(57)【要約】  シトシンを修飾する薬剤でウイルス核酸を処理してウイルス核酸誘導体を形成するステップと、ウイルス核酸誘導体の少なくとも一部分を増幅してＨＰＶ特異的核酸分子を形成するステップと、ＨＰＶ特異的核酸分子の存在を探すステップとを含むＨＰＶを検出するためのアッセイであって、ＨＰＶ特異的核酸分子の検出はＨＰＶの指標となるアッセイ。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を検出するためのアッセイであって、
シトシンを修飾する薬剤でウイルス核酸を処理し、ウイルス核酸誘導体を形成するステップと、
前記ウイルス核酸誘導体の少なくとも一部分を増幅し、ＨＰＶ特異的核酸分子を形成するステップと、
ＨＰＶ特異的核酸分子の存在を探すステップであって、前記ＨＰＶ特異的核酸分子の検出がＨＰＶを示すステップと
を含むアッセイ。
【請求項２】
ＨＰＶ特異的核酸分子の増幅を可能にすることができるＨＰＶプライマーを提供するステップをさらに含む請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
前記ウイルスが、スワブ、生検、スメア、パップスメア、血液、血漿、血清、血液製剤、表面スクレープ、スパチュラ、液体懸濁液、凍結材料、パラフィンブロック、スライドガラス、法医学収集システムおよびアーカイブ材料より成る群から選択される試料中にある請求項１または２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記試料がスメア、パップスメア、または細胞の液体懸濁液である、請求項３に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記薬剤がシトシンを修飾し、核酸誘導体中にウラシルを形成する請求項１〜４のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記薬剤が亜硫酸水素塩、酢酸塩、またはクエン酸塩から選択される請求項５に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記薬剤が亜硫酸水素ナトリウムである請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記薬剤が相補的二本鎖ウイルス核酸の各々の鎖におけるシトシンをウラシルに修飾し、２つの非相補的なウイルス核酸分子誘導体を形成する請求項１〜７のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記ウイルス核酸誘導体のシトシンの総数が、対応する未処理ウイルス核酸に比較して減少している請求項１〜８のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、等温増幅、シグナル増幅、またはそれらの組合せによって行われる請求項１〜９のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記増幅がＰＣＲによって行われる請求項１０に記載のアッセイ。
【請求項１２】
増幅が、天然ＨＰＶゲノムの一部を構成しないＨＰＶ特異的核酸分子を形成する請求項１〜１１のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記ＨＰＶ特異的核酸分子がＨＰＶ種、ＨＰＶの型、またはＨＰＶの亜型に特異的である請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１４】
前記ＨＰＶ型が、特定のヒト民族系統における所定の組織上に、高、中、または低レベルの発癌状態を与えうる請求項１３に記載のアッセイ。
【請求項１５】
高リスクＨＰＶ型がＨＰＶ１６、１８、４５、および５６であり、中リスクＨＰＶ型がＨＰＶ３１、３３、３５、３９、５１、５２、５６、５８、５９、および６８であり、かつ低リスク型がＨＰＶ６、１１、２６、３０、４０、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６６、７３、８２、８３、および８４である請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、および６８が検出される請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項１７】
前記ＨＰＶ特異的核酸がゲル電気泳動、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション、その後の識別を可能にするタグ付きプライマーの使用、酵素結合アッセイ、または標的ＤＮＡによるハイブリダイゼーションとともにシグナルを生じさせる蛍光タグ付きプライマーの使用によって検出される請求項１〜１６のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１８】
配列番号１〜配列番号５１６の１つもしくはそれ以上を含むＨＰＶプライマーまたはプローブ。
【請求項１９】
配列番号３３３〜配列番号３５０の１つもしくはそれ以上を含む高リスクＨＰＶ株を検出するための請求項１８に記載のＨＰＶプライマーまたはプローブ。
【請求項２０】
配列番号４６２、配列番号４７９、配列番号４６３、配列番号４７８、配列番号４７０、配列番号４８５、および配列番号４８６を含むＨＰＶを検出するための請求項１８に記載のＨＰＶプライマーまたはプローブ。
【請求項２１】
適切な試薬または希釈剤とともに請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の２つもしくはそれ以上のＨＰＶプライマーまたはプローブを含むＨＰＶの検出のためのキット。
【請求項２２】
以上に規定された少なくとも１５個のヌクレオチドを含むＨＰＶ核酸誘導体。
【請求項２３】
高リスクＨＰＶ１６、１８、４５、または５６を含む請求項２２に記載のＨＰＶ核酸誘導体。
【請求項２４】
中リスクＨＰＶ３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８、５９、および６８を含む請求項２２に記載のＨＰＶ核酸誘導体。
【請求項２５】
配列番号６１４、配列番号６１７、配列番号６２０、配列番号６２３、配列番号６２６、配列番号６２９、配列番号６３２、配列番号６３５、配列番号６３８、配列番号６４１、配列番号６４４、配列番号６４７、配列番号６５０、配列番号６５３、配列番号６５６、配列番号６５９、配列番号６６２、配列番号６６５、配列番号６６８、配列番号６７１、配列番号６７４、配列番号６７７、配列番号６８０、配列番号６８３、配列番号６８６、または配列番号６８９；少なくとも１５個のヌクレオチドを含むそれらの部分配列、および配列番号６１４、配列番号６１７、配列番号６２０、配列番号６２３、配列番号６２６、配列番号６２９、配列番号６３２、配列番号６３５、配列番号６３８、配列番号６４１、配列番号６４４、配列番号６４７、配列番号６５０、配列番号６５３、配列番号６５６、配列番号６５９、配列番号６６２、配列番号６６５、配列番号６６８、配列番号６７１、配列番号６７４、配列番号６７７、配列番号６８０、配列番号６８３、配列番号６８６、または配列番号６８９にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸分子を含む請求項２３または２４に記載のＨＰＶ核酸誘導体。
【請求項２６】
以上に規定された少なくとも１５個のヌクレオチドを含む簡易化したＨＰＶ核酸。
【請求項２７】
高リスクＨＰＶ１６、１８、４５、または５６を含む請求項２６に記載の簡易化したＨＰＶ核酸。
【請求項２８】
中リスクＨＰＶ３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８、５９、および６８である請求項２６に記載の簡易化したＨＰＶ核酸。
【請求項２９】
配列番号６１５、配列番号６１８、配列番号６２１、配列番号６２４、配列番号６２７、配列番号６３０、配列番号６３３、配列番号６３６、配列番号６３９、配列番号６４２、配列番号６４５、配列番号６４８、配列番号６５１、配列番号６５４、配列番号６５７、配列番号６６０、配列番号６６３、配列番号６６６、配列番号６６９、配列番号６７２、配列番号６７５、配列番号６７８、配列番号６８１、配列番号６８４、配列番号６８７、または配列番号６９０；少なくとも１５個のヌクレオチドを含むそれらの部分配列、および配列番号６１５、配列番号６１８、配列番号６２１、配列番号６２４、配列番号６２７、配列番号６３０、配列番号６３３、配列番号６３６、配列番号６３９、配列番号６４２、配列番号６４５、配列番号６４８、配列番号６５１、配列番号６５４、配列番号６５７、配列番号６６０、配列番号６６３、配列番号６６６、配列番号６６９、配列番号６７２、配列番号６７５、配列番号６７８、配列番号６８１、配列番号６８４、配列番号６８７、または配列番号６９０にストリンジェントな条件下でハイブリダイズできる核酸分子を含む請求項２７または２８に記載の簡易化したＨＰＶ核酸。
【請求項３０】
ＨＰＶ検出のためのプローブ、プライマー、または核酸配列を得るための請求項２２〜２９のいずれか１項に記載のＨＰＶ核酸誘導体または簡易化ＨＰＶ核酸の使用。
【請求項３１】
試料におけるＨＰＶの存在を検出するためのアッセイであって、
試料からウイルス核酸を得るステップと、
ウイルス核酸におけるシトシンがウラシルに変換され、ウイルス核酸誘導体を形成する条件下でウイルス核酸を亜硫酸水素塩で処理するステップと、
ウイルス核酸誘導体の領域に結合ができるプライマーを提供するステップであって、前記プライマーが所望のＨＰＶ特異的核酸分子をウイルス核酸誘導体に増幅を可能にすることができるステップと、
前記ウイルス核酸誘導体に増幅反応を行うステップと、
所望の増幅核酸産物の存在を探すステップであって、前記増幅産物の検出が試料におけるＨＰＶの存在を示すステップと
を含むアッセイ。
【請求項３２】
ＨＰＶが存在する試料を、前記試料におけるＨＰＶの型、亜型、変異型、または遺伝子型を決定しうる追加の試験で処理するステップをさらに含む請求項３１に記載のアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明はヒトパピローマウイルスの検出のためのアッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
ヒトパピローマウイルス
異なるＨＰＶゲノム型間に交差ハイブリダイゼーションの問題があるだけではなく、ＨＰＶ型を構成するものの正確な分類が重要な生物情報的制限を有するゲノム配列類似性に依存するため、単一のアッセイで異なるＨＰＶ型をすべて認識する確実かつ強固なＤＮＡベースの検出システムを実行することは困難であった。したがって、新しいＨＰＶ型が以前のＨＰＶ型との９０％未満の配列類似性があるものとして規定されているが、より細かい分類学上の下位分類は対処するにはより厄介である。したがって、ＤＮＡ配列類似性が以前の亜型に対して９０−９８％の範囲にある場合に新しいＨＰＶ「亜型」が規定されている。配列類似性が以前の変異型の９８−１００％にある場合に新しい「変異型」が規定されている（1993, Van Rast, M. A., et al., Papillomavirus Rep, 4, 61-65; 1998, Southern, S. A. and Herrington, CS. Sex. Transm. Inf. 74,101-109）。この範囲はさらに、変異が単一の単離ウイルス粒子からの単一のゲノムの比較に基づき測定されうる点まで広がりうる。かかる場合、「遺伝子型」が、いずれかの他の完全に配列決定されたＨＰＶゲノムとは１つの塩基で最小限に異なるいずれかの完全に配列決定されたＨＰＶゲノムとなる。これは、規定位置での単一の塩基が４つの状態、Ｇ、Ａ、Ｔ、またはＣの１つに存在しうるすべての場合、および所定の位置での塩基が欠失、付加、増幅、または転位によって別の部位に変化されている場合を含む。
【０００３】
疾患リスク評価との関連で既存ＨＰＶ検出システムが直面する困難は主として３部から成る。第一に技術システムそれ自体の制限。第二に、罹患細胞集団の病理学的解釈の制限。第三に、遺伝的背景および要因の差異の影響を受けやすい異なるヒト集団における疾患進行を評価する臨床レベルでの制限。
【０００４】
子宮頸部異常の臨床的検出
特定の型のＨＰＶが子宮頸部の癌に関与し、膣、外陰部、陰茎、および肛門の癌のより不明確な部分の一因である。子宮頸管の移行部である組織の環はＨＰＶ発癌性に対して高い感受性の領域であり、完全な細胞の正常な状態から浸潤癌までのその状態の評価が組織学的、細胞学的、および分子生物学的方法によって視覚的または顕微鏡的基準を使用してルーチンに評価されている。ウイルスレベルおよび易感染性ヒト細胞のレベルでのウイルス誘発異常の早期検出は、分子軌道に沿って、正常から異常な組織まで、細胞の集団が到達した測定に役立ちうる場合に莫大な臨床的関連性となる。しかし、半世紀間のパップスメアの使用にもかかわらず、異常な子宮頸部の細胞学的診断と正常との確かな早期リスク評価は現在、依然として問題を孕んでいる。主な問題は、さまざまな程度の子宮頸部上皮内新生物（ＣＩＮ１、ＣＩＮ２、およびＣＩＮ３）など「前癌状態」を規定し、したがって、治療オプションに関する臨床判断の分かりにくい規準を中心に展開する。前癌状態の定義は、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３、およびインサイチュー癌の使用を回避する擬似正確な方法であると一部の医師によってみなされている。ＣＩＮ２の顕微鏡的診断および臨床的意義における大きな不均一性がある（2003, Schiffman, M., J. Nat. Cancer Instil. Monog. 31, 14-19）。一部のＣＩＮ２病変は不良な顕微鏡像を有するが、それでもやはり免疫系によって克服され消失するが、他の病変は浸潤癌に進行する。したがって、ＣＩＮ２は一部ではあいまいな診断の緩衝地帯とみなされているが、かかる地帯の境界条件は依然として議論の余地がある。一部の医師は、ＣＩＮ２とＣＩＮ３を結合するのは粗末な仕事であるとみなしているが、その他の医師はＣＩＮ２もしくはより悪い病変のすべてを治療する。最後に、文献では、ＣＩＮ３に割り当てられた３分の１と３分の２の間の女性は浸潤癌を発現するが、さらにこれは予測不可能な時間依存的な形で起こることが示されている（2003, Schiffman, M., J. Nat. Cancer. Instil Monog. 31, 14-19; 1978, Kinlen, L. J., et al., Lancet 2, 463-465; 1956, Peterson, O. A
m. J. Obstet. Gynec. 72, 1063-1071）。
【０００５】
今日、依然として医師が直面する主要な問題は、重要性が不明の異型扁平上皮細胞（ＡＳＣＵＳ）、または扁平上皮内病変（ＳＩＬ）など低度の細胞学的異常の規定が困難であることである。実際に、ＡＳＣＵＳは適切な診断ではなく、むしろ不十分に理解された変化の「くずかご」カテゴリーである（1996, Lorincz, A.T., 1996, J. Obstet. Gyncol. Res. 22, 629-636）。前癌性病変の全体の範囲は、経口避妊薬の使用、喫煙、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）および単純ヘルペス２型ウイルスなどＨＰＶ以外の病原体、抗酸化栄養素、および子宮頸部炎症からの補因子の作用のため解釈が困難であるが、そのすべてが高度の扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）からまでの進行のリスクを調節すると主張されている（2003, Castellsague, X. J. Nat. Cancer Inst. Monog. 31, 20-28)。分類のヘ゛セスタ゛(Bethesda）システムの導入および２００１年におけるその改訂は、医師の間での混乱を削減するためにほとんど役に立たなかったが、それは最初、ＣＩＮ１の異型コイロサイトーシス（ｋｏｉｌｏｃｙｔｏｓｉｓ  ａｔｙｐｉａ）を低度の扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）の新しいカテゴリーに含めることが助けにならないことがわかったためである。ベセスダシステムの導入の結果は、多くの医師が異型コイロサイトーシスでは膣鏡診を行わないが、「ＣＩＮ１の患者でそうすることはやむを得ないと感じた」ことであった（1995, Hatch, K.D., , Am. J. Obstet. Gyn. 172, 1150-1157）。膣鏡診の専門的知識には長年の訓練を必要としたが、主観的な細胞学的基準が依然として矛盾および非再現性をもたらすことは明らかであった（1994, Sherman, M. E., Am. J. Clin. Pathology, 102, 182-187; 1988, Giles, J.A., Br. Med. J., 296, 1099-1102）。
【０００６】
引き続き存在する診断上の障害物は、「異型」など漠然とした診断が、一部の設定における診断の２０％以上の割合を占めうることである（1993, Schiffman, M. Contemporary OB/GYN, 27-40）。これは、「異型」であったスメアでの病理学者の独立した診断的合意のレベルを評価するために特に考えられた試験によって明らかにされる。同一のセットの試料での５人の専門の病理学者間の正確な合意は症例の２９％のみで生じることがわかった（1994, Sherman, M. E., et al., Am. J. Clin. Pathology, 102, 182-187）。最終結果は、子宮頸部細胞診は継続的に高い偽陰性率（低感度と呼ぶ）および高い偽陽性率（低特異性と呼ぶ）を有するということである。さまざまな病理学者の細胞学的解釈により、２０％ほどまでの偽陰性率および１５％までの偽陽性率が生じる（1993, Koss, L. G., Cancer, 71 , 1406-1412）。偽陽性結果は、不必要な膣鏡検診、生検、および治療をもたらすが、そのすべては医療費負担を増加させる。偽陰性結果は、その関連費用とともに潜在的な医療過誤訴訟をもたらす。この領域に入ったのが、ＨＰＶの検査を使用する子宮頸部の異常の初期段階の分子診断が細胞学的診断よりも主観的でない検査を提供することである。
【０００７】
ＨＰＶ検出のためのアッセイの制限
ＨＰＶ  ＤＮＡの存在は最初に外方増殖性尖圭コンジローマからの試料からのＤＮＡに適用される低い厳密性のサザンブロット法によって分析された（1975, Southern, E. M., J. MoI. Biol. 98, 503-527; 1993, Brown, D. R., et al., J. Clinical Microbiology, 31, 2667-2673）。しかし、臨床設定において、この方法は「面倒であり、時間がかかり、新鮮な組織試料を必要とする」ことがわかり、かつ広範囲に及ぶ実験室間のばらつきがあった。この方法は「臨床用途に不適切」と考えられた（1995, Ferenczy, A, Int. J. Gynecol. Cancer, 5, 321-328）。
【０００８】
サザンブロットの改良、すなわちドットブロット（Ｄｏｔ  Ｂｌｏｔ）の導入は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認され、Ｖｉｒａｐａｐ（商標）およびＶｉｒａｔｙｐｅ（商標）（ライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州（Ｍｄ））として市販された。検出限界は、ｍｌ当りおよそ３７５，０００ウイルスゲノムである、試料ミリリットル当り３ピコグラムのＨＰＶ  ＤＮＡであった。しかし、Ｖｉｒｐａｐ（商標）キットの感度は結局、細胞学的方法の感度よりも低いことがわかった（1991, Bauer, H. M., JAMA, 265, 472-477）。また、検出のために放射性核酸が使用されるかかるキットは労働集約的であり、臨床設定において高価であり、かつその臨床適用性について広範囲に及ぶ混乱があった。最後に、Ｖｉｒａｔｙｐｅ（商標）の分子ハイブリダイゼーション条件は、異なるＨＰＶ間に交差ハイブリダイゼーションを示した。したがって、どのＨＰＶ型が試料中に存在したかを正確に判定することは、Ｖｉｒａｔｙｐｅ（商標）検査がメーカーによって規定されているものよりも高い厳密性のハイブリダイゼーションで２度目の実行をされる必要があることを意味した。
【０００９】
インサイチュー細胞学的レベルでは、問題はわずかにましであるにすぎなかった。蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）を使用するＨＰＶ検出に関する初期データの多くは誤りがあり、かつＨＰＶ型の分類の誤りがあった（1996, Schiffman, M.; in Richart, Contemporary OB/GYN, July 1996, pp80）。現在、ＨＰＶ配列を検出するＯｍｎｉｐｒｏｂｅ（商標）（ダイジーン・ディアグノスティックス社（Ｄｉｇｅｎｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ、Ｓｉｌｖｅｒ  Ｓｐｒｉｎｇ、メリーランド州（Ｍｄ））を使用するパラフィン埋め込み切片へのハイブリダイゼーションにより、細胞当り２０〜５０のウイルスであることが主張される感度が生じ、Ｅｎｚｏ  ＰａｔｈｏＧｅｎｅ  ＨＰＶインサイチュータイピングアッセイ（Ｅｎｚｏ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ６０  Ｅｘｅｃｕｔｉｖｅ  Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ）、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ニューヨーク州（ＮＹ））は、ホルマリン固定パラフィン埋め込み組織切片で開始するＨＰＶ  ＤＮＡの存在を判定するために使用されている。
【００１０】
インサイチューハイブリダイゼーション試験は厳格であり、労働集約的であり、かつ時間がかかる。最も先進的な蛍光インサイチューハイブリダイゼーション法（ＦＩＳＨ）によっても、現在、単一の完全長ウイルスゲノム、またはヒトゲノムにおける単一の染色体部位へ一体化されうるウイルスゲノムの小断片をルーチンに分析することは不可能である。ルーチンＦＩＳＨは、（約１００キロベースの）細菌人工染色体のサイズであるプローブを使用して最も良く達成される。これらは完全ＨＰＶゲノムのサイズの１０倍超、かつＥ６またはＥ７などＨＰＶ遺伝子のサイズの１００倍である。
【００１１】
すべての関連ＨＰＶ型のＬ１カプシドタンパク質のエピトープに対する抗体を使用する免疫組織化学が別の検出方法である（2004, Griesser, H., et al., Analyt. Quant. Cytol. Histol. 26, 241-245）が、これも労働集約的であり、かつ時間がかかる。
【００１２】
ダイジーン・ディアグノスティックス（Ｄｉｇｅｎｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）によって開発された第１世代のＨＰＶハイブリダイゼーションキャプチャーキットでは、病変ＨＰＶ  ＤＮＡを検出するために非放射性ＲＮＡプローブ、およびより容易かつより経済的な使用のために作られたその非放射性の性質が利用された。ハイブリッドキャプチャーでは、感度を得るために標的ＤＮＡの増幅ではなくシグナル増幅が使用された。しかし、リチャート（Ｒｉｃｈａｒｔ）（Contemporary OB/GYN, July 1996）によって指摘された通り、ハイブリッドキャプチャーは、新規ＨＰＶ型と他のＨＰＶプローブとの交差ハイブリダイゼーションのため、および特に化学発光値が突然スパイクした場合に偽陽性結果の傾向があった。また、第１世代のハイブリッドキャプチャーでは、ＰＣＲによって検出される感染の３分の１〜半分しか検出されなかった。ハイブリッドキャプチャーはその後、更新され、ハイブリッドキャプチャー（Ｈｙｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ）２（商標）（ダイジーン社（Ｄｉｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州（Ｍｄ））試験は現在、型１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８の１３個のＨＰＶプローブの混合物を含有し、かつ米国ＦＤＡ承認の閾値は、ｍｌ当り１２５，０００ウイルスゲノムと同等の試験溶液ｍｌ当り１ピコグラムのＨＰＶ  ＤＮＡで設定されている（2001 , Salomon, D., J. Nat. Cancer Instit. 93, 293-299）。ハイブリッドキャプチャー（Ｈｉｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ）３（商標）（ダイジーン社（Ｄｉｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州（Ｍｄ））では、ビオチン化キャプチャーオリゴヌクレオチド、および非標識「ブロッカー」オリゴヌクレオチドのより複雑な混合物が利用されるが、これらはともにハイブリッドキャプチャー（Ｈｉｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ）２（商標）で見られるプローブ交差反応の問題を除去することが主張されている。しかし、ハイブリッドキャプチャー（Ｈｉｂｒｉｄ  Ｃａｐｔｕｒｅ）２（商標）は、プローブ交差ハイブリダイゼーションのその既知の問題を有するが、依然として唯一のＦＤＡ承認製品である（2001 , Lorincz, A. & Anthony, J. Papillomavirus Report, 12, 145-154）。
【００１３】
ハイブリッドキャプチャーは、ＨＰＶゲノムを含む遺伝子由来のＲＮＡ発現を測定するためにも適合されている（米国特許第６，３５５，４２４号明細書）。具体的には、Ｅ２および／またはＬ１  ＲＮＡレベルに対するＥ６および／またはＥ７  ＲＮＡレベルの比が評価される。これはマイクロタイタープレート中に溶解した細胞からのウイルスＲＮＡへのビオチン化ＤＮＡプローブのハイブリダイゼーションによって行われる。ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドは、ハイブリッドキャプチャー法の以前の実施形態におけるように抗体結合によって捕捉され、かつ化学発光試薬を使用して以前のように分析される。
【００１４】
最も感度のいいＨＰＶ検出法は、ヒトゲノムにおける単一のウイルスコピーを容易に検出するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。第１のＨＰＶ  ＰＣＲ検出キットは、実際の低い検出限界が約１００ウイルスゲノムであるロシュ・モレキュラー・システムズ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＬ１コンセンサスプライマーポリメラーゼ連鎖反応法であった。この試験は、サザンブロットとＰＣＲ法との直接比較によって評価され（1991, Schiffman, M. H., J. Clin. Microbiol, 29, 573-577）、きわめて労働集約的であることがわかった（1995, Schiffman, M. H., J. Clin. Microbiol, 33, 545-550を参照）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１５】
上記のすべての問題および欠点を考えると、前癌病変のスクリーニングにおけるＤＮＡ方法の臨床的影響に関して依然として議論の余地がある。細胞異常の感度のいい早期の分子予後指標がきわめて有益であろう。
【００１６】
本発明者は、ＨＰＶを検出し、かつ異なるＨＰＶの型間を区別するための新しい方法、キット、および一体化生物情報プラットフォームを開発した。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
発明の開示
第１の態様において、本発明は、
シトシンを修飾する薬剤でウイルス核酸を処理し、ウイルス核酸誘導体を形成するステップと、
前記ウイルス核酸誘導体の少なくとも一部分を増幅し、ＨＰＶ特異的核酸分子を形成するステップと、
ＨＰＶ特異的核酸分子の存在を探すステップであって、前記ＨＰＶ特異的核酸分子の検出がＨＰＶを示すステップと
を含むヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を検出するためのアッセイを提供する。
【００１８】
好ましくは、アッセイは、
ＨＰＶ特異的核酸分子の増幅を可能にすることができるＨＰＶプライマーを提供するステップをさらに含む。
【００１９】
好ましくは、ウイルスは試料中にある。試料は適切な臨床、臨床産物、または環境試料である。一般的に、試料はスワブ、生検、スメア、パップスメア、血液、血漿、血清、血液製剤、表面スクレープ、スパチュラ、液体懸濁液、凍結材料、パラフィンブロック、スライドガラス、法医学収集システムおよびアーカイブ材料となる。好ましくは、試料はスメア、パップスメア、または細胞の液体懸濁液である。
【００２０】
好ましくは、薬剤は、シトシンを修飾して誘導核酸におけるウラシルを形成する。好ましくは、薬剤は、亜硫酸水素塩（ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ）、酢酸塩、またはクエン酸塩から選択される。より好ましくは、薬剤は亜硫酸水素ナトリウムである。
【００２１】
好ましくは、薬剤は、シトシンを相補的二本鎖ウイルス核酸の各々の鎖におけるウラシルに修飾し、２つの誘導であるが非相補的ウイルス核酸分子を形成する。
【００２２】
好ましくは、薬剤はシトシンをウラシルに修飾し、これは次いで誘導核酸の増幅中にチミンとして置換される。好ましくは、シトシンを修飾するために使用される薬剤は亜硫酸水素ナトリウムである。同様にシトシンを修飾するが、メチル化シトシンを修飾しない他の薬剤も本発明の方法において使用されうる。例としては、亜硫酸水素塩、酢酸塩、またはクエン酸塩が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、薬剤は亜硫酸水素ナトリウムであり、これは、酸性水性条件の存在下にシトシンをウラシルに修飾する試薬である。
【００２３】
亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）はシトシンの５，６二重結合と容易に反応し、脱アミノ化の影響を受けやすい硫酸化シトシン反応中間体を形成し、かつ水の存在下に亜硫酸ウラシルを生じさせる。必要に応じて、亜硫酸基は弱アルカリ条件下に除去され、結果としてウラシルの形成をもたらしうる。したがって、潜在的にすべてのシトシンがウラシルに変換される。しかし、メチル化シトシンはメチル化による保護により試薬を修飾することによって変換されえない。
【００２４】
好ましくは、ウイルス核酸誘導体は対応する未処理ウイルス核酸と比べ減少した総数のシトシンを有する。
【００２５】
好ましくは、増幅はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、等温増幅、シグナル増幅、または上記の組合せによって行われる。より好ましくは、増幅はＰＣＲによって行われる。
【００２６】
通常、増幅は、天然ＨＰＶゲノムの一部を形成することがないＨＰＶ特異的核酸分子を形成する。
【００２７】
好ましい形態において、ＨＰＶ特異的核酸分子はＨＰＶ種、ＨＰＶの型、またはＨＰＶの亜型に特異的である。ＨＰＶ型は、特定のヒト民族系統における所定の組織上に高、中、または低レベルの発癌状態を与えうる。高リスクＨＰＶ型はＨＰＶ１６、１８、４５、および５６であり、中リスクＨＰＶ型はＨＰＶ３１、３３、３５、３９、５１、５２、５６、５８、５９および６８であり、かつ低リスク株はＨＰＶ６、１１、３０、４２、４３、４４、５３、５４、および５５である。好ましくは、高−リスクＨＰＶ１６、１８、４５、または５６、および中リスクＨＰＶ３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８、５９、および６８が検出される。
【００２８】
当然のことながら、ＨＰＶ特異的核酸は適切な手段によって検出される。例としては、ゲル電気泳動、標識プローブによりハイブリダイゼーション、その後の識別を可能にするタグ付きプライマーの使用、酵素結合アッセイ、または標的ＤＮＡによるハイブリダイゼーションとともにシグナルを生じさせる蛍光タグ付きプライマーが挙げられるが、これらに限定されない。
【００２９】
第２の態様において、本発明は、配列番号１〜配列番号５１６の１つもしくはそれ以上を含むＨＰＶプライマーまたはプローブを提供する。
【００３０】
好ましくは、高−中リスクＨＰＶ株を検出するためのＨＰＶプライマーまたはプローブとしては、配列番号３３３〜配列番号３５０の１つもしくはそれ以上が挙げられる。
【００３１】
好ましくは、ＨＰＶを検出するためのＨＰＶプライマーまたはプローブとしては、配列番号４６２、配列番号４７９、配列番号４６３、配列番号４７８、配列番号４７０、配列番号４８５、または配列番号４８６が挙げられる。
【００３２】
第３の態様において、本発明は、適切な試薬または希釈剤とともに本発明の第２の態様に従って２つもしくはそれ以上のＨＰＶプライマーまたはプローブを含むＨＰＶの検出のためのキットを提供する。
【００３３】
第４の態様において、本発明はＨＰＶ核酸誘導体を提供する。
【００３４】
好ましくは、ＨＰＶ核酸誘導体は、高リスクＨＰＶ１６、１８、４５、または５６、および中リスクＨＰＶ３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８、５９、および６８からのものである。
【００３５】
より好ましくは、ＨＰＶ核酸誘導体は、  配列番号６１４、配列番号６１７、配列番号６２０、配列番号６２３、配列番号６２６、配列番号６２９、配列番号６３２、配列番号６３５、配列番号６３８、配列番号６４１、配列番号６４４、配列番号６４７、配列番号６５０、配列番号６５３、配列番号６５６、配列番号６５９、配列番号６６２、配列番号６６５、配列番号６６８、配列番号６７１、配列番号６７４、配列番号６７７、配列番号６８０、配列番号６８３、配列番号６８６、または配列番号６８９、少なくとも１５個のヌクレオチドを含むその部分、および配列番号６１４、配列番号６１７、配列番号６２０、配列番号６２３、配列番号６２６、配列番号６２９、配列番号６３２、配列番号６３５、配列番号６３８、配列番号６４１、配列番号６４４、配列番号６４７、配列番号６５０、配列番号６５３、配列番号６５６、配列番号６５９、配列番号６６２、配列番号６６５、配列番号６６８、配列番号６７１、配列番号６７４、配列番号６７７、配列番号６８０、配列番号６８３、配列番号６８６、または配列番号６８９にストリンジェントな条件下にハイブリダイズできる核酸分子のいずれか１つもしくはそれ以上を含む。
【００３６】
ＨＰＶ核酸誘導体の部分は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個等もしくはそれ以上のヌクレオチドでありうる。
【００３７】
第５の態様において、本発明は簡易化したＨＰＶ核酸を提供する。
【００３８】
好ましくは、簡易化したＨＰＶ核酸は高リスクＨＰＶ１６、１８、４５、または５６、および中リスクＨＰＶ３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８、５９および６８である。
【００３９】
より好ましくは、簡易化したＨＰＶ核酸は、配列番号６１５、配列番号６１８、配列番号６２１、配列番号６２４、配列番号６２７、配列番号６３０、配列番号６３３、配列番号６３６、配列番号６３９、配列番号６４２、配列番号６４５、配列番号６４８、配列番号６５１、配列番号６５４、配列番号６５７、配列番号６６０、配列番号６６３、配列番号６６６、配列番号６６９、配列番号６７２、配列番号６７５、配列番号６７８、配列番号６８１、配列番号６８４、配列番号６８７、または配列番号６９０、少なくとも１５個のヌクレオチドを含むその部分、および配列番号６１５、配列番号６１８、配列番号６２１、配列番号６２４、配列番号６２７、配列番号６３０、配列番号６３３、配列番号６３６、配列番号６３９、配列番号６４２、配列番号６４５、配列番号６４８、配列番号６５１、配列番号６５４、配列番号６５７、配列番号６６０、配列番号６６３、配列番号６６６、配列番号６６９、配列番号６７２、配列番号６７５、配列番号６７８、配列番号６８１、配列番号６８４、配列番号６８７、または配列番号６９０にストリンジェントな条件下にハイブリダイズできる核酸分子のいずれか１つもしくはそれ以上を含む。
【００４０】
簡易化したＨＰＶ核酸の部分は、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０個等のヌクレオチドである。
【００４１】
第６の態様において、本発明は、ＨＰＶ検出のためのプローブまたはプライマーを得る本発明の第５または第６の態様に従って誘導または簡易化したＨＰＶ核酸の使用を提供する。
【００４２】
第７の態様において、本発明は、
試料からウイルス核酸を得るステップと、
ウイルス核酸におけるシトシンがウラシルに変換され、ウイルス核酸誘導体を形成する条件下にウイルス核酸を亜硫酸水素で処理するステップと、
ウイルス核酸誘導体の領域に結合ができるプライマーを提供するステップであって、前記プライマーが所望のＨＰＶ特異的核酸分子をウイルス核酸誘導体に増幅させることができるステップと、
前記ウイルス核酸誘導体で増幅反応を行うステップと、
所望の増幅核酸産物の存在を探すステップであって、前記増幅産物の検出が試料におけるＨＰＶの存在を示すステップと
を含む試料中のＨＰＶの存在を検出するためのアッセイを提供する。
【００４３】
１つの好ましい形態において、アッセイは、
ＨＰＶが存在する試料を、試料におけるＨＰＶの型、亜型、変異型、または遺伝子型を決定しうる追加の試験で処理するステップをさらに含む。
【００４４】
追加の試験は、好ましくは、所定のＨＰＶ型または型の群に特異的なプライマーを使用する増幅反応であり、ここで増幅産物の存在はＨＰＶ型または型の群を示す。
【００４５】
第８の態様において、本発明は、
シトシンを修飾してＨＰＶ核酸誘導体を形成する薬剤でＨＰＶ核酸を含有する試料を処理するステップと、
前記ＨＰＶ核酸誘導体の少なくとも一部を増幅し、対応する未処理ＨＰＶ核酸と比べ減少した総数のシトシンを有する簡易化したＨＰＶ核酸を形成するステップであって、ここで簡易化した核酸分子はＨＰＶに特異的な核酸配列を含むステップと
を含むＨＰＶ特異的核酸を生じる方法を提供する。
【００４６】
メチル化シトシンを含有する二本鎖ＤＮＡでは、処理するステップは結果として２つの誘導核酸をもたらし、各々は塩基アデニン、グアニン、チミン、およびウラシルを含有する。２つの誘導核酸は二本鎖ＤＮＡの２つの一本鎖から生成される。２つの誘導核酸は実質的にシトシンを有さないが、依然として最初の未処理ＤＮＡ分子と同じ総数の塩基および配列長さを有する。重要なことには、２つの誘導体は互いに相補的ではなく、トップおよびボトム鎖を形成する。１つもしくはそれ以上の鎖を増幅のための標的として使用し、簡易化した核酸分子を生成することができる。
【００４７】
一般的に、ＨＰＶに特異的な簡易化した核酸配列は未処理ＨＰＶゲノムにおいて自然に発生することはない。
【００４８】
好ましい形態において、この方法はさらに、
特定のＨＰＶ型を示す核酸配列を有するＨＰＶ特異的核酸を検出するステップを含む。
【００４９】
ＨＰＶ特異的核酸は任意の適切な手段によって検出されうる。例としては、ゲル電気泳動、標識プローブによりハイブリダイゼーション、その後の識別（例えば、酵素結合アッセイによる）を可能にするタグ付きプライマーの使用、および標的ＤＮＡによるハイブリダイゼーション（例えば、ビーコン（Ｂｅａｃｏｎ）およびタクマン（ＴａｑＭａｎ）システム）とともにシグナルを生じさせる蛍光タグ付きプライマーの使用が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
好ましくは、ＨＰＶ特異的核酸分子は、
核酸分子の標的領域に結合ができる検出リガンドを提供し、かつ検出リガンドが標的領域に結合する十分な時間を可能にするステップと、
検出リガンドの核酸分子との結合を測定し標的核酸分子の存在を検出するステップとによって検出される。当然のことながら、核酸分子は当業界で周知の任意の適切な手段によって検出されうる。
【００５１】
第９の態様において、本発明は、
シトシンを修飾する薬剤でＨＰＶの代表的な型からのＨＰＶ核酸を処理し、各々の型のＨＰＶ核酸誘導体分子を形成するステップと、
各々型からのＨＰＶ核酸誘導体分子の少なくとも一部を増幅し、対応する未処理ＨＰＶ核酸分子と比べ減少した総数のシトシンを有する簡易化した核酸分子を形成するステップと、
前記簡易化した核酸分子における一般的または特異の１つもしくは複数の配列を特定することによって１つもしくは複数の型のＨＰＶ特異的核酸分子を得るステップと
を含むＨＰＶ特異的核酸分子を得るための方法を提供する。
【００５２】
当然のことながら、この方法は、ＨＰＶ型の既知の核酸配列から生物情報的に（コンピュータ内で）行われうるが、ここで最初の配列における各々のシトシンはチミンに変化され、簡易化したＨＰＶ核酸分子を直接得ることができる。配列同一性は簡易化した核酸配列から測定されうる。
【００５３】
例えば、処理ステップは、代表的なＨＰＶゲノムにおけるすべてのシトシンをウラシルで置換し、各々の型のＨＰＶ核酸誘導体分子を形成することによって生物情報的に行われうる。各々のＨＰＶ核酸誘導体分子は、対応する未処理ＨＰＶゲノムと同じ総数の塩基を有する。当然のことながら、ＨＰＶ核酸誘導体分子における各々のウラシルは増幅プロセス中にチミンに複写される。したがって、簡易化した核酸分子を形成する増幅配列は最初のＨＰＶゲノムにおける配列に対応しない。誘導核酸の各々の鎖（「トップ」および「ボトム」）は相補的ではなく、したがって、それらは増幅のための２つの可能なテンプレートを形成する。
【００５４】
ＨＰＶ特異的核酸分子が本方法によって任意の所定のＨＰＶ型について得られている場合、プローブまたはプライマーはＰＣＲまたは他の適切な増幅反応で目的の領域の増幅を確実にするようにデザインされうる。処理およびしたがって変換ゲノムの両方の鎖（以後「誘導体」と呼ぶ）が、プライマーのデザインについて分析されうることに注意しなくてはならないが、それは処理または変換が配列の非対称をもたらし（以下参照）、したがって、異なるプライマー配列が同じ位置の「トップ」および「ボトム」鎖の検出のために必要とされるためである。したがって、それが変換直後に存在すると２つの分子集団、変換ゲノム、および誘導体は従来の酵素学的手段（ＰＣＲ）によって複製された後に結果として生じる分子の集団が認められる。プライマーは一般的に便宜上、変換トップ鎖のためにデザインされているが、ボトム鎖のためにプライマーを発生させることもできる。したがって、試料で臨床的または科学的アッセイを行い、所定の型のＨＰＶを検出することが可能である。
【００５５】
本発明は、いずれかのＨＰＶゲノムが所定の試料中に存在するかどうか判定するために使用されうるＨＰＶのすべての代表的な型を示すプローブまたはプライマーの発生も可能にする。さらに、ＨＰＶ型特異的プローブを使用し、実際にＨＰＶの所定の型、亜型、変異型、および遺伝子型を検出または識別するために使用されうる。
【００５６】
本明細書の全体を通じて、文脈上、他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、規定された要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の包含を示すが、いずれかの他の要素、整数もしくはステップ、または要素、整数もしくはステップの群の排除を示さないことが理解される。
【００５７】
本明細書に含まれている文書、法令、材料、デバイス、物品または同様のものの考察は単に本発明の文脈を提供する目的のためのものである。これらの事柄のいずれかもしくはすべてが従来技術の基礎を形成すること、またはそれが本発明の開発前にオーストラリアにおいて存在したように本発明に関連した分野における一般的な常識であったことが承認されていると見るできではない。
【００５８】
本発明はより明らかに理解されうるために、好ましい実施形態を以下の図面および実施例を参照して説明する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
発明を実施するための形態
定義
本明細書で使用される「ゲノム簡易化」という語は、ゲノム（または他の）核酸が４つの塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびシトシン（Ｃ）から成るものから、実質的に塩基アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）を含有するが、依然として実質的に同じ総数の塩基を含有するものに修飾されることを意味する。
【００６０】
本明細書で使用される「誘導核酸」という語は、塩基Ａ、Ｇ、Ｔ、およびＵ（または一部の他の非Ａ、Ｇ、もしくはＴ塩基、または塩基様エンティティ）を実質的に含有し、かつ対応する未修飾核酸と同じ総数の塩基を実質的に有する核酸を意味する。未処理核酸における実質的にすべてのシトシンは、薬剤による処理中にウラシル（または一部の他の非Ａ、Ｇ、もしくはＴ塩基、または塩基様エンティティ）に変換されることになる。当然のことながら、例えばメチル化によって変化したシトシンは必ずしもウラシル（または一部の他の非Ａ、Ｇ、もしくはＴ塩基、または塩基様エンティティ）に変換されえない。好ましくは、シトシンはウラシルに修飾される。
【００６１】
本明細書で使用される「ＨＰＶ核酸誘導体」という語は、塩基Ａ、Ｇ、Ｔ、およびＵ（または一部の他の非Ａ、Ｇ、もしくはＴ塩基、または塩基様エンティティ）を実質的に含有し、かつ対応する未修飾ＨＰＶ核酸と同じ総数の塩基を実質的に有するＨＰＶ核酸を意味する。ＨＰＶ  ＤＮＡにおける実質的にすべてのシトシンは、薬剤による処理中にウラシル（または一部の他の非Ａ、Ｇ、もしくはＴ塩基、または塩基様エンティティ）に変換されることになる。当然のことながら、例えばメチル化によって変化したシトシンは必ずしもウラシル（または一部の他の非Ａ、Ｇ、もしくはＴ塩基、または塩基様エンティティ）に変換されえない。ＨＰＶ核酸が一般的にメチル化シトシン（または他のシトシン変質）を含有することがないと、処理ステップは、好ましくは、すべてのシトシンを変換する。好ましくは、シトシンは、ウラシルに修飾される。
【００６２】
本明細書で使用される「変換ゲノム」という語は、塩基Ａ、Ｇ、Ｔ、およびＵ（または一部の他の非Ａ、Ｇ、もしくはＴ塩基、または塩基様エンティティ）を実質的に含有し、かつ対応する未修飾ＨＰＶ核酸と同じ総数の塩基を実質的に有するＨＰＶゲノムを意味する。ＨＰＶゲノムにおける実質的にすべてのシトシンはウラシル（または一部の他の非Ａ、Ｇ、もしくはＴ塩基、または塩基様エンティティ）に変換されることになる。
【００６３】
本明細書で使用される「簡易化した核酸」という語は、誘導核酸の増幅後に得られる結果として生じる核酸産物を意味する。次いで、誘導核酸におけるウラシルは誘導核酸の増幅中にチミン（Ｔ）として置換され、簡易化した核酸分子を形成する。結果として生じる産物は、対応する未修飾核酸と同じ総数の塩基を実質的に有するが、実質的に３つの塩基（Ａ、Ｇ、およびＴ）の組合せで構成されている。
【００６４】
本明細書で使用される「簡易化したＨＰＶ核酸」という語は、ＨＰＶ核酸誘導体の増幅後に得られる結果として生じるＨＰＶ核酸産物を意味する。次いで、誘導核酸におけるウラシルは誘導核酸の増幅中にチミン（Ｔ）として置換され、簡易化したＨＰＶ核酸分子を形成する。結果として生じる産物は、対応する未修飾ＨＰＶ核酸と同じ総数の塩基を実質的に有するが、実質的に３つの塩基（Ａ、Ｇ、およびＴ）の組合せで構成されている。
【００６５】
本明細書で使用される「簡易化した配列」という語は、簡易化した核酸を形成する誘導核酸の増幅後に得られる結果として生じる核酸配列を意味する。結果として生じる簡易化した配列は、対応する未修飾核酸配列と同じ総数の塩基を実質的に有するが、実質的に３つの塩基（Ａ、Ｇ、およびＴ）の組合せで実質的に構成されている。
【００６６】
本明細書で使用される「簡易化したＨＰＶ配列」という語は、簡易化したＨＰＶ核酸を形成するＨＰＶ核酸誘導体の増幅後に得られる結果として生じる核酸配列を意味する。結果として生じる簡易化した配列は、対応する未修飾ＨＰＶ核酸配列と同じ総数の塩基を実質的に有するが、実質的に３つの塩基（Ａ、Ｇ、およびＴ）の組合せで実質的に構成されている。
【００６７】
本明細書で使用される「非変換配列」という語は、処理および増幅前の核酸配列を意味する。非変換配列は一般的に天然起源核酸の配列である。
【００６８】
本明細書で使用される「非変換ＨＰＶ配列」という語は、処理および増幅前のＨＰＶ核酸配列を意味する。非変換配列は一般的に天然起源ＨＰＶ核酸の配列である。
【００６９】
本明細書で使用される「修飾する」という語は、シトシンの別のヌクレオチドへの変換を意味する。好ましくは、薬剤は非メチル化シトシンをウラシルに修飾し、誘導核酸を形成する。
【００７０】
本明細書で使用される「シトシンを修飾する薬剤」という語は、シトシンを別の化学エンティティに変換できる薬剤を意味する。好ましくは、薬剤はシトシンをウラシルに修飾し、これは次いで誘導核酸の増幅中にチミンとして置換される。好ましくは、シトシンを修飾するために使用される薬剤は亜硫酸水素ナトリウムである。同様にシトシンを修飾するが、メチル化シトシンを修飾しない他の薬剤も本発明の方法において使用されうる。例としては、亜硫酸水素塩、酢酸塩、またはクエン酸塩が挙げられるがこれらに限定されない。好ましくは、薬剤は、酸性水性条件下にシトシンをウラシルに修飾する試薬の亜硫酸水素ナトリウムである。亜硫酸水素ナトリウム（ＮａＨＳＯ３）はシトシンの５，６二重結合と容易に反応し、脱アミノ化の影響を受けやすい硫酸化シトシン反応中間体を形成し、かつ水の存在下に亜硫酸ウラシルを生じさせる。必要に応じて、亜硫酸基は弱アルカリ条件下に除去され、結果としてウラシルの形成をもたらしうる。したがって、潜在的にすべてのシトシンがウラシルに変換される。しかし、メチル化シトシンはメチル化による保護により試薬を修飾することによって変換されえない。当然のことながら、シトシン（または他の塩基）は酵素的手段によって修飾され、本発明によって開示されている通り誘導核酸を獲得しうる。
【００７１】
それによって核酸における塩基が修飾されうる２つの広範な一般的な方法、すなわち、化学的および酵素的方法がある。したがって、本発明の修飾も天然起源の酵素によって、またはさらに人工的に構成または選択されたと報告される酵素によって行われうる。亜硫酸水素法などの化学的処理は、適切な化学的ステップによってシトシンをウラシルに変換しうる。同様に、例えば、シトシンデアミナーゼは、変換を行って誘導核酸を形成しうる。本発明者らが知る限りシトシンデアミナーゼに関する最初の報告は、1932, Schmidt, G., Z. physiol. Chem., 208, 185である(1950, Wang, T.P. , Sable, H.Z., Lampen, J.O., J. Biol. Chem, 184, 17-28,  シトシンヌクレオシドの酵素的脱アミノ化も参照）。この初期の研究において、シトシンデアミナーゼは他のヌクレオ−デアミナーゼ含まずに得られなかったが、しかし、ワング（Ｗａｎｇ）らは、酵母および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）からかかる活性を精製することができた。したがって、その位置で次の複製中の塩基の挿入が結果として最終的もたらされる、シトシンと異なる誘導核酸を形成するシトシンのいずれかの酵素的変換が、簡易化したゲノムをもたらす。誘導体の後に簡易化したゲノムをもたらす化学的および酵素的変換は、微生物の天然起源核酸におけるプリンまたはピリミジンである、ヌクレオ塩基にも適用可能である。
【００７２】
本明細書で使用される「ＨＰＶゲノムまたは核酸の簡易化した形態」という語は、通常、４つの一般的な塩基Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣを含有するＨＰＶゲノムまたは核酸が現在、ゲノムにおけるＣの大部分もしくはすべてが適切な化学的修飾およびその後の増幅法によってＴに変換されているため、主に３つの塩基Ｇ、Ａ、およびＴのみから成ることを意味する。ゲノムの簡易化した形態は、相対的なゲノムの複雑性が４つの塩基の基礎から３つの塩基の組成に削減されていることを意味する。
【００７３】
本明細書で使用される「塩基様エンティティ」という語は、シトシンの修飾によって形成されるエンティティを意味する。塩基様エンティティは、誘導核酸の増幅中にＤＮＡポリメラーゼによって認識されうるとともに、このポリメラーゼはＡ、Ｇ、またはＴを誘導核酸における塩基様エンティティに対向する位置で新しく形成される相補的ＤＮＡ鎖上に配置させる。一般的に、塩基様エンティティは、対応する未処理核酸におけるシトシンから修飾されているウラシルである。塩基様エンティティの例としては、プリンまたはピリミジンである、ヌクレオ塩基が挙げられる。
【００７４】
本明細書で使用される「天然ＨＰＶゲノム」という語は、自然界に存在するウイルスのゲノムを意味する。天然ＨＰＶゲノムは、ＨＰＶ核酸分子を形成するヌクレオチド塩基の配列を含む。
【００７５】
本明細書で使用される「相対的複雑性の削減」という語は、プローブの長さ、すなわち、同じサイズの２つのゲノムにおける所定の設定の分子条件下、特定の位置へのプローブのハイブリダイゼーションの同じ特異性およびレベルを達成するために必要である平均プローブ長さの増大に関するが、ここで第１のゲノムは「そのまま」であり、４つの塩基Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣから成るが、第２のゲノムは正確に同じ長さのものであるが、一部のシトシン（理想的にはすべてのシトシン）はチミンに変換されている。試験用の位置は、最初の非変換および変換ゲノムにおける同じ位置にある。平均して、１１ｍｅｒのプローブが特定の位置を有し、ここに４つの塩基Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣから成る４，１９４，３０４個の塩基（４１１＝４，１９４，３０４）の通常のゲノムに完全にハイブリッドする。しかし、かかる４，１９４，３０４個の塩基の通常のゲノムが亜硫酸水素素または他の適切な手段によって変換されていると、この変換ゲノムはここで３個の塩基のみで構成され、明らかに複雑ではなくなる。しかし、ゲノム複雑性のこの減少の結果、本発明者らの以前の特異的な１１ｍｅｒのプローブは、簡易化したゲノムの範囲内でハイブリダイズしうる特異的部位をもはや有さない。現在、亜硫酸水素塩変換の結果として新たに生じた１１個の任意の塩基配列の他の可能な同等の位置が多く認められる。現在、最初の位置を見出し、ハイブリダイズするには１４ｍｅｒのプローブを必要とする。これは最初、直感と相容れないように思われるが、したがって、より多くのゲノムが同じに見える（より類似した配列を有する）ため、現在、簡易化した３個の塩基ゲノムがある最初の位置を検出する増大したプローブ長さを必要とする。したがって、削減した相対的なゲノムの複雑性（もしくは３個の塩基ゲノム簡易化）は、最初の特異的部位を見出す長いプローブをデザインしなければならないことを意味する。
【００７６】
本明細書で使用される「相対的なゲノムの複雑性の削減」という語は、未修飾ＤＮＡと比べＨＰＶ特異的であることができるプローブ長さの増大によって測定されうる。この語は、ＨＰＶの存在の判定において使用されるプローブ配列の型も組込む。これらのプローブは、ＩＮＡにおいて記載されているものなどの骨格へのＰＮＡもしくはＬＮＡまたは修飾付加のものなど非従来的骨格を有しうる。したがって、プローブがＩＮＡにおけるなど挿入偽ヌクレオチドなど追加の成分を有するかどうかに関係なく、ゲノムが削減された相対的複雑性を有するとみなされる。例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）、およびそれの混合物、およびそれのハイブリッドのほか、ホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホラミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステル、およびホスホボラノエートであるが、これらに限定されないそれのリン原子修飾が挙げられるが、これらに限定されない。非天然起源ヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リクソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、またはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。また、非リン含有化合物を、メチルイミノメチル、フォルムアセテート、チオフォルムアセテート、およびアミドを含む連結基などであるが、これらに限定されないヌクレオチドに結合するために使用されうる。具体的には、核酸および核酸類似体が１つもしくはそれ以上の挿入偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）を含みうる。ＩＰＮの存在は核酸分子の複雑性の説明の一部ではなく、ＰＮＡにおけるなど、その複雑性の骨格部分でもない。
【００７７】
「ＩＮＡ」によって、参照により本明細書で援用される、国際公開第０３／０５１９０１号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３２号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３３号パンフレット、および国際公開第０３／０５２１３４号パンフレット（Ｕｎｅｓｔ  Ａ／Ｓ）に記載の挿入核酸が意味される。ＩＮＡは、１つもしくはそれ以上の挿入偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）分子を含むオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド類似体である。
【００７８】
「ＨＮＡ」によって、例えば、ファン・エショット（Ｖａｎ  Ａｅｔｓｃｈｏｔ）ら、１９９５年によって記載された核酸が意味される。
【００７９】
「ＨＮＡ」によって、ホサイン（Ｈｏｓｓａｉｎ）ら、１９９８年によって記載された核酸が意味される。
【００８０】
「ＡＮＡ」は、アラート（Ａｌｌｅｒｔ）ら、１９９９年によって記載された核酸を指す。
【００８１】
「ＬＮＡ」は国際公開第９９／１４２２６号パンフレット（Ｅｘｉｑｏｎ）に記載された任意のＬＮＡ分子でありうるが、好ましくは、ＬＮＡは、国際公開第９９／１４２２６号パンフレットの要約書に記載された分子から選択される。より好ましくは、ＬＮＡは、シング（Ｓｉｎｇｈ）ら、１９９８年、コスキン（Ｋｏｓｈｋｉｎ）ら、１９９８年、またはオビカ（Ｏｂｉｋａ）ら、１９９７年に記載された核酸である。
【００８２】
「ＰＮＡ」は、例えば、ニールセン（Ｎｉｅｌｓｅｎ）ら、１９９１年によって記載されたペプチド核酸を指す。
【００８３】
本明細書で使用される「相対的複雑性の削減」は、ＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴＡＴである配列（配列番号６９１）対ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴである同じ長さの配列（配列番号６９２）の１つとの間の数学的複雑性の差など塩基が生じる順序を指すことはなく、Waring, M. & Britten R. J.1966, Science, 154, 791-794、および Britten, R.J and Kohne D E., 1968, Science, 161, 529-540、およびCarnegie Institution of Washington Yearbook報告に由来するそれらの中の初期の文献によって科学文献に導入された相対的ゲノムサイズ（および推論的に、ゲノムの複雑性）の最初の再連結データを指すこともない。
【００８４】
一例により、ヒト細胞およびウイルスゲノム、またはその部分を含有する臨床試料において生じる個々のウイルスゲノム、またはウイルスゲノムの混合物に適用される場合、かかる変換プロセスの結果が明らかにされる。
【００８５】
５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣ３’（配列番号６９３）（「トップ」鎖）である正常な１０個の塩基ゲノム配列が、５’ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ３’（配列番号６９４）である相補的「ボトム」鎖を有する。変性および亜硫酸水素処理の後、「トップ」鎖は５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＵ３’（配列番号６９５）になり、「ボトム」鎖は５’ＧＡＡＴＴＴＵＵＵＵ  ３’（配列番号６９６）になる。シトシンはウラシルに変換されており、かつウラシルはエクスビボでＤＮＡポリメラーゼ機構による認識の点でチミンと同等であるため、トップ鎖誘導体は基本的に５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ３’（配列番号６９６）であり、ボトム鎖誘導体は５’ＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号６９７）である。したがって、最初に正常ゲノムが、それらの間のトップおよびボトム鎖が５個のＣおよび５個のＴを有するものから、それらの間のトップおよびボトム鎖が現在、Ｃを有さず、１０個のＴを有するポリマーの誘導体集団に変換されている。正常ゲノムは４個の塩基エンティティから３個の塩基誘導体に削減されている。これは「複雑性が削減」されている。また、誘導体集団における「位置」は、その誘導体内の位置座標のみを指す。例えば、亜硫酸水素変換後、位置が任意のネットワークレベルですべての機能的生物学的特性を奪われる。これが以前に調節または構造的にコード化された場合は、両方の鎖において生物学的に無意味となっている。したがって、誘導体集団が、この場合には非公式に無能であるゲノムの以前に相補的な鎖の２つの非相補的なゴーストを表す無機能の化学ポリマーの収集物である。さらに、誘導体は特異的であり、統計上の事故によらない限り、任意の細胞（またはウイルスもしくはウイロイド）の生活型における正常な進化過程によって生成される配列を表すことはない。
【００８６】
プローブおよび複雑性の削減
分子プローブの公式の意味において、本発明者らは、第１は正常ゲノムであり、かつ第２は簡易化した配列である、同じサイズの２つのエンティティにおける所定の設定の分子条件下に、特異的位置へのプローブの同じ特異性およびレベルのハイブリダイゼーションを達成するために必要であるプローブ長さの増大（ＩＰＬ）に関して、本明細書で「複雑性の削減」を定義する。分子利用のために、ＩＰＬは１以上の整数である。各々位置は、正常ゲノムおよび簡易化した核酸における同じ位置にとどまる。
【００８７】
直感と相容れないように思われるかもしれないが、増大したオリゴヌクレオチドプローブ長さが、現在、Ｔが豊富な簡易化したＨＰＶ核酸である最初の位置を検出するために必要でありうる。したがって、簡易化したＨＰＶ核酸の削減された複雑性は、長いプローブが簡易化したＨＰＶ核酸における最初の特異的部位を見出す位置の「トップ」および「ボトム」鎖のためにデザインされる必要がありうることを意味する。しかし、以下に示した通り、挿入核酸（ＩＮＡ）の使用は、従来のオリゴヌクレオチドよりもはるかに短いプローブを可能にし、かつ、必要に応じて、長さの増大のこの要件を克服する。
【００８８】
位置での「トップ」および「ボトム」鎖のプローブ長さおよび異なるプローブ配列に関して定義された複雑性の削減の原理は、異なる分子環境における異なる構造的または修飾プローブおよびプライマーに適用可能な相対語である。ＩＮＡの例がこの相対性を明らかにする。ＩＮＡの標準オリゴヌクレオチドプローブに対する重要な利点は、ＩＮＡが従来のオリゴヌクレオチドよりもはるかに短く作られ、かつ依然として同等のハイブリダイゼーション結果が得られることである（ＩＮＡ長さ＜オリゴヌクレオチド長さ）。これは、ＩＮＡの構造的成分である挿入偽ヌクレオチド、ＩＰＮのため相補的ＤＮＡに対するＩＮＡの高アフィニティーによる。したがって、所定の数のＩＰＮにより、非変換ゲノムへの有効かつ特異的ハイブリダイゼーションを達成するために、長さＸヌクレオチドのＩＮＡを必要とする場合は、同じ分子条件下に亜硫酸水素変換ゲノムにおける同じ位置へハイブリダイズするために、さらに長さ＞ＸのＩＮＡを必要とする。
【００８９】
宿主病原体相互作用（ウイルスおよび宿主ゲノムが同じ臨床試料中であるが、きわめて異なる濃度で共存する）の場合、「複雑性の削減」およびＩＮＡまたは他のプローブの使用が新しい有利な条件をハイブリダイゼーションプロトコールへ導入するが、それは特に、ＩＮＡがＡＴが豊富である核酸配列へのハイブリダイズを好むためであることに留意するこも特に重要である。例えば、野生型ＨＰＶ  ＤＮＡの純粋溶液において、７９０４塩基ＨＰＶ１６ゲノムにおける特異的位置を見出し、これにハイブリダイズするために必要とされるウイルスプローブまたはプライマーのおおよその長さは、およそ６ｍｅｒのプローブ／プライマー（４６＝４０９６塩基）である。Ｔが豊富な簡易化したＨＰＶ核酸を生成する亜硫酸水素処理の後、同じ分子条件下に、この特異的位置を見出すために、およそ８ｍｅｒのプローブまたはプライマーが必要となる（３８＝６５６１塩基）。
【００９０】
しかし、７９０４塩基対のＨＰＶゲノムおよびおよそ３，０００，０００，０００塩基対のヒトゲノムなど２つの著しく不均一のサイズのゲノムが試料中に最初に存在し、かつ両方のゲノムがそのそれぞれの誘導体に「複雑性が削減」されている場合、特異的ウイルス配列のプローブまたはプライマーはここでＴが豊富なヒト簡易化した核酸によって圧倒的に左右される溶液中のそれらの誘導標的へハイブリダイズする。例えば、試料中の各々のヒト簡易化した核酸に対して１つの簡易化したＨＰＶ核酸があった場合は、ウイルスプローブまたはプライマーは、３，０００，００７，９０４塩基対の簡易化した核酸にハイブリダイズしている。したがって、ここで特異的ウイルス配列の分析には、新しくヒト配列に生じたウイルスおとり位置から生じるハイブリダイゼーションシグナルを回避するおよそ１４ｍｅｒのプローブまたはプライマーが必要となる。
【００９１】
プローブおよびプライマー長さを含む「複雑性の削減」問題に加えて、ＰＣＲ反応において使用される変性プライマーの数が適度である場合、ハイブリダイゼーションの動態およびＰＣＲ産物を検出する能力への重要な変化もある。ＨＰＶ型間の広範囲に及ぶゲノムのばらつきのため、従来技術の増幅は、関連増幅核酸産物または単位複製配列を多重ＰＣＲ反応から生成するために多数の変性プライマーの使用を必要とした。しかし、プローブ／プライマープールにおける縮退が大きいほど、溶液中の任意の個々の関連プローブまたはプライマーの濃度は低くなる。かかる状況は、複雑な真核ゲノムで行われ、１９６６年にWaring, M. & Britten R. J. Science, 154, 791-794によって、かつ1968年にBritten, R.J および Kohne D E., Science, 161, 529-540(およびCarnegie Institution of Washington Yearbook報告に由来するそれらの中の初期の文献）によって科学文献に最初に紹介されたドライバー・トレーサー（ｄｒｉｖｅｒ−ｔｒａｃｅｒ）反応におけるハイブリダイゼーションの動態および忠実性と類似している。
【００９２】
また、ＨＰＶ  ＰＣＲプライマーがヒト誘導体に対して高濃度にある場合、ハイブリダイゼーション反応における支配的な力はＨＰＶプライマーである。例えば、試料中のウイルス付加が高い場合は（単一のヒトゲノムに対して約１００，０００ＨＰＶゲノム）、ウイルスプライマーのハイブリダイゼーションの動態は、ヒト誘導体当り１つのＨＰＶ誘導体のみがあった場合の１００，０００倍速くなる。前者の場合、ウイルス成分は溶液中でゲノムのきわめて反復性の成分であるかのように機能する。しかし、単一のＰＣＲ反応によって臨床試料中の異なるリスクの異なるＨＰＶ型を検出するために、変性エンティティの使用を必要とする各々のＨＰＶ型から異なるプライマーが一般的に必要とされる。最終結果は、プライマー集団が混合正常ゲノムでの従来の多重ＰＣＲ反応においてコンビナトリアルに交互交代しうるということである。ＰＣＲ増幅が失敗し、または増幅核酸産物の分布が試料中に存在する特定のＨＰＶ型に味方して大きく偏るという最終結果により、ハイブリダイゼーション部位に競合する、文字通り何千もの異なるプライマーがありうる。これは従来の非変換ゲノムが存在する臨床試料からのデータの作成にとって主要な問題を示す。
【００９３】
ＩＮＡプローブおよびプライマーの任意の使用と組合せた「複雑性の削減」の本発明は、これら従来技術の問題の困難の多くを克服する。
【００９４】
「具体的にハイブリダイズすることができる」という語は、他の核酸分子の全部または一部による厳密な条件下にハイブリダイズする能力を有する核酸が意味される本明細書での「厳密な条件下にハイブリダイズすることができる」という語と同じ意味で使用される。ＤＮＡ断片の＋または−鎖の少なくとも１つのらせん回旋と相補的であるヌクレオチド配列（約１０〜１５個のヌクレオチド）。厳密な条件下にハイブリダイズすることができるによって、少なくとも核酸の一領域による対象核酸のアニーリングが標準条件下、例えば、非相補的ヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションを排除する傾向がある、高温および／または低塩分量で行われることが意味される。固定化ＤＮＡへの核酸プローブのハイブリダイゼーションのための厳密なプロトコールの例（０．１×ＳＳＣ、２時間６８℃を含む）が、Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, 1982, at pages 387-389に記載されているが、条件は適用によって変動する。
【００９５】
「ヌクレオチド配列」という語は、本明細書では、ヌクレオシドまたはヌクレオチドの配列を指すために使用される。
【００９６】
「隣接ヌクレオチド配列」という語は、本明細書では、連続した配列で、順々に連結したヌクレオチドの配列を指すために使用される。
【００９７】
「ＰＣＲ」（ポリメラーゼ連鎖反応）という語は、本明細書では、ＤＮＡテンプレート分子、２つのオリゴヌクレオチドプライマー、およびＤＮＡポリメラーゼ酵素の使用のよりＤＮＡ断片を増幅する方法を指すために使用される。ＤＮＡテンプレートは、テンプレートにアニーリングされうるプライマーから高温で解離される。ＤＮＡポリメラーゼはプライマーで開始するテンプレートを複写する。この方法は約３０〜４０回反復され、反応産物におけるテンプレート特異的分子を増幅し、かつこれを富化する。
【００９８】
プライマーおよび複雑性の削減
注目すべきは、複雑性の削減が、変換されている分子の集団（誘導体）が変換状態のままであるか、またはさらに増幅にかけられているかによって異なる。上記の例において、誘導体集団は、臨床試料中に存在するように増幅されないままであった。トップ鎖（５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＣ  ３’）（配列番号６９３）、およびボトム鎖（５’ＧＡＡＴＴＴＣＣＣＣ３’）（配列番号６９４）が、それぞれ、５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＵ３’（配列番号６９５）および５’ＧＡＡＴＴＴＵＵＵＵ３’（配列番号６９６）に変換されていることを想起されたい。シトシンはウラシルに変換されており、かつウラシルはエクスビボでＤＮＡポリメラーゼ機構による認識の点でチミンと同等であるため、トップ鎖誘導体は基本的に５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ３’（配列番号６９７）であり、ボトム鎖誘導体は５’ＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴ３’（配列番号６９８）である。しかし、誘導体集団がここで酵素的手段によってエクスビボで複製されている場合は、４つの明らかな誘導体集団が後に続いて起き、これらは［５’ＧＧＧＧＡＡＡＴＴＴ３’］（配列番号６９７）、［５’ＡＡＡＴＴＴＣＣＣＣ３’］（配列番号６９９）、［５’ＡＡＡＡＡＡＡＴＴＣ  ３’］（配列番号７００）および［ＧＡＡＴＴＴＴＴＴＴ３’］（配列番号６９８）である。これらの誘導体は確かに複雑性が削減されているが、変換直後に存在する最初の複製されていない誘導体と同じ程度には削減されていない。したがって、ＰＣＲプライマーが最初の非複製誘導鎖に作られている場合、トップまたはボトム鎖のいずれかに対するプライマーの選択が出力に影響を及ぼすため、検査したいと思う増幅核酸産物を賢明に決定する必要がある。変換ゲノムの出力を構成する２つの非相補的誘導体集団、対複製後に存在する４つの誘導体集団の対処間の違いは直感的に明らかではないが、プライマーデザインにとって重要な意義を有しうる。
【００９９】
最後に、「複雑性の削減」を形式化し、これを定量化するために以前紹介された長いプローブまたはプライマーの問題は、分子の誘導体集団内の特異的配列の検索に際してのみ関連性と仮定される。しかし、本発明の重要な基礎は、必要に応じて、１つの初期試験ですべてのＨＰＶ型が分析されることを可能にする、ＨＰＶ型間で最大限に類似している誘導体位置の選択でありうる。これら選択される位置は、トップまたはボトム鎖誘導体が選択されるかどうかによって変動し、かつかかる位置はボトム鎖と比べトップ鎖では異なる領域におけるものとなる。
【０１００】
誘導体集団における長いプローブおよびプライマーに対する要件の実際の重要性は、本発明におけるＨＧＳ亜硫酸水素処理を使用する変換によってより多くの配列類似性が与えられる位置の発生のためにＨＰＶ検出に有利である実際の利点のせいで影が薄い。それらは、従来のオリゴヌクレオチドの場合よりも短いプローブおよびプライマー分子を可能にするＩＮＡの任意の使用のせいでも影が薄い。また、誘導体集団へのネスト化ＰＣＲ法の適用は、増幅核酸産物生成を可能にするために同じ近傍で結合する２つのプライマーを必要とする。ＰＣＲプライマーの１つが、標的近傍の外側であるおとり位置と配列類似性を有する場合は、そのプライマー対の他のメンバーが同じ非標的領域において隣接するおとり位置も有する可能性は低い。さらに、かかるネスト化ＰＣＲの内部プライマーも第１回のプライマーと同じ非標的領域においておとり位置を有する可能性より低い。偽増幅の可能性はきわめて低い。
【０１０１】
ヒトパピローマウイルス
本明細書で使用される「ウイルス特異的核酸分子」という語は、ウイルスまたはウイルス型に特異的な１つもしくはそれ以上の配列を有する本発明による方法を使用して測定または獲得されている分子を意味する。
【０１０２】
本明細書で使用される「ウイルスの分類レベル」という語は、型、亜型、変異型、および遺伝子型を含む。ウイルスゲノムの流動性は認識されている。異なるウイルス集団はさらに単一のヌクレオチド変化に対して多型であり、または正常なＤＮＡ修復過程がもはや機能していない特定の癌性細胞内にそれらが存在する場合には異常に高い、または異常に低い変異性にさらされうる。
【０１０３】
本明細書で使用される「ＨＰＶ特異的核酸分子」という語は、ウイルスまたはウイルス型を示しうる処理または変換ウイルスＤＮＡに存在する特異的核酸分子を意味する。
【０１０４】
本明細書で使用される「ＨＰＶ型」という語は、以前に単離され、かつ特徴づけられたＨＰＶ型と９０％未満の配列類似性がある任意の既存のまたは新しいＨＰＶ集団を指す（1993, Van Rast, M. A., et al., Papillomavirus Rep, 4,61-65; 1998, Southern, S. A. および Herrington, C.S., Sex. Transm. Inf. 74,101-109）。
【０１０５】
本明細書で使用される「ＨＰＶ亜型」という語は、配列類似性が以前の亜型に対して９０−９８％の範囲である既存のまたは新しいＨＰＶ集団を指す（1993, Van Rast, M. A., et al., Papillomavirus Rep, 4,61-65; 1998, Southern, S. A. および Herrington, C.S., Sex. Transm. Inf. 74,101-109）。
【０１０６】
本明細書で使用される「ＨＰＶ変異型」という語は、配列類似性が以前の変異型の９８−１００％である既存のまたは新しいＨＰＶ集団を指す（1993, Van Rast, M. A., et al., Papillomavirus Rep, 4,61-65; 1998, Southern, A. および Herrington, C.S., Sex. Transm. Inf. 74,101-109）。
【０１０７】
本明細書で使用される「ＨＰＶ遺伝子型」という語は以下の通りである。すなわち、その単一の塩基がＧ、Ａ、Ｔ、またはＣとして存在し、またはその塩基が標準のコンパレータ（すなわち、位置１から位置７９０４までのＨＰＶ１６）における所定の位置で欠失、付加、増幅、または別の部位への転位によって変化されているかどうかを含む、いずれかの他の完全に配列決定されたＨＰＶゲノムとは１つの塩基で最小限に異なる遺伝子型がいずれかの完全に配列決定されたＨＰＶゲノムである。本発明者らは、従来技術のＢＬＡＳＴ法を使用してＨＰＶ１６基準に対して他のＨＰＶ遺伝子型すべてを比較する。
【０１０８】
本特許明細書において使用される生物情報ＨＰＶ比較のすべては、ＨＰＶ１６ゲノム（標準コンパレータとしてＨＰＶ１６の位置１〜７９０４を使用）に対して、および従来技術のＢＬＡＳＴ法を使用して行った（1996, Morgenstern, B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93, 12098-12103）。基準目的のために本明細書で使用される標準ＨＰＶ「型」は、乳糖種ウイルス科のＨＰＶ１６、７９０４塩基対の乳糖種ウイルスである（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ，  ＮＣＢＩ  ｌｏｃｕｓ  ＮＣ＿００１５２６；  ｖｅｒｓｉｏｎ  ＮＣ＿００１５２６．１  ；  ＧＩ：９６２７１００；  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ，  Ｍｅｄｌｉｎｅ，  ９１１６２７６３  および  ８５２４６２２０；  ＰｕｂＭｅｄ  １８４８３１９  ａｎｄ２９９００９９）。
【０１０９】
ＰＣＲによる増幅のためのプライマー
本発明による増幅方法は、ＨＰＶのゲノム的に簡易科したトップおよび／またはボトム鎖に対するオリゴヌクレオチドプライマーセットから成る。ヒト患者からの液状化細胞診およびアーカイブパラフィン試料からＨＰＶ特異的産物を生成したかかるプライマーのリストは表１に要約されている。大部分のプライマーは、異なるＨＰＶ型のトップ鎖誘導体に向けられているが、少数はボトム鎖誘導体（ＨＰＶＢ）に向けられている。
【表１】
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【表２】
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【表３】
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【表４】
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【表５】
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【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【０１１０】
本発明者は、高リスクＨＰＶの検出のための最適なプライマーが、プライマー配列番号３３３〜配列番号３５０であり、これらのプライマーがトップ鎖プライマーであることを見出した。これらのプライマーは第１回ＰＣＲには１および４、第２回ＰＣＲには２および３を使用して機能する。
【０１１１】
本発明者は、すべての肛門性器ＨＰＶの検出のための最適なプライマーが、以下のボトム鎖プライマー、第１回の配列番号４７９とともに配列番号４６２、第２回の配列番号４６３および配列番号４７８、または第１回の配列番号４７０および配列番号４８５、第２回の配列番号４７０および配列番号４８６であることを見出した。
【０１１２】
ウイルスプライマー配列は異なるＨＰＶ型に対する多重アラインメントを使用して生成され、普遍的ＨＰＶ（Ｕｎｉで示した）、高リスク型（ＨＲで示した）、中リスク型（ＨＭで示した）、低リスク型（ＬＲで示した）の検出のためのプライマーを生成した。およびかかるＨＰＶ型のさまざまな組合せ。組合せは高および中リスクＨＰＶ型（ＨＭ）、高、中、および低リスクＨＰＶ型（ＨＭＬ）で示されている。
【０１１３】
ＨＰＶの高、中、および低リスク型の構成は、被験者の居場所および民族系統によって変動する。ＦＤＡ承認ハイブリッドキャプチャー２試験では１３のウイルス型、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８が使用されるが、これらを本発明者らは集合的に高中リスクと呼ぶ。本発明のために、これらのサブグループを高リスク、すなわちＨＰＶ１６、１８、４５、および５８と呼び、かつその他のサブグループを中リスク、３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８、５９および６８と呼ぶ。低リスク型はＨＰＶ６、１１、２６、３０、４０、４２、４３、４４、５３、５４、５５、５７、６６、７３、８２、８３、および８４である。プライマーは上記ＨＰＶウイルス型のＥ６、Ｅ７、Ｅ４、Ｅ５遺伝子に基づき個々のＨＰＶ型のためにデザインされている。
【０１１４】
ＨＰＶ１１−Ｅ４−１など表１に使用されている表示の例は、Ｅ４遺伝子領域を使用するＨＰＶ１１のトップ鎖を標的とするプライマーを示す。−１はと口絵のプライマー番号を示す。
【０１１５】
２個以上の塩基が縮退の問題を克服するために特定の位置で使用されることが必要であり、以下の符号は塩基付加を示す。Ｎ＝Ａ、Ｇ、ＴまたはＣ、Ｄ＝Ａ、ＧまたはＴ、Ｈ＝Ａ、ＴまたはＣ、Ｂ＝Ｇ、ＴまたはＣ、Ｖ＝Ｇ、ＡまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ、Ｙ＝ＴまたはＣ、Ｒ＝ＡまたはＧ、Ｍ＝ＡまたはＣおよびＷ＝ＡまたはＴ。
【０１１６】
ＨＰＶアッセイ
本発明によるＨＰＶ検出方法（すなわち、ゲノム複雑性の削減後の増幅法）は、細胞集団内の変化した細胞状態の評価のため、感染細胞内の乱れたトランスクリプトーム、プロテオーム、代謝産物、またはメチロームネットワークによって裏打ちされたリスク評価のため、感染の進行のモニタリングのため、および抗ウイルス療法など治療方式を評価するためにかなり異なる型の他のアッセイと組合わせることができる。
【０１１７】
例えば、ＨＰＶ特異的核酸分子を測定する分子アッセイを以下と組合わせることができる。すなわち、
−組織切片における蛍光シグナルの自動定量のためのマルチ−エピトープ−リガンド−カルトグラフィー（ＭＥＬＫ）システムなどパターン認識および高スループットロボット画像技術を使用するアッセイ、
−蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のための光学、共焦点、透過または電子顕微鏡分析、異数性、または異常オルガネラなど細胞内の染色体障害（数、型、または形態的外観に関して）の総レベルを検出する細胞学的および組織学的分析を使用するアッセイ、
−分子の超高感度非同位体検出のための核酸またはポリペプチドアプタマー、Ｓｐｉｅｇｅｌｍｅｒ（鏡像高アフィニティーオリゴヌクレオチドリガンド）、多色ナノ結晶（量子ドットバイオコンジュゲート）、または細胞表面もしくは内部成分のためのバイオマーカー、異なる細胞成分を標的とする指数富化（Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  Ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）によるリガンドの系統的進化（ＳＥＬＥＸ）および高アフィニティーアプタマーリガンドを含むコンビナトリアル化学的方法を使用するアッセイ、
−細胞のレーザー捕捉または免疫磁性細胞富化技術、またはフローサイトメトリーと適合したミクロスフェアベースの技術、またはさまざまな核酸もしくはペプチド／タンパク質部分を含有するコロイド懸濁液の光学バーコードを使用するアッセイ、
−重複、欠失、転位、再配列などの肉眼的不均衡の検出をめざす単一細胞比較ゲノムハイブリダイゼーション、およびその関連インサイチュー技術を使用するアッセイ、
−遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、総遺伝子発現分析（ＴＯＧＡ）、ランダム順序アドレス可能高密度光ファイバーセンサーアレイ、マイクロビーズ上での超並列的シグネチャー配列決定（ＭＰＳＳ）を含むロボゲノムマイクロアレイ技術などトランスクリプトーム調節に関して報告するアッセイ、
−タンパク質マイクロアレイ、マトリックス支援型レーザー脱離イオン化飛行時間（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）法、フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴型質量分析計（ＦＴＩＣＲ）、ＬＣ  ＭＳ−ＭＳ、および急速気化冷却質量分析計（ＲａｐＥｖａｐ  ＭＳ）による細胞分析を含むさまざまな技術を使用するプロテオーム調節に関して報告するアッセイ、
−検出レベルゼプトモル（１０−２１）感度に近づく多光子検出（ＭＰＤ）技術を使用するアッセイ、
−臨床試料からの細胞のメチロームを尋問するメチローム法を使用し、正常状態から子宮頸部癌までの所定の軌道に沿って細胞集団の位置を判定し、好ましくは、ウイルス感染によって罹患している細胞、または感染もしくは炎症の部位に集められている免疫細胞のゲノム位置の変化したメチル化シグネーチャーを判定するアッセイ。
【０１１８】
上記技術の一部は以前に評価されている（2001 , Miklos and Maleszka, Proteomics, 1 , 30-41）。
【０１１９】
データ収集、集積、および管理システム
本発明と関連した材料のデータ収集およびデータ管理システムは、臨床患者データと結合され、特殊化アルゴリズム法を使用して分析されうる。ロボットプラットフォーム管理およびデータ収集は自動に保存され、収集データは、遺伝子オントロジー（ＧＯ）、国立医学図書館の医学問題表題集（ＭｅＳＨ）シソーラス、ヒトのオンラインメンデル遺伝（ＯＭＩＭ）などの疾患オントロジー、またはヒトゲノム突然変異データベース（ＨＧＭＤ）またはＰｕｂＭｅｄなど知見データベースと適合する情報科学インフラストラクチャーおよびソフトウェアツールと結合されうる。最近ヒトゲノムアセンブリーと適合し、ジェンバンクおよびＲｅｆＳｅｑなどのソースからの情報へのアクセス、そのダウンロードを提供するソフトウェアパイプラインは、感染したＨＰＶであり、または体内の他の部分に存在するＨＰＶのため細胞によって影響を受けている細胞のゲノム状態に関して報告するアッセイと結合されうる。
【０１２０】
例えば、臨床および関連生物情報学データとＨＰＶデータを統合するデータベースインフラストラクチャーでは、より良いソフトウェア工学およびデータベース管理を促進する疎結合モジュラーアーキテクチャーが使用される。関係データベース管理システム（ＲＤＢＭＳ）（Ｐｏｓｔｇｒｅｓｑ１バーション７．３など）がオープンソースおよびロバストであり、ＨＰＶ領域における臨床予後を評価およびより良く予測する統合システムの一部の例として役立つ。ウェブベースのグラフィカルユーザーインターフェイス（ＧＵＩ）を含む追加の特徴は、統合された細胞学的および組織学的分析がきわめて多様なフォーマットで利用可能な治療および医薬品データとともに分子ＨＰＶデータと結合されることを可能にする。画像分析のための強化されたデジタル技術、病理学者にる遠隔画像共有、および自動可視化システムの統合は、自動分子キットプラットフォームの統合部分として構想されている。
【０１２１】
細胞試料採取
ＨＰＶ検出プロトコールは、前胞胚期、胚組織、周産期物質、死体、または法医学供給源からの試料を含む体の任意の部分からの試料で実行されうる。好ましくは、それらは子宮頸部および膣など子宮頸部膣部からのものであるが、皮膚供給源からのものでもありうる。好ましくは、それらは子宮頸部移行部からのものである。試料は、ＣｅｒｖｅｘＢｒｕｓｈ、セラパック社（Ｔｈｅｒａｐａｋ  Ｃｏｒｐ）、Ｉｒｗｉｎｄａｌｅ、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国（ＵＳＡ）、ダイジーン子宮頸部サンプラー子宮頸部ブラシ、ダイジーン社（Ｄｉｇｅｎｅ  Ｃｏｒｐ．）、Ｇａｉｔｈｅｒｂｕｒｇ、メリーランド州（ＭＤ）、米国（ＵＳＡ）、プラスティックスパチュラ／ブラシコンビネーション、クーパー・インスツルメンツ（Ｃｏｏｐｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、Ｈｏｌｌｙｗｏｏｄ、フロリダ州（ＦＬ）、米国（ＵＳＡ）を使用し、または肛門性器部からの試料を得るためのダクロンスワブまたは任意の適切な材料を使用し、または針生検など標準生検法によって収集されうる。試料は、ＰｒｅｓｅｒｖｅＣｙｔｅ、サイテク社（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐ．）、マサチューセッツ州（ＭＡ）、米国（ＵＳＡ）、またはＡｕｔｏＣｙｔｅ  ＰＲＥＰ、トリパス・イメージング・バーリントン（ＴｒｉＰａｔｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ）、ノースカロライナ州（ＮＣ）、米国（ＵＳＡ）などさまざまな培地に配置されうる。好ましくは、初期試験は液状化細胞診で行われるが、パラフィン切片およびスライドなどの平面プラットフォームも適切である。
【０１２２】
キット
本発明は、さまざまなキット、またはキットの組合せの形で実行され、かつ手動、半自動、または完全ロボットプラットフォームの面で例示化されうる。好ましい形態において、ＭｅｔｈｙＥａｓｙ（商標）キットまたは高スループットＭｒｔｈｙｌＥａｓｙ（商標）キット（ヒューマン・ジェネティック・シグナーチャーズ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）Ｐｔｙ  Ｌｔｄ、オーストラリア）は、ＥｐＭｏｔｉｏｎなどのロボットプラットフォームを使用して９６または３８４プレートにおける核酸の変換を可能にする。
【０１２３】
ヒトパピローマウイルス
成熟ヒトパピローマウイルスＤＮＡを２つのウイルスコード化タンパク質から成る２０面体カプシドコート内にカプセル化する。二本鎖環状ＤＮＡゲノムはＨＰＶ１６に対して長さが７９０４塩基対であるが、一般的な中リスク型の中でＨＰＶ５１の７８０８塩基対からＨＰＶ５２の７９４２塩基対のばらつきがある。ウイルスゲノムの領域は、それらが環状分子上で発生する順序で以下に示されている。ウイルスはＵＲＰと呼ばれる非コーディング領域を有し、その後にコーディング領域の番号が示されている、Ｅ６、Ｅ７、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ４、Ｅ５、Ｌ２、およびＬ１。一部のウイルス型は機能的Ｅ５領域を欠きうる。Ｅ４領域は、細胞質ケラチンネットワークの混乱を引き起こし、細胞質の「ハロ効果」と呼ばれる空砲細胞症をもたらす多重タンパク質産物を産生する。異なるＨＰＶ型は上皮親和性であり、感染後に空砲細胞症、異常角化症、多核細胞化、核拡大および低度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）などの異常をもたらしうるが、これら変化のすべては子宮頸部にのみ適用される。ウイルス感染および染色体異常は子宮頸部癌において相関しうるが、腫瘍性病変において確認される多様性変化、およびウイルス感染、ウイルス遺伝子発現、ウイルス組込み、細胞分化、およびゲノム異常とのその関連は理解がきわめて不十分である（1998, Southern, S.A. et al., Sex Transm Inf., 74, 101-109）。この理由のために、異なるウイルス型および異なる遺伝的背景におけるその異なる影響の検出がきわめて重要である。
【０１２４】
また、ＨＰＶ型の皮膚および粘膜カテゴリーへ、および高、中、および低リスクカテゴリーへの指定は従来技術では受け入れられているが、これらのカテゴリーは若干の不安定を示し、さらにＨＰＶの皮膚と粘膜の下位カテゴリー間で重複する。例えば、ＨＰＶ７は皮膚のいぼおよび口腔病変と関連している。ＨＰＶ２６は全身いぼ症および肛門性器病変との関連で単離されている。さらに、ＨＰＶ６およびＨＰＶ１１は低リスク型として分類されているが、それらはブシュケ・レーベンシュタイン腫瘍のほか、喉頭および外陰部、および尖圭コンジロームから単離されている（1986, Boshart, M. et al., J. Virology, 58, 963-966; 1992, Rubben, A., et al., J Gen Virol., 73, 3147-3153）。
【０１２５】
宿主ゲノムへのウイルス組込みは、ＵＲＰ、Ｅ６、およびＥ７領域の保持とともにＥ１とＬＬの遺伝子領域間の線形化をもたらすが、Ｅ１、Ｌ１、およびＬ２などの遺伝子領域の欠失、およびＥ２の不活性化または欠失を伴う。Ｅ６およびＥ７領域は一般に子宮頸部癌では保持されるが、Ｅ２タンパク質発現は欠如している。Ｅ２の損傷は不良な予後および生存期間の短縮と関連している。
【０１２６】
患者試料
米国サイテク社（Ｃｙｔｙｃ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）によって供給される子宮頸部試料採取デバイスを使用して子宮頸部の表面から家庭医によって細胞試料が収集された。患者は、ルーチンの癌スクリーニングプログラムまたは以前の子宮頸部疾患のモニタリング試験の一環として試料を採取されることに同意した。医師は細胞を収集デバイスから細胞の保存および検査のための実験室への輸送用のメタノール／水溶液に移した。ルーチンの形態学的調製を使用して前癌またはウイルス感染による変化について評価した。細胞試料の分離アリコートを本明細書に概要を示したＤＮＡ試験のために使用した。
【０１２７】
ＤＮＡの抽出
ウイルスＤＮＡは適切な供給源から獲得されうる。例としては、細胞培養、ブロス培養、環境試料、臨床試料、体液、液体試料、組織など固体試料が挙げられるが、これらに限定されない。試料からのウイルスＤＮＡは標準方法によって獲得されうる。適切な抽出の例は以下の通りである。目的の試料を、４００μｌの７Ｍグアニジン塩酸塩、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ６．４、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、５０ｍＭプロテイナーゼＫ（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、１００μｇ／ｍｌ酵母ｔＲＮＡに配置する。試料を使い捨て式１．５ｍｌ乳棒で完全に均質化し、４８時間、６００℃下に放置する。インキュベーション後、試料を５分間のドライアイス／５分間の９５℃の５回冷凍／凍解サイクルにかけた。次いで、試料をボルテックスし、マイクロフージュで２分間回転し、細胞デブリをペレット状にする。上清を除去してきれいな管に入れ、希釈し、塩濃度を削減し、フェノール：クロロホルム抽出し、エタノール沈殿させ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ  ５０μｌ中に再懸濁する。
【０１２８】
意外にも、本発明者によって、他の核酸供給源からウイルスＤＮＡを分離する必要がないことがわかっている。処理ステップは異なるＤＮＡ型の無数の混合物のために使用され、さらにウイルス特異的核酸は本発明によって同定されうる。複雑なＤＮＡ混合物における検出限界は、標的ウイルス核酸分子の単一コピーに至るまででありうる標準ＰＣＲ検出の限界であると推定される。
【０１２９】
亜硫酸水素処理
核酸の有効な亜硫酸水素処理の例としてのプロトコールが以下に記載されている。プロトコールは結果として処理された実質的にすべてのＤＮＡの保持をもたらす。この方法は、本明細書ではヒト遺伝的シグネーチャー（ＨＧＳ）とも呼ばれる。当然のことながら、試料または試薬の体積または量は変動しうる。
【０１３０】
亜硫酸水素処理の好ましい方法は、参照により本明細書で援用される、米国特許出願第１０／４２８３１０号明細書または国際公開第（ＰＣＴ）／ＡＵ２００４／０００５４８号パンフレットにおいて確認されうる。
【０１３１】
必要に応じて、適切な制限酵素で前消化されうるＤＮＡ  ２μｇに、３Ｍ  ＮａＯＨ（水５０ｍｌ中６ｇ、新しく調製）２μｌ（１／１０体積）を添加して２０μｌの最終体積にした。このステップは、亜硫酸水素試薬が、好ましくは、一本鎖分子と反応するため、二本鎖ＤＮＡ分子を一本鎖形態に変性させる。混合物を３７℃下に１５分間インキュベートした。室温を上回る温度でのインキュベーションを使用し、変性の効率を改善することができる。
【０１３２】
インキュベーション後、２Ｍメタ亜硫酸水素ナトリウム２０８μｌ（１０Ｎ  ＮａＯＨ  ４１６ｍｌとともに水２０ｍｌ中７．６ｇ）、ＢＤＨ  ＡｎａｌａＲ＃１０３５６．４Ｄ、新しく調製）および１０ｍＭキノール１２μｌ（水５０ｍｌ中０．０５５ｇ、ＢＤＨ  ＡｎａｌＲ＃１０３１２２Ｅ、新しく調製）を連続して添加した。キノールは還元剤であり、試薬の酸化を削減するために役立つ。他の還元剤、例えば、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、メルカプトエタノール、キノン（ヒドロキノン）、または他の適切な還元剤も使用されうる。試料を鉱油２００μｌでオーバーレイした。鉱油のオーバーレイは試薬の気化および酸化を防ぐが、必須ではない。次いで、試料を一夜、５５℃でインキュベートした。あるいは、試料を以下の通りサーマルサイクラーで循環することができる。すなわち、試料を以下の通り約４時間または一夜インキュベートした。すなわち、ステップ１、５５℃／２時間、ＰＣＲ機械で循環、ステップ２、９５℃／２分。ステップ１は約３７℃〜約９０℃の任意の温度で実行され、５分〜８時間の長さで変動されうる。ステップ２は約７０℃〜約９９℃の任意の温度で実行され、約１秒〜６０分以上の長さで変動されうる。
【０１３３】
メタ亜硫酸水素ナトリウムによる処理後、油を除去し、ＤＮＡ濃度が低かった場合は、ｔＲＮＡ１μｌ（２０ｍｇ／ｍｌ）またはグリコーゲン２μｌを添加した。これらの添加剤は任意であり、これらを使用し、特にＤＮＡが低濃度で存在する場合、標的ＤＮＡとの共沈によって得られるＤＮＡの収量を改善することができる。核酸のより有効な沈殿のための担体としての添加剤の使用は、核酸の量が＜０．５μｇである場合に一般に望ましい。
【０１３４】
イソプロパノール浄化処理を以下の通り行った。すなわち、水８００μｌを試料に添加し、混合し、次いでイソプロパノール１ｍｌを添加した。水または緩衝液は反応管中の亜硫酸水素塩の濃度を塩が目的の標的核酸とともに沈殿しないレベルに削減する。希釈は一般に、塩濃度が本明細書に開示された所望の範囲以下に希釈されない限り、約１／４〜１／１０００である。
【０１３５】
試料を再び混合し、４℃で少なくとも５分間放置した。試料をマイクロフージュで１０−１５分間回転し、ペレットを７０％ＥＴＯＨで２回、毎回ボルテックスして洗浄した。この洗浄処理により核酸と沈殿した残留塩が除去される。
【０１３６】
ペレットを乾燥させ、次いで、５０μｌなど適切な体積のＴ／Ｅ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／０．１ｍＭ  ＥＤＴＡ）ｐＨ７．０−１２．５中に再懸濁した。ｐＨ１０．５での緩衝液は特に有効であることがわかっている。試料を３７℃〜９５℃で１分から９６時間インキュベートし、必要に応じて核酸に懸濁した。
【０１３７】
亜硫酸水素処理の例が、シトシンのウラシルへの変換のための方法および材料を提供する国際公開第２００５０２１７７８号パンフレット（参照により本明細書で援用）において確認されうる。一部の実施形態において、ｇＤＮＡなどの核酸が、トリアミンまたはテトラアミンなどの亜硫酸水素塩およびポリアミン触媒と反応される。場合により、亜硫酸水素塩は亜硫酸水素マグネシウムを含む。他の実施形態において、核酸が、場合によりポリアミン触媒および／または第４級アミン触媒の存在下に亜硫酸水素マグネシウムと反応される。本発明の方法を行うために使用されうるキットも提供される。当然のことながら、これらの方法は、処理ステップにおける本発明にも適切であろう。
【０１３８】
増幅
プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）ＰＣＲマスターミックス、６ｎｇ／μｌの各々のプライマーを使用することにより、亜硫酸水素処置ゲノムＤＮＡ  ２μｌを含有する反応混合液２５μｌ中でＰＣＲ増幅を行った。鎖特異的ネスト化プライマーが増幅のために使用される。第１回のＰＣＲ増幅をＰＣＲプライマー１および４を使用して行った（以下を参照）。第１の増幅後、増幅材料１μｌをＰＣＲプライマー２および３を含有する第２回のＰＣＲプレミックスに移し、既述の通り増幅した。ＰＣＲ産物の試料をＴｈｅｒｍｏＨｙｂａｉｄ  ＰＸ２サーマルサイクラーで以下の条件下に増幅した。すなわち、９５℃で４分間、１サイクルの後、９５℃で１分間、５０℃で２分間、および７２℃で２分間、３０サイクル、７２℃で１０分間、１サイクル。
【０１３９】
完全ネスト化ＰＣＲ法の説明が以下に示されている。
【表２１】
2008524990.tif 000022
【０１４０】
多重増幅
亜硫酸水素処理ＤＮＡ１μｌを、２５μｌの２０反応体積、×１キアゲン多重マスターミックス、５−１００ｎｇの各々第１回のＩＮＡまたはオリゴヌクレオチドプライマー１．５−４．０ｍＭ  ＭｇＳＯ４、４００μＭの各々のでｄＮＴＰ、および０．５−２単位のポリメラーゼ混合物中の以下の成分に添加する。次いで、成分をホットリッドサーマルサイクラーにおいて以下の通り循環する。一般的に、各々の増幅反応において２００までの個々のプライマー配列がありうる。
【０１４１】
ステップ１、９４℃１５分１サイクル
ステップ２、９４℃１分、５０℃３分３５サイクル、６８℃３分
ステップ３  ６８℃１０分１サイクル
次いで、酵素反応混合物および適切な第２回のプライマーを含有する第２の反応管に移される第１回の増幅のアリコート１μｌで第２回の増幅を行う。次いで、上記の通り循環を行う。
【０１４２】
ＨＧＳ「複雑性削減」プライマーおよびプローブ
適切なＰＣＲプライマーまたはプローブを本発明のために使用することができる。プライマーまたはプローブは一般的に、増幅される配列との相補的配列を有する。プライマーまたはプローブは一般的にオリゴヌクレオチドであるが、ＩＮＡなどのヌクレオチド類似体でありうる。「トップ」および「ボトム」鎖に対するプライマーは配列の点で異なる。
【０１４３】
プローブおよびプライマー
プローブおよびプライマーが適切な核酸分子または核酸類似体でありうる。例としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ロックド核酸（ＬＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ＭＮＡ、アルトリトール核酸（ＡＮＡ）、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、挿入核酸（ＩＮＡ）、シクロヘキサニル核酸（ＣＮＡ）、およびそれの混合物、およびそれのハイブリッドのほか、ホスホロチオエート、メチルホスホレート、ホスホラミダイト、ホスホロジチエート、ホスホロセレノエート、ホスホトリエステル、およびホスホボラノエートであるが、これらに限定されないそれのリン原子修飾が挙げられるが、これらに限定されない。非天然起源ヌクレオチドとしては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、ＩＮＡ、ＨＮＡ、ＭＮＡ、ＡＮＡ、ＬＮＡ、ＣＮＡ、ＣｅＮＡ、ＴＮＡ、（２’−ＮＨ）−ＴＮＡ、（３’−ＮＨ）−ＴＮＡ、α−Ｌ−リボ−ＬＮＡ、α−Ｌ−キシロ−ＬＮＡ、β−Ｄ−キシロ−ＬＮＡ、α−Ｄ−リボ−ＬＮＡ、［３．２．１］−ＬＮＡ、ビシクロ−ＤＮＡ、６−アミノ−ビシクロ−ＤＮＡ、５−エピ−ビシクロ−ＤＮＡ、α−ビシクロ−ＤＮＡ、トリシクロ−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］−ＤＮＡ、ビシクロ［３．２．１］−ＤＮＡ、ビシクロ［４．３．０］アミド−ＤＮＡ、β−Ｄ−リボピラノシル−ＮＡ、α−Ｌ−リクソピラノシル−ＮＡ、２’−Ｒ−ＲＮＡ、α−Ｌ−ＲＮＡ、またはα−Ｄ−ＲＮＡ、β−Ｄ−ＲＮＡ内に含まれるヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。また、非リン含有化合物を、メチルイミノメチル、フォルムアセテート、チオフォルムアセテート、およびアミドを含む連結基などであるが、これらに限定されないヌクレオチドに結合するために使用されうる。具体的には、核酸および核酸類似体が１つもしくはそれ以上の挿入偽ヌクレオチドを含みうる。
【０１４４】
プローブまたはプライマーは、ＩＮＡを形成する１つもしくはそれ以上の内部ＩＰＮを含有しうるＤＮＡまたはＤＮＡオリゴヌクレオチドでありうる。
【０１４５】
検出方法
所望の試料の状態を判定するために多数の可能な検出システムが存在する。当然のことながら、核酸を検出するための既知のシステムまたは方法を本発明のために使用されうる。検出システムとしては、以下が挙げられるが、これらに限定されない。すなわち、
Ｉ．  適切に標識したＤＮＡの１０−＞２００，０００の個々の成分を選択しうるマイクロアレイデバイスへのハイブリダイゼーション。アレイは、ガラス、プラスチック、雲母、ナイロン、ビーズ、電磁ビーズ、蛍光ビーズ、または膜など任意の適切な固体表面上でＩＮＡ、ＰＮＡ、またはヌクレオチドもしくは修飾ヌクレオチドアレイのいずれかで構成されうる、
ＩＩ．  サザンブロット型検出システム、
ＩＩＩ．アガロースゲルなど標準ＰＣＲ検出システム、ジーンスキャン（Ｇｅｎｅｓｃａｎ）分析など蛍光読取。サンドイッチハイブリダイゼーションアッセイ、臭化エチジウム、サイバーグリーンなどのＤＮＡ染色試薬、抗体検出、ＥＬＩＳＡプレートリーダー型デバイス、蛍光光度計デバイス、
ＩＶ．  特異的または多重ゲノム増幅断片またはそれの変形物のリアルタイムＰＣＲ定量、
Ｖ．  蛍光ビーズ、酵素コンジュゲート、放射性ビーズ、および同類のものなど国際公開第２００４／０６５６２５号パンフレットに概要が示されている検出システムのいずれか。
【０１４６】
ＶＩ．  リガーゼ連鎖反応などの増幅ステップまたは鎖置換増幅（ＳＤＡ）などの等温ＤＮＡ増幅技術を利用する任意の他の検出システム。
【０１４７】
ＶＩＩ．  多光子検出システム。
【０１４８】
ＶＩＩＩ．  電気泳動およびゲル中の視覚化。
【０１４９】
ＩＸ．  核酸を検出するために使用される、または使用されうる検出プラットフォーム。
【０１５０】
電気泳動
試料の電気泳動をＥ−ゲルシステムユーザーガイド（ｗｗｗ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｄｏｃ）に従って行った。
【０１５１】
挿入核酸
挿入核酸（ＩＮＡ）は、配列特異性を有する核酸（ＤＮＡおよびＲＮＡ）にハイブリダイズしうる非天然起源ポリヌクレオチドである。ＩＮＡは、いくつかの所望の特性を示すため、プローブ、またはプライマーベースのハイブリダイゼーションアッセイにおける核酸プローブおよびプライマーの代替／代用としての候補である。ＩＮＡは、核酸にハイブリダイズし、対応する天然起源の核酸／核酸複合体よりも熱力学的に安定であるハイブリッドを形成するポリマーである。それらは、ペプチドまたは核酸を分解することが知られている酵素の基質ではない。したがって、ＩＮＡは生体試料においてより安定であり、かつ天然起源核酸断片よりも長い寿命を有することになる。イオン強度にきわめて依存する核酸ハイブリダイゼーションとは異なり、核酸によるＩＮＡのハイブリダイゼーションはイオン強度からほとんど独立しており、天然起源核酸の核酸へのハイブリダイゼーションを強く嫌う条件下に低イオン強度で好まれる。ＩＮＡの結合活性は、分子へ操作される挿入基の数および二本鎖構造における特異的な形で積層される塩基間の水素結合からの通常の相互作用に依存している。配列識別は、ＤＮＡを認識するＤＮＡよりもＤＮＡを認識するＩＮＡでより効率的である。
【０１５２】
好ましくは、ＩＮＡは（Ｓ）−１−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル）−３−Ｏ−（１−ピレニルメチル）−グリセロールのホスホラミダイトである。
【０１５３】
ＩＮＡは、市販されているフォーマットで標準オリゴヌクレオチド合成法の適合によって合成される。ＩＮＡおよびその合成の完全な定義は、参照により本明細書で援用される、国際公開第０３／０５１９０１号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３２号パンフレット、国際公開第０３／０５２１３３号パンフレット、および国際公開第０３／０５２１３４号パンフレット（Ｕｎｅｓｔ  Ａ／Ｓ）において確認されうる。
【０１５４】
実際に、ＩＮＡプローブおよびプライマーと標準核酸プローブおよびプライマーとの間には多くの違いがある。これらの違いは便宜上、生物学的、構造的、および物理化学的な違いに分類される。上記および下記の通り、これらの生物学的、構造的、および物理化学的な違いは、各用途においてＩＮＡプローブおよびプライマーを使用する試みにより、核酸が一般的に使用されている場合、予測不可能な結果をもたらしうる。異なる組成のこの非等価性はしばしば化学技術においてしばしば確認される。
【０１５５】
生物学的な違いに関して、核酸は、遺伝的伝達および発現の薬剤として生物種の生命において中心的な役割を果たす生体物質である。そのインビボ特性はきわめて十分に理解されている。しかし、ＩＮＡは最近開発された完全に人工的な分子であり、化学者の頭で考えられ、合成有機化学を使用して製造されている。これは既知の生物学的機能を有さない。
【０１５６】
構造上、ＩＮＡは核酸と大幅に異なる。両方は一般的なヌクレオ塩基（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、およびＵ）を使用できるが、これらの分子の組成は構造的に多様である。ＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＩＮＡの骨格は繰り返しホスホジエステルリボースおよび２−デオキシリボース単位から成る。ＩＮＡは、リンカー分子によってポリマーに付着した１つもしくはそれ以上の大きな平面分子を有するという点でＤＮＡまたはＲＮＡと異なる。平面分子は、二本鎖構造でＩＮＡに対向して位置する相補的ＤＮＡにおける塩基間に挿入する。
【０１５７】
ＩＮＡとＤＮＡまたはＲＮＡとの間の物理／化学的な違いも実質的である。ＩＮＡは、同じ標的配列に結合した核酸プローブまたはプライマーよりも迅速に相補的ＤＮＡに結合する。ＤＮＡまたはＲＮＡ断片とは異なり、ＩＮＡは、挿入基が末端位置に位置していない限りＲＮＡに不十分に結合する。相補的ＤＮＡ鎖上での挿入基と塩基との間の強い相互作用のため、ＩＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定性は、類似のＤＮＡ／ＤＮＡまたはＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の安定よりも高い。
【０１５８】
ＤＮＡもしくはＲＮＡ断片またはＰＮＡなど他の核酸とは異なり、ＩＮＡは自己会合または結合特性を示すことはない。
【０１５９】
要約すれば、ＩＮＡが配列特異性を有する核酸にハイブリダイズすると、ＩＮＡは、プローブ、またはプライマーベースのアッセイを開発するための有用な候補であり、特にキットまたはスクリーニングアッセイに適合される。しかし、ＩＮＡプローブおよびプライマーは、核酸プローブおよびプライマーの同等物ではない。したがって、プローブ、またはプライマーベースのアッセイの特異性、感度、および信頼性を改善しうる方法、キット、または組成物は、試料を含有するＤＮＡの検出、分析、および定量において有用となる。ＩＮＡはこの目的に必要な特性を有する。
【実施例】
【０１６０】
本発明者らがコンピュータ内で本発明者らの生物情報学的分析を行った根拠を繰返すために、基準目的に利用された標準ＨＰＶ型は、ウイルス分類に関する国際委員会、ＩＣＴＶによってかかるものとして最初に指定されたパポバウイルス科、乳糖種ウイルス属のＨＰＶ１６である（1993, Van Rast, M. A., et al., Papillomavirus Rep, 4,61-65; 1998 Southern, S.A. および Herrington, C.S. Sex. Transm. Inf. 74,101-109も参照）が、乳糖種ウイルス科への分類上の更新はしばしば従来技術では交互に使用されている。あいまいさを避けるために、本発明者らは、ＨＰＶ１６の完全に配列決定された７９０４塩基対ゲノムを標準コンパレータとして使用する（国立バイオテクノロジー情報センター、ＮＣＢＩ位置ＮＣ＿００１５２６、バーションＮＣ＿００１５２６．１、ＧＩ：９６２７１００、文献、Ｍｅｄｌｉｎｅ、９１１６２７６３および８５２４６２２０、ＰｕｂＭｅｄ  １８４８３１９および２９９００９９）。
【０１６１】
また、本発明者らは、ＮＣＢＩ登録番号が、それぞれ、ＮＣ−００１５２６、ＮＣ−００１３５７、ＮＣ−００１５９０およびＮＣ−００１５９４であるいわゆる高リスクＨＰＶ型、１６、１８、４５、および５６の完全に配列決定されたゲノムを使用した。
【０１６２】
本発明者らは、ＮＣＢＩ登録番号が、それぞれ、ＮＣ−００１５２７、ＮＣ−００１５２８、ＮＣ−００１５２９、ＮＣ−００１５３５、ＮＣ−００１５３３、ＮＣ−００１５９２、ＮＣ−００１４４３およびＮＣ−００１６９５であるいわゆる中リスクＨＰＶ型３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８および６６の完全に配列決定されたゲノムを使用した。
【０１６３】
本発明者らは、ＮＣＢＩ登録番号が、それぞれ、ＮＣ−０００９０４、ＮＣ−００１５２５、ＮＣ−００１５８５、ＮＣ−００１５３４、ＮＣ−００５３４９、ＮＣ−００１６８９、ＮＣ−００１５９３、ＮＣ−００１６７６およびＮＣ−００１６９２であるいわゆる低リスクＨＰＶ型６、１１、３０、４２、４３、４４、５３、５４および５５の完全に配列決定されたゲノムを使用した。
【０１６４】
本発明者らは明らかにしたように、従来のＤＮＡ試験によるさまざまな臨床試料におけるヒトパピローマウイルスＤＮＡの検出は、多くの技術上、方法論上、および臨床上の問題によって阻まれている。本発明は、ＨＰＶ  ＤＮＡの亜硫酸水素変換がＨＰＶ誘導体配列プールの複雑性を削減するため、従来技術で遭遇する困難の多くの解決策を提供する。この複雑性の削減は、試料内の異なるＨＰＶ型のより効率的な初期スクリーニングを可能にし、したがって、臨床データとのより適切かつ正確な適合を可能にする。
【０１６５】
図１〜４は、最初のＨＰＶゲノムが何であったか、ただし現在ではその変換誘導体の部分の検出のためのプライマーおよびプローブの最適なデザインを可能にするコンピュータ内の基礎を示す。図５〜１０は、１６例の異なる患者からの臨床試料を使用する多重ＰＣＲ反応における「普遍的」プライマーまたはプライマーの組合せを使用する異なるＨＰＶ型の、異なる発癌リスク型の異なる領域から生成されたＰＣＲ増幅核酸産物を示す。図１１はこれらの結果の一覧である。図１２は、ＰＣＲ反応の結果でのプライマー縮退の結果および現在の発明の利点を示す。図１３および１４は、ＨＰＶ１６のトップおよびボトム鎖び正常、誘導、およびゲノム的に簡易化した配列を示す。図１５および１６は、好ましいプライマーがＨＰＶ配列のトップおよびボトム鎖で確認されることになる「ヘリコプター」図を示す。図１７は、正常間質細胞で囲まれた子宮頸部の癌性細胞を示す臨床試料の部分を示す。図１８および１９は、タイピング臨床試料の２つの段階を示し、前者の図は高中リスクＨＰＶが液状化細胞診試料に存在することを示し、後者は同じ試料における正確なウイルス型を示す。図２０は、液状化試料ではなく、アーカイブパラフィン切片からの高中リスクＨＰＶ型（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８）の識別の結果を示す。図２１は、ＨＰＶタイピングが、ゲノム的に簡易化したトップ鎖にされるプライマーを使用するだけではなく、ゲノム的に簡易化したボトム鎖にされるプライマーを使用することに行われうることを示す。さらに、本発明は表１〜４においても開示されるが、ここではプライマーの配列、予想単位複製配列サイズの一部の例、および何百もの臨床試料におけるＨＰＶタイピングの結果が、同じ試料に適用される現在のＦＤＡ承認ハイブリッドキャプチャー２方法と比較される。
【０１６６】
図２３〜４６は、高リスクＨＰＶ１８、４５、または５６、および中リスクＨＰＶ３１、３３、３５、３９、５１、５２、５８、５９、および６８のトップおよびボトム鎖の天然（Ａ）、誘導（Ｂ）、および簡易化（Ｃ）ＨＰＶ核酸配列を示す。発明はＢおよびＣ配列に関する。
【０１６７】
図１は、亜硫酸水素処理を使用する複雑性削減前後の個々のウイルス型ＨＰＶ３３、３５、３９、５２、５８、１６、１８、４５および５６の同じ８塩基対ゲノム領域の多重ＤＮＡアラインメントを示す。検討中の領域は、位置６６００−６６０７でのＬ１遺伝子内である（ＨＰＶ１６の標準座標を使用して固定）。異なるＨＰＶ型は、これらの位置で（太字）ＣまたはＴのいずれかを有する位置６５９０、６５９３、および６９５６でそのヌクレオチド配列が異なる。しかし、ＨＰＶ  ＤＮＡの化学変換後、これらＨＰＶ型のすべてはここで「トップ」鎖位置６５９０と６５９７との間で同一のＤＮＡ配列を有し（すなわちＴＴＡＴＡＡＴＡ）配列番号５１８）、したがって、単一のプライマーまたはプローブが合成されうり（隣接する適切なプライマーとともに）、この領域をプライマー対から増幅する。特異のプライマーを縮退する代わりに使用する能力は、正確性の増大および特異的増幅産物の生成へのカギであり、ウイルス型が臨床における診断目的およびその後の治療方式のために使用される場合に主として重要な問題である。第２の隣接する配列の使用は、１セットの非縮退プライマーを使用して、本図に示されたすべてのウイルス型（すなわち、ＨＰＶ型３３、３５、３９、５２、５８、１６、１８、４５および５６）の増幅を可能にする。
【０１６８】
強調すべきは、ＨＰＶ  ＰＣＲ分野における従来技術の主な欠点が、必然的に、塩基が異なるウイルス型間で異なる位置での塩基の混合物を含有する縮退プライマーの使用を回避することが不可能であったことである。したがって、非亜硫酸水素処理試料の配列を増幅するために、図１におけるＰＣＲプライマーは配列ＹＣＡＹＡＡＹＡ（配列番号７０１）（ここでその位置でＹ＝ＣまたはＴ）でなければならない。対照的に、亜硫酸水素処理ＨＰＶ誘導体により、プライマーＴＴＡＴＡＡＴＡ  （配列番号５１８）はすべてのウイルス型で同一のマッチとなる。縮退プライマー法の主な問題は、従来の４塩基ゲノムにおいて、プライマーはきわめて迅速に縮退し、非標的ＤＮＡ配列への非特異的ハイブリダイゼーションにより、それらは増幅産物を産生せず、または多重産物もしくはスメアを産生しないことである。
【０１６９】
図２は、個々のＨＰＶ型６、１１、４３、４４、５３、５５、３０、３１、３９、５１、５２、１６、１８および４５の１７塩基対ゲノム領域のＤＮＡアラインメント、およびＤＮＡ試料の亜硫酸水素処理後の複雑性削減を示す。この領域もＬ１遺伝子であるが、位置６５８１−６５９７にある。異なるＨＰＶ型は位置６５８１、６５８４、６５９０、６５９３および６５９６でそのヌクレオチド配列が変動する（ＨＰＶ１６の位置の番号によって規定）。亜硫酸水素処理前のコンセンサスプライマーはＮＧＣＮＣＡＧＧＧＨＣＡＨＡＡＹＡ（配列番号７０２）である（ここでは標準表記法において、Ｎ＝Ｇ、Ａ、ＴまたはＣ、およびＨ＝Ａ、Ｔ、またはＣ、およびＤ＝Ｇ、Ａ、またはＴ、およびＹ＝ＡまたはＣ）。亜硫酸水素処理後のコンセンサスプライマーはＤＧＴＤＴＡＧＧＧＹＴＡＴＡＡＴＡ（配列番号７０３）である。図に示すように、プライマーは、非変換ゲノム配列に基づくプライマーよりもはるかに縮退していない亜硫酸水素処理誘導体に由来する。非変換コンセンサスプライマーの場合、計２８８のプライマーの組合せがあるが、変動誘導体においては、１８のみのプライマーの組合せが必要とされる。また、非変換配列からのプライマーは各々の部位で４個までの塩基縮退を有するが、変換誘導体はいずれの部位でも最大３個までの塩基縮退しか有さない。
【０１７０】
従来のＰＣＲプライマーは一般に相補的鎖および増幅される領域のいずれかの末端で長さが２０〜３０個のヌクレオチドである。これより少ないプライマーは一般に、特に、ＰＣＲ増幅を問題のあるものにする、プライマーが縮退している場合には低い融解温度を有する。本明細書に記載した亜硫酸水素削減法を使用することにより、従来の縮退プライマーセットの場合のようにＰＣＲプライマーにおけるかかる多数のミスマッチ塩基を含む必要なしに確実な増幅を保証する個々のＨＰＶ型間のほぼ１００％の配列類似性の領域を位置づけることが可能である。
【０１７１】
図３は、位置６２２５〜６２４３のＨＰＶ型（ＨＰＶ６、４３、４４、５４、５５、３０、３３、５８、１８および４５）のＬ１領域における「トップ」鎖での２０塩基対領域のＤＮＡアラインメントを示す。この領域は、亜硫酸水素処理前に７５％の配列類似性を示し、亜硫酸水素処理後に９０％超の配列類似性を示す。ＧＡＴＧＧＹＧＡＹＡＴＧＧＴＤＧＡＹＡＹ（配列番号７０４）のコンセンサスプライマーは４８の可能なプライマーの組合せを有するが、複雑性削減後にＨＧＳ複雑性削減コンセンサスプライマー、ＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴＤＧＡＴＡＴ（配列番号７０５）は、３つのプライマーの組合せのみ必要とする。さらなる改善が、ハイブリダイゼーション反応におけるプライマーおよびプローブとしての挿入核酸の使用によって実行されうる。これらの改善は図４に示されている。
【０１７２】
図４は、位置６２２５〜６２４３の図３におけるように個々のＨＰＶ型（６、４３、４４、５４、５５、３０、３３、５８、１８および４５）の同じ２０塩基対領域のＤＮＡアラインメント、および標準オリゴヌクレオチドよりもハイブリダイゼーション反応においてより有効に使用されうる高アフィニティーＩＮＡプライマーおよびプローブの配列を示す。ＩＮＡプライマーは標準オリゴヌクレオチドよりも長さがはるかに短くありうるため、上記の２０塩基配列の最初の１４塩基はＩＮＡ形態で構成されうる。亜硫酸水素処理前に、適切に配置されたＩＰＮを有する１４塩基ＩＮＡは１４塩基にわたって８５％の配列類似性を有するが、これは亜硫酸水素処理後に同じ１４塩基対領域にわたって１００％の配列類似性を生じる数字である。ＨＧＳ複雑性削減プライマーまたはプローブ（ＧＡＴＧＧＴＧＡＴＡＴＧＧＴ）（配列番号７０６）は、いかなる縮退も有さない。
【０１７３】
標準のオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブに対するＩＮＡの重要な利点は、第一に、ＩＮＡが、相補的ＤＮＡに対してＩＮＡのきわめて高いアフィニティーにより従来のオリゴヌクレオチドよりはるかに短く製造されうることである。実際に、１２−１４塩基ほどのＩＮＡがＰＣＲ増幅反応において確実なシグナルを生成しうることが証明されている。さらに、プライマー長さの削減により第１回の増幅における特異性の喪失が第２回において克服される。第二に、ＩＮＡは相補的ＤＮＡに対してきわめて高いアフィニティーを有し、内部に配置された挿入偽ヌクレオチド（ＩＰＮ）では１０度まで、かつ末端位置ＩＰＮでは１１度までの安定性を有する。また、ＩＰＮは、ＡＴが豊富な環境においてＤＮＡを最大限に安定化させ、これにより亜硫酸水素処理ＤＮＡに適用される場合にそれらが特に有利になる。ＩＰＮは一般的に隆起として、またはＩＮＡ分子における末端挿入として配置される。したがって、亜硫酸水素変換方法とＩＮＡを結合することによって、プライマーのサイズを削減することが可能である。これは個々のＨＰＶ型の誘導体に対するＰＣＲ増幅プライマーの完全なマッチの生成を可能にし、したがって、図４に示されている確実な増幅を保証する。
【０１７４】
本発明者らは、異なるＨＰＶ型のＬ１領域における「普遍的」プライマーの使用で開始する段階的例における一般の分子検出方法を示す。説明は「トップ」鎖についてのみである。しかし、当然ことながら、同様の例がボトム鎖を使用して得ることができる。
【０１７５】
いずれの型のいずれのＨＰＶ  ＤＮＡが臨床試料で検出可能であるか
図５は、女性患者１６例からの液状化細胞診（ＬＢＣ）標本から抽出された亜硫酸水素処理ＨＰＶ  ＤＮＡのＬ１領域に対するＨＧＳ複雑性削減プライマーを使用するゲル電気泳動後に視覚化されたＰＣＲ増幅産物を示す。ＤＮＡ増幅産物は、すべての患者からの同じサイズのものであり、これが調査中の領域からの正確な増幅核酸産物であることを検証するために配列決定されている。図５〜１２におけるデータの生成で使用されるすべてのプライマーの長さは表２に示されており、図５の「普遍的」複雑性削減プライマーの配列も表１に示されている。
【表２２】
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【０１７６】
図５のデータは、患者１６例中１１例（患者＃１、＃２、＃３、＃４、＃６、＃９、＃１１、＃１３、＃１４、＃１５、および＃１６）からのＬＢＣ試料がＨＰＶウイルス誘導体の一部に対して陽性であったことを示した。こおれらの患者試料がＨＰＶ陽性であると考えると、どのような異なる型のウイルスゲノムがこれらの誘導体を示すのか。
【０１７７】
ＨＰＶ型の高リスクカテゴリーの存在、または非存在の判定―陽性患者試料に存在する高リスクＨＰＶ型はあるか。
【０１７８】
図６は、プライマーが高リスクＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ４５、およびＨＰＶ５６ゲノムで製造された混合であるＥ７領域のＨＧＳ複雑性削減プライマーを使用する多重ＰＣＲ増幅を示す。これらのプライマーでは、これら４つの高リスク型からの配列が存在するかどうか報告されるが、それがどの特異的型であるかについては報告されない。データは、陽性増幅が患者＃３、＃４、＃６、＃９、＃１１、＃１３、＃１４および＃１６の試料において確認されることを示す。したがって、これら８例の患者は少なくとも１つの高リスクＨＰＶ型を有する。アッセイは多重のものであるため、各々高リスクＨＰＶ型に対して特異的なプライマーによるＰＣＲ増幅が次のステップである。注目すべきは、陰性の症例がＰＣＲ反応に対して優れた対照を提供することである。患者＃５、＃７、＃８、＃１０および＃１２からの試料は、増幅産物をもたらさず（それらは初期のスクリーニングでウイルスを示さなかったため）、かつ実際にその通りである。
【０１７９】
４つの高リスクＨＰＶ型のうちどれを患者は有するか。
【０１８０】
本発明者らは最初に、Ｅ７領域に対するＨＧＳ複雑性削減ＰＣＲプライマーおよびゲル電気泳動による分析を使用する高リスクＨＰＶ１６型の存在について試験した。患者＃１１および＃１６からの試料のみが陽性であり、それらが高リスクＨＰＶ１６株の少なくとも一部を有することを示した（図７）。
【０１８１】
同様に、本発明者らは、Ｅ７領域に対するＨＧＳ複雑性削減ＰＣＲプライマーおよびゲル電気泳動による分析を使用する高リスクＨＰＶ１８型の存在について試験した。患者＃３、＃６、＃９、＃１１、＃１３および＃１６からの試料が陽性であり、それらが高リスクＨＰＶ１８株の少なくとも一部を有することを示した（図８）。したがって、患者＃１１および＃１６からの試料はＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のゲノム部分を有し、それらが少なくとも２つの高リスクＨＰＶ型に感染していることを示した。
【０１８２】
この方法は、これら高リスクＨＰＶ型のゲノム領域のすべてが試料中に存在するか（全ウイルスが完全長のエピソームとして複製していた場合、またはそれは宿主ゲノムへ完全に組込まれていた場合には実際にそうであるように）、または欠失を受けたウイルスゲノムを有し、欠失エンティティとして複製しているか、またはウイルスの一部のみがヒト染色体へ組込まれているかを判定するために適合されうる。
【０１８３】
Ｅ７以外の高リスクＨＰＶ型の追加の領域がさまざまな患者試料に存在するかどうか判定するために、ＨＰＶ１６のＥ４、Ｅ６、およびＥ７領域に対するＨＧＳ複雑性削減プライマーを使用するＰＣＲ増幅を行い、ゲル電気泳動によって分析した（図９、上、中、および下パネル）。患者＃１１および＃１６は試験された３つの領域すべて、すなわち、Ｅ４、Ｅ６、およびＥ７を有したが、患者＃４はＥ６のみを有した。患者＃１１および＃１６からの試料は最初にＬ１に対して陽性であったため、これらの患者２例はＬ１、Ｅ４、Ｅ６、およびＥ７を有したが、患者＃４はＬ１およびＥ４領域のみを有したことが明らかである。
【０１８４】
同様に、本発明者らは、ゲノム領域Ｅ４、Ｅ６、およびＥ７が高リスクＨＰＶ１８型において存在したかどうか判定した。図１０は、患者＃１１および＃１６がＨＰＶ１８について３つの領域すべてを有し、患者＃３および＃９はＥ６およびＥ７を有したが、Ｅ４は有さず、患者＃６および＃１３は断片Ｅ７のみを有したことを示す。これらの患者からの試料は最初にＬ１に対して陽性であったため、患者＃１１および＃１６はＬ１、Ｅ４、Ｅ６、およびＥ７領域を有し、患者＃３、＃９、および＃１１はＬ１、Ｅ６、およびＥ７領域を有し、かつ患者＃６および＃１３はＬ１およびＥ７のみを有したことが考えられる。
【０１８５】
したがって、患者＃１１および＃１６は２つの高リスクＨＰＶ型、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に感染しており、同患者らは試験された４つのゲノム断片すべてを有した。
【０１８６】
追加の患者を使用する別の分析では、データ生成の流れおよび一貫性が示された。患者２０例のデータ（＃Ａ〜＃Ｔで表示）が図１１に示されているが、ここでウイルスリスク型、ゲノム断片型、および検出の一貫性のばらつきが明らかである。
【０１８７】
最初に、患者＃Ｂ、＃Ｃ、＃Ｄ、＃Ｅ、＃Ｆ、＃Ｇ、＃Ｈ、＃Ｉ、＃Ｋ、＃Ｎおよび＃Ｒは、初期の「普遍的」複雑性削減プライマーに基づくＰＣＲ産物に対して陰性であり［陰性（ｎｅｇ）］で表示、かつ予想通り、高、中、および低リスクプライマーを使用する別の２８のすべてのＰＣＲアッセイに対してその後に陰性であった。
【０１８８】
患者＃ＡはＨＰＶに対して陽性であった、列１の［陽性（ｐｏｓ）］で表示、が、試料は２８の異なるＰＣＲ増幅の各々に対して試験されたＨＰＶ高、中、または低リスク型のいずれも含有しなかった。この患者は、８０のうちの１つ、または２１の異なるＨＰＶ型の本発明者らの試験パネルに含まれないＨＰＶリスク型を有する可能性は低かった。
【０１８９】
患者＃Ｊ、＃Ｑ、および＃Ｔは、高および中リスクＨＰＶに対して陽性であり、その後に高および中リスクＨＰＶ型からのゲノム断片のみを有することがわかった。したがって、患者＃７は高リスクＨＰＶ１６のＥ７断片、および中リスクＨＰＶ３１、３３、および３５型からの断片を有した。
【０１９０】
患者＃Ｌおよび＃Ｍは最初に中リスクＨＰＶに対してのみ陽性であり、その後のアッセイでは中リスクＨＰＶ３３型のみ示す。
【０１９１】
患者＃Ｏは最初に中および低リスクＨＰＶ型に対してのみ陽性であり、その後に中リスクＨＰＶ３９および低リスクＨＰＶ４２および５３型からの配列のみ有することがわかった。
【０１９２】
患者＃Ｐおよび＃Ｓは最初に３つのリスクカテゴリーすべてに対して陽性であり、その後により詳細に分析すると３つのリスクカテゴリー型すべてを示した。
【０１９３】
当然のことながら、上記の例は可能な試験範囲の一部の例示にすぎない。例えば、普遍的Ｌ１断片の代わりに、いずれかのＨＰＶ型についてのアッセイから始めるために、本発明者らは、ＨＰＶ誘導体の全体をカバーする多重複雑性削減プライマーセットを利用した。このようにして、初期ＰＣＲ増幅が陰性であった場合のあいまいさがなくなるであろう。
【０１９４】
また、配列増幅に関して従来技術を悩ます主要な問題の１つが、プライマー縮退問題の分析で示されている（図１２）。ＰＣＲアルファは高および中リスク型の患者＃２１−４２からの試料でのＰＣＲであるが、ＰＣＲベータは同じ試料での高、中、および低リスクに対するものである。図１２は、ＰＣＲ増幅効率に対するプライマー縮退の増大の効果を示す。図に示すように、ＰＣＲ反応ベータにおけるプライマー＃１の縮退の増大は、結果として、ＰＣＲによる任意の配列の増幅を完全に失敗させることになる。プライマー集団はここで縮退し、スメアのみが生じる。これは、ここでプライマーの、誘導体における多数の特異的でないおとり位置への結合および拡大の結果である。
【０１９５】
プライマーのＨＰＶ配列変換および特性の詳細
ＨＰＶ配列の段階的な変換および適切なプライマーの生成の結果が図１３および１４に示されている。各々のＨＰＶ型は、トップおよびボトムで表示した２つの相補的鎖を有し、各々は別々に示される。
【０１９６】
図１３は、その３つの可能な配列、正常ウイルス配列、シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列、およびウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列におけるＨＰＶ１６ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す。４つの通常の塩基をすべて含有する正常配列は、５’ＡＣＴＡＣＡＡＴＡＡＴＴＣＡＴＧ（配列番号７０６）として開始する。シトシンがウラシルに変換されて誘導鎖を形成すると、配列は依然として４つの塩基を含有するが、１つはここでウラシルであり、これは５’ＡＵＴＡＵＡＡＴＡＡＴＴＵＡＴＧ（配列番号７０７）となる。増幅が行われ、ウラシルがチミンによって置換されると、配列は５’ＡＴＴＡＴＡＡＴＡＡＴＴＴＡＴＧ（配列番号７０８）となり、これは３つの塩基Ａ、Ｔ、およびＧのみを含有するためゲノム的に簡易化したと呼ばれる。この誘導分子の形成後の簡易化は４〜３と呼ばれる。当然のことながら、ウイルス配列のいずれかの部分がシトシンでメチル化されると、その特定の修飾塩基は、その位置で、ウラシルに変換されない。
【０１９７】
図１４は、その３つの可能な配列、正常ウイルス配列、シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列、およびウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列におけるＨＰＶ１６ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す。ボトム鎖は、５’ＴＧＡＴＧＴＴＡＴＴＡＡＧＴＡＣ（配列番号７０９）で開始し、５’ＴＧＡＴＧＴＴＡＴＴＡＡＧＴＡＵ（配列番号７１０）で開始する誘導体となり、最後に５’ＴＧＡＴＧＴＴＡＴＴＡＡＧＴＡＴ（配列番号７１１）等で開始するゲノム的に簡易化した配列となる。
【０１９８】
トップおよびボトム鎖は最初に相補的ではなかったが、ここでは当然のことながら、そのゲノム的に簡易化した形態において、それらはまったく異なり、かつ非相補的である。したがって、これら２つの鎖の領域の増幅において使用されるプライマーは、２つのゲノム的に簡易化したランドスケープの異なる領域で生じる。これらは異なるトップおよびボトム鎖の「ヘリコプター」図に示されている。
【０１９９】
図１５は、増幅目的に使用されたさまざまなネスト化プライマーの位置を示す長方形をによりヌクレオチド位置＃１からヌクレオチド位置＃７９０４までのＨＰＶ１６のトップ鎖のゲノムランドスケープを示す概略図である。高および中リスク（ＨＭで表示）および高、中、および低リスク（ＨＭＬで表示）、高（Ｈで表示）、および高および中（ＨＭで表示）などＨＰＶ型の組合せからのＤＮＡを増幅するために有用であるプライマーの位置は示されている通りである。例えば、トップ鎖の一部の領域は、他の領域より増幅目的により有用であることがわかっている。当然のことながら、ＨＰＶのゲノムを簡易化する本発明を使用することのより、目的および使用の他の領域が識別されうる。
【０２００】
図１６は、増幅目的に使用されたさまざまなネスト化プライマーの位置を示す長方形をによりヌクレオチド位置＃１からヌクレオチド位置＃７９０４までのＨＰＶ１６のボトム鎖のゲノムランドスケープを示す概略図である。ＨＰＶ型の組合せからのＤＮＡを増幅するために有用であるプライマーの位置は示されている通りである。増幅目的に有用であるボトム鎖の領域は、トップ鎖のものと異なる。例えば、ボトム鎖の一部の領域は、他の領域より増幅目的により有用であることがわかっている。当然のことながら、ＨＰＶのゲノムを簡易化する本発明を使用することのより、目的および使用の他の領域が識別されうる。
【０２０１】
臨床試料およびハイブリッドキャプチャー２を使用するＦＤＡ承認診断法対ＨＧＳ「誘導体」および「ゲノム的に簡易化した」増幅技術の比較
現在、さまざまなＨＰＶ型の存在の唯一ＦＤＡ承認の診断試験は、既述の通り、１３のＨＰＶ型を利用する。本発明者らは、本発明によるゲノム的に簡易化した方法が市販の方法のものよりも優れていることを見出した。図１７〜２１、表１〜４、および最後に本発明者らの高スループット高リスクＨＰＶ  ＤＮＡ検出およびタイピングキットの説明により、さらに本発明が開示される。
【０２０２】
以下では、臨床試料の多くが細胞学的に検査されており、したがって、細胞学的データを分子データと相関させ、競合技術の感度および特異性を判定することができる。
【０２０３】
まず細胞学的に、図１７は、子宮頸部癌を有する患者からの組織切片を示す。矢印１は、大きな核とともに癌性細胞の暗い部分を示す。矢印２は、正常結合組織を示す。細胞学的記述は、異常が細胞学的に可視的でない場合は正常とされ、低度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ、ＣＩＮ１）、高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）、ＣＩＮ２、ＣＩＮ３（子宮頸部上皮内癌Ｉ）が、一部の病理学者による以前の古典的な記述において記載され、またはＡＳＣ−ＵＳ（重度が不明の非定型扁平上皮細胞）として記載されている。
【０２０４】
図１８および１９は、高レベルＨＰＶ型の存在がいかなる型であるか、すなわち、臨床試料に存在する１３のＨＰＶ型のいずれかの１つであるか、またその場合には（試料がゲルでの単位複製配列の視覚化によって陽性であるかどうかによて示される）、どの特異的ＨＰＶ型が実際に存在したかを掘り下げ、かつ尋ねる。これらのステップは、患者１２例で行われ、そのうちすべてが細胞学的に検査され、かつその一部はその病状のために外科的処置を受けていた。
【０２０５】
図１８は、細胞学的分析が完了していた患者１２例の試料（＃１〜１２で表示）からの液状化細胞診（ＬＢＣ）から抽出した亜硫酸水素処理ＨＰＶ  ＤＮＡのＥ７領域の「トップ」鎖についての１３のＨＰＶ型、すなわち、ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８の検出のための高中リスクＨＧ３複雑性削減プライマーを使用するＰＣＲ増幅の結果を示す。陽性結果は患者＃２、４、７、および１１から確認され、そのうち３例は細胞学的に判定される通り高度の病変を有すると考えられた。正常細胞診を有した残りの患者、すなわち、患者＃１、３、５、８、１０、１２のうちいずれも高中リスクＨＰＶを示さず、ＨＳＩＬの治療を受けていた患者２例、＃６および９も示さなかった。
【０２０６】
高中ＨＰＶ型に対して検査で陽性であった患者４例にどのＨＰＶ型が存在したかを判定するために、さらにゲノタイピングを行った。
【０２０７】
図１９は、図１８における高中リスクＨＰＶに対して陽性であった患者からの臨床試料＃２、＃４、＃７、および＃１１からの材料を使用するＰＣＲ増幅、およびＨＰＶ型（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８）のどれが図１８において可視的である単位複製配列の各々の原因であったかの正確な測定の結果を示す。示されている４つのゲルにおける単位複製配列の視覚化によって示されるように、患者＃２はＨＰＶ３１を有し、患者＃４および＃７はＨＰＶ１６を有していたが、患者＃１１はＨＰＶ１８およびＨＰＶ３５を有した。
【０２０８】
液状化細胞診試料採取はＨＰＶ試験における標準となっているが、多くの試験は依然として、泌尿生殖器部から採取され、固定され、切片化され、一般に、アーカイブされているスライド上で利用可能な試料で行われる。いかに十分にＨＧＳゲノム的に簡易化した方法がかかるアーカイブ材料で行われるかを判定するために、高度扁平上皮内病変を有する患者から得られた試料で増幅を行った。
【０２０９】
図２０は、ＨＰＶのゲノム的に簡易化したトップ鎖にされる高中リスクプライマーセット（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８）を使用する高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）を有する患者１６例からの材料のアーカイブパラフィン切片からのＰＣＲ増幅の結果を示す。患者１６例中１５例（９４％）がこの方法によって陽性であったが、これはＨＳＩＬにおけるＨＰＶの存在に関する文献と一致する。
【０２１０】
最後に、本明細書に記載された結果の大部分ではプライマー製造のためにＨＰＶのトップ鎖が利用されたため、ボトム鎖もＨＰＶ検出システムにおいて公平な利用であることを明らかにすることが必要であった。これは図２１に示されている。
【０２１１】
ボトム鎖ＨＰＶ  ＤＮＡ配列の検出に使用されるプライマーは、高中リスク型セット（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８）および低リスク型（ＨＰＶ６、１１、４２、４３、４４、５３、５４および５５）の検出のためにデザインされており、結果として、より普遍的なやり方で肛門性器部ＨＰＶ型を捕捉するプライマーセットをもたらした。したがって、これらのプライマーでは試料Ａ３およびＡ４におけるＨＰＶの存在が検出されたが、トップ鎖高中プライマーでは検出されなかった。これは高中リスクカテゴリーに分類して検討されないＨＰＶ型の存在を示す。
【０２１２】
図２１Ａは、亜硫酸水素変換のボトム鎖、ゲノム的に簡易化したＤＮＡにされるプライマーを使用する液状化細胞診試料からのＰＣＲ増幅の結果を示す。プライマーは、１３のＨＰＶ型（高中リスクＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８および低−リスクＨＰＶ６、１１、４２、４３、４４、５３、５４および５５）を標的した。単位複製配列は試験した試料６０例中４０例（６７％）で確認され、肛門性器部ＨＰＶ感染の存在を示した。
【０２１３】
図２１Ｂは、亜硫酸水素変換のトップ鎖、ゲノム的に簡易化したＤＮＡにされるプライマーを使用する液状化細胞診試料からのＰＣＲ増幅の結果を示す。プライマーは、１３のＨＰＶ型（高中リスクＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８）を標的した。単位複製配列は試験した試料６０例中２８例（４７％）で可視的であり、高中型ＨＰＶ感染の存在を示した。
【０２１４】
同じ試料でのＨＰＶに対するハイブリッドキャプチャー２試験対ＨＧＳ試験
本発明の使用の結果は、競合的方法によって試験された何百もの臨床試料を示すだけではなく、試験のために使用された材料の細胞学的説明も有する表３および４においてさらに詳細に示されている。
【０２１５】
表３Ａ、Ｂ、Ｃ。最初にハイブリッドキャプチャー２のダイジーン法を使用して試験され、次いでさまざまなＨＰＶ型の存在に対するＨＧＳ増幅法を使用して試験された液状化細胞診試料の３つの異なるセット。
【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【０２１６】
表３は、３部、Ａ、Ｂ、およびＣを有し、これらは分析で使用された廃棄材料の異なる供給源を示す。最初にハイブリッドキャプチャー２のダイジーン法を使用して試験され、次いでさまざまなＨＰＶ型の存在に対するＨＧＳ増幅法を使用して試験されていた液状化細胞診試料の３つの異なるセット。
【０２１７】
表３Ａではオーストラリアで試験された患者からの廃棄材料が使用された。列１はＨＧＳ識別番号を示し、列２はゲノムＤＮＡが試料中に存在したどうか判定された対照であり、列３では試料が高中リスクＨＰＶ型（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８）に対して陽性であったかどうか記載され、列４は確認された高中リスクＨＰＶの型の状態を提供し、列５はハイブリッドキャプチャー２試験を使用して得られた結果を示し、列６はハイブリッドキャプチャー２試験の特徴である相対蛍光単位を提供するが、ここで相対蛍光単位は内部標準と比較され、陽性または陰性シグナルのカットオフを判定し、かつ列７は（可能な場合には）試料の細胞学的特性を示す。最後の＊３７はＬＢＣではなく、スワブ試料を示す。
【０２１８】
２つの方法間の比較は驚くべきである。陰性であると考えられた多くのハイブリッドキャプチャー２試験は、実際には、ＨＧＳゲノム的に簡易化したＨＧＳ試験によって陽性であることが判明し、ＨＧＳ試験では存在するＨＰＶの型が識別された。したがって、ハイブリッドキャプチャー２試験では高比率の「偽陰性」が生じた。これらは、試験後に、ウイルスを保持していないと考えて、大丈夫だという誤った感覚で病院を去った個々の患者であり、実際には、ウイルス保有者である。また、細胞診では一部の患者について陰性でありうるが、ＨＧＳ試験では存在するＨＰＶが明らかにタイピングされている。
【０２１９】
さらに、蛍光に基づき陽性と考えられた多くのハイブリッドキャプチャー２試験は、実際には、ＨＧＳ試験によって陰性であることが判明した。ＨＧＳ試験はきわめて感度がよいため、ハイブリッドキャプチャー２試験によって陽性であることがわかった多くの患者は、実際には、ＨＧＳ試験によって「偽陽性」と判定された。ハイブリッドキャプチャー２試験によるこのカテゴリーの患者は、実際にウイルスが存在しない場合、潜在的に子宮頸部癌患者であるという不安を抱いて病院を去ることになる。
【０２２０】
表３Ｂでは、香港の患者からの廃棄液状化細胞診試料が利用された。各列は、ハイブリッドキャプチャー２試験が低リスクおよび高リスク型について行われたことを除き同様である。さらに、ＨＧＳゲノム的に簡易化した試験は、試料が２つのまったく異なる地理的位置および圧倒的に異なる民族グループからのものであるにせよ、２種類の試験間の多くの不一致を示した。
【０２２１】
表３Ｃも香港に基づく試料からの材料であり、再びＨＧＳ試験はハイブリッドキャプチャー２試験と高比率の症例で不一致である。列１および２は、識別番号（ＩＤ＃）およびヒトゲノムＤＮＡの存在に対する陽性対照を示し、列３は高中リスクＨＰＶ型の存在または非存在を示し、列４は高中Ｅ７遺伝子型を示し、列５は低リスクＥ７遺伝子型を示し、列６はＨＣ２高リスクコールおよび列７はその試料の対応する相対蛍光単位を示し、列８および９はＨＣ２低リスクコールおよびその試料の対応する相対蛍光単位を示し、列１０は標準記述子を使用する特定の試料の細胞診を示す。
【表３７】
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【表３８】
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【０２２２】
表４は、ＨＰＶのＥ７領域にされるプライマーがきわめて有用なプライマーセットであることを示す（ウイルスのＥ５、Ｅ６、およびＥ４領域にされるプライマーに優先して）。
【０２２３】
表４は、ＨＰＶウイルスのＥ７、Ｅ６、Ｅ５、およびＥ４領域に対するプライマーを使用するさまざまなＨＰＶ型の液状化細胞診臨床試料のゲノタイピングの結果を示す。ウイルスのＥ７、Ｅ６、Ｅ５、およびＥ４領域に対する異なるプライマーを使用する列１におけるＨＰＶ型の存在および単位複製配列の存在または非存在は列２−５に示されている。Ｅ７プライマーが存在する特定のＨＰＶ型を捕捉したが、多くの場合にＥ６、Ｅ５、およびＥ４はそうしないことは顕著である。したがって、Ｅ７は、使用するのに優れた領域である。この理由は、細胞に感染させた後、ＨＰＶがしばしばそのゲノムの一部を欠失し、Ｅ７はその他よりも高い確率で保持される領域であるためである。
【０２２４】
増幅ＤＮＡはＨＰＶから
ヒト子宮頸部の領域、または液状化細胞診試料からの臨床試料は、通常、広範囲に及びうる微生物フローラとともに、ヒト細胞の異種集団を含有する。かかる異種供給源からのＨＰＶ配列の増幅（すべての場合に本発明者らは試験した）により、ゲル上でのそれらの移動から推定される正確なサイズの単位複製配列が得られる。しかし、単位複製配列がＨＰＶから確かであり、思いがけなくもゲル上の可視バンドと同じ分子量を有する供給源からでは確かでない最良の指標は、所定のバンドをゲルから切除し、ＤＮＡをその内部にさらし、配列分析を方向づけることである。本発明者らはこの分析を行い、ＤＮＡ配列が確かにＨＰＶ１６のものに対応することを確認した。かかる分析の結果は図２２に示されている。
【０２２５】
高スループットＨＰＶアッセイ
本発明は、多くの試料がＨＰＶについて同時に試験される９６ウェルプレートを使用する高スループットの形で段階的に使用される。これは次の通り潜在的な市販キットの説明書によって示されている。
【表３９】
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【０２２６】
注：対照試料／プライマー１、２、３Ａ、および３Ｂは受領次第、−２０℃で保存すること。
【０２２７】
必要な材料および器具（供給されず）
・  真空マニホールドまたは遠心分離機のいずれかが次の通り必要である。すなわち、
ポンプ付きの９６ウェルプレート用の真空マニホールドを少なくとも
−１０ｉｎＨｇ（４．９ｐｓｉ）圧力にかける。（社内試験はＢｉｏｒａｄ  Ａｕｒｕｍマニホールドを使用して行ったが、他のマニホールドを使用に適合させることができる。）
または
高クリアランス９６ウェルフォーマットプレートと適合性のローター付きの遠心分離機。（社内試験はエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）５８１０を使用して行われた）。
【０２２８】
・  ９６ウェルフォーマット０．２ｍｌロープロフィールプレートに適合性の加熱リッドＰＣＲサーマルサイクラー
・  ３８４ウェルフォーマットに適合性の加熱リッドＰＣＲサーマルサイクラー
（ＨＰＶタイピング用）
・  ８０％イソプロパノール（分子生物学品質） 
・  水（分子生物学品質）
・  ＮａＯＨペレット（分析品質）
・  ２×ＰＣＲマスターミックス（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）カタログ番号Ｍ７５０５１０００ｒｘｎ）
・  Ｅ−ＧｅＩシステムマザーＥ−Ｂａｓｅ（商標）デバイス（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）ＥＢ−Ｍ０３）
・  Ｅ−ゲル９６高−スループット２％アガロース（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ番号Ｇ７００８−０２）
・  Ｅ−ゲル低レンジマーカー（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）カタログ番号１２３７３０３１）
・  試薬レザバー×５
標準実験室器具（供給されず）
・  多チャンネルピペット、最大１ｍｌ体積（２００μｌ−１０００μｌ）  
・  多チャンネルピペット、最大２００μＬ体積（２０μｌ−２００μｌ）
・  多チャンネルピペット、最大１０μｌ体積（１μｌ−１０μｌ）
・  糸くずの出ない組織
・  タイマー
・  エアロゾルバリアチップ（１０μｌ−１０００μｌ）
・  トランスイルミネーター
・  ゲルドキュメンテーションシステム
・  ジルソン（Ｇｌｉｓｏｎ）Ｐ１０００
・  ジルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）Ｐ２００
・  ジルソン（Ｇｉｌｓｏｎ）Ｐ２０
方法
ＨＰＶ高スループットＤＮＡ亜硫酸水素修飾キットを初めて使用する場合は、ユーザーガイドの詳細な方法を亜硫酸水素変換法を行う前に読むことがきわめて推奨される。
【０２２９】
ＨＰＶ高スループットＤＮＡ亜硫酸水素修飾キットの使用は、変換前のゲノムＤＮＡの前消化の必要を除去する。
【０２３０】
ＤＮＡ試料に添加される亜硫酸水素試薬の量を削減しないこと。社内試験により亜硫酸水素試薬の削減が反応に有害であることが証明された。
【０２３１】
本キットは、開始ＤＮＡ濃度を１ｎｇから４μｇまでのゲノムＤＮＡに最適化されている。
【０２３２】
試料調製
・  液状化試料（ＰｒｅｓｅｒｖＣｙｔ（登録商標））バイアルを手で強く振盪させ、沈降細胞を再懸濁し、確実に溶液を均質にする。
【０２３３】
・  再懸濁細胞４ｍｌを１５ｍｌコスター（Ｃｏｓｔａｒ）遠心分離管に移す。培地が４ｍｌ未満の場合は、すべての材料を１５ｍｌコスター（Ｃｏｓｔａｒ）遠心分離管に移し、体積を滅菌蒸留水で４ｍｌにする。最小体積１ｍｌの試料が正確な試験に必要である。
【０２３４】
・  スイングアウトバケットローターにおいて管を３０００×ｇ／１５分で遠心分離する。
【０２３５】
・  ペレット化細胞材料を阻害せずに上清を注意深く傾斜し、廃棄する。
【０２３６】
・  溶解緩衝液および混合ウェル２００μｌ中に溶液が均質になるまでペレット化細胞を再懸濁する。
【０２３７】
・  プロテイナーゼＫ  ２０μｌを添加し、インキュベーションプレートの各々のウェルにインキュベートする。 
・  試料８０μｌをインキュベーションプレート（プレート１）に移し、シーリングキャップで覆い、５５℃／１時間インキュベートする。
【０２３８】
プロトコール調製
・  試薬１の総量を試薬２の瓶に混ぜ、静かに回転させて混合する。注：いったん混合した試薬１および２は暗所の４℃下で１か月まで安定である。試薬１、２、３、および４は製造日から１年間、室温で安定である。
【０２３９】
・  新しいＮａＯＨ溶液を毎回作り（例えば、水８．３ｍｌ中ＮａＯＨ  １ｇ）、５μｌを変換プレート（プレート２）の各ウェルに添加する。
【０２４０】
・  対照試料１  ５μｌを水（分生生物学品質）１５μｌに添加し、被験試料と同時に処理する。
【０２４１】
・  細胞溶解物２０μｌを変換プレート（プレート２）に移し、静かに混合する。
【０２４２】
・  変換プレート（プレート２）を供給されたシーリングフィルムでシールし、オーブンにおいて３７℃／１５分インキュベートする。インキュベーション後、フィルムを除去する前にプレートを短く遠心分離し、フィルム上の凝縮物を沈殿させる。
【０２４３】
・  供給されたシーリングキャップでインキュベーションプレート（プレート１）をシールし、−２０℃で保存する。
【０２４４】
・  試薬３が固体沈殿物を形成していないことを確実にする。形成している場合、溶液を温め（８０℃以下）かつ混合する。
【０２４５】
遠心分離プロトコール
・  混合試薬１および試薬２  ２２０μｌを多チャンネルピペットを使用して変換プレート（プレート２）の各々のウェルに添加し、次いで静かにピペットで取ることによって混合し、供給された８個のストリップシーリングキャップでプレートをシールする。
【０２４６】
・  変換プレート（プレート２）をオーブンにおいて５５℃／３時間インキュベートする。
【０２４７】
亜硫酸水素処理は１時間ほどで実行されうるが、しかし、インキュベーション時間の削減は結果として単位複製配列内で局所非変換をもたらす。したがって、３時間未満のインキュベーション時間は推奨されない。
【０２４８】
・  インキュベーション後、試薬３（重要なプロトコール調製を参照）２４０μｌを変換プレート（プレート２）の各々のウェルに添加する。
【０２４９】
・  精製プレート（プレート３）を洗浄プレート（プレート４）の上部に配置する。
【０２５０】
・  変換プレート（プレート２）からの試料を精製プレート（プレート３）の対応するウェルに移し、供給されたシーリングフィルムで覆う。
【０２５１】
・  精製プレート（プレート３）／洗浄プレート（プレート４）の組合せを遠心分離機に配置し、１０００ｒｃｆ、室温／４−５分で回転させる。
【０２５２】
・  洗浄プレート（プレート４）からフロースルーを廃棄し、次いでこれを精製プレート（プレート３）下に交換する。８０％イソプロパノール（分子生物学品質）０．８ｍｌを精製プレート（プレート３）の各々のウェルに添加する。
【０２５３】
・  １，０００ｒｃｆで、室温／１分、遠心分離する。
【０２５４】
・  洗浄プレート（プレート４）を除去し、フロースルーを廃棄し、次いで交換し、室温で１，０００ｒｃｆ／２分、遠心分離する。
【０２５５】
・  精製プレート（プレート３）を溶出プレート（プレート５）の上部に配置し、精製プレート（プレート３）の先端が溶出プレート（プレート３）の適切なウェル内に確実に配置する。
【０２５６】
・  試薬４  ５０μｌを精製プレート（プレート３）の各々の試料ウェルに多チャンネルピペットを使用して添加し、ピペットの先端をこれに触れずに膜表面の近くに配置する。
【０２５７】
・  室温／１−２分インキュベートする。
【０２５８】
・  精製プレート（プレート３）／溶出プレート（プレート５）の組合せを１，０００ｒｄｆで室温／１分、遠心分離する。
【０２５９】
・  溶出プレート（プレート５）を除去し、供給されたシーリングキャップでシールする。
【０２６０】
・  加熱リッドＰＣＲ機械においてプレートを９５℃／３０分インキュベートする。
【０２６１】
ＤＮＡ試料はここで変換され、ＰＣＲ増幅の準備が整う。インキュベーション後、プレートを短く遠心分離し、シーリングキャップから凝縮物を除去する。
【０２６２】
内部対照ＰＣＲ反応
ゲノムＤＮＡおよび対照ＰＣＲプライマーが容易なトラブルシューティングを可能にするために供給されている。対照試料１（紫色）および２（緑色）がプロセス対照として供給されている。対照試料１は、８回の変換反応のために供給された十分な材料による未処理ＤＮＡである。対照試料２は、２０回のＰＣＲ増幅のために供給された十分な材料による亜硫酸処理ＤＮＡである。対照プライマー３Ａ（黄色）および３Ｂ（赤色）はＰＣＲプライマーであり、これを使用して回収ＤＮＡ（２０回のＰＣＲ増幅に十分供給）の完全性をチェックすることができる。
【０２６３】
「ネスト化」ＰＣＲプライマーは、ＨＰＶ高スループットＤＮＡ亜硫酸水素修飾キットで達成される検出の感度を改善するために使用される。対照プライマーは従来の亜硫酸水素ＰＣＲプライマーであり、２回のＰＣＲ増幅のために最適化されている。１回のＰＣＲのためのこれらＰＣＲプライマーの使用は、多くの場合、アガロースゲル電気泳動後に可視的な単位複製配列が確認されないため推奨されない。
【０２６４】
注：このプロトコールは、加熱リッドサーマルサイクラーの使用に基づく。加熱リッドサマーサイクラーは入手不可能であり、鉱油との反応をオーバーレイする。
【０２６５】
対照反応：
・  対照試料１（紫色）未処理ゲノムＤＮＡ（５０ｎｇ／μｌ）を含有
・  対照試料２（緑色）亜硫酸水素処理ヒトＤＮＡ（２０ｎｇ／μｌ）を含有
・  対照プライマー３Ａ（黄色）第１回のＰＣＲプライマーを含有
・  対照プライマー３Ｂ（赤色）第２回のＰＣＲプライマーを含有
対照ＰＣＲ
対照プライマー３Ａ（第１回のＰＣＲプライマー）および対照プライマー３Ｂ（第２回のＰＣＲプライマー）は、２０回までの対照ＰＣＲ反応に供給された十分な容積による有効な「ネスト化」プライマーである。これらのプライマー試料は、必要に応じてトラブルシュティングプロセスを促進するために供給されており、あなたの修飾ＤＮＡの品質を評価するために使用されうる。
【０２６６】
注：第２回のＰＣＲ反応は、第１回のＰＣＲ反応と同時に調製され、必要とされるまで凍結されうる。
【０２６７】
高リスクＰＣＲ増幅
第１回の増幅
・  各々の反応のために、ＰＣＲマスターミックス（例えば、プロメガ・マスター・ミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）１２．５μｌおよび水（分生生物学品質）９．５μｌを供給された高リスクＰＣＲプレートに添加する。９６試料を設定している場合は、マスターミックス１．２５ｍｌ、水８５０μｌ、およびプライマーミックス２００μｌを適切な管に混ぜ、ウェルを混合する。次いで、多チャンネルピペットを使用し、反応混合物２３μｌを供給された高リスクＨＰＶプレート（プレート６）の各々のウェルに添加する。
【０２６８】
・  対照プライマー３Ａ  ２μｌを適切なウェルに添加し、ウェルＨ１０およびＨ１１を制御する。
【０２６９】
・  溶出プレート（プレート５）から必要な修飾ＤＮＡ  ２μｌを供給された高リスクＨＰＶプレート（プレート６）に添加し、対照試料２  ２μｌをウェルＨ１１に添加し、次いで、残りをその後のＨＰＶタイピングのために−２０℃で保存する（次の高リスクプレートのレイアウトを参照）。
【０２７０】
・  次のＰＣＲプログラムを実行する。
【表４０】
2008524990.tif 000041
【０２７１】
第２回の増幅
・  第１の増幅ＤＮＡ  ２μｌを第１の増幅と厳密に同じく調製した第２回の混合物に添加する。
【０２７２】
・  次のＰＣＲプログラムを実行する。
【表４１】
2008524990.tif 000042
【０２７３】
電気泳動
・  ９６ウェル２％Ｅ−ゲルをフォイルラッパーから除去し、赤色９６ウェルコムを除去する。
【０２７４】
・  滅菌水１０μｌを多チャンネルピペットを使用してゲルの各々のウェルに添加する。
【０２７５】
・  ＤＮＡマーカー１０μｌをマーカーウェルに添加する。
【０２７６】
・  増幅産物１０μｌを多チャンネルピペットを使用してＥ−ゲルの各々のウェルに移す。
【０２７７】
・  Ｅ−ベースを５−７分間、圧力ｐｗｒ／ｐｒｇに設定する。
【０２７８】
・  ＵＶトランスイルミネーターおよびドキュメンテーションソフトウェアを使用して結果を記録する。
【０２７９】
ＨＰＶタイピング
第１回の増幅
高リスクタイピングプレート（プレート８）は、次の高リスクＨＰＶ型に対する株特異的プライマーを含有する。すなわち、１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８。すべての高リスク株に各々試料をタイピングするために溶出プレート（プレート５）中に十分なＤＮＡが残っている。
【０２８０】
・  −２０℃の冷凍庫から溶出プレート（プレート５）を除去する。
【０２８１】
・  高リスク普遍的増幅による任意の陽性試料をここで株特異的プライマーを使用してタイピングすることができる（以下のタイピングプレート設定を参照）。
【０２８２】
・  各々の反応のために、ＰＣＲマスターミックス（例えば、プロメガ・マスター・ミックス（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ））１２．５μｌおよび水８．５μｌを供給されたＰＣＲプレートの各々のウェルに添加する。タイピングする６個の試料がある場合は、マスターミックス１１８７．５μｌおよび水８０７．５μｌを適切な管へ添加し、ウェルを混合し、次いで、以下に指示されている通り、ＨＰＶタイピングプレート（プレート７）の各々のウェルに２１μｌを添加する。
【０２８３】
・  セットした適切なプライマー２μｌを、以下に指示されている通り、各々のウェルに添加する。
【０２８４】
・  タイピングが３８４ウェルフォーマットで行われ、２４個の試料がタイピングのために入手可能である場合は、マスターミックス４．５ｍｌおよび水３．４２ｍｌを適切な管に添加し、ウェルを混合し、次いで、以下に指示されている通り、３８４ウェルプレートの各々のウェルに２１μｌを添加する。次いで、セットした適切なプライマー２μｌを、以下に指示されている通り、各々のウェルに添加する。
【０２８５】
・  高リスク陽性試料（溶出プレート、プレート５からの）２μｌをタイピングプレートの適切なウェルに添加する。 
・  あなたの試料の各々および「テンプレートなし」（陰性）対照のために十分な管を設定する。
【０２８６】
・  次のＰＣＲプログラムを実行する。
【表４２】
2008524990.tif 000043
【０２８７】
第２回の増幅
・  第１の増幅ＤＮＡ  ２μｌを第１の増幅と厳密に同じく調製した第２回の混合物に添加する。
【０２８８】
・  次のＰＣＲプログラムを実行する。
【表４３】
2008524990.tif 000044
【０２８９】
電気泳動
・  ９６ウェル２％Ｅ−ゲルをフォイルラッパーから除去し、赤色９６ウェルコムを除去する。
【０２９０】
・  滅菌水１０μｌを多チャンネルピペットを使用してゲルの各々のウェルに添加する。
【０２９１】
・  ＤＮＡマーカー１０μｌをマーカーウェルに添加する。
【０２９２】
・  増幅産物１０μｌを多チャンネルピペットを使用してＥ−ゲルの各々のウェルに移す。
【０２９３】
・  Ｅ−ベースを５−７分間、圧力を実行する。
【０２９４】
・  ＵＶトランスイルミネーターおよびドキュメンテーションソフトウェアを使用して結果を記録する。
【０２９５】
・  試料はここでタイピングされている。
【表４４】
2008524990.tif 000045
【０２９６】
ゲノム的に簡易化したプライマーを使用して増幅した場合、供給源からの亜硫酸水素処理ＨＰＶ  ＤＮＡは、それらがオリゴヌクレオチド、またはＩＮＡなどの修飾核酸であれば、試料内の任意の型のＨＰＶを見出すための比類のない検出システムを提供するが、その試料はヒト臨床材料からのものであり、別の極端な場合には、環境由来である。本発明は、ヒト癌の原因と考えられている臨床上、関連性のあるウイルス（ＨＰＶ）のために開発されている。
【０２９７】
本発明による実用的意義は多様である。詳細に上記された原理は増幅のためのＰＣＲを使用して明らかにされているが、当業界で周知の方法によって読出しが保証されうる。現在、マイクロアレイ検出システムが重要視されていることにより、ゲノム的に簡易化したＤＮＡを使用して非常に多様性のあるＨＰＶを検出することができる。これは、亜硫酸水素処理はゲノムの複雑性を削減し、したがって、より多くのＨＰＶの型が、少ない数の検出器（機構）によるマイクロアレイでの試験が可能となるためである。
【０２９８】
要約すれば、ＨＧＳゲノム的に簡易化したプライマー法により、多くの患者の臨床表現型と相関されている一貫したデータセットが得られる。
【０２９９】
特定の実施形態において示されている通り、広範に記載された本発明の精神または範囲を逸脱せずに本発明には多くの変異型および／または変更が行われうることが当業者によって理解されるであろう。したがって、本実施形態は、すべての点で例示的であり、かつ限定的ではないとみなされる。
【図面の簡単な説明】
【０３００】
【図１】亜硫酸水素処理前の個々のウイルス型、ＨＰＶ３３、３５、３９、５２、５８、１６、１８、４５、および５６の同じ８つの塩基対ゲノム領域の「トップ」鎖のＤＮＡアラインメント、および亜硫酸水素変換後の誘導の対応する配列を示す図である。シトシンはウラシルに変換されており、かつウラシルはチミンとして表される。型間でばらつきがあるヌクレオチド位置が太字で示されている。（配列番号は各々配列後にリストアップされている）。
【図２】個々のウイルス型ＨＰＶ６、１１、４３、４４、５３、５５、３０、３１、３９、５１、５２、１６、１８および４５の１７の塩基対ゲノム領域の「トップ」鎖のＤＮＡアラインメント、および誘導体配列を生じさせるＤＮＡ試料の亜硫酸水素処理後の「複雑性削減」を示す図である。「トップ」および「ボトム」鎖の誘導のためのコンセンサスプライマーは亜硫酸水素処理後に異なり、１つの鎖のためのプライマーのみ示されている。シトシンはウラシルに変換されており、かつウラシルはチミンとして表される。ＨＰＶ型間でばらつきがあるヌクレオチド位置が太字で示されている。（配列番号は各々配列後にリストアップされている）。
【図３】個々のウイルス型（ＨＰＶ６、４３、４４、５４、５５、３０、３３、５８、１８および４５）の２０の塩基対領域の「トップ」鎖のＤＮＡアラインメントおよびＨＧＳ複雑性削減法を使用する誘導体配列における９０％を上回る配列類似性の領域の識別を示す図である。「トップ」および「ボトム」鎖の誘導のためのコンセンサスプライマーは亜硫酸水素処理後に異なり、１つの鎖のためのプライマーのみ示されている。シトシンはウラシルに変換されており、かつウラシルはチミンとして表される。ＨＰＶ型間でばらつきがあるヌクレオチド位置が太字で示されている。（配列番号は各々配列後にリストアップされている）。
【図４】個々のウイルス型（ＨＰＶ６、４３、４４、５４、５５、３０、３３、５８、１８および４５）の２０の塩基対領域の「トップ」鎖のＤＮＡアラインメントおよび標準オリゴヌクレオチドよりもハイブリダイゼーション反応においてより有効に使用されうる短い高アフィニティーＩＮＡプライマーまたはプローブの配列を示す図である。「トップ」および「ボトム」鎖の誘導のためのコンセンサスプライマーは亜硫酸水素処理後に異なり、１つの鎖のためのプライマーのみ示されている。シトシンはウラシルに変換されており、かつウラシルはチミンとして表される。（配列番号は各々配列後にリストアップされている）。
【図５】患者１６例＃１〜１６からの液状化細胞診（ＬＢＣ）標本から抽出された亜硫酸水素処理ＨＰＶ  ＤＮＡのＬ１領域の「トップ」鎖のための普遍的ＨＧＳ複雑性削減プライマーを使用するＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図６】ＨＰＶ１６、１８、４５、および５６からの高リスク亜硫酸水素処理複雑性削減誘導体のＥ７領域の「トップ」鎖のためのＨＧＳ複雑性削減プライマーを使用する多重ＰＣＲ増幅を示す図である。ＤＮＡは同じ患者＃１〜１６からの液状化細胞診標本から抽出された。矢印は増幅核酸産物の予想サイズを示す。
【図７】ＨＰＶ１６からの高リスク亜硫酸水素処理複雑性削減誘導体のＥ７領域の「トップ」鎖のためのＨＧＳ複雑性削減プライマーを使用するＰＣＲ増幅を示す図である。ＤＮＡは同じ患者＃１〜１６からの液状化細胞診標本から抽出された。
【図８】ＨＰＶ１８からの高リスク亜硫酸水素処理複雑性削減誘導体のＥ７領域の「トップ」鎖のためのＨＧＳ複雑性削減プライマーを使用するＰＣＲ増幅を示す図である。ＤＮＡは同じ患者＃１〜１６からの液状化細胞診標本から抽出された。
【図９】ＨＰＶ１６からの高リスク亜硫酸水素処理複雑性削減誘導体のＥ４、Ｅ６、およびＥ７領域の「トップ」鎖のためのＨＧＳ複雑性削減プライマーを使用するＰＣＲ増幅を示す図である。ＤＮＡは同じ患者＃１〜１６からの液状化細胞診標本から抽出された。矢印は増幅核酸産物の予想サイズを示す。
【図１０】ＨＰＶ１８からの高リスク亜硫酸水素処理複雑性削減誘導体のＥ４、Ｅ６、およびＥ７領域の「トップ」鎖のためのＨＧＳ複雑性削減プライマーを使用するＰＣＲ増幅を示す図である。ＤＮＡは同じ患者＃１〜１６からの液状化細胞診標本から抽出された。矢印は増幅核酸産物の予想サイズを示す。
【図１１】患者＃Ａ〜Ｔからの液状化細胞診試料からの正常または異常子宮頸部組織からの試料での「トップ」鎖のための複雑性削減プライマーを使用するさまざまなリスク型のＨＰＶ誘導体からＰＣＲ増幅可能であった３つの異なる誘導領域（Ｅ４、Ｅ６、およびＥ７）要約を示す図である。患者２０例［＃Ａ−Ｔで示した］からの液状化細胞診試料から集められ、ゲル電気泳動、および場合により直接配列分析によってサイズについて検査され、産物の同一性を検証した５８０のＰＣＲ試験の結果。プライマーを作成し、さまざまなＨＰＶ型のＥ４、Ｅ６、およびＥ７領域の領域の存在［陽性、および斜線で示した］、または非存在［陰性］を判定した。リスク状態に関係なく、すべてのＨＰＶ型のＬ１領域の一部に設定された普遍的ネスト化プライマー［普遍的（Ｕｎｉ）で示した］が列２について示されている。この図のために、高リスクＨＰＶ株がＨＰＶ１６、１８、４５および５６として、中リスク株がＨＰＶ３０、３１、３３、３５、３９、５１、５２、５６、５８、５９および６６として規定されているが、低リスク株はＨＰＶ６、１１、４２、４３、４４、５３、５４、および５５として規定されている。すべての高リスクＨＰＶ型［高で示した］のＥ７領域の一部に設定した多重ネスト化プライマーが列３について示されている。すべての中リスクＨＰＶ型［中で示した］のＥ７領域の一部に設定した多重ネスト化プライマーが列４について示されている。すべての低リスクＨＰＶ型［低で示した］のＥ７領域の一部に設定した多重ネスト化プライマーが列５について示されている。ゲル上のバンドの存在は、臨床試料における指定ウイルス断片を示す。
【図１２】患者＃２１〜４２からの亜硫酸水素処理試料でのＰＣＲ産物を得る可能性に対するプライマー縮退の効果を示す図である。プライマーを「トップ」鎖のみに作成した。ＰＣＲ増幅反応の効率に対する２３量体プライマー対の単一メンバーの縮退レベルの効果。ＰＣＲ反応ＨＰＶ−ＨＭにおいて、プライマー＃１の可能なプライマーの組合せの数は７２である。ＰＣＲ反応ＨＰＶ−ＨＭＬにおいて、プライマー＃１の可能なプライマー組合せの数は２３０４に大きく増加している。増幅核酸産物がＰＣＲ反応ＨＰＶ−ＨＭにおいて可視的であるが、ＰＣＲ反応ＨＰＶ−ＨＭＬにおいては可視的ではない。記号Ｇ、Ａ、Ｔ、およびＣは形態正常塩基を示すが、Ｄ、Ｋ、Ｗ、およびＨはその位置での異なる塩基の混合物の標準の記号である。（Ｄ＝Ａ、ＧまたはＴ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｗ＝ＡまたはＴ、Ｈ＝Ａ、Ｔ、またはＣ）。（配列番号は各々配列後にリストアップされている）。
【図１３】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ１６ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６１３）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６１４）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６１５）。
【図１４】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ１６ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６１６）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６１７）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６１８）。
【図１５】ヌクレオチド位置＃１から長方形によるヌクレオチド位置＃７９０４のＨＰＶ１６のトップ鎖のゲノムランドスケープを示す概略図であり、増幅目的に使用されるさまざまなネスト化プライマーセットの位置を示す。高および中リスク（ＨＭ）、および高、中、および低リスク（ＨＭＬ）、高（Ｈ）、および高および中（ＨＭ）の組合せなどＨＰＶ型の組合せからＤＮＡを増幅するために有用であるプライマーのためのプライマーセットの位置は示されている通りである。
【図１６】ヌクレオチド位置＃１から長方形によるヌクレオチド位置＃７９０４のＨＰＶ１６のボトム鎖のゲノムランドスケープを示す概略図であり、増幅目的に使用されるさまざまなネスト化プライマーセットの位置を示す。高および中リスク（ＨＭ）、および高、中、および低リスク（ＨＭＬ）、高（Ｈ）、および高および中（ＨＭ）の組合せなどＨＰＶ型の組合せからＤＮＡを増幅するために有用であるプライマーのためのプライマーセットの位置は示されている通りである。
【図１７】子宮頸癌の患者からの組織切片を示す図である。矢印１は、大きな核を有する癌性細胞の暗い部分を示す。矢印２は、正常結合組織を示す。
【図１８】細胞学的分析が完了されていた患者１２例（＃１〜１２で示した）の試料からの液状化細胞診（ＬＢＣ）標本から抽出された亜硫酸水素処理ＨＰＶ  ＤＮＡのＥ７領域の「トップ鎖」の（１３のＨＰＶ型、すなわちＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８の検出のための）高−中リスクＨＧＳ複雑性削減プライマーを使用するＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図１９】図１８における高−中リスクＨＰＶに対して陽性であった患者からの臨床試料＃２、＃４、＃７、および＃１１からの材料、およびＨＰＶ型（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８）のうち正確に図１８において可視的な単位複製配列の各々に関与した測定を使用するＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図２０】ＨＰＶのゲノム的に簡易化したトップ鎖になされる高−中リスクプライマーセット（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８）を使用する高度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）を有する患者１６例からの材料からのアーカイブパラフィン切片からのＰＣＲ増幅の結果を示す図である。
【図２１Ａ】亜硫酸水素変換され、ゲノム的に簡易化したＤＮＡのボトム鎖になされるプライマーを使用する液状化細胞診試料からのＰＣＲ増幅の結果を示す図である。プライマーをＨＰＶ型（高−中リスク型ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、６８、および低リスク型ＨＰＶ６、１１、４２、４３、４４、５３、５４、および５５）を標的する。
【図２１Ｂ】亜硫酸水素変換され、ゲノム的に簡易化したＤＮＡのトップ鎖になされるプライマーを使用する液状化細胞診試料からのＰＣＲ増幅の結果を示す図である。プライマーは１３の高−中リスクＨＰＶ型（ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９および６８）を標的する。
【図２２】自動化ゲルリードの部分からＨＰＶ１６としてゲノタイプしたＨＰＶ単位複製配列のＤＮＡ配列決定の結果を示す図である。ピークは示されているＤＮＡ塩基に対応する。
【図２３】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ１８ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６１９）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６２０）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６２１）。
【図２４】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ１８ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６２２）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６２３）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６２４）。
【図２５】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ３１ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６２５）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６２６）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６２７）。
【図２６】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ３１ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６２８）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６２９）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６３０）。
【図２７】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ３３ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６３１）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６３２）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６３３）。
【図２８】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ３３ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６３４）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６３５）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６３６）。
【図２９】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ３５ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６３７）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６３８）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６３９）。
【図３０】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ３５ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６４０）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６４１）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６４２）。
【図３１】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ３９ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６４３）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６４４）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６４５）。
【図３２】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ３９ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６４６）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６４７）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６４８）。
【図３３】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ４５ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６４９）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６５０）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６５１）。
【図３４】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ４５ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６５２）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６５３）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６５４）。
【図３５】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ５１ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６５５）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６５６）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６５７）。
【図３６】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ５１ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６５８）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６５９）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６６０）。
【図３７】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ５２ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６６１）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６６２）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６６３）。
【図３８】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ５２ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６６４）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６６５）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６６６）。
【図３９】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ５６ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６６７）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６６８）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６６９）。
【図４０】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ５６ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６７０）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６７１）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６７２）。
【図４１】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ５８ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６７３）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６７４）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６７５）。
【図４２】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ５８ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６７６）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６７７）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６７８）。
【図４３】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ５９ウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６７９）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６８０）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６８１）。
【図４４】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ５９ウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６８２）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６８３）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６８４）。
【図４５】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ６８ａウイルス核酸分子のトップ鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６８５）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６８６）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６８７）。
【図４６】その３つの可能な配列におけるＨＰＶ６８ａウイルス核酸分子のボトム鎖を示す図である。Ａ．正常ウイルス配列（配列番号６８８）、Ｂ．シトシンを置換するウラシルを有する誘導体配列（配列番号６８９）、およびＣ．ウラシルがチミンによって置換されているゲノム的に簡易化した配列（配列番号６９０）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2008524990.tif 000052
【図８】
2008524990.tif 000053
【図９】
2008524990.tif 000054
【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１１−３】
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【図１２】
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【図１３Ａ−１】
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【図１３Ａ−２】
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【図１３Ａ−３】
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【図１３Ｂ−１】
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【図１３Ｂ−２】
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【図１３Ｂ−３】
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【図１３Ｃ−１】
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【図１３Ｃ−２】
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【図１３Ｃ−３】
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【図１４Ａ−１】
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【図１４Ａ−２】
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【図１４Ａ−３】
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【図１４Ｂ−１】
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【図１４Ｂ−２】
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【図１４Ｂ−３】
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【図１４Ｃ−１】
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【図１４Ｃ−２】
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【図１４Ｃ−３】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ−１】
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【図２３Ａ−２】
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【図２３Ａ−３】
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【図２３Ｂ−１】
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【図２３Ｂ−２】
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【図２３Ｂ−３】
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【図２３Ｃ−１】
2008524990.tif 000092
【図２３Ｃ−２】
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【図２３Ｃ−３】
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【図２４Ａ−１】
2008524990.tif 000095
【図２４Ａ−２】
2008524990.tif 000096
【図２４Ａ−３】
2008524990.tif 000097
【図２４Ｂ−１】
2008524990.tif 000098
【図２４Ｂ−２】
2008524990.tif 000099
【図２４Ｂ−３】
2008524990.tif 000100
【図２４Ｃ−１】
2008524990.tif 000101
【図２４Ｃ−２】
2008524990.tif 000102
【図２４Ｃ−３】
2008524990.tif 000103
【図２５Ａ−１】
2008524990.tif 000104
【図２５Ａ−２】
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【図２５Ａ−３】
2008524990.tif 000106
【図２５Ｂ−１】
2008524990.tif 000107
【図２５Ｂ−２】
2008524990.tif 000108
【図２５Ｂ−３】
2008524990.tif 000109
【図２５Ｃ−１】
2008524990.tif 000110
【図２５Ｃ−２】
2008524990.tif 000111
【図２５Ｃ−３】
2008524990.tif 000112
【図２６Ａ−１】
2008524990.tif 000113
【図２６Ａ−２】
2008524990.tif 000114
【図２６Ａ−３】
2008524990.tif 000115
【図２６Ｂ−１】
2008524990.tif 000116
【図２６Ｂ−２】
2008524990.tif 000117
【図２６Ｂ−３】
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【図２６Ｃ−１】
2008524990.tif 000119
【図２６Ｃ−２】
2008524990.tif 000120
【図２６Ｃ−３】
2008524990.tif 000121
【図２７Ａ−１】
2008524990.tif 000122
【図２７Ａ−２】
2008524990.tif 000123
【図２７Ａ−３】
2008524990.tif 000124
【図２７Ｂ−１】
2008524990.tif 000125
【図２７Ｂ−２】
2008524990.tif 000126
【図２７Ｂ−３】
2008524990.tif 000127
【図２７Ｃ−１】
2008524990.tif 000128
【図２７Ｃ−２】
2008524990.tif 000129
【図２７Ｃ−３】
2008524990.tif 000130
【図２８Ａ−１】
2008524990.tif 000131
【図２８Ａ−２】
2008524990.tif 000132
【図２８Ａ−３】
2008524990.tif 000133
【図２８Ｂ−１】
2008524990.tif 000134
【図２８Ｂ−２】
2008524990.tif 000135
【図２８Ｂ−３】
2008524990.tif 000136
【図２８Ｃ−１】
2008524990.tif 000137
【図２８Ｃ−２】
2008524990.tif 000138
【図２８Ｃ−３】
2008524990.tif 000139
【図２９Ａ−１】
2008524990.tif 000140
【図２９Ａ−２】
2008524990.tif 000141
【図２９Ａ−３】
2008524990.tif 000142
【図２９Ｂ−１】
2008524990.tif 000143
【図２９Ｂ−２】
2008524990.tif 000144
【図２９Ｂ−３】
2008524990.tif 000145
【図２９Ｃ−１】
2008524990.tif 000146
【図２９Ｃ−２】
2008524990.tif 000147
【図２９Ｃ−３】
2008524990.tif 000148
【図３０Ａ−１】
2008524990.tif 000149
【図３０Ａ−２】
2008524990.tif 000150
【図３０Ａ−３】
2008524990.tif 000151
【図３０Ｂ−１】
2008524990.tif 000152
【図３０Ｂ−２】
2008524990.tif 000153
【図３０Ｂ−３】
2008524990.tif 000154
【図３０Ｃ−１】
2008524990.tif 000155
【図３０Ｃ−２】
2008524990.tif 000156
【図３０Ｃ−３】
2008524990.tif 000157
【図３１Ａ−１】
2008524990.tif 000158
【図３１Ａ−２】
2008524990.tif 000159
【図３１Ａ−３】
2008524990.tif 000160
【図３１Ｂ−１】
2008524990.tif 000161
【図３１Ｂ−２】
2008524990.tif 000162
【図３１Ｂ−３】
2008524990.tif 000163
【図３１Ｃ−１】
2008524990.tif 000164
【図３１Ｃ−２】
2008524990.tif 000165
【図３１Ｃ−３】
2008524990.tif 000166
【図３２Ａ−１】
2008524990.tif 000167
【図３２Ａ−２】
2008524990.tif 000168
【図３２Ａ−３】
2008524990.tif 000169
【図３２Ｂ−１】
2008524990.tif 000170
【図３２Ｂ−２】
2008524990.tif 000171
【図３２Ｂ−３】
2008524990.tif 000172
【図３２Ｃ−１】
2008524990.tif 000173
【図３２Ｃ−２】
2008524990.tif 000174
【図３２Ｃ−３】
2008524990.tif 000175
【図３３Ａ−１】
2008524990.tif 000176
【図３３Ａ−２】
2008524990.tif 000177
【図３３Ａ−３】
2008524990.tif 000178
【図３３Ｂ−１】
2008524990.tif 000179
【図３３Ｂ−２】
2008524990.tif 000180
【図３３Ｂ−３】
2008524990.tif 000181
【図３３Ｃ−１】
2008524990.tif 000182
【図３３Ｃ−２】
2008524990.tif 000183
【図３３Ｃ−３】
2008524990.tif 000184
【図３４Ａ−１】
2008524990.tif 000185
【図３４Ａ−２】
2008524990.tif 000186
【図３４Ａ−３】
2008524990.tif 000187
【図３４Ｂ−１】
2008524990.tif 000188
【図３４Ｂ−２】
2008524990.tif 000189
【図３４Ｂ−３】
2008524990.tif 000190
【図３４Ｃ−１】
2008524990.tif 000191
【図３４Ｃ−２】
2008524990.tif 000192
【図３４Ｃ−３】
2008524990.tif 000193
【図３５Ａ−１】
2008524990.tif 000194
【図３５Ａ−２】
2008524990.tif 000195
【図３５Ａ−３】
2008524990.tif 000196
【図３５Ｂ−１】
2008524990.tif 000197
【図３５Ｂ−２】
2008524990.tif 000198
【図３５Ｂ−３】
2008524990.tif 000199
【図３５Ｃ−１】
2008524990.tif 000200
【図３５Ｃ−２】
2008524990.tif 000201
【図３５Ｃ−３】
2008524990.tif 000202
【図３６Ａ−１】
2008524990.tif 000203
【図３６Ａ−２】
2008524990.tif 000204
【図３６Ａ−３】
2008524990.tif 000205
【図３６Ｂ−１】
2008524990.tif 000206
【図３６Ｂ−２】
2008524990.tif 000207
【図３６Ｂ−３】
2008524990.tif 000208
【図３６Ｃ−１】
2008524990.tif 000209
【図３６Ｃ−２】
2008524990.tif 000210
【図３６Ｃ−３】
2008524990.tif 000211
【図３７Ａ−１】
2008524990.tif 000212
【図３７Ａ−２】
2008524990.tif 000213
【図３７Ａ−３】
2008524990.tif 000214
【図３７Ｂ−１】
2008524990.tif 000215
【図３７Ｂ−２】
2008524990.tif 000216
【図３７Ｂ−３】
2008524990.tif 000217
【図３７Ｃ−１】
2008524990.tif 000218
【図３７Ｃ−２】
2008524990.tif 000219
【図３７Ｃ−３】
2008524990.tif 000220
【図３８Ａ−１】
2008524990.tif 000221
【図３８Ａ−２】
2008524990.tif 000222
【図３８Ａ−３】
2008524990.tif 000223
【図３８Ｂ−１】
2008524990.tif 000224
【図３８Ｂ−２】
2008524990.tif 000225
【図３８Ｂ−３】
2008524990.tif 000226
【図３８Ｃ−１】
2008524990.tif 000227
【図３８Ｃ−２】
2008524990.tif 000228
【図３８Ｃ−３】
2008524990.tif 000229
【図３９Ａ−１】
2008524990.tif 000230
【図３９Ａ−２】
2008524990.tif 000231
【図３９Ａ−３】
2008524990.tif 000232
【図３９Ｂ−１】
2008524990.tif 000233
【図３９Ｂ−２】
2008524990.tif 000234
【図３９Ｂ−３】
2008524990.tif 000235
【図３９Ｃ−１】
2008524990.tif 000236
【図３９Ｃ−２】
2008524990.tif 000237
【図３９Ｃ−３】
2008524990.tif 000238
【図４０Ａ−１】
2008524990.tif 000239
【図４０Ａ−２】
2008524990.tif 000240
【図４０Ａ−３】
2008524990.tif 000241
【図４０Ｂ−１】
2008524990.tif 000242
【図４０Ｂ−２】
2008524990.tif 000243
【図４０Ｂ−３】
2008524990.tif 000244
【図４０Ｃ−１】
2008524990.tif 000245
【図４０Ｃ−２】
2008524990.tif 000246
【図４０Ｃ−３】
2008524990.tif 000247
【図４１Ａ−１】
2008524990.tif 000248
【図４１Ａ−２】
2008524990.tif 000249
【図４１Ａ−３】
2008524990.tif 000250
【図４１Ｂ−１】
2008524990.tif 000251
【図４１Ｂ−２】
2008524990.tif 000252
【図４１Ｂ−３】
2008524990.tif 000253
【図４１Ｃ−１】
2008524990.tif 000254
【図４１Ｃ−２】
2008524990.tif 000255
【図４１Ｃ−３】
2008524990.tif 000256
【図４２Ａ−１】
2008524990.tif 000257
【図４２Ａ−２】
2008524990.tif 000258
【図４２Ａ−３】
2008524990.tif 000259
【図４２Ｂ−１】
2008524990.tif 000260
【図４２Ｂ−２】
2008524990.tif 000261
【図４２Ｂ−３】
2008524990.tif 000262
【図４２Ｃ−１】
2008524990.tif 000263
【図４２Ｃ−２】
2008524990.tif 000264
【図４２Ｃ−３】
2008524990.tif 000265
【図４３Ａ−１】
2008524990.tif 000266
【図４３Ａ−２】
2008524990.tif 000267
【図４３Ａ−３】
2008524990.tif 000268
【図４３Ｂ−１】
2008524990.tif 000269
【図４３Ｂ−２】
2008524990.tif 000270
【図４３Ｂ−３】
2008524990.tif 000271
【図４３Ｃ−１】
2008524990.tif 000272
【図４３Ｃ−２】
2008524990.tif 000273
【図４３Ｃ−３】
2008524990.tif 000274
【図４４Ａ−１】
2008524990.tif 000275
【図４４Ａ−２】
2008524990.tif 000276
【図４４Ａ−３】
2008524990.tif 000277
【図４４Ｂ−１】
2008524990.tif 000278
【図４４Ｂ−２】
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【図４４Ｂ−３】
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【図４４Ｃ−１】
2008524990.tif 000281
【図４４Ｃ−２】
2008524990.tif 000282
【図４４Ｃ−３】
2008524990.tif 000283
【図４５Ａ−１】
2008524990.tif 000284
【図４５Ａ−２】
2008524990.tif 000285
【図４５Ａ−３】
2008524990.tif 000286
【図４５Ｂ−１】
2008524990.tif 000287
【図４５Ｂ−２】
2008524990.tif 000288
【図４５Ｂ−３】
2008524990.tif 000289
【図４５Ｃ−１】
2008524990.tif 000290
【図４５Ｃ−２】
2008524990.tif 000291
【図４５Ｃ−３】
2008524990.tif 000292
【図４６Ａ−１】
2008524990.tif 000293
【図４６Ａ−２】
2008524990.tif 000294
【図４６Ａ−３】
2008524990.tif 000295
【図４６Ｂ−１】
2008524990.tif 000296
【図４６Ｂ−２】
2008524990.tif 000297
【図４６Ｂ−３】
2008524990.tif 000298
【図４６Ｃ−１】
2008524990.tif 000299
【図４６Ｃ−２】
2008524990.tif 000300
【図４６Ｃ−３】
2008524990.tif 000301
【配列表】
2008524990000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成18年8月17日(2006.8.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を検出するためのアッセイであって、
シトシンを修飾する薬剤でウイルス核酸を処理し、ウイルス核酸誘導体を形成するステップと、
前記ウイルス核酸誘導体の少なくとも一部からＨＰＶ特異的核酸分子を形成するステップと、
ＨＰＶ特異的核酸分子の存在を探すステップであって、前記ＨＰＶ特異的核酸分子の検出がＨＰＶを示すステップと
を含むアッセイ。
【請求項２】
前記ＨＰＶ特異的核酸分子が、前記ウイルス核酸誘導体の少なくとも一部を増幅することによって形成される請求項１に記載のアッセイ。
【請求項３】
ＨＰＶ特異的核酸分子の増幅を可能にすることができるＨＰＶプライマーを提供するステップをさらに含む請求項２に記載のアッセイ。
【請求項４】
前記ウイルスが、スワブ、生検、スメア、パップスメア、血液、血漿、血清、血液製剤、表面スクレープ、スパチュラ、液体懸濁液、凍結材料、パラフィンブロック、スライドガラス、法医学収集システムおよびアーカイブ材料より成る群から選択される試料中にある請求項１〜３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項５】
前記試料がスメア、パップスメア、または細胞の液体懸濁液である、請求項４に記載のアッセイ。
【請求項６】
前記薬剤がシトシンを修飾し、前記核酸誘導体中にウラシルを形成する請求項１〜５のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項７】
前記薬剤が亜硫酸水素塩、酢酸塩、またはクエン酸塩から選択される請求項６に記載のアッセイ。
【請求項８】
前記薬剤が亜硫酸水素ナトリウムである請求項７に記載のアッセイ。
【請求項９】
前記薬剤が、相補的二本鎖ウイルス核酸の各々の鎖におけるシトシンをウラシルに修飾し、２つの非相補的なウイルス核酸分子誘導体を形成する請求項１〜８のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１０】
前記ウイルス核酸誘導体が有するシトシンの総数が、対応する未処理ウイルス核酸に比較して減少している請求項１〜９のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１１】
前記増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、等温増幅、シグナル増幅、またはそれらの組合せによって行われる請求項２〜１０のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１２】
前記増幅がＰＣＲによって行われる請求項１１に記載のアッセイ。
【請求項１３】
前記ＨＰＶ特異的核酸分子が天然ＨＰＶゲノムの一部を形成することがない請求項１〜１２のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１４】
前記ＨＰＶ特異的核酸分子がＨＰＶ種、ＨＰＶの型、またはＨＰＶの亜型に特異的である請求項１〜１３のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１５】
前記ＨＰＶ型が、特定のヒト民族系統における所定の組織上に、高、中、または低レベルの発癌性状態を与えうる請求項１４に記載のアッセイ。
【請求項１６】
高リスクＨＰＶ型がＨＰＶ１６、１８、４５、および５６であり、中リスクＨＰＶ型がＨＰＶ３１、３３、３５、３９、５１、５２、５６、５８、５９、および６８であり、かつ低リスク型がＨＰＶ６、１１、２６、３０、４０、４２、４３、４４、５３、５４、５５、６６、７３、８２、８３、および８４である請求項１５に記載のアッセイ。
【請求項１７】
ＨＰＶ１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、および６８が検出される請求項１６に記載のアッセイ。
【請求項１８】
前記ＨＰＶ特異的核酸がゲル電気泳動、標識プローブを用いるハイブリダイゼーション、その後の識別を可能にするタグ付きプライマーの使用、酵素結合アッセイ、または標的ＤＮＡによるハイブリダイゼーションとともにシグナルを生じさせる蛍光タグ付きプライマーの使用によって検出される請求項１〜１７のいずれか１項に記載のアッセイ。
【請求項１９】
試料におけるＨＰＶの存在を検出するためのアッセイであって、
試料からウイルス核酸を得るステップと、
ウイルス核酸におけるシトシンがウラシルに変換され、ウイルス核酸誘導体を形成する条件下でウイルス核酸を亜硫酸水素で処理するステップと、
ウイルス核酸誘導体の領域に結合ができるプライマーを提供するステップであって、前記プライマーが所望のＨＰＶ特異的核酸分子をウイルス核酸誘導体に増幅することができるものである、ステップと、
前記ウイルス核酸誘導体に増幅反応を行うステップと、
所望の増幅核酸産物の存在を探すステップであって、前記増幅産物の検出が試料におけるＨＰＶの存在を示すステップと
を含むアッセイ。
【請求項２０】
ＨＰＶが存在する試料を、前記試料におけるＨＰＶの型、亜型、変異型、または遺伝子型を決定しうる追加の試験で処理するステップをさらに含む請求項１９に記載のアッセイ。
【国際調査報告】
2008524990.tif 000302
2008524990.tif 000303
2008524990.tif 000304
2008524990.tif 000305