(57)【要約】本発明は、とりわけ、癌の診断および治療における、ならびに癌を治療する能力について試験化合物をスクリーニングするための、WntおよびFZDのタンパク質、その遺伝子、WntおよびFZDの特異的抗体、およびそのプローブを使用する方法を提供する。肝臓癌のような癌を治療するために有用な化合物もまた開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌剤を同定するための方法であって、
Wnt3、Wnt8bまたはWnt11タンパク質またはそのFZD結合フラグメントのアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する試験化合物を選択する工程;
および
試験化合物が、
(i)細胞中でWnt/FZD7シグナル伝達を減少すること;
(ii)肝臓癌細胞の運動性を減少すること;
(iii)肝臓癌細胞中のβ-カテニン蓄積を減少すること;または
(iv)インビトロもしくはインビボで肝臓癌を治療すること
が可能であるか否かを決定し、ここで、(i)〜(iv)の少なくとも1つが可能である試験化合物が抗癌剤である、工程
を含む、方法。
【請求項２】
試験化合物の選択が、
Wnt3、Wnt8bまたはWnt11タンパク質またはそのFZD結合フラグメントのアミノ酸配列を含むポリペプチドと、試験化合物を接触させる工程;
該ポリペプチドと該試験化合物の間の結合を検出する工程;および
該試験化合物が該ポリペプチドに結合する場合に、該試験化合物を選択する工程
を含む、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
ポリペプチドが
(i)天然に存在するポリペプチド;
(ii)組換えポリペプチド;
(iii)細胞の表面上に発現されたポリペプチド;または
(iv)単離されたポリペプチド
として提供される、請求項1または2に記載の方法。
【請求項４】
ポリペプチドがWnt3タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項５】
アミノ酸配列が、SEQ ID NO:8〜12のいずれか1つおよび少なくとも1つの非Wnt配列を含む、請求項4に記載の方法。
【請求項６】
ポリペプチドがWnt11タンパク質のアミノ酸配列を含む、請求項1または2に記載の方法。
【請求項７】
アミノ酸配列が、SEQ ID NO:22〜26のいずれか1つおよび少なくとも1つの非Wnt配列を含む、請求項6に記載の方法。
【請求項８】
肝臓癌の治療における使用のための請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法によって同定される化合物。
【請求項９】
化合物が、
(i)抗Wnt抗体;または
(ii)FZD7受容体もしくはそのWnt結合フラグメント
である、肝臓癌の治療における使用のための請求項8に記載の化合物。
【請求項１０】
患者において肝臓癌を治療し、または肝臓癌細胞の運動性を減少するための医用薬剤の製造における、請求項1〜7のいずれか1項に記載の方法によって同定される化合物の使用。
【請求項１１】
患者において肝臓癌を治療し、または肝臓癌細胞の運動性を減少するための医用薬剤の製造における、Wnt3、8bまたは11に結合し、それによって患者の細胞中のWnt/FZD7シグナル伝達を減少する化合物の使用。
【請求項１２】
化合物が抗Wnt3抗体である、請求項11に記載の使用。
【請求項１３】
抗Wnt3抗体が、アミノ酸配列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQ ID NO:80)を含むポリペプチドに結合する、請求項12に記載の使用。
【請求項１４】
患者において肝臓癌を治療し、または肝臓癌細胞の運動性を減少するための医用薬剤の製造における、Wnt3の発現を減少し、それによって患者の細胞中のWnt/FZD7シグナル伝達を減少する化合物の使用。
【請求項１５】
化合物が、患者におけるWnt3の発現を減少するsiRNAである、請求項14に記載の使用。
【請求項１６】
siRNAが、
2008516895.tif 000011
からなる群より選択される配列を含む、請求項15に記載の使用。
【請求項１７】
候補抗癌剤を同定するための方法であって、
(a)(i)FZD7ポリペプチドまたはそのフラグメントを含み;かつ
(ii)Wnt結合能力を示す、
第1のポリペプチドを提供する工程;
(b)(i)Wnt3、8bまたは11ポリペプチドまたはそのフラグメントを含み;かつ
(ii)FZD7結合能力を示す、
第2のポリペプチドを提供する工程;
(c)試験化合物の存在下で、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを接触させる工程;および
(d)試験化合物の存在下での第1のポリペプチドと第2のポリペプチドの間の結合のレベルを、試験化合物の非存在下での結合のレベルと比較し、試験化合物の存在下で、その非存在下よりも減少した結合のレベルが、試験化合物が候補抗癌剤であることを示す、工程
を含む、方法。
【請求項１８】
(e)候補抗癌剤が、
(i)FZD7を発現する細胞中でWnt/FZD7シグナル伝達を減少すること;
(ii)癌細胞の運動性を減少すること;
(iii)癌細胞中のβ-カテニン蓄積を減少すること;または
(iv)インビトロもしくはインビボで癌を治療すること
が可能であるか否かを決定し、ここで、(i)〜(iv)の少なくとも1つが可能である候補が抗癌剤である、工程
をさらに含む、請求項17に記載の方法。
【請求項１９】
試験化合物が、ポリペプチド、リボ核酸、小分子およびデオキシリボ核酸からなる群より選択される、請求項17に記載の方法。
【請求項２０】
第1のポリペプチドが、(a)転写因子の転写活性化ドメインまたは(b)転写因子のDNA結合ドメインに融合されたFZDポリペプチドを含む第1の融合タンパク質であり;第2のポリペプチドが、(c)転写因子の転写活性化ドメインまたは(d)転写因子のDNA結合ドメインに融合されたWntポリペプチドを含む第2の融合タンパク質であり、ここで、Wntポリペプチドが、Wntポリペプチドに融合されたドメインとは異なるドメインに融合され、かつ、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドの結合が、転写因子の再構築として検出される、請求項17に記載の方法。
【請求項２１】
第2のポリペプチドがWnt3ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２２】
第2のポリペプチドが、SEQ ID NO:8〜12の任意の1つおよび少なくとも1つの非Wnt配列を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２３】
第2のポリペプチドがWnt11ポリペプチドまたはそのフラグメントを含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２４】
第2のポリペプチドが、SEQ ID NO:22〜26の任意の1つおよび少なくとも1つの非Wnt配列を含む、請求項17に記載の方法。
【請求項２５】
癌の治療における使用のための、請求項17〜24のいずれか1項に記載の方法によって同定される候補抗癌剤または抗癌剤。
【請求項２６】
癌の治療のための医用薬剤の製造における、請求項17〜24のいずれか1項に記載の方法によって同定される候補抗癌剤または抗癌剤の使用。
【請求項２７】
肝臓細胞が癌細胞であるか、または癌細胞になるリスクがあることを決定する方法であって、
(a)試験肝臓細胞を提供する工程;
(b)Wnt3発現の細胞のレベルが、対照細胞のレベルよりも高いか否かを決定する工程;および
(c)Wnt3発現の試験細胞のレベルが対照細胞のレベルよりも高い場合に、試験細胞を、癌細胞または癌細胞になるリスクがあると分類する工程
を含む、方法。
【請求項２８】
試験組織試料が、肝臓癌に罹患しているか、または肝臓癌のリスクがある患者に由来するか否かを決定する方法であって、
(a)患者から得られた肝臓試験組織試料を提供する工程;および
(b)該試験組織試料におけるWnt3発現のレベルが、健常個体から得られた比較可能な組織試料におけるレベルよりも高いか否かを決定する工程
を含み、ここで、試験組織試料におけるより高い発現のレベルが、患者が癌を罹患しているか、または癌のリスクがあることの表示である、
方法。
【請求項２９】
Wnt3発現のレベルを決定する工程が、試験細胞または試験組織試料中のWnt3 mRNAの量を決定することを含む、請求項27または28に記載の方法。
【請求項３０】
Wnt3 mRNAの量が、ノーザンブロットアッセイ法またはRT-PCRアッセイ法を使用して決定される、請求項29に記載の方法。
【請求項３１】
Wnt3発現のレベルを決定する工程が、試験細胞または試験組織試料中のWnt3タンパク質の量を決定することを含む、請求項27または28に記載の方法。
【請求項３２】
Wnt3タンパク質の量が抗体を使用して決定される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
抗体がアミノ酸配列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQ ID NO:80)に結合する、請求項32に記載の方法。
【請求項３４】
試験細胞のWnt11発現のレベルまたは試験組織のWnt11発現のレベルが、対照細胞または対照組織のレベルよりも低いか否かを決定する工程をさらに含み、ここで、より低いレベルのWnt11の発現が、(i)試験細胞が癌細胞であるか、もしくは癌細胞になるリスクがあること、または(ii)患者が癌に罹患しているか、もしくは癌のリスクがあることを示す、請求項27または28に記載の方法。
【請求項３５】
(a)において提供される組織試料が、腫瘍組織または腫瘍周囲組織である、請求項28に記載の方法。
【請求項３６】
(c)試験組織試料におけるWnt11発現のレベルが、健常個体から得られた組織試料におけるレベルよりも低いか否かを決定する工程をさらに含み、ここで、より低いレベルのWnt11の発現が、患者が癌に罹患しているか、または癌のリスクがあることの表示である、請求項28に記載の方法。
【請求項３７】
アミノ酸配列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQ ID NO:80)に結合する抗体。
【請求項３８】
請求項37に記載の抗体および薬学的に許容されるキャリアを含む薬学的化合物。
【請求項３９】
請求項37に記載の抗体を含む組成物の有効量を、癌に罹患しているかまたは癌のリスクがある患者に投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法。
【請求項４０】
癌が肝臓癌である、請求項39に記載の方法。
【請求項４１】
患者における癌を治療する方法であって、
2008516895.tif 000012
からなる群より選択される配列を含むsiRNAを含む組成物の有効量を、癌に罹患しているかまたは癌のリスクがある患者に投与する工程を含む、方法。
【請求項４２】
癌が肝臓癌である、請求項41に記載の方法。
【請求項４３】
Wnt11ポリペプチドまたはWnt11ポリペプチドをコードする遺伝子構築物を含む組成物の有効量を、癌に罹患しているかまたは癌のリスクがある患者に投与する工程を含む、患者における癌を治療する方法。
【請求項４４】
組成物がインサイチューで患者の肝臓に直接的に投与される、請求項43に記載の方法。
【請求項４５】
癌が肝臓癌である、請求項43に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は、肝臓癌の検出および治療に関する。
【０００２】
連邦政府によって資金援助された研究に関する言及
本発明は、米国国立衛生研究所(National Institutes of Health)補助金番号CA035711およびAA002666の下で政府の援助を伴ってなされた。政府は本発明において特定の権利を有する。
【０００３】
関連出願の相互参照
本願は、2004年9月21日に出願された米国特許仮出願番号60/612,098の恩典を主張する2005年1月5日に出願された国際出願番号PCT/US05/000267の一部継続出願であり、これらは両方とも、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００４】
肝細胞癌(HCC)は、肝臓の主要な原発性悪性腫瘍である。ウイルス性の病因的因子が同定されてきたが、肝臓癌形成の間の腫瘍進行に寄与する分子メカニズムは、大部分が不明のままである。フリッツルド(Frizzled)ファミリーのタンパク質は、Wntタンパク質についての受容体として作用する10個またはそれ以上の7回膜貫通タンパク質から構成される。このWnt／フリッツルドシグナル伝達ネットワークは、細胞の運命の決定から、細胞の運動性および増殖までの範囲の多様な生物学的プロセスに影響を与える。
【０００５】
β-カテニンは、アクチン細胞骨格へのカドヘリンおよびα−カテニンの連結を強化することに関与する、細胞-細胞接着における役割を有する多機能タンパク質である。Wnt／フリッツルドシグナル伝達の非存在下では、β-カテニンは、グリコーゲンシンターゼキナーゼ(GSK)-3βとの相互作用によってリン酸化され、かつアキシンおよび大腸腺腫性ポリポーシスタンパク質(APC)と複合体を形成する。続いて、β-カテニンは、ユビキチンプロテオソーム系による分解のために標的とされる。対照的に、そのフリッツルド受容体へのWntリガンドの結合は、GSK-3β酵素活性の阻害を通して、細胞内β-カテニンを安定化する。続いて、β-カテニンは、Tcf/Lefのような高移動度グループドメイン因子を結合して、核に移行する。この複合体は、増殖の制御および細胞の移動に関連する遺伝子の転写のアップレギュレーションに関与する。
【発明の開示】
【０００６】
概要
本発明は、Wnt3、8bおよび11が、HCC、例えば、B型肝炎ウイルス(HBV)関連HCCにおいて、mRNAおよびタンパク質のレベルで共通して過剰発現されているフリッツルド7についてのリガンドであるという発見に部分的に基づく。フリッツルド7を過剰発現する肝臓癌細胞は、細胞の運動性および移動の増強を示す。過剰発現は、肝細胞形質転換の多段階プロセスの間の初期の事象であると思われ、それゆえに、フリッツルド7およびWnt3、8bおよび11は、肝臓癌の治療のための新規な分子標的である。
【０００７】
従って、1つの局面において、本発明は、抗癌剤を同定するための方法を提供する。この方法は、Wnt3、Wnt8bまたはWnt11タンパク質またはそのFZD結合フラグメントのアミノ酸配列を含むポリペプチドに結合する試験化合物を選択する工程;およびこの試験化合物が、(i)細胞中でWnt/FZD7シグナル伝達活性を減少すること、(ii)肝臓癌細胞の運動性を減少すること、肝臓癌細胞中のβ-カテニン蓄積を減少すること;または(iv)インビトロもしくはインビボで肝臓癌を治療することが可能であるか否かを決定する工程を含み、ここで、(i)〜(iv)の少なくとも1つが可能である試験化合物は抗癌剤である。ある態様において、試験化合物を選択する工程が、Wnt3、Wnt8bまたはWnt11タンパク質またはそのFZD結合フラグメントのアミノ酸配列を含むポリペプチドを提供すること、このポリペプチドを試験化合物と接触させること、このポリペプチドとこの試験化合物の間の結合を検出すること;および該試験化合物がこのポリペプチドに結合する場合に、この試験化合物を選択することを含む。試験化合物が結合するポリペプチドは、(i)天然に存在するポリペプチド、(ii)組換えポリペプチド、(iii)細胞の表面上に発現されたポリペプチド、または(iv)単離されたポリペプチドであり得る。このポリペプチドがWnt3タンパク質のアミノ酸配列を含む場合、このポリペプチドは、SEQ ID NO:8〜12のいずれか1つを含むことができる。このポリペプチドがWnt8bタンパク質のアミノ酸配列を含む場合、このポリペプチドは、SEQ ID NO:15〜19のいずれか1つを含むことができる。このポリペプチドがWnt11タンパク質のアミノ酸配列を含む場合、このポリペプチドは、SEQ ID NO:22〜26のいずれか1つを含むことができる。特定の態様において、このポリペプチドがSEQ ID NO:7〜27のいずれか1つ、および少なくとも1つの非Wnt配列を含む。試験化合物は、ポリペプチド、リボ核酸、小分子(例えば、有機小分子)およびデオキシリボ核酸からなる群より選択することができる。
【０００８】
本明細書に記載される癌薬剤を同定する方法によって同定される抗癌剤には、抗Wnt抗体、例えば、モノクローナル抗体、FZD7受容体、FZD7受容体のWnt結合フラグメント、および他のWnt結合化合物が含まれるがこれらに限定されない。これらの方法によって同定される抗癌剤は、癌、例えば、肝臓癌の治療において使用することができる。加えて、これらの方法によって同定される抗癌剤は、患者における肝臓癌を治療するため、または肝臓癌細胞の運動性を減少するための医用薬剤を製造するために使用することができる。
【０００９】
別の局面において、本発明は、候補抗癌剤を同定する方法を含む。この方法は、(a)(i)FZD7ポリペプチド(例えば、FZD7ポリペプチド)またはそのフラグメントを含み;かつ(ii)Wnt(例えば、Wnt3、8bまたは11) 結合能力を示す、第1のポリペプチドを提供する工程;(b)(i)Wntポリペプチド(例えば、Wnt3、8bまたは11ポリペプチド)またはそのフラグメントを含み;かつ(ii)FZD(例えば、FZD7)結合能力を示す、第2のポリペプチドを提供する工程;(c)試験化合物の存在下で、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドを接触させる工程;および(d)試験化合物の存在下での第1のポリペプチドと第2のポリペプチドの間の結合のレベルを、試験化合物の非存在下での結合のレベルと比較し、試験化合物の存在下で、その非存在下よりも減少した結合のレベルは、試験化合物が候補抗癌剤であることを示す工程を含む。この方法は、(e)候補抗癌剤が、(i)細胞中でWnt/FZD7シグナル伝達を減少すること;(ii)肝臓癌細胞の運動性を減少すること;(iii)癌細胞中のβ-カテニン蓄積を減少すること;または(iv)インビトロもしくはインビボで癌を治療することが可能であるか否かを決定し、ここで、(i)〜(iv)の少なくとも1つが可能である試験化合物は抗癌剤である工程をさらに含む。試験化合物は、ポリペプチド、リボ核酸、小分子(例えば、有機小分子)およびデオキシリボ核酸からなる群より選択することができる。Wntポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:8〜12、15〜19、および／または22〜26を含むことができる。FZDポリペプチドは、例えば、SEQ ID NO:1、2および／または3を含むことができる。
【００１０】
特定の態様において、第1のポリペプチドが、(i)転写因子の転写活性化ドメインまたは(ii)転写因子のDNA結合ドメインに融合されたFZDポリペプチドを含む第1の融合タンパク質であり;第2のポリペプチドが、(i)転写因子の転写活性化ドメインまたは(ii)転写因子のDNA結合ドメインに融合されたWntポリペプチド(例えば、Wnt3、8bまたは11)を含む第2の融合タンパク質であり、ここで、Wntポリペプチドは、Wntポリペプチドに融合されたドメインとは異なるドメインに融合され、第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドの結合は、転写因子の再構築として検出される。
【００１１】
本明細書に記載される方法によって同定される抗癌剤(および／または候補抗癌剤)は、癌、例えば、肝臓癌の治療において使用することができる。加えて、本明細書に記載される方法によって同定される抗癌剤(および／または候補抗癌剤)は、癌、例えば、肝臓癌を治療するための医用薬剤の製造において使用することができる。
【００１２】
なお別の局面において、本発明は、細胞(例えば、肝臓細胞)が癌細胞であるか、または癌細胞になるリスクがあることを決定する方法を提供する。この方法は、(a)試験細胞(例えば、肝臓細胞)を提供する工程;(b)FZD7および／もしくはWnt3発現の試験細胞のレベルが対照細胞のレベルよりも高いか否か、ならびに／またはFZD8および／もしくはWnt11発現が対照細胞のレベルよりも低いか否かを決定する工程;ならびに(c)FZD7および／もしくはWnt3発現の試験細胞のレベルが対照細胞のレベルよりも高い場合、ならびに／またはFZD8および／もしくはWnt11発現の試験細胞のレベルが対照細胞のレベルよりも低い場合、試験細胞を、(i)癌細胞または(ii)癌細胞になるリスクがあると分類する工程を含む。この方法が、FZD7および／またはWnt3発現の細胞のレベルを決定する工程を含む場合、この方法は、(c)FZD8および／またはWnt1発現の試験細胞のレベルが、対照細胞のレベルよりも低いか否かを決定する工程をさらに含むことができ、ここで、FZD8および／またはWnt11の発現のより低いレベルは、試験細胞が癌細胞であるか、または癌細胞になるリスクがあることを示す。この方法が、FZD8および／またはWnt11発現の細胞のレベルを決定する工程を含む場合、この方法は、(c)FZD7および／またはWnt3発現の細胞のレベルが対照細胞のレベルよりも高いか否かを決定する工程をさらに含むことができ、ここで、FZD7および／またはWnt3の発現のより高いレベルは、試験細胞が癌細胞であるか、または癌細胞になるリスクがあることを示す。
【００１３】
さらなる局面において、本発明は、患者が癌に罹患しているか、または癌のリスクがあるか否か、例えば、試験組織試料が、癌に罹患しているか、または癌のリスクがある患者に由来するか否かを決定する方法を提供する。この方法は、患者から得られた試験組織試料(例えば、癌性腫瘍組織または腫瘍周囲組織のような肝臓組織)を提供する工程、および(b)健常個体から得られた比較可能な組織試料におけるレベルよりも、試験組織試料中で、FZD7および／もしくはWnt3発現のレベルがより高いか否か、ならびに／またはFZD8および／もしくはWnt11発現のレベルがより低いか否かを決定する工程を含み、ここで、試験組織試料におけるFZD7および／もしくはWnt3発現のより高い発現のレベル、ならびに／またはFZD8および／もしくはWnt11のより低い発現のレベルが、試料が、癌に罹患しているかまたは癌のリスクがある患者に由来することの表示である。この方法がFZD7および／またはWnt3発現のレベルを決定する工程を含む場合、この方法はさらに:(c)試験組織試料中のFZD8および／またはWnt11発現のレベルが、健常個体から得られた組織試料におけるレベルよりも低いか否かを決定する工程を含み、ここで、FZD8および／またはWnt11のより低い発現のレベルは、試料が、癌に罹患しているか、または癌のリスクがある患者に由来することの表示である。この方法は、FZD8および／またはWnt11発現のレベルを決定する工程を含み、この方法はさらに:(c)試験組織試料中のFZD7および／またはWnt3発現のレベルが、健常個体から得られた組織試料におけるレベルよりも高いか否かを決定する工程を含むことができ、ここで、FZD7および／またはWnt3のより高い発現のレベルは、患者が癌に罹患しているか、または癌のリスクがあることの表示である。
【００１４】
本明細書に記載される方法のいずれかにおいて、FZD7、FZD8、Wnt3またはWnt11発現のレベルを決定する工程は、例えば、ノーザンブロットアッセイ法またはRT-PCRアッセイ法を使用して、細胞中のFZD7、FZD8、Wnt3またはWnt11 mRNAの量を決定することを含むことができる。他の態様において、発現のレベルを決定する工程は、例えば、抗Wnt抗体、例えば、SEQ ID NO:7または80に結合する抗体を使用して、細胞中のFZD7、FZD8、Wnt3またはWnt11タンパク質の量を決定することを含むことができる。
【００１５】
なお別の局面において、本発明は、患者における癌(例えば、肝臓癌)を治療する方法を含む。この方法は、患者のFZD7発現細胞中のWnt/FZD7シグナル伝達を減少し、かつ任意に、FZD7発現細胞に対して致死的ではない、有効量の化合物を患者に投与する工程を含む。1つの態様において、この化合物は、患者におけるFZD7および／もしくはWnt3発現を減少し、ならびに／または患者におけるWnt11発現を増加する化合物である。別の態様において、この化合物は、患者におけるWnt3、Wnt8b、Wnt11、FZD7またはFZD8を結合する化合物である。この化合物は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、生理学的条件下でWntヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む二本鎖RNA(dsRNA)、単離されたFZD7受容体もしくはそのWnt3フラグメント、Wntポリペプチド(例えば、Wnt11ポリペプチド)をコードする遺伝子構築物もしくは切断型のFZD7(例えば、1つの型のFZD7は、FZD7の細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインを欠く)、ならびに／または抗FZD7および／もしくは抗Wnt抗体(例えば、抗Wnt3抗体)であり得る。この化合物は、任意の経路によって、例えば、患者の肝臓への投与によって投与することができる。特定の態様において、この化合物は、SEQ ID NO:7または80に結合する抗体である。他の態様において、この化合物は、SEQ ID NO:81、82または83を含むsiRNAである。
【００１６】
なお別の局面において、本発明は、癌細胞(例えば、肝臓癌細胞)の運動性を減少する方法を含む。この方法は、細胞中のWnt/FZD7シグナル伝達を減少することが可能であり、かつ任意に、細胞に対して致死的でない有効量の化合物を細胞に投与する工程を含む。1つの態様において、この化合物は、患者におけるFZD7および／もしくはWnt3発現を減少し、ならびに／または患者におけるWnt11発現を増加する化合物である。別の態様において、この化合物は、患者におけるWnt3、Wnt8b、Wnt11、FZD7またはFZD8を結合する化合物である。この化合物は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、生理学的条件下でWntヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む二本鎖RNA(dsRNA)、単離されたFZD7受容体もしくはそのWnt3フラグメント、Wntポリペプチド(例えば、Wnt11ポリペプチド)をコードする遺伝子構築物もしくは切断型のFZD7(例えば、1つの型のFZD7は、FZD7の細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインを欠く)、ならびに／または抗FZD7および／もしくは抗Wnt抗体(例えば、抗Wnt3抗体)であり得る。この化合物は、任意の経路によって、例えば、患者の肝臓への投与によって投与することができる。特定の態様において、この化合物は、SEQ ID NO:7または80に結合する抗体である。他の態様において、この化合物は、SEQ ID NO:81、82または83を含むsiRNAである。
【００１７】
別の局面において、本発明は、(i)肝臓癌の治療のための医用薬剤、または(ii)肝臓癌細胞の運動性を減少する医用薬剤の製造における、FZD7発現細胞におけるWnt/FZD7シグナル伝達を減少する化合物の使用を含む。任意に、この医用薬剤は、FZD7細胞に対して非致死的である。1つの態様において、この化合物は、患者におけるFZD7および／もしくはWnt3発現を減少し、ならびに／または患者におけるWnt11発現を増加する化合物である。別の態様において、この化合物は、患者におけるWnt3、Wnt8b、Wnt11、FZD7またはFZD8を結合する化合物である。この化合物は、例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチド、生理学的条件下でWntヌクレオチド配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む二本鎖RNA(dsRNA)、単離されたFZD7受容体もしくはそのWnt3フラグメント、Wntポリペプチド(例えば、Wnt11ポリペプチド)をコードする遺伝子構築物もしくは切断型のFZD7(例えば、1つの型のFZD7は、FZD7の細胞内ドメインおよび／または膜貫通ドメインを欠く)、ならびに／または抗FZDおよび／もしくは抗Wnt抗体(例えば、抗Wnt3抗体)であり得る。
【００１８】
特定の局面において、本発明は、抗Wnt抗体、例えば、抗Wnt3抗体、例えば、SEQ ID NO:7またはアミノ酸配列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQ ID NO:80)に結合する抗体を含む。この抗体は、患者への投与のために適切な薬学的組成物中に含めることができる。
【００１９】
他の局面において、本発明は、本明細書に記載される状態、例えば、癌、例えば、肝臓癌の治療または予防のための薬学的組成物の調製における、本明細書に記載される任意の化合物の使用を含む。この組成物は、本明細書に記載される方法に従って、癌を治療するため、および／または癌細胞の運動性を減少するための方法において使用することができる。この組成物は、本明細書に記載される任意の型、例えば、液体または固体の組成物であり得る。特定の態様において、この化合物は、抗体、例えば、抗Wnt抗体、例えば、SEQ ID NO:7またはアミノ酸配列LRAKYSLFKPPTERDL(SEQ ID NO:80)に結合する抗体を含む。他の態様において、この化合物は、siRNA、例えば、核酸配列
2008516895.tif 000002
を含むsiRNAである。
【００２０】
Wntタンパク質を検出するために有用である、本明細書に記載される核酸(例えば、以下の表1に記載されるプライマー)もまた、本発明に含まれる。
【００２１】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する当該分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。適切な方法および材料は以下に記載されるが、本明細書に記載されるものと同様のまたは等価な方法および材料を、本発明の実施または試験において使用することができる。すべての刊行物、特許出願、特許、および本明細書で言及される他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先する。材料、方法、および実施例は、例示的であるのみであり、限定を意図しない。
【００２２】
本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明から、および特許請求の範囲から明らかである。
【００２３】
詳細な説明
本発明は、少なくとも部分的に、特定のフリッツルド(FZD)タンパク質、例えば、FZD7および8が、肝臓癌のような特定の癌と関連し、およびWnt3、8bおよび11がWnt7リガンドであるという発見に部分的に基づく。従って、本明細書は、とりわけ、癌の診断および治療における、ならびに癌を治療する能力について試験化合物をスクリーニングするための、WntおよびFZDのタンパク質、その遺伝子、FZD特異的抗体、およびそのプローブを使用する方法を提供する。肝臓癌のような癌を治療するために有用な化合物もまた開示される。
【００２４】
1. 核酸、タンパク質、ベクター、および宿主細胞
「フリッツルド」「FZD」「フリッツルドタンパク質」および「フリッツルド受容体」という用語は、組織極性の発生において役割を果たす、ショウジョウバエ（Drosophila）フリッツルド遺伝子に関連する哺乳動物タンパク質のファミリーをいう。フリッツルドファミリーは、少なくとも10個の哺乳動物遺伝子を含む。例示的なフリッツルド受容体には、フリッツルド1、フリッツルド2、フリッツルド3、フリッツルド4、フリッツルド5、フリッツルド6、フリッツルド7、フリッツルド8、フリッツルド9およびフリッツルド10が含まれる。フリッツルド受容体は、アミノ末端リガンド結合ドメインを有するGタンパク質共役受容体に類似した、膜貫通シグナル伝達の動的モデルに関与する。
【００２５】
「Wntタンパク質」「Wntリガンド」および「Wnt」という用語は、ショウジョウバエ体節極性遺伝子、ウィングレスに関連する哺乳動物タンパク質のファミリーをいう。ヒトにおいては、Wntファミリーの遺伝子は、疎水性シグナル配列および保存性アスパラギン連結オリゴサッカリドコンセンサス配列を有する、38〜43kDaのシステインリッチ糖タンパク質をコードする(例えば、Shimizu et al, Cell Growth Differ 8:1349-1358 (1997)を参照されたい)。Wntファミリーメンバーは少なくとも19個の哺乳動物メンバーを含む。例示的なWntタンパク質には、Wnt-1、Wnt-2、Wnt-2b(Wnt-13としても知られている)、Wnt-3、Wnt-3A、Wnt-4、Wnt-5A、Wnt-5B、Wnt-6、Wnt-7A、Wnt-7B、Wnt-8A、Wnt-8B、Wnt-10A、Wnt-10B、Wnt-11、Wnt 14、Wnt 15、およびWnt 16が含まれる。
【００２６】
Wntリガンドに加えて、分泌型フリッツルド関連タンパク質(sFRP)のファミリーが単離されてきた。sFRPは、分泌型Wntリガンドの結合について、膜貫通型フリッツルド受容体を競合することによって、Wntシグナル伝達の可溶性内因性モジュレーターとして機能すると思われる。sFRPは、タンパク質を結合すること、およびその細胞表面シグナル伝達受容体への接近をブロックすることによって、Wnt機能と拮抗することができるか、またはsFRPは、フリッツルド受容体へのリガンドの提示を容易にすることによってWnt活性を増強することができるかのいずれかである。
【００２７】
「Wnt/FZDシグナル伝達経路」という用語は、フリッツルド受容体、例えば、FZD7と、1つまたは複数のそのリガンド、例えば、Wntタンパク質、例えば、Wnt3、8b、または11の間の相互作用によって開始される細胞内シグナル伝達経路をいう。典型的には、Wnt/FZD相互作用は、フリッツルド受容体、例えば、FZD7への、Wntタンパク質、例えば、Wnt3、8b、または11の結合を含み、これは、シグナル伝達経路の活性化をもたらす、ある場合において、Wnt／フリッツルドシグナル伝達経路の活性化は、下流のWntおよび／またはFZD誘導性遺伝子の誘導をもたらす。「下流のWnt／FZDによって調節される遺伝子産物」は、Wnt／FZDシグナル伝達経路によるシグナル伝達の結果として調節される(例えば、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされる)タンパク質またはRNAである。
【００２８】
本発明は、特定のFZDおよびWntの核酸の使用を含む。例えば、本発明は、特定のFZD7および8の核酸、例えば、図8A〜8Eに示される、例示的なヒトおよびマウスのFZD7(それぞれSEQ ID NO:1および3)および8(それぞれSEQ ID NO:4および6)のアミノ酸配列をコードする核酸の使用を含む。別の例として、本発明は、特定のWnt3、8b、および11の核酸、例えば、図8A〜8Eに示される、例示的なヒトおよびマウスのWnt3(それぞれSEQ ID NO:7および13)、8b(それぞれSEQ ID NO:14および20)、および11(それぞれSEQ ID NO:21および27)のアミノ酸配列をコードする核酸の使用を含む。
【００２９】
FZDおよびWntの核酸の特定のフラグメント、例えば、SEQ ID NO:l、3、4、6、7、13、14、20、21、または27をコードする核酸配列のフラグメントの使用もまた、本発明に含まれる。FZDまたはWntの核酸のフラグメントは、それぞれ、FZDまたはWntのポリペプチド(例えば、ヒトまたは齧歯類のポリペプチド)の少なくとも1つの有用なフラグメント、例えば、結合ドメイン(例えば、CRDドメイン)または他の有用なフラグメントをコードする。例えば、FZD核酸の有用なフラグメントは、結合活性を有するFZD受容体のフラグメント、例えば、SEQ ID NO:3または5に対応するフラグメントをコードしてもよい。別の例として、Wnt核酸の別のフラグメントは、結合活性を有するWntポリペプチドのフラグメント、例えば、SEQ ID NO:8〜12、15〜19および22〜26の任意の1つまたは複数に対応するフラグメントをコードしてもよい。
【００３０】
本明細書に記載されるFZDおよびWntの核酸は、RNAとDNAの両方を含み、これには、ゲノムDNAおよび合成(例えば、化学合成された)DNAが含まれる。核酸は、二本鎖または一本鎖であることが可能である。一本鎖である場合、核酸はセンス鎖またはアンチセンス鎖であることが可能である。核酸は、オリゴヌクレオチドアナログまたは誘導体(例えば、イノシンまたはホスホロチオエートヌクレオチド)を使用して合成することができる。このようなオリゴヌクレオチドは、例えば、塩基対形成能力の変化またはヌクレアーゼに対する耐性の増加を有する核酸を調製するために使用することができる。
【００３１】
「単離された核酸」は、任意の天然に存在する核酸の構造、または任意に3つより多くの別々の遺伝子にまたがる構造ではない、核酸の構造をいう。それゆえに、この用語は、例えば、以下を網羅する:(a)天然に存在するゲノムDNAの一部の配列を有するが、天然に存在する生物のゲノム中の分子の一部に隣接する両方のコード配列とは隣接しないDNA;(b)得られる分子が、任意の天然に存在するベクターまたはゲノムDNAとは同一ではないような様式で、ベクターまたは原核生物もしくは真核生物に組み込まれた核酸;(c)cDNA、ゲノムフラグメント、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)によって産生されたフラグメント、または制限フラグメントのような別々の分子;および(d)ハイブリッド遺伝子、すなわち、融合タンパク質をコードする遺伝子の一部である組換えヌクレオチド配列。(i)DNA分子、(ii)トランスフェクトされた細胞、および(iii)細胞クローンの混合物中に存在する核酸は、例えば、これらがcDNAライブラリーまたはゲノムDNAライブラリーのようなDNAライブラリー中に存在するように、この定義から特に除外される。
【００３２】
ある態様において、本発明は、FZDまたはWntの核酸に対して実質的に相同である核酸配列の使用を含む。FZDまたはWntの核酸に対して「実質的に相同」である核酸配列は、SEQ ID NO:1〜27のいずれか1つをコードするFZDまたはWntの核酸二対して少なくとも75%相同である。例えば、実質的に相同である核酸配列は、SEQ ID NO:1〜27をコードする配列に対して、少なくとも約80%、85％、90%、95%、98%または少なくとも約99%相同であり得る。核酸の比較の目的のために、参照核酸配列の長さは少なくとも50ヌクレオチドであるが、しかし、より長い、例えば、少なくとも60ヌクレオチド、またはそれ以上のヌクレオチドが可能である。
【００３３】
本明細書で使用される場合、2つのアミノ酸配列または2つの核酸配列の「相同性パーセント」は、Karlin and Altschul (1993) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 90:5873-5877におけるような、修飾されたKarlin and Altschul (1990) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Altschul, et al. (1990); J. Mol. Biol. 215:403-410のNBLASTおよびXBLASTプログラムに組み込まれている。BLASTヌクレオチド検索は、NBLASTプログラム、スコア=100、ワード長=12を用いて実施され、本発明において使用されるFZDまたはWnt核酸分子に相同なヌクレオチド配列を得る。BLASTタンパク質検索は、XBLASTプログラム、スコア=50、ワード長=3を用いて実施され、参照ポリペプチドに相同なアミノ酸配列を得る。比較目的のためにギャップを有するアラインメントを得るために、ギャップ付きBLASTは、Altschul et al., (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるように使用される。BLASTおよびギャップ付きBLASTのプログラムを使用する場合、それぞれのプログラム(例えば、XBLASTおよびNBLAST)のデフォルトパラメーターが使用される。アドレスncbi.nlm.nih.govのワールドワイドウェブを参照されたい。
【００３４】
本発明はまた、SEQ ID NO:1〜27のいずれかをコードするヌクレオチド配列のすべてもしくは一部、またはこのような核酸配列の相補物に、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件(本明細書に定義される)の下でハイブリダイズする核酸の使用を含む。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、典型的には、少なくとも15(例えば、20、25、30、または50)ヌクレオチド長である。ハイブリダイズする核酸のハイブリダイズする部分は、FZDまたはWntポリペプチド、またはその相補物をコードする核酸の一部またはすべての配列に対して、少なくとも約75%(例えば、少なくとも80%、90%、95%または98%)同一である。本明細書に記載される型のハイブリダイズする核酸は、例えば、クローニングプローブ、プライマー(例えば、PCRプライマー)、または診断用プローブとして使用することができる。核酸試料へのオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションは、ストリンジェントな条件下で実施される。核酸二重鎖またはハイブリッドの安定性は、プローブが標的DNAから解離する温度である融解温度、すなわちTmとして表現される。この融解温度は、必要とされるストリンジェンシー条件を規定するために使用される。関連性があり、かつ同一ではないがむしろプローブに対して実質的に同一である配列が同定されるならば、特定の塩濃度(例えば、SSCまたはSSPE)を用いてのみ相同的ハイブリダイゼーションが起こるより低い温度を最初に確立することが有用である。
【００３５】
次に、1%のミスマッチが1℃のTmを減少すると仮定すると、ハイブリダイゼーション反応における最終洗浄の温度は、それに応じて減少される(例えば、プローブと>95%同一性を有する配列が探索される場合、最終洗浄温度は5℃低下される)。実際には、Tmの変化は、1%のミスマッチあたり0.5℃から1.5℃の間であり得る。ストリンジェントな条件は、5×SSC/5×デンハルト溶液/1.0% SDSにおける68℃でのハイブリダイズ、および0.2×SSC/0.1% SDS、室温での洗浄を含む。中程度のストリンジェントな条件には、3×SSC中での42℃での洗浄を含む。塩濃度および温度のパラメーターは、プローブと標的核酸の間の最適な同一性のレベルを達成するように変化させることができる。このような条件に関するさらなる手引きは、例えば、Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N.Y.; およびAusubel et al. (編), 1995, Current Protocols in Molecular Biology, (John Wiley & Sons, N.Y.) ,Unit 2.10によって、当技術分野において容易に使用可能である。
【００３６】
SEQ ID NO:1〜27のいずれかをコードするヌクレオチド配列にハイブリダイズする核酸は、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とみなされる。
【００３７】
発現を可能にするために転写および／または翻訳配列、例えば、発現ベクターに作動可能に連結された、本明細書に記載のFZDおよび／またはWnt核酸を含む遺伝子構築物(例えば、ベクターおよびプラスミド)もまた、本発明に含まれる。選択された核酸、例えば、FZDまたはWntポリペプチドをコードするDNA分子は、それが、他の分子が、選択された核酸の転写および／または翻訳を方向付けることが可能であるような方法で配置される場合に、別の核酸分子、例えば、プロモーターに「作動可能に連結される」。例えば、選択された核酸は、他の核酸分子に隣接して配置することができる。
【００３８】
本明細書に記載されるFZDおよび／またはWnt核酸を含む種々の操作させた細胞もまた、本発明に含まれる。例えば、本発明は、形質転換された宿主細胞、すなわち、組換えDNA技術を用いて、FZDおよび／またはWntポリペプチドをコードする核酸が導入された細胞(またはその先祖に導入された細胞)を含む。原核生物と真核生物の両方の細胞には、例えば、哺乳動物細胞(例えば、肝臓細胞)、真菌類、および細菌(例えば、大腸菌(Escherichia coli))などが含まれる。本発明に含まれる例示的な型の操作された細胞は、FZD7導入遺伝子を過剰発現する肝臓細胞である。
【００３９】
「FZDを過剰発現する」細胞は、特定のFZDタンパク質、例えば、FZD7および／または8の発現が、それぞれ、同じ組織型における非癌性細胞または非トランスジェニック細胞におけるレベルの少なくとも約1.5倍、例えば、少なくとも約2、3、4または5倍である癌細胞および／またはトランスジェニック細胞である。ある態様において、細胞中のFZD発現は、異なる組織型の非癌性細胞もしくは非トランスジェニック細胞、または異なる組織型の非癌性細胞もしくは非トランスジェニック細胞のパネルにおける発現と比較することができる。加えて、1つの型のFZDタンパク質(例えば、FZD7)の発現は、同じ細胞における他のFZDタンパク質と比較することができる。特定の遺伝子の発現のレベルを決定するための方法は当技術分野において周知である。このような方法には、RT-PCR、リアルタイムPCRおよび遺伝子産物に対する抗体の使用が含まれるがこれらに限定されない。
【００４０】
特定のFZDおよびWntポリペプチドの使用もまた、本発明に含まれる。本発明において使用されるFZDポリペプチドの例は、ヒトおよびマウスのFZDポリペプチド、例えば、それぞれSEQ ID NO:1および3、ならびにそれぞれSEQ ID NO:4および6に示されるものである。本発明において使用されるWntポリペプチドの例は、ヒトおよびマウスのWnt3、8bおよび11ポリペプチド、例えば、SEQ ID NO:7、13、14、20、21および27に示されるものである。FZDおよびWntポリペプチドの特定のフラグメント、例えば、SEQ ID NO:1、3、4、6、7、13、14、20、21および27のフラグメントもまた本発明において使用される。FZDおよびWntポリペプチドのフラグメントは、少なくとも1つの結合ドメイン、または全長FZDおよびWntポリペプチドの他の有用な部分を含んでもよい。例えば、FZdおよびWntポリペプチドの有用なフラグメントには、結合活性を有するフラグメント(例えば、SEQ ID NO:2、5、8〜12、15〜19、および22〜26)が含まれるがこれらに限定されない。
【００４１】
「タンパク質」および「ポリペプチド」という用語は、両方とも、長さまたは翻訳後修飾(例えば、グリコシル化またはリン酸化)に関わりなく、アミノ酸の任意の鎖をいう。従って、「フリッツルドタンパク質」「Wntタンパク質」「フリッツルドポリペプチド」および「Wntポリペプチド」という用語は、全長の天然に存在する単離されたタンパク質、ならびに全長の天然に存在するタンパク質に対応する組換え的または合成的に産生されたポリペプチド、または全長の天然に存在するポリペプチドもしくは合成ポリペプチドのフラグメントを含む。
【００４２】
上記に議論されるように、「フリッツルドポリペプチド」および「Wntポリペプチド」という用語は、天然に存在するか、または合成のFZDおよびWntポリペプチドの生物学的に活性なフラグメントをそれぞれ含む。タンパク質のフラグメントは、当業者に公知である任意の種々の方法によって、例えば、組換え的に、タンパク質消化によって、または化学合成によって産生することができる。タンパク質の内部または末端のフラグメントは、そのポリペプチドをコードする核酸の一方の末端(末端フラグメントについて)または両方の末端(内部フラグメントについて)から1つまたは複数のヌクレオチドを除去することによって生成することができる。このような変異誘発されたDNAの発現は、ポリペプチドフラグメントを産生することができる。「末端を削る(end-nibbling)」エンドヌクレアーゼを用いる消化は、フラグメントのアレイをコードするDNAを生成することができる。タンパク質のフラグメントをコードするDNAもまた、例えば、ランダム剪断、制限消化、オリゴヌクレオチドの化学合成、ポリメラーゼ連鎖反応を使用するDNAの増幅、または上記に議論される方法の組み合わせによって生成することができる。フラグメントは、当技術分野において公知の技術、例えば、慣用的なメリフィールド固相FMOCまたはt-Bocケミストリーを使用して化学合成することができる。
【００４３】
精製または単離された化合物は、関心対象の化合物、例えば、FZDポリペプチド、Wntポリペプチド、または抗体が重量で少なくとも60%である組成物である。例えば、調製物は、関心対象の化合物が、重量で少なくとも75%(例えば、少なくとも90%、95%、または99%でさえ)であり得る。純度は、当技術分野において公知である任意の適切な方法、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、またはHPLC分析によって測定することができる。
【００４４】
特定の態様において、FZDおよびWntポリペプチドは、天然に存在するFZDおよびWntポリペプチドのすべてまたは一部に実質的に同一である配列を含む。本明細書に記載されるFZDおよびWntポリペプチド配列に「実質的に相同」であるポリペプチドは、SEQ ID NO:1〜27によって表されるアミノ酸配列に対して少なくとも65%(例えば、少なくとも75%、80%、85%、90%、95%または99%、例えば、100%)相同である(本明細書に記載されるように測定される)アミノ酸配列を有する。比較の目的のために、参照FZDおよびWntポリペプチド配列の長さは、少なくとも16アミノ酸、例えば、少なくとも20または25アミノ酸であり得る。
【００４５】
「保存性アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で規定されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸(例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン)、酸性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸)、電荷を有さない極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン)、非極性側鎖を有するアミノ酸(例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン)、β分枝側鎖を有するアミノ酸(例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン)、および芳香族側鎖を有するアミノ酸(例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン)が含まれる。
【００４６】
本発明はまた、FZD(例えば、FZD7および／または8)またはWnt(例えば、Wnt3、8bおよび／または11)ポリペプチドが関連性のないポリペプチド(例えば、マーカーポリペプチドまたは融合パートナー)と融合されて、融合タンパク質を作製する、融合タンパク質(およびこのような融合タンパク質をコードする核酸)の使用を含む。例えば、ポリペプチドは、細菌で発現されるポリペプチドの精製を容易にするためにヘキサヒスチジンタグもしくはFLAGタグに融合されることができ、または真核生物細胞中で発現されるポリペプチドの精製を容易にするためにヘマグルチニンタグもしくはFLAGタグに融合されることができる。本発明はまた、例えば、第1の部分および第2の部分を含む単離されたポリペプチド(およびこれらのポリペプチドをコードする核酸)の使用を含み、ここで、この第1の部分は、例えば、FZDまたはWntポリペプチドを含み、この第2の部分は、関連性のないポリペプチド、例えば、免疫グロブリン定常(Fc)領域または検出可能なマーカーを含む。
【００４７】
融合パートナーは、例えば、分泌を容易にするポリペプチド、例えば、分泌配列であり得る。このような融合ポリペプチドは、典型的には、プレタンパク質と呼ばれる。分泌配列は、宿主細胞によって切断され、成熟タンパク質を形成することができる。不活性プレタンパク質を産生するためにポリペプチド配列に融合された、FZDおよび／またはWntポリペプチドをコードする核酸もまた、本発明の中にある。プレタンパク質は、不活性化配列の除去によって、活性型のタンパク質に転換することができる。
【００４８】
II. 癌を検出するための方法
理論によって束縛されることはないが、種々のFZDタンパク質、例えば、FZD7および8、ならびにFZDリガンド、例えば、Wnt3および11は、癌、例えば、肝臓癌において重要であると思われる。特に、肝細胞は、形質転換のプロセスの間の初期に、例えば、HCCの発生の前に、FZD7およびWnt3を過剰発現すると思われる。同様に、このような細胞は、しばしば、FZD8および／またはWnt11を過小に発現する。Wnt3、8bおよび11はFZD7リガンドであると思われる。
【００４９】
従って、本発明は、癌を検出するための方法、患者における癌の存在および重症度(例えば、腫瘍の程度、および全身腫瘍組織量など)の診断の方法、患者の予後診断の決定を容易にする方法、および治療に対する患者の応答性を評価する方法(例えば、化学療法レジメン間またはその後の全身腫瘍組織量を評価することを通して、例えば、治療効果の測定を提供することによる)を提供する。
【００５０】
検出は、(例えば、非癌性細胞と比較して)癌細胞中で示差的に発現されるポリヌクレオチド(例えば、FZD7、FZD8、Wnt3および／またはWnt11ポリヌクレオチド)の検出、および／または癌細胞中で示差的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド(例えば、FZD7、FZD8、Wnt3および／またはWnt11ポリペプチド)の検出に基づくことができる。本発明の検出方法は、インビボまたはインビトロで、生物学的資料上で、例えば、単離された細胞および／または全体の組織上で行うことができる。
【００５１】
「生物学的資料」は、本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチド、例えば、FZD7タンパク質、ポリヌクレオチドまたは転写物を含む、生物学的組織または液体の試料である。このような試料には、例えば、肝臓、肺、リンパ節、結腸、胃、膵臓、胆管、小腸および／または食道から得られた組織が含まれるがこれらに限定されない。生物学的試料にはまた、生検および剖検試料のような組織の切片、組織学的目的のために取られた凍結切片、血液、血漿、血清、痰、糞便、涙液、粘液、胆汁、唾液、リンパ液、毛髪、皮膚などが含まれてもよい。生物学的試料にはまた、外植片、ならびに患者組織から誘導された初代細胞および／または形質転換細胞が含まれてもよい。生物学的試料は、典型的には、真核生物、例えば、チンパンジーもしくはヒトのような霊長類;ウシ;ウマ;ヤギ;ヒツジ;イヌ;ネコ;齧歯類、例えば、モルモット、ラットもしくはマウス;ウサギ;鳥類;爬虫類;または魚類から得られる。試料は、通常、動物から細胞の試料を取り出すことによって提供されるが、以前に単離された(例えば、別の人によって、別の時間に、および／または別の目的のために単離された)細胞を提供することによって、またはインビボで本発明の方法を実施することによってもまた、達成することができる。治療および結果の履歴を有する長期保存の組織を使用することができる。
【００５２】
ある態様において、癌細胞中で示差的に発現される転写物(例えば、FZD7、FZD8、Wnt3および／またはWnt11転写物)の細胞中での発現を検出することによって、癌細胞を検出するための方法が提供される。検出のための任意の種々の公知の方法を使用することができ、これには、適切なハイブリダイゼーションプローブとのmRNAのハイブリダイゼーションによる転写物の検出;特異的オリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応による転写物の検出;および適切なハイブリダイゼーションプローブを使用するインサイチューハイブリダイゼーションが含まれるがこれらに限定されない。これらの方法は、癌細胞中で示差的に発現される遺伝子のmRNAレベルを検出および／または測定するために使用することができる。ある態様において、これらの方法は以下を含む:a)ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、本明細書に記載される示差的に発現される遺伝子に対応するポリヌクレオチドと、試料を接触させる工程;およびb)もしあれば、ハイブリダイゼーションを検出する工程。
【００５３】
示差的ハイブリダイゼーションの検出は、適切な対照と比較した場合、癌細胞中で示差的に発現されるポリヌクレオチドの試料中での存在の表示である。適切な対照には、例えば、癌細胞ではない試料、癌細胞中で示差的に発現されるポリヌクレオチドを含まないことが知られている試料、および癌細胞中で示差的に発現されるポリヌクレオチドと同じ「センス」の標識ポリヌクレオチドの使用が含まれる。ハイブリダイゼーションを可能にする条件は当技術分野において公知であり、上記により詳細に記載されてきた。検出はまた、インサイチューハイブリダイゼーション、PCR(ポリメラーゼ連鎖反応)および／もしくはRT-PCR(逆転写PCR)、または公知の技術の組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の公知の方法によって達成することができる。ポリヌクレオチドについての種々の標識および標識方法は当技術分野において公知であり、本明細書のアッセイ方法において使用することができる。ハイブリダイゼーションの特異性は、適切な対照に対する比較によって決定することができる。
【００５４】
少なくとも10nt、少なくとも12nt、または少なくとも15個の連続するヌクレオチドの本明細書に記載されるポリヌクレオチドを一般的に含むポリヌクレオチド、例えば、本明細書に示されるような配列を有するものが、種々の目的、例えば、癌細胞中で示差的に発現されるポリヌクレオチドの転写レベルの検出および／または測定のためのプローブまたはPCRプライマーのために使用することができる。当業者によって認識されるように、プローブは、検出可能に標識され、かつ試験試料(例えば、mRNA)から得られる固定化ポリヌクレオチドを含むアレイと接触されることができる。または、プローブは、アレイ上に固定化することができ、試験試料は検出可能に標識することができる。本発明の方法のこれらおよび他のバリエーションの使用は、十分に当業者の範囲内にあり、本発明の範囲内にある。
【００５５】
ヌクレオチドプローブは、提供されたポリヌクレオチドに対応する遺伝子の発現を検出するために使用することができる。ノーザンブロットにおいて、mRNAは電気泳動により分離され、プローブと接触される。プローブは、特定のサイズのmRNA種にハイブリダイズするとして検出される。ハイブリダイゼーションの量は、発現の相対量を決定するために定量することができる。プローブは、発現を検出するために、細胞へのインサイチューハイブリダイゼーションのために使用することができる。プローブはまた、ハイブリダイズする配列の診断的検出のために、インビボで使用することができる。プローブは、放射性同位元素または他の型の検出可能な標識、例えば、発色団、蛍光団、および／もしくは酵素で標識することができる。ヌクレオチドハイブリダイゼーションアッセイ法の他の例は、WO92/02526および米国特許第5,124,246号に記載されている。
【００５６】
PCRは、少量の標的核酸を検出するための別の手段である(例えば、Mullis et al., Meth. Enzymol. (1987) 155:335; 米国特許第4,683,195号; および米国特許第4,683,202号を参照されたい)。標的核酸とハイブリダイズする2つのプライマーオリゴヌクレオチドが、反応を開始するために使用することができる。これらのプライマーは、本明細書に記載されるポリヌクレオチドの内部の配列、またはこれに対して3'および5'である配列から構成され得る。標準的PCR法による標的の増幅後、増幅された標的核酸は、当技術分野で公知の方法、例えば、サザンブロットによって検出することができる。mRNAまたはcDNAはまた、Sambrook et al.,「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989)に記載されるような伝統的なブロッティング技術(例えば、サザンブロット、ノーザンブロットなど)によって(PCR増幅なしで)検出することができる。一般的に、ポリメラーゼ酵素を使用してmRNAから生成されたmRNAまたはcDNAは、ゲル電気泳動を使用して精製および分離することができ、ならびにニトロセルロースのような固体支持体に転写することができる。固体支持体は、標識されたプローブに曝露し、およびハイブリダイズしていない任意のプローブを除去するために洗浄することができる。次いで、標識されたプローブを含む二重鎖を検出することができる。
【００５７】
PCR増幅を使用する方法は、1つまたは複数の細胞からのDNAに対して実施することができる。ポリメラーゼ連鎖反応の使用は、Saiki et al. (1985) Science 239:487に記載されており、技術の概説は、Sambrook et al.,「Molecular Cloning: A Laboratory Manual」(New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989; 14.2-14.33頁に見い出される。検出可能な標識は増幅反応に含めてもよい。適切な検出可能な標識には、蛍光色素(例えば、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、6-カルボキシルフルオレセイン(6-FAM)、2',7'-ジメトキシ-4',5'-ジクロロ-6-カルボキシフルオレセイン、6-カルボキシ-X-ローダミン(ROX)、6-カルボキシ-2',4,4',5',7,7',-ヘキサクロロフルオレセイン(HEX)、5-カルボキシフルオレセイン(5-FAM)またはN,N,N',N'-テトラメチル-6-カルボキシローダミン(TAMRA))、放射活性標識(例えば、32P、35S、3Hなど)が含まれる。標識は、2段階系であってもよく、ここでは、ポリヌクレオチドが、高親和性結合パートナー、例えば、アビジン、特異的抗体などを有するビオチン、ハプテンなどに結合体化され、ここで、結合パートナーは、検出可能な標識に結合体化される。この標識は、一方または両方のプライマーに結合体化されてもよい。または、増幅において使用されるヌクレオチドのプールは、増幅生成物に標識を取り込むように標識される。
【００５８】
1つの態様において、発現標識は、リアルタイムPCRを使用することによって評価される。RNAは、関心対象の試料から単離される。PCRプライマーは、関心対象の特異的遺伝子を増幅するように設計される。PCR産物の蓄積は、二重標識された蛍光発生的なオリゴヌクレオチドプローブを使用して測定される。このプローブは、2つの異なる蛍光色素、5'末端レポーター色素および3'末端クエンチング色素を用いて標識される。このオリゴヌクレオチドプローブは、PCRアンプリコン中に存在する内部標的配列に相同であるように選択される。プローブが無傷である場合、エネルギー移動が2つの蛍光団の間で起こり、蛍光発光がクエンチングされる。PCRの伸長相の間で、プローブはTaqポリメラーゼの5'ヌクレアーゼ活性によって切断される。それゆえに、レポーターは、もはやクエンチャーの近傍にはなく、発光強度の増加が測定される。リアルタイムPCRを使用してFZD発現を検出するための例示的な方法は、以下の実施例の節で提供される。プライマーはまた、他の方法、例えば、RT-PCRにおいて使用することができる。このアッセイ法は、核酸の定量的測定を提供する。
【００５９】
他の態様において、細胞によって示差的に発現されるタンパク質(例えば、FZD7、FZD8、Wnt3および／またはWnt11タンパク質)の発現を検出することによって癌細胞を検出するための方法が提供される。任意の種々の公知の方法が検出のために使用可能であり、これには、例えば、ELISAおよび／またはウェスタンブロッティング法において有用であるような、結合する化合物、例えば、抗体またはその抗原結合フラグメントを使用する方法が含まれるがこれらに限定されない。このような抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナルであり得、検出可能なマーカー(例えば、蛍光団、色素団または放射性同位元素など)で標識することができる。適切な場合、化合物は、ビーズ、プレート、フィルター、樹脂などの固体支持体に結合することができる。化合物／標的複合体の形成の決定は、第1の化合物(または複合体)に特異的に結合するさらなる化合物(例えば、二次抗体)と複合体を接触させることによってもたらすことができる。第1の化合物と同様に、さらなる化合物は、固体支持体に結合させることができ、および／または検出可能なマーカーで標識することができる。
【００６０】
本明細書に記載される検出方法を実施するために必要とされる材料は、キットの一部として提供することができる。従って、本発明は、生物学的試料において、癌細胞中で示差的に発現されるポリヌクレオチドを検出するため(例えば、関心対象の示差的に発現された遺伝子によってコードされるmRNAの検出によって)、およびそれによってコードされるポリペプチドの存在および／またはレベルを検出するためのキットを提供する。これらのキットを使用する手法は、臨床研究室、実験研究室、医療実務者、または私人によって実施することができる。癌細胞中で示差的に発現されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを検出するための本発明のキットは、ポリペプチドを特異的に結合する部分、例えば、抗体を含んでもよい。癌細胞中で示差的に発現されるポリヌクレオチドを検出するために使用される本発明のキットは、このようなポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズする部分を含んでもよい。このキットは、手法において有用である付加的な成分、例えば、緩衝剤、発色剤、標識、反応表面、検出のための手段、対照試料、標準、説明書、および解釈情報を任意に提供してもよい。
【００６１】
本発明はさらに、哺乳動物(例えば、ヒト)における新生物または前新生物状態を検出／診断する方法に関する。「診断」とは、本明細書で使用される場合、疾患または障害に対する患者の感受性の決定、被験体が疾患または障害によって現在影響を受けているか否かに関する決定、疾患または障害によって影響を受ける被験体の予後診断(例えば、前転移性または転移性癌状態、癌の段階、または治療に対する癌の応答性の同定)、および治療計量(therametrics)(例えば、治療の効果または効力に関する情報を提供するために被験体の状態をモニターすること)を一般的に含む。
【００６２】
1つの例示的な検出／診断法は以下を含む:(a)哺乳動物(例えば、ヒト)から生物学的試料(例えば、肝臓組織)を入手する工程、(b)FZD7、FZD8、Wnt3および／またはWnt11遺伝子産物(例えば、タンパク質またはmRNA)の存在を試料中で検出する工程、および(c)FZD7、FZD8、Wnt3および／またはWnt11遺伝子産物の量を、対照試料中の量と比較する工程。この方法に従って、試料中でのFZD7および／もしくはWnt3遺伝子産物のレベルの上昇、ならびに／またはFZD8および／もしくはWnt11遺伝子産物のレベルの減少の存在は、被験体が新生物状態または前新生物状態、例えば、肝臓癌または肝臓癌を発症するリスクを有することを示す。
【００６３】
FZD7および／もしくはWnt3タンパク質のレベルの上昇、ならびに／またはFZD8および／もしくはWnt11タンパク質のレベルの減少の同定は、本発明に従って、特定化された治療から恩恵を得る可能性がある患者の同定を可能にする。例えば、一次療法後の被験体(例えば、手術を受けた被験体)からの生物学的試料を、FZD7および／もしくはWnt3タンパク質のレベルの上昇、ならびに／またはFZD8および／もしくはWnt11タンパク質のレベルの減少の存在についてスクリーニングすることができ、このようなレベルは、残渣の腫瘍組織を示す。同様に、外科的に除去された腫瘍の切除部位の周辺の組織(例えば、腫瘍周囲組織)を試験することができ(例えば、免疫蛍光によって)、FZD7および／もしくはWnt3のレベルの上昇、ならびに／またはFZD8および／もしくはWnt11のレベルの減少の存在(周囲の組織と比較して)は、この組織中の疾患の潜在的な発生、または腫瘍の不完全な除去を示す。このような患者を同定する能力は、治療を特定の患者の要求に合わせたものにすることを可能にする。非外科的治療、例えば、化学療法または放射線療法を受けている被験体もまたモニターすることができ、このような被験体からの試料中でのFZD7および／もしくはWnt3のレベルの上昇、ならびに／またはFZD8および／もしくはWnt11のレベルの減少の存在は、継続した治療の必要性を示す。当業者はまた、癌(例えば、肝臓癌)の段階付けが、治療レジメンを最適化する目的のために、本明細書に記載される方法を使用して実施可能であることを認識する。
【００６４】
III. 癌を治療することが可能である化合物を同定するための方法
本発明は、癌、例えば、肝臓癌を治療する能力について試験化合物をスクリーニングするための方法を提供する。「試験化合物」は、本明細書に記載される場合、本明細書に記載される方法を使用してスクリーニングできる任意の化合物である。例えば、試験化合物は、例えば、有機または無機の小分子(1,000Da未満の分子量)であり得る。代替としてまたは加えて、試験化合物は、ポリペプチド(例えば、ランダムなもしくは所定のアミノ酸配列を有するポリペプチド、または天然に存在するかもしくは合成のポリペプチド)、または核酸、例えば、DNAもしくはRAN分子であり得る。試験化合物は、天然に存在するか(例えば、ハーブまたは天然物)もしくは合成であることが可能であり、または天然の化合物と合成の化合物の両方を含むことが可能である。試験化合物は、モルあたり約10,000グラム未満、モルあたり約5,000グラム未満、モルあたり約1,000グラム未満、またはモルあたり約500グラム未満の式量を有することができる。試験化合物は、例えば、任意の有機化合物または無機化合物(例えば、ヘテロ有機化合物または有機金属化合物)、アミノ酸、アミノ酸アナログ、ポリペプチド、ペプチド模倣物(例えば、ペプトイド)、オリゴペプチド(例えば、約5〜約25個のアミノ酸の長さ、好ましくは約10〜20個または12〜18個のアミノ酸の長さ、好ましくは12、15、または18個のアミノ酸の長さ)、ヌクレオチド、ヌクレオチドアナログ、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドアナログ、リボザイム、サッカリド、脂質(例えば、スフィンゴ脂質)、および／または脂肪酸、またなこれらの任意の組み合わせであり得る。
【００６５】
Wnt/FZDシグナル伝達(例えば、Wnt/FZD7シグナル伝達)の「アンタゴニスト」または「阻害剤」という用語は、Wntタンパク質(例えば、Wnt3、8、および／または11)および／もしくはFZD受容体(例えば、FZD7)化合物に結合し、ならびに／または、Wnt/FZDについての公知のアッセイ法(例えば、β-カテニンレベル、TcfおよびLef転写因子によって制御されるオンコジーン発現、または他の下流のWnt／フリッツルドで調節される遺伝子産物の測定)において測定されるように、Wnt/FZDシグナル伝達(例えば、Wnt/FZD7シグナル伝達)を、部分的にもしくは全体的にブロックもしくは阻害する化合物をいう。阻害剤には、例えば、WntまたはFZDタンパク質に対して指向される抗体(抗Wnt3抗体の1つの例は、以下の実施例の節に記載される)、WntまたはFZDタンパク質の修飾版、天然に存在するリガンドおよび合成リガンド、アンタゴニスト、アゴニスト、抗体、および小化学分子などが含まれる。阻害剤またはアンタゴニストを検出するためのアッセイ法は以下により詳細に記載される。
【００６６】
試験化合物のライブラリー
特定の態様において、本発明のスクリーニングは、試験化合物のライブラリーを使用する。「ライブラリー」は、1つまたは複数の出発化合物の種々の組み合わせから合成された化合物の収集物(例えば、混合物または物理的に分離された個々の化合物として)である。少なくともいくつかの化合物が、ライブラリー中の他の化合物の少なくともいくつかと異なってなくてはならない。ライブラリーは、例えば、5、10、50、100、1000、さらにまたは10,000、50,000、または100,000、またはそれ以上の異なる化合物を含むことができる(すなわち、同じ化合物の単なる複数のコピーではないが、ライブラリー中のある化合物は、1回より多く複製され、または表される)。異なる化合物の各々は、その存在がある手段によって決定可能であるような、例えば、単離され、分析され、および／または受容体もしくは適切なプローブを用いて検出されることが可能であるような量で存在する。その存在が決定可能であるように必要とされる各々の異なる化合物の実際の量は、使用される実際の手法によって変化し、単離、検出、および分析のための技術が進歩するのに従って変化する可能性がある。化合物が、実質的に等モル量で、混合物中に存在する場合、例えば、100ピコモルの各々の化合物がしばしば検出可能である。ライブラリーは、個々の化合物のライブラリー(例えば、並行合成またはプールおよびスプリットプール法により作った、ウェルあたりの単一型の化合物として実質的に存在する)と、実質的に等モル量の各々の所望の化合物を含む混合物(単一の化合物が優勢ではない)の両方を含むことができる。各ライブラリー形式は、アッセイ法において発見された活性化合物の同定を可能にする。
【００６７】
試験化合物は、個々にまたは並行してスクリーニングすることができる。並行スクリーニングの1つの例は、化学物質の大きなライブラリーの高処理能力薬物スクリーニングである。候補化合物のこのようなライブラリーは、例えば、Chembridge Corp., San Diego, CAから、作製または購入することができる。または、実験の前および事例的な証拠は、増強された潜在能力の化合物のクラスまたはカテゴリーを示唆することができる。ライブラリーは、このような化学物質のクラスを網羅するように設計および合成することができる。
【００６８】
コンビナトリアルライブラリーの合成は当技術分野において周知であり、概説されている(例えば、以下を参照されたい:E.M. Gordon et al., J. Med. Chem. (1994) 37:1385-1401 ; DeWitt, S. H.; Czarnik, A. W. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 114; Armstrong, R. W.; Combs, A. P.; Tempest, P. A.; Brown, S. D.; Keating, T. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29:123; Ellman, J. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29:132; Gordon, E. M.; Gallop, M. A.; Patel, D. V. Acc. Chem. Res. (1996) 29:144; Lowe, G. Chem. Soc. Rev. (1995) 309, Blondelle et al. Trends Anal. Chem. (1995) 14:83; Chen et al. J. Am. Chem. Soc. (1994) 116:2661; 米国特許第5,359,115号, 同第5,362,899号, および同第5,288,514号; PCT公開番号WO92/10092, WO93/09668, WO91/07087, WO93/20242, WO94/08051)。
【００６９】
化合物のライブラリーは種々の方法に従って調製することができ、このうちのいくつかは当技術分野において公知である。例えば、「スプリットプール」ストラテジーは、以下の方法で実施することができる。官能基化ポリマー支持体のビーズを複数の反応容器中に配置し;固相ペプチド合成のために適切である種々のポリマー支持体は公知であり、いくつかは市販されている(例えば、M. Bodansky「Principles of Peptide Synthesis」, 2nd edition, Springer- Verlag, Berlin (1993)を参照されたい)。各々のビーズのアリコートに、異なる活性化アミノ酸の溶液を加え、反応を進行させて、1つの反応容器中に1つ、複数の固定化アミノ酸を生じさせる。次いで、誘導体化されたビーズのアリコートを洗浄し、「プールし」(すなわち、再結合し)、およびビーズのプールを再度分け、各アリコートを別々の反応容器中に配置する。次いで、別の活性化アミノ酸を、各々のビーズのアリコートに加える。合成のサイクルを、所望のペプチドの長さが得られるまで反復する。各合成サイクルにおいて加えられるアミノ酸残基はランダムに選択することができ;または、アミノ酸は、「偏った」ライブラリー、例えば、阻害剤の特定の部分がランダムでなく選択されるライブラリーを提供するために、例えば、抗体、例えば、抗イディオタイプ抗体抗原結合部位と相互作用することが可能である既知のペプチドに対する構既知の造的な類似性または相同性を有する阻害剤を提供するために、選択することができる。
【００７０】
「スプリットプール」ストラテジーは、本発明の試験化合物のライブラリーを調製するために使用することができる、ペプチド、例えば、モジュレーターのライブラリーを生じることができる。別の例示的な合成において、「ダイバーソマー(diversomer)ライブラリー」が、Hobbs De Wittら (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 (1993))の方法によって作製される。Houghten (例えば、Houghten et al., Nature 354:84-86 (1991)を参照されたい)の「ティーバッグ(tea-bag)」技術を含む他の合成方法もまた、本発明に従って化合物のライブラリーを合成するために使用することができる。
【００７１】
化合物のライブラリーは、ライブラリーの任意のメンバーが所望の活性を有するか否かを決定するため、およびもしそうであれば、活性種を同定するために、スクリーニングすることができる。コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングする方法は記載されている(例えば、Gordon et al., J Med. Chem., 前出を参照されたい)。可溶性化合物ライブラリーは、受容体についてのリガンドを単離するために、適切な受容体を用いて、アフィニティークロマトグラフィーによってスクリーニングすることができ、続いて、コンビナトリアル技術によって単離されたリガンドの同定を行う(例えば、質量スペクトル測定、およびNMRなど)。固定化された化合物は、可溶性受容体と化合物を接触させることによってスクリーニングすることができ;好ましくは、可溶性受容体は、リガンド結合を示すために検出可能である標識(例えば、蛍光団、比色分析用酵素、放射性同位元素、および発光化合物など)に結合体化される。または、固定化化合物は、選択的に放出され、膜を通して拡散されて受容体と相互作用することができる。試験化合物のライブラリーをスクリーニングするために有用な例示的なアッセイ法は以下に記載される。
【００７２】
スクリーニング方法
本発明は、癌、例えば、肝臓癌を治療することが可能な化合物を同定するための方法を提供する。出願人らは、関連する生物学的メカニズムに関する任意の特定の理論によって束縛されることを意図しないが、このような化合物は、(1)Wnt/FZDシグナル伝達(例えば、FZD7、Wnt3、Wnt8bおよび／もしくはWnt11ポリペプチドに結合することによって、ならびに／またはWnt/FZD媒介性転写を減少する(例えば、妨害する)ことによって)ならびに／または(2)FZD7、FZD8、Wnt3、および／もしくはWnt11の発現を特異的に調節すると考えられている。
【００７３】
本発明の特定の局面において、このような化合物のスクリーニングは、(i)FZD7、Wnt3、Wnt8bおよび／もしくはWnt11に結合し、FZD7とそのリガンド(例えば、Wnt3、Wnt8bおよび／もしくはWnt11)の間の相互作用を調節(すなわち、増加または減少)し、ならびに／またはFZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8bおよび／もしくはWnt11の転写および／もしくは翻訳を調節(すなわち、増加または減少)する化合物を、試験化合物の群から同定すること;ならびに、任意に(ii)このような化合物を、Wnt/FZDシグナル伝達を調節し、癌細胞運動性を減少し、癌細胞中でのβ-カテニン蓄積を減少し、および／もしくは癌をインビトロもしくはインビボで治療するそれらの能力について試験することによって達成される。FZD7、Wnt3、Wnt8bおよび／もしくはWnt11ポリペプチドに結合し、FZD7およびそのリガンド(例えば、Wnt3、Wnt8bおよび／もしくはWnt11)との間の相互作用を調節し、またはFZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8bおよび／もしくはWnt11の転写および／もしくは翻訳を調節する試験化合物は、本明細書では、「候補抗癌剤」と呼ばれる。さらに試験され、インビトロまたはインビボでWnt/FZDシグナル伝達を調節し、癌細胞運動性を減少し、癌細胞中でのβ-カテニン蓄積を減少し、および／または癌を治療することが可能であることが見い出された候補抗癌剤は、「抗癌剤」とみなされる。本発明のスクリーニング方法において、候補抗癌剤は、これらが抗癌剤であるか否かを決定するために試験されることが可能であるが、必ずそうされなくてはならないわけではない。本発明のアッセイ法は、生物学的試料、全体の細胞調製物、および／またはエクスビボ無細胞系で実行されてもよい。
【００７４】
1つの局面において、本発明は、FZDポリペプチド、例えば、FZD7ポリペプチド、ならびに／またはWntポリペプチド、例えば、Wnt3、8bおよび／もしくは11ポリペプチドに結合する化合物を同定するために試験化合物をスクリーニングするための方法を含む。FZDまたはWntポリペプチドへの試験化合物の結合は、例えば、基材、例えば、96ウェルポリスチレンマイクロタイタープレートのウェルの表面上に、試験化合物またはWntもしくはFZDポリペプチドを可逆的にまたは不可逆的に固定化することによって、インビトロで検出することができる。ポリペプチドおよび他の小分子を固定化するための方法は当技術分野において周知である。例えば、マイクロタイタープレートは、各ウェルに、溶液中でポリペプチドを加えること(典型的には、1〜100μlの体積中で0.05〜1mg/mlの濃度で)、および所定の時間、例えば、0.1〜36時間の間、プレートを室温〜37℃でインキュベートすることによって、FZDまたはWntポリペプチドで被覆することができる。プレートに結合しないポリペプチドは、過剰の溶液を振盪することによって、および次いで、水または緩衝液でプレートを洗浄すること(1回または反復して)によって、プレートから除去することができる。典型的には、ポリペプチドは、水または緩衝液中にある。次いで、プレートは、結合したポリペプチドを欠く緩衝液で洗浄することができる。プレート上の遊離のタンパク質結合部位をブロックするために、結合したポリペプチドとは関係のないタンパク質を用いて、プレートをブロックすることができる。例えば、Tris-HCl中2mg/mlの濃度の300μlのウシ血清アルブミン(BSA)を使用することができる。適切な基材には、規定された架橋ケミストリーを含む基材(例えば、Corning Costar Corp. (Cambridge, MA)からのポリスチレン、スチレン、またはポリプロピレン基材のようなプラスチック基材)が含まれる。所望される場合、粒子、例えば、ビーズ状アガロースまたはビーズ状セファロースが、基材として使用することができる。次いで、試験化合物を、被覆されたプレートに加え、FZDまたはWntポリペプチドに結合させることができる(例えば、37℃、0.5〜12時間)。次いで、プレートを、上記のようにすすぐことができる。当業者は、この方法の多くのバリエーションが可能であることを認識している。例えば、この方法は、基材を試験化合物で被覆する工程、およびWntまたはFZDポリペプチドを、基材結合化合物に加える工程を含むことができる。
【００７５】
第2の化合物、例えば、上記に記載される試験化合物、または結合パートナー(例えば、FZD7からWnt3、8bおよび／または11;以下にさらに詳細に議論される)へのFZDまたはWntの結合は、任意の種々の当技術分野で公知の方法によって検出することができる。例えば、FZDまたはWntポリペプチドに特異的に結合する抗体(すなわち、抗FZD抗体または抗Wnt抗体、例えば、実施例の節に記載されるポリクローナル抗Wnt3抗体)は、イムノアッセイ法において使用することができる。所望される場合、抗体は標識され(例えば、蛍光的に、または放射性同位元素を用いて)、直接的に検出される(例えば、West and McMahon, J. Cell Biol. 74:264, 1977を参照されたい)。または、二次抗体が検出のために使用することができる(抗FZDまたは抗Wnt抗体のFc部分に結合する標識された抗体)。代替の検出方法において、FZDまたはWntポリペプチドは標識され(例えば、放射性同位元素、蛍光団、または発色団などを用いて)、標識が検出される。なお別の方法において、FZDまたはWntポリペプチドは、光学的に検出することができるタンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質(これはUV光下で検出することができる)との融合タンパク質として産生される。代替の方法において、ポリペプチドは、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、またはグルコースオキシダーゼのような検出可能な酵素活性を有する酵素との融合タンパク質として産生される。これらの酵素をコードする遺伝子のすべてはクローニングされ、当業者による使用のために利用可能である。所望される場合、融合タンパク質は、従来的な方法を使用して、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を用いて検出および測定することができる抗原またはエピトープを含むことができる。適切な抗原には、酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、およびβ-ガラクトシダーゼ)および非酵素ポリペプチド(例えば、BSAおよびグロブリンのような血清タンパク質、およびカゼインのような乳タンパク質)が含まれる。
【００７６】
FZDまたはWntポリペプチドに結合するポリペプチド(例えば、試験ポリペプチド)を同定するための種々の方法において、タンパク質／タンパク質相互作用の従来的なツーハイブリッドアッセイ法を使用することができる(例えば、Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88:9578, 1991; Fields et al.,米国特許第5,283,173号; Fields and Song, Nature, 340:245, 1989; Le Douarin et al., Nucleic Acids Research, 23:876, 1995; Vidal et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 93:10315-10320, 1996; およびWhite, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93:10001-10003, 1996を参照されたい)。一般的に、ツーハイブリッド法は、転写因子の2つの別々のドメインの再構成を含む。1つの融合タンパク質は、転写因子(例えば、Gal4)のトランス活性化ドメインまたはDNA結合ドメインのいずれかに融合されたFZDまたはWntポリペプチドを含む。他方の融合タンパク質は、転写因子のDNA結合ドメインまたはトランス活性化ドメインのいずれかに融合された、試験化合物または第1の融合タンパク質中に含まれるポリペプチドについての結合パートナーを含む。試験ポリペプチドまたは結合パートナーへの、FZDまたはWntポリペプチドの結合は、転写因子を再構成する。転写因子の再構成は、転写因子のDNA結合ドメインによって結合されるDNA配列に作動可能に連結される遺伝子(すなわち、レポーター遺伝子)の発現を検出することによって検出することができる。種々のツーハイブリッド法を実施するためのキットが市販されている(例えば、Clontech; Palo Alto, CAから)。
【００７７】
別の局面において、本発明は、FZDポリペプチドとWntポリペプチドの間のタンパク質-タンパク質相互作用を調節する化合物を同定するために試験化合物をスクリーニングするための方法を含む。転写調節因子間のタンパク質-タンパク質相互作用を調節することが可能である化合物の高処理能力スクリーニングのために有用な方法は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Lepourcelet et al., Cancer Cell 5: 91-102 (2004)に記載されている。典型的には、第1の化合物が提供される。この第1の化合物はFZD(例えば、FZD7)ポリペプチドまたはWnt(例えば、Wnt3、8b、または11)ポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントである。第1の化合物とは異なる第2の化合物が提供され、標識される。第2の化合物はFZD(例えば、FZD7)ポリペプチドまたはWnt(例えば、Wnt3、8b、または11)ポリペプチドまたはその生物学的に活性なフラグメントである。試験化合物が提供される。第1の化合物、第2の化合物、および試験化合物は、互いに接触される。次いで、第1の化合物に結合した標識の量が決定される。結合した標識によって評価されるような、第1の化合物と第2の化合物の間のタンパク質-タンパク質相互作用の変化は、FZDポリペプチドとWntポリペプチドの間のタンパク質-タンパク質相互作用を調節する際の試験化合物の有用性を示す。
【００７８】
特定の態様において、提供される第1の化合物は、固体支持体に結合される。固体支持体には、例えば、樹脂(例えば、アガロースおよびビーズ)およびマルチウェルプレートが含まれる。特定の態様において、この方法は、結合した標識および結合していない標識を分離するために、接触工程の後に洗浄工程を含む。
【００７９】
特定の態様において、複数の試験化合物が、第1の化合物および第2の化合物に接触される。異なる試験化合物を、グループ内で、または別々に、他の化合物と接触させることができる。特定の態様において、各々の試験化合物が、個々のウェル中で、第1の化合物と第2の化合物の両方と接触される。例えば、この方法は、試験化合物のライブラリーをスクリーニングすることができる。試験化合物のライブラリーは、以下に詳細に議論される。ライブラリーは、例えば、天然物、有機化学物質、D-アミノ酸を含む、ペプチドおよび／もしくは修飾ペプチド、従来的なアミノ酸、ならびにN置換アミノ酸を含むことができる。典型的には、ライブラリーは、マルチウェルプレート、例えば、96ウェルプレート中でのスクリーニングと適合可能な型である。このアッセイ法は、工程の多くがコンピュータによって制御され、ロボット装置によって実行される、マルチウェル形式での自動化された実行のために特に有用である。ライブラリーはまた、他の形式、例えば、固体支持体に固定され、かつ微小滴への放出のために使用可能である合成化学ライブラリーで使用することができる。
【００８０】
特定の態様において、第1の化合物はFZD7ポリペプチドまたはそのフラグメントであり、第2の化合物はWntポリペプチド、例えば、Wnt3、8b、または11、またはそのフラグメントである。他の態様において、第1の化合物はWntポリペプチド、例えば、Wnt3、8b、または11、またはそのフラグメントであり、第2の化合物はFZD7ポリペプチドまたはそのフラグメントである。第1の化合物が結合する固体支持体は、例えば、セファロースビーズ、SPAビーズ(シンチラントを取り込むミクロスフェア)またはマルチウェルプレートであり得る。SPAビーズは、アッセイ法が洗浄工程なしで、例えば、シンチレーション近接アッセイ法において、実施される場合に使用することができる。セファロースビーズは、アッセイ法が洗浄工程と伴って実施される場合に使用することができる。第2の化合物は、その検出を可能にする任意の標識、例えば、放射性標識、蛍光剤、ビオチン、ペプチドタグ、または酵素フラグメントを用いて標識することができる。第2の化合物はまた、例えば、125Iまたは3Hを用いて、放射標識することができる。
【００８１】
特定の態様において、第1の化合物または第2の化合物に化学的に結合体化されるか、または第1の化合物または第2の化合物との融合タンパク質として発現される酵素の酵素活性は、結合したタンパク質を検出するために使用される。標準的な免疫学的方法が、結合したタンパク質を検出するために使用される結合アッセイ法もまた、含まれる。特定の他の態様において、WntおよびFZDのポリペプチドまたはそのフラグメントの相互作用は、FZDまたはWntポリペプチドに共有結合的に連結されたドナー蛍光団(例えば、FZDまたはWnt-GFPキメラタンパク質として発現される、FZDもしくはWnt、または緑色蛍光タンパク質（GFP）の改変体に化学的に結合体化された蛍光基)と、基質タンパク質に共有結合的に連結されたアクセプター蛍光団との間の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)によって検出され、ここで、蛍光団が、FZDおよびWntポリペプチドのタンパク質-タンパク質相互作用を通して密接な近位に運ばれる場合に、ドナー発光スペクトルおよびアクセプター励起スペクトルの適切な重複が存在し、効率的な非放射性エネルギー移動を与える。
【００８２】
他の態様において、タンパク質-タンパク質相互作用は、酵素、例えば、β-ガラクトシダーゼの再構成ドメインによって検出される(Rossi et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:8405-8410 (1997)を参照されたい)。
【００８３】
なお他の態様において、タンパク質-タンパク質相互作用は、細胞中の適切なFZDおよびWntポリペプチドのキメラ構築物の蛍光比率画像化(Bacskai et al, Science 260:222-226 (1993))によって、またはFZDおよびWntポリペプチドの適切な構築物を使用し、かつFZD/Wnt相互作用を阻害する化合物を検出するような高処理能力アッセイ法に合ったものにした仕立てたツーハイブリッドアッセイ法(Fearon et al, Proc Natl Acad Sci USA. 89:7958-7962 (1992); Takacs et al, Proc Natl Acad Sci USA 90:10375-10379 (1993); Vidal et al, Proc Natl Acad Sci USA 93:10321-10326 (1996))によって評価される。これらの態様は、試験化合物の細胞浸透性が保証される利点を有する。
【００８４】
例えば、1つのアッセイ法において、FZDまたはWntポリペプチドまたはそのフラグメントはELISAプレートに吸着される。次いで、FZDまたはWntポリペプチドは、試験化合物に曝露され、続いて、グルタチオン-S-トランスフェラーゼ(GST)-結合パートナー融合タンパク質、例えば、GST-FZDまたはWntポリペプチド融合タンパク質に曝露される。結合したタンパク質は、ヤギ抗-GST抗体、アルカリホスファターゼ(AP)結合抗ヤギIgG、およびAP基質を用いて検出される。タンパク質-タンパク質相互作用に干渉する化合物は、ELISAプレート中で減少したAPシグナルを生じる。
【００８５】
なお別の局面において、本発明は、FZDおよび／またはWntポリペプチドの発現を調節する(例えば、増加するかまたは減少する)試験化合物を同定する方法を提供する。この方法は、FZDおよび／またはWnt核酸を試験化合物と接触させる工程、および次いで、コードされたFZDおよび／またはWntポリペプチドの発現を測定する工程を含む。関連する局面において、本発明は、(a)FZDおよび／またはWnt核酸配列またはそのフラグメントまたはその対立遺伝子バリエーションを含む組換え構築物がその中に組み込まれた細胞株の中で;あるいは(b)天然に選択的にFZDおよび／またはWntを発現する細胞集団または細胞株の中で、試験化合物の存在下で、または試験化合物の添加後に、FZDポリペプチドの発現を測定する工程、ならびに次いで、FZDおよび／またはWntタンパク質の発現を測定する工程によって、FZDおよび／またはWntポリペプチドの発現を調節する(例えば、増加するかまたは減少する)試験化合物を同定する方法を特徴とする。
【００８６】
本明細書に記載されるFZDおよびWnt核酸が同定されたので、これらは、全体の細胞でこのようなアッセイ法を実行するために、種々の宿主細胞(例えば、哺乳動物細胞、昆虫細胞、細菌または真菌)にクローニングすることができる。
【００８７】
特定の態様において、FZDおよび／またはWntポリペプチドをコードする核酸分子は、FZDおよび／またはWntの発現をインビボで(例えば、FZDおよび／またはWnt産生細胞中で)調節する(例えば、増加するか、または減少する)化合物を同定するために使用する。このような態様において、FZD(例えば、FZD7および／または8)および／またはWnt(例えば、Wnt3、Wnt8bまたはWnt11)を発現する細胞を培養し、試験化合物(または試験化合物の混合物)に曝露し、ならびにFZDおよび／またはWnt発現のレベルを、他の点では同一であるが試験化合物に曝露しなかった細胞中でのFZDおよび／またはWnt発現または活性のレベルと比較する。遺伝子発現の標準的な定量的アッセイ法を使用することができる。
【００８８】
FZDおよびWntの発現は、例えば、プローブとして本発明の核酸分子を使用する、ノーザンブロットPCR分析またはRNAse保護分析によって、当技術分野で公知の方法を使用して測定することができる。他の例には、酵素結合免疫吸着アッセイ法(ELISA)、ラジオイムノアッセイ法(RIA)および蛍光活性化細胞ソーティング(FACS)が含まれる。その非存在下での発現のレベルと比較した、試験分子の存在下での発現のレベルは、試験化合物が、FZDおよび／またはWntポリペプチドの発現を調節するか否かを示す。
【００８９】
なお別の局面において、本発明は、1個または数個の転写／翻訳成分の混乱に対して感受性である細胞系を使用する試験化合物をスクリーニングする方法を提供する。
【００９０】
特定の態様において、本発明は、FZDおよび／またはWnt翻訳の正確さにおける段階、例えば、翻訳の間の正確な読み枠を維持すること、および終止コドンで翻訳を終了することと干渉する候補化合物を同定する工程を含む。この方法は、検出可能なレポーターポリペプチドが、1つの読み枠にとどまること、または終止コドンで翻訳が終了することの正常なプロセスが破壊された場合のみに産生することができる細胞を構築する工程を含む。この方法はさらに、細胞を試験化合物と接触させて、これがレポーターポリペプチドの産生を増加するかまたは減少するかを試験する工程をさらに含む。
【００９１】
他の態様において、細胞系は無細胞抽出物であり、この方法は、インビトロで転写または翻訳を測定する工程を含む。条件は、レポーターの転写または翻訳が、細胞抽出物への転写修飾因子または翻訳修飾因子の添加によって、増加または減少されるように選択される。
【００９２】
候補化合物を同定するための1つの方法は、転写応答性の遺伝子産物に依存する。この方法は、その細胞の中でFZDおよび／またはWnt核酸の転写が変化する(すなわち、増加するかまたは減少する)条件下で、レポーター分子の産生が変化する(すなわち、増加するかまたは減少する)細胞を構築する工程を含む。具体的には、レポーター分子は、構築された配列に転写的に連結された核酸によってコードされ、FZDおよび／またはWnt核酸の転写が変化する場合に、レポーター分子の産生の相対的変化を引き起こすように配列される。レポーターをコードする遺伝子配列は、例えば、転写応答性遺伝子産物をコードする遺伝子の一部もしくはすべてに、および／または遺伝子産物の産生を制御する遺伝子エレメントの一部もしくはすべてに融合されてもよい。または、転写応答性遺伝子産物は、直接的または間接的のいずれかで、レポーターをコードする遺伝子の転写を刺激してもよい。この方法はさらに、細胞を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物が、細胞中のレポーター分子の産生を増加するかまたは減少するかを決定する工程をさらに含む。
【００９３】
または、候補化合物を同定するための方法は、翻訳応答性遺伝子産物に依存することができる。この方法は、その細胞の中でFZDおよび／またはWnt核酸の翻訳が変化する(すなわち、増加するかまたは減少する)細胞を構築する工程を含む。具体的には、レポーター分子は、構築された配列に翻訳的に連結された核酸によってコードされ、FZDおよび／またはWnt核酸の転写が変化する場合に、レポーター分子の産生の相対的な増加または減少を引き起こすように配列される。レポーターをコードする遺伝子配列は、例えば、転写応答性遺伝子産物をコードする遺伝子の一部もしくはすべてに、および／または遺伝子産物の産生を制御する遺伝子エレメントの一部もしくはすべてに融合されてもよい。または、翻訳応答性遺伝子産物は、直接的または間接的のいずれかで、レポーターをコードする遺伝子の翻訳を刺激してもよい。この方法はさらに、細胞を試験化合物と接触させる工程、および試験化合物が、細胞中の第1のレポーター分子の産生を増加するかまたは減少するかを決定する工程をさらに含む。
【００９４】
これらおよび任意の本明細書に記載される方法のために、広範な種々のレポーターが、検出可能なシグナルを便利に提供する(例えば、分光学によって)典型的なレポーターとともに使用されてもよい。例として、レポーター遺伝子は、光吸収特性を変化させる反応を触媒する酵素をコードしてもよい。
【００９５】
レポーターの例には、β-ガラクトシダーゼ、インベルターゼ、緑色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β-グルクロニダーゼ、エキソ-グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、および放射活性レポーターが含まれるがこれらに限定されない。例えば、レポーター分子の産生は、β-ガラクトシダーゼのようなレポーター遺伝子産物の酵素活性によって測定することができる。
【００９６】
本明細書に記載される任意の方法は、候補抗癌剤を同定するために、多数の試験化合物の高処理能力スクリーニングのために使用することができる。高処理能力スクリーニングとは、この方法が、多数の候補化合物を、比較的容易にかつ迅速にスクリーニングするために使用することができることを意味する。
【００９７】
候補抗癌剤として試験化合物を同定したら、この化合物は、所望される場合、これが抗癌剤であるか否かを確認するため、すなわち、これがWnt/FZDシグナル伝達;癌細胞運動性;ならびに／またはFZDおよび／もしくはWnt発現を、インビトロで(例えば、単離した細胞または無細胞系を使用して)またはインビボで(例えば、動物、例えば、齧歯類、モデル系)調節することができるか否かを決定するために、当技術分野において公知の技術を使用して、インビボまたはインビボでさらに試験することができる。
【００９８】
候補化合物のインビトロ試験は、例えば、野生型、癌性細胞、および／またはトランスジェニック生細胞の使用を含むアッセイ法のような当業者に公知である手段によって達成することができる。このようなアッセイ法において使用することができる有用な細胞と同様に、Wnt/FZDシグナル伝達、FZDおよびWnt発現、ならびに癌細胞運動性をモニターするための例示的なアッセイ法が、以下の実施例の節に記載される。
【００９９】
代替としてまたは加えて、候補化合物のインビボ試験は、当業者に公知の手段によって実施することができる。例えば、候補化合物は、齧歯類(マウス)またはウサギのような哺乳動物に投与することができる。このような動物モデル系は、試験中の潜在的な薬剤について、患者、例えば、ヒト患者におけるそれらの治療的効力を決定するために、当技術分野において受け入れられている。インビボ試験において特に有用な動物は、FZDおよび／またはWntポリペプチドを過剰発現する野生型動物または非野生型動物(例えば、マウス)、例えば、FZDまたはWnt導入遺伝子(FZD7またはWnt3導入遺伝子)を過剰発現し、ならびに／またはFZD8および／もしくはWnt11ポリペプチドの産生の減少を示す動物である。インビボ試験のために有用な他の動物は、肝臓癌を発症するように飼育された動物である。肝臓癌を発症する特定の特に有用なトランスジェニックマウスは、実施例の節において記載され、本発明に含められる。
【０１００】
典型的なインビボアッセイ法において、動物(例えば、野生型またはトランスジェニックマウス)は、適切であるとみなされた任意の経路によって(例えば、注射によって)、候補化合物の用量を投与される。次いで、従来的な方法および判断基準は、所望の活性について動物をモニターするために使用することができる。必要とされる場合、候補化合物の存在下で得られた結果は、試験化合物で処理されていない対照動物における結果と比較することができる。
【０１０１】
医化学
一旦、関心対象の化合物(薬剤)が同定されたら、医化学の標準的な原子が、さらなるラウンドの試験のために化合物の誘導体を産生するために使用することができる。誘導体は、改善された薬理学的特性、例えば、効力、薬物動態学、安定性、溶解性、およびクリアランスについてスクリーニングすることができる。上記のアッセイ法における化合物の活性の原因である部分は、当技術分野において共通して実施されるように、構造-活性相関(SAR)の試験によって描写することができる。薬理化学の当業者は、候補化合物または薬剤状の部分を修飾でき、化合物または薬剤の効力に対する修飾の効果を測定し、それによって、効力が増加した誘導体を産生することができる。例えば、Nagarajan et al. (1988) J. Antibiot. 41 : 1430-8を参照されたい。さらに、化合物(または薬剤)の生化学的な標的が既知であるか、または決定されるならば、標的および化合物の構造は、誘導体の設計および最適化に情報を与えることができる。この目的のために分子モデリングソフトウェアが市販されている(例えば、Molecular Simulations, Inc.)。
【０１０２】
IV. 抗体
本発明は、FZDおよび／またはWntポリペプチドに結合する、例えば、特異的に結合する、精製または単離された抗体、すなわち、抗FZD抗体および抗Wnt抗体を特徴とする。抗体は、これが特定の抗原に結合し、しかし、試料中の他の分子にはより低い程度で(例えば、認識せず、かつ結合しない)場合に、この抗原に、例えば、FZD7および／または8ポリペプチドに「特異的に結合する」。本発明の抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化またはキメラ抗体、短鎖抗体、Fabフラグメント、F(ab')2フラグメント、およびFab発現ライブラリーを使用して産生された分子を含む。
【０１０３】
本発明に含まれる抗体の型の例は、以下の実施例の節に記載されるポリクローナル抗Wnt3抗体である。ポリクローナル抗体を産生するための方法は、当業者に周知である。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、少なくとも1つ、例えば、2つの重(H)鎖可変領域(本明細書ではVHと略される)、および少なくとも1つ、例えば2つの軽(L)鎖可変領域(本明細書ではVLと略される)を含むタンパク質をいう。VH領域およびVL領域は、より保存性の「フレームワーク領域」(FR)と呼ばれる領域が散在する、「相補性決定領域」(「CDR」)と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。フレームワーク領域およびCDRの程度は、正確に規定されてきた(Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, および Chothia, C. et al. (1987) J. MoI. Biol. 196:901-917)。各VHおよびVLは、3つのCDRおよび4つのFRから構成され、以下の順番で、アミノ末端からカルボキシ末端まで配列される:FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
【０１０５】
抗FZD抗体または抗Wnt抗体は、重鎖および軽鎖の定常領域を含むことができ、それによって、それぞれ、免疫グロブリン重鎖および軽鎖を形成する。抗体は、2つの免疫グロブリン重鎖および2つの免疫グロブリン軽鎖のテトラマーであり得、ここで、免疫グロブリン重鎖および軽鎖は、例えば、ジスルフィド結合によって相互接続される。重鎖定常領域は、3つのドメイン、CH1、CH2、およびCH3から構成される。軽鎖定常領域は、1つのドメイン、CLから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、典型的には、免疫系の種々の細胞(例えば、エフェクター細胞)および古典的補体系の第1成分(C1q)を含む、宿主の組織または因子への抗体の結合を媒介する。
【０１０６】
抗体の「FZD結合フラグメント」および「Wnt結合フラグメント」とは、FZDもしくはWntポリペプチドにそれぞれ、またはその部分に特異的に結合する能力を保持する全長抗体の1つまたは複数のフラグメントをいう。抗体のペプチド結合フラグメントの例には、以下が含まれるがこれらに限定されない:(i)VL、VH、CLおよびCH1ドメインからなる一価フラグメントであるFabフラグメント;(ii)ヒンジ領域においてジスルフィド架橋によって連結される2つのFabフラグメントを含む二価フラグメントであるF(ab')2フラグメント;(iii)VHおよびCH1ドメインからなるFdフラグメント;(iv)抗体の単一アームのVLおよびVHドメインからなるFvフラグメント、(v)VHドメインからなるdAbフラグメント(Ward et al, (1989) Nature 341:544-546);ならびに(vi)単離された相補性決定領域(CDR)。さらに、Fvフラグメントの2つのドメイン、VLおよびVHが別々の遺伝子によってコードされるが、これらは、組換え方法を使用して、合成リンカーによって結合することができ、このリンカーは、これらのドメインが、VLおよびVH領域が対となって一価分子を形成する単一のタンパク質鎖(単鎖抗体Fv(scFv)として公知;例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426; およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85.:5879-5883を参照されたい)として作られることを可能にする。このような単鎖抗体もまた、抗体の「FZD結合フラグメント」および「Wnt結合フラグメント」という用語のなかに含まれる。これらの抗体フラグメントは、当業者に公知である従来的な技術を使用して入手することができる。
【０１０７】
抗体を産生するために、ポリペプチド(または抗原性フラグメント(例えば、高頻度の電荷を有する残基のような判断基準によって、抗原性である可能性が見られるポリペプチドのフラグメント)またはこのようなポリペプチドのアナログ、例えば、組換え技術またはペプチド合成技術(例えば、Solid Phase Peptide Synthesis, 前出; Ausubel et al., 前出を参照されたい)によって産生されるものを使用することができる。一般的に、ポリペプチドは、Ausubel et al., 前出によって記載されるように、KLHのようなキャリアタンパク質にカップリングされ、アジュバントと混合され、および宿主哺乳動物に注射することができる。「キャリア」は、付随する分子に安定性を付与し、および／または付随する分子の輸送もしくは免疫原性を補助もしくは増強する物質である。例えば、FZDまたはWntタンパク質、またはそのフラグメントは、標準的なPCRの技術を使用して生成することができ、pGEX発現ベクター(Ausubel et al., 前出)にクローニングすることができる。融合タンパク質は、E. coli中で発現させることができ、Ausubel et al., 前出において記載されるように、グルタチオンアガロースアフィニティーマトリックスを使用して精製することができる。
【０１０８】
典型的には、種々の宿主動物は、FZDおよび／またはWntポリペプチドを注射される。適切な宿主動物の例には、ウサギ、マウス、モルモット、およびラットが含まれる。種々のアジュバントを、宿主種に依存して、免疫学的応答を増加するために使用することができ、これには、フロイント(完全または不完全アジュバント)、水酸化アルミニウムのようなアジュバントミネラルゲル、リゾレシチンのような表面活性物質、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチド、オイルエマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、BCG(カルメット-ゲラン杆菌(bacille Calmette-Guerin))、コリネバクテリウム  パルバム(Corynebacterium parvum)が含まれるがこれらに限定されない。このような手法は、ポリクローナル抗体、すなわち、免疫した動物の血清から誘導される抗体分子の不均一な調製物の産生を生じる。抗体は、例えば、FZDおよび／またはWntポリペプチド抗原が樹脂上に固定化される、アフィニティークロマトグラフィー法によって、宿主動物から得られた血液から精製することができる。
【０１０９】
本発明はまた、抗FZDモノクローナル抗体および抗Wntモノクローナル抗体を含む。特定の抗原に特異的な抗体の均質な集団であるモノクローナル抗体(mAb)は、FZDポリペプチドまたはWntポリペプチド、および標準的なハイブリドーマ技術(例えば、Kohler et al., Nature, 256:495, 1975; Kohler et al., Eur. J. Immunol, 6:511, 1976; Kohler et al., Eur. J. Immunol., 6:292, 1976; Hammerling et al., In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas, Elsevier, NY, 1981; Ausubel et al.,前出を参照されたい)を使用して調製することができる。
【０１１０】
典型的には、モノクローナル抗体は、培養中の連続的な細胞株による抗体分子の産生を提供する任意の技術、例えば、Kohler et al., Nature, 256:495, 1975,および米国特許第4,376,110号に記載される技術;ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(Kosbor et al., Immunology Today, 4:72, 1983; Cole et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 80:2026, 1983);およびEBV-ハイブリドーマ技術(Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96, 1983)を使用して産生される。このような抗体は、IgG、IgM、IgE、IgA、IgDおよびその任意のサブクラスを含む任意の免疫グロブリンクラスであり得る。本発明のmAbを産生するハイブリドーマは、インビトロまたはインビボで培養することができる。
【０１１１】
一旦産生されると、ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体は、例えば、Ausubel et al.,前出において記載されるような標準的な技術を使用して、ウェスタンブロットまたは免疫沈殿分析のような免疫アッセイ法において、FZDまたはWntポリペプチドの認識、例えば、特異的認識について試験することができる。FZDまたはWntポリペプチド(例えば、FZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8bおよび／またはWnt11)に特異的に結合する抗体は、本発明において有用である。例えば、このような抗体は、試料、例えば、組織試料中のポリペプチドを検出するため、および／またはFZD/Wntシグナル伝達を調節するために(例えば、癌、例えば、肝臓癌を治療するために)、免疫アッセイ法において使用することができる。
【０１１２】
代替的にまたは加えて、モノクローナル抗体は、組換え的に産生することができ、例えば、ファージディスプレイによって、または例えば、以下に記載されるようなコンビナトリアル法によって産生することができる:Ladner et al. 米国特許第5,223,409号; Kang et al. 国際公開公報WO 92/18619号; Dower et al. 国際公開公報WO 91/17271; Winter et al.国際公開公報WO 92/20791; Markland et al. 国際公開公報WO 92/15679; Breitling et al. 国際公開公報WO 93/01288; McCafferty et al. 国際公開公報WO 92/01047; Garrard et al. 国際公開公報WO 92/09690; Ladner et al. 国際公開公報WO 90/02809; Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9: 1370-1372; Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281; Griffths et al. (1993) EMBO J 12;.725-734; Hawkins et al. (1992) J MoI Biol 226:889-896; Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628; Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrad et al. (1991) Bio/Technology 9: 1373-1377; Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137;および Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982。
【０１１３】
抗FZD抗体および抗Wnt抗体は、完全なヒト抗体(例えば、ヒト免疫グロブリン配列からの抗体を産生するために遺伝子操作された、マウス中で作られた抗体)、または非ヒト抗体、例えば、齧歯類(マウスまたはラット)、ウサギ、ウマ、ウシ、ヤギ、霊長類(例えば、サル)、ラクダ、ロバ、ブタ、または鳥類の抗体であり得る。
【０１１４】
抗FZD抗体および抗Wnt抗体は、可変領域またはその一部、例えば、CDRが、非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて生成されるものであり得る。抗FZD抗体および抗Wnt抗体はまた、例えば、キメラ抗体、CDR-移植抗体、またはヒト化抗体であり得る。抗FZD抗体および抗Wnt抗体はまた、非ヒト生物、例えば、ラットまたはマウスにおいて生成され、次いで、ヒトにおける抗原性を減少するために、例えば、可変フレームワークまたは定常領域において修飾されることが可能である。
【０１１５】
「キメラ抗体」の産生のために開発された技術(Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81 :6851, 1984; Neuberger et al., Nature, 312:604, 1984; Takeda et al., Nature, 314:452, 1984)は、適切な生物学的活性のヒト抗体分子からの遺伝子とともに、適切な抗原特異性のマウス抗体分子からの遺伝子をスプライシングするために使用することができる。キメラ抗体は、異なる部分が異なる動物種に由来する分子であり、例えば、マウスmAbおよびヒト免疫グロブリン定常領域に由来する可変領域を有するものである。
【０１１６】
または、単鎖抗体の産生のために記載される技術(米国特許第4,946,778号;ならびに同第4,946,778号および同第4,704,692号)は、FZDまたはWntポリペプチドに特異的な単鎖抗体を産生するように適合されることができる。単鎖抗体は、単鎖ポリペプチドを生じるアミノ酸架橋を介してFv領域の重鎖フラグメントおよび軽鎖フラグメントを連結することによって形成される。
【０１１７】
特異的エピトープを認識し、かつこれに結合する抗体フラグメントは、公知の技術によって生成することができる。例えば、このようなフラグメントには、抗体分子のペプシン消化によって産生することができるF(ab')2フラグメント、およびF(ab')2フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成することができるFabフラグメントを含むことができるがこれらに限定されない。または、Fab発現ライブラリーは、所望の特異性を有するモノクローナルFabフラグメントの迅速かつ容易な同定を可能にするように構築することができる(Huse et al., Science, 246:1275, 1989)。
【０１１８】
FZDおよび／またはWntポリペプチドに特異的に結合するポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体(またはそれらのフラグメント)は、例えば、患者の種々の組織におけるFZDおよび／またはWntの発現を検出するために使用することができる。例えば、FZD7および／または8ポリペプチドは、生物学的組織または抽出物の従来的な免疫アッセイ法において検出することができる。適切なアッセイ法の例には、非限定的に、ウェスタンブロッティング、ELISA、およびラジオイムノアッセイ法などが含まれる。
【０１１９】
V. 薬学的組成物
任意の薬学的に活性な化合物、薬剤、核酸、ポリペプチド、または抗体(これらのすべてが本明細書では「活性化合物」と呼ぶことができる)は、薬学的組成物に組み込むことができる。このような組成物は、典型的には、活性化合物および薬学的に許容されるキャリアを含む。「薬学的に許容されるキャリア」は、薬学的投与と適合可能な、溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、ならびに等張剤および吸収遅延剤などを含むことができる。補助的な活性化合物もまた、この組成物に取り込ませることができる。
【０１２０】
薬学的組成物は、その意図される投与の経路と適合可能であるように製剤化することができる。投与の経路の例には、経腸的(例えば、経口または直腸)、および非経口的、例えば、静脈内(例えば、肝臓の門脈に)、皮内、皮下、経皮、経粘膜、および肺の投与が含まれる。投与は、例えば、手術の間に、注射によって、または局所的投与によって、肝臓に直接的にであってもよい。注射のために使用される溶液または懸濁液は、以下の成分を含むことができる:注射用の水のような滅菌希釈液、生理食塩水溶液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒;ベンジルアルコールまたはメチルパラベンのような抗菌剤;アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムのような抗酸化剤;エチレンジアミン四酢酸のようなキレート剤;酢酸、クエン酸またはリン酸のような緩衝剤、ならびに塩化ナトリウムまたはデキストロースのような等張性の調整のための薬剤。pHは、酸または塩基、例えば、塩酸または水酸化ナトリウムを用いて調整することができる。非経口的調製物は、アンプル、使い捨てシリンジ、またはガラスもしくはプラスチック製の複数用量バイアル中に封入することができる。
【０１２１】
注射用途のために適切な薬学的組成物には、滅菌水溶液(水溶性である場合)または分散剤および滅菌注射可能溶液または懸濁液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。静脈内投与のために、適切なキャリアは、生理食塩水、静菌水、クレモフォールEL(Cremophor)(商標)(BASF, Parsippany, NJ)またはリン酸緩衝化生理食塩水(PBS)が含まれる。すべての場合において、組成物は滅菌状態でなくてはならず、容易な注射針通過が存在する程度まで流動性であるべきである。これは、製造および保存の条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌のような微生物の夾雑作用に対抗して保存されなくてはならない。キャリアは、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど)、およびこれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用によって、分散液の場合には、必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の妨害は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、およびチメロサールなどによって達成することができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖類、マンニトールまたはソルビトールのようなポリアルコール、および塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによって達成することができる。
【０１２２】
滅菌注射溶液は、上記に列挙した成分の1つまたは組み合わせを有する適切な溶媒中で、必要とされる量の活性化合物を取り込むことによって調製することができ、必要とされる場合、その後に濾過滅菌を行う。一般的に、分散液は、基礎分散媒体および上記に列挙したものからの他の必要とされる成分を含む滅菌媒体に、活性化合物を取り込むことによって調製される。滅菌注射溶液の調製のための滅菌粉末の場合において、好ましい調製の方法は、真空乾燥および凍結乾燥であり、これらは、以前に滅菌濾過したその溶液から、活性成分プラス任意のさらに所望される成分の粉末を生じる。
【０１２３】
経口組成物は、一般的には、不活性希釈液または可食性キャリアを含む。経口治療用投与の目的のために、活性化合物は、賦形剤とともに取り込まれ、錠剤、トローチ、またはカプセル、例えば、ゼラチンカプセルの型で使用することができる。経口組成物はまた、マウスウォッシュのような使用のための液体キャリアを使用して調製することができる。薬学的に適合可能な結合剤、および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸薬、カプセル、およびトローチなどは、以下の成分、または類似の性質の化合物のいずれかを含むことができる:微結晶セルロース、トラガカントガムまたはゼラチンのような結合剤;デンプンまたはラクトースのような賦形剤、アルギン酸、プリモゲル(Primogel)、またはコーンスターチのような崩壊剤;ステアリン酸マグネシウムまたはステローテス(Sterotes)のような滑沢剤;コロイド状二酸化ケイ素のような流動促進剤;スクロースまたはサッカリンのような甘味料;またはペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料のような香料。
【０１２４】
吸入による投与のために、化合物は、適切な噴霧剤、例えば、二酸化炭素のようなガスを含む加圧容器またはディスペンサー、または噴霧器からのエアロゾルスプレーの型で送達される。
【０１２５】
全身性投与はまた、経粘膜的または経皮的手段によってであり得る。経粘膜的または経皮的な投与のために、バリアに浸透するために適切な浸透液が製剤中で使用される。このような浸透液は、当技術分野において一般的に公知であり、例えば、経粘膜的投与のためには、界面活性剤、胆汁塩、およびフシジン酸誘導体を含む。経粘膜投与は、鼻スプレーまたは坐剤の使用を通して達成することができる(例えば、ココアバターおよび他のグリセリドのような従来的な坐剤基剤を用いる)。経皮的投与のために、活性化合物は、当技術分野において一般的に公知である、軟膏(ointment)、膏薬(salve)、ゲル、またはクリームに製剤化される。
【０１２６】
1つの態様において、活性化合物は、身体からの迅速な除去に対抗して化合物を保護するキャリア、例えば、制御放出製剤とともに調製され、これには、移植片およびマイクロカプセル化送達系が含まれる。生物分解性で、生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸を使用することができる。このような製剤の調製のための方法は、当業者に明らかである。これらの材料はまた、Alza CorporationおよびNova Pharmaceuticals, Inc.から商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液もまた、薬学的に許容されるキャリアとして使用することができる。これらは、当業者に公知の方法に従って、例えば、米国特許第4,522,811号に記載されるように調製することができる。
【０１２７】
投与の容易さおよび投薬の均一性のために、単位剤形で経口または非経口組成物を製剤化することが有利である可能性がある。本発明で使用されるような単位剤形とは、治療される被験体にとっての単位である投薬量として適している物理的に個別の単位をいう。各単位は、必要とされる薬学的キャリアと関連して、所望の治療効果を生じるために計算される活性化合物の所定の量を含む。
【０１２８】
このような化合物の毒性および治療的効力は、例えば、LD50(集団の50%に対して致死的である用量)およびED50(集団の50%において治療的に有効である用量)を決定するために、細胞培養または実験動物における標準的な薬学的手法によって決定することができる。毒性と治療的効果の間の用量比率は、治療指数であり、LD50/ED50の比率として表現することができる。高い治療指数を示す化合物が好ましい。毒性副作用を示す化合物が使用されてもよいが、健常組織への潜在的な損傷を最小化し、それによって、副作用を減少させるために、罹患した組織、例えば、肝臓の部位にこのような化合物を標的化する送達系を設計するように、配慮が行われるべきである。
【０１２９】
細胞培養アッセイ法および動物研究から得られたデータは、ヒトにおける使用のために一定の範囲の投薬量を処方する際に使用することができる。このような化合物の投薬量は、好ましくは、毒性をほとんど伴わないか、または全く伴わないED50を含む循環濃度の範囲内にある。投薬量は、使用される剤形、および使用される投与の経路に依存して、この範囲内で変化してもよい。本発明の方法において使用される任意の化合物については、治療的に有効な用量は、細胞培養アッセイ法から最初に見積もられることができる。用量は、細胞培養中で決定されるように、IC50(すなわち、徴候の最大阻害の半分を達成する試験化合物の濃度)を含む循環血漿濃度を達成するための動物モデルにおいて処方されてもよい。このような情報は、ヒトにおける有用な用量をより正確に決定するために使用することができる。血漿中のレベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定されてもよい。
【０１３０】
「有効量」および「治療するために有効」という用語は、本明細書で使用される場合、意図された効果または生理学的な結果を引き起こすためのその投与の状況の中で有効である時間の期間の間に使用される、本明細書に記載される化合物の量または濃度(急性または慢性の投与、および周期的または連続的な投与を含む)をいう。本明細書に記載される化合物については、例えば、ポリペプチドの有効量(すなわち、有効用量)は、約0.001〜500mg／kg体重、例えば、約0.01〜50mg／kg体重、例えば、約0.1〜20mg／kg体重の範囲である。ポリペプチドは、週あたり1回、約1〜10週間の間、例えば、2〜8週間、約3〜7週間、または約4、5、もしくは6週間投与することができる。当業者は、患者を効果的に治療するために必要とされる投薬量およびタイミングに影響を与える特定の要因を認識し、これには、治療される患者のタイプ、疾患または障害の重症度、以前の治療、一般的健康、および／または患者の年齢、および存在する他の疾患が含まれるがこれらに限定されない。さらに、化合物の治療的有効量を用いる患者の治療は、単独の治療を含むことができ、または好ましくは、一連の治療を含むことができる。
【０１３１】
抗体に関しては、部分的なヒト抗体および全体的なヒト抗体が、他の抗体よりも、ヒトの身体中でより長い半減期を有する。従って、より低い投薬量およびより頻繁でない投与が可能である。脂質化のような修飾が、抗体を安定化するため、ならびに取り込みおよび組織浸透を増強するために使用することができる。抗体のライブラリーの脂質化のための方法は、Cruikshank et al. ((1997) J. Acquired Immune Deficiency Syndromes and Human Retrovirology 14:193)によって記載されている。
【０１３２】
化合物が小分子である場合、例示的な用量は、被験体または試料の重量のキログラムあたりの小分子のミリグラムまたはマイクログラム量を含む(例えば、約1マイクログラム／キログラム〜約500ミリグラム／キログラム、約100マイクログラム／キログラム〜約5ミリグラム／キログラム、または約1マイクログラム／キログラム〜約50マイクログラム／キログラム)。小分子の適切な用量は、調節される発現または活性に関する小分子の効力に依存することがさらに理解される。これらの小分子の1つまたは複数が、FZDまたはWntポリペプチドまたは核酸の発現または活性を調節するために動物(例えば、ヒト)に投与される場合、医師、獣医、または研究者は、例えば、最初は比較的低い用量で処方し、続いて、適切な応答が得られるまで、用量を増加させる。加えて、任意の特定の動物被験体についての特定の用量レベルは、使用される特定の化合物の活性、被験体の年齢、体重、一般的健康、性別、および食事、投与の時間、投与の経路、排出の速度、任意の薬物の組み合わせ、および調節される発現または活性の程度を含む種々の要因に依存することが理解される。
【０１３３】
核酸分子(例えば、FZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8bおよび／またはWnt11 DNA)はベクターに挿入され、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所的投与(例えば、米国特許第5,328,470号を参照されたい)、または定位的注射(例えば、Chen et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:3054-3057を参照されたい)によって被験体に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的調製物は、許容される希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含むことができ、または遺伝子送達媒体が組み込まれた遅延放出マトリックスを含むことができる。または、完全な遺伝子送達ベクター、例えば、レトロウイルスベクターが組換え細胞から無傷で産生することができる場合、薬学的調製物は、遺伝子送達系を産生する1つまたは複数の細胞を含むことができる。遺伝子治療方法において潜在的に使用することができる例示的な構築物は、以下の実施例の節において記載される。
【０１３４】
薬学的組成物は、投与のための説明書と一緒に、容器、パック、またはディスペンサー中に含めることができる。
【０１３５】
VI. 癌およびそのための治療
「癌」という用語は、自律的増殖のための能力を有する動物細胞をいう。このような細胞の例には、迅速に増殖する細胞増殖によって特徴付けられる異常状態または条件を有する細胞を含む。この用語は、組織病理学的な型または侵襲性の段階に関わりなく、癌性増殖、例えば、腫瘍、発癌プロセス、転移組織、および悪性に形質転換された細胞、組織、または器官を含むことを意味する。種々の器官系、例えば、呼吸器系、心臓血管系、腎臓系、生殖器系、血液系、神経系、肝臓系、胃腸系、および内分泌系の悪性腫瘍;ならびに大部分の結腸癌、腎細胞癌腫、前立腺癌および／または精巣腫瘍、肺の非小細胞癌、小腸の癌、および食道の癌のような悪性腫瘍を含む腺癌もまた含まれる。「天然に生じる」癌には、被験体への癌細胞の移植によって実験的に誘導されない任意の癌が含まれ、ならびに例えば、自発的に生じる癌、発癌剤への患者の曝露によって引き起こされる癌、トランスジェニックオンコジーンの挿入または腫瘍抑制遺伝子のノックアウトから生じる癌、および感染、例えば、ウイルス感染によって引き起こされる癌が含まれる。「癌腫」という用語は、当技術分野で認識されており、上皮組織または内分泌組織の悪性腫瘍をいう。この用語は、癌腫組織および肉腫組織からなる悪性腫瘍を含む癌肉腫を含む。「腺癌」は、腺組織に由来するか、または腫瘍組織が認識できる腺性構造を形成する癌腫をいう。「肝細胞癌」(HCC)という用語は、肝臓の主要な細胞型である肝細胞から生じる癌をいう。
【０１３６】
「患者」という用語は、本発明の方法に従う治療が提供される、動物、ヒトまたはヒト以外、齧歯類または齧歯類以外を説明するために、本明細書を通して使用される。獣医学的なまたはヒトの臨床的適用が意図される。「患者」という用語は、鳥類、爬虫類、両生類、および哺乳動物、例えば、ヒト、他の霊長類、ブタ、マウスおよびラットのような齧歯類、ウサギ、モルモット、ハムスター、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、ヒツジおよびヤギを含むがこれらに限定されない。好ましい被験体は、ヒト、家畜、ならびにネコおよびイヌのような家庭内ペットである。「治療(する)」という用語は、状態、例えば、癌の発症を遅延させるか、それを阻害するか、その効果を軽減するか、またはそれに罹患している患者の寿命を長くすることを示すために本明細書で使用される。
【０１３７】
本発明の方法および組成物を使用して治療されてもよい癌には、とりわけ、肝臓、胃、結腸、直腸、口／咽頭、食道、喉頭、膵臓、肺、小腸、および胆管の癌が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３８】
癌を発症するリスクがあるとみなされる個体は、主として、予防的処置が腫瘍のいかなる証拠も存在する前に開始することができるために、本発明から特に恩恵を受ける可能性がある。「リスクがある」個体には、感受性のある個体において癌を促進することが統計学的に示されたレベルで、例えば、消費によって、例えば、吸入および／または摂取によって、例えば、発癌剤に曝露された個体が含まれる。ウイルス、例えば、肝炎ウイルス、例えば、B型肝炎ウイルス(HBV)に曝露された個体もまた含まれる。前癌性状態の兆候を示す個体と同様に、紫外線照射への曝露、または彼らの環境、職業、および／または遺伝に起因してリスクがある個体もまた含まれる。同様に、非常に初期の段階の癌または転移の発生にある個体(すなわち、1つまたは数個の異常な細胞のみが、個体の身体にまたは個体の組織中の特定の部位に存在する)は、このような予防的治療からの恩恵を受ける可能性がある。
【０１３９】
当業者は、患者が医師(または獣医、診断される患者のために適切に)によって、本発明に記載される方法を使用して、任意に、さらなる方法を使用して、例えば、患者の医学的履歴を評価し、他の診断的試験を実施し、および／または画像化技術を使用することによって、癌に罹患しているか、または癌のリスクがあると診断されることが可能であることを認識する。
【０１４０】
癌に罹患しているか、または癌のリスクがある患者を治療するための1つのストラテジーは、患者におけるWnt/FZDシグナル伝達を調節することである。その目的は、シグナル伝達が低すぎる場合にはシグナル伝達を増加させ、およびシグナル伝達が高すぎる場合にはシグナル伝達を減少させることである。Wnt/FZDシグナル伝達の調節は2つの基本的なカテゴリーに分けられる:Wnt/FZDシグナル伝達を低下させること(すなわち、減少させること、例えば、除去すること)、および活性が不十分であるか、または活性がない場合に、Wnt/FZDシグナル伝達を増加させること(すなわち、補充することまたは提供すること)である。Wnt/FZDシグナル伝達が阻害されるべきか、または増加されるべきかは、意図される適用に依存する。Wnt/FZDシグナル伝達は、本明細書に記載される活性化合物(例えば、抗Wnt抗体、siRNA、候補化合物および／または抗癌剤)を使用して調節することができる。例えば、FZD7および／もしくはWnt3の発現を減少し、ならびに／またはFZD7とそのリガンド(例えば、Wnt3、8bおよび／または11)との間の相互作用に干渉することによって、Wnt/FZDシグナル伝達活性を減少する化合物が、例えば、癌、例えば、肝臓癌の治療として使用することができる。例えば、FZD8の発現を増加することによって、活性を増加させる化合物もまた、例えば、癌、例えば、肝臓癌のための治療として使用することができる。
【０１４１】
Wnt/FZDシグナル伝達を減少すること
患者における特定のタンパク質の発現を減少するための当技術分野において公知の方法を、Wnt/FZDシグナル伝達を減少するために使用することができる。例えば、内因性FZDまたはWnt遺伝子、例えば、FZD7またはWnt3遺伝子の発現を阻害するために有効なアンチセンス核酸を使用することができる。本明細書で使用される場合、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」または「アンチセンス」という用語は、特定の遺伝子を含むDNAに、またはその遺伝子のmRNA転写物に、生理学的条件下でハイブリダイズし、それによって、その遺伝子の転写および／またはそのmRNAの翻訳を阻害する、オリゴリボヌクレオチド、オリゴデオキシリボヌクレオチド、修飾オリゴリボヌクレオチド、または修飾オリゴデオキシリボヌクレオチドであるオリゴヌクレオチドを説明する。
【０１４２】
アンチセンス分子は、標的遺伝子または転写物とのハイブリダイゼーションの際に、標的遺伝子(例えば、FZD7またはWnt3、8bまたは11をコードする遺伝子)の転写または翻訳に干渉するように設計される。アンチセンス核酸は、全体のFZDもしくはWnt RNAまたはRNAの一部のみに対して相補的であるヌクレオチド配列を含むことができる。一方では、アンチセンス核酸は、FZDまたはWnt RNAと効果的にハイブリダイズするために十分な長さであることが必要である。それゆえに、最小限の長さは約12〜25ヌクレオチドである。他方、長さが約150ヌクレオチドを超えて増加した場合には、翻訳を阻害する際の有効性は、わずかにのみ増加する可能性があるのに対して、標的細胞にアンチセンス核酸を導入することの困難さは顕著に増加する可能性がある。従って、アンチセンス核酸についての適切な長さは、約15〜約150ヌクレオチド、例えば、20、25、30、35、40、45、50、60、70、または80ヌクレオチドであり得る。アンチセンス核酸は、FZDもしくはWnt mRNAのコード領域、またはFZDもしくはWnt mRNAのの5'もしくは3'非コード領域、またはその両方に対して相補的であり得る。1つのアプローチは、FZDまたはWnt mRNAの翻訳開始部位の両側の領域に対して相補的であるアンチセンス核酸を設計することである。
【０１４３】
本明細書に開示される配列に基づいて、当業者は、本発明に従う使用のために任意の多数の適切なアンチセンス分子を容易に選択および合成することができる。例えば、FZDまたはWnt mRNAに相補的であり、かつその長さにわたる15〜30ヌクレオチドの一連のオリゴヌクレオチドを含む「遺伝子ウォーク」を調製することができ、続いて、FZDまたはWnt発現の阻害について試験することができる。任意に、合成および試験されるオリゴヌクレオチドの数を減少するために、5〜10ヌクレオチドのギャップをオリゴヌクレオチド間に残すことができる。
【０１４４】
アンチセンス核酸は、例えば、市販の核酸合成装置をベンダーの説明書に従って使用して、化学合成することができる。または、アンチセンス核酸は、組換えDNA技術を使用して産生させることができる。アンチセンス核酸は、天然に存在するヌクレオチドのみを取り込むことができる。または、アンチセンス核酸は、そのインビボ半減期を増加するために、またはアンチセンス分子とその標的RNAとの間に形成された二重鎖の安定性を増加するために、種々の修飾ヌクレオチドまたはヌクレオチドアナログを取り込むことができる。ヌクレオチドアナログの例には、ホスホロチオエート誘導体およびアクリジン置換ヌクレオチドが含まれる。標的および配列の説明が与えられると、適切なアンチセンス分子の設計および産生は当業者の範囲内にある。アンチセンス核酸に関するガイダンスのために、例えば、Goodchild, 「Inhibition of Gene Expression by Oligonucleotides」Topics in Molecular and Structural Biology, Vol. 12: Oligodeoxynucleotides (Cohen編), MacMillan Press, London, pp. 53-77 (1989)を参照されたい。
【０１４５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの送達は、当業者に公知の任意の方法によって達成することができる。例えば、細胞培養および／またはエクスビボ研究のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達は、リポソーム法のような標準的な方法、または単に膜浸透性オリゴヌクレオチドの添加によって、実施することができる。
【０１４６】
インビボ適用のためのアンチセンスオリゴヌクレオチドの送達は、例えば、選択された部位、例えば、肝臓におけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの局所的注射により達成することができる。この方法は、乾癬成長阻害およびサイトメガロウイルス阻害のために以前に実証されてきた。例えば、Wraight et al., (2001). Pharmacol Ther. 90(l):89-104; Anderson et al., (1996) Antimicrob Agents Chemother 40: 2004-2011; およびCrooke et al., (1996) J Pharmacol Exp Ther 277: 923-937を参照されたい。
【０１４７】
同様に、RNA干渉(RNAi)技術を、アンチセンス技術の使用に加えて、またはそれに対する代替として、FZDまたはWnt発現を阻害するために使用することができる。例えば、FZDまたはWnt核酸に対して指向される小さな干渉RNA(siRNA)二重鎖を合成し、コードされるタンパク質の発現を妨害するために使用することができた。例示的なWnt3 siRNAは、以下の実施例の節において記載されている。
【０１４８】
Wnt/FZdシグナル伝達を阻害するための別のアプローチは、化合物、例えば、FZDポリペプチド(例えば、FZD7ポリペプチド)および／またはそれらの結合パートナー(例えば、Wnt3、8bおよび／または11)に結合し、それによって2つの間の相互作用を妨害する、候補化合物または抗癌剤を患者に投与する工程を含む。このような化合物および薬剤は、例えば、FZDポリペプチドに(例えば、FZDポリペプチドのCRDドメインに)および／またはWntポリペプチドに(例えば、Wntポリペプチドの結合ドメインに)、タンパク質間の相互作用が妨害されるようなやり方で結合する可能性がある。このような候補化合物および抗癌剤は、本明細書に記載されるスクリーニング方法を使用して同定することができる。Wntポリペプチド、例えば、Wnt3、8bおよび／または11に結合することができる化合物の例は、FZD7受容体またはその切断型、および抗Wnt抗体(またはそのFZD結合フラグメント)、例えば、以下の実施例の節において記載される抗Wnt3抗体である。
【０１４９】
Wnt/FZDシグナル伝達を阻害することに対するなお別のアプローチは、FZD受容体、例えば、FZD7受容体の変異型(例えば、切断型)をコードするベクター(例えば、遺伝子治療ベクター)を患者に投与する工程を含む。構築物を取り込む患者の細胞による、変異型の受容体の発現は、細胞中のWnt/FZDシグナル伝達に干渉することができる。例えば、分泌型および可溶型のFZD受容体(例えば、FZD7受容体)をコードする構築物を使用することができる。標的細胞によるこのような構築物の発現は、Wntポリペプチドを結合するFZD受容体の可溶型を分泌することを細胞に引き起こし、Wntポリペプチドが細胞表面上の無傷のFZD受容体に結合できなくする。代替的にまたは加えて、膜結合型であるが不活性型のFZD受容体(すなわち、対応物である野生型FZD受容体によって実施されるある機能を実施することができない変異型FZD)をコードする構築物を使用することができる。標的細胞によるこのような構築物の発現は、Wntポリペプチドを拘束し、またはWntポリペプチドを含まない内部のメカニズムを介して、Wnt/FZDシグナル伝達に干渉する可能性がある。Wnt/FZDシグナル伝達を阻害することに対するなお別のアプローチは、HCCにおける標準的なWnt経路のサプレッサーであるWnt11ポリペプチドをコードするベクター(例えば、遺伝子治療ベクター)を患者に投与する工程を含む。このベクターは、非複製線状または環状DNAもしくはRNAベクターから、または自律的に複製するプラスミドもしくはウイルスベクターから誘導されることができる。適切な発現ベクターを構築するための方法は当技術分野において公知であり、有用な材料は市販されている。
【０１５０】
Wnt/FZDシグナル伝達を増加させること
新規なまたは追加的なWnt/FZDシグナル伝達は、患者におけるFZDポリペプチド(例えば、FZD8ポリペプチド)および／またはWntポリペプチド(例えば、Wnt3ポリペプチド)の発現を増加させることによってインビボで提供することができる。例えば、FZDまたはWntポリペプチドは、FZDポリペプチド(例えば、FZD8ポリペプチド)および／またはWntポリペプチド(例えば、Wnt3ポリペプチド)をコードするヌクレオチド配列を含む核酸構築物を生物の細胞中で発現させることによって、生物、例えば、ヒトの中で直接的に生成することができる。関心対象の生物の細胞にトランスフェクトするために適している適切な発現ベクターを、このような目的のために使用することができる。
【０１５１】
VII. トランスジェニック動物
本発明はまた、それらの肝臓細胞中で肝臓癌を発症し、かつFZD7を過剰発現するトランスジェニック動物を特徴とする。このような動物は、肝臓癌の研究のため、およびWnt/FZDシグナル伝達を調節し、かつ癌を治療することができる治療薬剤の開発のためのモデル系を表す。
【０１５２】
トランスジェニック動物は、例えば、家畜(ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウシ、ウマ、およびウサギなど)、齧歯類(例えば、ラット、モルモット、およびマウス)、非ヒト霊長類(例えば、ヒヒ、サル、およびチンパンジー)、および家庭用動物(例えば、イヌおよびネコ)であり得る。
【０１５３】
当技術分野において公知である任意の技術を、動物に導入遺伝子を導入して、トランスジェニック動物の創始系統を生じるために使用することができる。このような技術には、前核マイクロインジェクション(米国特許第4,873,191号);生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子移入(Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 82:6148, 1985);胚性幹細胞への遺伝子標的法(Thompson et al., Cell 56:313, 1989);および胚のエレクトロポレーション(Lo, Mol. Cell. Biol. 3:1803, 1983)が含まれるがこれらに限定されない。とりわけ有用であるものは、Yang et al. (Proc. Natl Acac. Sci USA 94:3004-3009, 1997)に記載される方法である。
【０１５４】
トランスジェニック動物を生成しかつ評価するために使用することができる技術の概説のために、当業者は、Gordon (Intl. Rev. Cytol. 115:171-229, 1989)を参考にすることができ、および例えば、Hogan et al. Manipulating the Mouse Embryo. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1986); Krimpenfort et al. {Bio/Technology 9: 86, 1991), Palmiter et al. (Cell 41:343, 1985), Kraemer et al. (Genetic Manipulation of the Early Mammalian Embryo. Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 1985), Hammer et al.(Nature 315:680, 1985), Purcel et al. (Science, 244:1281, 1986), Wagner et al. (米国特許第5,175,385号), およびKrimpenfort et al. (米国特許第5,175,384号)からさらなる手引きを入手してもよい。
【０１５５】
実施例
本発明は、以下の実施例によって部分的に例証され、これはいかなる場合においても本発明を限定するものと見なされない。
【０１５６】
実施例1. HCC増殖の阻害のための天然のWntリガンドの同定
方法
細胞表面HSPGの調製およびヘパリン-アガロースクロマトグラフィーによる分画
Huh7細胞を、10% FBS(Sigma, St. Louis, MO)MEM(Mediatech, Herndon, VA, USA)中で70%コンフルエンシーまで増殖させた。培地を0% FBS MEMに変更し、24時間のインキュベーション後に、細胞を、0.1% FBS MEM中のヘパリン(50μg/ml)ありまたはなしで12時間処理した。細胞を、氷冷PBSで5回洗浄し、細胞層をTris緩衝化生理食塩水／EDTA中の結晶トリプシン(20μl/ml)とともに氷上で10分間インキュベートした。トリプシン活性を、100μg/mlの最終濃度のダイズトリプシンインヒビターの付加によって停止した。夾雑細胞を、トリプシン分解物から、4℃にで400×g、5分間の遠心分離によって除去した。
【０１５７】
トリプシン分解物を、ヘパリン-アガロースクロマトグラフィーに供した。手短に述べると、トリプシン分解物を、ヘパリン(4%)アガロースビーズとともに、4℃で一晩インキュベートし、ビーズを2000×g、4分間の遠心分離によって収集し、20体積のPBS中の0.1M NaClでビーズを洗浄した。溶出した画分を、PBS中の0.25M、0.5M、0.75M、および1.0M NaClを用いて収集した。
【０１５８】
二次元ゲル電気泳動、ゲル内消化およびペプチドマッピング
ヘパリン-アガロースクロマトグラフィーからの分画した試料を、等電点電気泳動法(IEF)のためのIRG緩衝液を用いる沈殿および再水和によって調製した。IEFは、製造業者のプロトコールに従って、ZOOM IPGRunner(Invitrogen(商標), Carlsbad, CA)を使用して実行した。ZOOMストリップ(pH3〜10)を試料とともに一晩再水和し、次いで、ステップ電圧ランピング法を以下のように適用した:200Vで20分間、450Vで15分間、750Vで15分間、および2000Vで120分間。フォーカスしたゲルを、二次元目の電気泳動としてZOOMゲル(Invitrogen)を使用するSDS-PAGEに供した。電気泳動後、ゲルを、シルバークエスト銀染色キット(Invitrogen)を使用して染色した。
【０１５９】
銀染色ゲルから切除したタンパク質スポットを脱染色し、乾燥させ、その後、配列グレード修飾トリプシン(Promega, Madison, WI)で酵素消化した。トリプシン分解ペプチドを脱塩し、ZipTipC18(Millipore, Bedford, MA)で濃縮した。濃縮したトリプシン分解ペプチドを、SENDタンパク質チップに適用し、PBSII(Ciphergen, Fremont, CA)を使用してペプチドマッピングを実施した。ペプチド質量フィンガープリンティングを、http://prospector.ucsf.edu.において使用可能であるプログラムProtein Prospectorの中のデータベース検索ツールMS-fitを用いて実施した。多数の制限を、二次元ゲルにおけるスポットの位置に基づく最初の検索に適用した:種=ホモ  サピエンス、pI範囲=6〜9.5、質量範囲=35〜50kDa。
【０１６０】
RT-PCR分析
総細胞RNAを、トリゾール(TRIzol)(登録商標)試薬(Invitrogen)を使用して、HepG2、Hep3B、Huh7およびフォーカス細胞株から抽出した。第1鎖cDNAを、250ngの総RNAから、ランダムヘキサマーおよびAMV RTを用いて、RT-PCR(AMV)用ファ−ストストランドcDNA合成キット(Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)を使用して、20μlの反応混合物中で合成した。PCRを、サーモサイクラー(MJ Research Inc., Waltham, MA)中で、50ngのcDNAおよびハイフィデリティPCRマスター(Roche Diagnostics)を使用して実施した。各Wntリガンドについてのプライマー対は以下の表1に列挙する。各プライマーの最終濃度は250nMであった。94℃で4分間の最初の変性後、反応を以下の熱プログラム:94℃で30秒間、55℃で30秒間、および72℃で1分間の35サイクル、次に72℃、10分間の最終伸長工程に供した。増幅産物を、臭化エチジウム染色した2%アガロースゲル上で分析した。
【０１６１】
qRT-PCRアッセイ法
肝臓組織およびHCC細胞株からの総RNAの抽出およびRT反応を以下のように実施した。Wnt3、Wnt11およびFZD7のmRNA発現レベルを決定するために、qRT-PCRを、iCycler iQ マルチカラーリアルタイムPCR検出システム(Bio-Rad, Hercules, CA)を使用して、SYBRグリーンPCRマスターミックス(Applied Biosystems, Foster City, CA)、400nMの各プライマーおよび既知の試料からの5ngのcDNA(等価な総RNA)からなる混合液を使用して実施した。熱サイクリング条件は、95℃で10分間の初期段階、続いて40サイクルの、95℃で15秒間、60℃で30秒間、および72℃で30秒間を含んだ。Wnt3、Wnt11、FZD7および18SrRNAについてのプライマー配列は以下の通りであった。
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アンプリコンのサイズは、Wnt3について130bp、Wnt11について133bp、FZD7について54bpおよび18SrRNAについて50bpであった。1.5%アガロースゲル電気泳動および臭化エチジウムによるPCR産物の可視化後、PCR産物を切除し、pCR2.1ベクター(Invitrogen)にクローニングした。配列決定を、T7フォワードプライマーおよびM13リバースプライマーを使用して、両方の方向で実施した。ヌクレオチド配列の確認後、リアルタイムPCRのための標準を、pCR2.1ベクターにクローニングした各PCR産物の10倍希釈を用いて調製した。Wnt3、Wnt1およびFZD7 mRNAのコピー数は、Ct値を測定すること、続いて各遺伝子についての標準曲線との比較後の18SrRNAに対する標準化によって、未知の試料中で定量した。実験を2回通りで実施した。
【０１６２】
プラスミドおよび抗Wnt3 Abの調製
ヒトWnt3プラスミドのC末端から22アミノ酸がもともとのプラスミドにおいて欠失していたので(22)、HindIIIおよびEcoRI制限酵素部位によりpcDNA(商標)3.1/myc-His A (Invitrogen)にクローニングされたヒトWnt3の配列に基づくPCR増幅の3回の実行を使用して、このプラスミドを全長配列に伸長した。プライマーの配列は、
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であった。
【０１６３】
ウサギポリクローナル抗体を、ヒトWnt3 (259LRAKYSLFKPPTERDL274) (SEQ ID NO:80)のアミノ酸259〜274に対応する合成ペプチドに対して調製した。このペプチド配列は、Wntファミリーの他のメンバーまたは他の既知のタンパク質とは有意な相同性を共有しなかった。抗体の特異性は、mycタグ化Wnt3プラスミドでトランスフェクトしたHCC細胞株を使用するウェスタン分析によって確認した。
【０１６４】
細胞培養
Hep3B、Huh7およびフォーカス細胞株を、10% FBSおよび1×最少必須培地非必須アミノ酸溶液(Sigma)を補充したMEM中で増殖させた。 HepG2は、β-カテニン遺伝子の欠失変異(31)のために除外した。トランスフェクション実験は、リポフェクタミン(LipofectAMINE)2000(Invitrogen)またはTransIT-LTl (Mirus, Madison, WI)を製造業者の説明書に従って使用して、70%コンフルエンシーで実施した。Tcf転写活性は、pSUPER8xTOPFLASHまたはpSUPER8xFOPFLASHを用いて細胞をトランスフェクトした後で、ルシフェラーゼアッセイシステム(Promega, Madison, WI)を使用して分析した(32)。ルシフェラーゼ活性についての生のデータは、トランスフェクション対照としてβ-ガラクトシダーゼ活性を使用して標準化した。実験を3回通りで実行し、結果を確認するために3回反復した。
【０１６５】
HCC細胞におけるWnt3過剰発現の効果
HCC細胞を、pcDNA3.1/myc-His A(対照プラスミド)またはWnt3プラスミド、pSUPER8xTOPFLASHまたはpSUPER8xFOPFLASH、およびβ-ガラクトシダーゼプラスミドでトランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞を24時間、0% FBS MEMとともにインキュベートし、次いで1% FBS MEMで刺激した。細胞を、刺激後2時間および24時間で収集し、ルシフェラーゼアッセイ法に供し、ならびにWnt3およびβ-カテニンについてのウェスタンブロット分析に供した。
【０１６６】
抗Wnt3抗体の効果
ブロッキング実験のために、細胞を、12ウェルプレートにまき、pSUPER8xTOPFLASHまたはpSUPER8xFOPFLASHを用いて、β-ガラクトシダーゼプラスミドを用いて、上記のようにトランスフェクトした。24時間の血清枯渇後、細胞を、抗Wnt3 Abまたは対照Ab(10μg/ml)のいずれかを含む1% FBS MEMとともにインキュベートし、インキュベーションの24時間後に収集した。正常ウサギIgG(Upstate, Waltham, MA)を対照抗体として使用した。
【０１６７】
siRNAの効果
対照siRNAおよびWnt3 siRNA
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をAmbion (Austin, TX)から購入し、10nMまたは100nMの濃度で、pSUPER8xTOPFLASHまたはpSUPER8xFOPFLASH、およびβ-ガラクトシダーゼプラスミドとともに、TransIT-LT1またはDharmaFECT 4 (Dharmacon, Chicago, IL)を使用して、HCC細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、Wnt3およびTcf転写活性のmRNA発現レベルを、それぞれqRT-PCRおよびルシフェラーゼによって測定した。
【０１６８】
抗Wnt3 Abをブロックすることの創傷治癒に対する効果
フォーカス細胞を6ウェルプレート上に配置した。コンフルエント単層細胞に、滅菌プラスチック200μlマイクロプレートチップで傷を付けた。次いで、細胞を、抗Wnt3 AbまたはウサギIgGのいずれかを有する培地で処理し、異なる時点で写真撮影した。
【０１６９】
ウェスタンブロット分析
総タンパク質抽出のために、細胞を、プロテイナーゼインヒビター(Roche Diagnostics)を有する溶解緩衝液(30mM Tris、pH 7.5、150mM 塩化ナトリウム、1% NP-40、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% SDS、10% グリセロール、および2mM EDTA)中でホモジナイズし、超音波処理した。BSAを標準として用いて、BCAタンパク質アッセイキット(Pierce, Rockford, IL)を使用して、タンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質(150μg)を12〜15% SDS-PAGEを使用して分離し、PVDFメンブレン(PerkinElmer, Wellesley, MA)に転写した。メンブレンを、0.1% Tween 20を含むTris緩衝化生理食塩水中の5% BSAでブロックし、次いで、1;1,000で希釈したマウスモノクローナル抗myc Ab(Santa Cruz Biotechnology Inc., Santa Cruz, CA)、1:200で希釈したウサギポリクローナル抗Wnt3 Ab、1:1,000で希釈したマウスモノクローナル抗β-カテニンAb(Transduction Laboratories, San Diego, CA)、または1:2,000で希釈したウサギポリクローナル抗hsp90Ab(Santa Cruz Biotechnology Inc.)とともに、4℃で一晩インキュベートした。0.1% Tween20を含むTris緩衝化生理食塩水を用いる洗浄後、メンブレンを、1:10,000で希釈した二次HRP抗体とともに室温で1.5時間インキュベートし、化学発光画像化ウェスタンライトニング(PerkinElmer)を使用して可視化した。
【０１７０】
ヒトHCC組織
17対のHCCおよび一致する、関与しない、腫瘍周囲の肝臓組織を、韓国および南アフリカから入手した。12対の試料は、外科的切除を受けた韓国人の患者からであった。12例の患者のうちの9例は男性であり、メジアン年齢は52歳(範囲、22〜67歳)であった。11例の患者は、B型肝炎表面抗原(HBsAg)について陽性であり、残りの1例の患者において病因は未知であった。7例の患者(58%)は内在する肝硬変を有した。肝臓への結腸直腸癌の単一の転移についての肝切除を受けた韓国人患者から得られた5例の肝臓組織は、正常肝組織についての対照として働いた。4例の患者は男性であり、メジアン年齢は46歳(範囲37〜57歳)であった。組織学的試験は、周りを取り囲む腫瘍周囲肝臓組織中でいかなる病理も示さなかった。
【０１７１】
β-カテニンについての免疫組織化学
ホルマリン固定した、パラフィン包埋した切片を、キシレン中でパラフィン除去し、減少濃度のエタノールによって再水和した。切片を10mM クエン酸ナトリウム緩衝液(pH 6.0)中に浸漬し、電子レンジ中で10分間沸騰させ、およびエピトープの回復のために室温まで冷却した。次いで、スライドを、ユニバーサルダコサイトメーション(Universal DakoCytomation)LSAB(登録商標)+キット、ペルオキシダーゼ(DAKO Corp., Carpinteria, CA)を、製造業者の説明書に従って使用して処理した。内因性のペルオキシダーゼ、アビジンおよびビオチンの活性は、3%過酸化水素および内因性アビジン／ビオチンブロッキングキット(Zymed Laboratories Inc., South San Francisco, CA)を伴うインキュベーションによってブロックした。切片を、1:500希釈の抗ヒトβ-カテニンモノクローナルAbとともに、4℃で一晩インキュベートした。陰性対照のために一次抗体をPBSで置き換えた。核染色の存在に従って、β-カテニン発現パターンを2つのグループに分類した。腫瘍組織における細胞質染色もまた、腫瘍周囲組織における染色と比較した。
【０１７２】
β-カテニン遺伝子のエキソン-3についての変異分析
β-カテニン遺伝子のエキソン-3変異を、いくつかの改変を伴うWong et al.(11)の方法によって分析した。手短に述べると、β-カテニン遺伝子のエキソン-3の218bpフラグメントを、エクスパンドハイフィデリティーPCRシステム(Roche Diagnostics)を使用して、HCCおよび周りを取り囲む腫瘍周囲肝臓組織からのcDNA(50ng)から増幅した。プライマーの配列は、
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であった。熱サイクリング条件は、94℃で3分間の最初の変性工程、続いて、35サイクルの、95℃で30秒間、58℃で30秒間、および72℃で30秒間を含んだ。PCR産物の可視化後、PCR産物を、pCR2.1ベクター(Invitrogen)にクローニングし、続いて、T7フォワードプライマーおよびM13リバースプライマーを使用して配列決定した。各PCR産物からの少なくとも5個のクローンを配列決定のために分析した。
【０１７３】
結果
HCC細胞株におけるWntリガンドの同定
Wntタンパク質は、主として、細胞表面上のECMと結合されるので、Huh7中で結合型としてWntタンパク質を含む、細胞表面HSPGを精製するための試みがなされた。トリプシンによって調製したHuh7-HSPGを、前分画のために、ヘパリン-アガロースアフィニティー樹脂に供した。溶出した画分をSDS-PAGEに適用し、ヘパリン処理した試料と未処理試料との間でタンパク質バンドを比較した。ヘパリン未処理画分における約45kDaタンパク質バンドが、0.25M NaCl溶出画分から、区別可能であった(データ示さず)。Wntタンパク質の見積もられた分子量が35〜45kDaの範囲内にあるので、このタンパク質バンドは、潜在的にWntタンパク質を含むと見なされた。このタンパク質バンドを規定するために、二次元電気泳動を実施した。図1Aに示されるように、ヘパリン処理試料と未処理試料との間のタンパク質発現の異なるレベルを示す、いくつかの銀染色タンパク質スポットが存在した。35〜55kDaおよびpI5〜9.5のタンパク質スポットは、Wntリガンドタンパク質についての候補と見なされた。Wntタンパク質はヘパリン処理によって遊離可能であるので、ヘパリン未処理試料における2つのアップレギュレートされたタンパク質のスポットを調べた。銀染色二次元ゲルから切除したタンパク質のスポットを、ゲル内消化に供し、続いて、質量スペクトル測定によるペプチドマッピングに供した。データ分析は、図1Bに示されるように、9個のペプチドがヒトWnt11タンパク質と一致したことを示した。この知見をさらに裏付けるために、既知のすべてのヒトWntリガンドについて特異的な19対のプライマーを使用する、HCC細胞株中のRT-PCRによってWnt mRNA発現を試験した。図1Cに示されるように、試験した19個すべてのWnt遺伝子の中で、Wnt3およびWnt11 mRNAのみが、HCC細胞株において発現された。他の既知のWnt mRNAのいずれも、RT-PCRによって検出されなかった。Wnt3およびWnt11がHCC細胞株において同定された後、mRNA発現レベルを、HCC細胞株において定量的リアルタイムRT-PCR(qRT-PCR)アッセイ法を使用して試験した。HCC細胞株中でのWnt3 mRNAの発現レベル(平均±SE)は、HepG2において370.0±10.3コピー／109 18SリボソームRNA(18SrRNA)、Hep3Bにおいて381.3±12.7コピー／109 18SリボソームRNA(18SrRNA)、Huh7において95.2±6.3コピー／109 18SリボソームRNA(18SrRNA)、および210.4±9.5コピー／109 18SリボソームRNA(18SrRNA)であった。Wnt11 mRNAの発現レベルは、HepG2において8,499.3±845.0コピー／109 18SrRNA、Hep3Bにおいて290.9±40.1コピー／109 18SrRNA、およびHuh7において3.57±0.2コピー／109 18SrRNAであった。Wnt11 mRNAは、従来的なRT-PCRの結果と一致して、リアルタイムRT-PCRを用いてフォーカス細胞中で検出することができなかった(図2B)。
【０１７４】
ヒトHCC組織におけるWnt3、Wnt11およびFZD7 mRNAの発現
17個のHCC組織の内の13個(76.5%)および17個の腫瘍周囲組織の内の10個(58.8％)が、カットオフレベルが正常肝臓組織における平均±3SDの値として規定された場合に、正常対照におけるレベルと比較して増加したWnt3 mRNA発現レベルを示した。1個の腫瘍周囲組織のみが、正常肝臓と比較して、減少した発現を示した。17対の試料の中で、12個(70.6%)が、対応する腫瘍周囲組織と比較して、腫瘍中で増加したWnt3 mRNA発現を示したが、しかし、これは、統計学的に有意ではなかった(ウイルコクソンの符号付き検定によってP=.435)(図3A)。Wnt3とは対照的に、17個の内の11個(64.7%)の対の試料が、対応する腫瘍周囲組織と比較して、腫瘍中でWnt11 mRNAの発現の減少を示し、これはなお、統計学的に有意ではなかった(ウイルコクソンの符号付き検定によってP=.227)。しかし、17個の腫瘍組織の内の7個(41.2%)が、正常肝臓組織のより低いカットオフレベルの下でさえ減少した発現レベルを示したのに対し、腫瘍周囲組織においては示さなかった(フィッシャーの直接確率検定によってP=.0036)。17個の腫瘍組織の内の5個(29.4%)は、正常肝臓組織と比較してWnt11 mRNAの増加した発現を示したのに対して、17個の腫瘍周囲組織の内の9個(52.9%)が示した。HCCと腫瘍周囲組織の両方が、正常肝臓組織と比較して、17個の試料の内の10個(58.8%)で、増加したFZD7 mRNA発現を示した(図3B)。17個の対の試料の内の12個(70.6%)が、対応する腫瘍周囲組織と比較して、腫瘍におけるFZD7 mRNAの増加した発現を示し、この違いは統計学的に有意であった(ウイルコクソンの符号付き検定によってP=.031)(図3C)。
【０１７５】
β-カテニンの核蓄積
免疫組織化学染色は、17個のHCC組織の内の7個(41%)においてβ-カテニンの核蓄積を示した。周りを取り囲む腫瘍周囲組織においては、β-カテニンの核蓄積は存在しなかった(図4)。β-カテニンの核蓄積を有する7個の試料のすべてがまた、細胞質におけるβ-カテニンについての染色の増加を示した。β-カテニンの核蓄積がない10個の腫瘍組織の中で、1個の試料が、その対応する腫瘍周囲組織と比較して、β-カテニンについての細胞質染色の増加を示した。
【０１７６】
配列決定分析によって、β-カテニン遺伝子のエキソン3上の変異が、17個のHCC試料の内の4個(23.5%)において見い出されたのに対して、周りを取り囲む腫瘍周囲組織においては見い出されなかった。これらはすべて、コドン35、37および45に影響を与える単一のミスセンス変異であった(2つがI35S、1つがS37C、および1つがS45F)。免疫組織化学染色によってβ-カテニンの核蓄積を示した7個の試料の内の3個(42.9%)が、β-カテニンのリン酸化およびユビキチン化の原因である領域に変異を有した。β-カテニン遺伝子において変異を有したが(I35S)、しかしβ-カテニンの核蓄積を示さなかった1つの試料は、免疫組織化学染色において細胞質染色の増加を有した。β-カテニンの核蓄積を有したが、しかしβ-カテニン遺伝子のいかなる変異も有さなかった残りの4個すべての試料は、対の腫瘍周囲組織と比較して、増加したFZD7 mRNAレベルを有した。FZD7 mRNAレベルはまた、正常肝臓組織の平均値と比較して、7〜74倍増加された。しかし、Wnt3および／またはWnt11のmRNA発現レベルは、β-カテニン核蓄積とは関連しなかった。
【０１７７】
HCC細胞株中でのWnt3過剰発現の効果
HCC中での標準的なWnt経路に対するWnt3の効果を決定するために、T細胞因子(Tcf)転写活性の変化を、Wnt3プラスミドを用いるトランスフェクション後に試験した。Wnt3プラスミドを用いるトランスフェクションは、図5Aにおいて実証されるように、mRNAレベル(データ示さず)とタンパク質発現レベルの両方の際だった増加を生じた。Tcf転写活性はまた、対照の活性と比較して、フォーカス細胞において約3倍の増加を示し、これは統計学的に有意であった(p<0.01)。しかし、Tcf転写活性は、Hep3B細胞において変化せず、Huh7細胞においては、とりわけ刺激の24時間後でなお減少した(図5B)。これらの結果と一致して、ウェスタンブロット分析によって実証されるように、細胞β-カテニンレベルは、Wnt3プラスミドを用いるトランスフェクション後にフォーカス細胞において増加されたが、Hep3BまたはHuh7細胞においては変化しなかったかまたは減少した(図5A)。
【０１７８】
抗Wnt3 AbまたはWnt3 siRNAによるWntシグナル伝達と拮抗すること
次に、ベースラインTcf転写活性および細胞β-カテニンレベルが、フォーカス細胞と比較して、Huh7細胞およびHep3B細胞においてすでに高かったので(図5)、HCC細胞株における標準的な経路に対する抗Wnt3 AbまたはsiRNAによる阻害の効果を試験した。ポリクローナル抗Wnt3 Abとのインキュベーションは、Huh7細胞において60%、Hep3B細胞において26%、およびフォーカス細胞において40%のルシフェラーゼ活性の減少を生じた(図6A)。標準的な経路に対するこの阻害効果を確証するために、Wnt3についてのsiRNAを使用した。最初に、3つの異なる種類のsiRNAの阻害効率を、qRT-PCRアッセイ法を使用してHuh7細胞およびHep3B細胞において評価した。siRNA Wnt3-3が最も効率的であり(データ示さず)、100nMの濃度において50〜60%のmRNAレベルの平均減少であることが見い出された(図6B)。mRNAのこれらの減少と一致して、Tcf転写活性はまた、Huh7細胞において48.5%、Hep3B細胞において33%、およびフォーカス細胞において43.5%減少した(図6C)。それゆえに、Wnt3の阻害は、HCC細胞株における標準的な経路の抑制を生じることができたと結論付けられた。
【０１７９】
HCC細胞における創傷治癒に対する抗Wnt3 Abの効果
Tcf転写活性の阻害がHCC細胞の挙動の機能的変化をもたらすことができたか否かもまた研究した。フォーカス細胞を使用する創傷治癒アッセイ法は、抗Wnt3 Abで処理した細胞において創傷治癒の遅延を示し、これらの変化は、24時間で最も顕著であった。24時間において、対照Abで処理したフォーカス細胞においては、創傷の大部分は、移動している細胞および増殖している細胞で覆われたのに対して、抗Wnt3 Abで処理した細胞においては創傷は存続した(表7)。
【０１８０】
本研究は、肝臓およびHCCにおけるWntリガンドの発現パターンを分析した。Wnt3およびWnt11のmRNAは、従来的なRT-PCR法およびqRT-PCR法を使用して、試験された大部分のHCC細胞株において発現されたことを見い出した。そのタンパク質レベルでのWnt11発現はまた、プロテオミクス技術を使用して実証した。HCC細胞株におけるこれらの観察と一致して、Wnt3およびWnt11 mRNA発現はまた、HCCを含んだヒト肝臓組織において確証した。
【０１８１】
Wnt3、Wnt11、およびFZD7の発現パターンは、HCCを含むヒト肝臓組織および対応する腫瘍周囲組織において決定した。腫瘍組織におけるFZD7のmRNAレベルは、対応する腫瘍周囲組織および正常肝臓組織におけるレベルよりもより上昇した。HCCと腫瘍周囲組織の間でWnt3 mRNA発現の統計学的に有意な違いは存在しなかったが、71%のHCCが、それらの対応する腫瘍周囲組織と比較して、増加したWnt3発現を示した。さらに、77%のHCCおよび59%の腫瘍周囲組織が、正常肝臓組織における平均±3SDの値よりも上である、増加したWnt3 mRNA発現レベルを示した。これらの知見は、Wnt3のアップレギュレーションが、肝臓癌形成の間の初期の事象であり、ならびに／または肝臓の炎症および壊死の間の肝臓の再生において重要な役割を果たす可能性があることを示唆する。
【０１８２】
さらに、65%の対のHCC試料は、対応する腫瘍周囲組織と比較して、腫瘍においてWnt11 mRNAの発現の減少を示した。41%の腫瘍組織が、正常肝臓組織のより低いカットオフレベルの下でさえ減少したWnt11の発現レベルを示した。これらの知見は、標準的な経路の抑制因子としてのWnt11の役割と適合した。
【０１８３】
Wnt3の過剰発現はまた、Tcf転写活性の3倍の増加、および細胞β-カテニンレベルの増加によって証明されるように、フォーカス細胞において標準的なWnt経路を活性化することが見い出された。しかし、Tcf転写活性は、トランスフェクション後にWnt3 mRNAおよびタンパク質発現が顕著に増加したのにも関わらず、Hep3B細胞においては変化せず、Huh7細胞においてはわずかに減少すらした。
【０１８４】
ポリクローナル抗Wnt3 AbまたはsiRNAによるWnt3の阻害は、3つすべてのHCC細胞株においてTcf転写活性を減少した。これらの変化は、最高のベースラインTcf転写活性を有したHuh7細胞において最も顕著であった。さらに、抗Wnt3 Abを用いるフォーカス細胞の処理は創傷治癒を阻害し、これは、この阻害の機能的な結果が細胞移動および増殖を減少したことを示唆する。
【０１８５】
核および／または細胞質のβ-カテニンの蓄積は、17個のHCC組織の内の8個(47%)で観察され、これらの半分の場合でβ-カテニン遺伝子変異を有した。β-カテニン蓄積を有するが変異を有さない残りの4個の場合では、腫瘍においてFZD7のレベルの顕著な上昇を有し、FZD7アップレギュレーションが、これらの腫瘍における標準的なWntシグナル伝達経路の活性化と直接関連することを示唆した。Wnt3またはWnt11の発現レベルは、β-カテニン蓄積と関連せず、FZD7のそれとも関連しなかった。
【０１８６】
結論として、Wnt3およびWnt11を、HCC細胞株およびHCC組織を含むヒト肝臓組織において同定した。Wnt3 mRNA発現レベルは、正常肝臓組織におけるレベルと比較して、HCCと腫瘍周囲組織の両方においてアップレギュレートされた。Wnt11 mRNA発現は、HCC組織においてダウンレギュレートされた。抗Wnt3 AbまたはsiRNAによるWnt3の阻害は、標準的なWntシグナル伝達経路の減少を生じ、および創傷治癒を減弱したのに対し、Wnt3刺激は、フォーカス細胞におけるTcf転写活性を増加した。これらの知見は、Wnt3が、肝臓癌形成の間にβ-カテニン変異なしで、FZD7の過剰発現、および標準的なWntシグナル伝達経路の活性化に関連する天然のWntリガンドであることを示唆する。
【０１８７】
参考文献
2008516895.tif 000007
2008516895.tif 000008
2008516895.tif 000009
【０１８８】
（表１）WntリガンドmRNAの検出のために使用したプライマー対
2008516895.tif 000010
【０１８９】
本発明の多くの態様が説明されてきた。それにも関わらず、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、種々の改変を行い得ることが理解される。従って、他の態様は、添付の特許請求の範囲内にある。
【図面の簡単な説明】
【０１９０】
【図１Ａ】ヘパリン処理後のHuh7細胞(Hep+)または処理なしのHuh7細胞(Hep-)からの分画したヘパリン硫酸プロテオグリカン(HSPG)のパターンを図示する、銀染色二次元SDS-PAGEゲルの写真のセットである。ヘパリンアフィニティークロマトグラフィーからの0.25M NaCl画分を、一次元pH3〜10非線形IPGゲルおよび二次元4〜12%勾配NuPAGEゲル上で分離した。ヘパリン未処理画分からのタンパク質スポット(丸で囲んだ;本明細書以後「スポット1」と称する)は発現の増加を示した。
【図１Ｂ】スポット1から得られたトリプシンペプチドの質量スペクトルである。スポット1を切除し、脱染色し、およびトリプシンで消化した。ペプチドの質量を、PBSII機器上で分析した。印を付けたピーク(*)は、計算したヒトWnt-11ペプチドの質量と一致したペプチドを表す。
【図１Ｃ】RT-PCRを使用する、種々の肝細胞癌細胞株中でのWntリガンドmRNAの検出を図示するアガロースゲルの写真である。Wnt-3 mRNAはすべてのHCC細胞株において検出し、Wnt-11 mRNAはフォーカス(Focus)細胞以外の3つのHCC株において検出した。他のWnt mRNAは、RT-PCRによって検出可能ではなかった。
【図２】図2Aは、HCC細胞株中でqRT-PCRによって測定されるような、Wnt3 mRNAレベルを図示する棒グラフである。18SrRNAレベルを内部対照として使用し、Wnt3およびWnt11 mRNAレベルを、109 18SrRNAあたりのコピー数として表現した。HCC細胞株中のWnt3 mRNAの発現レベル(平均±SE)は、HepG2において370.0±10.3コピー／109 18SrRNA、Hep3Bにおいて381.3±12.7コピー／109 18SrRNA、Huh7において95.2±6.3コピー／109 18SrRNA、および210.4±9.5コピー／109 18SrRNAであった。図2Bは、HCC細胞株中のqRT-PCRによって決定されるようなWnt11 mRNAレベルを図示する棒グラフである。18SrRNAレベルを内部対照として使用し、Wnt11 mRNAレベルを、109 18SrRNAあたりのコピー数として表現した。Wnt11 mRNAの発現レベルは、HepG2において8,499.3±845.0コピー／109 18SrRNA、Hep3Bにおいて290.9±40.1コピー／109 18SrRNA、およびHuh7において3.57±0.2コピー／109 18SrRNAであった。Wnt11 mRNAは、従来的なRT-PCRの結果と一致して、qRT-PCRを用いてフォーカス細胞中で検出することができなかった。
【図３】図3Aは、ヒトHCC組織におけるWnt3 mRNAの発現を図示する棒グラフである。mRNAレベルはqRT-PCRによって測定した。白いバーは正常肝臓組織におけるmRNAレベルを表す。黒いバーはHCC組織におけるmRNAレベルを表す。灰色のバーは対応する腫瘍周囲組織におけるmRNAレベルを表す。実験は2回通りで実施し、データは平均±SDで表現する。77%のHCCおよび59%の腫瘍周囲組織が、正常肝臓組織における平均±3SDの値よりも上の増加したWnt3 mRNA発現レベルを示した。71%のHCC組織は、対応する腫瘍周囲組織におけるレベルと比較して、Wnt3 mRNA発現レベルを増加した。図3Bは、ヒトHCC組織におけるWnt11 mRNAの発現を図示する棒グラフである。mRNAレベルはqRT-PCRによって測定した。白いバーは正常肝臓組織におけるmRNAレベルを表す。黒いバーはHCC組織におけるmRNAレベルを表す。灰色のバーは対応する腫瘍周囲組織におけるmRNAレベルを表す。実験は2回通りで実施し、データは平均±SDで表現する。41%のHCC組織が、正常肝臓組織のより低いカットオフレベルの下でさえ減少した発現レベルを示したのに対し、腫瘍周囲組織においては示さなかった(フィッシャーの直接確率検定によってP=.0036)。65%の対の試料もまた、対応する腫瘍周囲組織と比較して、腫瘍においてWnt 11 mRNAの発現の減少を示した。図3Cは、ヒトHCC組織におけるFZD7 mRNAの発現を図示する棒グラフである。mRNAレベルはqRT-PCRによって測定した。白いバーは正常肝臓組織におけるmRNAレベルを表す。黒いバーはHCC組織におけるmRNAレベルを表す。灰色のバーは対応する腫瘍周囲組織におけるmRNAレベルを表す。実験は2回通りで実施し、データは平均±SDで表現する。HCC組織と腫瘍周囲組織の両方の59%が、正常肝臓組織におけるレベルと比較して、増加したFZD7 mRNAを示した。71%の対の試料は、対応する腫瘍周囲組織と比較して、腫瘍においてFZD7 mRNAの発現の増加を示した(ウイルコクソンの符号付き検定によってP=.031)。
【図４】免疫組織化学的に染色したヒトHCCおよび腫瘍周囲組織の写真である(倍率×400)。図4A:陰性対照。図4B:β-カテニンは腫瘍周囲組織を染色した。肝細胞は典型的な膜染色を示した。図4C:β-カテニンはHCC細胞を染色し、これは、β-カテニンの核蓄積を示す。増加したβ-カテニンの細胞質染色と同様に核染色を注目のこと。図4D:HCC組織、これは、β-カテニンの核または細胞質の蓄積を示さない。
【図５】図5Aは、HCC細胞株におけるT細胞因子(Tcf)転写活性に対するWnt3プラスミドトランスフェクションの効果を図示するウェスタンブロットの複合写真である。フォーカス細胞、Huh7細胞およびHep3B細胞を、myc-タグ化Wnt3プラスミドまたはpcDNA3.1/myc-His Aプラスミド、pSUPER8xTOPFLASHまたはpSUPER8xFOPFLASH、およびβ-ガラクトシダーゼプラスミドとともに同時トランスフェクトした。トランスフェクションの24時間後、細胞を24時間血清枯渇させ、次いで、1% FBS MEMで刺激した。細胞を、刺激の2時間後および24時間後に収集し、ルシフェラーゼアッセイ法ならびにWnt3およびβ-カテニンについてのウェスタンブロットに供した。ウサギポリクローナル抗Wnt3抗体を用いるウェスタンブロット分析は、トランスフェクション後のWnt3タンパク質の増加を示した。ポリクローナル抗Wnt3抗体の特異性は、モノクローナル抗myc抗体を用いて確認した。フォーカス細胞における細胞β-カテニンレベルの増加に注目のこと。Hsp90タンパク質を、内部ローディング対照として使用した。図5Bは、Wnt3プラスミドを用いるトランスフェクション後の、HCC細胞株中のTcf転写活性の変化を図示する棒グラフである。Tcf転写活性は、対照プラスミドでトランスフェクトしたフォーカス細胞における活性と比較して、トランスフェクション後に、フォーカス細胞において3倍増加した。Tcf転写活性は、Huh7細胞においてはわずかに減少し、トランスフェクション後にHep3B細胞においては変化しなかった。白いバーは対照プラスミド(pcDNA)でトランスフェクトした細胞を示し、黒いバーはWnt3プラスミドでトランスフェクトした細胞を示す。
【図６Ａ】HCC細胞株におけるTcf転写活性に対する抗Wnt3抗体の効果を図示する棒グラフである。HCC細胞は12ウェルプレートにまき、β-ガラクトシダーゼプラスミドとともに、pSUPER8xTOPFLASHまたはpSUPER8xFOPFLASHを用いてトランスフェクトした。細胞は24時間、血清を欠乏させ、引き続き、細胞を、抗Wnt3抗体(Wnt3-Ab;黒いバー)または対照抗体(10μg/ml)のいずれかを含む1% FBS MEMとともにインキュベートし、インキュベーションの24時間後に収集した。正常ウサギIgGを対照抗体として使用した(C-Ab;白いバー)。Tcf転写活性は、ポリクローナル抗Wnt3抗体処理を用いて、Huh7細胞において60%、Hep3B細胞において26%、およびフォーカス細胞において40%減少した。
【図６Ｂ】内因性Wnt3 mRNA発現に対するsiRNAの効果を図示する棒グラフである。10または100nMの濃度の対照siRNAおよびWnt3 siRNA(WNT3-3)を、HCC細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの48時間後、細胞を収集し、Wnt3 mRNA発現レベルを、qRT-PCRを使用して測定した。siRNA Wnt3-3は、3つの細胞株のすべてにおいて、100nMの濃度にて、平均で50〜60%、mRNAレベルの減少を引き起こした。図6BはHuh7細胞におけるこの効果を表す。
【図６Ｃ】Tcf転写活性またはHCC細胞株に対するWnt3 siRNAの効果を図示する棒グラフである。Wnt3 siRNAまたは対照siRNAは、示された濃度(nM)で、Tcfレポーターの存在下で同時トランスフェクトした。Tcf転写活性は、Huh7細胞において48.5%、Hep3B細胞において33%、およびフォーカス細胞において43.5%減少した。
【図７】抗Wnt3抗体で処理したフォーカス細胞において創傷治癒の遅延を図示する細胞培養の写真である。フォーカス細胞を6ウェルプレート中にプレーティングした。コンフルエント単層細胞を、滅菌プラスチック200μlマイクロピペットチップで傷つけた。次いで、細胞を、抗Wnt3 AbまたはウサギIgG(対照抗体(C Ab);10μg/ml)のいずれかを有する培地で処理し、異なる時点で写真撮影した。抗Wnt3 Abで処理したフォーカス細胞は、創傷治癒の遅延を示した。この効果は、24時間で最も顕著であった。24時間では、大部分の創傷が、C Abで処理した細胞中の移動している細胞および／または増殖している細胞で覆われたのに対して、創傷は、抗Wnt3 Abで処理した細胞においては存続した。
【図８】推定の結合モチーフを含む、例示的なFZD7、FZD8、Wnt3、Wnt8bおよびWnt11のヒトおよびマウスのアミノ酸は配列を図示する。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年5月24日(2007.5.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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