(57)【要約】本発明は、ｍＲＮＡ干渉酵素、例えば全ての細胞ｍＲＮＡをインビボで効率的および選択的に分解して全タンパク質合成を急落させる一本鎖ＲＮＡ−およびＡＣＡ−特異的エンドリボヌクレアーゼである細胞毒素のＭａｚＦの独特の特性を利用した、大腸菌生細胞における単一タンパク質産生（ＳＰＰ）システムを記載する。ＭａｚＦ、および無ＡＣＡｍＲＮＡをコードするよう操作された標的遺伝子の同時発現によって、実質的にバックグラウンド細胞タンパク質の合成なしで、持続的かつ高レベル（９０％もの）の標的発現が生じる。注目すべきことに、標的合成は少なくとも４日間続き、細胞がその増殖停止にもかかわらず転写および翻訳能力を保持していることが示される。ＳＰＰ技術は、酵母およびヒトタンパク質、さらには細菌内在性膜タンパク質にも有効である。この新規なシステムは、これまで扱いにくいが生物学的に重要なタンパク質の構造および機能の研究を劇的に単純化できるかってないシグナル／ノイズ比を可能にする。
2008518623.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
形質転換可能生細胞において非標的細胞タンパク質合成を減少させながら単一標的タンパク質を発現するためのシステムであって、
（ａ）第１のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を少なくとも１つ有する細胞ｍＲＮＡを含む単離された形質転換可能生細胞；
（ｂ）ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする単離された核酸配列を含む第１の発現ベクター、ここでｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、少なくとも１つの第２のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を代替のトリプレットコドン配列で置換することによって変異されて変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列となる；
（ｃ）任意に、標的タンパク質をコードする単離された核酸配列を含む第２の発現ベクター、ここで標的タンパク質をコードする単離された核酸配列は、少なくとも１つの第３のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列が代替のトリプレットコドン配列で置換されて変異されて、変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列を生じる；
を含んでなり、単離された細胞が第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターで形質転換されており、単離された細胞が、細胞における変異標的タンパク質の発現を可能にする条件下で維持されることを特徴とするシステム。
【請求項２】
第１および第２の発現ベクターが、それぞれ少なくとも１つの調節配列をさらに含む、請求項１に記載のシステム。
【請求項３】
少なくとも１つの調節配列が、少なくとも１つの誘導性プロモーターである、請求項２に記載のシステム。
【請求項４】
第１の発現ベクターにおける少なくとも１つの誘導性プロモーターが、変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列に動作可能に連結されている、請求項３に記載のシステム。
【請求項５】
第２の発現ベクターにおける少なくとも１つの誘導性プロモーターが、変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列に動作可能に連結されている、請求項３に記載のシステム。
【請求項６】
（ｂ）における変異核酸配列が、非変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする、請求項１に記載のシステム。
【請求項７】
（ｃ）における変異核酸配列が、非変異標的タンパク質のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する変異標的タンパク質をコードする、請求項１に記載のシステム。
【請求項８】
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドが細胞において発現された場合に細胞メッセンジャーＲＮＡ中の少なくとも１つの第１のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を認識する、請求項１に記載のシステム。
【請求項９】
細胞メッセンジャーＲＮＡが変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドによって選択的に切断され、それによって非標的細胞タンパク質合成が減少する、請求項１に記載のシステム。
【請求項１０】
第１のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列、第２のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列および第３のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列が同じｍＲＮＡ干渉酵素認識配列である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１１】
ｍＲＮＡ干渉酵素認識配列がアデニン−シトシン−アデニンである、請求項１０に記載のシステム。
【請求項１２】
変異標的タンパク質をコードする、発現されたメッセンジャーＲＮＡが、細胞中で安定して維持される、請求項１に記載のシステム。
【請求項１３】
変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列がさらに変異されてレアコドンを好ましいコドンに置換して二重変異核酸配列を生じ、二重変異核酸配列が、非変異標的タンパク質のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異標的タンパク質をコードする、請求項１に記載のシステム。
【請求項１４】
二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列が、二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結されている誘導性プロモーターを含む、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１５】
二重変異標的タンパク質をコードする、発現されたメッセンジャーＲＮＡが、細胞中で安定して維持される、請求項１３に記載のシステム。
【請求項１６】
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列がさらに変異されてレアコドンを好ましいコドンに置換して二重変異核酸配列を生じ、二重変異核酸配列が、非変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする、請求項１に記載のシステム。
【請求項１７】
二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列が、二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結されている誘導性プロモーターを含む、請求項１６に記載のシステム。
【請求項１８】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項１に記載のシステム。
【請求項１９】
細胞が真核細胞である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２０】
細胞が原核細胞である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２１】
細胞が大腸菌細胞である、請求項２０に記載のシステム。
【請求項２２】
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドがＭａｚＦである、請求項１に記載のシステム。
【請求項２３】
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドがＭａｚＦの機能的断片である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２４】
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドがＭａｚＦの機能的バリアントである、請求項１に記載のシステム。
【請求項２５】
標的タンパク質が哺乳動物タンパク質である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２６】
哺乳動物タンパク質がヒトタンパク質である、請求項２５に記載のシステム。
【請求項２７】
標的タンパク質が酵母タンパク質である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２８】
標的タンパク質が微量細菌タンパク質である、請求項１に記載のシステム。
【請求項２９】
標的タンパク質が、毒性の少量タンパク質である、請求項２８に記載のシステム。
【請求項３０】
細胞が、少なくとも１つの放射性標識同位元素を含む培地中で維持される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３１】
変異タンパク質が、発現された場合に放射性同位元素標識される、請求項３０に記載のシステム。
【請求項３２】
標的タンパク質をコードする単離された核酸配列がポリメラーゼ連鎖反応によって増幅される、請求項１に記載のシステム。
【請求項３３】
（ａ）ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする単離された核酸配列を変異させて少なくとも１つの第１のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を代替のトリプレットコドン配列で置換して、変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列を生じる工程、
（ｂ）標的タンパク質をコードする単離された核酸配列を変異させて少なくとも１つの第２のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を代替のトリプレットコドン配列で置換して、変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列を生じる工程、
（ｃ）工程（ａ）の変異核酸配列を含む第１の発現ベクターおよび工程（ｂ）の変異核酸配列を含む第２の発現ベクターを提供する工程、
（ｄ）少なくとも１つの第３のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を含む細胞メッセンジャーＲＮＡ配列を有する、単離された、形質転換可能生細胞を提供する工程、
（ｅ）第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターを、単離された、形質転換可能生細胞に導入する工程、
（ｆ）変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドを発現させる工程、ならびに
（ｇ）単離された細胞を、細胞における変異標的タンパク質の発現を可能にする条件下で維持する工程
を含む、単離された生細胞における標的タンパク質の発現を増大させる方法。
【請求項３４】
第１および第２の発現ベクターが、それぞれ少なくとも１つの調節配列をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つの調節配列が少なくとも１つの誘導性プロモーターである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
第１の発現ベクターにおける誘導性プロモーターが、変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列に動作可能に連結されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターを誘導因子で誘導して変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドを発現させる工程をさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドが細胞メッセンジャーＲＮＡを選択的に切断し、それによって非標的細胞タンパク質合成を減少させる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
第２の発現ベクターにおける誘導性プロモーターが、変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列に動作可能に連結されている、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターを誘導因子で誘導して変異標的タンパク質を発現させる工程をさらに含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
第１の発現ベクターにおける誘導性プロモーターが変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列に動作可能に連結されており、第２の発現ベクターにおける誘導性プロモーターが変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列に動作可能に連結されており、さらに以下の工程：
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターを第１の誘導因子で誘導して変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドを発現させる工程、および
変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列に動作可能に連結された誘導性プロモーターを第２の誘導因子で誘導して変異標的タンパク質を発現させる工程
を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
細胞が第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターでコトランスフェクションされる、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
工程（ａ）が、
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列をさらに変異させてレアコドンを好ましいコドンで置換して、非変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素をコードする二重変異核酸配列を生じる工程
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
工程（ｂ）が、
変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列をさらに変異させてレアコドンを好ましいコドンで置換して、非変異標的タンパク質のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列を生じる工程
をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
工程（ａ）が、
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異誘導性核酸配列をさらに変異させてレアコドンを好ましいコドンで置換して、非変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドのアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素をコードする二重変異誘導性核酸配列を生じる工程
をさらに含み、
工程（ｂ）が、
変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列をさらに変異させてレアコドンを好ましいコドンで置換して、非変異標的タンパク質のアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を有する二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列を生じる工程
をさらに含む、
請求項３３に記載の方法。
【請求項４６】
第１の発現ベクターの二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする二重変異核酸配列が、二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結された第１の誘導性プロモーターを含み、第２の発現ベクターの二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列が、二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結された第２の誘導性プロモーターを含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結された第１の誘導性プロモーターを第１の誘導因子で誘導して二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドを発現させる工程、および
二重変異標的タンパク質をコードする二重変異核酸配列に動作可能に連結された第２の誘導性プロモーターを第２の誘導因子で誘導して二重変異標的タンパク質を発現させる工程
をさらに含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
工程（ａ）における少なくとも１つの第１のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列、工程（ｂ）における少なくとも１つの第２のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列、および工程（ｄ）における少なくとも１つの第３のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列が、同じｍＲＮＡ干渉酵素認識配列である、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
工程（ａ）、（ｂ）および（ｄ）におけるｍＲＮＡ干渉酵素認識配列がアデニン−シトシン−アデニンである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
工程（ｇ）において、変異標的タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡが細胞中で安定して維持される、請求項３３に記載の方法。
【請求項５１】
工程（ｇ）において、二重変異標的タンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡが細胞中で安定して維持される、請求項４５に記載の方法。
【請求項５２】
細胞が真核細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５３】
細胞が哺乳動物細胞である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
細胞が原核細胞である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５５】
細胞が大腸菌細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドがＭａｚＦである、請求項３３に記載の方法。
【請求項５７】
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドがＭａｚＦの機能的断片である、請求項３３に記載の方法。
【請求項５８】
変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドがＭａｚＦの機能的バリアントである、請求項３３に記載の方法。
【請求項５９】
二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドがＭａｚＦである、請求項４５に記載の方法。
【請求項６０】
二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドがＭａｚＦの機能的断片である、請求項４５に記載の方法。
【請求項６１】
二重変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドがＭａｚＦの機能的バリアントである、請求項４５に記載の方法。
【請求項６２】
標的タンパク質が哺乳動物タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項６３】
標的タンパク質がヒトタンパク質である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
標的タンパク質が酵母タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項６５】
標的タンパク質が微量細菌タンパク質である、請求項３３に記載の方法。
【請求項６６】
標的タンパク質が、毒性の少量タンパク質である、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
工程（ｇ）の間に少なくとも１つの放射性標識同位元素を含む培地中で細胞をインキュベートする工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項６８】
工程（ｂ）における標的タンパク質をコードする単離された核酸配列をポリメラーゼ連鎖反応によって増幅する工程をさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２００４年１１月４日に出願された、Ｉｎｏｕｙｅらによる「ｍＲＮＡ干渉酵素によって促進される生細胞における単一タンパク質」と題された米国仮出願第６０／６２４９７６号への優先権を主張する。この出願の全開示は、参照によって本明細書中に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、一本鎖ＲＮＡおよび配列に特異的なエンドリボヌクレアーゼであるｍＲＮＡ干渉酵素によって促進される、生細胞における単一タンパク質の産生システムに関する。
【背景技術】
【０００３】
ほとんどの細菌は、細胞ストレスに曝されると発現して、増殖停止および最終的に死をもたらす自殺遺伝子を含有する（Ｅｌｅｎｂｅｒｇ−ＫｕｌｋａおよびＧｅｒｄｅｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：４３〜７０頁（１９９９年）、Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：６６〜７１頁（２００４年）によって概説されている）。これらの毒素遺伝子は、通常、同じオペロン中の同族抗毒素遺伝子とともに同時発現される（中毒モジュールまたは抗毒素−毒素系と呼ぶ）。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、５つの中毒モジュールを有し（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：８０９〜１９頁（２００３年））、その中で、ＭａｚＥ／ＭａｚＦモジュールが最も徹底的に調査されている。ＭａｚＥ／ＭａｚＦ複合体のｘ線構造（Ｋａｍａｄａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１：８７５〜８４頁（２００３年））は公知であり、ＭａｚＦの酵素活性は、最近特徴が明らかになった（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３２３００〜３０６頁（２００３年））。
【０００４】
ＭａｚＦは、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）を配列ＡＣＡにおいて特異的に切断する、配列特異的エンドリボヌクレアーゼである。エンドヌクレアーゼは、核酸を核酸鎖内の様々な位置で切断する、酵素の大グループの１つである。エンドリボヌクレアーゼまたはリボヌクレアーゼは、ＲＮＡに特異的である。ＭａｚＦは、その主要な標的がインビボでのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）なので、ｍＲＮＡ干渉酵素と呼ばれる。転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）は、それぞれ、その二次構造またはリボソームタンパク質との結合のせいで、切断から保護されているようである。したがって、ＭａｚＦが発現すると、ｍＲＮＡのほとんど完全な分解を引き起こし、タンパク質合成の激烈な減少、および最終的には細胞死をもたらす（Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜２３頁（２００３年））。ＭａｚＦは、選択された細菌中に見られ、最近では、大腸菌タンパク質ＰｅｍＫ（プラスミドＲ１００によってコードされる）もまた、配列特異的エンドリボヌクレアーゼであることが示された（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２０６７８〜２０６８４頁（２００４年））。ＰｅｍＫは、高い特異性で、特異的核酸配列、すなわちＵＡＸでＲＮＡを切断する。ここでＸはＣ、ＡまたはＵである。本明細書中に援用される国際公開米国第２００４／０１８５７１号を参照のこと。これらの配列特異的エンドリボヌクレアーゼはさまざまな種で保存されており、生理機能および進化において必須の役割を果たしていることを強く示している。本発明者らは、この配列特異的エンドリボヌクレアーゼ毒素のファミリーを、「ｍＲＮＡ干渉酵素」と呼ぶ（Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２０６７８〜２０６８４頁（２００４年））。
【特許文献１】米国仮出願第６０／６２４９７６号
【非特許文献１】Ｅｌｅｎｂｅｒｇ−ＫｕｌｋａおよびＧｅｒｄｅｓ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．５３：４３〜７０頁（１９９９年）
【非特許文献２】Ｅｎｇｅｌｂｅｒｇ−Ｋｕｌｋａら、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１２：６６〜７１頁（２００４年）
【非特許文献３】Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３２：８０９〜１９頁（２００３年）
【非特許文献４】Ｋａｍａｄａら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １１：８７５〜８４頁（２００３年）
【非特許文献５】Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：３２３００〜３０６頁（２００３年）
【非特許文献６】Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜２３頁（２００３年）
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：２０６７８〜２０６８４頁（２００４年）
【特許文献２】国際公開米国第２００４／０１８５７１号
【非特許文献８】Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１年）
【非特許文献９】Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：６８７〜９１頁（１９８３年）
【特許文献３】米国特許第５６５６４９３号
【特許文献４】米国特許第５３３６７５号
【特許文献５】米国特許第５２３４８２４号
【特許文献６】米国特許第５１８７０８３号
【非特許文献１０】Ｔｈｉｅｒｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ２０（１）：４９〜５７頁（１９９８年）
【非特許文献１１】Ｑｉｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８７７〜８８２頁（２００４年）
【非特許文献１２】ＴｏｋｕｄａおよびＭａｔｓｕｙａｍａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６９３：５〜１３頁（２００４年）
【非特許文献１３】ＹａｍａｇｕｃｈｉおよびＩｎｏｕｙｅ、Ｃｅｌｌ  ５３：４２３〜４３２頁（１９８８年）
【非特許文献１４】Ｗｏｌｆｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：７８９８〜７９０２頁（１９８２年）
【非特許文献１５】Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：５０１〜１０頁（２００２年）
【非特許文献１６】Ａｍｉｔａｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：８２９５〜８３００頁（２００４年）
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本研究において、本発明者らは、ＭａｚＦの独特の切断特性を利用して、大腸菌生細胞における単一タンパク質産生（ＳＰＰ）システムを設計した。アミノ酸配列は変えずに無ＡＣＡｍＲＮＡを発現するよう操作された遺伝子を発現させると、バックグラウンド細胞タンパク質合成が実質的にないのに、標的タンパク質合成が、少なくとも９６時間にわたって高レベルで維持された。したがって、ＭａｚＦの毒性効果は、細胞生理機能に与える副作用は最小で、ｍＲＮＡを標的とする。実際、増殖停止の状態にもかかわらず、これらの細胞は、エネルギー代謝（ＡＴＰ産生）、アミノ酸およびヌクレオチド生合成ならびに転写および翻訳に必須な代謝および生合成活性を保持する。ＳＰＰシステムはヒトおよび酵母タンパク質に関して有効であることを示すとともに、この技術はまた、天然の発現レベルが比較的低い内在性内膜タンパク質を過剰発現させるにも有効である。このＳＰＰシステムによれば、単離されたタンパク質の回収を必要とする実験でタンパク質精製工程を不要のものとし、より重要なことには、インタクトな生細胞におけるタンパク質の構造的および機能的研究が可能にするような、かつてないシグナル／ノイズ比が得られる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ｍＲＮＡ干渉酵素、例えば一本鎖ＲＮＡ−およびＡＣＡ−特異的エンドリボヌクレアーゼである細菌毒素のＭａｚＦの、インビボで全ての細胞ｍＲＮＡを効率的および選択的に分解して全てのタンパク質合成の急落を生じるという独特の特性を利用する大腸菌生細胞における単一タンパク質産生（ＳＰＰ）システムを記述するものである。本発明の一実施形態において、形質転換可能生細胞において非標的細胞タンパク質合成を減少させかつ単一標的タンパク質を発現するためのシステムは以下の（ａ）−（ｃ）を含む。（ａ）少なくとも１つの第１のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を有する細胞ｍＲＮＡを含む、単離された形質転換可能生細胞；（ｂ）ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする単離された核酸配列を含む第１の発現ベクター、ここでｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする単離された核酸配列は、変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列を生じるように、少なくとも１つの第２のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を別のトリプレットコドン配列で置換することによって変異されているものである；（ｃ）場合により、標的タンパク質をコードする単離された核酸配列を含む第２の発現ベクター、ここで標的タンパク質をコードする単離された核酸配列は、変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列を生じるように、少なくとも１つの第３のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を別のトリプレットコドン配列で置換することによって変異されているものである。ここで、単離された細胞は第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターで形質転換され、単離された細胞は、細胞中での変異標的タンパク質の発現を可能にする条件下で維持される。
【０００７】
別の実施形態において、本発明は以下の（ａ）−（ｇ）の工程からなる、単離された生細胞における標的タンパク質の発現を増大させる方法を提供する。（ａ）ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする単離された核酸配列を、少なくとも１つの第１のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を別のトリプレットコドン配列で置換して変異させて、変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドをコードする変異核酸配列を生じる工程、（ｂ）標的タンパク質をコードする単離された核酸配列を、第２のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を少なくとも１つ、代替のトリプレットコドン配列で置換して変異させて、変異標的タンパク質をコードする変異核酸配列を生じる工程、（ｃ）工程（ａ）の変異核酸配列を含む第１の発現ベクターおよび工程（ｂ）の変異核酸配列を含む第２の発現ベクターを用意する工程、（ｄ）第３のｍＲＮＡ干渉酵素認識配列を少なくとも１つ含む細胞メッセンジャーＲＮＡ配列を有する、単離された形質転換可能生細胞を用意する工程、（ｅ）第１の発現ベクターおよび第２の発現ベクターを、前記単離された、形質転換可能生細胞に導入する工程、（ｆ）変異ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドを発現させる工程、ならびに（ｇ）単離された細胞を、細胞中での変異標的タンパク質の発現を可能にする条件下で維持する工程を含む。
【発明を実施するための最良の形態】
【０００８】
以下の定義は、本発明のパラメータを述べる。
略語「ＡＣＡ」は、アデニン−シトシン−アデニン配列をいう。
本明細書中で使用される場合、ある特定の核酸に関して、用語「コードする」、「コードしている」または「コードされる」は、特定のタンパク質に翻訳されるために核酸中に保存された情報をいう。タンパク質をコードする核酸は、核酸の翻訳領域内に非翻訳配列（例えばイントロン）を含んでもよく、またはかかる介在非翻訳配列を欠失していてもよい（例えば、ｃＤＮＡでのように）。タンパク質をコードする情報は、コドンの使用によって特定される。典型的にはアミノ酸配列は、核酸により「ユニバーサル」遺伝子コードを用いてコードされる。
【０００９】
用語「コドン」は、本明細書中で使用される場合、ポリペプチド鎖中のある１つのアミノ酸残基を特定する、ヌクレオチドのトリプレットをいう。ほとんどの生物は、２０または２１種のアミノ酸を用いて、タンパク質またはタンパク質前駆体であるそれらのポリペプチドを産生する。ＤＮＡ中には４種の可能なヌクレオチド、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）およびチミン（Ｔ）があるので、わずか２０種のアミノ酸と終止シグナルを認識するために、６４種もの可能なトリプレットがある。この冗長性のために、ほとんどのアミノ酸は、２つ以上のトリプレットによってコードされる。単一のアミノ酸を特定するコドンは、等しい頻度で使用されない。異なる生物は、しばしば、同じ所定のアミノ酸をコードするいくつかのコドンの１つに対して、特に「好む傾向」を示す。コード領域が希少コドンを高レベルでまたはクラスターとして含む場合、遺伝子の再合成または変異誘発によって希少コドンを除くと、発現が増大する可能性がある。本明細書中に援用される、Ｊ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１年）の１５．１２を参照のこと。したがって、「コドン選択」を行って、選択された宿主における発現を最適化してもよい。最も好ましいコドンは、高度に発現される遺伝子に頻繁に見られるものである。大腸菌における「コドン選好性」については、本明細書中に援用される、Ｋｏｎｉｇｓｂｅｒｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：６８７〜９１頁（１９８３年）を参照のこと。
【００１０】
当業者は、コードされる配列中の１つのアミノ酸またはわずかな割合のアミノ酸を変化、付加または欠失させるような、核酸、ペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質配列への個々の置換、欠失または付加が、変更により１つのアミノ酸が化学的に類似したアミノ酸と置き換えられる「保存的に変更されたバリアント」であることが理解できよう。用語「保存的に変更されたバリアント」とは、アミノ酸および核酸配列の両方に適用される。特定の核酸配列に関して、保存的に変更されたバリアントとは、同一のアミノ酸配列または保存的に変更されたバリアントをコードする核酸をいう。遺伝子コードの縮重のために、多数の機能的に同一な核酸が、ある所定のタンパク質をコードする。例えば、ＵＵＡ、ＵＵＧ、ＣＵＵ、ＣＵＣ、ＣＵＡおよびＣＵＧコドンは、全てアミノ酸ロイシンをコードする。したがって、コドンによってロイシンが特定される全ての位置で、コドンをコードされるポリペプチドを変化させることなく、上記の対応コドンのいずれかに変えることができる。かかる核酸変異は、「サイレント変異」であり、保存的に変更された変異の一種を表す。本明細書中、ポリペプチドをコードする全ての核酸配列は遺伝子コードを参照することによって、核酸の全ての可能なサイレント変異を記述するものである。当業者は、核酸中の各コドン（通常メチオニンに対する唯一のコドンであるＡＵＧ、および通常トリプトファンに対する唯一のコドンであるＵＧＧを除く）が変更されて機能的に同一な分子を生じ得ることが理解できよう。したがって、本発明のポリペプチドをコードする核酸の各サイレント変異は、本発明の範囲内である。
【００１１】
用語「エオタキシン」は、本明細書中で使用される場合、Ｃ−Ｃ（またはβ）ケモカインファミリーに属する、動物およびヒトの好酸球性炎症状態に関係している、７４個のアミノ酸残基からなる化学走性因子をいう。
【００１２】
本発明は、ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドの活性部分、断片、誘導体、変異体および機能的バリアントを含むが、かかる活性部分、断片、誘導体および機能的バリアントはｍＲＮＡ干渉酵素のなんらかの生物学的特性を保持するものであればよい。ｍＲＮＡ干渉酵素ポリペプチドの「活性部分」は、全長ポリペプチドより短いが測定可能な生物学的活性を保持するペプチドを意味する。ｍＲＮＡ干渉酵素の「断片」は、少なくとも５個〜７個の連続したアミノ酸、しばしば少なくとも約７個〜９個の連続したアミノ酸、典型的には少なくとも約９〜１３個の連続したアミノ酸、最も好ましくは少なくとも約２０個〜３０個の連続したアミノ酸の、アミノ酸残基の範囲を意味する。ｍＲＮＡ干渉酵素の「誘導体」またはその断片は、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることによって、例えばタンパク質をコードする核酸を操作することによって、またはタンパク質自体を変化させることによって、変更されたポリペプチドを意味する。天然のアミノ酸配列のかかる誘導体は、１つまたは複数のアミノ酸の挿入、付加、欠失または置換を含んでもよく、元のｍＲＮＡ干渉酵素の本質的な活性を変化させても変化させなくてもよい。
【００１３】
用語「遺伝子」は、ＤＮＡのセグメントの特定の位置に位置する、特定の機能的産物（すなわち、タンパク質またはｍＲＮＡ分子）をコードするヌクレオチドの秩序のある配列をいう。これは、コードＤＮＡの前および後の領域、ならびにエキソンの間のイントロンを含み得る。
【００１４】
用語「誘導する」または「誘導性」は、細胞を誘導物質に曝す、またはある状態、例えば熱に曝すことによって、転写または合成が増大する遺伝子または遺伝子産物をいう。
【００１５】
用語「誘導物質」または「誘導因子」は、リプレッサー因子と結合して、オペレーターに結合できない複合体を生じる、低分子量化合物または物理的因子をいう。
【００１６】
用語「誘導」は、特定の刺激に曝露された後の生物によるいくつかの特定の効果、例えば特定の遺伝子もしくはオペロンの転写またはタンパク質の産生を引き起こす作用または過程をいう。
【００１７】
細胞に核酸を挿入することの文脈における、用語「導入された」、「トランスフェクション」、「形質転換」、「形質導入」は、核酸が細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、プラスチドまたはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ得るか、自律レプリコンに転換され得るか、または一時的に発現され得る（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）、原核細胞または真核細胞への核酸の組み込みへの言及を含む。
【００１８】
用語「単離された」は、天然に生じる環境で見られる場合通常それに伴うか、または相互作用する成分を、実質的に含まない、核酸またはタンパク質等の物質をいう。単離された物質は、場合によって、その天然の環境では見られない物質を含有する。または、物質がその天然の環境にある場合、物質は、故意の人間の介入によって、合成によって（非天然に）変えられている。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドまたはウイルスベクター等のベクターに挿入された、あるいは原核もしくは真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、ＤＮＡ分子を含み得る。ＲＮＡに適用される場合、用語「単離された核酸」は、主に、上記で定義されたような単離されたＤＮＡ分子によってコードされるＲＮＡ分子をいう。あるいは、この用語は、それが天然の状態（すなわち、細胞または組織中）では一般に結合している他の核酸から十分分離されたＲＮＡ分子を言うこともある。単離された核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）はさらに、生物学的手段または合成手段によって直接作られ、作製時に存在する他の成分から分離された分子を表すこともある。
【００１９】
略語「ＩＰＴＧ」は、乳糖利用を促進する酵素であるβ−ガラクトシダーゼを、ｌａｃリプレッサーに結合して阻害することにより誘導する合成誘導物質、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシドをいう。例えば、ＩＰＴＧは、ｌａｃＺ遺伝子を含有するプラスミドベクターを用いたクローニング戦略において合成色素生成基質Ｘｇａｌと組み合わせて使用されて、組み換え体を、非組み換え細菌コロニーと区別する。
【００２０】
用語「ＭａｚＦ」は、本明細書中で使用される場合、エンドリボヌクレアーゼの一般的なクラス、特定の名前を有する特定の酵素、ならびに本発明におけるＭａｚＦポリペプチドの役割と一致した構造的および配列相同性を有するその活性断片および誘導体をいう。
【００２１】
略語「ｌｓｐＡ」は、大腸菌におけるシグナルペプチダーゼＩＩ活性の原因である遺伝子をいう。
【００２２】
略語「ＬｓｐＡ」は、大腸菌におけるリポタンパク質シグナルペプチダーゼ活性の原因である遺伝子をいう。
【００２３】
本発明に包含される酵素のファミリーは、「ｍＲＮＡ干渉酵素」と呼ばれる。本発明は、本発明におけるこの酵素ファミリーの役割と一致する構造的および機能的類似性を有する分子まで拡張されることが意図される。
【００２４】
本明細書中で使用される場合、用語「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれかの任意のＤＮＡまたはＲＮＡ分子を含み、一本鎖の場合、線状または環状の形態のいずれかの、その相補配列の分子をも含む。核酸分子の議論において、特定の核酸分子の配列または構造は、配列を提供する通常の慣習に従って、５’から３’の方向で本明細書中に記載され得る。他に限定されなければ、この用語は公知の類似体を包含する。
【００２５】
用語「オリゴヌクレオチド」は、ホスホジエステル結合によって連結された、２つ以上、好ましくは３つより多くのリボまたはデオキシリボヌクレオチドで構成される核酸分子をいう。
【００２６】
用語「オペレーター」は、遺伝子（複数可）の上流（５’）の、１つまたは複数の調節タンパク質（リプレッサーまたは活性化因子）が結合して（複数可）遺伝子の発現を制御するＤＮＡの領域をいう。
【００２７】
本明細書中で使用される場合、用語「オペロン」は、遺伝子発現の制御のために機能的に一体となった遺伝子単位をいう。これは、１つまたは複数のポリペプチドをコードする１つまたは複数の遺伝子、および構造遺伝子の転写を制御することによってその発現を制御する隣接した部位（プロモーターおよびオペレーター）からなる。用語「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター等の転写および翻訳制御配列を有し得る、宿主細胞または生物におけるポリペプチドコード配列の発現を促進する核酸セグメントをいう。
【００２８】
語句「動作可能に連結された」は、プロモーターと第２の配列との間の機能的結合をいうものであり、ここでプロモーター配列は、第２の配列に相当するＤＮＡ配列の転写を開始および媒介する。一般に、「動作可能に連結された」とは、連結される核酸配列が連続していることを意味し、２つのタンパク質コード領域を結合する必要のある場合は、連続していて同じリーディングフレーム中にあること意味する。
【００２９】
略語「ＯＲＦ」は、内部停止配列によって中断されていない、ペプチドまたはタンパク質をコードする能力のある、塩基の配列を含有する遺伝子の配列の部分である「オープンリーディングフレーム」を表す。オープンリーディングフレームは、開始コドンで始まり、終止コドンで終わる。終止または停止コドンは、ポリペプチドの末端を決定する。
【００３０】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書中で交換可能に使用され、アミノ酸残基のポリマーをいう。この用語は天然に生じるアミノ酸ポリマーに加え、１つまたは複数のアミノ酸残基が天然アミノ酸からその人工的な化学的類似体に変わったアミノ酸ポリマーにも適用される。
【００３１】
略語「ＰＣＲ」は、ポリメラーゼ連鎖反応をいい、これはＤＮＡの量を増幅させて、ＤＮＡの単離、クローニングおよび配列決定をより容易にする技術である。例えば、米国特許第５６５６４９３号、第５３３６７５号、第５２３４８２４号および第５１８７０８３号を参照のこと。これらは本明細書中に援用される。
【００３２】
本明細書中で使用される場合、用語「プロモーター」は、転写の開始の上流（５’）にあって、転写を開始するためのＲＮＡポリメラーゼおよび他のタンパク質の認識および結合にかかわるＤＮＡの領域をさす。用語「誘導性プロモーター」は、特定の化合物すなわち誘導物質もしくは誘導因子の存在、または特定の外部条件（例えば上昇した温度）のいずれかに応答した、プロモーターの活性化をいう。
【００３３】
語句「部位特異的変異誘発」は、それによって一片のＤＮＡに特定の部位で塩基変化、すなわち変異が導入される、組み換えＤＮＡ方法を用いたインビトロ技術をいう。
【００３４】
用語「非翻訳領域」またはＵＴＲは、本明細書中で使用される場合、塩基がタンパク質合成に関係していないＤＮＡの部分をいう。
【００３５】
用語、核酸の特定の配列の「バリアント」、「変異体」および「誘導体」は、特定の配列に密接に関連しているが、天然にまたは設計により配列または構造に変化を有する核酸配列をいう。「密接に関連する」とは、少なくとも６０％、しばしば８５％を超える配列のヌクレオチドが核酸配列の定義された長さにわたって一致することを意味する。密接に関連する核酸配列の間のヌクレオチド配列の変化または違いは、天然の特定の核酸配列が通常の複製または複写の過程の間に生じる配列中のヌクレオチド変化を表すこともある。他の変化を特定の目的のために配列に特異的に設計および導入することもできる。かかる特異的変化は、種々の変異誘発技術を用いてインビトロで行われ得る。かかる特異的に生じた配列バリアントは、元の配列の「変異体」または「誘導体」と呼ばれ得る。
【００３６】
当業者は、同様に、単一または複数のアミノ酸置換、欠失、付加または置換を有するタンパク質バリアントを産生し得る。これらのバリアントとしては、とりわけ以下のものを挙げることができる。（ａ）１つまたは複数のアミノ酸残基が保存的または非保存的アミノ酸で置換されたバリアント、（ｂ）１つまたは複数のアミノ酸が付加されたバリアント、（ｃ）少なくとも１つのアミノ酸が置換基を含むバリアント、（ｄ）ある種由来のアミノ酸残基が、保存的または非保存的位置のいずれかで、別の種の対応する残基に置換されたバリアント、および（ｄ）標的タンパク質が、融合パートナーのような別のペプチドまたはポリペプチド、タンパク質タグまたは他の化学的部分等に融合したバリアント、これは例えば抗体に対するエピトープ等標的タンパク質に有用な特性を付与し得る。かかるバリアントを得るための技術は、遺伝学的（抑制、欠失、変異等）、化学的および酵素的技術を含み、当業者に公知である。
【００３７】
本明細書中で使用される場合、用語「ベクター」および「発現ベクター」は、レプリコン、すなわちファージ、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルス等の、担体または輸送体として作用する任意の因子をいい、それに別の遺伝子配列またはエレメント（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が結合することによりその配列またはエレメントの複製と宿主細胞への伝達が可能になる。本明細書中に記載される大腸菌ＳＰＰシステムは、低温でタンパク質産生を誘導する、ｐＣｏｌｄＩベクターを利用する。
【００３８】
本明細書中および添付の特許請求の範囲で使用される場合、名詞は、文脈によって他に明らかに規定されない限り、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、同じ意味を有する。
【００３９】
他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する分野の当業者に一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載されるものと同様または同等な任意の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において用いられ得るが、好ましい方法および材料をここに説明する。本明細書中で言及される全ての刊行物は、本明細書中に援用され、刊行物が引用された方法および／または材料を開示および記載する。
【００４０】
〔実施例〕
以下の実施例は、本発明をどのようにして行い、使用するかの完全な開示および説明を当業者に提供するよう提出され、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図せず、また、下記の実験が行われた全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図しない。使用した数（例えば、量、温度等）に関しては正確を期したが、いくつかの実験誤差および偏りが計上されるべきである。他に示されなければ、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧近くである。
【００４１】
菌株およびプラスミド
下記の実験において、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いた。ｍａｚＦ遺伝子を、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＡＣＹＣｍａｚＦを作製した。ｐＡＣＹＣｍａｚＦを鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、ｐＡＣＹＣｍａｚＦ（−９ＡＣＡ）を構築した。最適な大腸菌コドン使用頻度（図２Ａ参照）に基づいてエオタキシン遺伝子を合成し、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンを作製した。ｐＣｏｌｄＩ（エオタキシン）を鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、テキストに記載されるように、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンを構築した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のための使用説明書に従って、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて変異誘発を行った。ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンを鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）エオタキシンもまた構築した。ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンを鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシン（＋ＡＣＡ）を構築した。野生型Ｈｓｐ１０遺伝子を、酵母染色体を鋳型として用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｈｓｐ１０を作製した。酵母染色体を鋳型として用いた二段階ＰＣＲによって無ＡＣＡＨｓｐ１０遺伝子を増幅し、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｈｓｐ１０（−ＡＣＡ）を作製した。鋳型として野生型Ｒｐｂ１２プラスミド、および変化した配列を含有する５’および３’オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって野生型および無ＡＣＡＲｐｂ１２遺伝子を増幅しｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｒｐｂ１２およびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｒｐｂ１２（−ＡＣＡ）をそれぞれ作製した。二段階ＰＣＲによって無ＡＣＡＬｓｐＡ遺伝子を増幅し、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＣｏｌｄＩＶ（ＳＰ−２）ｌｓｐＡ（−ＡＣＡ）を作製した。
インビボでのタンパク質合成のアッセイ
【００４２】
これらのプラスミドを担持する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、Ｍ９−グルコース培地中で増殖させた。培養物のＯＤ６００が０．５に達したときに、培養物を１５℃に４５分間移し、１ｍＭのＩＰＴＧを培養物に添加した。指示された時間間隔で、１０ｍＣｉ［３５Ｓ］−メチオニンを含む試験管に１ｍｌの培養物を加えた。１５分間のインキュベーション（パルス）後、０．２ｍｌの４０ｍｇ／ｍｌメチオニンを添加し、さらに５分間インキュベートした（チェイス）。標識された細胞をＭ９−グルコース培地で洗浄し、１００μｌのＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファーに再懸濁した。各試料１０μｌを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、それに続くオートラジオグラフィによって解析した。
【００４３】
膜画分の調製
１ｍｌの培養物から遠心分離（１０，０００×ｇで５分間）によって採取した細胞を、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）に懸濁し、超音波によって破砕した。破壊されなかった細胞を除去した後、全膜画分を、遠心分離（１００，０００×ｇで６０分間）によって得た。
【実施例１】
【００４４】
細胞タンパク質合成のＭａｚＦ誘発の効果
ｐＡＣＹＣｍａｚＦを担持している大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシン（１Ａおよび１Ｂの左パネル）またはｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）エオタキシン（１Ｂの右パネルおよび１Ｃ）のいずれかで形質転換した。細胞をＭ９培地中、３７℃で増殖させた。ＯＤ６００が０．５で、培養物を１５℃に移し、１５℃で４５分間インキュベートして細胞を低温に順化させた後、ＩＰＴＧ（１ｍＭ）を添加して、エオタキシンおよびＭａｚＦ発現の両方を誘導した（時間０）。各ゲルの上部に示される時点で、細胞を３５Ｓ−メチオニンで１５分間パルスラベルし、全細胞タンパク質をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）と、それに続くオートラジオグラフィによって解析した。
【００４５】
ｐＡＣＹＣｍａｚＦは、ｍａｚＦ遺伝子を、ＩＰＴＧ誘導性ファージＴ７プロモーターを含有する低コピー数プラスミドであるｐＡＣＹＣにクローニングして作製した。クローニング技術は、一般に、本明細書に援用されるＪ．ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＤ．Ｗ．Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ第３版、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（２００１年）に見ることができる。ＩＰＴＧを含有する寒天プレート上にコロニーはまったく形成されなかったので、ｐＡＣＹＣｍａｚＦで形質転換された大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）はｌａｃ誘導物質であるＩＰＴＧに感受性があった（示さず）。
【００４６】
図１は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる、ＭａｚＦ同時発現のあるまたはない状態での、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）およびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）を用いたヒトエオタキシンの発現を示す。図１Ｂは、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンで形質転換された細胞（左パネル）、およびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）エオタキシンで形質転換された細胞（右パネル）の結果を示す。図１Ｃは、ｐＡＣＹＣｍａｚＦとｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）エオタキシンで形質転換された細胞の結果を示し、ＬＢ（左パネル）またはＭ９培地（右パネル）中でインキュベートした。図１Ａおよび図１Ｂと同様にして細胞を処理し、示された時点で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとそれに続くクマシーブルー染色によって、全細胞タンパク質を解析した。解析のために同じ体積の培養物が採取されたことに留意されたい。分子量マーカーの位置をゲルの左側に示し、エオタキシンの位置を矢印で示す。ＭａｚＦはｍＲＮＡをＡＣＡ配列において効果的に切断するので、細胞タンパク質合成は３７℃でＭａｚＦ誘発の際に（Ｚｈａｎｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  １２：９１３〜２３頁（２００３年））、または図１Ａに示されるように１５℃で、劇的に阻害された。この寒冷ショック実験では、ｐＡＣＹＣｍａｚＦを担持している細胞を、まず１５℃で４５分間インキュベートして、寒冷ショック順化に必要とされる寒冷ショックタンパク質を誘導した（Ｔｈｉｅｒｉｎｇｅｒら、Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  ２０（１）：４９〜５７頁（１９９８年）参照）。次いで、ＩＰＴＧを培養物に添加して、ＭａｚＦを誘導した（図１Ａ、左パネルの時間０）。ゲルの上部に示される時点で、［３５Ｓ］メチオニンで１５分間細胞をパルスラベルした。パネルＡ左パネルは、ｐＡＣＹＣエオタキシンのみで形質転換された細胞の結果を示す。パネルＡ中央パネルは、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンのみで形質転換された細胞の結果を示す。パネルＡ右パネルは、両方のプラスミドで形質転換された細胞の結果を示す。
【００４７】
時間０で、ＩＰＴＧなしの細胞（対照、Ｃとして示される）のものと非常に類似したパターンが観察されたが、細胞タンパク質合成はＩＰＴＧの添加の１時間後に劇的に阻害された。６時間後、ほとんど全ての細胞タンパク質の合成が、ほとんど完全にブロックされた。
【実施例２】
【００４８】
ＭａｚＦ誘発細胞における無ＡＣＡｍＲＮＡの発現
本発明者らは、ＡＣＡ配列を含まないよう操作されたｍＲＮＡをＭａｚＦ誘発細胞中で発現させた場合にｍＲＮＡが細胞中で安定して維持されて、他のいかなる細胞タンパク質も産生することなく、ｍＲＮＡによってコードされるタンパク質が産生され得ると推測した。この可能性を試験するために、本発明者らは、アミノ酸配列を変化させることなく遺伝子中の全てのＡＣＡ配列を排除して、ヒトエオタキシンの遺伝子を合成した。図２Ａは、ヒトエオタキシンのアミノ酸配列およびその遺伝子のヌクレオチド配列を示す。ヌクレオチド配列は、好ましい大腸菌コドンを用いて設計し、下線を引いたトリプレットを、下記の実験においてＡＣＡに変化させた。ＡＣＡ配列は、リーディングフレーム中のＡＣＡ配列の位置にかかわらず、タンパク質のアミノ酸配列を変化させることなく他のＭａｚＦ切断不可能配列に変えることができる。これは６４種の可能性のあるトリプレット配列の中で類がないものである。
【００４９】
図２Ａに示されるエオタキシン遺伝子を、主要な寒冷ショックタンパク質であるＣｓｐＡのｃｓｐＡ遺伝子の翻訳促進エレメントからの配列（Ｑｉｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８７７〜８８２頁（２００４年））、６個のＨｉｓ残基、第Ｘａ因子切断部位、および遺伝子挿入のためのＮｄｅＩ部位由来のＨｉｓ−Ｍｅｔ配列からなる、１７残基の配列と融合させた。融合タンパク質のコード領域全体を、寒冷ショックの際に高タンパク質発現を可能にする寒冷ショックベクターであるｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）およびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）ベクター（Ｑｉｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８７７〜８８２頁（２００４年））に挿入した。ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）においては２つのＡＣＡ配列、シャイン・ダルガーノ配列と開始コドンとの間に１つと翻訳促進エレメントに１つ、をＡＵＡに転換させた。ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）においては、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）中の２つのＡＣＡ配列に加えて、５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）中の３つの他のＡＣＡ配列もまた、塩基置換によってＭａｚＦ切断不可能配列に変化させた（５’ＡＣＡから３’ＡＣＡへ順に、ＧＣＡ、ＡＵＡおよびＧＣＡ）。得られた構築体、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンおよびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）エオタキシンで、それぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。
【００５０】
ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンで形質転換された細胞に１５℃で寒冷ショックを与えて１時間低温に順化させた後、ＩＰＴＧを添加して、エオタキシン産生を誘導した。次いで細胞を［３５Ｓ］メチオニンで１５分間パルスラベルした（時間０、図１Ａ、中央パネル）。時間０から、７２時間のインキュベーションの間、他の細胞タンパク質とともに、ほぼ一定のレベルでエオタキシンが産生された。１２時間の時点でのエオタキシンの産生は、［３５Ｓ］メチオニン取り込みから判断して、全細胞タンパク質合成のおよそ１１％であった。
【００５１】
ｐＡＣＹＣｍａｚＦおよびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンの両方を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を用いてエオタキシンおよびｍａｚＦ遺伝子の両方が同時発現された場合、バックグラウンド細胞タンパク質合成は３時間の誘導後に劇的に減少したが、エオタキシン産生はほぼ一定のレベルで７２時間持続した（図１Ａ、右パネル）。興味深いことに、この実験におけるエオタキシン産生のレベルは、ＭａｚＦ誘発なしのもの（図１Ａ、中央パネル、１２時間で４７％）よりも高かった（図１Ａ、右パネル、１２時間で全タンパク質産生の１１％）。このおよそ５倍の濃縮は、細胞のｍＲＮＡがＭａｚＦによって分解されるので、エオタキシンｍＲＮＡ翻訳により多くのリボソームが利用可能になったことによるようである。注目すべきことに、１２時間より後の時点では、固有のタンパク質バンドは観察されなかった。
【００５２】
ｐＡＣＹＣｍａｚＦおよびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）エオタキシンの両方を含む細胞を用いて同じ実験を行った場合、ほとんどエオタキシンのみが産生された（図１Ｂ、右パネル）。注目すべきことに、エオタキシン産生はｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンを用いたものより実質的に高かった（図１Ｂ、左パネル）。この、より高いエオタキシンの産生は、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）中の５’−ＵＴＲのＡＣＡ配列を除いたことよる、エオタキシンｍＲＮＡの安定化によるようである。ＭａｚＦ誘発の１２時間後に、およそ９０％の［３５Ｓ］メチオニンがエオタキシンに取り込まれており、注目すべきことに、明確な細胞タンパク質バンドは認められず（図１Ｂ、右パネル）、本ＳＰＰシステムによってエオタキシンのシグナル対ノイズ比が劇的に向上したことが示される。高レベルのエオタキシン産生が誘導の９６時間後でも減少しなかったことは注目に値する。さらに、バックグラウンド細胞タンパク質合成は、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンを用いた場合（６時間で）よりも早く（３時間で）減少した（図１Ｂの左パネルを右パネルと比較されたい）。
【００５３】
両方のベクター（図１Ａおよび１Ｂ）があると、細胞増殖は、ＯＤ６００およびまた細胞タンパク質への［３５Ｓ］メチオニン取り込みで判断して、ＭａｚＦ誘発の際に完全にブロックされた。これらの結果から、ＭａｚＦ誘発によって増殖停止された細胞は生理学的に死滅しておらず、むしろ、そのｍＲＮＡがＡＣＡ配列を持たなければタンパク質を合成する能力を完全に有していることがわかる。これは、言い換えると、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞の、細胞の完全性が長時間にわたって無傷で維持されており、増殖停止された細胞において、エネルギー代謝だけでなくアミノ酸およびヌクレオチドの生合成機能も完全に活性があることを示す。さらに、ＲＮＡポリメラーゼ、リボソーム、ｔＲＮＡ、およびタンパク質合成に必要とされる他の全ての因子を含む、転写および翻訳機序もまた、十分維持されている。
【００５４】
ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）エオタキシンを用いたエオタキシンの産生は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動法後のクマシーブルー染色によって、主要なバンドとして現れる（図１Ｃ）。０時間の時点で、エオタキシンバンドはほとんど認められないが、１２時間目では主要なバンドになり、その濃度は２４時間後でも増大している。しかしながら、より長いインキュベーションしても、その産生レベルは顕著に促進されず、ＭａｚＦ誘発細胞におけるエオタキシン産生の閾値レベルがあることが示唆される。［３５Ｓ］メチオニン取り込みは９６時間にわたって一定に維持されたので（図１Ｂ）、ＳＰＰシステムにおけるエオタキシン産生および分解は、２４時間後に平衡に達するようである。ＭａｚＦ誘発の際の完全な増殖阻害から予想されるように細胞タンパク質のバンドの濃度が一定のままであったことに注目することは重要である。本発明者らは、エオタキシン産生がＬＢ培地等の富栄養培地によって影響されるかどうかを調べたが、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）を用いた場合、ＬＢ培地の使用によってエオタキシン産生が、限定されたＭ９培地で得られるレベルより促進されることはなかった。
【実施例３】
【００５５】
タンパク質産生に対するＡＣＡ配列の負の効果
図１で観察されるＭａｚＦ誘発細胞における排他的エオタキシン産生が、ＡＣＡを持たないエオタキシンｍＲＮＡによることを確認するために、図２Ａに示されるように、エオタキシン遺伝子に、そのアミノ酸配列を変化させることなく、５つの本来のＡＣＡ配列を付加した。ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）の使用によってエオタキシン遺伝子を発現させ、図１に記載されているのと同様にして細胞を処理し、［３５Ｓ］−メチオニンで標識した。左パネルは、無ＡＣＡエオタキシン遺伝子の結果を示し（図１Ｂの左パネルと同じである）、右パネルは５つのＡＣＡ配列を有するエオタキシン遺伝子の結果を示す。
【００５６】
この遺伝子を、図１に記載されるのと同じ条件下で、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）とｐＡＣＹＣｍａｚＦをともに用いることによって発現させた場合、最初の２時間低レベルのエオタキシン産生が観察されたのみで、後の時点では、無ＡＣＡｍＲＮＡでの発現（図２Ｂ、左パネル）と比較して、産生はバックグラウンドレベルまでさらに減少した（図２Ｂ、右パネル）。
【００５７】
不思議なことに、ｍａｚＦ遺伝子は異常に高いＡＣＡ含量（１１１残基のタンパク質中９つのＡＣＡ配列）を有するｍＲＮＡをコードし（ＭａｚＥでは８２アミノ酸残基中わずか２つのＡＣＡ配列）、細胞においてｍａｚＦ発現が負に調節されていることが示唆される。したがって、本発明者らは、無ＡＣＡｍａｚＦ遺伝子［ｐＡＣＹＣｍａｚＦ（−９ＡＣＡ）］を構築し、ｍａｚＦコード領域からこれらのＡＣＡ配列を除去すると、バックグラウンド細胞タンパク質産生をより効果的に減らせるかどうかを試験した。
【００５８】
図３は、ｍａｚＦ  ＯＲＦ中の全てのＡＣＡ配列を除去した場合の、エオタキシン発現に対する効果を示す。パネルＡは、ＭａｚＦのアミノ酸配列、およびそのＯＲＦのヌクレオチド配列を示す。下線を引かれたトリプレット配列（合計９個）は、野生型ｍａｚＦ遺伝子中で元々ＡＣＡであり、ＭａｚＦ切断不可能配列に変化された。パネルＢは、野生型ｍａｚＦ遺伝子（左パネル）および無ＡＣＡｍａｚＦ遺伝子（右パネル）を用いた、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）エオタキシンによるエオタキシンの発現を示す。実験は、図１に記載されるように行った。
【００５９】
図３Ａに示されるように、塩基置換はいずれもＭａｚＦのアミノ酸配列を変化させない。ｐＹＣＡＣｍａｚＦ（−９ＡＣＡ）を含む細胞は、Ｍ９培地中ではｐＹＣＡＣｍａｚＦを含む細胞よりも少し増殖が遅かったが、バックグラウンドタンパク質合成は、エオタキシン産生に顕著に影響することなく、さらに減少した（図３Ｂ）。これらの結果は、ｍＲＮＡ中のＡＣＡ配列がＭａｚＦ誘発細胞中のタンパク質産生に重要な役割を果たしていることを明らかに示す。
【実施例４】
【００６０】
酵母タンパク質へのＳＰＰシステムの適用
本発明者らは、ＳＰＰシステムを２つの酵母タンパク質、熱ショック因子Ｈｓｐ１０およびＲＮＡポリメラーゼサブユニットＲｐｂ１２に適用した。Ｈｓｐ１０およびＲｐｂ１２のＯＲＦは、それぞれ３つおよび１つのＡＣＡを含み、それらのアミノ酸配列を変化させることなく、これをＭａｚＦ切断不可能配列に転換した（図４Ａ）。これらおよび野生型配列をそれぞれｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）に挿入した。得られたプラスミドを、それぞれ、野生型Ｈｓｐ１０に対してｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｈｓｐ１０、変異Ｈｓｐ１０に対してｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｈｓｐ１０（−１ＡＣＡ）、野生型Ｒｐｂ１２に対してｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｒｐｂ１２、およびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｒｐｂ１２（−３ＡＣＡ）と名づけた。これらのプラスミドで、ｐＡＣＹＣｍａｚＦを含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を個々に形質転換した。次いでタンパク質発現パターンを、１５℃で４８時間調べた。
【００６１】
ＳＰＰシステムにおける酵母タンパク質の発現を図４に示す。ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）を用いて、酵母Ｈｓｐ１０およびＲｐｂ１２を、それらの遺伝子中のＡＣＡ配列ありおよびなしで、ＳＰＰシステムにおいて発現させた。実験は、図１に関して上述したように行った。図４Ａは、野生型および無ＡＣＡＨｓｐ１０遺伝子を用いたＨｓｐ１０の発現を示す。１０６個のコドンからなるｈｓｐ１０  ＯＲＦは３つのＡＣＡ配列（Ａ２５−Ｑ２６のＧＣＡ−ＣＡＡ、Ｔ２９のＡＣＡおよびＰ７６−Ｑ７７のＣＣＡ−ＣＡＧ）を含み、これらをそれぞれＧＣＣ−ＣＡＡ、ＡＣＣおよびＣＣＣ−ＣＡＧに転換した（変化させた塩基は太字で示す）。これらの塩基置換は、Ｈｓｐ１０のアミノ酸配列を変化させない。図４Ｂは、野生型および無ＡＣＡ遺伝子を用いたＲｐｂ１２の発現を示す。７０個のコドンからなるｒｐｂ１２  ＯＲＦは、Ｔ１０に１つのＡＣＡを含み、これはスレオニン用ＡＣＣに転換された。
【００６２】
図４Ａは、天然の３つのＡＣＡ配列（ＷＴ）があってもＨｓｐ１０はそれなりのレベルで発現されることを示す。しかしながら、全てのＡＣＡ配列を除去すると、Ｈｓｐ１０合成は有意に数倍増した。おそらくより多くのリボソームがＨｓｐ１０の産生に専ら用いられたために、無ＡＣＡＨｓｐ１０の場合、バックグラウンドもまた顕著に減少したことは、注目に値する。図４Ｂでは野生型パネルでは３５Ｓ−メチオニン取り込みがほとんど観察されず、無ＡＣＡＲｐｂ１２ではそれなりの取り込みが見られた。したがってＲｐｂ１２は１つのＡＣＡしか含まないにもかかわらず、これがＳＰＰシステムにおける産生において壊滅的な効果を引き起こすことを示す。これらの結果から、ＭａｚＦに対するｍＲＮＡ感受性はｍＲＮＡ中のＡＣＡ配列の数だけでなく、ＭａｚＦに対するＡＣＡ配列の効果的な感受性によっても支配され得ることが示唆される。リボソームはｍＲＮＡをＭａｚＦによるその切断から保護すると考えられるので、ＡＣＡ配列感受性は、ｍＲＮＡの一本鎖領域中のその位置、ならびにリボソームによるｍＲＮＡの効果的翻訳によって決定されるようである。
【実施例５】
【００６３】
内在性膜タンパク質へのＳＰＰシステムの適用
本発明者らは、ＳＰＰシステムを微量内在性膜タンパク質へ適用しようと試みた。本発明者らは、リポタンパク質のシグナルペプチドの切断に特異的に必要とされる、大腸菌中のシグナルペプチダーゼＩＩの遺伝子ｌｓｐＡを選択した（ＴｏｋｕｄａおよびＭａｔｓｕｙａｍａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６９３：５〜１３頁（２００４年））。大腸菌は、合計９６種のリポタンパク質を含み、これらは、成熟したリポタンパク質の第２のアミノ酸残基の性質（酸性であるか中性であるか）により、内膜または外膜のいずれかで集合することが知られている（ＹａｍａｇｕｃｈｉおよびＩｎｏｕｙｅ、Ｃｅｌｌ  ５３：４２３〜４３２頁（１９８８年）、ＴｏｋｕｄａおよびＭａｔｓｕｙａｍａ、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １６９３：５〜１３頁（２００４年））。他の全ての分泌タンパク質のシグナルペプチドは、シグナルペプチダーゼＩ（リーダーペプチダーゼ）によって切断されるが、これは大腸菌中に１細胞あたり５００分子のレベルでしか存在しないと推定される（Ｗｏｌｆｅら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：７８９８〜７９０２頁（１９８２年））。
【００６４】
リポタンパク質シグナルペプチダーゼ（ＬｓｐＡ）もまた、内膜中の非常に少量のタンパク質であると考えられている。これは１６４個のアミノ酸残基からなり、４つの推定膜貫通ドメインを含むので、ＬｓｐＡが内在性内膜タンパク質であることが示される。ＩｓｐＡ  ＯＲＦ中の３つのＡＣＡ配列を、そのアミノ酸配列を変化させることなく非ＭａｚＦ切断可能配列に変化させ、ｍａｚＦ（−９ＡＣＡ）を用いたＳＰＰシステムにおいて、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）を用いて無ＡＣＡＬｓｐＡを発現させた。
【００６５】
ｐＣｏｌｄＬ（ＳＰ−２）を用いたＳＰＰシステムにおける、内膜タンパク質ＬｓｐＡの発現を図５に示す。ＬｓｐＡ（シグナルペプチダーゼＩＩ、リポタンパク質シグナルペプチダーゼ）を、図１に記載されるようにＳＰＰシステムにおいて発現させた。パネルＡは全細胞タンパク質を示す。パネルＢは膜画分を示す。ＬｓｐＡの位置を矢印で示す。
【００６６】
図５Ａに示されるように、３５Ｓ−メチオニン取り込みがＩＰＴＧ誘導後１時間しか続かなかったので、ＳＰＰシステムにおけるＬｓｐＡの発現は、見かけ上細胞に対して毒性がある。しかし、図５Ｂに示されるように、０時間および１時間の時点でのＬｓｐＡバンド濃度は他の細胞タンパク質バンドと比較して最も高かったので（図５Ａ中のＣレーンと比較されたい）、かなりの３５Ｓ−メチオニンがＬｓｐＡに取り込まれるようである。０時間および１時間で観察されたバックグラウンドの細胞タンパク質合成は、超遠心分離によって容易に除去され、３５Ｓ−メチオニン取り込みは膜画分に高度に濃縮された。
【００６７】
考察
本研究は、ｍＲＮＡ干渉酵素による細胞タンパク質合成の完全な阻害が、細胞生理機能劣化効果がないことを示す。ＭａｚＦによりほとんど全ての細胞ｍＲＮＡがＡＣＡ配列で切断される結果として、細胞タンパク質合成は完全にブロックされ、これは言い換えると、完全な細胞増殖停止につながる。しかし驚いたことに、ＭａｚＦ誘発によって増殖停止された細胞は、ｍＲＮＡがＡＣＡ配列を有さないように改変されていれば、タンパク質合成を高レベルで長時間にわたって（１５℃で少なくとも９６時間）行う能力があることがわかった。このようにして、本発明者らは、インビボでの単一タンパク質産生（ＳＰＰ）を確立することに初めて成功した。
【００６８】
本発明者らの結果から、ＭａｚＦ誘発細胞が死んでいないことが実証される。ＭａｚＦを誘発しても、ＲＮＡおよびタンパク質合成を含む種々の細胞機能に必要とされる十分なＡＴＰを産生するエネルギー代謝は維持され、細胞の統合性は妨げられない。また、アミノ酸およびヌクレオチドの生合成もまた、無傷のまま維持される。新しい細胞タンパク質合成が完全にない状態で、これらの細胞機能に必要とされる全てのタンパク質因子（例えばタンパク質合成に必要とされるタンパク質因子）および細胞代謝が１５℃で少なくとも９６時間安定して維持されることがわかったのは、実に驚くべきことである。ＳＰＰ能力に影響することなくこれらの細胞機能がどれぐらいの時間保持され得るかは、まだ決定されていない。それらの細胞は一見して休止状態にあるように見えるが、それらは、ＲＮＡおよびタンパク質合成の能力を完全に有しており、栄養の欠乏による静止期によって引き起こされる休止状態とは明らかに異なる。本発明者らは、ＭａｚＦ誘発によって生じる生理学的状態を、「擬休止」状態と呼ぶことを提案する。擬休止細胞が死んでいるかいないかは、まだ決定されていない。細菌の生存能は、種々の処理後の細胞のコロニー形成能力によってしばしば決定される。ＭａｚＦ誘発後の大腸菌細胞の生存能をこの方法で調べたが、ＭａｚＥが誘発されれば、ＭａｚＦ誘発後の限られた時間のインキュベーションの間に、生育が再開されることが示されている（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら、Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．４５：５０１〜１０頁（２００２年）、Ａｍｉｔａｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：８２９５〜８３００頁（２００４年））。したがって、ＭａｚＦの効果はある程度可逆的であるが、全ての細胞が死ぬことになる「引き返し限界点」があると主張されている（Ａｍｉｔａｉら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８６：８２９５〜８３００頁（２００４年））。重要なのは、両方のグループによって用いられているＭａｚＥ遺伝子は、そのＯＲＦ中に２つのＡＣＡ配列を含むことである。本結果から、ＭａｚＦ誘発細胞において任意の遺伝子が発現されるためには、これらの遺伝子中のＡＣＡ配列がＭａｚＦ切断不可能配列に転換されなければならないことが明らかに示される。したがって、ＭａｚＦを発現している擬休止細胞は、ＭａｚＥのＯＲＦから全てのＡＣＡ配列が排除されていなければＭａｚＥを発現できない可能性が高い。
【００６９】
生細胞または非死細胞において目的の単一タンパク質のみを産生する能力は、これまで達成できなかった、生細胞におけるタンパク質の種々の側面を研究するための新規なアプローチを提供する。ＳＰＰシステムを用いると生細胞中で目的のタンパク質を同位元素（１５Ｎおよび１３Ｃ）で排他的に標識することができるので、生細胞中でタンパク質のＮＭＲ構造を調べることも可能かもしれない。最近本発明者らは、高発現寒冷ショックベクターｐＣｏｌｄによって目的のタンパク質を発現させると、タンパク質精製なしで細胞溶解物を用いて、タンパク質のＮＭＲ構造決定ができることを示した（Ｑｉｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８７７〜８８２頁（２００４年））。我々はここで、ＭａｚＦとｐＣｏｌｄベクターを一緒に用いると、バックグラウンド細胞タンパク質合成がＭａｚＦ誘発によってほとんど完全にブロックされるので、シグナル対ノイズ比が劇的に減少することを示す。これらの実験において、本発明者らは、ｐＣｏｌｄＩベクター自体からのＡＣＡ配列の除去もまた非常に重要であり、それによってエオタキシン産生が５倍向上することを示した。ＭａｚＦと組み合わせた場合、エオタキシン合成の割合は、３５Ｓ−メチオニン取り込みで判断して、全細胞タンパク質合成の９０％のレベルであった。残りの１０％は、いかなる特定のタンパク質バンドへも取り込まれることなく、一般的なバックグラウンドを構成した。これは、次に、大量に発現された場合は毒性があるために産生が限られている非常に少量のタンパク質の構造研究を行うことを可能にする。本発明者らは、実際にここで非常に少量の内膜タンパク質であるＬｓｐＡが膜画分中で排他的に発現され得ることを実証した。いくつかのタンパク質は生細胞中でしかフォールディングができないので、その構造研究はＳＰＰシステムの使用によってのみ達成され得る。
【００７０】
その他のＳＰＰシステム独特の利点は、ＭａｚＦ誘発の際に細胞増殖が完全にブロックされるので、高度に濃縮された培養物中で、目的のタンパク質が産生、または同位元素で標識され得る点である。ＳＰＰシステムを、タンパク質だけでなく他の非タンパク質化合物の産生にも使用することも可能である。さらに、ＳＰＰシステムは細菌に限定されず、ＭａｚＦおよび他のｍＲＮＡ干渉酵素を真核細胞に適用して酵母および哺乳動物細胞においてＳＰＰシステムをつくることも可能である。
【００７１】
本明細書中にある範囲の値が提供される場合、他に文脈によって明らかに規定されない限り、低い方の限界の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間の、間にある値のそれぞれ、およびその述べられた範囲の任意の他の述べられた、または間にある値が本発明に包含されることが理解される。述べられた範囲の、任意の具体的に排除された限界を条件として、これらの、より小さい範囲に独立して含まれ得る、より小さい範囲の上限および下限もまた、本発明に包含される。述べられた範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれた限界の両方を排除する範囲もまた、本発明に含まれる。
【００７２】
本明細書中で議論された刊行物は、単に本願の出願日前のそれらの開示に関してのみ提供される。本明細書中で、本発明が以前の発明のためにかかる刊行物に先立つ権利がないと認めるものと解釈されるべきものはない。さらに、提供される発行の日付は、実際の発行の日付と異なり得、個々に確認される必要があり得る。
【００７３】
特定の実施形態を参照しながら本発明を説明してきたが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、種々の変化がなされ得、同等物が置換され得ることは、当業者によって理解されるべきである。また、特定の状況、物質、組成物、方法、方法の１つまたは複数の工程を目的の本発明の精神および範囲に適応させるように、多くの変更がなされ得る。かかる変更は全て、ここに添付される特許請求の範囲の範囲内にあるよう意図される。
【図面の簡単な説明】
【００７４】
【図１Ａ】ＭａｚＦ同時発現ありまたはなしでｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）およびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）を使用した、ヒトエオタキシンの発現を示す図である。
【図１Ｂ】ＭａｚＦ同時発現ありまたはなしでｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）およびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）を使用した、ヒトエオタキシンの発現を示す図である。
【図１Ｃ】ＭａｚＦ同時発現ありまたはなしでｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）およびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）を使用した、ヒトエオタキシンの発現を示す図である。
【図２Ａ】エオタキシン発現に対するＡＣＡ配列の効果を示す図である。
【図２Ｂ】エオタキシン発現に対するＡＣＡ配列の効果を示す図である。
【図３Ａ】エオタキシン発現に対する、ＭａｚＦ  ＯＲＦ中の全てのＡＣＡ配列の除去の効果を示す図である。
【図３Ｂ】エオタキシン発現に対する、ＭａｚＦ  ＯＲＦ中の全てのＡＣＡ配列の除去の効果を示す図である。
【図４】ＳＰＰシステムにおける酵母タンパク質の発現を示す図である。
【図５】ｐＣｏｌｄＩＶ（ＳＰ−２）を用いたＳＰＰシステムにおける、内膜タンパク質であるＬｓｐＡの発現を示す図である。
【図１Ａ】
2008518623.tif 000003
【図１Ｂ】
2008518623.tif 000004
【図１Ｃ】
2008518623.tif 000005
【図２Ａ】
2008518623.tif 000006
【図２Ｂ】
2008518623.tif 000007
【図３Ａ】
2008518623.tif 000008
【図３Ｂ】
2008518623.tif 000009
【図４】
2008518623.tif 000010
【図５】
2008518623.tif 000011
【手続補正書】
【提出日】平成19年7月9日(2007.7.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
菌株およびプラスミド
下記の実験において、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を用いた。ｍａｚＦ遺伝子を、ｐＡＣＹＣＤｕｅｔ（Ｎｏｖａｇｅｎ）のＮｄｅＩ−ＸｈｏＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＡＣＹＣｍａｚＦを作製した。ｐＡＣＹＣｍａｚＦを鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、ｐＡＣＹＣｍａｚＦ（−９ＡＣＡ）を構築した。最適な大腸菌コドン使用頻度（図２Ａ参照、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）に基づいてエオタキシン遺伝子を合成し、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）のＮｄｅＩ−ＨｉｎｄＩＩＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンを作製した。ｐＣｏｌｄＩ（エオタキシン）を鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、テキストに記載されるように、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンを構築した。ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ部位特異的変異誘発キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のための使用説明書に従って、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いて変異誘発を行った。ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンを鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）エオタキシンもまた構築した。ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンを鋳型として用いた部位特異的変異誘発によって、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシン（＋ＡＣＡ）を構築した。野生型Ｈｓｐ１０遺伝子を、酵母染色体を鋳型として用いたＰＣＲによって増幅し、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｈｓｐ１０を作製した。酵母染色体を鋳型として用いた二段階ＰＣＲによって無ＡＣＡＨｓｐ１０遺伝子を増幅し、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｈｓｐ１０（−ＡＣＡ）を作製した。鋳型として野生型Ｒｐｂ１２プラスミド、および変化した配列を含有する５’および３’オリゴヌクレオチドを用いたＰＣＲによって野生型および無ＡＣＡＲｐｂ１２遺伝子を増幅しｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングして、プラスミドｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｒｐｂ１２およびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）Ｒｐｂ１２（−ＡＣＡ）をそれぞれ作製した。二段階ＰＣＲによって無ＡＣＡＬｓｐＡ遺伝子を増幅し、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）のＮｄｅＩ−ＢａｍＨＩ部位にクローニングしてプラスミドｐＣｏｌｄＩＶ（ＳＰ−２）ｌｓｐＡ（−ＡＣＡ）を作製した。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４９】
図２Ａ(ＳＥＱＩＤＮＯ：１)に示されるエオタキシン遺伝子を、主要な寒冷ショックタンパク質であるＣｓｐＡのｃｓｐＡ遺伝子の翻訳促進エレメントからの配列（Ｑｉｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８７７〜８８２頁（２００４年））、６個のＨｉｓ残基、第Ｘａ因子切断部位、および遺伝子挿入のためのＮｄｅＩ部位由来のＨｉｓ−Ｍｅｔ配列からなる、１７残基の配列と融合させた。融合タンパク質のコード領域全体を、寒冷ショックの際に高タンパク質発現を可能にする寒冷ショックベクターであるｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）およびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）ベクター（Ｑｉｎｇら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：８７７〜８８２頁（２００４年））に挿入した。ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）においては２つのＡＣＡ配列、シャイン・ダルガーノ配列と開始コドンとの間に１つと翻訳促進エレメントに１つ、をＡＵＡに転換させた。ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）においては、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）中の２つのＡＣＡ配列に加えて、５’−非翻訳領域（５’−ＵＴＲ）中の３つの他のＡＣＡ配列もまた、塩基置換によってＭａｚＦ切断不可能配列に変化させた（５’ＡＣＡから３’ＡＣＡへ順に、ＧＣＡ、ＡＵＡおよびＧＣＡ）。得られた構築体、ｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−１）エオタキシンおよびｐＣｏｌｄＩ（ＳＰ−２）エオタキシンで、それぞれ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５９】
図３Ａ(ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２)に示されるように、塩基置換はいずれもＭａｚＦのアミノ酸配列を変化させない。ｐＹＣＡＣｍａｚＦ（−９ＡＣＡ）を含む細胞は、Ｍ９培地中ではｐＹＣＡＣｍａｚＦを含む細胞よりも少し増殖が遅かったが、バックグラウンドタンパク質合成は、エオタキシン産生に顕著に影響することなく、さらに減少した（図３Ｂ）。これらの結果は、ｍＲＮＡ中のＡＣＡ配列がＭａｚＦ誘発細胞中のタンパク質産生に重要な役割を果たしていることを明らかに示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2008518623000001.app
【国際調査報告】
2008518623.tif 000012
2008518623.tif 000013