出された相対量と同じであることが示される。
【００５１】
顆粒の効力は湿度に大きく依存する。タマナバエの防除を目的とするそのような顆粒の使用に関する実験例５（この実験例には、この効果を実証する結果も含まれている）を参照されたい。
【００５２】
濃縮物からこのようにして顆粒を形成させることにより、濃縮物の活性成分がさらに安定化されると考えられる。
【００５３】
以下に記述する実証実験は全て、秘密裏に、機密保持契約の下で行われた。
【００５４】
ニンニク顆粒を用いるウサギ忌避実証実験
ニンニク濃縮物を含浸させた顆粒がウサギ忌避剤として有効であることを示す非公開実証実験を行った。実験例１を参照されたい。これらの実証実験により、ニンニク顆粒／プリル（ｐｒｉｌｌ）は、ニンニクを含まないニンジンも入手できる場合に、ウサギにニンジンを食べることを思いとどまらせるのに有効であるという強い証拠が得られる。実験例１参照されたい。この実証実験で使用した顆粒／プリルは、５％および／または２０％のレベルでニンニクを含浸させた木粉から製造されたものであり、上述のように調製した。
【００５５】
ニンニク濃縮物の殺線虫活性
本発明のニンニク濃縮物は殺線虫剤として有効であることが見出されている。実験例２に示すように、最初のインビトロ結果によって、線虫に対する本濃縮物の毒性が立証され、圃場実証実験で使用すべきニンニク汁濃縮物（実験例２でＮＥＭｇｕａｒｄと呼ぶもの）の希釈度の目安が得られた。自由生活線虫およびシスト線虫から保護するためにニンニク濃縮物をジャガイモ作物に液体製剤として点滴潅漑によって使用した場合、ニンニク汁濃縮物を二回施用した後に、作物の総収量に１４％の増加が観察された。
【００５６】
ＮＥＭｇｕａｒｄと呼ぶニンニク濃縮物は、水による０．０５％ｖ／ｖの希釈度で、２４時間以内に、存在する線虫のほとんど全てを殺すことが分かり、０．１％ｖ／ｖの溶液強度では完全な死滅を４時間以内に達成することができ、０．２５％ｖ／ｖの溶液強度では、完全な死滅を１時間以内に達成することができる。好ましくは、ＮＥＭｇｕａｒｄを、植物撒水期間の終了時に、水に入れて混合するべきであり、このようにすることで、一次標的からの製品の溶離が減少する。そのような処理を、理想的には、作物の成長サイクル中、週に１回の割合で行うべきである。
【００５７】
需根作物に関して線虫に施用すべき臨界期は、条播後、最初の４〜５週間である。この期間中に、線虫は傷つきやすい根端を攻撃して、それが岐根発生（ｒｏｏｔ  ｆｏｒｋｉｎｇ）およびストラッティング（ｓｔｒｕｔｔｉｎｇ）をもたらし、その結果、品質と収量の低下が起こる。自由生活線虫は、全ての作物が経済上、収穫に値しなくなるほどの影響を有する場合がある。
【００５８】
自由生活線虫に関して、ＮＥＭｇｕａｒｄ（ニンニク濃縮物）のＬＤ５０は０．０２５％ｖ／ｖと確認され、自由生活線虫とシスト線虫のどちらにも殺線虫作用を有する。この濃縮物は、ジャガイモ、ニンジン、パースニップ、イチゴおよびメロンの作物を保護するために使用されている（ＰＣＮ−ジャガイモシスト線虫に注意）。
【００５９】
ＮＥＭｇｕａｒｄと呼ぶニンニク濃縮物を含浸させた顆粒の使用に関する詳細は、実験例３に記載する。この顆粒の有効性に関する証拠の主要部分は、実験例３で述べるように標準的顆粒散布器を有する条播機を使って施用される顆粒の使用から導き出される。
【００６０】
実験例３では、ニンニク汁濃縮物を含浸させた顆粒（実験例３の３．２項でＥＣＯｇｕａｒｄ顆粒と呼ぶもの）を水に溶解してから、その上清に様々な植物寄生線虫種の検体を導入することによって行われたインビトロ試験の結果にも言及する（３．２参照）。水に対して２．５ｗ／ｖ％顆粒の溶液強度では、例外なく、全ての線虫種が２時間で死滅した。
【００６１】
実験例３の３．３項におけるＮＥＭｇｕａｒｄへの言及は、ニンニク濃縮物の使用への言及であり、インビトロ試験を使って、線虫ロンギドルス・エロンガテス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）および他の線虫に対するニンニク濃縮物の効力を示している。
【００６２】
実験例３の３．４項および３．４．１項では、ニンニク濃縮物を含浸させた木粉顆粒の、グロベデラ・パリダ（Ｇｌｏｂｅｄｅｒａ  ｐａｌｌｉｄａ）（ＰＣＮ−ジャガイモシスト線虫）に対する有効性を示す。
【００６３】
実験例３の３．５．１、３．５．２、３．５．３の各項、実験例３Ａおよび実験例３Ｂでは、ニンジン作物に観察される岐根発生の低減における木粉含浸顆粒の有効性（ニンジン線虫に対する木粉含浸顆粒の有効性によるもの）を示す。
【００６４】
実験例４には、岐根発生の低減におけるニンニク濃縮物を含浸させた木粉顆粒の有効性（ニンジン線虫の防除におけるその顆粒の有効性によるもの）に関する、さらなる結果も示す。
【００６５】
実験例４には、ジャガイモシスト線虫（ＰＣＮ）の防除について、ニンニク濃縮物を含浸させた木粉顆粒（ＮＥＭｇｕａｒｄ顆粒）とニンニク濃縮物／液（ＣＬ  ＡＩＬ  ００２１）の併用の効力に関する結果も示す。
【００６６】
実験例４に記載するさらなる結果は、オリエンタルメロン（ｏｒｉｅｎｔ  ｍｅｌｏｎ）における根瘤線虫メロイドギネ属（Ｍｅｌｉｏｉｄｏｇｙｎａｅ  ｓｐｐ）の防除におけるニンニク濃縮物を含浸させた木粉顆粒（ＥＣＯｇａｒｄ  ＧＲと呼ぶもの）の有効性およびニンニク濃縮物（ＥＣＯｇｕａｒｄ  ＳＲおよびＣＬ  ＡＩＬ  ００２１と呼ぶもの）の有効性を示している。
【００６７】
実験例４Ａには、イチゴの栽培に使用する圃場における様々な線虫種、すなわちロンギドルス・エロンガトス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、ノコギリネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｃｒｅｎａｔｕｓ）、ティレンコリンクス・ズビウス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｄｕｂｉｕｓ）およびパラトリコドルス・パキデルムス（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ  ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｓ）の防除におけるニンニク含浸顆粒（ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）と呼ぶもの）の有効性を示す結果を記載する。
【００６８】
タマナバエ（Ｃａｂｂａｇｅ  Ｒｏｏｔ  Ｆｌｙ）
ＥＣＯｇｕａｒｄ顆粒と呼ぶ顆粒状濃縮物の使用は、カブハボタン（ｓｗｅｄｅ）の作物に使用した場合に、タマナバエ被害の有意な減少をもたらすことが示されている。実験例５を参照されたい。
【００６９】
タマナバエ卵にニンニク濃縮物の１％溶液を直接噴霧すると、噴霧を行わなかった対照卵試料よりも、卵の孵化率が低くなった。
【００７０】
ワクモ（Ｐｏｕｌｔｒｙ  Ｒｅｄ  Ｍｉｔｅ）
ニンニク濃縮物は、ワクモの外寄生を減少させるための殺生物剤として作用することも分かっている。本濃縮物は、ワクモ（ｒｅｄ  ｍｉｔｅ）がはびこる建物内に、その建物に鳥を入れたまま施用することができるので（ただし使用前に卵は取り除くべきである）、本濃縮物には、シペルメトリン（Ｂａｒｒｉｃａｄｅの商標名で販売されている）などの化合物と比較して、特別な利点がある。これは、本出願人が知る限り、ワクモの外寄生を減少させるのに有効であることが示されている初めての植物性殺生物剤であり、推奨される使用比率では、本濃縮物は接触殺生物剤として作用する。
【００７１】
本濃縮物は、限定された空間または軽度汚染環境で使用する場合は、殺生物剤として特に有効である。
【００７２】
擬似使用条件研究では通常８５％を越える死亡率レベルが観察され、秘密圃場実証実験からも同様の作用が報告され観察されている。実験例６参照されたい。
【００７３】
本濃縮物は忌避剤としても機能し、再コロニー形成を阻害するようである。
【００７４】
従来の殺生物剤は単一部位作用（アセチルコリンエステラーゼ阻害）を有する傾向があり、これらの化合物に対する耐性は、集団内の淘汰および突然変異により、迅速に発達し得る。
【００７５】
ワクモに対する防除手段として使用される本明細書に開示する濃縮物（Ｂｒｅｃｋ−ａ−ｓｏｌと呼ぶもの）は、例えば
・  呼吸酵素阻害、
・  膜の破壊および脱分極、
・  細胞質ゾルにおける金属イオンの封鎖およびキレート
などの多部位作用を有すると考えられる。
【００７６】
したがってワクモがニンニク濃縮物に対する耐性を発達させる可能性は、この製品の殺生物剤としての機能の仕方が生化学的に複雑であるために低い。
【００７７】
環境影響
近年、環境問題の認識が高まりつつあることから、より環境に優しい農業の実践が奨励されるようになり、有機表示を有する食品の生産が増加している。したがって、農薬または忌避剤として使用される本明細書に開示するニンニク抽出物の提供は、有意義な進歩である。この抽出物の使用によって形成される分解産物は、全くの天然物であって、ニンニクまたはリーキを栽培した後に土壌に残されるものと同じ物質に相当するが、そのレベルははるかに低い。通例、ニンニクおよびタマネギの商品作物は、１２ｋｇ／ｈａのＥｃｏｇｕａｒｄ顆粒施用よりも１２０〜６００倍多いポリスルフィドを土壌に放出する。参考文献（１）参照されたい。この主張の詳細な解析を補遺２に記載する（この補遺ではニンニク濃縮物をＡＩＬ  ００２１およびＣＬ  ＡＩＬと呼ぶ）。
【００７８】
ニンニク油の添加によるニンニク汁濃縮物の強化
本発明のニンニク汁濃縮物に含有されるポリスルフィド混合物は、蒸留ニンニク油のポリスルフィド混合物に似ている。したがって、本発明に従って製造されたニンニク汁濃縮物のポリスルフィド含量は、その製造後に、ニンニク油の添加によって強化することができる。このようにしてニンニク汁濃縮物のポリスルフィド混合物を強化することにより、増加したポリスルフィドレベルを有しつつも、ニンニク汁マトリックスの性質が得られた混合物を長期貯蔵に関して安定化し続ける物質が得られる。このようにして、ポリスルフィド含量を、７％ｗ／ｗを越える量にまで増加させることができる。得られた混合物中のポリスルフィドレベルの増加は、その混合物の農薬または忌避剤としての性能を改善すると予想され、そしてまた、野外条件下で施用した場合に、その混合物の滞留時間も改善すると予想される。
【００７９】
本発明は特許請求の範囲によって定義される。本明細書に開示する農薬は、蚊幼虫および他の昆虫幼虫ならびに線虫、アブラムシ（半翅類）、キンケクチブトゾウムシ、様々な甲虫（鞘翅類）、蛾および蝶（鱗翅類）、軟体動物、ダニおよびタマナバエに対するその毒性に関して、特に効力があると考えられる。本物質は殺線虫剤として特に有効である。
【００８０】
本物質は、その忌避性に関し、昆虫、ウサギおよび一定の鳥類種に対する忌避剤として、特に有効である。
【００８１】
（実験例１）
ニンニクを使ったウサギ採食忌避実証実験ＩＩＩ
序論
集団生活させたウサギでの予備的非公開実験により、ウサギ採食忌避剤としてのニンニクの有意な効果が実証された。より詳細な実験を個別に収容した２０匹のウサギで行った。この場合は、ウサギを無作為に選択して、ニンニク汁濃縮物を５％または２２％のレベルで含浸させたプリルを与えた。ニンニク汁濃縮物を含浸させたプリルは、有意な忌避効果を誘導することが分かった。ただし、二つのニンニク濃縮物の間に、有効性の有意差は見出されなかった。
【００８２】
さらに、プリルの材齢によるニンニク忌避反応の寿命を調べるために計画した非公開実証実験を行った。この報告では、実験プロトコールに関する情報を提供し、この実証実験の結果を要約する。
【００８３】
材料および方法
作業は野生の捕獲ウサギ２０匹で行った。通常はペアにして畜舎に入れたが、実験前の５日間および実験中は、各ウサギを３メートル×２メートルの戸外畜舎で個別に飼育した。各ウサギには、常時、市販のペレット状ウサギ飼料ならびに各畜舎内で自由に育っている草および水を、自由に摂取させた。ウサギは主に薄明薄暮性の採食動物なので、実験はおよそ１５：３０〜０９：００の時刻に行った。この季節は日が短いため、以前の実証実験と比べて曝露時間がわずかに長いことは、不可避だった。
【００８４】
実験の開始に先立って、１ボールあたり１ヘクタールあたり１２ｋｇのプリル密度をシミュレートするのに必要な乾燥プリルの平均数を決定するために、新たに開封した包みから取り出したプリルを、乾燥時に事前計量した。平均すると、これは、１ボールあたり５個の対照プリル（ニンニク含有率０％）および６個の試験プリル（５％のニンニク汁濃縮物が含浸されているもの）に相当した。
【００８５】
次に、実験開始の６週間前に、対照プリルおよび試験プリルの新たに開封した包みを、戸外に置いた別々の鉢で「風化」させた。ラベルを貼った２３ｃｍのプラスチック製植木鉢に、約３ｃｍの深さまで砂利を入れてから、約８ｃｍの土壌（ジョンイネス・ナンバー２・土壌ベース配合土）を入れた。約２００ｍｌの蒸留水を撒水することによって土壌を引き締めた。これを排水させ、実証実験の継続期間中は適切な数が確保されるように、十分なプリル（約２ｇ）を土壌の上にまき散らした。次に、その植木鉢を２時間にわたって戸外に放置するか（すなわち新鮮プリル＝０週）、２、４、５または６週間にわたって放置してから、それらを実験に使用した。１６週間にわたる風化には、日光、雨（下記参照）および−１２℃〜２０℃の範囲の温度への曝露が含まれた。
【００８６】
【表３】
2008534667.tif 000005
【００８７】
実証試験の開始前と非実験日には、新奇恐怖を最小限に抑えるために、薄く切ったニンジンをウサギに定期的に提示した。二者択一試験を使った。薄く切ったニンジンを二つの別個のボールに入れて、一つは対照プリルと共に、一つは試験プリルと共に提示した。２００ｇのニンジンを各ボールに入れて提示した。ボールは、ニンニク臭が対照に影響を及ぼすのを避けるために、畜舎内のできるだけ離れた位置にある別々の餌場に置いた。位置効果を避けるために、実験第二夜は、餌場およびボールの設置を交換した。
【００８８】
この実証実験では全部で１０週間の実験を行ったが、これには、実験開始前に行った６週間にわたるプリルの風化は含まれていない。慣れ効果を避けるために、各ウサギを、２週間に１回、２実験日にわたって試験した。プリルの五つの材齢のそれぞれを２０匹のウサギ全てで試験した。すなわち各ウサギを５回試験した。プリルの材齢は、無作為化ラテン方格法を使って、ウサギに配分した。ウサギ採食実験は２４／１０／００に開始し、２８／１２／００に終了した。
【００８９】
実験日に、（１２Ｋｇ・ｈａ−１の比率をシミュレートするのに）必要な数の風化プリルを、施釉陶器ボール中の湿った濾紙（３ｍｌの蒸留水で湿らせたもの）上に置いた。プリルがニンジンと直接接触するのを防ぐために、プラスチック被覆ワイヤメッシュをボールに入れた。これにより、プリルからの匂いはニンジンを通して広がることが可能になった。また、これにより、圃場においてウサギが消費する植物部分にプリルは近接しているが、接触はしていないという状態が模倣された。
【００９０】
結果
各餌場で２日間にわたって摂食された総飼料のパーセンテージを、プラスチック被覆格子越しに落ちてウサギが利用できなくなっていたニンジン「くず」を差し引いてから計算した。ウサギ、試験実施の週、およびニンニク汁濃縮物含浸プリルの材齢が、（両方の餌場で）摂食された飼料の総パーセンテージに及ぼす影響を調べるために、分散分析を行った。
【００９１】
プリルの材齢が摂食された飼料の全体量に影響を及ぼしたという証拠はなかった（ｐ＝０．４７９）。しかし、摂食された飼料の総量が週によって変動するという証拠はなかったものの（ｄ．ｆ．＝１６；ｐ＝０．１０４）、摂食された飼料の量は、ウサギ間でかなり変動することが分かった（ｄ．ｆ．＝１６；ｐ＜０．００１）。
【００９２】
ニンニク汁濃縮物含浸プリルに対する反応におけるウサギ間の個体差を図１に示す。図１は、ニンニク濃縮物を含浸させたプリルを含む餌場と、ニンニク濃縮物を含浸させていないプリルを含む餌場との間で、摂食されたニンジンの比較を示している。プリルが新鮮な場合にのみ、ニンニク汁濃縮物含浸プリルではなく対照の存在による、より一貫した正の採食反応があったことも認められた。
【００９３】
ニンニクの効果を解析するために、ニンニクプリルを含む餌場で摂食されたニンジンのパーセンテージを、対照餌場でのパーセンテージから差し引くことにより、摂食されたニンジンのパーセンテージの、ニンニク汁濃縮物による減少を求めた。プリルの様々な材齢において、摂食されたニンジンのパーセンテージの平均減少率を以下の表に示す。
【００９４】
【表４】
2008534667.tif 000006
【００９５】
ＡＮＯＶＡにより、平均して、プリルが古い場合よりもプリルが新鮮な場合の方が、平均して、ニンニクプリルを含む餌場からウサギが摂食するニンジンの量が少ないことを示す強い証拠（ｐ＝０．００７）があることが示された。２週間以上風化させたプリルが有効であるという証拠はなかった（ｐ＝０．５）。９５％信頼区間で、新鮮なプリルを使用した場合に摂食されるニンジンの減少量は、１０％〜３６％の範囲にあった。
【００９６】
先の試験時にウサギが経験したプリルの材齢からくる持ち越し効果に関する証拠は見出されなかったことに注目されたい。
【００９７】
このように、新鮮なプリルはウサギの選択に影響を及ぼしたようであるが、２週間以上風化させたプリルが有効であるという証拠はなかった。
【００９８】
結論および推奨
ニンニクは、それを新鮮なプリルとして提示した場合には、ニンニク臭のしないニンジンも入手できる時に、大半のウサギにニンジンを食べることを思いとどまらせるのに有効であることを示唆する強い証拠がある。しかし、プリルを秋季および冬季に２週間以上にわたって風化させた場合にもこの反応が続くという証拠はない。
【００９９】
新鮮なプリルを使って得られる一貫した顕著な結果に基づいて、同様の実験的試行を、プリルあたりのニンニク用量のパーセンテージを高くして行うことが推奨される。これは、風化による明らかな劣化に対抗して、この反応の寿命を延ばすことになるかもしれない。具体的には、プリル中のニンニク汁濃縮物のパーセンテージを１１％または２２％まで増加させることができる。プリル密度を１２Ｋｇ・ｈａ−１から２０Ｋｇ・ｈａ−１またはそれ以上（最大密度１５０Ｋｇ・ｈａ−１）に増加させても、プリルを同じように風雨に曝したのでは、寿命の増加は達成できないかもしれない。
【０１００】
（実験例２）
ＰＣＮ（ジャガイモシスト線虫−ジャガイモシロシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｌｌｉｄａ））に対するニンニク汁濃縮物（ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標））の使用
ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）は強力な殺線虫剤として作用するニンニク汁濃縮物である。
【０１０１】
ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）製剤を使った一連の開発作業により、自由生活線虫とシスト線虫の両方に対する殺線虫作用の明確な証拠が確認されている。
【０１０２】
ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）の液体製剤は点滴潅漑によって送達するのに特に向い、ジャガイモ作物で行った予備作業では、総収量が１４％増加するという極めて有望な結果が得られ、これはＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）を２回施用したことに起因すると考えられた。この非公開実証実験は、かなりのジャガイモシスト線虫（ＰＣＮ）個体数を含む圃場で行われた。
【０１０３】
インビトロ作業により、本発明者らは、圃場プロトコールをさらに開発することができるようになった。製品使用比率に関するプロトコールを以下に記載する。
【０１０４】
１．０  溶液の使用強度
ニンニク汁濃縮物（ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標））の溶液は、０．０５％ｖ／ｖの希釈液として、ほとんど完全な死滅を２４時間以内にもたらすことが示されている。０．１％ｖ／ｖ溶液強度では、完全な死滅を４時間で達成することができる。０．２５％ｖ／ｖ溶液強度では、完全な死滅を１時間で達成することができる。したがって本濃縮物の使用は、効力と費用のバランスとして、これら三つの希釈度の範囲内で作用するように計画されるべきである。
【０１０５】
選択肢１（時限的）
濃縮物を潅漑シークエンスの最後の１０００リットル量に加えるとすると、以下の体積添加比が必要である。
＠  1000リットルに0.05％ｖ/ｖ  ＝  0.5リットルのNEMguard（登録商標）
＠  1000リットルに0.1％ｖ/ｖ   ＝  1.0リットルのNEMguard（登録商標）
＠  1000リットルに0.25％ｖ/ｖ  ＝  2.5リットルのNEMguard（登録商標）
【０１０６】
理想的には、最後の１０００リットルについては、移動するＰＣＮを含有すると予想される土壌体積における持続性が最大になるように、透水時間を管理すべきである。シークエンスの最後に添加することにより、一次標的からの製品の溶離が減少することは明らかである。圃場容水量に等しいかそれに近い土壌が示す排水は少なく、したがって送達量を可能な限り長く維持することが可能になると考えられる。
【０１０７】
ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）は、送出する前に、最後の１０００リットルの水と混合することが好ましい。それが可能でない場合には、十分に混合する機会が増えるように、ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）を数分間にわたって配管網に加えるべきである。
【０１０８】
選択肢２（全般的）
ニンニク汁濃縮物（ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標））が約９０００リットルの潅漑送達イベント全体にわたって１〜２時間で加えられる場合を考えるとすると、以下の体積添加を考慮する必要がある。
＠    9000Ｌに0.05％ｖ/ｖ      ＝    4.5リットル
＠    9000Ｌに0.1％ｖ/ｖ       ＝    9.0リットル
＠    9000Ｌに0.25％ｖ/ｖ      ＝    22.5リットル
【０１０９】
これら二つの送達アプローチ（時限的および全般的）を検討すると、２．５ｌ〜２２．５ｌの単回使用比率体積で、効力の証拠が得られそうであると分かる。
【０１１０】
ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）が線虫を殺す速さを考えると、全体的アプローチは、経済的理由から水量を最小限に抑えつつ、ピーク用量を最大化するものであるべきである。
【０１１１】
総使用比率／ｈａを増加させ、それによって、より多くの製品を利用できるようにするのであれば、順列（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎｓ）はかなり増加する。
【０１１２】
２．０  結論
自由生活線虫に関するＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）のＬＤ５０は独立して約０．０２５％ｖ／ｖと決定されている。これにより、他の殺線虫剤と比較して経済的な状態を保ったまま、この値を実質的に上回る強度で製品を送達する余地がかなり与えられることは、明らかである。
【０１１３】
ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）が殺す速さには、比較的高い溶液強度の「バースト」が有利であり、これは潅漑イベントの後端に加えることによって、持続させることができる。
【０１１４】
このアプローチでは数回の反復施用（例えば週１回の間隔で６週間）も可能である。
【０１１５】
もう一つの選択肢は、製品を、ある潅漑イベントの全体を通して、単回高用量として施用することである。
【０１１６】
システムの管理およびインフラが許すのであれば、複数回のバーストアプローチを考慮すべきである。
【０１１７】
３．０  概略的プロトコール
１〜２時間で９０００ｌが送達されるとする。１０００リットルを送出するのに６．６分かかる（１時間の場合）。
１．通常の水を作物に７０００〜８０００リットル送出する。
２．２．５〜５ＬのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）を最後の１０００リットルに加える。これは約５３分（残り６．６分）である。
３．送出する。
４．ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）の添加に２分かかるとすると、最後のパルスは、約６６０リットルに希釈され、これは本製品を散布するのに十分なはずである。
５．使用する溶液強度および選択した総使用比率／Ｈａに応じて、３〜６週間にわたって、毎週繰り返す。
【０１１８】
（実験例３）
線虫に対するニンニク濃縮物および濃縮物を含浸させた顆粒の有効性
３．０  概要
線虫を防除する目的でここに提案する製剤（ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標））を施用したジャガイモおよび根菜作物における非公開圃場実証実験のプログラムにより、商業的に有意義なレベルの被害減少が確認されている。
【０１１９】
証拠の主要部分は、テミク（Ｔｅｍｉｋ）などの製品の効力と比較して、条播時に施用される顆粒製品の使用から導き出される。限られた数の実証実験が、農薬安全指令（Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｄｉｒｅｃｔｉｖｅ）によって承認された独立組織または該国（韓国）で認可された同様の組織によって行われている。これらの報告での結論は、ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）が殺線虫性を有するという主張を裏付けている。
【０１２０】
この最も進歩した製剤は、顆粒状「ＮＥＭｇｕａｒｄ」の形で、根菜類にはテミクおよびバイデート（Ｖｙｄａｔｅ）の代替物として十分に適しているようである。
【０１２１】
インビトロ実験および圃場実験には高度な一貫性がある。
【０１２２】
３．１  前置き
本発明者らが作物保護用のニンニク製品を検討していく中で、殺線虫剤としての製剤の潜在能力がますます明らかになってきた。インビトロ一次スクリーニングと、欧州および朝鮮で行われたジャガイモ、パースニップ、ニンジンおよびメロン作物での反復非公開圃場実証実験とを組み合わせることにより、ニンニク製品（ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標））中の化学物質によって線虫を殺すことができるという証拠が得られている。圃場の植物は、顆粒および液体の地下施用に反応して、殺線虫作用に関連すると思われる生長力および総収量の有意な増加を示すようである。
【０１２３】
ニンジンなどの根菜の場合は、自由生活線虫によって引き起こされる岐根発生および萎縮などといった品質問題を、条播時に施用されるＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒の単回施用によって、有意に減少させることができるという明白な独立した証拠がある。
【０１２４】
ロンギドルス・エロンガテス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｅｓ）およびジャガイモシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｒｈｏｓｔｏｃｈｉｅｎｓｉｓ）を使ったインビトロでの対照実験およびインビボでの対照バイオアッセイでも、ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）が、テミクに見られる効力に匹敵する効力を有する強力な殺線虫剤であるという証拠が得られる。
【０１２５】
欧州の農薬活性成分の再検討（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｐｅｓｔｉｃｉｄｅ  ａｃｔｉｖｅ  ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ）では、２００７年頃までに現在承認されている活性物質の約６６％が取り除かれることになると予想される。アルジカルブなどの殺線虫剤製品は既に厳しい監視下にある。２００７年までは、承認された作物でのその使用について、特例が認められている。
【０１２６】
したがって、殺線虫／静線虫活性を有する環境に良い製品には、アルジカルブ、バイデートおよび臭化メチルなどといった毒性の高い製品に取って代わる大きな好機がある。
【０１２７】
３．２  プログラムの概説
線虫に対してニンニクを使った予備バイオアッセイ作業は１９９８年に行われた。この作業では、ニンニク汁濃縮物を処方したプロトタイプＥＣＯｇｕａｒｄ顆粒を水に溶解し、次にその上清に様々な植物寄生性線虫種の検体を導入した。水に対して２．５ｗ／ｖ％顆粒の溶液強度では、例外なく、全ての種が２時間で死滅した。
【０１２８】
ジャガイモシロシストセンチュウ（Ｇｌｏｂｏｄｅｒａ  ｐａｌｌｉｄａ）（ＰＣＮ）およびロンギドルス・エロンガトス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）（股根の発生（ｒｏｏｔ  ｆａｎｇｉｎｇ））の場合、１．２５％ｗ／ｖの溶液強度では、死亡率が４時間でこれらのレベルに達した。ロンギドルス属（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ  ｓｐｐ．）の場合は、０．２５％ｗ／ｖの溶液強度で有意な死亡が２４時間で起こった。
【０１２９】
これらの一次スクリーニング実験以来、本発明者らは、非公開圃場実証実験と、さらなるインビトロ研究とを併用して、線虫学に関する研究および開発プログラムを維持してきた。
【０１３０】
これらの製剤のインビトロ使用と圃場規模使用の両方から得られるデータでは、経済的な使用比率での殺線虫性が、明確に確認されている。これは、ニンジンおよびパースニップなどの根菜作物に、それらを自由生活線虫およびシスト線虫の被害から保護するために、顆粒を施用した場合には、特にそのようであると言える。
【０１３１】
３．３  結果
表５：インビトロでの効果、死亡率（ＳＣＲＩ  １９９８）。ニンニク汁濃縮物（ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標））を使った最初の実験
【０１３２】
【表５】
2008534667.tif 000007
【０１３３】
上記のデータは、「ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）」製剤には線虫に対する毒性物質が存在することを明確に示している。
【０１３４】
この結果は、殺滅率を溶液強度と対比するインビトロバイオアッセイにニンニク汁濃縮物を使用することで、確認された。図２は、ロンギドルス・エロンガトス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）に対するニンニク汁濃縮物のインビトロバイオアッセイを表すグラフ表示である。死亡率は、様々な希釈度で、接触時間（１〜２４時間）に従って分類されている。
【０１３５】
このデータは、２４時間でのＬＤ５０が約０．０２５％であることを示している。
【０１３６】
３．４  自由生活線虫に対する顆粒の影響
ジャガイモ作物での非公開圃場実証実験により、施用比率を増加させた場合のＰＣＮに対する影響を示す証拠を得た。ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）を根菜作物に施用した場合、線虫の摂餌に起因すると考えられる根の形成異常の量およびタイプの相違によって、製品の影響を評価することができる。
【０１３７】
英国の根菜産業は、ニンジンおよびパースニップの作物において、根の被害を減少させ、収量を高める手段として、テメクに著しく頼っている。２００３年に、本発明者らは、これらの野菜作物においてテミクを置き換えるＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）の潜在能力を評価するために、非公開圃場実証実験のプログラムを開始した。
【０１３８】
テミクは、根菜作物を作付けする際に、種と一緒に同じ畝間に同時施用されて、出現する幼根を保護する。線虫は傷つきやすい新しい根端を攻撃する。これは、岐根発生および萎縮につながり、その結果、品質および収量の低下が起こる。自由生活線虫は、全ての作物が経済上、収穫に値しなくなるほどの影響を有する場合がある。
【０１３９】
３．４．１  パースニップ作物−ハインフォード（ノリッジ）
ハインフォード（ノリッジ）で行われた非公開実証実験で、本発明者らは、８反復６処置ランダム化ブロックをレイアウトし、テミクを商業的最良事例を反映する比率で含めた。ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）を４つの比率（５、１０、１５および２０ｋｇ／ｈａ）で使用し、これらの全てを無処置対照と比較した。施用は全て、標準的な顆粒散布器を有する市販の条播機によって行った。実験地は線虫個体数について検査され、被害を受ける危険があると考えられ、テミクの施用が正当化された。
【０１４０】
作物を成熟の中間段階で評価し、岐根（ｆｏｒｋｅｄ  ｒｏｏｔ）および股根（ｆａｎｇｅｄ  ｒｏｏｔ）の割合を決定した。
【０１４１】
処置間で股根の発生に有意差が見られた。これを図３に図解する。図３は、ハインフォード（ノリッジ）での、パースニップ作物における岐根発生を表す。
【０１４２】
枠（図３）は、値の５０％を含有する四分位数範囲を表す。ウィスカー（ｗｈｉｓｋｅｒ）は、異常値を除いて反復試験区での最高値および最低値に向かって枠から伸びる線分である。枠を横切る線分は中央値である。処置は有意に相違する。
処置
１  ＝  対照
２  ＝  テミク（アルジカルブ）
３  ＝  ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）５ｋｇ／ｈａ
４  ＝  ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）１０ｋｇ／ｈａ
５  ＝  ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）１５ｋｇ／ｈａ
６  ＝  ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）２０ｋｇ／ｈａ
【０１４３】
対照（処置１）では、どのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）処置（３〜６）（それぞれ５〜２０ｋｇ／ｈａ）よりも、岐根および股根が有意に多かった。１０〜２０ｋｇ／ｈａのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）処置はテミクより有意に良かった。この実証実験地では、ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）施用の増加と共に株立本数が増加するという証拠もあった（図４）。
【０１４４】
図４−株立本数と処置の関係
バーは、個々の反復試験区から得られる値の範囲を表す。テミク施用および全てのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）施用は、株立本数を対照より増加させるようである。比率２０ｋｇ／ｈａのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）は、対照から最も離れている。
【０１４５】
総合すると、岐根発生および株立本数に関するデータは、作物を植物損失および根の損傷から防御することに関して、ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）がテミクと同じぐらい有効であったことを示す良い証拠である。
【０１４６】
３．５．１  ニンジン実証実験−ポスケッツ（Ｐｏｓｋｅｔｔｓ）農場（ヨークシャー）
パースニップでの実証実験を補足する実証実験をニンジンで行った。この非公開実証実験では、比率２０ｋｇ／ｈａのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）の効果を、商業的最良事例を反映する比率で施用したテミクと比較した。全ての処置を無処置対照と比較した。実験地は、土壌試料採取によって決定した線虫数に基づいて選択した。
【０１４７】
この実証実験は三つの反復試験区にレイアウトし、全ての処置を従来のトラクター搭載条播機によって施用した。
【０１４８】
表６：ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）が岐根発生および萎縮に及ぼす影響。ポスケッツ農場（ヨークシャー）における実証実験結果の要約
４  反復ランダム化ブロック
１    対照
２    テミク
３    標準ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）２０ｋｇ／ｈａ
【０１４９】
【表６】
2008534667.tif 000008
【０１５０】
データの統計解析では処置間に有意差は見出されなかった。このデータは明確な傾向をいくつか有し、対照群では他の処置群よりも股根および萎縮根のニンジンが約５０％多かった。処置群あたりの調べた根の数の多さが、これらの効果の信頼性に、さらなる確かさを加えている。
【０１５１】
図５に、ブロックの一つで見られた症状を図解する図を示す。
【０１５２】
この実証実験では、ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）製剤が、同じ実証実験においてテミクに見られたものと少なくとも同程度に、岐根発生および萎縮を有意に減少させるという良い証拠が得られた。
【０１５３】
３．５．２  線虫によって引き起こされるニンジンにおける股根発生の予防に関するさらなる実証実験結果
テミクの代替品を見つけなければならないという圧力に応えて、テミク、バイデート、ネマトリン（Ｎｅｍａｔｈｏｒｉｎ）およびＮｅｍｇｕａｒｄの効力を比較し対比するために、一群の非公開実証実験を行った。ニンジンでの実証実験を、ノーフォーク、ヨークシャーおよびノッティンガムシャーにある３つの実験地に展開し、条播時に施用する２０ｋｇ／ｈａのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）を含めた。各実験地における岐根発生のパーセンテージの集計表を、以下の表７に示す。
【０１５４】
実験地は全て、土壌試料中の自由生活線虫の個体数に基づいて、特別に選択されたものである。
【０１５５】
表７：三つのニンジン作物における岐根発生の
パーセンテージの相対的相違
【表７】
2008534667.tif 000009
【０１５６】
有意な処置効果がノーフォークの実験地で見られた。そこではＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）が最も有効な処置であり、岐根発生を７３％減少させた。これに対して、テミクは岐根発生を６５％減少させた。三つの実証実験地を全てを総合すると、ＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）、テミクおよびバイデート（全ての比率で）は、極めてよく似た防除レベルを発揮した。
【０１５７】
３．５．３  ニンジンシスト線虫に対するＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）を使った実証実験
本発明者らは、ニンジンシスト線虫ヘテロデラ・カロタエ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｃａｒｏｔａｅ）の活動に起因すると考えられる収量および品質低下の被害を受けた作物を生産した経歴を有する圃場土壌にニンジンを作付けした一群の非公開鉢試験を行った。
【０１５８】
これらの実験を評価したところ、ニンジンシスト線虫によって引き起こされる症状に対する処置および用量効果を示す証拠が存在した。３０ｋｇ／ｈａに等しい比率でのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）施用は、他のどの処置よりも優れているようだった。
【０１５９】
このポット実験後に、四つの比率のＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）（１０、２０、３０および４０ｋｇ／ｈａ）を無処置対照と比較する非公開圃場規模研究を開始した。この実証実験を単独で評価したところ、この実証実験は、経済的重要性を有する明確な処置および用量効果を生じた。全てのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）施用が、実証実験における可販収量を増加させた。最大の増加は２０ｋｇ／ｈａのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）を施用した場合に起こり、総収量を１２．６トン／ｈａ増加させた。
【０１６０】
この圃場実証実験におけるＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）の効果を下記の表に示す。可販根数は１０〜３０ｋｇ／ｈａのＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）でも増加した。
【０１６１】
下記の前提のもとで、ニンジンにおけるＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）の使用は、実質的な経済的利益をもたらす。
秋の平均収量は１００トン／ｈａである。
１ｋｇあたりの平均売価は０．７８デンマーククローネ（Ｄｋｒ）である。
１本あたり１００ｇの最適重量を有するニンジンが１ヘクタールあたり約１，０００，０００本。
【０１６２】
表８：ラメフィヨルド（Ｌａｍｍｅｆｊｏｒｄｅｎ）ニンジンにおける
ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）使用の経済的利益
【表８】
2008534667.tif 000010
上記表８のデータでは用量反応が明確に確認され、最適な効果は２０ｋｇ／ｈａのＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）に見られた。
【０１６３】
（実験例３Ａ）
ニンジンシスト線虫による非公開実証実験
目的：  本実証実験の目的は、圃場実証実験で使用すべき至適用量を決定するために、ニンジンシスト線虫の攻撃に関して、考え得る用量反応を観察することだった。
作物：  ニンジンＦ１ＣＲ５０１。チラム被覆。
実証実験の開始：  ２００４年１月１５日。
実証実験の評価：  ２００４年４月７日および２００４年５月１１日。
試験区：  １処置につき１０列の鉢。反復なし。
植物：  １鉢につき種子１０個
処置：  無処置
１０ｋｇ／ｈａ＝１４粒／鉢＝５０ｍｇ／鉢
２０ｋｇ／ｈａ＝２８粒／鉢＝１００ｍｇ／鉢
４０ｋｇ／ｈａ＝５６粒／鉢＝２００ｍｇ／鉢
８０ｋｇ／ｈａ＝１１２粒／鉢＝４００ｍｇ／鉢
種子および顆粒を鉢中の土壌約０．５〜１ｃｍで覆った。
【０１６４】
結果：
４月初めに行った最初の評価では、異なる処置間で根の外観に大きな相違があった。無処置のニンジンは、１０〜８０ｋｇ／ｈａの処置をしたニンジンよりも白い根が少なかった。用量に関して目に見える相違はなかった。ニンジンは非常に小さかったので、最終評価までもう一ヶ月待つことにした。
【０１６５】
このスクリーニング実証実験では、１処置につき１０鉢しかなかったので、統計解析を行うことはできなかった。したがって、これらの結果は、圃場において予想され得る傾向を示すことしかできない。
【０１６６】
表９：処置別に分類した結果
【表９】
2008534667.tif 000011
生長力スコア：
１：悪い
２：
３：
４：最も良い植物。
シストの数：
ニンジン１本あたりのシスト数を大まかに数えた。１鉢あたりの植物全てについてシストの数の平均を見積った。
【０１６７】
シストの数は、ニンニク濃縮物の用量を増やすと共に、減少するようだった。最も長い葉の長さおよび植物の生長力は、用量を増やすと共に増加する傾向を示した。８０ｋｇ／ｈａの用量は、植物毒性であるかもしれない。なぜなら、葉の長さおよび生長力スコアはその前の用量と比較して低下し、それと同時に、シストの数は増加したと思われるからである。
【０１６８】
表１０：カテゴリーごとに分類したシストの平均数および最も長い根の長さ
【表１０】
2008534667.tif 000012
シストの数は、最も悪いカテゴリー１から最も良いカテゴリー４まで著しく減少したことが、表１０から分かる。最も長い葉の平均長はカテゴリーを通じて増加した。
【０１６９】
表１０の数字により、植物間に観察された目に見える相違が裏付けられた。
【０１７０】
表１１：生長力の各カテゴリーに属する鉢のパーセンテージ（１処置あたり９鉢）
【表１１】
2008534667.tif 000013
【０１７１】
用量を１０ｋｇ／ｈａから４０ｋｇ／ｈａに増やすと、活力のある良い植物の大半が、カテゴリー２からカテゴリー４に移動したことが、表１１から分かる。１０ｋｇ／ｈａでは、カテゴリー４に属する植物はなかった。４０ｋｇ／ｈａでは、カテゴリー１に属する植物はなく、植物の半分以上がカテゴリー４に属した。このように、ＥＣＯｇｕａｒｄの用量を増やすと植物の生長力が増す傾向があった。８０ｋｇ／ｈａは４０ｋｇ／ｈａほど良好ではなかったことが分かる。
【０１７２】
結論：
・  用量反応が観察された。
・  ニンジンシスト線虫の数は、１０〜４０ｋｇ／ｈａの施用によって減少した。
・  生長力および最も長い葉の長さは、１０〜４０ｋｇ／ｈａの施用によって増加した。
・  生長力が高いカテゴリー（３〜４）に属する鉢の数は、２０〜４０ｋｇ／ｈａの施用時に最も多かった。
・  ニンジンシスト線虫に関する至適用量はおそらく２０〜４０ｋｇ／ｈａである。
【０１７３】
（実験例３Ｂ）−ニンジンにおけるシスト線虫に対するニンニク濃縮物含浸顆粒の効力を示すさらなる結果
背景：
ジーランド島のラメフィヨルドでは、土壌が栄養に富み、ニンジンにとって理想的な構造を有するので、長年にわたってニンジンが栽培されてきた。残念ながら、実証実験地での長年にわたるニンジン生産により、多くの土壌でニンジンの生産が不可能なほどに、シスト線虫の病害虫圧（ｐｅｓｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）が増加している。
【０１７４】
目的：
本実証実験の目的は、遅蒔きのニンジン（ｌａｔｅ  ｃａｒｒｏｔ）におけるシスト線虫の攻撃を減少／低下させることができるかどうかを調べることだった。
【０１７５】
実証実験計画：
非公開実証実験では、１ヘクタールの感染線虫土壌を６列に分割し、ニンジン種子およびＥＣＯｇｕａｒｄ顆粒を条播した。２列を無処置とした。ニンジンを含む１列あたり６つの試験区を追跡し、測定した（１試験区あたり約８０〜１００本のニンジン）。
【０１７６】
【表１２】
2008534667.tif 000014
ニンジンは２００４年５月１２日に条播および処置した。
実証実験は２００４年９月２５日に評価した。
【０１７７】
４列を含む１メートルのバンドを追跡し、選別し、計数し、重量を測定した。無処置と２０〜３０ｋｇ  ＥＣＯｇｕａｒｄ／ｈａとの間に、成長の差が見られた。
【０１７８】
結果：
表１３：良いニンジンおよび悪いニンジンの数
【表１３】
2008534667.tif 000015
【０１７９】
良いニンジンの数は、１０〜３０ｋｇ／ｈａ  ＥＣＯｇｕａｒｄの施用と共に増加した。２０ｋｇ／ｈａによる処置では、列中のニンジンの数は、無処置ニンジンとほぼ同じだった。ニンジンの数が減少した理由は分かっていない。
【０１８０】
１０および３０ｋｇ／ｈａのＥＣＯｇｕａｒｄにより、可販ニンジンが１６〜２０％多くなった。悪いニンジンの数は減少した。ニンジンの総数は、平均して、１メートルの列あたり１１本増えた。
【０１８１】
ニンジンは４０ｋｇ／ｈａのＥＣＯｇｕａｒｄの施用に対して植物毒性反応を示す傾向がある。上記の表および下記の表では、４０ｋｇ／ｈａがニンジンの品質を改善しないことが分かる。
【０１８２】
図４は、シスト線虫によって引き起こされる変形のタイプ、すなわち圧縮された先端、裂けて変形したニンジンを示している。
【０１８３】
表１４：良いニンジンおよび悪いニンジンの重量
【表１４】
2008534667.tif 000016
１０〜３０ｋｇ／ｈａでは良いニンジンの重量が増加した。総重量の増加は１０〜１３．５％だった。ここでも２０ｋｇ／ｈａはこの傾向に合わない。
【０１８４】
表１５：１試験区あたりの根の平均数、平均根重量、平均根重量の増加百分率および可販ニンジン百分率
【表１５】
2008534667.tif 000017
１試験区あたりの根の平均数は１０ｋｇ／ｈａが一番多いことが分かる。ニンジン数が最も少ないのは２０ｋｇ／ｈａだった。おそらく条播機が種子を適切に条播しなかったのだろう。０、１０、２０、３０および４０ｋｇ／ｈａの間に有意差はなかった。
【０１８５】
平均根重量は１０〜３０ｋｇ／ｈａで増加した。増加は１５〜１７％根重量だった。
【０１８６】
可販根の数は１０〜３０ｋｇ／ｈａのＥＣＯｇｕａｒｄで増加した。
【０１８７】
表１６：ラメフィヨルドニンジンにＥＣＯｇｕａｒｄを使用することの経済的利益
【表１６】
2008534667.tif 000018
秋の平均収穫量は１００トン／ｈａである。
１ｋｇあたりの平均売価は０．７８Ｄｋｒである。
１本あたり１００ｇの最適重量を有するニンジンが１ヘクタールあたり約１，０００，０００本。
【０１８８】
結論：
ニンジンにおけるシスト線虫攻撃が減少する明確な傾向があった。
【０１８９】
可販ニンジン数は、ＥＣＯｇｕａｒｄ  ３０ｋｇ／ｈａで１７％増加し、平均根重量は７５グラムから８６グラムに増加した。最適なニンジンは１００グラムである。
【０１９０】
ニンジンを条播時に１回だけ処置した−至適用量は、顆粒または液状ニンニク濃縮物による、生育期中に２〜３回の処置である。例えば条播時に顆粒を施用し、生育期中に液体を施用する。
【０１９１】
（実験例４）
７．３  殺線虫剤としてのＥＣＯｇｕａｒｄ
７．３．１  ニンジン実証実験
ポスケッツでの非公開ニンジン実証実験で得たデータ（実験例３参照）を解析したところ、ＮＥＭｇｕａｒｄ顆粒を条播時に施用しておくと岐根発生が減少するという明確な傾向が示された。効果の強さを、図６にグラフ表示する。この図では、岐根発生率に対して、処置が示されている。
【０１９２】
処置１は対照、処置２はテミク、そして処置３および４は、２０ｋｇ／ＨａのＮＥＭｇｕａｒｄ顆粒の施用である。これら二つのＮＥＭｇｕａｒｄ施用は対照とはほとんど統計的に異質であり、パースニップに関してハインフォードで見られたデータのパターンに極めて似ている（実験例３参照）。少なくとも、ＮＥＭｇｕａｒｄおよびテミクは、これら二つの作物では類似するレベルの効果をもたらすようである。
【０１９３】
７．３．２  ニーダム（Ｎｅｅｄｈａｍ）圃場（ヤクスリー（Ｙａｘｌｅｙ））におけるＰＣＮ
ＮＥＭｇｕａｒｄ顆粒およびＣＬ  ＡＩＬ  ００２１液（ニンニク濃縮物）が併用された、目に見える総収量増加に関する報告の後、作物生産サイクル終了時の残存ＰＣＮ卵／グラムを決定するために、圃場を再び試料採取した。これらの結果を初期卵／グラムデータと比較して、以下の表１７に表す。
【０１９４】
表１７：ニーダム圃場（ヤクスリー）におけるＰＣＮ数
【表１７】
2008534667.tif 000019
上記の表１７に示すデータは、高度なＰＣＮ繁殖阻害を示唆している。
【０１９５】
最も重要なデータは、作付け開始時に見出されるＰＣＮの個体数が商業上極めて重大だった区分４に観察される。この区分では再試料データでも高いＰＣＮ個体数の存在が確認されるが、ジャガイモ作物による個体数の増加率は最小限に抑えられているようであり、開始時に見出された個体数と本質的に同じである。これは極めて有意義な結果である。ジャガイモ作物における殺線虫剤の使用は、主として、ＰＣＮ繁殖を阻害し、理想的には卵／グラムの個体数を作付けの開始時に近く保つために行われるからである。
【０１９６】
１．３１というＦｐ／Ｉｐ比は、通常は、殺線虫効果の証拠として、農薬安全理事会（Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  Ｓａｆｅｔｙ  Ｄｉｒｅｃｔｏｒａｔｅ：ＰＳＤ）に、受け入れられる。
【０１９７】
７．３．３  サンメロン（Ｓｕｎ  Ｍｅｌｏｎ）における根瘤線虫防除（朝鮮）
非公開実証実験で、根瘤線虫に対する殺線虫剤としてのＮＥＭｇｕａｒｄ（ニンニク濃縮物を含浸させた顆粒）およびＣＬ  ＡＩＬ  ００２１液（ニンニク濃縮物）の効力が評価されている。
【０１９８】
その結果得られた報告では、処置群と対照群との間に有意差が見出され、ＥＣＯｇｕａｒｄ製剤は全てカルボフランに統計上等価であると述べられている。
【０１９９】
結論として、その報告は、「カルボフランと比較して、Ｅｃｏ−ｇｕａｒｄ  ＧＲおよびＳＲは、処置３０日後に８３．５〜９４．９％の防除効力を示し、植物毒性を伴わずに８７．９〜９７．１％の防除効力（６０日後）を示した。したがって本製品は、根瘤線虫メロイドギネ属（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎａｅ  ｓｐｐ．）に対する殺線虫剤としてオリエンタルメロンに使用することができる」と述べている。
【０２００】
データの再評価により、開始時の処置反復試験区における初期線虫数が不規則な分布していたことにより、カルボフランと比較した効力の度合いは、上に引用したものよりは低い可能性があるが、それでもなお実質的であり、１．２５％の溶液強度でカルボフランの効力の７７％を有することが示唆される。
【０２０１】
結果をある程度慎重に解釈したとしても、朝鮮でのデータは、ＣＬ  ＡＩＬ  ００２１製剤が広範囲に分布する経済的に重要な属に対する殺線虫剤として作用することを示す良い証拠である。
【０２０２】
（実験例４Ａ）−イチゴの栽培に使用される圃場における土壌生活線虫に対するＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）の効力
非公開圃場実証実験で、下記の結果により、いくつかの異なる線虫種が寄生している圃場（この圃場はイチゴの栽培に使用される）での線虫の防除におけるニンニク濃縮物の効力が実証される。そのような寄生を防除しないと、イチゴの作物を放棄する必要が生じる場合がある。
【０２０３】
ノルウェイにおいて、針線虫ロンギドルス・エロンガトス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）はイチゴの深刻な根寄生虫であり、被害閾値は３〜５ｉｎｄ．／２５０ｇ土壌である。ロンギドルス・エロンガトス（Ｌ．ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）により、良い圃場が放棄され、深刻な例では、２作物年度が失われている。
【０２０４】
第１年イチゴ（栽培品種ポルカ（Ｐｏｌｋａ））の生長パラメータにＮＥＭｇｕａｒｄ（登録商標）処置が及ぼす効果を、２００５年に、ノルウェイ南部のマルナルダル（Ｍａｒｎａｒｄａｌ）において、ロンギドルス・エロンガトス（Ｌｏｎｇｉｄｏｒｕｓ  ｅｌｏｎｇａｔｕｓ）、ノコギリネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｃｒｅｎａｔｕｓ）、ティレンコリンクス・ズビウス（Ｔｙｌｅｎｃｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ｄｕｂｉｕｓ）およびパラトリコドルス・パキデルムス（Ｐａｒａｔｒｉｃｈｏｄｏｒｕｓ  ｐａｃｈｙｄｅｒｍｕｓ）が寄生している圃場で調べた。Ｐ≦０．０５の場合に、イチゴ対照に対して有意差あり（Ｓ）とし、０．１０≧Ｐ＞０．０５の範囲は、傾向（ｔ）と記載した。また、Ｐ＞０．１０については有意差なし（ＮＳ）とした。２試料試験。
【０２０５】
【表１８】
2008534667.tif 000020
【０２０６】
（実験例５）
ノルウェイにおいてタマナバエ被害を防除するためにＥＣＯｇｕａｒｄ顆粒が使用された圃場実証実験から得られた効力データの大要
１．０  前置き
五つのカブハボタン作物を含む広範な非公開圃場実証実験プログラムを実行した。圃場実証実験計画は、ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）液（ニンニク汁濃縮物）または顆粒（ニンニク汁濃縮物を含浸させた木粉顆粒）の複数回適用に基づくものであり、五つのカブハボタン実証実験のうち四つでは、標準としてのジメトエートと比較した。
【０２０７】
本発明者が行ったカブハボタン実証実験から得られる生データを解析したところ、五つの実証実験のうち二つ（ロメダル（Ｒｏｍｅｄａｌ）およびトテン（Ｔｏｔｅｎ））で、タマナバエ被害に有意な処置差が明らかになった。トテンでは、タマナバエ被害の減少が、可販収量の２８％増加につながった。
【０２０８】
全体的に見て、ジメトエートおよびＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）は、タマナバエ被害を類似するレベルで減少させるようだったが、これはトテンでのみ有意だった。
【０２０９】
タマナバエ被害は類似するレベル（対照のＲＤＩがそれぞれ５７．３３および６８．６９）だったが処置適用中の降雨パターンが大きく異なる二つの実証実験（トテンおよびガファ（Ｇａ−Ｆａ））を比較したところ、効力に対する降雨の影響が、明確に判明した。持続的な大雨のエピソードは有効な効果を取り去るようだった。
【０２１０】
２．０  結果
全体としての効果を下記の表に要約する。
【０２１１】
表１９：複合根被害指数（ＲＤＩ）四つの新しい実験地
【表１９】
2008534667.tif 000021
【０２１２】
表２０：各実験地における平均可販収量、ｋｇ／試料（カテゴリー１＋２、ノルウェーの表記、１＝被害なし、２＝軽被害）
【表２０】
2008534667.tif 000022
【０２１３】
上記表１９および表２０のデータは、ジメトエートおよびＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）の両方に付随するタマナバエ被害の平均減少を示している。トテンではタマナバエ被害の減少が有意だった。
【０２１４】
ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）は、四つの実験地全体で、可販物の最大増加をもたらし、ジメトエートにみられる増加のほぼ倍だった。
【０２１５】
処置の農学的影響に関する対応データ（表２０）は、可販収量を増加させるタマナバエ被害の減少と合致している。ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）の場合、全体的には可販収量の平均増加率は１５％だった。トテンでは２８％の最大値が記録され、この実験地に見られた対応するタマナバエ被害の有意な減少と合致した。
【０２１６】
ガファおよびトテン（タマナバエの攻撃が最も激しかった二つの実証実験）における降雨に関する効力の比較は、ガファでの効力の喪失が、まず間違いなく、最初の施用後に降雨がなく、２回目および３回目の施用には非常に強い降雨が伴ったことに原因があると考え得ることを示している。
【０２１７】
ガファにおいて、第２処置および第３処置を含む１４日間に記録された降雨量は９５．２ｍｍだった。これに対し、第２処置および第３処置を含む同じ期間にトテンでは、降雨量が１７．５ｍｍであり、その大半は小雨だった。
【０２１８】
両実験地に関する実際の降雨記録を以下の表２１に示す。
表２１：トテンおよびガファにおける降雨の比較
トテン第１処置：２００４年６月３０日
ガファ第１処置：２００４年６月１１日
各実証実験では１週間間隔で３回のＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）施用を行った。
【０２１９】
【表２１】
2008534667.tif 000023
【０２２０】
第１処置前の各実験地における降雨量はよく似ていて、４．２ｍｍと６．３ｍｍだった。しかし、第１施用後は、各実験地における降雨パターンが極めて異なるものになった。比較しやすいように、第２施用後の１０日間に陰影を付ける。
【０２２１】
ガファでは、第１施用後、８日間連続して降雨がなく、この期間は第２施用の２日間にも及んだ。この後、８日間は降雨が続き、第３施用はこの降雨の中間で行われた。この８日間の大雨中に記録された降雨量は８５ｍｍだった。
【０２２２】
ガファでは第１施用で８日間の全く乾燥した状態を経験した後、第２および第３施用ではそれぞれ８日間および４日間の絶え間ない大雨を経験したことにより、ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）の効果は、あったとしてもわずかしか期待できなかった。というのも、これらは、本発明者らが効力に負の影響を及ぼすと考えている両極端な条件に相当するからである。各処置がこれら両極端の一方または他方を経験したという事実は、タマナバエに対する影響を完全に損なう。データはこれを反映している。
【０２２３】
対照的に、トテンにある実験地は、ガファよりはるかに安定した条件を経験した。第１施用は、施用の２日後に大雨（１９．４ｍｍ）を経験し、これはおそらく、効力に負の影響を及ぼしたと思われるが、産卵ピークの中心に向けて配置された第２および第３施用は、極めてわずかな降雨（１日最大１ｍｍ）しかない１１日間連続の安定した条件を経験した。これらの条件は効力を最大化するには理想的であると考えられる。本発明者らは、これを示す実験室データを、先に提出している。したがって、トテンにおける第２および第３施用は有効であったと予想された。
【０２２４】
トテンにおけるタマナバエ被害の統計解析により、ジメトエートおよびＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）はどちらも被害を有意に減少させ（Ｐ＝０．００４）、ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）処置による可販物の農学的に意味のある増加につながった。
【０２２５】
ＲＤＩに関して、ジメトエートおよびＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）は対照より有意に良かったが、互いに有意差はなかった。
処置（Ｔｒｔ）    １    ＝対照
処置              ２    ＝ジメトエート
処置              ３    ＝ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）
処置＝１を引く：
レベル処置    平均の差    差の標準誤差    Ｔ値    調整Ｐ値
2         -0.3100        0.1223       -2.535     0.0302
3         -0.3900        0.1223       -3.190     0.0041
【０２２６】
２．１  ロメダル
カブハボタンを用いる第５の実証実験地では、表１９および表２０で紹介した他の四つの実験地より早く収穫した。
【０２２７】
この実験地では病害虫圧は概して軽かったが、噴霧剤として施用される他のＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）処置群を含んだ。
【０２２８】
ＧＬＩＭ  ＡＮＯＶＡで解析したところ、この実証実験で得たデータでも、処置に有意差が得られ、どのＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）処置も対照よりタマナバエ被害が少なかった。
【０２２９】
これを以下に示す。
Ｃ７でのクルスカル−ワリス検定
処置        Ｎ        中央値        平均ランク        Ｚ
1         75       0.00E+00          218.4           2.72
2         75       0.00E+00          175.4          -1.13
3         75       0.00E+00          182.8          -0.47
4         75       0.00E+00          175.4          -1.13
5         75       0.00E+00          188.1           0.01
全体       375
H=23.38  DF=4  P=0.000（結合のための調整）
【０２３０】
ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）処置は全て、タマナバエ被害が対照（処置１）より有意に低かった（Ｐ＝０．０００）。処置５はＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒であり、１４％の総被害減少を示す。
【０２３１】
根被害指数としてデータを表示すると、対照については１１．６およびＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒については４．９の値が得られる（ＰＳＤ算定）。
【０２３２】
ロメダルにおける攻撃のレベルはＲＤＩが１１．６と低かったが、トテンではＲＤＩが５４．６７と、はるかに高レベルの攻撃が起こり（２００４年の英国圃場実証実験で対照群に見られたどの被害よりも大きい）、これらの実験地はどちらも、タマナバエ被害の有意な減少を示した。
【０２３３】
ロメダルとトテンの両方に共通する特徴の一つは、第２および第３処置の適用に伴う概して安定した条件だった。トテンとロメダルの両方について降雨データを表２２に示す。
【０２３４】
表２２：トテンおよびロメダルにおける降雨の比較
【表２２】
2008534667.tif 000024
【０２３５】
トテンおよびロメダルでは、最初のタマナバエ卵の検出に応じて、同じ日に処置を開始した。次に、どちらの実験地でも、処置を週に１回のパターンで続け、ロメダルではトテンより１回多く処置を行った。したがって両実験地における第１、第２および第３処置は同時に行われ、第２および第３処置に関わる期間はどちらの実験地でも降雨が非常に少ないという、よく似たパターンおよび強さの降雨を経験した。
【０２３６】
表２１で議論したように、これは、第２および第３施用中に大雨が続いたガファにおける降雨パターンおよび降雨強度とは対照的である。
【０２３７】
トテンおよびロメダルにおける効力の証拠は、安定した条件および小雨のエピソード、ならびに第２および第３施用が産卵のピークに対応することと、極めて密接に関連していると思われる。
【０２３８】
３．０  結論
ノルウェイにおけるカブハボタンでの非公開圃場実証実験は、ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒が、タマナバエ被害の有意な減少をもたらすことを示した。これは、負荷（ｃｈａｌｌｅｎｇｅ）の強さとは無関係だった。対照のＲＤＩ値が１１．９〜５４．６７の範囲にあるデータセットで、有意差が見られた。
【０２３９】
実証実験は製品の要因加算（ｆａｃｔｏｒｉａｌ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）を特徴とはしなかったが、顕著な効果が、主として第２および第３処置（大抵は小雨が降っていた病害虫圧のピーク時に適用されたもの）によってもたらされたことは、降雨に関するデータから明確に推測することができる。
【０２４０】
これらの結論は、誤解を招きかねない実証実験データを制限すれば、英国における非公開圃場実証実験から到達される結論と食い違いはなく、全体として、適切な環境条件下で適時に施用すれば、有用なレベルの製品効力が得られることを実証している。
【０２４１】
トテンにおけるＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒施用に伴う可販物の最大増加率２８％は、商業的に有意義であると考えられる。英国では、このような増加は、価格が約２００ポンド／トンの物質、約１１．２トンに相当し、これは約２２４０ポンド／ｈａの利益増になる。
【０２４２】
顆粒の効力は、水分およびタマナバエによる産卵に対する施用の時期に、大きく依存する。
【０２４３】
これらの実験では、新たに生み付けられた卵をバイオアッセイの場に置いた時点に対する、顆粒への水の適用のタイミングを考察した。
【０２４４】
全部で二つの土壌タイプを、以下の処置（１０回反復）と共に、１０卵／アッセイで使用した。
１．    対照（水＋卵）
２．    顆粒＋卵
３．    顆粒＋卵＋卵の１日後に添加した水
４．    顆粒＋卵＋卵の３０分後に添加した水
５．    顆粒＋水＋１日後に添加した卵
６．    顆粒＋水＋３０分後に添加した卵。
【０２４５】
以下の結果を得た。
孵化した卵の百分率
【０２４６】
【表２３】
2008534667.tif 000025
以下の結果を得た。
孵化した卵の百分率
【０２４７】
これらの結果から、顆粒への水の適用が効力を高めるのに不可欠であるという明確な証拠が得られる。圃場の状況一般におそらく最も似ているであろう処置３は、卵と顆粒が植物の根本に存在し、その後で降雨があった場合、卵の孵化が３８％減少することを示している。顆粒の濡れが卵が置かれた後すぐに起これば（処置４）、この効力レベルは著しく高まる（８０％の減少）。この効果は、新鮮なタマナバエ卵が、産卵後数時間は透過性を保っていて、この時、ＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）中の活性成分は卵内により容易に侵入するという事実に起因すると考えられる。病害虫圧に対するＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒の施用のタイミングが効力に対して大きな影響を有するであろうことも、上記のデータから暗に示される（処置５および処置６を対比）。産卵の数日後に製品を施用すると、産卵時に施用した場合よりも、効果は低くなりそうである。
【０２４８】
（実験例６）
ワクモの防除におけるニンニク濃縮物の使用
３％ｖ／ｖ（１．５％ｖニンニク汁濃縮物および１．５％アジュバント油（ナタネ油））のＢｒｅｃｋ−ａ−ｓｏｌと呼ぶニンニク濃縮物を１８９ｍｌ／ｍ２の比率で施用した。
【０２４９】
図７は、ワクモに対するＢｒｅｃｋ−ａ−ｓｏｌ（Ｂｓｏｌ）の有効性を実証する結果を示している。ワクモの死亡率が対照およびＢａｒｒｉｃａｄｅの使用に対して示されている。
乾燥セル            （陽性対照）
水                  （水対照）
シペルメトリン      （189ml/ｍ２の1％v/v Barricade（Bcade)）
との比較。Ｂｒｅｃｋ−ａ−ＳｏｌおよびＢａｒｒｉｃａｄｅに関する結果は互いに有意差がなかった。
【０２５０】
このデータパターンは、異なる小屋から得たダニおよびニンニク汁濃縮物の異なるバッチを使った他の五つの実験でも繰り返された。
【０２５１】
汚染（塵埃）が効力に及ぼす影響も調べた。この作業により、汚染レベルが「中等度」である場合の有用な製品効力が示された。ニンニク濃縮物の効力は、塵埃汚染のレベルが極めて高い場合にのみ失われた。
【０２５２】
図８に、Ｂｒｅｃｋ−ａ−ｓｏｌまたはＢａｒｒｉｃａｄｅ（シペルメトリン）のどちらか一方を殺生物剤として施用した時のワクモの死亡率を様々な汚染レベルで比較した一連のデータを示す。Ｂａｒｒｉｃａｄｅの施用によって得られる結果を記号表にＢＣで示す。Ｄｒｙ  Ｃｏｎ＝乾燥対照、Ｗａｔｅｒ＝水の適用であり、残りの結果はＢｒｅｃｋ−ａ−ｓｏｌの施用に関する。
【０２５３】
汚染は、家禽小屋の表面に見出される汚染レベルを反映するように、負荷量を増加させて適用した。
０．１（塵埃約２０ｇ／ｍ２に相当）
０．２（塵埃約４０ｇ／ｍ２に相当）
０．４（塵埃約８０ｇ／ｍ２に相当）
０．８（塵埃約１６０ｇ／ｍ２に相当）。
【０２５４】
その結果から、ニンニク汁濃縮物（Ｂｒｅｃｋ−ａ−Ｓｏｌ（Ｂｓｏｌ））は汚染が約８０ｇ／ｍ２である場合に有用なレベルの効力を送達することが分かる。これは、約４０ｇｍ２の汚染に適用されたＢａｒｒｉｃａｄｅにみられるものと有意差がなかった。
【０２５５】
補遺１
ＨＰＬＣ分析
様々なニンニク油試料のクロマトグラムデータ
１．試料：
ニンニク油（黄金標準）を他の二つの製品−ニンニク油（工業標準）およびニンニク汁濃縮物と共に分析した。
【０２５６】
２．試料調製：
どちらの試料も１００％ＭｅＣＮに１：１０希釈した（ＭｅＣＮ  ４５０μｌに試料５０μｌ）。ニンニク汁濃縮物は希釈後に多少の白色沈殿物を生じた。これは、ＨＰＬＣ分析に先立って、０．２μｍ  Ｔａｒｇｅｔ（登録商標）溶媒フィルターを使って除去した。
【０２５７】
３．ＨＰＬＣ分析：
これは、ダイオードアレイ検出器を有するＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ１１００  ＨＰＬＣシステムを、「Ｓｅｃｕｒｉｔｙｇｕａｒｄ」Ｃ１８プレカラムを付けたＰｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  Ｃ１８（２）Ｌｕｎａカラム（２５０×４．６ｍｍ，５μｍ）と組み合わせて使用することによって行った。オートサンプラー温度を４℃、カラム温度を３７℃とし、カットオフ圧力を２８０バールとした。データを２４０ｎｍで収集した（全データは２００〜６００ｎｍで収集した）。注入体積は、１：１０希釈試料の場合、５μｌでほぼ最適であることが見出された。三つの方法を評価した。
【０２５８】
ｉ．文献法（下記参照）に基づく方法−以下の変更を加えたもの−Ｌｕｎａカラムならびに７０％ＭｅＣＮ（３％ＴＨＦを含む９７％ＭｅＣＮ）および３０％超純水の無勾配。実行時間＝４０分（ＲＢＳＵＬＦ１）。
【０２５９】
ｉｉ．第２の方法−基本的に上記と同じであるが、無勾配ステップの前にプレ勾配ステップを使用する（ＲＢＳＵＬＦ２）。
【０２６０】
【表２４】
2008534667.tif 000026
【０２６１】
ｉｉｉ．ＲＢＳＵＬＦ１に基づくが平衡化時間を延長（すなわち実行時間＝５０分）した第３の方法（ＲＢＳＵＬＦ３）。
【０２６２】
方法文献：
Ｌａｗｓｏｎ，Ｌ．Ｄ．，Ｗａｎｇ，Ｚ−Ｙ．Ｊ．，Ｈｕｇｈｅｓ，Ｂ．Ｇ．（１９９１）「Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＨＰＬＣ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｕｌｆｉｄｅｓ  ａｎｄ  ｄｉａｌｋ（ｅｎ）ｙｌ  ｔｈｉｏｓｕｌｆｉｎａｔｅｓ  ｉｎ  ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌ  ｇａｒｌｉｃ  ｐｒｏｄｕｃｔｓ（市販ニンニク製品中のスルフィド類およびジアルキル／ジアルケニルチオスルフィネート類の同定およびＨＰＬＣ定量）」Ｐｌａｎｔａ  Ｍｅｄｉｃａ  ５７：３６３−３７０
【０２６３】
結果：２４０ｎｍにおける全クロマトグラム
Ａ．分離
ＲＢＳＵＬＦ３ニンニク標準（５μｌ  １：１０）
ニンニク試料に関する生データ
ニンニク油黄金標準２．５μｌ注入（１：１０希釈油）−保持時間およびピーク形状基準物質として使用。
【０２６４】
図９（クロマトグラム１）参照。
ピークＩＤ（以下の帰属をクロマトグラムのピークに対して行った）
【表２５】
2008534667.tif 000027
【０２６５】
図１０（クロマトグラム２−ニンニク標準）参照
図１１（クロマトグラム３−ニンニク汁濃縮物）参照
ピーク番号は参考文献論文に示されているプロファイルに基づく暫定的ＩＤである−標準およびニンニク汁濃縮物には、関連化合物であるかもしれない追加化合物がいくつか存在する。
【０２６６】
試料：表２６．ニンニク濃縮物のいくつかのバッチに関する製品データの総括表
（各化合物を製品１ｇあたりのジアリルスルフィド換算量（μｇ）として表す）
【０２６７】
【表２６】
2008534667.tif 000028
【０２６８】
補遺２−環境におけるニンニク濃縮物の運命と挙動
Ｅｃｏｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒の製剤は、５５％の木部繊維およびセルロース系結合剤と混合された４５％のニンニク汁濃縮物（ＡＩＬ  ００２１）を含有する。原体ニンニク汁濃縮物（ＡＩＬ  ００２１）中の圧倒的最大成分は糖質である。ＡＩＬ  ００２１は、最終製品中に、重量で５０％までの糖質を含むと考えられる。したがってこの組成物は、全組成の７７．５％ｗ／ｗが生分解性および可溶性の糖質およびセルロースの混合物である顆粒をもたらす。
【０２６９】
ニンニク汁濃縮物中の有機硫黄分子の組成は、主として、二硫黄架橋（ｄｉ−ｓｕｌｐｈｕｒ  ｂｒｉｄｇｅ）を有する分子、例えばジアリル−ジスルフィドおよびジアリル−トリスルフィドなどであり、これらは３．５％ｗ／ｗの範囲にあると考えられる。これらはどの破砕ニンニクにも見出される天然化合物である。
【０２７０】
実験で見られるニンニク汁濃縮物の生物学的効果の原因は、どの特定分子または特定分子群にも帰されていない。認められた生物学的効果は、製品全体の作用によるものであると考えられている。ニンニクの一般化学に関する議論では、製造時の製品の一貫性を確立し実証する手段として、有機硫黄分子の一部の同定および定量に重点が置かれた。
【０２７１】
ニンニク汁濃縮物（ＡＩＬ  ００２１）でできているＥＣＯｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒から生じる残留物は、主として、木部繊維および結合剤担体マトリックスならびに全新鮮ニンニク小鱗茎の粉砕および濾過によって生じる生分解性の糖質およびセルロースの混合物と、約３．５％ｗ／ｗの有機硫黄化合物からくる有機硫黄残留物であると、本発明者らは考える。
【０２７２】
水（分解および沈降／水分配）
土壌（分解および移動性）
空気
については、以下の議論が当てはまると考えられる。
【０２７３】
ニンニク汁濃縮物（ＡＩＬ  ００２１）の微量構成成分、例えば有機硫黄代謝産物は、化学的に不安定な二硫黄架橋を有する分子を特徴とし、−ＮＨ２；−ＳＨ；−ＯＨ；＞Ｃ＝Ｏなどの求核性官能基を捜し出す求電子剤として反応する傾向がある。これらの官能基との反応は、ジスルフィド架橋を破壊し、水性反応環境の場合には、それが水和された硫黄含有官能基、例えば−Ｒ−Ｓ−ＯＨ（式中、Ｒは二硫黄架橋の半分を表す）を与える。
【０２７４】
より具体的に述べると、ニンニク汁濃縮物（ＣＬ  ＡＩＬ  ００２１）の特性解析に関するＨＰＬＣ分析作業により、四つの主要分子種はジ−アリルスルフィド；ジ−アリルジスルフィド；ジ−アリルトリスルフィドおよびジ−アリルテトラスルフィドであることが示されている。これは、Ｂｌｏｃｋ  １９９２により室温で起こると報告されているアリシンのジアリルモノ、ジおよびトリスルフィドへの分解と合致する。
【０２７５】
また、ニンニクとタマネギ類との間には、その有機硫黄化学に高度の類似性が存在する。Ｂｌｏｃｋ  １９９２は「１９４０年代にＳｔｏｌｌおよびＳｅｅｂｅｃがバーゼルで行った先駆的研究により、ニンニクに含まれるキャバリート（Ｃａｖａｌｌｉｔｏ）の抗細菌成分（アリシン）の安定な前駆体は、（＋）−Ｓ−２−プロペニル−Ｌ−システイン−Ｓ−オキシド（アリイン）であることが実証された。インタクト細胞では、アリインおよび関連Ｓ−アルキル／アルケニル−Ｌ−システイン−Ｓオキシド（芳香前駆体）は細胞質に位置し、Ｃ−Ｓリアーゼ酵素アリナーゼは液胞内に存在する。細胞が破壊されると、アリナーゼの放出に続いてＳ−オキシドのα−およびβ−脱離が起こり、最後にアリシンなどの揮発性で匂いを有する低分子量有機硫黄化合物が生じて、それが直ぐにジアリルジスルフィドおよび他の硫黄架橋アルケンと平衡する」と報告している。
【０２７６】
ネギ属（Ａｌｌｉｕｍ  ｓｐｐ）には四つのスルホキシドが存在する。
１    Ｓ−２−プロペニル−システインＳ−オキシド
２    Ｓ−（Ｅ）−１−プロペニル−システインＳ−オキシド
３    Ｓ−メチル−システインＳ−オキシド
４    Ｓ−プロピル−Ｌ−システインＳ−オキシド。
タマネギ類は２、３および４を含有する。ニンニクは１、２および３を含有する。
【０２７７】
したがって、タマネギ類とニンニクの有機硫黄化学には、高度の等価性がある。タマネギ類の場合、タマネギアリナーゼが前駆体に作用すると、ニンニクにおいて優勢なジアリルポリスルフィドではなく、ジプロピルポリスルフィドが生じる。
【０２７８】
本発明者らは、ジアリルスルフィドを、ニンニク汁濃縮物（ＣＬ  ＡＩＬ  ００２１製品）中の主要有機硫黄分子であるとみなしている。これは、文献および詳細な分析結果と合致している。五つの製造バッチから計算したＣＬ  ＡＩＬ  ００２１中のジアリルスルジフィド（ＤＡＤＳ）の平均濃度は、１２ｍｇ／ｇである。したがって、典型的なＥｃｏｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒中に０．５４％というＤＡＤＳの理論濃度が得られる。
【０２７９】
Ｅｃｏｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒中のＤＡＤＳの実際のパーセンテージは０．５４％であり、ＤＡＳｎについては３．４６％である。したがって、Ｅｃｏｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒の１２ｋｇ／ｈａ施用により、最大で６５ｇのジアリルジスルフィド／ｈａおよび４１５ｇ／ｈａのＤＡＳｎが適用される。Ｂｌｏｃｋ  １９９２は、ニンニク、タマネギおよびネギ属の他のメンバーは１〜５％乾燥重量の非タンパク質硫黄アミノ酸二次代謝産物を含有すると報告している。ニンニクの作付けが新鮮重で２０トン／ｈａをもたらし、その２５％が乾物であるとすると、ニンニクの典型的な商業的作付けは、５０〜２５０ｋｇの非タンパク質硫黄、すなわちＥｃｏｇｕａｒｄ（登録商標）ニンニク顆粒の施用の１００〜５００倍をもたらすことになる。
【０２８０】
ある簡単な重量分析によれば、１回のＥｃｏｇｕａｒｄ（登録商標）施用によって適用される有機硫黄は、作物を放棄して腐敗させた場合に典型的なニンニクの商業的作付けから環境に放出され得る有機硫黄の１００〜５００分の１になる。
【０２８１】
英国で栽培されるタマネギ類の面積が広いことと、１ヘクタールあたりの相対的収量を考えると、タマネギ類はニンニクよりも潜在的にはるかに重大なスルフェン酸およびポリスルフィドの供給源である。
【０２８２】
収穫時のタマネギ類の廃棄物は、英国タマネギ生産者組合（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｏｎｉｏｎ  Ｐｒｏｄｕｃｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ：ＢＯＰＡ）によれば、総収量の約１２％と考えられ、４０トン／ｈａの場合は約４．８トンである。これは収穫網を通って落ちる収穫直径５０ｍｍ未満のタマネギから構成される。このくずは圃場に放置され、腐敗させるために円板鋤で鋤返される。これらの状況では、環境への有機硫黄分子の実質的な放出が起こる。Ｂｌｏｃｋ  １９９２によれば、この数字は乾物の５％または６０ｋｇ／ｈａにもなり得る。２，０００年には、約９，０００ｈａのタマネギ類が英国で栽培され、圃場に放置されたくずは全部で４０，０００Ｔまたは約５００Ｔの有機硫黄化合物と見積られている。
【０２８３】
さらにまた、食料品包装出荷業者および加工業者が毎年さらに５０，０００トンのタマネギ廃棄物を排出して、６２５Ｔまでの追加有機硫黄化合物を生成し、その大半は、埋め立て廃棄されて、圃場境界にある廃棄物の堆積物中で堆肥になるか、焼却処理されて、やはり同様の比率で有機硫黄化合物の放出をもたらすと、ＢＯＰＡは見積っている。
【０２８４】
これらの事例のそれぞれにおいて、化合物は、自然の過程、例えば微生物による分解、光分解および一連の求電子官能基による結合切断などによって、環境中で分解される。Ｅｃｏｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒中のニンニク残留物は、同じ過程によって分解される。
【０２８５】
したがって本発明者らは、推奨された比率および推奨された方法によるＥｃｏｇｕａｒｄ（登録商標）顆粒の土壌への施用によって土壌表面に放出される有機硫黄分子は、ニンニク、タマネギおよび他のネギ類作物が関わる通常の農業的および食品加工的活動によるものよりも有意に少なく、上述の標準的活動が注目に値する影響を環境に及ぼすことはないので、環境における運命の問題をこれ以上詳細に検討する必要はないと結論する。同じ議論は、ニンニク汁濃縮物の直接使用にも当てはまる。
【図面の簡単な説明】
【０２８６】
【図１】ニンニク濃縮物を含浸させたプリルを含む餌場と、ニンニク濃縮物を含浸させていないプリルを含む餌場との間で、摂食されたニンジンの比較を示す図である。
【図２】ロンギドルス・エロンガトスに対するニンニク汁濃縮物のインビトロバイオアッセイを示す図である。
【図３】ハインフォード（ノリッジ）での、パースニップ作物における岐根発生を示す図である。
【図４】シスト線虫によって引き起こされる変形のタイプ、すなわち圧縮された先端、裂けて変形したニンジンを示す図である。
【図５】ブロックの一つで見られた症状を示す図である。
【図６】岐根発生率に対しての処置を示す図である。
【図７】ワクモに対するＢｒｅｃｋ−ａ−ｓｏｌ（Ｂｓｏｌ）の有効性を実証する結果を示す図である。
【図８】Ｂｒｅｃｋ−ａ−ｓｏｌまたはＢａｒｒｉｃａｄｅ（シペルメトリン）のどちらか一方を殺生物剤として施用した時のワクモの死亡率を様々な汚染レベルで比較した一連のデータを示す図である。
【図９】クロマトグラム１を示す図である。
【図１０】クロマトグラム２を示す図である。
【図１１】クロマトグラム３を示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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