(57)【要約】  後嚢混濁を予防するために用いられる処置用液は、白内障手術前、術中または術後に水晶体嚢バッグ中に投与または導入される。処置溶液はまた、手術前に眼内レンズに投与してもよい。処置溶液は、イオン輸送機構阻害物質を、単独で、または他の処置物質（例えば、適切なｐＨを実現するための浸透圧物質）とともに含有するものであり、水晶体上皮細胞の剥離および／または死滅を選択的に誘発して、後嚢混濁を予防する。イオン輸送機構阻害物質は、広範囲の細胞の細胞機構および細胞内イオン分布に干渉することができるが、当該物質の濃度は、処置溶液が水晶体上皮細胞の細胞機構に選択的に干渉し、他の眼細胞が実質的に無損傷のままであるように選択される。処置溶液は、他の眼細胞および組織を損傷せずに、かつ冗長な術前処置なしに、水晶体上皮細胞の死滅および／または剥離を選択的に誘発する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジヒドロクロロチアジドを含有する、ｐＨ約７〜１０の眼処置溶液であって、
角膜内皮細胞および網膜色素上皮細胞よりも本質的に高い発生率で水晶体上皮細胞の剥離を誘発して、後嚢混濁を予防し、
水晶体上皮細胞が剥離前に収縮する溶液。
【請求項２】
浸透圧調節物質をさらに含有する、請求項１に記載の眼処置溶液。
【請求項３】
浸透圧調節物質が無機塩を含有する、請求項２に記載の眼処置溶液。
【請求項４】
高浸透圧性のモル浸透圧濃度を有し、
ジヒドロクロロチアジドが約６０〜約５００μＭの濃度で溶液中に存在する、請求項２に記載の眼処置溶液。
【請求項５】
後嚢混濁を予防する方法であって、
ジヒドロクロロチアジドおよび浸透圧物質を含有する処置溶液を眼内レンズに投与すること、および
前記眼内レンズを眼内に挿入すること
を含み、
角膜内皮細胞および網膜色素上皮細胞よりも本質的に高い発生率で水晶体上皮細胞の剥離が発生して、後嚢混濁が予防される方法。
【請求項６】
ジヒドロクロロチアジドが約１５００μＭ未満の濃度で溶液中に存在する、請求項５に記載の眼処置溶液。
【請求項７】
ジヒドロクロロチアジドが約１０００μＭ未満の濃度で溶液中に存在する、請求項５に記載の眼処置溶液。
【請求項８】
ジヒドロクロロチアジドが約５００μＭ未満の濃度で溶液中に存在する、請求項５に記載の眼処置溶液。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン輸送機構阻害物質を単独で、または他の物質とともに含有し、他の眼細胞および組織を損傷せずに、かつ冗長な手術前処置なしに、水晶体上皮細胞の剥離および／または死滅を選択的に誘発することによって後嚢混濁を予防するために用いられる、新規な処置溶液および方法に関する。
【発明の背景】
【０００２】
ヒトの眼の水晶体の主な役割は、角膜および眼房水を通過した光線の焦点を網膜上に合わせることにある。水晶体の構造および代謝は、その完全性および透明性の維持に直接寄与する。水晶体は、全体が、様々な成熟段階の上皮細胞から構成されている。水晶体は、成熟過程で組織が廃棄されない点で比較的珍しい。新しい水晶体細胞が形成されるにつれて、古い細胞は水晶体の内側に移動する。水晶体は、すぐに直接の血液供給から隔離され、栄養経路および排出経路に関して眼房水および硝子体液に依存する。水晶体の光学的特徴の多くは、水晶体細胞が一定の細胞体積を維持すること、および線維の高密度パッキングにより細胞間隙の体積が減少することに依存している。それ故、その繊細な構造を維持することが、水晶体の本質的な特徴となる。水晶体は、イオン、糖、アミノ酸および水のバランスを調節することによって一定の細胞体積を維持する、独特の能力を発達させてきた。
【０００３】
ヒトの眼の白内障では、水晶体の透明性が失われることによって光の透過が妨害される。白内障は、視野のかすみや曇りを引き起こし、視覚の鋭敏さの低下の原因として最も一般的である。曇った水晶体は、外科的手法により、すなわち白内障嚢外摘出術（ＥＣＣＥ）により除去することができる。ＥＣＣＥは、手動または自動の吸引術を用いた皮質浄化とともに、臨床核（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ）の除去を含む。後嚢赤道部は、後房眼内レンズを挿入することができるエンベロープまたはバッグとして、そのまま残される。後嚢および小帯が手付かずの場合、このレンズは通常、患者の生涯を通じて、いかなる合併症も起こさずに定位置に留まる。手術では、水晶体嚢の前部が注意深く切開され、白内障が除去される。眼内レンズは、嚢の残部（後部）に挿入される。この結果、水晶体の自然な遠近調節も一部失われる。
【０００４】
標準的な白内障手術は、超音波乳化吸引法として知られる手法を採用している。この手法では、水晶体の内容物が撹拌されて、水晶体物質の分解が引き起こされ、次いで、水晶体物質が、洗浄溶液の注入・抽出を同時に行う超音波乳化吸引プローブにより水晶体嚢から流し出される。処置により剥離された水晶体上皮細胞は、死滅しているか生存しているかに関わらず、この流出操作により洗い出される。
【０００５】
水晶体前嚢の保存と、注入可能物質による水晶体内容物の置換と、を伴う新たな処置の開発が進められている。
【０００６】
この手術の後、視覚は回復するが、一般的な白内障手術の最も高頻度な合併症の一つは、白内障手術後の水晶体上皮細胞（ＬＥＣ）の増殖である。後嚢混濁（ＰＣＯ）は、後発白内障としても知られ、患者の約２０〜４０パーセントに生じる嚢外摘出術後の最も高頻度な合併症である。過去十年間に、数々の実験研究および臨床研究の結果から、ＰＣＯの発症機序の理解が深まってきている。
【０００７】
ＰＣＯの主な原因は、残留するＬＥＣの増殖、および水晶体後嚢への遊走である。残留する水晶体上皮細胞のほとんどを除去しようとする外科医たちの努力にも関わらず、それらを除去するのは困難である。したがって、多くのＬＥＣが、手術処置の終了時に、水晶体嚢バッグ（ｌｅｎｓ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｂａｇ）に取り残される。眼内レンズが挿入される膜またはエンベロープは、ＬＥＣの増殖により徐々に曇る。ＬＥＣの増殖は、例えば、注入可能なレンズを利用する新たな白内障処置においても、重大な問題である。曇った膜は、「後発白内障（ａｆｔｅｒ  ｃａｔａｒａｃｔ）」、またはＰＣＯと呼ばれている。ＰＣＯの症状は、白内障の症状と同じであり、視覚の緩やかな減弱を引き起こし、処置しない場合には最終的に失明をもたらす。
【０００８】
ＰＣＯの形成を予防または最小化する努力は相当行われている。これらの努力は、おおまかに３つの領域：手術の改善、レンズデザインの改善、および化学的予防に分類することができる。
【０００９】
ＰＣＯの予防を試みる数々の手術戦略が開発されている。これらは、様々な外科器具の使用、ならびにレーザー、超音波、および凍結技術の適用を伴う。一旦ＰＣＯが生じた後は、レーザー光を用いて曇った嚢の中心に開口を形成させるＹＡＧレーザー嚢切開が、簡単かつ迅速な方法である。しかし、ＹＡＧレーザー嚢切開に関しては、重大なリスクが存在する。主な例としては、網膜剥離、緑内障、嚢胞様黄斑浮腫の発症が挙げられる。
【００１０】
眼内レンズの材料のタイプ、および眼内レンズのエッジの形状に、多くの関心が寄せられている。両凸かつ平凸の、ポリメチルアクリレートまたはシリコーンプレートの肝臓色眼内レンズ、および鋭い光学部エッジのあるレンズが、ＰＣＯに有効であることが報告されている。この分野は、特にアルコン（Ａｌｃｏｎ）のＡｃｒｙｓｏｆレンズにより、著しく進歩した。しかし、これらのレンズは比較的高価であり、また、別の合併症や制約をもたらす。
【００１１】
他にも、化学物質を使用してＬＥＣを破壊し、または増殖を防ぐ試みがある。２００１年９月２１日出願の英国特許出願第０１２２８０７．１号では、アルドース還元酵素阻害物質でソルビトール経路を調節して、ＬＥＣにおける細胞内ソルビトール濃度を低減させることによって、浸透圧ショックによるＬＥＣの死滅を誘発し、これによりＰＣＯを予防することができる、という仮説が提示されている。しかし、提案されている処置法では、ソルビトール経路を調節するために、術前に最大４８時間、水晶体嚢バッグを予め処置する必要があり、そのため、現在の白内障手術には容易に組み入れることができない。
【００１２】
他にも、化学治療が試みられている。例えば、ＬＥＣに特異的な免疫毒素結合抗体の使用は、ＰＣＯの発症を低減することはできるが、完全に予防することはできない。Ｃｌａｒｋら、Ｊ．Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ．Ｓｕｒｇ．、１９９８年１２月、２４巻（１２）、１６１４〜２０頁；およびＭｅａｃｏｃｋら、Ｊ．Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ．Ｓｕｒｇ．、２０００年５月、２６巻（５）、７１６〜２１頁を参照されたい。エチレンジアミン四酢酸、トリプシンおよびＤＩＳＰＡＳＥ（登録商標）（中性プロテアーゼ）も、ＬＥＣを分離するために使用されているが、小帯および周囲組織を損傷することがある。Ｎｉｓｈｉ，Ｊ、Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ．Ｓｕｒｇ、１９９９年１月、２５巻（１）、１０６〜１７頁；およびＮｉｓｈｉら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｓｕｒｇ．、１９９１年８月、２２巻（８）、４４４〜５０頁を参照されたい。ＰＣＯ予防用として試験されている他の物質としては、水晶体上皮細胞の遊走および増殖を阻害するＲＧＤペプチド；および、マイトマイシンＣ、５−フルオロウラシル等の有糸分裂阻害薬が挙げられる。Ｃｈｕｎｇ  ＨＳ、Ｌｉｍ  ＳＪ、Ｋｉｍ  ＨＢ、Ｊ．Ｃａｔａｒａｃｔ  Ｒｅｆｒａｃｔ  Ｓｕｒｇ．、２０００年１０月、２６巻（１０）、１５３７〜４２頁；Ｓｈｉｎ  ＤＨ、Ｋｉｍ  Ｙ．Ｙ．、Ｒｅｎ  Ｊら、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ、１９９８年、１０５巻、１２２２〜１２２６頁を参照されたい。
【００１３】
残念なことに、上述の化学物質のほとんどは、有効量使用した場合に、角膜内皮細胞（ＣＥＤＣ）、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥＣ）等の眼細胞を含む周囲の眼組織に対する、許容できないレベルの毒性を示す。
【発明の概要】
【００１４】
本発明により、上述のようなＰＣＯを予防する従来の手段の不利益が克服された。本発明は、他の眼細胞および組織を著しく損傷せずに、水晶体上皮細胞（ＬＥＣ）の剥離および／または死滅を、迅速かつ選択的に誘発することによってＰＣＯを予防し、既存の標準的な白内障手術に、また、将来行われる可能性のある新たな処置に容易に組み入れられるものであり、本発明により、白内障手術中または術後に、残留した水晶体上皮細胞を容易に除去することが可能になる。ＰＣＯの予防は、処置溶液の投与により実現される。処置溶液は、白内障手術前、術中または術後に水晶体嚢バッグ（ｌｅｎｓ  ｃａｐｓｕｌａｒ  ｂａｇ）中に投与または導入される。あるいは、処置溶液は、白内障手術前に、注入可能な眼内レンズに投与してもよい。処置溶液は、イオン輸送機構阻害物質を、単独で、または他の処置物質（例えば、適切なｐＨを実現するための浸透圧物質）とともに含有するものであり、水晶体上皮細胞の剥離および／または死滅を選択的に誘発して、後嚢混濁を予防する。イオン輸送機構阻害物質は、広範囲の細胞の細胞機構および細胞内イオン分布に干渉することができるが、当該物質の濃度は、処置溶液が水晶体上皮細胞の細胞機構に選択的に干渉し、他の眼細胞が実質的に無損傷のままであるように選択される。処置溶液は、他の眼細胞および組織を損傷せずに、かつ冗長な術前処置なしに、水晶体上皮細胞の死滅および／または剥離を選択的に誘発する。
【００１５】
処置溶液は、白内障手術前、術中または術後に投与または導入することができるが、（ｉ）正常な細胞機能への干渉を介して、ＬＥＣの基質または膜からの選択的な剥離を誘発し、最終的に細胞死を引き起こし、または少なくともＬＥＣの容易な除去を可能にすること、（ｉｉ）正常な細胞機能への干渉を介してＬＥＣの選択的な死滅を誘発すること、および／または（ｉｉｉ）正常な細胞機能への干渉を介して、ＬＥＣの浸透圧ストレスに対する感受性を強化し、最終的に細胞の剥離および／または死滅を引き起こすこと、によって、ＬＥＣを選択的かつ迅速に除去する。本発明は、広範囲の細胞のイオン輸送機構に干渉する化学物質が、ＬＥＣを特異的かつ独自の標的とすることを可能にする。
【００１６】
本発明の一実施形態では、眼処置溶液および方法は、イオン輸送機構阻害物質を利用して、他の眼細胞よりも本質的に高い発生率でＬＥＣの剥離および／または死滅を誘発することによって、ＰＣＯを予防する。本発明のイオン輸送機構阻害物質は、ＬＥＣの細胞膜を隔てたイオンおよび水の流れを調節する、細胞内、細胞外および／または細胞間の機構を直接または間接に干渉することができる。この干渉により、細胞の収縮および／または膨張が引き起こされ、細胞の剥離または死滅が生じる。物質の濃度は、イオン輸送機構阻害物質を含有する処置溶液が、相当な割合の水晶体上皮細胞の剥離および／または死滅を引き起こす一方で、死滅および／または剥離が生じる他の眼細胞が少ないように選択される。具体的には、イオン輸送機構阻害物質としては、共輸送阻害物質、ナトリウムポンプ阻害物質、交換阻害物質またはチャネル阻害物質が挙げられる。
【００１７】
イオン輸送機構阻害物質は、それ自体で、ＬＥＣの細胞体積の変化、および／または細胞の剥離および／または死滅を誘発する。あるいは、浸透圧ストレスを生じて、ＬＥＣの選択的な剥離および／または死滅を引き起こし、ＰＣＯを予防する追加物質に対して十分に応答することができないように、ＬＥＣを感作する。この追加物質とは、ＬＥＣの浸透圧ショックを誘発し、細胞の剥離および／または死滅を引き起こす、浸透圧調節物質等の浸透圧物質である。
【００１８】
本発明の処置溶液は、選択的な濃度の特定の浸透圧物質に応じて選択される適切なｐＨを有する。溶液のｐＨは、溶液における水素イオン濃度を上昇または低下させる任意の酸、塩基、その他の物質により調節することができる。
【００１９】
本発明の利点、新規な特徴、および詳細は、以下の説明から完全に理解されよう。
【発明の詳細な説明】
【００２０】
本発明を、１つまたは複数の好適な実施形態に関して記載するが、本発明はこれらの実施形態に制限されないことは理解されよう。また、本発明は、本明細書をまとめる特許請求の範囲の精神および範囲に含まれる、全ての代替形態、改変形態および同等形態を包含する。
【００２１】
本発明は、イオン輸送機構阻害物質を単独で、または他の物質と組み合わせて用いて、他の眼細胞および組織を実質的に損傷せずに、かつ冗長な術前処置なしに、水晶体上皮細胞の水晶体嚢からの剥離、および／または細胞の死滅を迅速かつ選択的に誘発することによってＰＣＯを予防する。この選択的な剥離および／または死滅は、ＬＥＣを眼の他の細胞から区別している特有の性質により可能になる。用いた物質の投与量および濃度に応じて、細胞体積の変化（例えば、収縮）が起こり、ＬＥＣは水晶体から剥離され、殺傷および／または除去されるが、他の眼細胞および組織は無損傷のままである。
【００２２】
水は、事実上、ヒト細胞の細胞膜を隔てた熱力学的平衡状態にある。ほぼ全てのヒト細胞の細胞膜は、水に対する高度な透過性を有するので、細胞の体積は、浸透圧活性を有する溶質（電解質および浸透圧調節物質）の細胞含量により、また、細胞外液のモル浸透圧濃度および／または張性により決まる。一般に、細胞内および細胞外の張性は同じであり、生理的条件下では、ほとんどの哺乳動物細胞は広範囲の張性に曝されていない。体液のモル浸透圧濃度は通常、約２８５ｍＯｓｍ／ｋｇＨ２Ｏであり、体液の恒常性により、極めて狭い範囲内（±３％）に調節されている。しかし、病態生理的条件下では、体液の恒常性のかく乱が生じることがある。約２２０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ２Ｏ〜約３５０ｍＯｓｍ／ｋｇＨ２Ｏの範囲の血漿液のモル浸透圧濃度が観察されている。このような極端な条件下では、体積調節機構がないと、身体の細胞は、２０〜３０パーセント膨張または収縮する。
【００２３】
水晶体上皮細胞は、他の細胞と同様に、細胞外モル浸透圧濃度の変化から防御し、一定の細胞体積を維持する細胞体積調節プロセスを用いる。水晶体上皮細胞、水晶体線維細胞および毛様体上皮細胞の体積調節機構は、文献に既に記載されている。例えば、Ｃ．Ｗ．ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎら、Ａｍｅｒ．Ｊ．Ｐｈｓｉｏｌ、Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２００１年９月、２８１巻（３）、Ｃ８６５〜７５頁；Ｊ．Ｊ．Ｚｈａｎｇら、Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９７年３月、８２巻（２）、２４５〜５９頁；Ｊ．Ｊ．Ｚｈａｎｇら、Ｅｘｐ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９９４年９月、７９巻（５）、７４１〜５３頁；Ｊ．Ｊ．Ｚｈａｎｇら、Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９７年３月、１、４９９（Ｐｔ２）、３７９〜８９頁を参照されたい。浸透圧のかく乱の後には体積調節期が続き、体積調節期に、細胞は等張の媒体中で有する体積に戻る傾向がある。細胞体積の変化は、特定の代謝経路および膜輸送経路を活性化し、その結果、浸透圧活性を有する溶質の正味の蓄積または喪失を生じる。調節性体積減少（ＲＶＤ）は、細胞外の浸透圧または張性が低い場合に、それに応答して細胞体積を低減または維持するために用いられるプロセスである。調節性体積増加（ＲＶＩ）は、細胞外の浸透圧または張性が高い場合に、それに応答して細胞体積を増大または維持するために用いられるプロセスである。細胞内溶質量（すなわち、細胞内張性）、または細胞外張性が変化すると、膜を隔てた急速な水の流れが生じて、平衡を回復する。細胞膜は高度な弾性を有するので、水の流れは細胞の膨張または収縮を引き起こす。
【００２４】
細胞が細胞内イオン濃度を変化させて平衡を実現する一方法として、細胞の表面上に位置するイオン輸送機構の使用によるものが挙げられる。これらの機構は、イオンを細胞内外へ移動させ、細胞内イオン強度を変化させ、結果的に浸透圧を変化させる。例えば、様々なタイプの細胞でＲＶＤの間に活性化されるイオン輸送機構は、伝導性Ｋ＋およびＣｌ−チャネル（別々の伝導性Ｋ＋およびＣｌ−輸送経路）、Ｋ＋−Ｃｌ−共輸送、および機能的に共役したＫ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換を含む。様々なタイプの細胞でＲＶＩの間に活性化されるイオン輸送機構は、Ｎａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送、および機能的に共役したＫ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換を含む。
【００２５】
自然界における様々なタイプの細胞と、イオン輸送機構の応答との間には、驚くべき多様性が存在する。ＨｏｆｆｍａｎおよびＳｉｍｏｎｓｅｎ、Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ．、１９８９年４月、６９巻（２）、３１５〜８２頁を参照されたい。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、角膜内皮にはブメタニド依存性イオン共輸送機構が見られないが、水晶体上皮では高度に発現する。Ｈａａｓ，Ｍ、１９９４年、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２６７巻、Ｃ８６９〜Ｃ８８５頁；Ｌａｗｒｅｎｃｅら、２００１年、Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．、７３巻、６６９頁。様々な細胞間には、体積セットポイントにも著しい相違が存在する。例えば、細胞には、ＲＶＤおよびＲＶＩを行うことが可能な細胞がどちらも行わない体積セットポイントがある。細胞が異なれば、ある輸送機構のスイッチがオンまたはオフになる体積セットポイントも異なる。Ｐａｒｋｅｒ，Ｊ．Ｃ、Ａｍ  Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９３年、２６５巻、Ｃ１１９１〜１２００頁；Ｐａｒｋｅｒ  ＪＣら、Ｊ．Ｇｅｎ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．、１９９５年６月、１０５巻（６）、６７７〜９９頁を参照されたい。水晶体細胞がＲＶＩおよびＲＶＤプロセスのスイッチをオフにするセットポイントまたは閾値は他の眼細胞と異なる。細胞の形状、およびインテグリンの細胞外マトリックスとの相互作用は、接着細胞において、細胞の剥離、生存を決定し、またはプログラムされた細胞死を誘発する上で、決定的な役割を果たしている。体積調節機構は、細胞分裂にも不可欠である。さらに、共輸送機構は、前眼房に処置を適用した場合に結果に影響を及ぼす可能性がある様々な眼細胞における様々な位置にも見出される。例えば、毛様体上皮の共輸送は、前眼房に直接曝露しない（ＪａｃｏｂおよびＣｉｖａｎｎ、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．、２７１巻（４０）、Ｃ７０３〜７２０頁、１９９６年）。これらにより、ＬＥＣは眼および身体の他の細胞から区別される。
【００２６】
水晶体上皮細胞のイオン輸送機構に干渉すると、これらの細胞が、低浸透圧性または高浸透圧性の細胞外環境、または他の細胞ストレスに十分に応答することが妨げられる。細胞がこれらのストレスに応答できなくなると、即座に、または最終的に細胞の剥離および／または死滅が引き起こされる。
【００２７】
ストレスに応答することができないか、または応答できなくなった水晶体上皮細胞は、いくつかの応答を示す。１つの応答は細胞死である。他の応答としては、細胞を支持している基質または膜からの細胞の剥離がありうる。例えば、細胞は縮んで、基質への付着を維持できなくなることがあるが、これは細胞骨格の再構成を伴う。細胞の収縮はまた、接着細胞が、接着斑における接触、および接着斑への細胞骨格の付着を再構成するのを誘発する。この剥離は、最終的には細胞死を引き起こし、あるいはさらに、細胞の容易な除去を可能とする。細胞死は、周囲の細胞および細胞外マトリックス（ＥＣＭ）からの細胞の剥離を引き起こすことがあり、また、細胞の剥離は、即時の細胞死なしに生じることがある。例えば、細胞外マトリックスの接触のかく乱は、サブステーション（ｓｕｂｓｔａｔｉｏｎ）細胞からの細胞の剥離により誘発されるアポトーシスの一形態であるアノイキスを誘発することが示されている。水晶体上皮細胞の応答としては他に、細胞が浸透圧ストレスまたはショックの影響を受けやすくなる細胞の弱化または感作がありうる。例えば、一旦細胞が感作すると、細胞は浸透圧ショックまたはストレスに適切に応答することができなくなり、その結果、感作細胞にショックまたはストレスを導入すると、細胞体積の変化、細胞の剥離および／または死滅が生じる。実施例でも示されるように、処置後のＬＥＣの体積変化、剥離および／または死滅は、剥離および／または死滅したＬＥＣが除去可能なように細胞領域をすすぎ、洗浄し、または何らかの方法で撹拌する前または後に、細胞領域を観察することによって（あるいは、光学・画像技術、光学顕微鏡、落射蛍光顕微鏡、共焦点顕微鏡、電子顕微鏡、免疫蛍光法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション法、ならびにタンパク質の同定および分析のための技術により）確認することができる。本発明の処置溶液および方法は、他の眼細胞をほとんど損傷せずに、上述のＬＥＣの応答の少なくとも１つを選択的かつ迅速に誘発することによりＰＣＯを予防する。
【００２８】
一態様では、本発明の眼処置溶液および方法は、イオン輸送機構阻害物質により、角膜内皮細胞（ＣＥＤＣ）、網膜色素上皮細胞（ＲＰＥＣ）等の他の眼細胞よりも本質的に高い発生率で、ＬＥＣの基質または膜からの剥離、および／またはＬＥＣの細胞死を誘発することによってＰＣＯを予防する。したがって、本発明の大きな利点は、本発明の物質で処置すると、相当な割合のＬＥＣを水晶体嚢バッグから除去して、ＰＣＯを予防することが可能になり、他方、他の眼細胞および組織はあまり損傷しないことである。
【００２９】
イオン輸送機構阻害物質は、直接または間接に、水晶体上皮細胞の細胞膜を隔てた、または細胞膜内のイオンおよび水の流れを調節する、細胞内、細胞外および／または細胞間の機構に干渉することが可能な物質である。イオン輸送機構阻害物質は、正常な細胞のイオン分布機構に干渉し、結果的に細胞の機能を阻害する。本発明のイオン輸送機構阻害物質は、単独で、または他の物質とともに、ＬＥＣ細胞のイオンの正常な分布をかく乱し、その結果、直接または間接にＬＥＣの剥離および／または死滅を選択的に誘発して、ＰＣＯを予防する。物質の濃度は、処置溶液がＬＥＣのイオン輸送機構に干渉し、細胞体積の変化、ＬＥＣの剥離および／または死滅を引き起こすが、他の眼細胞のイオン輸送機構には実質的に干渉しないように選択される。ＬＥＣは、細胞の剥離および／または死滅により水晶体嚢バッグから容易に除去することができるが、他の眼細胞は実質的に無損傷のままである。
【００３０】
イオン輸送機構阻害物質は、ＬＥＣにおいて次の細胞機構の１つまたは複数に干渉することができる。（１）共輸送機構（例えば、Ｋ＋−Ｃｌ−共輸送、Ｎａ＋−Ｃｌ−共輸送、Ｎａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送、およびアミノ酸輸送）、（２）ナトリウムポンプ、（３）イオン交換（例えば、機能的に共役したＮａ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換、機能的に共役したＫ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換、Ｃｌ−−Ｃｌ−交換、Ｃａ２＋−Ｎａ＋交換）、ならびに（４）イオンチャネル（例えば、カリウムチャネル、クロライドチャネル、容量感受性有機浸透圧調節物質および陰イオンチャネル（ＶＳＯＡＣ）、ポア形成タンパク質およびペプチド、ならびに他の陰イオンチャネル）。イオン輸送機構阻害物質は、これらの細胞機構を直接または間接に活性化し、または阻害することができる。
【００３１】
低浸透圧性の媒体では、脊椎動物細胞は、最初、浸透圧性の水平衡により膨張するが、次いで、ＫＣｌの正味の喪失、および正常な細胞体積を回復するための付随的な細胞水喪失により、その体積が調節される。細胞の膨張により輸送経路が活性化し、その結果、カリウム、クロライドおよび有機浸透圧調節物質の正味の流出が生じる。様々なタイプの細胞でＲＶＤの間に活性化されたイオン輸送機構は、伝導性Ｋ＋およびＣｌ−チャネル（別々の伝導性Ｋ＋およびＣｌ−輸送経路）、Ｋ＋−Ｃｌ−共輸送、ならびに機能的に共役したＫ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換を含む。例えば、カリウムおよびクロライドは、主にＫ＋−Ｃｌ−共輸送の活性化を通じて、または別々のカリウムチャネルおよび陰イオンチャネルを通じて、細胞から失われる。
【００３２】
対照的に、高浸透圧性の媒体では、脊椎動物細胞は、最初、浸透圧性の水平衡により収縮するが、次いで、ＫＣｌの正味の獲得、および正常な細胞体積を回復するための付随的な細胞水取込みにより、その体積が調節される。細胞の収縮により輸送経路が活性化し、その結果、クロライド、ナトリウムおよびカリウムの正味の流入が生じる。様々なタイプの細胞でＲＶＩの間に活性化されたイオン輸送機構は、Ｎａ＋−Ｃｌ−またはＮａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送、ならびに機能的に共役したＮａ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換を含む。
【００３３】
イオン輸送機構阻害物質の例としては、以下のものが挙げられる（これらに限定されない）。
ｎ−エチルマレイミド
バリノマイシン
グラミシジン
カテコールアミン
カルシウム
イオノフォアＡ２３１８７（例えば、イオノフォアＡ２３１８７プラスカルシウムを含む。）
カルモジュリン
ピモジド
ループ利尿薬（例えば、フルセミド、ブメタニド、エタクリン酸、ピレタニド、トラセミド）
チアジド利尿薬（例えば、ジヒドロクロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、シクロペンチアジド、ベンズチアジド、クロロチアジド、ベンドロフルメチアジド、クロルサリドン、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、メトラゾン、ポリチアジド、キネタゾン、トリクロルメチアジド）
アミロライド
ジイソチオシアノ−ジスルホニルスチルベン（ＤＩＤＳ）
スタウロスポリン（ＳＩＴＳ）
ニフルム酸
スチルベン誘導体（例えば、４，４’−ジニトロスチルベン−２’，２−ジスルホン酸）
キニーネ
サイトカラシンＢ
【００３４】
一般に、４つのクラスのイオン輸送機構阻害物質：（１）共輸送阻害物質、（２）ナトリウムポンプ阻害物質、（３）交換阻害物質、および（４）チャネル阻害物質、が存在する。以下に示されるように、イオン輸送機構阻害物質は、４つの上記クラスの少なくとも１つに分類することができる。
【００３５】
共輸送阻害物質は、直接または間接に、細胞の共輸送機構に干渉することが可能な物質である。より詳しくは、共輸送阻害物質は、ＬＥＣの共輸送機構を活性化または阻害する。共輸送阻害物質の濃度は、処置溶液が、他の眼細胞よりも本質的に高い発生率でＬＥＣの剥離および／または死滅を誘発するように選択される。共輸送機構としては、Ｋ＋−Ｃｌ−またはＮａ＋−Ｋ＋−２Ｃｌ−共輸送が挙げられる。
【００３６】
共輸送阻害物質としては、例えば、次の利尿薬が挙げられる。
（ｉ）チアジド利尿薬、例えば、ジヒドロクロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、シクロペンチアジド、ベンズチアゾール、クロロチアジド、ベンドロフルメチアジド、クロルサリドン、ヒドロクロロチアジド、ヒドロフルメチアジド、メチクロチアジド、メトラゾン、ポリチアジド、キネタゾン、およびトリクロルメチアジド。米国で一般に用いられている商品としては、Ａｑｕａｔｅｎｓｅｎ（メチクロチアジド）、Ｄｉｕｃａｒｄｉｎ（ヒドロフルメチアジド）、Ｄｉｕｌｏ（メトラゾン）、Ｄｉｕｒｉｌ（クロロチアジド）、Ｅｎｄｕｒｏｎ（メチクロチアジド）、Ｅｓｉｄｒｉｘ（ヒドロクロロチアジド）、Ｈｙｄｒｏ−ｃｈｌｏｒ（ヒドロクロロチアジド）、Ｈｙｄｒｏ−Ｄ（ヒドロクロロチアジド）、ＨｙｄｒｏＤＩＵＲＩＬ（ヒドロクロロチアジド）、Ｈｙｄｒｏｍｏｘ（キネタゾン）、Ｈｙｇｒｏｔｏｎ（クロルサリドン）、Ｍｅｔａｈｙｄｒｉｎ（トリクロロメチアジド）、Ｍｉｃｒｏｚｉｄｅ（ヒドロクロロチアジド）、Ｍｙｋｒｏｘ（メトラゾン）、Ｎａｑｕａ（トリクロロメチアジド）、Ｎａｔｕｒｅｔｉｎ（ベンドロフルメチアジド）、Ｏｒｅｔｉｃ（ヒドロクロロチアジド）、Ｒｅｎｅｓｅ（ポリチアジド）、Ｓａｌｕｒｏｎ（ヒドロフルメチアジド）、Ｔｈａｌｉｔｏｎｅ（クロルサリドン）、Ｔｒｉｃｈｌｏｒｅｘ（トリクロロメチアジド）、Ｚａｒｏｘｏｌｙｎ（メトラゾン）、Ａｐｏ−Ｃｈｌｏｒｔｈａｌｉｄｏｎｅ（クロルサリドン）、Ａｐｏ−Ｈｙｄｒｏ（ヒドロクロロチアジド）、Ｄｉｕｃｈｌｏｒ  Ｈ（ヒドロクロロチアジド）、Ｄｕｒｅｔｉｃ（メチクロチアジド）、ＨｙｄｒｏＤＩＵＲＩＬ（ヒドロクロロチアジド）、Ｈｙｇｒｏｔｏｎ（クロルサリドン）、Ｎａｔｕｒｅｔｉｎ（ベンドロフルメチアジド）、Ｎｅｏ−Ｃｏｄｅｍａ（ヒドロクロロチアジド）、Ｎｏｖｏ−Ｈｙｄｒａｚｉｄｅ（ヒドロクロロチアジド）、Ｎｏｖｏ−Ｔｈａｌｉｄｏｎｅ（クロルサリドン）、Ｕｒｉｄｏｎ（クロルサリドン）、Ｕｒｏｚｉｄｅ（ヒドロクロロチアジド）、およびＺａｒｏｘｏｌｙｎ（メトラゾン）が挙げられる。
（ｉｉ）ループ作用性利尿薬、例えば、ベンズメタニド、ブメタニド、トルセミド、エタクリン酸、およびフルセミド（フロセミドとしても知られている）。一般に用いられている商品としては、Ｂｕｒｎｅｘ（ブメタニド）、Ｄｅｍａｄｅｘ（トルセミド）、Ｅｄｅｃｒｉｎ（エタクリン酸）、Ｌａｓｉｘ（フロセミド）、Ｍｙｒｏｓｅｍｉｄｅ（フロセミド）、Ａｐｏ−Ｆｕｒｏｓｅｍｉｄｅ（フロセミド）、Ｅｄｅｃｒｉｎ（エタクリン酸）、Ｆｕｒｏｓｉｄｅ（フロセミド）、Ｌａｓｉｘ（フロセミド）、Ｌａｓｉｘ  Ｓｐｅｃｉａｌ（フロセミド）、Ｎｏｖｏｓｅｍｉｄｅ（フロセミド）、およびＵｒｉｔｏｌ（フロセミド）が挙げられる。
（ｉｉｉ）カリウム保持性利尿薬。米国で一般に用いられている商品名としては、Ａｌｄａｃｔｏｎｅ（スピロノラクトン）、Ｄｙｒｅｎｉｕｍ（トリアムテレン）、およびＭｉｄａｍｏｒ（アミロライド）が挙げられる。カナダで一般に用いられる商品としては、Ａｌｄａｃｔｏｎｅ（スピロノラクトン）、Ｄｙｒｅｎｉｕｍ（トリアムテレン）、Ｍｉｄａｍｏｒ（アミロライド）、およびＮｏｖｏｓｐｉｒｏｔｏｎ（スピロノラクトン）が挙げられる。
（ｉｖ）炭酸脱水素酵素阻害薬、例えば、アセタゾラミド、ドルゾラミド、およびブリンゾラミド。
（ｖ）カリウム含有利尿薬、例えば、Ｂｕｒｉｎｅｘ  Ｋ（登録商標）（Ｌｅｏ）、Ｃｅｎｔｙｌ  Ｋ（登録商標）、Ｌａｓｉｋａｌ（登録商標）、およびＮｅｏ−ＮａＣｌｅｘ−Ｋ（登録商標）。
（ｖｉ）複合利尿薬、例えば、Ｔｒｉａｍ−ｃｏ（コトリアムテルジド（ｃｏ−ｔｒｉａｍｔｅｒｚｉｄｅ）５０／２５）、Ａｍｉｌ−ｃｏ（コアミロジド（ｃｏ−ａｍｉｌｏｚｉｄｅ）５／５０）、コアミロジド５／５０（コアミロフルセ（ｃｏ−ａｍｉｌｏｆｒｕｓｅ）５／５０）、Ｍｏｄｕｒｅｔｉｃ（コアミロジド５／５０）、Ｄｙａｚｉｄｅ（コトリアムテレジド（ｃｏ−ｔｒｉａｍｔｅｒｚｉｄｅ）５０／２５）、Ｎａｖｉｓｐａｒｅ（アミロライド２．５ｍｇ＋シクロペンチアジド２５０ｍｃｇ）、コアミロフルセ５／４０（コアミロフルセ５／４０）Ｆｒｕ−ｃｏ（コアミロフルセ５／４０）、Ｆｒｕｓｅｎｅ（トリアムテレン５０ｍｇ＋フルセミド４０ｍｇ）、Ｋａｌｓｐａｒｅ（トリアムテレン５０ｍｇ＋クロルタリドン５０ｍｇ）、Ｂｕｒｉｎｅｘ  Ａ（アミロライド５ｍｇ＋ブメタニド１ｍｇ）、Ｌａｓｏｒｉｄｅ（コアミロフルセ５／４０）、Ｆｒｕｍｉｌ（コアミロフルセ５／４０）、Ｌａｓｉｌａｃｔｏｎｅ（スピロノラクトン５０ｍｇ＋フルセミド２０ｍｇ）、Ａｌｄａｃｔｉｄｅ５０（コフルマクトン（ｃｏ−ｆｌｕｍａｃｔｏｎｅ）５０／５０）、およびＤｙｔｉｄｅ（トリアムテレン５０ｍｇ＋ベンズチアジド２５ｍｇ）、Ｃｏ−ｆｌｕｍａｃｔｏｎｅ（スピロノラクトンおよびチアジド類）。
【００３７】
共輸送阻害物質としてはまた、次のものが挙げられる。
Ｋ−Ｃｌ共輸送によるＫＣｌ流出の促進することにより細胞の収縮を引き起こす共輸送阻害物質、例えば、ＤＤＳ−ＮＯＨ、ジヒドロインデニル［オキシ］アルカン酸（ＤＩＯＡ）、オカダ酸（ＯＡ）、Ａ−２３１８７、１−エチル−２−ベンズイミダゾリノン、ＹＭ９３４、クロマカリム、ジェム−ジメチル置換基：９−（３，４−ジクロロフェニル）−３，４，６，７，９，１０−ヘキサヒドロ−１，８（２Ｈ，５Ｈ）−アクリジンジオン（Ａ−１８４２０８）、カリブドトキシン（ＣｈＴＸ）、プロスタグランジンＥ２、スタウロスポリン、Ｋ＋イオノフォアバリノマイシン、腫瘍壊死因子αプラスシクロヘキシミド、ジアゾキシド、ピナシジルおよびニコランジル、ならびにｃＡＭＰまたはサイクリックＧＭＰの細胞内レベルを増加させる物質（Ｎｅｌｓｏｎら、１９９５年）、ならびにアラキドン酸のエポキシド
Ｋ−Ｃｌ共輸送機構の活性化により、カリウムおよびクロライド、ならびに他のイオンおよび浸透圧調節物質の喪失（例えば、細胞内または細胞外のカルシウム枯渇または上昇）を誘発するあらゆる刺激物質
ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）（例えば、ｎ−エチルマレイミドプラスルビジウムを含む。）
ヨードアセトアミド
水銀（Ｈｇ２＋）
水晶体上皮細胞の共輸送機構を活性化または阻害することが可能な他の任意の物質
【００３８】
ナトリウムポンプ阻害物質は、直接または間接に、細胞のＮａ／Ｋ／ＡＴＰａｓｅポンプ（ナトリウムポンプとして知られる。）機構に干渉することが可能な物質である。より詳しくは、ナトリウムポンプ阻害物質は、ＬＥＣのＮａ／Ｋ／ＡＴＰａｓｅポンプを活性化または阻害する。例えば、ＬＥＣは非永続的な陰イオン性の巨大分子を含み、拡散性のイオンおよび水の侵入（Ｇｉｂｂｓ−Ｄｏｎｎａｎの平衡）に起因するコロイド浸透圧性の膨張は、散逸性の漏入の速度に等しい速度でイオンを押し出すイオン押出しポンプの作動により常時対抗されている。ナトリウムポンプ阻害物質の濃度は、処置溶液が、他の眼細胞よりも本質的に高い発生率でＬＥＣの剥離および／または死滅（例えば、膨張による。）を誘発するように選択される。ナトリウムポンプ阻害物質の例には、ウアバイン、および、水晶体上皮細胞のナトリウムポンプを活性化または阻害することが可能な他の任意の物質が含まれる。
【００３９】
さらに別のタイプのイオン交換機構阻害物質は、交換阻害物質である。交換阻害物質は、直接または間接に、細胞のイオン交換に干渉することが可能な物質である。より詳しくは、交換阻害物質はＬＥＣのイオン交換機構を活性化または阻害するが、これは、細胞内および細胞外のイオン再分布を引き起こすだけでなく、細胞内ｐＨを変化させることもできる。イオン交換機構としては、Ｋ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３交換が挙げられ、Ｎａ＋−Ｈ＋交換はＣｌ−−ＨＣＯ３−交換と機能的に共役する。例えば、ＬＥＣのＫ＋−Ｈ＋およびＣｌ−−ＨＣＯ３−交換を活性化することにより、カリウムおよびクロライドの喪失を誘発するあらゆる刺激物質は、交換阻害物質である。交換阻害物質としては、例えば、次のものが挙げられる。
スタウロスポリン（ＳＩＴＳ）
アミロライド
ジイソチオシアノ−ジスルホニルスチルベン（ＤＩＤＳ）
カルモジュリン（ＣａＭ）
銅（Ｃｕ２＋）
水素（Ｈ＋）
水晶体上皮細胞の交換を活性化または阻害することが可能な他の任意の物質
【００４０】
チャネル阻害物質は、直接または間接に、細胞のイオンチャネルに干渉することが可能な物質である。より詳しくは、チャネル阻害物質は、ＬＥＣのイオンチャネルを活性化または阻害する。イオンチャネルの例には、カリウムチャネル、クロライドチャネル、ナトリウムチャネルおよびＶＳＯＡＣ、ならびにポア形成タンパク質またはペプチドチャネルまたは輸送経路が含まれる。例えば、カリウムチャネルおよびクロライドチャネルを活性化することにより、塩化カリウムおよび有機浸透圧調節物質の喪失を誘発するあらゆる刺激物質は、チャネル阻害物質である。チャネル阻害物質の濃度は、処置溶液が、他の眼細胞よりも本質的に高い発生率でＬＥＣの剥離および／または死滅を誘発するように選択される。チャネル阻害物質としては、例えば、次のものが挙げられる。
ケトコナゾール（ＫＥＴＯ）
５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）安息香酸（ＮＰＰＢ）
１，９，−ジデオキシフォルスコリン（ＤＤＦ）
タモキシフェン
ベラパミル
キニーネ
バリウム（Ｂａ２＋）
ジフェニルアミン−２−カルボキシレート（ＤＰＣ）
アントラセン−９−カルボン酸
インドクリノン（Ｉｎｄｏｃｒｉｎｏｎｅ）（ＭＫ−１９６）
ピモジド
ＣＢＩＱ
ＥＢＩＯ，１−エチル−２−ベンズイミダゾロン
タモキシフェン＋ＡＴＰ
スルフヒドリル酸化物質
タンパク質リン酸化阻害物質
４−クロロ−ベンゾ［Ｆ］イソキノリン
β−ＣＣＭ，ＺＫ９３４２６
フルマゼニル
アデノシン
スルホニル尿素
アラキドン酸（ＡＡ）
ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）
タンパク質キナーゼＣ
Ｇタンパク質
Ｆ−アクチンの組織化の変化を誘発する物質
水晶体上皮細胞のイオンチャネルを活性化または阻害することが可能な他の任意の物質
【００４１】
ポア形成タンパク質およびペプチドは、水晶体上皮細胞の脂質二重層を通過することができない分子のための経路を作り出すことが可能な物質である。より詳しくは、これらのＰＰＦＰは、ポアまたはチャネルを形成して、ＬＥＣから細胞内Ｋが漏出するのを促進する。過去半世紀間に、次のような数百ものペプチド系抗生物質が報告されている。グラミシジン、バシトラシン；ポリミキシン（Ｂ）（Ｎｅｏｓｐｏｒｉｎ、Ｏｔｏｓｐｏｒｉｎ）、ナイスタチン（Ｎｙｓｔａｎ、Ｔｒｉ−Ａｄｃｏｒｔｙｌ）、糖ペプチド、ａ−ディフェンシン、ｂ−ディフェンシン１、タキプレシン（ｔａｃｈｙｐｌｅｓｉｎ）、細菌のナイシン（ｎｉｓｉｎ）、ａ−ヘモリシン、ロイムノリシン（ｒｏｉｍｍｕｎｏｌｙｓｉｎｓ）、ポーリン（ＯｍｐＡ、ＰｈｏＥ、ＮｍｐＣ、ＯｍｐＦ、Ｐｈｏｓｐｈｏｐｏｒｉｎ、ＬａｍＢポーリン）、Ｂｃｌ−ＸＬ；α−ヘモリシン、エロリシン（Ａｅｒｏｌｙｓｉｎ）、コリシン、アラメテシン（ａｌａｍｅｔｈｅｃｉｎ）、マガイニン、セクロピン；両親媒性のβシートペプチド（グラミシジン、ディフェンシンおよび細胞溶解素）、α−ヘリックス状のペプチド（アラメテシン、ニューモリシン、マガイニンおよびセクロピン）、ラナレキシン（ｒａｎａｌｅｘｉｎ）、ブレビニン（ｂｒｅｖｉｎｉｎ）、およびＰＲ３９。
【００４２】
本発明の物質を用いる場合、当該物質の濃度は、処置溶液の投与により、ＬＥＣの細胞生存率が、好ましくは約１０パーセント未満、より好ましくは約５パーセント未満、より好ましくはほぼ０パーセントであるように選択する。他の眼細胞（ＲＰＥＣ、ＣＥＤＣ等）の細胞生存率は、好ましくは約７０パーセントを超え、より好ましくは約９０パーセントを超え、より好ましくはほぼ１００パーセントである。
【００４３】
これらの状況下において、おそらくは他の物質とともに上記物質を含有する処置溶液は、ＬＥＣの剥離および／または死滅を選択的に誘発し、他の眼細胞よりも本質的に高い発生率でＬＥＣの剥離および／または死滅を誘発する。実施例で示されるように、細胞の剥離および／または死滅は、剥離および／または死滅したＬＥＣが除去可能なように細胞領域をすすぎ、洗浄し、または何らかの方法で撹拌する前または後に、細胞領域を観察することにより確認することができる。
【００４４】
上述の本発明の物質（以下、基本物質という。）は、直接または間接に、単独で、あるいは以下に記載の追加物質、またはその他の物質もしくは化学物質とともに、ＬＥＣの剥離および／または死滅を選択的に誘発する。例えば、本発明の眼処置溶液および方法は、基本物質の他に浸透圧物質を含有してもよく、この場合、溶液は、角膜内皮細胞および網膜色素上皮細胞よりも本質的に高い発生率で水晶体上皮細胞の剥離および／または死滅を誘発して、後嚢混濁を予防する。
【００４５】
浸透圧物質は、ＬＥＣに浸透圧ショックを誘発することが可能な物質である。ＬＥＣにおける浸透圧ショックは、正常な細胞内または細胞外のイオン平衡を変化させるどのような細胞条件によっても引き起こされる。例えば、浸透圧活性を有する溶質、または、細胞体積の制御に関与する特定のイオン輸送機構の活性に影響を及ぼす様々な刺激物質（例えば、ホルモン、成長因子および他の外部刺激、細胞膜電位、ならびに細胞内セカンドメッセンジャー）、の細胞外濃度の変化は、浸透圧ショックを誘発することができる。大量のイオンの経細胞流動は、細胞体積の恒常性にショックを与えることができる。細胞を低張溶液、または低浸透圧性のモル浸透圧濃度の溶液に曝すことにより、低浸透圧ストレスを引き起こすことができる。逆に、細胞を高張溶液、または高浸透圧性のモル浸透圧濃度の溶液に曝すことにより、高浸透圧ストレスを引き起こすことができる。浸透圧活性を有するイオンおよび有機溶質の細胞内濃度の増大または低減もまた、細胞体積調節にショックを与え、ＲＶＤまたはＲＶＩ応答に関与する膜輸送プロセスを活性化することができる。
【００４６】
浸透圧物質の投与または導入は、基本物質が、（例えば、イオン輸送機構を阻害することにより、）浸透圧ショックに対してＬＥＣを感作する場合、および浸透圧物質自体が細胞の剥離および／または死滅を誘発する場合に好適である。例えば、イオン輸送機構阻害物質が、必須のイオン輸送機構（例えば、ナトリウム−カリウムポンプまたは共輸送）を阻害する場合、ＬＥＣは、外部の浸透圧ストレスまたはショックに対して自身を防御することができず、その結果、追加的な浸透圧物質が引き起こす細胞外浸透圧に対してその感受性を増強する。ＬＥＣが浸透圧ストレスまたはショックに応答することができないと、細胞死シグナリングプロセスの活性化により細胞死が引き起こされることがある。
【００４７】
しかし、基本物質はまた、浸透圧物質であってもよく、基本物質がＬＥＣのイオン輸送機構に選択的に干渉し、浸透圧ショックを誘発してもよいことは理解されるところである。
【００４８】
より詳しく述べると、浸透圧物質は、高浸透圧性または低浸透圧性のモル浸透圧濃度を有する。低浸透圧性溶液は、生理的条件で通常見られるよりも低い溶質濃度を有し、高浸透圧性溶液は、生理的条件で通常見られるよりも高い溶質濃度を有する。換言すれば、浸透圧物質は、細胞外の高張状態または低張状態を作り出す。
【００４９】
生理学的に許容可能なあらゆる電解質および浸透圧調節物質、浸透圧強度に寄与するあらゆる溶質は、浸透圧ストレスまたはショックを誘発するのに適している。浸透圧調節物質としては、例えば、次のものが挙げられる。
・下記（ｉ）および（ｉｉ）のような塩（例えば、ＮａＣｌ）
（ｉ）ナトリウム、カリウム、リチウム、ルビジウム、ベリリウム、マグネシウム、カルシウム、ストロンチウム、バリウム、アルミニウム、亜鉛、スズ、銀、金、鉄、水銀等の陽イオンと、塩化物、臭化物、ヨウ化物、水酸化物、ホウ酸、メタホウ酸、炭酸、炭酸水素、硝酸、フッ化物、硫酸、一リン酸、二リン酸、リン酸、チオシアネート、イソチオシアネート等の陰イオンと、の無機塩
（ｉｉ）上記と同じ陽イオンと、酢酸、アルギン酸、安息香酸、酪酸、カプリル酸、カプロン酸、クエン酸、デカンスルホン酸、デシル硫酸、ドデシル硫酸、ジエチルバルビツール酸、ジメチルジチオカルバミン酸、亜ジチオン酸、ドデカンスルホン酸、エタンスルホン酸、フルオロ酢酸、フルオロリン酸、フマル酸、ヘキサフルオロリン酸、ヘキサンスルホン酸、ヨード酢酸、Ｌ−乳酸、Ｄ−乳酸、Ｄ，Ｌ−乳酸、マレイン酸、マロン酸、メソラキセート（ｍｅｓｏｌａｘａｔｅ）、ミリスチン酸、オレイン酸、シュウ酸、パルミチン酸、プロピオン酸、サリチル酸、酒石酸、トリフルオロ酢酸等の陰イオンと、の有機塩
・アミノ酸（例えば、タウリン、グリシン、アラニン）
・糖（例えば、マンニトール、ミオイノシトール、ベタイン、グリセロホスホリルコリン、尿素、ショ糖、グルコース）
・他の任意の有機または無機浸透圧調節物質
【００５０】
上述のように、浸透圧調節物質は塩化ナトリウムであってもよいが、塩化物は、ヨウ化物、臭化物、硝酸、チオシアネート、フッ化物、硫酸、イセチオン酸、グルコン酸、および他の任意の許容可能なイオンで置き換えることができ、また、ナトリウムは、カリウム、セシウム、ルビジウム、リチウム、フランシウム、および他の任意の許容可能な置換で置き換えることができることに留意されたい。
【００５１】
好ましい浸透圧調節物質としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、水酸化ナトリウム、ヨウ化ナトリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、硝酸ナトリウム、フッ化ナトリウム、硫酸ナトリウム、炭酸カリウム、クエン酸カリウム、乳酸カリウム、炭酸水素カリウム、臭化カリウム、水酸化カリウム、ヨウ化カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウム、塩化セシウム、塩化ルビジウムおよび塩化リチウムが挙げられる。
【００５２】
浸透圧物質および基本物質は、ＰＣＯの処置において、別々に、同時に、または順次投与することができる。
【００５３】
好ましくは、処置溶液のｐＨは、用いる物質および濃度に応じて約５〜１１である。好適な実施形態では、処置溶液は、約±２００ｍＭのＮａＣｌ、より好ましくは≦２００ｍＭのＮａＣｌを含有し、そのｐＨは、好ましくは約８〜１０、より好ましくは７〜１０、より好ましくは７．６である。処置溶液のｐＨは、基本物質または浸透圧物質の濃度を変化させることにより、あるいはｐＨを変化させる追加的化学物質を導入することにより調節することができる。ｐＨは、任意の酸または塩基、あるいは水素イオン濃度を増大または低減させる任意の物質により調節することができる。
【００５４】
処置は、基本物質、浸透圧物質、およびｐＨを調節する物質の濃度が一定の範囲内にある場合に有効である。本発明によると、物質の適切な濃度は、広範囲の細胞の細胞機構に干渉することが可能な物質が、ＬＥＣのイオン輸送機構を選択的に干渉して、ＬＥＣの剥離および／または死滅を引き起こすように選択される。処置溶液を投与すると、相当な割合のＬＥＣが剥離および／または殺傷され、他方、損傷される他の眼細胞は少ない。濃度範囲の一端では、処置溶液の有効性が低減し、その結果、ＬＥＣの細胞死を引き起こすのにより長時間を要することになる。範囲の他端では、薬物は眼における他の細胞に損傷を与える傾向がある。基本物質、浸透圧物質、およびｐＨを調節する物質の適切な濃度は、他の眼細胞および眼組織に対する著しい損傷なしに、選択的なＬＥＣの死滅および／または剥離を引き起こして、ＰＣＯを予防することができるように選択するべきである。好ましくは、物質の濃度は、投与後のＬＥＣの細胞生存率が約１０パーセント未満、より好ましくは約５パーセント未満、より好ましくはほぼ０パーセントであり、他の眼細胞（ＲＰＥＣ、ＣＥＤＣ等）の細胞生存率が約７０パーセントを超え、より好ましくは約９０パーセントを超え、より好ましくはほぼ１００パーセントであるように選択するべきである。有効成分の濃度は、有効成分の薬理活性によるが、一般に、好ましくは１５００μＭ未満、より好ましくは１０００μＭ未満、より好ましくは５００μＭ未満である。
【００５５】
上述の物質と、それらが導入される濃度と、の間には相関関係がある。例えば、ｐＨの高い処置溶液は、低レベルの浸透圧モル濃度でＬＥＣを死滅させる。ある物質の適切な濃度の例は、後述の実施例で示される。さらに、濃度は、一般的な白内障手術に特有の必要性、および患者の必要性に適合するように調節することができる。
【００５６】
本発明の処置溶液は、ＰＣＯを予防するために、白内障手術前、術中または術後に投与することができる。水晶体嚢の前部を切開し、白内障を除去する。次いで、眼内レンズを嚢の後部に挿入する。あるいは、水晶体または水晶体内容物を、注入可能な眼内レンズで置き換えてもよい（水晶体リフィリングとしても知られている）。眼内レンズおよびレンズ材料は、（例えば、注入または挿入により）水晶体嚢バッグ中に配置する前に、本発明の処置溶液で予め処置してもよい。残留するＬＥＣは、吸引または他の外科技術を用いて除去してもよいし、また、しなくてもよい。超音波乳化吸引法、レーザーまたは他の技術を用いて、水晶体内容物を除去してもよい。処置溶液は、このプロセスの前、間または後のあらゆる時点で、局所的に投与または導入することができる。次いで、眼球領域を洗浄して、残留細胞を除去することができる。
【００５７】
上述のように、処置溶液は、基本物質、浸透圧物質、および溶液のｐＨを調節するために用いられるあらゆる化学物質を含有することができる。あるいは、基本物質、浸透圧物質、および／またはｐＨを調節するための化学物質を別々に含有する複数の溶液を、順次、または同時に投与または導入して、ＰＣＯを予防することができる。上述のように、基本物質は、また浸透圧物質であってもよい。溶液は、シリンジ、ドロッパー、超音波乳化吸引法に用いられるプローブ、または他の任意の適切な、もしくは好都合な投与手段により投与することができる。
【００５８】
本発明のさらなる利点は、処置溶液が、比較的速く、水晶体上皮細胞の体積変化（例えば、収縮）、剥離および／または死滅を誘発するので、本発明の処置が白内障手術に容易に組み入れられるということである。水晶体上皮細胞の剥離は、本発明の溶液または物質を投与して約３０分以内に起こり、細胞死は数時間以内に起こる。細胞の体積変化および／または剥離は、投与後約１５分以内に起こることが好ましいが、選択した濃度および物質に依存する。
【００５９】
本発明の処置溶液および方法が、他の眼細胞よりも本質的に高い発生率でＬＥＣの細胞剥離および／または死滅を誘発したか否か、あるいは、そのような処置が選択的であるか否かは、処置後の細胞生存率の比較評価により、あるいは有効性を判定する他の任意の許容可能な方法により決定することができる。より詳しくは、処置溶液および方法は、上述のように、一方ではＰＣＯを予防し、他方では他の眼細胞に対する生理学的損傷を最小化する必要がある。好ましくは、物質の濃度は、投与後のＬＥＣの細胞生存率が約１０パーセント未満であり、他の眼細胞（ＲＰＥＣ、ＣＥＤＣ等）の細胞生存率が約７０パーセントを超えるように選択される。処置溶液は、追加物質、化学物質、タンパク質および／またはその他の物質を含有することができ、１種を超える基本物質または浸透圧物質を含有することができる。他の化学成分または生体成分をさらに加えて、処置溶液の性質、例えば、生理学的許容性、粘性または貯蔵性を改善してもよい。
【００６０】
処置溶液は、白内障手術の前に、眼内レンズおよび／または眼内レンズ材料をコーティングするのに使用することができ、あるいは、水晶体リフィリングを行う際に使用する眼内レンズ材料と混合することができる。処置溶液は、キットまたは他のパッケージに包装することができ、また、単一溶液として、あるいは上述のように、後で投与するための別々の溶液として貯蔵することができる。例えば、キットまたはパッケージは、浸透圧物質含有溶液とは別に包装されたイオン輸送機構阻害物質含有溶液を含んでもよい。さらに、処置溶液は、超音波乳化吸引法に用いられる液体を含むキットまたはパッケージに、あるいは注入可能な眼内レンズの注入の前に水晶体内容物を除去するために用いられるキットに包装してもよい。
【実施例】
【００６１】
〔比較実施例１〕
以下に記載のように、９６ウェル平底プレートで増殖させたコンフルエントな単層のＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣを、様々な濃度のＮａＣｌ（浸透圧調節物質）溶液に曝す。２００μＬのＮａＣｌ溶液（以下に記載のとおりに調製する。）を、１３７ｍＭ、１７０ｍＭ、３４０ｍＭ、６８０ｍＭ、１３６０ｍＭおよび２０００ｍＭのＮａＣｌ濃度で各ウェルに加える。溶液のｐＨは８．０±０．４である。ＮａＣｌの濃度はそれぞれ、約２８５〜４０００ｍＯｓｍ／Ｌの最終浸透圧モル濃度に対応する。高浸透圧性のＮａＣｌを加えた後約５〜１０分以内に、投与量に応じた様式で、いくつかのＬＥＣは収縮し、丸くなり、単層からの接着を失い始めた。この効果は、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣではそれほど顕著に見られない。
【００６２】
増加する様々な濃度の高浸透圧性のＮａＣｌに応答したＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣの細胞生存率を図１に示す（ＬＥＣを薄い灰色のダイアモンドで、ＲＰＥＣを濃い灰色の四角で、ＣＥＤＣを黒色のダイアモンドで示す）。各点は、２つの実験の平均値を表している。ＮａＣｌ約１３８０ｍＭの高浸透圧ストレスでは、約４０パーセントのＬＥＣが生存し、他方、８０パーセントを超えるＣＥＤＣおよびＲＰＥＣが生存し、これらの細胞間で浸透圧耐性が異なることを示している。
【００６３】
ヒト水晶体上皮細胞、ヒト角膜内皮細胞およびヒト網膜色素上皮の初代培養および継代培養（第１代）を行う。ＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣを死後の眼球から、細胞の単離および酵素消化の標準的な方法を用いて単離する。Ｕｅｂｅｒｓａｘ  ＥＤ、Ｇｒｉｎｄｓｔａｆｆ  ＲＤ、およびＤｅｆｏｅ  ＤＭ、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．、２０００年３月、７０巻（３）、３８１〜９０頁；Ｗａｇｎｅｒ  ＬＭ、Ｓｅｌｅｈ、ＳＭ、Ｂｏｙｌｅ  ＤＪ、およびＴａｋｅｍｏｔｏ  ＤＪ、Ｍｏｌ  Ｖｉｓ．、２００２年３月１４、８巻、５９〜６６頁；Ｃａｍｍａｒａｔａ  ＰＲ、Ｓｃｈａｆｅｒ  Ｇ、Ｃｈｅｎ  ＳＷ、Ｇｕｏ  Ｚ、およびＲｅｅｖｅｓ  ＲＥ、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．、２００２年２月、４３巻（２）、４２５〜３３巻；Ｒａｋｉｃ  ＪＭ、Ｇａｌａｎｄ  Ａ、およびＶｒｅｎｓｅｎ  ＧＦ、Ｅｘｐ  Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．、２０００年１１月、７１巻（５）、４８９〜９４巻を参照されたい。ＬＥＣおよびＣＥＤＣを、イーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）で培養する。ＲＰＥＣを、２ｍＭグルタミン、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１０Ｕ／ｍＬペニシリン、および１０μｇ／ｍＬストレプトマイシン、ならびに１５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を追加したＨａｍのＦ１０培地で培養する。初代培養のＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣを、９６ウェルの平底プレートで１０４細胞／ウェルで９０〜１００％のコンフルエンスに到達するまで継代培養する。これらの細胞を、５％ＣＯ２、３７℃の加湿雰囲気下、インキュベーターで増殖させてコンフルエントにする。細胞を、一晩コンフルエントな状態に維持した後、アッセイする。
【００６４】
ＮａＣｌの高浸透圧性溶液の調製は、まずＮａＣｌ  ５８．４４グラム（ＮａＣｌは、英国、Ｄｏｒｓｅｔ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｃｏより入手）をｄＨ２Ｏ  ５００ｍＬに加えて、２Ｍ  ＮａＣｌ保存溶液を調製することによって行う。次いで、２Ｍ保存溶液を蒸留水（ｄＨ２Ｏ）で希釈することにより、所望の濃度の浸透圧性ＮａＣｌ溶液を調製する。例えば、１７０ｍＭ  ＮａＣｌの高浸透圧性溶液を調製するには、２Ｍ  ＮａＣｌ保存溶液をｄＨ２Ｏで１対１０．１の比で希釈し、３４０ｍＭ  ＮａＣｌの高浸透圧性溶液を調製するには、２Ｍ  ＮａＣｌの保存溶液をｄＨ２Ｏで１対４．５６の比で希釈する。最終のモル浸透圧濃度（ｍＯｓｍ／ｋｇ／Ｈ２Ｏ）は、オズモメーターを用いた氷点降下法により測定する。
【００６５】
処置後、処置した細胞を完全に洗浄し、新鮮な培地で１２時間培養し、その後、細胞生存率を評価する。これらの細胞が、所定の高浸透圧性ストレスレベルで生存する能力を、曝露１２〜２４時間後にＭＴＴアッセイにより評価する。
【００６６】
ＭＴＴアッセイは、ミトコンドリア機能を評価するためのアッセイであり、Ｍｏｓｍａｎｎ（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．、１９８３年１２月１６、６５巻（１〜２）、５５〜６３頁）に記載のとおりに行われる。テトラゾリウム塩３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴＴ、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏより入手）をリン酸緩衝塩（ＰＢＳ）溶液に５ｍｇ／ｍＬ溶解し、０．２２μｍのＭｉｌｌｉｐｏｒｅフィルターに通過させることによって滅菌する。ＭＴＴ保存溶液を、増殖培地に１対１０の割合で加える。この増殖培地で細胞を３〜４時間インキュベートする。ＭＴＴを加えた時点で生存している細胞では、ミトコンドリアのデヒドロゲナーゼによりテトラゾリウム環が切断されて暗青色のホルマザン反応生成物が生じ、これが細胞に蓄積する。ＭＴＴと反応した培養物を、さらなる処理なしに明視野の顕微鏡下で観察する。各ウェル中の細胞が、反応生成物で完全に満たされている場合（非付着性細胞の場合）、または複数の増殖巣から発するホルマザン結晶を多く含む場合（付着した、または広がった細胞の場合）、当該細胞をＭＴＴ陽性とスコア付けする。次いで、ＭＴＴと反応した培養物を、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で溶解し、マイクロプレートリーダーを読んで、細胞生存率の測定値を得る。１ウェルあたりの生存細胞（ＭＴＴ陽性）数を特定の濃度で決定し、全細胞のパーセント値で表す（図１に示す）。
【００６７】
〔実施例２〕
コンフルエントな単層のＬＥＣを、ハンクスの緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）で３回洗浄し、実験前にＦＣＳを除去する。ＬＥＣを、比較実施例１と同様に、９６ウェル培養プレート中に調製する。これらの細胞を、３０μＭフルセミド（共輸送阻害物質、イオン輸送機構阻害物質）の存在下および非存在下で、増加する様々な濃度（〜１３５ｍＭ、〜１７０ｍＭ、〜３４０ｍＭ、〜６８０ｍＭ、〜１３６０ｍＭ、および〜２０００ｍＭ）のＮａＣｌ（浸透圧調節物質）を含有する処置溶液２００μＬ／ウェルに約５〜１０分間曝露する。処置溶液のｐＨは８．０±０．４である。処置後、処置した細胞を完全に洗浄し、新鮮な培地で培養する。処置したＬＥＣの生存率を、比較実施例１と同様に、処置１２〜２４時間後にＭＴＴアッセイにより決定した。
【００６８】
この処置の後、比較実施例１で観察されたのと同様の、細胞の収縮および剥離の現象がフルセミドの存在下でも起こるが、変化はずっと劇的である。図２は、フルセミドの非存在下（ダイアモンドで示されている）、１３８０ｍＭ  ＮａＣｌによる急速な高浸透圧ショック後に、約４０％のＬＥＣが生存することを示している。しかし、フルセミドを用いて共輸送機構を阻害した後（丸で示されている）、ＬＥＣの浸透圧耐性が劇的に低減し、３４０ｍＭ  ＮａＣｌによる急速な高浸透圧ショック後に生存した細胞はほとんどない。この結果は、ＬＥＣの生存能力が、フルセミドの非存在下の２０００ｍＭ  ＮａＣｌによる高浸透圧性ショックから、フルセミド存在下の１７０ｍＭ  ＮａＣｌにシフトすることを示している。
【００６９】
各点は、３つの実験の平均値±標準偏差（Ｓ．Ｄ）を表している。３０．３ｍＭフルセミドの保存溶液は、まずフルセミド２０ｍｇをＤＭＳＯ  １００μＬに確実に溶解し、次いで、それに、所望の濃度の高浸透圧性のＮａＣｌ  １．９ｍＬを加えることによって調製する。３０μＭフルセミドを得るためには、次いで、５μＬのフルセミド保存溶液を、所望の濃度のＮａＣｌ溶液（比較実施例１と同様に調製する。）５ｍＬに加える。
【００７０】
〔比較実施例３〕
この実施例は、ＬＥＣの浸透圧耐性に対するｐＨの効果を示すものである。コンフルエントな単層のＬＥＣを、比較実施例１と同様に調製する。対照群の細胞を、ｐＨ７．４±０．３で、生理学的な１３５ｍＭ  ＮａＣｌを含有する溶液に曝露する。異なる群の細胞を、様々なｐＨ（８．０±０．４、８．４±０．５、８．９±０．８、および１０．６±０．５）で、増加する様々な濃度（〜１７０ｍＭ、および〜３４０ｍＭ）のＮａＣｌを含有する溶液２００μＬ／ウェルに１０分間曝露する。
【００７１】
選択された高浸透圧性のＮａＣｌ溶液（比較実施例１と同様に調製する。）１０ｍＬに５Ｎ  ＮａＯＨ保存溶液を０、１、３、または５μＬ直接加えて、溶液のｐＨを調節する。対応する最終ｐＨは、専用のｐＨメーターを用いて測定した。ＮａＯＨを含有しないＮａＣｌ溶液１０ｍＬの最終ｐＨは、ｐＨ約８．０±０．４と読み取った。５Ｎ  ＮａＯＨ  １μＬを含有するＮａＣｌ溶液１０ｍＬの最終ｐＨは、ｐＨ約８．４±０．５と読み取った。５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬを含有するＮａＣｌ溶液１０ｍＬの最終ｐＨは、ｐＨ約８．９±０．８と読み取った。５Ｎ  ＮａＯＨ  ５μＬを含有するＮａＣｌ溶液１０ｍＬの最終ｐＨは、ｐＨ約１０．６±０．５と読み取った。
【００７２】
処置した細胞の生存率を、比較実施例１と同様に、処置１２〜２４時間後にＭＴＴアッセイにより決定する。溶液を投与した後のＬＥＣの細胞生存率を図３に示す。図に示されるように、灰色のバーは、ＬＥＣを生理学的な１３５ｍＭ  ＮａＣｌに曝露した対照群を表している。黒色および白色のバーはそれぞれ、ｐＨを増大させながら、１７０ｍＭ  ＮａＣｌおよび３４０ｍＭのＮａＣｌに曝露したＬＥＣを表している。図に示されるように、高浸透圧性ストレスに対するＬＥＣの感受性は、ｐＨの増大、およびＮａＣｌ濃度の増大とともに増大する。約１０．６±０．５のｐＨでは、約７５パーセントを超えるＬＥＣが５分以内に破裂し、死滅している。約８．９±０．８のｐＨでは、ＬＥＣは基質から効果的に剥離するが、大きく破裂することはない。
【００７３】
〔比較実施例４〕
この実施例は、ＲＰＥＣの浸透圧耐性に対する細胞外ｐＨの効果を示すものである。コンフルエントな単層のＲＰＥＣを、比較実施例１と同様に調製する。これらの細胞を、様々なｐＨ（８．４±０．５、および１０．６±０．５）で、増加する様々な濃度（１３７ｍＭ、１７０ｍＭ、３４０ｍＭ、６８０ｍＭ、１３６０ｍＭおよび２０００ｍＭ）のＮａＣｌを含有する溶液２００μＬ／ウェルに１０分間曝露する。ＮａＣｌの溶液を、比較実施例１と同様に調製する。比較実施例３と同様に、１μＬおよび５μＬの５Ｎ  ＮａＯＨを加えて溶液のｐＨを調節する。
【００７４】
処置した細胞の生存率を、比較実施例１と同様に、処置１２〜２４時間後にＭＴＴアッセイにより決定した。溶液を投与した後のＲＰＥＣの細胞生存率を図４に示す（ｐＨ８．４±０．５をダイアモンドで、ｐＨ１０．６±０．５を丸で示す）。各点は、３つの実験の平均値±標準偏差を表している。図に示されるように、ｐＨレベルを上昇させると、高浸透圧性のＮａＣｌに曝露したＲＰＥＣの生存レベルが劇的に低減する。
【００７５】
〔実施例５〕
比較実施例１と同様に、コンフルエントな単層のＬＥＣおよびＲＰＥＣを調製する。これらの細胞を、（ｉ）≦２００ｍＭの高浸透圧性のＮａＣｌ、（ｉｉ）増加する様々な濃度（１０μＭ、３０μＭ、６０μＭ、９０μＭおよび１２０μＭ）の共輸送阻害物質フルセミド、ならびに（ｉｉｉ）５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬ、を含有する処置溶液２００μＬ／ウェルに約１０分間曝露する。
【００７６】
フルセミドを含有する処置溶液は、≦２００ｍＭの高浸透圧性のＮａＣｌ溶液（比較実施例１と同様に調製する。）を含有するフルセミドの保存溶液を希釈することによって、実施例２と同様に調製する。例えば、６０μＭフルセミドを含有する高浸透圧性のＮａＣｌ溶液を得るには、フルセミドの保存溶液１０μＬを、高浸透圧性のＮａＣｌ溶液５ｍＬに加える。溶液のｐＨは５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬで調節する。
【００７７】
処置した細胞の生存率を、比較実施例１と同様に、処置１２〜２４時間後にＭＴＴアッセイにより決定する。ＬＥＣ（丸）およびＲＰＥＣ（ダイアモンド）の細胞生存率を図５に示す。各点は、ＨＬＥＣに対する６つの実験、およびＨＲＰＥＣに対する４つの実験の、平均値±標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表している。図に示されるように、１０μＭフルセミドでは、収縮したＬＥＣの５０％を超えるものが消滅または死滅する。フルセミド３０μＭ〜１２０μＭでは、約＞９０％のＬＥＣが除去または殺傷される。他方、フルセミド３０μＭ〜９０μＭでは、少数のＲＰＥＣが除去または殺傷される。したがって、例えば、このｐＨの約２００ｍＭの高浸透圧性ＮａＣｌ溶液では、約１５〜約１００μＭが、ＲＰＥＣに著しい損傷が与えられない有効濃度である。
【００７８】
〔実施例６〕
コンフルエントな単層のＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣを、比較実施例１と同様に調製する。これらの細胞を、（ｉ）≦２００ｍＭの高浸透圧性のＮａＣｌ、（ｉｉ）増加する様々な濃度（１４μＭ、２８μＭ、５６μＭ、１１２μＭおよび２２４μＭ）の共輸送阻害物質ブメタニド、ならびに（ｉｉｉ）５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬ、を含有する処置溶液２００μＬ／ウェルに約１０分間曝露する。
【００７９】
ブメタニドを含有する処置溶液を以下のように調製する。１．４Ｍブメタニドの保存溶液を調製する。次いで、１．４Ｍブメタニド溶液１μＬを高浸透圧性のＮａＣｌ溶液（比較実施例１と同様に調製する。）１ｍＬで希釈することにより、１４ｍＭブメタニドの第２の保存溶液を調製する。１４ｍＭブメタニドの保存溶液をＮａＣｌ溶液で希釈して、約０μＭ（対照）、１４μＭ、２８μＭ、５６μＭ、１１２μＭおよび２２４μＭの濃度を得ることにより、ブメタニドの最終の所望濃度を得る。溶液のｐＨは５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬで調節する。
【００８０】
処置した細胞の生存率を、比較実施例１と同様に、処置１２〜２４時間後にＭＴＴアッセイにより決定した。図６は、ＬＥＣ（丸）、ＲＰＥＣ（ダイアモンド）およびＣＥＤＣ（四角）の細胞生存率を示している。各点は、ＬＥＣに対する６つの実験、ならびにＲＰＥＣおよびＣＥＤＣに対する３つの実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ、および標準偏差を表している。図に示されるように、ブメタニド２８μＭ、１１２μＭおよび２２４μＭでは、ＬＥＣのほとんど全てが、位相差顕微鏡の観察下で、収縮、剥離および／または死滅し、洗浄後の残留細胞はほとんど存在しない。ほぼ１００％の細胞が、ＭＴＴ陰性の反応を示す。他方、同じ濃度では、約２０％未満のＲＰＥＣおよび約３０％未満のＣＥＤＣが、殺傷または除去される。したがって、ブメタニド２８μＭ、１１２μＭおよび２２４μＭが、これらの特定の処置溶液に適する治療用濃度である。
【００８１】
〔実施例７〕
コンフルエントな単層のＬＥＣを、比較実施例１と同様に調製し、９６ウェル平底培養プレートの代わりに、ガラス製のカバーガラス上で増殖させる。次いで、ＬＥＣを完全に洗浄して血清を除去する。
【００８２】
≦２００ｍＭ  ＮａＣｌ、９０μＭフルセミドおよび５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬを含有する処置溶液１０ミリリットル（１０ｍＬ）を、深型３５ｍｍペトリ皿に準備する。
【００８３】
次いで、カバーガラスを、処置溶液を含むペトリ皿に移し、処置溶液中で５〜１０分間保持する。次いで、処置溶液を注ぎ出し、カバーガラスを、剥離したＬＥＣと一緒に、吸引／洗浄プローブを用いてわずかに加圧して、新鮮ＨＢＳＳ溶液で完全にすすぐ。倒立位相差顕微鏡を用いて直ちに検査し、写真撮影した後、新鮮な培地によるＬＥＣの培養を７日間維持して、残留細胞が生存しているか否かを調べる。
【００８４】
図７は、倒立位相差顕微鏡を用いて得られたＬＥＣの画像、および処置の間のそれらの浸透圧応答を示している。写真７Ａは、０分の、全ての領域を覆うコンフルエントなＬＥＣを示している。写真７Ｂは、処置５分後の、丸くなり、基質から分離しているＬＥＣを示している。写真７Ｃは、処置１０分後および洗浄後の、細胞を洗い流した後の実質的に澄明な基質を示している。
【００８５】
〔実施例８〕
ｉｎ  ｖｉｖｏ環境に近い環境における治療の効果を評価するために、水晶体器官培養ＰＣＯモデルを使用する（モデルは、Ｌｉｕらにより最初に開発された（Ｌｉｕ  ＣＳ、Ｗｏｒｍｓｔｏｎｅ  ＩＭ、Ｄｕｎｃａｎ  Ｇ、Ｍａｒｃａｎｔｏｎｉｏ  ＪＭ、Ｗｅｂｂ  ＳＦ、Ｄａｖｉｅｓ，ＰＤ、Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．、１９９６年４月、３７巻（５）、９０６〜１４頁））。ドナー（１９〜８９歳の間）の眼から、ヒト水晶体を単離し、次いで、特注のステンレススチール製スタンド上に接着する。手術用顕微鏡下で、直径約６ｍｍの水晶体嚢１００の後部を、連続環状嚢切開により注意深く切開する。次いで、水晶体核をＨＢＳＳでハイドロエクスプレス（ｈｙｄｒｏｅｘｐｒｅｓｓ）し、残留する水晶体線維を注意深く除去する。後嚢２００および赤道部の嚢３００は、エンベロープ（バッグ）として無処置のまま、プラスチック製の培養皿（深型３５ｍｍペトリ皿）に貯蔵し、１０〜１５％のＦＣＳを追加したイーグルの最小必須培地増殖培地（ＭＥＭ）で覆う。次いで、器官培養モデルにおけるヒトＬＥＣを、４〜５日放置して、手術外傷から回復させる。
【００８６】
２群の器官培養ＰＣＯモデルを樹立した。第１群の水晶体１０個は対照とし、無処置で器官培養を維持した。これらの水晶体は全て、約４〜７日後、前嚢１００および後嚢２００上に、コンフルエントな単層または多層の、増殖したＬＥＣを生じた。
【００８７】
第２群の水晶体２０個は、培養４〜５日後、やはり単層の増殖したＬＥＣを有していた。この群を完全に洗浄して血清を除去した後、処置溶液を導入した。（ｉ）≦２００ｍＭ  ＮａＣｌ、（ｉｉ）約９０μＭフルセミドまたは約２８μＭブメタニドまたは約１１２μＭブメタニド、および（ｉｉｉ）５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬ、を含有する処置溶液１０ミリリットル（１０ｍＬ）を、深型３５ｍｍペトリ皿に準備する。溶液を、他の実施例と同様に調製する。次いで、器官培養物を、処置溶液を含むペトリ皿に移し、５〜１０分間、処置溶液中に保持する。次いで、器官培養物を、ピンセットを用いて別のペトリ皿に移す。次いで、嚢を、ＰＣＯ器官培養物中の剥離したＬＥＣと一緒に、吸引／洗浄プローブを用いてわずかに加圧して、新鮮ＨＢＳＳ溶液で完全にすすぐ。直ちに検査した後、器官培養物について、新鮮な培地による培養を７日間維持して、残留細胞が生存しているか否かを調べる。
【００８８】
この処置の、ＰＣＯ器官培養モデルにおけるＬＥＣに対する効果を、位相差倒立顕微鏡上で調べる。これらを、処置後０分、５分、１０分および１２時間に、Ｔ−Ｍａｘ４００フィルム（Ｋｏｄａｋ）で写真撮影する。図８に示されるように、処置５〜１０分以内に、ＬＥＣは全て丸くなり、単層および水晶体嚢からの接着を失う。位相差顕微鏡写真８Ａ（視野１ｍｍ×０．７５ｍｍ）は、切開後６〜７日および処置前の、前嚢１００および後嚢２００上の偽ＥＣＣＥ手術後の増殖したＬＥＣを、低倍率で示している。位相差顕微鏡写真８Ｂ（視野３．４ｍｍ×１．５ｍｍ）は、処置５分後に、ＬＥＣが丸くなり始め、水晶体嚢から剥離していることを、高倍率で示している。位相差顕微鏡写真８Ｃは、処置１０分後に、処置した細胞の大部分が単層から剥離していることを、高倍率で示している。位相差顕微鏡写真８Ｄは洗浄後の写真であり、処置１０分後には水晶体嚢がＬＥＣを欠いていたことを、低倍率で示している。
【００８９】
〔実施例９〕
この実施例では、初代のＲＰＥＣに対する処置の効果を調べている。他の眼細胞に対して副作用が存在するか否かを評価するために、初代培養のＲＰＥＣを、６ウェルの平底培養プレートで、２ｍＭグルタミン、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１０Ｕ／ｍＬペニシリンおよび１０μｇ／ｍＬストレプトマイシンならびに１５％熱不活化ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を追加したＨａｍのＦ１０培地で、９０〜１００％のコンフルエンスに到達するまで培養した。培養物を、５％ＣＯ２の加湿雰囲気下、３７℃でインキュベーターに保持し、一晩コンフルエントな状態に維持した後、アッセイした。
【００９０】
ＲＰＥＣ培養物を完全に洗浄して血清を除去した後、処置溶液を導入した。（ｉ）≦２００ｍＭ  ＮａＣｌ、（ｉｉ）約９０μＭフルセミドまたは約２８μＭブメタニドまたは約１１２μＭブメタニド、および（ｉｉｉ）５Ｎ  ＮａＯＨ  ６μＬ、を含有する処置溶液２０ミリリットル（２０ｍＬ）を、先の実施例と同様に、深型３５ｍｍペトリ皿に準備する。次いで、処置溶液５ミリリットル（５ｍＬ）を、６ウェル培養プレートにおける３ウェルの各ウェル中のコンフルエントなＲＰＥＣに加える。約１０分後、溶液を完全に除去し、処置したＲＰＥＣを、吸引／洗浄プローブを用いてわずかに加圧して、新鮮ＨＢＳＳ溶液で完全にすすぐ。速やかに検査した後、初代培養ＲＰＥＣについて、新鮮な培地による培養を７日間維持して、残留細胞が生存しているか否かを調べる。
【００９１】
これらの初代ＲＰＥＣに対する処置の効果を、位相差倒立顕微鏡上で観察する。これらを、処置後０分、５分、１０分および１２時間に、Ｔ−Ｍａｘ４００フィルム（Ｋｏｄａｋ）で写真撮影する。ＲＰＥＣは、処置溶液に１０分曝露したことによる顕著な影響を受けていない。図９は、これらの細胞に対する処置の効果の代表的な例を示している。写真９Ａは、０分のＲＰＥＣを示している。写真９Ｂは、処置５分後のＲＰＥＣを示している。写真９Ｃは、処置１０分後のＲＰＥＣを示している。写真８Ｄは、処置および細胞洗浄後のＲＰＥＣを示している。
【００９２】
〔実施例１０〕
この処置に、他の眼細胞に対する副作用があるか否かを評価するために、コンフルエントな単層のＬＥＣ、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣを、比較実施例１と同様に準備する。これらの細胞を、≧２００ｍＭ  ＮａＣｌ、９０μＭフルセミドおよび５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬを含有する処置溶液２００μＬ／ウェルに約１０分間曝露した。
【００９３】
処置した細胞の生存率を、比較実施例１と同様に、処置１２〜２４時間後にＭＴＴアッセイにより決定した。処置に対するＬＥＣ、ＲＰＥＣおよびＣＥＤＣの細胞の生存応答を図１０に示す。各点は、４つの実験の平均値±ｓ．ｅ．ｍ．を表している。図に示されるように、処置１０分後、処置溶液は、ＣＥＤＣおよびＲＰＥＣよりも本質的に大きな発生率（細胞生存率を尺度とする。）でＬＥＣの細胞剥離および／または死滅を誘発した。詳しくは、７０パーセントを超えるＣＥＤＣおよび８０パーセントを超えるＲＰＥＣが、処置後に生存していた。これは、ＬＥＣの１０パーセント未満の生存率と比較することができる。
【００９４】
〔実施例１１〕
器官培養の角膜ボタンに対する処置の効果を試験して、ｉｎ  ｖｉｖｏに近い環境で周囲の眼組織に対して処置が損傷を引き起こすか否かを判定する。角膜を選択したのは、その感受性のためであり、また、処置に直接曝露される危険性があるからである。角膜の器官培養物をＨＢＳＳで洗浄し、特注のステンレススチール製スタンド上に内皮側を上にして配置する。次いで、それらを、培養皿の底部だけを覆うＭＥＭ増殖培地を含む滅菌培養皿に保存し、上皮の乾燥を防ぐために加湿したチャンバーを用意する。次いで、角膜内皮の陥凹部を、１０〜１５％のＦＣＳで追加したＭＥＭ増殖培地で満たし、５％ＣＯ２インキュベーターで、３７℃で培養する。
【００９５】
器官培養物を、対照群と処置群とに分ける。培養物を最初にＨＢＳＳで３回洗浄し、次いで、その内皮の表面を生理学的ＮａＣｌ（１３７ｍＭ、２９３±９ｍＯｓｍ／Ｌ）または処置溶液のいずれかに１０分間曝露する。
【００９６】
処置群に対しては、（ｉ）≦２００ｍＭ  ＮａＣｌ、（ｉｉ）約９０μＭフルセミドまたは約１１２μＭブメタニド、および（ｉｉｉ）５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬ、を含有する処置溶液１０ミリリットル（１０ｍＬ）を、深型３５ｍｍペトリ皿に準備する。器官培養物を、処置溶液を含むペトリ皿に移し、処置溶液中に１０分以上保持する。次いで、器官培養物を、ピンセットを用いて、新鮮ＨＢＳＳを含む別のペトリ皿に移す。次いで、角膜器官培養物を、吸引／洗浄プローブを用いてわずかに加圧して、新鮮ＨＢＳＳ溶液で完全にすすぐ。処置後、角膜器官培養物を、新鮮な培地で６時間インキュベートする。
【００９７】
対照群では、上記処置溶液の代わりに、新鮮ＨＢＳＳを角膜器官培養物に１０分間投与した。
【００９８】
角膜内皮細胞に対する処置の毒性を評価するために、角膜の器官培養ボタンを、位相差倒立顕微鏡および蛍光共焦点顕微鏡の両方で調べる。共焦点顕微鏡下では、角膜内皮細胞のアクチンフィラメントの形態を調べて、細胞の構築物が無傷であることを証明する。これらの角膜器官培養物の内皮を処置の前および後に固定し、ＦＩＴＣ結合ファロイジンで染色する。角膜内皮の共焦点レーザースキャニング画像は、非処置（対照）群と処置群との間に著しい相違がないことを示している。処置群の内皮のシートは、非処置群におけるものと同様の統一性を維持している。角膜内皮細胞は、均等に分布された単層として残り、細胞は、対照および処置した器官培養物で六角形の外観を保持している。角膜内皮細胞には、著明な損傷は存在しない。
【００９９】
〔実施例１２〕
ジヒドロクロロチアジド（ＤＨＣＴ）（チアジドおよび関連する利尿薬の群からの共輸送阻害物質）および高浸透圧性のＮａＣｌを含有する処置溶液の、ヒトＬＥＣに対するｉｎ  ｓｉｔｕの効果を調べる。ヒト白内障手術から除去したばかりの、連続環状嚢切開を行った水晶体嚢（ＬＥＣ−ＣＣＣ）に依然として付着しているＬＥＣに対して、処置を試みる。
【０１００】
ＬＥＣ−ＣＣＣを白内障手術から入手し、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）を含有せず、２ｍＭグルタミン、２５ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）を追加した、新たに調製したイーグルの最小必須培地（ＭＥＭ）に速やかに入れ、評価のために実験室に輸送する。０．２％トリパンブルーで５分間、ＬＥＣ−ＣＣＣを染色することにより、生存可能なＬＥＣを同定する。７０％を超える生存可能なＬＥＣを含むシートを用いて、処置の有効性を評価する。
【０１０１】
処置溶液は、１７０ｍＭまたは２００ｍＭのＮａＣｌのｄＨ２Ｏ溶液、および２００または３００μｍのＤＨＣＴからなる。
【０１０２】
第１段階では、高浸透圧性のＮａＣｌ溶液の調製を、まずＮａＣｌ  ５８．４４ｇ（米国、Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｃｏ．より入手）をｄＨ２Ｏ  ５００ｍＬに加えて、２Ｍ  ＮａＣｌの保存溶液を調製することによって行う。２Ｍ保存溶液をｄＨ２Ｏで希釈することにより、所望の濃度の浸透圧性ＮａＣｌを調製する。例えば、１７０ｍＭ  ＮａＣｌの高浸透圧性溶液を調製するには、２Ｍ  ＮａＣｌ保存溶液をｄＨ２Ｏで１対１０．１の割合に希釈した。２００ｍＭ  ＮａＣｌの高浸透圧性溶液を調製するために、２Ｍ  ＮａＣｌ保存溶液をｄＨ２Ｏで１対９の割合に希釈する。最終のモル浸透圧濃度（ｍＯｓｍ／ｋｇ／Ｈ２Ｏ）を、オズモメーターを用いた氷点降下法により測定する。
【０１０３】
第２段階では、ＤＨＣＴ２５ｍｇをｄＨ２Ｏ１ｍＬに加えて、ＤＨＣＴ保存溶液を調製する。
【０１０４】
最終段階では、ＤＨＣＴ保存溶液を１７０ｍＭまたは２００ｍＭの高浸透圧性ＮａＣｌ中に希釈することにより、ＤＨＣＴ  ２００μｍまたは３００μｍを含有する処置溶液を調製し、ｐＨを±７．８に調節する。
【０１０５】
ＬＥＣ−ＣＣＣを、処置溶液を含む小型ペトリ皿に５分間曝露することにより、処置を施す。５分曝露後、処置溶液をシリンジで除去し、次いで、新鮮ＰＢＳをペトリ皿に加えて、処置溶液を洗い出す。ＬＥＣ−ＣＣＣを３回洗浄する。ＬＥＣの変化を、顕微鏡下でモニターする。０分、２分、５分、および洗浄後に、顕微鏡写真を撮影する。
【０１０６】
処置溶液に曝露後、ヒトＬＥＣは収縮し、徐々に細胞間に大きな間隙が形成される。次いで、収縮した細胞は徐々に丸くなり、破裂する。
【０１０７】
図１１は、（Ａ）０分、（Ｂ）２〜３分、および（Ｃ）洗浄後に、ＤＨＣＴ２００μｍおよび高浸透圧性の≦２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する処置溶液により引き起こされたＬＥＣ−ＣＣＣの変化を示す。処置前の水晶体細胞を示す図１１Ａでは、水晶体細胞は密に充填され、近接する細胞と緊密に接触していて、無傷のシートに似た外観を呈している。図１１Ａの挿入図は、より高倍率の画像である。処置２〜３分後に撮影した図１１Ｂは、細胞の収縮を示し、細胞間に大きな間隙が存在する。図１１Ｂの挿入図は、より高倍率の画像である。処置溶液および剥離した細胞をすすぎ流した後に撮影した図１１Ｃでは、残存細胞片以外は、生存細胞を観察することができない。図１１Ｃの挿入図は、より高倍率の画像である。
【０１０８】
〔実施例１３〕
実施例１２に記載の処置の、ＰＣＯ予防に関するｉｎ  ｖｉｖｏの効果を、２群のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギに対する実験により調べる。実験群にはウサギ眼１６個が含まれ、対照群にはウサギ眼４個が含まれている。対照動物に、偽の白内障手術を行う。残りの動物には治療を導入する。
【０１０９】
各ウサギ眼の瞳孔を、手術前に１時間に３回、局所のＧフェニレフリン１０％（Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．、中国）およびＧシクロペントレート１％（Ｂａｕｓｃｈ  ＆  Ｌｏｍｂ  Ｐａｒｍ．，Ｉｎｃ．、米国）で散瞳する。ウサギを、塩酸ケタミン（５ｍｇ／ｋｇ）および塩酸キシラジン（２ｍｇ／ｋｇ）で麻酔し、手術台上に配置する。いずれの場合も、５分毎に局所麻酔（塩酸ジエアイン（ｄｉｅａｉｎｅ）１％）を用いる。眼瞼を開いた状態で保持するために、ワイヤー開瞼器を配置する。
【０１１０】
側頭部の角膜縁で、眼中へ３．２ｍｍの強膜トンネル切開を形成する。粘弾性の物質で前眼房を維持し、水晶体の前部表面上に、直径４〜５ｍｍの連続環状嚢切開（ＣＣＣ）を形成してバッグを開く。まず、処置溶液を、ハイドロダイセクションによりＬＥＣに導入する。これにより、確実に、処置溶液が速やかに、前嚢／ＬＥＣ全体の下に到達するようになる。このプロセスにより、（ｉ）嚢および水晶体上皮から水晶体皮質が分離し、手術中に後で行う水晶体皮質の除去が容易になり、（ｉｉ）ＬＥＣが十分な時間処置に曝露される（合計で５分以上）。
【０１１１】
次いで、水晶体を、水晶体超音波吸引（Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＩＩ、Ａｌｃｏｎ  Ｌａｂｓ．，Ｉｎｃ．、中国）を用いて除去する。残留する皮質を完全に吸引し、できるだけ完全に除去してＬＥＣを曝露する。次いで、その形状を維持するために、水晶体嚢バッグは、粘弾性の材料で部分的に満たす。粘弾性の材料は、処置溶液を投与する場合は、ＬＥＣを覆ってはならない。
【０１１２】
処置は、前嚢バッグ（そこにＬＥＣが付着する。）の内側表面に渡って行われる。前嚢は、ベントニードル付シリンジを用いて、持続的に満たされる。バッグを溢れさせないように注意を払う。処置溶液が嚢バッグを覆った後、５分間放置し、次いで、シリンジを用いて除去する。
【０１１３】
ＩＯＬを挿入する場合もある。これらの場合には、溶液が嚢バッグの内側表面全体を覆った後、３〜５分後に、処置溶液をシリンジで注意深く除去する。同時に、切開を６．０ｍｍに拡げ、６．５ｍｍ光学の後房眼内レンズ（ＩＯＬ）（ポリメチルメタクリレート、ＰＭＭＡ）を準備し、嚢バッグ中に配置する。この手技は、通常、外科医には約５分かかるので、ＬＥＣは約１０分間処置溶液に曝露しておくべきである。
【０１１４】
次いで、嚢バッグをわずかに加圧して完全にすすぎ、剥離死滅したＬＥＣを洗浄し、過剰の処置溶液および粘弾性材料を除去する。傷口を、縫合して、または縫合せずに閉じる。
【０１１５】
外科手技が完了したら、各ウサギ眼にデキサメタゾン（０．２５ｍＬ）およびゲンタマイシン（０．２５ｍＬ）を結膜下投与する。手術後に、硫酸アトロピン１％点眼薬および硫酸ネオマイシン−硫酸ポリミキシン−デキサメタゾン眼軟膏を、１日２回、３週間投与する。
【０１１６】
動物を３週間および１０週間評価する。文献では、ウサギにおけるＰＣＯ予防効果を実証するための最適期間として３週間が提案されている。ウサギは全て細隙灯で評価し、１日、ならびに１、２および３週間に眼の反応についてスコア付けされる（表１を参照されたい）。手術３週間および１０週間後、塩酸ケタミンおよびキシラジンの１１：１の混合物２０ｍｇ／ｍＬの２ｍＬ筋肉内注射を用いて動物を麻酔し、次いで、ペントバルビタールナトリウム２ｍＬの静脈注射で屠殺する。
【０１１７】
眼球を摘出し、（そのいくつかを中性の緩衝ホルマリン１０％溶液で２４時間固定し、）赤道部の直前で冠状に二分する。肉眼検査を行って、ＰＣＯの発症を評価する。手術用顕微鏡（Ｌｅｉｃａ／Ｗｉｌｄ  ＭＺ−８、Ｖａｓｈａｗ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．）に装着したデジタルカメラを用いて、後ろから写真を撮影する（Ｍｉｙａｋｅ−Ａｐｐｌｅ後部写真法）。
【０１１８】
ＰＣＯの程度および重症度を、文献に報告されている方法にしたがってスコア付けする（表１を参照されたい）。次いで、水晶体嚢を固定し、顕微鏡（Ｏｌｕｍｐｕｓ，Ｏｐｔｉｃａｌ  ｃｏ．Ｌｔｄ．）下で評価し、デジタルカメラで写真撮影する。細胞の非存在または存在、細胞タイプ、および細胞増殖の程度を判定する。
【０１１９】
処置溶液で処置した群では、処置３週間後および１０週間後の両方で、微小の眼内炎症反応、および水晶体嚢表面上の沈着物が著明である。中央のＰＣＯ（ＣＰＣＯ）（瞳孔領域内の領域）、および辺縁のＰＣＯ（ＰＰＣＯ）（瞳孔領域の６〜６．５ｍｍ外側の範囲内）は、処置３週間または１０週間で発達が見られない（図１２Ｃおよび１２Ｄを参照されたい）。ほとんどの眼では、残留する水晶体皮質線維の量に関連した、ある程度のＳｏｅｍｍｅｒｉｎｇ輪が生じた。
【０１２０】
図１２Ｃは、手術３週間後の小切開白内障手術（ＩＯＬ挿入なし）後の処置したウサギ眼を示す、眼の後ろからの肉眼的写真である。瞳孔領域は澄明である。図１２Ｄは、虹彩を除去した後の肉眼的写真である。６ｍｍの中心領域を越える部分にＰＰＣＯは存在しない。図１２Ｅは、図１２Ｃに示した瞳孔領域の位相差顕微鏡写真であり、水晶体上皮細胞は残留していないようである。
【０１２１】
処置群とは対照的に、対照群における眼は、劇的なＣＰＣＯおよびＰＰＣＯを生じた。図１２Ａは、白内障手術（ＩＯＬ挿入なし）３週間後の対照ウサギ眼の肉眼的写真である（Ｍｉｙａｋｅ−Ａｐｐｌｅ法を用いて眼の後ろから撮影した）。瞳孔領域には、ＰＣＯから広がる顕著な線維状の領域が存在する。図１２Ｂは、顕微鏡下において、対照眼に色素性細胞および水晶体上皮細胞の顕著な増殖が見られ、水晶体嚢全体を覆うことを示している（図１２Ｂを参照されたい）。
【０１２２】
〔実施例１４〕
３０８μｍブメタニド（ループ利尿薬の群からの共輸送阻害物質）および高浸透圧性の１７０ｍＭまたは２００ｍＭ  ＮａＣｌのｄＨ２Ｏ溶液を含有する処置溶液の、ＬＥＣ−ＣＣＣに対するｉｎ  ｓｉｔｕの効果を調べる。ＬＥＣ−ＣＣＣは、白内障手術から新たに除去した直後に使用し、実施例１２と同様に処置を適用する。
【０１２３】
ブメタニド−高浸透圧性ＮａＣｌ処置溶液に曝露した後、ＬＥＣは収縮し、細胞間に間隙が形成される。収縮した細胞は丸くならないが、水晶体嚢上に、収縮した状態で固定または拘束される。ＬＥＣは剥離しないが、収縮している間に拘束され、死滅する（図１３を参照されたい）。
【０１２４】
図１３は、（Ａ）０分、（Ｂ）５分、および（Ｃ）洗浄後（１５分）に処置により誘発されたＬＥＣの細胞変化を示す。図１３Ａは、少数の剥離したＬＥＣ、赤血球、および白内障の手術で生じた細胞片、で処置する前の無傷の水晶体上皮のシートを示す。挿入図は、より高倍率の画像である。図１３Ｂは、処置５分後に撮影したものであり、細胞の収縮および細胞間の大きな間隙を示している。挿入図は、より高倍率の画像である。図１３Ｃは、処置溶液および全ての剥離細胞を流し出した１５分後に撮影したものである。画像は、図１３Ｂと同様の、収縮した細胞の外観を示している。挿入図は、より高倍率の画像である。トリパンブルー排除試験で確認されたが、細胞は処置後に死滅した。
【０１２５】
〔実施例１５〕
実施例１４に記載の処置溶液（ブメタニドおよび高浸透圧性ＮａＣｌ）のＰＣＯ予防に関するｉｎ  ｖｉｖｏの効果を、２群のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギに対する実験により調べる。処置群にはウサギ眼５個が含まれ、対照群には２個の眼が含まれ、並行して樹立、評価される。この実験では、実施例１３と同様の手術および評価手順を用いる。
【０１２６】
３週間のフォローアップでは、処置したウサギにＣＰＣＯおよびＰＰＣＯが発症しないことが、実験から明らかになっている（Ｍｉｙａｋｅ−Ａｐｐｌｅ法を用いて眼の後ろから肉眼的検査により観察を行った）（図１４を参照されたい）。ｉｎ  ｓｉｔｕの結果（実施例１４を参照されたい。）と合致して、ブメタニド−高浸透圧性ＮａＣｌ溶液に曝露した後は、水晶体上皮の単層全体は収縮した外観で停止している。これは、水晶体前嚢でのみ観察される（図１４Ｂを参照されたい）。水晶体後嚢では、多くの細胞は観察されない。また、水晶体前嚢上では顕著な細胞増殖が見られないが、上述の収縮した外観を有する単層のＬＥＣは存在する。
【０１２７】
図１４Ａは、Ｍｉｙａｋｅ−Ａｐｐｌｅ法を用いて、眼の後ろから撮影した肉眼的写真であり、白内障手術（ＩＯＬ挿入なし）３週間後に処置したウサギ眼における澄明な瞳孔を示している。図１４Ｂは、そのような瞳孔から撮影した、処置後の水晶体嚢の位相差顕微鏡写真であり、２層の嚢を示している。上部の層は、収縮した細胞の層を有する前嚢である。下部の層は後嚢であり、澄明な細胞は観察されない。挿入図は、より高倍率の画像である。図１４Ｂの挿入図は、収縮した外観の単層の細胞を示し、顕著な細胞増殖がないことを示している。
【０１２８】
ある程度のＳｏｅｍｍｅｒｉｎｇ輪が処置眼に形成されるが、これは、有効性のない皮質除去方法と関連しているようである。
【０１２９】
処置眼に観察される結果とは対照的に、対照眼の瞳孔領域にはＰＣＯからの顕著な線維性増殖が観察される。これは、白内障手術（ＩＯＬ挿入なし）３週間後に評価される。
【０１３０】
〔実施例１６〕
２００または３００μｍ  Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）（ＫＣｌの流出を活性化または刺激する共輸送阻害物質）のＰＢＳ溶液を含有する処置溶液の、ＬＥＣ−ＣＣＣに対するｉｎ  ｓｉｔｕの効果を試験する。実施例１２と同様に処置を適用する。
【０１３１】
ＮＥＭ処置溶液に５分間急性曝露した後、ＬＥＣには変化がほとんど観察されない。しかし、処置したＬＥＣをＰＢＳ洗浄溶液に入れると、これらは収縮し、細胞間に大きな間隙が形成される。次いで、実施例１２におけると同様に、収縮した細胞がＬＥＣ嚢から剥離する。
【０１３２】
図１５は、（Ａ）０分、（Ｂ）２〜３分、および（Ｃ）洗浄２分後にＮＥＭ処置により誘発されたＬＥＣ−ＣＣＣの細胞の変化を示す。図１５Ａは、処置前の無傷の水晶体上皮のシートを示しているが、いくらかの損傷、剥離ＬＥＣ、および白内障手術により生じた細胞片が見られる。図１５Ｂは、処置２〜３分後に撮影したものであり、わずかな細胞の収縮を示している。細胞を、新鮮ＰＢＳ洗浄溶液に戻した後では、細胞は顕著に収縮し、細胞間に大きな間隙が形成される。そして、これらの細胞は、実験終了時には、容易に剥離し、流し出される。
【０１３３】
〔実施例１７〕
実施例１６に概ね記載した処置溶液（ＮＥＭのＰＢＳ溶液）の、ＰＣＯ予防に関するｉｎ  ｖｉｖｏの効果を、２群のＮｅｗ  Ｚｅａｌａｎｄ白ウサギに対する実験により調べる。処置群にはウサギ眼６個が含まれ、対照群にはウサギ眼２個が含まれ、並行して樹立、評価される。実施例１３と同様の手術および評価手順を用いる。
【０１３４】
処置群の眼を、２００もしくは３００μｍ  ＮＥＭのＰＢＳ溶液、または１７０ｍＭマンニトールで処置する。３週間および１０週間のフォローアップでは、処置したウサギにＣＰＣＯまたはＰＰＣＯが発症しない（眼の後から肉眼的検査により観察した）（表１および図１５Ｄを参照されたい）。処置眼の瞳孔領域は澄明である。顕微鏡下で検査すると、水晶体嚢バッグ上にＬＥＣは存在しない（図１５Ｅ）。しかし、処置眼は、初期の重篤な眼内炎症反応および虹彩後癒着を示している。
【０１３５】
処置眼に観察された結果とは対照的に、２個の対照ウサギ眼の瞳孔領域には、ＰＣＯからの顕著な線維増殖が認められた（ＩＯＬ挿入なし）。
【０１３６】
〔実施例１８〕
処置をｉｎ  ｖｉｖｏで眼に適用した際の手順を一部改変して、重症の前眼房（ＡＣ）反応を予防する。処置溶液を眼内に直接導入する代わりに、ＩＯＬを処置溶液でコーティングし、水晶体内容物を除去した後の水晶体嚢バッグ中に挿入する。詳しくは、ＩＯＬの後部および赤道部を、３００μｍ  ＮＥＭのＰＢＳ溶液を含有する処置溶液でコーティングする。次いで、それらを無菌の層流フードで一晩乾燥する。次いで、ＩＯＬを使用する準備をする。この手順は、ＡＣ反応を大幅に低減させる。
【０１３７】
〔実施例１９〕
１０または１００μｍグラミシジン（ポア形成タンパク質およびペプチド（ＰＦＰ）のクラスからの物質）およびＰＢＳを含有する処置溶液の、ヒトＬＥＣに対するｉｎ  ｓｉｔｕの効果を調べる。実施例１２と同様に処置を適用する。
【０１３８】
ＬＥＣ−ＣＣＣを、グラミシジン−ＰＢＳ処置溶液に５分間曝露する。ＬＥＣに対する変化を、顕微鏡下でモニターする。図１６は、（Ａ）０分、（Ｂ）２分、および（Ｃ）洗浄後に撮影した顕微鏡写真を示している。
【０１３９】
処置に曝露した後、ヒトＬＥＣは収縮し、細胞間に大きな間隙が徐々に形成される。次いで、収縮した細胞は徐々に丸くなり、破裂する。図１６Ａは、処置溶液を投与する前に撮影したものであり、水晶体細胞が相互に緊密に接触していて、細胞の無傷のシートに似ている。図１６Ｂは、処置溶液に曝露して２分後に、細胞が、収縮した外観をとり、細胞間に澄明な間隙が形成されていることを示している。図１６Ｃは、処置溶液および剥離した細胞をすすぎ流した後には、残存細胞片以外は、生存細胞が残存していないことを示している。
【０１４０】
以上の教示に照らして、本発明については多くの修飾および改変が可能である。例えば、上で詳述した以外のイオン輸送機構阻害物質を用いることができる。そのようなイオン輸送機構阻害物質の好適な具体例としては、バリノマイシン、臭素、テオフィリンおよび他のアルキルキサンチン、イコサノイド、ホルボールエステル（例えば、ＴＰＡ）、カリウム保持性利尿薬（例えば、トリアムテレン、スピロノラクトン、カンレノ酸カリウム）、カリクリンＡ、オカダ酸（ＯＡ）、プロプラノロールおよびそのアナログ、アンジオテンシンＩＩ、ケトコナゾール（ＣＤＣ）、アラキドン酸、イアンサナム（ｉａｎｔｈａｎｕｍ）、トリフルオペラジン、イドキシフェン、２−アミノイソ酪酸、１７β−エストラジオール、ブラジキニン、ホスファチジルイノシトール４，５−二リン酸（ＰＩＰ２）、イノシトール１，４，５−三リン酸（ＩＰ３）、プロスタグランジン（ＰＧＥ２）、アデノシン３’５’−環状一リン酸（ｃＡＭＰ）、グアノシン３’５’−環状一リン酸（ｃＧＭＰ）、セリン／スレオニンタンパク質ホスファターゼ（Ｓ／Ｔ−Ｐｐａｓｅｓ）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）、プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）、ＳＲＣファミリーチロシンキナーゼ（ＳＦＫ）、多価不飽和脂肪酸、ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）、ホスファターゼ（ＰＰ）、Ｇタンパク質、ルビジウム、銅（Ｃｕ２＋）、硝酸（ＮＯ３−）、バリウム（Ｂａ２＋）、クロライド（Ｃｌ−）、カリウム（Ｋ＋）、細胞内マグネシウムおよび水素濃度を変化させる物質、ならびに細胞外ナトリウム、クロライド、またはカリウム濃度を低下させる物質、等が挙げられる。他にもイオン輸送機構阻害物質が存在することは理解されるべきである。したがって、添付する特許請求の範囲内で、本発明を、上述した以外の他の方法で実施することができることは理解されるはずである。
【０１４１】
表１は、ｉｎ  ｖｉｖｏウサギ眼におけるＰＣＯ予防に関する、様々な処置溶液の効果を示す表である。
【図面の簡単な説明】
【０１４２】
【図１】様々な濃度のＮａＣｌを含有する溶液を導入した後の、様々な眼細胞（ＬＥＣ、ＲＰＥＣおよびＣＥＤＣ）の細胞生存率を示す図である。
【図２】共輸送阻害物質フルセミド３０μＭの非存在下（ダイアモンド）および存在下（丸）で、増加する様々な濃度のＮａＣｌを投与した後のＬＥＣの細胞生存率を示す図である。
【図３】様々なｐＨレベルで、増加する様々な濃度のＮａＣｌを含有する溶液を投与した後の、全ＬＥＣの細胞生存率を示す図である。
【図４】様々なｐＨレベルで、増加する様々な濃度のＮａＣｌを含有する溶液を投与した後の、ＲＰＥＣの細胞生存率を示す図である。
【図５】≦２００ｍＭのＮａＣｌ、増加する様々な濃度の共輸送阻害物質フルセミドおよび５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬを含有する処置溶液を投与した後の、ＬＥＣおよびＲＰＥＣの細胞生存率を示す図である。
【図６】≦２００ｍＭのＮａＣｌ、増加する様々な濃度の共輸送阻害物質ブメタニドおよび５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬを含有する処置溶液を投与した後の、ＬＥＣ、ＲＰＥＣおよびＣＥＤＣの細胞生存率を示す図である。
【図７】本発明の処置溶液による初代培養ＬＥＣに対する処置の効果を示す３枚の写真である。Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ、洗浄後０分、５分および１０分の写真である。
【図８】ヒト器官培養ＰＣＯモデルにおける、本発明の処置溶液による初代培養ＬＥＣに対する処置の効果を示す４枚の写真である。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤはそれぞれ、処置前、処置後５分、１０分、および洗浄後の写真である。
【図９】≦２００ｍＭ  ＮａＣｌ、９０μＭフルセミドおよび５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬを含有する処置溶液によるＲＰＥＣに対する処置の効果を示す４枚の写真である。Ａ、Ｂ、ＣおよびＤはそれぞれ、処置後０分、５分、１０分、および洗浄後の写真である。
【図１０】≦２００ｍＭ  ＮａＣｌ、９０μＭフルセミドおよび５Ｎ  ＮａＯＨ  ３μＬを含有する処置溶液を投与した後の、ＬＥＣ、ＲＰＥＣおよびＣＥＤＣの細胞生存率を示す図である。
【図１１】２００μＭ  ＤＨＣＴおよび高浸透圧性の≦２００ｍＭ  ＮａＣｌを含有する処置溶液によるＬＥＣ−ＣＣＣに対する処置の効果を示す写真である。Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ、０分、約２分、および洗浄後の写真である。
【図１２】ＤＨＣＴおよび高浸透圧性のＮａＣｌを含有する処置溶液によるｉｎ  ｖｉｖｏウサギ眼に対する処置の効果を示す写真である。ＡおよびＢは手術３週間後の対照眼の写真であり、Ｃ、ＤおよびＥは手術３週間後の処置眼の写真である。
【図１３】３０８μＭブメタニドおよび高浸透圧性のＮａＣｌを含有する処置溶液によるＬＥＣ−ＣＣＣに対する処置の効果を示す写真である。Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ、０分、５分、および洗浄後の写真である。
【図１４】ブメタニドおよび高浸透圧性のＮａＣｌを含有する処置溶液によるｉｎ  ｖｉｖｏウサギ眼に対する処置の効果を示す写真である。
【図１５】ＮＥＭを含有する処置溶液による、ヒトＬＥＣおよびｉｎ  ｖｉｖｏウサギ眼に対する処置の効果を示す写真である。Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ、洗浄後０分、約３分、および２分のヒトＬＥＣの写真であり、ＤおよびＥはｉｎ  ｖｉｖｏウサギ眼の写真である。
【図１６】グラミシジンおよびＰＢＳを含有する処置溶液によるＬＥＣ−ＣＣＣに対する処置の効果を示す写真である。Ａ、ＢおよびＣはそれぞれ、０分、２分、および洗浄後の写真である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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