(57)【要約】  本発明は、高速複製及び高ひと死亡率に関係するペプチドの新規なクラス、並びに新興ウイルス疾患のワクチン及び治療を含んで成る疾患の診断、予防及び治療におけるこれらの使用、並びにペプチドの新規なクラス及び関連構造を同定するための方法を提供する。
2008539164.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス又は生物体中のレプリキン骨格を同定する方法であって、
（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；
（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、
（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び
（４）少なくとも６％のリジン、
を含む約１６〜約３０個のアミノ酸を含んで成る、一連のレプリキン骨格ペプチドを同定する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記一連のレプリキン骨格ペプチドの個々のメンバー又は複数のメンバーを同定する工程を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、エクソスケルトン骨格（Exoskeleton Scaffold)を同定することを含んで成り、ここで前記一連のレプリキン骨格ペプチドが第一系列のウイルス、ウイルス株又は生物体中で同定され、そして該第一系列のウイルス、ウイルス株又は生物体との比較として、前記エクソスケルトン骨格が後発ウイルス、ウイルス株又は生物体中で同定され、ここで該エクソスケルトン骨格が、該レプリキン骨格と約同数のアミノ酸を含有するアミノ酸配列を含んで成り、そして更に（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン、（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンを含んで成り、そして（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基中にリジンを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
更に、請求項１に記載の第二レプリキン骨格ペプチドを同定する工程、レプリキン骨格ペプチドと第二レプリキン骨格ペプチドを比較する工程、及び該第二レプリキン骨格ペプチドが該第二レプリキン骨格ペプチドから変化しない場合、ワクチンとしていずれかのレプリキン骨格ペプチドを選択する工程を含んで成る、請求項１に記載のレプリキン骨格ペプチドを同定する方法。
【請求項５】
（１）少なくとも１つのリジン残基が末端リジン残基である第二リジン残基から６〜１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基を含んで成る７〜約５０個のアミノ酸を含有する、単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチド。
【請求項６】
前記単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドがインフルエンザウイルスの新興株中に存在する、請求項５に記載の単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチド。
【請求項７】
（１）第二リジン残基から６〜１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；（３）少なくとも６％のリジン残基を含んで成る７〜約５０個のアミノ酸を含有する、単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドであって、ここで該単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドがインフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１株中に存在する、インフルエンザウイルスペプチド。
【請求項８】
末端リジンを更に含んで成る、請求項７に記載の単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨを含んで成る、請求項７に記載の単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチド。
【請求項１０】
約１６〜約３０個のアミノ酸、並びに
（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；
（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、
（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び
（４）少なくとも６％のリジン、
を含んで成る、請求項５に記載の単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドであって、ここで該ペプチドの相同体が、複数のウイルスの異種検体、ウイルス株又は生物体に存在し、ここで該相同体が約１６〜約３０個のアミノ酸、並びに
（５）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；
（６）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、
（７）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び
（８）少なくとも６％のリジン、
を含んで成る、インフルエンザウイルスペプチド。
【請求項１１】
（１）第二リジン残基から約６〜約１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；（３）少なくとも６％のリジン残基を含んで成る、インフルエンザウイルスの少なくとも１つの単離又は合成されたペプチドを含んで成る、予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１２】
前記単離又は合成されたペプチドが、インフルエンザウイルスの新興株中に存在する、請求項１１に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１３】
前記単離又は合成されたペプチドが、インフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１株中に存在する、請求項１１に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１４】
ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨを含んで成るアミノ酸配列を含むペプチドを含んで成る、請求項１１に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１５】
配列番号７３２、配列番号７３３、配列番号７３４、配列番号７３５、配列番号７３６、配列番号７３７、配列番号７３８、配列番号７３９、配列番号７４０、配列番号７４１、配列番号７４２のいずれかを更に含んで成る、請求項１１に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１６】
更に、配列番号７３２を含んで成る、請求項１４に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１７】
更に、医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを含んで成る、請求項１１に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１８】
更に、ワクチンＶ１２０３０４Ｕ２を含んで成る、請求項１４に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１９】
インフルエンザウイルスに対する抗体を産生するために対象の免疫系を刺激する方法であって、（１）第二リジン残基から６〜１０個の残基中に位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基、及び（３）少なくとも６％のリジン残基を含んで成る７〜約５０個のアミノ酸を含んで成る、少なくとも１つの単離又は合成したインフルエンザウイルスレプリキンペプチドの有効量を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項２０】
更に、医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを含んで成り、そして更にインフルエンザ感染を予防又は治療する工程を含んで成る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドが新興ウイルス中に存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドがインフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１株中に存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドが、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨを含むアミノ酸配列を含んで成る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
予防的又は治療的ウイルスワクチンを製造する方法であって、約１６〜約３０個のアミノ酸を含んで成る複数のレプリキン骨格ペプチドを含んで成るレプリキン骨格を同定する工程、及び予防又は治療的ウイルスワクチンとして少なくとも１つの該レプリキン骨格ペプチドを単離又は合成する工程を含んで成り、ここで該レプリキン骨格ペプチドが：
（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；
（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、
（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び
（４）少なくとも６％のリジン、
を含んで成る、方法。
【請求項２５】
前記レプリキン骨格ペプチドがインフルエンザウイルス中に存在する、請求項２４
に記載の方法。
【請求項２６】
複数の基準をタンパク質配列を表すデータに対して適用する工程；
該基準に基づき、該タンパク質配列中の任意のサブシーケンスを同定する工程；及び
該同定したサブシーケンスをデータファイルに出力する工程を含んで成る方法であって、
該基準が：
該サブシーケンス中に含まれるアミノ酸のセット｛ａ｝；
該サブシーケンスから除外されるアミノ酸のセット｛ｂ｝；及び
セット｛ａ｝及び｛ｂ｝のメンバー間の最小及び最大許容ギャップ、
を含んで成る、方法。
【請求項２７】
前記タンパク質配列がネットワークを介して得られる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法を実行するための、コンピュータ実行可能命令を記憶する機械可読媒体。
【請求項２９】
複数の基準をタンパク質配列を表すデータに対して適用する工程；
該基準に基づき、該タンパク質配列中のサブシーケンスを同定する工程、ここで該同定されたサブシーケンスは、そのリジンアミノ酸間の距離の所定の許容範囲、及びそのヒスチジンアミノ酸と最も遠いリジンの間の距離の所定の許容範囲を有し；そして
該同定したサブシーケンスをデータファイルに出力する工程、
を含んで成る方法。
【請求項３０】
前記タンパク質配列がネットワークを介して得られる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法を実行するための、コンピュータ実行可能命令を記憶する機械可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般に、構造的特徴、及びアミノ酸、核酸及び共通する構造的特徴を同定するためのほかの生物体情報を検索するためのバイオインフォマティクスの用途を共有する２つの新たに発見されたペプチドのクラスに関する。レプリキンは、構造的特徴を共有し、そしてウイルス及び生物体の高速複製に関係するペプチドの新たに発見されたクラスである。レプリキン骨格は、レプリキンペプチドのクラスのサブセットである。エクソスケルトン骨格（exoskeleton scaffold)は構造的特徴を共有し、そして複製の低下に相関する、ペプチドのほかの新たに発見されたクラスである。
【０００２】
本願は、２００５年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／６５３，０８３号の優先権を主張し、そして２００５年４月２８日に出願された米国特許出願第１１／１１６，２０３号の一部継続出願であり、これは２００４年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／５６５，８４７号の優先権を主張し、そして２００４年６月４日に出願された米国特許出願第１０／８６０，０５０号の一部継続出願であり、これは２００３年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／５３１，６８６号、２００３年９月２３日に出願された第６０／５０４，９５８号、及び２００３年６月６日に出願された第６０／４７６，１８６号の優先権を主張し、そして２００２年７月８日に出願された米国特許出願第１０／１８９，４３７号の一部継続出願であり、これは２００２年３月２６日に出願された米国特許出願第１０／１０５，２３２号の一部継続出願であり、これは２００１年１０月２６日に出願された米国特許出願第０９／９８４，０５７号の一部継続出願であり、これは２００１年７月９日に出願された米国仮出願第６０／３０３，３９６号の優先権、及び２００１年３月２７日に出願された第６０／２７８，７６１号の優先権を主張する。先の出願は、参考文献として本願明細書中に援用されている。
【背景技術】
【０００３】
高速複製は、一部の細菌、ウイルス及び悪性腫瘍における病原性の特徴であるが、異なる生物体における高速複製に対して共通な化学物質については何ら説明されてきていない。本発明者は、高速複製に関する保存された小タンパク質配列のファミリーであるレプリキンを発見した。このようなレプリキンは、有効な検出法及び治療を開発するための新たな標的を提供する。当業界において、レプリキンのようなアミノ酸のパターンを同定する方法の必要性が存在する。
【０００４】
アミノ酸配列のバイオインフォマティクス同定
アミノ酸配列、核酸配列及びほかの生物体的構造の同定は、バイオインフォマティクスの実行により補助することができる。アミノ酸及び核酸配列情報を含む公的に利用できるデータベースは、代表的なタンパク質若しくはタンパク質断片又はゲノム若しくはゲノム断片中のレプリキン、レプリキン骨格及びエクソスケルトン骨格を同定及び定義するために検索することができる。
【０００５】
アミノ酸及びタンパク質のデータベースは、多様な研究機関、例えば、米国国立医学図書館における全米バイオテクノロジー情報センター（NCBI）及びロスアラモス国立研究所におけるインフルエンザ配列データベースにより保持されている。これらのデータベースは、研究者のために特定のタンパク質を検索し、入手する可能性を提供するウエブページを通じたインターネットを介してアクセス可能である。
【０００６】
アミノ酸検索ツール
本分野で知られているとおり、タンパク質及びアミノ酸のデータベースは、多様なデータベースツール及び検索エンジンを用いて検索することができる。これらの公的に利用可能なツールを用いて、アミノ酸パターンは記述され、そして多くの異なる生物体に対応する多くの異なるタンパク質において位置決定することができる。いくつかの方法及び技術が利用可能であり、それによってアミノ酸パターンが記述されることができる。１つの一般的なフォーマットはPROSITEパターンである。PROSITEパターンの記述は以下の規則にしたがって構築されることができる。
【０００７】
（１）アミノ酸のための標準的な国際純正応用化学連合（IUPAC）の１文字コードが使用される（図１を参照のこと）。
（２）シンボル「ｘ」は任意のアミノ酸が受容される位置のために使用される。
（３）あいまいさは、所与の位置についての許容可能なアミノ酸を四角括弧「［］」の間に列挙することによって示される。例えば、［ALT］は、アラニン又はロイシン又はトレオニンをさす。
（４）あいまいさはまた、中括弧の対「｛｝」の間に所与の位置において許容されないアミノ酸を列挙することによっても示される。例えば、｛AM｝は、アラニン及びメチオニン以外のいずれかのアミノ酸をさす。
（５）パターン中の各要素は、その隣のものと「−」によって分けられる。
（６）パターンの要素の反復は、その要素に続く括弧の間の数値又は数字の範囲によって示されることができる。例：x(3)は、ｘ−ｘ−ｘに対応し、ｘ（２，４）は、ｘ−ｘ又はｘ−ｘ−ｘ又はｘ−ｘ−ｘ−ｘに対応する。
（７）パターンが配列のN−又はC−末端のいずれかに限定される場合、そのパターンは、それぞれシンボル「＜」で始まるか又はシンボル「＞」で終わる。
（８）ピリオドは、パターンを終了する。
【０００８】
PROSITEパターンの例は、以下のものを含む：
PA［AC］−ｘ−V−ｘ（４）−｛ED｝。このパターンは、［アラニン又はシステイン］−任意−バリン−任意−任意−任意−任意−｛任意であるが、グルタミン酸又はアスパラギン酸ではない｝と翻訳される。
【０００９】
PA＜A−ｘ−［ST］（２）−ｘ（０，１）−V。配列のN-末端になければならない（「＜」）このパターンは、以下のように翻訳される：アラニン−任意−「セリン又はトレオニン」−「セリン又はトレオニン」−（任意又はなし）−バリン。
【００１０】
アミノ酸パターンを記述するための他の一般的なフォーマットは、コンピュータ科学者によく知られた正規表現フォーマットである。コンピュータ科学においては、正規表現は、そのために有限のオートマタが自動的に構築されて言語におけるトークンを認識する、特徴のパターンを記述するために典型的に使用される。おそらく、最も注目すべき正規表現検索ツールは、Unix（登録商標）ユーティリティgrepである。
【００１１】
アミノ酸配列パターンを記述することに関しては、単純化された一組の正規表現機能が典型的に採用される。これらの単純な正規表現ルールによって定義されたアミノ酸配列パターンは、外観及び結果の両方においてPROSITE パターンにかなり類似することとなる。アミノ酸配列についての正規表現による記述は、以下のルールにしたがって作られる：
（１）アミノ酸残基については大文字を用い、そして（必要ではないが）「−」を２つのアミノ酸の間に置く。
（２）特定の位置における複数のアミノ酸の選択肢については「［］」を使用する。［LIVM］は、L、I、V又はMの任意の1つのアミノ酸がその位置にあることができることを意味する。
（３）アミノ酸を除外するためには「｛｝」を使用する。したがって、｛CF｝は、C及びFがその特定の位置にあってはならないことを意味する。いくつかのシステムにおいては、除外機能は、「＾」記号で特定されることができる。例えば、＾Gは、グリシン以外のすべてのアミノ酸を意味し、そして［＾ILMV］は、I、L、M及びV以外のすべてのアミノ酸を表す。
（４）任意のアミノ酸であることのできる位置については、「ｘ」又は「X」を使用する。
（５）複数の位置については、nが数字である「（n）」を使用する。例えば、ｘ（３）は、「ｘｘｘ」と同じである。
（６）複数又は可変の位置については、「（ｎ１，ｎ２）」を使用する。したがって、ｘ（１，４）は、「ｘ」又は「ｘｘ」又は「ｘｘｘ」又は「ｘｘｘｘ」を表す。
（７）パターンがＮ又はＣ末端にマッチすることを要求するためには、「＞」というシンボルを該パターンの最初又は最後に使用する。例えば、「＞MDEL」は、MDELで始まる配列のみを見出す。「DEL＞」はDELで終わる配列のみを見出す。
【００１２】
正規表現、「［LIVM］−［VIC］−ｘ（２）−G−［DENQTA］−ｘ−［GAC]−ｘ（２）−［LIVMFY］（４）−ｘ（２）−G」は、以下の：L、I、VまたはMを１位に有し；V、I、またはCを２位に；任意の残基を３及び４位に；Gを５位に・・・を有する１７個のアミノ酸を表す。
【００１３】
他の類似のフォーマットも使用される。例えば、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)は、インターネット上で利用可能な周知のシステムであり、ヌクレオチド及びタンパク質データベースの迅速な検索のためのツールを提供する。BLASTは、３つのフォーマット：FASTA配列フォーマット、NCBI受入番号、又はGenBank配列番号で入力された配列を受け入れる。しかしながら、これらのフォーマットは、正規表現又はPROSITEパターンよりも構造がより単純である。FASTAフォーマットの配列の例は以下の：
【化１】
2008539164.tif 000003
である。
【００１４】
BLASTシステムの特徴は、類似する領域を共有する配列間の関係を検出するために局所的な整列の領域についての配列データベースを検索するために使用される配列比較アルゴリズムを含む。しかしながら、BLASTツールは、発見しかつ位置決定できるアミノ酸配列の構造に関しては制限される。例えば、BLASTは、レプリキンパターンが必要とする「第二のリジン残基から６〜１０アミノ酸残基の位置にある少なくとも１つのリジン残基」を有する配列を検索することができない。BLASTは、「少なくとも６％のリジン残基」を有する配列のような、特別なアミノ酸の特定のパーセンテージ又は濃度を含むアミノ酸配列を検索することもできない。
【００１５】
レプリキン検索ツールの必要性
その定義からわかるように、レプリキンパターンの記述は、アミノ酸の単一の直線配列として表されることはできない。したがって、否定、和集合及び連結などの論理的設定構成オペレーションにしたがって得られる順序付けられた配列を記述するためによく適合されている、PROSITEパターン及び正規表現はどちらも、レプリキンパターンを記述するのに適していない。
【００１６】
アミノ酸の直線配列とは対照的に、レプリキンパターンは、単純な隣接順序を越えるアミノ酸の特性により特徴付けられる。特に、レプリキンパターンが少なくとも６％のリジン残基を含むという要求だけでは、レプリキンパターン中のリジン残基の実際の配置が比較的制限されないことを意味する。したがって、一般に、単一のPROSITEパターン又は単一の正規表現を用いてレプリキンパターンの記述を表すことは不可能である。
【００１７】
したがって、本分野では、与えられたアミノ酸配列をスキャンし、そしてレプリキンパターンのすべての場合を同定しカウントするためのシステム及び方法が必要とされる。同様に、レプリキンパターンにマッチするアミノ酸配列について、タンパク質データベース及びアミノ酸データベースを検索するためのシステム及び方法が必要とされる。さらに、研究者が以下の特徴のいかなる所望の組み合わせも含む任意の特定された長さのアミノ酸配列を位置決定することを可能とする、一般化検索ツールが本分野で必要とされている：（１）N位置超かつM位置未満、第二のアミノ酸残基から離れて位置する第一のアミノ酸残基；（２）配列の任意の場所に位置する第三のアミノ酸残基；及び（３）該配列は少なくともRパーセントの第四のアミノ酸残基を含む。最後に、従来技術の欠点は病気の予測及び治療に関する研究分野においてより明らかである。（菌株特異的なインフルエンザの流行などの）病気の発生を前もって予測するため、そして同様に、経時的に保存されることが発見され、タンパク質及びアミノ酸配列の検索のための従来方法ではこれまで検出されなかった、アミノ酸配列又はアミノ酸モチーフに基づいて設計される合成ワクチンを可能とするためのシステムが本分野で非常に必要とされている。
【発明の開示】
【００１８】
発明の要約
本発明は、レプリキン配列を含むヌクレオチド又はアミノ酸配列を同定するための方法を提供している。該方法は、本明細書では３点認識法と称する。「３点認識」法を用いることにより、（１）第二リジン残基から６〜１０個のアミノ酸残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基、及び（３）少なくとも６％のリジン残基（レプリキン）、を含む７〜約５０個のアミノ酸を含み、そして複製、形質転換又は酸化還元機能を有するペプチドを同定することができる。
【００１９】
本発明の観点は、ウイルス又は生物体中のレプリキン骨格（scaffold）を同定する方法であって、（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び（４）少なくとも６％のリジン、を含む約１６〜約３０個のアミノ酸を含む、一連のレプリキン骨格ペプチドを同定することを含む、方法を供する。
【００２０】
本発明の観点は、（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び（４）少なくとも６％のリジン、を含む約１６〜約３０個のアミノ酸を含むウイルス又は生物体中のレプリキン骨格を同定する方法を供することができる。
【００２１】
本発明の観点はまた、予防的又は治療的なウイルスワクチンを製造する方法であって、約１６〜約３０個のアミノ酸を含むレプリキン骨格を同定すること、そして予防的又は治療的ウイルスワクチンとして該レプリキン骨格を合成することを含んで成り、ここで上記レプリキン骨格が更に：（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び（４）少なくとも６％のリジンを含む、方法を供する。該レプリキン骨格は、インフルエンザウイルスペプチドレプリキンを含有することができる。レプリキン骨格はさらに、（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び（４）少なくとも６％のリジンを含むレプリキンの群を含むことができる。
【００２２】
本発明の観点は、エクソスケルトン骨格（exoskeleton scaffold）を同定する方法であって、ここでレプリキン骨格はウイルス又は生物体の一次株において同定され、そしてエクソスケルトン骨格は前記ウイルス又は生物体の後発株において同定され、ここで前記エクソスケルトン骨格が、レプリキン骨格のアミノ酸と同じ数のアミノ酸を含んで成り、さらに（１）２つの末端リジン、（２）２つの末端ヒスチジンを含んで成り、そして（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸中にリジンを含まないアミノ酸配列を含む、方法を供する。
【００２３】
本発明の観点において、単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドは、７〜約５０個のアミノ酸、第２リジン残基から６〜１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基で供される。よりさらなる観点において、該ペプチドは、インフルエンザウイルスの新興株、例えば、インフルエンザウイルス株Ｈ５Ｎ１において存在する。
【００２４】
本発明の更なる観点において、単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドは、Ｈ５Ｎ１ペプチド、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨを含んで供される。
【００２５】
本発明のほかの観点は、単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドは、約１６〜約３０個のアミノ酸；末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン；ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び少なくとも６％のリジンを有して供される。
【００２６】
本発明のほかの観点において、予防的又は治療的ウイルスワクチンは、第２リジン残基から６〜１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；少なくとも１つのヒスチジン残基及び少なくとも６％のリジン残基を伴う、少なくとも１つのインフルエンザウイルスの単離又は合成ペプチドを有して供される。
【００２７】
本発明のよりさらなる観点において、予防的又は治療的ウイルスワクチンは、代わりに合成ＵＴＯＰＥ尾部、アジュバント又はこれらの組み合わせを有するペプチドＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨを含む。よりさらなる観点において、予防的又は治療的ウイルスワクチンは、医薬的に許容される担体を含む。
【００２８】
本発明のさらなる観点において、該予防的又は治療的ウイルスワクチンは、ペプチドＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫＫＬＨを含む。
【００２９】
本発明のさらに他の観点において、インフルエンザウイルスに対する抗体を産生するために対象の免疫系を刺激する方法は、（１）第二リジン残基から６〜１０個のアミノ酸残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基、及び（３）少なくとも６％のリジン残基を含む、７〜約５０個のアミノ酸を含む、少なくとも１つの単離又は合成したインフルエンザウイルスレプリキンペプチドの有効量を投与することを含んで供される。
【００３０】
さらなる観点において、免疫系を刺激するための方法において投与されるレプリキンペプチドは、更に医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを含んでよく、そしてインフルエンザ感染を予防又は治療する。該免疫系を刺激する方法は更に、新興ウイルス中に存在する、あるいはインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１株中に存在する、単離又は合成したインフルエンザウイルスペプチドを含んでよい。該方法はさらに、ペプチドＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫＫＬＨの投与を含んでよい。
【００３１】
本発明の観点はまた、タンパク質配列を示すデータに対して複数の判断基準を適用し；該判断基準に基づき、該タンパク質配列中の任意のサブシーケンスを同定し；そして同定したサブシーケンスをデータファイルに出力することを含む方法であって、ここで該判断基準が：サブシーケンス中に含まれるアミノ酸のセット｛ａ｝；サブシーケンスから除外されるアミノ酸のセット｛ｂ｝；並びにセット｛ａ｝及び｛ｂ｝のメンバー間の最小及び最大許容ギャップを含む方法を供することができる。該方法において、タンパク質配列はネットワークを介して得ることができる。本発明の観点はさらに、このような方法を行うためのコンピュータ実行指示を記憶する機械可読媒体を含むことができる。
【００３２】
本発明の観点はさらに、タンパク質配列を示すデータに対して複数の判断基準を適用し；該判断基準に基づき、該タンパク質配列中の任意のサブシーケンスを同定し、該同定したサブシーケンスは、所定の許容範囲のリジンアミノ酸間の距離、及び所定の許容範囲のヒスチジンアミノ酸と最も遠いリジン間の距離を有し；そして同定したサブシーケンスをデータファイルに出力することを含む方法を供する。該タンパク質配列はネットワークを介して得ることができる。コンピュータ実行指示を記憶する機械可読媒体は、このような方法を実行することができる。
【００３３】
発明の詳細な説明
定義
本明細書中に使用されるとおり、「ペプチド」又は「タンパク質」という語は、１つのアミノ酸のカルボキシル基がもう一方のアミノ酸のアミノ基と一体化されている２つ以上のアミノ酸の化合物を意味する。ペプチドという語は同様に、このような化合物をコードするアミノ酸配列を表わすためにも用いられる。本明細書で使用されている「単離された」又は「合成された」ペプチド又はその生物体学的に活性な部分は、精製後に、自ら由来する細胞又は組織源からの細胞物質又はその他の汚染性ペプチドを実質的に含まない、又は任意の方法により化学的に合成された時点で化学的前駆物質又はその他の化学物質を実質的に含まない、又は組換え型遺伝子技術によって合成された時点で汚染ペプチドを実質的に含まないペプチドを意味する。
【００３４】
本明細書で使用する、レプリキンペプチド又はレプリキンタンパク質は、
（１）第二リジン残基から６〜１０個のアミノ酸残基に位置する少なくとも１つのリジン残基、
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基、
を含む７〜約５０個のアミノ酸を有するアミノ酸配列である。
同様にして、レプリキン配列はかかるペプチド又はタンパク質をコードするアミノ酸配列である。
【００３５】
本明細書中に使用されるとおり、「早期発生」ウイルス又は生物体は、別のウイルス又は生物体の検体が採取された日前におけるウイルス又は生物体の天然源から採取されたウイルス又は生物体の検体である。「後期発生」ウイルス又は生物体は、別のウイルス又は生物体の検体が採取された日後におけるウイルス又は生物体の天然源から採取されたウイルス又は生物体の検体である。
【００３６】
本明細書において使用されるとおり、本明細書で用いる「新興株」という語は、かかる生物体のその他の株内のレプリキンの濃度に比べてそのタンパク質配列のうちの１又は複数ののものの中のレプリキン配列の増大した漸増的濃度を有するものとして同定されたウイルス、細菌、真菌又はその他の生物体の株を意味する。レプリキンの増加又は漸増的濃度は、例えばインフルエンザウイルス内では、少なくとも約６ヵ月の期間にわたって、又は好ましくは少なくとも約１年の期間にわたって、最も好ましくは少なくとも約３年以上の期間にわたって起こるが、細菌及びその他の生物体については、はるかに短い期間であり得る。
【００３７】
本明細書で使用する「突然変異」という語は、アミノ酸の置換によって生じる生物体のこの構造及び特性の変化を意味する。これとは対照的に、本明細書で使用される「保存」という語は、置換が欠如していることに起因する特定のアミノ酸の保存を意味する。
【００３８】
本明細書において使用されるとおり、「レプリキン計数」は、タンパク質又は生物体中の１００個のアミノ酸あたりのレプリキンの数を意味する。ウイルス又は生物体の１次株におけるより高いレプリキン計数は、２次のより低いレプリキン計数を有するウイルス又は生物体の早期若しくは後期発生株と比較して、１次ウイルス又は生物体のより高速複製に相関することが発見された。
【００３９】
本明細書において使用される、「レプリキン骨格」は、一連の保存レプリキンペプチドを意味し、ここで各々のレプリキンペプチド配列は、約１６〜約３０個のアミノ酸を含み、そして更に：（１）末端リジン；（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン；（３）他のリジンから６〜１０個のアミノ酸残基中のリジン；及び（４）約６％のリジンを含む。「レプリキン骨格」ペプチドは、末端リジンに直接隣接する更なるリジンを含んでよい。「レプリキン骨格」はまた、一連の「レプリキン骨格」の個々のメンバー又は複数のメンバーを意味する。
【００４０】
レプリキンの同定
本明細書でレプリキンと呼ばれている高速複製現象に関係する小ペプチドの新しいファミリーの同定は、試料中の病原体の検出及びワクチン開発を含めた療法の開発のための標的を提供する。一般に、このペプチドファミリーの知識及び同定は、レプリキンを有するあらゆる生物体のための有効な療法及びワクチンの開発を可能にする。このペプチドファミリーの同定は同様に、ウイルスの検出及びウイルスワクチン開発をも提供する。
【００４１】
例えば、このペプチドファミリーの同定は、インフルエンザウイルスの検出を提供し、インフルエンザ治療のための新しい標的及びワクチン、例えば、インフルエンザＨ５Ｎ１のための治療及びワクチンを提供する。該ペプチドファミリーの検出により供されるさらなる例は、感染性疾患レプリキン、癌免疫レプリキン及び構造的タンパク質レプリキンの検出を含む。
【００４２】
高速複製は、或る種の細菌、ウイルス及び悪性腫瘍における病原性の特徴であるが、これまで、異なる生体における高速複製に共通の化学反応が記述されたことは全く無い。我々は、高速複製に関係する保存された小タンパク質配列ファミリーを発見し、これをレプリキンと命名した。このようなレプリキンは、有効な検出方法及び療法を開発するための新しい標的を提供する。最初に発見されたレプリキンは、マリグニンと呼ばれる多形性脳グリア芽腫（神経膠腫）細胞タンパク質の中で同定された神経膠腫レプリキンであった。
【００４３】
マリグニンの加水分解及び質量分析は、神経膠腫レプリキンを含有する新規１６量体ペプチド配列を明らかにした。このレプリキンは正常な健康なヒトゲノムのためのデータベース内には発見されず、従って体外の何らかの供給源から誘導されるように思われた。
【００４４】
我々は、神経膠腫レプリキン又はその相同体について探索するためのアルゴリズムを考案した。相同体は４０００以上のタンパク質配列内で一般的でなかったが、驚くべきことに、全ての腫瘍ウイルス内及び藻類、植物、真菌、ウイルス及び細菌の複製タンパク質内で発見された。
【００４５】
我々は、１）レプリキン濃度（１００個のアミノ酸あたりのレプリキンの数）及びレプリキン組成の両方が、高速複製の機能的現象と相関関係をもつことを識別した。これらの関係は、レプリキンが複製速度に量的並びに質的に関係するという決定のための機能的根拠を提供する。
【００４６】
高速複製に対するレプリキンの役割についての最初の機能的根拠は、グリオーマ複製において出願人により発見された。神経膠腫マリグニンが神経膠腫細胞の高速複製における細胞数及び膜タンパク質濃度の５倍の増加に比べ１０倍富化されるという事実は、複製に対するレプリキンの不可欠な関係を示唆している。神経膠腫レプリキンとインビトロで合成しウサギに合成ワクチンとして投与した場合、豊富な抗マリグニン抗体が産生される。このことは、血清中抗マリグニン抗体（ＡＭＡＳ）試験の抗原性の根拠を厳正に立証し、初めての潜在的合成癌ワクチン及びその他の生体内でのレプリキンワクチン用プロトタイプを提供する。癌レプリキンと高速複製の共有の特異性に基づく、細胞型に優先する癌レプリキンに対するこの自然免疫応答及び複製に対するレプリキンのこの自然免疫関係の実証により、抗マリグニン抗体での免疫の受動的増加及び合成レプリキンワクチンでの能動的増加がいまや可能である。
【００４７】
患者における抗ＡＧ抗体の存在と生存率の関係は、癌患者由来の８，０９０件の血清標本の研究の中で示された。集団内の癌の発生率が増大するのと同様、抗マリグニン抗体の濃度が年齢と共に増大し、細胞型の如何に関わらず早期悪性腫瘍においてさらに２〜３倍増大することが実証された。インビトロでは、該抗マリグニン抗体は癌細胞１個あたりのピコグラム（フェムトモル）で癌に対し細胞毒性をもち、インビボで抗マリグニン抗体の濃度は数量的に癌患者の生存率と関係する。神経膠腫細胞内で示されているように、今や、細胞が死に致らない悪性状態までしか形質転換されておらず、鎮静期又は休眠期にとどまっている癌病期を、レプリキンの濃度増加を特徴とするより活性の高い生命を脅かす複製状態と区別することが可能である。さらに、神経膠腫糖タンパク質１０Ｂが正常な１０Ｂと比べた場合に炭水化物残基の５０％の減少を示すという事実に、癌のウイルス病因論への糸口を見い出せるかもしれない。この減少は、その他のケースでウイルスの進入に結びつけられており、従って、悪性状態への形質転換における１つのステップとしてのグリア細胞の１０Ｂに対するウイルスレプリキンの送達のためのウイルスの付着の証拠であり得る。
【００４８】
過去１００年にわたるインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質配列及びインフルエンザ疫学に関する我々の研究は、高速複製に対するレプリキンの関係についての第２の機能的根拠を提供した。これまでのところ、血清学的血球凝集素及び抗体分類のみがインフルエンザにおいて記述されているが株特異的な保存されたペプチド配列はこれまで全く記述されていない。さらに疫学的に立証された地域的流行又は高速複製と相関関係をもついずれかの株特異的ペプチド配列の濃度及び組成の変化については全く記述されてきていない。４つの主要な株すなわちインフルエンザＢ型、（Ａ）Ｈ１Ｈ１、（Ａ）Ｈ２Ｎ２及び（Ａ）Ｈ３Ｎ２型の各々のうちの１つにおける株特異的インフルエンザレプリキンの濃度の４倍〜１０倍の増加が、１９０２年から２００１年まで各株によって特異的にひき起こされたインフルエンザの地域的流行に関係することが示されている。
【００４９】
我々はその後、これらの濃度増加が、その消滅から１年〜最高６４年後の少なくとも１つの特異的レプリキン組成の再出現に加えて新しい株特異的なレプリキン組成の新興に起因するものであることを示した。以前は、来たるインフルエンザの流行期において優位を占めと思われる株を予想できるようにする、又はワクチンのための全ウイルス株の年間混合物を考案できるようにする株特異的化学構造は全く知られていなかった。Ｈ３Ｎ２の歴史上最大である最近の急激なＨ３Ｎ２レプリキン濃度の増加（１９９７年〜２０００年）及び１９６８年の高死亡率のＨ３Ｎ２の世界的流行及び１９７５年及び１９７７年の２つの高死亡率の世界的流行において最後に見られたものの２０〜２５年間不在であった特異的レプリキン組成の再出現は、共に来たる地域的流行の警告であるかもしれない。同一の構造が１００年間持続し得るか又はこれが１〜６４年の不在の後に再出現し得るようにするレプリキン構造のこの高い保存率が観察されたことは、インフルエンザタンパク質におけるアミノ酸の無作為置換に起因する変化であると以前考えられてきたことが、レプリキンの組織立った保存プロセスに起因する変化である確率がより高いということを表わしている。
【００５０】
レプリキンの保存はインフルエンザウイルスに独特のものではなく、例えばそれは、口蹄病ウイルス、Ｏ型及びＨＩＶｔａｔ並びに小麦内でも観察された。
【００５１】
高速複製におけるレプリキンの役割についての第３の機能的根拠は、ＨＩＶ内の高速複製の増加に見られる。レプリキン濃度はＨＩＶ内の高速複製に関係することが示された。我々は、早期感染において優勢であるＨＩＶの緩慢に成長する低力価株（ＮＳ１、「Ｂｒｕ」）中のレプリキン濃度が、（後期ＨＩＶ感染において優勢である）ＨＩＶの急速に成長する高力価株（ＳＩ、「Ｌａｉ」）の６分の１であることを発見した。
【００５２】
さらなる例が、高速複製に対するレプリキンの関係を実証している。例えば、トマトの収穫を壊滅させるトマト縮葉病ジェミニウイルスの「複製タンパク質」においては、ＤＮＡに結合することが示されてきた配列である最初の１６１個のアミノ酸は５つのレプリキンを含有していることが示された。１つのトリパノゾームから何万個の割合で肝臓からトリパノゾームが放出される場合の、高速複製に関し伝説的に有名であるマラリアにおいては、１００個のアミノ酸につき最高３６の重複レプリキンの濃度で、多数の新規でほぼ「火炎状の」レプリキン構造が発見された。
【００５３】
いずれかの構造の保存は、その構造が、攻撃、破壊又は刺激するべき安定した不変の標的を提供するか否かにとってきわめて重要である。構造が何らかの形で生体の基本的生存メカニズムに結びつけられる場合、その構造は保存される傾向にある。変動する構造は、不変の標的を提供し、これは、以前の構造に対して特異的に生成されかくして修飾された形態に対しては効力のない抗体といったようなアタッカーを回避するための優れた戦略である。この戦略は、インフルエンザウイルスなどに用いられ、かくして先行ワクチンが現在病原性ウイルスに対し全く効力がなくなる可能性がある。
【００５４】
治療のための安定した標的としてのレプリキン
細菌及びＨＩＶは両方共、レプリキン及び非レプリキンの両方のアミノ酸を有する。ＨＩＶにおいては、例えば、突然変異、すなわちレプリキン構造の決定に必須ではないアミノ酸の置換に起因して薬物耐性が最近９％〜１３％増加した。（本明細書で論述されているＨＩＶのＴＡＴタンパク質の詳細な分析を参照のこと）。細菌において、「耐性株」の発生は、類似のメカニズムに起因している。しかしながら、我々は、レプリキン構造が非レプリキンアミノ酸と同程度に突然変異又は変化しないことを発見した（同様に、本明細書で論述されているレプリキンの口蹄病ウイルス保存の論述も参照のこと；さらに、本明細書で論述されているコロナウイルスレプリキンの保存についての論述も参照のこと）。レプリキン構造は、非レプリキン構造と異なり、保存され、かくして治療のための新しい恒常な標的を提供する。
【００５５】
生存機能に過度に緊密に関係している或る種の構造は恒常的に変化し得ないように思われる。レプリキン構造の基本的構成要素が複製に必要とされる確率の高いエネルギー源及び酸化還元酵素内の金属基に頻繁に結合するものとして知られているヒスチジン（ｈ）であることを理由として、又、このヒスチジン構造が恒常にとどまることから、この構造はなお一層魅力ある破壊又は刺激用標的であり続けている。
【００５６】
プロテオミクスの観点から見ると、新たに決定された神経膠腫ペプチド配列に基づいて自ら鋳型を構成したことで、発明者らは、関連する保存された構造及びこの場合は複製である特殊な機能をもつ広範なタンパク質の種類を発見するに至った。１つの疾病の病原性に伴うレプリキン濃度の増加の例としては、インフルエンザ、ＨＩＶ、癌及びトマト縮葉病ウイルスがある。この新たに認められた種の構造は、インフルエンザ、酵母、藻類、植物、ジェミニトマト縮葉病ウイルス、ＨＩＶ及び癌といったさまざまな生体内の高速複製の現象に関係している。
【００５７】
レプリキンの濃度及び組成は、各々の生物学的集団の生存率及び優性にとって中枢的なものである複製プロセスを検出し制御する新しい定量的方法を提供する。神経膠腫及び関連する癌レプリキンのための抗マリグニン抗体で実証されたように、該種類の多様な成員による免疫学的特異性の共有は、Ｂ細胞及びその産物抗体が類似の認識言語を用いてレプリキンを認識できるということを示唆している。
【００５８】
癌レプリキンのペプチド配列又はレプリキンすなわち神経膠腫ペプチドｋａｇｖａｆｌｈｋｋの相同体を含有するものとしてのペプチド配列の例は、肺、脳、肝臓、軟組織、唾液腺、鼻咽頭、食道、胃、結腸、直腸、胆のう、乳房、前立腺、子宮、子宮頸管、膀胱、眼、黒色腫形態、リンパ腫、白血病及び腎臓などの癌において発見され得るが、ただしこれらに制限されるわけではない。
【００５９】
レプリキンは、１）レプリキンの質的及び量的決定による病原体の検出、２）未変性レプリキンをターゲティングすること及びワクチンとして合成レプリキンを使用することによる、高速複製が主要な要因である広範囲の疾病の治療及び制御；及び３）藻類及び植物食品の増強された成長速度の助長を提供する。
【００６０】
同定すべき最初のレプリキン配列は、多形性グリア芽腫（神経膠腫）細胞の高速嫌気性複製中に１０倍に富化されることが実証された脳癌タンパク質、マリグニンの中に発見される癌細胞レプリキンであった。（図２）。マリグニンは、多形成グリア芽腫（神経膠腫）細胞の膜からインビボ及びインビトロで単離された２５０ＫＤａの糖タンパク質１０Ｂの１０ＫＤａ部分である。マリグニンの加水分解及び質量分析は、本明細書で神経膠腫レプリキンと呼ばれ、より短いペプチドｋａｇｖａｆｌｈｋｋ（配列番号１）を含む１６量体ペプチド配列ｙｋａｇｖａｆｌｈｋｋｎｄｉｄｅ（配列番号４）（両方共正常なヒトゲノム内では見かけ上不在である）を明らかにした。
【００６１】
【表１】
2008539164.tif 000004
【００６２】
１６量体神経膠腫レプリキンが合成ワクチンとしてウサギの体内に注射された時点で、豊富な抗マリグニン抗体が産生された。（Bogoch et al., 癌の検出と予防。２６（付録１）：４０２（２００２））。インビボでの血清中の抗マリグニン抗体の濃度は癌患者の生存率と量的に関係することが示された（Bogoch et al. 生物学的流体のペプチド、３１：７３９−７４７（１９８４）。インビトロ抗マリグニン抗体は、がん細胞１個あたりピコグラム（フェムトモル）の濃度で癌細胞に対し細胞毒性をもつことが示されてきた（Bogoch et al., 癌の検出と予防。２６（付録１）：４０２（２００２）。
【００６３】
発明者らにより実施された研究は、神経膠腫レプリキンが正常な健康なヒトゲノム内では現れないことを示した。その結果、さまざまな生体の公示済み配列の分析によってレプリキン配列の起源及び考えられる相同体についての探索が着手された。
【００６４】
鋳型として１６量体神経膠腫レプリキン配列を使用し、複数の異なる生体のタンパク質のアミノ酸配列を視覚的にスキャンするべく認識プロテオーム系を構築することによって、新しい種類のペプチド、レプリキンが同定された。本発明は、レプリキン配列を内含するヌクレオチド又はアミノ酸配列を同定するための方法を提供する。該方法は、本明細書では３点認識法と呼ばれている。３点認識法は、（１）第二リジン残基から６〜１０個の残基のところに位置する少なくとも１つのリジン残基、（２）少なくとも１つのヒスチジン残基及び（３）少なくとも６％のリジン残基、を含む７〜約５０個のアミノ酸のペプチド（レプリキン）を含む。これらのペプチド又はタンパク質は、複製、形質転換又は酸化還元機能を有する藻類、酵母、真菌、アメーバ、細菌、植物、ウイルス及び癌タンパク質を含む種の中で新しい種類のペプチドを構成する。レプリキンペプチドは、より大きい「複製」及び「形質転換」タンパク質（その研究者によりこのように呼称されている、表２参照）及び癌細胞タンパク質の中に集中していることが発見されてきた。マリグニン１６量体ペプチドと同一であることがわかった配列は無い。
【００６５】
本発明は、（１）単離又は合成されたペプチドのいずれかの末端に位置する少なくとも１つの第１のリジン、（２）第１のリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置する第２のリジン、（３）少なくとも１つのヒスチジン；及び（４）少なくとも６％のリジン、を含む７〜約５０個のアミノ酸を含むレプリキン配列を含む、ヌクレオチド又はアミノ酸配列を同定するための方法を供する。本発明のほかの観点において、単離又は合成されたペプチドは、インフルエンザウイルスペプチドである。本発明のさらに他の観点において、単離又は合成されたペプチドは、Ｈ５Ｎ１インフルエンザウイルスペプチドである。
【００６６】
表２
さまざまな生体内のレプリキンの例−プロトタイプ：神経膠腫レプリキン*ＫＡＧＶＡＦＬＨＫＫ（配列番号１）
【表２】
2008539164.tif 000005
【表３】
2008539164.tif 000006
【００６７】
レプリキンとして又はレプリキンを含有するものすなわち神経膠腫ペプチドｋａｇｖａｆｌｈｋｋの相同体としてのアミノ酸配列の同定には、以下の３つの必要条件が満たされる必要性がある。３点認識システムに従うと、配列は、７〜約５０残基のアミノ酸配列の内部に次の３つの要素すなわち、（１）もう１つのリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基の組成物を有している。典型的な非制限レプリキンは末端リジンを含む。
【００６８】
レプリキンを含有するタンパク質配列について国立医学図書館キーワード「PubMed」記述子を用いてデータベースが探索された。４０００以上のタンパク質配列が相同体について視覚的に検査された。PubMed分類されたタンパク質の各グループ内の個々のタンパク質すべての配列が、上述の３つの必要条件を満たすペプチドについて視覚的にスキャンされた。相同体のまれな発生が、「ウイルスペプチド」全体の中（１．５％）（Ｎ＝９５３）及び「脳ペプチド」及び「神経ペプチド」といった悪性形質転換又は複製に関連するものとして指定されていないその他のペプチドの中（合わせて８．５％）（Ｎ＝８４５）で観察された。ただし、驚くべきことに、相同体は、細菌、藻類及びウイルス内での複製における立証済みの機能をもつものとして同定された大きな「複製タンパク質」の中ではるかに高い頻度で同定された。さらに一層驚くべきことは、レプリキン相同体が、「腫瘍ウイルス」の１００％（Ｎ＝２５０）、「癌タンパク質」の９７％（Ｎ＝４０１）、そして「形質転換ウイルス」の８５％（Ｎ＝２４８）の中で発生したという発見事実であった。これらの結果は、細胞型の如何に関わらず癌の病因論には共有の特性が存在することを示唆しており、又、発癌すなわち、休眠中であれ形質転換された状態からより病原性の高い活発に複製している状態までの細胞の転換、におけるウイルスの役割を示唆している。
【００６９】
３点認識法によって画定される通りのｋａｇｖａｆｌｈｋｋといったアミノ酸配列の相同体が、アデノウイルス、レンチウイルス、ａ−ウイルス、レトロウイルス、アンデノ関連ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脳炎ウイルス、インフルエンザウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス、ヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、口蹄病ウイルス、天然痘ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス腫瘍遺伝子、ポリオーマウイルス、シンドビス、ヒト乳頭腫ウイルス、骨髄単球性腫瘍ウイルス、マウス急性白血病、Ｔ細胞リンパ栄養ウイルス及びトマト縮葉病ウイルスといったような（ただしこれらに制限されるわけではない）ウイルス又はウイルスペプチドの中で発見された。
【００７０】
さらに、アミノ酸配列ｋａｇｂａｆｈｋｋの相同体は、宿主細胞の細胞質中で複製する外被ウイルスファミリの成員である既知の種類のコロナウイルスの中に存在する。さらに、アミノ酸配列ｋａｇｖａｔｌｈｋｋの相同体は、重症急性呼吸器症候群つまりＳＡＲＳの原因である最近同定された種類のコロナウイルスの中に存在する。レプリキンは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド全タンパク質配列の中に位置特定される。さらに、レプリキンの場所は、コロナウイルスの種類のその他の成員の中に存在し、より特定的には、これらのコロナウイルス由来のヌクレオカプシドタンパク質配列内にも存在する。
【００７１】
レプリキンは、Acetobacter、Achromobacter、Actinomyces、Aerobacter、Alcaligenes、Arthrobacter、Azotobacter、Bacillus、Brevibacterium、Chainia、Clostridium、Corynebacterium、Erwinia、Escheria、Lebsiella、Lactobacillus、Haemophilus、Flavobacterium、Methylomonas、Micrococcus、Mycobacterium、Micronomspora、Mycoplasma、Neisseria、Nocardia、Proteus、Pseudomonas、Rhizobium、Salmonella、Serratia、Staphylococcus、Streptocossus、Streptomyces、Streptosporangium、Streptovirticillium、Vibrio peptide及びXanthomasといった細菌（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。レプリキンは、Penicillium、Diseula、Ophiostoma novoulim、Mycophycophta、Phytophthora infestans、Absidia、Aspergillus、Candida、Cephalosporium、Fusarium、Hansenula、Mucor、Paecilomyces、Pichia、Rhizopus、Torulopsis、Trichoderma及びErysipheといった真菌（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。レプリキンは、Saccharomyces、Cryptococcusneoformasを含むCryptococcus、Schizo saccharomyces、及びOryzaといった酵母（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。レプリキンは、Caldophera、Isolepisprolifera、Chondrus、Gracilaria、Gelidium、Caulerpa、Laurencia、Cladophexa、Sargassum、Penicillos、Halimeda、Laminaria、Fucus、Ascophyllum、Undari、Rhodymenia、Macrocystis、Eucheuma、Ahnfeltia及びPteroclasiaといった藻類（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。レプリキンは、Entamoeba（Entamoeba invadensを含む)、Amoebidae、Acanthamoeba及びNaegleriaといったアメーバ（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。レプリキンは、シロイヌナズナ、小麦、イネ及びトウモロコシといった植物（ただしこれらに制限されるわけではない）の中に存在する。
【００７２】
補助的特定
レプリキンのサブタイプを分類できるようにするため、基本的な「３点認識」必要条件に対して（ａ）癌細胞タンパク質（例えば形質転換タンパク質Ｐ２１Ｂ（Ｋ−ＲＡＳ  ２Ｂ）肺、表２、配列番号８９）内の隣接するジ−及びポリリジン及びＴＯＬＬ様レセプタ内のその他の隣接するジアミノ酸の共通の出現といったような構造的根拠に基づく、又は（ｂ）例えば表２に見られるようなＡＴＰアーゼ、チロシンキナーゼ又は酸化還元活性を示す機能的根拠に基づく付加的な又は「補助的特定」を付加することができる。
【００７３】
機能的誘導体
本明細書で記述されているレプリキンの「機能的誘導体」は、レプリキンに特異的な抗体との免疫学的交叉活性の少なくとも一部分を保持するレプリキンのフラグメント、変異体、類似体又は化学的誘導体である。レプリキンペプチドのフラグメントは、分子のあらゆるサブセットを意味する。変異体ペプチドは、例えば当該技術分野において周知の方法を用いて直接的化学合成によって作ることができる。レプリキンの類似体とは、全タンパク質又はそのフラグメントのいずれかに実質的に類似した非天然タンパク質を意味する。レプリキンの化学的誘導体は、通常ペプチド又はペプチドフラグメントの一部でない付加的な化学的部分を含有している。
【００７４】
レプリキン及び複製
図２に見られるように、細胞複製速度が上昇する嫌気性呼吸の間、マリグニンが富化される。すなわち、マリグニンは、細胞数及び合計膜タンパク質の増大に正比例して増加することがわかっているだけでなく、休止時の３％から始まって合計膜タンパク質の３０％に達して、濃度が１０倍も富化される。神経膠腫細胞複製に伴うレプリキン濃度の顕著な増加のこの明白な実証は、さまざまな生体内で３点認識法で同定されたレプリキンの存在を提示し、これと一貫性のあるものである。例えば、レプリキンは、「Saccharomyces cerevisiae複製結合タンパク質」（配列番号２）（ｈｓｉｋｒｅｌｇｉｉｆｄｋ）；「トウモロコシ条斑ウイルスの複製関連タンパク質Ａ」（配列番号８）（ｋｙｉｖｃａｒｅａｈｋ）及び（配列番号９）（ｋｅｋｋｐｓｋｄｅｉｍｒｄｉｉｓｈ）；「Staphylococcus aureusの複製関連タンパク質」（配列番号１０）（ｋｋｅｋｔｔｈｎｋ）；「ウシヘルペスウイルス４のＤＮＡ複製タンパク質」（配列番号１１）（ｈｋｉｎｉｔｎｇｑｋ）；及び「Ｍｅａｌｉｇｒｉｄヘルペスウイルス１複製結合タンパク質」（配列番号１２）（ｈｋｄｌｙｒｌｌｍｋ）といったようなタンパク質中で同定された。トマト縮葉病ジェミニウイルスについての先行研究は、ウイルス蓄積の調節には、ウイルス複製中の葉ＤＮＡ及びその他の複製タンパク質分子に対するそのウイルスの「複製タンパク質」のアミノ酸１−１６０の結合が関与するということを示している。この配列の分析は、この「複製タンパク質」のアミノ酸１〜１３５が２０．７といったような高いレプリキン計数（濃度）を含有することを示した（トマト縮葉病ジェミニウイルスについての節を参照のこと）。
【００７５】
表２は、レプリキン含有タンパク質も同様に頻繁に酸化還元機能及びタンパク質合成又は伸長並びに細胞複製と関連しているということを示している。金属ベースの酸化還元機能との関連、嫌気性複製中のレプリキン含有神経膠腫マリグニン濃度の富化及び低濃度（ピコグラム／細胞）での抗マリグニンの細胞毒性（図４Ｃ〜４Ｆ）は全て、レプリキンが、中枢性呼吸生存率関数に関連づけされ、非レプリキンアミノ酸の特徴である突然変異に付されることが少ないということがわかった、ということを示唆している。
【００７６】
インフルエンザ流行におけるレプリキン
特に興味深いことに、１００個のアミノ酸につき少なくとも１つのレプリキンが、検査されたインフルエンザウイルスの個々の株のうちのほぼ全ての株の血球凝集素タンパク質の中に存在することがわかるということが観察された。アミノ酸配列データが入手可能である各年について（１９０２〜２００１年）、インフルエンザウイルスの４つの優勢な株、インフルエンザＢ型、Ｈ１Ｎ１型、Ｈ２Ｎ２型及びＨ３Ｎ２型の各々の分離株の血球凝集素タンパク質の中で発生すると観察されたレプリキン配列が、表３、４、５及び６で示されている。
【００７７】
濃度及び種類、すなわち観察されたレプリキンの組成は、インフルエンザ世界的流行及び地域的流行の発生に関係することが発見された。インフルエンザウイルスにおけるレプリキンの濃度は、前世紀、すなわち１９００〜２００１年にわたる人及び動物蓄積からの世界的に単離されたインフルエンザ株のための国立医学図書館「PubMed」データベースに公開される赤血球凝集素アミノ酸配列を視覚的にスキャンすることにより調査した。その後これらのレプリキン濃度（１００個のアミノ酸あたりのレプリキンの数、平均値＋／−ＳＤ）を各株についてプロットした。
【００７８】
レプリキンの濃度は、インフルエンザ世界的流行及び地域的流行の発生に直接関係することが発見された。レプリキンの濃度は、図７に示されるとおり、インフルエンザＢ赤血球凝集素及びインフルエンザＡ株、Ｈ１Ｎ１において見出され、そしてレプリキンの濃度は、図８に示される２つのほかの一般的なインフルエンザウイルスＡ株、Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２において発見された（Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２）。図８中のデータはまた、成分レプリキン（Ｈ３Ｎ２（Ｒ））により明らかなように、インフルエンザウイルスの新規な新興株を示す。
【００７９】
各インフルエンザＡ株は、１９１８、１９５７及び１９６８年のそれぞれにおける大流行に起因する。図７及び８中のデータは、試験された４つの一般的なインフルエンザウイルスの全ての単離物のインフルエンザ赤血球凝集素タンパク質のそれぞれにおいて、１００個のアミノ酸あたりすくなくとも１つのレプリキンが存在することを示し、複製の生存レベルの維持におけるレプリキンのための機能を示唆する。１９９０年代において、Ｈ３Ｎ２株の減退中、Ｈ３Ｎ２の多くの単離物中にレプリキンは存在しなかったが、Ｈ３Ｎ２単離物中には高濃度の新規なレプリキンが見られ、これはＨ３Ｎ２（Ｒ）株の発生を規定する。表３、４、５及び６を参照のこと。
【００８０】
【表４】
2008539164.tif 000007
【表５】
2008539164.tif 000008
１．インフルエンザＢ型は、ヒトにおけるいかなる世界的流行の原因でもなかった。
２．年号の略号：例えば「４３」＝１９４３年、「０１」＝２００１年。
３．一定の与えられたレプリキンが現われた最初の年は、そのレプリキンが発見された一連の年の始めに示されている。
４．重複するレプリキン配列は別に列挙される。
５．下線の付された、１９７７年の地域的流行の前２年以内の、複数年にわたり不在であったレプリキンの復帰は、合計レプリキン濃度（レプリキン計数＝１００個のアミノ酸残基あたりのレプリキン数）の増加と相関関係をもつ。図７参照。
【００８１】
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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１．インフルエンザＨ１Ｎ１型は、１９１８年のヒトにおける世界的流行の地球規模の分布の原因であった。
２．年号の略号：例えば「９６」＝１９９６年。
３．一定の与えられたレプリキンが現われた最初の年は、この研究作業においてはそのレプリキンが発見された一連の年の始めに示されている。
４．重複するレプリキン配列は別に列挙される。
５．（下線の付された）例えば１９１８年及び１９７７年の地域的流行年に、新しいレプリキン構造の数の増加が起こり、このことは合計レプリキン濃度（１００個のアミノ酸残基あたりのレプリキン数）の増加と相関関係をもつ。図７参照。
【００８２】
【表１１】
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【表１２】
2008539164.tif 000015
１．インフルエンザＨ２Ｎ２型は、１９５７年のヒトにおける世界的流行（地球規模分布）の原因であった。
２．年号の略号：例えば「５８」＝１９５８年。
３．一定の与えられたレプリキンが現われた最初の年は、この研究作業においてはそのレプリキンが発見された一連の年の始めに示されている。
４．重複するレプリキン配列は別に列挙される。
５．（下線の付された）例えば１９５７年及び１９６５年の地域的流行の年に、新しいレプリキン構造の数の増加が起こり、このことは合計レプリキン濃度（１００個のアミノ酸残基あたりのレプリキン数）の増加と相関関係をもつ。図８参照。
【００８３】
【表１３】
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【表１４】
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１．インフルエンザＨ３Ｎ２型は、１９６８年のヒトにおける世界的流行（地球規模分布）の原因であった。
２．年号の略号：例えば「７７」＝１９７７年。
３．一定の与えられたレプリキンが現われた最初の年は、そのレプリキンが発見された一連の年の始めに示されている。
４．重複するレプリキン配列は別に列挙される。
５．（下線の付された）例えば１９７５年といった年において、新しいレプリキン構造の数の増加が起こり、このことは、合計レプリキン濃度（１００個のアミノ酸残基あたりのレプリキン数）の増加と相関関係をもつ。図８参照。
【００８４】
図７及び図８では、レプリキン濃度のいくつかの特性が、４種のインフルエンザウイルス株全てに共通であることがわかる。第１に、濃度は何年にもわたり周期的であり、上昇及び下降の単一サイクルが２〜３０年の周期にわたって起こっている。この上昇及び下降は、血球凝集素及びノイラミニダーゼ分類による個々のインフルエンザウイルス株の優位の既知の増強及び減弱と一貫性をもつ。第２に、世界的流行の原因であることがすでに示された各々のインフルエンザウイルス株のピークのレプリキン濃度は、世界的流行の３年各年に特定的かつ個別的に関係することが観察された。例えば、インフルエンザウイルス株Ｈ１Ｎ１が原因であることが示された１９１８年の世界的流行については、Ｈ１Ｎ１中のレプリキンのピーク濃度が独立して発生した（Ｐ１）；Ｈ２Ｎ２が新興し原因であることが示された１９５７年の世界的流行については、Ｈ２Ｎ２中のレプリキンのピーク濃度が発生した（Ｐ２）；そしてＨ３Ｎ２が新興しその原因であることが示された１９６８年の世界的流行については、Ｈ３Ｎ２中のレプリキンのピーク濃度が発生した（Ｐ３）。第３に、上述の３つの世界的流行の各々の直後の各年においては、特定のレプリキン濃度が顕著に減少し、これは恐らく各ケースにおいて生成された広く分布した免疫性を反映している。かくして、この世界的流行後の衰退は、自らが原因であった世界的流行（Ｐ１）の直後のＨ１Ｎ１に特異的であり、その時点での全ての株の一般的特性ではない。インフルエンザＢ型の中のレプリキン濃度の増加は、例えば共に最高の死亡率をもつインフルエンザＢ型の世界的流行に結びつけられた１９５１年のＥＢ１及び１９７６年のＥＢ２といったＨ１Ｎ１中のレプリキン濃度の減少と同時にくり返し発生した。（Stuart-Harris et al., Edward Arnold Ltd.（１９８５）。第４に、濃度の１次ピーク増加を超えた２次ピーク濃度が、３つの世界的流行の各々の１５年後に発生しており、この２次ピークには１つの世界的流行が随伴していた。すなわち、Ｈ１Ｎ１「地域的流行」年（Ｅ１）において１９１８年の世界的流行から１５年後；Ｈ２Ｎ２「地域的流行」年（Ｅ２）において１９５７年世界的流行の８年後；及びＨ３Ｎ２「地域的流行」年（Ｅ３）において１９６８年の世界的流行から７年後に起こった。特定のレプリキンのこれらの２次ピーク濃度は、該株の回復を反映し得る。第５に、各々の株の特定的レプリキン濃度のピークは、往々にして、１つ又は両方のその他の株のレプリキン濃度の減衰に付随すると思われ、宿主部位に対する株間の競争を示唆している。第６に、３５年（Ｈ２Ｎ２）から６０年（インフルエンザＢ型）の周期にわたり各株のレプリキン濃度が減衰する明白な全体的傾向が存在する。この減衰は、インフルエンザワクチンの一般的使用に先立つ１９４０年〜１９６４年のインフルエンザＢ型の場合に明らかであったことから、ワクチンの影響のせいにすることはできない。インフルエンザＢ型の場合、減衰からのレプリキンの回復は１９６５年以降に発生していることがわかるが、レプリキン濃度は１９９７年と２０００年の間で再び衰退した（図７）。これは、最近のケースの分離株におけるインフルエンザＢ型の低い発生と相関関係をもつ。Ｈ１Ｎ１��の再出現及び流行と合わせて、Ｈ１Ｎ１レプリキン濃度は１９７８年〜１９７９年にピークに達し、その後、Ｈ１Ｎ１の世界的流行と同時に１９９６年にピークに達した（図７）。Ｈ１Ｎ１レプリキン濃度も同様に１９９７年と２０００年の間で減衰し、Ｈ１Ｎ１株の存在は、これらの年の間に得られた分離株において減少した。Ｈ２Ｎ２レプリキンについては、３５年の減衰からの回復は起こっておらず（図８）、これは、最近の分離株にＨ２Ｎ２が不在であることと相関関係をもつ。Ｈ３Ｎ２については、数多くの分離株のレプリキン濃度は１９９６年〜２０００年の間にゼロまで降下したが、その他のＨ３Ｎ２分離株はレプリキン濃度の有意な鋭い増加を示した。このことは、本明細書でＨ３Ｎ２（Ｒ）と呼ばれているＨ３Ｎ２の亜株の新興を示している。
【００８５】
図７及び図８は、レプリキン濃度がピークに達する前に１〜３年の段階的増加が頻繁に観察されることを実証している。この段階的増加は、レプリキンピークと同時に発生する地域的流行の発生に先行する。かくして、特定の株の濃度の段階的増加は、この特定の株が地域的流行又は世界的流行をひき起こす確率の最も高い候補であることのシグナルである。
【００８６】
現在、インフルエンザウイルスのＨ３Ｎ２（Ｒ）株のレプリキン濃度は増大している（図８、１９９７〜２０００年）。Ｈ３Ｎ２レプリキン濃度の３つの類似した先行ピーク増加が、該株が最初に新興した１９６８年のＨ３Ｎ２ベースの世界的流行（図８）及び１９７２年と１９７５年のＨ３Ｎ２ベースの地域的流行（図８）において発生したということがわかる。これらの世界的流行及び地域的流行の各々に、過大な死亡率が付随した（Ailing et al., Am. J. Epidemiol., １１３（１）：３０−４３（１９８１））。従って１９９７〜２０００年におけるＨ３Ｎ２レプリキンのＨ３Ｎ２（Ｒ）亜種の濃度の急速な上昇は、近づきつつある重大な地域的流行又は世界的流行の早期警告を統計的に表わしている。Ｈ３Ｎ２の地域的流行は２０００年にロシアで発生し（図８、Ｅ４）、２００１年１２月のＣＤＣ報告書は、現在、Ｈ３Ｎ２が世界中のインフルエンザウイルスの最も高頻度で単離された株であると述べている。（罹患率と死亡率週間報告（ＭＭＷＲ）、病害対策センター；５０（４８）；１０８４−６８（２００１年１２月７日）。
【００８７】
インフルエンザウイルスの世界的流行又は地域的流行の各ケースにおいて、新しいレプリキンが新興している。一定の与えられた分離株内の一定の与えられた血球凝集素中の同じレプリキンのうちの２つについての観察は全く存在していない。新しいレプリキンの新興が、どのような程度でもう１つの動物又は鳥類のプールからのトランスファ又は突然変異を表わしているかの関係はわかっていない。一部のケースでは、毎年もとのレプリキン構造のうちの１又は複数ののものが保存され、それと同時に新しいレプリキンが新興している。例えばインフルエンザウイルスＢ型血球凝集素の中では、５つのレプリキンが１９１９年と２００１年の間で恒常的に保存されており、一方２６のレプリキンが同じ期間中にやって来ては去っている（一部は数年の不在の後再発した）。特定のレプリキン構造の消滅と何年も後の再興は、レプリキンが新規の突然変異を通してではなくもう１つのウイルス宿主プールから戻るということを示唆している。
【００８８】
Ｈ１Ｎ１レプリキンの場合、１９１８年の世界的流行に付随するＰ１ピーク内に存在する２つのレプリキンは、１２の新しいレプリキンを含む１９３３年の回復Ｅ１ピークには存在しなかった。従って、恒常的に保存されたレプリキンは、単独又は組合せた形のいずれであれ、ワクチンのための最高の選択肢である。しかしながら、１年の濃度増加に随伴する最近現われたレプリキンでさえ、頻繁に存続しさらに１年以降増加し、結果的に濃度ピーク及び地域的流行となり、かくして合成レプリキンでワクチン接種するための早期警告と時機の両方を提供する（例えば、１９９０年代初頭のＨ１Ｎ１、図７を参照のこと、同様に例えばＨ５Ｎ１、１９９５〜２００２年、図１１も参照のこと。「レプリキン計数」（１００個のアミノ酸あたりのＰＲＫ数）はレプリキン濃度を意味する）。
【００８９】
図７、８、１１及び１５中のデータは、インフルエンザタンパク質配列内の特定のレプリキンの存在及び濃度と、インフルエンザの世界的流行及び地域的流行の発生の間の直接的関係を実証している。かくして、レプリキンの存在及び濃度についてのインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質配列の分析は、インフルエンザの世界的流行及び／又は地域的流行の予測判断材料並びにインフルエンザワクチン処方のための標的を提供する。このデータを参照すると、以前は来たるインフルエンザの流行期に優勢となると思われる株の予測及びワクチン用の全ウイルス株のその年用混合物の考案を可能にする株特異的化学構造は知られていなかったということが注目に値する。
【００９０】
株特異的地域的流行の発生の１〜３年前のインフルエンザグループ内の株特異的レプリキン計数の増加という発見事実と同様に、コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質のレプリキン計数の増加も同定されてきた。コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質のレプリキン計数は、以下の通りに増加した。１９９９年に３．１（±１．８）；２０００年に３．９（±１．２）；２００１年に３．９（±１．３）；及び２００２年に５．１（±３．６）。この世界的流行の前の増加は、コロナウイルスが現在の（２００３年）ＳＡＲＳの世界的流行の原因であるという発見事実を裏づけている。（表７参照）。
【００９１】
かくして、レプリキン構造及びレプリキン計数を監視することで、インフルエンザ及びコロナウイルス株の両方に観察されているような１９１７〜１９１８年のガチョウレプリキン及びその修飾された随伴するレプリキンに対する合成の株特異的な予防的ワクチン接種及び抗体治療の開発手段が提供される。
【００９２】
図１０は、１９６２年〜２００３年に収集された分離株についてタンパク質配列が入手可能であるヌクレオカプシドコロナウイルスタンパク質の自動化されたレプリキン分析を描いている。各々個々のタンパク質は、受入れ番号によって表わされ、レプリキンの存在について分析されている。レプリキン計数（１００個のアミノ酸あたりのレプリキン計数）は、自動化されたレプリキン分析の一部として自動的に計算される。各年について、その年の全てのレプリキン計数に関して、平均（±標準偏差（Ｓ．Ｄ．））レプリキン計数が自動的に計算される。特定のウイルス株（コロナウイルス）中の特定のタンパク質（ヌクレオカプシドタンパク質）の地域的流行以前のこの早期複製増加警報は、インフルエンザの地域的流行及び世界的流行に先立つインフルエンザウイルスの株内に見られる増加に匹敵する（図７、８、１１及び１５）。レプリキン計数が、２００２年の終りに新興し２００３年内まで持続したＳＡＲＳのコロナウイルスペプチドＤと一貫して１９９９〜２００２年まで上昇したということがわかる。図９は、１９１７年から２００２年までのコロナウイルスヌクレオカプシドレプリキンを含め、複数のウイルス株についてのレプリキン計数のグラフを提供している。
【００９３】
【表１５】
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【表１６】
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【表１７】
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【００９４】
１９１８年の世界的流行のレプリキンにさかのぼったＳＡＲＳ及びＨ３Ｎ２−福建型インフルエンザウイルスレプリキン
ＳＡＲＳウイルスの起源はいまだに不明である。我々は、或る種のＳＡＲＳウイルスペプチドが、２００２年からのインフルエンザウイルス分離株のいくつかの株内の相同なペプチドを通して、２０００万人を超える死亡の原因となった１９１８年のインフルエンザの世界的流行の株内の１つの配列にまでさかのぼることができるものであることの証拠を報告する。
【００９５】
前世紀を通して記録されたインフルエンザウイルス及びその他の微生物の一次タンパク質配列の定量分析によって、我々は、生体のタイプ（例えば表１）ではなくむしろ高速複製の現象自体及び地域的流行に関連づけされる、リジン及びヒスチジンが豊富な新しい種類のペプチド構造を発見し、それをレプリキンと命名した。我々は、７〜５０個のアミノ酸中の少なくとも２個のリジン６〜１０残基離隔、リジン濃度６％以上、１ヒスチジン、という義務的アルゴリズムをもつ新しい種類のペプチド構造を発見した。これらのペプチドは、高速複製現象及び地域的流行に関係しているため、我々はこれらをレプリキンと命名した。我々は、血球凝集素タンパク質中の株特異的レプリキン濃度（レプリキン計数＝１００個のアミノ酸あたりのレプリキン数）とインフルエンザの地域的流行及び世界的流行の量的相関関係を発見した（図７）。株特異的ウイルスタンパク質の化学的性質とインフルエンザの地域的流行の相関関係はこれまで全く報告されていない。レプリキン構造の保存、縮合及び濃縮は同様に、インフルエンザ（表７ａ中）、ＨＩＶ及びマラリアにおいても発見された。ＳＡＲＳコロナウイルス中のレプリキンの検出は、その考えらえる進化の追跡に加えて、ワクチン用の小さいＳＡＲＳ抗原の合成を可能にした。
【００９６】
我々は、インフルエンザの地域的流行と、１９１８年、１９５７年及び１９６８年における前世紀の３つの世界的流行とのインフルエンザ血球凝集素タンパク質中の株特異的レプリキン濃度（計数）の量的相関関係を発見した。これら３つの世界的流行の各々について類似の経過が観察された。すなわち、株特異的高レプリキン計数の後、直ちに衰退が続き、その後、地域的流行が随伴する「リバウンド」増加が発生した。同様に、１〜３年の警告的計数増大が大部分の地域的流行に先行していた。
【００９７】
我々は、１９１７年にガチョウから単離されたインフルエンザウイルスの血球凝集素中のレプリキン（我々はこれをガチョウレプリキンと命名した）が、ｋｋｇ（ｔ／ｓ）ｓｙｐｋｌｓｋｓｙ（ｔ／ｖ）ｎｎｋｇｋｅｖｌｖｌｗｇｖｈｈという２つの置換のみを伴って、１９１８年の世界的流行の原因であるインフルエンザのＨ１Ｎ１株の中に翌年現われていることを発見した。表７ａは、インフルエンザ１９１７ガチョウレプリキン（ＧＲ）がこのとき、多数の小さい置換及びその他のインフルエンザ株への明白な転座にもかかわらず、基本的に８５年間保存されていたことを示している。我々は、１９１７年インフルエンザＧＲが、Ｈ１Ｎ１（１９１８年の世界的流行）、Ｈ２Ｎ２（１９５７〜５８年の世界的流行）、Ｈ３Ｎ２（１９６８年の世界的流行、２０００年の中国及びロシアでの地域的流行、２００３年の福建型株の地域的流行）及びＨ５Ｎ１（１９９７年の中国での地域的流行）に現われた、複数のインフルエンザ株の間で明白な移動性を示したということを発見した。１９９７年に、その構造は、Ｈ１Ｎ２内で正確にその１９１８年の構造ｋｋｇｓｓｙｐｋｌｓｋｓｙｖｎｎｋｇｋｅｖｌｖｌｗｇｖｈｈまで回復された。
【００９８】
ＳＡＲＳコロナウイルスはまず最初に２００２〜２００３年のインフルエンザの流行期に出現した。インフルエンザＧＲ及びコロナウイルスレプリキン（又は一部の未知の共有前駆体）からのＳＡＲＳレプリキンの２００２年における２重の起源は、全て２００２年に発生したものである以下の事象により示唆されている：１）８５年間で最初の縮合が、ＧＲ−Ｈ１Ｎ２レプリキン配列内で２９〜２８アミノ酸に見られる（表７ａ）（類似の縮合が、現地域的流行においては、福建型Ｈ３Ｎ２内で２９〜２７アミノ酸に見られた〔表７ａ〕）；２）ＧＲ−Ｈ１Ｈ２のレプリキン計数は、Ｈ１Ｈ２から外に移動するＧＲと一貫した顕著な衰退を示した；３）コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質のレプリキン計数は顕著な増大を示した；そして４）以下のモチーフを含むレプリキンを伴って２００２〜２００３年にＳＡＲＳコロナウイルスが出現した：ＧＲ１９１８及びＧＲ−Ｈ１Ｎ２  ２００１で先に見られた「ｋｋｇ」及び「ｋ−ｋ」；インフルエンザＧＲ−Ｈ１Ｎ２  ２００１に見られた「ｋ−ｋｋ」、「ｋｋ」及び「ｋｌ」；鳥類気管支炎コロナウイルスレプリキンの中に見られる「ｋｋ」；及びブタ伝染性下痢症のレプリキン内に見られる「ｋｋ−ｋｋ−ｋ」、「ｋ−ｋ」、「ｋｋ」、「ｋｌ」及び「ｋｔ」（表７ａ）（ＳＡＲＳは、糞便汚染という強力な下支えのあった密集共同住宅内で噴出しその後換気扇によって空気で運ばれた伝染性肺炎としてヒトにおいて最初に出現したと考えられている）。
【００９９】
【表１８】
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【０１００】
近年さらに増大を続けている１９１７年ガチョウレプリキン（図７）の存在を含む高いレプリキン計数ピークは、現在はＨ１Ｎ２（表７ａ）内での１９１７年のレプリキン計数に近づきつつあり、高い死亡率を伴うものとして表７及び７ａ内に示されているガチョウレプリキンの短いレプリキン誘導体の現在のキャリヤがＳＡＲＳウイルス及びＨ３Ｎ２−福建型ウイルスであることから、すでに始まってしまっている可能性のある来たる世界的流行の警告であり得る。
【０１０１】
ガチョウレプリキンは、インフルエンザ及びＳＡＲＳのＡ株の大部分及び全てが関与する少なくとも８５年間の歴史を有することから、それとその構成成分は、汎株保護のための保存ワクチン候補である。長さ７〜２１アミノ酸で、ガチョウレプリキンに比べてリジン及びヒスチジンの％が富化された縮合短ＳＡＲＳレプリキンが、長さ２９アミノ酸のガチョウレプリキンのもの（２．５％）と比べてさらに高いＳＡＲＳ死亡率（１０〜５５％）と付随して発生した。ここではＳＡＲＳにおいて長いレプリキンと混合された短レプリキンは、高い死亡率の原因でありうる。これは、エボラ及び天然痘ウイルス及び炭疽菌といったその他の生体のレプリキンにもあてはまる（表７ａ）。これらの短いＳＡＲＳレプリキンは、さらに一層高い未治療死亡率が付随する天然痘、炭疽菌及びエボラといったその他の生体の短いレプリキンと驚くべき相同性を示した。
【０１０２】
短合成ワクチンは、はるかに迅速に産生され（月単位ではなく日単位）かつはるかに安価である以外に、現行の全ウイルスワクチン全般における望まれない何千ものタンパク質の多重エピトープによって生み出される免疫学的干渉及び汚染に付随する副作用が回避されるはずである。インフルエンザについては、あらゆるケースにおいて現行の全ウイルスワクチンは、高齢者の半数以上において有効でない。しかし、短レプリキンは充分な免疫原性をもつのだろうか？短神経膠腫レプリキン「ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ」は、合成抗多形性グリア芽腫及び抗気管支原性癌ワクチンを首尾よく入手するための基礎原料であることが証明された。それは、ピコグラム／細胞単位で癌細胞に対する細胞毒性をもち、癌患者の生存率に量的に関係する抗マリグニン抗体を産生した。２００年のコロナウイルスヌクレオカプシドレプリキン計数に見られた急上昇を理由として再発する確率が高いと思われるＳＡＲＳ攻撃に備えるために、我々は、ヌクレオカプシド、スパイク及び外被タンパク質の中に見られる４つのＳＡＲＳ短レプリキンを合成した。我々は、これらの合成短ＳＡＲＳレプリキンがウサギに注射された時点で同じく豊富な特異的抗体を産生することを発見した。例えば、２１アミノ酸のＳＡＲＳヌクレオカプシドレプリキン抗体は、２０４，８００中１より大きい希釈度で結合する。さまざまな小さいペプチドを用いて、天然痘の場合のような何千ものタンパク質又は核酸又は全タンパク質で得られる望ましくない副作用無く強い免疫応答を達成しようとするその他の研究者による以前の試みが失敗してきたため、強い免疫応答を達成する小さい合成レプリキン抗原の能力は、これらのＳＡＲＳワクチンの効力にとって有意である。
【０１０３】
我々は、インフルエンザ及びＳＡＲＳウイルス内のレプリキン構造と死亡率の増加の関係を調査し、表７に示した通りの結果を得た。短い又は縮合されたレプリキン配列に対する高い死亡率の関係は、インフルエンザとＳＡＲＳ以外のウイルス及び細菌、マラリア及び癌において、表７のセクションＢに示された高死亡率の生体内で見られる。複製が伝播及び病原性にとって重大である広範囲のウイルス、細菌、マラリア及び癌生体の中での基本的レプリキン構造の普及に加えた、いずれかの細胞型又は感染性生体ではなくむしろ高速複製に対するレプリキンの関係とレプリキン構造を統合した概念を裏づけるものとして、以下の相同な配列が観察された。位置１及び２における「ｋ」；取込みのため又は高速複製を刺激するためＤＮＡ、ＲＮＡ又はその他のレセプタ又はリガンドに対して提示されることになる「ｋ」のアラインメント；「２重ｋ」及び「多重ｋ」の頻度；天然痘ウイルス、炭疽菌ウイルス、ラウス肉腫ウイルス及び多形性グリア芽腫（神経膠腫）といったさまざまな最高死亡率の生体、癌細胞及び遺伝子に結びつけられた最も縮合した短縮レプリキン内のトリプレット「ｋｋｇ」、「ｈｅｋ」、「ｈｄｋ」及び「ｈｋｋ」、結腸及び乳癌内のｃ−ｓｒｃ及び黒色腫及び結腸癌内のｃ−ｙｅｓの発生及び位置３における「ｇ」の頻度に留意のこと。同様にオーストラリア及び東南アジアにおける２つの最近新興している高死亡率のウイルス、Nipab 及びHandrahウイルスのためのほぼ同一のレプリキン構造にも留意されたい。これらの２つのウイルスは、それらに対して形成された類似の又は同一の抗体を有することが報告されているが、今までのところ、この類似の抗体について、その２つのほぼ同一のレプリキンについての我々の発見事実と共に、これについての構造的根拠は全く知られていない。
【０１０４】
表７は同様に、１９１７年のインフルエンザガチョウレプリキン及び２つのコロナウイルスすなわち鳥類気管支炎コロナウイルス及びブタ伝染性下痢ウイルスの両方に対する、我々が発見した２００３年の５つのＳＡＲＳレプリキンの関係を示している。表７中の最初の２００３年ヒトＳＡＲＳレプリキンは、２００２年におけるインフルエンザＨ１Ｈ２の中間的構造を通して、インフルエンザウイルスガチョウ１９１７とヒト１９１８レプリキンに対するいくつかの配列相同性を示す（例えば、位置１、１８及び１９におけるレプリキン「ｋ」を参照）。１９１７ガチョウレプリキン配列は表７において、１９９９までのレプリキンの画定にとって重要でないアミノ酸における数多くの置換（置換はイタリック体で示されている）にも関わらず、大幅に保存されてきたことがわかる。このとき、もとの２９アミノ酸１９１７レプリキン配列は、２００１Ｈ１Ｎ２レプリキン内でその１９１７−１９１８年の構造までほぼ正確に回復してきたことがわかった。しかしながら、２００２Ｈ１Ｎ２インフルエンザレプリキンは、２９から２８アミノ酸まで短縮されており、アミノ酸ｋｅｖｌ（ｉ／ｖ）ｗｇ（ｖ／ｉ）ｈｈの「左へのシフト」は明白である。
【０１０５】
２００３年には、１つのレプリキンは、最初に列挙された２００３ヒトＳＡＲＳウイルスの２１アミノ酸のレプリキンまでさらに短縮（又は圧密）された。２００３ＳＡＲＳレプリキンのｋの％は現在、ガチョウレプリキン及び１９１８ヒトにおける世界的流行レプリキンの２０．７％に比べ３８．１％（８／２１）である。インフルエンザ２９アミノ酸レプリキンに比較して、３つのＳＡＲＳレプリキンは、それぞれ１９、１１及び９アミノ酸長配列までさらに短縮（又は圧密）されていることがわかった。示されたＳＡＲＳ９アミノ酸配列においては、ｋの％は４４．４％（４／９）である。ＳＡＲＳレプリキンの短縮に伴って、ＳＡＲＳのヒトにおける死亡率は、１９１８インフルエンザの世界的流行における２．５％の死亡率に比べ、若者で１０％、高齢者で５５．５％まで上昇した。
【０１０６】
アミノ酸配列は、その証拠が１９１７ガチョウレプリキンにおいて最初に観察されたインフルエンザレプリキンの８５年間（１９１７〜２００２年）にわたる保存及び相同性の度合を強調するように表７に示されている。それまでにこのような保存が観察されたことは全くない。表７は同様に、２００３ヒトＳＡＲＳウイルス内のレプリキンが、１９１７ガチョウレプリキン及び１９１８ヒトにおける世界的流行インフルエンザレプリキンとしてまず最初に現われたインフルエンザレプリキンに対する相同性を有することに加えて、コロナウイルス鳥類気管支炎ウイルスレプリキン（例えば位置１及び２の「ｋ」、「ｈ」で終る）及びコロナウイルス急性下痢ウイルスレプリキン（例えば位置１及び１１の「ｋ」、レプリキンの終りの「ｈ」）の両方に対する或る配列相同性を示すことを例示している。インフルエンザ及びコロナウイルスの両方のレプリキンに対する関係のこの証拠は、ＳＡＲＳの最近のいくつかのインフルエンザの地域的流行及びそれ以前の世界的流行と同様に香港で発生し、ＳＡＲＳウイルスがヌクレオカプシド、スパイク及び外被タンパク質を含め一部にはその構造のために新しいコロナウイルスとして分類されてきたことから、有利なものである。或る種の疫学的証拠も同様に、ＳＡＲＳが糞便汚染という強力な下支えであった密集した香港の共同住宅内で噴出し換気扇によって空気で運ばれた伝染性肺炎としてヒトにおいて最初に出現したという点で、関連性がある。
【０１０７】
インフルエンザウイルスＢ型の株内のレプリキンの組成：  この株内で同定された合計２６のレプリキンのうち（表３）、以下の１０のレプリキンが、１９４０〜２００１年に調査された全てのインフルエンザＢ型分離株の中に存在している。重複するレプリキン配列は別途列挙されている。「３点認識」と一貫性ある相同性を実証するため、リジン及びヒスチジンは太字になっている。
【化２】
2008539164.tif 000022
【０１０８】
表３及び４は、Ｈ１Ｎ１プリキンと比べ、インフルエンザＢ型血球凝集素にはレプリキン構造のはるかに大きい安定性が存在すると思われるということを示している。インフルエンザＢ型は、いずれかの世界的流行の原因となったことはなく、動物又は鳥類レゼルボアをもたないように思われる（Stuart-Harris et al., Edward Arnold Ltd., London（１９８５））。
【０１０９】
時間におけるインフルエンザ中のレプリキン
インフルエンザＨ１Ｎレプリキン；この株が初めて現われその年の世界的流行をひき起こした１９１８年から、２０００年に至るまで配列が入手可能である全てのＨ１Ｎ１分解株の中に、１つのレプリキン「ｈｐ（ｖ/ｉ）ｔｉｇｅｃｐｋｙｖ−（ｒ/ｋ）（ｓ/ｔ）（ｔ/ａ）ｋ」のみが存在する（表４）。（「（ｖ/ｉ）」は、アミノ酸ｖ又はｉが異なる年に同じ位置に存在することを表わしている）。Ｈ１Ｎ１は１つの存続するレプリキンしか含有していないものの、Ｈ１Ｎ１はインフルエンザＢ型よりもさらに多産であると思われる。Ｈ１Ｎ１上には８２年間で９５の異なるレプリキン構造が存在するが、一方インフルエンザＢ型分離株の６２年間では３１の異なるレプリキンしか存在しない（表４）。新しいレプリキン構造の数の増加は、地域的流行の年に発生し（表３、４、５及び６）、合計レプリキン濃度の増加と相関関係をもつ（図７、８、１１及び１５）。
【０１１０】
インフルエンザＨ２Ｎ２レプリキン：  インフルエンザＨ２Ｎ２は、１９５７年のヒトにおける世界的流行の原因であった。１９５７年についてその株の中で同定された２０のレプリキンのうち３つが、１９９５年までＰｕｂＭｅｄ上での検査のために利用可能であったＨ２Ｎ２分離株の各々の中に保存されていた（表５）。
【化３】
2008539164.tif 000023
【０１１１】
しかしながら、Ｈ１Ｎ１とは対照的に、１９６１年から始まったＨ２Ｎ２の中には、１３の付加的レプリキンしか発見されなかった。新しいレプリキンの出現のこの少なさは、何年にもわたる分離株内のＨ２Ｎ２の出現及びＨ２Ｎ２レプリキンの濃度の衰退と相関関係をもつ（図８）。
【０１１２】
インフルエンザＨ３Ｎ２は、１９６８年のヒトにおける世界的流行の原因であった。１９６８年に現われた５つのレプリキンは、１９７７年以降消えたが１９９０年には再び現われた（表６）。２２年間存続した唯一のレプリキン構造は、１９７７年に最初に現われ１９９８年まで存続したｈｃｄ（ｇ/ｑ）ｆ（ｑ/ｒ）ｎｅｋｗｄｌｆ（ｖ/ｉ）ｅｒ（ｓ/ｔ）ｋであった。１９９０年中葉における１２の新しいＨ３Ｎ２レプリキンの新興（表６）は、同時のレプリキン濃度の増加（図８）及び最近の分離株中のＨ３Ｎ２株の普及とこれらの分離株のいくつかからの全てのレプリキンの同時消滅（図８）と相関関係をもち、このことは、新しい亜株Ｈ３Ｎ２（Ｒ）の新興を示唆している。Ｈ３Ｎ２（福建型）の新しい株の２００３年１１月〜１２月の現在の地域的流行は、２００１年７月９日付けの米国仮出願ＵＳ６０／３０３，３９６号の中で最初になされたこの予測を確認している。
【０１１３】
図７、８、１１及び１５は、インフルエンザの地域的流行及び世界的流行が、その消滅から１〜５９年後の少なくとも１つのレプリキンが再出現に起因するものである。インフルエンザウイルス内のレプリキンの濃度の増大と相関関係をもつことを示している。同様に、Ａ株のみにおいて、新しい株特異的レプリキン組成物の新興が存在する（表４〜６、同様に図１１及び１５のＨ５Ｎ１についての地域的流行前の新しいレプリキン数の増加も参照のこと）。単一のタンパク質内の個々のレプリキンの反復によるレプリキン濃度の増加は、インフルエンザウイルスでは発生しないと思われるが、その他の生体では見られる。
【０１１４】
異なるインフルエンザ株の活性の変化は、それ自体、以下の２つのほとんど理解されていないプロセスのうちの１つによりもたらされる置換の産物であるインフルエンザ血球凝集素の配列変化に関係づけられると考えられている。すなわちｉ）血球凝集素分子内の一連の点突然変異の蓄積に起因すると考えられる抗原連続変異、又はｉｉ）変化が非常に大きいため遺伝子の混ぜ合わせがヒト及び非ヒト宿主のウイルスの間で発生することが前提とされている抗原不連続変異、である。まず第１に、当該データは、異なるインフルエンザ株の活性の変化が、非特異的レプリキン濃度の増加に関連づけされるのではなくむしろ、株特異的レプリキンの濃度の増加及び地域的流行に付随する複製の株特異的増大に基づいているか又はそれに関係しているということを示唆している。さらに、該データは、どの配列変化が「連続変異」又は「不連続変異」に起因するか及びどれが保存、レゼルボア内の貯蔵及び再出現に起因するかについての考えられる洞察について検討された。該データは、レプリキン濃度の地域的流行関連増加が、血球凝集素あたりの既存のレプリキンの重複に起因するのではなく、その消滅から１年から最高５９年後の少なくとも１つのレプリキン組成物の再出現そしてＡ株のみにおいて新しい株特異的レプリキン組成物の新興に起因することを示している（表３〜６）。かくして、１９５１年及び１９７７年のインフルエンザＢ型の地域的流行におけるレプリキン濃度の増加は、該地域的流行の年における新しいレプリキン組成物の新興とは結びつけられず、先行する年において現われその後消滅したレプリキン組成物の再出現とのみ結びつけられる（表３）。これとは対照的に、Ａ株においては、以前に消滅したウイルスレプリキンの再出現に加えて、新しい組成物が現われる（例えば、１９９６年の地域的流行の年におけるＨ１Ｎ１では、６つのより早期のレプリキンの再出現に加えて、１０個の新しい組成物が新興した）。インフルエンザＢ型ではなくＡ株のみが非ヒト動物及び鳥類レゼルボアにアクセスできることから、完全に新しい組成物は恐らく、「３点認識」の基本的必要条件以外の新しい組成物と全く類似点が無いと思われる既存のヒトレプリキンの突然変異からではなくむしろ非ヒト宿主レゼルボアに由来する（表２−５）。Ｂ型に比べＨ１Ｎ１がより多産性であることそして世界的流行がＢ型株によってではなく３つのＡ株によってのみ生み出されたという事実は、両方共、非ヒトウイルスレゼルボアから新しいレプリキン組成物を受けとるヒトＡ株の能力の１つの関数でもあり得る。
【０１１５】
一部のレプリキンは、わずか１年間だけ現われ、消滅し、今日まで再出現していない（表３〜６）。その他のレプリキンは、１年から最高８１年間消滅し、その時点で同一のレプリキン配列が再度現われる。主要なレプリキン「ｋ」及び「ｈ」アミノ酸及びそれらの間の空間は、以下の株特異的レプリキンについて表２及び３−６に示されているように、長年にわたる特定のレプリキンの恒常的存在の間保存されている（インフルエンザＢのもの１０、Ｈ１Ｎ１の単一のレプリキン及びＨ３Ｎ２の単一のレプリキン並びに不在後の同一レプリキンの再出現について）。血球凝集素配列の残りのものの中のレプリキン構造の内側及び外側の両方でのその他のアミノ酸の顕著な交換又は置換活性にも関わらず、インフルエンザレプリキンヒスチジン（ｈ）は決して交換されることがないように思われ、リジン（ｋ）はまれにしか交換されない。この保存の例は、１９１８年と２０００年の間で恒常であるＨ１Ｎ１レプリキン「ｈｐ（ｖ/ｉ）ｔｉｇｅｃｐｋｙｖ（ｒ/ｋ）（ｓ/ｔ）（ｔ/ａ）ｋ」（配列番号１３５）、１９７５年と１９９８年の間で恒常であるＨ３Ｎ２レプリキン「ｈｃｄ（ｇ/ｑ）ｆ（ｑ、ｒ）ｎｅｋｗｄｌｆ（ｖ/ｉ）ｅｒ（ｓ/ｔ）ｋ」（配列番号２７７）及び、１９７５年に最初に現われ、２５年間消滅し次に２０００年に再度現われた「ｈｑｎ（ｓ／ｅ）（ｅ／ｑ）ｇ（ｔ／ｓ）ｇ（ｑ／ｙ）ａａｄ（ｌ／ｑ）ｋｓｔｑ（ａ／ｎ）ａ（ｉ／ｌ）ｄ（ｑ／ｇ）Ｉ（ｎ／ｔ）（ｇ／ｎ）ｋ、（ｌ／ｖ）ｎ（ｒ／ｓ）ｖｉ（ｅ／ｃ）ｋ」（配列番号２７６）の中に見られる。数多くのアミノ酸が置換されてきた一方で、約５０アミノ酸以下の６〜１０残基離隔した２つのリジン、１ヒスチジン、最低６％のリジンという基本的なレプリキン構造が保存された。
【０１１６】
完全に無作為な置換は、これらのＨ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２レプリキンの存続も、１９０２年〜２００１年のインフルエンザＢにおける１０個のレプリキン構造の存続も、７４年間の不在後の１９１９年の１８量体レプリキンの１９９３年における再出現も可能にしないと思われる。無作為なタイプの置換よりもむしろ、恒常性は、秩序立って制御されたプロセスを示唆するか又は、少なくとも、主要なレプリキンが何らかの要領で固定又は結合させられるような形でのそれらの保護を示唆している（おそらくは核酸に結合されるリジン及び恐らくは呼吸器酸化還元酵素に結合されるヒスチジン）。この保存を制御するメカニズムは現在のところわかっていない。
【０１１７】
レプリキン骨格のＨ５Ｎ１インフルエンザ保存
いくつかの国々において高死亡率であるＨ５Ｎ１「トリインフルエンザ」の近年の大流行は、期限が過ぎたインフルエンザの世界的流行の第一段階を表しうる。最近の報告は、Ｈ５Ｎ１の人から人への感染の第一の可能性において、”該ウイルス遺伝子の配列決定は、血球凝集素の受容体結合部位又は該ウイルスの他の重要な特徴において何ら変化を認識せず、すべての８つのウイルス遺伝子断片の配列は、タイにおける近年の家禽単離物由来のほかのＨ５Ｎ１配列と密接に凝集した”ことを示唆する。株発生解析は、「ヒトインフルエンザウイルスとの再集合」の不存在から、Ｈ５Ｎ１が新規の変異体ではないことを示唆した。しかしながら、我々は、このたび、最後の２つのＨ５Ｎ１流行において変化せず、そして事実１９５９年から保存されていた部位における特定のＨ５Ｎ１タンパク質配列において、３つの近年の変化を報告する。
【０１１８】
これまで、ウイルス流行及び休止と相関するタンパク質化学は存在しなかった。我々は、前世紀の３つのインフルエンザ世界的流行、Ｈ１Ｎ１、Ｎ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２のそれぞれが、高速複製に関し、レプリキンと称される、該ウイルス中のペプチドの特定のクラスの濃度における増加、リジン及びヒスチジンにおける豊富性により遡及的に予測され、そして相関した。我々は、このたび再度、１９９７年、２００１年、及び２００３〜２００４年における、３つのＨ５Ｎ１のそれぞれにおいて予測的であるレプリキンを発見した（図１５）。単離物中にこれらが現れる各年、レプリキンは、図１５のように、１００個のアミノ酸ごとに数えることができ、そしてこれらの配列は、表９のとおり分析及び比較した。レプリキンの分析は、手動で、又は本発明の好ましい観点においては、利用できる配列情報においてレプリキン濃度をカウントするために本発明者により設計されたソフトウェアにより機械的に達成することができる。
【０１１９】
３つの「トリインフルエンザ」大流行前のインフルエンザのＨ５Ｎ１株の赤血球凝集素タンパク質中のレプリキンパターンの急速な増加を示すグラフは、図１５において参照することができる。図１５のレビューは、Ｈ５Ｎ１の赤血球凝集素タンパク質中の増加するレプリキン濃度（「レプリキン計数」）が３つの「トリインフルエンザ」流行に先行したことを示す。例えば、１９９５〜１９９７年におけるレプリキン係数（平均値＋／−ＳＤ）の増加は、１９９７年の香港Ｈ５Ｎ１流行（Ｅ１）に先行した。１９９９年〜２００１年のレプリキン計数の増加は、２００１年の流行（Ｅ２）に先行した。そして２００２年〜２００４年のレプリキン計数の増加は、２００４年の流行（Ｅ３）に先行した。１９９９年の減退は、香港におけるＥ１流行に対応する家禽の大量処分により生じた。
【０１２０】
該ウイルスタンパク質中のレプリキンの総数に追加して、時間による各レプリキンの構造は有益である。表８は、１９１７年におけるインフルエンザに感染したガチョウ中で最初に観察されたレプリキン（ガチョウレプリキン）を示す。不変の長さ、アミノ末端における不変のリジン、及びカルボキシ末端におえるヒスチジン残基は、数十年間、固定された骨格において、異なる株中で保存された。ガチョウレプリキンの相同体は、１９１７年〜２００６年に、１９１８年、１９５７年、及び１９６１年のそれぞれの３つの世界的流行、Ｈ１Ｎ１、Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２に関係する株中でみられ、そしてＨ１Ｎ２、Ｈ７Ｎ７、Ｈ５Ｎ２及びＨ５Ｎ１間の更なる置換を伴う。該ガチョウレプリキンにおいて発生した一定の置換は、任意的というよりは、選択性の傾向にあり、そして数年間維持された。従って、アミノ酸置換が任意的に生じるという一般的想定にも関わらず、インフルエンザにおける全ての置換が、実際には任意的ではないようではる。数十年にわたるこのレプリキン保存は、有利的に迅速かつ安価に調製することができ、そして１年以上有効となりうる合成インフルエンザワクチンの生産を許容する。
【０１２１】
従って、合成インフルエンザワクチンの標的は、インフルエンザウイルス中の保存されたレプリキン骨格である。レプリキン骨格は、約１６〜約３０個のアミノ酸の配列を含んで成り、そして更に
（１）末端リジン
（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接残基部分におけるほかのヒスチジン
（３）少なくとも１つのほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基中の少なくとも１つのリジン；及び
（４）１６〜約３０個のアミノ酸ペプチド中の少なくとも約６％のリジン、
を含んで成る、一連の保存ペプチドを含む。
レプリキン骨格は、更に、末端リジンに直接隣接する追加的なリジンを含んでよい。「レプリキン骨格」ペプチドは、末端リジンに直接隣接する追加的なリジンを含んでよい。「レプリキン骨格」ペプチドはまた、一連の「レプリキン骨格」の個々のメンバー又は複数のメンバーを意味する。
【０１２２】
制限されずかつ好ましい合成インフルエンザワクチンの標的は、さらに約２９個のアミノ酸、及び末端リジンに直接隣接するリジンを含むインフルエンザウイルス中のレプリキン骨格であってよい。
【０１２３】
合成インフルエンザウイルスについての好ましくない標的は、約２９個のアミノ酸の第一ペプチド、及び
（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン
（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン
を含んで成り；そして
（３）いずれかの他のリジンから６〜１０個のアミノ酸残基においてリジンを含まない、インフルエンザウイルスの第一株中のエクソスケルトン骨格であってよく、
ここで、ウイルスの第一株又は他の株の早期発生検体は、約２９個のアミノ酸のレプリキン骨格を含んで成る。
【０１２４】
１９９７年のＨ５Ｎ１香港流行においてヒトの死亡率は約２７％であった。２００４年には、アジアでＨ５Ｎ１に感染されたことが報告された５２人のうち約７０％が死亡した。最近では、２００４年１２月２８日から２００５年１月２７日のベトナムにおいて１１ケース中９ケースで死亡した。該ウイルスの病原性は増加したように見えるが、更なるヒト間の伝播に必要と考えられるいずれの変化も発生しなかったものと思われる。しかしながら、我々は、このたび、２００４年のベトナム、タイ及び中国における単離物由来のガチョウレプリキン骨格の番号１８、２４及び２８の位置において３つのＨ５Ｎ１レプリキンアミノ酸残基中の近年の置換を発見した（表１を参照のこと）。部位番号２４における置換は、１９５９年のＨ５Ｎ１の出現から発生しなかったが、一緒に２００万人以上の死亡に関係しうる、他の株により生じた最後の２つのインフルエンザ世界的流行、１９５７年のＨ２Ｎ２及び１９６８年のＨ３Ｎ２において、そしてＨ７Ｎ７により生じた近年のウイルス地域的流行において存在する（表８を参照のこと）。これらは危険可能性の唯一のヒントであるが、図１５に示される上昇レプリキン計数及びこのようなレプリキンデータと世界的流行の過去の相関と組み合わせた置換におけるデータは、ウイルスがヒト間伝播となりそうにないという系統分析から得られるものと同じ安堵を与えない。
【０１２５】
Ｈ５Ｎ１インフルエンザに関して、図１５は、１９９７年（Ｅ１として示す）、２００１年（Ｅ２として示す）及び２００４年（Ｅ３として示す）の地域的流行の直前の１００個のアミノ酸あたりのレプリキンの濃度における急速な上昇を示す。
【０１２６】
表８：１９１７年ガチョウインフルエンザレプリキン及び１９１８年ヒト世界的流行レプリキンから２００６年Ｈ５Ｎ１「トリインフルエンザ」相同体の、高速複製に関する８９年のインフルエンザウイルスレプリキンペプチドの保存における整理した置換を示すレプリキン骨格
【０１２７】
【表１９】
2008539164.tif 000024
【表２０】
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【０１２８】
上記表８は、ヒト及びトリにおける地域的流行及び世界的流行におけるレプリキンの役割についての裏付けを供する。図８において、ガチョウレプリキン及びその相同体の履歴は、１９１７年からトリＨ５Ｎ１ウイルスの近年の大流行まで追跡された。表８は、インフルエンザの病原性株におけるガチョウレプリキンの「骨格」相同性の保存を示す。
【０１２９】
表８は、他のインフルエンザレプリキン中の１年又はより短い期間による、ガチョウレプリキン及びその相同体のタンパク質構造における存在の履歴を示す。表８は更に、レプリキンの定義及びレプリキンにより供される高速複製の機能に必要不可欠なレプリキン構造の一定のアミノ酸のこれらの相同体におけるアミノ酸置換及び保存を示す。
【０１３０】
表８のレビューは、アミノ酸の任意的な置換が、１９１７年から現在までのインフルエンザの病原性株中で発生する場合、ガチョウレプリキンの一定の枠組みのアミノ酸は、地域的流行が生じた株中において年間で保存されないことを示す。しかしながら、任意的な置換からもたらされるものとは対照的に、年から年のインフルエンザの病原性株は、レプリキンを定義するこれらの位置において一貫して保存アミノ酸を含有する。すなわち、置換が、レプリキンを定義するアミノ酸の１つ、例えば、リジン又はヒスチジンにおいて生じた場合、レプリキンの定義は失われる。それにもかかわらず、レプリキン配列は８５年以上も保存されている。このように、数十年にわたる一定のアミノ酸の保存が存在することから、置換は完全に無秩序であると言うことはできない。置換がレプリキンの定義に必要でないアミノ酸（すなわち、リジン又はヒスチジン以外のアミノ酸）において生じるという事実は、該株の病原性におけるレプリキンの重要性を示す。
【０１３１】
更に表８からは、置換が生じる場合、これらは、レプリキン骨格の一定の明らかに好ましい位置において生じていることに注目できる。表８は、位置１、３〜２４及び２６〜２７における反復性の置換を示す。更に、置換はこれらの位置において発生するが、第二のリジンから６〜１０個のアミノ酸の位置において、リジンが存在し続ける（これらの病原性株中では置換されない）。
【０１３２】
１９５７年に見られるとおり、２９個のアミノ酸伸展中にリジン位置の置換が存在する場合、１１位におけるＫが１０位にシフトする場合であっても、ＹＰ、ＡＹ、Ｎ（１５位）、及び、ほとんど例外を伴わずにレプリキン骨格の相同構造を保存するためのＬＶＬＷＧを有するように、この新たな位置は２００５年まで維持された。
【０１３３】
表８は、インフルエンザの病原性株におけるレプリキン骨格の完全性を示す。上述のとおり、レプリキン骨格のエクソスケルトン骨格(exoskeleton scaffold)への変性は、病原性を低下させるようである。このように、レプリキン骨格の完全性及び保存は、２つのリジンで開始し、そして２つのヒスチジンで終了する、一般に固定された２９個のアミノ酸配列が存在するという事実により明らかとなる。
【０１３４】
余分なＫが、中国（アンホイ）におけるＨ５Ｎ１の２００６年の株のレプリキン骨格中に発生したことを注目することは重要である。余分なＫの存在は、レプリキン骨格中のレプリキン計数の増加を示す。該２００６年の中国（アンホイ）株は、６．６のレプリキン計数を有する（下記に議論する）。６．６のレプリキン計数は、以前にＨ５Ｎ１株について観察された中で最も多く、そして全インフルエンザ株中、１９１８年の世界的流行により生じたインフルエンザ株のレプリキン計数と唯一比較できる。この最初の２００６年の報告が繰り返されかつ維持されるならば、これは２００４年及び２００５年の４．５及び４．０の計数がそれぞれ実質的に増加するであろうことを指摘し、そしてＨ５Ｎ１「トリインフルエンザ」の持続する又は増加する地域的流行を予測することができる。
【０１３５】
本発明の観点は、レプリキン構造とウイルス、地域的流行又は世界的流行の病原性又は複製速度を追跡するため、あるいは地域的流行又は世界的流行の発生を予測するための機能の組み合わせである。該組み合わせの例は、インフルエンザ株、例えば、１９１８年の株及びＨ５Ｎ１の現在のＨ５Ｎ１株中の増加したレプリキン計数を計測するために使用される本発明のレプリキンアルゴリズムの能力である。１９１８年のインフルエンザ世界的流行と「トリインフルエンザ」の近年の大流行のレプリキン計数は、本発明に従い可能となった代表的な観点の予測可能性を実証する。
【０１３６】
インフルエンザ固定骨格レプリキン構造に対するいくつかのエビ白斑ウイルスレプリキンの関係
本発明はまた、ウイルスのレプリキン骨格部分において、病原性インフルエンザウイルスと白斑ウイルス間の関係を確立した。これらの２つのウイルス間の関係については以前に何ら示唆されていない。広範な置換が存在するが、エビ白斑症候群ウイルスのいくつかの短いレプリキンの出願人の発見は、インフルエンザウイルスレプリキン配列に対して、特に長さ、並びに重要なレジン（ｋ）及びヒスチジン（ｈ）残基（固定された骨格又はレプリキン骨格）に対する有意な相同性を実証し、両ウイルス群においてレプリキン産生の類似の機構が用いられることを示唆する。
【０１３７】
【表２１】
2008539164.tif 000026
【０１３８】
更に、制限されることなく、ブタ及びトリを含む多くの種は、ヒトインフルエンザ感染のための動物「宿主（reservoir)」を供することが知られているため、現在、例えば、ブタインフルエンザ及びトリインフルエンザの大流行の可能性の早期警告診断の利益を伴い、海洋種、例えば、エビウイルスを調査することができる。いくつかのインフルエンザウイルスの類似性が種間で注目され、そしてこれらのウイルスの種間の移行が知られているが、ウイルス活性を評価する以前の定量法は存在しない。異なる種に移りうる増加した活性についての潜在的な宿主を調査することは以前には不可能であるため、従って、有益な警告を供する。各種におけるレプリキンの活性は、現在、増加したウイルス複製速度の証拠について一定にモニターすることができ、これにより他種に移行しうる種における流行を警告することができる。
【０１３９】
このデータは、それ自体の履歴、及びその宿主の高速複製の共有した機能及び疾患を伴い、ペプチドの新しいクラスとしてレプリキンを更に裏付ける。そのエビ宿主についての高い死亡率を伴い白斑症候群ウイルスは、現在、該ウイルスレプリキンの初期形態として、又は類似形態として調査されるそのレプリキンを有し、いずれのケースにおいても鳥及び動物レプリキン、例えば、インフルエンザウイルス中のものについての宿主として良く作用することができる。エビにおけるこれらのレプリキンの発見の診断的及び予防的使用は、インフルエンザにおいて行われ、そしてレプリキンを含有するほかの生物体について行われる。
【０１４０】
レプリキン構造の保存
また、レプリキン構造が保存されているか又は広範な自然突然変異に付されるかについて、そのウイルスのタンパク質における突然変異が何十年にもわたり世界中で充分立証されてきた口蹄病ウイルス（ＦＭＤＶ）のさまざまな分離株のタンパク質配列をスキャンすることによって検討された。ＦＭＤＶ分離株のタンパク質配列はレプリキン全体及び特定のレプリキンの中で観察された成分レプリキンアミノ酸残基の各々の両方の存在について目視により検査された。
【０１４１】
近隣のアミノ酸内で発生するように経時的に広範囲の置換が起こるのではなく、レプリキン構造を含むアミノ酸はほとんど又は全く置換されない。すなわちレプリキン構造は保存される。
【０１４２】
例えば、ＦＭＤＶ  Ｏ型のタンパク質ＶＰ１の中で、レプリキン（配列番号３）「ｈｋｑｋｉｖａｐｖｋ」は、ＰｕｂＭｅｄ中で報告された２３６の分離株の７８％において保存されることが発見され、各アミノ酸は、ｈｉｓ、９５．６％；ｌｙｓ、９１．８％；ｇｌｎ、９２．３％；ｌｙｓ、８４．１％；ｉｌｅ、９０．７％；ｖａｌ、９１．８％；ａｌａ、９７．３％；ｐｒｏ、９６．２％；ａｌａ、７５．４％；及びｌｙｓ、８８．４％といったような個々の分離株内に保存されることがわかった。高い保存率は、レプリキン構造の構造的及び機能的安定性を示唆し、治療のための恒常な標的を提供する。
【０１４３】
同様にして、配列保存は、ＨＩＶＩ型中の（配列番号５）「ｋｃｆｎｃｇｋｅｇｈ」又は（配列番号６）「ｋｖｙｌａｗｖｐａｈｋ」及びＨＩＶ２型中の（配列番号７）「ｋｃｗｎｃｇｋｅｇｈ」といったそのレプリキンについて、ＨＩＶの異なる分離株Ｐで発見された（表２）。配列保存のさらなる例は、主要リジン及びヒスチジンアミノ酸が保存されている（配列番号６１３）「ｈｃｌｖｃｋｑｋｋｇｌｇｉｓｙｇｒｋｋ」、といったようなＨＩＶｔａｔタンパク質の中に見い出された（表９参照）。
【０１４４】
同様にして、配列保存は、例えば酵素Ｅを活性化させる小麦ユビキチンといったような小麦の中などの植物中に観察された（配列番号６１４−６１６）。小麦中のレプリキンは、中で記述されているように植物の成長の刺激のための信頼性ある標的さえ提供した。その他の保存例は、神経膠腫細胞の組織培養１０年にわたる連続する世代間でのマリグニンの恒常的な存在の中に、そして、米国、英国、欧州及びアジアからの８，０９０件のヒト血清から免疫吸着により単離された抗マリグニン抗体に対する神経膠腫レプリキンの親和力の恒常性に見られる（例えば図５及び米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号）。
【０１４５】
同様にして、保存は、ＨＩＶの分離株内のＴａｔ（トランス作用因子）タンパク質中に観察された。Ｔａｔ（トランス作用因子）タンパク質は、レンチウイルス転写を調節する早期ＲＮＡ結合タンパク質である。これらのタンパク質は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）といったような全ての既知のレンチウイルスのライフサイクルにおける必要な構成要素である。Ｔａｔは、トランス作用性応答配列（ＴＡＲ）ＲＮＡ要素に結合することによって作用しＬＴＲプロモータからの転写の開始及び／又は伸長を活性化する転写調節因子タンパク質である。ＨＩＶは、ｔａｔ無しでは複製できないが、その化学的根拠はわかっていない。８９〜１０２個の残基のＨＩＶｔａｔタンパク質配列の中に、我々は、その他の生体内での高速複製と結びつけられているレプリキンを発見した。このレプリキンのアミノ酸配列は「ＨＣＬＶＣＫＱＫＫＧＬＧＩＳＹＧＲＫＫ」である。実際、我々はこのレプリキンが全てのＨＩＶｔａｔタンパク質の中に存在することを発見した。一部のｔａｔアミノ酸は表９に示されているように交互のアミノ酸により高頻度で置換されている（最も高頻度のアミノ酸の下に並んだ小さいフォント（表９）、優勢なレプリキン「ＨＣＬＶＣＦＱＫＫＧＬＧＩＳＹＧＲＫＫ」についての保存百分率）。これらの置換は、大部分の個々のアミノ酸について現われた。しかしながら、レプリキン構造を画定するレプリキン配列内の主要なリジン及びヒスチジンアミノ酸は、該配列中で１００％保存されている。置換はその他のアミノ酸中の他の場所でレプリキンの内外両方で一般的であるが、これらの主要なヒスチジンアミノ酸上で発生するものは全く無い。
【０１４６】
表９に示されているように、リジンがｔａｔタンパク質アミノ酸配列内で置換されていないとは限らない。表の左側から、レプリキン配列の外側にあるものの直ぐ隣接する配列内のまさに最初のリジン及び、レプリキン形成にとって不可欠でないことから「予備的なもの」であるレプリキン内部にあるが配列内の第２のリジン（ｋ）は、両方共高頻度で置換されている。しかしながら、合わさってレプリキン構造を規定するカッコ内の第３、第４及び第５のリジン、及び１つのヒスチジンは決して置換されていない。かくして、これらの主要アミノ酸配列は１００％保存されている。インフルエンザウイルスレプリキンの場合に観察された通り、この選択的置換及び選択的無置換が無作為置換により偶然発生する可能性はないと思われる。
【０１４７】
【表２２】
2008539164.tif 000027
【０１４８】
レプリキン構造の保存は、レプリキン構造が、保護及び保存されなくてはならないＨＩＶウイルスのための特異的存続機能を有し、抗体及びその他の「攻撃」を回避するために作り出されるアミノ酸置換のウイルス「防御」操作の犠牲にはなり得ないことを示唆している。これらの「防御」機能は、同様に不可欠であるものの、ＨＩＶ複製のウイルス存続機能と「競合」できない。
【０１４９】
ＨＩＶの異なる分離株において、ＨＩＶ１型における「ｋｃｆｎｃｇｋｅｇｈ」（配列番号５）又は「ｋｖｙｌａｗｖｐａｈｋ」（配列番号６）及びＨＩＶ２型における「ｋｃｗｎｃｇｋｅｇｈ」（配列番号７）といったようなそのレプリキンについて、さらなる保存が観察された。ＦＭＶＤ及びＨＩＶレプリキンにおいて観察された高い保存率は、インフルエンザレプリキンのレプリキン内でも観察された保存がウイルスレプリキンの一般的特性であることを示唆している。この保存によりこれらは、例えば神経膠腫レプリキンについて例示されているようにインフルエンザ、ＦＭＶＤ又はＨＩＶワクチン用といった特異的レプリキンを使用することによる破壊、又は刺激のいずれかのための恒常で信頼性の高い標的となる。
【０１５０】
同様にして、レプリキン内の高い保存率により、保存がウイルスレプリキンの一般的特性でありかくしてレプリキンを破壊又は刺激のための恒常かつ信頼性の高い標的としているということが示唆されている、インフルエンザウイルス、ＦＭＤＶ及びＨＩＶを含むウイルスにおいて発見された例において提供されている通りに、レプリキン構造の保存は植物内で発生する。例えば、小麦植物においては、レプリキンが保存され、刺激のための信頼性の高い標的を提供する。酵素Ｅを活性化する小麦植物ユビキチン内の保存されたレプリキンの例としては、以下のものが含まれる。
【化４】
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【０１５１】
ＨＩＶｔａｔタンパク質内で発見された保存と同様にして、小麦ユビキチン活性化酵素Ｅ内のレプリキンは保存される。ＨＩＶｔａｔタンパク質の場合と同様、小麦ユビキチン活性化酵素Ｅ内のレプリキン変異体形態に隣接するアミノ酸の置換（「*」により指定されている）は一般的である。しかしながらレプリキン構造を形成する主要ｋ及びｈアミノ酸は、わずか５つのアミノ酸（左側の最初のｋから）である「不可欠でない」ｋが置換されているのに対し、変動しない。
【０１５２】
抗レプリキン抗体
抗レプリキン抗体は、レプリキンに対する抗体である。抗レプリキン抗体についてのデータは、同様にレプリキンの種類の一体性を裏づけている。固定化されたマリグニンに対する血清抗マリグニン抗体の免疫吸着により抗−レプリキン抗体応答が定量化されてきた（米国特許第５，８６６，６９０号内の方法を参照のこと）。マリグニン、不在の炭水化物又はその他の基から配列が誘導された１６量体ペプチドの合成バージョンのウサギに対する投与による抗マリグニン抗体の豊富な産生は、このペプチド単独で１つのエピトープであることすなわちこの免疫応答のための充分な根拠を提供することを厳密に実証した（図３）。１６量体ペプチドは、抗体のＩｇＭ及びＩｇＧの両方の形態を産生した。抗マリグニン抗体の血清中濃度は、感染から約１５〜２５年後に発生する肝癌の通常の遵守よりはるかに前の最初の５年間の感染において、早期に、米国及びアジアにおけるＢ型及びＣ型肝炎の７９の症例の３７％で増加することがわかった。感染性肝炎及びＨＩＶ感染の両方に関連して、形質転換された細胞はウイルスにとって安全な隠れ場の１つの形態であり得る。すなわち細胞の寿命を延ばしウイルスの追い立てを回避し、かくしてウイルスは抗ウイルス治療にとってアクセス不可能なものであり続けることになる。
【０１５３】
レプリキンの投与は、免疫系を刺激して、細胞毒性効果をもつ抗体を産生することから、一定の与えられた時期全体にわたり最も濃度が高いことが観察された特定のインフルエンザウイルス又はレプリキン群に基づくペプチドワクチンは、一定の与えられたインフルエンザの流行期において勃発する確率の最も高い特定のインフルエンザ株、例えば新興株又は再興株に対する保護を提供する。例えば、年一回又は二年に一回のペースでインフルエンザウイルス血球凝集素アミノ酸配列を分析することで、その年について特異的にターゲティングされたインフルエンザワクチンを処方する上で有用なデータを提供する。かかる分析は、地域毎に又は任意の望まれる時期に行なうことができ、かくして世界中の異なる部域で新興する株を検出し、各地域のための特異的にターゲティングされたワクチンを処方することができる、ということは言うまでもない。
【０１５４】
インフルエンザワクチン、処置及び治療
現在、インフルエンザのためのワクチン処方は、ＷＨＯ及びＣＤＣの国際的な会合において年２回変更されている。ワクチン処方は、世界の一定の与えられた地域内のインフルエンザウイルス株の最新の優勢性の血清学的証拠に基づいている。しかしながら、本発明以前には、インフルエンザの地域的流行又は世界的流行の発生とインフルエンザウイルス株特異的アミノ酸配列の変化を相関させるものは全く存在しなかった。
【０１５５】
特異的レプリキン及びインフルエンザウイルスタンパク質中のその濃度を観察することにより、インフルエンザの世界的流行及び地域的流行の最初の特異的な量的早期化学的相関要素が提供され、世界の特定の地域内でのインフルエンザウイルスの優勢な新興又は再興株を処理するべく特定的にあつらえたインフルエンザワクチンの生産及び時宜を得た投与が提供される。レプリキンの存在、濃度及び／又は保存について血球凝集素タンパク質配列といったようなインフルエンザウイルスの株の分離株のタンパク質配列を分析することにより、インフルエンザウイルスの世界的流行及び地域的流行を予測することができる。さらに、かかるインフルエンザ勃発の重大性は、例えば約１年から約３年の一定の与えられた時期にわたりウイルス分離株について最も豊富であることがわかった又は上昇中であることが示されたレプリキン配列に基づいてインフルエンザペプチドワクチンを投与することによって著しく小さくすることができる。
【０１５６】
本発明のインフルエンザペプチドワクチンには、単一のレプリキンペプチド配列が含まれていてよく、そうでなければ、インフルエンザウイルス株の中で観察された複数のレプリキン配列が含まれていてよい。好ましくはペプチドワクチンは、一定の与えられた時期全体にわたり濃度を増大させていることが示され、少なくともその時期の間保存されているレプリキン配列（単複）に基づいている。しかしながら、ワクチンは、新しいレプリキン（単複）ペプチドと組み合わせた状態で保存されたレプリキンペプチド（単複）を内含でき、そうでなければ、新しいレプリキンペプチド配列に基づいていてもよい。レプリキンペプチドは、化学的合成又は組換え型遺伝子技術を含むあらゆる方法により合成され得、非レプリキン配列を内含できるが、レプリキン配列のみを含有するペプチドに基づくワクチンが好ましい。好ましくは、本発明のワクチン組成物は、薬学的に受容可能な担体及び／又はアジュバントも含有している。
【０１５７】
本発明のインフルエンザワクチンは、単独、又はガンシクロビル；インターフェロン；インタロイキン；アマシタジン、リマシタジンといったＭ２阻害剤；ザナミビル及びオセルタミビルといったようなノイラミニダーゼ阻害剤；などといった抗ウイルス薬、並びに組合せた抗ウイルス薬との組み合わせにおいて投与することができる。
【０１５８】
本発明のインフルエンザワクチンは、免疫応答において抗体を産生可能ないずれかの動物に投与することができる。例えば、本発明のインフルエンザワクチンは、ウサギ、ニワトリ、ブタ又はヒトに投与することができる。レプリキン配列の敷衍的な特性により、本発明のインフルエンザワクチンは、様々なインフルエンザの株又は特定のインフルエンザの株において作ることができる。
【０１５９】
本発明に従う制限されない観点において、インフルエンザワクチンは、インフルエンザの動物又はヒト株、例えば、インフルエンザＢ、（Ａ）Ｈ１Ｎ１、（Ａ）Ｈ２Ｎ２及び（Ａ）Ｈ３Ｎ２、又は将来的に生じうるウイルスのいずれかのヒト変異体、並びに動物中の優勢なインフルエンザの株、例えば、近年のトリＨ５Ｎ１に対する免疫応答を対象にすることができる。インフルエンザワクチンは更に、インフルエンザタンパク質のいずれかの部分における特定のレプリキンアミノ酸配列を対象にすることができる。
【０１６０】
本発明に従う制限されない観点において、インフルエンザワクチンは、Ｈ５Ｎ１ウイルスのレプリキン骨格、例えば、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨを含んでよい。更なる制限されない観点において、インフルエンザワクチンはＵＴＯＰＥ、例えば、ＫＫＫＫＨ又はＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨを含んでよい。さらにほかには、ワクチンは更なるアジュバント、例えば、アミノ酸配列ＫＬＨを有する周知の主要なカサガイヘモシアニンを含んでよい。さらに好ましい制限されない観点において、インフルエンザワクチンは、２つのＵＴＯＰＥＳ及びアジュバント配列、例えば、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ−ＫＬＨ（ワクチンＶ１２０３０４Ｕ２）を含むインフルエンザＨ５Ｎ１のレプリキン骨格を含んでよい。本発明の観点は、以前に構築され、そして「２００４年、Ｈ５Ｎ１、ベトナム、高病原性」と標識されたトリインフルエンザレプリキンの１つとして表８に示されるレプリキン骨格を含んでよい。ウサギ及びニワトリに皮下注射される１００μｇのワクチンＶ１２０３０４Ｕ２のペプチドの投与により、ワクチン接種をしていない１：５０以下の希釈から抗体応答が観察され、１：１２０，０００〜１：２４０，０００以上の希釈のワクチン接種後３週から４週目にピークに達した（実施例７を参照）。
【０１６１】
反復及び重複レプリキン構造
メロゾイド表面及び寄生菌含有空胞内部にある熱帯マラリア原虫マラリア抗原の一次構造の分析は、該生物体、例えば、インフルエンザウイルスもまた、多数のレプリキンを含有することを明らかにした。しかしながら熱帯マラリア原虫及びインフルエンザウイルス分離株中のレプリキンの観察において、いくつかの差異が存在する。例えば、熱帯マラリア原虫はいくつかの部分的レプリキンを含む。熱帯マラリア原虫に見られるもう１つの差異は、インフルエンザウイルスでは観察されなかった単一タンパク質内の個々のレプリキン構造の頻繁な反復である。反復は、（ａ）レプリキン間でのリジン残基の共有、及び（ｂ）もう１つのレプリキン配列内部でのレプリキン配列の一部分の反復によって発生し得る。
【０１６２】
インフルエンザウイルス分離株及び熱帯マラリア原虫内で観察されるレプリキン構造間のほかの有意な差異は、マラリアタンパク質全体を通してのレプリキン構造の顕著な重複であり、例えば、配列番号３９３の３９個のアミノ酸配列内に９つの重複レプリキン（レプリキン濃度＝２３．１／アミノ酸１００個）が、そして配列番号４６７の４１個のアミノ酸内に１５個の重複レプリキン（レプリキン濃度＝３６．６／アミノ酸１００個）が存在する。これらの重複するレプリキン構造はともに、血液ステージのトロフォゾイド及びシゾント中で発生する。これとは対照的に、インフルエンザウイルスレプリキンは、タンパク質全体を通してより散在しており、最大レプリキン濃度はアミノ酸１００個あたり約７．５であり（図７）、トマト縮葉病ジェミニウイルスもまた、重複レプリキンを有することが観察された。
【０１６３】
高濃度のレプリキンは高速複製と相関する
トマト縮葉病ジェミニウイルスは、中国及び世界のその他の数多くの部分でトマトの収穫を壊滅させた。そのレプリキンは、レプリキン計数が２０．７であった日本において単離されたウイルスの中の以下で例示する通りの重複するレプリキンのため、高い計数に達している。
【０１６４】
高速複製に対するより高いレプリキン濃度の関係は、同様に、ＨＩＶ分離株の分析によっても確認される。ＨＩＶの低速成長する低力価株（初期ＨＩＶ感染において優勢であるＮＳＩ、「Ｂｒｕ」）が、１００個のアミノ酸あたり１．１（＋／−１．６）レプリキンというレプリキン濃度を有し、一方ＨＩＶの高速成長する高力価株（晩期ＨＩＶ感染において優勢であるＳ１、「Ｌａｉ」）が１００個のアミノ酸残基あたり６．８（＋／−２．７）レプリキンというレプリキン濃度を有するということが発見された。
【０１６５】
受動免疫
本発明のほかの観点においては、例えば１つの個体内で受動免疫を提供するために使用し得る抗体を生成するべく、単離されたレプリキンペプチドを使用することができる。本発明の方法により来るべきインフルエンザ感染の最も確率の高い原因であると同定されたインフルエンザ株に対する受動免疫は、同定されたインフルエンザウイルス株のレプリキン配列に対する抗体を必要としている患者に対し投与することによって得ることができる。同様にして、熱帯性マラリア原虫レプリキン（単複）に対して抗体を投与することによりマラリアに対する受動免疫を得ることも可能である。
【０１６６】
当該技術分野において既知のさまざまな手順を、レプリキン配列に対する抗体の産生のために使用することができる。かかる抗体には、ポリクローナル、モノクローナル、キメラ、ヒト化、１本鎖、Ｆａｂフラグメント及びＦａｂ発現ライブラリによって産生されたフラグメントが含まれるが、ただしこれらに制限されるわけではない。細胞毒性作用物質に連結されている抗体も同じく生成可能である。抗ウイルス作用物質と組み合わせて抗体を投与することも可能である。さらに、異なるレプリキンに対する抗体の組合せを抗体カクテルとして投与することも可能である。
【０１６７】
抗体産生のためには、ウサギ、マウス、ラット、及びそれより大きい哺乳動物を含めた（ただしこれらに制限されるわけではない）さまざまな宿主動物又は植物をレプリキンペプチド又はその組合せを注射することによって免疫化することができる。
【０１６８】
レプリキンに対するモノクローナル抗体は、抗体分子の産生を提供するあらゆる技術を用いることによって調製可能である。これらには Kohler及びMilsteinによって当初記述されたハイブリドーマ技術（Nature, １９７５，２５６：４９５−４９７）、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Kosbor et al., １９８３、Immunology of Tody、４：７２）及びＥＢＶハイブリドーマ技術（Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy、Alan R. Liss, Inc.,pp.７７−９６）が含まれるがこれらに制限されるわけではない。さらに、キメラ抗体の産生のために開発された技術（Morrison et al., １９８４、Proc. Nat. Acad. Sci USA、 ８１：６８５１−６８５５）又はその他の技術も使用可能である。代替的には、１本鎖抗体の産生のために記述された技術（米国特許第４，９４６，７７８号）を、レプリキン特異的１本鎖抗体を産生するべく適合させることも可能である。
【０１６９】
本発明の特に有用な抗体は、インフルエンザウイルスのペプチド及び／又はポリペプチド内に含まれるレプリキン配列に特異的に結合するものである。例えば、インフルエンザウイルスの新興又は再興株の中に存在することが観察されたペプチドのいずれかに対する抗体及びかかる抗体の組合せが、インフルエンザの治療及び／又は予防において有用である。同様にして、マラリア抗原上に存在するいずれかのレプリキンに対する抗体及びかかる抗体の組合せが、マラリアの予防及び治療において有用である。
【０１７０】
レプリキンのための結合部位を含有する抗体フラグメントを、既知の技術により生成することが可能である。例えば、かかるフラグメントには、抗体分子のペプシン消化により産生できるＦ（ａｂ′）２フラグメント及びＦ（ａｂ′）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成可能であるＦａｂフラグメントが含まれるがこれらに制限されるわけではない。代替的には、Ｆａｂ発現ライブラリを生成して（Huse et al., １９８９，Science, ２４６：１２７５−１２８１）、所望の特異性をもつモノクローナルＦａｂフラグメントの高速かつ容易な同定を可能にすることもできる。
【０１７１】
癌細胞型の如何に関わらずヒト悪性腫瘍において抗マリグニン抗体の濃度が増大し（図５参照）、かくしてこの抗体が細胞型の如何に関わらず悪性細胞に結合するという事実は、今や、本明細書で大部分の悪性腫瘍内に存在することが発見されている（図１及び表２）レプリキン構造の存在によって説明することができる。集団研究は、抗マリグニン抗体が年令と共に健康な成人において濃度を増し、ハイリスクファミリーでは癌の頻度が増大するにつれて、それが増すことを示した。早期悪性腫瘍において発生するさらなる２倍以上の抗体増加は、１〜１０mmサイズの乳癌における９７％の感応性によって独立して確認されてきた。in vivoで悪性細胞内に優先的に局在化することが示されてきたものの、組織化学的には、該抗体は正常な細胞には結合せず、インビトロで形質転換した細胞に選択的に結合し（図４Ａ、Ｂ）、これらの細胞に対し高い細胞毒性を示す（図４Ｃ〜Ｆ）。これらの例では同じ抗体は複数の細胞型すなわち脳神経膠腫、造血細胞（白血病）及び小細胞肺癌によって結合されていることから、悪性レプリキンの種類の統一性が再び実証されている。
【０１７２】
抗マリグニンは良性増殖と共に増大せず、インビボで乳房内の悪性形質転換及び複製と共にしか特異的に増大せず、悪性細胞の除去の時点で高い値から正常値に戻る（図５）。抗マリグニン抗体濃度は、癌患者の生存率に量的に関係する、つまり抗体が増えれば増えるほど生存率が高くなることが示されてきた。これらの結果を合わせて考えると、抗レプリキン抗体が細胞形質転換及び複製の制御メカニズムの一部であり得るということが示唆されている。この免疫応答の増大は、合成レプリキンをワクチンとして用いて能動的に、又は抗レプリキン抗体の投与又はレプリキンを特異的にターゲティングするように類似の形で設計されている例えば炭水化物、脂質などといったような非免疫ベースの有機作用物質の導入によって受動的に、複製を制御するのに有用であり得る。
【０１７３】
本発明のほかの観点においては、１又は複数ののレプリキンに曝露された個体から得られた１又は複数ののレプリキンに対する抗体を含有する免疫血清を、もう１つの個体又は動物において受動免疫を誘発するために使用することができる。免疫血清は、治療を必要とする対象に対し静脈内に投与することができる。受動免疫は同様に、１又は複数ののレプリキンに対する予め形成された抗体をレシピエントに注射することによっても達成可能である。感染性生体に曝露された個体に対し直ちに保護を提供するために、受動免疫を使用することができる。免疫血清又は予め形成された抗体の投与は、日常的なことであり、熟練した開業医ならば、望ましい効果を達成するのに必要とされる血清又は抗体の量を容易に確認することができる。
【０１７４】
合成レプリキンワクチン（活性免疫）
神経膠腫レプリキン（配列番号１）「ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ」又はＣ型肝炎レプリキン（配列番号１８）「ｈｙｐｐｋｐｇｃｉｖｐａｋ」又はＨＩＶレプリキン例えば（配列番号５）「ｋｃｆｎｃｇｋｅｇｈ」又は（配列番号６）「ｋｖｙｌａｗｖｐａｈｋ」といったレプリキンに基づく合成レプリキンワクチンそして好ましくは一定の与えられた時期にわたり保存された及び／又は新興又は再興するレプリキン（単複）に基づくインフルエンザワクチンは、化学的治療がそのとき有効となりうる細胞外でそれぞれのウイルスに感染した細胞を溶解させウイルスを放出するべく抗体濃度を増大させるために使用可能である。同様にして、マラリアワクチンは、例えばメロゾイト表面上又は寄生虫含有空胞内部で熱帯性マラリア原虫マラリア抗原内に観察されたレプリキンに基づいて、マラリアに対する細胞毒性抗体を生成するために使用することができる。表７は、７個といった少ないアミノ酸に至るまでの、レプリキン配列の短縮又は圧密とこれらのレプリキンを含有する生体によってひき起こされる死亡率との関係を示す。我々は、この相関関係を生体のタイプの如何に関わらない一般的な現象であるということを発見した。我々は同様に、インフルエンザ及びＳＡＲＳウイルスの場合のように、短縮されたレプリキン構造に至るまで経時的な進行が存在し得るということも発見した。
【０１７５】
各々の感染性生体のつねに増大する「効能」の出現のためにつねに進化的及び競合的圧力が存在するという証拠は豊富に存在する。これらの観察事実に基づき、又、予測により、進化的圧力が、ＥＥＬ白血病の場合のように７０％という高い値までの上昇を続けるリジン（ｋ）濃度と共に、増々短くなるレプリキンへと向かっているのであれば（図７）、そのとき予測された理論的理想は、可能なかぎり高いｋの％（８３．３％のｋ、５／６及び１つの義務的「ｈ」を含む、演繹されたレプリキン「ｋｋｋｋｈｋ」を参照のこと）で、レプリキンを画定するアルゴリズムにより許される可能なかぎり短いレプリキンすなわち６つのアミノ酸（６〜１０個のアミノ酸だけ離隔した２つのｋ）となる。従って、我々はいわば、今のところまだ生体自体により見かけ上取られていない次なる進化上の段階であると思われる又はそうなるはずのものを取り上げ、一般的ワクチンとして使用すべき、結果としての演繹されたレプリキンを考案した。
【０１７６】
我々が演繹したこれらのレプリキンは最大の％の「ｋ」、ひいては最大の潜在的結合能力と定義上レプリキンに必要とされる成分「ｈ」を有し、酸化還元エネルギーシステムに対する「ｈ」接続に対する潜在性を提供している。これらの考案されたレプリキンは、その短い長さのため生体により分割される確率が最も低く（タンパク質は免疫細胞に対する提示及びそれによる認識のためのプロセッシングにおいて長さ６〜１０アミノ酸まで分割される）、従って、それらが投与される生体内で免疫形成性器官に対して無欠の状態で現れる確率が最も高く、かつその高いｋ含有率のため、短い相同な高死亡率のレプリキンに対して生成されうる最大限のこのような応答を模倣し増大させうる最大の免疫応答を生成する確率が最も高い。
【０１７７】
さらに、我々は、ｋの％が高いレプリキンがウサギに投与された場合に最高の抗体応答を生成するということを発見した。我々が設計したこれらの合成ペプチドは、汎用合成エピトープ又は「ＵＴＯＰＥ」と呼称され、これらのＵＴＯＰＥに基づくワクチンは「ＵＶＡＸ」と呼称される。演繹された合成ワクチンであるＵＶＡＸは、唯一のワクチンとして又はより特異的なレプリキンワクチン又はその他のワクチンと共に投与された場合にはアジュバントとして使用可能である。以下に記すのは、演繹されたＵＴＯＰＥ及びＵＶＡＸの例である。
【表２３】
2008539164.tif 000029
【０１７８】
抗レプリキン抗体を産生するべく対象の免疫系を誘発するために、対象に対してリコグニン及び／又はレプリキンペプチドを投与することができる。一般に、免疫応答を誘発するために、０．５〜約２ｍｇの投薬量、好ましくは１ｍｇの各ペプチドの投薬量が対象に投与される。望ましい場合には、後続の投薬量を投与することができる。
【０１７９】
レプリキン配列構造は、複製機能と結びつけられる。かくして、例えば本発明のレプリキンが診断的同定の目的でレプリキンを含有する配列をターゲティングするためか、複製を促進するためか又は複製を阻害又は攻撃するためのいずれの目的に使用されるにせよ、レプリキンの構造−機能関係は欠かせない。
【０１８０】
レプリキンフラグメントを認識し、これに付着しかくして細胞の破壊をひき起こすことになる抗体を誘発しようとする場合、特異的レプリキン構造のみを利用することが好ましい。より大きいタンパク質配列が「複製関連機能」をもつものとして当該技術分野において知られているにせよ、より大きいタンパク質を使用するワクチンは往々にして不首尾であるか又は有効でないことが証明されている。
【０１８１】
発明者らは単一の理論の縛られることを望んではいないものの、本明細書中の研究は、先行技術のワクチンがより大きなタンパク質配列の使用に基づいているために効果がないということを示唆している。より大きいタンパク質配列は、不変的に単数又は複数のエピトープ（特異的抗体形成を誘発し得る独立した抗原配列）を有する。レプリキン構造は通常、これらの潜在的エピトープの１つを含んでいる。より大きいタンパク質内のその他のエピトープの存在は、レプリキン抗原を先取りし得る無関係の抗原刺激で免疫系を「溢れさせる」ことにより、レプリキンに対する抗原の適切な形成と干渉し得る。免疫系により提示され認識された第１のペプチドエピトープがその後優勢となり、たとえその他のペプチドエピトープが同時に提示されてもそれに対する抗体が作られるようにする抗原第１主義というこの周知の現象の論述については、Webster, Ｒ.Ｇ., J.Immunol., ９７（２）：１７７−１８３（１９６６）；及びWebster et al., J. Infect. Dis., １３４：４８−５８、１９７６；Klenerman et al., Nature ３９４：４２１−４２２（１９９８）を参照のこと。これは、ワクチン形成において、レプリキンが先取りされず免疫学的メモリ内にとどめられるような形で生体からその他のエピトープを提示する前に、まず最初に免疫系に対し恒常なレプリキンペプチドを提示することが重要であるもう１つの理由である。
【０１８２】
非レプリキンエピトープに対する抗体の形成は、細胞に対する結合を可能にし得るものの、必ずしも細胞の破壊を導くわけではない。マラリアタンパク質のＣ末端上の構造的「デコイ」の存在は、デコイエピトープが数多くのリジン残基を有するもののヒスチジン残基を全くもたないことから、有効な抗レプリキン抗体の結合と干渉するその他のエピトープのこの能力のもう１つの様相である。かくして、デコイエピトープは、抗レプリキン抗体に結合できるが、ヒスチジンに結合した呼吸酵素から離れたところに抗体を保つことができる。従って、治療は、１）デコイを加水分解するためのプロテアーゼと次に２）抗レプリキン抗体又はその他の抗レプリキン作用物質という２つのステージで最も効果的であり得る。
【０１８３】
「外来性」タンパク質に対する抗体産生の過程でタンパク質がまず最初により小さなフラグメントへと加水分解されるということは、当該技術分野において周知である。通常、約６〜１０個のアミノ酸を含有するフラグメントが抗体形成について選択される。かくして、タンパク質の加水分解がレプリキン含有フラグメントを結果としてもたらさない場合、抗レプリキン抗体は産生されないことになる。この点において、リジン残基は膜に結合するものとして知られていることから、レプリキンが、６〜１０個のアミノ酸だけ離隔して位置特定されたリジン残基を含有していることが有利である。
【０１８４】
さらに、レプリキン配列は、少なくとも１つのヒスチジン残基を含有する。ヒスチジンは高頻度で酸化還元中心に対する結合に関与する。かくして、レプリキン配列を特異的に認識する抗体は、細胞１個あたりピコグラム単位で活性であってこれまで記述された中で恐らく最も細胞毒性の高い抗癌抗体である抗マリグニン抗体で見られるように、レプリキンが中に位置設定されている細胞を不活性化する又は破壊する確率がより高いものである。
【０１８５】
疾病をひき起こす作用物質の特定のタンパク質抗原に向けられたワクチンが、（例えばＶＰ１タンパク質又はその大きいセグメントに対して開発された口蹄病ワクチンといったような）該疾病に対する保護を提供する上で充分に効果的でなかったことの１つの理由は、最高の抗体が産生されなかったこと、すなわちレプリキンに対する抗体が産生されなかった確率が高いことにある。レプリキンは産生されなかった。すなわち、より大きなタンパク質フラグメント中に存在するレプリキン以外のいずれかのエピトープが、上述の抗原第１主義という現象に従って、かつ／又は、抗体を産生するためのプロセッシングのためのより小さい配列へのより大きなタンパク質配列の加水分解が、例えばレプリキンが２つに切断される及び／又はヒスチジン残基が加水分解プロセッシングにおいて喪失することなどといったように、存在するあらゆるレプリキン構造の無欠性が喪失することを理由として、干渉する可能性がある。本研究は、有効なワクチンが産生されるためには、レプリキン配列をワクチンとして使用すべきであり、その他のいかなるエピトープも使用すべきでないということを示唆している。例えば、本発明のワクチンは、３点認識システムによって同定されたレプリキンペプチドのいずれか１つを用いて生成可能である。
【０１８６】
例えばインフルエンザワクチンといったような特に好ましいペプチドとしては、単数又は複数年、好ましくは３年以上の期間にわたり保存されることが実証されかつ／又は例えば新興株といったようなその他のインフルエンザウイルス株内のレプリキン濃度との関係におけるレプリキン濃度が最高の増加を示すことが示されたインフルエンザウイルスの株の中に存在するペプチドが含まれる。レプリキンの増加は好ましくは、少なくとも約６ヵ月から１年、好ましくは少なくとも約２年以上そして最も好ましくは約３年以上の期間にわたり発生する。インフルエンザウイルスワクチン内で使用するための好ましいレプリキンペプチドの中には、単数又は複数年にわたる血球凝集素アミノ酸配列からの不在の後に「再興する」ことが観察されたレプリキンである。
【０１８７】
本発明のレプリキンペプチドは好ましくは、ペプチドの抗体を産生するべく対象の免疫系を刺激する目的で、静脈内又は筋内注射により、単独又はさまざまな組合せの形で、対象に投与される。一般に、ペプチド投薬量は、約０．１μｇ〜約１０mg、好ましくは約１０μｇ〜約１mg及び最も好ましくは約５０μｇ〜約５００μｇの範囲内にある。熟練した医師であれば、有効な免疫応答を生成するのに必要とされる投薬量及び投薬回数を容易に決定することができる。
【０１８８】
レプリキンワクチンに対する早期応答の定量的測定
レプリキンワクチンに対する日数単位の又は数週間以内での早期特異的抗体応答を定量的に測定する能力は、数ヵ月又は数年後にしか臨床的応答を測定できないその他のワクチンに比べ主たる実用的利点である。
【０１８９】
アジュバント
フロインドの（完全又は不完全）アジュバント、ミネラルゲル例えば水酸化アルミニウム、表面活性物質例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジントロフェノール及び潜在的に有用なヒトアジュバント例えばＢＣＧ及びコリネバクテリウム・パルヴムを含め（ただしこれらに制限されるわけではない）、宿主種に応じてさまざまなアジュバントを用いて免疫応答を高めることができる。ワクチン自体としての合成ＵＴＯＰＥの使用に加え、ＵＴＯＰＥは、その他のレプリキンワクチン及び非レプリキンワクチンに対するアジュバントとして使用可能である。
【０１９０】
レプリキンヌクレオチド配列
レプリキンＤＮＡ又はＲＮＡは、ウイルス、細菌又はその他のレプリキンコーディング作用物質による感染の結果もたらされる疾病の診断のための数多くの用途を有する可能性がある。例えば、組織試料又は環境試料などの中の特定の生体の存在を診断するため、インサイチュハイブリダイゼーション検定を含め、例えばサザン又はノーザン分析といった生検の行なわれた組織又は血液のハイブリダイゼーション検定において、レプリキンヌクレオチド配列を使用することができる。本発明は同様に、問題の特定の病原体の中に存在する特定のレプリキンに特異的な抗体を収納するか、又は特異的に特定のレプリキンをハイブリッド形成する核酸分子（センス又はアンチセンス）、そして任意には、診断に必要とされるさまざまな緩衝液及び／試薬を収納するキットをも考慮している。
【０１９１】
同じく本発明の範囲内に入るのは、アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子を含むオリゴリボヌクレオチド配列及びレプリキン又はリコグニン含有ｍＲＮＡの翻訳を阻害するように機能するリボザイムである。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡ分子及びリボザイムの両方共、当該技術分野において既知のあらゆる方法により調製することができる。対象への送達のためにはアンチセンス分子を多種多様なベクター内に取込むことができる。熟練した医師であれば、最良の送達経路を容易に決定することができるが、一般的には、静脈内又は筋内送達が日常的である。投薬量も容易に確認できる。
【０１９２】
特に好ましいアンチセンス核酸分子は、（１）第二リジン残基から６〜１０残基のところに位置する少なくとも１つのリジン；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基を含む７〜５０個のアミノ酸を含む例えばインフルエンザウイルスポリペプチドをコードするｍＲＮＡの中に含まれるレプリキン配列に相補的なものである。より好ましいのは、遺伝子のコーディングストランド内に存在するレプリキン又はインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質をコードするｍＲＮＡに対し相補的であり、６ヵ月から単数又は複数年の期間にわたり保存されることが実証されているレプリキンをコードするヌクレオチド配列に相補的であり、かつ／又はその他のインフルエンザウイルス株内でのレプリキン濃度に比べてレプリキン濃度が増大したことが示されたインフルエンザウイルスの１つの株内に存在するアンチセンス核酸分子である。レプリキン濃度の増加は、好ましくは少なくとも６ヵ月、好ましくは約１年、最も好ましくは約２年又は３年以上の期間にわたって発生する。
【０１９３】
同様にして、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子は、（１）第二リジン残基から６〜１０残基のところに位置する少なくとも１つのリジン；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基を含む７〜５０個のアミノ酸のレプリキン配列を含む細菌レプリキンをコードするｍＲＮＡに対し相補的なものである。より好ましいのは、遺伝子のコーディングストランド又は細菌のタンパク質をコードするｍＲＮＡに相補的なアンチセンス核酸分子である。
【０１９４】
レプリキンのさらなる観点
本発明の観点において、予防的又は治療的ワクチンを、それを必要とする患者に対して投与することを含むウイルス感染を予防又は治療するための方法は、ウイルスの新興株のタンパク質中に存在する少なくとも１つの単離したレプリキン、及び医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを含んで供される。本発明のさらなる観点において、単離又は合成したペプチドはインフルエンザウイルスペプチドである。本発明のより更なる観点において、単離又は合成したペプチドはＨ５Ｎ１インフルエンザウイルスペプチドである。
【０１９５】
本発明はまた、予防的又は治療的ウイルスワクチンを製造するための方法であって：
（１）新興株としてウイルス株を同定する工程、
（２）ウイルスワクチン製造のためのペプチド鋳型として、該新興株中に存在する少なくとも１つのレプリキン配列を選択する工程、
（３）工程（２）において選択した少なくとも１つのレプリキン配列のアミノ酸配列を有するペプチドを合成する工程、及び
（４）治療的有効量の工程（３）のペプチドと、医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを組み合わせる工程、
を含む方法を供する。
予防的又は治療的ウイルスワクチンを製造するための方法の更なる観点において、単離したレプリキンはインフルエンザウイルスに由来する。さらなる観点において、単離したレプリキンはインフルエンザＨ５Ｎ１ウイルスに由来する。
【０１９６】
ほかの観点において、本発明は、診断、予防又は治療目的のためのウイルス新興株の同定方法であって：
（１）複数のウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株を得る工程；
（２）レプリキン配列の存在及び濃度について複数のウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列を分析する工程；
（３）少なくとも２つの時点におけるレプリキンの濃度を供するために、複数のウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列中のレプリキン配列の濃度と、少なくとも１つのより早い時点における各株のアミノ酸配列中に観察されるレプリキン配列の濃度を比較する工程であって、前記少なくとも１つのより早い時点が、工程（１）の前約６ヶ月から約３年以内である工程；及び
（４）少なくとも２つの時点において、レプリキン配列の濃度における最も高い増加を有するウイルス株を同定する工程、
を含む方法を対象とする。
【０１９７】
本発明の他の観点において、レプリキン配列に特異的に結合する抗体を産生するために、対象の免疫系を刺激するための方法であって、該方法が、対象に対して、少なくとも１つのレプリキンペプチドを含む組成物の投与量の有効量を投与することを含む方法が供される。本発明の更なる観点は、このような新規株が出現する場合、生物体の新興株中に存在する少なくとも１つのペプチドを含む。本発明の他の観点は、インフルエンザＨ５Ｎ１中に存在する少なくとも１つのペプチドを含む。
【０１９８】
本発明はまた、本明細書に定義されるレプリキンと特異的に結合する抗体、並びにレプリキンと特異的に結合する複数の抗体を含有する抗体混合物を供する。本発明のほかの観点は、レプリキンと特異的に結合する抗体又は抗体群、及び医薬的に許容される担体を含む組成物を供する。
【０１９９】
本発明の１つの観点において、ウイルスレプリキン配列を含有する他のタンパク質、組換え体から単離され、または分離された、又は合成されたペプチド、あるいは他の方法が供される。
【０２００】
本発明のほかの観点において、ウイルスレプリキン配列に特異的に結合する抗体を産生するために、対象の免疫系を刺激する方法であって、該方法が、対象に対して、少なくとも１つのレプリキンペプチドを含む組成物の投与量の有効量を投与することを含む方法が供される。本発明のほかの観点は、このような新規株が出現する場合、生物体の新興株中に存在する少なくとも１つのペプチドを含む。
【０２０１】
本発明はまた、本明細書に定義されるウイルスレプリキンと特異的に結合する抗体、並びにウイルスレプリキンと特異的に結合する複数の抗体を含有する抗体混合物を供する。本発明のほかの観点は、ウイルスレプリキンと特異的に結合する抗体又は抗体群、及び医薬的に許容される担体を含む組成物を供する。
【０２０２】
本発明はまた、１又は複数の単離されたレプリキンウイルスペプチド、及び医薬的に許容される担体を含む治療組成物を供する。
【０２０３】
本発明の他の観点において、ウイルスレプリキンｍＲＮＡ配列と相補的なアンチセンス核酸分子であって、該レプリキンｍＲＮＡ配列が：
（１）第二のリジン残基から６〜１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基
を含む、７〜約５０個のアミノ酸を示す、アンチセンス核酸分子が供される。
【０２０４】
本発明のさらに他の観点において、ウイルスに対する抗体を産生するために、対象の免疫系を刺激する方法であって、該方法が：対象に対して、少なくとも１つのウイルスレプリキンペプチドの有効量を投与することを含む方法が供される。
【０２０５】
本発明の他の観点において、予防的又は治療的ウイルスワクチンに封入するためのウイルスペプチドを選択するための方法であって：
（１）上記複数のウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株を得る工程；
（２）レプリキン配列の存在及び濃度のために複数のウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列を分析する工程；
（３）少なくとも２つの時点におけるレプリキンの濃度を供するために、複数のウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株のアミノ酸配列中のレプリキン配列の濃度と、少なくとも１つのより早い時点における各株のアミノ酸配列中に観察されるレプリキン配列の濃度を比較する工程であって、前記少なくとも１つのより早い時点が、工程（１）の前約６ヶ月から約３年以内である工程；
（４）少なくとも２つの時点において、レプリキン配列の濃度における最も高い増加を有するウイルス株を同定する工程；及び
（５）ウイルスワクチンにおける封入のためのペプチドとして、工程（４）において同定されたウイルスペプチドの株中に存在する少なくとも１つのレプリキン配列を選択する工程、
を含む方法が供される。
【０２０６】
本発明の１つの観点において、レプリキン配列を含む単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドが供される。
【０２０７】
本発明の他の観点において、インフルエンザウイルスレプリキン配列に特異的に結合する抗体を産生するために、対象の免疫系を刺激する方法であって、該方法が、対象に対して、少なくとも１つのインフルエンザウイルスレプリキンペプチドを含む組成物の投与量の有効量を投与することを含む方法が供される。本発明の更なるの観点は、インフルエンザウイルスの新興株に存在する少なくとも１つのレプリキンペプチドを含む。本発明のほかの観点は、少なくとも１つのインフルエンザＨ５Ｎ１レプリキンペプチドを含む組成物異物を含む。
【０２０８】
本発明はまた、本明細書に定義されるインフルエンザウイルスレプリキンと特異的に結合する抗体、並びにインフルエンザウイルスレプリキンと特異的に結合する複数の抗体を含有する抗体混合物を供する。本発明のほかの観点は、インフルエンザレプリキンと特異的に結合する抗体又は抗体群、及び医薬的に許容される担体を含む組成物を供する。
【０２０９】
本発明はまた、
（１）第二のリジン残基から６〜１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基
を含む７〜約５０個のアミノ酸を有する、１又は複数の単離インフルエンザウイルスペプチドを含む治療組成物を供する。
【０２１０】
本発明の他の観点において、インフルエンザウイルス赤血球凝集素レプリキンｍＲＮＡ配列と相補的なアンチセンス核酸分子であって、該レプリキンｍＲＮＡ配列が：
（１）第二のリジン残基から６〜１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基
を含む、７〜約５０個のアミノ酸を示す、アンチセンス核酸分子が供される。
【０２１１】
本発明のさらに他の観点において、インフルエンザウイルスに対する抗体を産生するために、対象の免疫系を刺激する方法であって、
（１）第二のリジン残基から６〜１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；
（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び
（３）少なくとも６％のリジン残基
を含む、７〜約５０個のアミノ酸を有する、少なくとも１つのインフルエンザウイルスレプリキンペプチドの有効量を投与することを含む方法が供される。
【０２１２】
本発明の他の観点において、予防的又は治療的インフルエンザウイルスワクチンに封入するためのインフルエンザウイルスペプチドを選択するための方法であって：
（１）複数のインフルエンザウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株を得る工程；
（２）レプリキン配列の存在及び濃度のために複数のインフルエンザウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株の赤血球凝集素アミノ酸配列を分析する工程；
（３）少なくとも２つの時点におけるレプリキンの濃度を供するために、複数のインフルエンザウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株の赤血球凝集素アミノ酸配列中のレプリキン配列の濃度と、少なくとも１つのより早い時点における各株の赤血球凝集素アミノ酸配列中に観察されるレプリキン配列の濃度を比較する工程であって、前記少なくとも１つのより早い時点が、工程（１）の前約６ヶ月から約３年以内である工程；
（４）少なくとも２つの時点において、レプリキン配列の濃度における最も高い増加を有するインフルエンザウイルス株を同定する工程；及び
（５）インフルエンザウイルスワクチンにおける封入のためのペプチドとして、工程（４）において同定されたインフルエンザウイルスペプチドの株中に存在する少なくとも１つのレプリキン配列を選択する工程、
を含む方法が供される。
【０２１３】
本発明はまた、予防的又は治療的インフルエンザウイルスワクチンを製造するための方法であって：
（１）新興株としてインフルエンザウイルスの株を同定する工程、
（２）インフルエンザウイルスワクチン製造のためのペプチド鋳型として、該新興株中に存在する少なくとも１つのレプリキン配列を選択する工程、
（３）工程（２）において選択した少なくとも１つのレプリキン配列のアミノ酸配列を有するペプチドを合成する工程、及び
（４）治療的有効量の工程（３）のペプチドと、医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを組み合わせる工程、
を含む方法を供する。
【０２１４】
ほかの観点において、本発明は、診断、予防又は治療目的のためのインフルエンザウイルス新興株の同定方法であって：
（１）複数のインフルエンザウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株を得る工程；
（２）レプリキン配列の存在及び濃度のために複数のインフルエンザウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株の赤血球凝集素アミノ酸配列を分析する工程；
（３）少なくとも２つの時点におけるレプリキンの濃度を供するために、複数のインフルエンザウイルス株の各株の少なくとも１つの分離株の赤血球凝集素アミノ酸配列中のレプリキン配列の濃度と、少なくとも１つのより早い時点における各株の赤血球凝集素アミノ酸配列中に観察されるレプリキン配列の濃度を比較する工程であって、前記少なくとも１つのより早い時点が、工程（１）の前約６ヶ月から約３年以内である工程；及び
（４）少なくとも２つの時点において、レプリキン配列の濃度における最も高い増加を有するインフルエンザウイルス株を同定する工程、
を含む方法を対象とする。
【０２１５】
本発明のさらに他の観点において、インフルエンザウイルスの新興株の赤血球凝集素タンパク質中に存在する少なくとも１つの単離レプリキン、及び医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを含む予防的又は治療的インフルエンザウイルスワクチンが供される。
【０２１６】
また、本発明により、インフルエンザウイルスの新興株の赤血球凝集素タンパク質中に存在する少なくとも１つの単離レプリキン、及び医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを含む予防的又は治療的ワクチンを、それを必要とする患者に対して投与することを含む、インフルエンザウイルス感染の予防又は治療方法が供される。
【０２１７】
レプリキン及び関連構造を同定するためのコンピューターソフトウェア
レプリキン構造、レプリキン骨格構造及び変性エクソスケルトン骨格構造の同定は、バイオインフォマティクスの助けにより達成することができる。
【０２１８】
本発明の観点は、アミノ酸配列の複雑なパターン、例えば、レプリキンパターン、レプリキン骨格構造、エクソスケルトン骨格構造、及びアミノ酸及び核酸配列中の他の複雑なパターンを同定し及び／又は位置決定するためのシステム及び方法に向けられている。本発明の観点によれば、タンパク質データベースの問い合わせを促進するための技術が提供される。該問い合わせに対する応答として受け取られたタンパク質の記述については、本発明の観点は、受け取られたタンパク質の記述をスキャンして、レプリキンパターンを同定しかつ位置決定することを含む。ある観点によれば、レプリキンパターンは、それぞれが本発明の観点によって認識されることのできる以下の３つの（３）特徴を含む、７〜約５０アミノ酸の配列である。（１）該配列は、第二のリジン残基から６〜１０アミノ酸残基の位置に位置する少なくとも１つのリジン残基を有し；（２）該配列は、少なくとも１つのヒスチジン残基を有し；そして（３）該配列中の少なくとも６％のアミノ酸はリジン残基である。本発明の他の観点は、特定された長さの制約を有する複雑なアミノ酸配列を同定し及び／又は位置決定することができ、該配列はさらに、以下の特徴の任意の組み合わせを含む：（１）N位置超かつM位置未満、第二のアミノ酸残基から離れて位置する第一のアミノ酸残基；（２）配列の任意の場所に位置する第三のアミノ酸残基；及び（３）少なくともRパーセントの第四のアミノ酸残基。さらに他の観点によれば、本発明は同定されたアミノ酸配列の発生を計数し、そして計数された発生数を生の絶対値又は該タンパク質中のNアミノ酸あたりの同定されたアミノ酸配列の数の比率のいずれかとして報告することができる。本発明のさらに他の観点は、所与のタンパク質の変異体中における同定されたアミノ酸配列パターンの進化を経時的に分析することができ、そしてまた、複数の異なるタンパク質にわたって同定されたアミノ酸配列パターン例の間の類似性及び相違を経時的に分析することもできる。分析の結果として、本発明のさらに他の観点が、同定されたアミノ酸配列パターンの構成要素が突然変異及び／又は発生するときに、経時的にかつ異なるタンパク質間で保存されていると見られる潜在的なアミノ酸骨格構造を同定することができる。
【０２１９】
本発明の観点は、全体を通して同様の部分が同様の参照番号をつけられ、そして各参照番号の一番左の数字が参照された部分が最初に現れる図の番号を指す、添付の図面を参照しつつ記載されるであろう。
【０２２０】
図１７は、本発明の観点による、アミノ酸配列中のレプリキンパターンを同定するためのシステム及び方法を組み込んだコンピュータシステムの高度なブロック図である。図１７に示すように、コンピュータワークステーション６１０は、研究者がタンパク質データベースを検索し、そして選択されたアミノ酸パターンのためのタンパク質記述をスキャンすることを可能とするように構成されたプロセッサ及びメモリを含んでもよい。これらの機能を達成するために、コンピュータワークステーション６１０は、タンパク質及びアミノ酸リサーチシステム６３０を含んでよく、これはユーザー／研究者からの指示を受けてタンパク質検索及びアミノ酸スキャニング操作を行うことができる。ある観点によれば、タンパク質及びアミノ酸リサーチシステム６３０は、レプリキンパターンを含む特定のアミノ酸パターンについて、検索されたタンパク質及びアミノ酸配列を検索し及びスキャンするアミノ酸配列スキャナー６４０をさらにふくんでもよい。タンパク質及びアミノ酸リサーチシステム６３０は、ネットワークインターフェース６２０と連絡して、インターネットを含むことができるネットワーク６６０上の供給源からタンパク質配列及びアミノ酸配列を取得することができる。或いは、タンパク質及びアミノ酸リサーチシステム６３０は、ローカルなタンパク質データベース６５０からタンパク質配列及びアミノ酸配列を得ることができる。さらに、タンパク質及びアミノ酸リサーチシステム６３０は、キーボード入力などの他の入力手段から直接的にタンパク質配列及びアミノ酸配列を取得してもよい。タンパク質及びアミノ酸リサーチシステム６３０はまた、ネットワークインターフェース６２０と連絡して、ネットワーク６６０上の他のコンピュータに結果を伝送することができる。
【０２２１】
レプリキンパターンについての自動スキャニング
本発明の態様は、タンパク質内のアミノ酸の複雑なパターンを同定するための一般化された方法及びシステムを含んでもよい。タンパク質及びアミノ酸リサーチシステム６３０によって同定されるか又は選択されるいかなるタンパク質の定義にいついても、ユーザーは、アミノ酸のさまざまな複雑なパターンについて検索することに本発明の観点をむけさせることができる。アミノ酸の1つのパターンの例として、本発明は、レプリキンパターンを含むヌクレオチド又はアミノ酸配列を同定する方法を提供する。図１８は、本発明の態様にしたがってアミノ酸の配列中のレプリキンパターンを位置決定するための一般的な方法を図示する単純なフローチャートである。方法７００は、アミノ酸配列が得られた後に開始することができる。典型的には、アミノ酸配列は、図１２に与えられたコードにしたがってアルファベット文字によって表されることができる。しかしながら、他のコード化方法も同様に本発明の範囲内である。
【０２２２】
図１８を参照すると、アミノ酸配列がいったん得られれば、該配列はレプリキンパターンについて検索され（７１０）、これは、以下の特徴：
（１）該列は、７〜約５０のアミノ酸を含み；
（２）該列は、第二のリジン残基から６〜１０位置に位置する、少なくとも１つのリジン残基を含み；
（３）該列は、少なくとも１つのヒスチジン残基を含み；そして
（４）該列は、少なくとも６％のリジン残基を含む、を有するアミノ酸の配列（又は列）を含む。
【０２２３】
アミノ酸の列がレプリキンパターンとマッチすることが発見されたら、該列はそれに応じて同定されるか又は標識されることができる（７２０）。
【０２２４】
所与のアミノ酸配列は、レプリキンパターンにマッチする多くのサブ配列又は列を含むことができる。さらに、レプリキンパターンはお互いに重複してもよい。したがって、アミノ酸配列中ですべての可能なレプリキンパターンを位置決定し、そして同定するためには、方法７００はアミノ酸のもとの配列内に含まれるアミノ酸の各サブ配列について反復して起動することができる。
【０２２５】
アミノ酸配列中のすべての可能性のあるレプリキンパターンを同定し、そして位置決定するために方法７００が反復して起動される場合、本発明の観点は得られたレプリキンパターンの数を計数することができる。レプリキンの計測数は絶対値として報告されることができる。さらに、本発明の観点はまた、該配列中のNアミノ酸当たりのレプリキンの数の比率を決定することもできる。例えば、ある態様は、所与のタンパク質が１００アミノ酸あたり６の比率のレプリキンを含むと決定することができる。レプリキンの比率は、研究室での実験及び疫学的証拠によって示されて、所与のタンパク質が複製する速度に直接的に関係づけられた。タンパク質の高速複製は、病気の指標であることができる。例えば、レプリキンパターンの比較的高い比率の存在は、インフルエンザの流行と関係付けられた。同様に、タンパク質中で経時的に観察されたレプリキンパターンの計測数の増加は、該タンパク質がそこから得られた生物体によって引き起こされる将来の病気の指標であることもできる（例えば、図１５を参照のこと）。したがって、アミノ酸配列内でレプリキンパターンを検出しそして計数する能力は、本発明の顕著な利益である。
【０２２６】
なお図１８を参照すると、本発明の観点は、レプリキンパターンに類似した特徴を示す、アミノ酸の他の複雑なパターンを同定しそして位置決定するために、方法７００を利用することができる。すなわち、本発明のいくつかの観点が以下の：（１）アミノ酸間の距離、（２）認識されたアミノ酸配列の許容可能な長さ、及び（３）特定のアミノ酸のパーセンテージ又は濃度、の正確な値を特定することができるにもかかわらず、これらの正確な値は変数として表現されてもよい。したがって、研究者は、本発明の観点を採用して、以下の特徴：
（１）該配列は、rmin〜rmaxのアミノ酸を含み；
（２）該配列は、第二のリジン残基からkmin〜kmaxアミノ酸残基に位置する、少なくとも１つのリジン残基を含み；
（３）該配列は、少なくとも１つのヒスチジン残基を含み；そして
（４）該配列は、少なくともkパーセントのリジン残基を含む、を有する、タンパク質中のアミノ酸配列を同定することができる。
【０２２７】
図１９は、本発明の観点によって、所与のアミノ酸配列中の複数のレプリキンパターンを位置決定するための、一般化された方法８００を図示するフローチャートである。方法８００は、所与の配列中の第一のリジン残基を位置決定することによって開始する（８１０）。そして、方法８００は、第二のリジン残基が第一のリジン残基の位置kmin〜kmax内にあるか否かを決定することができる（８２０）。図１９に示すように、kminとkmaxは、第一及び第二のリジン残基の間の距離の限界を定義する。典型的なレプリキンパターンについては、kminは６に等しく、kmaxは１０に等しくなるであろう。しかしながら、これらの値は、他の類似のパターンを発見することに注目する研究者によって変更されうる。
【０２２８】
方法８００がお互いに十分に近い2つのリジン残基を同定したら（８２０）、方法８００は、第一及び第二リジン残基両方のrmax位置以内にあるそれぞれのヒスチジン残基を調べることができる（８３０）。典型的なレプリキンパターンを同定しそして位置決定するために方法８００が採用される場合、通常、rmaxは５０に等しく設定されるであろう。ステップ（８１０）及び（８２０）において同定された２つのリジン残基のrmax位置以内にある各ヒスチジン残基について、方法８００が第一のリジン残基、第二のリジン残基及び同定されたヒスチジン残基を含む、最も短いアミノ酸残基の列を構築するであろう（８４０）。そして、方法８００は、その最短の列の長さが所望の範囲内にあるか否か、すなわち、それが少なくともrminのアミノ酸残基、かつrmax以下のアミノ酸残基を含むか否か、を決定するであろう（８５０）。最後に、同定されたアミノ酸の列が少なくともkパーセントのリジン残基もを含む場合（８６０）、該列は所望のレプリキン様パターンに適合すると同定されるであろう（８７０）。
【０２２９】
なお、図１９を参照すると、方法８００が単一の所与のアミノ酸配列からいくつかのレプリキン様パターンを同定することができることは明らかである。これは、方法８００が2つの同定されたリジン残基のrmax位置以内にある1つ超のヒスチジン残基を調べることができるために、起こるかもしれない。同定された各ヒスチジン残基は、2つのリジン残基と一緒になって、所望のレプリキン様パターンにマッチしてもよい。
【０２３０】
図１９によって図示された方法の１つの観点が図２０に示され、これは、本発明の観点によって、所与のアミノ酸配列中に存在するすべてのレプリキンパターンを発見するための手順を含む、ソースコードリストである。図２０に示される「マッチ（match）」手順は、「Tcl」と呼ばれるインタプリト型シェル言語でプログラムされ、直接的な様式でレプリキンを認識する。本分野で知られているとおり、「ツールコマンドランゲージ（Tool Command Language）」又はTcl（「ティクル」と発音する）は、そのルーツをUnix（登録商標）コマンドシェルに有する、インタプリト型のスクリプト言語であるが、ネットワークコミュニケーション、インターネット機能及びグラフィカル・ユーザーインターフェースの急速な発達によく適合したさらなる能力を有する。
【０２３１】
レプリキンパターンを認識する他の方法も、本発明の教示に含まれる。例えば、図２０に示されるマッチ手順は、Java（登録商標）又はC又はC++などの他のプログラミング言語に実装されることができた。さらに、レプリキン認識アルゴリズムの他の態様は、任意の順番でレプリキンパターンの特徴を同定することができ、そしてまた、再帰的手順、反復手順、パラレル処理法、分割統治法、又はその任意の組み合わせを用いてアミノ酸配列及びサブ配列の構成要素を全検索することもできる。
【０２３２】
タンパク質検索エンジン
図１７に戻って、本発明は、タンパク質の定義を検索するために、ローカルに又はインターネットなどのネットワーク全体にわたってアミノ酸及びタンパク質データベースにアクセスしそして情報をやりとりする検索エンジンを含むことができる。例えば、タンパク質及びアミノ酸リサーチシステム６３０は、ユーザーからタンパク質検索基準を受容することができ、そして、供給された検索基準にマッチするタンパク質の定義を検索するための、複数のオンラインのアミノ酸及びタンパク質データベース検索エンジンにアクセスすることができる。タンパク質データベース検索基準は、任意のオンラインタンパク質又はアミノ酸検索エンジンにおける有効な検索タームを形成することのできる任意のテキスト列を含むことができる。典型的には、これらの検索基準は、各特定のタンパク質を記述するプリントアウトにおいて見出されることのできるテキストに関連する。例えば、ユーザーが検索基準「A型インフルエンザ」を与えた場合、本発明の観点は、このテキスト列を複数のインターネットタンパク質及びアミノ酸検索エンジンに転送することができ、上記検索エンジンはそれぞれ、ターム「A型インフルエンザ」を含むそのデータベース中に発見された任意のタンパク質記述を戻すことができる。アミノ酸配列スキャナー６４０を使用して、戻されたタンパク質の記述のそれぞれは、レプリキンパターンの存在についてスキャンされることができる。
【０２３３】
本発明のさらなる観点は、ユーザーに、複数のインターネットタンパク質検索エンジンを取捨選択すること、及び選択されたオンラインタンパク質検索エンジンのそれぞれのための本発明の検索基準とタンパク質検索能力をカスタマイズすることを可能とする。さらに、本発明の観点はまた、ユーザーがローカルなタンパク質データベース６５０にアクセスし、又は、例えば、タンパク質の定義を含むローカルファイルネームを供給するか、又はコンピューターソフトウェアにパラメータを供給するための本分野で知られた他の方法によって特定のタンパク質の定義を直接的に供給することを可能とする。
【０２３４】
本発明のほかの観点は、タンパク質定義又はアミノ酸配列定義を検索するためにインターネット上のアミノ酸及びタンパク質データベースにアクセスしそして情報をやりとりする検索エンジンを含んでよい。ユーザーからタンパク質又はアミノ酸配列検索基準を受け取った後、供された検索基準にマッチするタンパク質定義又はアミノ酸定義を検索するために、本発明はオンラインアクセスを介して複数のアミノ酸及びタンパク質データベース検索エンジンにアクセスすることができる。
【０２３５】
既存定義に基づく初期の既存タンパク質検索基準は、いずれかのオンラインタンパク質又はアミノ酸検索エンジンにおいて有効な検索用語を形成できるいずれかのテキスト文字列を含むことができる。典型的には、これらの検索基準は、各特定のタンパク質を記載するプリント中に発見できるテキストに関係する。例えば、ユーザーが検索基準「Ａ型インフルエンザ」を供給する場合、本発明は、複数のインターネットタンパク質及びアミノ酸検索エンジンに該テキスト文字列を送り、その後、それぞれ、「Ａ型インフルエンザ」の語を含むこれらのデータベース中のいずれかのタンパク質定義を返信する。
【０２３６】
「Genome Explorer」と題されるタンパク質検索エンジンを含む本発明の制限のない観点は、付録A中に含まれる。「GenomalEnquire」と称されるTcl手順はタンパク質検索エンジンのマクロレベル操作を制御できる（「proc GenomalEnquire｛detabase term additional Criteria｝を参照）。手順GenomalEnquireにおいて、一連の特定のオンラインタンパク質検索エンジンは、ユーザーが供したタンパク質検索用語及び更なる基準を用いてアクセスし、質問することができる。本発明の更なる観点は、複数のインターネットタンパク質検索エンジンを選択又は除外すること、そしてそれぞれの選択したオンラインタンパク質検索エンジンについて本発明の検索基準及びタンパク質検索能力をカスタマイズすることをユーザーに許容する。更に、本発明の観点はまた、ローカルタンパク質データベースにアクセスし、あるいは特定の定義を、例えば、タンパク質定義を含むローカルファイル名により、又はコンピューターソフトウェアにパラメータを供給するために当業界に知られる他の方法により直接供することをユーザーに許容することができる。
【０２３７】
Genome Exploreを操作するための説明は付録Bに含まれる。Genome Exploreアプリケーションのスクリーン写真は付録Cに含まれる。
【０２３８】
レプリキン分析
本発明の態様は、アミノ酸配列中のレプリキンパターンを同定し、そして位置決定するためだけに利用されるものではない。実施例は、異なるタンパク質中に発生するレプリキンパターンの構造における類似性を発見して分析するため、又は同じタンパク質中に経時的に発生する異なるレプリキンパターンを分析するためにも使用することができる。例えば、図２１は、レプリキン骨格又は「トリインフルエンザ（Bird Flu）」インフルエンザウイルス中に１９１７年〜２００４年の８７年間にわたって保存されてきた「固定骨格」構造を示す表である。本発明の態様は、同じタンパク質の変異体中に発見されたレプリキンパターンを含む、タンパク質中に発見された多数のレプリキンパターンを集めることができる。各レプリキンパターンとともに、本発明の観点は各タンパク質が最初に同定された日付も付随することができる。研究者によって指導される場合、レプリキンパターン中に経時的に保存され、そして異なるタンパク質並びに同じタンパク質の変異体中に存在することのできる実質的に固定されたアミノ酸構造を明らかにするために、本発明の観点は、複数の選択されたレプリキンパターンを、内容、日付又は他の基準によってソーティングし及びディスプレイすることを含んでよい。さらに、研究者によって指導される場合、かかる固定されたアミノ酸構造を自動的に同定するために、本発明の観点は複数の選択されたレプリキンパターンを比較するための既知のパターン分析方法を採用してもよい。例として、図２１においては、示されたレプリキンパターンは−この場合−アミノ末端において一対のリジン残基（kk）で始り、カルボキシル末端において一対のヒスチジン残基（hh）で終わり、そしてリジン残基を８、１０又は１１位のいずれかに含む、（通常）２９アミノ酸の比較的固定された骨格構造を示しているようである。何十年にもわたるこの骨格構造の保存は、合成ワクチンが迅速かつ安価に調製されることを可能とする。レプリキン骨格構造が同定された後、かかるワクチンを合成するために、研究者は経時的に保存され、そしてタンパク質の現在の変異体中にも存在するその骨格構造の構成要素を選択することができる。その後、ワクチンは骨格構造から選択された構成要素に基づいて調製されることができる。かかるワクチンは保存された骨格構造に基づくため、それらは何年もの間有効であり、かつ予想される大流行よりも充分前に開発されることができる。
【０２３９】
レプリキン自体の発見並びにレプリキンパターンの同定及び位置決定のための本発明の観点は、病原体の同定のための標的を提供し、並びにワクチンを含む抗病原体療法を促進する。一般に、ペプチドのレプリキンファミリーについての知識及び同定は、レプリキンを有する任意の生物のための有効な治療及びワクチンの開発を可能とする。特に、レプリキンの同定は、インフルエンザウイルスを含むウイルスの検出及びウイルスワクチンの開発に備える。さらに、レプリキンの同定は、レプリキン構造を標的とする治療及びワクチンの開発を可能とすることに加えて、マラリア、炭疽、及び天然痘ウイルスなどの他の病原体の検出にも備える。感染性疾患のレプリキン、癌免疫レプリキン、及び構造タンパク質レプリキンの検出を含むレプリキンの同定によってさらなる例が提供される。
【０２４０】
本発明の態様は、従来技術では見いだされなかったやり方で、アミノ酸の重要なレプリキンパターンが認識され、位置決定され、そして分析されることを可能とする。従来技術の能力を用いて、研究者らはアミノ酸の配列を記述するための現存する技術に限定されてきた。実際に、従来技術の限界は、この分野における研究の勢いを何らかの方法で弱めるものであり、それは、非直線の属性を含むアミノ酸の配列を特定することがこれまでできなかったからである。本発明の方法及び態様が開発されるまで、アミノ酸配列の記述は、せいぜい反復するサブ配列及びサブ配列成分に対する論理的制約を含むものであった。本発明の観点は、従来技術において見出されないツールを用いて、アミノ酸の新たなクラスを発見し、位置決定し、そして分析することを可能とする。このアミノ酸の新たなクラスは、特定のアミノ酸濃度及び特定のアミノ酸間の距離関係などの属性に特徴を有する。これらの属性は、単純な隣接する順番を超越し、そしてしたがって、本分野で知られた現存の方法では容易に記述され、発見されまたは位置決定されない。
【０２４１】
例えば、厳密なアミノ酸配列適合（相同性）の調査が、BLASTのような他の広く使用されるプログラムにより行われるよりも、本発明者は、アミノ酸グルーピングの新規なクラスを定義する高速複製に関するユニークな定量的「言語」を発見した。本明細書に記載される新規なコンピュータープログラムは、該新規な言語の例に関する。
【０２４２】
これらのプログラムは、所定の基準に適うアミノ酸サブシーケンスについての電子データを検索するための機能を含む。オンラインにより得られる該データは、タンパク質配列の特定のグループを定義するデータを含むことができる。
該基準は：
i)２つのアミノ酸のタンパク質配列中の出現、この場合、該配列中の特定の濃度におけるリジン（Ｋ）及びヒスチジン（Ｈ）
ii）該配列中のこれらの（Ｋ）の１つから第二のＫの間隔、及び
iii)規定されたパーセンテージ異常のパーセンテージにおける１又は複数のアミノ酸（例えばＫ）の濃度
を含むことができる。
【０２４３】
上記基準に適うアミノ酸配列は、特定の生物機能、例えば、高速複製に関連する。
【０２４４】
該プログラムは、ゲノム配列においてレプリキンサブシーケンスを同定するための能力を含む。該ゲノム配列の１つのソースは、ユーザーにより供される検索基準を使用して、オンライン、電子データベースから得られたゲノム配列を公開することができる。本発明の観点において、該データベースは、ＮＣＢＩ（全米バイオテクノロジー情報センター）又はＬＡＮＬ（ロスアラモス国立研究所）データベースであってよい。該プログラムはさらに、ユーザーが供した基準に基づき、任意のサブシーケンス（すなわち、レプリキンサブシーケンスのみでない）について検索するための能力を含む。
【０２４５】
１つの観点において、「Genome Explorer」と題されたプログラムは、検索タームについてユーザーの迅速化をもたらすユーザーインターフェースを作成することができる。Genome Explorerは、未加工の配列データを得るために、オンラインデータベース、例えば、ＮＣＢＩ又はＬＡＮＬデータベースに該検索タームを適用することができる。例えば、検索タームにマッチする全ての未加工の配列についての文献名、タンパク質ソース、株、血清型、及び発見年等のさらなるデータを更に得ることができる。該未加工データが獲得されると、Genome Explorerは更に、未加工配列中のレプリキンサブシーケンスを同定するために追加的な検索基準を適用することができる。該検索基準は、Genome Explorerにより報告される一致するサブシーケンスのセットを含むことができる比較的厳格な又は比較的緩和な定義を実行するように、ユーザーによって特定することができる。これがレプリキンサブシーケンスを同定すると、Genome Explorerは進行中の統計をコンパイルし、そしてユーザーインターフェース中のプログレスバーを表示することができる。Genome Explorerがその処理を完了すると、データファイル中に得られた統計をセーブすることができる。例えば、該データファイルは、結果の検査のためのいずれかのワードプロセッサー中で開くことができるＨＴＭＬであってよい。
【０２４６】
ほかの観点において、レプリキンサブシーケンス以外のサブシーケンスを同定するために「Dr. Peptide」と題されるプログラムの検索基準を適用することができる。Dr. Peptideにより、公的に利用可能なゲノムデータベースにおいて、例えば、最大１５個のアミノ酸により分離される、配列ｈｌｋ・・・・・・・ｈｌｋの全ての例を検索することが可能である。これらの検索は、合致する基準に基づきタンパク質の新たな統計的プロフィール及び新たなグルーピングを創作することを許容する。Dr. PeptideはGenome Explorerとほとんど同じ機能を含むことができる。例えば、Genome Explorerのように、Dr. Peptideは、ユーザーインターフェースを介して、ユーザーの検索タームを迅速化し、そして未加工の配列データを得るために、オンラインデータベース、例えば、ＮＣＢＩ又はＬＡＮＬデータベースに対して該検索タームを適用することができる。例えば、検索タームにマッチする全ての未加工の配列についての文献名、タンパク質ソース、株、血清型、及び発見年等のさらなるデータを更に得ることができる。未加工データが獲得されると、Dr. Peptideはさらに、任意のサブシーケンスを同定するためにデータを処理し、そしてデータファイル中の、例えば、いずれかのワードプロセッサーで開くことができるＨＴＭＬページ形態においてそのアウトプットを提示することができる。
【０２４７】
以下は、Genome Explorer中に含むことができる論理シーケンスの例の説明である。該説明において、「初期サーバー照会」は、１又は複数のネットワーク構成要素、例えば、サーバーコンピューター、タンパク質配列を示す記憶電子データに適用される検索基準を意味する。該ネットワーク構成要素は、プライベートネットワーク、又は例えば、インターネット中に含むことができる。該データは、「タンパク質ページ」、すなわちタンパク質配列を表すデータの量子の形態において存在することができる。文字「ｋ」はリジンアミノ酸を、そして文字「ｈ」はヒスチジンアミノ酸を表す。
【０２４８】
Genome Explorer論理シーケンス
ユーザーインターフェース手順を初期化し、そして検索パラメータについての分野を入力する。
ユーザーインターフェースを構築する。
検索パラメータを特定するためにユーザーを待つ。
検索パラメータは以下を含む：
（１）概略及びタンパク質ページを得るための初期サーバー照会においてマッチするワード又はフレーズ、
（２）セットを制限するための、サブシーケンスについてのｋ最小・・・ｋ最大の範囲として表現される、ｋ間の許容距離。
（３）セットを制限するための、サブシーケンスについてのｋ最小＋１・・・ｋ最大として表現される、ｈと最も遠いｋとの間の距離の許容範囲。
（４）セットを制限するための、サブシーケンスについてのｘパーセント又はそれ以上として表現される、サブシーケンス中のｋの許容フラクション。
【０２４９】
検索パラメータが特定されると、ＨＴＭＬフォーマット中の出力ファイルを初期化する−これらはレポートを表示するために使用される。
特定された検索パラメータを以前の検索と比較する。
該サーチパラメータが同一である場合、データ入力としてキャッシュされたタンパク質ページを再利用する。
該サーチパラメータが同一でない（キャッシュされたタンパク質ページが関連しない）場合、サーバー（ＮＣＢＩ又はＬＡＮＬ）に照会を送る。
全ての概略を返信しない場合、全ての概略を要求する照会を再度送る。
各概略について、取り込んだタンパク質ページをフェッチし、そしてセーブする。
取り込んだ各タンパク質ページについて、
ＮＣＢＩ由来の場合、
ＡＳＮページを解析する。
発見した配列データ（seq-data.ncbieaa)を抽出する。
文献名（descr.*.article.title.*.name)を抽出する。
タンパク質ソース（source.org.taxname)を抽出する。
株（subtype)を抽出する。
発見年を引き出す。
血清型を引き出す。
ＬＡＮＬ由来の場合、
株、定義、ソース、年、血清型、及び未加工ヌクレオチド配列について、ＨＴＭＬページを解析する。
アミノ酸に相当する配列中の各３つのヌクレオチドをマッピングすることにより、ヌクレオチドをアミノ酸に変換する。
該タンパク質について解析した値をセーブする。
各解析したページについて、プログレスバーを介して進行についてユーザーインターフェースをアップデートし、そして：
該ページ上で発見された各配列データについて、
以下にマッチする各サブシーケンスについてのアミノ酸配列データをスキャンする。
（ａ）上記ユーザーインターフェース由来のパラメータ（２）に定義されるとおり、ｋ間の距離はｋ最小・・・ｋ最大の範囲における。
（ｂ）（ａ）上記ユーザーインターフェース由来のパラメータ（３）に定義されるとおり、ｈと最も遠いｋとの間の距離はｋ最小＋１・・・ｋ最大の範囲内である。
（ｃ）上記ユーザーインターフェース由来のパラメータ（４）に定義されるとおり、サブシーケンス中のｋ単位のフラクションはｘパーセント又は以上として表現される。
そしてオーバーラップを含む、各マッチするサブシーケンスの範囲をセーブする。
マッチしない配列は無視する。
最もサブシーケンスマッチを伴う配列を受け取る。
配列を受け取ると、それが発見された年により各配列を列記する。
各基準の追加セットについて、
他の解析フィールドに対する追加基準をチェックする。
マッチしない場合、ページを受け入れない。
該ページを受け入れると、
合格ページとしてこれを追加する。
完全配列及び全てのマッチしたサブシーケンスを示すＨＴＭＬページを作成する。
ページを受け入れない場合、
不合格ページとしてこれを追加する。
各ユニークなマッチしたレプリキン配列について、
アミノ酸履歴ＨＴＭＬページを作成し、
年順序において生じた全てのタンパク質を示す。
以下を表す統計ＨＴＭＬページを作成する：
各年について、
マッチしたタンパク質及びレプリキンサブシーケンスの番号を示す。
操作が完了したことを反映するために、ユーザーインターフェースをアップデートする。
ユーザーにより特定される検索パラメータの次のセットを許容するために入力フィールドを再初期化する。
【０２５０】
先の説明を考慮すると、Genome Explorerは、複数の基準を、タンパク質配列を表すデータに適用し、そして該基準に基づき該タンパク質配列中のサブシーケンスを同定することを含む方法であって、該同定されたサブシーケンスは、ヒスチジンアミノ酸と最も遠いリジンアミノ酸の間の距離の所定の許容範囲を有する方法を実行することが理解できる。同定されたサブシーケンスはデータファイルに出力することができる。
【０２５１】
本明細書中の観点の機能は、プログラムの命令を実行する多様なコンピュータプラットフォームに提供されることができる。そのような1つのプラットフォーム１１００が図２２の単純化されたブロックダイアグラム中に例解される。そこでは、プラットフォーム１１００は、プロセッサ１６００によって仮定されたように示され、これは、バスサブシステム１１５０を介して多数の周辺デバイスと連絡する。これらの周辺デバイスは、典型的に、メモリサブシステム１１１０、ネットワークインターフェースサブシステム１１７０、及び入力／出力（I/O）ユニット１１８０を含む。プロセッサ１１６０は、マイクロプロセッサ、デジタルシグナルプロセッサ及びフィールドプログラマブル論理アレイを含む、複数の慣用のプロセシングシステムのいずれであることもできる。いくつかのアプリケーションにおいては、プラットフォーム１１００に複数のプロセッサ（示さない）を提供することが有利であることができる。プロセッサ１１６０は、メモリサブシステム１１１０中に記録されたプログラムの命令を実行する。メモリサブシステム１１１０は、電気的、磁気的、又は光学的メモリシステムを含む慣用のメモリサーキットの任意の組み合わせを含むことができる。図２２に示すように、メモリシステムは、リードオンリーメモリ１１２０、ランダムアクセスメモリ１１３０及びバルク記憶装置１１４０を含むことができる。メモリサブシステム１１１０は、本明細書に記載の様々な方法を表すプログラムの命令を記憶するのみでなく、これらの方法が実行されるデータアイテムを記憶することもできる。ネットワークインターフェースサブシステム１１７０は、外部ネットワークに、インターネットなどを含むネットワーク１１９０と連絡するインターフェースを含むインターフェースを提供することができる。I/Oユニット１１８０は、外部デバイス（示していない）との連絡を可能とするであろう。
【０２５２】
本発明のいくつかの観点を、本明細書に特別に例解し、記載した。しかしながら、本発明の改変及び変更が、本発明の精神及び意図した範囲を離れることなく、本発明の教示に包含されることは理解されるであろう。さらに、本発明の教示は、これまで限定された連続的な線形分析を用いて特異的な配列の構成要素の同定にこれまで取り組んできた他の配列認識に関する問題に適合されることができる。
【０２５３】
付録A中に含まれる代表的なソフトウェアを使用して、本発明者は、本発明に従う制限のない観点において、エビ白斑ウイルスのヌクレオカプシドタンパク質が、例外的に、現在までにレプリキンの調査対象となった全ての他のウイルス及び生物体（マラリアを除く）と比較して、高いレプリキン計数を有することが発見された。レプリキンは、真菌、酵母、ウイルス、細菌、藻類、及び癌細胞における高速複製の必須の随伴物であることが示されてきたが、本発明者は、藻類以外の海洋生物におけるレプリキンの存在の最初の実証を供した。そして、藻類によるように、レプリキンの存在は再度迅速な蔓延に関係する。エビにおいて、白斑ウイルスは、最初に東半球の国々において、そして現在は西半球の国々において、エビの回収に数百万ドルの損害を与えている。レプリキンの高い死亡率の海洋ウイルス疾患のほかの例は、魚、例えば、コイ及びサケにおける出血性疾患中で我々により実証され、そして海洋生物及び疾患においておそらく広範囲に及ぶ。
【０２５４】
エビ白斑症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）のヌクレオカプシドタンパク質のレプリキンの反復配列の存在は、１０３．８以上の高いレプリキン計数を明らかにする。このウイルスレプリキン計数は、例えば、通常１以下から最大５又は７の範囲であるインフルエンザウイルスのレプリキン計数よりも極めて高く、そして１１１の熱帯熱マラリア原虫（マラリア）において観察されるレプリキン計数の記録（これまでのところ）に唯一匹敵する。興味深いことに、エビ白斑症候群生物体はウイルスであり、そして熱帯熱マラリア原虫はトリパノソーマであるが、これらは共に赤血球におけるこれらの生殖周期の主要部分を用い、エビ（白斑ウイルス）又はヒト（マラリア）のいずれの異常な宿主細胞は共に、これらの宿主の高い死亡率を伴い高速複製疾患を爆発し、そして共にこれらの高いレプリキン計数をこのような記録的な高さに増加する同じ方法、すなわちレプリキン反復及びレプリキン重複を用いるように見える。
【０２５５】
表１０に示されるとおり、レプリキン反復及びレプリキン重複の例は、出願人によって、以下に示されるとおり、エビ白斑症候群ウイルスの上記ヌクレオカプシドタンパク質中に発見された。付録Aに供される代表的なソフトウェアを使用して、４９７のレプリキンが白斑ウイルス中に発見された。これらの４９７のうち、以下の表１０に示されるレプリキンはこれらの短い配列のために選択され、そして本願を介して実証されるとおり、高濃度のリジンが高い致死率に関係しているようである。選択された配列は表１０に含まれていないより長い配列よりも合成が容易であり、かつ費用がかからない。
【０２５６】
表１０は、１０３．８のレプリキン計数（１００個のアミノ酸あたりのレプリキン数）（４７９個のアミノ酸あたり４９７の総レプリキン）を伴う、エビ白斑症候群ウイルス（ＷＳＳＶ）ヌクレオカプシドタンパク質（ＶＰ３５）遺伝子中の分子内レプリキン反復及びレプリキン重複を示す。
【表２４】
2008539164.tif 000030
【０２５７】
今や我々は本願に記載したソフトウェアを使用してレプリキンを同定することが可能であるため、我々はこれらのそれぞれを合成し、そして抗体及び他の阻害生成物について、並びにエビ白斑症候群ウイルス、特に各反復レプリキンに対する特定の合成ワクチンのための標的としてこれらを使用することができる。
【０２５８】
反復の現象はタンパク質構造において周知である。該ケースにおいてユニーク且つ特異的なことは、これらがレプリキン反復であることである。従って、特定のレプリキン配列の反復は、特定の分子中のレプリキン計数を増加し、そしてマラリアにおける熱帯熱マラリア原虫におけるＡＴＰａｓｅの場合のように、より高速の複製に関連し、従って該分子及びこれを含む生物体についてのみかけ上の生存価を有し、同時にこれは、いわゆる「弱点」である増加する脆弱性を供する。従ってレプリキン反復は、分子あたりのより高い濃度、これらのレプリキンに対して産生された特異的な合成ワクチンにより産生される特異的な抗体、及び他の特異的な抗レプリキン剤による攻撃のための追加的な標的部位を供する。これらの新たな標的は、これらを同定できなかったために、以前には利用することができなかった。
【０２５９】
複合アミノ酸分析
本発明のさらなる観点は、オンラインデータベースにおける汎用アミノ酸及び核酸パターンの同定に関するタンパク質検索エンジンを含む。付録Dは、複合アミノ酸パターン、例えば、エクソスケルトン骨格の同定に関する代表的なタンパク質検索エンジンである。付録Dは「Dr. peptide」と題される。付録Dは、本発明の代表的な制限のない観点であり、そしてレプリキンパターンに追加して汎用のアミノ酸パターンを同定するために設計された。
【０２６０】
以下は、Dr. peptideプログラム中に含むことができる論理シーケンスの１つの例の説明である。該説明において、「初期サーバー照会」は、１又は複数のネットワーク構成要素、例えば、サーバーコンピューター、タンパク質配列を示す記憶電子データに適用される検索基準を意味する。該ネットワーク構成要素は、プライベートネットワーク、又は例えば、インターネット中に含むことができる。該データは、「タンパク質ページ」、すなわちタンパク質配列を表すデータの量子の形態において存在することができる。
【０２６１】
Dr. peptide 論理シーケンス
ユーザーインターフェース手順を初期化し、そして検索パラメータについての分野を入力する。
ユーザーインターフェースを構築する。
以下を含む検索パラメータを特定するためにユーザーを待つ：
（１）概略及びタンパク質ページを得るための初期サーバー照会中にマッチするワード又はフレーズ、
（２）セットを制限する、いずれかのサブシーケンス中に含まれなければならない特定のアミノ酸のセット。
（３）セットを制限する、いずれかのサブシーケンス中から除外されなければならない特定のアミノ酸のセット。
（４）セット包含及び除外基準（２）及び（３）に適用される、ギャップをスペーシングする許容サイズについての最小ｍ及び最大ｎサイズ。
【０２６２】
検索パラメータが特定されると、
質問（query)：
セーブされたタンパク質ページが関連しない場合、
照会をサーバーに送る（ＮＣＢＩ又はＬＡＮＬ）。
全ての概略を返信しなかった場合、
全ての概略を要求する照会を再度送る。
各概略について、
タンパク質ページをフェッチし、そしてセーブする。
各タンパク質ページについて、
ＮＣＢＩ由来の場合、
ＡＳＮページを解析する。
発見した配列データ（seq-data.ncbieaa)を抽出する。
文献名（descr.*.article.title.*.name)を抽出する。
タンパク質ソース（source.org.taxname)を抽出する。
株（subtype)を抽出する。
発見年を引き出す。
血清型を引き出す。
ＬＡＮＬ由来の場合、
株、定義、ソース、年、血清型、及び未加工ヌクレオチド配列について、ＨＴＭＬページを解析する。
アミノ酸に相当する配列中の各３つのヌクレオチドをマッピングすることにより、ヌクレオチドをアミノ酸に変換する。
該タンパク質について解析した値をセーブする。
各解析したページについて、
該ページ上で発見された各配列データについて、
各サブシーケンスマッチングについてのアミノ酸配列データをスキャンする。
該マッチパターンは別の工程の配列である。
（ａ）上記ユーザーパラメータ（２）に定義されるとおり、該アミノ酸配列データ中のアミノ酸が特定のアミノ酸のセットに存在する。
（ｂ）上記ユーザーパラメータ（３）に定義されるとおり、該アミノ酸配列データ中のアミノ酸が特定のアミノ酸のセットに存在しない。
（ｃ）上記ユーザーパラメータ（４）に定義されるとおり、該アミノ酸配列データ中のアミノ酸が、他のアミノ酸からのｍからｎのアミノ酸のスペーシングギャップを有する。
初期サブシーケンスセットが全ての可能な末端配列、又は第一パターン工程における配列データの「尾部」であり、
サブシーケンスのセットがエンプティーでない場合、
１つのサブシーケンスを除去し、そしてパターン文字列においてその評価が及ぶ距離を記録する。
現在のパターン工程におけるアミノ酸が、
−特定のアミノ酸のセット中に存在する場合、
サブシーケンスの次のアミノ酸がまたアミノ酸のセット中に存在するならば、
伸長したサブシーケンス及び次のパターン工程をサブシーケンスに加える。
−特定のアミノ酸のセット中に存在しない場合、
サブシーケンスの次のアミノ酸がアミノ酸のセットの１つではないならば、
伸長したサブシーケンス及び次のパターン工程をサブシーケンスに加える。
−ｍ〜ｎのいずれかのアミノ酸のギャップを有する場合、
まず、各可能な長さｍ〜ｎについての各サブシーケンスを伸長し、
次に該サブシーケンスの各伸長したバージョンをサブシーケンスセットに加える。
上記パターンが消耗される場合、
該サブシーケンスはマッチしたサブシーケンスである。
マッチしない配列は無視する。
最もサブシーケンスマッチを伴う配列を受け取る。
配列を受け取ると、
それが発見された年により各配列を列記する。
各基準の追加セットについて、
他の解析フィールドに対する追加基準をチェックする。
マッチしない場合、ページを受け入れない。
該ページを受け入れると、
合格ページとしてこれを追加する。
完全配列及び全てのマッチしたサブシーケンスを示すＨＴＭＬページを作成する。
ページを受け入れない場合、
不合格ページとしてこれを追加する。
【０２６３】
先の説明を考慮すると、Dr. Peptide は、複数の基準を、タンパク質配列を表すデータに適用し、そして該基準に基づき該タンパク質配列中の任意のサブシーケンスを同定することを含む方法を実行することが理解できる。同定されたサブシーケンスはデータファイルに出力することができる。同定されたサブシーケンスはデータファイルに出力することができる。該基準は：
サブシーケンス中に含まれるアミノ酸のセット｛ａ｝；
サブシーケンスから除外されるアミノ酸のセット｛ｂ｝；及び
セット｛ａ｝及び｛ｂ｝のメンバー間の最小及び最大許容ギャップ、を含んでよい。
【０２６４】
本発明の制限されない例示的な観点は、非レプリキン配列に変性するがレプリキン骨格の骨格構造を維持するインフルエンザの初期株中のレプリキン骨格配列を分析するための複合アミノ酸分析を利用する。汎用アミノ酸パターンを同定するための付録D中の例示的かつ非制限的なソフトウェアプログラムの使用の例として、本発明者は、タンパク質配列の視覚的スキャンにより（このたびDr. Peptide ソフトウェアにより）、特定のインフルエンザ種の早期発生検体において何がレプリキン骨格なのか、後の検体において何が以下のとおり変化したのかを発見した：
１）２９個のアミノ酸の長さが保存された；
２）最初の２つのアミノ酸位置（１及び２）、すなわちＫＫが保存された。
３）最後の２つのアミノ酸位置（２８及び２９）、すなわちＨＨが保存された。
４）しかしながら、ＫＫから６〜１０個のアミノ酸であるＫはもはや存在しなかった（レプリキンの定義に必要とされる）。
【０２６５】
このように、該骨格はもはやレプリキン骨格ではないが、いわゆるエクソスケルトン骨格（Scaffold Exoskeleton)である。レプリキン骨格は高いレプリキン計数及び流行の発生に関係するが、エクソスケルトン骨格はウイルス休眠及び流行の減退及び終了に関係する。従って、エクソスケルトン骨格はレプリキン骨格及び特定のウイルス大流行が減退する場合に残基として残された変性構造であり、従って該目的のための有用な特徴的な構造であるようにみえる。これは、１）抗高速複製剤、例えば、抗体又は低分子干渉ＲＮＡのための標的、及び２）抗ウイルスワクチンの基礎、としてレプリキン骨格の新事実及び用途を確認する。本発明の観点に従うソフトウェアは、上記の特徴１、２、３及び４を有する配列を同定するために、タンパク質を得て分析するための論理を含むことができる。例えば、エクソスケルトン骨格は現在、付録Dにおける代表的なソフトフェアにより、いずれかのタンパク質配列中において検出及び計測することができる。
【０２６６】
本発明に関するほかの制限のない観点は、レプリキン骨格を同定する方法であって、
（１）末端リジンを同定する工程；
（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接する残基位置における他のヒスチジンを同定する工程；
（３）少なくとも１つの他のリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基中の少なくとも１つのリジンを同定する工程；及び
（４）少なくとも約６％のリジンを同定する工程、
をさらに含んで成る、約１７〜約３０個のアミノ酸を含む一連のペプチドを同定することを含む方法である。
【０２６７】
本発明に関する制限のない観点において、レプリキン骨格を同定する方法は、一連のレプリキン骨格の単一又は複数の個々のメンバーを同定することを含んでよい。
【０２６８】
本発明に関する好ましい制限のない観点において、レプリキン骨格を同定する方法は、さらに、末端リジンに直接隣接する第二のリジンの同定を含む。本発明の観点に従うソフトウェアは、上記工程１、２、３及び４を使用して配列を同定するために、タンパク質配列を得てそして分析するためのロジックを含むことができる。
【０２６９】
Ｔｃｌプログラム言語
Ｔｃｌ（「チックル」と称する「ツール・コマンド言語」）は、Unix（登録商標）コマンドシェルにおけるルーツを有するが、ネットワークコミュニケーション、インターネット機能及びグラフィカル・ユーザーインターフェースによく適合する追加的な性能を有する単純なインタープリタ型スクリプト言語である。Ｔｃｌはカリフォルニア大学バークレー校のJohn k. Ousterhoutにより1988年に作成された。多様なソフトウェアツールのための再利用可能で、組み込み可能な言語コアとして最初は考えられたが、現在は、ウェブスクリプト、テスト・オートメーション、ネットワーク及びシステム・マネージメントを含むアプリケーション、並びに多様なほかの分野において広く使用される。
【０２７０】
本発明の観点において、Genome Explorer 及びDr. Peptideは、インターネットアクセス、ユーザーインターフェースデザイン、及び文字列処理のために強力な能力を含むスクリプトプログラム言語であるＴｃｌ／Ｔｋにおいてコードすることができる。Ｔｃｌ／Ｔｋは、殆ど全ての利用可能なコンピューター・アーキテクチャーに移植され、そして当業者に知られている殆どのオペレーティングシステムにおいて操作することができるＴｃｌ/Ｔｋにおいて記載されたプログラムである。Genome Explorer 及びDr. Peptideの特定の実行のためのソースコードは、付録A及びDに供される。特定の実行は、図及び実施例のみの方法により供され、そして本発明は例示された特定の実行を制限するいずれの方法におけるものではない。
【０２７１】
３点認識法のその他の使用
「３点認識」は特定のタンパク質の種類を特定するプロテオミクス方法であるため、その他のペプチドのために３つ以上の異なる認識点を使用することがその他のタンパク質の種類に関する有用な情報を提供するはずである。さらに、「３点認識」方法はその他のレコグニン例えば生体のリポ多糖類のＴＯＬＬ「生得的」認識に適用可能である。その他の共有結合により連結されたアミノ酸、ヌクレオチド、炭水化物、脂質又はそれらの組合せを内含するその他の有用な共有結合により連結された有機分子の化合物を同定するために、該３点認識法を修正することも可能である。本発明のこの観点においては、３つ以上の所望の構造的特性を含むサブ配列について、配列がスクリーニングされる。共有結合により連結されたアミノ酸、脂質又は炭水化物から成る化合物をスクリーニングする場合、約５０の共有結合によって連結された単位のサブ配列は、（１）第１のアミノ酸、炭水化物又は脂質残基のうちの第２のものから７〜１０残基のところにある少なくとも１つの第１のアミノ酸、炭水化物又は脂質残基；（２）コードする少なくとも１つの第２のアミノ酸、脂質又は炭水化物残基；及び（３）第１のアミノ酸、炭水化物又は脂質残基の少なくとも６％、を含有すべきである。ヌクレオチド配列をスクリーニングする場合、約２１〜約１５０個のヌクレオチドのサブ配列は、（１）第１のアミノ酸残基をコードする第２のコドンから１８〜３０ヌクレオチド以内のところにある第１のアミノ酸をコードする少なくとも１つのコドン；（２）少なくとも１つの第２のアミノ酸残基を含有すべきであり、（３）前記第１のアミノ酸残基の少なくとも６％をコードする。
【０２７２】
本発明のいくつかの観点が本明細書に特定的に例示され記述される。ただし、本発明の修正及び変形形態が上述の教示により包括され、本発明の精神及び意図された範囲から逸脱することなく添付のクレームの視野の中に入るということがわかるだろう。
【実施例】
【０２７３】
例１
レプリキンの抽出、単離及び同定のためのプロセス及びレプリキン含有生体をターゲティング、標識又は破壊するためのレプリキンの使用
【０２７４】
ａ）藻類
以下の藻類を、バミューダ水域サイトから収集し、同日に抽出するか又は−２０℃で冷凍して翌日に抽出した。藻類を低温室（０〜５℃）内でWaringブレンダーの中で１５分間中性緩衝液中、例えばｐＨ７の０．００５Ｍのリン酸緩衝溶液（「リン酸緩衝液」）１００ｃｃ中の１グラムのアリコートの中で均質化させ、３０００ｒｐｍで遠心分離に付し、浸透気化により上清を凝縮させ、低温下でリン酸緩衝液に対し透析して約１５mlの体積を生成した。この抽出物溶液の体積を書きとめ、タンパク質分析のためにアリコートを取り、残りを分留して１〜４のｐＫ範囲をもつタンパク質留分を得た。
【０２７５】
好ましい分留方法は、以下のとおりのクロマトグラフィである。すなわち、抽出物溶液を、０．００５Ｍのリン酸緩衝液で平衡化しておいたＤＥＡＥセルロース（Cellex−Ｄ）カラム上で、低温室（４℃）内で分留する。以下の溶液を用いて、段階的溶出用溶媒変更を行なう：
溶液１−１〜４．０４ｇのＮａＨ２ＰＯ４及び０．５ｇのＮａＨ２ＰＯ４を１５リットルの精製水中で溶解させる（０．００５モル、ｐＨ７）；
溶液２−８．５７ｇのＮａＨ２ＰＯ４を２４８０mlの精製水内で溶解させる；
溶液３−１７．１ｇのＮａＨ２ＰＯ４を２４８０mlの精製水中で溶解させる（０．０５モル、ｐＨ４．７）；
溶液４−５９．６５ｇのＮａＨ２ＰＯ４を２４７０mlの精製水中で溶解させる（０．１７５モル）；
溶液５−１０１．６ｇのＮａＨ２ＰＯ４を２４５５mlの精製水中で溶解させる（ｐＨ４．３；
溶液６−３４０．２ｇのＮａＨ２ＰＯ４を２４６５mlの精製水中で溶解させる（１．０モル、ｐＸ−ｉ４．１；
溶液７−２８３．６３ｇの８０％リン酸（Ｈ３ＰＯ４）を２４６０mlの精製水中で作り上げる（１．０モル、ｐＨ１０）
【０２７６】
６〜１０mlの体積中の抽出物溶液を、カラム上に移して、溶液１を上に積層させ、溶液１の３００ml入りタンクをとり付け、カラム上に重力により滴下させた。溶離液の３mlのアリコートを収集し、溶液１で除去されるべきタンパク質全てがカラムから除去されてしまうまでＯＤ２８０でのタンパク質含有量について分析した。次にカラムに溶液２を適用し、各溶液で除去できるタンパク質の全てがカラムから除去されるまで、溶液３、４、５、６及び７が連続して続いた。溶液７からの溶離液を組合せ、リン酸緩衝液に対して透析し、ダイアリザンド（Dialysand）と透析物の両方のタンパク質含有率を決定し、両方をゲル電気泳動によって分析した。溶液７中には、３０００〜２５，０００ダルトンの間の分子量のペプチド又はタンパク質の１本又は２本のバンドが得られる。例えば、上述の通りの抽出及び処置の後、藻類Caulerpa mexicana、 Laurencia obtura、 Cladophexa prolifera、 Sargassum natans、 Caulerpa verticillata、 Halimeda tuna、 及び Penicillos capitatusはすべて、溶液７溶離液中でいかなる汚染物質もないこの分子量領域内で鋭いペプチドバンドを実証した。これらの溶液７のタンパク質又はその溶離されたバンドは加水分解され、アミノ酸組成が決定される。６％以上のリジン組成をもつ、このようにして得られたペプチドはレプリキン前駆体である。これらのレプリキンペプチド前駆体を、その後アミノ酸配列について判定し、米国特許第６．２４２，５７８Ｂ１号に詳述されているように加水分解及び質量分析によりレプリキンを決定する。「３点認識」方法によって定義された基準を満たすものは、レプリキンとして同定される。酵素、細菌、及びあらゆる植物レプリキンを得るためにこの手順を利用することも可能である。
【０２７７】
ｂ）ウイルス
藻類についてａ）で上述されたものと同じ抽出及びカラムクロマトグラフィ分離方法を用いて、ウイルス感染細胞中のレプリキンを単離し同定する。
【０２７８】
ｃ）腫瘍細胞インビボ及びインビトロ組織培養
藻類についてａ）で上述されたものと同じ抽出及びカラムクロマトグラフィ分離方法を用いて、ウイルス感染細胞中のレプリキンを単離し同定する。例えば、各々ａ）で上述した通りに処理された悪性脳腫瘍から単離したアストロシチンのレプリキン前駆体、組織培養中のグリア芽腫腫瘍細胞から単離したマリグニン（Aglyco１０Ｂ）、組織培養中のＭＣＦ７哺乳動物癌細胞及び組織培養中のＰ３Ｊリンパ腫細胞は、それぞれ９．１％、６．７％、６．７％及び６．５％のリジン含有量をもつレプリキン前駆体を生成した。米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号例１０で記述されているようなAglyco１０Ｂの加水分解及び質量分析は、アミノ酸配列、ｙｋａｇｖａｆｌｈｋｋｎｄｉｉｄｅ、１６量体レプリキンを産生した。
【０２７９】
例２：
レプリキンの診断用途の例として、米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号の図２、３、４及び７に示されているように診断目的で血清中に存在するその対応する抗体を捕捉しその量を定量化するための抗原としてAglyco１０Ｂ又は１６量体レプリキンを使用することができる。
【０２８０】
標識、栄養又は破壊目的でレプリキンに付着させるべき作用物質の産生の一例として、１６量体レプリキンに対する特異的抗体を産生するためのウサギの体内への１６量体レプリキンの注射が、米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号の例６及び図９Ａ及び９Ｂ内に示されている。
【０２８１】
レプリキンを標識するための作用物質の使用の一例として、このレプリキンを含有する特異的細胞を標識するための１６量体レプリキンに対する抗体の使用は、米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号の図５及び例６中に示されている。
【０２８２】
レプリキンを破壊するための作用物質の使用の一例として、このレプリキンを含有する特定の細胞を阻害又は破壊するための１６量体レプリキンに対する抗体の使用は、米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号の図６中に示されている。
【０２８３】
例３
レプリキンの存在及び濃度についてのインフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質又はノイラミニダーゼタンパク質の分離株の配列データの分析を、本明細書で記述する３点認識システムに基づくコンピュータープログラムの使用を通して又は配列の視覚的スキャンによって実施する。インフルエンザウイルスの分離株が得られ、インフルエンザ血球凝集素及び／又はノイラミニダーゼタンパク質のアミノ酸配列は、血球凝集素又はノイラミダーゼ遺伝子を配列決定しそこからタンパク質配列を誘導することといった任意の既知の方法により得られる。各分離株内の新しいレプリキンの存在、レプリキンの経時的保存及びレプリキンの濃度について、配列をスキャンする。約６ヵ月〜約３年前といったより早い時点で分離株から得たアミノ酸配列に対するレプリキン配列及び濃度の比較は、来たるインフルエンザの流行期においてインフルエンザの原因となる確率が最も高く季節的インフルエンザペプチドワクチン又は核酸ベースのワクチンのための基礎原料を形成する株の新興を予測するために用いられるデータを提供する。約６ヵ月〜約３年以上の期間にわたるインフルエンザウイルスの一定の与えられた株内のレプリキンの濃度の増大とくにその段階的増加は、将来におけるインフルエンザの地域的流行又は世界的流行の確率の高い原因としての株の新興の予測判断材料である。
【０２８４】
新興株内で観察されるレプリキンに基づくペプチドワクチン又は核酸ベースのワクチンが生成される。新興する株は、該時期中に血球凝集素及び／又はノイラミニダーゼ配列内のレプリキン配列の濃度が最高の増加を示すインフルエンザウイルスの株として同定される。好ましくは、ペプチド又は核酸ワクチンは、新興株内に保存されていることが観察されているあらゆるレプリキン配列に基づくか又はこれを内含している。保存されたレプリキンは好ましくは、約２年そして好ましくはそれ以上の間血球凝集素又はノイラミニダーゼタンパク質配列内に存在するレプリキン配列である。ワクチンには、新興株内で同定されたレプリキン配列の任意の組合せが内含され得る。
【０２８５】
ワクチン産生のためには、有効なワクチンにとって有用なものとして同定されたレプリキンペプチド（単複）は、クローニング、宿主細胞内での発現及びそれからの精製を含む分子生物学技術及び化学合成を含むあらゆる方法によって合成される。ペプチドは好ましくは、それに対する治療用抗体反応を誘発するように決定された量で薬学的に受容可能な担体と混和される。一般に、投薬量は約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。
【０２８６】
インフルエンザワクチンは好ましくは「流行期」の開始より前に、それを必要とする患者に投与される。インフルエンザ流行期は一般に、１０月後半に発生し、４月後半まで続く。しかしながら、該ワクチンは、その年の間いつでも投与可能である。好ましくは、インフルエンザワクチンは一年に一回投与され、インフルエンザウイルスの新興株内に存在することが観察され好ましくは保存されているレプリキン配列に基づいている。インフルエンザワクチン内に内含させるためのもう１つの好ましいレプリキンは、単数又は複数年不在であった後インフルエンザの株内に再興したことが実証されたレプリキンである。
【０２８７】
例４
レプリキンの存在及び濃度についてのコロナウイルスヌクレオカプシド又はスパイク又は外皮又はその他のタンパク質の分離株の配列データの分析を、本明細書で記述する３点認識システムに基づくコンピュータープログラムの使用を通して又は配列の視覚的スキャンによって実施する。コロナウイルスの分離株が得られ、コロナウイルスタンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質の遺伝子を配列決定しそこからタンパク質配列を誘導することといった当該技術分野において既知の方法により得られる。各分離株内の新しいレプリキンの存在、レプリキンの経時的保存及びレプリキンの濃度について、配列をスキャンする。約６ヵ月〜約３年前といったより早い時点で分離株から得たアミノ酸配列に対するレプリキン配列及び濃度の比較は、世界的流行の勃発の原因となる確率が最も高くコロナウイルスペプチドワクチン又は核酸ベースのワクチンのための基礎原料を形成する株の新興を予測するために用いられるデータを提供する。約６ヵ月〜約３年以上の期間にわたるコロナウイルスの一定の与えられた種類又は株内のレプリキンの濃度の増大とくにその段階的増加は、将来におけるＳＡＲＳなどの地域的流行又は世界的流行の確率の高い原因としての株の新興の予測判断材料である。
【０２８８】
コロナウイルスの新興株中に観察されたレプリキンに基づくペプチドワクチン又は核酸型ワクチンが産生される。該時点におけるヌクレオカプシド配列中のレプリキン配列の最も高い増加を有するコロナウイルス株として新興株を同定する。好ましくは、該ペプチド又は核酸ワクチンは、該株中に保存されることが観察されるいずれかのレプリキン配列に基づくか、あるいはこの配列を含む。保存レプリキンは、このましくは、約２年及び好ましくはそれ以上においてヌクレオカプシドタンパク質配列中に存在するレプリキン配列である。該ワクチンは、該新興株中で同定されたレプリキン配列のいずれかの組み合わせを含んでよい。
【０２８９】
ワクチンの産生のために、有効なワクチンのために有用であると認識されたレプリキンペプチド又はペプチド群は、化学合成及び分子生物学技術、例えば、クローニング、宿主細胞内における発現、及びそれからの精製を含むいずれかの方法により合成される。該ペプチドは、好ましくは、治療的な抗体反応を誘発することが測定された量において、医薬的に許容される担体と混合される。一般に、該投与量は、約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。
【０２９０】
コロナウイルスワクチンは、その年の任意の時点で患者に投与することができる。好ましくは、コロナウイルスワクチンは一度投与され、コロナウイルスの該種類の中に存在することが観察され、かつ好ましくはその中に保存されているレプリキン配列に基づいている。
【０２９１】
例５
レプリキンの存在及び濃度についての熱帯性マラリア原虫抗原の分離株の配列データの分析を、本明細書で記述する３点認識法に基づくコンピュータープログラムの使用を通してか又は配列の視覚的スキャンによって実施する。熱帯性マラリア原虫の分離株が得られ、該タンパク質のアミノ酸配列は、遺伝子を配列決定しそこからタンパク質配列を誘導することといった任意の既知の方法により得られる。各分離株内のレプリキンの存在、レプリキンの経時的保存及びレプリキンの濃度について、配列をスキャンする。この情報は、抗マラリアワクチン又は核酸ベースのワクチンのための基礎原料を形成するために用いられるデータを提供する。
【０２９２】
マラリアを引き起こす生物体内で観察されるレプリキンに基づきペプチドワクチン又は核酸型ワクチンが産生される。好ましくは、ペプチド又は核酸ワクチンは、生物体の表面抗原上に存在することが観察されているあらゆるレプリキン配列に基づくか又はこれを内含している。該ワクチンは、マラリアを引き起こす株内で同定されたレプリキン配列のいずれかの組合せを内含することができる。
【０２９３】
ワクチン産生のためには、有効なワクチンにとって有用なものとして同定されたレプリキンペプチド（単複）は、クローニング、宿主細胞内での発現及びそれからの精製を含む分子生物学技術及び化学合成を含むあらゆる方法によって合成される。該ペプチドは、好ましくは、それに対する治療用抗体反応を誘発するように決定された量で医薬的に許容される担体と混和される。一般に、投薬量は約０．１ｍｇ〜約１０ｍｇである。
【０２９４】
その後、マラリアワクチンは、その年の間の任意の時点でそれを必要としている患者に対し、特に熱帯環境への旅行の前に投与される。
【０２９５】
ほかの観点は、レプリキン含有生体のヌクレオチド配列に相補的である、ウイルス、トリパノゾーマ、細菌、真菌、藻類、アメーバ及び植物を含む（ただしこれらに制限されるわけではない）生体内のレプリキンのための生体をコードするｍＲＮＡ又は遺伝子のコーディングストランドと相補的なアンチセンス核酸分子を内含している。
【０２９６】
例６
ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド、スパイク、及びエンベロープタンパク質中に発見された５つの短いＳＡＲＳレプリキンのアミノ酸配列を合成し、そしてＳＡＲＳコロナウイルス中のレプリキン配列に対する免疫応答を試験するためにウサギにおいて試験した。以下のレプリキン配列を試験した：（１）２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  ヌクレオカプシド（配列番号７１２）；（２）２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  スパイクタンパク質（配列番号７１７）；（３）２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  スパイクタンパク質（配列番号７１８）；２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  スパイクタンパク質（配列番号７１９）；（４）２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  エンベロープタンパク質（配列番号７２０）；及び（５）２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  ヌクレオカプシドタンパク質（配列番号７４３）。各合成ペプチドをウサギに皮下注射した。試験ウサギは、１０，００００中１以上の希釈において結合する５つの配列のそれぞれに対する測定可能な特異抗体を産生した。２１のアミノ酸ＳＡＲＳヌクレオカプシドレプリキン抗体（配列番号７１２）は、２０４，８００中１以上の希釈において結合することを実証した。多様な小ペプチドにより、天然痘ワクチンとして全てのタンパク質又は数千のタンパク質若しくは核酸で得られる、不必要な副作用を伴わない強力な免疫応答を達成するための以前の不成功の試験のために、強力な免疫応答を達成するための小分子合成レプリキン抗原の能力は、ＳＡＲＳワクチンの有効性に有意であることが示された。
【０２９７】
例７
４３個のアミノ酸レプリキン配列
ワクチンＶ１２０３０４Ｕ２を設計するＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ−ＫＬＨは、本発明者により、表８において「２００４年Ｇ５Ｎ１ベトナム、高病原性」と標識されたインフルエンザレプリキンである、Ｈ５Ｎ１「トリインフルエンザ」の２９個のアミノ酸レプリキン骨格と、Ｈ５Ｎ１骨格のＣ末端上の更に２つのＵＴＰＥユニット（ＫＫＫＫＨＫ）及び２つのＵＴＯＰＥユニットのＣ末端に共有結合する追加的アジュバンド（主要なカサガイヘモシアニン（配列ＫＬＨ）から設計された。１００μｇのワクチンワクチンＶ１２０３０４Ｕ２をウサギ及びニワトリに皮下注射した。ワクチン化の前及び注射後１週間〜注射後８週間において抗体応答を測定した。抗体応答は１週間目において顕著であり、そしてワクチン化３週間から４週間目においてピークに達した。ピーク抗体応答は、１：１２，０００の希釈から１：２４０，０００以上の希釈の範囲であった。高結合性９６ウェルプレートにいて固相（０．１μｇ／１００μｌ／ウェル）において結合するペプチド−ＧＧＧ（ヤギγグロブリン）による酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で抗体価を測定した。血清を先ず５０倍に希釈し、その後更に２倍連続希釈において希釈した。ＥＬＩＳＡ価の結果は、０．２の４０５ｎｍにおける光学密度からもたらされ、かつ連続希釈曲線の非線形回帰分析に由来する推定希釈係数から測定した。検出は、西洋わさびペルオキシダーゼ結合型二次抗体及びＡＢＴＳ（Boehringer Mannheim.の登録商標、ＧｍｂＨ）を使用して得られた。２羽のニワトリ及び２匹のウサギにおける試験からの結果を表１１に供する。ウサギＤ４５００における試験からの個々のウェル結果を表１２に供する。例６中に報告した結果との組み合わせにおいて、ウサギ又はニワトリにおける抗体応答についてのレプリキン配列の全部で６つの試験中、６つ全ての配列が測定可能な抗体応答を供し、そして抗原性であることを証明した。
【０２９８】
【表２５】
2008539164.tif 000031
【０２９９】
【表２６】
2008539164.tif 000032
【０３００】
付録Ａ−「Genome Explore」  レプリキン認識装置を伴うＴｃｌアプリケーション
【０３０１】
【表２７】
2008539164.tif 000033
【０３０２】
【表２８】
2008539164.tif 000034
【０３０３】
【表２９】
2008539164.tif 000035
【０３０４】
【表３０】
2008539164.tif 000036
【０３０５】
【表３１】
2008539164.tif 000037
【０３０６】
【表３２】
2008539164.tif 000038
【０３０７】
【表３３】
2008539164.tif 000039
【０３０８】
【表３４】
2008539164.tif 000040
【０３０９】
【表３５】
2008539164.tif 000041
【０３１０】
【表３６】
2008539164.tif 000042
【０３１１】
【表３７】
2008539164.tif 000043
【０３１２】
【表３８】
2008539164.tif 000044
【０３１３】
【表３９】
2008539164.tif 000045
【０３１４】
【表４０】
2008539164.tif 000046
【０３１５】
【表４１】
2008539164.tif 000047
【０３１６】
【表４２】
2008539164.tif 000048
【０３１７】
【表４３】
2008539164.tif 000049
【０３１８】
【表４４】
2008539164.tif 000050
【０３１９】
【表４５】
2008539164.tif 000051
【０３２０】
【表４６】
2008539164.tif 000052
【０３２１】
【表４７】
2008539164.tif 000053
【０３２２】
【表４８】
2008539164.tif 000054
【０３２３】
【表４９】
2008539164.tif 000055
【０３２４】
【表５０】
2008539164.tif 000056
【０３２５】
【表５１】
2008539164.tif 000057
【０３２６】
付録Ｂ−Genome Explorer アプリケーションを操作するための説明
【０３２７】
（１）アプリーケーションGenome（PubMedダブルヘリックスのようにみえる)を所望する場所に移動する（又はCDを起動する）。
【０３２８】
（２）アプリケーションを起動する（アイコンをダブルクリックする）。
【０３２９】
（３）データベース（NCBI又はLANL)を伴うダイアログボックス及びトップにクエリー［......］が示されるだろう。データベースを選択し、そしてPubMedクエリーページ「［......］についての検索［タンパク質］」（ＮＣＢＩデータベース）として［......］中の同じ文字列を入力し、インフルエンザ配列データベースクエリーページ（ＬＡＮＬデータベース）中の［......］について検索する。
NCBI
fetching ncbi.gif"
LANL
fetching lanl.gif"
（４）検索ボタンを押す。
【０３３０】
アプリケーションはインターネットコネクションを介してデータベースと接触し、そしてクエリー結果がフェッチされる。その後、アミノ酸配列及び記述にアクセスするためのタンパク質ページがダウンロードされる。
【０３３１】
すべてのページのフェッチ後、これらはデータベース形態からより便利なローカル形態に解析される。
Parsing.gif"
【０３３２】
最後に、フェッチし、解析されたページを、マッチするペプチドサブシーケンスについて検索する。合格した配列は、各タンパク質についての別々のhtmページとしてデスクトップフォルダー「（合格）pass」に記載され；全ての不合格タンパク質は単一のデスクトップhtmページ「（不合格）fail」に記載される。
searching.gif"
【０３３３】
ダイアログボックス中のほかのエントリーは、いくつかの適合されるマッチ基準を許容する。与えられた値は最初に要求されたものである。
【０３３４】
解析及び検索をオフラインで行う：インターネット接続はこれらの段階では必要ない。
【０３３５】
タンパク質がチェックされると、これらの識別子がダイアログボックスの下に示され、そして赤いプログレスバーがスクリーン上を横切る。「全」計数、該クエリーにおいてこれまでチェックされたタンパク質の総数；「合格」及び「不合格」計数、基準に合格又は不合格の数。プログレスバーは、フェッチ、解析、及び検索段階と別に進行する。
【０３３６】
（５）アクティブ検索を止めるためにストップボタンを押す。プログレステキストは「停止中」その後「停止」に変化する。
【０３３７】
（６）終了するために、終了ボタンを押す。
【０３３８】
（７）合格結果は、デスクトップ「合格」フォルダーを開き、ブラウザ中のhtmページを開くことにより見ることができる。
NCBI
report.ncbi.gif"
LANL
report.lanl.gif"
【０３３９】
レプリキン分析ページ中の各レプリキン配列は、特定の配列が現在のクエリー中に発見される全ての履歴にリンクする。レプリキン履歴中のエントリーは、レプリキン分析中のエントリーに戻ってリンクする。
sequence-history.gif"
【０３４０】
（８）不合格結果は、ブラウザ中のデスクトップ「fail.htm」ページを開くことにより見ることができる。追加基準がない場合、該検索がデータベースの完全テキスト検索である。
completed.gif"
【０３４１】
追加基準を、後ろの＋アイコンにより検索に追加することができる。除外基準は、与えられた文字列を有するページを除外するが、これらを含む基準を含む。除外及び包含は、検索結果を洗練するために混ぜることができる。
include exclude.gif"
【０３４２】
「must have」基準は、該分野で必ず生じる文字列を意図する。
must have.gif"
【０３４３】
検索は追加基準を編集後に自動的に再スタートし、あるいは該検索は検索ボタンを押すことにより再スタートすることができる。追加基準が編集される場合、検索は進行中であるが、検索は新たな基準で再スタートされる。検索はキャッシュされた結果が使用され；データベース及びクエリーに限り：文字列が変わらず、追加基準のみが変化し、フェッチ及び解析段階はスキップされる。インターネット接続は、以前にフェッチされた検索を洗練するために必要とされない。
【０３４４】
少しの優先をアプリケーション優先でセットすることができる。
preferences.gif"
【０３４５】
ワーキングディレクトリーは、全てのフィールド及びキャッシュが記載される場所である。デフォルトはデスクトップである。
【０３４６】
セーブフェッチページは、デバッグのために意図される。これはワーキングディレクトリーに対する中間のクエリーページをセーブする。
【０３４７】
パージクエリーキャッシュは、隠されたキャッシュから全てのページを除去する。これはデータベース又はクエリー文字列が変化する場合に自動的に発生する。
【０３４８】
ブラウザ中のオープン結果は、これが完了する場合にデフォルトブラウザ中にレプリキンレポートを開く。
【０３４９】
付録Ｃ−「Genome Explorer」のスクリーン写真
【０３５０】
【表５２】
2008539164.tif 000058
【０３５１】
【表５３】
2008539164.tif 000059
【０３５２】
【表５４】
2008539164.tif 000060
【０３５３】
【表５５】
2008539164.tif 000061
【０３５４】
【表５６】
2008539164.tif 000062
【０３５５】
【表５７】
2008539164.tif 000063
【０３５６】
【表５８】
2008539164.tif 000064
【０３５７】
【表５９】
2008539164.tif 000065
【０３５８】
【表６０】
2008539164.tif 000066
【０３５９】
【表６１】
2008539164.tif 000067
【０３６０】
【表６２】
2008539164.tif 000068
【０３６１】
付録Ｄ−「Dr. Peptide」  複合アミノ酸パターン認識装置を伴うＴｃｌアプリケーション
【０３６２】
【表６３】
2008539164.tif 000069
【０３６３】
【表６４】
2008539164.tif 000070
【０３６４】
【表６５】
2008539164.tif 000071
【０３６５】
【表６６】
2008539164.tif 000072
【０３６６】
【表６７】
2008539164.tif 000073
【０３６７】
【表６８】
2008539164.tif 000074
【０３６８】
【表６９】
2008539164.tif 000075
【０３６９】
【表７０】
2008539164.tif 000076
【０３７０】
【表７１】
2008539164.tif 000077
【０３７１】
【表７２】
2008539164.tif 000078
【０３７２】
【表７３】
2008539164.tif 000079
【０３７３】
【表７４】
2008539164.tif 000080
【０３７４】
【表７５】
2008539164.tif 000081
【０３７５】
【表７６】
2008539164.tif 000082
【０３７６】
【表７７】
2008539164.tif 000083
【０３７７】
【表７８】
2008539164.tif 000084
【０３７８】
【表７９】
2008539164.tif 000085
【０３７９】
【表８０】
2008539164.tif 000086
【０３８０】
【表８１】
2008539164.tif 000087
【０３８１】
【表８２】
2008539164.tif 000088
【０３８２】
【表８３】
2008539164.tif 000089
【０３８３】
【表８４】
2008539164.tif 000090
【０３８４】
【表８５】
2008539164.tif 000091
【０３８５】
【表８６】
2008539164.tif 000092
【０３８６】
【表８７】
2008539164.tif 000093
【０３８７】
【表８８】
2008539164.tif 000094
【０３８８】
【表８９】
2008539164.tif 000095
【０３８９】
【表９０】
2008539164.tif 000096
【０３９０】
【表９１】
2008539164.tif 000097
【０３９１】
【表９２】
2008539164.tif 000098
【０３９２】
【表９３】
2008539164.tif 000099
【図面の簡単な説明】
【０３９３】
【図１】さまざまな生物体内のレプリキンの発生頻度を示す棒グラフである。
【０３９４】
【図２】グリア芽腫細胞の嫌気性複製中の合計膜タンパク質１ミリグラムあたりのマリグニンの百分率を示すグラフである。
【０３９５】
【図３】リコグニン１６量体に対する被曝に応答して生成された抗マリグニン抗体の量を示す棒グラフである。
【０３９６】
【図４】図４Ａは、常光及び蛍光灯で撮った血液塗抹標本の写真である。図４Ｂは、２つの白血病細胞の存在を例示する常光及び蛍光灯で撮った血液塗抹標本の写真である。図４Ｃは、抗マリグニン抗体の存在下での神経膠腫細胞のち密層の写真である。図４Ｄ及び図４Ｅは、抗マリグニン抗体の添加から３０分及び４５分の時点で撮った図４Ｃの細胞層の写真である。
【０３９７】
【図４Ｆ】図４Ｆは、抗マリグニン抗体によるインビトロでの小細胞肺癌腫細胞の成長阻害を示す棒グラフである。
【０３９８】
【図５】外科手術前後の良性又は悪性乳腺疾患を患う患者の血清中に存在する抗マリグニン抗体の量のプロットである。
【０３９９】
【図６】レプリキン配列を同定する３点認識法を実施するためにコンピュータが使用される本発明の観点を示すブロック図である。
【０４００】
【図７】１９４０年から２００１年までの年毎のペースでのインフルエンザＢ型及びインフルエンザＡ型株、Ｈ１Ｎ１の血球凝集素中に観察されたレプリキンの濃度を示すグラフである。
【０４０１】
【図８】１９５０年〜２００１年までの年毎のペースでのインフルエンザＡ型株、Ｈ２Ｎ２及びＨ３Ｎ２、並びにその構成要素レプリキンによって画定された新興株の血球凝集素中で観察されたレプリキン濃度のグラフである。
【０４０２】
【図９】１９１７年〜２００２年までの、コロナウイルスヌクレオカプシドレプリキンを含むいくつかのウイルス株のための毎年のレプリキン計数を示すグラフである。
【０４０３】
【図１０Ａ】ヌクレオカプシドコロナウイルス分離株についての一年あたりの平均レプリキン計数を示す図表である。
【図１０Ｂ】ヌクレオカプシドコロナウイルス分離株についての一年あたりの平均レプリキン計数を示す図表である。
【図１０Ｃ】ヌクレオカプシドコロナウイルス分離株についての一年あたりの平均レプリキン計数を描いた図表である。
【０４０４】
【図１１】Ｈ５Ｎ１血球凝集素についての一年あたりのレプリキン計数を示す図表である。
【０４０５】
【図１２】国際純正及び応用化学連合（ＩＵＰＡＣ）により供される基準に従い１つのアルファベット文字としてコードされるアミノ酸を示す変換表である。
【０４０６】
【図１３】国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって保持されているタンパク質データベースを検索することによって得られたヒト癌タンパク質のプリントアウトである。
【０４０７】
【図１４】核酸塩基トリプレットとアミノ酸の間の対応を示す変換表である。
【０４０８】
【図１５】３つの「トリインフルエンザ」流行の増大前のインフルエンザのＨ５Ｎ１系列の赤血球凝集素タンパク質におけるレプリキンパターンの濃度における急速な増加を示すグラフである。図１５は、Ｈ５Ｎ１の赤血球凝集素タンパク質の増大するレプリキン濃度（「レプリキン計数」）が３つの「トリインフルエンザ」流行に先行したことを示す。Ｈ５Ｎ１インフルエンザにおいて、１９９５〜１９９７年の増大する系列特異性レプリキン濃度（「レプリキン計数、平均値＋／−ＳＤ）は１９９７年の香港Ｈ５Ｎ１流行（Ｅ１）を先行し；１９９９〜２００１年の増加は２００１年の流行（Ｅ２）を先行し；そして２００２〜２００４年の増加は２００４年における伝染（Ｅ３）を先行した。１９９９年における減退は、香港におけるＥ１流行に対する家禽の大量処分により生じた。
【０４０９】
【図１６】さまざまな生物体中に発見されたレプリキンパターンの選択された例を示す表である。
【０４１０】
【図１７】本発明の観点によって、アミノ酸配列中のレプリキンパターンを同定するためのシステム及び方法を組み込んだコンピュータシステムの高レベルのブロック図である。
【０４１１】
【図１８】本発明の観点によって、アミノ酸配列中のレプリキンパターンを位置決定するための一般的な方法を示す単純なフローチャートである。
【０４１２】
【図１９】本発明の観点によって、アミノ酸配列中の複数のレプリキン様パターンを位置決定するための一般化された方法を示すフローチャートである。
【０４１３】
【図２０】本発明の観点によって、アミノ酸配列中のレプリキンパターンを発見するための手順を含むソースコードリストである。
【０４１４】
【図２１】異なるタンパク質中の、実質的に固定されたアミノ酸位置において発生するレプリキン骨格を示す表である。
【０４１５】
【図２２】本発明において有用なコンピュータシステムプラットフォームの単純化されたブロック図である。
【図１】
2008539164.tif 000100
【図２】
2008539164.tif 000101
【図３】
2008539164.tif 000102
【図４Ａ】
2008539164.tif 000103
【図４Ｂ】
2008539164.tif 000104
【図４Ｃ】
2008539164.tif 000105
【図４Ｄ】
2008539164.tif 000106
【図４Ｅ】
2008539164.tif 000107
【図４Ｆ】
2008539164.tif 000108
【図５】
2008539164.tif 000109
【図６】
2008539164.tif 000110
【図７】
2008539164.tif 000111
【図８】
2008539164.tif 000112
【図９】
2008539164.tif 000113
【図１０Ａ】
2008539164.tif 000114
【図１０Ｂ】
2008539164.tif 000115
【図１０Ｃ】
2008539164.tif 000116
【図１１】
2008539164.tif 000117
【図１２】
2008539164.tif 000118
【図１３】
2008539164.tif 000119
【図１４】
2008539164.tif 000120
【図１５】
2008539164.tif 000121
【図１６】
2008539164.tif 000122
【図１７】
2008539164.tif 000123
【図１８】
2008539164.tif 000124
【図１９】
2008539164.tif 000125
【図２０】
2008539164.tif 000126
【図２１】
2008539164.tif 000127
【図２２】
2008539164.tif 000128
【手続補正書】
【提出日】平成19年6月25日(2007.6.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ウイルス又は生物体中のレプリキン骨格を同定する方法であって、
（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；
（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、
（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び
（４）少なくとも６％のリジン、
を含む約１６〜約３０個のアミノ酸を含んで成る、一連のレプリキン骨格ペプチドを同定する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記一連のレプリキン骨格ペプチドの個々のメンバー又は複数のメンバーを同定する工程を更に含んで成る、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
更に、エクソスケルトン骨格（Exoskeleton Scaffold)を同定することを含んで成り、ここで前記一連のレプリキン骨格ペプチドが第一系列のウイルス、ウイルス株又は生物体中で同定され、そして該第一系列のウイルス、ウイルス株又は生物体との比較として、前記エクソスケルトン骨格が後発ウイルス、ウイルス株又は生物体中で同定され、ここで該エクソスケルトン骨格が、該レプリキン骨格と約同数のアミノ酸を含有するアミノ酸配列を含んで成り、そして更に（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン、（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジンを含んで成り、そして（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基中にリジンを含まない、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
更に、請求項１に記載の第二レプリキン骨格ペプチドを同定する工程、レプリキン骨格ペプチドと第二レプリキン骨格ペプチドを比較する工程、及び該第二レプリキン骨格ペプチドが該第二レプリキン骨格ペプチドから変化しない場合、ワクチンとしていずれかのレプリキン骨格ペプチドを選択する工程を含んで成る、請求項１に記載のレプリキン骨格ペプチドを同定する方法。
【請求項５】
（１）少なくとも１つのリジン残基が末端リジン残基である第二リジン残基から６〜１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基を含んで成る７〜約５０個のアミノ酸を含有する、単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチド。
【請求項６】
前記単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドがインフルエンザウイルスの新興株中に存在する、請求項５に記載の単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチド。
【請求項７】
（１）第二リジン残基から６〜１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；（３）少なくとも６％のリジン残基を含んで成る７〜約５０個のアミノ酸を含有する、単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドであって、ここで該単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドがインフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１株中に存在する、インフルエンザウイルスペプチド。
【請求項８】
末端リジンを更に含んで成る、請求項７に記載の単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチド。
【請求項９】
アミノ酸配列、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨ（配列番号１５）を含んで成る、請求項７に記載の単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチド。
【請求項１０】
約１６〜約３０個のアミノ酸、並びに
（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；
（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、
（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び
（４）少なくとも６％のリジン、
を含んで成る、請求項５に記載の単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドであって、ここで該ペプチドの相同体が、複数のウイルスの異種検体、ウイルス株又は生物体に存在し、ここで該相同体が約１６〜約３０個のアミノ酸、並びに
（５）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；
（６）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、
（７）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び
（８）少なくとも６％のリジン、
を含んで成る、インフルエンザウイルスペプチド。
【請求項１１】
（１）第二リジン残基から約６〜約１０個の残基に位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；（３）少なくとも６％のリジン残基を含んで成る、インフルエンザウイルスの少なくとも１つの単離又は合成されたペプチドを含んで成る、予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１２】
前記単離又は合成されたペプチドが、インフルエンザウイルスの新興株中に存在する、請求項１１に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１３】
前記単離又は合成されたペプチドが、インフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１株中に存在する、請求項１１に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１４】
ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨ（配列番号１５）を含んで成るアミノ酸配列を含むペプチドを含んで成る、請求項１１に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１５】
配列番号４５９、配列番号４６０、配列番号４６１、配列番号４６２、配列番号４６３、配列番号４６４、配列番号４６５、配列番号４６６、配列番号４６７、配列番号４６８、配列番号４６９のいずれかを更に含んで成る、請求項１１に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１６】
更に、配列番号４５９を含んで成る、請求項１４に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１７】
更に、医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを含んで成る、請求項１１に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１８】
更に、ワクチンＶ１２０３０４Ｕ２を含んで成る、請求項１４に記載の予防的又は治療的ウイルスワクチン。
【請求項１９】
インフルエンザウイルスに対する抗体を産生するために対象の免疫系を刺激する方法であって、（１）第二リジン残基から６〜１０個の残基中に位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基、及び（３）少なくとも６％のリジン残基を含んで成る７〜約５０個のアミノ酸を含んで成る、少なくとも１つの単離又は合成したインフルエンザウイルスレプリキンペプチドの有効量を投与する工程を含んで成る方法。
【請求項２０】
更に、医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを含んで成り、そして更にインフルエンザ感染を予防又は治療する工程を含んで成る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドが新興ウイルス中に存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドがインフルエンザウイルスのＨ５Ｎ１株中に存在する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドが、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨ（配列番号１５）を含むアミノ酸配列を含んで成る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
予防的又は治療的ウイルスワクチンを製造する方法であって、約１６〜約３０個のアミノ酸を含んで成る複数のレプリキン骨格ペプチドを含んで成るレプリキン骨格を同定する工程、及び予防又は治療的ウイルスワクチンとして少なくとも１つの該レプリキン骨格ペプチドを単離又は合成する工程を含んで成り、ここで該レプリキン骨格ペプチドが：
（１）末端リジン及び該末端リジンに直接隣接するリジン；
（２）末端ヒスチジン及び該末端ヒスチジンに直接隣接するヒスチジン、
（３）ほかのリジンから約６〜約１０個のアミノ酸残基におけるリジン；及び
（４）少なくとも６％のリジン、
を含んで成る、方法。
【請求項２５】
前記レプリキン骨格ペプチドがインフルエンザウイルス中に存在する、請求項２４
に記載の方法。
【請求項２６】
複数の基準をタンパク質配列を表すデータに対して適用する工程；
該基準に基づき、該タンパク質配列中の任意のサブシーケンスを同定する工程；及び
該同定したサブシーケンスをデータファイルに出力する工程を含んで成る方法であって、
該基準が：
該サブシーケンス中に含まれるアミノ酸のセット｛ａ｝；
該サブシーケンスから除外されるアミノ酸のセット｛ｂ｝；及び
セット｛ａ｝及び｛ｂ｝のメンバー間の最小及び最大許容ギャップ、
を含んで成る、方法。
【請求項２７】
前記タンパク質配列がネットワークを介して得られる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
請求項２６に記載の方法を実行するための、コンピュータ実行可能命令を記憶する機械可読媒体。
【請求項２９】
複数の基準をタンパク質配列を表すデータに対して適用する工程；
該基準に基づき、該タンパク質配列中のサブシーケンスを同定する工程、ここで該同定されたサブシーケンスは、そのリジンアミノ酸間の距離の所定の許容範囲、及びそのヒスチジンアミノ酸と最も遠いリジンの間の距離の所定の許容範囲を有し；そして
該同定したサブシーケンスをデータファイルに出力する工程、
を含んで成る方法。
【請求項３０】
前記タンパク質配列がネットワークを介して得られる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
請求項２９に記載の方法を実行するための、コンピュータ実行可能命令を記憶する機械可読媒体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００２】
本願は、２００５年２月１６日に出願された米国仮特許出願第６０／６５３，０８３号の優先権を主張し、そして２００５年４月２８日に出願された米国特許出願第１１／１１６，２０３号の一部継続出願であり、これは２００４年４月２８日に出願された米国仮特許出願第６０／５６５，８４７号の優先権を主張し、そして２００４年６月４日に出願された米国特許出願第１０／８６０，０５０号の一部継続出願であり、これは２００３年１２月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／５３１，６８６号、２００３年９月２３日に出願された第６０／５０４，９５８号、及び２００３年６月６日に出願された第６０／４７６，１８６号の優先権を主張し、そして２００２年７月８日に出願された米国特許出願第１０／１８９，４３７号の一部継続出願であり、これは２００２年３月２６日に出願された米国特許出願第１０／１０５，２３２号の一部継続出願であり、これは２００１年１０月２６日に出願された米国特許出願第０９／９８４，０５７号の一部継続出願であり、これは２００１年７月９日に出願された米国仮出願第６０／３０３，３９６号の優先権、及び２００１年３月２７日に出願された第６０／２７８，７６１号の優先権を主張する。先の出願は、参考文献として本願明細書中に援用されている。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
アミノ酸配列パターンを記述することに関しては、単純化された一組の正規表現機能が典型的に採用される。これらの単純な正規表現ルールによって定義されたアミノ酸配列パターンは、外観及び結果の両方においてPROSITE パターンにかなり類似することとなる。アミノ酸配列についての正規表現による記述は、以下のルールにしたがって作られる：
（１）アミノ酸残基については大文字を用い、そして（必要ではないが）「−」を２つのアミノ酸の間に置く。
（２）特定の位置における複数のアミノ酸の選択肢については「［］」を使用する。［LIVM］は、L、I、V又はMの任意の1つのアミノ酸がその位置にあることができることを意味する。
（３）アミノ酸を除外するためには「｛｝」を使用する。したがって、｛CF｝は、C及びFがその特定の位置にあってはならないことを意味する。いくつかのシステムにおいては、除外機能は、「＾」記号で特定されることができる。例えば、＾Gは、グリシン以外のすべてのアミノ酸を意味し、そして［＾ILMV］は、I、L、M及びV以外のすべてのアミノ酸を表す。
（４）任意のアミノ酸であることのできる位置については、「ｘ」又は「X」を使用する。
（５）複数の位置については、nが数字である「（n）」を使用する。例えば、ｘ（３）は、「ｘｘｘ」と同じである。
（６）複数又は可変の位置については、「（ｎ１，ｎ２）」を使用する。したがって、ｘ（１，４）は、「ｘ」又は「ｘｘ」又は「ｘｘｘ」又は「ｘｘｘｘ」を表す。
（７）パターンがＮ又はＣ末端にマッチすることを要求するためには、「＞」というシンボルを該パターンの最初又は最後に使用する。例えば、「＞MDEL」（配列番号１３）は、MDEL（配列番号１３）で始まる配列のみを見出す。「DEL＞」はDELで終わる配列のみを見出す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１３】
他の類似のフォーマットも使用される。例えば、Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)は、インターネット上で利用可能な周知のシステムであり、ヌクレオチド及びタンパク質データベースの迅速な検索のためのツールを提供する。BLASTは、３つのフォーマット：FASTA配列フォーマット、NCBI寄託番号、又はGenBank配列番号で入力された配列を受け入れる。しかしながら、これらのフォーマットは、正規表現又はPROSITEパターンよりも構造がより単純である。FASTAフォーマットの配列の例は以下の：
【化１】
2008539164.tif 000129
である。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２４】
本発明の更なる観点において、単離又は合成されたインフルエンザウイルスペプチドは、Ｈ５Ｎ１ペプチド、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨ（配列番号１５）を含んで供される。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本発明のよりさらなる観点において、予防的又は治療的ウイルスワクチンは、代わりに合成ＵＴＯＰＥ尾部、アジュバント又はこれらの組み合わせを有するペプチドＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨ（配列番号１５）含む。よりさらなる観点において、予防的又は治療的ウイルスワクチンは、医薬的に許容される担体含む。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２８】
本発明のさらなる観点において、該予防的又は治療的ウイルスワクチンは、ペプチドＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ（配列番号１６）−ＫＬＨ（ここで−ＫＬＨは主要なカサガイヘモシアニンを表す）を含む。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３０】
さらなる観点において、免疫系を刺激するための方法において投与されるレプリキンペプチドは、更に医薬的に許容される担体及び／又はアジュバントを含んでよく、そしてインフルエンザ感染を予防又は治療する。該免疫系を刺激する方法は更に、新興ウイルス中に存在する、あるいはインフルエンザウイルスＨ５Ｎ１株中に存在する、単離又は合成したインフルエンザウイルスペプチドを含んでよい。該方法はさらに、ペプチドＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ（配列番号１６）−ＫＬＨ（ここで−ＫＬＨは主要なカサガイヘモシアニンを表す）の投与を含んでよい。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５８】
癌レプリキンのペプチド配列又はレプリキンすなわち神経膠腫ペプチドｋａｇｖａｆｌｈｋｋ（配列番号１）の相同体を含有するものとしてのペプチド配列の例は、肺、脳、肝臓、軟組織、唾液腺、鼻咽頭、食道、胃、結腸、直腸、胆のう、乳房、前立腺、子宮、子宮頸管、膀胱、眼、黒色腫形態、リンパ腫、白血病及び腎臓などの癌において発見され得るがただしこれらに制限されるわけではない。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６１】
【表１】
2008539164.tif 000130
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６７】
レプリキンとして又はレプリキンを含有するものすなわち神経膠腫ペプチドｋａｇｖａｆｌｈｋｋ（配列番号１）の相同体としてのアミノ酸配列の同定には、以下の３つの必要条件が満たされる必要性がある。３点認識システムに従うと、配列は、７〜約５０残基のアミノ酸配列の内部に次の３つの要素すなわち、（１）もう１つのリジン残基から６〜１０個の残基のところに位置する少なくとも１つのリジン残基；（２）少なくとも１つのヒスチジン残基；及び（３）少なくとも６％のリジン残基の組成物を有している。典型的な非制限レプリキンは末端リジンを含む。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
３点認識法によって画定される通りのｋａｇｖａｆｌｈｋｋ（配列番号１）といったアミノ酸配列の相同体が、アデノウイルス、レンチウイルス、ａ−ウイルス、レトロウイルス、アデノ関連ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、脳炎ウイルス、インフルエンザウイルス、トウモロコシ条斑ウイルス、ヘルペスウイルス、ウシヘルペスウイルス、ネコ免疫不全ウイルス、口蹄病ウイルス、天然痘ウイルス、ラウス肉腫ウイルス、神経芽細胞腫ＲＡＳウイルス腫瘍遺伝子、ポリオーマウイルス、シンドビス、ヒト乳頭腫ウイルス、骨髄単球性腫瘍ウイルス、マウス急性白血病、Ｔ細胞リンパ栄養ウイルス及びトマト縮葉病ウイルスといったような（ただしこれらに制限されるわけではない）ウイルス又はウイルスペプチドの中で発見された。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
さらに、アミノ酸配列ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ（配列番号１）の相同体は、宿主細胞の細胞質中で複製する外被ウイルスファミリの成員である既知の種類のコロナウイルスの中に存在する。さらに、アミノ酸配列ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ（配列番号１）の相同体は、重症急性呼吸器症候群つまりＳＡＲＳの原因である最近同定された種類のコロナウイルスの中に存在する。レプリキンは、ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド全タンパク質配列の中に位置特定される。さらに、レプリキンの場所は、コロナウイルスの種類のその他の成員の中に存在し、より特定的には、これらのコロナウイルス由来のヌクレオカプシドタンパク質配列内にも存在する。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９３】
【表１５】
2008539164.tif 000131
【表１６】
2008539164.tif 000132
【表１７】
2008539164.tif 000133
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
我々は、１９１７年にガチョウから単離されたインフルエンザウイルスの血球凝集素中のレプリキン（我々はこれをガチョウレプリキンと命名した）が、ｋｋｇ（ｔ／ｓ）ｓｙｐｋｌｓｋｓｙ（ｔ／ｖ）ｎｎｋｇｋｅｖｌｖｌｗｇｖｈｈ（配列番号３２３）という２つの置換のみを伴って、１９１８年の世界的流行の原因であるインフルエンザのＨ１Ｎ１株の中に翌年現われていることを発見した。表７ａは、インフルエンザ１９１７ガチョウレプリキン（ＧＲ）がこのとき、多数の小さい置換及びその他のインフルエンザ株への明白な転座にもかかわらず、基本的に８５年間保存されていたことを示している。我々は、１９１７年インフルエンザＧＲが、Ｈ１Ｎ１（１９１８年の世界的流行）、Ｈ２Ｎ２（１９５７〜５８年の世界的流行）、Ｈ３Ｎ２（１９６８年の世界的流行、２０００年の中国及びロシアでの地域的流行、２００３年の福建型株の地域的流行）及びＨ５Ｎ１（１９９７年の中国での地域的流行）に現われた、複数のインフルエンザ株の間で明白な移動性を示したということを発見した。１９９７年に、その構造は、Ｈ１Ｎ２内で正確にその１９１８年の構造ＫＫＧＳＳＹＰＫＬＳＫＳＹＶＮＮＫＧＫＥＶＬＶＬＷＧＶＨＨ（配列番号３２４）まで回復された。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
ＳＡＲＳコロナウイルスはまず最初に２００２〜２００３年のインフルエンザの流行期に出現した。インフルエンザＧＲ及びコロナウイルスレプリキン（又は一部の未知の共有前駆体）からのＳＡＲＳレプリキンの２００２年における２重の起源は、全て２００２年に発生したものである以下の事象により示唆されている：１）８５年間で最初の縮合が、ＧＲ−Ｈ１Ｎ２レプリキン配列内で２９〜２８アミノ酸に見られる（表７ａ）（類似の縮合が、現地域的流行においては、福建型Ｈ３Ｎ２内で２９〜２７アミノ酸に見られた〔表７ａ〕）；２）ＧＲ−Ｈ１Ｈ２のレプリキン計数は、Ｈ１Ｈ２から外に移動するＧＲと一貫した顕著な衰退を示した；３）コロナウイルスヌクレオカプシドタンパク質のレプリキン計数は顕著な増大を示した；そして４）以下のモチーフを含むレプリキンを伴って２００２〜２００３年にＳＡＲＳコロナウイルスが出現した：ＧＲ１９１８及びＧＲ−Ｈ１Ｎ２  ２００１で先に見られた「ｋｋｇ」及び「ｋ−ｋ」；インフルエンザＧＲ−Ｈ１Ｎ２  ２００１に見られた「ｋ−ｋｋ」、「ｋｋ」及び「ｋｌ」；鳥類気管支炎コロナウイルスレプリキンの中に見られる「ｋｋ」；及びブタ伝染性下痢症のレプリキン内に見られる「ｋｋ−ｋｋ−ｋ」（配列番号３２５）、「ｋ−ｋ」、「ｋｋ」、「ｋｌ」及び「ｋｔ」（表７ａ）（ＳＡＲＳは、糞便汚染という強力な下支えのあった密集共同住宅内で噴出しその後換気扇によって空気で運ばれた伝染性肺炎としてヒトにおいて最初に出現したと考えられている）。
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
【表１８】
2008539164.tif 000134
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０２】
短合成ワクチンは、はるかに迅速に産生され（月単位ではなく日単位）かつはるかに安価である以外に、現行の全ウイルスワクチン全般における望まれない何千ものタンパク質の多重エピトープによって生み出される免疫学的干渉及び汚染に付随する副作用が回避されるはずである。インフルエンザについては、あらゆるケースにおいて現行の全ウイルスワクチンは、高齢者の半数以上において有効でない。しかし、短レプリキンは充分な免疫原性をもつのだろうか？短神経膠腫レプリキン「ｋａｇｖａｆｌｈｋｋ」（配列番号１）は、合成抗多形性グリア芽腫及び抗気管支原性癌ワクチンを首尾よく入手するための基礎原料であることが証明された。それは、ピコグラム／細胞単位で癌細胞に対する細胞毒性をもち、癌患者の生存率に量的に関係する抗マリグニン抗体を産生した。２００年のコロナウイルスヌクレオカプシドレプリキン計数に見られた急上昇を理由として再発する確率が高いと思われるＳＡＲＳ攻撃に備えるために、我々は、ヌクレオカプシド、スパイク及び外被タンパク質の中に見られる４つのＳＡＲＳ短レプリキンを合成した。我々は、これらの合成短ＳＡＲＳレプリキンがウサギに注射された時点で同じく豊富な特異的抗体を産生することを発見した。例えば、２１アミノ酸のＳＡＲＳヌクレオカプシドレプリキン抗体は、２０４，８００中１より大きい希釈度で結合する。さまざまな小さいペプチドを用いて、天然痘の場合のような何千ものタンパク質又は核酸又は全タンパク質で得られる望ましくない副作用無く強い免疫応答を達成しようとするその他の研究者による以前の試みが失敗してきたため、強い免疫応答を達成する小さい合成レプリキン抗原の能力は、これらのＳＡＲＳワクチンの効力にとって有意である。
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０４】
表７は同様に、１９１７年のインフルエンザガチョウレプリキン及び２つのコロナウイルスすなわち鳥類気管支炎コロナウイルス及びブタ伝染性下痢ウイルスの両方に対する、我々が発見した２００３年の５つのＳＡＲＳレプリキンの関係を示している。表７中の最初の２００３年ヒトＳＡＲＳレプリキンは、２００２年におけるインフルエンザＨ１Ｈ２の中間的構造を通して、インフルエンザウイルスガチョウ１９１７とヒト１９１８レプリキンに対するいくつかの配列相同性を示す（例えば、位置１、１８及び１９におけるレプリキン「ｋ」を参照）。１９１７ガチョウレプリキン配列は表７において、１９９９までのレプリキンの画定にとって重要でないアミノ酸における数多くの置換（置換はイタリック体で示されている）にも関わらず、大幅に保存されてきたことがわかる。このとき、もとの２９アミノ酸１９１７レプリキン配列は、２００１Ｈ１Ｎ２レプリキン内でその１９１７−１９１８年の構造までほぼ正確に回復してきたことがわかった。しかしながら、２００２Ｈ１Ｎ２インフルエンザレプリキンは、２９から２８アミノ酸まで短縮されており、アミノ酸ｋｅｖｌ（ｉ／ｖ）ｗｇ（ｖ／ｉ）ｈｈ（配列番号３６７）の「左へのシフト」は明白である。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０９】
時間におけるインフルエンザ中のレプリキン
インフルエンザＨ１Ｎレプリキン；この株が初めて現われその年の世界的流行をひき起こした１９１８年から、２０００年に至るまで配列が入手可能である全てのＨ１Ｎ１分解株の中に、１つのレプリキン「ｈｐ（ｖ/ｉ）ｔｉｇｅｃｐｋｙｖ−（ｒ/ｋ）（ｓ/ｔ）（ｔ/ａ）ｋ」（配列番号１３５）のみが存在する（表４）。（「（ｖ/ｉ）」は、アミノ酸ｖ又はｉが異なる年に同じ位置に存在することを表わしている）。Ｈ１Ｎ１は１つの存続するレプリキンしか含有していないものの、Ｈ１Ｎ１はインフルエンザＢ型よりもさらに多産であると思われる。Ｈ１Ｎ１上には８２年間で９５の異なるレプリキン構造が存在するが、一方インフルエンザＢ型分離株の６２年間では３１の異なるレプリキンしか存在しない（表４）。新しいレプリキン構造の数の増加は、地域的流行の年に発生し（表３、４、５及び６）、合計レプリキン濃度の増加と相関関係をもつ（図７、８、１１及び１５）。
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１２】
インフルエンザＨ３Ｎ２は、１９６８年のヒトにおける世界的流行の原因であった。１９６８年に現われた５つのレプリキンは、１９７７年以降消えたが１９９０年には再び現われた（表６）。２２年間存続した唯一のレプリキン構造は、１９７７年に最初に現われ１９９８年まで存続したｈｃｄ（ｇ/ｑ）ｆ（ｑ/ｒ）ｎｅｋｗｄｌｆ（ｖ/ｉ）ｅｒ（ｓ/ｔ）ｋ（配列番号２７７）であった。１９９０年中葉における１２の新しいＨ３Ｎ２レプリキンの新興（表６）は、同時のレプリキン濃度の増加（図８）及び最近の分離株中のＨ３Ｎ２株の普及とこれらの分離株のいくつかからの全てのレプリキンの同時消滅（図８）と相関関係をもち、このことは、新しい亜株Ｈ３Ｎ２（Ｒ）の新興を示唆している。Ｈ３Ｎ２（福建型）の新しい株の２００３年１１月〜１２月の現在の地域的流行は、２００１年７月９日付けの米国仮出願ＵＳ６０／３０３，３９６号の中で最初になされたこの予測を確認している。
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２６】
表８：１９１７年ガチョウインフルエンザレプリキン及び１９１８年ヒト世界的流行レプリキンから２００６年Ｈ５Ｎ１「トリインフルエンザ」相同体の、高速複製に関する８９年のインフルエンザウイルスレプリキンペプチドの保存における整理した置換を示すレプリキン骨格（配列番号３６８〜４２９、それぞれ発生順）
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３２】
１９５７年に見られるとおり、２９個のアミノ酸伸展中にリジン位置の置換が存在する場合であっても、１１位におけるＫが１０位にシフトする場合、新たな位置は、ＹＰ、ＡＹ、Ｎ（１５位）、及びほとんど例外を伴わずにレプリキン骨格の相同構造を保存するためのＬＶＬＷＧ（配列番号４３０）を有するように、２００５年まで維持された。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３７】
【表２１】
2008539164.tif 000135
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４３】
同様にして、配列保存は、ＨＩＶＩ型中の（配列番号５）「ｋｃｆｎｃｇｋｅｇｈ」又は（配列番号６）「ｋｖｙｌａｗｖｐａｈｋ」及びＨＩＶ２型中の（配列番号７）「ｋｃｗｎｃｇｋｅｇｈ」といったそのレプリキンについて、ＨＩＶの異なる分離株Ｐで発見された（表２）。配列保存のさらなる例は、主要リジン及びヒスチジンアミノ酸が保存されている（配列番号４４１）「ｈｃｌｖｃｋｑｋｋｇｌｇｉｓｙｇｒｋｋ」、といったようなＨＩＶｔａｔタンパク質の中に見い出された（表９参照）。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４４】
同様にして、配列保存は、例えば酵素Ｅを活性化させる小麦ユビキチンといったような小麦の中などの植物中に観察された（配列番号４５４−４５６）。小麦中のレプリキンは、中で記述されているように植物の成長の刺激のための信頼性ある標的さえ提供した。その他の保存例は、神経膠腫細胞の組織培養１０年にわたる連続する世代間でのマリグニンの恒常的な存在の中に、そして、米国、英国、欧州及びアジアからの８，０９０件のヒト血清から免疫吸着により単離された抗マリグニン抗体に対する神経膠腫レプリキンの親和力の恒常性に見られる（例えば図５及び米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号）。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４５】
同様にして、保存は、ＨＩＶの分離株内のＴａｔ（トランス作用因子）タンパク質中に観察された。Ｔａｔ（トランス作用因子）タンパク質は、レンチウイルス転写を調節する早期ＲＮＡ結合タンパク質である。これらのタンパク質は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）といったような全ての既知のレンチウイルスのライフサイクルにおける必要な構成要素である。Ｔａｔは、トランス作用性応答配列（ＴＡＲ）ＲＮＡ要素に結合することによって作用しＬＴＲプロモータからの転写の開始及び／又は伸長を活性化する転写調節因子タンパク質である。ＨＩＶは、ｔａｔ無しでは複製できないが、その化学的根拠はわかっていない。８９〜１０２個の残基のＨＩＶｔａｔタンパク質配列の中に、我々は、その他の生体内での高速複製と結びつけられているレプリキンを発見した。このレプリキンのアミノ酸配列は「ＨＣＬＶＣＫＱＫＫＧＬＧＩＳＹＧＲＫＫ」（配列番号４４１）である。実際、我々はこのレプリキンが全てのＨＩＶｔａｔタンパク質の中に存在することを発見した。一部のｔａｔアミノ酸は表９に示されているように交互のアミノ酸により高頻度で置換されている（最も高頻度のアミノ酸の下に並んだ小さいフォント（表９）、優勢なレプリキン「ＨＣＬＶＣＦＱＫＫＧＬＧＩＳＹＧＲＫＫ」（配列番号４４２）についての保存百分率）。これらの置換は、大部分の個々のアミノ酸について現われた。しかしながら、レプリキン構造を画定するレプリキン配列内の主要なリジン及びヒスチジンアミノ酸は、該配列中で１００％保存されている。置換はその他のアミノ酸中の他の場所でレプリキンの内外両方で一般的であるが、これらの主要なヒスチジンアミノ酸上で発生するものは全く無い。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１４７】
【表２２】
2008539164.tif 000136
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５０】
同様にして、レプリキン内の高い保存率により、保存がウイルスレプリキンの一般的特性でありかくしてレプリキンを破壊又は刺激のための恒常かつ信頼性の高い標的としているということが示唆されている、インフルエンザウイルス、ＦＭＤＶ及びＨＩＶを含むウイルスにおいて発見された例において提供されている通りに、レプリキン構造の保存は植物内で発生する。例えば、小麦植物においては、レプリキンが保存され、刺激のための信頼性の高い標的を提供する。酵素Ｅを活性化する小麦植物ユビキチン内の保存されたレプリキンの例としては、以下のものが含まれる。
【化４】
2008539164.tif 000137
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６０】
本発明に従う制限されない観点において、インフルエンザワクチンは、Ｈ５Ｎ１ウイルスのレプリキン骨格、例えば、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨを（配列番号１５）含んでよい。更なる制限されない観点において、インフルエンザワクチンはＵＴＯＰＥ、例えば、ＫＫＫＫＨ（配列番号４５７）又はＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨ（配列番号４５８）を含んでよい。さらにほかには、ワクチンは更なるアジュバント、例えば、省略−ＫＬＨで表される周知の主要なカサガイヘモシアニンを含んでよい。さらに好ましい制限されない観点において、インフルエンザワクチンは、２つのＵＴＯＰＥＳ及びアジュバント配列、例えば、ＫＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ（配列番号１６）−ＫＬＨ（主要なカサガイヘモシアニンアジュバントを示す）（ワクチンＶ１２０３０４Ｕ２）を含むインフルエンザＨ５Ｎ１のレプリキン骨格を含んでよい。本発明の観点は、以前に構築され、そして「２００４年、Ｈ５Ｎ１、ベトナム、高病原性」と標識されたトリインフルエンザレプリキンの１つとして表８に示されるレプリキン骨格を含んでよい。ウサギ及びニワトリに皮下注射される１００μｇのワクチンＶ１２０３０４Ｕ２のペプチドの投与により、ワクチン接種をしていない１：５０以下の希釈から抗体応答が観察され、１：１２０，０００〜１：２４０，０００以上の希釈のワクチン接種後３週から４週目にピークに達した（実施例７を参照）。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７５】
各々の感染性生体のつねに増大する「効能」の出現のためにつねに進化的及び競合的圧力が存在するという証拠は豊富に存在する。これらの観察事実に基づき、又、予測により、進化的圧力が、ＥＥＬ白血病の場合のように７０％という高い値までの上昇を続けるリジン（ｋ）濃度と共に、増々短くなるレプリキンへと向かっているのであれば（図７）、そのとき予測された理論的理想は、可能なかぎり高いｋの％（８３．３％のｋ、５／６及び１つの義務的「ｈ」を含む、演繹されたレプリキン「ｋｋｋｋｈｋ」（配列番号４５９）を参照のこと）で、レプリキンを画定するアルゴリズムにより許される可能なかぎり短いレプリキンすなわち６つのアミノ酸（６〜１０個のアミノ酸だけ離隔した２つのｋ）となる。従って、我々はいわば、今のところまだ生体自体により見かけ上取られていない次なる進化上の段階であると思われる又はそうなるはずのものを取り上げ、一般的ワクチンとして使用すべき、結果としての演繹されたレプリキンを考案した。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７７】
さらに、我々は、ｋの％が高いレプリキンがウサギに投与された場合に最高の抗体応答を生成するということを発見した。我々が設計したこれらの合成ペプチドは、汎用合成エピトープ又は「ＵＴＯＰＥ」と呼称され、これらのＵＴＯＰＥに基づくワクチンは「ＵＶＡＸ」と呼称される。演繹された合成ワクチンであるＵＶＡＸは、唯一のワクチンとして又はより特異的なレプリキンワクチン又はその他のワクチンと共に投与された場合にはアジュバントとして使用可能である。以下に記すのは、演繹されたＵＴＯＰＥ及びＵＶＡＸの例である。
【表２３】
2008539164.tif 000138
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２４６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２４６】
ほかの観点において、レプリキンサブシーケンス以外のサブシーケンスを同定するために「Dr. Peptide」と題されるプログラムの検索基準を適用することができる。Dr. Peptideにより、公的に利用可能なゲノムデータベースにおいて、例えば、最大１５個のアミノ酸により分離される、配列ｈｌｋ・・・・・・・ｈｌｋ（配列番号４７０）の全ての例を検索することが可能である。これらの検索は、合致する基準に基づきタンパク質の新たな統計的プロフィール及び新たなグルーピングを創作することを許容する。Dr. PeptideはGenome Explorerとほとんど同じ機能を含むことができる。例えば、Genome Explorerのように、Dr. Peptideは、ユーザーインターフェースを介して、ユーザーの検索タームを迅速にし、そして未加工の配列データを得るために、オンラインデータベース、例えば、ＮＣＢＩ又はＬＡＮＬデータベースに対して該検索タームを適用することができる。例えば、検索タームにマッチする全ての未加工の配列についての文献名、タンパク質ソース、株、血清型、及び発見年等のさらなるデータを更に得ることができる。未加工データが獲得されると、Dr. Peptideはさらに、任意のサブシーケンスを同定するためにデータを処理し、そしてデータファイル中の、例えば、いずれかのワードプロセッサーで開くことができるＨＴＭＬページ形態において、そのアウトプットを提示することができる。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７８】
ｃ）腫瘍細胞インビボ及びインビトロ組織培養
藻類についてａ）で上述されたものと同じ抽出及びカラムクロマトグラフィ分離方法を用いて、ウイルス感染細胞中のレプリキンを単離し同定する。例えば、各々ａ）で上述した通りに処理された悪性脳腫瘍から単離したアストロシチンのレプリキン前駆体、組織培養中のグリア芽腫腫瘍細胞から単離したマリグニン（Aglyco１０Ｂ）、組織培養中のＭＣＦ７哺乳動物癌細胞及び組織培養中のＰ３Ｊリンパ腫細胞は、それぞれ９．１％、６．７％、６．７％及び６．５％のリジン含有量をもつレプリキン前駆体を生成した。米国特許第６，２４２，５７８Ｂ１号例１０で記述されているようなAglyco１０Ｂの加水分解及び質量分析は、アミノ酸配列、ｙｋａｇｖａｆｌｈｋｋｎｄｉｉｄｅ（配列番号４７１）、１６量体レプリキンを産生した。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９６】
例６
ＳＡＲＳコロナウイルスのヌクレオカプシド、スパイク、及びエンベロープタンパク質中に発見された５つの短いＳＡＲＳレプリキンのアミノ酸配列を合成し、そしてＳＡＲＳコロナウイルス中のレプリキン配列に対する免疫応答を試験するためにウサギにおいて試験した。以下のレプリキン配列を試験した：（１）２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  ヌクレオカプシド（配列番号３０３）；（２）２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  スパイクタンパク質（配列番号３０４）；（３）２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  スパイクタンパク質（配列番号３０５）；２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  スパイクタンパク質（配列番号３０６）；（４）２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  エンベロープタンパク質（配列番号３０７）；及び（５）２００３年  ヒト  ＳＡＲＳ  ヌクレオカプシドタンパク質（配列番号３０８）。各合成ペプチドをウサギに皮下注射した。試験ウサギは、１０，００００中１以上の希釈において結合する５つの配列のそれぞれに対する測定可能な特異的抗体を産生した。２１のアミノ酸ＳＡＲＳヌクレオカプシドレプリキン抗体（配列番号３０３）は、２０４，８００中１以上の希釈において結合することを実証した。多様な小ペプチドにより、天然痘ワクチンとして全てのタンパク質又は数先のタンパク質又は核酸で得られる不必要な副作用を伴わない強力な免疫応答を達成するための以前の不成功の試験のために、強力な免疫応答を達成するための小合成レプリキン抗原の能力は、ＳＡＲＳワクチンの有効性に有意であることが示された。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９７】
例７
４１アミノ酸レプリキン配列
ワクチンＶ１２０３０４Ｕ２を設計する、Ｃ末端（−ＫＬＨとして示される）において主要なカサガイヘモシアニンアジュバントの付加を伴う、ＫＮＳＴＹＰＴＩＫＲＳＹＮＮＴＮＱＥＤＬＬＶＬＷＧＩＨＨＫＫＫＫＨＫＫＫＫＫＨＫ（配列番号１６）−ＫＬＨは、本発明者により、表８において「２００４年Ｇ５Ｎ１ベトナム、高病原性」と標識されたインフルエンザレプリキンである、Ｈ５Ｎ１「トリインフルエンザ」の２９個のアミノ酸レプリキン骨格と、Ｈ５Ｎ１骨格のＣ末端上の更に２つのＵＴＰＥユニット（ＫＫＫＫＨＫ）（配列番号４５９）及び２つのＵＴＯＰＥユニットのＣ末端に共有結合する追加的アジュバンド（主要なカサガイヘモシアニンアジュバント（−ＫＬＨと示された）から設計された。１００μｇのワクチンワクチンＶ１２０３０４Ｕ２をウサギ及びニワトリに皮下注射した。ワクチン化の前及び注射後１週間〜注射後８週間において抗体応答を測定した。抗体応答は１週間目において顕著であり、そしてワクチン化３週間から４週間目においてピークに達した。ピーク抗体応答は、１：１２，０００の希釈から１：２４０，０００以上の希釈の範囲であった。高結合性９６ウェルプレートにいて固相（０．１μｇ／１００μｌ／ウェル）において結合するペプチド−ＧＧＧ（ヤギγグロブリン）による酵素結合性免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で抗体価を測定した。血清を先ず５０倍に希釈し、その後更に２倍連続希釈において希釈した。ＥＬＩＳＡ価の結果は、０．２の４０５ｎｍにおける光学密度からもたらされ、かつ連続希釈曲線の非線形回帰分析に由来する推定希釈係数から測定した。検出は、西洋わさびペルオキシダーゼ結合型二次抗体及びＡＢＴＳ（Boehringer Mannheim.の登録商標、ＧｍｂＨ）を使用して得られた。２羽のニワトリ及び２匹のウサギにおける試験からの結果を表１１に供する。ウサギＤ４５００における試験からの個々のウェル結果を表１２に供する。例６中に報告した結果との組み合わせにおいて、ウサギ又はニワトリにおける抗体応答についてのレプリキン配列の全部で６つの試験中、６つ全ての配列が測定可能な抗体応答を供し、そして抗原性であることを証明した。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９５】
【図３】リコグニン１６量体（配列番号４）に対する被曝に応答して生成された抗マリグニン抗体の量を示す棒グラフである。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４０７】
【図１３】国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって保持されているタンパク質データベースを検索することによって得られたヒト癌タンパク質（配列番号４７２）のプリントアウトである。
【手続補正４０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０４１５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０４１５】
【図２１】異なるタンパク質中の、実質的に固定されたアミノ酸位置において発生するレプリキン骨格を示す表である。図２１は、それぞれ発生順に、配列番号４７３〜５３１を開示する）。
【国際調査報告】
2008539164.tif 000139
2008539164.tif 000140