(57)【要約】  本発明は、抗腫瘍免疫反応に関するもので、一層詳しくは、腫瘍細胞に特異的に作用する腫瘍関連抗原−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を誘導する方法などに関するものである。本発明によると、組み換えアデノウイルスで形質導入された樹枝状細胞を用いてＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで誘導できるので、人間の兔疫体系を用いて疾病を安全かつ効率的に治療できる免疫治療法のうち最も優れた効果を示す。さらに、この免疫治療法を腫瘍ワクチンまたは他の腫瘍治療法と併用して複合治療法として活用する場合、強力な腫瘍の予防または治療道具として機能することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＥＡを発現する組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡ。
【請求項２】
ＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を生成する組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡで形質導入された樹枝状細胞。
【請求項３】
ＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで生成する請求項２に記載の樹枝状細胞。
【請求項４】
前記組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡによる樹枝状細胞の形質導入は、ＭＯＩ１００〜２，０００で行われることを特徴とする請求項２または３に記載の樹枝状細胞。
【請求項５】
前記組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡによる樹枝状細胞の形質導入は、ＭＯＩ５００〜１，０００で行われることを特徴とする請求項４に記載の樹枝状細胞。
【請求項６】
請求項２または３のうち何れか１項の樹枝状細胞を含む抗腫瘍ワクチン。
【請求項７】
請求項２または３のうち何れか１項の樹枝状細胞を含む腫瘍治療用薬剤学的組成物。
【請求項８】
請求項２または３のうち何れか１項の樹枝状細胞によって生成されるＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を含む抗腫瘍ワクチン。
【請求項９】
請求項２または３のうち何れか１項の樹枝状細胞によって生成されるＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を含む腫瘍治療用薬剤学的組成物。
【請求項１０】
組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡで形質導入された樹枝状細胞を用いてＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで誘導する方法。
【請求項１１】
前記組み換えアデノウイルスによる樹枝状細胞の形質導入は、ＭＯＩ１００〜２，０００で行われる請求項１０に記載のＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで誘導する方法。
【請求項１２】
前記組み換えアデノウイルスによる樹枝状細胞の形質導入は、ＭＯＩ５００〜１，０００で行われる請求項１１に記載のＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで誘導する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、抗腫瘍免疫反応に関するもので、一層詳しくは、腫瘍細胞に特異的に作用する腫瘍関連抗原−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を誘導する方法に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
現在の癌治療法としては、癌細胞化した組織を外科的に可能な限り多く除去した後、残存する癌細胞を破壊する放射線療法及び化学療法が主に行われている。しかしながら、外科的手術の場合、除去範囲が広く、微小転移などによる癌の再発危険性があり、放射線療法及び化学療法の場合も、多くの副作用が発生するという問題点があった。また、各抗癌剤が全ての癌に効能があるとは言えなく、多くの場合、抗癌剤に露出された残存癌細胞が、耐性を獲得して成長しつづけ、他の臓器に転移してしまい、治療不可能な状態に陥るという問題点があった。
【０００３】
したがって、現実的に、上記の療法のみでは、癌を征服するに限界がある。その限界を克服するための新しい癌治療法として、私たちの体自体の免疫機能を用いた免疫療法が注目を浴びている。
【０００４】
上記の免疫療法は、他の療法に比べて副作用が少なく、他の療法と併用する際に優れた効果を発揮するので、最近、その重要性が一層高まりつつある。癌治療法のうち、手術療法、化学療法（抗癌剤）及び放射線療法は、癌細胞を直接攻撃する治療方法である反面、免疫療法は、患者自身が持っている免疫力を活性化させることで、自身の免疫力で癌を治療する間接的な治療方法である。
【０００５】
人体の免疫機能には、体液性免疫及び細胞性免疫がある。体液性免疫は、細菌、ウイルスなどの抗原が体内に入ったとき、その抗原を分解除去するための抗体を作り出すことである。一方、細胞性免疫は、一つの抗原（癌細胞）に反応する細胞（リンパ球）を作り出し、免疫監視機構を作用させることである。癌に関する免疫においては、体液性免疫よりリンパ球を中心とした細胞性免疫が一層重要な役割をする。このように、抗腫瘍免疫反応には、一般的に細胞性免疫反応が関与しており、この反応においては、ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞（ＣＤ８+ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ、ＣＴＬ）の役割が重要なものとして知られている。これら抗腫瘍Ｔ細胞を誘導するために、腫瘍−関連抗原（ｔｕｍｏｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＴＡＡ）に対する研究が持続的に行われており、最近、組み換えＤＮＡ技術の発達に伴い、腫瘍に対するＴ細胞免疫治療法を開発するための研究が持続的に行われている。
【０００６】
上記のような試みの一つとして、米国特許第５，６９８，５３０号明細書には、ＣＥＡ遺伝子が挿入されたワクシニアウイルスを含む組み換えウイルス、すなわち、この組み換えウイルスに感染された細胞の表面でＣＥＡを発現し、そのＣＥＡ及びＣＥＡを発現する細胞に対する細胞媒介免疫反応をインビボで誘導する組み換えウイルスに対して開示している。
【０００７】
しかしながら、上記のような組み換えウイルスによって抗腫瘍免疫反応をインビボで誘導する場合、実際に癌患者の治療に適用するとき、免疫機能が弱化した癌患者の免疫能力を補充するに不充分であるという限界があった。そのため、一層効率的な免疫治療法の開発、特に、細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで誘導する方法が切実に要求されている。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
上記のような問題点を解決するために、本発明は、腫瘍細胞に特異的に作用する抗原−特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで誘導する方法を提供することを目的とする。
【０００９】
上記のような目的を達成するために、本発明は、ＣＥＡを発現する組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡ及びＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を生成する組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡで形質導入された樹枝状細胞を提供する。このとき、前記樹枝状細胞は、特にＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで生成する。
【００１０】
また、本発明は、前記樹枝状細胞を含む抗腫瘍ワクチン及び腫瘍治療用薬剤学的組成物を提供するだけでなく、前記樹枝状細胞によって生成されたＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を含む抗腫瘍ワクチン及び腫瘍治療用薬剤学的組成物を提供する。
【００１１】
さらに、本発明は、組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡで形質導入された樹枝状細胞を用いてＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで誘導する方法を提供する。
【００１２】
以下、本発明の構成を一層詳しく説明する。
【００１３】
まず、本発明は、ＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで生成するＡｄＶＣＥＡで形質導入された樹枝状細胞、及び前記組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡで形質導入された樹枝状細胞を用いてＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで誘導する方法を提供する。
【００１４】
本発明は、腫瘍を治療するための免疫治療法中でも、腫瘍抗原由来のペプチド抗原決定基（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｅｐｉｔｏｐｅ）を究明し、これら腫瘍抗原に特異的に作用する細胞毒性Ｔ細胞を用いて腫瘍を治療する免疫治療法に基づいている。このとき、腫瘍細胞に特異的に作用する抗原−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を誘導しなければならなく、このために適切な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を選択すべきである。腫瘍−関連抗原としては、ｐｒｏｓｔａｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＭＵＣ−１、ｐｏｉｎｔ  ｍｕｔａｔｅｄ  ｏｒ  ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ  ｏｖｅｒ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｐ５３、ＭＡＧＥ  ａｎｔｉｇｅｎ及びＣＥＡ（ｃａｒｃｉｎｏ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；癌胎児性抗原）などが知られている。特に、本発明では、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを使用しているが、これは、１８０ｋＤａの癌胎児性糖蛋白質であり、溶解性の腫瘍マーカーである。その理由は、ＣＥＡが、大腸・直腸癌、胃癌、膵臓癌で９５％以上発現し、乳癌の約５０％、非小細胞肺癌の７０％で発現するので、腫瘍免疫治療のための強力なターゲットＴＡＡであるためである。このように、本発明では、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを使用するので、本発明による樹枝状細胞がＣＥＡに特異的な細胞毒性Ｔ細胞を生成し、その結果、この細胞毒性Ｔ細胞が多様な種類の腫瘍に効果を示すようになる。
【００１５】
また、腫瘍細胞による抗原提示が適切な免疫反応を誘導するのに不充分であるため、抗腫瘍免疫反応では、専門的な抗原提示細胞（ＡＰＣｓ；ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）が必要である。特に、本発明では、抗原提示細胞として樹枝状細胞を使用する。樹枝状細胞を使用する理由は、腫瘍細胞に特異的に作用する抗原−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を誘導するために、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ分子に抗原が提示される過程が必須であるが、樹枝状細胞が強力な抗原提示細胞として機能するためである。抗原−特異的な細胞毒性Ｔ細胞の誘導に用いられる抗原提示細胞のうち、樹枝状細胞は、骨髄を起源として末梢部位（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｓｉｔｅ）で未成熟状態で存在した後、抗原を認知し、増殖が抑制されたＴ細胞を刺激することで、抗原に対して活性を有するＴ細胞の免疫反応を開始または調節するものとして知られている。また、樹枝状細胞は、細胞毒性Ｔ細胞の他にも、免疫反応に関与するＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＬＦＡ（ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ）１及び３、ＩＣＡＭ（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）１及び３などの分子を高い水準で発現するので、抗腫瘍免疫反応を誘導するための抗原提示細胞として好ましく用いられる。さらに、樹枝状細胞は、新しい合成なしにＣＤ８＋Ｔ−細胞でＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩ分子に対する交差提示を誘導し、組み換えＡｄＶによって容易に形質導入され、エンドサイトーシス膜からサイトゾルに抗原を移送できるという長所も有する。
【００１６】
上記のような抗原提示細胞としての樹枝状細胞に遺伝物質を伝達する方法には、電気衝撃法（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ）、脂質−媒介トランスフェクション、カルシウム・ホスフェート沈殿法及びウイルス−媒介遺伝子トランスファーなどの技術が挙げられる。特に、本発明では、樹枝状細胞に腫瘍遺伝子を転移することで腫瘍抗原を発現させるウイルスベクターを用いる。そのうち、特に組み換えアデノウイルスは、大きい大きさを有する外来抗原遺伝子の挿入が可能であり、細胞分裂をしないターゲット細胞に感染されて抗原蛋白質を発現する長所があるので好ましい。
【００１７】
本発明におけるＣＥＡを発現する組み換えアデノウイルスは、Ａｄｅｎｏ−ＸＴＭウイルスに、ＬＯＶＯ細胞株から合成したＣＥＡを挿入することで製作した。このように製作されたＡｄＶＣＥＡを、宿主細胞であるＨＥＫ２９３細胞株に転移してから培養し、高力価の組み換えアデノウイルスを収得した。
【００１８】
本発明における組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡ（寄託番号：ＫＣＴＣ  １０６４９ＢＰ）による樹枝状細胞の形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）は、ＭＯＩ１００〜２，０００で行うことが好ましく、ＭＯＩ５００〜１，０００で行うことが一層好ましい。このようなＭＯＩ範囲は、ＭＯＩ１００以下である場合、形質導入効率が非常に低く、ＭＯＩ２，０００以上である場合、ターゲット細胞に対してアデノウイルスが毒性を示すこともあるので、形質導入効率及びウイルス自体の毒性または抗原流入の憂いなどを勘案した上で定められた。このとき、アデノウイルスの使用に対する安定性検証は、下記の実施例で記載したように、ターゲット細胞の細胞死滅率を測定することで確認できた。
【００１９】
組み換えアデノウイルスで形質導入された樹枝状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４が含まれた培地で培養した後、ＴＮＦ−α及びＰＧＥ２の存在下で成熟させる。次いで、健康なドナーからのＨＬＡ−Ａ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔ２細胞株でＣＥＡペプチドなどで刺激することで、ＣＥＡに特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで誘導し、増殖アッセイを通して細胞毒性Ｔ細胞の生成を確認できた。また、クロム遊離アッセイ（ｃｈｒｏｍｉｕｍ  ｒｅｌｅａｓｅ  ａｓｓａｙ）を通して前記細胞毒性Ｔ細胞の細胞破壊能を確認できたし、動物モデルを使用して腫瘍の予防能力及び腫瘍治療能力を評価した結果、腫瘍の予防及び治療効果に優れていることを確認できた。
【００２０】
また、本発明は、前記ＣＥＡ−特異的な免疫物質を生成する組み換えアデノウイルスＡｄＶＣＥＡで形質導入された樹枝状細胞、または、この樹枝状細胞によって生成されるＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を含む抗腫瘍ワクチン及び腫瘍治療用薬剤学的組成物を提供する。本発明による抗腫瘍ワクチン及び腫瘍治療用薬剤学的組成物の場合、ＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を生成する樹枝状細胞、または、この樹枝状細胞によって生成されるＣＥＡ−特異的な細胞毒性Ｔ細胞を含むので、一種類の腫瘍に限定されず、多様な種類の腫瘍に対する予防ワクチン及び治療剤として機能することができる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２１】
以下、下記の実施例に基づいて、本発明を一層詳細に説明する。しかし、本発明は、これら実施例によって限定されるものと解析されてはならない。
【００２２】
細胞株及びその培養方法
以下、下記の実施例で用いられた全ての細胞株及びその培養方法を説明する。
【００２３】
結腸直膓癌腫瘍細胞株ＳＷ４０３（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ２、Ａ３）、ＳＷ４８０（ＨＬＡ−Ａ２）、ＬＯＶＯ（ＨＬＡ−Ａ１１）をＡＴＣＣ（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ、米国）から入手した。全ての細胞株は、１５％のＦＢＳ（ウシ胎児血清）、２ｍＭのＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン及び１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）が含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  ｍｅｄｉｕｍ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製、米国）培地で培養した。ＨＬＡ−Ａ２−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔ２細胞株も、ＡＴＣＣから入手し、２０％のＦＢＳが含まれたＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ；ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）培地で培養した。ヒトアデノウイルスｔｙｐｅ５で形質転換されたＨＥＫ２９３（ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｋｉｄｎｅｙ  ２９３；ＡＴＣＣ、ＣＲＬ１５７３）細胞株及び抗−ＣＥＡモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を生産するハイブリドーマ細胞株Ｔ８４．６６Ａ３．１Ａ．１Ｆ２（ＡＴＣＣ、ＨＢ８７４７）を１０％のＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ培地で培養した。ＥＢＶ（Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒ  ｖｉｒｕｓ）−形質転換したＢ  ＬＣＬ（ｌｙｍｐｈｏｂｌｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ）をドナーＰＢＭＣでＥＢＶ形質転換によって製造し、１０％のＦＢＳが含まれたＲＰＭＩ−１６４０（ＧｉｂｃｏＢＲＬ社製）で培養した。
【００２４】
ペプチド及びペプチドローディング方法
以下、下記の実施例で用いられたペプチド及びペプチドのローディング方法を説明する。
【００２５】
ＣＥＡペプチド、ＣＡＰ−１（ＨＬＡ−Ａ２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ、ＹＬＳ−ＧＡＮＬＮＬ）及びＣＥＡ６５２（ＨＬＡ−Ａ２４−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ、ＴＹＡＣＦＶＳＮＬ）をＡｎｙＧｅｎ社（韓国の光州技術院）から入手した。ペプチドを１０ｍｇ／ｍｌの濃度でＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｘｉｄｅ；シグマ社製）に溶解させた後、−７０℃で保存した。さらに、ＴＮＦ-α及びＰＧＥ２の存在下で２日間培養した後、成熟した樹枝状細胞を増殖アッセイのために使用した。ペプチドストリッピングのために、樹枝状細胞またはターゲット細胞を１％のコールドＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）／ＰＢＳ溶液で一回洗浄した後、ストリッピングバッファー［０．１３ＭのＬ−アスコルビン酸、０．０６Ｍのｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ（ｐＨ３．０）、１％のＢＳＡ、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリン（シグマ社製）、１０μｇ／ｍｌのペプチド］で５×１０６細胞／ｍｌに再び浮遊した。氷で２分間培養した後、細胞を中和バッファー［０．１５Ｍのｓｏｄｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｍｏｎｏｂａｓｉｃ（ｐＨ７．５）、１％のＢＳＡ、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリン（シグマ社製）、１０μｇ／ｍｌのペプチド］で中和した。引き続いて、細胞をペプチド溶液［ＰＢＳ、１％のＢＳＡ、２０μｇ／ｍｌのＤＮａｓｅ（シグマ社製）、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリン、２０μｇ／ｍｌのペプチド］に再び浮遊し、室温で２時間の間培養した。
【００２６】
実施例１：組み換えアデノウイルスの製作
ＣＥＡを発現する組み換えＡｄＶベクターは、Ａｄｅｎｏ−ＸＴＭ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社製、米国）を使用して、製造社の方法によって製作した。すなわち、ＣＥＡ蛋白質を発現するＬＯＶＯ細胞株からＲＮＡを抽出した後、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＡＭＶ  ｋｉｔ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ社製、ドイツ）を用いてｃＤＮＡを合成した。合成されたＣＥＡ  ｃＤＮＡは、ＮｈｅＩ部位を含むＣＥＡセンスプライマー５'−ＣＧＡＡＧＣＴＡＧＣＡＴＧＧＡＧＴＣＴＣＣＣＴＣＧＧＣＣＣＣ−３'及びＮｈｅＩ部位を含むＣＥＡアンチセンスプライマー５'−ＧＣＧＣＧＣＴＡＧＣＣＴＡＴＡＴＣＡＧＡＧＣＡＡＣＣＣＣＡＡＣＣ−３'を使用してＲＴ−ＰＣＲ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ−ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）法でＬＯＶＯ細胞株から増幅した。得られたＰＣＲ産物をＮｈｅＩ部位でシャトルベクターに挿入した後でクローニングし、可能なＴａｑポリメラーゼのエラーを確認するためにシーケンスした。次いで、ＣＥＡ発現カセットをＡｄｅｎｏ−ＸＴＭウイルスＤＮＡに挿入した。ＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることで、感染性ＡｄＶで組み換えアデノウイルスＤＮＡをパッケージした後、ＣＥＡ遺伝子を含むアデノウイルス（ＡｄＶＣＥＡ）を増幅し、ＣｓＣｌ密度勾配遠心分離を用いて２回遠心分離を行って細胞溶解物から精製した。ウイルス産物は、脱塩して１０％のグリセロール（ｖ／ｖ）を含むＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ  ｓａｌｉｎｅ）で−８０℃に保存した。ＡｄＶＧＦＰ（緑色蛍光蛋白質を発現する組み換えＡｄＶ）を製造するために、上記と類似したプロトコルを使用した。ＴＣＩＤ５０（５０％のｔｉｓｓｕｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｏｓｅ）方法でウイルス力価を測定した結果、１×１０９／ｍｌの力価を確認した。
【００２７】
実施例２．樹枝状細胞の形質導入及びＣＥＡ蛋白質の発現程度測定
樹枝状細胞の生産及び培養
樹枝状細胞は、Ｒｏｍａｎｉなどによって記述された手順を使用して生産した。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離で分離した健康な志願者の単核細胞を、６−ウェルプレートに１０７細胞／ウェルで分注し、２時間の間固定させた。固定されていない細胞を除去し、固定された細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ（ｇｒａｎｕｌｏｃｙｔｅ−ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｃｏｌｏｎｙ−ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ；Ｅｎｄｏｇｅｎ社製、米国）１００ｎｇ／ｍｌ及びＩＬ−４（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−４；Ｇｅｎｚｙｍｅ社製、米国）５００Ｕ／ｍｌを含むＲＰＭＩ−１６４０培地で７日間培養した。ＣＥＡ−特異的なＴ−細胞を誘導するために、単核球−誘導樹枝状細胞をＴＮＦ−α（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ−α；Ｅｎｄｏｇｅｎ社製）２００Ｕ／ｍｌ及びＰＧＥ２（プロスタグランディンＥ２；Ｓｉｇｍａ社製、米国）１μｇ／ｍｌの存在下で最終成熟を誘導するように、さらに２日間培養した。
【００２８】
形質導入効率及びＣＥＡ発現程度測定
（１）フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）測定による分析
形質導入効率を確認するために、５×１０５樹枝状細胞を無血清ＲＰＭＩ−１６４０培地に浮遊し、３７℃で２時間の間、ＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）５０〜１０００でＡｄＶＧＦＰに露出した。２回洗浄した後、形質導入された樹枝状細胞を新しいサイトカイン−添加培地に再び浮遊し、さらに２日間培養した。次いで、ＧＦＰ及び樹枝状細胞表現型の発現程度をＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ社製、米国）で測定した。表現型分析のために、ＡｄＶＧＦＰ−感染した樹枝状細胞をＰＥ（ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ）−接合ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩ、ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩＩ、ＣＤ８６、ＣＤ５４及びＣＤ８３（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製、米国）で染色した。ＣＥＡ発現を確認するために、ＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞を抗−ＣＥＡ  ＭＡｂ（ｃｌｏｎｅ；Ｔ８４．６６Ａ３．１Ａ．１Ｆ２）で標識してから、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ）−接合２次ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Ｃａｐｐｅｌ社製、米国）で標識した。
【００２９】
図１は、多様なＭＯＩにおけるアデノウイルスベクターの形質導入効率を示し、図２は、アデノウイルス-感染した樹枝状細胞の表面マーカー発現程度を示している。図面には、アイソタイプコントロールに明暗を入れており、細い線は感染していない樹枝状細胞を示し、太い線はＡｄＶＧＦＰ−感染した樹枝状細胞を示し、全てのデータは、ＧＦＰ−ポジティブ細胞のためにアンゲート（ｕｎｇａｔｅ）した。
【００３０】
形質導入効率及び樹枝状細胞表現型でＡｄＶ感染の影響を確認するためのフローサイトメトリー測定の分析結果から、単核球−誘導樹枝状細胞は、インビトロでＡｄＶ−媒介遺伝子トランスファーが可能であり、その効率がＭＯＩ−依存性方式で増加することを確認できた（図１）。また、ＡｄＶ感染は、ＡｄＶ−感染した樹枝状細胞が、感染していない樹枝状細胞と比較して、ＣＤ８６、ＣＤ５４及びＣＤ８３に対してやや高い発現率を示す反面、ＭＨＣ分子（ＨＬＡ  ｃｌａｓｓＩ及びＩＩ）の発現には如何なる影響も及ぼさないことを示している（図２）。ＭＯＩ５００において、ＡｄＶＧＦＰ形質導入率が、３名の異なるドナーからの樹枝状細胞で６５〜７０％の高い形質導入効率を示すことを確認できた。
【００３１】
次いで、ＡｄＶＣＥＡを使用して、樹枝状細胞へのＣＥＡ遺伝子トランスファーの効能を評価した。図３は、組み換えＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞に対し、フローサイトメトリーによって測定したＣＥＡの表面発現率を示している。図面には、アイソタイプコントロールに明暗を入れており、細い線はＣＥＡ−ポジティブ結腸癌細胞株ＬＯＶＯを示し、太線はＡｄＶＧＦＰ−感染した樹枝状細胞を示す。樹枝状細胞がＭＯＩの範囲でＡｄＶＣＥＡで形質導入された場合も、表面ＣＥＡの水準は僅かに増加し、ＡｄＶＣＥＡのドーズ量（ＭＯＩ）がＣＥＡの表面発現に何らの影響も及ぼさないことを確認できた（図３）。
【００３２】
（２）ウェスタンブロット分析
ウェスタンブロット分析のために、細胞抽出物から蛋白質を８％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を使用して分離した後、ニトロセルロースメンブレインにトランスファーした。メンブレインは、ＰＢＳで５％の無脂肪牛乳と一緒にインキューベートした後、室温で２時間の間、抗−ＣＥＡ  ＭＡｂと一緒に培養した。洗浄した後、メンブレインを室温で１時間の間、アルカリ性ホスファターゼ−接合ヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、英国、バッキンガムシャー）を使用して培養した。免疫反応バンドは、ＥＣＬウェスタンブロッティング分析システム（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製、英国、バッキンガムシャー）を使用して検出した。
【００３３】
図４は、ＣＥＡ発現に対する細胞のウェスタンブロット分析の結果を示している。このとき、ＬＯＶＯ細胞抽出物をＣＥＡコントロールとして使用した。ウェスタンブロット分析の結果、ＣＥＡの発現がＭＯＩ５００においてＭＯＩ−依存性方式で増加し、ＣＥＡの発現水準がＣＥＡ−発現結腸癌細胞株であるＬＯＶＯの発現水準と類似していた（図４）。
【００３４】
（３）免疫蛍光顕微鏡による測定
免疫蛍光顕微鏡による測定のために、ＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞をサイトスピンを用いてスライドに付着し、４％のパラホルムアルデヒド（シグマ社製）で１０分間固定した。スライドは、０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で洗浄し、抗−ＣＥＡ  ＭＡｂ及び陰性コントロール血清を各スライドに添加した。４℃で３０分間培養し、ＰＢＳで３回５分間完全に洗浄した後、スライドは、ＦＩＴＣ−接合抗−マウスＩｇＧで処理した。次いで、プロピジウムアイオダイド（シグマ社製）１μｇ／ｍｌを使用して５分間培養し、４回洗浄した後、搭載して核及び拡散された細胞質蛍光の存在を確認するために、共焦点レーザ走査顕微鏡（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製、米国、カリフォルニア、ハーキュリーズ）で観察した。
【００３５】
図５は、ＭＯＩ５００におけるＡｄＶＣＥＡで形質導入された樹枝状細胞の免疫蛍光染色結果を示している。このとき、細胞は、ＣＥＡ（緑色）及び核（赤色；８００ｘ）の位置を示すためにｃｙｔｏｓｐｕｎした。免疫蛍光顕微鏡の分析結果、ＣＥＡが主にＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞の細胞質に存在することを確認できた（図５）。
【００３６】
実施例３：細胞死滅（アポトーシス）検出によるＡｄＶベクターの安定性評価
ＡｄＶベクターのターゲット細胞に対する安定性を評価するために、ＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞における細胞死滅率を調査した。細胞死滅を確認するために、５×１０５の樹枝状細胞を、ＭＯＩ１００〜１０００でＡｄＶＣＥＡに２時間の間露出させた。次いで、細胞は、ＴＮＦ−α、ＰＧＥ２の存在下で２日間さらに培養した。コントロールとして、感染していない樹枝状細胞をも同一の条件で培養した。細胞死滅を誘導するために、感染していない樹枝状細胞は、アクチノマイシンＤ（ＡｃＤ；シグマ社製）１μｇ／ｍｌを付加的に含む培地で培養した。細胞死滅した細胞の染色及び分析は、製造者の方法によって、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＰＥ細胞死滅分析キット（ＰｈａｒＭｉｎｇｅｎ社製）で行った。
【００３７】
図６〜図８は、組み換えＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞における細胞死滅を分析した結果を示している。図６は、感染していない樹枝状細胞の場合を示し、図７は、アクチノマイシンＤ  １μｇ／ｍｌを付加的に含む培地で培養した、感染していない樹枝状細胞の場合を示している。そして、図８は、ＣＥＡの表面発現及びＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞における細胞死滅分析結果を示しており、細い線は、感染していない樹枝状細胞を示し、太い線は、ＡｄＶＧＦＰ−感染した樹枝状細胞を示す。
【００３８】
図６〜図８から分かるように、ＣＥＡの表面発現がＭＯＩ−依存性方式で増加した場合も、ＡｄＶＣＥＡ感染は、ＡｃＤ−処理された樹枝状細胞の細胞死滅と比較したとき、樹枝状細胞の細胞死滅に対する相当な効果を示していない。
【００３９】
実施例４：［３Ｈ］チミジン（ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ）統合アッセイによる増殖アッセイ
ＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞の刺激能力を、スタンダード［３Ｈ］チミジン統合アッセイを使用して調査した（図９）。
【００４０】
ＭＯＩ５００においてＡｄＶＣＥＡで形質導入したり、ＣＡＰ−１ペプチド−ローディングされた自家組織成熟樹枝状細胞をＴ−細胞株と一緒に培養し、クワドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）でレスポンダー：樹枝状細胞の比率を１００：１にし、２週間ＣＡＰ−１ペプチド−ローディングされた樹枝状細胞で刺激した。４日間培養した後、［３Ｈ］チミジンを各ウェルに添加し（２μＣｉ／ウェル）、６時間さらに培養した後、［３Ｈ］チミジンアップテイク（ｕｐｔａｋｅ）を液体閃光計数器を使用して測定した。処理されていない樹枝状細胞は、ネガティブコントロールとして使用した。平均（±標準偏差、棒）をクワドルプレット（ｑｕａｄｒｕｐｌｅｔ）の結果から計算した。増殖程度は、ｃｐｍ（ｃｏｕｎｔｓ  ｐｅｒ  ｍｉｎｕｔｅ）で示す。
【００４１】
図９から分かるように、感染していない樹枝状細胞は、ＣＥＡ−特異増殖反応を誘導しない反面、ＡｄＶＣＥＡで形質導入されたＨＬＡ−Ａ２−ポジティブ樹枝状細胞は、ＣＥＡ−特異増殖反応を誘導した。
【００４２】
実施例５：ＣＥＡ−特異Ｔリンパ球の生成及び細胞破壊能検査
ＣＥＡ−特異Ｔリンパ球の生成
ＣＥＡ−特異Ｔ−細胞株は、ＨＬＡ−Ａ２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ＣＡＰ−１ペプチドでローディングしたり、ＡｄＶＣＥＡで形質導入して放射線照射された自家組織樹枝状細胞を使用し、ＨＬＡ−Ａ２−ポジティブの健康なドナーからの非固定末梢血液リンパ球を週１回刺激することでインビトロで生成された。樹枝状細胞は、ＭＯＩ５００においてＡｄＶＣＥＡで形質導入し、２００Ｕ／ｍｌのＴＮＦ−α及び１μｇ／ｍｌのＰＧＥ２を含む新しいサイトカイン−添加培地で２日間培養した。ＣＡＰ−１ペプチドでローディングしたり、ＡｄＶＣＥＡで感染した樹枝状細胞を、コントロール培養で副産物を完全に防ぐ４０Ｇｙで放射線照射し、細胞を５×１０４細胞／ウェルで２４−ウェルプレートに接種した。非固定自家組織末梢血液リンパ球を、１．５×１０６細胞／ウェルで添加した。刺激子（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）と一緒に７日間培養した後、リンパ球を回収し、５×１０５細胞／ウェルで再び浮遊した。Ｔ−細胞株は、ＣＥＡ−提示、放射線照射された樹枝状細胞１×１０５細胞／ウェルで再び刺激した。３日後、細胞にインターロイキン−２（Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）２０Ｕ／ｍｌを供給した。細胞は、４日後に回収して再び刺激した。２１日目にＴ−細胞株を収得した後、その特異性を分析した。
【００４３】
クロム遊離アッセイによる細胞毒性検査
ＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞で３週間刺激した後、４時間のクロム遊離アッセイを使用して、培養されたＴ−細胞株の殺害能活性を測定した。エフェクター細胞を１回洗浄し、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩに再び浮遊した。ターゲットとして用いられたＣＥＡ−発現結腸細胞株を、ＭＨＣ  ｃｌａｓｓＩ分子の発現を強化するために、γインターフェロン（γ−ＩＦＮ；Ｇｅｎｚｙｍｅ社製）１００Ｕ／ｍｌの存在下で２日間培養した。これらペプチドローディングされたＬＣＬ及びＴ２細胞株を、ＣＥＡ−特異的な細胞毒性活性及びＮＫ（ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ）細胞活性を有するＫ５６２細胞を測定するために使用した。全てのターゲット細胞は、３７℃で１時間の間、１０％のＦＢＳを含むＲＰＭＩ０．２ｍｌで５１Ｃｒ１００μＣｉで標識した。４回洗浄した後、ターゲット細胞をカウントし、５×１０３／ウェルで９６−ウェルＶ−ｂｏｔｔｏｍプレートに３回接種した。エフェクター細胞は、指定されたＥ／Ｔ（ｅｆｆｅｃｔｏｒ−ｔｏ−ｔａｒｇｅｔ）の割合で添加した。１２００ｒｐｍで２分間遠心分離した後、プレートを４時間の間３７℃で培養した。上層液を回収し、５１Ｃｒ含量を測定した。％ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｒｅｌｅａｓｅ（ＳＲ）は、式：（ｃｐｍ  ｏｆ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ−ｃｐｍ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ）／（ｃｐｍ  ｏｆ  ｍａｘｉｍａｌ  ｒｅｌｅａｓｅ−ｃｐｍ  ｏｆ  ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｒｅｌｅａｓｅ）×１００を使用して計算した。
【００４４】
図１０は、ＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞と反応して成長するＴ−細胞株の細胞毒性を測定した結果を示している。ターゲット細胞は、Ｋ５６２、自家組織（ａｕｔｏ）または同種異系（ａｌｌｏ）ＬＣＬ（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）、及びＨＬＡ−Ａ２−発現Ｔ２細胞株であった。ＨＬＡ−Ａ２−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄペプチドＹＬＳＧＡＮＬＮＬ、指定されたＣＡＰ−１及びＨＬＡ−Ａ２４−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄペプチドＴＹＡＣＦＶＳＮＬ、指定されたＣＥＡ６５２がターゲット細胞感作のために用いられた。ＣＥＡ６５２ペプチドは、コントロールとして使用した。５１Ｃｒ−標識されたターゲット細胞は、指定された最終エフェクター：ターゲットの割合でエフェクター細胞と培養した。ターゲット細胞の溶解百分率は、標準５１Ｃｒ遊離アッセイを使用して３回測定した。図面において、Ｔ−細胞株は、ｔｙｐｅ；ＨＪ（ＨＬＡ  ｔｙｐｅ：Ａ２；Ｂ７、６１）、ＨＢ（ＨＬＡ  Ｔｙｐｅ：Ａ２；Ｂ５４、１５）、及びＳＨ（ＨＬＡ  Ｔｙｐｅ：Ａ２、２６；Ｂ４４、４０）で示される。
【００４５】
図１０から分かるように、これらＴ-細胞株の細胞毒性活性は、４０：１のＥ／Ｔ割合でＣＡＰ−１感作した自家組織ＬＣＬ及びＴ２ターゲット細胞株に比べて４３％高かった。しかしながら、如何なるＣＴＬ反応も、ＣＡＰ−１感作した同種異系ＬＣＬまたはＣＥＡ６５２ペプチド−感作した自家組織ＬＣＬ及びＴ２細胞株に対して観察されなかった。
【００４６】
また、図１１は、ＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞と反応して成長するＴ−細胞株の細胞毒性を測定した結果を示している。このとき、ＨＬＡ−Ａ２−ネガティブ（ＬＯＶＯ）またはＨＬＡ−Ａ２−ポジティブ（ＳＷ４８０及びＳＷ４０３）のＣＥＡ−発現結腸癌細胞株が、ターゲット細胞として用いられた。ターゲット細胞の溶解百分率は、標準５１Ｃｒ遊離アッセイを使用して３回測定した。Ｔ−細胞株は、ｔｙｐｅ；ＨＪ（ＨＬＡ  Ｔｙｐｅ：Ａ２；Ｂ７、６１）、ＨＢ（ＨＬＡ  Ｔｙｐｅ：Ａ２；Ｂ５４、１５）及びＳＨ（ＨＬＡ  Ｔｙｐｅ：Ａ２、２６；Ｂ４４、４０）のドナーから生成された。
【００４７】
図１１から分かるように、Ｔ細胞株は、ＨＬＡ−Ａ２−ネガティブ腫瘍細胞を溶解しない反面、特異的にＨＬＡ−Ａ２−ポジティブ腫瘍細胞（４０：１のＥ／Ｔ比率で２０％以上）を溶解した。
【００４８】
実施例６：動物モデルによる腫瘍予防能確認
Ｃ５７ＢＬ／６雌の６週齢マウス（８匹／グループ）の皮下層に、ＡｄＶＣＥＡ及びＡｄＶＧＦＰをそれぞれＭＯＩ５００で感染させた樹枝状細胞１×１０６、ＣＥＡペプチドに反応させた樹枝状細胞１×１０６、単独の樹枝状細胞１×１０６（２００μｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）を１週間の間隔で２回免疫させた。組み換えウイルス単独の効果を調査するために、ＡｄＶＣＥＡ及びＡｄＶＧＦＰをＭＯＩ５００と同一量で皮下層に２回注射し、対照群は、ＰＢＳで２回注射した。２回免疫させてから１週間後、マウスの反対側皮下層に、ＭＣ３８／ＣＥＡ２腫瘍細胞を１×１０６（２００μｌ  ｉｎ  ＰＢＳ）で注射した。腫瘍の大きさは、キャリパー（ｃａｌｉｐｅｒ）測定器によって測定した。腫瘍の体積は、次の計算式を用いて確認した。長軸×短軸＝ｍｍ２。この実験は、２回繰り返して同一の結果を得た。
【００４９】
図１２から分かるように、ＡｄＶＣＥＡ／樹枝状細胞は、８匹の全てが腫瘍を防御し、その効果を１２週間持続した。ＣＥＡ-ｐｅｐｔｉｄｅ／樹枝状細胞とＡｄＶＧＦＰ／樹枝状細胞の場合、８匹のうち４匹が腫瘍を制御し、樹枝状細胞単独の場合、８匹のうち３匹が腫瘍を制御した。ＡｄＶＣＥＡ単独、ＡｄＶＧＦＰ単独、ＰＢＳの場合、８匹の全てにおいて腫瘍が生成された。
【００５０】
実施例７：動物モデルによる腫瘍治療能確認
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１０匹／グループ）の皮下層にＭＣ３８／ＣＥＡ２細胞株を５×１０５で注射した後、直径３ｍｍの腫瘍マスが表れるとき、一週間の間隔で２回治療した。
【００５１】
実験群としては、ＡｄＶＣＥＡ／樹枝状細胞、ＡｄＶＧＦＰ／樹枝状細胞、ＣＥＡ−ｐｅｐｔｉｄｅ／樹枝状細胞、樹枝状細胞単独、ＡｄＶＣＥＡ単独、ＡｄＶＧＦＰ単独などを使用し、対照群としてはＰＢＳを使用した。一週間の間隔でマウスの生存率を調査した。この実験は、２回繰り返して同一の結果を得た。
【００５２】
図１３から分かるように、多様な実験群の結果中、ＡｄＶＣＥＡ／樹枝状細胞は、最も優れた生存率を示し、腫瘍マスも最も少なく表れた。すなわち、樹枝状細胞単独のワクチンや、ＣＥＡ腫瘍抗原蛋白質を発現する組み換えアデノウイルスを単独で使用したとき、一層良い効果が示された。
【産業上の利用可能性】
【００５３】
上述したように、本発明では、腫瘍関連抗原としてＣＥＡを使用し、ＣＥＡに特異的な細胞毒性Ｔ細胞を誘導するので、これに基づいて、一つの腫瘍に限定されず、多様な腫瘍に特異的なワクチン及び治療物質を開発することができる。
【００５４】
また、本発明によると、抗原提示細胞として樹枝状細胞を使用することで、免疫に関係する細胞性及び体液性免疫物質を全て誘導できるので、腫瘍の治療効果に優れている。
【００５５】
特に、本発明によると、ＣＥＡに特異的な細胞毒性Ｔ細胞をインビトロで誘導することで、生体内誘導に比べて、一層効果の優れた腫瘍ワクチン及び細胞性免疫治療法として活用することができる。
【００５６】
さらに、本発明を従来の化学療法及び放射線療法と並用する場合、複合治療法として優れた効果を得られ、癌の再発及び微小転移を防止できるので、完壁な治療法として機能することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】多様なＭＯＩにおけるアデノウイルスベクターの形質導入効率を示すグラフである。
【図２】アデノウイルス−感染した樹枝状細胞の表面マーカー発現を示すグラフである。
【図３】組み換えＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞におけるＣＥＡ発現率を示すグラフである。
【図４】ＣＥＡの発現に対するウェスタンブロット分析の結果である。
【図５】ＡｄＶＣＥＡで形質導入された樹枝状細胞の免疫蛍光染色結果を示す写真である。
【図６】組み換えＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞における細胞死滅程度を分析したグラフである。
【図７】組み換えＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞における細胞死滅程度を分析したグラフである。
【図８】組み換えＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞における細胞死滅程度を分析したグラフである。
【図９】ＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞の刺激能力を調査するために増殖アッセイを行った結果を示すグラフである。
【図１０】ＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞と反応して成長するＴ−細胞株の細胞毒性を、ターゲット細胞としてＫ５６２、自家組織（ａｕｔｏ）または同種異系（ａｌｌｏ）ＬＣＬ（ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ）及びＨＬＡ−Ａ２−発現Ｔ２細胞株を使用して評価した結果を示すグラフである。
【図１１】ＨＬＡ−Ａ２−ネガティブ（ＬＯＶＯ）またはＨＬＡ−Ａ２−ポジティブ（ＳＷ４８０及びＳＷ４０３）のＣＥＡ−発現結腸癌細胞株をターゲット細胞として、ＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞と反応して成長するＴ−細胞株の細胞毒性を示すグラフである。
【図１２】本発明によるＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞の腫瘍予防効果を測定するために、動物モデルを使用して実験した結果を示すグラフである。
【図１３】本発明によるＡｄＶＣＥＡ−感染した樹枝状細胞の腫瘍治療効果を測定するために、動物モデルを使用して実験した結果を示すグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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