(57)【要約】  混合物が少なくとも１つの溶媒（ｓ）によって供給される個々のクロマトグラフィーカラムを用いた多成分混合物（Ｆ）の連続又は準連続精製のためのプロセスを提案する。  多成分混合物（Ｆ）は少なくとも、軽い不純物（Ａ）、精製されるべき中間生成物（Ｂ）及び重い不純物（Ｃ）を含み、カラムは少なくとも４つのセクション（α，β，γ，δ）に分類され、そのうち、第１のセクション（α）は溶媒（ｓ）の少なくとも１つの入口と精製された中間生成物（Ｂ）用の少なくとも１つの出口を備え、精製された中間生成物（Ｂ）をシステムの外に洗い出すが、重い不純物（Ｃ）はセクション（α）内部に保持し、第２のセクション（β）は溶媒（ｓ）の少なくとも１つの入口と第４のセクション（δ）の入口に接続された少なくとも１つの出口を備え、この出口を通して重い不純物（Ｃ）で汚染されている中間生成物（Ｂ）を第４のセクション（δ）へと洗い流すが、純粋な重い不純物（Ｃ）はセクション（β）内部に保持し、第３のセクション（γ）は溶媒（ｓ）の少なくとも１つの入口と重い不純物（Ｃ）用の出口を１つ備え、この出口を通して重い不純物（Ｃ）を洗い出し、クロマトグラフィーカラムを洗浄し、第４のセクション（δ）は第２のセクション（β）の出口のアウトプットを受けるための少なくとも１つの入口と、多成分混合物（Ｆ）を供給するための少なくとも１つの入口と軽い不純物（Ａ）用の少なくとも１つの出口を備え、軽い不純物（Ａ）はシステムの外へ洗い出すが、中間生成物（Ｂ）はセクション（δ）内部に保持し、スイッチ時間（ｔ＊）後又は内に、第１のセクション（α）からの最後のカラムを第２のセクション（β）の第１のポジションへ移動させ、第２のセクション（β）の最後のカラムを第３のセクション（γ）の第１のポジションへ移動させ、第３のセクション（γ）の最後のカラムを第４のセクション（δ）の第１のポジションへ移動させ、第４のセクション（δ）の最後のカラムを第１のセクション（α）の第１のカラムになるよう移動させる。【選択図】図１５
2008539395.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
混合物が少なくとも１つの溶媒（ｓ）によって供給される少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの個々のクロマトグラフィーカラムを用いた多成分混合物（Ｆ）の連続又は準連続精製のためのプロセスであって、
前記多成分混合物（Ｆ）は少なくとも、軽い不純物（Ａ）、精製されるべき中間生成物（Ｂ）及び重い不純物（Ｃ）を含み、
カラムは、１つのカラムの出口が中間生成物（Ｂ）を収集するために使用される、少なくとも１つのバッチモードステップ又はポジションと、少なくとも１つのカラムの出口が少なくとも１つの他のカラムの入口と流体的に接続されている、少なくとも１つの連続又は準連続モードステップ又はポジションで走行され、
前記バッチモードと前記連続又は準連続モードは、同期的あるいは連続的に実現され、
切り替え時間（ｔ＊）後又は内に、前記カラムが前記溶媒流れの通常方向と反対方向にそのポジションを移動させられるプロセス。
【請求項２】
混合物が少なくとも１つの溶媒（ｓ）によって供給される個々のクロマトグラフィーカラムを用いた多成分混合物（Ｆ）の連続又は準連続精製のための、特に請求項１に記載のプロセスであって、
前記多成分混合物（Ｆ）は少なくとも、軽い不純物（Ａ）、精製されるべき中間生成物（Ｂ）及び重い不純物（Ｃ）を含み、
前記カラムは少なくとも４つのセクション（α，β，γ，δ）に分類され、そのうち、第１のセクション（α）は溶媒（ｓ）の少なくとも１つの入口と精製された中間生成物（Ｂ）用の少なくとも１つの出口を備え、精製された中間生成物（Ｂ）はシステムの外に洗い出すが、重い不純物（Ｃ）はセクション（α）内部に保持し、
第２のセクション（β）は溶媒（ｓ）の少なくとも１つの入口と第４のセクション（β）の入口に接続された少なくとも１つの出口を備え、重い不純物（Ｃ）で汚染されている中間生成物（Ｂ）は前記出口を通して第４のセクション（δ）へと洗い流すが、純粋な重い不純物（Ｃ）はセクション（β）内部に保持し、
第３のセクション（γ）は溶媒（ｓ）の少なくとも１つの入口と重い不純物（Ｃ）用の出口を１つ備え、重い不純物（Ｃ）は前記出口を通して洗い出し、クロマトグラフィーカラムを洗浄し、
第４のセクション（δ）は第２のセクション（β）の出口のアウトプットを受けるための少なくとも１つの入口と、多成分混合物（Ｆ）を供給するための少なくとも１つの入り口と軽い不純物（Ａ）用の少なくとも１つの出口を備え、軽い不純物（Ａ）はシステム外へ洗い出すが、中間生成物（Ｂ）はセクション（δ）内部に保持し、
切り替え時間（ｔ＊）後又は内に、第１のセクション（α）からの最後のカラムを第２のセクション（β）の第１のポジションへ動かし、第２のセクション（β）の最後のカラムを第３のセクション（γ）の第１のポジションへ動かし、第３のセクション（γ）の最後のカラムを第４のセクション（δ）の第１のポジションへ動かし、第４のセクション（δ）の最後のカラムが第１のセクション（α）の第１のカラムになるように動かし、
前記セクションの機能を、同期的あるいは連続的に実行し、後者の場合、好ましくは、１切り替え時間内に、連続又は準連続溶出とバッチ溶出を有する連続したステップが存在するプロセス。
【請求項３】
セクション（α，β，γ，δ）の少なくとも１つに供給される溶媒（ｓ）が、切り替え時間（ｔ＊）中、実質上連続的に成分を変化させ、及び／又は、超臨界溶媒の場合、セクション（α，β，γ，δ）の少なくとも１つに供給される超臨界溶媒（ｓ）が、切り替え時間（ｔ＊）中、実質上連続的に密度を変化させる、請求項２に記載のプロセス。
【請求項４】
少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの個々のカラムが存在し、セクション（α；β；γ；δ／δｇ，δｆ，δｒ）の分類がただ１つの（ｓｉｎｇｌｅ）カラムにより実現され、個々のセクション（α；β；γ；δ／δｇ，δｆ，δｒ）の機能は、１切り替え時間内に連続又は準連続溶出のステップとバッチ溶出を有するステップを選択的に交互に行いながら連続的に実行される、請求項１又は２に記載のプロセス。
【請求項５】
セクション（α，β，γ，δ）の全てに供給される溶媒（ｓ）が、切り替え時間（ｔ＊）中、増加又は減少するモディファイア濃度に伴い、実質上連続的に成分を変化させ、及び／又は、超臨界溶媒の場合は、切り替え時間（ｔ＊）中、増加又は減少する密度に伴い、密度を変化させ、
カラムの移動後、各カラム中のモディファイア濃度（Ｃｍｏｄ）／密度は、実質的に、カラムの新しいポジションにおける超臨界溶媒の濃度／密度のベース濃度であり、次の切り替え時間（ｔ＊）中に各カラム内のモディファイア濃度（Ｃｍｏｄ）／密度が、カラムのさらなる移動後、次のポジションのベース濃度／密度まで増加又は減少されるように、第４（δ）から第１（α）セクションまでの一連のカラムに沿って、モディファイア濃度（Ｃｍｏｄ）／密度が増加又は減少している、請求項３又は４に記載のプロセス。
【請求項６】
セクション（α，β，γ，δ）の全て又はいくつかに供給される溶媒（ｓ）が、切り替え時間（ｔ＊）中、線形的又は準線形的又は非線形的に、実質的連続的に成分及び／又は濃度を変化させ、好ましくは前記モディファイアの濃度をそのような方法で変化させる、請求項５に記載のプロセス。
【請求項７】
各溶媒入り口において、個々のモディファイアの一定ベース濃度（Ｃｍｏｄ，ｃ）を有する溶媒が供給され、流量及び／又は成分、好ましくはモディファイア濃度（Ｃｍｏｄ，ｖ）が変化する溶媒流が、いくつかの入口に供給され、システムに沿って勾配を作るために、個々のモディファイアの一定ベース濃度（Ｃｍｏｄ，ｃ）を有する溶媒と混合される、請求項５又は６に記載のプロセス。
【請求項８】
少なくとも１つのセクション（α，β，γ，δ）が少なくとも２つのカラムを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項９】
第２のセクション（β）が少なくとも２つの向流の連続的に接続されたカラムを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１０】
第４のセクション（δ）が、３つのサブセクション（δｆ，δｇ，δｒ）に分類された少なくとも３つのカラム、又はこれらのサブセクションの機能を連続的に提供するより少ないカラムを含み、第１のサブセクション（δｆ）は、多成分混合物（Ｆ）を好ましくはシステムの全体流量より低い流量で供給するための少なくとも１つの入口と、システムの外にあるいは第３のサブセクション（δｒ）の入口へ軽い不純物（Ａ）を直接取り除くための少なくとも１つの出口を含み、
第２のサブセクション（δｇ）は、第２のセクション（β）のアウトプットを取り上げるための少なくとも１つの入口と、第３のサブセクション（δｒ）の少なくとも１つの入口に接続された少なくとも１つの出口を含み、
第３のサブセクション（δｒ）は、第２のサブセクション（δｇ）のアウトプットを取り上げるための少なくとも１つの入り口と、場合により、第１のサブセクション（δｆ）のアウトプットを取り上げるための少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口を含み、
１切り替え時間（ｔ＊）後又は内に、第１のサブセクション（δｆ）からのカラムが第２のサブセクション（δｇ）の第１のポジションに動かされ、第２のサブセクション（δｇ）の最後のカラムが第１のセクション（β）の第１のポジションに動かされ、第３のセクション（γ）の最後のカラムが第３のサブセクション（δｒ）の第１のポジションに動かされ、第３のサブセクション（δｒ）の最後のカラムが第１のサブセクション（δｆ）のカラムになるように動かされ、
セクション（δｆ，δｇ，δｒ）の機能は、同期的あるいは連続的に実行される、請求項１〜９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１１】
前記システムが３つのカラムを含み、第１の（α）、第２の（β）及び第３の（γ）セクションの機能はただ１つの（ｓｉｎｇｌｅ）カラムにより実現され、１切り替え時間内に、このただ１つのカラムは、
まず、溶媒用の入口を備え、その出口を中間生成物（Ｂ）を収集するために使用する第１の（α）セクションの機能を行い、一方、第４の（δ）セクションの機能を供給しているカラムが直列に接続され、第４の（δ）セクションの出口を用いて軽い不純物（Ａ）が収集され、
次に、このただ１つのカラムは、溶媒用の入口を備え、その出口が第４の（δ）セクションの第１のカラムに直接接続される第２の（β）のセクションの機能を行い、一方、第４の（δ）セクションの機能を提供しているカラムが直列に接続され、第４の（δ）セクションの出口を用いて軽い不純物（Ａ）が収集され、
次に、このただ１つのカラムは、溶媒用の入口を備え、その出口が重い不純物（Ｃ）を収集するために使用される第３の（γ）のセクションの機能を行い、一方、第４の（δ）セクションの機能を提供しているカラムが直列に接続され、第４の（δ）セクションの出口を用いて軽い不純物（Ａ）が収集され、第４の（δ）セクションの機能を提供しているカラムの間で、多成分混合物（Ｆ）が第４の（δ）セクションに供給される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１２】
一組のセクション（α；β；γ；δ／δｇ，δｆ，δｒ）の連続する機能が１つのカラム内で結合され、１切り替え時間内に、連続又は準連続溶出のステップとバッチ溶出を有するステップが、それらの機能を連続的に実行しながら交互に起こる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１３】
第４のセクション（δ）が、請求項１０に記載の３つのサブセクション（δｆ，δｇ，δｒ）を含み、全システム中に３つのカラムが備わっており、これら３つのカラムが、１切り替え時間の第１の部分の範囲では、連続又は準連続溶出のステップ（ＣＣＬ）で連続的に接続され、前記切り替え時間の第２の部分の範囲では、多成分混合物（Ｆ）の個々の画分（Ａ、Ｂ、Ｃ）を取り出すためにバッチステップ（ＢＬ）で駆動される、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１４】
第４のセクション（δ）が、請求項１０に記載の３つのサブセクション（δｆ，δｇ，δｒ）を含み、全システム中に４つのカラムが備わっており、これら４つのカラムが、１切り替え時間の第１の部分の範囲では、連続又は準連続溶出のステップ（ＣＣＬ）で連続的に接続され、前記切り替え時間の第２の部分の範囲では、多成分混合物（Ｆ）の個々の画分（Ａ、Ｂ、Ｃ）を取り出すためにバッチステップ（ＢＬ）で駆動され、このバッチステップ（ＢＬ）ではカラムの１つがゼロに近いか又は等しい流量を有する、請求項１２に記載のプロセス。
【請求項１５】
前記システムが２つのカラムを備え、第４のセクション（δ）が請求項１０に記載の３つのサブセクション（δｆ，δｇ，δｒ）を含み、前記２つのカラムは、
前記切り替え時間の第１の部分で、連続溶出のために直列に接続され、一方、出口を用いて軽い不純物（Ａ）が収集され、
前記切り替え時間の第２の部分で、前記カラムは、上流のカラムの中間画分（Ｂ）と下流のカラムの軽い不純物（Ａ）を収集するためにバッチモードで駆動され、一方、同時に下流のカラムに多成分混合物（Ｆ）を供給し、
前記切り替え時間の第３の部分で、前記カラムは、連続溶出のために直列に接続され、一方、出口を用いて軽い不純物（Ａ）が収集され、
前記切り替え時間の第４の部分で、前記カラムは、上流のカラムの重い不純物（Ｃ）と下流のカラムの軽い不純物（Ａ）を収集するために、バッチモードで駆動され、
各切り替え時間後に前記２つのカラムのポジションが入れ替えられる、請求項３〜１０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１６】
第１のサブセクション（δｆ）が少なくとも２つの平行なカラムを含み、及び／又は、第２の（δｇ）及び／又は第３の（δｒ）サブセクションが少なくとも２つの向流の平行又は連続なカラムを含む、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１７】
前記供給が１切り替え時間（ｔ＊）内に連続、又はパルス状の、又は成形した濃度／密度プロファイルであり、及び／又は、溶媒流れが１切り替え時間（ｔ＊）内において変化し、及び／又は、個々の入口／出口の切り替えが１切り替え時間（ｔ＊）内において段階的である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１８】
個々のカラム内の流量が異なる、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項１９】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセスを行うためのパラメータを設定するための方法であって、第１のステップにおいて、グラジエントバッチクロマトグラムを行い、第２のステップにおいて、前記得られたクロマトグラムを軽い画分を有する第１の部分と、前記目的の画分を有する第２の部分と、前記重い画分が重なっている前記目的の画分を有する第３の部分と、前記重い画分だけを有する第４の部分に分け、第３のステップにおいて、前記プロセスのパラメータを、第１のセクション（α）が前記第２の部分の時間の前記グラジエントバッチクロマトグラムに相当するタスクを実行し、第２のセクション（β）が前記第３の部分の時間の前記グラジエントバッチクロマトグラムに相当するタスクを実行し、第３のセクション（γ）が前記第４の部分の時間の前記グラジエントバッチクロマトグラムに相当するタスクを実行し、第４のセクション（δ）が前記第１の部分の時間の前記グラジエントクロマトグラムに相当するタスクを実行するように選ぶ方法。
【請求項２０】
切り替え時間（ｔ＊）は、前記目的の画分が、目的とする純度で溶出し始めるまでの時間に、前記グラジエントバッチクロマトグラムの流量（Ｑｂａｔｃｈ）を乗じ、前記装置の最大流量（Ｑｍａｘ）と前記グラジエントの一部を行う第４のセクション（δ）中のカラムの数（Ｎ）とで割って計算される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
各カラムの流量は、相当する部分が前記グラジエントバッチクロマトグラムでかかる時間に、前記バッチ流量（Ｑｂａｔｃｈ）を乗じ、切り替え時間（ｔ＊）で割って決定される、請求項１９又は２０に記載の方法。
【請求項２２】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセスを実行するための装置であって、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの個々のクロマトグラフィーカラムのトポロジーを備え、これを通して混合物を少なくとも１つの溶媒（ｓ）によって供給し、多成分混合物（Ｆ）は少なくとも、軽い不純物（Ａ）、精製されるべき中間生成物（Ｂ）及び重い不純物（Ｃ）を含み、ポンプ、弁、カラム間を接続するチューブ、収集出口、溶媒入口及び供給入口の形状の手段を具備し、これらの要素により、少なくとも１つのバッチモードステップ又はポジションにおいて、１つのカラムの出口が中間生成物（Ｂ）を収集するために使用され、少なくとも連続又は準連続モードステップ又はポジションにおいて、少なくとも１つのカラムの出口が少なくとも１つの他のカラムの入口に流体的に接続されているように、前記カラムを走行させることができ、前記バッチモード及び前記連続又は準連続モードは、同期的あるいは連続的に実現することができ、切り替え時間（ｔ＊）後又は内に、前記カラムは溶媒流れの通常方向と反対方向にそのポジションを動かされる装置。
【請求項２３】
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のプロセスを実行するための装置であって、カラムが少なくとも４つのセクション（α，β，γ，δ）に分類され、そのうち、第１のセクション（α）には、溶媒（ｓ）の少なくとも１つの入口と精製された中間生成物（Ｂ）用の少なくとも１つの出口が備わり、精製された中間生成物（Ｂ）をシステムから外へ洗い出すが、重い不純物（Ｃ）はこのセクション（α）内に保持し、
第２のセクション（β）には、溶媒（ｓ）の少なくとも１つの入口と第４のセクション（δ）の入り口に接続された少なくとも１つの出口が備わり、前記出口を通して第４のセクション（δ）に重い不純物（Ｃ）で汚染されている中間生成物（Ｂ）を洗い流すが、純粋な重い不純物（Ｃ）はセクション（β）内に保持し、
第３のセクション（γ）には、溶媒（ｓ）の少なくとも１つの入口と重い不純物（Ｃ）用の出口が備わり、重い不純物（Ｃ）を前記出口を通して洗い出し、前記クロマトグラフィーカラムを洗浄し、
第４のセクション（δ）には、第２のセクション（β）の出口のアウトプットを受けるための少なくとも１つの入口と、多成分混合物（Ｆ）を供給するための少なくとも１つの入口と軽い不純物（Ａ）用の少なくとも１つの出口が備わり、軽い不純物（Ａ）をシステムから外へ洗い出すが、中間生成物（Ｂ）はセクション（δ）内に保持し、
接続及び切断手段を具備し、１つの切り替え時間（ｔ＊）後又は内に、第１のセクション（α）からの最後のカラムを第２のセクション（β）の第１のポジションへ動かし、第２のセクション（β）の最後のカラムを第３のセクション（γ）の第１のポジションへ、第３のセクション（γ）の最後のカラムを第４のセクション（δ）の第１のポジションへ、第４のセクション（δ）の最後のカラムが第１のセクション（α）の第１のカラムになるように動かすことができ、
セクションの機能を、同期的あるいは連続的に実行し、後者の場合、好ましくは、１切り替え時間内に連続又は準連続溶出とバッチ溶出を有する連続なステップが存在する装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、多カラム精製プロセス及びその最適化の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
バッチクロマトグラフィーは周知で、工業生産において定常的且つ予備的に利用される。その技術はしかしながら、溶媒消費量が多く、カラム剤が高価であるため、特に大規模な分離・精製に対してはかなりコスト高となる。収益を高めるために、クロマトグラフ装置の最適な使用が求められている。
【０００３】
実際の生産における大規模な分離に対しては、バッチプロセスよりも連続プロセスのほうがはるかに経済的である。連続プロセスの利点は、例えば、高収率、より少ない溶媒消費量（回収）、低コストの分別・分析、精製される量に対する高い柔軟性、などである。
【０００４】
連続クロマトグラフ法を実現するための１つの方法は、いわゆる疑似移動床法（ＳＭＢ、例えばＭａｒｋｕｓ  Ｊｕｚａ、  Ｍａｒｃｏ  Ｍａｚｚｏｔｔｉ  ａｎｄ  Ｍａｓｓｉｍｏ  Ｍｏｒｂｉｄｅｌｌｉ、  疑似移動床クロマトグラフとキラルテクノロジーへのその応用、  Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｂ．Ｖ．，  ＴＩＢＴＥＣＨ，Ｍａｒｃｈ  ２０００，Ｖｏｌ．１８，ｐ  １０８−１１８を参照）である。この方法は、２つの入口流（供給物（ｆｅｅｄ）、溶離剤）と２つの出口流（ラフィネート、抽出物）を調整することにより、混合物を２つの画分に分離することができる。ＳＭＢ法は、２つの画分の明確な分離が高収率で可能なように向流である。業界におけるＳＭＢ技術の典型的な例としてキラル分離があるが、２つの鏡像体がラセミ混合物から分離される。選択性が非常に小さい場合、通常バッチプロセスでは収益率がかなり小さいが、ＳＭＢでは高純度かつ高収率となり得る。
【０００５】
最適化及び個別の問題に合わせるために、ＳＭＢ法の各種改良が提案されてきた。例えば、入口流及び出口流の個々の接続及び切断の瞬間（ｉｎｓｔａｎｔｓ）を変えることが提案され、すなわち、入口流と出口流が古典的なＳＭＢのように同時に切り替えられるのではなく、個別の段階的なスキーム（いわゆるＶａｒｉｃｏｌ−ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、例えばＷＯ−Ａ−２００４／０３９４６８参照）により切り替えられる。
【０００６】
各サイクル時間後の不連続な切り替えによる抽出物及びラフィネートのアウトプット濃度の経時変化を補償するために、溶離剤の流量を切り替え間隔に合わせて補償するように変え、より高い純度を与える（いわゆるパワーフィードテクニック）という別の変形が、Ｍｏｒｂｉｄｅｌｌｉらによって提案されている（例えば、「疑似移動床ユニットのパワーフィードオペレーション：切り替え間隔中の流量変化」Ｚｉｙａｎｇ  Ｚｈａｎｇ、Ｍａｒｃｏ  Ｍａｚｚｏｔｔｉ、Ｍａｓｓｉｍｏ  Ｍｏｒｂｉｄｅｌｌｉ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ、１００６（２００３）８７−９９、Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｂ．Ｖ．）。
【０００７】
同じ目的を達成するために、溶離剤の流量でなく供給濃度を補償するように変化させるという第３の準類似の（ｑｕａｓｉ−ａｎａｌｏｇｏｕｓ）変形が提案されている（いわゆるＭｏｄｉｃｏｎ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ、例えばＷＯ２００４／０１４５１１参照）。
【０００８】
既に述べたように、特に大規模なクロマトグラフィーは、面倒で高価なテクニックであり、高価な分子の大規模な分離に対してのみ有益である。市場において最も高価な分子は、例えばペプチド、プロテインや抗体のような生体分子である。これらの分子は、通常、溶媒グラジエントバッチクロマトグラフィーによって精製される。本出願の内容においては、１つの混合物を２つの画分に分離することを表す「分離」とは対照的に、「精製」は、目的生成物が軽い吸着不純物と重い吸着不純物の間の中間体であり、３つの画分が生成されるということを意味する。１つのＳＭＢサイクルは、供給流を２つの画分に分割する（分離）ことができるだけで、精製に対しては、中間体画分中の目的成分を含む３つの画分が必要とされる。中間的な目的生体分子と重い不純物と軽い不純物との多成分混合物を精製するためには、２つの段階的又は連続的なＳＭＢが必要とされるが、例えば、第１段階ＳＭＢで第１のラフィネートと第１の抽出物が生成され、第２段階ＳＭＢで第１の抽出物が第２のラフィネート（目的生成物）と第２の抽出物に分離される場合、第１段階で分離される（第１のラフィネートで終わる）べきであった全ての不要な構成物質は、特に低濃度の目的画分に対して、このようなプロセスを無益にする第２のラフィネートで確かに終わるという問題がある。
【０００９】
上記とは別に、他のモディファイア（ｍｏｄｉｆｉｅｒ）変形がＳＭＢスキームに応用されており、ここ数年ＳＭＢ法等も、いわゆる「溶媒グラジエントモード」で行われている（例えばＵＳ４，０３１，１５５参照）。この「溶媒グラジエント」の意味は、ＳＭＢが、異なるモディファイアレベルで操作されるセクションを含むということである。この種のグラジエントは「ステップグラジエント」である。しかしながら、生体分子の精製に対しては、通常（線形）溶媒グラジエントバッチ精製で用いられるような、なめらかな線形グラジエントが望まれる。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
従って、本発明の目的は、３つの画分を分離することができる改良された精製プロセスを提供することである。このプロセスは、特に大規模な利用を考慮して、構成が簡単で、高い純度と高い収率が可能でなくてはならない。混合物が少なくとも１つの溶媒を用いて供給される個々のクロマトグラフィーカラムによって、多成分混合物の連続又は準連続精製のためのプロセスが提案される。このプロセスの目的は２つの画分の単なる分離ではなく、少なくとも、軽い不純物、精製されるべき中間生成物及び重い不純物を含む真の多成分混合物を精製可能な、すなわち中間生成物が単離され、たとえこの中間又は目的生成物が重い不純物と軽い不純物に比較して少量でしか存在していない場合でも単離することができるという主たる利点がある。
【００１１】
本発明は、グラジエントバッチクロマトグラフィーの可能性と疑似移動床技術の原理、又はむしろ向流原理と組み合わせることにより上記問題を解決し、それによりグラジエントバッチクロマトグラフィーの可能性だけでなく連続精製からも利益が得られる。
【００１２】
従って、本発明の目的は、請求項１のプロセス並びにそのようなプロセスを構成するための方法及びそのようなプロセスを実行するための装置の提供である。
【００１３】
多成分混合物の連続又は準連続精製のためのこのようなプロセスにおいては、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つの個々のクロマトグラフィーカラムが用いられ、このカラムを通して混合物が少なくとも１つの溶媒を用いて供給される。上述のように、多成分混合物には、少なくとも、軽い不純物、精製されるべき中間生成物及び重い不純物が含まれるので、システムは、実質的には中間体画分を単離することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
驚いたことに、１つのカラムの出口が目的中間生成物を収集するために用いられる、少なくとも１つのバッチモードステップ又はポジションと、少なくとも１つのカラムの出口が少なくとも１つの他のカラムの入口と流体的に（ｆｌｕｉｄｌｙ）連結される、少なくとも１つの連続又は準連続モードステップ又はポジションでカラムを走行させることが可能なことがわかった。バッチステップはまた、流体的に連結されたカラムを含むこともできるが、その場合、常に１つの出口が目的生成物を収集するために利用されることに注意すべきである。
【００１５】
１つの主要な要素は、驚いたことに、前記バッチモードと前記連続又は準連続モードは同期的あるいは連続的に実現することができ、切り替え後か切り替え中にカラムが、溶媒の流れる通常方向とは反対方向にポジションを移動することができるということが可能な点である。この構成は、グラジエント溶出と組み合わせた場合特に有益であるが、必ずしもグラジエント溶出に依存するわけではない。
【００１６】
本発明の主旨は、特に、連続的（段階的）に又は同期的、すなわち付随して実行することが可能な、連続ステップ又は機能及びバッチステップ又は機能と、カラムの向流移動（準疑似移動床）との巧妙な組み合わせを用いることにより、バッチステップ又はポジションにおいて目的画分又は副画分の非常に効率的な溶出、及び、連続ステップ又はポジションによる画分のリサイクルにより、中間体画分の非常に効率的な精製が可能であるという点にある。
【００１７】
当該技術者が容易に理解するように、この一般的概念は上述及び以下に記載するようなクロマトグラフィーカラムに適用するだけでなく、クロマトグラフィーカラムと同じ機能を採用する膜吸着にも同様に適用する。従って、本内容においてはクロマトグラフィーカラムが好ましいが、本明細書内でクロマトグラフィーカラムという表現が使用される場合、これには膜吸着も含まれる。
【００１８】
さらに、このことは当該技術者には明らかであるが、分離されるべき画分の内容においては、「重い」の意味はゆっくりと溶出する成分を意味する。つまり、固定相への親和性が比較的大きいため、プロセスにおいて溶出が遅い。「軽い」の意味は、すぐに溶出する成分を意味し、固定相への親和性が比較的小さいため、プロセスにおいて溶出が早い。
【００１９】
本概念は同様に、古典的な液体−固体系、つまりここでは「溶媒」と呼ばれる移動層が液体である系、並びに、超臨界系、つまり溶媒又は流体が超臨界状態にある系（いわゆる超臨界流体クロマトグラフィー、ＳＦＣ）に適用することができる。
【００２０】
溶媒強度を有機モディファイアで調節する、例えば逆相クロマトグラフィーとは対照的に、ＳＦＣシステムの吸着特性は、移動相の密度を調整することによって、同等に制御できる。ＳＦＣにおいて密度がどのように溶質の吸着挙動に作用するのか、という技術的な詳細は、例えば「超臨界流体クロマトグラフィーにおける、溶質保持及びカラム効率への圧力低下の影響」と題する、Ａｒｖｉｎｄ  Ｒａｊｅｎｄｒａｎ，  Ｏｌｉｖｅｒ  Ｋｒａｕｃｈｉ，  Ｍａｒｃｏ  Ｍａｚｚｏｔｔｉ，  Ｍａｓｓｉｍｏ  Ｍｏｒｂｉｄｅｌｌｉによる論文（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ，１０９２（２００５）１４９−１６０）から得られる。
【００２１】
切り替え時間中の（以下により詳しく説明されるような）溶媒濃度勾配の代わりに、ＳＦＣでは圧力勾配がかけられ、その結果、超臨界溶媒の密度が、目的の分離を達成するよう適切に調整される。圧力勾配はクロマトグラフィーカラムの背後の圧力制御弁によって調整することができる。ＳＦＣでは、溶媒のリサイクルが可能なため、システムは閉ループで操作することができる。超臨界溶媒は、セクションデルタ（以下参照）で装置を離れた後、その圧力と密度を変えることによって容易に元の状態に戻すことができる。そのため、以下で濃度勾配に言及したとき、超臨界溶媒の場合、相当する密度変化の意味を含む。
【００２２】
本発明の重要な特徴の１つは、上記に沿って、第１の好ましい実施形態により、カラム又はカラム（セクション）によって実行される機能の特殊なトポロジーの提案である。このトポロジーによって、いくつかのセクションにおいて、向流原理が最適に利用され、完全に閉じられた擬似移動床技術サークルの欠点が克服される。これにより、セクションが驚くほど簡単且つ効率的に相互接続され、グラジエント法による効果的な精製と、２つだけでなく３つの画分の分離が可能となる。それにより、連続プロセスを、多くの困難な精製プロセスにおいて精製可能な唯一の方法であるグラジエント技術とともに使用することができる。
【００２３】
これは、少なくとも４つのセクションにカラムを分類することで達成される。４つのセクションの１つ目は、少なくとも１つの溶媒入口と精製された中間生成物用の少なくとも１つの出口を備え、精製された中間生成物をシステムの外へ洗い出すが、重い不純物はこのセクションの内部に保持する。さらに、第２の部分は、少なくとも１つの溶媒用の入口と第４のセクションの入口に接続された少なくとも１つの出口を備え、重い不純物で「汚染された」中間生成物を前記出口を通して第４のセクションに洗い流すが、実質的に純粋な重い不純物はこのセクションに保持する。第３のセクションは、少なくとも１つの溶媒の入口と重い不純物用の出口を備え、前記出口を通して重い不純物を洗い出し、クロマトグラフィーカラムを洗浄する。第４のセクションは、第２のセクションの出口からのアウトプットを受けるための少なくとも１つの入口、並びに多成分混合物を供給するための少なくとも１つの入り口と、軽い不純物用の少なくとも１つの出口を備え、軽い不純物をシステムの外へ洗い出すが中間生成物はこのセクションに保持する。このようなシステムにおいては、切り替え時間の後又は切り替え時間内に、第１のセクションからの最後のカラムが第２のセクションの第１のポジションに動かされ、第２のセクションの最後のカラムは第３のセクションの第１のポジションに動かされ、第３のセクションの最後のカラムは第４のセクションの第１のポジションに動かされ、第４のセクションの最後のカラムは動かされて第１のセクションの第１カラムになる。切り替えが切り替え時間後に行われる場合、すべてのカラムはその瞬間に付随して切り替えられる。切り替えが切り替え時間内に行われる場合、上述のＶａｒｉｃｏｌ技術も利用できることを意味する。第２と第４のセクション間の準「短絡」により、中間体画分を「リサイクル」することができ、重い画分あるいは軽い画分を運ぶことなしに抽出可能なシステムの領域に中間体画分を保持できる。セクションの機能は同期的、すなわち付随して平行して実行されるか、あるいは連続的、すなわち経時段階的に実行することができる。後者の場合、１つの切り替え時間内に、連続又は準連続溶出を含むステップとバッチ溶出を含むステップが連続的に存在することが好ましい。
【００２４】
本発明の他の好ましい実施形態においては、このようなプロセスがグラジエント法と明確に組み合わされる。すなわち、セクションの少なくとも１つに供給された溶媒は、切り替え時間中、組成が実質上連続的に変えられる。
【００２５】
他の好ましい実施形態によると、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つの個々のカラムが存在し、セクションの分類はただ１つの（ｓｉｎｇｌｅ）カラムにより実現される。これは、これらの機能が連続的に実行されるが同時には実行されないことを意味する。好ましくは、個々のセクションの機能は、好ましくは、１つの切り替え時間内に、連続又は準連続的な溶出のステップとバッチ溶出を有するステップを交互に行いながら順次に実行される。
【００２６】
選択的に、セクションのすべて又は少なくとも大部分に供給された溶媒は、切り替え時間中、モディファイア濃度の上昇とともに実質上連続的に組成が変わる。第４から第１セクションまでの一連のカラムに沿って、モディファイア濃度は、カラム移動後、各カラムのモディファイア濃度が、実質的に、カラムの新しいポジションにおけるモディファイアのベース濃度であり、次の切り替え時間中、各カラム内のモディファイア濃度がカラムのさらなる移動後の次のポジションのベース濃度まで増えるように、増加していることが望ましい。このスキームは、逆相及びイオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフ法に適用され、その場合の、基本メカニズムは、モディファイアが吸着し、樹脂上の吸着部位をふさぐ。すなわち、この場合、モディファイア濃度が高ければ高いほど、（生体）分子の吸着できる強さは小さいことを意味する。しかし、例えばＨＩＣ（疎水性相互作用クロマトグラフィー）等の他のシステムにおいて、そのメカニズムは、塩濃度が高いと液相中の（生体）分子の溶解度が小さい。従って、この場合、生体分子はもはや液相中に留まろうとはせず、固体上に吸着する。液相中の塩濃度（モディファイア）が減少すると、（生体）分子は再び液相に溶解することができ、固体表面から脱着する。それに対応して後者の場合には、モディファイア濃度は増加ではなく減少するものの、システムは、逆相及びイオン交換クロマトグラフィー等のクロマトグラフ法の場合に対して上述したことと完全に類似して操作される。
【００２７】
システムがそのように実行される場合、固体は実際には、主な溶媒通路（ｓｏｌｖｅｎｔ  ｐａｔｈ）に実質的に逆らってシステムに沿って移動するため、連続勾配をを形成する。バッチクロマトグラフィーから分かるように、移動相の組成、特にモディファイアの濃度は線形的に変えることができるが、準線形的に、例えば特定の目的とされるプロファイルに従って（各カラムに対し個別にでも可能）、精製問題に合わせて切り替え時間中に変化させてもよい。同じように、超臨界溶媒の場合、それに応じて密度を変えることができる。
【００２８】
技術的には、このような勾配は、各溶媒入口で、個々の一定のモディファイアのベース濃度を有する溶媒が供給され、周期的に変化する組成（つまり、例えばモディファイア濃度）及び／又は流量を有する溶媒流が各入口に供給され、個々の一定のモディファイアのベース濃度を有する溶媒と混合されてシステムに沿って勾配を作れば、最も容易に行うことができる。同じように、超臨界溶媒の場合、それに応じて密度を変えることができる。
【００２９】
本プロセスの好ましい実施の形態によると、少なくとも１つのセクションは、少なくとも２つのカラムを含む。しかしながら、原則として、特に第１、第２及び第３のセクションは、１つのカラムに結合されてもよく、その画分は一連の時間的な隔たりのあるステップで取り込まれ、同じ又は少なくとも同等の目標を達成することに留意しなければならない。
【００３０】
基本的に、精製問題は、第１のセクションによって実行され、目的生成物の抽出を取り扱う主要部分に分けられる。他のセクションは主に、目的生成物と軽い不純物と重い不純物それぞれの間の接触面の最も効果的な分離を取り扱っている。これにより、セクションの少なくともいくつか、好ましくは第２のセクションが、カラムに連続的に接続された少なくとも２つの向流を含む場合、有利であることが判明する。
【００３１】
第４のセクションは実際には、三成分混合物を精製することができるために重要なセクションの１つである。従って、より高度な方法で構築されてもよく、例えば、３つのサブセクションに分類された、少なくとも３つのカラムを含んでもよいし、これらのサブセクションの機能を連続的に備えているそれ以下のカラムを含んでもよい。この第４のセクションの第１のサブセクションは、好ましくは、システムの全体的な流量より小さい流量で、多成分混合物を供給するための少なくとも１つの入口と、システムから外へあるいは第３のサブセクションの入り口へと、軽い不純物を直接取り除くための少なくとも１つの出口を含む。第２のサブセクションは、第２のセクションからのアウトプットを取り上げるための少なくとも１つの入り口と、第３のサブセクションの少なくとも１つの入口に接続された少なくとも１つの出口を含む。第３のサブセクションは、第２のサブセクションのアウトプットを取り上げるための少なくとも１つの入口と、場合により、第１のサブセクションのアウトプットを取り上げるための少なくとも１つの入口と、少なくとも１つの出口を含む。ここでまた、主要なシステムと同じく、切り替え時間後（又は非同期切り替え法であれば切り替え時間中）、カラムが動かされ（又は対応して異なる接続を与えることにより同じカラムの機能が変えられ）、つまり、第１のサブセクションからのカラムが第２のサブセクションの第１のポジションに動かされ、第２のサブセクションの最後のカラムが第１のセクションの第１のポジションに動かされ、第３のセクションの最後のカラムが第３のサブセクションの第１のポジションに動かされ、第３のサブセクションの最後のカラムが第１のサブセクションのカラムになるように動かされる。また、第４のセクションの３つの異なるセクションの機能は、同期的あるいは連続的に実行することができる。
【００３２】
本発明の特に好ましい実施形態によると、本システムは３つのカラムを含み、第１、第２及び第３のセクションの機能は、ただ１つのカラムで実現され、１つの切り替え時間内にこのただ１つのカラムが連続的に、溶媒用の入口を備え、その出口がシステムから中間生成物を取り出すために使用される第１のセクションの機能を行い、一方、第４のセクションの機能を供給しているカラムが直列に接続され、第４のセクションの出口を用いて軽い不純物がシステムから取り出される。続いて、このただ１つのカラムは、溶媒用の入口を備え、その出口が第４のセクションの第１のカラムに直接接続されている第２のセクションの機能を行い、一方、第４のセクションの機能を提供しているカラムが直列に接続され、第４のセクションの出口を用いて軽い不純物がシステムから取り出される。続いて、このただ１つのカラムは、溶媒用の入口を備え、その出口が重い不純物を収集するために使用される第３のセクションの機能を行い、一方、第４のセクションの機能を提供しているカラムが直列に接続され、第４のセクションの出口を用いて軽い不純物がシステムから取り出され、第４のセクションの機能を提供しているカラムの間で、多成分混合物が第４のセクションに供給される。
【００３３】
別の好ましい実施形態においては、一組のセクションの連続する機能が、１つのカラム内で結合され、１つの切り替え時間内に、連続又は準連続溶出のステップとバッチ溶出を有するステップが、連続的にそれらの機能を実行しながら交互に起こる。
【００３４】
この場合、好ましくは第４のセクションが上述した３つのサブセクションを含み、全システムには３つのカラムが備わっており、これら３つのカラムが１つの切り替え時間の第１の部分内に、連続又は準連続溶出のステップで連続的に接続され、切り替え時間の第２の部分内に、多成分混合物の個々の画分を取り出すためにバッチステップで駆動される。
【００３５】
第４のセクションはまた、３つのサブセクションを含むことができ、全システムには４つのカラムを備えていてもよく、これら４つのカラムが１つの切り替え時間の第１の部分内に、連続又は準連続溶出のステップで連続的に接続され、切り替え時間の第２の部分内に、多成分混合物の個々の画分を取り出すためにバッチステップで駆動される。このバッチステップでは、カラムの１つがゼロに近いかゼロに等しい流量を有する。
【００３６】
必要なカラムの数をさらに減らした、他の好ましい実施形態によると、システムはカラムを２つだけ含み、第４のセクションは３つのサブセクションを含む。この場合、２つのカラムは切り替え時間の第１の部分で連続溶出のために直列に接続され、出口を用いて軽い不純物がシステムから取り除かれる。切り替え時間の第２の部分では、カラムが、上流のカラムの中間体画分と下流のカラムの軽い不純物を取り出すためにバッチモードで駆動され、同時に、多成分混合物を下流のカラムへ供給する。切り替え時間の第３の部分では、カラムが連続溶出のために直列に接続され、出口を用いて軽い不純物がシステムから取り除かれる。切り替え時間の第４の部分では、カラムが、上流のカラムの重い不純物と下流のカラムの軽い不純物を取り出すためにバッチモードで駆動される。各切り替え時間後、２つのカラムのポジションが交換される。
【００３７】
選択的に、３つのサブセクションを具備する第４のシステムの構造において、第１のサブセクションが少なくとも２つの平行なカラムを含み、及び／又は第２の及び／又は第３のサブセクションが少なくとも２つの向流の平行又は連続なカラムを含む。
【００３８】
選択的に、供給物は連続的にシステムに導入され、さらにより好ましくは、１つの切り替え時間内に、周期的なパルス状の（ｐｕｌｓｅｄ）濃度プロファイル（切り替え周波数を伴い断続的）を用いて導入されるか、成形濃度プロファイルを用いて導入される。その代わりに、又はそれに加えて、溶媒の流量／密度は１つの切り替え時間内で変化し、及び／又は個々の入口／出口の切り替えが１つの切り替え時間内で行われる。個々のカラムの流量が異なれば特に有益である。
【００３９】
精製のための装置が複雑になればなるほど、このような精製スキーム用のパラメータを設定する簡単な方法を見つけることがより重要になる。この場合、これはまず第１に供給の標準グラジエントバッチクロマトグラムを実行し、バッチデータの簡単で単純な直感的分析により可能となる。
【００４０】
現状では、パラメータの設定は、以下のようにして可能である。第１のステップで、グラジエントバッチクロマトグラムを行い、第２のステップで、得られたクロマトグラムを軽い画分を有する最初の部分、目的の画分を有する第２の部分、重い画分と重なっている目的の画分を有する第３の部分及び重い画分だけを有する第４の部分に分類する。設定の第３のステップで、本プロセスのパラメータを、第１のセクションが第２の部分の時間のグラジエントバッチクロマトグラムに等しいタスクを実行し、第２のセクションが第３の部分の時間のグラジエントバッチクロマトグラムに等しいタスクを実行し、第３のセクションが第４の部分の時間のグラジエントバッチクロマトグラムに等しいタスクを実行し、第４のセクションが第１の部分の時間のグラジエントバッチクロマトグラムに等しいタスクを実行するように選ぶ。
【００４１】
従って、生産性に関して最適な切り替え時間は、好ましくは、（軽い不純物がグラジエントバッチクロマトグラムで完全に溶出されるまでの時間）×（グラジエントバッチクロマトグラムの流量）÷（装置の最大流量）÷（軽い不純物がバッチクロマトグラムで完全に溶出されるまでバッチグラジエントを実行するカラム数）として計算される。各カラムの流量は選択的に、（相当する部分がグラジエントバッチクロマトグラムでかかる時間）×（バッチ流量）÷（切り替え時間）に基づいて決定される。
【００４２】
さらに、本発明は、上述のプロセスを実行するための装置に関する。この装置においては、少なくとも２つの、好ましくは少なくとも３つ、より好ましくは４，５又は６つの個々のクロマトグラフィーカラムを備え、これを通して混合物を少なくとも１つの溶媒によって供給することができる。多成分混合物は少なくとも、軽い不純物、精製されるべき中間生成物及び重い不純物を含む。装置は、ポンプ、弁、カラム間の接続チューブ、収集出口、溶媒入口及び少なくとも１つの供給入口の形状の手段を含み、これらの要素により、少なくとも１つのバッチモードステップ又はポジションにおいて、１つのカラムの出口が中間生成物を収集するために使用され、少なくとも連続又は準連続モードステップ又はポジションにおいて、少なくとも１つのカラムの出口が少なくとも１つの他のカラムの入口に流体的に接続されているように、カラムを走行させることができる。前記バッチモード及び前記連続又は準連続モードは、同期的あるいは連続的に実現することができ、切り替え時間後又は切り替え時間内に、カラムが溶媒流れの通常方向とは反対の方向にそのポジションを動かされる。
【００４３】
好ましくは、装置の第１の実施形態によると、装置は少なくとも４つのセクションに分類され、そのうち第１のセクションには、溶媒の少なくとも１つの入口と精製された中間生成物用の少なくとも１つの出口が備わり、精製された中間生成物はシステムから洗い出すが、重い不純物はこのセクション内に保持する。第２のセクションには、溶媒の少なくとも１つの入口と第４のセクションの入口に接続された少なくとも１つの出口が備わり、前記出口を通して第４のセクションに重い不純物で汚染されている中間生成物を洗い流すが、純粋な重い不純物はこのセクション内に保持する。第３のセクションには、溶媒の少なくとも１つの入口と重い不純物用の出口が備わり、重い不純物を前記出口を通して洗い出しクロマトグラフィーカラムを洗浄する。第４のセクションには、第２のセクションの出口のアウトプットを受けるための少なくとも１つの入口と、多成分混合物を供給するための少なくとも１つの入口及び軽い不純物用の少なくとも１つの出口が備わり、軽い不純物はシステムから洗い出すが中間生成物はこのセクション内に保持する。接続及び切断手段が具備され、１つの切り替え時間後又は内に、第１のセクションからの最後のカラムを第２のセクションの第１のポジションへ動かし、第２のセクションの最後のカラムを第３のセクションの第１のポジションへ、第３のセクションの最後のカラムを第４のセクションの第１のポジションへ、第４のセクションの最後のカラムが第１のセクションの第１のカラムになるように動かすことができる。
【００４４】
本発明のさらなる実施形態を従属請求項に記載する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４５】
本発明の好ましい実施形態を添付の図に示す。
予備的で分析的な溶媒グラジエントバッチ溶出に対してもっともよく用いられるのは、時間に関する線形溶媒グラジエントである。矩形等温線を有する生体分子に対しては、線形グラジエント溶出は多くの場合唯一の有益な溶出法である。本研究で導入されるシステムは、バッチシステムで用いられるような準線形グラジエントを使用する。
【００４６】
バッチ溶出のリニア溶媒グラジエントは、一定のレベルと、１つの切り替え時間「ｔ＊」の期間で周期的に重畳された線形グラジエントとに分けることができる。
【００４７】
この「グラジエント分割」を、６カラム「線形溶媒グラジエント疑似移動床（ＳＭＢ）」を示す図１の次の例で説明する。
【００４８】
１つの切り替え後、カラムのモディファイア濃度は、下側の線で示されるベースステップ濃度ａｓ（ａｆｔｅｒ  ｓｗｉｔｃｈ）である。次の切り替え時間中に、各カラム内の濃度は、図１中にｂｓ（ｂｅｆｏｒｅ  ｓｗｉｔｃｈ）で示した上側の濃度で示される次のレベルまで線形的に（もちろん非線形的にでも可能）変えられる。システムが「ｔ＊」で切り替わり始めるとき、つまりカラムが溶媒流れとは反対方向に動かされるとき、新しいポジションでの始まりの濃度は、ちょうど前のポジションでの終わりの濃度となる。溶媒又は溶離剤は左から右へ流れるので、この場合の切り替えとは、カラム６がカラム５へ、カラム５はカラム４へ、カラム４はカラム３へ、カラム３はカラム２へ、カラム２はカラム１へ、カラム１はカラム６に切り替わることを意味する。
【００４９】
カラム内部の溶質分子には、ｔ＊におけるカラムの切り替えが「見え」ない。溶質分子は、時間経過に従って、モディファイア濃度が準連続的に変化することに「気づく」だけであり、これが周期的な部分（図１にａｓと示した、カラムごとに異なる一定のレベルから始まる）である。最終的に、溶質分子は例えばカラム６から逆にカラム１へと、固相とともに移動でき、線形溶媒グラジエントバッチ溶出に完全に類似して、ＣｓｔａｒｔからＣｅｎｄへと線形的に増加するモディファイア濃度を「感じる」だけである。
【００５０】
図２に、どのように準線形グラジエントが効果的に作り出されるかを示す。時間の関数として変化しているモディファイア濃度Ｃｍｏｄ，Ｖ（例えば、酸を有する水等の弱溶剤に加えられたアセトニトリルＡＣＮＬ等の強溶剤、また塩や他のモディファイアも可能である）（図２ａ）を、各カラムに対する一定のレベルのモディファイア濃度Ｃｍｏｄ，ｃ（図２ｂ）と合成又は重畳／混合する。両濃度が合成されてＣｍｏｄになる場合、効果的なグラジエントはカラムの観点からすれば線形グラジエントとなる。図２ｃ）に、モディファイア濃度Ｃｍｏｄを、５カラムシステムにおけるカラムの観点からプロットする。
【００５１】
カラムがポジション５なら、そのカラムには最も低いモディファイア濃度が「見える」。この濃度は時間にともない線形的に増加する。切り替え時間ｔ＊で、カラムはポジション４に切り替えられる。ここで再度線形的な濃度増加が起こるが、濃度増加はポジション５での切り替え直前の濃度に等しい濃度から始まる。カラムがポジション３，２及び１に切り替わるときにも同様なことが起こる。１サイクル後、カラムはポジション５に戻り、そこで再び同じ手順が開始する。
【００５２】
溶質の選択性が広い「簡単な分離」（ベースライン分離）のためには、図３に示すシステムを用いることができる。ここで各カラムｉは入口で溶出プロファイルを含み、次のカラム（ｉ−１）で洗い出される成分を含む。最も高濃度のモディファイアがカラム１に適用され（ｓ．ｓ．：ｓｔｒｏｎｇ  ｓｏｌｖｅｎｔ）、一連のカラム２〜５に沿って濃度が低下する（ｗ．ｓ．：ｗｅａｋ  ｓｏｌｖｅｎｔ）。この場合、４つの画分つまり軽い画分Ａ、２つの中間体画分ＢとＣ及び重い画分Ｄが分離される。
【００５３】
各カラムには３つのタスクがあり（ここではカラム番号３に対して）、それは、１．）「１つの成分（ここでは成分Ｂ）を溶出する」、２．）「他の成分（Ｃ，Ｄ）は動かないよう保持する」、及び３．）「次のカラム“３−１＝２”で溶出される成分（ここではＣ）を捕らえる」である。
【００５４】
簡単な分離（高い選択性、ベースライン分離）に対しては、ステップグラジエントで十分であり、準線形グラジエントは実際には必要でなく、実質的にはプロセスの収率や選択性に影響を及ぼさない。
【００５５】
しかしながら、簡単な分離はまれである。通常、精製されるべき混合物は、何百もの異なる成分からなり、そのうちのいくつは非常に似た吸着挙動を有し、そこから実際にはたった１つか非常に少ない数の成分を画分として求める。それに加えて、この目的とする画分は多くの場合非常に少なく、取り除きたい大量の重い成分と軽い成分により目立たなくされている。図１に示したＳＭＢは、このような状況では、例えば逆相樹脂上のポリペプチドのような「通常の」多成分混合物の中間体画分を精製することができないであろう。
【００５６】
従って、このような構成の問題の１つは、ベースライン分離が存在する状況にだけ効果的に適用でき、そうでない場合には、特に目的画分（例えばＢ）の目的でない画分に対する割合が低い場合、仮に高い収率と良好な分離を得ることが可能であっても非常に難しいだろうという事実である。つまり、部分的に目的の画分の上に重なっているいかなる化合物も、下流あるいは上流の画分中で失われるため、望まない状態（ｏｒｄｅｒ）の画分の混合は避けられないであろう。
【００５７】
従って、カラムの切り替えが「遅く」起こる場合、例えば軽い画分（例えばＡ）との重なりがない場合、目的とする画分（Ｂ）を抽出するために残された時間はあまりなく、完全に且つ最も確実に画分Ｃ用の出口で終わるため、目的とする画分（Ｂ）の大部分は次の重い画分中で失われる。あるいは、カラムが「早く」切り替えられ、切り替え時に軽い画分Ａと目的とする画分Ｂの部分的な重なりを許せば、目的とする画分（Ｂ）は軽い画分（Ａ）の量によって汚染される。これは図３の段階的又は順次的ＳＭＢによっては克服できない特有の問題であることを指摘しなければならない。
【００５８】
これら及びその他の問題を克服するために、添付の請求項による方法を開発し、「短絡移動カラム技術（Ｓｈｏｒｔ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  Ｍｏｖｉｎｇ  Ｃｏｌｕｍｎ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）」と称する。
【００５９】
この驚くほど効率的で簡単な構想の背後にある基本的なアイデアの１つは、図３に挙げたようなプロセスを「短絡する」ことによって、カラムの切り替えが「遅く」起こることがあっても、目的とする画分を取り戻すことができることである。つまり、カラムの切り替え前には特定のカラム３はもはや軽い画分Ａをほとんど含まないということである。このことは、基本的に、次の重い画分（図３の場合画分Ｃ）との重なりが回避され、「溶媒通路」の短絡を用いて、すなわちカラム２のアウトプットをカラム４の入口に直接接続することによって、図３の構成では、Ｃと混合されて終わりシステムから出される、いかなる量の目的画分Ｂもカラム４に戻され、カラムの向流切り替えにより、溶出のために再びポジション３に持ち込まれることで達成される。
【００６０】
準連続リニア溶媒グラジエントの作り方を図１で紹介する。溶媒グラジエントバッチ溶出での供給は、溶出が始まる前に不連続的に行われる。供給物は、溶質の吸着が非常に強く吸着部位が空いている（ｆｒｅｅ）、モディファイア濃度の小さい状態で装填される。装填後、モディファイア濃度が遅れることなく増加し、溶質は順々に溶出し始める。図１に示したグラジエントＳＭＢでの連続装填はあまり有益ではない。パルス供給は切り替えの初めに行わなければならず、その結果、グラジエントが遅れることなくその効果を表すことができる。
【００６１】
高い収率を得るためには、図１中のカラム５は中間体Ｅ１が通り抜ける前に、ポジション４へ切り替えられる必要がある。切り替え直前、カラム５は、次の切り替えで液体流とともにカラム４からカラム５へ運ばれる軽い不純物（ラフィネート、Ｒ）をまだいくらか含んでいる。マイナスの効果としては、軽い成分が固体とともに上流へ移動し、新しい供給パルスに遅れてカラム４のポジションに到達することである。従って、中間の目的成分Ｅ１を高純度にすることは不可能であろう。
【００６２】
中間体成分Ｅ１がカラム３のカラム出口において洗浄された時点で、精製された流れの一部だけが「抽出物１」Ｅ１流れでＳＭＢから送り出される。カラム３とカラム４の間の液体接続により、最大部分がカラム４へと流れる。カラム４の入口では、重い成分が樹脂に吸着され、その結果、精製された中間体Ｅ１成分が重い不純物Ｅ２と混合され、分離が不可能となる。
【００６３】
短絡移動カラム技術は、図４に示すようにこれらの問題を解決する。カラム３は他のカラムとの液体接続が全くなく、カラム２はカラム４と接続されており、カラム５は連続供給が可能となり、カラム４がカラム６と接続されている。
【００６４】
この技術のより一般的なアプローチを図５に示す。図５は、図４のカラムの接続トポロジーを一般化し、基本原理を示している。この場合、３つの画分Ａ（軽い画分）、Ｂ（目的画分）及びＣ（重い画分）からなる供給物Ｆがシステムに導入される。破線矢印は固体の移動、例えばシステム中のカラムの移動を示す。中央の右を差している水平の矢印はセクションβとδの間の液体リサイクルを示す。
【００６５】
図５に示す一般化されたプロセスでは、１つ又はいくつかのクロマトグラフィーカラムからなる４つのセクションα、β、γ、δが、閉ループの疑似固体移動（破線矢印）と接続されている。一定の時間、つまり切り替え時間ｔ＊の後、セクションαからの最後のカラムがセクションβの第１のポジションに動かされ、セクションβの最後のカラムはセクションγの第１のポジションに動かされる。セクションγの最後のカラムはセクションδの第１のポジションに切り替えられ、セクションδの最後のカラムがセクションαの第１のカラムになる。これは、軽い不純物Ａ、目的中間生成物Ｂと重い不純物Ｃを連続的に分離できるようになされる。液体流に関しては、セクションβ−δ間の接続を除いて、セクション間のカラムの移動はクロスフローでなされるが、セクション内部でカラムは液体流に対して向流的に動かすことができる。
【００６６】
セクション内部のカラムの数は、分離の困難さによって決まる。成分をバッチカラムで簡単に精製できる場合は、システムはセクション内部及びセクション間に向流移動を必要とせず、全てのセクションはただ１つのカラムからなることができ、セクションβは必要でさえない。しかしながら、バッチ溶出では部分的にしか精製が可能でないような難しい分離に対しては、高い収率及び純度を得るために、セクションβ及びδ内部のカラムは１つ以上であることが好ましい。セクションβとδは液体リサイクル流で相互接続されている（水平な中央の矢印）。連続的流れ供給又はパルス供給が可能な点を除き、入口と出口流はすべて連続的である。個々のセクション及びセクション内部のカラムの流量は必ずしも同一でなくてよい。このプロセスは、アイソクラティック、及び線形グラジエント溶出を、連続的で、部分的に向流の分離に移すことができる。
【００６７】
セクションは特定のタスクを有し、それらは以下の通りである。
−セクションα：  精製された中間生成物をシステムから洗い出すが、重い不純物はセクション内部に保持する。
−セクションβ：  重い不純物で汚染されている中間生成物をセクションδへ洗い流すが、純粋な重い不純物はセクション内部に保持する。
−セクションγ：  重い不純物を洗い出し、セクションのクロマトグラフィーカラムを洗浄する。定置洗浄（ＣＩＰ）。
−セクションδ：  軽い不純物をシステムから洗い出すが、目的生成物はセクション内部に保持する。供給物を精製システムに取り入れる。
【００６８】
セクションのそれぞれは、解決されなければならない特定の分離問題に合わせて設計できる。以下、図６から８には、セクションのいくつかに対して可能な変形を示す。
【００６９】
例えば、図６には、セクションに５個のカラムを含むセクションδの具体的な構造を示す。軽い不純物がバッチカラムで完全に溶出されてしまうまで、このセクションは完全な勾配掃引を与えなければならず、重い不純物が通り抜け始めるまで、純粋な目的生成物をしばらくの間バッチカラムから採取することができるという事実により、ほとんどの場合、このセクションδに、より多いカラム数を有するのがよい。
【００７０】
図７は、セクションβに、向流で機能しているいくつかのカラムを有する場合を示す。そのため、このセクションは実際にはＳＭＢ配置に非常に類似した構造となっている。
【００７１】
図７及び８には、セクションδの他の変形もまた示されており、３個のカラムが使用されている。図４に示されたような構成をもつように、図７では、カラム７の出口はカラム８の入口に接続されていない。
【００７２】
図６は、実験的検証のために使用された８カラムシステムの例を示す。原則として、図６に示したような配置では、カラム２の出口をカラム４の入口に接続することも可能であることを指摘しなければならない。
【００７３】
セクションδ内もまた、特殊な構造を構築することができる。通常、少なくとも１つのカラム（第１のサブセクションδｆ）、この場合カラム６を有することが望ましく、供給物を装填するために使用され、低流量である。このカラムは直接システムから外へ、またはセクションδの他のカラムへと軽い不純物を移すことができる。セクションδ内の別の第２のサブセクションδｇはカラム４及び５で示され、それらは第２のセクションβのアウトプットを受け入れるための入口となり、この特殊の場合では、カラム７及び８からなる、さらなる第３のサブセクションδγへアウトプットする。
【００７４】
第２のサブセクションδｇは基本的に、全ての軽い不純物Ａを取り除き、必ず軽い不純物を第３のサブセクションへと直接運ぶ。それに加えて、第２のサブセクションδｇは、必ず、カラム４がポジション３に動かされるとき、切り替え直前に目的生成物Ｂがカラム４内に完全に置かれ、固体の適切な位置にＢを運ぶために必要である十分な勾配を有する。この内容においては、この第２のサブセクションは、軽い不純物の最後の部分がセクションの最後のカラムの終わりに達するまで、十分な勾配の駆動に関与することを指摘しなければならない。従って、この時間が特に長い場合には、このセクションのカラム数を調整することができる。
【００７５】
特に、軽い不純物が固相中の不適切な位置でカラム５に流し込まれることを避けるため、カラム５のインプットにカラム４のアウトプットを接続することが好ましい。
【００７６】
カラム７及び８から形成される第３のサブセクションは、第２のサブセクションδｇのアウトプットを取り上げるための少なくとも１つの入口と、場合により、第１のサブセクションδｆのアウトプットを取り上げるための少なくとも１つの入り口と、少なくとも１つの出口を含み、必ずＢをシステム中に保持し、軽い不純物をシステムから取り除くように働く。図６の構成においては、カラム８の出口はクリーン溶媒によって形成される。
【００７７】
図７は、セクションβ内の分離をよりよくするために、３個のカラムを向流に配置した別の構成を示す。図７及び８には、図６の内容で上述したようなセクションδにおける下部構造の最も簡単な構造を示す。軽い不純物からの分離が困難な場合、図８の構成が図４の構成より好ましい。
【００７８】
一般化スキームは例えば次のような多くの特殊な形態をとることが可能である。
−パルス供給される場合、セクションδは、供給が連続の場合より、１つだけ少ないカラムを必要とする。
−重い不純物が中間生成物よりずっと強く吸着する場合、セクションβはカラムを含まない。
−うまくゆけば、プロセスは溶媒グラジエントを利用せずに操作することも可能である。
【００７９】
また、セクションα、β及びγは結合して、経時段階的に図５のセクションα、β及びγのアウトプットと等しい個々の画分を取り出し、図５の相当する要素のインプットに供給する、１つのカラムにすることもできるということも指摘しなければならない。
【００８０】
この明細書で提案されたような可変の構成には、特定の精製問題に合うようにシステムを動かすためのパラメータを設定するため、一般化された簡単なスキームを有することが非常に重要である。この場合は、グラジエントバッチクロマトグラムから出発して、提案したような連続プロセス用のパラメータを見つけることを可能とする、非常に簡単なスキームと技術がある。
【００８１】
本プロセスは、以下のような実験的（又は模擬的）濃度プロファイルから、容易に設計することができる。各セクションは、図９に示すような時間間隔を参照する。セクションαからδのタスクは、バッチ溶出の相当する時間間隔に起こっているイベント（ｅｖｅｎｔ）を参照する。
【００８２】
バッチから連続精製への移動の理解を高めるために、具体的な例をシミュレートする。この例においては、１７０ｇ／ｌＡＣＮＬ（アセトニトリル）から１９０ｇ／ｌＡＣＮＬの溶媒グラジエント（モディファイアグラジエント）が行われる。流量０．５ｍｌ／ｍｉｎ、カラム体積１．６６ｍｌである。グラジエントは０分に始まり２５分に終わる。１ｇ／ｌ未処理カルシトニン２５μｌが注入され、その純度は、軽い１（Ａ１）が２５％、軽い２（Ａ２）が５％、中間体（Ｂ）が５５％、重い（Ｃ）が１５％である。
【００８３】
目的収率は６０％、純度は８２．９％であり、中間画分は２６．８から３１分に取り出される。
【００８４】
これにより、図１０に示すプロファイルとなる。
【００８５】
このようなバッチグラジエントクロマトグラムから出発して、連続的プロセスが以下のように設計される。
７カラムを使用し、大きさはシングルバッチカラムと同じである。
【００８６】
例として、図６のシステムを選ぶが、シミュレーションでは、供給物（Ｆｅｅｄ）としてパルスが注入され、連続的供給はない。パルス供給のため、カラム６は必要でなく使用されない。
【００８７】
セクションのタスクは以下の通り：
−セクションα：  ２６．８〜３１．０分の間に起こったことを行う。
−セクションβ：  ３１．０〜３８．０分の間に起こったことを行う。
−セクションγ：  ３８．０〜４３．０分の間に起こったことを行う。
−セクションδ：  ０．０〜２６．８分の間に起こったことを行い、セクションβの出口（ｏｕｔｌｅｔ）を収集する。システム内に供給を行う。
【００８８】
すべてのタスクは１切り替え時間ｔ＊内に完了しなければならない。セクションδのタスクは、最も長い時間を必要とし、セクションδに４カラム有する理由はここにある。我々は、クロマトグラムに値が相当する、以下の設計パラメータを定義する。
【００８９】
【表１】
2008539395.tif 000003
【００９０】
切り替え時間を計算するための基本手順は以下のとおりである：
図６に示した配置に対して、供給（ｆｅｅｄｉｎｇ）から純粋な目的中間生成物が通り抜ける時間までのグラジエントを、カラム４及び５に移すとする。より多い流量で操作されるカラムがプロセスを制限している。ここでの例においては、カラム５がグラジエントのより長い部分にわたって走行し（Ｓｔａｒｔ＿Ａ−ｔ＿Ｓｔａｒｔ＝１８分）、カラム４はより短い部分にわたって走行する（Ｓｔａｒｔ＿Ｆｒａｃ−Ｓｔａｒｔ＿Ａ＝２６．８−１８＝８．８分）。生産性に関して最適なのは、カラム４とカラム５が同じ流量で操作される場合であろう。
【００９１】
この具体例においては、軽い不純物が溶出し始めるまで、バッチグラジエントの部分をカラム５内で行うことが決定される。従って必要とされる切り替え時間は、
【数１】
2008539395.tif 000004
として計算される。従って、カラム内部の流量は次のようでなければならない。
【数２】
2008539395.tif 000005
ただし、上述のように、ここではカラム５中にパルス供給されるため、カラム６は使用されず、
【数３】
2008539395.tif 000006
【００９２】
溶媒グラジエントは、カラム入口での特性時間における移動相成分に依存する（図１参照）。モディファイア濃度と内部流量に対しこれらの値を用いて、カラムに対する入力パラメータが計算できる。
【００９３】
【表２】
2008539395.tif 000007
【００９４】
連続プロセスのシミュレーションを図１１〜１３に示す。セクション内の濃度プロファイルを、定常状態における切り替え前（図１２）、後（図１３）及び真ん中（図１１）で示す。左のｙ軸上にはペプチドの濃度をｇ／ｌで、右のｙ軸上にはモディファイアの濃度をｇ／ｌで示す。
【００９５】
このシミュレーションの収率は約９９．９５％、純度は８５．２％である。連続プロセスの設計の基礎となったバッチプロセスとの比較を表３に示す。
【００９６】
【表３】
2008539395.tif 000008
【００９７】
この例においてはバッチプロセスの生産性が連続プロセスの生産性の約２倍となってはいるが、連続プロセスの利点が非常に明らかになっており、溶媒消費量をさらに減らすことが可能である。しかし、この例においては、連続プロセスはバッチクロマトグラムから直接移され、まだ最適化されていない。カラム４及び５の流量のわずかな変化により、最小の切り替え時間を３分に減少することができ、その結果、生産性が３３％増加するであろう。最適化の可能性はまだ完全には調査されていない。
【００９８】
収率や純度のような品質制限が高くなればなるほど、連続プロセスはより有益となる。このことは、生体分子のような非常に高価な溶質の場合、最も重要である。
【００９９】
バッチプロセスが高い理論段数を必要とすることはよく知られている。そのため、上の例はまた、バッチカラムが連続マルチカラムプラントと同じ量の樹脂からなる場合において、連続プロセスとバッチプロセスの比較が必要である。
【０１００】
図１４は、最大流量２．２５ｍｌ／ｍｉｎ、連続７シングルカラムで行われたバッチ溶出を示す（７倍の段階数、７倍の装填）。９９．９５％の収率に対する純度はわずか７９％であることがわかる。要求純度が８５．２％の場合、バッチの収率は９９．６％になるであろう。連続プロセスに比べて、連続７カラムのバッチの生産性はわずか５４％である。表４を参照されたい。
【０１０１】
【表４】
2008539395.tif 000009
【０１０２】
クロマトグラフィーカラムの全圧力損失はカラムの長さに比例するため、長いカラムの最大流量は短いカラムの最大流量よりずっと小さくなり、これによりバッチ溶出の生産性をさらに減少させるであろう。
［実験的検証−カルシトニンの精製］
【０１０３】
新規のプロセスは、図１５に示すように、８カラム開ループ系で実験的に検証された。実験用の入力パラメータはシミュレーションから選ばれる。図の下部は図６と等しい。クロマトグラム並びに溶媒グラジエントは、４つのセクションα−β−γ−δにより実行されるタスクに分割される。このプロセスは、グラジエントバッチ溶出に完全に類似しているが、セクションδ内及びセクションβとδ間の純粋でない側の画分の向流リサイクルが可能である。
【０１０４】
４つのセクション内の８カラムには以下のタスクがある：
−セクションγ：（１カラム）
カラム１は、システム外に成分Ｃを流し出す。
−セクションβ：（１カラム）
カラム２は、Ｃにより汚染されている、少量で有益な量のＢを流し出す。Ｂをリサイクルするために、カラム２の液体出口流がカラム５に洗い流される。
−セクションα：（１カラム）
カラム３は、精製された生成物Ｂを洗い出す。可能な限りの高純度を保証するために新しい溶媒が使用される。
−セクションδ：（５カラム）
カラム４は、Ａにより汚染されている、少量だが有益な量のＢを洗い出す。この例では、新しい溶媒が使用される。カラム４のもう１つのタスクは、ＣとＢ間の部分的分離である。線形グラジエント状態でカラム４を走行するのは理にかなっている。溶出した溶媒はリサイクルのためにカラム７に洗い流される。
カラム５は、Ａの大部分をカラム８へ洗い出す。ここで使用される溶媒は、カラム２（セクションβ）からくるリサイクルされた溶媒と正確なモディファイア濃度を調整するために必要であるポンプ５からの弱溶媒からなる。カラム５のもう１つのタスクは、ＣとＢ間の部分的分離である。
カラム６は、供給カラムである。ここで流量は、大きな理論段数と幅の狭い装填プロファイルを得るために、できるだけ小さくするべきである。
カラム７は、リサイクルカラムである。そのタスクは、ａ）カラム４の出口からＡ＋Ｂを受け取り、ｂ）ＢからＡをできるだけ十分に分離する、ことである。ここで使用される溶媒は、カラム４からくるリサイクルされた溶媒と、正確なモディファイア濃度を調整するために必要とされるポンプＰ７からの弱溶媒からなる。
カラム８も、リサイクルカラムである。そのタスクは、ａ）カラム５の出口からＡ＋Ｂを受け取り、ｂ）ＢからＡをできるだけ十分に分離する、ことである。ここで使用される溶媒は、カラム５からくるリサイクルされた溶媒とポンプＰ８からの弱溶媒からなる。
【０１０５】
非線形な吸着等温線の場合、よりよい安定度を得るために、カラム７又は８で負の溶媒グラジエントを走行することが、ときに有益である。カラム２もまた、負の溶媒グラジエントで操作するべきである（高濃度のモディファイアで始まり、低濃度のモディファイアで終わる）。
【０１０６】
実験に用いられるプラントは、３つの「Ａｅｋｔａ−Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｂａｓｉｃ」システムからなり、いくつかの付加的なマルチポジションバルブと付加的なグラジエントポンプが装備されている。３つのＡｅｋｔａマシン用のソフトウェアはアマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）の「ＵＮＩＣＯＲＮ」であり、同時に走行する３つのＵＮＩＣＯＲＮシステムの統括コントロールはソフトウェア「Ｇｅｎｅｓｉｓ」を用いて実現される。
【０１０７】
精製される混合物は、逆相精製前に生成プロセスから取り出された、３４３２ｇ／ｍｏｌの分子量を有するポリペプチドカルシトニンである。供給物の分析的クロマトグラムを図１６に示す。この供給物は約４６パーセントのカルシトニン、約１９％の重い不純物及び３５％の軽い不純物からなる。カルシトニンは中間画分「Ｂ」である。
【０１０８】
ペプチドを精製するために使用される連続プラント内のカラムには、アマシャムのＳＯＵＲＣＥ  ＲＰＣ  １５が詰め込まれている（ｐａｃｋ）。カラムの寸法は１００×４．６ｍｍである。移動相は水／Ｈ３ＰＯ４とアセトニトリルである。カラムごとの理論段数はおよそＮＴＰ＝１００である。
【０１０９】
流量及びモディファイア濃度等の実験パラメータはシミュレーションに基づいている。検証のために選んだ実験パラメータは以下の通りである：
溶媒Ａ：  水９９８．５ｇ／ｌ、Ｈ３ＰＯ４（８５％）１．１７ｇ／ｌ
溶媒Ｂ：  純粋アセトニトリル
供給物：  Ａに溶解させた純度４３％の０．９ｇ／ｌ未処理カルシトニン
切り替え時間：  ｔ＊＝６分
ポンプ１  ０．２５ｍｌ／ｍｉｎ、０．７３ｔ＊に６０．０％Ｂから３０．１％Ｂ
ポンプ２  ０．７５ｍｌ／ｍｉｎ、ｔ＊に２４．３１％Ｂから２９．１３％Ｂ
ポンプ３  ０．１３ｍｌ／ｍｉｎ、ｔ＊に２４．３１％Ｂから２４．３１％Ｂ
ポンプ４  ０．１５ｍｌ／ｍｉｎ、ｔ＊に２４．３１％Ｂから２４．３１％Ｂ
ポンプ５  ０．１３ｍｌ／ｍｉｎ、ｔ＊に２４．３１％Ｂから１．２９％Ｂ
ポンプ６  ０．０４５ｍｌ／ｍｉｎ、（カラム６へ供給物、０．０３ｍｌ／ｍｉｎで純粋Ｂをカラム８へ）
【０１１０】
カラム１（Ｃ）、３（Ｂ）及び７（Ａ）からの出口のオンラインＵＶ信号と伝導度信号によって、信号が、約１５０分後に周期的な一定パターンに達し始めることがわかる。このシステムは、定常状態に達するのに約８００分必要とする。
【０１１１】
定常状態におけるカルシトニンの純度は８５％で、これはシミュレーションによって予測される値に一致する。収率もまたシミュレーションと一致し、およそ９７％の値である。
【０１１２】
１６の実験を行った。これらの実験の純度及び収率に関する図を図１７に示す。％での純度を％での収率の関数として表す（ｘ軸）。
【０１１３】
連続的配置
通常、生体分子を完全に精製するために、又は安全な制限を満たすためには、一種類のクロマトグラフィー分離では十分でない。そこで、例えばイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）とその後疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）というように、連続する２つのシステムを用いることができる。２つの精製システムは、例えば図１７のように、続けておくことができる。供給物Ｆが第１のシステムのセクションδ１に導入される。システム１からの精製された中間画分は、システム２のδセクションに装填される。塩又は有機モディファイアもシステム２のこのセクションδ２に導入される。例えば１つの切り替えの３分の１内にα１の出口をパルスする（ｐｕｌｓｅ）ことが可能である。切り替えの残り３分の２を、セクションδ２の装填カラムからトレーサーを洗い出すために用いることができる。両プロセスは連続しているため、２つのシステムは異なる切り替え時間で操作できる。システム２はセクションα１からの部分的に精製された出口（ｏｕｔｌｅｔ）のクロマトグラムから設計することができる。
【０１１４】
グラジエント精製プロセスはまた、準連続又は半連続モードで操作することもできる。その場合、精製タスクを実施するために使用されるカラムは、３カラム以下、つまり例えば２か３カラムに下げることができる。これにより、精製された生成物流と供給流が他の流量に比べて小さい場合に対し、上記の完全に連続したプロセスに比べて生産性を向上することができる。さらに、システムは操作の信頼性のためにほぼ同一のカラムを必要とし、多数のほぼ同一のカラムの詰め込みが厄介な可能性もあるため、カラム数の減少は装置を単純化する。
【０１１５】
セクションα、β及びγの結合：
準又は半連続操作用の最も明白な構成は、既に上述したように、セクションα、β及びγを結合して、経時段階的に図５に示すようにセクションα、β及びγのアウトプットと等しい個々の画分を取り出し、図５中の相当する要素のインプットに供給する、１つのカラムにすることもできる。
【０１１６】
セクションβとしてただ１つのカラムだけを有することを除き、図５のフローシートを具体化するそのような考え得る構成を図１９に示す。この場合、セクションα、β、γは１つのカラムで結合される。図１９中の黒いボックスはこの機能を実行しているカラムがあることを意味し、影付きのボックスはそのポジションを満たしているカラムがないことを意味する。図１９のスキームは、次のスキームにより切り替わる：（１ａ−１ｂ−１ｃ）−（２ａ−２ｂ−２ｃ）−（３ａ−３ｂ−３ｃ）−（１ａ−１ｂ−１ｃ）−（２ａ−２ｂ−２ｃ）−．．．等。
【０１１７】
この図は、個々のセクションの機能は必ずしも、個々のカラムによって付随して、つまり同期して実行されなくてもよいということを示すが、図１９からわかるように、ステップ１ａ）〜１ｃ）、つまりカラム１がセクションαの機能（ステップ１ａ）を、次にセクションβの機能（ステップ１ｂ）を、最後にセクションγの機能（ステップ１ｃ）を連続的に実行するというように、段階的に個々の機能を実行することが十分に可能である。これらのステップ１ａ）〜１ｃ）すべては１切り替え時間内に実行される。この最初の切り替え時間の後、つまりステップ１ａ）〜１ｃ）の後、カラム１〜３のポジションは循環してシステムの望ましい向流をもたらす。
【０１１８】
セクションα、β及びγを結合するという概念はまた、例えば８カラム配置（例えば図６を参照）のように、他のカラムの構造にも適用でき、わずか６カラムにまで減少されるだろう。
【０１１９】
ただ１つのカラムへのセクションのペア結合：
より少数のカラムを使用するための非常に効果的な別の方法は、セクションのペア結合である。つまり、例えばセクションδ＋αやセクションβ＋γのような結合、又はより正確に言えば、ペアγ＋β；α＋δｇ；δｆ＋δｒ；又は同等にβ＋α；δｇ＋δｆ；δｒ＋γである。
【０１２０】
図２０ａ）には、図４の６カラム構成が示され、ただ１つのカラムのそれぞれにより具体化されたセクションが図中に示されている。具体的に、次のタスクはその番号のカラムにより実行される。
１．カラムから重い不純物Ｃをすべて取り出す。
２．このカラムから中間生成物Ｂをすべて取り出すが、重い不純物Ｃはこのカラムに保持する。
３．重い不純物Ｃはこのカラムから取り出さず、中間生成物Ｂだけを確実に取り出す。
４．カラムから軽い不純物Ａをすべて取り出すが、中間生成物Ｂはカラムに保持する。
５．供給物Ｆをカラムに取り入れ、第１の軽い不純物Ａをカラムから取り出す。
６．確実に中間生成物Ｂをカラムから離れないようにし、トレーサーをカラムから取り除く。
【０１２１】
図２０ｂ）では、６カラム構成が、３つの相互接続カラムと３つの非接続カラムに分割されているが、図２０ａ）の６カラム構成と同一である。３つの相互接続カラムのレーンを「ＣＣＬ」（向流レーン）、非接続カラムのレーンを「ＢＬ」（バッチレーン）と呼ぶ。
【０１２２】
図２０の構成の全体的なトポグラフィーを図２１に示す。
【０１２３】
ＣＣＬはカラムポジション２，４，６（β、δｇ、δｒ）からなり、バッチレーンはカラムポジション１，３，５（γ、α、δｆ）からなる。６カラムシステムがＣＣＬとＢＬの２つの状態の間で切り替わるとき、ＣＣレーンのすべてのカラムは「バッチレーン」のカラムとなり、バッチレーンの全てのカラムはＣＣレーンのカラムとなることは明白である。両レーンの局部的切り替え時間は全切り替え時間ｔ＊に等しい。それにより全プロセスを連続にする。バッチカラムと向流カラムは、同時に同じプラントで操作される。
【０１２４】
このような（カラムの）減少の影響を示すために、例を挙げて説明する。図２２において、上部ａ）は切り替え時間３分の６カラムプロセスを示す。この例では、シングルカラムの最大流量は２ｍｌ／ｍｉｎと推定される。そのため、カラム６が流量と生産性を制限している。
【０１２５】
すでに説明したように、両切り替え時間は、「フルタイムの」連続プロセスを持つに等しくなければならない。２つのレーンＢＬとＣＣＬ間には液体流れが存在しないため、これらのレーンは互いに独立している。
【０１２６】
結果として、全プロセスに対して６カラムでなく３カラムだけを使用し、バッチラインで始めるものの、この３カラムがＣＣレーンに切り替わるとき、バッチレーンの全ての流量を止めることが好ましい。同じことがＣＣレーンに対しても有効である。３カラムがバッチレーンに戻るとき、ＣＣレーンの流量はゼロに設定される。
【０１２７】
そのため、各カラムは２つのセクションの機能を引き継ぎ、これらの機能は、同期的に実行されるのではなく、経時段階的に実行される。
【０１２８】
局部的プロセスは常に連続的であるが、それらが操作を止めても他のレーンが動いている。従って全プロセスは完全に連続的ではないが準連続的である。
【０１２９】
上の場合、生産性は１００％と推定される。
【０１３０】
バッチレーンの切り替え時間は、図２２ｂ）に示すように例えば１分まで減らすことができ、全切り替え時間は４分となる。その際、バッチレーンにおいて最も多い流量は１．８ｍｌ／ｍｉｎ（＜２ｍｌ／ｍｉｎ＝Ｑｍａｘ）となり、システムの最大流量に近づく。
【０１３１】
異なる切り替え時間を有する２つの独立したマルチカラム切り替えプロセスがあり、これらが交互に操作される。ＣＣレーンの切り替え時間は３分、バッチレーンの切り替え時間は１分である。
【０１３２】
全切り替え時間は、ｔ＊＝ｔ＊ｂａｔｃｈ＋ｔ＊Ｃ．Ｃ．と増加するが、カラム数は６から３へと減少する。そのためこの例においては、生産性が、Ｐ＝１００％・３／（３＋１）・６／３＝１５０％となり、プロセスの生産性は５０％も増加する。
図２２の構成の全体的な切り替えスキームを図２３に図示する。
【０１３３】
準又は半連続操作の全体的な配置を図２４ａ）に示す。この構成は大幅に簡略化されており、必要なポンプ数も接続数もより少ないことがわかる。２つの異なる状態に対する図２４ｂ）に示すように、各カラム間で弁が２つのレーン間を切り替える。
【０１３４】
上に説明した構成のカラムポジションを、図２５のスキームで図示する。黒いボックスは上述の機能を実行しているカラムがあることを示し、影付きのボックスはその機能を実行しているカラムがないことを示す。６つの異なるカラムポジションが、１ａ−１ｂ−２ａ−２ｂ−３ａ−３ｂ−１ａ−１ｂ−２ａ−２ｂ−・・・というような順序で操作される。
【０１３５】
セクションβ及びδ内に向流が必要とされる場合、図２１に示したような配置でセクションβ内に２つ以上のカラムを有するものは、半連続モードに移ることができる。４カラムからなる相当する半連続構成を図２６に示す。ここでは、「β」ポジション中、セクションβの第１のカラムの流量はゼロに設定されている。
【０１３６】
原則的には、このようにカラムを二重にすることは、セクションのそれぞれ及びいくつかのセクションに対しても可能である。
【０１３７】
２カラム構成：
本発明の要旨の範囲で、３カラム半連続プロセスを２カラムだけに減らすことも可能であるが、その場合、軽い画分Ｃと重い画分Ａのリサイクルを同時に実施することはできず、その上段階的でなければならない。
【０１３８】
３つのステップ（図２８のステップ２〜４）においては、３つの機能α、β、γのうちただ１つが、図１９の場合と同様に１つのカラムによって実行されるため、原則は３カラムに対するもの（上記参照）に類似している。しかしさらに、この構成では、１つの別のステップ（図２８のステップ１）において、α、β、γのどの機能もカラムによって実行されず、δの機能だけが実行される（図２８のステップ１、機能δｇとδｒ）。
【０１３９】
２カラム構成を図２７に示す。このプロセスは、ポジションγからのカラムがポジションδｆに切り替えられる前に、Ｂがポジションδｇのカラムを全く離れないように設計される必要がある。そうでなければ、有益な生成物Ｂは軽い画分出口Ａで失われてしまう。
【０１４０】
図２７に示すように、上側の第１ステップ（図２８のより体系的な図に合わせて参照番号３とした）では、その目的は、ポジションβとδｇ間で、重い画分Ｃと中間画分Ｂをリサイクルさせることと、軽い画分Ａを収集することである（閉鎖線はその間に弁を有していることに注意）。
【０１４１】
次のステップ４では、その目的は、重い画分Ｃを収集し、同時に軽い画分Ａも収集することである。この次のステップ４は、Ｃだけがカラム１を離れようとする時点でスタートする。
【０１４２】
これら２つの最初のステップ３及び４では、第３のポジションがカラムに占有されていない（斜線をかけた長方形）。
【０１４３】
このステップ４の後、ポジション１のカラムがポジション３に切り替わる。つまり、ポジション１の上流のカラムとポジションの２の下流のカラムがそれらの場所を交換するといえる。続く２つのステップでは、ポジション１にカラムがない。これは、ポジション２だけが常にカラムに占有されていることを意味する。
【０１４４】
続くステップ１では、その目的は軽い画分Ａをリサイクルさせ、トレーサーを収集することである。このステップは、純粋な中間生成物Ｂがポジション２のカラムを出始めるまで行われる。
【０１４５】
純粋な中間生成物Ｂがポジション２のカラムを出始めるとすぐに、次のステップ２が始まる。すなわちこのステップ２では、その目的は、バッチモードのカラム２から中間画分Ｂを収集し、同時に供給物をポジション３のカラムに装填し、非常に軽い画分Ａを収集することである。このステップ２は、中間画分Ｂが、重い画分Ｃの一部とともに混合物の状態で、ポジション２のカラムを離れ始める直前まで続けられる。
【０１４６】
このステップ２の後、カラムは、ポジション２のカラムがポジション１に動かされ、ポジション３のカラムがポジション２に動かされるように切り替えられる。このプロセスは３−４−１−２−３−４−１−２−・・・というように順番に繰り返される。１つの完全なサイクルには、図２７のようなタイプの２つのシリーズが含まれることに注意しなければならない。
【０１４７】
図２８は、同じプロセスをより系統的な図に示す。１つの完全なサイクルを含む２カラム構成を上側に示す。下側には、向流グラジエント精製のためのグラジエントクロマトグラムの相当するタスクを示し、また下側には、モディファイア１６の濃度プロファイルを示す。実際のところ、この２カラム構成は、特にグラジエント走行用に稼働する。このプロセスは、２つのカラムを交互に入れ替えながら、ポジションを１−２−３−４−１−２−．．．と繰り返す。
【０１４８】
半連続ユニットの連続的構成
既に上述したように、数種の精製を含む１つのプラント内で、本発明の精製ユニットを連結することもできる。上記の精製ユニットにつきわずか３カラムまで減らすことは、例えば以下に示すような好ましい操作モードを提供する。
【０１４９】
全体的なクロマトグラフ精製プロセスにはいくつかのステップを含むことができ、例えば：
−陽イオン交換（ＣＥＸ）
−陰イオン交換（ＡＥＸ）
−疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
を含むことができる。
半連続精製プロセスの連続的構成を図２９に提案する。ここでは、「ＣＥＸ」、「ＡＥＸ」と「ＨＩＣ」が１つのプラント内で連結されている。
【０１５０】
定置洗浄ステップは図２９では考慮されていない。ＣＩＰを可能にするための、最も経済的な方法は、カラムを定置洗浄のために「駐車させる」ことのできる第４のポジションを具備することであろう。
【０１５１】
多くの場合、「ＡＥＸ」ステップは負の（ｎｅｇａｔｉｖｅ）クロマトグラフステップであり、その場合生成物は吸着しないが、例えばウィルスは吸着する。このような２つの成分の分離（生成物からウィルスを取り除く）には、２つのカラムが必要なだけであり、ユニット２のポジション１は必要ではないであろう。
【０１５２】
ユニット１と２の間及びユニット２と３の間のミキサーは、１サイクルに渡って生成物濃度を均一にする。非線形等温線の場合、これは重要な内容であるかもしれない。
【図面の簡単な説明】
【０１５３】
【図１】６カラムの線形溶媒グラジエントＳＭＢの例を示す。
【図２】ステップグラジエント（ｂ）と周期的溶媒グラジエント（ａ）の重ね合わせによる準線形グラジエントの、ここでは５カラム用の技術的な実現を示す。
【図３】４成分混合物を分離するための、５カラム溶媒グラジエントＳＭＢの略フローシートを示す。
【図４】「短絡線形溶媒グラジエントＳＭＢ」構成の具体例を示す。
【図５】「連続的グラジエント精製プロセス」の一般化フローシートを示す。
【図６】具体的な「連続的グラジエント精製プロセス」のフローシートを示す。
【図７】他の具体的な「連続的グラジエント精製プロセス」のフローシートを示す。
【図８】他の具体的な「連続的グラジエント精製プロセス」のフローシートを示す。
【図９】定性的クロマトグラムと精製プロセスのセクションを示す。
【図１０】連続プロセスの構造を説明するための疑似グラジエントクロマトグラムを示す。
【図１１】切り替え真ん中のプロセスシミュレーションを示す。カラム１が既に完全に洗浄されているのがわかる。
【図１２】切り替え前のプロセスシミュレーションを示す。
【図１３】切り替え後のプロセスシミュレーションを示す。
【図１４】最大流量２．２５ｍｌ／ｍｉｎ、純度７９％、収率１００％の連続７ショートカラムのバッチ溶出用疑似グラジエントクロマトグラムを示す。
【図１５】確認のために使用される８カラムプロセスのフローシートと定性的クロマトグラムを示す。
【図１６】分析ＯＤＳ−カラム  ＺＯＲＢＡＸ  ＯＤＳ  ＳＢ−３００を用いた、供給物のグラジエント分析を示す。
【図１７】わずかに異なる操作条件に対する、収率と純度の間の関係を示す。
【図１８】連続する２つの精製システムを示す。
【図１９】３カラムだけで操作された「５カラムユニット」のスキームを示す。ここでセクションα、β及びγは１つのカラムに結合されている。
【図２０】向流レーンとバッチレーンを具備する連続６カラムユニットを示す。
【図２１】図２０で示されたような特定の「連続グラジエント精製プロセス」のフローシートを示す。
【図２２】特定の実験値のための３カラムだけ具備する、図２０の構成の操作を示す。
【図２３】図２０の構成の切り替えスキームを示す。
【図２４】明確に３カラムだけで実現された、図２０の構成の操作を示す。
【図２５】３カラムで操作される「６カラムユニット」の１サイクル中のカラムポジションを示す。
【図２６】セクションβに２つの向流カラムを具備した、図２１の接続形態のための考えられる４カラム構成を示す。
【図２７】向流グラジエント精製のための２カラム構成を示す。
【図２８】図２７の構成を、下部に相当するグラジエントクロマトグラムのタスクを含む概略図に示す。
【図２９】１つのプラントに「ＣＥＸ」、「ＡＥＸ」及び「ＨＩＣ」を具備する連続的な半連続構成を示す。
【符号の説明】
【０１５４】
１．  開ループ用の溶媒
２．  排水管
３．  第１の短絡
４．  第２の短絡
５．  第１の「分離した」カラム
６．  第２の「分離した」カラム
１１．  純粋なＣ
１２．  リサイクル
１３．  分別
１４．  リサイクル
１５．  純粋なＡ
１６．  モディファイアグラジエント
２１．  システム１、Ｉｅｘ
２２．  システム２、ＨＩＣ又は逆相
２３．  精製された生成物
２４．  塩又は有機モディファイア
ａ．  精製プロセスの第１セクション
ｂ．  精製プロセスの第２セクション
ｃ．  精製プロセスの第３セクション
ｄ．  精製プロセスの第４セクション
Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ：    画分
Ａ．    軽い画分
Ｂ．    中間画分、目的生成物
Ｃ．    重い画分
ｓ    溶媒
Ｅ１    抽出物１
Ｅ２    抽出物２
Ｒ    ラフィネート
Ｆ    供給物
ｔ    時間
ｔ＊    切り替え時間
ｔｒ    トレーサー
ｂｆ    切り替え前
ａｆ    切り替え後
Ｃｍｏｄ，ｖ    可変モディファイア濃度
Ｃｍｏｄ，ｃ    ポジションごとの一定のモディファイア濃度
Ｃｍｏｄ    モディファイア濃度
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【国際調査報告】
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