(57)【要約】  本発明は、感染性自己増殖性組換えパラミクソウイルスを提供する。組換えパラミクソウイルスは、一つまたは複数の減弱化変異を有するのが好ましい。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、別個のＰタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチド、および別個のＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、少なくとも一つの温度感受性変異と一つの非温度感受性変異とを有する。さらに、本明細書に記載するように、組換えパラミクソウイルスを使用するための組成物および方法も提供する。
2008537683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む、部分または完全ポリ六量体ゲノムまたはアンチゲノムを有する、パラミクソウイルス亜科の感染性自己増殖性組換えパラミクソウイルス。
【請求項２】
さらに、主要なヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｐ）、および大型のポリメラーゼタンパク質（Ｌ）を含む、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３】
パラミクソウイルスが、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）である、請求項３に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４】
ＨＰＩＶがＨＰＩＶ２である、請求項３に記載の組換えパラミクヨウイルス。
【請求項５】
表現型が減弱されている、請求項１〜４に記載の組換えパラミクヨウイルス。
【請求項６】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドが、遺伝子転写終止シグナル、遺伝子間転写シグナル、および遺伝子転写開始シグナルを含む非翻訳ポリヌクレオチドスペーサー配列によって分離されている、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項７】
前記スペーサー配列がＶ  ＯＲＦの上流にある、請求項６に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項８】
前記遺伝子転写開始シグナルがシス作動性である、請求項６に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項９】
前記遺伝子転写開始シグナルが、位置６ｎ＋１に第１のアデノシンを含む、請求項８に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１０】
Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドが、変異体Ｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列が、感染宿主でインターフェロンの産生を妨害し、またはその受容体によってシグナル伝達を妨害する、Ｖタンパク質の能力を阻害する変異を含む、請求項１０に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１２】
表現型が減弱されている、請求項５に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１３】
Ｖタンパク質が、配列番号３の位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２に相当するアミノ酸残基または残基間に、あるいは１７４〜２２５のアミノ酸のいずれか一つに、一個または複数のアミノ酸置換を含む、請求項１１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１４】
ゲノムの３’末端にＶ遺伝子をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを置く、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１５】
変異がアミノ酸置換または欠失である、請求項１１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１６】
Ｖタンパク質が、配列番号３に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１０に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１７】
アンチゲノムが、配列番号１に少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１８】
アンチゲノムが、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１９】
減弱化変異である少なくとも一個の追加の変異を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項２０】
前記少なくとも一個の追加の減弱化変異が、変異を特定するコドンの少なくとも２個を変化させることによって安定している、請求項１９に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項２１】
減弱化表現型が、野生型と比較して約３７℃以上でin vitroで減弱される、請求項１９または２０に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項２２】
哺乳動物で複製が減弱される、請求項１９〜２１のいずれかに記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項２３】
哺乳動物が、ハムスター、サル、またはヒトである、請求項２２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項２４】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドが、ヘプタグアノシン配列を有するｍＲＮＡ編集部位を含む、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項２５】
ｍＲＮＡ編集部位が、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項２４に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項２６】
Ｐ遺伝子のｍＲＮＡの編集が阻害されるように、ヘプタグアノシン配列を置換する、請求項２４に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項２７】
前記置換が配列番号８のＧ９Ａ、Ｇ１２Ａ、およびＧ１５Ｔである、請求項２６に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項２８】
Ｐタンパク質のカルボキシ末端部分をコードするヌクレオチド配列がインフレームになるように、ｍＲＮＡ編集部位に一個または複数のヌクレオチドを挿入する、請求項２４に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項２９】
２個のヌクレオチドが、配列番号１のヌクレオチド位置２４８７の後に挿入されている、請求項２８に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３０】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドが、一個または複数のヌクレオチド置換を有するＰ  ＯＲＦを含み、該置換が、重複するＶ  ＯＲＦ読み枠に一個または複数の終止コドンを導入するが、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドによってコードされているＰタンパク質のアミノ酸配列は変化させない、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３１】
Ｐ  ＯＲＦが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項３０に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３２】
Ｐタンパク質が、配列番号１５のアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３３】
Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドが、ヘプタグアノシン配列を有するｍＲＮＡ編集部位を含む、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３４】
ｍＲＮＡ編集部位が、配列番号８のヌクレオチド配列を含む、請求項３３に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３５】
Ｖタンパク質ｍＲＮＡをコードするポリヌクレオチドの編集が阻害されるように、ヘプタグアノシン配列を置換する、請求項３３に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３６】
前記置換が、配列番号８のＧ９ＡおよびＧ１２Ｃである、請求項３５に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３７】
Ｎタンパク質が、配列番号１６に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３８】
Ｐタンパク質が、配列番号１５に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項３９】
Ｌタンパク質が、配列番号１７に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４０】
ゲノムまたはアンチゲノムが、一つまたは複数の減弱化変異を含む、請求項２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４１】
減弱化変異の少なくとも一つが温度感受性（ｔｓ）である、請求項４０に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４２】
減弱化変異が、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬタンパク質の位置４６０、９４８、１５６６、１７２４、または１７２５に相当する一個または複数のアミノ酸残基にアミノ酸置換または欠失を含む、請求項４１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４３】
前記置換が、Ｆ４６０Ｌ、Ｆ４６０Ａ、またはＦ４６０Ｐを含む、請求項４２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４４】
前記置換が、Ｙ９４８Ａ、Ｙ９４８Ｌ、またはＹ９４８Ｇを含む、請求項４２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４５】
前記置換がＬ１５６６Ｉを含む、請求項４２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４６】
前記置換がＳ１７２４Ｉを含む、請求項４２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４７】
位置１７２４および１７２５のアミノ酸残基が欠失している、請求項４２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４８】
Ｓ１７２４およびＴ１７２５が欠失している、請求項４７に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項４９】
減弱化変異が、配列番号１８の核酸配列を有する３’リーダー配列の位置１５に相当する位置に核酸置換を含む、請求項４０に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項５０】
前記置換がＴ１５Ｃを含む、請求項４９に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項５１】
ゲノムまたはアンチゲノムが、異種病原体の一個または複数の抗原決定基をコードする、一個または複数の過剰な異種ポリヌクレオチドまたはゲノムセグメントを含む、請求項１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項５２】
異種病原体が、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、麻疹ウイルス、下位群Ａまたは下位群Ｂ呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブニアウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス属、ヒトメタニューモウイルス、またはインフルエンザウイルスを含む、請求項５１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項５３】
前記抗原決定基が麻疹ＨＡを含む、請求項５１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項５４】
前記抗原決定基がＨＰＩＶ１  ＨＮまたはＦを含む、請求項５１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項５５】
表現型が減弱されている、請求項５１〜５４のいずれかに記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項５６】
感染性自己増殖性組換えパラミクソウイルスを生成する方法であって、
（ａ）細胞中で
（ｉ）請求項１〜５５のいずれかに記載の、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む部分または完全ポリ六量体パラミクソウイルスゲノムまたはアンチゲノムを含む発現ベクターと、
（ｉｉ）Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、およびＬポリメラーゼをコードする、一個または複数のポリヌクレオチドを含む一個または複数のベクターと
を同時発現させるステップ、および
（ｂ）ウイルスが複製できる条件下で該細胞をインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項５８】
形質を導入した細胞を約３２℃でインキュベートする、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
形質を導入した細胞が、ＨＥｐ−２細胞、ベロ細胞、またはＬＬＣ−ＭＫ２細胞である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６０】
パラミクソウイルスが、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
ＰＩＶが、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＨＰＩＶがＨＰＩＶ２である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記アンチゲノムが、配列番号１に少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６４】
前記アンチゲノムが、配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドが、配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６６】
Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドが、配列番号３のヌクレオチド配列を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項６７】
Ｌタンパク質（配列番号１７）の位置４６０または９４８に相当する一個または複数のアミノ酸残基に一個のアミノ酸置換を含む、組換え感染性変異体ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ＨＰＩＶ２）であって、
（ａ）位置４６０がＡまたはＰで置換され、
（ｂ）位置９４８がＡ、Ｌ、またはＧで置換され、または
（ｃ）位置１７２４がＩで置換されている
組換え感染性変異体ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ＨＰＩＶ２）。
【請求項６８】
温度感受性表現型を有する、請求項６７に記載の組換えＨＰＩＶ２。
【請求項６９】
３’リーダー（配列番号１８）の位置１５に相当する位置に核酸置換を含む減弱化変異を含む、感染性組換え変異体ヒトパラインフルエンザウイルス２型（ＨＰＩＶ２）。
【請求項７０】
温度感受性表現型を有しない、請求項６９に記載の組換えＨＰＩＶ２。
【請求項７１】
宿主範囲制限表現型を有する、請求項６９に記載の組換えＨＰＩＶ２。
【請求項７２】
ハムスターで複製するが、アフリカミドリザルでは複製しない、請求項７０に記載の組換えＨＰＩＶ２。
【請求項７３】
前記置換がＴ１５Ｃを含む、請求項７０に記載の組換えＨＰＩＶ２。
【請求項７４】
さらに、３’リーダー中に、該３’リーダー（配列番号１８）の位置１５に相当する位置に核酸置換を含む減弱化変異を含む、請求項６７に記載の組換えＨＰＩＶ２。
【請求項７５】
３’リーダー中の減弱化変異が温度感受性ではない、請求項７４に記載の組換えＨＰＩＶ２。
【請求項７６】
宿主範囲制限を有する、請求項７４に記載の組換えＨＰＩＶ２。
【請求項７７】
ハムスターで複製するが、アフリカミドリザルでは複製しない、請求項７６に記載の組換えＨＰＩＶ２。
【請求項７８】
前記置換がＴ１５Ｃを含む、請求項７３に記載の組換えＨＰＩＶ２。
【請求項７９】
感染性自己増殖性組換えパラミクソウイルスを生成する方法であって、
（ａ）細胞中で
（ｉ）請求項６７または６９に記載のＨＰＩＶ２をコードする部分または完全ポリ六量体ゲノムまたはアンチゲノムを含む発現ベクターと、
（ｉｉ）Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、およびＬポリメラーゼをコードする、一個または複数のポリヌクレオチドと
を同時発現させるステップ、および
（ｂ）ウイルスが複製できる条件下で該細胞をインキュベートするステップ
を含む方法。
【請求項８０】
形質を移入した細胞を約３２℃でインキュベートする、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
形質を移入した細胞が、ＨＥｐ−２細胞、ベロ細胞、またはＬＬＣ−ＭＫ２細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８２】
免疫原有効量の請求項１〜７８のいずれか一項に記載のパラミクソウイルスと生理学的に受容可能な担体とを含む組成物。
【請求項８３】
さらにアジュバントを含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８４】
２種以上の血清型から得たパラミクソウイルスを含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８５】
前記血清型の少なくとも一つが、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、またはＨＰＩＶ４である、請求項８４に記載の組成物。
【請求項８６】
２種以上の株から得たパラミクソウイルスを含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項８７】
パラミクソウイルスがＨＰＩＶ２である、請求項８６に記載の組成物。
【請求項８８】
少なくとも一つの株がＶ９４、Ｖ９８、またはＧｒｅｅｒである、請求項８７に記載の組成物。
【請求項８９】
２属以上から得たパラミクソウイルスを含む、請求項８２に記載の組成物。
【請求項９０】
少なくとも１つの属がルブラウイルス属である、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
ＨＰＩＶ２を含む、請求項９０に記載の組成物。
【請求項９２】
請求項８２〜９１のいずれかに記載の組成物を投与するステップを含む、哺乳動物で免疫応答を誘発する方法。
【請求項９３】
免疫応答によって抗ＰＩＶ抗体が産生される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記抗ＰＩＶ抗体が保護性である、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記抗体がＩｇＡである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
免疫応答によって、過剰遺伝子またはゲノムセグメントによってコードされる異種病原体の一個または複数の抗原決定基に結合する抗体が産生される、請求項９２に記載の方法。
【請求項９７】
前記異種病原体が、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、麻疹ウイルス、下位群Ａまたは下位群Ｂ呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブニアウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス属、ヒトメタニューモウイルス、またはインフルエンザウイルスを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記抗原決定基が麻疹ＨＡを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項９９】
前記抗原決定基がＨＰＩＶ１  ＨＮまたはＦを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１００】
前記抗原決定基がＨＰＩＶ３  ＨＮまたはＦを含む、請求項９６に記載の方法。
【請求項１０１】
抗体が保護性である、請求項９６〜１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
請求項８２〜９１に記載の組成物を投与するステップを含む、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）感染を阻害する方法。
【請求項１０３】
ＰＩＶがＨＰＩＶ２である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０４】
組成物が抗ＰＩＶ抗体を誘発する、請求項１００または１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記抗ＰＩＶ抗体が保護性である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記抗体がＩｇＡである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
感染性自己増殖性パラミクソウイルスを生成する方法であって、
（ａ）パラミクソウイルスのウイルスゲノムまたはアンチゲノムから、ＰおよびＶタンパク質をコードするバイシストロン性ポリヌクレオチドを除去するステップ、および
（ｂ）Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを挿入するステップであって、Ｐタンパク質をコードするｍＲＮＡの編集が阻害されるように、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドが変異したｍＲＮＡ編集部位を含み、Ｖタンパク質をコードするｍＲＮＡの編集が阻害されるように、Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドが変異したｍＲＮＡ編集単位を含むステップ
を含む方法。
【請求項１０８】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドが、遺伝子転写終止シグナル、遺伝子間転写シグナル、および遺伝子転写開始シグナルを含む非翻訳ポリヌクレオチドスペーサー配列によって分離されている、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
除去ステップが、
（ａ）認識配列が前記バイシストロン性ポリヌクレオチドに隣接するように、前記ゲノムまたはアンチゲノムに特有の制限酵素認識配列を導入するステップ、および
（ｂ）前記バイシストロン性ポリヌクレオチドに隣接する制限部位で、前記ゲノムを切断する一種または複数の制限酵素によって前記ゲノムを消化するステップ
を含む、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
挿入ステップが
（ａ）前記切断された制限部位に、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを挿入するステップ、および
（ｂ）前記ゲノムまたはアンチゲノムを再ライゲートするステップ
を含む、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
パラミクソウイルスが減弱されている、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１１２】
少なくとも一つの温度感受性変異と少なくとも一つの非温度感受性変異とを含み、少なくとも一つの非温度感受性変異が、３’リーダー（配列番号１８）の位置１５に相当する位置に核酸置換を含む、パラミクソウイルス亜科の感染性自己増殖性組換えパラミクソウイルス。
【請求項１１３】
温度感受性変異が、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬタンパク質の位置４６０、９４８、１５６６、１７２４、または１７２５に相当する一個または複数のアミノ酸残基に、一個のアミノ酸置換または欠失を含む、請求項１１２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１１４】
前記置換が、Ｆ４６０Ｌ、Ｆ４６０Ａ、またはＦ４６０Ｐを含む、請求項１１２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１１５】
前記置換がＹ９４８Ｈ、Ｙ９４８Ａ、Ｙ９４８Ｌ、またはＹ９４８Ｇを含む、請求項１１２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１１６】
前記置換がＬ１５６６Ｉを含む、請求項１１２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１１７】
前記置換がＳ１７２４Ｉを含む、請求項１１２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１１８】
位置１７２４および１７２５のアミノ酸残基が欠失している、請求項１１２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１１９】
Ｓ１７２４およびＴ１７２５が欠失している、請求項１１８に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１２０】
パラミクソウイルスが、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む、部分または完全ポリ六量体ゲノムまたはアンチゲノムを有する、請求項１１２〜１１９に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１２１】
Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドが、変異体Ｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する、請求項１２０に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１２２】
前記ヌクレオチド配列が、感染宿主でインターフェロンの産生を妨害し、またはその受容体によってシグナル伝達を妨害する、Ｖタンパク質の能力を阻害する変異を含む、請求項１２１に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１２３】
Ｖタンパク質が、配列番号３の位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２に相当するアミノ酸残基に、または１７４〜２２５のアミノ酸のいずれか一つに、一個または複数のアミノ酸置換を含む、請求項１２２に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１２４】
変異がアミノ酸置換または欠失である、請求項１２２または１２３に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１２５】
Ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、配列番号３に少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１２０〜１２４のいずれか一項に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１２６】
前記アンチゲノムが、配列番号１に少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１１２〜１２５に記載の組換えパラミクソウイルス。
【請求項１２７】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドを含む、部分的ポリ六量体パラミクソウイルスゲノムまたはアンチゲノムを有するベクター。
【請求項１２８】
Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む、部分的ポリ六量体パラミクソウイルスゲノムまたはアンチゲノムを有するベクター。
【請求項１２９】
配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを含む単離した核酸。
【請求項１３０】
配列番号２の配列を有するポリヌクレオチドを含む単離した核酸。
【請求項１３１】
配列番号３の配列を有するポリヌクレオチドを含む単離した核酸。
【請求項１３２】
配列番号４５の配列を有するＶポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離した核酸。
【請求項１３３】
配列番号１７の配列を有するＬポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離した核酸。
【請求項１３４】
請求項１２８〜１３２のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１３５】
ポリヌクレオチドの発現に適切な条件下で、請求項１２８〜１３２のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含む宿主細胞を培養するステップを含む、パラミクヨウイルスポリペプチドを生成する方法。
【請求項１３６】
配列番号４５の配列を有するポリペプチドの位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２に相当する１つのアミノ酸残基に、またはそれらを混合した残基に、少なくとも一つの変異を含む、単離したＶポリペプチド。
【請求項１３７】
配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬタンパク質の位置４６０、９４８、１５６６、１７２４に相当するアミノ酸残基に少なくとも一つの変異を含む、単離したＬポリペプチド。
【請求項１３８】
位置４６０がＡまたはＰで置換されている変異、位置９４８がＡ、Ｌ、またはＧで置換されている変異、または位置１７２４がＩで置換されている変異の一つまたは複数を含む、請求項１３６に記載の単離したＬポリペプチド。
【請求項１３９】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４０】
Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項１４１】
配列番号１の配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸を含むベクター。
【請求項１４２】
配列番号２の配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸を含むベクター。
【請求項１４３】
配列番号３の配列を有するポリヌクレオチドを含む核酸を含むベクター。
【請求項１４４】
配列番号４５の配列を有するＶポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むベクター。
【請求項１４５】
配列番号１７の配列を有するＬポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含むベクター。
【請求項１４６】
Ｎポリペプチド、配列番号１７の配列を有するＬポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、またはＰポリペプチド、あるいはそれらの混合物をコードするポリヌクレオチドを含む、一個または複数の核酸を含むベクター。
【請求項１４７】
さらに、Ｍタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、請求項１４６に記載のベクター。
【請求項１４８】
さらに、ＨＮタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、請求項１４７に記載のベクター。
【請求項１４９】
さらに、Ｆタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む核酸を含む、請求項１４８に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、本発明の感染性パラミクソウイルスクローンをコードするポリヌクレオチド、およびその感染性クローンを含む宿主細胞、ならびに組換え法によるそのようなベクターおよび宿主細胞の生成方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
連邦が支援する研究開発下でなされた発明に対する権利宣言
本発明の開発中に実施された研究の一部は、保健社会福祉省国立アレルギー感染症研究所下、米国政府基金を利用した。
【０００３】
ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）は、ウイルスのパラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科メンバーである。パラミクソウイルスは、細胞質および原形質膜にある芽で複製され、約１３〜１９ｋｂの一本鎖負センスの区分化されていないＲＮＡゲノムを有するエンベロープウイルスである。ＨＰＩＶは、ヒト集団で重大な病原体であり、乳幼児で重篤な下気道感染を引き起こす。ヒトパラインフルエンザウイルス１型（ＨＰＩＶ１）および２型（ＨＰＩＶ２）は、喉頭気管気管支炎（クループ）の主要な病原体であり、また肺炎および気管支炎の原因でもある（Chanockら, 2001, Parainfluenza Viruses 第４版, Knipeら編, Lippincott (Philadelphia, PA) 1341-1379）。ヒトパラインフルエンザウイルス３型（ＨＰＩＶ３）は、乳幼児でウイルス性下気道疾患による入院の主要原因である（上記Chanockら、2001）。ＨＰＩＶは、成人の気道疾患の重大な原因でもある。集合的に、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、およびＨＰＩＶ３は、病原体として小児呼吸器疾患入院の約１８％を原因であることが確認されている（Murphyら, 1988, Virus Res., 11:1-15）。ＨＰＩＶはまた、中耳炎の小児でのウイルスにより誘発された中耳浸出事例の高い割合に関与している（Heikkinenら, 1999, N. Engl. J. Med., 340:260-264）。
【０００４】
相当な努力にもかかわらず、現在、利用できるパラインフルエンザウイルスワクチンはない。ワクチン使用に適当な減弱されたパラミクソウイルスは現在開発中である。現在、野生型ＨＰＩＶ３  ＪＳ株およびウシＰＩＶ３株の温度感受性（ｔｓ）誘導体である、２種の減弱された生ＨＰＩＶ３ワクチン候補が試験されている（Karronら, Pediatric Infectious Dis. J., 15:650, 1996；Karronら, J. Infect. Dis., 171:1107, 1995；Karronら, J. Infect. Dis., 172:1445, 1995）。ＰＩＶ３全長ｃＤＮＡのＰＩＶ１の読み枠で、ＰＩＶ３  ＨＮおよびＦの読み枠を置換することによって、キメラＰＩＶ１ワクチン候補が生成されている（Taoら、2000a）。ＨＰＩＶ２の糖タンパクを有するキメラＨＰＩＶ３もまた、既に開発されている（Taoら、2000b）。既に、減弱されたＨＰＩＶ２株は、Ｌタンパク質に変異を導入することによって作製されている（国際公開第０４／０２７０３７号）。組換えウイルスには、Ｌ遺伝子に３個の同定された変異を有するＨＰＩＶ３組換えウイルスが含まれる。（Skiadopoulosら, J Virol. 72:1762, 1998；Taoら, J Virol. 72:2955, 1998；Taoら, Vaccine, 17:1100, 1999）。数頭の実験動物モデルで、これらの減弱された生ワクチン候補はＨＰＩＶ感染に対して保護を誘発することができる。（Karronら, J Infect. Dis., 172:1445, 1995b；Skiadopoulosら, Vaccine 18:503, 1999；Skiadopoulos, Virology, 297: 136, 2002）。しかし、以前のＨＰＩＶ３感染に対する免疫によって、異種ＨＰＩＶ１またはＨＰＩＶ２糖タンパクを有するキメラＨＰＩＶ３ワクチンの使用が制限される恐れがある。生ウイルスワクチンを開発するための作戦は、安全かつ安定したウイルスワクチン候補を設計する際に重要である。
【０００５】
パラインフルエンザウイルス感染および疾患からの保護が可能なワクチン候補の提供に加えて、候補ワクチンもまた、異種抗原の発現に有用でありうる。外来遺伝子がパラミクソウイルスゲノムに挿入可能であり、そして良好に発現することは研究によって実証されている。（Bukereyevら, J. Virol., 70:6634, 1996；Hassanら, Virology, 237:249, 1997；Jinら, Virology 251:206, 1998；Schmidtら, 2001; Skiadopoulosら, 2002）。しかし、ワクチン使用に向けてベクターを開発するためには、高レベルを超えるタンパク質の発現が必要になる。異種抗原を送達するためのベクターを設計する際の要素には、ウイルス宿主範囲、免疫原性、および病原性が含まれる。数種の負の鎖のウイルスは、麻疹および狂犬病ウイルスなど、その病原性のためにベクターとして望ましくない。
【特許文献１】国際公開第０４／０２７０３７号
【非特許文献１】Chanockら, 2001, Parainfluenza Viruses第４版, Knipeら編， Lippincott (Philadelphia, PA) 1341-1379
【非特許文献２】Murphyら, 1988, Virus Res., 11:1-15
【非特許文献３】Heikkinenら, 1999, N. Engl. J. Med., 340:260-264
【非特許文献４】Karronら, Pediatric Infectious Dis. J., 15:650, 1996
【非特許文献５】Karronら, J. Infect. Dis., 171:1107, 1995
【非特許文献６】Skiadopoulosら, J Virol. 72:1762, 1998
【非特許文献７】Taoら, J Virol. 72:2955, 1998
【非特許文献８】Taoら, Vaccine, 17:1100, 1999
【非特許文献９】Karronら, J Infect. Dis., 172:1445, 1995b
【非特許文献１０】Skiadopoulosら, Vaccine 18:503, 1999
【非特許文献１１】Skiadopoulos, Virology, 297: 136, 2002
【非特許文献１２】Bukereyevら, J. Virol., 70:6634, 1996
【非特許文献１３】Hassanら, Virology, 237:249, 1997
【非特許文献１４】Jinら, Virology 251:206, 1998
【非特許文献１５】Kolakofskyら, J.Virol. 72, 891-899, 1998
【非特許文献１６】Chancockら, Parainfluenza Viruses, Knipeら (編), pp. 1341-1379, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001
【非特許文献１７】Katoら, 1997, Embo J., 16(3):578-587
【非特許文献１８】Delendaら, 1997, Virology, 228(1):55-62
【非特許文献１９】Durbinら, 1999, Virology, 261(2):319-330
【非特許文献２０】Kawanoら, 2001, Virology, 284(1):99-112
【非特許文献２１】Heら, 2002, Virology, 303(1):15-32
【非特許文献２２】Parkら, 2003, J. Virol., 77(17):9522-9532
【非特許文献２３】Zollerら, 1987, Nucl. Acids Res., 10: 6487-6500
【非特許文献２４】Wellsら, 1985, Gene, 34:315
【非特許文献２５】Wellsら, 1986, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415
【非特許文献２６】Sambrook,ら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY
【非特許文献２７】Davisら, 1986, Basic Methods in Molecular Biology
【非特許文献２８】(CalainおよびRoux, 1993; Kolakofskyら, 1998
【非特許文献２９】Skiadopoulosら, 2003, J. Virol., 77:270-279
【非特許文献３０】Durbin etal., Virology 235: 323-332,1997
【非特許文献３１】Durbinら, Virology 234: 74-83,1997
【非特許文献３２】Elroy- Steinら , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 6126-30, 1989
【非特許文献３３】Moellerら, J. Virol. 75: 7612-20, 2001
【非特許文献３４】Schmidtら , J. Virol. 74: 8922-9, 2000
【非特許文献３５】Skiadopoulosら, 1999, Virology, 260:125-35
【非特許文献３６】Hallら, 1992, Virus Res., 22:173-184
【非特許文献３７】Skiadopoulosら, 1999, Vaccine, 18:503-510
【非特許文献３８】Skiadopolousら, 2003, J. Virol., 77:270-279
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
従って、ＨＰＩＶウイルスおよび他の病原体に付随する健康状態の問題を緩和し、複数のＨＰＩＶ血清型に対してを免疫化するのに有効な免疫原性組成物を開発する必要性が残されている。また、異種抗原を送達するために免疫原性組成物を開発する必要もある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、感染性自己増殖性組換えパラミクソウイルス（ＰＩＶ）、本発明のパラミクソウイルスの製造方法、およびその使用を提供する。本発明のＰＩＶは、減弱された表現型をもたらす一つまたは複数のアミノ酸または核酸変異を有することができる。いくつかの実施形態では、挿入し、または欠失させるヌクレオチド数は、変異体ウイルスゲノムの総ヌクレオチド数を６で割り切れるようにするものである（「６の法則」として知られている）。その変異は、変異を特定するコドンの少なくとも２個を変化させることによって安定化できる。本発明のＰＩＶは、例えばＨＰＩＶ２など、ヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）であってよい。一実施形態では、本発明のＰＩＶは、配列番号１に少なくとも８０％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
【０００８】
本発明のＰＩＶは、Ｐタンパク質、Ｖタンパク質、主要なヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、および／または大型のポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質を含むことができる。それらのタンパク質は、変異体でも、または自然のものであってもよい。一実施形態では、Ｐタンパク質は、配列番号１５に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一実施形態では、Ｖタンパク質は、配列番号４５に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一実施形態では、Ｎタンパク質は、配列番号１６に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。一実施形態では、Ｌタンパク質は、配列番号１７に少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０００９】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＩＶは、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む、部分または完全ポリ六量体ゲノムまたはアンチゲノムを有する。好ましくは、Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含むＰＩＶは減弱された表現型を有する。Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドは、非翻訳ポリヌクレオチドスペーサー配列によって分離してよく、任意により別個のベクターに乗せることができる。いくつかの実施形態では、その非翻訳スペーサーは、遺伝子転写終止シグナル、遺伝子間転写シグナル、および遺伝子転写開始シグナルを含む。非翻訳スペーサーはＶ  ＯＲＦの上流にあってもよい。
【００１０】
Ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、感染宿主でインターフェロンの産生を妨害し、またはその受容体によってシグナル伝達を妨害する、Ｖタンパク質の能力を阻害する変異を含む、変異体Ｖタンパク質をコードすることができる。その変異は、アミノ酸または核酸の置換または欠失であってよい。好ましくは、挿入し、または欠失させるヌクレオチド数は、変異体ウイルスゲノムの総ヌクレオチド数を６で割り切れるようにするものである。変異は、変異を特定するコドンの少なくとも２個を変化させることによって安定化できる。いくつかの実施形態では、Ｖタンパク質は、配列番号４５の位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２に相当するアミノ酸残基に、もしくはそれらを混合した残基に、または残基間に、あるいは１７４〜２２５のアミノ酸のいずれか一つに、一個または複数のアミノ酸置換を含む。Ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヘプタグアノシン配列を有するｍＲＮＡ編集部位を含んでよい。Ｖ遺伝子ｍＲＮＡの編集が阻害されるように、ヘプタグアノシン配列を置換することができる。
【００１１】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドは、一個または複数のヌクレオチドが置換されているＰ  ＯＲＦを含んでよいが、その際、その置換は、重複するＶ  ＯＲＦ読み枠に一個または複数の終止コドンを導入するが、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドによってコードされているＰタンパク質のアミノ酸配列は変化させない。Ｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ヘプタグアノシン配列を有するｍＲＮＡ編集部位を含んでよい。Ｐタンパク質のカルボキシ末端をコードするヌクレオチド配列がインフレームになるように、ｍＲＮＡ編集部位中に一個または複数のヌクレオチドを挿入することができる。Ｐ遺伝子のｍＲＮＡの編集が阻害されるように、ヘプタグアノシン配列を置換することができる。
【００１２】
本発明はまた、ポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの使用法も含む。いくつかの実施形態では、単離した核酸は、配列番号１のポリヌクレオチドに少なくとも８０％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む。他の実施形態では、単離した核酸は、配列番号２の配列を有するポリヌクレオチドを含む。別の実施形態では、単離した核酸は、配列番号３の配列を有するポリヌクレオチドを含む。本発明は、配列番号４５のＶポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離した核酸を含む。他の実施形態は、配列番号１７のポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む単離した核酸を含む。本発明は、それらのポリヌクレオチドのいずれかと、部分もしくは完全ゲノムまたはアンチゲノムを含むベクターも含む。また、本明細書に記載したポリヌクレオチドのいずれかを含む宿主細胞を培養することによって、パラミクソウイルスポリペプチドを産生する方法も提供する。
【００１３】
本発明の別の態様は、パラミクソウイルスポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、単離したＶポリペプチドは、配列番号４５の位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２に相当する１つのアミノ酸残基に、またはそれらを混合した残基に少なくとも一つの変異を含む。他の実施形態では、単離したＬポリペプチドは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬタンパク質の位置４６０、９４８、１５６６、１７２４に相当するアミノ酸残基に、またはそれらを混合した残基に少なくとも一つの変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｌタンパク質は、位置４６０がＡまたはＰで置換されている置換、位置９４８がＡ、Ｌ、またはＧで置換されている置換、または位置１７２４がＩで置換されている置換の一つまたは複数を含む。
【００１４】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＩＶは一つまたは複数の減弱化変異を含む。減弱化変異は温度感受性であってよい。一つまたは複数の温度感受性変異を含む本発明のＰＩＶの複製は、野生型ＰＩＶと比較してin vitroで約３７℃以上で減弱される。温度感受性変異は、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬタンパク質の位置４６０、９４８、１５６６、１７２４、または１７２５に相当する一個または複数のアミノ酸残基のアミノ酸置換または欠失を含むことができる。一実施形態では、その置換は、Ｆ４６０Ｌ、Ｆ４６０Ａ、またはＦ４６０Ｐを含む。一実施形態では、その置換は、Ｙ９４８Ａ、Ｙ９４８Ｌ、またはＹ９４８Ｇを含む。一実施形態では、その置換はＬ１５６６Ｉを含む。一実施形態では、その置換はＳ１７２４Ｉを含む。一実施形態では、位置１７２４および１７２５のアミノ酸残基が欠失している。
【００１５】
減弱化変異は、非温度感受性であってよい。非温度感受性変異は、配列番号１８の核酸配列を有する３’リーダー配列の位置１５に相当する位置に核酸置換を含むことができる。一実施形態では、その置換はＴ１５Ｃを含む。好ましい実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、位置１５にＣを有するポリヌクレオチドを含むが、その位置にＴを有する検出可能ウイルスはほとんど、またはまったく含まない。非温度感受性変異によって宿主範囲を限定することができる。一実施形態では、本発明のＰＩＶはハムスターで複製するが、アフリカミドリザルでは複製しない。
【００１６】
本発明のＰＩＶは、少なくとも一つの温度感受性変異と少なくとも一つの非温度感受性変異とを含むことができる。一実施形態では、温度感受性変異の少なくとも一つは、配列番号１７のアミノ酸配列を有するＬタンパク質の位置４６０、９４８、１５６６、１７２４、または１７２５に相当する一個または複数のアミノ酸残基、あるいはそれらを混合した残基のアミノ酸置換または欠失を含み、非温度感受性変異の少なくとも一つは、配列番号１８の核酸配列を有する３’リーダー配列の位置１５に相当する位置に核酸置換を含む。好ましい実施形態では、組換えパラミクソウイルスは、位置１５にＣを有するポリヌクレオチドを含むが、その位置にＴを有する検出可能なウイルスは含まない。
【００１７】
いくつかの実施形態では、本発明のＰＩＶは、異種病原体の一個または複数の抗原決定基をコードする、一個または複数の過剰な異種ポリヌクレオチドまたはゲノムセグメントを含む。その異種病原体は、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、麻疹ウイルス、下位群Ａまたは下位群Ｂ呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブニアウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス属、ヒトメタニューモウイルス、またはインフルエンザウイルスを含むことができる。一実施形態では、その抗原決定基は麻疹ＨＡ、ＨＰＩＶ１  ＨＮ、またはＨＰＩＶ１  Ｆを含む。好ましくは、異種病原体の一個または複数の決定基を含む本発明のＰＩＶは減弱された表現型を有する。
【００１８】
本発明の別の態様は、本発明のＰＩＶおよびポリヌクレオチドの製造方法を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、ＰＩＶのウイルスゲノムまたはアンチゲノムから、ＰおよびＶタンパク質をコードするバイシストロン性ポリヌクレオチドを除去するステップ、ならびにＰＩＶの全長または部分ゲノムまたはアンチゲノムに、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを挿入するステップを含む。変異体Ｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドは、同じベクターまたは別個のベクターに乗せることができる。Ｐタンパク質をコードするｍＲＮＡの編集が阻害されるように、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドは、変異したｍＲＮＡ編集部位を含むことができる。Ｖタンパク質をコードするｍＲＮＡの編集が阻害されるように、Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドは、変異したｍＲＮＡ編集単位を含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドが、遺伝子転写終止シグナル、遺伝子間転写シグナル、および遺伝子転写開始シグナルを含む非翻訳ポリヌクレオチドスペーサー配列によって分離されている。
【００１９】
一実施形態では、前記除去ステップは、認識配列が、バイシストロン性ポリヌクレオチドを側置するように、ゲノムまたはアンチゲノムに特有の制限酵素認識配列を導入するステップ、およびバイシストロン性ポリヌクレオチドを側置する制限部位で、ゲノムを切断する一種または複数の制限酵素によって前記ゲノムを消化するステップを含む。一実施形態では、前記挿入ステップは、切断された制限部位に、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを挿入するステップ、および前記ゲノムまたはアンチゲノムを再ライゲートするステップを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、細胞中で、本発明のＰＩＶをコードする、部分または完全ポリ六量体ゲノムまたはアンチゲノムを含む発現ベクターと、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、およびＬタンパク質をコードする、一個または複数のポリヌクレオチドとを同時発現させるステップ、およびウイルスが複製できる条件下でその細胞をインキュベートするステップを含む。その細胞は、例えばＨｅｐ−２細胞、ベロ細胞、またはＬＬＣ−ＭＫ２細胞であってよい。
【００２１】
本発明の別の態様は、本発明のＰＩＶを含む組成物である。本発明のＰＩＶは、例えば、異種抗原を発現するための生ウイルスワクチンおよびベクターを含め、動物で免疫応答を誘発するための免疫原性組成物に有用である。本発明のＰＩＶは、複数の属、血清型、および株に対する免疫応答を誘発するための組成物で、他のＰＩＶの血清型、株、または属のウイルスと併用することができる。
【００２２】
本発明の組成物は、免疫原有効量の本発明のＰＩＶと生理学的に受容可能な担体とを含む。本発明の組成物は、さらにアジュバントを含むこともできる。一実施形態では、本発明の組成物は２種以上の血清型から得たＰＩＶを含む。好ましくは、血清型の少なくとも一つまたは複数は、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、またはＨＰＩＶ４である。ＨＰＩＶ２はＶ９４、Ｖ９８、またはＧｒｅｅｒ株であってよい。一実施形態では、本発明の組成物は、２種以上の属から得たＰＩＶを含む。好ましくは、少なくとも一つの属はルブラウイルス属である。
【００２３】
本発明の別の態様は、動物で免疫応答を誘発する方法である。一般的に、その方法は、免疫原有効量の本発明の組成物を動物に投与するステップを含む。好ましくは、免疫応答によって保護性の抗ＰＩＶ抗体が産生される。一実施形態では、その抗体はＩｇＡである。一実施形態では、免疫応答によって、本発明のＰＩＶの過剰遺伝子またはゲノムセグメントがコードする、異種病原体の一個または複数の抗原決定基に結合する抗体が産生される。その異種病原体は、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、麻疹ウイルス、下位群Ａまたは下位群Ｂ呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブニアウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス属、ヒトメタニューモウイルス、またはインフルエンザウイルスであってよい。一実施形態では、抗原決定基は麻疹ＨＡ、ＨＰＩＶ１  ＨＮ、またはＨＰＩＶ１  Ｆである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００２４】
Ｉ．定義
本明細書で使用するパラミクソウイルスは、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科パラミクソウイルスをさす。パラミクソウイルスは、ゲノムとして約１３〜１９ｋｂの負センスＲＮＡ一本鎖を有するエンベロープウイルスである。パラミクソウイルスの例には、それだけには限らないが、１、２、３、４Ａ、および４Ｂ型を含むヒトパラインフルエンザウイルス（ＨＰＩＶ）（それぞれ、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、ＨＰＩＶ４Ａ、およびＨＰＩＶ４Ｂ）、マウスパラインフルエンザ１型（センダイウイルス、ＭＰＩＶ１）、ウシパラインフルエンザウイルス３型（ＢＰＩＶ３）、サルウイルス５（ＳＶ５）、サルウイルス４１（ＳＶ４１）、および流行性耳下腺炎ウイルスが含まれる。ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、ＭＰＩＶ１、およびＢＰＩＶ３はレスピロウイルス属に分類される。ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ４、ＳＶ５、ＳＶ４１、および流行性耳下腺炎ウイルスはルブラウイルス属に分類される。ＭＰＩＶ１、ＳＶ５、およびＢＰＩＶ３は、それぞれ、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、およびＨＰＩＶ３の動物対応物である（Chancockら, Parainfluenza Viruses, Knipeら (編), pp. 1341-1379, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia, 2001）。ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、およびＨＰＩＶ３は別個の血清型を表し、有意な交差免疫を誘発しない。ＨＰＩＶは、クループ、肺炎、または気管支炎など、呼吸器感染症の病原体である。
【００２５】
「ヒトパラインフルエンザウイルス２型」または「ＨＰＩＶ２」という用語は、パラミクソウイルス亜科ヒトパラインフルエンザウイルス２型の単離物、クローン、組換え体、または変異体をさす。「天然」単離物または「野生型」ＨＰＩＶ２は、天然源から単離したウイルスであり、または天然源から単離したＨＰＩＶ２の配列を有する。天然単離物は、配列が互いに異なる。いくつかの実施形態では、本発明のＨＰＩＶ２の天然単離物はＨＰＩＶ２株Ｖ９４に対して少なくとも９０％の核酸配列同一性を有する（配列番号４；表６；Genbank受託番号ＡＦ５３３０１０）。「組換えＨＰＩＶ２」は、ＨＰＩＶゲノムまたはアンチゲノムをコードするように構築されたポリヌクレオチドから派生させたウイルスをさし、野生型または変異体ＨＰＩＶ２配列を含みうる。いくつかの実施形態では、組換えＨＰＩＶ２は発現ベクターを含む。
【００２６】
ＨＰＩＶ２ゲノムは、少なくとも７つのポリペプチドをコードする。リボヌクレオカプシドが関連するポリペプチドには、ヌクレオカプシドタンパク質（Ｎ）（表９；配列番号１６）、リンタンパク質（Ｐ）（表１０；配列番号１５）、および転写と複製を実施する大型のポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質（表１１；配列番号１７）が含まれる。他のルブラウイルス属に類似して、ＨＰＩＶ２のＰ／Ｖ遺伝子は、Ｐタンパク質をコードするｍＲＮＡを生成するための、同時転写編集が媒介する読み枠内シフトによってアクセスされる代替の読み枠（ＯＲＦ）を含む。未編集ｍＲＮＡは、Ｖタンパク質をコードする。内部マトリックスタンパク質（Ｍ）、ならびに主要な防御抗原である融合糖タンパク（Ｆ）および赤血球凝集素-ノイラミニダーゼ糖タンパク（ＨＮ）は、エンベロープに関連するタンパク質である。遺伝子順序は３’−Ｎ−Ｐ／Ｖ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５’である。ポリヌクレオチドをコードするＨＰＩＶ２は、感染したヒトまたは細胞から単離することができ、または本明細書に記載したように調製することができる。
【００２７】
ＨＰＩＶ「変異体」は、参照ウイルス配列と異なるゲノム配列を有するウイルスをさす。いくつかの実施形態では、変異体は、ヌクレオチドの付加、置換、および欠失により、そのウイルスゲノムの核酸配列を変更しまたは修飾することによって調製できる。既に説明したように、ヌクレオチドの付加または欠失によって修飾を受けた変異体は６の法則に合致するのが好ましい。いくつかの実施形態では、変異体は、宿主細胞中in vitroで、または非ヒト宿主中in vivoで、ウイルスの粒子またはゲノムを継代培養することによって得られる。いくつかの実施形態では、挿入し、または欠失させるヌクレオチド数は、変異体ウイルスゲノムの総ヌクレオチド数を６で割り切れるようにするものである（「６の法則」として知られている）。
【００２８】
いくつかの実施形態では、その変異体は変化した表現型を少なくとも一個有する。変化する表現型には、それだけには限らないが、増殖特性、減弱、温度感受性増殖、低温適応、プラークサイズ、宿主範囲制限の変化または免疫原性変化が含まれうる。いくつかの実施形態では、変異体ＨＰＩＶ２は、免疫原性であり、哺乳動物で防御抗体を誘発できる。好ましくは、ＨＰＩＶ２変異体が減弱される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、変異体ＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムは、パラミクソウイルス参照ゲノム配列またはアンチゲノム配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を有する。参照配列は、ＨＰＩＶ２株Ｖ９４（配列番号４；表６；Genbank受託番号ＡＦ５３３０１０）、ＨＰＩＶ２株Ｖ９８（配列番号５；表７；Genbank受託番号ＡＦ５３３０１１）、またはＨＰＩＶ２株Ｇｒｅｅｒ（配列番号６；表８；Genbank受託番号ＡＦ５３３０１２）であってよい。参照配列は、配列番号４の配列を有するＶ９４株であるのが好ましい。
【００３０】
いくつかの実施形態では、変異体ＨＰＩＶ２ゲノムは、ＨＰＩＶ２株Ｖ９４（配列番号４；表６）、ＨＰＩＶ２株Ｖ９８（配列番号５；表７）、ＨＰＩＶ２株Ｇｒｅｅｒ（配列番号６；表８）から得たＶ遺伝子参照ゲノム配列、または配列番号４５のアミノ酸配列を含むＶポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を有するＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドから構成される。いくつかの実施形態では、参照配列は、配列番号３のアンチゲノムポリヌクレオチド配列によってコードされていてよい。好ましくは、変異体ＨＰＩＶ２によってコードされているＶタンパク質の活性は、ＨＰＩＶ２株Ｖ９４、ＨＰＩＶ２株Ｖ９８、またはＨＰＩＶ２株ＧｒｅｅｒによってコードされているＶタンパク質と比較して低減している。
【００３１】
いくつかの実施形態では、変異体ＨＰＩＶ２ゲノムは、ＨＰＩＶ２株Ｖ９４（配列番号４；表６）、ＨＰＩＶ２株Ｖ９８（配列番号５；表７）、ＨＰＩＶ２株Ｇｒｅｅｒ（配列番号６；表８）から得たＬタンパク質をコードする参照ポリヌクレオチド配列、または配列番号１７の配列を有するＬポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を有するＬタンパク質をコードするポリヌクレオチドから構成される。好ましくは、変異体ＨＰＩＶ２によってコードされているＬタンパク質の活性は、ＨＰＩＶ２株Ｖ９４、ＨＰＩＶ株Ｖ９８、またはＨＰＩＶ２株ＧｒｅｅｒによってコードされているＬタンパク質と比較して低減している。
【００３２】
「アンチゲノム」という用語は、負センス一本鎖ウイルスＲＮＡゲノムに相補的なウイルスＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子を意味する。
【００３３】
「減弱された（attenuated）」または「ａｔｔ（減弱された）表現型」を有するパラミクソウイルスは、哺乳動物において、類似の感染条件下での参照野生型パラミクソウイルスの複製と比較して、複製が低下したパラミクソウイルスをさす。いくつかの実施形態では、減弱されたパラミクソウイルスは、哺乳動物の上気道または下気道でのウイルス力価が、同じ感染条件下で同種哺乳動物の、それぞれ、上気道または下気道での減弱されていない野生型ウイルス力価と比較して、少なくとも約１／１０以下に減少し、より好ましくは少なくとも約１／１００以下に減少し、より好ましくは少なくとも約１／１０００以下に減少している。哺乳動物の例には、それだけには限らないが、ヒト、マウス、ウサギ、ラット、例えばゴールデンハムスターなどのハムスター、および例えばサバンナモンキーなどの非ヒト霊長類が含まれる。減弱されたパラミクソウイルスは、それだけではないが、増殖、温度感受性増殖、宿主範囲限定増殖の変化またはプラークサイズの変化を含む異なる表現型を提示しうる。
【００３４】
本明細書で使用する「担体」には、使用投薬量および濃度で細胞または哺乳動物に曝露してもそれらには無害である、製薬上許容される担体、賦形剤、または安定剤が含まれる。生理学的に受容可能な担体は、ｐＨ緩衝化水溶液であることが多い。生理学的に受容可能な担体の例には、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／あるいは非イオン界面活性剤、例えば、TWEEN（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびPLURONICS（登録商標）が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用するパラミクソウイルスの「感染性クローン」は、細胞中でウイルスゲノムを増幅する複製可能ベクター中にクローン化したパラミクソウイルス単離物の全長ゲノムまたはゲノムの一部をさし、いくつかの実施形態ではウイルス粒子をもたらす。いくつかの実施形態では、パラミクソウイルスゲノムの一部は、単一複製可能ベクター中で、少なくともＮタンパク質、Ｐタンパク質、およびＬタンパク質をコードするポリ六量体核酸配列を有する。他の実施形態では、そのウイルスゲノムは全長ゲノムである。複製可能ベクターは、広範な原核および真核細胞でウイルスゲノムの導入および増幅を行う。
【００３６】
パラミクソウイルス、その成分、または他の抗原決定基の「免疫原有効量」という用語は、動物で免疫応答を誘発するパラミクソウイルス、その成分、または他の抗原決定基の量をさす。Ｔ細胞またはＢ細胞の応答を測定し、または宿主種で複製可能なウイルスにより免疫化した動物を攻撃することによって、免疫応答を定量することができる。典型的には、パラミクソウイルス、その成分、または他の抗原決定基に特異的な抗体を検出することによって免疫応答の誘発を定量する。
【００３７】
「単離した」核酸分子は、通常、天然源と関連している少なくとも一つの混入核酸分子から同定し分離した核酸分子をさす。単離した核酸は、自然に関連している全ての成分とは関連性を持たないのが好ましい。単離した核酸分子は、自然に見出される形式または設定以外のものである。
【００３８】
「モノシストロン性」ポリヌクレオチドは、唯一のタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさす。例えば、Ｖタンパク質のみをコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドは、Ｖタンパク質をコードするが、両Ｖタンパク質およびＰタンパク質はコードしない。
【００３９】
本明細書で同定した核酸配列に関する「％核酸配列同一性」は、最大％配列同一性を得るために配列を整列し、必要に応じて間隙を導入した後の、参照パラミクソウイルス核酸配列中のヌクレオチドと同一である、候補配列中のヌクレオチドの割合として定義される。いくつかの実施形態では、参照パラミクソウイルス核酸配列はＨＰＩＶ２株Ｖ９４（配列番号４）である。％核酸配列同一性の定量を目的とする配列比較は、例えば、公的に入手できるコンピューターソフトウエア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを使用し、当業者の技術内にある様々な方法で実現することができる。当業者ならば、比較する配列の全長におよぶ最大の配列比較を実現するのに必要なあらゆるアルゴリズム含め、配列比較を測定するのに適当なパラメーターを決定することができる。
【００４０】
本明細書の目的には、所与の核酸配列Ｂについて、同配列Ｂとの、または同配列Ｂ対する所与の核酸配列Ａ（あるいは、所与の核酸配列Ｂについて、同配列Ｂとの、または同配列Ｂに対してある％核酸配列同一性を有し、または含む所与の核酸配列Ａとして表すことができる）の％核酸配列同一性は以下のように算出する。
【００４１】
１００×分数Ｗ／Ｚ
式中、Ｗは、配列比較プログラムにより、そのＡとＢのプログラム配列比較で同一適合すると認められたヌクレオチド数であり、ＺはＢ中の総ヌクレオチド数である。核酸配列Ａの長さが核酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％核酸配列同一性は、Ａに対するＢの％核酸配列同一性とは等しくはならないことは理解されよう。
【００４２】
本明細書で同定したアミノ酸配列に関する「％アミノ酸配列同一性」は、最大％配列同一性を得るために配列を整列し、必要に応じて間隙を導入した後のアミノ酸残基ポリペプチド参照配列、例えば、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、Ｖタンパク質、Ｍタンパク質、Ｆタンパク質、ＨＮ、またはＬタンパク質のアミノ酸配列と同一である、候補配列中のアミノ酸残基の割合として定義される。％アミノ酸配列同一性の定量を目的とする配列比較は、例えば、公的に入手できるコンピューターソフトウエア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2、clustal V（DNASTAR）またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアを使用し、当業者の技術内にある様々な方法で実現することができる。当業者ならば、比較する配列の全長におよぶ最大の配列比較を実現するのに必要なあらゆるアルゴリズム含め、配列比較を測定するのに適当なパラメーターを決定することができる。
【００４３】
本明細書の目的には、所与のアミノ酸配列Ｂについて、同配列Ｂとの、または同配列Ｂに対する所与のアミノ酸配列Ａ（あるいは、所与のアミノ酸配列Ｂについて、同配列Ｂとの、または同配列Ｂに対してある％アミノ酸配列同一性を有し、または含む所与のアミノ酸配列Ａとして表すことができる）の％アミノ酸配列同一性は以下のように算出する。
【００４４】
１００×分数Ｘ／Ｙ
式中、Ｘは、配列比較プログラムにより、そのＡとＢのプログラム配列比較で同一適合すると認められたアミノ酸残基数であり、ＹはＢ中の総アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと等しくない場合、Ｂに対するＡの％アミノ酸配列同一性は、Ａに対するＢの％アミノ酸配列同一性と等しくはならないことは理解されよう。
【００４５】
本明細書で使用する、「安定した」パラミクソウイルスは、継代培養、感染、または選択加圧後に、参照ウイルス配列または表現型へ逆転する危険性が低いパラミクソウイルスをさす。いくつかの実施形態では、参照配列は、変化するパラミクソウイルスまたは変異体パラミクソウイルスが派生する配列である。他の実施形態では、参照配列または参照表現型は、Ｖ９４、Ｖ９８またはＧｒｅｅｒなどの野生型株のものであってよい。非野生型表現型には、それだけには限らないが、増殖特性、減弱、温度感受性増殖、低温適応、プラークサイズ、宿主範囲制限の変化、または免疫原性変化、またはそれらの混合物が含まれる。いくつかの実施形態では、少なくとも８代のin vitro細胞培養継代の後でも、参照配列または参照表現型に逆転しない場合、その変異は安定している。いくつかの実施形態では、３８〜４０℃で増殖しても参照配列または参照表現型に逆転しない場合、その変異は安定している。いくつかの実施形態では、哺乳動物に感染後少なくとも１０日間、参照配列または参照表現型に逆転しない場合、その変異は安定している。一般的に、遺伝子の安定性は、ヌクレオチド置換数が増大するについれ増大する。例えば、野生型または野生型様コドンに逆転するために３個のヌクレオチド変化を必要とするコドン置換は、野生型または野生型様コドンに逆転するために唯一のヌクレオチド変化を必要とするコドン置換よりも安定している。一般的に、欠失変異は、コドン置換よりも高いレベルの遺伝子安定性をもたらす。例えば、コドンの欠失が野生型に逆転するには、３個のヌクレオチドを挿入しなければならないであろう。
【００４６】
ポリヌクレオチドに関して「組換え」は、人の手により単離され、かつ／または変化したポリヌクレオチドをさし、組換え分子および組換えウイルスを含む。パラミクソウイルスに関して「組換え体」は、そのようなポリヌクレオチドからコードし、または生成されたウイルスをさす。「組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノム」または「ｒＨＰＩＶ２」は、ＨＰＩＶ株または変異体をコードするように構築され、野生型または変異体ＨＰＩＶ２の配列を含みうるポリヌクレオチドをさす。いくつかの実施形態では、組換えＨＰＩＶ２ゲノムまたはアンチゲノムはｃＤＮＡ形である。いくつかの実施形態では、パラミクソウイルスウイルスゲノムまたはアンチゲノムの全てまたは一部をコードするポリヌクレオチド配列を単離し、ベクター中で他の制御配列と組み合わせることができる。他の制御配列は、天然遺伝子に見出される配列または他の供給源から得た配列であってよい。ベクターは、原核または真核細胞中で組換え分子を増幅する。ベクターは、宿主細胞に導入し、ポリヌクレオチドの発現させることができる。組換えパラミクソウイルス配列用に本明細書に記載したベクターは、当業者に既知の適当な条件下で真核細胞に導入し増殖され、当業者に既知の適当な条件下で動物細胞に導入し発現される。
【００４７】
本明細書で使用する「複製可能ベクター」という用語は、連結した別の核酸を細胞中に輸送し、その核酸の増幅することができる核酸分子をさす。ベクターの一つの型は、「プラスミド」であり、これはその中に追加のＤＮＡセグメントをライゲートしうる環状二本鎖ＤＮＡループをさす。別の型のベクターはファージベクターである。別の型のベクターは、ウイルスベクターであり、追加の核酸セグメントをそのウイルスゲノム中にライゲートすることができる。ある種のベクターは、導入された宿主細胞中で自律的複製を行うことができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム性哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）も、宿主細胞へ導入する同時に宿主細胞のゲノムに組み込むことができ、それによって宿主ゲノムと共に複製される。本明細書では、「プラスミド」および「ベクター」を互換的に使用することができる。プラスミドが、最も一般的に使用されるベクター形であるからである。いくつかの実施形態では、ベクターは、細胞中で高コピー数に複製できるベクターである。
【００４８】
「シャットオフ温度」という用語は、参照温度のウイルス力価と比較したウイルス力価の減少が、同温度の野生型ウイルスの減少の１／１００を下回る温度さす。いくつかの実施形態では、参照温度は約３２℃であり、シャットオフ温度は約３９℃であり、より好ましくは３８℃または３７℃である。シャットオフ温度を決定することによって、異なるウイルス株または単離物の温度感受性を比較できるようになり、減弱レベルの指標となることが多い。シャットオフ温度が低いほど、パラミクソウイルス単離物または株の減弱レベルは高くなる。
【００４９】
本明細書で使用する「形質移入」という用語は、染色体外要素として、または染色体組み込み体によって、ＤＮＡが複製し、かつ／または発現されるように、真核細胞中にＤＮＡを導入することをいう。使用する宿主細胞に応じて、そのような細胞に適した標準的技術を使用し形質移入を行う。真核細胞に形質移入する方法には、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯ、リポソーム、電気穿孔法、および電気核輸送が含まれる。
【００５０】
本明細書で定義するポリペプチド配列は、以下のようにアミノ酸残基を示す１文字または３文字の符号によって表される。
【表１】
2008537683.tif 000003
【００５１】
ＩＩ．本発明の態様
減弱されたウイルスを生成する戦略は、免疫原性組成物に有用な安全かつ安定したウイルス構築体の設計に重要である。ウイルス複製の減弱と修飾した変異体の免疫原性との間のバランスを保つために、ウイルス単離物または株の表現型を改変することができる。いくつかの実施形態では、依然として免疫原性を保持させたまま、ウイルスの複製を約１／１００〜１／１０００に減少させることができる。いくつかの実施形態では、少なくとも一つの温度感受性減弱化変異と一つの非ｔｓ減弱化変異とを有する減弱されたウイルスを生成するのが望ましい。一つを超える変異および／または一つを超える表現型を有する減弱されたウイルスは高い安定性を有することができる。
【００５２】
パラミクソウイルスのＶタンパク質は、一つまたは複数の変異を導入するのに魅力的な標的である。Ｖタンパク質は、α／βインターフェロンの産生を阻害し、その受容体によってα／βインターフェロンのシグナル伝達を減少させる。修飾したＶタンパク質を有するパラミクソウイルスは、宿主細胞のインターフェロン応答の相殺で欠陥を有するかもしれず病原性は減少しているであろう。カルボキシ末端が欠失しているＶタンパク質を発現するパラミクソウイルスの複製は、抗ウイルスインターフェロンαおよびβを発現しないベロ細胞中を含め、in vivoおよびin vitroで不完全であることが判明している（Katoら, 1997, Embo J., 16(3):578-587；Delendaら, 1997, Virology, 228(1):55-62；Durbinら, 1999, Virology, 261(2):319-330；Kawanoら, 2001, Virology, 284(1):99-112；Heら, 2002, Virology, 303(1):15-32；Parkら, 2003, J. Virol., 77(17):9522-9532）。Ｖタンパク質はまた、ウイルス感染中に他の機能を持つ可能性があり、追加の機能に干渉することによって変異もまた、減弱化効果を得る可能性がある。
【００５３】
Ｖタンパク質は、両ＰおよびＶタンパク質をコードするバイシストロン性ポリヌクレオチドによってコードされる。バイシストロン性ポリヌクレオチドは、重複する読み枠から、ヌクレオカプシドに関連するＰリンタンパク質をコードする（Ohgimotoら、1990）。Ｐタンパク質は、ウイルスゲノムの転写および複製において主要な役割を果たす構造タンパク質である。代替読み枠には、ｍＲＮＡをコードするＰ／Ｖを通常にはない同時転写編集することによってアクセスするが、パラミクソウイルス亜科のほとんどのメンバーに特有な特徴である。ＰおよびＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドは代替読み枠（ＯＲＦ）を含むが、この読み枠には、Ｐタンパク質をコードするｍＲＮＡを生成するための、同時転写編集が媒介する読み枠内シフトによってアクセスする。Ｖタンパク質は、ＰおよびＶをコードする未編集ｍＲＮＡから生成される。従って、ＰおよびＶ遺伝子は、共通アミノ末端配列および特有のカルボキシ末端を有する。しかし、ＰおよびＶのＯＲＦが重複する性質は、Ｐタンパク質に影響を与えることなく、Ｖタンパク質中に導入することができ、逆も同様である変異の数および型を著しく制限する。
【００５４】
本発明の一態様は、変異体Ｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む、ポリヌクレオチド、ベクター、およびウイルス構築体を含む。ＶおよびＰタンパク質のコード配列を分離することによって、Ｐタンパク質の機能に作用することなくＶタンパク質を変化させることができる 。ウイルスゲノムへＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを挿入することによって減弱化表現型が得られる。好ましくは、インターフェロン生成および／またはシグナル伝達を阻害するＶタンパク質の能力を低減させる少なくとも一つの変異によって、Ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドを修飾する。変異体Ｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドは、同じベクターまたは別個のベクターに乗せることができる。
【００５５】
本発明の別の態様は、Ｌポリメラーゼの新規な減弱化変異が関与する。いくつかの実施形態では、置換する残基の位置は、他の関連ウイルスとの比較、およびその位置のアミノ酸が他の関連するウイルスによって置換されたとき、減弱化表現型が観察されるという指標に基づいて選択される。それらの位置で置換するために選択するアミノ酸は、少なくとも２個のヌクレオチド位置が、その位置で見られる野生型アミノ酸とは異なるコドンによってコードされるようなアミノ酸から選択する。いくつかの実施形態では、変化したアミノ酸を特定するコドンで少なくとも２個のヌクレオチドを変化させる。いくつかの実施形態では、Ｌポリメラーゼの変異は温度感受性表現型を有する。
【００５６】
さらに別の態様では、ウイルスゲノムの３’リーダーおよび／または５’トレーラーを含むゲノムの非翻訳領域で減弱化変異を行うことができる。いくつかの実施形態では、組換え感染性パラインフルエンザウイルスは、ウイルスゲノムまたはアンチゲノムの３’リーダーのヌクレオチド位置１５に相当する位置に減弱化変異を含む。いくつかの実施形態では、位置１５に相当する位置に変異を有する組換えパラインフルエンザウイルスは宿主範囲制限表現型を有する。
【００５７】
本発明の減弱化変異および方法は、変異体Ｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチド、ならびにＬポリメラーゼおよび３’リーダー配列中に新規な減弱化変異を有するを有する、部分または完全ポリ六量体ゲノムまたはアンチゲノムを含む感染性自己増殖性組換えパラミクソウイルスを提供する。いくつかの実施形態では、減弱されたパラミクソウイルスは、温度感受性と、宿主範囲制限、減少したプラークサイズ、または免疫原性変化を含む表現型をもたらす少なくとも一個の別の減弱化変異とを有する。減弱された感染性ウイルスは、ＨＰＩＶ感染から保護し、かつ／または異種抗原を送達するための、生ウイルスワクチンおよび／または免疫原性組成物に使用することができる。ワクチンで使用することができる減弱されたパラミクソウイルス株を生成するために、減弱化変異メニューの一部として、減弱化変異を使用することができる。
【００５８】
Ａ．変異
１．Ｌポリメラーゼ
本発明の一態様は、Ｌポリメラーゼ中に一つまたは複数の減弱化変異を有するＨＰＩＶ２の感染性組換え変異体（Ｌタンパク質）を提供する。いくつかの実施形態では、置換する残基の位置は、他の関連ウイルスとの比較、およびある位置のアミノ酸が、他の関連するウイルスによって置換されたとき、減弱化表現型が観察されるという指標に基づいて選択される。それらの位置で置換するために選択するアミノ酸は、少なくとも２個のヌクレオチド位置が、その位置で見られる野生型アミノ酸とは異なるコドンによってコードされるようなアミノ酸から選択する。いくつかの実施形態では、変化したアミノ酸を特定するコドンで少なくとも２個のヌクレオチドを変化させる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、減弱化変異は、配列番号１７の位置４６０、９４８、または１７２４に相当する一個または複数のアミノ酸残基に置換を含む。好ましいアミノ酸置換には、Ｆ４６０Ａ、Ｆ４６０Ｐ、Ｙ９４８Ａ、Ｙ９４８Ｌ、Ｙ９４８Ｇ、Ｓ１７２４Ｉ、またはそれらの混合物が含まれる。
【００６０】
減弱化変異は、安定していることがことが好ましい。２個または３個のヌクレオチド置換を必要とするアミノ酸置換が好ましい。例えば、Ｆ４６０Ａは、３個のヌクレオチド置換変異（野生型ＴＴＴ、変異体ＧＣＡ）を必要とする。上記の好ましいアミノ酸置換をコードするヌクレオチド置換を表２に示す。
【００６１】
減弱化変異は温度感受性であってよい。一実施形態では、Ｌタンパク質変異は、許容温度、例えば３０〜３２℃での複製には減弱的ではないが、制限温度、例えば３７℃〜４０℃での複製には減弱的である。一実施形態では、約３９℃でＨＰＩＶ２変異体の複製は減少する。いくつかの実施形態では、ＨＰＩＶ２変異体のシャットオフ温度は、約３９℃が好ましく、約３８℃または約３７℃がより好ましい。好ましくは、Ｌポリメラーゼ中に変異を有するパラミクソウイルス株は、対照パラミクソウイルスよりもシャットオフ温度が低い。いくつかの実施形態では、対照は野生型ウイルスである。他の実施形態では、対照は、別の減弱されたパラミクソウイルスである。
【００６２】
好ましくは、ＨＰＩＶ２変異体はin vivoで減弱される。一実施形態では、ＨＰＩＶ２変異体は、哺乳動物の上気道および／または下気道において、野生型ＨＰＩＶ２または他の減弱されたパラミクソウイルスと比較して複製が低減する。一実施形態では、野生型ＨＰＩＶ２または他の減弱されたパラミクソウイルスと比較して、その複製は、少なくとも約１／１０、１／１００、より好ましくは約１／５００、より好ましくは約１／１０００、より好ましくは約１／１５００、より好ましくは約１／２０００、より好ましくは約１／３０００、より好ましくは約１／４０００、より好ましくは約１／５０００、より好ましくは約１／６０００に低減する。一実施形態では、その哺乳動物は、ゴールデンシリアンハムスター（Mesocricetus auratus）である。別の実施形態では、その哺乳動物は、アフリカミドリザル（Cercopithecus aethiopsである）。
【００６３】
ＨＰＩＶ２変異体は、主要なヌクレオカプシド（Ｎ）タンパク質、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｐ）、およびＬポリメラーゼ（Ｌ）タンパク質をコードする、部分または完全ポリ六量体ゲノムまたはアンチゲノムを含むのが好ましい。ＨＰＩＶ２変異体は、さらに、融合（Ｆ）タンパク質および赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質をコードするゲノムまたはアンチゲノムを含みうる。ＦおよびＨＮタンパク質をさらに含むＨＰＩＶ２変異体は免疫原性組成物に有用である。
【００６４】
本発明の別の態様は、配列番号１７の配列を有するＬタンパク質に対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、単離した核酸またはベクターを含む。配列番号１７のＬポリペプチドに対して少なくとも８０％の配列同一性を含み、そして好ましくは配列番号１７の位置４６０、９４８、または１７２４に相当するアミノ酸残基の少なくとも一個の変異を含む単離したポリペプチドを提供する。
【００６５】
Ｌタンパク質中の減弱化変異は、ＰＣＲ変異誘発および標準的分子クローニング技術によって生成することができる。本発明の減弱化変異を生成するのに有用なＰＣＲプライマーの例を実施例１および表２に記載する。
【００６６】
２．３’リーダー配列
本発明の一態様は、ウイルスゲノムの３’リーダーに減弱化変異を有するＨＰＩＶ２の感染性組換え変異体を提供する。いくつかの実施形態では、一減弱化変異は、配列番号４のＴ１５に相当する位置に核酸置換を含む。一実施形態では、そのヌクレオチド置換はＴ１５Ｃを含む。いくつかの実施形態では、組換え感染性変異体は、位置１５に主としてＣを有し、より好ましくは位置１５にＴを有する検出可能ウイルスをほとんど、またはまったく含まない。
【００６７】
いくつかの実施形態では、減弱化変異は、増殖特性、減弱、温度感受性、低温適応、プラークサイズ、宿主範囲制限の変化または免疫原性変化から選択した表現型を含んでよい。減弱化変異は宿主範囲制限の表現型を有するのが好ましい。一実施形態では、配列番号５のＴ１５に相当する位置にヌクレオチド置換を含むＨＰＩＶ２は、アフリカミドリザルの気道で減弱されるが、ゴールデンシリアンハムスターの気道では減弱されない。いくつかの実施形態では、その減弱化変異は、温度感受性表現型をもたらさない。
【００６８】
ＰＣＲ変異誘発および標準的分子クローニング技術によって、ＨＰＩＶ２の３’リーダーの減弱化変異を生成することができる。本発明の減弱化変異を生成するのに有用なＰＣＲプライマーの例を実施例２に記載する。
【００６９】
３．ＰまたはＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド中へのＰおよびＶタンパク質をコードするバイシストロン性ポリヌクレオチドの分離。
【００７０】
本発明の一態様は、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む、部分または完全ポリ六量体ゲノムまたはアンチゲノムを有する、感染性自己増殖性組換えパラミクソウイルスを提供する。Ｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、それ以上Ｖタンパク質をコードしないように変化されている。本発明のパラミクソウイルスは、主要なヌクレオカプシドタンパク質（Ｎタンパク質）、ヌクレオカプシドリンタンパク質（Ｐタンパク質）、および大型のポリメラーゼタンパク質（Ｌタンパク質）を含むのが好ましい。Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、またはＬタンパク質は、異種ルブラウイルス属、例えば、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ４ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ４、流行性耳下腺炎、ＳＶ４１およびＳＶ５から得ることができる。パラミクソウイルス変異体は、融合（Ｆ）タンパク質および赤血球凝集素−ノイラミニダーゼ（ＨＮ）タンパク質をコードするゲノムまたはアンチゲノムをさらに含みうる。ＦおよびＨＮタンパク質をさらに含むパラミクソウイルス変異体は免疫原性組成物に有用である。いくつかの実施形態では、変異体Ｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを別個のベクターに乗せる。
【００７１】
パラミクソウイルスは、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）であってよい。ＨＰＩＶ２、マウスＰ１Ｖ１（センダイウイルス）ＨＰＩＶ４Ａ、ＨＰＩＶ５、ＳＶ４１、ＳＶ５、流行性耳下腺炎ウイルス、およびＮＤＶを含め、いくつかのパラミクソウイルスは、ＰおよびＶタンパク質両方をコードするポリヌクレオチドを有する。一実施形態では、そのＰＩＶはヒトＰＩＶ（ＨＰＩＶ）である。好ましくは、ＨＰＩＶはＨＰＩＶ２型（ＨＰＩＶ２）である。一実施形態では、そのＨＰＩＶ２は、Ｖ９４、Ｖ９８、またはＧｒｅｅｒ株である。一実施形態では、そのゲノムまたはアンチゲノム配列は、ＨＰＩＶ２参照配列に少なくとも８０％以上のヌクレオチド配列同一性を有する変異体ＨＰＩＶ２に由来する。一実施形態では、その参照配列は、Ｖ９４株（配列番号４）、Ｖ９８株（配列番号５）、またはＧｒｅｅｒ（配列番号６）のＨＰＩＶ２ゲノム配列である。一実施形態では、そのゲノム配列は配列番号４のヌクレオチド配列を有する。
【００７２】
モノシストロン性Ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ゲノム、アンチゲノム、またはベクターの任意の箇所に挿入することができる。いくつかの実施形態では、モノシストロン性Ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドを３’末端に挿入することができる。いくつかの実施形態では、遺伝子順序は、例えば、３’Ｖ−Ｎ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−ＨＮ−Ｌ−５’であってよい。他の実施形態では、遺伝子順序は、例えば、３’Ｎ−Ｖ−Ｐ−Ｍ−Ｆ−ＮＨ−Ｌ−５’であってよい。いくつかの実施形態では、あるタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドをゲノムの制限部位に挿入する。図５に示すように、制限部位には、ＡｓｃＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｇｅＩまたはＳａｃ  ＩＩを含めてよい。一実施形態では、別個のＰおよびＶタンパク質をコードする組換えウイルスは、配列番号１のアンチゲノムｃＤＮ配列を含む。
【００７３】
そのゲノムまたはアンチゲノムの任意の箇所にＰタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドを挿入することができる。加えて、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを別個のベクターに置くことができる。いくつかの実施形態では、そのゲノムまたはアンチゲノムの制限部位にＰタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドを挿入する。図５に示すように、制限部位には、ＡｓｃＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｇｅＩまたはＳａｃ  ＩＩを含めてよい。
【００７４】
任意により、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドは、非翻訳ポリヌクレオチドスペーサー配列によって分離されている。一実施形態では、スペーサー配列は、Ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチド中のＶコード配列または読み枠（ＯＲＦ）の上流にある。一実施形態では、スペーサー配列は、遺伝子転写終止シグナル、遺伝子間転写シグナル、および／または遺伝子転写開始シグナルを含む。一実施形態では、遺伝子転写開始シグナルはシス作動性である。一実施形態では、遺伝子転写開始シグナルは位置６ｎ＋１の第１のアデノシンを含む。一実施形態では、そのスペーサー配列は配列番号７のヌクレオチド配列を有する。
【００７５】
モノシストロン性Ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドをそのウイルスゲノムに挿入する場合、挿入したポリヌクレオチドは異種配列である。Ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むウイルス性組換えウイルスは変化した表現型を有しうる。いくつかの実施形態では、表現型は減弱的であってよい。いくつかの実施形態では、表現型は温度感受性である。増殖特性、減弱、温度感受性、低温適応、プラークサイズ、宿主範囲制限の変化、または免疫原性変化から選択される他の表現型変化を導入するために、別個のＰおよびＶ遺伝子をコードする組換えウイルスに追加のヌクレオチド変化を導入することができる。
【００７６】
減弱化表現型は温度感受性であってよい。一実施形態では、別個のＰおよびＶタンパク質をコードする組換えウイルスの複製は、許容温度（例えば、約３０〜３２℃）では減弱されないが、制限温度、例えば３７℃〜４０℃では減弱される。一実施形態では、パラミクソウイルス変異体の複製は約３８℃で減少する。いくつかの実施形態では、その変異体のシャットオフ温度は、約３８℃が好ましく、約３７℃であることがより好ましい。好ましくは、別個のＰおよびＶタンパク質をコードする組換えウイルスは、対照パラミクソウイルスよりもシャットオフ温度が低い。いくつかの実施形態では、対照は野生型ウイルスである。他の実施形態では、対照は他の減弱されたパラミクソウイルスである。
【００７７】
好ましくは、別個のＰおよびＶタンパク質をコードする組換えパラミクソウイルスはin vivoで減弱される。一実施形態では、野生型ＨＰＩＶ２または他の減弱されたパラミクソウイルスと比較して、別個のＰおよびＶタンパク質をコードする組換えウイルスは、哺乳動物の上気道および／または下気道で複製が低減する。一実施形態では、野生型ＨＰＩＶ２または他の減弱されたパラミクソウイルスと比較して、その複製は、少なくとも約１／１０、１／１００、より好ましくは約１／５００、より好ましくは約１／１０００、より好ましくは約１／１５００、より好ましくは約１／２０００、より好ましくは約１／３０００、より好ましくは約１／４０００、より好ましくは約１／５０００、より好ましくは約１／６０００に低減される。一実施形態では、その哺乳動物はゴールデンシリアンハムスター（Mesocricetus auratus）である。別の実施形態では、その哺乳動物はアフリカミドリザル（Cercopithecus aethiops）である。いくつかの実施形態では、減弱されたパラミクソウイルスは、免疫原性であり、感染から保護するのに十分な抗体を誘発する。
【００７８】
Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドは、天然または変異体Ｖタンパク質の配列を有するＶタンパク質をコードすることができる。Ｖタンパク質は、ＨＰＩＶ４Ａ、ＨＰＩＶ４Ｂ、ＳＶ５、ＳＶ４１、流行性耳下腺炎、ＮＤＶ、またはセンダイウイルスを含むが、それだけには限らない異種パラミクソウイルスから得ることができる。一実施形態では、Ｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、参照配列のＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を有する。一実施形態では、その参照配列は、ＨＰＩＶ２株Ｖ９４（配列番号４；表６）、ＨＰＩＶ株Ｖ９８（配列番号５表７）、ＨＰＩＶ２株Ｇｒｅｅｒ（配列番号６；表８）、または配列番号４５のアミノ酸配列を有するＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドである。一実施形態では、Ｖ  ＯＲＦをコードするアンチゲノムｃＤＮＡ配列は図１２に示す配列番号３の配列である。いくつかの実施形態では、配列番号４５の配列を有するＶタンパク質に対して、少なくとも８０％配列同一性を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチド含む単離したモノシストロン性核酸を提供する。
【００７９】
一実施形態では、Ｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、感染宿主または宿主細胞でインターフェロンの生成またはシグナル伝達を妨害するＶタンパク質の能力を阻害する変異を含む。その変異は、実質的に細胞培養でウイルスの複製に影響を与えないことが好ましい。一実施形態では、ＨＰＩＶ２株Ｖ９４、ＨＰＩＶ２株Ｖ９８、またはＨＰＩＶ２株ＧｒｅｅｒによってコードされているＶタンパク質と比較して、Ｖタンパク質の活性は減少する。好ましくは、その変異は、細胞培養でＰタンパク質の発現または活性に影響を与えない。
【００８０】
ｒＨＰＩＶ２  Ｐ＋Ｖのin vivoでの複製を減弱させるＶタンパク質中の変異を同定するのに数種の手法の一つを採用することができる。第一の手法は、実験動物の気道で複製が制限されるウイルスを生成するためのＶ  ＯＲＦのランダム変異誘発である。例えば、各位置にアラニン変異を導入することができ、タンパク質の機能に重要な位置を同定することができる。他の実施形態では、少なくとも２個のアミノ酸を欠失させることができる。こうした変異を有する組換えウイルスをin vitroおよびin vivoで特徴付けることができる。
【００８１】
あるいは、標的化した変異誘発のガイドとして、異種パラミクソウイルスのＶタンパク質による配列比較を使用することができる。例えば、ガイドとして配列比較を使用するために２つの方法がある。第一に、保存性アミノ酸置換または少ない（２個のアミノ酸）欠失により、特定のＶタンパク質活性に必要と思われる保存配列を直接標的化することができる。保存性が低い手法を取ることもでき、無関係のアミノ酸をアミノ酸置換に使用することができ、または保存領域の大部分（６個以上のアミノ酸）を欠失させることもできる。その位置に野生型アミノ酸をコードするコドンと比較して、コドンの少なくとも２個のヌクレオチドを変化させる必要がある無関係のアミノ酸を選択することができる。変異誘発部位の選択は、保存配列に限定されない。
【００８２】
Ｖタンパク質の生物学的特性の実質的な改変は、（ａ）置換領域のポリペプチド主鎖の構造、例えば、シート立体構造、へリックス構造、またはループ構造など、（ｂ）標的部位の分子の電荷または疎水性、または（ｃ）側鎖のバルク、の維持に及ぼす効果に著しい差がある置換を選択することによって実現される。天然残基は、共通する側鎖の特性に基づいてグループ分けする。
【００８３】
（１）疎水性：ロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ
（２）中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ
（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ
（４）塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ
（５）鎖の向きに影響を与える残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ、および
（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ
非保存的置換には、これらのクラスの一クラスの一メンバーを別のクラスに交換することを伴う。そのように置換された残基もまた、保存的置換部位に、より好ましくは残りの（非保存的）部位に導入することができる。
【００８４】
Ｖタンパク質中の点変異または欠失変異誘発の候補部位例を要約し、図９Ａに強調する：（Ｉ）ＲＮＡ結合に必要なＳＶ５で同定された配列への類似性、（ＩＩ）ＳＴＡＴ結合に必要なＳＶ５で同定された配列への類似性、（ＩＩＩ）ＳＴＡＴ分解に必要なＳＶ５で同定された配列への類似性、（ＩＶ）推定ロイシン（太字）リッチ核エクスポートシグナル配列、（Ｖ）亜鉛フィンガー結合ドメインの一部を形成しうる高度保存配列、（ＶＩ）領域はシステインリッチドメイン（ＣＲＤに保存された７個のシステイン残基のうち５個を含む。図９Ｂは、パラミクソウイルス科の２２のメンバーの高度に保存されたカルボキシ末端システインリッチドメインのアミノ酸配列比較を示し、このドメインは亜鉛イオンに結合することが知られている重要なＶタンパク質ドメインである。四角で囲った太字の配列は高度に保存されている。＊で示す残基は、一個または複数の亜鉛イオンと直接相互作用し、アミノ酸欠失または置換変異誘発の標的となりうる。いくつかの実施形態では、変異体Ｖタンパク質は、そのドメインの少なくとも一個のドメインの、より好ましくはそのドメインの一個を超えるドメインのアミノ酸残基に相当する少なくとも１個の残基の少なくとも一個のアミノ酸変異を含む。
【００８５】
一実施形態では、Ｖタンパク質は、配列番号４の位置６７、６８、６９、７０、７１、７２、１０５、１０６、１０７、１０８、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２に相当する残基または残基間に、あるいはアミノ酸１７４〜２２５のいずれか一つに、一個または複数のアミノ酸置換または欠失を含む。好ましくは、変異をコードするヌクレオチド変化は、変異の安定性を増大させるために、その位置の野生型アミノ酸をコードするコドンと比較して、少なくとも２個のヌクレオチド変化を含む。好ましくは、変異体Ｖタンパク質は、参照配列のその配列に対して少なくとも８０％の配列同一性を有する。
【００８６】
Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドはｍＲＮＡ編集部位を含む。好ましくは、編集部位にはヘプタグアノシン配列が含まれる。一実施形態では、編集部位は、配列番号８のヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、Ｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列の編集が阻害されるように、ヘプタグアノシン配列を置換する。ｍＲＮＡの編集を阻害するためにヌクレオチドの欠失、挿入、または置換変異誘発を使用することができる。例えば、Ｖ９４  ＨＰＩＶ２では、編集部位（配列番号８）のＧ９に相当するヌクレオチドとＡを置換し、編集部位（配列番号８）のＧ１２に相当するヌクレオチドとＣを置換することによって、Ｖタンパク質をコードするヌクレオチド配列のｍＲＮＡの編集を阻害することができる。ヌクレオチドの欠失または挿入は、本明細書および国際公開第０４０２７０３７号に記載したように「６の法則」と合致しなければならない。
【００８７】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドは、Ｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。そのＰタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドをＶタンパク質をコードしないように変化させる。Ｐタンパク質のアミノ酸配列もまた、変異体配列であってよい。Ｐタンパク質は、ＳＶ５、ＳＶ４１、ＨＰＩＶ４ＡおよびＨＰＩＶ４Ｂを含むが、それだけには限らないルブラウイルス属の異種パラミクソウイルスから得ることができる。一実施形態では、Ｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、参照配列中のＰタンパク質をコードするヌクレオチド配列に対して、少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８１％、より好ましくは少なくとも８２％、より好ましくは少なくとも８３％、より好ましくは少なくとも８４％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも８６％、より好ましくは少なくとも８７％、より好ましくは少なくとも８８％、より好ましくは少なくとも８９％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９１％、より好ましくは少なくとも９２％、より好ましくは少なくとも９３％、より好ましくは少なくとも９４％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９６％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％以上の配列同一性を有する。一実施形態では、その参照配列は、ＨＰＩＶ２株Ｖ９４（配列番号４；表６）、ＨＰＩＶ２株Ｖ９８（配列番号５；表７）、またはＨＰＩＶ２株Ｇｒｅｅｒ（配列番号６；表８）である。一実施形態では、Ｐタンパク質をコードするアンチゲノムｃＤＮＡ配列は配列番号２の配列を有する。
【００８８】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドは、Ｐコード配列または読み枠（ＯＲＦ）を含む。Ｐ  ＯＲＦは、一個または複数のヌクレオチド置換を含むのが好ましく、その置換は、重複するＶ  ＯＲＦ読み枠に一個または複数の終止コドンを導入するが、Ｐ  ＯＲＦによってコードされているＰタンパク質のアミノ酸配列は変えない。一実施形態では、Ｖ  ＯＲＦ読み枠のコドン位置１６７、１７６、１８４、および／または１８６にある終止コドンをコードする第３の塩基コドン置換をＰ  ＯＲＦ（配列番号２）に導入する。別の実施形態では、Ｐ  ＯＲＦは配列番号２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｐ  ＯＲＦコード配列中のｍＲＮＡ編集部位を修飾することが望ましくない場合、Ｖ  ＯＲＦに一個または複数の終止コドンを挿入することが好ましく利用されるであろう。
【００８９】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドはｍＲＮＡ編集部位を含む。編集部位はヘプタグアノシン配列を含むが好ましい。一実施形態では、編集部位は配列番号８のヌクレオチド配列を含む。一実施形態では、Ｐタンパク質をコードするヌクレオチド配列の編集が阻害されるように、ヘプタグアノシン配列を置換する。ｍＲＮＡの編集を阻害するために、ヌクレオチドの欠失、挿入、または置換変異誘発を使用することができる。好ましくは、挿入および／または置換によって編集部位のヘプタグアノシン配列を破壊するが、Ｐタンパク質のカルボキシ末端部分をコードする読み枠は変化させない。ＨＰＩＶ２では、例えば、Ｐタンパク質のカルボキシ末端部分をコードするヌクレオチド配列が、インフレームでシフトするように、２個のグアノシンをｍＲＮＡ編集部位に挿入する。一実施形態では、Ｐタンパク質のカルボキシ末端部分をコードするヌクレオチド配列に、読み枠をシフトするのに必要なグアノシン数をｍＲＮＡ編集部位に挿入し、ヘプタグアノシン配列中の２個以上のグアノシンをＡまたはＴで置換する。例えば、図６を参照されたい。別の実施形態では、Ｐタンパク質のカルボキシ末端部分をコードするヌクレオチド配列に読み枠をシフトするのに必要なグアノシン数に相当する、Ａ、Ｔ、またはそれらの組合せをｍＲＮＡ編集部位のヘプタグアノシン配列に挿入する。例えば、図６を参照されたい。本明細書および国際公開第０４０２７０３７号に記載したように、ヌクレオチドの欠失または挿入は、「６の法則」に合致し、正確なＰ  ＯＲＦ読み枠を維持しなければならない。
【００９０】
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む、本発明のパラミクソウイルスまたはポリヌクレオチドは、既知の組換え法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（Zollerら, 1987, Nucl. Acids Res., 10: 6487-6500）、カセット変異誘発（Wellsら, 1985, Gene, 34:315）、制限選択変異誘発（Wellsら, 1986, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415）などを使用し作製することができる。
【００９１】
Ｂ．変異の組合せ
Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む、部分または完全ポリ六量体ゲノムまたはアンチゲノムを有する本発明のパラミクソウイルスは、本明細書に記載する、Ｌポリメラーゼおよび／または３’リーダー中の減弱化変異のいずれか、または公知の他の減弱化変異を含むことができる。一つを超える変異を有する組換えウイルス変異体は、単一変異または少数の変異（例えば、３個未満の変異）を有するような変異体よりも安定性が高いと思われる。本発明のパラミクソウイルスはまた、国際公開第０４／０２７０３７号に記載されている減弱化Ｌポリメラーゼ変異のいずれかを含むことができる。Ｌポリメラーゼおよび／または３’リーダー中の変異の減弱化効果は追加的なものであり、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む本発明のパラミクソウイルスの減弱をさらに高めるのに役立つのが好ましい。いくつかの実施形態では、減弱レベルと免疫原性のバランスを保つのが望ましい。好ましい実施形態では、変異体パラミオウイルス（paramyoviruses）は、哺乳動物でウイルス力価が約１／１００〜１／５０００に低減する。いくつかの実施形態では、約１／１００，０００を下回るウイルスの複製の低減は、免疫原性を消失させ、または大規模なウイルスの生成を不可能にする。
【００９２】
いくつかの実施形態では、本発明の変異体パラミクソウイルスは、少なくとも一つの温度感受性変異と少なくとも一つの非温度感受性変異とを有する。好ましい実施形態では、Ｖ遺伝子をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドの挿入、またはＬポリメラーゼをコードするポリヌクレオチド中の変異により、本発明の組換え変異体パラミクソウイルスは、少なくとも一つの温度感受性変異を有するが、その際、少なくとも２個のヌクレオチドが野生型アミノ酸をコードするコドンへ変化することによってそのアミノ酸は変化する。別の実施形態では、本発明の組換え変異体パラミクソウイルスは、宿主範囲制限表現型をもたらす変異を含む。好ましい実施形態では、宿主範囲制限を有する変異体ウイルスは、ウイルスゲノム３’末端の位置１５に変異を有する。
【００９３】
Ｃ．異種抗原を含むベクター
本発明のパラミクソウイルスは、免疫原性組成物で異種抗原を発現するためのベクターとして有用である。一個または複数の異種ポリペプチドをコードする一個または複数の過剰遺伝子を本発明のパラミクソウイルス中にクローン化し発現させることができる。例えば、単一パラミクソウイルス中に複数のＰＩＶ血清型および株の保護性エピトープを設計することによって、複数のＰＩＶ血清型または株に対する免疫応答を誘発することができる。過剰遺伝子は、本明細書に記載したような別個のＰおよびＶタンパク質をコードする組換えウイルス、ならびにＬポリメラーゼ中に一つまたは複数の変異および／または３’リーダー領域中に変異を含む組換えウイルス中にクローン化し発現させることができる。追加の異種遺伝子の挿入もまた、減弱された表現型をもたらしうる。好ましくは、異種遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含むパラミクソウイルスは、細胞または哺乳動物中で約１／１００〜１／５０００以下に減弱される。
【００９４】
一実施形態では、ゲノムまたはアンチゲノムは、異種病原体の一個または複数の抗原決定基をコードする、一個または複数の異種遺伝子またはゲノムセグメントを含む。例えば、麻疹ウイルス、下位群Ａおよび下位群Ｂ呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型および２型、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブニアウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、ヒトメタニューモビツセス（metapneumovituses）、またはインフルエンザウイルスの一個または複数の異種抗原決定基を本発明のパラミクソウイルスによって発現させることができる。有用な抗原決定基の例には、それだけには限らないが、麻疹ウイルスＨＡおよびＦタンパク質、下位群Ａまたは下位群Ｂ呼吸器合胞体ウイルスＦ、Ｇ、ＳＨおよびＭ２タンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスＨＮおよびＦタンパク質、ヒトパピローマウイルスＬ１タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型ｇｐ１６０タンパク質、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ、およびｇＭタンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、エプスタイン−バーウイルスｇｐ３５０タンパク質、フィロウイルスＧタンパク質、ブニアウイルスＧタンパク質、フラビウイルスｐｒｅＥ、およびＮＳ１タンパク質、ヒトメタニューモウイルス（metapneuomovirus）（ＨＭＰＶ）ＧおよびＦタンパク質、およびアルファウイルスＥタンパク質、ならびにそれらの抗原ドメイン、フラグメント、およびエピトープが含まれる。
【００９５】
一実施形態では、ＨＰＩＶ２ベクターのゲノムまたはアンチゲノム中に、麻疹ウイルスＨＡ遺伝子の読み枠（ＯＲＦ）をコードするポリヌクレオチドを組み込むことによって、麻疹および／またはＨＰＩＶ２もしくは別のＨＰＩＶに対して免疫化するのに有用なキメラ候補が得られる。別の実施形態では、ＨＰＩＶ２ベクターのゲノムまたはアンチゲノム中に、一個または複数の異種ＰＩＶ（例えば、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、および／またはＨＰＩＶ４）ＨＰＩＶ２  Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｆ、ＨＮおよび／またはＬタンパク質、あるいはそのフラグメントをコードする遺伝子またはゲノムセグメントを含むポリヌクレオチドを組み込む。別の実施形態では、ＨＰＩＶｌ  ＨＮ、ＨＰＩＶ２  Ｆ、ＨＰｌＶ３  ＨＮ、ＨＰＩＶ３  Ｆ、麻疹ＨＡおよびＦ、ＨＭＰＶ  ＧおよびＦタンパク質、および／またはＲＳＶ下位群ＡまたはＢＧおよびＦタンパク質から選択した、一個または複数の過剰な異種遺伝子またはゲノムセグメントを本発明のパラミクソウイルス中にクローン化する。
【００９６】
パラミクソウイルスウイルスゲノムまたはアンチゲノム中に、一個または複数の過剰遺伝子または転写単位を挿入する数種の方法は、国際公開第０４／０２７０３７号に記載されており、これにより参照により組み込む。過剰な異種遺伝子またはゲノムセグメントは、組換えゲノムまたはアンチゲノム中の様々な部位に、例えば、Ｎの位置３’に、Ｎ／Ｐ、Ｐ／Ｍ、および／またはＨＮ／Ｌ遺伝子間に、あるいはＨＰＩＶ２ベクターのゲノムまたはアンチゲノムの別の遺伝子間物連結部もしくは非コード領域に挿入することができる。図５Ｃに示すように、異種または過剰な遺伝子または転写単位は、制限部位、例えば、ＡｓｃＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｇｅＩ、またはＳａｃＩＩに挿入するのが好ましい。ウイルスゲノムの任意の挿入または欠失は６の法則と合致する好ましい。
【００９７】
Ｄ．組換え法、ベクター、および宿主細胞
本発明の感染性パラミクソウイルスおよびポリヌクロエチド（polynucloetides）を合成および組換え法によって生成する。従って、本発明は、本発明の感染性パラミクソウイルスクローンをコードするポリヌクレオチド、およびその感染性クローンを含む宿主細胞、ならびに組換え法によってそのようなベクターおよび宿主細胞を製造する方法に関する。
【００９８】
本発明のパラミクソウイルスまたはポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の技術によって合成し、またはによって調製することができる。例えば、国際公開第９４／０２７０３７号を参照されたい。野生型パラミクソウイルスゲノムのヌクレオチド配列は公知であり、例えば、インターネットによりGenBank（www-ncbi-nlm-nihgov/entrezからアクセス可能）から容易に入手することができる。本発明のパラミクソウイルスをコードするヌクレオチド配列は、無細胞環境でのＤＮＡポリメラーゼの利用を含め、当業者に知られている方法を使用し合成しまたは増幅することができる。
【００９９】
アミノ酸の置換、挿入、および欠失は、既知の組換え法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介（部位特異的）変異誘発、アラニンスキャニング、ＰＣＲ変異誘発、部位特異的変異誘発（Zollerら, 1987, Nucl. Acids Res., 10: 6487-6500）、カセット変異誘発（Wellsら, 1985, Gene, 34:315）、制限選択変異誘発（Wellsら, 1986, Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415）などを使用し作製することができる。本発明の減弱化変異の生成に使用するのに適当なＰＣＲプライマーの例を実施例１、２、および３に記載する。
【０１００】
本発明のパラミクソウイルスは、生物試料から単離したウイルスから生成することができる。ポリヌクレオチドおよびベクターは、当技術分野で公知の標準的組換え方法、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（Sambrook,ら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY）によって生成することができる。核酸配列を変化させ、または修飾する方法も当業者に知られている。
【０１０１】
宿主で増殖させるための選択マーカーを含むベクター中に、順次クローン化したポリメラーゼ連鎖反応カセットからパラミクソウイルスゲノムを組立てることができる。そのようなマーカーは、真核細胞培養にはジヒドロ葉酸還元酵素またはネオマイシン耐性、ならびに大腸菌および他の細菌での培養にはテトラサイクリンまたはアンピシリン耐性遺伝子を含む。
【０１０２】
ポリヌクレオチドは、クローニングするために、標準的組換え法を使用し複製可能ベクターに挿入することができる。様々なベクターを公的に入手することができる。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、またはファージの形態をしていてよい。様々な手順により好適な核酸配列をベクターに挿入することができる。一般に、当技術分野で公知の技術を使用し、核酸を適切な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入する。一般的に、ベクター成分には、それだけには限らないが、シグナル配列、複製起点、一個または複数の標識遺伝子、エンハンサー要素、プロモーター、および転写停止配列の一つまたは複数が含まれる。これらの成分の一つまたは複数を含む好適なベクターの構築には、当業者に公知の標準的ライゲーション技術が使用される。
【０１０３】
好適な複製可能ベクターの例には、それだけには限らないが、ｐＵＣ１９またはｐＴＭ１が含まれる。好適なプロモーター、例えば、Ｔ７ポリメラーゼプロモーター、サイトメガロウイルスプロモーター、細胞ポリメラーゼＩＩプロモーター、またはＳＰ１プロモーターなどにポリヌクレオチドを作動可能に連結することができる。複製可能ベクターは、転写開始部位、転写停止用部位、および翻訳用リボソーム結合部位をさらに含みうる。
【０１０４】
一実施形態では、認識配列がＰ／Ｖタンパク質をコードするバイシストロン性ポリヌクレオチドを側置するように、パラミクソウイルスｃＤＮＡ中に特有の制限酵素認識配列を導入するステップ、Ｐ／Ｖタンパク質をコードするバイシストロン性ポリヌクレオチドを側置する制限部位で、ゲノムを切断する一種または複数の制限酵素によってゲノムを消化するステップ、切断された制限部位に、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよび／またはＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを挿入するステップ、およびゲノムを再ライゲートするステップによって、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む、本発明のパラミクソウイルスをクローン化する。好適な制限酵素認識配列の例には、それだけには限らないが、ＮｏｔＩ、ＡｓｃＩ、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｇｅＩ、およびＳａｃ  ＩＩが含まれる。いくつかの実施形態では、バイシストロン性Ｐ／Ｖ  ＯＲＦの上流または下流の非コード領域に制限部位を導入する。一実施形態では、ＡｓｃＩ部位はバイシストロン性Ｐ／Ｖ  ＯＲＦの上流にあり、ＢｓｔＥＩＩ、ＡｇｅＩ、およびＳａｃＩＩ部位はバイシストロン性Ｐ／Ｖ  ＯＲＦの下流にある（図５Ａおよび５Ｂ）。一実施形態では、ＡｓｃＩおよびＢｓｔＥＩＩ制限部位を使用し、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドをゲノムに導入する。一実施形態では、ＡｇｅＩおよびＳａｃＩＩ制限部位を使用し、Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドをゲノムに導入する。
【０１０５】
パラミクソウイルスゲノム、またはパラミクソウイルスタンパク質をコードするポリヌクレオチドから構成される組換えベクターを宿主細胞、例えば、細菌細胞または真核細胞に導入することは、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介形質移入、カチオン脂質媒介形質移入、電気穿孔法、電気核輸送、化学的形質導入、電気的形質導入、感染、または他の方法による影響を受ける恐れがある。そのような方法は、標準的実験マニュアル、例えば、Sambrook,ら, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Vols. 1-3, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NYまたはDavisら, 1986, Basic Methods in Molecular Biologyに記載されている。市販の形質移入試薬、例えば、リポフェクタミン（Invitrogen, Carlsbad, CA）およびFuGENE 6（登録商標）（Roche Diagnostics, Indianapolis, IN）も入手可能である。いくつかの実施形態では、宿主細胞の形質移入効率は、約１５％以上、約２０％以上、約３０％以上、約４０％以上、または約５０％以上である。適切な宿主細胞には、それだけには限らないが、ＨＥｐ−２細胞、ＦＲｈＬ−ＤＢＳ２細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＲＣ−５細胞、およびベロ細胞が含まれる。
【０１０６】
Ｅ．免疫原性組成物
本発明は、減弱された生ウイルスワクチンを含め、免疫原性組成物で使用するための一つまたは複数の減弱化変異を含む、単離した感染性組換えパラミクソウイルスを提供する。本発明のパラミクソウイルスは、哺乳動物で免疫応答を誘発するための免疫原性組成物に有用である。好ましくは、減弱されたパラミクソウイルスは、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、Ｖ遺伝子は、感染宿主で、インターフェロンの生成および／またはシグナル伝達を妨害するＶタンパク質の能力を阻害する変異を含むＶタンパク質をコードするヌクレオチド配列を有する。一実施形態では、その減弱されるウイルスはＨＰＩＶ２である。
【０１０７】
複数の属、血清型、および株に対する免疫応答を誘発する組成物で、本発明の組換えＨＰＩＶ２と、他のＰＩＶ血清型または株のウイルス、ならびに複数の属から得たパラミクソウイルスとを併用することができる。免疫原性組成物は、２種以上の血清型から得たパラミクソウイルスを含んでもよい。一実施形態では、その血清型の少なくとも一つは、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ２、ＨＰＩＶ３、またはＨＰＩＶ４である。免疫原性組成物は、２種以上の株から得たパラミクソウイルスを含んでもよい。一実施形態では、株の少なくとも一種はＨＰＩＶ２株、例えば、Ｖ９４、Ｖ９８、またはＧｒｅｅｒなどである。免疫原性組成物は、２属以上から得たパラミクソウイルスを含んでもよい。一実施形態では、一つの属はルブラウイルス属である。
【０１０８】
本発明のパラミクソウイルスは、免疫原性組成物で異種抗原を発現するためのベクターとしても有用である。本発明のパラミクソウイルスによって、一個または複数の異種ポリペプチドをコードする一個または複数の過剰遺伝子をクローン化し、発現させることができる。例えば、単一パラミクソウイルス中に複数のＰＩＶ血清型および株の保護性エピトープを設計することによって、複数のＰＩＶ血清型または株に対する免疫応答を誘発することができる。一実施形態では、そのゲノムまたはアンチゲノムは、異種病原体の一個または複数の抗原決定基をコードする、一個または複数の異種遺伝子またはゲノムセグメントを含む。
【０１０９】
例えば、麻疹ウイルス、下位群Ａおよび下位群Ｂ呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型および２型、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブニアウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス、ヒトメタニューモビツセス（metapneumovituses）、またはインフルエンザウイルスの一個または複数の異種抗原決定基を本発明のパラミクソウイルスによって発現させることができる。有用な抗原決定基の例には、それだけには限らないが、麻疹ウイルスＨＡおよびＦタンパク質、下位群Ａまたは下位群Ｂ呼吸器合胞体ウイルスＦ、Ｇ、ＳＨおよびＭ２タンパク質、流行性耳下腺炎ウイルスＨＮおよびＦタンパク質、ヒトパピローマウイルスＬ１タンパク質、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型ｇｐ１６０タンパク質、単純ヘルペスウイルスおよびサイトメガロウイルスｇＢ、ｇＣ、ｇＤ、ｇＥ、ｇＧ、ｇＨ、ｇＩ、ｇＪ、ｇＫ、ｇＬ、およびｇＭタンパク質、狂犬病ウイルスＧタンパク質、エプスタイン−バーウイルスｇｐ３５０タンパク質、フィロウイルスＧタンパク質、ブニアウイルスＧタンパク質、フラビウイルスｐｒｅＥ、およびＮＳ１タンパク質、ヒトメタニューモウイルス（ＨＭＰＶ）ＧおよびＦタンパク質、およびアルファウイルスＥタンパク質、ならびにそれらの抗原ドメイン、フラグメントおよびエピトープが含まれる。
【０１１０】
一実施形態では、ＨＰＩＶ２ベクターのゲノムまたはアンチゲノム中に麻疹ウイルスＨＡ遺伝子の読み枠（ＯＲＦ）をコードするポリヌクレオチドを組み込むことによって、麻疹および／またはＨＰＩＶ２もしくは別のＨＰＩＶに対して免疫化するのに有用なキメラ候補が得られる。別の実施形態では、ＨＰＩＶ２ベクターのゲノムまたはアンチゲノム中に、一個または複数の異種ＰＩＶ（例えば、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、および／またはＨＰＩＶ４）ＨＰＩＶ２  Ｎ、Ｐ、Ｖ、Ｆ、ＨＮおよび／またはＬタンパク質、あるいはそのフラグメントをコードする遺伝子またはゲノムセグメントを含むポリヌクレオチドを組み込む。別の実施形態では、ＨＰＩＶｌ  ＨＮ、ＨＰＩＶ２  Ｆ、ＨＰｌＶ３  ＨＮ、ＨＰＩＶ３  Ｆ、麻疹ＨＡおよびＦ、ＨＭＰＶ  ＧおよびＦタンパク質、および／またはＲＳＶ下位群ＡまたはＢＧおよびＦタンパク質から選択した一個または複数の過剰な異種遺伝子またはゲノムセグメントを本発明のパラミクソウイルス中にクローン化する。
【０１１１】
パラミクソウイルスウイルスゲノムまたはアンチゲノム中に、一個または複数の過剰遺伝子または転写単位を挿入する数種の方法は、国際公開第０４／０２７０３７号記載されており、これにより参照により組み込む。過剰な異種遺伝子またはゲノムセグメントは、組換えゲノムまたはアンチゲノム中の様々な部位、例えば、Ｎの位置３’に、Ｎ／Ｐ、Ｐ／Ｍ、および／またはＨＮ／Ｌ遺伝子間に、あるいはＨＰＩＶ２ベクターのゲノムまたはアンチゲノムの別の遺伝子間物連結部もしくは非コード領域に挿入することができる。
【０１１２】
例えばワクチンなどの免疫原性組成物で使用する候補ウイルスは、その減弱と免疫原性に基づいて選択する。これらのワクチンの選択基準は公知の方法により決定する。好ましくは、候補ウイルスは安定した減弱表現型を有し、免疫化する宿主で複製し、そしてレシピエントで免疫応答、好ましくは保護免疫応答の発生を効果的に誘発する。好ましくは、候補ウイルスは、免疫応答を刺激し拡大し、例えば、異なるウイルス株または下位群に対して免疫応答を誘発し、かつ／または異なる免疫基準（例えば、血清免疫グロブリンに対する分泌性免疫、細胞性免疫など）が媒介する免疫応答を刺激する。
【０１１３】
本発明の組換えパラミクソウイルスは、適切な減弱、表現型の逆転に対する耐性、および免疫原性を確認するために、公知のin vitroおよびin vivoモデルで試験することができる。in vitroアッセイでは、修飾したウイルスである本発明のパラミクソウイルスは、例えば温度感受性複製など、一つまたは複数の所望の表現型について試験される。本発明のパラミクソウイルスはまた、ＰＩＶ感染動物モデルでも試験することができる。様々な動物モデルが知られている。ＰＩＶワクチン候補の減弱と免疫原性活性を評価するために、例えば、げっ歯類および非ヒト霊長類を含むＰＩＶモデル系が知られており、そこから得られるデータは、ヒトでのＰＩＶの感染、減弱、および免疫原性と相関することが知られている。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、組換え変異体パラミクソウイルスは、ｔｓ表現型を伴う少なくとも一つの減弱化変異、および非ｔｓ表現型を伴う少なくとも一つの変異を有する。減弱された組換えパラミクソウイルスは、細胞または哺乳動物で、野生型パラミクソウイルスと比較して約１／１００〜１／５０００に減弱されるのが好ましい。いくつかの実施形態では、１／１００，０００を下回る減弱は免疫原性を低減させうる。いくつかの実施形態では、in vitroでのウイルスの複製レベルは、広く普及した規模で使用するためのウイルスワクチンの生成を準備するのに十分であることが好ましい。いくつかの実施形態では、減弱されたパラミクソウイルスのin vitroでのウイルスの複製レベルは、少なくとも１ｍｌ当たり１０６であることが好ましく、少なくとも１０７がより好ましく、少なくとも１０８が最も好ましい。減弱化変異は、安定している変異であるのが好ましい。例えば、Ｌポリメラーゼの変異には、ある位置のアミノ酸の変化が、その位置の野生型アミノ酸をコードするコドンと比較して、そのコドンの少なくとも２個のヌクレオチドの変化を必要とするのが好ましい。少なくとも２、３、４、またはそれ以上の減弱化変異を有する組換えパラミクソウイルスはより安定しているように思われる。別個のＶ遺伝子をコードするポリヌクレオチドなど、その全長が６の法則に合致する過剰遺伝子を挿入することによって、安定した表現型を提供することもできる。
【０１１５】
減弱された組換えパラミクソウイルスの免疫原性は、１回の免疫化の後に、そして２回目の免疫化の後に、パラミクソウイルスに対する抗体を形成する動物数を定量することによって、動物モデルで評価することができる。いくつかの実施形態では、１回目の免疫化後、約６０〜８０％の動物が抗体を生成し、２回目の免疫化後には約８０〜１００％の動物が抗体を生成する場合、組換えパラミクソウイルスは十分な免疫原性を有する。免疫原性の定量に好ましい動物はアフリカミドリザルである。好ましくは、その免疫応答によって、同じ株または複数の株のパラミクソウイルスによる感染から保護される。
【０１１６】
本発明はまた、本発明の単離したポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む免疫原性組成物も提供する。例えば、免疫原性組成物は、配列番号４５の配列を有するＶポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、または配列番号４５の配列を有するＶポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。他の実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号１７の配列を有するＬポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性を有するポリペプチド、または配列番号１７の配列を有するＬポリペプチドに対して、少なくとも８０％の配列同一性の配列を有するポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含むことができる。他の実施形態では、免疫原性組成物は、配列番号２のポリヌクレオチドを含む核酸を含んでよい。
【０１１７】
本発明の組換えパラミクソウイルスは、免疫原性組成物中に免疫原有効量で存在するのが好ましい。免疫原有効量は、動物で免疫応答を誘発する組換えパラミクソウイルスの量である。組換えパラミクソウイルスの実際の量は、免疫化する動物、投与経路、およびアジュバントに応じて変ってよい。免疫応答を誘発するのに必要な組換えパラミクソウイルスの実際の量、投与のタイミングおよび反復は、宿主の健康状態および体重、投与方式、製剤の性質などに基づく従来法を使用して決定することができる。免疫原性用量は、当業者が決定することができる。一般的に、用量は、一宿主につきウイルス約１０３〜約１０７プラーク形成単位（ＰＦＵ）の範囲以上、より一般的には一宿主につきウイルス約１０４〜１０６ＰＦＵである。いずれにせよ、製剤は、抗ＰＩＶまたは他の抗病原免疫応答を効果的に刺激しまたは誘発するのに十分な量の本発明の減弱された組換えパラミクソウイルスを提供する。
【０１１８】
免疫応答は、Ｔ細胞および／またはＢ細胞の応答によって表しうる。典型的には、免疫応答は、特定の抗原に特異的に結合する抗体の存在によって検出する。特定の抗原に対する抗体を検出する方法は、当業者に公知であり、ＥＬＩＳＡアッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、赤血球凝集阻害アッセイ、および感染力中和アッセイなどのアッセイを含む。本発明の免疫原性組成物を投与された宿主を上気道および下気道疾患の徴候および症状についてモニターするのが好ましい。好ましくは、鼻内投与された減弱されたウイルスは、レシピエントの上咽頭で野生型ウイルスの約１／１０以下のレベルで、または不完全に減弱されたウイルスレベルと比較したとき約１／１０以下のレベルで増殖する。
【０１１９】
乳幼児では、十分な免疫レベルを誘発するのに多数回投与が必要であろう。投与は、誕生の一ヶ月目から開始し、天然（野生型）ＰＩＶ感染に対する免疫応答を維持する必要に応じて、幼児期の最初の数年にわたり間欠的に、例えば、２ヵ月、６ヵ月、１年、および２年目に行うことができる。同様に、例えば保健医療スタッフ、デイケアスタッフなど、特に繰り返しまたは重篤なＰＩＶ感染に罹患しやすい成人、児童の家族、高齢者、心肺機能が損なわれている個人は、免疫応答を樹立しかつ／または維持するために複数回免疫化を行う必要があるであろう。誘発される免疫レベルは、分泌型抗体および血清抗体を中和する量を測定し、用量を調整し、または所望の免疫応答レベルを維持するのに必要に応じて免疫化を繰り返すことによってモニターすることができる。
【０１２０】
本発明の組換えパラミクソウイルス、ポリヌクレオチド、およびポリペプチドは、公知の方法を使用して、製剤に直接使用し、または適宜凍結乾燥することができる。凍結乾燥ウイルスは通常約４℃で維持される。使用準備が整ったとき、凍結乾燥したウイルスを適切な安定化溶液で再構成する。多くの安定化溶液が知られている。本発明のパラミクソウイルスを含む免疫原性組成物は、生理学的に受容可能な担体および／またはアジュバントを含んでよい。生理学的に受容可能な担体の例には、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸を含む酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／あるいは非イオン界面活性剤、例えば、TWEEN（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびPLURONICS（登録商標）が含まれる。一般的に、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌溶液と混合する。
【０１２１】
組成物は、生理学的状態に近づけるのに必要な製薬上許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝化剤、張度調製剤、湿潤剤など、例えば、酢酸ナトリウム、ナトリウムラクタート、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアルニン（triethanolarnine）などを含んでよい。受容可能なアジュバントには、それだけには限らないが、フロイントアジュバント（不完全または完全）、ＭＰＬＴＭ（３−０−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａ；Corixa，Hamilton IN）およびＩＬ−１２（Genetics Institute，Cambridge MA）、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、免疫賦活性組成物およびミョウバン塩が含まれる。
【０１２２】
本発明の免疫原性組成物は、滴形、エアロゾル形、または噴霧器形で経鼻的に、経口的に、あるいは皮下注射、静脈内、筋肉内、胸骨内、または点滴技術を含み非経口的に、従来の無毒の製薬上許容される担体、アジュバントまたはビヒクルを含む単位用量製剤で投与することができる。本発明の組成物は、懸濁液または経口投与に適当な錠剤、または滅菌注射用調製物、例えば滅菌注射用水性もしくは油性懸濁液の形にすることができる。
【０１２３】
注射液または懸濁液としての投与には、本発明の免疫原性組成物は、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤、例えば、合成モノまたはジグリセリドを含む滅菌油、ならびにオレイン酸を含む脂肪酸を使用し当技術分野で公知の技術にしたがって製剤化することができる。
【０１２４】
鼻経路による免疫化は、筋肉内または皮下注射と比較してより有効であろう。上気道で局所分泌性ＩｇＡが生成されることによって、ＰＩＶ感染から保護できるからである。例えば、ＰＩＶ特異的分泌性ＩｇＡは、ＰＩＶ変異体株に対してより広範な交差反応を示すことができるので、変異体ＰＩＶに対してより高度な保護が得られるであろう。それに反して、注射用ワクチンは、粘膜ＩｇＡの誘発では非効率的である。特に、本発明の免疫原性組成物の経鼻投与は、全身免疫系とは異なって、粘膜免疫応答が年齢と共に低下しないので高齢者においてより有効であろう。全身免疫応答も刺激する本発明の免疫原性組成物は、血清からの抗体浸出物によって下気道（肺）を保護することができる。加えて、鼻関連リンパ組織のＰＩＶ特異的細胞障害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）は、感染からの回復の一助となりうる。
【０１２５】
経鼻投与用免疫原性組成物は、毒性、ｐＨ、および粘度の点で鼻分泌物に類似し、その結果通常の絨毛動作を維持されるように製剤化することが好ましい。一実施形態では、本発明の免疫原性組成物は、等張であり、ｐＨ約５．５〜約６．５に維持するためにわずかに緩衝化した水溶液で製剤化する。必要に応じて、製剤には抗菌性防腐剤および好適な安定剤を含める。
【０１２６】
Ｆ．使用方法
本発明はまた、本発明の組換えパラミクソウイルスを製造し使用する方法も提供する。一実施形態では、本明細書に記載したように、本発明は、感染性自己増殖性パラミクソウイルスを生成する方法に関する。一般的に、その方法は、パラミクソウイルスのウイルスゲノムまたはアンチゲノムから、ＰおよびＶタンパク質をコードするバイシストロン性ポリヌクレオチドを除去し、または変化させるステップ、ならびにＰタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよび／またはＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを挿入するステップを含む。別の実施形態では、それ以上Ｖタンパク質をコードしないように、標準的方法を使用し、パラミクソウイルス中のＰ遺伝子をコードする変異体ポリヌクレオチドをin situで変化させることができ、そしてパラミクソウイルスゲノムまたはアンチゲノム中に、Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを挿入することができる。好ましくは、Ｐタンパク質をコードするｍＲＮＡの編集が阻害されるように、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドが変異したｍＲＮＡ編集部位を含み、Ｖタンパク質をコードするｍＲＮＡの編集が阻害されるように、Ｖタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドが変異したｍＲＮＡ編集部位を含む。より好ましくは、Ｖタンパク質は、インターフェロンの生成および／またはシグナル伝達を阻害するために、Ｖタンパク質の能力を低減する少なくとも一つの変異を含む。
【０１２７】
一実施形態では、前記除去ステップは、認識配列がＰおよびＶタンパク質をコードするバイシストロン性ポリヌクレオチドを側置するように、ゲノムまたはアンチゲノムに特有の制限酵素認識配列を導入するステップ、およびバイシストロン性ポリヌクレオチドを側置する制限部位でゲノムまたはアンチゲノムを切断する一種または複数の制限酵素によって、ゲノムまたはアンチゲノムを消化するステップを含む。一実施形態では、前記挿入ステップは、切断された制限部位に、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを挿入するステップおよび前記ゲノムまたはアンチゲノムを再ライゲートするステップを含む。
【０１２８】
別の実施形態では、本発明は、感染性自己増殖性組換えパラミクソウイルスを生成する方法に関する。本発明の方法は、部分または完全ポリ六量体ゲノムまたはアンチゲノム配列を有する発現ベクターと、Ｎタンパク質、Ｐタンパク質、およびＬポリメラーゼをコードする一個または複数のポリヌクレオチドを含む一個または複数の補助ベクターを細胞集団に形質移入するステップ、およびウイルスが複製できる条件下で形質を移入した細胞をインキュベートするステップを含む。好ましくは、パラミクソウイルスは、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよび／またはＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む。
【０１２９】
別の実施形態では、本発明は、哺乳動物で免疫応答を誘発する方法に関する。本発明の方法は、本発明の免疫原性組成物を投与するステップを含む。好ましくは、免疫応答によって保護性（例えば、感染を阻害し、または感染重症度を低減する）抗体が産生される。一実施形態では、その抗体は抗ＰＩＶ抗体である。一実施形態では、その抗ＰＩＶ抗体はＩｇＡである。いくつかの実施形態では、免疫応答によって、過剰遺伝子またはゲノムセグメントによってコードされる異種病原体の一個または複数の抗原決定基に結合する抗体が産生される。異種病原体の例には、それだけには限らないが、ＨＰＩＶ１、ＨＰＩＶ３、麻疹ウイルス、下位群Ａまたは下位群Ｂ呼吸器合胞体ウイルス、流行性耳下腺炎ウイルス、ヒトパピローマウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型または２型、単純ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、狂犬病ウイルス、エプスタインバーウイルス、フィロウイルス、ブニアウイルス、フラビウイルス、アルファウイルス属、ヒトメタニューモウイルス、またはインフルエンザウイルスが含まれる。一実施形態では、抗原決定基にはは、麻疹ウイルスＨＡ、ＨＰＩＶ１  ＨＮ、および／またはＨＰＩＶ３  ＨＮが含まれる。
【０１３０】
別の実施形態では、本発明は、それだけには限らないが、ＰＩＶ感染を含むパラミクソウイルス感染を阻害する方法に関する。本発明の方法は、本発明の減弱されたパラミクソウイルスを含む本発明の免疫原性組成物を投与するステップを含む。好ましくは、本発明のパラミクソウイルスは、Ｐタンパク質をコードする変異体ポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドを含む。一実施形態では、そのパラミクソウイルスはＰＩＶである。一実施形態では、そのＰＩＶはＨＰＩＶ２である。好ましくは、免疫原性組成物は保護性（例えば、感染を阻害し、または感染の重症度を低減する）抗体を誘発する。一実施形態では、その抗体は抗ＰＩＶ抗体である。一実施形態では、その抗ＰＩＶ抗体はＩｇＡである。
【０１３１】
全ての刊行物、特許、および特許出願をこれにより参照により組み込む。以下の実施例は、単に例示的な目的で提供され、決して本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【０１３２】
代替コドン置換により増強されたＬタンパク質変異がもたらす減弱レベルおよび安定性
減弱されたＨＰＩＶ１およびＨＰＩＶ２ワクチン候補は、Ｌタンパク質の坐位のアミノ酸置換によって既に生成されている（国際公開第０４／０２７０３７号；（McAuliffeら、2004））。本実施例では、Ｌタンパク質変異坐位の代替コドン置換によって得られる減弱レベルを研究した。各位置で野生型アミノ酸を特定するコドンを再生するのに、少なくとも２個のヌクレオチド変化が必要とし、それによってその野生型アミノ酸を特定するコドンへの自発的逆転の機会を減少させるようにコドン置換変異を設計した。例えば、ＲＮＡウイルスの変異率についてよく言われている値１０−４をあげると、単一ヌクレオチド置換を必要とする逆転は約１０−４の頻度で生じるが、２個または３個の置換を必要とする逆転は、それぞれ、著しく減少した頻度である約１０−８および約１０−１２で生じる。
【０１３３】
材料および方法
プラスミドの調製および変異体の生成
ＰＣＲ変異誘発および標準的分子クローニング技術によって、１５，６５４ヌクレオチド長であり「６の法則」に合致するＨＰＩＶ２  Ｖ９４株アンチゲノムセンスｃＤＮＡ（配列番号４）（CalainおよびRoux, 1993; Kolakofskyら, 1998；VulliemozおよびRoux, 2001）が、Ｎ遺伝子内にあり、かつＮ  ＯＲＦの上流にあるＨＰＩＶ２ゲノムのヌクレオチド配列位置１４９〜１５６のＮｏｔＩ部位（ＧＣＧＧＣＣＧＣ（配列番号１１））を含むように修飾した。次のクローニングステップで役立つように、そして次の過剰遺伝子の挿入のための部位としてＮｏｔＩ制限部位を導入した。別段の記載が無い限り、記載した組換え変異体ＨＰＩＶ２のそれぞれは、このＮｏｔＩ部位を含む。
【０１３４】
生物学的に派生させた元の野生型臨床的ＨＰＩＶ２単離物をＶ９４（配列番号４）と名付け、ＮｏｔＩ部位を持たないその組換え野生型対応物をｒＶ９４（配列番号１２）と名付け、ＮｏｔＩ部位を含むその異形をｒＶ９４Ｎｏｔ（配列番号１３）と名付ける。国際公開第０４／０２７０３７号およびSkiadopoulosら, 2003, J. Virol., 77:270-279に記載されているように、野生型および組換えＨＰＩＶ２を組立て回収した。
【０１３５】
予め、ｔｓ減弱（ａｔｔ）表現型が得られる４つのＬタンパク質変異を数種の異種パラミクソウイルス（国際公開第０４／０２７０３７号）中で同定した。これらの変異を以下のようにＨＰＩＶ２に移入した：Ｆ４６０ＬはＲＳＶｃｐｔｓ５３０  Ｌタンパク質Ｆ５２１Ｌから移入（Juhaszら、1999；Whiteheadら、1999；Skiadopoulosら、1999c；Juhasz、Murphy、およびCollins、1999）；Ｙ９４８ＨおよびＬ１５６６Ｉは、それぞれ、ＨＰＩＶ３ｃｐ４５Ｌタンパク質Ｙ９４２ＨおよびＬ１５５８Ｉから移入、（Skiadopoulosら、1998；Skiadopoulosら、1999a））；ならびにＳ１７２４ＩはウシＰＩＶ３（ＢＰＩＶ３）Ｌタンパク質Ｔ１７１１Ｉから移入（Skiadopoulosら、2003a）。
【０１３６】
本発明の例では、アミノ酸位置４６０を特定するコドンに２個の変異（Ｆ４６０ＡおよびＦ４６０Ｐ）、およびアミノ酸位置９４８に３個の変異（Ｙ９４８Ａ、Ｙ９４８Ｇ、およびＹ９４８Ｌ）を含む、一個を超えるヌクレオチド変化を含むようにＬタンパク質変異を設計した。ＢＰＩＶ３  Ｌ  ＯＲＦで当初同定された変異（Ｔ１７１１Ｉ）を特定する位置１７２４（Ｓ１７２４Ｉ）のコドン置換もまた生成させたが、この変異体コドンは野生型とたった一つの単一ヌクレオチド置換によって異なった。ポリ六量体のゲノム長を維持するために、すなわちゲノム長を６の法則に合致させるために、位置１７２４および１７２５のコドンを欠失させた。従って、ＰＣＲ変異誘発（Moellerら、2001）および標準的分子クローニング技術（Skiadopoulosら, 2003, J. Virol., 77:270-279；Newmanら、2004）によって、表２に示すヌクレオチド配列が得られるように設計した変異原性ＰＣＲプライマーを使用し、位置４６０、９４８、１５６６、１７２４、および１７２５のアミノ酸をコードするコドンの位置に、新規な変異を含む６つの変異を生成した。
【０１３７】
表２にＨＰＩＶ２のＬ  ＯＲＦに導入した置換変異をまとめる。生成したアミノ酸置換によってＬタンパク質に変異を有する変異体を名付けた（例えば、ｒＦ４６０ＡはＦ−４６０をＡに変異させた組換えＶ９４）。
【表２】
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【０１３８】
ＨＰＩＶ２全長アンチゲノムｃＤＮＡに表２に示さない追加のコドン置換変異を導入したが、１回または２回の試行後にもこれらの構築体からｒＨＰＩＶ２は回収できず、これらの変異が致死の表現型を特定する可能性が示唆された。こうした変異には、Ａｌａ−９９８をＰｈｅまたはＣｙｓに、Ｌｅｕ−１５６６をＡｌａ、Ｇｌｙ、Ｌｙｓ、およびＡｓｎに、およびＴｙｒ−９４８をＴｈｒする変異が含まれた。
【０１３９】
国際公開第０４／０２７０３７号および以下に記載されるように、一つの全長ＨＰＩＶ２／ｒＶ９４Ｎｏｔプラスミドおよび３つのＨＰＩＶ２補助プラスミドを使用する復帰遺伝子系を使用し、表示したＬ遺伝子変異を含むｒＶ９４Ｎｏｔ（表２）をｃＤＮＡから回収した。
【０１４０】
ＨＰＩＶ２／Ｖ９４のＮタンパク質をコードする補助プラスミド（ｐＴＭ−Ｎ２）は、Thermoscript RT-PCR System（Invitrogen, Inc．）およびAdvantage-HF PCRキット（Clontech）を使用し、Ｎ  ＯＲＦ  ＡＴＧ翻訳開始コドン部位にかかるＡｆｌ  ＩＩＩ部位を含むアンチゲノムセンスオリゴヌクレオチド、およびＥｃｏＲＩ部位を有するアンチセンスオリゴを含むを用いてｖＲＮＡから誘導した。ＰＣＲ生成物をＡｆｌ  ＩＩＩおよびＥｃｏＲＩで消化し、Ｎｃｏ  ＩおよびＥｃｏＲＩで消化したｐＴＭｌ中にクローン化した（Durbin etal., Virology 235: 323-332,1997；Durbin etal., Virology 235: 323-332,1997；Elroy- Steinら , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 86: 6126-30, 1989）。
【０１４１】
Ｎｃｏ  Ｉ〜ＥｃｏＲＩフラグメントとしてｐＴＭｌ中にサブクローン化した完全Ｐ  ＯＲＦを生成するために（それによってＶ  ＯＲＦと区別されるように）、２個の重複するＰＣＲフラグメントからＨＰＩＶ２／Ｖ９４のＰタンパク質をコードする補助プラスミド（ｐＴＭ−Ｐ２）を生成し（Moellerら, J. Virol. 75: 7612-20, 2001、参照により本明細書に組み込む）、ＨＰＩＶ２  Ｐ遺伝子編集部位（ｎｔ２４８１〜２４８７）中に２個のグアノシンヌクレオチド挿入物が含まれるように設計した。
【０１４２】
ＰＣＲ増幅によって、Ｌ遺伝子ＡＴＧ翻訳開始コドンにかかるＮｃｏ  Ｉ部位を含むセンスオリゴ、およびＬ  ＯＲＦ中の特有ＡａｔＩＩ部位（ｎｔ１０３４２）の下流にあるアンチセンスオリゴを用いて、ＨＰＩＶ２のＬポリメラーゼをコードする補助プラスミド（ｐＴＭ−Ｌ２）を作製した。Ｌ  ＯＲＦの残部は、ＨＰＩＶ２全長クローンを構築するために使用したサブクローンから誘導した。ＰＣＲ生成物をＡｓｐ７１８およびＡａｔＩＩで消化し、ＨＰＩＶ２のｎｔ１０３４２〜１５６５４と、続いて特有の遺伝子外Ｒｓｒ  ＩＩ部位を含むｐＵＣ１９プラスミド中にクローン化した。次いで、Ｎｃｏ  Ｉ〜ＲｓｒＩＩフラグメントとして、修飾したｐＴＭｌに完全ＨＰＩＶ２／Ｖ９４  Ｌ  ＯＲＦをサブクローン化した。
【０１４３】
リポフェクタミン-2000試薬（Invitrogen, Inc.）を使用し、６ウェルプレート（Costar, Coming Inc., Coming, NY）中のＨＥｐ−２細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２３）に、本発明の変異体ＨＰＩＶ２をコードするｃＤＮＡプラスミドと３つのＨＰＩＶ２補助プラスミド（ｐＴＭ−Ｎ２、ｐＴＭ−Ｐ２、ｐＴＭ−Ｌ２）を同時形質移入した。既に記載したように、ＨＥｐ−２細胞にＭＶＡ−Ｔ７を同時感染させた（Durbin etal., Virology 235: 323-332,1997；Schmidtら , J. Virol. 74: 8922-9, 2000）。形質移入後３日目または４日目に上清を回収し、ＬＬＣ−ＭＫ２（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７．１）単層上で２度継代培養した。
【０１４４】
ウイルスがｃＤＮＡから誘導されたことを確認するために、生物学的に派生させたウイルスによる混入を示すのではなく、ＲＴを実施し、ウイルスゲノムセグメントをＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ生成物の配列分析によって、野生型親ウイルス中にはないが、組換えウイルスのＦおよびＬ遺伝子に存在する２個の点変異の存在が判明しｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４と名付けた。次いで、標準的技術を使用し、ＬＬＣ−ＭＫ２単層上でプラーク精製するために、各ｒＨＰＩＶ２／Ｖ９４をプラークによってクローン化し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞で６〜８回継代培養した（Skiadopoulosら, 1999, Virology, 260:125-35）。
【０１４５】
ＨＥｐ−２およびＬＬＣ−ＭＫ２細胞は、５％ＦＢＳおよび硫酸ゲンタマイシン（５０uｇ／ｍＬ）を添加したOptiMEM I（LifeTechnologies, Gaithersburg, MD）中で維持した。標準的技術を使用し、組換えＨＰＩＶ２および生物学的に派生させたＨＰＩＶ２をＬＬＣ−ＭＫ２細胞中で増殖させ、モルモットの赤血球で血球吸着させることにより確認したウイルス感染培養物を用いて、限界希釈により定量した（Hallら, 1992, Virus Res., 22:173-184）。
【０１４６】
in vitroでの組換えｒＨＰＩＶ２および変異体ｒＨＰＩＶ２の複製
in vitroで、許容温度（３２℃）および制限温度（３７〜４０℃）で、組換え野生型ｒＨＰＩＶ２および変異体ｒＨＰＩＶ２の複製を試験した。組換えＨＰＩＶ２または生物学的に派生させたＨＰＩＶ２を感染効率０．０１で６ウェルプレートのＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層に三つ組で播種し、培地１ｍｌ当たりブタトリプシン５μｇを添加し、または添加せずに培養物を３２℃でインキュベートした（Skiadopoulosら, 1999, Vaccine, 18:503-510）。感染後０時および１〜６日目に、各ウェルから培地（０．５ｍｌ）を回収し、０．５ｍｌの新鮮培地と交換した。許容温度（３２℃）または制限温度（３７〜４０℃）で６日間インキュベートした９６ウェルプレートのＬＬＣ−ＭＫ２単層で、試料中に存在するウイルスを滴定により定量した（Skiadopoulosら, 1999, Vaccine, 18:503-510）。トリプシン存在下で増殖したウイルスをトリプシンを含む培地で滴定した。モルモットの赤血球で血球吸着によりウイルスを検出した（Skiadopoulosら, 1999, Vaccine, 18:503-510）。
【０１４７】
in vitroでのＨＰＩＶ２の複製（マルチサイクル増殖曲線）
組換えＨＰＩＶ２または生物学的に派生させたＨＰＩＶ２を感染効率（ｍ．ｏ．ｉ．）０．０１で６ウェルプレートのＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層に三つ組で播種し、培養物を３２℃でインキュベートした。感染後０時および１〜７日目に、各ウェルから０．５ｍｌの培地を回収し、０．５ｍｌの新鮮培地と交換した。３２℃で６、７日間インキュベートした９６ウェルプレートのＬＬＣ−ＭＫ２単層で試料中に存在するウイルスを滴定により定量した。血球吸着によってウイルスを検出した。力価をｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌ（５０％組織培養物感染用量／ｍｌ）として報告する。
【０１４８】
in vivoでの組換えＨＰＩＶ２Ｌタンパク質変異体の複製
ゴールデンシリアンハムスター（Mesocricetus auratus）は、ヒトパラインフルエンザウイルスの複製レベルを評価するのに好適な小動物モデルであることが実証されている。従って、既に記載したように、ハムスターの上気道および下気道で、野生型ＨＰＩＶ２および組換え変異体ＨＰＩＶ２の複製レベルを検証した（Skiadopoulosら、2003b）。手短に言えば、群当たり６頭の４週齡ゴールデンシリアンハムスター（Charles River Laboratories, NY）の鼻内（ＩＮ）に、ＨＰＩＶ２  １０６．０ＴＣＩＤ５０を含むＬ１５培地０．１ｍｌを接種した。先に記載した通り（Newmanら、2002）、感染後４日目に、肺および鼻甲介を回収し、ＬＬＣ−ＭＫ２単層で組織ホモジネートの段階希釈によってウイルスを定量した。ハムスターの各群について平均ウイルス力価を算出し、組織１ｇ当たりｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０として表示する。
【０１４９】
アフリカミドリザル（Cercopithecus aethiops）は、ＨＰＩＶ２の複製について好適な非ヒト霊長類動物モデルであることが既に実証されている（Durbin、Elkins、およびMurphy、2000）。既に記載したように（Durbin、Elkins、およびMurphy、2000）、ＨＰＩＶ２に対して血清抗体を持たないサル（赤血球凝集阻害（ＨＡＩ）力価≦１ｌｏｇ２）に、Ｌ１５培地中ウイルス１０６ＴＣＩＤ５０を含む、一部位当たり１ｍｌの接種原を用いて、ＩＮおよび気管内（ＩＴ）経路により同時接種した。１〜１０日目に鼻咽頭（ＮＰ）綿棒試料を回収し、感染後２、４、６、８、および１０日目に気管洗浄液（ＴＬ）試料を回収した。ＮＰおよびＴＬ試料中に存在するウイルスをＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層で滴定することによって定量し、得られた平均ピークウイルス力価をｌｏｇ１０６ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして表した。一回目の感染後２８日目または３１日目に、一部位当たり、生物学的に派生させたＶ９４  ＨＰＩＶ２株を１０６ＴＣＩＤ５０含む１ｍｌをサルにＩＮおよびＩＴで攻撃し、攻撃後２、４、６、８、および１０日目にＮＰおよびＴＬ試料を回収した。試料中に存在するＨＰＩＶ２は上記のように定量した。免疫化前（０日目）、免疫化後（２８または３１日目）、および攻撃後２８日間（一回目の感染後５６または５９日目）に、血清抗体力価を定量するために血清試料を回収した。
【０１５０】
結果および考察
表２に示すＬタンパク質変異体は、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層（≧１０６．８ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）で３２℃で高力価に増殖することが判明し、Ｌタンパク質中の変異は許容温度（３２℃）のin vitroで複製が減弱しないことが示された（表３）。ｒＨＰＩＶ２変異体のシャットオフ温度は、３２℃のその力価と比較してウイルス力価の減少が、その同じ２温度間のＨＰＩＶ２／Ｖ９４の差の１／１００未満という最低温度として定義される。ｔｓ表現型を有するとして、変異組換え体ｒＦ４６０Ａ、ｒＦ４６０Ｐ、ｒＹ９４８Ａ、ｒＹ９４８Ｇ、ｒＹ９４８Ｌ、ｒＳ１７２４Ｉ、およびｒｄｅｌ１７２４が名付けられた（表３）。
【表３】
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【０１５１】
図１および表４に示すように、代替コドン置換を含む組換えＨＰＩＶ２（ｒＦ４６０Ａ、ｒＦ４６０Ｐ、ｒＹ９４８Ａ、ｒＹ９４８ＧおよびｒＹ９４８Ｌ）は、ｒＶ９４Ｎｏｔ親ウイルスよりも減弱された。ｒＦ４６０ＡおよびｒＦ４６０Ｐは、上気道および下気道で当初移入した変異を有するＦ４６０Ｌよりも減弱された。同様に、ｒＹ９４８Ａ、ｒＹ９４８Ｇ、およびｒＹ９４８Ｌは、上気道および下気道で当初移入した変異を有するｒＹ９４８Ｈよりも減弱された。従って、コドン置換変異体は、ワクチンウイルスに望ましい特性である高い減弱度を示した。
【０１５２】
新たに派生させたｒＳ１７２４Ｉおよび既に派生されているｒｄｅｌ１７２４（国際公開第０４／０２７０３７号）組換え体は、ハムスターの上気道および下気道でｒＶ９４Ｎｏｔ親ウイルスよりも減弱された。これらの結果は、ＨＰＩＶ２  Ｌタンパク質のアミノ酸１７２４が減弱表現型をもたらしやすい部位であることを示した。ハムスターで高度に減弱されるｒｄｅｌ１７２４は２個のアミノ酸欠失を含み、それによって野生型に逆転するためには６個の特定のヌクレオチドを挿入する必要があるが、ｒＳ１７２４Ｉは一個のヌクレオチド置換を含み、はるかに逆転しやすいということは重要なことである。従って、欠失変異は、in vivoで安定するはずのａｔｔ表現型を特定するので、ＨＰＩＶ２ワクチンに封入するのに好ましい変異である。
【表４】
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【０１５３】
Ｙ９４８Ｌ変異は、ハムスターの気道でＨＰＩＶ２の複製を最高度に減弱させた（ｒＶ９４Ｎｏｔと比較して、それぞれ、上気道および下気道で１／４０００および／１６０００の複製の減少）。従って、本発明者らは、非ヒト霊長類の気道でＹ９４８Ｌ変異体が複製する能力を試験した。
【０１５４】
図２および表５に示すように、新規なＨＰＩＶ２Ｌタンパク質Ｙ９４８Ｌ変異は、そのｒＶ９４Ｎｏｔ親と比較して、アフリカミドリザルの下気道で、平均ピークウイルス複製レベルでさらに１／１６０の減少と、下気道に流れる日々のウイルスの平均合計で有意な減少が得られた。さらに、ｒＹ９４８Ｌによる感染は、生物学的に派生させたＶ９４による攻撃から動物を保護した（表５）。これらの結果は、ｒＹ９４８Ｌ変異体が非ヒト霊長類で適切に減弱され、有効であることを示唆している。加えて、Ｙ９４８Ｌのコドン置換は、野生型Ｔｙｒコドンに逆転するのに３個のヌクレオチド変化を必要とし、従ってこの変異を遺伝子的により安定的なものにする。従って、異種ウイルスで減弱表現型をもたらすことが知られている位置での代替コドン置換を使用することは、非ヒト霊長類でＨＰＩＶ２減弱レベルを高める有効な手段である。
【０１５５】
アミノ酸１７２４〜１７２５が欠失しているＨＰＩＶ２変異体もまた、アフリカミドリザルで高度に減弱され、有効であった（図２および表５）。ｒＶ９４  ｄｅｌ１７２４は、ｒＶ９４ｄｅｌ１７２４が野生型に逆転するのに６個のヌクレオチドを挿入する必要があるので、ｒＶ９４Ｙ９４８Ｌよりも高い安定性レベルを有している。
【表５】
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【０１５６】
ａ．動物には、０日目にＩＮおよびＩＴで、一部位当たり表示したウイルス１０６ＴＣＩＤ５０を接種した。
ｂ．同様に感染させ試料を採取したアフリカミドリザルから回収した３回の研究のデータを含む。
ｃ．  感染後１〜１０日目に鼻咽頭（ＮＰ）綿棒試料を回収した。感染後２、４、６、８、および１０日目に気管洗浄液（ＴＬ）試料を回収した。サンプリング日に関わりなく、その群の各動物のピークウイルス力価の平均を示す。Ｓ．Ｅ．＝標準誤差。ウイルス力価の検出の限界は１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。Ａによって示す値は、Ｖ９４を投与された群とは有意に異なる（Ｐ＜０．０５）。Ｂによって示す値は、ｒＶ９４Ｎｏｔを投与した群とは有意に異なる。
ｄ．全サンプリング日（ＮＰについては１〜１０日目、ＴＬについては２、４、６、８および１０日目）に、各動物について得られたウイルス力価の合計を算出し、各群の平均（ｌｏｇ１０）±Ｓ．Ｅ．を示す。検出の下限はＮＰ綿棒では５．０ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、ＴＬ試料では２．５ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌである。Ａで示す値は、Ｖ９４を投与した群とは有意に異なった。Ｂで示す値は、ｒＶ９４Ｎｏｔを投与した群とは有意に異なった。
ｅ．攻撃後２８〜３１日目に血清を回収し、同じＨＰＩＶ２赤血球凝集阻害アッセイにより滴定した。
ｆ．一回目の免疫化後２８または３１日目にＩＮおよびＩＴにより、一部位当たりＨＰＩＶ２  Ｖ９４株１０６ＴＣＩＤ５０で動物を攻撃した。感染後２、４、６、および８日目に、ＮＰ綿棒およびＴＬ試料を回収した。３２℃でＬＬＣ−ＭＫ２細胞でウイルス滴定を実施した。サンプリング日に関わりなく、その群の各動物についてピークウイルス力価±Ｓ．Ｅ．の平均を示す。ウイルス力価の検出限界は１０ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。Ｖ９４を投与されたＨＰＩＶ２未処置サルで得られた平均ピークウイルス力価の値と比較。
ｇ．攻撃後２８日目に攻撃後抗体力価を入手し、同じＨＰＩＶ２赤血球凝集阻害アッセイで滴定した。
ｈ．２個のＡＧＭから十分ではない血清量。６頭の動物から平均を算出した。
ｉ．１個のＡＧＭから十分ではない血清量。７頭の動物から平均を算出した。
ｊ．先の研究からＨＡＩデータ、試料は他の試料とは同時に試験しなかった。
【０１５７】
これらの変異体の複製特性をin vivoおよび動物モデルで分析することによって、Ｆ４６０ＬおよびＬ１５６６Ｉ変異は、それぞれ、ハムスターの下気道で複製を約１／２５０減少させ、１７２４〜１７２５の欠失変異はアフリカミドリザルの気道で複製を１／４から１／２５減少させることが実証された。興味深いことに、Ｙ９４２Ｈ変異は、ＨＰＩＶ３およびＨＰＩＶ１でｔｓおよびａｔｔ表現型をもたらしたが、類似の変異体はＨＰＩＶ２を減弱しなかった。これは、移入戦略によって、必ずしもではないが頻繁にレシピエントウイルスにａｔｔ表現型がもたらされること示している。
【実施例２】
【０１５８】
ＨＰＩＶ２／Ｖ９４の３’リーダー配列の推定非ｔｓ、宿主範囲ａｔｔ変異の同定
本発明者らは、アフリカミドリザルの下気道で、ｐｒｅ−Ｎ  ＯＲＦ  ＮｏｔＩ制限部位を有するｒＶ９４（ｒＶ９４Ｎｏｔ）と、生物学的に派生させたＶ９４との間の複製レベルに有意で予想外の差があることを認めた（表５および図２）。導入されたｐｒｅ−Ｎ  ＯＲＦ  ＮｏｔＩ制限部位、およびＦ  ＯＲＦ中の翻訳上サイレントなヌクレオチド置換を除いて、組換えＶ９４配列は、生物学的に派生させたウイルスで同定された配列と同一であった（Skiadopoulosら、2003b）。導入されたＮｏｔＩ部位が、減弱表現型を担ったかどうかを確認するために、本発明者らは、生物学的に派生させたＶ９４の複製レベルと、ｐｒｅ−Ｎ  ＯＲＦ  ＮｏｔＩ部位を含まない組換えＶ９４（ｒＶ９４）の複製レベルを比較した。本発明者らは、ｒＶ９４もまた、アフリカミドリザルの下気道で有意に減弱されたことを見出した（図２および表５）。これらの結果から、アフリカミドリザルの下気道で観察された組換えＶ９４と生物学的に派生させたＶ９４の複製レベルの差には別の要因が関与し、ＮｏｔＩ部位はおそらくａｔｔ表現型を特定しなかった。
【０１５９】
材料および方法
継代培養および配列決定
実施例１のサルに投与した未クローン化の生物学的に派生させたＨＰＩＶ２  Ｖ９４臨床的単離物を、次いでベロ細胞単層で９回継代培養し、次にＬＬＣ−ＭＫ２細胞単層で１回継代培養してウイルス調製物（Ｖ９４（ａ））を生成した。
【０１６０】
しかし、ＨＰＩＶ２／Ｖ９４コンセンサス配列を決定するために使用したウイルス調製物は、まずベロ細胞で９回継代培養し、次いでＬＬＣ−ＭＫ２細胞で複数回継代培養したＶ９４から調製した（Ｖ９４（ｂ））。従って、Ｖ９４（ａ）とＶ９４（ｂ）は遺伝子的に同一ではない可能性が存在した。本発明者らは、Ｖ９４（ａ）の配列を決定し、それとＶ９４（ｂ）コンセンサス配列を比較した（図３Ａ）。既に記載したように、ゲノム全体にかかる重複するＲＴ−ＰＣＲ  ｃＤＮＡフラグメントを配列決定することによって配列を決定した（国際公開第０４／０２７０３７号；Skiadopoulosら, 2003, J. Virol., 77:270-279）。Ｖ９４（ａ）に感染した４頭のアフリカミドリザルの下気道から回収したウイルスの一次単離物に由来する未クローンＲＴ−ＰＣＲ生成物から得た配列電気泳動図を図３ｂに示す。対照としてＬＬＣ−ＭＫ２細胞で継代培養したＶ９４（ａ）を示す。電気泳動図は、Big Dye sequencingキット（Perkin-Elmer Applied Biosystems, Warrington, UK）を用いてPerkin-Elmer ABI 3100 sequencerで、ABI Prism Sequencing Analysisソフトウェア（バージョン３．０）（Perkin-Elmer, UK）によって生成した。
【０１６１】
アフリカミドリザルの気管洗浄液のウイルス単離物の配列決定
Ｖ９４（ａ）（ヌクレオチド位置１５にＴまたはＣの混合集団を含む）に感染させた４頭のアフリカミドリザルから回収した気管洗浄液試料をＬＬＣ−ＭＫ２単層で一回継代培養することによって増幅した。対照として、元のＶ９４（ａ）接種原もまた、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞上で１回継代培養した。一次単離物も同様にｒＶ９４（位置１５に排他的にＣを含む）を投与した動物の気管洗浄液試料から調製した。３２℃で６日間インキュベーション後、これらの一次単離物を回収し、ｖＲＮＡを調製し、３’ＲＡＣＥ（ｃＤＮＡ末端の迅速増幅）反応で使用して、ウイルスゲノムの３’末端かかるＲＴ−ＰＣＲ生成物を生成した。ヌクレオチド位置１５付近でＰＣＲ生成物を配列決定した。
【０１６２】
結果および考察
Ｖ９４（ａ）およびＶ９４（ｂ）の配列は、３’リーダー中の一つの位置を除き、完全に同一であることが判明した。Ｖ９４（ｂ）のヌクレオチド位置１５の配列はシトシン（Ｃ、アンチゲノムｃＤＮＡセンス）であるが、サルに投与したＶ９４（ａ）調製物について決定された配列はシトシンとチミジン（Ｔ）の混合物であった。配列におけるこの差は、ベロ細胞でＶ９４を継代培養している間に発生し、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞で複数回継代培養することによって選択された自発的変化である可能性が高い。Ｖ９４の組換え異形体の（ｒＶ９４およびｒＶ９４Ｎｏｔ）配列は位置１５にＣを有していた。これは、生物学的に派生させたＶ９４（Ｖ９４（ａ））と組換えＶ９４（Ｖ９４（ｂ））との間で観察された唯一の配列差なので、本発明者らは、位置１５のＣがアフリカミドリザルの下気道でウイルスの複製に対して減弱化効果を有すると結論づける。
【０１６３】
興味深いことに、ハムスターの気道では生物学的に派生させたＶ９４とｒＶ９４との間に複製レベルの差はなかった。さらに、生物学的に派生させたウイルスと組換えウイルスのin vitroでの増殖特性も同一であり（表３）、このヌクレオチド置換が宿主範囲ａｔｔ表現型を特定すること、すなわち、この置換によってアフリカミドリザルでは減弱されたが、ハムスターでは野生型表現型であることが示された。非ヒト霊長類での結果は、ヒトでの結果を予測するものと思われる。従って、Ｔ１５Ｃは、減弱された生ＨＰＩＶ２ワクチンを生成するのに利用できる別の新規な減弱化変異を構成する。
【０１６４】
サルに接種するのに使用されたＶ９４（ａ）調製物の配列電気泳動図では、位置１５のＣおよびＴヌクレオチドの相対的シグナル強度はおよそ同じであり（図示せず）、調製物が、存在量がほぼ同等のＣまたはＴを有するウイルス集団を含んでいたことが示唆された。この観察に基づき、本発明者らは、Ｔを含むウイルス集団が、Ｖ９４（ａ）を投与されたサルで観察されたＶ９４の高い複製レベルをおそらく説明できると示唆する。こもしこれが事実ならば、これらの動物の肺で複製されるウイルスは位置１５に主としてＴを有するであろう。
【０１６５】
この仮説を試験するために、Ｖ９４（ａ）（ヌクレオチド位置１５にＴまたはＣの混合集団を含む）に感染させた４頭のアフリカミドリザルから回収した気管洗浄液試料をＬＬＣ−ＭＫ２単層で一回継代培養することによって増幅した。図３Ｂに示すように、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞で１回継代培養した元のＶ９４（ａ）接種原は、位置１５座位に混合集団（Ｃ＋Ｔ）を保持した。重要なことに、同じＶ９４（ａ）接種原を投与した動物から得た単離物のそれぞれも、今回、同じ座位に均質な集団（Ｔ１５）を主として有した。これは、サルの気道で位置１５にＴを含むウイルス集団が、主たる複製集団であることを示している。
【０１６６】
一次単離物も同様に、ｒＶ９４（位置１５に排他的にＣを含む）を投与した動物の気管洗浄液試料から調製した。これらの単離物から精製したｖＲＮＡから調製したＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列分析から、この位置（Ｃ−１５）のインプットされたウイルス配列は変化せず（データ示さず）、in vivo複製後も遺伝子的に安定していることが実証された。従って、Ｖ９４ゲノムの位置１５のＣは、アフリカミドリザルの下気道での減弱に関与するが、ハムスターでは関与しない。ｒＶ９４の複製は、３９℃または４０℃では制限されないので（表３）、この変化ではｔｓ表現型は得られない。
【０１６７】
Ｔ１５Ｃは、非ｔｓ、宿主範囲ａｔｔ表現型をもたらすので、減弱された生ＨＰＩＶ２ワクチンに含めるのに有用な成分である。図２は、Ｙ９４８Ｌ変異によって特定された減弱は、３’リーダーＴ１５Ｃ変異に付加的なものであり、ｔｓおよび非ｔｓ  ａｔｔ変異が両立的であり付加的なものであることを示す。これらの変異によって、ＨＰＩＶ２ワクチンウイルスの減弱レベルの調整を高める方法が得られる。
【実施例３】
【０１６８】
ＰまたはＶタンパク質をコードする別個のポリヌクレオチドを含む組換えＨＰＩＶ２
ＨＰＩＶ２のバイシストロン性Ｐ／Ｖ遺伝子は、２個の重複する読み枠から、ヌクレオカプシドに関連するＰリンタンパク質（３９５アミノ酸）および付属のＶタンパク質（２２５アミノ酸）をコードする（Ohgimotoら、1990）。Ｖタンパク質はウイルス複製に必ずしも必要ではないので（Katoら、1997；Fukuharaら、2002；Heら、2002；Sunら、2004）、細胞培養でワクチンウイルスの複製に干渉しないが、ヒト宿主でウイルスの複製を減弱する変異を導入する際の魅力的標的である。しかし、ＰおよびＶのＯＲＦが重複する性質は、Ｐタンパク質に影響を与えることなく、Ｖタンパク質中に導入することができる（逆も同様）変異の数および型を著しく制限する。この障害を克服するために、本発明者らは、新規な手法に着手し、ＰおよびＶタンパク質が、それぞれ、別個のＰタンパク質をコードするポリヌクレオチドおよびＶタンパク質をコードするモノシストロン性ポリヌクレオチドによってコードされるように、ＨＰＩＶ２  Ｖ９４株アンチゲノムｃＤＮＡを修飾した。これにより、Ｐタンパク質の統合性を損なうことなく、Ｖタンパク質で様々な置換および欠失変異を導入できるようになる。
【０１６９】
Ｐ／Ｖ遺伝子の代替読み枠には、Ｐ／Ｖ遺伝子ｍＲＮＡを通常にはない同時転写編集することによってアクセスし（Ohgimotoら、1990）、これは、パラミクソウイルス科パラミクソウイルス亜科のほとんどのメンバーに特有の特徴である（Kawanoら、1993；Chanock、Murphy、およびCollins、2001）。ｍＲＮＡ編集部位のヘプタグアノシン配列（下線で）（ＴＴＴＡＡＧＡＧＧＧＧＧＧＧ、Ｖ９４ヌクレオチド２４７４〜２４８７；配列番号８）に挿入された、２個の追加のグアノシン残基を有するＰ／Ｖ遺伝子ｍＲＮＡからＨＰＩＶ２  Ｐタンパク質は翻訳される。他のパラミクソウイルスの編集部位と共通の特徴を有するこの編集部位は、連続したヘプタグアノシン経路を含む（JacquesおよびKolakofsky、1991；Chanock、Murphy、およびCollins、2001）（図４ＡおよびＢ）。ｍＲＮＡ合成中、ウイルスのポリメラーゼは、ヘプタグアノシン経路で動きが鈍くなることによって、一個または複数のグアノシン残基を挿入すると考えられている。ＨＰＩＶ２の場合、２個のグアノシン残基が挿入される。挿入された残基は、コドン１６４で翻訳読み枠をシフトし、続いて翻訳機械がＰタンパク質のカルボキシ末端半分（ａａ１６５〜３９５）を特定する代替ＯＲＦにアクセスする。短い方のＶタンパク質は、未編集Ｐ／Ｖ遺伝子ｍＲＮＡから生成される。従って、ＰおよびＶタンパク質は共通アミノ末端配列（ａａ１〜１６４）と特有のカルボキシ末端を有する（図４Ｃ）。
【０１７０】
パラミクソウイルスＶタンパク質は、ウイルス形態形成に作用する活性から、宿主細胞固有の免疫応答を相殺する活性まで一範囲の機能を有する（Parisienら、2001；Andrejevaら、2002a；Parisien、Lau、およびHorvath、2002）。ルブラウイルスＶタンパク質に類似して、推定ＨＰＩＶ２Ｖタンパク質の活性には、ＲＮＡ結合（Lin、Paterson、およびLamb、1997）、ウイルスヌクレオタンパク質（Ｎ）結合（Preciousら、1995；RandallおよびBermingham、1996；Watanabeら、1996a）、細胞下局在化活性（Watanabeら、1996b；Rodriguez、Cruz、およびHorvath、2004）、Ｅ２様またはＥ３様ユビキチンリガーゼ活性（UlaneおよびHorvath、2002）、ユビキチン化、ＳＴＡＴ結合、および分解の誘発（Andrejevaら、2002a；Kozukaら、2003）、傷害特異的ＤＮＡ結合タンパク質（ＤＤＢＰ）に結合（Linら、1998；Andrejevaら、2002b）、アポトーシスを阻止（Sunら、2004）、ならびに高度に保存されたシステインリッチカルボキシ末端ドメインが媒介する亜鉛イオン結合（ListonおよびBriedis、1994；Patersonら、1995；Huangら、2000）が含まれる。多くのこれら機能の活性部位は、Ｖタンパク質ドメインを分離するために局在化すると思われるが、いくつかの活性は重複する可能性が高い。
【０１７１】
Ｖタンパク質は、ウイルス複製に必ずしも必要ではないので（Katoら、1997；Fukuharaら、2002；Heら、2002；Sunら、2004）、Ｖタンパク質は、細胞培養でワクチンウイルスの複製に干渉しないが、ヒト宿主でウイルスの複製を減弱する変異を導入するための魅力的標的である。カルボキシ末端が欠失しているＶタンパク質を発現するパラミクソウイルスは、抗ウイルスインターフェロンαおよびβを発現しないベロ細胞を含め、in vivoで、時にはin vitroで、複製する際に欠陥があるが判明した（Katoら、1997；Delendaら、1997；Durbinら、1999；Kawanoら、2001；Heら、2002；Parkら、2003）。従って、in vitroでの増殖促進機能およびin vivoでの抗固有の免疫応答活性を担う、ＨＰＩＶ２Ｖタンパク質のタンパク質ドメインを決定することが重要である。しかし、ＰおよびＶのＯＲＦが重複する性質は、Ｐタンパク質に影響を与えることなく、Ｖタンパク質中に導入することができる（逆も同様）変異の数および型を著しく制限する。
【０１７２】
材料および方法
Ｐ／Ｖ遺伝子の遺伝子再構成を含む、組換えＨＰＩＶ２の生成および回収。次のクローニングステップを促進にするために、特有のエンドヌクレアーゼ制限認識配列［ＡｓｃＩ（ｎｔ１９８６〜１９９３）；ＢｓｔＥＩＩ（ｎｔ３１８８〜３１９４）、ＡｇｅＩ（ｎｔ３１９２〜３１９７）、ＳａｃＩＩ（ｎｔ３２２１〜３２２６）］をｒＶ９４Ｎｏｔ  ｃＤＮＡに導入した（図５Ａ）。ヌクレオチド置換ＰＣＲ変異誘発によって、図５Ｂまたは５Ｃに示す配列が得られるように設計した変異原性ＰＣＲプライマーを使用し、Ｐ／Ｖ  ＯＲＦの上流（ＡｓｃＩ）または下流（ＢｓｔＥＩＩ、ＡｇｅＩ、およびＳａｃＩＩ）にある非コード領域に制限部位を導入した。制限部位は、そのＯＲＦ外側に生じたので翻訳上サイレントであった。実施例１に記載したように、導入した制限部位を含む組換えＶ９４（ｒＶ９４Ｎ／Ａ／Ｂと称する）を回収した。
【０１７３】
Ｐタンパク質のみをコードする修飾されたＰ  ＯＲＦ（配列番号２）によって、ｒＶ９４Ｎ／Ａ／Ｂ中の天然Ｐ／Ｖ  ＯＲＦを置換した。Ｐ遺伝子単位中、Ｐタンパク質のカルボキシ末端半分を特定する好適なＰ読み枠にアクセスするのに役立つ２個のヌクレオチドの挿入、およびＰタンパク質をコードするｍＲＮＡが編集されるのを防止する、３個のグアノシンの翻訳上サイレントな置換によって編集部位を修飾した。最終構築体のゲノム長が「６の法則」に合致するように、Ｐ  ＯＲＦを側置する非コード領域に４個の追加のヌクレオチド（ＴＧＡＣ、配列番号１４）を挿入した（図５Ｃ）（CalainおよびRoux, 1993; Kolakofskyら, 1998；VulliemozおよびRoux, 2001）。図６に示す配列が得られるように設計した変異原性ＰＣＲプライマーを使用し、ＰＣＲ変異誘発によってその編集部位を修飾した（Moellerら、2001）。編集部位中、サイレントな第３の塩基コドン置換を太字下線で示す。Ｐ  ＯＲＦの３’末端半分にアクセスするために挿入した２個のヌクレオチド（ＴＧ）を矢印で示す。６の法則と合致しないｃＤＮＡから生成したパラインフルエンザウイルスは、予想外の位置に自発的なヌクレオチドの欠失または挿入変異を蓄積させ（Skiadopoulosら、2003b）、従って生ワクチン生成に安心して使用することができない。
【０１７４】
Ｖタンパク質が、さらに確実に、Ｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドから生成できないようにするために、図６に示すヌクレオチド配列が得られるように設計した変異原性プライマーを使用し、ＰＣＲによって、切断した編集部位の下流にあるＰ  ＯＲＦにサイレントな第３の塩基コドン置換変異を導入した（Moellerら、2001）。これらのヌクレオチド置換は、重複するＶ読み枠中の終止コドンをコードした。従って、翻訳装置がＶ読み枠に翻訳をシフトバックする可能性が低い場合、翻訳終止コドンは、Ｖ  ＯＲＦ残部のコドンの位置１６７、１７６、１８４、および１８６で出会うはずである。図５Ｃに示した通り、標準的方法を使用し、ＡｓｃＩおよびＢｓｔＥＩＩ部位間のｒＶ９４Ｎ／Ａ／Ｂ  ｃＤＮＡ中に修飾したＰ  ＯＲＦをサブクローン化した。
【０１７５】
修飾したＶ  ＯＲＦは、Ｖタンパク質のみをコードするように設計した（配列番号３）。ＰおよびＶ遺伝子は、非翻訳ポリヌクレオチドスペーサー配列によって分離した。スペーサー配列は、修飾したＶ  ＯＲＦの上流に置いた（図５Ｃ）。スペーサー配列には、それぞれ、Ｐ遺伝子転写を終結しＶ遺伝子転写を開始するために役立つ、ＡｇｅＩ部位および上流遺伝子終止（ＧＥ）、遺伝子間物（ＩＧ）、および遺伝子開始（ＧＳ）転写シグナルを含めた。
【０１７６】
ＰＣＲ変異誘発および標準的分子クローニング技術を使用し、２個のグアノシンをアデノシンまたはシトシンに置換（図６）することによって、ｍＲＮＡ編集部位のヘプタグアノシン配列が変異するように、Ｖ遺伝子単位中の編集部位を設計した（Moellerら、2001；Skiadopolousら, 2003, J. Virol., 77:270-279）。この変異によってＲＮＡ編集は排除され、その結果、遺伝子単位はＶタンパク質のみをコードし、翻訳レベルでサイレントであった。最終構築体のゲノム長が「６の法則」に合致するように、Ｖ  ＯＲＦを側置する非コード領域に４個の追加のヌクレオチド（ＴＧＡＣ）を挿入した（図５Ｃ）（CalainおよびRoux, 1993; Kolakofskyら, 1998；VulliemozおよびRoux, 2001）。
【０１７７】
ポリ六量体のゲノム中のその位置に関して、転写遺伝子開始配列の第１のアデノシンのフェージングは、パラミクソウイルス亜科の全メンバーのウイルスｍＲＮＡの好適な産生に重要でありうると考えられている（Kolakofskyら、1998）。従って、天然Ｐ／Ｖ遺伝子のシス作動性転写開始制御領域のそれと類似して、シグナル配列の第１のアデノシン（アンチゲノムｃＤＮＡ配列）のフェージングが６ｎ＋１位置（図５Ｃ）であるように、挿入するＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドのシス作動性転写開始遺伝子配列を設計した。
【０１７８】
標準的方法を使用し、図５ｃに示すように、ＡｇｅＩおよびＳａｃＩＩ制限部位を使用し、修飾したＶ  ＯＲＦをｐＦＬＣ  Ｖ９４中にサブクローン化した。Ｐ  ＯＲＦの上流とＶ  ＯＲＦの下流にある転写制御配列は、Ｖ遺伝子単位のシス作動性転写遺伝子開始配列の影響を受けず、ｒＶ９４  Ｐ＋ＶのＰタンパク質をコードするポリヌクレオチドのフェージングは変化されずに残った。
【０１７９】
標準的方法を使用し、最終全長アンチゲノムｃＤＮＡプラスミド（ｐＦＬＣ  Ｖ９４  Ｐ＋Ｖ）を配列決定した。ＨＰＩＶ２Ｐ＋Ｖ  ｃＤＮＡ（配列番号１）は１６，３５０ヌクレオチド長であった。これを図１０に示す。過剰なＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、コードするｍＲＮ数を７に増加したが、これは野生型ＨＰＩＶ２のｍＲＮＡ数よりもｍＲＮＡが１つ多い。
【０１８０】
組換えＶ９４  Ｐ＋Ｖの回収および配列決定。実施例１に記載した復帰遺伝子系で、全長アンチゲノムＨＰＩＶ２プラスミドｐＦＬＣ  Ｖ９４  Ｐ＋Ｖ、ならびにＨＰＩＶ２Ｎ、ＰおよびＬ補助プラスミドを使用し、ＨＥｐ−２細胞で、別個のポリヌクレオチド（ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖ）からＰおよびＶタンパク質を発現する組換えＨＰＩＶ２を回収した。ベロ細胞単層培養またはＬＬＣ−ＭＫ２細胞で、形質移入したＨＥｐ−２細胞から回収したウイルスを継代培養した。回収したウイルスｒＶ９４  Ｐ＋ＶをＬＬＣ−ＭＫ２（１．３×１０８ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）、およびベロ細胞培養（５×１０８ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）で高い力価に増殖させた。
【０１８１】
回収したウイルスの同一性は、ＰまたはＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むサブゲノムフラグメントの精製ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）から、ＲＴ−ＰＣＲ増幅することによって確認した（図７Ａ）。ＨＰＩＶ２ゲノムにかかる、センスおよびアンチセンス方向の約２５−３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドプライマーを配列決定プライマーとして使用した。反応にＲＴ酵素を添加しなかった同様のＲＴ−ＰＣＲ反応からは、ＰＣＲ生成物は得られず（データ示さず）、ＲＴ−ＰＣＲ生成物が混入プラスミドＤＮＡからではなく、ＲＮＡ鋳型から生成されたことが示された。ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖから得られたＰＣＲ生成物のサイズを生物学的に派生させたＶ９４ウイルスのサイズ、およびｐＦＬＣ  Ｖ９４  Ｐ＋Ｖ  ｃＤＮＡを用いて得られたＰＣＲ生成物と比較した。
【０１８２】
タンパク質抽出物のウエスタンブロット
Ｖタンパク質がｒＶ９４  Ｐ＋Ｖによって生成されたことを実証するために、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖまたは野生型Ｖ９４に感染させたベロ細胞から全細胞タンパク質を精製した。未感染ベロ細胞とＨＰＩＶ３感染ベロ細胞を対照として使用した。感染後４８時間後に、ベロ細胞単層を回収しＰＢＳで一回洗浄した。細胞ペレットを２×試料緩衝液（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ［ｐＨ６．８］、４％ドデシル硫酸ナトリウム、２０％グリセロール、０．２％ブロモフェノールブルー、２００ｍＭジチオトレイトール）で破砕し、Qiashredders（Qiagen）により遠心分離した。各試料５μｌをドデシル硫酸ナトリウム-４により２０％ポリアクリルアミドゲル（Invitrogen）で電気泳動させ、ニトロセルロースメンブレンに移した。ＨＰＩＶ２のＶタンパク質（配列番号４５）のアミノ酸１８６〜２０１を表すＶタンパク質特異的ペプチドに対して誘起したウサギポリクローナル抗血清と一緒にそのメンブレンをインキュベートした。西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ウサギ免疫グロブリンＧ抗体によるインキュベーションおよび化学冷光（Pierce）によって、結合した抗体を可視化した。感染細胞から得たタンパク質抽出物をウエスタンブロット分析することによって、Ｖタンパク質がｒＶ９４  Ｐ＋Ｖにより生成されたこと確認した（図７Ｂ）。
【０１８３】
許容温度および制限温度でのｒＶ９４  Ｐ＋Ｖのin vitro複製
６ウェルプレートのＬＬＣ−ＭＫ２単層上に感染効率（ｍ．ｏ．ｉ．）０．０１でＨＰＩＶ２を播種することによって、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖ複製の反応速度を定量した。対照ウイルスとしてｒＶ９４Ｎｏｔ、ならびにｔｓおよびａｔｔ組換えｒｄｅｌ１７２４を使用し、培養物を３２℃でインキュベートした。感染後０時および７日目まで２４時間間隔で、各ウェルから培地０．５ｍｌを回収し、０．５ｍｌの新鮮ＯｐｔｉＭＥＭ培地と交換した。毎日の回収物中に存在するウイルスは、３２℃でインキュベートした９６ウェルプレート中のＬＬＣ−ＭＫ２単層で滴定して定量した。
【０１８４】
ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現する組換えＨＰＩＶ２（ｒＶ９４  ＲＳＶ−Ｆ）
国際公開第０４／０２７０３７号に記載されているように、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現する組換えＨＰＩＶ２を構築した。手短に言えば、過剰なＨＰＩＶ２遺伝子単位として、ＲＳＶサブタイプＡ融合（Ｆ）タンパク質ＯＲＦを発現するポリヌクレオチドを、Ｎコード配列の上流にあり、シス作動性ＨＰＩＶ２転写シグナルの制御下にあるＶ９４Ｎｏｔ  ｃＤＮＡ中にクローン化した。国際公開第０４／０２７０３７号および実施例１に記載されるように、一つの全長ＨＰＩＶ２／ｒＶ９４Ｎｏｔプラスミドおよび３つのＨＰＩＶ２補助プラスミドを利用する復帰遺伝子系を使用し、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現する組換えＶ９４Ｎｏｔベクターウイルスを回収した。
【０１８５】
結果および考察
ＰおよびＶタンパク質をコードする別個のポリヌクレオチドを含む、修飾したＨＰＩＶ２  Ｖ９４株アンチゲノムｃＤＮＡを調製し、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖと名付けた。組換えＶ９４  Ｐ＋Ｖウイルスの同一性は、ＰおよびＶ遺伝子を含むサブゲノムフラグメントの精製ウイルスＲＮＡ（ｖＲＮＡ）から、ＲＴ−ＰＣＲ増幅することによって確認した（図７Ａ）。図７Ａに示すように、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖ  ｖＲＮＡから得られたＲＴ−ＰＣＲ生成物は、野生型Ｖ９４から得られたものより約７００ｂｐ長く、ｐＦＬＣ  Ｖ９４  Ｐ＋Ｖ  ｃＤＮＡから得られたものと同じサイズであった。
【０１８６】
配列決定しなかった５’末端のヌクレオチド１６２８７〜１６３５０を除き、精製したｖＲＮＡから生成したゲノム全体にかかるＲＴ−ＰＣＲ生成物を配列決定することによって、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖのゲノム配列を決定した。モノシストロン性ポリヌクレオチドの遺伝子構造は配列分析によって確認した。数個の自発的点変異も同定した。これらのヌクレオチド置換は、ｐＦＬＣＰ＋Ｖ  ｃＤＮＡ中にはコードされておらず、従って細胞培養でウイルスの増殖中に誘起された。同定されたコーディング置換には、Ｖタンパク質では変異Ｐｈｅ２５ＬｅｕおよびＬｅｕ２７Ｐｒｏ、ならびにＬタンパク質では変異Ａｓｎ１１２０ＨｉｓおよびＡｓｐ１８９２Ａｓｎが含まれた。感染細胞から得たタンパク質抽出物をウエスタンブロット分析することによって、Ｖタンパク質がｒＶ９４  Ｐ＋Ｖによって生成されたことが確認された（図７Ｂ）。
【０１８７】
ベロ細胞でのｒＶ９４  Ｐ＋Ｖの増殖反応速度は、ｒｄｅｌ１７２４の増殖反応速度に類似するものであり（図８）、ｒＶ９４Ｎｏｔよりもやや遅い速度で増殖した。しかし、生ワクチンウイルスの製造において慎重に考慮される、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖおよびｒｄｅｌ１７２４のピークウイルス力価はｒＶ９４Ｎｏｔに匹敵した。
【０１８８】
ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖの高温（３７〜４０℃）で複製する能力も検証した。ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖは、シャットオフ温度の３８℃で高度にｔｓであることが判明した（表３）。それに反して、ｒＶ９４およびｒＶ９４Ｎ／Ａ／Ｂは、４０℃においてさえも顕著なシャットオフを示さなかった。ＨＰＩＶ２Ｎ  ＯＲＦの上流に挿入した過剰遺伝子単位からＲＳＶ融合Ｆタンパク質を発現する、前述の組換えＨＰＩＶ２（ｒＶ９４  ＲＳＶ−Ｆ；国際公開第０４／０２７０３７号）の複製は、３９または４０℃で制限されないことが判明した（表３）。このデータによって、挿入した過剰遺伝子単位数の増大またはゲノム長の増大がｒＶ９４  Ｐ＋Ｖのｔｓ表現型に関与しないことが示された。遺伝子単位が挿入された組換えＨＰＩＶ３は、中程度の温度感受性を示すように見えた（Skiadopoulosら、2000；Skiadopoulosら、2002）。しかし、この現象の原理は不明である。
【０１８９】
実施例１に記載したように、ハムスターでのｒＶ９４  Ｐ＋Ｖの複製を試験した。親ウイルスｒＶ９４ＮｏｔおよびｒＶ９４Ｎ／Ａ／Ｂと比較して、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖの複製は、ハムスターの上気道では約１／８００に制限され、下気道では約１／１００に制限された（図１および表３）。同様に、ＲＳＶ  Ｆタンパク質を発現する組換えＨＰＩＶ２（ｒＶ９４  ＲＳＶ−Ｆ）の複製は、ハムスターの上気道および下気道で減弱された。これらの過剰遺伝子単位の挿入によって得られた高レベルの減弱の原理は不明である。しかし、減弱レベルは、追加の遺伝子単位を含む他の組換えパラミクソウイルス（例えば、ＨＰＩＶ３およびＨＰＩＶ１）で観察された減弱レベルよりも顕著であった（Skiadopoulosら、2000；Skiadopoulosら、2002）。
【０１９０】
実施例１に記載したように、アフリカミドリザルでｒＶ９４  Ｐ＋Ｖの複製を試験した。図４および表４に示すように、アフリカミドリザルの下気道では、生物学的に派生させたＶ９４と比較して、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖの複製は約１／２５０に制限された。アフリカミドリザルの上気道では、親ｒＶ９４Ｎｏｔウイルスと比較して、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖの複製は約１／６に制限された。しかし、この差は統計上有意ではない。３’リーダーのＴ１５Ｃ置換によって得られたサルでの減弱が、Ｐ／Ｖ遺伝子を再構成することによって得られた減弱に追加的なものであるかどうかはまだ明らかにされない。ハムスターでのｒＶ９４  Ｐ＋Ｖの減弱はＴ１５Ｃ変異とは無関係であった。ｒＶ９４ＮｏｔおよびｒＶ９４  Ｐ＋Ｖが変異を有し、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖの複製がｒＶ９４Ｎｏｔよりも顕著に制限されたからである。アフリカミドリザルでの独立したＰ＋Ｖ再構成による減弱への寄与は、Ｔ１５Ｃ変異を持たないＶ９４  Ｐ＋Ｖを構築し特徴づけることによって定量されるであろう。
【０１９１】
サルでｒＶ９４  Ｐ＋Ｖワクチン候補は複製が高度に減弱されるが、その候補は野生型ＨＰＩＶ２攻撃ウイルスに対して高度の保護作用を提供する（表５）。従って、Ｐ／Ｖ  ＯＲＦの再構成および過剰なポリヌクレオチドの挿入は、ＨＰＩＶ２に減弱表現型を提供する方法として有用である。遺伝子再構成の減弱化効果が、実施例１および２に記載したコドンの置換および欠失変異の減弱化効果に類似して、in vivoで複製後、遺伝子的に、そして表現型上安定していなければならないことは重要である。
【０１９２】
別個の遺伝子からのＰおよびＶタンパク質をコードする組換えＨＰＩＶ２を回収する能力は、Ｖタンパク質のドメイン構造を検証する際に、そして減弱化Ｖタンパク質変異を導入するのに役立つ。Ｖタンパク質中の変異の候補部位を図９にまとめる。これらには、高度に保存されたシステインリッチカルボキシ末端ドメイン中の変異が含まれ、このドメインは、亜鉛イオンに結合し、他のパラミクソウイルスで数種のＶタンパク質活性で重要な役割を果たすと思われる、Ｖタンパク質の重要なドメインである。Ｖタンパク質のＮ末端半分中の変異は、ＲＮＡ結合またはＳＴＡＴ結合に直接作用し、分解はＨＰＩＶ２を減弱するために使用されうる。有用な変異は、in vitroでのウイルス複製に最小限に影響し、インターフェロン応答を阻止するウイルスの能力を不能にし、結果的に免疫原性であり、かつ／またはヒト宿主でウイルス複製を減弱するウイルスをもたらす。示した部位の変異には、それだけには限らないが、示した残基のアミノ酸置換または欠失が含まれる。
【表６】
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【表７】
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【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【表１１】
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【０１９３】
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【図面の簡単な説明】
【０１９４】
【図１】ハムスターの上気道（鼻甲介：１Ａ）および下気道（肺：１Ｂ）で生物学的に派生させたＨＰＩＶ２  Ｖ９４株およびその組換え誘導体（ｒ）の複製レベルを示す図である。各群の平均複製レベルは、±標準誤差（誤差範囲）で示される。親ｒＶ９４Ｎｏｔウイルスと有意に異なる値［Ｐ＜０．０５；Tukey-Kramer試験（Winer, 1971；Dunnet, 1980）］を星印（＊）で示す。破線により示すウイルスの複製の検出下限は１．５ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｇである。Ｇｒｅｅｒ、Ｖ９４、およびＶ９８は野生型ＨＰＩＶ２株である。
【図２】組換えＶ９４、およびアフリカミドリザルの上気道（鼻甲介）および下気道（肺）で生物学的に派生させたＶ９４、ならびにその組換え誘導体の複製レベルを示す図である。鼻咽頭（ＮＰ）綿棒試料を図２Ａおよび２Ｃに示す。気管洗浄液（ＴＬ）試料を図２Ｂおよび２Ｄに示す。サンプリング日に関わりなく、各動物のピークウイルス力価の平均を図２Ａおよび２Ｂに±標準誤差（誤差範囲）で示す。図２Ａおよび２Ｂでウイルス力価の検出下限（破線）は、０．５ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであった。全サンプリング日に各動物で得られたウイルス力価の平均合計を図２Ｃおよび２Ｄ±に標準誤差（誤差範囲）で示す。検出下限（破線）は、ＮＰ綿棒（図２Ｃ）では５．０ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌであり、ＴＬ試料（図２Ｄ）では２．５ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌである。星印を付した平均力価および合計力価平均は、親Ｖ９４ウイルスと統計学的に異なる（Ｐ＜０．０５；Tukey-Kramer試験）。τは、ｒＶ９４Ｎｏｔと比較した差が統計上有意（Ｐ＜０．０５；Tukey-Kramer試験）である値を示す。各群の動物の頭数を表５に示す。
【図３】図３Ａは生物学的に派生させた低継代のＨＰＩＶ２  Ｖ９８（配列番号１８）株、生物学的に派生させたＨＰＩＶ２  Ｖ９４株の異なる２種の調製物Ｖ９４（ａ）（配列番号１９）およびＶ９４（ｂ）（配列番号２０）、ならびに組換えＶ９４コンセンサスｃＤＮＡ配列の３’リーダー（ｎｔ１〜３０）の部分的ヌクレオチド配列比較（アンチゲノムセンス）を示す図である。ヌクレオチド位置１５（太字下線で示す）は、これらのウイルス調製物中で変化することが判明した唯一の位置である。図３Ｂは、Ｖ９４（調製物ａ）に感染した４頭のアフリカミドリザルの下気道から回収したウイルスの一次単離物から派生させた、未クローン化ＲＴ−ＰＣＲ生成物の配列電気泳動図である。ＬＬＣ−ＭＫ２細胞で継代培養したＶ９４（ａ）から得られた配列を対照として使用した。
【図４】野生型ＨＰＩＶ２  Ｖ９４のゲノム構成を示す略図である。図４Ａでは、各遺伝子について、それぞれ、灰色と黒色で陰影をつけた遺伝子開始（ＧＳ）シグナルと遺伝子終止（ＧＥ）シグナルによって分離されたボックスとして個々の遺伝子を示す。その３’遺伝子外リーダー領域および５’遺伝子外トレーラー領域を示す。図４Ａは、Ｖタンパク質をコードする未編集ｍＲＮＡ中の編集部位領域のヌクレオチド配列（上段の配列：配列番号４６）、および２個の挿入Ｇ残基を含み、Ｐタンパク質をコードする、編集されたｍＲＮＡのヌクレオチド配列（太字、下段の配列：配列番号４７）を示す拡大図である。その配列は、アンチゲノムセンス中にあり、三つ組コドンによって並べられている。コドン１６４および１６５と番号を付す。コドン１６４は、ＰおよびＶポリペプチドのＮ末端半分の最後の共通アミノ酸をコードする。コドン１６５と続く全てのコドンは、ＰおよびＶタンパク質の異なるＣ末端部分のアミノ酸をコードする。図４Ｂは、アミノ酸配列に従って番号を付した、共通アミノ末端ドメイン（白色ボックス）と異なるカルボキシ末端ドメイン（線影ボックス）とを含む、ＰおよびＶポリペプチドを示す略図である。
【図５−１】図５ＡはＰ／Ｖ遺伝子の改変、およびＶタンパク質をコードする過剰遺伝子の導入で使用するために、特有の制限酵素認識配列を組換えＶ９４ゲノムの４位置へ導入する図である。図５ＢはＶタンパク質のみを発現するように設計したポリヌクレオチドから分離して、Ｐタンパク質を発現するように設計したポリヌクレオチドを含む、ＨＰＩＶ２  ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖウイルスのゲノムを示す図である。各ポリヌクレオチドの遺伝子開始シグナルと遺伝子終止シグナルを、それぞれ、灰色および黒色で陰影を付ける。ＰおよびＶタンパク質の拡大図は、それらの共通アミノ酸ドメイン（白色ボックス）および異なるカルボキシ末端ドメイン（線影ボックス）を示す。
【図５−２】図５Ｃは、変異体ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖゲノム中、Ｐタンパク質およびＶタンパク質をコードする別個のポリヌクレオチドの構築の詳細図である。配列は、アンチゲノムセンス中にあり、ｒＶ９４  Ｐ＋Ｖアンチゲノム配列中のそれらの位置に従って番号を付している。Ｐタンパク質をコードするポリヌクレオチドの拡大図（上図）は、Ｐ  ＯＲＦ、ならびに導入されたＡｓｃＩ、ＢｓｔＥＩＩおよびＡｇｅＩ部位の位置を示すフランキング配列、「６の法則」を維持するために導入された４個のヌクレオチド挿入物、および天然Ｐ遺伝子終止シグナルを示す。Ｖタンパク質をコードするポリヌクレオチドの拡大図（下図）は、Ｖ  ＯＲＦ、ならびに導入されたＢｓｔＥＩＩおよびＳａｃＩＩ部位の位置を示すフランキング配列、さらに遺伝子終止シグナル、遺伝子間物、および６ｎ＋１フェージングと共に位置する遺伝子開始シグナルを含む遺伝子連結部を示す。「６の法則」は、パラミクソウイルス亜科のほとんどまたは全てのメンバーのゲノムの複製が、そのゲノムのヌクレオチド長が６の偶数倍の時に限り有効であるという知見をさし、各Ｎタンパク質モノマーと、まさに６個のヌクレオチドとの密接な関連性を反映する思われる要件をさす（Kolakofskyら, J.Virol. 72, 891-899, 1998）。
【図６】共通アミノ酸ドメイン（白色ボックス）、ならびにＰタンパク質およびＶタンパク質の異なるカルボキシ末端ドメイン（線影ボックス）を示す図である。拡大図は、Ｖタンパク質のみを発現するＶ  ＯＲＦ、およびＰタンパク質のみを発現するＰ  ＯＲＦを形成するように、野生型Ｐ／Ｖ  ＯＲＦに導入された配列修飾を示す。編集部位中のサイレントな第３の塩基コドン置換を下線太字で示す。上段の配列（ｒＶ９４  Ｐ＋ＶのＶ  ＯＲＦ）は、編集部位を不活化し、Ｖタンパク質のみが発現されるようにする、修飾Ｖ遺伝子の編集部位に導入される修飾を示す（配列番号９）。中段の配列（ｗｔ  Ｖ９４のＰ／Ｖ  ＯＲＦ）は、野生型編集部位（配列番号８）を含む未編集野生型Ｐ／Ｖ配列を示す。下段の配列（Ｖ９４  Ｐ＋ＶのＰ  ＯＲＦ）は、Ｐタンパク質は発現させるが、Ｖタンパク質は発現させない、野生型Ｐ／Ｖ  ＯＲＦに導入される修飾を示す。Ｐ  ＯＲＦの３’末端半分にアクセスするために編集部位に挿入された２個のヌクレオチド（ＴＧ）を矢印で示す（↑：配列番号１０）。Ｖ  ＯＲＦ読み枠（Ｖ  ＯＲＦコドンの位置１６７、１７６、１８４、および１８６を四角で囲む）に終止コドンを導入するが、Ｐタンパク質の配列は変えない、提案の第３の塩基コドン置換変異を示す（下線太字）。点線は、Ｐタンパク質中のサイレントな第３のコドン変異の相対位置を示す。実線は、Ｖタンパク質中の終止コドンの相対位置を示す。
【図７】図７Ａはセンスオリゴヌクレオチド（Ｖ９４、ヌクレオチド３９５〜４２５）およびアンチセンスオリゴヌクレオチド（Ｖ９４、ヌクレオチド３５６７〜３５９８）を使用し、Ｖ９４またはｒＶ９４  Ｐ＋Ｖ感染細胞から精製したｖＲＮＡから得られたＲＴ−ＰＣＲ生成物、あるいはアンチゲノムのＶ９４  Ｐ＋Ｖ  ｃＤＮＡ（ｐＦＬＣ  Ｖ９４  Ｐ＋Ｖ）から生成したＰＣＲ生成物のアガロースゲル電気泳動分析図を示す。野生型Ｖ９４から得られたＰＣＲ生成物の予想サイズは３２０３ｂｐである。両ｒＶ９４  Ｐ＋ＶおよびｐＦＬＣ  Ｖ９４  Ｐ＋Ｖ用に再構成したＰ＋Ｖ遺伝子から得られたＰＣＲ生成物の予想サイズは３８９９ｂｐである。図７Ｂは野生型Ｖ９４またはｒＶ９４  Ｐ＋Ｖに感染したベロ細胞でのＶタンパク質の産生を示すウエスタンブロット分析図である。
【図８】ベロ細胞培養での組換えＶ９４の増殖を示す図である。ウイルス力価を三つ組試料の平均ｌｏｇ１０  ＴＣＩＤ５０／ｍｌとして示す。誤差範囲は標準誤差を示す。
【図９】図９ＡはＨＰＩＶ２株Ｖ９４のＶポリペプチドの一次アミノ酸配列を示す図である（配列番号４５）。点変異または欠失変異誘発の潜在的標的である領域を強調する。Ｉ：ＲＮＡ結合に必要なＳＶ５で同定された配列に類似。ＩＩ：ＳＴＡＴ結合に必要なＳＶ５で同定された配列に類似。ＩＩＩ：ＳＴＡＴ分解に必要なＳＶ５で同定された配列に類似。ＩＶ：推定ロイシン（太字）リッチ核エクスポートシグナル配列。Ｖ：この高度に保存された配列は、亜鉛フィンガー結合ドメインの一部をも形成しうる。ＶＩ：この領域は、システインリッチドメイン（ＣＲＤ）に保存された７個のシステイン残基のうち５個を含む。＊は、Ｖタンパク質のカルボキシ末端半分に特有の第一アミノ酸Ａｌａ−１６５（太字下線）を示す。図９Ｂはパラミクソウイルス科の２２のメンバーの高度に保存されたカルボキシ末端システインリッチドメインの配列比較である。四角で囲った太字の配列は高度に保存されている。＊で示す残基は、一個または複数の亜鉛イオンと直接相互作用し、アミノ酸欠失または置換変異誘発の標的となりうる。
【図１０−１】ヌクレオチド１〜１６３５０の完全ｒＶ９４  Ｐ＋ＶアンチゲノムｃＤＮＡ配列である（配列番号１）。
【図１０−２】ヌクレオチド１〜１６３５０の完全ｒＶ９４  Ｐ＋ＶアンチゲノムｃＤＮＡ配列である（配列番号１）。
【図１０−３】ヌクレオチド１〜１６３５０の完全ｒＶ９４  Ｐ＋ＶアンチゲノムｃＤＮＡ配列である（配列番号１）。
【図１１】アンチゲノムｃＤＮＡ  Ｐ  ＯＲＦ配列（１１８８ヌクレオチド）を示す図であり、ｒＶ９４  Ｐ＋ＶアンチゲノムｃＤＮＡ配列のヌクレオチド１９９７〜３１８４にあたる（配列番号２）。
【図１２】ｒＶ９４  Ｐ＋ＶアンチゲノムｃＤＮＡ配列のヌクレオチド３２３９〜３９１６であるアンチゲノムｃＤＮＡＶ  ＯＲＦ配列（６７８ヌクレオチド）である（配列番号３）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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