(57)【要約】  本明細書では、JTベクターとシンドビスウイルスコンセンサス配列の間、さらにJTベクターとAr-339ベクターの間で、レプリカーゼ及びエンベロープタンパク質が異なる、野生型Ar-339シンドビスウイルスから作製した新たな欠陥シンドビスウイルスベクターが開示される。前記ベクターを作製するために使用するプラスミド、ベクターの生成方法、腫瘍に罹患している哺乳動物を治療するための方法、及び治療方法において使用するための製剤も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号３７に明示されるヌクレオチド配列（SP6-H）を含む精製した単離核酸。
【請求項２】
配列番号３８に明示されるヌクレオチド配列（SP6-H-K70）を含む精製した単離核酸。
【請求項３】
配列番号４０に明示されるヌクレオチド配列（SP6-H-K70-V251）を含む精製した単離核酸。
【請求項４】
配列番号３９に明示されるヌクレオチド配列（SP6-H-I3-K70-E181-Val251）を含む精製した単離核酸。
【請求項５】
配列番号３６に明示されるヌクレオチド配列（SP6-R）を含む精製した単離核酸。
【請求項６】
欠陥シンドビスウイルスベクターを生成するための方法であって、：
（a）配列番号３６に明示されるヌクレオチド配列を含む線状レプリコンプラスミド、並びに配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、及び配列番号３９から選択される線状ヘルパープラスミドを提供する工程；
（b）前記レプリコンプラスミド及び1個のヘルパープラスミドを転写してRNAを生成する工程；
（c）段階（b）で転写されたRNAを回収し、前記RNAを細胞にトランスフェクションする工程；
（d）欠陥シンドビスウイルスベクターを生成するのに有効な時間及び温度で、前記トランスフェクションされた細胞をインキュベーションする工程；及び
（e）前記トランスフェクションされた細胞の培地から前記欠陥シンドビスウイルスベクターを回収する工程；
を含む方法。
【請求項７】
前記ヘルパープラスミドが配列番号３８に明示されるヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ヘルパープラスミドが配列番号４０に明示されるヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ヘルパープラスミドが配列番号３９に明示されるヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ヘルパープラスミドが配列番号３７に明示されるヌクレオチド配列を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
請求項６に記載の方法によって生成される欠陥シンドビスウイルスベクター。
【請求項１２】
前記ベクターがMut-1、Mut-2、及びMut-4から選択される、請求項１１に記載の欠陥シンドビスベクター。
【請求項１３】
前記細胞がBHK-21、ES-2、ES-2/Fluc、及びMOSEC細胞から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項１４】
腫瘍に罹患している哺乳動物を治療するための方法であって、ベクターC、Mut-1、Mut-2、及びMut-4から選択される治療有効量の欠陥シンドビスウイルスベクターを、このような治療を必要とする哺乳動物に投与する工程を含む方法。
【請求項１５】
ベクターC、Mut-1、Mut-2、及びMut-4から選択される欠陥シンドビスウイルスベクター、並びに製薬上許容され得るキャリアまたは希釈剤を含む、腫瘍に罹患している哺乳動物を治療するための製剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府により資金援助された研究または開発に関する記述
米国政府は、米国公衆衛生局の助成金CA22247及びCA68498、国立癌研究所、国立衛生研究所、厚生省から得た資金によって、並びに米国陸軍の助成金0C000111によって、本発明に対してある権利を有する。
【０００２】
本発明は、欠陥シンドビスウイルスベクター、このようなベクターを生成するために使用するプラスミド、ベクターを含む製剤、及びその生成法、並びに腫瘍に罹患している哺乳動物を治療するための使用を対象とする。
【背景技術】
【０００３】
トガウイルス科のアルファウイルス属のメンバーであるシンドビスウイルスは、一本鎖エンベロープのポジティブセンスRNAウイルスである（Strauss & Strauss、1994）。自然界では、シンドビスウイルスは蚊刺を介して哺乳動物に伝染する。従って、シンドビスウイルスは血液媒介性ベクターとして進化してきたため、この血因性の送達性により、シンドビスウイルスは循環の隅々まで腫瘍細胞に到達することが可能である（Tseng et al. 2004a, b）。
【０００４】
TUMOR THERAPY WITH ALPHAVIRUS-BASED AND HIGH AFFINITY LAMININ RECEPTOR-TARGETED VECTORSという表題のWO 02/076468として公開されたPCT/US02/09432は、アルファウイルスベクターを使用して哺乳動物中の固形腫瘍を治療するための方法を開示している。前記方法は、腫瘍を治療するのに有効な量のアルファウイルスベクターを、腫瘍を有する哺乳動物に投与する工程を含んでいた。前記ベクターは、高親和性ラミニン受容体（HALR）に対する優先的親和性を有するとされていた。腫瘍細胞は、同系統の正常細胞と比較して高レベルのHALRを発現するとされていた。当該抗腫瘍効果は、シンドビスウイルスの感染が感染細胞においてアポトーシスを誘導した事実によるものであるとされていた。
【０００５】
A METHOD FOR DETECTING CANCER CELLS AND MONITORING CANCER THERAPYに関するPCT/US2004/026671は、哺乳動物の身体中の癌細胞を同定するため、及び抗癌療法をモニターするための、シンドビスウイルスベクターの使用を開示している。
【０００６】
シンドビスベクターが癌遺伝子療法に役立つための知識を広げる目的で、2つの異なる種類のシンドビスベクター、野生型Ar-339由来のSP6-H/SP6-R、及びAr-339研究室適合型菌株Toto 1101由来のJT-BB/JT-Repが試験された。シンドビスウイルスAr-339は1952年8月に、エジプト内のシンドビス衛生地帯で捕らえられた蚊（Culex pipiens及びC.univittatus）の集合から最初に単離された（Hurlbut 1953；Taylor及びHurlbut 1953；Frothingham 1955；Taylor et al.1955）。Toto 1101は、初期はAR-339に由来した熱耐性（HR）菌株から作製された（Burge及びPfefferkorn、1966）。動物モデルにおいてJTベクターを用いて行った最初の試験は、腫瘍細胞の優れた標的化及び転移性移植片の大きさの有意な減少を示した（Tseng et al. 2002）。腫瘍誘導型SCIDマウスにおけるこれらのベクターについてのさらなる試験は、同じ動物中のウイルスベクター及び腫瘍細胞のin vivo検出を可能にする、IVIS（登録商標）という新たなイメージング技術を使用して行った。腫瘍誘導型SCIDマウスでは、ベクターと腫瘍細胞の間に充分な相関関係があった（Tseng et al. 2004b）。遺伝子療法に非常に有望である、ベクター標的化及び腫瘍のin vivo増殖の低下、及びマウスの生存率というこれらの前向きな結果にもかかわらず、これらの腫瘍モデルにおける全マウスの生存は依然として達成されていない。
【特許文献１】PCT/US02/09432
【特許文献２】WO02/076468
【特許文献３】PCT/US2004/026671
【特許文献４】同時係属番号第10/983,432号
【非特許文献１】Sambrook、Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning : A Laboratory Manual、Second Edition.Cold Spring Harbor、NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989
【非特許文献２】DNA Cloning : A Practical Approach、Volumes I and II (D.N.Glover ed.1985)
【非特許文献３】Oligonucleotide Synthesis (M.J.Gait ed.1984)
【非特許文献４】Nucleic Acid Hybridization [B.D.Hames & S.J.Higgins eds. (1985)]
【非特許文献５】Transcription And Translation [B.D.Hames & S.J.Higgins、eds. (1984)]
【非特許文献６】Animal Cell Culture[R.I.Freshney、ed. (1986)]
【非特許文献７】Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press, (1986)]
【非特許文献８】B.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning (1984)
【非特許文献９】Ausubel、F.M.et al.(eds.). Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons、Inc.、1994
【非特許文献１０】E.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」
【非特許文献１１】Hardy、In : The Arbiviruses : Epidemiology and Ecology、Ch.4、pp.87〜126
【非特許文献１２】Strauss et al、Virology133、1984
【非特許文献１３】Theilmann et al.、J.Virology、1995、69 (12): 7775〜7781
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
従って、当技術分野で必要とされているのは、抗癌剤として使用するための改良型シンドビスウイルスベクターである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本明細書では、JTベクターとシンドビスウイルスコンセンサス配列の間、さらにJTベクターとAr-339ベクターの間で、レプリカーゼ及びエンベロープタンパク質が異なる、野生型Ar-339シンドビスウイルスから作製した新たなベクターが開示される。両方の系統を組み合わせたキメラを作製し、IVIS（登録商標）イメージング技術によって腫瘍誘導型SCIDマウスにおいて試験した。驚くべきことに、JTのエンベロープタンパク質はAr-339よりも効果的に腫瘍を標的化し、一方でAr-339のレプリカーゼは腫瘍の減少において増大した有効性を示した。どの残基が腫瘍標的化に関与するのかを分析するために、Ar-339 E2エンベロープタンパク質の突然変異体を作製し、ES-2誘導型及び無腫瘍マウスモデルにおいてIVIS（登録商標）イメージング技術によって試験した。Ar-339 E2の70位におけるGluからLysへのただ1つのアミノ酸の変化が、マウスにおける転移性腫瘍移植片を標的化する能力を抑制した。K70及びV251を有する二重E2突然変異体Mut-2は、標的化を回復しなかった。JT E2の全配列がAr-339ヘルパー中で置換された場合のみ、低度ではあるが、転移性腫瘍移植片を標的化する能力は回復した。従って、E2タンパク質の外被中の残基70は、シンドビスベクターの腫瘍特異的標的化に必要不可欠である。
【０００９】
一態様では本発明は、配列番号３７で明示されるヌクレオチド配列（SP6-H）を含む精製した単離核酸を提供する。
【００１０】
他の態様では本発明は、配列番号３８で明示されるヌクレオチド配列（SP6-HK70）を含む精製した単離核酸を提供する。
【００１１】
他の態様では本発明は、配列番号４０で明示されるヌクレオチド配列（SP6-HK70-V251）を含む精製した単離核酸を提供する。
【００１２】
他の態様では本発明は、配列番号３９で明示されるヌクレオチド配列（SP6-H-I3-K70-E181-V251）を含む精製した単離核酸を提供する。
【００１３】
さらに他の態様では本発明は、欠陥シンドビスウイルスベクターを生成するための方法であって、：
（a）配列番号３６に明示されるヌクレオチド配列を含む線状レプリコンプラスミド、並びに配列番号３７、配列番号３８、配列番号４０、及び配列番号３９から選択される線状ヘルパープラスミドを提供する工程；
（b）前記レプリコンプラスミド及び1個のヘルパープラスミドを転写してRNAを生成する工程；
（c）工程（b）で転写されたRNAを回収し、前記RNAを細胞にトランスフェクションする工程；
（d）欠陥シンドビスウイルスベクターを生成するのに有効な時間及び温度で、前記トランスフェクションされた細胞をインキュベーションする工程；及び
（e）前記トランスフェクションされた細胞の培地から、前記欠陥シンドビスウイルスベクターを回収する工程；
を含む方法を提供する。
【００１４】
本発明のこれらの態様及び他の態様は、本明細書、特許請求の範囲、及び図面を鑑みて当業者には明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
用語「約」または「およそ」は、当業者により決定された特定の値に関して許容される誤差範囲内であることを意味し、これは値がどのように測定または決定されるか、すなわち測定システムの限界、すなわち製剤等の特定の目的に必要とされる精度に、部分的に依存する。例えば「約」は、当技術分野では実践当たり1または1を超える標準偏差内であることを意味することができる。あるいは「約」は、所与の値の20%まで、好ましくは10%まで、より好ましくは5%まで、及びより好ましくはさらに1%までの範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関しては、この用語は、ある値の10倍以内、好ましくは5倍以内、及びより好ましくは2倍以内を意味することができる。本出願及び特許請求の範囲中に特定の値を記載する場合、他に述べない限り、特定の値に関して許容される誤差範囲内であることを意味する、用語「約」を想定すべきである。
【００１６】
本発明に従い、当技術分野の技術内の従来の分子生物学、微生物学、及び組換えDNA技術を利用することができる。このような技術は文献中で完全に説明されている。例えば、Sambrook、Fritsch & Maniatis、Molecular Cloning : A Laboratory Manual、Second Edition.Cold Spring Harbor、NY : Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989（本明細書では「Sambrook et al、1989」）; DNA Cloning : A Practical Approach、Volumes I and II （D.N.Glover ed.1985）; Oligonucleotide Synthesis （M.J.Gait ed.1984）; Nucleic Acid Hybridization [B.D.Hames & S.J.Higgins eds.（1985）] ; Transcription And Translation [B.D.Hames & S.J.Higgins、eds.（1984）] ; Animal Cell Culture[R.I.Freshney、ed.（1986）] ; Immobilized Cells And Enzymes [IRL Press、（1986）] ; B.Perbal、A Practical Guide To Molecular Cloning （1984）; Ausubel、F.M.et al.（eds.）.Current Protocols in Molecular Biology.John Wiley & Sons、Inc.、1994を参照のこと。
【００１７】
タンパク質中のアミノ酸残基を以下のように略記する：フェニルアラニンはPheまたはFであり、ロイシンはLeuまたはLであり、イソロイシンはIleまたはIであり、メチオニンはMetまたはMであり、バリンはValまたはVであり、セリンはSerまたはSであり、プロリンはProまたはPであり、スレオニンはThrまたはTであり、アラニンはAlaまたはAであり、チロシンはTyrまたはYであり、ヒスチジンはHisまたはHであり、グルタミンはGlnまたはQであり、アスパラギンはAsnまたはNであり、リジンはLysまたはKであり、アスパラギン酸はAspまたはDであり、グルタミン酸はGluまたはEであり、システインはCysまたはCであり、トリプトファンはTrpまたはWであり、アルギニンはArgまたはRであり、且つグリシンはGlyまたはGである。
【００１８】
本明細書で使用する用語「腫瘍」は、制御不能に増殖する形質転換細胞を含む悪性組織を表す。腫瘍には白血病、リンパ腫、骨髄腫、形質細胞腫等、及び固形腫瘍がある。本発明により治療することができる固形腫瘍の例には、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、大腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、類表皮癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭状癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺腫、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝臓癌、胆管癌、絨毛癌、セミノーマ、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頚癌、精巣腫瘍、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、グリオーマ、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、脳室上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起細胞腫、髄膜腫、メラノーマ、神経芽腫、神経膠腫、及び網膜芽細胞腫に制限されないが、これら等の肉腫及び癌腫がある。
【００１９】
本発明の組成物に関して使用する語句「製薬上許容され得る」は、ヒトへの投与時に生理的に許容され、且つ典型的には非所望の反応を生み出さないような組成物の分子体及び他の成分を表す。好ましくは、本明細書で使用する用語「製薬上許容され得る」は、連邦または州政府の統制機関により承認されていること、あるいは哺乳動物、とりわけヒトにおける使用に関して米国薬局方、または他の一般に認められている薬局方中に記載されていることを意味する。
【００２０】
用量または量に適用する用語「治療上有効」は、それを必要とする哺乳動物への投与時に所望の活性をもたらすのに充分な、化合物または製薬組成物のその量を表す。本発明のウイルスベクターに関して本明細書で使用するように、用語「治療上有効な量/用量」は、哺乳動物への投与時に有効な抗腫瘍応答を生み出すのに充分な、ベクターまたはベクターを含む製薬組成物の量/用量を表す。
【００２１】
以下に記載するのは、ベクターC、Mut-1、Mut-2、及びMut-4と呼ぶ本発明中で使用するのに好ましい複製欠陥シンドビスウイルスベクター、並びにこれらを生成するために使用されるプラスミドである。Mut-1、Mut-2、及びMut-4はE2エンベロープタンパク質に突然変異を含み、あるいは本明細書では「E2突然変異体」と表す。
【００２２】
本発明のE2突然変異体は、特有のヘルパー及びレプリカーゼプラスミドを使用して作製された。本発明は、4個の新規のヘルパープラスミド（SP6-H（配列番号３７）、SP6-H-K70（配列番号３８）、SP6-H-K70-V251（配列番号４０）、及びSP6-H-I3-K70-E181-V251（配列番号３９））、並びに1個のレプリコンプラスミド（SP6-R（配列番号３６））を提供する。いずれのアミノ酸変化も含まないが異なるヌクレオチド配列を有するヘルパープラスミドSP6-Hは、配列番号３７で明示される。前記新規のレプリコンプラスミドを使用して生成させる場合、前記4個のヘルパープラスミドを使用してベクターC、Mut-1、-2、及び4ベクターがそれぞれ生成される。
【００２３】
この系においてウイルスベクターを生成するために、2個のプラスミド、レプリコン及びヘルパーを使用する。前記レプリコンはウイルスレプリカーゼ、ウイルスパッケージシグナル、nt945〜nt1075、（Weiss B et al.1994 ; Frolova et al 1997）、ウイルスサブゲノムプロモーター、関心のある遺伝子の挿入及び発現を可能にするマルチクローニングサイト1（MCS1）、及びウイルス（-）鎖RNA合成を可能にするウイルスの3'末端（nt 11394〜11703）を含む。第2のマルチクローニングサイト（MCS2）は、in vitro転写用のプラスミドの線状化を可能にする。
【００２４】
前記ヘルパープラスミドは、当該ウイルスの最初の425nt、次にサブゲノムプロモーター、カプシド、及びウイルスエンベロープタンパク質（E3、E2、6K及びE1）並びに3'末端（nt11394〜11703）を含む当該ウイルスの3'末端nt 7334〜nt 11703を含む。
【００２５】
両プラスミドは、以下のウイルス配列、最初の425nt及び3'末端の309nt、並びにサブゲノムプロモーターを共有している。
【００２６】
両プラスミドは、共通のいくつかの非ウイルス要素、pUCクローニングプラスミド由来の複製起点（reppMB1）及びアンピシリン耐性遺伝子、in vitro転写用のプロモーター（T7またはSP6）、及びMCS2を有する。構築プロセスにおいて、両ベクターに共通であるpUC配列、SP6またはT7プロモーター、マルチクローニングサイト、及びウイルス3'末端を含むプラスミドを最初に作製した。次いで、特定のウイルス配列をこのプラスミド内にクローニングした（図３）。
【００２７】
本発明のウイルスベクターを生成するために、一対のプラスミドをPacI、NotI、またはXhoI等の制限酵素を使用して線状化させ、in vitro転写させ、当該RNAを回収し、細胞内にエレクトロポレーションにより導入する。in vitro転写用に、シンドビスウイルスの配列前にプロモーターを挿入する。前記プロモーターは、我々にとってその各RNAポリメラーゼを備える、SP6またはT7（Ambion Austin、TX）等のバクテリオファージプロモーターであることが好ましい。
【００２８】
本発明中で使用するための細胞には、BHK-21細胞（American Type Culture Collection、ATCC、Manassas、VAからCRL6281として入手可能）、ES-2細胞（ATTC、CRL1978）、プラスミドのトランスフェクションによってES-2系に由来したES-2/Fluc細胞、pIRES2-Luc/EGFP及びMOSEC細胞系（クローンID8）がある。転写されたRNA（すなわち、1個のヘルパー及び1個のレプリコンプラスミド）を、約0.75mg/mLと約1.25mg/mLの間の範囲の濃度で細胞にエレクトロポレーションにより導入する。ウイルスRNAの細胞濃度に対する比は、6×106個の細胞当たり約30〜50μgのRNAの範囲である。エレクトロポレーションは、例えばBio Rad（Hercules、CA）から市販されている機器を使用して実施される。
【００２９】
5%ウシ胎児血清（FBS）を含む培地に前記トランスフェクションされた細胞を加え、37℃で約12時間インキュベーションする。次いで培地を廃棄し、9mlのOpti-MEM I培地（GIBCO-BRL Invitrogen、San Diego CA）と交換し、約37℃で約24時間インキュベーションする。次いで上清を回収し、2,400rpm（〜1,500g）で15分間遠心分離にかけて、細胞残骸を除去する。当該ウイルスベクターを含む透明な上清を回収し、等分試料に分け-80℃で保存した。
【００３０】
WO02/076468として公開された国際出願番号PCT/US02/09432中に記載されたように、ウイルスベクターを抗腫瘍物質として使用することができる。Mut-1ベクターは高親和性ラミニン受容体（HALR）と結合しないが、それらはコントロールとして、及び当該ベクターの非ウイルス性の影響をモニターするのに有用である。Mut-1ベクターは細胞に入らないため、抗癌性応答における宿主因子の寄与を調査することができる。
【００３１】
同時係属番号第10/983,432号及び以下の紙面の実施例１中に記載されたように、本発明のプラスミドを使用して、細胞を移動させ、欠陥シンドビスウイルスベクターを連続的に生成するためのパッケージング細胞系を作製することができる。
【００３２】
生成されるウイルスベクターの量は、実施例中で以下に記載するように測定することができる。簡潔には、透明な上清をOpti-MEM I培地中に連続希釈し、300μLの各ベクターの希釈物を、2×105個の細胞を含む35mmウェル、12ウェルプレート中に加える。室温で1時間のインキュベーション後、当該細胞をPBS（リン酸緩衝生理食塩水）で洗浄し、37℃で約24時間2mLのαMEMとともにインキュベーションする。培地を除去し、細胞をPBSで洗浄し、細胞溶解物を調製し、異なるレポーター活性、β-ガラクトシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、またはRenillaルシフェラーゼに関してアッセイする。検出可能なレポーター活性を有する最高希釈物としてベクター力価を評価した。レポーター活性の検出を、実施例２中に記載する。
【００３３】
polyA配列後のヘルパー及びレプリコンプラスミドを線状化させ、次にin vitro転写反応を別々に実施することによって、ウイルスベクターを生成することができる。通常、1.6μgのプラスミドは、15〜25μgのmRNA/反応を生成する。次いで30〜50μgの両RNAを、6×106個のBHK-21細胞に同時にエレクトロポレーションにより導入し、次いで37℃で約12時間、5%FBSを含む10mlのαMEM中でインキュベーションする。次いで、当該培地を、0.7μMのCaCl2を補充した9mlのOpti-MEM I培地（GIBCO-BRL Invitrogen、San Diego CA）で置換し、細胞を37℃で約24時間インキュベーションし、上清を回収し、〜1,500gで15分間遠心分離にかけて細胞残骸を除去する。前記手順は、以下のエレクトロポレーション比、106個のBHK-21当たり5〜8μgのヘルパー及びレプリコンmRNA、並びに反応当たり9mlのCa-Opti-MEM I培地を使用することによって、スケールアップすることができる。
【００３４】
本発明のウイルスベクターは、Strauss and Strauss 1994中に要約される以下の性質を有する。簡潔には、アルファウイルスは細胞質中でのみ複製するため、偶然のスプライシングの可能性はない。それらは複製不全且つパッケージングに欠陥があるため、当該ベクターは再感染によって広がることができない。当該ベクターは細胞内で高コピー数に複製し、多量のmRNAが産生され、多量の関心のあるタンパク質の産生をもたらす。
【００３５】
本明細書に記載するように得られたウイルスベクターを、患者に投与するための製薬組成物中に配合することができる。本明細書で使用するように「製薬組成物」は、活性物質、すなわちウイルスベクター、及び製薬上許容され得るキャリア、賦形剤、または希釈剤を含む。語句「製薬上許容され得る」は、ヒトへの投与時に生理的に許容され、且つ例えば胃の不調、めまい等のアレルギーまたは類似の非所望の反応を典型的には生み出さない、分子体及び組成物を表す。好ましくは、本明細書で使用する用語「製薬上許容され得る」は、連邦または州政府の統制機関により承認されていること、あるいは動物、とりわけヒトにおける使用に関して米国薬局方、または他の一般に認められている薬局方中に記載されていることを意味する。用語「キャリア」は、化合物とともに投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または溶媒を表す。このような医薬キャリアは、滅菌液体、例えば、水及び例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油等の、石油、動物、植物、または合成由来の液体を含めた油であってよい。水または水性生理食塩水溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、特に注射溶液用のキャリアとして利用されることが好ましい。適切な医薬キャリアは、E.W.Martinによる「Remington's Pharmaceutical Sciences」中に記載されている。
【００３６】
ヒト治療用に、本発明のウイルスベクターは、食品医薬品局（FDA）により設定された品質管理規則（GMP）基準に従い調製することができる。品質保証（QA）及び品質管理（QC）基準は、複製能力のあるウイルス（ウイルスベクターに複製欠陥がある場合）、活性（アポトーシスまたは細胞変性効果（CPE）の誘導、あるいはβ-ガラクトシダーゼ等のマーカー遺伝子の発現によって試験される、ウイルス粒子数当たりのコロニー形成単位［CFU］）、毒性、及び他の基準測定値を試験することを含む。
【００３７】
腫瘍を治療するために、当該腫瘍細胞にベクターを取り込ませることができる任意の経路によって製薬組成物を投与する。投与は静脈内、動脈内、細動脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹膜内、脳室内、及び頭蓋内投与に制限されないが、これらを含めた非経口投与であることが好ましい。本明細書に開示するように、鼻腔内または経口経路によって腫瘍を有する動物に、ウイルスベクターを投与することもできる（Hardy、In : The Arbiviruses : Epidemiology and Ecology、Ch.4、pp.87〜126を参照）。しかしながら重要なことに、遺伝子療法における他のウイルスベクターとは対照的に、本発明のシンドビスベクターの投与は腫瘍に局所的である必要はない。実際、本発明の利点の1つは、標準的な技術（例えば、CATスキャニング、MRIスキャニング等）によって切除または位置特定することができない癌細胞、さらに微小癌組織の転移に対する当該ベクターの高い特異性及び親和性である。
【００３８】
本発明の療法治療では、治療有効量のベクターを患者に投与する。本明細書で使用する用語「治療有効量」は、宿主の活性、機能、及び応答性の臨床上重大な欠陥を少なくとも約15パーセント、好ましくは少なくとも50パーセント、より好ましくは少なくとも90パーセントを低下させる、及び最も好ましくは予防するのに充分な量を意味する。あるいは、治療有効量は、宿主における臨床上重大な状態の改善を引き起こすのに充分な量である。詳細には、治療有効量は、以下の：腫瘍細胞のアポトーシス、腫瘍細胞のネクローシス、腫瘍転移の排除または予防、腫瘍増殖率の低下、腫瘍の大きさの減少または腫瘍の縮小、皮膚腫瘍上の疥癬形成、腫瘍の排除、癌の軽減、癌の再発のための時間の増大、及び増大した患者の生存期間の1つ以上を引き起こすはずである。当該ベクター療法の頻度及び用量は、標準的な用量-応答性技術を使用することによって、当業者により滴定することができるが、一般に1日1回、1週間に1回、2週間に1回、または1カ月に1回、少なくとも2回、好ましくは少なくとも3回投与される用量当たり約106〜約1012個のウイルスベクター粒子の範囲であろう。
【００３９】
野生型シンドビスが当該ベクター系を改善するかどうかを調べるために、両系統のヘルパー及びレプリカーゼ断片を組み合わせて4個のベクターを作製し（JT-BB/SP6-R、SP6-H/JT-Rep、SP6-H/SP6-R、JT-BB/JT-Rep）、腫瘍誘導型SCIDマウスにおける腫瘍の大きさの減少及び生存期間を試験した。予想外に、Ar-339ヘルパー（SP6-H）を有するベクターは腫瘍標的化においてJTベクターより有効性が低いこと、及びAr-339レプリカーゼを有するベクター（JT-BB/SP6-R及びSP6-H/SP6-R）は腫瘍減少においてより有効性が高いことが分かった。当該ヘルパーの驚くべき表現型を試験するために、両方のウイルス配列を分析及び比較した。1個のアミノ酸の違いをカプシドタンパク質中で発見し（Pro67（JT-BB）からGln（Ar-339））、3個のアミノ酸変化をエンベロープタンパク質E1中（Ala72（JT-BB）からVal（Ar-339）、Gly75（JT-BB）からAsp（Ar-339）、及びSer237（JT-BB）からAla（Ar-339））、及び4個の変化をエンベロープタンパク質E2中で発見した（Ile3（JT-BB）からThr（AR-339）、Lys70（JT-BB）からGlu（Ar-339）、Glu181（JT-BB）からLys（Ar-339）、及びVal251（JT-BB）からAla（Ar-339））。どのアミノ酸が当該ベクターの性質に重要であるかを決定するために、両系統由来の混合配列を含む両ベクター由来の異なるキメラを作製した。動物モデルにおける分析は、最適なアミノ酸パターンは定義されなかったが、Ar-339 E2エンベロープタンパク質の配列が腫瘍転移の標的化を主に担っていることを示した。この問題に取り組むため、JT及びAr-339に対するE2中の4個のアミノ酸を混合した組合せを有する配列を含むベクターを作製し、ES-2誘導型及び無腫瘍マウスモデルにおいてIVIS（登録商標）イメージング技術によって試験した。驚くべきことに、Ar-339 E2の70位におけるGluからLysへのただ1個のアミノ酸の変化が、マウス中の転移性腫瘍移植片を標的化する能力を抑制し、さらに脂肪組織の背景を示さなかった。ES-2培養細胞において測定した場合、この
突然変異体（Mut-1）がAr-339ベクターと等しい力価を繰り返し示したことを考慮すると、この結果は予想外であった。K70及びV251を有する二重突然変異体Mut-2は標的化を回復しなかった。Ar-339中のJT E2の全体配列が置換された場合のみ、低度ではあるが、ヘルパーは転移性腫瘍移植片を標的化する能力を回復させることができた。従って、当該E2タンパク質の外殻中の残基70は、ベクターの腫瘍特異的標的化に必要不可欠である。
【００４０】
本明細書において、マウス腹膜腔中の転移性腫瘍移植片の特異的感染に関与するシンドビスウイルスベクターのアミノ酸を記載する。クローニングされたAr-339及びJTウイルスベクターの配列分析は、これらのアミノ酸を発見するための重要なツールとなっている。
【００４１】
公開されたStrauss配列との配列の分析比較によって、JT及びAr-339それぞれに対するウイルスレプリカーゼにおける2または3個のアミノ酸変化が明らかになった。Ar-339 nsP1 Ile441は、アルファウイルスの保存的残基に対する復帰突然変異体である、このアミノ酸はBHK-21組織培養に対するウイルスの適合性とも関係している可能性がある。Ar-339レプリカーゼは疾患進行を抑制する際にJTより有効であり、JT中の極性Cysから脂肪族残基Ile441への変化は、レプリカーゼ活性を増大させる際に役割を果たす可能性がある。興味深いことに、JT及びAr-339ベクターの両方が、Strauss配列に対してnsP2タンパク質中の同じ2個のアミノ酸変化を有している。JT及びAr-339 nsP2残基は、シンドビス様アルファウイルス群中でより保存されている。
【００４２】
Strauss配列をJT及びAr-339ベクターの構造部分をコードする領域と比較すると、異なる残基中では、両系統の異なる進化系統が示唆されたが、変化したアミノ酸は主にウイルススパイクにおいて見られた。Ar-339のE1 D75及びA237はシンドビス様アルファウイルス中では高度に保存されており、この群中の全てのウイルスはD75を有する。JTベクター中にのみ生ずる237におけるセリンを有するウイルスは、当該群中には存在しない。これらのデータは、JTベクターのE1 D75及びS237はおそらく、この研究室用菌株において生じた点突然変異体である可能性がより高いことを示唆する。E1突然変異に関するさらなる試験によって、当該ウイルスベクターの特異的な腫瘍標的化におけるこれらのE1残基の関与が明らかになるはずである。大部分の配列の変化は、ウイルススパイクにおけるリーフ様ドメイン中のE2エンベロープタンパク質において見出されており、これらの残基はさらに、シンドビス様アルファウイルス群中ではあまり保存されていない。マウス腫瘍モデルにおける、これらのE2スパイクの突然変異の役割をin vivoにおいて調べた。
【００４３】
当該Mut-1ベクターはES-2細胞中でAr-339ベクターと同じ力価を示すが、マウス中のES-2転移性腫瘍移植片に効率良く感染しないという事実は、遺伝子療法用のシンドビスベクターの試験及び改善のための強力なツールとなる。in vivoにおける腫瘍標的化の消失の一因は、マウス中でのベクターの低い安定性である可能性がある。シンドビス様アルファウイルス群の17の異なるウイルス間のタンパク質配列のアラインメントは、17メンバーのうちの10が、シンドビスウイルスに適合する構造を有するセムリキ森林ウイルス（SFV）を含めて、シンドビスE2残基68〜71中にギャップを有することを示した。当該ウイルススパイクは、互いに傾いた3個のE1-E2ヘテロ二量体から構成される。隣接するE1-E2ヘテロ二量体の塩基間にはギャップが存在し、これによってE2は融合中にスパイクの中心から動くことができる（Zhang et al.2002）。さらに、E2受容体結合ドメイン中の安定した欠失型突然変異体に関する以前の研究は、同等のin vitro力価も示すが、生きたAedes aegypti蚊の感染性の極端な低下を示す（Myles et al.2003）。理論によって縛られることは望まずに、これらのデータは、当該スパイクのこの領域には構造柔軟性があり、従って残基70の改変は、in vivoでのMut-1ベクターの安定性には重要ではないことを示唆すると考えられる。ベクター感染性の消失は、特にin vivoでの細胞結合親和性の低下によって生じる可能性がより高く、この場合、ベクター感染に関する環境条件はより制限的である。
【００４４】
シンドビス及びセムリキ森林ウイルス（SFV）中では、宿主細胞の融合及び細胞受容体との結合に関与する残基は、当該ウイルススパイク中に位置する。75位の小さな非極性バリンからE1 SFVスパイクサブユニット中の酸性アスパラギン酸へのただ1箇所の変化が、ウイルスの細胞-細胞融合性を変えることが記載されている（Levy-Mintz及びKielian、1991）。従って、これらのE1及びE2スパイクドメイン中のアミノ酸は、スパイクの形状及びウイルスの感染性に重要である。
【００４５】
E1中に疎水性（V72）、及び酸性（D75）残基、並びにE2タンパク質中にグルタミン酸（E70）を有するベクターAr-339は、in vivoにおいて腫瘍細胞を効率良く標的化することができる。E2残基70がリジンに変わっているMut-1では、スパイクの形状及び従ってベクターの細胞結合性を変える得るアミノ酸の極性及び電荷の変化がある。この仮説は、Mut-1とAr-339の間のin vitroにおいて観察される細胞親和性（cell tropism）の違いによって支持される。Mut-4中のJT-BB E2の完全配列の回復によってのみ、BHK-21細胞においてより高い力価がもたらされる。細胞の結合に関する条件が最適化されているin vitroにおいてこれらの違いが観察される場合、細胞-ベクター相互作用に関与するin vivoの要因が、当該ウイルス受容体とのベクターの接着を防ぎ得ると考えられる。Ar-339及びMut-1ベクターはin vitroではES-2細胞において同じ力価を有するが、ES-2細胞が異なる環境にあり、且つ受容体の変化を有し得るマウスの転移性移植片では、両ベクター間のわずかな親和性の違いが明らかになる。
【００４６】
本発明を、本発明の範囲を制限せずに本発明を記載することを目的とする以下の実施例中にさらに記載する。
【００４７】
下記の実施例において、以下の材料及び方法を使用した。
【実施例】
【００４８】
＜実施例１：シンドビスウイルスのcDNAクローニング＞
（一般的技術）
［ウイルスの増殖］
シンドビスウイルス系統Ar-339（原型）をATCC（Manassas、VA、Item #VR-68）から得て、二次ニワトリ胚線維芽細胞の細胞系、CEFにおいて増殖させた。10%ウシ胎児血清、NaHCO3 1.5g/l、1-グルタミン292mg/l、及びペニシリン/ストレプトマイシン100U/mlを補充したEMEM培地（Bio Whittalcer、カタログ番号12-684）中で細胞を培養した。80%コンフルエントのCEF細胞単層を含む2つのT-75フラスコに、0.7μMのCaCl2を補充した1mlのOpti-Mem I培地（GIBCO-BRL Invitrogen、San Diego CA；カタログ番号31985-070）に希釈した、それぞれ2.5×107pfu及び5×107pfuのシンドビスウイルスAr-339を感染させた。ウイルス感染細胞を37℃で1時間インキュベーションし、フラスコ当たり10mlのEMEM培地を加え、細胞は37℃で一晩インキュベーションした。シンドビス「接種原」を含む上清を採取し、さらなる感染で使用するまで-80℃で保存した。全RNA抽出用にCEF細胞を回収した。
【００４９】
［RNA抽出］
90%コンフルエントのCEF単層を含む5つのT-75フラスコを、あらかじめ得た「シンドビス接種原」の1:100、1:20、1:10、及び1:5希釈物（Ca-OPTI-MEM培地中）とともに、37℃で1時間インキュベーションした。次いで、フラスコ当たり10mlのEMEM培地を加え、37℃で一晩インキュベーションした。上清を回収した後、フラスコ当たり2mlのトリゾール（Invitrogen、San Diego CA；カタログ番号15596-018）を当該感染細胞に加え、抽出物を回収し、-80℃で保存した。感染細胞由来の全RNAを、製造者の（トリゾール）プロトコールに従って調製した。簡潔には、1mlのトリゾール細胞抽出物を15秒間攪拌し、200μLのクロロホルムを加え、攪拌し、室温（rt）において15,000gで10分間スピン処理し、水性上相を滅菌チューブに移し、750μLのイソプロパノールを加え、室温で15分間インキュベーションし、再度スピン処理し、上清を除去し、ペレットをエタノール（DEPC水中70%）で洗浄した。前記ペレットを室温で5〜10分間空気乾燥させ、50μLのDEPC水中に再懸濁した。
【００５０】
［シンドビスウイルスのcDNAクローニング］
シンドビスウイルスのRNAを、シークエンシングプラスミドpCR4Blunt-TOPO（Invitrogen、San Diego CA；カタログ番号45-0245）中に、6個の重複断片（CDNA-1、CDNA-2、CDNA-3A、CDNA-3-B、CDNA-4、及びCDNA-5）でクローニングした。前記断片の位置を図１中に示し、使用されたプライマーの配列を表I（付表A）中に示す。当該ウイルスの特有の制限部位を利用するようにプライマーを設計した。プライマーSV-C3R 中にRE XbaIを導入して、CDNA-3クローニングを可能にした。それぞれの断片に関して、RT及びPCR反応を同じプライマー対を用いて実施した。前記クローニング手順は、PCRサイクルの条件以外全ての断片に関して同じであった。
【００５１】
逆転写酵素（RT）反応を、感染細胞由来の全RNAからの5μg、反応バッファー（1×）、正方向及び逆方向特異的プライマー（それぞれ2.5μM）、dNTP（1mM）、DTT（5mM）、並びに15uのThermoScript（登録商標）RNaseH逆転写酵素（Invitrogen、カタログ番号12236-014）を用いて、20μLの最終体積で実施した。PCR中で使用する前に、RTを蒸留水に1:1で希釈した。
【００５２】
Pfx-PCR反応を、1μLのRT反応混合物、反応バッファー（1×）、MgSO4（1mM）、dNTP（それぞれ0.3mM）、正方向及び逆方向プライマー（それぞれ0.3μM）、並びに1UのプラチナPfxDNAポリメラーゼ（Invitrogen、カタログ番号11708-0l3）を用いて、25μlの最終体積で実施した。RT及びPCR反応を、エッペンドルフの「Mastercycler Gradient」サーマルサイクラー中で実施した。Taq-PCR反応混合物は、反応バッファー（1×）、dNTP（200μM）、正方向及び逆方向プライマー（それぞれ0.5μM）、並びに1uのTaq-DNA-ポリメラーゼ（Fisher Scientific、Pittsburgh、PA、カタログ番号FB600025）を、20μlの最終体積中に含んだ。いずれの場合も、PCR産物を、1%アガロースゲルにおける電気泳動によって分析し、DNAバンドを切断し、QIAEXIIゲル抽出キット（Qiagen、Valencia CA；カタログ番号20021）を用いて精製した。
【００５３】
全ての酵素は、New England Biolabs（NEB、Beverly、MA）から購入された。制限酵素（RE）を用いた消化後、抽出したDNAをCIP脱リン酸化し（37℃で1時間）、且つ/あるいはT4-ポリヌクレオチド-キナーゼでリン酸化し（1時間、37℃）、酵素を失活させ（70℃で10分間または65℃で20分）、反応物を1%アガロースゲルにかけた。バンドを切断し、抽出し、既知のDNA濃度のバンドとの比較により、ゲル電気泳動によって定量化した。ライゲーション反応を、T4-DNA-リガーゼ（NEB）を用いて（16℃で14時間）、あるいはQuickライゲーション反応キット（NEB）を用いて（室温（rt）で5分間）実施した。形質転換を、RapidTrans（登録商標）TAM1エクストラコンピテント大腸菌（Active Motif、Carlsbad、CA；カタログ番号11099）を使用して実施した。大腸菌の形質転換及び前記ライゲーション反応の後、陽性細菌の最初のスクリーニングを、大腸菌コロニーのTaq-PCRによって実施した。陽性プラスミドを制限酵素によって調べた。シークエンシングをSkirball Institute of Biomolecular Medicine、NYUで実施した。
【００５４】
《CDNA-1プラスミド》
RT反応は、55℃で1時間、プライマーCDNA-1F/CDNA1-Rを用いて実施した。2回のPfx-PCR、94℃で5分間、35サイクル［94℃で30秒間、66℃で30秒間（バンドD）または67℃で30秒間、72℃で2.5分間、及び72℃で2.5分間］（バンドE）を実施した。PCR産物は1%アガロースゲルにかけ、2.2Kbのバンド、DとEの両方を単離し、pCR4Blunt-TOPOプラスミド中に別々にクローニングした。65℃でアニーリング温度及びTaq-DNA-ポリメラーゼに関して同じPCR条件を使用して、陽性コロニーをスクリーニングした。2つのプラスミド（それぞれのPCRバンド由来のもの）を選択し、プラスミドCDNA-1_Topo#64中のPCRバンドDを完全にシークエンシングした。当該配列を、Strauss et al、Virology 133、1984によって公開されたAr-339配列と比較した。発見された差異を、PCRバンドEの配列と比較した。同一の差異をバンドD及びE中に発見し、これらがPCR突然変異体ではなくウイルスに由来することを確認した。
【００５５】
《CDNA-2プラスミド》
逆転写酵素反応を、55℃で1時間、プライマーCDNA-2F/CDNA-2Rを用いて実施した。3回の勾配式PCR、94℃で5分間、［94℃で30秒間、64.7℃で30秒間（バンド1）または66℃で30秒間（バンド2）または67℃で30秒間（バンド3）、72℃で2.5分間］の35サイクル、及び72℃で2.5分間。当該2kbのバンドをpCR4Blunt-TOPO内に別々にクローニングした後、コロニーのPCRスクリーニングを64.5℃のアニーリング温度で実施した。プラスミドCDNA-2#213中のバンド2を完全にシークエンシングし、発見された任意の突然変異をPCRバンド1及び3の配列と比較することによって調べた。
【００５６】
《CDNA-3Aプラスミド》
3回のRT反応を、1時間30分、それぞれ53.2℃、55.5℃、及び60.8℃で、プライマーCDNA-3F/SV-6932Rを用いて勾配式に実施した。3回のPfx PCRをそれぞれ、1μLの各RT、94℃で5分間、［94℃で30秒間、53℃で30秒間、72℃で3分間］の35サイクル、及び72℃で3分間により実施した。当該2.68kbpのバンドT、U、及びVを別々にクローニングし、プラスミドC3A_Topo#735中のバンドVを完全にシークエンシングした。公開されたAn-339配列（Strauss et al.1984）と比較して変化は見られなかった。
【００５７】
《CDNA-3Bプラスミド》
RT反応を、1時間30分60.8℃で、プライマーSV-6882F/SV-C3Rを用いて実施した。3回の勾配式PfxPCRを、94℃で5分間、［94℃で30秒間、55.3℃で30秒間（バンドJ）または56℃で30秒間（バンドK）または58.3℃で30秒間（バンドL）、72℃で1分間］の35サイクル、及び72℃で2分間により実施した。当該3本の774bpバンドを別々にクローニングし、プラスミドC3B-Topo#334中のバンドLを完全にシークエンシングした。発見された突然変異を、バンドJ及びKのシークエンシングによって確認した。
【００５８】
《CDNA-3（CDNA-3A+3B）プラスミド》
HpaI REはシンドビス配列に特有ではなく、従って、CDNA3A及びCDNA3B断片を新たなレポーターベクターにクローニングするために、両方の配列を含むTopoプラスミドを最初に作製し、次いでAvrII/XbaI部位に断片CDNA-3（CDNA-3A+3B）をクローニングすることが必要であった。プラスミドC3B-Topo#334をHpaI及びSacIで消化し、当該774bpのウイルスバンドをアガロースゲルから単離し、HpaI/SacIで消化したC3A_Topo#735プラスミドとライゲーションさせた（T4-DNA-リガーゼ16℃で14時間）。Taqポリメラーゼ、及びプライマーCDNA-3F、SV-C3Rを用いたPCR：94℃で10分間、［94℃で30秒間、55℃で30秒間、72℃で3分間］の35サイクル、及び72℃で2分間によって、形質転換体をスクリーニングした。当該陽性プラスミドをC3A+3B_Topo#810と名づけ、連結部分をシークエンシングした。
【００５９】
《CDNA-4プラスミド》
RT反応を、52℃で1時間30分、プライマーCDNA-4F/CDNA-4Rを用いて実施した。3回のPCRを、94℃で5分間、［94℃で45秒間、49.7℃で30秒間（バンドM）または55℃で30秒間（バンドN）または57.2℃で30秒間（バンドO）、72℃で2.5分間］の35サイクル、及び72℃で2.5分間により勾配式に実施した。当該2kbのバンドを単離し、別々にクローニングし、プラスミドCDNA-4_Topo#422中のバンドNを完全にシークエンシングした。発見された突然変異を、バンドM及びOのシークエンシングによって確認した。
【００６０】
《CDNA-5プラスミド》
RT反応を、49.7℃で1時間30分、プライマーCDNA-5F/CDNA5-Rを用いて実施した。3回のPCRを、94℃で5分間、［94℃で30秒間、46.8℃で30秒間（バンドQ）または48.6℃で30秒間（バンドR）または50.5℃で30秒間（バンドS）、72℃で2分間］の35サイクル、及び72℃で2分間により勾配式に実施した。当該2.35kbpのバンドを別々にクローニングし、プラスミドCDNA-5_Topo#525中のバンドSを完全にシークエンシングした。発見された突然変異を、バンドQ及びRのシークエンシングによって確認した。
【００６１】
［ベクター構築］
《pUCプラスミド中のポリリンカークローニング》
要するに、SP6及びT7ポリリンカーバンドを、2つの断片、SP6プロモーター（プライマー対Poly1-SP6（+）/Poly-2（-））またはT7プロモーター（プライマーPoly1-T7（+）/Poly-2（-））を含む5'末端、及び共通3'末端（プライマーPoly-3（+）/Poly-4（-））においてプライマーから構築し、当該プライマーの配列を表II（付表A）中に提供する。5'及び3'バンドを消化し、ライゲーションさせてポリリンカーを作製し、次いで大腸菌複製起点及びアンピシリン耐性遺伝子を含むAflIII/AatII pUCバンドとライゲーションさせて、T7-pUCまたはSP6-pUCプラスミドを作製した。
【００６２】
《T7-pUCプラスミド》
2つの別個の反応を、プライマー対Polyl-T7（+）/Poly-2（-）またはPoly-3（+）/Poly-4（-）を用いて実施した。両反応に関して、条件は、プライマー（それぞれ5μg）、バッファー（1×）、dNTP（1.5mM）、BSA（50μg/ml）であった。混合物を5分間沸騰させ、プライマーのアニーリング用に室温まで冷却し、次いで、3単位/反応のT4-DNA-ポリメラーゼを20μlの最終体積まで加え、鎖を延長させるために37℃で30分間インキュベーションした。0.5μLのそれぞれの反応物を、2つのPCR反応：1つは、鋳型Polyl-T7（+）/Poly-2（-）及びプライマーPCR-Poly1-F/PCR-Poly2-Rを用いるPCR反応、並びにもう一方は、鋳型Poly-3（+）/Poly-4（-）及びプライマーPCR-Poly-3F/PCR-Poly-4Rを用いるPCR反応中で、鋳型として使用した。両PCRに関して、条件は、20μlの最終体積中に、反応バッファー（1×）、dNTP（200μM）、正方向及び逆方向プライマー（それぞれ0.5μM）、及び1単位のTaq-DNA-ポリメラーゼであった。それぞれの一次反応に関して、3本の二次チューブを調製し、PCR反応をアニーリング温度に関して勾配式：94℃で5分間、［94℃で30秒間、40℃で30秒間（チューブ1）または45.4℃で30秒間（チューブ2）または50.7℃で30秒間（チューブ3）、72℃で30秒間］の35サイクル、及び72℃で1分間により実施した。40℃のアニーリング温度に対して、バンドはより強度であった。当該145bpのバンドを次いで単離し、酵素：PolyT7/Poly2-R用にAflIII及びXbaI、並びにPoly3（+）/Poly4（-）用にAatII及びXbaIを用いて消化した。65℃で20分間酵素を失活させた後、等モル量の両バンドのライゲーションを、T4-DNA-リガーゼを用いて25℃で1時間により実施した。当該pUCプラスミドの1811ntのAatII/AflIIバンドを加え、一晩16℃でインキュベーションした。大腸菌Tam1コンピテント細胞に前記ライゲーション産物を形質転換し、陽性として選択したコロニーはAatII及びAflIIIを用いた二重消化によってスクリーニングした。前記陽性プ
ラスミドをT7-pUC#32と名づけ、シークエンシングによって調べた。
【００６３】
《SP6-pUCプラスミド》
反応混合物：Poly1-SP6（+）及びPoly-2（-）プライマー（それぞれ5μg）、バッファー（1×）、dNTP（1.5mM）、BSA（50μg/ml）を5分間沸騰させ、プライマーアニーリング用に室温まで冷却した。次いで、3単位/反応のT4-DNA-ポリメラーゼを20μlの最終体積まで加え、37℃で30分間インキュベーションした。20μl最終体積中にPCR-Poly1-F/PCR-Poly2-Rプライマー（それぞれ0.5μM）、反応バッファー（1×）、dNTP（200μM）、及び1単位のTaq-DNA-ポリメラーゼの勾配式PCR反応において、0.5μL/Rxnを鋳型として使用した。PCR条件：94℃で5分間、［94℃で30秒間、40℃で30秒間（チューブ4）または45.4℃で30秒間（チューブ5）または50.7℃で30秒間（チューブ6）、72℃で30秒間］の35サイクル、及び72℃で1分間。バンドをアガロースゲル中で単離し、1つに集め精製した。得られたDNAを、酵素AflIII及びXbaIを用いて37℃で2時間消化した。65℃で20分間、前記酵素を失活させた後、消化したDNAバンドを、25℃で1時間T4-DNA-リガーゼを用いて、AatII及びXbaIで消化したPoly-3（+）/Poly-4（-）バンドとライゲーションさせた。プライマーPCR-Poly1-F及びPCR-Poly4-R、（以前のPCRと同じ濃度）、並びにサイクル：94℃で2分間、［94℃で30秒間、40℃で30秒間（チューブ4）または43.1℃で30秒間（チューブ5）または45.4℃で30秒間（チューブ6）、72℃で30秒間］の18サイクル、及び72℃で1分間により実施した第2の勾配式PCR反応用の鋳型として、5μLの前記ライゲーション産物を使用した。バンドをアガロースゲル中で単離し、1つに集め精製し、37℃で16時間AflIII/AatIIで消化した。酵素失活後（65℃で20分間）、当該AflIII/AatII SP6バンドを、室温で5分間、Quick T4-DNA-リガーゼ（New England Biolabs）を用いてpUCプラスミドの1811ntのAatII/AflIIバンドとライゲーションさせ、大腸菌Tam1細胞を形質転換した。コロニーのスクリーニングを、T7ポリリンカーと同様に実施した。当該プラスミドをSP6-pUC#51と名づけた。
【００６４】
《T7-pUC-PolyA#114プラスミド》
シンドビスの3'末端、nt11392〜11694を、プライマー：PolyA-F（5'CCCCAATGATCCGACCA3"）（配列番号１）及びPolyA-R（5'AAAACAAATTTTGTTGATTAATAAAAG3'）（配列番号２）、PCR条件：25μlの最終体積中に、反応バッファー（1×）、MgSO4（1mM）、dNTP（それぞれ0.3mM）、プライマー（それぞれ0.3μM）、及び1単位のプラチナPfxDNAポリメラーゼを用いた、プラスミドCDNA-5_Topo#525におけるPCRによって得た。3回のPCR反応を、アニーリング温度に関して勾配式：94℃で5分間；［94℃で45秒間、53.2℃で30秒間（チューブ1）または55.5℃で30秒間（チューブ2）または60.8℃で30秒間（チューブ3）、72℃で45秒間］の35サイクル、及び72℃で1分間により実施した。当該53.2℃のバンドはより強度が高く、そのDNAをゲルから単離し、37℃で30分間、10単位のT4-ポリヌクレオチド-キナーゼ（Biolabs）を用いてリン酸化した。70℃で10分間の失活の後、16℃で14時間T4-DNA-リガーゼを使用することによって、（HpaIであらかじめ消化し、且つ脱リン酸化させた）プラスミドT7-pUC#32と前記DNAをライゲーションさせた。組換え体のスクリーニングを、同じプライマー、Taq-ポリメラーゼ、及びサイクル：94℃で5分間；［94℃で45秒間；53℃で30秒間；72℃で45秒間］の35サイクル、及び72℃で1分間を使用してコロニーのPCRによって実施した。当該挿入の方向を、制限酵素AflII/AseIを用いて分析した。当該陽性プラスミドをシークエンシングによって確認し、T7-pUC-PolyA#114と名づけた。このベクターから、最終ベクターT7-ARep#68及びSP6-pUC-PolyA#914を作製して、最終ベクターSP6-ARep#68を構築した。
【００６５】
《レプリコンベクターの構築》
T7-ARepプラスミド：ウイルスのcDNA断片CDNA-1、CDNA-2、及びCDNA-3をT7-pUC-PolyA#114内にクローニングして、新たなレポーターベクターT7-ARep#68を作製した。プラスミドCDNA-1_Topo#64をMfeI及びBglII REで消化し、当該2247bpのウイルスバンドを単離し、クイックリガーゼキットを用いてT7-pUC-PolyA#114とライゲーションさせ、MfeI、BglIIで消化し、且つCIP脱リン酸化した。TAM1形質転換細菌を、94℃で10分間、［94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で2.5分間］の35サイクル、及び72℃で2分間、Taq-ポリメラーゼ、プライマーCDNA-1F及びCDNA-1Rを用いたPCRによってスクリーニングした。当該陽性プラスミドをT7-pUC-PolyA-C1#11と名づけ、AvrII/BglIIで消化し、CIP脱リン酸化し、AvrII/BglIIによるプラスミドCDNA-2_Topo#213の消化後に得たCDNA-2の1950bpのウイルスバンドと、クイックリガーゼを用いてライゲーションした。陽性コロニーのスクリーニングを、94℃で10分間、［94℃で30秒間、64℃で30秒間、72℃で2.5分間］の35サイクル、及び72℃で3分間の、Taqポリメラーゼ、プライマーCDNA-2F及びCDNA-2Rを用いたPCRによって実施した。当該プラスミドをT7-pUC-PolyA-C1-C2#35と名づけた。C3A+B_Topo#810をXbaI/AvrII及びBsshIIで消化し、3350ntのウイルスC3バンドをアガロースゲル中で分離し、単離し、XbaI/AvrIIで消化したT7-pUC-PolyA-C1-C2#35プラスミドとライゲーションさした（クイックリガーゼキット）。形質転換体を、XbaI/AvrIIを用いた消化によって分析した。当該新たなレポーターベクターをT7-ARep#68と名づけ、完全にシークエンシングした。
【００６６】
《SP6-ARepプラスミド》
SP6プロモーター下のレポーターベクターを3ステップでクローニングした。最初に、SP6プロモーターをT7-pUC-PolyA#114内にクローニングし、次いでCDNA-1を挿入し、最後のステップで、T7-ARep#68由来のCDNA-2+CDNA-3バンドをクローニングした。
【００６７】
SP6-pUC#51をSphI及びAflIIIで消化し、154ntのバンドを単離し、T7-pUC-PolyA#114 SphI/AflIII/CIPバンドとライゲーションした（T4-DNA-リガーゼ）。プラスミドを、MboII消化によってスクリーニングし、シークエンシングによって調べた。当該陽性プラスミドをSP6-pUC-PolyA#902と名づけ、MfeI及びBglIIで消化し、CIP脱リン酸化し、MfeI/BglIICDNA-1バンドとライゲーションした（クイックリガーゼ）。コロニーは、94℃で10分間、［94℃で30秒間、65℃で30秒間、72℃で2.5分間］の35サイクル、及び72℃で2分間の、CDNA-1F/CDNA-1Rプライマーを用いたPCRによって分析した。当該陽性プラスミドを、MfeI/BglIIを用いた消化によってさらに分析し、SP6-pUC-PolyA-C1#306と名づけた。プラスミドT7-ARep#68をBglII/XbaIを用いて消化し、5.6kbのCDNA-2+CDNA-3バンドをアガロースゲルから単離し、BglII/XbaI/CIPで消化したSP6-pUC-PolyA-C1#306プラスミドとライゲーションした。スクリーニングを、BglII及びBglII/XbaIを用いた消化によって実施した。当該新たなベクターをSP6-Arep#701と名づけた。
【００６８】
《ヘルパーベクターの構築》
T7-AH#17プラスミド。最初のステップにおいて、シンドビスウイルスのnt1〜425をT7-pUC-PolyA#114内にクローニングした。第2のステップにおいて、CDNA-4とCDNA-5ウイルス断片の両方をクローニングして、新たなヘルパーベクターを作製した。20μl最終体積中に、鋳型としての54ngのCDNA-1_Topo#64、プライマー（それぞれ0.5μM）SIN1-19F（5'ATTGACGGCGTAGTACACA3'）（配列番号３）、及びCDNA-4断片のクローニングを可能にするためにBamHI REに加えるH-BamR（5'GTATCAAGTAGGATCCGGAG3'）（配列番号４）、反応バッファー（1×）、dNTP（200μM）、並びに1単位のTaq-DNA-ポリメラーゼを使用するPCRによって、シンドビスウイルスのnt1〜425を増幅させた。2回のPCR反応を、以下のアニーリング温度：94℃で5分間、［94℃で30秒間、45.3℃で30秒間（チューブ1）または46.4℃で30秒間（チューブ2）、72℃で30秒間］の28サイクル、及び72℃で1分間により勾配式に実施した。バンドをアガロース1.3%ゲル中で分析し、抽出し、1つに集め、MfeI/BamHIで消化した。プラスミドT7-pUC-PolyA#114をMfeI/BamHIで消化し、CIP脱リン酸化し、当該バンドをアガロースゲルから単離し、350bpのMfeI/BamHI PCRバンドとライゲーションさせた。94℃で10分間、［94℃で30秒間、45℃で30秒間、72℃で30秒間］の45サイクル、及び72℃で1分間の、プライマーSIN1-19F/H-BamRを用いたTaq-PCRによって、コロニーをスクリーニングした。陽性プラスミドをシークエンシングによって調べ、T7-pUC-PolyA-5'#604と名づけた。このプラスミドをBamHI及びNsiIで消化し、CIP脱リン酸化し、ウイルス挿入体とライゲーションさせた。
【００６９】
CDNA-4とCDNA-5のライゲーションはRE BclIによるものであった。この酵素はdamメチル化依存性であり、従って当該DNAを脱メチル化させるために、CDNA-4_Topo#422及びCDNA-5_Topo#525を有するプラスミドを、dam-/dcm-大腸菌系統GM2163（New England Biolabs）内に形質転換した。CDNA-4_Topo#422（dam-）をBamHI及びBclIで消化し、プラスミドCDNA-5_Topo#525をBclI及びNsiIで消化した。いずれの場合も、当該酵素を70℃で15分間失活させた。当該ライゲーションを、T4-DNA-リガーゼ（16℃で14時間）とともに等モル量の3つのバンド： T7-pUC-PolyA-5'#604（BamHI/NsiI/CIP）、CDNA-4_Topo#422（dam-）（BamHI/BclI）、及びCDNA-5_Topo#525（dam-）（BclI/NsiI）を用いて実施した。コロニーをBamHI及びNsiIを用いた消化によってスクリーニングした。当該陽性プラスミドをT7-AH#17と名づけ、完全にシークエンシングした。
【００７０】
《SP6-AHプラスミド》
プラスミドSP6-pUC-PolyA#902をMfeI及びNsiIで消化し、CIP処理し、当該2.4kbのバンドを当該4.5kbのT7-AH#17MfeI/NsiIバンドとライゲーションさせた（T4-DNA-リガーゼ）。94℃で10分間、［94℃で30秒間、53℃で30秒間、72℃で3分間］の25サイクル、プライマーCDNA-5F及びCDNA-5Rを用いたTaqPCRによって、コロニーをスクリーニングした。陽性プラスミドを、NsiI及びNsiI/MfeIを用いた消化によって調べ、シークエンシングした。生成したプラスミドをSP6-AH#318と名づけた。
【００７１】
《T7-R及びSP6-Rプラスミド》
当該4つのプラスミド（SP6-AH#318、SP6-ARep#701、T7-AH#17、及びT7-ARep#68）を完全にシークエンシングし、4つ全てにおいて、当該ウイルスの3'末端において、polyA、nt11686前に、1個のTの欠失を発見した。当該ウイルスAr-339と同じ配列を有するために、欠失を一定にした。
【００７２】
Ar-339配列を、プラスミドT7-pUC-polyA#114中に最初に置いた。当該新たな3'末端をプライマー：PolyA-F（5'CCCCAATGATCCGACCA3'）（配列番号５）及びEND-R（5'AAAACAAAATTTTGTTGATTAATAAAAG3'）（配列番号６）を用いたPCRによって獲得し、T7-pUC-polyA#114のクローニングに関して前述したのと同様にT7-pUC#32内にクローニングした。新たなプラスミドT7-pUC-3末端#9をシークエンシングし、これを使用して新たなヘルパー及びレポーターを作製した。
【００７３】
レポーターベクターを作製するために、T7-pUC-3末端#9プラスミドをXbaI及びXhoIで消化し、当該423bpのバンドをSP6-Arep#701 XbaI/XhoI 9504bpバンド内及びT7-ARep#68 XbaI/XhoI 9504bpバンド内にクローニングして、新たなレポーター、それぞれSP6-R#406及びT7-R#202を作製した。
【００７４】
《T7-H及びSP6-Hプラスミド》
プラスミドT7-pUC-3末端#9をNsiI及びXhoIで消化し、当該311bpのバンドをSP6-AH#38 NsiI/XhoI 6399bpバンド内及びT7-AH#17 NsiI/XhoI 6399bpバンド内にクローニングして、新たなヘルパー、それぞれSP6-H#432及びT7-H#226を作製した。当該新たなレポーター及びヘルパープラスミドを完全にシークエンシングした。
【００７５】
《SP6-HE2突然変異体》
キットQuickChange IIx部位特異的突然変異誘発（Stratagene、La Jolla、CA）に従い、SP6-Hプラスミドにおいて突然変異体を作製した。簡潔には、10ngのSP6-H#432を相補的プライマー：E2-I3-F/E2-I3-RまたはE2-K70-F/E2-K70-RまたはE2-E181-F/E2-E181-R、またはE2-V251-F/E2-V251-R、反応バッファー、dNTP、及び2.5単位のpfuUltra HF DNAポリメラーゼとともにインキュベーションした。PCR反応は、95℃で1分間、［95℃50秒間、60℃50秒間、68℃7分間］の18サイクル、及び68℃7分間の最終延長であった。
【００７６】
当該PCR反応後、10Uの制限酵素DpnIを加え、反応物を37℃で1時間インキュベーションして、メチル化された親DNAを消化した。XL-10-Goldコンピテント大腸菌細胞を形質転換し、当該コロニーを制限酵素による消化（RE）によって分析した。突然変異をシークエンシングによって確認した。PCR用の鋳型として前の突然変異体を使用して同じプロトコールに従い、多数の突然変異体を作製した。使用したプライマーの配列及びntの変化を、表III（付表A）中に示す。作製したプラスミドは、SP6-H-I3#5、SP6-H-K70#59、SP6-H-I3-K70#66、SP6-H-I3-K70-E181#3、SP6-H-K70-V251#SP6-H-I3-K70-E181-V251である。PCR技術によってさらなる突然変異が存在しなかったことを確認するために、各クローンの1270bpのBssHII/BanII断片を、シークエンシングされたプラスミドSP6-H内にサブクローニングした。
【００７７】
《レプリコンベクターにおけるレポーター遺伝子のクローニング》
LacZ遺伝子をベクターSP6-ARep#701、SP6-R#406、T7-ARep#68、及びT7-R#202のPmlI/XbaI部位においてクローニングして、それぞれSP6-ARepLacZ、SP6-RLacZ、T7-ARepLacZ、及びT7-RLacZを作製した。
【００７８】
ホタルルシフェラーゼ遺伝子をpGL3プラスミド（Promega Co、Madison WI）由来のNheI/XbaI部位において切除し、ベクター：SP6-ARep#701、SP6-R#406、T7-ARep#68、及びT7-R#202のXbaI部位においてクローニングして、それぞれSP6-ARepFluc、SP6-RFluc、T7-ARepFluc、及びT7-RFlucを作製した。
【００７９】
プラスミドphRL-CMV（Promega Co、Madison WI）由来のRenillaルシフェラーゼ遺伝子を、当該レプリコンのXbaI部位においてクローニングして、プラスミドSP6-RhRluc及びT7-RhRlucを作製した。
【００８０】
＜実施例２＞
［細胞］
BHK-21、及びES-2細胞はAmerican Type Culture Collection（ATCC）から得た。BHK-21細胞を、5%FBSを含むαMEM（JRH Bioscience）中で維持した。ES-2細胞は、不良な予後を有しシスプラチンを含めたいくつかの化学療法剤に耐性がある明らかな細胞癌、卵巣癌の1種を有する患者に由来した。ES-2細胞を、5%FBSを含むマッコイの5A培地（Mediatech）中で培養した。全ての基礎培地に、100μg/mlのペニシリン-ストレプトマイシン及び0.5μg/mlのアムホテリシンB（いずれもMediatech製）を補充した。ES-2/Fluc細胞は、ホタルルシフェラーゼとEGFP遺伝子の両方を含むバイシストロン性mRNA転写産物を発現するプラスミドpIRES2-Luc/EGFPのトランスフェクションによるES-2株に由来した。pIRES2-Luc/EGFPプラスミドを構築するために、ルシフェラーゼ遺伝子を含むDNA断片をpGL-3ベーシックプラスミド（Promega）から得て、次いでpIRES2-EGFPプラスミド（BD Biosciences Clontech）のマルチクローニングサイト内にサブクローニングした。
【００８１】
マウス卵巣MOSEC細胞系（クローンID8）は、Dr.Katherine F.Roby（University of Kansas Medical Center、Kansas City）からの寛大に提供されたものであり、4%FBS及び1×インシュリン-トランスフェリン-セレン（Mediatech、Inc）を補充したダルベッコ修飾イーグル培地（DMEM）中で維持した。
【００８２】
［in vitro転写及びベクター調製］
シンドビスレプリコンまたはJT-BBヘルパーRNAを有するプラスミドを、mMESSAGE mMACHINE RNA転写キット（T7及びSP6バージョン；Ambion）を使用することによって、in vitro転写の前にPacI、NotI、またはXhoIを用いて線状化した。ヘルパー及びレプリコンRNA転写産物の両方（それぞれ20μl）を、次いでBHK-21細胞内にエレクトロポレーションにより導入し、5%FBSを含む10mlのαMEM中で37℃で12時間インキュベーションした。当該培地を、0.7μMのCaCl2を補充した9mlのOpti-MEM I培地（GIBCO-BRL Invitrogen、San Diego CA）で置換した。24時間後、当該培養培地を回収し、-80℃で保存した。
【００８３】
［ベクターの力価］
シンドビスベクターの力価をBHK-21、ES-2、ES-2/Fluc、またはMOSEC細胞においてアッセイした。ベクターの連続希釈物（それぞれ300μL）を、12ウェルプレート中の2×105個のBHK-21細胞に加えた。室温で1時間のインキュベーション後、当該細胞をPBSで洗浄し、2mLのαMEMとともに37℃で24時間インキュベーションした。
【００８４】
LacZの発現を2つの方法、染色、及び青色細胞/ウェルの計数または吸光度の読み取りによって測定した。最初に、室温で20分間0.5%グルタルアルデヒドを含むPBS中に細胞を固定し、PBSで3回洗浄し、次いで、1mg/mLのX-gal（5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-D-ガラクトピラノシド；（Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）、5mMのフェリシアン化カリウム、5mMのフェロシアン化カリウム、及び1mMのMgSO4を含むPBSを用いて37℃で3時間染色した。X-Gal溶液を用いた染色後、LacZを発現した細胞は青色であった。青色染色細胞を計数し、1mLの等分試料当たりの形質導入単位（TU）の数を測定することによってベクターの力価を評価した。第2の方法に関しては、細胞を200μLのM-PER溶解バッファー（Pierce Biotechnology、Rockford、IL）で溶解した。50μLの前記細胞溶解物をAll-in-One-ガラクトシダーゼアッセイ試薬（Pierce Biotechnology）中に加え、405nmでの読み取り前に室温で5分間インキュベーションした。最終希釈物が検出可能な吸光度を有していた場合に、ベクターの力価を評価した。
【００８５】
細胞溶解物中のホタルルシフェラーゼ活性を、ウェルから培養培地を吸引すること、並びにウェル当たり200μLの培養培地及びウェル当たり200μLのSteady-GloTM試薬（Promega Corp、Madison、WI）を加えることによって測定した。プレートから細胞が剥離するまで5分間軽く攪拌しながら、プレートをインキュベーションした。次いで、当該細胞溶解物を12×47mmキュベット（BD Pharmingen、San Diego、CA）に移し、それぞれの溶解物のルシフェラーゼ活性を、LUMI-ONE携帯型ルミノメーター（Bioscan、Inc.、Washington、DC）を用いて30秒間の読み取り値をとることによって測定した。
【００８６】
Renillaルシフェラーゼ活性を、「Renillaルシフェラーゼアッセイシステム」（Promega Corp.、Madison、WI）中のプロトコールに従うことによって測定した。簡潔には、細胞をPBSで洗浄し、250μl/ウェルの溶解バッファーを加えた。20μLの基質を100μLの抽出物に加え、それぞれの溶解物のルシフェラーゼ活性を、LUMI-ONE携帯型ルミノメーター（Bioscan、Inc.、Washington、DC）を用いて30秒間の読み取り値をとることによって測定した。
【００８７】
［動物モデル］
全ての動物実験は、NIH及び規格化されたガイドラインに従い行われた。シンドビスウイルスベクターの治療効果を判定するために、SCIDマウス（メス、6〜8週齢、Taconic、Germantown、NY）に、0日目に1.5×106個のES-2/Fluc細胞/マウスを腹腔内注射し、IVIS（登録商標）システムを用いて翌日（1日目に）イメージングして、腫瘍細胞の存在を確認した。次いで4日目に、5マウス/ベクターにRenillaルシフェラーゼを有するベクター：A（JT-BB/SP6-RhRluc）、B（SP6-H/JT-RephRluc）、C（SP6-H/SP6-RhRluc）、D（JT-BB/JT-RephRluc）を用いて腹腔内投与を行った。全てのベクターはES-2/Fluc細胞において同じ力価を有しており、マウス一匹あたり0.5mlのOpti-MEM I中に〜106TUを、マウスに毎日腹腔内投与した。コントロールマウス（n=5）にはシンドビスベクターの処理を行わなかった。その後、1、5、9、及び13日目にIVIS（登録商標）によるイメージングによって、疾患の進行を測定した。
【００８８】
生存曲線をログランク検定と比較した。この試験中に提供された全てのP値は、両側検定の値である。
【００８９】
共局在の実験用に、2匹のSCIDマウス/ベクターに、0日目に2×106個のES-2/Fluc細胞を腹腔内接種し、5日目にベクターC（0.5mLのOpti-MEM I中に〜106TU）の1回の腹腔内投与を行った。翌日（6日目）、0.2mg/mLのセレンテラジン（Biotium、Inc.、Hayward、CA）0.3mLをマウスに腹腔内注射し、次いでRenillaルシフェラーゼ活性をIVIS（登録商標）によってイメージングした。30分後、同じマウスに15mg/mLのD-ルシフェリン（Biotium、Inc）0.3mLを腹腔内注射し、ホタルルシフェラーゼ活性に関する第2のIVIS（登録商標）イメージングを実施した。
【００９０】
細胞親和性の実験を、1ベクターあたり5匹のマウスを有する2群のSCIDマウス：腫瘍を誘発しなかった一群及び誘発された腫瘍を有する第2のマウス群において実施した。
【００９１】
無腫瘍動物に、0日目にFlucベクターを腹腔内注射し、1日目にIVIS（登録商標）によってイメージングし、2日目にベクターの2回目の注射を施し、3日目に再度IVIS（登録商標）によってイメージングした。
【００９２】
第2群に関しては、SCIDメスマウスに、0日目に2×106個のES-2細胞/マウスを腹腔内注射し、4日目にはマウスに、ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するベクターを注射した。1日目の最初の全身のIVIS（登録商標）によるイメージングの後に、別の腹膜腔のIVIS（登録商標）イメージング用に腹膜を除去した。バックグラウンドコントロール用のもの以外の群の残りのマウスに、6日目にベクターの2回目の腹腔内注射を施し、7日目に再度イメージングした。
【００９３】
［IVIS（登録商標）イメージングシステムを用いたin vivoにおける生物発光の検出］
低温冷却したIVIS（登録商標）イメージングシステムシリーズ100（Xenogen）を、Living Image取得及び分析ソフトウェア（バージョン2.11、Xenogen Corp.Alameda、CA）とともに使用して、マウス中の生物発光シグナルを検出した。ホタルルシフェラーゼの検出用に、各マウスにPBSに溶かした15mg/mlの甲虫ルシフェリン（カリウム塩；Promega Corp.、Madison、WI）0.3mlを腹腔内注射した。5分後、0.3mlのアベルチン（5%tert-アミルアルコール中に1.25%の2,2,2-トリブロモエタノール）またはイソフルラン混合酸素を用いてマウスに麻酔をかけた。当該イメージングシステムは、最初に減光照明下でチャンバー内に写真画像を撮り、続いて発光画像を取得した。擬似色画像の重なりは、活性ルシフェラーゼによって生じた空間中のフォトン数の分布を表す。全てのマウス腫瘍モデルに関する発光画像の取得に対し、1分の統合時間（integration time）を使用した。Living Imageソフトウェア（Wave Metrics Inc.、Lake Oswego、Oregon）を使用して、マウスから得た全生物発光シグナルを（フォトン数に関して）統合した。IVIS（登録商標）イメージングシステムのin vitro検出限界は、1,000ES-2/Fluc細胞である。
【００９４】
［Ar-339配列の分析］
Ar-339ウイルスをニワトリ胚線維芽細胞において増幅させ、6個の別個の重複断片として、シークエンシングしたプラスミド内にクローニングした（図１）。CDNA-3BとCDNA-4は、当該ウイルスのサブゲノムプロモーターを含む312bp断片（nt7334〜7646）重複している。RTまたはPCR反応による突然変異を回避するために、それぞれのプラスミドに対して3つの異なるRT反応を実施し、それぞれは1つのPCR反応用の鋳型として働いた。それぞれの断片の3つのPCR増幅バンドを別々にクローニングし、シークエンシングし、比較して当該ウイルスの配列を確認した。得られたAr-339の配列を、シンドビスの公開された配列（Strauss EG、Rice CM及びStrauss JH 1984）、並びに我々が我々の研究室で以前に使用したシンドビスベクター、JT-BB、及びJT-Rep（Tseng et al 2004a、b）の配列と比較した。当該結果を表IV（付表A）中に示す。Strauss配列とJTベクターの間の配列の違いを、表V（付表A）中に記載する。JT及びAR-339プラスミド間の機能的変化は、表VI（付表A）中に要約する。
【００９５】
ウイルスレプリカーゼにおいて、StraussマップとAr-339を比較すると、nsp1において3箇所の点突然変異：nt353サイレント突然変異、nt1380及び1381を発見した。いずれもAr339においてアミノ酸441がCysからIleに変化していた。シンドビス様ウイルス超群では、メチルトランスフェラーゼnsp1は4個の保存されたモチーフI（a.a31〜51）、II（a.a87〜86）、III（168〜220）、及びIV（243〜260）を有する（Rozanov et al.1992）。Cys441からIleへの変化は、酵素活性に必要とされるカルボキシ末端ドメイン（K468〜L512）中には存在しない（Wang et al.1996）。Nsp2は、Strauss配列と比較して3つの突然変異を有しており、1つはnt3698におけるサイレント突然変異（AからG）であり、並びにアミノ酸438（ProからLeu）及び634（LysからGlu）がそれぞれ変化する2つの突然変異（nt2992及び3579）である。両方のアミノ酸は、nsp2の活性ヘリカーゼ及びプロテアーゼドメインの外側に存在する（Rikkonen et al.1994）。Strauss配列中に記載されたのと同様に、438にProを有するシンドビスウイルスは、ウイルス複製に対して致命的な影響を有する（Rice et al.1987）。nsp4では、nt7337においてサイレント突然変異が存在した（TからC）。
【００９６】
構造タンパク質に関して、Ar-339カプシドタンパク質は、Strauss配列と比較して2つの突然変異、nt8345における1つのサイレント突然変異（CからA）及びPro67がGlnに変化したnt7846における1つの突然変異を有していた。Straussコンセンサス配列及びJTベクターでは、プロリンは67位に存在する。この残基は、オーストラリアのウイルスの異なる単離体中に保存されており、これに対し、ニューギニア内の単離体であるMK6962では、Tyr（T）がこの部位に存在する（Sammels et al.1999）。この変化は、シンドビスRNAと結合しない11〜74アミノ酸領域内に存在し（Geigenmuller-Gnirke et al.1993）、E2またはカプシドタンパク質の相互作用ドメイン残基36〜39、108〜111、172、180〜183、201、231〜234、240、または254内には存在しない（Katherine E.Owen and Richard J.Kuhn、1996；H.Lee and D.T.Brown 1994）。
【００９７】
nt10392（TからC）及び10469（TからA）においてE1の2つのサイレント突然変異がさらに存在し、Ar-339におけるStraussマップとの2つの違いが、Ar-339中の位置Ala72からVal及び237（SerからAla）が発見され、これらはいずれもドメインII中に位置する。このドメインの残基は、当該ウイルススパイクにおけるE1-E1相互作用と関係がある（Zhang W et al.2002）。
【００９８】
コード変化の大部分はエンベロープタンパク質E2中で見出され、当該ウイルスの抗原部位及び結合受容体ドメインは記載されている。Strauss配列とAr-339を比較すると、5つのアミノ酸変化がE2タンパク質の外部リーフ様ドメインに局在していることが分かり、これはアミノ末端から残基218に広がる（Zhang W et al.2002）。変化は、アミノ酸3（IleからThr）、23（ValからAla）、70（LysからGlu）中であり、さらに2つの突然変異、172（ArgからGly）及び181（GluからLys）が、推定結合受容体ドメイン（アミノ酸170〜220）中に存在する。当該カプシドタンパク質（391〜483）またはE2-E1相互作用領域と相互作用するエンドドメイン中では、変化は見られなかった。
【００９９】
JTプラスミドとAr-339配列の間のアミノ酸変化の分析によって、当該レプリカーゼにおけるただ1つの突然変異、nsp1のCys441からIleへの突然変異が明らかになった。当該構造タンパク質中には、合計8つの違いが存在し、当該カプシドタンパク質中にはただ1つ、Pro67からGlnであり、E1及びE2エンベロープタンパク質中には7つであった。E1における3つの突然変異は、Ala72からVal、Gly75からAsp、及びSer237からAlaであった。当該差異の大部分はE2タンパク質中で見られ、3つはリーフ様ドメイン中に、Ile3からThr、Lys70からGlu、及びGlu181からLys、並びに1つは外部ドメイン中に、Val251からAlaであった。V251はCEFにおけるウイルス成熟に重要である（Li ML et al.1999）。
【０１００】
［ベクターの構築］
Ar-339ベクターを構築するために、シンドビスのゲノムを2つのプラスミド：レプリコン及びヘルパーに分けた（図２）。in vitro転写したウイルスRNAを感受性細胞系にエレクトロポレーションにより導入して、ゲノムとしてレプリカーゼRNAを含み構造遺伝子を欠く、ウイルスベクターと呼ばれる複製欠陥シンドビスウイルスを生成するように、このベクター系を設計する。in vitro転写用に、当該ウイルス配列の前にバクテリオファージプロモーターが必要とされる。
【０１０１】
この系におけるウイルスベクターの収量を比較するために、二対のベクター、SP6プロモーターの制御下にあるレプリコン及びヘルパーを有する一対（SP6-HとSP6-R）、及びT7プロモーターの制御下にあるもう一対（T7-HとT7-R）を作製した。
【０１０２】
前記レプリコンは、ウイルスレプリカーゼ、パッケージングシグナル、nt945〜nt1075、（Weiss B et al.1994； Frolova et al 1997）、ウイルスサブゲノムプロモーター、関心のある遺伝子の挿入及び発現を可能にするマルチクローニングサイト1（MCS1）、及びウイルス（-）鎖RNA合成を可能にするウイルスの3'末端（nt11394〜11703）を含む。第2のマルチクローニングサイト（MCS2）は、in vitro転写用のプラスミドの線状化を可能にする。
【０１０３】
前記ヘルパープラスミドは、当該ウイルスの最初の425nt、次にサブゲノムプロモーター、カプシド、及びウイルスエンベロープタンパク質（E3、E2、6K及びE1）並びに3'末端（nt11394〜11703）を含む当該ウイルスの3'末端nt 7334〜nt 11703を含む。
【０１０４】
両プラスミドは、以下のウイルス配列、最初の425nt及び3'末端の309nt、並びにサブゲノムプロモーターを共有している。
【０１０５】
両プラスミドは、共通のいくつかの非ウイルス要素、pUCクローニングプラスミド由来の複製起点（reppMB1）及びアンピシリン耐性遺伝子、in vitro転写用のプロモーター（T7またはSP6）、及びMCS2を有する。構築プロセスにおいて、両ベクターに共通であるpUC配列、SP6またはT7プロモーター、マルチクローニングサイト、及びウイルス3'末端を含むプラスミドを最初に作製した。次いで、特定のウイルス配列をこのプラスミド内にクローニングした（図３）。
【０１０６】
［SP6及びT7プロモーター］
in vitro転写系に関して、SP6またはT7RNAポリメラーゼを使用することによる、長いRNA転写産物に対するRNA収量は異なる可能性がある。当該プロモーターがウイルスベクター生成の力価の違いを示すかどうかを試験するために、BHK-21細胞に二組のin vitroで転写されたRNA：SP6-AH及びSP6-ARepLacZをエレクトロポレーションにより導入して、SP6-LacZウイルスベクターを作製し、T7-AH及びT7-ARepLacZを用いてT7-LacZベクターを作製した。反復実験においてBHK-21細胞における両ベクターの力価を比較することによって、等しい力価、〜106の形質導入単位（TU）/mLを得た。感染粒子の産生に関して、両プロモーターはこの系において同じ効率で働く。
【０１０７】
当該4個のプラスミド（SP6-AH、SP6-ARep、T7-AH及びT7-ARep）のシークエンシングによって、polyA前のウイルスの3'末端における1個のTの欠失（SVnt11686）が明らかになった。ウイルスベクターに対するこの欠失の影響を試験するために、欠失のない4個の新しいプラスミド（SP6-H、SP6-R、T7-H、及びT7-R）を構築し、両組のプラスミド由来のウイルスベクターの力価を比較した。有意な差異は観察されず、T11686の欠失はベクターの複製に重要ではないことが示された。これら4組のベクターは同じin vitro力価を示したため、結果を標準化するために、SP6-H及びSP6-Rプラスミドを使用することによって、マウスを用いた実験を実施して、ウイルスベクターを合成した。
【０１０８】
＜実施例３：生物学的性質＞
［細胞親和性］
JT及びAr-339ベクターの間で見られた大部分のアミノ酸の違いは、エンベロープタンパク質中に存在した。そのうちの1つはBHK-21へのウイルス適合性、E2のLys70からGluへ、に関するものであり（McNight K et al、1996）、そのうちの2つはE2タンパク質の受容体結合ドメインに位置した。アミノ酸の変化がウイルスベクターの感染性に対して何らかの影響があったかどうかを分析するために、JT、Ar-339、及びキメラウイルスベクターを生成し、3つの細胞系：BHK-21（ベビーハムスター腎臓）、ES-2、及びMosecヒト及びマウス卵巣癌細胞系においてそれぞれ力価測定した。当該結果を表VII（付表A）中に示す。JT-BBヘルパーを有するベクター（JT-BB/SP6-ARepLacZ及びJT-BB/JT-RepLacZ）は、BHK-21において他の2つの細胞系より2log高い力価を有しており、当該ヘルパーがSP6-Hである場合、観察した差はわずか1logであった。in vitroにおける当該ベクターの感染性は、卵巣癌細胞系、ES-2及びMosecにおいて同等であった。この差は反復実験において観察された。
【０１０９】
［疾患の進行］
シンドビスベクターAr-339及びJTによる疾患の進行を標的化及び抑制する際の能力を比較するために、JT及びAr-339キメラベクターを生成し、以前に記載された（Tseng et al.2004b）ES-2/Flucマウス転移性卵巣癌モデルにおいて試験した。1ベクター群当たり5匹のメスSCIDマウスに、1.5×106個のES-2/Fluc細胞を腹腔内注射し（0日目）、翌日IVIS（登録商標）によりイメージングしてES-2/Fluc細胞の存在を確認した。ベクターを用いた1日1回の処理を開始するまで、細胞を4日間増殖させた。5つのマウス群が存在し、そのうちの1群にはベクター処理を施さず、一方残りの4群はベクター：A（JT-BB/SP6-RhRluc）、B（SP6-H/JT-RephRluc）、C（SP6-H/SP6-RhRluc）、及びD（JT-BB/JT-RephRluc）を有していた。これらの系統はBHK-21細胞において異なる細胞親和性を示したため、腫瘍ES-2/Flucを誘導するために使用した同じ細胞系においてベクターを力価測定し、全てのベクターに対する力価を106 TU/mLで標準化した。全身の総フォトン数を1、5、13、及び19日目にIVIS（登録商標）によるイメージングによって測定して、ES-2/Fluc転移の疾患進行を測定した（図４）。生存曲線も比較した（図５）。
【０１１０】
Ar-339レプリカーゼ（SP6-RhRluc）及びJT構造タンパク質を有するベクターAは、腫瘍の進行を低下させる際により有効であり、当該動物のより長い生存期間をもたらした。同じ構造タンパク質を有するベクター、ベクターB対C、並びにA対Dを比較した。いずれの場合も、Ar-339レプリカーゼ（SP6-RhRluc）に関してさらなる腫瘍の減少があった。構造部分に関しては、同じレプリカーゼを有するベクターを分析した場合、ある場合ではSP6-Hはより有効であるようであったが（ベクターD対B）、フォトン数の差が大きいA対Cの場合では、JT-BBが腫瘍標的化においてより有効である。ベクターB、C、及びDの間のわずかな差は同様の動物生存データと関係があり、構造タンパク質とレプリカーゼの両方がin vivoにおける当該ベクターの有効性に機能するが、これらのデータは、腫瘍細胞に対するAr-339レプリカーゼ（SP6-R）の標的化の改善は、より有効な遺伝子療法ベクターをもたらし得ることを示唆する。
【０１１１】
［共局在］
腫瘍細胞のAr-339シンドビス感染の程度及び特異性を立証するために、IVIS（登録商標）イメージング試験を実施し、腫瘍細胞及びベクターからの独立した生物発光シグナルを測定した。当該ES-2/Fluc細胞は、基質としてD-ルシフェリンを使用するホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現し、当該ベクターは、セレンテラジンを使用して生物発光を生じる軟体サンゴRenilla renifomis（Rluc）からクローニングした異なるルシフェラーゼ遺伝子を有していた。前記2つのルシフェラーゼは基質特異性が高く、交差反応しない（Bhaumik S及びGambhir SS.2002）。それぞれの麻酔をかけたマウスを、まずセレンテラジンで処理し、画像を収集し（図６Ａ、左図）、次いで2回目のIVIS（登録商標）イメージングのために、今度はES-2/Fluc細胞用にD-ルシフェリンで処理した（図６Ａ、右図）。同じ動物においてシンドビス/Rluc及びES-2/Flucから生じた生物発光シグナルを、Living Imageソフトウェアを使用することによって定量化した。Rluc及びFlucシグナルの画像はグリッドで区切り（12 8,96の四角で囲った領域）、対応する領域を統計的相関について分析した（図６Ｂ）。Ar-339シンドビスベクターの1回の腹腔内送達が、腹膜腔中の転移した腫瘍細胞の有効な感染をもたらしたことを示す、非常に有意な関係が立証された（P<0.0001）。数匹のマウスにおいて、腹膜腔の外側のさらなる感染を観察した。
【０１１２】
［Ar-339の標的化］
Ar-339系統によって標的化される組織または臓器を分析するために、レポーター遺伝子としてホタルルシフェラーゼ（Fluc）を用いて新たなキメラベクターを作製した、なぜならその強烈な生物発光シグナルによって、動物臓器中のベクターを試験することができるためである。それぞれのベクターを2群の5匹のSCIDメスマウス：無腫瘍及び5日目のES-2転移誘導型マウスにおいて試験した。Cベクターのどの部分が胸部の生物発光の原因であったかを評価するために、3個のFlucキメラベクター：A（JT-BB/SP6-RFLuc）、B（SP6-H/JT-RepFluc）、及びC（JT-BB/JT-RepFluc）を作製した。前記と同様に、ES-2細胞においてベクターを力価測定した。無腫瘍マウスに1回用量のベクター（104 TU/mL）を0日目に与え、翌日IVIS（登録商標）によってイメージングした（図７Ａ）。全3群が脂肪組織中で低度のバックグラウンドシグナルを示した。5匹のベクターBマウスのうちの2匹、及びベクターC群中の5匹のマウスのうちの1匹が、共局在の実験で以前に観察したのと同様に、胸部においていくらかのさらなる生物発光シグナルを示した。ベクターがこれらのマウス中の臓器に感染しているかどうかを調べるために、腹膜腔及び採取した臓器をさらにIVIS（登録商標）によってイメージングした。観察した胸部のシグナルは肋骨中の結合組織に対応するが、臓器にはバックグラウンドシグナルがなかった。これらのベクターの反復投与が、無腫瘍マウスにおいて累積的感染をもたらし得るかどうかを試験するために、2回目の投与は2日目の腹腔内注射であり、イメージングは3日目に反復した。当該結果（図７Ｂ）はベクターB及びCに関する脂肪組織中での低度のバックグラウンドシグナルを示し、ベクターAに関しては全くシグナルを示さず、当該バックグラウンドは一時的であり、反復処理におけるAr-339ベクターの標的有効性に影響を及ぼさないだろうことが示された。
【０１１３】
ES-2腫瘍誘導型マウスにおけるJT/Flucベクターの前の試験は、1回の注射の後、さらに2日後の2回目の投与で、当該ベクターは転移したES-2細胞を特異的に標的化することを示した（Tseng et al.2004）。配列間の違いがAr-339ベクターの特異性に影響を与える可能性があるかどうかを試験するために、これら3個のキメラベクターを同じモデルで試験した。マウスには2×106個のES-2細胞を0日目に注射し、5日目に1回腹腔内用量のベクターを与え、6日目にIVIS（登録商標）によってイメージングした。1群当たり2匹のマウスの腹膜腔及び臓器をイメージングした。全てのベクターに関して図８Ａ中に示したように、生物発光はES-2転移性移植片と相関した。7日目に、1群当たり2匹のマウスに、ベクターの2回目の腹腔内投与を施し、1匹のマウスには注射せず、ルシフェラーゼバックグラウンドシグナルのコントロールとして働かせた（図８Ｂ）。ベクターAは前の投与と比較して同様のシグナルを示したが、Ar-339構造タンパク質、B、及びCを有するベクターは、最初の注射と比較して腫瘍中で低下した生物発光シグナルを示した。再感染の違いは、構造タンパク質中のアミノ酸の変化は、ベクターを用いた反復処理によって転移を標的化する際に、重要な役割を果たす可能性があることを示唆する。
【０１１４】
どの突然変異がベクターの性質に重要であるかを決定するために、キメラベクター：JT-BB由来のE2及びAr-339由来の残りの構造タンパク質を含むQE2を作製した。我々が前の実験と同じIVIS（登録商標）動物モデルにおいてAr-339ベクターと比較すると、無腫瘍動物では、1回目の投与で脂肪組織中に低度のバックグラウンドを観察し、2回目の投与ではシグナルは観察されなかった。ES-2 5日誘導型腫瘍マウスにおいて、ベクターQE2は腫瘍を標的化し、動物に再感染することができたが、生物発光シグナルはAr-339ベクターほど強くなかった（データ示さず）。これは、最適なアミノ酸パターンは依然明らかではなかったが、E2エンベロープタンパク質中のAr-339配列は主に標的化パターンに関与することを示す。この問題に取り組むために、部位特異的突然変異誘発をAr-339 E2エンベロープタンパク質において実施した。
【０１１５】
［E2突然変異体］
E2エンベロープは、主にシンドビスウイルスの細胞親和性及び感染性の原因であるタンパク質として記載されている。とりわけ、Lys70はBHK-21の特異性と関係があり（McNight K et al、1996）、さらに残基69〜72は脊椎動物細胞の標的化と関連している（Ohno K et al.1997；Dubuisson J及びRice CM、1993）。Ar-339系統はこの位置にGluを有するため、70位にLysを含む3個の点突然変異体を作製した（図９）。Mut-1では、Ar-339のGlu70のみがLysに変化した。E2のアミノ酸251は異なるシンドビス単離体間で高度に保存されており（Sammels LM et al.1999）、この位置におけるバリンへの突然変異は宿主範囲の表現型と関連している（Li ML et al.1999）。ベクター標的化におけるこのアミノ酸の影響を調べるために、Lys70及びさらにValに突然変異したAr-339のAla251を有するMut-2を生成した。3位及び181位の残基はE2タンパク質の外部リーフ様ドメインに位置し、181は受容体結合ドメインに存在する。E2におけるこれら4つのアミノ酸変化の組合せが、Ar-339ベクターの感染の違いに関与するかどうかを評価するために、Lys70、及びVal251、並びにAr-339のThr3からIleへ、及びAr-339のLys181からGluへの変化を有する突然変異体Mut-4を生成した（図９）。前記突然変異体を、ベクターA、B、及びCに関して前に記載したのと同様に、無腫瘍及びES-2 5日誘導型腫瘍マウスにおいて試験した。シグナルの違いが当該E2突然変異体によるものであったことを確かめるために、同じレプリカーゼSP6-RFlucを有する全部で5個のベクター：ベクターA（JT-BB/SP6-RFluc）、C（SP6-H/SP6-RFluc）、Mut-1（SP6-H-K70/SP6-RFluc）、Mut-2（SP6-H-K70-V251/SP6-RFluc）、及びMut-4（SP6-H-I3-K70-E181-V251/SP6-RFluc）を試験した。
【０１１６】
BHK-21細胞及び卵巣細胞系ES-2及びMosecにおいてベクターを力価測定した（表VIII（付表A））。BHK-21において力価測定すると、突然変異体はAとCの間で卵巣細胞系におけるより大きな違いを示した。
【０１１７】
無腫瘍マウスでは、ベクターA及びCは数匹の動物においてバックグラウンドシグナルをもたらした。5匹のマウスのうちの1匹のみ、ベクターCマウスが肋骨中で低度の生物発光シグナルを示した（図１０Ａ）。これらのベクターの2回目の投与では、バックグラウンドシグナルはさらに顕著ではなかった（図１０Ｂ）。Mut-1及びMut-2は、いずれの投与でもバックグラウンド生物発光シグナルを産生しなかった。Mut-4は、ベクターA及びCよりはるかに強度が低く、脂肪組織中でかろうじて検出可能なシグナルを示した。
【０１１８】
ES-2腫瘍誘導型マウスでは（図１１Ａ）、Aベクター群中のマウス#79及びCベクター群中の#88は生物発光を示さず、これらのマウスは腹膜腔中でES-2転移性移植片を発達させなかった（これらのマウスは図中に示さない）。
【０１１９】
この結果は、1回目及び2回目の投与後の、突然変異体Mut-1及びMut-2の感染性の劇的な低下、並びにMut-4の重要な減少を示した（図１１）。Ar-339 E2中の70位におけるただ1つのアミノ酸の変化が、ベクターCにin vivoにおけるES-2腫瘍転移を標的化する際の特異性を喪失させる。251位のバリンを有する二重突然変異体、Mut-2はベクター親和性を回復しない。Mut-4はベクターA E2とAr-339 E1、E3、及びカプシド配列を組み合わせる。Mut-4が完全な完全性を回復し得ないという事実は、ベクタースパイク中のE2とE1の間の相互作用が、ベクター標的化において重要な役割を果たし得ることを示している。
【０１２０】
＜実施例４：Ar-339、Mut-4、及びJTベクターによる疾患進行の抑制＞
前のマウスの実験では、ベクターCは処理した動物の数匹においてバックグラウンド感染を示した。この影響は一時的であり、且つベクターCは疾患進行の抑制において有効であったが、バックグラウンドの組織感染を引き起こさないウイルスベクターを使用することが、遺伝子療法にとって好ましい。SP6-HE2突然変異体の腫瘍標的化の実験において、ベクターMut-4はベクターCより低い強度ではあったが腫瘍標的化を示し（図１１）、バックグラウンド感染は示さなかった（図１０Ａと１０Ｂを比較）。このベクター系を改善する目的で、前の実験中でベクターA、B、C、及びDに関して記載したのと同じモデルを使用することによって、腫瘍を減少させるMut-4の能力を試験し、ベクター-腫瘍の共局在を分析した。
【０１２１】
（材料及び方法）
［動物モデル］
全ての動物実験は、NIH及び規格化されたガイドラインに従い行った。シンドビスウイルスベクターの治療効果を測定するために、SCIDマウス（メス、6〜8週齢、Taconic、Germantown、NY）に、0日目に1.5×106個のES-2/Fluc細胞/マウスを腹腔内注射し、IVIS（登録商標）システムを用いて翌日（1日目に）イメージングして、腫瘍細胞の存在を確認した。次いで4日目に、1ベクターあたり10匹のマウスににRenillaルシフェラーゼを有するベクター、Mut-4（SP6-HI3K70E181V251/SP6-RHRluc）、C（SP6-H/SP6-RhRluc）、及びD（JT-BB/JT-RephRluc）を用いて腹腔内処理を施した。全てのベクターはES-2/Fluc細胞において同じ力価を有しており、1匹のマウスあたり0.5mlのOpti-MEM I中に〜106 TUで、マウスに1日1回腹腔内注射した。コントロールマウス（n=5）にはシンドビスベクターの処理を施さなかった。その後、1、5、9、及び13日目にIVIS（登録商標）によるイメージングによって、疾患の進行を測定した。
【０１２２】
生存曲線をログランク検定と比較した。この試験において提供された全てのP値は両側検定の値である。
【０１２３】
共局在の実験用に、1ベクターあたり2匹のSCIDマウスに0日目に1.5×106個のES-2/Fluc細胞を腹腔内接種し、5日目にベクターMut-4（0.5mLのOpti-MEM I中に〜106 TU）の1回の腹腔内処理を施した。翌日（6日目）、0.2mg/mLのセレンテラジン（Biotium、Inc.、Hayward、CA）0.3mLをマウスに腹腔内接種し、次にRenillaルシフェラーゼ活性をIVIS（登録商標）によってイメージングした。30分後、同じマウスに15mg/mLのD-ルシフェリン（Biotium、Inc）0.3mLを腹腔内注射し、ホタルルシフェラーゼ活性に関する第2のIVIS（登録商標）イメージングを実施した。
【０１２４】
（結果）
［共局在］
腫瘍細胞のMut-4シンドビス感染の程度及び特異性を測定するために、IVIS（登録商標）イメージング試験を実施し、腫瘍細胞及びベクターMut-4（SP6-HI3K70E181V251/SP6-RhRluc）からの独立した生物発光シグナルを測定した。ES-2/Fluc細胞は、基質としてD-ルシフェリンを使用するホタルルシフェラーゼ遺伝子を発現し、当該ベクターは、セレンテラジンを使用して生物発光を生じる軟体サンゴRenilla renifomis（hRluc）からクローニングした異なるルシフェラーゼ遺伝子を有していた。前記2つのルシフェラーゼは基質特異性が高く、交差反応しない（Bhaumik S及びGambhir SS.2002）。それぞれの麻酔をかけたマウスを、まずセレンテラジンで処理し、画像を収集し（図１２Ａ、左図）、次いでES-2/Fluc細胞の一連のIVIS（登録商標）イメージング用にD-ルシフェリンで処理した（図１２Ａ、右図）。同じ動物においてベクター及びES-2/Flucから生じた生物発光シグナルを、Living Imageソフトウェアを使用して定量化した。Rluc及びFlucシグナルの画像はグリッドで区切り（12×8、96の四角で囲った領域）、対応する領域を統計的相関に関して分析した（図１２Ｂ）。Mut-4シンドビスベクターの1回の腹腔内送達が、腹膜腔中の転移した腫瘍細胞の有効な感染をもたらしたことを示す、非常に有意な関係が立証された（P<0.0001）。
【０１２５】
［疾患の進行］
疾患を標的化及び抑制する際のシンドビスベクターAr-339及びMut-4の能力を比較するために、ベクターを構築し、以前に記載されたES-2/Flucマウス転移性卵巣癌モデルにおいて試験した。ベクター群当たり10匹のメスSCIDマウスに、1.5×106個のES-2/Fluc細胞を腹腔内注射し（0日目）、翌日IVIS（登録商標）によりイメージングしてマウス中のES-2/Fluc細胞の存在を確認した。ベクターを用いた1日1回の処理を開始するまで、細胞を4日間増殖させた。動物の4群が存在し、その1群にはベクター処理を施さず、残りの4群は106TU/ml用量のRenillaルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するベクター、C（SP6-H/SP6-RhRluc）、Mut-4（SP6-HI3K70E181V251/SP6-RhRluc）、及びD（JT-BB/JT-RephRluc）を1日1回腹腔内注射した。
【０１２６】
全身の総フォトン数を1、5、13及び19日目にIVIS（登録商標）によるイメージングによって測定して、ES-2/Fluc転移の疾患進行を測定した。生存曲線も比較した（図１３）。ベクターC及びMut-4で処理したマウスは、同様のフォトン数減少及び生存性を示した。これらのデータは、ベクターMut-4（SP6-HI3K70E181V251/SP6-RhRluc）はベクターC（SP6-H/SP6-RhRluc）と同様のin vivoにおける腫瘍減少の有効性を有し、従って遺伝子療法において使用することもできることを示唆する。両ベクター：C及びMut-4は、ベクターDと比較して、有意に改善された腫瘍減少及びマウスの生存を示した。
【０１２７】
＜論文中の実施例１：再誘導Ar-339プラスミドを有するC6/36パッケージング細胞系の生成＞
プラスミドSP6-H及びSP6-Rを使用して、昆虫プラスミドを操作し、Ar-339シンドビスベクターを生成する蚊C6/36由来のパッケージング細胞系を作製することができる。Opa12蚊プロモーター（Theilmann et al.、J.Virology、1995、69 （12）: 7775〜7781中に記載された）を有する3個のプラスミドが、蚊細胞中でウイルス配列を構成的に発現するのに必要とされる。当該レプリコンプラスミド（pIZ-Ar339-R）はレプリカーゼ、サブゲノムプロモーター、及び関心のある遺伝子を有し、他の2個は分割ヘルパー配列を含み、1個はカプシドタンパク質のみを有し（PIB-Ar339-C）、第2のプラスミドはE1、E2、E3及びK6エンベロープタンパク質を有する（pIZ-Ar339-H）。最初のステップでは、C6/36細胞系（ATCC CRL 1660としてAmerican Type Culture Collection、ATCC、Manassas、VAから入手可能である）にはレプリコンプラスミド（pIZ-Ar339-R）をトランスフェクションし、クローンを選択する。第2のステップでは、レプリコンを含む前記クローンにカプシドプラスミド（PIB-Ar339-C）をトランスフェクションし、レプリコン及びカプシド陽性クローンを選択する。最後のステップでは、第2のヘルパープラスミド（pIZ-Ar339-H）を、前記の単離したクローンにトランスフェクションして、3個全てのプラスミドを発現するパッケージング細胞系を作製する。
【０１２８】
１．pIZ/V5-Hisプラスミド内へのSP6-Rレプリカーゼのクローニング
pIZ/V5-His（Invitrogen、San Diego、CA）内にAr-339レプリカーゼをクローニングするためには、SP6プロモーターの前にSacI RE部位を導入することが必要である。
【０１２９】
１．１−PCR反応をプライマーSacI_SP6F/cDNA-1Rを使用してSP6-R#406プラスミドにおいて実施し、次いで当該2340bpのバンドをpcr4blunt_topoベクター（Invitrogen、San Diego、CA）内にクローニングする。新たなプラスミドTOPO-Rep1
プライマー配列：
SacI_SP6F  GGCTAGAGCTCATTTAGGTGACA（SacI）
cDNA-1R  GTAACAAGATCTCGTGCCGTGACA
【０１３０】
１．２−前記SP6-R#406プラスミドをBglII/NotIで消化し、当該5776bpのバンドをBglII/NotI TOPO-Rep1内にクローニングして、新たなプラスミドTOPO-Ar339-Rを作製する。
【０１３１】
１．３−当該8085bpのSacI/NotI TOPO-Ar339-RバンドをSacI/NotI PIZ/V5-His内にクローニングして、pIZ-Ar339-Rを作製する。
【０１３２】
２．Ar-339ヘルパーPのクローニング
複製能のある組換えコンピテントウイルスの存在を最小にするために、当該ヘルパーのゲノムを2つのプラスミド：PIB-Ar339-C及びpIZ-Ar339-Hに分ける。
【０１３３】
２．１−pIB-Ar339-Cの構築
Ar-339カプシドDNA配列を、当該ベクターのBamHI/SpeI部位においてpIB-V5-His（Invitrogen、San Diego、CA）内にクローニングする。プライマーC1-F及びC1-Rを使用してプラスミドSP6-H#432においてPCRを実施し、Ar-339カプシド1133bpのDNAバンドを得る。
C1-F  GGA TCT CCG GAT CCC CTG AAA AGG（BamHI）
C1-R  GTG ACC AGT GGA CTA GTG GAC CAC TCT TC （SpeI）
【０１３４】
当該バンドを消化し、BamHI/SpeI部位においてpIB-V5-Hisベクター内にクローニングして、新たなプラスミドpIB-Ar-339-Cを作製する。
【０１３５】
２．２−pIZ-Ar339-Hの構築
最初のステップは、Ar-339の5'末端（nt425〜692）をpIZ/V5-His内にクローニングすることである。プライマー416B-F及び676NB-Rを用いてSP6#432プラスミドにおいてPCR反応を実施する。制限部位はこの非コード配列中に含まれ、ヘルパー配列のさらなるクローニングを可能にする。
416B-F  GGA TCT CCG GAT CCC CTG AAA AGG CTG T（BamHI）
676NB-R  GAT GAA AGG ATC CTC GCG AAC TAT TTA GGA CCA CCG（BamHI/NruI）
【０１３６】
当該296bpのバンドをBamHIで消化し、pIZ/V5-HisのBamHI部位においてクローニングしてpIZ-5ENDプラスミドを作製する。
【０１３７】
第2のステップでは、SP6-H#432プラスミドをNruI及びXhoIで消化し、当該3435bpのバンドを前記pIZ-5ENDプラスミドのNruI/XhoI部位にクローニングする。
【０１３８】
本発明は、本明細書に記載した特定の実施形態によって範囲が制限されるべきではない。実際、本明細書に記載したもの以外の本発明の様々な変更形態は、前述の記載及び添付の図面から当業者には明らかになるはずである。このような変更形態は、添付の特許請求の範囲内に入ると考えられる。
【０１３９】
全ての値は近似値であり、記載のために与えられることはさらに理解されよう。
【０１４０】
特許、特許出願、刊行物、製品に関する記載、及びプロトコールを本出願中に引用し、その開示はあらゆる目的でその全容が参照により本明細書に組み込まれている。
【０１４１】
付表A
【表１】
2008534014.tif 000002
【０１４２】
【表２】
2008534014.tif 000003
【０１４３】
【表３】
2008534014.tif 000004
【０１４４】
【表４】
2008534014.tif 000005
【０１４５】
【表５】
2008534014.tif 000006
【０１４６】
【表６】
2008534014.tif 000007
【０１４７】
【表７】
2008534014.tif 000008
【０１４８】
【表８】
2008534014.tif 000009
【０１４９】
（参考文献）
2008534014.tif 000010
2008534014.tif 000011
2008534014.tif 000012
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１】シンドビスウイルスAr-339のcDNAクローニング。Ar-339の11703ntのゲノムRNAを灰色の線で概略的に示し、ウイルスのサブゲノムプロモーター（PSG）のnt7334〜7646を灰色の中実の四角形として表す。当該ウイルスゲノムを、6個のPCR重複断片でクローニングした。ウイルスレプリカーゼ（灰色の点線）及びサブゲノムプロモーターを、4個のPCR断片：CDNA-1、CDNA-2、CDNA-3A、及びCDNA-3Bでクローニングした。シンドビスのサブゲノムプロモーター及び構造タンパク質配列（灰色の破線）を、2個のPCR重複断片CDNA-4及びCDNA-5でクローニングした。さらなるクローニングストラテジーに使用したPCR断片中の制限酵素部位の位置を示す。
【図２】シンドビスのレプリコン及びヘルパープラスミド。シンドビスウイルスAr-339のゲノムを2つに分けて、レプリコンプラスミドとヘルパープラスミドの両方を作製した。ウイルスの配列を灰色で表す。ウイルスのヌクレオチド番号を示し、Strauss et at 1984の配列に従う。
【図３】ベクター構築の概要。最初のステップで、細菌断片（アンピシリン耐性、pMB1複製起点）、バクテリオファージプロモーターT7、2つのマルチクローニングサイト（MCS1及びMCS2）、及び当該ウイルス配列の3'末端（灰色の破線）を含むプラスミドT7-pUC-PolyA#114を作製した。レプリコンを作製するために、制限酵素（RE）で消化しゲル精製された、CDNA-1、CDNA-2、及びCDNA-3由来のDNA断片を、T7-pUC-PolyA#114内に連続的にクローニングした。ヘルパーを作製するために、最初にCDNA-1プラスミド由来のMfeI/BamHI断片をT7-pUC-PolyA#114内にクローニングし、CDNA-4及びCDNA-5由来のバンドをこのプラスミド内にクローニングした。Ar-339のcDNA断片をクローニングするために使用したプライマーの配列を表I（付表A）中に示す。
【図４Ａ】Ar-339及びJTキメラベクターによる疾患進行の抑制。ES-2/Fluc細胞（1.5×106）を、0日目にSCIDマウスに腹腔内接種した。翌日（1日目）、基質としてD-ルシフェリンを使用してIVIS（登録商標）Imaging Systemを使用することによってマウスをイメージングし、それぞれ5匹のマウスの5群：ベクター処理を施さなかったコントロール群、ベクターA（JT-BB/SP6-RhRLuc）、ベクターB（SP6-H/JT-RephRluc）、ベクターC（SP6-H/SP6-RhRluc）、及びベクターD（JT-BB/JT-RephRluc）を施した群に分けた。5日目に、前記群に1日1回対応するシンドビスベクターの腹腔内処理を施し、1、5、13、及び19日目にIVIS（登録商標）によってイメージングした。全てのベクター処理が、腸間膜及び横隔膜における腫瘍の増殖を抑制し、コントロールマウスと比較して腹膜網におけるシグナルを低下させた。
【図４Ｂ】Ar-339及び3Tキメラベクターによる疾患進行の抑制。コントロール及びシンドビス処理マウスの全身の総フォトン数の定量分析。誤差線はSEMを表す。
【図５】Ar-339及びJTベクターで処理したマウスの生存曲線。図４中に記載したマウスの生存曲線。ES-2/Fluc腫瘍を有するマウスの生存期間を延長させる際に、ベクターAが最も有効であった。
【図６Ａ】ベクターCの腹膜腔における共局在。IVIS（登録商標）システムにより確認されるように、ベクターC（SP6-H/SP6-RhRluc）感染は、腹膜腔中に転移したES-2/Fluc腫瘍と共局在した。1.5×106個のES-2/Fluc細胞をSCIDマウスに腹腔内接種した。5日後、疾患は依然顕微鏡でしか見えなかったが、接種マウスにベクターCの1回腹腔内処理を施し、翌日イメージングした。最初のIVIS（登録商標）イメージングはRluc基質、セレンテラジンの腹腔内注射によって行い、次に5分間の獲得時間を与えた（左図）。セレンテラジン注射後30分、一時的なRlucシグナルが消失した際に、Flue基質、D-ルシフェリンを腹腔内注射して、ES-2/Fluc腫瘍の位置を決定した（右図）。
【図６Ｂ】ベクターCの腹膜腔における共局在。ベクターCの相関分析は、腹膜腔中の腫瘍細胞とベクター感染の間の高い対応性を示す。
【図７Ａ】Ar-339及びJTキメラベクターのバックグラウンド感染。一群当たり5匹の無腫瘍マウスに1回用量のベクターA（JT-BB/SP6-RFluc）、ベクターB（SP6-H/JT-RepFluc）、またはベクターC（SP6-H/SP6-RFluc）を0日目に腹腔内注射し、翌日（1日目）、IVIS（登録商標）によってベクターのルシフェラーゼシグナルをイメージングした。腹膜腔をイメージングするために腹膜を除去し、臓器を採取し、各マウスに関してイメージングした（列3〜5）。全てのベクターが脂肪組織中で感染を示し、ベクターB及びC群では、数匹のマウスが肋骨において低度のバックグラウンドシグナルを示したが、臓器中では示さなかった。
【図７Ｂ】Ar-339及びJTキメラベクターのバックグラウンド感染。一群当たり数匹のマウスに、2日目にベクターの2回目の腹腔内注射を施し、3日目に腹膜腔（第2列）及び臓器（底部列）中をIVIS（登録商標）によってイメージングした。非常に低いシグナルが、ベクターB及びCに対する脂肪組織中で観察された。
【図８Ａ】Ar-339及びJTキメラベクターの腫瘍標的化。SCIDメスマウスに、2×106個のES-2細胞/マウスを0日目に腹腔内注射した。4日目に、一群当たり5匹のマウスに1回用量のベクターA（JT-BB/SP6-RFluc）、ベクターB（SP6-H/JT-RepFluc）、またはベクターC（SP6-H/SP6-RFluc）を腹腔内注射し、翌日（5日目）、IVIS（登録商標）によってベクターのルシフェラーゼシグナルをイメージングした。腹膜腔をイメージングするために腹膜を除去し、臓器を採取し、イメージングした。全てのベクターが腫瘍移植片を標的化した。腹膜、膵臓-腹膜網、及び腸上の腫瘍を丸で囲む。
【図８Ｂ】Ar-339及びJTキメラベクターの腫瘍標的化。一群当たり数匹のマウスに、6日目にベクターの2回目の腹腔内注射を施し、7日目に腹膜腔（第2列）及び臓器（底部列）をIVIS（登録商標）によってイメージングした。一群当たり1匹のマウス（番号28、33、38）には注射せず、ルシフェラーゼバックグラウンドコントロールとして働かせた。ベクターB及びCは、1回目の注射（A）と比較して腫瘍中で低下した生物発光シグナルを示した。
【図９Ａ】SP6-HA r-339 E2突然変異体。Ar-339 E2突然変異体、Mut-1、Mut-2、及びMut-4において変化したアミノ酸。JT-BBプラスミド由来の配列及び残基は黒色で、Ar-339に対応する配列及び残基を灰色で表す。
【図９Ｂ】SP6-HA r-339 E2突然変異体。Ar-339 E2突然変異体、Mut-1、Mut-2、及びMut-4において変化したアミノ酸。JT-BBプラスミド由来の配列及び残基は黒色で、Ar-339に対応する配列及び残基を灰色で表す。
【図９Ｃ】SP6-HA r-339 E2突然変異体。Ar-339 E2突然変異体、Mut-1、Mut-2、及びMut-4において変化したアミノ酸。JT-BBプラスミド由来の配列及び残基は黒色で、Ar-339に対応する配列及び残基を灰色で表す。
【図９Ｄ】SP6-HA r-339 E2突然変異体。Ar-339 E2突然変異体、Mut-1、Mut-2、及びMut-4において変化したアミノ酸。JT-BBプラスミド由来の配列及び残基は黒色で、Ar-339に対応する配列及び残基を灰色で表す。
【図９Ｅ】SP6-HA r-339 E2突然変異体。Ar-339 E2突然変異体、Mut-1、Mut-2、及びMut-4において変化したアミノ酸。JT-BBプラスミド由来の配列及び残基は黒色で、Ar-339に対応する配列及び残基を灰色で表す。
【図１０Ａ】Ar-339 E2突然変異体のバックグラウンド感染。一群当たり5匹の無腫瘍マウスに1回用量のベクターA（JT-BB/SP6-RFluc）、ベクターC（SP6-H/SP6-RFluc）、Mut-1（SP6-H-K70/SP6-RFluc）、Mut-2（SP6-H-K70-V251/SP6-RFluc）、及びMut-4（SP6-H-I3-K70-E181-V251/SP6-RFluc）を0日目に腹腔内注射した。翌日、ベクターのルシフェラーゼシグナルに関して、マウスをIVIS（登録商標）によってイメージングした。各マウスの腹膜腔をイメージングするために腹膜を除去し、臓器を採取し、さらにイメージングした。E2突然変異体ベクターは、ベクターA及びCに関して観察されるように、脂肪組織のバックグラウンド感染を示さなかった。E2突然変異体の臓器配列をさらに、Bin10解像度でIVIS（登録商標）によってイメージングして、検出限界を増大させた（底部列）、矢印はシグナルを有する領域を表す。
【図１０Ｂ】Ar-339 E2突然変異体のバックグラウンド感染。一群当たり数匹のマウスに、2日目にベクターの2回目の腹腔内注射を施し、臓器を採取し、IVIS（登録商標）によってイメージングした。丸で囲んだマウス（番号17、24、27、32、及び39）には注射せず、ルシフェラーゼバックグラウンドコントロールとして働かせた。高感度Bin10解像度を使用することによってのみ、（矢印で示す）低い生物発光シグナルを、それぞれベクター群A、C、及びMut-4のマウス21、22及び38において検出した。
【図１１Ａ】Ar-339 E2突然変異体の腫瘍標的化。SCIDメスマウスに、2×106個のES-2細胞/マウスを0日目に腹腔内注射した。4日目に、一群当たり5匹のマウスに1回用量のベクターA（JT-BB/SP6-RFluc）、ベクターC（SP6-H/SP6-RFluc）、Mut-1（SP6-H-K70/SP6-RFluc）、Mut-2（SP6-H-K70-V251/SP6-RFluc）、またはMut-4（SP6-H-I3-K70-E181-V251/SP6-RFluc）を腹腔内注射し、翌日（5日目）、IVIS（登録商標）によってベクターのルシフェラーゼシグナルをイメージングした。腹膜腔をイメージングするために腹膜を除去し、臓器を採取しイメージングした。ベクターA及びCは腫瘍を効率良く標的化し、Mut-4は低下した生物発光シグナルを示し、Mut-1及びMut-2は発光を示さなかった。3つの突然変異体に関して、完全なマウス及び臓器配列の、Bin10解像度でのIVIS（登録商標）画像を得た。この高感度でのみ、Mut-1及びMut-2群の数匹のマウスが転移性移植片中で非常に低度の残存シグナルを示した（下図）、矢印はシグナルを有する領域を表す。
【図１１Ｂ】Ar-339 E2突然変異体の腫瘍標的化。一群当たり数匹のマウスに、6日目にベクターの2回目の腹腔内注射を施し、7日目に腹膜腔及び臓器をIVIS（登録商標）によってイメージングした。一群当たり1匹のマウス（番号80、85、89、94、及び99）には注射せず、ルシフェラーゼバックグラウンドコントロールとして働かせた。3つのE2突然変異体に関して、高感度Bin10画像をさらに得た。ベクターは1回目の注射と等しい感染パターンを示した。
【図１２Ａ】ベクターMut-4の腹膜腔における共局在。IVIS（登録商標）Imaging Systemにより確認されるように、ベクターMut-4感染は、腹膜腔において転移したES-2/Fluc腫瘍と共局在した。1.5×106個のES-2/Fluc細胞をSCIDマウスに腹腔内接種した。5日後、疾患は依然顕微鏡でしか見えなかったが、接種マウスにベクターMut-4の1回腹腔内処理を施し、翌日イメージングした。最初のIVIS（登録商標）イメージングはRluc基質、セレンテラジンの腹腔内注射によって行い、次に5分間の獲得時間を与えた（左図）。セレンテラジン注射後30分、一時的なRlucシグナルが消失した際に、Flue基質、D-ルシフェリンを腹腔内注射して、ES-2/Fluc腫瘍の位置を決定した（右図）。
【図１２Ｂ】ベクターMut-4の腹膜腔における共局在。ベクターMut-4の相関分析は、腹膜腔中の腫瘍細胞とベクター感染の間の高い対応性を示す。
【図１３Ａ】Ar-339及びMut-4キメラベクターによる疾患進行の抑制。ES-2/Fluc細胞（1.5×106）を、0日目にSCIDマウスに腹腔内接種した。翌日（1日目）、基質としてD-ルシフェリンを使用してIVIS（登録商標）Imaging Systemを使用することによってマウスをイメージングし、それぞれ5匹のマウス4群：ベクター処理を施さなかったコントロール群、ベクターD、ベクターC、及びベクターMut-4群に分けた。前記群に1日1回対応するシンドビスベクター（106 TU）の腹腔内処理を施し、処理開始後1、5、13、及び19日目にIVIS（登録商標）によってイメージングした。全てのベクター処理が腸間膜及び横隔膜における腫瘍の増殖を抑制し、コントロールマウスと比較して腹膜網におけるシグナルを低下させた。画像スケールは、最小8×103最大105数/ピクセル。
【図１３Ｂ】Ar-339及びMut-4キメラベクターによる疾患進行の抑制。コントロール及びシンドビス処理マウスの全身の総フォトン数の定量分析。誤差線はSEMを表す。
【図１３Ｃ】Ar-339及びMut-4キメラベクターによる疾患進行の抑制。マウスの生存曲線。
【図１】
2008534014.tif 000013
【図２】
2008534014.tif 000014
【図３】
2008534014.tif 000015
【図５】
2008534014.tif 000016
【図６Ｂ】
2008534014.tif 000017
【図９Ａ】
2008534014.tif 000018
【図９Ｂ】
2008534014.tif 000019
【図９Ｃ】
2008534014.tif 000020
【図９Ｄ】
2008534014.tif 000021
【図９Ｅ】
2008534014.tif 000022
【図１２Ｂ】
2008534014.tif 000023
【図１３Ｃ】
2008534014.tif 000024
【図４Ａ】
2008534014.tif 000025
【図４Ｂ】
2008534014.tif 000026
【図６Ａ】
2008534014.tif 000027
【図７Ａ】
2008534014.tif 000028
【図７Ｂ】
2008534014.tif 000029
【図８Ａ】
2008534014.tif 000030
【図８Ｂ】
2008534014.tif 000031
【図１０Ａ】
2008534014.tif 000032
【図１０Ｂ】
2008534014.tif 000033
【図１１Ａ】
2008534014.tif 000034
【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
2008534014.tif 000036
【図１３Ａ】
2008534014.tif 000037
【図１３Ｂ】
2008534014.tif 000038
【配列表】
2008534014000001.app