(57)【要約】  本発明は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）の治療用の式（Ｉ）又は（ＩＩ）のＰＰＡＲ作動薬の使用を記載する。  【化１】2008524129.tif 000011
2008524129.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）の治療用薬剤の製造のための、式（Ｉ）：
【化１】
2008524129.tif 000008
の化合物又はその薬学的に許容される塩又は生理的機能性誘導体の使用。
【請求項２】
うっ血性心不全（ＣＨＦ）の治療用薬剤の製造のための、式（ＩＩ）：
【化２】
2008524129.tif 000009
の化合物又はその薬学的に許容される塩又は生理的機能性誘導体の使用。
【請求項３】
化合物（ＩＩ）が式（ＩＩＩ）：
【化３】
2008524129.tif 000010
の化合物によって特徴付けられる、請求項２に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、うっ血性心不全の治療のためのＰＰＡＲ作動薬の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
うっ血性心不全は、肺に液体の貯留を引き起こす、心臓の役に立たないポンプ機能がある破壊的な疾患である。典型的な症状としては、息切れ、平らに横たわったときの呼吸困難及び脚や足首の腫脹を包含する。そのような体力の進行性障害は、究極的には死に至る。心不全には多くの原因があるが、最も頻度が高いのは、心筋梗塞（全ての原因の内で約６０パーセント）、慢性高血圧（約２５％）、遺伝的素質（１０％）及び心筋症、又はこれら因子の組合せである。
【０００３】
患者においては、ＣＨＦの重症度は、ニューヨーク心臓協会（ＮＹＨＡ）によって開発された分類法に基づき、臨床症状に従って分類されている。患者の体力が、ＮＹＨＡ・Ｉ（症状を訴えない）、ＮＹＨＡ・ＩＩ（中程度の動作中に症状を訴える）、ＮＹＨＡ／ＩＩＩ（軽度の動作中に症状を訴える）、又はＮＹＨＡ・ＩＶ（安静時に症状を訴える）への分類を決定づける。
【０００４】
ＣＨＦの進行を遅らせるＣＨＦの現行の治療は、大幅に生存を延長する。それにもかかわらず、いずれのＮＹＨＡの病期にあっても、全般的な死亡率は高く、主としてＮＹＨＡ・ＩＩ期又はＩＩＩ期の患者において実行された、近年の大規模治験で年間平均１５パーセントであった。死亡率改善が証明されて、現在承認されているＣＨＦの医薬品の全て（例えば、利尿薬、ＡＣＥ阻害剤、β遮断薬）に共通する不都合な点は、血圧を低下させる影響である。併用療法は多くの患者の血圧が大巾に低下するので、しばしば不可能である。結果として、新しい作用機作を標的とする、代替治療戦略が、ＣＨＦの薬物療法の更なる進歩のために緊急に必要とされている。
【０００５】
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）は、あるクラスの核内ホルモン受容体を表し、その中の２つ（ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγ）は、心筋及び血管を含む多くの組織で発現されている。ＰＰＡＲの活性化によって、種々の遺伝子の発現が、次いで、タンパク質の産生が導かれる。ＰＰＡＲγ活性化剤（例えば、ロシグリタゾン）は、インスリン感受性の改善及びインスリン抵抗性の顕性糖尿病への進行を遅らせるという効果に基づいて、ＩＩ型糖尿病の治療に対して承認されている（Malinowski and Bolesta Clin. Therapeutics (2000), 22, 1151-1168; Leff and Reed, Curr. Med. Chem. Immunology, Endocrine & Metabolic Agents  (2002), 2, 33-47）。更に、ある種のＰＰＡＲα活性化剤、フィブラート、は、血中コレステロールレベルを減じる能力があるので、臨床で使用されている（Sacks-FM, Am. J. Cardiol. (2001), 88(12A), 14N-18N））。フィブラートとは構造的に異なり、より強力な新規ＰＰＡＲα活性化剤は、脂質障害及び糖尿病に対する臨床開発が行われている（Inoue and Katayama, Current Drug Targets: Cardiovascular & Haematological Disorders (2004), 4, 35-52）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
不全心筋では、代謝障害が脂肪酸からグルコース酸化へのシフトと平行している。この作用は、心筋におけるエネルギー生成の効率を減じ、代わりに、ＣＨＦにおける収縮機能の喪失に寄与することになる。高齢ラットモデルにおいて、身体トレーニングによるＣＨＦの改善は、心筋におけるＰＰＡＲαの発現の正常化と平行している。
【０００７】
それらの代謝効果とは別に、心臓に関してＰＰＡＲ活性化剤の直接的効果については殆ど知られていない。インビトロの単離された新生児心筋細胞において、ＰＰＡＲα活性化剤のフェノフィブラート及びＷＹ１４,６４３の両者、並びにＰＰＡＲγ活性化剤のロシグリタゾンは、エンドセリン−１誘発肥大を予防することができた。同様に、ＰＰＡＲγ活性化剤は、単離した心筋細胞での機械的ひずみによって誘発された肥大を減少した。動脈性高血圧のモデルにおいて、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγ活性化は、両者とも、心臓線維症を減少した。急性心筋虚血及び再潅流のマウスモデルにおいて、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγ活性化は、心筋梗塞面積を減少することが示された。心筋梗塞後の慢性相において、ＰＰＡＲγ活性化剤は、心筋リモデリング及び心不全症状を改善することを示した（Lianget al. Endocrinology 2003, 144: 4187-4194）。他方では、心不全は、ＩＩ型糖尿病の患者では、ＰＰＡＲγ作動薬によって悪化するであろうという証拠がある。
【０００８】
それ故、ＣＨＦにおけるＰＰＡＲγ活性化の利点は、議論の余地があるが、ＣＨＦにおける選択的ＰＰＡＲα活性化の役割についてはデータが全くない。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の１つの実施態様は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）の治療のための薬剤を製造するための、式（Ｉ）：
【化１】
2008524129.tif 000003
の化合物又はその薬学的に許容される塩又は生理学的機能性誘導体の使用である。
【００１０】
更なる実施態様は、うっ血性心不全（ＣＨＦ）の治療のための薬剤を製造するための、式（ＩＩ）：
【化２】
2008524129.tif 000004
の化合物又はその薬学的に許容される塩又は生理学的機能性誘導体の使用である。
【００１１】
式（ＩＩ）の好ましい化合物は、式（ＩＩＩ）：
【化３】
2008524129.tif 000005
の化合物である。
【００１２】
式（Ｉ）の化合物は、国際特許出願第２００４／０８５３７７号、実施例５に従って製造された。式（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）の化合物は、国際特許出願第０３／０２０２６９号、実施例Ｉ及びＩＩに従って製造された。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１３】
薬学的に許容される塩は、出発物質又は塩基化合物と比較して、より大きな水への溶解性の故に、医薬としての適用に好適である。これらの塩は、薬学的に許容される陰イオン又は陽イオンを有していなければならない。本発明の化合物の好適な薬学的に許容される酸付加塩は、塩酸、臭化水素酸、リン酸、メタリン酸、硝酸、硫酸のような無機酸の塩、及び、例えば、酢酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、クエン酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルコン酸、グリコール酸、イセチオン酸、乳酸、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、コハク酸、ｐ−トルエンスルホン酸及び酒石酸のような有機酸の塩である。好適な薬学的に許容される塩基性塩は、アンモニウム塩、（ナトリウム塩及びカリウム塩のような）アルカリ金属塩、及び（マグネシウム塩及びカルシウム塩のような）アルカリ土類金属塩である。
【００１４】
本明細書で使用される用語「生理学的機能性誘導体」は、例えば、ヒトのような哺乳類に投与した場合、例えば、式（Ｉ）、（ＩＩ）若しくは（ＩＩＩ）の化合物又はその活性代謝物を（直接的に、又は間接的に）形成することができるエステルのような、本発明の式（Ｉ）の化合物の生理学的に容認される誘導体のいずれをも表している。生理学的機能性誘導体は、又、例えば、H. OkadaらChem. Pharm. Bull. 1994, 42, 57-61に記載されているように、本発明の化合物のプロドラッグを包含する。そのようなプロドラッグは、本発明の化合物にインビボにおいて代謝され得る。これらのプロドラッグは、それ自体、活性を有していても、いなくてもよい。
【００１５】
本発明の化合物は、種々の多型体、例えば、アモルファス及び結晶性多型体として存在してもよい。本発明の化合物の全ての多型体は、本発明の範囲内に属し、本発明の更なる態様である。
【００１６】
所望の生物学的効果を達成するのに必要な式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物の量は、多くの因子、例えば、選択された具体的な化合物、使用の意図、投与様式、及び患者の臨床状態に依存する。一日投与量は、一般的に、体重１ｋｇにつき１日当たり約０.３ｍｇから１００ｍｇ（典型的には、約３ｍｇから５０ｍｇ）の範囲、例えば約３〜１０ｍｇ／ｋｇ／日である。静脈内投与量は、例えば、約０.３ｍｇから１.０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよく、体重１ｋｇ当たり、及び１分当たり約１０ｎｇから１００ｎｇの注入として、好適に投与することができる。これらの目的に好適な注入溶液は、例えば、１ミリリットル当たり約０.１ｎｇから１０ｍｇ、典型的には、約１ｎｇから１０ｍｇ含有していてもよい。単回投与量は、例えば、活性化合物の約１ｍｇから１０ｇを含有していてもよい。それ故、注射用アンプルは、例えば、約１ｍｇから１００ｍｇを含有していてもよく、そして、例えばカプセル又は錠剤のような経口的に投与することができる単回投与製剤は、例えば、約１.０から１０００ｍｇ、典型的には、約１０から６００ｍｇを含有していてもよい。上に挙げた状態の治療のためには、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物は、化合物それ自体として使用してもよいが、許容される担体との医薬組成物の形態であってもよい。担体は、それが組成物の他の成分と適合性があって、患者の健康に有害でないという意味において、許容されるものである。担体は、固体若しくは液体又はその両者であってもよく、しばしば単回投与用として、例えば、錠剤として、上記化合物と共に処方され、ここで、上記錠剤は、約０.０５から９５重量％の活性化合物を含有してもよい。その他の医薬として活性な物質も、式Ｉの別の化合物を含めて、同様に存在し得る。本発明の医薬組成物は、公知の薬学的方法の１つによって製造することができ、その方法は、本質的に、上記成分を薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤と混合することから成ってもよい。
【００１７】
本発明の医薬組成物は、経口、経直腸、局所、経口腔（例えば、舌下）及び非経口（例えば、皮下、筋肉内、経皮又は静脈内）投与に好適なものを包含する。但し、最も好適な投与様式は、それぞれ個々の場合において、治療される状態の性質及び重症度、並びに各々の場合において使用される式（Ｉ）、（ＩＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物の性質に依存する。被覆された製剤及び被覆された徐放性製剤も、又、本発明の枠内に属している。好ましいものは、酸及び胃液抵抗性製剤である。胃液に抵抗性のある好適な被覆は、酢酸フタル酸セルロース、フタル酸ポリ酢酸ビニル、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、及びメタクリル酸及びメタクリル酸メチルのアニオン性ポリマーを含む。
【００１８】
経口投与用に好適な医薬品は、例えば、カプセル、ウエハー、又は錠剤のような分離された単位の形態であってもよく、それらの各々は、粉末又は顆粒として、水性又は非水性液体の溶液又は懸濁液として、又は水中油又は油中水懸濁液として、一定の量の式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物を含有している。これらの組成物は、既に挙げたように、活性化合物及び担体（１つ又はそれ以上の更なる成分から構成されていてもよい）を接触させる工程を包含する、いずれかの好適な医薬の方法によって製造することができる。組成物は、一般的に活性化合物を液体及び／又は細かく砕いた固形担体と均一に均質に混合することによって製造され、その後、必要に応じて製品は成形される。このように、錠剤は、例えば、化合物の粉末又は顆粒を、必要に応じて１つ又はそれ以上の追加の成分と共に、圧縮又は成形することによって製造することができる。圧縮した錠剤は、例えば、粉末又は顆粒のような自由に流動する形態の化合物を、必要に応じて、結合剤、流動促進剤、不活性希釈剤及び／又は１つ又はそれ以上の界面活性剤／分散剤と、好適な機械で混合しながら、打錠することによって製造することができる。成形された錠剤は、粉末の形態であって、不活性な液体希釈剤で濡れている化合物を、好適な機械で成形することによって製造することができる。
【００１９】
経口（舌下）投与に好適な医薬組成物は、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物を、着香料、通常はショ糖及びアラビアゴム又はトラガカントゴムと共に含有する錠剤、及びゼラチン及びグリセリン又はショ糖及びアラビアゴムのような不活性基剤中に化合物を含んだトローチを含む。
【００２０】
非経口投与に好適な医薬組成物は、対象である受容者の血液に等張である、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物の滅菌水性製剤を含む。これらの製剤は、静脈内投与することができるが、投与は、皮下、筋肉内又は皮内注射によって行ってもよい。これらの製剤は、化合物を水と混合し、得られた溶液を滅菌し、血液と等張にすることによって製造することができる。本発明の注射し得る組成物は、一般的に活性化合物を約０.１から５重量％含有する。
【００２１】
直腸投与に好適な医薬組成物は、単回投与座薬の形態であってもよい。これらは、式（Ｉ）の化合物を１つ又はそれ以上の通常の固形担体、例えば、カカオバターと混合し、得られた混合物を成形することによって製造することができる。
【００２２】
皮膚での局所使用に好適な医薬組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、スプレー、エーロゾル又はオイルの形態であってよい。好適な担体は、例えば、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール及びこれらの物質の２つ又はそれ以上の混合物である。活性化合物は、一般的に、組成物の約０.１から１５重量％、例えば約０.５から２％の濃度で存在する。
【００２３】
経皮投与も又可能である。経皮使用に好適な医薬組成物は、患者の表皮に長期間密着するのに好適な単一のプラスターの形態であることができる。そのようなプラスターは、粘着剤中に溶解及び／又は分散された、又はポリマー中に分散された、必要に応じて緩衝化された水性溶液中に、活性化合物を好適に含有する。好適な活性化合物の濃度は、約１重量％から３５重量％であり、又は約３％から１５％である。可能性があるのは、例えば、Pharmaceutical Research, 2(6): 318 (1986)に記載されているような、エレクトロトランスポート又はイオントフォレシスによって放出される活性化合物である。
【００２４】
ＣＨＦの改善に対するＰＰＡＲγ（ロシグリタゾン）又はＰＰＡＲα（式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物）のいずれかの特異的活性化の効果を試験するために、慢性冠動脈結紮ラットモデルを使用した。何故なら、心筋梗塞が先進工業国におけるＣＨＦの最も一般的な原因であるからである。
【００２５】
ＰＰＡＲαの活性化が、うっ血性心不全に有益であることが本明細書に示される。心筋機能に関して、収縮期及び拡張期の両者の左心室機能、即ち、心排出量が、式（Ｉ）、（ＩＩ）又は（ＩＩＩ）の化合物による治療後に改善されるが、ＰＰＡＲγ活性化剤では改善されない。
【００２６】
ＰＰＡＲαの活性化も、又、右心室及び肺重量の両者の正常化によって証明されるように、肺のうっ血を改善する（低い肺重量は、良好な心機能の指標であり、高い肺重量は、しばしば心臓の機能低下（すなわちＣＨＦ）に起因する肺のうっ血を示している）。
【００２７】
以前の研究で、ＰＰＡＲα及びＰＰＡＲγの活性化の両者が、インビトロで筋細胞肥大を減少させること、ミネラルコルチコイド依存性高血圧における線維症を減少すること、及び急性虚血再潅流モデルにおいて心筋梗塞面積を限定する（上記参照）ことが報告されていた。心筋梗塞後心不全における、これら２つのＰＰＡＲサブタイプの活性化の相反する効果は、それ故に、予期されなかった。この矛盾する発見の理由の１つは、２つのＰＰＡＲサブタイプの組織特異的発現差異であるかもしれない。
【００２８】
略語及び頭文字
ＣＨＦ：うっ血性心不全
ＬＶ：左心室／左心室の
ＭＩ：心筋梗塞
ＰＰＡＲ：ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体
ＳＥＭ：平均値の標準偏差
【００２９】
〔実施例１〕
うっ血性心不全の治療のための式（Ｉ）の化合物の使用についての概念研究の証明
雄性ウイスターラットを、１ケージ当たり３頭、温度、湿度及び光の標準条件下で収容した。動物は、標準食（ナトリウム含量：０.２％、Altomin, Lage, Germany製）及び水道飲料水を自由摂取とした。慢性心不全を、大動脈からの左冠動脈の起点よりおよそ２ｍｍ遠位の左冠動脈の永久的閉塞によって誘導し、繋がっていない左心室壁の大きな梗塞を作成した。長期間治療を心筋梗塞が作成された日に開始し、８週間続けた。
【００３０】
治療期間の終了時に、心機能を、単離された動いている心臓標本を用いて測定した（改変 Langendorff 装置、Linz et al., J. Ren. Angiotensin Aldosterone Syst., 2003を参照）。心臓を、Langendorff 法に従って、酸素供給した（９５％Ｏ2、５％ＣＯ2）以下の組成の非循環Krebs-Henseleit溶液で灌流した：（ｍｍｏｌ／Ｌ）ＮａＣｌ、１１８；ＫＣｌ、４.７；ＣａＣｌ2、２.５；ＭｇＳＯ4、１.６；ＮａＨＣＯ3、２４.９；ＫＨ2ＰＯ4、１.２；グルコース、５.５；ピルビン酸ナトリウム、２.０。左心耳の切開によって、左心房にカニューレを挿入した。６０ｍｍＨｇの一定の灌流圧で１５分間の平衡期間の後に、一定の充満圧１１ｍｍＨｇで、心臓を作動モードに転換した。次いで、後負荷圧を、毎２分毎に４０から１４０ｍｍＨｇに段階的に変化させた。表のデータは、代表的なものであり、一定の後負荷圧８０ｍｍＨｇに対して得られたものである。流動シグナル及び圧シグナルは、平均毎２秒毎に５００Ｈｚで取り出したものである。心拍出量は、身体を通して血液を送り込む心臓の総能力を測定するものである。ＬＶｄＰ／ｄｔｍａｘは、心筋収縮能の指標、即ち、心臓の能力を発生する力である。ＬＶｄＰ／ｄｔｍｉｎは、緩和する心筋の能力の指標である。更に、肺重量は、ＣＨＦの間接的徴候である、肺うっ血の指標として測定された。
【００３１】
式（Ｉ）の化合物での治療（固形飼料に圧縮し、結果として２０ｍｇ／ｋｇ／日の投与量となった）は、心筋梗塞発症後の日から開始した。純粋なＰＰＡＲγ作動薬ロシグリタゾンを、追加群（固形飼料中に３ｍｇ／ｋｇ／日）に比較のために使用した。
【００３２】
式（Ｉ）のＰＰＡＲα活性化剤での長期間治療は、心不全の異なった態様を改善するが、（ロシグリタゾンを使用した）ＰＰＡＲγの活性化は改善しない。全体的に、これらのデータは、うっ血性心不全の治療における、式（Ｉ）の化合物の有益な効果に対する強い理論的根拠を提供する。
【表１】
2008524129.tif 000006
【００３３】
データは、平均±平均値の標準偏差を表す。Ｎ＝６〜１２頭／群。*印は、対プラセボｐ＜０.０５。心拍出量、ＬＶｄＰ／ｄｔｍａｘ及びＬＶｄｐ／ｄｍｉｎは、８０ｍｍＨｇの負荷後（動いている心臓）で測定した。
【００３４】
〔実施例２〕
慢性心筋梗塞における用量反応
雄性スプラーグドウレイラットを、心筋梗塞（ＭＩ）を作成し、続いて心不全を発症するために、左冠動脈の長期間結紮で前処置した。式（Ｉ）の化合物での治療（固形飼料に圧縮し、結果として異なった１日投与量となった）は、心筋梗塞発症後の日から開始した。８週間の治療後、動物を殺処理し、肺重量を計った、そして単離した心臓の機能を、実施例１に記載したのと同じ様式で、動いている心臓のモードでエクスビボ（ex vivo）で解析した（上記参照）。この方法は、心筋の機能の異なった態様を評価できる。本実験シリーズにおいて確立された治療の原理の効果に対する比較のために、ＣＨＦの治療において活性であることが知られている、二成分ＡＣＥ／ＮＥＰ、即ち、バソペプチダーゼ、阻害剤（７−（２−アセチルスルファニル−３−メチル−ブチルアミノ）−６−オキソ−１，２，３，４，６，７，８，１２ｂ−オクタヒドロ−ベンゾ［ｃ］ピリド［１，２−ａ］アゼピン−４−カルボン酸；国際特許出願第０２／０８３６７１号）を、追加群に用いた。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物での長期間治療は、心不全の異なった態様を改善する。これらのデータは、共に、うっ血性心不全における式（Ｉ）の化合物の有益な効果を証明している。
【表２】
2008524129.tif 000007
【００３６】
データは、平均±平均値の標準偏差で表す。Ｎ＝６〜１２頭／群。*印は、対プラセボｐ＜０.０５。心拍出量、ＬＶｄＰ／ｄｔｍａｘ及びＬＶｄｐ／ｄｍｉｎは、８０ｍｍＨｇの負荷後（動いている心臓）で測定した。
【００３７】
〔実施例３〕
式（Ｉ）の化合物の作動薬効力
式（Ｉ）の化合物の作動薬活性を、国際特許出願第０３／０２０２６９号に従って、以下のように試験した。ヒトＰＰＡＲαに結合して、作動薬的様式で活性化する物質の有効性を解析するために、安定なトランスフェクトＨＥＫ細胞株（ＨＥＫ＝ヒト胎児腎臓）、本明細書では「ＰＰＡＲα受容体細胞株」と称する、を使用した。
【００３８】
ＰＰＡＲα作動薬の活性は、以下に記載する３日間試験で測定した。
第１日：
ＰＰＡＲα受容体細胞株を、以下の添加物を含有するＤＭＥＭ培地（Life Technologies社）で、８０％コンフルエンスまで培養した：１０％ｃｓＦＣＳ（ウシ胎仔血清、Hyclone社）、抗生物質［ゼオジン（Invirogen社）０.５ｍｇ／ｍｌ、Ｇ４１８（Life Technologies社）０.５ｍｇ／ｍｌ、１％ペニシリン・ストレプトマイシン溶液（Life Technologies社）］及びＬ−グルタミン（Life Technologies社）２ｍＭ。培養は、３７℃、５％ＣＯ2の条件下に細胞培養インキュベーター内で標準細胞培養瓶（Becton Dickinson社）中で行った。８０％コンフルエント細胞をＰＢＳ（Life Technologies社）３０ｍｌで１回洗滌し、トリプシン溶液（Life Technologies社）２ｍｌを用いて、３７℃で２分間処理し、上記した培地５ｍｌをとり、細胞計数器で計数した。５００,０００細胞／ｍｌに希釈した後、各々の場合１００,０００細胞を、透明なプラスチックの底部を有する９６ウエルマイクロタイタープレート(Corning Costar社)の各ウエルに播種した。プレートを細胞インキュベーターで３７℃、５％ＣＯ2の雰囲気で２４時間インキュベートした。
【００３９】
第２日：
被検ＰＰＡＲα作動薬を、ＤＭＳＯ中濃度１０ｍＭに溶解した。この原液を、ｃｓ−ＦＣＳ５％（Hyclone社）、Ｌ−グルタミン（Life Technologies社）２ｍＭ及び上記した抗生物質（ゼオジン、Ｇ４１８、ペニシリン及びストレプトマイシン）を加えた、フェノールレッド・フリーのＤＭＥＭ培地（Life Technologies社）に希釈した。被検物質は、通常、１１の異なった濃度（１０μＭ；３.３μＭ；１μＭ；０.３３μＭ；０.１μＭ；０.０３３μＭ；０.０１μＭ；０.００３３μＭ；０.００１μＭ；０.０００３３μＭ；及び０.０００１μＭ）で試験した。より強力な化合物は、１μＭから１０ｐＭ又は１００ｎＭから１ｐＭの濃度範囲で試験した。各ウエルから、第１日に播種したＰＰＡＲαレポーター細胞株の培地を吸引により完全に除去し、直ちに、培地中に希釈した被検物質を細胞に加えた。物質の希釈及び添加は、ロボット（Beckman Biomek 2000）を使用して実施することができる。培地中に希釈した被検物質の最終容積は、９６ウエルプレートのウエル当たり１００μｌであった。アッセイにおけるＤＭＳＯ濃度は、常に、溶媒の細胞障害効果を予防するために０.１容量％未満であった。アッセイが個々のプレートで行われていることを示すため、同様に１１の異なった濃度に希釈した、標準ＰＰＡＲα作動薬を、各プレートに加えた。試験プレートをインキュベーターで、３７℃、５％ＣＯ2雰囲気で、２４時間インキュベートした。
【００４０】
第３日：
被検物質で処理したＰＰＡＲα受容体細胞をインキュベーターから取り除き、細胞溶解をよくするため−２０℃で１時間凍結した。プレートを解凍した後（少なくとも３０分間室温で解凍する）、バッファ−１（Luc-Screen kit #LS1000, PE Biosystems Tropix社）５０μｌを各ウエルにピペット注入し、発光を測定するために、プレートを装置に移し、ピペット操作単位に合わせた（Luminoscan Ascent, LabSystems社）。測定装置のルシフェラーゼ反応を、バッファ−２（Luc-Screen kit #LS1000, PE Biosystems Tropix社）５０μｌを９６ウエルプレートの各ウエルにピペット注入し、開始した。個々のウエルへのバッファーの添加は、製造社（LabSystems社）の指示書に従って、決められた同じ時間間隔で行った。全ての試料を、バッファー２添加の正確に１６分後に測定した。測定時間は、１試料当たり１０秒である。
【００４１】
化合物（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のＰＰＡＲα作動薬活性並びに化合物（Ｉ）、（ＩＩ）及び（ＩＩＩ）のＰＰＡＲγ作動薬活性は、同様な方法で測定することができる。
【国際調査報告】
2008524129.tif 000012
2008524129.tif 000013
2008524129.tif 000014