(57)【要約】  本発明はＰｌＧＦに対する新規なモノクローナル抗体およびそれらのフラグメントおよび誘導体を提供し、より具体的には病的血管新生の治療および／または予防に使用されるヒト化抗体およびそれらのフラグメントに関する。
2008532557.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７〜配列番号２２からなる群から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含むか、またはそれらに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２つの配列を含むことを特徴とするＰｌＧＦに結合することのできる抗原結合性分子。
【請求項２】
配列番号１７〜配列番号２２の配列に対応するＣＤＲ領域またはそれらに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１記載の抗原結合性分子。
【請求項３】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の組合せ、可溶性または膜固定の単鎖可変部分または単一の可変ドメインからなる群から選択される分子である請求項１または２記載の抗原結合性分子。
【請求項４】
配列番号２の配列を含む重鎖可変領域を含むか、またはＣＤＲ領域内でそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ配列番号４の配列を含む軽鎖可変領域を含むか、またはＣＤＲ領域内でそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１または２記載の抗原結合性分子。
【請求項５】
ＬＭＢＰ  ６３９９ＣＢとして寄託された細胞株により産生される抗体１６Ｄ３またはそのフラグメントである請求項１〜４のいずれかに記載の抗原結合性分子。
【請求項６】
ヒト化抗体または抗体フラグメントである請求項１〜４のいずれかに記載の抗原結合性分子。
【請求項７】
ヒト／マウスハイブリッド抗体または抗体フラグメントである請求項１〜４のいずれかに記載の抗原結合性分子。
【請求項８】
前記ＣＤＲ領域がヒト抗体の骨格にグラフトされた請求項１〜４のいずれかに記載の抗原結合性分子。
【請求項９】
前記ヒト抗体がＩｇＧ１κまたはＩｇＧ４κである請求項８記載の抗原結合性分子。
【請求項１０】
配列番号１７〜配列番号２２からなる群から選択される少なくとも２つのＣＤＲか、またはそれらに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する少なくとも２つの配列を含むＰｌＧＦに結合する単鎖可変フラグメントである請求項１または２記載の抗原結合性分子。
【請求項１１】
配列番号２４のアミノ酸配列を含む請求項１０記載の抗原結合性分子。
【請求項１２】
ヒト化抗原結合分子である請求項１１記載の抗原結合性分子。
【請求項１３】
配列番号２６のアミノ酸配列を含む請求項１２記載の抗原結合性分子。
【請求項１４】
請求項１または２記載の抗原結合性分子を産生する細胞株。
【請求項１５】
ＬＭＢＰ  ６３９９ＣＢとして寄託された細胞株である請求項１４記載の細胞株。
【請求項１６】
有効成分として、請求項１〜１３のいずれかに記載のＰｌＧＦ結合分子を医薬的に許容される担体と混合して含む、哺乳動物の病的状態における望まれない血管新生の予防また
は治療のための医薬組成物。
【請求項１７】
さらに、治療有効量の別の血管新生阻害剤を含む請求項１６記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記別の血管新生阻害剤が、ＶＥＧＦ阻害剤とｂＦＧＦ阻害剤からなる群から選択される請求項１７記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ＶＥＧＦ阻害剤が抗ＶＥＧＦ抗体である請求項１８記載の医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれかに記載の抗原結合性分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２１】
哺乳動物の病的状態において望まれない血管新生を治療および／または予防する方法において、そのような治療または予防を必要とする哺乳動物に請求項１〜１３のいずれかに記載の１つ以上の抗原結合性分子である治療有効量の有効成分を投与することからなる方法。
【請求項２２】
病的状態が、癌、炎症、癒着形成、目の病気、肺性高血圧および血液漏出からなる群から選択される請求項２１記載の方法。
【請求項２３】
前記癌が、結腸癌、乳癌、膵臓癌および黒色腫からなる群から選択される請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
ヒト試料中のＰｌＧＦの免疫学的検出のための請求項１〜１３のいずれかに記載の抗原結合性分子の使用。
【請求項２５】
癌の治療でＰｌＧＦ阻害に対して相加作用を有する化合物のスクリーニングのための請求項１〜１３のいずれかに記載の抗原結合性分子の使用。
【請求項２６】
インビトロ診断ツールとしての請求項１〜１３のいずれかに記載の抗原結合性分子の使用。
【請求項２７】
哺乳動物の病的状態において望まれない血管新生を治療および／または予防するための医薬の製造のための請求項１〜１３のいずれかに記載の抗原結合性分子の使用。
【請求項２８】
病的状態が、癌、炎症、癒着形成、目の病気、肺性高血圧および血液漏出からなる群から選択される請求項２７記載の使用。
【請求項２９】
前記癌が、結腸癌、乳癌、膵臓癌および黒色腫からなる群から選択される請求項２８記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の属する技術分野
本発明は、特に病的状態における血管新生の阻害に適する新規な抗体およびそれらのフラグメントならびに誘導体に関する。本発明は、それら特定の抗体を産生する細胞株にも関する。本発明は、本発明の抗体、それらのフラグメントおよび／または誘導体を含む医薬組成物を提供し、腫瘍形成、目の病気、肺性高血圧および炎症性疾患等において望まれない血管新生および／または血液漏出の予防および治療方法、ならびに骨粗鬆症等の骨疾患の予防および治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
異常な血管形成は高い罹患率と死亡率を有する多数の病気の発病に寄与する。血管増殖の根底にある機構の解明は、虚血組織における血管増殖を促進するか、または腫瘍におけるそれら形成を抑制する治療方法の開発を可能とするだろう。胚における最近の遺伝子標的法の研究によって、内皮チャンネルの初期形成（血管新生）および平滑筋細胞の被覆によるそれらのその後の成熟（動脈新生）に関わる機構の一部が同定された。異なる分子機構が病的状態における血管成長を仲介するという証拠が明らかになりつつあるが、その分子的プレーヤーは大部分未確定なままにある。
【０００３】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は脈管構造の発達と病理学的成長に結び付いていることが証明されている（Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ．ｅｔ  ａｌ，１９９９，Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２３７，１−３０）。さらに、ＶＥＧＦの相同体である胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）は、虚血性網膜症、腫瘍形成、炎症性疾患および浮腫等の多様な病的状態におけるＶＥＧＦの特定のモジュレータであることも示されている。ＰｌＧＦ−／−マウスは病気において血管新生および動脈新生が損なわれることが示されたが（Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９０，３８７−４０５）、正常に健康である場合、生理学的血管新生は影響を受けずにいる。よって、ＰｌＧＦの阻害剤は、血管新生と動脈新生が病気の病原性に寄与する病気の治療に莫大な可能性を有する。
【０００４】
ヒトＰｌＧＦに対するヤギポリクローナル抗体（Ｒ＆Ｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ａｂｉｎｇｄｏｎ，ＵＫ）やニワトリポリクローナル抗体（Ｇａｓｓｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｆａｓｅｂ  Ｊ．４，２５２８）等のＰｌＧＦ阻害剤は当分野で知られている。これらの抗体はウエスタンブロット、組織化学および免役沈降研究のために用いられている。ＷＯ０１／８５７９６は、腫瘍形成等の病気の治療または予防のための、モノクローナル抗ＰｌＧＦ抗体等のＰｌＧＦ阻害剤の使用を記載している。より具体的には、マウスＰｌＧＦ−２がそのレセプターＦｌｔ−１に結合することを完全に阻害するマウスモノクローナル抗体の調製が記載され、抗体Ｍａｂ−ＰＬ５Ｄ１１が最も効果的な阻害活性を有するものとして選択されている。病的な血管新生の動物モデルにおける抗体の使用が記載されている。
【０００５】
動物において生成する抗体は、ヒトでの治療においてそれらの使用を厳しく制限しうる特徴を有する。１９８６年にＪａｆｆｅｒｓ等（Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  １９８６  ４１：５７２）により教示されたように、それらの抗体は外来タンパク質として、それらの治療有効性を減少または破壊し、および／または患者においてアレルギー性または過敏性反応を引き起こす抗免疫グロブリン応答（マウス抗体については、ヒト抗マウス抗体またはＨＡＭＡと称される）を誘発することがある。ヒトモノクローナル抗体の使用
はこの制限に取り組むものであろうが、従来のハイブリドーマ技術による大量のヒト抗ヒト抗体の産生は困難であることが証明されている。したがって、マウスのモノクローナル抗体等、動物の高い結合親和性を維持するが、ヒトにおいて低減した免疫原性を示す「ヒト化」抗体を構築するために、組換え技術が当分野で用いられている。特に、非ヒト抗体の可変領域（Ｖ）をヒト抗体の定常（Ｃ）領域に組み合わせたキメラ抗体が提唱されている。そのようなキメラ免疫グロブリンを得る方法は米国特許第５，７７０，１９８号に詳細に説明されている。マウス抗体の免疫原性を低減させる他の試みでは、全Ｖ領域ではなく、相補性決定領域（ＣＤＲ）のみ、すなわち、Ｖ領域の超可変性領域のみがヒト抗体に移植される。そのようなヒト化抗体はＣＤＲグラフト化抗体として知られている。さらに複雑な抗原を認識するＣＤＲグラフト化抗体の構築は、天然の非ヒト抗体よりも顕著に低い結合活性を有する抗体をもたらした。多くの場合に、非ヒトＣＤＲのヒト抗体骨格への単なる導入は完全な結合活性の維持には不十分であることが示された。ヒト化抗体の設計で考慮すべき重要なアミノ酸を同定するために、関心の対象であるマウス抗体の緻密なコンピュータモデルが必要とされ、一般的な理論的指針がそのような設計のために提案されたが、すべての場合に、その手順は関心の対象である特定の非ヒト抗体に適合させて、最適化させる必要がある。
【０００６】
その次には、ヒトＰｌＧＦがそのレセプターに結合するのを最適に阻害する（モノクローナル）抗体の必要性が残っている。さらに、そのような抗体は、ＨＡＭＡを誘発しえない（またはそうする傾向が低い）点で非免疫原性である必要もある。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の要約
本発明は、ＰｌＧＦがそのレセプターに結合することを阻害できる、ＰｌＧＦに対する新規なモノクローナル抗体およびその誘導体に関する。本リガンドは、インビボの病的状態においてヒトＰｌＧＦの阻害を示す最初のものである。さらに具体的には、本発明による抗体およびその誘導体はインビボで腫瘍サイズおよびヒト腫瘍組織の血管新生を低減させることができる。本発明の抗体は、ＶＥＧＦを標的とした現在使用されている抗血管新生療法に代わる手段を提供し、これら療法に関連した生理学的血管新生の阻害により引き起こされる副作用が顕著に低減するという重要な利点を有する。
【０００８】
本発明は、本明細書において１６Ｄ３と称される抗体と同じＰｌＧＦエピトープに結合する、ヒト化抗体および抗体フラグメント等の抗原結合性分子、特にモノクローナル抗体、そのフラグメントまたは誘導体に関する。
【０００９】
本発明の第１の目的は、ＰｌＧＦに結合でき、ＰｌＧＦの機能を阻害する能力を有する新規なモノクローナル抗体であって、より具体的には、それらの重鎖可変領域が配列番号２の配列、またはＣＤＲ領域内においてそれに対して少なくとも８０％、特には少なくとも９０％、最も特には９５％の配列同一性を有する配列を含み、および／またはそれらの軽鎖可変領域が、配列番号４の配列、またはＣＤＲ領域内においてそれに対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする、抗体１６Ｄ３またはその誘導体等の抗体を提供することにある。さらに、またはその代わりとして、さらなる実施形態において、本発明の抗原結合性分子は、ＣＤＲ領域の外側の重鎖および／または軽鎖の可変領域内で、配列番号２および配列番号４の配列のそれぞれに対して少なくとも７０％、特には少なくとも８０％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％同一である配列同一性を有する。
【００１０】
本発明の特定の実施形態にしたがえば、本抗体はヒト化抗体、さらに特にはハイブリッ
ド抗体、最も特にはマウス／ヒトハイブリッド抗体、さらに特にはハイブリッドマウス１６Ｄ３／ヒトＩｇＧ１κまたはＩｇＧ４κである。もしくは、ヒト化抗体は、ＰｌＧＦに結合可能な本発明のマウス１６Ｄ３抗体のＣＤＲ領域を、ヒト抗体の骨格にグラフト化させて含む抗体である。
【００１１】
本発明のさらなる実施形態は、マウス１６Ｄ３抗体またはその誘導体（例えば、そのヒト化抗体）の抗原結合性フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の組合せ、可溶性または膜固定の単鎖可変領域または単一の可変ドメイン等の、しかし、これらに限定されない抗原結合性フラグメントに関する。そのような抗原結合性フラグメントの特定の実施形態は、１６Ｄ３の少なくとも２つのＣＤＲまたはその誘導体、または特に配列番号１７（ＧＹＴＦＴＤＹＹ）、配列番号１８（ＩＹＰＧＳＧＮＴ）、配列番号１９（ＶＲＤＳＰＦＦＤＹ）、配列番号２０（ＱＳＬＬＮＳＧＭＲＫＳＦ）、配列番号２１（ＷＡＳ）および配列番号２２（ＫＱＳＹＨＬＦＴ）からなる群から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含むフラグメントか、またはそれらに対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２つの配列を含むフラグメントを包含する。本発明の特定の実施形態は、ＰｌＧＦ活性を阻害できるマウス１６Ｄ３抗体の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）およびヒト化ｓｃＦｖの提供に関する。最も特には、本発明は、配列番号２４または配列番号２６のアミノ酸配列、またはＰｌＧＦに結合できるＣＤＲ内においてそれと少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むｓｃＦｖを提供する。
【００１２】
本発明のさらなる目的は、本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞株、特に１６Ｄ３抗体を産生する細胞株１６Ｄ３、さらに、例えば組換え技術の結果として１６Ｄ３またはそのフラグメントに由来する抗原結合性分子を産生できる他の細胞株をも提供することである。
【００１３】
本発明のさらなる目的は、１６Ｄ３またはフラグメントまたは誘導体であるＰｌＧＦ抗体、特に１６Ｄ３のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントを医薬的に許容される担体に混合して含む、哺乳動物の病的状態または疾患における（望まれない）血管新生の予防または治療用または骨吸収の予防または治療用の医薬組成物を提供することである。本発明の特定の実施形態は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、可溶性または膜固定の単鎖可変部分または単一の可変ドメインからなる群から選択される１６Ｄ３の抗原結合性フラグメントまたはその誘導体を含む医薬組成物である。本発明の最も特定の実施形態は、配列番号１７（ＧＹＴＦＴＤＹＹ）、配列番号１８（ＩＹＰＧＳＧＮＴ）、配列番号１９（ＶＲＤＳＰＦＦＤＹ）、配列番号２０（ＱＳＬＬＮＳＧＭＲＫＳＦ）、配列番号２１（ＷＡＳ）および配列番号２２（ＫＱＳＹＨＬＦＴ）からなる群から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含むか、または配列番号１７〜配列番号２２からなる群から選択される２つの異なる配列に対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２つの配列を含む抗原結合性フラグメントを含む医薬組成物に関する。その特定の実施形態は、本発明の１６Ｄ３抗体のｓｃＦｖを含む医薬組成物、特に配列番号１７（ＧＹＴＦＴＤＹＹ）、配列番号１８（ＩＹＰＧＳＧＮＴ）、配列番号１９（ＶＲＤＳＰＦＦＤＹ）、配列番号２０（ＱＳＬＬＮＳＧＭＲＫＳＦ）、配列番号２１（ＷＡＳ）および配列番号２２（ＫＱＳＹＨＬＦＴ）からなる群から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含むｓｃＦＶを含む医薬組成物、または配列番号２４を含むｓｃＦｖ等のように配列番号１７〜配列番号２２からなる群から選択される２つの異なる配列に対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２つの配列を含むｓｃＦｖを含む医薬組成物に関する。最も特に
は、医薬組成物は、配列番号２６を含むヒト化ｓｃＦｖ等の、しかし、これに限定されない１６Ｄ３のヒト化ｓｃＦｖを含むか、またはＰｌＧＦに結合することのできるＣＤＲ内においてそれと少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１４】
本発明による医薬組成物のさらに別の特定の実施形態において、治療有効量の別の血管新生阻害剤が、本発明のＰｌＧＦに結合できる抗原結合性分子に加えて含まれる。この点において、最も特には、ＶＥＧＦ阻害剤やｂＦＧＦ阻害剤等の血管新生阻害剤、最も特には抗ＶＥＧＦ抗体が想定される。
【００１５】
本発明の別の目的は、本明細書において開示されたＰｌＧＦに結合する抗体の抗原結合性フラグメントをコードする塩基配列、特に細胞系１６Ｄ３により産生される１６Ｄ３の重鎖および軽鎖の可変領域をコードする塩基配列を提供することにある。もっとも具体的には、配列番号２と配列番号４の可変領域をコードする塩基配列が想定される。さらに、１６Ｄ３の少なくとも２つのＣＤＲを含む抗原結合性フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列、さらに具体的には、配列番号１７（ＧＹＴＦＴＤＹＹ）、配列番号１８（ＩＹＰＧＳＧＮＴ）、配列番号１９（ＶＲＤＳＰＦＦＤＹ）、配列番号２０（ＱＳＬＬＮＳＧＭＲＫＳＦ）、配列番号２１（ＷＡＳ）および配列番号２２（ＫＱＳＹＨＬＦＴ）からなる群から選択される少なくとも２つのＣＤＲをコードするポリヌクレオチド、または配列番号１７〜配列番号２２に対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２つのＣＤＲを含む配列をコードするポリヌクレオチドである。本発明の塩基配列の特定の実施形態は、配列番号１、配列番号３、配列番号５および配列番号６で提供される。さらなる具体的な実施形態は、１６Ｄ３のｓｃＦｖおよびそのヒト化フラグメントをコードする塩基配列、最も特には配列番号２３および配列番号２５の配列、および最も特にはｓｃＦｖのＣＤＲ領域をコードする領域内で、それらに対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を包含する。しかし、遺伝子コードの重複の結果として本発明の範囲に入る多数の塩基配列が存在することが理解されよう。
【００１６】
本発明の別の目的は、哺乳動物の病的状態において望まれない（または病的）血管新生を治療および／または予防する方法において、そのような治療または予防を必要とする哺乳動物に本発明の抗体１６Ｄ３またはその抗原結合性フラグメントまたは誘導体、最も特には本明細書に記載されたｓｃＦｖである有効成分の治療有効量を投与することからなる方法を提供することにある。特に、ヒト化抗体および抗体フラグメント、例えば１６Ｄ３のｓｃＦｖやその誘導体が本発明の方法に特に適する。本発明の方法の特定の実施形態は、癌、炎症、目の病気、肺性高血圧および血液漏出等の、しかし、これらに限定されない病的状態の治療および／または予防に関する。本発明の特定の目的は、哺乳動物、特にヒトにおいて、病的血管新生、特に腫瘍増殖、炎症、目の病気または血液漏出に効果的で安全な（すなわち、副作用のない）療法を提供することにある。最も特には本発明の方法は、固形腫瘍の治療および／または予防、特に結腸癌、乳癌、膵臓癌および黒色腫の治療および／または予防に適する。
【００１７】
本発明の抗体および抗原結合性フラグメントのさらなる使用は、診断方法における標識された標的部分としての、および癌治療でのＰｌＧＦ阻害に対して相加作用を有する化合物のスクリーニングのための、ヒト試料におけるＰｌＧＦの免疫学的検出に関する。
【００１８】
本発明は、新しいリガンド、すなわち、ＰｌＧＦを非常に効率的に阻害する新しいマウスおよびヒト化モノクローナル抗体およびそれらのフラグメント、誘導体および相同体の予期しない測定に基づく。最も特には、本発明は、腫瘍増殖を低減でき、最も特には腫瘍
の大きさを２０％〜５０％低減することのできるリガンドを明らかにする。
【００１９】
ここに記載の特定の実施形態に本発明を限定することを意図しない以下の説明は、参照することにより本書に組み込まれる添付の図面と合わせて理解される。
【００２０】
定義
本明細書において用いられる「１６Ｄ３」との用語は、ＬＭＢＰ６３９９ＣＢの番号でＢＣＣＭ／ＬＭＢＰに寄託された細胞株により産生されるＰｌＧＦに対するモノクローナル抗体をいう。
【００２１】
「抗体フラグメント」との用語は、単独または他のフラグメントと組み合わされて、対応する抗体を産生させる抗原に対して結合することのできる抗体分子の副部分をいう。典型的な抗体分子はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＦｖまたはｓｃＦｖであり、これらは完全抗体に匹敵する抗原親和性をしばしば保持する。それよりも小さなフラグメントとして、重鎖または軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３等のＣＤＲ、すなわち相補性決定領域および／またはそれらの２つ以上の組合せが挙げられる。
【００２２】
本明細書において用いられる「誘導体」との用語は、抗原に対する結合に顕著に影響を与えることなく、（例えば、ハイブリドーマ細胞株により作られた）元の抗体またはそのフラグメントの改変体に対応する抗原結合性分子をいう。典型的な改変体として、元の抗体のアミノ酸配列の改変体、または例えばヒト化に関連して、抗体またはそのフラグメントの標識またはビーズ等の他の分子に対する結合またはグリコシル化の改変に関して、アミノ酸配列上に存在する官能基の改変体が挙げられる。したがって、誘導体は、元の抗体の可変領域および／またはＣＤＲの１つ以上を別の抗体の骨格または同一種か異種のフラグメントにグラフトまたは導入することにより得られたヒト化抗体、ハイブリッド抗体、抗体または他の抗原結合性分子を含むが、これらに限定されない。抗体の誘導体として、合成ポリペプチド等の抗原結合性分子をもたらす抗体の１つ以上のＣＤＲの代替構造物が挙げられる。
【００２３】
本明細書において用いられる「ヒト化抗体または抗体フラグメント」との用語は、元の抗体に比べて、ヒト抗体にさらに密接に似るためにアミノ酸が置換された抗体分子またはそのフラグメントをいう。これらの置換の大多数は抗体または抗体フラグメントの骨格中、すなわち、非抗原結合領域中にある。しかし、ＣＤＲ内で、抗原に対する結合に関与しない、またはほとんど関与しないアミノ酸も置換できることが想定される。
【００２４】
本明細書において用いられる「再形成」抗体または抗体フラグメントまたは「ハイブリッド抗体」は、任意に同一種または異種であることができる少なくとも２つの異なる抗体のそれぞれの一部を含む抗体をいう。典型的には、ヒトハイブリッド抗体は、ある抗体のヒト定常領域を（関心の対象である抗原に対する）別の抗体のヒト化可変領域に結合させたものか、またはある抗体の抗原結合領域の一部アミノ酸配列を別の抗体、例えば関心の対象であるヒト抗原に対する非ヒト抗体の一部の配列で置換したヒト抗体骨格でありうる。特に、関心の対象である抗原に対する親和性を有する１つ以上のＣＤＲまたはそれらの可変領域または部分等のある（通常、非ヒト）抗体の抗原結合領域を、別の（通常、ヒト）抗体の骨格に導入する（例えば、ＣＤＲグラフト化抗体）。
【００２５】
本発明の２つ以上の抗原結合性分子に関連して本明細書において用いられる「相同性」または「相同的」との用語は、抗原結合性分子が同じ抗原、特に同じエピトープに結合する能力をいう。２つの抗原結合性分子が同じエピトープに結合する能力は、それら抗原結合性分子が、例えば競合結合測定法で、同じ抗原に対する結合に関して互いに競合しうるのかどうかを決定することにより評価することができる。相同的な抗原結合性分子同士の
抗原に対する結合は類似の特異性を有する。
【００２６】
本明細書において用いられる２つの配列の「配列同一性」は、それら２つの配列を並べたときに同一のヌクレオチドまたはアミノ酸を有する位置の数をそれら配列の短い配列中のヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割った数に関する。好ましくは、配列同一性は、７０％〜８０％を超え、好ましくは８１〜８５％、さらに好ましくは８６〜９０％、特に好ましくは９１〜９５％、最も好ましくは９６〜１００％、さらに具体的には１００％である。可変領域の骨格が抗原結合に対して一般的に限定的に寄与することを考慮すると、配列同一性は、本明細書において、相補性決定領域（ＣＤＲ）内の配列に関して、すなわち、ＣＤＲをコードする塩基配列とＣＤＲを構成するアミノ酸配列に関して最も一般的に特定される。したがって、ある配列が「ＣＤＲ内」の特定の配列にわたって８０％の配列同一性を有することが特定された場合、それら２つの配列のＣＤＲを構成する配列のみに関する配列同一性を提供することが意図される。
【００２７】
「ＰｌＧＦ」との用語は、本明細書において胎盤成長因子を示すために用いられる。ＰｌＧＦは、２つのスプライス変異体またはイソ型（すなわち、カルボキシ末端領域中の２１アミノ酸挿入物を含む１４９アミノ酸のＰｌＧＦ−１および１７０アミノ酸のＰｌＧＦ−２）に主に存在することがわかっているが、さらに他のイソ型も発見されている。
【００２８】
「阻害」との用語は、ＰｌＧＦに対する抗体またはそのフラグメントまたは誘導体に言及する場合、抗体、そのフラグメントまたは誘導体がＰｌＧＦのそのレセプターＦｌｔ−１への結合を阻害することができることを示すために用いられる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
詳細な説明
以下、本発明を一定の実施形態と一定の図面を参照して説明するが、本発明はそれらに限定されず、請求の範囲のみにより限定される。
【００３０】
本発明は、本明細書において抗体１６Ｄ３と称する抗体と同一のＰｌＧＦエピトープに結合する抗原結合性分子、特にモノクローナル抗体、そのフラグメントまたは誘導体に関する。細胞株ＬＭＢＰ  ６３９９ＣＢにより産生される「抗体１６Ｄ３」はヒト由来のＰｌＧＦに対して産生され、ヒトＰｌＧＦ（イソ型ＰｌＧＦ−１とＰｌＧＦ−２の両方）に結合する。抗体１６Ｄ３はヒトＰｌＧＦのそのレセプターｆｌｔ−１への結合を阻害して、ＰｌＧＦ活性を阻害する。よって、１６Ｄ３抗体それ自体およびそのフラグメントまたは誘導体、ならびに該抗体、フラグメントまたは誘導体をコードする塩基配列は、治療の場面と、試験またはスクリーニングの目的のための動物モデルとの両方でＰｌＧＦの阻害に用いることができる。もしくは、抗体はインビボ、エキソビボまたはインビトロでＰｌＧＦの検出および／または定量に用いることができる。よって、本発明は、本発明の抗原結合性分子とそれらをコードする塩基配列のさまざまな適用を提供する。本発明は、さらに、本発明の抗原結合性分子を産生する方法、およびこれらの抗原結合性分子を産生することのできる細胞株に関する。
【００３１】
本発明の第１の態様は本発明の抗原結合性分子を産生する細胞株、特に１６Ｄ３またはそのフラグメントまたは誘導体と同じ抗原と結合することのできるモノクローナル抗体を産生する細胞株に関する。本発明のこの態様の特定の実施形態は、モノクローナル抗体１６Ｄ３を産生し、かつＴｈｒｏｍｂ−Ｘにより、２００５年３月２９日に寄託番号ＬＭＢＰ  ６３９９ＣＢとしてＢＣＣＭ／ＬＭＢＰ（Ｂｅｌｇｉａｎ  Ｃｏ−ｏｒｄｉｎａｔｅｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ／Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｕｍ  ｖｏｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ
Ｂｉｏｌｏｇｉｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｇｈｅｎｔ  Ｋ．Ｌ．Ｌｅｄｅｇａ
ｎｃｋｓｔｒａａｔ  ３５，Ｂ−９０００  Ｇｈｅｎｔ、ベルギー）に寄託された「細胞株１６Ｄ３」とも称されるハイブリドーマ細胞株である。さらに、本発明はモノクローナル抗体１６Ｄ３に由来するモノクローナル抗体を産生する細胞株を提供する。そのような細胞株は、モノクローナル抗体１６Ｄ３をコードする配列、最も特には１６Ｄ３の非抗原結合領域をコードするコード配列を修飾することにより得ることができる。行なうべき修飾の性質を決定する方法および適切な修飾の例を本書に記載する。
【００３２】
本発明の第２の態様は、抗体１６Ｄ３と同じ抗原に結合することのできる抗原結合性分子に関する。特に、本発明は上記の細胞株１６Ｄ３により産生される１６Ｄ３と名付けられた抗体、およびＰｌＧＦに結合し、ＰｌＧＦ活性を阻害することのできるその相同体、フラグメントおよび誘導体に関する。
【００３３】
したがって、本発明の特定の実施形態は、細胞株ＬＭＢＰ  ６３９９ＣＢにより産生される抗ヒトＰｌＧＦ抗体であるモノクローナル抗体１６Ｄ３およびこの抗体のフラグメントを提供する。モノクローナル抗体１６Ｄ３は、配列番号２と配列番号４にそれぞれ開示されるその重鎖と軽鎖の可変領域のアミノ酸配列を特徴とする。
【００３４】
特定の実施形態によれば、本発明は、抗体１６Ｄ３のフラグメント、特に抗原結合性フラグメントに関する。そのようなフラグメントとして、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ＣＤＲ、該抗体またはそのＣＤＲの一部の配列を有するペプチド、単一可変ドメインおよびこれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２フラグメントは、Ｓｔａｎｗｏｒｔｈ等（Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（１９７８年）、Ｖｏｌ．１、第８章（Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ））によって記載されたような当分野で周知の方法を用いたモノクローナル抗体のタンパク質分解により作ることができる。抗原に結合する能力を保持するそのようなフラグメントは、補体活性化またはＦｃガンマレセプターに結合する能力等の親抗体の多くの性質を失っている。より具体的には、本発明は、配列番号２および配列番号４のそれぞれに対応する１６Ｄ３の重鎖および軽鎖の可変領域を含むフラグメントを提供する。本発明のさらなる特定の実施形態は、１６Ｄ３の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むフラグメントおよびその誘導体に関する。ＣＤＲを同定する２つの最も一般的に追随される方法はＩＭＧＴとＫＡＢＡＴであり、１６Ｄ３のいずれかのタイプのＣＤＲの２つ以上を含むフラグメントならびにこれらのフラグメントまたはＣＤＲを含む１６Ｄ３の誘導体が本発明に関して想定される。ＣＤＲのＩＭＧＴ同定によれば、１６Ｄ３の可変領域内のＣＤＲ領域は配列番号１７（ＧＹＴＦＴＤＹＹ）、配列番号１８（ＩＹＰＧＳＧＮＴ）、配列番号１９（ＶＲＤＳＰＦＦＤＹ）、配列番号２０（ＱＳＬＬＮＳＧＭＲＫＳＦ）、配列番号２１（ＷＡＳ）および配列番号２２（ＫＱＳＹＨＬＦＴ）に対応する。よって、本発明は、配列番号１７〜配列番号２２に提供される１６Ｄ３の１つ以上のＣＤＲを含む抗体１６Ｄ３のフラグメントを提供する。
【００３５】
本発明のさらなる具体的な実施形態は、１６Ｄ３の可溶性または膜固定の単鎖可変部分である１６Ｄ３のフラグメントを提供する。単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、通常は、免疫グロブリンの可変の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）またはそれらの一部を柔軟なペプチドリンカーによってつなぎ合わせた遺伝子的に設計された抗体フラグメントである。任意に、ｓｃＦｖは、対象となる抗体のＣＤＲ領域と別の抗体のフレームワーク領域とを含む。ｓｃＦｖフレームワークおよび／またはＣＤＲ領域のアミノ酸配列は、ヒト用医薬として使用するために任意にヒト化されて抗原性を低減する。本発明は、１６Ｄ３のｓｃＦｖおよび配列番号２４と配列番号２６をそれぞれ含むそのヒト化ｓｃＦｖを提供する。抗体の単鎖可変部分を得る方法は当業者に知られており、本書の実施例６に記載されている。例えば、この方法は、別々の反応におけるヒト重鎖および軽鎖の可変部分のＤＮ
Ａ配列の増幅およびクローニングと、その後の１５アミノ酸リンカー配列の挿入、例えば２工程ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３のＶＨとＶＬとの間への挿入を含み得る（例えば、Ｄｉｅｆｆｅｎｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｄｖｅｋｓｌｅｒ，“ＰＣＲ  Ｐｒｉｍｅｒ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ”（１９９５），Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，ＮＹ，ＵＳＡを参照）。得られたフラグメントは、次に、単鎖可変フラグメントを可溶性またはファージ提示ポリペプチドとして発現するために適切なベクターに挿入することができる。これは、当業者に周知の方法、例えばＧｉｌｌｉｌａｎｄ等（Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ（１９９６）４７：１−２０）に記載された方法により達成することができる。
【００３６】
本発明は、抗体１６Ｄ３の超可変領域を代表とする抗原結合ペプチドまたはそれらの組合せである１６Ｄ３のフラグメントも提供する。そのようなペプチドは、ａｐｐｌｉｅｄ
ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ合成機、例えばＭｉｌｌｉｇｅｎ（ＵＳＡ）から入手可能なモデル９０５０や関連技術からのモデル等のポリペプチド合成機を用いた合成により得ることができる。
【００３７】
本発明のさらなる実施形態は、抗体１６Ｄ３の誘導体またはそれらのフラグメントに関する。特に、本発明は、配列番号２と配列番号４にそれぞれ開示された可変重鎖領域および／または可変軽鎖領域を含むが、そのうち定常領域が１６Ｄ３とは異なる抗体に関する。さらに、またはその代わりとして、本発明の抗体１６Ｄ３の誘導体は配列番号１７（ＧＹＴＦＴＤＹＹ）、配列番号１８（ＩＹＰＧＳＧＮＴ）、配列番号１９（ＶＲＤＳＰＦＦＤＹ）、配列番号２０（ＱＳＬＬＮＳＧＭＲＫＳＦ）、配列番号２１（ＷＡＳ）および配列番号２２（ＫＱＳＹＨＬＦＴ）に示される１６Ｄ３の少なくとも２つのＣＤＲを含む一方で、ＣＤＲおよび／または定常領域間のフレームワーク領域は異なる。
【００３８】
本発明の一実施形態によれば、配列番号２と配列番号４にそれぞれ提供された１６Ｄ３の重鎖および軽鎖の可変領域に対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する抗体１６Ｄ３の誘導体またはそれらのフラグメントが提供される。最も特には、本発明は、ＣＤＲ領域内で配列番号２および配列番号４のそれぞれに対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する重鎖可変領域および／または軽鎖領域を含む抗体１６Ｄ３の誘導体またはそれらのフラグメントを提供する。フレームワーク内の配列同一性は、８０％未満でありうるが、これに限定されるものではない。配列番号１７〜配列番号２２の配列に対してそれぞれ少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２つのＣＤＲを含む誘導体も想定される。
【００３９】
さらなる実施形態において、本発明は、最も特にはＣＤＲ領域内において、配列番号２４に対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、および配列番号２６に対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む１６Ｄ３のｓｃＦｖの誘導体を提供する。
【００４０】
別の実施形態にしたがえば、本発明は、ヒト化された１６Ｄ３の誘導体またはそれらのフラグメントを提供する。１６Ｄ３のそのようなヒト化誘導体は、それらがＰｌＧＦに対する結合親和性を保持する点において相同的である。特定の実施形態によれば、１６Ｄ３のヒト化誘導体もＰｌＧＦ活性を阻害する能力を保持する。非ヒト抗体のヒト化は、ヒト抗体の骨格にさらによく似るように、抗体の骨格の１つ以上のアミノ酸、すなわち、抗体
の抗原への結合に関わらないアミノ酸を置換することにより達成される。さまざまなタイプまたはレベルのヒト化が想定される。本発明の特定の実施形態は、非ヒト抗体またはフラグメントの全領域、特には定常領域が、キメラ（例えばヒト／マウス）抗体またはフラグメントをもたらすようにヒト抗体の定常領域により置換された抗体またはフラグメントに関する。さらに特定の実施形態は、ＰｌＧＦに対する非ヒト抗体の抗原結合アミノ酸（例えば、２つ以上のＣＤＲ）がヒト抗体の骨格に導入された抗体（例えば、ＣＤＲグラフト化抗体）である。非ヒトモノクローナル抗体の結合相補性決定領域（「ＣＤＲ」）をヒトフレームワーク領域（特に、ヒト遺伝子の定常Ｃ領域）に結合させる方法は、例えば、Ｊｏｎｅｓ等（Ｎａｔｕｒｅ（１９８６）３２１：５２２）またはＲｉｅｃｈｍａｎｎ（Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３）により開示されているように当業者に公知である。もしくは、本発明の非ヒト抗ＰｌＧＦ抗体のさらに限られた数のアミノ酸の置換も想定される。本発明の特定の実施形態は、図９のヒト化可変重鎖および／または軽鎖領域またはそれらの一部を含む抗体および配列番号１７〜配列番号２２の少なくとも２つ、さらに特には３〜５つ、最も特には６つすべてのＣＤＲを含む抗体に関する。本発明のさらなる実施形態は、配列番号６および配列番号８のそれぞれに少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する可変の重鎖および／または軽鎖領域を含むヒト化抗体に関する。もしくは、本発明は配列番号１７〜２２のそれぞれに対して少なくとも８０％、特には少なくとも８５％、さらに特には少なくとも９０％、最も特には少なくとも９５％の配列同一性を有する少なくとも２つ、さらに特には３〜５つ、最も特には６つすべてのＣＤＲを含むヒト化抗体を提供する。
【００４１】
したがって、本発明はマウス抗体１６Ｄ３に由来するヒト化および／またはキメラまたはハイブリッド抗体に関する。特定の実施形態において、マウス抗体１６Ｄ３の特定のアミノ酸は、免疫原性アミノ酸を除くために変異させられる。したがって、特定の実施形態において、本発明は、アミノ酸配列：Ｉ２Ｖ、Ｐ９Ａ、Ｋ４０Ａおよび／またはＴ１１１Ｌの１つ以上が変化した配列番号２による重鎖可変部分のアミノ酸配列を含む抗原結合性分子に関する。さらに、または代わりに、抗体１６Ｄ３に由来するヒト化抗体は、Ｓ５Ｔ、Ｓ９Ｄ、Ａ１５Ｌ、Ｋｌ８Ｒ、Ｒ２２Ｎおよび／またはＬ８９Ｖアミノ酸の１つ以上が変化した配列番号４による軽鎖可変部分のアミノ酸配列を含む抗原結合性分子である。よって、特定の実施形態によれば、本発明は、アミノ酸配列：Ｉ２Ｖ、Ｐ９Ａ、Ｋ４０Ａおよび／またはＴ１１１Ｌの１つ以上が変化した配列番号２による重鎖可変部分のアミノ酸配列と、アミノ酸配列：Ｓ５Ｔ、Ｓ９Ｄ、Ａ１５Ｌ、Ｋ１８Ｒ、Ｒ２２Ｎおよび／またはＬ８９Ｖの１つ以上が変化した配列番号４の軽鎖可変部分のアミノ酸配列とを含む抗原結合性分子を提供する。
【００４２】
別の実施形態において、本抗体はマウス抗体１６Ｄ３の（ヒト化）可変軽鎖および／または重鎖がヒト免疫グロブリンフレームにグラフトしているか、またはヒト抗体の定常領域、特にヒトＩｇＧ定常領域に結合している点でさらにヒト化されている。この点で特に適するのは、体内でナチュラルキラー細胞を活性化することのできるＩｇＧ１κ（ＩｇＧ１−カッパ）である。よって、特定の実施形態において、本発明はハイブリッドＨｕ１６Ｄ３−ＩｇＧ１κに関する。本発明の別の実施形態は、ハイブリッドＨｕ１６Ｄ３−ＩｇＧ４κハイブリッドである。ヒトＩｇＧ抗体（およびヒトＩｇＧ骨格および／または定常領域を用いて得られたハイブリッド抗体も）は長期の半減期を示すので、非常に安定的な血漿レベルを提供し、投与頻度の大幅な低減を可能とする。さらに、ヒト化抗体または誘導体の使用は免疫応答を引き起こす危険性が最小である。
【００４３】
本発明のさらなる実施形態は、抗体１６Ｄ３またはそのフラグメントに相同的な抗原結合性分子、すなわち、抗体１６Ｄ３と同じエピトープに結合する抗原結合性分子に関する。一実施形態において、相同的抗原結合性分子は、動物、特にマウスでの故意の免疫化に
より、例えば、ＰｌＧＦをマウスに注射し、次に脾臓リンパ球をマウスミエローマ細胞系に融合した後に、（例えば、ＰｌＧＦへの結合に関するスクリーニングにより）抗ＰｌＧＦ抗体を産生する細胞培養物を同定し、それらをクローニングすることにより産生される。抗体の任意のさらなる選択は１６Ｄ３エピトープに対する反応性、または抗体１６Ｄ３またはそのフラグメントとの競合に基づいて実施される。
【００４４】
よって、本発明のさらに別の態様は本発明の抗原結合性分子を作る方法に関する。これらの方法として、本明細書の実施例の部分で提供される抗体１６Ｄ３に対するヒト化の方法が挙げられるが、これに限定されない。
【００４５】
本発明のさらに別の態様は、本発明の抗原結合性分子、最も特にはその抗原結合領域をコードする塩基配列の提供に関する。本発明の特定の実施形態は、抗体１６Ｄ３の重鎖および軽鎖領域をコードする細胞株１６Ｄ３の配列に対応する配列番号１および配列番号３の塩基配列等の、しかし、これらに限定されない配列番号２および配列番号４により規定される可変重鎖領域および軽鎖可変領域をコードする塩基配列に関する。さらに本発明に関して、配列番号１７〜２２で同定されるモノクローナル抗体１６Ｄ３の１つ以上のＣＤＲ領域をコードする塩基配列が提供される。本発明の特定の実施形態として、配列番号２３と配列番号２５等の、しかし、これらに限定されない１６Ｄ３のｓｃＦｖとヒト化ｓｃＦｖをそれぞれコードする配列が挙げられる。本発明は、本書に記載の１６Ｄ３の誘導体およびそれらのフラグメントをコードする塩基配列も提供する。さらに、本発明は、実施例の部分に記載されるプライマー等の、しかし、これらに限定されない、上記塩基配列に特異的にハイブリダイズできるプローブおよびプライマーを提供する。
【００４６】
また、本発明は、本明細書に記載のモノクローナル抗体、それらのフラグメントまたは誘導体をコードする配列に相補的な塩基配列を含む。
【００４７】
本発明のさらなる態様は本発明の抗原結合性分子の治療的応用に関する。したがって、本発明は本発明の抗原結合性分子の医薬としての使用を提供する。この点において、本発明は、血管新生が病気または疾患の病理に寄与する病気または疾患の予防または治療のために、本発明の１つ以上の抗原結合性分子を含む医薬組成物を提供する。したがって、血管新生が病気または疾患の病理に寄与する病気の治療および／または予防の方法において、そのような治療または予防を必要とする哺乳類に、本書に記載の１つ以上の抗原結合性分子を含む治療有効量の組成物を投与することからなる方法である。
【００４８】
そのような病気において、血管新生は「病的血管新生」とも称される。そのような病的血管新生の実例として、血管の病態（アテローム動脈硬化、血管腫、血管内皮腫）、骨関節の病態（関節リウマチ、滑膜炎、骨と軟骨の破壊、骨髄炎、パンヌス増殖、骨棘形成、新生物および転移）、皮膚の病態（いぼ、化膿性肉芽腫、発毛、カポジ肉腫、瘢痕ケロイド、アレルギー性浮腫、新生物）、肝臓、腎臓、肺、耳および他の上皮の病態（肝炎、糸球体腎炎、肺炎、喘息、鼻ポリープ、耳炎等の炎症および感染プロセスおよびこれらの器官における移植、再生、新生物および転移）、子宮、卵巣および胎盤の一定の病態（機能不全性子宮出血、例えば、子宮内避妊器具、卵胞嚢胞形成、卵巣過刺激症候群、子宮内膜症、新生物によるもの）、脳または神経の病態（新生物および転移）、一定の心臓と骨格筋の苦痛（例えば、作業過負荷によるもの）、脂肪組織の病的状態（肥満）および内分泌器官（甲状腺炎、甲状腺腫脹、膵臓移植）において観察される血管新生が挙げられる。さらに、病的血管新生は血液生成の病気（エイズ、カポジ）、血液悪性腫瘍（白血病等）にも寄与しうる。
【００４９】
多くの目の病気において、病的血管新生は重要な因子であると考えられているので、本発明の抗原結合性分子による治療が想定される。「網膜虚血性疾患」においては、網膜に
よる血液と酸素の供給が減少し、網膜の末梢部がそれらの栄養源を失い、適切に機能することを止める。網膜症の一般的原因は、網膜中心静脈閉塞症、頸動脈の狭窄、糖尿病（糖尿病性網膜症）および貧血（鎌状赤血球網膜症）である。網膜症は早産児にも観察される（未熟児網膜症）。糖尿病性網膜症は糖尿病患者の視力喪失の主要な原因である。虚血性網膜では、新しい血管の増殖が起こる（新血管形成）。これらの血管は、網膜の表面、視神経、または虹彩上の目の前面でしばしば成長する。これらの新しい血管は必要な栄養の流れを交換することができず、その代わりに、硝子体出血、網膜剥離および調節されない緑内障等の多くの問題を引き起こしうる。これらの問題は、新しい血管は壊れやすく、出血する傾向があるために生じる。その初期段階で発見されれば、増殖性糖尿病性網膜症の進行は汎網膜光凝固により時には止めることができる。しかし、硝子体切除術が唯一の選択肢である場合もある。血管新生が重要な役割を果たしていると思われる他の目の病気は、脈絡叢および他の眼球内疾患、白質軟化症および新生物と転移である。脈絡膜血管新生は、脈絡膜から始まる新しい血管のブルッフ膜の破壊を経た網膜下色素上皮（ｓｕｂ−ＲＰＥ）または網膜下腔への増殖である。ＣＮＶの位置、成長パターンおよびタイプ（１または２）は患者の年齢や基礎疾患に依存する。出血と浸出はさらなる増殖とともに起こり、視覚症状の主な原因となる。脈絡膜血管新生（ＣＮＶ）は、視力喪失の主要な原因である。ＣＮＶは近視者の５〜１０％に起こると推定され、治癒期中に事実上すべての脈絡膜破裂において起こる。ほとんどが自発的に退行するが、患者の１５〜３０％で、ＣＮＶは再発し、視力喪失を伴う出血性または漿液黄斑性剥離に至る。
【００５０】
「肺性高血圧」との用語は、肺動脈の血圧が異常に高い疾患をいう。心臓または肺の他の病気が存在しない場合、それは原発性肺高血圧と呼ばれる。肺動脈の散在性狭小化は、病的動脈新生とその後の血液流に対する抵抗性の高まりの応答としての肺性高血圧の結果として起こる。その発症は１００，０００人あたり８人で起こる。しかし、肺性高血圧は、さらに、気腫、慢性気管支炎またはびまん性間質性線維症等の慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）の合併症として、喘息形ＣＯＰＤを有する患者において起こりうる。ＣＯＰＤの発症は１０，０００人あたり約５人で起こる。
【００５１】
血管新生が病気の病理に寄与する疾患で、本発明の抗原結合性分子による治療が想定される疾患のさらなる実例は炎症疾患群である。本明細書において用いられる「炎症」は、生体組織の傷害に対する局所的な制御されない反応（すなわち、身体的、化学的または感染の結果としての反応）、特に小血管の局所反応、それらの内容物およびそれらの関連構造の局所反応を意味する。血液成分の血管壁を経た組織への通過は炎症の特徴であり、そのように形成された組織収集物は浸出物または浮腫と呼ばれる。細菌感染、過度の熱、寒さ、押し潰し等の機械的傷害、酸、アルカリ、照射またはウイルス感染等の、しかし、これらに限定されない生体組織を損傷するいかなる有害なプロセスも、関与する器官または組織には関係なく炎症を引き起こしうる。そのような「炎症性疾患」として、火傷から肺炎、ハンセン病、肺結核および関節リウマチまでにわたる反応が挙げられる。
【００５２】
術後癒着形成（ＰＯＡ）は婦人科手術、骨盤手術および心臓病学的手術でよくある外科合併症である。組織への外科手術による外傷は、損傷した組織を別の器官に結合させる永久的な瘢痕形成をしばしば引き起こす。よって、そのような損傷の部位において、普通は別々であり続ける内部組織がしばしば結合される。癒着形成から生じる合併症は、腸閉塞、小腸閉塞、慢性的な骨盤痛および婦人の不妊である。「癒着形成」との用語はその医学的意味において、２つの表面または部分を癒着または一体化するプロセスである膠着反応をいう。例えば、傷の相対する表面または腹膜の相対する表面の一体化をいう。また複数形の癒着（ａｄｈｅｓｉｏｎｓ）は相対する漿膜面を結合させる炎症性のバンドをいうことができる。本書で用いられる癒着との用語は、血漿またはリンパの浸出物または血液の血管外遊出から生じるフィブリンの細い糸からなる癒着である線維素性癒着も含む。損傷の領域に生じる、または自然に生じることのある線維芽組織の滑らかな過成長であるケロ
イドも癒着の一形態である。胎盤成長因子（ＰｌＧＦ）の阻害は術後癒着形成の著しい抑制を導くことが示された（ＷＯ０３０６３９０４）。
【００５３】
さらに、骨粗鬆症等の、しかし、これに限定されない骨吸収を特徴とする病気はＰｌＧＦの阻害から利益を受けうることが示されている（ＷＯ２００４００２５２４）。
【００５４】
したがって、特定の実施形態によれば、本発明の抗原結合性分子は、腫瘍成長と転移、目の病気、炎症、癒着形成および肺性高血圧の治療および／または予防に特に適する。
【００５５】
本発明のさらなる特定の実施形態は、胸、肺、前立腺、脳、肝臓、膵臓、結腸、腎臓、子宮または骨髄の癌等の、しかし、これらに限定されない癌の予防および／または治療のための本発明の抗原結合性分子の使用に関する。特に、本発明は、大腸癌、乳癌、膵臓癌および黒色腫等の、しかし、これらに限定されない固形腫瘍の予防および／または治療のための本発明の抗原結合性分子の使用に関する。さらに詳細には、本発明の抗体がヒト膵臓腫瘍の退行を得るために特に適することを示すデータが本書に提供される。本発明の抗体はインビボで腫瘍の大きさを顕著に減少させることが示され、それにより約５０％までの大きさの減少が示される。このように、本発明は腫瘍の大きさを少なくとも２０％、さらに特には少なくとも３０％、最も特には少なくとも５０％減少させる方法および医薬組成物を提供する。
【００５６】
本発明のさらなる特定の実施形態は、骨疾患の治療または予防において、より具体的には例えば骨粗鬆症または骨軟化症等の増強骨吸収が存在する状態の治療のための本発明の抗原結合性分子の使用に関する。
【００５７】
したがって、本発明は上記病気の治療用医薬の製造のための本発明の抗原結合性分子の使用に関する。
【００５８】
本発明の重要な態様として、抗体、それらのフラグメントおよび誘導体が、他の抗血管新生治療、より詳細にはＶＥＧＦ等の血管新生因子を標的とする別の治療に帰せられる副作用またはそれらの治療で予測される副作用なしに上記病気の治療および／または予防を可能とすることが挙げられる。組換えヒト抗ＶＥＧＦ抗体による前臨床の安全性試験は、ＶＥＧＦの阻害が生理学的血管新生の阻害、より具体的には長期的な骨成長および黄体形成における新血管新生阻害をもたらすことを早くも１９９９年に示した（Ｒｙａｎ  ｅｔ
ａｌ．，１９９９）Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｉｃ  ｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ２７（ｌ）：７８−８６）。最近の研究は、ＶＥＧＦ阻害剤が、健康な気管と甲状腺の血管の退縮を引き起こすし、それによって臓器障害がもたらされることもあることを記載している（Ｂａｆｆｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ，２００４，Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ  ９４：９８４−９９２；Ｉｎａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００４  Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １６５：３５−５２）。それにもかかわらず、抗ヒトＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブは、創傷治癒、血圧および血栓症の危険性に対するその観察される効果にもかかわらず、腫瘍縮退に対するこの抗血管新生アプローチの全体的有効性のために、血管新生の抑制因子として現在販売されている。本発明の抗ＰｌＧＦ抗体および誘導体は、血圧、創傷治癒、血栓症の危険性、および健康な器官での血管退縮に対するこれらの観察された副作用なしに、望まれない血管新生の阻害を可能とする。
【００５９】
本発明の特定の実施形態は、有効成分として、モノクローナル抗体１６Ｄ３またはそのフラグメントまたは誘導体を医薬的に許容される担体と混合して含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は治療有効量の１つ以上の抗原結合性分子を含む。同様に、本発明は、本発明の治療有効量の１つ以上の抗原結合性分子を投与することからなる治療および／または予防の方法を提供する。
【００６０】
本明細書において用いられる治療有効量は、治療される哺乳動物の体重１キログラムあたり（ｍｇ／ｋｇ）約０．５ｍｇから約５０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇの範囲内にある量を意味する。ほとんどのＩｇＧヒト抗体の長い半減時間を鑑みれば、このクラスのモノクローナル抗体である本発明の抗原結合性分子は、患者の快適さに関わる治療の周期性に恵まれていることが理解される。
【００６１】
本発明のさらに別の態様によれば、本発明の抗原結合性分子および別の血管新生阻害剤を含む医薬組成物、ならびに本発明の抗原結合性分子および別の血管新生阻害剤の同時または連続投与を提供する治療方法が提供される。実際、本発明は、本発明の抗原結合性分子と、抗ＶＥＧＦ抗体等の別の血管新生阻害剤との腫瘍成長の阻害に対する相加作用を示す。さらに具体的には、本発明の１６Ｄ３抗体とＡｖａｓｔｉｎ（登録商標）の併用は腫瘍の大きさを約７０％まで低減することができるが、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）のみまたは抗ＰｌＧＦ抗体のいずれかの増加投与量は同じ条件で５５％を超える腫瘍の大きさの減少には達しないことが示されている。適切な他の抗血管新生産物、ならびにそれらが属するクラスに依存するそれらの通常の投与量は当業者によく知られている。血管新生阻害剤の例として、Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）の名前で商品化されたＶＥＧＦに対する抗体等、ＶＥＧＦに直接作用するか、またはＶＥＧＦレセプターに作用するＶＥＧＦ阻害剤が挙げられる。本発明の抗体は、上記のように多くの副作用を引き起こすことが知られている例えばＶＥＧＦを阻害する血管新生阻害剤の投与量を減少させることができる。
【００６２】
本発明の医薬組成物は、治療される病気に対して有効な他の化合物／医薬、さらに具体的には腫瘍増殖、炎症、目の病気および肺性高血圧の治療に有用な他の化合物／医薬の治療有効量をさらに含んでよい。
【００６３】
本発明の医薬組成物に使用される適切な医薬担体は例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１６版（１９８０年）に記載されており、それらの処方は当業者によく知られている。それら担体として、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤（例えば、フェノール、ソルビン酸、クロロブタノール）、等張剤（例えば、糖または塩化ナトリウム）等が挙げられる。組成物中のモノクローナル抗体有効成分の作用持続時間を制御するために、さらなる成分を含めてもよい。したがって、制御放出組成物は、例えばポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン−酢酸ビニル共重合体、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、硫酸プロタミン等の適切なポリマー担体を選択することにより、得ることができる。医薬の放出速度と作用の持続時間はモノクローナル抗体有効成分を、ハイドロゲル、ポリ乳酸、ヒドロキシメチルセルロース、ポリメタクリル酸メチルおよび他の上記ポリマー等の重合物質の粒子、例えば、マイクロカプセルに導入することで制御してもよい。そのような方法は、リポソーム、微粒子、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、ナノカプセルのようなコロイド薬送達システムを含む。投与経路に依存して、有効成分を含む医薬組成物は保護被膜を必要とすることがある。注射可能な使用に適する医薬形として、滅菌水溶液または分散液およびそれらの即時調製用の滅菌粉末が挙げられる。そのための典型的な担体として、生体適合性水性緩衝液、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物が挙げられる。
【００６４】
本発明の抗原結合性分子は当分野でよく知られた手段、すなわち、経口、鼻腔内、皮下、筋肉内、皮内、静脈内、動脈内、非経口で、またはカテーテル法により患者に提供することができる。
【００６５】
本発明の特定の態様にしたがえば、本発明の抗原結合性分子は遺伝子治療により投与される。抗体に基づいた遺伝子治療によって、大量生産、体内分布、迅速な血中クリアラン
スおよび一価抗体の乏しい保持等、抗体の投与に関連した多くの潜在的な制限を克服することが可能となる。インビボ生産は抗体の免疫原性を低下させ、抗体の耐容性を良好とし、抗原結合性分子またはそれらのフラグメントの効果的で持続的なレベルをもたらす。さらに、遺伝学的アプローチは抗原結合性分子に対する新しい機能の提供を可能とする。さまざまな細胞／組織によるモノクローナル抗体のインビボ生産と全身送達の実現可能性がウイルスベクターによるインビボ遺伝子移入を用いて示された（Ｐｅｌｅｇｒｉｎ  ｅｔ
ａｌ．，２００４，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：３４７−３５６）。抗血管形成活性を有する抗ラミニン抗体による線維肉腫細胞の遺伝子組み換えにより、インビトロおよびインビボでの腫瘍増殖の減少も示されている（Ｓａｎｚ  ｅｔ  ａｌ．２００１，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５０：５５７−５６５）。
【００６６】
したがって、本実施形態によれば、本発明は、本明細書に記載の病的血管新生を特徴とする病気の治療において、遺伝子治療に使用される本発明の抗原結合性分子をコードするヌクレオチドを提供する。特に、本発明は、遺伝子治療に使用される配列番号２により規定される可変重鎖領域をコードする塩基配列および／または配列番号４により規定される軽鎖可変領域をコードする塩基配列を含む組成物を提供する。さらに具体的には、本発明は、抗体１６Ｄ３の重鎖および軽鎖領域をコードする細胞株１６Ｄ３の配列に対応する配列番号１および／または配列番号３の塩基配列を含む組成物を提供する。本発明に関して、配列番号１７〜２２に同定されたモノクローナル抗体１６Ｄ３の１つ以上のＣＤＲ領域をコードする塩基配列を含む組成物も提供される。本発明の特定の実施形態は、配列番号２３および配列番号２５等の、しかし、これらに限定されない１６Ｄ３のｓｃＦｖおよびヒト化ｓｃＦｖをそれぞれコードする配列を包含する。
【００６７】
本発明による治療および／または予防の方法は、医薬組成物の表題で以上に開示された治療有効量の血管新生阻害剤または抗腫瘍剤を患者に投与することにより、好ましくは連続的に投与することにより、上記の病的血管新生状態の治療または予防をさらに含むことができる。本明細書において用いられる連続的とは、本発明のリガンドと公知の血管新生阻害剤とを患者に同時ではなく、連続的に投与することを意味する。
【００６８】
本発明のさらに別の態様は、ヒト試料中のＰｌＧＦの免疫学的検出のため、およびそのような検出に適するキットの成分としての本発明の抗原結合性分子の使用に関する。抗原の免疫学的検出法は当分野で公知であり、ＥＩＡ、ＥＬＩＳＡやＲＩＡおよび免疫組織化学法が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のマウス抗体のＰｌＧＦ抗原への結合は間接的に、例えば、標識抗マウス抗体により検出することができる。もしくは、抗体またはそのフラグメントは直接標識することができる。本発明のこの態様の特定の実施形態は、抗ＰｌＧＦによる治療に感受性のある患者の同定におけるＰｌＧＦに対する抗体およびその抗原結合性フラグメントの使用に関する。これは癌の治療に特に重要である。
【００６９】
本発明のさらに別の態様は、本発明の抗原結合性分子の診断ツールとしての使用に関する。多くの病的状態において、ＰｌＧＦ発現はアップレギュレートされることが当分野で示されている。さらに具体的には、多くの腫瘍がＰｌＧＦを過剰発現することが示されている。本発明のヒト化抗体または抗体フラグメントは、例えば本発明の抗体または抗原結合性フラグメントが標識され、インビボで可視化されるイメージング技術により、これらの病的状態の診断に用いることができる。本発明の抗原結合性分子の結合をインビボで画像化するための多様な標識が当分野で知られており、それぞれが特定の（照射および）検出装置を必要とする光学的（例えば蛍光）標識、金属標識および磁気標識が挙げられるが、これらに限定されない。本発明のこの態様の特定の実施形態は、病気の予後を予測し、治療計画を決定する際の本発明の抗体の使用に関する。
【００７０】
本発明のさらに別の態様は、抗ＰｌＧＦ治療に併用される化合物のスクリーニングでの
動物モデルにおける本発明の抗原結合性分子の使用に関する。そのようなモデルとして、ｎｕ／ｎｕマウスでのヒト腫瘍の増殖と発達が研究される腫瘍モデルが挙げられるが、これに限定されない。試験化合物と本発明の抗体またはフラグメントとの併用投与は、その化合物が本発明の抗体もしくはフラグメントのみを投与した際に観察された効果に対して相加効果を有するかどうかを同定することを可能とする。抗ＰｌＧＦ抗体と組み合わされた化合物の対抗有効性または毒素等の他の側面もまたこのようにして決定できる。
【００７１】
上記の治療的応用以外に、上記の本発明の塩基配列は、例えば組換え法により抗体および他の抗原結合性フラグメントの生産に有用である。したがって、本発明は、抗体遺伝子のクローニングと操作、ｓｃＦｖや本明細書に記載する塩基配列を用いた他の抗原結合性フラグメントの生産を含む、組換え抗体および抗体フラグメントの生産方法をさらに提供する。これらの方法の手順書は当分野で入手可能である。さらに、本発明の抗体および抗体フラグメントの発現についてスクリーニングするために、本発明の塩基配列に特異的にハイブリダイズするプローブを用いることができる。
【００７２】
例示目的のためのみに提供される下記の実施例によって本発明をさらに説明する。
実施例
【実施例１】
【００７３】
マウス抗ヒトＰｌＧＦ抗体（１６Ｄ３）の産生と特性づけ
１．マウスの免疫付与と融合
ヒトＰｌＧＦに対するモノクローナル抗体は基本的にはＧａｌｆｒｅおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（Ｇａｌｆｒｅ  Ｆ，Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ．  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ．  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １９８１；７３：３−４６）に記載されたように作った。手短に説明すれば、ＰｌＧＦノックアウトマウス（Ｌｕｔｔｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２９５（２）：４２８−３４，Ｃａｒｍｅｌｉｅｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００１），Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ７：５７５−５９３またはＷＯ０１／８５７９６）を、フロイント完全アジュバント中の５０μｇの組換えヒトＰｌＧＦ−２（Ｐｉｃｈｉａにおいて産生）の皮下注射と、それから２週間後のフロイント非完全アジュバント中の５０μｇの組換えヒトＰｌＧＦの皮下注射により免疫付与した。血液試料（約１００μｌ）を１０日後にマウスの尾から集めた。血清は、ヒトＰｌＧＦをキャプチャとして被覆したマイクロタイタープレート、希釈血清の適用（１／５００〜１／８０００）および標識用に西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）複合化ヤギ抗マウスＩｇＧを用いるＥＬＩＳＡにより抗ｈｕＰｌＧＦ抗体について調べた。
【００７４】
少なくとも６週間の間隔の後に、（高い陽性反応を有する）マウスに対して細胞融合の４日前と２日前に塩水中の５０μｇの組換えヒトＰｌＧＦを腹腔内に追加免疫を行なった。
【００７５】
脾臓細胞を単離し、Ｓｐ２／０−Ａｇ１４骨髄腫細胞に融合した。ヒポキサンチン、アミノプテリン、チミジン培地中での選択後、培養上清を上記のようにＥＬＩＳＡに適用することによって陽性クローンを選択した。
２．ＰｒｏＳｅｐ  ｖＡ  Ｕｌｔｒａによる抗体の精製
ＰｒｏＳｅｐ  ｖＡ  Ｕｌｔｒａ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いるアフィニティクロマトグラフィによって、製造者の手順書にしたがって抗体を細胞培養物から精製した。手短に説明すれば、１５０ｍＭのＮａＣｌを上清に加え、ＰＢＳで前もって平衡化しておいたＰｒｏＳｅｐ  ｖＡ  Ｕｌｔｒａカラムに上清を加えた。カラムはＰＢＳで洗浄し、結合タンパク質を０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．８）で溶出した。溶出タンパク質はＰＢＳに対
して透析した。溶出タンパク質の純度は還元および非還元状態下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより確認した。
３．（実施例２に記載したように得た）１６Ｄ３／ｈｕ１６Ｄ３のＰｌＧＦに対する結合（図１を参照）
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのｈｕＰｌＧＦ−２（Ｐｉｃｈｉａ）により１００μＬ／ウエルにて４℃で被覆した。１％ＢＳＡによる１時間、室温でのブロッキング後、１６Ｄ３／ｈｕ１６Ｄ３の希釈系列を１００μＬ／ウエルで加え、抗体を１時間室温で結合させた。結合した１６Ｄ３をヤギ抗ヒトまたはヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）により１００μＬ／ウエルにて、１時間、室温で検出した。アッセイはＯＰＤにより開発された。
４．ｈｕＦｌｔ−１レセプターに対するＰｌＧＦ結合の阻害（図２を参照）
ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌのｈｕＦｌｔ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により２００μＬ／ウエルにて４℃で被覆した。１％ＢＳＡによる１時間、室温でのブロッキング後、１６Ｄ３／ｈｕ１６Ｄ３の希釈系列を１００μＬ／ウエルで加え、さらに１００μＬ／ウエルのｈｕＰｌＧＦ−２を加えた。室温での２時間のインキュベーション後、結合したＰｌＧＦをヤギ抗ｈｕＰｌＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により１８０μＬ／ウエルにて、１時間、室温で検出した後に、ＲＡＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）とともに１時間、室温でインキュベートした。アッセイはＯＰＤにより展開された。
５．Ｂｉａｃｏｒｅ実験による１６Ｄ３およびＦａｂ  １６Ｄ３のさらなる特徴づけ
・阻害：ｒｈｕＰｌＧＦ−２（Ｐｉｃｈｉａ，ＴＸ）を、ＥＤＣ／ＮＨＳ化学（アミンカップリングキット、Ｂｉａｃｏｒｅ）を用いてＣＭ５チップに固定化して、４１２ＲＵを得た。１６Ｄ３を注射した後、ｒｈｕＦｌｔ−１／Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を注射した。この操作を、マウス抗体の代わりに緩衝液を用いても実施した。これらはネガティブコントロール流路にわたっても注入し、これらの値は既に差し引いた。このアッセイはリン酸緩衝液（ｐＨ９．６）で実施した。
【００７６】
ｒｈｕＦｌｔ−１のｒｈｕＰｌＧＦ−２への最大結合に比較して、ｒｈｕＦｌｔ−１のシグナルは最初の１６Ｄ３または１６Ｄ３Ｆａｂが注射されている場合に減少する（図３）。
６．１６Ｄ３のマウス可変領域のクローニングと配列決定
・ｍＲＮＡの単離：１６Ｄ３のハイブリドーマ細胞のｍＲＮＡをＱｕｉｃｋＰｒｅｐ（登録商標）マイクロｍＲＮＡ精製キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単離した。このｍＲＮＡは、Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い、キットで利用できるｐｄ（Ｎ）６プライマーによりｃＤＮＡを作るために使用された。
・ＰＣＲ：重鎖および軽鎖の可変部分の配列は、一群のプライマー（リーダー配列で始まる８プライマーと重鎖の定常領域で始まる２プライマー、リーダー配列で始まる１１プライマーと軽鎖の定常領域で始まる１プライマー）を用いるＰＣＲを実施することにより見出した。プライマーの異なる組合せによる８回および１１回のＰＣＲ反応を実施した。
抗体１６Ｄ３の重鎖のために用いられるプライマー：
ＭＨＶＲ３  ５’−ＡＴＧ  ＧＲＡ  ＴＧＧ  ＡＧＣ  ＴＧＫ  ＡＴＣ  ＷＴＴ  ＨＴＣ−３’（配列番号９）
ＭＨＣＲ１  ５’−ＣＡＳ  ＡＹＭ  ＣＡＧ  ＧＧＧ  ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＧＡＴ  ＡＧＡ
Ｃ−３’（配列番号１０）
抗体１６Ｄ３の軽鎖のために用いられるプライマー：
ＭＫＶＲ３  ５’−ＡＴＧ  ＲＡＧ  ＴＣＡ  ＣＡＫ  ＡＣＹ  ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＴＴＹ
ＲＴＡ−３’（配列番号１１）
ＭＫＣＲ１  ５’−ＧＣＴ  ＣＡＣ  ＴＧＧ  ＡＴＧ  ＧＴＧ  ＧＧＡ  ＡＧＡ  ＴＧＧ−３’（配列番号１２）
ＰＣＲセットアップ：変性、１０分間、９４℃；変性、３０秒間、９４℃；アニーリング
、３０秒間、５５℃；伸長、１分間、７２℃；伸長、５分間、７２℃；サイクル数、３０回。
【００７７】
配列番号９〜１１の配列における重複性は慣用の略号を用いて示す：Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｈ＝ＡまたはＣまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ。
・クローニングおよび配列決定：ＰＣＲ産物をアガロースゲルに負荷し、右側のバンドを選択し、精製し（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社）、配列決定用Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に供給されたｐＣＲ（登録商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡはＨｉｇｈ  Ｐｕｒｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）を用いて調製し、Ｔ７およびＭ１３リバースプライマーを用いてＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）３１０（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）により挿入物の配列を決定した。
・抗体１６Ｄ３の重鎖と軽鎖の可変領域の塩基配列とアミノ酸配列を配列番号１、配列番号２、配列番号３および配列番号４に示す（図１１を参照）。
【実施例２】
【００７８】
ヒト化抗ヒトＰｌＧＦ抗体（１６Ｄ３）の産生と特徴づけ
１．ヒト化１６Ｄ３の構築
可変領域のヒト化
・変異：マウス抗体１６Ｄ３の可変部分をヒト化するために以下の変異を行なった：
重鎖： Ｉ２Ｖ
Ｐ９Ａ
Ｋ４０Ａ
Ｔ１１１Ｌ
軽鎖： Ｓ５Ｔ
Ｓ９Ｄ
Ａ１５Ｌ
Ｋ１８Ｒ
Ｒ２２Ｎ
Ｌ８９Ｖ
・変異はＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｌｔｉ  Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ
Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（登録商標））を用いて行なった。変異を含む１〜５プライマーを１回のＰＣＲに使用することができた。形質転換後、コロニーを採集し、ＤＮＡの配列決定を行なって、ほとんどの点突然変異を有するクローンを決定した。このクローンを取って、すべての変異が配列に存在するまでこの操作を繰り返した。
可変領域のヒトＩｇＧ定常領域への連結：
ＰＣＲを実施することにより、適切な制限部位が付加された重鎖と軽鎖のヒト化可変部分を得た。
軽鎖の可変部分用プライマー：
プライマー１：５’−ＣＣＡＣＣＧＧＴ  ＧＡＣ  ＡＴＴ  ＧＴＧ  ＣＴＧ  ＡＣＣ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  ＣＣ−３’（配列番号１３）
プライマー２：５’−ＣＡＣＣＧＴＡＣＧ  ＴＴＴ  ＴＡＴ  ＴＴＣ  ＣＡＡ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＣＣＣ  ＣＧＡ  Ｇ−３’（配列番号１４）
重鎖の可変部分用プライマー：
プライマー３：５’−ＣＡＧ  ＧＴＣ  ＣＡＧ  ＣＴＧ  ＣＡＧ  ＣＡＧ  ＴＣＴ  Ｇ−
３’（配列番号１５）
プライマー４：５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣ  ＴＧＡ  ＧＧＡ  ＧＡＣ  ＴＧＴ  ＧＡＧ  ＣＡＧ  ＧＧ−３’（配列番号１６）
ＰＣＲセットアップ：変性、５分間、９４℃；変性、３０秒間、９４℃；アニーリング、３０秒間、６０℃；伸長、３０秒間、７２℃；伸長、５分間、７２℃；サイクル数、２５回。
【００７９】
ＰＣＲ産物をアガロースゲルにロードし、バンドを選択し、精製した（ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット、Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ社）。１６Ｄ３の重鎖の可変部分のＰＣＲ産物をＳａｌＩで消化し、ヒト抗体（ＩｇＧ４）の重鎖の完全定常部分を含むベクターｐＫＡＮＥＯ−ＭＣＳ５０−Ｈｌｅｕ−ｖａｒ＃２４をＥｃｏ４７ＩＩＩとＳａｌＩで消化し、連結した。最初に、軽鎖の可変部分のＰＣＲ産物を配列決定用Ｚｅｒｏ  Ｂｌｕｎｔ（登録商標）ＴＯＰＯ（登録商標）ＰＣＲクローニングキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）  ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に供給されたｐＣＲ（登録商標）４Ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯ（登録商標）ベクターにクローニングした。軽鎖の可変部分をＡｇｅＩとＢｓｉＷＩにより切り出し、ヒトカッパ軽鎖の定常部分を既に含んでいるベクターｐＫＡＮＥＯ−ＣＭ３０−Ｌ−ｖａｒ＃７にクローニングした。両ベクターは、ＰｍｅＩとＰａｃＩを用いてベクターから軽鎖の発現カセットを取り出して、これを、重鎖を含むベクターに付加することによって、１つのベクターへと組み立てた。
【００８０】
ヒト化抗体１６Ｄ３の重鎖と軽鎖の可変部分の塩基配列とアミノ酸配列を配列番号５、配列番号６、配列番号７および配列番号８に示す（図１２を参照）。
２．ｈｕ１６Ｄ３の一時的発現
ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ  ２９３  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を製造者の使用説明書にしたがって使用して、Ｈｕ１６Ｄ３  ＩｇＧ４κをＨＥＫ２９３細胞に一時的に発現させた。Ｈｕ１６Ｄ３は、ｐｒｏＳｅｐ  ｖＡ  Ｕｌｔｒａによるアフィニティクロマトグラフィを用いて上清から精製した。精製Ｈｕ１６Ｄ３は、還元および非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより純度を確認した。Ｈｕ１６Ｄ３は、ｈｕＰｌＧＦに対する結合に関して、およびＨｕＰｌＧＦ／ｈｕＦＬＴ−１結合の阻害に関して、ＥＬＩＳＡによりさらに調べた（図１および図２を参照）。
【実施例３】
【００８１】
腫瘍増殖の抗ＰＬＧＦ抗体による阻害のインビボ研究
１．材料と方法の一般的説明
細胞培養
マウス膵臓細胞株Ｐａｎｃ０２およびヒト膵臓細胞株ＤａｎＧはＳ．Ｒｏｓｅｗｉｃｚ（Ｃｈａｒｉｔｅ−Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔａｔｓｍｅｄｉｚｉｎ、ベルリン、ドイツ）の親切な寄贈品である。ヒト乳房ＭＤＡ−ＭＢ、結腸ＬＯＶＯおよび黒色腫Ｍｅｌ２ａ細胞株はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；マナッサス、ＶＡ、ＵＳＡ）から得た。すべての細胞は推奨されたように培養した。抗体に対する免疫反応を避けるために、マウス１６Ｄ３抗ＰｌＧＦ抗体をすべてのインビボ実験に用いた。
実験動物
すべての動物手順は、動物実験委員会（ｔｈｅ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｉｍａｌ  ｃａｒｅ  ａｎｄ  ｕｓｅ  ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ）により完全に承認された。メスＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスを準滅菌条件下で収容し、８〜１０週齢（およその体重、２５ｇ）で定期的に使用した。腫瘍源の調製のために、腫瘍細胞をトリプシン処理して単細胞懸濁物を調製し、ＰＢＳで洗浄した。その遠心ペレットを２００μｌのＰＢＳに再懸濁し、マウスの右脇腹に皮下注射した。同所性膵臓腫瘍モデルのために、３０μｌのＰＢ
Ｓ中の１×１０６腫瘍細胞を、９〜１０週齢のメスＣ５７Ｂ１６マウスの腹部開腹術により膵臓頭部に注射した。これらの手順の前に、マウスはケタミン（９０ｍｇ／体重ｋｇ）およびキシラジン（９ｍｇ／体重ｋｇ）で麻酔した。
医薬（すなわち、抗体、ビヒクル等）の投与
抗体またはビヒクルコントロールによる処置は、腫瘍が約６０ｍｍ３の大きさに達したときに開始した。抗体Ｐ１５Ｄ１１Ｄ４（ＷＯ０１／８５７９６）、１６Ｄ３、１Ｃ８またはビヒクルは、示された用量で腹腔内に１日おきに投与した。Ａｖａｓｔｉｎは、示された用量で腹腔内に週２回投与した。
腫瘍の測定
皮下増殖している腫瘍を、キャリバーを用いて１日おきに測定し、腫瘍容積を式：ｐ／６（ｗ１×ｗ２×ｗ２）（式中、ｗ１とｗ２は最大腫瘍直径と最小腫瘍直径をそれぞれ表す）を用いて計算した。マウスを屠殺したときに、膵臓の同所性増殖腫瘍を同じ方法を用いた腹部開腹術後に測定した。
統計分析
統計分析は、ＧｒａｐｈＰａｄ統計ソフトウエア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ社、サンジエゴ、ＣＡ）を用いるペア観察のために両側スチューデントｔ検定により実施した。すべてのデータは、別途の指定がない限り、平均±ＳＥＭとして示す。別途の指定がない限り、＊ｐ＜０．５、＊＊ｐ＜０．０１である。
２．皮下ヒト膵臓ＤａｎＧ異種移植片腫瘍モデルにおける腫瘍増殖のマウス抗ｈＰｌＧＦ抗体１６Ｄ３による阻害
１×１０６腫瘍細胞を、１１週齢のメスＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３の大きさに達した後、抗ｈＰｌＧＦ（１６Ｄ３、５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）、抗ｍＰｌＧＦ（ＰＬ５Ｄ１１Ｄ４（ＷＯ０１／８５７９６に記載のように得たもの；５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）、コントロールＩｇＧ（１Ｃ８；５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）、抗ｈＰｌＧＦと抗ｍＰｌＧＦの組合せ（それぞれが２５ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）およびビヒクル（ｎ＝１０）による処置を開始した。抗体を１日おきに腹腔内に注射した。（Ａ）腫瘍を１日おきに測定し、腫瘍容積を式：Ｗ１×Ｗ２×Ｗ２×ｐ／２（式中、Ｗ１は最大直径およびＷ２は最小直径を示す）を用いて計算した。（Ｂ）マウスを腫瘍接種の１８日後に屠殺し、腫瘍を切除し、重量を測定した。平均腫瘍容積：ビヒクル：９１５±９０ｍｍ３、ＩｇＧ：±８９ｍｍ３、ＰＬ５Ｄ１１Ｄ４：８３２±１１８ｍｍ３、１６Ｄ３：５２１±８３ｍｍ３、ＰＬ５Ｄ１１Ｄ４＋１６Ｄ３：４９７±８６ｍｍ３。
【００８２】
その結果は、図４に示されるように、抗ヒトＰＬＧＦ抗体１６Ｄ３の投与が腫瘍重量と大きさに対して明らかな影響を有することを示している。
３．抗ｈＰｌＧＦは皮下ヒト膵臓ＤａｎＧ異種移植片腫瘍モデルの腫瘍増殖を用量依存的に阻害する。
【００８３】
１×１０６腫瘍細胞を、１１週齢のメスＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３の大きさに達した後、抗ｈＰｌＧＦ、ＩｇＧ（１Ｃ８；５０ｍｇ／ｋｇ）、１６Ｄ３（５０ｍｇ／ｋｇ、３７．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／体重ｋｇ；各濃度でｎ＝１０）およびビヒクル（ｎ＝１０）による処置を開始した。（Ｂ）マウスは腫瘍接種の１８日後に屠殺した。
【００８４】
結果を図５に示す。平均腫瘍容積±ＳＥＭ：１６Ｄ３、５０ｍｇ／体重ｋｇ：４５０±３７ｍｍ３；３７．５ｍｇ／体重ｋｇ：４６９±９７ｍｍ３；２５ｍｇ／体重ｋｇ：４９３±１０７ｍｍ３；１２．５ｍｇ／体重ｋｇ：６９３±１０７ｍｍ３；ＩＣ８：８６５±１０９ｍｍ３；ビヒクル：８８９±１００ｍｍ３。
４．抗ｈｕＰｌＧＦは皮下ヒト乳房ＭＤＡ−ＭＢ異種移植片腫瘍モデルの腫瘍増殖を阻害する。
【００８５】
１×１０７腫瘍細胞を、１１週齢のメスＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３の大きさに達した後、抗ｈＰｌＧＦ、１６Ｄ３（５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）およびビヒクル（ｎ＝１０）による処置を開始した。
【００８６】
結果を図６（および下記の表１）に示す。
【００８７】
【表１】
2008532557.tif 000003
【００８８】
５．抗ｈｕＰｌＧＦは皮下ヒト結腸ＬＯＶＯ異種移植片腫瘍モデルの腫瘍増殖を阻害する。
【００８９】
１×１０７腫瘍細胞を、１１週齢のメスＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３の大きさに達した後、抗ｈＰｌＧＦ、１６Ｄ３（５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）およびビヒクル（ｎ＝１０）による処置を開始した。
【００９０】
結果を図７および下記の表２に示す。
【００９１】
【表２】
2008532557.tif 000004
【００９２】
６．抗ｈｕＰｌＧＦは皮下ヒト黒色腫Ｍｅｌ２ａ異種移植片腫瘍モデルの腫瘍増殖を阻害する。
【００９３】
４×１０６腫瘍細胞を、１１週齢のメスＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３の大きさに達した後、抗ｈＰｌＧＦ、１６Ｄ３（５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）およびビヒクル（ｎ＝１０）による処置を開始した。
【００９４】
結果を図８および下記の表３に示す。
【００９５】
【表３】
2008532557.tif 000005
【実施例４】
【００９６】
１６Ｄ３抗体による処置の体重減少に対する効果のインビボ研究
材料と方法は実施例３に記載したとおりであった。
【００９７】
１×１０６腫瘍細胞を、１１週齢のメスＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３の大きさに達した後、抗ｈＰｌＧＦ（１６Ｄ３、５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）、抗ｍＰｌＧＦ（ＰＬ５Ｄ１１Ｄ４；５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）、コントロールＩｇＧ（１Ｃ８；５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）、抗ｈＰｌＧＦと抗ｍＰＬＧＦの組合せ（それぞれが２５ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）およびビヒクル（ｎ＝１０）による処置を開始した。抗体は１日おきに腹腔内注射した。マウスの体重は抗体処置の最初の日と最後の日に測定した。腫瘍重量は、体重減少の比率の計算前に体重から差し引いた。
【００９８】
結果を図９に示す。抗ｈＰｌＧＦは、この皮下ヒト膵臓ＤａｎＧ異種移植片の腫瘍モデルにおいて体重減少を妨げることが示されている。
【実施例５】
【００９９】
腫瘍増殖の治療のための抗ｈＰｌＧＦ抗体と抗ＶＥＧＦ抗体の組合せ
材料と方法は実施例３に記載したとおりであった。
【０１００】
１×１０６腫瘍細胞を、１１週齢のメスＮＭＲＩ  ｎｕ／ｎｕマウスの右脇腹に皮下注射した。腫瘍が約６０ｍｍ３の大きさに達した後、抗ｈＰｌＧＦ（１６Ｄ３、５０ｍｇ／ｋｇ、３７．５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／体重ｋｇ、１日おきの腹腔内；各濃度でｎ＝１０）、Ａｖａｓｔｉｎ（１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／体重ｋｇ、週２回の腹腔内、各濃度でｎ＝１０）および抗ｈＰｌＧＦ（１２．５ｍｇ／体重ｋｇ）とＡｖａｓｔｉｎ（５ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）の組合せによる処置を開始した。マウスは腫瘍接種の２０日後に屠殺した。
【０１０１】
結果を図１０に示す。平均腫瘍容積±ＳＥＭ：１Ｃ８、３７；３７，５ｍｇ／体重ｋｇ：９５４±１６４ｍｍ３；１２．５ｍｇ／体重ｋｇ：１３９８±２３６ｍｍ３；ＩｇＧ：１７８９±２３１ｍｍ３；Ａｖａｓｔｉｎ：１５ｍｇ／体重ｋｇ：８２８±１８６ｍｍ３；５ｍｇ／体重ｋｇ：９２６±２０２ｍｍ３；Ａｖａｓｔｉｎ＋１６Ｄ３：５６９±９４ｍｍ３。抗ｈＰｌＧＦとＡｖａｓｔｉｎは皮下ヒト膵臓ＤａｎＧにおいて腫瘍増殖の阻害に対してさらなる効果をおよぼすことが観察される。
【実施例６】
【０１０２】
１６Ｄ３のｓｃＦｖの産生
重鎖と軽鎖の可変部分の配列（それぞれ配列番号２と配列番号４、実施例１に記載されたように得られたもの）を、適切な制限結合部位とリンカーを有するプライマーを用いたＰＣＲにより増幅した。ＳＯＥ  ＰＣＲ（オーバーラップ伸長による遺伝子スプライシング）後、ｓｃＦｖをｐＥＥ１４．４（ＨｉｎｄＩＩＩ−ＥｃｏＲＩクローニング部位）に
クローニングした（図１２）。このｓｃＦｖｈｐ１６Ｄ３／ｐＥＥ１４．４は、Ｆｕｇｅｎｅ  ６（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いたＢａｍＨＩによる直線化の後に、ＣＨＯ−ＫＩ細胞に移入し、希釈により２回サブクローニングした。モノクローナルｓｃＦｖ  ｈｐ１６Ｄ３、６Ｃ５Ｄ４が得られ、作られた。このクローンもまたｓｃＦｖ  ｈｐ１６Ｄ３／ｐＫＡＮＥＯ−ＭＣＳ５０−ｄｈｆｒ１（ＮｈｅＩ−ＮｏｔＩクローニング部位）と平行してＰｒｏｄｕｃｅｌｌにより２９３細胞に一時的に移入した（図１３）。
【０１０３】
１６Ｄ３  ｓｃＦｖの塩基配列とアミノ酸配列を配列番号２３と配列番号２４にそれぞれ示す。重鎖と軽鎖の可変領域、リンカー配列とＨＡ−ｔａｇおよびＨｉｓ  Ｔａｇを示すアミノ酸配列も図１５に示す。
【実施例７】
【０１０４】
ｓｃＦｖ  １６Ｄ３のヒト化
ｓｃＦｖの可変領域のヒト化を実施例２に記載のように実施した。１６Ｄ３のヒト化ｓｃＦｖの塩基配列とアミノ酸配列を配列番号２５と配列番号２６にそれぞれ示す。ヒト化ｓｃＦｖの重鎖と軽鎖の可変領域、リンカー配列とＨＡ−ｔａｇおよびＨｉｓ  Ｔａｇを示すアミノ酸配列も図１５に示す。
【実施例８】
【０１０５】
ヒト化Ｆａｂｌ６Ｄ３の生産
１．ヒト化ｓｃＦｖ１６Ｄ３からＶＨフラグメントとＶＬフラグメントを増幅する
ヒト化ｓｃＦｖ１６Ｄ３のＶＨフラグメント増幅用プライマー
＿１６Ｄ３Ｖｈｂａｃｋｂｌｕｎｔ  ５’−ＣＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣＴＧ−３’（配列番号２７）
１６Ｄ３ＶｈｆｏｒＳａｌＩ      ５’−ＧＡＴＧＧＧＣＣＣＴＴＧＧＴＣＧＡＣＧＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＴＧＡＧＣＡＧＧＧ−３’（配列番号２８）
ヒト化ｓｃＦｖ１６Ｄ３のＶＬフラグメント増幅用プライマー
＿１６Ｄ３ＶＬＢａｃｋＡｇｅＩ    ５’−ＣＣＡＣＣＧＧＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴＣＣ−３’（配列番号２９）
１６Ｄ３ＶＬＦｏｒＢｓｉＷＩ    ５’−ＣＡＣＣＧＴＡＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＣＴＴＴＧＴＣＣＣＣＧＡＧ−３’（配列番号３０）
２．重鎖ベクターと軽鎖ベクターの構築
最初に、軽鎖のＰＣＲ産物をｐＣＲ４ｂｌｕｎｔ−ＴＯＰＯベクターにクローニングした。配列決定後、軽鎖をＡｇｅＩとＢｓｉＷＩ消化により取り出し、ｐＫＡＮＥＯ−ＣＭ３０−Ｌｖａｒ＃７ベクターにクローニングした。重鎖のＰＣＲ産物は消化後にｐＫＡＮＥＯ−ＭＣＳ５０−Ｆａｂｖａｒ＃３に直接クローニングした。
３．重鎖構築物と軽鎖構築物の連結
軽セグメントを含むカセットを取り出し、これを、酵素ＰｍｅＩとＰａｃＩを用いて重セグメントを含むベクターに付加することにより、軽セグメントと重セグメントを含む（上記の）両ベクターを結合させて、最終構築物ｈｐｌ６Ｄ３ｍｕｔｃｍｐｌＦａｂ／ｐＫＡＮＥＯ−ＭＣＳ５０−Ｆａｂｖａｒ＃３を得た（図１６を参照）。
【実施例９】
【０１０６】
ｓｃＦｖ  １６Ｄ３およびヒト化ｓｃＦｖ１６Ｄ３による抗原結合とＰｌＧＦ／ｆｌｔ−１相互作用の阻害の分析（図１４）
１．抗原結合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのｈｕＰｌＧＦ−１により、２００μＬ／ウエルにて、４℃で被覆した。１％ＢＳＡによる１時間室温でのブロッキング後、ｓｃＦｖ１６Ｄ３／ヒト化ｓｃＦｖ１６Ｄ３の希釈系列を２００μＬ／ウエルで加え、抗体
フラグメントを１時間室温で結合させた。結合したｓｃＦｖ１６Ｄ３を、マウス抗ＨＡ（１８０μＬ／ウエル、１時間、室温）により検出した後、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｓｉｇｍａ）とともに１７０μＬ／ウエルにて１時間室温でインキュベートした。アッセイはＯＰＤにより展開された。
２．ＥＬＩＳＡによるＰｌＧＦ／Ｆｌｔ−１相互作用の阻害
ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌのｈｕＦｌｔ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、２００μＬ／ウエルにて、４℃で被覆した。１％ＢＳＡによる１時間室温でのブロッキング後、ｓｃＦｖ１６Ｄ３／ヒト化ｓｃＦｖ１６Ｄ３の希釈系列を１００μＬ／ウエルで加え、さらに１００μＬ／ウエルのｈｕＰｌＧＦ−２を加えた。室温での２時間のインキュベーション後、結合したＰｌＧＦを、ヤギ抗ｈｕＰＬＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により１８０μＬ／ウエル、１時間、室温で検出した後、ＲＡＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）とともに、１時間室温でインキュベートした。アッセイはＯＰＤにより展開された。
【実施例１０】
【０１０７】
ヒト化Ｆａｂ１６Ｄ３による抗原結合とＰｌＧＦ／Ｆｌｔ−１相互作用の阻害の分析
１．抗原結合ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中の１μｇ／ｍｌのｈｕＰｌＧＦ−１により、１００μＬ／ウエル、４℃で被覆した。１％ＢＳＡによる１時間室温でのブロッキング後、ヒト化Ｆａｂ１６Ｄ３の希釈系列を１００μＬ／ウエルで加え、抗体フラグメントを１時間室温で結合させた。結合したヒト化Ｆａｂｌ６Ｄ３は抗ｈｕＩｇＧ−ＨＲＰ（Ｆａｂ特異的）（１００μＬ／ウエル、１時間、室温）で検出した。アッセイはＯＰＤにより展開された。結果を図１７Ａに示す。
２．ＥＬＩＳＡによるＰｌＧＦ／Ｆｌｔ−１相互作用の阻害
ＥＬＩＳＡプレートを、１μｇ／ｍｌのｈｕＦｌｔ−１（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により、２００μＬ／ウエルにて、４℃で被覆した。１％ＢＳＡによる１時間室温でのブロッキング後、ヒト化ｓｃＦａｂ１６Ｄ３の希釈系列を１００μＬ／ウエルで加え、さらに１００μＬ／ウエルのｈｕＰｌＧＦ−２を加えた。室温での２時間のインキュベーション後、結合したＰｌＧＦを、ヤギ抗ｈｕＰｌＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により１８０μＬ／ウエルにて１時間、室温で検出した後、ＲＡＧ−ＨＲＰ（ＤＡＫＯ）とともに、１時間室温でインキュベートした。アッセイはＯＰＤにより展開された。それらの結果を図１７Ｂに示す。
【実施例１１】
【０１０８】
ＫＤ値の決定
１６Ｄ３、ヒト化１６Ｄ３  ＩｇＧ４、ヒト化ｓｃＦｖ１６Ｄ３およびヒト化Ｆａｂ１６Ｄ３のそれぞれのＫＤ値を、Ｂｉａｃｏｒｅを用いて決定した。結果を以下の表４に示す。
【０１０９】
【表４】
2008532557.tif 000006
【０１１０】
１６Ｄ３、ヒト化１６Ｄ３  ＩｇＧ４、ヒト化Ｆａｂ  １６Ｄ３およびヒト化ｓｃＦｖ１
６Ｄ３のＫＤ値。
【図面の簡単な説明】
【０１１１】
【図１】本発明の一実施形態によるＥＬＩＳＡ試験による、ヒトＰｌＧＦ−２（Ｐｉｃｈｉａにおいて産生）に対する抗体１６Ｄ３（Ａ）またはヒト化抗体１６Ｄ３（ｈｕ１６Ｄ３）（Ｂ）の結合。
【図２】本発明の一実施形態によるＥＬＩＳＡ試験による、抗体１６Ｄ３（四角形）またはヒト化抗体１６Ｄ３（三角形）によるＰｌＧＦ−２のヒトＦｌｔ−１レセプターへの結合阻害。
【図３】本発明の一実施形態による試験で抗体１６Ｄ３およびそのＦａｂフラグメントの阻害可能性を調べるための、ｒｈｕＰｌＧＦ−２がＣＭ５チップに固定化されたＢｉａｃｏｒｅ実験の結果。
【図４】モノクローナル抗体１６Ｄ３は皮下ヒト膵臓ＤａｎＧ異種移植片腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する。本発明の一実施形態による抗ｔＰＡ（「コントロールＩｇＧ」）（１Ｃ８；５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）、抗ｈＰｌＧＦ  １６Ｄ３（「抗ｈＰｌＧＦ」）（５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）、抗ｍＰｌＧＦ（ＰＬ５Ｄ１１Ｄ４（ＷＯ０１／８５７９６に記載のように得られたもの；５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）、抗ｈＰｌＧＦ  １６Ｄ３と抗ｍＰｌＧＦ  ＰＬ５Ｄ１１Ｄ４との組合せ（「抗ｈＰｌＧＦ／抗ｍＰｌＧＦ」）（それぞれが２５ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）および「ビヒクル」（ｎ＝１０）による約６０ｍｍ３の腫瘍を有するｎｕ／ｎｕマウスの処置。腫瘍接種の１８日後の（Ａ）腫瘍サイズ（Ｂ）腫瘍重量。
【図５】モノクローナル抗体１６Ｄ３は皮下ヒト膵臓ＤａｎＧ異種移植片腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を用量依存的に阻害する。本発明の一実施形態による抗ｈＰｌＧＦ  １６Ｄ３（５０ｍｇ／ｋｇ＝「１０００μｇ」／「Ｃ」、３７，５ｍｇ／ｋｇ＝「７５０μｇ」／「Ｄ」、２５ｍｇ／ｋｇ＝「５００μｇ」／「Ｅ」、１２．５ｍｇ／ｋｇ＝「２５０μｇ」／「Ｆ」；各濃度でｎ＝１０）、コントロールＩｇＧ（「１Ｃ８」／「Ｂ」；５０ｍｇ／ｋｇ）および「ビヒクル」／「Ａ」（ｎ＝１０）による約６０ｍｍ３の腫瘍を有するｎｕ／ｎｕマウスの処置。Ａ：腫瘍細胞接種後の平均腫瘍サイズの成長；Ｂ：２０日目での平均腫瘍サイズ。
【図６】モノクローナル抗体１６Ｄ３は皮下ヒト乳房ＭＤＡ−ＭＢ異種移植片腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を阻害する。本発明の一実施形態による抗ｈＰｌＧＦ  １６Ｄ３（５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）またはビヒクルによる約６０ｍｍ３の腫瘍を有するｎｕ／ｎｕマウスの週３回の処置。（接種の３２日後に測定した）Ａ：腫瘍重量およびＢ：腫瘍容積。
【図７】モノクローナル抗体１６Ｄ３は皮下ヒト結腸ＬＯＶＯ異種移植片腫瘍モデルの腫瘍増殖を阻害する。本発明の一実施形態による抗ｈＰｌＧＦ  １６Ｄ３（５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）またはビヒクルによる約６０ｍｍ３の腫瘍を有するｎｕ／ｎｕマウスの週３回の処置。（接種の３０日後に測定した）Ａ：腫瘍重量およびＢ：腫瘍容積。
【図８】モノクローナル抗体１６Ｄ３は皮下ヒト黒色腫Ｍｅｌ２ａ異種移植片腫瘍モデルの腫瘍増殖を阻害する。本発明の一実施形態による抗ｈＰｌＧＦ  １６Ｄ３（５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）またはビヒクルによる約６０ｍｍ３の腫瘍を有するｎｕ／ｎｕマウスの週３回の処置。接種の５３日後に測定した腫瘍重量。
【図９】モノクローナル抗体１６Ｄ３は皮下ヒト膵臓ＤａｎＧ異種移植片腫瘍モデルの体重減少を抑制する。本発明の一実施形態による抗ｈＰｌＧＦ  １６Ｄ３（５０ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）、コントロールＩｇＧ、抗ｈＰｌＧＦと抗ｍＰｌＧＦとの組合せ（それぞれ２５ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）およびビヒクル（ｎ＝１０）による約６０ｍｍ３の腫瘍を有するｎｕ／ｎｕマウスの処置。腫瘍重量は体重減少の比率の計算前に体重から差し引いた。白バー：治療の第１日目の体重；黒バー：治療最終日の体重。
【図１０】モノクローナル抗体１６Ｄ３とＡｖａｓｔｉｎは皮下ヒト膵臓ＤａｎＧの腫瘍増殖の阻害にさらなる効果をおよぼす。本発明の一実施形態による抗ｈＰｌＧＦ  １６Ｄ３（３７．５ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、１２．５ｍｇ／体重ｋｇ；各濃度でｎ＝１０）、コントロールＩｇＧ（１Ｃ８；５０ｍｇ／ｋｇ）、Ａｖａｓｔｉｎ（１５ｍｇ／ｋｇおよび５ｍｇ／体重ｋｇ、週２回の腹腔内、各濃度でｎ＝１０）および抗ｈＰｌＧＦ（１２．５ｍｇ／体重ｋｇ）とＡｖａｓｔｉｎ（５ｍｇ／体重ｋｇ；ｎ＝１０）との組合せによる約６０ｍｍ３の腫瘍を有するｎｕ／ｎｕマウスの処置。腫瘍接種の２０日後にマウスを屠殺し、腫瘍容積を測定した。
【図１１】本発明の一実施形態によるマウス抗体１６Ｄ３の可変部分の塩基配列およびアミノ酸配列。Ａ．重鎖の可変部分をコードする塩基配列；Ｂ．軽鎖の可変部分をコードする塩基配列；Ｃ．重鎖の可変部分のアミノ酸配列；Ｄ．軽鎖の可変部分のアミノ酸配列。本発明の一実施形態によるヒト化の目的のために修飾することのできるヌクレオチドおよびアミノ酸に下線を付す。
【図１２】本発明の一実施形態による１６Ｄ３のヒト化可変部分の塩基配列およびアミノ酸配列。Ａ．重鎖のヒト化可変部分をコードする塩基配列；Ｂ．軽鎖のヒト化可変部分をコードする塩基配列；Ｃ．重鎖のヒト化可変部分のアミノ酸配列；Ｄ．軽鎖のヒト化可変部分のアミノ酸配列。ヒト化の目的のために修飾されるヌクレオチドおよびアミノ酸に下線を付す。
【図１３】２９３細胞でのヒト化１６Ｄ３  ｓｃＦｖの発現用ベクターの図。
【図１４】Ａ：ｓｃＦｖ１６Ｄ３およびヒト化ｓｃＦｖ１６Ｄ３のＰｌＧＦへの結合；Ｂ：ｓｃＦｖ１６Ｄ３およびヒト化ｓｃＦｖ１６Ｄ３によるｈｕＰｌＧＦ−２のそのレセプターｈｕＦｌｔ−１への結合の阻害（Ｂ）。
【図１５】Ａ：マウス抗体１６Ｄ３のｓｃＦｖのアミノ酸配列；Ｂ：抗体１６Ｄ３のヒト化ｓｃＦｖのアミノ酸配列。重鎖および軽鎖の可変領域以外の領域に下線を付す。
【図１６】本発明の一実施形態による２９３細胞でのヒト化１６Ｄ３  Ｆａｂ発現用ベクターの図。
【図１７】Ａ：本発明の一実施形態によるＥＬＩＳＡ試験によるヒト化Ｆａｂ  １６Ｄ３のｈｕＰＬＧＦへの結合；Ｂ：ヒト化Ｆａｂ  １６Ｄ３によるｈｕＰｌＧＦ−２のそのレセプターｈｕＦｌｔ−１への結合の阻害。
【図１】
2008532557.tif 000007
【図２】
2008532557.tif 000008
【図３】
2008532557.tif 000009
【図４】
2008532557.tif 000010
【図５】
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【図６】
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【図７】
2008532557.tif 000013
【図８】
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【図９】
2008532557.tif 000015
【図１０】
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【図１１】
2008532557.tif 000017
【図１２】
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【図１３】
2008532557.tif 000019
【図１４】
2008532557.tif 000020
【図１５】
2008532557.tif 000021
【図１６】
2008532557.tif 000022
【図１７】
2008532557.tif 000023
【配列表】
2008532557000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月3日(2007.10.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１７〜配列番号２２からなる群から選択される少なくとも２つのＣＤＲを含むか、またはそれらに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する少なくとも２つの配列を含むことを特徴とするＰｌＧＦに結合することのできる抗原結合性分子。
【請求項２】
配列番号１７〜配列番号２２の配列に対応するＣＤＲ領域またはそれらに対して少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１記載の抗原結合性分子。
【請求項３】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’またはＦ（ａｂ’）２、少なくとも２つの相補性決定領域（ＣＤＲ）の組合せ、可溶性または膜固定の単鎖可変部分、単鎖可変フラグメントまたは単一の可変ドメインからなる群から選択される分子である請求項１または２記載の抗原結合性分子。
【請求項４】
配列番号２の配列を含む重鎖可変領域を含むか、またはＣＤＲ領域内でそれと少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ配列番号４の配列を含む軽鎖可変領域を含むか、またはＣＤＲ領域内でそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むことを特徴とする請求項１または２記載の抗原結合性分子。
【請求項５】
ＬＭＢＰ  ６３９９ＣＢとして寄託された細胞株により産生される抗体１６Ｄ３またはそのフラグメントである請求項１に記載の抗原結合性分子。
【請求項６】
ヒト化抗体または抗体フラグメントである請求項１に記載の抗原結合性分子。
【請求項７】
配列番号２４のアミノ酸配列を含む請求項１記載の抗原結合性分子。
【請求項８】
ヒト化抗原結合分子である請求項１記載の抗原結合性分子。
【請求項９】
請求項１または２記載の抗原結合性分子を産生する細胞株。
【請求項１０】
ＬＭＢＰ  ６３９９ＣＢとして寄託された細胞株である請求項９記載の細胞株。
【請求項１１】
有効成分として、請求項１に記載のＰｌＧＦ結合分子を医薬的に許容される担体と混合して含む、哺乳動物の病的状態における望まれない血管新生の予防または治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
さらに、治療有効量の別の血管新生阻害剤を含む請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１３】
病的状態が、癌、炎症、癒着形成、目の病気、肺性高血圧および血液漏出からなる群から選択される請求項１１記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記癌が、結腸癌、乳癌、膵臓癌および黒色腫からなる群から選択される請求項１３記載の医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１記載の抗原結合性分子をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１６】
癌の治療でＰｌＧＦ阻害に対して相加作用を有する化合物のスクリーニングのための請求項１記載の抗原結合性分子の使用。
【請求項１７】
インビトロ診断ツールとしての請求項１記載の抗原結合性分子の使用。
【国際調査報告】
2008532557.tif 000024
2008532557.tif 000025
2008532557.tif 000026
2008532557.tif 000027