(57)【要約】  スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定方法が記載される。スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドは、スキンケア組成物マトリックスから皮膚に強く結合し、そこで安定である。スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドベースの、スキンコンディショナーおよび皮膚着色剤などのペプチドベースの皮膚効果剤について記載される。ペプチドベースのスキンコンディショナーおよび皮膚着色剤は、スキンコンディショニング剤または着色剤に対して直接的にまたは任意選択のスペーサーを介して共役されたスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドよりなる。これらのペプチドベースのスキンコンディショナーおよび着色剤を含んでなるスキンケアおよび皮膚着色製品組成物についても記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを準備し、
ｂ）（ａ）のライブラリーを皮膚試料と接触させ、ここで、皮膚がＤＮＡ会合ペプチドと複合してＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成し、
ｃ）（ｂ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を反応溶液から単離し、
ｄ）（ｃ）の単離されたＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をスキンケア組成物マトリックスと接触させて、ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物を形成せしめ、ここで、スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度であり、
ｅ）（ｄ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をペプチド−皮膚複合体−組成物混合物から単離し、
ｆ）（ｅ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅し、
ｇ）スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをコードする（ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定し、ここで、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定する、
ことを含んでなるスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定方法。
【請求項２】
ステップ（ｅ）の後、
ｉ）ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体のペプチドを溶出剤と接触させ、それによりＤＮＡ会合ペプチドの一部を皮膚から溶出させ、かつＤＮＡ会合ペプチドの一部を複合されたままにし、そして
ｉｉ）（ｉ）の溶出または複合されたＤＮＡ会合ペプチドをステップ（ｆ）および（ｇ）に付す
請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ペプチドをコードするＤＮＡを、
ａ）ポリメラーゼ連鎖反応、および
ｂ）宿主細胞にペプチドをコードするＤＮＡを含んでなるファージを感染させ、かつ宿主細胞を適切な成長培地で成長させること
よりなる群から選択されるプロセスによって増幅する請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ｆ）の増幅されたＤＮＡによってコードされたペプチドを新しい皮膚試料と接触させ、かつステップ（ｂ）〜（ｆ）を１回もしくはそれ以上の回数繰り返す請求項１または２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
ステップ（ｄ）を１回もしくはそれ以上の回数繰り返す請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーをスキンケア組成物マトリックス中に準備し、そして皮膚試料と接触させて、ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成せしめ、ここでスキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーをスキンケア組成物マトリックス中に準備し、そして皮膚試料と接触させて、ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成せしめ、ここでスキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度であり、かつステップ（ｄ）および（ｅ）が場合により削除してもよい請求項１に記載の方法。
【請求項８】
ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーをファージディスプレイ、細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイよりなる群から選択される方法によって創製する請求項１に記載の方法。
【請求項９】
ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを、場合により皮膚試料との接触に先立ちまたはそれと同時に非標的と接触させて、非標的に結合するペプチドが除去してもよい請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約２０％のフルストレングス濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約５０％のフルストレングス濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約７５％のフルストレングス濃度である請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
スキンケア組成物マトリックスが希釈されない請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
溶出剤が、酸、塩基、塩溶液、水、エチレングリコール、ジオキサン、チオシアネート、グアニジンおよび尿素よりなる群から選択される請求項２に記載の方法。
【請求項１５】
スキンケア組成物マトリックスがスキンコンディショニング製品である請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
スキンケア組成物マトリックスがスキンクレンジング製品である請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
ａ）ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを準備し、
ｂ）（ａ）のライブラリーを皮膚試料と接触させ、ここで、皮膚がＤＮＡ会合ペプチドと複合してＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成し、
ｃ）（ｂ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を反応溶液から単離し、
ｄ）（ｃ）の単離されたＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をスキンケア組成物マトリックスと接触させて、ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物を形成せしめ、ここで、スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度であり、
ｅ）（ｄ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をペプチド−皮膚複合体−組成物混合物から単離し、
ｆ）（ｅ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させ、
ｇ）スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをコードする（ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定し、ここで、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定する
ことを含んでなるプロセスによって同定されるスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド。
【請求項１８】
配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、および２７よりなる群から選択されるスキンケア組成物抵抗性の毛髪結合ペプチド。
【請求項１９】
一般構造（ＳＣＰｍ）ｎ−ＢＡ［式中、
ａ）ＳＣＰはスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドであり、
ｂ）ＢＡは効果剤であり、
ｃ）ｍは１〜約１００の範囲であり、そして
ｄ）ｎは１〜約５０，０００の範囲である］
を有するジブロックのペプチドベースの皮膚効果剤。
【請求項２０】
一般構造［（ＳＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＢＡ［式中、
ａ）ＳＣＰはスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドであり、
ｂ）ＢＡは効果剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｘは１〜約１０であり、
ｅ）ｍは１〜約１００の範囲であり、そして
ｆ）ｎは１〜約５０，０００の範囲である］
を有するトリブロックのペプチドベースの皮膚効果剤。
【請求項２１】
効果剤がスキンコンディショニング剤である請求項１９に記載のジブロックのペプチドベースの効果剤。
【請求項２２】
効果剤がスキンコンディショニング剤である請求項２０に記載のトリブロックのペプチドベースの効果剤。
【請求項２３】
効果剤が着色剤である請求項１９に記載のジブロックのペプチドベースの効果剤。
【請求項２４】
効果剤が着色剤である請求項２０に記載のトリブロックのペプチドベースの効果剤。
【請求項２５】
スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが、
ａ）ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを準備し、
ｂ）（ａ）のライブラリーを皮膚試料と接触させ、ここで、皮膚がＤＮＡ会合ペプチドと複合してＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成し、
ｃ）（ｂ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を反応溶液から単離し、
ｄ）（ｃ）の単離されたＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をスキンケア組成物マトリックスと接触させて、ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物を形成せしめ、ここで、スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度であり、
ｅ）（ｄ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をペプチド−皮膚複合体−組成物混合物から単離し、
ｆ）（ｅ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅し、
ｇ）スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをコードする（ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定し、ここで、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定する
ことを含んでなるプロセスによって単離される請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項２６】
スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが約７アミノ酸長〜約２５アミノ酸長である請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項２７】
スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが約１２アミノ酸長〜約２０アミノ酸長である請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項２８】
スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが、
ａ）Ｎ−末端、および
ｂ）Ｃ−末端
よりなる群から選択されるペプチドの少なくとも１つの末端上に少なくとも１つのシステイン残基をさらに含んでなる請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項２９】
スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが、
ａ）Ｎ−末端、および
ｂ）Ｃ−末端
よりなる群から選択されるペプチドの少なくとも１つの末端上に少なくとも１つのリジン残基をさらに含んでなる請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項３０】
スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが、配列番号８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５および２７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有する請求項１９〜２４のいずれか一項に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項３１】
スキンコンディショニング剤が、ポリサリチレート、プロピレングリコール、グリセリン、グリコール酸、乳酸、リンゴ酸、クエン酸、酒石酸、グルカル酸、ガラクタル酸、３−ヒドロキシ吉草酸、サリチル酸、および１，３−プロパンジオールよりなる群から選択される請求項２１または２２に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項３２】
着色剤が、Ｄ＆Ｃレッド２１号、Ｄ＆Ｃレッド２７号、Ｄ＆Ｃレッドオレンジ５号、Ｄ＆Ｃレッド２１号、Ｄ＆Ｃオレンジ１０号、二酸化チタン、酸化亜鉛、Ｄ＆Ｃレッド３６号、Ｄ＆Ｃオレンジ１７号、Ｄ＆Ｃレッド７号、１１号、３１号、３４号のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド１２号のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド１３号のストロンチウムレーキ、ＦＤ＆Ｃイエロー５号のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆Ｃイエロー６号のアルミニウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド２７号のアルミニウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド２１号のアルミニウムレーキ、ＦＤ＆Ｃブルー１号のアルミニウムレーキ、酸化鉄、マンガンバイオレット、酸化クロム、ウルトラマリンブルー、カーボンブラック、ジヒドロキシアセトン、および着色されたミクロスフィアよりなる群から選択される請求項２３または２４に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項３３】
着色されたミクロスフィアが、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、スチレン／ブタジエン共重合体およびラテックスよりなる群から選択される物質を含んでなり、ミクロスフィアが約１０ｎｍ〜約２μｍの直径を有する請求項３２に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項３４】
スペーサーが、エタノールアミン、エチレングリコール、６個の炭素原子鎖長を有するポリエチレン、３〜６個の反復単位を有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル、エチルアルキル鎖、プロピルアルキル鎖、ヘキシルアルキル鎖、ステアリルアルキル鎖、セチルアルキル鎖およびパルミトイルアルキル鎖よりなる群から選択される請求項２０、２２または２４のいずれか一項に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項３５】
スペーサーが、プロリン、リジン、グリシン、アラニン、セリンおよびこれらの混合物よりなる群から選択されるアミノ酸を含んでなるペプチドである請求項２０、２２または２４のいずれか一項に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項３６】
スペーサーが、配列番号１、配列番号５、配列番号６および配列番号７よりなる群から選択されるアミノ酸配列を含んでなるペプチドである請求項２０、２２または２４のいずれか一項に記載のペプチドベースの効果剤。
【請求項３７】
請求項１９または２０に記載のペプチドベースの効果剤の有効量を含んでなるスキンケア製品組成物。
【請求項３８】
請求項２１または２２に記載のペプチドベースの効果剤の有効量を含んでなるスキンコンディショニング製品組成物。
【請求項３９】
請求項２３または２４に記載のペプチドベースの効果剤の有効量を含んでなる皮膚着色製品組成物。
【請求項４０】
請求項２１または２２に記載のペプチドベースの効果剤の有効量を含んでなる皮膚着色製品組成物。
【請求項４１】
請求項２１または２２に記載のペプチドベースの効果剤の有効量を含んでなるスキンクレンジング製品組成物。
【請求項４２】
請求項３８に記載の組成物を皮膚に適用し、そして、保護層を形成させることを含んでなる皮膚上にペプチドベースのコンディショナーの保護層を形成する方法。
【請求項４３】
皮膚を着色させるのに十分な時間、請求項３９に記載の組成物を皮膚に適用することを含んでなる皮膚の着色方法。
【請求項４４】
ａ）ｉ）（ＳＣＰｍ）ｎ−Ｃ、および
ｉｉ）［（ＳＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−Ｃ
［式中、
１）ＳＣＰはスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドであり、
２）Ｃは着色剤であり、
３）ｎは１〜約５０，０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約１００の範囲であり、そして
６）ｘは１〜約１０の範囲である］
よりなる群から選択される皮膚着色剤を含んでなる皮膚着色組成物を準備し、ここで、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが、
Ａ）ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを準備し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを皮膚試料と接触させ、ここで、皮膚がＤＮＡ会合ペプチドと複合してＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を反応溶液から単離し、
Ｄ）（Ｃ）の単離されたＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をスキンケア組成物マトリックスと接触させて、ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物を形成せしめ、ここで、スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度であり、
Ｅ）（Ｄ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をペプチド−皮膚複合体−組成物混合物から単離し、
Ｆ）（Ｅ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅し、
Ｇ）スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをコードする（Ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定し、ここで、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定する
ことを含んでなる方法によって選択され、そして
ｂ）（ａ）の皮膚着色組成物を皮膚に、皮膚着色剤が皮膚に結合するのに十分な時間適用する
ことを含んでなる皮膚の着色方法。
【請求項４５】
ａ）ｉ）（ＳＣＰｍ）ｎ−ＳＣＡ、および
ｉｉ）［（ＳＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＳＣＡ
［式中、
１）ＳＣＰはスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドであり、
２）ＳＣＡはスキンコンディショニング剤であり、
３）ｎは１〜約５０，０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約１００の範囲であり、そして
６）ｘは１〜約１０の範囲である］
よりなる群から選択されるスキンコンディショナーを含んでなるスキンケア組成物を準備し、ここで、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが、
Ａ）ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを準備し、
Ｂ）（Ａ）のライブラリーを皮膚試料と接触させ、ここで、皮膚がＤＮＡ会合ペプチドと複合してＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を反応溶液から単離し、
Ｄ）（Ｃ）の単離されたＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をスキンケア組成物マトリックスと接触させて、ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物を形成せしめ、ここで、スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度であり、
Ｅ）（Ｄ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をペプチド−皮膚複合体−組成物混合物から単離し、
Ｆ）（Ｅ）のＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅し、
Ｇ）スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをコードする（Ｆ）の増幅されたＤＮＡを配列決定し、ここで、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定する
ことを含んでなる方法によって選択し、そして
ｂ）（ａ）のスキンケア組成物を皮膚に適用し、保護層を形成させる
ことを含んでなる皮膚上のペプチドベースのコンディショナーの保護層の形成方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２００５年３月１日出願の米国仮特許出願第６０／６５７，４９４号明細書の利益を主張するものである。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、パーソナルケア製品の分野に関する。より詳細には、本発明は、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定方法ならびにスキンコンディショナーおよび皮膚着色剤などのペプチドベースの皮膚効果剤におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
スキンコンディショナーおよび皮膚着色剤は、よく知られた、頻繁に利用されるスキンケア製品である。現行のスキンコンディショナーおよび皮膚着色剤に伴う主要な問題は、それらにおける長期持続効果に必要な耐久性が不足する点である。これらの組成物の耐久性を改善するため、ペプチドベースのスキンコンディショナー、皮膚着色剤、および他の効果剤が開発されている（ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、同時係属および共有の特許文献１および特許文献２）。ペプチドベースのスキンコンディショナーまたは着色剤は、皮膚に対して高い結合親和性を有する特異的なペプチド配列とコンディショニング剤または着色剤との各共役によって調製される。ペプチド部分は皮膚に結合し、それによりコンディショニング剤または着色剤が強く付着される。ファージディスプレイスクリーニング技術（ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、上記；エステル（Ｅｓｔｅｌｌ）ら、特許文献３；マレイ（Ｍｕｒｒａｙ）ら、特許文献４；ジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら、特許文献５；およびジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）ら、特許文献６）を用い、皮膚に対して高い結合親和性を有するペプチドが同定されている。特許文献３、特許文献４、特許文献５、および特許文献６といった出願では、バスゲルの希薄溶液（すなわち２％水溶液）の存在下でのペプチドライブラリーと皮膚試料との接触、およびファージディスプレイスクリーニングの間での、生成されるファージ−ペプチド−皮膚複合体のバスゲル溶液による洗浄について記載されているが、用いられるバスゲルの濃度は、バスゲル抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定するには低すぎる。
【０００４】
皮膚結合ペプチドは、スキンケア組成物マトリックスの存在下で結合親和性を低下させており、それ故、組成物マトリックスから皮膚に強く結合することはなく、スキンケア製品の適用によって皮膚から洗い流される。さらに、皮膚結合ペプチドは、スキンケア組成物マトリックス中で長期間安定ではなく、それはスキンケア製品組成物中でのそれらの結合親和性の経時的低下の原因である。
【０００５】
シャンプー抵抗性の毛髪結合ペプチド（ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、同時係属および共有の特許文献１、およびオブライエン（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ）ら、同時係属および共有の特許文献７）、マラセチア・フルフル（Ｍａｌａｓｓｅｚｉａ  ｆｕｒｆｕｒ）の細胞表面タンパク質に結合するシャンプー抵抗性の抗体断片（非特許文献１）、ならびに毛髪コンディショナー抵抗性の毛髪結合ペプチド（ワン（Ｗａｎｇ）ら、同時係属および共有の特許文献８）の同定方法については報告されている。しかし、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定方法については記載がなされていない。
【０００６】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００５／０２２６８３９号明細書
【特許文献３】国際公開第０１７９４７９号パンフレット
【特許文献４】米国特許出願公開第２００２／００９８５２４号明細書
【特許文献５】米国特許出願公開第２００３／０１５２９７６号明細書
【特許文献６】国際公開第０４０４８３９９号パンフレット
【特許文献７】米国特許出願第１１／２５１７１５号明細書
【特許文献８】米国仮特許出願第６０／６５７４９６号明細書
【非特許文献１】ドルク（Ｄｏｌｋ）ら、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７１：４４２−４５０頁（２００５年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、解決されるべき課題は、スキンケア組成物マトリックスから皮膚に結合可能であり、かつそこで安定な皮膚結合ペプチドを提供することである。
【０００８】
出願者らは、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定方法を見出すことにより、記載された課題に対処してきた。本発明の方法によって同定されるスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド配列を用いることで、スキンケア組成物マトリックスの存在下での皮膚に対する高い結合親和性およびスキンケア組成物中での改善された安定性を有する、スキンコンディショナーおよび皮膚着色剤などのペプチドベースの皮膚効果剤の調製が可能である。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、結合特性がスキンケア組成物の存在によって影響を受けない皮膚結合ペプチドを同定および単離する方法に関する。本発明のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドは、コンビナトリアルペプチドライブラリーから選別され、かつ、場合によりスペーサーならびに着色剤およびコンディショナーなどの効果剤を含んでなる、ジブロックまたはトリブロック構造のスキンケア組成物中に提供される。
【００１０】
したがって、本発明は、
ａ）ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを準備し、
ｂ）（ａ）の該ライブラリーを皮膚試料と接触させ、ここで、該皮膚が該ＤＮＡ会合ペプチドと複合してＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成し、
ｃ）（ｂ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を該反応溶液から単離し、
ｄ）（ｃ）の該単離されたＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をスキンケア組成物マトリックスと接触させて、ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物を形成せしめ、ここで、該スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度であり、
ｅ）（ｄ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を該ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物から単離し、
ｆ）（ｅ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅し、
ｇ）スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをコードする（ｆ）の該増幅されたＤＮＡを配列決定し、ここで、該スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定する、
ことを含んでなるスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定方法を提供する。
【００１１】
場合により、ステップ（ｅ）の後、皮膚結合ペプチドを、溶出剤で皮膚から溶出させ、かつ、本発明の方法によって同定されたペプチドを、本方法にうまく適用させることにより、さらに精製することが可能である。
【００１２】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを準備し、
ｂ）（ａ）の該ライブラリーを皮膚試料と接触させ、ここで、該皮膚が該ＤＮＡ会合ペプチドと複合してＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成し、
ｃ）（ｂ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を該反応溶液から単離し、
ｄ）（ｃ）の該単離されたＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をスキンケア組成物マトリックスと接触させて、ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物を形成せしめ、ここで、該スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度であり、
ｅ）（ｄ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を該ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物から単離し、
ｆ）（ｅ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅させ、
ｇ）スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをコードする（ｆ）の該増幅されたＤＮＡを配列決定し、ここで、該スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定する
ことを含んでなるプロセスによって同定されるスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、一般構造（ＳＣＰｍ）ｎ−ＢＡ［式中、
ａ）ＳＣＰはスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドであり、
ｂ）ＢＡは効果剤であり、
ｃ）ｍは１〜約１００の範囲であり、そして
ｄ）ｎは１〜約５０，０００の範囲である］
を有するジブロックのペプチドベースの皮膚効果剤を提供する。
【００１４】
同様に、本発明は、一般構造［（ＳＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＢＡ［式中、
ａ）ＳＣＰはスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドであり、
ｂ）ＢＡは効果剤であり、
ｃ）Ｓはスペーサーであり、
ｄ）ｘは１〜約１０であり、
ｅ）ｍは１〜約１００の範囲であり、そして
ｆ）ｎは１〜約５０，０００の範囲である］
を有するトリブロックのペプチドベースの皮膚効果剤を提供する。
【００１５】
別の実施形態では、本発明は、本発明のペプチドベースのスキンコンディショナーの有効量を含んでなるスキンケア製品組成物を提供する。同様に、本発明は、本発明のペプチドベースの皮膚着色剤の有効量を含んでなる皮膚着色製品組成物を提供する。さらに、本発明は、本発明のペプチドベースのスキンコンディショナーの有効量を含んでなるスキンクレンジング製品組成物を提供する。
【００１６】
別の実施形態では、本発明は、本発明の組成物を皮膚に適用し、そして、該保護層を形成させることを含んでなる皮膚上にペプチドベースのコンディショナーの保護層を形成する方法を提供する。同様に、本発明は、本発明の組成物を皮膚に皮膚を着色させるのに十分な時間適用することを含んでなる皮膚の着色方法を提供する。
【００１７】
別の実施形態では、本発明は、
ａ）ｉ）（ＳＣＰｍ）ｎ−Ｃ、および
ｉｉ）［（ＳＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−Ｃ
［式中、
１）ＳＣＰはスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドであり、
２）Ｃは着色剤であり、
３）ｎは１〜約５０，０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約１００の範囲であり、そして
６）ｘは１〜約１０の範囲である］
よりなる群から選択される皮膚着色剤を含んでなる皮膚着色組成物を準備し、ここで、該スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが、
Ａ）ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを準備し、
Ｂ）（ａ）の該ライブラリーを皮膚試料と接触させ、ここで、該皮膚が該ＤＮＡ会合ペプチドと複合してＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を該反応溶液から単離し、
Ｄ）（Ｃ）の該単離されたＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をスキンケア組成物マトリックスと接触させて、プチド−皮膚複合体−組成物混合物を形成せしめ、ここで、該スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度であり、
Ｅ）（Ｄ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を該ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物から単離し、
Ｆ）（Ｅ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅し、
Ｇ）スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをコードする（Ｆ）の該増幅されたＤＮＡを配列決定し、ここで、該スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定する
ことを含んでなる方法によって選択され、そして
ｂ）（ａ）の該皮膚着色組成物を皮膚に、該皮膚着色剤が皮膚に結合するのに十分な時間適用する
ことを含んでなる皮膚の着色方法を提供する。
【００１８】
さらなる実施形態では、本発明は、
ａ）ｉ）（ＳＣＰｍ）ｎ−ＳＣＡ、および
ｉｉ）［（ＳＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＳＣＡ
［式中、
１）ＳＣＰはスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドであり、
２）ＳＣＡはスキンコンディショニング剤であり、
３）ｎは１〜約５０，０００の範囲であり、
４）Ｓはスペーサーであり、
５）ｍは１〜約１００の範囲であり、そして
６）ｘは１〜約１０の範囲である］
よりなる群から選択されるスキンコンディショナーを含んでなるスキンケア組成物を準備し、ここで、該スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが、
Ａ）ＤＮＡ会合ペプチドのコンビナトリアルライブラリーを準備し、
Ｂ）（ａ）の該ライブラリーを皮膚試料と接触させ、ここで、該皮膚が該ＤＮＡ会合ペプチドと複合してＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液を形成し、
Ｃ）（Ｂ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を該反応溶液から単離し、
Ｄ）（Ｃ）の該単離されたＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をスキンケア組成物マトリックスと接触させて、ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物を形成せしめ、ここで、該スキンケア組成物マトリックスの濃度が少なくとも約１０％のフルストレングス濃度であり、
Ｅ）（Ｄ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を該ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物から単離し、
Ｆ）（Ｅ）の該ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体のペプチド部分をコードするＤＮＡを増幅し、
Ｇ）スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをコードする（Ｆ）の該増幅されたＤＮＡを配列決定し、ここで、該スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定する
ことを含んでなる方法によって選択し、そして
ｂ）（ａ）の該スキンケア組成物を皮膚に適用し、該保護層を形成させる
ことを含んでなる皮膚上のペプチドベースのコンディショナーの保護層の形成方法を提供する。
【００１９】
配列記述の簡単な説明
本発明は、本出願の一部を形成する、以下の詳細な説明および添付の配列記述からより十分に理解されうる。
【００２０】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列の開示を含む、特許出願のための要求事項−配列規則（Ｒｅｑｕｉｒｅｍｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｐａｔｅｎｔ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ａｎｄ／ｏｒ  Ａｍｉｎｏ  Ａｃｉｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｉｓｃｌｏｓｕｒｅｓ−ｔｈｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｒｕｌｅｓ）」）に一致し、かつ世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８年）ならびにＥＰＯおよびＰＣＴの配列リストへの要求事項（規則５．２および４９．５（ａ−ｂｉｓ）、ならびに実施細則のセクション２０８および付録Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために用いられる記号および形式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２に示される規則に従う。
【００２１】
配列番号１は、カスパーゼ３切断部位のアミノ酸配列である。
【００２２】
配列番号２は、ファージＤＮＡを配列決定するためのオリゴヌクレオチドプライマーのヌクレオチド配列である。
【００２３】
配列番号３は、実施例４および１５に記載の対照の毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２４】
配列番号４は、実施例４に記載の蛍光標識された毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２５】
配列番号５〜７は、ペプチドスペーサーのアミノ酸配列である。
【００２６】
配列番号８〜２５は、身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２７】
配列番号２６は、実施例１５における対照として用いられる毛髪結合ペプチドのアミノ酸配列である。
【００２８】
配列番号２７は、Ｃ−末端に付加されたシステイン残基を有する、身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドのアミノ酸配列（配列番号２０）である。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２９】
本発明は、スキンケア組成物マトリックスの存在下でヒト皮膚に高親和性で特異的に結合する皮膚結合ペプチドの同定方法を提供する。これらの皮膚結合ペプチドを用いることで、スキンケア組成物マトリックスの存在下での皮膚に対する高い結合親和性およびスキンケア組成物中での改善された安定性を有する、スキンコンディショナーおよび皮膚着色剤などのペプチドベースの皮膚効果剤の調製が可能である。
【００３０】
以下の定義は、本明細書において用いられ、特許請求の範囲および本明細書の解釈において参照されるべきものである。
「ＳＣＰ」はスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを意味する。
「ＢＡ」は皮膚効果剤を意味する。
「ＳＣＡ」はスキンコンディショニング剤を意味する。
「Ｃ」は着色剤を意味する。
「Ｓ」はスペーサーを意味する。
【００３１】
「ペプチド」という用語は、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合によって互いに結合される２個もしくはそれより多数のアミノ酸を示す。
【００３２】
本明細書において用いられる「皮膚」という用語は、ヒト皮膚、またはブタ皮膚のビトロ−スキン（Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ）（登録商標）およびエピダーム（ＥｐｉＤｅｒｍ）（商標）などのヒト皮膚の代替物を示す。
【００３３】
「スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド」という語句は、スキンケア組成物マトリックスから皮膚に強く結合し、かつそこで安定であるペプチドを示す。
【００３４】
「スキンケア組成物マトリックス」という語句は、不希釈または希釈形態の、スキンコンディショナー、スキンクレンザー、メイクアップ、皺取り製品および皮膚着色剤などのスキンケア製品、あるいはスキンケア製品の少なくとも１つの成分、さらにはスキンケア製品の少なくとも２つの成分を含んでなる混合物を含んでなる媒体を示す。スキンケア製品の成分には、オイル、ワックス、ガム、いわゆるペースト状脂肪物質、スキンコンディショニング剤、皮膚着色剤、抗酸化剤、保護剤、充填剤、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢサンスクリーン、香料、増粘剤、浸潤剤ならびに陰イオン性、非イオン性または両性ポリマー、ならびに染料または色素が含まれるがこれらに限定されない。
【００３５】
「フルストレングス濃度」という語句は、成分がスキンケア製品中に存在する場合の成分の濃度を示す。
【００３６】
「効果剤」という用語は、皮膚への適用により化粧または皮膚効果を得るための、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドと共役されうる化合物または物質を示す一般用語である。効果剤は、典型的にはパーソナルケア産業において一般に用いられる他の物質とともに、コンディショナー、着色剤、香料、サンスクリーンなどを含む。
【００３７】
本明細書で用いられる「共役」および「共役される」という用語は、任意の化学結合を示し、かつ共有と非共有の双方の相互作用を含む。
【００３８】
「ペプチド−皮膚複合体」という用語は、ペプチド上の結合部位を介して皮膚に結合されるペプチドを含んでなる構造を意味する。
【００３９】
「ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体」という用語は、ペプチドが同定対象の核酸成分と結合している場合の皮膚とペプチドの間の複合体を示す。典型的には、ＤＮＡ会合ペプチドは、ファージディスプレイなどのディスプレイ系の結果として生成される。この系では、ペプチドはファージの表面上に提示される一方、ペプチドをコードするＤＮＡは、ファージの付着された糖タンパク質コート内に含まれる。ファージ内でのコーディングＤＮＡの結合を用いることで、ペプチドの同定を意図したコーディング領域の増幅を行いやすくなる。
【００４０】
「非標的」という用語はある基質を示し、ここではそれに対する結合親和性を有するペプチドは望ましくない。スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの選択においては、非標的は毛髪およびプラスチックを含むがこれらに限定されない。
【００４１】
「アミノ酸」という用語は、タンパク質またはポリペプチドの塩基性化学構造単位を示す。以下の略語は、特定のアミノ酸を特定するのに本明細書中で用いられる。
【００４２】
【表１】
2008537479.tif 000002
【００４３】
「遺伝子」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）および下流（３’非コーディング配列）の調節配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を示す。「天然遺伝子」は、それ自身の調節配列を有する天然に見出される遺伝子を示す。「キメラ遺伝子」は、天然遺伝子ではない任意の遺伝子を示し、天然に共に見出されることのない調節およびコーディング配列を含んでなる。したがって、キメラ遺伝子は、異なるソース由来の調節配列およびコーディング配列、または同じソース由来であるが天然に見出される様式とは異なる様式で配列された調節配列およびコーディング配列を含んでなる場合がある。「外来」遺伝子は、通常は宿主生物内に見出されることがないが遺伝子転移により宿主生物に導入される遺伝子を示す。外来遺伝子は、非天然生物またはキメラ遺伝子に挿入される天然遺伝子を含んでなる可能性がある。
【００４４】
「合成遺伝子」は、当業者に既知の手順を用いて化学的に合成されるオリゴヌクレオチドビルディングブロックから構築されうる。これらのビルディングブロックは、ライゲートおよびアニールされて遺伝子セグメントが形成され、次いでそれは酵素的に構築されて遺伝子全体が作製される。ＤＮＡ配列に関連して「化学的に合成された」とは、ヌクレオチド成分がインビトロで構築されたことを意味する。手動によるＤＮＡ化学合成が周知の手順を用いて実施される場合がある一方、自動化学合成については多数の市販の機器の１つを用いて実施してもよい。したがって、遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて最適な遺伝子発現に適合させることで、宿主細胞のコドンバイアスを反映させてもよい。もしコドンの使用が宿主にとって好ましいコドン群に向けてバイアスされる場合、当業者は遺伝子発現が成功する可能性について理解している。好ましいコドンについては、配列情報が得られる宿主細胞に由来する遺伝子の調査に基づいて判定されうる。
【００４５】
「コーディング配列」は、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を示す。「適切な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、内部、または下流（３’非コーディング配列）に位置し、かつ関連するコーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、あるいは翻訳に作用するヌクレオチド配列を示す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位およびステムループ構造を含みうる。
【００４６】
「プロモーター」は、コーディング配列または機能的ＲＮＡの発現を制御可能なＤＮＡ配列を示す。一般に、コーディング配列はプロモーター配列に対して３’方向に位置する。プロモーターは、それら全体が天然遺伝子由来であるか、天然に見出される異なるプロモーター由来の異なる要素よりなるか、またはさらに合成ＤＮＡセグメントを含んでなる場合がある。異なるプロモーターが、異なる組織内または細胞型内で、発生の異なる段階で、または異なる環境条件もしくは生理的条件に応答して遺伝子の発現を指示しうることが当業者によって理解されている。ほぼ常に大部分の細胞型内で遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構成的プロモーター」と称される。さらに、ほとんどの場合、調節配列の正確な境界が完全に確定されていないことから、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有する場合があることが認識されている。
【００４７】
本明細書中で用いられる「発現」という用語は、本発明の核酸断片由来のセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定な蓄積を示す。発現はｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を示す場合もある。
【００４８】
「形質転換」という用語は、核酸断片の宿主生物ゲノムへの転移により遺伝的に安定な形質がもたらされることを示す。形質転換された核酸断片を含む宿主生物は、「トランスジェニック」または「組み換え」または「形質転換された」生物と称される。
【００４９】
「宿主細胞」という用語は、外来ポリヌクレオチド配列により形質転換または形質移入されているか、あるいは形質転換または形質移入可能である細胞を示す。
【００５０】
「プラスミド」、「ベクター」および「カセット」という用語は、細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を運搬することが多く、通常は環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である特別な染色体要素を示す。かかる要素は、任意のソース由来の一本鎖もしくは二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの、自己複製配列、ゲノム融合配列、ファージまたはヌクレオチド配列、線形体または環状体である場合があり、ここでは多数のヌクレオチド配列が、適切な３’非翻訳配列を伴う選択された遺伝子産物におけるプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞に導入可能な固有の作製物に連結されるかまたは組み換えられている。「形質転換カセット」は、外来遺伝子を有しかつ特定の宿主細胞の形質転換を促進する外来遺伝子以外の要素を有する特定のベクターを示す。「発現カセット」は、外来遺伝子を有しかつ外来宿主内でのその遺伝子の発現の促進を可能にする外来遺伝子以外の要素を有する特定のベクターを示す。
【００５１】
「ファージ」または「バクテリオファージ」という用語は、細菌に感染するウイルスを示す。本発明の目的にかなうように別の形態が使用される場合がある。好ましいバクテリオファージは、Ｍ１３と称される「野生型」ファージ由来である。Ｍ１３系は細菌内部で成長可能であることから、それが感染する細胞を破壊することはないが新たなファージを連続的に作る原因になる。それは一本鎖ＤＮＡファージである。
【００５２】
「ファージディスプレイ」という用語は、バクテリオファージ粒子またはファージミド粒子の表面上の機能的な外来ペプチドまたは小タンパク質の提示を示す。遺伝子組み換えファージは、ペプチドをそれらの天然表面タンパク質のセグメントとして提示するのに使用されうる。異なる遺伝子配列を有するファージ集団により、ペプチドライブラリーが創製されうる。
【００５３】
「ＰＣＲ」または「ポリメラーゼ連鎖反応」は、特定のＤＮＡセグメントの増幅において用いられる技術である（米国特許第４，６８３，１９５号明細書および米国特許第４，８００，１５９号明細書）。
【００５４】
本明細書中で用いられる標準の組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サンブルック  Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．）、フリッツ  Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス  Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、第２版、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９８９年）（以下、「マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）」）；およびシルハヴィ  Ｔ．Ｊ．（Ｓｉｌｈａｖｙ  Ｔ．Ｊ．）、ベナン  Ｍ．Ｌ．（Ｂｅｎｎａｎ  Ｍ．Ｌ．）およびエンキスト  Ｌ．Ｗ．（Ｅｎｑｕｉｓｔ  Ｌ．Ｗ．）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（ＮＹ）（１９８４年）；およびアウスベル  Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）（１９８７年）による出版）に記載されている。
【００５５】
本発明は、スキンケア組成物マトリックスの存在下で高親和性で皮膚に特異的に結合するスキンケア組成物抵抗性のペプチド配列の同定方法を提供する。方法は、皮膚がコンビナトリアルに生成されたペプチドのライブラリーと接触される、標準のバイオパニング技術を改良したものである。次いで、生成されたＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体がスキンケア組成物マトリックスとある時間接触される。ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体は、単離され、溶出剤との接触により、溶出されたＤＮＡ会合ペプチドと皮膚に結合されたままのＤＮＡ会合ペプチドが得られる。溶出されたＤＮＡ会合ペプチドおよび／または残存する結合されたＤＮＡ会合ペプチドは、増幅および同定される。同定されたスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド配列を用い、スキンコンディショナーおよび皮膚着色剤などのペプチドベースの皮膚効果剤を作製することが可能である。
【００５６】
スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定
本明細書において定義されたスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド（ＳＣＰ）は、スキンケア組成物マトリックスから皮膚に特異的に結合しかつそこで安定なペプチド配列である。本発明のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドは、約７アミノ酸長〜約４５アミノ酸長、より好ましくは約７アミノ酸長〜約２５アミノ酸長、最も好ましくは約１２〜約２０アミノ酸長である。本発明のペプチドは、ランダムに生成され、次いで、下記のように、スキンケア組成物マトリックスの存在下でのその皮膚に対する結合親和性に基づき、皮膚試料に対して選択される。
【００５７】
ペプチドのランダムライブラリーの創製は、周知であり、細菌ディスプレイ（ケンプ  Ｄ．Ｊ．（Ｋｅｍｐ  Ｄ．Ｊ．）；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７８（７）：４５２０−４５２４頁（１９８１年）、およびヘルフマン（Ｈｅｌｆｍａｎ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０（１）：３１−３５頁（１９８３年））、酵母ディスプレイ（キエン（Ｃｈｉｅｎ）ら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８（２１）：９５７８−８２頁（１９９１年））、コンビナトリアル固体相ペプチド合成（米国特許第５，４４９，７５４号明細書、米国特許第５，４８０，９７１号明細書、米国特許第５，５８５，２７５号明細書、米国特許第５，６３９，６０３号明細書）、ならびにファージディスプレイ技術（米国特許第５，２２３，４０９号明細書、米国特許第５，４０３，４８４号明細書、米国特許第５，５７１，６９８号明細書、米国特許第５，８３７，５００号明細書）を含む種々の技術によって実施可能である。かかる生体ペプチドライブラリーを創製するための技術は、当該技術分野で周知である。典型的な方法は、ダニ  Ｍ．Ｊ．（Ｄａｎｉ  Ｍ．Ｊ．）、Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＆  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  Ｒｅｓ．、２１（４）：４４７−４６８頁（２００１年）、シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：３３３−３６３頁（２０００年）、およびＰｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、ブライアン  Ｋ．ケイ（Ｂｒｉａｎ  Ｋ．Ｋａｙ）、ジル・ウインター（Ｊｉｌｌ  Ｗｉｎｔｅｒ）、およびジョン・マッカファーティ（ＪｏｈｎＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ）編；アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（ＮＹ）、１９９６年において記載されている。さらに、ファージディスプレイライブラリーは、ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｂｉｏｌａｂｓ）（ビバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））などの商用ソースから購入可能である。
【００５８】
一実施形態では、いくつかの様式でペプチドに結合したペプチドをコードするＤＮＡを有することは特に有用である。この結合により、スクリーニングまたはバイオパニングプロセスにおいて結合ペプチドを迅速に同定しやすくなる。同定を容易にするため、コーディングＤＮＡをＰＣＲ増幅するかまたは複製宿主への感染に用い、ペプチドの発現を高めることが可能である。典型的には、ＤＮＡ会合ペプチドは、上で参照されたファージディスプレイ、細菌ディスプレイおよび酵母ディスプレイの方法によって生成される。
【００５９】
ペプチドをランダムに生成するための好ましい方法は、ファージディスプレイによるものである。ファージディスプレイは、インビトロ選択技術であり、ここではペプチドまたはタンパク質がバクテリオファージのコートタンパク質に遺伝的に融合されて、ファージウイルス粒子の外表面上に融合ペプチドの提示がなされる一方、融合体をコードするＤＮＡはウイルス粒子内に存在する。提示されたペプチドとそれをコードするＤＮＡの間のこの物理的な連結により、膨大な数で各々が対応するＤＮＡ配列に連結されたペプチドの変異体のスクリーニングが「バイオパニング（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）」と称される単純なインビトロ選択手順により可能になる。バイオパニングは、その最も単純な形態では、ファージディスプレイが施された変異体のプールを目的の標的とともにインキュベートし、非結合ファージを洗い流し、かつファージと標的の間の結合相互作用の妨害によって特異的に結合されたファージを溶出させることによって実施される。次いで、溶出されたファージがインビボで増幅されかつプロセスが繰り返されて、最も緊密な結合配列を支持するファージプールの段階的濃縮がもたらされる。選択／増幅を３回以上行った後、各クローンがＤＮＡ配列決定により特徴づけられる。
【００６０】
本発明のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドは、ファージディスプレイを用い、皮膚組成物マトリックスの存在下でのその皮膚に対する結合親和性に基づいて皮膚試料に対してファージペプチドを選択することによって同定されうる。皮膚およびファージペプチドを様々な方法で皮膚組成物マトリックスと接触させることで、下記に詳細に記載されるようにペプチド−皮膚複合体−組成物混合物の形成が可能である。例えば、ファージペプチドライブラリーは、皮膚組成物マトリックス中に溶解可能であり、次いで皮膚試料と接触される。あるいは、ファージ−ペプチド−皮膚複合体は、皮膚試料とファージディスプレイライブラリーとの接触によって形成され、続いて皮膚組成物マトリックスと接触されうる。さらに、これらの皮膚組成物マトリックスとの接触方法の任意の組み合わせが用いられうる。
【００６１】
ＤＮＡ会合ペプチドの適切なライブラリーが創製されるかまたは商用サプライヤから購入された後、ライブラリーは適量の皮膚試料と接触されてＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を含んでなる反応溶液が形成される。ヒト皮膚試料は、死体からまたはインビトロでヒト皮膚の培養物から入手されうる。さらに、ブタ皮膚のビトロ−スキン（Ｖｉｔｒｏ−Ｓｋｉｎ）（登録商標）（ＩＭＳ社（ＩＭＳ  Ｉｎｃ．）、ミルフォード（Ｍｉｌｆｏｒｄ）、コネチカット州（ＣＴ）から入手可能）およびエピダーム（ＥｐｉＤｅｒｍ）（商標）（マテック社（ＭａｔＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．）、アシュランド（Ａｓｈｌａｎｄ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）から入手可能）は、ヒト皮膚の代用物として使用される場合がある。ＤＮＡ会合ペプチドのライブラリーは、皮膚試料と接触するための適切な溶液中に溶解される。一実施形態では、ペプチドライブラリーは、界面活性剤を含有する緩衝生理食塩水溶液中に溶解される。適切な溶液は０．５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０を有するトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）である。別の実施形態では、ペプチドライブラリーは、スキンケア組成物マトリックス中に溶解され（下記参照）、皮膚試料と接触される。ペプチドの皮膚表面への物質移動速度を高めるために、溶液が任意の手段によって撹拌されることにより、最大の結合を得るのに必要な時間が短縮されうる。最大の結合を得るのに必要な時間は、皮膚試料の大きさ、ペプチドライブラリーの濃度、および撹拌速度などの多数の因子に依存して変化する。必要な時間は、当業者により、通常の実験を用いて容易に決定されうる。典型的には、接触時間は１分から１時間である。場合により、ペプチドライブラリーを、皮膚試料との接触に先立ちまたはそれと同時に、毛髪またはプラスチックなどの非標的と接触させることで、非標的に結合する望ましくないＤＮＡ会合ペプチドを除去することが可能である。
【００６２】
多数のランダムに創製されたペプチドは、皮膚試料との接触時に皮膚に結合してＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体を形成する。多数のペプチドは複合体が形成されないままであり、かつ皮膚試料の一部も結合されない。複合体を形成していないペプチドは、場合によりトリス−ＨＣｌ、トリス緩衝生理食塩水、トリス−ホウ酸塩、トリス−酢酸、トリエチルアミン、リン酸塩緩衝液、およびグリシン−ＨＣｌなど（ここではトリス緩衝生理食塩水が好ましい）の任意の適切な緩衝溶液を用いて洗浄することにより除去されうる。洗浄溶液は、ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）、ＤＯＣ（デオキシコール酸ナトリウム）、ノニデット（Ｎｏｎｉｄｅｔ）Ｐ−４０、トリトン（Ｔｒｉｔｏｎ）Ｘ−１００、および０．５％の濃度が好ましいトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０などの界面活性剤も含有しうる。洗浄ステップは、１つもしくはそれ以上の回数繰り返される場合がある。
【００６３】
複合体を形成していない物質の除去後、ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体をある時間、典型的には約１分〜約３０分間、スキンケア組成物マトリックスと接触させることで、ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物が形成される。本明細書にて用いられるスキンケア組成物マトリックスは、スキンコンディショナー、スキンクレンザー、メイクアップ、皺取り製品および皮膚着色剤などのスキンケア製品を、不希釈または希釈形態で、あるいはスキンケア製品の少なくとも１つの成分、さらにスキンケア製品の少なくとも２つの成分を含んでなる混合物を含んでなる媒体を示す。適切なスキンケア製品組成物は、当該技術分野で周知である。スキンケア組成物は、米国特許第６，２８０，７４７号明細書でフィリップ（Ｐｈｉｌｉｐｐｅ）らによって記載されている。例えば、スキンケア組成物は、一般に組成物の総重量に対して約１０〜約９０％重量の割合で脂肪物質を含有する無水組成物である場合があり、ここで脂肪相は少なくとも１つの液体、固体または半固体の脂肪物質を含有する。脂肪物質は、オイル、ワックス、ガム、およびいわゆるペースト状脂肪物質を含むがこれらに限定されない。あるいは、組成物は、水中油または油中水エマルジョンなどの安定な分散形態でありうる。さらに、組成物は、スキンコンディショニング剤（例えば下記参照）、皮膚着色剤（例えば下記参照）、抗酸化剤、保護剤、充填剤、界面活性剤、ＵＶＡおよび／またはＵＶＢサンスクリーン、香料、増粘剤、浸潤剤、ならびに陰イオン性、非イオン性または両性ポリマー、ならびに染料または色素を含むがこれらに限定されない、１つもしくはそれ以上の従来の化粧用または皮膚用の添加剤または補助剤を含みうる。ロレアル（Ｌ’Ｏｒｅａｌ）、ニュートロジーナ（Ｎｅｕｔｒｏｇｅｎａ）、プロクター・アンド・ギャンブル（Ｐｒｏｃｔｏｒ  ａｎｄ  Ｇａｍｂｌｅ）、ユニリーバ（Ｕｎｉｌｅｖｅｒ）、およびジョンソン・アンド・ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ）などの企業から市販されているスキンケア製品が使用されうる。これらのスキンケア製品は、地方のスーパーマーケットおよび薬局で購入されうる。好ましくは、最終的にスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドが使用されることになるスキンケア組成物マトリックスは、本方法において使用される。スキンケア組成物マトリックスは、希釈されずに使用されうるか、あるいは特に極めて粘性の高い組成物の場合には希釈されてその適用が容易になりうる。スキンケア組成物は、水で希釈されるか、または上記を例とする適切な緩衝溶液が使用される場合がある。スキンケア組成物マトリックスの濃度は、フルストレングス濃度の、少なくとも約１０％、好ましくは少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７５％である。最も好ましくは、スキンケア組成物マトリックスは不希釈形態で使用される。場合により、ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体は、スキンケア組成物マトリックスと１回もしくはそれ以上の回数接触されうる。
【００６４】
一実施形態では、スキンケア組成物マトリックスは、スキンコンディショニング製品を含んでなる。別の実施形態では、スキンケア組成物マトリックスは、スキンクレンジング製品を含んでなる。
【００６５】
ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体は、ペプチド−皮膚複合体−組成物混合物から単離され、場合により、上記のように緩衝溶液を使用して１回もしくはそれ以上の回数洗浄される。スキンケア組成物マトリックスは、洗浄溶液として使用される場合もある。次いで、ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体が、ある時間、典型的には１〜３０分間、溶出剤と接触されて、皮膚からＤＮＡ会合ペプチドが解離するが、ＤＮＡ会合ペプチドの一部は、この処理後、依然として皮膚に結合されたままでありうる。場合により、ＤＮＡ会合ペプチド−皮膚複合体は、溶出剤と接触する前に新しい容器に移される。溶出剤は、酸（ｐＨ１．５〜３．０）；塩基（ｐＨ１０〜１２．５）；ＭｇＣｌ２（３〜５Ｍ）およびＬｉＣｌ（５〜１０Ｍ）などの高塩濃度；水；エチレングリコール（２５〜５０％）；ジオキサン（５〜２０％）；チオシアン酸塩（１〜５Ｍ）；グアニジン（２〜５Ｍ）；および尿素（２〜８Ｍ）（ここでは酸による処理が好ましい）を含むがこれらに限定されない任意の既知の溶出剤でありうる。もし使用される溶出緩衝液が酸または塩基である場合、溶出ステップ後、中性緩衝液が添加されてｐＨが中性範囲に調節される。任意の適切な緩衝液の使用が可能であり、酸溶出緩衝液を伴う使用については１Ｍ  トリス−ＨＣｌ  ｐＨ９．２が好ましい。
【００６６】
次いで、溶出されたペプチドまたは残存する結合されたペプチドをコードするＤＮＡ、あるいは溶出されたペプチドと残存する結合されたペプチドの双方をコードするＤＮＡは、当該技術分野で既知の方法を用いて増幅される。例えば、溶出されたペプチドおよび残存する結合されたペプチドをコードするＤＮＡは、ファン（Ｈｕａｎｇ）ら（同時係属および共有の米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書、参照により本明細書中に援用）に記載のように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＥＲ２７３８などの細菌宿主細胞に所望のペプチドをコードするＤＮＡを感染させることによって増幅されうる。感染された宿主細胞はＬＢ（ルリア−ベルターニ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ））培地などの適切な成長培地内で成長され、この培養物はＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）およびＳ−Ｇａｌ（商標）（３，４−シクロヘキセノエスクレチン−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）を有するＬＢ培地などの適切な成長培地を含む寒天上に広げられる。成長後、ＤＮＡの単離および配列決定のためにプラークが採取され、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド配列が同定される。あるいは、溶出されたペプチドおよび残存する結合されたペプチドをコードするＤＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの核酸増幅方法を用いて増幅されうる。そのアプローチにおけるＰＣＲは、参照により本明細書中に援用される米国特許出願公開第２００３／０１５２９７６号明細書中でのジャンセン（Ｊａｎｓｓｅｎ）らによる記載のように、溶出されたペプチドおよび／または残存する結合されたペプチドをコードするＤＮＡ上で適切なプライマーを用いて行われる。
【００６７】
一実施形態では、溶出されたペプチドおよび残存する結合されたペプチドをコードするＤＮＡは細菌宿主細胞に感染させることによって増幅され、増幅されたＤＮＡ会合ペプチドは新しい皮膚試料に接触され、上記のプロセス全体が１回もしくはそれ以上の回数繰り返されてスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ＤＮＡ会合ペプチド内に濃縮された集団が得られる。バイオパニングサイクルを所望の回数行った後、増幅されたＤＮＡ配列が当該技術分野で周知の標準のＤＮＡ配列決定技術を用いて決定されて、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド配列が同定される。
【００６８】
スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの生成
本発明のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドは、当該技術分野で周知の標準のペプチド合成方法（例えば、スチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、ピアース・ケミカル社（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ）、１９８４年；ボダンスズキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、シュプリンガー・フェアラーク（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、１９８４年；およびペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、トトワ（Ｔｏｔｏｗａ）、ニュージャージー州（ＮＪ）、１９９４年を参照）を用いて調製されうる。さらに、多数の企業がカスタムペプチド合成サービスを提供している。
【００６９】
あるいは、本発明のペプチドは、組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を用いて調製されうる。異種宿主細胞内、特に微生物宿主細胞内で皮膚結合ペプチドをコードする遺伝子が生成されうる。
【００７０】
本発明の結合ペプチドの発現において好ましい異種宿主細胞は、真菌または細菌のファミリー内で幅広く見出される可能性があり、かつ温度、ｐＨ値、および溶媒耐性の広範囲にわたり成長する微生物宿主である。転写、翻訳、およびそのタンパク質生合成装置は細胞供給原料（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆｅｅｄｓｔｏｃｋ）に関係なく同じであることから、細胞バイオマスを生成するのに用いられる炭素供給原料に関係なく機能的遺伝子が発現される。宿主株の例として、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ハンセヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）などの真菌種または酵母種、またはサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、アシネトバクター（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、ロードコッカス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ）、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、エスケリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、メチロモナス（Ｍｅｔｈｙｌｏｍｏｎａｓ）、メチロバクター（Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、アルカリゲネス（Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ）、シネコシスティス（Ｓｙｎｅｃｈｏｃｙｓｔｉｓ）、アナバエナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、チオバチルス（Ｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ）、メタノバクテリウム（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）およびクレブシエラ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）などの細菌種が挙げられるがこれらに限定されない。
【００７１】
種々の発現系を用いることで、本発明のペプチドを生成してもよい。かかるベクターは、染色体、エピソームおよびウイルス由来ベクター、例えば、細菌プラスミド由来ベクター、バクテリオファージ由来ベクター、トランスポゾン由来ベクター、挿入要素由来ベクター、酵母エピソーム由来ベクター、バキュロウイルス、レトロウイルスなどのウイルス由来ベクター、ならびにコスミドやファージミドなど、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素に由来するものなどのそれらの組み合わせに由来するベクターを含むがこれらに限定されない。発現系コンストラクトは、発現を調節するとともに引き起こす調節領域を含む場合がある。一般に、宿主細胞内でのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの維持、増殖または発現に適する任意の系またはベクターは、これに関連する発現のために使用される場合がある。微生物の発現系および発現ベクターは、宿主細胞の成長との関連において外来タンパク質の高レベルの発現を指示する調節配列を含む。調節配列は当業者に周知であり、例として、例えばエンハンサー配列といったベクター内の調節因子の存在を含む、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子発現のオンまたはオフを誘発するものが挙げられるがこれらに限定されない。これらのいずれかを用いるならば、本発明の結合ペプチドのいずれかを生成するためのキメラ遺伝子の作製が可能である。次いで、これらのキメラ遺伝子が形質転換を介して適切な微生物に導入されるならば、ペプチドの高レベルの発現が可能である。
【００７２】
適切な宿主細胞の形質転換にとって有用なベクターまたはカセットは、当該技術分野で周知である。典型的には、ベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を指示する配列、１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカー、および自律的複製または染色体の統合を可能にする配列を含んでなる。適切なベクターは、転写開始制御を内在させる遺伝子の領域５’および転写終結を制御するＤＮＡ断片の領域３’を含んでなる。それは、両方の制御領域が形質転換された宿主細胞に対して相同な遺伝子由来である場合に最も好ましいが、かかる制御領域が生成宿主として選択される特定の種に対して天然の遺伝子由来である必要がないものと理解されるべきである。選択可能なマーカー遺伝子は、大腸菌におけるテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性など、形質転換された宿主細胞の選択における表現型形質をもたらす。
【００７３】
所望の宿主細胞内でのキメラ遺伝子の発現を駆動するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数存在し、当業者にとって周知である。遺伝子を駆動可能な事実上任意のプロモーターは、本発明の結合ペプチドの生成に適し、ＣＹＣ１、ＨＩＳ３、ＧＡＬ１、ＧＡＬ１０、ＡＤＨ１、ＰＧＫ、ＰＨＯ５、ＧＡＰＤＨ、ＡＤＣ１、ＴＲＰ１、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＥＮＯ、ＴＰＩ（サッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）における発現に有用）；ＡＯＸ１（ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）における発現に有用）；ｌａｃ、ａｒａ、ｔｅｔ、ｔｒｐ、ｌＰＬ、ｌＰＲ、Ｔ７、ｔａｃおよびｔｒｃ（大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）における発現に有用）；ならびにバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）における発現に有用なａｍｙ、ａｐｒ、ｎｐｒプロモーターおよび様々なファージプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【００７４】
終結制御領域はまた、好ましい宿主に対して天然の様々な遺伝子に由来する場合がある。場合により、終結部位は不要である場合があるが、もしそれが含まれるとしたら最も好ましい。
【００７５】
上記の適切なＤＮＡ配列を含むベクターおよび適切なプロモーターまたは制御配列を用いることで、適切な宿主を形質転換して宿主における本発明のペプチドの発現を可能にする場合がある。さらに細胞を伴わない翻訳系を用い、本発明のＤＮＡコンストラクト由来のＲＮＡを用いてかかるペプチドを生成してもよい。場合により、形質転換された宿主の分泌産物として本発明の遺伝子産物を生成することが望ましいかもしれない。所望のタンパク質の成長培地への分泌は、精製手順における簡素化およびそのコスト低減という利点を有する。分泌シグナル配列が細胞膜を横切る発現可能なタンパク質の能動輸送の促進に有用な場合が多いことは、当該技術分野で周知である。分泌可能な形質転換された宿主の構築は、生成宿主内で機能的な分泌シグナルをコードするＤＮＡ配列の取り込みによって行われる場合がある。適切なシグナル配列を選択するための方法は、当該技術分野で周知である（例えば、欧州特許第５４６０４９号明細書および国際公開第９３２４６３１号パンフレットを参照）。分泌シグナルＤＮＡまたは促進因子（ｆａｃｉｌｉｔａｔｏｒ）は、発現を制御するＤＮＡとインスタント遺伝子または遺伝子断片との間、および後者を有する同じリーディングフレーム内に位置する場合がある。
【００７６】
ペプチドベースの皮膚効果剤
本発明のペプチドベースの皮膚効果剤は、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド（ＳＣＰ）とコンディショナー、着色剤、香料、サンスクリーンなどの効果剤（ＢＡ）との共役によって形成される。ペプチドベースの効果剤のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド部分がスキンケア組成物マトリックスから皮膚に強く結合することから、皮膚に付着された効果剤における長期持続効果が保持される。スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドと効果剤との共役相互作用は、共有結合または非共有相互作用であり、下記のように任意選択のスペーサーによるものである場合がある。
【００７７】
ファン（Ｈｕａｎｇ）ら（同時係属および共有の米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書）で記載のように、複数のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドと効果剤とを共役させてペプチドベースの効果剤と皮膚との間の相互作用を高めることが望ましい場合もある。単一のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド配列の複数のコピーと効果剤とを共役させるか、あるいは２つもしくはそれ以上のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド配列を直接的にまたはスペーサーを介して共に連結させ、かつ生成される複数のコピーの皮膚結合配列と効果剤とを共役させることにより、これは実施されうる。さらに、複数のコピーのスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド配列の複数のコピーが効果剤に共役されうる。すべてのこれらのペプチドベースの皮膚効果剤では、同じスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの複数のコピーまたは異なるスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの組み合わせの使用が可能である。
【００７８】
本発明の一実施形態では、ペプチドベースの効果剤は、一般構造（ＳＣＰｍ）ｎ−ＢＡ（式中、ｍは１〜約１００、好ましくは１〜約１０の範囲である）を有する、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド（ＳＣＰ）および効果剤（ＢＡ）よりなるジブロック組成物である。効果剤が分子種である場合、ｎは１〜約１００、好ましくは１〜約１０の範囲である。効果剤が色素などの粒子である場合、ｎは１〜約５０，０００、好ましくは１〜約１０，０００の範囲である。
【００７９】
別の実施形態では、ペプチドベースの効果剤は、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを効果剤から分離するスペーサー（Ｓ）を有する。スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの複数のコピーは、単一のスペーサー分子と共役されうる。あるいは、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドの複数のコピーは、様々なスペーサーによって分離されうる。この実施形態では、ペプチドベースの効果剤は、一般構造［（ＳＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＢＡ（式中、ｘは１〜約１０の範囲であり、好ましくはｘは１であり、かつｍは１〜約１００、好ましくは１〜約１０の範囲である）を有する、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド、スペーサー、および効果剤よりなるトリブロック組成物である。効果剤が染料または非粒子状コンディショニング剤などの分子種である場合、ｎは１〜約１００、好ましくは１〜約１０の範囲である。効果剤が色素などの粒子である場合、ｎは１〜約５０，０００、好ましくは１〜約１０，０００の範囲である。
【００８０】
本明細書で用いられるＳＣＰは総称であり、単一のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド配列に言及することを意味するものではないことが理解されるべきである。上で用いられるｍ、ｎまたはｘが１より大きい場合、一連の異なる配列の皮膚結合ペプチドが組成物の一部を形成しうる場合の状況を設けることは本発明の範囲内で十分になされる。さらに、Ｓは総称であり、単一のスペーサーに言及することを意味するものではない。トリブロック組成物において上で用いられるｍおよびｎが１より大きい場合、一連の異なるスペーサーが組成物の一部を形成しうる場合の状況を設けることは本発明の範囲内で十分になされる。これらの構造がペプチド、効果剤、および任意選択のスペーサーの間の共有結合を必ずしも示さないことも理解されるべきである。下記のように、ペプチド、効果剤、および任意選択のスペーサーの間の共役相互作用は、共有的または非共有的でありうる。
【００８１】
本発明のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドベースの効果剤の調製については、スキンコンディショナーおよび皮膚着色剤に対して下記に記載される。これらの方法が他の効果剤に適用される場合があり、かつこれらの他のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドベースの効果剤が本発明の範囲内にあることが理解されるべきである。
【００８２】
ペプチドベースのスキンコンディショナー
本発明のペプチドベースのスキンコンディショナーは、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド（ＳＣＰ）とスキンコンディショニング剤（ＳＣＡ）との共役によって形成される。コンディショナーのスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド部分がスキンケア組成物マトリックスから皮膚に強く結合することから、皮膚に付着されたコンディショニング剤における長期持続性のコンディショニング効果が保持される。スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドは、上記方法を用いて同定される。
【００８３】
本明細書にて定義されたスキンコンディショニング剤は、皮膚を引き締めるアストリンゼント；死滅した皮膚細胞を除去するエクスフォリアン（ｅｘｆｏｌｉａｎｔｓ）；滑らかで柔らかくしなやかな外観の維持を助ける皮膚軟化剤；皮膚の最上層における含水量を増加させる保湿剤；水の皮膚表面からの蒸発を遅らせる閉塞剤（ｏｃｃｌｕｓｉｖｅｓ）；健康増進剤、ならびに乾燥もしくは損傷した皮膚の外観を良くするか、または剥離を少なくしかつ柔軟性を回復させる多種多様な化合物を含むがこれらに限定されない。本発明のペプチドベースのスキンコンディショナーでは、任意の適切な既知のスキンコンディショニング剤が使用されうる。スキンコンディショニング剤は、例えば、参照により本明細書中に援用されるグリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら（国際公開第０１０７００９号パンフレット）を参照しても当該技術分野で周知であり、様々なソースから市販されている。スキンコンディショニング剤の適切な例として、α−ヒドロキシ酸、β−ヒドロキシ酸、ポリオール、ヒアルロン酸、Ｄ，Ｌ−パンテノール、ポリサリチレート（ｐｏｌｙｓａｌｉｃｙｌａｔｅｓ）、ビタミンＡパルミテート、ビタミンＥアセテート、グリセリン、ソルビトール、シリコーン、シリコーン誘導体、ラノリン、天然油、中性脂肪エステル、γアミノ酪酸、ヒト成長ホルモン放出ホルモンなどのホルモン、およびインスリン様成長因子−Ｉが挙げられるがこれらに限定されない。本発明の好ましいスキンコンディショニング剤は、ポリサリチレート、プロピレングリコール（ＣＡＳ番号５７−５５−６、ダウ・ケミカル（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ）、ミッドランド（Ｍｉｄｌａｎｄ）、ミシガン州（ＭＩ））、グリセリン（ＣＡＳ番号５６−８１−５、プロクター・アンド・ギャンブル社（Ｐｒｏｃｔｏｒ＆Ｇａｍｂｌｅ  Ｃｏ．）、シンシナティ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ）、オハイオ州（ＯＨ））、グリコール酸（ＣＡＳ番号７９−１４−１、デュポン社（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．）、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、デラウェア州（ＤＥ））、乳酸（ＣＡＳ番号５０−２１−５、アルファ・エイサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ）、ワードヒル（Ｗａｒｄ  Ｈｉｌｌ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））、リンゴ酸（ＣＡＳ番号６１７−４８−１、アルファ・エイサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ））、クエン酸（ＣＡＳ番号７７−９２−９、アルファ・エイサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ））、酒石酸（ＣＡＳ  ＮＯ．１３３−３７−９、アルファ・エイサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ））、グルカル酸（ＣＡＳ番号８７−７３−０）、ガラクタル酸（ＣＡＳ番号５２６−９９−８）、３−ヒドロキシ吉草酸（ＣＡＳ番号１０２３７−７７−１）、サリチル酸（ＣＡＳ番号６９−７２−７、アルファ・エイサー（Ａｌｆａ  Ａｅｓａｒ））、および１，３−プロパンジオール（ＣＡＳ番号５０４−６３−２、デュポン社（ＤｕＰｏｎｔ  Ｃｏ．）、ウィルミントン（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ）、デラウェア州（ＤＥ））である。ポリサリチレートは、参照により本明細書中に援用される米国特許第４，８５５，４８３号明細書にてホワイト（Ｗｈｉｔｅ）らにより記載された方法によって調製されうる。グルカル酸は、メルボウ（Ｍｅｒｂｏｕｈ）ら（��ａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．３３６：７５−７８頁（２００１年）により記載の方法を用いて合成されうる。３−ヒドロキシ吉草酸は、国際公開第０２／０１２５３０号パンフレットでのブラムッチ（Ｂｒａｍｕｃｃｉ）による記載のように調製されうる。
【００８４】
本発明のペプチドベースのスキンコンディショナーは、特定のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドとスキンコンディショニング剤との直接的なまたは任意選択のスペーサーを介した共役によって調製される。共役相互作用は、共有結合、あるいは水素結合、静電相互作用、疎水性相互作用、またはファンデルワールス相互作用などの非共有相互作用でありうる。非共有相互作用の場合、ペプチドベースのスキンコンディショナーは、ペプチドとコンディショニング剤および任意選択のスペーサー（もし必要な場合）との混合ならびに相互作用が生じるための十分な時間を許容することによって調製される。結合していない物質は、ゲル透過クロマトグラフィーを例とする当該技術分野で既知の方法を用い、生成されたペプチドベースのスキンコンディショナーの付加物から分離されうる。
【００８５】
本発明のペプチドベースのスキンコンディショナーは、ファン（Ｈｕａｎｇ）ら（同時係属および共有の米国特許出願公開第２００５／００５０６５６号明細書）によって記載のように、特定のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをスキンコンディショニング剤に直接にまたはスペーサーを介して共有結合させることによっても調製されうる。任意の適切な既知のペプチドまたはタンパク質の化学抱合体（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を用い、本発明のペプチドベースのスキンコンディショナーを形成することが可能である。化学抱合体は当該技術分野で周知である（例えば、ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９６年）を参照）。適切なカップリング剤は、ペプチド上の末端アミン基および／またはカルボン酸基、およびスルフヒドリル基、ならびにスキンコンディショニング剤上のアミン基、カルボン酸基またはアルコール基に対して反応性を示す、カルボジイミドカップリング剤、塩化酸、イソシアネート、エポキシド、マレイミド、および他の官能性カップリング試薬を含むがこれらに限定されない。さらに、ペプチド上の反応性アミン基またはカルボン酸基を保護し、ペプチドベースのスキンコンディショナーにおいて所望の構造を作製することが必要な場合がある。ｔ−ブチロキシカルボニル（ｔ−Ｂｏｃ）など、アミノ酸における保護基の使用は、当該技術分野で周知である（例えばスチュワート（Ｓｔｅｗａｒｔ）ら、上記；ボダンスズキー（Ｂｏｄａｎｓｚｋｙ）、上記；およびペニントン（Ｐｅｎｎｉｎｇｔｏｎ）ら、上記を参照）。場合により、皮膚結合ペプチドに対する共役のため、カルボン酸基、アルコール基、アミン基、イソシアネート基またはアルデヒド基などの反応基をスキンコンディショニング剤上に導入することが必要でありうる。これらの修飾は、当該技術分野で周知の酸化、還元、ホスゲン化（ｐｈｏｓｇｅｎａｔｉｏｎ）などの通常の化学反応を用いて行われる場合がある。
【００８６】
スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをスキンコンディショニング剤に対してスペーサーを介して共役することが望ましい場合もある。スペーサーがコンディショニング剤をペプチドから分離するように機能することで、同剤がペプチドの皮膚への結合と干渉しないことが保証される。スペーサーは、アルキル鎖、フェニル化合物、エチレングリコール、アミド、エステルなどの種々の分子のいずれかでありうる。好ましいスペーサーは、親水性を示し、１〜約１００原子、より好ましくは２〜約３０原子の鎖長を有する。好ましいスペーサーの例として、エタノールアミン、エチレングリコール、６炭素原子の鎖長を有するポリエチレン、３〜６反復単位を有するポリエチレングリコール、フェノキシエタノール、プロパノールアミド、ブチレングリコール、ブチレングリコールアミド、プロピルフェニル、ならびにエチル、プロピル、ヘキシル、ステリル、セチル、およびパルミトイルアルキルの鎖が挙げられるがこれらに限定されない。スペーサーは、上記のカップリング化学物質のいずれかを用いてペプチドおよびスキンコンディショニング剤と共有結合されうる。スペーサーの取り込みを促進するため、ペプチドおよびコンディショニング剤に対する共役において、スペーサーおよび反応基を両末端に含む二官能性架橋剤が使用されうる。適切な二官能性架橋剤は、当該技術分野で周知であり、１，６−ジアミノヘキサンなどのジアミン；グルタルアルデヒドなどのジアルデヒド；エチレングリコール−ビス（琥珀酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステル）、ジサクシニミジルグルタレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｇｌｕｔａｒａｔｅ）、ジサクシニミジルスベレート（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｂｅｒａｔｅ）、およびエチレングリコール−ビス（サクシニミジルサクシネート（ｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ  ｓｕｃｃｉｎａｔｅ））などのビスＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル；ヘキサメチレンジイソシアネートなどのジイソシアネート；１，４ブタンジイルジグリシジルエーテルなどのビスオキシラン；サクシニルジサリチレート（ｓｕｃｃｉｎｙｌｄｉｓａｌｉｃｙｌａｔｅ）などのジカルボン酸などを含むがこれらに限定されない。異なる反応基を各末端に含むヘテロ二官能性架橋剤もまた使用されうる。ヘテロ二官能性架橋剤の例として、以下の構造を有する化合物が挙げられるがこれに限定されない。
【００８７】
【化１】
2008537479.tif 000003
【００８８】
（式中、Ｒ１はＨまたは−ＳＯ３Ｎａ、−ＮＯ２、または−Ｂｒなどの置換基であり、かつＲ２は−ＣＨ２ＣＨ２（エチル）、−（ＣＨ２）３（プロピル）、または−（ＣＨ２）３Ｃ６Ｈ５（プロピルフェニル）などのスペーサーである）かかるヘテロ二官能性架橋剤の例として、３−マレイミドプロピオン酸Ｎ−ヒドロキシサクシンイミドエステルが挙げられる。これらの試薬のＮ−ヒドロキシサクシンイミドエステル基はコンディショナー上のアミン基またはアルコール基と反応する一方、マレイミド基はペプチド上に存在するチオール基と反応する。チオール基は、少なくとも１つのシステイン基を結合ペプチド配列の少なくとも一方の末端すなわちＣ−末端またはＮ−末端に付加することによってペプチドに取り込まれうる。グリシンなどの数個のスペーサーのアミノ酸残基が結合ペプチド配列と末端システインの間に取り込まれることで、反応性のチオール基が結合配列から分離されうる。さらに、少なくとも１つのリジン残基が結合ペプチド配列の少なくとも１方の末端すなわちＣ−末端またはＮ−末端に付加されて、共役におけるアミン基が提供されうる。
【００８９】
さらに、スペーサーは、任意のアミノ酸およびその混合物を含んでなるペプチドでありうる。好ましいペプチドスペーサーは、アミノ酸のプロリン、リジン、グリシン、アラニン、およびセリン、ならびにこれらの混合物を含んでなる。さらに、ペプチドスペーサーは、配列番号１で与えられる、プロテアーゼカスパーゼの３部位などの特定の酵素切断部位を含む場合があり、皮膚からのコンディショニング剤の酵素的除去が可能になる。ペプチドスペーサーは、１〜約５０アミノ酸長、好ましくは１〜約２０アミノ酸長でありうる。ペプチドスペーサーの例として配列番号５〜７が挙げられるがこれらに限定されない。これらのペプチドスペーサーは、当該技術分野で既知の任意の方法によって結合ペプチド配列に連結されうる。例えば、結合ペプチド−ペプチドスペーサー−ジブロックの全体は、上記の標準のペプチド合成方法を用いて調製されうる。さらに、結合ペプチドとペプチドスペーサーブロックは、ペプチド上の末端のアミンおよび／またはカルボン酸に反応性を示す、カルボジイミドカップリング剤（例えば、ハーマンソン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、アカデミック・プレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）（１９９６年）を参照）、塩化二酸、ジイソシアネートおよび他の二官能性カップリング試薬を用いて結合されうる。あるいは、結合ペプチド−ペプチドスペーサー−ジブロックの全体は、上記の組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術を用いて調製されうる。スペーサーはまた、ペプチドスペーサーと有機スペーサー分子の組み合わせである場合があり、上記の方法を用いて調製されうる。
【００９０】
ペプチドベースのスキンコンディショナーと皮膚の間の相互作用を高めるのに、複数のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをスキンコンディショニング剤に共役させることが望ましい場合もある。同じ皮膚結合ペプチドの複数のコピーまたは異なる皮膚結合ペプチドの組み合わせが使用されうる。大きいコンディショニング粒子（例えば粒子エマルジョン）の場合、多数の皮膚結合ペプチドすなわち約５０，０００個までがコンディショニング剤に付着されうる。より少数の皮膚結合ペプチドをより少ないコンディショナー分子すなわち最大約１００個に共役させてもよい。さらに、ペプチドの複数のコピーが共に連結され、かつスキンコンディショニング剤に共役されうる。したがって、本発明の一実施形態では、ペプチドベースのスキンコンディショナーは、一般構造（ＳＣＰｍ）ｎ−ＳＣＡ（式中、ｍは１〜約１００、好ましくは１〜約１０の範囲である）を有する、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド（ＳＣＰ）およびスキンコンディショニング剤（ＳＣＡ）よりなるジブロック組成物である。コンディショニング剤が分子種である場合、ｎは１〜約１００、好ましくは１〜約１０の範囲である。コンディショニング剤が粒子である場合、ｎは１〜約５０，０００、好ましくは１〜約１０，０００の範囲である。
【００９１】
別の実施形態では、ペプチドベースのスキンコンディショナーは、上記のように、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドをスキンコンディショニング剤から分離するスペーサー（Ｓ）を含む。皮膚結合ペプチドの複数のコピーは、単一のスペーサー分子に共役されうる。さらに、ペプチドの複数のコピーは、スペーサーを介して共に連結されかつスペーサーを介してスキンコンディショニング剤に共役されうる。この実施形態では、ペプチドベースのスキンコンディショナーは、一般構造［（ＳＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−ＳＣＡ（式中、ｘは１〜約１０の範囲、好ましくはｘは１であり、かつｍは１〜約１００、好ましくはｍは１〜約１０の範囲である）を有する、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド、スペーサー、およびスキンコンディショニング剤よりなるトリブロック組成物である。スキンコンディショニング剤が分子種すなわち非粒子状コンディショニング剤である場合、ｎは１〜約１００、好ましくは１〜約１０の範囲である。スキンコンディショニング剤が粒子である場合、ｎは１〜約５０，０００、好ましくは１〜約１０，０００の範囲である。
【００９２】
本明細書で用いられるＳＣＰは総称であり、単一の皮膚結合ペプチド配列に言及することを意味するものではないことが理解されるべきである。上で用いられるｍ、ｎまたはｘが１より大きい場合、一連の異なる配列の皮膚結合ペプチドが組成物の一部を形成しうる場合の状況を設けることは本発明の範囲内で十分になされる。さらに、Ｓは総称であり、単一のスペーサーに言及することを意味するものではない。トリブロック組成物において上で用いられるｍおよびｎが１より大きい場合、一連の異なるスペーサーが組成物の一部を形成しうる場合の状況を設けることは本発明の範囲内で十分になされる。これらの構造がペプチド、スキンコンディショニング剤、および任意選択のスペーサーの間の共有結合を必ずしも示さないことも理解されるべきである。上記のように、ペプチド、スキンコンディショニング剤、および任意選択のスペーサーの間の共役相互作用は、共有的または非共有的でありうる。
【００９３】
本発明のペプチドベースのスキンコンディショナーは、スキンケア用製品において使用されうる。皮膚結合ペプチド自体が皮膚用コンディショニング剤としての機能を果たしうることも理解されるべきである。スキンケア製品組成物は、スキンコンディショナー、スキンクレンザー、メイクアップ、皺取り製品および皮膚着色剤を含むがこれらに限定されない。一実施形態では、スキンケア製品組成物はスキンコンディショニング製品である。別の実施形態では、スキンケア製品組成物は皮膚着色製品である。別の実施形態では、スキンケア製品組成物はスキンクレンジング製品である。
【００９４】
本発明のスキンケア製品組成物は、ペプチドベースのスキンコンディショナーまたは化粧用に許容可能な媒体中での異なるペプチドベースのスキンコンディショナーの混合物の有効量を含んでなる。スキンケア組成物におけるペプチドベースのスキンコンディショナーまたは皮膚結合ペプチドの有効量は、本明細書において、組成物の総重量に対する重量で約０．００１％〜約１０％、好ましくは約０．０１％〜約５％の割合として定義される。この割合は、スキンケア製品のタイプの関数として変化しうる。スキンケア製品における化粧用に許容可能な媒体の成分は、当該技術分野で周知であり、上記に例を挙げる。
【００９５】
ペプチドベースの皮膚着色剤
本発明のペプチドベースの皮膚着色剤は、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド（ＳＣＰ）と着色剤（Ｃ）との共役によって形成する。ペプチドベースの皮膚着色剤のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド部分がスキンケア組成物マトリックスから皮膚に強く結合することにより、着色剤の皮膚への付着状態が保持されて長期持続性の皮膚着色効果が得られる。スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドは、上記方法を用いて同定される。
【００９６】
本発明のペプチドベースの皮膚着色剤は、上記の共役方法のいずれかを用い、特定のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドと着色剤との直接的なまたはスペーサーを介した共役によって調製される。本明細書で定義される着色剤は、皮膚の色を変化させるのに使用可能な任意の染料、色素などである。本発明のペプチドベースの皮膚着色剤では、任意の適切な既知の着色剤が使用されうる。着色剤は、当該技術分野で周知であり（例えば、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）ら、上記、ＣＦＴＡ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｌｏｒ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、第２版、ミセル・プレス（Ｍｉｃｅｌｌｅ  Ｐｒｅｓｓ）、英国（１９９２年）およびＣｏｓｍｅｔｉｃ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ、米国食品医薬品局（ＵＳ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）、ＦＤＡ／ＩＡＳ  Ｂｏｏｋｌｅｔ（１９９２年）を参照）、様々なソース（例えばバイエル（Ｂａｙｅｒ）、ピッツバーグ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ）、ペンシルバニア州（ＰＡ）；チバ・ガイギー（Ｃｉｂａ−Ｇｅｉｇｙ）、タリータウン（Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ）、ニューヨーク州（ＮＹ）；ＩＣＩ、ブリッジウォーター（Ｂｒｉｄｇｅｗａｔｅｒ）、ニュージャージ州（ＮＪ）；サンドズ（Ｓａｎｄｏｚ）、ウィーン（Ｖｉｅｎｎａ）、オーストリア；ＢＡＳＦ、マウントオリーブ（Ｍｏｕｎｔ  Ｏｌｉｖｅ）、ニュージャージ州（ＮＪ）；およびヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）、フランクフルト（Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ）、ドイツ）から市販されている。本発明のペプチドベースの皮膚着色剤にて用いるための好ましい着色剤は、染料では、Ｄ＆Ｃレッド２１号などのエオシン誘導体や、Ｄ＆Ｃレッド２１号およびＤ＆Ｃオレンジ１０号と併用されたＤ＆Ｃレッド２７号、Ｄ＆Ｃレッドオレンジ５号などのハロゲン化フルオレセイン誘導体、ならびに色素では、二酸化チタン、酸化亜鉛、Ｄ＆Ｃレッド３６号およびＤ＆Ｃオレンジ１７号、Ｄ＆Ｃレッド７号、１１号、３１号および３４号のカルシウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド１２号のバリウムレーキ、Ｄ＆Ｃレッド１３号のストロンチウムレーキ、ＦＤ＆Ｃイエロー５号、ＦＤ＆Ｃイエロー６号、Ｄ＆Ｃレッド２７号、Ｄ＆Ｃレッド２１号、ＦＤ＆Ｃブルー１号のアルミニウムレーキ、酸化鉄、マンガンバイオレット、酸化クロム、ウルトラマリンブルー、およびカーボンブラックを含む。着色剤はまた、太陽に暴露することなく皮膚上に日焼けした外観をもたらす、ジヒドロキシアセトンなどのサンレスタンニング剤でありうる。
【００９７】
さらに、付着、吸着または吸収された染料を有する、有機および無機ナノ粒子は、着色剤として使用されうる。例えば、着色剤は着色重合体ナノ粒子でありうる。典型的な高分子ミクロスフィアは、ポリスチレン、ポリメタクリル酸メチル、ポリビニルトルエン、スチレン／ブタジエン共重合体およびラテックスのミクロスフィアを含むがこれらに限定されない。本発明での使用においては、ミクロスフィアは約１０ｎｍ〜約２μｍの直径を有する。ミクロスフィアは、上記を例とする任意の適切な染料とミクロスフィアとの共役によって着色されうる。染料は、ミクロスフィアの表面に共役されるか、または多孔質ミクロスフィアの多孔質構造内に吸着されうる。共有結合を可能にするように官能性付与された、染色されていないミクロスフィアおよび染色されたミクロスフィアを含む、適切なミクロスフィアは、バング・ラボラトリーズ（Ｂａｎｇ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（フィッシャーズ（Ｆｉｓｈｅｒｓ）、インディアナ州（ＩＮ））などの企業から入手可能である。
【００９８】
ペプチドベースの皮膚着色剤と皮膚の間の相互作用を高めるのに、複数のスキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチドを着色剤に共役させることが望ましい場合もある。同じ皮膚結合ペプチドの複数のコピーまたは異なる皮膚結合ペプチドの組み合わせが使用されうる。さらに、複数の皮膚結合ペプチド配列が共に連結され、かつ上記のように着色剤に共役されうる。大きい色素粒子の場合、多数すなわち約５０，０００個までの皮膚結合ペプチドが色素に付着されうる。より少数すなわち約１００個までの皮膚結合ペプチドをより少ない染料分子に共役させてもよい。したがって、本発明の一実施形態では、ペプチドベースの皮膚着色剤は、一般構造（ＳＣＰｍ）ｎ−Ｃ（式中、ｍは１〜約１００、好ましくはｍは１〜約１０の範囲である）を有する、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド（ＳＣＰ）および着色剤（Ｃ）よりなるジブロック組成物である。着色剤が染料などの分子種である場合、ｎは１〜約１００、好ましくは１〜約１０の範囲である。着色剤が色素などの粒子またはナノ粒子である場合、ｎは１〜約５０，０００、好ましくは１〜約１０，０００の範囲である。
【００９９】
別の実施形態では、ペプチドベースの皮膚着色剤は、上記のように、結合ペプチドを着色剤から分離するスペーサー（Ｓ）を含む。皮膚結合ペプチドの複数のコピーは、単一のスペーサー分子に共役されうる。さらに、ペプチドの複数のコピーは、スペーサーを介して共に連結されかつスペーサーを介して着色剤に共役されうる。この実施形態では、ペプチドベースの皮膚着色剤は、一般構造［（ＳＣＰｘ−Ｓ）ｍ］ｎ−Ｃ（式中、ｘは１〜約１０の範囲、好ましくはｘは１であり、かつｍは１〜約１００、好ましくはｍは１〜約１０の範囲である）を有する、スキンケア組成物抵抗性の皮膚結合ペプチド、スペーサー、および着色剤よりなるトリブロック組成物である。着色剤が染料などの分子種である場合、ｎは１〜約１００、好ましくは１〜約１０の範囲である。着色剤が色素などの粒子またはナノ粒子である場合、ｎは１〜約５０，０００、好ましくは１〜約１０，０００の範囲である。
【０１００】
本明細書で用いられるＳＣＰは総称であり、単一の皮膚結合ペプチド配列に言及することを意味するものではないことが理解されるべきである。上で用いられるｍ、ｎまたはｘが１より大きい場合、一連の異なる配列の皮膚結合ペプチドが組成物の一部を形成しうる場合の状況を設けることは本発明の範囲内で十分になされる。さらに、Ｓは総称であり、単一のスペーサーに言及することを意味するものではない。トリブロック組成物において上で用いられるｍおよびｎが１より大きい場合、一連の異なるスペーサーが組成物の一部を形成しうる場合の状況を設けることは本発明の範囲内で十分になされる。これらの構造がペプチド、着色剤、および任意選択のスペーサーの間の共有結合を必ずしも示さないことも理解されるべきである。上記のように、ペプチド、着色剤、および任意選択のスペーサーの間の共役相互作用は、共有的または非共有的でありうる。
【０１０１】
本発明のペプチドベースの皮膚着色剤は、ファンデーション、ブラッシュ、リップスティック、リップライナー、リップグロス、アイシャドウおよびアイライナーを含むがこれらに限定されない、化粧品およびメイクアップ製品における着色剤として使用されうる。これらは、脂肪物質を含有する化粧用に許容可能な媒体を含んでなる無水メイクアップ製品であるか、あるいは、上記のように水中油または油中水エマルジョンなどの安定な分散形態でありうる。これらの組成物では、ペプチドベースの皮膚着色剤の割合は、一般に組成物の総重量に対して約０．００１％〜約４０％重量である。
【０１０２】
皮膚を処理するための方法
別の実施形態では、皮膚を本発明のペプチドベースのコンディショナーおよび着色剤で処理するための方法が提供される。詳細には、本発明は、有効量のペプチドベースのスキンコンディショナーを含んでなる上記組成物のうちの１つを皮膚に適用するステップと、保護膜の形成を可能にするステップとにより、皮膚上にペプチドベースのコンディショナーの保護膜を形成するための方法も含んでなる。本発明の組成物は、スプレー、ブラッシング、および手による塗布を含むがこれらに限定されない様々な手段によって皮膚に適用されうる。ペプチドベースのコンディショナー組成物は、保護膜を形成するのに十分な時間、好ましくは少なくとも約０．１〜６０分間、皮膚と接触状態にされる。
【０１０３】
本発明は、上記手段による、有効量のペプチドベースの皮膚着色剤を含んでなる皮膚着色組成物の皮膚への適用によって皮膚の着色方法も提供する。
【実施例】
【０１０４】
本発明は、以下の実施例においてさらに明らかにされる。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、あくまで例示目的で与えられることが理解されるべきである。上記の考察およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認でき、その趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更および改良を行うことでそれを様々な使用および条件に適合させることができる。
【０１０５】
用いられる略語の意味は以下の通りである。すなわち、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「ｎｍ」はナノメータを意味し、「ｍｍ」はミリメータを意味し、「ｃｍ」はセンチメータを意味し、「μｍ」はマイクロメータを意味し、「ｍＭ」はミリモルを意味し、「Ｍ」はモルを示し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｍｇ」はミリグラムを意味し、「ｐｆｕ」はプラーク形成単位を意味し、「ＢＳＡ」はウシ血清アルブミンを意味し、「ＥＬＩＳＡ」は酵素結合免疫吸着アッセイを意味し、「Ａ」は吸光度を意味し、「Ａ４５０」は４５０ｎｍの波長で測定された吸光度を意味し、「ＴＢＳ」はトリス緩衝生理食塩水を意味し、「ＴＢＳＴ−Ｘ」は「Ｘ」がトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０の重量パーセントである場合のトゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）（登録商標）２０を含有するトリス緩衝生理食塩水を意味し、「ＳＥＭ」は平均の標準誤差を意味し、「ＴＨＦ」はテトラヒドロフランを意味し、「ＤＭＦ」はジメチルホルムアミドを意味し、「Ｍｗ」は重量平均分子量を意味し、「ｋＤａ」はキロダルトンを意味し、「ＮＭＲ」は核磁気共鳴分光法を意味し、かつ「ｖ／ｖ」は容量対容量の比率を意味する。
【０１０６】
一般的方法
標準の組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、当該技術分野で周知であり、サンブルック  Ｊ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．）、フリッツ  Ｅ．Ｆ．（Ｆｒｉｔｓｃｈ  Ｅ．Ｆ．）およびマニアティス  Ｔ．（Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）、１９８９年、Ｔ．Ｊ．シルハヴィ（Ｔ．Ｊ．Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベナン（Ｍ．Ｌ．Ｂｅｎｎａｎ）およびＬ．Ｗ．エンキスト（Ｌ．Ｗ．Ｅｎｑｕｉｓｔ）、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ）、コールド・スプリング・ハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）、ニューヨーク州（Ｎ．Ｙ．）、１９８４年、およびアウスベル  Ｆ．Ｍ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  Ｆ．Ｍ．）ら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、グリーン・パブリッシング・アソシエイツ・アンド・ワイリー・インターサイエンス（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ）、１９８７年に記載されている。
【０１０７】
細菌培養物の維持および成長に適する材料および方法も当該技術分野で周知である。以下の実施例における使用に適する技術は、Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ、フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレイ（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフ  Ｎ．コスチロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユーギーン  Ｗ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリス  Ａ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエル  Ｒ．クリーク（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、ワシントンＤＣ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ．）、１９９４年、またはトーマス  Ｄ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）によるＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、シナウアー・アソシエーツ社（Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．）、マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）、１９８９年の中で見出されうる。細菌細胞の成長および維持を目的とした実施例に記載のすべての試薬および物質を、他に規定のない限り、アルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）（ミルウォーキー（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ）、ワイオミング州（ＷＩ））、ＢＤダイアグノスティック・システムズ（ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）（スパークス（Ｓｐａｒｋｓ）、メリーランド州（ＭＤ））、ライフ・テクノロジーズ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（ロックヴィル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド州（ＭＤ））、またはシグマ・ケミカル社（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ）（セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）、ミズーリ州（ＭＯ））から入手可能である。
【０１０８】
ファージディスプレイペプチドライブラリー
以下の実施例では、４つのファージディスプレイペプチドライブラリーを用いる。Ｐｈ．Ｄ．−１２（商標）ファージディスプレイペプチドライブラリー（Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ）をニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）（ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））から購入する。このキットは、Ｍ１３ファージの小コートタンパク質（ｐＩＩＩ）と融合されたランダムペプチド１２−ｍｅｒｓのコンビナトリアルライブラリーに基づく。提示されたペプチドは、シグナルペプチドの切断後にコートタンパク質の１番目の残基が提示されたペプチドの１番目の残基であるように、ｐＩＩＩのＮ末端で発現される。Ｐｈ．Ｄ．−１２（商標）ライブラリーは、約２．７×１０９配列よりなる。
【０１０９】
第一に１５−ｍｅｒランダムペプチド配列を有し、第二に２０−ｍｅｒランダムペプチド配列を有し、第三に位置３および１１にシスチン残基を含む１４−ｍｅｒジスルフィド制約型ランダムペプチド配列を有する３つのファージディスプレイペプチドライブラリーを、ケイ（Ｋａｙ）ら（Ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ＆  Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、第８巻、５４５−５５１頁（２００５年））に記載の方法を用いて調製する。この方法は、大腸菌株ＣＪ２３６（ｄｕｔ−ｕｎｇ−）を用いることでウリジンを有する一本鎖ファージミドＤＮＡ（Ｕ−ｓｓＤＮＡ）が生成されるという、シドゥ（Ｓｉｄｈｕ）ら（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ３２８：３３３−３６３頁（２０００年））で報告された方法を改良したものである。このＤＮＡは、二本鎖のプライマーとしてだけでなくコード対象のランダムアミノ酸を挿入することを目的とした、オリゴヌクレオチドを用いる二本鎖合成用鋳型として用いられる。二本鎖合成の完了時に、二本鎖（ｄｓＤＮＡ）は野生型株に形質転換される。任意のＵ−ｓｓＤＮＡが宿主細胞により分解され、それ故に組み換え鎖のみが残存してファージ粒子が生成される。この方法を用い、Ｍ１３コートタンパク質に対するペプチド融合体または変異体を生成してもよい。ケイ（Ｋａｙ）らの方法は、遺伝子ＩＩＩの開始点でアンバー停止コドンを用いる。ＤＮＡ配列のランダム化されたストレッチを有するオリゴヌクレオチドを、ランダム化された領域が停止コドンと整列するように一本鎖ファージゲノムにアニールさせる。一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を、共有結合により閉じた環状ｄｓＤＮＡに酵素的に変換し、続いて大腸菌の非サプレッサー株にエレクトロポレーションする。新たに合成されたＤＮＡ鎖（マイナス鎖）は、宿主細胞内でプラス鎖を生成するための鋳型としての機能を果たし、それはウイルス遺伝子の転写／翻訳用に利用されかつウイルス粒子内にパッケージングされる。
【０１１０】
実施例１−３（予測）
スキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定
これらの予測的な実施例の目的は、３つのランダムファージディスプレイペプチドライブラリー、詳細にはＰｈ．Ｄ．−１２（商標）ファージディスプレイペプチドライブラリー（Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ）、１５−ｍｅｒおよび２０−ｍｅｒのランダムペプチドライブラリーからのスキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定方法について記載することである。
【０１１１】
プロセスにおいて、１層のパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）をミニフォールドＩドット−ブロットシステム（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉ  Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）（シュライヒャー・アンド・シュエル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）、キーン（Ｋｅｅｎｅ）、ニューハンプシャー州（ＮＨ））の最上位ウェルブロックの下に適用し、無毛ブタ皮膚の層をパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）カバー上に追加し、次いで装置を締め付けることにより、独自のブタ皮膚−底部９６−ウェル装置を作製する。ブタ皮膚については、地元のスーパーマーケットから購入して−８０℃で保存することができる。使用前に、皮膚を脱イオン水中に入れて解凍し、次いでペーパータオルを使用して拭き取って乾かす。皮膚の表面を９０％イソプロパノールで拭き、次いで脱イオン水ですすぐ。
【０１１２】
各実験では、目的のライブラリー由来の約４×１０１０ｐｆｕのファージを含有する試料を使用する。ファージライブラリーの試料をまず前処理して毛髪およびプラスチック結合クローンを除去する。毛髪結合クローンを除去するため、ファージライブラリーの試料を、インターナショナル・ヘア・インポーターズ・アンド・プロダクツ（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈａｉｒ  Ｉｍｐｏｒｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ベルローズ（Ｂｅｌｌｅｒｏｓｅ）、ニューヨーク州（ＮＹ））から得たヒト毛髪の試料とともに室温で１時間インキュベートする。以下の手順を用いてこれを行う。毛髪をまず９０％イソプロパノール中に室温で３０分間入れ、次いでそれぞれを脱イオン水で１０分間、５回洗浄する。毛髪を室温で一晩風乾する。毛髪を１ｃｍの長さに切断し、ファージライブラリーとのインキュベーションのために１０〜２０の毛髪をマイクロ遠心チューブに入れる。ファージ試料を、毛髪試料への暴露後、ポリスチレンの６ウェルのセルカルチャークラスター（ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ）（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）、アクトン（Ａｃｔｏｎ）、マサチューセッツ州（ＭＡ）；カタログ番号３５２６）に移し、室温で１時間インキュベートしてプラスチック結合クローンを除去する。
【０１１３】
前処理したファージ試料をブタ皮膚試料を有する装置に添加し、混合物を室温で１時間インキュベートする。ファージ溶液を除去し、ブタ皮膚試料を、希釈されていないオレイ・エイジ・ディファイニング・プロテクティブ・リニューアル・ローション（Ｏｌａｙ  Ａｇｅ  Ｄｅｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｒｅｎｅｗａｌ  Ｌｏｔｉｏｎ）（プロクター・アンド・ギャンブル（Ｐｒｏｃｔｏｒ＆Ｇａｍｂｌｅ）、シンシナティ（Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ）、オハイオ州（ＯＨ））中で室温で５分間インキュベートする。次いで、ブタ皮膚試料をＴＢＳＴ−０．５％緩衝液で６回洗浄する。洗浄後、ブタ皮膚を、０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２中の１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡよりなる溶出緩衝液で処理し、１０分間インキュベートする。次いで、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２よりなる中和緩衝液を添加する。溶出されたかまたは依然としてブタ皮膚に結合されたファージを、新しい宿主細胞（大腸菌ＥＲ２３３８）の添加により増幅する。増幅および単離されたファージを新しい皮膚試料に接触させ、各ライブラリーに対してバイオパニング法をさらに２回繰り返す。
【０１１４】
バイオパニングを３回行った後、ランダムな単一のファージクローンを選択し、単一のプラーク溶解物を製造業者の使用説明書（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））に従って調製し、一本鎖ファージゲノムＤＮＡをキアプレップ・スピンＭ１３キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３  Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して精製し、デュポン・シークエンシング・ファシリティ（ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で、配列番号２として与えられる−９６ｇＩＩＩ配列決定プライマー（５’ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）を用いて配列決定する。提示されるペプチドは、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドの直後に位置する。同定された皮膚結合ペプチド配列は、スキンコンディショナーマトリックスから皮膚に結合可能であり、かつそこで安定であると予想される。
【０１１５】
実施例４（予測）
スキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドの特異性
この予測的な実施例の目的は、ＥＬＩＳＡ法を用いて、実施例１〜３に記載の方法を用いて同定されるスキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドの特異性を判定する方法について記載することである。
【０１１６】
実施例１〜３に記載の方法を用いて同定されるスキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドを、配列番号３として与えられる対照ペプチドである関連のない毛髪結合ペプチドＩ−Ｂ５（ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、上記）とともに用いる。すべてのペプチドは、シンペプ（ＳｙｎＰｅｐ）（ダブリン（Ｄｕｂｌｉｎ）、カリフォルニア州（ＣＡ））により、リジン残基の付加によって合成され、Ｃ末端で蛍光タグの５−カルボキシフルオレセイン−アミノヘキシルアミダイト（５−ＦＡＭ）で誘導体化される。標識されたＩ−Ｂ５毛髪結合ペプチドの配列は、配列番号４として与えられる。
【０１１７】
アッセイにおいて、１層のパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）をミニフォールドＩドット−ブロットシステム（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉ  Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）（シュライヒャー・アンド・シュエル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）、キーン（Ｋｅｅｎｅ）、ニューハンプシャー州（ＮＨ））の最上位ウェルブロックの下に適用し、毛髪または無毛ブタ皮膚層をパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）カバー上に追加し、次いで装置を締め付けることにより、独自の毛髪またはブタ皮膚−底部９６−ウェル装置を作製する。まず９６ウェル装置内の毛髪または皮膚試料を、室温で１時間インキュベートし、スーパーブロック（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）（登録商標）ブロッキング緩衝液（トリス緩衝化；ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ））でブロッキングする。次いで、毛髪または皮膚試料を洗浄緩衝液（ＴＢＳＴ−０．５％）で６回洗浄する。結合緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ−０．５％）１．０ｍＬ中、２０μＭの濃度で蛍光標識したペプチドを各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。毛髪または皮膚試料をＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄し、次いで抗−フルオレセイン／マウスＩｇＧ（モレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ）、オレゴン州（ＯＲ））溶液（ブロッキング緩衝液で１：１０００希釈）１．０ｍＬを各ウェルに添加する。試料を室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄する。次いで、抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抱合体（ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））溶液（ブロッキング緩衝液で１：１０００希釈）１．０ｍＬを各ウェルに添加し、試料を室温で１時間インキュベートする。試料を洗浄緩衝液で６回洗浄し、ＴＭＢ基質（ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））３００μＬを各ウェルに添加する。試料を室温で１０分間インキュベートし、次いで各ウェルから試料１００μＬを採取し、新しいマイクロタイタープレート内のウェルに添加する。次いで、停止溶液（２Ｍ硫酸溶液）１００μＬを各ウェルに添加し、各試料の吸光度を４５０ｎｍの波長で測定する。このアッセイを２通りに実施し、ここで各々は少なくとも３つの複製物よりなる。
【０１１８】
スキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドが、皮膚に対して高いＡ４５０値で示されるように強い結合親和性を有し、毛髪に対して低いＡ４５０値で示されるように低い結合親和性を有することになると予想される。対照の毛髪結合ペプチドＩ−Ｂ５は、皮膚に対して低い結合親和性および毛髪に対して高い結合親和性を有することになる。
【０１１９】
実施例５（予測）
スキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドのスキンコンディショナーマトリックスからの皮膚への結合
この予測的な実施例の目的は、スキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドがスキンコンディショナーマトリックスから皮膚に結合することを実証する方法について記載することである。
【０１２０】
実施例４に記載と同じＥＬＩＳＡ法を用いる。実施例１〜３で同定した皮膚結合ペプチドを、高剪断ミキサー（シルバーソン（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ）、モデルＬ４Ｒ７Ａ；シルバーソン・マシーンズ（Ｓｉｌｖｅｒｓｏｎ  Ｍａｃｈｉｎｅｓ）、イースト・ロングメドゥ（Ｅａｓｔ  Ｌｏｎｇｍｅａｄｏｗ）、マサチューセッツ州（ＭＡ））を使用し、希釈されていないオレイ・エイジ・ディファイニング・プロテクティブ・リニューアル・ローション（Ｏｌａｙ  Ａｇｅ  Ｄｅｆｙｉｎｇ  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｒｅｎｅｗａｌ  Ｌｏｔｉｏｎ）と別々に６分間混合し、２０μＭの最終ペプチド濃度を得る。ブタ皮膚試料を実施例４に記載のようにブロッキングし、次いでペプチド−コンディショナー混合物中で３７℃で３０分間インキュベートする。次いで、ブタ皮膚試料を、実施例４に記載のように洗浄および処理し、各試料の吸光度を４５０ｎｍの波長で測定する。
【０１２１】
同じ手順を用い、皮膚結合ペプチドと緩衝液からの皮膚との結合について測定する。さらに同じ手順を用い、スキンコンディショナー中と緩衝液中の双方で任意の皮膚結合ペプチドの非存在下で対照について実施する。
【０１２２】
皮膚結合ペプチドに対する、Ａ４５０値で示される結合親和性がスキンコンディショナーマトリックス中および緩衝液中で類似することになり、これはスキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドがスキンコンディショナーマトリックスから皮膚に強く結合することを示すと予想される。
【０１２３】
実施例６（予測）
スキンコンディショナーマトリックス中でのスキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドの安定性
この予測的な実施例の目的は、スキンコンディショナーマトリックス中でのスキンコンディショナー抵抗性の皮膚結合ペプチドの安定性を実証する方法について記載することである。
【０１２４】
スキンコンディショナー中の、実施例１〜３で同定した皮膚結合ペプチドの別々の混合物を、実施例５に記載のように調製する。比較のため、緩衝液中での皮膚結合ペプチドの溶液を使用する。すべての溶液を室温で保存し、異なる時間で採取した試料を用い、実施例５に記載のＥＬＩＳＡ法を用いてペプチドの結合活性を測定する。対照についても皮膚結合ペプチドを含有しなかった緩衝液およびスキンコンディショナーを用いて実施する。
【０１２５】
皮膚結合ペプチドを最大で２１日の期間にわたりスキンコンディショナー中で保存後、同ペプチドでは、Ａ４５０値で示される結合親和性における有意な低下は全くないものと予想される。
【０１２６】
実施例７〜１０（予測）
スキンクレンザー抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定
これらの予測的な実施例の目的は、３つのランダムファージディスプレイペプチドライブラリー、詳細にはＰｈ．Ｄ．−１２（商標）ファージディスプレイペプチドライブラリー（Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ）、１５−ｍｅｒおよび２０−ｍｅｒランダムペプチドライブラリーに由来するスキンクレンザー抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定方法について記載することである。
【０１２７】
スキンクレンザーのジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）のヘッドトゥトウ・ベイビーウォッシュ（Ｈｅａｄ−ｔｏ−Ｔｏｅ  Ｂａｂｙ  Ｗａｓｈ）（ジョンソン・アンド・ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、スキルマン（Ｓｋｉｌｌｍａｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ））をスキンコンディショナーの代わりに使用する場合を除き、実施例１〜３に記載の手順を用いる。
【０１２８】
同定した皮膚結合ペプチド配列は、スキンクレンザーマトリックスから皮膚に結合可能でありかつそこで安定であると予想される。実施例４に記載のように皮膚結合ペプチドの特異性について判定する。皮膚結合ペプチドのスキンクレンザーマトリックスからの皮膚に対する結合能を実施例５に記載の方法を用いて測定し、実施例６に記載のようにスキンクレンザーマトリックスにおける皮膚結合ペプチドの安定性について判定する。
【０１２９】
実施例１１〜１３
身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドの同定
これらの実施例の目的は、３つのランダムファージディスプレイペプチドライブラリー、詳細にはＰｈ．Ｄ．−１２（商標）ファージディスプレイペプチドライブラリー（Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｌｉｂｒａｒｙ）、１５−ｍｅｒランダムペプチドライブラリー、および１４−ｍｅｒジスルフィド制約型のランダムペプチドライブラリーに由来する身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドを同定することである。
【０１３０】
プロセスにおいて、１層のパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）をミニフォールドＩドット−ブロットシステム（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉ  Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）（シュライヒャー・アンド・シュエル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）、キーン（Ｋｅｅｎｅ）、ニューハンプシャー州（ＮＨ））の最上位ウェルブロックの下に適用し、無毛ブタ皮膚の層をパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）カバー上に追加し、次いで装置を締め付けることにより、独自のブタ皮膚−底部９６−ウェル装置を作製した。ブタ皮膚を地元のスーパーマーケットから購入し、−８０℃で保存した。使用前に、皮膚を脱イオン水中に入れて解凍し、次いでペーパータオルを使用して拭き取って乾かした。皮膚の表面を９０％イソプロパノールで拭き、次いで脱イオン水ですすいだ。
【０１３１】
まず９６ウェル装置内の皮膚試料を、室温で１時間インキュベートし、スーパーブロック（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）（登録商標）ブロッキング緩衝液（トリス緩衝化；ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ））でブロッキングした。次いで、皮膚試料を洗浄緩衝液（ＴＢＳＴ−０．５％）で６回洗浄した。
【０１３２】
各実験では、目的のライブラリー由来の約１×１０１１ｐｆｕのファージを含有する試料を使用した。ファージライブラリーの試料をジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）のヘッドトゥトウ・ベイビーウォッシュ（Ｈｅａｄ−ｔｏ−Ｔｏｅ  Ｂａｂｙ  Ｗａｓｈ）（ジョンソン・アンド・ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｊｏｈｎｓｏｎ）、スキルマン（Ｓｋｉｌｌｍａｎ）、ニュージャージー州（ＮＪ））と前混合し、皮膚ウェルに添加し、ゆっくり振とうしながら３７℃で３０分間インキュベートした。この時間経過後、未結合のファージ粒子を除去し廃棄した。次いで、皮膚試料をＴＢＳＴ緩衝液（０．５％トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０）で１０回洗浄した。結合されたファージの皮膚からの溶出前、装置の最上位プレート（ウェルを形成する皮膚上部）を除去し、新しいプレートと交換した。このステップでは、任意のプラスチック結合ファージを除去した。ブタ皮膚を０．２Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．２中の１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡよりなる溶出緩衝液で処理し、２０分間までインキュベートした。次いで、１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ９．２よりなる中和緩衝液を添加した。溶出されたかまたは依然としてブタ皮膚に結合されたファージを、新しい宿主細胞（大腸菌ＥＲ２３３８）の添加によって増幅した。増幅および単離したファージを新しいブタ皮膚試料に接触させ、バイオパニング法を各ライブラリーに対してさらに３回ずつ繰り返した。
【０１３３】
バイオパニングを４回行った後、単一のランダムファージクローンを選択し、単一のプラーク溶解物を製造業者の使用説明書（ニュー・イングランド・バイオラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ））に従って調製し、キアプレップ・スピンＭ１３キット（ＱＩＡｐｒｅｐ  Ｓｐｉｎ  Ｍ１３  Ｋｉｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア（Ｖａｌｅｎｃｉａ）、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して一本鎖ファージゲノムＤＮＡを精製し、デュポン・シークエンシング・ファシリティ（ＤｕＰｏｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ）で、配列番号２として与えられる−９６ｇＩＩＩ配列決定プライマー（５’ＣＣＣＴＣＡＴＡＧＴＴＡＧＣＧＴＡＡＣＧ−３’）を用いて配列決定した。提示されるペプチドは、遺伝子ＩＩＩのシグナルペプチドの直後に位置した。同定した身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチド配列を表１に示す。
【０１３４】
【表２】
2008537479.tif 000004
【０１３５】
【表３】
2008537479.tif 000005
【０１３６】
実施例１４
身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドの特徴づけ
この実施例の目的は、身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドの皮膚結合親和性をＥＬＩＳＡ法を用いて評価することである。
【０１３７】
実施例１１〜１３において同定したファージ−ペプチドクローンを、新しい宿主細胞（大腸菌ＥＲ２３３８）に感染させることによって増幅した。ＥＬＩＳＡ法においては、実施例１１〜１３に記載のブタ皮膚−底部９６−ウェル装置系を用いた。試験されるべき各クローン系においては、ブタ皮膚ウェルを、ＴＢＳ中の２％脱脂粉乳（シュライヒャー・アンド・シュエル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．））よりなるブロッキング緩衝液４００μＬとともに室温で１時間インキュベートした。ブロッキング緩衝液を、系を反転させ、ペーパータオルを使用して拭き取って乾かすことによって除去した。系をＴＢＳＴ−０．０５％よりなる洗浄緩衝液で６回すすいだ。ウェルを１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡおよび１×１０１１ｐｆｕのファージを含有する１００μＬのＴＢＳＴ−０．５％で満たした。試料をゆっくりと振とうしながら３７℃で１５分間インキュベートした。非結合ファージを、ウェルをＴＢＳＴ−０．５％で１０〜２０回洗浄することによって除去した。次いで、ブロッキング緩衝液で１：５００に希釈した西洋わさびペルオキシダーゼ／抗−Ｍ１３抗体抱合体（アマシャムＵＳＡ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  ＵＳＡ）、ピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）、ニュージャージー州（ＮＪ））１００μＬを各ウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。抱合体溶液を除去し、ウェルをＴＢＳＴ−０．０５％で６回洗浄した。ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ））から得たＴＭＢ基質（２００μＬ）を各ウェルに添加し、室温で５〜３０分間、典型的には１０分間、色を展開させておいた。次いで、停止溶液（２００μＬの２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４）を各ウェルに添加し、溶液を９６ウェルプレートに移し、４５０ｎｍ（Ａ４５０）での吸光度を、マイクロプレート分光光度計（モレキュラーデバイス（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）、サニーベール、カリフォルニア州（ＣＡ））を使用して測定した。得られる吸光度値は、少なくとも３つの複製物の平均として報告されたものであり、平均の標準誤差（ＳＥＭ）を表２に与える。
【０１３８】
【表４】
2008537479.tif 000006
【０１３９】
表２中のデータから分かるように、クローンは、Ａ４５０値での測定によると皮膚に対して様々な親和性を有した。しかし、すべてのクローンは、対照で得られたＡ４５０値よりも有意に高いＡ４５０値で示されるように、皮膚に対して有意な親和性を有した。
【０１４０】
実施例１５
身体洗浄処理後での身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドの特徴づけ
この実施例の目的は、ＥＬＩＳＡ法を用い、身体洗浄による処理後での選択された身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドの皮膚結合親和性を評価することである。
【０１４１】
実施例１４に記載のＥＬＩＳＡ法を以下の改良を加えた上で用いた。ウェルからの非結合ファージペプチド溶液の除去後、ジョンソン（Ｊｏｈｎｓｏｎ）のヘッドトゥトウ・ベイビーウォッシュ（Ｈｅａｄ−ｔｏ−Ｔｏｅ  Ｂａｂｙ  Ｗａｓｈ）２００μＬをウェルに添加し、３０分間インキュベートした。引き続いて実施例１４に記載の洗浄および色展開ステップを行った。緩衝液の洗浄試料において、実施例１４に記載の同じ手順を用いた。２つの毛髪結合ファージペプチドＩＢ５およびＤ２１は、それぞれ配列番号３および２６として与えられて皮膚に対して既知の低い結合親和性を有するものであり、それらを対照の場合と同じ手順を用いて試験した。得られる吸光度値は、少なくとも３つの複製物の平均として報告されたものであり、平均の標準誤差を表３に与える。
【０１４２】
【表５】
2008537479.tif 000007
【０１４３】
結果は、身体洗浄抵抗性の皮膚結合ファージペプチドが皮膚に対して高い結合親和性を有し、かつ身体洗浄による処理後に皮膚に対して有意な結合親和性を維持することを示す。予想どおり、毛髪結合対照は、緩衝液での洗浄および身体洗浄処理の後に皮膚に対して皮膚結合ファージペプチドよりも有意に低い結合親和性を有した。
【０１４４】
実施例１６（予測）
身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドの特異性
この予測的な実施例の目的は、実施例１１〜１３において同定した身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドの特異性をＥＬＩＳＡ法を用いて判定する方法を記載することである。
【０１４５】
実施例１１〜１３において同定した身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドを、配列番号３として与えられる対照ペプチドである関連のない毛髪結合ペプチドＩ−Ｂ５（ファン（Ｈｕａｎｇ）ら、上記）とともに用いる。すべてのペプチドは、シンペプ（ＳｙｎＰｅｐ）（ダブリン（Ｄｕｂｌｉｎ）、カリフォルニア州（ＣＡ））により、リジン残基の付加によって合成され、Ｃ末端で蛍光タグの５−カルボキシフルオレセイン−アミノヘキシルアミダイト（５−ＦＡＭ）で誘導体化される。
【０１４６】
アッセイにおいて、１層のパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）をミニフォールドＩドット−ブロットシステム（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ  Ｉ  Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ  Ｓｙｓｔｅｍ）（シュライヒャー・アンド・シュエル社（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ＆Ｓｃｈｕｅｌｌ，Ｉｎｃ．）、キーン（Ｋｅｅｎｅ）、ニューハンプシャー州（ＮＨ））の最上位９６ウェルブロックの下に適用し、毛髪または無毛ブタ皮膚層をパラフィルム（Ｐａｒａｆｉｌｍ）（登録商標）カバー上に追加し、次いで装置を締め付けることにより、独自の毛髪またはブタ皮膚−底部９６−ウェル装置を作製する。まず９６ウェル装置内の毛髪または皮膚試料を、室温で１時間インキュベートし、スーパーブロック（ＳｕｐｅｒＢｌｏｃｋ）（登録商標）ブロッキング緩衝液（トリス緩衝化；ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、ロックフォード（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ）、イリノイ州（ＩＬ））でブロッキングする。次いで、毛髪または皮膚試料を洗浄緩衝液（ＴＢＳＴ−０．５％）で６回洗浄する。結合緩衝液（１ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡを含有するＴＢＳＴ−０．５％）１．０ｍＬ中、２０μＭの濃度で蛍光標識したペプチドを各ウェルに添加し、３７℃で３０分間インキュベートする。毛髪または皮膚試料をＴＢＳＴ−０．５％で６回洗浄し、次いで抗−フルオレセイン／マウスＩｇＧ（モレキュラー・プローブス社（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．）、ユージン（Ｅｕｇｅｎｅ）、オレゴン州（ＯＲ））溶液（ブロッキング緩衝液で１：１０００希釈）１．０ｍＬを各ウェルに添加する。試料を室温で１時間インキュベートし、次いで洗浄緩衝液で６回洗浄する。次いで、抗−マウスＩｇＧ−ＨＲＰ抱合体（ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））溶液（ブロッキング緩衝液で１：１０００希釈）１．０ｍＬを各ウェルに添加し、試料を室温で１時間インキュベートする。試料を洗浄緩衝液で６回洗浄し、ＴＭＢ基質（ピアス・バイオテクノロジー（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））３００μＬを各ウェルに添加する。試料を室温で１０分間インキュベートし、次いで各ウェルから試料１００μＬを採取し、新しいマイクロタイタープレート内のウェルに添加する。次いで、停止溶液（２Ｍ硫酸溶液）１００μＬを各ウェルに添加し、各試料の吸光度を４５０ｎｍの波長で測定する。このアッセイを２通りに実施し、ここで各々は少なくとも３つの複製物よりなる。
【０１４７】
身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドは、皮膚に対して高いＡ４５０値で示されるように強い結合親和性を有し、かつ毛髪に対して低いＡ４５０値で示されるように低い結合親和性を有すると予想される。対照の毛髪結合ペプチドＩ−Ｂ５は、皮膚に対して低い結合親和性および毛髪に対して高い結合親和性を有することになる。
【０１４８】
実施例１７（予測）
皮膚結合ペプチドベースのスキンコンディショナー
この予測的な実施例の目的は、ペプチドベースのスキンコンディショナーを、身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドと８−アームポリエチレングリコール（８−アームＰＥＧ）とのリンカーとして３−マレイミドプロピオン酸を用いた共役によって調製する方法について記載することである。
【０１４９】
８−アームＰＥＧの官能性付与
８−アームＰＥＧ（Ｍｗ  １０ｋＤａ；ネクター・トランスフォーミング・セラピューティクス（Ｎｅｋｔａｒ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ハンツビル（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ）、アラバマ州（ＡＬ）から入手可能）の溶液を、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）２０ｍＬに０．９７ｇ（０．７８ｍｍｏｌ）を溶解させて調製する。溶液を窒素下で十分に撹拌し、３−マレイミドプロピオン酸溶液（７．５ｍｍｏｌ；アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））２ｍＬを添加する。次いで、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシル−カルボジイミド（ＤＣＣ）溶液（ＤＭＦ２ｍＬ中１．５５ｇ）２ｍＬの添加後、ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）２５０μＬを滴下添加する。混合物を５０℃で一晩撹拌する。翌日、混合物を室温まで冷却し、中型のフリット濾過漏斗（ケミグラス社（Ｃｈｅｍｇｌａｓｓ  Ｉｎｃ）、バインランド（Ｖｉｎｅｌａｎｄ）、ニュージャージー州（ＮＪ））を使用して濾過する。濾過物を大量のエーテル／ＤＭＦ（３０：１のｖ／ｖ）と共沈させる。沈殿物を収集し、水７０ｍＬに溶解し、均一の水溶液を形成する。水溶液をエーテルで４回抽出する。最後に、水性部分を凍結乾燥し、乾燥粉末を生成する。
【０１５０】
官能性付与した８−アームＰＥＧ−リンカーと皮膚結合ペプチドとの共役
上記のように調製した、官能性付与した８アーム−ＰＥＧ−リンカーをＴＢＳ緩衝液に懸濁し、（シンペプ（ＳｙｎＰｅｐ）から得られた、配列番号２７として与えられる）ペプチド配列のＣ末端に付加されたシステイン残基を有する、等しいモル比の身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドのスキン−シス−１（Ｓｋｉｎ−ｃｙｓ−１）（配列番号２０）を溶液に添加する。混合物を室温で６時間撹拌する。最終生成物を水／エーテルで抽出して精製し、ＮＭＲによって分析する。
【０１５１】
実施例１８（予測）
ペプチドベースの皮膚着色剤の調製
この予測的な実施例の目的は、ペプチドベースの皮膚着色剤を、身体洗浄抵抗性の皮膚結合ペプチドのスキン−シス−１（Ｓｋｉｎ−ｃｙｓ−１）（配列番号２０）とディスパース・オレンジ３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ３）染料との共有結合によって調製する方法について記載することである。染料をまずイソシアネートで官能性付与し、次いでスキン−シス−１（Ｓｋｉｎ−ｃｙｓ−１）ペプチドと反応させる。
【０１５２】
ディスパース・オレンジ３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ３）の官能性付与
ドライボックス内で、１４．２５ｇのディスパース・オレンジ３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ３）（アルドリッチ（Ａｌｄｒｉｃｈ））を添加漏斗（ａｄｄｉｔｉｏｎ  ｆｕｎｎｅｌ）内の乾燥ＴＨＦ４００ｍＬに懸濁する。磁気撹拌棒を有する２リットルの四つ首反応フラスコ（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）、コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ニューヨーク州（ＮＹ）；部品番号１５３３−１２）を乾燥トルエン２００ｍＬで帯電させる。フラスコを、コールドフィンガー・コンデンサー（ｃｏｌｄ  ｆｉｎｇｅｒ  ｃｏｎｄｅｎｓｅｒ）（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）、部品番号１２０９−０４）および添加漏斗を具備する第２のコールドフィンガー・コンデンサーに取り付け、フード内の油槽上に置く。
【０１５３】
ホスゲン（Ｐｈｏｓｇｅｎｅ）（２５．４ｍＬ）を室温で反応フラスコに濃縮させる。ホスゲン添加の完了後、油槽の温度を８０℃に上昇させ、ディスパース・オレンジ３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ３）懸濁液を、反応温度およびスクラバーからのガス放出を監視しながら、反応フラスコに滴下添加し２時間かけて１００ｍＬ増加させる。添加の間中、温度を６４℃もしくはそれ未満で維持する。添加完了後、反応物質を６４℃で１時間加熱し、次いで攪拌しながら室温になるまで一晩冷却しておく。
【０１５４】
反応溶媒を、４０℃もしくはそれ未満で含有量を維持しながら乾燥するまで真空蒸留し、さらに１時間真空を維持する。反応フラスコをドライボックスに移す、すなわち生成物を収集して一晩乾燥させる。所望の生成物をプロトンＮＭＲによって確認する。
【０１５５】
イソシアネートで官能性付与した染料とスキン−シス−１（Ｓｋｉｎ−ｃｙｓ−１）皮膚結合ペプチドとの共役
上記のように調製したイソシアネートで官能性付与したディスパース・オレンジ３（Ｄｉｓｐｅｒｓｅ  Ｏｒａｎｇｅ  ３）［（２−（４−イソシアントフェニル（ｉｓｏｃｙａｎｔｏｐｈｅｎｙｌ））−１−（４−ニトロフェニル）ジアゼン］（１６ｍｇ）を、ＤＭＦ５ｍＬに溶解し、ＤＭＦ１０ｍＬに溶解された、シンペプ（ＳｙｎＰｅｐ）から得られた、７５ｍｇの保護されていないスキン−シス−１（Ｓｋｉｎ−ｃｙｓ−１）ペプチド（配列番号２０）を含有する溶液に添加する。トリエチルアミン（３０ｍｇ）を添加して反応を触媒する。溶液を室温で２４時間撹拌する。溶媒を蒸発させ、暗赤褐色の粉末生成物を生成する。生成物をＭＡＬＤＩ質量分析によって分析し、付加体の形成を確認する。
【配列表】
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【国際調査報告】
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