(57)【要約】  本明細書は、抗ウイルス抗体の存在または非存在に関して生物を評価することに関する方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、生物（例えばブタ種のメンバー、ブタ等）が抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含むか否かを判定するために使用することができる方法および材料を提供する。他の実施形態において、本明細書は、特定の生物がウイルスのワクチン型の接種を受けたか、ウイルスの天然型に感染したか、または該ウイルスに関して曝露経験がないかを判定するために使用することができる方法および材料を提供する。【選択図】  図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体に対するエピトープを含み、ＮＳＰ２ポリペプチドおよびＯＲＦ５ポリペプチドからなる群より選択されるＰＲＲＳウイルスポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに
（ｂ）抗ブタＩｇ抗体
を含む、ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するためのキット。
【請求項２】
前記ポリペプチドが少なくとも８アミノ酸残基長である、請求項１に記載のキット。
【請求項３】
前記ポリペプチドが、アミノ酸長にわたって配列番号５に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有する少なくとも１００アミノ酸長のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項４】
前記ポリペプチドが、アミノ酸長にわたって配列番号５に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の同一性を有する少なくとも１００アミノ酸長のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項５】
前記ポリペプチドが、アミノ酸長にわたって配列番号２２に存在する配列と少なくとも約８０％の同一性を有する少なくとも２０アミノ酸長のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項６】
前記ポリペプチドが、アミノ酸長にわたって配列番号２２に存在する配列と少なくとも約９０％の同一性を有する少なくとも２０アミノ酸長のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項７】
前記ポリペプチドが配列番号１１に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項８】
前記ポリペプチドが配列番号１６、１９、２２、２６、２９、３２、３９、４５、６１、または６４のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項９】
前記ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスに感染していない細胞により産生される組換えポリペプチドである、請求項１に記載のキット。
【請求項１０】
前記抗ブタＩｇ抗体が抗ブタＩｇＧまたはＩｇＭ抗体である、請求項１に記載のキット。
【請求項１１】
前記抗ブタＩｇ抗体がヤギ抗ブタＩｇ抗体である、請求項１に記載のキット。
【請求項１２】
ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１３】
ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１４】
ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ６ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１５】
前記抗ブタＩｇ抗体が酵素を含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１６】
ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１７】
ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含む対照サンプルを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１８】
ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含まないブタ血清を含む対照サンプルを含む、請求項１に記載のキット。
【請求項１９】
サンプルがブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含むか否かを判定する方法であって、
（ａ）ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体に対するエピトープを含み、ＮＳＰ２ポリペプチドおよびＯＲＦ５ポリペプチドからなる群より選択されるＰＲＲＳウイルスポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドと、該サンプルとを、該サンプル中に該抗体が存在する場合には該ポリペプチドが該サンプル中の抗体とポリペプチド：ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体複合体を形成する条件下で接触させるステップ；ならびに
（ｂ）該複合体の存在または非存在を検出するステップであって、該複合体の存在が該サンプルが該ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含むことを示すステップ
を含む方法。
【請求項２０】
前記サンプルがブタ血清サンプルである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ポリペプチドが少なくとも８アミノ酸残基長である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ポリペプチドが、アミノ酸長にわたって配列番号５に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有する少なくとも１００アミノ酸長のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記ポリペプチドが、アミノ酸長にわたって配列番号２２に存在する配列と少なくとも約８０％の同一性を有する少なくとも２０アミノ酸長のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリペプチドが配列番号１１に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリペプチドが配列番号１６、１９、２２、２６、２９、３２、３９、４５、６１、または６４のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスに感染していない細胞により産生される組換えポリペプチドである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記ステップ（ｂ）が前記複合体と抗ブタＩｇ抗体とを接触させることを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記抗ブタＩｇ抗体が酵素を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記ステップ（ａ）が、前記サンプルとキット中のポリペプチドとを接触させることを含み、該キットはＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記キットが、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を含むポリペプチド、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ６ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を含むポリペプチド、およびＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を含むポリペプチドを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記サンプルと追加のポリペプチドとを接触させて、ポリペプチド：ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体複合体を形成させるステップを含み、該追加のポリペプチドはＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチド、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ６ポリペプチドまたはＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項３２】
動物がウイルスのワクチン型の接種を受けたかまたは該ウイルスの天然型に感染したかを判定するためのキットであって、
（ａ）該ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合し、かつ該天然型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合するようなアミノ酸配列を有する第１ポリペプチド、および
（ｂ）該ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合し、かつ該天然型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合しないようなアミノ酸配列を有する第２ポリペプチド
を含むキット。
【請求項３３】
前記動物が脊椎動物である、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記動物がブタである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３５】
前記ウイルスがＰＲＲＳウイルスである、請求項３２に記載のキット。
【請求項３６】
前記ワクチン型が弱毒ＰＲＲＳウイルスである、請求項３５に記載のキット。
【請求項３７】
前記ワクチン型がＲｅｓｐＰＲＲＳワクチンである、請求項３５に記載のキット。
【請求項３８】
第１ポリペプチドがＶＲ２３３２またはＲｅｓｐＰＲＲＳ  ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ５ポリペプチドのＣ末端部分に存在するアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項３９】
第２ポリペプチドがＶＲ２３３２またはＲｅｓｐＰＲＲＳ  ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ５ポリペプチドのＮ末端側の半分に存在するアミノ酸配列を含む、請求項３５に記載のキット。
【請求項４０】
ウイルスに関する動物の免疫状態を判定する方法であって、該免疫状態は、（１）該動物がウイルスのワクチン型の接種を受けたか、（２）該動物が該ウイルスの天然型に感染したか、または（３）該動物が該ウイルスに関して免疫学的に曝露経験がないかであり、
（ａ）該動物からの第１サンプルと第１ポリペプチドとを、第１サンプル中に抗体が存在する場合には第１ポリペプチドが該抗体と第１ポリペプチド：抗体複合体を形成する条件下で接触させるステップであって、第１ポリペプチドは、該ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合し、かつ該天然型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合するようなアミノ酸配列を含む、上記ステップ、
（ｂ）該動物からの第２サンプルと第２ポリペプチドとを、第２サンプル中に抗体が存在する場合には第２ポリペプチドが該抗体と第２ポリペプチド：抗体複合体を形成する条件下で接触させるステップであって、第２ポリペプチドは、該ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合し、かつ該天然型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合しないようなアミノ酸配列を含む、上記ステップ、ならびに
（ｃ）第１ポリペプチド：抗体複合体の存在または非存在および第２ポリペプチド：抗体複合体の存在または非存在を検出するステップであって、第１ポリペプチド：抗体複合体が存在し、かつ第２ポリペプチド：抗体複合体が存在することは該動物が該ワクチン型ウイルスの接種を受けたことを示し、第１ポリペプチド：抗体複合体が存在し、かつ第２ポリペプチド：抗体複合体が非存在であることは、該動物が該天然型ウイルスに感染したことを示し、第１ポリペプチド：抗体複合体が非存在であり、かつ第２ポリペプチド：抗体複合体が非存在であることは、該動物が該ウイルスに関して免疫学的に曝露経験がないことを示すステップ
を含む方法。
【請求項４１】
前記動物が脊椎動物である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記動物がブタである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記ウイルスがＰＲＲＳウイルスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記ワクチン型が弱毒ＰＲＲＳウイルスである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記ワクチン型がＲｅｓｐＰＲＲＳワクチンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
第１ポリペプチドがＶＲ２３３２またはＲｅｓｐＰＲＲＳ  ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ５ポリペプチドのＣ末端側の半分に存在するアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４７】
第２ポリペプチドがＶＲ２３３２またはＲｅｓｐＰＲＲＳ  ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ５ポリペプチドのＮ末端側の半分に存在するアミノ酸配列を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４８】
ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチドまたは該ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチドの２０アミノ酸残基長を超える断片のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項４９】
ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドまたは該ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドの２０アミノ酸残基長を超える断片のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項５０】
ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ４ポリペプチドまたは該ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ４ポリペプチドの２０アミノ酸残基長を超える断片のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なポリペプチド。
【請求項５１】
ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１、ＮＳＰ２、またはＮＳＰ４ポリペプチドを発現する宿主細胞。
【請求項５２】
原核細胞である、請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
細菌細胞である、請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５４】
ＰＲＲＳウイルスに関するブタの免疫状態を判定する方法であって、該免疫状態は、（１）該ブタがＰＲＲＳウイルスのワクチン型の接種を受けたか、（２）該ブタが該ＰＲＲＳウイルスの天然型に感染したか、または（３）該ブタが該ＰＲＲＳウイルスに関して免疫学的に曝露経験がないかであり、
（ａ）該ブタからの第１サンプルと第１ポリペプチドとを、第１サンプル中に抗体が存在する場合には第１ポリペプチドが該抗体と第１ポリペプチド：抗体複合体を形成する条件下で接触させるステップであって、第１ポリペプチドは、該ワクチン型ＰＲＲＳウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合し、かつ該天然型ＰＲＲＳウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合するようなアミノ酸配列を含む、上記ステップ、
（ｂ）該ブタからの第２サンプルと第２ポリペプチドとを、第２サンプル中に抗体が存在する場合には第２ポリペプチドが該抗体と第２ポリペプチド：抗体複合体を形成する条件下で接触させるステップであって、第２ポリペプチドは、該ワクチン型ＰＲＲＳウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合し、かつ該天然型ＰＲＲＳウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合しないようなアミノ酸配列を含む、上記ステップ、ならびに
（ｃ）第１ポリペプチド：抗体複合体の存在または非存在および第２ポリペプチド：抗体複合体の存在または非存在を検出するステップであって、第１ポリペプチド：抗体複合体が存在し、かつ第２ポリペプチド：抗体複合体が存在することは該ブタが該ワクチン型ＰＲＲＳウイルスの接種を受けたことを示し、第１ポリペプチド：抗体複合体が存在し、かつ第２ポリペプチド：抗体複合体が非存在であることは該ブタが該天然型ＰＲＲＳウイルスに感染したことを示し、第１ポリペプチド：抗体複合体が非存在であり、かつ第２ポリペプチド：抗体複合体が非存在であることは該ブタが該ＰＲＲＳウイルスに関して免疫学的に曝露経験がないことを示すステップ
を含む方法。
【請求項５５】
ブタサンプル中のＰＲＲＳウイルス抗体を検出可能なアッセイにおいてバックグラウンドシグナルを低下させる方法であって、該アッセイが、ＰＲＲＳウイルスポリペプチドを含む固体支持体と該ブタサンプルとを接触させるステップを含み、該方法が、８．０を超える値のｐＨで該固体支持体をブロッキング溶液により処理するステップを含む方法。
【請求項５６】
前記ｐＨの値が８．５を超える、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記ｐＨの値が９．０を超える、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
前記ｐＨの値が９．５を超える、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
前記ｐＨの値が１０．０を超える請求項５５に記載の方法。
【請求項６０】
前記ブロッキング溶液がミルクである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６１】
前記ブロッキング溶液が脱脂粉乳含有ＰＢＳである、請求項５５に記載の方法。
【請求項６２】
８．０を超える値のｐＨでブロッキング溶液により処理した、ＰＲＲＳウイルスポリペプチドを含む固体支持体。
【請求項６３】
前記ｐＨの値が８．５を超える、請求項６２に記載の固体支持体。
【請求項６４】
前記ｐＨの値が９．０を超える、請求項６２に記載の固体支持体。
【請求項６５】
前記ｐＨの値が９．５を超える、請求項６２に記載の固体支持体。
【請求項６６】
前記ｐＨの値が１０．０を超える、請求項６２に記載の固体支持体。
【請求項６７】
前記ブロッキング溶液がミルクである、請求項６２に記載の固体支持体。
【請求項６８】
前記ブロッキング溶液が脱脂粉乳含有ＰＢＳである、請求項６２に記載の固体支持体。
【請求項６９】
プラスチックプレートである、請求項６２に記載の固体支持体。
【請求項７０】
固体支持体に付着したポリペプチドが該ポリペプチドに結合する抗体と反応する能力を増大させる方法であって、該固体支持体と該ポリペプチドおよびリゾチームとを接触させるステップを含む方法。
【請求項７１】
前記ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスポリペプチドである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチドである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスに感染していない細胞により産生された組換えポリペプチドである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
前記抗体が抗ＰＲＲＳウイルスポリペプチド抗体である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７５】
前記リゾチームがニワトリ卵リゾチームである、請求項７０に記載の方法。
【請求項７６】
前記ポリペプチドおよび前記リゾチームを、前記リゾチーム１ｎｇにつき前記ポリペプチド少なくとも４ｎｇの比で前記固体支持体と接触させる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７７】
前記リゾチームおよび前記ポリペプチドを、前記ポリペプチド１ｎｇにつき前記リゾチーム少なくとも１ｎｇの比で前記固体支持体と接触させる、請求項７０に記載の方法。
【請求項７８】
ＰＲＲＳウイルスポリペプチドおよびリゾチームと接触させた、ＰＲＲＳウイルスポリペプチドを含む固体支持体。
【請求項７９】
前記ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチドである、請求項７８に記載の固体支持体。
【請求項８０】
前記ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスに感染していない細胞により産生された組換えポリペプチドである、請求項７８に記載の固体支持体。
【請求項８１】
前記リゾチームがニワトリ卵リゾチームである、請求項７８に記載の固体支持体。
【請求項８２】
前記ポリペプチドおよび前記リゾチームを、前記リゾチーム１ｎｇにつき前記ポリペプチド少なくとも４ｎｇの比で前記固体支持体と接触させたものである、請求項７８に記載の固体支持体。
【請求項８３】
前記リゾチームおよび前記ポリペプチドを、前記ポリペプチド１ｎｇにつき前記リゾチーム少なくとも１ｎｇの比で前記固体支持体と接触させたものである、請求項７８に記載の固体支持体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書はウイルス感染したまたはワクチン接種した生物（例えば脊椎動物および哺乳動物）を同定する際に必要になる方法および材料に関する。例えば、本明細書は、ブタ生殖器・呼吸器症候群（ＰＲＲＳ）ウイルスなどのウイルスに対する抗体を有する哺乳動物（例えばブタ）を同定する方法および材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
ウイルスに感染した生物はその感染ウイルスに対する免疫応答を開始することができる。そのような免疫応答は該ウイルスに結合する抗体の産生を含むことができる。ウイルスに対する抗体の存在は該生物がそのウイルスに曝露されたことを示しうる。例えば、ＰＲＲＳウイルスに感染したブタはＰＲＲＳウイルスに結合するブタ抗体を含みうる。
【０００３】
ＰＲＲＳは雌ブタにおける生殖不全（例えば雌ブタにおける後期流産および死産）および子ブタにおける呼吸困難（例えば保育中の子ブタにおける間質肺炎）を特徴とするブタのウイルス性疾患である（Collinsら、J.Vet.Diagn.Invest., 4:117-126(1992)およびWensvoortら、Vet.Q., 13:121-130 (1991)）。その存在は１９８７年に北米で（Keffaber, Am.Assoc.Swine Pract.Newsl., 1:1-9 (1989)およびProceedings of the Mystery Swine Disease Committee Meeting、10月6日、Denver CO, pp.29-30. Livestock Conservation Institute, Madison, WI (1990)に記載のHill, Overview and History of Mystery Swine Disease (Swine Infertility and Respiratory syndrome)）および１９９０年に欧州で（Patonら、Vet Rec., 128:617 (1991)）発見された。病因は、感染したブタの主として肺マクロファージおよび血液から回収される小さなエンベロープを有するプラス鎖ＲＮＡウイルスである。このウイルスは、ニドウイルス目（Cavanagh, Arch. Virol., 142:629-633 (1997)）中のウマ動脈炎ウイルス（ＥＡＶ；den Boonら、J. Virol., 65:2910-2920 (1991)）、マウスの乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（ＬＤＶ；Plagemann and Moennig, Adv. Vir. Res., 41:99-192 (1992)）、およびサル出血熱ウイルス（ＳＨＦＶ；Godenyら、Proceedings of the  9th International Congress of Virology, p22、8月8〜13日、Glasgow, Scotland (1993) およびPlagemann, In Fields Virology, 3rd ed., pp.1105-1120. B. N. Fields, D. M. Knipe およびP. M. Howley(編), Philadelphia: Lippincott-Raven (1996)）を含むアルテリウイルス科（Arteriviridae）のメンバーである。他のアルテリウイルスと同様にＰＲＲＳウイルスは主にマクロファージに感染して、多くの組織の常在性マクロファージにおける持続的感染を確立する（Lawsonら、Virus Res., 51:105-113 (1997)およびChristopher-Henningsら、J. Vet. Diag. Invest., 7:456-464 (1995)）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本明細書は、生物がウイルスワクチン接種またはウイルス感染を受けたか否かを判定する生物の評価に関する方法および材料を包含する。例えば、本明細書は、生物（例えばブタ種のメンバー、ブタ等）が抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含むか否かを判定するために使用することができる方法および材料を提供する。例えばブタが抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含むか否かを判定することは、農家がＰＲＲＳウイルスに感染した可能性のあるブタを同定することを可能にする。このことは農家がＰＲＲＳウイルス感染の疑いのあるブタを未感染と考えられるブタから隔離することを可能にする。抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含まないブタを同定することはまた、ブタ農家が、多くの既に感染したブタを含む可能性のある集団全体に対して、ブタの未感染集団に予めワクチン接種することも可能にする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
一実施形態において、本明細書は特定の生物がウイルスのワクチン型の接種を受けたか、そのウイルスの天然型に感染したか、またはそのウイルスに関して曝露経験がないかどうかを判定するために使用することができる方法および材料を提供する。ワクチン接種した生物と天然型ウイルスに感染した生物を識別することにより、ヒトの場合は臨床医が、家畜の場合は農家が、各生物のウイルスに対する免疫の免疫学的由来を判定することが可能になる。例えば、ブタの集団を受け入れる農家が、そのブタの集団がＰＲＲＳウイルスワクチン接種を受けたか、ウイルスの天然型（例えばＰＲＲＳウイルスの野生分離株）に感染したか、またはそのウイルスに曝露経験がないかを判定することができる。この情報をもって、農家は、その集団にワクチン接種する必要がないか、またはどの未感染ブタが例えば天然型ウイルスに感染したブタから感染させられる危険にあるかを判定することができる。
【０００６】
一般的に、本明細書はブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するためのキットに関する。前記キットは、（ａ）ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体に対するエピトープを含み、ＮＳＰ２ポリペプチドおよびＯＲＦ５ポリペプチドからなる群より選択されるＰＲＲＳウイルスポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチド；ならびに（ｂ）抗ブタＩｇ抗体を含む。前記ポリペプチドは少なくとも８アミノ酸残基長であることができる。前記ポリペプチドは、アミノ酸長にわたって配列番号５に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有する少なくとも１００アミノ酸長のアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドは、アミノ酸長にわたって配列番号５に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも約９０％の同一性を有する少なくとも１００アミノ酸長のアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドは、アミノ酸長にわたって配列番号２２に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する少なくとも２０アミノ酸長のアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドは、アミノ酸長にわたって配列番号２２に示される配列と少なくとも約９０％の同一性を有する少なくとも２０アミノ酸長のアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドは、配列番号１１の核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドは、配列番号１６、１９、２２、２６、２９、３２、３９、４５、６１、または６４のアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドはＰＲＲＳウイルスに感染していない細胞により産生される組換えポリペプチドであってよい。前記抗ブタＩｇ抗体は抗ブタＩｇＧまたはＩｇＭ抗体とすることができる。抗ブタＩｇ抗体はヤギ抗ブタＩｇ抗体でありうる。前記キットはＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。前記キットはＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば配列番号３６または５４のアミノ酸配列を含むポリペプチド）を含むことができる。前記キットはＰＲＲＳウイルスＯＲＦ６ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば配列番号３２、４８、５１、または６７のアミノ酸配列を含むポリペプチド）を含むことができる。抗ブタＩｇ抗体は酵素を含むことができる。前記キットはＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。前記キットはブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含む対照サンプルを含むことができる。前記キットはブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含まないブタ血清を含む対照サンプルを含むことができる。
【０００７】
他の実施形態において、本明細書は、サンプルがブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含むか否かを判定する方法に関する。その方法は、（ａ）ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体に対するエピトープを含み、ＮＳＰ２ポリペプチドおよびＯＲＦ５ポリペプチドからなる群より選択されるＰＲＲＳウイルスポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドと、サンプルとを、サンプル中に該抗体が存在する場合には該ポリペプチドが該サンプル中の該抗体とポリペプチド：ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体複合体を形成する条件下で接触させるステップ；ならびに（ｂ）複合体の存在または非存在を検出するステップであって、該複合体の存在は該サンプルが該ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含むことを示すステップを含む。サンプルはブタ血清サンプルとすることができる。前記ポリペプチドは少なくとも８アミノ酸残基長であることができる。前記ポリペプチドは、アミノ酸長にわたって配列番号５に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列と少なくとも約８０％の同一性を有する少なくとも１００アミノ酸長のアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドは、アミノ酸長にわたって配列番号２２に示される配列と少なくとも約８０％の同一性を有する少なくとも２０アミノ酸長のアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドは、配列番号１１に示される核酸配列によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドは、配列番号３２のアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドは、配列番号１６、１９、２２、２６、２９、３２、３９、４５、６１、または６４のアミノ酸配列を含むことができる。前記ポリペプチドはＰＲＲＳウイルスに感染していない細胞により産生される組換えポリペプチドであってよい。前記ステップ（ｂ）は前記複合体と抗ブタＩｇ抗体とを接触させることを含む。前記抗ブタＩｇ抗体は酵素を含むことができる。前記ステップ（ａ）はサンプルとキット中のポリペプチドとを接触させることを含み、前記キットはＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドおよびＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。前記キットはＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば配列番号３６または５４のアミノ酸配列を含むポリペプチド）、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ６ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチド（例えば配列番号３２、４８、５１、または６７のアミノ酸配列を含むポリペプチド）、およびＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。前記方法は、サンプルと追加のポリペプチドとを接触させて、ポリペプチド：ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体複合体を形成させるステップを含んでもよく、前記追加のポリペプチドはＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチド、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ６ポリペプチドまたはＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチドに存在するアミノ酸配列を含むことができる。
【０００８】
他の態様において、本明細書は、動物がウイルスのワクチン型の接種を受けたかまたは該ウイルスの天然型に感染したかを判定するためのキットに関する。キットは、（ａ）ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合し、かつ天然型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合するようなアミノ酸配列を有する第１ポリペプチド、および（ｂ）ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合し、かつ天然型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合しないようなアミノ酸配列を有する第２ポリペプチドを含む。動物は脊椎動物（例えば鳥類または哺乳類）でありうる。動物はブタまたはヒトとすることができる。ウイルスはＰＲＲＳウイルスでありうる。ワクチン型は弱毒ＰＲＲＳウイルスでありうる。ワクチン型はＲｅｓｐＰＲＲＳワクチンであってもよい。第１ポリペプチドはＶＲ２３３２またはＲｅｓｐＰＲＲＳ  ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ５ポリペプチドのＣ末端部分に存在するアミノ酸配列を含むことができる。第２ポリペプチドはＶＲ２３３２またはＲｅｓｐＰＲＲＳ  ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ５ポリペプチドのＮ末端側の半分に存在するアミノ酸配列を含むことができる。
【０００９】
他の実施形態において、本明細書は、ウイルスに関する動物の免疫状態を判定する方法であって、該免疫状態が、（１）動物がウイルスのワクチン型の接種を受けたか、（２）動物がウイルスの天然型に感染したか、または（３）動物が該ウイルスに関して免疫学的に曝露経験がないかである方法に関する。前記の方法は、（ａ）第１ポリペプチドと動物からの第１サンプルとを、第１サンプル中に抗体が存在する場合には第１ポリペプチドが該抗体と第１ポリペプチド：抗体複合体を形成する条件下で接触させるステップであって、第１ポリペプチドは、ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合し、かつ天然型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合するようなアミノ酸配列を含む、上記ステップ；（ｂ）第２ポリペプチドと動物からの第２サンプルとを、第２サンプル中に抗体が存在する場合には第２ポリペプチドが該抗体と第２ポリペプチド：抗体複合体を形成する条件下で接触させるステップであって、第２ポリペプチドは、ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合し、かつ天然型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合しないようなアミノ酸配列を含む、上記ステップ；ならびに（ｃ）第１ポリペプチド：抗体複合体の存在または非存在および第２ポリペプチド：抗体複合体の存在または非存在を検出するステップ（第１ポリペプチド：抗体複合体が存在し、かつ第２ポリペプチド：抗体複合体が存在することは、動物がワクチン型ウイルスの接種を受けたことを示し、第１ポリペプチド：抗体複合体が存在し、かつ第２ポリペプチド：抗体複合体が非存在であることは、動物が天然型ウイルスに感染したことを示し、第１ポリペプチド：抗体複合体が非存在であり、かつ第２ポリペプチド：抗体複合体が非存在であることは、動物がそのウイルスに関して免疫学的に曝露経験がないことを示す）を含む。動物は脊椎動物（例えば鳥類または哺乳類）でありうる。動物はブタまたはヒトとすることができる。ウイルスはＰＲＲＳウイルスでありうる。ワクチン型は弱毒ＰＲＲＳウイルスであってもよい。ワクチン型はＲｅｓｐＰＲＲＳワクチンであってよい。第１ポリペプチドはＶＲ２３３２またはＲｅｓｐＰＲＲＳ  ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ５ポリペプチドのＣ末端部分に存在するアミノ酸配列を含むことができる。第２ポリペプチドはＶＲ２３３２またはＲｅｓｐＰＲＲＳ  ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ５ポリペプチドのＮ末端側の半分に存在するアミノ酸配列を含むことができる。
【００１０】
本明細書の他の態様は、ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドまたは該ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドの２０アミノ酸残基長を超える断片のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なポリペプチドに関する。
【００１１】
本明細書の他の態様は、ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ４ポリペプチドまたは該ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ４ポリペプチドの２０アミノ酸残基長を超える断片のアミノ酸配列を有する実質的に純粋なポリペプチドに関する。
【００１２】
本明細書の他の態様は、ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１、ＮＳＰ２、またはＮＳＰ４ポリペプチドを発現する宿主細胞に関する。前記細胞は原核細胞（例えば細菌細胞）でありうる。
【００１３】
本明細書の他の態様は、ブタサンプル中のＰＲＲＳウイルス抗体を検出可能なアッセイにおいてバックグラウンドシグナルを低下させる方法に関する。前記アッセイはＰＲＲＳウイルスポリペプチドを含む固体支持体とブタサンプルとを接触させるステップを含む。前記方法は前記固体支持体を８．０を超える（例えば８．５、９．０、９．５、１０．０、または１０．５を超える）値のｐＨでブロッキング溶液により処理するステップを含む。ブロッキング溶液はミルク（例えば脱脂粉乳含有ＰＢＳ）、タンパク質溶液、または動物血清であってよい。
【００１４】
本明細書の他の態様は、ＰＲＲＳウイルスポリペプチドを含む固体支持体に関する。前記固体支持体は８．０を超える（例えば８．５、９．０、９．５、１０．０、または１０．５を超える）値のｐＨでブロッキング溶液により処理されている。ブロッキング溶液はミルク（例えば脱脂粉乳含有ＰＢＳ）、タンパク質溶液、または動物血清であってよい。固体支持体はプラスチックプレート（例えば９６ウェルプレート）、ガラススライド、ガラスもしくはプラスチックビーズ等であってよい。
【００１５】
本明細書の他の態様は、固体支持体に付着したポリペプチドが該ポリペプチドに結合する抗体と反応する能力を増大させる方法に関する。その方法は固体支持体とポリペプチドおよびリゾチームとを接触させるステップを含む。ポリペプチドはＰＲＲＳウイルスポリペプチドでありうる。ポリペプチドはＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチドでありうる。ポリペプチドはＰＲＲＳウイルスに感染していない細胞により産生された組換えペプチドでありうる。抗体は抗ＰＲＲＳウイルスポリペプチド抗体でありうる。リゾチームはニワトリ卵リゾチームでありうる。ポリペプチドおよびリゾチームは、リゾチーム１ｎｇにつきポリペプチド少なくとも４ｎｇの比で固体支持体と接触させることができる。リゾチームおよびポリペプチドは、ポリペプチド１ｎｇにつきリゾチーム少なくとも１ｎｇの比で固体支持体と接触させることができる。
【００１６】
本明細書の他の態様は、ＰＲＲＳウイルスポリペプチドおよびリゾチームで処理された固体支持体に関する。ポリペプチドはＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチドでありうる。ポリペプチドはＰＲＲＳウイルスに感染していない細胞により産生された組換えポリペプチドでありうる。リゾチームはニワトリ卵リゾチームでありうる。ポリペプチドおよびリゾチームは、リゾチーム１ｎｇにつきポリペプチド少なくとも４ｎｇの比で固体支持体と接触させることができる。リゾチームおよびポリペプチドは、ポリペプチド１ｎｇにつきリゾチーム少なくとも１ｎｇの比で固体支持体と接触させることができる。
【００１７】
特に断らない限り、本明細書で使用する全ての技術および科学用語は本発明が関係する当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載するものと同様または等価の方法および材料が本発明の実施または試行に使用することができるが、適当な方法および材料を以下に述べる。本明細書中で言及した全ての刊行物、特許出願、特許、およびその他の引用文献はそれらの全体を参照により組み込む。係争の場合、本明細書が、定義を含めて、規制する。付け加えると、材料、方法、および実施例は例示的なものに過ぎず、限定的であることを意図するものではない。
【００１８】
本発明の他の特徴および利点は次の詳細な説明および特許請求の範囲から明らかであろう。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１９】
本明細書は、生物が、例えばウイルスワクチン接種（例えば組換えウイルスポリペプチドワクチンまたは弱毒ウイルスワクチンでのワクチン接種）またはウイルス感染により、ウイルス抗原に曝露されたことがあるか否かを判定するための、生物を評価することに関する方法および材料を提供する。例えば、本明細書は、ポリペプチド、上記ポリペプチドをコードする核酸、上記ポリペプチドを作製する方法、上記ポリペプチドを発現する宿主細胞、そのような宿主細胞を作製する方法、抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するためのキット、抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するための方法、ウイルスに関する生物の免疫状態を評価するためのキット、および生物の免疫状態を評価するための方法を提供する。
【００２０】
ポリペプチド
一実施形態において、本明細書は生物（例えばブタ）からのサンプル中に存在する抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するために使用することができるポリペプチドを提供する。抗ＰＲＲＳウイルス抗体は如何なるタイプの抗ＰＲＲＳウイルス抗体でありうる。例えば、抗ＰＲＲＳウイルス抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、またはＩｇＭ抗体でもよい。そのような抗体は、生物が、ＰＲＲＳウイルスポリペプチド、弱毒ＰＲＲＳウイルスワクチン、または病原性ＰＲＲＳウイルスなどのＰＲＲＳウイルス抗原に曝露されたときに、その生物中に形成され得る。加えて、抗ＰＲＲＳウイルス抗体は、限定するものではないが、ＶＲ−２３３２  ＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＰＲＵ８７３９２；米国特許第５，８４６，８０５号および第５，６８３，８６５号）、ＭＮ３０１００  ＰＲＲＳウイルス（Bierkら、Vet.Rec.,148:687-690(2001)）、弱毒ＰＲＲＳウイルス、例えばＲｅｓｐＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ０６６１８３）、１６２４４Ｂ  ＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ０４６８６９）、ＰＡ８  ＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ１７６３４８）、ＳＰ  ＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ１８４２１２）、ＮＶＳＬ９７−７９８５  ＩＡ  １−４−２  ＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ３２５６９１）、Ｐ１２９  ＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ４９４０４２）、ＣＨ−１ａ  ＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＹ０３２６２６）、ＪＡ１４２  ＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＹ４２４２７１）、ＮＶＳＬ９７−７８９５  ＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＹ５４５９８５）またはＰＬ９７−１  ＰＲＲＳウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＹ５８５２４１）を含む、如何なる種類のＰＲＲＳウイルスに結合する抗体であってもよい。同様に、前記抗ＰＲＲＳウイルス抗体は、限定するものではないが、北米、欧州、または他の何処か（例えば中国）に〔由来するＰＲＲＳウイルスの分離株および天然型を含むＰＲＲＳウイルスの野生分離株または天然型に結合する抗体であってよい。
【００２１】
本明細書で提供するポリペプチドは、ＰＲＲＳウイルスに感染しやすい生物からのサンプル中に存在する抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するために使用することができる。そのような生物としては、限定はないが、家畜のおよび野生化したブタおよび野生種のイノシシなどのブタ種が含まれる。ある場合には、本明細書で提供するポリペプチドはＰＲＲＳウイルスに感染しやすくない生物からのサンプル中に存在する抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するために使用することができる。例えば、本明細書で提供するポリペプチドは、例えばＰＲＲＳウイルスポリペプチド、弱毒ＰＲＲＳウイルスワクチン、または病原性ＰＲＲＳウイルスの注射により、ＰＲＲＳウイルス抗原に曝露されたウサギまたはマウスからのサンプル中に存在する抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するために使用することができる。ウサギまたはマウスにおいて抗ＰＲＲＳウイルス抗体が作製される場合、ウサギまたはマウス血清サンプル中の抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出することは、抗ＰＲＲＳウイルス抗体を産生するウサギまたはマウスを科学者が同定するのに役立つことができる。
【００２２】
任意のサンプルを生物から得て、抗ＰＲＲＳウイルス抗体の存在または非存在を評価することができる。そのようなサンプルとしては、限定はないが、血液サンプル、血清サンプル、組織サンプル（例えばリンパ組織、筋肉組織、および皮膚組織）が挙げられる。例えば、血液サンプルをブタから得て、ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体の存在または非存在を評価することができる。
【００２３】
本明細書で提供するポリペプチドは如何なる長さでもよい（例えば、８〜２５００アミノ酸残基）。ある実施形態において、ポリペプチドは少なくとも８アミノ酸残基を含むことができる。例えば、ポリペプチドの長さは８を超えて、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０、２５、３０、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、またはそれを超えるアミノ酸残基であってよい。他の実施形態において、ポリペプチドの長さは、２５〜８００アミノ酸残基、５０〜８００アミノ酸残基、５０〜４５０アミノ酸残基、５０〜４００アミノ酸残基、５０〜３００アミノ酸残基、１００〜４００アミノ酸残基、または１００〜３００アミノ酸残基であることができる。
【００２４】
前記ポリペプチドは任意のアミノ酸配列を有することができる。例えばポリペプチドは、ＰＲＲＳウイルスポリペプチド（例えば、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ３、ＮＳＰ４、ＮＳＰ５、ＮＳＰ６、ｐｏｌ、Ｃ／Ｈ、ＨＥＬ、ＣＯＲＯＮＡ、ＯＲＦ２、ＯＲＦ２ｂ、ＯＲＦ３、ＯＲＦ４、ＯＲＦ５、ＯＲＦ６、またはＯＲＦ７ポリペプチド）に存在するアミノ酸配列を含むことができる。ある実施形態では、ポリペプチドはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＰＲＵ８７３９２に示される配列のヌクレオチド１３３９〜３４９５によりコードされる領域などの、疎水性領域を欠損するＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドでありうる。他の実施形態では、ポリペプチドはＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５またはＯＲＦ６ポリペプチドのエクトドメインでありうる。例えば、ポリペプチドは、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５ポリペプチドの５’末端から最初のエクトドメイン（ＯＲＦ５  ５’エクトドメイン１）、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５ポリペプチドの５’末端から２番目のエクトドメイン（ＯＲＦ５  ５’エクトドメイン２）、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ６ポリペプチドの５’末端から最初のエクトドメイン（ＯＲＦ６  ５’エクトドメイン１）、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ６ポリペプチドの５’末端から２番目のエクトドメイン（ＯＲＦ６  ５’エクトドメイン２）、またはそれらの組合せを含むことができる。ポリペプチドが２つ以上（例えば２、３、４、５、６、または７以上）のエクトドメインを含む場合には、エクトドメインは互いに隣接してもよいし、またはリンカー配列（例えばＧＧＧＧＳアミノ酸リンカー配列）によって分離されていてもよい。
【００２５】
本明細書で提供するポリペプチドは、タグとして通常使用されるもの（例えばポリヒスチジンタグ、ｍｙｃタグ、ＧＦＰタグ、およびＧＳＴタグ）を含む追加のアミノ酸配列を含むことができる。例えば、ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドの５０アミノ酸断片はポリヒスチジンタグ（例えばＨＨＨＨＨＨ、配列番号３３）のアミノ酸配列を含むことができる。
【００２６】
本明細書で提供するポリペプチドは、（１）ある長さ、および（２）その長さにわたり同定されているアミノ酸配列に対してある同一性（％）を有するアミノ酸配列を含むことができる。同様に、本明細書で提供する単離された核酸はそのようなポリペプチドをコードすることができるか、または（１）ある長さ、および（２）その長さにわたり同定されている核酸配列に対してある同一性（％）を有する核酸配列を含むことができる。典型的には、同定されている核酸またはアミノ酸配列は、特定の配列番号もしくは特定のＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号により示される配列であるか、または特定のＰＲＲＳウイルス核酸もしくはポリペプチド（例えばＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチド）である。同定されている配列と比較される核酸もしくはアミノ酸配列は、典型的には標的配列と称せられる。例えば、同定されている配列は、配列番号１６、１９、または２２に示されるＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５ポリペプチド配列でありうる。
【００２７】
任意の核酸またはアミノ酸配列についての長さおよびその長さにわたるパーセント同一性は次のようにして決定することができる。先ず、核酸またはアミノ酸配列を、ＢＬＡＳＴＮ２．０．１４版およびＢＬＡＳＴＰ２．０．１４版を含むＢＬＡＳＴＺのスタンドアロン版から、ＢＬＡＳＴ２配列（Ｂｌ２ｓｅｑ）プログラムを使用して、同定されている核酸またはアミノ酸配列と比較する。このＢＬＡＳＴＺスタンドアロン版は、ニューヨーク州立大学のＯｌｄ  Ｗｅｓｔｂｕｒｙキャンパス図書館から（カタログ番号ＱＨ４４７．Ｍ６７１４）、同様にＦｉｓｈ＆Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎのウェブサイトから（"fr"ドット"com/blast/"）または米国政府Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトから（"ncbi"ドット"nlm"ドット"nih"ドット"gov"）得ることができる。Ｂｌ２ｓｅｑプログラムの使用法を説明する説明書はＢＬＡＳＴＺに添付のｒｅａｄｍｅファイルに見出すことができる。Ｂｌ２ｓｅｑは、ＢＬＡＳＴＮまたはＢＬＡＳＴＰのいずれかのアルゴリズムを使用して２つの配列間の比較を実行する。ＢＬＡＳＴＮは核酸配列を比較するために使用され、一方ＢＬＡＳＴＰはアミノ酸配列を比較するために使用される。２つの核酸配列を比較するために、選択肢が次のように設定されている：−ｉは比較すべき第１の核酸配列を含むファイルへの設定である（例えば、C:＼seq1.txt）；−ｊは比較すべき第２の核酸配列を含むファイルへの設定である（例えば、C:＼seq2.txt）；−ｐはｂｌａｓｔｎへの設定；−ｏは任意の所望ファイル名への設定（例えばC:＼output.txt）；−ｑは−１への設定；−ｒは２への設定；および他の全ての選択肢はそれらのデフォルト設定のままにする。例えば、次のコマンドは２つの配列間の比較を含む出力ファイルを生成するために使用することができる：C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastn -o c:＼output.txt -q -1 -r 2。２つのアミノ酸配列を比較するために、Ｂ１２ｓｅｑの選択肢を次のように設定する：−ｉは比較すべき第１のアミノ酸配列を含むファイルへの設定であり（例えば、C:＼seq1.txt）；−ｊは比較すべき第２のアミノ配列を含むファイルへの設定であり（例えば、C:＼seq2.txt）；−ｐはｂｌａｓｔｐへの設定であり；−ｏは任意の所望のファイル名への設定であり（例えば、C:＼output.txt）；全ての他の選択肢はそれらのデフォルト設定のままにする。例えば、２つのアミノ酸配列間の比較を含む出力ファイルを生成するために次のコマンドを使用することができる：C:＼Bl2seq -i c:＼seq1.txt -j c:＼seq2.txt -p blastp -o c:＼output.txt。標的の配列が同定されている配列のいずれかの部分と相同性を有していれば、その場合は指定した出力ファイルがアラインメントした配列としてこれらの相同性の領域を表示するであろう。標的配列が同定されている配列のいずれの部分とも相同性を有していなければ、その場合は指定した出力ファイルはアラインメントした配列を表示しない。
【００２８】
アラインメントを行った場合、長さは、任意の一致した位置で始まり任意の他の一致した位置で終わる同定されている配列の配列とのアラインメントにおいて表示される標的配列の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸残基の数を計数することにより決定される。一致した位置は、標的配列および同定されている配列の両方に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が表される任意の位置である。ギャップはヌクレオチドまたはアミノ酸残基ではないので、標的配列に表示されたギャップは数に入れない。同様に、同定されている配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基ではなく標的配列のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を計数するので、同定されている配列に表示されたギャップは数に入れない。
【００２９】
決定した長さにわたるパーセント同一性は、その長さにわたる一致位置数を計数してその数を長さで除し、次にその商に１００を乗ずることによって決定する。例えば、（１）１０００ヌクレオチドの標的配列をＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチド配列と比較して、（２）Ｂ１２ｓｅｑプログラムが標的配列からの２００ヌクレオチドを、２００ヌクレオチド領域の最初と最後のヌクレオチドが一致するＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチド配列の領域とアラインメントして表示し、（３）これら２００のアラインメントしたヌクレオチドにわたる一致数が１８０であれば、そのとき１０００ヌクレオチドの標的配列は２００の長さおよびその長さにわたる９０％の同一性を含む（すなわち、１８０÷２００＊１００＝９０）。
【００３０】
同定されている配列とアラインメントを行った単一の核酸またはアミノ酸標的配列はそれ自体のパーセント同一性を有する各々の長さをもつ多くの異なる長さを有し得ることが理解されるであろう。例えば、次の同定されている配列とアラインメントを行う２０ヌクレオチド領域を含む標的配列は、表Ａに掲載した長さを含む多くの異なる長さを有する。
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【００３１】
パーセント同一性の値は小数点第２位で四捨五入してあることを注意しておく。例えば、７８．１１、７８．１２、７８．１３、および７８．１４は７８．１に切り下げ、一方７８．１５、７８．１６、７８．１７、７８．１８および７８．１９は７８．２に切り上げてある。長さの値は常に整数であることも注意しておく。
【００３２】
ある実施形態において、前記ポリペプチドは、配列番号９、１６、１９、２２、２６、２９、３２、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、６１、６４、または６７に示される配列に対して、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００またはそれを超えるアミノ酸残基などの長さにわたって、少なくとも約７０パーセント（例えば少なくとも約７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセント）の同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
【００３３】
本明細書で提供するポリペプチドは実質的に純粋であることができる。本明細書においてポリペプチドに関して用いる「実質的に純粋」という用語は、ポリペプチドが天然に付随する他のポリペプチド、脂質、炭水化物、および核酸を実質的に含まないポリペプチドを指す。例えば、実質的に純粋なポリペプチドはその自然環境から取り出された任意のポリペプチドであり、少なくとも６０パーセント純粋である。ポリペプチドを指して本明細書で使用する「実質的に純粋」という用語は、化学的に合成されたポリペプチドも含む。実質的に純粋なポリペプチドは、少なくとも約６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または９９パーセント純粋であってよい。典型的には、実質的に純粋なポリペプチドは、非還元ポリアクリルアミドゲル上において単一の主要バンドを生ずるものでありうる。
【００３４】
ポリペプチドまたは実質的に純粋なポリペプチドを得るために、任意の方法を使用することができる。例えば、ポリペプチド合成技法と同様にアフィニティクロマトグラフィおよびＨＰＬＣなどの一般的なポリペプチド精製技法を使用することができる。加えて、実質的に純粋なポリペプチドを得るために、任意の材料を供与源として使用することができる。例えば、目的の特定のポリペプチドを過剰発現するように操作した培養細胞を実質的に純粋なポリペプチドを得るために使用することができる。そのような細胞は原核細胞（例えば大腸菌細胞などの細菌細胞）または真核細胞（例えば、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞）であってよい。ポリペプチドは該ポリペプチドがアフィニティマトリックスに捕捉されることが可能なアミノ酸配列を含むように設計することができる。例えば、ｃ−ｍｙｃ、ヘマグルチニン、ポリヒスチジン、またはＦｌａｇＴＭタグ（Ｋｏｄａｋ）などのタグをポリペプチド精製を補助するために使用することができる。そのようなタグは、カルボキシル末端またはアミノ末端などのポリペプチド内の任意の部位に挿入できる。有用でありうる他の融合物には、アルカリホスファターゼなどポリペプチドの検出に役立つ酵素が含まれる。
【００３５】
本明細書で提供するポリペプチドは、追加の成分を含むポリペプチド組成物に製剤化することができる。例えば、本明細書で提供するポリペプチドを他のポリペプチドと組み合わせて２種以上の異なるポリペプチド（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なるポリペプチド）を含む組成物を形成することができる。例えば、組成物はＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドおよびＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチドを含むことができる。本明細書で提供するポリペプチドの１つまたは２つ以上を含む組成物は、溶媒、懸濁剤または任意の他の媒体などの１つまたは２つ以上の担体を含むことができる。担体は液体または固体であってよく、所望の体積、濃度、およびその他適当な輸送および化学的特性を備えるように、所望用途に合わせて選択することができる。代表的な担体としては、限定はしないが、水；生理食塩水；結合剤（例えば、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；充填剤（例えば、ラクトースおよび他の糖類、ゼラチン、または硫酸カルシウム）；滑沢剤（例えば、デンプン、ポリエチレングリコール、または酢酸ナトリウム）；崩壊剤（例えば、デンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム）；および湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）が挙げられる。
【００３６】
核酸
本明細書で使用する「核酸」という用語は、ＲＮＡならびにＤＮＡ、例えばｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、および合成（例えば、化学的に合成された）ＤＮＡなどの両方を包含する。前記核酸は二本鎖または一本鎖であってよい。一本鎖の場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であってよい。さらに、核酸は環状でもまたは線状でもよい。
【００３７】
本明細書で核酸に関して使用する「単離された」という用語は、それが由来する生物またはウイルスの天然ゲノム中では直接隣接している配列の両者（一方が５’末端でかつ一方が３’末端）とは直接隣接していない天然の核酸を指す。例えば、単離された核酸は、限定はしないが、天然ゲノム中の組換えＤＮＡ分子に通常は直接隣接して見出される核酸配列の１つが除去されているかまたは存在していなければ、任意の長さのその組換えＤＮＡ分子でありうる。このように、単離された核酸には、限定はしないが、他の配列とは独立した別個の分子（例えば、ＰＣＲもしくは制限エンドヌクレアーゼ処理により作製されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片）として存在する組換えＤＮＡ、ならびにベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）中に、または原核細胞もしくは真核細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込まれる組換えＤＮＡが含まれる。それに加えて、単離された核酸には、ハイブリッドまたは融合核酸配列の一部である組換えＤＮＡ分子を含めることができる。
【００３８】
非天然の核酸配列は自然界には存在せず、天然ゲノム中で直接隣接する配列を有しないので、本明細書で核酸に関して使用する「単離された」という用語は、任意の非天然の核酸もまた含む。例えば、操作された核酸などの非天然核酸は単離された核酸と見なされる。操作された核酸は、通常の分子クローニングまたは化学的核酸合成技法を使用して作製することができる。単離された非天然核酸は他の配列とは独立であるか、あるいはベクター、自律的に複製するプラスミド、ウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）中に、または原核細胞もしくは真核細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込むことができる。さらに、非天然核酸には、ハイブリッドまたは融合核酸配列の一部である核酸分子を含めることができる。
【００３９】
例えば、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリー、またはゲノムＤＮＡ制限消化物を含むゲル切片中の数百から数百万の他の核酸分子の中に存在する核酸を単離された核酸と見なすべきでないことは、当業者には明らかであろう。
【００４０】
核酸および特定の細胞に関して本明細書で使用する「外因性の」という用語は、自然界に見出されるその特定の細胞に由来しない如何なる核酸をも指す。したがって、非天然核酸は、ひとたび細胞に導入されると、その細胞には外因性であると見なされる。非天然核酸は、その核酸が全体として自然界に存在しなければ、自然界に見出される核酸配列または核酸配列の断片を含むことができるということを注意することは重要である。例えば、発現ベクター内のゲノムＤＮＡ配列を含む核酸分子は非天然核酸であり、したがってひとたび細胞に導入されれば、その核酸分子（ゲノムＤＮＡにベクターＤＮＡが加わっている）は全体としては自然界には存在しないので、その細胞には外因性である。このように、全体としては自然界に存在しない任意のベクター、自律的に複製するプラスミド、またはウイルス（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、またはヘルペスウイルス）は非天然核酸であると見なされる。同様に、ＰＣＲまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により作製されたゲノムＤＮＡ断片、ならびにｃＤＮＡは、それらが自然界に見出されない別個の分子として存在するので、非天然核酸であると見なされる。自然界に見出されない配置にあるプロモーター配列およびポリペプチドをコードする配列を含む任意の核酸（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）は非天然核酸である。
【００４１】
天然の核酸が特定の細胞に対して外因性であることは可能である。例えば、Ｘというヒトの細胞から単離された完全な染色体は、ひとたびその染色体がＹというヒトの細胞に導入されれば、Ｙの細胞に関しては外因性核酸である。
【００４２】
単離された核酸は本明細書で提供する任意のポリペプチドをコードすることができる。例えば、単離された核酸は、ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドに通常存在する疎水性領域（例えば、ＶＲ−２３３２  ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドのアミノ酸残基１〜７２２）を欠損するＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドをコードする。ある実施形態において、核酸は、配列番号９、１６、１９、２２、２６、２９、３２、３６、３９、４２、４５、４８、５１、５４、６１、６４、または６７に示される配列に対して、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００またはそれを超えるアミノ酸残基などの長さにわたって、少なくとも約７０パーセント（例えば少なくとも約７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセント）の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードすることができる。他の実施形態において、核酸は、配列番号２、５、８、１１、１５、１８、２１、２５、２８、３１、３５、３８、４１、４４、４７、５０、５３、５６、５８、６０、６３、または６６に示される配列に対して、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、またはそれを超えるヌクレオチドなどの長さにわたって、少なくとも約７０パーセント（例えば少なくとも約７５、８０、８５、９０、９５または９９パーセント）の同一性を有する核酸配列を有することができる。
【００４３】
本明細書で提供する単離された核酸は、長さが少なくとも約５塩基（例えば、長さが少なくとも約５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、または５０００塩基）であってよく、ハイブリダイゼーション条件下で、本明細書で提供するポリペプチド（例えば、ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ＰポリペプチドまたはＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５／ＯＲＦ６キメラポリペプチド）をコードする核酸のセンスまたはアンチセンス鎖とハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション条件は中程度または高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とすることができる。
【００４４】
本発明の目的において、中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、２５ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ７．４）、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５０μｇ／ｍＬ変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、および１〜１５ｎｇ／ｍＬプローブ（約５×１０７ｃｐｍ／μｇ）を含むハイブリダイゼーション溶液中約４２℃でハイブリダイゼーションを実施し、一方約５０℃で２×ＳＳＣおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液で洗浄を実施することを意味する。
【００４５】
高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件とは、２５ｍＭ  ＫＰＯ４（ｐＨ７．４）、５×ＳＳＣ、５×Ｄｅｎｈａｒｔ溶液、５０μｇ／ｍＬ変性超音波処理サケ精子ＤＮＡ、５０％ホルムアミド、１０％硫酸デキストラン、および１〜１５ｎｇ／ｍＬプローブ（約５×１０７ｃｐｍ／μｇ）を含むハイブリダイゼーション溶液中約４２℃でハイブリダイゼーションを実施し、一方約６５℃で０．２×ＳＳＣおよび０．１％ドデシル硫酸ナトリウムを含む洗浄溶液で洗浄を実施することを意味する。
【００４６】
単離された核酸は、限定はしないが、通常の分子クローニングおよび化学的核酸合成技法を含む任意の方法を使用して得ることができる。例えば、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）で提供されるＰＲＲＳウイルス核酸配列（例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＰＲＵ８７３９２）と類似性を有する核酸配列を含む単離された核酸を得るために、例えばＰＣＲを使用することができる。ＰＣＲとは、米国特許第４，６８３，１９５号に記載されたものと同様な手法で標的核酸を増幅する操作または技法、および前記特許に記載された操作に続く改良を指す。一般的に、増幅しようとする潜在的鋳型と対になる鎖に配列が同一または類似であるオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、目的領域の末端またはその外側からの配列情報を使用する。核酸配列は、ＰＣＲを使用してＲＮＡまたはＤＮＡから増幅することができる。例えば、総細胞ＲＮＡ、全ゲノムＤＮＡ、およびｃＤＮＡから、ならびにバクテリオファージ配列、プラスミド配列、ウイルス配列等から核酸配列をＰＣＲ増幅によって単離することができる。鋳型の供与源としてＲＮＡを使用するとき、相補ＤＮＡ鎖を合成するために逆転写酵素を使用することができる。
【００４７】
それに加えて、核酸およびアミノ酸データベース（例えばＧｅｎＢａｎｋ（登録商標））を、単離された核酸を得るために使用することができる。例えば、本明細書で提供するポリペプチドをコードする核酸配列に対してある程度の相同性を有する任意の核酸配列を、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）を検索するクエリーとして使用することができる。
【００４８】
宿主細胞
宿主細胞は、本明細書で述べた単離された核酸を含むようにデザインできる。そのような細胞は原核細胞（例えば、大腸菌、枯草菌、またはアグロバクテリウム・ツメファシエンス、ストレプトミセス種細胞などの細菌細胞）または真核細胞（例えば、限定はしないが、サッカロミセス種細胞およびピヒア・パストリス細胞を含む酵母細胞などの真菌細胞；昆虫細胞；または哺乳動物細胞）であってよい。本明細書で提供する単離された核酸を含む細胞はポリペプチドを発現する必要はないことを注意しておく。さらに、単離された核酸は細胞のゲノムに組み込まれてもよいし、またはエピソーム状態で維持されてもよい。したがって、宿主細胞には本明細書で提供する単離された核酸を含む構築物を安定的にまたは一過性にトランスフェクトすることができる。典型的には、宿主細胞は本明細書で提供するポリペプチドをコードする外因性核酸を含み、そのコードされるポリペプチドを発現する。
【００４９】
単離された核酸分子を細胞に導入するために任意の方法を用いることができる。例えば、リン酸カルシウム沈殿法、エレクトロポレーション法、ヒートショック法、リポフェクション法、マイクロインジェクション法、およびウイルス媒介核酸導入法が、単離された核酸分子を細胞に導入するために使用することができる一般的な方法である。
【００５０】
抗ＰＲＲＳウイルス抗体の検出
本明細書で提供する方法および材料は、生物（例えばブタ）中の抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するために使用することができる。一般的に、本明細書で提供するＰＲＲＳウイルスポリペプチドと生物からのサンプルとを、該サンプル中に抗ＰＲＲＳウイルス抗体が存在する場合にはＰＲＲＳウイルスポリペプチドがサンプル中の前記抗体に結合して抗体−ポリペプチド複合体を形成する条件下で接触させることにより、抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出する。そのような複合体は、例えば、その生物の抗体に結合する標識抗体を使用して検出することができる。
【００５１】
本明細書で提供するＰＲＲＳウイルスポリペプチドのいずれでも抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するために使用することができる。さらに、本明細書で提供する多数の異なるＰＲＲＳウイルスポリペプチドは、組み合わせて抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するために使用することができる。例えば、ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１、ＮＳＰ２、ＮＳＰ４、およびＯＲＦ７ポリペプチドを含むキットを、抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するために使用することができる。
【００５２】
典型的には、ＰＲＲＳウイルスポリペプチドを、試験紙、マイクロタイタープレート、粒子（例えばビーズ）、アフィニティカラム、およびイムノブロット膜などの固体基板上に固定化する。固体基板およびそれらの使用法の代表的説明については米国特許第５，１４３，８２５号、第５，３７４，５３０号、第４，９０８，３０５号、および第５，４９８，５５１号を参照されたい。例えば、ＰＲＲＳウイルスポリペプチドを、既知の方法を使用して９６ウェルプレートなどの固体基板上に固定化してから、それを、ブタからのサンプルと、サンプル中に存在する抗ＰＲＲＳウイルス抗体が固定化ＰＲＲＳウイルスポリペプチドに結合して抗体−ポリペプチド複合体を形成することができるような条件で接触させることができる。好適な条件には、適当なバッファー（例えば、リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．２〜７．４）中、室温での少なくとも約１０分〜約１０時間（例えば、約１〜約２．５時間）のインキュベーションが含まれる。その後で、結合しなかった物質を洗い流し、抗体−ポリペプチド複合体を検出することができる。
【００５３】
そのような抗体−ポリペプチド複合体の存在を検出することにより、ＰＲＲＳウイルス感染を示すことができる。抗体−ポリペプチド複合体を検出するために任意の方法を用いることができる。例えば、抗体−ポリペプチド複合体に対する結合アフィニティを有する指示分子を、抗体−ポリペプチド複合体を検出するために使用することができる。本明細書で使用する「指示分子」とは、所定のポリペプチド、抗体、または抗体−ポリペプチド複合体を裸眼または適当な機器のいずれかにより可視化できるようにする任意の分子である。典型的には、指示分子は、サンプルを得た生物（例えばブタ）からの抗体、例えば抗ブタＩｇＧ抗体に対する結合アフィニティを有する抗体である。指示分子は標準的方法によって直接的または間接的いずれかにより検出することができる。Current Protocols in Immunology, Chapter 2及び8, Coliganら(編), John Wiley & Sons (1996)を参照されたい。直接的検出のためには、指示分子を放射性同位体、蛍光色素、その他の非放射性標識、または任意の他の適当な発色団で標識することができる。間接的検出法のためには、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）およびアルカリホスファターゼ（ＡＰ）などの酵素を指示分子に結合して、ＨＲＰまたはＡＰのための標準的アッセイを使用して、抗体−ポリペプチド複合体の存在を検出することができる。あるいは、指示分子をアビジンまたはストレプトアビジンに結合して、抗体−ポリペプチド複合体の存在を、例えば蛍光色素に結合したビオチンで、またはその逆で、検出することができる。したがって、抗体−ポリペプチド複合体を検出するためのアッセイ様式としては、競合ＥＬＩＳＡなどの酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、蛍光アッセイ、化学発光アッセイ、イムノブロットアッセイ（ウェスタンブロット）、粒子系アッセイ、および他の公知の技法が挙げられる。ある実施形態では、抗体−ポリペプチド複合体は溶液中で形成される。そのような複合体は免疫沈降法により検出することができる。例えば、Short Protocols in Molecular Biology, Chapter 10, Section VI, Ausubelら(編), Green Publishing Associates and John Wiley & Sons (1992)を参照されたい。
【００５４】
抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するためのキット
本明細書で提供するＰＲＲＳウイルスポリペプチドは抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出するためのキットを作製するために使用することができる。そのようなキットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なるＰＲＲＳウイルスポリペプチドを含むことができる。例えば、キットは、ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチド、ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチド、ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ４ポリペプチド、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５ポリペプチド、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ６ポリペプチド、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチド、またはそれらの任意の組合せを含むことができる。ある実施形態で、キットはＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ＰポリペプチドおよびＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチドを含むことができる。
【００５５】
ＰＲＲＳウイルスポリペプチドを含むキットは、限定はしないが、包装材料（例えば、使用説明書）、指示分子（例えば、抗ブタＩｇ抗体）、バッファー、陽性対照サンプル（例えば、ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含むサンプル）、および陰性対照サンプル（例えば、ブタ抗ＰＲＲＳウイルス抗体を含まないブタ血清を含むサンプル）などの他の成分を含むことができる。
【００５６】
生物の免疫状態の評価
本明細書で提供する方法および材料は、ウイルスに関する生物の免疫状態を判定するためにも使用することができる。そのような方法および材料は、如何なる生物の免疫状態を判定するために使用することができる。例えば、ブタ、イヌ、ネコ、鳥類（例えば、ニワトリ、シチメンチョウ、またはアヒル）、ヒツジ、ウシ、ウマ、ヤギ、サル、またはヒトの免疫状態を、本明細書で提供する方法および材料を使用して判定することができる。それに加えて、如何なるウイルスに関する生物の免疫状態も判定することができる。例えば、ＰＲＲＳウイルス、シルコウイルス、インフルエンザウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、パルボウイルス、コロナウイルス、ピコルナウイルス、パラインフルエンザウイルス、またはフィロウイルスに関する生物の免疫状態を判定することができる。
【００５７】
一実施形態において、本明細書で提供する方法および材料は、生物の免疫状態が（１）該生物がウイルスのワクチン型の接種を受けたか、（２）該生物がウイルスの天然型に感染したか、または（３）該生物がそのウイルスに関して免疫学的に曝露経験がないかを判定するために使用することができる。ある場合に、本明細書で提供する方法および材料は、（１）生物がウイルスのワクチン型の接種を受けたか、または（２）生物がウイルスの天然型に感染したかのいずれかの免疫状態を有する生物間の区別をするために使用することができる。
【００５８】
一般的に、生物の免疫状態を評価するためには少なくとも２種のポリペプチドを使用する。第１ポリペプチドは、ワクチン型ウイルスと天然型ウイルスの間で保存された（例えば、高度に保存された、またはある場合には、完全に保存された）アミノ酸配列を有するポリペプチドであり得る。例えば、第１ポリペプチドは、ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合し、かつ天然型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合するようなアミノ酸配列を有することができる。ＰＲＲＳウイルスに関するブタの免疫状態を評価する場合、第１ポリペプチドはＰＲＲＳ  ＯＲＦ５ポリペプチドのＣ末端領域などのＰＲＲＳウイルスのワクチン型と天然型の間で保存されているアミノ酸配列を有するポリペプチドであることができる。ＰＲＲＳウイルスのワクチン型と天然型の間で保存されている他のアミノ酸配列は標準的な配列アラインメント（図１４〜１６）から得ることができる。
【００５９】
第２ポリペプチドは、ワクチン型ウイルスと天然型ウイルスの間でよく保存されていないアミノ酸配列（例えば可変配列）を有するポリペプチドであることができる。第２ポリペプチドは、ワクチン型ウイルスに存在する配列に類似または同一の配列を有することができる。例えば、第２ポリペプチドは、ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合し、かつ天然型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合しないようなアミノ酸配列を有することができる。ＰＲＲＳウイルスに関するブタの免疫状態を評価する場合、第２ポリペプチドは、ＰＲＲＳ  ＯＲＦ５ポリペプチドのＮ末端領域などのＰＲＲＳウイルスのワクチン型と天然型の間において可変的であるアミノ酸配列を有するポリペプチドであることができる。そのような第２ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＶＲ−２３３２またはＲｅｓｐＰＲＲＳ  ＰＲＲＳウイルス由来のものであることができる。ＰＲＲＳウイルスのワクチン型と天然型の間で保存されていない他のアミノ酸配列は標準的な配列アラインメント（図１４〜１６）から得ることができる。
【００６０】
ウイルスに関する生物の免疫状態を評価するために、第１および第２ポリペプチドと生物からのサンプルとを、該サンプル中に抗ウイルス抗体が存在する場合には第１および第２ポリペプチドが該抗体に結合して、（１）第１ポリペプチド−抗体複合体、または（２）第１ポリペプチド−抗体複合体と第２ポリペプチド−抗体複合体を形成することができるような条件下で接触させうる。第１ポリペプチド−抗体複合体が形成され、かつ第２ポリペプチド−抗体複合体が形成されないことは、該サンプルが天然型ウイルスに曝露された生物からのものであることを示しうる。第１ポリペプチド−抗体複合体と第２ポリペプチド−抗体複合体の両方の形成は、該サンプルがワクチン型ウイルスに曝露された生物からのものであることを示しうる。第１ポリペプチド−抗体複合体または第２ポリペプチド−抗体複合体のいずれも検出されないことは、該サンプルが該ウイルスに関して曝露経験がない生物からのものであることを示しうる。
【００６１】
ＰＲＲＳウイルスに関するブタの免疫状態を評価する場合には、第１および第２ポリペプチドとブタからの血液サンプルとを、該血液サンプル中に抗ＰＲＲＳウイルス抗体が存在する場合には第１および第２ポリペプチドが該抗体に結合して、（１）第１ポリペプチド−抗体複合体、または（２）第１ポリペプチド−抗体複合体と第２ポリペプチド−抗体複合体を形成することができるような条件下で接触させうる。第１ポリペプチド−抗体複合体が形成され、かつ第２ポリペプチド−抗体複合体が形成されないことは、該サンプルが天然型ＰＲＲＳウイルスに曝露されたブタからのものであることを示しうる。第１ポリペプチド−抗体複合体と第２ポリペプチド−抗体複合体の両方の形成は、該サンプルがワクチン型ＰＲＲＳウイルスに曝露されたブタからのものであることを示しうる。第１ポリペプチド−抗体複合体または第２ポリペプチド−抗体複合体のいずれも検出されないことは、該サンプルが該ウイルスに関して曝露経験がないブタからのものであることを示しうる。
【００６２】
典型的には、ウイルスポリペプチドを、試験紙、マイクロタイタープレート、粒子（例えばビーズ）、アフィニティカラム、およびイムノブロット膜などの固体基板上に固定化する。固体基板およびそれらの使用法の代表的説明については米国特許第５，１４３，８２５号、第５，３７４，５３０号、第４，９０８，３０５号、および第５，４９８，５５１号を参照されたい。例えば、ＰＲＲＳウイルスポリペプチド（例えば、保存されたＰＲＲＳウイルスアミノ酸配列に限定されたＰＲＲＳウイルス配列を有する１つのポリペプチドおよび多様なＰＲＲＳウイルスアミノ酸配列に限定されたＰＲＲＳウイルス配列を有する別のポリペプチド）を、公知の方法で９６ウェルプレートなどの固体基板上に固定化してから、それを、ブタからのサンプルと、該サンプル中に存在する抗ＰＲＲＳウイルス抗体が固定化されたＰＲＲＳウイルスポリペプチドに結合してポリペプチド−抗体複合体を形成することができるような条件で接触させることができる。好適な条件には、適当なバッファー（例えば、リン酸ナトリウムバッファー、ｐＨ７．２〜７．４）中、室温での少なくとも約１０分〜約１０時間（例えば、約１〜約２．５時間）のインキュベーションが含まれる。その後で本明細書で述べるようにして、結合しなかった物質を洗い流し、ポリペプチド−抗体複合体を検出することができる。
【００６３】
生物の免疫状態を評価するためのキット
ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合でき、かつ天然型ウイルスに対して生起された抗体が第１ポリペプチドに結合できるようなアミノ酸配列を有する第１ポリペプチドを、第２ポリペプチドと組み合わせて、生物の免疫状態を評価するためのキットを作製することができる。第２ポリペプチドはワクチン型ウイルスに存在する配列と類似または同一である配列を有することができる。さらに、第２ポリペプチドは、ワクチン型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合し、かつ天然型ウイルスに対して生起された抗体が第２ポリペプチドに結合しないようなアミノ酸配列を有することができる。そのようなキットは追加のポリペプチドを含んでもよい。例えば、キットは、各々がワクチン型ウイルスと天然型ウイルスの間で保存されている異なる配列を有する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上の異なるポリペプチドを含むことができる。同様にキットは、各々がワクチン型ウイルスと天然型ウイルスの間で保存されていない異なるウイルス配列を有する２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１１種以上の異なるポリペプチドを含むことができる。
【００６４】
キットは、限定はしないが、包装材料（例えば、使用説明書）、指示分子（例えば、抗生物Ｉｇ抗体）、バッファー、陽性対照サンプル、および陰性対照サンプルなどの他の成分を含むことができる。
【００６５】
ある場合には、固体支持体に付着したポリペプチドが該ポリペプチドに結合する抗体と反応する能力を増大させるために、該固体支持体をポリペプチドおよびリゾチームと接触させることができる。限定はしないが、本明細書で提供するＰＲＲＳウイルスポリペプチド（例えば、ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチド）を含む任意のポリペプチドを固体支持体に付着させることができる。如何なるリゾチームも使用することができる。典型的には、リゾチームは、ある種の細菌、特にグラム陽性細菌の細胞壁中のＮ−アセチルムラミン酸とＮ−アセチルグルコサミンとの間のβ−１，４−グルコシド結合を分解する加水分解酵素でありうる。リゾチームは、限定はしないが、唾液、涙液、乳汁、尿、子宮頚部粘液、白血球、および腎臓を含む動物分泌液および組織中に見出すことができる。例えば、リゾチームはブタの子宮分泌液中に見出すことができる（Roberts and Bazer, J. Reprod. Fertil., 82:875-892 (1988)）。ニワトリの卵白からのリゾチームは広範に研究されており、結晶構造が解明された最初の酵素である（Diamond, J. Mol. Biol., 82:371-391 (1974)）。リゾチームは鳥類の卵白中に広く分布している（Pragerら、J. Biol. Chem., 249:7295-7297 (1974)）。リゾチームの構造と機能の関係は他所で述べられている（Imotoら、J. Vertebrate Lysozymes, The Enzymes 7, P. Boyer, Academic Press, NY, 1972)）。
【００６６】
ポリペプチドとリゾチームとの如何なる比も使用することができる。例えば、ポリペプチドおよびリゾチームは、リゾチーム１ｎｇにつきポリペプチド少なくとも４ｎｇの比（例えば４：１、５：１、６：１、７：１、またはそれを超えて）で固体支持体と接触させることができる。ある場合には、リゾチームおよびポリペプチドは、ポリペプチド１ｎｇにつきリゾチーム少なくとも１ｎｇの比（例えば、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、またはそれを超えて）で固体支持体と接触させることができる。
【００６７】
固体支持体は、限定はしないが、ガラススライド、プラスチックプレート、９６ウェルプレート、ビーズ等を含む如何なる種類の固体支持体でもよい。
【００６８】
本発明を次の実施例でさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載した本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例１】
【００６９】
組換えＰＲＲＳウイルスポリペプチドの生成
方法および材料
プラスミドクローニングベクターｐＥＴ２４ｂ、ｐＥＴ２５ｂ、およびｐＥＴＢｌｕｅ２はNovagen（Madison、WI）から得、ｐＧＥＭ−ＴはPromega（Madison、WI）から得た。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞はNovagenから得た。大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株Ｔｕｎｅｒ、ＲＰ、およびＡＢＬＥ−Ｋは、Stratagene（La Jolla、CA）から得た。ＤＨ５α細胞はInvitrogen（Carlsbad、CA）から得た。プラスミドおよびＤＮＡ精製キットはQiagen（Valencia、CA）から得た。ＰＣＲ試薬はApplied Biosystems（Roche Molecular Systems、Branchburg、NJ）から得た。標準的な研究所の備品、細菌増殖培地、および電気泳動用試薬はSigma Chemical Co.（St.Louis、MO）から得た。クローニング用のＰＲＲＳウイルスのｃＤＮＡ断片は、ＮＳＰ１αおよび１β、ＮＳＰ２、およびＮＳＰ４をコードするＶＲ−２３３２ゲノムＲＮＡの領域の逆転写酵素によるＰＣＲ増幅によって得た。
【００７０】
ＰＣＲ増幅、ＤＮＡ断片のクローニング、および制限酵素分析
ＰＣＲ用のプライマーは、プライマー３（Whitehead Institute for Biomedical Research、Cambridge、Massachusetts）およびＰＲＲＳウイルスＶＲ２３３２株配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｕ８７３９２またはＰＲＵ８７３９２）を使用して設計した（表１）。プライマーは、Integrated DNA Technologies、Inc.（Coralville、IA）によって合成、精製、および定量された。ＰＣＲ反応には、Applied Biosystemsの熱活性化ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）キット（Roche Molecular Systems、Branchburg、NJ）を使用した。反応混合物（５０μＬの合計体積）は、１０×バッファーＩＩ（１×濃度）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、それぞれ２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；０．２μＭ  各プライマー対（表１）；１．０Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）、および適切なｃＤＮＡを含んでいた。溶液は、混合後直ちにサーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００、Perkin Elmer、Shelton、CT）中に置いた。温度サイクル：１サイクル（９５℃で１０分間）；３５サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間）；１サイクル（７２℃で７分間、４℃で保つ）。次いで、生成した増幅ＤＮＡは、アガロースゲルを使用して分離した。予想した産物サイズに対応するバンドをゲル抽出し（ゲル抽出キット、Qiagen）、次いで、ＰＣＲ精製キットを使用してさらに精製した。次いで、単離された産物はｐＧＥＭ−Ｔベクターにクローニングし、ＤＨ５α細胞に形質転換し、これらをＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌを含むＬＢ１００μｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐ）寒天プレート上に広げた。白いコロニーを選択し増殖させた。選択したコロニー由来の核酸は、標準的なＴ７およびＳＰ６プライマー（Advanced Genetic Analysis Center、University of Minnesota、St, Paul MN）を使用して塩基配列を決定した。最初のＢＬＡＳＴ検索スクリーニング（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＮＣＢＩ、Bethesda、MD）の後、トレースファイルを修正してベクター配列を除去し（Ｓｅｑｍａｎ、DNASTAR、Inc.、Madison、WI）、アラインメントした（Ｍｅｇａｌｉｇｎ、DNASTAR）。
【００７１】
高い効率でポリペプチドを発現および単離するためにｍｙｃタグ５’リーダー配列および末端３’Ｈｉｓタグを含むｐＥＴ２４ｂ（Novagen、Madison、WI）をベースとして特殊化したベクターを遺伝子操作した。このプラスミド（ｐＥＴ２４ｂｍｙｃＨｉｓ）は、ｍｙｃタグのすぐ３’側にＢａｍＨＩ部位を含み、末端６×Ｈｉｓタグに先行してＸｈｏＩ部位を含む。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩを用いた消化、次に子牛小腸アルカリホスファターゼ（ＣＩＡＰ）（Promega）を用いた脱リン酸化によって、挿入のためのベクターを調製した。連結用のインサートを調製するための、ＰＣＲ条件、インサート単離、および精製、その後の制限消化（ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ）は前に記載したものと同じであった。連結反応混合物は、１００ｎｇの脱リン酸化ベクター、２０ｎｇのインサート、１×連結反応用バッファー、および４００単位のＴ４リガーゼ（New England Biolabs、Beverly、MA）、合計体積１０μＬを典型的には含んでいた。連結反応混合物は、ＤＨ５α細胞への形質転換の前に１６℃で１６時間放置した。コロニーは前に記載したのと同様に選択し、増殖させた。選択したコロニー由来の核酸を、配列決定し、分析した（プラスミドｐＥＴ２４ｂｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓが得られた）。
【００７２】
タンパク質発現の試験
ポリペプチドの発現を試験するために、アルギニンおよびプロリンの真核生物ｔＲＮＡを含みクロラムフェニコール（ｃａｍ）耐性であるＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＰ細胞に、組換えプラスミドを形質転換した。形質転換細胞は、カナマイシン３０μｇ／ｍＬ（ｋａｎ３０）、クロラムフェニコール３５μｇ／ｍＬ（ｃａｍ３５）のＬＢプレート上に広げ、Ｔ７およびＳＰ６プライマーを使用するコロニーＰＣＲによってｐＥＴ２４ｂプラスミドについてスクリーニングした。１０個の陽性コロニーを、２ｍＬの２×ＹＴ培地（ｋａｎ３０、ｃａｍ３５）中で３０℃において一晩増殖させた。各一晩培養物２００μＬを使用して、２×ＹＴ（ｋａｎ３０）の１０個の温度平衡状態（３０℃）の１０ｍＬアリコートに接種した。これらの培養物は３０℃においてＯＤ６００が０．４になるまで増殖させ、２００μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に取り出し、ＩＰＴＧを最終濃度が１．０ｍＭとなるよう加えた。誘導したサンプルは３０℃において４時間増殖させ、次いで、２００μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に取り出した。
【００７３】
大規模なポリペプチドの発現および精製
未処理のＨｉｓタグタンパク質のためのQiagenのＮｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティ単離手順の変法を使用して、ポリペプチドを精製した。簡単に説明すると、１リットルの培養物からの誘導した細菌細胞を４℃において２０分間、４０００ｇでペレット状にし、上清はデカンテーションした。ペレットを３０ｍＬの溶解バッファー（５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭイミダゾール、１μＭペプスタチンＡ、１μＭロイペプチン、および１ｍＭ  ＰＭＳＦ、ＰＨ８．０）に再懸濁させ、次いで、リゾチームを最終濃度が１．０ｍｇ／ｍＬとなるよう加えた。この溶液を、氷上で６０分間インキュベートし、次に１０秒間隔で６回、２５０Ｗの１０秒間バーストを使用して、氷上で超音波処理した。次いで、ＲＮＡｓｅＡ（１０μｇ／ｍＬ最終）およびＤＮＡｓｅＩ（５μｇ／ｍＬ最終）を加え、溶液をさらに氷上で１５分間インキュベートして、核酸をさらに分解させた。次いで、溶解物を１０，０００×ｇで３０分間遠心分離にかけ（４℃）、不溶性凝集体および細胞残屑をペレット状にした。ペレットは大部分の発現組換えポリペプチドを封入体の形で含んでおり、後にリフォールディングされる変性形態で単離した。遠心分離の直後に、このペレットを１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、および８Ｍ尿素を含むｐＨ８．０の３０ｍＬ溶液中に再懸濁させた。再懸濁したペレットを室温において（２００ｒｐｍで）３０分間回転させ、次いで、後の処理のために４℃に放置した。
【００７４】
さまざまなレベルの可溶性ポリペプチドを含む上清を６ｍＬの５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー中にデカンテーションし、４℃において１時間（２００ｒｐｍで）軽く回転させた。次いで、上清−Ｎｉ−ＮＴＡ混合物を１．５×３０ｃｍのカラムに注ぎ入れ、重力により排出させた。５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、１μＭペプスタチンＡ、１μＭロイペプチン、および１ｍＭ  ＰＭＳＦを含む２０ｍＬの溶液（ｐＨ８．０）でカラムを２回洗浄した。５０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾール、１μＭペプスタチンＡ、１μＭロイペプチン、および１ｍＭ  ＰＭＳＦを含むｐＨ８．０の溶出バッファーの３ｍＬアリコート４つを用いてポリペプチドを溶出させた。精製ポリペプチドを、接線流式濾過カセット（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＰＬＣ  ５ｋＤ、Millipore、Bedford MA）、またはＹＭ−３  Ａｍｉｃｏｎ  Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ（登録商標）遠心分離濾過装置（Millipore Corp.Bedford、MA）のいずれかによって濃縮し、次に５０％グリセロールおよび２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ（登録商標）６−８，０００、Spectrum Laboratories、Rancho Dominguez、CA）。ポリペプチド濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＲＣ  ＤＣタンパク質アッセイキット（Bio-Rad、Hercules、CA）を使用して測定した。精製ポリペプチド溶液は−２０℃で保存した。
【００７５】
４℃で保存した変性した不溶性組換えポリペプチド混合物を１０，０００×ｇで４℃において３０分間遠心分離にかけて、細胞残屑をペレット状にした。上清は高レベルの、前に不溶性状態であった変性組換えポリペプチドを含んでおり、これを６ｍＬの５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー中にデカンテーションし、４℃において１時間（２００ｒｐｍで）軽く回転させた。上清−Ｎｉ−ＮＴＡ混合物は次いで、１．５×３０ｃｍのカラムに注ぎ、排出させた。１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、および８Ｍ尿素を含むｐＨ６．３の溶液２０ｍＬでカラムを２回洗浄した。次いで、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、および８Ｍ尿素を含むｐＨ５．９の溶出バッファーの３ｍＬアリコートを用いて、４回ポリペプチドを溶出させた。ＳＤＳゲル分析、ポリペプチドの濃縮、ＰＢＳへの透析、および濃度測定は前に記載したものと同様に行った。
【００７６】
ポリペプチドのリフォールディング
変性組換えポリペプチドのリフォールディングを、他で記載された方法（Buchnerら、Anal.Biochem.、205 : 263〜270 (1992)およびClark、Curr.Opin.Biotechnol.、9 : 157〜163 (1998)）の変法を使用して実施した。簡単に説明すると、精製ポリペプチドを含む変性ポリペプチドの溶液をプールし、５００ｍＬの０．１Ｍトリス、ｐＨ８．０、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡに対して４℃において４時間透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ（登録商標）６−８，０００、Spectrum Laboratories、Rancho Dominguez、CA）。次いで、透析をさらに４時間新たなバッファーを用いて繰り返した。ポリペプチド濃度を３ｍｇ／ｍＬに調節した後（濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＲＣ  ＤＣタンパク質アッセイキット、Bio-Rad、Hercules、CAを用いて測定した）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を３００ｍＭ  ＤＴＴの最終濃度まで加えた。得られた５ｍＬの溶液を室温で２時間攪拌し、次に０．４５μｍフィルター（Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ、Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）を使用して濾過した。次いで、還元ポリペプチド溶液を、約１：１００の最終希釈率に対応する５００ｍＬのリフォールディングバッファー（１００μＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、８ｍＭ酸化グルタチオン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭロイペプチン、および１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に、４℃で急速に穏やかに攪拌しながら加えた。次いで、生成した溶液を０．２２μｍの膜（Ｓｔｅｒｉｔｏｐ、Millipore、Bedford MA）で濾過して、粒子を除去し、一晩攪拌した。精製ポリペプチドは接線流式濾過カセット（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＰＬＣ  ５ｋＤ、Millipore、Bedford MA）で１０ｍＬの体積に濃縮して、次に５０％グリセロールおよび２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ７．５に対して透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ（登録商標）６−８，０００、Spectrum Laboratories）。ポリペプチド濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＲＣ  ＤＣタンパク質アッセイキット（Bio-Rad、Hercules、CA）を使用して測定した。精製ポリペプチドの溶液は−２０℃で保存した。
【００７７】
ゲル電気泳動およびイムノブロッティング
細菌溶解物、精製分画、および精製ポリペプチドを、Ｌａｅｍｍｌｉバッファーシステム（Laemmli、Nature、227 : 680〜684 (1974)）を用いてＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルで分析した。タンパク質バンドは、０．０２５％クーマシーブルーを用いた染色によって可視化した。イムノブロッティングのため、ゲルを固定ニトロセルロース膜（MSI Separations、Westbrook MA）にエレクトロブロッティングした。膜は抗ｍｙｃモノクローナル抗体９Ｅ１０と共に室温で１時間インキュベートした。抗体の結合はアルカリホスファターゼ結合ヤギ抗マウスＩｇＧを使用して検出し、ＥＣＬウエスタンブロッティングシステム（Amersham Pharmaciea Biotech、Piscataway、NJ）によって可視化した。
【００７８】
ＥＬＩＳＡ
ＥＬＩＳＡプレートを、個々のＰＲＲＳウイルスポリペプチドを１００μＬの炭酸バッファー（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３および３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３）、ｐＨ９．６に溶かしたものまたはバッファー単独を用いて一晩コーティングし、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０）を用いて６回洗浄した。２．５％脱脂粉乳を含む２００μＬのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを加えて１時間室温におき、非結合部位を事前にブロッキングし、プレートは５回洗浄した。さまざまな希釈の１００μＬのブタ血清を二連で加えて２時間室温におき、プレートはＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎを用いて４回洗浄した。特異的抗体のレベルを、１：５０００に希釈した西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ブタＩｇＧ（重鎖＋軽鎖）（KPL、Gaithersburg MD）中でウエルを１時間インキュベーションすることによって測定した。ウエルは５回洗浄し、１００μＬのＴＭＢ基質（ＫＰＬ）を用いて発色させた。１５分後に１００μＬの１Ｍリン酸を用いて反応を停止させ、プレートを４５０ｎｍで読み取った。
【００７９】
ｐＥＴＢｌｕｅ２（Novagen）
ｐＧＥＭ−Ｔ中のクローンをＤＨ５α細胞に形質転換した。コロニーを一晩増殖させ、プラスミドはＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ精製キットを用いて単離した。精製プラスミドおよび２μｇのｐＥＴＢｌｕｅ２を、ＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを用いて個別に４時間消化した。消化の最後の２０分間でＣＩＡＰを用いてｐＥＴＢｌｕｅ２を脱リン酸化させた。インサート断片および線状ｐＥＴＢｌｕｅ２はＱｉａｇｅｎゲル精製キットを用いてゲル精製し、次いで、ベクター対インサート約１：２の比で連結させた。
【００８０】
連結物をＤＨ５α細胞に形質転換した。プレート当たり２個のコロニーを一晩培養し、プラスミドの調製を培養物上で実施してプラスミドを単離した。次いで、精製プラスミドはＢＬ−２１（ＤＥ３）ＲＰ細胞に形質転換した。１クローンにつき２個のコロニーを培養し、３０℃で４時間かけて４００μＭのＩＰＴＧを用いて誘導した。その後の全細胞溶解物のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、特異的なポリペプチドの誘導の証拠を示さなかった。同様に、マイクロタイタープレートにコーティングし、ＰＲＲＳ＋およびＰＲＲＳ−ブタ血清と反応させた誘導細胞溶解物のＥＬＩＳＡ試験では、ＰＲＲＳウイルスポリペプチドの証拠が明らかにならなかった。ＰＲＲＳウイルスポリペプチドの発現に関するｐＥＴＢｌｕｅ２の評価はこの時点で中止した。
【００８１】
ｐＥＴ２４ｄ／ｐＥＴ２５ｂ（Novagen）
２μｇのｐＥＴ２４ｄをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩを用いて消化し、ＣＩＡＰを用いて脱リン酸化させた。次いで、断片をＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。アガロースゲルを使用して断片をさらに精製し、ＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを使用してゲルからベクター断片を抽出した。次いで、ｐＥＴ２４ｄ断片を、クローン断片にインサート対ベクター約２：１の比で連結させた。これらのプラスミドのＤＨ５α細胞への形質転換によって、コロニーが増殖することはなかった。脱リン酸化しなかったｐＥＴ２４ｄベクターへのクローニング、あるいは脱リン酸化したかまたは脱リン酸化しなかったｐＥＴ２５ｄへのクローニング後にも同様の結果が得られた。
【００８２】
クローニング
ＰＣＲを使用して、ＰＲＲＳウイルスＶＲ２３３２株のＯＲＦ１ａ中の以下のアミノ酸位置のそれらの活性部位によって特定される３つのＰＲＲＳウイルスプロテアーゼ、すなわちパパイン様システインプロテアーゼαおよびβ（ＰＣＰα／β）（アミノ酸７４〜１４６および２６８〜３３９）、異常なシステインプロテアーゼ（アミノ酸４３５〜５０６）、およびポリオウイルス３Ｃ様セリンプロテアーゼ（アミノ酸１８４０〜１９４６）を増幅した。ＰＲＲＳウイルスゲノム中のこれらの機能性プロテアーゼドメインの位置は、図１中に図式的に示す。表１に、ＰＣＲ増幅させたＰＲＲＳウイルスＶＲ２３３２株のヌクレオチド配列領域を列挙し、全体的な結果をまとめる。
【表１】
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【００８３】
非構造タンパク質１（ＮＳＰ１）
この断片とｐＥＴ２４ｂの連結産物から、大腸菌ＤＨ５α細胞の形質転換後にコロニーが得られた。コロニーはゆっくりと増殖し、典型的には可視化するのに３７℃において４８時間を必要とした。ＰＣＲによるコロニーのスクリーニングは、クローニング断片の存在と一致した陽性の結果を与えた。ブロス中で増殖させた細菌から組換えプラスミドを回収する努力は成功しなかった。組換えプラスミドは不安定であるようであった。この問題を克服するために、さまざまな大腸菌株、すなわちＤＨ５α、ＪＭ１０９、ＨＢ１０１、ＳＵＲＥ（Stratagene）、およびＡＢＬＥ（Stratagene）をプラスミドのレシピエントとして使用した。形質転換用プレートおよびブロス培養物は３７、３０および２２℃でインキュベートした。１、２、５、１０、および２５ｍＬの体積で培養を実施した。Ｑｉａｇｅｎ  ｍｉｎｉｐｒｅｐ、フェノール／クロロホルム抽出による標準的なアルカリ溶解、および塩化リチウム／イソプロパノール沈殿による沸騰溶解を含めた、プラスミド精製のさまざまな方法を試みた。これらの条件および処理はいずれでも、組換えプラスミドは回収されなかった。全体として、３５３の形質転換体をコロニーＰＣＲによってスクリーニングし、約７０の反応物からバンドが得られた。プラスミドの精製によって可視のバンド、すなわち高分子量のバンドが得られない。これは診断用制限酵素による消化によってゲルから消失した。この結果はゲノムＤＮＡの挙動と一致する。
【００８４】
非構造タンパク質２（ＮＳＰ２）
ＮＳＰ１と同じ結果を得た。ＰＣＲにより陽性であった形質転換コロニーをＬＢ寒天プレート上で得たが、プラスミドＤＮＡを単離するための試みは成功しなかった。
【００８５】
非構造タンパク質４（ＮＳＰ４）
ＮＳＰ４に関する結果は、１つの例外を除きＮＳＰ１およびＮＳＰ２に関する実験と同じであった。プラスミドＤＮＡをクローンから首尾良く回収し、ＤＮＡ配列決定によって予想したＮＳＰ４を含むことが示された。アミノ酸１６がイソロイシンからスレオニンに変化した点突然変異が示された。
【００８６】
ｐＥＴ２４ｂｍｙｃＨｉｓ中のＮＳＰ断片のクローニング
ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、およびＮＳＰ４に対応するＤＮＡ断片をＰＣＲによって増幅し、ｐＥＴ２４ｂ−ｍｙｃＨｉｓにクローニングした（図２、３、および４）。機能的に陽性であるクローンを個々のコロニーの小規模な試験誘導によって同定し、１つの高発現クローンを採取し、増殖させ、精製し、配列決定した。それぞれのクローンは５’末端にＥｃｏＲ１およびＢａｍＨＩ部位、３’末端にＸｈｏＩ部位を含んでいた。コードされていたポリペプチドは、アミノ末端ｍｙｃタグおよびカルボキシル末端６×Ｈｉｓタグを含んでいた。
【００８７】
組換えＮＳＰの発現および精製
本明細書に記載するように、個々のコロニーを増殖させポリペプチド発現を誘導した。ポリペプチドはＮｉ−ＮＴＡ固定金属アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。組換えＮＳＰ１およびＮＳＰ４は、記載した条件下で振とうフラスコ中においてｍｇ／Ｌのレベルで容易に発現され、アフィニティクロマトグラフィーおよびリフォールディング後に約５０％のポリペプチドが回収された（表２）。精製ポリペプチドとリフォールディングポリペプチドは相同性があり、予想したプロテアーゼ活性と一致する断片サイズを含んでいた。ＮＳＰ１およびＮＳＰ４ポリペプチドは相同的なポリペプチドからなっており、ＮＳＰ１調製物は完全なポリペプチドと、２つの断片が（ＰＣＰ１αおよびＰＣＰ１βに自己タンパク質分解によって切断される）を含み、一方、ＮＳＰ４調製物は単一バンドであった（図５および６）。
【表２】
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【００８８】
ＮＳＰ２ポリペプチドは、クーマシーブルーで染色したＳＤＳポリアクリルアミドゲル上の全細胞溶解物において、可視化できない低レベルで発現されたが、それは抗ｍｙｃ抗体を用いたウエスタンブロット検出によって観察された。１３２ｋＤのコードされていたポリペプチド配列より小さいサイズの多数のバンドの存在は、細菌増殖およびポリペプチド発現中、あるいは細胞溶解およびサンプル処理中にタンパク質分解が起こったことを示した。ウエスタンブロットバンドがＰＲＲＳウイルスのＮＳＰ２を含んでいたという他の証拠は、試験ＥＬＩＳＡの結果から得た。このＥＬＩＳＡにおいてマイクロタイタープレートのウエルは、ＮＳＰ１、ＮＳＰ２、またはＮＳＰ４を発現するクローンから誘導した細菌の溶解物でコーティングした。ＮＳＰ２ポリペプチドを含むウエルは、強く特異的かつ希釈依存的に反応した。ＮＳＰ２ポリペプチドの低レベルの発現は、ポリペプチドのカルボキシル末端側に疎水性領域が存在することによる可能性がある。
【００８９】
ＥＬＩＳＡの反応性に対するリフォールディングの影響
３個のＮＳＰポリペプチド間で抗体反応性の明らかな違いを予備試験ＥＬＩＳＡにおいて観察し、これにより精製した組換えポリペプチドの立体配座は可変であり、免疫反応性に影響を与え得るという可能性が生じた。組換えヌクレオカプシド（Ｎ）は、発現、精製、およびリフォールディングの条件に応じて免疫反応性が変わった。したがって、ＮＳＰ１およびＮＳＰ４の免疫反応性はリフォールディングの前後で評価した。
【００９０】
リフォールディングは、ＮＳＰ１の免疫反応性に対して影響を及ぼした（図７）。リフォールディングされていないアフィニティ精製ＮＳＰ１ポリペプチドは、ＰＲＲＳウイルス感染後１２０日間にブタから得た血清とほとんど反応性がなかった。
【００９１】
対照的に、非リフォールディング状態またはリフォールディング状態のＮＳＰ４ポリペプチドに対する、抗ＮＳＰ４抗体の力価の実質的な違いは存在しなかった（図８）。リフォールディング状態のポリペプチドの反応性の分析は５２日で終了した。何故なら、ＮＳＰ４の２つの形態の違いが存在しないことが明らかであったからである。リフォールディングの影響がなかったことは、分析用の血清サンプルを選択することによってさらに強調された。最大の抗体応答は、相同ウイルス（ＶＲ２３３２はＩｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶワクチンの親株である）で免疫処置し、リフォールディング状態、おそらく未処理のポリペプチドで試験した動物において生じると予想した。最小の応答は、異種株（ＭＮ３０１００）で感染状態にし、非リフォールディング状態のポリペプチドで試験した動物において生じると予想した。これらの条件下では、違いは観察されなかった。
【００９２】
これらの結果は、ポリペプチドのリフォールディングはＮＳＰ１の場合には免疫反応性に影響を与え、ＮＳＰ４には重要でないことを実証する。しかしながら、それぞれの組換えＮＳＰポリペプチドは通常はリフォールディング状態であり、均一な産物を維持するためにグリセロール中に可溶形態で保存する。
【００９３】
ＮＳＰ組換えポリペプチドに対する抗体応答の誘導および持続期間
抗ＮＳＰ１抗体の応答の動態は、４カ月齢の雌ブタにおけるＮに対する応答と類似していた。抗ＮＳＰ１の力価は感染後１４日で約１／５０，０００であり、感染後２１日でピークである約１／１４０，０００に達した。抗体レベルは急速に低下し、感染後２８〜１２０日でＮ（ＯＲＦ７）と同等になった。Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶで免疫処置した若いブタ（４〜６週齢）の小グループにおいて、ＮＳＰ１に対する抗体力価は類似した急激なピークおよび急速な低下を示したが、ピークは感染後２１日ではなく感染後２８日に生じた（図９）。
【００９４】
雌ブタでは、ＮＳＰ４に対する抗体応答はＮおよびＮＳＰ１と比較して弱かった。感染後４０〜５５日、およびおそらく感染後１００〜１１０日で再度、力価が増大した証拠が存在した。若いブタでは、免疫処置後約２８〜３５日で始まる類似した後期のわずかな抗ＮＳＰ４力価の増大があった（図９）。この時間枠は、急性感染が消失する期間に対応する。
【００９５】
ＶＲ２３３２  ＮＳＰ組換えポリペプチドに対するブタ抗ＮＳＰ抗体の交差反応性
ＰＲＲＳウイルスのＶＲ２３３２株に由来し細菌中で発現された、精製およびリフォールディングのＮＳＰ１および４ポリペプチドは、ＰＲＲＳウイルスの相同株（Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶ）および異種株（ＭＮ３０１００）に曝露したブタ由来の抗血清と等しく反応した。
【実施例２】
【００９６】
他の組換えＰＲＲＳウイルスポリペプチドの生成
以下のポリペプチドを生成した。ＰＲＲＳウイルスのＮＳＰ２Ｐポリペプチド（図１９）、ＰＲＲＳウイルスの第１のＮ末端のエクトドメインＯＲＦ５ポリペプチド（ＯＲＦ５  ５’；図２０および２１）、ＰＲＲＳウイルスの第１および第２のＮ末端のエクトドメインＯＲＦ５ポリペプチド（ＯＲＦ５’全体；図２２）、ＰＲＲＳウイルスのエンドドメインＯＲＦ５ポリペプチド（ＯＲＦ５  ３’；図２３および２４）、ＰＲＲＳウイルスの第１および第２のＮ末端のエクトドメインＯＲＦ５ポリペプチドとＰＲＲＳウイルスの第１および第２のＮ末端のエクトドメインＯＲＦ６ポリペプチドを組み合わせたキメラポリペプチド（ＯＲＦ５＋６；図２５）、ならびにＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ７ポリペプチド。これらのポリペプチドをコードする核酸は、ＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＰＲＵ８７３９２）のヌクレオチド配列、またはＰＲＲＳウイルスのＭＮ３０１００株中のヌクレオチド配列由来のものであった。
【００９７】
ＰＣＲ増幅およびクローニング
クローニング用の断片は、他で記載されたのと同様に（Nelsenら、J.Virol 73 : 270〜280 (1999)）調製したプラスミドから得た。ＰＣＲによって適切なクローニング部位を有する所望の断片を単離した。プライマー３（Whitehead Institute for Biomedical Research、Cambridge、Massachusetts）を使用してプライマーを設計した。オリゴヌクレオチドプライマーは、ＩＤＴ（Coralville、IA）から得た。ＯＲＦ７、ＯＲＦ５  ５’、およびＯＲＦ５  ３’ポリペプチドをコードする核酸を、ＡｍｐｌｉＴａｑ  Ｇｏｌｄ（登録商標）キット（Roche Molecular Systems、Branchburg、NJ）を使用して別々の反応においてＰＣＲ増幅させた。ＯＲＦ５  ５’全体およびＯＲＦ５＋６ポリペプチドをコードする核酸は、ｃＤＮＡのＰＣＲと後のオリゴアニーリング、ＰＣＲ増幅、および連結によっていずれも構築した。反応混合物（５０μＬの合計体積）は、１０×バッファーＩＩ（１×濃度）、１．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２００μＭのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ；０．２μＭのそれぞれのプライマー対；１．０Ｕ  ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（登録商標）、および適切な連続希釈した（１：１０〜１：１０，０００）ｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡを含んでいた。溶液は混合後すぐにサーモサイクラー（ＧｅｎｅＡｍｐ  ＰＣＲシステム２４００、Perkin Elmer、Shelton、CT）中に置いた。温度サイクル：１サイクル（９５℃で１０分間）；３５サイクル（９４℃で３０秒間、５５℃で３０秒間、７２℃で４５秒間）；１サイクル（７２℃で７分間、４℃で保つ）。次いで、生成した増幅ＤＮＡはアガロースゲル上で分離した。予想した産物サイズに対応するバンドをゲル抽出し（ゲル抽出キット（登録商標）、Qiagen、Valencia、CA）、次いで、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キット（登録商標）（Qiagen、Valencia、CA）を使用してさらに精製した。単離した産物は次いで、ｐＧＥＭ（登録商標）Ｔベクター（Promega、Madison、WI）にクローニングし、ＤＨ５α細胞（Invitrogen Corp.、Carlsbad、カリフォルニア）に形質転換し、これらをＩＰＴＧおよびＸ−Ｇａｌを含むＬＢ１００ｍｇ／ｍＬのアンピシリン（Ａｍｐ）寒天プレート上に広げた。コロニーを色により選択し増殖させ、核酸を塩基配列決定した（Advanced Genetic Analysis Center、University of Minnesota、St、Paul MN）。最初のＢＬＡＳＴ検索スクリーニング（ＧｅｎｅＢａｎｋ  ＮＣＢＩ、Bethesda、MD）の後、トレースファイルを修正してベクター配列を除去し（Ｓｅｑｍａｎ（登録商標）DNASTAR、Inc.、Madison、WI）、重複配列はアラインメントした（Ｍｅｇａｌｉｇｎ（登録商標）DNASTAR、Inc.、Madison、WI）。ＮＳＰ２Ｐポリペプチドをコードする核酸は、ＸｈｏＩでクローンｐＥＴ２４ｂｍｙｃ−ＮＳＰ２−Ｈｉｓ（図３）を消化すること、およびベクターと再連結させることによって得た。
【００９８】
発現プラスミドへのサブクローニング
末端ＢａｍＨ１およびＸｈｏＩ部位を有するプライマー用の鋳型として、適切なｐＧＥＭ（登録商標）Ｔ構築体を使用してクローンを増幅させた。ＰＣＲ条件およびインサートの単離および精製は標準的なものであり、次に制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩ）により消化して、連結用のインサートを調製した。連結条件は、１００ｎｇの脱リン酸化ベクター、２０ｎｇのインサート、１×連結反応用バッファー、および４００単位のＴ４リガーゼ（New England Biolabs）、合計体積１０μＬであった。連結反応混合物は、ＤＨ５α細胞（Invitrogen Corp.、Carlsbad、カリフォルニア）への形質転換の前に１６℃で１６時間放置した。コロニーは前に記載したのと同様に選択し増殖させ、核酸は塩基配列を決定し分析した（プラスミドｐＥＴ２４ｂｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓが得られた）。
【００９９】
ＯＲＦ５  ５’およびＯＲＦ５  ３’と類似したポリペプチドをコードする核酸構築体も、ウイルスを含む細胞培養物上清から始めてＭＮ３０１００  ＰＲＲＳウイルスの配列から作製した（Bierkら、Vet.Rec.、148 : 687〜690 (2001)）。ウイルスＲＮＡは標準手順によって培地から得た。ウイルスＲＮＡはＱＩＡａｍｐウイルスＲＮＡキット（Qiagen）を使用して単離し、−８０℃で保存した。ＧｅｎｅＡｍｐ  ＲＮＡ  ＰＣＲキット（Applied Biosystems、Roche Molecular Systems、Branchburg、NJ）を使用して、ランダムヘキサマーを用いて、精製ＲＮＡをｃＤＮＡに転換した。簡単に説明すると、１μＬのランダムヘキサマーの５０μＭ溶液を、３．０μｇの全ＲＮＡと組み合わせて４μＬの合計体積にした。この溶液を６８℃で１０分間加熱し、次いで、氷上で直ちに冷却した。１６μＬのマスター混合溶液を、１０×バッファーＩＩ（１×最終濃度）；５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１．０ｍＭのそれぞれのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ；２０Ｕ／μＬ  Ｒｎａｓｅ阻害剤、および２５Ｕ／μＬ逆転写酵素を含む最終濃度にするために加えた。この溶液を直ちに２５℃で１０分間、４２℃で３０分間、９９℃で５分間、次いで、４℃で５分間インキュベートした。生成したｃＤＮＡは−２０℃で保存し、ＰＣＲ増幅に使用した。
【０１００】
タンパク質の発現
アルギニンおよびプロリンの真核生物ｔＲＮＡを含みクロラムフェニコール（ｃａｍ）耐性であるＢＬ２１ＴＭ（ＤＥ３）−ＲＰ細胞（Stratagene、River Creek、TX）に、プラスミドｐＥＴ２４ｂｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓを形質転換した。形質転換細胞は、カナマイシン３０μｇ／ｍＬ（ｋａｎ３０）、クロラムフェニコール３５μｇ／ｍＬ（ｃａｍ３５）ＬＢプレート上に広げ、Ｔ７、Ｔ７終結プライマーを使用するコロニーＰＣＲによってｐＥＴ２４ｂプラスミドについてスクリーニングした。１０個の陽性コロニーを、２ｍＬの２×ＹＴ培地（ｋａｎ３０、ｃａｍ３５）中で３０℃においてそれぞれ一晩増殖させた。２００μＬのそれぞれの一晩培養物を使用して、２×ＹＴ（ｋａｎ３０）の１０個の温度平衡状態（３０℃）の１０ｍＬアリコートに接種した。これらの培養物は３０℃においてＯＤλ＝６００が０．３になるまで増殖させ、２００μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に取り出し、ＩＰＴＧは最終濃度が１．０ｍＭとなるよう加えた。誘導サンプルは３０℃において４時間増殖させ、次いで、２００μＬをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析用に取り出した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルは、全てのコロニーが高レベルで（＞２ｍｇ／培地１リットル）予想したサイズのポリペプチドを発現したことを示した。合計１リットルの培地に関して１００倍までスケールアップさせて同じ方法で、大規模で発現を行った。
【０１０１】
ポリペプチドの精製
変性Ｈｉｓタグポリペプチド用のＱｉａｇｅｎのＮｉ−ＮＴＡアガロースアフィニティ単離手順（Qiagen、Valencia、CA）の変法を使用して、ポリペプチドを精製した。簡単に説明すると、１リットルの細菌細胞を含む誘導プラスミドを４℃において４０００ｇで２０分間かけてペレット状にし、上清はデカンテーションした。遠心分離の直後に、ペレットは１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８Ｍ尿素を含むｐＨ８．０の溶液３０ｍＬ中に再懸濁させ、室温において３０分間軽く回転させた。生成した懸濁液は次いで、１０，０００ｇにおいて３０分間遠心分離にかけて（４℃）、細胞残屑をペレット状にした。懸濁液は高レベルの変性ポリペプチドを含んでおり、これを６ｍＬの５０％Ｎｉ−ＮＴＡスラリー中にデカンテーションし、４℃において１時間軽く回転させた。上清−Ｎｉ−ＮＴＡ混合物は次いで、１．５ｃｍＩＤ×３０ｃｍ長のカラムに注ぎ、排出させた。次いで、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８Ｍ尿素を含むｐＨ６．３の溶液２０ｍＬを用いて、カラムを２回洗浄した。次いで、１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８Ｍ尿素を含むｐＨ５．９の溶出バッファーの３ｍＬアリコートを用いて、４回ポリペプチドを溶出させた。ＳＤＳゲル分析およびタンパク質濃度は前に記載したのと同様に決定した（図１７）。
【０１０２】
ポリペプチドのリフォールディング
変性組換えポリペプチドのリフォールディングを、他で記載された方法（Buchnerら、Anal.Biochem.、205 (2): 263〜270 (1992)およびClark、Curr.Opin.Biotechnol.、9 (2): 157〜63 (1998)）の変法を使用して実施した。最初に、純粋なポリペプチドを含む変性ポリペプチドの溶液をプールし、５００ｍＬの０．１Ｍトリス、ｐＨ８．０、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、および２ｍＭ  ＥＤＴＡに対して４℃において４時間透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ（登録商標）６−８，０００、Spectrum Laboratories、Rancho Dominguez、CA）。次いで、透析を、さらに４時間新たなバッファーを用いて繰り返した。ポリペプチド濃度を３ｍｇ／ｍＬに調節した後（濃度はＢｉｏ−Ｒａｄ  ＲＣ  ＤＣタンパク質アッセイキット、Bio-Rad、Hercules、CAを使用して測定した）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を加え３００ｍＭ  ＤＴＴの最終濃度にした。この溶液（５ｍＬ）を室温で２時間攪拌し、次に０．４５μｍフィルター（Ｓｙｒｉｎｇｅ  Ｆｉｌｔｅｒ、Fisher Scientific、Pittsburgh、PA）を使用して濾過した。還元ポリペプチド溶液を次いで、４℃において、穏やかに攪拌しながら、約１：１００の最終希釈率に対応する５００ｍＬのリフォールディングバッファー（ｐＨ８．０の１００ｍＭトリス、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、８ｍＭ酸化グルタチオン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭロイペプチン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に加えた。次いで、得られた溶液を０．２２μｍの膜（Ｓｔｅｒｉｔｏｐ、Millipore、Bedford MA）で濾過して、粒子を除去し、一晩攪拌した。精製ポリペプチドは接線流式濾過カセット（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＰＬＣ  ５ｋｄ、Millipore、Bedford MA）によって１０ｍＬの体積に濃縮して、次に２０ｍＭトリスＨＣｌ、ｐＨ８．０に対して透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ（登録商標）６−８，０００、Spectrum Laboratories、Rancho Dominguez、CA）。ポリペプチド濃度は、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ＲＣ  ＤＣタンパク質アッセイキット（Bio-Rad、Hercules、CA）、定量ＳＤＳゲル、およびＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ＬａｂＣｈｉｐ（登録商標）キット、Agilent Technologies、Palo Alto、カリフォルニア）を使用して測定した。精製ポリペプチドの溶液は−８０℃で保存した。ポリペプチドＯＲＦ５  ５’、ＯＲＦ５  ３’、およびＯＲＦ５全体は常にリフォールディング状態であるわけではなかった。何故ならリフォールディングはＥＬＩＳＡの反応性に影響を与えなかったからである。
【０１０３】
ＥＬＩＳＡ
ポリペプチドを炭酸バッファー（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３および３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６）に１μｇ／ｍＬの濃度まで希釈した。ＥＬＩＳＡプレートのウエル（ＣＯＳＴＡＲ３５９０、９６ウエルＥＩＡ／ＲＩＡプレート、Corning Inc.、Corning、NY）のそれぞれを、１００μＬの適切なポリペプチド炭酸塩溶液（１ウエル当たり１００ｎｇのポリペプチドを与える）でコーティングし、次いで、４℃で一晩インキュベートした。サンプルは二連で実施した。一組のウエルは、血清および二次抗体のバックグラウンド効果を測定するために非コーティング状態とした（０．００５吸光度単位未満であることが分かった）。次いで、プレートをＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０（０．１％）を用いて室温で６回洗浄した（ＥＬ−４０４  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｗａｓｈｅｒ、Bio-Tek Instruments Inc.Winooski、VT）。非特異的結合部位は、３％の脱脂粉乳（ＮＦＤＭ）を含む３００μＬ／ウエルのＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）を用いて室温において２時間かけてブロッキングした。次いで、前に記載したのと同様にプレートを洗浄した。次いで、血清サンプルを３％ＮＦＤＭを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ−２０（０．１％）を用いて１：２０００に希釈し、次いで、１００μＬを適切なウエルに加え、プレートは室温において２時間かけて平衡状態にした。連続希釈を使用した力価数値は、１：２０００の血清希釈が（誤差の範囲内で）類似したデータ傾向を示したことを示した。次いで、ウエルを前と同様に洗浄した。二次検出抗体（ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ブタＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.(KPL) Gaithersburg、MD）は、３％ＮＦＤＭを含むＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（０．１％）に１：５０００に希釈し、１００μＬの希釈溶液をそれぞれのウエルに加えた。室温で１時間のインキュベーションの後、プレートを再度洗浄した。テトラメチルベンジジン（ＴＭＢカタログ番号５０−７６−００ Kirkegaard & Perry Laboratories Inc.(KPL) Gaithersburg、MD）を使用して比色分析を実施した。等体積のＴＭＢペルオキシダーゼ（溶液Ａ）とペルオキシダーゼ（溶液Ｂ）を１つに混合し、１００μＬをそれぞれのウエルに加えた。溶液は室温で１５分間かけて発色させた（青色）。１００μＬの１Ｍリン酸を加えることによって、反応をクエンチさせた（黄色）。プレートは４５０ｎｍで読み取った（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍａｘマイクロタイターリーダー、Molecular Devices、Sunnyvale、CA）。
【実施例３】
【０１０４】
相同野生型ウイルスによる反復チャレンジ後のＰＲＲＳウイルス抗体応答
血清学は家畜の疾患の調査および管理の基礎となっている。血清中の特異的抗体の存在は疾患に対する事前の曝露を示し、動物が防御免疫を有することを確認することもできる。現在利用可能なＰＲＲＳウイルスＥＬＩＳＡ抗体試験は、ブタの感染群、特に再感染動物において見られる全ての考えられる状況に感度が良いわけではないことがある。多くの動物は、初期感染後４〜６カ月以内に血清反応陰性状態に戻る（Yoonら、J.Vet.Diagn.Invest.、7 : 305〜312 (1995)）。さらに、改変型生ＰＲＲＳウイルスワクチンによる複数回の反復ワクチン接種中にＥＬＩＳＡ抗体陰性状態に戻り留まる動物の報告がある（Bakerら、Proc.Allen D.Leman Swine Conference、vol.26(suppl.) p.31(1999)）。同じ野生型ＰＲＲＳウイルスへの頻繁な反復曝露後にＥＬＩＳＡ抗体応答の消失が起こる場合、連続的なウイルス循環の動物群を調べるときの、その動物のＰＲＲＳウイルスＥＬＩＳＡ試験の結果に対する獣医の解釈の仕方を変える可能性がある。
【０１０５】
以下の実験を実施して、（１）ＰＲＲＳウイルスＥＬＩＳＡ血清反応陰性動物が、野生型ウイルスを用いた複数回の低用量免疫処置によって誘導されうるかどうかを判定し、かつ（２）ＰＲＲＳウイルス血清中和抗体および個々の組換えＯＲＦポリペプチドに対する抗体の発現の時間的概略を特徴付けした。
【０１０６】
６８匹のＰＲＲＳウイルス陰性の６カ月齢の去勢ブタに、用量当たり１０２．５の野生分離株ＳＤ２８９８３  ＰＲＲＳウイルスを使用して約６／６０型のスケジュール計６回の免疫処置で、１月隔てて２回、次いで、２カ月に１回注射した。動物はそれぞれの免疫処置３週間後に採血し、サンプルはＰＲＲＳウイルスＥＬＩＳＡおよび血清中和抗体に関して試験した。最後の免疫処置の４カ月後（最初の曝露の１２カ月後）に、ＳＤ２８９８３を用いて動物を再度チャレンジした。
【０１０７】
血液サンプルは、蛍光焦点中和により血清中和抗体に関して（アッセイ接種原として２３９８３株ウイルス）、および本明細書に記載するように得た組換えＰＲＲＳウイルスポリペプチドに対する抗体に関して試験した。簡単に説明すると、ＰＲＲＳウイルスｒＯＲＦポリペプチドは、所望のｃＤＮＡ核酸断片を大腸菌に挿入して発現させることによって生成させた。生成させたポリペプチドには、ヌクレオカプシド（ＯＲＦ７ポリペプチド）、およびウイルスエンベロープ内に共に位置するＯＲＦ５エンベロープポリペプチドとＯＲＦ６マトリクスポリペプチドの両方のエクトドメイン領域を含むキメラポリペプチド断片が含まれた。ＥＬＩＳＡプレートはそれぞれのポリペプチドでコーティングし、血清サンプルは限界希釈によって試験した。結果は光学濃度比ではなく力価として記録した。市販のＰＲＲＳウイルスＥＬＩＳＡ（２ＸＲ  ＰＲＲＳウイルス抗体試験キット；IDEXX Laboratories）を使用して血液サンプルも試験した。
【０１０８】
ＰＲＲＳウイルス２ＸＲ  ＥＬＩＳＡ抗体のレベルは、毒性２８９８３株ＰＲＲＳウイルスを用いた反復注射にもかかわらず、初期のセロコンバージョン後に急激に低下した。ほぼ全ての動物が、一貫した陽性の抗体応答を初期に示した。しかしながら、これらの動物の７５パーセントは、生きたウイルスを６回注射した後に４カ月で血清反応陰性状態に戻った。これは、ＭＬＶ  ＰＲＲＳウイルスワクチンの複数回のワクチン接種後に雌ブタで観察されたこと（Bakerら、Proc.Allen D.Leman Swine Conference、vol.26(suppl.) p.31(1999)）と類似している。逆に、血清中和試験は初期感染後に後期に抗体を検出し、実験の終期に全ての動物は血清中和抗体を陽性に保っていた。
【０１０９】
ｒＯＲＦ  ＥＬＩＳＡは経時的な抗体曲線を明らかにした。組換えヌクレオカプシドポリペプチドを使用したアッセイは、ＩＤＥＸＸ  ２ＸＲ  ＥＬＩＳＡ応答曲線に綿密に従う曲線をもたらし、４カ月で低レベルに下降した。逆に、エンベロープキメラＯＲＦ５およびＯＲＦ６ポリペプチドＥＬＩＳＡは、ＰＲＲＳ血清中和抗体の応答曲線とほぼ同一の経時的パターンをたどった。したがって、ブタは主にヌクレオカプシドポリペプチドに対する強い抗体応答を最初に示し、経時的に抗体応答は再度エンベロープポリペプチドに対して生起されるようである。ＰＲＲＳウイルスに対する免疫応答は、免疫学的に防御性のある血清中和抗体にゆっくりと移行するようである。
【０１１０】
これらの結果は、有効な診断キットがＯＲＦ５ポリペプチドおよびＯＲＦ６ポリペプチドを含み得ることを実証する。これらの結果はまた、ワクチン接種または再曝露後の弱いＩＤＥＸＸ  ＰＲＲＳウイルスＥＬＩＳＡ抗体応答が、動物がワクチンまたはウイルスに対する防御的な免疫応答を有することを逆説的に示し得ることを実証する。何故ならＩＤＥＸＸ  ＰＲＲＳウイルスＥＬＩＳＡキットは、ＰＲＲＳウイルスのヌクレオカプシドポリペプチドと結合する抗体の検出に限られる可能性があるからである。
【実施例４】
【０１１１】
ＰＲＲＳウイルスの毒性株と弱毒性株の相対的な抗体応答
以下の実験を実施して、（１）個々のＰＲＲＳウイルスポリペプチドに対するブタの抗体応答を特徴付けし、（２）毒性が異なるウイルス分離株に対する抗体応答を決定し、かつ（３）抗体応答とチャレンジに対する防御の間の関係を決定した。
【０１１２】
１００匹のＰＲＲＳ陰性である３〜４週齢の子ブタを幾つかのグループに分けた。１グループ当たり１０匹のブタに、高度または中等度に毒性（ＳＤＳＵ７３、ＭＮ１８４、ＪＡ１４２、および１７１９８−６）、低毒性（ＶＲ２３３２およびＡＢＳＴ−１）、または無毒性（Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＰＲＲＳおよびＩｎｇｅｌｖａｃ  ＡＴＰ）として特徴付けられる２×１０３ＴＣＩＤ５０のＰＲＲＳウイルス株を鼻腔内に接種した。１グループの１０匹のブタには等量の全ウイルスを含むカクテルを与え、１０匹の対照ブタにはウイルスは与えなかった。動物を急性感染から完全に回復させた後に、ＭＮ１８４で動物をチャレンジした。臨床的徴候を実験を通して記録し、チャレンジ後１４日で検死を実施した。動物は週に１回採血し、所望のｃＤＮＡ断片を大腸菌に挿入して発現及び精製することによって生成した精製非構造および構造ポリペプチドに対する抗体レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。これらのポリペプチドには、ＶＲ２３３２  ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチド（ヌクレオカプシドポリペプチド）、ＶＲ２３３２  ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ１ポリペプチド、ＶＲ２３３２  ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２Ｐポリペプチド、ＶＲ２３３２  ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ４ポリペプチド、ＶＲ２３３２  ＯＲＦ５  ５’エクトドメイン１ポリペプチド、ＭＮ３０１００  ＶＲ２３３２  ＯＲＦ５  ５’エクトドメイン１ポリペプチド、ＶＲ２３３２  ＯＲＦ５  ３’エンドドメインポリペプチド、ＭＮ３０１００  ＯＲＦ５  ３’エンドドメインポリペプチド、ＶＲ２３３２  ＯＲＦ５  ５’エクトドメイン１および２ポリペプチド、ならびにＶＲ２３３２  ＯＲＦ５／ＯＲＦ６キメラポリペプチド（ＯＲＦ５  ５’エクトドメイン１および２とＯＲＦ６  ５’エクトドメイン１および２；ＧＰ５−Ｍキメラエクトドメインポリペプチドとも呼ばれる）が含まれた。ＥＬＩＳＡプレートはそれぞれのポリペプチドでコーティングし、血清サンプルは１／２０００の希釈で試験した。特異的抗体のレベルは、バックグラウンド補正した光学濃度の値として表した。
【０１１３】
ＰＲＲＳウイルス接種に対する臨床応答は、無毒性または低毒性株を与えた動物においてゼロまたは最小限の影響の観察から、ＭＮ１８４を投与した約５０パーセントの動物の死の範囲であった。高度または中等度に毒性である株を接種した動物に対する抗体応答は顕著であった。一般に、抗体は第２１日に初めて出現し、感染後２８日でピークに達した。ヌクレオカプシドに対する抗体のレベルは２８日後に劇的に低下し、一方で他のウイルスポリペプチドに対する応答は、実験の終期に高レベルで保たれる傾向があった。非構造ポリペプチドＮＳＰ１およびＮＳＰ２に対する抗体応答は、ヌクレオカプシドに対する応答と同じくらい高いかあるいはそれより高かったが、ウイルスプロテアーゼをコードするＮＳＰ４に対する応答は全時点で低かった。
【０１１４】
ウイルス投与に対する体液性応答は全処置グループにおいてＩＤＥＸＸ陽性であったが、抗体応答の強度の著しい変動が明らかであった。無毒性および低毒性株は、中等度または高度に毒性である株と比較して強さが低い抗体応答を誘導した。これらの違いは、試験した全ての抗原において存在した。しかしながら、チャレンジに対する応答は全処置グループで類似していた。
【０１１５】
要約すると、さまざまな構造および非構造ＰＲＲＳウイルスポリペプチドに対する抗体応答の違いが観察された。さらに、それらの弱毒形と比較したＰＲＲＳウイルスの毒性株に対する抗体応答の違いを観察した。しかしながら抗体応答の違いは、異種の高毒性のチャレンジ株による再感染に対する防御とは関係がなかった。これらの知見は、急性感染中および毒性チャレンジ後の個々のＰＲＲＳウイルスポリペプチドに対する抗体応答の最初の特徴である。
【実施例５】
【０１１６】
個々のＰＲＲＳウイルスポリペプチドおよび市販のＥＬＩＳＡキットを使用する、ＰＲＲＳウイルスに対する抗体の検出
以下の実験を実施して、ＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡが陽性から陰性に変わる複数回の曝露および長期間の条件下において、特定ポリペプチドのＥＬＩＳＡがＰＲＲＳウイルス陽性サンプルを検出することができるかどうかを判定した。ＰＲＲＳ陰性である６カ月齢の去勢ブタに、１０２．５５０％組織培養感染量（ＴＣＩＤ５０）の野生分離株ＳＤ２８９８３  ＰＲＲＳウイルスを最初に注射し、次いで、１、２、４、６、および８カ月目に計６回接種した。それぞれの接種前に動物から採血し、血清を回収した。血液サンプルは、（１）市販のＰＲＲＳウイルスＥＬＩＳＡ（２ＸＲ  ＰＲＲＳウイルス抗体試験キット；IDEXX Laboratories）または（２）特定のＰＲＲＳウイルスポリペプチドを含むＥＬＩＳＡを使用して試験した。ＩＤＥＸＸ  ２ＸＲ  ＨｅｒｄＣｈｅｋ（登録商標）ＥＬＩＳＡは、製造者の指示に従い１／４０に希釈した血清サンプルに対して実施した。データはそれぞれのグループ中の全サンプルの平均および標準偏差として表した。１グループのサイズは、１グループ当たり１９〜２３サンプル、２３匹のブタで変化した。
【０１１７】
ＩＤＥＸＸキットを使用して分析した約半分の動物は、第３５３日の時点で陰性であることが分かった（表３および図１０）。０．４を超えるＳ／Ｐ比は、ＰＲＲＳウイルスに対する抗体に関してサンプルが陽性であったことを示し、一方で０．４未満のＳ／Ｐ比は、ＰＲＲＳウイルスに対する抗体に関してサンプルが陰性であったことを示した。
【表３】
2008503727.tif 000006
【０１１８】
同じサンプルを、ＥＬＩＳＡにおいて組換えＧＰ５エンドドメインポリペプチドまたは組換えＧＰ５−Ｍキメラポリペプチドのいずれかを使用して分析した。簡単に説明すると、一晩けけて炭酸塩ｐＨ９．６中において１ウエル当たり１００ｎｇのポリペプチドでプレートをコーティングした。血清は１／１０００に希釈し、二連で試験した。ＧＰ５エンドドメインポリペプチドのＥＬＩＳＡについては、それぞれのグループ中の全サンプルの未調整ＯＤ値のサンプル／陽性比、および０．２１を超える（陽性）または０．２１未満の（陰性）平均値を有するサンプルの数としてデータを表す。ＧＰ５−ＭキメラポリペプチドのＥＬＩＳＡについては、それぞれのグループ中の全サンプルの未調整ＯＤ値のサンプル／陽性比、および０．５を超える（陽性）または０．５未満の（陰性）平均値を有するサンプルの数としてデータを表す。サンプル／陽性比は、（サンプルＯＤ）−（抗原／陽性対照ＯＤを含まない対照ウエルのＯＤ）−（抗原を含まない対照ウエルのＯＤ）として決定した。
【０１１９】
２つのサンプルは、第３５３日の時点で試験したＰＲＲＳウイルスＧＰ５エンドドメインポリペプチドに対する抗体に関して陰性であることが分かった（表４および図１１）。ＧＰ５−Ｍキメラポリペプチドを使用した場合には、試験した全てのサンプルは、第３５３日の時点で陽性であることが分かった（表５および図１２）。これらの結果は、ＧＰ５ポリペプチドを使用するアッセイは、市販のＩＤＥＸＸキットが検出できない状況において、抗ＰＲＲＳウイルス抗体を検出することができることを実証する。
【表４】
2008503727.tif 000007
【０１２０】
【表５】
2008503727.tif 000008
【実施例６】
【０１２１】
ＰＲＲＳウイルスポリペプチドの混合物および市販のＥＬＩＳＡキットを使用する、ＰＲＲＳウイルスに対する抗体の検出
１グループ当たり１０匹の離乳ブタに、３．０Ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍＬの表６に列挙したウイルス分離株を含む２ｍＬの組織培養培地をそれぞれ鼻腔内接種した。プールは等しい比率のそれぞれ８種の分離株の混合物とした。対照は組織培養培地のみとした。
【表６】
2008503727.tif 000009
【０１２２】
ＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡキットと組換えポリペプチドＥＬＩＳＡを比較するために、接種後第７日に１グループ当たり５匹のブタから血清を無作為に選択した。５のサンプルのうちの４つを第１４日にさらに試験した。ＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡキットに関しては、０．４以上のＳ／Ｐ比はサンプルが陽性であったことを示し、一方で０．４未満のＳ／Ｐ比はサンプルが陰性であったことを示した。同じサンプルを、ＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡキットと組換えポリペプチドＥＬＩＳＡを使用して分析した。
【０１２３】
組換えポリペプチドＥＬＩＳＡについては、本明細書に記載するように以下のポリペプチドを発現させ精製した。すなわち、ＯＲＦ７ポリペプチド、ＯＲＦ５＋６キメラエクトドメインポリペプチド、ＮＳＰ２Ｐポリペプチド、およびＯＲＦ５  ３’エンドドメインポリペプチド。精製ポリペプチドの濃度は、ＯＤ２８０吸光度の一致、Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーによる分析、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、およびＲＣ  ＤＣローリーのタンパク質アッセイによって決定した。マイクロタイタープレートは、１００μＬのｐＨ９．６のコーティング炭酸バッファー中に合計６００ｎｇで１５０ｎｇの各ポリペプチドを用いてコーティングした。ＥＬＩＳＡを１／５００希釈で血清サンプルに対して実施した。第７日のサンプルと第１４日のサンプルは、ＩＤＥＸＸ  ＥＬＩＳＡにより分析して同一のサンプルである。さらに、１グループ当たり７匹の動物（５匹はＭＮ１８４およびプールグループ中）を第５０日に分析した。対照動物は常時陰性であった。グループ１０の７匹のブタを試験して、これらは全ての試験日において陰性であった。
【０１２４】
第７日に回収した試験サンプルのうち１つだけが、ＩＤＥＸＸキットを使用して分析すると陽性であった（表７）。さらに、第１４日に回収した１３のサンプルがＰＲＲＳウイルス抗体に陰性であった。第１４日に回収した３６のサンプルのうち２３のサンプルが、ＰＲＲＳウイルス抗体に陽性であった。
【表７】
2008503727.tif 000010
【０１２５】
対照的に、第７日に回収した４５の試験サンプルのうち１４のサンプルが、ＰＲＲＳウイルスポリペプチドの混合物を含むＥＬＩＳＡを使用して分析すると陽性であった（表８）。さらに、第１４日に回収した３６のサンプルのうち８のみが、ＰＲＲＳウイルス抗体に陰性であった。第１４日に回収した３６のサンプルのうち２８のサンプルが、ＰＲＲＳウイルス抗体に陽性であった。さらに、第５０日に回収した５９のサンプルのうち５４のサンプルが、ＰＲＲＳウイルス抗体に陽性であった（表８）。
【表８】
2008503727.tif 000011
【０１２６】
これらの結果は、ＰＲＲＳウイルスポリペプチドの混合物を使用して、ＰＲＲＳウイルス曝露の時間に関して初期だけでなく後期である幾つかの時点で、ＰＲＲＳウイルスに曝露した動物において、ＰＲＲＳウイルス抗体を検出することができることを実証する。例えば陽性サンプルは、ＰＲＲＳウイルス曝露後第７、１４、および５０日に検出された。
【０１２７】
それぞれのグループのサンプルは、本明細書に記載するように得た個々のＰＲＲＳウイルスポリペプチドを用いるＥＬＩＳＡを使用してさらに試験した（図１８）。
【実施例７】
【０１２８】
ＰＲＲＳウイルスのワクチン株または野生分離株に曝露した動物間の識別
Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶ（ＲｅｓｐＰＲＲＳ；ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＦ０６６１８３とも呼ばれる）をワクチン接種した２８日後に、５匹のブタから血清サンプルを得て、１／３００に希釈し、２００ｎｇのＰＲＲＳウイルスＶＲ２３３２株由来の５’エクトドメインＯＲＦ５ポリペプチド、ＰＲＲＳウイルス分離株ＭＮ３０１００由来の５’エクトドメインＯＲＦ５ポリペプチド、ＰＲＲＳウイルスＶＲ２３３２株由来の３’エンドドメインＯＲＦ５ポリペプチド、またはＰＲＲＳウイルス分離株ＭＮ３０１００由来の３’エンドドメインＯＲＦ５ポリペプチドでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上において二連で分析した。ＰＲＲＳウイルス分離株ＭＮ３０１００を接種した２８日後に、同じ方法で血清サンプルを５匹のブタから得て分析した。ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ５ポリペプチドの５’エクトドメインはＰＲＲＳウイルス分離株間で可変的なアミノ酸配列を含み、一方ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ５ポリペプチドの３’エンドドメインは、ＰＲＲＳウイルス分離株間で保存されているアミノ酸配列を含む。
【０１２９】
３’エンドドメインＯＲＦ５ポリペプチド（ＶＲ２３３２由来の３’エンドドメインＯＲＦ５ポリペプチドまたはＭＮ３０１００由来の３’エンドドメインＯＲＦ５ポリペプチドのいずれか）を含むＥＬＩＳＡによって、ＰＲＲＳウイルスのワクチン株（Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶ）または野生分離株（ＭＮ３０１００）のいずれかに曝露した動物から得たサンプル中において、ＰＲＲＳウイルス抗体が検出された（表９および図１３）。これらの結果は、ＰＲＲＳウイルス間で保存されているＰＲＲＳウイルスの配列に限定したポリペプチドは、ＰＲＲＳウイルスのワクチン型または野生型のいずれに由来するものであっても、それを使用していずれかの型のＰＲＲＳウイルス（例えば、ワクチン型または野生型のＰＲＲＳウイルス）に曝露された動物を検出できることを実証する。
【表９】
2008503727.tif 000012
【０１３０】
ＶＲ２３３２由来の５’エクトドメインＯＲＦ５ポリペプチドを含むＥＬＩＳＡによって、ＰＲＲＳウイルスのワクチン株（Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶ）に曝露した動物から得たサンプルではＰＲＲＳウイルス抗体が検出されたが、ＰＲＲＳウイルスの野生分離株（ＭＮ３０１００）に曝露した動物から得たサンプルではＰＲＲＳウイルス抗体は検出されなかった（表９および図１３）。同様に、ＭＮ３０１００由来の５’エクトドメインＯＲＦ５ポリペプチドを含むＥＬＩＳＡによって、ＰＲＲＳウイルスの野生分離株（ＭＮ３０１００）に曝露した動物から得たサンプルではＰＲＲＳウイルス抗体が検出されたが、ワクチン株（Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶ）に曝露した動物から得たサンプルではＰＲＲＳウイルス抗体は検出されなかった（表９）。これらの結果は、ＰＲＲＳウイルス間で可変的であるワクチン型ＰＲＲＳウイルス由来のＰＲＲＳウイルスの配列に限定したポリペプチドを使用して、野生型のＰＲＲＳウイルスに曝露した動物とは対照的に、ワクチン型のＰＲＲＳウイルスに曝露した動物を同定できることを実証する。
【実施例８】
【０１３１】
ワクチン株および野生分離株からの他の組換えＰＲＲＳウイルスポリペプチドの生成
以下のポリペプチドを生成した。ＰＲＲＳウイルスのＯＲＦ７ポリペプチド（図２６）、ＰＲＲＳウイルスのＮＳＰ２  ＨＰポリペプチド（図２７）、ＰＲＲＳウイルスのＮＳＰ２  Ｓ１  ＨＰポリペプチド（図２８）、ＰＲＲＳウイルスのＮＳＰ２  Ｓ２  ＨＰポリペプチド（図２９）、ＰＲＲＳウイルスの第１および第２のＮ末端のエクトドメインＯＲＦ６ポリペプチド（ＯＲＦ６  ５’全体；図３０）、およびＰＲＲＳウイルスのエンドドメインＯＲＦ６ポリペプチド（ＯＲＦ６  ３’；図３１）。それぞれの場合、ポリペプチドはｍｙｃ配列、次にＰＲＲＳウイルス配列、次にポリヒスチジン配列を含んでいた。ＰＲＲＳウイルス配列のこれらのポリペプチドをコードする核酸は、ＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＰＲＵ８７３９２）のヌクレオチド配列由来のものであった。さらに、ｍｙｃ−ＯＲＦ７−Ｈｉｓポリペプチド、ｍｙｃ−ＯＲＦ５  ３’−Ｈｉｓポリペプチド、ｍｙｃ−ＯＲＦ６  ３’−Ｈｉｓポリペプチド、およびｍｙｃ−ＮＳＰ２−Ｈｉｓポリペプチドを生成した。これらのポリペプチドのＰＲＲＳウイルス配列をコードする核酸は、ＰＲＲＳウイルスのＬｅｌｙｓｔａｄウイルス（ＬＶ）株（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｍ９６２９２）のヌクレオチド配列由来のものであった。ｍｙｃ−ＮＳＰ２  ＨＰ−Ｈｉｓポリペプチドも生成した。このポリペプチドのＰＲＲＳウイルス配列をコードする核酸は、Boehringer Ingelheimワクチン株ＡＴＰ中のヌクレオチド配列由来のものであった。ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号ＡＹ４２４２７１のＰＲＲＳウイルスＪＡ１４２株を使用してＡＴＰ配列を得た。何故ならＰＲＲＳウイルスＪＡ１４２株は、Boehringer Ingelheimワクチン株ＡＴＰの親ウイルス株だからである。
【０１３２】
ＶＲ−２３３２のＰＲＲＳ配列を含むポリペプチドを実施例２に記載したのと同様に構築した。ＰＲＲＳウイルスＬＶ株またはＡＴＰ株の配列を含むプラスミドのために、スクロース緩衝（sucrose cushion）を介した遠心分離によって細胞培養溶解物からウイルスを単離した。ウイルスＲＮＡはＱｉａｇｅｎキットを用いて抽出した。プライマーを、所望の配列を増幅し、必要な制限酵素認識部位を含むように設計した。ＰＣＲ産物はＱｉａｇｅｎ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製しｐＧＥＭ−Ｔベクターに連結させた。プラスミドは大腸菌ＤＨ５α中で増幅させ、精製し、ＢａｍＨＩおよびＸｈｏ１を用いて消化した。インサートを精製し、ｐＥＴ２４ｂｍｙｃＨｉｓベクターに再度クローニングした。
【０１３３】
組換えポリペプチドは、ＢＬ２１（ＤＥ３）−ＲＰ細胞中でプラスミドから発現させた。形質転換後、細胞はカナマイシン（３０μｇ／ｍＬ）およびクロラムフェニコール（３５μｇ／ｍＬ）を含むＬＢ寒天プレート上に広げ、３７℃において一晩インキュベートした。１つのコロニーを採取して、前と同様にカナマイシンおよびクロラムフェニコールを含む２０ｍＬの２×ＹＴ培地中で増殖させ、２２５ｒｐｍで攪拌しながら一晩増殖させた。２０ｍＬの培養物は抗生物質を含む１リットルの２×ＹＴ培地に移し、ＯＤ６００が０．３に達するまで３０℃において攪拌した。ＩＰＴＧは１ｍＭまで加え、フラスコは３０℃において４〜５時間攪拌した。２００μＬの培養物をゲル分析用に取り出した。
【０１３４】
残りの培養物は４℃において４０００×ｇで２０分間遠心分離にかけて、細菌をペレット状にした。ペレットは３０ｍＬの１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ８．０中に再懸濁させた。ＰＭＳＦを１ｍＭまで加え、混合物は室温において２時間軽く回転させた。この混合物を４℃において１０，０００×ｇで３０分間遠心分離にかけて、細胞残屑をペレット状にした。６ｍＬのＮｉ−ＮＴＡアガロース（Qiagen、Valencia CA）の５０％スラリーを、変性タンパク質を含む上清に加え、室温で１時間軽く回転させた。混合物は次いで、ガラス製カラム１．５ｃｍＩＤ×４０ｃｍに入れ、排出させた。２０ｍＬの１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ６．３を用いてカラムを２回洗浄した。組換えタンパク質は１００ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、８Ｍ尿素、ｐＨ５．５〜５．７の４ｍＬアリコート３〜４つを用いて溶出させた。タンパク質はリフォールディングまで−２０℃で保存した。
【０１３５】
２３１．３ｍｇのジチオスレイトールをプールしたタンパク質の溶液に加え、２時間軽く攪拌することによって、タンパク質をリフォールディング状態にした。次いで、この溶液を５００ｍＬのリフォールディングバッファー（１００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．５Ｍ  Ｌ−アルギニン、８ｍＭ酸化グルタチオン、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、１０μＭペプスタチンＡ、１０μＭロイペプチン、１ｍＭ  ＰＭＳＦ）に直ちに希釈し、４℃において一晩軽く攪拌した。タンパク質は接線流式濾過（Ｐｅｌｌｉｃｏｎ  ＸＬ  Ｕｌｔｒａｃｅｌ  ＰＬＣ  ５ｋｄ、Millipore、Bedford MA）によって再度濃縮し、１０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０に対して４℃において一晩かけて透析した（Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ  ＭＷＣＯ３，０００）。溶液は必要に応じて４℃において３，８００ｒｐｍでの３０分間の遠心分離（Ｃｅｎｔｒｉｐｒｅｐ、Millipore）によって濃縮した。タンパク質は−８０℃においてアリコートとして保存した。タンパク質の濃度および純度は、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によって評価した。
【実施例９】
【０１３６】
一方または両方の遺伝子型由来のＰＲＲＳウイルスポリペプチドの混合物を使用する、北米および欧州遺伝子型ＰＲＲＳウイルスに対する抗体の検出
以下の実験を実施して、（１）北米型ＰＲＲＳウイルス（例えばＶＲ−２３３２）由来のポリペプチドを使用するＥＬＩＳＡが、欧州型ＰＲＲＳウイルス（例えばＬｅｌｙｓｔａｄウイルス）を接種したブタからのＰＲＲＳウイルス陽性サンプルを検出することができるかどうかを決定し、かつ（２）欧州型ＰＲＲＳウイルス（例えばＬｅｌｙｓｔａｄウイルス）由来のポリペプチドを使用するＥＬＩＳＡが、北米型ＰＲＲＳウイルス（例えばＶＲ−２３３２）を接種したブタからのＰＲＲＳウイルス陽性サンプルを検出することができるかどうかを決定した。以下の実験をさらに実施して、北米型ウイルスおよび欧州型ウイルス由来のポリペプチドの組合せを使用するＥＬＩＳＡが、いずれかの型のウイルスに感染させたブタからＰＲＲＳウイルス陽性サンプルを検出することができるかどうかを決定した。
【０１３７】
１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、ｐＨ９．６中の以下のポリペプチドを使用して、ＥＬＩＳＡプレートをコーティングした（ＣＯＳＴＡＲ３５９０、９６ウエルＥＩＡ／ＲＩＡプレート、Corning NY）。すなわちｍｙｃ−ＯＲＦ７−Ｈｉｓ（ＶＲ−２３３２）、ｍｙｃ−ＯＲＦ６  ３’−Ｈｉｓ（ＶＲ−２３３２）、ｍｙｃ−ＯＲＦ５  ３’−Ｈｉｓ（ＶＲ−２３３２）、ｍｙｃ−ＯＲＦ７−Ｈｉｓ（ＬＶ）、ｍｙｃ−ＯＲＦ６  ３’−Ｈｉｓ（ＬＶ）、およびｍｙｃ−ＯＲＦ５  ３’−Ｈｉｓ（ＬＶ）。これらのポリペプチドは、ＯＲＦ７（Ｎ）、ＯＲＦ６（Ｍ）、またはＯＲＦ５（ＧＰ５）の全体または一部分を含むそれぞれのプラスミドから発現させた。３つのＶＲ−２３３２ポリペプチドのそれぞれを１００ｎｇ／１００μＬ、または３つのＬＶポリペプチドのそれぞれを１００ｎｇ／１００μＬ、または全６つのポリペプチドのそれぞれを５０ｎｇ／１００μＬのいずれかを含む溶液でウエルをコーティングした。したがって、全てのウエルは３００ｎｇのポリペプチドを含んでいた。
【０１３８】
プレートを４℃で一晩コーティング溶液と共にインキュベートした。プレートのウエルをＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．３〜７．５で１回洗浄し、１ウエル当たり３００μＬの５％脱脂粉乳含有ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ９．４〜９．６で２時間かけてブロッキングした。ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．３〜７．５中で５回プレートを洗浄し、ＰＢＳ、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、５％脱脂粉乳で１／５００に希釈した１００μＬの試験血清を二連のウエルに加えて１時間おいた。プレートを５回洗浄し、ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、５％脱脂粉乳で１／５０００に希釈したブタＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）に対するペルオキシダーゼ標識アフィニティ精製抗体（KPL、Gaithersburg MD）の１００μＬを加えて１時間おいた。プレートを５回洗浄し、酵素基質を５分間加えた。酵素基質は、１ウエル当たり１００μＬの混合した等しい割合のＴＭＢペルオキシダーゼ基質溶液ＡとペルオキシダーゼＨ２Ｏ２基質溶液Ｂ（ＴＭＢ  Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍ、KPL、Gaithersburg MD）からなっていた。１００μＬの２Ｍリン酸を用いて反応を停止させ、結果はＴｈｅｒｍｏ  Ｍａｘ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ、Molecular Devices、Sunnyvale CAにおいて４５０ｎｍで読み取った。
【０１３９】
非感染状態であったブタ（陰性血清Ａおよび陰性血清Ｂ）、欧州型ＰＲＲＳウイルスに感染したブタ（ｎ＝９）、および２つの北米型ＰＲＲＳウイルス株であるＭＮ１８４またはＳＤＳＵ７３（Johnsonら、Vet.Immunol.Immunopathol.、102 : 233〜247 (2004)）（それぞれｎ＝１）のいずれかに感染したブタから血清サンプルを得た。感染のおよそ０、７、１４、２１、２８、３５、および４９日後にサンプルを得た。ＶＲ−２３３２ポリペプチドの混合物では、感染後第１４日およびその後の全時点でＭＮ１８４またはＳＤＳＵ７３に曝露したブタの血清中に抗ＰＲＲＳウイルス抗体が検出された（図３２；パネルＡ）。ＶＲ−２３３２ポリペプチドでは、欧州型ＰＲＲＳウイルスに感染させたブタの血清中で抗ＰＲＲＳウイルス抗体は検出されなかった。
【０１４０】
ＬＶポリペプチドの混合物では、感染後第７日およびその後の全時点において高レベルで、欧州遺伝子型ＰＲＲＳウイルスに曝露したブタの血清中で抗体が検出された（図３２；パネルＢ）。ＬＶポリペプチドでも、第１４日およびそれ以降に北米型ＰＲＲＳウイルスに曝露したブタにおいて抗体が検出された（図３２；パネルＢ）。ＬＶポリペプチドとＶＲ−２３３２ポリペプチドの組合せによって、ＬＶポリペプチドのみに同様に曝露したブタの血清中で抗ＰＲＲＳウイルス抗体が検出されたが、ただしＭＮ１８４に曝露した動物において値が高い傾向があった（図３２；図Ｃ）。
【０１４１】
これらの結果は、ＬＶポリペプチド、ＯＲＦ５  ３’、ＯＲＦ６  ３’、およびＯＲＦ７ポリペプチドの混合物などは、感染後第７日で早くも欧州および北米遺伝子型ＰＲＲＳウイルスに曝露したブタにおいて抗体応答を検出することができることを示す。ＶＲ−２３３２ポリペプチドは北米型ＰＲＲＳウイルスに曝露したブタの血清を特異的に認識し、欧州型ウイルスに曝露したブタ由来の血清は認識しなかった。したがって、ポリペプチドの適切な混合物を用いて、全ＰＲＲＳウイルスに対する血清応答を検出することができ、欧州型に対する応答と北米型に対する応答を識別することができる。
【実施例１０】
【０１４２】
非構造タンパク質ポリペプチドを使用する、ＰＲＲＳウイルスのワクチン株または野生分離株に曝露した動物間の識別
実施例４は、ＰＲＲＳウイルスに対するブタの抗体応答が、Ｎなどの構造タンパク質よりも非構造タンパク質に対する方が大きい可能性があることを実証した。ＮＳＰの検出はさらに感度の良いアッセイをもたらす可能性があるので、以下の実験を実施して、ＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２またはＩｎｇｅｌｖａｃ  ＡＴＰワクチン株の非構造タンパク質由来のポリペプチドからなるＥＬＩＳＡが、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶ株またはＩｎｇｅｌｖａｃ  ＡＴＰ株を接種したブタとＰＲＲＳウイルスの野生分離株に曝露したブタを識別し得るかどうかを判定した。ＮＳＰ２の一部分を含むさまざまなポリペプチドを生成した（図３３）。
【０１４３】
最初の実験では、野生分離ウイルスまたはＩｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶワクチンウイルスに２８日間曝露したブタ由来の血清サンプルを、ｍｙｃ−ＮＳＰ２Ｐ−Ｈｉｓ（ＶＲ−２３３２）またはｍｙｃ−ＮＳＰ２  ＨＰ−Ｈｉｓ（ＶＲ−２３３２）ポリペプチドでコーティングしたマイクロタイタープレート中でインキュベートした。ＶＲ−２３３２株に由来したＭＬＶワクチンを接種したブタ由来の血清は、ｍｙｃ−ＮＳＰ２Ｐ−Ｈｉｓポリペプチドおよびｍｙｃ−ＮＳＰ２  ＨＰ−Ｈｉｓポリペプチドの両方と強く反応した。７匹のブタ由来の１／１０００に希釈した血清サンプル中の陽性シグナルは、ＮＳＰ２Ｐに対して０．８〜３．６ＯＤ単位、およびＮＳＰ２ＨＰに対して０．７〜３．１ＯＤ単位の範囲であった。バックグラウンドを差し引いた後の相対的割合の差（１−（ＯＤＮＳＰ２ＨＰ／ＯＤＮＳＰ２Ｐ））は、９．９〜２３．２パーセントの範囲であった。対照的に、５つの異なる野生型の野生分離ウイルスのいずれかを接種したブタ由来の血清は、ｍｙｃ−ＮＳＰ２  ＨＰ−Ｈｉｓポリペプチドよりｍｙｃ−ＮＳＰ２Ｐ−Ｈｉｓポリペプチドと強く反応した。５つの異なるウイルスに曝露した３５匹のブタ中の陽性シグナルは、ＮＳＰ２Ｐに対して０．５４〜３．３ＯＤ単位、およびＮＳＰ２  ＨＰに対して０．２２〜１．９ＯＤ単位の範囲であった。相対的割合の差は３６．６〜８５．１パーセントの範囲であった。
【０１４４】
これらの結果は、ＮＳＰ２  ＨＰ（ＶＲ−２３３２）ポリペプチドは他のＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ＨＰポリペプチドと異なり、したがってその誘導型ワクチンウイルスであるＭＬＶは、ＮＳＰ２ＨＰ（ＶＲ−２３３２）ポリペプチドと選択的に反応するブタにおいて抗体を誘導することを示す。さらに、野生分離ウイルスに曝露したブタ由来の血清サンプルとＮＳＰ２Ｐ（ＶＲ−２３３２）の顕著な反応性は、このポリペプチドが診断用ポリペプチドとして使用することができることを示す。ＭＬＶワクチンに対するＮＳＰ２ＨＰポリペプチドの相対的特異性は、試験血清のＶＲ−２３３２  ＮＳＰ２ＰおよびＮＳＰ２  ＨＰの両方に対する相対的な血清学的反応性を比較する試験が、野生分離ウイルスに曝露したブタ由来のＩｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶをワクチン接種したブタを識別することができることを示す。
【０１４５】
第２の実験では、ＧｅｎＢａｎｋのＰＲＲＳウイルス配列間でアミノ酸配列の違いを示すＮＳＰ２（ＶＲ−２３３２）ポリペプチド由来の他の部分を、前の実験と同様に、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶワクチンまたは野生分離ウイルスに曝露したブタ由来の血清との特異的反応性に関して評価した。ＥＬＩＳＡプレートはｍｙｃ−ＮＳＰ２Ｐ−Ｈｉｓ（ＶＲ−２３３２）ポリペプチド、またはｍｙｃ−ＮＳＰ２  Ｓ１  ＨＰ−Ｈｉｓ（ＶＲ−２３３２）、またはｍｙｃ−ＮＳＰ２  Ｓ２  ＨＰ−Ｈｉｓ（ＶＲ−２３３２）ポリペプチドでコーティングした。
【０１４６】
ワクチン接種した動物および野生分離ウイルスに曝露した動物に由来し１／１０００に希釈した全てのブタ血清（ｎ＝４２）が、前の実験と同様に高いＯＤ値でＮＳＰ２Ｐと反応した。しかしながら、血清は、ＮＳＰ２  Ｓ１  ＨＰおよびＮＳＰ２  Ｓ２  ＨＰの両方とわずかに反応した。９０パーセントを超えるサンプルのＯＤ値は０．１未満であった。これらの結果は、約３０〜４０アミノ酸のポリペプチドが、ポリペプチドのアミノ酸配列の可変性が高い場合でも、ウイルス感染に対する異なる血清反応性を識別するほど充分な免疫反応性を含まない可能性があることを示す。
【０１４７】
第３の実験では、実施例９に記載したのと同様に、ｍｙｃ−ＮＳＰ２  ＨＰ−Ｈｉｓ（ＡＴＰ）またはｍｙｃ−ＮＳＰ２Ｐ−Ｈｉｓ（ＶＲ−２３３２）ポリペプチドでマイクロタイタープレートをコーティングした。実施例４に記載したのと同様に、ワクチンおよび野生分離ウイルスに曝露したブタ由来の血清サンプルを用いてＥＬＩＳＡアッセイを実施した。アッセイは実施例９に記載したのと同様に実施したが、ただし血清サンプルは１／１０００に希釈し、発色反応は３分後に停止させた。本明細書に示すように、野生分離ウイルスまたはＭＬＶワクチンに曝露したブタ由来の血清サンプルは、ＮＳＰ２Ｐ（ＶＲ−２３３２）と陽性反応する（図３４）。Ａｂｓｔ−１またはワクチン株ＡＴＰに曝露したブタ由来の血清は、低度または無視できる程度の免疫応答を誘導する用量で使用したので陽性反応を示さなかった。ＮＳＰ２  ＨＰ（ＡＴＰ）ポリペプチドはＪＡ１４２、すなわちワクチンウイルスの親ウイルスに曝露したブタ由来の血清と強く反応したが、野生分離ウイルスＳＤＳＵ７３および１７１９８−６に曝露したブタ由来の血清とも反応した。これらの結果は、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＡＴＰおよびＶＲ−２３３２などの異なるＰＲＲＳウイルス株由来の、ＮＳＰ２  ＨＰおよびＮＳＰ２Ｐなどの非構造ポリペプチドの使用が、特定の株または分離体へのブタの曝露に特異的な血清試験の結果をもたらさなかったことを実証する。ＮＳＰ２  ＨＰ（ＡＴＰ）ポリペプチドは、ＮＳＰ２  ＨＰ（ＶＲ−２３３２）のように他のＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２  ＨＰポリペプチドと特異的に異なる可能性はない。
【実施例１１】
【０１４８】
ブロッキングステップ中にｐＨを増大させるとバックグラウンドシグナルは低減する
ＥＬＩＳＡ試験における非常に非特異的なバックグラウンドは、ブタ血清、特に低い希釈度の血清や６カ月齢以上などの高齢の動物に由来する血清に関する一般的な問題である。陽性および陰性のブタ血清の特異的反応性と非特異的反応性のレベルを、ｐＨ７．４または９．６でブロッキングしたＥＬＩＳＡプレート上で測定した。ゼロ〜３００ｎｇ／ウエルで等量のＮ、ＯＲＦ５およびＯＲＦ６エクトドメイン、およびＯＲＦ５エンドドメイン（いずれもＶＲ−２３３２由来）を用いてウエルをコーティングし、陽性または陰性の血清は１／４０〜１／４０００の希釈で使用した。陽性血清サンプルは、ＶＲ−２３３２への曝露の３週間後に７週齢のブタから得た。陰性血清サンプルは、６カ月齢のブタから得た。ブロッキングは５％脱脂粉乳含有ＰＢＳ、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０、ｐＨ７．４または９．６で実施した。
【０１４９】
ｐＨ７．４において、血清濃度依存性の発色がＰＲＲＳウイルス陽性サンプルで観察されたが、ＰＲＲＳウイルス陰性血清ウエル中の非特異的な発色は、プレート上の中および低レベルの抗原での特異的反応性よりさらに高かった（図３５）。ｐＨ値９．６でのブロッキングで、非特異的な反応性はほぼ完全に消失した。特異的反応性は約５０パーセント低下したが、全シグナル対ノイズ比は大幅に増大した（図３５）。
【０１５０】
これらの結果は、中性ｐＨにおいてＥＬＩＳＡプレートに適用するブロッキング溶液（例えばタンパク質溶液）が、タンパク質結合能を完全に中和するわけではなく、ブタ免疫グロブリンの非特異的結合および高いＯＤ値をもたらすことを示す。この問題は、他の場合アッセイ感度を増大させると思われる低い血清希釈で悪化する。ブロッキング溶液のｐＨを７．４より高く（例えば９より大きく）上昇させることによって、広範囲の抗原コーティング量および血清希釈において非特異的な反応性が低下または消失した。
【実施例１２】
【０１５１】
組換えＰＲＲＳウイルスポリペプチドの生成
実施例２に記載した方法および物質と類似した方法および物質を使用して、以下のポリペプチドを生成した。ＰＲＲＳウイルス（Ｌｅｌｙｓｔａｄ株）のＯＲＦ７ポリペプチド（図３６）、ＰＲＲＳウイルス（Ｌｅｌｙｓｔａｄ株）のＮＳＰ２Ｐポリペプチド（図３７）、ＰＲＲＳウイルス（ＪＡ１４２株）のＮＳＰ２Ｐポリペプチド（図３８）、ＰＲＲＳウイルス（ＡＴＰ株）のＮＳＰ２  ＨＰポリペプチド（図３９）、ＰＲＲＳウイルス（Ｌｅｌｙｓｔａｄ株）のエンドドメインＯＲＦ５ポリペプチド（ＯＲＦ５  ３’；図４０）、およびＰＲＲＳウイルス（Ｌｅｌｙｓｔａｄ株）のエンドドメインＯＲＦ６（ＯＲＦ６  ３’；図４１）ポリペプチド。
【実施例１３】
【０１５２】
リゾチームをコーティングバッファーに加えることによって、ヌクレオカプシドに対する反応性が増大する
組換えポリペプチドによるウエルのコーティングにおける対照として、リゾチームを含めた。簡単に説明すると、１００ｎｇのポリペプチド（例えば、リフォールディング状態のｍｙｃ−ＯＲＦ７−Ｈｉｓポリペプチド）単独、または１００μＬの炭酸バッファーに溶かしたさまざまな量のニワトリ卵リゾチーム（Sigma）でＥＬＩＳＡウエルをコーティングした。ＰＲＲＳウイルスＶＲ２３３２株に感染した２１日後の２匹のブタ由来の血清サンプル、または２匹の非感染状態の対照ブタ血清を用いてＥＬＩＳＡを実施した。
【０１５３】
さまざまな濃度のリゾチームの存在下または不在下において、ｍｙｃ−ＯＲＦ５−３’−Ｈｉｓポリペプチドおよび非リフォールディング状態のｍｙｃ−ＯＲＦ７−Ｈｉｓポリペプチドを含めたさまざまな組換えポリペプチドでプレートをコーティングした場合に、発色反応の強度の違いは観察されなかった。同様に、リゾチーム単独に対する反応性は観察されなかった。しかしながら、リフォールディング状態のｍｙｃ−ＯＲＦ７−Ｈｉｓポリペプチドの反応性は、リゾチームの存在下において実質的に増大した。さらに増大の程度は、加えたリゾチームの量に正比例した（図４２）。コーティングステップにリゾチームを含ませたことによって、１ウエル当たり約２００ｎｇのリゾチームの最大値まで用量依存的に、免疫ＰＲＲＳウイルス血清の特異的反応性が増大した（図４２）。
【０１５４】
この影響は調べた全ての希釈の血清で観察され、低希釈の血清でより大きな影響が観察された。１／３００希釈の血清において、平均的な比吸光度はリゾチームの不在下において約０．４２であったが、１６４ｎｇ以上のリゾチームの存在下においては１．０を超えた。さらにリゾチームの増大した影響は、１ウエル当たり２０〜５００ｎｇのリフォールディング状態のｍｙｃ−ＯＲＦ７−Ｈｉｓポリペプチドの範囲を含めた広範囲のコーティング量で観察された。１ウエル当たり約１００ｎｇのリゾチームは、例えば１：４０〜１：５０００の試験血清の希釈、４５分〜９０分の試験血清と抗原のインキュベーション、１：５００〜１：５０００の二次抗体コンジュゲートの希釈、および２分〜２０分の発色反応時間を含めた、さまざまな条件下において増大した結果を与えた。リゾチームがＯＲＦ７ポリペプチドに対する特異的な抗ＰＲＲＳ血清反応性を増大させるという知見は有用である。何故なら、ＯＲＦ７ポリペプチドはＰＲＲＳウイルスの主要抗原であり、血清試験において広く使用されているからである。抗ＯＲＦ７ポリペプチド抗体の検出の感度を増大させる条件は、ＰＲＲＳウイルスへの初期感染または曝露に対する診断アッセイの感度を増大させる可能性があり、曝露またはセロコンバージョン後の検出期間を延長させる可能性があり、より確固たる試験の基盤を与える可能性がある。何故なら、陽性の結果と陰性の結果の間の差異が広がり得るからである。
【実施例１４】
【０１５５】
組換えウイルスタンパク質を用いるＥＬＩＳＡの安定性の増大
商業用ブタ飼育作業中の妊娠中の雌ブタのＰＲＲＳウイルスへの以前の曝露を検出する組換えポリペプチドの能力を、ＩＤＥＸＸ  ２ＸＲ  ＥＬＩＳＡと比較して評価した。流行性感染した３２匹の妊娠中の雌ブタ由来の血清を３５日間隔で採取して、ＩＤＥＸＸ  ２ＸＲ  ＥＬＩＳＡによって、および３つの組換えＰＲＲＳウイルスポリペプチド（ＯＲＦ７、ＯＲＦ５−３’、およびＯＲＦ６−３’、全てＶＲ２３３２株）の組合せ、またはＶＲ２３３２株由来の個々のＰＲＲＳウイルスポリペプチド（ＯＲＦ５＋６エクトドメインキメラ、ＮＳＰ１、およびＮＳＰ２Ｐ）、またはＬｅｌｙｓｔａｄウイルス株由来の個々のＰＲＲＳウイルスポリペプチド（ＮＳＰ２Ｐ；図３７）に対するＥＬＩＳＡの反応性によって、抗ＰＲＲＳウイルス抗体について試験した。簡単に説明すると、１／５００に希釈した血清サンプルを、５０ｎｇのＯＲＦ５＋６キメラのみ、または１００ｎｇのＯＲＦ７、ＯＲＦ５−３’およびＯＲＦ６−３’（それぞれ３３ｎｇ）の組合せ、または１００ｎｇのＮＳＰ１、または１００ｎｇのＮＳＰ２ＰでコーティングしたＥＬＩＳＡプレート上に二連で適用した。血清サンプルはＩＤＥＸＸ  ２ＸＲ  ＥＬＩＳＡによっても分析した。それぞれのＥＬＩＳＡアッセイについて、平均吸光度の値（第３５日〜第０日）の差を全３２匹のブタに関して計算し、陽性から陰性に順序付けた。それぞれのデータセット用に、推定線形回帰式および回帰係数を計算した。得られた値は、それぞれの組換えポリペプチド調製物に関して全３２匹の動物の最高値から最低値に順序付けた（図４３）。
【０１５６】
それぞれの場合、陽性（３５日間隔で０日間隔より高い値）から陰性（３５日間隔で０日間隔より低い値）の一定範囲の値を得た。ＩＤＥＸＸ  ２ＸＲ  ＥＬＩＳＡ試験において、動物間で最大の変動（剰余の標準偏差＝０．５５）が、抗体レベル、陽性と陰性の両方で生じた（図４３）。この推定回帰分析においてより均一な結果を示した組換えポリペプチドＥＬＩＳＡは、ゼロに近い勾配を有する直線を示し、最高の応答および最低の応答の変動を低下させた（図４３）。それぞれの場合ＩＤＥＸＸ  ２ＸＲ  ＥＬＩＳＡと比較してゼロに近かった線形回帰式の勾配および剰余の小さな標準偏差により示したように、これらの結果は平均してより均一であった。最も一貫した結果は、Ｌｅｌｙｓｔａｄウイルス由来のＮＳＰ２Ｐに関して得られた。
【０１５７】
３５日間のアッセイの結果の大きな差は、反応性の大幅な低下を示す動物で免疫がないこと、および反応性が大きく増大した場合には感受性動物での新たな感染として解釈することができる。結果として、個々の動物および商業用ブタ集団のＰＲＲＳウイルスの状態の偽陽性および偽陰性との解釈が増大する可能性がある。組換えポリペプチドＥＬＩＳＡアッセイでは、ＰＲＲＳウイルスへの動物の曝露と一致した動物の応答の変動が少なく、動物では免疫応答が存在し、３５日間中動物の抗体の状態はほとんど変化しなかった。これらの結果は、個々のポリペプチドまたはポリペプチドの組合せに基づく組換えポリペプチドＥＬＩＳＡが、ＰＲＲＳウイルスに曝露した群のより均一な評価を与えることができ、偽陽性および偽陰性の解釈の可能性が低くなりうることを示す。
【実施例１５】
【０１５８】
一方の遺伝子型由来の個々のＰＲＲＳウイルスポリペプチドを使用する、北米および欧州遺伝子型ＰＲＲＳウイルスに対する抗体の検出
実施例９に記載した血清サンプル、ならびに組換えＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７（Ｌｅｌｙｓｔａｄウイルス、欧州遺伝子型由来；図３６）およびＮＳＰ２Ｐ（ＶＲ２３３２、北米遺伝子型；またはＬｅｌｙｓｔａｄウイルス由来、図３７）ポリペプチドを使用して、個々のＰＲＲＳウイルスポリペプチドに関する反応特異性を調べた。欧州遺伝子型ＰＲＲＳウイルスおよび北米遺伝子型ウイルスＭＮ１８４を接種したブタ由来の血清サンプルは、ＬｅｌｙｓｔａｄウイルスのＯＲＦ７ポリペプチドと強く反応し、一方北米遺伝子型ＳＤＳＵ７３株、ＶＲ２３３２株、およびＩｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶ株はわずかに反応した（図４４）。これらの結果は、ＬｅｌｙｓｔａｄウイルスのＯＲＦ７ポリペプチドを使用して、北米ＰＲＲＳウイルスの亜型に対する血清応答と欧州ＰＲＲＳウイルス株に対する血清応答を識別することができることを示す。欧州遺伝子型ＰＲＲＳウイルスを接種したブタ由来の血清サンプルはＬＶ  ＮＳＰ２Ｐポリペプチドのみと反応し、ＶＲ２３３２  ＮＳＰ２Ｐポリペプチドとは全く反応しなかった（図４４、パネルＢおよびＣ）。ＶＲ２３３２  ＮＳＰ２ＰポリペプチドはＶＲ２３３２に曝露したブタ由来の血清と強く反応し、Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶおよびＳＤＳＵ７３に曝露したブタの血清と、強くはないが陽性に反応した。ＭＮ１８４に曝露したブタ由来の血清とは全く反応しないようであった。これらの知見は、個々のＰＲＲＳウイルスポリペプチドが、ＰＲＲＳウイルスの亜型に曝露したブタに対する血清応答を検出できることを示す。
【０１５９】
他の実施形態
本発明をその詳細な説明と関連させて説明したが、前記の説明は例示することを意図するもので、添付の特許請求の範囲により規定した本発明の範囲を限定することを意図しないことを理解すべきである。他の態様、利点、および改良は特許請求の範囲の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【０１６０】
【図１】ＰＲＲＳウイルスゲノムの図解である。灰色のゲノム領域をＶＲ２３３２ウイルスＲＮＡからＰＣＲ増幅し、クローニングし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３ＲＰ）細胞中で発現させた。
【図２】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＮＳＰ１ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号１）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号２）はＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＮＳＰ１ポリペプチドをコードしている。示したアミノ酸配列（配列番号３）は開始部位からＮＳＰ１ポリペプチドのコード領域の開始までのアミノ酸配列である。
【図３】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＮＳＰ２ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号４）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号５）はＮＳＰ２ポリペプチドをコードしている。示したアミノ酸配列（配列番号６）は開始部位からｍｙｃタグをコードしている領域までのアミノ酸配列である。ＬＥＨＨＨＨＨＨ配列（配列番号１３）はｈｉｓタグを含む。
【図４】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＮＳＰ４ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号７）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号８）はＮＳＰ４ポリペプチドをコードしている。示したアミノ酸配列（配列番号９）はｍｙｃ−ＮＳＰ４−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図５】Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを使用して検出したリフォールディングＮＳＰ１ポリペプチドの蛍光強度をプロットしたグラフである。精製しリフォールディングしたＮＳＰ１ポリペプチドをＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）にかけて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ５０  Ａｓｓａｙ  ＬａｂＣｈｉｐキットにおいて標準プロトコールに従って分析した。ＮＳＰ１ポリペプチドの結果は、４６ｋＤ（完全ポリペプチド）ならびに２４および２２ｋＤのＰＣＰ１αおよびＰＣＰ１βにそれぞれ対応するピークになった。
【図６】Ａｇｉｌｅｎｔバイオアナライザーを使用して検出したリフォールディングＮＳＰ４ポリペプチドの蛍光強度をプロットしたグラフである。精製しリフォールディングしたＮＳＰ４ポリペプチドをＡｇｉｌｅｎｔ２１００バイオアナライザー（Agilent Technologies, Palo Alto, CA）にかけて、Ｐｒｏｔｅｉｎ  ５０  Ａｓｓａｙ  ＬａｂＣｈｉｐキットにおいて標準プロトコールに従って分析した。ＮＳＰ４ポリペプチドの結果は、２６ｋＤの単一ピークになった。
【図７】ＮＳＰ１ポリペプチド（リフォールディングなし）、ＮＳＰ１ポリペプチド（リフォールディング）、およびヌクレオカプシド（ＯＲＦ７）ポリペプチド（リフォールディング）に対して反応性の抗体の平均力価数値をプロットしたグラフである。抗ＮＳＰ１または抗Ｎ抗体応答の時間経過を、ＰＲＲＳウイルスＭＮ３０１００株に感染させ、指示した時間に採血した１４匹のブタ集団を使用して調べた。
【図８】ＮＳＰ４ポリペプチド（リフォールディングなし）、ＮＳＰ４ポリペプチド（フォールディング）、およびヌクレオカプシド（ＯＲＦ７）ポリペプチド（リフォールディング）に対して反応性の抗体の平均力価数値をプロットしたグラフである。抗ＮＳＰ４（リフォールディングなし）および抗ＯＲＦ７抗体応答の時間経過を、ＰＲＲＳウイルスＭＮ３０１００株に感染させた１４匹のブタ集団を使用して調べ、一方、抗ＮＳＰ４（フォールディング）応答はＩｎｇｅｌａｃ  ＭＬＶワクチンで免疫したブタで調べた。
【図９】Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＭＬＶで免疫したブタにおけるリフォールディングしたＮＳＰ１ポリペプチドおよびＮＳＰ４ポリペプチドに対して反応性の抗体の平均力価数値をプロットしたグラフである。
【図１０】市販ＥＬＩＳＡキット（ＩＤＥＸＸ  ２ＸＲキット）を使用して分析したサンプルに対するサンプル／陽性比（Ｓ／Ｐ比）をプロットしたグラフである。Ｙ軸を０．４で交差する水平の直線は陽性の結果に対するカットオフ値を示す。
【図１１】ＥＬＩＳＡでＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５の３’ポリペプチド断片を使用して分析したサンプルに対するＳ／Ｐ比をプロットしたグラフである。Ｙ軸を０．２１で交差する水平の直線は陽性の結果に対するカットオフ値を示す。
【図１２】ＥＬＩＳＡでＧＰ５−Ｍキメラポリペプチドを使用して分析したサンプルに対するＳ／Ｐ比をプロットしたグラフである。Ｙ軸を０．５で交差する水平の直線は陽性の結果に対するカットオフ値を示す。
【図１３】ＭＬＶまたはＭＮ３０１００  ＰＲＲＳウイルスに曝露された動物から得たサンプルの吸光度をプロットした２つの棒グラフを含む図である。吸光度はＥＬＩＳＡを使用して指示したポリペプチドで検出した。
【図１４】ＰＲＲＳウイルスＮＳＰ２ポリペプチドの配列アラインメントを含む図である。ＶＲ−２３３２  ＰＲＲＳウイルスのＮＳＰ２ポリペプチドをコードする核酸を、天然のＸｈｏＩ制限部位を使用して３４９０〜３４９５ヌクレオシドで切り取り、ＮＳＰ２Ｐポリペプチドと称せられる末端切断ＮＳＰ２ポリペプチドをコードする核酸を生じさせる。
【図１５】ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ５ポリペプチドの配列アラインメントを含む図である。
【図１６】ＰＲＲＳウイルスＯＲＦ７ポリペプチドの配列アラインメントを含む図である。
【図１７】指示した精製ＰＲＲＳウイルスポリペプチドのゲルの写真を含む図である。
【図１８】指示したポリペプチドを含むＥＬＩＳＡの吸光度をプロットしたグラフを含む図である。グループは表６に示してある。
【図１９】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＮＳＰ２ＰポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号１０）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号１１）はＮＳＰ２Ｐポリペプチドをコードしている。最初のアミノ酸配列（配列番号１２）はｍｙｃ−ＮＳＰ２Ｐ−Ｈｉｓポリペプチドのｍｙｃタグ領域のアミノ酸配列であり、一方、２番目のアミノ酸配列（配列番号１３）はｍｙｃ−ＮＳＰ２Ｐ−ＨｉｓポリペプチドのＨｉｓタグ領域のアミノ酸配列である。
【図２０】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＭＮ３０１００株由来のＯＲＦ５  ５’ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号１４）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号１５）はＯＲＦ５  ５’ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号１６）はｍｙｃ−ＯＲＦ５  ５’−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図２１】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＯＲＦ５  ５’ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号１７）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号１８）はＯＲＦ５  ５’ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号１９）はｍｙｃ−ＯＲＦ５  ５’−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図２２】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＯＲＦ５  ５’全体ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号２０）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号２１）はＯＲＦ５全体ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号２２）はｍｙｃ−ＯＲＦ５ｔｏｔａｌ−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。リンカーのアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ；配列番号２３）はＯＲＦ５ポリペプチドの５’領域の第１エクトドメインと第２エクトドメインの間に位置している。
【図２３】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＯＲＦ５  ３’ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号２４）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号２５）はＯＲＦ５  ３’ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号２６）はｍｙｃ−ＯＲＦ５  ３’−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図２４】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＭＮ３０１００株由来のＯＲＦ５  ３’ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号２７）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号２８）はＯＲＦ５  ３’ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号２９）はｍｙｃ−ＯＲＦ５  ３’−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図２５】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＯＲＦ５＋６ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号３０）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号３１）はＯＲＦ５＋６ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号３２）はｍｙｃ−ＯＲＦ５＋６−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。第１のリンカーのアミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ；配列番号２３）はＯＲＦ５ポリペプチドの５’領域の第１エクトドメインと第２エクトドメインの間に位置している。第２のリンカーのアミノ酸配列はＯＲＦ５ポリペプチドの５’領域の第２エクトドメインとＯＲＦ６ポリペプチドの５’領域の第１エクトドメインの間に位置している。第３のリンカーのアミノ酸配列はＯＲＦ６ポリペプチドの５’領域の第１エクトドメインと第２エクトドメインの間に位置している。
【図２６】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＯＲＦ７ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号３４）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号３５）はＯＲＦ７ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号３６）はｍｙｃ−ＯＲＦ７−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図２７】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＮＳＰ２  ＨＰポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号３７）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号３８）はＮＳＰ２  ＨＰポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号３９）はｍｙｃ−ＮＳＰ２  ＨＰ−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図２８】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＮＳＰ２  Ｓ１  ＨＰポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号４０）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号４１）はＮＳＰ２  Ｓ１  ＨＰポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号４２）はｍｙｃ−ＮＳＰ２  Ｓ１  ＨＰ−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図２９】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＮＳＰ２  Ｓ２  ＨＰポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号４３）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号４４）はＮＳＰ２  Ｓ２  ＨＰポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号４５）はｍｙｃ−ＮＳＰ２  Ｓ２  ＨＰ−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図３０】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＯＲＦ６  ５’全体ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号４６）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号４７）はＯＲＦ６  ５’全体ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号４８）はｍｙｃ−ＯＲＦ６  ５’ｔｏｔａｌ−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図３１】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＶＲ−２３３２株由来のＯＲＦ６  ３’ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号４９）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号５０）はＯＲＦ６  ３’ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号５１）はｍｙｃ−ＯＲＦ６  ３’−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図３２】ＭＮ１８４、ＳＤＳＵ７３、またはＥｕｒｏＰＲＲＳに曝露した動物から得たサンプルならびに２つの対照の吸光度をプロットした３つのグラフを含む図である。吸光度の値はＶＲ−２３３２ポリペプチド（Ａ）、ＬＶポリペプチド（Ｂ）、または両者の混合物（Ｃ）のＥＬＩＳＡを使用して検出した。
【図３３】図３３のＡはＮＳＰ２ポリペプチドのＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ親水性プロフィルを含む。図３３のＢはＮＳＰ２およびＮＳＰ２の断片の図解である。アミノ酸の番号付けはＶＲ−２３３２  ｏｒｆ１（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）アクセッション番号Ｕ８７３９２）による。システインプロテアーゼ触媒作用部位および疎水性ドメインが表示されている。
【図３４】示したように処理した動物から得たサンプルの吸光度をプロットした２つのグラフを含む図である。吸光度の値はＮＳＰ２  ＨＰ（ＡＴＰ）ポリペプチド（Ａ）またはＮＳＰ２Ｐ（ＶＲ−２３３２）ポリペプチド（Ｂ）のＥＬＩＳＡを使用して検出した。
【図３５】示したように希釈して示した量のポリペプチドを有するウェルで評価した陽性および陰性のサンプルの吸光度をプロットした２つの３Ｄグラフを含む図である。ブロッキングステップ中のｐＨは７．４（Ａ）または９．６（Ｂ）のいずれかであった。
【図３６】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＬｅｌｙｓｔａｄウイルス株由来のＯＲＦ７ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号５２）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号５３）はＯＲＦ７ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号５４）はｍｙｃ−ＯＲＦ７−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図３７】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＬｅｌｙｓｔａｄウイルス株由来のＮＳＰ２ＰポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号５５）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号５６）はＮＳＰ２Ｐポリペプチドをコードしている。示したアミノ酸配列は開始部位からＮＳＰ２Ｐポリペプチドをコードする領域（配列番号３）の開始までおよびＮＳＰ２Ｐポリペプチドをコードする領域の終端からそのｈｉｓタグまで（配列番号１３）のアミノ酸配列である。
【図３８】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＪＡ１４２ウイルス株由来のＮＳＰ２ＰポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号５７）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号５８）はＮＳＰ２Ｐポリペプチドをコードしている。示したアミノ酸配列は開始部位からＮＳＰ２Ｐポリペプチドをコードする領域（配列番号３）の開始までおよびＮＳＰ２Ｐポリペプチドをコードする領域の終端からｈｉｓタグまで（配列番号１３）のアミノ酸配列である。
【図３９】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＢｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ  Ｉｎｇｅｌｖａｃ  ＡＴＰウイルス株由来のＮＳＰ２  ＨＰポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号５９）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号６０）はＮＳＰ２  ＨＰポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号６１）はｍｙｃ−ＮＳＰ２  ＨＰ−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図４０】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＬｅｌｙｓｔａｄウイルス株由来のＯＲＦ５  ３’ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号６２）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号６３）はＯＲＦ５  ３’ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号６４）はｍｙｃ−ＯＲＦ５  ３’−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図４１】ポリペプチドがＰＲＲＳウイルスのＬｅｌｙｓｔａｄウイルス株由来のＯＲＦ６  ３’ポリペプチドであるｐＥＴ  ２４ｂ  ｍｙｃ−ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ−Ｈｉｓ構築物の核酸配列（配列番号６５）の表である。下線を引いた核酸配列（配列番号６６）はＯＲＦ６  ３’ポリペプチドをコードしている。アミノ酸配列（配列番号６７）はｍｙｃ−ＯＲＦ６  ３’−Ｈｉｓポリペプチドのアミノ酸配列である。
【図４２】１００ｎｇのリフォールディングｍｙｃ−ＯＲＦ７−Ｈｉｓポリペプチドに加えたニワトリ卵リゾチームの量に対する吸光度をプロットしたグラフである。値は陰性血清バックグラウンドを差し引いた後の特異的抗ＯＲＦ７ポリペプチドの平均値である。データの点は、１／３００（菱形）、１／６００（四角）、１／２００（三角）、および１／２４００（ｘ交差）に希釈した血清から得た。
【図４３】示したＥＬＩＳＡを使用して動物で検出した吸光度の変化をプロットしたグラフである。ＶＲはポリペプチドがＶＲ２３３２株由来であることを示す。ＬＶはポリペプチドがＬｅｌｙｓｔａｄウイルス由来であることを示す。剰余の標準偏差は、直線回帰により決定した方程式に対するデータの適合度の尺度である。
【図４４】示したポリペプチドを含むＥＬＩＳＡを使用して、示したＰＲＲＳウイルスを接種したサンプルで観察した吸光度をプロットしたグラフである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【国際調査報告】
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