(57)【要約】  油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））におけるω脂肪酸に富んだ微生物油の製造で使用するのに適したアシルトランスフェラーゼが提供される。具体的にはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）をコードする遺伝子が、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびクサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）から単離された。これらの遺伝子は、酵母における油生合成の最終段階に関与する酵素をコードする。それぞれは、油性酵母の油中に生成される多価不飽和脂肪酸量を変更するのに重要な役割を果たすことが期待される。
2008524984.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）配列番号１４および１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする単離された核酸分子。
【請求項２】
配列番号１３および１７よりなる群から選択される請求項１に記載の単離された核酸分子。
【請求項３】
請求項１に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項４】
請求項２に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項５】
配列番号１４に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、ＢＬＡＳＴＰ法によるアラインメントに基づいて少なくとも７０％の同一性を有する少なくともアミノ酸５２６個のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項６】
配列番号１８に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、ＢＬＡＳＴＰ法によるアラインメントに基づいて少なくとも７０％の同一性を有する少なくともアミノ酸５２５個のジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項７】
（ａ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、アシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼをコードする単離された核酸分子。
【請求項８】
配列番号１５よりなる群から選択される請求項７に記載の単離された核酸分子。
【請求項９】
請求項７に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項１０】
請求項８に記載の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド。
【請求項１１】
配列番号１６に記載の配列を有するポリペプチドと比較して、ＢＬＡＳＴＰ法によるアラインメントに基づいて少なくとも７０％の同一性を有する少なくともアミノ酸５４３個のアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼをコードする第１のヌクレオチド配列、または
第１のヌクレオチド配列の相補体を含んでなる第２のヌクレオチド配列
を含んでなる単離された核酸分子。
【請求項１２】
適切な制御配列に作動的に結合した請求項１または７のいずれかに記載の単離された核酸分子を含んでなるキメラ遺伝子。
【請求項１３】
請求項１２に記載のキメラ遺伝子を含んでなる形質転換宿主細胞。
【請求項１４】
藻類、細菌、カビ、真菌、および酵母よりなる群から選択される請求項１３に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１５】
酵母が油性酵母である請求項１４に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１６】
油性酵母細胞が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される請求項１５に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１７】
宿主細胞がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項１６に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１８】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される株である請求項１７に記載の形質転換宿主細胞。
【請求項１９】
ａ）ゲノムライブラリーを請求項１に記載の核酸分子で探索し、
ｂ）請求項１に記載の核酸分子とハイブリダイズするＤＮＡクローンを同定し、
ｃ）ステップ（ｂ）で同定されたクローンを含んでなるゲノム断片を配列決定することを含んでなり、
配列決定されたゲノム断片が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする、
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする核酸分子の取得方法。
【請求項２０】
ａ）配列番号１３および１７よりなる群から選択される配列の一部に対応する少なくとも１つのオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、
ｂ）ステップ（ａ）のオリゴヌクレオチドプライマーを使用してクローニングベクター中に存在するインサートを増幅させることを含んでなり、
増幅されたインサートが、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１をコードするアミノ酸配列の一部をコードする
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする核酸分子の取得方法。
【請求項２１】
請求項１９または２０に記載の方法の生成物。
【請求項２２】
ａ）配列番号３１、
ｂ）配列番号３２、
ｃ）配列番号３３、
ｄ）配列番号３４、
ｅ）配列番号３５、
ｆ）配列番号３６、
ｇ）配列番号３７、
ｈ）配列番号２３、
ｉ）配列番号２４、
ｊ）配列番号２５、
ｋ）配列番号２６、
ｌ）配列番号２７、
ｍ）配列番号２８、
ｎ）配列番号２９、および
ｏ）配列番号３０よりなる群から選択されるアミノ酸モチーフをコードする単離された核酸分子。
【請求項２３】
ａ）配列番号３１、
ｂ）配列番号３２、
ｃ）配列番号３３、
ｄ）配列番号３４、
ｅ）配列番号３５、
ｆ）配列番号３６、
ｇ）配列番号３７、
ｈ）配列番号２３、
ｉ）配列番号２４、
ｊ）配列番号２５、
ｋ）配列番号２６、
ｌ）配列番号２７、
ｍ）配列番号２８、
ｎ）配列番号２９、および
ｏ）配列番号３０よりなる群から選択されるアミノ酸モチーフ配列。
【請求項２４】
（ａ）（ｉ）適切な制御配列の制御下にある配列番号１４、１８、１９、２０、２１、および２２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
（ｉｉ）脂肪酸供給源
を含んでなる、形質転換された宿主細胞を準備し、
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が発現する条件下でステップ（ａ）の細胞を生育させて、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換された宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法。
【請求項２５】
（ａ）（ｉ）機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある配列番号１４、１８、１９、２０、２１、および２２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
を含んでなる形質転換された宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝子が発現する条件下でステップ（ａ）の細胞を生育させて、少なくとも１つのω−３またはω−６脂肪酸の生産、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換された宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−３またはω−６脂肪酸含量の増大方法。
【請求項２６】
（ａ）（ｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号３１、
２）配列番号３２、
３）配列番号３３、
４）配列番号３４、
５）配列番号３５、
６）配列番号３６、および
７）配列番号３７に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
（ｉｉ）脂肪酸供給源
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が発現し、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法。
【請求項２７】
（ａ）（ｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号２３、
２）配列番号２４、
３）配列番号２５、
４）配列番号２６、
５）配列番号２７、
６）配列番号２８、
７）配列番号２９、および
８）配列番号３０に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
（ｉｉ）脂肪酸供給源
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が発現し、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法。
【請求項２８】
（ａ）（ｉ）機能性のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号３１、
２）配列番号３２、
３）配列番号３３、
４）配列番号３４、
５）配列番号３５、
６）配列番号３６、および
７）配列番号３７に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝子が発現し、少なくとも１つのω−３またはω−６脂肪酸の生成、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−３またはω−６脂肪酸含量の増大方法。
【請求項２９】
（ａ）（ｉ）機能性のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号２３、
２）配列番号２４、
３）配列番号２５、
４）配列番号２６、
５）配列番号２７、
６）配列番号２８、
７）配列番号２９、および
８）配列番号３０に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝子が発現し、少なくとも１つのω−３またはω−６脂肪酸の生成、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−３またはω−６脂肪酸含量の増大方法。
【請求項３０】
機能性のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子が、デサチュラーゼおよびエロンガーゼよりなる群から選択される請求項２５、２８または２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
デサチュラーゼが、Δ９デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼよりなる群から選択される請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
宿主細胞が、藻類、細菌、カビ、真菌、および酵母よりなる群から選択される請求項２４〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
宿主細胞が油性酵母である請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
油性酵母が、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）よりなる群から選択される属のメンバーである請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
油性酵母がヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）が、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃８８６２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃１８９４４、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＬＧＡＭＳ（７）１よりなる群から選択される株である請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
脂肪酸が、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、γ−リノール酸、ジホモ−γ−リノール酸、アラキドン酸、α−リノール酸、ステアリドン酸、エイコサテトラエン酸、エイコサペンタエン酸、ドコサペンタエン酸、エイコサジエン酸、およびエイコサトリエン酸よりなる群から選択される請求項２４、２５、２６、２７、２８または２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
（ａ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有することが疑われるポリペプチドのアミノ酸配列を得て、
（ｂ）ステップ（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列中で、
１）配列番号３１、
２）配列番号３２、
３）配列番号３３、
４）配列番号３４、
５）配列番号３５、
６）配列番号３６、および
７）配列番号３７に記載のアミノ酸モチーフ配列の全ての存在を同定すること
を含んでなり、
ポリペプチド中のステップ（ａ）のモチーフ配列全ての存在が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性の徴候である
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有するポリペプチドの同定法。
【請求項３９】
（ａ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有することが疑われる真菌ポリペプチドのアミノ酸配列を得て、
（ｂ）ステップ（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列中で、
１）配列番号２３、
２）配列番号２４、
３）配列番号２５、
４）配列番号２６、
５）配列番号２７、
６）配列番号２８、
７）配列番号２９、および
８）配列番号３０に記載のアミノ酸モチーフ配列の全ての存在を同定すること
を含んでなり、
ポリペプチド中のステップ（ａ）のモチーフ配列の全ての存在が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性の徴候である
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有する真菌ポリペプチドの同定法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願との関係】
【０００１】
本願明細書は、２００４年１１月４日に出願された米国特許仮出願第６０／６２４８１２号明細書の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、バイオテクノロジー分野にある。より具体的には本発明は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）およびアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼをコードする核酸断片の同定に関する。これらの酵素は、油性酵母菌などの油性微生物中の油の量を変更させるのに有用である。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、長鎖ω−３および／またはω−６多価不飽和脂肪酸（「ＰＵＦＡ」、例えば１８：３、１８：４、２０：３、２０：４、２０：５、および２２：６脂肪酸）が豊富な油を蓄積する、油性酵母菌の開発に向けたものである。このような目的で、遺伝子操作における進歩によって油性酵母の自然の能力（主に１８：２脂肪酸の生成に限定される）が増強されており、形質転換体ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中で、２０：４（アラキドン酸または「ＡＲＡ」）、２０：５（エイコサペンタエン酸または「ＥＰＡ」）、および２２：６（ドコサヘキサエン酸または「ＤＨＡ」）ＰＵＦＡの生成がもたらされている。これらのω−３およびω−６脂肪酸は、油性の宿主（その内容全体を参照によって本願明細書に引用する同時係属中の特許文献１を参照されたい）中に、ω−３／ω−６の生合成経路をコードする異種の遺伝子を導入し発現させて生成された。しかしこれらの特定の宿主生物体に適切な脂肪酸デサチュラーゼおよびエロンガーゼを導入する技術を開発するのに加えて、ＰＵＦＡの合成に続いてそれらの貯蔵脂質プールへの転移を増大させることもまた必要である。
【０００４】
ほとんどの遊離脂肪酸は補酵素Ａ（ＣｏＡ）にエステル化されて、アシル−ＣｏＡを生じる。次にこれらの分子は、細胞の小胞体中でグリセロ脂質合成基質となり、ホスファチジン酸およびジアシルグリセロール（ＤＡＧ）が生成される。これらの代謝中間体のどちらが膜リン脂質（例えばホスファチジルグリセロール、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン）に向けられてもよく、またはＤＡＧが真核生物細胞中の脂質の主要な備蓄であるトリアシルグリセロール（ＴＡＧ）を形成するのに向けられてもよい。
【０００５】
関与遺伝子およびＴＡＧ合成をもたらす代謝中間体に関する詳細を含めた、酵母菌におけるＴＡＧ生合成に関する２つの包括的なミニレビューは、非特許文献１および非特許文献２である。しかし著者らは、これまでに実施されたほとんどの研究が酵母サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）に集中しており、ＴＡＧ形成および制御に関する多数の疑問が残されていることを認めている。
【０００６】
手短に述べると、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）については、ＴＡＧ合成のための３つの経路について述べられている（非特許文献３）。最初にＴＡＧは、主にジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（すなわちＤＧＡ１遺伝子によってコードされるＤＧＡＴ２）の活性によって、ＤＡＧおよびアシル−ＣｏＡから合成される。しかしより最近では、リン脂質およびＤＡＧをリゾリン脂質およびＴＡＧにそれぞれ変換することで、アシル−ＣｏＡ−非依存性機序（非特許文献４）を通じたＴＡＧ生成に関与する、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（すなわちＰＤＡＴによってコードされるＬＲＯ１遺伝子）もまた同定されている。最後にアシル−ＣｏＡおよびステロールを利用してステロールエステル（および少量のＴＡＧ、非特許文献５参照）を生成する２つのアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼ（ＡＲＥ１およびＡＲＥ２遺伝子によってコードされる）が知られている。ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２を合わせると、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）油生合成のおよそ９５％に関与している。
【０００７】
様々なその他の生物体で、上述の各アシルトランスフェラーゼ遺伝子の相同体が同定され、公共の文献で開示されているが、油性として分類される生物体からはわずかな遺伝子しか入手できない。酵母に関してはヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポミセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属に含まれ、それらの乾燥細胞重量の少なくとも２５％を油として蓄積できる種が油性として分類される。しかしこのユニークな酵母のファミリー内では、２つのアシルトランスフェラーゼのみが単離され、特性決定されている。これらとしてはヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からのＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴが挙げられる（その内容全体を参照によって本願明細書に引用する同時係属中の特許文献２を参照されたい）。しかしサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における知見とは対照的に、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴは、生物体の全油生合成に部分的にのみ関与することが発見された。
【０００８】
ＰＦＵＡ生成のために、油性酵母における発現に有用なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）およびアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を同定する必要性がなおも残っている。本研究は、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における油生合成に関与する追加的遺伝子を同定し、特性決定するために行われた。この生物体における油生合成の天然機序の理解は、組み換え的に生成された脂肪酸（例えばＡＲＡ、ＥＰＡ、およびＤＨＡなどの長鎖ＰＵＦＡ）の形質転換油性酵母内の貯蔵脂質プール（すなわちＴＡＧ画分）への転移を修正する技術の開発に先だって、有用である。
【０００９】
出願人は、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）およびアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼ（ＡＲＥ２）をコードする遺伝子を単離することで、既述の問題を解決した。ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）のＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ１は、合わせて約９５％までの油生合成に関与する（一方、ＡＲＥ２が油生合成に対するさらにマイナーな寄与体であってもよい）。さらにオルソロガスＤＧＡＴ１遺伝子をクサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（油性真菌）からクローンして、公共配列データベースからの別の４つの真菌ＤＧＡＴ１オルソログ（すなわちニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＰＨ−１、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ））が同定された。これらの真菌ＤＧＡＴ１タンパク質配列によって、出願人は、このタンパク質ファミリー内で引き続く遺伝子を同定するのに有用な診断用の特徴を発見した。これらのＤＧＡＴ１遺伝子は、油性酵母において長鎖遊離脂肪酸（例えばω−３および／またはω−６脂肪酸）のＴＡＧプールへの転移を修正できるようにするのに有用であろう。
【００１０】
【特許文献１】米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書
【特許文献２】米国特許出願第１０／８８２７６０号明細書
【非特許文献１】Ｄ．ソルガー（Ｓｏｒｇｅｒ）およびＧ．ダウム（Ｄａｕｍ）著、「Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」６１：２８９〜２９９頁（２００３年）
【非特許文献２】Ｈ．ミュルナー（Ｍｕｅｌｌｎｅｒ）およびＧ．ダウム（Ｄａｕｍ）著、「Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  Ｐｏｌｏｎｉｃａ」５１（２）：３２３〜３４７頁（２００４年）
【非特許文献３】サンダガー（Ｓａｎｄａｇｅｒ），Ｌ．ら著、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（８）：６４７８〜６４８２頁（２００２年）
【非特許文献４】ダルキビスト（Ｄａｈｌｑｖｉｓｔ）ら著、ＰＮＡＳ．９７（１２）：６４８７〜６４９２頁（２０００年）
【非特許文献５】サンダガー（Ｓａｎｄａｇｅｒ），Ｌ．ら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２８（６）：７００〜７０２頁（２０００年）
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、アシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の発見に関する。遺伝子およびコードされる酵素は、微生物、特に油性酵母菌において、商業的に有用な油の生産を操作する上で有用である。したがって本発明は、
（ａ）配列番号１４および１８よりなる群から選択されるアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補である単離された核酸分子
よりなる群から選択される、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１２】
同様に、本発明は、
（ａ）配列番号１６に記載のアミノ酸配列をコードする単離された核酸分子、
（ｂ）０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで６５℃、および２×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで洗浄、次いで０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）とハイブリダイズする単離された核酸分子、または
（ｃ）（ａ）または（ｂ）と完全に相補である単離された核酸分子
よりなる群から選択されるアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼをコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１３】
さらに本発明は、本発明の単離された核酸分子によってコードされるポリペプチド、ならびに該物質を発現する遺伝的キメラおよび宿主細胞を提供する。
【００１４】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）配列番号３１、
ｂ）配列番号３２、
ｃ）配列番号３３、
ｄ）配列番号３４、
ｅ）配列番号３５、
ｆ）配列番号３６、
ｇ）配列番号３７、
ｈ）配列番号２３、
ｉ）配列番号２４、
ｊ）配列番号２５、
ｋ）配列番号２６、
ｌ）配列番号２７、
ｍ）配列番号２８、
ｎ）配列番号２９、および
ｏ）配列番号３０よりなる群から選択されるアミノ酸モチーフ配列をコードする単離された核酸分子を提供する。
【００１５】
別の実施態様では、本発明は、
ａ）配列番号３１、
ｂ）配列番号３２、
ｃ）配列番号３３、
ｄ）配列番号３４、
ｅ）配列番号３５、
ｆ）配列番号３６、
ｇ）配列番号３７、
ｈ）配列番号２３、
ｉ）配列番号２４、
ｊ）配列番号２５、
ｋ）配列番号２６、
ｌ）配列番号２７、
ｍ）配列番号２８、
ｎ）配列番号２９、および
ｏ）配列番号３０よりなる群から選択されるアミノ酸モチーフ配列を提供する。
【００１６】
本発明の好ましい実施態様では、
（ａ）（ｉ）適切な制御配列の制御下にある配列番号１４、１８、１９、２０、２１、および２２よりなる群から選択される、アミノ酸配列を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
（ｉｉ）脂肪酸供給源
を含んでなる、形質転換された宿主細胞を準備し、
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が発現する条件下でステップ（ａ）の細胞を生育させて、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換された宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法を提供する。
【００１７】
同様に、本発明は、
（ａ）（ｉ）機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある配列番号１４、１８、１９、２０、２１、および２２よりなる群から選択されるアミノ酸配列を有するジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
を含んでなる形質転換された宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝子が発現する条件下でステップ（ａ）の細胞を生育させて、少なくとも１つのω−３またはω−６脂肪酸の生産、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換された宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−３またはω−６脂肪酸含量の増大方法を提供する。
【００１８】
関連して本発明は、
（ａ）（ｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号３１、
２）配列番号３２、
３）配列番号３３、
４）配列番号３４、
５）配列番号３５、
６）配列番号３６、および
７）配列番号３７に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
（ｉｉ）脂肪酸供給源
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が発現し、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法を提供する。
【００１９】
同様にして本発明は、
（ａ）（ｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号２３、
２）配列番号２４、
３）配列番号２５、
４）配列番号２６、
５）配列番号２７、
６）配列番号２８、
７）配列番号２９、および
８）配列番号３０に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子、および
（ｉｉ）脂肪酸供給源
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子が発現し、脂肪酸をトリアシルグリセロールに転移させる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロール含量の増大方法を提供する。
【００２０】
代案として本発明は、
（ａ）（ｉ）機能性のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号３１、
２）配列番号３２、
３）配列番号３３、
４）配列番号３４、
５）配列番号３５、
６）配列番号３６、および
７）配列番号３７に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝子が発現し、少なくとも１つのω−３またはω−６脂肪酸の生成、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−３またはω−６脂肪酸含量の増大方法を提供する。
【００２１】
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）（ｉ）機能性のω−３／ω−６脂肪酸生合成経路をコードする遺伝子、および
（ｉｉ）適切な制御配列の制御下にある、
１）配列番号２３、
２）配列番号２４、
３）配列番号２５、
４）配列番号２６、
５）配列番号２７、
６）配列番号２８、
７）配列番号２９、および
８）配列番号３０に記載のアミノ酸モチーフの全てを含んでなる、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１酵素をコードする少なくとも１つの遺伝子
を含んでなる形質転換宿主細胞を準備し、
（ｂ）（ｉ）および（ｉｉ）の遺伝子が発現し、少なくとも１つのω−３またはω−６脂肪酸の生成、およびそのトリアシルグリセロールへの転移がもたらされる条件下で、ステップ（ａ）の細胞を生育させ、
（ｃ）ステップ（ｂ）のトリアシルグリセロールを場合により回収すること
を含んでなる形質転換宿主細胞中のトリアシルグリセロールのω−３またはω−６脂肪酸含量の増大方法を提供する。
【００２２】
一実施態様では、本発明は、
（ａ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有することが疑われるポリペプチドのアミノ酸配列を得て、
（ｂ）ステップ（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列中で、
１）配列番号３１、
２）配列番号３２、
３）配列番号３３、
４）配列番号３４、
５）配列番号３５、
６）配列番号３６、および
７）配列番号３７に記載のアミノ酸モチーフ配列の全ての存在を同定すること
を含んでなり、
ポリペプチド中のステップ（ａ）のモチーフ配列の全ての存在が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性の徴候である、
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有するポリペプチドの同定法を提供する。
【００２３】
別の実施態様では、本発明は、
（ａ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有することが疑われる真菌ポリペプチドのアミノ酸配列を得て、
（ｂ）ステップ（ａ）のポリペプチドのアミノ酸配列中で、
１）配列番号２３、
２）配列番号２４、
３）配列番号２５、
４）配列番号２６、
５）配列番号２７、
６）配列番号２８、
７）配列番号２９、および
８）配列番号３０に記載のアミノ酸モチーフ配列の全ての存在を同定すること
を含んでなり、
ポリペプチド中のステップ（ａ）モチーフ配列の全ての存在が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性の徴候である、
ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ−１活性を有する真菌ポリペプチドの同定法を提供する。
【００２４】
配列説明
本願明細書の一部を形成する以下の詳細な説明および添付の配列説明によって、本発明をより完全に理解できるであろう。
【００２５】
以下の配列は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２１〜１．８２５（「ヌクレオチド配列および／またはアミノ酸配列開示を含む特許出願の要件−配列規則」）を満たし、世界知的所有権機関（ＷＩＰＯ）標準ＳＴ．２５（１９９８）およびＥＰＯおよびＰＣＴの配列表要件（規則５．２および４９．５（ａの２）、および実施細則第２０８号および附属書Ｃ）に一致する。ヌクレオチドおよびアミノ酸配列データのために使用される記号および型式は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８２２で述べられる規則に従う。
【００２６】
配列番号１〜３８、１１２〜１１５、１１７〜１２０、１２２、１２３、１２５、１２６、１３０、１３１、１３３〜１３６、１４０、１４１、および１６９〜１７４は、表１に同定されるような遺伝子またはタンパク質（またはその一部）またはタンパク質モチーフをコードするＯＲＦである。
【００２７】
【表１】
2008524984.tif 000003
【００２８】
【表２】
2008524984.tif 000004
【００２９】
【表３】
2008524984.tif 000005
【００３０】
配列番号５５、８２、１１０、１２１、１２４、１２８、１２９、１３７〜１３９、１４４、１６４、１６５、および１６８は、表２で同定されるようなプラスミドである。
【００３１】
【表４】
2008524984.tif 000006
【００３２】
配列番号３９および４０は、ＴＥＦプロモーターを単離するのに使用されるプライマーＴＥＦ５’およびＴＥＦ３’にそれぞれ対応する。
【００３３】
配列番号４１および４２は、ＸＰＲ２転写ターミネーターを単離するのに使用されるプライマーＸＰＲ５’およびＸＰＲ３’にそれぞれ対応する。
【００３４】
配列番号４３〜５４は、プラスミド構築のために使用されるプライマーＹＬ５、ＹＬ６、ＹＬ９、ＹＬ１０、ＹＬ７、ＹＬ８、ＹＬ３、ＹＬ４、ＹＬ１、ＹＬ２、ＹＬ６１、およびＹＬ６２にそれぞれ対応する。
【００３５】
配列番号５６は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含有する１ｋＢのＤＮＡ断片（アミノ酸配列は配列番号５７として提供される）に対応する。
【００３６】
配列番号５８は、プライマーＫＵ５およびＫＵ３（それぞれ配列番号６０および６１）によって増幅されたヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｕｒａ３遺伝子（アミノ酸配列は配列番号５９として提供される）を含有する、１．７ｋＢのＤＮＡ断片に対応する。
【００３７】
配列番号６２および６４は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２の単離のために使用される、Ｐ７およびＰ８としてそれぞれ同定される変性プライマーである。
【００３８】
配列番号６３および６５は、変性プライマーＰ７およびＰ８にそれぞれ対応するアミノ酸の共通配列である。
【００３９】
配列番号６６〜６８は、染色体歩行のために使用される、プライマーＰ８０、Ｐ８１、およびＬｉｎｋＡｍｐプライマー１にそれぞれ対応する。
【００４０】
配列番号６９〜７２は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２遺伝子の標的を定めた中断のために使用される、プライマーＰ９５、Ｐ９６、Ｐ９７、およびＰ９８にそれぞれ対応する。
【００４１】
配列番号７３〜７５は、中断されたＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーンするのに使用される、プライマーＰ１１５、Ｐ１１６、およびＰ１１２にそれぞれ対応する。
【００４２】
配列番号７６および７８は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴの単離のために使用される、Ｐ２６およびＰ２７としてそれぞれ同定される変性プライマーである。
【００４３】
配列番号７７および７９は、変性プライマーＰ２６およびＰ２７にそれぞれ対応する、アミノ酸共通配列である。
【００４４】
配列番号８０、８１、８３、および８４は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ遺伝子の標的を定めた中断のために使用されるプライマーＰ３９、Ｐ４２、Ｐ４１、およびＰ４０にそれぞれ対応する。
【００４５】
配列番号８５〜８８は、中断されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーンするのに使用される、プライマーＰ５１、Ｐ５２、Ｐ３７、およびＰ３８にそれぞれ対応する。
【００４６】
配列番号８９は、レスキューされたプラスミドから完全長のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２遺伝子を増幅するのに使用される、プライマーＰ７９に対応する。
【００４７】
配列番号９０および９１は、レスキューされたプラスミドから完全長のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ遺伝子を増幅するのに使用される、プライマーＰ８４およびＰ８５にそれぞれ対応する。
【００４８】
配列番号９２および９３は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１の単離のために使用される、Ｐ２０１およびＰ２０３としてそれぞれ同定される縮重プライマーである。
【００４９】
配列番号９４〜９９は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１遺伝子の標的を定めた中断のために使用される、プライマーＰ２１４、Ｐ２１５、Ｐ２１６、Ｐ２１７、Ｐ２１８、およびＰ２１９にそれぞれ対応する。
【００５０】
配列番号１００および１０１は、中断されたＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１遺伝子の標的を定めた組み込みをスクリーンするために使用される、プライマーＰ２２６およびＰ２２７にそれぞれ対応する。
【００５１】
配列番号１０２および１０３は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＲＥ２の単離のために使用される、Ｐ２０５およびＰ２０８としてそれぞれ同定される縮重プライマーである。
【００５２】
配列番号１０４〜１０９は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＲＥ２遺伝子の標的を定めた中断のために使用される、プライマーＰ２２０、Ｐ２２１、Ｐ２２２、Ｐ２２３、Ｐ２２４、およびＰ２２５にそれぞれ対応する。
【００５３】
配列番号１１１、１１６、１２７、および１３２は、次のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）プロモーターにそれぞれ対応する。フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ＋イントロン（ＦＢＡＩＮ、９７３ｂｐ）、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ（ＦＢＡ、１００１ｂｐ）、フルクトース−ビスリン酸アルドラーゼ＋変性イントロン（ＦＢＡＩＮｍ、９２４ｂｐ）、グリセロール−３−リン酸アシルトランスフェラーゼ（ＧＰＡＴ、１１３０ｂｐ）。
【００５４】
配列番号１４２および１４３は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１  ＯＲＦの配列決定のために使用される、プライマーＰ２３９およびＰ２４０にそれぞれ対応する。
【００５５】
配列番号１４５〜１４７は、ＢＤ−クロンテック・クリエイター・スマート（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｃｒｅａｔｏｒ  Ｓｍａｒｔ）（登録商標）ｃＤＮＡライブラリー・キット・プライマー・スマート（ＳＭＡＲＴ）ＩＶオリゴヌクレオチド、ＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー、および５’−ＰＣＲプライマーに対応する。
【００５６】
配列番号１４８は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリーの配列決定のために使用される、Ｍ１３順方向プライマーに対応する。
【００５７】
配列番号１４９は、推定上のＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１遺伝子をコードする、部分的ｃＤＮＡ配列（６０１ｂｐ）に対応する。
【００５８】
配列番号１５０および１５１は、推定上のＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１遺伝子の５’末端領域をクローニングするために使用される、プライマーＭＡＲＥ２−Ｎ１およびＭＡＲＥ２−Ｎ２にそれぞれ対応する。
【００５９】
配列番号１５２および１５３は、ゲノム歩行のために使用されるクロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ）のユニバーサル・ゲノム歩行TMキットからのゲノム歩行アダプターに対応する。
【００６０】
配列番号１５４および１５５は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１の５’末端領域を単離するゲノム歩行のために使用される、プライマーＡＰ１およびＡＰ２にそれぞれ対応する。
【００６１】
配列番号１５６は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１  ｃＤＮＡ断片の５’末端配列（１６８３ｂｐ）に対応する。
【００６２】
配列番号１５７および１５８は、推定上のＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１遺伝子の３’末端領域をクローニングするために使用される、プライマーＡＲＥ−Ｎ３−１およびＡＲＥ−Ｎ３−２にそれぞれ対応する。
【００６３】
配列番号１５９および１６０は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１の３’末端領域を単離するゲノム歩行のために使用される、プライマーＡＰおよびＵＡＰにそれぞれ対応する。
【００６４】
配列番号１６１は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１  ｃＤＮＡ断片の３’末端配列（１８４ｂｐ）に対応する。
【００６５】
配列番号１６２および１６３は、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１  ＯＲＦをクローニングするために使用される、プライマーＭＡＣＡＴ−Ｆ１およびＭＡＣＡＴ−Ｒにそれぞれ対応する。
【００６６】
配列番号１６６および１６７は、「対照」プラスミドｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１を作り出すために使用される、プライマーｐｚｕｆ−ｍｏｄ１およびｐｚｕｆ−ｍｏｄ２にそれぞれ対応する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６７】
本発明に従って、出願人は、脂肪酸を貯蔵トリアシルグリセロール（ＴＡＧ）中に転移するために有用なジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）酵素をコードする、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子を単離し、アイデンティティを確認した。オルソロガス遺伝子もまたクサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）から単離され、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＰＨ−１、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）中で同定された。さらに本発明は、真菌生物体からのその他のＤＧＡＴ１遺伝子を容易に同定するためのモチーフを提供する。別の実施態様では、アシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼ（ＡＲＥ２）酵素をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子が単離された。これらの各遺伝子は、形質転換油性酵母中で生成される長鎖多価不飽和脂肪酸（ＰＵＦＡ）の量を変更するのに有用かもしれない。
【００６８】
ＰＵＦＡの重要性には議論の余地がない。例えば特定のＰＵＦＡは、健康な細胞の重要な生物学的構成要素であり、哺乳類において新規に（ｄｅ  ｎｏｖｏ）合成できず、その代わりに食餌中で得なくてはならず、またはリノール酸（ＬＡ）またはα−リノレン酸（ＡＬＡ）のさらなる不飽和化および延長によって送達されなくてはならない「必須」脂肪酸として、リン脂質またはＴＡＧなどの形態であってもよい細胞の原形質膜の構成物として、（特に発達中の幼児の脳における）適切な発達、組織形成および修復のために必要なものとして、哺乳類において重要ないくつかの生物学的に活性なエイコサノイドの前駆物質（例えばプロスタサイクリン、エイコサノイド、ロイコトリエン、プロスタグランジン）として認識される。さらに長鎖ω−３ＰＵＦＡの大量摂取からは、心臓血管保護効果が生じる（ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．ら著、「Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｃｌｉｎ  Ｎｕｔｒ．」２８：９５８〜９６６頁（１９７５年）；ダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．ら著、「Ｌａｎｃｅｔ」  ２（８０８１）：１１７〜１１９頁（１９７８年７月１５日）；シモカワ（Ｓｈｉｍｏｋａｗａ），Ｈ．著、「Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ」、８８：１００〜１０８頁（２００１年）；フォンシャッキー（ｖｏｎ  Ｓｃｈａｃｋｙ），Ｃ．およびダイヤーバーグ（Ｄｙｅｒｂｅｒｇ），Ｊ．著、「Ｗｏｒｌｄ  Ｒｅｖ  Ｎｕｔｒ  Ｄｉｅｔ」、８８：９０〜９９頁（２００１年））。そしてその他の多数の研究は、ω−３および／またはω−６脂肪酸の投与によって得られる、多様な症状および疾患（例えば喘息、乾癬、湿疹、糖尿病、癌）に対する多岐にわたる健康上の利点を実証している。
【００６９】
したがって本発明には多くの用途がある。本願明細書で開示される方法によって蓄積されるＰＵＦＡ、またはその誘導体は、食餌代用品、またはサプリメント、特に乳児用調製粉乳として、静脈内栄養補給を受けている患者のために、または栄養不良を防止または処置するために使用できる。代案としては精製されたＰＵＦＡ（またはその誘導体）は、正常な使用で受容者が食餌栄養補給のための所望量を受容するように調合された、料理用油、脂肪またはマーガリンに組み込まれてもよい。ＰＵＦＡはまた、乳児用調製粉乳、栄養サプリメントまたはその他の食品に組み込まれてもよく、抗炎症薬またはコレステロール低下剤としての用途があるかもしれない。場合により組成物は、医薬品用途（ヒトまたは獣医学）のために使用されてもよい。この場合、ＰＵＦＡは一般に経口投与されるが、例えば非経口的（例えば皮下、筋肉内または静脈内）、経直腸、経腟または局所的（例えば皮膚用軟膏またはローションとして）など、それによって成功裏に吸収されるあらゆる経路で投与することができる。
【００７０】
組み換え手段によって製造されたＰＵＦＡによるヒトまたは動物の栄養補給は、追加的なＰＵＦＡ、ならびにそれらの代謝子孫の増大したレベルをもたらすことができる。例えばＡＲＡによる処置は、ＡＲＡの増大したレベルだけでなく、プロスタグランジンなどのＡＲＡの下流生成物をももたらすことができる。複雑な制御機序は、このような機序を防止、制御または克服して、個人（個体）における特定なＰＵＦＡの所望レベルを達成するために、様々なＰＵＦＡを組み合わせ、または異なるＰＵＦＡコンジュゲートを追加することを望ましいものにできる。
【００７１】
定義
本開示中では、いくつかの用語および略語を使用する。以下の定義が提供される。
【００７２】
「読み取り枠」はＯＲＦと略記される。
【００７３】
「ポリメラーゼ連鎖反応」はＰＣＲと略記される。
【００７４】
「米国微生物系統保存機関」はＡＴＣＣと略記される。
【００７５】
「多価不飽和脂肪酸」はＰＵＦＡと略記される。
【００７６】
「アシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼ」はＡＲＥ２と略記される。
【００７７】
「リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」はＰＤＡＴと略記される。
【００７８】
「ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ」はＤＡＧ  ＡＴ  またはＤＧＡＴと略記される。
【００７９】
「ジアシルグリセロール」はＤＡＧと略記される。
【００８０】
「トリアシルグリセロール」はＴＡＧと略記される。
【００８１】
「Ｃｏ−酵素Ａ」はＣｏＡと略記される。
【００８２】
「脂肪酸」という用語は、（より長い、およびより短い鎖長の酸の双方も知られているが）約Ｃ12〜Ｃ22の様々な鎖長の長鎖脂肪族酸（アルカン酸）を指す。優勢な鎖長はＣ16〜Ｃ22の間である。脂肪酸の構造は単純な表記法システム「Ｘ：Ｙ」によって表され、ここでＸは特定の脂肪酸中の炭素（Ｃ）原子の総数であり、Ｙは二重結合の数である。
【００８３】
一般に脂肪酸は、飽和または不飽和として分類される。「飽和脂肪酸」という用語は、炭素主鎖間に「二重結合」を有さない脂肪酸を指す。対照的に「不飽和脂肪酸」は、それらの炭素主鎖に沿って「二重結合」を有する（それらは最も一般的にｃｉｓ−配置にある）。「一不飽和脂肪酸」は、（例えばパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）のように通常９および１０番目の炭素原子の間に）炭素主鎖に沿って１個の「二重結合」のみを有し、他方「多不飽和脂肪酸」（または「ＰＵＦＡ」）は、（例えばリノール酸（１８：２）のように９および１０番目、および１２および１３番目の炭素原子間、およびα−リノレン酸（１８：３）のように９および１０番め、１２および１３番め、および１５および１６番目の炭素原子間に）炭素主鎖に沿って少なくとも２個の二重結合を有する。
【００８４】
「ＰＵＦＡ」は、（脂肪酸炭素鎖のメチル末端に最も近い第１の二重結合の位置（ｎ）次第で）２つの主要ファミリーに分類できる。したがって「ω−６脂肪酸」（ω−６またはｎ−６）は、分子のω（メチル）末端から６個目の炭素原子に第１の不飽和二重結合を有し、さらに全部で２つ以上の二重結合を有して、それぞれの続く不飽和は、分子のカルボキシル末端に向かって３つのさらに別の炭素原子で生じる。対照的に「ω−３脂肪酸」（ω−３またはｎ−３）は、第１の不飽和二重結合を分子のω末端から３個離れた炭素原子に有し、さらに全部で３つ以上の二重結合を有して、それぞれの続く不飽和は、分子のカルボキシル末端に向かって３つのさらに別の炭素原子で生じる。
【００８５】
本開示の目的のために、ω参照システムを使用して、炭素数、二重結合数、およびω炭素（この目的では１番めとする）から数えたω炭素に最も近い二重結合の位置を示す。この命名法を下の表３で、「省略表記法」と題された欄に示す。表の残りは、ω−３およびω−６脂肪酸の共通の名称、明細書全体で使用される略語、および各化合物の化学名をまとめる。
【００８６】
【表５】
2008524984.tif 000007
【００８７】
「微生物油」または「単細胞油」は、微生物（例えば藻類、油性酵母菌、および糸状菌）によって、それらの生涯において天然に生成される油である。「油」という用語は、２５℃で液体であり、通常多価不飽和脂質である脂質物質を指す。対照的に「脂肪」という用語は、２５℃で固形物であり、通常飽和である脂質物質を指す。
【００８８】
「リピッドボディ」とは、通常、特定のタンパク質およびリン脂質単層に結合する脂肪滴を指す。これらの細胞小器官は、ほとんどの生物体が中性脂質を輸送／貯蔵する部位である。リピッドボディは、ＴＡＧ−生合成酵素を含有する小胞体のミクロドメインから発生すると考えられ、それらの合成およびサイズは、特定のタンパク質構成要素によって制御されているように見える。
【００８９】
「中性脂質」とは、貯蔵脂肪および油として一般にリピッドボディの細胞に見られる脂質を指し、細胞ｐＨでは脂質が荷電群を有さないことからこう呼ばれる。一般にこれらは完全に非極性で水に対する親和性がない。中性脂質とは、一般に脂肪酸とグリセロールのモノ−、ジ−、および／またはトリエステルを指し、それぞれモノアシルグリセロール、ジアシルグリセロールまたはＴＡＧ（または集合的にアシルグリセロール）とも称される。アシルグリセロールから遊離脂肪酸を放出するためには、加水分解反応が起きなくてはならない。
【００９０】
「トリアシルグリセロール」、「油」、および「ＴＡＧ」という用語は、グリセロール分子とエステル化する３つの脂肪酸アシル残基から構成される中性脂質を指す（そしてこのような用語は、本開示の全体を通して区別なく使用される）。このような油は、長鎖ＰＵＦＡ、ならびにより短い飽和および不飽和脂肪酸、および鎖長のより長い飽和脂肪酸を含有できる。したがって「油生合成」は、一般に細胞におけるＴＡＧ合成を指す。
【００９１】
「ＤＡＧ  ＡＴ」という用語は、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（アシル−ＣｏＡ−ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼまたはジアシルグリセロールＯ−アシルトランスフェラーゼとしても知られる）（ＥＣ２．３．１．２０）を指す。この酵素は、アシル−ＣｏＡおよび１，２−ジアシルグリセロールのＴＡＧおよびＣｏＡへの変換に関与する（したがってＴＡＧ生合成の最終段階に関与する）。ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２の２つのＤＡＧＡＴ酵素ファミリーが存在する。前者のファミリーはアシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）遺伝子ファミリーと類似しており、後者のファミリーは関連性がない（ラルディザバル（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ）ら著、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７６（４２）：３８８６２〜２８８６９頁（２００１年））。
【００９２】
「ＰＤＡＴ」という用語は、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＥＣ２．３．１．１５８）を指す。この酵素は、リン脂質のｓｎ−２位から１，２−ジアシルグリセロールのｓｎ−３位へのアシル基転移に関与し、その結果リゾリン脂質およびＴＡＧが得られる（したがってＴＡＧ生合成の最終段階に関与する）。この酵素はアシル−ＣｏＡ−非依存性機序を通じてＴＡＧを合成することで、ＤＧＡＴ（ＥＣ２．３．１．２０）とは異なる。
【００９３】
「ＡＲＥ２」という用語は、アシル−ＣｏＡ＋コレステロール＝ＣｏＡ＋コレステロールエステルの反応を触媒するアシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼを指す（ＥＣ２．３．１．２６、ステロール−エステルシンターゼ２酵素としてもまた知られている）。
【００９４】
「ＰＵＦＡ生合成経路酵素」と言う用語は、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１２デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼをはじめとする、ＰＵＦＡの生合成に関連する酵素（および前記酵素をコードする遺伝子）のいずれかを指す。
【００９５】
「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」という用語は、適切な条件下で発現されると、ω−３およびω−６脂肪酸のいずれかまたは双方の生成を触媒する酵素をコードする遺伝子の組を指す。典型的にω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関与する遺伝子は、次の酵素のいくつかまたは全てをコードする。Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ１５デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼ、およびΔ４デサチュラーゼ。代表的な経路は図２に図示され、様々な中間体を経由するオレイン酸のＤＨＡへの転換が提供され、ω−３およびω−６脂肪酸の双方が、共通の原料からどのように生成されてもよいかを実証する。経路は自然に２つの部分に別れ、１つの部分はω−３脂肪酸、別の部分はω−６脂肪酸のみを発生させる。ω−３脂肪酸のみを発生させる部分を本願明細書でω−３脂肪酸生合成経路と称するのに対し、ω−６脂肪酸のみを発生させる部分は、本願明細書でω−６脂肪酸生合成経路と称する。
【００９６】
「機能性」という用語は、本願明細書でω−３／ω−６脂肪酸生合成経路に関する文脈で、経路中の遺伝子のいくつか（または全て）が、活性酵素を発現することを意味する。いくつかの脂肪酸生成物は、この経路の遺伝子のサブセットの発現のみを必要とするので、「ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」または「機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路」は、上の段落で列挙される全遺伝子が必要とされることを暗示しないものとする。
【００９７】
「デサチュラーゼ」と言う用語は、不飽和化できる、すなわち１個（つ）もしくはそれ以上の脂肪酸中に二重結合を導入して、一価または多価不飽和脂肪酸を生じるポリペプチドを指す。特定の脂肪酸を指すために、本願明細書全体を通じてω参照システムを使用するのにもかかわらず、Δシステムを使用して基質のカルボキシル末端から数えることで、デサチュラーゼの活性を示す方が都合よい。ここで特に関心が高いのは、分子のカルボキシル末端から数えて１２および１３番目の炭素原子間で脂肪酸を不飽和化し、オレイン酸からＬＡへの変換を触媒するΔ１２デサチュラーゼ、ＬＡからＡＬＡへの変換を触媒するΔ１５デサチュラーゼ、ＡＲＡからＥＰＡへのおよび／またはＤＧＬＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ１７デサチュラーゼ、ＬＡからＧＬＡへのおよび／またはＡＬＡからＳＴＡへの変換を触媒するΔ６デサチュラーゼ、ＤＧＬＡからＡＲＡへのおよび／またはＥＴＡからＥＰＡへの変換を触媒するΔ５デサチュラーゼ、ＤＰＡからＤＨＡへの変換を触媒するΔ４デサチュラーゼ、ＥＤＡからＤＧＬＡへのおよび／またはＥＴｒＡからＥＴＡへの変換を触媒するΔ８デサチュラーゼ、およびパルミチン酸からパルミトレイン酸（１６：１）および／またはステアリン酸からオレイン酸（１８：１）への変換を触媒するΔ９デサチュラーゼである。
【００９８】
「エロンガーゼ」と言う用語は、脂肪酸炭素鎖を伸長して、エロンガーゼが作用した脂肪酸基質よりも炭素２個分長い酸を生成できるポリペプチドを指す。この延長プロセスは、ＣｏＡがアシルキャリアである脂肪酸合成酵素と関連した多段階機序で起きる（ラスナー（Ｌａｓｓｎｅｒ）ら著、「Ｔｈｅ  Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ」  ８：２８１〜２９２頁（１９９６年））。手短に述べると、マロニル−ＣｏＡが長鎖アシル−ＣｏＡと縮合して、ＣＯ2およびβ−ケトアシル−ＣｏＡを生じる（アシル部分が炭素原子２個分伸長される）。引き続く反応には、β−ヒドロキシアシル−ＣｏＡへの還元、エノイル−ＣｏＡへの脱水、および伸長されたアシル−ＣｏＡを生じる第２の還元が含まれる。エロンガーゼによって触媒される反応の例は、ＧＬＡからＤＧＬＡ、ＳＴＡからＥＴＡ、およびＥＰＡからＤＰＡへの変換である。したがってエロンガーゼは、異なる特異性を有することができる。例えばＣ16/18エロンガーゼはＣ16基質を好み、Ｃ18/20エロンガーゼはＣ18基質を好み、Ｃ20/22エロンガーゼはＣ20基質を好む。同様にΔ９エロンガーゼは、ＬＡおよびＡＬＡからＥＤＡおよびＥＴｒＡへの変換をそれぞれ触媒できる。
【００９９】
「油性」と言う用語は、それらのエネルギー源を脂質の形態で保存する傾向がある生物体を指す（ウィーテ（Ｗｅｅｔｅ）著、「真菌脂質生化学（Ｆｕｎｇａｌ  Ｌｉｐｉｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）」第２版、Ｐｌｅｎｕｍ、１９８０年）。一般にこれらの微生物細胞の油含量はＳ字形曲線に従い、対数増殖後期または定常増殖初期において脂質濃度が最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）著、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」５７：４１９〜２５頁（１９９１年））。
【０１００】
「油性酵母菌」と言う用語は、油を生成できる酵母菌として分類される微生物を指す。一般に、油性微生物の細胞油またはトリアシルグリセロール含量はＳ字形曲線に従い、脂質濃度は対数増殖後期または定常増殖初期において最大に達するまで増大し、次に定常増殖後期および死滅期において徐々に減少する（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）著、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」５７：４１９〜２５頁（１９９１年））。油性微生物が２５％を超えるその乾燥細胞重量を油として蓄積するのは珍しくない。油性酵母菌の例としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）属が挙げられるが、決してこれに限定されるものではない。
【０１０１】
「発酵性炭素源」と言う用語は、微生物が代謝してエネルギーを引き出す炭素源を意味する。本発明の典型的な炭素源としては、単糖類、少糖類、多糖類、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ギ酸、および炭素含有アミンが挙げられるが、これに限定されるものではない。
【０１０２】
「単離された核酸断片」および「単離された核酸分子」と言う用語は区別なく使用され、場合により合成、非天然または修飾ヌクレオチド塩基を含有する一本鎖または二本鎖であるＲＮＡまたはＤＮＡのポリマーを意味する。ＤＮＡポリマーの形態の単離された核酸断片は、１つまたはそれ以上のｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡの断片を含んでなってもよい。
【０１０３】
核酸分子は、適切な温度および溶液イオン強度条件下で、核酸分子の一本鎖形態がその他の核酸分子とアニールできる場合、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＲＮＡなどの別の核酸分子と「ハイブリダイズ可能」である。ハイブリダイゼーションおよび洗浄条件についてはよく知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第２版、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州（ＮＹ）コールドスプリングハーバー、（１９８９年）の特に第１１章およびその表１１．１で例示される（その内容全体を参照によって本願明細書に引用する）。温度およびイオン強度条件が、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を定める。ストリンジェンシー条件は、（遠縁の生物からの相同的配列などの）中程度に類似した断片をスクリーニングするため、そして（機能性酵素を複製する近縁の生物からの遺伝子などの）高度に類似した断片をスクリーニングするために調節できる。ハイブリダイゼーション後の洗浄が、ストリンジェンシー条件を決定する。１つの好ましい条件の組は、室温において６×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで１５分間に始まり、次に４５℃において２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を反復し、次に５０℃において０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳで３０分間を２回反復する、一連の洗浄を使用する。より好ましいストリンジェンシー条件の組はより高い温度を使用し、そこでは洗浄は、最後の０．２×ＳＳＣ、０．５％ＳＤＳ中での２回の３０℃の洗浄温度を６０℃に増大させること以外は上述したのと同一である。別の好ましい高度にストリンジェンシー条件の組は、６５℃において０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中での２回の最終洗浄を使用する。さらに別のストリンジェンシー条件の組は、例えば０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、６５℃でのハイブリダイゼーション、および２×ＳＳＣでの洗浄、０．１％ＳＤＳ、それに続く０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳを含む。
【０１０４】
ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー次第で塩基間のミスマッチは可能であるが、ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求する。核酸がハイブリダイズする適切なストリンジェンシーは、技術分野でよく知られた変数である核酸の長さおよび相補性の程度に左右される。２つのヌクレオチド配列間の類似性または相同性の程度が高い程、これらの配列を有する核酸ハイブリッドのＴｍ値は大きくなる。核酸ハイブリダイゼーションの相対安定性（より高いＴｍに対応する）は、次の順で低下する。ＲＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＲＮＡ、ＤＮＡ：ＤＮＡ。長さがヌクレオチド１００個を超えるハイブリッドでは、Ｔｍを計算する式が導かれている（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著、前出、９．５０〜９．５１参照）。より短い核酸、すなわちオリゴヌクレオチドによるハイブリダイゼーションのためにはミスマッチの配置がより重要になり、オリゴヌクレオチドの長さがその特異性を決定する（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前出、１１．７〜１１．８参照）。一実施態様では、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、少なくともヌクレオチド約１０個である。ハイブリダイズ可能な核酸の好ましい最小の長さは、少なくともヌクレオチド約１５個、より好ましくは少なくともヌクレオチド約２０個、そして最も好ましくは長さが少なくともヌクレオチド約３０個である。さらに当業者は、温度および洗浄液の塩濃度が、プローブの長さなどの要因次第で必要に応じて調節できることを認識する。
【０１０５】
アミノ酸またはヌクレオチド配列の「かなりの部分」とは、当業者による配列の手動評価によって、あるいはＢＬＡＳＴ（（「基礎的局在性配列探索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら著、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））などのアルゴリズムを使用したコンピュータ自動化配列比較および同定によって、遺伝子またはポリペプチドの推定上の同定を得るのに十分なポリペプチドまたは遺伝子のヌクレオチド配列のアミノ酸配列を含んでなる部分である。推定的にポリペプチドまたは核酸配列が既知のタンパク質または遺伝子に相同的であると同定するためには、一般に１０個以上の隣接するアミノ酸または３０個以上のヌクレオチド配列が必要である。さらにヌクレオチド配列に関して、２０〜３０個の隣接するヌクレオチドを含んでなる遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブを配列依存遺伝子同定法（例えばサザンハイブリダイゼーション）および単離（例えば細菌コロニーまたはバクテリオファージ・プラークの原位置（ｉｎ  ｓｉｔｕ）ハイブリダイゼーション）において使用してもよい。さらにプライマーを含んでなる特定の核酸断片を得るために、塩基１２〜１５個の短いオリゴヌクレオチドを増幅プライマーとしてＰＣＲで使用してもよい。したがってヌクレオチド配列の「かなりの部分」は、配列を含んでなる核酸断片を特異的に同定および／または単離できるようにする十分な配列を含んでなる。本願明細書は、１つまたはそれ以上の特定の酵母および糸状菌タンパク質をコードする部分的または完全アミノ酸およびヌクレオチド配列を教示する。当業者は本願明細書で報告される配列の恩恵を被り、当業者に既知の目的のために、今や開示された配列の全てまたはかなりの部分を使用できる。したがって本発明は、添付の配列表で報告される完全な配列、ならびに上で定義される配列のかなりの部分を含んでなる。
【０１０６】
「相補的」と言う用語は、互いにハイブリダイズできるヌクレオチド塩基間の関係について述べるために使用される。例えばＤＮＡについて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって本発明は添付の配列表で報告されるような完全な配列に相補である単離された核酸断片、ならびに実質的に類似した核酸配列も含む。
【０１０７】
技術分野で既知の「パーセント同一性」と言う用語は、配列を比較して判定される２つ以上のポリペプチド配列または２つ以上のポリヌクレオチド配列の関係である。技術分野において「同一性」は、場合によってはこのような配列ストリング間のアラインメントによって判定されるような、ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列間の配列関連性の程度も意味する。「同一性」および「類似性」は、１）レスク（Ｌｅｓｋ），Ａ．Ｍ．編、「計算分子生物学（Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ニューヨーク州（ＮＹ）オックスフォードユニバーシティ（１９８８年）、２）スミス（Ｓｍｉｔｈ），Ｄ．Ｗ．編、「バイオコンピューティング：情報科学およびゲノムプロジェクト（Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ）」、ニューヨーク州アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ）（１９９３年）、３）グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ａ．Ｍ．およびグリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ），Ｈ．Ｇ．編、「配列データのコンピュータ分析（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ）」第一部、ニュージャージー州ヒューマニア（Ｈｕｍａｎｉａ、ＮＪ）（１９９４年）、４）フォン・ハインェ（ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ），Ｇ．編、「分子生物学における配列分析（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、ニューヨーク州アカデミック（Ａｃａｄｅｍｉｃ、ＮＹ）（１９８７年）、５）グリブスコフ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ），Ｍ．およびデュヴルー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ），Ｊ．編、「配列分析入門（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ）」、ニューヨーク州ストックトン（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ、ＮＹ）（１９９１年）で述べられるものをはじめとするが、これに限定されるものではない、既知の方法によって容易に計算できる。同一性を判定する好ましい方法は、試験される配列間に最良のアラインメントを与えるように設計される。同一性および類似性を判定する方法は、一般に入手できるコンピュータプログラムで体系化されている。配列アラインメントおよび同一性百分率の計算は、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのレーザージーン（ＬＡＳＥＲＧＥＮＥ）バイオインフォマティクス計算スイートのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して実施してもよい。クラスタル法によるアラインメント（ヒギンズ（Ｈｉｇｇｉｎｓ）およびシャープ（Ｓｈａｒｐ）著、ＣＡＢＩＯＳ．５：１５１〜１５３頁（１９８９年））を使用して、特に断りのない限りデフォルトのパラメーター（ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０、ＧＡＰ  ＬＥＮＧＴＨ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝１０）で、配列の複数の配列アラインメントを実施する。クラスタル法を使用した対アラインメントのデフォルトのパラメーターは、ＫＴＵＰＬＥ  １、ＧＡＰ  ＰＥＮＡＬＴＹ＝３、ＷＩＮＤＯＷ＝５、およびＤＩＡＧＯＮＡＬＳ  ＳＡＶＥＤ＝５である。
【０１０８】
適切な核酸断片（本発明の単離ポリヌクレオチド）は、本願明細書で報告するアミノ酸配列と少なくとも約７０％同一の、好ましくは少なくとも約７５％同一の、そしてより好ましくは少なくとも約８０％同一のポリペプチドをコードする。好ましい核酸断片は、本願明細書で報告するアミノ酸配列と約８５％同一のアミノ酸配列をコードする。より好ましい核酸断片は、本願明細書で報告するアミノ酸配列と少なくとも約９０％同一のアミノ酸配列をコードする。最も好ましい核酸断片は、本願明細書で報告するアミノ酸配列と少なくとも約９５％同一のアミノ酸配列をコードする。適切な核酸断片は上の相同性を有するだけでなく、典型的に少なくとも５０個のアミノ酸、好ましくは少なくとも１００個のアミノ酸、より好ましくは少なくとも１５０個のアミノ酸、さらにより好ましくは少なくとも２００個のアミノ酸、そして最も好ましくは少なくとも２５０個のアミノ酸を有するポリペプチドをコードする。
【０１０９】
「コドン縮重」とは、コードされるポリペプチドのアミノ酸配列に影響することなく、ヌクレオチド配列の変更を可能にする遺伝コードにおける性質を指す。当業者は、任意のアミノ酸を特定化するためのヌクレオチドコドンの利用において、特定の宿主細胞によって示される「コドンバイアス」を十分承知している。したがって宿主細胞中における改善された発現のために遺伝子を合成する場合、コドン使用頻度が宿主細胞の好ましいコドン使用頻度に近くなるように、遺伝子をデザインすることが望ましい。
【０１１０】
遺伝子または核酸分子のコード領域に関連して、「コドン最適化された」という用語は、改変されるコドンが、ＤＮＡがコードするポリペプチドを変更させることなく、宿主生物体の典型的なコドン使用を反映するようなコドンの修正を指す。
【０１１１】
「化学的に合成された」とは、ＤＮＡ配列に関連して構成要素ヌクレオチドが、生体外で（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）構築されたことを意味する。確立した手順を使用してＤＮＡの手動化学合成を達成してもよく、あるいはいくつかの市販の機器の１つを使用して自動化学合成を実施できる。「合成遺伝子」は、当業者に知られた手順を使用して化学的に合成されるオリゴヌクレオチド構成単位から構築できる。これらの構成単位をライゲートしアニールして遺伝子セグメントを形成し、次にそれを酵素的にアセンブルして遺伝子全体を構成する。したがって遺伝子をヌクレオチド配列の最適化に基づいて、最適な遺伝子発現のために調整し、宿主細胞のコドンバイアスを反映させることができる。当業者は、コドン利用が宿主によって好まれるコドンに偏っている場合の遺伝子発現成功の見込みを理解する。好ましいコドンの判定は、配列情報が利用できる宿主細胞から誘導された遺伝子の調査に基づくことができる。
【０１１２】
「遺伝子」とは、コード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）制御配列を含む、特定のタンパク質を発現する核酸断片を指す。「天然遺伝子」とは、自然界にそれ自体の制御配列と共に見られる遺伝子を指す。「キメラ遺伝子」とは、自然界に共に見られない制御およびコード配列を含んでなる天然遺伝子でないあらゆる遺伝子を指す。したがってキメラ遺伝子は、異なる供給源から誘導される制御配列およびコード配列、あるいは同一供給源から誘導されるが、自然界に見られるのとは異なるやり方で配列する制御配列およびコード配列を含んでなってもよい。「内在性遺伝子」とは、生物体ゲノムにおいてその天然位置にある天然遺伝子を指す。「外来性」遺伝子とは、宿主生物体において常態では見られないが、遺伝子移入によって宿主生物体に導入される遺伝子を指す。外来性遺伝子は、非天然生物体中に挿入された天然遺伝子、あるいはキメラ遺伝子を含んでなることができる。「導入遺伝子」とは、形質転換手順によってゲノム中に導入された遺伝子である。「コドン最適化遺伝子」とは、そのコドン使用頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度を模倣するようにデザインされた遺伝子である。
【０１１３】
「コード配列」とは、特定のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列を指す。「適切な制御配列」とは、コード配列の上流（５’非コード配列）、配列内、または下流（３’非コード配列）に位置して、転写、ＲＮＡプロセシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列は、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセッシング部位、エフェクター結合部位、およびステム−ループ構造を含んでもよい。
【０１１４】
「プロモーター」とは、コード配列または機能性ＲＮＡの発現を調節できるＤＮＡ配列を指す。一般にコード配列は、プロモーター配列に対して３’に位置する。プロモーターは、そっくりそのまま天然遺伝子から誘導されてもよく、あるいは自然界に見られる異なるプロモーターから誘導される異なる要素からなってもよく、あるいは合成ＤＮＡセグメントを含んでなってもよい。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞タイプ中で、あるいは異なる開発段階において、あるいは異なる環境または生理学的条件に呼応して、遺伝子の発現を導いてもよいことが当業者には理解される。ほとんどの細胞タイプ中でほとんどの場合に遺伝子の発現を引き起こすプロモーターは、一般に「構造プロモーター」と称される。ほとんどの場合、制御配列のはっきりした境界は完全に画定されていないので、異なる長さのＤＮＡ断片が同一のプロモーター活性を有してもよいこともさらに認識される。
【０１１５】
「３’非コード配列」または「転写ターミネーター」と言う用語は、コード配列の下流に位置するＤＮＡ配列を指す。これには、ｍＲＮＡプロセッシングまたは遺伝子発現に影響できる調節シグナルをコードするポリアデニル化認識配列およびその他の配列が含まれる。ポリアデニル化シグナルは、通常ｍＲＮＡ前駆物質の３’末端へのポリアデニル酸トラクトの付加に影響することで特徴づけられる。３’領域は、転写、ＲＮＡプロセッシングまたは安定性、または関連コード配列の翻訳に影響できる。
【０１１６】
「ＲＮＡ転写物」とは、ＲＮＡポリメラーゼが触媒するＤＮＡ配列の転写から得られる生成物を指す。ＲＮＡ転写物がＤＮＡ配列の完全な相補的コピーである場合、それは一次転写物と称され、あるいはそれは一次転写物の転写後プロセッシングから誘導されるＲＮＡ配列であるかもしれず、成熟ＲＮＡと称される。「メッセンジャーＲＮＡ」または「ｍＲＮＡ」とはイントロンがなく、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡを指す。「ｃＤＮＡ」とは、ｍＲＮＡに対して相補的であり、それから誘導される二重鎖ＤＮＡを指す。「センスＲＮＡ」とは、ｍＲＮＡを含み、細胞によってタンパク質に翻訳されることができるＲＮＡ転写物を指す。「アンチセンスＲＮＡ」とは、標的一次転写物またはｍＲＮＡの全部または一部に相補的であり、標的遺伝子の発現をブロックするＲＮＡ転写物を指す（米国特許第５，１０７，０６５号明細書、国際公開第９９／２８５０８号パンフレット）。アンチセンスＲＮＡの相補性は、特定遺伝子転写物のあらゆる部分、すなわち５’非コード配列、３’非コード配列、イントロン、またはコード配列にあってもよい。「機能性ＲＮＡ」とは、翻訳されないがそれでもなお細胞プロセスに影響するアンチセンスＲＮＡ、リボザイムＲＮＡ、またはその他のＲＮＡを指す。
【０１１７】
「作動可能に連結した」と言う用語は、１つの機能が他方の機能によって影響されるような、単一核酸断片上の核酸配列のつながりを指す。例えばプロモーターがコード配列の発現に影響できる（すなわちコード配列がプロモーターの転写調節下にある）場合、それはそのコード配列と作動可能に連結する。コード配列はセンスまたはアンチセンスオリエンテーションで、制御配列に作動可能に連結できる。
【０１１８】
「発現」と言う用語は、本願明細書の用法では、本発明の核酸断片から誘導されるセンス（ｍＲＮＡ）またはアンチセンスＲＮＡの転写および安定した蓄積を指す。発現はまた、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指してもよい。
【０１１９】
「形質転換」とは、遺伝的に安定した遺伝形質をもたらす、宿主生物体中への核酸分子の転移を指す。核酸分子は、例えば自律的に複製するプラスミドであってもよく、またはそれは宿主生物体のゲノム中に組み込まれてもよい。形質転換核酸断片を含有する宿主生物体は、「遺伝子導入」または「組み換え」または「形質転換」生物体と称される。
【０１２０】
「プラスミド」、「ベクター」、および「カセット」と言う用語は、細胞の中心的代謝の一部ではない遺伝子を運ぶことが多く、通常環状二本鎖ＤＮＡ断片の形態である染色体外因子を指す。このような因子は、あらゆる供給源から誘導される一本鎖または二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡの配列、ゲノム一体化配列、直鎖または環状のファージまたはヌクレオチド配列を自律的に複製するかもしれず、そこではいくつかのヌクレオチド配列が独自の構成に連結または組み換えされ、それは選択された遺伝子産物のために、適切な３’非翻訳配列と共にプロモーター断片およびＤＮＡ配列を細胞中に導入することができる。「形質転換カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来遺伝子に加えて特定の宿主細胞の形質転換を容易にする因子を有する特定のベクターを指す。「発現カセット」とは、外来性遺伝子を含有し、外来性遺伝子に加えて外来性宿主におけるその遺伝子の促進された発現を可能にする因子を有する特定のベクターを指す。
【０１２１】
「相同的組換え」と言う用語は、（交差中の）２つのＤＮＡ分子間のＤＮＡ断片の交換を指す。交換される断片は、２個のＤＮＡ分子間で同一ヌクレオチド配列の部位（すなわち「相同性領域」）に挟まれる。「相同性領域」と言う用語は、相同的組換えに関与する、核酸断片上の互いに相同性を有するひと続きのヌクレオチド配列を指す。効果的な相同的組換えは、一般に長さが少なくとも約１０ｂｐである相同性領域で起き、少なくとも約５０ｂｐの長さが好ましい。典型的に遺伝子組み換えが意図される断片は、標的を定めた遺伝子中断または置換が所望される少なくとも２つの相同性領域を含有する。
【０１２２】
「配列分析ソフトウェア」と言う用語は、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の分析のために有用なあらゆるコンピュータアルゴリズムまたはソフトウェアプログラムを指す。「配列分析ソフトウェア」は、市販のものでも、あるいは独立して開発されてもよい。典型的な配列分析ソフトウェアとしては、１．）ＧＣＧ一連のプログラム（ＧＣＧ  ｓｕｉｔｅ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒａｍｓ）（ウィスコンシン州マディソンのジェネティックス・コンピュータ・グループ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）ウィスコンシン・パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ）バージョン９．０、２．）ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ、ＢＬＡＳＴＸ（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら著、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０頁（１９９０年））、３．）ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）からのＤＮＡＳＴＡＲ、４．）ミシガン州アンアーバーのジーンコーズ社（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）、および５．）スミス−ウォーターマン・アルゴリズムを組み入れたＦＡＳＴＡプログラム（Ｗ．Ｒ．ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）著、「Ｃｏｍｐｕｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．」［Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．］（１９９４年）、１９９２年会議、１１１〜２０頁、スハイ、サンドル（Ｓｕｈａｉ，Ｓａｎｄｏｒ）編、Ｐｌｅｎｕｍ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。本願明細書の文脈内では、配列分析ソフトウェアを分析のために使用する場合、分析結果は特に断りのない限り、言及されるプログラムの「デフォルト値」に基づくものと理解される。本願明細書の用法では、「デフォルト値」とは、最初に初期化されるときにソフトウェアに最初にロードされる、あらゆる値またはパラメーターの組を意味する。
【０１２３】
「保存ドメイン」または「モチーフ」という用語は、進化的に関連したタンパク質のアラインメント配列に沿った特定位置において保存されたアミノ酸の組を意味する。その他の位置のアミノ酸が相同的なタンパク質間で異なることができるのに対し、特定の位置で高度に保存されたアミノ酸は、タンパク質の構造、安定性、または活性に必須のアミノ酸を示唆する。それらはタンパク質相同体ファミリーのアラインメント配列におけるそれらの高度な保存によって同定されるので、それらは新たに判定された配列のタンパク質が、以前同定されたタンパク質ファミリーに属するかどうかを判別するための識別子、または「シグネチャ」として使用できる。ＤＧＡＴ１酵素中に普遍的に見られるモチーフ（すなわち動物、植物、および真菌）は配列番号３１〜３７として提供され、真菌生物体に特異的なＤＧＡＴ１中に見られるモチーフは、配列番号２３〜３０として提供される。
【０１２４】
本願明細書で使用される標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は技術分野でよく知られており、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．、およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第２版、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、ニューヨーク州コールドハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）（以下マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ））；シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ），Ｔ．Ｊ．、ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ），Ｍ．Ｌ．、およびエンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ），Ｌ．Ｗ．著、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）；およびオースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら著、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃ．ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）で述べられている。
【０１２５】
脂肪酸およびトリアシルグリセロールの微生物生合成
一般に油性微生物中の脂質の蓄積は、増殖培地中に存在する全体的な炭素と窒素の比率に応答してトリガーされる（図１）。細胞が利用できる窒素供給を消耗した場合（例えば炭素と窒素の比率が約４０を超える場合）、細胞アデノシン一リン酸（ＡＭＰ）の枯渇は、ミトコンドリア中のＡＭＰ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性の休止、およびクエン酸の蓄積、クエン酸の細胞質ゾル内への輸送、そして引き続くＡＴＰクエン酸リアーゼによるクエン酸の切断をもたらして、アセチル−ＣｏＡおよびオキサロ酢酸が生成する。アセチル−ＣｏＡは、脂肪酸の新規（ｄｅ  ｎｏｖｏ）生合成の主要構成ブロックである。効果的にアセチル−ＣｏＡに代謝されることができるあらゆる化合物が、脂肪酸前駆物質の役割を果たせるが、このタイプの反応ではグルコースが炭素の主な供給源である（図１）。グルコースは解糖を通じてピルビン酸に変換され、次にピルビン酸はミトコンドリア中に輸送され、そこでピルビン酸デヒドロゲナーゼ（「ＰＤ」）によってアセチル−ＣｏＡに変換される。アセチル−ＣｏＡはミトコンドリア膜を越えて細胞質中に直接輸送できないので、アセチル−ＣｏＡからの２個の炭素がオキサロ酢酸と縮合して、クエン酸を生成する（クエン酸合成酵素によって触媒される）。クエン酸は細胞質内に直接輸送されて、そこでＡＴＰ−クエン酸リアーゼによって切断され、アセチル−ＣｏＡおよびオキサロ酢酸が再生する。オキサロ酢酸はリンゴ酸への変換を通じて、トリカルボン酸サイクルに再び入る。
【０１２６】
マロニル−ＣｏＡの合成は、細胞質内で起きる脂肪酸生合成の最初の関与段階である。マロニル−ＣｏＡは、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼ（「ＡＣＣ」）によって、アセチル−ＣｏＡのカルボキシル化を通じて生成される。脂肪酸合成は、多酵素脂肪酸合成酵素複合体（「ＦＡＳ」）によって触媒され、８個の二炭素断片（アセチル−ＣｏＡからのアセチル基）の縮合によって起き、炭素１６個の飽和脂肪酸であるパルミチン酸が形成する。より具体的にはＦＡＳは以下が関与する７つの一連の反応を触媒する（スミス（Ｓｍｉｔｈ）Ｓ．著、「ＦＡＳＥＢ  Ｊ．」、８（１５）：１２４８〜５９頁（１９９４年））。
１．アセチル−ＣｏＡおよびマロニル−ＣｏＡが、ＦＡＳのアシルキャリアペプチド（ＡＣＰ）に転移される。次にアセチル基がマロニル基に転移されて、β−ケトブチリル−ＡＣＰが形成し、ＣＯ2が放出される。
２．β−ケトブチリル−ＡＣＰが還元（β−ケトアシル還元酵素による）および脱水（β−ヒドロキシアシルデヒドラターゼによる）を被り、ｔｒａｎｓ−単不飽和脂肪アシル基が形成する。
３．二重結合がＮＡＤＰＨによって還元され、最初のものよりも炭素が２個分長い飽和脂肪−アシル基が生じる。次に新しいマロニル基と縮合して、延長プロセスを繰り返すブチリル基の能力が再生する。
４．脂肪アシル基が炭素１６個の長さになったら、チオエステラーゼ活性がそれを加水分解して遊離パルミチン酸（１６：０）を放出する。
【０１２７】
パルミチン酸合成がサイトゾル内で起きるのに対し、より長鎖の飽和および不飽和脂肪酸誘導体の形成はミトコンドリアおよび小胞体（ＥＲ）の双方で起き、そこではＥＲが支配的なシステムである。具体的にはエロンガーゼおよびデサチュラーゼの作用を通じて、パルミチン酸（１６：０）は、ステアリン酸（１８：０）、パルミトレイン酸（１６：１）、およびオレイン酸（１８：１）の前駆物質である。例えばパルミチン酸およびステアリン酸は、Δ９デサチュラーゼの作用によって、それらの不飽和誘導体であるパルミトレイン酸（１６：１）およびオレイン酸（１８：１）にそれぞれ変換される。
【０１２８】
ＴＡＧ（脂肪酸の主要な貯蔵単位）は、以下が関与する一連の反応によって形成される。１．）リゾホスファチジン酸を生じる、アシルトランスフェラーゼによるアシル−ＣｏＡの１分子のグリセロール−３−リン酸塩へのエステル化、２．）１，２−ジアシルグリセロールリン酸塩（一般にホスファチジン酸として同定される）を生じる、アシルトランスフェラーゼによるアシル−ＣｏＡの第２の分子のエステル化、３．）１，２−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）を生じる、ホスファチジン酸ホスファターゼによるリン酸塩の除去、および４．）ＴＡＧを形成する、別のアシルトランスフェラーゼの作用による第３の脂肪酸の付加（例えばＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ１またはＤＧＡＴ２）（図１）。
【０１２９】
飽和および不飽和脂肪酸および短鎖および長鎖脂肪酸をはじめとする、幅広い脂肪酸をＴＡＧに組み込むことができる。アシルトランスフェラーゼ（例えばＤＡＧ  ＡＴまたはＰＤＡＴ）によってＴＡＧに組み込むことができる脂肪酸の制限を意図しない例のいくつかとしては、カプリン（１０：０）、ラウリン（１２：０）、ミリスチン（１４：０）、パルミチン（１６：０）、パルミトレイン（１６：１）、ステアリン（１８：０）、オレイン（１８：１）、バクセン（１８：１）、リノール（１８：２）、エレオステアリン（１８：３）、γ―リノレン（１８：３）、α−リノレン（１８：３）、ステアリドン（１８：４）、アラキジン（２０：０）、エイコサジエン（２０：２）、ジホモ−γ−リノール（２０：３）、エイコサトリエン（２０：３）、アラキドン（２０：４）、エイコサテトラエン（２０：４）、エイコサ−ペンタエン（２０：５）、ベヘン（２２：０）、ドコサ−ペンタエン（２２：５）、ドコサ−ヘキサエン（２２：６）、リグノセリン（２４：０）、ネルボン（２４：１）、セロチン（２６：０）、およびモンタン（２８：０）脂肪酸が挙げられる。本発明の好ましい実施態様では、ＴＡＧへのＰＵＦＡの組み込みが最も望ましい。
【０１３０】
アシルトランスフェラーゼおよびＴＡＧ生合成の最終段階におけるそれらの役割
ＤＧＡＴ１をコードする遺伝子
歴史的に、（アシル−ＣｏＡ基がアシル−ＣｏＡからＤＡＧのｓｎ−３位に転移してＴＡＧを形成する、第３のアシルトランスフェラーゼ反応に関与する）ＤＧＡＴ１が、特異的にＴＡＧ合成に関与する唯一の酵素と考えられていた。この酵素は、アシル−ＣｏＡ：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＡＣＡＴ）と相同的であることが知られていた。しかし最近の研究から、ＡＣＡＴ遺伝子ファミリーとは関係のないＤＡＧアシルトランスフェラーゼの新しいファミリー（ＤＡＧ  ＡＴ）が同定されている。したがって命名法は今や、ＡＣＡＴ遺伝子ファミリーに関連性があるＤＡＧ  ＡＴ酵素（ＤＧＡＴ１ファミリー）と、関連性のないもの（ＤＧＡＴ２ファミリー）との間で区別する（ラルディザバル（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ）ら著、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７６（４２）：３８８６２〜２８８６９頁（２００１年））。
【０１３１】
ＤＧＡＴ１酵素をコードする多くの遺伝子が遺伝的手段を通じて同定されており、これらの遺伝子のいくつかのＤＮＡ配列は公的に入手できる。例えばいくつかの制限を意図しない例としては、以下のジェンバンク登録番号が挙げられる。ＡＹ４４５６３５（オリブ）、ＡＦ３８４１６０（マウス）、ＮＭ＿０５３４３７（ドブネズミ）、ＮＭ＿１７４６９３（ウシ）、ＡＹ１１６５８６（ブタ）、ＡＹ３２７３２７およびＡＹ３２７３２６（トキソプラズマ原虫（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ））、ＡＦ２９８８１５（シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ））、およびＡＦ１６４４３４（アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ））。さらに特許文献は、ＤＧＡＴ１遺伝子の多くのさらに別のＤＮＡ配列（および／または上のいくつかの遺伝子に関連した詳細とそれらの単離法）を提供する。例えば米国特許第６，１００，０７７号明細書（ヒト）、米国特許第６，５５２，２５０号明細書（アブラナ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ））、米国特許第６、３４４，５４８号明細書（ヒト、マウス、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ））、米国特許出願公開第２００４／００８８７５９Ａ１号明細書（植物）、およびファレーゼ（Ｆａｒｅｓｅ）らの米国特許出願公開第２００４／００７８８３６Ａ１号明細書を参照されたい。
【０１３２】
ＤＧＡＴ２をコードする遺伝子
ＤＧＡＴ２ファミリーのメンバーは、全ての主要な真核生物門（真菌、植物、動物、および基底真核生物）に存在するようである。したがってＤＧＡＴ２酵素をコードする多くの遺伝子が遺伝的手段を通じて同定されており、これらの遺伝子のいくつかのＤＮＡ配列は公的に入手できる。例えばいくつかの制限を意図しない例としては、以下のジェンバンク登録番号が挙げられる。ＮＣ＿００１１４７（遺伝子座ＮＰ＿０１４８８８（サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＮＭ＿０１２０７９（ヒト）、ＮＭ＿１２７５０３、ＡＦ０５１８４９およびＡＪ２３８００８（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））、ＮＭ＿０２６３８４、ＮＭ＿０１００４６およびＡＢ０５７８１６（マウス）、ＡＹ０９３６５７（ブタ）、ＡＢ０６２７６２（ラット）、ＡＦ２２１１３２（エレガンス線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ））、ＡＦ３９１０８９およびＡＦ３９１０９０（クサレケカビ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ））、ＡＦ１２９００３（タバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ））、そしてＡＦ２５１７９４およびＡＦ１６４４３４（アブラナ（Ｂｒａｓｓｉｃａ  ｎａｐｕｓ））。さらに特許文献は、ＤＧＡＴ２遺伝子の多くのさらに別のＤＮＡ配列（および／または上のいくつかの遺伝子に関連した詳細とそれらの単離法）を提供する。例えばケーシズ（Ｃａｓｅｓ）らの米国特許出願公開第２００３／１２４１２６号明細書、バナーズ（Ｂａｎａｓ）らの国際公開第２００１／０３４８１４号パンフレット、およびラルディザバル（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ）らの米国特許出願公開第２００３／１１５６３２号明細書、米国特許出願公開第２００３／００２８９２３号明細書、および米国特許出願公開第２００４／０１０７４５９号明細書を参照されたい。ラルディサバル（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ）らの研究は、例えばクサレケカビ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ）、トウモロコシ（Ｚｅａ  ｍａｙｓ）、ダイズ（Ｇｌｙｃｉｎｅ  ｍａｘ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ  ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）、ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）、およびシロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのＤＧＡＴ２のＤＮＡ配列を含む。
【０１３３】
ごく最近では、油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からのＤＧＡＴ２酵素が、同時係属米国特許出願第１０／８８２７６０号明細書で単離され、特性決定されている（その内容全体を参照によって本願明細書に引用する）。簡単に述べると、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの部分的な推定上ＤＧＡＴ２  ＤＮＡ断片のクローニングに続いて、内在性Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の標的を定めた中断を実施して、断片のアイデンティティを試験した。中断された株中のより低い含油量は、天然ＤＧＡＴ２活性が排除されたことを裏付けた。引き続いて全長Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２遺伝子（２１１９ｂｐ、配列番号１）をアセンブルし、それは次の３つの入れ子になった読み取り枠を含んだ。１．）ＯＲＦ１：配列番号２（５１４個のアミノ酸残基）によってコードされるタンパク質に対応する、配列番号１のヌクレオチド＋２９１〜＋１８３５、２．）ＯＲＦ２：配列番号３（１３８０個の塩基）と、配列番号４（４５９個のアミノ酸残基）によってコードされるタンパク質とに対応する、配列番号１のヌクレオチド＋４５６〜＋１８３５、および３．）ＯＲＦ３：配列番号５（１０６８個の塩基）と、配列番号６（３５５個のアミノ酸残基）によってコードされるタンパク質とに対応する、配列番号１のヌクレオチド＋７６８〜＋１８３５。
【０１３４】
ＰＤＡＴをコードする遺伝子
ダルキビスト（Ｄａｈｌｑｖｉｓｔ）ら（「Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．」（ＵＳＡ）９７：６４８７〜６４９２頁（２０００年））およびエルカース（Ｏｅｌｋｅｒｓ）ら（「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７５：１５６０９〜１５６１２頁（２０００年））によって最近発見されたように、ＴＡＧ合成はアシル−ＣｏＡ−非依存性ＰＤＡＴ酵素を通じてアシル−ＣｏＡの不在下でもまた起きることができる。具体的にはＰＤＡＴがホスファチジルコリン基質のｓｎ−２位からアシル基を除去して、ＤＡＧのｓｎ−３位に転移させてＴＡＧを生じる。そしてＰＤＡＴの機能はＤＧＡＴ２程にはよく特性決定されていないが、ＰＤＡＴは、いくつかの油料種子においてリン脂質から「異常な」脂肪酸を除去する上で主要な役割を果たすと見なされている（バナーズ（Ｂａｎａｓ），Ａ．ら著、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｔｒａｎｓ．２８（６）：７０３〜７０５頁（２０００年））。
【０１３５】
ＰＤＡＴは、タンパク質のレシチン：コレステロールアシルトランスフェラーゼ（ＬＣＡＴ）ファミリーに構造的に関連している。ＰＤＡＴ酵素をコードするいくつかの遺伝子が遺伝的手段を通じて同定されており、これらの遺伝子のいくつかのＤＮＡ配列は公的に入手できる。例えばいくつかの制限を意図しない例としては、以下のジェンバンク登録番号が挙げられる。Ｐ４０３４５（サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、Ｏ９４６８０およびＮＰ＿５９６３３０（シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））、およびＮＰ＿１９００６９およびＡＢ００６７０４［ｇｉ：２３５１０６９］（シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ））。さらに特許文献は、ＰＤＡＴ遺伝子のさらに別の多くのＤＮＡ配列（および／または上のいくつかの遺伝子に関連した詳細とそれらの単離法）を提供する。例えばダルキビスト（Ｄａｈｌｑｖｉｓｔ）らの国際公開第２０００／０６００９５号パンフレットを参照されたい。
【０１３６】
そして本願明細書の開示と特に関連深いことに、ＤＧＡＴ２について上述したのと同様にして、同時係属米国特許出願第１０／８８２７６０号明細書において油性酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からのＰＤＡＴ酵素が単離され、特性決定されている。ここでも推定上のＰＤＡＴ遺伝子に中断を有する株のより低い含油量は、天然ＰＤＡＴ活性の排除を裏付けた。引き続いて全長Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ遺伝子（２３２６ｂｐ、配列番号７）がアセンブルされた。
【０１３７】
ＡＲＥ２をコードする遺伝子
酵母中のステロールのエステル化プロセスは、最初にＨ．ヤン（Ｙａｎｇ）ら（「Ｓｃｉｅｎｃｅ．」２７２（５２６６）：１３５３〜１３５６頁（１９９６年））によって研究され、そこでは２つの遺伝子（ＡＲＥ１およびＡＲＥ２）が、コレステロールをエステル化させるＡＣＡＴ関連酵素をコードすることが発見された。わずか２、３のＡＲＥ２遺伝子のＤＮＡ配列が公的に入手できる。例えばジェンバンク登録番号Ｑ８７６Ｌ２（サッカロミセスバヤヌ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｂａｙａｎｕｓ））、Ｐ５３６２９（Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ））、およびＱ１０２６９（シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））を参照されたい。
【０１３８】
ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ１、ＤＧＡＴ２、およびＡＲＥ２間の相互作用
Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）では、４つの遺伝子（すなわちＡＲＥ１、ＡＲＥ２、ＤＧＡ１［ＤＧＡＴ２をコードする］、およびＬＲＯ１［ＰＤＡＴをコードする］）が油生合成に寄与する。ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２は、油生合成のおよそ９５％に関与する（サンダガー（Ｓａｎｄａｇｅｒ），Ｌ．ら著、「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７７（８）：６４７８〜６４８２頁（２００２年））、エルカース（Ｏｅｌｋｅｒｓ）ら（「Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．」２７７：８８７７頁（２００２年））。
【０１３９】
意外にも、同時係属米国特許出願第１０／８８２７６０号明細書で述べられる研究によれば、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中では、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２は、油生合成に部分的にのみ関与するように見える。したがってＴＡＧ形成において、少なくとも１つの他のＤＡＧ  ＡＴが役割を果たさなくてはならないのは明らかである。本願明細書で述べられるように、酵母ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の油生合成はＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ１、およびＤＧＡＴ２の活性を必要とし、一方ＡＲＥ２は油生合成のさらにマイナーな貢献要素であるかもしれない。これはＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴのみが主要なＤＡＧ  ＡＴである、Ｓ．セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）中で油生合成に関与する酵素とは好対照である。
【０１４０】
ω−３およびω−６多価不飽和脂肪酸の生合成
ＬＡをＧＬＡ、ＤＧＬＡ、およびＡＲＡ（ω−６経路）に、ＡＬＡをＳＴＡ、ＥＴＡ、ＥＰＡ、ＤＰＡ、およびＤＨＡ（ω−３経路）に変換する代謝プロセスは、２−炭素単位の付加を通じた炭素鎖の延長と、二重結合の添加を通じた分子の不飽和化を伴う（図２）。これは一連の不飽和化および延長酵素を必要とする。具体的にはオレイン酸は、Δ１２デサチュラーゼの作用によって、最初のω−６脂肪酸であるＬＡ（１８：２）に変換される。引き続くω−６脂肪酸は、次のようにして生成される。１．）ＬＡがΔ６デサチュラーゼの作用によってＧＬＡに変換され、２．）ＧＬＡがエロンガーゼの作用によってＤＧＬＡに変換され、３．）ＤＧＬＡがΔ５デサチュラーゼの作用によってＡＲＡに変換される。同様にしてリノール酸（ＬＡ）は、Δ１５デサチュラーゼの作用によって、最初のω−３脂肪酸であるＡＬＡに変換される。引き続くω−３脂肪酸は、ω−６脂肪酸と類似した一連のステップで生成される。具体的には１．）ＡＬＡがΔ６デサチュラーゼ活性によってＳＴＡに変換され、２．）ＳＴＡがエロンガーゼ活性によってＥＴＡに変換され、３．）ＥＴＡがΔ５デサチュラーゼ活性によってＥＰＡに変換される。代案としてはＥＴＡおよびＥＰＡは、Δ１７デサチュラーゼ活性によって、ＤＧＬＡおよびＡＲＡからそれぞれ生成できる。ＥＰＡは、エロンガーゼおよびΔ４デサチュラーゼ活性によってＤＨＡにさらに変換できる。
【０１４１】
代案の実施態様では、Δ９エロンガーゼがＬＡおよびＡＬＡの、ＥＤＡおよびＥＴｒＡへの変換をそれぞれ触媒できる。次にΔ８デサチュラーゼが、これらの生成物をＤＧＬＡおよびＥＴＡにそれぞれ変換する。
【０１４２】
藻類、細菌、カビ、真菌および酵母菌をはじめとする多くの微生物は、通常の細胞代謝経路内でＰＵＦＡおよびω脂肪酸を合成できる。特に良く研究されているのは、ヤブレツボカビ（Ｔｈｒａｕｓｔｏｃｈｙｔｒｉｕｍ）属の種であるスキゾキトリウム・アグレガトム（Ｓｃｈｉｚｏｃｈｙｔｒｉｕｍ  ａｇｇｒｅｇａｔｍ）、およびクサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）をはじめとする真菌である。さらに多くの渦鞭毛藻類（渦鞭毛藻綱）は、高濃度のＰＵＦＡを自然に生成する。したがってＰＵＦＡ生成に関与する多様なデサチュラーゼおよびエロンガーゼ遺伝子が遺伝的手段を通じて同定されており、これらのいくつかの遺伝子のＤＮＡ配列は公的に入手できる（制限を意図しない例は次のとおり）。ＡＹ１３１２３８、Ｙ０５５１１８、ＡＹ０５５１１７、ＡＦ２９６０７６、ＡＦ００７５６１、Ｌ１１４２１、ＮＭ＿０３１３４４、ＡＦ４６５２８３、ＡＦ４６５２８１、ＡＦ１１０５１０、ＡＦ４６５２８２、ＡＦ４１９２９６、ＡＢ０５２０８６、ＡＪ２５０７３５、ＡＦ１２６７９９、ＡＦ１２６７９８（Δ６デサチュラーゼ）、ＡＦ１９９５９６、ＡＦ２２６２７３、ＡＦ３２０５０９、ＡＢ０７２９７６、ＡＦ４８９５８８、ＡＪ５１０２４４、ＡＦ４１９２９７、ＡＦ０７８７９、ＡＦ０６７６５４、ＡＢ０２２０９７（Δ５デサチュラーゼ）、ＡＦ４８９５８９．１、ＡＹ３３２７４７（Δ４脂肪酸デサチュラーゼ）、ＡＡＧ３６９３３、ＡＦ１１０５０９、ＡＢ０２００３３、ＡＡＬ１３３００、ＡＦ４１７２４４、ＡＦ１６１２１９、ＡＹ３３２７４７、ＡＡＧ３６９３３、ＡＦ１１０５０９、ＡＢ０２００３３、ＡＡＬ１３３００、ＡＦ４１７２４４、ＡＦ１６１２１９、Ｘ８６７３６、ＡＦ２４０７７７、ＡＢ００７６４０、ＡＢ０７５５２６、ＡＰ００２０６３（Δ１２デサチュラーゼ）、ＮＰ＿４４１６２２、ＢＡＡ１８３０２、ＢＡＡ０２９２４、ＡＡＬ３６９３４（Δ１５デサチュラーゼ）、ＡＦ３３８４６６、ＡＦ４３８１９９、Ｅ１１３６８、Ｅ１１３６７、Ｄ８３１８５、Ｕ９０４１７、ＡＦ０８５５００、ＡＹ５０４６３３、ＮＭ＿０６９８５４、ＡＦ２３０６９３（Δ９デサチュラーゼ）、およびＡＸ４６４７３１、ＮＭ＿１１９６１７、ＮＭ＿１３４２５５、ＮＭ＿１３４３８３、ＮＭ＿１３４３８２、ＮＭ＿０６８３９６、ＮＭ＿０６８３９２、ＮＭ＿０７０７１３、ＮＭ＿０６８７４６、ＮＭ＿０６４６８５（エロンガーゼ）。
【０１４３】
さらに特許文献は、ＰＵＦＡ生成に関与する多くのさらに別の遺伝子のＤＮＡ配列（および／または上の遺伝子のいくつかに関する詳細およびそれらの単離方法）を提供する。例えば米国特許第５，９６８，８０９号明細書（Δ６デサチュラーゼ）、米国特許第５，９７２，６６４号明細書および米国特許第６，０７５，１８３号明細書（Δ５デサチュラーゼ）、国際公開第９１／１３９７２号パンフレットおよび米国特許第５，０５７，４１９号明細書（Δ９デサチュラーゼ）、国際公開第９３／１１２４５号パンフレット（Δ１５デサチュラーゼ）、国際公開第９４／１１５１６号パンフレット、米国特許第５，４４３，９７４号明細書および国際公開第０３／０９９２１６号パンフレット（Δ１２デサチュラーゼ）、国際公開第００／１２７２０号パンフレットおよび米国特許出願公開第２００２／０１３９９７４  Ａ１号明細書（エロンガーゼ）、米国特許出願公開第２００３／０１９６２１７  Ａ１号明細書（Δ１７デサチュラーゼ）、国際公開第００／３４４３９号パンフレット（Δ８デサチュラーゼ）、および国際公開第０２／０９０４９３号パンフレット（Δ４デサチュラーゼ）を参照されたい。これらの各特許および出願は、その内容全体を参照によって本願明細書に引用する。
【０１４４】
宿主細胞、基質の入手可能性、および所望の最終生成物次第で、いくつかのデサチュラーゼおよびエロンガーゼが、ＰＵＦＡの生産において使用する上で重要である。デサチュラーゼまたはエロンガーゼ活性を有する特定のポリペプチドを選択する上での考察としては、以下が挙げられる。１）ポリペプチドの基質特異性、２）ポリペプチドまたはその構成要素が律速酵素であるかどうか、３）所望のＰＵＦＡの合成のためにデサチュラーゼまたはエロンガーゼが必須であるかどうか、４）および／またはポリペプチドが必要とする補助因子。発現するポリペプチドは、好ましくはその宿主細胞中における位置の生化学的環境と適合性のパラメーターを有する。例えばポリペプチドは、宿主細胞内で基質獲得のためにその他の酵素と競争しなくてはならないかもしれない。したがって特定の宿主細胞においてＰＵＦＡ生成を修正する特定のポリペプチドの適性を判定する上で、ポリペプチドのＫMおよび特異的活性分析が考慮される。特定の宿主細胞で使用されるポリペプチドは、意図される宿主細胞中に存在する生化学的条件下で機能できるものであるが、その他の点では所望の脂肪酸基質を変性できる、デサチュラーゼ活性またはエロンガーゼを有するあらゆるポリペプチドであることができる。
【０１４５】
ＤＧＡＴ１アシルトランスフェラーゼの配列同定
油性酵母菌（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））における異種発現のために使用できる、ＤＧＡＴ１（前出）をコードするいくつかの遺伝子が利用できるにもかかわらず、可能なら、異種（または「外来性」）酵素よりも天然酵素の発現の方が好ましいことがある。この選択の理由は次のようである。１．）天然酵素は細胞中のその他の酵素およびタンパク質との相互作用のために最適化されており、２．）異種遺伝子が、宿主生物体において同一コドン選択をすることはありそうにない。宿主生物体の天然ＤＧＡＴ１の配列の知識はまた、標的を定めた中断による相同染色体の遺伝子の中断を容易にする。そして本発明が示したように、生物体中でＴＡＧ合成ができるようにするアシルトランスフェラーゼ遺伝子の完全相補体の理解は、宿主生物体が多様なやり方で生成する含油量を容易に操作できるようにする。
【０１４６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１ヌクレオチド塩基（配列番号１３）および推定アミノ酸（配列番号１４）配列と公共データベースとの比較は、低複雑性フィルターおよび次のパラメーターがあるＢＬＡＳＴＰ法によるアラインメントを使用して、最も類似した既知の配列が、本願明細書で報告するＤＧＡＴ１のアミノ酸配列とアミノ酸５２６個の長さにわたり約５５％同一であることを明らかにする。期待値＝１０、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ  ６２（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））。
【０１４７】
クサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１ヌクレオチド塩基（配列番号１７）および推定アミノ酸（配列番号１８）配列と公共データベースとの比較は、ＢＬＡＳＴＰ法によるアラインメント（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、前出）を使用して、最も類似した既知の配列が、本願明細書で報告するＤＧＡＴ１のアミノ酸配列とアミノ酸５２５個の長さにわたり約４９％同一であることを明らかにする。さらにＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１とＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１との比較は、２つのタンパク質が３２．４％同一であることを明らかにする。
【０１４８】
同様に、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）ＤＧＡＴ１アミノ酸（配列番号１９）配列とヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１アミノ酸（配列番号１４）との比較は、アミノ酸５３３個の長さにわたる約３７％の同一性を明らかにする。ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＰＨ−１  ＤＧＡＴ１アミノ酸（配列番号２０）配列とＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１アミノ酸（配列番号１４）との比較は、アミノ酸４９９個の長さにわたる約３８．１％の同一性を明らかにする。マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）ＤＧＡＴ１アミノ酸（配列番号２１）配列とＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１アミノ酸（配列番号１４）との比較は、アミノ酸５０３個の長さにわたる約３６．２％同一性を明らかにし、アスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）ＤＧＡＴ１アミノ酸（配列番号２２）配列とＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１アミノ酸（配列番号１４）との比較は、アミノ酸４５８個の長さにわたる約４１．７％同一性を明らかにする。
【０１４９】
より好ましいＤＧＡＴ１アミノ酸断片は、本願明細書の配列（すなわち配列番号１４、１８、１９、２０、２１、２２）と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。同様に本ＯＲＦ（すなわち配列番号１３および１７）に対応する核酸配列をコードする好ましいＤＧＡＴ１は、本願明細書で報告するＤＧＡＴ１をコードする核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一の活性タンパク質をコードするものであり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。
【０１５０】
ＡＲＥ２アシルトランスフェラーゼの配列同定
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＲＥ２ヌクレオチド塩基（配列番号１５）および推定アミノ酸（配列番号１６）配列と公共データベースとの比較は、低複雑性フィルターおよび次のパラメーターがあるＢＬＡＳＴＰ法によるアラインメントを使用して、最も類似した既知の配列が、アミノ酸５４３個の長さにわたり本願明細書で報告するＡＲＥ２のアミノ酸配列と約４４％同一であることを明らかにする。期待値＝１０、マトリックス＝Ｂｌｏｓｕｍ  ６２（アルシュール（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」２５：３３８９〜３４０２頁（１９９７年））。より好ましいＡＲＥ２アミノ酸断片は、本願明細書の配列と少なくとも約７０％〜８０％同一であり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。同様に本ＯＲＦに対応する核酸配列をコードする好ましいＡＲＥ２は、本願明細書で報告するＡＲＥ２をコードする核酸配列と少なくとも約７０％〜８０％同一の活性タンパク質をコードするものであり、８５％〜９０％同一の配列が特に適切であり、約９５％同一の配列が最も好ましい。
【０１５１】
相同体の単離
本発明の各アシルトランスフェラーゼ核酸断片を使用して、同一のまたは他の微生物種からの相同的タンパクをコードする遺伝子を単離してもよい。配列依存プロトコルを使用した相同的遺伝子の単離は、技術分野で周知である。配列依存プロトコルの例としては以下が挙げられるが、これに限定されるものではない。１．）核酸ハイブリダイゼーション法、２．）核酸増幅技術の様々な使用で例示されるようなＤＮＡおよびＲＮＡ増幅法［例えばマリス（Ｍｕｌｌｉｓ）らに付与された米国特許第４，６８３，２０２号明細書のポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）；タボール（Ｔａｂｏｒ），Ｓ．ら著、「Ｐｒｏｃ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ」８２；１０７４頁（１９８５年）のリガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）；または（ウォーカー（Ｗａｌｋｅｒ）ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．、８９、３９２頁（１９９２年）の連鎖置換増幅（ＳＤＡ）］、および３．）相補性によるライブラリー構築およびスクリーニング法。
【０１５２】
例えば本願明細書で述べるＤＧＡＴ１およびＡＲＥ２に類似したタンパク質またはポリペプチドをコードする遺伝子は、当業者によく知られている方法を使用して、本核酸断片の全てまたは一部をＤＮＡハイブリダイゼーションプローブとして使用して、あらゆる所望の酵母菌または真菌からライブラリーをスクリーニングして直接単離できる。本核酸配列に基づく特異的オリゴヌクレオチドプローブは、技術分野で既知の方法によってデザインおよび合成できる（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前出）。さらに当業者に既知の方法（例えばランダムプライマーＤＮＡ標識、ニック翻訳または末端標識技術）によって、配列全体を直接使用してＤＮＡプローブを合成でき、または利用できる生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転写システムを使用してＲＮＡプローブを合成できる。さらに特異的プライマーをデザインして使用し、本配列の一部（または全長）を増幅できる。得られた増幅生成物を増幅反応中に直接標識し、または増幅反応後に標識して、適切なストリンジェンシー条件下でプローブとして使用し、完全長ＤＮＡ断片を単離できる。
【０１５３】
典型的にＰＣＲ−タイプ増幅技術では、プライマーは異なる配列を有し、互いに相補的でない。所望の試験条件次第で、プライマーの配列は、標的核酸の効率的かつ忠実な複製を提供するようにデザインされるべきである。ＰＣＲプライマーデザインの方法は技術分野で一般的であり、よく知られている。（Ｋ．Ｅ．デービス（Ｄａｖｉｓ）編、「ヒトにおける遺伝病：実際的アプローチ（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ）」よりテイン（Ｔｈｅｉｎ）およびウォリス（Ｗａｌｌａｃｅ）著、「遺伝的障害診断における特異的ハイブリダイゼーションプローブとしてのオリゴヌクレオチドの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｐｒｏｂｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」（１９８６年）３３〜５０頁、ＩＲＬ：ヘルンドン（Ｈｅｒｎｄｏｎ），ＶＡ；およびホワイト（Ｗｈｉｔｅ），Ｂ．Ａ．編、「分子生物学における方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」よりライクリック（Ｒｙｃｈｌｉｋ），Ｗ．著、「ＰＣＲプロトコル：最近の方法と応用（ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ）」（１９９３年）Ｖｏｌ．１５、３１〜３９頁、Ｈｕｍａｎｉａ：ニュージャージー州トトワ（Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ））。
【０１５４】
一般にポリメラーゼ連鎖反応プロトコルにおいて、本配列の２本の短い断片を使用して、ＤＮＡまたはＲＮＡからの相同遺伝子をコードするより長い核酸断片を増幅してもよい。またクローンされた核酸断片ライブラリーに対してポリメラーゼ連鎖反応を実施してもよく、そこでは１つのプライマーの配列が本核酸断片から誘導され、別のプライマーの配列は、微生物遺伝子をコードするｍＲＮＡ前駆物質の３’末端のポリアデニル酸トラクトの存在を利用する。
【０１５５】
代案としては第２のプライマー配列は、クローニングベクターから誘導される配列に基づいてもよい。例えば当業者は、ＲＡＣＥプロトコル（フローマン（Ｆｒｏｈｍａｎ）ら著、「ＰＮＡＳ  ＵＳＡ」８５：８９９８頁（１９８８年））に従って、ＰＣＲを使用して転写物の一点と３’または５’末端との間の領域のコピーを増幅し、ｃＤＮＡを作り出すことができる。３’および５’方向を向いたプライマーは、本配列からデザインできる。例えばメリーランド州ゲイザーズバーグのＢＲＬ（ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））から市販される３’ＲＡＣＥまたは５’ＲＡＣＥシステムを使用して、特定の３’または５’ｃＤＮＡ断片を単離できる（オハラ（Ｏｈａｒａ）ら著、ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  ８６：５６７３頁（１９８９年）；ロー（Ｌｏｈ）ら著、「Ｓｃｉｅｎｃｅ」２４３：２１７頁（１９８９年））。
【０１５６】
代案としては相同体の同定のために、本ＤＧＡＴ１およびＡＲＥ２配列をハイブリダイゼーション試薬として用いてもよい。核酸ハイブリダイゼーション試験の基本的構成要素には、プローブ、関心のある遺伝子または遺伝子断片を含有することが疑われるサンプル、および特定のハイブリダイゼーション法が含まれる。本発明のプローブは典型的に検出する核酸配列に相補である一本鎖核酸配列である。プローブは、検出される核酸配列と「ハイブリダイズ可能」である。プローブの長さは、５個の塩基から数万個の塩基の間で変動してもよく、実施される特定の試験に左右される。典型的に約１５個の塩基から約３０個の塩基のプローブ長が適切である。プローブ分子の一部のみが、検出される核酸配列に相補的であればよい。さらにプローブと標的配列との間の相補性は完璧でなくてもよい。ハイブリダイゼーションは不完全に相補である分子間でも生じ、その結果、ハイブリダイズした領域の特定塩基の一部は、適切な相補的塩基と対合形成しない。
【０１５７】
ハイブリダイゼーション法についてはよく定義されている。典型的には、プローブおよびサンプルは、核酸ハイブリダイズ可能な条件下で混合されなくてはならない。これは適切な濃度および温度条件下において、無機または有機塩存在下で、プローブとサンプルを接触させることを伴う。プローブとサンプル核酸の間であらゆる可能なハイブリダイゼーションが起きるように、プローブおよびサンプル核酸は、十分長い時間接触しなくてはならない。混合物中のプローブまたは標的濃度が、ハイブリダイゼーションが生じるのに必要な時間を決定する。プローブまたは標的濃度が高いほど、必要なハイブリダイゼーションインキュベーション時間は短くなる。場合により、カオトロピック剤を添加してもよい。カオトロピック剤は、ヌクレアーゼ活性を阻害することによって核酸を安定化させる。さらにカオトロピック剤は、室温において短いオリゴヌクレオチドプローブの高感度でストリンジェントなハイブリダイズが可能になる（ヴァン・ネス（Ｖａｎ  Ｎｅｓｓ）およびチェン（Ｃｈｅｎ）著、「Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」１９：５１４３〜５１５１頁（１９９１年））。適切なカオトロピック剤としては、特に塩化グアニジニウム、グアニジニウムチオシアネート、ナトリウムチオシアネート、リチウムテトラクロロ酢酸、過塩素酸ナトリウム、ルビジウムテトラクロロ酢酸、ヨウ化カリウム、およびセシウムトリフルオロ酢酸が挙げられる。典型的にカオトロピック剤は、約３Ｍの最終濃度で存在する。所望するならば、ハイブリダイゼーション混合物にホルムアミドを典型的に３０〜５０％（ｖ／ｖ）で添加できる。
【０１５８】
様々なハイブリダイゼーション溶液を用いることができる。それらは典型的に約２０〜６０容量％、好ましくは３０容量％の極性有機溶剤からなる。一般的なハイブリダイゼーション溶液は、約３０〜５０％ｖ／ｖのホルムアミドと、約０．１５〜１Ｍの塩化ナトリウムと、（例えばクエン酸ナトリウム、トリス−ＨＣＩ、ＰＩＰＥＳまたはＨＥＰＥＳ（ｐＨ範囲約６〜９）などの）約０．０５〜０．１Ｍの緩衝液と、（例えばドデシル硫酸ナトリウムなどの）約０．０５〜０．２％の洗剤、または０．５〜２０ｍＭのＥＤＴＡ、ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｉｎｃ．）からのＦＩＣＯＬＬ（約３００〜５００ｋｄａｌ）、ポリビニルピロリドン（約２５０〜５００ｋｄａｌ）、および血清アルブミンを用いる。また典型的なハイブリダイゼーション溶液には、約０．１〜５ｍｇ／ｍＬの非標識の担体核酸、（例えば仔ウシ胸腺またはサケ精子ＤＮＡ、または酵母菌ＲＮＡなどの）核酸ＤＮＡ断片、および場合により約０．５〜２％重量／容積のグリシンも含まれる。様々な（例えばポリエチレングリコールなどの）極性水溶性または水性膨張剤、（例えばポリアクリレートまたはポリメチルアクリレートなどの）陰イオンポリマー、（例えば硫酸デキストランなどの）陰イオン糖類ポリマーをはじめとする容積排除剤などのその他の添加剤を含めてもよい。
【０１５９】
核酸ハイブリダイゼーションは多様なアッセイ型式に適合できる。最も適切なもの１つは、サンドイッチアッセイ型式である。サンドイッチアッセイは、特に非変性条件下でのハイブリダイゼーションに適合できる。サンドイッチ−タイプアッセイの主要構成要素は個体担体である。個体担体はそれに吸着され、あるいはそれと共有結合的に結合する、未標識で配列の一部と相補である固定核酸プローブを有する。サンドイッチタイプのアッセイの主要構成要素は、固体担体である。固体担体は、未標識で配列の一部と相補的である固定化核酸プローブをそれに吸着し、またはそれと共有結合する。
【０１６０】
本ヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列が利用できれば、ＤＮＡ発現ライブラリーの免疫学的スクリーニングが容易になる。本アミノ酸配列の一部をなす合成ペプチドを合成してもよい。これらのペプチドを使用して、アミノ酸配列を含んでなるペプチドまたはタンパク質に対して特異性があるポリクローナルまたはモノクローナル抗体を生成するように、動物を免疫できる。次にこれらの抗体を使用してＤＮＡ発現ライブラリーをスクリーニングし、関心のある完全長ＤＮＡクローンを単離できる（レーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）Ｒ．Ａ．、「Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．」３６：１頁（１９８４年）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、前出）。
【０１６１】
改善された異種発現のための遺伝子最適化
特定宿主生物内で所望される特定のＴＡＧ組成物次第で、本アシルトランスフェラーゼおよび／またはＰＵＦＡ生合成経路酵素の発現を修正して、それぞれの最適変換効率を達成することが望ましいかもしれない。このように多様な技術を使用して、代案の宿主における関心のあるポリペプチドの発現を改善および／または最適化できる。このような２つの技術としては、コドン最適化および遺伝子の変異誘発が挙げられる。
【０１６２】
コドン最適化
当業者によって理解されるように、修正ポリペプチドが代案の宿主に好まれるコドンを使用するように、異種宿主中で発現される特定ポリペプチドをコードするコドンの一部を修正するのは有用なことが多い。宿主が好むコドンの使用は、ポリペプチドをコードする異種遺伝子の発現を実質的に増強できる。
【０１６３】
一般に宿主が好むコドンは、タンパク質（好ましくは最大量で発現するもの）中でのコドン使用を調べ、いずれのコドンが最高頻度で使用されるかを判定することにより、関心のある特定の宿主種内で判定できる。したがって宿主種で好まれるコドンを使用して、アシルトランスフェラーゼ活性を有するポリペプチドのコード配列を全部または部分的に合成できる。ＤＮＡの全部（または一部）はまた、転写ｍＲＮＡ中に存在するあらゆる不安定化配列または二次構造領域を除去するように合成できる。ＤＮＡの全部（または一部）はまた、塩基組成を所望の宿主細胞中でより好まれるものに改変するように合成できる。
【０１６４】
したがって例えば酵素の基質特異性が、本願明細書で開示されるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１とは異なる場合、ＤＧＡＴ１活性を有するクサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）ポリペプチドをコードするコドンの一部を修正して、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）遺伝子の発現を増強することが望ましいかもしれない。この特定の生物体（すなわちＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））に関するコドン使用頻度プロフィール、および「ＡＴＧ」翻訳開始コドン周囲の共通配列は同時係属米国特許出願第１０／８４０４７８号明細書（その内容全体を参照によって本願明細書に引用する）で教示され、同様にＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中での発現のために最適化された遺伝子の迅速な合成のための方法もまた提供される。
【０１６５】
変異誘発
配列を合成し、配列を一緒にまとめる方法は、文献においてよく確立されている。例えば生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での変異誘発および選択、部位特異的変異誘発、誤りがちなＰＣＲ（メルニコフ（Ｍｅｌｎｉｋｏｖ）ら著、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ」、２７（４）：１０５６〜１０６２頁（１９９９年２月１５日））、「遺伝子シャフリング」またはその他の手段を用いて、天然由来アシルトランスフェラーゼの変異を得ることができる。これによって生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）でアシルトランスフェラーゼ活性を有し、宿主細胞中での機能により望ましい物理的および動力学的パラメーター（例えばより長い半減期またはより高速の脂肪酸からのＴＡＧ合成）がある、ポリペプチドの生成が可能になる。
【０１６６】
所望ならば、酵素活性に重要なＤＧＡＴ１またはＡＲＥ２ポリペプチドの領域は、ルーチンの変異誘発、得られる変異体ポリペプチドの発現、およびそれらの活性測定を通じて判定できる。変異体は、欠失、挿入、および点変異、またはそれらの組み合わせを含んでもよい。典型的な機能分析は、欠失変異を誘発して機能に必要なタンパク質のＮ−およびＣ−末端限界を判定するのに始まって、次に内部欠損、挿入または点変異体を作り出し、機能に必要な領域をさらに判定する。カセット変異誘発または完全合成などのその他の技術もまた使用できる。例えば欠失変異誘発は、エキソヌクレアーゼを使用して５’または３’コーディング領域を逐次除去して達成される。このような技術のためのキットが入手できる。欠失後、５’または３’欠失の後ろの欠失コーディング領域に、開始または停止コドンを含有するオリゴヌクレオチドをそれぞれライゲーションして、コーディング領域を完成させる。代案としては部位特異的変異誘発、変異原性ＰＣＲをはじめとする多様な方法によって、または既存の制限部位における消化ＤＮＡ上へのライゲーションによって、開始または停止コドンをコードするオリゴヌクレオチドをコーディング領域に挿入する。内部欠損は、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲを通じた変異原性プライマーの使用によって、ＤＮＡ中の既存の制限部位の使用をはじめとする多様な方法を通じて同様に作り出せる。挿入は、リンカー−スキャニング変異誘発、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲなどの方法を通じて作り出される。点変異は、部位特異的変異誘発または変異原性ＰＣＲなどの技術を通じて作り出される。
【０１６７】
化学変異誘発もまた、活性に重要なアシルトランスフェラーゼポリペプチドの領域を同定するために使用できる。変異コンストラクトが発現し、得られる改変タンパク質がアシルトランスフェラーゼとして機能する能力をアッセイする。このような構造−機能分析は、どの領域が欠失してもよいか、どの領域が挿入を許容するか、どの点変異によって変異体タンパク質が、天然アシルトランスフェラーゼと実質的に同じように機能できるようにするかを判定できる。
【０１６８】
本願明細書で述べるＤＧＡＴ１およびＡＲＥ２遺伝子から誘導されるこのような全ての変異体タンパク質、およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、本発明の範囲内である。
【０１６９】
脂肪酸およびトリアシルグリセロールの微生物による生成
微生物による脂肪酸およびＴＡＧの生成には、魚または植物などの天然供給源からの精製に比べて、いくつかの利点がある。例えば、
１．）多くの微生物は、油組成が高等生物のものと比べてはるかに単純であることが知られており、所望の構成要素の精製を容易にする。
２．）微生物による生成には、天候および食物供給などの外的変数によって引き起こされるばらつきがない。
３．）微生物的に生成された油は、実質的に環境汚染物質による混入がない。
４．）微生物による油生成は、培養条件を制御することで、特に微生物的発現酵素のための特定基質を提供することで、または化合物の添加または遺伝子工学的アプローチによって望まれない生化学的経路を抑制することで操作できる。
【０１７０】
微生物は、特定用途があるかもしれない特定形態で脂肪酸を提供できるので、特にω−３および／またはω−６脂肪酸、およびこれらのＰＵＦＡを含有するＴＡＧの生産に関して、さらに別の利点がある。また組み換え微生物は、宿主中に新しい生合成経路を提供することで、あるいは所望されない経路を抑制することで、所望のＰＵＦＡまたはその共役形態のレベルを増大させ、所望されないＰＵＦＡのレベルを減少させることにより、天然由来微生物脂肪酸プロフィールを変更する能力を提供する。
【０１７１】
したがって本アシルトランスフェラーゼ遺伝子の配列の知識は、油性酵母菌、特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）において脂肪酸生合成および蓄積を操作するのに有用であろう。これは脂肪酸またはＴＡＧ生合成経路内における代謝エンジニアリング、または炭素から脂肪酸への生合成経路に寄与する経路の追加的操作を必要とするかもしれない。生化学的経路を操作するのに有用な方法は、当業者によく知られている。
【０１７２】
油性酵母菌における脂肪酸合成および油蓄積に影響する遺伝子および生合成経路を上方制御する代謝エンジニアリング
適切なプロモーターの制御下における、本願明細書で述べるアシルトランスフェラーゼをコードするキメラ遺伝子の導入からは、脂肪酸から貯蔵ＴＡＧへの転移の増大がもたらされることが予期される。したがって本発明は、脂肪酸を生成する形質転換された油性酵母菌宿主細胞において、脂肪酸がＴＡＧプールに転移するように、本発明の少なくとも１つのアシルトランスフェラーゼを発現するステップを含んでなる、油性酵母菌のＴＡＧ含量の増大方法を包含する。
【０１７３】
アシルトランスフェラーゼ遺伝子（例えばＤＧＡＴ１、ＡＲＥ２）の追加的コピーを宿主に導入して、脂肪酸からＴＡＧ画分への転移を増大させてもよい。遺伝子の発現はまた、ｍＲＮＡまたはコードされたタンパク質のいずれかから不安定化配列を除去／消去することで、または安定化配列をｍＲＮＡに追加することで、（制御されたまたは構成的な）より強力なプロモーターの使用を通じて発現増大を引き起こして、転写レベルで増大できる（米国特許第４，９１０，１４１号明細書）。異種遺伝子の発現を増大させるさらに別のアプローチは、選択された宿主微生物中において、天然遺伝子中のコドンを最適の遺伝子発現のためのコドンで置換することにより、コードされたｍＲＮＡの翻訳効率を増大させることである。
【０１７４】
ω−３および／またはω−６脂肪酸生合成に必要な各酵素をコードする発現カセットを生物体に導入することが可能であるため、１つの具体的実施態様では、本発明は、油性酵母菌においてＴＡＧのω−３および／またはω−６脂肪酸含量の増大方法を包含する（これらの生物体において天然に生成されるＰＵＦＡは、１８：２（すなわちＬＡ）、およびもっとまれには１８：３（すなわちＡＬＡ）脂肪酸に限定されるため）。したがって方法は、
ａ）機能性ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路および少なくとも１つの本発明のアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有する、形質転換した油性酵母菌宿主細胞を準備し、
ｂ）発酵性炭素基質の存在下でステップ（ａ）の酵母菌細胞を生育させることで、ω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子およびアシルトランスフェラーゼが発現することにより、ω−３および／またはω−６脂肪酸が生成し、それによってω−３および／またはω−６脂肪酸がＴＡＧに転移するステップ
を含んでなる。
【０１７５】
脂肪酸基質、および宿主細胞中に形質転換されるω−３／ω−６脂肪酸生合成経路の遺伝子次第で、（ＴＡＧへの転移に先だって）多様なＰＵＦＡ生成物が生成できる。したがって所望の脂肪酸生成物の生成は、直接（脂肪酸基質が中間ステップまたは経路中間体なしに、所望の脂肪酸生成物に直接変換する）、または間接的に（一連の反応が起きて所望のＰＵＦＡを生成するように、ＰＵＦＡ生合成経路をコードする複数の遺伝子を組み合わせて使用してもよい）起きることができる。具体的には例えばＥＰＡの過剰生産のために、Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、エロンガーゼ、Δ５デサチュラーゼ、およびΔ１７デサチュラーゼを含んでなる発現カセットで、油性酵母菌を形質転換することが望ましいかもしれない。当業者にはよく知られているように、本願明細書で述べるアシルトランスフェラーゼと共に、宿主において次の様々なその他の酵素活性の組み合わせを発現することが有用かもしれない。Δ１５デサチュラーゼ、Δ４デサチュラーゼ、Δ５デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、Δ１７デサチュラーゼ、Δ９デサチュラーゼ、Δ８デサチュラーゼおよび／またはエロンガーゼ（図２参照）。特定発現カセット内に含まれる特定遺伝子は、宿主細胞（およびそのＰＵＦＡプロフィールおよび／またはデサチュラーゼプロフィール）、基質の利用可能性、および所望の最終生成物に左右される。
【０１７６】
したがって本発明の文脈で、上述のいずれか１つの方法によって、ＴＡＧ生合成経路の発現を調節することが有用かもしれない。例えば本発明は、脂肪酸生合成経路において重要な酵素をコードする遺伝子を提供し、ＴＡＧの貯蔵をもたらす。これらの遺伝子は、ＤＧＡＴ１およびＡＲＥ２酵素をコードする。宿主生物体の代謝エンジニアリングの様々な手段を使用して、油性酵母菌におけるこれらの遺伝子の発現レベルを修正し、ＴＡＧの生産および蓄積を最大化することが特に有用であろう。好ましい実施態様では、ω−３／ω−６生合成遺伝子の発現と組み合わせた、これらの遺伝子の発現レベルの修正を使用して、ＴＡＧプールにおける好ましいＰＵＦＡの生産および蓄積を最大化できる。
【０１７７】
油性酵母菌における脂肪酸合成および油蓄積に影響する望ましくない遺伝子および生合成経路を下方制御するための代謝エンジニアリング
実施態様によっては、本願明細書で述べる完全な配列、これらの完全な配列の相補体、それらの配列のかなりの部分、それから誘導されるコドン最適化アシルトランスフェラーゼ、および実質的にそれと相同である配列に基づいて、宿主生物体の天然ＤＧＡＴ１および／またはＡＲＥ２を中断させ、または不活性化することが有用かもしれない。
【０１７８】
遺伝子中断では、そのコード配列を妨害し、それによって遺伝子を機能的に不活性化するために、中断させたい構造的遺伝子中に外来ＤＮＡ断片（典型的に選択可能マーカー遺伝子）を挿入して中断させる。中断カセットの宿主細胞中への形質転換は、相同的組み換えによって、機能的天然遺伝子の非機能的中断遺伝子による置換をもたらす（例えばハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら著、「Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．」１７１：４６１７〜４６２２頁（１９８９年）；バルバス（Ｂａｌｂａｓ）ら著、「Ｇｅｎｅｓ」、１３６：２１１〜２１３頁（１９９３年）；ゲルデナー（Ｇｕｅｌｄｅｎｅｒ）ら著、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．」２４：２５１９〜２５２４頁（１９９６年）；およびスミス（Ｓｍｉｔｈ）ら著、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．」５：２７０〜２７７頁（１９９６年）参照）。
【０１７９】
アンチセンス技術は、標的遺伝子配列が既知の場合に遺伝子を下方制御する別の方法である。これを達成するために、所望の遺伝子からの核酸セグメントをクローンして、ＲＮＡのアンチセンス鎖が転写されるようにプロモーターに作動可能に連結する。次にこのコンストラクトを宿主細胞に導入し、ＲＮＡのアンチセンス鎖を生成する。アンチセンスＲＮＡは、関心のあるタンパク質をエンコードするｍＲＮＡの蓄積を防止することで、遺伝子発現を阻害する。当業者は特定遺伝子の発現を低下させるために、アンチセンス技術の使用に特別な考慮が伴うことを理解する。例えばアンチセンス遺伝子の適切な発現レベルは、当業者には既知の異なる調節因子を使用した、異なるキメラ遺伝子の使用を必要とするかもしれない。
【０１８０】
配列が既知の場合、標的を定めた遺伝子中断およびアンチセンス技術が遺伝子を下方制御する効果的手段を提供するが、配列ベースではないその他のより特異性が低い方法が開発されている。例えば細胞をＵＶ放射線に暴露して、次に所望の表現型についてスクリーンしてもよい。変異体を作り出すために、化学薬品による変異誘発もまた効果的であり、一般に使用される物質としては、非複製ＤＮＡに影響する化学物質（例えばＨＮＯ2およびＮＨ2ＯＨ）、ならびに複製ＤＮＡに影響する薬剤（例えばフレームシフト変異を引き起こすことで注目に値するアクリジン染料）が挙げられる。放射線または化学薬品を使用して変異体を作り出す具体的方法は、技術分野でよく実証されている。例えばトーマスＤ．ブロック（Ｔｈｏｍａｓ  Ｄ．Ｂｒｏｃｋ）著、「バイオテクノロジー：工業微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第２版（１９８９年）「Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ」：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．著、「Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、３６：２２７頁（１９９２年）を参照されたい。
【０１８１】
別の非特異的遺伝子中断法は、転移因子またはトランスポゾンの使用である。トランスポゾンは、ＤＮＡに無作為に挿入される遺伝的因子であるが、後で配列に基づいて探索して、挿入がどこで起きたのか判定できる。生体内（ｉｎ  ｖｉｖｏ）および生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転位法の双方が知られている。どちらの方法にもトランスポザーゼ酵素と組み合わさった転移因子の使用が関与する。転移因子またはトランスポゾンがトランスポザーゼ存在下で核酸断片に接触すると、転移因子が核酸断片中に無作為に挿入される。中断された遺伝子は転移因子の配列に基づいて同定されてもよいので、技術はランダム変異誘発のため、そして遺伝子単離のために有用である。生体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）転位のためのキットは市販されている。例えば１．）ニュージャージー州ブランチバーグのパーキン・エルマー・アプライド・バイオシステムズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｂｒａｎｃｈｂｕｒｇ，ＮＪ））から入手できる酵母菌Ｔｙ１因子ベースのプライマー・アイランド転位キット、２．）マサチューセッツ州のニュー・イングランド・バイオ・ラブズ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、（マサチューセッツ州ベバリー（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））から入手できる細菌性トランスポゾンＴｎ７ベースのゲノム・プライミング・システム、および３．）ウィスコンシン州マディソンのエピセンター・テクノロジーズ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）））から入手できるＴｎ５細菌性転移因子ベースのＥＺ：：ＴＮトランスポゾン挿入システムを参照されたい。
【０１８２】
したがって本発明の文脈で、本発明のアシルトランスフェラーゼ遺伝子の１つを中断することが有用かもしれない。例えば既存の脂肪酸プールを減少させるおよび／またはＴＡＧを加水分解する遺伝子および経路を中断して、ＴＡＧ蓄積を調節する（および／または最大化する）ことが必要かもしれない。
【０１８３】
発現システム、カセット、およびベクター
本願明細書で述べる本配列の遺伝子および遺伝子産物は、微生物宿主細胞、特に油性酵母菌（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））の細胞中で生成されてもよい。組み換え微生物宿主における発現は、様々な脂肪酸のＴＡＧへの転移のために有用かもしれない。
【０１８４】
外来タンパク質の高レベル発現を指示する調節配列を含有する、微生物の発現システムおよび発現ベクターは、当業者によく知られている。これらのいずれも本アシルトランスフェラーゼ配列の遺伝子産物生成のためのキメラ遺伝子を構築するのに使用できる。次に形質転換を通じてこれらのキメラ遺伝子を適切な微生物に導入して、コードされた酵素の高レベル発現を提供できる。
【０１８５】
適切な宿主細胞の形質転換に有用なベクターまたはＤＮＡカセットは、技術分野でよく知られている。コンストラクト中に存在する配列の具体的選択は、所望の発現産物（前出）、宿主細胞の性質、および提案される形質転換細胞と非形質転換細胞とを分離する手段に左右される。しかし典型的にベクターまたはカセットは、関連遺伝子の転写および翻訳を導く配列、選択マーカー、および自律複製または染色体組み込みを可能にする配列を含有する。適切なベクターは、転写開始を制御する遺伝子の５’領域、および転写終結を制御するＤＮＡ断片の３’領域を含んでなる。双方の制御領域が、形質転換された宿主細胞の遺伝子に由来することが最も好ましいが、このような制御領域は、必ずしも生成宿主として選択された特定種に天然の遺伝子に由来しなくてよいものと理解される。
【０１８６】
所望の宿主細胞中で、本ＯＲＦの発現を推進するのに有用な開始制御領域またはプロモーターは多数あり、当業者にはなじみが深い。選択された宿主細胞中でこれらの遺伝子の発現を導くことができる、実質的にあらゆるプロモーターが本発明に適する。宿主細胞中での発現は、一時的または安定様式で達成できる。一時的発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された、調節可能プロモーターの活性を誘導することで達成できる。安定発現は、関心のある遺伝子に作動可能に連結された構成的プロモーターの使用によって達成できる。一例として宿主細胞が酵母菌の場合、酵母菌細胞中で機能する転写および翻訳領域は、特に宿主種から提供される。転写開始調節領域は、例えば次から得ることができる。１．）アルコールデヒドロゲナーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸−デヒドロゲナーゼ（参照によってここに編入する米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書参照）、ホスホグリセリン酸ムターゼ（米国特許出願第１０／８６９６３０号明細書参照）、フルクトース−ビスリン染色体外因子アルドラーゼ（参照によってここに編入する米国仮特許出願第６０／５１９９７１号明細書参照）、ホスホグルコース−異性化酵素、ホスホグリセラートキナーゼ、グリセロール−３−ホスフェートＯ−アシルトランスフェラーゼ（米国仮特許出願第６０／６１００６０号明細書参照）などの解糖経路中の遺伝子、または２．）酸ホスファターゼ、ラクターゼ、メタロチオネイン、グルコアミラーゼ、翻訳延長因子ＥＦ１−α（ＴＥＦ）タンパク質（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）、リボソームタンパク質Ｓ７（米国特許第６，２６５，１８５号明細書）などの調節可能遺伝子。構成的または誘導的転写が所望されるかどうか、関心のあるＯＲＦを発現する上でのプロモーター効率、構築の容易さなど次第で、いくつかの調節配列のいずれか１つを使用できる。
【０１８７】
翻訳開始コドン「ＡＴＧ」を取り囲むヌクレオチド配列が、酵母菌細胞中の発現に影響することが分かっている。所望のポリペプチドの酵母菌中での発現が不良であれば、外来性遺伝子のヌクレオチド配列を修正して効率的な酵母菌翻訳開始配列を含めさせ、最適の遺伝子発現を得ることができる。酵母菌中での発現のために、これは非効率的に発現する遺伝子を内在性酵母菌遺伝子、好ましくは高度に発現する遺伝子にインフレームで融合させることによる、部位特異的変異誘発によって実施できる。代案としては宿主中の共通翻訳開始配列を判定して、関心のある宿主中でのそれらの最適発現のために、この配列を異種性遺伝子内に組み換えできる。（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）に適用可能な具体的教示については米国特許出願第１０／８４０４７８号明細書を参照されたい）。
【０１８８】
終結領域は、それから開始領域が得られた遺伝子の３’領域から、または異なる遺伝子から誘導されることができる。多数の終結領域が知られており、（それらが由来するのと同一および異なる属および種の双方で使用した際に）多様な宿主において満足に機能する。終結領域は、通常特定の特性のためと言うよりも便宜上で選択される。好ましくは終結領域は、特にサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）またはクリヴェロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）である酵母菌遺伝子から誘導される。γ−インターフェロンおよびα−２インターフェロンをコードする哺乳類の遺伝子の３’領域もまた、酵母菌中で機能することが知られている。終結制御領域もまた、好ましい宿主に天然の様々な遺伝子から誘導されてもよい。場合により終結部位は不必要かもしれないが、含まれることが最も好ましい。
【０１８９】
当業者は気づいているように、遺伝子をクローニングベクターに単に挿入するだけでは、それが必要なレベルで成功裏に発現することは確証されない。高発現率の必要性に答えて、転写、翻訳、タンパク質安定性、酸素限界、および宿主細胞からの分泌の側面を制御するいくつかの異なる遺伝的要素を操作することで、多くの特殊化した発現ベクターが作り出されている。より具体的には遺伝子発現を制御するように操作される分子の特徴のいくつかとして以下が挙げられる。１．）関連転写プロモーターおよびターミネーター配列の性質、２．）クローンされた遺伝子のコピー数、および遺伝子がプラスミド上にあるかまたは宿主細胞のゲノム中に組み込まれているかどうか、３．）合成された外来タンパク質の最終細胞内位置、４．）宿主生物体中の翻訳効率、５．）宿主細胞内のクローン遺伝子タンパク質の本質的な安定性、および６．）頻度が宿主細胞の好むコドン使用頻度に近づくようなクローン遺伝子内のコドン使用。これらの各タイプの修正は、アシルトランスフェラーゼの発現をさらに最適化する手段として本発明中に包含される。
【０１９０】
アシルトランスフェラーゼの組み換え発現のための好ましい微生物宿主
本ＤＧＡＴ１およびＡＲＥ２遺伝子および核酸断片の発現のための宿主細胞としては、広範な温度およびｐＨで、単純または複合炭水化物、有機酸およびアルコール、および／または炭化水素をはじめとする多様な原材料上で生育する微生物宿主が挙げられる。本発明で述べられる遺伝子は、油性酵母菌および特にヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における発現のために単離されているが、転写、翻訳、およびタンパク質生合成器官は高度に保存されているので、あらゆる細菌、酵母菌、藻類および／または糸状菌が、本核酸断片の発現のための適切な宿主になることが考察される。
【０１９１】
好ましい微生物宿主は、油性酵母菌などの油性生物体である。これらの油性生物体は自然に油の合成および蓄積ができ、総油含量は細胞乾燥重量の約２５％を超え、より好ましくは細胞乾燥重量の約３０％を超え、最も好ましくは細胞乾燥重量の約４０％を超える量を構成できる。さらにその内容全体を本願明細書に引用した同時係属米国特許出願第１０／８４０５７９号明細書に記載のように、ＰＵＦＡの生産のためにこれらの生物体を使用する根拠がある。
【０１９２】
油性酵母菌として典型的に同定されている属としては、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ）、ロドスポリジウム（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ）、クリプトコッカス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）、トリコスポロン（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ）、およびリポマイセス（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ）が挙げられるが、これに限定されるものではない。より具体的には例示的な油合成酵母菌として、ロドスポリジウム・トルロイデス（Ｒｈｏｄｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｔｏｒｕｌｏｉｄｅｓ）、リポマイセス・スターケイ（Ｌｉｐｏｍｙｃｅｓ  ｓｔａｒｋｅｙｉｉ）、Ｌ．リポフェラス（Ｌ．ｌｉｐｏｆｅｒｕ）、カンジダ・レブカウフィ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｒｅｖｋａｕｆｉ）、Ｃ．プルケリマ（Ｃ．ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍａ）、Ｃ．トロピカリス（Ｃ．ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ）、Ｃ．ユチリス（Ｃ．ｕｔｉｌｉｓ）、トリコスポロン・プランス（Ｔｒｉｃｈｏｓｐｏｒｏｎ  ｐｕｌｌａｎｓ）、Ｔ．クタネウム（Ｔ．ｃｕｔａｎｅｕｍ）、ロドトルラ・グルティナス（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕｌａ  ｇｌｕｔｉｎｕｓ）、Ｒ．グラミニス（Ｒ．ｇｒａｍｉｎｉｓ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（以前はカンジダ・リポリティカ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）として分類された）が挙げられる。
【０１９３】
最も好ましいのは油性酵母菌ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）であり、さらに別の実施態様で最も好ましいのは、ＡＴＣＣ＃２０３６２、ＡＴＣＣ＃８８６２、ＡＴＣＣ＃１８９４４、ＡＴＣＣ＃７６９８２、ＡＴＣＣ＃９０８１２および／またはＬＧＡＭＳ（７）１と称されるＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株である（パパニコラオウ（Ｐａｐａｎｉｋｏｌａｏｕ）Ｓ．、およびアゲリス（Ａｇｇｅｌｉｓ）Ｇ．著、Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．８２（１）：４３〜９頁（２００２年））。
【０１９４】
微生物宿主の形質転換
油性酵母菌中での発現に適したポリペプチドをコードするＤＮＡがひとたび得られると、それは宿主細胞中で自律複製できるプラスミドベクター中に入れられ、またはそれは宿主細胞のゲノム中に直接組み込まれる。発現カセットの組み込みは、宿主ゲノム内で無作為に起きることができ、または宿主遺伝子座内における遺伝子組み換えを標的とするのに十分な宿主ゲノムとの相同性領域を含有するコンストラクトの使用を通じて、標的を定めることができる。コンストラクトが内在性遺伝子座に標的を定めると、全てまたはいくつかの転写および翻訳調節領域が、内在性遺伝子座によって提供できる。
【０１９５】
別々の複製ベクターから２つ以上の遺伝子が発現する場合、各ベクターが異なる選択手段を有することが望ましく、他のコンストラクトに対する相同性を欠いて、安定した発現を維持し、コンストラクト中の要素の再集合を防止すべきである。調節領域、選択手段、および導入コンストラクト増殖方法の思慮深い選択は、全ての導入された遺伝子が必要なレベルで発現して、所望の生成物の合成を提供するように実験的に判定できる。
【０１９６】
関心のある遺伝子を含んでなるコンストラクトは、あらゆる標準的技術によって宿主細胞に導入してもよい。これらの技術としては、形質転換（例えば酢酸リチウム形質転換［「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」、１９４：１８６〜１８７頁（１９９１年）］）、プロトプラスト融合、微粒子銃衝撃、電気穿孔、マイクロインジェクション、または宿主細胞中に関心のある遺伝子を導入するその他のあらゆる方法が挙げられる。油性酵母菌（すなわちヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））に適用できるより具体的な教示としては、米国特許第４，８８０，７４１号明細書および米国特許第５，０７１，７６４号明細書、およびチエン（Ｃｈｅｎ）Ｄ．Ｃ．ら著、「Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」４８（２）：２３２〜２３５頁（１９９７年）が挙げられる。
【０１９７】
便宜上、ＤＮＡ配列（例えば発現カセット）を取り込むように、あらゆる方法によって操作されている宿主細胞を「形質転換された」または「組み換え」と本願明細書中で称する。形質転換された宿主は、遺伝子がゲノム中に組み込まれるか、増幅されるか、または複数のコピー数を有する染色体外因子上に存在するかどうか次第で、発現コンストラクトの少なくとも１つのコピーを有し、２つ以上を有してもよい。形質転換された宿主細胞は、導入されたコンストラクト上に含有されるマーカーの選択によって同定できる。代案としては多くの形質転換技術が多くのＤＮＡ分子を宿主細胞中に導入するので、別のマーカーコンストラクトを所望のコンストラクトと共に同時形質転換してもよい。典型的に形質転換された宿主は、選択的培地上で生育するそれらの能力について選択される。選択培地には抗生物質が組み込まれていてもよく、または栄養素または成長因子などの非形質転換宿主の生育に必要な要素が欠如していてもよい。導入されたマーカー遺伝子は、形質転換された宿主中で発現すると、抗生物質抵抗性を与え、または必須成長因子または酵素をコードしてもよく、それによって選択培地上での生育を可能にしてもよい。発現したマーカータンパク質が直接または間接に検出できる場合にもまた、形質転換された宿主の選択ができる。マーカータンパク質は単独で、または別のタンパク質と融合して発現してもよい。マーカータンパク質は、次によって検出できる。１．）その酵素活性（例えばβガラクトシダーゼは、基質Ｘ−ｇａｌ［５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド］を着色生成物に変換でき、ルシフェラーゼはルシフェリンを発光生成物に変換できる）、または２．）その光生成または修正特性（例えばオワンクラゲ（Ａｅｑｕｏｒｅａ  ｖｉｃｔｏｒｉａ）の緑色蛍光タンパク質は青色光で照明されると蛍光を発する）。代案としては抗体を使用して、例えば関心のあるタンパク質上のマーカータンパク質、または分子タグを検出できる。マーカータンパク質またはタグを発現する細胞は、例えば視覚的に、またはＦＡＣＳ、または抗体を使用したパニングなどの技術によって選択できる。酵母菌形質転換体の選択のためには、酵母菌中で機能するあらゆるマーカーを使用してもよい。望ましくはカナマイシン、ハイグロマイシン、およびアミノグリコシドＧ４１８に対する抵抗性、ならびにウラシルまたはロイシンを欠く培地で生育する能力も重要である。
【０１９８】
形質転換に続いて、本配列の遺伝子産物（そして場合により、宿主細胞内で発現するその他のＰＵＦＡ酵素）に適した基質が、宿主によって自然にまたは遺伝子導入的に生成されてもよく、またはそれらは外来性に提供されてもよい。
【０１９９】
トリアシルグリセロール生合成および蓄積のための発酵プロセス
形質転換された微生物宿主細胞を脂肪酸生合成遺伝子およびアシルトランスフェラーゼ遺伝子活性を最適化する条件下で生育させる。これによって脂肪酸の最大かつ最も経済的な収率の生成がもたらされ、それは次に貯蔵のためにＴＡＧに転移できる。一般に最適化されてもよい培地条件としては、炭素源のタイプおよび量、窒素源のタイプおよび量、炭素−対−窒素比、酸素レベル、生育温度、ｐＨ、バイオマス生成相の長さ、油蓄積相の長さ、および細胞収穫時間が挙げられる。油性酵母菌などの関心のある微生物を複合培地（例えば酵母菌抽出物−ペプトン−デキストロース液体培地（ＹＰＤ））、または生育に必要な構成要素が欠如する合成最少培地（例えばミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの酵母菌窒素ベース）上で生育させて、所望の発現カセットの選択を強要する。
【０２００】
本発明における発酵培地は、適切な炭素源を含有しなくてはならない。適切な炭素源としては、単糖類（例えばグルコース、フルクトース）、二糖類（例えばラクトース、スクロース）、少糖類、多糖類（例えばデンプン、セルロースまたはそれらの混合物）、糖アルコール（例えばグリセロール）または再生可能原材料からの混合物（例えば乳清透過液、コーンスティープリカー、甜菜モラセス、大麦の麦芽）が挙げられるが、これに限定されるものではない。さらに炭素源としては、アルカン、脂肪酸、脂肪酸エステル、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、リン脂質、および植物油（例えばダイズ油）および動物脂肪をはじめとする脂肪酸の様々な商業的供給源が挙げられる。さらに炭素基質としては、重要な生化学的中間体への代謝変換が実証されている一炭素基質（例えば二酸化炭素、メタノール、ホルムアルデヒド、ホルメート、炭素含有アミン）が挙げられる。したがって本発明で使用される炭素源は多種多様な炭素含有基質を包含し、および宿主生物体の選択によってのみ制限されることが考察された。上述の全ての炭素基質およびそれらの混合物が本発明で適切であることが期待されるが、好ましい炭素基質は糖および／または脂肪酸である。最も好ましいのは、１０〜２２個の炭素を含有するグルコースおよび／または脂肪酸である。
【０２０１】
窒素は、無機源（例えば（ＮＨ4）2ＳＯ4）または有機源（例えば尿素、グルタミン酸）から供給されてもよい。適切な炭素および窒素源に加えて、発酵培地はまた、適切なミネラル、塩、補助因子、緩衝液、ビタミン、および微生物の生育と、脂肪酸生成に必須の酵素的経路の促進とに適した、当業者に既知であるその他の構成要素を含有しなくてはならない。脂質およびＰＵＦＡの合成を促進するいくつかの金属イオン（例えばＭｎ+2、Ｃｏ+2、Ｚｎ+2、Ｍｇ+2）が注目されている（Ｄ．Ｊ．カイル（Ｋｙｌｅ）およびＲ．コリン（Ｃｏｌｉｎ）編、「単細胞油の工業的応用（Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌ  Ｏｉｌｓ）」より、ナカハラ（Ｎａｋａｈａｒａ）Ｔ．ら、６１〜９７頁（１９９２年））。
【０２０２】
本発明における好ましい増殖培地は、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの酵母菌窒素ベースなどの一般的な市販の調製培地である。その他の合成または人工増殖培地もまた使用されてもよく、特定微生物の生育に適する培地は、微生物学または発酵科学の当業者に知られている。発酵に適したｐＨ範囲は、典型的に約ｐＨ４．０〜ｐＨ８．０の間であり、ｐＨ５．５〜ｐＨ７．０が初期生育条件の範囲として好ましい。発酵は好気性または好気性条件下で実施されてもよく、微好気条件が好ましい。
【０２０３】
典型的に油性酵母菌細胞中の脂肪酸およびＴＡＧの高レベルの蓄積は、代謝状態が生育と脂肪合成／貯蔵との間で「平衡状態」でなくてはならないので、二段階プロセスを必要とする。したがって最も好ましくは、油性酵母菌における油生成には、二段階発酵プロセスが必要である。このアプローチでは、発酵の第１段階は細胞集団の生成および蓄積のみを行い、迅速な細胞生育および細胞分割によって特徴づけられる。発酵の第２段階では、培養内の窒素欠乏条件を確立して、高レベルの脂質蓄積を促進することが好ましい。この窒素欠乏の効果は、細胞内のＡＭＰの有効濃度を低下させることにより、ミトコンドリアのＮＡＤ−依存イソクエン酸デヒドロゲナーゼ活性を低下させることである。これが起きるとクエン酸が蓄積するので、細胞質中に豊富なアセチル−ＣｏＡのプールが形成し、脂肪酸合成の下準備をする。したがってこの相は、細胞分割休止と、それに続く脂肪酸合成およびＴＡＧ蓄積によって特徴づけられる。
【０２０４】
細胞は典型的に約３０℃で生育させるが、いくつかの研究は、より低い温度における不飽和脂肪酸合成の増大を示している（ヨンマニットチャイ（Ｙｏｎｇｍａｎｉｔｃｈａｉ）およびワード（Ｗａｒｄ）著、「Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」５７：４１９〜２５頁（１９９１年））。プロセスの経済に基づけば、この温度シフトは、生物生育の大部分が起きる二段階発酵の第１相の後に起きるべきである。
【０２０５】
本アシルトランスフェラーゼ遺伝子を使用した脂肪酸およびＴＡＧの商業生産が所望される場合、多様な発酵プロセスデザインを適用してもよいことが考察される。例えば組み換え微生物宿主からのＰＵＦＡを含有するＴＡＧの商業生産は、バッチ、供給バッチまたは連続発酵プロセスによって生産されてもよい。
【０２０６】
バッチ発酵プロセスは閉鎖システムであり、培地組成がプロセス開始時に設定され、プロセス中にｐＨおよび酸素レベル維持のために必要とされるもの以外は、さらなる追加を受けない。したがって培養プロセスの始めに所望の生物体を培地に接種し、培地への追加的基質（すなわち炭素および窒素源）の添加なしに、生育または代謝活動を生じさせる。バッチプロセスでは、システムの代謝産物およびバイオマスの組成は、培養が終結するまで絶えず変化する。典型的なバッチプロセスでは、細胞は静止遅滞期から高対数増殖期を通過して、最終的に発育速度が低下または停止する定常期に減速する。処置されない場合、定常期の細胞は次第に死滅する。標準バッチプロセスのバリエーションが供給バッチプロセスであり、発酵プロセス経過中に基質が発酵槽に連続的に添加される。供給バッチプロセスもまた、本発明に適している。供給バッチプロセスは、分解産物抑制が細胞代謝を阻害する傾向がある場合に、またはあらゆる時点で培地中に限定量の基質を有することが望ましい場合に有用である。供給バッチシステム中の基質濃度の測定は困難であるので、ｐＨ、溶解酸素、および排ガス（例えばＣＯ2分圧）などの測定可能な要素の変化に基づいて推定してもよい。バッチおよび供給バッチ培養方法は一般的であって技術分野でよく知られており、実例が以下にある。トーマス（Ｔｈｏｍａｓ）Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）第２版、「Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ」：マサチューセッツ州サンダーランド（Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ）（１９８９年）、またはデシュパンデ，ムカンド（Ｄｅｓｈｐａｎｄｅ，Ｍｕｋｕｎｄ）Ｖ．著、「Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」、３６：２２７頁（１９９２年）。これらは参照によってここに編入される。
【０２０７】
本遺伝子を使用した脂肪酸の商業生産はまた、連続発酵プロセスによって達成されてもよく、そこでは生成物の回収のため等量の培養物を除去するのと同時に、合成培地をバイオリアクター内に連続的に添加する。連続培養は、一般に細胞を一定細胞密度の対数増殖期に保つ。連続または半連続培養法は、細胞生育または最終生成物濃度に影響する１つの因子またはあらゆる数の因子の調節を可能にする。例えば１つのアプローチでは炭素源を制限して、あらゆるその他のパラメーターが代謝を調節できるようにしてもよい。別のシステムでは、培地濁度によって測定される細胞濃度を一定に保ちながら、生育に影響するいくつかの因子を連続的に変化させてもよい。連続システムは定常状態生育を維持することを目指すので、細胞生育率は、培養から培地が抜き取られることによる細胞損失に対してバランスが取れていなくてはならない。連続培養プロセスのために栄養素および成長因子を調節する方法、ならびに生成物形成速度を最大化する技術は工業微生物学の技術分野でよく知られており、多様な方法が前出のブロック（Ｂｒｏｃｋ）で詳述される。
【０２０８】
脂肪酸の精製
ＰＵＦＡをはじめとする脂肪酸は、遊離脂肪酸として、またはアシルグリセロール、リン脂質、スルホリピドまたは糖脂質などのエステル化形態で宿主微生物中に見ることができ、技術分野でよく知られている多様な手段を通じて宿主細胞から抽出されてもよい。酵母菌脂質の抽出技術、品質分析、および許容性基準に関する１つのレビューは、Ｚ．ジェーコブス（Ｊａｃｏｂｓ）著、「Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」１２（５／６）：４６３〜４９１頁（１９９２年）である。下流プロセスに関する簡潔なレビューはまた、Ａ．シン（Ｓｉｎｇｈ）およびＯ．ワード（Ｗａｒｄ）著、「Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．」４５：２７１〜３１２頁（１９９７年）にもある。
【０２０９】
一般に（ＰＵＦＡをはじめとする）脂肪酸の精製手段は、有機溶剤、超音波処理、（例えば二酸化炭素を使用した）超臨界流体抽出による抽出と、鹸化と、圧搾などの物理的手段またはそれらの組み合わせを含んでもよい。特に興味深いのは、水存在下でのメタノールおよびクロロホルムによる抽出である（Ｅ．Ｇ．ブライ（Ｂｌｉｇｈ）およびＷ．Ｊ．ダイヤー（Ｄｙｅｒ）著、「Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．」３７：９１１〜９１７頁（１９５９年））。望ましい場合、水層を酸性化して負の電荷を帯びた部分をプロトン化することで、有機層中への所望の生成物の分配を増大できる。抽出後、有機溶剤は窒素流下で蒸発によって除去できる。コンジュゲートされた形態で単離されると、生成物は酵素的にまたは化学的に切断されて、関心のある遊離脂肪酸またはより単純なコンジュゲートを放出してもよく、次にさらに操作されて所望の最終生成物を生成できる。望ましくはコンジュゲートされた形態の脂肪酸は、水酸化カリウムによって切断される。
【０２１０】
さらに精製が必要ならば、標準方法を用いることができる。このような方法としては、抽出、尿素処理、分別結晶化、ＨＰＬＣ、分留、シリカゲルクロマトグラフィー、高速遠心分離または蒸留、またはこれらの技術の組み合わせが挙げられる。酸またはアルケニル基などの反応性基の保護は、既知の技術（例えばアルキル化、ヨウ素化）を通じて、あらゆるステップで実施してもよい。使用される方法としては、メチルエステルを生成するための脂肪酸のメチル化が挙げられる。同様に、保護基をあらゆるステップで除去してもよい。望ましくはＧＬＡ、ＳＴＡ、ＡＲＡ、ＤＨＡ、およびＥＰＡを含有する画分の精製は、尿素および／または分留による処置によって達成されてもよい。
【０２１１】
好ましい実施態様の説明
本願明細書で述べる研究の究極の目的は、ω−３および／またはω−６  ＰＵＦＡが濃縮されたＴＡＧを蓄積する油性酵母菌の開発である。このような目的で、貯蔵脂質プールおける好ましいＴＡＧの合成および高い蓄積を可能にするために、油性酵母菌において効率的に機能するアシルトランスフェラーゼが同定されなくてはならない。具体的にはこれらのアシルトランスフェラーゼの発現レベルの修正が、脂肪酸（特にＰＵＦＡ）のＴＡＧへの転移増大を可能にする。したがって宿主細胞において生産されるＴＡＧ画分に組み込まれるω−３／ω−６  ＰＵＦＡ量の操作のために、効率的なアシルトランスフェラーゼの同定が必要である。
【０２１２】
本発明では、出願人は、ＤＧＡＴ１およびＡＲＥ２をコードするヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）から遺伝子を単離し、クローンした。この研究は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴが、油生合成に部分的にのみ関与するという意外な発見（ダブルノックアウト突然変異体の分析に基づく、同時係属米国特許出願第１０／８８２７６０号明細書参照）に続いて行われた。ＤＧＡＴ１遺伝子の活性の確認は、相同的組換え（実施例９）を通じた標的を定めた遺伝子置換によって天然ＤＧＡＴ１の中断が起きた、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株中のより低い含油量（乾燥細胞重量の％としての全脂肪酸）に基づいて、本願明細書で提供された。さらに本発明のＤＧＡＴ１およびＡＲＥ２遺伝子の過剰発現は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＤＧＡＴ１が過剰発現して得られる結果に基づいて、含油量（乾燥細胞重量の％としての全脂肪酸）を増大させることが期待される（実施例１２）。
【０２１３】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１（配列番号１３および１４）の同定に続いて、クサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡ配列の非公開データベースを探索し、オルソロガス遺伝子を同定した。これはＤＧＡＴ１相同体の同定をもたらし、その完全ヌクレオチド配列が決定された（配列番号１７）。これらの２つの新規配列に基づいて、次に出願人らは、ＴＡＧ合成に関与する一連のユニークな真菌ＤＧＡＴ１オルソログを同定することができた。より具体的にはこれらのＤＧＡＴ１は、当業者によく知られているＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用して、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）およびクサレケカビ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ）のＤＮＡ配列とジェンバンクデータベースとの比較に基づいて、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）（配列番号１９）、ジベレラ・ゼアエ（Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ  ｚｅａｅ）ＰＨ−１（配列番号２０）、マグナポルテ・グリセア（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｇｒｉｓｅａ）（配列番号２１）、およびアスペルギルス・ニデュランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）（配列番号２２）から同定された。
【０２１４】
しかしこれらの６つのＤＧＡＴ１の配列分析をマウス（配列番号１６９）、ダイズ（配列番号１７０）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（配列番号１７１）、コメ（配列番号１７２）、シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ）（配列番号１７３）、および小麦（配列番号１７４）からのＤＧＡＴ１配列と比較すると、真菌に特異的で、上述の非真菌生物体（すなわち真菌モチーフ＃１〜８、本願明細書で配列番号２３〜３０として述べられる）からのＤＧＡＴ１に欠けているユニークな特性が明らかになる。さらにより広い文脈では、ＤＧＡＴ１酵素に普遍的に見出だされる一般的なモチーフもまた発見された（配列番号３１〜３７）。これらのユニークな真菌および普遍的保存ドメインは、配列番号１４に関して、アミノ酸９７〜１０５、２７８〜２８４、３３４〜３４１、３６４〜３７４、４１８〜４２４、４１５〜４２４、４５６〜４６６、および５１３〜５１９の間にある。したがって当業者によく知られているように、これらのモチーフがＤＧＡＴ１の指標となり、新規ＤＧＡＴ１の迅速な同定を可能にする。本願明細書で述べられるモチーフは、最近にラルディサバル（Ｌａｒｄｉｚａｂａｌ）ら（米国特許出願第０４／０１０７４５９  Ａ１号明細書）によって述べられ、好ましくは真菌起源のＤＧＡＴ２を同定するのに有用な「ＦｘｘＰｘＹＲ」モチーフ（配列番号３８）とは区別される。
【０２１５】
出願人は、これらのＤＧＡＴ１およびＡＲＥ２アシルトランスフェラーゼ遺伝子が、様々な微生物宿主における発現、特に油性酵母（例えばヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））中での過剰発現のために有用であるという結論を出す。アシルトランスフェラーゼの発現はまた、天然遺伝子の調節的束縛のない強力な構成的または制御プロモーターの制御下に置くことができるので、追加的利点が帰結するかもしれない。
【実施例】
【０２１６】
以下の実施例で本発明をさらに定義する。これらの実施例は、本発明の好ましい実施態様を示しながら、例示のみの目的で提供されるものとする。上の考察およびこれらの実施例から、当業者は本発明の必須特性を把握でき、その精神と範囲を逸脱することなく、本発明の様々な変更および修正を行って、それを様々な使用法および条件に適合できる。
【０２１７】
一般方法
実施例で使用する標準組み換えＤＮＡおよび分子クローニング技術は、技術分野でよく知られており、１．）サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ），Ｊ．、フリッチュ（Ｆｒｉｔｓｃｈ），Ｅ．Ｆ．およびマニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｔ．著、「分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」第２版、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８９年）、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）、２．）Ｔ．Ｊ．シルハビー（Ｓｉｌｈａｖｙ）、Ｍ．Ｌ．ベンナン（Ｂｅｎｎａｎ）、およびＬ．Ｗ．エンクイスト（Ｅｎｑｕｉｓｔ）著、「遺伝子融合実験（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｇｅｎｅ  Ｆｕｓｉｏｎｓ）」、コールドスプリングハーバー研究所（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）：ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）（１９８４年）、および３．）オースベル（Ａｕｓｕｂｅｌ），Ｆ．Ｍ．ら著、「分子生物学現代プロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅによる出版（１９８７年）で述べられる。
【０２１８】
微生物培養の維持および生育に適した材料および方法は、技術分野でよく知られている。以下の実施例で使用するのに適した技術は、次で述べられる。フィリップ・ゲアハルト（Ｐｈｉｌｌｉｐｐ  Ｇｅｒｈａｒｄｔ）、Ｒ．Ｇ．Ｅ．マレー（Ｒ．Ｇ．Ｅ．Ｍｕｒｒａｙ）、ラルフＮ．コスティロウ（Ｒａｌｐｈ  Ｎ．Ｃｏｓｔｉｌｏｗ）、ユージーンＷ．ネスター（Ｅｕｇｅｎｅ  Ｗ．Ｎｅｓｔｅｒ）、ウィリスＡ．ウッド（Ｗｉｌｌｉｓ  Ａ．Ｗｏｏｄ）、ノエルＲ．クリーグ（Ｎｏｅｌ  Ｒ．Ｋｒｉｅｇ）およびＧ．ブリッグス・フィリップス（Ｇ．Ｂｒｉｇｇｓ  Ｐｈｉｌｌｉｐｓ）編、「一般微生物学方法マニュアル（Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ」、米国微生物学会、ワシントンＤ．Ｃ．（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）（１９９４年）、またはトーマス（Ｔｈｏｍａｓ），Ｄ．ブロック（Ｂｒｏｃｋ）著、「バイオテクノロジー：工業的微生物学テキストブック（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）」第２版、Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ：Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，ＭＡ（１９８９年）。微生物細胞の生育および維持のために使用される全ての試薬および材料は、特に断りのない限り、ウィスコンシン州ミルウォーキーのアルドリッチ・ケミカルズ（Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ））、ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））、メリーランド州ゲーサーズバーグのギブコ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））、またはミズーリ州セントルイスのシグマケミカル（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））から得た。
【０２１９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＯＰ１０細胞および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）エレクトロマックス（Ｅｌｅｃｔｒｏｍａｘ）ＤＨ１０Ｂ細胞は、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））から得た。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＨ５αのマックス・エフィシェンシー（Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ）コンピテント細胞は、メリーランド州ゲイザーズバーグのＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ））から得た。大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）（ＸＬ１−Ｂｌｕｅ）コンピテント細胞は、カリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））から購入した。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、典型的にルリア・ベルターニ（Ｌｕｒｉａ  Ｂｅｒｔａｎｉ）（ＬＢ）プレート上で３７℃で生育させた。一般分子クローニングは、標準方法に従って実施した（サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、前出）。オリゴヌクレオチドは、テキサス州スプリングのシグマ−ジェノシス（Ｓｉｇｍａ−Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｓｐｒｉｎｇ，ＴＸ））によって合成された。
【０２２０】
全てのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ポリメラーゼ製造業者によって推奨される緩衝液中のＤＮＡポリメラーゼを使用して、サーモサイクラー内で実施した。特に断りのない限り、次のようにして増幅を実施した。９５℃で１分間の初期変性、続いて９５℃で３０秒間の変性、５５℃で１分間のアニーリング、７２℃で１分間の延長を３０サイクル。７２℃で１０分間の最終鎖延長サイクルを実施し、４℃での反応終結がそれに続いた。ＰＣＲ生成物は、特に断りのない限りウィスコンシン州マディソンのプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのｐＧＥＭ−Ｔ−イージーベクター中にクローンした。
【０２２１】
ＤＮＡ配列は、ベクターとインサート特異的プライマーとの組み合わせを使用して、染料ターミネーター技術（米国特許第５，３６６，８６０号明細書、欧州特許第２７２，００７号）を使用して、ＡＢＩ自動シーケンサー上で生成した。ミシガン州アンアーバーのジーン・コーズ社（Ｇｅｎｅ  Ｃｏｄｅｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ，ＭＩ））からのシーケンチャー（Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ）中で配列編集を実施した。全配列は、双方向で少なくとも２回のカバレッジを表す。遺伝的配列の比較は、ウィスコンシン州マディソンのＤＮＡＳＴＡＲ（ＤＮＡＳＴＡＲ  Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ））からのＤＮＡＳＴＡＲソフトウェアを使用して達成された。以下のパラメーターでクラスタルＷを使用して、ＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して、これらのタンパク質間の％同一性を判定した。ギャップ・ペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、発散数列（％）＝３０、ＤＮＡ遷移重量＝０．５、およびゴネット・シリーズによるタンパク質重量マトリックス。
【０２２２】
略語の意味は以下の通り。「ｓｅｃ」は秒を意味し、「ｍｉｎ」は分を意味し、「ｈ」は時間を意味し、「ｄ」は日を意味し、「μＬ」はマイクロリットルを意味し、「ｍＬ」はミリリットルを意味し、「Ｌ」はリットルを意味し、「μＭ」はマイクロモル濃度を意味し、「ｍＭ」はミリモル濃度を意味し、「Ｍ」はモル濃度を意味し、「ｍｍｏｌ」はミリモルを意味し、「μｍｏｌｅ」はマイクロモルを意味し、「ｇ」はグラムを意味し、「μｇ」はマイクログラムを意味し、「ｎｇ」はナノグラムを意味し、「Ｕ」は単位を意味し、「ｂｐ」は塩基対を意味し、「ｋＢ」はキロベースを意味する。
【０２２３】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換および培養
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２、＃７６９８２、および＃９０８１２株は、メリーランド州ロックビル（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）の米国微生物系統保存機関から購入した。Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株は、ＹＰＤ寒天（１％酵母菌抽出物、２％バクトペプトン、２％グルコース、２％寒天）上において通常２８℃で生育させた。
【０２２４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の形質転換は、特に断りのない限りチェン（Ｃｈｅｎ），Ｄ．Ｃ．ら著、「Ａｐｐｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．」４８（２）：２３２〜２３５頁（１９９７年）の方法に従って実施した。簡単に述べると、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）をＹＰＤプレート上に画線し、３０℃でおよそ１８時間生育させた。いくつかの大型白金耳を満たす細胞をプレートからこすり取り、平均分子量３３５０の２．２５ｍＬの５０％ＰＥＧ、ｐＨ６．０の０．１２５ｍＬの２Ｍ酢酸Ｌｉ、０．１２５ｍＬの２Ｍ  ＤＴＴ、および５０μｇの剪断サケ精子ＤＮＡを含有する１ｍＬの形質転換緩衝液に再懸濁した。次に約５００ｎｇの直線化プラスミドＤＮＡを１００μＬの再懸濁細胞内でインキュベートし、１５分間隔でボルテックス混合しながら３９℃に１時間保った。細胞を選択培地プレートに蒔いて、３０℃に２〜３日間保った。
【０２２５】
形質転換体の選択のために、一般に最少培地（「ＭＭ」）を使用した。ＭＭの組成は次のとおり。ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母菌窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、ｐＨ６．１。適切ならばアデニン、ロイシン、リジンおよび／またはウラシルのサプリメントを最終濃度０．０１％に添加した（それによって２０ｇ／Ｌの寒天で調製される「ＭＭＡ」、「ＭＭＬｅ」、「ＭＭＬｙ」、および「ＭＭＵ」選択培地を生成した）。
【０２２６】
代案として、形質転換体は、次を含んでなる５−フルオロオロチン酸（「ＦＯＡ」、また５−フルオロウラシル−６−カルボン酸一水和物とも）選択培地上で選択される。ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの硫酸アンモニウムまたはアミノ酸を含まない０．１７％酵母窒素ベース、２％グルコース、０．１％プロリン、７５ｍｇ／Ｌのウラシル、７５ｍｇ／Ｌのウリジン、カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ社（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐ．（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からの９００ｍｇ／Ｌ  ＦＯＡおよび２０ｇ／Ｌの寒天。
【０２２７】
油生成条件を促進するために、高グルコース培地（「ＨＧＭ」）を次のように調製した。１４ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、４ｇ／ＬのＫ2ＨＰＯ4、２ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2０、８０ｇ／Ｌのグルコース（ｐＨ６．５）。
【０２２８】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の脂肪酸分析
脂肪酸分析のために、ブライ（Ｂｌｉｇｈ），Ｅ．Ｇ．およびダイヤー（Ｄｙｅｒ），Ｗ．Ｊ．著、Ｃａｎ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．３７：９１１〜９１７頁（１９５９年）で述べられるように、細胞を遠心分離し収集して脂質を抽出した。ナトリウムメトキシドでの脂質抽出物のエステル交換反応によって、脂肪酸メチルエステルを調製し（ローガン（Ｒｏｕｇｈａｎ），Ｇ．およびニシダ（Ｎｉｓｈｉｄａ），Ｉ．著、Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．２７６（１）：３８〜４６頁（１９９０年））、引き続きヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）からの３０ｍ×０．２５ｍｍ（内径）ＨＰ−ＩＮＮＯＷＡＸカラムを装着したヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで分析した。オーブン温度は３．５℃／分で、１７０℃（２５分間保持）から１８５℃であった。
【０２２９】
直接塩基エステル交換のために、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）培養物（３ｍＬ）を収集し、蒸留水で１回洗浄し、スピードバック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）内で真空下において５〜１０分乾燥させた。ナトリウムメトキシド（１００μＬの１％）をサンプルに添加して、次にサンプルをボルテックスし２０分間振盪した。３滴の１Ｍ  ＮａＣｌおよび４００μＬのヘキサンを添加した後、サンプルをボルテックスして遠心分離した。上層を除去して上述のようにＧＣで分析した。
【０２３０】
実施例１
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における遺伝子発現に適したプラスミドの構築
本実施例は、プラスミドｐＹ５、ｐＹ５−１３、ｐＹ２０、およびｐＬＶ５の構築について述べる。
【０２３１】
プラスミドｐＹ５の構築
フランス国ティベルバル−グリニョン、Ｆ−７８８５０、国立作物学研究所、バイオテクノロジー農業関連産業センター、遺伝分子および細胞研究所ＩＮＲＡ−ＣＮＲＳ（Ｉｎｓｉｔｕｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｇｒｉｎｏｍｉｑｕｅ，Ｃｅｎｔｒｅ  ｄｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅ  Ａｇｒｏ−Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｌｌｅ，ｌａｂｏｒａｔｏｉｒｅ  ｄｅ  Ｇｅｎｅｔｉｑｕｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｉｒｅ  ｅｔ  Ｃｅｌｌｕｌａｒｉｅ  ＩＮＲＡ−ＣＮＲＳ（Ｆ−７８８５０，Ｔｈｉｖｅｒｖａｌ−Ｇｒｉｇｎｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）のクロード・ガィヤルダン（Ｃｌａｕｄｅ  Ｇａｉｌｌａｒｄｉｎ）博士から贈与されたｐＩＮＡ５３２の誘導体であるプラスミドｐＹ５を図３に図解するようにヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における異種性遺伝子発現のために構築した。
【０２３２】
最初に、ｐＩＮＡ５３２のＡＲＳ１８配列およびＬＥＵ２遺伝子を含有する部分的に消化された３５９８ｂｐのＥｃｏＲＩ断片をカリフォルニア州サンディエゴのストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））からのｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔのＥｃｏＲＩ部位にサブクローニングしてｐＹ２を生成した。ＴＥＦ５’（配列番号３９）およびＴＥＦ３’（配列番号４０）をプライマーとして使用して、ＰＣＲによりＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ゲノムＤＮＡから、ＴＥＦプロモーター（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ），Ｓ．ら著、「Ｙｅａｓｔ」、１４：１２６７〜１２８３頁（１９９８年））を増幅した。１００ｎｇのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡと、１０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭの（ＮＨ4）2ＳＯ4、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．７５）、２ｍＭのＭｇＳＯ4、０．１％トリトンＸ−１００、１００μｇ／ｍＬのＢＳＡ（最終濃度）を含有するＰＣＲ緩衝液と、各２００μＭのデオキシリボヌクレオチド三リン酸と、１０ｐｍｏｌｅの各プライマーと、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からの１μＬのＰｆｕＴｕｒｂｏ  ＤＮＡポリメラーゼとを含有する、５０μＬの総容積内でＰＣＲ増幅を実施した。増幅は次のように実施した。９５℃で３分の初期変性、続いて９５℃で１分間、５６℃で３０秒間、７２℃で１分間を３５サイクル。７２℃で１０分間の最終延長サイクルを実施し、続いて４℃での反応終結。４１８ｂｐのＰＣＲ生成物をｐＣＲ−ＢｌｕｎｔにライゲーションしてｐＩＰ−ｔｅｆを生成した。ｐＩＰ−ｔｅｆのＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＶ断片をｐＹ２のＢａｍＨＩ／ＳｍａＩ部位にサブクローニングして、ｐＹ４を生成した。
【０２３３】
テンプレートとしてｐＩＮＡ５３２、プライマーとしてＸＰＲ５’（配列番号４１）およびＸＰＲ３’（配列番号４２）を使用して、ＰＣＲによってＸＰＲ２転写ターミネーターを増幅した。上述の構成要素および条件を使用して、ＰＣＲ増幅を５０μＬの総容積内で実施した。１７９ｂｐのＰＣＲ生成物をＳａｃＩＩで消化し、ｐＹ４のＳａｃＩＩ部位にライゲーションしてｐＹ５を生成した。したがってｐＹ５（図３に示す）は、次を含有するヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）−大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）シャトルプラスミドとして有用である。ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）自律複製配列（ＡＲＳ１８）、ＣｏｌＥ１プラスミド複製起点、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）における選択のためのアンピシリン抵抗性遺伝子（ＡｍｐR）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における選択のためのヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＬＥＵ２遺伝子（Ｅ．Ｃ．１．１．１．８５、イソプロピルリンゴ酸異性化酵素をコードする）、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）における異種性遺伝子発現のための翻訳延長プロモーター（ＴＥＦ）、およびヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の異種性遺伝子発現の転写終結のための細胞外プロテアーゼ遺伝子ターミネーター（ＸＰＲ２）。
【０２３４】
プラスミドｐＹ５−１３の構築
ｐＹ５の誘導体としてｐＹ５−１３を構築し、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中のサブクローニングおよび異種性遺伝子発現を容易にした。具体的にはｐＹ５をテンプレートとして使用して、６ラウンドの部位特異的変異誘発により、ｐＹ５−１３を構築した。オリゴヌクレオチドＹＬ５およびＹＬ６（配列番号４３および４４）を使用して、部位特異的変異誘発によってＳａｌＩおよびＣｌａＩ部位の双方をｐＹ５から除去し、ｐＹ５−５を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ９およびＹＬ１０（配列番号４５および４６）を使用して、部位特異的変異誘発によって、ＬＥＵ２遺伝子とＴＥＦプロモーター間のｐＹ５−５にＳａｌＩ部位を導入し、ｐＹ５−６を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ７およびＹＬ８（配列番号４７および４８）を使用して、ＬＥＵ２遺伝子とＡＲＳ１８の間のｐＹ５−６にＰａｃＩ部位を導入し、ｐＹ５−８を生成した。オリゴヌクレオチドＹＬ３およびＹＬ４（配列番号４９および５０）を使用して、ＴＥＦプロモーターの翻訳開始コドン周囲のｐＹ５−８にＮｃｏＩ部位を導入し、ｐＹ５−９を生成した。ＹＬ１およびＹＬ２オリゴヌクレオチド（配列番号５１および５２）を使用して、ｐＹ５−９のＬＥＵ２遺伝子の内側のＮｃｏＩ部位を除去し、ＰＹ５−１２を生成した。最後にオリゴヌクレオチドＹＬ６１およびＹＬ６２（配列番号５３および５４）を使用して、ＣｏｌＥＩとＸＰＲ２領域間のｐＹ５−１２にＢｓｉＷＩ部位を導入し、ｐＹ５−１３を生成した。
【０２３５】
プラスミドｐＹ２０およびｐＬＶ５の構築
プラスミドｐＹ２０（配列番号５５）はｐＹ５の誘導体である。これはキメラハイグロマイシン抵抗性遺伝子を含有するＮｏｔ  Ｉ断片をｐＹ５のＮｏｔ  Ｉ部位に挿入して構築された。具体的には発現のために、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ハイグロマイシン抵抗性遺伝子（配列番号５６、「ＨＰＴ」、カスター（Ｋａｓｔｅｒ），Ｋ．Ｒ．ら著、「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．」１１：６８９５〜６９１１頁（１９８３年））をＰＣＲ増幅した。キメラ遺伝子は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＴＥＦプロモーターの制御下にあるハイグロマイシン抵抗性ＯＲＦを有した。
【０２３６】
プラスミドｐＬＶ５はｐＹ２０の誘導体である。これはハイグロマイシン抵抗性遺伝子をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｕｒａ３遺伝子で置換して構築された。オリゴヌクレオチドＫＵ５およびＫＵ３（配列番号６０および６１）をプライマーとして、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用して、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｕｒａ３遺伝子を含有する１．７ｋＢのＤＮＡ断片（配列番号５８）をＰＣＲ増幅した。
【０２３７】
実施例２
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ２）遺伝子の一部のクローニング、および内在性ＤＧＡＴ２遺伝子の中断
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２の部分的コーディング配列を単離するための変性ＰＣＲプライマーの使用、およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の天然遺伝子を中断させるための部分的配列の使用について述べる。
【０２３８】
変性ＰＣＲプライマーおよび染色体歩行を使用したＰＣＲによるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの推定上の部分的ＤＧＡＴ２配列のクローニング
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのＤＮｅａｓｙ組織キット（カタログ番号６９５０４）を使用して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ＃７６９８２）からゲノムＤＮＡを単離し、ＤＮＡ濃度０．５μｇ／μＬでキット緩衝液ＡＥに再懸濁した。テンプレートとしてゲノムＤＮＡを使用し、異なる既知のＤＧＡＴ２（すなわちジェンバンク登録番号ＮＣ＿００１１４７［サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）］およびＡＦ３９１０８９およびＡＦ３９１０９０［クサレケカビ・ラマニアナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ｒａｍａｎｎｉａｎａ）］）の間で保存されるアミノ酸配列をコードするようにデザインされた、いくつかの変性プライマーセットを使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。下の表で示すように、変性プライマーＰ７およびＰ８によって最良の結果が得られた。
【０２３９】
【表６】
2008524984.tif 000008
【０２４０】
ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのロボサイクラー・グラディエント（ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）４０  ＰＣＲマシン内で、製造業者の推奨およびインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのアキュープライム（Ａｃｃｕｐｒｉｍｅ）Ｔａｑポリメラーゼを使用して、ＰＣＲを実施した。増幅を一般方法で述べられるようにして実施した。
【０２４１】
予期されたＰＣＲ生成物（約２６４ｂｐ）を４％ＮｕＳｉｅｖｅ（ＦＭＣ）アガロースゲル電気泳動法によって検出し、単離精製して、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクター中にクローンし、配列決定した。得られた配列（配列番号１内に含有される）は、ＢＬＡＳＴ（（「基礎的局在性配列探索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら著、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））に基づいて、既知のＤＧＡＴ２との相同性を有した。
【０２４２】
インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＴＯＰＯ（登録商標）歩行キット（カタログ番号Ｋ８０００−０１）を使用して、２６４ｂｐの断片を開始点として使用し、染色体歩行によって６７３ｂｐの断片を得た。染色体歩行を次で簡潔に述べるようにして６段階で実施した。
１．）ゲノムＤＮＡ（５μｇ）を制限酵素Ｐｓｔ  ＩまたはＳａｃ  Ｉで、３’のオーバーハングを残して消化した。
２．）消化したＤＮＡを０．１Ｕの子ウシ小腸由来アルカリホスファターゼで処理し、ＤＮＡを脱リン酸した。
３．）ＤＧＡＴ２特異的プライマーＰ８０（配列番号６６）およびＴａｑポリメラーゼを使用して、プライマー延長を実施した。
４．）ＴＯＰＯ（登録商標）リンカー（１μＬ）を添加し、反応を３７℃で５分インキュベートして、ＴＯＰＯ（登録商標）リンカーをＤＮＡにライゲートした。
５．）ＤＧＡＴ２遺伝子特異的プライマー、Ｐ８１（配列番号６７）およびＬｉｎｋＡｍｐプライマー１（配列番号６８）を使用して、ＰＣＲを実施した。
６．）プライマーＰ８１およびＬｉｎｋＡｍｐプライマー１によって、新たに増幅された断片を配列決定した。
【０２４３】
染色体歩行によって得られた６７３ｂｐの断片の配列もまた、既知のＤＧＡＴ２配列に対する相同性を示した。
【０２４４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２遺伝子の標的を定めた中断
プラスミドｐＹ２１ＤＧＡＴ２と称される標的カセットによる内在性ＤＧＡＴ２遺伝子の相同的遺伝子組み換え媒介置換によって、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ））ＡＴＣＣ＃９０８１２およびＡＴＣＣ＃７６９８２中のＤＧＡＴ２遺伝子の標的を定めた中断を実施した。ｐＹ２１ＤＧＡＴ２は、プラスミドｐＹ２０から誘導された（実施例１、配列番号５５）。具体的にはｐＹ２１ＤＧＡＴ２は、５７０ｂｐのＨｉｎｄ  ＩＩＩ／Ｅｃｏ  ＲＩ断片を同様に直線化されたｐＹ２０中に挿入して作り出された。この５７０ｂｐの断片は（５’から３’に向けて）次を含有した。（配列番号１中のコード配列（ＯＲＦ）の）位置＋１０９０〜＋１４６４の３’相同配列、（配列番号１中のコード配列（ＯＲＦ）の）位置＋９０６から＋１０８９のＢｇｌＩＩ制限部位および５’相同配列。２組のＰＣＲプライマーＰ９５およびＰ９６（配列番号６９および７０）、そしてＰ９７およびＰ９８（配列番号７１および７２）をそれぞれ使用して、染色体歩行によって得られた６７３ｂｐのＤＧＡＴ２  ＰＣＲ生成物からの３’および５’配列のＰＣＲ増幅によって断片を調製した。
【０２４５】
ｐＹ２１ＤＧＡＴ２をＢｇｌ  ＩＩ制限酵素消化によって直線化し、一般方法で述べるようにして、対数増殖中期のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２およびＡＴＣＣ＃７６９８２細胞中に形質転換した。ＹＰＤハイグロマイシン選択プレート上に細胞を播種して、３０℃に２〜３日間保った。
【０２４６】
４個のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２ハイグロマイシン抵抗性コロニーおよび１４個のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２ハイグロマイシン抵抗性コロニーを単離し、ＰＣＲによって標的を定めた中断についてスクリーニングした。ＰＣＲプライマー（Ｐ１１５およびＰ１１６［それぞれ配列番号７３および７４］）の１つの組をデザインし、相同的組換えに続いて特定の接合部断片を増幅した。ＰＣＲプライマー（Ｐ１１５およびＰ１１２［配列番号７５］）の別の組をデザインして、天然遺伝子を検出した。
【０２４７】
ＡＴＣＣ＃７６９８２株の全て（４個中４個）のハイグロマイシン抵抗性コロニーが接合部断片について陽性であり、天然断片について陰性であった。ＡＴＣＣ＃９０８１２株の１４個のハイグロマイシン抵抗性コロニー中の２個が、接合部断片について陽性であり、天然断片について陰性であった。したがってこれらの６菌株において、標的を定めた組み込みが確認された。「Ｓ−Ｄ２」と称される中断された菌株の１つの総脂質のＧＣ分析によって、遺伝子の中断がさらに確認された（実施例９参照）。
【０２４８】
実施例３
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰＤＡＴ）遺伝子の一部のクローニング、および内在性ＰＤＡＴ遺伝子の中断
本実施例は、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴの部分的コード配列を単離するための変性ＰＣＲプライマーの使用、およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の天然遺伝子を中断させるための部分的配列の使用について述べる。
【０２４９】
変性ＰＣＲプライマーおよび染色体歩行を使用したＰＣＲによるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの推定上の部分的ＰＤＡＴ配列のクローニング
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのＤＮｅａｓｙ組織キット（カタログ番号６９５０４）を使用して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ＃７６９８２）からゲノムＤＮＡを単離し、ＤＮＡ濃度０．５μｇ／μＬでキット緩衝液ＡＥに再懸濁した。テンプレートとしてゲノムＤＮＡを使用し、異なる既知のＰＤＡＴ（ジェンバンク登録番号ＮＰ  １９００６９およびＡＢ００６７０４［ｇｉ：２３５１０６９シロイヌナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）］、およびＮＰ＿５９６３３０［分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ］；およびサッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）Ｌｒｏ１遺伝子［ダルキビスト（Ｄａｈｌｑｖｉｓｔ）ら著、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９７：６４８７頁（２０００年）］）間で保存されるアミノ酸配列をコードする変性プライマーのいくつかの組を使用して、ＰＣＲ増幅を実施した。下の表で示すように、変性プライマーＰ２６およびＰ２７によって最良の結果が得られた。
【０２５０】
【表７】
2008524984.tif 000009
【０２５１】
ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのロボサイクラー・グラディエント（ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）４０  ＰＣＲマシン内で、一般方法で述べられる増幅条件を使用してＰＣＲを実施した。予期されたＰＣＲ生成物（約６００ｂｐ）を４％ＮｕＳｉｅｖｅ（ＦＭＣ）アガロースゲル電気泳動法によって検出し、単離精製して、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクター中にクローンし、配列決定した。得られた配列（配列番号７内に含有される）は、ＢＬＡＳＴプログラム分析（アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら著、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））に基づいて、既知のＰＤＡＴとの相同性を有した。
【０２５２】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ遺伝子の標的を定めた中断
この約６００ｂｐのＰＤＡＴコード領域部分の配列決定に続いて、この配列をコードするより大きいＤＮＡ断片が、「酵母菌プロジェクト・ジェノレビュール（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ）」（バイオインフォマティクス・センター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、ＬａＢＲＩ、フランス国タランスセデックス（Ｃｅｄｅｘ））の公共Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベースに発見された（ドゥジョン（Ｄｕｊｏｎ），Ｂ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ４３０（６９９５）：３５〜４４頁（２００４年）もまた参照されたい）。これによりＰＣＲプライマーＰ３９およびＰ４２（配列番号８０および８１）を使用して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２からのＰＤＡＴ遺伝子の一部を含んでなる１００８ｂｐゲノムＤＮＡ断片の単離が可能になった。
【０２５３】
ｐＬＶ１３（配列番号８２）と称されるターゲティングカセットによる、内在性ＰＤＡＴ遺伝子の相同的組換え媒介置換によって、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２におけるＰＤＡＴ遺伝子の標的を定めた中断を実施した。ＰＬＶ１３はプラスミドｐＬＶ５（実施例１）から誘導された。具体的には９９２ｂｐのＢａｍ  ＨＩ／Ｅｃｏ  ＲＩ断片を同様に直線化されたｐＬＶ５に挿入して、ｐＬＶ１３を作り出した。９９２ｂｐのＤＮＡ断片は、（５’から３’に向けて）次を含有した。（配列番号７中のコード配列（ＯＲＦ）の）位置＋８７７〜＋１３７１の３’相同配列、Ｂｇｌ  ＩＩ制限部位、および（配列番号７中のコーディング配列（ＯＲＦ）の）位置＋３９０〜＋８７６の５’相同配列。ＰＣＲプライマーＰ３９およびＰ４１（配列番号８０および８３）、そしてＰ４０およびＰ４２（配列番号８４および８１）をそれぞれ使用して、上述の１００８ｂｐのＰＣＲ生成物からの３’および５’配列のＰＣＲ増幅によって、断片を調製した。
【０２５４】
ｐＬＶ１３をＢｇｌ  ＩＩ制限消化によって直線化し、酢酸リチウム法によって対数増殖中期のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２細胞中に形質転換した（一般方法）。細胞をＢｉｏ１０１  ＤＯＢ／ＣＳＭ−ウルトラ選択プレート上に播いて、２〜３日間３０℃に保った。
【０２５５】
１０個のＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２コロニーが単離され、ＰＣＲによって標的を定めた中断についてスクリーニングされた。１組のＰＣＲプライマー（Ｐ５１およびＰ５２［それぞれ配列番号８５および８６］）をデザインし、ターゲティングカセットを増幅した。ＰＣＲプライマー（Ｐ３７およびＰ３８［それぞれ配列番号８７および８８］）の別の組をデザインし、天然遺伝子を検出した。１０菌株中の１０菌株が接合部断片について陽性であり、１０菌株中の３菌株が天然断片について陰性であったので、これらの３菌株における標的を定めた組み込みの成功が確認された。「Ｓ−Ｐ」と称される中断された菌株の１つの総脂質のＧＣ分析によって、遺伝子の中断がさらに確認された（実施例９参照）。
【０２５６】
実施例４
ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２遺伝子の双方に中断を含有するヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ダブルノックアウト菌株の構築
本実施例は、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２遺伝子の双方が中断された、ダブルノックアウト菌株の作成について述べる。
【０２５７】
具体的には実施例３で述べるように、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２ハイグロマイシン抵抗性「Ｓ−Ｄ２」変異株（実施例２からのＤＧＡＴ２中断を含有する）をプラスミドｐＬＶ１３（実施例３からの）で形質転換し、形質転換体をＰＣＲによってスクリーニングした。１２個の形質転換体中２個が、ＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴ遺伝子の双方で中断されていることが確認された。「Ｓ−Ｄ２−Ｐ」と称される中断された菌株の１つの総脂質のＧＣ分析によって、遺伝子の中断がさらに確認された（実施例９参照）。
【０２５８】
実施例５
完全長のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴ遺伝子のクローニング
本実施例は、天然遺伝子の天然ＯＲＦをＰＣＲするための、レスキューされたプラスミド中の配列を使用したプラスミドレスキューによる、中断されたＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴ遺伝子の傍らにあるゲノム配列の回復について述べる。完全長の遺伝子およびそれらの推定アミノ酸配列をその他の真菌ＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴ配列と、それぞれ比較する。
【０２５９】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴ遺伝子のプラスミドレスキュー
アシルトランスフェラーゼ遺伝子は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）アンピシリン抵抗性遺伝子および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ｏｒｉをそれぞれ含有する完全なｐＹ２１ＤＧＡＴ２およびｐＬＶ１３ベクターの挿入によって中断されたので、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中の隣接ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２配列をレスキューすることが可能であった。このためにＤＮｅａｓｙ組織キットを使用して、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株「Ｓ−Ｄ２」（中断されたＤＧＡＴ２遺伝子を保有する、実施例２）およびＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株「Ｓ−Ｐ」（中断されたＰＤＡＴ遺伝子を保有する、実施例３）のゲノムＤＮＡを単離した。具体的には２００μＬの反応容積内で、１０μｇのゲノムＤＮＡをＤＧＡＴ２のためにはＡｇｅ  ＩおよびＮｈｅ  Ｉ、ＰＤＡＴのためにはＫｐｎ  Ｉ、Ｐａｃ  Ｉ、およびＳａｃ  Ｉの制限酵素５０Ｕで消化した。消化ＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、４０μＬの脱イオン水に再懸濁した。３ＵのＴ４  ＤＮＡリガーゼを含有する２００μＬのライゲーション混合物中で、消化ＤＮＡ（１０μＬ）を自己ライゲートした。各ライゲーション反応を１６℃で１２時間実施した。ライゲートしたＤＮＡをフェノール：クロロホルムで抽出し、４０μＬの脱イオン水に再懸濁した。最後に１μＬの再懸濁したライゲートＤＮＡを使用して、電気穿孔によって大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を形質転換し、アンピシリン（Ａｐ）を含有するＬＢ上に播種した。Ａｐ抵抗性形質転換体を単離し、プラスミドの存在について分析した。以下の挿入サイズが、再生またはレスキューされたプラスミド内に見出された（表６および７）。
【０２６０】
【表８】
2008524984.tif 000010
【０２６１】
【表９】
2008524984.tif 000011
【０２６２】
ＤＧＡＴ２レスキューされたプラスミドの配列決定は、配列決定プライマーＰ７９（配列番号８９）およびＰ９５（配列番号６９）で開始した。対照的にＰＤＡＴプラスミドの配列決定は、配列決定プライマーＰ８４（配列番号９０）およびＰ８５（配列番号９１）で開始した。
【０２６３】
配列決定結果に基づいて、Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２遺伝子をコードする完全長の遺伝子（２１１９ｂｐ、配列番号１）をアセンブルした。具体的には配列は、１５４５個の塩基（配列番号１のヌクレオチド＋２９１〜＋１８３５）の読み取り枠（ＯＲＦ）をコードし、一方推定アミノ酸配列は、長さが残基５１４個（配列番号２）であった。このＯＲＦは、位置１、ならびに位置５６および１６０に開始コドン（「ＡＴＧ」）を有するので、それは少なくとも２個のさらに別の入れ子になった（より小さな）ＯＲＦを含有する。具体的には１個のＯＲＦは長さが塩基１３８０個（配列番号１のヌクレオチド＋４５６〜＋１８３５、配列番号３に対応する）であり、推定アミノ酸配列は残基４５９個（配列番号４）である。別のＯＲＦは長さが１０６８個の塩基（配列番号１のヌクレオチド＋７６８〜＋１８３５、配列番号５に対応する）であり、推定アミノ酸配列は残基３５５個（配列番号６）である。
【０２６４】
配列番号５によってコードされるＯＲＦは、その他の既知のＤＧＡＴ２酵素に対して高度の類似性を有し、配列番号５における中断が天然遺伝子のＤＡＧ  ＡＴ機能を除去したために、配列番号６のポリペプチドは、明らかにＤＧＡＴ２機能性を有すると同定されている。
【０２６５】
上述のＤＧＡＴ２タンパク質の配列決定および分析に続いて、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ２タンパク質配列を「酵母菌プロジェクト・ジェノレビュール（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ）」（バイオインフォマティクスセンター（Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ）、ＬａＢＲＩ、ビルディングＡ３０、ボルドー大学１、３５１、クールデラリベラシオン、フランス国タランスセデックス（Ｃｅｄｅｘ）  ３３４０５の後援）の公共Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベース内で公開した（（ドゥジョン（Ｄｕｊｏｎ），Ｂ．ら、「Ｎａｔｕｒｅ」４３０（６９９５）：３５〜４４頁（２００４年）もまた参照されたい）。具体的には本願明細書で開示される配列を５１４個のアミノ酸をコードするＯＲＦ  ＹＡＬＩ−ＣＤＳ２２４０．１として同定し、タンパク質はｔｒ｜Ｑ０８６５０サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＯＲ２４５Ｃ  ＤＧＡ１アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼといくつかの類似性を有すると報告された。
【０２６６】
ＤＧＡＴ２の完全長の配列を推定するのに使用されるやり方と同様にして、配列決定結果に基づいてＹ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴ遺伝子をコードする完全長の遺伝子をアセンブルした（２３２６ｂｐ、配列番号７）。具体的には配列が塩基１９４４個の読み取り枠（配列番号７のヌクレオチド＋２７４〜＋２２１７）をコードするのに対し、推定アミノ酸配列（配列番号８）は長さが残基６４８個であった。
【０２６７】
上述のＰＤＡＴタンパク質の配列決定および分析に続いて、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＰＤＡＴタンパク質配列を「酵母菌プロジェクト・ジェノレビュール（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ）」（前出）の公共Ｙ．リポリティカ（Ｙ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベースの一部として公開した。そこで開示されるＰＤＡＴ配列を６４８個のアミノ酸をコードするＯＲＦ  ＹＡＬＩ−ＣＤＳ１３５９．１として同定し、タンパク質は、ジアシルグリセロールのエステル化を媒介するレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼ様遺伝子であるｓｐ｜Ｐ４０３４５サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＮＲ００８ｗ  ＬＲＯ１といくつかの類似性を有すると報告された。
【０２６８】
実施例６
追加的な推定上のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＡＧ  ＡＴの同定
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の追加的ＤＡＧ  ＡＴを同定するために、サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＡＲＥ１（Ｓｃ  ＡＲＥ１、ジェンバンク登録番号ＣＡＡ４２２９６）およびＡＲＥ２（Ｓｃ  ＡＲＥ２、ジェンバンク登録番号Ｐ５３６２９）タンパク質配列（ヤン（Ｙａｎｇ），Ｈ．ら（「Ｓｃｉｅｎｃｅ．」２７２（５２６６）：１３５３〜１３５６頁（１９９６年））を使用して、酵母菌プロジェクト・ジェノレビュール（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ）（前出）の公共Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）タンパク質データベースを探索した。双方の探索から、次のＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＯＲＦがそれぞれ第１および第２のヒットとして同定された。
（１）ＹＡＬＩ−ＣＤＳ２０１１．１：「ｓｐ｜Ｐ５３６２９サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＹＮＲ０１９ｗ  ＡＲＥ２アシル−ＣｏＡステロールアシルトランスフェラーゼに類似、仮説的開始」と注釈される、長さアミノ酸５４３個（配列番号９および１０）、および
（２）ＹＡＬＩ−ＣＤＳ２１４１．１：「無名タンパク質生成物、ｔｒ｜Ｑ９ＦＵＬ６シソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＰｆＤＧＡＴ１）に弱く類似、仮説的開始」と注釈される、長さアミノ酸５２６個（配列番号１１および１２）。
【０２６９】
これらのタンパク質間の％同一性は、一般方法で述べられるパラメーターに従って、クラスタルＷを使用して、ＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して判定された。同一性を下に示し、そこでは％同一性は、２つのタンパク質間で同一のアミノ酸の百分率として定義される。
【０２７０】
【表１０】
2008524984.tif 000012
【０２７１】
この比較に基づいて、（本願明細書でそれぞれ「ＹｌＤＧＡＴ１」および「ＹｌＡＲＥ２」と称する）ＹＡＬＩ−ＣＤＳ２１４１．１およびＹＡＬＩ−ＣＤＳ２０１１．１は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中でＤＡＧＡＴ機能性を有するタンパク質をコードする可能性があるＯＲＦの候補であった。
【０２７２】
上述のタンパク質分析に続いて、ジェンバンクにおいてジェノレビュール（Ｇｅｎｏｌｅｖｕｒｅｓ）プロジェクトの一部としてヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株ＣＬＩＢ９９の完全なゲノムを公開した。したがってＹＡＬＩ−ＣＤＳ２０１１．１として同定されたＯＲＦはジェンバンク登録番号ＮＣ＿００６０７２、遺伝子座＿ｔａｇ＝「ＹＡＬＩ０Ｆ０６５７８ｇ」に対応し、ＹＡＬＩ−ＣＤＳ２１４１．１として同定されたＯＲＦはジェンバンク登録番号ＣＲ３８２１３０、遺伝子座＿ｔａｇ＝「ＹＡＬＩ０Ｄ０７９８６ｇ」に対応する。
【０２７３】
実施例７
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アシル−ＣｏＡ：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）遺伝子のクローニングおよび内在性ＤＧＡＴ１遺伝子の中断
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１（ＯＲＦＹＡＬＩ−ＣＤＳ２０１１．１（実施例６）によってコードされる）の全長コード配列を単離するための縮重ＰＣＲプライマーの使用、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の天然遺伝子を中断するための配列の使用について述べる。
【０２７４】
縮重ＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲによるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの推定上のＤＧＡＴ１配列クローニング
縮重ＰＣＲプライマーＰ２０１およびＰ２０３（それぞれ配列番号９２および９３）、およびテンプレートとして（実施例２からの）Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２ゲノムＤＮＡを使用して、ＰＣＲによって全長Ｙｌ  ＤＧＡＴ１  ＯＲＦをクローンした。Ｙｌ  ＤＧＡＴ１をコードするヌクレオチド配列が分かっていなかったので、縮重プライマーが必要であった。
【０２７５】
ロボサイクラー・グラディエント（ＲｏｂｏＣｙｃｌｅｒ  Ｇｒａｄｉｅｎｔ）４０  ＰＣＲマシン内で、一般方法で述べられる構成要素およびサーモサイクラー条件を使用して、ＰＣＲを実施した。アガロースゲル電気泳動法によって予期されたＰＣＲ生成物（約１．６ｋＢ）を検出し、単離して精製し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からのＴＯＰＯ（登録商標）クローニングベクター中にクローンして、部分的に配列決定してその同一性を確認した。
【０２７６】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１遺伝子の標的を定めた中断
（実施例２で述べられる方法を使用して）内在性ＤＧＡＴ１遺伝子のターゲティングカセットとの相同的組換え媒介置換によって、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２中の推定上のＤＧＡＴ１遺伝子の標的を定めた中断を実施した。具体的には１．６ｋＢの単離されたＹｌ  ＤＧＡＴ１  ＯＲＦ（配列番号１３）をＰＣＲテンプレート分子として使用し、５’相同的Ｙｌ  ＤＧＡＴ１配列、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ロイシン２（Ｌｅｕ２）遺伝子、および３’相同的Ｙｌ  ＤＧＡＴ１配列からなるＹｌ  ＤＧＡＴ１ターゲティングカセットを構築した。このために、以下に記載するプライマーを使用して、最初にターゲティングカセットの各部分を個別に増幅した。
５’相同的ＤＧＡＴ１配列の増幅のための上方プライマーＰ２１４および下方プライマーＰ２１５（それぞれ配列番号９４および９５）、
３’相同的ＤＧＡＴ１配列の増幅のための上方プライマーＰ２１６および下方プライマーＰ２１７（それぞれ配列番号９６および９７）、および
Ｌｅｕ２遺伝子（ジェンバンク登録番号ＡＡＡ３５２４４）増幅のための上方プライマーＰ２１８および下方プライマーＰ２１９（それぞれ配列番号９８および９９）。
【０２７７】
一般方法で述べられるようにして、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からのＰｆｕウルトラポリメラーゼ（カタログ番号６００６３０）を使用してＰＣＲを実施し、精製した。ＰＣＲプライマーＰ２１４およびＰ２１９（配列番号９４および９９）を使用した第２のＰＣＲ反応のためのテンプレート分子として、３つの正しいサイズの精製断片を共に混合し、Ｙｌ  ＤＧＡＴ１中断カセットを得た。
【０２７８】
ターゲティングカセットをゲル精製して使用し、対数増殖中期の野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（ＡＴＣＣ＃９０８１２）を形質転換した。一般方法で述べられるようにして形質転換を実施した。
【０２７９】
形質転換体をＢｉｏ１０１  ＤＯＢ／ＣＳＭ−Ｌｅｕ選択プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。いくつかのロイシン原栄養株をＰＣＲによってスクリーンし、標的を定めたＤＧＡＴ１中断を確認した。具体的には一組のＰＣＲプライマー（Ｐ２２６およびＰ２２７［それぞれ配列番号１００および１０１］）をデザインして、中断カセットと天然標的遺伝子間の接合部を増幅した。ＰＣＲプライマーの別の組（Ｐ２１４およびＰ２１７［それぞれ配列番号９４および９７］）をデザインして、天然遺伝子を検出した。
【０２８０】
全てのロイシン原栄養株コロニーは、接合部断片について陽性であり、天然断片について陰性であった。したがってこれらの株において、標的を定めた組み込みが確認された。「Ｓ−Ｄ１」と命名された中断された株の１つの全脂質のＧＣ分析によって、遺伝子の中断をさらに確認した（実施例９参照）。
【０２８１】
同様に、ＤＧＡＴ１ターゲティングカセットを使用して、ＰＤＡＴ（実施例３からの「Ｓ−Ｐ」）、ＤＧＡＴ２（実施例２からの「Ｓ−Ｄ２」）のいずれかの単一中断、またはＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２（実施例４「Ｓ−Ｄ２−Ｐ」）中の二重中断を含有する株中のＤＧＡＴ１遺伝子を中断した。これはＤＧＡＴ１およびＰＤＡＴ（「Ｓ−Ｄ１−Ｐ」）中、ＤＧＡＴ２およびＤＧＡＴ１（「Ｓ−Ｄ２−Ｄ１」）中にダブルノックアウトがある株、ＤＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１、およびＰＤＡＴ（「Ｓ−Ｄ２−Ｄ１−Ｐ」）中にトリプルノックアウトがある株の生成をもたらした。
【０２８２】
実施例８
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）アシル−ＣｏＡ：ステロール−アシルトランスフェラーゼ（ＡＲＥ２）遺伝子のクローニングおよび内在性ＡＲＥ２遺伝子の中断
本実施例は、（ＯＲＦ  ＹＡＬＩ−ＣＤＳ２１４１．１（実施例６）によってコードされる）ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＲＥ２の全長コード配列単離するための縮重ＰＣＲプライマーの使用、およびＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）中の天然遺伝子を中断するための配列の使用について述べる。
【０２８３】
縮重ＰＣＲプライマーを使用したＰＣＲによるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）からの推定上のＡＲＥ２配列のクローニング
縮重ＰＣＲプライマーＰ２０５およびＰ２０８（それぞれ配列番号１０２および１０３）、およびテンプレートとしてＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃７６９８２（実施例２からの）ゲノムＤＮＡを使用したＰＣＲによって全長Ｙｌ  ＡＲＥ２  ＯＲＦをクローンした。Ｙｌ  ＡＲＥ２をコードするヌクレオチド配列が分かっていなかったので、縮重プライマーが必要であった。実施例７で述べられるプロトコルを使用して、ＰＣＲを実施した。予期されたサイズのＰＣＲ生成物が検出された。
【０２８４】
ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＲＥ２遺伝子の標的を定めた中断（予言的）
（実施例７で述べられるようにして）内在性ＡＲＥ２遺伝子のターゲティングカセットとの相同的組換え媒介置換によって、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２中のＡＲＥ２遺伝子の標的を定めた中断が実施される。具体的には推定上のＹｌＡＲＥ２タンパク質（配列番号１５）をコードする約１．６ｋＢの単離されたＯＲＦをＰＣＲテンプレート分子として使用し、５’相同的Ｙｌ  ＡＲＥ２配列、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ロイシン２（Ｌｅｕ２）遺伝子、および３’相同的Ｙｌ  ＡＲＥ２配列からなるＹｌ  ＡＲＥ２ターゲティングカセットを構築する。このために、実施例７で述べられるようにして、以下に記載するプライマーを使用して、最初にターゲティングカセットの各部分が個別に増幅される。
５’相同的ＡＲＥ２配列の増幅のための上方プライマーＰ２２０および下方プライマーＰ２２１（それぞれ配列番号１０４および１０５）、
３’相同的ＡＲＥ２配列の増幅のための上方プライマーＰ２２２および下方プライマーＰ２２３（それぞれ配列番号１０６および１０７）、および
Ｌｅｕ２遺伝子増幅のための上方プライマーＰ２２４および下方プライマーＰ２２５（それぞれ配列番号１０８および１０９）。
【０２８５】
精製に続いて、正しいサイズの各断片を混合して、プライマーＰ２２０およびＰ２２３を使用したＰＣＲ反応におけるテンプレート分子として利用し、ターゲティングカセットを得る。生成物のゲル精製に続いて、ターゲティングカセットを使用して、ＰＤＡＴ（実施例３からの「Ｓ−Ｐ」）、ＤＧＡＴ２（実施例２からの「Ｓ−Ｄ２」）、ＤＧＡＴ１（実施例７からの「Ｓ−Ｄ１」）中に単一中断を含有し、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２（実施例４からの「Ｓ−Ｄ２−Ｐ」）中に二重中断を含有し、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ１（実施例７からの「Ｓ−Ｄ１−Ｐ」）中に二重中断を含有し、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２（実施例７からの「Ｓ−Ｄ１−Ｄ２」）中に二重中断を含有し、またはＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ１（実施例７からの「Ｓ−Ｄ１−Ｄ２−Ｐ」）中に三重中断を含有する、対数増殖中期の野生型および突然変異Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株（ＡＴＣＣ＃９０８１２）を形質転換する。一般方法で述べられるようにして形質転換を実施する。
【０２８６】
形質転換体をＢｉｏ１０１  ＤＯＢ／ＣＳＭ−Ｌｅｕ選択プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保つ。実施例７で述べられた方法を使用して、いくつかのロイシン原栄養株をＰＣＲによってスクリーンし、標的を定めたＡＲＥ２中断を確認する。
【０２８７】
実施例９
突然変異および野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株（ＡＴＣＣ＃９０８１２）中のＴＡＧ含量測定
本実施例は、野生型および次を含有する突然変異Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２中のＴＡＧ含量の比較について述べる。（１）ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ１中の単一中断、（２）ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１およびＰＤＡＴ、およびＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２中の二重中断、および（３）ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ１中の三重中断。
【０２８８】
具体的には野生型の単一コロニーと、ＰＤＡＴ（実施例３からの「Ｓ−Ｐ」）、ＤＧＡＴ２（実施例２からの「Ｓ−Ｄ２」）、ＤＧＡＴ１（実施例７からの「Ｓ−Ｄ１」）中に単一中断、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２（実施例４からの「Ｓ−Ｄ２−Ｐ」）、ＤＧＡＴ１およびＰＤＡＴ（実施例７からの「Ｓ−Ｄ１−Ｐ」）、ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２（実施例７からの「Ｓ−Ｄ１−Ｄ２」）中に二重中断、および三重中断（実施例７からの「Ｓ−Ｄ１−Ｄ２−Ｐ」）を含有する突然変異Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）の単一コロニーとを油生成を誘導する条件を使用して別々に生育させた。各培養からのループ１つ分の細胞を３ｍＬのＹＰＤ培地中にそれぞれ別々に接種して、３０℃で（３００ｒｐｍ）振盪機上で一晩生育させた。細胞を採取して０．９％ＮａＣｌで１回洗浄し、５０ｍＬのＨＧＭに再懸濁した。次に振盪機上で細胞を４８時間生育させた。細胞を水で洗浄し、細胞ペレットを凍結乾燥した。ＴＬＣ（下記）およびＧＣ分析に続く、ＧＣ分析による全脂肪酸および油分画のために２０ｍｇの乾燥細胞重量を使用した。
【０２８９】
薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）
ＴＬＣのために使用される方法は、以下の５段階で述べられる。１）内部標準１５：０脂肪酸（１０μＬの１０ｍｇ／ｍＬ）を２〜３ｍｇの乾燥細胞塊に添加し、メタノール／クロロホルム法を使用した総脂質の抽出がそれに続いた。２）２５〜５０μＬの微量ピペットを使用して、５×２０ｃｍシリカゲル６０プレートの下端からおよそ１インチのところに鉛筆で薄く描いた線を横切って、抽出した脂質（５０μＬ）をブロットした。３）次にＴＬＣプレートをＮ2下で乾燥させ、約１００ｍＬの８０：２０：１のヘキサン：エチルエーテル：酢酸溶剤を含有するタンクに挿入した。４）バンドの分離後、プレートの片面にヨウ素蒸気を吹き付けてバンドを同定した。これによってさらなる分析のために、カミソリの刃を使用してプレートのもう一方の面のサンプルがこすり取れるようになった。５）こすり取ったサンプルの塩基性エステル交換反応、およびＧＣ分析を一般方法で述べられるようにして実施した。
【０２９０】
ＧＣ分析からの結果
ＧＣ結果を下の表９に示す。培養は「Ｓ」株（野生型）、「Ｓ−Ｐ」（ＰＤＡＴノックアウト）、「Ｓ−Ｄ１」（ＤＧＡＴ１ノックアウト）、「Ｓ−Ｄ２」（ＤＧＡＴ２ノックアウト）、「Ｓ−Ｄ１−Ｄ２」（ＤＧＡＴ１およびＤＧＡＴ２ノックアウト）、「Ｓ−Ｐ−Ｄ１」（ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ１ノックアウト）、「Ｓ−Ｐ−Ｄ２」（ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２ノックアウト）、および「Ｓ−Ｐ−Ｄ１−Ｄ２」（ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ１、およびＤＧＡＴ２ノックアウト）として既述される。使用される略語は次のとおり。「ＷＴ」＝野生型。「ＦＡ」＝脂肪酸、「ｄｃｗ」＝乾燥細胞重量、および「ＦＡ％ｄｃｗ、重量％」＝野生型中の％に対するＦＡ％ｄｃｗ、「Ｓ」株は野生型である。
【０２９１】
【表１１】
2008524984.tif 000013
【０２９２】
表９中の結果は、ＤＧＡＴ１の中断が野生型株と比較してより低い含油量をもたらすので、それがＤＡＧ  ＡＴであるという証拠を提供する。上に示す結果はまた、油生合成に対する３つのＤＡＧ  ＡＴの相対的貢献度も示唆する。ＤＧＡＴ２の貢献が最も大きいのに対し、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ１は等しく貢献するがＤＧＡＴ２よりも小さい。三重ノックアウト株中の約３％の残留含油量は、Ｙｌ  ＡＲＥ２の貢献によるかもしれない（実施例８参照）。
【０２９３】
実施例１０
ＥＰＡ産生ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２  ＭＵ株およびＹ２０６７Ｕ株の発生
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２にそれぞれ由来する、ＭＵ株およびＹ２０６７Ｕ株の構築について述べ、各株は全脂質と比較して顕著な濃度のＥＰＡを生成できた（図５）。実施例１１、１２、および１５（下記）で述べられるように、ＴＡＧ含量および／または脂肪酸組成の分析に基づいて、これらのＥＰＡ生成株中で、様々なアシルトランスフェラーゼノックアウトおよびアシルトランスフェラーゼ遺伝子過剰発現の効果を調べた。
【０２９４】
本願明細書でＭＵ株の開発は、Ｍ４株（８％のＤＧＬＡを生成する）、Ｙ２０３４株（１０％のＡＲＡ）、Ｅ株（１０％のＥＰＡを生成する）、ＥＵ株（１０％のＥＰＡを生成する）、およびＭ２６株（１４％を生成する）の構築を必要とした。Ｙ２０６７Ｕ株の開発は、最初にＹ２０６７株（１５％のＥＰＡを生成する）と称されるＥＵ株の誘導体を作り出すことを必要とした。
【０２９５】
８％のＤＧＬＡを生成するＭ４株の構築
コンストラクトｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅ（図６Ａ、配列番号１１０）を生成して、野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２株のＵｒａ３遺伝子座に、４つのキメラ遺伝子（Δ１２デサチュラーゼ、Δ６デサチュラーゼ、および２つのエロンガーゼを含んでなる）を組み入れ、それによってＤＧＬＡの生成を可能にした。ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅプラスミドは次の構成要素を含有した。
【０２９６】
【表１２】
2008524984.tif 000014
【０２９７】
ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６ＥプラスミドをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用して野生型Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２を形質転換した。形質転換体細胞をＦＯＡ選択培地プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。ＦＯＡ抵抗性コロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＵ選択プレート上に画線培養した。ＭＭＵプレート上で生育できるが、ＭＭプレート上で生育できないコロニーをＵｒａ-株として選択した。次にＵｒａ-株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＵに接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出して、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで分析した。
【０２９８】
ＧＣ分析は、ＤＧＬＡの存在をｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅの４つのキメラ遺伝子を含有する形質転換体中に示したが（図６Ａ）、野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）対照株中には示さなかった。選択された３２Ｕｒａ-株のほとんどは、全脂質の約６％のＤＧＬＡを生成した。全脂質の約８％のＤＧＬＡ生成する２つの株（すなわち株Ｍ４および１３−８）があった。
【０２９９】
約１０％のＡＲＡを生成するＹ２０３４株の構築
コンストラクトｐＤＭＷ２３２（図６Ｂ、配列番号１２１）を生成して、２つのΔ５キメラ遺伝子をヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｍ４株のＬｅｕ２遺伝子に組み入れた。プラスミドｐＤＭＷ２３２は、次の構成要素を含有した。
【０３００】
【表１３】
2008524984.tif 000015
【０３０１】
プラスミドｐＤＭＷ２３２をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＭ４株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭＬｅプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。ＭＭＬｅプレート上に生育した各形質転換からの個々のコロニーを拾って、ＭＭおよびＭＭＬｅプレート上に画線培養した。ＭＭＬｅプレート上で生育できるが、ＭＭプレート上で生育できないコロニーをＬｅｕ２-株として選択した。次にＬｅｕ２-株の単一コロニーを３０℃の液体ＭＭＬｅ培地に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出して、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで分析した。
【０３０２】
ＧＣ分析は、ＡＲＡの存在をｐＤＭＷ２３２形質転換体中に示したが、親Ｍ４株中には示さなかった。具体的には４８個の選択されたｐＤＭＷ２３２によるＬｅｕ２-形質転換体の内、３４株が組み換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の全脂質の５％未満のＡＲＡを生成し、１１株が６〜８％のＡＲＡを生成し、３株が約１０％のＡＲＡを生成した。１０％のＡＲＡを生成する株の１つを「Ｙ２０３４」と命名した。
【０３０３】
約１０％のＥＰＡを生成するＥ株の構築
コンストラクトｐＺＰ３Ｌ３７（図６Ｃ、配列番号１２４）を作り出して、３つの合成Δ１７デサチュラーゼキメラ遺伝子をＹ２０３４株のアシル−ＣｏＡオキシダーゼ３（すなわちＰＯＸ３）遺伝子中に組み入れた。プラスミドｐＺＰ３Ｌ３７は、次の構成要素を含有した。
【０３０４】
【表１４】
2008524984.tif 000016
【０３０５】
プラスミドｐＺＰ３Ｌ３７をＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＹ２０３４株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。ＭＭプレート上に生育した全部で４８個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。ひとたび生育すると、これらの株を３０℃の液体ＭＭに個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出して、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで分析した。
【０３０６】
ＧＣ分析は、ＥＰＡの存在をｐＺＰ３Ｌ３７による形質転換体中に示したが、親株（すなわちＹ２０３４）中には示さなかった。４８個の選択されたｐＺＰ３Ｌ３７による形質転換体の内、１８株が組み換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）の全脂質の２％未満のＥＰＡを生成し、１４株が２〜３％のＥＰＡを生成し、１株が約７％のＥＰＡを生成した。
【０３０７】
７％のＥＰＡを生成する株を次のように培養（「二段階生育条件」）した後に、株をさらに分析した。最初に、細胞を３０℃の液体ＭＭ中で２５０ｒｐｍ／分で４８時間振盪して、三連で生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、液体上清を抜き出した。ペレット化細胞をＨＧＭに再懸濁し、３０℃で７２時間２５０ｒｐｍ／分で振盪して生育させた。細胞を遠心分離によって再度収集し、液体上清を抜き出した。
【０３０８】
ＧＣ分析は、組み換え株が二段階生育後に、全脂質の約１０％のＥＰＡを生成することを示した。株を「Ｅ」株と命名した。
【０３０９】
約１０％のＥＰＡを生成するＥＵ株の構築
５−ＦＯＡ抵抗性であるＥ株の突然変異細胞を同定して、ＥＵ（Ｕｒａ-）株を作り出した。具体的にはループ１つ分のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Ｅ株細胞を３ｍＬのＹＰＤ培地に接種して、３０℃で２４時間２５０ｒｐｍ／分で振盪して生育させた。培養をＯＤ600０．４にＹＰＤで希釈して、次にさらに４時間インキュベートした。培養をＦＯＡ選択プレート上に播種（１００μＬ／プレート）して、３０℃に２〜３日間保った。全部で１６個のＦＯＡ抵抗性コロニーを拾って、ＭＭおよびＦＯＡ選択プレート上に画線培養した。これらから１０個のコロニーがＦＯＡ選択プレート上で生育したが、ＭＭプレートでは生育せず、可能なＵｒａ-株として選択された。
【０３１０】
これらの株の１つをキメラＧＰＤ：：フザリウム・モニリフォルメ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｍｏｎｉｌｉｆｏｒｍｅ）Δ１５：：ＸＰＲ２遺伝子、および選択マーカーとしてＵｒａ３遺伝子を含んでなるｐＹ３７／Ｆ１５での形質転換のための宿主として使用した（図６Ｄ、配列番号１２８）。ＭＭプレート上での３日間の選択後、数百のコロニーがプレート上に生育し、プラスミドを持たない形質転換対照コロニーの生育はなかった。この５−ＦＯＡ抵抗性株を「ＥＵ」株と命名した。
【０３１１】
次にＥＵ株の単一コロニーを０．１ｇ／Ｌのウリジンをさらに含有する液体ＭＭＵに接種して、３０℃で２日間２５０ｒｐｍ／分で振盪して培養した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出して、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで分析した。ＧＣ分析は、ＥＵ株が全脂質の約１０％のＥＰＡを生成したことを示した。
【０３１２】
１４％のＥＰＡを生成するＭ２６株の構築
コンストラクトｐＺＫＯ２ＵＭ２６Ｅ（図６Ｅ、配列番号１２９）を使用して、（エロンガーゼ、Δ６デサチュラーゼ、およびΔ１２デサチュラーゼを含んでなる）３つのキメラ遺伝子およびＵｒａ３遺伝子のクラスターをＥＵ株のヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子部位に組み入れた。プラスミドｐＫＯ２ＵＭ２６Ｅは、次の構成要素を含有した。
【０３１３】
【表１５】
2008524984.tif 000017
【０３１４】
プラスミドｐＫＯ２ＵＭ２６ＥをＳｐｈＩ／ＡｓｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＥＵ株を形質転換した。形質転換に続いて細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。
【０３１５】
ＭＭプレート上に生育した全部で４８個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に再度画線培養した。ひとたび生育すると、これらの株を３０℃の液体ＭＭに個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で１日間振盪して生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出して、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで分析した。
【０３１６】
ＧＣ分析は、ＭＭ培地中での１日間の生育後に、ｐＫＯ２ＵＭ２６Ｅによるほとんど全ての形質転換体においてＥＰＡが生成されたことを示した。４８個の選択された形質転換体の内、５株は組み換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の全脂質の４％未満のＥＰＡを生成し、２３株は４〜５．９％のＥＰＡを生成し、９株は６〜６．９％のＥＰＡを生成し、１１株は７〜８．２％のＥＰＡを生成した。８．２％のＥＰＡを生成する株を二段階生育手順（すなわち４８時間のＭＭ＋ＨＧＭ中で９６時間）を使用して、さらなる分析のために選択した。ＧＣ分析は、組み換え株が全脂質の約１４％のＥＰＡを生成したことを示した。株を「Ｍ２６」株と命名した。野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に関するＭ２６株の最終遺伝子型は、次のとおり。Ｐｏｘ３-、Ｙ．Δ１２-、ＦＢＡ：：Ｆ．Δ１２：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮ：：ＭΔ１２：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：Δ６Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：Δ６Ｂ：：Ｐｅｘ２０、ＦＢＡＩＮ：：Ｅ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０；ＧＰＡＴ：：Ｅ１Ｓ：：Ｘｐｒ、ＴＥＦ：：Ｅ２Ｓ：：Ｘｐｒ；ＦＢＡＩＮ：：ＭＡΔ５：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：ＭＡΔ５：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：Δ１７Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ１６、およびＴＥＦ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ２０。
【０３１７】
ＥＰＡを生成するＭＵ株の構築
ＭＵ株はＭ２６株のＵｒａ栄養要求株であった。この株はＰａｃＩおよびＨｉｎｃＩＩで消化された５μｇのプラスミドｐＺＫＵＭ（図７Ａ、配列番号１３７）で、Ｍ２６株を形質転換して作られた。形質転換は、カリフォルニア州オレンジのザイモリサーチ社（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｏｒａｎｇｅ，ＣＡ））からの凍結ＥＺ酵母形質転換キットを使用して実施され、形質転換体は、１００μＬの形質転換細胞ミクスを次の培地を含む寒天プレート上に播種して選択された。ミシガン州デトロイトのディフコ・ラボラトリーズ（ＤＩＦＣＯ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ））からの６．７ｇ／Ｌの酵母窒素ベース、２０ｇ／Ｌのデキストロース、５０ｍｇ／Ｌのウラシル、および８００ｍｇ／ＬのＦＯＡ。７日後、小型コロニーが出現し、それをＭＭおよびＭＭＵ寒天プレート上に播種した。全てＵｒａ栄養要求株であった。株の１つを「ＭＵ」と命名した。
【０３１８】
約１５％のＥＰＡを生成するＹ２０６７株の構築
プラスミドｐＫＯ２ＵＦ２ＰＥ（図７Ｂ、配列番号１３８）を作り出して、（異種のΔ１２デサチュラーゼおよびエロンガーゼを含んでなる）２つのキメラ遺伝子およびＵｒａ３遺伝子を含有するクラスターをＥＵ株（前出）の天然ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）Δ１２デサチュラーゼ遺伝子に組み入れた。プラスミドｐＫＯ２ＵＦ２ＰＥは、次の構成要素を含有した。
【０３１９】
【表１６】
2008524984.tif 000018
【０３２０】
プラスミドｐＫＯ２ＵＦ２ＰＥをＡｓｃＩ／ＳｐｈＩで消化し、次に一般方法に従って使用してＥＵ株を形質転換した（ただしＥＵ株は形質転換緩衝液への懸濁に先だってＹＰＤプレート上に画線培養して［１８時間に対して］およそ３６時間生育させた）。形質転換に続いて細胞をＭＭプレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。ＭＭプレート上で生育した全部で７２個の形質転換体を拾って、新鮮なＭＭプレート上に個別に再度画線培養した。ひとたび生育すると、これらの株を３０℃の液体ＭＭに個別に接種して、２５０ｒｐｍ／分で２日間振盪した。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出して、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで分析した。
【０３２１】
ＧＣ分析は、ｐＫＯ２ＵＦ２ＰＥによるほとんど全ての形質転換体においてＥＰＡの存在を示した。より具体的には７２個の選択された形質転換体の内、１７株は組み換えヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）中の全脂質の８〜９．９％のＥＰＡを生成し、２７株は１０〜１０．９％のＥＰＡを生成し、１６株は１１〜１１．９％のＥＰＡを生成し、７株は１２〜１２．７％のＥＰＡを生成した。１２．７％のＥＰＡを生成する株を二段階生育条件を使用してさらに分析した。ＧＣ分析は、組み換え株が二段階生育後、全脂質の約１５％のＥＰＡを生成したことを示した。株を「Ｙ２０６７」株と命名した。
【０３２２】
Ｕｒａ-表現型による約１４％のＥＰＡを生成するＹ２０６７Ｕ株の構築
Ｙ２０６７株中のＵｒａ３遺伝子を中断するために、コンストラクトｐＺＫＵＴ１６（図７Ｃ、配列番号１３９）を作り出して、ＴＥＦ：：ｒＥＬＯ２Ｓ：：Ｐｅｘ２０キメラ遺伝子をＹ２０６７株のＵｒａ３遺伝子に組み入れた。ｒＥＬＯ２Ｓは、１６：０を１８：０に延長するラット肝酵素をコードする、コドン最適化ｒＥＬＯ遺伝子である。プラスミドｐＺＫＵＴ１６は、次の構成要素を含有した。
【０３２３】
【表１７】
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【０３２４】
プラスミドｐＺＫＵＴ１６をＳａｌＩ／ＰａｃＩで消化し、次に一般方法に従って使用して、Ｙ２０６７株を形質転換した。形質転換に続いて、細胞をＦＯＡ選択プレート上に播種して、３０℃に２〜３日間保った。
【０３２５】
ＦＯＡプレート上に生育した全部で２４個の形質転換体を拾って、ＭＭプレートおよびＦＯＡプレート上に別個に再度画線培養した。ＦＯＡ選択プレート上で生育できるが、ＭＭプレートでは生育できない株をＵｒａ-株として選択した。全部で１０個のＵｒａ-株を個別に３０℃の液体ＭＭＵに接種して、２５０ｒｐｍ／分で１日間振盪して生育させた。細胞を遠心分離によって収集し、脂質を抽出して、エステル交換によって脂肪酸メチルエステルを調製し、引き続いてヒューレットパッカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）６８９０  ＧＣで分析した。
【０３２６】
ＧＣ分析は、ＭＭＵ培地中での１日間の生育後にｐＺＫＵＴ１６による全ての形質転換体中に５〜７％のＥＰＡの存在を示した。６．２％のＥＰＡを生成する株を二段階生育条件（４８時間ＭＭ＋ＨＧＭ中で９６時間）を使用して、さらに分析した。ＧＣ分析は、組み換え株が全脂質の約１４％のＥＰＡを生成することを示した。株を「Ｙ２０６７Ｕ」株と命名した。野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２に関するこの株の最終遺伝子型は次のとおり。Ｕｒａ３-、Ｐｏｘ３-、Ｙ．Δ１２-、ＦＢＡ：：Ｆ．Δ１２：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：Ｆ．Δ１２：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：Δ６Ｓ：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：Ｅ１Ｓ：：Ｐｅｘ２０；ＧＰＡＴ：：Ｅ１Ｓ：：Ｏｃｔ、ＴＥＦ：：Ｅ２Ｓ：：Ｘｐｒ；ＦＢＡＩＮ：：ＭＡΔ５：：Ｐｅｘ２０、ＴＥＦ：：ＭＡΔ５：：Ｌｉｐ１、ＦＢＡＩＮ：：Δ１７Ｓ：：Ｌｉｐ２、ＦＢＡＩＮｍ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ１６、ＴＥＦ：：Δ１７Ｓ：：Ｐｅｘ２０、およびＴＥＦ：：ｒＥＬＯ２Ｓ：：Ｐｅｘ２０。
【０３２７】
実施例１１
ＥＰＡ生合成のために組み換えた突然変異および野生型ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）  ＭＵ株のＴＡＧ含量の測定
本実施例は、ＭＵ株（ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃２０３６２の組み換え株、１０％を超えるＥＰＡを生成できる）の様々なアシルトランスフェラーゼノックアウト株中のＴＡＧ含量および脂肪酸組成について述べる。より具体的にはＭＵ株において、ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、およびＤＧＡＴ１中の単一中断、ＰＤＡＴおよびＤＧＡＴ２中の二重中断が作り出された。４つの異なる生育条件での生育に続いて、これらの各株中で脂質含量および組成物を比較する。
【０３２８】
より具体的には（ＤＧＡＴ１中断の選択がＵＲＡ３遺伝子に依存したこと以外は）実施例２、３、および７で述べられる方法を使用して、ＭＵ株（前出、実施例１０）において、ＰＤＡＴ、ＤＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１中の単一中断を作り出した。これは「ＭＵ−Ｄ１」（ＤＧＡＴ１中断）、「ＭＵ−Ｄ２」（ＤＧＡＴ２中断）、および「ＭＵ−Ｐ」（ＰＤＡＴ中断）として同定された単一ノックアウト株をもたらした。個々のノックアウト株は、ＰＣＲによって確認された。さらにＭＵ−Ｄ２株をＰＤＡＴ遺伝子について中断し、中断をＰＣＲによって確認した。得られた二重ノックアウト株を「ＭＵ−Ｄ２−Ｐ」と命名した。
【０３２９】
下で述べるように、ＭＵ−Ｄ１、ＭＵ−Ｄ２、ＭＵ−Ｐ、およびＭ−Ｄ２−Ｐノックアウト株を分析して、脂質含量および組成物に対する各ノックアウトの効果を判定した。さらに油脂生成を促進する生育条件もまた考察して、全脂質含量に対するそれらの効果を判定した。したがって「実験Ａ」、「実験Ｂ」、「実験Ｃ」、および「実験Ｅ」と同定される全部で４つの異なる実験を行った。具体的には上の各株を含有するプレートからループ３つ分の細胞をＭＭＵ［実験ＢおよびＣでは３ｍＬ、実験ＡおよびＥでは５０ｍＬ］に接種して、３０℃で２４時間（実験Ａ、Ｂ、およびＣ）または４８時間（実験Ｅ）振盪して生育させた。細胞を採取してＨＧＭ中で１回洗浄し、ＨＧＭ（実験ＡおよびＥでは５０ｍＬ、実験Ｂでは３ｍＬ）またはウラシル添加ＨＧＭ（「ＨＧＭＵ」）（実験Ｃでは３ｍＬ）のいずれかに再懸濁し、上記のように４日間培養した。一般方法で述べられるように、１アリコート（１ｍＬ）をＧＣによる脂質分析のために使用する一方、第２のアリコートを６００ｎｍで培養ＯＤを測定するために使用した。実験ＡおよびＥの残る培養物を採取して水で１回洗浄し、乾燥細胞重量（ｄｃｗ）測定のために凍結乾燥した。対照的に実験ＢおよびＣのｄｃｗは、それらの関係を示す式を使用してそれらのＯＤ600から判定された。実験Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＥの異なる各株の脂肪酸組成もまた判定した。
【０３３０】
結果を下の表１６に示す。培養物は、「ＭＵ」株（親ＥＰＡ生成株）、「ＭＵ−Ｐ」（ＰＤＡＴノックアウト）、「ＭＵ−Ｄ１」（ＤＧＡＴ１ノックアウト）、「ＭＵ−Ｄ２」（ＤＧＡＴ２ノックアウト）、および「ＭＵ−Ｄ２−Ｐ」（ＤＧＡＴ２およびＰＤＡＴノックアウト）として表現される。使用した略語は次のとおり。「ＷＴ」＝野生型（すなわちＭＵ）、「ＯＤ」＝光学濃度、「ｄｃｗ」＝乾燥細胞重量、「ＴＦＡ」＝全脂肪酸、および「ＴＦＡ％ｄｃｗ、重量％」＝野生型（「ＭＵ」）株と比較したＴＦＡ％ｄｃｗ。脂肪酸は１６：０、１６：１、１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定される。各組成は全脂肪酸の％として表される。  
【０３３１】
【表１８】
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【０３３２】
データは形質転換された細胞内の脂質含量が、生育条件次第で変動することを示した。さらに脂質含量に対する各アシルトランスフェラーゼの貢献もまた、変動した。具体的には実験Ｂ、Ｃ、およびＥでは、ＤＧＡＴ２が、ＰＤＡＴまたはＤＧＡＴ１のどちらよりも油生合成により大きく貢献した。対照的に実験Ａで実証されたように、ＤＧＡＴ２、ＤＧＡＴ１、およびＰＤＡＴ中の単一ノックアウトは、脂質含量にほぼ同等の損失をもたらした（すなわちそれぞれ４８％、４９％、および４２％の損失［「ＴＦＡ％ｄｃｗ、重量％」を参照されたい］）。
【０３３３】
実施例１２
ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）プロモーターの制御下にあるヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１の配列決定およびＯＲＦ発現
本実施例は、ＹｌＤＧＡＴ１の配列決定、および野生型ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）株中のヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＴＥＦプロモーター、ＹｌＤＧＡＴ１、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ペルオキシン（Ｐｅｘ２０）ターミネーター（すなわちＴＥＦ：：ＹｌＤＧＡＴ１：：Ｐｅｘ２０遺伝子）を含んでなるキメラ遺伝子の過剰発現について述べる。
【０３３４】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１の配列決定
最初に、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＡＴＣＣ＃９０８１２の縮重プライマーＰ２０１およびＰ２０３（配列番号９２および９３）、およびテンプレートとしてゲノムＤＮＡ（実施例２から）を使用して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１のＯＲＦをＰＣＲ増幅した。一般方法で述べられるようにして、インディアナ州インディアナポリスのロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ））からのエキスパンド・ハイ・フィディリティ（Ｅｘｐａｎｄ  Ｈｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ）ＰＣＲシステムを使用してＰＣＲを実施した。
【０３３５】
予期された１．６ｋＢの断片を標準アガロースゲル電気泳動法によって単離して精製し、カリフォルニア州カールズバッドのインビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ））からのｐＣＲ４−ＴＯＰＯベクター中にクローンしてプラスミドｐＹＡＰ４２−２３を得た。プラスミドｐＹＡＰ４２−２３を大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ２に形質転換し、プラスミドミニプレップ分析およびＮｏｔＩまたはＮｃｏＩのいずれかでの制限酵素消化によって、ｐＹＡＰ４２−２３を含んでなる形質転換体を確認した。配列決定プライマーＴ７、Ｔ３、Ｐ２３９（配列番号１４２）、およびＰ２４０（配列番号１４３）を使用して、一般方法で述べられる方法に従って、プラスミドｐＹＡＰ４２−２３中のＤＮＡインサートを配列決定して、ＹｌＤＧＡＴ１  ＯＲＦの完全なヌクレオチド配列を得た。
【０３３６】
ＹｌＤＧＡＴ１  ＯＲＦのヌクレオチド配列は、配列番号１３として提供され、翻訳生成物は、配列番号１４で提供されるアミノ酸配列を有する。得られた配列をＢＬＡＳＴ（（「基礎的局在性配列探索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら著、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））に基づいて、その他の知られているタンパク質と比較した。特に配列番号１３は、縮重ＰＣＲプライマー領域における６つのサイレント突然変異の存在以外は、実施例７で得られたＹｌＤＧＡＴ１の部分的配列と同一であった。これらの突然変異には、位置６におけるＡからＧへの突然変異、位置２１におけるＡからＧへの突然変異、位置２４におけるＡからＧへの突然変異、位置１５４８におけるＴからＣへの突然変異、位置１５５２におけるＣからＴへの突然変異、および位置１５５７におけるＴからＣへの突然変異が含まれた。これらの突然変異は縮重ＰＣＲプライマーの使用から帰結するので、配列番号１３の推定アミノ酸配列、すなわち配列番号１４は、ＯＲＦ  ＹＡＬＩ−ＣＤＳ２１４１．１（配列番号１２、ジェンバンク登録番号ＮＣ＿００６０７２に対応する、遺伝子座＿ｔａｇ＝「ＹＡＬＩ０Ｆ０６５７８ｇ」）と同一である。
【０３３７】
ＡＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１キメラ遺伝子の構築
プラスミドｐＹＡＰ２３−４２をＮｃｏＩおよびＮｏｔ  Ｉで１時間消化して、ＹｌＤＧＡＴ１を含有する１．６ｋＢの断片を単離し、ＯＲＦがＴＥＦプロモーターの制御下でクローンされ、組み込みベクター中のＰＥＸ２０−３’ターミネーター領域がヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＰＯＸ２遺伝子中に標的を定めるように、ＮｃｏＩ−およびＮｏｔ  Ｉ消化ｐＺＰ２ｌ７＋Ｕｒａ（配列番号１４４、図７ＤＡ）にインサートした。ミニプレップ分析によって正しい形質転換体を確認し、得られたプラスミドを「ｐＹＤＡ１」と命名した。
【０３３８】
一般方法に従って、プラスミドｐＺＰ２ｌ７＋ＵｒａおよびｐＹＤＡ１をＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）（前出、実施例１１）の「ＭＵ−Ｄ２」株中に形質転換した。形質転換体をＭＭ上に播種し、単一コロニーを拾って精製し分析して、過剰発現されたＤＧＡＴ１の脂質含量に対する効果を判定した。具体的には次の培養中で脂質含量を分析した。「ＭＵ」（「野生型」）、ｐＺＰ２ｌ７＋Ｕｒａで形質転換されたＭＵ−Ｄ２、およびｐＹＤＡ１（クローン＃５、６、７および１６）で形質転換されたＭＵ−Ｄ２。上記の各株からの数ループ分の細胞を５０ｍＬのＭＭに接種し、振盪機内で３０℃で４８時間生育させた。細胞を採取してＨＧＭ中で１回洗浄し、３０ｍＬのＨＧＭ培地に再懸濁して、さらに４日間上記のように生育させた。生育後、各培養からの１００μＬのアリコートを使用して、６００ｎｍでの吸光度（ＯＤ600）を測定し、１ｍＬのアリコートをＧＣ分析のために使用した。このために１ｍＬのサンプルを採取して、水で１回洗浄し遠沈してペレット化し、塩基法による直接エステル交換反応に続く脂質測定およびＧＣ分析に使用した（一般方法で述べられるように）。残る培養物を採取して水で１回洗浄し、凍結乾燥して乾燥細胞重量を得た。
【０３３９】
結果を下の表に示す。培養は「ＭＵ」株（「野生型」）および「ＭＵ−Ｄ２」（ＤＧＡＴ２ノックアウト）として述べられる。使用した略語は次のとおり。「ＷＴ」＝野生型（すなわちＤＧＡＴ２ノックアウトを有するＭＵ−Ｄ２株）、「ＯＤ」＝光学濃度、「ｄｃｗ」＝乾燥細胞重量、「ＴＦＡ」＝全脂肪酸、および「ＴＦＡｓ％ｄｃｗ、重量％」＝野生型（「ＭＵ−Ｄ２」）株と比較したＴＦＡｓ％ｄｃｗ。
【０３４０】
【表１９】
2008524984.tif 000021
【０３４１】
一般に結果は、ＭＵ−Ｄ２株においてＤＧＡＴ１の過剰発現がＤＧＡＴ２活性の欠如を補償でき、ＭＵ株とほぼ等しいまたはそれを超える脂質含量をもたらすことを示した（すなわちＭＵ−Ｄ２＋ｐＹＤＡ１クローン＃５、６、および１６は、ＭＵ株とほぼ等しいまたはそれを超える（ＴＦＡｓ％ｄｃｗとして測定される）脂質含量を有する）。ＭＵ−Ｄ２＋ｐＹＤＡ１、クローン＃５、６、および１６中のこの脂質含量は、対照株ＭＵ−Ｄ２＋ｐＺＰ２ｌ７＋Ｕｒａの２倍を超えた。これらの結果は、ヤロウィア（Ｙａｒｒｏｗｉａ）ＤＧＡＴ１が、油生合成に関与する機能性ＤＡＧ  ＡＴをコードすることのさらなる裏付けをを提供した。
【０３４２】
形質転換体ＭＵ−Ｄ２＋ｐＹＤＡ１クローン＃７は、クローン＃５、６、および１６と比較して、脂質含量の増大を示さなかった。しかしこれらの染色体の組み込みは一般にランダムであるので、このようなバリエーションは予期された。
【０３４３】
実施例１３
クサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡライブラリーの構築および配列決定
本実施例は、クサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）のＤＮＡライブラリーの構築、および引き続くライブラリーの配列決定について述べる。
【０３４４】
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡの合成
カナダ国オンタリオ州ミシサーガのＢＤクロンテック（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ，ＯＮ，Ｃａｎａｄａ）からのクリエーター・スマートＣｒｅａｔｏｒ  Ｓｍａｒｔ（登録商標）ｃＤＮＡライブラリーキットを使用して、製造業者のプロトコルに従ってＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡを合成した。
【０３４５】
具体的にはＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＡＴＣＣ＃１６２６６株を６０ｍＬのＹＰＤ培地（２％バクトイースト抽出物、３％バクトペプトン、２％グルコース）中で３日間２３℃で生育させた。ベックマン（Ｂｅｃｋｍａｎ）ＧＨ３．８ローター内での３７５０ｒｐｍで１０分間の遠心分離によって細胞をペレット化し、インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの６×０．６ｍＬのトリゾール試薬中に再懸濁した。再懸濁した細胞をそれぞれ０．６ｍＬの０．５ｍｍガラスビーズを含有する６本の２ｍＬネジ蓋管に移した。オクラホマ州バートルズビルのバイオスペック（Ｂｉｏｓｐｅｃ（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ））からのミニビーズビーターの均質化設定において、細胞を２分間均質化した。管を短時間遠沈して、ビーズを沈下させた。液体を４本の新鮮な１．５ｍＬ微量遠心管に移して、各管に０．２ｍＬのクロロホルム／イソアミルアルコール（２４：１）を添加した。管を手で１分間振盪し、３分間静置した。次に管を４℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間遠沈した。上層を４本の新しい管に移した。各管にイソプロピルアルコール（０．５ｍＬ）を添加した。管を室温で１５分インキュベートし、続いて４℃において１４，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。ペレットをＲＮＡ分解酵素を含まない水で作った７５％エタノール各１ｍＬで洗浄し風乾した。次に全ＲＮＡサンプルを５００μＬの水に再溶解し１：５０希釈ＲＮＡサンプルを使用して、Ａ２６０ｎｍでＲＮＡ量を測定した。全部で３．１４ｍｇのＲＮＡが得られた。
【０３４６】
この全ＲＮＡサンプルをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＲＮｅａｓｙ全ＲＮＡ  Ｍｉｄｉキットで、製造業者のプロトコルに従ってさらに精製した。このようにして全ＲＮＡサンプルを２ｍＬに希釈して、８０μＬのβ−メルカプトエタノールおよび５．６ｍＬの１００％エタノールを添加した８ｍＬのＲＬＴ緩衝液と混合した。サンプルを４つの部分に分割し、４本のＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｄｉｄカラムに装入した。次にカラムを５分間４５００×ｇで遠心分離した。カラムを洗浄するために２ｍＬのＲＰＥ緩衝液を装入し、カラムを２分間４５００×ｇで遠心分離した。洗浄ステップを１回繰り返したが、遠心分離時間は５分間に延長した。各カラムに２５０μＬのＲＮＡ分解酵素を含まない水を適用して全ＲＮＡを溶出し、１分間待って４５００×ｇで３分間遠心処理した。
【０３４７】
次にファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）のキットプロトコルに従って、上の全ＲＮＡサンプルからＰｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡを単離した。簡単に述べると、２オリゴ−ｄＴ−セルロースカラムを使用した。カラムを各１ｍＬの高塩濃度緩衝液で２回洗浄した。前段階からの全ＲＮＡサンプルを２ｍＬの全容積に希釈して、１０ｍＭトリス／ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｍＭ  ＥＤＴＡに調節した。サンプルを６５℃で５分間加熱し、次に氷上にのせた。サンプル緩衝液（０．４ｍＬ）を添加して、次にサンプルを重力供給法下で２本のオリゴ−ｄＴ−セルロースカラムに装入した。カラムを３５０×ｇで２分間遠心分離し、各０．２５ｍＬの高塩濃度緩衝液で２回洗浄し、毎回それに３５０×ｇで２分間の遠心分離が続いた。カラムを低塩濃度緩衝液でさらに３回洗浄し、同一の遠心分離ルーチンが続いた。カラムを６５℃に予熱された溶出緩衝液各０．２５ｍＬで４回洗浄して、Ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを溶出し、同一の遠心分離手順が続いた精製プロセス全体を１回繰り返した。精製ｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡを濃度３０．４ｎｇ／μＬで得た。
【０３４８】
ＢＤクロンテック（ＢＤ−Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によって規定されるＬＤ−ＰＣＲ法、および０．１μｇのｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡサンプルを使用して、ｃＤＮＡを発生させた。具体的には第１ストランドｃＤＮＡ合成のために、３μＬのｐｏｌｙ（Ａ）＋ＲＮＡサンプルと、１μＬのＳＭＡＲＴ  ＩＶオリゴヌクレオチド（配列番号１４５）および１μＬのＣＤＳＩＩＩ／３’ＰＣＲプライマー（配列番号１４６）とを混合した。混合物を７２℃に２分間加熱して、氷上で２分間冷却した。２μＬの第１ストランド緩衝液、１μＬの２０ｍＭ  ＤＴＴ、１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミクス、および１μＬのパワースクリプト（Ｐｏｗｅｒｓｃｒｉｐｔ）逆転写酵素を管に添加した。混合物を４２℃で１時間インキュベートし、氷上で冷却した。
【０３４９】
第１ストランドｃＤＮＡ合成混合物をＰＣＲ反応のためのテンプレートとして使用した。具体的には反応混合物は、次を含有した。２μＬの第１ストランドｃＤＮＡ混合物、２μＬの５’−ＰＣＲプライマー（配列番号１４７）、２μＬのＣＤＳＩＩＩ／３’−ＰＣＲプライマー（配列番号１４６）、８０μＬの水、１０μＬの１０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２ＰＣＲ緩衝液、２μＬの５０×ｄＮＴＰミクス、および２μＬの５０×アドバンテージ（Ａｄｖａｎｔａｇｅ）２ポリメラーゼミクス。サーモサイクラー条件を９５℃で２０秒間に設定し、ＧｅｎＡｍｐ９６００装置上において９５℃で５秒間および６８℃で６分間を１４サイクルがそれに続いた。ＰＣＲ生成物をアガロースゲル電気泳動法および臭化エチジウム染色によって定量した。
【０３５０】
７５μＬの上のＰＣＲ生成物（ｃＤＮＡ）と、キットで提供される３μＬの２０μｇ／μＬタンパク質分解酵素Ｋとを混合した。混合物を４５℃で２０分間インキュベートし、次に７５μＬの水を添加して、混合物を１５０μＬのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール混合物（２５：２４：１）で抽出した。水相を１５０μＬのクロロホルム：イソアミルアルコール（２５：１）でさらに抽出した。次に水相を１５μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム、２μＬの２０μｇ／μＬのグリコーゲン、および４００μＬの１００％エタノールと混合した。混合物を即座に微量遠心管中で、室温において１４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。ペレットを１５０μＬの８０％エタノールで１回洗浄し、風乾させて７９μＬの水に溶解した。
【０３５１】
溶解したｃＤＮＡを引き続いてＳｆｉＩで消化した（７９μＬのｃＤＮＡと、１０μＬの１０×ＳｆｉＩ緩衝液、１０μＬのＳｆｉＩ酵素、および１μＬの１００×ＢＳＡとを混合し、混合物を５０℃で２時間インキュベートした）。キシレンシアノール染料（２μＬの１％）を添加した。次に製造業者の手順に正確に従って、混合物をキットで提供されるクロマスピン（Ｃｈｒｏｍａ  Ｓｐｉｎ）４００カラム上で画分した。画分をカラムから収集し、アガロースゲル電気泳動法で分析した。ｃＤＮＡを含有する第１の３つの画分をプールして、ｃＤＮＡをエタノールで沈殿した。沈殿したｃＤＮＡを７μＬの水に再溶解して、キットで提供されるｐＤＮＲ−ＬＩＢにライゲートした。
【０３５２】
ライブラリー配列決定
ライゲーション生成物を使用して、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）からの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＸＬ−１ブルー電気穿孔コンピテント細胞を形質転換した。推定総数２×１０6個のコロニーが得られた。マサチューセッツ州ベバリーのアージンコート・バイオサイエンス社（Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ））によってＭ１３順方向プライマー（配列番号１４８）を使用して、ｃＤＮＡライブラリーの配列決定が実施された。
【０３５３】
実施例１４
クサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ（ＤＧＡＴ１）遺伝子の同定およびクローニング
本実施例は、９，９８４個のｃＤＮＡ配列の１つの内の推定上のＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１の同定について述べる。具体的にはＢＬＡＳＴ（（「基礎的局在性配列探索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）」アルトシュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ），Ｓ．Ｆ．ら著、「Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．」２１５：４０３〜４１０頁（１９９３年））を使用して、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１タンパク質配列（実施例７、配列番号１４）をＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡの各配列に対するクエリー配列として使用した。１つのｃＤＮＡ断片はＹ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１との顕著な相同性を有したので、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１（配列番号１７５）として暫定的に同定された。引き続く公的に入手できる配列データベースに対するクエリーとして配列番号１７５を用いたＢＬＡＳＴ分析は、ｃＤＮＡといくつかのその他の種からのＤＧＡＴ１との顕著な類似度を確認した。次にｃＤＮＡ末端迅速増幅（ＲＡＣＥ）技術およびゲノム歩行を使用して、そのクサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）コード配列全体を単離した。
【０３５４】
ゲノムＤＮＡの単離
キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）からのキアプレップ（ＱｉａＰｒｅｐ）スピンミニプレップキット（カタログ番号６２７１０６）を使用してクサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）（ＡＴＣＣ＃１６２６６）からゲノムＤＮＡを単離した。ＹＰＤ寒天プレート上に生育した細胞をこすり取り１．２ｍＬのキット緩衝液Ｐ１に再懸濁した。再懸濁した細胞をそれぞれ０．６ｍＬのガラスビーズ（０．５ｍｍ径）を含有する２本の２．０ｍＬネジ蓋管に入れた。オクラホマ州バートルズビルのバイオスペック（Ｂｉｏｓｐｅｃ（Ｂａｒｔｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＯＫ））からのミニビーズビーターの均質化設定において、細胞を２分間均質化した。次に管をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）微量遠心管内で１４，０００ｒｐｍで２分間遠心分離した。上清（０．７５ｍＬ）を３本の１．５ｍＬ微量遠心管に移した。各管に等容積のキット緩衝液Ｐ２を添加した。管を反転して３回混合した後、０．３５ｍＬの緩衝液Ｎ３を各管に添加した。管を５回反転させて内容物を再度混合した。混合物をエッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）微量遠心管中で１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。各管からの上清を別々のキットスピンカラムに移した。カラムを１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、緩衝液ＰＥで１回洗浄し、再度１４，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、続いて１４，０００ｒｐｍで１分間、最終遠心分離した。各カラムに緩衝液ＥＢ（５０μＬ）を添加して、１分間静置した。次にゲノムＤＮＡを１４，０００ｒｐｍで１分間の遠心分離によって溶出した。
【０３５５】
推定上のＤＧＡＴ１遺伝子の５’末端領域のクローニング
カリフォルニア州パロアルトのクロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ））からのユニバーサル・ゲノム歩行TMキットを利用して、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１の５’末端領域に対応する１辺のゲノムＤＮＡを得た。クローニングで使用するために、入手できる部分的ＤＧＡＴ１遺伝子配列（配列番号１４９）に基づいて、プライマーＭＡＲＥ２−Ｎ１およびＭＡＲＥ２−Ｎ２（配列番号１５０および１５１）を合成した。
【０３５６】
簡単に述べると、各２．５μｇのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ゲノムＤＮＡをＤｒａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＰｖｕＩＩまたはＳｔｕＩで個別に消化し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットを使用して、消化ＤＮＡサンプルを精製して各３０μＬのキット緩衝液ＥＢで溶出し、次に精製サンプルを下に示すようなゲノム歩行アダプター（配列番号１５２［上のストランド］および１５３［下のストランド］）にライゲートした。
【化１】
2008524984.tif 000022
【０３５７】
具体的には各ライゲーション反応混合物は、１．９μＬの２５μＭゲノム歩行アダプター、１．６μＬの１０×ライゲーション緩衝液、０．５μＬのＴ４ＤＮＡリガーゼ、および４μＬの精製消化ゲノムＤＮＡサンプルの１つを含有した。反応混合物を１６℃で一晩インキュベートした。反応を７０℃で５分間のインキュベーションによって終結した。次に７２μＬの１０ｍＭトリスＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ７．４の緩衝液を各ライゲーション反応ミクスに添加した。
【０３５８】
次に各ライゲーション生成物をテンプレートとして使用して、４つのＰＣＲ反応を実施した。各ＰＣＲ反応混合物は、１μＬのライゲーション混合物、１μＬの２０μＭ  ＭＡＲＥ２−Ｎ１（配列番号１５０）、２μＬの１０μＭキットプライマーＡＰ１（配列番号１５４）、２１μＬの水、および日本国滋賀県大津市５２０−２１９３のタカラバイオ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）からの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクスＴａｑ  ２×ＰＣＲ溶液を含有した。ＰＣＲ増幅を次のように実施した。９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で９０秒間の延長を３０サイクル。７２℃で７分間の最終延長サイクルを実施し、続いて４℃での反応終結。
【０３５９】
次に１μＬの１：５０希釈した第１のＰＣＲ生成物をテンプレートとして使用し、１μＬの２０μＭ  ＭＡＲＥ２−Ｎ２（配列番号１５１）、２μＬの１０ｕＭキットプライマーＡＰ２（配列番号１５５）、２１μＬの水、およびタカラ（ＴａＫａＲａ）からの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクスＴａｑ  ２×ＰＣＲ溶液を使用して、第２のＰＣＲ反応を実施した。上述と同一の条件を使用して、ＰＣＲ反応を３０サイクル実施した。
【０３６０】
ＤｒａＩ消化されアダプターにライゲートされたゲノムＤＮＡをテンプレートとして使用すると、約１．６ｋｂのＰＣＲ生成物が観察された。この断片をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）ＰＣＲ精製キットを使用して精製し、ｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯにライゲートして配列決定した。配列（配列番号１５６）の分析は、このＤＮＡ断片がＤＧＡＴ１  ｃＤＮＡ断片の５’末端延長であることを示した。
【０３６１】
推定上のＤＧＡＴ１遺伝子の３’末端領域のクローニング
ＲＡＣＥによる推定上のＤＧＡＴ１遺伝子の３’末端領域をクローニングするために、プライマーＡＲＥ−Ｎ３−１およびＡＲＥ−Ｎ３−２（それぞれ配列番号１５７および１５８）を合成した。
【０３６２】
インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）の３’末端ＲＡＣＥキットを使用し、製造業者のプロトコルに従って３’末端ＲＡＣＥを実施した。簡単に述べると、１１μＬの水中の９０ｎｇのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｐｏｌｙＡ（＋）ＲＮＡサンプルと１μＬの１０μＭアダプタープライマー（ＡＰ、配列番号１５９）溶液とを混合した。混合物を７０℃で１０分間加熱して、氷上で２分間冷却した。次に各２μＬの１０×ＰＣＲ緩衝液、２５ｍＭのＭｇＣｌ2、および０．１ＭのＤＴＴ、および１μＬの１０ｍＭ  ｄＮＴＰミクスを添加した。反応混合物を４２℃で３分間加熱し、次にキットで提供されるスーパースクリプト（Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ）ＩＩ逆転写酵素（１μＬ）を添加した。反応を４２℃で５０分間進行させた。その後反応混合物を７０℃で１５分間加熱して、氷上で２分間冷却した。キットからのＲＮＡ分解酵素Ｈ（１μＬ）を添加して、全混合物を３７℃で２０分間インキュベートした。
【０３６３】
反応混合物（２μＬ）をＰＣＲテンプレートとして直接使用した。ＰＣＲ反応混合物は、１μＬの２０μＭ  ＡＲＥ−Ｎ３−１（配列番号１５７）、２μＬの１０ｕＭキットプライマーＵＡＰ（配列番号１６０）、タカラ（ＴａＫａＲａ）からの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクスＴａｑ  ２×ＰＣＲ溶液、および２０μＬの水を含有した。ＰＣＲ増幅を上で既述したように実施した。次にプライマーＡＲＥＮ３−１をプライマーＡＲＥ−Ｎ３−２（配列番号１５８）で置き換えたこと以外は同一条件を使用して、希釈ＰＣＲ反応混合物（１μＬの１：１０希釈）を２回目のＰＣＲのためにテンプレートとして使用した。
【０３６４】
約３００ｂｐの断片がＰＣＲから得られた。キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のキアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットでの精製後、断片をｐＣＲ２．１−ＴＯＰＯ中にクローンして配列決定した。配列分析は、配列がｐｏｌｙＡ末端（配列番号１６１）を含むＤＧＡＴ１  ｃＤＮＡの３’末端をコードすることを確認した。
【０３６５】
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）のＤＧＡＴ１をコードするヌクレオチド配列の完全なアセンブリー
５’領域（配列番号１５６）配列、オリジナルのｃＤＮＡ断片（配列番号１４９）、および３’領域（配列番号１６１）のアセンブリーからは、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１コード配列（配列番号１７）が生じた。５’領域ゲノムの配列は、イントロン（配列番号１７内のヌクレオチド塩基４４９〜８４５）を含んだ。
【０３６６】
実施例１５
多価不飽和脂肪酸を生じるように組み換えたクサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１Ｉｎヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株の発現
本実施例は、Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株におけるＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１（前出、実施例１０）の発現、および生成されるＥＰＡおよびその他のＰＵＦＡの最終濃度に対するＭＤＧＡＴ１発現の効果について述べる。
【０３６７】
Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１  ＯＲＦを次のようにしてクローンした。最初にｃＤＮＡのクローニングを助けるために、ＤＧＡＴ１の第２のコドン配列を「ＡＣＡ」から「ＧＣＡ」に変化させ、スレオニンからアラニンへのアミノ酸変化がもたらされた。これは、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１  ＯＲＦの完全なコード領域をプライマーＭＡＣＡＴ−Ｆ１およびＭＡＣＡＴ−Ｒ（それぞれ配列番号１６２および１６３）で増幅して達成された。具体的にはＰＣＲ反応混合物は、２０μＭのプライマーＭＡＣＡＴ−Ｆ１およびＭＡＣＡＴ−Ｒ溶液各１μＬ、１μＬのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ｃＤＮＡ（前出、実施例１３）、２２μＬの水、およびの日本国滋賀県大津市５２０−２１９３のタカラバイオ（ＴａＫａＲａ  Ｂｉｏ  Ｉｎｃ．）からの２５μＬのＥｘＴａｑプレミクスＴａｑ  ２×ＰＣＲ溶液を含有した。増幅を次のようにして実施した。９４℃で１５０秒間の初期変性、続いて９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、および７２℃で９０秒間の延長を３０サイクル。７２℃で１０分間の最終延長サイクルを実施し、続いて４℃での反応終結。約１６００ｂｐのＤＮＡ断片がＰＣＲ反応から得られた。これをキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）のＰＣＲ精製キットを使用して、製造業者のプロトコルに従って精製した。
【０３６８】
ＦＢＡＩＮプロモーター（配列番号１１１）およびＰＥＸ２０−３’ターミネーター領域の制御下でＯＲＦがクローンされるように、Ｍ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１  ＯＲＦをＮｃｏ  Ｉ−およびＮｏｔ  Ｉ−消化プラスミドｐＺＵＦ１７（配列番号１６４、図７Ｅ）に挿入した。しかしＤＧＡＴ１  ＯＲＦは内部ＮｃｏＩ部位を含有したので、クローニングのために２つの別々の制限酵素消化を実施することが必要であった。最初に約２μｇの精製ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＮｃｏ  Ｉで消化した。反応混合物は全容積６０μＬ中に、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの各２０Ｕの酵素、および６μＬの制限緩衝液Ｄを含有した。混合物を３７℃で２時間インキュベートした。約３２０ｂｐの断片をアガロースゲル電気泳動法によって分離し、キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キアエクス（Ｑｉａｅｘ）ＩＩゲル精製キットを使用して精製した。Ｎｃｏ  ＩをＮｏｔ  Ｉで置換したたこと以外は、上と同一の反応条件を使用して、別々に約２μｇの精製ＰＣＲ生成物をＢａｍＨＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化した。上記のように約１２８０ｂｐの断片が単離され、精製された。最後に約３μｇのｐＺＵＦ１７を上述のようにＮｃｏ  ＩおよびＮｏｔ  Ｉで消化し精製して、約７ｋＢの断片を生じさせた。
【０３６９】
約７ｋＢのＮｃｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  ＩｐＺＵＦ１７断片、約３２０ｂｐのＮｃｏ  Ｉ／ＢａｍＨＩＤＧＡＴ１断片、および約１２８０ｂｐのＢａｍＨＩ／Ｎｏｔ  ＩＤＧＡＴ１断片を三元ライゲーションで共にライゲートし、室温で一晩インキュベートした。ライゲーション混合物は全容積２０μＬ中に、７ｋＢの断片１００ｎｇおよび３２０ｂｐおよび１２８０ｂｐの断片各２００ｎｇ、２μＬのリガーゼ緩衝液、およびプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの２Ｕ  Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを含有した。ライゲーション生成物を使用して、製造業者のプロトコルに従ってインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０化学コンピテント細胞を形質転換した。
【０３７０】
ミニプレップ分析のために、形質転換からの個々のコロニー（総計１２個）を使用して培養を接種した。制限酵素地図および配列決定は、１２個のコロニー中５個が「ｐＭＤＧＡＴ１−１７」と命名された所望のプラスミドを持つことを示した（図４Ｃ、配列番号１６５）。
【０３７１】
「対照」ベクターｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１（配列番号１６８）を次のようにして調製した。最初にプライマーｐｚｕｆ−ｍｏｄ１（配列番号１６６）およびｐｚｕｆ−ｍｏｄ２（配列番号１６７）を使用し、カリフォルニア州パロアルトのクロンテック（ＣｌｏｎＴｅｃｈ（ＰａｌｏＡｌｔｏ，ＣＡ））からのｐＤＮＲ−ＬＩＢをテンプレートとして使用して、２５２ｂｐの「スタッファー」ＤＮＡ断片を増幅した。増幅された断片をキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットによって精製し、標準条件を使用してＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化して、次にキアクイック（ＱｉａＱｕｉｃｋ）ＰＣＲ精製キットによって再度精製した。この断片を同様に消化されたＮｃｏＩ−／ＮｏｔＩ−ｃｕｔ  ｐＺＵＦ１７ベクター（配列番号１６４、図１０Ｅ）にライゲートして、得られたライゲーション混合物を使用してインビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）Ｔｏｐ１０細胞を形質転換した。得られた４個のコロニーからキアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）キアプレップ（ＱｉａＰｒｅｐ）スピンミニプレップキットを使用して、プラスミドＤＮＡを精製した。精製プラスミドをＮｃｏＩおよびＮｏｔＩで消化して、約２５０ｂｐの断片の存在を確認した。得られたプラスミドを「ｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１」と命名した（図４Ｄ、配列番号１６８）。
【０３７２】
Ｙ．リポリティカ（ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）Ｙ２０６７Ｕ株（実施例１０、全脂質の１４％のＥＰＡを生成する）を一般方法に従ってそれぞれｐＭＤＧＡＴ１−１７およびｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１で形質転換した。形質転換体をアミノ酸強化した合成ＭＭ中で２日間生育させ、ＨＧＭ中での４日間がそれに続いた。（一般方法で述べられるような）ＧＣ分析に基づく、ｐＭＤＧＡＴ１−１７を含有する２つの形質転換体、およびｐＺＵＦ−ＭＯＤ−１を含有する２つの形質転換体の脂肪酸プロフィールを下の表１８に示す。脂肪酸は１８：０、１８：１（オレイン酸）、１８：２（ＬＡ）、ＧＬＡ、ＤＧＬＡ、ＡＲＡ、ＥＴＡ、およびＥＰＡとして同定され、各組成物は全脂肪酸の％で表される。
【０３７３】
【表２０】
2008524984.tif 000023
【０３７４】
上で実証されるように、プラスミドｐＭＤＧＡＴ１−１７からのＭ．アルピナ（ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１の発現は、ＥＰＡ濃度を「対照」株中での約１３．３％から、約１４．１％（「Ｙ２０６７Ｕ＋ｐＭＤＧＡＴ１−１７＃１」）および約１５．１％（「Ｙ２０６７Ｕ＋ｐＭＤＧＡＴ１−１７＃２」）にそれぞれ増大させる。
【０３７５】
実施例１６
ＤＧＡＴ１真菌相同体の同定
本実施例は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびクサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１配列（それぞれ配列番号１３および１７）を使用した、その他の真菌中のオルソロガスタンパク質の同定について述べる。
【０３７６】
ＢＬＡＳＴ「ｎｒ」データベース（全ての非冗長ジェンバンクＣＤＳ翻訳、３次元構造ブルックヘブンタンパク質データバンクに由来する配列、スイスＰＲＯＴタンパク質配列データベース、ＥＭＢＬおよびＤＤＢＪデータベースを含んでなる）に含まれる配列に対する類似性についてＢＬＡＳＴ探索を行って、オルソロガスＤＧＡＴ１真菌タンパク質を同定した。国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）によって提供されるＢＬＡＳＴＮアルゴリズムを使用して、「ｎｒ」データベースに含まれる公共的に入手できる全てのＤＮＡ配列との類似性について、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）およびクサレケカビ・アルピナ（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎａ）ＤＧＡＴ１配列（配列番号１３および１７）を分析した。ＤＮＡ配列を全ての読み枠で翻訳し、ＮＣＢＩによって提供されるＢＬＡＳＴＸアルゴリズム（ギッシュ（Ｇｉｓｈ），Ｗ．およびステーツ（Ｓｔａｔｅｓ），「Ｄ．Ｊ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」３：２６６〜２７２頁（１９９３年））を使用して、「ｎｒ」データベースに含まれる全ての公共的に入手できるタンパク質配列との類似性について比較した。これらの探索は、４個のオルソロガスタンパク質の同定をもたらした（下で表１９に示す）。表１９は、ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）ＤＧＡＴ１配列（配列番号１３）と、本願明細書で開示される各ＤＧＡＴ１タンパク質との配列比較結果を観察された「％同一性」に関してさらに示す（２個のタンパク質間で同一のアミノ酸の百分率として定義される）。
【０３７７】
【表２１】
2008524984.tif 000024
【０３７８】
実施例１７
普遍的および真菌ＤＧＡＴ１モチーフの同定
本実施例は、その他の既知のＤＧＡＴ１配列に関連して、本発明のＤＧＡＴ１配列を使用した真菌および普遍的ＤＧＡＴ１モチーフの同定について述べる。
【０３７９】
ＤＧＡＴ１タンパク質の徴候であるモチーフ（すなわち進化的に関連したタンパク質のアラインメント配列に沿って特異的位置で保存されるアミノ酸の組）を同定するために、ＤＧＡＴ１配列の配列アラインメントを生成することが最初に必要であった。このために、配列番号１４、１８、１９、２０、２１、および２２の真菌配列を使用した。さらに次の６個の非真菌源からのＤＧＡＴ１オルソログもまた、配列アラインメントに含めた。マウス（ＭｍＤＧＡＴ１、ジェンバンク登録番号ＡＦ３８４１６０、本願明細書の配列番号１６９に対応する）、ダイズ（Ｇｍ  ＤＧＡＴ１、米国公開特許第２００４００８８７５９  Ａ１号の配列番号１６、本願明細書の配列番号１７０に対応する）、アラビドプシス（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ）（Ａｔ  ＤＧＡＴ１、米国公開特許第２００４００８８７５９  Ａ１号の配列番号２、本願明細書の配列番号１７１に対応する）、コメ（Ｏｓ  ＤＧＡＴ１、米国公開特許第２００４００８８７５９  Ａ１号の配列番号１４、本願明細書の配列番号１７２に対応する）、小麦（Ｔａ  ＤＧＡＴ１、米国特許出願公開第２００４００８８７５９  Ａ１号明細書の配列番号２２、本願明細書の配列番号１７４に対応する）、およびシソ（Ｐｅｒｉｌｌａ  ｆｒｕｔｅｓｃｅｎｓ）（Ｐｆ、ジェンバンク登録番号ＡＦ２９８８１５、本願明細書の配列番号１７３に対応する）。
【０３８０】
次のパラメーターでクラスタルＷを使用して、ＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）プログラムを使用して、配列アラインメントを行った。ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝０．２、遅延発散数列（％）＝３０、ＤＮＡ遷移重量＝０．５、およびゴンネット（Ｇｏｎｎｅｔ）シリーズによるタンパク質重量マトリックス。この配列アラインメントの結果を図８ａ、８ｂ、８ｃ、８ｄ、８ｅ、８ｆ、８ｇ、および８ｈに示す。配列アラインメントの分析に基づいて、８個のモチーフが真菌ＤＧＡＴ１配列に特有であるとして同定された。さらに植物、動物、および真菌からのＤＧＡＴ１配列中に普遍的に存在する、７個のモチーフもまた推定された。
【０３８１】
【表２２】
2008524984.tif 000025
【０３８２】
タンパク質相同体ファミリーの配列アラインメントにおいて、（配列アラインメント位置は配列番号１４に対する）位置９７〜１０４、２７８〜２８４、３３４〜３４０、３６４〜３７４、４１８〜４２４、４１５〜４２４、４５６〜４６６、および５１３〜５１９に位置するモチーフは、ＤＧＡＴ１タンパク質内に高度の保存を有するので、その中に位置するアミノ酸残基は、構造、安定性、またはタンパク質活性に必須であることが予期される。観察された配列保存に基づいて、当業者はどのようにモチーフを使用して、配列番号２３〜３７を識別子または「シグネチャ」として提供し、新たに判定された配列があるタンパク質が本願明細書で述べられるＤＧＡＴ１タンパク質ファミリーに属するかどうかを判定するかを理解するであろう。
【図面の簡単な説明】
【０３８３】
【図１】油性酵母菌における脂質蓄積のための生化学的機序の概略図を示す。
【図２】ω−３およびω−６脂肪酸生合成経路を図示する。
【図３】ヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）における遺伝子発現のためのプラスミドベクターｐＹ５の構築を図示する。
【図４】（Ａ）ｐＹ２０、（Ｂ）ｐＬＶ１３、（Ｃ）ｐＭＤＧＡＴ１−１７、および（Ｄ）ｐＺＵＦ−Ｍｏｄ−１のプラスミドマップを提供する。
【図５】全脂質画分中に１５％までのＥＰＡを生成する、様々なヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）株の開発を図解する。
【図６】（Ａ）ｐＫＵＮＦ１２Ｔ６Ｅ、（Ｂ）ｐＤＭＷ２３２、（Ｃ）ｐＺＰ３Ｌ３７、（Ｄ）ｐＹ３７／Ｆ１５、および（Ｅ）ｐＫＯ２ＵＭ２６Ｅのプラスミドマップを提供する。
【図７】（Ａ）ｐＺＫＵＭ、（Ｂ）ｐＫＯ２ＵＦ２ＰＥ、（Ｃ）ｐＺＫＵＴ１６、（Ｄ）ｐＺＰ２ｌ７＋Ｕｒａ、および（Ｅ）ｐＺＵＦ１７のプラスミドマップを提供する。
【図８ａ】クラスタルＷを使用したＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）を使用した、ＤＧＡＴ１タンパク質の配列アラインメントである。
【図８ｂ】クラスタルＷを使用したＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）を使用した、ＤＧＡＴ１タンパク質の配列アラインメントである。
【図８ｃ】クラスタルＷを使用したＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）を使用した、ＤＧＡＴ１タンパク質の配列アラインメントである。
【図８ｄ】クラスタルＷを使用したＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）を使用した、ＤＧＡＴ１タンパク質の配列アラインメントである。
【図８ｅ】クラスタルＷを使用したＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）を使用した、ＤＧＡＴ１タンパク質の配列アラインメントである。
【図８ｆ】クラスタルＷを使用したＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）を使用した、ＤＧＡＴ１タンパク質の配列アラインメントである。
【図８ｇ】クラスタルＷを使用したＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）を使用した、ＤＧＡＴ１タンパク質の配列アラインメントである。
【図８ｈ】クラスタルＷを使用したＤＮＡＳＴＡＲのメガライン（Ｍｅｇａｌｉｇｎ）を使用した、ＤＧＡＴ１タンパク質の配列アラインメントである。
【図１】
2008524984.tif 000026
【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
2008524984.tif 000029
【図３Ｃ】
2008524984.tif 000030
【図４Ａ】
2008524984.tif 000031
【図４Ｂ】
2008524984.tif 000032
【図４Ｃ】
2008524984.tif 000033
【図４Ｄ】
2008524984.tif 000034
【図５】
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【図６Ａ】
2008524984.tif 000036
【図６Ｂ】
2008524984.tif 000037
【図６Ｃ】
2008524984.tif 000038
【図６Ｄ】
2008524984.tif 000039
【図６Ｅ】
2008524984.tif 000040
【図７Ａ】
2008524984.tif 000041
【図７Ｂ】
2008524984.tif 000042
【図７Ｃ】
2008524984.tif 000043
【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
2008524984.tif 000045
【図８Ａ】
2008524984.tif 000046
【図８Ｂ】
2008524984.tif 000047
【図８Ｃ】
2008524984.tif 000048
【図８Ｄ】
2008524984.tif 000049
【図８Ｅ】
2008524984.tif 000050
【図８Ｆ】
2008524984.tif 000051
【図８Ｇ】
2008524984.tif 000052
【図８Ｈ】
2008524984.tif 000053
【配列表】
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