(57)【要約】  本発明は、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）の結合パートナー、特に、胎盤増殖因子に向けられた抗体、加えて、それらの製造方法および使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
一次ＰｌＧＦアイソフォームの配列情報を有する免疫学的に活性なペプチド。
【請求項２】
以下のアミノ酸配列：
【化１】
2008540477.tif 000020
の少なくとも１つを含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
ＩＡＮ１、ＩＡＮ２、ＩＡＮ３、ＩＡＮ４、または、ＩＡＮ２／３のうちの１つのペプチド由来の４〜３０個の連続したアミノ酸を含む、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
以下のアミノ酸配列：ＦＱＥＶＷＧＲＳＹ（ＩＡＮ：１−１）、ＳＡＧＮＧＳＳＥＶＥＶＶ（ＩＡＮ：１−１−１）、ＶＶＰＦＱＥＶＷＧＲＳＹ（ＩＡＮ：１−１−２）、ＧＤＥＮＬ（ＩＡＮ：２−１）、ＧＣＣＧＤＥＮＬＨ（ＩＡＮ：２−１−１）、ＱＬＬＫＩＲＳＧＤＲＰＳＹ（ＩＡＮ：３−１）、ＱＬＬＫＩ（ＩＡＮ：３−２）、ＲＰＳＹＶ（ＩＡＮ：３−３）、ＲＳＧＤＲＰＳＹＶＥＬＴ（ＩＡＮ：３−３−１）、および、ＥＣＲＰ（ＩＡＮ：４−１）のうちの少なくとも１種由来の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項５】
以下のアミノ酸配列：ＥＶＶＰＦ、ＶＶＰＦＱ、ＶＰＦＱＥ、ＰＦＱＥＶ、ＦＱＥＶＷ、ＱＥＶＷＧ、ＥＶＷＧＲ、ＶＷＧＲＳ、ＷＧＲＳＹ、ＧＲＳＹＣ、ＲＳＹＣＲ、ＳＹＣＲＡ、ＹＣＲＡＬ、ＧＣＣＧＤ、ＣＣＧＤＥ、ＣＧＤＥＮ、ＰＬＲＥＫ、ＳＡＧＮＧＳＳＥＶＥＶＶＫ（ＩＡＮ：１−１−１Ｋ）、ＳＧＤＲＰＳＹＶＥＬＴＫ（ＩＡＮ：３−３−１Ｋ）、ＶＰＶＥＴＡＮＶＴＭＱＬＫ（ＩＡＮ：２／３Ｋ）、ＶＶＰＦＱＥＶＷＧＲＳＹＫ（ＩＡＮ：１−１−２Ｋ）、または、ＧＣＣＧＤＥＮＬＨＫ（ＩＡＮ：２−１−１Ｋ）のうちの少なくとも１種を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項６】
以下のアミノ酸配列：ＶＥＴＡＮＶＴＭＱ由来の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項７】
以下のアミノ酸配列：（ＩＡＮ５）ＲＥＫＭＫＰＥＲＲ  ＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲ  ＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬ  ＣＧＤＡＶＰＲ由来の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項８】
以下のアミノ酸配列：（ＩＡＮ６）ＨＶＲＣＥＣＲＨＳＰ  ＧＲＱＳＰＤＭＰＧＤ  ＦＲＡＤＡＰＳＦＬＰ  ＰＲＲＳＬＰＭＬＦＲ  ＭＥＷＧＣＡＬＴＧＳ  ＱＳＡＶＷＰＳＳＰＶ  ＰＥＥＩＰＲＭＨＰＧＲ  ＮＧＫＫＱＱＲＫＰ  ＬＲＥＫＭＫ由来の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項９】
以下のアミノ酸配列：（ＩＡＮ７）ＮＧＫＫＱＱＲＫＰＬ  ＲＥＫＭＫＰＥＲＲＲ  ＰＫＧＲＧ由来の少なくとも４個の連続したアミノ酸を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項１０】
少なくとも５個の連続したアミノ酸を含むことを特徴とする、請求項６〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
【請求項１１】
二次ＰｌＧＦアイソフォームのポールにおける受容体結合ドメインの領域で特異的に結合することを特徴とする、ＰｌＧＦに関する特異的な結合パートナー。
【請求項１２】
抗体であることを特徴とする、請求項１１に記載の特異的な結合パートナー。
【請求項１３】
モノクローナル抗体であることを特徴とする、請求項１２に記載の特異的な結合パートナー。
【請求項１４】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２７６４という受託番号でＤＳＭＺに寄託された、２００５−８１−０５という名称を有する細胞系によって生産されるモノクローナル抗体０５−８１−０５。
【請求項１５】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２７６５という受託番号でＤＳＭＺに寄託された、２００５−８１−０１０という名称を有する細胞系によって生産されるモノクローナル抗体０５−８１−０１０。
【請求項１６】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２７６６という受託番号でＤＳＭＺに寄託された、２００５−６４／０２６という名称を有する細胞系によって生産されるモノクローナル抗体０５−６４／０２６。
【請求項１７】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２７６９という受託番号でＤＳＭＺに寄託された、２００５−５４／０４という名称を有する細胞系によって生産されるモノクローナル抗体０５−５４／０４。
【請求項１８】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７０という受託番号でＤＳＭＺに寄託された、２００５−１６４／０５４という名称を有する細胞系によって生産されるモノクローナル抗体０５−１６４／０５４。
【請求項１９】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７１という受託番号でＤＳＭＺに寄託された、２００５−１６４／０４２という名称を有する細胞系によって生産されるモノクローナル抗体０５−１６４／０４２。
【請求項２０】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７２という受託番号でＤＳＭＺに寄託された、２００５−１６４／０３８という名称を有する細胞系によって生産されるモノクローナル抗体０５−１６４／０３８。
【請求項２１】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７３という受託番号でＤＳＭＺに寄託された、２００５−１６４／０１２という名称を有する細胞系によって生産されるモノクローナル抗体０５−１６４／０１２。
【請求項２２】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７４という受託番号でＤＳＭＺに寄託された、２００５−１２１／０６という名称を有する細胞系によって生産されるモノクローナル抗体０５−１２１／０６。
【請求項２３】
ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７５という受託番号でＤＳＭＺに寄託された、２００５−１２０／０３という名称を有する細胞系によって生産されるモノクローナル抗体０５−１２０／０３。
【請求項２４】
遊離ＰｌＧＦへの結合に関して、請求項１３〜２３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体の１種またはそれ以上と競合する、特異的な結合パートナー。
【請求項２５】
請求項１３〜２３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体が結合するエピトープの１種またはそれ以上に結合する特異的な結合パートナー。
【請求項２６】
以下のアミノ酸配列：ＥＫＭＫＰＥＲＣＧＤＡＶＰ、および／または、ＭＫＰＥＲＣＧＤＡＶＰＲＲに含まれるアミノ酸から形成されたエピトープに結合する特異的な結合パートナー。
【請求項２７】
以下のアミノ酸配列：ＲＳＧＤＲＰＳＹＶＥＬＴに含まれるアミノ酸から形成されたエピトープに結合する特異的な結合パートナー。
【請求項２８】
以下のアミノ酸配列：ＶＶＰＦＱＥＶＷＧＲＳＹに含まれるアミノ酸から形成されたエピトープに結合する特異的な結合パートナー。
【請求項２９】
二次ＰｌＧＦアイソフォームが、ＰｌＧＦのホモ二量体であることを特徴とする 、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の特異的な結合パートナー。
【請求項３０】
ＰｌＧＦのホモ二量体が、ＰｌＧＦ−１のホモ二量体であることを特徴とする、請求項２９に記載の特異的な結合パートナー。
【請求項３１】
ＰｌＧＦ−１のホモ二量体が、ｒｈＰｌＧＦ−１のホモ二量体であることを特徴とする、請求項３０に記載の特異的な結合パートナー。
【請求項３２】
ｒｈＰｌＧＦ−１のホモ二量体が、Ｎ−グリコシル化されたｒｈＰｌＧＦ−１のホモ二量体であることを特徴とする、請求項３１に記載の特異的な結合パートナー。
【請求項３３】
請求項６〜１３のいずれか一項に記載の特異的な結合パートナーから製造できる抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
適切な実験動物を、一次または二次の、結合型または非結合型（遊離）のＰｌＧＦアイソフォームで免疫化すること、この実験動物の脾臓細胞と骨髄腫細胞とを融合し、抗体産生ハイブリッド細胞を形成すること、該ハイブリッド細胞をクローニングすること、および、二次ＰｌＧＦアイソフォームのポールにおける受容体結合ドメインの領域で選択的に結合する抗体を生産するハイブリッド細胞クローンを選択すること、および、このようにして選択されたハイブリッド細胞クローンから抗体を単離することによる、請求項１１に記載の特異的な結合パートナーの製造方法。
【請求項３５】
サンプル中でＰｌＧＦを検出するためのイムノアッセイであって、請求項１１〜１３および２４〜３２のいずれか一項に記載の特異的な結合パートナー、または、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、または、請求項３３に記載の抗原結合フラグメントと、サンプルとを接触させ、ＰｌＧＦを含む免疫複合体の形成を、定性的または定量的に決定することを特徴とする、上記イムノアッセイ。
【請求項３６】
請求項３５に記載のイムノアッセイを実施するための試験キットであって、請求項１１〜１３および２４〜３２のいずれか一項に記載の特異的な結合パートナー、または、請求項１４〜２３のいずれか一項に記載のモノクローナル抗体、または、請求項３３に記載の抗原結合フラグメントを含む、上記試験キット。
【請求項３７】
ＰｌＧＦアイソフォームの結合に関する分析で用いるための、受容体チロシンキナーゼファミリー、またはそれらの相同体、フラグメントもしくは分解産物生成物の抗体およびタンパク質の使用。
【請求項３８】
ＰｌＧＦアイソフォームは、ｆＰｌＧＦであることを特徴とする、請求項２２に記載の使用。
【請求項３９】
受容体チロシンキナーゼファミリーの抗体またはタンパク質は、Ｆｌｔ−１、Ｆｌｔ−２、Ｆｌｔ−３、または、Ｆｌｔ−４であることを特徴とする、請求項３７または３８に記載の使用。
【請求項４０】
ＰｌＧＦ−２アイソフォームの結合に関する分析に用いるための、ヘパリン硫酸プロテオグリカン、および、ニューロピリン、またはそれらの相同体、フラグメントもしくは分解産物生成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、胎盤増殖因子（または、ｐｌａｃｅｎｔａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ，ＰｌＧＦ）の結合パートナー、具体的には胎盤増殖因子に対して向けられた抗体、ならびにそれらの製造および使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＰｌＧＦは、生理学的および病理学的過程、具体的には血管新生に関与することがはっきりしている。ＰｌＧＦは、腫瘍の進行、腎臓病（具体的には、糖尿病によって引き起こされる腎臓病）、乾癬、炎症性疾患、具体的には、リウマチ様関節炎、心臓血管疾患などにおいて重要な役割を果たす［Ｉｙｅｒ，Ｓ．；Ｌｅｏｎｉｄａｓ，Ｄ．Ｄ．；Ｓｗａｍｉｎａｔｈａｎ，Ｇ．Ｊ．；Ｍａｇｌｉｏｎｅ，Ｄ．；Ｂａｔｔｉｓｔｉ，Ｍ．；Ｔｕｃｃｉ，Ｍ．；Ｐｅｒｓｉｃｏ，Ｍ．Ｇ．；Ａｃｈａｒｙａ，Ｋ．Ｒ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００１，２７６，（１５），１２１５３〜６１．／Ｉｙｅｒ，Ｓ．；Ａｃｈａｒｙａ，Ｋ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２００２，１２，（３），１２８〜３４．／Ｈｅｅｓｃｈｅｎ，Ｃ．；Ｄｉｍｍｅｌｅｒ，Ｓ．；Ｆｉｃｈｔｌｓｃｈｅｒｅｒ，Ｓ．；Ｈａｍｍ，Ｃ．Ｗ．；Ｂｅｒｇｅｒ，Ｊ．；Ｓｉｍｏｏｎｓ，Ｍ．Ｌ．；Ｚｅｉｈｅｒ，Ａ．Ｍ．ＪＡＭＡ  ２００４，２９１，（４），４３５〜４１．／Ｙａｎｇ，Ｗ．；Ａｈｎ，Ｈ．；Ｈｉｎｒｉｃｈｓ，Ｍ．；Ｔｏｒｒｙ，Ｒ．Ｊ．；Ｔｏｒｒｙ，Ｄ．Ｓ．Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００３，６０，（１），５３〜６０］。
【０００３】
ＰｌＧＦは、主に胎盤で発現され、「システインノット（ｃｙｓｔｅｉｎｅ−ｋｎｏｔ）」タンパク質ファミリーに属する。ＰｌＧＦは、様々な形態で発生する。ＰｌＧＦの様々な形態としては、（Ｉ）一次アイソフォーム、および、（ＩＩ）二次アイソフォームが挙げられる。さらに、（ＩＩＩ）遊離ＰｌＧＦ（ｆＰｌＧＦ）と、結合型ＰｌＧＦ（ｇＰｌＧＦ）とを区別することができる。
【０００４】
（Ｉ）一次ＰｌＧＦアイソフォーム
一次ＰｌＧＦアイソフォームは、一次配列、すなわちタンパク質におけるアミノ酸の順番が特徴的である。オルタナティブスプライシング、および、翻訳後修飾、例えば糖付加、リン酸化、分解（分解産物生成物，フラグメントなど）、アセチル化などにより、異なる一次ＰｌＧＦアイソフォームが生じる。これまでに、ヒトＰｌＧＦにおいて４種の異なる一次アイソフォーム、ＰｌＧＦ−１（ＰｌＧＦ−１３１）、ＰｌＧＦ−２（ＰｌＧＦ１５２）、ＰｌＧＦ−３（ＰｌＧＦ−２０３）、および、ＰｌＧＦ−４が説明されている。
【０００５】
ＰｌＧＦ−１前駆体の配列（配列番号（ＳＮ）１Ｖ）は、以下の通りである：
【化１】
2008540477.tif 000002
【０００６】
分泌型ＰｌＧＦ−１は、典型的にはＰｌＧＦ−１前駆体（ＰｌＧＦ前駆体）のリーダー配列を有さないため、Ｎ末端においてアラニン（Ａ）で始まる（ＰｌＧＦ−１前駆体の配列ではＡで始まる；上記参照）。これは、概して、その他の一次ＰｌＧＦアイソフォームにも当てはまる。
【０００７】
従って、一次ＰｌＧＦ−１アイソフォームの配列は、以下の通りである：
【化２】
2008540477.tif 000003
【０００８】
この一次配列において、翻訳後修飾の可能性のある部位を識別することができ、従って、翻訳後修飾で改変された一次アイソフォームの存在も識別することができる。例えば、一般的には、インビボにおいて、８４位（アスパラギン，Ｎ）でグリコシル化されたＰｌＧＦ−１の翻訳後修飾で改変された一次ＰｌＧＦアイソフォームが存在する。
【０００９】
一次アイソフォームＰｌＧＦ−１の最初のＮ末端アミノ酸は、アラニンの代わりにメチオニン（Ｍ）であることが多い。これは、一般的に、組換えによって例えばエシェリキア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ；Ｅ．ｃｏｌｉ）で発現されたＰｌＧＦ−１（ｒＰｌＧＦ−１）に関連し、具体的にはヒトｒＰｌＧＦ−１（ｒｈＰｌＧＦ−１）に関連する。本明細書において、メチオニンをコードするＡＵＧは、開始コドンとして用いられる。このようなＥ．ｃｏｌｉで発現されたＰｌＧＦは、翻訳後修飾されておらず、具体的には糖付加もされていない。
【００１０】
組換えヒト一次ＰｌＧＦ−１アイソフォームの配列は、一般的に、以下のように記載される：
【化３】
2008540477.tif 000004
【００１１】
ＰｌＧＦ−２アイソフォームにおいて、オルタナティブスプライシングを介してアルギニン(R)１２４の代わりに配列：ＲＲＲＰＫＧＲＧＫＲＲＲＥＫＱＲＰＴＤＣＨＬが存在する。従って、一次ＰｌＧＦ−２アイソフォームの配列は、以下のように読み出しされる：
【化４】
2008540477.tif 000005
【００１２】
オルタナティブスプライシングによって挿入された７２個のアミノ酸のインサート（ＨＳＰＧＲＱＳＰＤＭＰＧＤＦＲＡＤＡＰＳＦＬＰＰＲＲＳＬＰＭＬＦＲＭＥＷＧＣＡＬＴＧＳＱＳ  ＡＶＷＰＳＳＰＶＰＥＥＩＰＲＭＨＰＧＲＮＧＫＫＱＱＲＫ）により、一次ＰｌＧＦ−３アイソフォームの配列が生じる：
【化５】
2008540477.tif 000006
【００１３】
一次ＰｌＧＦ−４アイソフォームは、ＰｌＧＦ−２アイソフォーム（イタリック）、さらにはＰｌＧＦ−３アイソフォーム（下線）の両方の配列を含む：
【化６】
2008540477.tif 000007
【００１４】
（ＩＩ）二次ＰｌＧＦアイソフォーム
二次ＰｌＧＦアイソフォームは、一次ＰｌＧＦアイソフォームまたはその他の分子、具体的にはＰｌＧＦに相同な分子の組み合わせから生じる。一次ＰｌＧＦアイソフォームまたはその他の分子は、二次ＰｌＧＦアイソフォームのサブユニットである。一般的に、二次ＰｌＧＦアイソフォームは、２つのサブユニットからなる。従ってＰｌＧＦは、一般的には二量体として、すなわちホモ二量体またはヘテロ二量体として存在する。ホモ二量体は、２つの同一な一次ＰｌＧＦアイソフォーム（サブユニット）からなり、例えばＰｌＧＦ−１×ＰｌＧＦ−１、ＰｌＧＦ−２×ＰｌＧＦ−２、ＰｌＧＦ−３×ＰｌＧＦ−３、および、ＰｌＧＦ−４×ＰｌＧＦ−４である。ヘテロ二量体は、２つの異なる一次ＰｌＧＦアイソフォームからなるか、または、１つの一次ＰｌＧＦアイソフォームと、１つのその他の分子、具体的にはＰｌＧＦ同族体、例えば血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）やそれらの一次アイソフォームからなる。ヘテロ二量体の可能性のある例は、ＰｌＧＦ−１×ＰｌＧＦ−２、ＰｌＧＦ−３×ＰｌＧＦ−４、ＰｌＧＦ−１×ＶＥＧＦなどである。
【００１５】
（ＩＩＩ）遊離ＰｌＧＦ（ｆＰｌＧＦ）および結合型ＰｌＧＦ（ｇＰｌＧＦ）
ＰｌＧＦは結合パートナーと複合体を形成するため、ＰｌＧＦの複合体化した形態または結合した形態も同様に、アイソフォームとして考慮しなければならない。原則的には、遊離の一次ＰｌＧＦアイソフォーム、ただし具体的には遊離の二次ＰｌＧＦアイソフォーム（遊離ＰｌＧＦ、ｆＰｌＧＦ）は、複合体化した形態または結合した形態（結合型ＰｌＧＦ、ｇＰｌＧＦ）と区別すべきである。ｇＰｌＧＦは、例えば複合体化した形態で存在するホモ二量体のＰｌＧＦ−１である。これらは単純な複合体の可能性があり、すなわちＰｌＧＦ−１のホモ二量体は、受容体に結合しており、例えば膜結合型のｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体−１（ｍＦｌｔ−１）である。その他の例は、可溶性Ｆｌｔ−１（ｓＦｌｔ−１）、ニューロピリン（ｎｅｕｒｏｐｈｉｌｉｎ）（ＮＰ；具体的にはＮＰ−１、および、ＮＰ−２）、キナーゼドメインを含む受容体／胎児肝臓キナーゼ受容体（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ＶＥＧＦＲ−２）、ヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）、ならびにそれらのアイソフォーム、相同体、フラグメントおよび分解産物生成物との複合体である。また、数個の、場合によっては異なるＰｌＧＦアイソフォーム、および、数個の、場合によっては異なる結合パートナー、具体的には受容体の複合体で構成される多層も可能性がある。
【００１６】
ＰｌＧＦの機能は、膜結合型または可溶性ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体−１（ｆｍｓ様チロシンキナーゼ受容体−１（Ｆｌｔ−１）、または、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）受容体−１（ＶＥＧＦＲ−１））、および、キナーゼドメインを含む受容体／胎児肝臓キナーゼ受容体（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、または、ＶＥＧＦＲ−２）に結合することによって、仲介、調節または阻害される。その他の可能性のあるＰｌＧＦの機能に加えて、ＰｌＧＦの膜結合型のＦｌｔ−１（ｍＦｌｔ−１）への結合が特に重要である。これによりｍＦｌｔ−１のリン酸転移反応が起こり、従って、シグナル伝達カスケードを活性化する［Ｉｙｅｒ，Ｓ．；Ａｃｈａｒｙａ，Ｋ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２００２，１２，（３），１２８〜３４］。
【００１７】
これに対して、ＰｌＧＦのｓＦｌｔ−１への結合は、ＰｌＧＦの生理学的活性を減少させる作用があると推測される［Ｉｙｅｒ，Ｓ．；Ａｃｈａｒｙａ，Ｋ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２００２，１２，（３），１２８〜３４］。さらに、ＰｌＧＦアイソフォームが関与すると推測される。ＰｌＧＦ−２は、場合によっては膜に結合するが、カルボキシ末端に２１個のアミノ酸のカチオン性インサートを有する。アニオン性、具体的にはポリアニオン系の物質、例えばヘパリン、ヘパリン硫酸プロテオグリカンなどの結合を介して、さらなる機能が介在する可能性がある。また、アスパラギン（Ａｓｎ）８４、および、ＰｌＧＦ−３に存在するアミノ酸配列のＮ−グリコシル化も、類似の作用を有する可能性がある。さらに、この場合、ＶＥＧＦ発現、従ってその活性は負の調節を受けるため、ＰｌＧＦおよびＶＥＧＦの結合はさらにその他の作用を有すると推測される［Ｉｙｅｒ，Ｓ．；Ａｃｈａｒｙａ，Ｋ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ  Ｍｅｄ  ２００２，１２，（３），１２８〜３４］。要約すると、これは、ＰｌＧＦの様々な形態が異なる機能を有するか、または、異なる作用を発揮することを意味する。
【００１８】
従来技術
今のところ分析や診断目的に用いられる現行の検出方法および結合パートナー、具体的には抗体に関して、ＰｌＧＦの異なる形態は、区別されないか、または、効率的な区別が不十分である（十分に特異的ではない）という問題がある。例えば、Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）製の「抗ヒトＰｌＧＦ抗体」は、所定のＰｌＧＦ形態、具体的にはｒｈＰｌＧＦ−１のホモ二量体を特異的に認識しないだけでなく、ｒｈＰｌＧＦ、および、ＶＥＧＦ、および、ｒｈＰｌＧＦ−２のヘテロ二量体（Ｒ＆Ｄシステムズのカタログ番号：ＡＦ−２６４−ＰＢ、または、ＤＰＧ００の製品説明）も特異的に認識しない。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１９】
さらに、ｆＰｌＧＦまたはｇＰｌＧＦは特異的に検出されず、すなわち現存する抗体では、ｆＰｌＧＦとｇＰｌＧＦとを区別しないか、または、十分に効率的に区別しない。具体的には、ｆＰｌＧＦの特異的な検出が不十分である。これは、ｒｈＦｌｔ−１／Ｆｃの形態のｒｈＦｌｔ−１は、ＰｌＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズのカタログ番号：ＤＰＧ００）の決定に対して作用を有するという事実によって実証されている。この非特異性は文献で確認されている［Ｍａｙｎａｒｄ，Ｓ．Ｅ．；Ｍｉｎ，Ｊ．Ｙ．；Ｍｅｒｃｈａｎ，Ｊ．；Ｌｉｍ，Ｋ．Ｈ．；Ｌｉ，Ｊ．；Ｍｏｎｄａｌ，Ｓ．；Ｌｉｂｅｒｍａｎｎ，Ｔ．Ａ．；Ｍｏｒｇａｎ，Ｊ．Ｐ．；Ｓｅｌｌｋｅ，Ｆ．Ｗ．；Ｓｔｉｌｌｍａｎ，Ｉ．Ｅ．；Ｅｐｓｔｅｉｎ，Ｆ．Ｈ．；Ｓｕｋｈａｔｍｅ，Ｖ．Ｐ．；Ｋａｒｕｍａｎｃｈｉ，Ｓ．Ａ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２００３，１１１，（５），６４９〜５８］。Ｍａｙｎａｒｄ等によれば、関連するＲ＆ＤシステムズのＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄシステムズのカタログ番号：ＡＦ−２６４−ＰＢまたはＤＰＧ００）はｆＰｌＧＦに所定の特異性を示すことが示されているが、行われた研究によれば、この特異性は低いことがわかる。０.５ｎｇ／
ｍＬのｒｈＰｌＧＦ−１の決定において、０.５ｎｇ／ｍＬのｓＦｌｔ−１の存在下ではわずか約１２％のシグナルの減少が観察される。１０倍過量のｓＦｌｔ−１（５ｎｇ／ｍＬ）を用いたとしても、シグナルの減少は２倍になった程度である。より顕著なシグナルの減少は、ｆＰｌＧＦに対してより高い特異性を有する抗体を用いれば起こると予想される。
【課題を解決するための手段】
【００２０】
本発明に係る問題とその解決方法
従って、本発明の目的は、具体的には特異的な結合パートナーによって、具体的には抗体によって特定のＰｌＧＦの形態の特異的な検出を可能にする方法または成分を提供することである。
【００２１】
この問題の解決方法は、請求項で説明されている本発明に係る目的および方法を提供することからなる。
【００２２】
具体的には、上記目的は、ＰｌＧＦの一次アイソフォームに特異的に結合する結合パートナー、具体的には抗体を提供することによって達成される。これらの結合パートナー、具体的には抗体は、一次および二次アイソフォーム、および、遊離または結合型ＰｌＧＦの形態の免疫学的な検出および定量化の基礎を構成する。これは、具体的には、診断用途のための生物学的材料、具体的には血漿サンプルに適用される。同様に治療用途も可能である。
【００２３】
驚くべきことに、以下で説明されているように異なる形態のＰｌＧＦを検出することができる。以下、遊離ＰｌＧＦを特異的に検出するための、結合パートナーの選択、および、特異的な結合パートナーを製造するための物質をより詳細に説明する：
本発明によれば、ｆＰｌＧＦ、具体的には非ｍ／ｓＦｌｔ−１結合型ＰｌＧＦを検出するのに特に適しているのは、二次ＰｌＧＦアイソフォームのポールにおける受容体結合ドメインの領域で結合する受容体チロシンキナーゼファミリー、具体的にはＦｌｔ−１、Ｆｌｔ−２、Ｆｌｔ−３、Ｆｌｔ−４、好ましくはＦｌｔ−１、相同体、フラグメントおよび分解産物生成物の特異的な結合パートナー、具体的には抗体およびタンパク質である。
【００２４】
特に適切なのは、遊離の一次および二次ＰｌＧＦアイソフォーム、具体的には二次ＰｌＧＦアイソフォーム、好ましくはＰｌＧＦのホモ二量体、特に好ましくはＰｌＧＦ−１のホモ二量体、具体的にはｒｈＰｌＧＦ−１のホモ二量体、好ましくはＮ−グリコシル化ｒｈＰｌＧＦ−１のホモ二量体を使用して製造される特異的な結合パートナー、具体的には抗体であり、これらは例えば、免疫化によって製造され、特徴付けの際に、結合の際に受容体結合部位の領域における相互作用が起こるか、または必要であることが示されるものである。
【００２５】
二量体（二次ＰｌＧＦアイソフォーム）における単量体（一次ＰｌＧＦアイソフォーム）の「頭一尾」配向は、それぞれ受容体結合ドメインをＰｌＧＦ二量体のポールに位置付ける作用を有する。受容体結合は単量体と単量体との境界で起こり、１つの単量体のみで起こることはない。
【００２６】
具体的には、驚くべきことに、ｆＰｌＧＦに特異的な抗体を生産するための免疫化抗原として特に適切なものは、１つの単量体の配列情報しか有さないペプチド、従って両方の単量体で構成される受容体結合ドメイン全体を含まないペプチドである。
【００２７】
免疫化抗原として特に適切なものは、受容体の相互作用に重要なアミノ酸を含むペプチド、または、それらの周辺の配列領域を包含するペプチドである。以下のＰｌＧＦ−１配列内で、具体的には、これに限定されないがＦｌｔ−１受容体の相互作用に重要なアミノ酸を下線で示す。説明のための一例として、ＰｌＧＦ−１配列を選択した。また、これらのアミノ酸は、その他のＰｌＧＦアイソフォームの場合における受容体の相互作用にも重要である。
【化７】
2008540477.tif 000008
【００２８】
Ｅ−１１２およびＰ−１１５、具体的にはＰ−１ｌ５は、ＰｌＧＦ−３およびＰｌＧＦ−４の場合、それに対応する受容体の相互作用において二次的な役割を果たすか、または実際には何の役割も果たさないと予想され、これらは、上述の７２個のアミノ酸のインサート（ＳＮ３およびＳＮ４）がこれらのアミノ酸の間に存在することから例外の一つである。
【００２９】
以下のペプチドは、ｆＰｌＧＦに特異的な抗体を製造するための免疫化抗原として特に適切である（免疫化抗原番号（ＩＡＮ）１−４）：
【化８】
2008540477.tif 000009
【００３０】
また、免疫化抗原は、免疫化抗原番号ＩＡＮ１−４を含む異なるペプチド由来の配列を含んでいてもよい。例えば、以下のペプチドを用いることができる：
【化９】
2008540477.tif 000010
【００３１】
以下で、特定の実施態様をより詳細に説明する：
本発明の目的は、４〜３０個のアミノ酸、好ましくは５〜２０個のアミノ酸、さらに特に好ましくは１０〜１５個のアミノ酸からなるペプチドであり、これらは、アミノ酸配列ＦＱＥＶＷＧＲＳＹ（ＩＡＮ：１−１）、ＳＡＧＮＧＳＳＥＶＥＶＶ（ＩＡＮ：１−１−１）、ＶＶＰＦＱＥＶＷＧＲＳＹ（ＩＡＮ：１−１−２）、ＧＤＥＮＬ（ＩＡＮ：２−１）、ＧＣＣＧＤＥＮＬＨ（ＩＡＮ：２−１−１）、ＱＬＬＫＩＲＳＧＤＲＰＳＹ（ＩＡＮ：３−１）、ＱＬＬＫＩ（ＩＡＮ：３−２）、ＲＰＳＹＶ（ＩＡＮ：３−３）、ＲＳＧＤＲＰＳＹＶＥＬＴ（ＩＡＮ：３−３−１）、および／または、ＥＣＲＰ（ＩＡＮ：４−１）を含むことを特徴とする。
【００３２】
また、特に好ましくは、既述の配列からの５個の連続したアミノ酸、すなわち例えばＥＶＶＰＦ（ＩＡＮ：１−２）、ＶＶＰＦＱ（ＩＡＮ：１−３）、ＶＰＦＱＥ（ＩＡＮ：１−４）、ＰＦＱＥＶ（ＩＡＮ：１−５）、ＦＱＥＶＷ（ＩＡＮ：１−６）、ＱＥＶＷＧ（ＩＡＮ：１−７）、ＥＶＷＧＲ（ＩＡＮ：１−８）、ＶＷＧＲＳ（ＩＡＮ：１−９）、ＷＧＲＳＹ（ＩＡＮ：１−１０）、ＧＲＳＹＣ（ＩＡＮ：１−１１）、ＲＳＹＣＲ（ＩＡＮ：１−１２）、ＳＹＣＲＡ（ＩＡＮ：１−１３）、ＹＣＲＡＬ（ＩＡＮ：１−１４）、または、ＧＣＣＧＤ（ＩＡＮ：２−２）、ＣＣＧＤＥ（ＩＡＮ：２−３）、ＣＧＤＥＮ（ＩＡＮ：２−４）などから、ＰＬＲＥＫ（ＩＡＮ：４−２）までを含むペプチドである。
【００３３】
非結合型および／またはキャリアー結合型を免疫化するために、免疫化抗原を用いることができる。典型的なキャリアー、例えばオバルブミン、アルブミンまたはキーホールリンペットヘモシニアンのようなタンパク質へのカップリングを容易にするために、好ましくは、リシンを含むペプチドが合成される。そのためには、以下のペプチドが特に適している：ＳＡＧＮＧＳＳＥＶＥＶＶＫ（ＩＡＮ：１−１−１Ｋ）、ＳＧＤＲＰＳＹＶＥＬＴＫ（ＩＡＮ：３−３−１Ｋ）、ＶＰＶＥＴＡＮＶＴＭＱＬＫ（ＩＡＮ：２／３Ｋ）、ＶＶＰＦＱＥＶＷＧＲＳＹＫ（ＩＡＮ：１−１−２Ｋ）、および、ＧＣＣＧＤＥＮＬＨＫ（ＩＡＮ：２−１−１Ｋ）。
【００３４】
また、「多重抗原ペプチド系」も免疫化抗原として用いることができる［Ｔａｍ，Ｊ．Ｐ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １９８８，８５，５４０９〜５４１３］。具体的には、ＩＡＮ１−１−１、ＩＡＮ３−３−１、または、ＩＡＮ２／３の８−ｍｅｒを用いることができる：
【化１０】
2008540477.tif 000011
【００３５】
以下、gＰｌＧＦを特異的に検出する特異的な結合パートナーを製造するための物質の選択をより詳細に説明する：
ｇＰｌＧＦを使用して、特異的な結合パートナー、具体的には抗体を、例えば免疫化によって同定または製造する。これらの特異的な結合パートナーは、それらと結合する際に、ＰｌＧＦ、加えて結合した結合パートナーの両方と相互作用が起こるという特徴によって区別される。
【００３６】
例えば、抗体ＰｌＧＦを製造するために、結合パートナーと複合体を形成するものが免疫化に用いることができる。具体的には、これらは、ｓＦｌｔ−１と複合体化したＰｌＧＦ−１のホモ二量体であってもよい。また、関連する相同体、フラグメントなどからなる対応する複合体も使用可能である。
【００３７】
以下、翻訳後修飾によって改変された、具体的にはグリコシル化されたＰｌＧＦを特異的に検出する特異的な結合パートナーを製造するための物質の選択をより詳細に説明する。
【００３８】
この目的のために、翻訳後修飾された、または翻訳後修飾されていないＰｌＧＦまたは対応するペプチドが、特異的な結合パートナー、具体的には抗体を製造するために用いられる。従って、このような特異的な結合パートナーは、翻訳後修飾の存在または非存在を特異的に検出することに適している。
【００３９】
例えば、配列ＶＥＴＡＮＶＴＭＱ（ＩＡＮ：３−４）またはそれらの部分、例えばＶＥＴＡＮ（ＩＡＮ：３−５）、ＴＡＮＶＴ（ＩＡＮ：３−６）、または、ＮＶＴＭＱ（ＩＡＮ：３−７）を含むＮ−グリコシル化ペプチドを、アスパラギン８４（Ｎ８４）におけるＰｌＧＦのグリコシル化を特異的に検出するのに使用可能な特異的な結合パートナー、具体的には抗体を製造するために用いることができる。これらのＮ−グリコシル化ペプチドと同様に、グリコシル化ＰｌＧＦまたは対応するフラグメントを使用することも可能である。
【００４０】
加えて、適切な相同な非グリコシル化ペプチド、ＰｌＧＦおよび適切なフラグメントの使用によって、非グリコシル化ＰｌＧＦの特異的な検出で使用可能な結合パートナーを製造することもできる。
【００４１】
以下、ＰｌＧＦ−２を特異的に検出する特異的な結合パートナーを製造するための物質の選択をより詳細に説明する：
本発明において、一次または二次ＰｌＧＦ−２アイソフォーム、それらのフラグメントまたは対応するペプチドは、特異的な結合パートナー、具体的には抗体を製造するために用いられる。以下の配列またはそれらの部分を含むペプチドおよびそれらのフラグメントは、ＰｌＧＦ−２−特異的な抗体を製造するための免疫化抗原として特に適切である：
【化１１】
2008540477.tif 000012
【００４２】
特に好ましくは、下線で示した配列またはそれらの部分を含むペプチドを使用すべきである。
【００４３】
特に適切なのは、上記の配列（ＩＡＮ５）の５個の連続したアミノ酸を含むペプチドであり、例えばＭＫＰＥＲ（ＩＡＮ：５−１）、ＫＰＥＲＲ（ＩＡＮ：５−２）などからＬＣＧＤＡ（ＩＡＮ：５−３）までである。
【００４４】
上述のタンパク質やペプチドを用いた免疫化またはその他の手法によって製造されたＰｌＧＦ−２に関する特異的な結合パートナー、具体的には抗体と同様に、特異的な結合パートナー、例えばアニオン性化合物、具体的にはポリアニオン系化合物、好ましくはヘパリン化合物、具体的にはヘパリン硫酸プロテオグリカンを使用することも可能である。さらなる実施態様において、セマフォリン受容体ファミリーに属するタンパク質、具体的にはニューロピリン、好ましくはニューロピリン−１（ＮＰ−１）、および、ニューロピリン−２（ＮＰ−２）が、特異的なＰｌＧＦ−２結合パートナーとして用いられる。
【００４５】
以下、ＰｌＧＦ−３を特異的に検出する特異的な結合パートナーを製造するための物質の選択をより詳細に説明する：
本明細書において、一次または二次ＰｌＧＦ−２アイソフォーム、それらのフラグメントまたは対応するペプチドは、特異的な結合パートナー、具体的には抗体を製造するために用いられる。以下の配列またはそれらの部分を含むペプチドおよびそれらのフラグメントは、ＰｌＧＦ−３−特異的な抗体を製造するための免疫化抗原として特に適切である：
【化１２】
2008540477.tif 000013
【００４６】
特に好ましくは、 下線で示した配列またはそれらの部分を含むペプチドを使用すべきである。
【００４７】
特に適切なのは、既述の配列ＩＡＮ６の５個の連続したアミノ酸、すなわち  例えばＣＥＣＲＨ（ＩＡＮ：６−１）、ＥＣＲＨＳ（ＩＡＮ：６−２）などから、ＫＰＬＲＥ（ＩＡＮ：６−３）までを含むペプチドである。
【００４８】
以下、ＰｌＧＦ−４を特異的に検出する特異的な結合パートナーの選択、および、このような結合パートナーを製造するための物質の選択をより詳細に説明する：
本明細書において、一次または二次ＰｌＧＦ−４アイソフォーム、それらのフラグメントまたは対応するペプチドは、特異的な結合パートナー、具体的には抗体を製造するために用いられる。以下の配列またはそれらの部分を含むペプチドおよびそれらのフラグメントは、ＰｌＧＦ−４−特異的な抗体を製造するための免疫化抗原として特に適切である：
【化１３】
2008540477.tif 000014
【００４９】
特に好ましくは、下線で示したアミノ酸を含むペプチドが用いられるべきである。
【００５０】
以下の配列を含むペプチドが、特に適切である：ＱＱＲＫＰ（ＩＡＮ：７−１）、ＱＲＫＰＬ（ＩＡＮ：７−２）、ＲＫＰＬＲ（ＩＡＮ：７−３）、ＫＰＬＲＥ（ＩＡＮ：６−３）、ＭＫＰＥＲ（ＩＡＮ：５−１）、ＫＰＥＲＲ（ＩＡＮ：５−２）、ＰＥＲＲＲ（ＩＡＮ：７−４）、および、ＥＲＲＲＰ（ＩＡＮ：７−５）。
【００５１】
ＰｌＧＦ−４は、特異的なＰｌＧＦ−２配列と、さらに特異的なＰｌＧＦ−３配列の両方を含むため、ＰｌＧＦ−４の検出は、本発明に係る特異的なＰｌＧＦ−２結合パートナー、および、ＰｌＧＦ−３結合パートナー、具体的には本発明に係る抗原によって製造される抗体、具体的にはペプチドによって行うことができる。
【００５２】
以下、ＰｌＧＦ／ＶＥＧＦヘテロ二量体を特異的に検出する特異的な結合パートナーの選択、および、このような結合パートナーを製造するための物質の選択をより詳細に説明する：
ＰｌＧＦ／ＶＥＧＦヘテロ二量体は、特異的なＰｌＧＦ配列（ＰｌＧＦ１−４）、さらに特異的なＶＥＧＦ配列（ＶＥＧＦアイソフォーム）の両方を含むため、ＰｌＧＦ／ＶＥＧＦヘテロ二量体の検出は、本発明に係る特異的なＰｌＧＦ結合パートナー、具体的には本発明に係る抗原によって製造される抗体、具体的にはペプチド、および、ＶＥＧＦ抗体によって行うことができる。
【００５３】
加えて、本発明によれば、ＶＥＧＦ／ＰｌＧＦヘテロ二量体に特異的な結合パートナーＫＤＲ／Ｆｌｋ−１、ならびにそれらのアイソフォーム、相同体、フラグメントおよび分解産物生成物を用いてもよい。
【００５４】
また、具体的には、ＶＥＧＦ／ＰｌＧＦヘテロ二量体の使用によって、例えば免疫化によって同定または製造され、特徴付けの際に、結合の際にＶＥＧＦ単量体との、加えてＰｌＧＦ単量体との両方の相互作用が始まることが示される特異的な結合パートナー、特に抗体も使用可能である。
【００５５】
特に免疫化抗原として用いられる本発明に係るペプチドの好ましい製造方法は、固相合成であり、ここにおいて、リシンコアで複数のペプチドのコピーが合成される［Ｔａｍ  Ｊ．Ｐ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５４０９〜５４１３も参照］。好ましくは、このようなペプチド合成は、標準的なプロトコールに従って自動機械によって行われ、このような自動機械としては、例えば、例えばアプライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，米国）によって供給されている自動機械が挙げられる。このような多量体のペプチドをさらにキャリアータンパク質に結合させてもよい。
【００５６】
本発明に係る特異的な結合パートナーは、エピトープに結合する。当然ながら、「特異的な結合パートナー」は、特異的な結合対の構成要素を意味するものと理解されるべきである。特異的な結合対の構成要素は２つの分子であって、ここにおいて、この分子の一方が、他方の分子の構造に相補的な構造を少なくとも１つを有するため、２つの分子は、相補的構造の結合を介して結合することができる。また、分子という用語は、例えば、アポおよび補酵素からなる酵素、数種のサブユニットからなるタンパク質、タンパク質や脂質などからなるリポタンパク質のような分子の複合体も含む。特異的な結合パートナーは天然に存在するものでもよいが、例えば化学合成、微生物学的な技術、および／または、遺伝子工学プロセスによって製造された物質でもよい。特異的な結合パートナーという用語の説明のために、以下の一覧を示すが、これらの物質に限定されない：チロキシン結合グロブリン、ステロイド結合タンパク質、抗体、抗体フラグメント、設計された反復タンパク質、タンパク質骨格、アンキリン、ロイシンリッチな反復、アンチカリン（ａｎｔｉｃａｌｉｎ）、デュオカリン（ｄｕｏｃａｌｉｎ）、リポカリン、アフィボディ（Ａｆｆｉ−ｂｏｄｉｅｓ(R)）、抗原、ハプテン、酵素、レクチン、核酸、具体的にはアプタマー、リプレッサー、オリゴおよびポリヌクレオチド、プロテインＡ、プロテインＧ、アビジン、ストレプトアビジン、ビオチン、補体成分Ｃｌｑ、核酸結合タンパク質など。特異的な結合対の例は、以下の通りである：抗体−抗原、抗体−ハプテン、オペレーター−リプレッサー、ヌクレアーゼ−ヌクレオチド、ビオチン−アビジン、レクチン−多糖類、ステロイド−ステロイド結合タンパク質、活性物質−活性物質受容体、ホルモン−ホルモン受容体、酵素−基質、ＩｇＧ−タンパク質Ａ、相補的なオリゴ−またはポリヌクレオチドなど。
【００５７】
用語「ペプチド」は、本発明に関して、加水分解でアミノ酸に分解する酸アミド、例えばアミノ酸ポリマー、例えばポリペプチド、 オリゴペプチド、 タンパク質またはタンパク質フラグメントなどに分解する酸アミドを含む。
【００５８】
本発明に係るペプチドは、本発明に係る抗体を製造するための免疫化抗原として、または、さらに本発明に係る抗体の親和性クロマトグラフィー精製のための免疫化抗原として用いることができる。さらに、本発明に係るペプチドは、分析物、好ましくは様々なＰｌＧＦの形態の定量または定性検出に関する工程でも使用可能である。また、本発明に係るペプチドは、例えばイムノアッセイにおいて、固相、および／または、シグナルを発生させる系の成分に結合させてもよい。
【００５９】
用語「抗原」は、１価抗原および多価抗原を含む。多価抗原は、２種以上の免疫グロブリンが同時に結合できる分子または分子複合体であり、一方、一価抗原は、一種の抗体にしか同時に結合できない。それ自身単独では免疫原性ではないが、通常は免疫化のためにキャリアーに結合する分子は、一般的に、ハプテンと説明されている。
【００６０】
用語「抗体」は、本発明に関して、免疫グロブリンを意味するものと理解するべきであり、例えばクラスまたはサブクラスＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2a、ＩｇＧ2b、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、または、ＩｇＭの免疫グロブリンである。抗体は、抗原またはハプテンにおける１つのエピトープ（または、しばしば抗原決定基とも呼ばれる）に対して、少なくとも１つの結合部位（しばしばパラトープと呼ばれる）を有する。このようなエピトープは、例えば、その空間的な構造、および／または、極性および／または、無極性基の存在を特徴とする。抗体の結合部位は、エピトープに相補的である。抗原−抗体反応、または、ハプテン−抗体反応は、いわゆる「鍵と鍵穴」の原理に従って機能し、概して  高度に特異的であり、すなわち抗体は、一次構造、電荷、空間的な立体配置、および、抗原またはハプテンの立体配置におけるわずかな偏差を区別することができる。具体的には、いわゆる抗体の「相補性決定領域」が、抗体の抗原またはハプテンへの結合に寄与する。
【００６１】
しかしながら、用語「抗体」は、本発明に関して、完全な抗体を意味するだけでなく、特に抗体フラグメント、例えばＦａｂ、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’；さらに、キメラ、ヒト化二重または多重特異性、または、「単鎖」抗体；さらに、免疫グロブリンおよび／またはそれらのフラグメントの集合体、ポリマーおよび結合体（ただし、抗原またはハプテンへの結合特性は保持されるというという条件で）も意味すると理解すべきである。抗体フラグメントは、例えば、ペプシンまたはパパインのような酵素を用いた抗体の酵素的な切断によって製造することができる。抗体の集合体、ポリマーおよび結合体は様々な方法によって製造することができ、例えば、熱処理、グルタルアルデヒドのような物質との反応、免疫グロブリン結合分子との反応、抗体のビオチン化、それに続くストレプトアビジンまたはアビジンとの反応などによって製造することができる。
【００６２】
本発明に関する抗体は、モノクローナルであってもよいし、または、ポリクローナル抗体であってもよい。このような抗体は一般的な方法によって製造することができ、例えば、ヒト、または、例えばマウス、ラット、モルモット、ウサギ、ウマ、ロバ、ヒツジ、ヤギもしくはニワトリのような動物の免疫化［Ｍｅｓｓｅｒｓｃｈｍｉｄ（１９９６）ＢＩＯｆｏｒｕｍ  １１：５００〜５０２も参照］、それに続いて抗血清を単離すること；または、ハイブリドーマ細胞を確立し、続いて分泌された抗体を精製すること；または、天然の抗体の抗原および／またはハプテンへの結合に関与するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列またはそれらの改変型のクローニングおよび発現によって製造することができる。
【００６３】
本発明に係る抗体は、具体的には、上述のタンパク質、タンパク質複合体またはペプチドに結合する抗体である。
【００６４】
本発明に係る抗体を提供することによって、目下当業者は、例えば競合実験によって［Ｐｅｔｅｒｓ等（１９８５）Ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌｅ  Ａｎｔｉｋoｒｐｅｒ、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ、章  １２．２「Ｅｐｉｔｏｐ−Ａｎａｌｙｓｅ”も参照］、その他の特異的な結合パートナー、特に、それと共に含まれる本発明に係る抗体のエピトープに結合する抗体を同定することが可能である。従って、特異的な結合パートナーは、目下、合成ペプチドデータベースを用いたファージディスプレイライブラリー、または、「組換え抗体ライブラリー」によって選択することができる［Ｌａｒｒｉｃｋ＆Ｆｒｙ（１９９１）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ２：１７２〜１８９］。
【００６５】
また本発明の目的は、固相、および／または、シグナルを発生させる系の成分に結合する本発明に係る抗体でもある。
【００６６】
用語「固相」は、本発明に関して、多孔質および／または非多孔質の、一般的には水不溶性の材料からなる物体であって、例えば容器、チューブ、マイクロタイトレーションプレート、球体、微粒子、ロッド、ストリップ、フィルターまたはクロマトグラフィーペーパーなどのような多種多様の形態をとることができる物体を含む。一般的に、固相の表面は親水性であるか、または、親水性にすることができる。固相は、例えば無機および／または有機物質、合成、天然に存在する材料、および／または、改変された天然に存在する材料のような多種多様の材料からなるものでもよい。固相の材料の例は、ポリマー、例えばセルロース、ニトロセルロース、酢酸セルロース、塩化ビニル、ポリアクリルアミド、架橋されたデキストラン分子、アガロース、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ−メタクリラート、または、ナイロン；セラミック、ガラス、金属、具体的には貴金属、例えば金、および、銀；磁鉄鉱；これらの混合物または組み合わせである。またこのような固相という用語には、細胞、リポソームまたはリン脂質小胞も包含される。
【００６７】
固相は、例えばタンパク質、炭水化物、親油性物質、バイオポリマー、有機ポリマー、または、それらの混合物の１またはそれ以上の層からなるコーティングを有していてもよく、これらは、例えばサンプル成分の固相への非特異的結合を抑制したり、または、防いだりするために、または、例えば、微粒子の固相の懸濁液の安定性、貯蔵安定性、寸法の安定性、または、紫外光、微生物もしくはその他の有害な作用に対する耐性における改善を達成するためになされる。
【００６８】
微粒子は、固相および／または標識として用いられることが多い。用語「微粒子」は、本発明に関して、およその直径が少なくとも２０ｎｍかつ２０μｍ以下、一般的には４０ｎｍ〜１０μｍ、好ましくは０.１〜１０μｍ、特に好ましくは０.１〜５μｍ、よりいっそう好ましくは０.１５〜２μｍの粒子を意味するものとして理解されるべきである。このような微粒子は、規則的な形状であってもよいし、または、不規則な形状であってもよい。このような微粒子は、球体、回転楕円体、または、様々なサイズの空孔を有する球体であってもよい。このような微粒子は、有機または無機物質、または、その両方の混合物またはの組み合わせからなっていてもよい。このような微粒子は、多孔質または非多孔質の、膨潤性、または、非膨潤性の材料からなっていてもよい。原則的に、このような微粒子はどのような密度を有していてもよいが、水の密度に近い密度を有する粒子、例えば約０.７〜約１.５ｇ／ｍｌの密度を有する粒子が好ましい。好ましい微粒子は、水溶液中で懸濁性であり、できる限り長期間、安定して懸濁されるものである。このような微粒子は、透明、部分的に透明でもよいし、または、不透明でもよい。このような微粒子は、例えば、いわゆる１つのコアと１またはそれ以上の外殻層とを含む「コア・シェル」粒子のような、数種の層からなっていてもよい。微粒子という用語は、例えば、染料の結晶、金属ゾル、シリカ粒子、ガラス粒子、磁気粒子、ポリマー粒子、油滴、脂質粒子、デキストラン、および、タンパク質凝集体を含む。好ましい微粒子は、水溶液中で懸濁性であり、水不溶性の高分子材料からなる粒子であり、具体的には置換されたポリエチレンの粒子である。よりいっそう好ましくは、ラテックス粒子であり、例えばポリスチレン、アクリル酸ポリマー、メタクリル酸ポリマー、アクリロニトリルポリマー、アクリロニトリル−ブタジエン−スチレン、ポリ酢酸ビニル−アクリラート、ポリビニルピリジン、または、塩化ビニル−アクリラートのラテックス粒子である。特に興味深いのは、それらの表面に、例えばカルボキシル、アミノまたはアルデヒド基のような例えば特異的な結合パートナーのラテックス粒子への共有結合を可能にする反応性基を有するラテックス粒子である。ラテックス粒子の製造は、例えば、ＥＰ００８０６１４、ＥＰ０２２７０５４、および、ＥＰ０２４６４４６で説明されている。
【００６９】
「シグナルを発生させる系」は、１種またはそれ以上の成分からなっていてもよく、ここにおいて、少なくとも１つの成分は検出可能な標識である。当然ながら、標識は、それ自身シグナルを生産する、または、シグナルの生産を誘導することができるあらゆる分子を意味するものと理解され、例えば、蛍光物質、放射活性物質、酵素または化学発光物質である。このようなシグナルは、例えば、酵素活性、発光、光吸収、光散乱、放出された電磁放射線もしくは放射線、または、化学反応に基づき検出または測定することができる。
【００７０】
標識は、それ自身、検出可能なシグナルを発生させることができるため、その他の成分を必要とすることがない。多くの有機分子は、紫外線および可視光を吸収し、その結果として、これらの分子は励起されたエネルギー状態に到達して、吸収されたエネルギーを放射された光の波長以外の波長の光の形態で放出することができる。また、その他の標識も、例えば放射性同位体または色素のような検出可能なシグナルを直接生成することができる。
【００７１】
また、その他の標識として、シグナル生成のためのその他の成分を必要とするものもあり、すなわちこのような場合、シグナルを発生させる系は、シグナル発生に必要な全ての成分、例えば基質、補酵素、消光剤、促進剤、追加の酵素、酵素産物と反応する物質、触媒、活性剤、補因子、阻害剤、イオンなどを含む。
【００７２】
適切な標識の例は、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、グルコース−６−リン酸塩デヒドロゲナーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、ウレアーゼ、および、アセチルコリンエステラーゼなどの酵素；色素；フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、フィコエリトリン、フィコシアニン、エチジウムブロマイド、５−ジメチル−アミノナフタレン−１−スルホニル塩化物、および、希土類の蛍光性のキレートなどの蛍光物質；ルミノール、イソルミノール、アクリジニウム化合物、オレフィン、エノールエーテル、エナミン、アリールビニルエーテル、ジオキセン、アリールイミダゾール、ルシゲニン、ルシフェリン、および、エクオリンなどの化学発光物質；エオシン、９，１０−ジブロモ−アントラセン、メチレンブルー、ポルフィリン、フタロシアニン、クロロフィル、ローズベンガルなどの増感剤；補酵素；酵素基質；125Ｉ、131Ｉ、14Ｃ、3Ｈ、32Ｐ、33Ｐ、35Ｓ、51Ｃｒ、59Ｆｅ、57Ｃｏ、および、75Ｓｅなどの放射性同位体；磁気粒子などの粒子、または、好ましくはラテックス粒子などの粒子（これらは、それ自身、例えば色素、増感剤、蛍光物質、化学発光物質、同位体またはその他の検出可能な標識で標識することができる）；金、または、銀ゾルなどのゾル粒子；リポソームまたは細胞（これらは、それ自身、検出可能な標識で標識することができる）；などである。［ＥＰ−Ａ２−０５１５１９４；ＵＳ５,３４０,７１６；ＵＳ５,５４５,８３４；Ｂａｉｌｅｙ等（１９８７）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ＆Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ５：６４９〜６５８も参照］。
【００７３】
また、シグナルを発生させる系は、例えばエネルギードナーとエネルギーアクセプターの形態で、互いが空間的に近接した場合に、検出可能な相互作用に関与することができる成分を含んでいてもよく、このような形態としては、例えば、光増感剤と化学発光性物質（ＥＰ−Ａ２−０５１５１９４）、光増感剤と発蛍光団（ＷＯ９５／０６８７７）、放射性ヨウ素125と蛍光団［Ｕｄｅｎｆｒｉｅｎｄ等（１９８５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８２：８６７２〜８６７６］、発蛍光団と発蛍光団［Ｍａｔｈｉｓ（１９９３）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．３９：１９５３〜１９５９］、または、発蛍光団と蛍光消光剤（ＵＳ３,９９６,３４５）の形態が挙げられる。
【００７４】
これらの成分間の相互作用としては、例えば光放射または電子線による、または、寿命の短い反応性の化学分子を介した、成分間の直接のエネルギー移動が挙げられる。また、１種の成分の活性が、１種またはそれ以上の他の成分によって阻害または強化されるプロセスも含まれ、例えば酵素活性の阻害もしくは強化、または、影響を受けた成分によって放出された電磁放射の阻害、強化もしくは改変（例えば波長シフト、極性化）である。また、成分間の相互作用は、酵素カスケードも含む。この場合において、成分は酵素であり、そのうち少なくとも１種は、カップリングされた基質変換の最大限または最小の反応速度が得られるような他方のための基質を提供する。
【００７５】
成分間の有効な相互作用は、一般的には、これらが空間的に近接している場合、すなわち例えば数μｍの程度の距離で近接している場合に起こり、具体的には、６００ｎｍ未満、好ましくは４００ｎｍ未満、よりいっそう好ましくは２００ｎｍ未満の距離の範囲内で近接している場合である。
【００７６】
用語「結合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」は、概して、例えば、共有結合および非共有結合、直接および間接結合、表面への吸着、ならびに、凹部または空隙への封入などと理解されることとし、この用語はこれらを包含する。共有結合の場合、抗体または結合パートナーは、化学結合を介して固相または標識に結合している。非共有結合の例は、表面への吸着、空孔への封入、または、２つの特異的な結合パートナーの結合である。固相または標識への直接結合と同様に、抗体または結合パートナーは、他方の特異的な結合パートナーとの特異的な相互作用を介して固相または標識に間接的に結合していてもよい（ＥＰ−Ａ２〜０４１１９４５も参照）。この例は、以下の通りである：標識結合アビジンを介して標識に結合することができるビオチン化した抗体、または、固相に結合した抗フルオレセイン抗体を介して固相に結合することができるフルオレセイン−抗体結合体、または、免疫グロブリン結合タンパク質を介して固相または標識に結合することができる抗体。
【００７７】
本発明のさらなる目的は、インビトロでの診断薬として、または、インビトロでの診断薬の成分として用いられる、本発明に係る抗体または特異的な結合パートナーである。
【００７８】
インビトロでの診断薬の場合、生きているヒトまたは動物の体から採取されたサンプル中で、検出しようとする分析物、例えば特定のＰｌＧＦの形態が検出されるか、または、それらの濃度または含量が決定される。
【００７９】
「サンプル」は、本発明に関して、検出しようとする物質を含むと予想される材料を意味すると理解されることとする（この例としては、ＥＰ−Ａ２−０５１５１９４の「Ａｎａｌｙｔ」を参照）。サンプルという用語は、例えば、具体的にはヒトおよび動物の生体液または組織を含み、例えば、血液、血漿、血清、痰、滲出液、気管支肺胞洗浄液、リンパ液、滑液、精液、膣粘液、便、尿、脳脊髄液、毛髪、皮膚、組織サンプルまたは切片である。また、細胞培養サンプル、植物の流体または組織、法医学的なサンプル、水および廃水サンプル、食材ならびに医薬品も含まれる。必要に応じて、分析物を上記検出方法で処理できるようにするために、または、干渉するサンプル成分を除去するために、このようなサンプルは前処理されていなければならない。このようなサンプルの前処理としては、細胞の分離および／または溶解、例えばタンパク質のようなサンプル成分の沈殿、加水分解または変性、サンプルの遠心分離、例えばアルコール、具体的にはメタノールのような有機溶媒でのサンプルの処理、または、界面活性剤でのサンプルの処理が挙げられる。このようなサンプルは、その他の媒体に移すことが一般的であり、このような溶媒は、検出工程に干渉する可能性がない限り、ほとんどの場合水性媒体である。
【００８０】
本発明に係る抗体は、サンプル中の分析物、好ましくは特定のＰｌＧＦの形態、具体的にはｆＰｌＧＦを定量的または定性的に決定する工程で用いることができる。
【００８１】
定量的な決定の場合、サンプル中の分析物の含量、濃度または活性（例えば酵素活性）が測定される。また、用語「定量的な決定」は、サンプル中の分析物のおよその含量、濃度または活性を単に確認するだけの半定量的な方法、または、単に相対的な含量、濃度または活性の値を得るのに用いることができるような半定量的な方法も含む。定性的な決定は、何らかのサンプル中の分析物の存在を検出すること、または、サンプル中の分析物の濃度または活性が、既定された閾値、または、いくつかの既定された閾値より高いのか、または低いのかを示すことを意味すると理解されることとする。
【００８２】
従って、本発明はまた、サンプル中の分析物の、好ましくは特定の ＰｌＧＦの形態、具体的にはfＰｌＧＦの定量的または定性的な決定方法、および、それに適した試薬にも関する。
【００８３】
分析物を決定するために、一般的には結合試験が使用されるが、ここにおいて決定しようとする分析物の分析物特異的な結合パートナーへの特異的な結合によって、サンプル中の分析物の存在、非存在または含量に関して結論を得ることができる。結合試験の例としては、イムノアッセイが挙げられ、または、オリゴまたはポリヌクレオチドがハイブリダイズされる方法も挙げられる。
【００８４】
いわゆる「異種結合試験」は、１回またはそれ以上の分離工程および／または洗浄工程を特徴とする。分離は、例えば、免疫沈降反応、ポリエチレングリコールまたは硫酸アンモニウムのような物質を用いた沈殿、ろ過、磁気分離、または、固相への結合によって実行することができる。異種結合試験をサンドイッチ様式で用いた場合、概して、分析物に特異的な結合パートナーの一方が固相に結合しており、液相からの結合複合体「分析物／分析物に特異的な結合パートナー」の除去に役立ち、一方で、他方の分析物に特異的な結合パートナーは、結合した複合体を検出するための、例えば酵素、蛍光または化学発光標識などの検出可能な標識を有する。これらの試験方法はさらに、同時に２種の特異的な結合パートナーがサンプルとインキュベートされるいわゆる一工程サンドイッチ試験と、まずサンプルを固相試薬とインキュベートして、分離および洗浄工程の後、固相に結合した分析物および分析物に特異的な結合パートナーの結合複合体を、検出試薬とインキュベートする二工程サンドイッチ試験に細分される。
【００８５】
「同種結合試験」において、シグナルを発生させる系の遊離の成分と、「分析物／分析物に特異的な結合パートナー」複合体に結合した成分との分離は実行されない。分析物に特異的な結合パートナー、シグナルを発生させる成分、および、サンプルを含む試験混合物は、さらなる分離および／または洗浄工程を行わないで結合反応の後に分析され、または、結合反応の最中にも分析され、それに対応する測定シグナルが決定される。同種のイムノアッセイの例［Ｂｏｇｕｓｌａｓｋｉ＆Ｌｉ（１９８２）Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ７：４０１〜４１４も参照］としては、混濁度測定または比濁分析が挙げられ、ここにおいて、決定に用いられる分析物に特異的な結合パートナーは、ラテックス粒子に結合させてもよく、例えばＥＭＩＴ(R)試験；ＣＥＤＩＡ(R)試験；蛍光偏光イムノアッセイ；発光  酸素チャネリングイムノアッセイ［ＬＯＣＩ(R)、ＥＰ−Ａ２−０５１５１９４を参照；Ｕｌｌｍａｎ等（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９１：５４２６〜５４３０；Ｕｌｌｍａｎ等（１９９６）Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４２：１５１８〜１５２６］なども挙げられる。例えばラテックスを用いた比濁試験のような同種のサンドイッチイムノアッセイにおいて、抗体試薬をサンプルと共にインキュベートして、測定の前に分離または洗浄工程を行わないで、インキュベート中に、および／または、インキュベート後にシグナルを測定する。言い換えれば：遊離の分析物、または、どの分析物にも結合しなかった抗体から、抗体が結合した分析物を分離することは行われない。
【００８６】
また、同種および異種結合試験は、いわゆる「サンドイッチ分析」の形態で行うこともできる。この場合、例えば異種結合試験において、分析物は、１つの固相に連結された分析物に特異的な結合パートナーと、１つの分析物に特異的な結合パートナー（これは、シグナルを発生させる系の成分に連結している）とによって結合している。サンドイッチイムノアッセイにおいて、抗体、または、抗原、または、ハプテンが、分析物に特異的な結合パートナーを構成していてもよい。
【００８７】
異種または同種結合試験のさらなる特定の実施態様は、「間接的なイムノアッセイ」である。この場合、分析物は抗体である。分析物に特異的な結合パートナーの１つは、抗原であるか、または、例えば本発明に係るペプチド、または、決定しようとする抗体（すなわち分析物）の改変された抗原であり、他方の分析物に特異的な結合パートナーは通常、免疫グロブリン結合タンパク質であり、例えば、決定しようとする抗体（すなわち分析物）に特異的に結合することができる抗体である。
【００８８】
同種または異種の「競合結合試験」において、サンプル−分析物、および、試薬−分析物が、限られた数の分析物に特異的な結合パートナーへの結合に関して競合する。試薬−分析物は、例えば「改変された分析物」であり、例えば標識された、または、マーカーが付された分析物、分析物フラグメント、例えば本発明に係るペプチド、または、分析物の類似体である。原理を説明するための例は以下の通りである：（ｉ）サンプル−分析物が、シグナルを発生させる系の成分に連結された試薬−分析物と、固相に連結された分析物に特異的な結合パートナーへの結合に関して競合するか、または、（ｉｉ）サンプル−分析物が、固相に連結された分析物（すなわち試薬−分析物）と、シグナルを発生させる系の成分に連結された分析物に特異的な結合パートナーへの結合に関して競合する。
【００８９】
また、本発明に係る特異的な結合パートナー、具体的には抗体を用いた異なるＰｌＧＦの形態の検出は、例えばウェスタンブロット、ドットブロット、免疫電気泳動法、免疫固定電気泳動法、電気免疫拡散、免疫沈降、放射免疫拡散、免疫固定、イムノクロマトグラフィー、ラテックス凝集、混濁度測定または比濁試験、同種または異種異種結合試験、一工程または二工程試験、サンドイッチ試験、間接的な試験、競合試験、「ポイントオブケア」検定などの方法によっても実行することができる。これらのおよびその他の検出方法は、例えば、“Ｌａｂｏｒ  ｕｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｅ”，Ｌ．Ｔｈｏｍａｓ編集，ＴＨ−Ｂｏｏｋｓ  Ｖｅｒｌａｇｓｇｅｓｅｌｌｓｃｈａｆｔ  ｍｂＨ，フランクフルト，１９９８，第６０章、または、“Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ａｎ  Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ  ａｎｄ  Ｒｅｌａｔｅｄ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ”，Ｔ．Ｃｈａｒｄ編集，エルゼビア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ），アムステルダム，１９８７で説明されている。
【００９０】
用語「ポイントオブケア検査」または「ＰＯＣ検査」は、検査の実施または評価において別個の分析または測定機器を必要としない検査を含む。ＰＯＣ検査は、多くの場合において、免疫クロマトグラフィー法、ろ過および／または免疫固定技術による免疫複合体の分離に基づく。ＰＯＣ検査は、具体的には、大規模な研究所のためというよりはむしろ、緊急時の医師、および／または、かかりつけの医師のための、その場での測定、例えば病床または自宅での測定を目的とする。またＰＯＣ検査は、具体的には、実験医学分野における詳細な医学的で専門的な訓練や経験を受けていない人によっても行うことができる。また、用語「ＰＯＣ検査」はさらに、本発明に関して、いわゆる家庭用の検査、または、医療に関して専門家ではない人によって行うことができる  ＯＴＣ検査を意味することとし、例えば家庭で使用するために販売されている様々な妊娠検査である。その他のＰＯＣ検査は、例えば、心筋梗塞マーカー、薬物、医薬品、ならびに感染および炎症マーカーの検出に関する。多くのＰＯＣ検査において、特異的な結合パートナーは、フィルターまたはクロマトグラフィーのストリップに結合しているか、または、検査の過程で、フィルターまたはクロマトグラフィーのストリップに結合するようになる。陽性または陰性の検出反応は、例えば、既定された検査欄に色付きのバンドが出現するか、または出現しないか、および／または、所定の記号が出現するか、または出現しないか、例えば、「＋」または「−」、および／または、特定の測定シグナルの強度が出現するか、または出現しないかと組み合わせることができる。
【００９１】
特定のＰｌＧＦの形態、具体的にはｆＰｌＧＦに関するＰＯＣ検査は、例えば以下のように構成することができる：サンプル、および、ｆＰｌＧＦの形態に結合することができるが、その他のＰｌＧＦの形態には結合できないか、または、ほとんど結合できない標識された特異的な抗体を、試験ストリップに塗布する。適切な標識の例は、染色したラテックス粒子、コロイド金、酵素などである。サンプル中にｆＰｌＧＦの形態が含まれる場合、ｆＰｌＧＦ／抗体複合体が形成されると予想される。これらの複合体は、その他の特異的な結合パートナー、具体的には抗体が、その他のｆＰｌＧＦエピトープに結合して例えばバンドの形態で固定されたり、または検査手順の過程で（例えば、ビオチン−アビジン架橋を介して）固定されるようになる領域の方向に、例えば毛細管力によって移動する。標識されたｆＰｌＧＦ／抗体複合体はこの領域で結合し、固定された特異的な結合パートナー、具体的には抗体とサンドイッチ複合体を形成する。ここで標識シグナルの強度は、ｆＰｌＧＦサンプル濃度に比例する。競合的なＰＯＣ検査方法において、例えば抗体フラグメントは、試験ストリップの領域に固定されていてもよいし、または、検査手順の過程で固定されてもよい。この固定された抗体は、サンプルからのｆＰｌＧＦの形態と、標識された抗ｆＰｌＧＦ抗体への結合に関して競合すると予想される。あるいは、固定されたｆＰｌＧＦ抗体、および、標識されたｆＰｌＧＦタンパク質、または、本発明に係るペプチドも、競合的なｆＰｌＧＦ試験を構築するために用いることができる。
【００９２】
本発明に係る方法の特に好ましい実施態様は、比濁または混濁度測定試験であり、具体的には、本発明に係る抗体、好ましくは微粒子（具体的にはラテックス粒子）に連結させた抗体が用いられる試験である。
【００９３】
本発明に係るその他の目的は、１種またはそれ以上の本発明に係る抗体および／またはペプチドを含む試験キットである。このようなキットは通常、パッケージ化された形態で、試験の成分全て、または、そのうち数種のみを含む。本発明に係る抗体および／またはペプチドは、例えば、１またはそれ以上の固相、および／または、１またはそれ以上のシグナルを発生させる系の成分に連結させることもできる。試験キットは、例えば、標準、コントロールおよびその他の試薬、例えば緩衝液、洗浄溶液、測定シグナル発生を開始させる溶液、および／または、酵素基質、キュベット、ピペット、および／または、試験の指標を含んでいてもよい。本発明に係る具体的に好ましい試験キットは、ラテックス粒子に連結させた本発明に係る抗体、および／または、本発明に係るペプチドを含む。
【００９４】
また本発明に係る抗体およびペプチドは、アフィニティークロマトグラフィーにも使用可能である。用語「アフィニティークロマトグラフィー」は、物質、具体的にはバイオポリマーの精製および単離方法を意味すると理解されることとし、これは、多くの物質は、それらに特異的な結合パートナーと、選択的な非共有結合の可逆的な結合を起こすという事実に基づく。このような方法の原理は、特異的な結合パートナーを、一般的に、不溶性マトリックス（例えば、多孔質ガラス、または、アガロース、セルロース、デキストラン、ポリマー、および、シリカゲルベースのゲル）に共有結合させ、物質を含むサンプルと接触させて置くことからなる。試験物質はマトリックスに結合した特異的な結合パートナーと特異的に相互作用するために、試験物質は固定され、保持されるが、一方で、サンプル中に含まれるその他の物質は全て、溶出によって除去される。次に、物質と特異的な結合パートナーとの非共有結合を除去するような適切な溶出物質を用いて、試験物質はマトリックスから放出される（Ｅ．Ｂｕｄｄｅｃｋｅ，１９８９，Ｇｒｕｎｄｒｉｓｓｅ  ｄｅｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｅ，Ｗａｌｔｅｒ  ｄｅ  Ｇｒｕｙｔｅｒ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ７”Ｐｒｏｔｅｉｎｅ”も参照）。
【００９５】
本発明のさらなる目的は、治療剤として用いられる本発明に係る抗体または特異的な結合パートナーである。このような治療剤は、製薬的に相溶性の滅菌注射媒体中に、本発明に係る抗体、または、本発明に係るペプチドを含む。製薬的に相溶性の滅菌注射媒体は、例えば、無菌のパイロジェンフリー溶液、例えば食塩水、またはその他の電解質溶液を意味することとし、例えば、薬物、ワクチンまたは造影剤の、静脈内、筋肉内、腹膜内または皮下投与に一般的に用いられるものである。
【００９６】
本発明のさらなる目的は、診断薬として、または、診断薬の成分としての本発明に係る抗体の使用である。
【００９７】
本発明のさらなる目的は、上述のペプチドの１種またはそれ以上が免疫化に用いられることを特徴とする、本発明に係る抗体の製造方法である。
【００９８】
また本発明に係る抗体は、天然に存在する、および／または、組換えＰｌＧＦ、および、ＶＥＧＦタンパク質、タンパク質アイソフォーム、または、それらのフラグメントの使用によっても生産することができる。
【００９９】
本発明のさらなる目的は、参照物質、標準、較正物質およびコントロールとしての、本発明に係るタンパク質、タンパク質アイソフォーム、フラグメント、分解産物生成物、相同体およびペプチドの使用である。参照物質は、較正物質、標準およびコントロールとして参照物質が用いられるような方式において確立された特性を有する材料または物質である。加えて、参照物質は、測定方法の確認や、規定値、具体的には「一般的に正しい値」の割り当てのために用いることができる。較正物質、標準およびコントロールとしての参照物質の使用、または、参照物質、もしくは、そこで述べられる「一般的に正しい値」に関する較正物質、標準およびコントロールの使用は、品質管理および品質保証において重要である。
【０１００】
非結合型および／またはキャリアー結合型を免疫化するために、免疫化抗原として用いられるペプチドを用いることができる。
【０１０１】
典型的なキャリアーとしては、例えば、タンパク質、例えばオバルブミン、アルブミン、もしくは、キーホールリンペットヘモシニアン（ＫＬＨ）、または、ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリアクリルアミド、もしくは、ポリ−ｄ−グルタミン−ｄ−リシンが挙げられる。これらのキャリアーに、例えば、カルボジイミドもしくはグルタルアルデヒドによって、または、ヘテロ二官能性試薬によっても、上記ペプチドを結合させることもでき、ヘテロ二官能性試薬はまたスペーサーとしても作用することができ、例えばＮ−マレイミド−ブチリルオキシスクシンイミドエステル（ＧＢＭＳ）である。その他の例およびカップリング方法に関しては、Ｗｏｎｇ，Ｓ．（１９９３）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｒｏｓｓ−Ｌｉｎｋｉｎｇ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎも参照。
【０１０２】
免疫化抗原は、例えばリン酸緩衝食塩水に溶解させて、イミューン・イージー（Ｉｍｍｕｎ  Ｅａｓｙ）マウスアジュバントで処理することができる。次に、このエマルジョンは、例えばウサギ、マウス、ラット、モルモット、ウマ、ロバ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリなどの動物に、例えば皮内、腹腔内および／または皮下投与することができる。また、ブースター注射（ここにおいて、免疫化抗原が不完全フロイントアジュバントで乳化されていてもよい）によって、免疫反応の強化を促進することもできる。
【０１０３】
本発明に係るポリクローナル抗体は、免疫動物の抗血清から得ることができ、さらに、例えば関連するＰｌＧＦの形態、または、免疫化抗原として用いられるペプチドが結合することができるマトリックス上でのアフィニティークロマトグラフィーによって精製することができる。
【０１０４】
本発明に係るモノクローナル抗体を作製するために、免疫動物（例えばマウスまたはウサギ）の免疫細胞と、骨髄腫細胞とを融合させて、抗体産生ハイブリドーマ細胞を作製し、続いて一般的に既知の手法によって適切なクローンを単離する［Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバーラボラトリー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ），コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ）；Ｐｅｔｅｒｓ等（１９８５）Ｍｏｎｏｋｌｏｎａｌｅ  Ａｎｔｉｋoｒｐｅｒ：Ｈｅｒｓｔｅｌｌｕｎｇ  ｕｎｄ  Ｃｈａｒａｋｔｅｒｉｓｉｅｒｕｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇも参照］。望ましいモノクローナル抗体を生産するクローンの選択は、特異的なスクリーニング方法によって行われる。この場合、細胞培養上清に放出された、例えば免疫化抗原、または、免疫化抗原のいくつかのキャリアーに対する抗体の結合特異性は、酵素免疫検査法、ラジオイムノアッセイ、および／または、ウェスタンブロッティングによってチェックされる。本発明に係る抗体を生産するハイブリドーマは、クローニングによって再生産される。続いてこのようにして得られたハイブリドーマ細胞系は、永続的なモノクローナル抗体生産に利用することができる。例えば、細胞培養上清から比較的大量の抗体を得ることができ、具体的には発酵槽または回転培養物、および腹水から得ることができる。
【０１０５】
望ましい使用目的に応じて、例えばＦａｂ−、Ｆ（ａｂ’）2-、または、Ｆａｂ’−フラグメントのような、抗体の一部のみを使用することが有利である。これらは、例えば、当業者既知の酵素的な切断方法によって作製することができる［Ｈａｒｌｏｗ＆Ｌａｎｅ（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバーラボラトリー，コールドスプリングハーバーも参照］。
【０１０６】
抗体の抗原結合部位は、Ｖ遺伝子によってコードされているいわゆる可変ドメインに位置している。従って、既知の遺伝子工学的な方法を用いれば［例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  等（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，コールドスプリングハーバーラボラトリー，コールドスプリングハーバー，第二版；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ等（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２〜５５４］、本発明に係る抗体の対応する核酸の配列も決定することができ、さらにその配列によって、それに対応するアミノ酸配列がアミノ酸配列解析からわかっていない場合、そのアミノ酸配列も決定することができる。このような解析の出発原料として、免疫動物のハイブリドーマ細胞、または、抗体産生免疫細胞を用いることができる。
【０１０７】
核酸および／またはアミノ酸配列の知識を用いて、標準的な遺伝子工学や分子生物学的な方法によって［Ｊｏｈｎｓｏｎ＆Ｃｈｉｓｗｅｌｌ（１９９３）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３：５６４〜５７１も参照］、ヒト化抗体、キメラ抗体、二重または多重特異性抗体を製造することができ、さらには「相補性決定領域」（「最小認識単位」）から誘導されたペプチド、単鎖フラグメント、および／または、機能的な融合生成物を製造することができ、例えば、ＰｌＧＦの形態の特定の特異的なエピトープ、具体的には本発明に係るペプチドに結合する組換えによって生産された抗体−酵素コンストラクトを製造することができる［Ｌａｒｒｉｃｋ＆Ｆｒｙ（１９９１）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ２：１７２〜１８９；Ｋｉｔａｎｏ等（１９８６）Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ１．２４：２８２〜２８６；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ等（１９８６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ９４：７〜１２も参照］。用語「抗体」に含まれるようなペプチドを用いて、例えば、医薬品として、または、インビボでの診断薬として投与する際の免疫原性の減少および／または活性の強化が達成でき、および／または、インビトロでの診断薬として使用するために、または、インビトロでの診断薬中で使用するための利点をもたらすことができる。また、このような抗体は、必要に応じて遺伝子工学的な方法を利用して、例えば、酵母細胞のような菌類［Ｆｉｓｃｈｅｒ  等（１９９９）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８０：８２５〜８３９；Ｈｉａｔｔ  等（１９９２）Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  １４：４９〜６４］、植物、動物および原核細胞（ＷＯ９５／２５１７２も参照）、ならびに、単離したヒト細胞中で生産させることができる。
【０１０８】
また、本発明のさらなる目的は、本発明に係る抗体を生産する菌類、動物、植物または原核細胞、および、単離したヒト細胞である。本発明の好ましい実施態様は、本発明に係る抗体を生産するハイブリドーマ細胞系を含む。
【０１０９】
本発明のそれぞれの形態を説明するために、以下で説明する実施例を一例として示す。
【実施例】
【０１１０】
実施例１：ｆＰｌＧＦに特異的なモノクローナル抗体の製造
ａ）マウスの免疫化
ＢＡＬＢ／ｃマウスにそれぞれ、イミューン・イージー・マウスアジュバント（キアゲン社（Ｑｉａｇｅｎ  ＧｍｂＨ），ドイツ）で腹腔内に免疫化抗原（ＫＬＨに結合したＬＲＣＴＧＣＣＧＤＥＮＬＨＣＶＰＶＥＴ（ＩＡＮ２）を含むペプチド）２０μｇを投与することによって免疫化した。ＩＡＮ２を、固相合成によって、一般的に既知の方法に従って合成した。４および８週間後に、それぞれの免疫化抗原２０μｇを含み、アジュバントを含まないブースター注射を行った。融合前の最後の３日間、これらのマウスに、各免疫化抗原１０μｇを静脈内にブースター投与した。
【０１１１】
ｂ）融合
マウスをＣＯ2吸入によって殺した後、脾臓を取り出して、無血清ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；ＰＡＮバイオテク社（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ），ドイツ）中で単一の細胞懸濁液を製造した。この細胞を遠心分離（６５２×ｇ）し、ＤＭＥＭで２回洗浄した。次に、トリパンブルー染色によってこの細胞の数を測定した。約１０8個の脾臓細胞に対して２×１０7個の骨髄腫細胞（Ｓｐ２／０）を添加した。遠心分離（３６０×ｇ）の後、上清を捨て、細胞ペレットに、ポリエチレングリコール溶液（ＰＥＧ  ４０００、メルク・ユーロラボ社（Ｍｅｒｃｋ  Ｅｕｒｏｌａｂ  ＧｍｂＨ），ドイツ；ＤＭＥＭ中で約５０％）１ｍｌを添加して再懸濁した後、３７℃で１分間インキュベートした。次に、ＤＭＥＭ約１０ｍｌを添加し、この混合物を室温で２〜４分間インキュベートした。融合した細胞を遠心分離（３２６×ｇ）で沈殿させ、ペレットを、ＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清（バイオホイッタカー・ヨーロッパ（Ｂｉｏ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ  Ｅｕｒｏｐｅ），ベルギー）＋ＨＡＴ培地（ＣＣプロ社（ＣＣ  Ｐｒｏ  ＧｍｂＨ），ドイツ）に再懸濁し、２４ウェルの細胞培養プレート（コーニング・コースター社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ｃｏｓｔａｒ  ＧｍｂＨ），ドイツ）に充填した。およその細胞濃度は、５×１０4-5×１０6細胞／ウェルであった。
２〜３週間後に、形成された細胞のコロニー（ハイブリッド）を取り出して、新しい培養プレートに移した。
【０１１２】
ｃ）スクリーニング
第一の試験工程で、アミノ酸配列ＬＲＣＴＧＣＣＧＤＥＮＬＨＣＶＰＶＥＴを含むペプチドでコーティングされたマイクロタイタープレート（ヌンク社（Ｎｕｎｃ  ＧｍｂＨ＆Ｃｏ．）ＫＧ，ドイツ）によって細胞培養物に放出された抗体の特異性を試験した。
マイクロタイタープレートの各ウェルに、細胞培養上清（１：２に希釈）１００μｌをピペットで取って入れ、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。プレートを、洗浄溶液ＰＯＤ（ＯＳＥＷ；デイド・ベーリング・マールブルグ社（Ｄａｄｅ  Ｂｅｈｒｉｎｇ  Ｍａｒｂｕｒｇ  ＧｍｂＨ），ドイツ）で２回洗浄し、次に、各ウェルに、抗マウスＩｇＧ／Ｆ（ａｂ’）２ＰＯＤ結合体（デイド・ベーリング・マールブルグ社，ドイツ）１００μｌを充填し、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。プレートをさらに２回洗浄した後、各ウェルに、クロモゲンＴＭＢ−溶液（デイド・ベーリング・マールブルグ社，ドイツ）１００μｌを充填し、＋１５〜＋２５℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベートした後に、各ウェルに、停止溶液ＰＯＤ（デイド・ベーリング・マールブルグ社，ドイツ）１００μｌを充填し、ＢＥＰＩＩ（ベーリング−ＥＬＩＳＡプロセッサーＩＩ（Ｂｅｈｒｉｎｇ−ＥＬＩＳＡ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ  ＩＩ），デイド・ベーリング・マールブルグ社，ドイツ）で、４５０ｎｍでマイクロタイタープレートを評価した。
第二の試験工程で、上述のように単離した後に、ハイブリッドを同じ試験様式で再度試験した。
【０１１３】
ｄ）クローニング
ｆＰｌＧＦに特異的な抗体を生産するハイブリッドの個々の細胞を、マイクロマニピュレータ（ライツ・メステクニーク社（Ｌｅｉｔｚ  Ｍｅｓｓｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨ），ドイツ）を用いてクローニングした。これらのクローンの培養上清をｇ）で説明されているようにして精製し、ｅ）、ｈ）およびｉ）で説明されているようにしてより詳細に特徴付けた。
【０１１４】
ｅ）抗体クラスの決定
ベーリンガー・マンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ  Ｃｏ．，ドイツ）製のアイソストリップTM  マウスモノクローナル抗体アイソタイプ分類キット（ＩｓｏＳｔｒｉｐTM  Ｍｏｕｓｅ  Ｍｏｎｏｃ１ｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｓｏｔｙｐｉｎｇ  Ｋｉｔ）を用いて、ｆＰｌＧＦに対する抗体のサブクラスを決定した。
【０１１５】
ｆ）抗体の生産
大量の抗体を生産するために、関連する細胞クローンをローラーボトル（コーニング・コースター社，ドイツ）に移し、＋３７℃で望ましい最終容量に増量した。それに続いて、回転培養による懸濁液を、０.２２μｍでろ過して、細胞を除去した。この無細胞抗体溶液をウルトラフィルター（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｅｒ；分離限界は３０,０００ダルトン）で濃縮し、次に精製した。
【０１１６】
ｇ）抗体の精製
得られた抗体溶液を、０.１４Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８.６）で再度緩衝化し、ｒプロテインＡセファロースTMファストフロー（ｒＰｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ＳｅｐｈａｒｏｓｅTMＦａｓｔ  Ｆｌｏｗ；アマシャム・バイオサイエンス・ヨーロッパ社（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｅｕｒｏｐｅ  ＧｍｂＨ），ドイツ）で充填されたクロマトグラフィーカラムにアプライした（精製しようとする抗体１０ｍｇに対して、ｒプロテインＡセファロースTMファストフローは、１ｍｌ用いられた）。カラムを０.１４Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ８.６）で洗浄することによって、全ての結合していない成分を除去した。結合した抗体をカラムから０.１Ｍのクエン酸（ｐＨ３.０）で溶出させ、０.０５Ｍ酢酸ナトリウム＋０.５ＭのＮａＣｌ＋０.０５Ｍのトリス＋０.０１％アジ化ナトリウム（ｐＨ７.０）に対して透析した。
【０１１７】
ｈ）ｆＰｌＧＦサンドイッチＥＬＩＳＡに適切な抗体の選択
モノクローナル抗ｆＰｌＧＦ抗体と、ｆＰｌＧＦに特異的な  エピトープ（例えば、アミノ酸配列ＬＲＣＴＧＣＣＧＤＥＮＬＨＣＶＰＶＥＴを含むペプチド）との反応を調査した：
ｆＰｌＧＦとの反応：固相として、ｆＰｌＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレートが用いられた。この上で、培養上清からの抗ｆＰｌＧＦ抗体をインキュベートした。洗浄工程の後、ウサギ由来のポリクローナル抗マウス抗体と、酵素ペルオキシダーゼとからなる結合体を介して抗体のＰｌＧＦへの結合を検出し、続いて色素反応を行った。
【０１１８】
ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ複合体との反応：
固相として、ｆＰｌＧＦでコーティングされたマイクロタイタープレートが用いられた。この中で、ｓＦｌｔ−１をインキュベートした。この反応に用いられたｓＦｌｔ−１は、Ｒ＆Ｄシステムズ製の「組換えヒトＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）／Ｆｃキメラ」（カタログ番号：３２１−ＦＬまたは３２１−ＦＬ／ＣＦ）であった。洗浄工程の後、培養上清からの抗ｆＰｌＧＦ抗体をインキュベートした。洗浄工程の後、結合部位は主にｓＦｌｔ−１で占められているため、特異的な抗ｆＰｌＧＦ抗体の結合は、検出されないか、またはわずかであると予想される。また、ｆＰｌＧＦに非特異的な抗体も、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ複合体、すなわちｇＰｌＧＦにより多く結合した。洗浄工程の後、ウサギ由来のポリクローナル抗マウス抗体と、酵素ペルオキシダーゼとからなる結合体によって、この非特異的抗体の結合を検出し、続いて色素反応を行った。
【０１１９】
この試験系において、ｆＰｌＧＦに特異的な抗体は、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ複合体との反応において色素反応を示さないか、または、ｆＰｌＧＦに特異的なペプチドとの反応の場合よりも著しく少ない色素反応を示す抗体である。
【０１２０】
このようにしてｆＰｌＧＦに特異的な抗体が選択された。当業者既知の手法（例えばナカネ結合）でホースラディッシュペルオキシダーゼに結合させたｆＰｌＧＦに特異的な結合体抗体を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて固相抗体として使用するための、これらの抗体の適性を調査した。
【０１２１】
実施例２ａ）で説明されているようにしてサンドイッチＥＬＩＳＡで上記適性をチェックした。適性に関する必須の決定基準は、ｆＰｌＧＦと、ｓＦｌｔ−１／ＰｌＧＦ複合体との明確な識別である。さらなる基準は、より低い検出限界と、検量線の直線性である。
【０１２２】
実施例２：ｆＰｌＧＦに特異的なモノクローナル抗体の製造
ａ）マウスの免疫化
ＢＡＬＢ／ｃマウスはそれぞれ、イミューン・イージー・マウスアジュバント（キアゲン社，ドイツ）で免疫化抗原（ＫＬＨに結合したＧＣＣＧＤＥＮＬＨＫを含むペプチド（ＩＡＮ２−１−１Ｋ））２０μｇを腹腔内投与して免疫化した。ＩＡＮ２−１−１Ｋを、固相合成によって、一般的に既知の方法に従って合成した。カラムクロマトグラフィー（カラム：メルク（Ｍｅｒｃｋ）２５０×４ｍｍ）によってＩＡＮ２−１−１Ｋの純度をチェックした。この目的のために、緩衝液Ａとして０.１％のＴＦＡ／水、および、緩衝液Ｂとして０.０８％  ＦＦＡ／アセトニトリルを用いた。流速は０.８ｍｌとした。２２０ｎｍで検出を実行した。さらに、マトリックス支援レーザー脱離イオン化マススペクトロメトリー（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）を行った。１０７５ｍ／ｚにおいて主要なピークがみられた。４および８週間後、それぞれの免疫化抗原２０μｇを含み、アジュバントを含まないブースター注射を行った。融合の前の最後の３日間、マウスに、それぞれの免疫化抗原１０μｇをブースター投与した。
実施例１と同様に、融合ｂ）、クローニングｄ）、抗体クラスの決定ｅ）、抗体の生産ｆ）、抗体の精製ｇ）、および、ｆＰｌＧＦサンドイッチＥＬＩＳＡに適した抗体の選択ｈ）を行った。スクリーニングｃ）に関しても、実施例１と同じ手法に従ったが、第一の試験工程で細胞培養に放出された抗体の特異性を、アミノ酸配列ＧＣＣＧＤＥＮＬＨＫを含むペプチド（ＩＡＮ：２−１−１Ｋ）でコーティングされたマイクロタイタープレート（ヌンク社ＫＧ，ドイツ）によって試験したことを除く。
【０１２３】
実施例３：サンプル中でのfＰｌＧＦの検出
ａ）試験方法Ａ
ペルオキシダーゼ接合抗ＰｌＧＦ抗体は、サンドイッチの原理に従って、酵素免疫検査法において本発明に係るモノクローナル抗ｆＰｌＧＦ抗体と組み合わせて用いられた。
第一のインキュベートの際に、サンプル中に含まれるｆＰｌＧＦ（存在する場合）は、マイクロタイトレーションプレートのウェルの表面に固定された、本発明に係るｆＰｌＧＦに対して向けられた抗体に結合する。ウェルを洗浄し、次に、第二の結合反応で、ＰＩＧＦのあらゆるエピトープに対して向けられたペルオキシダーゼ接合抗ＰｌＧＦ抗体（ただしＰｌＧＦの受容体に結合するエピトープは除く）が用いられた。この試験方法では、特異的なペルオキシダーゼ接合抗ＰｌＧＦ抗体を用いて、原則的に特定のＰｌＧＦアイソフォームの存在も検出することができる。例えば、ＰｌＧＦ−１などを検出するために、ＰｌＧＦ−１に特異的な抗体を用いることができる。原則的に、異なるＰｌＧＦアイソフォームの存在の検出は、異なる特異的な抗体を用いる可能性がある。過量の酵素に結合した抗体を洗浄した。次に、ウェル中の結合した酵素の活性を決定した。希硫酸の添加によって、過酸化水素およびテトラメチルベンジジンの酵素反応を止めた。ｆＰｌＧＦ抗原濃度に比例する色の強度を、光分析によって４５０ｎｍの波長で測定し、カットオフによって定性的に評価するか、または、標準に基づく検量線に基づき定量した。
このような本発明に係るサンドイッチイムノアッセイは、たった１回の試験手順で特異的にｆＰｌＧＦを検出する。
【０１２４】
ｂ）試験方法Ｂ
本発明に係るペルオキシダーゼ接合されたモノクローナル抗ｆＰｌＧＦ抗体は、酵素免疫検査法において、サンドイッチの原理に従って本発明に係るモノクローナル抗ｆＰｌＧＦ抗体と組み合わせて用いられる。
試験方法Ａと同様に、第一のインキュベートの際に、サンプル中に含まれるｆＰｌＧＦ（存在する場合）は、マイクロタイトレーションプレートのウェルの表面に固定された、本発明に係るｆＰｌＧＦに対して向けられた抗体に結合する。ウェルを洗浄し、次に、第二の結合反応でペルオキシダーゼ接合抗ｆＰｌＧＦ抗体を用いた。過量の酵素に結合した抗体を洗浄した。次に、ウェル中の結合した酵素の活性を決定した。希硫酸の添加によって、過酸化水素およびテトラメチルベンジジンの酵素反応を止めた。ｆＰｌＧＦ抗原濃度に比例する色の強度を、光分析によって４５０ｎｍの波長で測定し、カットオフによって定性的に評価するか、または、標準に基づく検量線に基づき定量した。
【０１２５】
このような本発明に係るサンドイッチイムノアッセイは、たった１回の試験手順で特異的にｆＰｌＧＦを検出する。ｆＰｌＧＦは一般的にホモ二量体として（例えばｆＰｌＧＦ−１のホモ二量体として）存在し、受容体は、ホモ二量体の両方のポールで結合することができるため、試験方法Ｂが特に好ましい。試験方法Ｂにおいて、ポールのどちらにも結合パートナーを有さないｆＰｌＧＦが、優勢に決定されるように、１種の固定された抗ｆＰｌＧＦ抗体と、１種のペルオキシダーゼ接合抗ｆＰｌＧＦ抗体とを利用したサンドイッチの原理による酵素免疫検査法が用いられた。
【０１２６】
説明した実施例および試験方法によれば、本発明に係るその他の結合パートナー（具体的には抗体）の特異性も、同じように決定され、診断で用いることができる。
【０１２７】
実施例４：その他のfＰｌＧＦに特異的なモノクローナル抗体の製造  
実施例１に従って、以下のモノクローナル抗体を選択し、それらが遊離の、および、結合型ＰｌＧＦの形態を認識するかどうかについて調査した。免疫化には、以下の表に示される免疫化抗原が用いられた。Ｒ＆Ｄシステムズ製の抗体「ＭＡＢ２６４」は最先端の抗体であり、本発明において製造されたものではない。
【０１２８】
【表１】
2008540477.tif 000015
【０１２９】
表に記載の本発明に係るモノクローナル抗体を生産する細胞培養物、または、比較抗体を生産する細胞培養物を、ブダペスト条約に従って、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ，マシェローダーヴェーク１ｂ，３８１２４ブラウンシュバイク，ドイツ連邦共和国）に、国際寄託当局によって割り当てられた以下の登録番号で寄託した：
細胞培養物２００５−８１−０５＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７６４
細胞培養物２００５−８１−０１０＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７６５
細胞培養物２００５−６４／０２６＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７６６
細胞培養物２００５−６３／０２０＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７６７
細胞培養物２００５−６１／０１６＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７６８
細胞培養物２００５−５４／０４＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７６９
細胞培養物２００５−１６４／０５４＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７０
細胞培養物２００５−１６４／０４２＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７１
細胞培養物２００５−１６４／０３８＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７２
細胞培養物２００５−１６４／０１２＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７３
細胞培養物２００５−１２１／０６＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７４
細胞培養物２００５−１２０／０３＝ＤＳＭ  ＡＣＣ２７７５。
【０１３０】
前述の細胞培養物全てについて、寄託日は２００６年３月２３日である。
【０１３１】
実施例５：本発明に係る抗体および比較抗体と組換え（遊離の）ＰｌＧＦとの反応性
マイクロタイトレーションプレート（ヌンク，タイプＢ）を、マウスＩｇＧ／Ｆ（ａｂ）2（デイド・ベーリング・マールブルグ社，ドイツ）に対してポリクローナル抗体でコーティングした；コーティング濃度は、１０μｇ／ｍｌ〜１.５μｇ／ウェルである。
【０１３２】
調査しようとするモノクローナル抗体１００μｌを、マイクロタイトレーションプレートのウェルに、ａ）１.０μｇ／ｍｌ、または、ｂ）０.１μｇ／ｍｌの濃度でピペットで取って入れ、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートを、洗浄溶液ＰＯＤ（製品番号：ＯＳＥＷ；デイド・ベーリング・マールブルグ，ドイツ）で３回洗浄した後、組換えＰｌＧＦ（Ｒ＆Ｄシステムズ、カタログ番号：２６４−ＰＧ／ＣＦ）の溶液１００μｌを、０.１μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに添加し、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートを、洗浄溶液ＰＯＤで３回洗浄した後、抗ヒト−ＰｌＧＦ−ＰＯＤ結合体（従来の結合方法によって「ヒトＰｌＧＦの親和性によって精製したポリクローナル抗体」から生産された，製品番号：ＡＦ−２６４−ＰＢ／Ｒ＆Ｄシステムズ）１００μｌを各ウェルに充填し、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートをさらに３回洗浄した後、クロモゲンＴＭＢ溶液（製品番号：ＯＵＶＦ，デイド・ベーリング・マールブルグ社，ドイツ）１００μｌを各ウェルに充填し、＋１５〜＋２５℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベートした後に、停止溶液ＰＯＤ（製品番号：ＯＳＦＡ，デイド・ベーリング・マールブルグ社，ドイツ）１００μｌを各ウェルに充填し、マイクロタイトレーションプレートを、ＢＥＰＩＩ（デイド・ベーリング・マールブルグ社，ドイツ）で４５０ｎｍで評価した。表１に、その結果を示した。
【０１３３】
【表２】
2008540477.tif 000016
【０１３４】
実施例６：本発明に係る抗体、比較抗体および最先端の抗体と、ＰｌＧＦ／ｓＦｌｔ−１複合体（ｇＰｌＧＦ）との反応性
マイクロタイトレーションプレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ）、タイプＢ）を、ヒトＩｇＧ／Ｆｃに対するポリクローナル抗体（デイド・ベーリング・マールブルグ社，ドイツ）でコーティングした。コーティング濃度は、２.５μｌ／ｍｌ〜０.３７６μｇ／ウェルである。
組換えヒトＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）／Ｆｃキメラ：Ｒ＆Ｄシステムズ，カタログ番号：３２１−ＦＬ／ＣＦ）の溶液１００μｌを、１μｇ／ｍｌの濃度でマイクロタイトレーションプレートの各ウェルに入れ、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートを、洗浄溶液ＰＯＤで３回洗浄した後（実施例５を参照）、ＰｌＧＦ／ｓＦｌｔ−１複合体を製造するために、組換えＰｌＧＦ（実施例５を参照）の溶液１００μｌを、１μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルに添加し、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートを、洗浄溶液ＰＯＤで３回洗浄した後、調査しようとするモノクローナル抗体１００μｌを、ａ）１μｇ／ｍｌ、または、ｂ）０.１μｇ／ｍｌの濃度で各ウェルにピペットで取って入れ、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートを、洗浄溶液ＰＯＤで３回洗浄した後、抗マウスＩｇＧ／Ｆ（ａｂ）2−ＰＯＤ結合体（デイド・ベーリング・マールブルグ社，ドイツ）１００μｌを各ウェルに充填し、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートをさらに３回洗浄した後、クロモゲンＴＭＢ溶液（実施例５を参照）１００μｇを各ウェルに充填し、＋１５〜＋２５℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベートした後に、停止溶液ＰＯＤ（実施例５を参照）１００μｌを各ウェルに充填し、マイクロタイトレーションプレートを、ＢＥＰＩＩで４５０ｎｍで評価した（実施例５を参照）。表２に、その結果を示した。
【０１３５】
【表３】
2008540477.tif 000017
【０１３６】
本発明に係る抗体は、形成されたＰｌＧＦ／ｓＦｌｔ−１複合体との反応性を示さなかったが、それに対して比較抗体および最先端の抗体は、明確な反応性を示した。
【０１３７】
実施例７：エピトープマッピング
ヒトＰｌＧＦの配列から誘導されたオーバーラップするペプチドのスキャン（１３−ｍｅｒのペプチド、１１個のアミノ酸のオーバーラップ）を、ＳＰＯＴ合成技術によって製造した。この方法は、Ｗｅｎｓｃｈｕｈ，Ｈ．等（２０００）“Ｃｏｈｅｒｅｎｔ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｕｐｐｏｒｔｓ  ｆｏｒ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｍｉｃｒｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｏｆ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ”，Ｂｉｏｐｏｌｙｍｅｒｓ（Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ），５５：１８８〜２０６で説明されている。このようなペプチドを、セルロースメンブレン上に既定された順番で（「ペプチドアレイ」として）、セルロースメンブレンに共有結合するように段階的に合成した。ペプチドの免疫反応性をチェックするための結合試験を、アレイ上で直接行った。そのためのインキュベートプロトコールは以下の通りである：
・ＴＢＳ緩衝液（ｐＨ８.０）中で平衡させ、
・ブロッキング緩衝液（ｐＨ８.０）中で２時間、
・ブロッキング緩衝液（ｐＨ８.０）中で２時間、抗体をインキュベートし（３μｇ／ｍｌ）、
・ＴＢＳ（０.０５％のトゥイーン２０（Ｔｗｅｅｎ  ２０））で洗浄し、
・ブロッキング緩衝液（ｐＨ８.０）中で抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤと共に２時間インキュベートし、
・ＴＢＳ（０.０５％のトゥイーン２０）で３×５分間洗浄し、
・化学発光（Ｌｕｍｉ−Ｉｍａｇｅｒ，ロシュ・ダイアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ））で検出する。
【０１３８】
結果：
本発明に係るグループ１からの２種の抗体０５−８１−０５および０５−８１−０１０は、以下の配列セグメントと反応した：
１．ＥＫＭＫＰＥＲＣＧＤＡＶＰ、
２．ＭＫＰＥＲＣＧＤＡＶＰＲＲ。
【０１３９】
認識された配列は、ＰｌＧＦ−１のＣ末端ドメインと同一である。
【０１４０】
固相上の試験用のモノクローナル抗体を用いた追加の試験：
以下の実施例８および９では、グループ１のより高い親和性の抗体だけを、最先端の抗体および比較抗体と比較して試験した。
【０１４１】
実施例８：ＰｌＧＦとの反応
マイクロタイトレーションプレート（実施例５を参照）を、本発明に係るモノクローナル抗体、比較抗体、および、最先端のモノクローナル抗体でコーティングした。コーティング濃度は、３μｇ／ｍｌ〜０.４５μｇ／ウェルである。
５０ｎｇ／ｍ１の組換えＰｌＧＦ（実施例５を参照）から開始した一連の幾何級数的な希釈液１００μｌを、マイクロタイトレーションプレートのウェルにピペットで取って入れ、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。プレートを洗浄溶液ＰＯＤ（実施例５を参照）で３回洗浄した後に、抗ヒトＰｌＧＦ−ＰＯＤ結合体（実施例５を参照）１００μｌを各ウェルに充填し、＋１５〜＋２５℃で１.５時間インキュベートした。プレートをさらに３回洗浄した後に、クロモゲンＴＭＢ−溶液（実施例５を参照）１００μｌを各ウェルに充填し、＋１５〜＋２５℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベートした後に、停止溶液ＰＯＤ（実施例５を参照）１００μｌを各ウェルに充填し、マイクロタイトレーションプレートを、ＢＥＰＩＩで４５０ｎｍで評価した（実施例５を参照）。表３に、その結果を示した。
【０１４２】
【表４】
2008540477.tif 000018
【０１４３】
実施例９：本発明に係る抗体、比較抗体および最先端の抗体と、ＰｌＧＦ／ｓＦｌｔ−１複合体（ｇＰｌＧＦ）との反応性
マイクロタイトレーションプレート（実施例５を参照）を、本発明に係るモノクローナル抗体、比較抗体および最先端のモノクローナル抗体でコーティングした。コーティング濃度は、３μｇ／ｍｌ〜０.４５μｇ／ウェルである。
反応容器中で、２５ｎｇ／ｍｌの組換えＰｌＧＦから開始した一連の幾何級数的な希釈液を製造した。組換えヒトＶＥＧＦＲ１（Ｆｌｔ−１）／Ｆｃキメラ（実施例６を参照）を、４００ｎｇ／ｍｌの濃度で、各希釈液に添加し、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。次に、１００μｌを、それぞれのマイクロタイトレーションプレートのウェルにピペットで取って入れ、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートを洗浄溶液ＰＯＤ（実施例５を参照）で４回洗浄した後、抗ヒトＶＥＧＦＲ１−ＰＯＤ結合体（Ｒ＆Ｄシステムズ，クアンティカイン（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ）ヒトＶＥＧＦＲ１イムノアッセイからの一部８９１０９６；ＤＶＲ１００Ｂ）１００μｌを各ウェルに充填し、＋１５〜＋２５℃で１時間インキュベートした。マイクロタイトレーションプレートをさらに３回洗浄した後、クロモゲンＴＭＢ溶液（実施例５を参照）１００μｌを各ウェルに充填し、＋１５〜＋２５℃でさらに３０分間インキュベートした。インキュベートした後に、停止溶液ＰＯＤ（実施例５を参照）１００μｌを各ウェルに充填し、マイクロタイトレーションプレートを、ＢＥＰＩＩで４５０ｎｍで評価した（実施例５を参照）。表４に、その結果を示した。
【０１４４】
【表５】
2008540477.tif 000019
【０１４５】
本発明に係る抗体は、ＰｌＧＦ／ｓＦｌｔ−１複合体を、極めて弱くしか認識しないか、または、全く認識しない。このような抗体は、遊離ＰｌＧＦに特異的であるが、比較抗体および最先端の抗体は明確な反応を示し、すなわち遊離ＰｌＧＦに特異的ではない。
【０１４６】
本発明はまた、以下の特許請求の範囲で、本発明を限定することなく明確に説明される。
【配列表】
2008540477000001.app
【国際調査報告】
2008540477.tif 000021
2008540477.tif 000022
2008540477.tif 000023
2008540477.tif 000024
2008540477.tif 000025
2008540477.tif 000026
2008540477.tif 000027
2008540477.tif 000028
2008540477.tif 000029
2008540477.tif 000030