(57)【要約】多重化ビーズアッセイにおける分析物の定量化の改善を可能とする対照ビーズが開示される。対照ビーズは、滴定曲線の作成をもたらす様々な濃度の較正部分を有する。滴定曲線は分析物の濃度を定量化するために使用できる。滴定曲線はビーズから得られるシグナルを、そのビーズに結合した分析物の濃度（又は分子の絶対数）に関連付けるために使用できる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
多重化アッセイにおいて少なくとも１種の分析物の濃度を定量する方法であって、以下の工程を含む方法：
試料ビーズのセット及び対照ビーズのセットを含む混合物を準備する工程であって、試料ビーズの前記セットが第１コード化部分、及び少なくとも１種の分析物に選択的に結合する第１捕捉部分を含んでおり、対照ビーズの前記セットが第２コード化部分及び較正部分を含む工程、
前記少なくとも１種の分析物を含有することが疑われる試料に前記混合物を接触させる工程、
第１コード化部分からシグナルを得る工程、
第２コード化部分からシグナルを得る工程、
前記較正部分からシグナルを得る工程、
前記較正部分から得られるシグナルから滴定曲線を作成する工程、及び
前記滴定曲線及び画像を用いて、前記少なくとも１種の分析物の濃度を定量する工程。
【請求項２】
第１コード化部分から得られるシグナル、第２コード化部分から得られるシグナル及び前記較正部分から得られるシグナルを同時に得る、請求項１記載の方法。
【請求項３】
対照ビーズの前記セットが前記較正部分を様々な濃度で有する、請求項１記載の方法。
【請求項４】
滴定曲線を作成する工程が、前記較正部分から得られるシグナルを、一次多項、二次多項、三次多項、四次多項、又はシグモイド適合を用いて分析することを含む、請求項１記載の方法。
【請求項５】
第１コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶である、請求項１記載の方法。
【請求項６】
第２コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶である、請求項１記載の方法。
【請求項７】
第１コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶であり、第２コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶である、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記較正部分が直接検出可能な部分である、請求項１記載の方法。
【請求項９】
前記較正部分が間接的に検出可能な部分である、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記較正部分がビオチン化化合物である、請求項１記載の方法。
【請求項１１】
前記較正部分がビオチン化オリゴヌクレオチドである、請求項１記載の方法。
【請求項１２】
同時に画像化する工程の前に前記混合物を標識ストレプトアビジンに接触させることを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１３】
同時に画像化する工程の前に、少なくとも１種の半導体ナノ結晶で標識されたストレプトアビジンに前記混合物を接触させることを更に含む、請求項１記載の方法。
【請求項１４】
試料ビーズの前記セットがポリマービーズである、請求項１記載の方法。
【請求項１５】
試料ビーズの前記セットがポリスチレンビーズである、請求項１記載の方法。
【請求項１６】
対照ビーズの前記セットがポリマービーズである、請求項１記載の方法。
【請求項１７】
対照ビーズの前記セットがポリスチレンビーズである、請求項１記載の方法。
【請求項１８】
前記少なくとも１種の分析物がＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、タンパク質、抗体、リガンド、受容体、脂質又は多糖である、請求項１記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１種の分析物がＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１種の分析物がビオチン化ＤＮＡである、請求項１記載の方法。
【請求項２１】
多重化アッセイにおいて少なくとも１種の分析物の濃度を定量する方法であって、以下の工程を含む方法：
ビーズの第１セット及びビーズの第２セットを含む混合物を準備する工程であって、ビーズの第１セットが第１半導体ナノ結晶、及び少なくとも１種の分析物に選択的に結合するオリゴヌクレオチドを含んでおり、ビーズの第２セットが第２半導体ナノ結晶及びビオチン化オリゴヌクレオチドを含む工程、
前記少なくとも１種の分析物を含有することが疑われる試料に前記混合物を接触させる工程、
第３半導体ナノ結晶で標識されたストレプトアビジンに前記混合物を接触させる工程、
前記混合物を同時に画像化して画像を生成する工程であって、前記画像が第１半導体ナノ結晶から得られるシグナル、第２半導体ナノ結晶から得られるシグナル及び第３半導体ナノ結晶から得られるシグナルを含む工程、
第３半導体ナノ結晶から得られるシグナルから滴定曲線を作成する工程、及び
前記滴定曲線及び前記画像を用いて、前記少なくとも１種の分析物の濃度を定量する工程。
【請求項２２】
滴定曲線を作成する方法であって、以下の工程を含む方法：
対照ビーズのセットを準備する工程であって、前記対照ビーズのセットがコード化部分及び較正部分を含む工程、
前記コード化部分からシグナルを得る工程、
前記較正部分からシグナルを得る工程、及び
前記較正部分から得られたシグナルから滴定曲線を作成する工程。
【請求項２３】
前記コード化部分から得られるシグナル及び前記較正部分から得られるシグナルを同時に得る、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
対照ビーズの前記セットが前記較正部分を様々な濃度で有する、請求項２２記載の方法。
【請求項２５】
滴定曲線を作成する工程が、前記較正部分から得られるシグナルを、一次多項、二次多項、三次多項、四次多項、又はシグモイド適合を用いて分析することを含む、請求項２２記載の方法。
【請求項２６】
前記コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶である、請求項２２記載の方法。
【請求項２７】
前記較正部分が直接検出可能な部分である、請求項２２記載の方法。
【請求項２８】
前記較正部分が間接的に検出可能な部分である、請求項２２記載の方法。
【請求項２９】
前記較正部分がビオチン化化合物である、請求項２２記載の方法。
【請求項３０】
前記較正部分がビオチン化オリゴヌクレオチドである、請求項２２記載の方法。
【請求項３１】
同時に画像化する工程の前に前記混合物を標識ストレプトアビジンに接触させることを更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３２】
同時に画像化する工程の前に、少なくとも１種の半導体ナノ結晶で標識されたストレプトアビジンに前記混合物を接触させることを更に含む、請求項２２記載の方法。
【請求項３３】
対照ビーズのセットがポリマービーズである、請求項２２記載の方法。
【請求項３４】
対照ビーズのセットがポリスチレンビーズである、請求項２２記載の方法。
【請求項３５】
滴定曲線を作成する方法であって、以下の工程を含む方法：
対照ビーズのセットを準備する工程であって、前記対照ビーズのセットが第１半導体ナノ結晶及びビオチン化オリゴヌクレオチドを含む工程、
第２半導体ナノ結晶で標識されたストレプトアビジンに前記セットを接触させる工程、
前記セットを同時に画像化して画像を生成する工程であって、前記画像が第１半導体ナノ結晶から得られるシグナル及び第２半導体ナノ結晶から得られるシグナルを含む工程、及び
第２半導体ナノ結晶から得られるシグナルから滴定曲線を作成する工程。
【請求項３６】
対照ビーズのセットであって、
コード化部分及び較正部分を含む複数のビーズを含んでおり、
前記コード化部分が前記複数のビーズ中に一定濃度で存在し、
前記較正部分が前記複数のビーズ中に様々な濃度で存在する、セット。
【請求項３７】
前記較正部分が前記ビーズの表面上にある、請求項３６記載のセット。
【請求項３８】
前記ビーズが複数種の異なる較正部分を含む、請求項３６記載のセット。
【請求項３９】
前記ビーズが球状である、請求項３６記載のセット。
【請求項４０】
前記ビーズがポリスチレンビーズである、請求項３６記載のセット。
【請求項４１】
前記ビーズの径が約０．１μｍ〜約１００μｍである、請求項３６記載のセット。
【請求項４２】
前記コード化部分が直接検出可能な部分である、請求項３６記載のセット。
【請求項４３】
前記コード化部分が間接的に検出可能な部分である、請求項３６記載のセット。
【請求項４４】
前記コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶を含む、請求項３６記載のセット。
【請求項４５】
前記較正部分が直接検出可能な部分である、請求項３６記載のセット。
【請求項４６】
前記較正部分が間接的に検出可能な部分である、請求項３６記載のセット。
【請求項４７】
前記較正部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶を含む、請求項３６記載のセット。
【請求項４８】
前記較正部分が少なくとも１種のビオチン化化合物を含む、請求項３６記載のセット。
【請求項４９】
前記較正部分が少なくとも１種のビオチン化オリゴヌクレオチドを含む、請求項３６記載のセット。
【請求項５０】
前記コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶を含んでおり、
前記較正部分が少なくとも１種のビオチン化化合物を含む、請求項３６記載のセット。
【請求項５１】
前記コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶を含んでおり、前記較正部分が少なくとも１種のビオチン化オリゴヌクレオチドを含む、請求項３６記載のセット。
【請求項５２】
前記較正部分が最高濃度のビーズから得られるシグナルと前記較正部分が最低濃度のビーズから得られるシグナルの比が１．１より大きい、請求項３６記載のセット。
【請求項５３】
対照ビーズのセットであって、
半導体ナノ結晶及びビオチン化オリゴヌクレオチドを含む複数のビーズを含んでおり、
前記半導体ナノ結晶が前記複数のビーズ中に一定濃度で存在し、
前記ビオチン化オリゴヌクレオチドが前記複数のビーズ中に様々な濃度で存在する、セット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は多重化ビーズ系アッセイの定量結果を向上するための対照ビーズの使用に関する。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は２００４年１２月１６日に出願した米国仮特許出願第６０／６３７３４７号の優先権を主張し、この出願は援用して本明細書の一部をなす。
【背景技術】
【０００３】
多数の分析物の迅速なスクリーニング及び測定を同時に円滑に行わせる、多重化アッセイが多く存在している。これらのアッセイにより、ライブラリーメンバーの個々のスクリーニングが時間及び資源の両面で法外に費用が嵩むことになってしまっていたような分析物のライブラリーを、化学、生物学、及び生物医学の研究者が容易にスクリーニングできるようになっている。
【０００４】
最もよく知られた多重化アッセイ様式は、二次元アレイである。本質的には、フォトリソグラフィ又は他の物理的方法を用いて、チップ上に素材の二次元格子を形成する。１種以上の分析物を含有することが疑われる試料をチップに接触させて、結合する分析物を検出する。このアッセイ形式は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、その他によって市販されている。
【０００５】
選択可能な多重化アッセイ形式は、フローサイトメトリーに基づき「液体アレイ」を形成するものである。ビーズを特定の比の複数染料で個々に標識して、対象の標的に連結させた「レポーター」に連結される複数標的と相互作用させる。かかるビーズを、フローサイトメトリーシステムを用いて個々に分析する。このアッセイ形式は、Ｌｕｍｉｎｅｘ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｑｉａｇｅｎ、その他によって市販されている。
【０００６】
様々な市販の多重化システムの有用性に関わらず、それらにはすべて、圧縮されたダイナミックレンジの問題が伴う。基本的に、所望の標的との相互作用に由来するシグナル出力のダイナミックレンジは、標的による入力のダイナミックレンジに対して圧縮されている。この圧縮されたダイナミックレンジにより、標的分析物の正確な定量化が大幅に損なわれる。よって、この問題に対応して定量結果の向上を実現する、新規又は改良された多重化アッセイ法が必要とされている。
【発明の開示】
【０００７】
発明の概要
様々な較正部分を含む対照ビーズのセットを提供する。この対照ビーズは、滴定曲線の形成を可能とするために試料ビーズと組み合わせることができる。滴定曲線の使用によって、多重化アッセイにおける試料ビーズからの分析物濃度の定量性が改善される。
【０００８】
発明の詳細な説明
組成物及び方法は、様々な構成要素や工程を「含む」（「特に限定されないが、挙げられる」の意味として解釈される）という表現で記載しているが、これらの組成物及び方法は、該様々な構成要素及び工程「から実質的になる」又は「からなる」こともありえ、かかる語法は実質的にクローズド・メンバー群を定義するものとして解釈されるべきである。
【０００９】
本発明の態様には、多重化アッセイにおける対照ビーズのセットの調製及び使用が包含される。対照ビーズによって、滴定曲線の作成が図られ、これにより対象の分析物の定量的測定の質が高められる。「ビーズ」という用語によって、単一のビーズ、又はより一般的には単一種のビーズを言及できる。実際の実験室でのアッセイにおいては、数百又は数千の特定タイプのビーズを、単独又は複数タイプのビーズを混合したものとして使用することになるであろう。小球状ビーズは当技術分野において「ミクロスフェア」と称される場合もある。
【００１０】
材料−対照ビーズ
本発明の一実施形態は対照ビーズのセットに関するものである。このセットはコード化部分及び較正部分を含む複数のビーズを含んでおり、該コード化部分は複数のビーズ中に一定濃度で存在し、該較正部分は複数のビーズ中に様々な濃度で存在する。コード化部分はビーズ内部に存在させるか、ビーズ全体に分布させるか、又はビーズの表面若しくはその近傍に配置できる。較正部分はビーズ内部に存在させるか、ビーズ全体に分布させるか、又はビーズの表面若しくはその近傍に配置できる。濃度範囲は低濃度から高濃度までとすることができ、換言すると、ビーズは低絶対数から高絶対数までの範囲の較正部分をビーズ上に有することができる。対照ビーズは１以上、例えば、２、３、４、５、６等のコード化部分を含むことができる。対照ビーズは１以上、例えば、２、３、４、５、６等の較正部分を含むことができる。
【００１１】
ビーズは一般にどのようなタイプのビーズとすることもできる。例えば、ビーズはポリマービーズとすることができる。ポリマービーズの例としては、ポリスチレンビーズ、ポリ（エチルメタクリレート）ビーズ、ポリ（メチルメタクリレート）ビーズ、ポリアクリレートビーズ、デキストランビーズ、ホルムアルデヒドとの酸触媒反応によって架橋されたメラミン粒子、ポリラクチドビーズ及びポリ（ｅ−カプロラクトン）ビーズが挙げられる。かわりに、ビーズはガラス、シリカ、セラミック、ジルコニア、チタニア、アルミナ、金、銀、パラジウムまたは白金であってもよい。ビーズは常磁性又は水に分散可能等のさらなる性質を有することができる。ビーズは通例、球状の形態であるが、必ずしもそうである必要はなく、桿状、楕円状、又は不定形等の他の形態とすることができる。
【００１２】
球状ビーズの場合、ビーズは通常いかなる径を有することもできる。径の例としては、約０．０５μｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約２μｍ、約３μｍ、約４μｍ、約５μｍ、約６μｍ、約７μｍ、約８μｍ、約９μｍ、約１０μｍ、約１１μｍ、約１２μｍ、約１３μｍ、約１４μｍ、約１５μｍ、約２０μｍ、約３０μｍ、約４０μｍ、約５０μｍ、約６０μｍ、約７０μｍ、約８０μｍ、約９０μｍ、約１００μｍ及びこれら任意の数値間の範囲が挙げられる。ビーズはすべてほぼ同一サイズを有するのが普通であるが、必ずしもその必要はない。
【００１３】
コード化部分及び較正部分は、種々の態様でビーズに結合できる。コード化部分及び較正部分は、同じ態様で、又は異なる態様でビーズに結合できる。例えば、コード化部分及び較正部分は、ビーズに共有結合したり、ビーズに静電的に結合したり、π−π相互作用によってビーズに結合したり、ファンデルワールス相互作用によってビーズに結合したり、ビーズ内部又はビーズ表面に物理的に組み込まれたりすることができる。コード化部分及び較正部分は、直接的にビーズに結合することも、又はリンカー若しくは他の中間物を介して間接的に結合することもできる。
【００１４】
コード化部分及び較正部分は一般に、何らかの検出可能な部分とすることができる。コード化部分と較正部分は、同じ又は異なることができるが、通常は異なっている。検出可能な部分は、直接検出可能であるか、又は間接的に検出可能とすることができる。直接検出可能な部分は、別の分子を添加することなしに検出できる。直接検出可能な部分の例として、半導体ナノ結晶、蛍光有機染料、蛍光蛋白質、放射性同位体等が挙げられる。かわりに、直接検出可能な部分はエッチングされたコード又はＲＦＩＤ（無線識別子）チップ等の物理的なものとすることもできる。間接的に検出可能な部分はいくつかの部分又は断片を有することができる。かかる例は共に検出可能な第１結合パートナー及び第２結合パートナーとすることができる。間接的に検出可能な部分の例としては、光又は色を放出する加負荷（ｓｔｒａｉｎｅｄ）前駆体の切断等の、検出可能な産物を放出する化学反応を引き起こす酵素（発色するベータ−ラクタマーゼ酵素、又は発光するペルオキシダーゼもしくはホスファターゼ酵素等）が挙げられる。
【００１５】
現時点で好ましい実施形態において、コード化部分は直接検出可能であり、較正部分は間接的に検出可能である。コード化部分が１種以上の半導体ナノ結晶であることが現時点では好ましい。
【００１６】
ビーズのセットの具体例は、ビーズに埋設、含浸又は結合された１種以上の半導体ナノ結晶を有するビーズである。これらの半導体ナノ結晶は、コード化部分とすることができる。ビーズはその表面に少なくとも１種のビオチン化化合物を有することもでき、これが較正部分になる。ビオチン化化合物は標識アビジン又はストレプトアビジン蛋白質と相互作用できる。アビジン又はストレプトアビジン蛋白質の標識としては、半導体ナノ結晶、蛍光有機染料、放射性同位体等が挙げられる。さらなる具体例は、ビーズに埋設、含浸又は結合された１種以上の第１半導体ナノ結晶（コード化部分）、ビーズの表面に付着された少なくとも１種のビオチン化オリゴヌクレオチド（較正部分）を有するビーズである。ビオチン化オリゴヌクレオチドは、第２半導体ナノ結晶で標識されたストレプトアビジンを用いることによって検出できる。第１半導体ナノ結晶（単数又は複数種）及び第２半導体ナノ結晶は、別々に検出できるように、異なる波長の光を発することが好ましい。ビーズのセットは、その表面に同じビオチン化オリゴヌクレオチドを有することができるが、異なるビーズから様々なシグナルが生成されるように異なる濃度とする。対応する抗体とハプテン、抗ＤＩＧ抗体とＤＩＧ、抗ＤＮＰ抗体とジニトロフェノール、ニッケルＮＴＡとポリヒスチジンタグ等の金属キレート剤、ＳＨ２ドメイン等といった、ビオチンの代替となるその他のものが多々存在する。化学反応は標識された実体をビーズに結合させるために用いることもできる。かかる化学反応としては、ＮＨＳエステルとアミン、アミノ酸カップリング化学反応等が挙げられる。
【００１７】
ビーズのセットにより生成されるシグナルは、好ましくは、滴定曲線の作成を円滑化するために広い範囲を有する。シグナルは、多種多様な方法によって生成できる。例えば、可視光、ＵＶ光の付加、レーザでの照射、レーザダイオードでの照射、ＬＥＤでの照射等によって、シグナルを生成できる。較正部分が最低濃度のビーズからのシグナルに対する較正部分が最高濃度のビーズからのシグナルの比は、好ましくは１より大きく、約１．１より大きく、約１．２より大きく、約１．３より大きく、約１．４より大きく、約１．５より大きく、約１．６より大きく、約１．７より大きく、約１．８より大きく、約１．９より大きく、約２より大きく、約３より大きく、約４より大きく、約５より大きく、約６より大きく、約７より大きく、約８より大きく、約９より大きく、約１０より大きく、約１００より大きく、約１，０００より大きく、約１０４より大きく、約１０５より大きく、約１０６より大きく、約１０７より大きく、約１０８より大きく、約１０９より大きく、約１０１０より大きく、約１０１１より大きく、約１０１２より大きく、これら任意の数値間の範囲である。
【００１８】
材料−ビーズ混合物
本発明のさらなる実施形態は、分析物のアレイと相互作用するように構成された試料ビーズのセット、及び滴定曲線を作成できるように構成された対照ビーズのセットを含む組成物に関する。
【００１９】
試料ビーズのセットは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、蛋白質、抗体、リガンド、受容体、脂質、多糖等の分析物と結合するように構成できる。分析物は、ビオチン化されているか、ビオチン化されていないかの何れかとすることができる。試料ビーズのセットは、特定の分析物の選択的な結合を可能にする捕捉部分のアレイを、それらの表面に有することができる。例えば、試料ビーズ（単数種又は複数種）は、第１オリゴヌクレオチドに相補的な配置との特異的ハイブリダイゼーションを許容する第１オリゴヌクレオチドをその表面に有することができ；第２ビーズ（単数種又は複数種）は、第２オリゴヌクレオチドに相補的な配置との特異的ハイブリダイゼーションを許容する第２オリゴヌクレオチドをその表面に有することができる、等である。捕捉部分は通常、対象の分析物と選択的に結合するように構成されている、いかなる材料又は化合物であることもできる。捕捉部分の例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ペプチド、蛋白質、抗体等が挙げられる。試料ビーズのセットは、１種のコード化部分、又は２種以上のコード化部分を含むことができる。現時点で好ましい実施形態において、試料ビーズのセットは、コード化部分及び捕捉部分を含む。試料ビーズのセットは、１種又は複数種のコード化部分としてビーズに埋設、含浸、又はその他の方法で結合された１種以上の半導体ナノ結晶を有することができる。
【００２０】
ビーズの第２セットは、前の段落に記載の対照ビーズのセットの何れかとすることができる。
【００２１】
ビーズ混合物の具体的な例として挙げられるのは、ビーズに埋設、含浸、又はその他の方法で結合された１種以上の半導体ナノ結晶（第１コード化部分）、及びそれらの表面にオリゴヌクレオチドのアレイ（１種または複数種の、第１捕捉部分）を有する試料ビーズのセット；並びにビーズに埋設、含浸、又はその他の方法で結合された１種以上の半導体ナノ結晶（第２コード化部分）、及びそれらの表面にビオチン化オリゴヌクレオチド（較正部分）を有する対照ビーズのセットである。
【００２２】
キット
本発明のさらなる実施形態は、ビーズ組成物を備えたキットに関する。キットは、滴定曲線を得るためのプロトコル、及びの段落に記載のビーズ混合物の何れかを含むことができる。
【００２３】
滴定曲線の作成に使用する方法
本発明のさらなる実施形態は、上記の対照ビーズを用いて滴定曲線を作成する方法に関する。方法は、対照ビーズのセットを準備する工程であって、対照ビーズのセットがコード化部分及び較正部分を含む工程；コード化部分からシグナルを得る工程；較正部分からシグナルを得る工程；並びに較正部分から得られるシグナルから滴定曲線を作成する工程を含むことができる。対照ビーズのセットは様々な濃度の較正部分を有することができる。
【００２４】
滴定曲線作成工程は、通常の方法を用いて、較正部分から得られるシグナルを分析することを含むことができる。この方法は、線形一次多項、二次多項、三次多項、四次多項又はシグモイド適合の使用を包含できる。滴定曲線を、三次多項、四次多項、又はシグモイド適合の使用によって得ることが現時点では好ましい。
【００２５】
滴定曲線が一旦得られれば、その後の多重化分析物アッセイを新しい滴定曲線を作成せずに実施できる。あるいは、同時画像化又はフローサイトメトリー等の方法によって、多重化分析物アッセイと同時に滴定曲線を得ることができる。
【００２６】
コード化部分は一般にいかなるコード化部分とすることもできる。コード化部分は直接検出可能な部分又は間接的に検出可能な部分とすることができる。コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶であることが、現時点では好ましい。複数種の半導体ナノ結晶を用いる場合、それらから「バーコード」を作成できる。
【００２７】
較正部分は一般にいかなる検出可能な部分とすることもできる。較正部分は直接検出可能な部分又は間接的に検出可能な部分とすることができる。較正部分はハプテンとすることができる。較正部分がビオチン化化合物であることが、現時点では好ましい。較正部分がビオチン化オリゴヌクレオチドであることも、現時点では好ましい。ビオチン化化合物は、標識アビジン若しくはストレプトアビジン、又は較正部分に結合する他の材料の添加によって容易に検出できる。
【００２８】
この方法は、シグナルを得る前に、標識アビジン又は標識ストレプトアビジンにセットを接触させることをさらに含むことができる。具体的には、この方法は、シグナルを得る前に、少なくとも１種の半導体ナノ結晶で標識ストレプトアビジンに混合物を接触させることをさらに含むことができる。
【００２９】
多重化分析物アッセイにおける使用方法
上記の対照ビーズ、ビーズ混合物及びキットは多重化分析物アッセイの定量結果を改善するために使用できる。対照ビーズのセットの使用によって、１種以上の分析物の濃度を定量化するためにその後使用できる滴定曲線を作成することが可能になる。本発明者らは、滴定曲線を用いなければ、分析物の濃度とシグナルが直接相関しないことを見出した。従って、本発明の方法は、多重化分析物アッセイの精度を大幅に高めることがわかった。分析物は一般にいかなる分析物とすることもできる。分析物の例として、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＰＮＡ、蛋白質、抗体、リガンド、受容体、脂質、多糖等が挙げられる。分析物は、ビオチン化されているか、又はビオチン化されていないかの何れかとすることができる。
【００３０】
本発明の一実施形態は、多重化アッセイにおいて少なくとも１種の分析物の濃度を定量する方法に関し、該方法は、試料ビーズのセット及び対照ビーズのセットを含む混合物を準備する工程であって、試料ビーズのセットが第１コード化部分及び少なくとも１種の分析物に選択的に結合する第１捕捉部分を含んでおり、対照ビーズのセットが第２コード化部分及び較正部分を含む工程；混合物を少なくとも１種の分析物を含有することが疑われる試料に接触させる工程；第１コード化部分からシグナルを得て、第２コード化部分からシグナルを得て、較正部分からシグナルを得る工程；較正部分から得られるシグナルから滴定曲線を作成する工程；並びに滴定曲線及び画像を用いて、少なくとも１種の分析物の濃度を定量する工程を含む。様々なシグナルの取得は、連続的（例えばフローサイトメトリー）又は同時（例えばビーズのアレイを同時に画像化する）に実施できる。
【００３１】
滴定曲線を作成する工程は、何らかの通常の方法を用いて、較正部分から得られるシグナルを分析することを含むことができる。方法は、線形一次多項、二次多項、三次多項、四次多項又はシグモイド適合の使用を包含できる。滴定曲線を、三次多項、四次多項又はシグモイド適合の使用によって得ることが、現時点では好ましい。
【００３２】
滴定曲線が一旦得られれば、その後の多重化分析物アッセイを、新しい滴定曲線を作成することなく実施できる。あるいは、同時画像化又はフローサイトメトリー等の方法によって、多重化分析物アッセイと同時に滴定曲線を得ることができる。
【００３３】
第１コード化部分は一般にいかなるコード化部分であることもできる。第１コード化部分は、直接検出可能な部分又は間接的に検出可能な部分とすることができる。第１コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶であることが、現時点では好ましい。複数種の半導体ナノ結晶を用いる場合、それから「バーコード」を作成できる。
【００３４】
第２コード化部分は一般にいかなるコード化部分とすることもできる。第２コード化部分は直接検出可能な部分、又は間接的に検出可能な部分とすることができる。第２コード化部分が少なくとも１種の半導体ナノ結晶であることが、現時点では好ましい。複数種の半導体ナノ結晶を用いる場合、それから「バーコード」を作成できる。
【００３５】
第１コード化部分と第２コード化部分は、同じ又は異なることができる。ビーズの第１セットとビーズの第２セットの同定を円滑化するために、第１コード化部分と第２コード化部分が異なっていることが、現時点では好ましい。しかしながら、同じ化合物（１種又は複数種）／材料（１種又は複数種）である第１コード化部分及び第２コード化部分を有するが、異なる濃度存在するようにすることが可能である。
【００３６】
較正部分は一般にいかなる検出可能な部分とすることもできる。較正部分は直接検出可能な部分又は間接的に検出可能な部分とすることができる。較正部分はハプテンとすることができる。較正部分がビオチン化化合物であることが、現時点では好ましい。較正部分がビオチン化オリゴヌクレオチドであることも、現時点では好ましい。ビオチン化化合物は、標識アビジン若しくはストレプトアビジン、又は較正部分に結合する他の材料の添加によって容易に検出できる。
【００３７】
この方法は、シグナルを得る前に、標識アビジン又は標識ストレプトアビジンに混合物を接触させることをさらに含むことができる。具体的には、この方法は、シグナルを得る前に、少なくとも１種の半導体ナノ結晶で標識されたストレプトアビジンに混合物を接触させることをさらに含むことができる。
【００３８】
以下の実施例を挙げて、本発明の好ましい実施形態を説明する。以下の実施例に開示した技術は、本発明者（１名又は複数名）によって発見された、本発明の実施において良好に機能する技術を表し、よって、その実施に好ましい態様を構成するものと考えることができることは当業者によって理解されるはずである。しかし、当業者であれば、本明細書における開示に鑑み、本発明の範囲を逸脱することなく、開示した特定の実施形態を多々変更でき、そうしても同様又は類似の結果が得られることを理解すべきである。
【００３９】
実施例
実施例１：量子ドットナノ粒子の調製
量子ドットナノ粒子の調製は、当該技術分野において周知である。量子ドットの調製方法の例は、米国特許第６２０７２９９号、同第６３２２９０１号、及び同第６５７６２９１号、並びに刊行物「Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  Ｒｏｕｔｅｓ  ｔｏｗａｒｄ  Ｈｉｇｈ  Ｑｕａｌｉｔｙ  ＣｄＳｅ  Ｎａｎｏｃｒｙｓｔａｌ，」（Ｑｕ  ｅｔ．  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．，１（６）：３３３−３３７（２００１））に記載されている。量子ドットナノ粒子は、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）より市販されている。量子ドットナノ粒子の調製は、多くの特許及び刊行物の主題になっており、以下にいくつかの例を挙げる。合金又は混合シェルの使用が、米国特許第６８１５０６４号に記載されている。プロモーターを用いて量子ドットコアを作製することが、米国特許公開第２００３／００９７９７６号（２００３年５月２９日公開）に記載されている。混合された疎水性／親水性ポリマー転移剤を量子ドットの表面に結合させる表面修飾法が、米国特許第６６４９１３９号に示唆されている。
【００４０】
実施例２：量子ドットナノ粒子含浸ミクロスフェアの調製
量子ドットナノ粒子含浸ミクロスフェアを作製する方法は、当技術分野において周知である。量子ドットナノ粒子含浸ミクロスフェアの調製は、多くの特許及び刊行物の主題になっており、以下にいくつかの例を挙げる。米国特許第６４７９１４６号には、分解可能なコロイドテンプレート上でナノコンポジット多層の静電的自己集合を使用する方法が記載されている。国際公開第００／７７２８１号（２０００年１２月２１日公開）には、多層コーティングを介した結晶の封入が記載されている。国際公開第０１／５１１９６号（２００１年７月１９日公開）には、ポリマー多層を用いる固体粒子のテンプレート法が記載されている。国際公開第９９／４７２５２号（１９９９年９月２３日公開）には、層様の高分子電解質の自己集合を使用してナノカプセル及びマイクロカプセルを調製することが記載されている。米国特許第６５４８１７１Ｂ１号明細書及び同第６６８０２１１Ｂ２号には、蛍光ナノ結晶が埋設されたミクロスフェア記載されている。最後に、高分子電解質多層膜が、Ｐａｒｋ他、Ｌａｎｇｍｕｉｒ  １８：９６００−９６０４（２００２）によって成形された。
【００４１】
実施例３：結合較正ビーズの調製
以下のプロトコルを使用して、ほぼ等量の橙色及び赤色を発する量子ドットナノ粒子を組み込んでいるビーズを調製した。ビーズは、卓上遠心分離器又は磁気分離の何れかによって洗浄工程及び沈着工程の間に懸濁液から簡便に分離できる。球状ポリスチレン基材ビーズ（９μｍ、常磁性コア、非誘導化）は、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｈｒｏｐｓｈｉｒｅ，ＵＫ）から購入した。基材ビーズ（２０ｍｇ、４％溶液として５００μＬ）を水洗し、次いでポリエチレンイミン（１０ｍＬ、４％、約２５，０００ｇ／モル分子量、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））と３０分間インキュベートした。このビーズを、水の中で撹拌しその後遠心分離して再懸濁することによって１０回洗浄した。
【００４２】
洗浄工程の後、ビーズをさらに、両親和性ポリマーに可溶化した５９１ｎｍで発光するＣｄＳｅ／ＣｄＺｎＳコア−シェル量子ドットナノ粒子（６８．０７μＬ、８μＭ）、及び同様に調製した６５５ｎｍで発光する量子ドットナノ粒子（４０．２３μＬ、８μＭ）と、３．４ｍＬの水中で撹拌しながら１時間インキュベートした。量子ドットナノ粒子のインキュベーションの後、さらに一連の水洗（１０回）を行い、４％ポリアクリル酸（約１，２００ｇ／モル分子量、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））で３０分間再懸濁させた。さらにまた１０回水洗した後、ビーズを４％ポリエチレンイミン溶液で３０分間再懸濁させた。ビーズを１０回洗浄して、２ｍＬの１％ポリアクリル酸中で保存した。
【００４３】
実施例４：ビーズへのビオチン化オリゴヌクレオチドの接合
以下の表１及び２の数値を用いて、ビオチン化及び非ビオチン化オリゴヌクレオチドの貯蔵混合物（各々、一級アミン官能基で５’端キャップしたもの）を、ＭＥＳ緩衝液（２−モルホリノエタンスルホン酸、１００ｍＭ）中で最終総オリゴヌクレオチド濃度が２．５μＭになるように調製した。ＥＤＣ（（１−エチル−３−［３−ジメチルアミノプロピル］カルボジイミド塩酸塩））貯蔵溶液を、ＥＤＣ（１ｇ）を２５ｍＬのＭＥＳ緩衝液（１００ｍＭ）と合わせることによって、ＭＥＳ中４％の濃度で調製した。量子ドットナノ粒子含浸ビーズ（実施例より；１反応につき１００万個のビーズ）を水で洗浄し（３回）、次いで１００ｍＭのＭＥＳ緩衝液で洗浄して（１回）、ＭＥＳ（１０μＬ）に再懸濁させた。オリゴヌクレオチド貯蔵溶液（８０μＬ）を、最終ＥＤＣ濃度が２％になるように、ＥＤＣ貯蔵溶液（９０μＬ）と共にビーズ懸濁液と合わせた。こうして得られた反応懸濁液を混合し、その後Ｖｏｒｔｅｍｐ振盪培養器を用いて終夜、１５００ｒｐｍ、２２℃にて反応させた。反応後、ビーズを洗浄して、５００μＬのＰＢＳ中で４℃にて保存した。
【００４４】
【表１】
2008524600.tif 000002
【００４５】
【表２】
2008524600.tif 000003
【００４６】
実施例５：アッセイ及びハイブリダイゼーションプロトコル
遺伝子パネル選択：適切な試料（例えば、細胞、組織等）から、例えば５０の標的遺伝子を分析用に選択した。各標的遺伝子に対して１つの捕捉プローブを設計及び選択した。各捕捉プローブは、独自に光学的検出が可能な量子ドットナノ粒子含浸ビーズの１集団に接合させた。標的遺伝子及びスパイクしたオリゴヌクレオチドを増幅させ、米国特許第５５１４５４５号；第５５４５５２２号；第５７１６７８５号；及び第５８９１６３６号に開示のＴ７増幅法を用いて、ビオチンで標識した。
【００４７】
以下の３種の構成要素を、９６ウェルマイクロタイタープレートの各ウェルに添加した。（ａ）例えば５０のメンバーを備えた特定の遺伝子パネルにつき、独自にコード化された５０ビーズのうちの１つに接合された、各遺伝子に対して１つの捕捉プローブ；（ｂ）例えば２０のメンバーの所定ハウスキーピング遺伝子の特定のパネルにつき、各ウェルに添加される独自にコード化された２０ビーズのさらなるセットに接合された捕捉プローブの対応するセット；及び（ｃ）各ウェルに添加される様々な対照としての機能を果たす、独自にコードされた２０ビーズのさらなるセット。
【００４８】
結合較正ビーズ
結合較正ビーズは、ビオチン−オリゴの付着レベルを漸増させて各ウェルに添加される例えば９種の独自にコードされたビーズの１シリーズであって、実施例に記載の通りに調製する。結合検量線を、このシリーズから得られるシグナルから、各ウェルに対して作成する。このデータにより、１ビーズ当たり既知数のビオチンによって生成されるシグナルレベル（ＲＦＵ）の情報が与えられる。次いでこのデータを使用して、各ウェル内の他の全ビーズからのシグナルを較正する。こうして、「較正ＲＦＵ」すなわち、各ウェル内の独自にコード化された各ビーズについての、１ビーズ当たりのビオチン数が与えられる。較正ＲＦＵを用い、次の実施例に提示するデータ曲線適合アルゴリズムに示すような方法を使用して標的分子の数を定量化する。
【００４９】
ハイブリダイゼーション対照ビーズ
使用できるビーズのさらなるセットは、ハイブリダイゼーション対照ビーズである。これらのビーズは、１種以上の異なる定義済みオリゴヌクレオチド配列を表面に有する。ビオチン化逆相補オリゴヌクレオチドを、希釈系列に結合させて、システムのハイブリダイゼーションの有効性を試験できる。オリゴヌクレオチド配列は、独自なものであって、且つ対象の標的配列とはクロスハイブリダイズしないように設計できる。そのアッセイで既知配列の何れともハイブリダイズしないように設計したオリゴヌクレオチド配列を有する、非特異的ハイブリダイゼーション対照ビーズを使用することもできる。
【００５０】
ハイブリダイゼーション対照ビーズからの較正ＲＦＵを、コピー数に対してプロットして、例えば、生じたシグナルレベルが許容範囲にあるかどうか、プロトコルのハイブリダイゼーション工程が有効であったかどうか、反応が線形であるかどうか、及びバックグラウンドシグナルの高さはどの程度かについての情報を与える。非特異的ハイブリダイゼーション対照から、非特異的ハイブリダイゼーションのレベルに関する情報が得られる。
【００５１】
標識対照ビーズ
標識対照ビーズを使用し、陽性対照の一形式として作用させることができる。これらの既知配列の合成ＲＮＡ転写物を、ビーズに接触させる前に試料に添加できる。合成ＲＮＡ転写物を異なる濃度添加して、標識対照ビーズの応答を試験できる。増幅された転写物配列とハイブリダイズするように設計したオリゴヌクレオチド配列を有する標識対照ビーズを添加できる。合成ＲＮＡ転写物及びそれらの相補体は、他の分析物配列と交差反応しないように設計する。
【００５２】
「較正ＲＦＵ」を、標識対照ビーズの各々に対して作成する。標識対照ビーズ較正ＲＦＵを、試料標識及びスパイク標識工程に添加した「スパイク」の既知濃度に対してプロットする。これらのデータは、例えば、生じたシグナルレベルが許容範囲にあるかどうか、プロトコルの増幅／標識工程が有効であったかどうか、標識反応が線形であるかどうか、及びバックグラウンドシグナルの高さはどの程度かについての情報を与える。
【００５３】
機器対照ビーズ
機器対照ビーズも各ウェルに添加できる。このビーズは、例えば、６５５ｎｍピークの発光量子ドット等の、レポーター量子ドットナノ結晶で染色されたビーズを含む。機器対照ビーズは、例えば６５５ｎｍ及び７０５ｎｍの複数のレポーター色を有することができる。
【００５４】
典型的には、以下のビーズを５０重アッセイ（すなわち、５０の独自の標的遺伝子の発現の同時アッセイ）の各ウェルに添加する。表３にビーズのセットの例を示すが、ビーズの各々の数及びビーズの総数は変更できる。ウェル内のビーズの総数が数千であれば、ウェル内には各ビーズの同一性が多数存在する。
【００５５】
【表３】
2008524600.tif 000004
【００５６】
実施例６：データ曲線適合アルゴリズム
１ビーズ当たりのビオチンの関数としての測定強度に対する、最適なデータモデル（曲線適合）を求めた。
【００５７】
二次、三次、及び四次多項、並びにシグモイド曲線の適合からの残差を算出して、スチューデントｔ検定によって比較した。その結果は、シグモイド、三次多項、及び四次多項適合がすべて、二次多項よりも有意に良好であったことを示唆する。四次多項適合は、三次多項又はシグモイド適合よりも有意に良好ではなかった。シグモイド適合と三次多項適合は、実験データの記述上、ほぼ同等であった。各ＯｌｉｇｏＩＤ標識に対するビオチン密度を、表４から割り出した。
【００５８】
【表４】
2008524600.tif 000005
【００５９】
ビオチン密度の対数の関数として強度中央値の対数を適合させるべく、４種の関数を提起した。二次、三次、及び四次多項並びにシグモイドを、データモデルの関数形式用に選択した。提起したモデルに対する関数形式、最良適合パラメータ、及びｒ２を表５に示し、さらに生データと共に図１にプロットする。
【００６０】
【表５】
2008524600.tif 000006
【００６１】
精査によれば、二次多項適合が最も不良であり、その他のモデルは互いにかなり近い。これらの適合の質をより良く見極めるために、各適合に対する残差を図２に示す。三次多項、四次多項、及びシグモイドに対する残差を別々のグラフに示し、参照用に、二次多項に対する残差を各グラフに反復表示している。
【００６２】
データモデルの質を定量化するために０．９５の信頼レベルでスチューデントｔ検定を用い、各レベルのビオチン密度での残差の統計的有意差について確認した。この方法は、別異のビオチンレベルでの適合の比較を可能とするために採用した。合併分散アプローチでは、ビオチン密度の関数として適合における差を認めることはできないはずである。各々の比較に対するｐ値（Ｈｏ：μｘ−μｙ＝０）を、プロットの変数として図３に示す（μｘは、図３のｘ軸に沿って表示した適合の平均値を表し、μｙは、図３のｙ軸に沿って表示した適合の平均値を表す）。個々のグラフの各々は、ビオチン密度に対してｐ値をプロットしたものであり、実線は９５％の信頼限界を表している。線よりも下の点は、そのビオチン密度での、適合「ｙ」に比較した適合「ｘ」に対する統計的有意差を表す。図３は、三次多項、四次多項、及びシグモイド適合残差がすべて、二次多項適合残差と異なっており、ほとんどのビオチンレベルで互いに識別できないことを示している。
【００６３】
図４は、片側ｔ検定（Ｈｏ：μｘ−μｙ＞０）についての結果を図３と同じ形式で表す。９５％信頼限界を下回る点では、ｘ軸上に表示の適合に対する残差の平均が、ｙ軸上に表示の適合に対する残差の平均よりも大きいとの帰無仮説を却下する。ここでは予想通り、三次多項、四次多項、及びシグモイド適合残差がすべて、ほとんどのビオチンレベルで二次多項適合残差を下回ることが示されている。三次多項、四次多項、及びシグモイド適合残差を互いに識別できないので、これらの適合でより誤差が少ないのはどれかを言明することもできない。
【００６４】
実施例７：滴定曲線使用の有無の場合での分析物定量の比較
培養細胞を異なる化合物で、異なる濃度にて処理して、１５種の試料を作製した。処理後に、細胞を溶解して、総ＲＮＡを抽出した。総ＲＮＡ（１００ｎｇ）を次いで、Ｅｂｅｒｗｉｎｅプロトコルの変法によりＴ７で増幅した。試料を、全ウェルに入れた試料ビーズ及び対照ビーズの混合物を用いて個々に分析した。試料をビーズとハイブリダイズさせ、洗浄し、ストレプトアビジンＱ６５５レポーターで染色し、洗浄して、Ｍｏｓａｉｃ機器（Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｈａｙｗａｒｄ，ＣＡ）で走査した。
【００６５】
１５種の試料の各々に対する検量線についての生データを、Ｌｏｇ１０［ビオチン／ビーズ］に対してＬｏｇ１０［生ＲＦＵ］を対比するようプロットした（図５に示す）。検量線の各々に対して較正されたデータを、Ｌｏｇ１０［ビオチン／ビーズ］に対してＬｏｇ１０［較正ＲＦＵ］を対比するようプロットした（図６に示す）。
【００６６】
線形アルゴリズムを用いてデータを適合化して、ｙ＝０．５８１ｘ−１．４６７の式を得た。ビオチン密度／ビーズの関数としての生シグナル（ＲＦＵ）の傾きが約０．５２、すなわち、ビオチン密度の２倍の増加に対してシグナルがわずか約１倍しか増加しないであることがわかった。ビオチン密度の４−ｌｏｇレンジに対して、生のシグナルダイナミックレンジを観察すると、１．９５ｌｏｇであった。生の検量線データを較正すると、傾きは約０．９９になり、シグナルダイナミックレンジを観察すると、３．９ｌｏｇであった。この結果、較正されたＲＦＵはビオチン密度の変動をより厳密に反映することが観察され、生データにおける圧縮シグナルダイナミックレンジはビオチン密度の変動をより厳密に反映するように補正されていた。
【００６７】
次に、全ウェルのハイブリダイゼーション対照ビーズを用いて、較正の効果を評価した。ビオチン密度滴定（較正）曲線を用いて、生データを較正した。生データを、Ｌｏｇ１０［分子入力］に対してＬｏｇ１０［生ＲＦＵ］を対比するようプロットした（図７に示す）。線形アルゴリズムを用いてデータを適合化して、ｙ＝０．５７３９ｘ−２．１７７５の式と、０．９９のＲ２値を得た。同様に、Ｌｏｇ１０［分子入力］に対するＬｏｇ１０［較正ＲＦＵ；１ビーズ当たりのビオチン］を図８に示す。線形アルゴリズムを用いてデータを適合化して、ｙ＝０．９２５ｘ−３．５８９１の式と、０．９９のＲ２値を得た（図８に示す）。
【００６８】
ビオチン化オリゴの既知コピー数入力がハイブリダイゼーション対照滴定曲線で用いられるとすると、予測される傾きは１であり、シグナルダイナミックレンジは３ｌｏｇであると予測された。生データでは、約０．５７の傾きと、約１．７ｌｏｇのシグナルダイナミックレンジが得られた。これはまた、生データが、既知の入力に対して変動及びレンジの双方で圧縮されたことを意味している。さらに、ハイブリダイゼーション対照からの生データに対する傾き及びシグナルダイナミックレンジについて得られた数値は、検量線からの生データに対して観察されたものと非常に類似していることが観察された。生データの較正により、今度はハイブリダイゼーション滴定曲線の傾きが０．９３であって、ダイナミックシグナルレンジが２．８ｌｏｇという結果が得られた。シグナルの変動はハイブリダイゼーションへの入力の変動をより厳密に複製し、そしてシグナルダイナミックレンジは入力ダイナミックレンジをより厳密に複製した、という最終結果が得られた。ハイブリダイゼーション対照及びビオチン結合検量線に対する傾き及びシグナルダイナミックレンジの類似から、ハイブリダイゼーションシグナルの圧縮は、ビーズへのビオチン結合の結果であることが示唆された。
【００６９】
ＲＮＡスパイク滴定曲線は、既知のコピー数入力にて、Ｔ７増幅工程の前に各試料にスパイクされたＲＮＡからなるものであった。ビオチン密度滴定（較正）曲線を用いて、生データを較正した。生データを、Ｌｏｇ１０［分子入力］に対してＬｏｇ１０［生ＲＦＵ］を対比するようプロットした（図９に示す）。線形アルゴリズムを用いてデータを適合化して、ｙ＝０．５８１ｘ−１．４６７の式と、０．９６のＲ２値を得た。同様に、Ｌｏｇ１０［分子入力］に対するＬｏｇ１０［較正ＲＦＵ；１ビーズ当たりのビオチン］を図８に示す。線形アルゴリズムを用いてデータを適合化して、式ｙ＝０．９８８ｘ−２．８６２、０．９８のＲ２値を得た（図１０に示す）。
【００７０】
ＲＮＡ転写物の既知コピー数入力で試料をスパイクしてＲＮＡ滴定曲線を形成するとすれば、予測される傾きは１であり、シグナルダイナミックレンジは３ｌｏｇであると予測された。生データでは、約０．５８の傾きと、約１．６ｌｏｇのシグナルダイナミックレンジが得られた。これはまた、生データが、Ｔ７増幅への既知の入力に対して変動及びレンジの双方で圧縮されたことを意味している。さらに、ハイブリダイゼーション対照からの生データに対する傾き及びシグナルダイナミックレンジについて得られた数値は、検量線からの生データに対して観察されたものと非常に類似していることが観察された。生データの較正により、今度はハイブリダイゼーション滴定曲線の傾きが０．９９であって、ダイナミックシグナルレンジが２．８ｌｏｇという結果が得られた。シグナルの変動はハイブリダイゼーションへの入力の変動をより厳密に複製し、そしてシグナルダイナミックレンジは入力ダイナミックレンジをより厳密に複製した、という最終結果が得られた。ＲＮＡスパイク滴定対照、ハイブリダイゼーション対照及びビオチン結合検量線に対する、傾き及びシグナルダイナミックレンジの類似から、ハイブリダイゼーションシグナルの圧縮は、ビーズへのビオチン結合の結果であることが示唆された。
【００７１】
対照ビーズセットと同様のウェルに、細胞に内在する遺伝子の発現レベルの分析用のビーズを入れた。これらの遺伝子についての発現レベルを、生シグナルを用いて評価した（図１１）。ビオチン密度滴定（較正）曲線を用い、対照について上記の通りに生データを較正した（図１２）。
【００７２】
シグナルダイナミックレンジ及び発現の変動の双方を、生データで圧縮した。較正されたデータから、遺伝子発現におけるより大幅なシグナルダイナミックレンジ及び変動が容易に観察されることが立証された。
【００７３】
本明細書において開示し請求する組成物及び／又は方法及び／又は装置のすべては、本明細書の開示に鑑み、過度の実験を必要とせずに作製し実行することができる。好ましい実施形態によって本発明の組成物及び方法を説明してきたが、本明細書に記載の組成物及び／若しくは方法及び／若しくは装置並びに工程又は方法の工程の配列において本発明の技術思想及び技術的範囲内で変更をなすことができることは当業者には明らかであろう。具体的には、本明細書に記載の試薬を、化学的及び物理的に関連する特定の試薬と置換してもよく、この場合、同じ又は類似の結果が得られるはずであることは明らかであろう。当業者にとって明らかな、かかる類似の置換及び修正はすべて、本発明の技術的範囲及び技術思想内に属するものと考える。
【００７４】
以下の図面は、本明細書の一部をなすものであり、本発明の特定の態様をさらに示すために添付する。本発明は、本明細書に示す具体的な実施形態の詳細な説明と組み合わせ、これらの図面の１以上を参照することによって、より充分に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】実施例６からの生データに対する最良適合モデルのプロットを示す図である。
【図２】最良適合モデルからの残差を示す図である。
【図３】二次、三次、四次、及びシグモイド適合残差の比較を示す図である。
【図４】片側ｔ検定を用いた、最良適合モデルの比較を示す図である。
【図５】Ｌｏｇ１０［ビオチン／ビーズ］（ｘ軸）に対するＬｏｇ１０［生ＲＦＵ］（ｙ軸）のプロットを示す図である。
【図６】Ｌｏｇ１０［ビオチン／ビーズ］（ｘ軸）に対するＬｏｇ１０［較正ＲＦＵ］（ｙ軸）のプロットを示す図である。
【図７】ハイブリダイゼーション対照ビーズについての、Ｌｏｇ１０［分子入力］（ｘ軸）に対するＬｏｇ１０［生ＲＦＵ］（ｙ軸）のプロットを示す図である。
【図８】ハイブリダイゼーション対照ビーズについての、Ｌｏｇ１０［分子入力］（ｘ軸）に対するＬｏｇ１０［較正ＲＦＵ；１ビーズ当たりのビオチン］（ｙ軸）のプロットを示す図である。
【図９】ＲＮＡスパイク試料についての、Ｌｏｇ１０［分子入力］に対するＬｏｇ１０［生ＲＦＵ］のプロットを示す図である。
【図１０】ＲＮＡスパイク試料についての、Ｌｏｇ１０［分子入力］に対するＬｏｇ１０［較正ＲＦＵ；１ビーズ当たりのビオチン］のプロットを示す図である。
【図１１】生データを用いて内在性遺伝子の発現レベルを示す図である。
【図１２】生データを較正するビオチン密度滴定曲線を用いて内在性遺伝子の発現レベルを示す図である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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