(57)【要約】本発明は、高脂血症および／または異常脂質血症、または不完全な炭水化物代謝に関与するか、あるいはそれらの指標である染色体領域を含む核酸分子に関するものであり、該核酸分子は、（ａ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１機能に対する効果を有する１個以上の変異を有する；（ｂ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１配列のイントロン７の位置３９６６においてグアニンまたはアデニン残基を含むことにより特徴付けられる；および／または（ｃ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１配列のエクソン１１の位置５２０５においてシトシンまたはチミン残基を含むことにより特徴付けられる、からなる群から選択され、該核酸分子は、配列番号：１の核酸分子の５’および／または３’末端を超えて最大５００００ヌクレオチド伸長する。本発明はさらに、ＵＳＦ１またはそのフラグメントをコードする核酸分子を含む診断用組成物、本明細書に開示の核酸分子、本発明のベクター、プライマーまたはプライマーペア、またはＵＳＦ１特異的抗体に関するものである。最後に、本発明は、高脂血症、異常脂質血症、冠状動脈性心臓病、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血圧、またはアテローム性動脈硬化症の処置用医薬組成物を製造するための本発明の核酸分子の使用に関するものである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝に関与するか、あるいはそれらの指標である染色体領域を含む核酸分子であって、
（ａ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１機能に対する効果を有する１個以上の変異を有する；
（ｂ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１配列のイントロン７の位置３９６６においてグアニンまたはアデニン残基を含むことにより特徴付けられる；および／または
（ｃ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１配列のエクソン１１の位置５２０５においてシトシンまたはチミン残基を含むことにより特徴付けられる；
からなる群より選択され；
該核酸分子は、配列番号：１の核酸分子の５’および／または３’末端を超えて最大５００００ヌクレオチド伸長する、核酸分子。
【請求項２】
ゲノムＤＮＡである、請求項１記載の核酸分子。
【請求項３】
少なくとも２０ヌクレオチドを有する請求項１または２記載の核酸分子のフラグメントであって、配列番号：１のヌクレオチド位置３９６６および／または位置５２０５を含む、フラグメント。
【請求項４】
請求項１から３のいずれか１項記載の核酸分子に相補的であって、かつ少なくとも２０ヌクレオチド長を有する、核酸分子。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか１項記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項６】
ストリンジェントな条件下で、配列番号：１のヌクレオチド位置３９６６および５２０５を含む核酸分子、またはその相補鎖とハイブリダイゼーションする、プライマーまたはプライマーペア。
【請求項７】
請求項５記載のベクターを用いて形質転換された非ヒト宿主。
【請求項８】
細菌、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、哺乳類細胞、植物細胞、トランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物である、請求項７記載の非ヒト宿主。
【請求項９】
ＵＳＦ１またはそのフラグメント、ＵＳＦ１またはそのフラグメントをコードする核酸分子、またはＵＳＦ１特異的抗体を含む、医薬組成物。
【請求項１０】
ＵＳＦ１またはそのフラグメントをコードする核酸分子、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸分子、請求項５記載のベクター、請求項６記載のプライマーまたはプライマーペア、またはＵＳＦ１特異的抗体を含む、診断用組成物。
【請求項１１】
高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の存在または素因について試験する方法であって、予想患者またはかかる素因を有することが疑われる人から得た試料をＵＳＦ１遺伝子の野生型または変異体アリールの存在について分析することを含む、方法。
【請求項１２】
該変異体が、ホモ接合性またはヘテロ接合性状態でＵＳＦ１遺伝子の位置３９６６および／または位置５２０５のＳＮＰを含むものである、請求項１１記載の方法。
【請求項１３】
該試験が、ストリンジェントな条件下で請求項４記載の相補核酸分子を試料中に含まれる核酸分子とハイブリダイゼーションさせること、および該ハイブリダイゼーションを検出することを含み、該相補核酸分子がＳＮＰを含有する配列位置を含む、請求項１１または１２記載の方法。
【請求項１４】
該ハイブリダイゼーション産物を制限酵素で消化すること、または該ハイブリダイゼーション産物を制限酵素消化の対象とし、次に該消化物を分析することをさらに含む、請求項１１から１３のいずれか１項記載の方法。
【請求項１５】
該プローブが検出可能に標識されている、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
該試験が、請求項１から４のいずれか１項記載の核酸分子の少なくとも一部の核酸配列を決定することを含み、ここで該部分がＳＮＰ位置を含むものである、請求項１１から１５のいずれか１項記載の方法。
【請求項１７】
核酸配列の決定が固相ミニシークエンスにより達成される、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
核酸配列の決定に先立ち、該核酸分子の少なくとも該一部を増幅することをさらに含む、請求項１７記載の方法。
【請求項１９】
該試験が増幅反応を行うこと、ここで該増幅反応において利用されるプライマーの少なくとも１個が、請求項６記載のプライマーであるか、あるいは請求項６記載のプリマーペアに属するものであり、増幅産物についてアッセイすることを含む、請求項１１から１５記載の方法。
【請求項２０】
該増幅がポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により達成されるか、あるいは該増幅がポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）である、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の存在または素因について試験する方法であって、人から得た試料を、該試料に含有される（ａ）ＵＳＦ１、（ｂ）ＡＢＣＡ１、（ｃ）アンジオテンシノーゲン、または（ｄ）アポリポタンパク質Ｅの量についてアッセイすることを含む、方法。
【請求項２２】
該試験が、（ａ）ＵＳＦ１、（ｂ）ＡＢＣＡ１、（ｃ）アンジオテンシノーゲン、または（ｄ）アポリポタンパク質Ｅに特異的な抗体またはアプタマーを用いて達成される、請求項２２記載の方法。
【請求項２３】
該抗体またはアプタマーが検出可能に標識されている、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
試験がイムノアッセイである、請求項２１から２３のいずれか１項記載の方法。
【請求項２５】
高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の存在または素因について試験する方法であって、人から得た試料を、該試料に含有される（ａ）ＡＢＣＡ１、（ｂ）アンジオテンシノーゲン、または（ｃ）アポリポタンパク質ＥをコードするＲＮＡの量についてアッセイすることを含む、方法。
【請求項２６】
該試料が、血液、血清、血漿、胎児組織、唾液、尿、粘膜組織、粘液、膣組織、膣から得た胎児組織、皮膚、髪、毛包、または別のヒト組織である、請求項１１から２５のいずれか１項記載の方法。
【請求項２７】
該試料由来の核酸分子またはタンパク質が固体支持体に固定されている、請求項１１から２６のいずれか１項記載の方法。
【請求項２８】
該固体支持体が、チップ、シリカウエハ、ビーズ、またはマイクロタイタープレートである、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の存在または素因の分析のための、請求項１から５のいずれか１項記載の核酸分子の使用。
【請求項３０】
家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低αリポ蛋白血症、高アポβリポ蛋白血症（高アポＢ）、家族性脂質異常性高血圧症（ＦＤＨ）、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、冠状動脈性心臓病、アテローム性動脈硬化症、または高血圧を含む高脂血症および／または異常脂質血症の処置用医薬組成物を製造するための、ＵＳＦ１またはそのフラグメント、またはＵＳＦ１をコードし、および／またはＵＳＦ１のイントロン７および／またはエクソン１１の野生型配列を少なくとも含む核酸分子の使用。
【請求項３１】
請求項１から５のいずれか１項記載の核酸分子、請求項６記載のプライマーまたはプライマーペア、および／または請求項７記載のベクターを１個以上の容器内に含むキット。
【請求項３２】
家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低αリポ蛋白血症、高アポβリポ蛋白血症（高アポＢ）、家族性脂質異常性高血圧症（ＦＤＨ）、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、冠状動脈性心臓病、アテローム性動脈硬化症、または高血圧を含む高脂血症および／または異常脂質血症の処置用医薬組成物を製造するためのＵＳＦ１の発現の阻害剤の使用であって、該阻害剤が、（ａ）ＵＳＦ１遺伝子の転写された領域に相補的なヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ分子、または（ｂ）ＵＳＦ１に特異的な抗体、アプタマー、または小さな阻害分子である、使用。
【請求項３３】
家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低αリポ蛋白血症、高アポβリポ蛋白血症（高アポＢ）、家族性脂質異常性高血圧症（ＦＤＨ）、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、冠状動脈性心臓病、アテローム性動脈硬化症、または高血圧を含む高脂血症および／または異常脂質血症の処置用医薬組成物を製造するためのＵＳＦ１の発現の活性化剤の使用であって、該活性化剤が小分子である、使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本発明は、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝（defective crbohydrate metabolism）に関与するか、あるいはそれらの指標である染色体領域を含む核酸分子に関するものであり、該核酸分子は、（ａ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１機能に対する効果を有する１個以上の変異を有する；（ｂ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１配列のイントロン７の位置３９６６においてグアニンまたはアデニン残基を含むことにより特徴付けられる；および／または（ｃ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１配列のエクソン１１の位置５２０５においてシトシンまたはチミン残基を含むことにより特徴付けられる、からなる群より選択され；該核酸分子は、配列番号：１の核酸分子の５’および／または３’末端を超えて最大５００００ヌクレオチド伸長する。本発明はさらに、ＵＳＦ１またはそのフラグメントをコードする核酸分子を含む診断用組成物、本明細書に開示の核酸分子、本発明のベクター、プライマー、またはプライマーペア、またはＵＳＦ１特異的抗体に関するものである。最後に、本発明は、高脂血症、異常脂質血症、冠状動脈性心臓病、ＩＩ型糖尿病、メタボリックシンドローム、高血圧、またはアテローム性動脈硬化症の処置用医薬組成物を製造するための本発明の核酸分子の使用に関するものである。
【０００２】
様々な文書が本明細書を通じて引用される。製造マニュアルおよびカタログを含むこれらの文書の開示内容は、本明細書において引用により取り込まれる。
【０００３】
家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）は、血清の総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、またはそれらの両方の上昇した濃度により特徴付けられる（参考文献１および２）。最近、３１のフィンランド人ＦＣＨＬ家族において、ＦＣＨＬの第１の主要な遺伝子座がヒト染色体１ｑ２１〜ｑ２３上で同定された（参考文献４）。この知見は、他のより不均一な集団由来のＦＣＨＬ家族において反復された（参考文献５〜７）。さらに全ゲノムスキャンにより、いくつかのＦＣＨＬの他の推定遺伝子座がフィンランド人およびドイツ人研究試料において同定された（参考文献８〜９）。興味深いことに、フィンランド人についての研究（参考文献１５）を含む多くの研究（参考文献１０〜１４）において、１ｑ２１領域の同一マーカーが２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）とも関連付けられた。１ｑ２１について得られた関連性の証拠は、おそらく遺伝子の多様性、ならびに集団に基づく相違および診断上の相違を反映して、これらのＦＣＨＬおよびＴ２ＤＭ研究において変動した。しかしながら、重大なことに、ＦＣＨＬの決定的な代謝特徴の多く、例えば、高トリグリセリド血症およびインスリン抵抗性はまた、Ｔ２ＤＭの特性要素を表す。興味深いことに、混合型高脂血症のげっ歯類遺伝子座は、おそらくヒト１ｑ２１とオルソロガスであるマウス第３染色体の領域と関連付けられる（参考文献１６）。最近、根底の遺伝子であるチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）が同定され、これによりヒトＦＣＨＬの強力な位置候補がもたらされた（参考文献１７）。
【０００４】
上述の通り、家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）は、血清総コレステロール（ＴＣ）、トリグリセリド（ＴＧ）、または両方の上昇した濃度により特徴付けられる（参考文献１、２）。この複合型疾患は最も一般的な家族性高脂血症であり、西洋人集団において１％から２％の有病率である（参考文献１）。ＦＣＨＬは、６０歳未満の冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）患者の約２０％において観察されるので、アテローム性動脈硬化症の強力な遺伝因子を構成する（参考文献３）。ＦＣＨＬの根底にある分子メカニズムを同定するための途方もない努力にも関わらず、その病因はわからないままである。結果、現時点では家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）に襲われた患者を診断または処置することはできない。
【０００５】
以上を鑑みて、本発明の根底にある技術的な課題は、高脂血症および／または異常脂質血症、または不完全な炭水化物代謝、またはこれらの病気の素因の正確かつ適切な診断を可能にする手段および方法を提供することである。
【０００６】
該技術的な課題は、請求の範囲で特徴付けられる実施態様により解決される。
【０００７】
従って、本発明は、高脂血症および／または異常脂質血症、または不完全な炭水化物代謝に関与するか、あるいはそれらの指標である染色体領域を含む核酸分子に関するものであり、該核酸分子は：（ａ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１機能に対する効果を有する１個以上の変異を有する；（ｂ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１配列のイントロン７の位置３９６６においてグアニンまたはアデニン残基を含むことにより特徴付けられる；および／または（ｃ）配列番号：１の核酸配列を有するか、あるいは含む核酸分子、ここで該核酸配列はＵＳＦ１配列のエクソン１１の位置５２０５においてシトシンまたはチミン残基を含むことにより特徴付けられる、からなる群より選択され；該核酸分子は、配列番号：１の核酸分子の５’および／または３’末端を超えて最大５０００ヌクレオチド伸長する。好ましい実施態様において、核酸分子は、配列番号：１の核酸分子の５’および／または３’末端を超えて４００００ヌクレオチドまで、または２５０００ヌクレオチドまで、または５０００ヌクレオチドまで伸長する。
【０００８】
用語「高脂血症および異常脂質血症」は、血清総コレステロールおよび／またはトリグリセリドの濃度の上昇、ならびに低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）コレステロールおよび／またはアポリポタンパク質Ｂの濃度の上昇、および／または血清高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）コレステロールおよび／または低密度ＬＤＬの濃度の低減と関連する疾患を意味する。本発明をふまえて、かかる疾患は、家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低αリポ蛋白血症、高アポβリポ蛋白血症（hyperapobetalipoproteinemia）（高アポＢ）、家族性脂質異常性高血圧症（ＦＤＨ）、高血圧、冠状動脈性心臓病、およびアテローム性動脈硬化症を含む。
【０００９】
本発明をふまえて、用語「不完全な炭水化物代謝」は、耐糖能異常およびインスリン抵抗性を意味する。それゆえ、不完全な炭水化物代謝は、２型糖尿病（Ｔ２ＤＭ）およびメタボリックシンドロームのような疾患の指標となり得る。
【００１０】
用語「高脂血症および／または異常脂質血症、または不完全な炭水化物代謝に関与するか、あるいはそれらの指標である」は、見出されたＳＮＰおよび対応する核酸分子が、該病気の指標であり、それゆえおそらく病因でもあるという事実を意味する。従って、この用語は、示された位置が該病気の指標であることを必然的に必要とする。他方、該用語は、ＳＮＰを含有する具体的な位置が、実際に該病気の病因であるか、あるいは関与することを必ずしも必要としない。なお、該用語は、いずれかのＳＮＰ、または両方のＳＮＰの病因または関与上の役割を排除しない。
【００１１】
配列番号：１を指定されたヌクレオチド配列は、ＵＳＦ１を表す５６８７ｂｐのゲノムヌクレオチド配列であり、ヒトＵＳＦ１  ｍＲＮＡはデータバンク受託番号ＲｅｆＳｅｑ：ＮＭ＿００７１２２の下寄託され、対応するゲノム配列は、２００３年７月にヒトのＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒに＞ｈｇ１６＿ｒｅｆＧｅｎｅ＿ＮＭ＿００７１２２  範囲＝ｃｈｒ１：１５８２２５８３３−１５８２３１５１９の下寄託されている。本発明の目的上、このヌクレオチド配列によりコードされるポリペプチドの活性または機能は、「野生型ＵＳＦ１タンパク質活性」と定義される。同様に、配列位置３９６６がアデニンであり、配列位置５２０５がチミンであると、配列番号：１は野生型ＵＳＦ１を表すと解される。ＵＳＦ１は、Ｅボックスと呼ばれる認識配列ＣＡＣＧＴＧと結合でき、かつアポリポタンパク質ＣＩＩＩ（ＡＰＯＣ３）、ＡＩＩ（ＡＰＯＡ２）、ＡＰＯＥ、ホルモン感受性リパーゼ（ＬＩＰＥ）、脂肪酸合成酵素（ＦＡＳ）、グルコキナーゼ（ＧＣＫ）、グルカゴン受容体（ＧＣＧＲ）、ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ（ＡＢＣＡ１）、レニン（ＲＥＮ）、およびアンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）のような遺伝子の発現を調節できる転写因子として知られている。さらに、ＵＳＦ１は、ＵＳＦ２のような細胞転写機構の他因子と相互作用することが知られている。
【００１２】
本明細書で用いられる用語「（ポリ）ペプチド」は、ペプチドまたは（ポリ）ペプチドを意味する。通常、ペプチドは３０残基までの共有結合したアミノ酸であり、一方ポリペプチド（本明細書において、「タンパク質」とも称される）は、３１個以上のアミノ酸残基を含む。
【００１３】
用語「ＵＳＦ１機能に対する効果を有する１個以上の変異」は、ＵＳＦ１機能に影響を及ぼす変異を意味する。本発明を通じて、用語「機能」および「活性」は互換使用される。ＵＳＦ１は転写因子であるので、用語「ＵＳＦ１機能」は、ゲノムＤＮＡ上のその標的認識配列に対する特異性、そのタンパク質相互作用配列、および転写を調整または調節するその能力を含む転写因子としてのその活性を意味する。しかしながら、ＵＳＦ１のコード領域の外側の変異もＵＳＦ１機能に対する効果を有し得ることに注意することが重要である。かかる変異は、例えば、細胞で転写されたＵＳＦ１の量に影響する変異（プロモーター活性に影響する変異を含む）、またはＲＮＡ転写物のスプライシングまたは細胞内デリバリーに影響する変異である。任意のこれらの変異も、本発明に含まれる。
【００１４】
用語「核酸分子」は、天然に存在する核酸分子および天然に存在しない核酸分子の両方を意味する。天然に存在しない核酸分子は、ｃＤＮＡならびにＰＮＡのような誘導体を含む。
【００１５】
本明細書を通じて用いられる用語「配列番号：の核酸配列を含む核酸分子［...］」は、配列番号により特定される核酸分子より少なくとも１ヌクレオチド長い核酸分子を意味する。同時に、これらの核酸分子は、例えば、配列番号：１により特定される本発明の核酸分子の５’および／または３’末端を超えて最大５００００ヌクレオチド伸長する。
【００１６】
哺乳類における多くの従前の研究は、家族性混合型高脂血症に関与するか、あるいは関連する染色体領域を同定しようとするものであった。混合型高脂血症のげっ歯類遺伝子座は、おそらくヒト染色体１ｑ２１とオルソロガスなマウス第３染色体上の領域と関連付けられた（参考文献１６）。最近、基礎をなす遺伝子のチオレドキシン相互作用タンパク質（ＴＸＮＩＰ）が同定され、これによりヒトＦＣＨＬの強力な位置候補がもたらされた（参考文献１７）。驚くことに、本発明により開示される結果は、それぞれヒトＵＳＦ１のイントロン７およびエクソン１１に位置する２つの一塩基多型が、高脂血症、異常脂質血症、および不完全な炭水化物代謝と関連することを示すものである。開示の多型により、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の存在または素因について個体をスクリーニングすることが可能になる。
【００１７】
本発明者等は、ＦＣＨＬと関連するアリール、およびメタボリックシンドロームのいくつかの構成形質を特徴付けることが報告された非コードＳＮＰを調べた（参考文献６Ａ、７Ａ）（Ng, M.C.Y. et al., manuscript submitted）。本発明者等は、最も強力に関連するＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ２を含有するＤＮＡ配列が、種を超えて保存され、核抽出物のタンパク質と結合することを観察した（ＥＭＳＡ実験での移動度シフトを生み出すその能力により示される）。このインビトロの証拠に加えて、本発明者等は、１９個体の脂肪組織におけるＵＳＦ１の下流遺伝子の差次的発現を観察することができ、それは、それらがＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ２のリスクまたはリスクのないアリールを有するかどうかに依存するものであった。
【００１８】
転写因子は、可変数の縮重ヌクレオチドに隣接する約４〜６ｂｐの短いコア配列により特徴付けられる非常に特異的なヌクレオチド配列と結合する。イントロン７のｕｓｆ１ｓ２の周りの配列はこれらの基準と十分に一致し、５ｂｐの完全な異種間での保存を示す。本発明者等のＥＭＳＡの結果は、実際、ｕｓｆ１ｓ２を囲む配列が機能的エレメントを表すという知見を支持する強力な証拠となった。本発明者等はまず、この保存されたＤＮＡモチーフを含む２６８ｂｐのセグメントが、正しい向きのレポーター遺伝子の発現のみを増強することを報告した（参考文献６Ａ）。これは、このイントロン配列のｃｉｓ調節機能を強く示すものである。本発明者等の認識上、ＵＳＦ１遺伝子の調節エレメントについて最初に示したものである。ＥＭＳＡは単純なインビトロアッセイであり、ここで、研究下のＤＮＡ配列は本質的にネイキッドであり、そのすべての転写機構を有する正常細胞環境および他の調節エレメントの宿主の不存下で試験される。これらの相互作用エレメントのいくつかを有意な距離で見出すことができ、かつそれらはＥＭＳＡのために用いられるプローブに存在しないであろう。任意の組織特異的効果もインビトロアッセイでは無効にされるだろう。しかしながら、本発明者等の、脂肪において遺伝子を調節したＵＳＦ１の発現プロファイルデータは、これらの遺伝子の発現パターンにおけるアリール特異的な差を示し、そしてＵＳＦ１の機能におけるアリール特異的な差を含意するだろう。
【００１９】
本発明者等は、発現において可能性のある変化についてＵＳＦ１の既知の下流遺伝子を分析した。通常、遺伝子の転写調節は、組織および異なるホルモン／環境合図に依存した種々の転写因子からなる提携が、上手く整調された結果であるので、任意のシグナル因子における変化が劇的な効果を有するとは予測されない。さらに、本発明者等は、ＵＳＦ１が、ＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ２における特異的アリールに依存して有意に異なって遺伝子ＡＰＯＥ（参考文献１３Ａ）、ＡＢＣＡ１（参考文献１４Ａ）、およびＡＧＴ（参考文献１５Ａ）を調節することを見出した。３種の遺伝子全てが、異常脂質血症表現型に高度に関連する。ＡＢＣＡ１は、マクロファージから新生ＨＤＬ粒子へのリン脂質およびコレステロールの流れを仲介することにより、コレステロールの逆のデリバリーの第１の工程に関与する（参考文献２２Ａ）。ＡＢＣＡ１の機能的アリールの欠如は、非常に低いＨＤＬ濃度により特徴付けられるタンジール病および家族性低αリポ蛋白血症を生じることが示された（参考文献２３Ａ）。ＡＧＴは、特に腎臓による水分吸収量を調節することによる血圧および血液容量の制御において必須の要素である。ＡＰＯＥは、肝臓におけるＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）介在性エンドサイトーシスを介した循環からのカイロミクロンおよびＶＬＤＬ残遺物の除去を促進する（参考文献２４Ａ〜２６Ａ）。ＡＰＯＥは、ＬＤＬ受容体に対して高い親和性を有し、ＡＰＯＥの過剰発現は、血漿低密度リポタンパク質の顕著な低減を生じる（参考文献２７Ａ）。従って、ＡＰＯＥの低減は、循環中のコレステロールに富むカイロミクロンおよびＶＬＤＬ残遺物の蓄積および抵抗時間の増長（極めて、アテローム生成表現型）を生じる（参考文献２４Ａ、２８Ａ）。ＡＰＯＥの欠損は、血漿からのコレステロールおよびトリグリセリドのクリアランスの障害を伴う家族性異常βリポ蛋白血症を生じることも示された（参考文献２９Ａ、３０Ａ）。最近の証拠により、ＡＰＯＲは、細胞内脂質代謝において重要な役割を果たすことも示唆されている。ＡＰＯＥのトリグリセリドに富むリポタンパク質（ＴＲＬ）からの再循環は、ＨＤＬ代謝およびコレステロール流出に重要である（参考文献３１Ａ）。本明細書で示されるＡＰＯＥ発現に対するｕｓｆ１ｓ２リスクアリールの明らかに非所望な効果は、ＵＳＦ１のＦＨＣＬとの関連の本発明者等の初期の知見、および構成形質に見合っている（参考文献６Ａ）。
【００２０】
ＡＣＡＣＡ発現のインスリン濃度との相関は、初期知見において反復された（参考文献１８Ａ）が、２種のＵＳＦ１アリールハプロタイプ間のこの相関の程度の差が重要であることがさらに明らかとなった。該相関は、保護ハプロタイプ群内で特に高かった。インスリンに対するこの異なる転写応答は、非常に興味深いものであり、代謝遺伝子のインスリンおよび糖濃度の変化に対する応答の仲介におけるＵＳＦ１の既知の役割を担うものである（参考文献１６Ａ）。ＡＣＡＣＡは、長鎖脂肪酸の生合成における律速工程を触媒する酵素として、全体的な脂質代謝の鍵となる位置を占める（参考文献３２Ａ）。これらの知見は、ＦＣＨＬおよびメタボリックシンドロームの患者組織において十分に確立されたインスリン抵抗性を生じる複合体分子経路におけるＵＳＦ１の役割を示唆する。
【００２１】
ＵＳＦ１局所遺伝子の調査は、ｕｓｆ１ｓ２アリールのそれらの発現を超えた影響を全く示さなかった。これは、効果がＵＳＦ１遺伝子に含有されることを示唆している。しかしながら、Ｆ１６Ｒの３’直後の小さな未知のＥＳＴ（ＡＷ９９５０４３）は、ｕｓｆ１ｓ２で異なるアリールを有する群間で差次的に発現した。通常、ＥＳＴは転写された遺伝子のフラグメントを表すが、ＡＷ９９５０４３は、Ｆ１１Ｒに対して逆の鎖から転写され、かつ任意の既知のスプライスバリアントとオーバーラップしないので、その一部ではないようであった。このＥＳＴの差次的発現は例外的であり得るか、あるいはそれは今のところ未知の機能を有する小さな調節ＲＮＡ分子を表し得る。好ましい実施態様において、本発明の核酸分子はゲノムＤＮＡである。本発明のこの好ましい実施態様は、通常、分析が、研究中の人から単離された体液、細胞または組織由来のゲノムＤＮＡに基づき行われるという事実を反映する。本発明の核酸分子のさらに好ましい実施態様において、該ゲノムＤＮＡは遺伝子の一部である。本発明をふまえて、好ましくは、ＵＳＦ１遺伝子と比較して、位置３９６６にＳＮＰ１を有するＵＳＦ１遺伝子のイントロン７、および／または位置５２０５にＳＮＰ２を有するＵＳＦ１遺伝子のエクソン１１が少なくとも分析される。本発明の中心的態様は、ＵＳＦ１遺伝子の位置３９６６のグアニン残基が疾患関連アリールの存在を示し、一方、ＵＳＦ１遺伝子の同じ位置のアデニン残基は健常アリールの指標であることである。同様に、ＵＳＦ１遺伝子の位置５２０５のシトシン残基は疾患関連アリールの存在を示し、一方、チミン残基は健常アリールの指標である。
【００２２】
本発明はまた、少なくとも２０ヌクレオチドを有する本発明の核酸分子のフラグメントに関するものであり、該フラグメントは、配列番号：１のヌクレオチド位置３９６６および／または位置５２０５を含む。本発明のフラグメントは、天然起源ならびに（半）合成起源のものであり得る。従って、フラグメントは、例えば、有機化学の通常のプロトコールにより合成された核酸分子であってもよい。重大なことに、本発明の核酸フラグメントは、ＵＳＦ１遺伝子のイントロン７のヌクレオチド位置３９６６、またはＵＳＦ１遺伝子のエクソン１１のヌクレオチド位置５２０５を含む。これらの位置で、フラグメントは、野生型ヌクレオチド、または高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝に関与するか、あるいはそれらの指標であるヌクレオチド（「変異」または「疾患関連」配列とも称される）のいずれかを有し得る。結果として、本発明のフラグメントは、例えば、野生型配列と変異配列とを区別するアッセイにおいて用いられ得る。
【００２３】
さらに好ましくは、本発明のフラグメントは、少なくとも１７ヌクレオチド、より好ましくは、少なくとも２０ヌクレオチド、最も好ましくは、少なくとも２５ヌクレオチド（例えば、３０ヌクレオチド）からなる。しかしながら、好ましくは、該フラグメントは、１００ｂｐまで、２００ｂｐまで、３００ｂｐまで、４００ｂｐまで、５００ｂｐまで、６００ｂｐまで、７００ｂｐまで、８００ｂｐまで、９００ｂｐまで、または１０００ｂｐまでの長さである。
【００２４】
さらに、本発明は、本発明の核酸分子に相補的であって、かつ少なくとも１７または少なくとも２０ヌクレオチド長を有する核酸分子に関するものである。しかしながら、好ましくは、相補核酸分子は、１００ｂｐまで、２００ｂｐまで、３００ｂｐまで、４００ｂｐまで、５００ｂｐまで、６００ｂｐまで、７００ｂｐまで、８００ｂｐまで、９００ｂｐまで、または１０００ｂｐまでの長さである。
【００２５】
少なくとも１５または少なくとも２０ヌクレオチドを含み、かつＵＳＦ１遺伝子の少なくとも位置３９６６または位置５２０５をカバーする本発明のこの実施態様は、ハイブリダイゼーションアッセイにおける列挙した位置の遺伝子セットアップの分析において特に有用である。従って、例えば、野生型配列、または高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝に関与するか、あるいはそれらの指標である変異体のいずれかに厳密に相補的な１５ｍｅｒを用いて、多型変異体間が区別され得る。これは、適切なハイブリダイゼーションおよび洗浄条件が選択されたなら、分析される試料中のＤＮＡに正確に相補的でない、検出可能な標識で標識された核酸分子は検出可能なシグナルを生じないからである。
【００２６】
これと関連して、本発明の核酸分子、そのフラグメント、ならびに相補核酸分子が検出可能に標識され得ることに注意することが重要である。検出可能な標識は、３Ｈ、または３２Ｐのような放射標識、または蛍光標識を含む。核酸の標識は当該技術分野でよく理解されており、例えば、Sambrook et al.,"Molecular Cloning, A Laboratory Manual"；ISBN：0879695765, CSH Press, Cold Spring Harbor, 2001に記載されている。
【００２７】
好ましくは、ハイブリダイゼーションは、ストリンジェントまたは高度にストリンジェントな条件下で行われる。ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントまたは高度にストリンジェントな条件」は、当業者によく知られているか、あるいは通常のプロトコールに従い、当業者によって確立され得る。各配列についての適当なストリンジェントな条件は、温度、核酸分子の組成、塩濃度などのようなよく知られたパラメーターに基づき確立され得る：例えば、Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"；ISBN：0879695765, CSH Press, Cold Spring Harbor, 2001および初版のSambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"；CSH Press, Cold Spring Harbor, 1989、またはHiggins and Hames (eds.), "Nucleic acid hybridization, a practical approach", IRL Press, Oxford 1985（参考文献５４）、特に、chapter"Hybridization Strategy"by Britten & Davidson, 3 to 15を参照。典型的な（高度にストリンジェントな）条件は、６５℃、０．５×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、または４２℃、５０％  ホルムアミド、４×ＳＳＣ、および０．１％ＳＤＳでのハイブリダイゼーションを含む。通常、ハイブリダイゼーションに、非特異的なシグナルを除去するための洗浄が続く。洗浄条件は、６５℃、０．２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ、または２×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ、または０．３×ＳＳＣおよび０．１％  ＳＤＳ、２５℃〜６５℃のような条件を含む。ハイブリダイゼーションはまた、より低いストリンジェンシー条件下で行われてもよい。かかるハイブリダイゼーション条件のパラメーターは、Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual"；ISBN：0879695765, CSH Press, Cold Spring Harbor, 2001により詳細に記載されている。低ストリンジェンシー条件の非限定的な例は、３５％  ホルムアミド、５×ＳＳＣ、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２％  ＰＶＰ、０．０２％  Ｆｉｃｏｌｌ、０．２％  ＢＳＡ、１００ｍｇ／ｍｌ  変性サケ血清ＤＮＡ、１０％（ｗｔ／ｖｏｌ）  硫酸デキストラン中、４０℃でのハイブリダイゼーション、次に、２×ＳＳＣ、２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、および０．１％  ＳＤＳ中、５５℃での１回以上の洗浄である。用いられ得る低ストリンジェンシーの他の条件は、当該技術分野においてよく知られている（例えば、異種間ハイブリダイゼーションのため利用されるもの）。例えば、Ausubel, et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons. NY, and Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY；Shilo and Weinberg, 1981, Proc Natl Acad Sci USA 78: 6789-6792を参照。
【００２８】
さらに、本発明は、上述の核酸分子を含むベクターに関するものである。具体的には、該ベクターは、本発明の核酸分子を含む、遺伝子操作で通常用いられるプラスミド、コスミド、ウイルス、またはバクテリオファージであり得る。好ましくは、該ベクターは、発現ベクター、および／または遺伝子移入または標的ベクターである。レトロウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、またはウシパピローマ・ウイルスのようなウイルス由来の発現ベクターが、本発明の核酸分子の標的細胞集団へのデリバリーのために用いられ得る。当業者によく知られた方法を用いて、組換えウイルスベクターが構築され得る；例えば、Sambrook et al., loc. cit.およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y. (2001)に記載の技術を参照。別法として、本発明の核酸分子およびベクターは、標的細胞へのデリバリーのためリポソーム内に再構築され得る。本発明の核酸分子を含有するベクターは、よく知られた方法（細胞宿主の種類に依存して変動する）により細胞宿主細胞に移入され得る。例えば、原核細胞には、塩化カルシウムトランスフェクションが一般に用いられるが、一方、他の細胞宿主には、例えば、リン酸カルシウムまたはＤＥＡＥ−デキストラン介在性トランスフェクション、またはエレクトロポレーションが用いられ得る；上記Sambrook参照。
【００２９】
かかるベクターは、適当な宿主細胞中かつ適当な条件下で該ベクターの選択を可能にするマーカー遺伝子のような遺伝子をさらに含んでもよい。好ましくは、本発明の核酸分子は、原核細胞または真核細胞における発現を可能にする発現制御配列に作動可能に結合する。該ポリヌクレオチドの発現は、ポリヌクレオチドの翻訳可能なｍＲＮＡへの転写を含む。真核細胞、好ましくは、哺乳類細胞での発現を確かなものとする調節エレメントは、当業者によく知られている。通常、それらは、転写開始を確かなものとする調節配列、必要に応じて、転写終結および転写物の安定を確かなものとするポリＡシグナル、および／または該ポリヌクレオチドの発現をさらに増強するイントロンを含む。さらなる調節エレメントは、転写ならびに翻訳エンハンサー、および／またはもともと関連するかあるいは異種性プロモーター領域を含み得る。原核生物宿主細胞での発現を可能にする可能性のある調節エレメントは、例えば、エシエリキア・コリ（E. coli）のＰＬ、ｌａｃ、ｔｒｐ、またはｔａｃプロモーターを含み、原核生物宿主細胞での発現を可能にする調節エレメントの例は、酵母のＡＯＸ１またはＧＡＬ１、または哺乳類または他の動物細胞のＣＭＶ−、ＳＶ４０−、ＲＳＶ−プロモーター（ラウス肉腫ウイルス）、ＣＭＶ−エンハンサー、ＳＶ４０−エンハンサー、またはグロビンイントロンである。加えて、調節エレメントのような転写の開始に関与するエレメントは、該ポリヌクレオチドの下流にＳＶ４０−ポリ−Ａ部位またはｔｋ−ポリ−Ａ部位のような転写終結シグナルも含んでいてもよい。必要に応じて、異種性配列は、所望の特徴、例えば、発現した組換え産物の安定化または単純化された精製を与える、Ｃ−またはＮ−末端同定ペプチドを含む融合タンパク質をコードし得る。この関連で、ＯＫＡＹＡＭＡ−Ｂｅｒｇ  ｃＤＮＡ発現ベクターｐｃＤＶ１（Pharmacia）、ｐＣＤＭ８、ｐＲｃ／ＣＭＶ、ｐｃＤＮＡ１、ｐＣＤＮＡ３、Ｅｃｈｏ［登録商標］クローニングシステム（Invitorogen）、ｐＳＰＯＲＴ１（GIBCO BRL）、またはｐＲｅｖＴｅｔ−Ｏｎ／ｐＲｅｖＴｅｔ−ＯｆｆまたはｐＣＩ（Promega）のような適当な発現ベクターが当該技術分野で知られている。
【００３０】
好ましくは、発現制御配列は、真核生物宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションすることが可能なベクターにおける真核生物のプロモーターシステムであるだろうが、真核生物宿主の制御配列も用いられ得る。
【００３１】
上述の通り、本発明のベクターはまた、遺伝子移入またはターゲティングベクターであってもよい。エキソビボまたはインビボ技術による治療用遺伝子の細胞内への導入に基づく遺伝子治療は、遺伝子移入の最も重要な応用の１つである。インビトロまたはインビボ遺伝子治療に適当なベクターおよび方法は、文献に記載されており、当業者に知られている（例えば、Giordano, Nature Medicine 2 (1996), 534-539；Schaper, Circ. Res. 79 (1996), 911-919；Anderson, Science 256 (1992), 808-813；Isner, Lancet 348 (1996), 370-374；Muhlhauser, Circ. Res. 77 (1995), 1077-1086；Wang, Nature Medicine 2 (1996), 714-716；Ｗ０９４／２９４６９；ＷＯ９７／００９５７；Schaper, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635-640；またはKay et al. (2001) Nature Medicine, 7, 33-40、および本明細書において引用する参考文献）。本発明のポリヌクレオチドおよびベクターは、細胞内への直接的導入、またはリポソームまたはウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、レトロウイルス）を介した導入用に設計され得る。好ましくは、該細胞は、生殖系列細胞、胚細胞、または卵細胞、またはそれらに由来するものであり、最も好ましくは、該細胞は幹細胞である。野生型核酸分子のみを用いた遺伝子治療が予想される。
【００３２】
本発明はまた、プライマーまたはプライマーペアに関するものであり、該プライマーまたはプライマーペアは、ストリンジェントな条件下で、配列番号：１のヌクレオチド位置３９６６および／または５２０５を含む本発明の核酸分子、またはその相補鎖にハイブリダイゼーションする。好ましい実施態様において、該プライマーは、ＵＳＦ１配列の位置３９６６に対応する位置にアデニンまたはグアニン残基を有する。別の好ましい実施態様において、該プライマーは、ＵＳＦ１配列の位置５２０５に対応する位置にシトシンまたはチミン残基を有する。プライマーは、ＤＮＡ２本鎖のコード（＋）鎖または非コード（−）鎖に結合し得る。
【００３３】
好ましくは、本発明のプライマーは、１７、２０、または２１ヌクレオチドのような少なくとも１４ヌクレオチド長を有する。１つの実施態様において、プライマーの標的配列がＳＮＰの３’側に位置する事実により、プライマーが配列分析に実際有用であること、すなわち、伸長プライマー配列は実際ＳＮＰを含有することが確認される。ＰＣＲ反応が行われる場合、例えば、通常は２つのプライマーが含まれ、１つのプライマーは＋鎖のＳＮＰの３’側に結合し、残りのプライマーが−鎖のＳＮＰの３’側に結合する。
【００３４】
１つの実施態様において、プライマーは実際にＳＮＰの位置に結合する。結果として、結合がストリンジェントな条件下で行われる場合、該結合はプライマーと標的の配列が完全な相補性を有するときのみ生じるので、かかるプライマーは異なる多型変異体を区別するのに有用である。さらに好ましくは、プライマーは最大２４ヌクレオチド長を有する。しかしながら、特定の場合では、好ましくは、最大３０から３５ヌクレオチド長を有するプライマーが用いられ得る。伸長反応または増幅反応のような適当な検出方法と結びつけて、適当な条件下での位置３９６６または位置５２０５のいずれかを含むゲノム配列とのプライマーのハイブリダイゼーションまたはハイブリダイゼーションの欠如を用いて、多型変異体が区別され、次に、例えば、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の研究下の人の素因についての結果が示される。本発明は、２種類のプライマー／プライマーペアを予測する。１種類目は、変異を含む配列、すなわち、疾患関連配列にハイブリダイゼーションする。言い換えると、プライマーペアの１つのヌクレオチドは、位置３９６６のグアニン残基（または相補鎖のシトシン残基）、または位置５２０５のチミン残基（または相補鎖のアデニン残基）を有する。他の種類のプライマーは、野生型配列に正確に相補的である。好ましくは、十分にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択されるので、例えば、変異配列に正確に相補なプライマーの野生型アリールとの接触は、ミスマッチ形成に起因して有効なハイブリダイゼーションを生じない。洗浄後、プライマーの除去に起因するシグナルは検出されない。
【００３５】
さらに、本発明は、上述の本発明のベクターで形質転換された非ヒト宿主に関するものである。宿主は、変異または野生型配列のいずれかを有し得る。繁殖などの際、宿主は、ＳＮＰの１つまたは両方にヘテロ接合性またはホモ接合性であってもよい。
【００３６】
本発明の宿主は、一過性または安定的のいずれかでゲノムに組み込まれた本発明のベクターを有し得る。本発明の非ヒト宿主を生成する方法は、当該技術分野でよく知られている。例えば、Sambrook et al., loc. cit.,に記載の通常のトランスフェクションプロトコールを利用して、形質転換された細菌（例えば、エシエリキア・コリ）または形質転換された酵母が生成され得る。本発明の非ヒト宿主を用いて、例えば、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の発症が明らかにされ得る。
【００３７】
本発明の好ましい実施態様において、非ヒト宿主は、細菌、酵母細胞、昆虫細胞、真菌細胞、哺乳類細胞、植物細胞、トランスジェニック動物、またはトランスジェニック植物である。
【００３８】
エシエリキア・コリが好ましい細菌であり、好ましい酵母細胞はサッカロマイセス・セレヴィシエ（S. cerevisiae）またはピキア・パストリス（Pichia pastoris）細胞である。好ましい真菌細胞はアスペルギルス細胞であり、好ましい昆虫細胞はスポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera frugiperda）細胞を含む。好ましい哺乳類細胞は、ＵＳＦ１転写因子の発現を示すＣＨＯ細胞、大腸癌腫、および肝癌細胞株である。しかしながら、ＨｅＬａ細胞などまたは線維芽細胞を含むＵＳＦ１を非常に低く発現する細胞株も、特定の実験に特に有用であり得る。
【００３９】
トランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスを生成する方法は、上述のポリヌクレオチドまたは標的ベクターを生殖細胞、胚性細胞、幹細胞、卵細胞、またはそれらに由来する細胞に導入することを含む。非ヒト動物は、本明細書に記載の本発明のスクリーニング方法をふまえて用いられ得る。例えば、A. L. Joyner Ed., Gene Targeting, A Practical Approach (1993), Oxford University Pressにより記載のトランスジェニック胚の生成およびそれらのスクリーニングが行われてもよい。胚の胚性メンバーのＤＮＡは、例えば、適当な相補核酸分子を用いたサザンブロット法を用いて分析され得る（上記参照）。トランスジェニック非ヒト動物を生成する一般的な方法は、当該技術分野、例えば、ＷＯ９４／２４２７４に記載されている。トランスジェニック非ヒト生物（相同的に標的化された非ヒト動物を含む）の生成には、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）が好ましい。有糸分裂上不活性なＳＮＬ７６／７細胞の支持細胞層（McMahon and Bradley, Cell 62: 1073-1085 (1990)、本質的には、Robertson, E. J. (1987) in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells：A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (Oxford : IRL Press), p. 71-112に記載）上で成長させたＡＢ−１株のようなマウスＥＳ細胞が、相同的遺伝子ターゲティングのために用いられ得る。他の適当なＥＳ細胞は、Ｅ１４株（Hooper et al., Nature 326: 292-295 (1987)）、Ｄ３株（Doetschman et al., J. Embryol. Exp. Morph. 87: 27-45 (1985)）、ＣＣＥ株（Robertson et al., Nature 323: 445-448 (1986)）、ＡＫ−７株（Zhuang et al., Cell 77: 875-884 (1994)）を含むが、これらに限定されない。特定の標的変異を生じるＥＳ細胞由来のマウス系統の生成の成功は、ＥＳ細胞の多能性（すなわち、胚胎胞または桑実胚のような発生期の宿主の胚に注入されたときに、胚形成に関与し、かつ生じた動物の生殖細胞に寄与するそれらの能力）に依存する。注入されたＥＳ細胞を含有する胚胎胞は、偽妊娠非ヒトメスの子宮での発生が可能であり、キメラマウスとして生まれる。生じたトランスジェニックマウスは、所望の核酸分子を有する細胞についてキメラであり、それは戻し交配され、子孫の尾の生検ＤＮＡでのＰＣＲまたはサザンブロット分析により、正確に標的化された導入遺伝子の存在についてスクリーニングされ、本発明の核酸分子についてヘテロ接合性のトランスジェニックマウスが同定される。
【００４０】
トランスジェニック非ヒト動物は、例えば、トランスジェニックマウス、ラット、ハムスター、イヌ、サル（類人猿)、ウサギ、ブタ、またはウシであってもよい。好ましくは、該トランスジェニック非ヒト動物はマウスである。本発明のトランスジェニック動物は、とりわけ、本発明の核酸およびベクターの表現型の発現／結果を研究するのに有用である。さらに、本発明のトランスジェニック動物は、例えば、げっ歯類の腸において、ＵＳＦ１遺伝子の発生上の発現、および高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の発症に対するその役割を研究するのに有用である。さらに、本発明の非ヒトトランスジェニック動物は、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝に有用な治療用物質／組成物または他の可能性のある治療剤について試験するために利用されることが予測される。
【００４１】
本発明はまた、ＵＳＦ１またはそのフラグメント、ＵＳＦ１またはそのフラグメントをコードする核酸分子、またはＵＳＦ１特異的抗体を含む医薬組成物に関するものである。
【００４２】
本発明の医薬組成物の成分は、医薬的に許容される担体、および／または希釈剤、および／または賦形剤と組み合わされてもよい。好ましくは、ＵＳＦ１は、疾患症状を緩和する能力のある任意のＵＳＦ１を意味する。一般に、ＵＳＦ１は野生型のものであるだろう。しかしながら、特定の場合では、１個以上の点変異、挿入、欠損などを有し、かつ増大または低減した機能または活性を示す変異ＵＳＦ１の投与に有用であり得る。ポリペプチドの取り込みまたは安定性を改良した化学的に修飾された分子も本発明に包含される。
【００４３】
適当な医薬担体の例は、当該技術分野でよく知られており、それは、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルジョンのようなエマルジョン、様々な種類の湿潤剤、無菌溶液などを含む。かかる担体を含む組成物は、よく知られた通常の方法により製剤され得る。これらの医薬組成物は、適当な用量で対象に投与され得る。適当な組成物の投与は、異なった方法、例えば、静脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、局所、経皮、経鼻、または気管支内投与により達成され得る。投与計画は、主治医および臨床上のファクターにより決定されるだろう。医薬分野においてよく知られているとおり、任意の１人の患者に対する投薬量は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与されるべき具体的な化合物、性別、投与時間および経路、一般的な健康状態、および同時に投与される他の薬物を含む多くのファクターに依存する。典型的な用量は、例えば、発現または発現の阻害のために核酸０．００１から１０００μｇの範囲にあり得るが；この例示的な範囲より下またはそれより上の用量は、特に上述のファクターを考慮して予測される。投薬量は変動するだろうが、ＤＮＡの静脈内投与に好ましい投薬量は、ＤＮＡ分子約１０６から１０１２コピーである。進行は定期的な評価によりモニタリングされ得る。本発明の組成物は、局所または全身性に投与され得る。一般に、投与は非経腸、例えば、静脈内投与であり；ＤＮＡはまた、例えば、内部または外部標的部位への遺伝子銃デリバリーにより、あるいは動脈内部位へのカテーテルにより標的部位に直接投与され得る。非経腸投与用製剤は、無菌水性または非水性溶液、懸濁液、およびエマルジョンを含む。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物油、およびオレイン酸エチルのような注入可能な有機エステルである。水性担体は、生理食塩水および緩衝媒体を含む水、アルコール／水性溶液、エマルジョン、または懸濁液を含む。非経腸ビークルは、塩化ナトリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンガー液、または不揮発性油を含む。静脈注射用ビークルは、液体および栄養補充薬、電解質補充薬（例えば、リンゲルのデキストロースベースのもの）などを含む。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどのような保存剤および他の添加剤も存在していてもよい。
【００４４】
さらに、本発明は、ＵＳＦ１またはそのフラグメントをコードする核酸分子、上述の核酸分子、上述のベクター、上述のプライマーまたはプライマーペア、またはＵＳＦ１特異的抗体を含む診断用組成物に関するものである。
【００４５】
診断用組成物は、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝を発症する彼または彼女の素因に関して、または急性疾患の診断に関して、人の遺伝子状態を評価するのに有用である。診断用組成物の様々な可能性のある成分は、溶媒中、そうでなければ凍結乾燥形態で１個以上のバイアルにパッケージされ得る。溶媒中に溶解されるなら、好ましくは、診断用組成物は少なくとも＋８℃から＋４℃に冷却される。他の場合では、凍結するのが好ましい。
【００４６】
本発明はまた、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の存在または素因について試験する方法に関し、該方法は、予測患者またはかかる素因を有することが疑われる人から得た試料を、ＵＳＦ１遺伝子の野生型または変異体アリールの存在について分析することを含む。好ましくは、該変異体は、ホモ接合またはヘテロ接合状態でＵＳＦ１遺伝子の位置３９６６および／または位置５２０５のＳＮＰを含む。様々な実施例において、野生型配列または変異配列の存在のいずれかについて試験され得る。本発明をふまえて、ＵＳＦ１遺伝子の位置３９６６のグアニン残基は疾患関連アリールの存在を示し、一方、ＵＳＦ１遺伝子の同じ位置のアデニン残基は、健常アリールの指標である。同様に、ＵＳＦ１遺伝子の位置５２０５のシトシン残基は疾患関連アリールの存在を示し、一方、チミン残基は健常アリールの指標である。
【００４７】
本発明の方法は、該人／患者の遺伝子セットアップの検出、および該患者が罹患している病気が高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝であるかどうかの適当な結論を示すのに有用である。別法では、病気に罹患していない人が、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の素因を有するかどうかが評価され得る。ＵＳＦ１遺伝子のエクソン１１の位置５２０５に関して、シトシンのみがホモ接合性またはヘテロ接合性状態で見出される場合、病気は、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝と診断されるか、あるいは対応の素因が判然する。一方、チミンがホモ接合性状態で見出される場合、患者が罹患している病気は、高脂血症、または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝と関連せず、かつ該患者はこの病気を発症する素因を有さないと結論付けられ得る。位置３９６６のＳＮＰの分析についても、状況は同じであり、本質的に同じ結論が適用される：ＵＳＦ１遺伝子のイントロン７の位置３９６６に関して、グアニンのみがホモ接合性またはヘテロ接合性状態で見出される場合、病気は、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝と診断されるか、あるいは対応の素因が判然とする。一方、アデニンがホモ接合性状態で見出される場合、患者が罹患している病気は、高脂血症または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝と関連せず、さらに患者はこの病気を発症する素因を有さないと結論付けられ得る。
【００４８】
本発明の方法の好ましい実施態様において、該試験は、（高度に）ストリンジェントな条件下で、プローブとして高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝に関与するか、あるいはそれらの指標である核酸分子に相補的な上記相補核酸分子、または野生型配列に相補的な上記核酸分子を、該試料に含まれる核酸分子にハイブリダイゼーションさせること、および該ハイブリダイゼーションを検出することを含み、該相補核酸分子はＳＮＰを含有する配列位置を含む。
【００４９】
加えて、用いられる核酸プローブに依存して、野生型または変異配列（すなわち、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝に関与するか、またはそれらの指標である配列）のいずれかが検出されるだろう。野生型配列に相補的な核酸分子が、変異配列にハイブリダイゼーションしないか、あるいは本質的にハイブリダイゼーションしないように、ハイブリダイゼーション条件が選択されることが理解される。同様に、変異配列に相補的な核酸分子は、野生型配列にハイブリダイゼーションしないか、あるいは本質的にハイブリダイゼーションしない。本発明のハイブリダイゼーション方法においてホモ接合性およびヘテロ接合性遺伝子型から得られた結果を同定するために、例えば、ハイブリダイゼーション後のそれぞれの検出シグナルの強さ／強度をモニタリング／検出することができる。本発明のハイブリダイゼーション方法において野生型ホモ接合性、ヘテロ接合性、および／または変異ホモ接合性アリールを区別するために、対応の遺伝子型の内部対照試料が分析に含まれるだろう。
【００５０】
さらに好ましい実施態様において、本発明の方法はさらに、該ハイブリダイゼーション産物を制限酵素で消化すること、または該ハイブリダイゼーション産物を制限酵素での消化の対象とし、次に該消化産物を分析することを含む。
【００５１】
本発明のこの好ましい実施態様は、通常の方法により、有効なハイブリダイゼーションと無効なハイブリダイゼーションとの区別を可能にする。例えば、位置３９６６または位置５２０５に隣接するＤＮＡ配列が制限酵素認識部位を含む場合、ハイブリダイゼーション産物は、適当な制限酵素により、有効なハイブリダイゼーション上で開裂され、一方、ハイブリダイゼーションの欠如は、２本鎖産物を生じないか、あるいは制限酵素認識部位を含まず、従って開裂されない。適当な制限酵素は、例えば、Ｗｅｂｃｕｔｔｅｒプログラムを用いて見出され得る。消化産物の分析は、ゲル電気泳動法のような通常の方法により達成され、必要に応じて、例えば、核酸をエチジウムブロマイドで染色することと組合せれてもよい。サザンブロット法のようなさらなる技術との組合せも予想される。
【００５２】
該ハイブリダイゼーションの検出は、例えば、抗ＤＮＡ２本鎖抗体により、あるいは標識オリゴヌクレオチドを利用して、達成され得る。通常、本発明の方法は、サザンブロット法またはノーザンブロット法のようなブロット技術、および関連技術と共に利用される。標識は、例えば、標準的プロトコールにより達成され、それは、放射マーカー、蛍光、リン光、化学発光、酵素標識などでの標識を含む。標識は、核酸分子の５’および／または３’末端に位置するか、あるいは内部に位置することができる。好ましい標識は、蛍光色素、例えば、カルボキシフルオレッセイン（ＦＡＭ）および６−カルボキシ−Ｘ−ローダミン（ＲＯＸ）、フルオレッセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ローダミン、テキサスレッド、フィコエリトリン、アロフィコシアニン、６−カルボキシフルオレッセイン（６−ＦＡＭ）、２’，７’−ジメトキシ−４’，５’−ジクロロ−６−カルボキシフルオレッセイン（ＪＯＥ）、６−カルボキシ−２’，４’，７’，４，７−ヘキサクロロフルオレッセイン（ＨＥＸ）、５−カルボキシフルオレッセイン（５−ＦＡＭ）、またはＮ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチル−６−カルボキシローダミン（ＴＡＭＲＡ）、放射標識、例えば、３２Ｐ、３５Ｓ、３Ｈなどを含むが、これらに限定されない。標識はまた２工程システムであってもよく、ここで、プローブは、高親和性結合パートナー、例えば、アビジン、特異的抗体などを有するビオチン、ハプテンなどと結合し、該結合パートナーは検出可能な標識と結合している。
【００５３】
上記をふまえて、本発明の方法の別の好ましい実施態様において、該プローブは、例えば、上述の方法および標識により検出可能に標識される。
【００５４】
本発明の方法のなお別の好ましい実施態様において、該試験は、ＳＮＰ位置を含む、上述の核酸分子の少なくとも一部分の核酸配列を決定することを含む。核酸分子の決定は、サンガーまたはマクサム・ギルバートプロトコール（さらなる手引のため、Sambrook et al., loc. cit.を参照）のような通常のプロトコールの１つに従い達成され得る。
【００５５】
本発明のさらに好ましい実施態様において、核酸配列の決定は、固相ミニシークエンスにより達成される。固相ミニシークエンスは、溶液中の野生型および変異ヌクレオチドの定量的分析に基づくものである。第１に、変異を含有するゲノム領域が、１つのビオチン化または非ビオチン化プライマー（ビオチン化プライマーは、ストレプトアビジン（ＳＡ）コートプレートに結合する）を用いたＰＣＲにより増幅される。ＰＣＲ産物は１本鎖形態に変性されて、ミニ配列決定プライマーが変異部位の直前のこの鎖と結合することが可能となる。トリチウム（Ｈ３）または蛍光標識変異および野生型ヌクレオチドは、非標識ｄＮＴＰと共に、ミニシークエンス反応液に添加され、Ｔａｑポリメラーゼを用いて配列決定される。結果は、βカウンターまたは蛍光光度計により測定されＲ比として表された反応物中の野生型および変異ヌクレオチド量に基づくものである。Syvaunen AC, Sajantila A, Lukka M. Am J Hum Genet 1993: 52, 46-59およびSuomalainen A and Syvanen AC. Methods Mol Biol 1996; 65:73-79も参照。
【００５６】
本発明の方法の好ましい実施態様は、該核酸配列の決定に先立ち、該核酸分子の少なくとも該一部分を増幅することをさらに含む。好ましくは、増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により達成される。リガーゼ連鎖反応法のような他の増幅方法も利用され得る。
【００５７】
本発明の方法の好ましい実施態様において、該試験は、増幅反応を行うこと、ここで、該増幅反応で利用されるプライマーの少なくとも１つが上記のプライマーであるか、あるいは上記プライマーペアに属する、および該増幅産物についてアッセイすることを含む。この実施態様において、かつ情報に依存して、研究者／医師は、用いる野生型または変異配列のいずれかとハイブリダイゼーションするプライマーを得たいと願う。特に好ましい実施態様において、プライマーの少なくとも１つが実際にＳＮＰ位置に結合する。結果として、結合がストリンジェントな条件下で行われると、結合はプライマーおよび標的の配列が完全な相補性を有する場合にのみ生じるので、異なる多型変異体を区別するのに有用である。
【００５８】
標的配列がハイブリダイゼーションに用いられるプライマーに正確に相補的な配列を含むと、本発明の方法は標的配列のみの増幅を生じるだろう。これは、オリゴヌクレオチドプライマーが、好ましくは（高度に）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、野生型／変異配列とハイブリダイゼーションしないが−用いたプライマーの種類に依存する−（結果、増幅産物は全く得られない）正確に一致した配列にのみハイブリダイゼーションすることによる。当然、両方のＳＮＰにハイブリダイゼーションするプライマーペアの組合せが用いられ得る。この場合、予測増幅産物（これは、第２の区別できないプライマーが各遺伝子座について同じであると、０、１、２、３、または４種の増幅産物であり得る）の分析により、位置３９６６および５２０５の両方の遺伝子状態についての情報が提供されるだろう。
【００５９】
本発明の方法の好ましい実施態様において、該増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）により達成されるか、あるいは該増幅がポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）である。ＰＣＲは当該技術分野で十分に確立されている。本発明をふまえて用いられるべき典型的な条件は、例えば、合計容量５０μｌ中、合計３５サイクルを含み、例えば、９５℃、３分間の変性工程；５５℃、３０秒間のアニーリング工程；７２℃、７５秒間の伸長工程；次に、７２℃、１０分間の最終伸長工程である。
【００６０】
本発明はさらに、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の存在または素因について試験する方法に関するものであり、該方法は、ヒトから得られた試料を、該試料に含有される（ａ）ＵＳＦ１、（ｂ）ＡＢＣＡ１、（ｃ）アンジオテンシノーゲン、または（ｄ）アポリポタンパク質Ｅの量についてアッセイすることを含む。ＵＳＦ１の量は任意の適当な方法により決定され得る。
【００６１】
好ましくは、ＵＳＦ１の量は、試料、すなわち、該試料中に含有されるＵＳＦ１を、（ａ）ＵＳＦ１、（ｂ）ＡＢＣＡ１、（ｃ）アンジオテンシノーゲン、または（ｄ）アポリポタンパク質Ｅに特異的な抗体またはアプタマー、またはそれらの誘導体と接触させることにより決定される。例えば、ＵＳＦ１含有試料は、ウエスタンブロットまたはＲＩＡアッセイにおいて分析されてもよい。これに関連して、ホモ接合性野生型対照試料（２つの持続アリールを含む）と比較して、本発明の抗原の存在についてより弱い染色は、ヘテロ接合性野生型（１つの持続アリールおよび１つの疾患関連アリール）の指標であり、一方、ヘテロ接合性疾患状態については、適当な抗体が用いられた場合、染色されないか、あるいは低減された染色が予測される。好ましくは、本発明の方法は、全部で３種類の可能性のあるアリールの組合せに対応する対照試料の存在下で行われる。試験は、野生型に特異的または変異配列に特異的な抗体またはアプタマーなどを用いて行われ得る。加えて、結合試験は、ＥＬＩＳＡのような標準的技術の利用を含んでもよい；例えば、Harlow and Lane（参考文献５３）, loc. citを参照。本発明を通じて用いられる用語「抗体」は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、１本鎖抗体、またはそれらのフラグメントを意味する。好ましくは、抗体は、ＵＳＦ１、または野生型もしくは疾患関連ＵＳＦ１に特異的である。抗体は、二重特異的抗体、ヒト化抗体、合成抗体、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ２）’、Ｆｖ、またはｓｃＦｖフラグメントなどのような抗体フラグメント、またはこれらのいずれかの化学的に修飾された誘導体である（全て、用語「抗体」に含まれる）。モノクローナル抗体は、例えば、Kouhler and Milstein, Nature 256 (1975), 495およびGalfre, Meth. Enzymol. 73 (1981), 3にもとは記載の技術であって、当該技術分野で開発された修飾を含む、マウスミエローマ細胞の免疫動物由来脾細胞との融合を含む技術により製造され得る。抗体は、本発明に記載の標識のいずれかを用いて標識されてもよい。
【００６２】
本発明の方法の好ましい実施態様において、該抗体またはアプタマーは検出可能に標識される。好ましくは、アプタマーは３Ｈまたは３２Ｐで放射標識されるか、あるいは蛍光マーカーで標識され、一方抗体は、対応する方法（好ましい放射標識として１３１Ｉを用いて）で標識されるか、あるいはＨｉｓ−タグ、ＦＬＡＧ−タグ、またはｍｙｃ−タグのようなタグで標識され得る。
【００６３】
本発明の方法のさらに好ましい実施態様において、試験は免疫アッセイである。
【００６４】
本発明はまた、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の存在または素因についての試験方法に関するものであり、該方法は、ヒトから得られた試料を、該試料に含有される（ａ）ＡＢＣＡ１、（ｂ）アンジオテンシノーゲン、または（ｃ）アポリポタンパク質ＥをコードするＲＮＡ量についてアッセイすることを含む。試験は、ノーザンブロット分析のような当業者に既知の方法のいずれかにより、あるいは本明細書に記載の方法により行われ得る。
【００６５】
本発明の方法の別の好ましい実施態様において、該試料は、血液、血清、血漿、脂肪組織、唾液、尿、粘膜組織、粘液、膣組織、膣から得られた胎児組織、皮膚、髪、毛包、または別のヒト組織である。
【００６６】
本発明の方法のさらなる好ましい実施態様において、該試料由来の該核酸分子は、固体支持体に固定される。
【００６７】
核酸分子の固体支持体への固定は、試験アッセイの取扱を容易にし、さらに、チップ、シリカウエハ、またはマイクロタイタープレートのような少なくともある種の個体支持体により、より多くの試料の同時分析が可能になる。理想的には、固体支持体は、例えば、ロボット装置を利用した自動試験を可能にする。
【００６８】
本発明の方法の特に好ましい実施態様において、該固体支持体は、チップ、シリカウエハ、ビーズ、またはマイクロタイタープレートである。
【００６９】
本発明の方法は、エキソビボ、インビトロ、またはインビボで行われ得る。
【００７０】
本発明はまた、高脂血症、異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝の存在または素因を分析するための、ＵＳＦ１をコードする核酸分子、上述の核酸分子、またはＵＳＦ１ポリペプチドの使用に関するものである。上で詳述した通り、該核酸分子は、病気または該病気の素因の不存の同時分析を可能にする。特定の場合では、試験のためにＵＳＦ１ポリペプチドを使用することが可能である。これは、例えば、ＵＳＦ１の発現がＵＳＦ１に対する自己免疫反応を生じさせる場合であってもよい。かかる場合、ＵＳＦ１ポリペプチドを用いることで、ＵＳＦ１に対する抗体を検出することで患者をモニタリングすることが可能だろう。かかるアッセイは、例えば、ウエスタンブロット技術または（放射）免疫沈降法に基づくものであり得る。
【００７１】
加えて、本発明は、家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低αリポ蛋白血症、高アポβリポ蛋白血症（高アポＢ）、および／または家族性脂質異常性高血圧症（ＦＤＨ）、冠状動脈性心臓病、ＩＩ型糖尿病、アテローム性動脈硬化症、またはメタボリックシンドロームを含む高脂血症および／または異常脂質血症の処置用医薬組成物を製造するための、ＵＳＦ１またはそのフラグメント、ＵＳＦ１をコードし、および／または少なくともＵＳＦ１のイントロン７および／またはエクソン１１の野生型配列を含む核酸の使用に関する。本発明に記載の疾患のいずれかは、疾患の症状を改善するのに十分な量および質のＵＳＦ１を患者に投与することにより、処置され得る。例えば、疾患症状が、患者の低減したＵＳＦ１量により引き起こされたなら、ＵＳＦ１の患者への投与は、患者の低減したＵＳＦ１を補填するだろう。ＵＳＦ１は、例えば、ポリペプチドとして患者に提供されてもよい。別法として、ＵＳＦ１をコードする核酸分子が投与され得る。好ましくは、ＵＳＦ１は、全長の野生型ポリタンパク質である。しかしながら、特定の場合、１個以上の点変異、挿入、欠損などを有し、かつ増大または低減した機能または活性を示す変異ＵＳＦ１を投与することも有用であり得る。ポリペプチドの取り込みまたは安定性が改良された化学的に修飾された分子も本発明に包含される。遺伝子治療法は、本発明のベクターと関連して上述され、同様にここで適用される。本発明をふまえて、本明細書において上で定義した核酸分子のフラグメントも遺伝子治療法において利用され得る。該フラグメントは、ＵＳＦ１遺伝子の位置３９６６または位置５２０５のヌクレオチドを含む。好ましくは、該フラグメントは、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも４００、そして最も好ましくは、少なくとも５００ヌクレオチドを含む。本発明の使用の好ましい実施態様において、該遺伝子治療は、高脂血症および／または異常脂質血症、および／または不完全な炭水化物代謝を処置または予防する。
【００７２】
本発明は、本発明の核酸分子、プライマーまたはプライマーペア、および／またはベクターを１個以上の容器内に含むキットに関するものである。
【００７３】
本発明はまた、家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低αリポ蛋白血症、高アポβリポ蛋白血症（高アポＢ）、家族性脂質異常性高血圧症（ＦＤＨ）、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、冠状動脈性心臓病、アテローム性動脈硬化症、または高血圧を含む高脂血症および／または異常脂質血症の処置用医薬を製造するためのＵＳＦ１発現の阻害剤の使用に関し、該阻害剤は、（ａ）ＵＳＦ１遺伝子の転写領域に相補的なヌクレオチド配列を含むｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡ分子、または（ｂ）ＵＳＦ１遺伝子に特異的な抗体、アプタマー、または小分子阻害剤である。
【００７４】
本明細書に開示の阻害分子は、インビボまたはインビトロで用いられ得る。本発明の１つの実施態様において、阻害性ＲＮＡ分子、アプタマー、および抗体は発現カセットから発現される。この発現カセットを用いて、例えば、本明細書に開示のｓｉＲＮＡを発現する安定な細胞株が生成され得る。安定な細胞株は、例えば、本明細書に記載の疾患の処置の必要な患者から得られる幹細胞に基づくものであってもよい。これらの安定な細胞株は、患者に再導入されてもよい。本発明の別の実施態様において、ｓｉＲＮＡはウイルスベクターから発現される。ｓｉＲＮＡの発現は、特定の標的遺伝子のダウンレギュレーションを生じる。
【００７５】
本明細書で用いられる用語「ｓｉＲＮＡ」は、「低分子干渉ＲＮＡ」を意味する。ＲＮＡ干渉において、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、配列に特異的な方法で標的ｍＲＮＡに結合し、その分解を促進し、これにより、コードタンパク質の翻訳を妨げる。細胞のｓｉＲＮＡでのトランスフェクションは、例えば、親油性薬物（中でも、Ｏｌｉｇｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ［登録商標］およびＴｒａｎｓｉｔ−ＴＫＯ［登録商標］）およびエレクトロポレーションを用いて達成され得る。
【００７６】
哺乳類細胞またヒト細胞において低分子干渉ＲＮＡまたは低分子ヘアピン型ＲＮＡを安定的に発現させる方法は、当業者に知られており、例えば、Paul et al. 2002 (Nature Biotechnology 20: 505-508)、Brummelkamp et al. 2002 (Science 296: 550-553)、Sui et al. 2002 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 5515-5520）、Yu et al. 2002 (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99: 6047-6052)、Lee et al. 2002 (Nature Biotechnology 20: 500-505)、Xia et al. 2002 (Nature Biotechnology 20: 1006-1010）により記載されている。疾患関連変異アリールを特異的に標的にするｓｉＲＮＡを設計し、それにより、変異遺伝子からの発現を選択的にサイレンシングさせることにより、ＲＮＡｉアプローチは遺伝的疾患の可能性のある処置の開発に適していることが、いくつかの研究により示されている（Miller et al. 2003, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100: 7195-7200；Gonzalez-Alegre et al. 2003, Ann. Neurol. 53: 781-787）。
【００７７】
ｓｉＲＮＡ分子は、本質的には２本鎖であるが、３’または５’オーバーハングを含み得る。それらは、標的遺伝子と同一でないか、あるいは本質的に同一でない配列も含み得るが、これらの配列は、同一性のある配列の外側に位置していなければならない。配列同一性または実質的同一性は、少なくとも１４、より好ましくは、少なくとも１９ヌクレオチド長である。好ましくは、それは２３ヌクレオチドを超えない。必要に応じて、ｓｉＲＮＡは、同一性または実質的同一性のある２箇所の領域を含み、それは同一性のない領域により隔離される。用語「実質的同一性」は、標的ｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡのセンス鎖の１個以上のミスマッチ、または同一性のある領域内の標的ｍＲＮＡミスマッチに対してｓｉＲＮＡの全長の１０から１５％を有する領域を意味する。該ミスマッチは、ヌクレオチド置換、付加、欠損、重複などの結果であり得る。２３ｂｐより長く、４０ｂｐ未満のｄｓＲＮＡも、３または４個のミスマッチを含有し得る。
【００７８】
ｓｉＲＮＡの標的ｍＲＮＡとの干渉は、転写／翻訳が、少なくとも５０％、好ましくは、少なくとも７５％、より好ましくは、少なくとも９０％、なおより好ましくは、少なくとも９５％、例えば、少なくとも９８％、そして最も好ましくは、少なくとも９９％低減されるという効果を有する。
【００７９】
用語「小分子阻害剤」または「小分子化合物」は、多くとも１０００Ｄａ、好ましくは、多くとも５００Ｄａの相対分子量を有する化合物を意味する。それは、有機または無機性質のものであり得る。多数の市販の小分子ライブラリーが当該技術分野で知られている。従って、例えば、小分子阻害剤は、かかるライブラリーに含有される化合物、またはかかるライブラリーに含有される化合物由来の修飾化合物のいずれかであってもよい。好ましくは、かかる阻害剤は、十分な特異性でもって標的タンパク質と結合する。ここで、十分な特異性は、好ましくは、５００ｎＭ未満、より好ましくは、２００ｎＭ未満、なおより好ましくは、５０ｎＭ未満、さらにより好ましくは、１０ｎＭ未満、最も好ましくは、１ｎＭ未満の解離定数（Ｋｄ）を意味する。
【００８０】
用語「アンチセンス核酸分子」は、遺伝子発現を調節するために用いられ得る核酸分子を意味する。根底技術であるアンチセンス技術は、アンチセンスＤＮＡまたはＲＮＡを通じて、または３重らせんの形成を通じて遺伝子発現を制御するために用いられ得る。アンチセンス技術は、例えば、Okano, J. Neurochem. 56: 560 (1991) ;"Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression." CRC Press, Boca Raton, FL (1988)またはPhilips MI (ed.), Antisense Technology, Methods in Enzymology, Vol. 313, Academic Press, San Diego (2000)において考察されている。３重らせんの形成は、例えば、Lee et al., Nucleic Acids Research 6: 3073 (1979)；Cooney et al., Science 241: 456 (1988)；およびDervan et al., Science 251: 1360 (1991)において考察されている。該方法は、標的ポリヌクレオチドの相補ＤＮＡまたはＲＮＡとの結合に基づくものである。例えば、ＵＳＦ１をコードするポリヌクレオチドの５’コード部分を用いて、約１０から４０塩基対の長さのアンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドが設計され得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、転写に関与する遺伝子領域に相補的であるよう設計され、それにより、ＵＳＦ１の転写および産生を妨げる。アンチセンスＲＮＡオリゴヌクレオチドは、インビボでｍＲＮＡとハイブリダイゼーションし、ｍＲＮＡ分子のＵＳＦ１タンパク質への翻訳をブロックする。
【００８１】
用語「リボザイム」は、触媒活性を有するＲＮＡ分子を意味し（例えば、Sarver et al, Science 247: 1222-1225 (1990)参照）；しかしながら、ＤＮＡ触媒（デオキシリボザイム）も知られている。リボザイムおよび新たな治療ツールの開発のためのそれらの可能性は、例えば、Steele et al. 2003 (Am. J. Pharmacogenomics 3: 131-144)およびPuerta-Fernandez et al.2003 (FEMS Microbiology Reviews 27: 75-97)により考察されている。認識配列に特異的な部位でｍＲＮＡを開裂するリボザイムを用いて、ＵＳＦ１  ｍＲＮＡが破壊されうる際、好ましくは、ｔｒａｎｓ−作用型ヘアピンまたはハンマーヘッドリボザイムが用いられる。ハンマーヘッドリボザイムは、標的ｍＲＮＡを有する相補塩基対を形成する隣接領域により指示される位置でｍＲＮＡを開裂する。唯一必要なことは、標的ｍＲＮＡが２塩基からなる次の配列：５’−ＵＧ−３’を有することである。ハンマーヘッドリボザイムの構築および産生は、当該技術分野でよく知られており、より詳細にはHaseloff and Gerlach, Nature 334: 585-591 (1988)において考察されている。当業者に明らかな凝固因子ＸＩＩ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列内に可能性のあるハンマーヘッドリボザイム開裂部位が多数存在する。好ましくは、リボザイムは、開裂認識部位がｍＲＮＡの５’末端近くに位置するよう；すなわち、効果を増大させ、かつ非機能的ｍＲＮＡの細胞内蓄積を最小とするよう設計される。ＲＮａｓｅ  Ｐは、病因ＲＮＡの選択的阻害のために用いられる別のリボザイムアプローチである。リボザイムは、修飾オリゴヌクレオチド（例えば、安定性、ターゲッティングなどの改善）からなり、ＵＳＦ１を発現する細胞にデリバリーされるべきである。リボザイムをコードするＤＮＡコンストラクトは、事実上当業者に知られた方法のいずれかにより細胞内に導入され得る。好ましいデリバリー方法は、トランスフェクションされた細胞が、ＵＳＦ１メッセンジャーを破壊し、翻訳を阻害するのに十分な量のリボザイムを産生するように、例えば、ｐｏｌ  ＩＩＩまたはｐｏｌ  ＩＩプロモーターのような強力な構成プロモーターの制御下でリボザイムを「コードする」ＤＮＡコンストラクトを用いることを含む。アンチセンス分子同様リボザイムは触媒であるので、一般に、効率上より低い細胞内濃度が必要とされる。リボザイム介在性ＲＮＡ修復は、リボザイム技術を応用した別の治療オプションであり（Watanabe & Sullenger 2000, Adv. Drug Deliv. Rev. 44: 109-118)、本発明の目的上有用である。
【００８２】
用語「アプタマー」は、モノクローナル抗体の親和性および特異性に匹敵する親和性および特異性で標的タンパク質に結合できるＲＮＡ、およびまたＤＮＡ分子を意味する。所望の標的に特異的なアプタマーを得る方法または同定する方法は、当該技術分野で知られている。好ましくは、これらの方法は、「試験管内進化法」（ＳＥＬＥＸ）の過程に基づくものであり得る（Ellington and Szostak, Nature, 1990, 346 : 818-822；Tuerk and Gold, 1990, Science 249: 505-510；Fitzwater & Polisky, 1996, Methods Enzymol. 267: 275-301）。例えば、出発ライブラリーの２’−フルオロピリミジンの使用、およびアプタマーの５’末端へのポリエチレングリコールの結合のような様々な化学的修飾を用いて、安定性を確かにし、アプタマーの生物学的利用能が増強され得る（例えば、Toulme 2000, Current Opinion in Molecular Therapeutics 2: 318-324参照）。
【００８３】
阻害剤はまた、抗体またはフラグメント、またはそれらの誘導体であり得る。本明細書で用いられる用語「抗体またはフラグメント、またはそれらの誘導体」は、ＵＳＦ１と特異的に結合する、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、１本鎖抗体、１本鎖Ｆｖ抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、またはＦａｂフラグメントを意味する。
【００８４】
最後に、本発明は、家族性混合型高脂血症（ＦＣＨＬ）、高コレステロール血症、高トリグリセリド血症、低αリポ蛋白血症、高アポβリポ蛋白血症（高アポＢ）、家族性脂質異常性高血圧症（ＦＤＨ）、メタボリックシンドローム、２型糖尿病、冠状動脈性心臓病、アテローム性動脈硬化症、または高血圧を含む高脂血症および／または異常脂質血症の処置用医薬組成物を製造するためのＵＳＦ１遺伝子の発現の活性化剤の使用に関するものであり、該活性化剤は小分子である。
【００８５】
参考文献
１．Goldstein, J.L., Schrott, H.G., Hazzard, W.R., Bierman, E.L. & Motulsky, A.G. Hyperlipidemia in coronary heart disease ll. Genetic analysis of lipid levels in 176 families and delineation of a new inherited disorder, combined hyperlipidemia. J. Clin. Invest. 52, 1544-1568 (1973).
２．Nikkila, E.A. & Aro, A. Family study of serum lipids and lipoproteins in coronary heart disease. Lancet 1, 954-959 (1973).
３．Genest, J.J. Jr. et al., Familial lipoprotein disorders in patients with premature coronary artery disease. Circulation 85, 2025-2033 (1992).
４． Pajukanta, P. et al. Linkage of familial combined hyperlipidemia to chromosome 1q21-q23. Nat. Genet. 18, 369-373 (1998).
５．Coon, H. et aL., Replication of linkage of familial combined hyperlipidemia to chromosome 1q with additional heterogenous effect of apolipoprotein A-I/C-III/A-IV locus : the NHLBI family heart study. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 20, 2275-2280 (2000).
６．Pei, W. et al., Support for linkage of familial combined hyperlipidemia to chromosome 1q21-q23 in Chinese and German families. Clin. Genet. 57, 29-34 (2000).
７．Allayee, A. et al., Locus for Elevated Apolipoprotein B Levels on Chromosome 1p31 in Families with Familial Combined Hyperlipidemia. Circ. Res. 90, 926-931 (2002).
８．Aouizerat, B.E. et al. A genome scan for familial combined hyperlipidemia reveals evidence of linkage with a locus on chromosome 11. Am. J. Hum. Genet. 65, 397-412(1999).
９．Pajukanta, P.et al. Genomewide scan for familial combined hyperlipidemia genes in Finnish families, suggesting multiple susceptibility loci influencing triglyceride, cholesterol and apolipoprotein B levels. Am. J. Hum. Genet. 64, 1453-1463 (1999).
１０．Elbein, S.C., Hoffman, M.D., Teng, K., Leppert,M.F. ; & Hasstedt, S.J. A genome-wide search for type 2 diabetes susceptibility genes in Utah Caucasians. Diabetes 48, 1175-1182 (1999). 
１１．Hanson, R.L. et al. An autosomal genomic scan for loci linked to type II diabetes mellitus and body-mass index in Pima Indians.Am. J. Hum. Genet. 634, 1130-1138 (1998).
１２．Vionnet, N., Hani, El.-H., Dupont, S., Gallina, S., Francke, S. & Dotte, S. Genomewide search for type 2 diabetes-susceptibility genes in French whites: evidence for a novel susceptibility locus for early-onset diabetes on chromosome 3q-qter and independent replication of a type 2-diabetes locus on chromosome 1q21-q24. Am. J. Hum. Genet. 67, 1470-1480 (2000).
１３．Wiltshire, S. et al. A genomewide scan for loci predisposing to type 2 diabetes in a U.K. population (the Diabetes UK Warren 2 Repository): analysis of 573 pedigrees provides independent replication of a susceptibility locus on chromosome 1q. Am. J. Hum. Genet. 69, 553-569(2001).
１４．Hsueh, W.C. et al. Genome-wide and fine-mapping linkage studies of type 2 diabetes and glicose traits in the Old Order Amish : evidence for a new diabetes locus on chromosome 14q11 and confirmation of a locus on chromosome 1q21-q24. Diabetes 52, 550-507(2003).
１５．Watanabe, R.M. et al. The Finland-United States investigation of non-insulin-dependent diabetes mellitus genetics (FUSION) study. II. An autosomal genome scan for diabetes-related quantitative-trait loci. Am. J. Hum. Genet. 67, 1186-1200 (2000).
１６．Castellani, L.W. et al. Mapping a gene for combined hyperlipidaemia in a mutant mouse strain. Nat. Genet. 18, 374-377 (1998).
１７．Bodnar, J.S. et al. Positional cloning of the combined hyperlipidemia gene Hyplipl. Nat. Genet. 30, 110-116 (2002).
１８．Salero, E., Gimenez, C. & Zafra, F. Identification of a non-canonical E-box motif as a regulatory element in the proximal promoter region of the apolipoprotein Ｅ gene. Biochem. J. 370, 979-986 (2003).
１９．Portois, L., Tastenoy, M., Viollet, B. & Svoboda, M. Functional analysis of the glucose response element of the rat glucagon receptor gene in insulin-producing INS-1 cells. Biochim. Biophys. Acta. 1574, 175-186 (2002).
２０．Yang, X.P. et al. The E-box motif in the proximal ABCA1 promoter mediates transcriptional repression of the ABCA1 gene. J. Lipid. Res. 43, 297-306 (2002).
２１．Smih, F. et al. Transcriptional regulation of adipocyte hormone-sensitive lipase by glucose. Diabetes 51, 293-300 (2002).
２２．Casado, M., Vallet, V.S., Kahn, A. & Vaulont, S. Essential role in vivo of upstream stimulatory factors for a normal dietary response of the fatty acid  synthase gene in the liver. J. Biol. Chem. 274, 2009-2013 (1999).
２３．Ribeiro, A., Pastier, D., Kardassis, D., Chambaz, J. & Cardot, P. Cooperative binding of upstream stimulatory factor and hepatic nuclear factor 4 drives the transcription of the human apolipoprotein A-II gene. J. Biol. Chem. 274, 1216-1225 (1999).
２４．Iynedjian, P.B. Identification of upstream stimulatory factor as transcriptional activator of the liver promoter of the glucokinase gene. Biochem. J. 333, 705-712 (1998).
２５．Soro, A., Jauhiainen, M., Ehnholm, C. & Taskinen, M.R. Determinants of low HDL levels in familial combined hyperlipidemia. J. Lipid Res. 44, 1536-1544 (2003).
２６．Risch, N. & Teng, J. The relative power of family-based and case-control designs for linkage disequilibrium studies of complex human diseases I. DNA pooling. Genome Res. 8, 1273-1288 (1998).
２７．Terwilliger, J.D. & Ott, J. A haplotype-based 'haplotype relative risk' approach to detecting allelic associations. Hum. Hered. 42, 337-346 (1992).
２８．Spielman, R.S., McGinnis, R.E. & Ewens, W.J. Transmission test for linkage disequilibrium : the insulin gene region and insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). Am. J. Hum. Genet. 52,506-516 (1993).
２９．Sinsheimer, J.S., Blangero, J. & Lange, K. Gamete competition models. Am. J. Hum. Genet 66, 1168-1172 (2000).
３０．Peltonen, L., Pekkarinen, P. & Aaltonen, J. Messages from an isolate: lessons from the Finnish gene pool. Biol. Chem. 376, 697-704 (1995).
３１．Rioux, J.D. et al. Genetic variation in the 5q31 cytokine gene cluster confers susceptibility to Crohn disease. Nat. Genet. 29, 223-228 (2001).
３２．Vallet, V.S. et al. Differential roles of upstream stimulatory factors 1 and 2 in the transcriptional response of liver genes to glucose. J. Biol. Chem. 7, 20175-20179 (1998).
３３．Wang, D. & Sul, H.S. Upstream stimulatory factor binding to the E-box at-65 is required for insulin regulation of the fatty acid synthase promoter. J. Biol. Chem. 272, 26367-26374 (1997).
３４．Pan, L. et al. Critical roles of a cyclic AMP responsive element and an E-box in regulation of mouse renin gene expression. J. Biol. Chem. 276, 45530-45538 (2001).
３５．Yanai, K., Saito, T., Hirota, K., Kobayashi, H., Murakami, K. & Fukamizu, A. Molecular variation of the human angiotensinogen core promoter element located between the TATA box and transcription initiation site affects its transcriptional activity. J. Biol. Chem. 272, 30558-30562 (1997).
３６．Barton, E.S. et al. Junction adhesion molecule is a receptor for reovirus. Cell 104, 441-451 (2001).
３７．Ostermann, G., Weber, K.S., Zernecke, A., Schroder, A. & Weber, C. JAM-1 is a ligand of the beta(2) integrin LFA-1 involved in transendothelial migration ofleukocytes. Nat. Immunol. 3,151-158 (2002).
３８．Enattah, N.S., Sahi, T., Savilahti, E., Terwilliger, J.D., Peltonen, L. & Javela,I. Identification of a variant associated with adult-type hypolactasia. Nat. Genet. 30, 233-237 (2002).
３９．Vakkilainen, J., Jauhiainen, M., Ylitalo, K., Nuotio, I.O., Viikari, J.S., Ehnholm, C. & Taskinen, M.R. LDL particle size in familial combined hyperlipidemia : effects of serum lipids, lipoprotein-modifying enzymes, and lipid transfer proteins. J. Lipid Res. 43, 598-603 (2002).
４０．Pielberg, G., Olsson, C., Syvanen, A.-C. & Andersson, L. Unexpectedly High Allelic Diversity at the. KIT Locus Causing Dominant White Color in the Domestic Pig. Genetics 160, 305-311 (2002).
４１．The Gene Ontology Consortium Gene Ontology : tool for the unification ofbiology. Nat. Genet 25, 25-29 (2000).
４２．Hosack, D.A., Dennis, G. Jr., Sherman, B.T., Lane, H.C., Lempicki, R.A. Identifying biological themes within lists of genes with EASE. Genome Biol. 4, R70.1-R70.8 (2003).
４３．Lathrop, G.M., Lalouel, J.-M., Julier, C.A. & Ott, J. Strategies for multilocus linkage analysis in humans. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 3443-3446 (1984).
４４．Cottingham, R.W., Jr, Idury, R.M. & Schlaffer, A.A. Faster sequential genetic linkage computations. Am. J. Hum. Genet 53, 252-263 (1993).
４５．Schaffer, A.A., Gupta, S.K., Shriram, K. & Cottingham, R.W., Jr. Avoiding recomputation in linkage analysis. Hum. Hered. 44, 225-237 (1994).
４６．Goring, H.H. & Terwilliger, J.D. Gene mapping in the 20th and 21st centuries: statistical methods, data analysis, and experimental design. Hum. Biol. 72, 63-132 (2000a).
４７．Goring, H.H. &Terwilliger, J.D. Linkage analysis in the presence of errors III : marker loci and their map as nuisance parameters. Am. J. Hum. Genet. 66, 1298-1309 (2000b).
４８．Terwilliger, J.D. A powerful likelihood method for the analysis of linkage disequilibrium between trait loci and one or morepolymorphic marker loci. Am.J. Hum. Genet. 56, 777-787 (1995).
４９．Laird, N., Horvath, S. & Xu, X. Implementing a unified approach to family based tests of association. Genet. Epidemiol. 19, 36-42 (2000).
５０．Martin, E.R., Bass, M.P., Gilbert, J.R., Pericak-Vance, M.A., & Hauser ER. Genet.Epidemiol. (2003, in press)
【００８６】
さらなる参考文献：１Ａから３３Ａ
１．Goldstein, J.L., Schrott, H.G., Hazzard, W.R., Bierman, E.L. & Motulsky, A.G. Hyperlipidemia in coronary heart disease.II. Genetic analysis of lipid levels in 176 families and delineation of a new inherited disorder, combined hyperlipidemia. J Clin Invest 52, 1544-68 (1973).
２．Nikkila, E.A. & Aro, A. Family study of serum lipids and lipoproteins in coronary heart-disease. Lancet 1, 954-9 (1973).
３．Wojciechowski, A.P. et al. Familial combined hyperlipidaemia linked to the apolipoprotein AI-CII-AIV gene cluster on chromosome 11q23-q24. Nature 349, 161-4 (1991).
４．Aouizerat, B.E. et al. Linkage of a candidate gene locus to familial combiined hyperlipidemia : lecithin : cholesterol acyltransferase on 16q. Arterioscler Thromb Vasc Biol 19, 2730-6 (1999).
５．Pajukanta, P. et al. Genomewide scan for familial combined hyperlipidemia genes in finnish families, suggesting multiple susceptibility loci influencing triglyceride, cholesterol, and apolipoprotein B levels. Am J Hum Genet 64, 1453-63 (1999).
６．Pajukanta, P. et al. Familial combined hyperlipidemia is associated with upstream transcription factor 1 (USF1). Nat Genet 36, 371-6 (2004).
７．Putt, W. et al. Variation in USF1 shows haplotype effects, gene : gene and gene: environment associations with glucose and lipid parameters in the European Atherosclerosis Research Study II. Hum Mol Genet 13, 1587-97 (2004).
８．Casado, M., Vallet, V.S., Kahn, A. & Vaulont, S. Essential role in vivo of upstream stimulatory factors for a normal dietary response of the fatty acid synthase gene in the liver. J Biol Chem 274, 2009-13 (1999).
９．Ribeiro, A., Pastier,D., Kardassis, D., Chambaz, J. & Cardot, P. Cooperative binding of upstream stimulatory factor and hepatic nuclear factor 4 drives the transcription of the human apolipoprotein A-II gene. J Biol Chem 274, 1216-25 (1999).
１０．Groenen, P.M. et al. Structure, sequence, and chromosome 19 localization of human USF2 and its rearrangement in a patient with multicystic renal dysplasia. Genomics 38, 141-8 (1996).
１１．Horikawa, Y. et al. Genetic variation in the gene encoding calpain-10 is associated with type 2 diabetes mellitus. Nat Genet 26, 163-75 (2000).
１２．Rioux, J.D. et al. Genetic variation in the 5q31 cytokine gene cluster confers susceptibility to Crohn disease. Nat Genet 29, 223-8 (2001).
１３．Yang, X.P. et al. The E-box motif in the proximal ABCA1 promoter mediates transcriptional repression of the ABCA1 gene. J Lipid Res 43, 297-306 (2002).  １４．Yanai, K. et al. Molecular variation of the human angiotensinogen core promoter element located between the TATA box and transcription initiation site affects its transcriptionalactivity. J Biol Chem 272, 30558-62 (1997).
１５．Salero, E., Gimenez, C. & Zafra, F. Identification of a non-canonical E-box motif as a regulatory element in the proximal promoter region of the apolipoprotein Ｅ gene. Biochem J 370, 979-86 (2003).
１６．Nowak, M. et al. Insulin mediated down-regulation of the Apolipoprotein A5 gene expression through the Phosphatidylinositol 3-kinase pathway : Role of the Upstream Stimulatory Factor. Molecular and Cellular Biology (2004, accepted).
１７．Wallace, T.M., Levy, J.C. & Matthews, D.R. Use and abuse of HOMA modeling. Diabetes Care 27, 1487-95 (2004).
１８．Lopez-Casillas, F., Ponce-Castaneda, M.V. & Kim, K.H. In vivo regulation of the activity of the two promoters of the rat acetyl coenzyme-A carboxylase gene. Endocrinology 129, 1049-58 (1991).
１９．Mootha, V.K. et al. PGC-1alpha-responsive genes involved in oxidative phosphorylation are coordinately downregulated in human diabetes. Nat Genet 34, 267-73 (2003).
２０．Dyrskjot, L. et al. Identifying distinct classes of bladder carcinoma using microarrays. Nat Genet 33, 90-6 (2003).
２１．Zhao, Q. et al. Essential Role of vascular endothelial growth factor in angiotensin II-induced vascular inflammation and remodeling. Hypertension 44, 264-70 (2004).
２２．Oram, J.F. ATP-binding cassette transporter A1 and cholesterol trafficking. Curr Opin Lipidol 13, 373-81 (2002).
２３．Brooks-Wilson, A. et al. Mutations in ABC1 in Tangier disease and familial high-density lipoprotein deficiency. Nat Genet 22, 336-45 (1999).
２４．Zhang, S.H., Reddick, R.L., Piedrahita, J.A. & Maeda, N. Spontaneous hypercholesterolemia and arterial lesions in mice lacking apolipoprotein E. Science258, 468-71 (1992).
２５．Beisiegel, U., Weber, W. & Bengtsson-Olivecrona, G. Lipoprotein lipase enhances the binding of chylomicrons to low density lipoprotein receptor-related protein. Proc Natl Acad Sci USA 88, 8342-6 (1991).
２６．Mahley, R.W. Apolipoprotein E : cholesterol transport protein with expanding role in cell biology. Science 240, 622-30 (1988).
２７．Shimano, H. et al. Overexpression of apolipoprotein E in transgenic mice: marked reduction in plasma lipoproteins except high density lipoprotein and resistance against diet-induced hypercholesterolemia. Proc Natl Acad Sci USA 89, 1750-4 (1992).
２８．Wilhelm, M.G. & Cooper, A.D. Induction of atherosclerosis by human chylomicron remnants : a hypothesis. J Atheroscler Thromb 10, 132-9 (2003).
２９．Kypreos, K.E., Li,X., van Dijk, K.W., Havekes, L.M. & Zannis, V.I. Molecular mechanisms of type III hyperfipoproteinemia : The contribution of the carboxy-terminal domain of ApoE can account for the dyslipidemia that is associated with the E2/E2 phenotype. Biochemistry 42, 9841-53 (2003).
３０．Rall, S.C., Jr. & Mahley, R.W. The role of apolipoprotein E genetic variants in lipoprotein disorders. J Intern Med 231, 653-9 (1992).
３１．Heeren, J. et al. Impaired recycling of apolipoprotein E4 is associated with intracellular cholesterol accumulation. J Biol Chem (2004).
３２．Ha, J. et al. Cloning of human acetyl-CoA carboxylase cDNA. Eur J Biochem 219, 297-306 (1994).
３３．Soro, A. et al. Genome scans provide evidence for low-HDL-C loci on chromosomes 8q23,16q24.1-24.2, and 20q13.11 in Finnish families. Am J Hum Genet 70, 1333-40 (2002).
【００８７】
実施例は、本発明を説明するものである。
実施例１：実施例２から５の実験の概略
分析した全てのＦＣＨＬ家族が、重度のＣＨＤおよび脂質表現型を有する発端者、および平均５〜６人のＦＣＨＬ罹患家族構成員を有していた。極端かつ十分に定義された表現型を示すこれらのＦＣＨＬ家族を分析して、１ｑ２１上のＦＣＨＬに関与する根本的な遺伝子を同定した。本発明者等は、局所候補遺伝子アプローチを選択し、１ｑ２１上の４つの機能上関連する局所候補遺伝子について配列決定した。ＴＸＮＩＰ、ＵＳＦ１、レチノイドＸ受容体γ（ＲＧＲＧ）、およびアポリポタンパク質Ａ２（ＡＰＯＡ２）遺伝子を配列決定し、可能性のある変異体全てを同定した。これらのうち、まずＴＸＮＩＰが最も有望な位置候補遺伝子であることを示した。なぜならそれはマウスにおける混合型高脂血症表現型を示したからである（参考文献１７）。さらに３種の局所遺伝子を、それらの機能上の候補およびオリジナルの最高連鎖マーカーＤ１Ｓ１０４およびＤ１Ｓ１０４と隣接する位置（＜２．５Ｍｂ）に基づき選択し、配列決定した（図１）。並行して、本発明者等は機能上無作為な遺伝子アプローチを利用し、最高連鎖マーカー付近の遺伝子の最初のＳＮＰセットの関連について試験した。１ｑ２１上の２６遺伝子について、合計６０種のＳＮＰの遺伝子型を特定した。これらのＳＮＰのうち５０個は、Ｄ１Ｓ１０４およびＤ１Ｓ１６７７に隣接する５．８Ｍｂ内に位置していた。オリジナルの連鎖研究の３１家族（参考文献４）を含む４２のＦＣＨＬ家族の２３８人の構成員において全６０種のＳＮＰ、および６０のＦＣＨＬ家族の７２１人の家族構成員の拡大試料において最も有望な１０種のＳＮＰの遺伝子型を特定した（以下参照）。６０種のＳＮＰの結果を補充の表１において示す。
【００８８】
補充の表１  ２ポイントの連鎖において得た６０種の遺伝子型を同定したＳＮＰおよび関連する分析の結果  ４種の特性全てを分析した：全ての患者について、ＦＣＨＬおよびＴＧ特性、ならびに罹患男性について、ＦＣＨＬおよびＴＧ特性。
２ポイントの連鎖分析（詳細については方法を参照）においてロッドスコアを、そしてＨＨＲＲ試験を用いた関連する分析においてｐ−値を得た。Ｎｆは、ｄｂＳＮＰまたはＣｅｌａｒａデータベースにおいて見出されなかったことを示す。これらのＳＮＰについてのＳＮＰ情報を公的データベース（ｄｂＳＮＰ）に登録する予定である。６０の拡大したＦＣＨＬ家族において、太字で示したＳＮＰの遺伝子型を特定した。他の結果全てが、４２の中心的ＦＣＨＬ家族において得たものである。また、０．０５未満のｐ−値を太字で示し、ｎｓは有意でないことを示す（ｐ−値が０．０５より大きい）。
【００８９】
【表１】
2008506354.tif 000002
【表２】
2008506354.tif 000003
【表３】
2008506354.tif 000004
【表４】
2008506354.tif 000005
【００９０】
実施例２：候補遺伝子としてのＵＳＦ１遺伝子
本発明者等は、ＵＳＦ１遺伝子の５６８７ｂｐの配列について、計２３種のＳＮＰを同定した（補充の表２）：これらのうち３種はエクソン中のサイレント変異体であり、残りは非コード領域および推定プロモーターに位置するものであった。２３種のＳＮＰのうち８種が新規であった。本発明者等はまず、ＵＳＦ１遺伝子の３種のＳＮＰの遺伝子型を同定した：ｕｓｆ１ｓ１（エクソン１１）、ｕｓｆ１ｓ２（イントロン７）、およびｕｓｆ１ｓ７（エクソン２）（遺伝子型を同定したＳＮＰの対応するｒｓ数を表２〜３に示す）。
【００９１】
表１．ＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ１（＝ｒｓ３７３７７８７）およびｕｓｆ１ｓ２（＝ｒｓ２０７３６５８）についてのマルチポイントＨＨＲＲおよび配偶子間の競争分析
全ての値は、両ＳＮＰの同時分析のｐ−値を表す。ｎｓは有意でないことを示す。初めに示したｐ−値は、６０の拡大したＦＣＨＬ家族において得たものであり、括弧に示す値は、４２の中心的ＦＣＨＬ家族において得たものである。少なくとも５０，０００回のシミレーションを用いて、６０の拡大したＦＣＨＬ家族においてのみジーンドロッピングをを行った。上記の配偶子間の競争分析の全てにおいて、分離ハプロタイプは１−１（１は、共通するアリールを示す）であった。
【００９２】
【表５】
2008506354.tif 000006
【００９３】
補充の表２  ＦＣＨＬを有するＴＸＮＩＰの関連性および連鎖分析
ロッドは、ＭＬＩＮＫプログラムおよび基本モードの遺伝的形質を用いたパラメーター２ポイントまたはマルチポイント連鎖分析の最高ロッドスコアを示す（組換え画分を括弧内に示す）。ＡＳＰは、罹患同胞対解析にて得たロッドスコアを示し；配偶子は、配偶子間の競争分析にて得たｐ−値を示し；ＨＨＲＲおよびマルチ−ＨＨＲＲは、ハプロタイプベースのハプロタイプ関連リスク分析において得たｐ−値を示し；そしてＨＢＡＴは、ＴＸＮＩＰハプロタイプ間試験のｐ−値、およびＦＣＨＬ特性を示す。ｎｓは有意でないことを示す。ＴＧ特性について、関連する分析の全ての対応ｐ−値は依然として有意でなく、２ポイントおよびマルチポイントロッドスコアの両方が＜１．５であった。新規ＳＮＰ２のナンバリングは、２００３年７月のＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＢｒｏｗｓｅｒのＴＸＮＩＰ領域のゲノム配列に基づくものである。６０のＦＣＨＬ家族由来の７２１人の家族構成員からなる拡大試料において、これらのＳＮＰの全ての遺伝子型を同定した。
【００９４】
【表６】
2008506354.tif 000007
【００９５】
ｕｓｆ１ｓ１およびｕｓｆ１ｓ２は、ＦＣＨＬについて最大ロッドスコア３．５および２．０、およびＴＧについて３．７および２．０を有する４２のＦＣＨＬ家族における連鎖の証拠をもたらした。これらのＳＮＰの組み合わせ分析も、ＦＣＨＬ（ｐ＝０．００５）およびＴＧ（ｐ＝０．００８）について配偶子の競合と関連する証拠をもたらした（表１）が、個々のＳＮＰの結果は有意なものではなかった。本発明者等は、罹患男性と非罹患男性との間のアリール頻度、特に、ＴＧ特性の相違も観察した。ｕｓｆ１ｓ１のマイナーアリールの頻度は、ＴＧ−罹患男性において２２．０％、そして非罹患男性家族構成員において４０％であった。これらの罹患および非罹患家族構成員は、独立した男性群を表すので、本発明者等は、家族ベースの関連性、ＨＨＲＲおよびマルチ−、および配偶子の競争を用いて、ＴＧ罹患男性においてｕｓｆ１ｓ１およびｕｓｆ１ｓ２を試験し：ＨＨＲＲ分析において、ｐ−値０．０１および０．０２を、そして４２の中心的ＦＣＨＬ家族の配偶子の競争試験において０．００８および０．０２を得た（表２）。これらのＳＮＰの組合せ分析は、ＨＨＲＲ試験においてｐ−値０．０００３を、そして男性のＴＧについての配偶子の競争試験において０．００４を生じた（表１）。
【００９６】
表２．男性におけるＴＧおよびＦＣＨＬについてのＪＡＭ１−ＵＳＦ１領域の個々のＳＮＰの関連性分析
全結果はｐ−値を表し、ｎｓは有意でないことを示し、ＨＨＲＲは、ハプロタイプベースのハプロタイプ関連リスク試験を示し、そして配偶子は、配偶子間の競争試験を示す。最後の列のＬＤクラスター数は、高ＴＧ（＞９０  人口パーセンタイル）を有する男性発端者における強力な内部マーカーＬＤ（ｐ＜０．００００２）を示すＳＮＰクラスターを示す。すなわち、同じクラスター数を有するＳＮＰは、強力な対ＬＤにおけるものである。６０を超えるＦＣＨＬ家族において、太字で示すＳＮＰの遺伝子型を特定し、括弧内の値は、４２の中心的ＦＣＨＬ家族において、これらのＳＮＰについて得たものである。他の結果全てを、４２の中心的ＦＣＨＬ家族において得た。
【００９７】
【表７】
2008506354.tif 000008
【００９８】
補充の表３  オリジナルの連鎖研究（参考文献３）の３１人のＦＣＨＬ発端者におけるＵＳＦ１遺伝子配列決定により同定した変異体
【００９９】
【表８】
2008506354.tif 000009
【０１００】
【表９】
2008506354.tif 000010
【０１０１】
ＦＣＨＬ家族において、下線を引いた変異体の遺伝子型を特定した。これらのＳＮＰについて、本明細書および表１〜３で用いた数ｕｓｆ１ｓ１〜ｓ９も示す；新規とは、ＳＮＰデータベースで見出されなかったＳＮＰを示す。新規ＳＮＰのナンバリングは、２００３年７月のＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  ＢｒｏｗｓｅｒのＵＳＦ１のゲノム配列（ｒｅｆＧｅｎｅ＿ＮＭ＿００７１２２）に基づくものである。
【０１０２】
次に、本発明者等は、より多くの研究試料である６０の拡大したＦＣＨＬ家族において、これら２種の関連ＳＮＰであるｕｓｆ１ｓ１およびｕｓｆ１ｓ２の遺伝子型を特定した。さらにＵＳＦ１領域について、１２種のＳＮＰの遺伝子型を特定した（表２、図１）。配列決定により同定した２３種のＳＮＰのうち、本発明者等は、３人以下の個体に存在する６種の希なＳＮＰを除き、ＳＮＰ全ての遺伝子型を同定したが、これは３１人の発端者の強力なＬＤには存在しなかった（補充の表２）。中心的な研究試料における有望な結果および／またはＬＤパターンに基づき、６０の拡大家族において４種のＵＳＦ１  ＳＮＰ全ての遺伝子型を特定した（表２）。６０の拡大ＦＣＨＬ家族において遺伝子型を特定する場合、２種の個々のＳＮＰであるｕｓｆ１ｓ１およびｕｓｆ１ｓ２は、男性のＴＧについてＨＨＲＲ試験においてｐ−値０．０００９および０．００２を、ならびに配偶子間の競争試験において０．００００１および０．０００６を生じた（表２）。両ＳＮＰの共通アリールは、両試験の罹患個体にＦＣＨＬおよびＴＧ特性を伴ってより高頻度で遺伝した。男性のＴＧについてのこれらの２種のＳＮＰの組合せた分析の漸近的ｐ−値は、ＨＨＲＲにおいて０．００００３、そして組合せた配偶子間の競争試験において０．００００００９であった（表１）。分離ハプロタイプは１−１（１は、共通アリールを示す）であった。全てのＴＧ罹患家族構成員について、組合せた分析も、ＨＨＲＲにおけるｐ−値０．０５および配偶子間の競争試験におけるｐ−値０．００００６、加えて分離ハプロタイプ１−１と関連する証拠を提供した（表１）。
【０１０３】
配偶子間の競争の結果が実際に有意であり、分散データのような関与因子によって偏らないことを確かめるために、本発明者等は、少なくとも５０，０００シミレーションを伴うジーンドロッピング（方法を参照）を用いて、複数のＳＮＰ（表１）に関与する全配偶子間の競争分析についての経験的ｐ−値を計算した。得られた経験的ｐ−値は、配偶子間の競争分析の経験的ｐ−値と非常によく一致した（表１）。このことは、観察された結果が、分散データを伴う漸近的近似のアーチファクトを表さないことを示す。
【０１０４】
ＵＳＦ１領域の計１５種のＳＮＰの遺伝子型を同定した後、本発明者等は、高ＴＧを有する男性において少なくとも４６ｋｂに達し、セントロメアジャンクション接着分子１（ＪＡＭ１）遺伝子からＵＳＦ１遺伝子に及ぶ関連性およびＬＤパターンを同定した（図１および表２）：ｕｓｆ１ｓ１およびｕｓｆ１ｓ２に加えて、他の３種のＳＮＰ、ｊａｍ１ｓ１、ｊａｍ１ｓ４、ｊａｍ１ｓ５も、男性における高ＴＧについて、４２の中心的ＦＣＨＬ家族における関連性の証拠を示した（表２）。これらの３種のＳＮＰは、ｕｓｆ１ｓ１およびｕｓｆ１ｓ２（ｐ＜０．００００２）を有する強力なＬＤにおいて存在した。ＪＡＭ１−ＵＳＦ１領域のＳＮＰについてＧｅｎｅｐｏｐプログラムにより試験したＬＤパターンを表２に示す。これら５種のＳＮＰに加えて、ＵＳＦ１のイントロン１中の１つのＳＮＰ（ｕｓｆ１ｓ８）が、十分な関連性の証拠を示した（表２）。このＳＮＰは、１４種の他のＳＮＰのいずれかを有するＬＤにおいては存在しなかった（表２）。
【０１０５】
全ての罹患家族構成員において、ＦＣＨＬおよびＴＧ特性両方を用いた関連性の証拠は、ＵＳＦ１遺伝子内のｕｓｆ１ｓ１およびｕｓｆ１ｓ２（表２）に限定された。ＪＡＭ１−ＵＳＦ１領域について遺伝子型を同定した残りの１３種のＳＮＰは、関連性の有意な証拠をもたらさなかった。しかしながら、本発明者等は、配列決定により同定したそれらの２３種のＳＮＰのうちさらに２種のＵＳＦ１  ＳＮＰであるイントロン３におけるｒｓ２０７３６５５およびイントロン６におけるｒｓ２０７３６５６も、３１人のＦＣＨＬ発端者において関連するｕｓｆ１ｓ２を有する全ＬＤに存在し、ＦＣＨＬ関連領域がＵＳＦ１のイントロン３に及ぶようであると観察した。ＪＡＭ１−ＵＳＦ１領域の外側に生じるＳＮＰとの関連性は得られなかった（補充の表１）。結論として、関連性およびＬＤの証拠は、ＦＣＨＬ家族の罹患個体全てのＵＳＦ１遺伝子内の１２３９ｂｐ領域に限定されるが、高ＴＧを有する男性のＪＡＭ１−ＵＳＦ１領域内の少なくとも４６ｋｂに及ぶ（表２〜３、図１）。
【０１０６】
ＦＣＨＬおよびＴＧについての有意なハプロタイプを生じるｕｓｆ１ｓ１−ｕｓｆ１ｓ２  ＳＮＰの組合せも、さらに３種の定性的脂質特性：高アポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）、高ＴＣ、および小分子低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）ピーク粒子直径を用いて試験した。配偶子間の競争分析において、全ての罹患個体および罹患男性の感受性のあるハプロタイプ１−１について、アポＢについてのｐ−値０．００００３および０．０００７を得た。ＴＣについて、ｐ−値は０．０００１および０．００７であり；そしてＬＤＬピーク粒子直径は、それぞれ０．００２および０．０１であった。これらの結果は、ＦＣＨＬについて得られた結果と共に、根底にある遺伝子がＴＧのみには影響しないが、複雑なＦＣＨＬ表現型に影響することを示唆する。
【０１０７】
実施例３：ＪＡＭ１−ＵＳＦ１遺伝子領域のハプロタイプ分析
ＨＢＡＴプログラムを用いて、本発明者等は、ｕｓｆ１ｓ１およびｕｓｆ１ｓ２の領域において共有されるハプロタイプの証拠を得た（表３）。この知見は、マルチポイントＨＨＲＲ分析により支持された（表３）。ハプロタイプ１−１（１は、共通アリールを示す）について、−ｏオプションを用いてｐ−値０．０００７を得た。
【０１０８】
表３．ＨＭＡＴプログラムを用いたＴＧ罹患男性におけるハプロタイプ分析（多遺伝視座−ＰＤＴおよびマルチ−ＨＨＲＲ結果を比較のため下部に示す）
ＳＮＰ  ｊａｍ１ｓ４−ｓ６およびｕｓｆ１ｓ１−ｓ５のＳＮＰ間距離および対応するｒｓ数を表２に示す；１は共通アリールを示し、ｎｓは有意でないことを示す。ＨＢＡＴプログラムのｐ−値は、特定のハプロタイプがオプション−ｏ（オフセットを最適化する）またはオプション−ｅ（経験的試験）を用いて罹患個体に遺伝する確率を示す。多遺伝子座−ＰＤＴは、一般家系の遺伝子型に基づく関連性を示す。マルチ−ＨＨＲＲ分析は、ＳＮＰの遺伝アリールと非遺伝アリールとの間のマーカーアリール分布の均一性の仮説を試験する。
【０１０９】
【表１０】
2008506354.tif 000011
【０１１０】
このオプションは、感受性ハプロタイプの罹患患者への優性遺伝ばかりでなく、非罹患患者への程度を抑えた優性遺伝も測定する。これらの拡大した家族において、非罹患患者も重要な情報を含有するので、それは有用となる。連鎖を付与する関連性の試験であるＨＢＡＴ−ｅオプションの結果も表３に示す。この試験の統計は連鎖情報の状態を暗に示すものなので、それはよりいっそう強力ではなく、低減したｐ−値となる。しかしながら、これはＨＨＲＲ分析の結果と一体となって、本発明者等に１−１ハプロタイプは表現型と関連すると結論づけさせる（表３）。さらに、ハプロタイプ２−２は、罹患対象に有意に低く遺伝される（ｐ＝０．００４）。これは、このアリールの保護機能を示唆している。これらの結果は、一般家系（遺伝子型−ＰＤＴ）の遺伝子型に基づく関連性試験（これは、関連性の証拠（表３）をもたらす）、ならびに同じハプロタイプ１−１がＦＣＨＬおよびＴＧ特性両方を有する罹患個体に分離する、配偶子間の競争分析（表１）によりサポートされる。
【０１１１】
実施例４：脂肪生検の発現プロファイルおよび初期機能分析
本発明者等は、ＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ１およびｕｓｆ１ｓ２により構成される感受性ハプロタイプ１−１を有する６人の罹患ＦＣＨＬ家族構成員由来の脂肪生検遺伝子発現プロファイルが、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧＵ１３３Ａプローブアレイを用いて、推定保護ハプロタイプ２−２（上記参照）ホモ接合性罹患ＦＣＨＬ家族構成員４人と比較したとき、相違を示すかどうかを調べた。ＵＳＦ１は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  ＨＧＵ１３３Ａチップ上では十分に表されないので、本発明者等は、ＵＳＦ１が脂肪組織において発現するかどうかも具体的に調べた。ＲＴ−ＰＣＲを用いて、ＵＳＦ１が脂肪生検試料において発現することを見出した（データは示していない）。定量的リアルタイムＰＣＲも行い、リスクハプロタイプを有する罹患ＦＣＨＬ家族構成員、およびリスクハプロタイプを有さない罹患構成員の脂肪組織におけるＵＳＦ１相対的発現レベルを決定した。ＵＳＦ１発現レベルの検出可能な差は観察されなかった。これは、ＵＳＦ１のＦＣＨＬ関連アリールの可能性のある機能的有意性は、脂肪組織の定常状態の転写レベルに対する直接的効果を介してデリバリーされないことを示唆している。
【０１１２】
入手可能な試料の数は限られているので、ハプロタイプ群の遺伝子発現の差を検出する統計的検出力は有意であるとはみなされない。それゆえ代わりとして、本発明者等は、有意差と実験手順における技術的または生物学的ノイズに起因する差を区別するためにカットオフ値を定義した（方法を参照）。これらの基準を用いて、本発明者等は、感受性ハプロタイプ保因者において、アップレギュレーションを示す２５遺伝子、およびダウンレギュレーションを示す７３遺伝子を同定した（完全なリストは、本発明者等のウェブサイトで入手可能となるが、未処理のデータは、ＧＥＯアクセション番号ＧＳＥ５９０を用いてＮＣＢＩのＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓを通じてアクセス可能である）。これらの知見に生物学的妥当性を付与するために、Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＥＡＳＥ）ツールを用いて、遺伝子オントロジー（ＧＯ）コンソーシアムにより定義された機能的分類の過剰出現について、差次的発現遺伝子を調べた。３分類のみが、アップレギュレーションされる遺伝子（主に脂肪代謝に関与する遺伝子を意味する）間で統計上有意に過剰出現することが見出された（図２）。ダウンレギュレーションされる遺伝子間で、免疫応答遺伝子の顕著なダウンレギュレーションを観察した（図２）。対応するＥＡＳＥスコア（ｐ−値）を含むＥＡＳＥ分析の全結果、および有意（＝ｐ−値＜０．０５）な機能カテゴリーの遺伝子リストを、補充の表３ａ〜ｂに示す。
【０１１３】
次に、本発明者等は、ハプロタイプ１−１に隣接するゲノム配列を調べ、次の９１ヒト遺伝子において見出された６０ｂｐの配列エレメントを同定した：ハプロタイプ１−１の一部を形成するＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ２（３０６ｂｐのＡｌｕＳｘ反復に隣接する残基（８ｂｐ））。このＡｌｕＳｘ反復の２つの部分（２〜６１ｂｐ、および１３７〜１９６ｂｐ）は、マウス反復との配列類似性を示す（図３ａ）。マウス配列データベースで検索した場合、Ｂ１エレメントはマウスｍＲＮＡの非翻訳領域に位置するので、ＡｌｕＳｘ配列のこれら２つの部分は多数のＥＳＴを同定する。ヒト配列データベースで検索した場合、ＵＳＦ１を含む９１ヒト遺伝子は、コード鎖（４３遺伝子）または逆鎖（４８遺伝子）のいずれかにＡｌｕＳｘのこの６０ｂｐ部分を有する。フグおよび線虫（Caenorhabeditis elegans）で見出されるが、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）および酵母（Saccharomyces cerevisiae）では見出されないので、該６０ｂｐ部分はヒトから虫で高度に保存される。９１ヒト遺伝子の全リスト、ならびにそれらの個々のｐ−値および同一性パーセンテージ（８３〜９８％の間）を補充の表４に示す。９１遺伝子のドメイン注釈の分析は、タンパク質修飾に関与するドメイン（ｎ＝１６）および核酸と関連するドメイン（ｎ＝３５）の濃縮を示す。この知見は、生物学的過程について利用可能な注釈（大部分の遺伝子が核酸代謝（ｎ＝１８）、ならびに転写およびシグナル伝達（ｎ＝３３）に関与する）によってもサポートされる。
【０１１４】
この保存された６０ｂｐ  ＤＮＡエレメントの機能的有意性の証拠を得るために、本発明者等は、重要な６０ｂｐ配列ならびにｕｓｆ１ｓ２  ＳＮＰ領域を含有する２６８ｂｐ長のコンストラクトを生成し、ＳＥＡＰレポーターシステムを用いて、インビトロでその調節機能を試験した（図３ｂ）。１人のホモ接合性感受性保因者（ハプロタイプ１−１）および１人のホモ接合性非保因者（２−２）由来のゲノムＤＮＡを、ＳＥＡＰ受容体遺伝子の前に２方向でクローニングした。レポーター遺伝子の転写に対する効果は、両コンストラクトにおけるフォワード方向にて関与し、一方リバース方向は、負対照に匹敵する転写効率となった（図３ｂ）。
【０１１５】
補充の表４ａ  ＥＡＳＥツール（参考文献２７）を用いた機能的カテゴリーの過剰出現についてのハプロタイプ保因者と非保因者との間の差次的発現遺伝子を含むリストの分析結果  この補充の表４ａ〜ｂを本発明者等のウェブサイトに示す予定である。機能的カテゴリーによるこれらの遺伝子の図式的分布については図２を参照されたい。
【０１１６】
【表１１】
2008506354.tif 000012
【表１２】
2008506354.tif 000013
【表１３】
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【表１４】
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【表１５】
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【表１６】
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【０１１７】
１遺伝子オントロジー（ＧＯ）分類による、生物学的過程（参考文献４１）  略語：ＬＨ−リストにヒット、ＬＴ−全リスト、ＰＨ−集団ヒット、ＰＴ−全集団、およびＥＡＳＥ−Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（参考文献４２）  それぞれの機能カテゴリーの遺伝子の全リストは、本発明者等のウェブサイトにて提示する予定である。
【０１１８】
補充の表４ｂ  上記表３ａにおける有意（＝ＥＡＳＥ  ｐ−値＜０．０５）な機能的カテゴリーの遺伝子リスト  この補充の表４ａ〜ｂを本発明者等のウェブサイトにて示す予定である。
【０１１９】
【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
2008506354.tif 000020
【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
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【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【表３８】
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【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【０１２０】
この実験の目的は、ｕｓｆ１ｓ１  ＳＮＰがＦＣＨＬの直接的原因であるかどうかを解くことではない。１つの非コードＳＮＰの機能的有意性について結論を下す前に、より複雑な機能的研究を行うことが必要である。しかしながら、異種間の保存と組み合わせたこれらの予備的データは、感受性ハプロタイプに隣接するＤＮＡ領域が、転写の調節に影響するエレメントを含有することを意味する。データはまた、エレメントが方向依存性エンハンサーエレメントよりむしろ、おそらくＣｉｓ作用性制御因子であることを示唆する。
【０１２１】
実施例５：実施例１から４における実験の設定−方法
フィンランドのＦＣＨＬ家族は、既に記載（参考文献４、９）の通りHelsinki, Turku and Kuopio University Central Hospitalsにおいて見出された。それぞれの対象者は、研究への参加に先立ち書面のインフォームドコンセントを受けた。全ての試料をヘルシンキ宣言に従い採取し、加入センターの倫理委員会が研究の計画を承認した。ＦＣＨＬ発端者の組み入れ基準は、次の通りである（参考文献４）：１）血清ＴＣおよび／またはＴＧ＞９０人口（age-sex）特定フィンランド人集団パーセンタイル（参考文献４）（発端者が上昇した脂質特性のみを有している場合、一等親血縁者は組み合わされた表現型；２を有する）；２）年齢  男性＜３０歳かつ＜５５歳、女性＜６５歳；３）冠動脈造影における１ヶ所以上の冠動脈の少なくとも５０％の狭窄。ＦＣＨＬ発端者の除外基準は、１型糖尿病、肝疾患または腎疾患、および甲状腺機能低下症であった。リンパ球培養法により発端者のＬＤＬ受容体の状態を決定することで、家族性高コレステロール血症をそれぞれの家系から除外した（参考文献４）。上記基準を完全に満たした場合、少なくとも２人の罹患構成員を有する家族を研究に組み入れ、受入可能な家族構成員全てを調べた。２種類の特性：ＦＣＨＬおよびＴＧを分析した。National Public Health Institute, Finlandのウェブサイトから入手可能な高ＴＣおよび高ＴＧについてのフィンランド人口特定９０パーセンタイルを用いて、本発明者等のオリジナルの連鎖研究（参考文献４）におけるものと同じ診断基準により、家族構成員を罹患と記録した。これらの確認基準は、オリジナルの基準と非常に類似する（参考文献１）。ＴＧ分析については、ＴＧ濃度＞９０フィンランド人口特定集団パーセンタイルを有する家族構成員を罹患と記録した。ＦＣＨＬおよびＴＧ特性に加えて、ＦＣＨＬおよびＴＧ特性の有意なハプロタイプとなるｕｓｆ１ｓ１−ｕｓｆ１ｓ２  ＳＮＰの組合せも、アポリポタンパク質Ｂ（アポＢ）、ＬＤＬピーク粒子径、およびＴＣ特性を用いて分析した。アポＢおよびＴＣについては、National Public Health Institute, Finlandのウェブサイトから公的に入手可能な９０人口特定フィンランド集団パーセンタイルを用いた。ＬＤＬピーク粒子径については、カットポイント２５．５ｍｍを用いて、小さなＬＤＬ粒子を有する個体を罹患と記録した。ＬＤＬ−ＣはＦＣＨＬの重要な成分特性であるが、フィンランド人ＦＣＨＬ家族の確認、ならびにＵＳＦ１感受性ハプロタイプ形成ＳＮＰの統計的分析においては血清ＴＣが代わりに用いられる。この理由は、有意な高トリグリセリド血症はＦＣＨＬと有意に関連するからである。一般に、ＴＧがオーバーしたとき（しばしば、高トリグリセリド血症のＦＣＨＬ家族構成員の場合である）は、Ｆｒｉｅｄｅｗａｌｄの式は推奨されない。加えて、この因子を含む場合のＬＤＬ−Ｃの集団パーセンタイルポイントが確立されているので、本発明者等は現時点でＬＤＬ−Ｃの集団パーセンタイルを有していない。
【０１２２】
生化学分析
血清脂質パラメーターおよびＬＤＬピーク粒子径を既に記載の通り測定した（参考文献４、９、３９）。脂質降下剤を用いている発端者または高脂血症の血縁者については、処置を４週間ひかえた後に調べた。６０のＦＣＨＬ家族において、それぞれ家族構成員７２１人および７７１人について、ＤＮＡおよび脂質測定値を入手した。これらの６０のＦＣＨＬ家族において、２２０人がＴＣ＞９０人口特定フィンランド人集団パーセンタイルを有し、３２１人がＴＣおよび／またはＴＧ＞９０人口特定パーセンタイルを有し、および１２５人がＴＣおよびＴＧ共に＞９０人口特定パーセンタイルを有していた。全部で９６人の男性、および１２４人の女性が高ＴＧを示した（＞人口９０パーセンタイル）。
【０１２３】
配列決定、遺伝子型特定、および配列注釈
ＴＸＮＩＰ遺伝子を６０人のＦＣＨＬ発端者において配列決定し、ＡＰＯＡ２、ＲＸＲＧ、およびＵＳＦ１遺伝子をオリジナルの連鎖研究（参考文献４）の３１人の発端者において配列決定した。ＴＸＮＩＰおよびＵＳＦ１については、遺伝子の５’末端から２０００ｂｐ上流も配列決定した。ＵＳＦ１については、残る２９人の発端者において、ＤＮＡ結合ドメインも配列決定した。巨大な４４，２６１ｂｐのＲＸＲＧ遺伝子（エクソンおよび１００ｂｐのエクソン−イントロン境界部のみ配列決定した）を除き、全ての遺伝子についてエクソンおよびイントロンの両方を配列決定した。ヘテロ接合性を確実に同定するために両方向で配列決定した。わずかに修飾したＢｉｇ  Ｄｙｅ  Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ  Ｃｙｃｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇプロトコール（Applied Biosystems）に従い配列を決定し、試料を自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ  ３７７ＸＬ（Applied Biosystems）を用いて分類した。シークエンサーのソフトウェア（GeneCodes）を用いて、配列コンティグをアセンブリした。ｄｂＳＮＰおよびＣＥＬＥＲＡデータベースを用いて、ＳＮＰを選択した。既に記載（参考文献４、４０）の通り、ピロシーケンスおよび固相ミニシークエンス技術をＳＮＰの遺伝子型の特定に適用した。ＰＳＱ９６指示書およびＳＮＰ試薬キット（Pyrosequencing AB）を用いて、ピロシーケンスを行った。まず、６０のうち１８のＦＣＨＬ家族由来の家族構成員４６人のサブセットにおいて、全ＳＮＰの遺伝子型を同定した。ＳＮＰが多型（このサブセットにおけるマイナーアリール頻度＞１０％）の場合、オリジナルの連鎖研究（参考文献４）の３１ＦＣＨＬ家族を含む４２ＦＣＨＬ家族の家族構成員２３８人において、ＳＮＰの遺伝子型を同定した。このストラテジーは、変異体がマイナーアリール頻度＜１０％を有しているＴＸＮＩＰ遺伝子については適用しなかった。ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒを用いてマーカーおよび遺伝子の天然オーダーを決定した。この研究で特徴付けた新規ＳＮＰを公的データベース（ＮＣＢＩ）に登録予定である。National Public Health Institute of FinlandのDr. Markus Perolaにより開発されたＨＷＳＮＰプログラムを用いて、３つの群（全家族構成員、発端者、および配偶者）におけるハーディ・ワインベルグ平衡（ＨＷＥ）の可能性のある相違について、全ＳＮＰを試験した。Ａｌｕエレメントの注釈データをＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒからダウンロードし、ＲｅｐｅａｔＭａｓｋｅｒを用いて、散在反復配列についてＤＮＡ配列をスクリーニングした。これらのＡｌｕエレメント上の６０ｂｐの配列の位置をＢＬＡＳＴを用いて同定した。他の注釈データをＬｏｃｕｓＬｉｎｋからダウンロードした。
【０１２４】
脂肪組織の発現アレイ分析
遺伝子発現の評価のため、感受性ハプロタイプを示す罹患ＦＣＨＬ家族構成員６人（結果を参照）、および保護ハプロタイプホモ接合性罹患ＦＣＨＬ家族構成員４人を選択した。感受性ハプロタイプ保因者の６人は全て、６つの個々のファミリーに由来した。ホモ接合性保護ハプロタイプ保因者４人は、２家族由来の２人の同胞対であった。局所麻酔下、臍皮下脂肪組織にて生検を行い、脂肪組織５０〜２０００ｍｇを採取した。ＳＴＡＴ  ＲＮＡ−６０試薬（Tel-Test, Inc.）を用いて、製造元の指示に従いＲＮＡを抽出し、次に、ＤＮＡｓｅ  Ｉにより処理し、さらにＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔカラム（Qiagen）を用いて精製した。リボソームのＳ２８／Ｓ１８ＲＮＡ比、および分解のサインについてモニタリングしながら、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Agilent）においてＲＮＡ  ６０００ナノアッセイを用いて、ＲＮＡのクオリティを評価した。試料の濃度およびＡ２６０／Ａ２８０比を分光光時計を用いて測定した。許容可能な比は１．８〜２．２であった。次に、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  Ｃｈｏｉｃｅ  Ｓｙｓｔｅｍ（Invitrogen）およびＴ７−オリゴ（ｄＴ）２４プライマーを用いて、プライマー６０ｐｍｏｌおよび反応容量１０μｌを用いる以外Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより提供される指示に従い、トータルＲＮＡ２μｇをｃＤＮＡに逆転写し、次に、Ｅｎｚｏ［登録商標］ＢｉｏＡｒｒａｙ［商標］ＨｉｇｈＹｉｅｌｄ［商標］ＲＮＡ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｋｉｔ（Affymetrix）を用いて、ビオチン標識ｃＲＮＡを生成した。ハイブリダイゼーションに先立ち、ｃＲＮＡを断片化し、５０から２００ｂｐの転写物サイズを分布させ、次に、試料をＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｕ１３３Ａアレイにハイブリダイズさせ、製造元の推奨に従いスキャンした。
【０１２５】
統計的発現アルゴリズムを利用したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ５（Affymetrix, Santa Clara, CA）ソフトウェアを用いて、スキャンしたイメージを分析した。分析パラメーター全てを、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘにより推奨されるデフォルト値に設定した。標的強度１００に対するグローバルスケーリングを全アレイに適用したが、この時点ではさらなる標準化を行わなかった。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ５．０データ分析ソフトウェア（Silicon Genetics, Redwood City, CA）を用いて、測定したシグナル強度の値および不存、境界、または存在として表される対応する検出信号を含む結果メトリクスの出力ファイルをさらに処理した。それぞれのプローブアレイについて、シグナル強度を全１０プローブアレイを用いて測定した中間強度で割り、遺伝子毎の標準化を適用した。ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇにおいて実行されたＣｒｏｓｓ  Ｇｅｎｅ  Ｅｒｒｏｒ  Ｍｏｄｅｌを用いて確立された比例値で基準値を割り、それぞれのハプロタイプ群について別々に低クオリティのデータを識別するためのカットオフ値を決定した。２つのハプロタイプ間の差次的発現遺伝子を同定するために、平均標準化強度の比を計算した。生じた比が、ｌｏｇ１０比の分布から計算した平均比の外側少なくとも３標準偏差にある場合、差を有意であるとみなした。結果のストリンジェンシーをさらに増大させるために、全１０試料において存在、あるいは全ケースで不存または境界、かつ全対照において存在（または逆）と記録された遺伝子のみを含めた（参考文献４１）。それぞれの遺伝子が関与する生物学的過程を定義する注釈情報を、遺伝子オントロジー（ＯＧ）協会提供の分類から検索した。閾値を３に設定したＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ（ＥＡＳＥ）ツールを用いて、プローブアレイ上の遺伝子の全集団において観察される部分と比較して、それぞれの遺伝子リストに表されるカテゴリー濃縮の統計的評価を行った（参考文献４１）。フィッシャーの抽出検定を用いて、検定統計量を計算した。ロバスト性を最大にするために、数個の遺伝子によりサポートされるカテゴリーを非常に不利にし、一方多くの遺伝子によりサポートされるカテゴリーをわずかに不利にするよう、フィッシャー抽出確率を調節したＥＡＳＥスコア（ｐ−値）を計算した。０．０５未満となるＥＡＳＥスコア（ｐ−値）を統計上有意とみなす。
【０１２６】
ＵＳＦ１の定量的リアルタイムＰＣＲ分析  ＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎアッセイ（Applied Biosystems）を利用して、脂肪組織におけるＵＳＦ１発現を評価するため、感受性ハプロタイプを示す罹患ＦＣＨＬ家族構成員２人、および該ハプロタイプを有さない罹患ＦＣＨＬ家族構成員２人を選択した。ＴａｑＭａｎ  Ｇｏｌｄ  ＲＴ−ＰＣＲキットを用いて、製造元の推奨に従い、２ステップＲＴ−ＰＣＲを行った。反応液（１μｌを定量的ＰＣＲ反応に用いる）１００μｌにおいて、ＲＮＡ計１μｇをｃＤＮＡに変換した。２つのハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨおよびＨＰＢＧＤに対するＵＳＦ１比を用いて、データを標準化した。鋳型を含まない対照に加え、解離曲線を用いて反応の特異性を評価した。次のＰＣＲプライマーをそれぞれＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎ反応溶液１０μｌにおいて用いた：ＵＳＦ１について；フォワード：５’−ＡＴＧＡＣＧＴＧＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＡＧ−３’、リバース：５’−ＧＧＧＣＴＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＴＴＧＧ−３’。ＧＡＰＤＨについて：フォワード：５’−ＣＧＧＡＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＧＧＴＣＧＴＡＴ−３’、リバース：５’−ＡＧＣＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＡＡＧＡＣ−３’。ＨＰＢＧＤについて；フォワード：５’−ＡＡＣＣＣＴＣＡＴＧＡＴＧＣＴＧＴＴＧＴＣ−３’、リバース：５’−ＴＡＧＧＡＴＧＡＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＴＣ−３’。ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００  ＨＴ配列検出システムを用いて、製造元の推奨に従い、反応をトリプリケートで行い、次に、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒバージョン２．０ソフトウェアを用いてデータを分析した。
【０１２７】
初期機能分析  ＣＯＳ細胞において、ＳＥＡＰレポーターシステム（Clontech Laboratories, Palo Alto, CA）を用いて初期機能分析を行った。このシステムは、ヒト胎盤アルカリホスファターゼの分泌形態であるＳＥＡＰをリポーター分子として利用し、可能性のあるプロモーターおよびエンハンサー配列の活性をモニターする。コンストラクトをＳＶ４０エンハンサー含有ＳＥＡＰ２−Ｅｎｈａｎｃｅｒベクターにクローニングした。それぞれのコンストラクトの正確なアリールおよび向きを配列決定により証明した。ＳＥＡＰレポーターアッセイのため、トランスフェクションの４８時間後と７２時間後の細胞培養液を採取した。蛍光アッセイにおいて蛍光基質４−メチルウンベリフェリルリン酸（ＭＵＰ）を用いて、製造元の指示に従い、ＳＥＡＰタンパク質のモニタリングを行った。データは、少なくとも２回の独立実験の代表的なものである。
【０１２８】
統計的分析  オリジナルの連鎖研究（参考文献４）におけるものと同じプログラムおよびパラメーターを用いて、パラメトリック連鎖および非パラメトリック罹患同胞対（ＡＳＰ）の分析を行った。２種類の特性、ＦＣＨＬおよびＴＧ特性を調べた。ＡＮＡＬＹＺＥパッケージ（参考文献４６）により実行される、ＬＩＮＫＡＧＥパッケージ（参考文献４３）バージョンＦＡＳＴＬＩＮＫ４．１Ｐ（参考文献４４〜４５）のＭＬＩＮＫプログラムを用いて、パラメトリック２ポイントおよびマルチポイント連鎖分析を行った。ＡＮＡＬＹＺＥパッケージのＳＩＢＰＡＩＲプログラムを用いて、ＡＳＰ分析を行った（参考文献４６）。それぞれのマーカーについて、ＤＯＷＮＲＥＱプログラムを用いて、全個体からアリール頻度を確立した。
【０１２９】
ＨＨＲＲ（参考文献２７）および配偶子間の競争試験（参考文献２９）を用いて、関連性についてＳＮＰを試験した。行う試験数を最小とするために、ＴＧおよびＦＣＨＬ罹患男性を分析するときはＨＨＲＲ（参考文献２７）のみを用いて、関連性についてＵＳＦ１−ＪＡＭ１領域の外側に存在するＳＮＰを試験した。ＨＲＲＬＡＭＢプログラム（参考文献４８）を使用して行われるＨＨＲＲおよびマルチ−分析は、遺伝アリールと非遺伝アリール間のマーカーアリールの分布の均一性を試験するものである。マルチポイント−ＨＨＲＲ分析は、いくつかのＳＮＰを用いて同じ仮説を試験するものである。配偶子間の競争試験は一般化したＴＤＴであり、罹患した子供へのマーカーアリールの遺伝をアリール間の競争として示すものである。これにより、全血統データの有効な使用が可能になる。配偶子間の競争の方法は単なる関連性の試験ではない。なぜなら、帰無仮説は無関連かつ無連鎖であり、従って、連鎖自体も観察されるｐ−値に影響するからである。さらに、配偶子間の競争試験は、２連鎖マーカーまで容易に及び、これにより、遺伝子の多ＳＮＰの同時分析が可能になる。漸近的近似に基づくｐ−値は、それらを計算するために用いたデータが比較的まばらなら、バイアスを受けることができる。配偶子間の競争の結果が本当に有意であることを確かめるために、本発明者等は、ジーンドロッピングを用いて、複数のＳＮＰ（表１）を含む全分析について経験的ｐ−値も計算した。ジーンドロッピングにおいて、確立したアリール頻度を用いてＨＷＥおよび連鎖平衡（ＬＥ）を仮定し、発端者の遺伝子型を指定した。メンデル型分離を仮定し、子孫の遺伝子型を指定した。これにより、ＬＥおよび無連鎖の帰無仮説下で、ジーンドロッピングを行う。実験的ｐ−値を計算するために、ジーンドロッピングを複数回行う。ここで、各分析について、少なくとも５０，０００回シミレーションを行った。それぞれのジーンドロッピング相互作用の尤度比検定統計（ＬＲＴ）を、観察したデータのＬＲＴと比較する。経験的ｐ−値は相互作用の割合であり、ここで、ジーンドロッピングＬＲＴは、観察したＬＲＴと等しくなるか、あるいはそれを超える。一般に、得られたジーンドロッピングの経験的ｐ−値は、小さな試料サイズの漸近ｐ−値より保存性である。
【０１３０】
オフセット（−ｏ）および経験的試験（−ｅ）を最適化するオプションのＨＢＡＴプログラムを実行し、ハプロタイプと特性との間の関連性について試験した（参考文献４９）。オプション−ｏは、感受性ハプロタイプの罹患患者への優性遺伝ばかりでなく、非罹患患者への程度を抑えた優性遺伝も測定する。−ｅオプションは、連鎖を付与する関連性の試験となり、これにより、分散の経験的評価が可能になる。これらのハプロタイプの分析は、６０の拡大したＦＣＨＬ家族において、ＪＡＭ１−ＵＳＦ１領域の１５のうち４つのＳＮＰの遺伝子型を同定し、４２の中心的ＦＣＨＬ家族において１１のＳＮＰの遺伝子型を同定したという事実により、影響される。一般の家系遺伝子型に基づく関連性の試験を提供する遺伝子型Ｐｅｄｉｇｒｅｅ  Ｄｉｓｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ  Ｔｅｓｔ（ｇｅｎｏ−ＰＤＴ）（参考文献５０）も、選択したＵＳＦ１  ＳＮＰ由来の遺伝子型の組合せについて行った（表３）。Ｇｅｎｐｏｐ  ｖ３０１ｂプログラム、オプション２を用いて、それらのウェブサイトでＪＡＭ１−ＵＳＦ１領域のＳＮＰについてのマーカー遺伝子型間のＬＤを試験した。このプログラムにおいて、遺伝子型ＬＤについて関連性の１試験を行う。帰無仮説は、１つの遺伝子座の遺伝子型は、他の遺伝子座の遺伝子型から独立しているというものである。プログラムは、それぞれの手段における遺伝子座の全対についての分割表を作成し、マルコフ連鎖を用いて、それぞれの表についてフィッシャー抽出試験を行う。
【０１３１】
ＵＲＬ
補充の表１〜４およびマイクロアレイデータのさらなる詳細は、本発明者等のウェブサイト（www.genetics.ucla.edu/labs/pajukanta/fchl/chr1/）において入手可能となるだろう。プローブアレイの全セットの未処理のデータは、ＧＥＯアクセション番号ＧＳＥ５９０を用いてＮＣＢＩのＧｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｏｍｎｉｂｕｓ（www.ncbi.nim.nih.gov/geo）を通じてアクセス可能である。ＴＣおよびＴＧについて、９０フィンランド人の人口特定パーセンタイル値が、National Public Health Institute of Finlandのウェブサイト（www.ktl.fi.molbio/wwwpub/fchl/genomescan）において入手可能である。本発明者等は、ＳＮＰの選択のためｄｂＳＮＰ（www.ncbi.nim.nih.govにて入手可能）およびＣＥＬＥＲＡ（www.celera.com）を用いた；遺伝子の天然オーダーおよびＡｌｕエレメントの注釈については、ＵＣＳＣ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｒｏｗｓｅｒ（genome.ucsc.edu）；ヒトおよびマウスデータベースに対する配列の検索のためには、ＢＬＡＳＴ（www.ncbi.nim.nih.gov/blast/）；注釈データをダウンロードするためには、ＬｏｃｕｓＬｉｎｋ（www.ncbi.nim.nih.gov/LocusLink/）；そして内部マーカーＬＤを計算するためには、Ｇｅｎｅｐｏｐ（wbiomed.curtin.edu.au/genepop/index.htmi）。
【０１３２】
実施例６：実施例７から１１における方法
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
対象領域の両方の差を表すＤＮＡプローブをＰｒｏｌｉｇｏに発注し、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼを用いて［γ−３２Ｐ］ＡＴＰで５’末端を標識した。ＱＩＡｑｕｉｋキット（Qiagen）を用いて、製造元の指示に従い過剰な未結合標識を除去した。核抽出物を、結合バーファー（５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２．５ｍＭ  ＥＤＴＡ、２．５ｍＭ  ＤＴＴ、２．５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．２５μｇ／μｌ  ポリ（ｄＩ−ｄＣ）・ポリ（ｄＩ−ｄＣ）、２０％  グリセロール）中、室温にて３０分間インキュベーションし、次に、０．５Ｍ  ＴＢＥバッファー含有６％  ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動した。−７０℃にてゲルをオートラジオグラフィーにかけた。結合の特異性について試験するために、増加濃度の非標識「非放射性」ｄｓ−プローブ、ならびにゲルシフトを生じない３’−ＵＴＲ  ＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ１の周囲の配列を表す非特異的プローブを用いて、抽出を行った。
【０１３３】
発現アレイ分析
本発明者等は、ＵＳＦ１ハプロタイプに基づき、本発明者等のＦＣＨＬ（参考文献６Ａ）および低ＨＤＬ−Ｃ家族（参考文献３３Ａ）由来の脂肪生検のため、１９個体を選択した。それらは、重要なＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ２のリスクアリールの保因者１２人、およびリスクのないアリールのホモ接合性個体７人を含むものであった。これらのうち９人が、本発明者等のオリジナルの報告（参考文献６Ａ）に含まれていた。両方の群の平均年齢は４９歳であり、性別の割合は五分五分に近かった（リスク群、女性７人および男性５人対リスクのない群、女性４人および男性３人）。脂肪生検を回収し、既に記載の通り（参考文献６Ａ）、ＲＮＡを抽出し、定量した。既に記載の通り（参考文献６Ａ）、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘによる標準的プロトコール（若干の修飾を含む）に従い、ＲＮＡの標識、アレイ処理、およびスキャンを行った。
【０１３４】
統計的発現アルゴリズムを利用したＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｓｕｉｔｅ５（Affymetrix, Santa Clara, California）ソフトウェアを用いて、スキャンしたイメージを分析した。標的強度１００に対するグローバルスケーリングを全アレイに適用し、次に、ＧｅｎｅＳｐｒｉｎｇ  ６．１データ分析ソフトウェア（Silicon Genetics, Redwood City, California）を用いて、さらなるデータ処理を行った。それぞれのプローブアレイについて、全１９プローブアレイを用いて測定した中間強度で強度を割り（有効にデータを単一中心化する）、遺伝子毎の標準化を適用した。
【０１３５】
２つのハプロタイプ間の差次的発現遺伝子を同定するために、本発明者等は、統計的分析と組み合わせた２フィルタリング工程からなるストラテジーを採用した。第１に、本発明者等は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ検出値を用いて、不確かなデータまたは一貫性のないデータを除去した。これは、それぞれのハプロタイプ群において５０％より多くの試料に存在すると記録されるべき遺伝子を必要とする。発現が、ある群では「オフ」にされ、他の群では「オン」にされる遺伝子に関与する、可能性のある興味深いデータの損失を避けるために、本発明者等は、ある群では１００％の試料で不存と記録され、他の群では少なくとも５０％存在すると記録された遺伝子も含めた。次に、標準化した値をそれぞれのハプロタイプ群の試料において平均化し、これらの比を計算した。比の分布を評価し、１．５倍のカットオフリミットを選択し、最も顕著かつ確かな発現変化に注意を向けた。本発明者等は、群間の不等分散を可能にする２試料ｔ−検定を利用して、有意な変化を決定し、両側ｐ−値０．０５以下を統計上有意とみなした；アレイ上で１つ以上のプローブセットにより表される遺伝子については、保存性ｐ−値と関連する測定値を用いた。
【０１３６】
統計的分析
本発明者等は、均等分散の仮定のない２試料ｔ−検定を用いて、選択した遺伝子について遺伝子発現に対するハプロタイプの効果を評価した。両側の有意な値を計算し、タイプＩエラー確率５％以下を用いて、統計上の有意性を決定した。ハプロタイプ群で観察した相違において、臨床的に関連するパラメーター由来の可能性のある混同関与を制御するために、本発明者等は、共分散分析（ＡＮＣＯＶＡ）を行った。ＢＭＩ、インスリンおよびトリグリセリド濃度、およびＨＯＭＡ指標を、ハプロタイプ群により決定された因子に共分散として含め、主要かつ相互作用効果について、それぞれの共分散の別々のモデルを評価した。また、本発明者等は、タイプＩエラー５％以下を統計上有意とみなした。遺伝子発現と共分散との関係に対するハプロタイプ効果の精査を、線形回帰分析により行った。線形モデルを評価し、Ｒ、Ｒ２、およびＦ統計を研究した。
【０１３７】
群平均連鎖法、ＵＰＧＡ、合同ルールを用いた凝集アルゴリズムを利用して、選択した遺伝子について、遺伝子発現パターンと関連する試料の教師なし階層的クラスタ分析を行った。クラスター類似性をピアソンの相関を用いて決定した。本発明者等は、系統樹および視覚的に評価した可能性のあるクラスター上のオーバーレイ状態の情報により、分枝パターンと性、罹患状態（ＦＣＨＬまたは低−ＬＤＬ）と家族関係との間の可能性のある関連性を分析した。
【０１３８】
実施例７：重要なイントロン配列は核タンパク質と結合する
９つの同定した遺伝子内ＵＳＦ１  ＳＮＰのうち、２つがコード領域の代表的同義変異体を表し、一方７つがイントロンに位置していた（図４ａ）。ＦＣＨＬ家族における関連性の強力な証拠を、２つのＳＮＰを用いて最初に観察した：３’−ＵＴＲにおけるｕｓｆ１ｓ１、および１．２４ｋｂに離れて、本質的には完全なＬＤ（Ｄ’＝０．９８）に位置するイントロン７のｕｓｆ１ｓ２。本発明者等は、異種間の全７つのイントロンＳＮＰの配列環境を分析し、それらの機能上の重要性のかぎを提供するであろう系統的保存についてモニターした。イントロン７の強く関連するＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ２は、ゲノム領域内に、そうでなければ非保存ヌクレオチドにおいて濃縮されて、ヒトからチンパンジーを経て、イヌ、マウス、およびラットにおいて、完全に保存されたＤＮＡストレッチに位置していた（図４）。かかる保存配列ストレッチに位置すべき他のＳＮＰは、イントロン１のｕｓｆ１ｓ９のみであるが、それは、ＦＣＨＬまたはその成分特性との関連性を示さないので、本発明者等は、それをさらに追跡しなかった。ｕｓｆ１ｓ２を含有するこの配列の領域保存により、本発明者等は、それがＵＳＦ１の転写のダイナミクスの機能上重要ないくつかのエレメントを有するかどうかを調べるよう促された。
【０１３９】
本発明者等はまず、ｕｓｆ１ｓ２の領域が、ＤＮＡ結合タンパク質の結合部位を表すかどうかを決定した。本発明者等は、ＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ２〜４を含有する２つの３４ｍｅｒプローブ（図４ｂ）を構築した。それはｕｓｆ１ｓ２の２つのアリールについて変動可能であった。ＨｅＬａ細胞の核抽出物タンパク質と共にインキュベーションした後、両方の重要な配列の変異体は、ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動移動度シフト（ＥＭＳ）を生じた。可能性のある機能的配列モチーフをさらに限定するため、本発明者等は、より短い２−ｍｅｒのプローブペア（重要な最も保存されたヌクレオチド配列を３４−ｍｅｒプローブと共有する）を用いてＥＭＳ分析を行った。このプローブは、３４ｂｐのシフトに匹敵する移動度シフトを生じたが、ＵＳＦ１の３’ＵＴＲに位置する他の強く関連するＳＮＰ  ｕｓｆ１ｓ１を含有する配列を表す類似の２０ｂｐプローブは、シフトを生じなかった（図５ａ）。プローブの核タンパク質との結合は、非標識特異的プローブを用いて競合され得るが、非特異的プローブとは競合しない（図５ｂ）。
【０１４０】
実施例８：ＵＳＦ１リスクアリールの保因者は、脂肪において下流遺伝子の差次的発現を示す
ＵＳＦ１のような転写因子の定性的または定量的機能変化は、その制御下での発現の効率または遺伝子パターンに影響すると予測される。本発明者等は、ｕｓｆ１ｓ２多型またはそれ自体のいずれかが、近隣で機能するか、あるいは未知の機能エレメントのマーカーとして作用すると仮説を立て、「リスクのある」または「リスクのない」アリールのいずれかを有する個体の脂肪生検におけるＵＳＦ１制御遺伝子の転写プロファイルにおける相違を観察した。これは、可能性のある感受性多型の機能を強調するための説得力のあるインビボアプローチを表している。本発明者等は、転写因子データベースのクエリー（Ｔｒａｎｓｆａｃ）を作成し、文献において公開した。合計４０個のＵＳＦ１制御遺伝子を同定し、生物学的経路または組織特異性についての知識にもかかわらず、さらなる分析のためそれらを選択した（表４）。
【０１４１】
表４：制御におけるＵＳＦ１の報告された関与を有する遺伝子
ＵＳＦ１は、インビトロまたはインビボのいずれかにおいてこれらの遺伝子のプロモーターと結合することが報告されており、いくつかは、機能的証拠が存在する。参考文献の全リストは、要請に応じて入手可能である。これらの遺伝子のうち、２９個が、本研究で用いたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａチップにおいて出現した。１３個は、脂肪生検において、確かなシグナルを生じるレベルで発現した。太字の遺伝子は、ｕｓｆ１ｓ２の異なるアリールを有する個体間で統計上有意に差次的発現した。
【０１４２】
【表５１】
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【０１４３】
転写プロファイルのＵＳＦ１のアリール変異体の可能性のある効果を調べるために、本発明者等は、異常脂質血症家族（ＦＣＨＬおよび低−ＨＤＬ−Ｃ）のコホート由来の１９個体から脂肪生検を得た。それらは、ｕｓｆ１ｓ２の希な２−２遺伝子型（「リスクのなり」ハプロタイプを示す）ホモ接合性の７個体、およびヘテロ接合性（８）またはホモ接合性（４）形態のいずれかで共通アリール１（「リスクのある」ハプロタイプを示す）を有する１２個体を含むものであった。４０個のリストに挙げたＵＳＦ１制御遺伝子のうち、２９個が本研究で用いたＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３Ａチップ上に出現し、いくつかの遺伝子が複数のプローブセットにより出現した。本発明者等は、合計１９個のプローブセットにより表される１３個の遺伝子が、確かなシグナルを生じる有意に高レベルで脂肪組織において発現することを見出し、本研究に含めた（表４）。脂質およびグルコース代謝のいくつかの高度に関係する遺伝子がこのリスト上にあるが、いくつかの遺伝子の関係性はすぐには明らかにならない。標準化の後、３個の遺伝子（合計６個のプローブセット全てにより一致して表される）は、ＵＳＦ１の２つのハプロタイプ群でそれらの発現において有意（ｐ＜０．０５）に異なった（均等分散の仮定のない２試料ｔ−検定を用いて評価した）。ＵＳＦ１の「リスクのある」または「リスクのない」ハプロタイプのいずれかを有する個体間で差次的に発現する３個の遺伝子全てが、表現型：ＡＴＰ−結合カセットサブファミリーＡ（ＡＢＣＡ１）（参考文献１３Ａ）、アンジオテンシノーゲン（ＡＧＴ）（参考文献１４Ａ）およびアポリポタンパク質Ｅ（ＡＰＯＥ）（参考文献１５Ａ）と高度に関係した（図７）。
【０１４４】
実施例９：インスリンに対するＡＣＡＣＡの異なる応答
血清インスリンおよびグルコースのようなシグナルは、様々な代謝遺伝子の調節において重要である。インスリンは、Ｅボックス配列と結合するＵＳＦ１の能力に影響し、それにより、代謝変化に応答して遺伝子発現の調節に関与することが知られている（参考文献１６Ａ）。ＵＳＦ１制御遺伝子の発現におけるこれらの遺伝子の可能性のある関与を評価するために、本発明者等はＡＮＣＯＶＡモデルをデータに合わせた。本発明者等は、さらにモデルを拡大し、ボディー・マス・インデックス（ＢＭＩ）、トリグリセリドおよびＨＯＭＡ（ホメオスタシスモデル評価）、空腹時血清インスリンおよびグルコースの値に基づくインスリン抵抗性の測定値の可能性のある効果についても試験した（参考文献１７Ａ）。試験した遺伝子のうち１個を除き、本発明者等は、種々の共変量に由来する有意な分布を観察し、ゆえに、２試料ｔ−検定のものと本質的に同じ試験統計となった。しかしながら、初期の知見（参考文献１８Ａ）と一致して、本発明者等は、アセチル−ＣｏＡカルボキシラーゼα（ＡＣＡＣＡ）の発現に対するインスリン濃度の検出可能な効果を観察した（ｐ＝０．０５）。この関係は、直線回帰を用いて精査され、ＡＣＡＣＡの定常状態の転写レベルとインスリンの空腹時濃度との間で中程度の負の相関（Ｒ２＝０．４５３）を示した。ハプロタイプ群の偏回帰はさらに、この相関がＵＳＦ１の「リスクのある」ハプロタイプ（Ｒ２＝０．０９３）を有する個体においてよりむしろ、２−２「リスクのない」ハプロタイプ（Ｒ２＝０．９５６）を有する個体において本質的にずっと強いことを示した。
【０１４５】
本発明者等は、性別または研究コホート（ＦＣＨＬまたは低ＨＤＬ）のようなパラメーターの任意の効果が、個々の発現レベルの教師のいないクラスタリングの実施による分析において考慮されるべきかどうかも試験した。本発明者等は、観察した任意の測定についての効果を検出しなかった。これは、これらの変化と関連する個体のランダムなクラスタリングにより示された（データは示していない）。
【０１４６】
実施例１０：ＡＰＯＲの変化は、全ゲノム転写プロファイルにおいて突出する
既知のＵＳＦ１調節遺伝子の分析に加えて、本発明者等は、異なるＵＳＦ１ハプロタイプの保因者間で変化した遺伝子の転写レベルについて全マイクロアレイデータを試験した。この種のアプローチを上手く用いて、経路および異なるセットで同時調節される遺伝子の集合物を同定した（参考文献１９Ａ）。これは、糖尿病対非糖尿病（参考文献１９Ａ）、または癌組織対非癌組織（参考文献２０Ａ）のような明確な表現型の相違と群を比較したときに、最も起こり得た。本研究において、発現差が１．５倍以上であり、２試料ｔ−検定における統計上の有意性（ｐ＜０．０５）に達する変化を有意と同定した。このアプローチにより１５個の遺伝子を同定し、このうち、リスクのないハプロタイプを有する個体において、１０個がアップレギュレーションされ、５個がダウンレギュレーションされた（表５）。
【０１４７】
表５：全アレイにおいて最も差次的に発現した遺伝子
２種類のハプロタイプ群（ｕｓｆ１ｓ２のアリールにより定義）の全アレイにおいて標準化した遺伝子発現の比較を用いて、最も異なって調節された遺伝子のリストを作成した。発現差が少なくとも１．５倍であり、２試料ｔ−検定において統計上の有意性（ｐ＜０．０５）のリミットに達する有意な変化を１と定義した。特に、リスクのない個体において最もアップレギュレーションされた遺伝子は、ＵＳＦ１調節遺伝子アポリポタンパク質Ｅであった。
【０１４８】
【表５２】
2008506354.tif 000053
【０１４９】
また、リスクのある個体においてダウンレギュレーションされる遺伝子のリストの一番上の遺伝子はＡＰＯＥであった。ＵＳＦ１のリスクのあるハプロタイプを有する個体の脂肪組織におけるＡＰＯＥの発現は、リスクのないハプロタイプを有するものにおける発現より２倍低かった。リストの他の可能性のある興味深い遺伝子は、脂肪代謝に関与するＣＹＰ４Ｂ１、血管新生、高血圧、それが本質的なメディエーターであるアンギオテンシンＩＩ誘発性血管炎症に関与するＶＥＧＦを含む（参考文献２１Ａ）。ＵＳＦ１がこれらの遺伝子の調節において十分に役割を果たすか否かを証明する実験データが必要である。
【０１５０】
実施例１１：領域遺伝子に対する重要なＳＮＰの強力でない効果
最後に、イントロン７の推定調節エレメントが強力なｃｉｓ制御エレメントを表し、ＵＳＦ１付近において他の遺伝子の発現に対する制御を発揮するかどうかを調べるために、本発明者等は、３９２ｋｂに及ぶ５’ＣＤ２４４遺伝子から常にＡＰＯＡ２の１０個のフランキング遺伝子の発現レベルを研究した。これらの１０個の遺伝子のうち、６個はＵＳＦ１と同じＤＮＡ鎖から転写され、４個は逆鎖から転写された。発現レベルがｕｓｆ１ｓ２の個々のアリールに依存して差次的となるプローブセットは、血小板Ｆ１１受容体（Ｆ１１Ｒ）遺伝子に隣接したもののみであった（ｐ＝０．０１３）。ＦＣＨＬ家族における関連性を示す重要な染色体インターバルは、高トリグリセリド男性のアリールのＦ１１Ｒ遺伝子に達していたので、これは興味深いものであった（参考文献６Ａ）。Ｕ１３３Ａアレイにおいて、２つのプローブセットがＦ１１Ｒを表したが、２つのＵＳＦ１ハプロタイプ群の有意な差を示したのは一方のみであった。ゲノムの代表的配列の精査の際、本発明者等は、差次的発現を示したプローブセットが、実際にはＦ１１Ｒ遺伝子を表すのではなく、それに直隣接した短い発現配列タグ（ＥＳＴ）（ＡＷ９９５０４３）を示すことに気付いた。
【図面の簡単な説明】
【０１５１】
【図１】図１：１ｑ２１上の関連領域の概要の図示  本発明者等がＳＮＰの遺伝子型を特定した遺伝子、ならびに最高連鎖マーカーＤ１Ｓ１０４およびＤ１Ｓ１６７７（Pajukanta et al. 1998）の遺伝子座を最上部に示す。太字で示す遺伝子も配列決定した。次の部分には、ＪＡＭ１およびＵＳＦ１について遺伝子型を特定したＳＮＰを示す（これらのＳＮＰの距離、ｒｓ数、およびＬＤクラスターについては表２を参照）。下から２番目の部分には、男性のＴＧと関連するＳＮＰを示し、最下部には、家族構成員全てのＦＣＨＬおよびＴＧと関連するＳＮＰを示す。
【図２】図２：１６種のアップレギュレーションされる遺伝子および６０種のダウンレギュレーションされる遺伝子の機能的カテゴリーによる遺伝子の分布（注釈の情報は遺伝子オントロジー（ＧＯ）分類生物学的過程を利用）  統計上有意な過剰発現についてのＥＡＳＥスコア（＜０．０５）を示すカテゴリーのみを示す。対応のＥＡＳＥスコア（ｐ−値）を含むＥＡＳＥ分析の全結果、有意なカテゴリー毎の遺伝子のリストを補充の表３ａ〜ｂにて提示する。
【図３】図３ａ：ＵＳＦ１のイントロン７は６０ｂｐの配列を有し、これを９１種のＵＳＦ１類似遺伝子が共有している。ＵＳＦ１のイントロン７のＡｌｕＳｘ繰り返し部分（２〜６１ｂｐおよび１３７〜１９６）は、マウスＢ１繰り返しとの配列類似性を有する。ＵＳＦ１を含む計９１種のヒト遺伝子はＡｌｕＳｘのこの６０ｂｐ部分を有し、これはコード鎖（４３遺伝子）または逆鎖（４８遺伝子）上のいずれかに位置する。これらの９１種の遺伝子を補充の表４に挙げる。図３ｂ：重要な６０ｂｐの配列を含有するＵＳＦ１のイントロン７の２６８ｂｐおよびｕｓｆ１ｓ２  ＳＮＰの転写効率（図３ａ参照）  １人のホモ接合性擬保因者（ハプロタイプ１−１）および１人のホモ接合性非保因者（２−２）由来ＤＮＡをフォワードおよびリバースの両方向でＳＥＡＰレポーターシステムにクローニングした。ＨＣＬ  ｆｏｒおよびＨＣ  ｒｅｖは、フォワード、そしてリバースの両方向のハプロタイプ保因者（１−１）ＤＮＡコンストラクトを示す；ＮＨＣ  ｆｏｒおよびＨＮＣ  ｒｅｖは、フォワード、そしてリバース方向のハプロタイプ非保因者（２−２）ＤＮＡコンストラクトを示す。ｐＳＥＡＰ２−基本ベクターでトランスフェクションした細胞由来の培養液を負対照（Ｎｅｇ）として、そしてｐＳＥＡＰ２−対照ベクターでトランスフェクションした細胞由来の培養液を正対照（Ｐｏｓ）として用いた。ＳＥＡＰタンパク質のモニタリングを、トランスフェクションの４８時間および７２時間後に行った。エラーバーは、トリプリケートで行った１回の実験のＳＤを表す。棒の大きさは、負対照（１と設定）と比較したときの転写活性の増大を示す。
【図４ａ】図４ａ：６．７ｋｂ  ＵＳＦ１遺伝子の概要の図示  エクソンは幅広の四角形として、ＵＴＲを幅の狭い四角形として、そしてイントロンを直線として示す。アスタリスクで示す関連ＳＮＰの上に、遺伝子型を特定したＵＳＦ１  ＳＮＰを示す。配列位置（黒色の棒）を示すイントロン７のセグメントを増幅し、ＥＭＳＡで用いる２０ｍｅｒのプローブを生成するために用いる。大きなフォントおよび矢印を用いて、近くのＳＮＰを示す。
【図４ｂ】図４ｂ：異種間保存およびＥＭＳＡプローブ  ＥＭＳＡシフトを生じる能力のある２つのプローブを構築した；１つは長さ３４ｂｐであり、もう１つは長さ２０ｂｐである。３４ｍｅｒのプローブは、このイントロン７領域由来の３種のＳＮＰ全てを含有し、一方、２０ｍｅｒのプローブは重要なｕｓｆ１ｓ２  ＳＮＰのみを含有するものであった。下部に、異種間保存配列および一致配列を示す。Ｙはピリミジンを表し、そしてＲはプリンを表す。特に、ｕｓｆ１ｓ２自体のヌクレオチドは完全に保存されており、これは先祖のアリールを示すリスクアリールである。
【図５ａ】図５ａ：ＥＭＳＡの結果は、ｕｓｆ１ｓ２近くの３４ｂｐおよび２０ｂｐのプローブの両方が、ＨｅＬＡ細胞抽出物由来の核タンパク質に結合することを示す。両方のプローブセットの相違するｕｓｆ１ｓ２アリール変異体はゲルシフトを生じ、これを矢印で示す。逆に、３’ＵＴＲのｕｓｆ１ｓ１近くの配列を表す２０ｂｐのプローブの変異体はいずれもゲルシフトを生じない。
【図５ｂ】図５ｂ：核タンパク質の結合特異性  ｕｓｆ１ｓ２近くの配列を表す３４ｂｐのプローブは強力なゲルシフトを生じ、これは添加した非標識プローブのモル濃度の増加と徐々に競合する。
【図６】有意に異なって調節されるＵＳＦ１調節遺伝子の同定の概要の図示  最初のリストにある４０種の遺伝子を、脂肪生検で発現している１３種に限定した。これらのうち、３種の重要な代謝遺伝子が、定常状態にてＵＳＦ１のリスクまたはリスクのないハプロタイプを有する個体間で差次的に発現していた。ｐ−値は、非等分散仮定下の２試料ｔ−検定由来のものである。
【図７】図７：ＵＳＦ１転写レベルのアリール特異的調節メカニズム、およびＵＳＦ１タンパク質量のバリエーションの予測結果の概要の図示  タンパク質は、ＵＳＦ１のイントロン７の調節配列に結合し、そして転写レベルに影響する。ＵＳＦ１は（大抵、ＵＳＦ２と）２量体を形成し、多数の遺伝子のプロモーターのＥ−ボックス配列に結合し、グルコースおよび食べ物の炭水化物のようなシグナルに応答して、それらの転写を活性化する。ＵＳＦ１活性の翻訳後調節は、Ｅ−ボックスモチーフとのその結合を排除するダイマーのリン酸化に仲介される（参考文献１６）。ポリペプチドレベルで影響されると、観察した下流遺伝子の転写レベルでの低減は、異常脂質血症およびメタボリックシンドロームと高度に相関する変化となるだろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図５ａ】
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【図５ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成18年10月16日(2006.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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