(57)【要約】  細胞を殺すために使用する試験物質をスクリーニングする方法であって、試験物質とプロテアソームとを接触させ、そしてプロテアソームの構造の変化をもたらす試験物質とプロテアソームとの相互作用を検出することを含む。このようにして同定された物質は、癌ならびにウイルス感染細胞および細菌の処置において有用であり、そして本発明のさらなる態様を形成する。
2008539716.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験物質とプロテアソームとを接触させ、そしてプロテアソームの構造の変化をもたらすそれらの間の相互作用を検出することを含む、細胞を殺すために使用する試験物質をスクリーニングする方法。
【請求項２】
試験物質と損傷を受けていないプロテアソームとをインビトロで接触させ、そしてそのプロテアソームとの相互作用を検出することにより行なう、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プロテアソームがヒト赤血球20Sプロテアソームである、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
プロテアソームが、選択的であるが可逆的なプロテアソーム阻害物質の存在下でプレインキュベーション工程に付される、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
試験物質とプロテアソームとの間の相互作用が、プロテアソーム構造の断片化の検出により検出される、請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
プロテアソーム構造の変化が、ゲル分離方法を用いて検出される、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
プロテアソームのα6サブユニットの変化を生じさせる物質が選択される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
試験物質を、インビトロで細胞とインキュベーションし、そして細胞内での試験物質の位置を観測する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
細胞を、共焦点顕微鏡検査を用いて観測する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
試験物質を、蛍光標識を用いて標識する、請求項８または９に記載の方法。
【請求項１１】
プロテアソームのための標識結合剤を、物質と共に投与し、そして細胞内での相対的な位置を観察する、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
結合剤が、プロテアソームの触媒性コアに特異的である標識化抗体である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
細胞を殺すために使用する試験物質をスクリーニングする方法であって、以下の工程：
（ａ）少なくとも部分的なプロテアーゼ抵抗性を検出するために、試験物質をプロテアーゼと接触させる工程；
（ｂ）試験物質を、インビトロでプロテアソームと接触させて、それらの間の相互作用を検出するか；またはインビトロで細胞と接触させて、試験物質がその中のプロテアソームと共局在化するかどうかを測定する工程；および
（ｃ）工程（ａ）においてプロテアーゼ抵抗性であることが見出され、そして工程（ｂ）を基にして、プロテアソームと相互作用するか、または細胞中でのプロテアソームと共局在化する、物質を選択する工程、
を含む、上記の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）が、試験物質を、哺乳類の蛋白分解酵素である少なくとも１つのプロテアーゼと共にインキュベーションすることにより行われる、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
蛋白分解酵素が、キモトリプシンまたはトリプシンである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
工程（ａ）において、プロテアーゼ抵抗性が、分解の結果生成するタンパク質断片を検出することにより検出される、請求項１３〜１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１７】
細胞のプロテアソームと相互作用し、細胞を殺すために使用するそれに構造的変化をもたらす薬剤であるが、ただし該薬剤は、HAMLETもしくはその既知の生物学的活性修飾物質、またはそれらのいずれかの生物学的活性断片以外のものである、上記の薬剤。
【請求項１８】
プロテアソームの構造変化がプロテアソームの断片化である、請求項１７に記載の薬剤。
【請求項１９】
薬剤が、細胞のプロテアソームを活性化するが、上記プロテアソームによる分解には抵抗性である、請求項１７または１８に記載の薬剤。
【請求項２０】
少なくとも部分的に変性されたまたは誤って折り畳まれたタンパク質（α−ラクトアルブミンまたはその変異体以外のもの）を含む、タンパク質またはタンパク質複合体である、請求項１７〜１９のいずれかに記載の薬剤。
【請求項２１】
腫瘍または未分化細胞に特異的な標的化試薬を含む、請求項１７〜２０のいずれかに記載の薬剤。
【請求項２２】
さらに転位因子を含む、請求項１７〜２１のいずれかに記載の薬剤。
【請求項２３】
タンパク質またはペプチドである、請求項１７〜２２のいずれかに記載の薬剤。
【請求項２４】
癌の治療において使用するための、請求項１７〜２３のいずれかに記載の薬剤。
【請求項２５】
請求項２３に記載の薬剤をコードする、核酸。
【請求項２６】
請求項２５に記載の核酸を含む、発現ベクターまたはプラスミド。
【請求項２７】
医薬的に受容可能なベクターである、請求項２６に記載の発現ベクターまたはプラスミド。
【請求項２８】
医薬的に受容可能な担体と組み合わせた、請求項１７〜２４のいずれかに記載の薬剤を含む、医薬組成物。
【請求項２９】
請求項２７に記載の発現ベクターまたはプラスミドを含む、医薬組成物。
【請求項３０】
請求項１７〜２４のいずれかに記載の薬剤の有効量、または請求項２７に記載の発現ベクターまたはプラスミドを、細胞内に導入することを含む、細胞を殺す方法。
【請求項３１】
請求項２６に記載のベクターを用いて形質転換した細胞。
【請求項３２】
癌の治療のための医薬の製造における、請求項１７〜２４のいずれかに記載の薬剤、または請求項２７に記載の発現ベクターまたはプラスミドの使用。
【請求項３３】
実質的に上記で記載された、細胞を殺すのに使用する試験物質をスクリーニングする方法。
【請求項３４】
細胞を殺すのに使用する、請求項１〜１６のいずれかに記載の方法を用いて同定された、薬剤。
【請求項３５】
実質的に上記で記載された、細胞を殺すのに使用する、請求項１７に記載の薬剤。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化合物をスクリーニングし、細胞、特に腫瘍細胞に対しての、そしてそれだけではなく細菌細胞またはウイルス感染細胞に対しての、それらを殺す能力を評価する方法、ならびに、治療、例えば腫瘍の治療において使用するための、細胞を殺す新規な薬剤、に関する。
【背景技術】
【０００２】
HAMLET（腫瘍細胞致死的ヒトα−ラクトアルブミン）（Human α−lactalbumin made lethal to tumor cells）は、腫瘍細胞における細胞死を誘導する分子複合体である。実際、その作用は、腫瘍細胞およびいくつかの未成熟細胞に選択的であり、そして健常で分化した細胞では、HAMLETに応答する細胞死は起こらない。この選択性は、HAMLETが腫瘍細胞における独特の標的に到達することを示唆しているが、このことは抵抗性細胞ではそうはならない。
【０００３】
本願で用いられる場合、「HAMLET」という表現は、α−ラクトアルブミン（起源がヒトであってもなくてもいい）の生物学的に活性な複合体を意味し、これは、EP-A-0776214の実施例に記載されたように陰イオン交換およびゲルクロマトグラフィーを組み合わせて、pH4.6で沈殿した乳のカゼイン画分から分離して得られるか、または、α−ラクトアルブミンを、WO99/26979で記載されたように、C18：1脂肪酸として特徴付けられるヒト乳カゼイン由来の補因子の存在下で、イオン交換クロマトグラフィーに付することにより得られる。同様の活性を有するこの複合体の生物学的に活性な変異体または誘導体は、例えば国際特許出願番号第PCT/IB03/01293号の実施例に記載されている。
【０００４】
HAMLETは、インビトロで多くの異なった腫瘍細胞においてアポトーシス様細胞死の引き金になる。白血病細胞が最も感受性が高いが、癌腫、黒色腫およびグリア芽腫細胞株も全て、アポトーシス様特徴を有しながら、HAMLETにより破壊される。成熟した分化細胞は、それらの生存性および損傷を受けていない細胞の形態により示されるように、HAMLETに抵抗性であり、そして胎芽細胞は部分的な応答を示す。HAMLETの広範な抗腫瘍活性は逆説的で、正常細胞を死に至らすアポトーシスのシグナルに対して腫瘍細胞はしばしば抵抗性である。腫瘍細胞は、p53およびbcl−2遺伝子ファミリーを含む古典的アポトーシスに関与する主要シグナル伝達経路を破壊する突然変異を有するが、HAMLETの作用はそれらの経路とは別のものであり、このことは、HAMLET複合体が、腫瘍細胞では活性が維持されるが成熟した分化細胞では失われている、根本的な細胞死プログラムを識別する能力を有することを示唆している。最近になって、HAMLETは、ヒトのラットグリア芽腫の異種移植モデルにおいてインビボでも腫瘍細胞の選択的なアポトーシスの引き金となることが示され、そして、プラセボ対照比較臨床試験において、HAMLETの皮膚乳頭腫への局所適用が、その病変を縮小させまたは除去することが示された。
【０００５】
HAMLETの細胞性標的は、共焦点顕微鏡検査および細胞下分画法を組み合わせて調べられた［Hakansson等, 1999 Exp Cell Res. 246, 451-60］。HAMLETは細胞表面に結合し、そして細胞質に入り、そこでミトコンドリアと相互作用をして活性化する。最終的に、このタンパク質は細胞核に入り、そこで集積する。
【０００６】
本出願人は、抵抗性および感受性細胞がHAMLETをそれらの表面に同じような効率で結合させることを見出し、このことはこのことが識別化のための事象ではないことを示唆している。反対に、核への集積は、死につつある細胞でのみ起こり、このことはこの段階により感受性細胞が抵抗性細胞から識別されることを示唆している。共焦点顕微鏡検査により、核への集積は不可逆的であるようにみえ、このことは、核区画においてHAMLETと結合し保持する核標的の存在を示唆している。
【０００７】
本出願人は、HAMLETの核内分布のより詳しい調査を行い、このタンパク質が核小体に対応する領域に最も強く局在化することを発見し、このことはHAMLETが染色質構造の制御に関与している分子と相互作用をすることを暗示している。
【０００８】
さらなる試験の結果、HAMLETの核標的が同定された。驚くべきことに、HAMLETは特定のヒストンタンパク質およびヌクレオソームと相互作用をすることが判明した。したがって、この相互作用は細胞を不可逆的に死に至る経路に固定する事象であるようだ。
【０００９】
しかしながら、さらなる機構が今回現われ、これはさらなる治療剤および治療機会に導くさらなるスクリーニング方法を生じさせるものと信じられている。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は、細胞の殺傷に使用するための試験化合物をスクリーニングする方法を提供し、該方法は、試験化合物とプロテアソームとを接触させ、そして、プロテアソームの構造の変化をもたらすそれらの間の相互作用を検出することを含む。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
この試験の要件を満たすために、試験物質は、プロテアソーム（時にはプロテオソームと呼ばれる）と、このプロテアソームの構造変化がもたらされるように、相互作用ができなければならない。一般に、これらの変化はプロテアソームの断片化を含むだろう。そうした差異は、インキュベーションの後のプロテアソームの構造を調べることにより、適切に測定される。
【００１２】
このタイプの構造試験は、一般に、慣用のゲル分離方法を用いて行われる。いかなるバンドの有意な移動も、バンドサイズの変化の表れも、または新規なバンドの形成も、試験物質が、プロテアソームと構造変化をもらすように相互作用をしていることを示すだろう。
【００１３】
本発明の方法は、様々なやり方で行うことができる。例えば、この方法は、試験物質をプロテアソームとインビトロで接触させ、そしてそれらの間の相互作用を検出することで、行うことができる。その代わりにまたは追加的に、この方法は、試験物質を細胞とインビトロで接触させ、そしてこの試験物質がそこでプロテアソームと共局在化するかどうか、および相互作用するかどうか測定することにより、実施することができる。
【００１４】
一つの実施態様において、この方法は、試験物質をインタクトなプロテアソームとインビトロで接触させることにより、達成される。適切なプロテアソームには、例えばヒト赤血球20Sプロテアソームのような、20Sプロテアソームが含まれる。用いるプロテアソームの濃度は、試験の感度に影響を与え、そして一般に、50から500μg／mLの範囲、例えば150μg／mLであるだろう。
【００１５】
接触は通常、生理的に受容できるpH、例えば7.2の緩衝液の存在下で達成されるだろう。プロテアソームは、MG132（Z−Leu−Leu−Leu−CHO、アフィニテイ・リサーチ）のような、選択的ではあるが可逆的なプロテアソーム阻害物質の存在下で、適切に、プレインキュベーション工程に付されるだろう。
【００１６】
特に好ましい実施態様において、この物質はプロテアソームのα6サブユニットの変化を生じさせる。これは、このサブユニットが核局在化配列（NLS）を有するからである。核局在化配列の正確なアミノ酸配列は異なっているであろうが、一般にはリシンに富んだ領域である。一つの特定のNLS配列（KKVKKK）は、20Sプロテアソームのアミノ酸181〜186に対応する。
【００１７】
このNLSの露出は、プロテアソームが、細胞の殺滅を最も効率よく行える細胞核中に、物質を運搬できるようにするために、重要であると信じられている。以下に記載するように、この効果は、腫瘍殺滅活性を有することが知られているHAMLETの作用様式とは明らかに異なっている。
【００１８】
別法として、試験物質はインビトロで細胞とインキュベーションでき、そして細胞内での試験物質の位置を、例えば共焦点顕微鏡を用いて観測できる。この実施態様において、試験物質は、例えば添加前に、蛍光標識のような可視性標識を用いて適切に標識される。同様に、プロテアソームのための標識化結合剤、例えば標識化抗体またはその結合性断片を物質と共に投与し、そして細胞内の相対的な位置を観察する。プロテアソームのための特に適切な結合剤は、プロテアソームの触媒性コアに特異的である。
【００１９】
結合剤上の標識は、試験物質の標識と同一でも異なっても良い。適切には、両方とも蛍光で標識される。
【００２０】
特に、上記のように、プロテアソームと相互作用する化合物ではあるが、プロテアーゼ酵素には相対的に抵抗性であり、HAMLETタイプの活性をさらに模倣するような、化合物を検出することが有用だろう。
【００２１】
特に好ましい実施態様では、本発明は細胞を殺すために使用する試験物質をスクリーニングする方法を提供するもので、この方法は以下の工程を含んでいる：
（ａ）少なくとも部分的なプロテアーゼ抵抗性を検出するために、試験物質をプロテアーゼと接触させる工程；
（ｂ）試験物質を、インビトロでプロテアソームと接触させて、それらの間の相互作用を検出するか；またはインビトロで細胞と接触させて、試験物質がその中のプロテアソームと共局在化するかどうかを測定する工程；および
（ｃ）工程（ａ）においてプロテアーゼ抵抗性であることが見出され、そして工程（ｂ）を基にして、プロテアソームと相互作用するか、または細胞中でのプロテアソームと共局在化する、物質を選択する工程。
【００２２】
工程（ａ）および（ｂ）はいかなる順序で行っても良い。工程（ｂ）で陽性の結果を与えなかった物質は、他の工程を行うことなく廃棄されるだろう。
【００２３】
工程（ａ）は、物質を、標的となる動物種、例えば哺乳類、特にヒトの蛋白分解酵素である少なくとも１つのプロテアーゼとインキュベーションすることによって、適切に実施される。哺乳類のプロテアソームは、５つまでの異なったペプチダーゼ活性を示し、それには、優先的に、疎水性、塩基性および酸性残基のカルボキシ末端でペプチドを開裂する活性（一般にキモトリプシン様もしくはトリプシン様活性と呼ばれる）、または、ペプチジルグルタミル−ペプチド加水分解活性を含んでいる。
【００２４】
適切な酵素には、キモトリプシンのような蛋白分解性ペプチダーゼもしくはキモトリプシン様活性を有する酵素、トリプシン様活性を有するトリプシン、またはペプチジルグルタミル−ペプチド加水分解活性を有する酵素が含まれる。特に、この酵素はキモトリプシンまたはトリプシンである。
【００２５】
適切には、この物質を、抵抗性の状態を裏付けるために、１より多いそうした酵素、例えばキモトリプシンおよびトリプシンとインキュベーションする。
【００２６】
工程（ａ）で用いる酵素の量は、酵素、試験中の物質等の正確な性質に依存して変化しうる。典型的には、用いる酵素の濃度は、質量比で1/20から1/200の範囲であろう。例えば、トリプシンは質量比でE/S 1/50で、そしてキモトリプシンは質量比でE/S 1/100で、用いられる。
【００２７】
インキュベーションは、適切には生理的に受容可能な温度、例えば37℃で行うことができる。
【００２８】
試験物質が工程（ａ）の要件を満たすためには、これがプロテアーゼに少なくとも部分的に抵抗性を示さなければならない。それゆえに適切には10分未満、そして好ましくは少なくとも１時間は完全には分解されないであろう。
【００２９】
分解は、それぞれの場合に、タンパク質断片を検出することによって測定できる。これは、慣用の方法、例えば、ゲル上でのタンパク質の分離（例えば、ゲル電気泳動、および特にSDS PAGEを用いたもの）、またはウエスタン・ブロッテング、を用いて行うことができる。
【００３０】
上記の工程（ｂ）は、本発明の方法に関連して、上記のように実施されるだろう。
【００３１】
このようにして同定された試験物質が抗癌剤として良い候補である理由は、これらがHAMLETの挙動を模倣することである。しかしながら、これらは加えて、望ましくない細胞、例えばウイルス感染細胞または肺炎球菌のような細菌を殺すためにも使用しうる。
【００３２】
上記の方法で使用されるための適切な試験物質には、化学的化合物、ならびにタンパク質またはペプチドが含まれる。これらは、化合物のコレクションもしくはライブラリーから得ることができ、またはスクリーニング工程のために合成することもできる。
【００３３】
特に好ましい試験物質は、タンパク質またはタンパク質複合体であり、そして特に、変性（unfolded）状態での、内因性のタンパク質を含むだろう。
【００３４】
細胞の品質制御系がタンパク質合成を精査し、誤って折り畳まれたまたは変性した生成物を除去する。新たに合成されたタンパク質は校正され、次いで折り畳みに欠陥のある分子種はプロテアソーム中での分解の標的となる。より大きい26Sプロテアソーム複合体はユビキチン化タンパク質のATP依存性分解を触媒し、これがプロテアソーム複合体の樽形の20Sコアへと供給される。さらに、この20Sプロテアソームは、認識のためのユビキチン標識を必要としない変性タンパク質を分解する。内因性の誤って折り畳まれたタンパク質の不適切な除去は、増殖停止およびアポトーシスを伴う変性タンパク質応答（unfolded protein response（UPR）)を活性化しうるけれども、細胞外環境から細胞へ到達して近づく、変性タンパク質を分解するために用いられる機構は論じられていなかった。
【００３５】
本出願人は、HAMLETに対する死に至る応答が、タンパク質の変性状態、およびプロテアソームによる認識に関連しているかどうかを研究した。その結果は、プロテアソームの乱れ（frustration）および変性タンパク質の過剰負荷が、HAMLETに応答する腫瘍細胞死の本質的な様相であることを示唆している。
【００３６】
成熟し、折り畳まれたタンパク質は、それらがその機能を発揮する細胞外環境へと分泌できる。しかしながら、三次立体配置の変化が移動環境シグナルに応答して生じ、そして変性ポリペプチド鎖は新たなドメインの露出と機能の多様性を達成する機構として認識される。本出願人は、変性タンパク質の取り込みが、内因性の誤って折り畳まれたタンパク質を除去する細胞性機構を混乱させることにより、腫瘍細胞の死を引き起こすことを見出した。腫瘍細胞の死は、HAMLET、すなわち部分的に変性したα−ラクトアルブミンおよび脂肪酸補因子の複合体により引き起こされた。
【００３７】
20Sプロテアソームは活性化されるが、HAMLET複合体は分解が遅く、そして代わりにこのプロテアソームが構造的に変化した。核局在化配列（NLS）が露出し、腫瘍細胞は、染色質構造のプロテアソーム依存性変化が生じる核への、HAMLETと活性化プロテアソームの移動により応答した。かくして、HAMLETの分解の失敗および乱れたプロテアソーム応答は、核の集積および腫瘍細胞の死をもたらした。この20Sプロテアソームの外来性の変性タンパク質に対する防御の役割はこれまで記載されてはいなかった。このことは、プロテアソームの「乗っ取り（highjacking）」が、細胞外環境から細胞に進入するものを含めて他の変性タンパク質への細胞性応答に関連するものである可能性を示しているようだ。
【００３８】
変性タンパク質応答（UPR）は、望ましくないタンパク質の集積に対して、細胞を生き残らせるための機構として進化してきた。内在性の、変性タンパク質の生理的な除去は、細胞質ゾル中のERが関与する分解により、シャペロンおよびフォルダーゼ（foldase）により、ならびに転写および翻訳への作用を介したタンパク質合成の阻害により、達成される。増殖停止は、ユビキチン系の不活性化および26Sプロテアソームを介した細胞周期タンパク質のリサイクルの機能障害から生じるだろう。26Sプロテアソームの不具合はまた、IκBインヒビターの阻害された分解によって、NF−kB依存性の転写活性を損なうであろう。しかしながら、もし変性タンパク質の負荷が正常なERホメオスタシスの臨界的なレベルを超えた場合は、プロテアソームのストレスが細胞死を導くようだ。
【００３９】
細胞死応答は、ER中のカスパーゼ−12活性化を介して、または、ミトコンドリア、カスパーゼおよびbcl−2/p53遺伝子ファミリーを含む、従来のアポトーシスを介して実行される。
【００４０】
UPRの致死の相（lethal phase）は、タンパク質が折り畳みに不具合を生じそしてプロテオソームの分解に接近できない場合に活性化される。誤った折り畳みは、タンパク質の二次構造を変化させそして折り畳み能力を永久的に損なう突然変異から、またはUV照射もしくは化学的傷害からもたらされるだろう。
【００４１】
しかしながら、α−ラクトアルブミンは突然変異型でも傷害を受けたタンパク質でもなく、乳腺から天然型の折り畳まれたタンパク質として分泌されている。HAMLETは細胞外で形成されうるもので、そしてHAMLETが腫瘍細胞の細胞質へと侵入し、そこで腫瘍細胞は変性形態のα−ラクトアルブミンに曝される。本願で報告される研究成果は、HAMLETが、内在性の変性タンパク質を分解する細胞性機構により、変性タンパク質として識別されたことを示している。HAMLETに対する応答はUPRの多くの特徴を示すが、大きな差異もまた認められた。HAMLETは、他の変性タンパク質と同様に、20Sプロテアソームを標的としているが、HAMLETは、変性α−ラクトアルブミンより分解に対してより抵抗性であった。HAMLET処理細胞は、ERの膨潤、熱ショック応答および破棄された翻訳物を含むERに関連する変化を示していた（データは示さない）。
【００４２】
HAMLETはミトコンドリアの応答およびカスパーゼ依存性の染色質変化を引き起こすことが示されてきたが、カスパーゼ阻害物質の存在下でも生存することで示されているように、HAMLETは従来型のアポトーシスにより腫瘍細胞を殺すのではない。さらに、腫瘍細胞のHAMLET感受性は、抗アポトーシス性bcl−2ファミリーメンバーの過剰発現により、または変異体p53発現により変化しない。したがって、この結果は、HAMLETが、20Sプロテアソームの活性化、およびプロテアソーム依存性機能の破壊が関与する新たな機構を介して細胞死を引き起こすことを示唆している。
【００４３】
哺乳類のプロテアソームは、1または２個の19S制御性粒子と連合しているであろう20Sコア粒子（700kD）から成っている。触媒ユニットは、４つの積み重なった輪であって、各輪につき７個のサブユニット（α1-7、β1-7、β1-7、α1-7）から構成されている円筒であり、そして触媒チャンバーは２つの内部のβ輪から形成され、その各々は３つの活性蛋白分解部位を含んでいる。細胞周期制御および染色質ホメオスタシスに関与するタンパク質の不適切な監視のために、プロテアソームの阻害はUFR様状態を生じさせる。本願の研究は、20Sプロテアソームが変性形態のα−ラクトアルブミンを分解することを示したインビトロ研究に基づいて、20Sプロテアソームへ焦点を合わせた。この結果は、HAMLET中の変性α−ラクトアルブミンの20Sプロテアソームへの親和性を、インビボの腫瘍細胞中で確認し、このことはプロテアソームがHAMLETを変性α−ラクトアルブミンとして認識することを示唆している。
【００４４】
HAMLET複合体の分解の欠陥は、未分解のHAMLETの滞荷を生じさせ、そして、プロテアソームコアを占有し、変性タンパク質の長びく負荷を引き起こし、他の変性タンパク質が酵素的部位に接近することを妨害する。したがって、HAMLETは、酵素活性の阻害を介するというよりは、占有を介して、20Sプロテアソームの機能に干渉するのであろう。しかしながら、HAMLETはプロテアソーム阻害物質としては作用しなかったが、プロテアソーム活性は細胞死に必須であることが示された。我々は、UPRの機能およびHAMLETに対する細胞死応答が、プロテアソーム阻害物質により開始させられる応答とは異なると結論付ける。
【００４５】
HAMLETは20Sプロテアソーム中の構造の修飾を促進することが示された。20Sプロテアソーム断片化の証拠が、インビトロでHAMLETを用いたインキュベーションの数分後に得られた。以前に、αサブユニットの微小な構造変化は記載されていた。トリパノソーマ・ブルセイ（Trypanosoma brusei）の構造研究は、11Sアクチベーターが、αサブユニットの修飾によって、プロテアソームの入り口孔を開くことを示唆している。酵母のプロテアソームでの機能研究では、α3サブユニットのＮ末端の削除がプロテアソームのペプチダーゼ活性を消失させそして残余の孔の残基を障害するために十分であったので、この作用が確認できた。本研究において、α3サブユニットの構造の修飾が検出され、このことはHAMLETがこのサブユニットに、おそらくＮ末端の削除とそれによる孔開口と蛋白分解の阻害により、直接作用を引き起こしているのであろうということを示唆している。さらに、構造性のα1およびα3サブユニットは、触媒性のβ1およびβ5サブユニットのように、修飾されていた。タンパク質のサイズの顕著な減少が、PAGEおよびウエスタン・ブロッテングにより、サブユニット中で検出された。細胞性アゴニストに応答するプロテアソーム断片化はこれまで記載されたことはない。我々は、HAMLETがインビボでプロテアソーム断片化を引き起こし、そしてこのことが細胞死への重要な道筋であろうということを示唆する。
【００４６】
プロテアソームは、細胞質および核の両方で見出され、そして細胞周期の進行の間にそれらのコンパートメントの間を行き来する。以前の研究ではプロテアソームがアポトーシス性刺激に応答して核から離れることを示唆していたが、本研究により、HAMLETおよびプロテアソームが核へと移動することが示された。HAMLETおよび20Sプロテアソームのこの核への転位の可能性のある機構を検討できる。様々なプロテアソームのサブユニットが、NLSのKKXKモチーフ、ならびにこのNLSに相補的な想定されるモチーフを含み、そして核への転位を制御できるだろう。HAMLETによるプロテアソーム断片化が、α6サブユニット中のNLSモチーフを露出させると提案されている。この断片は、HAMLET／プロテアソーム複合体との密着を維持でき、そしてさらにHAMLETとプロテアソームの核転位に寄与する。核中でのそうした複合体の存在は、共焦点顕微鏡検査により証明され、このことは核集合体中での２つの分子の完全な共局在化を示す。20SプロテアソームのHAMLETの誘導による構造の修飾は、HAMLETおよびプロテアソームの核転位の機構を提供できるようである。
【００４７】
これまで、変性タンパク質の分解の欠陥のみが、疾患の原因として記載されてきていた。アルツハイマー病では、アミロイド原繊維が凝集物を形成しこれが細胞死と組織損傷を引き起こしており、プリオン病も同様の機構で引き起こされることが考えられる。HAMLETに対する細胞性の応答は、これらの誤って折り畳まれたタンパク質に対する応答に似ているが、しかしアミロイド沈着と違ってHAMLETは有益な効果を有している。そうであれば、どのようにしてHAMLETは正常細胞に毒性を有せずに、癌細胞を選択的に殺す物質となりうるのか？最も重要な様相は、変性HAMLETの腫瘍細胞中への侵入およびそれに続くプロテアソームの応答にあるらしい。これに対して、アミロイド原繊維では細胞の型を識別せずに、それらが沈着する部位で区別することなく組織の傷害を引き起こすようである。他の重要な差異は、蛋白分解に対する感受性にあるようだ。プリオンまたはアミロイド沈着と異なって、HAMLETは最終的にはプロテアソーム酵素により分解されており、このことはアポトーシスの指標を伴う死につつある腫瘍細胞およびそれらに負荷されたHAMLETが、マクロファージ依存性機構により捕捉され、そして組織から除去されることを示唆している。これに対して、アミロイド原繊維では、永久的に存続する細胞外沈着が形成され、そしてこの場合の組織傷害または溶解の機構は未だ不明である。
【００４８】
したがって、さらなる局面で、本発明は、細胞のプロテアソームと相互作用し、断片化のような構造変化を引き起こし、細胞を殺すために使用できる薬剤を提供するが、ただし該薬剤は、HAMLETもしくは公知のその生物学的活性修飾物質またはそれらのいずれかの生物学的活性断片以外のものである。とりわけ、この薬剤は、細胞のプロテアソームを活性化するが、該プロテアソームによる分解には抵抗性である薬剤である。
【００４９】
この場合の細胞は、適切には、癌細胞、細菌またはウイルス感染細胞である。
【００５０】
生物学的に活性な複合体を形成するために、α−ラクトアルブミンは、通常、構造または折り畳みの変化、および脂質補因子の存在、の両方を必要とする。立体配置的変化は、適切には、α−ラクトアルブミンからカルシウムイオンを除去することにより行われる。好ましい実施態様では、このことは、α−ラクトアルブミンの機能的なカルシウム結合部位を欠く変異体を用いて、適切に進められる。
【００５１】
このような変異体を含む生物学的活性複合体は、本願中で用いられているように、HAMLETの「公知の生物学的活性修飾物」という表現により包含される。これらは特にWO 99/26979またはWO 03/074547に記載され、クレームされており、これらの内容は参照により本願に組み入れられる。
【００５２】
本願で用いる「変異体」という表現は、元のタンパク質に相同性のあるポリペプチドまたはタンパク質であって、適切にはヒトまたはウシα−ラクトアルブミンであり、ただし由来した元のものとは塩基配列が異なり、その配列中の１またはそれ以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されている。アミノ酸が広義で類似の性質を有する異なったアミノ酸により置換されている場合は、このアミノ酸置換は「保守的な」置換と呼ばれる。非保守的置換とは、アミノ酸が他のタイプのアミノ酸により置換されている場合である。おおまかにいって、そのポリペプチドの生物学的活性を変えることのない、より少ない非保守的置換が可能であろう。適切な変異体は、少なくとも60％の相同性、好ましくは70％の相同性、より好ましくは80％または85％、そして特に好ましくは90％、95％もしくは98％またはそれ以上の相同性を有する。
【００５３】
相同性の程度を決める目的でアミノ酸配列を比較する場合、BESTFITおよびGAP（両者は、ウイスコンシン遺伝学コンピューターグループ（GCG）のソフトウエアパッケージである）が用いられる。例えば、BESTFITは ２つの配列を比較し、最も類似した区分の最適なアラインメントを与える。GAPは、配列をそれらの全長に沿って揃えて、必要な場合はいずれかの配列に空白を挿入して、最適なアラインメントを見出す。適切には、配列の相同性を論じる場合に本発明の文脈に沿って、比較はそれらの全長に沿った配列のアラインメントにより行う。
【００５４】
「その断片」という表現は、完全なα−ラクトアルブミンのアミノ酸配列を含む複合体と類似の活性を有する複合体を形成することが予想される、与えられたアミノ酸配列のあらゆる部分を意味する。
【００５５】
特に、この薬剤は、少なくとも部分的に変性したまたは誤って折り畳まれたタンパク質（α−ラクトアルブミンまたはその変異体以外のもの）を含有する、タンパク質またはタンパク質複合体を含むだろう。このタンパク質は内因性のタンパク質であって良い。好ましくは、これは、例えば、適切な補因子の存在下で、変性状態で安定化されている。HAMLETの場合は、適切な補因子は、ヒト乳のカゼイン含有画分中に見出されるC18：l：9もしくはC18：l：11脂肪酸または同様の立体配置を有する他の脂肪酸のような、脂質または脂肪酸である。特に、この補因子はオレイン酸である。
【００５６】
タンパク質の変性化（unfolding）、例えば、いわゆる「アポ」状態の作成は、慣用方法を用いて実施することができる。例えば、α−ラクトアルブミンのようなタンパク質は、低いpHに曝された場合、立体構造の切り替えが生じる。Ａ状態または融解した球状態は、本来の二次構造を有するが、その本来の状態より良く定められない三次構造を有する。α−ラクトアルブミンの類似の状態はまた、固く結合しているCa2+イオンの除去、ジスルフィド結合の還元または温度の上昇により、中性pHで作成できる。
【００５７】
しかしながら、その代替法として、この薬剤は、内因性タンパク質の突然変異形態を含んでも良く、そこでは、結合部位、例えばカルシウム結合部位またはシステイン結合部位が破壊されており、それによりこのタンパク質の折り畳みは、細胞によって、天然の折り畳み形態のようには認識されない。
【００５８】
他の実施態様においては、この薬剤は、組換え方法により、非天然細胞型の中で生成され、その結果タンパク質の正しくない折り畳みが生じている内因性タンパク質を含む。例えば、真核細胞のタンパク質の原核細胞中での発現は、識別可能なように折り畳まれたタンパク質を生成する可能性があり、このことは異なったグリコシル化方法の結果である可能性がある。したがって、原核細胞（例えば大腸菌）中で発現した、組換えの内因性哺乳類タンパク質は、本発明の薬剤を形成しうる。
【００５９】
所望の活性を有する薬剤を試験するために、先に略記したようなスクリーニング方法をそれらに適用するべきである。
【００６０】
さらにHAMLETの活性を模倣するために、この薬剤はさらに、腫瘍または未分化細胞に特異的な標的化剤、例えば腫瘍特異的抗体またはその結合性断片を含んでも良い。
【００６１】
必要な場合は、これらを細胞内に侵入させる適切な転位因子を含むか、または融合させても良い。転位因子の例には、HIV由来のtatタンパク質、または単純ヘルペスウイルスＩ型の外被タンパク質VP22、またはそれらの機能的な断片もしくは相同体が含まれる（例えばWO 98/32866、およびWO99/11809に記載されたアンテナペディアのホメオドメイン、を参照する）。
【００６２】
本発明のなおさらなる局面によれば、細胞を殺す方法が提供され、該方法は、細胞に、上記の薬剤の有効量を導入することを含む。
【００６３】
この薬剤が、タンパク質またはペプチド、例えば、標的細胞内で所望の折り畳み状態で発現される突然変異型の内因性タンパク質またはペプチドである場合、タンパク質またはペプチドの細胞内発現を実施しても良い。この場合、細胞を、ベクター、例えばこの薬剤をコードする核酸配列を含み細胞中に入り込むことができるプラスミドまたはベクターと接触させ、次いでこの配列を細胞中で発現させる。ベクターの特定の例には、アデノウイルスまたはワクシニアウイルスベクターのようなウイルスベクターを含むことができる。
【００６４】
そうした薬剤をコードする核酸はまた新規であっても良く、そして本発明のさらなる局面を形成できる。このような核酸はベクターの形質転換において用いることができ、この薬剤の細胞内でのインビボでの発現をもたらすために使用される。これらはまた、組換え方法を用いて、薬剤それ自体の生産においても使用できる。
【００６５】
したがって、これらの核酸は、宿主細胞（真核細胞でも原核細胞でも良いが、好ましくは原核細胞）を形質転換するために使用される適切な発現ベクター中に組み込まれるだろう。これらのベクターおよび細胞は、本発明のさらなる局面を形成する。
【００６６】
特に、これらの薬剤は、癌のような症状の治療において適用を見出すだろう。そしてこれらの方法は本発明のさらなる局面を形成する。薬剤が製薬的に受容可能な担体と、適切な投与単位で、当該分野での標準的な手法にしたがって組み合わされた、これらの薬剤を含有する医薬組成物もまた本発明の他の局面を形成する。
【００６７】
ここで、本発明は、以下に記載された添付の図面を参照して、実施例により詳細に記載されるだろう。
【００６８】
図１．HAMLETは腫瘍細胞に侵入する
A549肺癌細胞中でのHAMLET（Ａ, Ｂ）およびα−ラクトアルブミン（Ｃ）の結合および取り込み。（Ｄ）フローサイトメトリーによる定量化。（Ｅ）腫瘍細胞（ヒトグリア芽腫細胞、ヒト腎癌（A498））と正常細胞（星状細胞およびヒト腎細胞（HRTEC））との間でのHAMLET取り込みの差異。細胞は、HAMLETまたはα−ラクトアルブミンの34μMで１時間処理された。共焦点画像はアレキサ・フルオア568標識HAMLET（上部のパネル）を示し、対応する光学透過画像（下部のパネル）を付す。
【００６９】
図２．HAMLET複合体
（Ａ）HAMLETは、ヒト乳由来のα−ラクトアルブミンとオレイン酸の分子複合体である。HAMLETの生成は、強く結合したCa2+イオンを放出したときに、部分的に変性した立体配置を取るというα−ラクトアルブミンの特性に依存している。その結果、このタンパク質は部分的に変性されて、脂肪酸結合部位を露出し、オレイン酸（C18：9, 9シス）との相互作用が可能となり、この部分的に変性したタンパク質の立体配置を安定化する。この構造は、ヒトα−ラクトアルブミン、PDB ID: IHML (54) およびMOLMOL 2K.2 (55)の結晶構造を用いて作成した。（Ｂ）近UV CD分光法。スペクトルを、EDTA不含リン酸ナトリウム緩衝液中で記録した。天然のα−ラクトアルブミン（明灰色）は、チロシン残基に由来する250nmの最小値およびトリプトファン残基に由来する290nmの最大値を有した。部分的に変性したα−ラクトアルブミン（黒色）およびHAMLET（中間的灰色）は、変性タンパク質に特徴的なチロシンおよびトリプトファン領域での楕円率の減少を示していた。（Ｃ−Ｄ)HAMLETは、プロテアソーム酵素による分解に対して部分的に抵抗性である。天然のα−ラクトアルブミン、HAMLETおよび部分的に変性したα−ラクトアルブミンを、インビトロで、プロテアソーム酵素のトリプシンおよびキモトリプシンを用いた蛋白分解反応に付した。断片をSDS−PAGEにより検出した。
【００７０】
図３．HAMLETと20Sプロテアソームの共局在化
（Ａ−Ｃ）A549細胞を34mMのHAMLETと共に１時間インキュベーションした後で生じた３つの特徴的な細胞型。共焦点画像は、アレキサ・フルオア568標識HAMLETおよび対応する光学透過画像で着色した20Sプロテアソームを示す。底部の図表は、共局在化しているピクセル／領域（膜ブレブ（bleb）、細胞質および核コンパートメント）のパーセントを示す。黄色の人為的な色上塗りは、各細胞型において共局在化しているピクセルを明示する。
【００７１】
図４．機能的なプロテアソームは、HAMLETとプロテアソームの腫瘍細胞核への転位に関与する
（Ａ, Ｂ）34mMのHAMLETまたはα−ラクトアルブミンで１時間処理されたA549細胞由来の細胞抽出物の細胞質および核画分中のプロテアソーム活性。プロテアソーム阻害物質のMG132による前処理は１時間だった。プロテアソーム活性は、プロテアソームのキモトリプシンに特異的な基質のsuc−LLVY−AMCからのAMCの遊離として測定した。結果を、対照の細胞抽出物の活性に対するパーセントで示した。（Ｃ, Ｄ）A549細胞を34mMのHAMLET±MG132と共に１時間インキュベーションした後の20Sプロテアソーム染色の強度およびプロテアソームの局在化。共焦点画像は20S着色を示す。（Ｅ−Ｆ）プロテアソームの存在または不存在下での、生細胞中のHAMLETの細胞内局在化。A549細胞をMG132またはラクタシスチンで１時間前処理し、そしてさらに34mMのHAMLETと共にインキュベーションした。
【００７２】
図５．HAMLETは20Sプロテアソームにおける構造修飾を引き起こす
哺乳類のプロテアソームは、１または２個の19S制御粒子と連結している可能性のある、20Sコア粒子（700kD）から成っている。触媒ユニットは、４つの積み重なった輪であって、各輪につき７個のサブユニット（α1-7、β1-7、β1-7、α1-7）から構成されている円筒形であり、そして触媒チャンバーは２つの内部のβ輪から形成され、それぞれ３つの蛋白分解性部位を含んでいる。（Ａ）HAMLET、α−ラクトアルブミン（34μM）とヒト20Sプロテアソームの12μgとを20分間混合した後のPAGE。HAMLETの処置後に、20Sプロテアソームサブユニットのいくつかの変化が検出された（矢印を参照）。試料を変性４−12％ ビス−トリス（NuPAGE）で泳動し、アミドブラックで染色した。（Ｂ）ヒト20Sプロテアソームのα／βサブユニットに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによる確認。HAMLETは＜20kDaの分子量を有する新たなプロテアソームのバンドの形成をもたらす。（Ｃ）HAMLETにより改変された20Sプロテアソームおよび特にα6サブユニットの構造。アミノ酸181−186に対応するNLS（KKVKKK）を配列中、および対応する構造ドメイン中で、明灰色で示した。下線を付したアミノ酸は、質量分析により検出された配列を示す。構造は、ウシ20S結晶構造、PDB ID: IIRU (31) およびMOLMOL 2K.2 (55)を用いて作成した。
【００７３】
図６．HAMLETによる腫瘍細胞死は部分的に機能的なプロテアソームに依存する
形態的な変化（Ａ, Ｂ）およびHAMLETに対する染色質の応答（Ｃ, Ｄ）、ならびにMG132によるプロテアソーム阻害の役割。A549細胞を、MG132の前処理の有無の下、34μMのHAMLETで刺激する前の３時間ガラススライド上で増殖させた。染色質の応答に関しては、この細胞を４％ PFA中で固定し、そしてDNA マーカーの TOPRO−3で染色した。
【実施例】
【００７４】
材料と方法
天然のα−ラクトアルブミン、変性α−ラクトアルブミンおよびHAMLET
α−ラクトアルブミンはヒト乳から精製するか（Svensson等、Proc. Natl. Acad Sci. USA (2000)97:4221-4226）、またはシグマ社（セントルイス、ミズリー州、米国）から購入した。HAMLETは、記載された（Svensson等、前出）ように、変性α−ラクトアルブミンから調製した。略記すれば、このタンパク質を、EDTAを用いて変性させ、ついで、C18：l, 9 シス脂肪酸で前処理したDEAE−トリスアクリルＭ（バイオセプラ、フランス）カラムでのイオン交換クロマトグラフィーによりオレイン酸に結合させた。実時間の共焦点顕微鏡検査のために、HAMLETをアレキサ・フルオル568（モレキュラー・プローブInc．、ユージン、オレゴン州、米国）と結合させた。
【００７５】
蛋白分解
天然のα−ラクトアルブミン、HAMLETまたは部分的に変性したα−ラクトアルブミンを、プロテアソーム酵素を用いて、インビトロでの蛋白分解に付した。タンパク質試料を10mM 酢酸アンモニウム、pH 7.5に溶解した。天然のα−ラクトアルブミンは200μMの酢酸カルシウムの存在下であり、他方変性ラクトアルブミンは200μMのEDTA中に存在であった。この混合物を、トリプシン（質量比でE/S 1/50）およびキモトリプシン（質量比でE/S 1/100）と共にインキュベーションし、次いで断片をSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動により検出した。
【００７６】
細胞株
ヒト肺癌細胞株A549（CCL 185, ATCC）、ヒトグリア芽腫D54およびヒト腎癌A498（HTB44, ATCC）を、記載されているように培養した（Hakansson等、(1994) Infect. Immnun. 62:2707-2714；Hedlund等、J. Exp. Med. (1996)183 1037-1044）。ヒトの未形質転換星状細胞（CC−2565、カンブレックス、ラ・ホヤ、カリフォルニア州、米国）のためには、製造者の指示書に従って、アスコルビン酸、rhEGF、GA−100、インスリン、Ｌ−グルタミンおよび３％ FBSを補充した星状細胞増殖培地を用いた。ヒト腎上皮細胞、HRTEC、は記載されたように３才の少年の腎臓から分離された。
【００７７】
細胞画像化
細胞を組織培養フラスコから採取し、次に、５％ウシ胎児血清（FCS）を補充した各培地（上記参照）中で、３時間、８穴ガラススライド（0.1×106）（ナルゲ・ヌンク、ネーパービル、イリノイ州、米国）に付着させた。付着した細胞をPBSで２回洗浄し、0.5mg／mlのアレキサ・フルオル568標識化HAMLET、またはα−ラクトアルブミンに曝し（非必須アミノ酸（1：100希釈、NEAA）、１mMピルビン酸ナトリウムおよび50μg／mlのゲンタマイシンを補充したRPMI（ギブコ／BRL、ライフ・テクノロジーLtd.）培地中にて）、次いで37℃でインキュベーションした。HAMLETまたはα−ラクトアルブミンとインキュベーションを１時間行った後、５％のFCSを加えた。細胞を一度PBSで洗浄し、共焦点顕微鏡検査により、LSM 510 METAシステム（カール・ツァイスAB、ドイツ）で解析した。共焦点スキャンを同一の設定で記録した。光学的切片は1.0μｍであった。細胞下のコンパートメント（表面、Su；細胞質、Cy；核、Nu）内の蛍光強度を測定するために、対応する微分干渉コントラスト（DIC）画像を基に、手動で関心ある領域（ROI）に位置付けた。
【００７８】
８穴ガラススライドに付着したA549細胞（0.1×106）をアレキサ・フルオル標識化HAMLETと上記のように１時間処理した。このスライドをさらに４％のPFAで10分間固定し、PBSで一度洗浄し、0.01％ PBS−サポニン／５％ FCS中で20分間浸透化させ、そして、室温で、１時間一次抗体で、ついで１時間二次抗体を用いてインキュベーションした。脱離した細胞を含む上清を、1500rpmで５分間、ガラススライド上にサイトスピンで移し、ついで個別に分析した。20Sプロテアソームのα／βサブユニットに対するモノクローナル抗体（PW8265、アフィニテイ・リサーチ、デンボン、イギリス）またはポリクローナルウサギ抗体（PW8155、アフィニテイ・リサーチ）を20Sプロテアソームの検出のために用いた。二次抗体は、ウサギ抗マウスアレキサ488またはヤギ抗ウサギアレキサ488（モレキュラー・プローブInc．、ユージン、オレゴン州、米国）であった。共局在化は、共焦点顕微鏡検査により、LSM META 510ソフトウエアパッケージ（カール・ツァイス）および1.0μｍ細胞切片に対応する画像を用いて、解析した。
【００７９】
プロテアソーム活性
細胞（２×106）をPBS中で１回洗浄し、そして低張性緩衝液（10mM HEPES、1.5mM MgCl2、10mM KCl、0.01％ NP−40、0.2mM PMSF、0.5mM β−メルカプトエタノール、pH 7.9）中に再懸濁した。細胞を氷上で10分間膨潤させた。核を1500rpmで10分間、遠心分離で回収した。上清を細胞質画分として集め、−70℃で保存した。核画分を低塩緩衝液（20mM HEPES、25％ グリセロール、1.5mM MgCl2、20mM KCl、0.2mM EDTA、0.01％ NP−40、0.2mM PMSF、0.5mM β−メルカプトエタノール、pH 7.9）中に再懸濁し、その後、高塩濃度緩衝液（20mM HEPES、25％ グリセロール、1.5mM MgCl2、１M KCl、0.2mM EDTA、0.01％ NP−40、0.2mM PMSF、0.5mM β−メルカプトエタノール、pH 7.9）をボルテックスで撹拌しながら滴下して加え、核タンパク質を抽出した。核画分を16000 rpmで30分間、上清として回収し、そして−70℃で保存した。DCタンパク質アッセイ法を、BSAを標準として用いて、全タンパク質濃度を定量した（バイオラド、カリフォルニア州、米国）。プロテアソーム性キモトリプシンに特異的な蛍光発光性基質のSuc−Leu−Leu− VAL−Tyr−7−アミド−メチルクマリン（suc−LLVY−AMC、25mM）を20mM TRIS−HCl（pH 7.5、全体積 200μl）中の細胞抽出物の10μgに加えた。この反応を、ノボスター分光蛍光計（BMG、オッフェンブルグ、ドイツ）を用いて、350／440nmの励起／放射波長で30分間、37℃で観測した。
【００８０】
プロテアソーム阻害
細胞を、選択的だが可逆的なプロテアソーム阻害物質MG132（Z−Leu−Leu−Leu−CHO、アフィニテイ・リサーチ）の25μMを用いて１時間、プレインキュベーションした。インビトロ試験のためには、MG132によるプレインキュベーションは15分間であった。不可逆的なプロテアソーム阻害物質のラクタシスチン（1.5μM）を、プロテアソーム阻害の効果を立証するためにHAMLET局在化試験で用いた。
【００８１】
HAMLETと20Sプロテアソームとのインビトロでの混合
HAMLET、α−ラクトアルブミン（34μM）を、20μlの反応緩衝液（20mM Tris、pH 7.2、１mM EDTA、１mM DTT）中の３μgのヒト赤血球20Sプロテアソームと、１時間インキュベーションした。プロテアソームの阻害は、25μMのMG132（カルビオケム）と10分間プレインキュベーションにより誘導した。試料を、変性４−12％ ビス−トリス（NuPAGE）上で泳動し、PVDF膜に免疫ブロットし、20Sα／βサブユニットに対する一次マウスポリクローナル抗体（1：1000）（PW8265、アフィニテイ・リサーチ）、およびHRPに共役させた二次ウサギ抗マウス抗体（1：1000）を用いてプローブ検出した。第二の同じゲルをブロットし、マウスモノクローナルα−ラクトアルブミン抗体（ダコ）を用いてプローブ検出した。
【００８２】
MALDI−TOF（マトリクス支援型レーザー脱離イオン化、飛行時間）
HAMLETと20Sプロテアソームとのインビトロでの混合およびSDS−PAGEでのサブユニットの分離の後、いくつかのバンドをさらなる特徴付けのために選択した。バンドをゲルから切り出して、MQLDITM−LR HT機器（マイクロマス、マンチェスター、イギリス）を用いる質量分析の前に、トリプシン処理した。解析は、MASCOT分析を用いて行った。
【００８３】
HAMLETに対する細胞性応答
HAMLET処理後の染色質凝縮での変化を、付着したおよび脱離した細胞で調べた。スライドを４％ PFAで10分間固定し、PBSで一度洗浄し、0.01％ PBS−サポニン／５％FCSで20分間浸透化処理をし、次いでTOPRO−3 DNAプローブ（モレキュラー・プローブ）で５分間染色した。脱離した細胞を含む上清を、1500 rpmで５分間、ガラススライド上にサイトスピンで移し、ついで個別に分析した。染色質凝縮の程度は、共焦点顕微鏡検査（LSM 510 META システム、カール・ツァイスAB）により、次いで細胞核の蛍光強度の定量的測定により測定した。
【００８４】
結果
HAMLETは腫瘍細胞に侵入する
腫瘍細胞によるHAMLETの取り込みを、１時間後に共焦点顕微鏡検査を用いて調べ、そしてα−ラクトアルブミンと比較した（図１）。HAMLETは腫瘍細胞の表面に結合し、大部分は膜を通して細胞質に取り込まれ、そして核に集積した（図１Ａおよび１Ｂ）。腫瘍細胞は大きく形態的変化を受け、アポトーシス様形態を示して死んだ。未処理の細胞は球状で、平滑な細胞の輪郭を有していたが、HAMLETへ曝した後では、これらは細胞質ブレブを伴う不規則状となり、そしてサイズが縮小し、アポトーシス体を形成した（図１Ａ）。天然型のα−ラクトアルブミンは、腫瘍細胞にはより低い効率で結合し、少量が内部に取り込まれそして核への転位は観察されなかった（図１Ｃ）。α−ラクトアルブミン処理細胞は、インタクトな細胞の形態で少なくとも24時間生存した。HAMLETとα−ラクトアルブミンとの間の取り込みの大きな差異がフローサイトメトリーで確認された（図１Ｄ）。
【００８５】
腫瘍細胞は次いで同じ組織起源の正常細胞と比較された（図１Ｅ）。HAMLETは悪性の星状細胞腫またはヒト腎癌細胞に急激に取り込まれ、そして特徴的な形態変化を受けた。これに対して、初代腎細胞培養およびインタクトで完全に生存可能な細胞では、HAMLETの取り込みはほとんど検出できなかった。ヒト星状細胞はいくらかのHAMLETを内部に取り込んだが、より大きな凝集体は形成されず、核への転位または形態もしくは生存性に関する変化はなかった。我々は、HAMLETの取り込みは、アポトーシス様特性を伴って死ぬ腫瘍細胞に特異的であると結論付けた。
【００８６】
HAMLETはプロテアソーム酵素活性による分解に抵抗性である
HAMLETの流入は、腫瘍細胞の細胞質を大量の部分的に変性したタンパク質に曝している。α−ラクトアルブミンの変性化およびオレイン酸の結合によるHAMLETの生成を図２Ａに図示する。天然型および変性型α−ラクトアルブミンならびにHAMLETの高次構造の差異が、円偏光二色性（CD）スペクトルにより確認された（図２Ｂ）。
【００８７】
誤って折り畳まれたタンパク質は、哺乳類細胞のプロテアソームにより分解される。哺乳類の20Sプロテアソームは３つの主なペプチダーゼ活性を有し、それらはキモトリプシン様、トリプシン様およびペプチジルグルタミル−ペプチド加水分解活性と呼ばれる。HAMLETの蛋白分解に対する感受性を、天然型のα−ラクトアルブミンおよび部分的に変性したα−ラクトアルブミンを対照として用いて、インビトロで調べた（図２Ａ〜Ｂ）。天然型のα−ラクトアルブミンはトリプシンに抵抗性であり、54時間後もインタクトなままであったが、部分的に変性したα−ラクトアルブミンは５分以内に分解された。HAMLETは、部分的に変性したα−ラクトアルブミンよりトリプシンに対して抵抗性を有し、分解に６時間必要とした（図２Ｃ）。HAMLETの蛋白分解性分解の同様の遅延が、キモトリプシンでも示された。天然型α−ラクトアルブミンは29時間インタクトなままであったが、部分的に変性したα−ラクトアルブミンは５分後完全に分解し、これに対してHAMLETではそれに２時間必要とした（図２D）。
【００８８】
HAMLETと20Sプロテアソームの細胞質および核での共局在化
HAMLETが、内因性の誤って折り畳まれたタンパク質と同じ様式で認識されるとすれば、このプロテアソームがこの複合体を分解することが期待されるだろう。インビトロ試験では、20Sプロテアソームがα−ラクトアルブミンおよび関連するリゾチームＣの変性形態、ならびに、変性α−ラクトアルブミンを含んでいるカゼインを分解できることが示されていた。HAMLETと20Sプロテアソームとの間の直接な相互作用の潜在能力（potential）は、アレキサ・フルオル568標識化HAMLETおよび20Sプロテアソームの触媒コアに対する抗体を用いて、共焦点顕微鏡検査により調べられた。未処理細胞では、弱くそしてかなり均一な細胞質の20Sプロテアソーム染色を示したが、核の染色は見られなかった。HAMLETに曝した１時間後、３つの共局在化のパターンが観察された。細胞質の20SプロテアソームはHAMLETと共局在化し、特に細胞質プレブに顕著だった（図３Ａ）。他の細胞は、強い細胞質の共局在化（89％）、および、HAMLETとプロテアソームが明確な環状構造を形成する核において、実質的に完全な共局在化（99％）を示した（図３Ｂ）。細胞の３番目の集団は、強い核HAMLET染色と、非常に弱い核20Sプロテアソーム染色を示し、そして細胞質のほとんどを消失したように見えた（図３Ｃ）。全体的に、プロテアソーム染色がHAMLET処理細胞では検出された。これらの結果は、HAMLETが腫瘍細胞中でプロテアソームと相互作用することを示唆していた。
【００８９】
HAMLET処理細胞中でのプロテアソーム活性化と再分布
プロテアソーム活性に対するHAMLETのインビボの作用を、蛍光発色基質を用いて、細胞質および核抽出物中で定量化した（図４Ａ）。１時間後、細胞質プロテアソーム活性は、HAMLET処理細胞で増加したが、α−ラクトアルブミン処理細胞では見られなかった。反対に、核プロテアソーム活性は、HAMLET処理細胞で減少していた（図４Ｂ）。この作用は、プロテアソーム阻害物質のMG132で阻止された。この結果は、HAMLETとの相互作用が腫瘍細胞中のプロテアソーム活性を修飾することを示唆している。
【００９０】
プロテアソームの再分布がHAMLET処理細胞で検出されたが、α−ラクトアルブミン処理細胞では見られなかった（図３Ａ、そしてデータは示されていない）。この20Sプロテアソームは、HAMLETに対する早期のアポトーシス性応答の間に、細胞質の周囲に移動した。細胞質のプロテアソーム染色は、HAMLET処理後に1.8倍増加した（対照と比較してｐ＜0.001）。さらに、核プロテアソーム染色の22倍の増加で示されるように、プロテアソームは核に移動した（対照と比較してｐ＜0.001）（図４Ｃ）。再分布は、プロテアソーム活性を必要とすることが示された（図４ＣおよびＤ）。MG132は、細胞質染色のHAMLET誘導性増加およびプロテアソームの核集積を抑制した（対照と比較してｐ＜0.001）。この結果は、20SプロテアソームがHAMLETにより活性化されること、そして複合体の消化の失敗が、プロテアソームの細胞周囲と核への再分布を引き起こすことを示唆している。
【００９１】
HAMLETの核集積がプロテアソーム活性に関与する
HAMLETの細胞核への輸送は、α−ラクトアルブミンが核局在化配列（NLS）を欠いているために、説明されていない。この研究で、プロテアソーム活性化が、HAMLETの核転位にも関与することが示された（図４Ｄ〜Ｅ）。MG132を用いたプロテアソーム阻害は、細胞核にHAMLETを有する細胞数を55％から21％へと減少させ、そしてラクタシスチンは79％から34％までの減少を生じさせた（ｐ＜0.05）。この結果は、プロテアソーム活性化がHAMLETの核取り込みに必須であることを示唆している。
【００９２】
プロテアソームの改変および核局在化配列の露出
様々な20Sプロテアソームαサブユニットが核局在化配列を有している。KKXKモチーフが特定の細胞周期制御タンパク質に応答して曝され、転写中のプロテアソームの核転位を促進する。このように20SプロテアソームのHAMLETによる活性化はNLSを露出させ、次にプロテアソームとHAMLETの核転位を助けるだろう。この仮説は、インビトロで、HAMLETとインタクトなプロテアソームとを混合することで調べた。プロテアソームの断片化は、20分間のインキュベーション後にSDS−PAGEにより検出され、次いでこの断片をマスコットソフトウェアを用いて質量分析により同定した。20Sプロテアソームのサブユニットの様々な変化が検出された（図５Ａの矢印、およびＣのプロテアソームの分子モデルを参照する）。バンド１は構造性のα3サブユニット、およびインタクトなプロテアソーム中に核KKXKモチーフを含有するαβサブユニットを含んでいた。しかしながら、δサブユニット中のNLSモチーフに対応する質量断片は、HAMLET処理後は欠けていた（図５Ｃ）。バンド３は、構造性のβ3サブユニットを含んでいた。バンド４は、ペプチジルグルタミル加水分解活性を有する触媒サブユニットβ1、およびキモトリプシン様活性を有するβ5の混合物を含むことが示された。観察されたタンパク質の合致には高い有意性があった（Ｐ値範囲が、1.3×10-19から2.5×10-37）。この断片化は、プロテアソーム中のα／βサブユニットに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットにより確認した。この抗体は、分子量が＜20 kDaの新規なプロテアソームのバンドを認識した（図５Ｂ）。しかしながら、これは図５Ａ中のSDS−PAGEにより示された残りの新規なバンドは認識しなかった。
【００９３】
この結果は、HAMLETが、20Sプロテアソーム中の大きな構造的改変を引き起こすことを示しており、そしてこの過程が核局在化シグナルをHAMLETに露出させることを示唆している。
【００９４】
プロテアソーム活性およびHAMLET処理細胞の死
細胞死へのプロテアソーム応答の関与を、細胞質および核のエンドポイントを用いて調べた。HAMLETと１時間インキュベーションした後、細胞の71％が、ブレブ形成を伴う形態的変化を受け、次いでガラススライドから脱離した。プロテアソームの阻害は、脱離を29％まで減少させた（ｐ＜0.05、図６Ａ）。プロテアソーム活性はまた染色質の凝縮にも関与していた。HAMLETと１時間インキュベーションした後、腫瘍細胞の64％が凝縮し断片化した染色質を含んでいたが、プロテアソーム阻害はこの染色質の凝縮および断片化の頻度を31％まで減少させた（図６Ｂ、ｐ＜0.01）。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】HAMLETは腫瘍細胞に侵入する。  A549肺癌細胞中でのHAMLET（Ａ, Ｂ）およびα−ラクトアルブミン（Ｃ）の結合および取り込み。（Ｄ）フローサイトメトリーによる定量化。（Ｅ）腫瘍細胞（ヒトグリア芽腫細胞、ヒト腎癌（A498））と正常細胞（星状細胞およびヒト腎細胞（HRTEC））との間でのHAMLET取り込みの差異。細胞は、HAMLETまたはα−ラクトアルブミンの34μMで１時間処理された。共焦点画像はアレキサ・フルオア568標識HAMLET（上部のパネル）を示し、対応する光学透過画像（下部のパネル）を付す。
【図２】HAMLET複合体。  （Ａ）HAMLETは、ヒト乳由来のα−ラクトアルブミンとオレイン酸の分子複合体である。HAMLETの生成は、強く結合したCa2+イオンを放出したときに、部分的に変性した立体配置を取るというα−ラクトアルブミンの特性に依存している。その結果、このタンパク質は部分的に変性されて、脂肪酸結合部位を露出し、オレイン酸（C18：9, 9シス）との相互作用が可能となり、この部分的に変性したタンパク質の立体配置を安定化する。この構造は、ヒトα−ラクトアルブミン、PDB ID: IHML (54) およびMOLMOL 2K.2 (55)の結晶構造を用いて作成した。（Ｂ）近UV CD分光法。スペクトルを、EDTA不含リン酸ナトリウム緩衝液中で記録した。天然のα−ラクトアルブミン（明灰色）は、チロシン残基に由来する250 nmの最小値およびトリプトファン残基に由来する290 nmの最大値を有した。部分的に変性したα−ラクトアルブミン（黒色）およびHAMLET（中間的灰色）は、変性タンパク質に特徴的なチロシンおよびトリプトファン領域での楕円率の減少を示していた。（Ｃ−Ｄ)HAMLETは、プロテアソーム酵素による分解に対して部分的に抵抗性である。天然のα−ラクトアルブミン、HAMLETおよび部分的に変性したα−ラクトアルブミンを、インビトロで、プロテアソーム酵素のトリプシンおよびキモトリプシンを用いた蛋白分解反応に付した。断片をSDS−PAGEにより検出した。
【図３】HAMLETと20Sプロテアソームの共局在化。  （Ａ−Ｃ）A549細胞を34mMのHAMLETと共に１時間インキュベーションした後で生じた３つの特徴的な細胞型。共焦点画像は、アレキサ・フルオア568標識HAMLETおよび対応する光学透過画像で着色した20Sプロテアソームを示す。底部の図表は、共局在化しているピクセル／領域（膜ブレブ（bleb）、細胞質および核コンパートメント）のパーセントを示す。黄色の人為的な色上塗りは、各細胞型において共局在化しているピクセルを明示する。
【図４】機能的なプロテアソームは、HAMLETとプロテアソームの腫瘍細胞核への転位に関与する。  （Ａ, Ｂ）34mMのHAMLETまたはα−ラクトアルブミンで１時間処理されたA549細胞由来の細胞抽出物の細胞質および核画分中のプロテアソーム活性。プロテアソーム阻害物質のMG132による前処理は１時間だった。プロテアソーム活性は、プロテアソームのキモトリプシンに特異的な基質のsuc−LLVY−AMCからのAMCの遊離として測定した。結果を、対照の細胞抽出物の活性に対するパーセントで示した。（Ｃ, Ｄ）A549細胞を34mMのHAMLET±MG132と共に１時間インキュベーションした後の20Sプロテアソーム染色の強度およびプロテアソームの局在化。共焦点画像は20S着色を示す。（Ｅ−Ｆ）プロテアソームの存在または不存在下での、生細胞中のHAMLETの細胞内局在化。A549細胞をMG132またはラクタシスチンで１時間前処理し、そしてさらに34mMのHAMLETと共にインキュベーションした。
【図５】HAMLETは20Sプロテアソームにおける構造修飾を引き起こす。  哺乳類のプロテアソームは、１または２個の19S制御粒子と連結している可能性のある、20Sコア粒子（700kD）から成っている。触媒ユニットは、４つの積み重なった輪であって、各輪につき７個のサブユニット（α1-7、β1-7、β1-7、α1-7）から構成されている円筒形であり、そして触媒チャンバーは２つの内部のβ輪から形成され、それぞれ３つの蛋白分解性部位を含んでいる。（Ａ）HAMLET、α−ラクトアルブミン（34μM）とヒト20Sプロテアソームの12μgとを20分間混合した後のPAGE。HAMLETの処置後に、20Sプロテアソームサブユニットのいくつかの変化が検出された（矢印を参照）。試料を変性４−12％ ビス−トリス（NuPAGE）で泳動し、アミドブラックで染色した。（Ｂ）ヒト20Sプロテアソームのα／βサブユニットに対するポリクローナル抗体を用いたウエスタンブロットによる確認。HAMLETは＜20kDaの分子量を有する新たなプロテアソームのバンドの形成をもたらす。（Ｃ）HAMLETにより改変された20Sプロテアソームおよび特にα6サブユニットの構造。アミノ酸181−186に対応するNLS（KKVKKK）を配列中、および対応する構造ドメイン中で、明灰色で示した。下線を付したアミノ酸は、質量分析により検出された配列を示す。構造は、ウシ20S結晶構造、PDB ID: IIRU (31) およびMOLMOL 2K.2 (55)を用いて作成した。
【図６】HAMLETによる腫瘍細胞死は部分的に機能的なプロテアソームに依存する。  形態的な変化（Ａ, Ｂ）およびHAMLETに対する染色質の応答（Ｃ, Ｄ）、ならびにMG132によるプロテアソーム阻害の役割。A549細胞を、MG132の前処理の有無の下、34μMのHAMLETで刺激する前の３時間ガラススライド上で増殖させた。染色質の応答に関しては、この細胞を４％ PFA中で固定し、そしてDNA マーカーの TOPRO−3で染色した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年12月7日(2007.12.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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