(57)【要約】  本発明は、腫瘍細胞においてFoxM1B (とも呼ばれる)活性を阻害することによって、腫瘍細胞増殖を阻害するための方法を提供する。また、本発明は、FoxM1B siRNA分子およびFoxM1B siRNA分子を含む医薬組成物を提供し、ここに該siRNA分子は、FoxM1B活性を阻害し得、腫瘍細胞の増殖を阻害し得る。本発明は、さらに、siRNA分子またはFoxM1B siRNA分子を含む医薬組成物を用いて、FoxM1B活性を阻害することを特徴とする、動物において、腫瘍成長、進行または両方を予防するための方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍細胞においてFoxM1B活性を阻害するsiRNA分子であって：
a)長さが約18ないし約23 ヌクレオチドであり；
b)哺乳類のFoxM1Bコード配列の一部に相補的であり；かつ
c)腫瘍細胞の増殖を阻害し得るヌクレオチド配列を含む該siRNA分子。
【請求項２】
該ヌクレオチド配列がマウスまたはヒトFoxM1Bコード配列の一部に相補的である請求項１記載のsiRNA分子。
【請求項３】
マウスまたはヒトFoxM1Bコード配列の一部に相補的である該ヌクレオチド配列が、長さ約19 ヌクレオチドである請求項２記載のsiRNA分子。
【請求項４】
該siRNAが、長さ約36ないし約70 ヌクレオチドである単一自己相補的RNA鎖を含む請求項１記載のsiRNA分子。
【請求項５】
約18ないし約23 ヌクレオチドの一部が、マウスまたはヒトFoxM1Bコード配列の一部に相補的である請求項４記載のsiRNA分子。
【請求項６】
該siRNAが、２つの別個の相補的RNA鎖を含む請求項１記載のsiRNA分子。
【請求項７】
該鎖のうちの１つが、長さ約18ないし約23 ヌクレオチドであり、マウスまたはヒトFoxM1Bコード配列の一部に相補的である請求項６記載のsiRNA分子。
【請求項８】
請求項１記載のsiRNA分子を含む発現ベクター。
【請求項９】
該発現ベクターがウイルスベクターである請求項８記載の発現ベクター。
【請求項１０】
該ウイルスベクターが、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスである請求項９記載のウイルスベクター。
【請求項１１】
請求項１記載のsiRNAを患者に投与する工程を含む癌患者を治療する方法。
【請求項１２】
細胞を請求項１記載のsiRNA分子と接触させる工程を含む腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１３】
細胞を請求項１記載のsiRNA分子と接触させる工程を含む腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項１４】
請求項１記載のsiRNAを含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項１４記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む癌患者を治療する方法。
【請求項１６】
請求項１４記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む、患者を癌発生から保護する方法。
【請求項１７】
該患者が、癌発生に対して増加したリスクを有する請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
該siRNAが、配列番号: 1、2、3、または4に示されるヌクレオチド配列を含む請求項１記載のsiRNA。
【請求項１９】
請求項１８記載のsiRNAを患者に投与する工程を含む癌患者を治療する方法。
【請求項２０】
該細胞を、請求項１８記載のsiRNA分子と接触させる工程を含む腫瘍細胞の増殖を阻害する方法。
【請求項２１】
請求項１８記載のsiRNAを含む医薬組成物。
【請求項２２】
請求項２１記載の医薬組成物を患者に投与する工程を含む癌患者を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の背景
本出願は、2004年6月22日に出願された米国仮出願60/582,141に関連し、それに対する優先権を主張し、その開示は本明細書中に引用によって援用される。
【０００２】
これらの研究は、国立老化研究所、認可番号 AG21842-02および国立糖尿病・消化器病・腎臓病研究所、認可番号 DK54687-06からの補助金によって資金を提供された。米国政府は、本発明に対して特定の権利を有し得る。
【０００３】
1.発明の分野
本発明は、FoxM1B活性を阻害することによって、腫瘍細胞増殖を阻害する方法に関する。具体的には、本発明は、FoxM1B siRNA分子を用いて、腫瘍細胞増殖を阻害する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
2.関連分野の背景
フォークヘッドボックス転写因子は、細胞の長寿および増殖能力を制御するのに関係があるとされている。そのような研究は、該インスリン/インスリン様成長因子1 (IGF1) 受容体の虫ホモログをコードする突然変異daf-2遺伝子を有するC. elegansにおける増加した長寿の発見を含む(Lin et al., 1997, Science 278: 1319-1322; Ogg et al., 1997, Nature 389: 994-999)。該daf-2遺伝子の分裂は、該ホスファチジルイノシトール3-キナーゼ (PI3K)-蛋白質キナーゼB/Akt (Akt)シグナル変換経路のインスリン媒介活性化を無効にし、(哺乳類のホモログFoxO1またはFkhrに対応する)該フォークヘッド転写因子 daf-16の阻害を防ぐ (Paradis and Ruvkun, 1998, Genes Dev. 12: 2488-2498)。該PI3K/Akt経路の活性化は、該Daf-16 (FoxO1; Fkhr)遺伝子産物のC-末端をリン酸化し、該細胞質への核外輸送を媒介して、従って、標的遺伝子のFoxO1転写活性化を防ぐ (Biggs et al., 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96: 7421-7426; Brunet et al., 1999, Cell 96: 857-68; Guo et al., 1999, J. Biol. Chem. 274: 17184-17192)。
【０００５】
Daf-2- C. elegans 突然変異体のより最近の研究は、Daf-16が酸化的ストレスを制限する遺伝子の発現を刺激し(Barsyte et al., 2001, FASEB J. 15: 627-634; Honda et al., 1999, FASEB J. 13: 1385-1393; Wolkow et al., 2000, Science 290: 147-150)、該哺乳類のFoxO1遺伝子が、C. elegansにおいて該Daf-16遺伝子を機能的に置換し得る(Lee et al., 2001, Curr. Biol. 11: 1950-1957)ことを示している。哺乳類細胞を増殖する際、該PI3K/Akt シグナル変換経路は、該CDK阻害剤p27 kip1遺伝子の発現を刺激する該FoxO1およびFoxO3蛋白質の転写活性を防ぐため、G1ないしS-相進行に重要である (Medema et al., 2000, Nature 404: 782-787)。さらに、出芽酵母における遺伝子研究は、フォークヘッドFkh1およびFkh2蛋白質が、有糸分裂への進行に重要な遺伝子の発現を制御する転写因子複合体の要素であることを示した(Hollenhorst et al., 2001, Genes Dev. 15: 2445-2456; Koranda et al., 2000, Nature 406: 94-98; Kumar et al., 2000, Curr. Biol. 10: 896-906; Pic et al., 2000, EMBO J. 19: 3750-3761)。
【０００６】
フォークヘッドボックスM1B (FoxM1BまたはFoxM1)転写因子(TridentおよびHFH-11Bとしても知られる)は、該HNF-3翼状らせんDNA結合ドメインと、39%のアミノ酸相同性を共有する増殖特異的転写因子である。また、該分子は、M-相特異的キナーゼに対していくつかのリン酸化部位を有する強力なC末端転写活性化ドメインならびに急速蛋白質分解を媒介するPEST配列を含有する(Korver et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 1715-1719; Korver et al., 1997, Genomics 46: 435-442; Yao et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 19827-19836; Ye et al., 1997, Mol. Cell Biol. 17: 1626-1641)。
【０００７】
インサイチュハイブリダイゼーション研究は、FoxM1Bが胎生肝、腸、肺、および腎盂において発現されると示している(Ye et al., 1997, Mol. Cell Biol. 17: 1626-1641)。しかしながら、成体の組織において、FoxM1Bは、該胸腺、精巣、小腸、および結腸の増殖する細胞において発現されるが、該肝臓および肺の有糸分裂後の、分化された細胞においては発現されない(Id)。FoxM1B発現は、部分的肝切除によって誘導される再生後の肝細胞DNA複製前に、該肝臓において再活性化される(Id)。
【０００８】
FoxM1Bは、いくつかの腫瘍由来上皮細胞系において発現され、その発現は、該G1/S 移行前に、血清によって誘導される(Korver et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 1715-1719; Korver et al., 1997, Genomics 46: 435-442; Yao et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 19827-19836; Ye et al., 1997, Mol. Cell Biol. 17: 1626-1641)。細胞周期進行におけるFoxM1Bの該役割と一貫して、上昇したFoxM1Bレベルは、数多くの活発に増殖する腫瘍細胞系において見受けられる(Korver et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25: 1715-1719; Yao et al., 1997, J. Biol. Chem. 272: 19827-36; Ye et al., 1997, Mol. Cell Biol. 17: 1626-1641)。また、FoxM1Bの増加した核染色は、ヒト基底細胞腫において見受けられて(Teh et al., 2002, Cancer Res. 62: 4773-80)、FoxM1Bがヒト癌における細胞の増殖に必要であることを示唆する。
【０００９】
これらの研究およびその他は、FoxM1Bがヒトの癌において何らかの役割を果たすことを示唆する。従って、FoxM1Bは発現は、典型的に、正常な加齢の間、減少するため、FoxM1Bは抗癌療法に対して魅力的な標的を提供するであろう(本明細書中に引用によって援用される、2003年8月28日に出願された共有され同時係属のPCT出願 PCT/US03/27098参照)。従って、FoxM1Bは、正常な細胞、特に腫瘍を取り囲む末端分化、加齢または加齢した正常な細胞よりも腫瘍細胞においてより活性である選択的標的を提供して、正常な細胞に対するそのような化合物の有害な副作用を最小化しつつ腫瘍細胞は治療され得る。
【発明の開示】
【００１０】
発明の概要
本発明は、該腫瘍細胞においてFoxM1B (またはFoxM1)活性を阻害する工程を含む、腫瘍細胞の増殖を阻害する方法を提供する。
【００１１】
１つの態様において、FoxM1B活性は、腫瘍細胞をFoxM1B siRNA分子と接触させることによって阻害され得る。好ましくは、該siRNA分子は、約15ないし約30 ヌクレオチドを含む。好ましくは、該siRNA分子は、約18ないし約23 ヌクレオチドを含む。より好ましくは、該siRNA分子は約19 ヌクレオチドを含む。例えば、FoxM1B siRNA分子は、配列番号: 1、2、3、または4において示される配列を有し得る。
【００１２】
また、本発明は、体内に存在する少なくとも１つの腫瘍細胞を有する動物に、治療上有効な時間、治療上有効量のFoxM1B siRNA分子を投与することを特徴とする、動物において腫瘍成長を阻害するための方法を提供する。さらなる態様において、FoxM1B活性を阻害するFoxM1B siRNAの組合せを、該動物に投与することができる。
【００１３】
また、本発明は、FoxM1B siRNA分子を含む医薬組成物および該医薬組成物を使用して、動物において腫瘍成長を阻害する方法を提供する。特定の態様において、本発明の医薬組成物は、腫瘍細胞においてFoxM1B活性を阻害することによって、動物における腫瘍細胞成長を阻害するのに有用である。
【００１４】
本発明の方法を使用して、FoxM1B蛋白質を発現するまたはFoxM1B蛋白質を発現した細胞から由来するいずれかの腫瘍細胞の成長を阻害することができる。FoxM1B蛋白質を発現した細胞は、例えば、高齢の個人からの細胞であり得、ここに、FoxM1B蛋白質の発現は、加齢の結果として減少する。特定の態様において、本発明の方法を使用して、腫瘍細胞成長を、インビトロ（つまり、細胞培養条件下で）またはインビボ（つまり、生きた動物において）で阻害することができる。他の態様において、本発明の方法を使用して、良性または悪性腫瘍から由来する腫瘍細胞の成長を阻害することができる。特定の態様において、該腫瘍細胞は、上皮細胞起源のもの、例えば、肝臓、肺、皮膚、腸（小腸または結腸）、脾臓、前立腺、乳房、脳、または胸腺上皮細胞からのものである。また、該腫瘍細胞は、中胚葉細胞起源のもの、例えば、肝臓、肺、皮膚、腸（小腸または結腸）、脾臓、前立腺、乳房、脳、骨髄または胸腺上皮細胞からのものであり得る。
【００１５】
本発明の特定の好ましい具体例は、特定の好ましい具体例および特許請求の範囲の以下のより詳細な記載から明白になるであろう。
【００１６】
好ましい具体例の詳細な記載
当業者によく知られた慣用的技術を、組換えDNA生成、オリゴヌクレオチド合成、および組織培養および細胞形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）手順に使用した。酵素反応および精製技術を、製造者らの仕様書に従ってまたは当該分野で一般的に達成されるようにまたは本明細書中に記載のように実施した。該技術および手順を、一般的には、当該分野でよく知られる慣用的な方法に従っておよび本明細書を通して引用され論議される種々の一般的かつよりより特異的な引用文献に記載されるように、実施した。例えば、いずれかの目的のために引用によって本明細書中に援用されるSambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor参照。特異的な定義が提供されない限り、本明細書中に記載の分子生物学、遺伝子工学、分析化学、合成有機化学、および医薬品化学および薬化学と関連して利用される命名、およびそれらの検査法および技術は当該分野でよく知られ一般的に使用されるものである。標準技術を、化学合成、化学分析、および患者の治療に使用することができる。
【００１７】
内容によって必要とされない限り、単数形の要素は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。
【００１８】
定義
本開示によって利用されるように、特記されない限り、以下の用語は、以下の意味を有すると理解される：
本発明は、単離されたポリヌクレオチド、特にFoxM1Bまたはその一部をコードするポリヌクレオチドを提供する。本明細書において使用されるように、用語「単離されたポリヌクレオチド」は、ゲノム、cDNA、または合成起源またはその組合せのポリヌクレオチドを意味し、その源に基づき、該「単離されたポリヌクレオチド」は、(1)該「単離されたポリヌクレオチド」が自然界に見られる全てのポリヌクレオチドまたはその一部と関連していない、(2)自然界とリンクしていないポリヌクレオチドとリンクしている、あるいは(3)より大きな配列の一部として自然界で生じない。
【００１９】
特記されない限り、一本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は5'末端であり；二本鎖ポリヌクレオチド配列の左手方向は、5'方向と呼ばれる。新生RNA転写体の5'ないし3'付加の方向は、転写方向と呼ばれ；該RNAと同じ配列を有し、該RNA転写体の5'ないし該5'末端である該DNA鎖上の配列領域は「上流配列」と呼ばれ；該RNAと同じ配列を有し、該RNA転写体の3'ないし該3'末端である該DNA鎖上の配列領域は「下流配列」と呼ばれる。
【００２０】
本明細書中で使用されるように、用語「ポリヌクレオチド」は、長さが少なくとも10塩基であるヌクレオチドの多量体型を意味する。特定の具体例において、該塩基は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドまたはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾された形態であり得る。該用語は、DNAの一本鎖および二本鎖形態を含む。
【００２１】
本明細書中で使用されるように、用語「オリゴヌクレオチド」は、天然に生じる、および／または天然に生じないオリゴヌクレオチド連結によって一緒に連結した天然に生じる、および修飾されたヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、一般的に200 ヌクレオチド以上を含まないポリヌクレオチドサブセットである。特定の具体例において、オリゴヌクレオチドは、長さが10ないし60 ヌクレオチドである。特定の具体例において、オリゴヌクレオチドは、長さが12、13、14、15、16、17、18、19、または20ないし40塩基である。オリゴヌクレオチドは、例えば、部位特異的突然変異誘発技術を用いる遺伝子突然変異体の構築における使用のために、一本鎖であり得る。本発明のオリゴヌクレオチドは、センスまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。オリゴヌクレオチドは、放射標識、蛍光標識、抗原標識またはハプテンのような検出可能な標識を含み得る。
【００２２】
用語「天然に生じるヌクレオチド」は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドを含む。用語「修飾されたヌクレオチド」は、修飾されたまたは置換された糖群等のようなオリゴヌクレオチド連結を含む。用語「オリゴヌクレオチド連結」は、ホスフェート、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエートホスホロアニロチオエート、ホスホリアニラデート、ホスホロアミデート等のような連結を含む。例えば、各々の開示がいずれかの目的のために引用によって本明細書に援用されるLaPlanche et al., 1986, Nucl. Acids Res. 14: 9081; Stec et al., 1984, J. Am. Chem. Soc. 106: 6077; Stein et al., 1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209; Zon et al., 1991, Anti-Cancer Drug Design 6: 539; Zon et al., 1991, OLIGONUCLEOTIDES AND ANALOGUES: A PRACTICAL APPROACH, (F. Eckstein, ed.), Oxford University Press, Oxford England, pp. 87-108; Stec et al., U.S. Pat. No. 5,151,510; Uhlmann and Peyman, 1990, Chemical Reviews 90: 543参照。
【００２３】
用語「ベクター」を使用して、宿主細胞または標的細胞にコード情報を移すのに使用される分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指す。本発明の方法に適当なウイルスベクターは、例えば、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、単純ヘルペスウイルス、またはワクシニアウイルスから由来するものを含む。
【００２４】
用語「発現ベクター」は、宿主細胞または標的細胞の情報に適当なベクターを指し、挿入された核酸配列の発現を方向付けるおよび／または制御する対照配列を含む核酸配列を含有する。用語「発現」は、もしイントロンが存在するなら、転写およびRNAスプライシングのようなプロセスを含むが、これらに限定されるものではない。
【００２５】
本発明の発現ベクターは、対照配列に操作可能に連結されたコード配列を有するDNAまたはRNA 配列を含み得る。用語「対照配列」または「対照要素」は、本明細書中で使用されるように、それらが結紮したコード配列の発現および処理に影響を及ぼし得るポリヌクレオチド配列を指す。そのような対照配列の性質は、宿主生物によって異なり得る。特定の具体例によると、原核生物に対する対照配列は、プロモーター、リプレッサー、オペレーター、リボソーム結合部位、および転写終止配列およびアンチセンス mRNAを含んでもよい。特定の具体例によると、真核生物に対する対照配列は、プロモーター、エンハンサーおよび転写終止配列、または蛋白質分解、mRNA分解、核局在、核外輸送、細胞質保持、蛋白質リン酸化、蛋白質アセチル化、蛋白質ユビキチン様蛋白質による修飾、またはRNA 阻害(RNAi)を制御する配列を含んでもよい。特定の具体例において、「対照配列」は、リーダー配列および／または融合パートナー配列を含み得る。「対照配列」が、それらが結紮したコード配列の発現および処理に影響を及ぼす時、「対照配列」はコード配列に「操作可能に連結」される。
【００２６】
本明細書中で使用されるように、用語「組織特異的プロモーター」は、コード配列の転写を方向付けることが可能であり、特異的な細胞型内で特異的に活性化される対照配列を含む核酸配列を指す。例えば、肝臓細胞において遺伝子の発現を促進する肝臓特異的プロモーターは、ヒトまたはマウスα1-アンチトリプシンをコードする遺伝子からのプロモーター、アルブミンプロモーター、血清アミロイドA、トランスサイレチン、肝細胞核因子 6、および主要尿蛋白質 (MUP)を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
典型的には、宿主細胞または標的細胞において使用される発現ベクターは、ベクター維持のためのおよび外因性ヌクレオチド配列の発現のための配列を含有する。特定の具体例においてまとめて「フランキング配列」と呼ばれるそのような配列は、典型的には、１以上の以下のヌクレオチド配列を含むであろう：プロモーター、１以上のエンハンサー配列、転写終止配列、供与体および受容体スプライス部位を含有する完了イントロン配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル配列、発現されるsiRNAをコードする核酸を挿入するための１または複数の制限酵素部位を含むポリリンカー領域、および選択可能なマーカー要素。
【００２８】
フランキング配列は、同種（つまり、宿主細胞または標的細胞と同じ種および／または株から）、異種（つまり、宿主細胞または標的細胞種または株以外の種から）、ハイブリッド（つまり、１以上の源からのフランキング配列の組合せ）、合成または天然であってもよい。そのようなものとして、フランキング配列の源は、いずれかの原核または真核生物、いずれかの脊椎または無脊椎生物、またはいずれかの植物であってもよいが、但し、該フランキング配列は、宿主細胞または標的細胞機構において機能的であり、それによって活性化され得る。
【００２９】
本発明のベクターにおいて有用なフランキング配列は、当該分野でよく知られるいくつかの方法のうちのいずれかによって入手可能であってよい。典型的には、本明細書中で有用なフランキング配列は、予め、マッピングによっておよび／または制限酵素消化によって同定されており、従って適切な制限酵素を用いて、適切な組織源から単離することができる。いくつかのケースにおいて、フランキング配列の完全ヌクレオチド配列が知られているかもしれない。また、該フランキング配列は、核酸合成またはクローニングのために本明細書中に記載の方法を用いて合成され得る。
【００３０】
該フランキング配列の全てまたは一部のみが知られている場合、それは、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)のようなインビトロ増幅方法を用いておよび／または適当なオリゴヌクレオチドおよび／または同一またはもう１つの種からのフランキング配列断片によってゲノムライブラリーをスクリーニングすることによって入手され得る。該フランキング配列が知られていない場合、フランキング配列を含有するDNAの断片は、例えば、コード配列またはさらにもう１つの遺伝子または複数の遺伝子を含有し得るより大きな片のDNAから単離され得る。単離は、制限酵素消化、その後のアガロースゲル精製、QIAGEN（登録商標） カラムクロマトグラフィー (CHATSWORTH, CA)、または当業者に知られる他の方法を用いる単離によって達成されて、適切なDNA断片を生成する。この目的を達成するための適当な酵素の選択は、当業者にすぐに明白である。
【００３１】
転写終止配列は、典型的には、ポリペプチドコード領域の末端の3’に位置し、転写を終了する働きをする。通常、原核細胞における転写終止配列は、ポリ-T配列の前のG-C豊富断片である。該配列はライブラリーから容易にクローン化されるまたはベクターの一部として商業的に購入されるが、本明細書中に記載のもののような核酸合成のための方法を用いてすぐに合成できる。真核生物において、該配列AAUAAA (配列番号: 5)は、転写終了シグナルとしてかつ酵素切断、引き続いての(通常、約200 A残基よりなる)ポリA残基の添加に必要なポリAシグナルとして機能する。
【００３２】
本発明の発現およびクローニングベクターは、典型的には、該宿主生物によって認識され、該FOXM1B蛋白質をコードする核酸に操作可能に連結されたプロモーターを含有する。プロモーターは、構造遺伝子の転写を制御する構造遺伝子の出発コドン (一般的には約100ないし1000 BP内)に対して上流(つまり、5’)に位置する転写されていない配列である。プロモーターは、慣用的には、２つのクラスのうちの１つにグループ分けされる：誘導性プロモーターおよび構成的プロモーター。誘導性プロモーターは、栄養素の存在または不在または温度の変化のような培養条件下の何らかの変化に応答した制御下で、DNAからの増加したレベルの転写を開始する。他方で、構成的プロモーターは、連続遺伝子産物生成を開始する；つまり、遺伝子発現に対してほとんどまたは全く実験的制御が存在しない。種々の潜在的宿主細胞または標的細胞によって認識された多数のプロモーターはよく知られる。
【００３３】
哺乳類の細胞との使用に適当なプロモーターはよく知られており、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス (例えば、アデノウイルス2)、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルスおよび最も好ましくはシミアンウイルス40 (SV40)のような真核生物ウイルスのゲノムから得られたものを含むが、これらに限定されるものではない。他の適当な哺乳類プロモーターは、異種哺乳類プロモーター、例えば、熱ショックプロモーターおよびアクチンプロモーターを含む。
【００３４】
本発明の組換え発現ベクターの実施において有用な特定のプロモーターは：SV40初期プロモーター領域 (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-10); CMVプロモーター; 3'末端反復配列 ofラウス肉腫ウイルスの3'末端反復配列に含有されるプロモーター(Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787-97);ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-45);およびメタロチオニン遺伝子の制御配列(Brinster et al., 1982, Nature 296: 39-42)を含むが、これらに限定されるものではない。また、組織特異性を呈し、トランスジェニック動物において利用されている以下の動物転写制御領域も関心事である:膵腺房細胞において活性なエラスターゼI遺伝子制御領域(Swift et al., 1984, Cell 38: 639-46; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515);膵臓ベータ細胞において活性なインスリン遺伝子制御領域(Hanahan, 1985, Nature 315: 115-22);精巣、乳腺、リンパ球様および肥満細胞で活性なマウス乳癌ウイルス制御領域(Leder et al., 1986, Cell 45: 485-95);骨髄細胞において活性なベータグロビン遺伝子制御領域(Mogram et al., 1985, Nature 315: 338-40; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89-94); 脳内の乏突起膠細胞において活性なミエリン塩基性蛋白質遺伝子制御領域(Readhead et al., 1987, Cell 48: 703-12);骨格筋において活性なミオシン軽鎖-2遺伝子制御領域(Sani, 1985, Nature 314: 283-86);視床下部において活性な性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域(Mason et al., 1986, Science 234: 1372-78); 特にリンパ球様細胞において活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域(Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647-58; Adames et al., 1985, Nature 318: 533-38; Alexander et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7: 1436-44)。
【００３５】
好ましくは、本発明の発現ベクターのプロモーターは、標的または宿主細胞が由来する組織において活性である。例えば、もし該細胞が肝細胞であるならば、全て肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域 (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-76);アルファフェトプロテイン遺伝子制御領域 (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell Biol. 5: 1639-48; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); またはアルファ1-アンチトリプシン遺伝子制御領域 (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-71)を有利に使用できるだろう。
【００３６】
また、本発明のベクターは、FoxM1B蛋白質をコードする核酸のより高い真核細胞において転写を増加するエンハンサー配列を含有し得る。エンハンサーは、DNAのシス作用要素であり、通常長さが約10-300 bpであり、プロモーターに対して作用して、転写を増加する。エンハンサーは、比較的、配向および位置依存性である。それらは、イントロン内ならびに転写ユニットに5'および3'両方の数キロ塩基内で見受けられている。哺乳類の遺伝子から入手可能ないくつかのエンハンサー配列は知られている(例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファフェトプロテイン、インスリン、トランスサイレチン、およびHNF-6遺伝子からのエンハンサー)。また、ウイルスからのエンハンサーを使用して、遺伝子の発現を増加することができる。SV40エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、およびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的エンハンシング要素である。エンハンサーは、核酸分子に対して5'または3'の位置にて、ベクターへとスプライスされ得るが、それは典型的にはプロモーターから5'の場所に位置する。
【００３７】
本発明の発現ベクターは、商業的に入手可能なベクターのような便利な出発ベクターから構築され得る。そのようなベクターは、所望のフランキング配列の全てを含有してもよく、あるいは含有しなくてもよい。本明細書中に記載の１以上のフランキング配列がベクター内に既に存在していない場合、それらは、個々に入手され、ベクターへと結紮されてよい。該フランキング配列の各々を入手するのに使用される方法は、当業者によく知られる。
【００３８】
該ベクターが構築され、FoxM1B siRNAをコードする核酸分子が該ベクターの適切な場所に挿入された後、該完了したベクターは、適当な宿主細胞または標的細胞に挿入されてよい。FoxM1B siRNAをコードする発現ベクターの選択された宿主細胞または標的細胞への導入は、形質移入、感染、塩化カルシウム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポフェクション、DEAE-デキストラン方法、または上記のような他の既知の技術のような方法を含むよく知られた方法によって達成され得る。選択された該方法は、部分的に、使用される宿主細胞または標的細胞のタイプの機能であろう。これらの方法および他の適当な方法は当業者によく知られ、例えば、Sambrook et al., 2001, MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Yに記載される。
【００３９】
用語「宿主細胞」を使用して、核酸配列および関心のある遺伝子を発現する核酸配列が導入されている、あるいは導入したことが可能な細胞を指す。該用語は、該遺伝子が存在する限り、該子孫が該起源親に対して、形態学または遺伝子構成において同一であるか否かに拘わらず、該親細胞の該子孫を含む。好ましい具体例において、該宿主細胞は、真核細胞、より好ましくは哺乳類細胞および最も好ましくは齧歯類またはヒト細胞である。
【００４０】
また、適切な標的細胞の選択は、適切な宿主細胞の選択について上記で論議した種々の因子によって決まるであろう。加えて、標的細胞は、本発明の方法によって治療される患者に影響を及ぼす病気または状態に基づき選択することができる。
【００４１】
用語「形質移入」を使用して、細胞による外来または外因性DNAの取り込みを指し、細胞は、該外因性DNAが該細胞内に導入されると「形質移入」されている。多くの形質移入技術が当該分野でよく知られており、本明細書中で開示される。例えば、Graham et al., 1973, Virology 52: 456; Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; Davis et al., 1986, BASIC METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY (Elsevier);および Chu et al., 1981, Gene 13: 197参照。そのような技術を使用して、外因性DNAを適当な宿主細胞に導入することができる。
【００４２】
特定の具体例において、本発明によって提供されるように、FoxM1B阻害剤は、低分子干渉RNA (siRNA)の種である。本明細書中で使用されるように、用語「低分子干渉RNA」または「siRNA」は、例えば、Bass, 2001, Nature 411: 428-429; Elbashir et al., 2001, Nature 411: 494-498; and Kreutzer et al., 国際PCT公報WO 00/44895; Zernicka-Goetz et al., 国際PCT公報WO 01/36646; Fire, 国際PCT公報WO 99/32619; Plaetinck et al., 国際PCT公報WO 00/01846; Mello and Fire, 国際PCT公報WO 01/29058; Deschamps-Depaillette, 国際PCT公報WO 99/07409; and Li et al., 国際PCT公報WO 00/44914において開示されるように、RNA干渉または「RNAi」が可能である二本鎖核酸分子を指す。本明細書中で使用されるように、siRNA分子は、RNAのみを含有する分子に限定される必要はないが、さらに、RNAi能力または活性を有する化学的に修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドを含んでよい。
【００４３】
RNA干渉は、低分子干渉RNA (siRNA)によって媒介される動物における配列特異的転写レベルでの遺伝子サイレンシング後のプロセスを指す(Fire et al., 1998, Nature 391:806)。細胞中の長dsRNAの存在は、「ダイサー」と呼ばれるリボヌクレアーゼIII酵素の活性を刺激する。ダイサーは、dsRNAの短片であるsiRNAへの該長dsRNAの処理に関与する(Berstein et al., 2001, Nature 409:363)。ダイサー活性から由来する低分子干渉RNAは、典型的には、長さが約21-23 ヌクレオチドであり、約19の塩基対二本鎖を含む。また、ダイサーは、翻訳対照に関係する保存された構造の前駆体RNAからの21および22 ヌクレオチド小さな一時的RNA (stRNA)の該切除に関係している(Hutvagner et al., 2001, Science 293:834)。また、該RNAi応答は、該siRNAに相同的な配列を有する一本鎖RNAの開裂を媒介する一般的にRNA誘導サイレンシング複合体 (RISC)と呼ばれるsiRNAを含有するエンドヌクレアーゼ複合体を特徴付ける。該標的RNAの開裂は、該siRNA 二本鎖のガイド配列に相補的な領域の真ん中で起こる(Elbashir et al., 2001, Genes Dev. 15:188)。
【００４４】
低分子干渉RNA媒介RNAiは、種々のシステムにおいて研究されている。Fire et al.は、C. elegansにおけるRNAiを最初に観察した (1998, Nature 391:806)。Wianny and Goetzは、マウス胚におけるdsRNAによって媒介されるRNAiを記載した(1999, Nature Cell Biol. 2:70)。Hammond et al.は、dsRNAによって形質移入されたDrosophila細胞中のRNAiを記載した(2000, Nature 404:293)。Elbashir et al.は、ヒト胎児由来腎臓およびHeLa細胞を含む培養された哺乳類の細胞における合成21-ヌクレオチド RNAの二本鎖の導入によって誘導されたRNAiを記載した (2001, Nature 411:494)。
【００４５】
ショウジョウバエ胚溶解物における最近の研究は、効率的なRNAi活性を媒介するのに重要なsiRNAの長さ、構造、化学組成、および配列に対する特定の要件を明らかにしている。これらの研究は、21 ヌクレオチドを含むsiRNA 二本鎖が、２つのヌクレオチド 3'-突出を含有する時、最も活性であることを示している。さらに、2'-デオキシまたは2'-O-メチルヌクレオチドによる１つまたは両方のsiRNA鎖の置換はRNAi活性を無効にするが、デオキシヌクレオチドによる3'-末端siRNA ヌクレオチドの置換は許容されることが示された。また、該siRNA 二本鎖の中心のミスマッチ配列は、RNAi活性を無効にすることが示された。加えて、これらの研究は、該標的RNAにおける該開裂部位の位置が、3'-末端よりも、該siRNAガイド配列の5'-末端によって規定されることも示す (Elbashir et al., 2001, EMBO J. 20:6877)。他の研究は、siRNA 二本鎖の標的相補鎖上の5'-リン酸塩がsiRNA活性に必要であり、ATPが細胞において利用されて、該siRNA上の該5'-リン酸塩部位を維持することを示している (Nykanen et al., 2001, Cell 107:309)。しかしながら、5'-リン酸塩を欠くsiRNA分子は、細胞外に導入される時に活性であり、これは、siRNA構築体の5'-リン酸化反応がインビボで生じ得ることを示唆する。
【００４６】
本発明のFoxM1B siRNA分子は、自己相補的なセンスおよびアンチセンス領域を含む二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得、ここに該アンチセンス領域は、FoxM1Bのヌクレオチド配列またはその一部に相補的であるヌクレオチド配列を含み、該センス領域は、FoxM1B核酸配列またはその一部に対応するヌクレオチド配列を有する。該FoxM1B siRNA分子は、２つの別々のオリゴヌクレオチドから構築され得、ここに１つの鎖は該センス鎖であり、他方は該アンチセンス鎖であり、ここに該アンチセンスおよびセンス鎖は自己相補的である。また、該FoxM1B siRNA分子は、核酸系または非核酸系リンカーの手段によって連結された自己相補的センスおよびアンチセンス領域を有する単一のオリゴヌクレオチドから構築され得る。該FoxM1B siRNA分子は、実質的に対照的な二本鎖、非対照二本鎖、ヘアピン、または非対照ヘアピン二次構造を形成し得るポリヌクレオチドであり得る。また、該FoxM1B siRNA分子は、該FoxM1B ヌクレオチド配列またはその一部に相補的なヌクレオチド配列を有する一本鎖ポリヌクレオチドを含み得、ここに該一本鎖ポリヌクレオチドは、さらに、例えば、Martinez et al., 2002, Cell 110:563-574 and Schwarz et al., 2002, Molecular Cell 10:537-568で論議されるように、5',3'-二リン酸塩または5'-リン酸塩のような末端リン酸基を含み得る。
【００４７】
一本鎖ヘアピン構造を含む本発明のFoxM1B siRNA分子は、好ましくは、長さが約36ないし約70 ヌクレオチドであり、スペーサー配列によって分離された約15ないし約30 ヌクレオチドの２つの相補的配列を有して、該相補的配列のハイブリダイゼーションを可能にする。従って、該一本鎖ヘアピン構造は、該分子の該二本鎖部分を含む約15ないし約30塩基対を有する。１つの具体例において、該ヘアピンsiRNAは、該二本鎖部分および該相補的siRNA配列のハイブリダイゼーションを適応する長さのループ部分において、約18、19、20、または21塩基対を有する。
【００４８】
好ましい具体例において、FoxM1B (またはFoxM1) siRNAは、ヌクレオチド残基377-395 (配列番号: 1)、1066-1084 (配列番号: 2)、564-582 (配列番号: 3)、または該マウスFoxM1Bコード配列の223-261 (配列番号: 4)に対応する19-塩基対siRNAの生成を記載する本明細書中の実施例１に記載のように、設計され構築される。また、FoxM1B (またはFoxM1) siRNAは、ヒトFoxM1B (またはFoxM1)コード配列からの相同配列を用いて生成することができる。実施例１に記載の該FoxM1B siRNAは、配列番号: 1、2、3、または4に示されるように、ヌクレオチド配列を有する例示的FoxM1B siRNA分子である。別法として、FoxM1B siRNAは、本明細書中に引用によって援用されるElbashir et al. (2001, Genes Dev. 15:188-200; 2001, Nature 411:494-498)に記載の方法を用いて構築することができる。
【００４９】
特定の具体例において、本発明は、該FoxM1B siRNA分子の発現を可能にする様式で、少なくとも１つの本発明のFoxM1B siRNA分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。例えば、該ベクターは、二本鎖を含むFoxM1B siRNA分子の両方の鎖をコードする（複数の）配列を含有し得る。また、該ベクターは、自己相補的である単一の核酸分子をコードする（複数の）配列を含有し得、従って、FoxM1BヘアピンsiRNA分子を形成する。そのような発現ベクターの非限定的例は、Paul et al., 2002, Nature Biotechnology 19:505; Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology 19:497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology 19:500; and Novina et al., 2002, Nature Medicine, online publication June 3に記載される。
【００５０】
他の具体例において、本発明は、例えば、本発明の発現ベクターを含むヒト細胞といった哺乳類細胞を提供する。さらなる具体例において、本発明の該細胞を含む該発現ベクターは、ヒトまたはマウスFoxM1B (またはFoxM1)コード配列の少なくとも一部に相補的なsiRNA分子に対する配列を含み、ここに、該細胞中の該siRNAの発現は、その中のFoxM1B発現を阻害する。他の具体例において、本発明の発現ベクターは、同一または異なり得る２以上のsiRNA分子をコードする核酸配列を含む。本発明の他の具体例において、siRNA分子、好ましくはFoxM1B-特異的siRNA分子は、DNAまたはRNAベクターに挿入された転写ユニットから発現される。
【００５１】
特定の具体例において、本発明によるsiRNA分子は、対象への投与用のなかでもリポソーム；担体および希釈剤およびそれらの塩を含む送達ビヒクルを含み得；医薬組成物中に存在し得る。核酸分子の送達のための方法が、例えば、その全てが本明細書中に引用によって援用されるAkhtar et al., 1992, Trends Cell Bio. 2:139; Delivery Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., 1999, Mol. Membr. Biol. 16:129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol., 137:165-192; およびLee et al., 2000, ACS Symp. Ser. 752:184-192に記載される。Beigelman et al.,米国特許6,395,713およびSullivan et al., PCT WO 94/02595は、さらに、細胞および組織への核酸分子の送達のための一般的な方法を記載する。これらのプロトコルは、細胞への実質的にいずれかの核酸分子の送達に利用することができる。核酸分子は、リポソームにおけるカプセル化、イオントフォレシスによって、またはヒドロゲル、シクロデキストリン、生体分解性ナノカプセル、および生体接着ミクロスフィアのような他の送達ビヒクルへの組み込みによって、蛋白質性ベクターによってを含むが、これらに限定されるものではない当業者に知られる種々の方法によって、細胞へ投与され得る (例えば、O'Hare and Normand, 国際PCT公報WO 00/53722参照)。
【００５２】
別法として、該核酸／ビヒクル組合せは、直接注射によってまたは注入ポンプの使用によって、局所的に投与され得る。本発明の核酸分子の直接注射は、皮下、筋肉内、または皮内に拘わらず、標準の針およびシリンジ方法論を用いて、またはConry et al., 1999, Clin. Cancer Res. 5:2330-2337 and Barry et al., 国際PCT公報WO 99/31262に記載のもののような針なしの技術によって起こり得る。当該分野の多くの例は、浸透圧ポンプ、(Chun et al., 1998, Neuroscience Letters 257:135-138, D'Aldin et al., 1998, Mol. Brain Research 55:151-164, Dryden et al., 1998, J. Endocrinol. 157:169-175, Ghirnikar et al., 1998, Neuroscience Letters 247:21-24参照)または直接注入(Broaddus et al., 1997, Neurosurg. Focus 3, article 4)によるオリゴヌクレオチドの送達方法を記載する。他の送達経路は、経口送達(例えば、錠剤または丸剤形態) および／またはくも膜下腔内送達(Gold, 1997, Neuroscience 76:1153-1158)を含むが、これらに限定されるものではない。核酸送達および投与のより詳細な記載は、その全てが本明細書中の引用によって援用されるSullivan et al., PCT WO 94/02595、Draper et al., PCT WO93/23569、Beigelman et al., PCT WO99/05094、およびKlimuk et al., PCT WO99/04819において提供される。
【００５３】
別法として、本発明の特定のsiRNA分子は、真核生物プロモーターからの細胞内で発現され得る(例えば、Izant and Weintraub, 1985, Science 229:345; McGarry and Lindquist, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:399; Scanlon et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:10591-5; Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev. 2:3-15; Dropulic et al., 1992, J. Virol. 66:1432-41; Weerasinghe et al., 1991, J. Virol. 65:5531-4; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:4581-9; Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:2259; Good et al., 1997, Gene Therapy 4: 45参照）。当業者は、いずれかの核酸が、該適切なDNA/RNAベクターを用いて、真核細胞において発現され得ることを認識するであろう。そのような核酸の活性は、酵素核酸による一次転写産物からの放出によって増大され得る(Draper et al., PCT WO 93/23569, and Sullivan et al., PCT WO 94/02595; Ohkawa et al., 1992, Nucleic Acids Symp. Ser. 27:15-6; Taira et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19:5125-30; Ventura et al., 1993, Nucleic Acids Res. 21:3249-55; Chowrira et al., 1994, J. Biol. Chem. 269:25856)。
【００５４】
本発明のもう１つの態様において、本発明のRNA分子を、DNAまたはRNAベクターに挿入された転写単位(例えば、Couture et al., 1996, TIG 12:510参照)から発現することができる。該組換えベクターは、DNAプラスミドまたはウイルスベクターであり得る。ウイルスベクターを発現するsiRNAは、アデノ関連ウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、またはアルファウイルスに制限されないものに基づき構築され得る。もう１つの具体例において、pol III系構築体を使用して、本発明の核酸分子を発現する(例えば、Thompson, 米国特許5,902,880および6,146,886参照)。該siRNA分子を発現することが可能な組換えベクターは、上記のとおり送達され得、標的細胞において持続する。別法として、核酸分子の一時的発現に提供するウイルスベクターを使用することができる。そのようなベクターは、必要に応じて、繰り返し投与され得る。一旦発現されると、該siRNA分子は、該標的mRNAと相互作用し、RNAi応答を生成する。静脈内または筋肉内投与によって、対象から外植され、その後、該対象に再導入される標的細胞への投与によって、または該所望の標的細胞への導入を可能にするであろういずれかの他の手段によってのようなsiRNA分子発現ベクターの送達は全身性であり得る(概説については、Couture et al., 1996, TIG. 12:510参照)。
【００５５】
１つの具体例において、本発明は、少なくとも１つの本発明のsiRNA分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供する。該発現ベクターは、siRNA 二本鎖、またはsiRNA 二本鎖に自己ハイブリダイズする単一の自己相補鎖の１または両方の鎖をコードすることができる。該siRNA分子をコードする核酸配列は、該siRNA分子の細胞における発現が可能な様式で、操作可能に連結され得る(例えば、Paul et al., 2002, Nature Biotechnology 19:505; Miyagishi and Taira, 2002, Nature Biotechnology 19:497; Lee et al., 2002, Nature Biotechnology 19:500; および Novina et al., 2002, Nature Medicine, online publication June 3参照)。
【００５６】
もう１つの態様において、本発明は：a)転写開始領域（例えば、真核生物pol I、II またはIII 開始領域); b)転写終止領域（例えば、例えば、真核生物pol I、II またはIII終止領域）；およびc)少なくとも１つの本発明のsiRNA分子をコードする核酸配列を含む発現ベクターを提供し；ここに、該配列は、該siRNA分子の発現および／または送達を可能にする様式で、該開始領域および該終止領域に操作可能に連結される。該ベクターは、所望により、本発明のsiRNAをコードする配列の5'側または3'-側上に操作可能に連結された蛋白質に対するオープンリーディングフレーム (ORF); および／またはイントロン (介在配列)を含み得る。
【００５７】
該siRNA分子配列の転写は、真核生物RNA ポリメラーゼ I (pol I)、RNA ポリメラーゼ II (pol II)、またはRNA ポリメラーゼ III (pol III)に対するプロモーターから駆動され得る。pol IIまたはpol III プロモーターからの転写体は、全細胞において高レベルにて発現され；所与の細胞における所与のpol II プロモーターのレベルは、近くに存在する遺伝子制御配列 (エンハンサー、サイレンサー等)の性質によって決まる。また、該原核生物RNA ポリメラーゼが該適切な細胞において発現されることを条件として、原核生物RNAポリメラーゼプロモーターが使用される(Elroy-Stein and Moss, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:6743-7; Gao and Huang 1993, Nucleic Acids Res. 21:2867-72; Lieber et al., 1993, Methods Enzymol. 217:47-66; Zhou et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 10:4529-37)。数人の研究者らは、そのようなプロモーターから発現された核酸分子が哺乳類細胞において機能し得ることを示している（例えば、Kashani-Sabet et al., 1992, Antisense Res. Dev. 2:3-15; Ojwang et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10802-6; Chen et al., 1992, Nucleic Acids Res. 20:4581-9; Yu et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6340-4; L'Huillier et al., 1992, EMBO J. 11:4411-8; Lisziewicz et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 90:8000-4; Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:2259; Sullenger and Cech, 1993, Science 262:1566)。より具体的には、U6低分子核内(snRNA)、転移RNA (tRNA)およびアデノウイルス VA RNAをコードする遺伝子から由来のもののような転写ユニットは、細胞中のsiRNAのような高濃度の所望のRNA分子を生成するのに有用である(Thompson et al., 1995, Nucleic Acids Res. 23:2259; Couture et al., 1996, TIG 12:510; Noonberg et al., 1994, Nucleic Acid Res. 22:2830; Noonberg et al., 米国特許5,624,803; Good et al., 1997, Gene Ther. 4:45; Beigelman et al., 国際PCT公報WO 96/18736。上記のsiRNA転写単位は、プラスミドDNAベクター、ウイルスDNAベクター (例えば、アデノウイルスまたはアデノ関連ウイルスベクター)、またはウイルスRNAベクター(例えば、レトロウイルスまたはアルファウイルスベクター)を含むが、これらに制限されない哺乳類細胞への導入のための種々のベクターに組み込まれ得る(概説については、Couture et al., 1996, TIG 12:510参照)。
【００５８】
本発明の実施において有用な発現ベクターは、ヘアピンループを含有する該siRNA分子の発現を可能にする様式で、小ヌクレオチドスペーサー配列によって分離されたsiRNA分子の２つの相補配列をコードする核酸配列を含む発現ベクターを含む。一般的には、有用な発現ベクターは：a)転写開始領域；b)転写終止領域；およびc)小ヌクレオチドスペーサー配列によって分離されたsiRNA分子の２つの相補配列をコードする核酸配列を含み；ここに、該配列は、該小ヘアピンループを含有する該siRNA分子の発現および／または送達を可能にする様式で、該開始領域および該終止領域に操作可能に連結される。
【００５９】
特定の具体例において、本発明は、体内に存在する少なくとも１つの腫瘍細胞を有する該動物に、例えば、配列番号: 1、2、3、および4として本明細書中に提供されるように、治療上有効量のFoxM1B siRNA分子を、治療上有効な時間、投与することを特徴とする方法を提供し、ここに該FoxM1B siRNA分子は、FoxM1B遺伝子発現を阻害し得る。
【００６０】
特定の具体例において、本発明は、例えば、医薬上許容される希釈剤、担体、溶解剤、乳剤、保存料および／またはアジュバントと一緒に哺乳類の細胞においてFoxM1B発現を阻害する本明細書において配列番号: 1、2、3、および4として提供される治療上有効量のFoxM1B siRNA分子を含む医薬組成物を提供する。本発明は、さらに、例えば、本明細書において配列番号: 1、2、3、および4として提供されるFoxM1B siRNA分子を含む医薬組成物を提供する。
【００６１】
用語「剤」は、本明細書中で使用されて、化学化合物、化学化合物の混合物、生物学的巨大分子、または生物学的物質から作成された抽出物を指す。
【００６２】
本明細書中で使用されるように用語「医薬組成物」は、医薬上許容される担体、賦形剤、または希釈剤および化学化合物、ペプチド、または患者に適切に投与された時、所望の治療効果を誘導することが可能な本明細書中に記載の組成物を含む組成物を指す。
【００６３】
用語「治療上有効量」は、哺乳類において治療応答を生成すると決定された成長ホルモンまたは本発明の医薬組成物または本発明のスクリーニング方法において同定された化合物の量を指す。そのような治療上有効量は、当業者によっておよび本明細書中に記載の方法を用いて、すぐに確証される。
【００６４】
本明細書中で使用されるように、「実質的に純粋」は、存在する優勢種である（つまり、モルベースで、それは、該組成物中のいずれの他の個々の種より豊富である）対象種を意味する。特定の具体例において、実質的に精製された画分は、該対象種が存在する全巨大分子種の少なくとも約50パーセント（モルベースでまたは重量または数ベースで）含む組成物である。特定の具体例において、実質的に純粋な組成物は、該組成物中に存在する全巨大分子種の約80%、85%、90%、95%、または99%以上を含むであろう。特定の具体例において、該対象種は、本質的な均一性（ここに、汚染種は、慣用的検出方法によって該組成物中で検出されない）まで精製され、ここに、該組成物は、本質的に、単一巨大分子種よりなる。
【００６５】
用語「患者」は、ヒトおよび動物対象を含む。本明細書中で使用されるように、用語「腫瘍成長」および「腫瘍細胞増殖」を使用して、腫瘍細胞の成長を指す。本明細書中で使用されるように、用語「腫瘍細胞」は、腫瘍性である細胞を指す。腫瘍細胞は、良性、つまり、転移を形成せず、隣接する正常な組織に侵入せずそれを破壊しないもの、または悪性、つまり、周囲の組織に侵入し、転移を生成することが可能であり、除去を試みた後に再発し得、該宿主の死を引き起こす可能性があるものであり得る。好ましくは、本発明の方法に付された腫瘍細胞は、皮膚細胞、肺細胞、腸上皮細胞、結腸上皮細胞、精巣細胞、乳腺細胞、前立腺細胞、脳細胞、骨髄細胞、血リンパ球、卵巣細胞または胸腺細胞から由来する腫瘍細胞のような上皮由来腫瘍細胞である。
【００６６】
許容される処方材料は、好ましくは、使用される用量および濃度では、受取人に無毒である。該医薬組成物は、例えば、pH、モル浸透圧濃度、粘度、透明性、色、等張性、匂い、無菌性、安定性、溶解または放出の速度、組成物の吸収または浸透を修飾、維持または保存するための処方材料を含有し得る。適当な処方材料は、アミノ酸(例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジン); 抗菌剤;抗酸化剤 (例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウムまたは亜硫酸水素ナトリウム);緩衝剤 (例えば、ホウ酸塩、重炭酸塩、Tris-HCl、クエン酸塩、リン酸塩または他の有機酸); 充填剤 (例えば、マンニトールまたはグリシン); キレート剤 (例えば、エチレンジアミン4酢酸(EDTA)); 錯化剤 (例えば、カフェイン、ポリビニルピロリドン、ベータ-シクロデキストリンまたはヒドロキシプロピル−ベータ−シクロデキストリン); 賦形剤; 単糖類, 二糖類, および他の炭水化物(例えば、グルコース、マンノースまたはデキストリン); 蛋白質(例えば、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン); 着色剤、香料添加剤および賦形剤; 乳剤; 親水性ポリマー (例えば、ポリビニルピロリドン); 低分子量ポリペプチド; 塩形成対イオン(例えば、ナトリウム); 保存剤 (例えば、塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸または過酸化水素); 溶剤 (例えば、グリセリン、プロピレングリコールまたはポリエチレングリコール); 糖アルコール (例えば、マンニトールまたはソルビトール); 懸濁剤; 界面活性剤または湿潤剤 (例えば、pluronics、PEG、ソルビタンエステル、ポリソルベート20およびポリソルベート80のようなポリソルベート、Triton、トロメタミン、レシチン、コレステロール、またはチロキサポール); 安定性促進剤 (例えば、スクロースまたはソルビトール); 等張化促進剤(例えば、ハロゲン化アルカリ金属、好ましくは塩化ナトリウムまたは塩化カリウム、マンニトール、またはソルビトール); 送達ビヒクル; 希釈剤; 賦形剤および／または医薬アジュバントを含むが、これらに限定されるものではない。例えば、remington's pharmaceutical sciences, 18th Edition, (A.R. Gennaro, ed.), 1990, Mack Publishing Company参照。
【００６７】
最適な医薬組成物は、例えば、意図された投与経路、送達形態および所望の用量に基づき、当業者によって決定され得る。例えば、remington's pharmaceutical sciences,  Id参照。そのような組成物は、本発明の抗体の物理的状態、安定性、インビボ放出の速度およびインビボクリアランスの速度に影響を及ぼし得る。
【００６８】
医薬組成物中の主要なビヒクルまたは担体は、非経口投与用の組成物に共通した他の物質で補充され得る注射用の水、生理食塩水または人工脳脊髄液を含み得るが、これらに限定されるものではない。中性緩衝生理食塩水または血清アルブミンと混合された生理食塩水は、さらなる例示的ビヒクルである、医薬組成物は、さらにソルビトールまたはその適当な代替物を含み得る、約pH 7.0-8.5のTris緩衝液、または約pH 4.0-5.5の酢酸緩衝液を含み得る。本発明の医薬組成物は、凍結乾燥ケーキまたは水溶液の形態で、所望の程度の純度を有する選択された組成物を、所望の処方剤と混合することによって(remington's pharmaceutical sciences, Id.)、保存用に調製され得る。さらに、該FoxM1B-阻害siRNAは、スクロースのような適切な賦形剤を用いて、凍結乾燥物として処方され得る。
【００６９】
処方成分は、投与の部位に許容される濃度で存在する。緩衝液は、有利に使用されて、典型的には約5ないし約8のpH範囲内の生理学的pHにてまたはわずかにより低いpHにて、該組成物を維持する。
【００７０】
本発明の医薬組成物は非経口で送達され得る。非経口投与が考慮される時、本発明における使用のための治療組成物は、所望の本発明のsiRNAを含む発熱物質なしの非経口的に許容される水溶液の形態であり得る。調製物は、所望の分子の注射可能なミクロスフィア、生体侵食性粒子、(ポリ乳酸またはポリグリコール酸のような)高分子化合物、ビーズまたはリポソームのような剤との処方を含み得、これは、次いで蓄積注射を介して送達され得る生成物の制御されたまたは徐放性放出を提供し得る。ヒアルロン酸との処方は、循環血液における持続期間を高める効果を有する。移植可能な薬物送達デバイスを使用して、所望の分子を導入してもよい。
【００７１】
該組成物は、吸入用に処方されてよい。これらの具体例において、本発明のスクリーニング方法において同定された化合物または本明細書中に開示されたFoxM1B siRNAは、吸入用のドライパウダーとして処方され、あるいは吸入溶液は、例えば、噴霧によって、エアロゾル送達用噴霧剤と処方され得る。肺投与は、化学的に修飾された蛋白質の肺送達を記載し、引用によって援用されるPCT出願PCT/US94/001875に、さらに記載される。
【００７２】
本発明の医薬組成物は、例えば経口で、消化管を介して送達され得る。そのような医薬上許容される組成物の調製は、当業者の範囲内である。この様式で投与される本明細書中に開示されるFoxM1B siRNAは、通例、錠剤および丸剤のような固体用量形態の配合で使用される担体あるなしで処方され得る。丸剤は、生物学的利用能が最大化され、全身循環に到達する前の分解（pre-systemic degradation）が最小化される時、消化管の地点にて、該処方の活性部分を放出するように設計され得る。さらなる剤を含んで、本明細書中に開示されるFoxM1B siRNAの吸収を促進し得る。また、希釈剤、香味料、低融点ワックス、植物油、滑沢剤、懸濁剤、タブレット崩壊剤、および結合剤を使用してもよい。
【００７３】
医薬組成物は、錠剤の製造に適当な無毒の賦形剤との混合物で、本明細書中に開示される有効量のFoxM1B siRNAを含み得る。滅菌水、またはもう一方の適切なビヒクル中に錠剤を溶解することによって、溶液はユニット用量形態で調製され得る。適当な賦形剤は、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウムまたは重炭酸塩、ラクトース、またはリン酸カルシウムのような不活性希釈剤；または澱粉、ゼラチン、またはアカシアのような結合剤；またはステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルクのような平滑剤を含むが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
徐放処方または制御送達処方で、本明細書中に開示されるFoxM1B阻害剤または本発明の化合物を含む処方を含むさらなる医薬組成物は当業者に明白である。また、リポソーム担体、生体侵食性微粒子または多孔性ビーズおよび蓄積注射のような種々の他の徐放性または制御された送達手段を処方するための技術も当業者に知られている。例えば、医薬組成物の送達につき多孔性高分子微粒子の制御された放出を記載するPCT出願PCT/US93/00829参照。徐放性調製物は、例えば、フィルム、またはマイクロカプセル、ポリエステル、ハイドロゲル、ポリ乳酸 (U.S. 3,773,919およびEP 058,481)、l-グルタミン酸およびガンマエチル-l-グルタミン酸塩の共重合体(Sidman et al., 1983, Biopolymers 22: 547-556)、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリル酸塩) (Langer et al., 1981, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277) and Langer, 1982, Chem. Tech. 12: 98-105)、エチレン酢酸ビニール(Langer et al., id.)またはポリ-d(-)-3-ヒドロキシ酪酸(EP 133,988)といった造形品の形態の半透性ポリマーマトリックスを含み得る。また、徐放性組成物は、リポソームを含んでもよく、これは、当該分野で知られるいくつかの方法のうちのいずれかによって調製することができる。例えば、Eppstein et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 3688-3692; EP 036,676; EP 088,046およびEP 143,949参照。
【００７５】
インビボ投与に使用される医薬組成物は、典型的には、無菌である。特定の具体例において、これは、無菌ろ過膜を介するろ過によって達成され得る。特定の具体例において、該組成物が凍結乾燥される場合、この方法を用いる滅菌は、凍結乾燥および再構築前またはその後のいずれかに実施され得る。特定の具体例において、非経口投与用の組成物は、凍結乾燥形態でまたは溶液中で保存されてよい。特定の具体例において、非経口組成物は、一般的には、例えば、皮下注射針によって貫通することが可能なストッパーを有する静脈注射用の溶液バッグまたはバイアルといった殺菌したアクセスポートを有する容器に入れられる。
【００７６】
一旦、本発明の医薬組成物が処方されると、それは、溶液、懸濁液、ゲル、乳剤、固体として、または乾燥したまたは凍結乾燥した粉末として保存され得る。そのような処方は、すぐに使える形態または投与前に再構築された（凍結乾燥した）形態のいずれかで保存され得る。
【００７７】
本発明は、単一用量投与単位を生成するためのキットに指向される。本発明によるキットは、各々、本発明のスクリーニング方法において同定された乾燥蛋白質化合物を有する第１の容器および例えば、単一および複数チャンバーのプレフィルシリンジ(例えば、液体シリンジ、リオシリンジまたは針なしのシリンジ)を含む水性処方を有する第２の容器の両方を含有し得る。
【００７８】
治療的に使用される本発明の有効量の医薬組成物は、例えば、治療的内容および目的によって決まるであろう。当業者は、特定の具体例による治療のための適切な用量レベルは、従って、部分的に、送達される分子、該医薬組成物が使用される適応症、投与経路、およびサイズ(体重、体表面または臓器サイズ) および／または患者の状態（年齢および一般的健康）によって変動するであろうことを理解するであろう。臨床医は、用量を調整し、投与経路を修飾して、最適な治療効果を得てもよい。
【００７９】
投薬頻度は、本明細書中で開示されるFoxM1B siRNA薬物動態パラメータに基づくであろう。例えば、所望の効果を達成する用量が達成されるまで、臨床医は該siRNAを投与する。従って、該組成物は、単一用量として、または経時的に２以上の用量(同量の所望の分子を含有してもしなくてもよい)として、あるいは移植デバイスまたはカテーテルを介する継続注入として投与されてよい。適切な用量のさらなる改良は、ルーチン的に当業者によってなされ、彼らによってルーチン的に行われるタスクの範囲内である。適切な用量は、適切な用量−応答データを介して確証され得る。
【００８０】
本発明の医薬組成物の投与経路は、経口、静脈内、腹腔内、脳内（実質内）、脳室内、筋肉内、眼内、動脈内、門脈内、または病巣内経路による注射を介して；徐放性システムによってまたは移植デバイスによってを含む。該医薬組成物は、大量瞬時投与によってまたは注入によって継続的に、または移植デバイスによって投与されてもよい。また、該医薬組成物は、該所望の分子が吸収または封入されている膜、スポンジまたはもう１つの適切な物質の移植を介して、局所的に投与することができる。移植デバイスが使用される場合、該デバイスはいずれかの適当な組織または臓器に移植されてよく、所望の分子の送達は、拡散、時限放出ボーラス、または継続投与を介してであってよい。
【００８１】
特定の具体例において、本明細書中に開示のFoxM1B siRNAまたは本発明のFoxM1B siRNAを含む医薬組成物を、生体外で使用することが望ましいかもしれない。そのような例において、該患者から除去された細胞、組織または臓器は、該細胞、組織および／または臓器が、引き続いて、該患者に再び移植された後、本発明の医薬組成物または本明細書中に開示されるsiRNAに暴露される。
【００８２】
本発明の医薬組成物は、単独でまたは他の治療剤と組み合わせて、特に、他の癌治療剤と組み合わせて投与され得る。そのような剤は、一般的には、放射線治療または化学療法を含む。例えば、化学療法は、１以上の以下の剤：アントラサイクリン、タキソール、タモキシフェン、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、および当業者に知られる他の薬物による治療を含み得る。
【００８３】
本発明のsiRNAの細胞への導入は、当該分野で知られるいずれかの方法を用いてまたは本明細書に記載のとおり達成することができる。例えば、FoxM1B siRNAの局所送達は、直接注射によってまたは他の適切なウイルスまたは非ウイルス送達ベクターによって達成することができる。(Hefti, 1994, Neurobiology 25:1418-35.)例えば、FoxM1Bポリペプチドをコードする核酸分子は、該標的細胞に送達するためのアデノ関連ウイルス (AAV)ベクター中に含有され得る(例えば、Johnson, PCT公報WO 95/34670; PCT出願PCT/US95/07178参照)。本発明の教示に従って使用される組換えAAVゲノムは、典型的には、機能的プロモーターに操作可能に連結されたFoxM1B siRNAをコードするDNA配列およびポリアデニル化配列に隣接する逆方向末端反復を含有する。
【００８４】
別の適当なウイルスベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、パポバウイルス、ポックスウイルス、アルファウイルス、コロナウイルス、ラブドウイルス、パラミクソウイルス、およびパピローマウイルスベクターを含むが、これらに限定されるものではない。米国特許5,672,344は、組換え神経栄養HSV-1ベクターを含むインビボウイルス媒介遺伝子移動システムを記載する。米国特許5,399,346は、治療用蛋白質をコードするDNAセグメントを挿入するために、インビトロで処理されているヒト細胞の送達によって、患者に治療用蛋白質を提供するための方法の例を提供する。遺伝子治療技術の実施のためのさらなる方法および物質は、米国特許5,631,236 (アデノウイルスベクターを含む)、5,672,510 (レトロウイルスベクターを含む)、および5,635,399 (サイトカインを発現するレトロウイルスベクターを含む)に記載される。
【００８５】
非ウイルス送達方法は、リポソーム媒介移動、裸のDNA送達（例えば、直接注射によって）、受容体媒介移動（リガンド-DNA複合体）、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、およびミクロ粒子衝撃(例えば、遺伝子銃)を含むが、これらに限定されるものではない。また、遺伝子治療物質および方法は、誘導性プロモーター、組織特異的エンハンサー-プロモーター、部位特異的統合に設計されたDNA配列、該親細胞を超える選択的利点を提供することが可能なDNA配列、形質転換された細胞を同定する標識、陰性選択システムおよび発現対照システム（安全対策）、（細胞標的のための）細胞特異的結合剤、細胞特異的内部化因子、および転写因子を含んで、ベクターならびにベクター製造の方法によって発現を促進してもよい。遺伝子治療技術の実施のためのそのようなさらなる方法および物質は、米国特許4,970,154 (エレクトロポレーション技術を含む)、5,679,559 (遺伝子治療のためのリポ蛋白質含有システムを記載する)、5,676,954 (リポソーム担体を含む)、5,593,875 (リン酸カルシウム形質移入のための方法を記載する)、および4,945,050(生物学的に活性な粒子が、該粒子が該細胞の表面に浸透し、該細胞の内部に組み込まれるようになる速度で、細胞にて推進される方法を記載する)、およびPCT公報WO 96/40958 (核リガンドを含む)に記載される。
【００８６】
以下の実施例は、説明の目的のために提供されるものであって、本発明の範囲を制限するように意図されていない。本発明は、本発明の個々の態様の説明として意図される例示される具体例によって範囲を制限されるものではない。実に、本明細書中に示され記載されたものに加えて、本発明の種々の修飾が、以下の記載および添付の図面から、当業者に明白になるであろう。そのような修飾は、添付の請求の範囲内にあるものと意図される。
【実施例】
【００８７】
実施例１
FoxM1B siRNAは両方のFoxM1B転写活性を減少する
最近のマウス遺伝学研究は、Alb-Cre Foxm1b -/- 肝細胞は、DEN/PB 肝臓腫瘍誘導後、増殖に失敗し、肝細胞癌(HCC)を発達させることに非常に抵抗性であることを示した(Kalinichenko et al. 2004 Genes & Dev. 18:830-850)。FoxM1b蛋白質の発現を阻害する方法を開発するために、アルゴリズムを使用して(Dharmacon Research, Lafayette, Colorado)、各末端にてさらなる対称 2-ウラシル (U) 3'オーバーハングを含有する該ヒトFoxM1b cDNAに特異的な４つの19-ヌクレオチド 低分子干渉RNA (siRNA) 二本鎖を合成した。これらの４つのFoxm1b siRNA配列および該ヒトFoxm1b cDNA配列内のそれらのヌクレオチド位置を表１に示す。
【００８８】
【表１】
2008503234.tif 000002
【００８９】
各々が該ヒトFoxM1b cDNAに特異的な（該ヒトFoxM1b cDNAにおける該ヌクレオチド位置が示される）４つの異なる19-ヌクレオチド 低分子干渉RNA (siRNA) 二本鎖を合成した。該siRNA 二本鎖の各々は、各末端にて、さらなる対称2-ウラシル (U) 3'オーバーハングを含有して、安定性を促進した。
【００９０】
これらのFoxM1b siRNAは、siFoxM1b #1ないし#4と命名され；また、これらの４つのFoxM1b siRNAの混合物(siFoxM1bプール)を含有するFoxM1b siRNAプールを使用した。該組織培養媒体へのドキシサイクリン(Dox)の添加が該緑色蛍光蛋白質(GFP)-Foxm1b 融合蛋白質の発現を刺激した(Kalinichenko et al., 2004, Genes & Dev. 18:830-850)、TetO-GFP-FoxM1bクローンC3 U2OS細胞系統を使用して、該siFoxM1b分子の活性を分析した。これらのFoxM1b siRNA 二本鎖に対する用量応答曲線を、該GFP-FoxM1b蛋白質のドキシサイクリン誘導後、該TetO-GFP-FoxM1bクローンC3 U2OS細胞系統に、増加する量の該個々のFoxM1b siRNA (表1, siFoxM1b #1ないし#4)または該siFoxM1bプールのいずれかを形質移入することによって行った。該siRNAを、リポフェクタミン2000(Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)を用いて形質移入した。蛋白質抽出物は、形質移入後48時間に調製し、次いで、GFPに対するモノクローナル抗体を用いるウエスタンブロット分析によって、GFP-FoxM1b蛋白質レベルについて分析した(図1A)。これらの分析は、該FoxM1b siRNAの各々の100 nMの形質移入が、該TetO-GFP-FoxM1bクローンC3 U2OS細胞系統において、該GFP-FoxM1b蛋白質のDox誘導発現を減少することを示した(図1A)。
【００９１】
25 nMのみの該FoxM1b siRNA #2の形質移入が、誘導されたGFP-FoxM1b蛋白質の発現を完全に阻害するのに十分であるため、該siFoxM1b #2 二本鎖は、FoxM1b蛋白質発現を減少するのに最も効果的であった(図1A)。先の研究は、該Foxm1b蛋白質が、発現がCdk1活性化に必要である該Cdc25Bホスファターゼ遺伝子の転写に重要であることを示した(Wang et al. 2002  Proc. Natl. Acad. Sci USA. 99:6881-16886)。これらの研究と一貫して、誘導されたレベルの該GFP-FoxM1b蛋白質は、非処理クローンC3 U2OS細胞系統と比較して、該Cdc25B蛋白質の発現を刺激した(図1B, -および+ Doxを比較)。さらに、Dox処理クローンC3 U2OS細胞系統への増加する量のsiFoxM1b #1またはsiFoxM1b #2いずれかの形質移入は、siFoxM1b #2が、該Cdc25B蛋白質の発現を効果的に減少する(図1B)ことを示し、これは、GFP-FoxM1b蛋白質レベルを減少させるこのsiRNAの能力と合致する知見である(図1A)。
【００９２】
該クローンC3 U2OS細胞系統を、同等量のこれらのFoxM1b siRNAによって形質移入し、蛋白質抽出物を、形質移入後48時間単離し、ウエスタンブロット分析を使用して、GFP-FoxM1b蛋白質および組織化有糸分裂に関与する潜在的FoxM1b標的蛋白質の誘導されたレベルを測定した。１つのそのような標的は組織化有糸分裂に関与するオーロラBキナーゼ（Aurora B Kinase）であり、Foxm1b 欠損 (-/-)胎生肝における発現の85%減少を有することが示されている(Krupczak-Hollis et al. 2004 Dev. Biol., In press)。該ウエスタンブロット分析は、該GFP-FoxM1b蛋白質のドキシサイクリン誘導が、非処置クローンと比較して、該オーロラBキナーゼの発現の増加を引き起こすことを示した。これらの研究は、これらの研究は、全ての該FoxM1b siRNAが、誘導されたGFP-FoxM1b 蛋白質レベルの発現を減少し、siFoxM1b #2が、GFP-FoxM1b蛋白質の発現レベルを阻害することを示した（図2）。FoxM1b siRNA #1、#2または#3の形質移入が、オーロラBキナーゼ蛋白質のレベルを効果的に減少させ、FoxM1b siRNA #1および#2のみが、M-相制御因子ポロ様キナーゼ (Plk-1) 蛋白質の発現を効果的に減少した(図2)。対照的に、GFP-FoxM1bレベルにおけるsiRNA媒介減少は、有糸分裂に関与した染色体パッセンジャー蛋白質である内側動原体蛋白質 (INCENP)の発現に影響を及ぼさない（図2）。興味深いことに、GFP-FoxM1bの発現がFoxM1b siRNAによって阻害される時、E2F1蛋白質の発現もまた減少された。
【００９３】
また、該Foxm1b siRNA #1、#2および#3の形質移入は、非処置対照または該Foxm1b siRNA #4と比較して、細胞成長速度において有意な減少を引き起こし、その後者の方が、GFP-FoxM1b蛋白質発現のあまり効率的でない阻害剤である（図3）。U2OS細胞の該FoxM1b siRNAプールによる形質移入は、フローサイトメトリーによって決定されるように、該細胞周期の該G2/M-相において蓄積する増加した数の細胞による細胞DNA複製の有意な減少を引き起こした(図4)。これらの結果は、FoxM1b発現のsiRNA媒介減少がG2/M遮断を引き起こしたことを示唆し、これはFoxM1bが有糸分裂への進行に必要であることを示す。さらに、該Foxm1b siRNA #1、#2、#3またはsiRNAプールのDox-誘導C3クローンU2OS細胞系統への形質移入は、軟寒天上で増殖する細胞コロニーの数の減少によって実証されるように、足場非依存性増殖の有意な減少を引き起こした（図5Aないし5B)。これらの研究は、該Foxm1b siRNAは、Foxm1b媒介細胞増殖および細胞形質転換（軟寒天上の増殖）を減少する効果的な試薬であることを示した。
【００９４】
該前述の開示は本発明の特定の特異的な具体例に重点を置いたものであって、それへの全修飾または代替の同等物は、添付の請求の範囲に記載されるように、本発明の精神および範囲内であることが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】図1Aおよび1Bは、FoxM1b siRNAの形質移入が、実施例１に記載のとおり、GFP-FoxM1b蛋白質およびその標的Cdc25B蛋白質の発現を阻害することを示す。図1A: GFP-FoxM1b蛋白質レベルのFoxM1b siRNA阻害の用量応答曲線。増加する量の該個々のFoxM1b siRNA (siFoxM1b #1ないし#4)または該siFoxM1bプールのいずれかを、該GFP-FoxM1b蛋白質のドキシサイクリン誘導後、該TetO-GFP-FoxM1bクローンC3 U2OS細胞系統に形質移入した。蛋白質抽出物を形質移入の48時間後調製し、次いで、GFPに対するモノクローナル抗体を用いてウエスタンブロット分析によって、GFP-FoxM1b蛋白質レベルについて分析した。図1B: FoxM1b siRNA #2は、該FoxM1b標的Cdc25B蛋白質の発現を効果的に阻害する。増加する量のsiFoxM1b #1またはsiFoxM1b #2のいずれかのDox処理クローンC3 U2OS細胞系統への形質移入は、siFoxM1b #2が該Cdc25B蛋白質の発現を効果的に減少することを示した。
【図２】図2は、FoxM1b siRNAの形質移入が、GFP-FoxM1b蛋白質および有糸分裂に関与するその潜在的標的の発現を阻害することを示す。該クローンC3 U2OS細胞系統を、同等量(100 nM)のFoxM1b siRNA #1、#2、#3または#4によって形質移入し、ドキシサイクリン(Dox)によってGFP-FoxM1bに誘導し、蛋白質抽出物を形質移入後48時間で単離した。ウエスタンブロット分析を使用して、組織化する有糸分裂に関与する誘導されたレベルのGFP-FoxM1b蛋白質および潜在的FoxM1b標的蛋白質を測定した。ウエスタンブロット分析を、該GFP蛋白質に対する抗体、オーロラBキナーゼ、オーロラAキナーゼ、内側セントロメア蛋白質(INCENP)、ポロ様キナーゼ1 (Plk-1)および該増殖特異的E2F1転写因子によって実施した。
【図３】図3は、U2OS細胞へのFoxM1b siRNAの形質移入が細胞増殖の速度を減少することを示す。U2OS細胞を、100 nMのFoxM1b siRNA #1、#2、#3または#4によって形質移入し、細胞を、72時間後、トリプシン処理し、カウントした。三つ組プレートを使用して、非処理に正常化した細胞の平均パーセンテージ±標準偏差 (SD)を決定した。
【図４】図4は、U2OS細胞へのFoxM1b siRNAの形質移入が、実施例１に記載のように、該細胞周期の該G2/M相における細胞の蓄積を引き起こしたことを示す。U2OS細胞を、100 nMのFoxM1b siRNAプール (siFoxM1b #1、#2、#3および#4の混合物)で形質移入し、細胞を3日後、トリプシン処理し、エタノール中で固定し、ヨウ化プロピジウムで染色し、次いで、フローサイトメトリーによって、細胞周期進行について分析した。
【図５】図5Aないし5Gは、C3クローンU2OS細胞へのFoxM1b siRNAの形質移入が、軟寒天上の足場非依存性増殖を減少することを示す。該クローンC3 U2OS細胞系統を、100 nMのFoxM1b siRNAプール (図5C)または#1 (図5D)、#2 (図5E)、#3 (図5F)または#4 (図5G)によって形質移入し、次いで、ドキシサイクリン(Dox)によって、GFP-FoxM1bに誘導し、該結果を、図5の該棒グラフに示すように、表にした。対照は、Doxによって誘導された(図5A)または誘導されていない(図5B)のいずれかであるクローンC3 U2OS細胞系統を含んだ。FoxM1b siRNA 形質移入の１日後、該細胞を、Kalinichenko et al. (2004, Genes & Dev. 18: 830-850)に記載のように、２週間、軟寒天上にそれらをプレートすることによって、足場非依存性細胞増殖につきアッセイした。３つ組プレートを使用して、コロニーをカウントし、コロニーの平均数±標準偏差 (SD)を決定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年2月20日(2007.2.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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