(57)【要約】  ＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチド（ＲＩＰ）は、埋込まれた骨セメント表面での生物膜形成リスクを有利になるように処理するか、又は低減するため、持続的な化学療法、入院、又は骨セメントの外科的除去の可能性が少なくなる。抗体とは異なり、ＲＩＰは抵抗性細菌株を誘導せずに生物膜を根絶するため、ＲＩＰをこのことに適用すると特に好適である。またＲＩＰを含む生分解性組成物も提供される。
2008534225.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨セメント組成物及びＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチド（ＲＩＰ）を含む組成物であって、前記組成物を哺乳類個体に投与した場合に細菌感染症のリスクを処理又は低減するのに有効な量の前記ＲＩＰを含む組成物。
【請求項２】
前記骨セメント組成物が粉末状の成分を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記組成物が抗生物質又は抗菌性ペプチドをさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記抗生物質がアミノ配糖体又はβラクタムである請求項３に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物が骨形態形成性蛋白質をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記組成物が麻酔剤をさらに含む請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記骨セメント組成物が、ポリメタクリル酸メチル又はメタクリル酸メチルを含む請求項１に記載の組成物。
【請求項８】
前記骨セメントが、注入可能なセラミックスセメント、注入可能なリン酸カルシウム水硬セメント、カルシウム不含ヒドロキシアパタイトセメント、ダールライト（ｄａｈｌｌｉｔｅ）セメント、又はブルシャイトセメントである請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記ＲＩＰが、
（ａ）ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦ配列の５個の連続したアミノ酸であって、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳであるアミノ酸；又は
（ｂ）２個の置換又は欠失によりＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦ配列とは異なる配列を持つアミノ酸であって、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳであるアミノ酸；
を含む請求項１に記載の組成物。
【請求項１０】
前記ＲＩＰが担体系内に調合されている請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記担体系がナノ粒子を含む請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
個体へ骨セメント組成物を投与する方法であって、前期方法は、ＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチド（ＲＩＰ）組成物を含有する骨セメント組成物を個体に挿入する工程を含み、前記ＲＩＰが、前記個体における細菌感染症のリスクを処理又は低減するのに有効な量である方法。
【請求項１３】
前記ＲＩＰが、前記骨セメントの投与前に、前記骨セメント組成物の粉末化成分と混合される請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＩＰが、前記骨セメントの固化の前に前記骨セメントと混合される請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
個体における細菌感染症のリスクを処理又は低減する方法であって、前期方法は、前記個体に挿入された骨セメントに関連する感染症のリスクを処理又は低減するのに有効な量のＲＩＰ組成物を前記個体に投与する工程を含む方法。
【請求項１６】
前記ＲＩＰ組成物が、前記個体への前記骨セメント組成物の挿入と同時に投与される請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＩＰ組成物が、前記個体への前記骨セメントの埋込み後に投与される請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記方法が、前記ＲＩＰ組成物を非経口投与する工程を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記方法が、前記ＲＩＰ組成物を経口投与する工程を含む請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記ＲＩＰ組成物が、急速放出のキネティクスが可能な製剤である請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＲＩＰ組成物が、持続放出が可能な製剤である請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
生分解性組成物及びＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチド（ＲＩＰ）を含む組成物であって、前記組成物を哺乳類個体に投与する場合に細菌感染症のリスクを処理又は低減するのに有効な量の前記ＲＩＰを含む組成物。
【請求項２３】
前記生分解性組成物が粉末状の成分を含む請求項２２に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組成物が抗生物質又は抗菌性ペプチドを含む請求項２２に記載の組成物。
【請求項２５】
前記生分解性組成物がフィブリンシーラントである請求項２２に記載の組成物。
【請求項２６】
前記生分解性組成物がコラーゲンシートのヒドロゲル又はヒドロコロイドである請求項２２に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の説明
本出願は２００５年４月４日に出願された米国特許仮出願第６０／６６７９４０号の権益を主張するものであり、ここで参照することによってその全体が組込まれたものとする。
【０００２】
本出願は全般的には細菌感染症の治療のための組成物及びその方法に関し、特に骨セメント組成物、又はＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチドを含む類似組成物、ならびにそれらを用いる方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
必要認識及びＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチド
近年の研究によって、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、及び黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）を含む細菌種の病理学における必要認識が重要であることが明らかになった。必要認識とは、細菌集団が隣の細胞から情報を受け、適当な反応を誘導して宿主内でのそれ自体の生存を可能にするメカニズムのことである。それについては、バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０：４３８‐４０（１９９８）；ミラーら、（Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、セル（Ｃｅｌｌ）１１０：３０３‐１４（２００２）；ヘンツァーら（Ｈｅｎｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、エンボジャーナル（ＥＭＢＯ  Ｊ．）２２：３８０３‐１５（２００３）；コレムら、（Ｋｏｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ．）、ＦＥＭＳ・マイクロバイオロジー・レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．）２２３：１６７‐７５（２００３）を参照のこと。スタフィロコッカス属菌では、必要認識によって、定着、播種、及び疾患の促進に関わる多くの毒素の産生を含めた細菌の有毒性の関与を受ける蛋白質の発現がコントロールされる。これらの有毒因子のうちのいくつかは、超抗原として作用することで宿主の免疫系を過剰に刺激し、サイトカインを過剰に放出させ、Ｔ細胞を過剰増殖させるエンテロトキシン及び毒素ショック症候群毒素‐１（ＴＳＳＴ‐１）である。
【０００４】
黄色ブドウ球菌における必要とされる認識系では、エフェクターが必要認識分子ＲＮＡＩＩＩで活性化するペプチド（ＲＡＰ）については、スタフィロコッカス属菌の中で高い保存性を有する２１ｋＤａの蛋白質である「ＲＮＡＩＩＩ活性化蛋白質の標的」（ＴＲＡＰ）をリン酸化する。ＴＲＡＰのリン酸化によって、細菌の付着が促進され、トキシン合成の原因であるＲＮＡＩＩＩと呼ばれる制御性ＲＮＡ分子の下流での産生が促進される。バラバン（Ｂａｌａｂａｎ）（１９９８）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ ｅｔ ａｌ．）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）３７６：２６５８‐６６７（２００１）。ＲＡＰの拮抗物質であるＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチド（ＲＩＰ）は、ＴＲＡＰのリン酸化を抑制し、それによってインビボにおいて、下流域での有毒因子類の産生、細菌付着、生物膜形成、及び感染が強く抑制される。ＲＩＰの作用機序については、一般的な抗生物質とは異なり、細菌を殺さない。ＲＩＰは、宿主の防御機構に対する細菌の有毒性を増大させる細菌細胞間のコミュニケーションを抑制する。そのことについてはバラバン（Ｂａｌａｂａｎ）（１９９８）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ ｅｔ ａｌ．）、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２１：１３０１‐１１（２０００）；ゴブら（Ｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２２：１６０９‐２０（２００１）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、ジャーナル・オブ・インフェクシャウス・ディジーズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１８７：６２５‐３０（２００３）；キリオーニら（Ｃｉｒｉｏｎｉ ｅｔ ａｌ．）、サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）１０８：７６７‐７１（２００３）；リベリオら（Ｒｉｂｅｒｉｏ ｅｔ ａｌ．）、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２４：１８２９‐３６（２００３）；ジャコメッチら（Ｇｉａｓｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．）、アンチバイオロジカル・エイジェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４７：１９７９‐８３（２００３）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ．）、キドニー・インターナル（Ｋｉｄｎｅｙ  Ｉｎｔ．）２３：３４０‐４５（２００３）；バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ.）、アンチマイクロバイオロジカル・エイジェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４８：２５４４‐５０（２００４）；デラクワら（Ｄｅｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ.）、ジャーナル・オブ・インフェクシャウス・ディジーズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１９０：３１８‐２０（２００４）を参照のこと。
【０００５】
骨セメントの生物膜感染症
骨セメント組成物は、損傷を受けた骨の強化、又は人工関節のようなインプラント材を骨構造物に固定するのに用いられる。そのような適用は、整形外科、歯科及び関連する医療科目の領域で特に有用である。一般に、外科医は手術前に、ポリメタクリル酸メチル（ＰＭＭ）粉末を、メタクリル酸メチル及び放射線不透明化生成物を作り出す硫酸バリウム結晶を含む液状成分と混合して骨セメントを直接調製する。外科医は、得られた固化し得る液状物質を骨の空洞に圧入又は注入し、その液状物は数分以内で重合し、硬化する。化学組成及び物理的特性が異なる多くの市販骨セメント製剤が購入でき、骨セメントの混合及び注入の新たな手法についても現在開発されつつある。
【０００６】
骨セメントの表面は、しばしば細菌の定着を助け、手術後感染症を引起こす。したがって、ほとんどの骨セメントは、手術後感染症の予防として働く抗生物質混合物を含み、通常は抗生物質の全身投与と組合される。それについてはハラブら（Ｈａｌｌａｂ  ｅｔ  ａｌ.）、ジャーナル・オブ・ボーン・アンド・ジョイント・サージェリー（Ｊ．Ｂｏｎｅ  Ｊｏｉｔ  Ｓｕｒｇ．）８３‐Ａ：４２８‐３６（２００１）を参照のこと。しかしながら、細菌が定着している骨セメント表面については、補綴剤表面に生物膜が形成されるので、通常の抗生物質で撲滅することは困難である。生物膜は、多糖類である「糖衣」から主として構成され、分泌された接着性細胞外ポリマーのマトリックス内に包埋した付着性細菌の多重層から成る。宿主の防御機構及び化学療法に対する付着補綴性感染症の抵抗性については、糖衣の防護環境に大いに関係する。例えば、ドビンスら（Ｄｏｂｂｉｎｓ ｅｔ ａｌ．），１９８８参照のこと。
【０００７】
抗生物質はインプラントに伴う生物膜を低減するが、撲滅するのは極めて困難である。インプラント周辺に抗生物質を持続的に存在させても細菌を完全には殺せず、抗生物質耐性株の誘発のリスクが増大するファンデバルトら（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｂｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ.）、アクタ・オルソペディア・スカンジナビア（Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．）７１：６２５‐２９（２０００）参照。米国疾病対策予防センター（ＣＤＣ：Ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）の評価によると、米国では年間２００万人の患者が院内感染症（すなわち、病院内で罹る感染症）を患い、その結果年間１０万人近くの死者が存在し、それらの感染症の原因細菌の約７０％は、そのような感染症の治療にごく一般的に用いられる少なくとも一種の薬物に抵抗性を持つ。２００万人の症例のうちの概ね７０％については、医療用器具の体内留置に伴うものであり、それらの感染症の２／３は、黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌（Ｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）によるものである。そのことについては、バインシュタイン（Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ）、“Ｎｏｓｏｃｏｍｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  Ｕｐｄａｔｅ”，エマージング・インフェクシャス・ディジージズ（Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ）４：４１６‐２０（１９９８）を参照のこと。
【０００８】
整形外科手術後の感染症については、コスト面、ならびに予防可能な患者の罹病及び死亡の面の両方で重大な結果に陥る可能性がある。インプラントが関係した感染症に対する治療オプションについては、様々なものがあるが、一般的には外科的なデブリードマン及び抗生物質の全身投与を組合わせたものが含まれる。埋込まれた骨セメントに伴う感染症には、通常は数週間から数ヶ月の抗生物質の静脈内投与、ベッドでの拘束、安静、及び／又は近接の骨の粉砕及び周囲の軟組織の破壊を伴うプロテーゼの摘出が必要となる。持続的な抗生物質の曝露及び骨セメントの摘出によって、しばしば感染症の撲滅に成功する一方、回復は最適にまでは及ばず、患者はしばしば長期間の機能障害状態に放置される。したがって、埋込まれた骨セメントに付随した感染症、特に薬剤耐性菌による感染症に伴う生物膜に付随した感染症の予防及び治療のための有効、安全で即効性の薬物の必要に迫られている。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
ＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチド（ＲＩＰ）は、骨セメントインプラントに定着する細菌における生物膜形成及び毒素産生を抑制するのに必要である。抗生物質とは異なり、ＲＩＰは耐性菌株を誘発させずに生物膜を撲滅する。ＲＩＰについては、多くの投与方法で投与できる。例えば、ＲＩＰは埋込み術の前に骨セメントと混合できる。ＲＩＰ自体を速放出型又は徐放出型の製剤に配合することもでき、その例としてはＲＩＰ組成物含有のナノ粒子が挙げられ、ＲＩＰ組成物は骨セメント組成物と混合でき、又は骨セメント組成物とは別々に投与することもできる。ＲＩＰは、抗生物質とは異なるメカニズムで機能するため、抗生物質の有効性を補完することができる。したがってＲＩＰについては、抗生物質又は抗菌性ペプチドのような抗菌性薬剤との混合又はその全身投与と組合わせて使用できる。またＲＩＰについては、麻酔性又は骨形態形成性蛋白質のような薬剤とともに使用することもできる。
【００１０】
第一の実施形態によれば、骨セメント組成物はＲＩＰを含有する。骨セメント組成物にはさらに、抗生物質（例えば、アミノ配糖体系又はβラクタム系）、抗菌性ペプチド、麻酔剤、又は骨形態形成性蛋白質も含有できる。ＲＩＰについては、骨セメントインプラント表面に生物膜が形成されるリスクの処理又は低減に有効な量で存在できる。ＲＩＰについては、速放出性又は徐放出性のキネティクスが可能な担体系とともに製剤化することができ、その製剤にはナノ粒子も含有可能である。本発明は、いずれかのタイプの骨セメント組成物を用いて実現でき、その組成物にはポリメタクリル酸メチル又はメタクリル酸メチルを含有するもの、ならびに注入可能なセラミックスセメント、注入可能なリン酸カルシウム水硬性セメント、カルシウム不含ヒドロキシアパタイトセメント、ダールライトセメント、又はブルシャイトセメントを含有するものが挙げられる。
【００１１】
第二の実施形態によれば、骨セメントの投与方法にはＲＩＰ組成物との同時投与工程が含まれ、その場合のＲＩＰ組成物については、骨セメントの添加の前、最中又は後で加えることができる。例えば、ＲＩＰは骨セメントの粉末状成分と混合でき、あるいは固化前の骨セメントに加えることもできる。ＲＩＰ組成物については、非経口的又はそのほかの適当な投与経路で投与できる。ＲＩＰ組成物はさらに、抗生物質又は抗菌性ペプチドのような抗菌剤、あるいは麻酔剤又は骨形態形成性蛋白質も含有できる。ＲＩＰ含有の骨セメント組成物の投与については、必要に応じて同じ個人に対して反復できる。
【００１２】
第三の実施形態によると、生分解性組成物はＲＩＰを含有する。生分解性組成物にはフィブリンシーラントが挙げられる。フィブリンシーラントとしては、外科用接着性グルー、外科用シーラントなどが挙げられる。フィブリンシーラントは、骨セメントと同様に製造されるか、ＲＩＰと混合した状態で保存され、その形態は粉末状、あるいはそれ以外の固化前又は埋込み前の形態をとる。同様にＲＩＰについては、創傷の治療に用いられるコラーゲンシートヒドロゲル又はヒドロコロイドなどのような生分解性組成物にも加えることができる。ヒドロゲル又はヒドロコロイドには、コラーゲン‐アルギン酸塩創傷治療用包帯、一時的皮膚代替物及び瘢痕除去シートが含まれる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
本発明はＲＩＰ含有の骨セメント組成物を提供し、その組成物によって、埋込まれた骨セメントに伴う生物膜形成のリスクが有利になるように処理又は低減され、時間の消費、高価で痛みを伴う化学療法及び入院が防止され、骨セメントが外科的に除去される可能性が低減する。ＲＩＰは、骨セメントインプラント又はそのほかの生分解性組成物表面にしばしば形成される生物膜のリスクを処理又は低減するため、前述の適用に特に好適である。さらにＲＩＰは抗生物質とは異なり、細菌がＲＩＰに持続的にさらされても一般的には耐性株が誘導されないため、前述の適用に有益である。
【００１４】
本発明のＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチド
必要認識性の抑制物質であるＲＩＰは、細菌の増殖には影響を及ぼさないが、細胞外毒素を産生させるシグナル変換に干渉することで細菌の病原性を減弱する。ＲＩＰは、ａｇｒ遺伝子座の上流域のアクティベーターである標的分子ＴＲＡＰのリン酸化を抑制することで毒素産生を遮断する。図１は、ａｇｒ遺伝子座の下流域のアクティベーターにおけるＴＲＡＰリン酸化の役割を示す。細胞増殖時には、ＲＡＰは細胞外環境中に蓄積し、ＴＲＡＰリン酸化を促進することで、細菌の付着が増し、増殖の中期指数的増加段階におけるａｇｒ活性化が増大する。ａｇｒ活性化によって、自己誘導性ペプチド（ＡＩＰ）が産生され、ＡＩＰはＴＲＡＰリン酸化を低下させるが、ＲＮＡＩＩＩの発現を可能にする。なお、ＲＮＡＩＩＩは溶血素及びエンテロトキシンの産生を増大させる。ＲＩＰ、又は抗ＲＡＰ抗体のようなＲＩＰアゴニストは、ＴＲＡＰリン酸化を抑制し、ＴＲＡＰ酵素を非リン酸化状態の非活性型に平衡を移行させ、ａｇｒの発現をブロックする。それによって細菌の付着、生物膜形成、及び毒素産生が低減する。
【００１５】
ＲＩＰは、一般式ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦを含み、Ｘ１はＣ、Ｗ、又はＩあるいは修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳである。詳細なＲＩＰ配列については、米国特許第６２９１４３１号、２００３年２月３日出願の米国特許出願第１０／３５８４４８号、２００１年４月１９日出願の米国特許出願第０９／８３９６９５号、及びゴブら（Ｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ.）、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２２：１６０９‐２０（２００１）に開示されており、それらのすべては、本明細書に参照によって組込まれたものとする。ＲＩＰ配列には、アミノ酸配列ＫＫＹＸ２ＰＸ１ＴＮを含み、Ｘ１はＣ、Ｗ、Ｉ又は修飾アミノ酸であり、Ｘ２はＫ又はＳであるポリペプチドが含まれる。さらにＲＩＰ配列には、Ｘ１がＣ又はＷであるＹＳＰＸ１ＴＮＦ、及びＹＫＰＩＴＮを含むポリペプチドも含まれる。一つの実施形態では、上記の一般式ＹＸ２ＰＸ１ＴＮＦを含むＲＩＰについては、１個〜２個のアミノ酸の置換、欠失、及びそのほかの修飾による修飾がさらになされている。但し、そのＲＩＰは活性を示すものである。
【００１６】
本明細書で用いられる「蛋白質」「ポリペプチド」又は「ペプチド」という用語には、修飾配列（例えば、グリコシル化、ＰＥＧ化、保存的アミノ酸置換を含むもの、保護基を含むもの、５‐オキソプロリル基を含むもの、アミド化、Ｄ‐アミノ酸など）が含まれる。アミノ酸置換には保存的置換が含まれ、それらは一般にはグリシン、アラニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、リシン、アルギニン、ならびにフェニルアラニン、チロシンの群中のものである。
【００１７】
本発明の蛋白質、ポリペプチド及びペプチドは、精製又は単離されることができる。「精製された」とは、本来の状態で見出される化合物に正常な場合、随伴する成分が、ほとんど存在しない、例えば約６０％、約７５％、又は約９０％存在しない化合物を指す。「単離された」化合物とは、化合物が自然に生じるのとは異なる環境における化合物のことである。本発明の蛋白質、ポリペプチド及びペプチドについては、天然に生じるもの、遺伝子組換えによって得られたもの、又は当業者によく知られた方法による化学合成で得ることができるものである。
【００１８】
骨セメント組成物
骨セメントは、骨内ギャップの充填、及び損傷した骨、例えば手首、股関節及び背骨の強化のために用いられる。例えばその他にも骨セメントは、虚血壊死（すなわち骨壊死）に対する複雑な股関節再建が必要とされると考えられる患者に対して使用でき、ほかのタイプのインプラント、ピン、ステープルなどの挿入術のようなほかの外科的手法と組合せても使用できる。骨セメントの適用については当業者に知られており、口腔外科、骨の手術、美容形成、災害外科、インターベンショナルラジオロジー、及びリウマチ治療における使用が含まれる。
【００１９】
本明細書で用いられる「骨セメント組成物」という用語には、ＰＭＭ及びメタクリル酸メチルなどを主成分とする骨セメント組成物が含まれる。骨セメント組成物のほかの例としては、注入可能なセラミックス、及びカルシウム不含のヒドロキシアパタイトセメントのような注入可能なリン酸カルシウム水硬性セメントが挙げられ、それらにはサンゴ由来のプロオステオンヒドロキシアパタイト、ダールライトセメント、又はブルーシャイトセメントが含まれる。それらについては、例えばハルドウインら（Ｈａｒｄｏｕｉｎ  ｅｔ  ａｌ.）、“Ｎｅｗ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ”，セミノロジカル・マスキュロスケレタル・ラジオロジー（Ｓｅｍｉｎ．  Ｍｕｓｃｕｌｏｓｋｅｌｅｔａｌ  Ｒａｄｉｏｌ．）１（２）：３１９‐３２４（１９９７）を参照のこと。これらの組成物は、生体適合性、吸収可能、骨誘導性、及び注入可能であって、シリンジ及び針で皮膚から搬送できるものが有益である。それらは、非吸収性の骨セメント組成物と組合せて用いるか、又はそれの代わりに用いることもできる。ベッツ（Ｂｅｔｚ）、オルソペディックス・ジャーナル（Ｏｒｔｈｏｐｅｄｉｃｓ  Ｊ．）２５（５  Ｓｕｐｐｌ．）：Ｓ５６１‐７０（２００２）を参照のこと。また骨セメントには、金属幹と医療用骨セメントとの界面で使用可能なアクリル系接着剤も含まれる。適するアクリル系接着剤含有骨セメントは、セメントの固定化を強める被覆素材として適用される無水トリメリト酸‐４‐メタクリロイルオキシエチルエステル（４‐ＭＥＴＡ）を含む。それについてはモリタら（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ.）、ジャーナル・オブ・バイオメディカル・マテリアル・リサーチ（Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔｅｒ．Ｒｅｓ．）３４：１７１‐７５（１９９７）を参照のこと。「骨グラフト組成物」についても、脱灰骨マトリックス、合成骨グラフト置換物、架橋化コラーゲン骨グラフト、骨グラフトパテなどが含まれる。
【００２０】
「骨セメント組成物」には、個人に挿入又は埋込まれる前又は後の骨セメント製剤が含まれる。このことは、骨セメントが体内で固化した後にＲＩＰを対象個人に投与できることである。言い換えると、又は追加して言うと、骨セメント組成物はＲＩＰとともに混合した状態で製造又は保存できる。したがって一つの実施形態では、ＲＩＰ含有の骨セメント組成物の成分は粉末状である。
【００２１】
ＲＩＰ含有の生分解性組成物
ＲＩＰ組成物は、対象患者に挿入されるほかの生分解性組成物に付随した生物膜のリスクの処理又は低減のために使用できる。ＲＩＰ含有の適当な生分解性組成物には、例えばフィブリンシーラントが含まれる。フィブリンシーラントは、濃縮されたフィブリノーゲン及びトロンビン、ならびに通常のそのほかの凝固因子を含有し、一般的には粉末状である。フィブリンシーラントは血液と接触すると、直ちに血餅を形成するため、広範囲の外科的手法における止血剤、及び組織又は創傷のシーラントとして有用である。アルバラ（Ａｌｂａｌａ）、カルジオバスキュラー・サージェリー（Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｓｕｒｇ．）１１（Ｓｕｐｐｌ．１）：５‐１１を参照のこと。本明細書で用いられる「フィブリンシーラント」には、外科用接着グルー、外科用シーラント、又はそれらの類似物のような組成物が含まれる。フィブリンシーラントは、骨セメントと同様に製造できるか、又はＲＩＰと混合した状態で保存でき、その形態は粉末状、あるいは固化前の状態又は埋込み前のいずれかほかの状態である。同様にＲＩＰは、創傷の治療に用いられるコラーゲンシートヒドロゲル又はヒドロコロイドなどのような生分解性組成物に加えることもできる。ヒドロゲル又はヒドロコロイドには、コラーゲンアルギン酸塩の創傷用包帯、一時的皮膚代替物及び瘢痕除去用シートが含まれる。
【００２２】
ＲＩＰ及びＲＩＰ製剤の活性測定用のアッセイ系
前述のように、ＲＩＰが必要認識メカニズムを抑制するのに関わるメカニズムには、ＴＲＡＰのリン酸化の抑制が伴う。表皮ブドウ球菌中にＴＲＡＰ及びＴＲＡＰリン酸化が存在するという証拠があり、そのことから黄色ブドウ球菌及び表皮ブドウ球菌の両方においても、同様な必要認識メカニズムが存在することが示され、両方の細菌種で起こる生物膜形成及び感染症にＲＩＰが干渉できることが示される。さらに、ＴＲＡＰがスタフィロコッカス属のすべての株及び種に保存されているという証拠もあり、したがってＲＩＰは、スタフィロコッカスのいずれのタイプに対しても有効であると考えられる。さらに、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｕｓ）、炭疽菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓ）、セレウス菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）、リステリア・イノクア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｎｎｏｃｕａ）、及びＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含めたほかの感染症起因細菌についても、ＴＲＡＰに類似した配列の蛋白質が存在すると考えられる。そのうえ、ＲＡＰはｒｐｌＢ遺伝子によってコードされるリボソーム蛋白質Ｌ２のオルソログである。それについてはコレムら（Ｋｏｒｅｍ  ｅｔ  ａｌ.）、ＦＥＭＳ・マイクロバイオロジカル・レターズ（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．）２２３：１６７‐７５（２００３）を参照のこと。なお、この文献はｒｐｌＢ遺伝子によってコードされるＲＡＰオルソログに関するものとして、参照によって本明細書に組込まれたものとする。Ｌ２については、ストレプトコッカス属菌類、リステリア属菌類、ラクトコッカス属菌類、エンテロコッカス属菌類、大腸菌、クロストリジウム・アセトブチリクム（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ａｃｅｔｏｂｔｙｌｉｃｕｍ）、及びバチルス属菌類を含めた細菌の中に高度に保存されている。この見解から、黄色ブドウ球菌中のＲＡＰの機能を妨げるのに役立つ処理も、Ｌ２合成性の細菌の処理に充分有効であろうことが分かる。
【００２３】
本発明による好ましいＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチドは、ＲＮＡＩＩＩ抑制活性を直接又は間接的に示し、その活性については、多くのルーチンスクリーニング法を用いてアッセイできる。ＲＩＰは、スタフィロコッカスの必要認識系の既知の機能に対して干渉することによって、スタフィロコッカス属菌の付着及び毒素産生を抑制する。ＲＩＰは、上記考察のように、ＴＲＡＰリン酸化のＲＡＰ誘導と競合して、ＴＲＡＰリン酸化を抑制する。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ.）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．）２７６：２６５８‐６７（２００１）を参照のこと。このことで細胞付着、生物膜形成、及びＲＮＡＩＩＩ合成が低下し、究極的には有毒な表現型も抑制される。バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ.）、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ）２８０：４３８‐４０（１９９８）を参照のこと。例えば、ＲＮＡＩＩＩ産生又はＴＲＡＰリン酸化のＲＩＰによる抑制については、本明細書に参考によって組込まれているバラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ.）、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２１：１３０１‐１１（２０００）に記載の手法を用いてインビトロでアッセイできる。合成ＲＩＰ類縁物質ＹＳＰＷＴＮＦ（‐ＮＨ２）のアミド化体（合成ＲＩＰの非アミド化体は不活性である）の活性については、黄色ブドウ球菌に感染させたスミス・ディヒューズ・マウスを用いる蜂窩織炎モデル、マウスの黄色ブドウ球菌ＬＳ‐１株に対して試験される敗血症起因関節炎モデル、ウサギの黄色ブドウ球菌８３２５‐４株に対して試験される角膜炎モデル、ウサギの黄色ブドウ球菌ＭＳ株に対して試験される骨髄炎モデル、及び牝牛の黄色ブドウ球菌Ｎｅｗｂｏｕｌｄ３０５株、ＡＥ‐１株及び自然環境における感染に対して試験される乳腺炎モデルで証明できる。それらについては、バラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ.）、ペプチド（Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）２１：１３０１‐１１（２０００）及び表１を参照のこと。これらの見解によって、ＲＩＰ活性の範囲、及びＲＩＰ活性のアッセイを可能にするスクリーニングが証明され、さらにＲＩＰがスタフィロコッカスによる感染症を防ぎ抑制することが分かる。
【００２４】
【表１】
2008534225.tif 000003
【００２５】
スクリーニングアッセイについては、検出可能なシグナルを提供する標識に対して一個又は複数の分子が結合され得るバインディングアッセイが可能である。あるいはスクリーニングアッセイでは、ＲＮＡＩＩＩの産生及び／又は有毒因子の産生に対するＲＩＰ候補の影響を測定できる。例えば、スタフィロコッカスにおけるｒｎａｉｉｉ転写に対する候補ペプチドの影響を計測できる。そのようなスクリーニングアッセイでは、ＣＡＴ（クロラムフェニコール‐アセチルトランスフェラーゼ）、β‐ガラクトシダーゼなどのようなレポーター遺伝子システムを含有する組換え宿主細胞が、当業者によく知られた手法に従い利用できる。あるいはスクリーニングアッセイでは、当業者にもよく知られたハイブリダイゼーション技法を用いてｒｎａｉｉｉ又は有毒因子の転写も検出できる。さらに、分子間相互作用のモデリングに使用可能な三次元結晶構造の決定にも、精製ＲＩＰが用いられ得る。
【００２６】
ＲＩＰ製剤のインビトロでのハイスループット分析
ＲＩＰ組成物に対する以下のスクリーニングアッセイは、特定のＲＩＰ、あるいはＲＩＰの組成物又は製剤が所望のレベルの生物学的活性を示すかどうかを求めるために使用できるいくつかのアッセイタイプを例示するものである。このアッセイ系では、ノザンブロティングで確認が成されるＲＮＡＩＩＩレポーター遺伝子アッセイを用い、ハイスループットでａｇｒの発現の試験が行われる。初期指数的増殖期における、ｒｎａｉｉｉ：：ｂｌａＺ融合構造体を含有する黄色ブドウ球菌細胞（約２×１０７コロニー形成単位（ＣＦＵ））については、濃度を次第に上昇させるＲＩＰ製剤を用い、９６穴プレート中、３７℃で２．５‐５時間振とうして増殖させる。ｒｎａｉｉｉ：：ｂｌａＺ融合構造体については、ゴブら（Ｇｏｖ  ｅｔ  ａｌ.）、２００１の文献に記載されている。このアッセイでは、βラクタマーゼはＲＮＡＩＩＩに対するレポーターとして作用する。細菌の生菌数については、６５０ｎｍの吸光度測定で試験し、さらにプレート上の培養によってＣＦＵを求める試験が行われる。βラクタマーゼ活性については、βラクタマーゼの基質であるニトロセフィンを加えて計測される。βラクタマーゼによるニトロセフィンの加水分解については、４９０ｎｍ及び６５０ｎｍの吸光度比の変化で示され、黄色の場合はＲＮＡＩＩＩの合成がないことを示し、ピンク色の場合はＲＮＡＩＩＩの合成を示す。
【００２７】
ハイスループットアッセイにおいて有効性を示す製剤については、ノザンブロッティングで確認できる。細菌は、ＲＩＰ候補製剤でも同様に増殖する。次に細胞を遠心分離で集め、全ＲＮＡを抽出し、アガロースゲル電気泳動で分離し、ノザン法でブロッティングする。ＲＮＡＩＩＩについては、例えばＰＣＲ法で調製された放射能標識化ＲＮＡＩＩＩ特異的ＤＮＡにハイブリダイズさせることで検出される。ランダムペプチドを含む対照製剤では、通常０‐１０μｇ／１０７細菌の条件で試験が成される。
【００２８】
ＲＩＰ製剤のインビボでの分析
候補ペプチドについては、例えばヒト以外の動物モデルでのスタフィロコッカス有毒因子の産生に対する効果に関するスクリーニングによって、インビボでの活性をアッセイすることもできる。候補ペプチドは、予めスタフィロコッカスに感染させた動物に投与されるか、又は感染量のスタフィロコッカスと同時に動物に投与される。候補ペプチドについては、所望の結果に適した方法のいずれかで投与可能である。候補ペプチドは、例えば静脈内、筋肉内、皮下、又は望ましい影響を受けるとされる組織内への直接的な注射によって投与が可能であり、あるいは局所又は経口などの投与法も可能である。そのペプチドは、動物内に埋込まれる予定の器具を被覆するのに使用できる。そのペプチドの効果については、スタフィロコッカスに伴う病変の数及び大きさをアッセイすること、微生物学的な感染証明、健康全般など、適切な方法でモニタリングできる。
【００２９】
選択される動物モデルについては、当業者に知られた多数の因子で変わると思われ、それらの因子には、候補薬剤がスクリーニングされる際の特定のスタフィロコッカス病原株又は標的疾患が含まれる。ラットグラフトモデルは、生物膜形成に伴う感染症に対する製剤の抑制能を評価するのに特に有用である。ジャコメッチら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ.）、アンチマイクロバイオロジカル・エイジェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４７：１９７９‐８３（２００３）；チリオーニら（Ｃｉｒｉｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ.）、サーキュレーション（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ）１０８：７６７‐７１（２００３）；及びバラバンら（Ｂａｌａｂａｎ  ｅｔ  ａｌ.）、ジャーナル・オブ・インフェクシャス・ディジージズ（Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１８７：６２５‐３０（２００３）参照。このモデルは、細菌接種と生物膜感染との間の時間差、通常は７２時間を提供して、ＲＩＰ製剤の最適な投与経路及び用量の試験を可能にするため、臨床上の設定との関連性が高い。このモデルは、生物膜が抗生物質に対して極めて抵抗性を示すことが知られているため、ＲＩＰ活性の興味ある試験を提供する。
【００３０】
ラットグラフトモデルにおける一般的な工程については、図２に示される。この試験を用いると、グラフトが２０μｇ／ｍＬのＲＩＰに２０分間浸漬された場合、又は体重１ｋｇあたり、１０ｍｇのＲＩＰが腹腔内に注射された場合、感染の程度が１／４に低下することが示された。典型的な実験では、ウイスター系のオスの成熟ラット（ｎ＝１０）を麻酔し、正中線の各々の側を１．５ｃｍ切開して皮下ポケットを形成する。ポリエチレンテレフタレートで織られた滅菌コラーゲンシール化二重ベロア製グラフト（１ｃｍ２）（Ａｌｂｏｇｒａｆｔ（商標）、Ｄａｃｒｏｎ社（イタリア）製）を生理食塩水、ＲＩＰ活性がないランダムペプチド、又はＲＩＰに浸漬させた後、前述のポケットに埋込む。ポケットを皮膚クリップで閉じ、ツベルクリンシリンジを用いてグラフト表面に２×１０７ＣＦＵ／ｍＬの細菌を接種し、流体が充填された皮下ポケットを形成する。その動物を、各々のケージにもどし、毎日試験を行う。グラフトの注入から０‐６日後に、動物にＲＩＰ又はＲＩＰ製剤を静脈内又は経口投与する。遊離のＲＩＰについては、陽性対照として腹腔内に投与する。埋込みから７日後に、グラフトを取出して体外培養し、既知の手順、例えばジャコメッチら（Ｇｉａｃｏｍｅｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３）の方法に従ってＣＦＵを求める。その体外培養グラフトを滅菌チューブに入れ、滅菌生理食塩水で洗浄後、１０ｍＬのリン酸緩衝化生理食塩水が入ったチューブに入れ、５分間超音波処理してグラフトから付着細菌を除去する。超音波処理後に、グラフトを顕鏡してすべての細菌が除去されていることを確かめる。（抗生物質感受性又は抗生物質耐性のいずれかの細菌に対しては、１０分までの超音波処理の効果を試験しても、生細胞数（ＣＦＵ／ｍＬ）の有意な差は見られなかった。）生菌数の定量については、血液寒天プレート上、細菌懸濁液の連続希釈列での培養（０．１ｍＬ）で行われる。すべてのプレートを３７℃で４８時間培養し、プレートごとのＣＦＵの数を評価する。この方法の検出限界は、約１０ＣＦＵ／ｍＬである。
【００３１】
ラットグラフトに特別な変更を加えたアッセイについては、骨セメント組成物とともに投与されるＲＩＰ組成物の有効性の評価に特に使用できる。このアッセイ体制では、骨セメント組成物はＤａｒｃｏｎグラフトの代わりとなる。骨セメントは試験ラットに注入又は埋込みができ、あるいは硬化させてラットの皮下ポケットに挿入することもでき、その場合は挿入前に骨セメントをＲＩＰに浸漬することができる。またＲＩＰ組成物を、例えば持続放出製剤として、骨セメントの注入又は挿入部位に適用することもできる。Ｄａｃｒｏｎモデルと同様に、骨セメントの注入又は挿入の０‐６日後に、代わりに又は追加でＲＩＰ組成物を静脈内又は経口投与することもできる。遊離のＲＩＰについては、前述のように陽性対照として腹腔内に投与される。７日目に骨セメントを外科的に除去し、ファンデベルトら（Ｖａｎ  ｄｅ  Ｂｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ.）、アクタ・オルソピディカ・スカンジナビカ（Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐ．Ｓｃａｎｄ．）７１：６２５‐６２９（２０００）又はノイトら（Ｎｅｕｔ  ｅｔ  ａｌ・）、アクタ・オルソピディカ（Ａｃｔａ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃａ）７６：１０９‐１１（２００５）などのいずれかに記載の方法によって、感染症又は生物膜形成についてのアッセイを行う。
【００３２】
ＲＩＰ組成物の投与方法
本発明は、ＲＩＰ組成物を投与する工程も含む骨セメント組成物の投与方法を提供し、ＲＩＰ組成物は骨セメントの添加の前、最中又は後に加えることができ、あるいは骨セメントと混合もできる。ＲＩＰを骨セメントの前に投与する場合、骨セメントが埋込まれる際の細菌感染症のリスクの処理又は低減に有効な量のＲＩＰがまだ存在している。ＲＩＰを骨セメントの埋込みと同時又はすぐ後で投与する場合、骨セメントの投与で生じる感染症、すなわち骨セメントの埋込みに伴う感染症のリスクを処理又は低減するのにＲＩＰが用いられる。さらにＲＩＰ組成物は、抗生物質又は抗菌性ペプチドのような抗菌剤、あるいは麻酔剤も含有できる。ＲＩＰ含有の骨セメント組成物の投与については、必要に応じて同一個体に繰返すことができる。
【００３３】
「治療」又は「治療する」という用語は、個々の動物、例えば哺乳類、好ましくはヒトへの、いずれかの治療介入を意味する。治療には、（ｉ）臨床上の徴候を発生させない「予防」、例えば有害な状態の発生及び／又は発症からの感染症の予防；（ｉｉ）臨床上の徴候の発生を阻止する「抑制」、例えば感染症の進行を止めて感染症が完全に又はもはや有害でない程度まで排除される；及び（ｉｉｉ）臨床上の徴候を回復させる「緩和」、例えば感染症によって起こる発熱及び／又は炎症の寛解が含まれる。治療には、生物膜形成の予防、抑制、又は緩和が含まれ得る。細菌感染症の「リスクを有する」個体への投与における「リスクを有する」とは、その個体がこれまで必ずしも細菌感染症とは診断されていないが、感染症に対する正常なリスクよりも高い状況に置かれていること、例えば個体が骨セメント組成物を体内に適用されている場合を意味する。細菌感染症を有する「疑いがある」個体への投与における「疑いがある」とは、その個体が感染症の初期症状のいくつか、例えば高熱を示すが、診断が未実施又は未確認であることを意味する。
【００３４】
「有効量」という用語は、治療又は予防を提供するのに充分な用量を意味する。有効な治療に必要な活性成分の量については、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態、及びそのほかの投薬を含めた多くの異なる因子に依存すると思われ、したがって治療投薬量は安全性と有効性とを最適化するように調整されるべきである。一般にインビトロで用いられる投薬量によって、活性成分のインビボでの投与に役立つ量に関する有用なガイダンスが提供され得る。特定の病気の治療に有効な用量の動物での試験によって、さらにヒトでの投薬量の予測値が示される。医薬製剤中の活性成分の含量については一般に、変動幅が約０．１％未満であって、重量あたりの含量は通常約２％、又は少なくとも２％以上、２０％‐５０％程度」、あるいはそれ以上であり、特別に選択された投与法によれば液状物、粘性物などが一義的に選択されると思われる。様々な適する考察については、例えばグッドマン（Ｇｏｏｄｍａｎ）及びギルマン（Ｇｉｌｍａｎ）、“Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ”、ハードマンら（Ｈａｒｄｍａｎ  ｅｔ  ａｌ.）編、第１０版、マグローヒル社刊、及び“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｓｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”、フィラデルフィア科学大学、第２１版、マック出版社（ペンシルバニア州、イーストン市、２００５）刊に記載されており、経口、静脈内、腹腔内、筋肉内、経皮、経鼻、局所、及び電離療法による投与などを含めた、本明細書で考察される種々の医薬製剤及び投与方法に対する有効投薬量に関して、両書とも本明細書において参考文献として収載されている。そのようなＲＩＰ投与経路については、本明細書で企図されており、その場合のＲＩＰは単独では投与されず、骨セメント組成物又はほかの生分解性組成物の一成分として投与される。
【００３５】
本発明の目的では、「ＲＩＰ組成物」はＲＮＡＩＩＩ抑制性ペプチド、及び可能な場合にそのほかの薬理学的活性を有する薬剤も含有する。適する活性剤には、抗生物質及び抗菌性ペプチドが含まれる。有用な抗生物質には、アミノグリコシド系（例えばゲンタマイシン）、βラクタム系（例えばペニシリン）、又はセファロスポリンが含まれるが、それらに限定されない。有用な抗菌性ペプチドについては、前述でさらに述べている。活性剤については、ＲＩＰと同じ製剤、あるいはＲＩＰ組成物と同時又はほぼ同時に別の製剤で個体に投与できる。本方法には例えば、ＲＩＰ含有の骨セメントとともに抗生物質を同時に経口投与することが含まれる。ＲＩＰ及び抗生物質の投与については、骨セメント又はほかの生分解性組成物の投与から約４８時間以内、好ましくは約２‐８時間以内、及び最も好ましくはほぼ同時に行われる。
【００３６】
抗菌性ペプチド
前述のように本発明による組成物は、抗菌性ペプチドを含有し得る。抗菌性ペプチドは、一連の微生物に対する宿主防衛の第一線を意味する、ほとんどの多細胞生物に内在する先天的な免疫反応の重要な一成分である。抗菌性ペプチドには広い活性スペクトルがあり、グラム陰性及びグラム陽性の両方の、抗生物質抵抗性細菌株を含む細菌を殺すか、又は中和する。ハンコック（Ｈａｎｃｏｃｋ）、ランセット・インフェクシャス・ディジージズ（Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．）１：１５６‐６４（２００１）参照。米国ネブラスカ大学、医療センターのＷａｎｇ氏によると、本明細書に参照することによって組み込まれる抗菌性ペプチドデータベース（ｈｔｔｐ：／／ａｐｓ．ｕｎｍｃ．ｅｄｕ／ＡＰ／ｍａｉｎ．ｐｈｄ（最近の修正は２００５年３月５日））では、本発明に有用な可能性があって抗菌活性を有する約５００種類の抗菌性ペプチドのデータベースが提供される。
抗菌性ペプチドは通常、１２‐５０個のアミノ酸残基から構成され、多価カチオン性である。通常、それらのアミノ酸の約５０％は疎水性であり、一般的には両親媒性であって、それらの一次アミノ酸配列には、疎水性基と極性基とが交互に含まれる。抗菌性ペプチドは、以下の四種の構造カテゴリーにうちの一つに収まる。（ｉ）多数のジスルフィド結合で安定化したβシート構造（例えば、ヒト‐デフェンシン‐１）；（ｉｉ）共有結合で安定化したループ構造（例えば、バクテネクチン）；（ｉｉｉ）トリプトファン（Ｔｒｐ）を多く含み、伸張したらせん型ペプチド（例えば、インドリシジン）；及び（ｉｖ）両親媒性のαヘリックス（例えば、マガイニン類及びセクロピン類）。ファンら（Ｈｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、バイオケミカル・セル・バイオロジー（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．）７６：２３５‐４６（１９９８）；スタークら（Ｓｔａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．）、アンチマイクロバイオロジカル・エイジェンツ・アンド・ケモセラピー（Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．）４６：３５８５‐９０（２００２）を参照のこと。
【００３７】
ＲＩＰ担体系
一つの実施形態では、ＲＩＰ組成物は担体系の中に存在する。担体系によって、骨セメントインプラントの中及び／又はその周囲でＲＩＰの徐放出が可能となる。ナノ粒子は、以下に記載するように、リポソームとして機能する好適なＲＩＰ担体系を提供する。ナノ粒子は通常、ポリマーマトリックス（「ナノスフィア」）、又は薄いポリマー壁で周囲を囲まれ、ＲＩＰ組成物含有の油状のコアを含むリザーバー系（「ナノカプセル」）のいずれかを含む。ナノ粒子の調製に適したポリマーには、ポリ（アルキルシアノアクリレート）、ならびにポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸、ポリカプロラクトン及びそれらの共重合体のようなポリエステル類が含まれる。
【００３８】
ナノ粒子の大きさ及び形態については、所望の物理化学的特性、装填性、及びＲＩＰ組成物に適した制御放出特性を有する製剤が得られるように改変できる。製剤を適切に変更することによって、抗菌効果が迅速に現われるようにＲＩＰの速放出に介在することができる。本明細書で用いられる「速放出キネティックス」とは、ＲＩＰ組成物が宿主に投与されてから、ＲＩＰのほとんどが２４時間以内、好ましくは１‐７時間以内に製剤から放出するという意味である。
【００３９】
ナノ粒子は、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、及びグリコール酸の量を変えて製造される共重合体（ＰＬＧＡ）のポリマー類ような生分解性ポリエステル類を用いて製造できる。ＰＬＡはＰＬＧＡよりも疎水的であるため、ＰＬＡは比較的持続的な放出プロフィールを提供する。同様に、共重合工程における乳酸に対するグリコール酸の比は、得られる共重合体の分解特性に影響する。一つの実施形態では、低分子量（１４ｋＤａ）のＰＬＧＡが、高グリコール酸含量（５０％）で共重合化される（ＰＬＧＡ５０：５０）。これらの粒子は、ＰＬＧＡの分子量が小さく、用いたＰＬＧＡのグリコール含量が高いため、比較的速く分解する。ＲＩＰの９０％が放出する期間は３０日以内であり、ポリマーの９０％が吸収される期間は５週間以内であると予想される。中間的又は長期の分解プロフィールを有するナノ粒子を得るには、前述製剤はさらに高分子量の共重合体（例えば、６０‐１００ｋＤａ）を含み、グリコリド含量は低い（ＰＬＧＡ６５：３５又は７５：２５）か、又は同等である。これらをまとめると、広範囲のＰＬＡ及びＰＬＧＡの分子量、乳酸／グリコール酸比、及びＰＬＡ‐ＰＬＧＡ混和物を用いることで、装填性及び放出プロフィールの最適化が可能となる。
【００４０】
ＲＩＰ組成物については、カプセル化、粒子表面の吸着、又はその両方のいずれかによるナノスフィアを伴い得る。１０％ｗ／ｗの装填レベルを試みる場合には、ＲＩＰ組成物中の特別の分子に依存して１００％までのペプチド装填の有効性が期待される。これまでのカプセル化の研究から、薬物装填性を上げると粒子の大きさが増すことが予想される。このため、高ペプチド装填及び低ペプチド装填の製剤を用いることができ、各々、大粒子（平均粒径２０００‐５０００ｎｍ）及び小粒子（平均粒径２００‐５００ｎｍ）が用いられる。大粒子については、粒径がミクロン単位に達しているが、本発明の目的では「ナノ粒子」とみなすことに注意を要する。
【００４１】
ＲＩＰ含有の組成物
ＲＩＰ含有の組成物については公知であり、例えば米国特許第６２９１４３１号、２００３年２月３日出願の米国特許出願第１０／３５８４４８号、及び２００１年４月１９日出願の米国特許出願第０９／８３９６９５号に記載されており、それらは本明細書に参照によって組込まれたものとする。ＲＩＰが骨セメント組成物中で製剤化される場合、ＲＩＰ組成物の成分が骨セメントの固化に干渉しないことに注意を払わなければならない。混合ＲＩＰ組成物の成分の、骨セメントの重合に対する効果については、インビトロでの試験が可能である。同様に、ＲＩＰ活性に対する骨セメントの固化の効果についても、前述記載のいずれかの手順を用いてインビトロで試験ができる。ＲＩＰと骨セメントとの使用を組合わせる方法によって、ＲＩＰ活性のロスを防ぐように調節することができる。例えば、ＲＩＰ組成物は担体系の中に含有できるか、又は本明細書のいずれかに記載のように、骨セメントが硬化した後に注入することもできる。
【００４２】
いかなる製剤中のＲＩＰ含量についても、治療反応を最適化するために変動させることができる。例えば、一日のうちでいくつかに分割投与することもでき、あるいは治療状況に応じて示されるように、用量を定率的に下げることができる。ヒトでの感染症治療のための用量レベルは知られており、一般的には１日用量が体重１ｋｇあたり、約０．１‐５００ｍｇ、好ましくは６‐２００ｍｇ、最も好ましくは１２‐１００ｍｇの範囲である。投与される製剤の量については、言うまでもなく被験者、ならびに病苦の重篤度、投与の手法及びスケジュール、及び処方を指示する医師の判断に依存するだろう。静脈内に投与する場合、例えば血清中濃度は、１０日以内の感染治療に充分なレベルに維持できる。なお、本発明によって提供される利点は、比較的低レベルのＲＩＰ組成物では１０日以上の治療期間の延長が可能なことであるが、レベルを下げると、治療が長期になるにしたがって、本組成物に対して細菌が抵抗性を獲得する可能性も考えられる。
【００４３】
医薬グレードの有機又は無機の担体又は希釈材については、治療用の活性化合物を含有する組成物の調製に使用できる。当業者に公知の希釈材には、水性媒体、植物性及び動物性の油及び脂肪が含まれる。安定化剤、湿潤化剤、乳化剤、及び浸透圧を変え、水性ｐＨ値を固定化する緩衝液を変える塩類、ならびに皮膚浸透増強剤については、補助剤として使用できる。本組成物には、ほかの医薬品添加物、担体なども含まれ得る。適する添加剤の例としては、水、生理食塩水、デキストロース、グリセリン、エタノールなどが挙げられる。医薬組成物の製法については、当業者によく知られている。それについては、例えば、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ”、フィラデルフィア科学大学、第２１版、マック出版社（ペンシルバニア州、イーストン市）刊（２００５）が参照され、それは本明細書に参照によって組み込まれたものとする。前述のように、骨セメントの固化について、これらの組成物の内いずれかの効果が、まずインビトロで試験できる。
【００４４】
本発明のＲＩＰ組成物については、投与法に依存して様々な単位投与形態で投与できる。例えば、経口投与に適した単位投与形態には、粉剤、錠剤、丸剤及びカプセル剤のような固形剤、エリキシル剤、シロップ剤及び懸濁剤のような液剤が含まれる。また活性成分は、滅菌性液剤で非経口的にも投与できる。ゼラチンカプセル剤は、活性成分、ならびにグルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、澱粉、セルロース又はセルロース誘導体、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、タルク、炭酸マグネシウムなどのような不活性粉末担体を含有する。
【００４５】
本発明の組成物に加えることができる不活性成分の例には、所望の色、味、安定性、緩衝能、分散、あるいは酸化鉄赤色顔料、シリカゲル、ラウリル硫酸ナトリウム、二酸化チタン、食添白色顔料などのようなそのほかの特性を提供する薬剤が挙げられる。同様の希釈材が圧縮錠剤の製造に使用できる。錠剤及びカプセル剤はともに徐放出製品として製造でき、数時間にわたって医薬品を連続して放出させることができる。圧縮錠剤については、糖衣による被覆又はフィルムコーティングが可能で、それによって好ましくない味がマスキングされ、湿気から錠剤が保護され、あるいは消化管内で選択的に崩壊させるための腸溶性コーティングがなされる。経口投与用の液状剤形には、患者の受容性を高めるための着色剤又は香料が含有可能である。
【００４６】
また本発明のＲＩＰ組成物は、エマルジョン、フォーム、ミセル、不溶性単分子膜、液晶、リン脂質分散物、ラメラ層などを含むリポソームによっても投与可能である。これらの調合物では、搬送され得る本発明の組成物は、単独、又は抗体のような標的分子とともに、あるいはほかの治療用又は免疫原性組成物とともにリポソームの一部として取込まれ得る。したがって、本発明の所望の組成物を含むリポソームは全身に搬送でき、あるいは対象組織に指向させることができる。
【００４７】
本発明で用いられるためのリポソームについては、中性又は負に荷電したリン脂質、又はコレステロールのようなステロールを一般に含む標準的な小胞形成性の液体から形成される。その脂質の選択については、所望のリポソームの大きさ、酸不安定性、及び血流中での安定性によって一般に導かれる。リポソームの調製には、種々の方法が可能であり、それらはスゾカら（Ｓｚｏｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、アニュアル・レビュー・オブ・バイオフィジックス・アンド・バイオエンジニアリング（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｅｎｇ．）９：４６７（１９８０）、米国特許第４２３５８７１号、第４５０１７２８号、第４８３７０２８号、及び第５０１９３６９号に記載されており、本明細書に参照によって組込まれたものとする。本発明の組成物を含むリポソーム懸濁物については、静脈内、局所、局部などに投与でき、その用量は特に投与手法、搬送され得る本発明の組成物、及び治療される疾患の段階などによって変動する。
【００４８】
固形の組成物については、通常の非毒性の固体の担体が使用でき、例えば医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルク、セルロース、グルコース、スクロース、炭酸マグネシウムなどが挙げられる。経口投与では、薬学的に許容される非毒性の組成物は、上記の担体のような通常用いられる添加物のいずれかを取込むことによって形成され、ＲＩＰ含量は一般には１０‐９５％、より好ましくは２５‐７５％である。さらに、本発明のＲＩＰ組成物はデポタイプの系、カプセル化形態、又は当業者によく知られたによるインプラントにも搬送できる。例えばＲＩＰ組成物は、骨セメントが挿入され得る部位に、生分解性のマトリックス又はフォームの中に投与可能と考えられ、それによってＲＩＰ組成物が骨セメントの周囲のすべての組織に曝露されることが保証される。同様にＲＩＰ組成物は、例えば浸透圧ポンプのようなポンプによっても対象組織に搬送できる。
【００４９】
エアゾル投与では、本発明の組成物は界面活性剤及び噴射剤を用いて微粉末状に飛散するように供給されるのが好ましい。そのような薬剤の代表には、カプロン酸、オクタン酸、ラウリル酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、オレステリン酸、及びオレイン酸のような炭素を６‐２２個含む脂肪酸の、脂肪族多価アルコール又は環状無水物とのエステル又は部分エステルが挙げられる。混合又は天然のグリセリドのような混合エステルも使用できる。界面活性剤の含量は、組成物の０．１‐２０重量％、好ましくは０．２５‐５％であり得る。組成物の平衡性を保つために、通常噴射剤が用いられる。また担体には、所望により例えば経鼻搬送用のレシシンも含むことができる。
【００５０】
本明細書で記載したすべての刊行物及び特許については、参照によって本明細書に援用され、その刊行物及び特許の引用に結びついた特定の方法及び／又は材料を開示及び記載するものである。本明細書で考察される刊行物及び特許については、本出願の出願日の前にこれらが単に開示されたことを示しているだけである。本明細書では、本発明が先行発明によって本発明がそのような刊行物又は特許に先行する資格がないと認めるように解釈すべきものではない。さらに、付与された公開日又は発行日についても、これとは別に確認する必要があるかもしれない実際の日付と異なる場合がある。
【００５１】
以上のことから、説明のために実施例を提示して本発明の本質を教示したが、当然のことながら、当業者ならば、本開示を読めば、本発明の真の範囲から逸脱することなく、形式及び細部の様々な変更が可能であることを認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５２】
【図１】図１は、ＴＲＡＰ及びａｇｒによる細菌有毒性の制御を示す。
【図２】図２は、本発明のＲＩＰ組成物の試験に有用で代表的な動物モデルであるラットのグラフトモデル系を示す。
【図１】
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【図２】
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【国際調査報告】
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