(57)【要約】本発明は、インテグリンαＩＩｂβ３特異的抗体およびペプチドを提供する。その抗体およびペプチドは、他のインテグリンとほとんど免疫反応性を示さない、または全く免疫反応性を示さない。その抗体およびペプチドを用いて血小板凝集を阻害する方法も提供される。本発明は、９〜約５０アミノ酸残基を含む、単離され、精製されたペプチドであって、配列番号４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸残基配列を有し、血小板凝集を阻害する活性を有するペプチドを提供する。
2008501305.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
９〜約５０アミノ酸残基を含む、単離され、精製されたペプチドであって、配列番号４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸残基配列を有し、血小板凝集を阻害する活性を有する、ペプチド。
【請求項２】
配列番号５〜７のいずれかのアミノ酸残基配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号５〜７のいずれかからなる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号５〜７のいずれかから本質的になる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
インテグリンαＩＩＢβ３と特異的に免疫反応し、配列番号８、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１からなる群より選択されるアミノ酸残基配列を含む抗体であって、該アミノ酸残基配列が、該抗体の相補性決定領域内にある、抗体。
【請求項６】
前記相補性決定領域が、前記抗体の重鎖内に位置する、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記相補性決定領域が、ＨＣＤＲ３である、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
本明細書中で、ＲＡＤ３、ＲＡＤ４、ＲＡＤ９、ＲＡＤ１１、ＲＡＤ１２、ＲＡＤ３２、ＲＡＤ３４、ＲＡＤ８７またはＲＡＤ８８と示された抗体からなる群より選択される請求項５に記載の抗体であって、インテグリンαＩＩＢβ３との免疫反応性を有する、抗体。
【請求項９】
ヒト抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載の抗体の免疫反応性を有する、抗体。
【請求項１１】
血小板を、有効阻害量の請求項１に記載のペプチドと接触させる工程を包含する、血小板凝集を阻害する、方法。
【請求項１２】
血小板を、有効阻害量の請求項５に記載の抗体と接触させる工程を包含する、血小板凝集を阻害する、方法。
【請求項１３】
血小板を、有効阻害量の請求項１に記載のペプチドと接触させる工程を包含する、フィブリノゲンの血小板に対する結合を阻害する、方法。
【請求項１４】
血小板を、有効阻害量の請求項５に記載の抗体と接触させる工程を包含する、血小板凝集を阻害する、方法。
【請求項１５】
インテグリンαＩＩＢβ３結合活性を有する抗体であって、該結合が、他のタンパク質の結合活性と競合し、該他のタンパク質が、トリペプチドモチーフＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＲＡＤ）のアミノ酸残基配列を含み、該結合が、標準競合アッセイで行われる、抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の抗体であって、前記他のタンパク質が、他の抗体であって、該他の抗体が、該他の抗体の相補性決定領域内にアミノ酸残基配列を含み、該アミノ酸配列が、配列番号８、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１からなる群より選択され、前記結合が、標準競合アッセイで行われる、抗体。
【請求項１７】
９〜約５０アミノ酸残基を含むペプチドをコードする単離され、精製されたポリヌクレオチドであって、配列番号４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸残基配列を有し、該ペプチドが、血小板凝集を阻害する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２０】
タンパク質を産生するために、ポリヌクレオチドを使用するための方法であって、該方法は、
ａ）タンパク質発現のための条件下で、請求項１９に記載の宿主細胞を培養する工程；
および
ｂ）該宿主細胞培養物から、配列番号４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を回収する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載のペプチド、および静脈内投与、動脈内投与、リンパ循環投与、腹腔内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、関節空間投与または肺投与に適した形態で適切な薬学的キャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項５に記載の抗体、および静脈内投与、動脈内投与、リンパ循環投与、腹腔内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、関節空間投与または肺投与に適した形態で適切な薬学的キャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１５に記載の抗体、および静脈内投与、動脈内投与、リンパ循環投与、腹腔内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、関節空間投与または肺投与に適した形態で適切な薬学的キャリアを含有する、薬学的組成物。
【請求項２４】
肺塞栓症、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、深静脈血栓症、冠状動脈バイパス手術、および人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術からなる群より選択される状態における血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２５】
肺塞栓症、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、深静脈血栓症、冠状動脈バイパス手術、および人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術からなる群より選択される状態における血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項５に記載の抗体。
【請求項２６】
肺塞栓症、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、深静脈血栓症、冠状動脈バイパス手術、および人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術からなる群より選択される状態における血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項１５に記載の抗体。
【請求項２７】
バルーン血管形成術、冠状動脈内じゅく腫切除術およびレーザー血管形成術により行なわれる血管形成術手順からなる群より選択される手順において、血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２８】
バルーン血管形成術、冠状動脈内じゅく腫切除術およびレーザー血管形成術により行なわれる血管形成術手順からなる群より選択される手順において、血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項５に記載の抗体。
【請求項２９】
バルーン血管形成術、冠状動脈内じゅく腫切除術およびレーザー血管形成術により行なわれる血管形成術手順からなる群より選択される手順において、血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項１５に記載の抗体。
【請求項３０】
血栓形成の障害を処置または予防するために、被験体を処置する方法であって、該障害が、肺塞栓症、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、深静脈血栓症、冠状動脈バイパス手術、人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術における血栓症からなる群より選択され、該方法は、所望の処置を達成するために有効な量の請求項１に記載のペプチドを該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３１】
血栓形成の障害を処置または予防するために、被験体を処置する方法であって、該障害が、肺塞栓症、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、深静脈血栓症、冠状動脈バイパス手術、人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術における血栓症からなる群より選択され、該方法は、所望の処置を達成するために有効な量の請求項５に記載の抗体を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【請求項３２】
血栓形成の障害を処置または予防するために、被験体を処置する方法であって、該障害が、肺塞栓症、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、深静脈血栓症、冠状動脈バイパス手術、人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術における血栓症からなる群より選択され、該方法は、所望の処置を達成するために有効な量の請求項１５に記載の抗体を該被験体に投与する工程を包含する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の技術分野）
本発明の分野は、血小板凝集である。より具体的には、本発明は、インテグリン特異的抗体およびペプチド、および血小板凝集を阻害するためのそれら化合物の使用に関係する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
インテグリンαＩＩｂβ３阻害剤は、血小板インテグリンαＩＩｂβ３へのフィブリノーゲンの結合を阻害し、それによって血小板血栓の形成に必須の血小板−血小板相互作用を阻害する、新規種類の抗血栓症薬である（非特許文献１；非特許文献２）。インテグリンαＩＩｂβ３阻害剤は、非ＳＴ上昇型急性冠症候群を有する患者、および経皮的冠動脈形成術を受ける患者の管理に使用される（非特許文献３）。これら阻害剤の中で、アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ、Ｃｅｎｔｏｃｏｒ，Ｉｎｃ．、Ｍａｌｖｅｒｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ、およびＥｌｉ  Ｌｉｌｌｙ＆Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄｉａｎａ）（非特許文献２）、エプチフィバチド（ＩＮＴＥＧＲＩＬＩＮ、ＣＯＲ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．、Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、およびＫｅｙ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｋｅｎｉｌｗｏｒｔｈ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）（非特許文献４、非特許文献５）、およびチロフィバン（Ａｇｇｒａｓｔａｔ、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．，Ｉｎｃ．、Ｗｈｉｔｅｈｏｕｓｅ  Ｓｔａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ）（非特許文献６）が、米国において臨床的に認可されている。最初に認可され、そして最も広く使用されている薬剤であるアブシキシマブは、マウス可変ドメインおよびヒト定常ドメインを有するキメラＦａｂである。それは、リガンド結合領域に隣接するエピトープに結合し、そして空間的な妨害によってフィブリノーゲンの結合を阻害する。アブシキシマブは、インテグリンαｖβ３およびαＭβ２と交差反応することが報告された（非特許文献５）。他方、エプチフィバチドおよびチロフィバンは、インテグリンのＲＧＤリガンド相互作用部位に結合する小分子薬剤であり、そしてαＩＩｂβ３特異的である。それらは、アブシキシマブより低い親和性およびはるかに短い循環半減期を示した（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。
【０００３】
急性血小板減少症は、インテグリンαＩＩｂβ３阻害剤による治療の認識された合併症である。血小板減少症は、しばしば重篤であり（５０×１０９／Ｌより少ない血小板）、最初にアブシキシマブを投与された患者の０．５％から１％（非特許文献８；非特許文献９；非特許文献１０）、および２回目投与後の患者の４％に起こる（非特許文献１１；非特許文献１２）。チロフィバンの臨床試験において、発生率は０．１％から０．５％の範囲であり、それは薬剤を投与されていない患者において見られる発生率のわずか２倍である（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５）。エプチフィバチドのＰＵＲＳＵＩＴトライアルにおいて、発生率は、研究薬剤を投与された患者において、プラセボを投与された患者とほぼ同じであった（非特許文献１６）。エプチフィバチドを投与された患者の少数のサブセットのみが、重篤な、未解明の血小板減少症を起こした（非特許文献１６）。インテグリンαＩＩｂβ３阻害剤によって誘発される血小板減少症の原因は未知であるが、最近、おそらくアブシキシマブとの最初の接触によって誘導された、アブシキシマブのマウス可変ドメインに対するヒト抗体が、アブシキシマブを２回目に投与された後に重篤な血小板減少症を起こした患者における血小板破壊の原因であったことが報告された（非特許文献１７）。
【０００４】
インテグリンαＶβ３、αＶβ５、αＩＩｂβ３およびα５β１は、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）トリペプチドを含む様々な接着タンパク質に結合する。この特徴を利用して、６つの無作為化残基にはさまれた、ＨＣＤＲ３におけるＲＧＤモチーフを含む、接着タンパク質を模倣する合成ヒトｍＡｂが、ファージディスプレイによる抗体ライブラリーから選択された（非特許文献１８）。これら抗体のうち最も強力なＦａｂ−９は、インテグリンαＶβ５およびα５β１よりほとんど１０００倍良くインテグリンαＶβ３に結合する。しかし、Ｆａｂ−９を含む選択された抗体のいずれも、２つのβ３インテグリン、αＶβ３およびαＩＩｂβ３を区別しなかった。従って、モチーフ最適化ライブラリーを産生して、Ｆａｂ−９のＨＣＤＲ３におけるＲＧＤモチーフに対するさらなるラウンドの遺伝子操作および選択が、インテグリンαＶβ３またはαＩＩｂβ３のいずれかに関して特異性を有する抗体を産生し得るかどうか決定した（非特許文献１９）。多くの選択された抗体がインテグリンαＶβ３またはインテグリンαＩＩｂβ３のいずれかにいくらかの選択性を示したが、全ての抗体は依然として両方のインテグリンに結合した。選択された抗体の大部分は、コンセンサス配列（Ｋ／Ｒ）ＸＤを有していた。興味深いことに、ＲＧＤモチーフの中央の位置は、任意性が高いことが判明した。Ｇｌｙは、Ｖａｌ、Ａｌａ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、およびＴｒｐによって置換され得ることが見出された（非特許文献１９）。
【非特許文献１】Ｔｏｐｏｌ，Ｅ．Ｊ．、Ｂｙｚｏｖａ，Ｔ．Ｖ．、およびＰｌｏｗ，Ｅ．Ｆ．、「Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ  ｂｌｏｃｋｅｒｓ」、１９９９年、Ｌａｎｃｅｔ  第３５３巻、ｐ．２２７−２３１
【非特許文献２】Ｃｏｌｌｅｒ，Ｂ．Ｓ．、「Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ：ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ａｎｔｉ−ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．」、１９９７年、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、第９９巻、ｐ．１４６７−１４７１
【非特許文献３】Ｐｒｏｉｍｏｓ，Ｇ．、「Ｐｌａｔｅｌｅｔ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ−ＩＩＩａ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ．」、２００１年、Ｊ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｔｈｒｏｍｂｏｌｙｓｉｓ、第１１巻、ｐ．９９−１１０
【非特許文献４】Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｄ．Ｒ．およびＳｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｍ．、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ」、１９９７年、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、第８０巻、ｐ．１１Ｂ−２０Ｂ
【非特許文献５】Ｓｃａｒｂｏｒｏｕｇｈ，Ｒ．Ｍ．、「Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｅｐｔｉｆｉｂａｔｉｄｅ．」、１９９９年、Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ、第１３８巻、ｐ．１０９３−１１０４
【非特許文献６】Ｖｉｃｋｅｒｓ、Ｓ．、Ｔｈｅｏｈａｒｉｄｅｓ，Ａ．Ｄ．、Ａｒｉｓｏｎ，Ｂ．、Ｂａｌａｎｉ，Ｓ．Ｋ．、Ｃｕｉ，Ｄ．、Ｄｕｎｃａｎ，Ｃ．Ａ．、Ｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｄ．、Ｇｏｒｈａｍ，Ｌ．Ｍ．、Ｐｏｌｓｋｙ，Ｓ．Ｌ．、Ｐｒｕｅｋｓａｒｉｔａｎｏｎｔ，Ｔ．、Ｒａｍｊｉｔ，Ｈ．Ｇ．、Ｓｌａｕｇｈｔｅｒ，Ｄ．Ｅ．、およびＶｙａｓ，Ｋ．Ｐ．、「Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｓｔｕｄｉｅｓ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｏｆ  ｔｉｒｏｆｉｂａｎ．」、１９９９年、Ｄｒｕｇ  Ｍａｔａｂ  Ｄｉｓｐｏｓ、第２７巻、ｐ．１３６０−１３６６
【非特許文献７】ＭｃＣｌｅｌｌａｎ，Ｋ．Ｊ．およびＧｏａ，Ｋ．Ｌ．、「Ｔｉｒｏｆｉｂａｎ．Ａ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅｓ．」、１９９８年、Ｄｒｕｇｓ、第５６巻、ｐ．１０６７−１０８０
【非特許文献８】Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．、Ｓａｎｅ，Ｄ．Ｃ．、Ｓｉｇｍｏｎ，Ｋ．Ｎ．、Ｓｈａｖｅｎｄｅｒ．Ｊ．Ｈ．、Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．、Ｔｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｅ．、Ｔｏｐｏｌ，Ｅ．Ｊ．およびＣａｌｉｆｆ，Ｒ．Ｍ．、「Ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  ａ  ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ｒｉｓｋ  ｐｒｅｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｒｅｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ．Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃ７Ｅ３  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｃｏｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  （ＥＰＩＣ）  Ｓｔｕｄｙ  Ｇｒｏｕｐ」、１９９８年、Ｊ  Ａｍ  Ｃｏｌｌ  Ｃａｒｄｉｏｌ、第３２巻、ｐ．３１１−３１９
【非特許文献９】Ｊｕｂｅｌｉｒｅｒ，Ｓ．Ｊ．、Ｋｏｅｎｉｇ，Ｂ．Ａ．およびＢａｔｅｓ，Ｍ．Ｃ．、「Ａｃｕｔｅ  ｐｒｏｆｏｕｎｄ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  Ｃ７Ｅ３  Ｆａｂ（Ａｂｃｉｘｉｍａｂ）ｔｈｅｒａｐｙ：ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｓ，ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｙ」、１９９９年、Ａｍ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ、第６１巻、ｐ．２０５−２０８
【非特許文献１０】Ｋｅｒｅｉａｋｅｓ，Ｄ．Ｊ．、Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．、Ｌｉｎｃｏｆｆ，Ａ．Ｍ．、Ｔｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｅ．、Ｗｏｌｓｋｉ，Ｋ．、Ａｃｈｅｎｂａｃｈ，Ｒ．、Ｍｅｌｓｈｅｉｍｅｒ，Ｒ．、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｋ．、Ｃａｌｉｆｆ，Ｒ．Ｍ．およびＴｏｐｏｌ，Ｅ．Ｊ．、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｃｏｒｒｅｌａｔｅｓ  ａｎｄ  ｃｏｕｒｓｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｄｕｒｉｎｇ  ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｒａ  ｏｆ  ａｂｃｉｘｉｍａｂ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ  ｂｌｏｃｋａｇｅ．」、２０００年、Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ、第１４０巻、ｐ．７４−８０
【非特許文献１１】Ｍａｄａｎ，Ｍ．、Ｋｅｒｅｉａｋｅｓ，Ｄ．Ｊ．、Ｈｅｒｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｂ．、Ｒｕｎｄ，Ｍ．Ｍ．、Ｔｕｄｏｒ．Ｇ．、Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．、ＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｍ．Ｂ．、Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．、Ｓｋｅｔｃｈ，Ｍ．Ｈ．，Ｊｒ．、Ｐｈｉｌｌｉｐｓ，Ｈ．Ｒ．，３ｒｄおよびＴｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｅ．、「Ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｂｃｉｘｉｍａｂ  ｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｉｎｔｅｒｖｅｎｔｉｏｎ．」、２０００年、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、第８５巻、ｐ．４３５−４４０
【非特許文献１２】Ｔｃｈｅｎｇ，Ｊ．Ｅ．、Ｋｅｒｅｉａｋｅｓ，Ｄ，Ｊ．、Ｂｒａｄｅｎ，Ｇ．Ａ．、Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．、Ｍａｓｃｅｌｌｉ，Ｍ．Ａ．、Ｌａｎｇｒａｌｌ，Ｍ．Ａ．およびＥｆｆｒｏｎ，Ｍ．Ｂ．、「Ｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｂｃｉｘｉｍａｂ：ｉｎｔｅｒｉｍ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＲｅｏＰｒｏ  ｒｅａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｒｅｇｉｓｔｒｙ．」、１９９９年、Ａｍ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ、第１３８巻、ｐ．Ｓ３３−３８
【非特許文献１３】ＲＥＳＴＯＲＥ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ、「Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｒｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｗｉｔｈ  ｔｉｒｏｆｉｂａｎ  ｏｎ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ｅｖｅｎｔｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ａｎｇｉｎａ  ｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ  ｕｎｄｅｒｇｏｉｎｇ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ａｎｇｉｏｐｌａｓｔｙ．」、１９９７年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第９６巻、ｐ．１４４５−１４５３
【非特許文献１４】Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ（ＰＲＩＳＭ）Ｓｔｕｄｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ、「Ａ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ａｓｐｉｒｉｎ  ｐｌｕｓ  ｔｉｒｏｆｉｂａｎ  ｗｉｔｈ  ａｓｐｉｒｉｎ  ｐｌｕｓ  ｈｅｐａｒｉｎ  ｆｏｒ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ａｎｇｉｎａ」、１９９８年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、第３３８巻、ｐ．１４９８−１５０５
【非特許文献１５】Ｐｌａｔｅｌｅｔ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｉｓｃｈｅｍｉｃ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ  ｉｎ  Ｐａｔｉｅｎｔｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｕｎｓｔａｂｌｅ  Ｓｉｇｎｓ  ａｎｄ  Ｓｙｍｐｔｏｍｓ（ＰＲＩＳＭ−ＰＬＵＳ）Ｓｔｕｄｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒｓ、「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｗｉｔｈ  ｔｉｒｏｆｉｂａｎ  ｉｎ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ａｎｇｉｎａ  ａｎｄ  ｎｏｎ−Ｑ−ｗａｖｅ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．」、１９９８年、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、第３３８巻、ｐ．１４８８−１４９７
【非特許文献１６】ＭｃＣｌｕｒｅ，Ｍ．Ｗ．、Ｂｅｒｋｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｄ．、Ｓｐａｒａｐａｎｉ，Ｒ．、Ｔｕｔｔｌｅ，Ｒ．、Ｋｌｅｉｍａｎ，Ｎ．Ｓ．、Ｂｅｒｄａｎ，Ｌ．Ｇ．、Ｌｉｎｃｏｆｆ，Ａ．Ｍ．、Ｄｅｃｋｅｒｓ，Ｊ．、Ｄｉａｚ，Ｒ．、Ｋａｒｓｃｈ，Ｋ．Ｒ．、Ｇｒｅｔｌｅｒ，Ｄ．、Ｋｉｔｔ，Ｍ．、Ｓｉｍｏｏｎｓ，Ｍ．、Ｔｏｐｏｌ，Ｅ．Ｊ．、Ｃａｌｉｆｆ，Ｒ．Ｍ．およびＨａｒｒｉｎｇｔｏｎ，Ｒ．Ａ．、「Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ｄｕｒｉｎｇ  ａ  ｎｏｎ−ＳＴ−ｅｌｅｖａｔｉｏｎ  ａｃｕｔｅ  ｃｏｒｏｎａｒｙ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ．Ｔｈｅ  ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎ  ＩＩｂ／ＩＩＩａ  ｉｎ  ｕｎｓｔａｂｌｅ  ａｎｇｉｎａ：ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎｔｅｇｒｉｌｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  （ＰＵＲＳＵＩＴ）ｔｒｉａｌ  ｅｘｐｅｒｉｅｎｃｅ」、１９９９年、Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ、第９９巻、ｐ．２８９２−２９００
【非特許文献１７】Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂ．Ｒ．、Ｓｗｙｅｒｓ，Ｊ．、Ｄｉｖｇｉ，Ａ．、ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｊ．Ｇ．およびＡｓｔｅｒ，Ｒ．Ｈ．、「Ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉａ  ａｆｔｅｒ  ｓｅｃｏｎｄ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ｔｏ  ａｂｃｉｘｉｍａｂ  ｉｓ  ｃａｕｓｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｅ  ａｂｃｉｘｉｍａｂ−ｃｏａｔｅｄ  ｐｌａｔｅｌｅｔｓ．」、２００２年、Ｂｌｏｏｄ、９９、２０５４−２０５９
【非特許文献１８】Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｌａｎｇｕｉｎｏ，Ｌ．Ｒ．およびＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．、「Ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｅｌｆ−ｒｅａｃｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ：ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｇｒｉｎ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ．」、１９９３年、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ、第９０巻、ｐ．１０００３−１０００７
【非特許文献１９】Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．、Ｈｕ，Ｄ．、Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔ，Ａ．、Ｐｉｎｚ−Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｓ．およびＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、「Ｂｕｉｌｄｉｎｇ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ａｄｈｅｓｉｖｅ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｆｏｒ  ｉｎｔｅｇｒｉｎｓ．」、１９９４年、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ、第２６９巻、ｐ．３２７８８−３２７９５
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
（発明の簡単な概要）
１つの好ましい実施態様において、本発明は、血小板凝集の単離および精製されたペプチド阻害剤であり、そのペプチドは９から約５０アミノ酸残基を含み、そして配列番号４、５、６、および７からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を有する。好ましい実施態様において、そのペプチドは配列番号５−７のいずれかのアミノ酸残基配列を含む。別の好ましい実施態様において、そのペプチドは、配列番号５−７のいずれかから成る。より好ましい実施態様において、そのペプチドは本質的に配列番号５−７のいずれかから成る。
【０００６】
別の実施態様において、本発明は、インテグリンαＩＩｂβ３と特異的に免疫反応し、そして配列番号８、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を含む抗体を企図し、ここでそのアミノ酸残基配列は、抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）内である。好ましい実施態様において、その抗体の相補性決定領域は、抗体の重鎖に位置する。より好ましい実施態様において、その抗体の相補性決定領域は、ＨＣＤＲ３である。
【０００７】
さらに別の実施態様において、その抗体は、本明細書中でＲＡＤ３、ＲＡＤ４、ＲＡＤ９、ＲＡＤ１１、ＲＡＤ１２、ＲＡＤ３２、ＲＡＤ３４、ＲＡＤ８７、またはＲＡＤ８８と呼ばれる抗体からなる群から選択され、そしてそれはインテグリンαＩＩｂβ３と免疫反応性を有する。好ましい実施態様において、その抗体はヒト抗体である。
【０００８】
またさらなる実施態様において、本発明は、インテグリンαＩＩｂβ３と免疫反応性を有する抗体を企図する。
【０００９】
本発明はまた、本発明の抗体、免疫グロブリン、およびペプチドを使用する方法を企図する。１つの実施態様において、その方法は、配列番号４、５、６、および７からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を有する、有効な阻害量のペプチドと血小板を接触させることを含む、血小板凝集を阻害する方法である。
【００１０】
さらなる実施態様において、その方法は、インテグリンαＩＩｂβ３と特異的に免疫反応し、そして配列番号８、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を含み、ここでそのアミノ酸残基配列は抗体の相補性決定領域内である、有効な阻害量の抗体と血小板を接触させることを含む、血小板凝集を阻害する方法である。
【００１１】
本発明はまた、配列番号４、５、６および７からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を有する、有効な阻害量のペプチドと血小板を接触させることを含む、フィブリノーゲンの血小板への結合を阻害する方法を企図する。
【００１２】
本発明はまたさらに、インテグリンαＩＩｂβ３と特異的に免疫反応し、そして配列番号８、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１からなる群から選択されるアミノ酸残基配列を含み、ここでそのアミノ酸残基配列は抗体の相補性決定領域内である、有効な阻害量の抗体と血小板を接触させることを含む、血小板凝集を阻害する方法を企図する。
【００１３】
本発明はまたさらに、インテグリンαＩＩｂβ３結合活性を有する抗体を企図し、ここでその結合は別のタンパク質の結合活性と競合し、その他のタンパク質はトリペプチドモチーフＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＲＡＤ）のアミノ酸残基配列を含み、そしてここでその結合は標準的な競合アッセイにおいて行われる。さらなる実施態様において、そのタンパク質は別の抗体であり、その他の抗体は、他の抗体の相補性決定領域内にアミノ酸残基配列を含み、ここでそのアミノ酸配列は、配列番号８、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１からなる群から選択され、そしてここでその結合は標準的な競合アッセイにおいて行われる。
【００１４】
本発明のさらなる実施態様は、静脈内、動脈内、リンパ循環、腹腔内、経皮、皮下、筋肉内、関節空間への投与、または肺投与による投与に適当な形式で、血小板凝集のペプチド阻害剤および適当な医薬品キャリアを含む医薬品組成物を企図する。またさらなる実施態様は、インテグリンαＩＩｂβ３と特異的に免疫反応する抗体および適当な医薬品キャリアを含む医薬品組成物を企図する。
【００１５】
本発明のさらなる実施態様は、肺塞栓、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、深部静脈血栓症、冠動脈バイパス手術、および自己、非自己、または合成血管の移植におけるプロテーゼ弁または血管を挿入する手術からなるグループから選択される状態において血栓症を予防するための治療薬として、血小板凝集のペプチド阻害剤を使用することを企図する。さらなる実施態様は、血栓症を予防する治療薬として、インテグリンαＩＩｂβ３と特異的に免疫反応する抗体を使用することを企図する。
【００１６】
別の実施態様において、血小板凝集のペプチド阻害剤を、バルーンによって行われる血管形成手順、冠動脈アテレクトミー、およびレーザー血管形成術からなる群から選択される手順において血栓症を予防する治療薬としても使用し得る。さらなる実施態様において、インテグリンαＩＩｂβ３と特異的に免疫反応する抗体を、血栓症を予防する治療薬として使用する。
【００１７】
本発明はまた、血栓形成の異常、肺塞栓症、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、深部静脈血栓症、冠動脈バイパス手術、自己、非自己、または合成血管の移植におけるプロテーゼ弁または血管を挿入する手術からなるグループから選択される異常を治療または予防するために患者を治療する方法を企図し、その方法は望ましい治療を達成するために有効な量の、血小板凝集を阻害する活性を有するペプチドを患者に投与することを含む。本発明のさらなる実施態様は、望ましい治療を達成するために有効な量の、インテグリンαＩＩｂβ３と特異的に免疫反応する抗体を患者に投与することを含む、血栓形成の異常を治療または予防するために患者を治療する方法を企図する。
【００１８】
１つの局面において、本発明は、血小板凝集の、単離および精製されたペプチド阻害剤を提供する。そのペプチドは、９から約５０アミノ酸残基、およびＶ（Ｖ／Ｗ）ＣＲＡＤ（Ｋ／Ｒ）ＲＣに対応するアミノ酸残基配列（配列番号４、５、６、および７によって例示される）を有する。そのペプチドは、好ましくは配列番号５−７のいずれかのアミノ酸残基配列を含み、そしてより好ましくは配列番号５−７のいずれかのアミノ酸残基配列を有する。
【００１９】
別の局面において、本発明は、インテグリンαＩＩｂβ３と特異的に免疫反応する抗体を提供する。その抗体は、抗体の相補性決定領域内に、アミノ酸残基配列Ｖ（Ｒ／Ｇ）Ｖ（Ｖ／Ｗ）ＣＲＡＤ（Ｒ／Ｋ）ＲＣＹＡＭＤＶを含む（配列番号８、２５、２６、２７、２８、２９、３０、および３１によって例示される）。好ましくは、相補性決定領域は抗体の重鎖に位置し、そしてより具体的には、相補性決定領域はＨＣＤＲ３である。その抗体は、最も好ましくはヒト抗体である。典型的なおよび好ましい抗体は、本明細書中でＲＡＤ３、ＲＡＤ４、ＲＡＤ９、ＲＡＤ１１、ＲＡＤ１２、ＲＡＤ３２、ＲＡＤ３４、ＲＡＤ８７、またはＲＡＤ８８と呼ばれる。本発明はまた、ＲＡＤ３、ＲＡＤ４、ＲＡＤ９、ＲＡＤ１１、ＲＡＤ１２、ＲＡＤ３２、ＲＡＤ３４、ＲＡＤ８７、またはＲＡＤ８８のいずれかの免疫反応性を有する抗体を企図する。
【００２０】
さらに別の局面において、本発明は、血小板を、有効な阻害量の本発明のペプチドまたは抗体と接触させる工程を含む、血小板凝集を阻害する方法を提供する。
【００２１】
またさらに別の局面において、本発明は、血小板を、有効な阻害量の本発明のペプチドまたは抗体と接触させる工程を含む、フィブリノーゲンの血小板への結合を阻害する方法を提供する。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２２】
（発明の詳細な説明）
本発明は、インテグリンαＩＩｂβ３と免疫反応する抗体を提供する。その様々な文法形式において抗体という用語は、本明細書中で免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分、すなわち抗体結合部位またはパラトープを含む分子を指して使用される。典型的な抗体分子は、そのままの免疫グロブリン分子、実質的にそのままの免疫グロブリン分子、および当該分野においてＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦ（ｖ）として公知の部分を含む免疫グロブリン分子の一部、単一ドメイン抗体（ｄＡｂ）、フォールディングされた免疫グロブリン構築物、およびその活性な断片である。
【００２３】
本発明の抗体は、当該分野で周知であるように、ファージディスプレイ技術を用いて作成および同定される（例えば、国際特許申請公開ＷＯ９４／１８２２１を参照のこと）。そのような手順の詳細な説明を、以下の実施例において述べる。好ましい抗体は、ヒト抗体である。本発明は、新規にデザインした合成ヒト抗体ライブラリー由来の、インテグリンαＩＩｂβ３特異的ヒトｍＡｂを開示する。まず、以前のライブラリーに存在した２つのシステイン残基をＨＣＤＲ３から除去した。ジスルフィド架橋の除去と共に、ＨＣＤＲ３の長さの減少が、潜在的にＨＣＤＲ３ループにおけるより構造的な柔軟性を可能にする。ジスルフィド架橋の除去は、以前に選択された抗体のＨＣＤＲ３由来のペプチド（ＣＳＦＧＲＧＤＩＲＮＣ）（配列番号１）およびその直線状のバージョンＧＳＦＧＲＧＤＩＲＮＧ（配列番号２）が、リガンド結合アッセイにおいてほとんど同じ有効性を有するという観察によって促進される（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．、Ｈｕ，Ｄ．、Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔ，Ａ．、Ｐｉｎｚ−Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｓ．およびＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ（１９９４）インテグリンの接着リガンドとしての合成抗体の作成。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９、３２７８８−３２７９５）。２番目に、我々は、インテグリン結合コアモチーフとしてＲＧＤよりもＲＡＤを選択し、そして側面領域の６つの残基を無作為化した。ＲＡＤを含むペプチド、ＧＲＡＤＳＰは、ＲＧＤを含むペプチドが試験される実験において、不活性なコントロールペプチドとして広く使用されてきた（Ｗｕ，Ｍ．Ｈ．、Ｕｓｔｉｎｏｖａ，Ｅ．およびＧｒａｎｇｅｒ，Ｈ．Ｊ．（２００１）フィブロネクチンおよびビトロネクチンに対するインテグリンの結合が、単離されたブタ冠細静脈のバリア機能を維持する。Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ５３２、７８５−７９１；Ｓｌｅｐｉａｎ，Ｍ．Ｊ．、Ｍａｓｓｉａ，Ｓ．Ｐ．、Ｄｅｈｄａｓｈｔｉ，Ｂ．、Ｆｒｉｔｚ，Ａ．、およびＷｈｉｔｅｓｅｌｌ，Ｌ．（１９９８）ベータ１インテグリンよりもベータ３インテグリンが、損傷後の平滑筋細胞移動に関わるインテグリン−マトリックス相互作用を支配する。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９７、１８１８−１８２７；Ｇｕｉｌｈｅｒｍｅ，Ａ．、Ｔｏｒｒｅｓ，Ｋ．およびＣｚｅｃｈ，Ｍ．Ｐ．（１９９８）インスリン受容体およびインテグリンアルファ５ベータ１シグナル伝達経路間のクロストーク。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７３、２２８９９−２２９０３；Ｈａｕｔａｎｅｎ，Ａ．、Ｇａｉｌｉｔ，Ｊ．、Ｍａｎｎ，Ｄ．Ｍ．、およびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９８９）ＲＧＤ配列およびその前後関係の修飾の、フィブロネクチン受容体による認識に対する影響。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６４、１４３７−１４４２；Ａｄｄｅｒｌｅｙ，Ｓ．Ｒ．、およびＦｉｔｚｇｅｒａｌｄ，Ｄ．Ｊ．（２０００）糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストは、カスパーゼ−３の活性化によって、ラット心筋細胞においてアポトーシスを誘導する。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５、５７６０−５７６６）。しかし、我々が我々のモチーフ最適化ライブラリーからＲＡＤを選択したという事実（Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．、Ｈｕ，Ｄ．、Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔ��Ａ．、Ｐｉｎｚ−Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｓ．およびＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ（１９９４）インテグリンの接着リガンドとしての合成抗体の作成。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９、３２７８８−３２７９５）は、側面に位置する残基が、ＲＡＤモチーフがインテグリンに結合し得るか否かを決定することを示唆する。我々は、無作為化した側面領域に埋め込まれたＲＡＤモチーフが、インテグリンαＩＩｂβ３に特異的な抗体を選択する可能性を高め得るという仮説を立てた。
【００２４】
ここで我々は、ファージディスプレイを使用して、無作為化ＨＣＤＲ３配列ＶＧＸＸＸＲＡＤＸＸＸＹＡＭＤＶ（配列番号３）に基づく合成ヒト抗体ライブラリーからインテグリンαＩＩｂβ３に特異的なモノクローナル抗体を選択した。選択した抗体は、ＨＣＤＲ３に強力なコンセンサスアミノ酸配列（Ｖ（Ｖ／Ｗ）ＣＲＡＤ（Ｋ／Ｒ）ＲＣ）（配列番号４、５，６および７によって例示される）、およびインテグリンαＩＩｂβ３に対する高い特異性を示したが、インテグリンαＶβ３、αＶβ５、およびα５β１のような他のＲＧＤ結合インテグリンには示さなかった。選択された抗体、およびその配列が選択された抗体のＨＣＤＲ３配列から得られた３つの合成ペプチドＶＷＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号５）、ＶＷＣＲＡＤＫＲＣ（配列番号６）、およびＶＶＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号７）は、エキソビボでインテグリンαＩＩｂβ３およびフィブリノーゲン間の相互作用、および血小板凝集を強力に阻害した。我々の知る限り、これらはインテグリンαＩＩｂβ３に特異的な最初の完全なヒトモノクローナル抗体であり、そして血小板凝集を強力に阻害し得る。
【００２５】
１つの局面において、本発明は、単離および精製された血小板凝集のペプチド阻害剤を提供する。そのペプチドは、９から約５０アミノ酸残基、およびＶ（Ｖ／Ｗ）ＣＲＡＤ（Ｋ／Ｒ）ＲＣに対応するアミノ酸残基配列を有する（配列番号４、５、６および７によって例示される）。そのペプチドは、好ましくは配列番号５−７のいずれかのアミノ酸残基配列を含み、そしてより好ましくは、配列番号５−７のいずれかのアミノ酸残基配列を有する。別の局面において、本発明はインテグリンαＩＩｂβ３と特異的に免疫反応する抗体を提供する。その抗体は、抗体の相補性決定領域内にアミノ酸残基配列Ｖ（Ｒ／Ｇ）Ｖ（Ｖ／Ｗ）ＣＲＡＤ（Ｒ／Ｋ）ＲＣＹＡＭＤＶを含む（配列番号８、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１によって例示される）。好ましくは、相補性決定領域は抗体の重鎖に位置し、そしてより具体的には、相補性決定領域はＨＣＤＲ３である。その抗体は、最も好ましくはヒト抗体である。典型的なおよび好ましい抗体は、本明細書中でＲＡＤ３、ＲＡＤ４、ＲＡＤ９、ＲＡＤ１１、ＲＡＤ１２、ＲＡＤ３２、ＲＡＤ３４、ＲＡＤ８７、またはＲＡＤ８８と呼ばれる。本発明はまた、ＲＡＤ３、ＲＡＤ４、ＲＡＤ９、ＲＡＤ１１、ＲＡＤ１２、ＲＡＤ３２、ＲＡＤ３４、ＲＡＤ８７、またはＲＡＤ８８のいずれかの免疫反応性を有する抗体を企図する。
【００２６】
さらに別の局面において、本発明は、血小板を、有効な阻害量の本発明のペプチドまたは抗体と接触させる工程を含む、血小板凝集を阻害する方法を提供する。
【００２７】
またさらに別の局面において、本発明は、血小板を、有効な阻害量の本発明のペプチドまたは抗体と接触させる工程を含む、フィブリノーゲンの血小板への結合を阻害する方法を提供する。
【００２８】
本発明は、１つの実施態様において、本明細書中で記載したような結合部位を含み、そして前もって選択した標的分子に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体を記載する。本発明はまた、その抗体を産生する細胞系統、その細胞系統を産生する方法、およびヒトモノクローナル抗体を産生する方法を記載する。
【００２９】
ファージミド粒子上の本発明のディスプレイタンパク質が、好ましい実施態様において、免疫グロブリン重鎖または軽鎖および線状のファージ膜アンカー間の融合タンパク質である限り、ディスプレイタンパク質は事実上、結合部位が導入された、遺伝子操作された免疫グロブリン重鎖または軽鎖であることが理解される。さらに、多くの実施態様において、ディスプレイタンパク質の発現を、１つまたは他方が膜アンカーとの融合タンパク質である、免疫グロブリン重鎖または軽鎖ペプチド間に形成されたヘテロダイマーとして、ファージミド表面に調製する。従って、融合タンパク質として重鎖が使用される場合、好ましい実施態様におけるディスプレイタンパク質は、軽鎖と会合した、アンカーで固定された重鎖を有するＦａｂ断片を含む。
【００３０】
本発明はまた、１つの実施態様において、本明細書中で記載したような結合部位を含むヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを記載し、そしてそのヒトモノクローナル抗体は、前もって選択した標的分子と特異的に結合する。ヒトモノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチドを配列決定して、ポリヌクレオチド配列を同定し得る。ＤＮＡ配列決定の方法は、当該分野で周知であり、そして本発明の実施態様のいずれかを実施するために使用し得る。その方法は、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、ＳＥＱＵＥＮＡＳＥ（ＵＳ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、熱安定性のＴ７ポリメラーゼ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ  ＮＪ）、またはポリメラーゼの組み合わせ、およびＥＬＯＮＧＡＳＥ増幅システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、Ｍｄ．）において見出されるもののようなプルーフリーディングエキソヌクレアーゼのような酵素を採用し得る。好ましくは、配列の調製は、Ｈａｍｉｌｔｏｎ  ＭＩＣＲＯＬＡＢ２２００（Ｈａｍｉｌｔｏｎ、Ｒｅｎｏ  Ｎｅｖ．）、Ｐｅｌｔｉｅｒ  サーマルサイクラー２００（ＰＴＣ２００；ＭＪ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｗａｔｅｒｔｏｗｎ  Ｍａｓｓ．）およびＡＢＩ  ＣＡＴＡＬＹＳＴ８００（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）のような機械を用いて自動化する。次いでＡＢＩ３７３または３７７ＤＮＡ配列決定システム（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）、ＭＥＧＡＢＡＣＥ１０００  ＤＮＡ配列決定システム（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ  Ｃａｌｉｆ．）、または当該分野で公知の他のシステムのいずれかを用いて、配列決定を行う。出てきた配列を、当該分野で周知の様々なアルゴリズムを用いて分析する。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．（１９９７）Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．、単元７．７；Ｍｅｙｅｒｓ，Ｒ．Ａ．（１９９５）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｗｉｌｅｙ  ＶＣＨ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  Ｎ．Ｙ．、８５６−８５３頁を参照のこと。）
本発明のモノクローナル抗体を産生する細胞系統の調製を、本明細書中でさらに詳細に記載し、そして本明細書中で記載したファージミドベクター突然変異生成方法を用いて、および結合部位が導入されたことを示す、関心のあるモノクローナル抗体の基本的な結合パターンの決定を可能にする、日常的なスクリーニング技術を用いて達成し得る。従って、試験されるヒトモノクローナル抗体が前もって選択された標的分子に結合するなら、その試験されるヒトモノクローナル抗体、および本発明の細胞系統によって産生されるヒトモノクローナル抗体は、同等であると考えられる。
【００３１】
過剰な実験無しに、前者が、後者が前もって選択した標的分子に結合することを阻害するかどうかを確かめることによって、ヒトモノクローナル抗体が、本発明のヒトモノクローナル抗体と同じ（すなわち同等の）特異性を有するかどうかを決定することも可能である。固相に存在する場合、標的分子への結合に関する標準的な競合アッセイにおいて、本発明のヒトモノクローナル抗体による結合の減少によって示されるように、試験されるヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体と競合するなら、２つのモノクローナル抗体は同じ、または密接に関連したエピトープに結合する可能性が高い。
【００３２】
ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体またはペプチドの特異性を有するかどうかを決定するさらに別の方法は、本発明のヒトモノクローナル抗体またはペプチドを、それが通常反応性の標的分子とプレインキュベートし、そして次いで試験されるヒトモノクローナル抗体を加えて、試験されるヒトモノクローナル抗体がその標的分子に結合する能力において阻害されるかどうかを決定することである。もし試験されるヒトモノクローナル抗体が阻害されるなら、おそらく、それは本発明のモノクローナル抗体またはペプチドと同じ、または機能的に同等のエピトープ特異性を有する。
【００３３】
ヒトモノクローナル抗体が本発明のヒトモノクローナル抗体の特異性を有するかどうかを決定するさらなる方法は、問題の抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）のアミノ酸残基配列を決定することである。そのＣＤＲ領域において同一の、または機能的に同等のアミノ酸残基配列を有する抗体分子は、同じ結合特異性を有する。ペプチドを配列決定する方法は、当該分野において周知である。
【００３４】
抗体の免疫特異性、その標的分子結合能力、およびその抗体がエピトープに対して示す付随（ａｔｔｅｎｄａｎｔ）親和性は、その抗体が免疫反応するエピトープによって規定される。エピトープ特異性は、少なくとも部分的には、免疫グロブリン抗体の重鎖の可変領域のアミノ酸残基配列によって、そして部分的には軽鎖可変領域アミノ酸残基配列によって規定される。
【００３５】
特に好ましいのは、Ｅ．ｃｏｌｉ微生物または真菌微生物またはハイブリドーマ細胞によって産生される、または本明細書中でさらに記載されるようにプラスミドベクターによって産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を有するヒトモノクローナル抗体である。ペプチド、ポリペプチド、タンパク質および抗体を産生するそのような方法は、当該分野で周知である。「〜の結合特異性を有する」という用語の使用は、同等のモノクローナル抗体は、同じまたは同様の免疫反応（結合）特徴を示し、そして前もって選択した標的分子への結合に関して競合することを示す。
【００３６】
「保存的変異」という用語はまた、置換ペプチドを有する抗体も前もって選択した標的分子に結合するなら、未置換の親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用を含む。同様に、本発明の別の好ましい実施態様は、上記で述べた重鎖および／または軽鎖ペプチドをコードするポリヌクレオチド、およびこれらのポリヌクレオチド配列に相補的なポリヌクレオチド配列に関連する。相補的なポリヌクレオチド配列は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で本発明のポリヌクレオチド配列とハイブリダイズする配列を含む。
【００３７】
ヒトモノクローナル抗体は、特にそれらをヒトにおいて治療的に使用し得るなら、マウスモノクローナル抗体に対して特に利点を提供する。具体的には、ヒト抗体は、「外来性」抗原と同じくらい迅速に循環から除去されず、そして外来性抗原および外来性抗体と同じ方式では免疫系を活性化しない。
【００３８】
本発明は、１つの実施態様において、本方法によって産生された本発明のモノクローナル抗体を企図する。
【００３９】
別の好ましい実施態様において、本発明は、本発明のヒトモノクローナル抗体由来のＦａｂ断片を含む、短縮免疫グロブリン分子を企図する。Ｆｃ受容体を欠くＦａｂ断片は、可溶性であり、そして血清半減期において治療的利点を、そして可溶性Ｆａｂ断片を使用する方法において診断的利点を提供する。可溶性Ｆａｂ断片の調製は、一般的に免疫学分野において公知であり、そして様々な方法によって達成し得る。可溶性Ｆａｂ断片を産生する好ましい方法を、本明細書中で記載する。
【００４０】
好ましくは、本発明の抗体は、インテグリンαＩＩｂβ３と特異的に免疫反応する。すなわち、抗体は、他のインテグリンと比較して、インテグリンαＩＩｂβ３に対して優先的な結合を示す。典型的および好ましい抗体が本明細書中で開示され、そしてＲＡＤ３、ＲＡＤ４、ＲＡＤ９、ＲＡＤ１１、ＲＡＤ１２、ＲＡＤ３２、ＲＡＤ３４、ＲＡＤ８７、またはＲＡＤ８８と呼ばれる。それら抗体のＶＨ領域のアミノ酸残基配列を、図６で述べる。
【００４１】
特に好ましいヒトモノクローナル抗体は、対で（Ｈ：Ｌ）重鎖（Ｈ）および軽鎖（Ｌ）免疫グロブリン可変領域アミノ酸残基配列を有するモノクローナル抗体の免疫反応（結合）特異性を有するものであり、ここで軽鎖は本明細書中で記載された軽鎖であり、そして重鎖は図６の引用された配列の１つおよびその保存的置換を有する。
【００４２】
保存的置換は、アミノ酸配列の少なくとも１つの残基が除去され、そして異なる残基がその場所に挿入されたものである。そのような置換は、タンパク質の活性を維持することが望ましい場合に、一般的に表２に従って行われる。表２は、タンパク質においてアミノ酸を置換し得る、そして典型的には保存的置換と考えられるアミノ酸を示す。
【００４３】
【化１】
2008501305.tif 000003
（ａ）例えばシートまたはらせんコンフォメーションとしての、置換の領域におけるポリペプチドバックボーンの構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖の大きさを維持することに対するその影響がより有意に異なる残基を選択することによって、表２におけるものよりも保存的でない置換を選択し得る。一般的にタンパク質の性質において最も大きな変化を引き起こすことが予測される置換は、（ａ）親水性残基、例えばセリン、スレオニンを、疎水性残基、例えばロイシン、イソロイシン、フェニルアラニン、バリン、またはアラニンと（またはそれによって）置換する；（ｂ）システインまたはプロリンを、あらゆる他の残基と（またはそれによって）置換する；（ｃ）正に帯電した側鎖を有する残基、例えばリシン、アルギニン、またはヒスチジンを、負に帯電した残基、例えばグルタミン酸またはアスパラギン酸と（またはそれによって）置換する；または（ｄ）大きな側鎖を有する残基、例えばフェニルアラニンを、側鎖を有さないもの、例えばグリシンと（またはそれによって）置換するものである。
【００４４】
ラジオイムノアッセイ技術と組み合わせたスキャッチャード分析のような様々な方法を使用して、インテグリンに対する抗体の親和性を評価し得る。親和性は、結合定数Ｋａとして表され、それは平衡状態下でのフリーの抗原およびフリーの抗体のモル濃度で割ったインテグリン−抗体複合体のモル濃度として規定される。複数のインテグリンエピトープに関するその親和性において不均一であるポリクローナル抗体の調製物に関して決定されたＫａは、インテグリンに対するその抗体の平均の親和性、またはアビディティを示す。特定のインテグリンエピトープに対して単一特異的なモノクローナル抗体の調製物に関して決定されたＫａは、親和性の真の尺度を示す。インテグリン−抗体複合体が激しい操作を耐えなければならないイムノアッセイにおいて使用するためには、約１０９から１０１２Ｌ／モルの範囲のＫａを有する高親和性抗体調製物が好ましい。最終的に好ましくは活性な形式でインテグリンの抗体からの解離を必要とする免疫精製および同様の手順において使用するためには、約１０６から１０７Ｌ／モルの範囲のＫａを有する低親和性抗体調製物が好ましい。（Ｃａｔｔｙ，Ｄ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；およびＬｉｄｄｅｌｌ，Ｊ．Ｅ．およびＣｒｙｅｒ，Ａ．（１９９１）Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）
親和性はまた、解離定数またはＫｄとして表され得る。好ましい結合親和性は、１０−６Ｍ、５×１０−７Ｍ、１０−７Ｍ、５×１０−８Ｍ、１０−８Ｍ、５×１０−９Ｍ、１０−９Ｍ、５×１０−１０Ｍ、１０−１０Ｍ、５×１０−１１Ｍ、１０−１１Ｍ、５×１０−１２Ｍ、１０−１２Ｍ、５×１０−１３Ｍ、または１０−１３Ｍより低い解離定数またはＫｄを有するものを含む。
【００４５】
別の局面において、本発明は、血小板凝集を阻害するペプチドを提供する。そのペプチドは、９から約５０アミノ酸残基を有し、そして本発明の抗体由来である。好ましくは、そのペプチドは式Ｖ（Ｖ／Ｗ）ＣＲＡＤ（Ｋ／Ｒ）ＲＣに対応するアミノ酸残基配列を含む（配列番号４、５、６、および７によって例示される）。典型的および好ましいペプチドを、下記の実施例において述べる。
【００４６】
本発明は、本明細書中で記載される治療方法を実施するために有用な治療組成物を企図する。本発明の治療組成物は、活性成分としてその中に溶解または分散した、本明細書中で記載されたようなヒトモノクローナル抗体またはそれ由来のペプチドの少なくとも１つの種とともに、生理学的に許容可能なキャリアを含む。好ましい実施態様において、治療組成物は、治療目的のためにヒト患者に投与された場合に免疫原性ではない。
【００４７】
本明細書中で使用された場合、「薬学的に受容可能な」、「生理学的に許容可能な」という用語およびその文法的なバリエーションは、組成物、キャリア、希釈物、および試薬に言及する場合、交換可能に使用され、そしてその材料が、嘔気、めまい、胃の不調等のような望ましくない生理学的影響を産生することなく、ヒトに投与し得ることを示す。
【００４８】
その中に溶解または分散した活性成分を含む薬理学的組成物の調製は、当該分野においてよく理解されている。典型的には、そのような組成物を、水性または非水性の液体溶液または懸濁液のいずれかとして滅菌注射液として調製するが、使用の前に液体における溶液または懸濁液に適当な固形形式も調製し得る。従って、抗体分子を含む組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放性処方または粉末の形式、または他の組成物形式を取り得る。
【００４９】
活性成分を、薬剤学的に許容可能な、および活性成分と適合性の賦形剤と、そして本明細書中で記載された治療方法において使用するために適当な量で混合し得る。適当な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等およびその組み合わせである。それに加えて、もし望ましいなら、その組成物は、活性成分の有効性を増強する湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝化剤等のような少量の補助物質を含み得る。
【００５０】
本発明の治療組成物は、その中の構成成分の薬剤学的に許容可能な塩を含み得る。薬剤学的に許容可能な塩は、例えば塩酸またはリン酸のような無機酸、または酢酸、酒石酸、マンデル酸等のような有機酸と形成される、酸添加塩（ペプチドのフリーのアミノ基と形成される）を含む。フリーのカルボキシル基と形成される塩も、例えばナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、または水酸化鉄のような無機塩基、およびイソプロピルアミン、トリメチルアミン、２−エチルアミノエタノール、ヒスチジン、プロカイン等のような有機塩基から得ることができる。
【００５１】
生理学的に容認できるキャリアは、当該分野において周知である。液体キャリアの例は、活性成分および水に加えて材料を含まない、または生理学的ｐＨ値でリン酸ナトリウムのような緩衝液、生理食塩水またはリン酸緩衝化生理食塩水のような両方を含む、滅菌水性溶液である。またさらに、水性キャリアは１つ以上の緩衝塩、および塩化ナトリウムおよびカリウムのような塩、デキストロース、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および他の溶質を含み得る。
【００５２】
液体組成物はまた、水に加えて、または水を除いて液体相を含み得る。そのようなさらなる液体相の例は、グリセリン、綿実油のような植物油、オレイン酸エチルのような有機エステル、および水−油エマルションである。
【００５３】
治療組成物は、本発明のヒトモノクローナル抗体を、典型的には全治療組成物の重量あたり少なくとも０．１重量パーセントの抗体の量で含む。重量パーセントは、全組成物に対する抗体の重量による比である。従って、例えば０．１重量パーセントは、１００グラムの全組成物あたり０．１グラムの抗体である。
【００５４】
好ましくは、抗体を含む治療組成物は、典型的には組成物の容積あたり活性成分として１ミリリットル（ｍｌ）あたり約１０マイクログラム（μｇ）から１ｍｌあたり約１００ミリグラム（ｍｇ）の抗体を含み、そしてより好ましくは約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ（すなわち約０．１から１重量パーセント）を含む。
【００５５】
別の実施態様における治療組成物は、本発明のペプチドを、典型的には全治療組成物の重量あたり少なくとも０．１重量パーセントのペプチドの量で含む。重量パーセントは、全組成物に対するペプチドの重量による比である。従って、例えば０．１重量パーセントは、１００グラムの全組成物あたり０．１グラムのペプチドである。
【００５６】
好ましくは、ペプチドを含む治療組成物は、典型的には組成物の容積あたり活性成分として１ミリリットル（ｍｌ）あたり約１０マイクログラム（μｇ）から１ｍｌあたり約１００ミリグラム（ｍｇ）のペプチドを含み、そしてより好ましくは約１ｍｇ／ｍｌから約１０ｍｇ／ｍｌ（すなわち約０．１から１重量パーセント）を含む。
【００５７】
別の局面において、本発明は、本発明の組成物および化合物を用いた治療方法を企図する。ヒト患者においてインビボでヒトモノクローナル抗体を使用する利点を考えると、現在記載される抗体は、その抗体が結合する標的分子の機能をブロックまたは阻害するための治療薬としてインビボで使用するために、特によく適する。本明細書中で記載したモノクローナル抗体由来のペプチドも、本発明の治療方法における使用のために企図される。その方法は、標的分子を含むと考えられる試料を、治療的に有効な量の、標的分子に結合する本発明のヒトモノクローナル抗体またはペプチドを含む組成物と接触させることを含む。
【００５８】
インビボの様相に関して、その方法は、患者に治療的に有効な量の、本発明のヒトモノクローナル抗体またはペプチドを含む生理学的に容認できる組成物を投与することを含む。
【００５９】
本発明のモノクローナル抗体およびペプチドの投与に関する投与量範囲は、標的分子によって媒介される疾患の症状が軽減する望ましい効果を産生するのに十分多いものである。投与量は、過粘稠度症候群、肺水腫、うっ血性心不全等のような、有害な副作用を引き起こすほど多くあるべきではない。一般的に、投与量は、年齢、状態、性別および患者における疾患の程度によって変化し、そして当業者によって決定され得る。投与量を、あらゆる合併症の場合において個々の医師が調節し得る。
【００６０】
本発明の抗体の治療的に有効な量は、典型的には、生理学的に容認できる組成物中で投与した場合に、１ミリリットル（ｍｌ）あたり約０．１マイクログラム（μｇ）から約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌから約５μｇ／ｍｌ、そして通常約５μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するのに十分な抗体の量である。言い換えると、投与量は、毎日１回またはそれ以上の投与で、１日または数日間、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ、最も好ましくは約０．５ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇまで変化し得る。
【００６１】
本発明のペプチドの治療的に有効な量は、典型的には、生理学的に容認できる組成物中で投与した場合に、１ミリリットル（ｍｌ）あたり約０．１マイクログラム（μｇ）から約１００μｇ／ｍｌ、好ましくは約１μｇ／ｍｌから約１０μｇ／ｍｌの血漿濃度を達成するのに十分なペプチドの量である。言い換えると、投与量は、毎日１回またはそれ以上の投与で、１日または数日間、約０．１ｍｇ／ｋｇから約３００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは約０．２ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇまで変化し得る。
【００６２】
本発明のヒトモノクローナル抗体またはペプチドを、注射によって非経口的に、または時間をかけて徐々に注入によって投与し得る。典型的には標的分子には体内で全身投与によって近づき得、そして従って最も多く治療組成物の静脈内投与によって治療されるが、標的とされる組織が標的分子を含む可能性がある場合、他の組織および伝達手段を企図する。従って、本発明のヒトモノクローナル抗体またはペプチドを、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、腔内、経皮的に投与し得、そして蠕動性手段によって伝達し得る。
【００６３】
本発明のヒトモノクローナル抗体またはペプチドを含む治療組成物を、例えば単位投与量の注射によるように、伝統的に静脈内投与する。本発明の治療組成物に関して使用された場合、「単位投与量」という用語は、対象の単位投与量として適当な、物理的に分離した単位を指し、各単位は、必要な希釈剤、すなわちキャリアまたは賦形剤と共に、望ましい治療効果を産生するために計算された、前もって決定された量の活性物質を含む。
【００６４】
組成物は、製剤処方と適合性の方式で、そして治療的に有効な量で投与される。投与される量は、治療される患者、活性成分を利用する患者のシステムの能力、および望ましい治療的効果の程度に依存する。投与される活性成分の正確な量は、医師の判断に依存し、そして各個人に特有である。しかし、全身適用のために適当な投与量範囲が本明細書中で開示され、そして投与経路に依存する。投与の適当なレジメも可変性であるが、最初の投与に続く、引き続く注射または他の投与による、１時間またはそれ以上の間隔での反復投与によって典型的に表される。あるいは、インビボ治療に関して特定された範囲で血中濃度を維持するために十分な持続的静脈内注入が企図される。
【００６５】
抗インテグリンαＩＩｂβ３ヒトモノクローナル抗体またはインテグリンαＩＩｂβ３結合部位を含むそれ由来のペプチドを、インビボまたはインビトロで、血小板に対するインテグリンαＩＩｂβ３の機能を調節するために使用し得る。例えば、ヒトモノクローナル抗体またはペプチドを、薬剤学的に許容可能な組成物において使用し得、それはヒト患者に有効な量で投与された場合、血小板凝集を阻害することができ、そしてそれによって血栓の形成率を減少させる。従って、血小板凝集を阻害する抗インテグリンαＩＩｂβ３ヒトモノクローナル抗体のインビボにおける投与を、凝固および炎症性反応のいくつかのような、血小板の接着によって開始されるあらゆる生理学的反応を調節するためにインビボで使用し得る。
【００６６】
この方法をインビボで実施する場合、生理学的に容認できる希釈剤、およびインテグリンαＩＩｂβ３と免疫反応し、そして血小板凝集を阻害する抗体分子を含む、有効な量の抗体またはペプチド組成物を、哺乳類に静脈内投与し、そして抗体分子が存在するいかなるインテグリンαＩＩｂβ３と免疫反応し、そして免疫反応産物を形成するのを可能にする、およびペプチドを含む結合部位がインテグリンαＩＩｂβ３に結合し、そして正常なリガンドがもはや受容体に結合できないようにペプチド−受容体複合体を形成することを可能にするのに十分な時間、その哺乳類を維持する。
【００６７】
本発明のインテグリンαＩＩｂβ３特異的抗体は、抗血栓治療薬として有用である。その抗体（またはその断片）を使用して、血小板凝集および血栓の形成を阻害し得る。その抗体を使用して、血小板凝集によって引き起こされ、そして血栓の形成または再形成の前に起こり得る環状の流れの変化（ｃｙｃｌｉｃ  ｆｌｏｗ  ｖａｒｉａｔｉｏｎｓ）も阻害し得る。その抗体を、血栓の形成または再形成（再閉塞）が予防されるべき様々な状況において使用し得る。例えば、その抗体を個体（例えば、ヒトのような哺乳類）に投与して、肺塞栓、一過性虚血発作（ＴＩＡ）、深部静脈血栓症、冠血管バイパス手術、プロテーゼ弁または血管を挿入する手術（例えば、自己、非自己または合成血管移植において）における血栓症を予防し得る。本発明の抗体をまた、個体に投与して、バルーンによって行われる血管形成術、冠血管アテレクトミー、レーザー血管形成術、または他の適当な方法における血小板凝集および血栓症を予防し得る。抗体を、血管形成術の前に（血管形成術前）、血管形成術中、または血管形成術後に投与し得る。そのような治療は、血栓症を予防し、そしてそれによって死亡、心筋梗塞、またはＰＴＣＡまたは冠血管バイパス手術を必要とする再発性の虚血性イベントのような、血管形成術後の血栓性合併症の割合を抑制し得る。
【００６８】
血小板の凝集は、凝固カスケードを活性化し、そしてより安定なフィブリン網および閉塞血栓を形成し、それは血栓溶解剤によって溶解し得る。その抗体を単独で、またはプラスミノーゲンアクチベーター（例えば組織プラスミノーゲンアクチベーター、ウロキナーゼ、またはストレプトキナーゼ、組換え組織プラスミノーゲンアクチベーター）のような血栓溶解剤、またはアスピリン、ヘパリン、またはクマリン抗凝固剤（例えばワーファリン）のような抗凝固剤または抗血小板薬と組み合わせて、個体（例えばヒト）に投与して、血栓溶解後に起こり得る再閉塞を予防または抑制し得、そして血栓の溶解を促進し得る。その抗体または断片を、再閉塞を引き起こし得る血小板凝集を予防するために十分な量で、血栓溶解剤または抗凝固剤の投与の前に、それと共に、またはそれに続いて投与し得る。
【００６９】
有効な量（例えば、血小板凝集の阻害、そしてそれによる血栓形成の阻害に十分な量）の抗体または抗体断片を、滅菌生理食塩水のような薬剤学的に許容可能な賦形剤中で、非経口的に、好ましくは静脈内に投与し得る。緩衝化剤を含み得る。その抗体処方は、安定化剤（例えばポリソルベート８０、ＵＳＰ／ＮＦ）のような、さらなる添加物を含み得る。その抗体を、単回投与で、持続的に、または複数回の注入（例えばボーラス注射、続いて持続注入）で投与し得る。あるいは、その抗体を、徐放性メカニズム（例えばポリマーまたはパッチ伝達システムによる）によって、または別の適当な方法によって投与し得る。投与される量は、臨床症状、個体の体重、他の薬剤（例えば血栓溶解剤）を投与するかどうかのような様々な因子に依存する。
【００７０】
本発明のインテグリンαＩＩｂβ３特異的免疫グロブリンはまた、血栓のイメージングにも有用である。この目的のためには、抗体断片が一般的に好ましい。上記で記載したように、キメラ重鎖遺伝子を短縮形式でデザインし、免疫シンチグラフィーイメージングのために、キメラ免疫グロブリン断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ’、またはＦ（ａｂ’）２）を産生し得る。これらの分子を、直接または結合したＤＴＰＡのようなキレート化剤を介してのいずれかで、１３１ヨウ素、１２５ヨウ素、９９テクネチウム、または１１１インジウムのような放射性同位体で標識して、放射性免疫シンチグラフィー剤を産生し得る。あるいは、放射性金属結合（キレート化）ドメインを、キメラ抗体部位に遺伝子操作して、標識の部位を提供し得る。従って、免疫グロブリンを、非ヒト血小板特異的可変領域、ヒト定常領域（好ましくは短縮されている）、およびメタロチオネインのような金属結合タンパク質由来の金属結合ドメインを有するタンパク質としてデザインし得る。
【００７１】
インテグリンαＩＩｂβ３特異的免疫グロブリンを、血栓を有すると疑われる患者に投与する。標識免疫グロブリンが血栓部位に局在化するのを可能にするのに十分な時間の後、標識によって産生されるシグナルを、ガンマカメラのような光走査装置によって検出する。次いで検出されたシグナルを、血栓の画像に変換する。画像は、インビボにおいて血栓を位置付け、そして適当な治療戦略を考案することを可能にする。
【００７２】
以下の実施例は、本発明の典型的な実施態様を説明し、そしてあらゆる方法において明細書または請求を制限しない。
【実施例】
【００７３】
（細胞系統、タンパク質、およびペプチド）
ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ（Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＡ）から購入し、そして細胞と共に供給されたＥＧＭ−２培地（Ｂｉｏｗｈｉｔｔａｋｅｒ）中で増殖させた。インテグリンαＩＩｂβ３を、Ｅｎｚｙｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｓｏｕｔｈ  Ｂｅｎｄ、ＩＮ）から購入した。インテグリンαＶβ３、およびαＶβ５は、Ｃｈｅｍｉｃｏｎ（Ｔａｍｅｃｕｌａ、ＣＡ）から購入した。ヒトフィブリノーゲンを、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。この研究において使用するペプチドを、Ｐｅｐｔｒｏｎ（Ｔａｅｊｏｎ、Ｋｏｒｅａ）で合成した。ヒトフィブリノーゲンおよびペプチドを、ＥＺ−Ｌｉｎｋ−ＰＦＰ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）を用いて、製造会社による指示に従ってビオチン化した。アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ）を、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）から購入した。
【００７４】
（ライブラリーの産生）
全ＲＮＡを、６人の健康なドナーの骨髄から、ＴＲＩ  ＲＥＡＧＥＮＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ、ＯＨ）を用いて調製した。第１鎖ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）プライマー（ｐｒｉｍｉｎｇ）を用いるＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴ  Ｐｒｅａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを用いて合成した（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）。ＦＲ３の一部、無作為化ＨＣＤＲ３、およびＣＨ１に融合したＶＨのＦＲ４をコードするｃＤＮＡ断片を、プライマーｎｅｏ−ｒａｄ−ｆ（ＧＴＧＴＡＴＴＡＣＴＧＴＧＣＧＡＧＡＧＴＧＧＧＧＮＮＫＮＮＫＮＮＫＣＧＴＧＣＣＧＡＣＮＮＫＮＮＫＮＮＫＴＡＣＧＣＴＡＴＧＧＡＣＧＴＣＴＧＧＧＧＣ）（配列番号９）およびｄｐｓｅｑ（ＡＧＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＡＣＧＴＣ）（配列番号１０）および鋳型としてファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ−ＴＴ（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。ＶＨのＦＲ１からＦＲ３までをコードするｃＤＮＡ断片を増幅するために、調製したヒト骨髄ｃＤＮＡを、プライマーＤＰ−４７Ｎ−ｔｅｒｍ（ＧＣＴＧＣＣＣＡＡＣＣＡＧＣＣＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧＧＴＡ）（配列番号１１）およびＤＰ−４７ＦＲ３（ＣＡＣＴＣＴＣＧＣＡＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＣＧＧＣＣＧＴＧＴＣＣＴＣＧＧＣＴＣＴ）（配列番号１２）を用いてＰＣＲにかけた。全ての増幅を、Ｔａｑポリメラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）を用いた標準的なＰＣＲ条件下で行った。２つのｃＤＮＡ断片を、プライマーｌｅａｄ−ＶＨ（ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣ）（配列番号１３）およびｄｐ−Ｅｘ（ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＡＧＡＡＧＣＧＴＡＧＴＣＣＧＧＡＡＣＧＴＣ）（配列番号１４）を用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって組み立てた。ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘ中の前に選択したＤＰＫ−２６ヒトカッパ軽鎖ｃＤＮＡを、プライマーｏｍｐｓｅｑ（ＡＡＧＡＣＡＧＣＴＡＴＣＧＣＧＡＴＴＧＣＡＧＴＧ）（配列番号１５）およびｌｅａｄＢ（ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣ）（配列番号１６）を用いて、ＰＣＲによって増幅した。重鎖断片ライブラリーおよび軽鎖をコードするｃＤＮＡを、プライマーｏｍｐｓｅｑおよびｄｐ−Ｅｘを用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって融合した。できたＦａｂをコードするライブラリーを、記載されたように、ＳｆｉＩ（Ｒｏｃｈｅ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）で消化し、ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘにライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２５３７（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）に形質転換した（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００７５】
（ライブラリーの選択）
全部で７回のパニングを行った（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。最初に、固定化ヒトインテグリンαＩＩｂβ３に対する５回のパニングを、コーティングのために５０μｌの金属緩衝液（２５ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１３７ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＣａＣｌ２、および１ｍＭのＭｎＣｌ２）中１００ｎｇのタンパク質、洗浄のためにＴＢＳ（Ｔｒｉｓ緩衝化生理食塩水）中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０、および溶出のためにＴＢＳ中１０ｍｇ／ｍｌのトリプシン（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｓｏｎ、Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ、ＮＪ）を用いて行った。Ｃｏｓｔａｒ３６９０  ９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を、パニングのために使用した。トリプシン処理を、３７℃で３０分間行った。６回目のパニングのために、金属緩衝液中２５ｎｇのタンパク質をコーティングのために使用し、そしてＴＢＳ中０．５％のＴｗｅｅｎ２０を洗浄のために使用した。７回目のパニングのために、１２．５ｎｇのタンパク質をコーティングのために使用した。プレートを、初回において５回、２回目および３回目において１０回、そして残る４回において１５回洗浄した。各回のアウトプットファージプールを、２次抗体として西洋ワサビペルオキシダーゼに結合したヒツジ抗Ｍ１３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いたファージＥＬＩＳＡによってモニターした。最終回のパニングの後、ファージをアウトプットプレートで増殖させた単一のクローンから産生し、そして記載されたようにファージＥＬＩＳＡによってインテグリンαＩＩｂβ３に対する結合に関して試験した（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００７６】
（軽鎖のシャッフリングおよび選択）
ＶκおよびＶλをコードするｃＤＮＡを、高度に保存された、それぞれ様々なＶκおよびＶλファミリーのＮ末端アミノ酸をコードする配列にハイブリダイズするセンスプライマー、およびＶκおよびＶλのＦＲ４のＣ末端アミノ酸をコードする配列にハイブリダイズする逆向きプライマーを含む（Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．、Ｗｕ，Ｔ．Ｔ．、Ｐｅｒｒｙ，Ｈ．Ｍ．、Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｋ．Ｓ．、およびＦｏｅｌｌｅｒ，Ｃ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｌ．Ｉｎｓｔ．Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ）、以前に公開されたプライマーのパネルを用いて、調製したヒト骨髄ｃＤＮＡから増幅した（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。ＣκおよびＣλをコードする配列を、記載されたように調製し（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、そしてプライマーＲＳＣ−Ｆ（ＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＧＧＣＣＣＡＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＣＴＣ）（配列番号１７）およびｌｅａｄ−Ｂ（ＧＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＡＧＣ）（配列番号１８）を用いて、オーバーラップエクステンションＰＣＲによって、ＶκおよびＶλをコードする配列にそれぞれ融合した。選択されたＦａｂにおいてＤＰＫ−２６ヒトカッパ軽鎖を置換するために、２つのクローニング戦略を使用した。１つのアプローチにおいて、ＤＰＫ−２６ヒトカッパ軽鎖ｃＤＮＡを、ＳａｃＩおよびＸｂａＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）による制限酵素消化によって、最終回のパニングの後に得られたファージミドベクタープールから除去した。次いでヒト軽鎖をコードするライブラリーを、同じ制限酵素で消化し、調製したファージミドベクターにライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２５３７に形質転換した。２番目のアプローチにおいて、ｃＤＮＡをコードする重鎖断片を、ｌｅａｄ−ＶＨおよびｄｐｓｅｑプライマーを用いて最終回のパニングの後に得られたファージミドベクタープールから増幅し、そしてプライマーｏｍｐｓｅｑおよびｄｐ−ＥＸを用いてオーバーラップエクステンションＰＣＲによって、ヒト軽鎖をコードするライブラリーと融合した。できたＦａｂをコードするライブラリーを、以前に記載されたように、ＳｆｉＩで消化し、ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘにライゲーションし、そしてＥ．ｃｏｌｉ株ＥＲ２５３７に形質転��した（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。２つの軽鎖ライブラリーを混合した後、それぞれ１２．５ｎｇのコートされたヒトインテグリンαＩＩｂβ３を用いた３回のパニングを行った。各回においてプレートを１５回洗浄した。最終回のパニングの後、アウトプットプレートで増殖させた単一のクローンからファージを産生し、そして記載されたように、ファージＥＬＩＳＡによって、インテグリンαＩＩｂβ３に対する結合に関して試験した（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００７７】
（ＥＬＩＳＡ）
可溶性Ｆａｂの産生に関して、公開された手順に従った（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。簡単には、選択されたコロニーを、５ｍｌのスーパーブロス（ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）中で、３７℃で６時間増殖させた。ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を１ｍＭの最終濃度まで加えた後、一晩増殖を継続した。Ｃｏｓｔａｒ３６９０  ９６穴プレートの各ウェルに関して、５０μｌの金属緩衝液中１００ｎｇのインテグリンαＩＩｂβ３を、４℃で一晩コーティングした。ＴＢＳ中３％（ｗ／ｖ）のスキムミルクを加え、続いて３７℃で１時間インキュベーションすることによって、プレートを固定した。続いて、同じ容積のＴＢＳ中３％（ｗ／ｖ）のスキムミルクで希釈した５０μｌの培養上清、ＴＢＳ中３％のスキムミルク中で１μｇ／ｍｌに希釈した、５０μｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ラット抗ＨＡｍＡｂ  ３Ｆ１０（Ｒｏｃｈｅ）、および５０μｌのＡＢＴＳ基質溶液（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を、連続的に加えた。試薬を加える前に、プレートをＴＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄した。各工程において、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。選択されたＦａｂの交差反応性をチェックするために、コーティングされたインテグリンαＶβ３、αＶβ５、およびα５β１を用いた同時アッセイを、上記で記載したのと同じ条件を用いて行った。
【００７８】
（フィブリノーゲンの結合阻害アッセイ）
Ｃｏｓｔａｒ３６９０  ９６穴プレートのウェルを、５０μｌの金属緩衝液中１００ｎｇのインテグリンαＩＩｂβ３で、４℃で一晩コーティングした。プレートを水で２回洗浄し、そして１６０μｌのＴＢＳ中３％（ｗ／ｖ）のスキムミルクで、３７℃で１時間固定した。プレートを水で簡単に洗浄した後、ＴＢＳ中３％（ｗ／ｖ）のスキムミルク中、１．２μＭのビオチン化フィブリノーゲン５０μｌと混合した、５０μｌのＦａｂを含む培養上清、精製Ｆａｂ  ＲＡＤ８７およびアブシキシマブ、または合成ペプチドを、各ウェルに加えた。最終濃度を、１．３×１０−８Ｍから８．０×１０−７ＭのＦａｂ、および８．９×１０−８Ｍおよび９．１×１０−５Ｍの合成ペプチドの間に調整した。３７℃で２時間インキュベーションし、続いて水で１０回、そしてＴＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄した後、ＴＢＳ中３％（ｗ／ｖ）のスキムミルク中で希釈した５０μｌの０．５μｇ／ｍｌのストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ｐｉｅｒｃｅ）を加え、そして３７℃で１時間インキュベートした。上記のように洗浄した後、５０μｌのＡＢＴＳ基質溶液（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を加えた。この実験を各濃度で３回繰り返して、平均値および標準偏差を得た。
【００７９】
（フローサイトメトリー）
末梢血を健康なボランティアから取り、そしてＡＣＤチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）中に採取した。ＨＵＶＥＣを０．０５％（ｗ／ｖ）のトリプシン、０．５３ｍＭのＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で５分間処理し、５００ｇで２分間の遠心によって回収し、そしてＰＢＳ（リン酸緩衝化生理食塩水）中１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡに再懸濁した。続いて、Ｆａｂ  ＲＡＤ８７またはＦａｂアブシキシマブを、０．２μＭの最終濃度に達するように、４０μｌのＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡまたは４０μｌの末梢血に再懸濁した細胞に加えた。室温で４０分間インキュベートし、続いてＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで２回洗浄した後、７５０μｌのＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで希釈した、１０μｌのＦＩＴＣ結合抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加え、そして室温で２０分間インキュベートした。ＰＢＳ中１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡで２回洗浄した後、Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）のＦＡＣＳｔａｒ装置を用いて、フローサイトメトリーを行った。
【００８０】
（血小板凝集アッセイ）
ヒト末梢血を上記で記載したように採取した。１３５ｇで１５分間遠心することによって、採取した末梢血から血小板が豊富な血漿（ＰＲＰ）を得た。続く１５００ｇで１５分間の遠心は、血小板が少ない血漿（ＰＰＰ）を産生した。ＰＲＰおよびＰＰＰを混合することによって、血漿１μｌあたり３００，０００−３５０，０００の血小板の調整血漿を調製した。４３５μｌの調整血漿に、１５μｌのＰＢＳに溶解したＲＡＤ８７  ｍＡｂ、アブシキシマブ、およびペプチドを、２０ｎＭおよび１００ｎＭの間のｍＡｂおよび０．４μＭおよび９０μＭの間のペプチドの最終濃度まで加えた。以前に記載されたように、全血光凝集能測定装置（Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ、Ｈａｖｅｒｔｏｗｎ、ＰＡ）を用いて、血小板凝集アッセイを行った（Ｋｌｉｎｋｈａｒｄｔ，Ｕ．、Ｋｉｒｃｈｍａｉｅｒ，Ｃ．Ｍ．、Ｗｅｓｔｒｕｐ，Ｄ．、Ｂｒｅｄｄｉｎ，Ｈ．Ｋ．、Ｍａｈｎｅｌ，Ｒ．、Ｇｒａｆｆ，Ｊ．、Ｈｉｌｄ，Ｍ．およびＨａｒｄｅｒ，Ｓ．（２０００）血小板凝集、フィブリノーゲン結合および血小板分泌パラメーターに対する、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤アブシキシマブまたはＳＲ１２１５６６Ａの、差次的なインビトロ効果。Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ９７，２０１−２０７）。各試料のインピーダンスを、安定なベースラインが確立するまでモニターした（１分当たり＜５ｍＶのドリフト）。血小板凝集を誘発するために、９μｌのＡＤＰ溶液を、２０μＭの最終濃度に達するまで加えた。時間と共に１対の電極間のインピーダンスの増加を、分析のためにパーソナルコンピューターへ接続器を通して伝達した（ＡＧＧＲＯ／ＬＩＮＫ、Ｃｈｒｏｎｏ−ｌｏｇ）。
【００８１】
（親和性の測定）
Ｆａｂ  ＲＡＤ８７およびアブシキシマブのインテグリンαＩＩｂβ３に対する解離定数を、以前に記載されたように競合的ＥＬＩＳＡによって決定した（Ｄｊａｖａｄｉ−Ｏｈａｎｉａｎｃｅ，Ｌ．、Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．Ｅ．、およびＦｉｒｇｕｅｔ，Ｂ．（１９９６）溶液における抗体親和性の測定。Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ（ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ，Ｊ．、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．、およびＣｈｉｓｗｅｌｌ，Ｊ．編）７７−９８頁、ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ；Ｙｉ，Ｋ．、Ｃｈｕｎｇ，Ｊ．、Ｋｉｍ，Ｈ．、Ｋｉｍ，Ｉ．、Ｊｕｎｇ，Ｈ．、Ｋｉｍ，Ｊ．、Ｃｈｏｉ，Ｉ．、Ｓｕｈ，Ｐ．、およびＣｈｕｎｇ，Ｈ．（１９９９）ＳｆｉＩおよびＮｏｔＩ部位を含むように修飾した原核生物発現ベクターにおける、抗−ＮＣＡ−９５ｓｃＦｖ（ＣＥＡ７９ｓｃＦｖ）の発現および特徴づけ。Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  １８、２４３−２４９）。簡単には、Ｃｏｓｔａｒ３６９０  ９６穴プレートのウェルを、５０μｌの金属緩衝液中、２５０ｎｇのインテグリンαＩＩｂβ３で、４℃で一晩コーティングした。プレートを水で５回洗浄し、そして１６０μｌのＰＢＳ中２％のＢＳＡで、３７℃で２時間固定した。精製Ｆａｂ  ＲＡＤ８７またはＦａｂアブシキシマブを、２×１０−１０Ｍの最終濃度に達するまでインテグリンαＩＩｂβ３と混合した。インテグリンαＩＩｂβ３の最終濃度を、１×１０−７Ｍおよび１×１０−１０Ｍの間に調整した。これらの混合物を一晩インキュベートし、平衡化を可能にした。プレートを水で簡単に洗浄した後、抗体−抗原混合物をウェルに加え、そして室温で２時間インキュベートした。プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で３回洗浄した後、２００ｎｇ／ｍｌの西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ヒトＩｇＧ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ）を加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳ中０．０５％のＴｗｅｅｎ２０で５回洗浄し、その後５０μｌのＡＢＴＳ基質溶液を加えた（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。３７℃で２時間インキュベートした後、５０μｌの３Ｎ  ＨＣｌを加えることによって反応を停止させた。各ウェルの吸光度を、ＥＬＩＳＡプレートリーダーにおいて、４０５ｎｍで測定した。ｙ軸にυ／［Ａｇ］を、そしてｘ軸にυを使用してスキャッチャードプロットを描いた。［Ａｇ］は、フリーの抗原の濃度である；υは結合した抗体の画分であり、それは規定された濃度の可溶性抗原の存在下での吸光度を、可溶性抗原の非存在下での吸光度で割ることによって得られた。スキャッチャードプロットの直線の勾配が、１／Ｋｄに等しい。
【００８２】
（ハイブリッド未処理／合成ヒトＦａｂライブラリーの産生および選択）
この研究の目的は、両方の部位を３つの無作為化アミノ酸残基ではさまれたＲＡＤモチーフをＨＣＤＲ３に移植することによって、インテグリンαＩＩｂβ３を他のＲＧＤ結合インテグリン、特にインテグリンαＶβ３と区別する合成ヒト抗体を産生することであった。最初に、我々は、中央の認識配列としてＲＧＤモチーフよりもＲＡＤモチーフを使用した。２番目に、以前の研究の両方における、中央認識配列を囲むＣＸ９Ｃジスルフィド架橋を除去した。３番目に、合成ＨＣＤＲ３ライブラリーを、ヒト骨髄ｃＤＮＡから増幅した未処理のヒトＶＨライブラリーに移植した。従って、そのＨＣＤＲ３における無作為化に加えて、多様化ＶＨによって、２番目のレベルのライブラリーの複雑性が導入された。
【００８３】
無作為化ＨＣＤＲ３配列ＶＧＸＸＸＲＡＤＸＸＸＹＡＭＤＶ（配列番号３）を有するヒト抗体ライブラリーを、ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘにおいて産生し、ここでＸは２０の通常天然アミノ酸のいずれかを表す。ＶＨ、重鎖可変ドメインのＦＲ１からＦＲ３をコードする断片を、ヒト可変重鎖遺伝子ＤＰ−４７特異的プライマー、および鋳型として６人の健康なドナー由来のヒト骨髄ｃＤＮＡを用いて、ＰＣＲによって増幅した。このハイブリッド未処理／合成重鎖断片ライブラリーを、まず以前に選択されたＤＰＫ−２６ヒトカッパ軽鎖と対にした。できたＦａｂライブラリーを、ファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘにクローニングし、１×１０９の独立した形質転換体の複雑性を得た。選択されていないライブラリーから無作為に選んだクローンが、ＶＨおよびＨＣＤＲ３配列における企図した多様性を確認した。固定化ヒトインテグリンαＩＩｂβ３に対する７回のパニングの後、ファージＥＬＩＳＡによって分析した場合、８０％以上の選択されたクローンが、インテグリンαＩＩｂβ３に結合した（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。
【００８４】
選択された重鎖断片をコードする配列を、軽鎖シャッフリングに基づく２番目の選択工程にかけた。このために、ＤＰＫ−２６ヒトカッパ軽鎖を、ヒト骨髄ｃＤＮＡから増幅したヒトカッパおよびラムダ軽鎖ライブラリーと置換した。できた未処理ヒト軽鎖ライブラリーを、再びファージミドベクターｐＣｏｍｂ３Ｘにクローニングし、７×１０８の独立した形質転換体の複雑性を得た。固定化ヒトインテグリンαＩＩｂβ３に対する３回のパニングの後、ファージＥＬＩＳＡによって分析した場合、全ての選択されたクローンがインテグリンαＩＩｂβ３に結合した。
【００８５】
最も強力な結合を示した１０個の個々のクローンを、続いてＤＮＡ配列決定によって分析した。１つ以外全てのクローンが、コンセンサス配列Ｖ（Ｖ／Ｗ）ＣＲＡＤ（Ｋ／Ｒ）ＲＣ（配列番号１４）を有する、ＨＣＤＲ３におけるジスルフィド架橋で束縛されたループを含んでいた（表２）。その例外であるクローンＲＡＤ１は、対応する配列ＴＨＳＲＡＤＲＲＥ（配列番号１９）を有していた（表２）。全てのクローンがＤＰ４７  ＶＨ重鎖断片を示した。４つのクローンがもともとのＤＰＫ−２６ヒトカッパ軽鎖を有していたが、６つのクローンは未処理ヒト軽鎖ライブラリー由来のヒトカッパまたはラムダ軽鎖を示した。
【００８６】
（選択されたヒトＦａｂの生化学的および機能的特徴づけ）
１０個の選択されたクローンから発現するＦａｂを、そのＲＧＤ結合インテグリンとの反応性に関して、ＥＬＩＳＡによって試験した。すべてのＦａｂはヒトインテグリンαＩＩｂβ３に強力に結合したが、ヒトインテグリンαＶβ３、α５β１、およびαＶβ５には結合しなかった（図１）。ヒト血小板表面に発現する天然インテグリンαＩＩｂβ３に対する反応性をチェックするために、続いて全てのＦａｂをフローサイトメトリーによって分析した。全ての選択されたＦａｂはヒト血小板に結合するが、関連性のないＦａｂは結合しないことが見出された。インテグリンαＩＩｂβ３およびフィブリノーゲン間の相互作用は、部分的にＲＧＤモチーフによって媒介されるので、我々は次に、選択されたＦａｂがこのタンパク質−タンパク質相互作用を阻害し得るかどうかを試験した。この目的のために、我々は、固定化インテグリンαＩＩｂβ３、ビオチン化フィブリノーゲン、およびアビジン−ＨＲＰに基づく競合的ＥＬＩＳＡアッセイを確立した。選択されたＦａｂを、ビオチン化フィブリノーゲンと異なる濃度で混合し、そして続いて固定化インテグリンαＩＩｂβ３とインキュベートした。アビジン−ＨＲＰを用いて、固定化インテグリンαＩＩｂβ３に結合したビオチン化フィブリノーゲンを検出した。全ての選択されたＦａｂは、インテグリンαＩＩｂβ３およびフィブリノーゲンの相互作用の強力な阻害を示した。
【００８７】
我々は続いて、インテグリンαＩＩｂβ３に対して最も強力な結合を示したＦａｂ  ＲＡＤ８７に焦点を当てた（図１）。Ｆａｂ  ＲＡＤ８７をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現し、そして以前に記載されたように精製した（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。フローサイトメトリーによって明らかになったように、Ｆａｂ  ＲＡＤ８７は、ヒト血小板のみに結合し、主にインテグリンαＶβ３を発現するＨＵＶＥＣ細胞には結合しなかった（図２）。対照的に、Ｆａｂアブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ、Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮ）は、血小板およびＨＵＶＥＣ細胞の両方に結合し（図２）、その記録された２つのβ３インテグリンとの交差反応性を確認した（Ｂｏｕｇｉｅ，Ｄ．Ｗ．、Ｗｉｌｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．、Ｗｕｉｔｓｃｈｉｃｋ，Ｅ．Ｄ．、Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂ．Ｒ．、Ｍａｌｉｋ，Ｍ．、Ｌｅｖｉｎｅ，Ｓ．、Ｌｉｎｄ，Ｒ．Ｎ．、Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｊ．、およびＡｓｔｅｒ，Ｒ．Ｈ．（２００２）チロフィバンまたはエプチフィバチドによる治療後の急性血小板減少症は、リガンド結合ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的な抗体に関連する。Ｂｌｏｏｄ  １００、２０７１−２０７６）。Ｆａｂ  ＲＡＤ８７は、インテグリンαＩＩｂβ３およびフィブリノーゲン間の相互作用を、８．０×１０−８ＭのＩＣ５０で、用量依存的な方式で阻害した。同時実験において、Ｆａｂアブシキシマブは９．０×１０−８ＭのＩＣ５０を示した（図３Ａ、表３）。競合的ＥＬＩＳＡに基づいて（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．、Ｓａｔｏ，Ｋ．、Ｋａｍｏｈａｒａ，Ｍ．、Ｋａｋｕ，Ｓ．、Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．、Ｙａｎｏ，Ｓ．、およびＩｉｚｕｍｉ，Ｙ．（２００２）ヒト化抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、ＹＭ３３７およびアブシキシマブの、インビトロ抗血小板効果および結合性質に対する比較研究。Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ２５、１００６−１０１２；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．、Ｙａｎｏ，Ｓ．、Ｈｓｕ，Ｒ．Ｋ．、Ｌａｎｄｏｌｆｉ，Ｎ．Ｆ．、Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｍ．、Ｃｏｌｅ，Ｍ．、Ｔｓｏ，Ｊ．Ｔ．、Ｂｒｉｎｇｍａｎ，Ｔ．、Ｌａｉｒｄ，Ｗ．、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら（１９９４）血小板インテグリンｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的なヒト化抗体。Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２、２９６８−２９７６）、一価のＦａｂ  ＲＡＤ８７／インテグリンαＩＩｂβ３相互作用のＫｄ値は、３．３×１０−９Ｍであった（表３）。同じアッセイは、一価のＦａｂアブシキシマブ／インテグリンαＩＩｂβ３相互作用に関して、公開された６．２×１０−９Ｍと比較して、１．１×１０−９ＭのＫｄ値を得た（表３）（Ｔａｍ，Ｓ．Ｈ．、Ｓａｓｓｏｌｉ，Ｐ．Ｍ．、Ｊｏｒｄａｎ，Ｒ．Ｅ．、およびＮａｋａｄａ，Ｍ．Ｔ．（１９９８）アブシキシマブ（ＲｅｏＰｒｏ、キメラ７Ｅ３  Ｆａｂ）は、糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａおよびアルファ（ｖ）ベータ３インテグリンの等価な親和性および機能的阻害を示す。Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  ９８、１０８５−１０９１）。
【００８８】
インテグリンαＩＩｂβ３およびフィブリノーゲン間の相互作用は、血小板凝集に必須の工程であるので、我々は次に、Ｆａｂ  ＲＡＤ８７がエキソビボで血小板凝集を阻害し得るかどうかを試験した。ＡＤＰをヒト末梢血から調製した調整血漿に２０μＭの最終濃度まで加えることによって、血小板凝集を誘発し、そして血小板凝集計によってモニターした。Ｆａｂ  ＲＡＤ８７は、６０ｎＭまたは３μｇ／ｍｌのＥＣ５０で、血小板凝集を強力に阻害することが見出された（図４；表３）。同時実験において、ＦａｂアブシキシマブのＥＣ５０は、血小板凝集が５μＭのＡＤＰ濃度で誘発された場合、４５ｎＭと決定され、それは以前に３４ｎＭであると報告された（Ｋｌｉｎｋｈａｒｄｔ，Ｕ．、Ｋｉｒｃｈｍａｉｅｒ，Ｃ．Ｍ．、Ｗｅｓｔｒｕｐ，Ｄ．、Ｂｒｅｄｄｉｎ，Ｈ．Ｋ．、Ｍａｈｎｅｌ，Ｒ．、Ｇｒａｆｆ，Ｊ．、Ｈｉｌｄ，Ｍ．およびＨａｒｄｅｒ，Ｓ．（２０００）血小板凝集、フィブリノーゲン結合および血小板分泌パラメーターに対する、血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ阻害剤アブシキシマブまたはＳＲ１２１５６６Ａの、差次的なインビトロ効果。Ｔｈｒｏｍｂ  Ｒｅｓ  ９７，２０１−２０７）。
【００８９】
（選択されたＨＣＤＲ３配列由来の合成ペプチドの生化学的および機能的特徴づけ）
その配列が、選択されたインテグリンαＩＩｂβ３結合ＦａｂのＨＣＤＲ３配列から得られた、４つのノナペプチドを、化学的に合成した。このパネルは、３つの環状ペプチド、ＶＷＣＲＡＤＫＲＣ（配列番号６）、ＶＷＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号５）、およびＶＶＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号７）、および直線状ペプチドＴＨＳＲＡＤＲＲＥ（配列番号１９）を含んでいた。上記で記載した競合的ＥＬＩＳＡアッセイを用いて、全ての環状ペプチドは、マイクロモルの濃度範囲で、インテグリンαＩＩｂβ３およびフィブリノーゲン間の相互作用を阻害することが見出された。直線状ペプチドおよび３つのコントロールペプチド−２つは逆向きＲＡＤモチーフ、ＶＶＣＤＡＲＲＲＣ（配列番号２０）およびＴＨＳＤＡＲＲＲＥ（配列番号２１）を有し、そして１つは無関係の配列を有する−は、同じ濃度範囲でそのタンパク質−タンパク質相互作用を阻害しなかった（図３Ｂ）。最も強力な環状ペプチド、ＶＷＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号５）およびＶＷＣＲＡＤＫＲＣ（配列番号６）のＩＣ５０を、それぞれ１．２×１０−６Ｍおよび４．２×１０−６Ｍと決定した。その配列をＦａｂ  ＲＡＤ８７から得た環状ペプチドＶＶＣＲＡＤＲＲＣのＩＣ５０は、１．１×１０−５であり、それはＦａｂ  ＲＡＤ８７に関して得られた対応するＩＣ５０より２けた高い（図３Ｂ）。
【００９０】
図５は、様々な濃度のＶＷＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号５）（Ａ）、ＶＶＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号７）（Ｂ）、ＶＷＣＲＡＤＫＲＣ（配列番号６）（Ｃ）、およびＴＨＳＲＡＤＲＲＥ（配列番号１９）およびコントロールペプチド（Ｄ）の存在下におけるエキソビボ血小板凝集アッセイを示す。驚くべきことに、３つの環状ペプチドの全ては９０μＭの濃度で血小板凝集を完全に阻害したが、直線状またはコントロールペプチドはしなかった。インテグリンαＩＩｂβ３／フィブリノーゲン相互作用アッセイと関連して、９μＭと低い濃度で血小板凝集を阻害する唯一のペプチドである、環状ペプチドＶＷＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号５）が、再び最も強力な阻害剤であることが見出された。
【００９１】
それらを抗血栓症薬として適用する可能性はアブシキシマブと重複するが、我々が本明細書中で記載したＲＡＤ抗体は、いくつかの特有の特徴を有する。まず、それらはヒト抗体であり、それらは患者において免疫反応を誘発する可能性がより低い。２番目に、ＲＧＤペプチドおよびペプチド模倣物と同様に（Ｘｉｏｎｇ，Ｊ．Ｐ．、Ｓｔｅｈｌｅ，Ｔ．、Ｚｈａｎｇ，Ｒ．、Ｊｏａｃｈｉｍｉａｋ，Ａ．、Ｆｒｅｃｈ，Ｍ．、Ｇｏｏｄｍａｎ，Ｓ．Ｌ．、およびＡｒｎａｏｕｔ，Ｍ．Ａ．（２００２）Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐリガンドとの複合体における、インテグリンアルファＶベータ３の細胞外部分の結晶構造。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６、１５１−１５５）、ＲＡＤ抗体は、インテグリンαＩＩｂβ３のＲＧＤ結合部位を直接阻害する。対照的に、ＲＧＤまたはＲＧＤ様モチーフを含まないアブシキシマブによるインテグリンαＩＩｂβ３連結のメカニズムは、ＲＧＤ結合部位の直接的阻害よりは、立体的またはアロステリックな妨害が関与すると考えられる。３番目に、ＲＡＤ抗体はインテグリンαＩＩｂβ３に選択的に結合するが、アブシキシマブはインテグリンαＶβ３およびαＩＩｂβ３を区別しない。アブシキシマブの交差反応性は、我々の初期のインテグリン結合合成抗体と同様である（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｌａｎｇｕｉｎｏ，Ｌ．Ｒ．、およびＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）デザインおよび選択による高親和性自己反応性ヒト抗体：インテグリンリガンド結合部位の標的化。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０、１０００３−１０００７；Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．、Ｈｕ，Ｄ．、Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔ，Ａ．、Ｐｉｎｚ−Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｓ．、およびＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ（１９９４）インテグリンの接着性リガンドとしての合成抗体の産生。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９，３２７８８−３２７９５）。
【００９２】
原因が未知である急性血小板減少症は、インテグリンαＩＩｂβ３阻害剤に伴う主な安全性問題の１つである。上記で言及したように、アブシキシマブのマウス可変ドメインに対するヒト抗体が、アブシキシマブを２回目に投与された後重篤な血小板減少症を発症した患者における血小板破壊の主な原因であると報告された（Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂ．Ｒ．、Ｓｗｙｅｒｓ，Ｊ．、Ｄｉｖｇｉ，Ａ．、ＭｃＦａｒｌａｎｄ，Ｊ．Ｇ．およびＡｓｔｅｒ，Ｒ．Ｈ．（２００２）アブシキシマブに対する２回目の接触後の血小板減少症は、アブシキシマブにコートされた血小板を認識する抗体によって引き起こされる。Ｂｌｏｏｄ  ９９、２０５４−２０５９）。この発見は、そのＣＤＲをヒト可変ドメインの枠組みに移植することによる、アブシキシマブのさらなるヒト化を必要とし得る（Ｒａｄｅｒ，Ｃ．、Ｒｉｔｔｅｒ，Ｇ．、Ｎａｔｈａｎ，Ｓ．、Ｅｌｉａ，Ｍ．、Ｇｏｕｔ，Ｉ．、Ｊｕｎｇｂｌｕｔｈ，Ａ．Ａ．、Ｃｏｈｅｎ，Ｌ．Ｓ．、Ｗｅｌｔ，Ｓ．、Ｏｌｄ，Ｌ．Ｊ．、およびＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ（２０００）治療的ヒト抗体産生の新規供給源としてのウサギ抗体レパートリー。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５、１３６６８−１３６７６）。しかし、抗体の詳細な構造的情報に基づいた枠組みの精密な調整を伴わなければ、このＣＤＲ移植戦略は、現在臨床試験において評価されている抗インテグリンαＩＩｂβ３モノクローナル抗体ＹＭ３３７の場合と同様に、しばしば抗原に対して非常に減少した親和性を有する抗体を産生する（Ｓｕｚｕｋｉ，Ｋ．、Ｓａｔｏ，Ｋ．、Ｋａｍｏｈａｒａ，Ｍ．、Ｋａｋｕ，Ｓ．、Ｋａｗａｓａｋｉ，Ｔ．、Ｙａｎｏ，Ｓ．、およびＩｉｚｕｍｉ，Ｙ．（２００２）ヒト化抗糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａモノクローナル抗体、ＹＭ３３７およびアブシキシマブの、インビトロ抗血小板効果および結合性質に対する比較研究。Ｂｉｏｌ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｕｌｌ  ２５、１００６−１０１２；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．、Ｙａｎｏ，Ｓ．、Ｈｓｕ，Ｒ．Ｋ．、Ｌａｎｄｏｌｆｉ，Ｎ．Ｆ．、Ｖａｓｑｕｅｚ，Ｍ．、Ｃｏｌｅ，Ｍ．、Ｔｓｏ，Ｊ．Ｔ．、Ｂｒｉｎｇｍａｎ，Ｔ．、Ｌａｉｒｄ，Ｗ．、Ｈｕｄｓｏｎ，Ｄ．ら（１９９４）血小板インテグリンｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的なヒト化抗体。Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５２、２９６８−２９７６）。ＲＡＤ抗体は、合成ＨＣＤＲ３以外は完全にヒト配列から構成されているので、それらはキメラまたはヒト化抗体より免疫原性が低いと期待される。しかし、我々のＲＡＤ抗体によるヒト抗イディオタイプ抗体の誘発はあり得る。循環抗イディオタイプ抗体は、ＲＡＤ抗体を介して血小板表面に結合するより、ＲＡＤ抗体の結合に関して血小板インテグリンαＩＩｂβ３と競合するので、それらは重篤な血小板減少症を引き起こさないであろうというのは妥当な推定である。興味深い最近の発見は、チロフィバンおよびエプチフィバチドと複合体化した場合にインテグリンαＩＩｂβ３を選択的に認識するヒト抗体が、小分子薬剤で治療された後に重篤な血小板減少症を発症した非常に限られた数の患者において見出されたことである（Ｂｏｕｇｉｅ，Ｄ．Ｗ．、Ｗｉｌｋｅｒ，Ｐ．Ｒ．、Ｗｕｉｔｓｃｈｉｃｋ，Ｅ．Ｄ．、Ｃｕｒｔｉｓ，Ｂ��Ｒ．、Ｍａｌｉｋ，Ｍ．、Ｌｅｖｉｎｅ，Ｓ．、Ｌｉｎｄ，Ｒ．Ｎ．、Ｐｅｒｅｉｒａ，Ｊ．、およびＡｓｔｅｒ，Ｒ．Ｈ．（２００２）チロフィバンまたはエプチフィバチドによる治療後の急性血小板減少症は、リガンド結合ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに特異的な抗体に関連する。Ｂｌｏｏｄ  １００、２０７１−２０７６）。この前後関係において、その結合様式は小分子薬剤を模倣するので、インテグリンαＩＩｂβ３上の免疫原性エピトープのディスプレイを誘発することによって、ＲＡＤ抗体が血小板減少症を引き起こす可能性は残る。
【００９３】
ＬＪ−ＣＰ３、ＯＰＧ２、およびＰＡＣ−１を含むインテグリンαＩＩｂβ３に特異的ないくつかのマウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）（Ｐｕｚｏｎ−ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ，Ｗ．、Ｋａｍａｔａ，Ｔ．およびＴａｋａｄａ，Ｙ．（２０００）複数の不連続なリガンド模倣物抗体結合部位が、インテグリンアルファ（ＩＩｂ）β（３）におけるリガンド結合ポケットを規定する。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７５、７７９５−７８０２；Ｋａｍａｔａ，Ｔ．、Ｉｒｉｅ，Ａ．、Ｔｏｋｕｈｉｒａ，Ｍ．およびＴａｋａｄａ，Ｙ．（１９９６）アルファＩＩｂベータ３（糖タンパク質ＩＩｂ−ＩＩＩａ）のフィブリノーゲンおよびリガンド模倣抗体（ＰＡＣ−１、ＯＰ−Ｇ２、およびＬＪ−ＣＰ３）に対する結合に関するインテグリンアルファＩＩｂサブユニットの決定的な残基。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１、１８６１０−１８６１５；Ｐｒａｍｍｅｒ，Ｋ．Ｖ．、Ｂｏｙｅｒ，Ｊ．、Ｕｇｅｎ，Ｋ．、Ｓｈａｔｔｉｌ，Ｓ．Ｊ．、およびＫｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ，Ｔ．（１９９４）抗インテグリンＧＰＩＩｂ−ＩＩＩａ抗体における生物活性Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐコンフォメーション。Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４、９３−１０８；Ｔｏｍｉｙａｍａ，Ｙ．、Ｂｒｏｊｅｒ，Ｅ．、Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｚ．Ｍ．、Ｓｈａｔｔｉｌ，Ｓ．Ｊ．、Ｓｍｉｌｔｎｅｃｋ，Ｊ．、Ｇｏｒｓｋｉ，Ｊ．、Ｋｕｍａｒ，Ａ．、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ，Ｔ．、およびＫｕｎｉｃｋｉ，Ｔ．Ｊ．（１９９２）ＲＧＤリガンドの分子モデル。インテグリンアルファＩＩｂベータ３に対する特異性を指示する抗体Ｄ遺伝子の部分。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７、１８０８５−１８０９２；Ｎｉｉｙａ，Ｋ．、Ｈｏｄｓｏｎ，Ｅ．、Ｂａｄｅｒ，Ｒ．、Ｂｙｅｒｓ−Ｗａｒｄ，Ｖ．、Ｋｏｚｉｏｌ，Ｊ．Ａ．、Ｐｌｏｗ，Ｅ．Ｆ．、およびＲｕｇｇｅｒｉ，Ｚ．Ｍ．（１９８７）血小板活性化によって誘発された膜糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ複合体の表面発現の増加。フィブリノーゲンの結合および血小板凝集に対する関係。Ｂｌｏｏｄ  ７０、４７５−４８３；Ｂｅｎｎｅｔｔ，Ｊ．Ｓ．、Ｈｏｘｉｅ，Ｊ．Ａ．、Ｌｅｉｔｍａｎ，Ｓ．Ｆ．、Ｖｉｌａｉｒｅ，Ｇ．、およびＣｉｎｅｓ，Ｄ．Ｂ．（１９８３）モノクローナル抗体による刺激されたヒト血小板へのフィブリノーゲン結合の阻害。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８０、２４１７−２４２１）が、ＨＣＤＲ３にＲＹＤモチーフを含む。これらマウスｍＡｂのインテグリンαＩＩｂβ３への結合を、ＲＧＤペプチドによって完全に阻害し得、そのＲＹＤモチーフはＲＧＤ結合部位との直接的な相互作用を媒介していることを示唆する。興味深いことに、ＨＣＤＲ３にＲＧＤモチーフを含むマウスｍＡｂである１６Ｎ７Ｃ２は、β３インテグリン間を区別しなかった（Ｄｅｃｋｍｙｎ，Ｈ．、Ｓｔａｎｓｓｅｎｓ，Ｐ．、Ｈｏｅｔ，Ｂ．、Ｄｅｃｌｅｒｃｋ，Ｐ．Ｊ．、Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ，Ｍ．、Ｇａｎｓｅｍａｎｓ，Ｙ．、Ｔｏｒｎａｉ，Ｉ．およびＶｅｒｍｙｌｅｎ，Ｊ．（１９９４）ヒト血小板糖タンパク質ＩＩｂ／ＩＩＩａ機能を阻害する、マウスモノクローナル抗体の重鎖ＣＤＲ３におけるエキスタチン様Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）を含む配列。Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ  ８７、５６２−５７１）。従って、我々の合成ＲＡＤモチーフと同様に、ある前後関係中の天然ＲＹＤモチーフは、インテグリンαＩＩｂβ３の選択的認識を提供する。しかし、合成ＲＡＤ抗体と対照的に、ＬＪ−ＣＰ３、ＯＰＧ２、またはＰＡＣ−１のいずれも、ＲＧＤ様モチーフを示すＨＣＤＲ３におけるジスルフィド架橋を含まず（Ｔｏｍｉｙａｍａ，Ｙ．、Ｂｒｏｊｅｒ，Ｅ．、Ｒｕｇｇｅｒｉ，Ｚ．Ｍ．、Ｓｈａｔｔｉｌ，Ｓ．Ｊ．、Ｓｍｉｌｔｎｅｃｋ，Ｊ．、Ｇｏｒｓｋｉ，Ｊ．、Ｋｕｍａｒ，Ａ．、Ｋｉｅｂｅｒ−Ｅｍｍｏｎｓ，Ｔ．、およびＫｕｎｉｃｋｉ，Ｔ．Ｊ．（１９９２）ＲＧＤリガンドの分子モデル。インテグリンアルファＩＩｂベータ３に対する特異性を指示する抗体Ｄ遺伝子部分。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６７、１８０８５−１８０９２）、ＶＤＪ組換えによって達成され得る構造的多様性における限界、またはＨＣＤＲ３におけるジスルフィド架橋に対する選択を示唆する。以前に、我々はインテグリンαＶβ３およびαＩＩｂβ３への結合のためにＨＣＤＲ３において合成的に移植したＲＧＤモチーフまたはＲＧＤ模倣モチーフを有するヒト抗体を選択した（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｌａｎｇｕｉｎｏ，Ｌ．Ｒ．およびＳｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．（１９９３）デザインおよび選択による高親和性自己反応性ヒト抗体：インテグリンリガンド結合部位のターゲティング。Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０、１０００３−１０００７；Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ｗ．、Ｈｕ，Ｄ．、Ｓａｔｔｅｒｔｈｗａｉｔ，Ａ．、Ｐｉｎｚ−Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｓ．およびＢａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ（１９９４）インテグリンの接着リガンドとしての合成抗体の作成。Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６９、３２７８８−３２７９５；Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ（１９９３）ファージディスプレイにおける最近の進歩。Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４、５２６−５３０）。選択された抗体はどれも、いずれかのインテグリンに対して独占的に特異的ではなかった。より高い特異性を有する抗体を選択することを試みて、我々は、無作為化ＨＣＤＲ３配列ＶＧＸＸＸＲＡＤＸＸＸＹＡＭＤＶ（配列番号３）を有する、新しい合成ヒト抗体ライブラリーを産生した。ＲＧＤモチーフをＲＡＤモチーフで置換することに加えて、新しいライブラリーの重要な特徴は、以前のライブラリーにおける、インテグリン結合モチーフおよびその側面配列を囲むＣＸ９Ｃジスルフィド架橋の除去であった。興味深いことに、インテグリンαＩＩｂβ３に対する新しいライブラリーの選択は、選択された抗体配列の９０％に見出される、新しいモチーフを示すＣＸ５Ｃ型のジスルフィド結合を得た。ＣＸ９Ｃジスルフィド架橋中でのその選択は、もし不可能でないにしても非常にまれであった、このより小さいループ構造は、インテグリンαＩＩｂβ３に対する例外的な選択性を生じた。
【００９４】
ＨＣＤＲ３内の選択されたＸＸＸＲＡＤＸＸＸ（配列番号２２）モチーフの構造的束縛は、それらを抗体の骨格から切り離し、そしてそれらの機能的性質を評価するよう我々を促した。ＣＸ５Ｃジスルフィド架橋内にＲＡＤモチーフを示す３つの合成ペプチド、ＶＷＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号５）、ＶＷＣＲＡＤＫＲＣ（配列番号６）、およびＶＶＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号７）は、選択されたＲＡＤ抗体のインテグリンαＩＩｂβ３に対する結合、フィブリノーゲンのインテグリンαＩＩｂβ３に対する結合、および血小板凝集を阻害したが、直線状合成ペプチドＴＨＳＲＡＤＲＲＥ（配列番号１９）はしなかった。インテグリンαＩＩｂβ３に関するペプチドアンタゴニストを、ファージディスプレイによるペプチドライブラリーから選択した（Ｏ’Ｎｅｉｌ，Ｋ．Ｔ．、Ｈｏｅｓｓ，Ｒ．Ｈ．、Ｊａｃｋｓｏｎ，Ｓ．Ａ．、Ｒａｍａｃｈａｎｄｒａｎ，Ｎ．Ｓ．、Ｍｏｕｓａ，Ｓ．Ａ．、およびＤｅＧｒａｄｏ，Ｗ．Ｆ．（１９９２）コンフォメーションが束縛されたファージペプチドライブラリーからの、ＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａに対する新規ペプチドアンタゴニストの同定。Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  １４，５０９−５１５；Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｅ．、Ｗａｎｇ，Ｂ．、およびＲｕｏｓｌａｈｔｉ，Ｅ．（１９９５）異なるリングサイズを有する環状ペプチドをディスプレイするファージライブラリー：ＲＧＤ指向性インテグリンのリガンド特異性。Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮＹ）  １３、２６５−２７０；Ｋｏｉｖｕｎｅｎ，Ｅ．、Ｒｅｓｔｅｌ，Ｂ．Ｈ．、Ｒａｊｏｔｔｅ，Ｄ．、Ｌａｈｄｅｎｒａｎｔａ，Ｊ．、Ｈａｇｅｄｏｒｎ，Ｍ．、Ａｒａｐ，Ｗ．、およびＰａｓｑｕａｌｉｎｉ，Ｒ．（１９９９）ファージディスプレイライブラリー由来のインテグリン結合ペプチド。Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １２９、３−１７）。ＣＸ５Ｃ、ＣＸ６Ｃ、ＣＸ７Ｃ、およびＣＸ９Ｃ型の束縛ペプチドライブラリーを使用した。しかし、ＣＸ６ＣおよびＣＸ７Ｃペプチドライブラリーのみが、インテグリンαＩＩｂβ３に対する結合物を得た。選択された配列を、２つのグループ、ＲＧＤモチーフを含むもの、およびＲＧＤのグリシンまたはアルギニン残基のいずれかが置換されたＲＧＤ様モチーフを含むものに分類し得る。中央のグリシンは、セリン、スレオニン、ロイシン、アラニン、グルタミン、ヒスチジン、およびメチオニンのような様々な異なるアミノ酸残基で置換された。２つのペプチド；ＣＲＡＤＶＰＬＣ（配列番号２３）およびＣＭＳＲＡＤＲＰＣ（配列番号２４）が、ＲＡＤモチーフを含んでいた。インテグリンαＩＩｂβ３に対して選択されたＲＧＤを含む配列は、インテグリンαＶβ３およびα５β１に対して選択されたものと異なっており、そこでは芳香族残基Ｔｒｐ、Ｐｈｅ、またはＴｙｒが、ＲＧＤモチーフのすぐＣ末端側の位置で豊富であった。それに加えて、いくつかの配列が、ＲＧＤモチーフの外側に１つまたは２つの塩基性残基を含んでいた。しかし、選択されたペプチド配列はいずれも、我々の選択したＨＣＤＲ３配列ＶＷＣＲＡＤＫＲＣ（配列番号６）、ＶＷＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号５）、およびＶＶＣＲＡＤＲＲＣ（配列番号７）と類似性を共有していなかった。我々のＣＸ５Ｃコ���コンセンサス配列ＣＲＡＤ（Ｋ／Ｒ）ＲＣを含むＣＸ５Ｃペプチドライブラリーは、インテグリンαＩＩｂβ３に対する結合ペプチドを得なかったという事実に注意し、それは我々の選択したＨＣＤＲ３配列におけるＮ末端ＶＷまたはＶＶ残基が、インテグリンαＩＩｂβ３との相互作用において重要な役割を果たしていることを示唆する。
【００９５】
ペプチドおよび抗体ライブライリー両方のファージディスプレイは、研究および開発において様々な適用のための標準的な技術となった（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ、Ｂｕｒｔｏｎ，Ｄ．Ｒ．、Ｓｃｏｔｔ，Ｊ．Ｋ．、およびＳｉｌｖｅｒｍａｎ，Ｇ．Ｊ．（２００１）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ；Ｋａｙ，Ｂ．Ｋ．、Ｋａｓａｎｏｖ，Ｊ．およびＹａｍａｂｈａｉ，Ｍ．（２００１）ファージディスプレイコンビナトリアルペプチドライブラリーのスクリーニング。Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４、２４０−２４６；Ｓｉｄｈｕ，Ｓ．Ｓ．（２０００）医薬品生物工学におけるファージディスプレイ。Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １１、６１０−６１６）。抗体免疫グロブリン可変ドメイン内のペプチドライブラリーのディスプレイがこの技術を合併し、抗体、ペプチド、およびペプチド模倣物薬剤の発見の間に興味深い関連を提供する。ここで我々は、新規特異的抗受容体ペプチドおよび抗体を産生するための、このアプローチの有効性を示した。生物活性および／または結合ペプチドの抗体の骨格における配置またはその骨格内におけるその産生は、生物学的ツールまたは治療薬として使用し得る免疫学的薬剤の迅速な開発を提供する（Ｂａｒｂａｓ，Ｃ．Ｆ．，３ｒｄ（１９９３）ファージディスプレイにおける最近の進歩。Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ４、５２６−５３０）。しばしばペプチド自身はインビボにおいて折衷した活性を有し、そしてその結合はモニターすることが難しくあり得るが、抗体および抗体断片は比較的予測可能な薬物動態的挙動を示すので、抗体の状況におけるそのディスプレイが、検出の問題およびペプチドのタンパク質分解およびその迅速なクリアランスに関連する問題に取り組む。望ましい場合には、例えば癌の状況において、免疫エフェクターの結合の結果として、抗体のＦｃ領域が、ペプチド配列に細胞破壊性質を与え得る。我々は、このアプローチを、結合活性を有する広い範囲のペプチドに適用して、有用な免疫学的薬剤を迅速に産生し得ると考える（Ｂｒｏｗｎ，Ｋ．Ｃ．（２０００）細胞特異的ターゲティングの新規アプローチ：コンビナトリアルライブラリーからの細胞選択的ペプチドの同定。Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  ４、１６−２１）。
【００９６】
当業者は、今記載した実施態様の様々な適応および修飾が、本発明の範囲および意図から離れることなく形成され得ることを認識する。当該分野で公知の他の適当な技術および方法を、当業者によって、および本明細書中で記載された本発明の説明に照らして、多くの特定の様相において適用し得る。従って、本発明を本明細書中で明確に記載された以外のように実施し得ることが理解される。上記の説明は説明的であり、そして制限的ではないことが意図される。多くの他の実施態様が、上記の説明の検討時に、当業者に明らかである。従って、本発明の範囲は、そのような請求が権利を与えられる全範囲の同等物と共に、添付の請求に関して決定されるべきである。
【００９７】
【表１】
2008501305.tif 000004
【００９８】
【表２】
2008501305.tif 000005
【００９９】
【表３】
2008501305.tif 000006
【図面の簡単な説明】
【０１００】
【図１】図１は、選択されたＦａｂが、ヒトインテグリンαＩＩｂβ３と結合するが、他のＲＧＤ結合ヒトインテグリンとは結合しないことを示す。固定化ヒトインテグリンαＶβ３、αＶβ５、αＩＩｂβ３、およびα５β１、およびｐＣｏｍｂ３ＸをトランスフェクトしたＥ．ｃｏｌｉによって発現された可溶性Ｆａｂを含む上清に基づくＥＬＩＳＡ結果を示す。検出のために、ＨＲＰに結合したラット抗ＨＡｍＡｂを使用した。
【図２】図２は、Ｆａｂ  ＲＡＤ８７が、ヒト血小板に結合するが、ヒト臍帯静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）に結合しないことを示す。フローサイトメトリーによる分析は、Ｆａｂ  ＲＡＤ８７が、インテグリンαＶβ３およびαＩＩｂβ３の両方を発現するヒト血小板のみに結合し、主にインテグリンαＶβ３を発現するＨＵＶＥＣ細胞に結合しないことを示した。対照的に、Ｆａｂアブシキシマブは、血小板およびＨＵＶＥＣの両方に結合し、記述されたその２つのβ３インテグリンとの交差反応性を確認した。ｙ軸は、線形の尺度でイベントの数を与え、ｘ軸は対数尺で蛍光強度を与える。
【図３】図３は、Ｆａｂ  ＲＡＤ８７および選択されたＨＣＤＲ３配列由来の合成ペプチドが、インテグリンαＩＩｂβ３およびフィブリノーゲン間の相互作用を阻害することを示す。ビオチン化フィブリノーゲンを、（Ａ）様々な濃度のＦａｂ  ＲＡＤ８７およびアブシキシマブおよびネガティブコントロールとしてプールしたヒトＩｇＧ、および（Ｂ）合成ペプチドと混合し、そしてＥＬＩＳＡプレートに固定化したインテグリンαＩＩｂβ３に加えた。検出のためにストレプトアビジン−ＨＲＰを使用した。３つの独立した実験の平均値および標準偏差を示す。
【図４】図４は、Ｆａｂ  ＲＡＤ８７が、エキソビボで血小板凝集を阻害することを示す。示した血小板凝集アッセイは、全血光凝集能測定装置（ｌｕｍｉ−ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）から得た。各アッセイに関して、１５μｌのＦａｂ  ＲＡＤ８７（Ａ）またはＦａｂアブシキシマブ（Ｂ）溶液を、４３５μｌの血小板が豊富な血漿と混合し、最終濃度を２０ｎＭから１００ｎＭの間にした。次いでＡＤＰを２０μＭの最終濃度まで加え、そして凝集を１０分間モニターした。３つの独立した実験のプロットした平均値および標準偏差を（Ｃ）で示す。
【図５】図５は、選択されたＨＣＤＲ３配列由来の合成ペプチドが、エキソビボで血小板凝集を阻害することを示す。血小板凝集アッセイを、示したペプチド濃度の存在下で、図４で記載したように実施した。ＲＡＤモチーフを有する３つの環状ペプチドは全て血小板凝集を強力に阻害した（Ａ−Ｃ）が、ＲＡＤモチーフを有する直線状ペプチドおよび逆向きＲＡＤモチーフを有する２つのコントロールペプチドは、バックグラウンド以上に影響を有さないことに注意すること（Ｄ）。全ての血小板凝集アッセイにおいて、アブシキシマブＦａｂをポジティブコントロールとして使用した。
【図６】図６は、本発明の抗体の重鎖の一部のアミノ酸残基配列を示す。
【図１】
2008501305.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成19年11月21日(2007.11.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
９〜約５０アミノ酸残基を含む、単離され精製されたペプチドであって、配列番号４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸残基配列を有し、血小板凝集を阻害する活性を有する、ペプチド。
【請求項２】
配列番号５〜７のいずれかのアミノ酸残基配列を含む、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
配列番号５〜７のいずれかからなる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項４】
配列番号５〜７のいずれかから本質的になる、請求項２に記載のペプチド。
【請求項５】
インテグリンαＩＩＢβ３と特異的に免疫反応し、配列番号８、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１からなる群より選択されるアミノ酸残基配列を含む抗体であって、該アミノ酸残基配列が、該抗体の相補性決定領域内にある、抗体。
【請求項６】
前記相補性決定領域が、前記抗体の重鎖内に位置する、請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記相補性決定領域が、ＨＣＤＲ３である、請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
本明細書中で、ＲＡＤ３、ＲＡＤ４、ＲＡＤ９、ＲＡＤ１１、ＲＡＤ１２、ＲＡＤ３２、ＲＡＤ３４、ＲＡＤ８７またはＲＡＤ８８と示された抗体からなる群より選択される請求項５に記載の抗体であって、インテグリンαＩＩＢβ３との免疫反応性を有する、抗体。
【請求項９】
ヒト抗体である、請求項５に記載の抗体。
【請求項１０】
請求項８に記載の抗体の免疫反応性を有する、抗体。
【請求項１１】
請求項１に記載のペプチド
を含む、血小板凝集を阻害するための組成物。
【請求項１２】
請求項５に記載の抗体
を含む、血小板凝集を阻害するための組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載のペプチド
を含む、血小板に対するフィブリノゲンの結合を阻害するための組成物。
【請求項１４】
請求項５に記載の抗体
を含む、血小板凝集を阻害するための組成物。
【請求項１５】
インテグリンαＩＩＢβ３結合活性を有する抗体であって、該結合が、他のタンパク質の結合活性と競合し、該他のタンパク質が、トリペプチドモチーフＡｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ（ＲＡＤ）のアミノ酸残基配列を含み、該結合が、標準競合アッセイで行われる、抗体。
【請求項１６】
請求項１５に記載の抗体であって、前記他のタンパク質が、他の抗体であって、該他の抗体が、該他の抗体の相補性決定領域内にアミノ酸残基配列を含み、該アミノ酸配列が、配列番号８、２５、２６、２７、２８、２９、３０および３１からなる群より選択され、前記結合が、標準競合アッセイで行われる、抗体。
【請求項１７】
９〜約５０アミノ酸残基を含むペプチドをコードする単離され精製されたポリヌクレオチドであって、配列番号４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸残基配列を有し、該ペプチドが、血小板凝集を阻害する活性を有する、ポリヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２０】
タンパク質を産生するためにポリヌクレオチドを使用するための方法であって、該方法は、
ａ）タンパク質発現のための条件下で、請求項１９に記載の宿主細胞を培養する工程；および
ｂ）該宿主細胞培養物から、配列番号４、５、６および７からなる群より選択されるアミノ酸配列を含むタンパク質を回収する工程；
を包含する、方法。
【請求項２１】
請求項１に記載のペプチド、および
適切な薬学的キャリア
を、静脈内投与、動脈内投与、リンパ循環投与、腹腔内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、関節空間投与または肺投与に適した形態で含有する、薬学的組成物。
【請求項２２】
請求項５に記載の抗体、および
適切な薬学的キャリア
を、静脈内投与、動脈内投与、リンパ循環投与、腹腔内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、関節空間投与または肺投与に適した形態で含有する、薬学的組成物。
【請求項２３】
請求項１５に記載の抗体、および
適切な薬学的キャリア
を、静脈内投与、動脈内投与、リンパ循環投与、腹腔内投与、経皮投与、皮下投与、筋肉内投与、関節空間投与または肺投与に適した形態で含有する、薬学的組成物。
【請求項２４】
肺塞栓症、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、深静脈血栓症、冠状動脈バイパス手術、および人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術からなる群より選択される状態における血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２５】
肺塞栓症、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、深静脈血栓症、冠状動脈バイパス手術、および人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術からなる群より選択される状態における血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項５に記載の抗体。
【請求項２６】
肺塞栓症、一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）、深静脈血栓症、冠状動脈バイパス手術、および人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術からなる群より選択される状態における血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項１５に記載の抗体。
【請求項２７】
バルーン血管形成術、冠状動脈内じゅく腫切除術およびレーザー血管形成術により行なわれる血管形成術手順からなる群より選択される手順において、血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項１に記載のペプチド。
【請求項２８】
バルーン血管形成術、冠状動脈内じゅく腫切除術およびレーザー血管形成術により行なわれる血管形成術手順からなる群より選択される手順において、血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項５に記載の抗体。
【請求項２９】
バルーン血管形成術、冠状動脈内じゅく腫切除術およびレーザー血管形成術により行なわれる血管形成術手順からなる群より選択される手順において、血栓症を予防するための処置のための医薬としての使用のための、請求項１５に記載の抗体。
【請求項３０】
血栓形成の障害を処置または予防するために被験体を処置するための組成物であって、該障害は、
肺塞栓症における血栓症、
一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）における血栓症、
深静脈血栓症における血栓症、
冠状動脈バイパス手術における血栓症、
人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術における血栓症
からなる群より選択され、該組成物は、
請求項１に記載のペプチド
を含む、組成物。
【請求項３１】
血栓形成の障害を処置または予防するために被験体を処置するための組成物であって、該障害は、
肺塞栓症における血栓症、
一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）における血栓症、
深静脈血栓症における血栓症、
冠状動脈バイパス手術における血栓症、
人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術における血栓症
からなる群より選択され、該組成物は、
請求項５に記載の抗体
を含む、組成物。
【請求項３２】
血栓形成の障害を処置または予防するために被験体を処置するための組成物であって、該障害は、
肺塞栓症における血栓症、
一過性脳虚血発作（ＴＩＡ）における血栓症、
深静脈血栓症における血栓症、
冠状動脈バイパス手術における血栓症、
人工弁または人工管を、自系、非自系または合成の管移植片に挿入するための手術における血栓症
からなる群より選択され、該組成物は、
請求項１５に記載の抗体
を含む、組成物。
【国際調査報告】
2008501305.tif 000013