(57)【要約】  抗呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）モノクローナル抗体、ＲＳＶ  Ｆタンパク質抗原、およびそれらの用途が開示される。
2008518602.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８、１０および１２に示されるところのＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４、１６および１８に示されるところのＬ鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗体の抗原結合能力を有する呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質と反応性の単離された抗体。
【請求項２】
パリビズマブ若しくはｍＡｂ１９由来のＣＤＲを含有する抗体若しくは抗体フラグメントによる中和を逃れる、ＲＳＶ単離物と反応性の単離された抗体。
【請求項３】
ＲＳＶ単離物がＦタンパク質中にＳｅｒ２７５Ｐｈｅ突然変異を含んでなる、請求項２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
Ｆタンパク質の残基４２２ないし４３６（配列番号２８）に位置するＲＳＶ  Ｆタンパク質エピトープと反応性の単離された抗体。
【請求項５】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質の残基Ｒ４２９およびＫ４２３と反応性の単離された抗体。
【請求項６】
それぞれ配列番号８、１０および１２のＨ鎖ＣＤＲ１（Ｈｃ−ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（Ｈｃ−ＣＤＲ２）およびＣＤＲ３（Ｈｃ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列、ならびにそれぞれ配列番号１４、１６および１８のＬ鎖ＣＤＲ１（Ｌｃ−ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（Ｌｃ−ＣＤＲ２）およびＣＤＲ３（Ｌｃ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列を含んでなる、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項７】
配列番号３のアミノ酸配列を有する可変領域Ｈ鎖（ＶＨ）および配列番号５のアミノ酸配列を有する可変領域Ｌ鎖（ＶＬ）を含んでなる、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項８】
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨおよび配列番号５１のアミノ酸配列を有するＶＬを含んでなる、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項９】
それぞれ配列番号８、１０および１２に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２およびＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに式（Ｉ）：
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ０  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｇｌｙ  Ｘａａ３  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｘａａ４  Ｈｉｓ
（Ｉ）
［式中、Ｘａａ０はＧｌｎ、Ａｓｐ若しくはＨｉｓであり；Ｘａａ１はＬｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ若しくはＴｙｒであり；Ｘａａ２はＰｈｅ、Ｌｅｕ若しくはＳｅｒであり；Ｘａａ３はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ若しくはＳｅｒであり；およびＸａａ４はＶａｌ若しくはＭｅｔである］
に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１；ならびにそれぞれ配列番号１６および１８に示されるところのＬ鎖ＣＤＲ２（Ｌｃ−ＣＤＲ２）およびＬ鎖ＣＤＲ３（Ｌｃ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列を有する、単離された抗体。
【請求項１０】
配列番号４９のアミノ酸配列を有するＶＨ、および配列番号６３、６４、６５、６６、６７、６８、１０５、６９、７０、７１、７２、７３若しくは１１１のアミノ酸配列を有するＶＬを含んでなる、請求項９に記載の単離された抗体。
【請求項１１】
配列番号８に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、式（ＩＩ）：
Ｈｉｓ  Ｘａａ７  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｘａａ８  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｘａａ９  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ
（ＩＩ）
［式中、Ｘａａ７はＩｌｅ若しくはＬｅｕであり、Ｘａａ８はＬｙｓ若しくはＴｙｒであり、およびＸａａ９はＡｓｎ若しくはＳｅｒである］
に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１２に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに、それぞれ配列番号１４および１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１およびＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに配列番号１０７若しくは１１０に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、単離された抗体。
【請求項１２】
配列番号７４に示されるところのＶＬアミノ酸配列、および配列番号１０６に示されるところのＶＨアミノ酸配列を含んでなる、請求項１１に記載の単離された抗体。
【請求項１３】
それぞれ配列番号８および１０に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１およびＨｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに、式（ＩＩＩ）：
Ｌｅｕ  Ｘａａ５  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｘａａ６  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｔｙｒ
（ＩＩＩ）
［式中、Ｘａａ５はＴｙｒ若しくはＴｒｐであり；およびＸａａ６はＡｒｇ、Ｌｙｓ若しくはＡｌａである］
に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに、Ｌｃ−ＣＤＲ１、Ｌｃ−ＣＤＲ２およびＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１４、１６および１８に示されるようであるを有する、単離された抗体。
【請求項１４】
配列番号５１に示されるところのＶＬアミノ酸配列、および配列番号７５、７６、７７、７８、７９若しくは８０に示されるところのＶＨアミノ酸配列を含んでなる、請求項１３に記載の単離された抗体。
【請求項１５】
それぞれ配列番号８および１０に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１およびＨｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに式（ＩＶ）に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、式（Ｉ）に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、ならびにそれぞれ配列番号１６および１８に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２およびＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、単離された抗体。
【請求項１６】
配列番号６３に示されるところのＶＬアミノ酸配列、および配列番号７６、８０若しくは７９に示されるところのＶＨアミノ酸配列を含んでなる、請求項１５に記載の単離された抗体。
【請求項１７】
それぞれ配列番号８、１０および１２に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２およびＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに式（Ｉ）［式中、Ｘａａ０がＧｌｎ若しくはＡｓｐであり、Ｘａａ１がＬｅｕ若しくはＴｙｒであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＬｙｓ若しくはＡｒｇであり、およびＸａａ４がＭｅｔである］に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに配列番号１０７に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、単離された抗体。
【請求項１８】
配列番号８１、８２、８３若しくは１１２に示されるところのＶＬアミノ酸配列、および配列番号４９に示されるところのＶＨアミノ酸配列を含んでなる、請求項１７に記載の単離された抗体。
【請求項１９】
配列番号８に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、式ＩＩのＨｃ−ＣＤＲ２、式ＩＩＩのＨｃ−ＣＤＲ３、式ＩのＬｃ−ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１０７に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、単離された抗体。
【請求項２０】
以下のＶＬおよびＶＨアミノ酸配列の組合せ：
【表１】
2008518602.tif 000011
を含んでなる、請求項１９に記載の単離された抗体。
【請求項２１】
配列番号８に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、式ＩＩのＨｃ−ＣＤＲ２、式ＩＩＩのＨｃ−ＣＤＲ３、式ＩのＬｃ−ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、単離された抗体。
【請求項２２】
以下のＶＬおよびＶＨアミノ酸配列の組合せ：
【表２】
2008518602.tif 000012
を含んでなる、請求項２０に記載の単離された抗体。
【請求項２３】
抗体がヒト起源のものである、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項２４】
抗体がマウス起源のものである、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項２５】
抗体がＦａｂフラグメントを含んでなる、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項２６】
抗体がｓｃＦｖフラグメントを含んでなる、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項２７】
抗体若しくはフラグメントがヒト適応型である、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項２８】
抗体若しくはフラグメントがキメラ抗体を含んでなる、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項２９】
抗体がポリエチレングリコールに複合されている、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３０】
抗体若しくはフラグメントがマウス抗原結合残基およびヒト抗体残基を含んでなる、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３１】
請求項１に記載の単離された抗体を含んでなる製薬学的組成物。
【請求項３２】
請求項１、２、４、５、９、１１、１３、１５、１７、１９若しくは２１に記載の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項３２に記載のポリヌクレオチドを含んでなるベクター。
【請求項３４】
請求項３３に記載のベクターを含んでなる宿主細胞。
【請求項３５】
請求項３４に記載の宿主細胞を培養すること、および該宿主細胞により産生されたモノクローナル抗体を回収することを含んでなる、抗ＲＳＶ抗体の作成方法。
【請求項３６】
請求項１に記載の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株。
【請求項３７】
ＲＳＶ誘発性疾患の危険に曝されている患者に、予防上有効な量の請求項１、２、４、５、９、１１、１３、１５、１７、１９若しくは２１に記載の抗体を投与することを含ん
でなる、ＲＳＶ誘発性疾患の予防方法。
【請求項３８】
治療上有効な量の請求項１、２、４、５、９、１１、１３、１５、１７、１９若しくは２１に記載の抗体を患者に投与することを含んでなる、ＲＳＶ誘発性疾患の処置方法。
【請求項３９】
ペプチドＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳ（配列番号３８）を含んでなる単離されたポリペプチド。
【請求項４０】
配列番号３８のアミノ酸配列をコードする単離された核酸。
【請求項４１】
請求項３９に記載の単離されたポリペプチドを含んでなるワクチン製剤。
【請求項４２】
請求項４０に記載の単離された核酸を含んでなるワクチン製剤。
【請求項４３】
請求項４１若しくは４２に記載のワクチン製剤を投与することによる、ＲＳＶ誘発性疾患に対する患者の免疫方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質およびＦタンパク質ペプチドに対する中和抗体、ならびにＲＳＶ誘発性疾患を処置および予防するためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）による感染症は、乳児、幼児、免疫無防備状態の個体、およびより最近は高齢者における重篤な下部気道感染症（ＬＲＴＩ）の単一の最も一般的な原因として長く認識されている。本病原体は、米国で毎年乳児および幼児の１２６，０００超の入院および推定される５００例の死亡の直接の原因である（非特許文献１；非特許文献２）。さらに、ＲＳＶ感染は、小児の喘鳴の発症および喘息の悪化と関連づけられている。現在、付加的な１４，０００ないし６０，０００例のＲＳＶ関連の入院が、およそ１１％の死亡率を伴い、増大する高齢の区分内で米国で毎年発生している（非特許文献３；非特許文献４に総説されている）。ＲＳＶ感染は、造血幹細胞および実質臓器移植レシピエントの最も一般的なウイルス呼吸器感染症であり、そしてこの集団における広範な死亡と関連する（非特許文献５に総説されている）。
【０００３】
ＲＳＶに対する中和抗体はウイルスの表面に存在するウイルスＦおよびＧタンパク質に向けられ、Ｆは主要保護抗原を表す。Ｆタンパク質は、ＲＳＶの２サブグループ（ＡおよびＢ）間で高度に保存されており（８９％のアミノ酸同一性）、そして、Ｇタンパク質と対照的に、Ｆタンパク質に対する保護抗体応答はサブグループ間で交差反応性である。一般に、ＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する中和抗体の大多数は、部位ＩＩおよび部位ＩＶ、Ｖ、ＶＩと呼称される該タンパク質の２領域に位置づける（非特許文献６；非特許文献７；非特許文献８）。
【０００４】
保護的ＲＳＶワクチンは未だ開発されていない。さらに、有効な治療的抗ウイルス薬は現在存在しない。該ウイルスＦタンパク質を標的とする、ＲＳＶを中和するヒト化モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、パリビズマブのＳｙｎａｇｉｓ（Ｒ）銘柄が、危険にさらされている乳児（気管支肺異形成（ＢＰＤ）若しくは先天性心疾患を伴う３５週未満の期間）の受動免疫予防のため、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．により販売されている。非特許文献９および特許文献１を参照されたい。しかしながら、Ｓｙｎａｇｉｓ（Ｒ）での免疫予防は、これらの危険にさらされている乳児全体での入院率を５５％だけ（非特許文献１０）、およびＢＰＤを伴う者で有意により少なく良好に（３９％の低下）低下させるのみである。であるから、ＲＳＶ感染症を効果的に予防および処置する剤に対する大きな満たされていない医学上の必要性が存在する。
【特許文献１】米国特許第５，８２４，３０７号
【非特許文献１】Ｓｈａｙら、ＪＡＭＡ  ２８２：１４４０−１４４６、１９９９
【非特許文献２】Ｓｈａｙら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１８３：１６−２２、２００１
【非特許文献３】Ｄｏｗｅｌｌら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７４：４５６−４６２、１９９６
【非特許文献４】Ｈａｎら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．１７９：２５−３０、１９９９
【非特許文献５】ＩｓｏｎとＨａｙｄｅｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１５：３５５−３６７、２００２
【非特許文献６】Ａｒｂｉｚａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．、７３：２２２５−２２３４、１９９２
【非特許文献７】Ｌｏｐｅｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６９２２−６９２８、１９９３
【非特許文献８】Ｃｏｌｌｉｎｓら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．１、第４版中、ｐｐ．１４４３−１４８５、２００１
【非特許文献９】Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．、１７６：１２１５−１２２４、１９９７
【非特許文献１０】Ｉｍｐａｃｔ−ＲＳＶ  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ、Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ、１０２：５３１−５３７、１９９８
【発明の開示】
【０００５】
［発明の要約］
本発明の一局面は、配列番号８、１０および１２に示されるところのＨ鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１４、１６および１８に示されるところのＬ鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を有する、モノクローナル抗体の抗原結合能力を有する呼吸器多核体ウイルス（ＲＳＶ）Ｆタンパク質と反応性の単離された抗体である。
【０００６】
本発明の別の局面は、パリビズマブ若しくはｍＡｂ１９由来のＣＤＲを含有する抗体若しくは抗体フラグメントによる中和を逃れるＲＳＶ単離物と反応性の単離された抗体である。
【０００７】
本発明の別の局面は、Ｆタンパク質の残基４２２ないし４３６（配列番号２８）に位置するＲＳＶ  Ｆタンパク質エピトープと反応性の単離された抗体である。
【０００８】
本発明の別の局面は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の残基Ｒ４２９およびＫ４３３と反応性の単離された抗体である。
【０００９】
本発明の別の局面は、それぞれ配列番号８、１０および１２に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２およびＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに式（Ｉ）：
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ０  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｇｌｙ  Ｘａａ３  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｘａａ４  Ｈｉｓ
（Ｉ）
［式中、Ｘａａ０はＧｌｎ、Ａｓｐ若しくはＨｉｓであり；Ｘａａ１はＬｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ若しくはＴｙｒであり；Ｘａａ２はＰｈｅ、Ｌｅｕ若しくはＳｅｒであり；Ｘａａ３はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ若しくはＳｅｒであり；およびＸａａ４はＶａｌ若しくはＭｅｔである］
に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１；ならびにそれぞれ配列番号１６および１８に示されるところのＬ鎖ＣＤＲ２（Ｌｃ−ＣＤＲ２）およびＬ鎖ＣＤＲ３（Ｌｃ−ＣＤＲ３）を有する、単離された抗体である。
【００１０】
本発明の別の局面は、配列番号８に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、式（ＩＩ）：
Ｈｉｓ  Ｘａａ７  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｘａａ８  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｘａａ９  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ
（ＩＩ）
［式中、Ｘａａ７はＩｌｅ若しくはＬｅｕであり、Ｘａａ８はＬｙｓ若しくはＴｙｒであり、およびＸａａ９はＡｓｎ若しくはＳｅｒである］
に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１２に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに、それぞれ配列番号１４および１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１およびＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに配列番号１０７若しくは１１０に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、単離された抗体である
。
【００１１】
本発明の別の局面は、それぞれ配列番号８および１０に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１およびＨｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに、式（ＩＩＩ）：
Ｌｅｕ  Ｘａａ５  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｘａａ６  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｔｙｒ
（ＩＩＩ）
［式中、Ｘａａ５はＴｙｒ若しくはＴｒｐであり；およびＸａａ６はＡｒｇ、Ｌｙｓ若しくはＡｌａである］
に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに、Ｌｃ−ＣＤＲ１、Ｌｃ−ＣＤＲ２およびＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１４、１６および１８に示されるとおりであるを有する、単離された抗体である。
【００１２】
本発明の別の局面は、それぞれ配列番号８および１０に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１およびＨｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに式（ＩＶ）に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、式（Ｉ）に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、ならびにそれぞれ配列番号１６および１８に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２およびＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、単離された抗体である。
【００１３】
本発明の別の局面は、それぞれ配列番号８、１０および１２に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２およびＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに式（Ｉ）［式中、Ｘａａ０がＧｌｎ若しくはＡｓｐであり、Ｘａａ１がＬｅｕ若しくはＴｙｒであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＬｙｓ若しくはＡｒｇであり、およびＸａａ４がＭｅｔである］に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに配列番号１０７に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、単離された抗体である。
【００１４】
本発明の別の局面は、配列番号８に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、式ＩＩのＨｃ−ＣＤＲ２、式ＩＩＩのＨｃ−ＣＤＲ３、式ＩのＬｃ−ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１０７に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、単離された抗体である。
【００１５】
本発明の別の局面は、配列番号８に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、式ＩＩのＨｃ−ＣＤＲ２、式ＩＩＩのＨｃ−ＣＤＲ３、式ＩのＬｃ−ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する、単離された抗体である。
【００１６】
本発明の別の局面は、本発明の抗体をコードする単離されたポリヌクレオチドである。
【００１７】
本発明の別の局面は、その危険に曝されている患者に、予防上有効な量の本発明の抗体を投与することを含んでなる、ＲＳＶ誘発性疾患の予防方法である。
【００１８】
本発明の別の局面は、治療上有効な量の本発明の抗体を患者に投与することを含んでなる、ＲＳＶ誘発性疾患の処置方法である。
【００１９】
本発明の別の局面は、ペプチドＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳ（配列番号３８）を含んでなる単離されたポリペプチドである。
【００２０】
本発明の別の局面は、配列番号３８のアミノ酸配列をコードする単離された核酸である。
【００２１】
［発明の詳細な記述］
本明細で引用される、限定されるものでないが特許および特許出願を挙げることができる全部の刊行物は、完全に示されるかのように引用することにより本明細書に組み込まれる。
【００２２】
本明細書で使用されるところの「抗体」という用語は広範な意味で意味しており、そしてポリクローナル抗体、マウス、ヒト、ヒト化およびキメラモノクローナル抗体を包含するモノクローナル抗体、ならびに抗体フラグメントを包含する免疫グロブリンすなわち抗体分子を包含する。
【００２３】
一般に、抗体は特定の一抗原に対する結合特異性を表すタンパク質若しくはポリペプチドである。無傷の抗体は、２本の同一のＬ鎖および２本の同一のＨ鎖より構成されるヘテロ四量体の糖タンパク質である。典型的には、各Ｌ鎖は１個の共有ジスルフィド結合によりＨ鎖に連結される一方、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプのＨ鎖間で変動する。各ＨおよびＬ鎖はまた、規則的に空間を空けられた鎖内ジスルフィド架橋も有する。各Ｈ鎖は、一端に可変ドメイン（ＶＨ）、次いで多数の定常ドメインを有する。各Ｌ鎖は一端に可変ドメイン（ＶＬ）およびその他端に定常ドメインを有し；Ｌ鎖の定常ドメインはＨ鎖の第一の定常ドメインと整列され、また、Ｌ鎖可変ドメインはＨ鎖の可変ドメインと整列される。いかなる脊椎動物種の抗体Ｌ鎖も、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２種の明確に異なるタイプ、すなわちκおよびλの一方に割り当てられ得る。
【００２４】
免疫グロブリンは、Ｈ鎖定常ドメインのアミノ酸配列に依存して５種の主要なクラス、すなわちＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭに割り当てられ得る。ＩｇＡおよびＩｇＧは、アイソタイプＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４としてさらに下位分類される。
【００２５】
「抗体フラグメント」という用語は、無傷の抗体の一部分、一般には無傷の抗体の抗原結合すなわち可変領域を意味している。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント、二特異性抗体、可変Ｈおよび可変Ｌ鎖がリンカーにより単一ポリペプチド鎖として結合されているｓｃＦｖ分子のような一本鎖抗体分子、ならびに最低２種の無傷の抗体から形成される多特異性抗体を包含する。
【００２６】
本明細書で使用されるところの「抗原」という用語は、直接若しくは間接のいずれかで抗体を生成させる能力を有するいかなる分子も意味している。「抗原」の定義内に、タンパク質をコードする核酸を包含する。
【００２７】
「ＣＤＲ」は、免疫グロブリンＨおよびＬ鎖の超可変領域である抗体の相補性決定領域のアミノ酸配列と定義される。例えば、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第４版、米国保健福祉省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）、国立保健研究所（Ｎａｔｉｏａｎｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ
Ｈｅａｌｔｈ）（１９８７）を参照されたい。免疫グロブリンの可変部分には３個のＨ鎖および３個のＬ鎖ＣＤＲ若しくはＣＤＲ領域が存在する。従って、本明細書で使用されるところの「ＣＤＲ」は、全３個のＨ鎖ＣＤＲ、全３個のＬ鎖ＣＤＲ、若しくは、適切な場合は全Ｈおよび全Ｌ鎖双方のＣＤＲを指す。
【００２８】
ＣＤＲは、抗原若しくはエピトープへの抗体の結合のための接触残基の大多数を提供する。本発明の目的のＣＤＲはドナー抗体可変ＨおよびＬ鎖配列由来であり、そして天然に
存在するＣＤＲのアナログおよびバリアントを包含する。抗体中に存在する場合、アナログＣＤＲは、それらが由来したドナー抗体と同一の抗原結合特異性および／若しくは中和能力を保持している。バリアントＣＤＲは、抗体中に存在する場合、それらが由来したドナー抗体に関係した、改良された抗原結合および／若しくは中和能力を賦与する。
【００２９】
本明細書で使用されるところの、および請求の範囲の「と組合せの」という用語は、記述される剤が、混合物中で、単一の剤として同時に、若しくは単一の剤としていずれかの順序で連続して一緒に哺乳動物に投与され得ることを意味している。
【００３０】
本明細書で使用されるところの「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体（若しくは抗体フラグメント）を意味している。モノクローナル抗体は高度に特異的であり、典型的には単一の抗原決定基に向けられる。「モノクローナル」という修飾語は抗体の実質的に均一な特徴を示し、そしていずれかの特定の方法による抗体の産生を必要としない。例えば、マウスｍＡｂはＫｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５）のハイブリドーマ法により作成し得る。アクセプター抗体（典型的にはヒトのような別の哺乳動物種）由来のＬおよびＨ鎖定常領域とともにドナー抗体（典型的にはマウス）由来のＬ鎖およびＨ鎖可変領域を含有するキメラｍＡｂは、米国特許第４，８１６，５６７号に開示される方法により製造し得る。ヒト以外のドナー免疫グロブリン（典型的にはマウス）由来のＣＤＲ、および、場合によっては結合親和性を保存するための変えられた枠組み支持残基を有する１種若しくはそれ以上のヒト免疫グロブリン由来である分子の残存する免疫グロブリン由来部分を有するヒト化ｍＡｂは、Ｑｕｅｅｎら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ（ＵＳＡ）、８６：１００２９−１００３２（１９８９）およびＨｏｄｇｓｏｎら、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、９：４２１（１９９１）に開示される技術により得ることができる。ヒト化に有用な例示的ヒト枠組み配列は、例えば、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ；ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ；ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ／ｐｈａｇｅ／ｈｄｂ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ＡＬＩＧＮＭＥＮＴＳ．ｐｈｐ；ｗｗｗ．ｋａｂａｔｄａｔａｂａｓｅ．ｃｏｍ／ｔｏｐ．ｈｔｍｌ；ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／ｋａｂａｔ；ｗｗｗ．ｓｃｉｑｕｅｓｔ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ａｂｃａｍ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ａｎｔｉｂｏｄｙｒｅｓｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ／ｏｎｌｉｎｅｃｏｍｐ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐｕｂｌｉｃ．ｉａｓｔａｔｅ．ｅｄｕ／〜ｐｅｄｒｏ／ｒｅｓｅａｒｃｈ＿ｔｏｏｌｓ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｗｈｆｒｅｅｍａｎ．ｃｏｍ／ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ／ＣＨ０５／ｋｕｂｙ０５．ｈｔｍ；ｗｗｗ．ｈｈｍｉ．ｏｒｇ／ｇｒａｎｔｓ／ｌｅｃｔｕｒｅｓ／１９９６／ｖｌａｂ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｍｉｋｅｉｍａｇｅｓ．ｈｔｍｌ；ｍｃｂ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ＢｉｏＬｉｎｋｓ／Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｌｉｎｋ．ｃｏｍ；ｐａｔｈｂｏｘ．ｗｕｓｔｌ．ｅｄｕ／〜ｈｃｅｎｔｅｒ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ａｐｐｌｉｅｄｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｎａｌ．ｕｓｄａ．ｇｏｖ／ａｗｉｃ／ｐｕｂｓ／ａｎｔｉｂｏｄｙ；ｗｗｗ．ｍ．ｅｈｉｍｅ−ｕ．ａｃ．ｊｐ／〜ｙａｓｕｈｉｔｏ／Ｅｌｉｓａ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ．ｃｏｍ；ｗｗｗ．ｃａｎｃｅｒｒｅｓｅａｒｃｈｕｋ．ｏｒｇ；ｗｗｗ．ｂｉｏｔｅｃｈ．ｕｆｌ．ｅｄｕ；ｗｗｗ．ｉｓａｃ−ｎｅｔ．ｏｒｇ；ｂａｓｅｒｖ．ｕｃｉ．ｋｕｎ．ｎｌ／〜ｊｒａａｔｓ／ｌｉｎｋｓ１．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｒｅｃａｂ．ｕｎｉ−ｈｄ．ｄｅ／ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ；ｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／Ｖ＿ｍｉｃｅ．ｈｔｍｌ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆ．ｏｒｇ．ｕｋ／ａｂｓ；ａｎｔｉｂｏｄｙ．ｂａｔｈ．ａｃ．ｕｋ；ｗｗｗ．ｕｎｉｚｈ．ｃｈ；ｗｗｗ．ｃｒｙｓｔ．ｂｂｋ．ａｃ．ｕｋ／〜ｕｂｃｇ０７ｓ；ｗｗｗ．ｎｉｍｒ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ／ＣＣ／ｃｃａｅｗｇ／ｃｃａｅｗｇ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｐａｔｈ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／〜ｍｒｃ７／ｈｕｍａｎｉｓａｔｉｏｎ／ＴＡＨＨＰ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｉｂｔ．ｕｎａｍ．ｍｘ／ｖｉｒ／ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ／ｓｔａｔ＿ａｉｍ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｂｉｏｓｃｉ．ｍｉｓｓｏｕｒｉ．ｅｄｕ／ｓｍｉｔｈｇｐ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ｗｗｗ．ｊｅｒｉｎｉ．ｄｅ；ｉｍｇｔ．ｃｉｎｅｓ．ｆｒ；Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、米国保健省（Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ）（１９８３）（それぞれ引用することによりそっくりそのまま本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【００３１】
いかなるヒト以外の配列も欠く完全にヒトのｍＡｂは、例えば、Ｌｏｎｂｅｒｇら、Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄら、Ｎａｔｕｒｅ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−８５１（１９９６）およびＭｅｎｄｅｚら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）で参照される技術により、ヒト免疫グロブリントランスジェニックマウスから製造し得る。ヒトｍＡｂはまた、例えばＫｎａｐｐｉｋら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：５７−８６（２０００）およびＫｒｅｂｓら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２５４：６７−８４（２００１）で参照される技術により、ファージディスプレイライブラリーからも調製かつ至適化し得る。
【００３２】
本明細書で使用されるところの「ＲＳＶ中和活性」という用語は、細胞を感染させるか若しくは感染した細胞から未感染の細胞に広がるＲＳＶの能力を阻害する抗体若しくは抗体フラグメントを指す。
【００３３】
後に続くところの慣習的一および三文字アミノ酸記号を本明細書で使用する：
アミノ酸                      三文字記号              一文字記号
アラニン                        ａｌａ                    Ａ
アルギニン                      ａｒｇ                    Ｒ
アスパラギン                    ａｓｎ                    Ｎ
アスパラギン酸                  ａｓｐ                    Ｄ
システイン                      ｃｙｓ                    Ｃ
グルタミン酸                    ｇｌｕ                    Ｅ
グルタミン                      ｇｌｎ                    Ｑ
グリシン                        ｇｌｙ                    Ｇ
ヒスチジン                      ｈｉｓ                    Ｈ
イソロイシン                    ｉｌｅ                    Ｉ
ロイシン                        ｌｅｕ                    Ｌ
リシン                          ｌｙｓ                    Ｋ
メチオニン                      ｍｅｔ                    Ｍ
フェニルアラニン                ｐｈｅ                    Ｆ
プロリン                        ｐｒｏ                    Ｐ
セリン                          ｓｅｒ                    Ｓ
トレオニン                      ｔｈｒ                    Ｔ
トリプトファン                  ｔｒｐ                    Ｗ
チロシン                        ｔｙｒ                    Ｙ
バリン                          ｖａｌ                    Ｖ
【００３４】
本発明は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質（配列番号１および２）を結合するＲＳＶ中和活性をもつ抗体に関する。Ｆ（融合）抗原は、ＲＳＶ粒子の表面上およびＲＳＶに感染した細胞の表面上の双方で発現され、そして感染した細胞のシンシチウムへの融合を媒介する。本発明の抗体の結合エピトープはＦタンパク質の領域４２０ＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫ４４５（配列番号２８）に位置する。より具体的には、本発明
の抗体はＲＳＶ  Ｆタンパク質の残基４２２ＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳ４３６（配列番号３８）を結合する。とりわけ、本発明の抗体はＲＳＶ  Ｆタンパク質の残基Ｒ４２９およびＫ４３３を結合する。これらの抗体は、ヒトのような哺乳動物におけるＲＳＶ感染の処置若しくは予防のための潜在的治療若しくは予防薬として有用である。これらの抗体はまた研究若しくは診断試薬としても有用である。
【００３５】
本発明の別の態様は、アミノ酸配列ＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳ（配列番号３８）を有するペプチドを含んでなる単離されたポリペプチド、および該ポリペプチドをコードする単離された核酸若しくはその相補物である。本発明のこれらのポリペプチドおよび核酸は、被験体においてＲＳＶに対する中和抗体を導き出してそれによりＲＳＶ誘発性疾患に対し該患者を免疫するためのワクチン製剤中の抗原として有用である。いかなるこうしたワクチン製剤も処方されることができ、そして当業者に公知であるとおり適切なアジュバントを含有することができる。
【００３６】
本発明の別の態様は、それぞれ配列番号８、１０および１２に示されるところのＨ鎖ＣＤＲ１（ｈｃ−ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（ｈｃ−ＣＤＲ２）およびＣＤＲ３（ｈｃ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列、ならびにそれぞれ配列番号１４、１６および１８に示されるところのＬ鎖ＣＤＲ１（ｌｃ−ＣＤＲ１）、ＣＤＲ２（ｌｃ−ＣＤＲ２）およびＣＤＲ３（ｌｃ−ＣＤＲ３）アミノ酸配列を有するモノクローナル抗体の結合能力を有する、ＲＳＶ  Ｆタンパク質と反応性の単離された抗体である。例示的一抗体は、それぞれ配列番号８、１０および１２に示されるところのｈｃ−ＣＤＲ１、ｈｃ−ＣＤＲ２およびｈｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびにそれぞれ配列番号１４、１６および１８に示されるところのｌｃ−ＣＤＲ１、ｌｃ−ＣＤＲ２およびｌｃ−ＣＤＲ３のＣＤＲアミノ酸配列を有するモノクローナル抗体である。
【００３７】
本発明の別の態様は、配列番号４に示されるところのＨ鎖可変領域（ＶＨ）アミノ酸配列および配列番号６に示されるところのＬ鎖可変領域（ＶＬ）アミノ酸配列を有する単離されたモノクローナル抗体である。本発明の別の態様は、配列番号４若しくは配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする核酸またはその相補物である。配列番号４に示されるアミノ酸配列をコードする例示的一核酸配列は配列番号３に示される。配列番号６に示されるアミノ酸配列をコードする例示的一核酸配列は配列番号５に示される。
【００３８】
本発明のなお別の態様は、それぞれ配列番号８、１０および１２に示されるｈｃ−ＣＤＲ１、ｈｃ−ＣＤＲ２およびｈｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗体Ｈ鎖をコードする単離された核酸、若しくは相補核酸である。例示的一核酸配列は、それぞれ配列番号８、１０および１２に示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号７、９および１１に示される核酸配列を有する。
【００３９】
本発明のなお別の態様は、それぞれ配列番号１４、１６および１８に示されるｌｃ−ＣＤＲ１、ｌｃ−ＣＤＲ２およびｌｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗体Ｌ鎖をコードする単離された核酸、若しくは相補核酸である。例示的一核酸配列は、それぞれ配列番号１４、１６および１８に示されるアミノ酸配列をコードする、配列番号１３、１５および１６に示される核酸配列を有する。
【００４０】
本発明の別の態様は、配列番号４９に示されるところのＶＨアミノ酸配列および配列番号５１に示されるところのＶＬアミノ酸配列を有するヒト適応型（ｈｕｍａｎ−ａｄａｐｔｅｄ）モノクローナル抗体である。
【００４１】
本発明の別の態様は、それぞれ配列番号８、１０および１２に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２およびＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに式（Ｉ）：
Ａｒｇ  Ａｌａ  Ｓｅｒ  Ｘａａ０  Ｓｅｒ  Ｖａｌ  Ａｓｐ  Ｘａａ１  Ｘａａ２  Ｇｌｙ  Ｘａａ３  Ｓｅｒ  Ｔｙｒ  Ｘａａ４  Ｈｉｓ
（Ｉ）
［式中、Ｘａａ０はＧｌｎ、Ａｓｐ若しくはＨｉｓであり；Ｘａａ１はＬｅｕ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｐｈｅ若しくはＴｙｒであり；Ｘａａ２はＰｈｅ、Ｌｅｕ若しくはＳｅｒであり；Ｘａａ３はＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｎ、Ｖａｌ、Ｇｌｙ、Ｔｈｒ若しくはＳｅｒであり；およびＸａａ４はＶａｌ若しくはＭｅｔである］
に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１；ならびに、それぞれ配列番号１６および１８に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２およびＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗体である。例示的種は、配列番号４９に示されるところのＶＨアミノ酸配列、ならびにそれぞれ配列番号１６および１８に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２およびＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに式（Ｉ）［式中：
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＬｅｕであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＡｒｇであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号６３）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＬｅｕであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＬｙｓであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号６４）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＬｅｕであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＧｌｎであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号６５）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＬｅｕであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＶａｌであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号６６）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＨｉｓであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＬｙｓであり、およびＸａａ４がＶａｌであり（配列番号６７）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＶａｌであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＡｒｇであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号６８）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＬｅｕであり、Ｘａａ２がＬｅｕであり、Ｘａａ３がＧｌｙであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号１０５）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＬｅｕであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＴｈｒであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号６９）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＴｙｒであり、Ｘａａ２がＬｅｕであり、Ｘａａ３がＡｒｇであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号７０）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＬｅｕであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＳｅｒであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号７１）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＴｙｒであり、Ｘａａ２がＳｅｒであり、Ｘａａ３がＡｒｇであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号７２）；
Ｘａａ０がＧｌｎであり、Ｘａａ１がＰｈｅであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＬｙｓであり、およびＸａａ４がＭｅｔであり（配列番号７３）；ならびに
Ｘａａ０がＡｓｐであり、Ｘａａ１がＬｅｕであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＶａｌであり、およびＸａａ４がＭｅｔである（配列番号１１１）］
のＬｃ−ＣＤＲ１を含んでなるＶＬアミノ酸配列を有する抗体を包含する。
【００４２】
本発明の別の態様は、配列番号８に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、式（ＩＩ）：
Ｈｉｓ  Ｘａａ７  Ｔｙｒ  Ｔｒｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｘａａ８  Ａｒｇ  Ｔｙｒ  Ｘａａ９  Ｐｒｏ  Ｓｅｒ  Ｌｅｕ  Ｌｙｓ  Ｓｅｒ
（ＩＩ）
［式中、Ｘａａ７はＩｌｅ若しくはＬｅｕであり、Ｘａａ８はＬｙｓ若しくはＴｙｒであり、およびＸａａ９はＡｓｎ若しくはＳｅｒである］
に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、配列番号１２に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに、それぞれ配列番号１４および１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１およびＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに配列番号１０７に示され
るところのＧｌｎ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ａｓｐ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  Ｔｈｒ若しくは配列番号１１０に示されるところのＧｌｎ  Ｇｌｎ  Ｉｌｅ  Ｉｌｅ  Ａｌａ  Ａｓｐ  Ｐｒｏ  Ｔｒｐ  ＴｈｒのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する単離された抗体である。例示的種は、配列番号７４に示されるところのＶＬアミノ酸配列および配列番号１０６に示されるところのＶＨアミノ酸配列を有する抗体を包含する。
【００４３】
本発明の別の態様は、それぞれ配列番号８および１０に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１およびＨｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに式（ＩＩＩ）：
Ｌｅｕ  Ｘａａ５  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ｘａａ６  Ｔｙｒ  Ｇｌｙ  Ｐｈｅ  Ａｌａ  Ｔｙｒ
（ＩＩＩ）
［式中、Ｘａａ５はＴｙｒ若しくはＴｒｐであり；およびＸａａ６はＡｒｇ、Ｌｙｓ若しくはＡｌａである］
に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびにＬｃ−ＣＤＲ１、Ｌｃ−ＣＤＲ２およびＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列がそれぞれ配列番号１４、１６および１８に示されるようであるを有する単離された抗体である。例示的種は、配列番号５１に示されるところのＶＬアミノ酸配列、ならびに、式（ＩＶ）［式中：
Ｘａａ５がＴｒｐであり、およびＸａａ６がＡｒｇであり（配列番号７５）；
Ｘａａ５がＴｒｐであり、およびＸａａ６がＬｙｓであり（配列番号７６）；
Ｘａａ５がＴｒｐであり、およびＸａａ６がＡｌａであり（配列番号７７）；
Ｘａａ５がＴｙｒであり、およびＸａａ６がＡｒｇであり（配列番号７８）；
Ｘａａ５がＴｙｒであり、およびＸａａ６がＬｙｓであり（配列番号７９）；ならびに
Ｘａａ５がＴｙｒであり、およびＸａａ６がＡｌａである（配列番号８０）］
のＨｃ−ＣＤＲ３を含んでなるＶＨアミノ酸配列を有する抗体を包含する。
【００４４】
本発明の別の態様は、それぞれ配列番号８および１０に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１およびＨｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに式（ＩＶ）に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、式（Ｉ）に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、ならびにそれぞれ配列番号１６および１８に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２およびＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する単離された抗体である。例示的種は、配列番号６３に示されるところのＶＬアミノ酸配列、および配列番号７６、８０若しくは７９に示されるところのＶＨアミノ酸配列を有する抗体を包含する。
【００４５】
本発明の別の態様は、それぞれ配列番号８、１０および１２に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１、Ｈｃ−ＣＤＲ２およびＨｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列、ならびに式（Ｉ）［式中、Ｘａａ０がＧｌｎ若しくはＡｓｐであり、Ｘａａ１がＬｅｕ若しくはＴｙｒであり、Ｘａａ２がＰｈｅであり、Ｘａａ３がＬｙｓ若しくはＡｒｇであり、およびＸａａ４がＭｅｔである］に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、配列番号１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、ならびに配列番号１０７に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗体である。例示的種は、配列番号８１、８２、８３若しくは１１２に示されるところのＶＬアミノ酸配列、および配列番号４９に示されるところのＶＨアミノ酸配列を有する抗体を包含する。
【００４６】
本発明の別の態様は、配列番号８に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、式ＩＩのＨｃ−ＣＤＲ２、式ＩＩＩのＨｃ−ＣＤＲ３、式ＩのＬｃ−ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１０７若しくは１１０に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗体である。例示的種は、以下のＶＬおよびＶＨアミノ酸配列の組合せの１種を有する抗体を包含する：
【００４７】
【表１】
2008518602.tif 000003
【００４８】
本発明の別の態様は、配列番号８に示されるところのＨｃ−ＣＤＲ１アミノ酸配列、式ＩＩのＨｃ−ＣＤＲ２、式ＩＩＩのＨｃ−ＣＤＲ３、式ＩのＬｃ−ＣＤＲ１、配列番号１６に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ２アミノ酸配列、および配列番号１８に示されるところのＬｃ−ＣＤＲ３アミノ酸配列を有する抗体である。例示的種は、以下のＶＬおよびＶＨアミノ酸配列の組合せの１種を有する抗体を包含する：
【００４９】
【表２】
2008518602.tif 000004
【００５０】
本発明の抗体は、それらの薬物動態プロファイルを改良するためにポリエチレングリコールに複合（ペグ化）し得る。複合は当業者に既知の技術により実施し得る。治療的抗体のＰＥＧとの複合は、機能を妨害しない一方で薬動力学を高めることが示されている。Ｄｅｃｋｅｒｔら、Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８７：３８２−３９０、２０００；Ｋｎｉｇｈｔら、Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ  １５：４０９−４１８、２００４；Ｌｅｏｎｇら、Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  １６：１０６−１１９、２００１；およびＹａｎｇら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１６：７６１−７７０、２００３を参照されたい。本発明の抗体の薬物動態特性はまた、当業者に既知の技術によるＦｃ改変によっても高め得る。
【００５１】
本発明の別の態様は、本発明の抗体のいずれか１種のＨおよびＬ鎖をコードする単離された核酸若しくはその相補物である。例示的核酸は、配列番号５１、６３、６４、６５、６６、６７、６８、１０４、６９、７０、７１、７２、７３、７４、８１、８２、８３、８５、８７、８９、９０、９１、９２、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２および１０３のアミノ酸配列のいずれか１種を有するＶＬ領域をコードするものを包含する。他の例示的核酸は、配列番号４９、１０６、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８４、８６、８８および９３のアミノ酸配列のいずれかを有するＶＨ領域をコードすることを包含する。
【００５２】
本発明の抗体を製造するのに有用な例示的プラスミドベクターは、ＨＣＭＶ前初期エンハンサー／プロモーター若しくはＭＨＣクラスＩプロモーターのような強力なプロモーター、ＨＣＭＶ前初期遺伝子イントロンＡのような転写物のプロセシングを高めるためのイントロン、および後期ＳＶ４０ポリＡシグナルのようなポリアデニル化（ポリＡ）シグナルを含有する。プラスミドは、該抗体の完全長のＨおよびＬ鎖の双方、一本鎖Ｆｖフラグメント、若しくは他の免疫グロブリンフラグメントの発現を可能にするように多シストロン性であり得る。
【００５３】
本発明の抗ＲＳＶ抗体の治療的若しくは予防的使用のための投与様式は、該剤を宿主に送達するいかなる適する経路であってもよい。抗体、抗体フラグメントおよびこれらの剤の製薬学的組成物は、非経口投与により、すなわち皮下、筋肉内、皮内、静脈内、若しくは鼻内で、ならびに直接肺のような標的臓器への送達のための局所若しくはエアゾル経路により送達し得る。
【００５４】
本発明の抗ＲＳＶ抗体は、製薬学的に許容できる担体中に有効成分として有効量の剤を含有する製薬学的組成物として製造しうる。好ましくは、注入のための準備ができている形態の生理学的ｐＨで緩衝された剤を含有する水性懸濁液若しくは溶液が好ましい。非経口投与のための組成物は、一般に、製薬学的に許容できる担体、好ましくは水性担体に溶解された本発明の結合剤若しくはそれらのカクテルの溶液を含むことができる。多様な水性担体、例えば０．４％生理的食塩水、０．３％グリシンなどを使用しうる。
【００５５】
これらの製薬学的組成物の溶液は無菌であり、そして一般に微粒子を含まない。これら
の溶液は慣習的滅菌技術（例えば濾過）により滅菌しうる。該組成物は、ｐＨ調節剤および緩衝剤などのような生理学的条件に近づけるために必要とされるところの製薬学的に許容できる補助物質を含有しうる。こうした製薬学的製剤中での本発明の抗ＲＳＶ抗体の濃度は、広範に、すなわち約０．５％未満、通常は約１％若しくは最低約１％から約１５若しくは２０重量％まで変動し得、そして、選択される特定の投与様式に従って、主として液体の容量、粘度などに基づき選択されることができる。
【００５６】
従って、筋肉内注入のための本発明の製薬学的組成物は、１ｍＬの無菌緩衝水、および約１ｎｇないし約１００ｍｇ、例えば約５０ｎｇないし約３０ｍｇ、若しくはより具体的には約５ｍｇないし約２５ｍｇの間の本発明の抗ＲＳＶ抗体を含有するよう調製し得る。同様に、静脈内注入のための本発明の製薬学的組成物は、約２５０ｍｌの無菌リンゲル液、および約１ｍｇないし約３０ｍｇ、若しくはより具体的には約５ｍｇないし約２５ｍｇの本発明の抗ＲＳＶ抗体を含有するよう構成し得る。非経口で投与可能な組成物の実際の製造方法は、当業者に公知であるか若しくは明らかであることができ、そして、例えば“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（以前はＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）”、第１９版、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ペンシルバニア州イーストン（１９９５）に、より詳細に記述されている。
【００５７】
本発明の抗ＲＳＶ抗体は、製薬学的製剤中の場合に単位投与剤形で存在し得る。適切な治療上有効な用量は当業者により容易に決定され得る。決定された用量は、必要な場合は、処置期間の間に医師により適切なように選択される適切な時間間隔で反復しうる。
【００５８】
本発明の抗ＲＳＶ抗体は、貯蔵のため凍結乾燥しかつ使用前に適する担体中で再構成し得る。この技術は、慣習的免疫グロブリンおよびタンパク質製剤で有効であることが示されており、そして技術既知の凍結乾燥および再構成技術を使用し得る。
【００５９】
本発明は今や、以下の特定の制限しない例に関して記述されよう。
実施例
【実施例１】
【００６０】
抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１Ｆの生成および選択
抗ＲＳＶ  ｍＡｂは標準的ハイブリドーマ技術（Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５−４９７（１９７５））を使用して正常ＢＡＬＢ／ｃマウスで生成させた。マウスは、精製したウイルス（Ｌｏｎｇ株）および精製したＦタンパク質（ＲＳＶ  Ｌｏｎｇ株由来）の組合せを使用して、本質的に以前に記述された（Ｇａｒｃｉａ−Ｂａｒｒｅｎｏら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６３：９２５−９３２、１９８９）とおり免疫した。
【００６１】
Ｂ細胞融合の３日前に、雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスにＰＢＳ中の免疫原の静脈内注入を与えた。免疫したマウスからの脾を収集し、そしてＳ、ｐ２／０骨髄腫細胞とのＢ細胞融合をＫｏｈｌｅｒら、上記の標準的方法を使用して実施した。融合した細胞はヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジンを含有する培地を使用して選択し、そして、精製したウイルス若しくは精製したＦタンパク質いずれかを抗原として使用する酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）により、抗ＲＳＶ  Ｆ抗体の存在についてウェルをスクリーニングした。陽性のウェルを拡張しかつ限界希釈によりクローン化する。
【００６２】
抗ＲＳＶ  ｍＡｂは、精製したウイルス若しくは精製したＦタンパク質いずれかを抗原として使用して結合するそれらの能力に基づき選択した。
【実施例２】
【００６３】
１０１Ｆ  ＨおよびＬ鎖可変領域遺伝子のクローニングおよび配列決定
マウス１０１Ｆ  ＩｇＧ２ａ  κを発現するハイブリドーマ細胞株からの全ＲＮＡを、５’ＲＡＣＥのためのＧｅｎｅＲａｃｅｒキット（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用するｃＤＮＡ生成のため精製した。キットとともに供給されるオリゴｄＴが該プロトコルのｃＤＮＡ合成部分をプライミングした。Ｈ鎖可変領域遺伝子を得るため、該ｃＤＮＡを、製造元の説明書に従ったタッチダウンＰＣＲ反応で鋳型として使用した。等量のＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’プライマー（５’−ＣＧＡＣＴＧＧＡＧＣＡＣＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＡ−３’）（配列番号１９）およびラットＩｇＧ２ａ  ３’プライマー６４２（５’−ＣＴＧＴＣＣＣＧＡＧＧＴＣＴＣＡＡＧＧ−３’）（配列番号２０）が、反応後に６６０ｂｐの期待された大きさのバンドを生成した。同一の鋳型および反応条件を使用してＬ鎖可変領域を得た。等量のＧｅｎｅＲａｃｅｒ  ５’プライマー（配列番号１９）およびラットκ  ３’プライマー６４５（５’−ＧＡＡＣＴＧＴＧＡＣＴＡＣＡＧＡＧＡＣＣ−３’）（配列番号２１）が、７００塩基対の期待された大きさのバンドを生成した。ＨおよびＬ鎖双方の増幅を二重で実施した。個々のコロニーからのＨおよびＬ鎖双方の８個のＤＮＡ調製物を、Ｔ３およびＴ７プライマーを使用して配列決定した。全８種のＨ鎖サンプルが同一配列を含有することが確認された。Ｌ鎖サンプルの大多数（８種中６種）は、元の融合物に由来した十分に報告された「擬似遺伝子」をコードした２種を除き、同一配列を共有した。図１ならびに２ａおよび２ｂは、１０１ＦのＨ（配列番号３および４）ならびにＬ鎖（配列番号５および６）の可変領域のそれぞれヌクレオチドおよび推定されるタンパク質配列を示す。
【実施例３】
【００６４】
抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１Ｆおよびキメラ１０１Ｆの一過性構築物のクローニング
Ｈ鎖可変領域ｃＤＮＡを、オリゴ１０１ＨＣ５’および１０１ＨＣ３’（配列を下に示す）を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で鋳型として使用した。
１０１ＨＣ５’：５’−ＴＴＣＧＴＡＣＧＧＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＴＣＣＴ−３’（配列番号２２）
１０１ＨＣ３’：５’−ＴＴＣＧＡＡＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡ−３’（配列番号２３）
これらのプライマーは、翻訳開始部位（太字）にコザックコンセンサス配列（下線）、ならびに適切な制限部位ＢｓｉＷＩおよびＢｓｔＢＩ（斜体）を付加する。この増幅したフラグメントを、ＨＣＭＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含有するマウスゲノムＩｇＧ２ａ発現プラスミドｐ２３７０のＢｓｉＷＩおよびＢｓｔＢＩ部位にクローン化して、マウス１０１Ｆ  ＩｇＧ２ａ  Ｈ鎖をコードする一過性発現プラスミドｐ２５０４を生成した。Ｌ鎖可変領域ｃＤＮＡを鋳型として使用し、そして、翻訳開始部位（太字）にコザックコンセンサス配列（下線）およびスプライスドナー部位（斜体）を付加するオリゴＬＣ１０１ＬＩＣ５’およびＬＣ１０１ＬＩＣ３’（配列を下に示す）を用いて増幅した。
Ｌ１０１ＬＩＣ５’：５’ＧＧＴＧＣＧＴＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＴＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣ−３’（配列番号２４）
Ｌ１０１ＬＩＣ３’：５’−ＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＣＧＡＣＴＴＡＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧＴＧＣＣ−３’（配列番号２５）
生じる増幅された１０１Ｆ  Ｌ鎖可変領域ＤＮＡフラグメントを、連結に依存しないクローニングによりマウスκ鎖発現ベクターにクローン化して、ＨＣＭＶプロモーターの制御下にマウス１０１Ｆ  κ  Ｌ鎖をコードするｐ２５０５を生成した。
【００６５】
キメラ１０１Ｆ（ｃｈ１０１Ｆ）ｍＡｂ（ヒトＩｇＧ１定常領域にグラフトされたマウス可変領域）の構築のため、１０１Ｆ  Ｈ鎖可変領域を、それぞれ翻訳開始部位（太字）にコザックコンセンサス配列（下線）、ならびに該ＤＮＡフラグメントの５’および３’端にスプライスドナー部位（斜体）を付加するオリゴＨＣ１０１ＬＩＣ５’およびＨ１０１ＬＩＣ３’（配列を下に示す）を使用するＰＣＲにより増幅した。
Ｈ１０１ＬＩＣ５’：５’−ＧＧＴＧＣＧＴＣＣＴＴＣＧＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＣＡＧＧＣＴＴＡＣＴＴＣＣＴＣＡＴＴ−３’（配列番号２６）
Ｈ１０１ＬＩＣ３’：５’−ＣＧＣＣＴＣＣＧＣＴＴＣＧＡＣＴＴＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＣＣＡＧＡＧＴＣＣＣ−３’（配列番号２７）
Ｈ鎖ＤＮＡフラグメントを発現ベクターへの連結に依存しないクローニングによりクローン化して、ＨＣＭＶプロモーターの制御下にヒトＩｇＧ１定常領域にグラフトされた融合されたマウス１０１Ｆ可変領域をコードするプラスミドｐ２５３５を生成した。ヒトκ  Ｌ鎖定常領域に融合された１０１Ｆ  Ｌ鎖可変領域を発現するプラスミドｐ２５３６は、プラスミドｐ２５０５を製造するのに使用した同一のＤＮＡフラグメントをＨＣＭＶプロモーターの制御下にヒトκ  Ｌ鎖を含有する発現プラスミドにクローン化することにより生成した。
【実施例４】
【００６６】
抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１Ｆおよびキメラの安定構築物のクローニング
１０１Ｆ  Ｈ鎖可変領域を使用して、マウス抗ヒトＣＤ４、ＩｇＧ２ａのＨ鎖を発現するプラスミドｐ２５２１の可変領域を置換した。Ｌ鎖可変領域を、抗ヒトＣＤ４、ＩｇＧ２ａのマウスκ  Ｌ鎖を発現するプラスミドｐ２５２７にクローン化した。生じる発現プラスミドｐ２５３３およびｐ２５３４は、それぞれマウス１０１Ｆ  ＩｇＧ２ａのＨおよびＬ鎖を発現する。
【実施例５】
【００６７】
抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１ＦおよびＦａｂの発現および精製
１０１Ｆ  ＨおよびＬ鎖の安定発現のため設計されたプラスミドを、標準的電気穿孔手順によりＣＤ−Ｓｐ２／０細胞（Ｃ４６３Ａ）にコトランスフェクトし、そしてミコフェノール酸で選択した。９６ウェルプレートからの上清を、抗マウス若しくは抗ヒトＦｃ被覆プレートを使用する標準的ＥＩＡ手順を使用してアッセイし、そして、アルカリホスファターゼ結合抗マウス若しくは抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）抗体を検出に使用した。ｍＡｂの一過性発現のため、２９３Ｅ細胞を、製造元の推奨に従ってＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カールズバッド）でトランスフェクトした。ハイブリドーマ若しくはトランスフェクトした細胞の上清からｍＡｂを精製するため、Ｍｇ＋＋若しくはＣａ＋＋を含まない１０×ダルベッコのリン酸緩衝生理的食塩水（ＤＰＢＳ）、ｐＨ７．２を、澄明にした細胞上清に１×ＤＰＢＳの最終濃度まで添加した。希釈した上清をその後、１×ＤＰＢＳで平衡化した１００ｍＬのＭａｂＳｅｌｅｃｔＴＭカラムに６．０ｍｌ／分で負荷した。カラムを１０カラム容量すなわち１０００ｍｌの１×ＤＰＢＳで洗浄した。０．１Ｍグリシン緩衝液、ｐＨ２．５を使用して抗体を溶離した。２８０ｎｍの吸光度の増大により検出されるところの画分を、溶離されたｍＡｂを中和するため２．５Ｍトリス緩衝液、ｐＨ７．５中に収集した。精製されたｍＡｂを１×ＤＰＢＳに対し透析し、そして０．２ミクロンのフィルターを通す濾過により滅菌した。ｍＡｂ調製物の純度はＨＰＬＣ−ＳＥＣ、およびＳＤＳ含有ポリアクリルアミドゲルを通る電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。調製物のエンドトキシンレベルを、Ｐｙｒｏｓ（Ｒ）Ｋｉｎｅｔｉｘ装置（Ｓｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ、マサチューセッツ州イーストファルマス）で実施したカブトガニ血球抽出物（Ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）（ＬＡＬ）アッセイを使用して測定した。多様なｍＡｂからのＦａｂを、２％パパインおよび２ｍＭ  Ｌ−システインでの３７℃で４時間の消化により生成し、その後反応を０．０２Ｍヨードアセトアミドの添加により停止した。Ｆａｂを、プロテイン−Ａアフィニティークロマトグラフィー、次いでサイズ排除クロマトグラフィーにより消化混合物から精製した。Ｆａｂを含有する適切な画分を合わせ、そして高速液体クロマトグラフィー−サイズ排除クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ−ＳＥＣ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。
【実施例６】
【００６８】
抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１Ｆの結合活性
組換え発現したＲＳＶ  Ｆタンパク質の可溶性の細胞外ドメイン（Ｃａｌｄｅｒら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２７１：１２２−１３１、２０００；Ｂｅｇｏｎａ  Ｒｕｉｚ−Ａｎｇｕｅｌｌｏら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ２９８：３１７−３２８、２００２）へのｍＡｂおよびＦａｂの結合をＥＬＩＳＡにより定量した。Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートのウェル（Ｎａｌｇｅ−Ｎｕｎｃ、ニューヨーク州ロチェスター）を、トリス緩衝生理的食塩水（ＴＢＳ、Ｔｅｋｎｏｖａ、カリフォルニア州ホリスター）中の精製したＲＳＶ  Ｆタンパク質５０マイクロリットル（０．５μｇ／ｍｌ）で、４℃で一夜のインキュベーションにより被覆した。被覆したプレートをその後ＴＢＳ−Ｔ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するトリス緩衝生理的食塩水、Ｔｅｋｎｏｖａ  ＃Ｔ０３９０）で１回洗浄し、次いで、室温で１時間振とうしながらＣｈｅｍｉＢＬＯＣＫＥＲＴＭ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ、カリフォルニア州テメキュラ）およびＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ（Ｒ）（Ｐｉｅｒｃｅ、イリノイ州ロックフォード）の１：１混合物を添加した。プレートをＴＢＳ−Ｔで１回洗浄し、次いで、１０μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＴＢＳ中の抗体の５倍連続希釈を１０μｇ／ｍｌの最大濃度まで添加した。振とうしながら室温で１時間インキュベーション後に、プレートをＴＢＳ−Ｔで５回洗浄し、次いで４０００倍希釈のアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、ペンシルバニア州ウェストグローブ）５０マイクロリットルを添加した。室温で１時間のインキュベーション後に、５０マイクロリットルのＡｔｔｏＰｈｏｓ基質（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｔｃｓ、インジアナ州インジアナポリス）をウェルに添加し、次いで暗所で１０分間インキュベートした。Ｔｅｃａｎ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｆｌｕｏｒ  Ｐｌｕｓ（Ｔｅｃａｎ、スイス・チューリッヒ）を使用して蛍光を測定した。検出感度を高めるため、該アッセイは以下の改変を伴い上述されたとおり実施した。４０００倍希釈のビオチン結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を、上述されたアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２の代わりに用い、次いで振とうしながら２２℃で１時間インキュベートした。ＴＢＳ−Ｔでの５回の洗浄後に、各ウェルへの４５分間の５０００倍希釈のアルカリホスファターゼ結合ストレプトアビジン（ＺｙＭｅｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）５０マイクロリットルの添加、次いで上述されたところのＴＢＳ−Ｔでの５回洗浄および検出により、抗体結合を検出した。
【００６９】
図３に示されるとおり、親マウス１０１Ｆ  ｍＡｂは５．５ｎｇ／ｍｌのＥＣ５０で組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質に結合する。図４は、組換えＲＳＶ  Ｆタンパク質へのキメラ１０１Ｆおよびキメラ１０１Ｆ  Ｆａｂの同等の結合活性を示す。
【実施例７】
【００７０】
抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１Ｆの親和性の測定
ＢＩＡｃｏｒｅ  ３０００装置（Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｉｎｃ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）をＣＭ５センサーチップとともに使用した。ランニング緩衝液は、３ｍＭ  ＥＤＴＡおよび０．００５％  Ｔｗｅｅｎ−２０を含む１０ｍＭリン酸ナトリウム１５０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．４を含有し、そして全部の研究実験は２５℃で実施した。以前に記述された（Ｂｅｇｏｎａ  Ｒｕｉｚ−Ａｎｇｕｅｌｌｏら、上記）ところのＲＳＶ
Ｆタンパク質の精製した組換え細胞外ドメインを使用した。Ｆタンパク質を３００マイクロリットルの１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ４．５で希釈して、ＮＨＳ／ＥＤＣカップリング試薬（Ｂｉａｃｏｒｅ，Ｉｎｃ）を使用する固定のため９．５μｇ／ｍＬの最終濃度を生成した。アプリケーションウィザードを、１５０ＲＵの固定されたＦタンパク質の近似範囲にあるようにプログラムし、２００ＲＵ未満を許容できるパラメータとして評価した。固定後に、５０ｍＭ水酸化ナトリウムを使用して表面を洗浄した。１Ｍエタ
ノールアミン、ｐＨ８．０で修飾した表面を対照として使用した。表面の再生は５０ｍＭ
ＮａＯＨを使用して達成した。
【００７１】
Ｆａｂ若しくはｍＡｂいずれかの連続３濃度（サンプルあたり二重の点）に、対照若しくはＦタンパク質修飾表面上を横切らせた。サンプルはランニング緩衝液で１．２５、５．０および２０．０ｎＭに希釈した。ランニング緩衝液のみのサンプルを陰性対照としてサンプル組に包含した。センサー図は、ＢＩＡｃｏｒｅにより提供された評価ソフトウェア（ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ３．２）を使用して解析した。バックグラウンド（緩衝液のみ）の値を生データから差し引き、そしてバックグラウンド補正済データをＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアにインポートした。該ソフトウェアとともに提供される単純解離モデルを使用して、解離および会合速度定数を決定した（ラングミュアー結合モデル）。これらの値を平均し、そして平衡解離定数（ＫＤ）を計算するのに使用した。
【００７２】
表１に示されるとおり、親マウスおよびキメラ双方の１０１Ｆはパリビズマブよりおよそ６倍より高い親和性を有する一方、キメラ１０１Ｆ  ＦａｂはパリビズマブＦａｂと類似の親和性を有する。
【００７３】
【表３】
2008518602.tif 000005
【実施例８】
【００７４】
抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１Ｆによるウイルス中和
Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）（バージニア州マナサス）から得たＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−２３）を、１０％ウシ胎児血清（熱不活性化かつγ線照射済、Ｈｙｃｌｏｎｅ、ユタ州ローガン）、非必須アミノ酸、ペニシリンＧ（１００単位／ｍｌ）ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）および２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充した変法イーグル培地（ＭＥＭ）中で維持し、そして５％ＣＯ２の加湿雰囲気中３７℃で増殖させた。ヒトＲＳＶ（Ｌｏｎｇ株、ＡＴＣＣ  ＶＲ−２６）をＡＴＣＣ（バージニア州マナサス）から得た。ＲＳＶストックは、ＨＥｐ−２細胞を細胞あたり０．０１ＰＦＵのＭＯＩのＲＳＶに感染させることにより調製した。培養上清を感染後６日に収集し、１０％ショ糖に調節しかつ液体窒素中で保存した。ＲＳＶ力価を、培地中０．５％メチルセルロースオーバーレイを使用するＨＥｐ−２細胞でのプラークアッセイにより測定した。抗体中和アッセイは９６ウェル形式で実施した。モノクローナル抗体は、培地中５０μｌ容量で２倍希釈を使用して６．４μｇ／ｍｌから出発して０．０１２５μｇ／ｍｌまで９６ウェルプレート中で希釈した。パリビズマブ（Ｓｙｎａｇｉｓ（Ｒ）、ＭｅｄＩｍｍｕｎｅ  Ｉｎｃ．、メリーランド州ゲイサーズバーグ）を全アッセイで陽性対照として使用した。培地中等容量の３×１０４ＰＦＵ／ｍｌのＲＳＶを各ウェルに添加した。ｍＡｂ−ウイルス混合物を室温で２時間インキュベートした。同時に、ＨＥｐ−２細胞を、１００マイクロリットル中１．５×１０４／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。１時間の抗体インキュベーション段階の後に、ｍＡｂ−ウイルス混合物をＨＥｐ−２細胞に添加し、そして３７℃で多様な時間インキュベートし、そして下の方法の１種により処理した。感染６日後に培地を除去し、そして５０μｌの０．５％クリスタルバイオレット溶液（７０％メタノール溶液中で調製）を添加し、以前に記述された（Ｔｒｅｐａｎｉｅｒら、Ｖｉｒｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ、１：３４３−３４７、１９８０）とおり各ウェルを１０分間染色した。過剰の着色剤を除去し、そして固定された単層を水で穏やかに洗浄し、そしてその後１時間風乾した。１００μｌの７０％メタノールをその後各ウェルに添加した。１０分の穏やかな振とう後に、マイクロプレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、カリフォルニア州メンロパーク）を使用して光学密度を５７０ｎｍで測定した。Ｐｒｉｓｍ  ３．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州サンディエゴ）をデータ解析のためおよびＥＣ５０曲線を生成するため使用した。
【００７５】
表２に示されるとおり、親マウス（ハイブリドーマ由来および組換え生成）ならびにキメラ１０１Ｆ双方は、ここに記述される条件下でパリビズマブとほぼ同一の（１〜２倍以内）ウイルス中和活性を有する。キメラ１０１Ｆおよびパリビズマブ由来のＦａｂは、親ＩｇＧよりそれぞれおよそ１０倍および１６ないし３０倍より低い活性を有する。
【００７６】
【表４】
2008518602.tif 000006
【実施例９】
【００７７】
コトンラットにおける免疫予防
抗体を、本質的にはＰｒｉｎｃｅらによりＶｉｒｕｓ  Ｒｅｓ．、３：１９３−２０６、１９８５に記述されたところの免疫予防モデルで試験した。近交系コトンラット（アラゲコトンラット（Ｓｉｇｍｏｄｏｎ  ｈｉｓｐｉｄｕｓ）、平均５週齢、体重６０〜９０グラムの間になる雌性）はＨａｒｌａｎ  Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ、アラバマ州プラットビルから得た。単一の試験で使用した全動物の重量は相互の３グラム以内であった。第１日に、動物に多様な用量のｍＡｂ若しくはＢＳＡ（陰性対照）を筋肉内注入した。２４時間後に血清サンプルを採取し、そして動物をイソフルランで麻酔し、そしてその後、マイクロピペットを使用して、０．１ｍｌの容量のＲＳＶ（１０５ＰＦＵのウイルス）を鼻内に接種した。ウイルス感染４日後に動物をＣＯ２窒息により殺し、そして肺および血清を収集した。血清サンプルは−８０℃で凍結させた。各動物からの肺を氷冷肺洗浄媒体（２０Ｕ／ｍｌペニシリンＧ、２０μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１００μｇ／ｍｌゲンタマイシンおよび０．２５μｇ／ｍｌアムホテリシンＢを含有するＰＢＳ）で３回洗浄し、そしてその後鋏で切断することにより細かく刻み、Ｓｅｗａｒｄ  Ｓｔｏｍａｃｈｅｒ（Ｒ）８０  Ｂｉｏｍａｓｔｅｒ（Ｂｒｉｎｋｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ウェストベリー）に移し、そして高速で２分間ホモジナイズした。ウイルス力価をＨＥｐ−２細胞で測定し、そしてＰＦＵ／ｇ肺組織として表した。
【００７８】
図５に示されるとおり、キメラ１０１Ｆおよびパリビズマブ双方が、５．０ｍｇ／ｋｇでウイルス肺力価の９９％低下を伴い、試験した全用量でウイルス肺力価の統計学的に有意の低下を引き起こした。
【実施例１０】
【００７９】
抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１Ｆエピトープの決定
ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現するよう工作したプラスミドを、真核生物細胞中での翻訳のため哺乳動物に至適化したコドンを用いてＲＳＶ  Ａ２株および１８５３７株のＦ遺伝子を最初に合成すること、ならびに以前の報告（Ｍｏｒｔｏｎら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ３１１：２７５−２８８、２００３）に類似の全部の潜在性ＲＮＡプロセシングシグナルの除去により構築した（それぞれ配列番号４６および４７）。これらをｐｃＤＮＡ  ３．１哺乳動物発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｉｎｃ．）にクローン化した。多様な突然変異をＲＳＶ  Ｆタンパク質（Ａ２株）のコーディング領域内で作成し、それらは、以前に記述されたｍＡｂエスケープ変異体、とりわけパリビズマブについてＳｅｒ２７５からＰｈｅ（Ｃｒｏｗｅら、Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、２５２：３７３−３７５、１９９８）、ｍＡｂ  ７．９３６についてＬｙｓ４３３からＴｈｒ（Ｌｏｐｅｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６９２２−６９２８、１９９８）、およびｍＡｂ１９についてＡｒｇ４２９からＳｅｒ（Ａｒｂｉｚａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２２２５−２２３４、１９９２）に対応した。ＲＳＶ  Ｆ変異体を発現するプラスミドを２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション２４時間後に、細胞をリン酸緩衝生理的食塩水中０．０５％グルタルアルデヒドで固定し、そしてＥＬＩＳＡアッセイを使用してパリビズマブ若しくはキメラ１０１Ｆの結合を測定した。
【００８０】
表３は、野性型ＲＳＶ  Ｆタンパク質に関してのｍＡｂ結合として示される結果を示す。これらの結果は、パリビズマブおよびキメラ１０１ＦがＲＳＶ  Ｆタンパク質上の別個のエピトープを認識することを示す。さらに、１０１Ｆは、パリビズマブによりもはや認識されない変異体ＲＳＶ  Ｆタンパク質（Ｓｅｒ２７５Ｐｈｅ）に結合することが可能である。
【００８１】
【表５】
2008518602.tif 000007
【００８２】
これらのデータは、抗体１０１Ｆおよびパリビズマブがこれらの条件下でｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで類似の効力を有することを示す。さらに、１０１Ｆ  ｍＡｂはパリビズマブと異なる１エピトープを認識し、そしてパリビズマブによりもはや結合されないＲＳＶ  Ｆの変異体に結合することが可能であり、１０１Ｆが抗原部位ＩＶ、Ｖ、
ＶＩに位置づけたことを示唆する。従って、１０１Ｆはパリビズマブに抵抗性であるウイルスを中和することが可能であることが期待される。
【００８３】
抗原部位ＩＶ、Ｖ、ＶＩは複雑であり、そしてｍＡｂ１９のような数種の異なるｍＡｂにより定義されるところのオーバーラップするエピトープを含有するようである（Ａｒｂｉｚａら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７３：２２２５−２２３４、１９９２；Ｌｏｐｅｚら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：６９２２−６９２８、１９９３）。該エピトープを遺伝子的に定義するため、部位ＩＶ、Ｖ、ＶＩ領域中に単一アミノ酸突然変異を含有する一団のＲＳＶ  Ｆタンパク質を、一過性トランスフェクションにより哺乳動物細胞の表面上で発現させ、そして１０１Ｆ、パリビズマブおよびｍＡｂ１９の結合をＥＬＩＳＡにより測定するのに使用した。ｍＡｂ結合のいかなる変化もＦタンパク質の全体的な変化に起因しなかったことを確実にするために、各変異体を発現のレベル、翻訳後プロセシング、細胞表面発現および細胞融合活性に関して特徴付けした。
【００８４】
野性型および変異体ＲＳＶ  Ｆタンパク質への１０１Ｆ、ｍＡｂ１９およびパリビズマブｍＡｂの結合を、野性型ＲＳＶ  Ｆタンパク質若しくは一団のＲＳＶ  Ｆ変異体いずれかを発現するプラスミドで一過性にトランスフェクトした２９３Ｔ細胞を使用するＥＬＩＳＡによりアッセイした。結果は、多様な点突然変異へのｍＡｂの結合を野性型ＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合に関して表されるところの表４に示す。キメラ１０１Ｆおよびパリビズマブは双方ともヒトＩｇＧ１κ抗体であるため、同一の二次抗体および検出試薬を使用して、１０１Ｆおよびパリビズマブの結合の直接比較を見込むことができる。
【００８５】
該結果は、パリビズマブ、ｍＡｂ１９および１０１Ｆ双方が、双方のサブグループ（Ａ２株および１８５３７株）からの野性型ＲＳＶ  Ｆタンパク質に同等に結合することを示す。Ｓ２７５Ｆへのパリビズマブ結合は完全に排除された一方、１０１ＦおよびｍＡｂ１９は野性型に類似のレベルでＳ２７５Ｆを結合する。驚くべきことに、１０１Ｆ結合はＲ４２９Ｓに対しわずかにのみ低下され、なおＫ４３３Ｔで有意に低下された一方、パリビズマブは双方を野性型に類似のレベルで結合する。残基４３３での１０１Ｆ結合の有意の減少は、これがＲＳＶ−Ｆとの１０１Ｆの相互作用にとって決定的な残基であることを示した。
【００８６】
付加的な変異体のスクリーニングは、残基Ｋ４３３がＲＳＶ−Ｆタンパク質への１０１Ｆ結合に決定的に重要であることを確認した。表４は、ＲＳＶ−Ｆ野性型と比較した場合のＫ４２７Ｄ、Ｋ４２７Ｑ、Ｎ４２８Ｑ、Ｒ４２９ＫおよびＩ４３１Ａへの１０１Ｆおよびパリビズマブの同等な結合を示す。１０１Ｆ結合は、野性型と比較した場合、Ｎ４２８Ｄで約２５％、ならびにＲ４２９ＳおよびＧ４３０Ａで約５０％低下される。１０１Ｆ結合は、Ｋ４３３Ｌ、Ｋ４３３ＮおよびＫ４３３Ｔで排除され、そしてＫ４３３Ｑ、Ｋ４３３ＲおよびＫ４３３Ｓで低下される。Ｋ４３３Ｄでの１０１Ｆおよびパリビズマブ双方についての結合は劇的に低下される。これは、この特定の変異体の不十分なプロセシングおよび切断によるようである。代謝標識アッセイは、Ｋ４３３ＤがＦ０からＦ１およびＦ２にプロセシングされるとは言え、それは他の変異体の全部より少ない程度までであることを示した（データは示されない）。表４は、Ｔ４３４、Ｓ４３６、Ｎ４３７、Ｓ４３８およびＶ４４７での付加的な変異体もまた示す。１０１Ｆおよびパリビズマブ双方の結合はこれらの変化で同等であるようである。この表はまた、パリビズマブおよびｍＡｂ１９エスケープ変異体（それぞれＳ２７５ＦおよびＲ４２９Ｓ）双方を含有する二重突然変異も示す。単一のＳ２７５Ｆ変化の影響に同様に、パリビズマブの結合は完全に破壊される一方、１０１Ｆの結合は約７０％低下される。プラスミドΔＲ４２９−Ｇ４６６は１個のインフレーム欠失を含有し、そしてＦ０のＦ１およびＦ２への不完全なプロセシングをもたらし、１０１Ｆおよびパリビズマブ双方の結合を排除する。一緒にすれば、これらのデータは、残基Ｋ４３３が１０１Ｆ結合に決定的に重要であることを示す。それはまたｍＡｂ  １９エスケープ変異体Ｒ４２９Ｓが、１０１Ｆ結合に重要とは言え１０１Ｆ結合の専らの原因でないことも示唆する。
【００８７】
【表６】
2008518602.tif 000008
【００８８】
ｍＡｂ結合のレベルの変化がＲＳＶ  Ｆタンパク質中のより包括的な変化によったとい
う可能性を排除するため、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の発現、プロセシングおよび細胞表面レベルに対する点突然変異の影響を、野性型ＲＳＶ  Ｆについて記述されたところの免疫沈降およびフローサイトメトリーにより検査した。トランスフェクトした細胞を［３５Ｓ］−メチオニン／システインで標識しかつ免疫沈降した
該結果（データは示されない）は、全部の変異体ＲＳＶ−ＦプラスミドＤＮＡ構築物が、Ｆ１およびＦ２はなお検出可能であったとは言え、Ｆ０のＦ１およびＦ２へのプロセシングの若干の低下を表したＫ４３３Ｄを除き、ＲＳＶ−Ｆ野性型に類似の様式でプロセシングされるタンパク質を発現することを示した。変異体構築物の相対発現レベルは、野性型ＲＳＶ−Ｆに類似であるようであり、特定の点突然変異が発現若しくはタンパク質プロセシングに対する顕著な影響を有しないことを示す。付加的な対照はＲＳＶウイルスに感染させた２９３Ｔ細胞（Ｌｏｎｇ株に０．１の感染多重度での感染の２４時間後）を包含した。３７アミノ酸のインフレーム欠失（欠失Ｒ４２９−Ｇ４６６）を含有する変異体をＲＳＶ  Ｆタンパク質プロセシングの陰性対照として包含した。この変異体はＦ０の発現をもたらすが、しかしＦ１およびＦ２へのプロセシングを予防する。
【００８９】
一団のＲＳＶ−Ｆ変異体の細胞表面発現を確認するため、およびＥＬＩＳＡ結合結果を確認するために、フローサイトメトリーを使用した。１０１Ｆおよびパリビズマブの代表的ドットプロットは、特定の点突然変異Ｒ４２９Ｓ、Ｉ４３２ＴおよびＫ４３３Ｔを含有するＲＳＶ−Ｆ変異体への結合を示した（データは示されない）。１０１Ｆの結合は、ＥＬＩＳＡの結果と一致して、Ｒ４２９Ｓ突然変異で穏やかに低下され、およびＫ４３３Ｔ突然変異でほぼ完全に排除された。これらのデータは、組換え発現したＲＳＶ−Ｆ変異体の細胞表面発現を確認し、そして特定の点突然変異への１０１Ｆおよびパリビズマブの相対的結合の差違を描写する。
【００９０】
１０１Ｆのエピトープを生化学的に特徴づけるため、精製したＲＳＶ  Ｆタンパク質−１０１Ｆ  ｍＡｂ複合体のトリプシン消化、次いで生じる回収されたｍＡｂに結合したペプチドの質量分析を実施した。回収されたペプチドの配列に基づき、Ｎ末端およびＣ末端から欠失された一連のペプチドが１０１Ｆのエピトープをさらに描写した。
【００９１】
ｍ／ｚ＝３３３０の１ペプチドがキメラ１０１Ｆ  ｍＡｂにより捕捉された。同一のペプチドは、消化プロテアーゼとしてＬｙｓ  Ｃを使用して捕捉された。配列の割り当ては質量に基づき、そして、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の仮想トリプシン消化からのデータベースと一致した。このペプチドすなわちｍ／ｚ＝３３３０は、ＲＳＶ  Ｆタンパク質の残基４２０−４４５と同定され、そして配列４２０ＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫ４４５（配列番号２８）を有する。
【００９２】
ＣＥＮ番号２５５５、２５６１、２５５６、２５５８、２５５９、２５６２、２５６３、２５６０、２５５７、２５５５、２６４４、２６４３、２６４８、２６４２、２６４５、２６４７および２６４６（それぞれ配列番号２９ないし４５）と同定された１６種のＮ末端ビオチニル化合成ペプチドを、ＭＳＤストレプトアビジン被覆ＥＬＩＳＡプレートとインキュベートした。１００μｇ／ｍｌの各ペプチド２５μｌを１ウェルに添加し、そして１０１  Ｆ  ｍＡｂ若しくはパリビズマブいずれかの連続希釈を各ウェルに分注した。結合の結果を図６に示す。ＲＳＶ  Ｆタンパク質ペプチド４２２ＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳ４３６（配列番号２９および３８（ＣＥＮ２５５５））は、他１５種の合成ペプチドに比較して、最高の親和性を伴いキメラ１０１Ｆ  ｍＡｂにより結合された（図６Ａおよび６Ｂ）。ペプチド番号２５６３、２５６０、２５５７、２６４５、２６４７および２６４６は、キメラ１０１Ｆへの有意に低下された結合を有した。パリビズマブは、キメラ１０１Ｆを使用して検出されたシグナルに関して非特異的にこれら１６種のペプチドを結合した（図６Ｃ）。多様な合成ペプチドに対するキメラ１０１Ｆ  ｍＡｂの結合親和性を要約しかつ優先順位を付けるため、棒グラフを図７に示す。要約すれば、親和性に基づくプロテアーゼ消化および質量分析により決定された結合エピトープは、領域４２０ＴＫＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳＮＧＣＤＹＶＳＮＫ４４５（配列番号２８）に位置する。
【００９３】
合成ペプチドを使用するさらなる分析がエピトープを絞り込んだ。ペプチドのＥＬＩＳＡデータに基づき、キメラ１０１Ｆ結合領域は４２２ＣＴＡＳＮＫＮＲＧＩＩＫＴＦＳ４３６（配列番号３８）に縮小され得る。加えて、Ｒ４２９およびＫ４３３はエピトープ結合に有意に寄与する。この観察結果は、合成ペプチドを使用するＲ４２９のＳ若しくはＥへのさらなる置換ならびにＫ４３３のＴおよびＥへの置換により確認された。別の正に荷電した残基Ｋ４２７は、Ｋ４２７のＥへの置換により示されるとおり、結合に小さな寄与をなす（図６）。
【００９４】
ｍＡｂ−抗原複合体のプロテアーゼ消化、Ｆ由来ペプチドのＥＬＩＳＡに基づく結合、および一団のＲＳＶ  Ｆ変異体の遺伝子解析は、１０１Ｆの結合に決定的であるとしてＲＳＶ  Ｆタンパク質の同一の領域を同定し、そして、このエピトープがパリビズマブおよびｍＡｂ１９のエピトープと異なることを示す。ＲＳＶ−Ｆタンパク質の残基Ｋ４３３は、タンパク質のプロセシングおよび切断、細胞表面発現、抗体結合ならびにペプチド結合を調査する一団の定性的および機能的アッセイ由来のデータから示されるとおり、１０１Ｆ結合に決定的に重要である。これらのペプチドは強力な広範に中和するＲＳＶ  ｍＡｂ（１０１Ｆ）により認識されるため、これらのペプチド、これらのペプチド配列を含有するタンパク質融合物、若しくはこれらのペプチドおよびこれらのペプチド配列を含有するタンパク質融合物をコードする核酸を使用する免疫化をワクチンとして使用し得、そしてＲＳＶに対する広範に反応性かつ強力な血清抗体を導き出し得る。
【実施例１１】
【００９５】
ヒト適応型抗ＲＳＶ  ｍＡｂの生成
抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１Ｆのアミノ酸配列を使用して、公的抗体配列データベースから蓄積されたヒト抗体データベースを問い合わせた。１０１ＦのＨ鎖の可変領域（配列番号４）は、ヒトＶＨ２Ｈ鎖ファミリーのｖｂ＿２−０５  Ｈ鎖生殖系列配列（配列番号４８）に対する高い相同性を示した。１０１Ｆ  Ｈ鎖のＣＤＲ領域をその後ｖｂ  ２−０５関連のＨ鎖配列に移した構築物を合成して、配列番号４９および図２ｃに示される可変領域アミノ酸配列を有するヒト適応型抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  Ｈ鎖Ｂ２１Ｍを生成した。
【００９６】
１０１ＦのｍＡｂ  １０１Ｆ  ＶκＬ鎖アミノ酸配列（配列番号６）は、ヒトＶＫ  ＩＶファミリーのｖｂ＿Ｂ３  Ｌ鎖Ｖκ生殖系列配列（配列番号５０）に対する最大の相同性を示した。１０１ＦのＣＤＲ領域をこのバックボーンに移してＢ２１Ｍ  Ｖｋ  Ｌ鎖を生成し、その可変領域配列を配列番号５１および図２ｄに示す。
【実施例１２】
【００９７】
Ｂ２１Ｍ  ＨおよびＬ鎖バリアントの生成および特徴付け
Ｂ２１ＭからのＣＤＲバリアントのＦａｂライブラリーを、Ｌｃ−ＣＤＲ１およびＬｃ−ＣＤＲ３ならびにＨｃ−ＣＤＲ２およびＨｃ−ＣＤＲ３中の選択された残基の飽和突然変異により、ｐＩＸファージディスプレイ系で調製した。精製したＦａｂ（＞９０％純度および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）産生にコドンを至適化）を、ヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合についてＥＬＩＳＡ（上の実施例６に記述されるところの）により試験し、そして野性型を上回る改良された結合をもたらしたＣＤＲ突然変異を同定した。代表的ＥＬＩＳＡデータを図８に示す。これらの結果は、野性型Ｂ２３Ｍ抗体を上回るクローンＧ７、Ａ７およびＦ８の結合親和性の有意の改良を示した。
【００９８】
結合の会合（Ｋａ）、解離定数（Ｋｄ）ならびに結合親和性（ＫＤ）を精製したＦａｂ
でのＢＩＡｃｏｒｅ分析により決定し、そしてＥＬＩＳＡの結果を確認した。Ｆａｂ／ＲＳＶ−Ｆ結合アッセイは、ＣＭ５（カルボキシメチルデキストラン）チップを装備したＢｉａｃｏｒｅ  ２０００若しくは３０００いずれかのバイオセンサーを使用して２５℃で実施した。全表面（フローセル）は、標準的アミンカップリング法を使用して、５００〜１０００ＲＵのＳＡ（ストレプトアビジン）を１０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ５．０中１０μｇ／ｍＬで固定することにより修飾した。サンプルおよびランニング緩衝液は、デキストラン表面へのサンプル汚染物質の非特異的結合を最小限にするように０．１％  Ｐ−２０を添加したＰＢＳであった。組換えＲＳＶ−Ｆをビオチニル化し、そしてセンサーチップ上の３個のＳＡ表面で捕捉した。約４０ＲＵのビオチニル化ＲＳＶ−Ｆがフローセル１で、２５ＲＵがフローセル３で捕捉された。フローセル２は、Ｆタンパク質を使用しなかった参照表面として使用した。Ｆａｂサンプルを、４表面上に１濃度（３０ｎＭ）で注入した。会合期を２分間、および解離期を６ないし６０分間モニターした。強固な相互作用の複雑な減少を正確に測定するためにより長い解離時間が必要とされた。ＲＳＶ−Ｆ表面は、各結合周期の終了時に３秒のパルスの１０ｍＭリン酸で再生した。各サンプル分析は３回反復した。Ｆａｂ  Ｂ２３を活性参照として使用した。Ｆａｂ  ２３のサンプルは、０、１．２３、３．７、１１．１、３３．３、１００および３００ｎＭで注入した。
【００９９】
フローセル１および３からのＦａｂ／ＲＳＶ−Ｆ結合データを、フローセル２から得た参照データを使用して補正した。生じる補正済結合応答データを、ＣＬＡＭＰＴＭソフトウェアを使用して１：１相互作用モデルに当てはめた。結合速度定数は、複製データ組への該１：１モデルの当てはめから直接得た。平衡結合定数はそれらの比から計算した（ＫＤ＝ｋｄ／ｋａ）。
【０１００】
Ｂ２１Ｍに関してヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質に対する改良された結合活性を伴うＦａｂはまた配列決定もした。表５は、ＢＩＡｃｏｒｅ分析により決定されたところのＦａｂの結合特徴およびそれらのＣＤＲアミノ酸変化を要約する。野性型Ｆａｂ  Ｂ２１Ｍのデータを表５の上部に列挙する。ＣＤＲバリアントを含有するＶＬおよびＶＨ領域の完全なアミノ酸配列の配列番号もまた表５の第一列に列挙し；第一の配列番号はＶＬ配列を、第二のものはＶＨ配列を表す。
【０１０１】
該結果は、１０倍を上回る結合の改良をもたらした突然変異がＬｃ−ＣＤＲ１中にあったことを示す。Ｌｃ−ＣＤＲ１バリアントＡ７、Ｈ８、Ｆ８、Ａ２、Ｇ３、Ｆ５、Ａ１０、Ｈ４、Ｃ１１、Ｂ８、Ａ１１およびＢ６のアミノ酸配列はそれぞれ配列番号５２、５３、５４、５５、５６、５７、１０５、５８、５９、６０、６１および６２に示す。例えば、Ｌｃ−ＣＤＲ１中のＹ３１Ｌ／Ｎ３２Ｆ／Ｉ３４Ｒ突然変異（クローンＡ７、配列番号５２）は、３２倍の結合の改良および抗ウイルスＩＣ５０の１０倍の減少を示した。Ａ７の突然変異を付加的なＬｃ  ＣＤＲ突然変異すなわちＱ２７ＤおよびＥ９７Ｄと組合せたＦａｂ  ００９は、Ａ７に関しておよそ４倍の結合解離定数（Ｋｄ）のさらなる減少をもたらした。他のＣＤＲ中の突然変異すなわちＦａｂ  ００４（Ｈｃ−ＣＤＲ３突然変異）およびＦａｂ  Ｇ７（Ｌｃ−ＣＤＲ３突然変異）もまた、野性型Ｆａｂを上回る付加的な結合の改良をもたらした。結合親和性の改良に相関して、該Ｆａｂは、上の実施例８に記述されたとおり実施したｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＲＳＶ微小中和アッセイで、改良された抗ウイルス活性を示した（データを図９に示す）。
【０１０２】
配列の結果は、改良された結合活性を伴うそれらのＦａｂ中に存在する設計されたＬｃ−ＣＤＲ領域中の一組の変化の有意の選択を示した。例えば、芳香族アミノ酸フェニルアラニンを、位置３２で野性型アスパラギンおよび１８種の他の可能なアミノ酸より優先的に選択した。位置３４では、荷電したすなわち極性のアミノ酸が、位置３２のフェニルアラニン変化とともに、野性型イソロイシンより好ましい。位置３１のアミノ酸置換は保存的であり、野性型若しくは関連するアミノ酸が好ましかったことを示唆した。位置３６の
野性型アミノ酸チロシンをこれらのバリアントで選択した。
【０１０３】
表５に列挙されるＦａｂのＲＳＶウイルスを中和する能力は上の実施例８でのとおり測定した。該データを表５に野性型Ｂ２３  Ｆａｂ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のコドンに至適化したＢ２１Ｍ  Ｆａｂ）を上回るウイルス中和の増大の倍数として報告する。表５に記述されるＦａｂから製造した全抗体は類似の抗原結合およびウイルス中和活性を表すとみられることが期待される。
【０１０４】
【表７】
2008518602.tif 000009
【０１０５】
【表８】
2008518602.tif 000010
【実施例１３】
【０１０６】
ポリエチレングリコール修飾抗ＲＳＶ  ｍＡｂの生成および特徴付け
精製したｍＡｂ（Ｂ２１Ｍ）を、Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、カリフォルニア州サンカルロス（カタログ番号２Ｍ４Ｍ０Ｐ０１）から商業的に入手可能な試薬を使用してポリエチレングリコール修飾（ペグ化）した。全般に部位特異的に行われる一方
で、アミン基による無作為カップリングがＣＤＲ中のリシンの存在にもかかわらず活性のペグ化ｍＡｂを生じることが示された（データは示されない）。この範囲に理論上制限されないとは言え、１：１から１：２４までのｍＡｂ：ＰＥＧ比を試験した。ＳＤＳ  ＰＡＧＥは、この範囲にわたり、物質の大部分が、出発原料が決して完全に修飾されなかったとは言えより多くの出発原料を修飾するより高濃度で０〜６回ペグ化されたことを示した（データは示されない）。活性試験前に全部のサンプルを同一のＰＥＧ濃度にもたらすため、追加のクエンチしたＰＥＧを添加した。ペグ化したサンプルは標準的中和アッセイを使用して抗ウイルス活性について試験した。該結果は図１０に示し、そして、ペグ化がこの抗体の抗ウイルス活性に対し悪影響を有しないことを示す。表５のＣＤＲバリアントを含有する全抗体のペグ化は抗体機能に対する悪影響を有しないとみられ、かつ、これらの分子の増大された半減期をもたらすとみられることが期待される。
【０１０７】
本発明は今や完全に記述され、多くの変更および改変が付随する請求の範囲の技術思想若しくは範囲から離れることなくそれに対しなされ得ることが当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０１０８】
【図１ａ−１ｂ】それぞれ抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１ＦのＨおよびＬ鎖の核酸配列を示す。ＣＤＲが各鎖中で下線を付けられている。
【図２ａ−２ｂ】それぞれ抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１ＦのＨおよびＬ鎖の予測されるアミノ酸配列を示す。
【図２ｃ−２ｄ】それぞれ抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  Ｂ２１ＭのＨおよびＬ鎖の予測されるアミノ酸配列を示す。ＣＤＲが下線を付けられている。
【図３】抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１ＦのＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合を示す。
【図４】キメラ抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１Ｆおよびキメラ１０１Ｆ  ＦａｂのＲＳＶ  Ｆタンパク質への結合を示す。
【図５】コトンラット免疫予防モデルでの抗ＲＳＶ  ｍＡｂ  １０１ＦのＲＳＶ中和活性を示す。
【図６】抗ＲＳＶ  Ｆ  ｍＡｂの合成ペプチドへのＥＬＩＳＡ結合を示す。図ＡおよびＢは１０１Ｆ  ｍＡｂ結合を示し；図Ｃはペプチド２５５５ないし２５６３へのパリビズマブ結合を示す。
【図７】１０１Ｆ  ｍＡｂの合成ペプチドに対する相対的結合親和性を示す。
【図８】野性型Ｂ２３  Ｆａｂ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に至適化したＢ２１Ｍ  Ｆａｂ）に関するＬ鎖バリアントＦａｂのヒトＲＳＶ  Ｆタンパク質へのＥＬＩＳＡ結合を示す。
【図９】野性型Ｂ２３  Ｆａｂに関するＬ鎖バリアントＦａｂによるＲＳＶ融合物のＦａｂ阻害を示す。
【図１０】ポリエチレングリコール複合した抗ＲＳＶ  ｍＡｂの抗ウイルス活性を示す。
【図１ａ−１ｂ】
2008518602.tif 000013
【図２ａ−２ｄ】
2008518602.tif 000014
【図３】
2008518602.tif 000015
【図４】
2008518602.tif 000016
【図５】
2008518602.tif 000017
【図６ａ−６ｂ】
2008518602.tif 000018
【図６Ｃ】
2008518602.tif 000019
【図７】
2008518602.tif 000020
【図８】
2008518602.tif 000021
【図９】
2008518602.tif 000022
【図１０】
2008518602.tif 000023
【配列表】
2008518602000001.xml