(57)【要約】【課題】無機材料及び有機材料を含有するコンポジット生体材料の新規な調製方法の提供。【溶液手段】（ａ）液体担体、無機材料及び有機材料を含有する第１スラリー組成物を準備する工程と、（ｂ）スラリー用の型を準備する工程と、（ｃ）スラリーを型に注入する工程と、（ｄ）液体担体が複数の固体結晶又は粒子に変化する温度で、型に注入されたスラリーを冷却する工程と、（ｅ）少なくとも複数の固体結晶又は粒子の一部を、好ましくは昇華及び／又は蒸発で除去し、無機材料及び有機材料を含んでなる多孔質のコンポジット材料とする工程と、（ｆ）型から材料を取り出す工程を含んでなる方法。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
無機材料及び有機材料を含有するコンポジット生体材料の調製方法であって、
（ａ）液体担体、無機材料及び有機材料を含んでなる第１スラリー組成物を準備する工程と、
（ｂ）スラリー用の型を準備する工程と、
（ｃ）スラリーを型に注入する工程と、
（ｄ）液体担体が複数の固体結晶又は粒子に変化する温度で、型に注入されたスラリーを冷却する工程と、
（ｅ）少なくとも複数の固体結晶又は粒子の一部を、好ましくは昇華及び／又は蒸発によって除去し、無機材料及び有機材料を含んでなる多孔質のコンポジット材料とする工程と、
（ｆ）型から材料を取り出す工程を含んでなる方法。
【請求項２】
前記無機材料がリン酸カルシウム材を含有する、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記リン酸カルシウム材がブラッシャイトを含有する、請求項２記載の方法。
【請求項４】
前記有機材料が、コラーゲン（組換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン及びコラーゲンの一部のポリペプチド配列を含む合成ポリペプチドのうちの１つ以上を含有する、請求項１から３のいずれか１項記載の方法。
【請求項５】
前記無機材料がリン酸カルシウム材を含有し、
前記有機材料がコラーゲン及び任意にグリコサミノグリカンを含有し、
前記多孔質のコンポジット材料がリン酸カルシウム材、コラーゲン及び任意にグリコサミノグリカンを含有する、請求項１から４のいずれか１項記載の方法。
【請求項６】
前記第１スラリーがコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈殿物を含有する、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記第１スラリーがコラーゲン、リン酸カルシウム材及びグリコサミノグリカンの３成分共沈殿物を含有する、請求項５記載の方法。
【請求項８】
前記リン酸カルシウム材がブラッシャイトを含有する、請求項５から７のいずれか１項記載の方法。
【請求項９】
更に、液体担体、有機材料及び任意に無機材料を含んでなる第２スラリー組成物を準備する工程と、
前記の冷却工程に先立ち、前記第１スラリー組成物を堆積させる前又は堆積させた後に前記第２スラリー組成物を型に堆積させる工程を含んでなる、請求項１から８のいずれか１項記載の方法。
【請求項１０】
前記有機材料がコラーゲン（組換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン及びコラーゲンの部分ポリペプチド配列を含んでなる合成ポリペプチドのうちの１つ以上を含有する、請求項９記載の方法。
【請求項１１】
前記第２スラリー組成物が無機材料（好ましくはリン酸カルシウム材）を含有する、請求項９又は請求項１０記載の方法。
【請求項１２】
前記第２スラリー組成物が、液体担体、コラーゲン、任意にリン酸カルシウム材及び任意にグリコサミノグリカンを含有する、請求項９から１１のいずれか１項記載の方法。
【請求項１３】
前記第２スラリー組成物が、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈殿物、又はコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈殿物、又はコラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウム材の３成分共沈殿物を含有する、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記第２スラリー組成物がブラッシャイトであるリン酸カルシウム材を含有する、請求項１２又は請求項１３記載の方法。
【請求項１５】
前記第１スラリー組成物及び第２スラリー組成物が、型の第１層及び第２層として堆積する、請求項９から１４のいずれか１項記載の方法。
【請求項１６】
請求項１２から１５のいずれか１項記載の方法であって、該方法により多層材料が形成され、その少なくとも１つの層がコラーゲン、リン酸カルシウム材及び任意にグリコサミノグリカンを含む多孔質コンポジット材料を含んでなる方法。
【請求項１７】
前記第２スラリー組成物から生じる層が多孔質である、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
前記第１スラリー組成物及び第２スラリー組成物を型に堆積させた後、型中の含有物の冷却工程の前に、最高２４時間静置する、請求項９から１７のいずれか１項記載の方法。
【請求項１９】
型中の含有物を静置する工程を、１〜２００ｋＰａ、好ましくは５０〜１５０ｋＰａ、より好ましくは５０〜１０１．３ｋＰａの圧力で実施する、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記液体担体が水を含有する、請求項１から２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２１】
冷却工程の前に型に堆積させたスラリーの温度が、好ましくは２〜４０℃、より好ましくは４〜３７℃、更に好ましくは２０〜３７℃の範囲である、請求項１から２０のいずれか１項記載の方法。
【請求項２２】
型に堆積させたスラリーの冷却工程を≦０℃の温度で実施する、請求項１から２１のいずれか１項記載の方法。
【請求項２３】
前記冷却工程を−１００〜０℃、好ましくは−８０〜−１０℃、より好ましくは−４０〜−２０℃の範囲の温度で実施する、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
型に堆積させたスラリーの冷却工程を、０．０２〜１０℃／分、好ましくは０．０２〜６．０℃／分、より好ましくは０．２〜２．７℃／分の冷却速度で実施する、請求項１から２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
型に堆積させたスラリーの厚が、０．１〜５００ｍｍ、好ましくは０．５〜２０ｍｍ、より好ましくは１．０〜１０ｍｍである、請求項１から２４のいずれか１項記載の方法。
【請求項２６】
型に堆積したスラリーの粘性が、０．１〜５０Ｐａ・ｓ、好ましくは０．１〜１０Ｐａ・ｓ、より好ましくは０．５〜５Ｐａ・ｓである、請求項１から２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
昇華によって固体結晶又は粒子の少なくとも一部分を除去する工程を、０〜０．０８ｋＰａ、好ましくは０．００２５〜０．０８ｋＰａ、より好ましくは０．００２５〜０．０４ｋＰａの圧力で実施する、請求項１から２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
昇華によって固体結晶又は粒子の少なくとも一部分を除去する前記工程を、最高１２０時間、好ましくは１２〜７２時間、より好ましくは２４〜３６時間実施する、請求項１から２７のいずれか１項記載の方法。
【請求項２９】
昇華によって固体結晶又は粒子の少なくとも一部分を除去する前記工程を、−１０〜６０℃、好ましくは０〜４０℃、より好ましくは２０〜３７℃の温度で実施する、請求項１から２８のいずれか１項記載の方法。
【請求項３０】
多孔質のコンポジット生体材料中でコラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカンを架橋させる工程を更に含んでなる、請求項５から８及び１２から２９のいずれか１項記載の方法。
【請求項３１】
更に、多孔質のコンポジット生体材料中のリン酸カルシウム材料の少なくとも一部を、異なるリン酸カルシウム相に変化させる工程を含んでなる、請求項２から８及び１１から３０のいずれか１項記載の方法。
【請求項３２】
リン酸カルシウム材がブラッシャイトを含有し、リン酸オクタカルシウム及び／又はアパタイトに変化する、請求項３１記載の方法。
【請求項３３】
合成コンポジット生体材料であって、
少なくともその生体材料の一部が、リン酸カルシウム材、並びにコラーゲン（組換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン又はコラーゲンの一部のポリペプチド配列を含有する合成ポリペプチドのうちの１つを含有する多孔質の共沈殿物から形成され、
そのマクロ孔サイズ範囲（孔直径）が１〜１０００ミクロン、好ましくは２００〜６００ミクロンである生体材料。
【請求項３４】
前記生体材料の少なくとも一部がリン酸カルシウム材とコラーゲンを含有する多孔質の共沈殿物から形成される、請求項３３記載の生体材料。
【請求項３５】
合成コンポジット生体材料であって、少なくともその生体材料の一部が、リン酸カルシウム材、並びにコラーゲン（組換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン及びコラーゲンの一部のポリペプチド配列を含有する合成ポリペプチドのうちの２つ以上を含有する多孔質の３成分共沈殿物から形成され、
そのマクロ孔サイズ範囲（孔直径）が１〜１０００ミクロン、好ましくは２００〜６００ミクロンである生体材料。
【請求項３６】
前記生体材料の少なくとも一部が、コラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウム材を含有する多孔質の３成分共沈殿物から形成される、請求項３５記載の生体材料。
【請求項３７】
合成コンポジット生体材料であって、
コラーゲン及びリン酸カルシウム材及び任意にグリコサミノグリカンを含有する多孔質材料から形成される第１層、並びに、
前記第１層と接着し、コラーゲン、又はコラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈殿物、又はコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈殿物、又はコラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウム材の３成分共沈殿物を含有する材料から形成される第２層を有する生体材料。
【請求項３８】
前記第１層が請求項３３又は請求項３６のいずれか１項記載の生体材料から形成される、請求項３７記載の生体材料。
【請求項３９】
前記第１層及び前記第２層が重層的に形成され、好ましくは液相共合成により形成される、請求項３７又は請求項３８記載の生体材料。
【請求項４０】
前記第１層及び前記第２層が相互拡散層を介して互いに結合する、請求項３３から３９のいずれか１項記載の生体材料。
【請求項４１】
前記第１層及び前記第２層が中間層を介して互いに結合する、請求項３３から３９のいずれか１つに記載の生体材料。
【請求項４２】
前記第２層が多孔質又は非多孔質である、請求項３３から４１のいずれか１項記載の生体材料。
【請求項４３】
前記第１層及び／又は前記第２層に結合される１つ以上の更なる層を含有し、前記更なる層の各々がコラーゲン、又はコラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈殿物、又はコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈殿物、又はコラーゲン、グリコサミノグリカン及び少なくとも１つのリン酸カルシウム材の３成分共沈殿物を含有する材料から形成される、請求項３３から４２のいずれか１項記載の生体材料。
【請求項４４】
前記第１層、前記第２層及び前記１つ以上の更なる層が重層的に形成される、請求項４３記載の生体材料。
【請求項４５】
隣接する層が相互拡散層を介して互いに結合する、請求項４３又は請求項４４記載の生体材料。
【請求項４６】
前記１つ以上の更なる層の少なくとも１つが多孔質又は非多孔質である、請求項４３から４５のいずれか１項記載の生体材料。
【請求項４７】
前記材料がコラーゲン及びグリコサミノグリカンを含有し、コラーゲン及びグリコサミノグリカンが架橋されている、請求項３３から４６のいずれか１項記載の生体材料
【請求項４８】
前記材料がコラーゲンを含有し、前記コラーゲンが１〜９９重量％、好ましくは５〜９０重量％、より好ましくは１５〜６０重量％の量で材料に含まれる、請求項３３から４７のいずれか１項記載の生体材料
【請求項４９】
前記材料がグリコサミノグリカンを含有し、前記グリコサミノグリカンが０．０１〜２０重量％、好ましくは１〜５．５重量％の量で材料に含まれる、請求項３３から４８のいずれか１項記載の生体材料。
【請求項５０】
前記材料がコラーゲンを含有し、前記リン酸カルシウムがブラッシャイトを含む場合、ブラッシャイトに対するコラーゲンの重量比が１０：１〜１：１００、好ましくは５：１〜１：２０である、請求項３３から４９のいずれか１項記載の生体材料。
【請求項５１】
前記材料がコラーゲンを含有し、前記リン酸カルシウムがリン酸オクタカルシウムを含む場合、リン酸オクタカルシウムに対するコラーゲンの重量比が１０：１〜１：１００、好ましくは５：１〜１：２０である、請求項３３から４９のいずれか１項記載の生体材料。
【請求項５２】
前記材料がコラーゲン及びグリコサミノグリカンを含有し、グリコサミノグリカンに対するコラーゲンの重量比が８：１〜３０：１である、請求項３３から５１のいずれか１項記載の生体材料。
【請求項５３】
請求項３３から５２のいずれか１項記載の生体材料を含有する合成骨材料、骨インプラント、移植骨片、代替骨、骨足場、充填材、コーティング又はセメント。
【請求項５４】
請求項３３から５２のいずれか１項記載の生体材料を含有する、組織工学用途の単層又は層状構造の骨足場。
【請求項５５】
請求項１から３２のいずれか１項記載の方法で得られる多孔質のコンポジット生体材料。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は広義には、生医学的用途に用いる合成骨材料に関し、具体的には、組織工学の使用のための、コラーゲン、リン酸カルシウム及び任意にグリコサミノグリカンを含んでなる多孔質の単層足場及び多孔質の層状構造を有する足場に関する。
【０００２】
天然骨は、コラーゲン及び、グリコサミノグリカンとリン酸カルシウムを含む非コラーゲン有機相からなる生体複合材料である。天然骨の複合階層構造は高い剛性、強度、破壊靱性を含む優れた機械的性質もたらし、言い換えれば、それにより骨格は日々さらされる生理学的ストレスに耐えうる。この分野の研究者が直面する課題は、人体又は動物体において、合成物質の中や周りを囲い込むように天然骨が成長することができる組成と構造を有する合成物質を提供することである。
【０００３】
骨は、生体環境内で形成される骨様アパタイト層を通して、人体内で直接リン酸カルシウムに結合すること（生物活性と称される特性）が観察されている。一方では、コラーゲン及び、コラーゲンとグルコサミノグリカンといった他の生体有機物からなる共重合体が、人体内で骨の生成と維持に関与している多種の細胞の接着や増殖に対して最適な基質として知られている。
【０００４】
ヒドロキシアパタイトは、骨代替材料として使われている最も一般的なリン酸カルシウムである。しかしながら、これは、ブラッシャイトやリン酸三カルシウムやリン酸オクタカルシウムといったリン酸カルシウム材料の他の形態と比較して、相対的に不溶性の物質である。アパタイトの相対的に低い溶解性は、体内での物質の吸収速度が著しく遅いという点で生体材料の製造には不利である。
【０００５】
ヒドロキシアパタイトのようなリン酸カルシウム類は機械的剛性のある材料である。しかし、これらは天然骨に比べ相対的に脆い。コラーゲンは機械的強靭さのある材料であるが、天然骨に比べて相対的に剛性が低い。コラーゲンとグリコサミノグリカンの共重合体からなる素材は、コラーゲン単独より強靭で剛性がある。しかしそれでもまだ天然骨に比べて相対的に剛性が低い。
【０００６】
機械的強靭さをヒドロキシアパタイトよりも改良し、コラーゲン及び、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共重合体よりも剛性を改良した人工骨代替材料を製造しようとする過去の試みには、機械的混合によるコラーゲンとアパタイトの一体化がある。例えば特許文献１に記載の機械的手法がある。
【０００７】
その後の進歩としては、ヒドロキシアパタイトやコラーゲンやコンドロイチン−４−硫酸エステルを機械的に混合して作られた、これら組成物から成る骨代替材料の製造が挙げられる。これは特許文献２に記述されている。更に、この文献には、コラーゲンに対するコンドロイチン−４−硫酸エステルの脱水熱処理架橋結合について記述されている。アパタイト、コラーゲン及びコンドロイチン−４−硫酸エステルからなる材料は、優れた生体適合性を有することが知られている。アパタイト及び、コラーゲンと必要に応じてコンドロイチン−４−硫酸エステルとの機械的混合は、アパタイトのコラーゲン／コンドロイチン−４−硫酸エステル被覆粒子の形成に必須である。このような素材は、生体適合性はあるものの、人体や動物体において天然骨の制限的な内部成長を作り出し、合成材料のリン酸カルシウム相を再構築しないことが知られている。
【０００８】
外傷や奇形又は疾患により障害を受けた骨格部位の修復は、整形外科医に以下の特別な難題をもたらす。皮膚や神経や他の大半の組織における損傷とは異なり、骨の異常は、複数のはっきりと異なる種類の組織（すなわち、骨、軟骨、腱、靱帯）を包含し、日常的に機械的加重を受ける部位を含み、石灰化と非石灰化組織の境界領域（例えば、靱帯付着点、骨／軟骨接合部分にある”タイドマーク”）をまたがっている。
【０００９】
現行の臨床的な取り組みとして、非吸収性の人工インプラント若しくは自家組織移植又は同種組織移植、化学物質、細胞移植、又はこれらの方法の組み合わせによる骨損傷の修復が試みられている。これらの取り組みは、単一組織タイプの処置に対して成功を収めている場合もあるが、一方で、例えば関節接合不全のような石灰化組織と非石灰化組織の間の境界領域を含む事例では、良くても不完全な治癒という結果になる。その上、たとえ現行の処置で最も成功する場合でも、少なくとも採骨部位からの組織の採取や、骨か軟骨か腱か靱帯への縫合が必要となる。前述の手法は、採骨部位の欠落や採骨による不具合（ドナーサイトモビディティ）に悩まされており、一方後者は、実施することが難しく、縫合穴においてさらなる損傷を引き起こしてしまう。
【００１０】
複合足場と層状足場という用語は同意語であり、隣接する層の材料組成が実質的に異なる各層の材料組成を持つ２つもしくはそれ以上の層からなる足場のことを言う。単層足場もしくはモノリシック足場という用語は同意語であり、各層が全体にわたって概して均一な材料組成を持つ一層のみからなる足場のことを言う。
【００１１】
数は多くないものの近年の取り組みは、軟骨のみ、又は骨と軟骨の双方を含む関節接合不全の処置に対して多孔性層状足場を利用しようと組織工学戦略の進歩に努めてきた。これらの成果物は、骨と軟骨の同時並行的な再生を誘導するように努めてきたが、それぞれに対して別々の足場を用いてきた（Ｎｉｅｄｅｒａｕｅｒら、２０００；Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０００；Ｇａｏら、２００１；Ｇａｏら、２００２；Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２００２；Ｓｈｅｒｗｏｏｄら、２００２；Ｈｕｎｇら、２００３；Ｈｕｎｚｉｋｅｒ及びＤｒｉｅｓａｎｇ、２００３）。
【００１２】
層状足場の追加的な特徴は、骨層の軟骨下板への直接接着を通した無縫合固定を達成する可能性を有していることである。もし軟骨部が骨部に堅固に接着したままであれば、さらなる固定は必要ない。無縫合固定はまた、腱と靱帯の骨付着点に関連する損傷の処置を可能にする。
【００１３】
この新しい手法の保証にもかかわらず、２つの欠点が現在までに報告されている層状足場の有効性を限定している。第一は、足場の各層に用いられる材料に関するものである。吸収性合成ポリマーは、軟骨層に利用できる唯一の材料であり、しばしばこれら足場の多くにおいても骨部の構成成分であった。調製が容易であるが、合成ポリマーはコラーゲンのような天然ポリマーに比べて細胞の接着や増殖への貢献が低いことが知られており、その上、それらが分解する際に高濃度の酸を放出する。更に、腱や靱帯修復が必要な用途のため、それらが架橋結合する方法にもかかわらず、吸収性合成ポリマーは、リハビリテーション運動の間にかかる軽減負荷に持ちこたえるために十分な強度と剛性さえ有していない。
【００１４】
標準的な層状足場の第二の欠点は、各層の間の境界領域に関するものである。天然の関節や腱／靱帯の付着点は、石灰化部位と非石灰化部位との間のコラーゲン源線維の連続性により特徴付けられる。結果として得られる滑らかな移行系（軟部境界領域）は、機械的障害なく生理学的負荷に耐えうる固有の機械的安定性をこれらの部位に与える。その一方で、現行の層状足場の大半は、２つの異なる材料の間に明らかな境界を形成する硬い境界領域を含んでいる。縫合（Ｓｃｈａｅｆｅｒら、２０００）やフィブリン接着接合（Ｇａｏら、２００１）や他の技術（Ｇａｏら、２００２；Ｈｕｎｇら、２００３）は、この境界領域を補強するのに用いられてきた。しかし、境界剥離は、管理された動物モデルにおいてでさえ、いまだに報告されている。これらの縫合及び接着手法はまた、繊細で再現性に乏しい。
【００１５】
先行研究では、コラーゲン及び１つ又はそれ以上のグルコサミノグリカン類（ＧＡＧｓ）の多孔性足場を製造するための凍結乾燥手順の条件を制御する方法を開発してきた（Ｙａｎｎａｓら、１９８９；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、２００４；Ｏ’Ｂｒｉｅｎら、２００５；Ｌｏｒｅｅら、１９８９）。これらの技術により、孔径や縦横比（アスペクト比）といった足場特性が、外傷や損傷部位での治癒反応に顕著な効果を持つことが知られている管理された手法や条件によって変化を受ける。しかし、骨格や筋骨格損傷の不具合を伴う損傷の処置に対しては、非石灰化コラーゲン−ＧＡＧ足場の組成や特徴とは対照的に、骨の組成や特徴とよく適合する材料組成や機械的特長を有する多孔性足場を製造するための技術の進歩が必要である。
【特許文献１】欧州特許出願公開第０１６４４８４号公報
【特許文献２】欧州特許出願公開第０２１４０７０号公報
【非特許文献１】Ｇａｏ  Ｊ，Ｄｅｎｎｉｓ  ＪＥ，Ｓｏｌｃｈａｇａ  ＬＡ，  Ａｗａｄａｌｌａｈ  ＡＳ，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＶＭ，Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ．２００１．Ｔｉｓｓｕｅ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎ  Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｇｒａｆｔ  Ｕｓｉｎｇ  Ｒａｔ  Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ７：３６３−３７１．
【非特許文献２】Ｇａｏ  Ｊ，  Ｄｅｎｎｉｓ  ＪＥ，Ｓｏｌｃｈａｇａ  ＬＡ，  Ｇｏｌｄｂｅｒｇ  ＶＭ，Ｃａｐｌａｎ  ＡＩ．２００２．Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  Ｄｅｆｅｃｔ  ｗｉｔｈ  Ｔｉｓｓｕｅ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔｗｏ−  Ｐｈａｓｅ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｍａｔｅｒｉａｌ  ｏｆ  Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ａｎｄ  Ｈｙａｌｕｒｏｎａｎ  Ｓｐｏｎｇｅ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ８：８２７−８３７．
【非特許文献３】Ｈｕｎｇ  ＣＴ，Ｌｉｍａ  ＥＧ，Ｍａｕｃｋ  ＲＬ，  Ｔａｋｉ  Ｅ，ＬｅＲｏｕｘ  ＭＡ，Ｌｕ  ＨＨ，  Ｓｔａｒｋ  ＲＧ，Ｇｕｏ  ＸＥ，Ａｔｅｓｈｉａｎ  ＧＡ．２００３．Ａｎａｔｏｍｉｃａｌｌｙ  Ｓｈａｐｅｄ  Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ  ｆｏｒ  Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｒｅｐａｉｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｃｈａｎｉｃｓ  ３６：１８５３−１８６４．
【非特許文献４】Ｈｕｎｚｉｋｅｒ  ＥＢ，Ｄｒｉｅｓａｎｇ  ＩＭＫ．２００３．Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｂａｒｒｉｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅ  ｆｏｒ  Ｇｒｏｗｔｈ−Ｆａｃｔｏｒ−Ｂａｓｅｄ  Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｒｅｐａｉｒ．Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  １１：３２０−３２７．
【非特許文献５】Ｎｉｅｄｅｒａｕｅｒ  ＧＧ，Ｓｌｉｖｋａ  ＭＡ，  Ｌｅａｔｈｅｒｂｕｒｙ  ＮＣ，Ｋｏｒｖｉｃｋ  ＤＬ，Ｈ．Ｈ．ＨＪ，Ｅｈｌｅｒ  ＷＣ，Ｄｕｎｎ  ＣＪ，Ｋｉｅｓｗｅｔｔｅｒ  Ｋ．２０００．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｍｕｌｔｉｐｈａｓｅ  Ｉｍｐｌａｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｆｏｃａｌ  Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  Ｄｅｆｅｃｔｓ  ｉｎ  Ｇｏａｔｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２１：２５６１−２５７４．
【非特許文献６】Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＦＪ，  Ｈａｒｌｅｙ  ＢＡ，Ｙａｎｎａｓ  ＩＶ，Ｇｉｂｓｏｎ  Ｌ．２００４．Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｒａｔｅ  ｏｎ  Ｐｏｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｉｎ  Ｆｒｅｅｚｅ−Ｄｒｉｅｄ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ−  ＧＡＧ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２５：１０７７−１０８６．
【非特許文献７】Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ＦＪ，Ｈａｒｌｅｙ  ＢＡ，Ｙａｎｎａｓ  ＩＶ，Ｇｉｂｓｏｎ  ＬＪ．２００５．Ｔｈｅ  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｐｏｒｅ  Ｓｉｚｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｃｏｌｌａｇｅｎ−ＧＡＧ  Ｓｃａｆｆｏｌｄｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６：４３３−４４１．
【非特許文献８】ＨＭ  Ｌｏｒｅｅ，ＩＶ  Ｙａｎｎａｓ，Ｂ  Ｍｉｋｉｃ，ＡＳ  Ｃｈａｎｇ，ＳＭ  Ｐｅｒｕｔｚ，ＴＶ  Ｎｏｒｒｅｇａａｒｄ，ａｎｄ  Ｃ  Ｋａｒａｒｕｐ，  ’Ａ  ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｉｎｇ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｂｒｉｄｇｅｓ  ｆｏｒ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｎｅｒｖｅ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ’  Ｐｒｏｃ．１５ｔｈ  Ａｎｎｕａｌ  Ｎｏｒｔｈｅａｓｔ  Ｂｉｏｅｎｇ．Ｃｏｎｆ．Ｐ．５３−５４，１９８９．
【非特許文献９】Ｓｃｈａｅｆｅｒ  Ｄ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｉ，Ｊｕｎｄｔ  Ｇ，Ｓｅｉｄｅｌ  Ｊ，Ｈｅｂｅｒｅｒ  Ｍ，Ｇｒｏｄｚｉｎｓｋｙ  Ａ，Ｂｅｒｇｉｎ  Ｉ，Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ  Ｇ，Ｆｒｅｅｄ  ＬＥ．２００２．Ｔｉｓｓｕｅ−Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｐａｉｒ  ｏｆ  Ｌａｒｇｅ  Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  Ｄｅｆｅｃｔｓ．Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｒｈｅｕｍａｔｉｓｍ  ４６：２５２４−２５３４．
【非特許文献１０】Ｓｃｈａｅｆｅｒ  Ｄ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｉ，Ｓｈａｓｔｒｉ  Ｐ，Ｐａｄｅｒａ  ＲＦ，Ｌａｎｇｅｒ  Ｒ，Ｆｒｅｅｄ  ＬＥ，Ｖｕｎｊａｋ−Ｎｏｖａｋｏｖｉｃ  Ｇ．２０００．Ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２１：２５９９−２６０６．
【非特許文献１１】Ｓｈｅｒｗｏｏｄ  ＪＫ，Ｒｉｌｅｙ  ＳＬ，Ｐａｌａｚｚｏｌｏ  Ｒ，Ｂｒｏｗｎ  ＳＣ，Ｍｏｎｋｈｏｕｓｅ  ＤＣ，Ｃｏａｔｅｓ  Ｍ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ  ＬＧ，  Ｌａｎｄｅｅｎ  ＬＫ，Ｒａｔｃｌｉｆｆｅ  Ａ．２００２．Ａ  Ｔｈｒｅｅ−Ｄｉｍｅｎｓｉｐｎａｌ  Ｏｓｔｅｏｃｈｏｎｄｒａｌ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ  Ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｆｏｒ  Ａｒｔｉｃｕｌａｒ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ  Ｒｅｐａｉｒ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３：４７３９−４７５１．
【非特許文献１２】Ｙａｎｎａｓ  ＩＶ，Ｌｅｅ  Ｅ，Ｏｒｇｉｌｌ  ＤＰ，Ｓｋｒａｂｕｔ  ＥＭ，  Ｍｕｒｐｈｙ  ＧＦ．１９８９．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｍｏｄｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍａｔｒｉｘ  ｔｈａｔ  Ｉｎｄｕｃｅｓ  Ｐａｒｔｉａｌ  Ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｕｌｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｓｋｉｎ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ８６：９３３−９３７．
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１６】
本発明は、従来技術に関連する少なくとも１つの課題の克服に関する。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
すなわち、無機材料及び有機材料を含有するコンポジット生体材料の調製方法であって、
（ａ）液体担体、無機材料及び有機材料を含有する第１スラリー組成物を準備する工程と、
（ｂ）スラリー用の型を準備する工程と、
（ｃ）スラリーを型に注入する工程と、
（ｄ）液体担体が複数の固体結晶又は粒子に変化する温度で、型に注入されたスラリーを冷却する工程と、
（ｅ）少なくとも複数の固体結晶又は粒子の一部を、好ましくは昇華及び／又は蒸発によって除去し、無機材料及び有機材料を含んでなる多孔質のコンポジット材料とする工程と、
（ｆ）型から材料を取り出す工程を含んでなる方法である。
【００１８】
本明細書中で使用される用語「生体材料」とは、ヒト又は動物の体内で生物学的適合性を有する材料を意味する。
【００１９】
本明細書で用いられる用語「スラリー」には、スラリー、溶液、懸濁液、コロイド及び分散液が含まれる。
【００２０】
無機材料は典型的にはリン酸カルシウム材が含まれる。
【００２１】
有機材料には典型的には、生体有機物質種であって、例えば水溶媒質中に可溶性であるか、又は懸濁させてスラリーを形成できるものが含まれる。例としては、アルブミン、グリコサミノグリカン、ヒアルロナン、キトサン及びコラーゲンの一部のポリペプチド配列を含んでなる合成ポリペプチドのうちのうちの１つ以上が挙げられる。任意にグリコサミノグリカンとの組み合わせで、コラーゲンが好適な材料である。
【００２２】
本明細書で用いられる用語「コラーゲン」には、組換えヒト（ｒｈ）コラーゲンが含まれる。
【００２３】
好ましい実施態様では、無機材料がリン酸カルシウム材を含有し、有機材料がコラーゲン及び任意にグリコサミノグリカンを含有する。その結果、リン酸カルシウム材及びコラーゲン及び任意にグリコサミノグリカンを含有する多孔質コンポジット材料が得られる。好ましくは、第１スラリーはコラーゲン及びリン酸カルシウム材の共沈殿物を含有する。より好ましくは、第１スラリーはコラーゲン、リン酸カルシウム材及びグリコサミノグリカンの３成分共沈殿物を含有する。
【００２４】
あるいは、第１スラリーは単にコラーゲン、リン酸カルシウム材及び任意にグリコサミノグリカンの機械的混合物を含有してもよい。これは例えば、欧州特許出願公開第０１６４４８４号公報及び第０２１４０７０号公報に記載のように、従来技術で調製できる。機械的混合の方法を用いてスラリー、コラーゲン及びリン酸カルシウム材の共沈殿物、又は好ましくはコラーゲン、リン酸カルシウム材及びグリコサミノグリカンの３成分共沈殿物を形成してもよい。
【００２５】
リン酸カルシウム材には、例えばブラッシャイト、リン酸オクタカルシウム及び／又はアパタイトのうちの１つ以上を選択して用いてもよい。好ましくはリン酸カルシウム材はブラッシャイトを含有する。
【００２６】
スラリーのｐＨは、好ましくは２．５〜６．５、より好ましくは２．５〜５．５、より更に好ましくは３．０〜４．５、最も好ましくは３．８〜４．２である。
【００２７】
スラリー組成物は１つ以上のグリコサミノグリカンを含有してもよい。スラリー組成物は１つ以上のリン酸カルシウム材を含有してもよい。
【００２８】
前駆体スラリー中には他の物質（例えば銀、シリコン、シリカ、食塩、糖など）が存在してもよい。
【００２９】
少なくとも複数の固体結晶又は粒子の幾つかを昇華及び／又は蒸発によって除去し、コラーゲン、リン酸カルシウム材及び任意にグリコサミノグリカンを含有する多孔質コンポジット材料として形成してもよい。好ましい方法は昇華である。
【００３０】
処理（ｄ）及び（ｅ）を凍結乾燥法により行ってもよい。液体担体が水である場合は、昇華の工程は、型及び冷凍スラリー周辺の環境の圧力を、水／氷／水蒸気の三重点以下に減圧する工程と、それに続く、提供された真空圧での、固体−気体遷移温度以上の温度へ昇温させる工程とを含んでなる。周囲の液体の分圧が、その場における温度で凍結した液体の分圧より低い限り、形成された氷は昇華により蒸気に直接変化する。典型的には温度を０℃以上に上昇させる。この工程は、昇華により冷凍スラリーから氷晶を除去する目的で実施される。
【００３１】
凍結乾燥パラメータを調節して、所望の細孔サイズ及び縦横比に制御してもよい。一般に、遅い冷却速度及び高い最終的な凍結温度（例えば約０．２５℃／分で、−１０℃に冷却）により、高い縦横比の大きな孔が得られる。一方、急速な冷却速度及び低い最終的な凍結温度（例えば約２．５℃／分で−４０℃に冷却）により、等軸の小さな孔が得られる。
【００３２】
本明細書の用語「型」とは、スラリー組成物を成形、担持又は保持できるあらゆる型、容器又は基材が含まれるものとして用いられる。すなわち、最も単純な形態の型は単に支持面を有するのみであってもよい。型はいかなる形状でもあってもよく、ポリマー（例えばポリスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレン）、金属（例えばステンレス鋼、チタン、コバルト色のクロム）、セラミック（例えばアルミナ、ジルコニア面）、ガラスセラミックス及びガラス（例えばホウケイ酸ガラス）などの任意の適切な材料で作製してもよい。
【００３３】
２００４年１０月２８日出願の、出願人による以前の特許出願（国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号）では、コラーゲン、ブラッシャイト及びグリコサミノグリカンの３成分共沈殿物及びその調製方法を開示している。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号の開示内容は本願明細書に援用される。国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号のコピーを付録１に掲載する。
【００３４】
国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号に記載の方法は、コラーゲン、カルシウム供給源及びリン供給源、並びにグリコサミノグリカンを含有する酸性水溶液を準備する工程と、コラーゲン、ブラッシャイト及びグリコサミノグリカンを一斉に水溶液中に沈殿させ、３成分共沈殿物を形成させる工程を含んでなる。
【００３５】
用語「共沈殿物」とは、２又は３の化合物を実質的に同時に、同じ溶液／分散液から沈殿させて得た沈殿物を意味する。これは、例えばこれらの成分を異なる溶液で別々に調製し、それらの成分を機械的に混合して調製した材料とは区別される。共沈殿物の微細構造は、その成分を機械的に混合して調製した材料と実質的に異なる。
【００３６】
共沈殿物の調製方法では、当該カルシウム供給源は好ましくは硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムアルコキシド、水酸化カルシウム、ケイ酸カルシウム、硫酸カルシウム、グルコン酸カルシウム及びヘパリンのカルシウム塩のうちのうちの１つ以上から選択される。ヘパリンのカルシウム塩は、豚の腸粘膜由来のものであってもよい。好適なカルシウム塩は、例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から購入可能である。リン供給源は好ましくはリン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸、オルトリン酸水素二ナトリウム二水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４・２Ｈ２Ｏ（ＧＰＲソレンセン塩と称することもある））及びトリメチルリン酸、リン酸アルカリ金属塩（例えばＮａ又はＫ）、リン酸アルカリ土金属塩類（例えばマグネシウム又はＣａ）のうちのうちの１つ以上から選択される。
【００３７】
グリコサミノグリカンとは、反復する二糖類単位を含む分岐のない長鎖の多糖類を含んでなる高分子の一種である。グリコサミノグリカンは好ましくはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラチン硫酸及びヒアルロン酸のうちの１つ以上から選択される。コンドロイチン硫酸はコンドロイチン−４−硫酸又はコンドロイチン−６−硫酸であってもよく、両方とも例えばＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から市販されている。コンドロイチン−６−硫酸はサメ軟骨由来のものが使用できる。ヒアルロン酸はヒトの臍帯由来のものが使用できる。ヘパリンはブタの腸管粘膜由来のものが使用できる。
【００３８】
コラーゲンは可溶性でも不溶性でもよく、いかなる動物の由来でも、いかなる組織の由来でもよく、また任意の従来技術を使用して抽出してもよい。
【００３９】
以下の手順で沈殿を実施してもよい。すなわち、酸性水溶液中でコラーゲン、カルシウム供給源、リン供給源及びグリコサミノグリカンを混合し、更に、沈殿が生じるまで溶液を静置するか、溶液を激しく撹拌するか、塩基性溶液（例えばアンモニア）を使用して滴定するか、既製のブラッシャイトなどの成核剤を添加するか、カルシウム供給源の添加速度を変化させるか、又は以上の技術若しくは他の公知の多くの技術の任意の組合せを実施する手順である。
【００４０】
当然ながら他の成分がスラリーに存在してもよい。例えば成長因子、遺伝子、薬剤又は他の生物学的活性物質を、単独又は組合せでスラリーに任意に添加してもよい。
【００４１】
好ましい実施態様では、本発明の方法に更に以下の工程を含めるのが好適である。すなわち、液体担体、有機材料及び任意に無機材料を含んでなる第２スラリー組成物を準備する工程と、前記の冷却工程に先立ち、前記第１スラリー組成物を堆積させる前又は堆積させた後に前記第２スラリー組成物を型に堆積させる工程である。
【００４２】
上記と同様、当該有機材料は典型的にはコラーゲン（組換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン及びコラーゲンの部分ポリペプチド配列を含んでなる合成ポリペプチドのうちの１つ以上を含有する。
【００４３】
第２スラリー組成物は無機材料（例えばリン酸カルシウム材）を含有してもよい。
【００４４】
好ましくは、第２スラリー組成物は液体担体、コラーゲン、任意にリン酸カルシウム材及び任意にグリコサミノグリカンを含有する。この実施態様では、第２スラリー組成物は好ましくはコラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈殿物、又はコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈殿物、又はコラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウム材の３成分共沈殿物を含有する。共沈殿は第１スラリーの調製において既に説明したとおりである。
【００４５】
あるいは、第２スラリーはコラーゲン、並びに任意にリン酸カルシウム材及びグリコサミノグリカンの一方又は両方の、単なる機械的な混合物を含有してもよい。当該機械的な混合物は第１スラリーの調製において既に説明したとおりである。
【００４６】
第２スラリー中にリン酸カルシウム材を存在させる場合、ブラッシャイト、リン酸オクタカルシウム及び／又はアパタイトのうちの１つ以上から選択してもよい。
【００４７】
第１及び第２スラリー組成物は、典型的には型中の第１及び第２の層として堆積する。例えば、第１スラリー、続いて第２スラリーを型に堆積させる。更に型中の含有物を工程（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）に供することができる。すなわち、上記の方法は多層材料の形成に使用でき、その少なくとも１つの層は、好ましくはコラーゲン、リン酸カルシウム材及び任意にグリコサミノグリカンを含む多孔質コンポジット材料を含んでなる。第２スラリー組成物から生じる層は多孔質層であっても非多孔質層であってもよい。多孔質層が必要な場合、孔は第２スラリー中で形成された複数の固体結晶又は粒子の昇華及び／又は蒸発によって形成できる。この方法は第１スラリーにおいて既に説明したとおりであり、好ましくは凍結乾燥法を含む方法である。
【００４８】
上記の方法は液相において実施され、これは第１スラリー層及び第２スラリー層との間の拡散に貢献する。
【００４９】
層はいかなる堆積順序又はジオメトリで堆積させてもよい。例えば層を垂直に（１つの層を他の層の上に）、水平に（１つの層を他の層の隣に）及び／又は放射状に（１つの球状層を次の層の上に）配置してもよい。
【００５０】
本発明の鋳型成形工程により、組織工学に用いる多孔質の一枚岩の足場及び多孔質の層状構造を有する足場の形成が可能となる。
【００５１】
第１及び第２スラリー組成物を型に堆積させた後、型中の含有物の冷却工程の前に、最高２４時間静置させる。隣接層との間での様々なスラリー成分の相互拡散がなされるため、この方法は有効である。これにより、中間層の接着強度の強化につながる。
【００５２】
第１スラリーの液体担体は好ましくは水を含有する。第２スラリーの液体担体もまた、好ましくは水を含有する。
【００５３】
当然ながら、更なるスラリー層を、前記冷却工程の前に、前記第１及び／又は第２スラリー組成物を堆積させる前又はさせた後に、型中に堆積させてもよい。
【００５４】
冷却工程の前の、型中に堆積させるスラリーの温度は通常スラリーの粘性に影響を及ぼす。温度が高過ぎる場合は極端に低い粘性のスラリーとなる傾向が高まり、第２スラリーを堆積させたときに、第１及び第２の層が完全な（すなわち望ましくない）混合状態になる。また、高過ぎる温度ではコラーゲンが変性してしまうため、注意を要する。一方では、低過ぎる温度では、スラリーの粘度が高くなってしまい、効率的な延展、平滑化又は成形が困難となり、また氷晶の形成が不十分になるおそれが生じる。したがって、発明者は、冷却工程の前に型に堆積させた第１スラリーの温度が、好ましくは２〜４０℃、より好ましくは４〜３７℃、更に好ましくは２０〜３７℃の範囲であることを見出した。多層状でスラリー組成物を用いる場合でも、これらの温度範囲を追加的なスラリーに適用できる。
【００５５】
型に堆積させた第１スラリーの冷却工程は、好ましくは≦０℃の温度で実施する。より好ましくは、冷却工程は−１００〜０℃、好ましくは−８０〜−１０℃、より好ましくは−４０〜−２０℃の範囲の温度で実施する。多層状でスラリー組成物を用いる場合でも、これらの温度範囲を追加的なスラリーに適用できる。
【００５６】
型に堆積させた第１スラリーの冷却工程は、好ましくは０．０２〜１０℃／分、より好ましくは０．０２〜６．０℃／分、更に好ましくは０．２〜２．７℃／分の冷却速度で実施する。多層状でスラリー組成物を用いる場合でも、これらの温度範囲を追加的なスラリーに適用できる。
【００５７】
一般に、遅い冷却速度で高い最終凍結温度に冷却する（例えば０．２５℃／分で−１０℃に冷却する）ことにより高い縦横比の大きな孔が形成され、一方、急速な冷却速度及び低い最終凍結温度に冷却する（例えば２．５℃／分で−４０℃に冷却する）ことにより等軸の小さな孔が形成される。
【００５８】
型に堆積させたスラリーの冷却工程は、好ましくは１〜２００ｋＰａ、より好ましくは５０〜１５０ｋＰａ、更に好ましくは５０〜１０１．３ｋＰａの圧力で実施する。多層状でスラリー組成物を用いる場合でも、これらの温度範囲を追加的なスラリーに適用できる。発明者は、５０ｋＰａ未満の圧力ではスラリー中で泡が形成され、一方で２００ｋＰａ超の圧力では隣接層同士の過剰な混合をもたらしうることを見出した。
【００５９】
型に堆積させた第１スラリーの厚は、好ましくは０．１〜５００ｍｍ、より好ましくは０．５〜２０ｍｍ、更に好ましくは１．０〜１０ｍｍである。多層状でスラリー組成物を用いる場合でも、これらの温度範囲を追加的なスラリーに適用できる。５００ｍｍ超の厚の層では完全な凝固が困難となり、一方０．１ｍｍ未満の厚の層では即座に凍結してしまい、好適な氷晶核形成及び成長の進行の制御が困難となりうる。
【００６０】
型に堆積させた第１スラリーの粘性は、好ましくは０．１〜５０Ｐａ・ｓ、より好ましくは０．１〜１０Ｐａ・ｓ、更に好ましくは０．５〜５Ｐａ・ｓである。多層状でスラリー組成物を用いる場合でも、これらの温度範囲を追加的なスラリーに適用できる。高過ぎる粘性を有するスラリーでは延展、平滑化、成形が困難となり、一方低過ぎる粘性を有する場合には、第２スラリーを堆積させたときに第１及び第２の層が完全な（すなわち望ましくない）混合状態となる。
【００６１】
昇華によって第１スラリーの固体結晶又は粒子の少なくとも一部分を除去する工程は、好ましくは０〜０．０８ｋＰａ、より好ましくは０．００２５〜０．０８ｋＰａ、更に好ましくは０．００２５〜０．０４ｋＰａの圧力で実施する。多層状でスラリー組成物を用いる場合でも、これらの温度範囲を追加的なスラリーに適用できる。水の三重点（ほぼ０．０８ｋＰａ）以上の圧力では昇華の代わりに溶解が発生するおそれがあり、一方極端に低い圧力は設定すること自体が困難であり、また昇華の奨励にとっても不必要である。
【００６２】
昇華によって第１スラリーの固体結晶又は粒子の少なくとも一部分を除去する工程は、昇華させる時間が短過ぎる場合、残留水分及び溶媒によって足場の壁の再融解が生じるおそれが生じ、それにより孔の構造が崩壊してしまう。そこで発明者は、この工程を好ましくは最高９６時間、より好ましくは、１２〜７２時間、更に好ましくは２４〜３６時間実施すべきであることを見出した。多層状でスラリー組成物を用いる場合でも、これらの温度範囲を追加的なスラリーに適用できる。
【００６３】
昇華によって第１スラリーの固体結晶又は粒子の少なくとも一部分を除去する工程は、好ましくは−１０〜６０℃、より好ましくは０〜４０℃、更に好ましくは２０〜３７℃、より更に好ましくは２５〜３７℃の温度で実施する。多層状でスラリー組成物を用いる場合でも、これらの温度範囲を追加的なスラリーに適用できる。昇華工程中の温度が低過ぎる場合、昇華が完了するまでに必要となる時間が極端に長くなり、一方高過ぎる（すなわち４０℃超）ではコラーゲンが変性する危険性が生じる。
【００６４】
材料中にコラーゲン及びグリコサミノグリカンが含まれる場合、本発明の方法には、多孔質のコンポジット生体材料中でコラーゲンとグリコサミノグリカンを架橋させる工程を更に含めてもよい。架橋工程は典型的には、昇華の後で材料を型から取り出した後に行う。当該架橋工程は、共沈殿物をγ線や紫外線照射、加熱脱水処理、グルコース、マンノース、リボース及び蔗糖などの単糖との非酵素的な糖化のうちの１つ以上に供すること、３成分共沈殿物をグルタルアルデヒド、カルボジイミド（例えばエチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド）及び／又はノルジヒドログルタル酸のうちの１つ以上に接触させること、又はこれらの方法の任意の組合せに供することによって実施できる。これらの方法は、当該技術分野において公知である。
【００６５】
材料がリン酸カルシウムを含有する場合、本発明の方法には、多孔質コンポジット生体材料中のリン酸カルシウム材の少なくとも一部を、他のリン酸カルシウム相に変化させる工程を更に含めてもよい。例えば、当該方法には多孔質コンポジット生体材料中のブラッシャイトの少なくとも一部をリン酸オクタカルシウム及び／又はアパタイトに変化させる工程を含めてもよい。ブラッシャイトのリン酸オクタカルシウム及び／又はアパタイトへの転換は好ましくは加水分解によって行う。典型的には、材料が型から除去され（更に任意に架橋され）た後で相変化を生じさせる。
【００６６】
アパタイトはカルシウム及びリン酸塩からなるミネラルの一種であって、以下の一般式を有する。Ｃａ５（ＰＯ４）３（Ｘ）（式中、Ｘは典型的にはＯＨ−、Ｆ−及びＣｌ−のイオンであるが、当業者に公知の他のイオンであってもよい）。アパタイトという用語には、シリコン置換アパタイトのような置換アパタイトも包含される。用語「アパタイト」には、アパタイトの代表例であるヒドロキシアパタイトが包含される。ヒドロキシアパタイトは他の分子種（例えばシリコン）で置換されてもよい。
【００６７】
上記したように、更なるスラリー層を、前記冷却工程の前に、前記第１及び／又は第２スラリー組成物を堆積させる前又はさせた後に、型中に堆積させてもよい。更なるスラリー層は典型的には、例えば液体担体、コラーゲン、任意にリン酸カルシウム材及び任意にグリコサミノグリカンを含有する。型中の含有物の冷却工程前に最高２４時間静置し、隣接層間で様々なスラリー成分を相互拡散させるのが好適である。
【００６８】
すなわち本発明は、２又はそれ以上の層を有するコンポジット生体材料の調製方法を提供する。少なくとも１つの層は好ましくはコラーゲン、リン酸カルシウム材、及び好ましくはグリコサミノグリカンを含む多孔質コンポジット生体材料を含んでなる。好ましくは全ての層がコラーゲンを含有する。
【００６９】
本発明のコンポジット生体材料は例えば、一枚岩の多孔質の足場、又は少なくとも１つの層が多孔質である多層状の足場の作製に使用できる。本発明のコンポジット生体材料は、筋骨格及び歯における組織再生用足場として使用するのが好適である。
【００７０】
本発明の方法では、好ましくはコラーゲンを第１及び第２の層中に有機成分として（より好ましくはコラーゲンを第１及び第２の層の主要有機成分として）取り込ませる。更なる層が存在する場合、当該方法では好ましくは、これらの更なる１つ以上の層中に有機成分として（より好ましくはコラーゲンをこれらの更なる１つ以上の層の主要有機成分として）取り込ませる。当該方法には、全ての層及びそれら層間の接合部を液相中で同時に形成させることが含まれる。それにより、相互拡散による層間での強固な接合部が形成される。「相互拡散」という用語は、異なる２つのスラリー組成物が重層的に接触するときに生じる、分子拡散又はブラウン運動による混合作用を指す。
【００７１】
本発明の第２の態様は、生体材料の少なくとも一部が、リン酸カルシウム材及び１つ以上のコラーゲン（組換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン又はコラーゲンの部分ポリペプチド配列を含む合成ポリペプチドを含んでなる多孔質共沈殿物から形成され、マクロ孔サイズ（孔直径）が好ましくは１〜１０００ミクロン、より好ましくは２００〜６００ミクロンである合成コンポジット生体材料に関する。上記材料は好ましくはコラーゲンを含有する。上記リン酸カルシウム材は好ましくはブラッシャイト、リン酸オクタカルシウム及び／又はアパタイトのうちの１つ以上から選択される。上記多孔質材料はコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈殿物を含有するのが好ましい。これに関しては本発明の第１の態様で既に記載したとおりである。本願明細書における「多孔質」という用語は、その材料がマクロ孔及び／又はミクロ孔を含むことを意味する。マクロ孔性とは典型的には約１０ミクロン超のスケールの孔に関連する特徴を指す。ミクロ孔性とは典型的には約１０ミクロン未満のスケールの孔に関連する特徴を指す。当然ながら、上記材料中でオープンセルとクローズセルをいかなる態様で組合せてもよい。例えば、上記材料は典型的にはマクロ孔とミクロ孔を含む。マクロ孔性とは典型的にはオープンセルの状態であるが、クローズセル成分が含まれてもよい。
【００７２】
本発明の第２の態様における多孔質材料のマクロ孔サイズ（孔直径）は典型的には１〜１２００ミクロン、好ましくは１０〜１０００ミクロン、より好ましくは１００〜８００ミクロン、更に好ましくは２００〜６００ミクロンの範囲である。
【００７３】
本発明の第２の態様おける多孔質材料の平均縦横比は好ましくは１〜５０、更に好ましくは１〜１０で変動させることができ、最も好ましくは約１である。
【００７４】
本発明の第２の態様における多孔質材料の細孔径分布（孔直径の平均値と標準偏差）は好ましくは１〜８００ミクロン、より好ましくは１０〜４００ミクロン、更に好ましくは２０〜２００ミクロンである。
【００７５】
本発明の第２の態様における多孔質材料の多孔性は好ましくは５０〜９９．９９の容量％、より好ましくは７０〜９８の容量％である。
【００７６】
本発明の第２の態様における多孔質材料中のオープンセル多孔性（オープンセルとクローズセル両方の孔の総数に対するパーセンテージとして測定）のパーセンテージは、好ましくは１〜１００％、より好ましくは２０〜１００％、更に好ましくは９０〜１００％である。
【００７７】
本発明の第３の態様は、生体材料の少なくとも一部が、リン酸カルシウム材及び２つ以上のコラーゲン（組換えヒト（ｒｈ）コラーゲンを含む）、グリコサミノグリカン、アルブミン、ヒアルロナン、キトサン又はコラーゲンの部分ポリペプチド配列を含む合成ポリペプチドを含んでなる多孔質共沈殿物から形成される合成コンポジット生体材料に関する。当該材料は好ましくはコラーゲンとグリコサミノグリカンを含有する。上記リン酸カルシウム材は、好ましくはブラッシャイト、リン酸オクタカルシウム及び／又はアパタイトのうちの１つ以上から選択される。多孔質材料は好ましくはコラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウム材の３成分共沈殿物を含有する。これについては既に本発明の第１の態様にて記載したとおりである。本発明の第２の態様における多孔質材料のマクロ孔サイズ（孔直径）の範囲は第３の態様にも適用できる。また、平均縦横比の範囲、細孔径分布、多孔性及びオープンセル多孔性のパーセンテージに関しても同様である。
【００７８】
本発明の第４の態様は、本発明の第２又は第３の態様に従って調製したコンポジット生体材料で形成させた第１層、並びに、第１層と接着し、コラーゲン、又はコラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈殿物、又はコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈殿物、又はコラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウム材の３成分共沈殿物を含んでなる材料で形成される第２層を有してなる合成コンポジット生体材料の提供に関する。上記リン酸カルシウム材は、好ましくはブラッシャイト、リン酸オクタカルシウム及び／又はアパタイトのうちの１つ以上から選択される。
【００７９】
好ましくは第１及び第２の層を重層的に形成する。好適には、液相共合成を組み込んだ工程によってそれが可能となる。この工程には、前記スラリーから液体担体又は担体を除去する前に、前駆体を含むスラリーを、各層上に各々重層的に接触する態様で堆積させることにより、多層を含む材料中に隣接層（高密度又は多孔質）が形成され、なおかつ全ての層からの前記液体担体又は担体の除去が好ましくは実質的に同時に実施される、いかなる工程も包含される。液体担体の除去前に重層的に接触する態様で前駆体スラリー（すなわち液相状態のまま）を配置することにより、隣接するスラリー間での相互拡散を生じさせる。この現象は、形成される材料同士が隣接する層間接合部における相互拡散ゾーンで生じ、そこでは両隣接層の成分組成の中間の成分組成となる。相互拡散ゾーンの存在により隣接層間の接合部に機械強度及び安定性を付与することができる。それにより、第１及び第２層は好ましくは相互拡散層で互いに結合する。
【００８０】
あるいは、第１及び第２層は中間層で互いに結合してもよい。「中間層」という用語は、層間での接着力を向上させるか、又は得られる足場中の隣接層間での細胞、分子又は流体の通過を妨害するための、他の２枚の層の間に独立に堆積するあらゆる層を指し、それは例えばコラーゲン、グリコサミノグリカン、フィブリン、抗血管新生薬（例えばスラミン）、成長因子、遺伝子又は他のいかなる成分を含有してもよい。中間層と相互拡散層は、中間層ではそれが隣接する層の組成とは組成が異なるスラリーとして別個に堆積するという意味で相互拡散層とは区別され、一方、相互拡散層では隣接層間の相互拡散のみの結果として形成されるという意味で中間層とは区別される。
【００８１】
第１層は多孔質である。第２層は好ましくは多孔質であるが、必要に応じて非多孔質若しくは実質的に非多孔質層であってもよい。
【００８２】
本発明の第２の態様における多孔質材料のマクロ孔サイズ（孔直径）の範囲は、上記第４の実施態様の第１及び／又は第２層にも適用できる。また、平均縦横比の範囲、細孔径分布、多孔性及びオープンセル多孔性のパーセンテージに関しても同様である。第２、第３及び第４の態様のいずれにおいても、生体材料中に第１及び／又は第２層と結合する１つ以上の更なる層を含めてもよく、前記更なる層の各々は、好ましくはコラーゲン、又はコラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈殿物、又はコラーゲンとリン酸カルシウム材の共沈殿物、又はコラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウム材の３成分共沈殿物を含む材料で形成されてもよい。上記リン酸カルシウム材は、ブラッシャイト、リン酸オクタカルシウム及び／又はアパタイトのうちの１つ以上から好ましくは選択される。第１及び第２層及び前記の更なる１つ以上の層は好ましくは重層的に形成され、隣接層は好ましくは相互拡散層により互いに結合し、それは典型的には液相共合成によって形成される。通常、少なくとも１つの前記更なる層は多孔質である。本発明の第２の態様における多孔質材料のマクロ孔サイズ（孔直径）の範囲は、上記の更なる層にも適用できる。また、平均縦横比の範囲、細孔径分布、多孔性及びオープンセル多孔性のパーセンテージに関しても同様である。
【００８３】
隣接層間での細孔寸法の差異は、ごくわずかな数値から＋／−１０００ミクロンで変動させてもよい。
【００８４】
特に明記しない限り、以下の説明は、本発明のいかなる態様にも適用できる。
【００８５】
材料がコラーゲンとグリコサミノグリカンを含む場合、コラーゲンとグリコサミノグリカンを架橋してもよい。
【００８６】
コラーゲンは好ましくは１〜９９重量％、より好ましくは５〜９０重量％、更に好ましくは１５〜６０重量％で材料中に含有させてもよい。
【００８７】
グリコサミノグリカンは好ましくは０．０１〜２０重量％、より好ましくは１〜１２重量％、更に好ましくは１〜５．５重量％の量で材料中に含有させてもよい。
【００８８】
材料にブラッシャイトを含有させる場合、ブラッシャイトに対するコラーゲンの重量比は好ましくは１０：１〜１：１００、より好ましくは５：１〜１：２０である。
【００８９】
材料にリン酸オクタカルシウムを含有させる場合、リン酸オクタカルシウムに対するコラーゲンの重量比は好ましくは１０：１〜１：１００、より好ましくは５：１〜１：２０である。
【００９０】
グリコサミノグリカンに対するコラーゲンの重量比率は、好ましくは８：１〜３０：１である。
【００９１】
本発明の生体材料は、代替骨又は歯科用材料として使用できる。したがって、本発明は、本願明細書に記載の生体材料を含んでなる合成骨材料、骨インプラント、移植骨片、代替骨、骨足場、充填材、コーティング又はセメントを提供する。
【００９２】
生体材料は、好適には多層足場の形態で提供される。具体的には本発明は、筋骨格及び歯に関連する用途に用いる組織再生用の足場を提供する。本発明の多層（すなわち２層以上の）足場の用途としては、骨／軟骨接合部（例えば関節の接合部）、骨／腱接合部（例えば腱挿入位置）、骨／靭帯接合部（例えば靭帯挿入位置）、及び歯／靭帯接合部（例えば歯／歯根膜接続）が挙げられる。
【００９３】
本発明は主に組織工学的用途に使用する足場に関するものだが、本発明の材料は一定期間体内に残存するインプラントの作製にも使用できる。例えば腱及び靭帯への用途に必要な半永久インプラントであってもよい。
【００９４】
本発明は更に、本願明細書に記載の方法で得られる多孔質コンポジット生体材料を提供する。
【００９５】
合成方法
更に本発明の例示的態様を以下に記載する。好ましい合成方法は、好ましくはコラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウム材の３成分共沈殿物を含む層を少なくとも１つ有する多孔質足場を生産するための、全体的又は部分的に適用される一連の工程を含んでなる。
【００９６】
工程０：スラリー調製
ミネラル処理したコラーゲン／ＧＡＧ／ブラッシャイトのうちの１つ以上のスラリーの調製は、出願人による過去の特許出願（ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号、２００４年１０月２８日出願）で概説される方法を使用して実施できる。ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号の開示内容は参照によって本願明細書に援用される。ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号のコピーを付録１に掲載する。
【００９７】
非ミネラル質コラーゲン／ＧＡＧのうちの１つ以上のスラリーの調製はＹａｎｎａｓその他（１９８９）、Ｏ’Ｂｒｉｅｎその他（２００４）、Ｏ’Ｂｒｉｅｎその他２００５）、Ｌｏｒｅｅその他（１９８９）で概説される方法を使用して実施できる。
【００９８】
この段階で、成長因子、遺伝子、薬又は他の生物学的活性物質を任意に、単独又は組み合わせで機械による混合によりスラリーに添加し、足場へのそれら取り込ませてもよい。複数の層を有する足場の場合、１つの層に取り込ませる生物学的活性物質の種類は、隣接する層のそれと同じである必要はない。
【００９９】
工程Ｉ：キャスティング
工程Ｉ−ａ：１枚目の層のキャスティング
工程Ｉ−ｂ：２枚目の層のキャスティング
工程Ｉ−ｃ：３枚目の層のキャスティング
工程Ｉ−ｎ：第ｎ番目の層のキャスティング
【０１００】
上記のうちの１つ以上のキャスティング工程には、型への溶液、懸濁液、コロイド又は分散液における１つ以上のスラリーの連続的な堆積工程が含まれ、その場合水が主要な希釈剤であり、また少なくとも１つのスラリーがコラーゲン、１つ以上のグリコサミノグリカン及びリン酸カルシウムブラッシャイトの３成分共沈殿物を含有し、全てのスラリーがコラーゲンを含有する。
【０１０１】
型は所望の任意の形状であってもよく、ポリマー（例えばポリスルホン、ポリプロピレン、ポリエチレン）、金属（例えばステンレス鋼、チタン、コバルト色のクロム）、又はセラミック（例えばアルミナ、ジルコニア面）、ガラスセラミックス又はガラス（例えばホウケイ酸ガラス）などの多くの材料のいずれかで作製してもよい。
【０１０２】
型は堆積にが容易に行える具体的な態様で作製できる。適切なデザインの例を図１及び２に示す。
【０１０３】
例えば層を垂直に（１つの層を他の層の上に）、水平に（１つの層を他の層の隣に）及び／又は放射状に（１つの球状層を次の層の上に）配置してもよい。
【０１０４】
足場が１つの層のみを有する場合、キャスティングされる層はコラーゲンとリン酸カルシウム材（好ましくはブラッシャイト）及び任意にグリコサミノグリカンを含む共沈殿物のスラリーを含有する。好ましくは、スラリーはコラーゲン、ブラッシャイト及びグリコサミノグリカンを含む３成分共沈殿物を含有する。層の好ましい厚は、表１の適当なセクションで特定されるとおりである。
【０１０５】
足場が２つの層を有する場合、キャスティングされる少なくとも１つの層はコラーゲンとリン酸カルシウム材（好ましくはブラッシャイト）及び任意にグリコサミノグリカンを含む共沈殿物のスラリーを含有する。好ましくは、スラリーはコラーゲン、ブラッシャイト及びグリコサミノグリカンを含む３成分共沈殿物を含有する。層の好ましい厚は、表１の適当なセクションで特定されるとおりである。その他の層はコラーゲン、任意にリン酸カルシウム材及び任意にグリコサミノグリカンを含んでなるスラリーを含有する。このスラリー組成物は好ましくは、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈殿物、コラーゲンとリン酸カルシウム材（ブラッシャイトなど）の共沈殿物、又はコラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウム材（好ましくはブラッシャイト）の３成分共沈殿物を含んでなる。
【０１０６】
必要に応じて更なる層を含めても良く、これらの更なる層は好ましくはコラーゲン、任意にリン酸カルシウム材及び任意にグリコサミノグリカンを含有するスラリーから形成される。その更なるスラリー組成物は好ましくは、コラーゲンとグリコサミノグリカンの共沈殿物、コラーゲンとリン酸カルシウム材（ブラッシャイトなど）の共沈殿物、又はコラーゲン、グリコサミノグリカン及びリン酸カルシウム材（好ましくはブラッシャイト）の３成分共沈殿物を含んでなる。
【０１０７】
各層のスラリー組成は同一でも、わずかに異なっても、又は著しく異なってもよいが、そのコラーゲン及び好ましくはグリコサミノグリカンが各層に含まれ、少なくとも１つの層がリン酸カルシウム材（例えばブラッシャイト）を含む必要がある。
【０１０８】
工程ＩＩ：相互拡散
共拡散工程には、キャスティングされて層を形成した各スラリー層を相互拡散させる操作が含まれる。この工程は隣接層間でスラリー成分を相互拡散させるために実施され、それにより凝固及び昇華後の中間層の接着強度が増加する。相互拡散工程の好ましい条件を表２の所定のセクションに列記する。
【０１０９】
工程ＩＩＩ：冷却制御
制御冷却工程には、スラリーを含む型を系内に置き、後に０℃未満の最終温度まで一定に制御された冷却速度で冷却する操作が含まれる。この工程は、スラリー中での氷晶核の形成及び成長の開始及び速度制御を目的として実施する。続いて、氷晶を昇華によって多孔質足場から放出させて除去する。氷晶の結晶構造は足場の最終的な多孔構造を左右する。冷却時の好ましいパラメータを表３に列記する。
【０１１０】
工程ＩＶ：アニーリング
アニーリング工程には、スラリーを一定時間、冷却制御の工程の最終的な温度に維持する操作が含まれる。この工程は、スラリーの完全、又は実質的に完全な凍結を確実にするために実施する。アニーリングの好ましいパラメータを表４に列記する。
【０１１１】
工程Ｖ：昇華
冷凍スラリーを大まかに制御冷却及びアニーリング工程の最終温度に維持しつつ、型及び冷凍スラリー周辺の環境を、水／氷／水蒸気相の三重点以下の圧力にまで減圧し、続いてその際の真空圧における固体−気体遷移温度（通常は≦０℃）にまで昇温させ、昇華工程を実施する。この工程は、冷凍スラリーから氷晶を昇華により除去するために実施する。蒸発と比べた水除去手段としての昇華工程の利点は、前にした氷晶の微細構造の形状が、そのままの形で空間（すなわち細孔）として残るということである。氷が溶解する場合には、氷晶構造の形状が崩壊し、得られる孔の微細構造も不安定になる。昇華工程の好ましいパラメータを表５に示す。
【０１１２】
工程ＶＩ：架橋
必要に応じて、上記方法にはコラーゲンとグリコサミノグリカンとの架橋工程を含めてもよい。これは出願人による過去の特許出願（ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号、２００４年１０月２８日出願）に記載されている。ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号の開示内容は参照によって本願明細書に援用される。ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号のコピーを付録１に掲載する。
【０１１３】
（実施例）例Ｉ：コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰの単層足場材料
【０１１４】
コラーゲン：Ｉ型、ウシの腱由来の微繊維性コラーゲン、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ＮＪ，ＵＳＡ
ＧＡＧ：サメ軟骨由来、コンドロイチン−６−硫酸、ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
カルシウム源：
（ｉ）水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
（ｉｉ）硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
リン酸源：オルトリン酸（Ｈ３ＰＯ４）、ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ（Ｐｏｏｌｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）
架橋剤：
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（＝ＥＤＡＣ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（＝ＮＨＳ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
【０１１５】
方法
工程０：スラリー調製
３．８６４４ｇのコラーゲンを、１９ｍｍの直径の固定子を備えているホモジェナイザを使用して１５，０００回転数／分で９０分間混合し、氷浴で冷却しつつ１７１．４ｍＬの０．１３８３ＭのＨ３ＰＯ４中に分散させ、非常に粘着性の高いコラーゲン分散液を得た。並行して、０．３４３６ｇのコンドロイチン−６−硫酸化（ＧＡＧ）を室温で周期的に振盪させ１４．３ｍＬの０．１３８３ＭのＨ３ＰＯ４中に溶解させ、溶解したＧＡＧを分散させ、ＧＡＧ溶液を得た。９０分後に、ＧＡＧ溶液１４．３ｍＬを、１５，０００回転数／分で懸濁を維持させつつ、約０．５ｍＬ／分の速度で混合中のコラーゲン分散に添加し、得られた粘稠性の高いコラーゲン／ＧＡＧ分散液を更に９０分間混合した。混合開始後９０分で、１．８０４ｇのＣａ（ＯＨ）２及び０．７８０ｇのＣａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏを、１５，０００回転数／分で一定に混合しながら、粘着性の高いコラーゲン／ＧＡＧ分散に３０分にわたり添加し、コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを調製した。ｐＨは約４．０であった。コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを２５℃で４８時間撹拌プレート上に置き混合し、更に４℃で１２時間静置した。更に冷却したスラリーを２５Ｐａの圧力で２５時間にわたり真空フラスコ中で脱ガスした。
【０１１６】
工程Ｉ：キャスティング
自動ピペッターを用いて、深さ１０ｍｍ×幅３０ｍｍ×長さ５０ｍｍのポリスルホン型に、ミネラル質コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリー１５ｍＬをキャスティングした。全ての大きい気泡をハンドピペッターを用いてスラリーから除去した。
【０１１７】
工程ＩＩ：相互拡散
例Ｉの足場は１つの層のみからなるため、相互拡散工程は不要である。
【０１１８】
工程ＩＩＩ：冷却制御
型及びスラリーをＶｉｒＴｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ凍結乾燥器（温度制御可能なステンレススチール棚を備える）に置き、凍結乾燥器の棚温度を４℃〜−２０℃まで、約−２．４℃／分で冷却した。
【０１１９】
工程ＩＶ：アニーリング
凍結乾燥器の棚温度を、−２０℃で１０時間維持した。
【０１２０】
工程Ｖ：昇華
棚で−２０℃の温度にて静置している間、型及びスラリー（冷凍状態）を有するチャンバーを２５Ｐａ以下（約２００ｍＴｏｒｒ）の真空圧にした。次いでチャンバー温度を３７℃に加温し、昇華を３６時間実施した。真空状態を解除し、温度を室温に戻し、５０ｍｍ×３０ｍｍ×１０ｍｍのサイズのコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰの単一層による足場を得た。
【０１２１】
工程ＶＩ：架橋
足場を２０分間、４０ｍＬの脱イオン水で水和させた。０．０３５ＭのＥＤＡＣ及び０．０１４ＭのＮＨＳの溶液２０ｍＬを、足場と脱イオンを入れている容器に添加し、足場を穏やかに撹拌しつつ室温で２時間架橋した。ＥＤＡＣ溶液を除去し、足場をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）でリンスし、更に軽く撹拌しつつ新鮮なＰＢＳで２時間、３７℃でインキュベートした。ＰＢＳによる２時間のインキュベート後、足場を軽く撹拌しつつ３７℃で１０分間隔で２回、脱イオン水でインキュベートしてリンスした。更に足場を、冷却制御（室温から−２０℃、約２．４℃／分の冷却速度）により凍結乾燥して全ての残留水分を除去した。更にアニーリングを−２０℃で約５時間行い、更に３７℃、２５Ｐａ以下で昇華させ、凡そ５０ｍｍ×３０ｍｍ×１０ｍｍの架橋コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ足場を得た。
【０１２２】
得られた単層の足場のＸ線マイクロ断面撮影画像、走査型電子顕微鏡画像、イオン分布図及び圧縮による機械的挙動を図３から１０に示す。図３は上記手順で得られた足場の９．５ｍｍ×９．５ｍｍの円筒形セクションの側面を示す（Ｘ線マイクロトモグラフィで観察）。足場の全体にわたり、材料組成及び多孔性が実質的に均一な様相を示すことが明らかとなった。同じ足場の連続的な横断切片を図４に示すが、同様に足場の多孔構造が均一な様相を示している。また、図４で明白なように、高密度な孔の相互連関、等軸な孔の形態、更に大きい（５００ミクロンの平均直径）マクロ孔サイズも示している。またＳＥＭ顕微鏡写真では、マクロ孔の形態、並びに限られたミクロ孔性（特定のマクロ孔の壁中に見られる）の存在を示している（図５）。高倍率（４０００×）の二次電子検出（すなわちトポグラフィ検出）及び後方散乱検出（すなわち組成物検出）電子イメージングにより足場の壁中び領域を観察した結果、約１〜２ミクロンの大きさの突出粒子の存在による若干の形態的変動が見られたものの、足場の壁の組成が均質であることが示された（図６）。図７に示されるカルシウム及びリンのマップでは、足場全体にわたって両方の材料が均一に分布していることが示され、足場全体にわたって実質的に均質な組成となっていることを裏付けるものである。図８は、乾燥状態の単層の足場を示し、それが粉砕、ひび割れ又はその統一性の喪失を生じることなく、一般の外科手術用ツール（例えば外科用メス、かみそりの刃及び穿孔器刃（角膜移植術で使用する円形のバイト））を使用して、いかなる所望の形状にもカットできることを示す。図８はまた、固体鋼ボールベアリングの重量による、乾燥状態の単層足場の重量耐力を示す。図９は乾燥状態の単層足場の挙動を示す。すなわち多孔質固体に典型的な３段階の変形（７６２＋／−１８８ｋＰａの弾性率、及び−８５．２＋／−１１．７ｋＰａの圧縮降伏応力）の挙動を呈した。重要なことに、乾燥足場の降伏強さは、それらに一定の親指圧（例えば欠陥部位への挿入時の圧）を加えた場合にはそれに耐え、一定の形状を維持する。但し、非常に強い親指圧（例えばインプラントの形状を外科医が成形する時の圧）を加えた場合には更に形状が変化する。図１０は水和状態の単層足場の圧縮変形を示す。乾燥状態では、水和ミネラル質コラーゲン／ＧＡＧ足場は、それに対応する乾燥足場よりほぼ１桁低い弾性率（４．１２＋／−０．７６ｋＰａ）及び収率応力（０．２９＋／−０．１ＩｋＰａ）の特性を示す以外は、同様に圧縮荷重の下で３段階の機械的挙動を示す。更に、圧壊プラトー領域における圧縮ストレスの解放試験により、粘弾性力の回復が確認された。
【０１２３】
例ＩＩ：２層ミネラル質−非ミネラル質足場
材料
コラーゲン（ミネラル質スラリー用）：Ｉ型、ウシの腱由来の微繊維性コラーゲン、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ＮＪ，ＵＳＡ
ＧＡＧ（ミネラル質スラリー用）：サメ軟骨由来、コンドロイチン−６−硫酸、ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
ＩＩ型コラーゲン＋ＧＡＧ（非ミネラル質スラリー用）：ＩＩ型コラーゲン及びＧＡＧ（コラーゲン／ＧＡＧ）スラリー、豚の軟骨由来、可溶化済（Ｇｅｌｓｔｌｉｃｈ  Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ（Ｗｏｌｈｕｓｅｎ、スイス））
カルシウム源：
（ｉ）水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
（ｉｉ）硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
リン酸源：オルトリン酸（Ｈ３ＰＯ４）、ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ（Ｐｏｏｌｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）
架橋剤：
１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（＝ＥＤＡＣ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
Ｎ−ヒドロキシスクシニミド（＝ＮＨＳ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
【０１２４】
工程０：スラリー調製
ミネラル質スラリーの調整
３．８６４４ｇのコラーゲンを、１９ｍｍの直径の固定子を備えているホモジェナイザを使用して１５，０００回転数／分で９０分間混合し、氷浴で冷却しつつ１７１．４ｍＬの０．１３８３ＭのＨ３ＰＯ４中に分散させ、非常に粘着性の高いコラーゲン分散液を得た。並行して、０．３４３６ｇのコンドロイチン−６−硫酸化（ＧＡＧ）を室温で周期的に振盪させ１４．３ｍＬの０．１３８３ＭのＨ３ＰＯ４中に溶解させ、溶解したＧＡＧを分散させ、ＧＡＧ溶液を得た。９０分後に、ＧＡＧ溶液１４．３ｍＬを、１５，０００回転数／分で懸濁を維持させつつ、約０．５ｍＬ／分の速度で混合中のコラーゲン分散に添加し、得られた粘稠性の高いコラーゲン／ＧＡＧ分散液を更に９０分間混合した。混合開始後９０分で、１．８０４ｇのＣａ（ＯＨ）２及び０．７８０ｇのＣａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏを、１５，０００回転数／分で一定に混合しながら、粘着性の高いコラーゲン／ＧＡＧ分散に３０分にわたり添加し、コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを調製した。ｐＨは約４．０であった。更に冷却したスラリーを２５Ｐａの圧力で２５時間にわたり真空フラスコ中で脱ガスし、３０分にわたりホモジェナイザを用いて再混合し、再度４８時間脱ガスした。
【０１２５】
非ミネラル質スラリーの調製
タイプＩＩコラーゲン／ＧＡＧスラリーを冷蔵庫から取り出し、室温に戻した。
【０１２６】
工程Ｉ：キャスティング
２．５ｍＬの非ミネラル質ＩＩ型コラーゲン／ＧＡＧスラリーを、合成ポリスルホン製の型の底部に堆積させた（底部は深さ２ｍｍ×幅３０ｍｍ×長さ５０ｍｍ）。かみそりの刃を使用してスラリー表面を平滑にした。上部カラー（ポリスルホン製、深さ６ｍｍ×３０ｍｍ×長さ５０ｍｍ）を、平滑化された非ミネラル質スラリーを含む型の底部に取り付けた。９ｍｌのミネラル質コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを、平滑化した非ミネラル質層上で、上記した空の上部カラー内に、均一に拡散するように添加した。全ての大きい気泡をハンドピペッターを用いてスラリーから除去した。
【０１２７】
工程ＩＩ：相互拡散
凍結乾燥器に置く前に、層をなしたスラリーを合計４時間、室温及び常圧下で静置した。
【０１２８】
工程ＩＩＩ：冷却制御
型及びスラリーをＶｉｒＴｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ凍結乾燥器（温度制御可能なステンレススチール棚を備える）に置き、凍結乾燥器の棚温度を４℃〜−４０℃まで、約−２．４℃／分で冷却した。
【０１２９】
工程ＩＶ：アニーリング
凍結乾燥器の棚温度を、−４０℃で１０時間維持した。
【０１３０】
工程Ｖ：昇華
棚で−４０℃の温度にて静置している間、型及びスラリー（冷凍状態）を有するチャンバーを２５Ｐａ以下（約２００ｍＴｏｒｒ）の真空圧にした。次いでチャンバー温度を３７℃に加温し、昇華を３６時間実施した。真空状態を解除し、温度を室温に戻し、５０ｍｍ×３０ｍｍ×８ｍｍ（非ミネラル質層２ｍｍ、ミネラル質層６ｍｍの構成）のサイズのコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰの２層足場を得た。
【０１３１】
工程ＶＩ：架橋
足場を２０分間、４０ｍＬの脱イオン水で水和させた。０．０３５ＭのＥＤＡＣ及び０．０１４ＭのＮＨＳの溶液１８ｍＬを、足場と脱イオンを入れている容器に添加し、足場を穏やかに撹拌しつつ室温で２時間架橋した。ＥＤＡＣ溶液を除去し、足場をリン酸緩衝液（ＰＢＳ）でリンスし、更に軽く撹拌しつつ新鮮なＰＢＳで２時間、３７℃でインキュベートした。ＰＢＳによる２時間のインキュベート後、足場を軽く撹拌しつつ３７℃で１０分間隔で２回、脱イオン水でインキュベートしてリンスした。更に足場を、冷却制御（室温度から−２０℃、約２．４℃／分の冷却速度）により凍結乾燥して全ての残留水分を除去した。更にアニーリングを−２０℃で約５時間行い、更に３７℃、２５Ｐａ以下で昇華させ、凡そ５０ｍｍ×３０ｍｍ×８ｍｍ（非ミネラル質層２ｍｍ、ミネラル質層６ｍｍの構成）の架橋コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ足場を得た。
【０１３２】
得られた２層の足場のＸ線マイクロ断面撮影画像、走査型電子顕微鏡画像及びイオン分布図を図１１から１７に示す。図１１は上記手順で得られた足場の９．５ｍｍ×９．５ｍｍの円筒形セクションの側面を示す（Ｘ線マイクロトモグラフィで観察）。不透明な下部領域はミネラル質層を示し、一方、半透明の上部領域は非ミネラル質層を示す。多孔性及び組成に関して、両方の層では概ね同一であることが分かる。図１２に示される連続断面図は、ミネラル質層の平均マクロ孔サイズが約４００ミクロンで、非ミネラル質層では７００ミクロンのオーダーであることを示す。ミネラル質及び非ミネラル質層の孔は共に等軸の形態を呈していた。図１３のＳＥＭ画像は非ミネラル質層の上面を示す。そこではミクロ孔がほとんど存在しないことを示す。一方、図１４に示される界面領域の画像はいかなる大きな空間、又はミネラル質層と非ミネラル質層を分け隔てる不連続性も含まれないことを示す。図１５は、圧縮荷重下での２層足場の挙動を示す。圧縮荷重がなされると、対応する非ミネラル質層が圧縮され始め、ミネラル質足場のいかなる顕著な変形ももたらせない程のストレスで、軟骨区画がほぼ完全に圧縮する結果となる。負荷からの解放後、非ミネラル質コラーゲン／ＧＡＧ層はほとんど即座にその原形に戻る（図１５ｄ）。図１６は、水和状態の２層足場の機械的挙動を示す。水和後、非ミネラル質コラーゲン／ＧＡＧ層は弱い負荷で圧縮されうる（図１６ａ−ｃ）。乾燥状態と異なり、水和非ミネラル質区画は最初の圧縮荷重を掛けた後にはその元の厚さに回復しなかったが（図１６ｄ）、その代わりにミネラル質区画の横断切片上を完全に被覆する。しかしながら、この最初の圧縮後、非ミネラル質層はそれに続く各圧縮荷重を掛けた後に、その圧縮厚（図１６ｄ）に戻った。図１７は、２層足場中の非ミネラル質層の外科的欠陥部（骨と関節のジョイント部分の軟骨接合部）の壁に付着する能力を類推した図である。図１７中のガラススライドは骨軟骨欠陥部の壁を模したものであり、非ミネラル質層がこの表面に付着する能力は、これらの足場が、非ミネラル質層とその隣接する関節軟骨との間の間隙を形成することなく、この種の欠陥部を周辺から被覆する能力を有することを示す。
【０１３３】
例ＩＩＩ：３層（ミネラル質−非ミネラル質−ミネラル質）足場
材料
コラーゲン（ミネラル質スラリー用）：Ｉ型、ウシの腱由来の微繊維性コラーゲン、Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，ＮＪ，ＵＳＡ
ＧＡＧ（ミネラル質スラリー用）：サメ軟骨由来、コンドロイチン−６−硫酸、ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
カルシウム源：
（ｉ）水酸化カルシウム（Ｃａ（ＯＨ）２）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
（ｉｉ）硝酸カルシウム（Ｃａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏ）、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
リン酸源：オルトリン酸（Ｈ３ＰＯ４）、ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ（Ｐｏｏｌｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ）
コラーゲン（非ミネラル質コラーゲン−ＧＡＧスラリー用）：８５％のＩ型コラーゲン；１５％のＩＩＩ型コラーゲン、豚の真皮由来、ペプシンで可溶化、Ｊａｐａｎ  Ｍｅａｔ  Ｐａｃｋｅｒｓ（大阪、日本）
ＧＡＧ（非ミネラル質スラリー用）：サメ軟骨由来、コンドロイチン−６−硫酸、ナトリウム塩、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）
非ミネラル質コラーゲン及びＧＡＧ用の希釈剤：氷酢酸（ＣＨ３ＣＯＯＨ）Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｌｏｕｇｈｂｏｒｏｕｇｈ，ＵＫ）
架橋剤：ノルジヒドログアヤレチック酸（ＮＤＧＡ），Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＩｎｃ（セントルイス、ＭＯ、米国）；リン酸二水素ナトリウム（ＮａＨ２ＰＯ４）ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｓｕｐｐｌｉｅｓ（Ｐｏｏｌｅ、英国）塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）Ｓｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＩｎｃ（セントルイス、ＭＯ、米国）
【０１３４】
工程０：スラリー調製
ミネラル質スラリーの調整
３．８６４４ｇのコラーゲンを、１９ｍｍの直径の固定子を備えているホモジェナイザを使用して１５，０００回転数／分で９０分間混合し、氷浴で冷却しつつ１７１．４ｍＬの０．１３８３ＭのＨ３ＰＯ４中に分散させ、非常に粘着性の高いコラーゲン分散液を得た。並行して、０．３４３６ｇのコンドロイチン−６−硫酸化（ＧＡＧ）を室温で周期的に振盪させ１４．３ｍＬの０．１３８３ＭのＨ３ＰＯ４中に溶解させ、溶解したＧＡＧを分散させ、ＧＡＧ溶液を得た。９０分後に、ＧＡＧ溶液１４．３ｍＬを、１５，０００回転数／分で懸濁を維持させつつ、約０．５ｍＬ／分の速度で混合中のコラーゲン分散に添加し、得られた粘稠性の高いコラーゲン／ＧＡＧ分散液を更に９０分間混合した。混合開始後９０分で、１．８０４ｇのＣａ（ＯＨ）２及び０．７８０ｇのＣａ（ＮＯ３）２・４Ｈ２Ｏを、１５，０００回転数／分で一定に混合しながら、粘着性の高いコラーゲン／ＧＡＧ分散に３０分にわたり添加し、コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを調製した。ｐＨは約４．０であった。更に冷却したスラリーを２５Ｐａの圧力で２５時間にわたり真空フラスコ中で脱ガスし、３０分にわたりホモジェナイザを用いて再混合し、再度４８時間脱ガスした。
【０１３５】
非ミネラル質スラリーの調製
１．９３２２ｇのタイプＩ／ＩＩＩコラーゲンを、１９ｍｍの直径の固定子を備えているホモジェナイザを使用して１５，０００回転数／分で９０分間混合し、氷浴で冷却しつつ１７１．４ｍＬの０．０５Ｍの酢酸溶液中に分散させ、非常に粘着性の高いコラーゲン分散液を得た。並行して、０．３４３６ｇのコンドロイチン−６−硫酸化（ＧＡＧ）を室温で周期的に振盪させ２８．６ｍＬの０．０５Ｍの酢酸溶液中に溶解させ、溶解したＧＡＧを分散させ、ＧＡＧ溶液を得た。９０分後に、ＧＡＧ溶液１４．３ｍＬを、１５，０００回転数／分で懸濁を維持させつつ、約０．５ｍＬ／分の速度で混合中のコラーゲン分散に添加し、得られた粘稠性の高いコラーゲン／ＧＡＧ分散液を更に９０分間混合した。
【０１３６】
工程Ｉ：キャスティング
３．５ｍＬのミネラル質コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを、合成ポリスルホン製の型の底部に堆積させた（底部は深さ３ｍｍ×幅３０ｍｍ×長さ５０ｍｍ）。かみそりの刃を使用してスラリー表面を平滑にした。中央部カラー（ポリスルホン製、深さ５ｍｍ×３０ｍｍ×長さ５０ｍｍ）を、平滑化されたミネラル質スラリーを含む型の底部に取り付けた。７．５ｍｌの非ミネラル質コラーゲン／ＧＡＧスラリーを、平滑化した非ミネラル質層上で、上記した空の中央部カラー内に、均一に拡散するように添加した。上部カラー（ポリスルホン製、深さ３ｍｍ×３０ｍｍ×長さ５０ｍｍ）を、平滑化された非ミネラル質スラリーを含む型の中央部に取り付けた。３．５ｍｌのミネラル質コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰスラリーを、平滑化した非ミネラル質層上で、上記した空の上部カラー内に、均一に拡散するように添加した。全ての大きい気泡をハンドピペッターを用いてスラリーから除去した。
【０１３７】
工程ＩＩ：相互拡散
凍結乾燥器に置く前に、３層をなしたスラリーを合計２０分間、室温及び常圧下で静置した。
【０１３８】
工程ＩＩＩ：冷却制御
型及び３層スラリーをＶｉｒＴｉｓ  Ｇｅｎｅｓｉｓ凍結乾燥器（温度制御可能なステンレススチール棚を備える）に置き、凍結乾燥器の棚温度を４℃〜−４０℃まで、約−２．４℃／分で冷却した。
【０１３９】
工程ＩＶ：アニーリング
凍結乾燥器の棚温度を、−４０℃で１０時間維持した。
【０１４０】
工程Ｖ：昇華
棚で−４０℃の温度にて静置している間、型及びスラリー（冷凍状態）を有するチャンバーを２５Ｐａ以下（約２００ｍＴｏｒｒ）の真空圧にした。次いでチャンバー温度を３７℃に加温し、昇華を３６時間実施した。真空状態を解除し、温度を室温に戻し、５０ｍｍ×３０ｍｍ×８１１ｍｍ（非ミネラル質層５ｍｍ、ミネラル質層３ｍｍ×２の構成）のサイズのコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰの３層足場を得た。
【０１４１】
工程ＶＩ：架橋
０．１Ｍ  ＮａＨ２ＰＯ４及び０．１５Ｍ  ＮａＣｌを含有するリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）で３層足場を３０分間水和させた。ＮＤＧＡを１Ｎ  ＮａＯＨの中に懸濁し、ＰＢＳに添加して３ｍｇ／ｍＬ  ＮＧＤＡのＰＢＳ中溶液を調製した。更に足場をこの溶液で２４時間撹拌し、水和させた。３層足場をＮＧＤＡ−ＰＢＳ溶液から取り出し、脱イオン水でリンスした。更に足場を、冷却制御（室温から−２０℃、約２．４℃／分の冷却速度）により凍結乾燥して全ての残留水分を除去した。更にアニーリングを−２０℃で約５時間行い、更に３７℃、２５Ｐａ以下で２４時間昇華させ、乾燥した架橋足場を得た。以降の工程は、０．１ｍｇ／ｍＬ  ＮＤＧＡの濃度中で実施した。次に足場を６時間、７０％エタノールで洗浄し、更に室温で２４時間、ＰＢＳで洗浄した。更に足場を、２度目の冷却制御（室温から−２０℃、約２．４℃／分の冷却速度）により凍結乾燥して全ての残留水分を除去した。更にアニーリングを−２０℃で約５時間行い、更に３７℃、２５Ｐａ以下で２４時間昇華させた。
【０１４２】
特に明記しない限り、下記の表のパラメータを単独で、又は組み合わせて本発明の態様に適用しても差し支えない。
【０１４３】
表１：キャスティングのための好適なパラメータ
（冷却制御における開始温度）
好適な態様：０〜３７℃
より好適な態様：２〜３７℃
最も好適な態様：４〜３７℃
（層厚）
好適な態様：０．１〜５００ｍｍ
より好適な態様：０．５〜２０ｍｍ
最も好適な態様：１．０〜１０ｍｍ
（スラリーの粘性）
好適な態様：０．１〜５０Ｐａ・ｓ
より好適な態様：０．１〜１０Ｐａ・ｓ
最も好適な態様：０．５〜５Ｐａ・ｓ
（型の壁厚）
好適な態様：１〜５０ｍｍ
より好適な態様：５〜２０ｍｍ
最も好適な態様：５〜１５ｍｍ
（層の数）
好適な態様：１〜５０
より好適な態様：１〜５
最も好適な態様：１〜３
【０１４４】
表２：相互拡散のための好適なパラメータ
（相互拡散を実施する時間）
好適な態様：０〜２４時間
より好適な態様：０〜６時間
最も好適な態様：０〜２時間
（温度）
好適な態様：０〜３７℃
より好適な態様：２〜３７℃
最も好適な態様：４〜３７℃
（圧力）
好適な態様：１〜２００ｋＰａ
より好適な態様：５０〜１５０ｋＰａ
最も好適な態様：５０〜１０１．３２５ｋＰａ
【０１４５】
表３：冷却制御のための好適なパラメータ
（冷却速度）
好適な態様：０．０２〜１０．０℃／分
より好適な態様：０．０２〜６．０℃／分
最も好適な態様：０．２〜２．７℃／分
（最終冷却温度）
好適な態様：−１００〜０℃
より好適な態様：−８０〜−１０℃
最も好適な態様：−４０〜−２０℃
【０１４６】
表４：アニーリングのための好適なパラメータ
（アニーリング温度）
好適な態様：−１００〜０℃
より好適な態様：−８０〜−１０℃
最も好適な態様：−４０〜−２０℃
（アニーリング時間）
好適な態様：０〜４８時間
より好適な態様：２〜１２時間
最も好適な態様：８〜１０時間
【０１４７】
表５：昇華のための好適なパラメータ
（昇華時の圧力）
好適な態様：０〜０．０８ｋＰａ
より好適な態様：０．００２５〜０．０８ｋＰａ
最も好適な態様：０．００２５〜０．０４ｋＰａ
（昇華時間）
好適な態様：０〜１２０時間
より好適な態様：１２〜７２時間
最も好適な態様：２４〜３６時間
（昇華温度）
好適な態様：−１０〜６０℃
より好適な態様：０〜４０℃
最も好適な態様：２０〜３７℃
【０１４８】
本発明は、例えば以下に挙げるような多くの領域及び用途において適用される。
【０１４９】
関節軟骨修復用具：２層足場
２層足場は、骨関節−軟骨損傷の部位に髄から派生した幹細胞を補充する既存の第一線の外科的手技の有効性を強化する可能性を有する。例えば、乾燥状態（２ｃｍ×２ｃｍ×１ｃｍの乾燥ブロック、真空包装、スタイロフォームに似たγ線滅菌された材料）として輸送され、これらの足場は外科用メス又は他の器具を使用してカットでき、単純な親指による挿入、又は鈍器を使用した機械的な挿入により欠陥部位に容易に挿入でき、直接縫合又は接着剤を用いずに対象部位に接着できる。
【０１５０】
膝蓋靱帯供与部位修復用具：３層足場
３層足場は、前十字靱帯（ＡＣＬ）修復の間、膝蓋靱帯（膝蓋骨腱）供与部位における再生を強化し、正面の膝の痛みを和らげ、膝蓋靱帯破裂及び膝蓋骨の破壊の危険率を低下させる可能性を有する。
【０１５１】
腱修復用具：２層足場
拡張非ミネラル質部品を有する２層足場は、回旋腱板法の間の腱の修復効力を高め、また有効な治療法が現在存在しない小さい腱へ適用する可能性を有する。大型動物による試験に基づいて本発明を更に検討した。概要を以下に示す。
【０１５２】
試験１：羊骨欠損モデル
本発明により、一方が骨に擬態し、もう一方が非ミネラル質の組織（例えば軟骨、靭帯、腱）、更にその間の平滑な、安定な接合部を有する構造及び組成を有する、層状の組織再生足場の作製が可能となる。本発明では更に、系統的にこの種のインプラントの骨区画のミネラル相の化学的組成を変化させる能力が提供される。
【０１５３】
動物：成熟した骨格を有するＴｅｘｃｅｌ  Ｃｏｎｔｉｎｅｎｔａｌヒツジ（メス）。
【０１５４】
欠陥：外側顆上の深さ９ｍｍ×直径９ｍｍの海綿骨欠陥。
【０１５５】
インプラント期間：６週間。
【０１５６】
実験群：各実験群（６個体ずつ）で、同じ動物に同じインプラントタイプで対側的に両側にインプラントした。
【０１５７】
対照群：陽性対照：４つの部位に、脛骨粗面から収穫される海綿骨の自家移植で注入した。
【０１５８】
陰性対照：４つの部位を、全くミネラル相を含んでいないインプラント（ＣｈｏｎｄｒｏＭｉｍｅｔｉｃの骨側に有機成分を含むのみ）材を含有する対照インプラントを注入した。
【０１５９】
試験目的：４つの実験インプラント群のパフォーマンスの違いを化学組成の比較により確認すること。並びに、ＣｈｏｎｄｒｏＭｉｍｅｔｉｃの骨区画の最終組成として最も望ましいものを確認すること。
【０１６０】
重要な所見：３つの実験群のいずれにおいても、望ましくない免疫応答が生じなかった。全３つの実験群及び非ミネラル質の陰性対照群では、細胞が媒介する直接的な置換機構により骨形成が維持された。３つのインプラント群において統計学的な有意は見られなかった。また、３つの全実験群で観察された骨生成は、統計学的に有意に、陰性対照群のそれより高レベルであった。
【０１６１】
インプラントのデザインによる影響：この試験で示唆された直接的な置換メカニズムは、従来の移植骨片で観察された典型的並置機構よりも、骨生成機構がより密接に、胎児及び新生児の動物（ヒトを含む）の成長板で発生するテンプレートによる骨生成に類似していることを示唆する。非ミネラル質対照でこの置換機構が生じるということが、この特徴を与えるのがインプラント中の有機成分であることを示唆する。
【０１６２】
インプラントの細孔寸法は、インプラントの骨の区画の平均孔径を減少させることにより、この置換機構に適応する態様に調節しなければならない。
【０１６３】
３つの実験群の骨生成挙動の統計学的な有意差の欠如は、工程パラメータを用いてインプラントの最適なミネラル組成を確認できることを示唆する。
【０１６４】
試験２：ヤギの骨軟骨欠陥モデル
この試験の目的は、髄刺激技術（軟骨下穿孔）の結果を改善する手段としての、ＣｈｏｎｄｒｏＭｉｍｅｔｉｃの性能を評価することである。
【０１６５】
動物：成熟した骨格のスペインヤギ（メス）。
【０１６６】
欠陥：深さ６ｍｍ×直径４ｍｍの骨軟骨の離脱（滑車溝１；外側顆１）。
【０１６７】
インプラント期間：１６週。
【０１６８】
実験群：ＣｈｏｎｄｒｏＭｉｍｅｔｉｃワーキングプロトタイプによるインプラント群（６個体）。
【０１６９】
コントロール群：従来の軟骨下穿孔（すなわちインプラントなし）をシミュレーションする欠陥群（６個体）。
【０１７０】
試験目的：髄刺激の補助としての、ＣｈｏｎｄｒｏＭｉｍｅｔｉｃの性能を評価すること。
【０１７１】
所見：ＣｈｏｎｄｒｏＭｉｍｅｔｉｃの取り扱い適性についての外科医からのフィードバックは、例外なく、圧倒的に好ましいものであった。
【０１７２】
＜付録１＞
ＰＣＴ／ＧＢ０４／００４５５０号（２００４年１０月２８日出願）（特表２００７−５１２０３８号公報）の記載。
【０１７３】
本発明は医用用途のための合成骨、歯科材料及び再生足場、特にコラーゲン、リン酸カルシウム材及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含む合成骨、歯科材料及び再生足場及びそれらの前駆体に関する。
［背景技術］
【０１７４】
自然骨はコラーゲン、グリコサミノグリカンを含む非コラーゲン状有機相及びリン酸カルシウムとの生体複合体である。その複雑な階層構造によって、高剛性、強度及び破壊靭性などの優れた機械的性質を有し、それによって骨は日々受ける生理学的な応力に耐える。この分野の研究者が直面する難題は、人体や動物体内の合成材料の中や周辺に自然骨が成長する組成及び構造を有する合成材料を作ることである。
【０１７５】
骨は、体環境の中で形成される骨類似アパタイト層によって（生体活性と称される性質）人体内のリン酸カルシウムに直接結合することが観察されている。一方、コラーゲン及び、コラーゲンやグリコサミノグリカンのような他の生体有機物を含む共重合体は、人体の骨の生成及び維持に欠かせないものを含む多数の細胞タイプの接合や増殖に最適な基材として知られている。
【０１７６】
ヒドロキシアパタイトはリン酸カルシウムであり、骨の代用材料の成分として最も一般的に使用されている。しかしながら、ブルシャイト、リン酸三カルシウム及びリン酸八カルシウムなどの他のリン酸カルシウム形と比べたとき、それは、比較的に不溶性である。人体中の材料吸収速度は特に遅いので、アパタイトの比較的低い溶解性が、生体材料を製造する場合、不利に働くことがあり得る。
【０１７７】
ヒドロキシアパタイトのようなリン酸カルシウムは機械的に硬い材料である。しかしながら、それらは自然骨と比べると比較的脆い。コラーゲンは機械的に靭性のある材料であるが、自然骨と比べると比較的剛性が低い。コラーゲンとグリコサミノグリカンの共重合体を含む材料はコラーゲン単体に比較して靭性と剛性があるが、しかし、自然骨と比べるとまだ比較的に剛性が低い。
【０１７８】
従来技術で、ヒドロキシアパタイトよりも機械的に改良された靭性、並びにコラーゲン及びコラーゲンとグリコサミノグリカンの共重合体よりも改良された剛性を有する合成骨代用材料を製造するこれまでの試みには、コラーゲンとアパタイトを機械的に混合する方法がある。そのような機械的方法は欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０１６４４８４（特許文献１）に記載されている。
【０１７９】
この技術のその後の開発には、ヒドロキシアパタイト、コラーゲン及びコンドロイチン‐４‐硫酸を含みこれらの成分を機械的に混合して骨代替材料の製造を含む。これは、欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０２１４０７０（特許文献２）に記載されている。この文献は更に、コンドロイチン‐４‐硫酸をコラーゲンに脱水素熱的に架橋させることが記載されている。アパタイト、コラーゲン及びコンドロイチン‐４‐硫酸を含む材料は良好な生体適合性を有することが見出されている。アパタイトをコラーゲン、任意選択的にコンドロイチン‐４‐硫酸と機械的に混合することで、コラーゲン／コンドロイチン‐４‐硫酸でコートされたアパタイト粒子が実質的に形成される。そのような材料は、生体適合性はあるものの、人体又は動物体内では自然骨の成長に限界があり、合成材料のリン酸カルシウム相の改造にならないことが見出されている。
［特許文献１］欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０１６４４８４
［特許文献２］欧州特許公開ＥＰ‐Ａ‐０２１４０７０
［発明の開示］
【０１８０】
本発明は従来技術に付随する少なくともいくつかの問題を解決しようとするものである。
【０１８１】
第一の態様において、本発明はコラーゲン、ブルシャイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含むコンポジット材料の製造方法であって、その方法が、コラーゲン、カルシウム源、リン源及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含む酸性水溶液を供給する工程、及びコラーゲン、ブルシャイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを一緒に前記水溶液から３種共沈殿物を形成するように沈殿する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０１８２】
３種共沈殿物なる用語は３種類の化合物がその溶液／分散液から実質的に同時に沈殿した３種類の化合物の沈殿を包含する。それは、特に成分を個別に、例えば異なる溶液から沈殿させ、それらの成分を機械的に混合して形成した材料と区別される。共沈殿物の微細構造は成分を機械的に混合して形成した材料と本質的に異なる。
【０１８３】
第一の態様において、溶液のｐＨは２．５から６．５、より好ましくは２．５から５．５である。更に好ましくは溶液のｐＨが３．０から４．５である。更により好ましくは溶液のｐＨは３．８から４．２である。もっとも好ましくは溶液のｐＨが約４である。
【０１８４】
カルシウム源は好ましくは、硝酸カルシウム、酢酸カルシウム、塩化カルシウム、炭酸カルシウム、カルシウムアルコキシド、水酸化カルシウム、珪酸カルシウム、硫酸カルシウム、グルコン酸カルシウム及びヘパリンのカルシウム塩から１つ以上が選択される。ヘパリンのカルシウム塩は豚の腸粘膜から誘導することができる。適当なカルシウム塩はシグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ）から市販されている。
【０１８５】
リン源は好ましくは、リン酸二水素アンモニウム、リン酸水素二アンモニウム、リン酸、オルトリン酸水素二ナトリウム２水和物（Ｎａ２ＨＰＯ４．２Ｈ２Ｏ時折ＧＰＲセレンセン塩と称される）及びリン酸トリメチル、リン酸のアルカリ金属塩（例、Ｎａ又はＫ）及びリン酸のアルカリ土類塩（例、Ｍｇ又はＣａ）から１つ以上が選択される。
【０１８６】
グリコサミノグリカンはニ糖の繰り返し単位を含む長鎖の分岐のない多糖類を含む一群の高分子である。好ましくはコンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパリン硫酸、ケラチン硫酸及びヒアルロン酸から１つ以上が選択される。コンドロイチン硫酸は、コンドロイチン‐４‐硫酸又はコンドロイチン‐６‐硫酸でよいし、その両方ともシグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ）から入手できる。コンドロイチン‐６‐硫酸は鮫の軟骨から誘導できる。ヒアルロン酸は人間の臍帯から誘導できる。ヘパリンは豚の腸粘膜から誘導できる。
【０１８７】
３種共沈殿物の沈殿において溶液の温度は、好ましくは４．０から５０℃である。より好ましくは溶液の温度は１５から４０℃である。溶液は２０から３０℃の室温でもよく、２０から２７℃が好ましい。最も好ましくは約２５℃である。
【０１８８】
水溶液のカルシウムイオン濃度は典型的には０．０００２５から１ｍｏｌｄｍ‐３、好ましくは０．００１から１ｍｏｌｄｍ‐３である。その方法が更にろ過及び／又は低温乾燥の工程を含む場合、水溶液中のカルシウムイオン濃度はより好ましくは０．０５から０．５ｍｏｌｄｍ‐３（例、０．０８から０．２５ｍｏｌｄｍ‐３）、最も好ましくは０．１から０．５ｍｏｌｄｍ‐３である。その方法が更に、凍結乾燥及び任意選択的に射出成形工程を含む場合、水溶液中のカルシウムイオン濃度はより好ましくは０．０１から０．３ｍｏｌｄｍ‐３、最も好ましくは０．０５から０．１８ｍｏｌｄｍ‐３である。
【０１８９】
好ましくは、溶液はリン酸塩イオンを含み、溶液中のリン酸塩イオン濃度は典型的には０．０００２５から１ｍｏｌｄｍ‐３、好ましくは０．００１から１Ｍである。その方法が更にろ過及び／又は低温乾燥の工程を含む場合、水溶液中のリン酸塩イオン濃度はより好ましくは０．０５から０．５ｍｏｌｄｍ‐３、更により好ましくは０．１から０．５Ｍ、例えば０．１から０．０３５ｍｏｌｄｍ‐３である。その方法は更に、凍結乾燥及び任意選択的に射出成形工程を含む場合、水溶液中のリン酸塩イオン濃度はより好ましくは０．０１から０．３ｍｏｌｄｍ‐３、更により好ましくは０．０５から０．１８Ｍである。
【０１９０】
好ましくは、沈殿前の溶液中のコラーゲンと１つ以上のグリコサノグリカン全量との比率が重量で８：１から３０：１である。より好ましくは、コラーゲンと１つ以上のグリコサノグリカン全量との比率が１０：１から１２：１、最も好ましくはその比率が１１：１から２３：２である。
【０１９１】
好ましくは、３種共沈殿物中のコラーゲンとブルシャイトとの比率が重量で１０：１から１：１００、より好ましくは５：１から１：２０、更により好ましくは３：２から１：１０、最も好ましくは３：２から１：４である。
【０１９２】
沈殿前の溶液中のコラーゲン濃度は典型的には、１から２０ｇ／Ｌ、より好ましくは１から１０ｇ／Ｌである。その方法がろ過及び／又は低温乾燥の工程を含む場合、溶液中のコラーゲン濃度がより好ましくは１から１０ｇ／Ｌ、更により好ましくは１．５から２．５ｇ／Ｌ、最も好ましくは１．５から２．０ｇ／Ｌである。その方法が凍結乾燥及び任意選択的に射出成形工程を含む場合、沈殿前の溶液中のコラーゲン濃度が好ましくは５から２０ｇ／Ｌ、より好ましくは５から１２ｇ／Ｌ、最も好ましくは９から１０．５ｇ／Ｌである。
【０１９３】
沈殿前の溶液中のうちの１つ以上のグリコサミノグリカン全濃度は典型的には、０．０１から１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．０１から１ｇ／Ｌである。その方法が更にろ過及び／又は低温乾燥の工程を含む場合、水溶液中のうちの１つ以上のグリコサミノグリカンの濃度は好ましくは０．０３から１．２５ｇ／Ｌ、更により好ましくは０．１２５から０．２５ｇ／Ｌ、最も好ましくは０．１３から０．１８２ｇ／Ｌである。その方法が更に凍結乾燥及び任意選択的に射出成形工程を含む場合、溶液中のうちの１つ以上のグリコサミノグリカンの濃度はより好ましくは０．１５から１．５ｇ／Ｌ、更に好ましくは０．４１から１．２ｇ／Ｌ、最も好ましくは０．７８から０．９６ｇ／Ｌである。
【０１９４】
好ましくはその溶液がカルシウムイオンを含み、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率が典型的には重量で１：４０から５００：１、その方法が更にろ過及び／又は低温乾燥の工程を含む場合、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率は好ましくは１：４０から２５０：１、更により好ましくは１：１３から５：４であり、最も好ましくは１：１３から１：２である。その方法が更に凍結乾燥及び任意選択的に射出成形工程を含む場合、コラーゲンとカルシウムイオンとの比率はより好ましくは１：８から５００：１、更により好ましくは５：１２から３０：１、最も好ましくは５：５から５：１である。
【０１９５】
沈殿は、コラーゲン、カルシウム源、リン源、１つ以上のグリコサミノグリカンを酸性水溶液中で組み合わせて、沈殿が生じるまで放置するか、溶液を攪拌、アンモニアのような塩基性の滴定剤を用いて滴定、予め作成したブルシャイトのような核剤の添加、カルシウム源の添加速度の変化、及びこれらの技術の組み合わせによって達成される。
【０１９６】
第二の態様において、本発明は、コラーゲン、リン酸八カルシウム及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料の製造方法であって、その方法が、コラーゲン、ブルシャイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含むコンポジット材料を供給する工程、及び前記コンポジット材料中の少なくともブルシャイトの幾分かが加水分解によってリン酸八カルシウムに変換する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０１９７】
生体材料たる用語は人体又は動物体と生体適合性がある材料を包含する。
【０１９８】
第二の態様において、コンポジット材料がコラーゲン、ブルシャイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含む３種共沈殿物を含む又は実質的に構成される。３種共沈殿物は本発明の第一の態様に関連して本明細書で記述される方法によって形成することができる。
【０１９９】
好ましくは、ブルシャイトのリン酸八カルシウムへの加水分解の工程が３種共沈殿物を水溶液と接触させることを含み、その水溶液はリン酸八カルシウムがブルシャイトよりも熱力学的に安定するｐＨ以上である。好ましくは、この水溶液のｐＨは６から８である。より好ましくは、この水溶液のｐＨは６．３から７である。最も好ましくは、この水溶液のｐＨは約６．６５である。水溶液は、例えば、ｐＨが滴定剤でコントロールされた脱イオン水、緩衝溶液、他のカルシウム含有化合物及び／又はリン含有化合物に関して飽和した溶液を含む。好ましい水溶液はアンモニアを用いて所望のｐＨに滴定した酢酸を含む。
【０２００】
ブルシャイトのリン酸八カルシウムへの加水分解工程は、好ましくは２０から５０℃、より好ましくは３０から４０℃、更により好ましくは３６から３８℃、最も好ましくは約３７℃の温度で実施される。
【０２０１】
ブルシャイトのリン酸八カルシウムへの加水分解工程は、好ましくは１２から１４４時間、より好ましくは１８から７２時間、最も好ましくは２４から４８時間で実施される。
【０２０２】
第三の態様において、本発明は、コラーゲン、アパタイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料の製造方法であって、その方法が、コラーゲン、ブルシャイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含むコンポジット材料を供給する工程、及び前記コンポジット材料中のブルシャイトの少なくとも幾分かが加水分解によってアパタイトに変換する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【０２０３】
アパタイトはカルシウムとリン酸塩を含む一群の鉱物であり、一般式Ｃａ５（ＰＯ４）３（Ｘ）で表され、式中、Ｘは典型的にはＯＨ‐、Ｆ‐、Ｃｌ‐のイオン、当業者に公知の他のイオンでもよい。アパタイトはシリコン置換アパタイトのような置換されたアパタイトも含む。アパタイトはヒドロキシアパタイトを含み、それはアパタイトの特定例である。ヒドロキシアパタイトはシリコンで置換されてもよい。
【０２０４】
第三の態様において、好ましくはコンポジット材料が、コラーゲン、ブルシャイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンの３種共沈殿物を含む又は実質的に構成される。３種共沈殿物は、発明の第一の態様に関連して本明細書で記述される方法によって形成することができる。
【０２０５】
好ましくは、ブルシャイトのアパタイトへの加水分解の工程が３種共沈殿物を水溶液と接触させることを含み、その水溶液はアパタイトがブルシャイトよりも熱力学的に安定するｐＨ以上である。好ましくはブルシャイトのアパタイトへの変換は、水溶液のｐＨが６．６５から９であり、より好ましくは７から８．５であり、更により好ましくは７．２から８．５である。水溶液は、例えば、ｐＨが滴定剤でコントロールされた脱イオン水、緩衝溶液、他のカルシウム含有化合物及び／又はリン含有化合物に関して飽和した溶液を含む。
【０２０６】
ブルシャイトのアパタイトへの加水分解工は、好ましくは２０から５０℃、より好ましくは３０から４０℃、更に好ましくは３６から３８℃、最も好ましくは約３７℃の温度で実施される。
【０２０７】
ブルシャイトのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくは１２から２８８時間、より好ましくは１８時間から７２時間、最も好ましくは２４から４８時間で実施される。
【０２０８】
ブルシャイトのリン酸八カルシウム及び／又はアパタイトへの変換速度を増加させる方法は、（ｉ）温度を上げること、（ｉｉ）溶液中のブルシャイトの濃度及び／又は（ｉｉｉ）攪拌速度である。
【０２０９】
本発明に従って、アパタイトとリン酸八カルシウムの両方を含む生体材料を製造することが望ましいであろう。本発明の第二及び第三の態様の方法は、リン酸八カルシウムとアパタイトの両方を含む生体材料を製造するために組合すことができる。まず、３種共沈殿物中のブルシャイトをリン酸八カルシウムに変換し、それからリン酸八カルシウムを部分的にアパタイトに変換することができる。全体として、又はほぼ全体として（例、少なくとも９８％）、ブルシャイト又はリン酸八カルシウムのアパタイトへの変換は典型的にｐＨが８．０以上、約１２時間で生じる。したがって、前記材料中のブルシャイト及び／又はアパタイトの部分的変換は１２時間以内で加水分解によって達成することができる。
【０２１０】
リン酸八カルシウムのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくはｐＨが６．６５から１０、より好ましくは７．２から１０、更により好ましくは８から９である。
【０２１１】
リン酸八カルシウムのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくは２０から５０℃、より好ましくは３０から４０℃、更に好ましくは３６から３８℃、最も好ましくは約３７℃の温度で実施される。
【０２１２】
リン酸八カルシウムのアパタイトへの加水分解工程は、好ましくは２から１４４時間、より好ましくは１２から９６時間、最も好ましくは２４から７２時間で実施される。
【０２１３】
本発明の第二及び第三の態様において、ブルシャイトのリン酸八カルシウム及び／又はアパタイトへの変換が、好ましくは３０から４０℃の温度で実施される。より好ましくはその変換は３６から３８℃の温度で実施される。最も好ましくは、その変換は約３７℃で実施される。
【０２１４】
好ましくは、本発明の方法が、３種共沈殿物中のうちの１つ以上のグリコサミノグリカンとコラーゲンとの架橋工程を含む。３種共沈殿物によって、これはコラーゲン、ブルシャイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含む３種共沈殿物及びその誘導体を含む。誘導体は、少なくともブルシャイトの幾分かがリン酸八カルシウム及び／又はアパタイトへ変換された共沈殿物及び、成形又は鋳造された、又はいかなる化学的又は機械的な加工にかけられた共沈殿物を含む。架橋はいかなる従来技術を用いても達成される。
【０２１５】
好ましくは、少なくともブルシャイトの幾分かがリン酸八カルシウム及び／又はアパタイトへ変換され、ブルシャイトのリン酸八カルシウム及び／又はアパタイトへの変換前にグリコサミノグリカンとコラーゲンとが架橋される。この架橋は、３種共沈殿物を１つ以上のガンマ線照射、紫外線照射、脱水素熱的処理、ブドウ糖、マンノース、リボース又は蔗糖のような単純な糖によって非酵素的な糖化、３種共沈殿物をグルタルアルデヒド、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド及び／又はノルジヒドログアヤレト酸のうちの１つ以上に接触及びこれらの方法のいかなる組み合わせによっても達成される。これらの方法は従来技術である。
【０２１６】
好ましくは、少なくともブルシャイトの幾分かがリン酸八カルシウム及び／又はアパタイトへ変換される場合、ブルシャイがリン酸八カルシウム及び／又はアパタイトへの変換後にグリコサミノグリカンとコラーゲンとが架橋される。ブルシャイトがアパタイト／リン酸八カルシウムへ変換後の架橋が上記に記載のうちの１つ以上の方法、又は脱水素熱的処理、又はこれらの方法のいかなる組み合わせによっても達成される。脱水素熱的処理は基材を昇温下、低圧で処理する。脱水素熱的処理の温度は９５℃から１３５℃でよい。その温度は、脱水素熱的処理が典型的に１８から３６時間で完了が所望される場合、好ましくは１００℃から１１０℃、最も好ましくは１０５℃から１１０℃である。その温度は、脱水素熱的処理が典型的に４から８時間で完了が所望される場合、好ましくは１２０℃から１３５℃、最も好ましくは１２５℃から１３５℃である。
【０２１７】
好ましくは、コラーゲンとグリコサミノグリカンとが、ブルシャイトがリン酸八カルシウム及び／又はアパタイトへ変換される前と後両方で架橋される。
【０２１８】
本発明の方法は、複合生体材料を骨又は歯の代用として用いるため適当な構造に成形する工程を含む。そのような工程は３種共沈殿物の形成の後で、しかし、ブルシャイトのいかなる変換又は生ずるかもしれないコラーゲンとグリコサミノグリカンとの架橋の前に起こるかもしれない。
【０２１９】
別の方法として、生体材料の成形工程はブルシャイトのアパタイト及び／又はリン酸八カルシウムの変換後、又はコラーゲンとグリコサミノグリカンとの架橋後で起こるかもしれない。
【０２２０】
好ましくは、コンポジット材料は、（ｉ）ろ過及び／又は低温乾燥、（ｉｉ）凍結乾燥、（ｉｉｉ）射出成形及び（ｉｖ）常温圧縮から選択される技術で成形される。ろ過及び／又は低温乾燥は、その温度が１５℃から４０℃、最も好ましくは３５℃から４０℃であり、典型的に材料の密度の高い粒状形になる。凍結乾燥は典型的には、開放多孔形状になる。射出成形は用いる金型の形に依存して材料の広範囲な形状／形態になる。常温圧縮は典型的には密度の高いペレット形状になる。
【０２２１】
更に本発明は、前駆体材料がコラーゲン、ブルシャイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含むコンポジット材料を合成生体材料に変化させるのに適する前駆体材料を提供する。好ましくは、そのコンポジット材料がコラーゲン、ブルシャイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含む３種共沈殿物を含む又は実質的に構成される。３種共沈殿物は本発明の第一の態様の方法によって製造することができる。
【０２２２】
本発明はまた、コラーゲン、ブルシャイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料を提供し、その生体材料が本明細書で記述される本発明の方法によって得ることができる。
【０２２３】
本発明はまた、コラーゲン、リン酸八カルシウム及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料を提供し、その生体材料が本発明の第二の態様に従う方法によって得ることができる。
【０２２４】
本発明はまた、コラーゲン、アパタイト及び１つ以上のグリコサミノグリカンを含む複合生体材料を提供し、その生体材料が本発明の第三の態様に従う方法によって得ることができる。
【０２２５】
本発明はまた、コラーゲン、グリコサミノグリカン及びブルシャイトの３種共沈殿物を含む複合生体材料を提供する。
【０２２６】
本発明はまた、一つ以上のリン酸カルシウム材の粒子、コラーゲン及び１つ以上のグリコサミノグリカン含む複合生体材料を提供し、コラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカンとが架橋してマトリクスを形成し、リン酸カルシウム材の粒子がマトリクス中に分散し、及びそのリン酸カルシウム材がブルシャイト、リン酸八カルシウム及び／又はアパタイトのうちの１つ以上から選択される。
【０２２７】
以下の説明は、他に特に指定がない限り、本発明に従って複合生体材料のすべての態様に関する。
【０２２８】
コラーゲンと１つ以上のグリコサミノグリカンは好ましくは架橋されている。
【０２２９】
コラーゲンは好ましくは材料中に５から９０（乾燥）重量％、より好ましくは１５から６０（乾燥）重量％、より好ましくは２０から４０（乾燥）重量％の量で存在する。
【０２３０】
材料中に１つ以上のグリコサミノグリカンは、好ましくは０．０１から１２（乾燥）重量％、より好ましくは１から５．５（乾燥）重量％、最も好ましくは１．８から２．３（乾燥）重量％の量で存在する。
【０２３１】
材料がブルシャイトを含む場合、好ましくはコラーゲンとブルシャイトとの比率が重量（乾燥）で１０：１から１：１００、より好ましくは重量（乾燥）５：１から１：２０、最も好ましくは重量（乾燥）で３：２から１：１０、例えば、重量（乾燥）で３：２から１：４である。
【０２３２】
材料がリン酸八カルシウムを含む場合、コラーゲンとリン酸八カルシウムとの比率は、好ましくは重量（乾燥）で１０：１から１：１００、より好ましくは重量（乾燥）で５：１から１：２０、最も好ましくは３：２から１：１０重量（乾燥）である。
【０２３３】
コラーゲンと１つ以上のグリコサノグリカン全量との比率が好ましくは重量（乾燥）で８：１から３０：１であり、より好ましくは、重量（乾燥）で１０：１から３０：１、更により好ましくは重量（乾燥）で１０：１から１２：１、最も好ましくは重量（乾燥）で１１：１から２３：２である。
【０２３４】
本発明による複合生体材料は代用骨又は歯科材料として使用することができる。
【０２３５】
本発明はまた、本発明の複合生体材料を含む合成骨材料、骨移植物、骨接ぎ片、骨代用品、骨足場、充填剤、コーティング又は接着剤を提供する。コーティングなる用語は本発明の生体材料又は前駆体を含むいかなるコーティングを含む。コーティングは補綴部材、骨又は、人体又は動物の体に使用する目的のいかなる基材の外面又は内面に適用できるが、それは粒子状材料を含む。本発明の組成は、限定されないが骨及び歯科材料を含む無機物化された生体材料で生体内及び生体外修復用に用いることができる。本発明の生体材料は同種移植及び自家移植の成長に用いることができる。
【０２３６】
リン酸八カルシウムを含む本発明による生体材料は、前駆体ブルシャイト相が無い、又は実質的に無くてよい。この生体材料は、ブルシャイトが生体材料中のリン酸カルシウムの全量に対して重量で２％以下でよい。
【０２３７】
リン酸カルシウム材は、相が純粋なリン酸八カルシウム又はアパタイトを含む又は実質的に構成される。相が純粋とは、所望の相（Ｘ線解析で測定）が少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも９９．５％を意味する。別の方法として、生体材料は、生体材料の所望の性質に依存するが、リン酸八カルシウムとアパタイトの混合物でもよい。
【０２３８】
ブルシャイトを含む本発明の材料は、生体材料を作成する前駆体材料として使用するか又はそれ自体で生体材料として使用するのが適しているであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２３９】
本発明による方法は以下の一連の方法を用いて実施されるが、その方法とは、コラーゲン、１つ以上のグリコサノグリカン又は１つ以上のリン酸カルシウム成分の生体材料を製造するために全体として又は部分的に適用される。以下の説明は実施例の方法で提供され、本発明によるいかなる態様の方法にも適用が可能である。
【０２４０】
「Ｉ：コラーゲン、ＧＡＧ及びリン酸カルシウム・ブルシャイトの酸性ｐＨでの３種共沈殿」
この工程は複合体の３種（又はそれ以上）の成分からなる溶液から沈殿を経て同時形成を開始し、３種（又はそれ以上）それぞれの相の比率をコントロールするために実施される。複合体の組成上の性質のコントロール（特に、コラーゲン：ＧＡＧ：ＣａＰ比率）は、ｐＨ、温度、熟成時間、カルシウムイオン濃度、リンイオン濃度、コラーゲン濃度及びＧＡＧ濃度のうちの１つ以上を変化させることにより達成される。ｐＨは一定に保っても（例えば、緩衝剤、ｐＨスタット滴定又は他の方法を用いて）又は変化させてもよい。可能な２次（汚染物）相は、他の酸性リン酸カルシウム（例、モネタイト、リン酸水素カルシウム）及び、滴定及び反応剤付加の副産物を含む錯体（例、リン酸アンモニウム、硝酸アンモニウム）を含む。架橋を助成する添加剤（例、グルコース、リボース）又は生体内反応を高める添加剤（例、成長因子、遺伝子転写因子、シリコン、ナトリウム排泄増加ペプチド）もこの工程で添加することができる。
【０２４１】
「ＩＩ：ネット・シェイプの形成」
この工程は最終複合体形状の所望の構造、特に気孔構造のコントロールに重点を置いて製造するために実施される。技術として、ろ過及び低温乾燥（密度の高い粒状形となる）、凍結乾燥（開放気孔形状になる）、射出成形（金型のタイプに依存して広範囲な形状になる）及び常温圧縮（密度の高いペレット形状になる）が挙げられる。
【０２４２】
「ＩＩＩ：一次架橋」
この工程は好ましくは、高いｐＨの溶液に置かれる場合、複合体のＧＡＧ含量が急速に流出せず、更に、複合体の機械的及び分解上の性質を高めるために実施される。技術として、低温物理的技術（例、ガンマ線照射、紫外線照射、脱水素熱的処理）、化学的技術（例、単純な糖での非酵素的糖化、グルタルアルデヒド、エチルジメチルアミノプロピルカルボジイミド、ノルジヒドログアヤレト酸）又は組み合わせ方法（例、同時に非酵素的糖化とガンマ線照射）が挙げられる。リン酸八カルシウム（即ち、工程ＩＶとして）に変換が望ましい場合、一次架橋は３７℃未満で有利に実施され、ブルシャイト相がその脱水素化形であるモネタイト（容易にリン酸八カルシウムに加水分解されないリン酸カルシウム）に変換されるのを防ぐ。
【０２４３】
「ＩＶ：加水分解」
この工程は、ブルシャイト（生理的ｐＨにおいて高い溶解性の相）からのＣａＰ相が加水分解され、リン酸八カルシウム及び／又はアパタイト（生理的ｐＨにおいて低い溶解性の相）になり、実質的に溶解性汚染物質（例、硝酸アンモニウム、リン酸水素カルシウム）を除去するために部分的に又は全面的に実施される。ＯＣＰに加水分解の場合、選択したｐＨは約６．６５の一定値に有利に保持され（緩衝液、ｐＨスタット又は他の方法を用いて）、約３７℃で約２４〜４８時間である。工程Ｉの場合のように、架橋を助成する添加剤（例、グルコース、リボース）又は生体内反応を高める添加剤（例、成長因子、遺伝子転写因子、シリコン、ナトリウム排泄増加ペプチド）も加水分解工程（工程ＩＶ）の間に添加できる。
【０２４４】
「Ｖ：二次架橋」
この工程は、コンポジット材料の機械的及び分解上の性質を更に調整するために実施することができる。上記の工程ＩＩＩに挙げた架橋手順のある部分あるいはすべてを、二次架橋を達成するために用いることができる。
【０２４５】
以下の実施例及び添付する図は、本発明を理解するのに更に役立つように提供される。実施例及び図は、本発明の範囲を制限するものと考えてはならない。実施例及び図で記載されたいかなる特徴は前記の説明のいかなる態様にも適用可能である。
［実施例１］
【０２４６】
実施例１は、前記説明した合成方法の一例であり、工程ＩからＩＩＩのみを適用して実施される。３種共沈殿は室温（２０〜２５℃）、約３．２のｐＨ（アンモニアで滴定して保持）で実施される。この実施例において、共沈殿物は３７℃で乾燥、脱水素熱的処理を経て架橋される。ＣａＰの加水分解的変換も二次架橋もこの実施例では実施されない。
【０２４７】
「材料」
・コラーゲン：再生、ペプシン抽出豚デルマールコラーゲン（アテロコラーゲン）；８５％タイプＩ、１５％タイプＩＩＩ：日本ミートパッカー社（Ｊａｐａｎ  Ｍｅａｔ  Ｐａｃｋｅｒｓ，日本、大阪）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）２シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ３ＰＯ４；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｕｐｐｌｉｅｓ，  Ｐｏｏｌｅ，英国）
・滴定剤：アンモニア；ＮＨ３；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｕｐｐｌｉｅｓ，  Ｐｏｏｌｅ，英国）
【０２４８】
「手順」
〔工程Ｉ〕
溶液Ａ
Ｃａ（ＯＨ）２を０．４８ＭのＨ３ＰＯ４に室温で濃度０．１２Ｍになるように溶解し、得られた溶液をアンモニアを用いてｐＨ３．２まで滴定する。
溶液Ｂ
コンドロイチン‐６‐硫酸を脱イオン水に３．２ｇ／Ｌとなるように溶解する。一定の攪拌のもと、コンドロイチン硫酸溶液にＣａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ、それからＣａ（ＯＨ）２を、硝酸塩と水酸化物のモル比が１．５になるように添加し、全カルシウム濃度２・４Ｍの分散液を製造する。０．１４４ｇのコラーゲンを２０ｍＬの溶液Ａに加え、溶解するまでホモジナイザーを用いて混合する。それから４ｍＬの溶液Ｂを一定攪拌のもと溶液Ａに加える。６０分間攪拌を続け、３．１５＜ｐＨ＜３．３０の範囲を確実に保つようにｐＨを監視する。それから得られたスラリーを室温で２４時間、熟成する。
【０２４９】
〔工程ＩＩ〕
そのスラリーを空気中３７℃で５日間乾燥し、残った３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、引き続いて再び３７℃でもう２４時間乾燥する。得られた３種共沈殿物のＸ線回折パターンを図１（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）及びＳＥＭ画像を図２に示す。
【０２５０】
〔工程ＩＩＩ〕
３種共沈殿物を、１０５℃、５０ミリトールの真空のもと、４８時間の脱水素熱的処理（ＤＨＴ）で架橋する。ＤＨＴ後の３種共沈殿物のＴＥＭ画像を図３に示す。図４はＤＨＴ後の３種共沈殿物のＸ線回折パターンを示しており、ブルシャイト相が脱水素された形のモネタイトに変換されていることを示唆している。
［実施例２］
【０２５１】
実施例２は、前述の説明の合成方法の例であり、工程ＩからＩＶのみの適用を経て実施される。３種共沈殿は室温、ｐＨ４．０で実施される。この実施例において、ｐＨのコントロールは、水酸化カルシウム及び硝酸カルシウム濃度の注意深いコントロール（３種共沈殿中のブルシャイトのコラーゲンとＧＡＧ合計との重量比のコントロールも可能な手法）によって達成される。得られた３種共沈殿物は、−２０℃に凍結され真空下に置かれ、それから加熱して非結合水（即ち、氷）を昇華に誘導する。一次架橋は１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド処理を用いて実施される。得られる乾燥した３種共沈殿物はそれから、ｐＨ６．６７、温度約３７℃での加水分解によってリン酸八カルシウムに変換される。この実施例において、二次架橋は実施されない。
【０２５２】
「材料」
・タイプＩ：牛の腱から酸溶解、インテグラライフサイエンスプラインスボロ社（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，  ＮＪ，米国）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）２シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ３ＰＯ４；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｕｐｐｌｉｅｓ，  Ｐｏｏｌｅ，英国）
・滴定剤：なし
・架橋剤：（ｉ）１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）（ｉｉ）Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）
【０２５３】
「手順」
〔工程Ｉ〕
ブルシャイトのコラーゲンとガリコサミノグリカンの合計との質量比を目標の１：１に選択する。２００ｍＬの全反応体積中でコラーゲンとＧＡＧの合計濃度を２１ｍｇ／ｍＬに設定する。ｐＨ変動の実験的３次元マップ（一定の［Ｃａ２＋］で、［Ｐ］反応物イオン比率１．０まで作成された）を異なる（ｉ）イオン濃度（即ち、［Ｃａ２＋］＝［Ｈ３ＰＯ４］）及び（ｉｉ）硝酸カルシウム：水酸化カルシウムの比率で用いて、ｐＨが４．０で一定に保たれる点の軌跡が決定される。これは図５（ｐＨを４．０に保つためのイオン濃度及びの硝酸カルシウム：水酸化カルシウム比との組み合わせ群）に示している。この点の軌跡を同一軸でブルシャイト質量収量のマップと重ね合わせ、２１ｍｇ／ｍＬ曲線との交点の求めることによって、リン酸カルシウム（２１ｍｇ／ｍＬ）のコラーゲンとＧＡＧの合計（２１ｍｇ／ｍＬ）との１：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーがｐＨ４．０で（［Ｃａ２＋］＝［Ｈ３ＰＯ４］＝０．１３８３Ｍ；Ｃａ（ＮＯ３）．４Ｈ２Ｏ：Ｃａ（ＯＨ）２＝０．１３５６）で製造することができる一組の反応物濃度が与えられる。図６（リン酸カルシウムのコラーゲンとＧＡＧの合計との１：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーのｐＨ４．０合成のための条件の決定方法）参照。３．８６４４ｇのコラーゲンを氷浴で冷却した０．１３８３ＭのＨ３ＰＯ４の１７１．４ｍＬに分散し、１５，０００ｒｐｍで９０分以上攪拌し、直径１９ｍｍの固定子を備えたホモジナイザーを用いて非常に粘調なコラーゲン分散液を作り出す。０．３４３６ｇのコンドロイチン‐６‐硫酸（ＧＡＧ）を室温で、０．１３８３Ｍの１４．３ｍＬに溶解し、溶解しているＧＡＧを分散させるため周期的に振り混ぜて、ＧＡＧ溶液を製造する。９０分後に、１４．３ｍＬのＧＡＧ溶液を混合されているコラーゲン分散液に約０．５ｍＬ／分の速度で加え、１５，０００ｒｐｍで連続的に均一化し、全９０分間混合して、非常に粘調なコラーゲン／ＧＡＧを得る。９０分の混合後、１．８０４ｇのＣａ（ＯＨ）２及び０．７８０ｇのＣａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏを極めて粘調なコラーゲン／ＧＡＧ分散液に１５，０００ｒｐｍの一定の混合のもと３０分かけて加え、コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物スラリーを作り出し、その後、更に１４．３ｍＬの０．１３８３ＭのＨ３ＰＯ４をそのスラリーに混合する。３種共沈殿物スラリーのｐＨは約４．０である。３種共沈殿物スラリーは２５℃で４８時間保持される。
【０２５４】
〔工程ＩＩ〕
３種共沈殿物スラリーを−２０℃の冷凍庫に入れ、一晩中固形化させる。凍結したスラリーはそれから冷凍庫から取り出し、約８０ミリトールの真空に置き、温度を室温まで上昇させ、これによってスラリーから氷の昇華を誘導し、これを４８時間かけて進行させる。非結合水除去後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を図７に示し、共沈殿物の表面のＳＥＭ画像を図８（ＣａＰ：コラーゲン＋ＧＡＧ＝１：１の３種共沈殿物の表面の二次（ＳＥ）及び後方散乱電子（ＢＳＥ）画像）に示す。
【０２５５】
〔工程ＩＩＩ〕
非結合水の完全な除去後、得られる乾燥した３種共沈殿物１．２５ｇを４０ｍＬの脱イオン水の中で２０分間、水和させる。０．０３５ＭのＥＤＡＣ及び０．０１４ＭのＮＨＳの溶液２０ｍＬを３種共沈殿物と脱イオン水をいれた容器に加え、３種共沈殿物をゆっくり攪拌しながら室温で２時間、架橋させる。ＥＤＡＣ溶液を取り除き、３種共沈殿物をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）でリンスし、ゆっくり攪拌して新鮮なＰＢＳ中、３７℃で２時間、成長させる。ＰＢＳ中で２時間後、３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、ゆっくり攪拌しながら３７℃で２回１０分間隔で、成長させる。それから３種共沈殿物を３７℃で７２時間乾燥させる。図９にＥＤＡＣ架橋後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を示す。
【０２５６】
〔工程ＩＶ〕
架橋した３種共沈殿物顆粒を３７℃で５０ｍＬの脱イオン水の中に入れ、アンモニアを用いて溶液のｐＨを６．６７に調整する。温度及びｐＨを４８時間、一定に保ち、その時間後に共沈殿物をろ過し、脱イオン水でリンスして空気中３７℃で乾燥する。ＯＣＰに変換後の共沈殿物のＸ線回折パターンを図１０（コラーゲン／ＧＡＧ／ＯＣＰ生体材料を形成するために、ＯＣＰに３７℃、ｐＨ６．６７で７２時間かけて変換後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物、Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）に示す。
［実施例３］
【０２５７】
実施例３は、前述の説明の合成方法の例であり、工程ＩからＶまでの適用を経て実施される。３種共沈殿は室温、ｐＨは約４．５で実施される。実施例２のように、ｐＨのコントロールは、滴定剤を用いず、水酸化カルシウム及び硝酸カルシウム濃度を注意深くコントロールして達成する。得られた共沈殿物は、−２０℃に凍結され、真空下に置かれ、それから加熱して非結合水（即ち、氷）を昇華に誘導する。一次架橋は１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド処理を用いて実施する。得られる乾燥した共沈殿物はそれから、ｐＨ８．５０、約３７℃でアパタイトに変換される。二次架橋はガンマ線照射を用いて実施する。
【０２５８】
「材料」
・タイプＩ：牛の腱から酸溶解、インテグラライフサイエンスプラインスボロ社（Ｉｎｔｅｇｒａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｌａｉｎｓｂｏｒｏ，  ＮＪ，米国）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）２シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ３ＰＯ４；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｕｐｐｌｉｅｓ，  Ｐｏｏｌｅ，英国）
・滴定剤：なし
・架橋剤：（ｉ）１‐エチル‐３‐（３‐ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＡＣ）；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）（ｉｉ）Ｎ‐ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）
【０２５９】
「手順」
〔工程Ｉ〕
ブルシャイトのコラーゲンとグリコサミノグリカンの合計との質量比を目標の３：１に選択する。２００ｍＬの全反応体積中でコラーゲンとＧＡＧの合計濃度を１０ｍｇ／ｍＬに設定する。ｐＨ変動の実験的３次元マップ（一定の［Ｃａ２＋］で、［Ｐ］反応物イオン比率１．０まで）を異なる（ｉ）イオン濃度（即ち、［Ｃａ２＋］＝［Ｈ３ＰＯ４］）及び（ｉｉ）硝酸カルシウム：水酸化カルシウムの比率で用いて、ｐＨが４．５で一定に保たれる点の軌跡が決定される。これは図１１（ｐＨを４．５に保つためのイオン濃度及び、硝酸カルシウム：水酸化カルシウム比との組み合わせ群）に示している。この点の軌跡をブルシャイト質量収量のマップと重ね合わせ（同一軸で）、３０ｍｇ／ｍＬ（コラーゲンとＧＡＧの合計濃度の３倍）曲線との交点の求めることによって、リン酸カルシウム（３０ｍｇ／ｍＬ）のコラーゲンとＧＡＧの合計濃度（１０ｍｇ／ｍＬ）との３：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーがｐＨ４．５で（［Ｃａ２＋］＝［Ｈ３ＰＯ４］＝０．１７６８Ｍ；Ｃａ（ＮＯ３）．４Ｈ２Ｏ：Ｃａ（ＯＨ）２＝０．０４９）で製造することができる一組の反応物濃度が与えられる。これが図１２（リン酸カルシウムのコラーゲンとＧＡＧの合計との３：１質量比を有する３種共沈殿物スラリーのｐＨ４．５合成のための条件の決定方法）に示される。１．８３７ｇのコラーゲンを氷浴で冷却した０．１７６８ＭのＨ３ＰＯ４の１７１．４ｍＬに分散し、１５，０００ｒｐｍで９０分間攪拌し、直径１９ｍｍの固定子を備えたホモジナイザーを用いてコラーゲン分散液を作り出す。０．１６３ｇのコンドロイチン‐６‐硫酸（ＧＡＧ）を室温で、０．１７６８Ｍの１４．３ｍＬに溶解し、溶解しているＧＡＧを分散させるため周期的に振り混ぜて、ＧＡＧ溶液を製造する。９０分後に、１４．３ｍＬのＧＡＧ溶液を混合されているコラーゲン分散液に約０．５ｍＬ／分の速度で加え、１５，０００ｒｐｍで連続的に均一化し、全９０分間混合して、コラーゲン／ＧＡＧが得られる。９０分の混合の後、２．４９８ｇのＣａ（ＯＨ）２及び０．３８０ｇのＣａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏをコラーゲン／ＧＡＧ分散液に１５，０００ｒｐｍの一定の混合のもと３０分かけて加えて、コラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物スラリーを作り出し、その後、更に１４．３ｍＬの０．１７６８ＭのＨ３ＰＯ４をその混合しているスラリーに添加する。３種共沈殿物スラリーのｐＨは約４．５である。３種共沈殿物スラリーは２５℃で４８時間保持される。
【０２６０】
〔工程ＩＩ〕
３種共沈殿物スラリーを−２０℃の冷凍庫に入れ、一晩中固形化させる。凍結したスラリーは冷凍庫から取り出し、約８０ミリトールの真空に置き、温度を室温まで上昇させ、これによってスラリーから氷の昇華を誘導し、これを４８時間かけて進行させる。非結合水の除去後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を図１３に示す。
【０２６１】
〔工程ＩＩＩ〕
非結合水の完全な除去後、得られる乾燥３種共沈殿物１．２５ｇを４０ｍＬの脱イオン水の中で２０分間、水和させる。０．０１８ＭのＥＤＡＣ及び０．００７ＭのＮＨＳの溶液２０ｍＬを３種共沈殿物と脱イオン水をいれた容器に加え、３種共沈殿物をゆっくり攪拌しながら室温で２時間、架橋させる。ＥＤＡＣ溶液を取り除き、３種共沈殿物をリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）でリンスし、ゆっくり攪拌しながら新鮮なＰＢＳ中、３７℃で２時間、成長させる。ＰＢＳ中で２時間後、３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、ゆっくり攪拌しながら３７℃で、２回１０分間隔で、成長させる。それから３種共沈殿物を３７℃で７２時間乾燥させる。図１４にＥＤＡＣ架橋後のコラーゲン／ＧＡＧ／ブルシャイトの３種共沈殿物のＸ線回折パターン（Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）を示す。
【０２６２】
〔工程ＩＶ〕
架橋した３種共沈殿物顆粒を３７℃でブルシャイトに関して予め飽和した５０ｍＬの脱イオン水の中に入れ、アンモニアを用いて溶液のｐＨを８．５０に調整する。温度及びｐＨを７２時間、一定に保ち、その時間後に共沈殿物をろ過し、脱イオン水でリンスして空気中３７℃で乾燥する。アパタイトに変換後の共沈殿物のＸ線回折パターンを図１５（コラーゲン／ＧＡＧ／アパタイト生体材料を形成するために、アパタイトに３７℃、ｐＨ８．５０で７２時間かけて変換後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／ＣａＰ３種共沈殿物、Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）に示す。
【０２６３】
〔工程Ｖ〕
乾燥したコラーゲン／ＧＡＧ／Ａｐ３種共沈殿物を線量３２．１ｋＧｙのガンマ線照射を施した。図１６にガンマ線照射後（ガンマ線照射による二次架橋後のＥＤＡＣで架橋したコラーゲン／ＧＡＧ／Ａｐ３種共沈殿物、Ｃｕ‐Ｋ（α）照射）のＸ線か回折パターンを示す。
［実施例４］
【０２６４】
「材料」
・コラーゲン：再生、ペプシン抽出豚デルマールコラーゲン（アテロコラーゲン）；重量で８５％タイプＩ、重量で１５％タイプＩＩＩ；日本ミートパッカー社（Ｊａｐａｎ  Ｍｅａｔ  Ｐａｃｋｅｒｓ，日本、大阪）
・ＧＡＧ：鮫軟骨由来コンドロイチン‐６‐硫酸；ナトリウム塩；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ‐Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）
・カルシウム源：（ｉ）水酸化カルシウム；Ｃａ（ＯＨ）２シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）（ｉｉ）硝酸カルシウム；Ｃａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ；シグマアルドリッチ社（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｉｎｃ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，米国）
・リン源：オルトリン酸；Ｈ３ＰＯ４；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｕｐｐｌｉｅｓ，  Ｐｏｏｌｅ，英国）
・滴定剤：アンモニア；ＮＨ３；ビーディーエッチラボラトリーサプライズ社（ＢＤＨ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｓｕｐｐｌｉｅｓ，  Ｐｏｏｌｅ，英国）
【０２６５】
「手順」
〔工程Ｉ〕
溶液ＡはＣａ（ＯＨ）２を０．４８ＭのＨ３ＰＯ４に室温で濃度０．１２Ｍになるように溶解し、得られた溶液をｐＨ３．２まで滴定して準備した。溶液Ｂはコンドロイチン‐６‐硫酸を脱イオン水に３．２ｇ／Ｌとなるように溶解して準備した。一定の攪拌のもと、コンドロイチン硫酸溶液にＣａ（ＮＯ３）２．４Ｈ２Ｏ、それからＣａ（ＯＨ）２を、硝酸塩：水酸化物のモル比が１．５になるように添加し、全カルシウム濃度２・４Ｍの分散液を製造した。０．１４４ｇのコラーゲンを２０ｍＬの溶液Ａに加え、溶解するまでホモジナイザーを用いて混合した。それから４ｍＬの溶液Ｂを一定攪拌のもと溶液Ａに加えた。６０分間攪拌を続け、３．１５＜ｐＨ＜３．３０の範囲を確実に保つようにｐＨを監視した。それから得られたスラリーを室温で２４時間、熟成した。
【０２６６】
〔工程ＩＩ〕
そのスラリーを空気中３７℃で５日間乾燥し、残った３種共沈殿物を脱イオン水でリンスし、引き続いて再び３７℃でもう２４時間乾燥した。
【０２６７】
〔工程ＩＩＩ〕
共沈殿物を希薄な酢酸（ｐＨ３．２）に入れ、線量３０ｋＧｙのガンマ線で照射した。それから架橋した沈殿物を溶液から分離し、リンスして空気中３７℃で乾燥した。
【０２６８】
〔工程ＩＶ〕
架橋した共沈殿物顆粒を３７℃で５０ｍＬの脱イオン水の中に入れ、アンモニアを用いて溶液のｐＨを６．６５に調整した。温度及びｐＨを４８時間、一定に保ち、その後に共沈殿物をろ過し、脱イオン水でリンスして空気中３７℃で乾燥した。
【０２６９】
〔工程Ｖ〕
架橋、加水分解した共沈殿物顆粒を室温で真空炉に置き、５０ミリトールの真空にして、それから温度を１０５℃まで上げた。２４時間後、温度を室温に戻し、真空を解除した。
【０２７０】
図１７は、３種共沈殿物及び乾燥（工程ＩとＩＩ）直後の複合体のＸ線回折パターンを示す。このパターンで存在する主要な相はブルシャイトであることが確認される。
【０２７１】
図１８は、一次架橋（工程ＩＩＩ）後の共沈殿物顆粒の構造のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。顆粒の微細構造的に均一な本質に言及することは価値がある。
【０２７２】
リン酸八カルシウムへの加水分解の進行（工程ＩＶ）は、図１９のＸＲＤパターンで説明される。進行する１２．５°のブルシャイトの強度の減少、４．５°の主要なリン酸八カルシウム（ＯＣＰ）の強度の増加によって４８時間に渡って無機相のＯＣＰへの変換が示唆される。
【０２７３】
複合体のＴＥＭ画像を図２０に示す。コラーゲン／ＧＡＧマトリクス中に分散した１０〜２０ｎｍの低アスペクト比のリン酸カルシウム結晶のランダム分布は明らかである。
【０２７４】
本発明の複合生体材料は生体吸収材料として使用することができる。移植の後、その材料から作製されたデバイスが完全に吸収され、後には健康な再生された組織だけが残り、移植それ自体の痕跡を残さないことが期待される。
＜付録１  以上＞
【図面の簡単な説明】
【０２７５】
【図１】型の適切なデザイン例を示す。
【図２】型の適切なデザイン例を示す。
【図３】上記手順で得られた足場の９．５ｍｍ×９．５ｍｍの円筒形セクションの側面を示す（Ｘ線マイクロトモグラフィで観察）。
【図４】同じ足場の連続的な横断切片を示す。
【図５】同じ足場のＳＥＭ顕微鏡写真を示す。
【図６】同じ足場の高倍率（４０００×）の二次電子検出（すなわちトポグラフィ検出）及び後方散乱検出（すなわち組成物検出）電子イメージングを示す。
【図７】カルシウム及びリンのマップを示す。
【図８Ａ】乾燥状態の単層の足場が、いかなる所望の形状にもカットできることを示す。
【図８Ｂ】固体鋼ボールベアリングの重量による、乾燥状態の単層足場の重量耐力を示す。
【図９】乾燥状態の単層足場の挙動を示す。
【図１０】水和状態の単層足場の圧縮変形を示す。
【図１１】得られた足場の９．５ｍｍ×９．５ｍｍの円筒形セクションの側面を示す（Ｘ線マイクロトモグラフィで観察）。
【図１２】ミネラル質層の平均マクロ孔サイズが約４００ミクロンで、非ミネラル質層では７００ミクロンのオーダーであることを示す連続断面図。
【図１３】非ミネラル質層の上面を示すＳＥＭ画像。ミクロ孔がほとんど存在しないことを示す。
【図１４】非ミネラル質層の上面を示すＳＥＭ画像。いかなる大きな空間、又はミネラル質層と非ミネラル質層を分け隔てる不連続性も含まれないことを示す界面領域の画像。
【図１５】圧縮荷重下での２層足場の挙動を示す。
【図１６】水和状態の２層足場の機械的挙動を示す。
【図１７】２層足場中の非ミネラル質層の外科的欠陥部（骨と関節のジョイント部分の軟骨接合部）の壁に付着する能力を類推した図を示す。
【図１】
2008531230.tif 000003
【図２】
2008531230.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
2008531230.tif 000021
2008531230.tif 000022
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