(57)【要約】  固相結合材料への核酸の結合と、新規な試薬組成物での溶離による固相からの結合核酸の解離を含む核酸の単離方法が見出された。組成物は、高イオン強度緩衝液、または親水性有機補助溶剤、またはその両方を特徴とする。本方法で使用する好適な固相材料および本発明の組成物は、４級オニウム基の核酸結合部分を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ類似体からなる群から選択される核酸をサンプルから単離する方法において、
ａ）固相結合材料を与える工程と、
ｂ）固相結合材料に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相結合材料からサンプルを分離する工程と、
ｄ）ｐＨ７〜９の水溶性アミン緩衝液であって、アミン濃度が少なくとも０．０１Ｍである当該水溶液アミン緩衝液と、０．１〜３Ｍの１価または２価のハロゲン化塩または酢酸塩と、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、水溶性のメルカプタン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、フルフリルアルコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、アセトン、ＴＨＦおよびｐ−ジオキサンからなる群から選択される親水性有機補助溶剤０．０１〜５０％と、を含む組成物での溶離により、固相から核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。
【請求項２】
前記固相が、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類から選択される請求項１記載の単離方法。
【請求項３】
前記固相が、式ＰＲ3+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基からなる群から選択され、Ｘがアニオンである）で表される４級ホスホニウム基を含む核酸結合部分を有する請求項１記載の単離方法。
【請求項４】
前記固相が、式ＳＲ2+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘがアニオンである）で表される３級スルホニウム基を含む核酸結合部分を有する請求項１記載の単離方法。
【請求項５】
前記固相が、式ＮＲ3+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘがアニオンである）で表される４級アンモニウム基を含む核酸結合部分を有する請求項１記載の単離方法。
【請求項６】
前記固相材料が、磁性コア部分を含む請求項１記載の単離方法。
【請求項７】
前記塩が、ＮＨ4、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｃａ、ＭｇおよびＺｎのハロゲン化物および酢酸塩から選択される請求項１記載の単離方法。
【請求項８】
前記塩が、少なくとも０．１Ｍの濃度で存在する請求項７記載の単離方法。
【請求項９】
前記親水性有機補助溶剤が、２−メルカプトエタノールおよびジチオスレイトールから選択される請求項１記載の単離方法。
【請求項１０】
前記アミンが、脂肪族アミン、脂肪族アミノ酸、脂肪族アミノアルコールおよびスルホン化脂肪族アミンからなる群から選択される請求項１記載の単離方法。
【請求項１１】
前記核酸が、ヒトゲノムＤＮＡであり、前記サンプルが体液である請求項１記載の単離方法。
【請求項１２】
前記核酸が、プラスミドＤＮＡであり、前記サンプルが細胞培養組織である請求項１記載の単離方法。
【請求項１３】
前記固相が、前記核酸結合部分に前記固相支持体を結合する開裂可能な結合部分を含む請求項１記載の単離方法。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ類似体からなる群から選択される核酸をサンプルから単離する方法において、
ａ）固相結合材料を与える工程と、
ｂ）固相結合材料に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相結合材料からサンプルを分離する工程と、
ｄ）ｐＨ７〜９の水溶性アミン緩衝液であって、アミン濃度が少なくとも０．１Ｍである当該水溶性アミン緩衝液と、Ｃ1−Ｃ4のアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、水溶性のメルカプタン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、フルフリルアルコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、アセトン、ＴＨＦおよびｐ−ジオキサンからなる群から選択される親水性有機補助溶剤０〜５０％と、を含む組成物での溶離により、固相から核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。
【請求項１５】
前記緩衝液の濃度が、少なくとも０．４Ｍである請求項１４記載の単離方法。
【請求項１６】
前記緩衝液の濃度が、少なくとも１Ｍである請求項１４記載の単離方法。
【請求項１７】
前記アミンが、脂肪族アミン、脂肪族アミノ酸、脂肪族アミノアルコールおよびスルホン化脂肪族アミンからなる群から選択される請求項１４記載の単離方法。
【請求項１８】
前記親水性有機補助溶剤が、２−メルカプトエタノールおよびジチオスレイトールから選択される請求項１４記載の単離方法。
【請求項１９】
前記固相が、式ＰＲ3+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基からなる群から選択され、Ｘがアニオンである）で表される４級ホスホニウム基、式ＳＲ2+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基からなる群から選択され、Ｘがアニオンである）で表される３級スルホニウム基および式ＮＲ3+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基からなる群から選択され、Ｘがアニオンである）で表される４級アンモニウム基からなる群から選択される４級オニウム基を含む核酸結合部分を有する請求項１４記載の単離方法。
【請求項２０】
前記固相材料が、磁性コア部分を含む請求項１４記載の単離方法。
【請求項２１】
前記核酸が、ヒトゲノムＤＮＡであり、前記サンプルが体液である請求項１４記載の単離方法。
【請求項２２】
前記核酸が、プラスミドＤＮＡであり、前記サンプルが細胞培養組織である請求項１４記載の単離方法。
【請求項２３】
オリゴヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡまたは合成ＤＮＡ類似体からなる群から選択される核酸をサンプルから単離する方法において、
ａ）式ＰＲ3+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基からなる群から選択され、Ｘがアニオンである）で表される４級ホスホニウム基または式ＳＲ2+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基からなる群から選択され、Ｘがアニオンである）で表される３級スルホニウム基を含む核酸結合部分を有する固相結合材料を与える工程と、
ｂ）固相結合材料に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相からサンプルを分離する工程と、
ｄ）ｐＨ７〜９の水溶性アミン緩衝液であって、アミン濃度が少なくとも０．０１Ｍである当該水溶性アミン緩衝液と、０．１〜３Ｍの濃度の１価または２価のハロゲン化塩または酢酸塩と、Ｃ1−Ｃ4のアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、水溶性のメルカプタン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、フルフリルアルコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、アセトン、ＴＨＦおよびｐ−ジオキサンからなる群から選択される親水性有機補助溶剤０．０１〜５０％と、を含む組成物での溶離により、固相から核酸を解離する工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。
【請求項２４】
前記固相材料が、磁性コア部分を含む請求項２３記載の単離方法。
【請求項２５】
前記アミンが、脂肪族アミン、脂肪族アミノ酸、脂肪族アミノアルコールおよびスルホン化脂肪族アミンからなる群から選択される請求項２３記載の単離方法。
【請求項２６】
前記塩が、ＮＨ4、Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｃａ、ＭｇおよびＺｎのハロゲン化物および酢酸塩から選択される請求項２３記載の単離方法。
【請求項２７】
前記親水性有機補助溶剤が、２−メルカプトエタノールおよびジチオスレイトールから選択される請求項２３記載の単離方法。
【請求項２８】
前記親水性有機補助溶剤の濃度が、少なくとも１％である請求項２７記載の単離方法。
【請求項２９】
前記核酸が、ヒトゲノムＤＮＡであり、前記サンプルが体液である請求項２３記載の単離方法。
【請求項３０】
前記核酸が、プラスミドＤＮＡであり、前記サンプルが細胞培養組織である請求項２３記載の単離方法。
【請求項３１】
前記固相が、前記核酸結合部分に前記固相支持体を結合する開裂可能な結合部分を含む請求項２３記載の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を結合、単離または精製するために使用される固相材料に結合された核酸を解離するための新規な組成物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子診断（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）および分子生物学における最新の技術（逆転写、クローニング、制限分析、遺伝子増幅、および配列解析を含む）においては、これらの技術で使用される核酸が実質的に汚染物質や干渉物質を含まないことが要求される。望ましくない汚染物質には、酵素などの高分子物質や、他のタイプのタンパク質、多糖類、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、脂質、低分子量酵素阻害物質、または非標的核酸、酵素補助因子、塩、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅｓ）、染料、金属塩、緩衝塩および有機溶剤が含まれる。
【０００３】
分子生物学的な適用のために実質的に汚染物質を含まない標的核酸を得ることは、標的核酸が見出されるのが基質サンプルの複合物中であるために、困難である。かかるサンプルには、例えば、組織からの細胞、体液からの細胞、血液、培養組織中の細菌細胞、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、または標的核酸の増幅から得られる溶液が含まれる。基質サンプルはしばしば顕著な量の汚染物質を含み、関心のある核酸を分子生物学的または診断技術において使用する前に、これらをその核酸から除去しなければならない。
【０００４】
上述のような細胞や組織より生成される混合物から標的核酸を単離するための慣用の技術には、フェノール、クロロホルム、および臭化エチジウム等の有害な化学薬品の使用が必要となる。フェノール／クロロホルム抽出は、標的核酸と様々な汚染物質との混合物から汚染物質を抽出するためのかかる手法において用いられる。あるいはまた、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配が、公知技術の方法として使用される。例えば、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」，サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著（１９８９），コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ），１．４２〜１．５０頁を参照。後者の方法は、一般に、エタノールまたは２−プロパノールを水相に添加して核酸を沈殿させることにより、抽出された水相中に残留する核酸材料を沈殿することによる。沈殿物は、通常は遠心分離により溶液から除去され、沈殿物の結果として得られるペレットは、さらなる使用のために水または緩衝液中に再懸濁される前に、乾燥される。
【０００５】
様々なタイプの固相を使用する単純かつ迅速な方法が、細胞溶解物または他の核酸と汚染物質との混合物から核酸を分離するために、開発されている。かかる固相には、クロマトグラフィ樹脂、ポリマーおよびシリカ、または、繊維、フィルターおよび被膜された容器などの様々な外形および形態でのガラスベース材料が含まれる。小さな微粒子の形態である場合には、磁性コアが時に分離において助けを与える。
【０００６】
核酸の単離に使用される一つのタイプの固相には、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）用に設計された多孔質シリカゲル粒子が含まれる。多孔質シリカゲル粒子の表面は、一定の塩およびｐＨ条件下でプラスミドＤＮＡと交換されるアニオン交換体で官能化されている。例えば、米国特許４，６９９，７１７号および５，０５７，４２６号明細書を参照。これらの固相材料に結合したプラスミドＤＮＡは、高濃度の塩を含む水溶液中で溶離する。そこで溶離された核酸溶液は、下流のプロセスで使用される前に、塩を除去するためにさらに処理することが必要である。
【０００７】
他のシリカベース固相材料には、制御ポアガラス（ＣＰＧ）、シリカ粒子で取り囲まれたフィルター、シリカゲル粒子、珪藻土、ガラス繊維または上記の混合物が含まれる。各シリカベース固相材料は、核酸を含むサンプル中で、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、グアニジニウムチオシアネートまたは塩化グアニジニウム（ｑｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）などのカオトロピック剤の存在下で、可逆的に核酸と結合する。かかる固相は、核酸材料と結合して保持し、固相は、残留するサンプル成分から、基質とそれに結合した核酸材料とに分離するために固相の遠心分離または真空ろ過が行なわれた。次に核酸材料を、水または低塩溶離緩衝液で溶離することにより固相から遊離する。核酸単離用の商業的に入手可能なシリカベース固相材料には、例えば、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＤＮＡ精製システム製品（プロメガ（株），マディソン，ＷＩ）、ｔｈｅＱｉａＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ単離システム（（株）キアゲン，サンタクラリタ，ＣＡ）、ハイピュア（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））、およびＧＦＸマイクロプラスミドキット（Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ）（アマルシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））が含まれる。
【０００８】
粒子の形状での重合樹脂も、核酸の単離および精製のために広範に使用されている。カルボキシレート変性重合粒子（バーンズ，エージェンコート（Ｂａｎｇｓ，Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ））ポリマーは、公知である。４級アンモニウム先端基を有するポリマーは、欧州特許出願公開番号ＥＰ１２４３６４９Ａ１号中に開示されている。このポリマーは共有結合された線状非架橋ポリマーを有する不活性担体粒子である。このタイプの重合固相は一般に、触手（テンタクル）樹脂と呼ばれる。この線状ポリマーは、４級テトラアルキルアンモニウム基を包含する。アルキル基は、メチル基またはエチル基として明示されている（４欄、５２〜５５行）。より長いアルキル基は、望ましくないと考えられる。
【０００９】
アニオン交換則に基づいて核酸と結合する他の固相材料が、現在使用されている。これらには、ＤＥＡＥ先端基（（株）キアゲン）を有するシリカベース材料および欧州特許公報ＥＰ０４９６８２２Ｂ１号に記載されたクロマトグラフィ支持体に基づくシリカ−ヌクレオボンドＡＸ（ベクトン  ディッキンソン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ），ロシュ−ゲノピュア（Ｒｏｃｈｅ−Ｇｅｎｏｐｕｒｅ））が含まれる。重合トリアルキルアンモニウム基をもつポリマー樹脂が、欧州特許公報ＥＰ１２４３６４９号中に開示されている（ゲネスキャン（ＧｅｎｅＳｃａｎ））。ＤＮＡ単離用のカルボキシ変性ポリマーは、非常に多くの供給先から入手可能である。核酸は、高塩条件下で引き寄せられて、低イオン強度条件下で解離される。カチオン性のトリメチルアミンを外側に有する重合マイクロキャリアビーズは、米国特許６，２１４，６１８号明細書に開示されている。このビーズは、比較的に大きな径を有し、細胞結合と培養組織中での成長のための支持体として有用である。
【００１０】
トリブチルホスホニウム先端基を有する重合ビーズは、３相システムでの相転写触媒としての使用について開示されている。このビーズは、架橋ポリスチレンから生成される（Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｐｅｒｋｉｎ  Ｔｒａｎｓ．  ＩＩ，１８２７−１８３０，（１９８３））。アルキレン鎖およびアルキレンエーテル鎖を通して架橋ポリスチレン樹脂に結合されたペンダント型のトリアルキルホスホニウム基を有するポリマービーズも開示されている（トモイ（Ｔｏｍｏｉ）ら．，Ｍａｋｒｏｍｏｌｅｋｕｌａｒｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，１８７（２），３５７−６５（１９８６）；トモイ（Ｔｏｍｏｉ）ら．，Ｒｅａｃｔｉｖｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅｒｓ，Ｓｏｒｂｅｎｔｓ，３（４），３４１−９（１９８５））。架橋ポリスチレン樹脂をベースとする混合された４級アンモニウム／ホスホニウム不溶性ポリマービーズは、触媒と殺生物剤として開示されている（ダビデシュー（Ｄａｖｉｄｅｓｃｕ）ら．，Ｃｈｅｍ．Ｂｕｌｌ．Ｔｅｃｈｎ．Ｕｎｉｖ．Ｔｉｍｉｓｏａｒａ，４０（５４），６３−７２（１９９５）；パルベルシュー（Ｐａｒｖｕｌｅｓｃｕ）ら．，Ｒｅａｃｔｉｖｅ＆Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，３３（２，３），３２９−３６（１９９７））。
【００１１】
磁性反応性粒子もまた、核酸を単離する際に固相として使用するために開発されている。核酸単離用に設計された幾つかの異なるタイプの磁性反応粒子は公知技術であり、かつ、いくつかの出所から商業的に入手可能である。可逆的に核酸材料と結合する磁性粒子には、まさにマグネシル（Ｍａｇｎｅｓｉｌ）（登録商標）粒子（プロメガ（株））が含まれる。磁性粒子は、ｍＲＮＡのポリＡ末端とのハイブリッド形成のために結びついたオリゴｄＴ末端を有する共有結合されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して、可逆的にｍＲＮＡと結合することも知られている。
【００１２】
種々のタイプの磁性反応シリカベース粒子を、核酸結合単離法において固相として使用することは公知である。かかる粒子の一つのタイプは、磁性反応ガラスビーズであり、好ましくは、ＣＰＧ社（リンカーンパーク，ＮＪ）から磁性多孔ガラス（ＭＰＧ）粒子として入手可能な制御ポア径を有し、または、米国特許４，３９５，２７１号，４，２３３，１６９号，４，２９７，３３７号明細書に記載された多孔質磁性ガラス粒子である。核酸の結合および単離のために有用な他のタイプの磁性粒子は、重合二酸化シリコン化合物の基質中に磁性材料を混合することにより製造される。（ドイツ特許ＤＥ４３０７２６２Ａ１号）。４級アンモニウム基を有するセルロース基質に固定された酸化鉄ナノ粒子を含む磁性粒子は、ＭａｇａＣｅｌｌ−Ｑ（登録商標）としてコルテックスバイオケム（Ｃｏｒｔｅｘ  Ｂｉｏｃｈｅｍ）（Ｓａｎ  Ｌｅａｎｄｒｏ、ＣＡ）により商業的に販売されている。
【００１３】
誘導可能な磁性特性を有する粒子またはビーズは、磁石の存在下で一時的に磁性特性を発現しうる金属酸化物を形成するための遷移金属、例えば、鉄、ニッケル、銅、コバルトおよびマンガンの小粒子を含む。これらの粒子は、常磁性体または超常磁性体と呼ばれる。常磁性体または超常磁性体ビーズを形成するために、金属酸化物は、水中で比較的安定なポリマーで被覆される。米国特許４，５５４，０８８号明細書には、重合シランの層により被包された金属酸化物コアを含む常磁性体粒子が開示されている。米国特許５，３５６，７１３号明細書には、疎水性ビニル芳香族モノマーの殻で被包された磁化しうる粒子のコアからなる、磁化しうるミクロスフェアが開示されている。米国特許５，３９５，６８８号明細書には、混合された常磁性体金属酸化物−ポリマー層で被覆されたポリマーコアが開示されている。他の方法は、ポリマーコアを、例えば米国特許４，７７４，２６５号明細書中におけるように、金属酸化物を吸着するために利用する。常磁性体金属酸化物粒子層で被覆された重合コア粒子を含む磁性粒子は、米国特許５，０９１，２０６号明細書中に開示されている。この粒子は、その後さらに、金属酸化物層を遮蔽するとともに反応性被膜を与えるために、付加的な重合層で被覆される。米国特許５，８６６，０９９号明細書には、金属塩を配位するためにたんぱく質の存在下で２つの金属塩を共沈し、混合した金属酸化物粒子を捕捉による磁性粒子の調製が開示されている。非常に多くの典型的な金属塩対が記載されている。米国特許５、４１１、７３０号明細書には、沈殿された混合金属酸化物粒子をデキストラン、オリゴ糖類中で捕捉する、類似の工程が記載されている。
【００１４】
ＤＮＡおよびＲＮＡの不可逆的な捕捉のためのアルミナ（酸化アルミニウム）粒子が、米国特許６，２９１，１６６号明細書に開示されている。結合核酸は、ＰＣＲなどの固相増幅法での使用に、利用できる。
【００１５】
これらの固相材料に結合したＤＮＡは、高濃度の塩を含む水溶液中で溶離される。これらから溶離された核酸溶液は、下流のプロセスで使用する前に、塩を除去するためにさらに処理されなければならない。対象的に、シリカベース材料に結合した核酸は、水または低塩溶離緩衝液での溶離により、固相から遊離される。米国特許５，７９２，６５１号明細書には、細胞内のトランスフェクションでの核酸の能力を増大する核酸のクロマトグラフィ単離のための組成物が開示されている。この組成物は、２−プロパノールと任意の塩と緩衝材料を含む水溶液を含む。
【００１６】
さらに、磁性微粒子コアを含むアガロースまたはセルロース粒子を含んでいる他の磁性固相材料は、高濃度の塩とポリアルキレングリコールを含む組成物での処理により、核酸に結合して核酸を保持することが報告されている（例えば、米国特許５，８９８，０７１号明細書およびＰＣＴ公報ＷＯ０２０６６９９３号）。核酸は、水または低イオン強度緩衝液での処理により、続いて解離される。
【発明の開示】
【００１７】
本発明の目的は、本発明の固相核酸結合材料と試薬組成物を使用した核酸の単離のための方法を提供することである。本発明の他の目的は、本発明の試薬組成物を用いた固相材料からの核酸の結合と解離のための方法を提供することにある。
【００１８】
本発明の他の目的は、アルカリアミン緩衝液と親水性有機溶媒と任意に塩を含む本発明の試薬組成物を用いて結合核酸を解離させることによる、固相核酸結合材料を用いた核酸の単離方法を提供することにある。
【００１９】
本発明の他の目的は、固相材料から結合核酸を解離するための試薬組成物を提供することである。本発明の組成物は、本開裂可能な固相材料、および他の慣用の固相材料の両方からの結合核酸の解離と溶離のために作用し、それら材料にはカチオン性、アニオン性または中性の表面をもつものが含まれる。
【００２０】
好適実施形態
定義
アルキル基  −  １〜２０個の炭素原子を含む分岐、直鎖または環状炭化水素基であり、水素原子以外の１またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。ここで使用されるような低級アルキル基は、炭素原子を８個まで含むアルキル基に当てはまる。
【００２１】
アラルキル基  −  アリール基で置換されたアルキル基である。
【００２２】
アリール基  −  １〜５個の炭素環式芳香環を含む芳香環含有基であり、水素原子以外の１またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００２３】
磁性粒子  −  外部磁場に対し反応する粒子、微粒子またはビーズである。この粒子はそれ自体が磁性体、常磁性体または超常磁性体であってよい。強磁性材料を用いる場合のように、外部磁石かまたは適用された磁場に引き付けられてもよい。粒子は、磁性的に反応し、1またはそれ以上の非磁性的に反応する層により被包された固体コア部分を有してもよい。あるいはまた、磁性的に反応する部分は周囲の層であってもよく、または、非磁性的に反応するコア内に配置された粒子であってもよい。
【００２４】
オリゴマー、オリゴヌクレオチド  −  ここに使用されるものとして、ホスホジエステルヌクレオチド間結合および５’−末端モノホスフェート基を含む化合物が当てはまる。ヌクレオチドは、通常生ずるリボヌクレオチドＡ，Ｃ，ＧおよびＵまたはデオキシリボヌクレオチドｄＡ，ｄＣ，ｄＧおよびｄＴであってよい。
【００２５】
ポリヌクレオチド  −  ポリヌクレオチドはＤＮＡ，ＲＮＡまたはＰＮＡ等の合成ＤＮＡ類似体であってよい。これら３つのタイプの鎖のいくつかの二重らせん構造ハイブリッドもまた、この用語の範囲内である。
【００２６】
プライマー  −  連結反応の部位に直接用いられるオリゴヌクレオチドに当てはまり、連結反応プロセスを開始するために必要とされる。プライマーは、テンプレートに対し安定的にハイブリッド形成するために十分な長さをもち、テンプレート内で独自の配列を示す。プライマーは通常、およそ１５〜３０塩基の長さとなる。検出可能な標識または固相により捕捉可能な標識を含む標識プライマーは、ここで使用されるような用語の範囲内である。
【００２７】
解離、溶離  −  溶液または組成物と接触することにより、固相材料の表面またはポアに結合した材料の実質的な部分を除去すること。
【００２８】
サンプル  −  核酸を含むかまたは含んでいる可能性のある流体である。本発明の方法において使用可能である代表的なサンプルは、血液、血漿、漿液、尿、精液、唾液、細胞溶解物、組織抽出物等および同様のもの等の体液を含む。他のタイプのサンプルは、溶剤、海水、工業用水サンプル、食品サンプル、土壌または水のような環境サンプル、植物材料、および原核生物、真核生物、細菌、プラスミド、ウイルス由来の細胞等を含む。
【００２９】
固相材料  −  核酸分子を引き寄せ得る表面を有する材料である。この材料は、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態を有してよい。
【００３０】
置換  −  １つの基内における少なくとも１個の水素原子の、非水素基による置換に当てはまる。置換基に関しては、明確に他のことを示している場合を除き、置換基が複数となる点が存在し得ることを意味することに留意すべきである。
【００３１】
テンプレート、試験ポリヌクレオチド、および標的は、相互交換可能に使用され、その長さが複製された核酸に当てはまる。
【００３２】
核酸は、様々な技術によって種々のサンプル型から単離抽出され、その他の方法で精製される。これらの技術の多くは、核酸に対するいくらかの親和力による材料の表面への選択的吸着による。他の強固でない組成物を除去するための洗浄工程後、固相は、結合核酸を除去するか、または溶離するために溶液で処理される。本出願人は、固相結合材料に結合した核酸の溶離のために有用な新規試薬組成物見出した。本発明の組成物に有用である固相結合材料は、慣用のシリカベース材料、カルボキシル基、アミノ基および水酸基のような表面の官能基と共有結合した官能化シリカ支持体、炭化水素ベース材料、および、４級および３級のオニウム塩型材料のような重合材料を含んでいる。４級および３級のオニウム塩型は、以下および出願人により出願中の２００３年１１月１７日出願の米国出願番号１０／７１４，７６３号および１０／７１５，２８４号明細書中に記載され、参照することによりここにこの教示を取り入れる。
【００３３】
本発明の組成物および方法で使用する核酸結合のための固相材料は、粒子、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態であってよい。材料は、さらに捕捉を許す核酸結合表面および種々の長さの核酸分子の結合を含む。表面とは、固相材料の外周だけでなく、固相材料内の利用できるどんなポア範囲の表面をも意味する。
【００３４】
本組成物は、中性からアルカリ性までのｐＨの一群の水溶性緩衝溶液を含む。１つのグループは、ｐＨ７〜９のアミン緩衝水溶液を含み、その水溶液のアミン濃度は、少なくとも０．１Ｍ、好ましくは少なくとも０．４Ｍ、さらに好ましくは少なくとも１Ｍである。この型の緩衝液は、ＮａＣｌまたはＫＣｌ等の他の塩の添加を含まず、溶離効果を達成するための緩衝成分に対応している。緩衝成分として有用なアミンには、脂肪族アミン、脂肪族アミノアルコールおよびスルホン化脂肪族アミンが含まれる。典型的なアミンには、ジエチルアミン、トリエチルアミン、イミダゾール、アミノ酸（例えば、グリシン、グリシルグリシン、Ｎ−（カルバモイルメチル）イミノジアセティックアシッド（ＡＤＡ、Ｎ−（Ｃａｒｂａｍｏｙｌｍｅｔｈｙｌ）ｉｍｉｎｏｄｉａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ）が含まれる。
【００３５】
典型的なアミノアルコール化合物には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）、トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノプロパン（Ｂｉｓ−ＴＲＩＳ）、２−メチル−２−アミノ−１−プロパノール（ＡＭＰ）、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤ）、エタノールアミン、ジエタノールアミンおよびトリエタノールアミンが含まれる。
【００３６】
典型的なスルホン化脂肪族アミンには、３−Ｎ−モルホリノプロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、３−Ｎ−（トリスヒドロキシメチル）メチルアミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）、３−Ｎ−（トリスヒドロキシメチル）メチルアミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸（ＴＡＰＳＯ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、１，４−ピペラジンビス（エタンスルホニックアシッド）（ＰＩＰＥＳ）、４−モルホリノエタンスルホン酸（ＭＥＳ）、２−（トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ）エタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタン−スルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−シクロヘキシル−２−アミノエタン−スルホン酸（ＣＨＥＳ）、２−（カルバモイルメチルアミノ）−エタンスルホン酸（ＡＣＥＳ）、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシ−エチル）グリシン（ｂｉｃｉｎｅ）、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパンスルホン酸（ＣＡＰＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシ−エチル）ピペラジン−Ｎ’−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）（ＨＥＰＰＳＯ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシプロパン−スルホン酸）（ＰＯＰＳＯ）、およびＮ−トリス（ヒドロキシメチル）−メチルグリシン（ｔｒｉｃｉｎｅ）が含まれる。
【００３７】
好ましい組成物では、緩衝液がまた親水性有機補助溶剤を溶媒の０．１〜５０％、より好ましくは１〜２０％を含む。親水性有機溶媒については、水または水溶液の溶解度が少なくとも０．１％、好ましくは少なくとも１％、さらに好ましくは少なくとも１０％である有機化合物を含むことを意味する。典型的な親水性有機補助溶剤には、Ｃ1−Ｃ4のアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、水溶性のメルカプタン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、フルフリルアルコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、アセトン、ＴＨＦおよびｐ−ジオキサンが含まれる。好適例としては、親水性有機補助溶剤として２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールを含む組成物を使用する。
【００３８】
他のグループの組成物は、ｐＨ７〜９のアミン緩衝水溶液を含み、ここで緩衝液のアミン濃度が少なくとも０．０１Ｍであり、０．１〜３Ｍの濃度の少なくとも一種の１価または２価のハロゲン化塩または酢酸塩を含んでいる。代表的な塩としては、ＮＨ4および金属Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｃａ、ＭｇおよびＺｎのハロゲン化物および酢酸塩が含まれる。好適なハロゲン化物は塩化物である。緩衝液と塩の組合せ濃度は、少なくとも０．１Ｍである。この型の典型的な緩衝液は、ＰＣＲ緩衝液２０ｘコンセントレートとして販売され、０．４Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、１ＭのＫＣｌおよび０．０５ＭのＭｇＣｌ2を含む。このグループの組成物のメンバーは、さらに任意に０．０１〜５０％で親水性有機補助溶剤を含む。典型的な親水性有機補助溶剤には、Ｃ1−Ｃ4のアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、水溶性のメルカプタン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、フルフリルアルコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、アセトン、ＴＨＦおよびｐ−ジオキサンが含まれる。好適例としては、親水性有機補助溶剤として２−メルカプトエタノールまたはジチオスレイトールを含む組成物を使用する。他の好適な組成物では、親水性有機補助溶剤の量は、組成物に対して０．１〜５０％である。より好ましくは、親水性有機補助溶剤の量は、溶媒の１〜２０％である。
【００３９】
新規組成物の利点は、最初に沈殿させて核酸を集めることなく、たくさんの下流の分子生物学工程で直接に溶離した核酸の溶液を使用できることである。サンプルから核酸を単離または精製する工程の一部として、結合核酸を溶離、または解離するために組成物を使用する方法は、また発明の他の部分を形成し、以下に詳細に記述されている。
【００４０】
開示された組成物の全ては、核酸に結合するために４級オニウム基を有する固相材料から結合核酸を除去するために効果的であることがわかっている。かかる固相材料を使用する核酸の単離方法でのこれらのどんな組成物の使用でも本発明の１つの側面を構成する。
【００４１】
他の公知の核酸結合支持体に結合した核酸は、約ｐＨ７〜９の緩衝液を含む本発明の新規試薬組成物とそれらを接触させることにより、これらの固相支持体から解離されることがわかっている。その緩衝液は、緩衝成分として、少なくとも０．１Ｍ、好ましくは少なくとも０．４Ｍの濃度であり、任意に０．１〜５０％の親水性有機補助溶剤を含んでいる。
【００４２】
本発明の１つの側面は、次の工程を含むサンプルからの核酸の単離方法を提供する。
ａ）シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固相を与える工程と、
ｂ）固相に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相からサンプルを分離する工程と、
ｄ）、緩衝液濃度が少なくとも０．１ＭであるｐＨ７〜９の水溶性緩衝液と、親水性有機補助溶剤０．１〜５０％を含む試薬組成物と固相とを接触させることにより、固相から核酸を解離する工程。
【００４３】
本発明の溶離組成物との結合で使用できる慣用の固相材料には、シリカ粒子、メンブランを含むシリカ−被覆表面、アミン官能化およびカルボキシ官能化されたシリカ等の官能化された表面を有するシリカ、核酸精製技術で公知の合成ポリマービーズおよび粒子、アガロースまたはセルロース粒子およびアガロースまたはセルロース被覆シリカ粒子が含まれる。前述のどんな材料で被覆された磁性粒子も同じように作用し、また本発明の組成物と方法との結合で使用できる。
【００４４】
本発明の組成物は、基質の表面に結合された式ＱＲ2＋Ｘ−またはＱＲ3＋Ｘ−の４級オニウム基を有する固相結合材料との結合で特に有用であることがわかる。４級オニウム基は、３級スルホニウム基、４級アンモニウム基およびホスホニウム基から選択され、そこで、ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである。好適には、オニウム基は４級ホスホニウム基ＰＲ3＋Ｘ−から選択され、Ｒは上述の定義である。
【００４５】
本発明のさらなる側面は、次の工程を含むサンプルからの核酸の単離方法を提供する。
ａ）シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマーおよび不溶性多糖類から選択される基質、および、式ＱＲ2＋Ｘ−（ここでＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される３級スルホニウム基、式ＮＲ3+Ｘ-（ここでＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される４級アンモニウム基および式ＰＲ3+Ｘ-（ここでＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである）で示される４級ホスホニウム基から選択された基質の表面に結合されたオニウム基を含む固相を与える工程と、
ｂ）固相に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相からサンプルを分離する工程と、
ｄ）０．０１〜３Ｍの金属ハロゲン化物塩または酢酸塩、親水性有機補助溶剤０．１〜５０％およびｐＨ７〜９の水溶性緩衝液を含む試薬組成物と固相とを接触させることにより、固相から核酸を解離する工程。
【００４６】
代表的な塩としては、ＮＨ4および金属Ｌｉ、Ｎａ、Ｋ、Ｒｂ、Ｃｓ、Ｃａ、ＭｇおよびＺｎのハロゲン化物および酢酸塩が含まれる。好適なハロゲン化物は塩化物である。
【００４７】
典型的な親水性有機補助溶剤には、Ｃ1−Ｃ4のアルコール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、水溶性のメルカプタン、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、フルフリルアルコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、アセトン、ＴＨＦおよびｐ−ジオキサンが含まれる。好適な方法で、固相上のオニウム基は、４級ホスホニウム基ＰＲ3＋Ｘ−から選択され、Ｒは上述の定義である。
【００４８】
前述の出願中の米国出願番号１０／７１４，７６３号および１０／７１５，２８４号明細書中に記載されているように、本出願人は、核酸と結合し、結合核酸を解離するために開裂し得る開裂可能な結合部分を有する固相材料を開発した。これらの開裂可能な固相材料は、結合基の開裂なしで本発明の組成物との接触を通して、それに対して結合する核酸の溶離を可能にする。この材料は、効率的な結合を可能にするために十分な表面積を有する微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態であってよい。微粒子の形態での本発明の方法で有用な固相材料は、さらに、磁性コア部分を含み得る。一般に、粒子および磁性反応微粒子は、本発明において好適である。
【００４９】
本発明の方法で有用なすべての固相核酸結合材料は、その大きさ、形態、多孔度、および物理的特性を規定する基質と、共有結合された核酸結合基とを含む。３つのもっとも一般的な種類の基質は、シリカまたはガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類である。固相は、さらに、磁性反応部分を含んでもよい。
【００５０】
ポリマーは、ホモポリマーまたは１若しくはそれ以上のエチレン不飽和モノマー単位のコポリマーであり、架橋されていても架橋されていなくてもよい。好ましいポリマーは、ポリスチレンを含むポリオレフィンおよびポリアクリル型ポリマーである。後者には、種々の置換されたアクリル酸、アミドおよびエステルのポリマーが含まれ、ここで、アクリルモノマーは、２−または３−炭素において、アルキル置換基を有してもよく有しなくてもよい。
【００５１】
本発明の方法で有用な開裂可能または開裂できない固相結合材料中に含まれる核酸結合基は、種々の長さおよび塩基組成または配列をもつ核酸、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを引き寄せて、これらと結合する。核酸結合基には、カルボキシル基、アミン基および３級または４級オニウム基が含まれる。アミン基は、ＮＨ2、アルキルアミン、およびジアルキルアミン基であってよい。３級または４級オニウム基は、４級トリアルキルアンモニウム基（−ＱＲ3＋）、トリアルキルホスホニウム若しくはトリアリールホスホニウムまたは混合アルキルアリールホスホニウム基を含むホスホニウム基（−ＱＲ3＋）、および３級スルホニウム基（−ＱＲ2＋）を含む。固相は、ここに記載されているような核酸結合基の一種以上を含んでもよい。Ｒ基が少なくとも４個の炭素原子をもつアルキル基である３級または４級オニウム基−ＱＲ2＋または−ＱＲ3＋を含む固相材料は、核酸結合において特に有効であるが、１個程度の少ない炭素原子を有するアルキル基もまた、アリール基と同様に有用である。かかる固相材料は、結合核酸を強固に保持し、かつ、従来技術において公知の溶離のために使用される大抵の条件下で、核酸の除去または溶離を阻害する。低および高イオン強度の両方の最も公知の溶離条件は、核酸結合の除去において効果を有しない。ＤＥＡＥおよびＰＥＩ基を含む慣用のアニオン交換樹脂とは異なり、３級または４級オニウム固相材料は、反応媒体のｐＨに関わらず、明確に荷電されたままである。
【００５２】
開裂可能な固相材料は、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固体支持体部分を含み、それには、表面に、核酸を引き寄せて結合するための核酸結合部分を有しており、その核酸結合部分（ＮＡＢ）は、開裂可能な結合部分により、固体支持体部分に対し結合されている。
【００５３】
2008506387.tif 000002
【００５４】
一つの実施形態においては、ＮＡＢは、一般式ＱＲ2＋Ｘ−（ここで、ＱはＳ原子である）で示される３級オニウム基または４級オニウム基ＱＲ3＋Ｘ−（ここで、ＱはＮまたはＰ原子である）であり、Ｒはアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、また、Ｘはアニオンである。Ｑが窒素原子である場合、Ｒ基はそれぞれ４〜２０個の炭素原子を含む。Ｑが硫黄またはリン原子である場合、Ｒ基は１〜２０個の炭素原子を含みうる。
【００５５】
2008506387.tif 000003
【００５６】
好ましい開裂可能な固相は、市場で入手可能なポリスチレン型ポリマー、例えば、メリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂（架橋）と呼ばれる種類のものから得られる。これらのポリマーにおいて、スチレン単位の割合は、共有結合の手段として、反応基、通常はクロロメチルまたはヒドロキシメチル基を含む。硫化物（Ｒ2Ｓ）または３級アミンまたはホスフィンとの反応によるいくらかの塩素の置換により、本発明の固相材料が生成される。この定義に一致して調製されたポリマーは、反応性クロロメチル基の全てが３級または４級オニウム基に転化される場合には、以下の式（１）により表すことができる。本発明の重合性固相がしばしばオニウム基およびクロロメチル基の混合物を含むようにするためには、かかる基の全てが転化されることは必要ではない。
【００５７】
2008506387.tif 000004
【００５８】
上記式において、ｍ，ｎ，およびｏはポリマー内のそれぞれのモノマー単位のモル％を表し、ｍは０．１％〜１００％、ｎは０％〜９９％、ｏは０％〜１０％の値をとりうる。より好ましくは、ｍは１％〜２０％であり、ｎは８０％〜９９％であり、また、ｏは０％〜１０％である。
【００５９】
他の実施形態においては、開裂可能な固相は、共有結合のための反応性クロロアセチルまたはクロロプロピオニル基を含むスチレン単位の割合を有する、市場で入手可能な架橋されたメリーフィールド樹脂から得られる。これらの出発ポリマーより調製される本発明の３級または４級オニウムポリマーは、下記式で表される。
【００６０】
2008506387.tif 000005
【００６１】
ここで、Ｑ，Ｒ，Ｘ，ｍ，ｎ，およびｏは、上記で定義されたようなものである。
【００６２】
非常に多くの他の公知技術の重合樹脂が、開裂可能な固相材料の調製において、固体基質として用いることができる。重合樹脂は、アドバンスド  ケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）（ルイビル，ＫＹ）およびノバビオケム社（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）などの商業的な供給者より入手可能である。この樹脂は、一般に、反応性官能基を有する架橋された重合粒子をベースとする。アドバンスド  ケムテック社２００２カタログの１０５〜１４０ページに記載されているような、固体支持されたペプチド合成で使用される多くの好適な重合樹脂が、出発材料として適している。反応性のＮＨ2，ＮＨ−ＮＨ2，ＯＨ，ＳＨ，ＣＨＯ，ＣＯＯＨ，ＣＯ2ＣＨ＝ＣＨ2，ＮＣＯ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＳＯ2ＣＨ＝ＣＨ2，ＳＯ2Ｃｌ，ＳＯ2ＮＨ2，アクリルイミダゾール、オキシム（Ｃ＝Ｎ−ＯＨ）、サクシンイミドエステル基を有するポリマーは、本発明の重合固相の調製における使用のために、それぞれ市場で入手可能である。以下に示すように、非常に多くの例において、前駆体ポリマー樹脂を３級または４級オニウム基に対し共有結合させる手段を与えることが、ときに必要、あるいは望まれる。これは、一般に、アルキレン、アリーレンまたはアラルキレン基から選択される１〜２０個の原子からなる鎖または環状基を含む。鎖または環はまた、Ｏ，Ｓ，またはＮ原子、および、ケトン、エステル、チオエステル、アミド、ウレタン、カーボネート、キサントゲン酸塩、ウレア、イミン、オキシム、スルホキシドおよびチオケトンの形態でのカルボニル基を含んでもよい。
【００６３】
ここにおいて使用されるように、磁性微粒子は、磁界により引き付けられ操作されうる粒子である。本発明の方法において使用される磁性微粒子は、磁性金属酸化物コアを含み、これは一般に、核酸結合層が選択されたカップリング作用を通じて共有結合されるように、吸着的または共有的な結合層により被包されて、それにより３級スルホニウム、４級アンモニウム、または４級ホスホニウム官能基で微粒子の表面を被覆する。磁性金属酸化物コアは、好ましくは酸化鉄であり、ここで鉄はＦｅ2+とＦｅ3+との混合物である。酸化鉄コアを含む磁性微粒子は、上述したように、シラン被覆なしで本発明の方法において使用することもできる。磁性粒子はまた、米国特許４，６５４，２６７号明細書に開示されているように、磁性反応性金属粒子を捕捉するために、多孔ポリマーの存在下で金属粒子を沈殿させて、形成されうる。これにより調製されうる磁性金属酸化物には、Ｆｅ3Ｏ4，ＭｎＦｅ2Ｏ4，ＮｉＦｅ2Ｏ4，およびＣｏＦｅ2Ｏ4が含まれる。他の磁性粒子はまた、米国特許５，４１１，７３０号明細書に開示されているように、磁性反応性金属粒子を捕捉するために、多糖類デキストランの存在下で金属酸化物粒子を沈殿させて形成されうる。さらに、他の種類の磁性粒子は、先に言及された米国特許５，０９１，２０６号明細書中に開示されている。この粒子は、金属酸化物層を遮蔽するとともに反応性被膜を与えるために、常磁性金属酸化物粒子層および付加的な重合層で被覆された重合コア粒子を含む。クロロメチル化メリーフィールド樹脂を含むマグネタイトの調製は、出版物（テトラへドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４０（１９９９）,８１３７−８１４０））中に記載されている。
【００６４】
市場で入手可能な磁性シリカまたは磁性重合粒子は、本発明における開裂可能な磁性粒子の調製の出発材料として使用することができる。表面カルボキシル基を有する好適なタイプの重合粒子は、商品名セラマグ（ＳｅｒａＭａｇ，登録商標）（セラダイン社，Ｓｅｒａｄｙｎ）およびビオマグ（ＢｉｏＭａｇ，登録商標）（ポリサイエンスアンドバーンズラボラトリーズ）により公知である。好適なタイプのシリカ磁性粒子は、商品名マグネシル（ＭａｇｎｅＳｉｌ，登録商標）（プロメガ（株））により公知である。表面にカルボキシル基またはアミノ基を有するシリカ磁性粒子は、ケミセル（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ）ＧｍｂＨ社（ベルリン）からも入手可能である。
【００６５】
開裂可能な結合部分は、好ましくは、直鎖、分岐鎖および環から選択される有機基であり、１〜１００個の原子、より好ましくは１〜約５０個の原子を含む。この原子は、好ましくは、Ｃ，Ｈ，Ｂ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｓｉ，Ｐ、ハロゲンおよびアルカリ金属から選択される。典型的な結合基は、加水分解的に開裂可能な基であり、これは加水分解により開裂する。カルボキシエステルおよび無水物、チオエステル、カーボネートエステル、チオカーボネートエステル、ウレタン、イミド、スルホンアミド、およびスルホンイミドは、スルホネートエステルとして典型的である。他の典型的な結合基の種類は、還元開裂を受けるそれらの基である。典型的な基の一つは、エタンチオール、メルカプトエタノール、およびＤＴＴなどのチオールにより開裂するジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）を含む有機基である。他の典型的な基は、過酸化結合（Ｏ−Ｏ）を含む有機基である。過酸化結合は、チオール、アミンおよびホスフィンにより開裂可能である。
【００６６】
2008506387.tif 000006
2008506387.tif 000007
2008506387.tif 000008
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【００６７】
多くの特有の構造図は、簡単のために４級オニウム基のみを示しているが、類似の３級スルホニウム基もまた同様に表されることを意味するものと理解すべきである。
典型的な光化学的に開裂可能な結合基には、窒素置換芳香族エステルおよび、次式のエステルを含む。
【００６８】
2008506387.tif 000010
【００６９】
ここで、ＲｄおよびＨは、アルキル基またはフェニル基であり、さらに特には、下記のものである。
【００７０】
2008506387.tif 000011
【００７１】
オルト−ニトロベンジルエステルは、よく知られた反応として紫外光により、開裂する。
【００７２】
2008506387.tif 000012
【００７３】
典型的な酵素的に開裂する結合基には、エステラーゼおよび加水分解酵素により開裂可能なエステル、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）およびペプチダーゼにより開裂可能なアミドおよびペプチド、グリコシダーゼにより開裂可能なグリコシド基が含まれる。
【００７４】
2008506387.tif 000013
2008506387.tif 000014
2008506387.tif 000015
【００７５】
開裂可能な１，２−ジオキセタン部分を含む結合基を有する固相材料もまた、本発明の核酸結合材料の範囲内である。かかる材料は、化学反応または酵素剤により断片化を開始され得るジオキセタン部分を含む。オキシアニオンを生成するための保護基の除去は、ジオキセタン環の分解を促進する。断片化（フラグメンテーション）は、過酸化結合Ｏ−Ｏの開裂により、Ｃ−Ｃ結合と同様に、よく知られたプロセスに従って生ずる。
【００７６】
2008506387.tif 000016
【００７７】
あるいは、結合したオニウム基はアリール基Ａｒに対して、または、開裂可能な基Ｙに対して、結合可能である。さらにあるいはまた、固相および３級または４級オニウム基に対する結合は、示された配向から、逆である。
【００７８】
前述の典型的な反応においては、基Ａは、アルキル基、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基、ポリシクロアルケニル基、アリール基、アリーロキシ基、およびアルコキシ基から選択される安定的な置換基を示す。Ａｒは、アリール環基を示す。好ましいアリール環基は、フェニル基およびナフチル基である。アリール環は、付加的な置換基、特にはハロゲン、アルコキシ基およびアミン基を含んでもよい。Ｙ基は、化学試薬または酵素により除去されうる基または原子である。好適なＯＹ基には、ＯＨ、ＯＳｉＲ33、カルボキシル基、リン酸塩、硫酸塩、およびグリコシド基が含まれ、Ｒ3は、アルキル基、アリール基から選択される。非常に多くの開始可能なジオキセタン構造は公知技術であり、多数の特許の題目が存在する。典型的な開裂可能なジオキセタン結合およびその開裂は、以下のように表される。
【００７９】
2008506387.tif 000017
【００８０】
保護基Ｙの除去は、ジオキセタン環の断片化を開始し、それにより固体基質およびオニウム基を分離する。アルカリ反応条件下では、結果として得られたアリールエステルは、さらなる加水分解を受ける。
【００８１】
不安定な１，２−ジオキセタン部分に転化されうるエレクトロンリッチＣ−Ｃ二重結合を含む結合基を有する固相材料は、開裂可能な核酸結合材料の他の群である。二重結合における少なくとも１個の置換基（Ａ’）は、Ｏ，ＳまたはＮ原子を用いて二重結合と結合する。エレクトロンリッチ二重結合の一重項酸素との反応により、不安定な１，２−ジオキセタン環基が生成され、そのジオキセタン環は、周囲温度にて自然に断片化して、２つのカルボニル断片を生成する。
【００８２】
2008506387.tif 000018
【００８３】
開裂可能な結合基を有する固相材料の他の基は、ＰＣＴ公報ＷＯ０３／０５３９３４号に開示されているように、開裂可能な部分としてケテンジチオアセタールを有する。ケテンジチオアセタールは、ペルオキシダーゼ酵素および過酸化水素を用いた酵素の酸化により、酸化開裂を受ける。
【００８４】
2008506387.tif 000019
【００８５】
開裂可能な部分は示された構造を有し、アクリダン環において置換基をもつ類似体を含み、ここでＲａ、ＲｂおよびＲＣはそれぞれ、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜約５０個の非水素原子を含む有機基であり、ここでＲａおよびＲｂは互いに結合して環を形成してもよい。
【００８６】
ケテンジチオアセタール開裂可能な結合基を有する固相材料は、次式のうちのいずれかを有してもよい。
【００８７】
2008506387.tif 000020
または
2008506387.tif 000021
【００８８】
固体基質およびオニウム基の開裂可能な結合部分に対する結合の順序が異性体構造にしたがって、示されたそれらとは逆転している。
【００８９】
開裂可能な結合基を有する固相材料の他の群は、開裂可能な部分として、トリアルキルまたはトリアリールホスホニウム基に結合した少なくとも１個の炭素原子を有するアルキレン基をもつ。
【００９０】
2008506387.tif 000022
【００９１】
この基の材料は、ケトンまたはアルデヒドを用いたヴィティヒ反応により開裂可能である。有機溶媒中での４級ホスホニウム化合物と強塩基との反応により、リンイリドを生成するリンに結合した炭素原子が脱プロトン化する。ケトンまたはアルデヒド等の化合物を含むカルボニル基とイリドとの反応は、二重結合およびホスフィン酸化物を形成する。ホスホニウム基と固相との間の結合は、そのプロセスにおいて破壊される。
【００９２】
本発明のさらなる側面には、開裂可能な固相結合材料を用いた、核酸の単離および精製方法が含まれる。一つの実施形態においては、以下の工程を含むサンプルからの核酸の単離方法が与えられる。
ａ）シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固体支持体部分、
核酸を引き寄せて核酸と結合するための核酸結合部分、および、
開裂可能な結合部分、
を含む固相を与える工程と、
ｂ）固相に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相からサンプルを分離する工程と、
ｄ）任意に、開裂可能な結合部分を開裂する工程と、さらに、
ｅ）０．１〜３Ｍの金属ハロゲン化物塩または酢酸塩、親水性有機補助溶剤０．１〜５０％およびｐＨ７〜９の水溶液を含む試薬組成物と固相とを接触させることにより、固相から核酸を解離する工程。
【００９３】
開裂可能な結合を有する固相の好ましい実施形態においては、核酸結合部分は、基質の表面に結合した式ＱＲ2+Ｘ-またはＱＲ3+Ｘ-で表される４級オニウム基であり、ここに４級オニウム基は３級スルホニウム基、４級アンモニウムおよびホスホニウム基から選択され、ここにＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである。
【００９４】
固相からのサンプル分離の工程は、例えば、ろ過、重力沈殿、傾瀉、磁力分離、遠心分離、真空吸引、および例えば多孔膜またはフィルターマットを通しての強制的な液体化のような空気または他のガスによる過圧により実施される。核酸以外のサンプルの成分は、この工程において除去される。他の成分の除去が完全でない範囲に対して、付加的な洗浄を行って、それらの完全な除去を助けることができる。
【００９５】
開裂可能な結合の開裂の工程は、開裂可能な結合部分における共有結合を切るためには十分であるが核酸を破壊するためには十分でないだけの時間の間、開裂剤で核酸結合を有する固相の処理を含んでいる。開裂剤の選択は、開裂可能な結合の性質により決定される。開裂可能な結合が加水分解的に開裂する基である場合には、開裂剤は水または低級アルコールまたはそれらの混合物である。開裂剤は、好ましくは、水に添加した際にｐＨを上げるような塩基を含む。
【００９６】
開裂可能な結合が、ジスルフィドまたはペルオキシド基等の還元的に開裂可能な基である場合には、開裂剤はチオール、アミンおよびホスフィンから選択される還元剤である。典型的な還元剤には、エタンチオール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、トリアルキルアミンおよびトリフェニルホスフィンが含まれる。
【００９７】
光化学的に開裂可能な結合基は、開裂剤としての光、通常は紫外線域または可視光域の光の使用を必要とする。
【００９８】
上述したような酵素的に開裂可能な結合基は、エステラーゼ、加水分解酵素、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）、ペプチダーゼ、ペルオキシダーゼおよびグリコシダーゼから選択される酵素により開裂する。
【００９９】
開裂可能な結合基が開始可能なジオキセタンである場合には、開裂剤は、上記に説明したように、開始Ｙ基においてＯ−Ｙ結合を開裂するために作用する。Ｏ−Ｙ結合の開裂は、ジオキセタン環基を不安定化させ、Ｃ−ＣおよびＯ−Ｏ結合の破断による、ジオキセタン環の２つの部分への断片化を導く。開始試薬は、有機または無機の塩基、フッ化物イオン、酵素、エステルを加水分解する化学薬品（剤）および過酸化水素を含む。
【０１００】
開裂可能な結合が少なくとも１個のＯ，ＳまたはＮ原子で置換されたエレクトロンリッチＣ−Ｃ二重結合である場合には、開裂剤は一重項酸素である。二重結合基と一重項炭素との反応により、周囲温度またはそれ以上で自然に断片化する不安定な１，２−ジオキセタン基が生成する。一重項酸素は、一重項酸素化の分野における公知の方法に従い、色素感光によるか、またはオゾン化トリフェニルホスファイトまたはアンスラセンエンドペルオキシドの熱解離により、生成され得る。
【０１０１】
開裂可能な結合が上述したようなケテンジチオアセタールである場合には、開裂剤はペルオキシダーゼ酵素および過酸化水素である。
【０１０２】
開裂可能な結合がケトンまたはアルデヒドとのヴィティヒ反応により開裂される場合は、イリドを形成するための好ましい塩基は、アルコキシド塩および水素化物塩であり、特にはアルカリ金属塩である。イリドとの反応のための好ましいカルボニル化合物は、脂肪族および芳香族アルデヒド並びに脂肪族および芳香族ケトンである。アセトンが最も好ましい。好ましい溶剤は、反応物を溶解させることができ、かつ、ＴＨＦ，ジエチルエーテル、ｐ−ジオキサン、ＤＭＦおよびＤＭＳＯを含んで塩基を消費しない非プロトン性有機溶剤である。
【０１０３】
2008506387.tif 000023
【０１０４】
開裂可能な結合部分として、少なくとも１つの炭素原子でトリアルキルまたはトリアリールホスホニウム基（例えば、ケトンまたはアルデヒドとのヴィティヒ反応により開裂が行われるそれらの固体支持体）またはトリアルキルアンモニウム基に結合したアルキレン基を有する本発明の固体支持体に結合した核酸が、本発明の新規試薬組成物と接触することにより核酸を解離するという発見は、特に驚くことであった。以下のような、結合核酸を溶離するために従来技術において公知である非常に多くの試薬および組成物との接触を通しては、結合核酸がこれらの固相結合材料から除去されないことから、この結果は予期されなかった。
【０１０５】
脱イオン化水Ｈ2Ｏ
１Ｍホスフェート緩衝液、ｐＨ６．７
０．１％ドデシル硫酸塩ナトリウム
０．１％ドデシルリン塩ナトリウム
３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ５．５
ＴＥ（トリスＥＤＴＡ）緩衝液
５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５＋１．２５Ｍ  ＮａＣｌ
０．３Ｍ  ＮａＯＨ＋１Ｍ  ＮａＣｌ
１Ｍ  ＮａＯＨ  または
１Ｍ  ＮａＯＨ＋１Ｍ  Ｈ2Ｏ2
【０１０６】
本発明の方法での開裂後の固相からの核酸の解離の工程は、溶液を用いた溶離を含み、これは解離された核酸を溶解し十分に保護する。溶液は、ｐＨ７〜９の水溶性緩衝液、０．１〜３Ｍの金属ハロゲン化物または酢酸塩および親水性有機補助溶剤を０．１〜５０％を含む試薬組成物である。あるいはまた、溶液は、緩衝成分として少なくとも０．１Ｍの濃度と、さらに親水性有機補助溶剤を０．１〜５０％を有するｐＨ約７〜９である緩衝液を含んでもよい。より好ましくは、親水性有機溶剤は、約１〜２０％含まれる。金属ハロゲン化物塩には、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が含まれる。好ましい塩は、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，およびＭｇＣｌ2である。親水性有機補助溶剤は、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｔ−ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、フルフリルアルコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、アセトン、ＴＨＦおよびｐ−ジオキセタンを含む。捕捉された核酸の解離の工程は、開裂工程に引き続いてまたは、それと同時でもよい。後者の場合においては、開裂剤は溶離溶液としても作用しうる。
【０１０７】
開裂反応および解離（溶離）工程は、それぞれ室温で行うことができるが、水の氷点より上であってかつ水の沸点より下のいかなる温度も使用可能である。溶離温度は、核酸単離の本方法の成功に対し重大なものではないようである。周囲温度が好ましいが、水の氷点より上であってかつ水の沸点より下のいかなる温度も使用可能である。高められた温度は、いくつかの場合において、溶離速度を増大させ、またはより少ない量の塩または親水性有機補助溶剤を含む組成物の使用を許す。解離または溶離工程は一回行うことができ、または、解離された核酸の量を増大させるために１またはそれ以上の回数が必要であるならば、繰り返してもよい。
【０１０８】
開裂反応および溶離工程は、それぞれの工程を実施するために分離された別個の溶液を用いて、連続した工程として行ってもよい。あるいはまた、開裂および溶離工程は、同じ工程において、一緒に行ってもよい。後者の同時に行なう方法は、開裂反応条件が、溶離された核酸の下流での使用に適合する試薬を利用する場合に、好ましい。例としては、適度にアルカリ性の反応緩衝液や、より強アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液を用いた開裂反応がある。前者の連続的な方法は、開裂反応のための試薬または溶剤の存在が核酸に対し不適合であるかまたは望ましくない場合において、望ましいかもしれない。この場合の一つの例としては、ヴィティヒ解離反応がある。開裂および溶離のための分離された溶液の使用は、開裂反応条件が実質的にＤＮＡを溶液中に解離させない場合に可能となる。
【０１０９】
この方法は、さらには、固相からサンプルの他の成分を除去するために、洗浄溶液で捕捉された核酸結合を有する固相を洗浄する工程を含んでいてもよい。これらの望ましくない物質には、酵素、他のタイプのタンパク質、多糖類、脂質および酵素阻害剤などの低分子量物質が含まれる。上記の方法により本発明の固相上で捕捉された核酸は、標識されたまたは標識されていない相補的な核酸をハイブリッド形成するために、ハイブリッド形成反応において、捕捉された形態で使用することができる。ハイブリッド形成反応は、捕捉された核酸の存在または量を検出するための診断テストにおいて有用である。ハイブリッド形成反応は、固相核酸増幅プロセスにおいても有用である。
【０１１０】
固相からのサンプル分離の工程は、例えば、ろ過、重力沈殿、傾瀉、磁力分離、遠心分離、真空吸引、および多孔膜またはフィルターマットを通しての強制的に液体化する空気または他のガスによる過圧により実施される。核酸以外のサンプルの成分は、この工程において除去される。他の成分の除去が完全でない範囲に対して、付加的な洗浄を行って、それらの完全な除去の助けることができる。
【０１１１】
溶離組成物は、使用前に溶剤を蒸発させるかまたは核酸を沈殿させる必要なしで、次に続く下流のプロセスで直接に溶離された核酸の使用を有利に可能にする。
【０１１２】
上述のような本発明の試薬組成物を用いて核酸を溶離させる場合、溶離温度は、核酸単離の本方法の成功に対して重要ではない。周囲温度が好ましいが、水の氷点より上であってかつ水の沸点より下のいかなる温度も使用可能である。高められた温度は、いくつかの場合において、溶離速度を増大させるかもしれない。加えて、異なる核酸は、異なる容易さで溶離されることがわかっている。
【０１１３】
下流プロセスでの使用
これらの試薬組成物の重要な利点は、それらが、多くの下流の分子生物学プロセスに適合することである。上述のような試薬組成物中に溶離される核酸は、多くの場合、すぐ次にさらなるプロセスにおいて使用することができる。ＰＣＲ、米国特許５，９９８，１７５号明細書中に記載された多重オリゴマーの連結反応（ＬＭＯ）、およびＬＣＲなどの増幅反応には、かかる核酸溶離剤（ｅｌｕｅｎｔ）を用いることができる。慣用の手法により単離された核酸、特に、細菌細胞培養組織由来かまたは血液サンプル由来のものには、沈殿工程を用いる。低分子量アルコールが、水溶液から核酸を沈殿させるために高体積％にて、加えられる。沈殿させた物質は、その後分離し、収集し、さらに、使用前に好適な媒体に溶解させなければならない。これらの工程は、上述の試薬組成物を用いた本発明の固相結合材料からの核酸の溶離により、不要とすることができる。
【０１１４】
本発明の方法により核酸を単離することができるサンプルは、１またはそれ以上の核酸および、任意に、他の物質を含む水溶液を含む。典型的な例としては、核酸、増幅反応生成物、および配列反応生成物の水溶液がある。細菌培養組織、体液、血液および血液成分、組織抽出物、植物材料、および環境サンプルから得られる材料は、同様に、使用する前に、水性の、好ましくは緩衝液中に置かれる。
【０１１５】
固相核酸の捕捉方法は、非常に多くの用途に用いることができる。以下の特有の例において示されるように、一重螺旋および二重螺旋の核酸の双方が、捕捉され解離されうる。ＤＮＡ，ＲＮＡおよびＰＮＡは、捕捉され解離されうる。第一の用途は、細菌培養組織由来のプラスミドＤＮＡの精製である。プラスミドＤＮＡは、複製のために宿主内に特有の遺伝子または遺伝子の断片を含む遺伝子組み換えＤＮＡの断片を取り込ませるための複製ベクターとして使用される。
【０１１６】
第二の用途は、増幅反応由来の増幅生成物の精製である。これらの反応は、ＬＭＯまたはＰＣＲのように、交互により高い、および、より低い温度の間を熱的にサイクルしてもよく、または、例えば、核酸配列塩基増幅（ＮＡＳＢＡ）のように、それらは単一の温度で行われてもよい。この反応には、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素を含む、様々な増幅試薬および酵素を用いることができる。本発明の方法を用いて精製されうるポリヌクレオチド増幅反応混合物は、多重オリゴマーの連結反応（ＬＭＯ）、自己維持（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（３ＳＲ）、螺旋転位増幅（ＳＤＡ）、「分岐鎖」ＤＮＡ増幅、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、ＱＢ複製増幅（ＱＢＲ）、連結反応活性化転写（ＬＡＴ）、核酸配列塩基増幅（ＮＡＳＢＡ）、修復鎖反応（ＲＣＲ）、反復プローブ反応（ＣＰＲ）、および回転環増幅（ＲＣＡ）が含まれる。
【０１１７】
第三の用途は、配列反応クリーンアップである。デオキシ末端化配列反応は、４つの反応混合物のそれぞれにおけるｄＮＴＰｓおよび1つのｄｄＮＴＰの混合物を持つプライマーの拡張に由来するポリヌクレオチドラダーを生成する。それぞれにおけるｄｄＮＴＰは、一般的に異なる蛍光色素を用いて標識される。反応混合物は、過剰のｄＮＴＰｓおよび標識されたｄｄＮＴＰ、ポリメラーゼ酵素およびＡＴＰ等の共同因子を含む。配列分析前に、後者の材料を除去することが望ましい。
【０１１８】
第四の用途は、全血からのＤＮＡの単離である。ＤＮＡは通常用いられる手法において白血球から抽出される。血液は選択的に赤血球が溶解するために典型的に処理され、さらに、沈殿または遠心分離工程の後に、核酸含量を明らかにするために完全な白血球を分離的に溶解する。タンパク質を蒸解して、得られたＤＮＡを固相を用いて単離し、その後、配列多形性の決定、配列解析、ＲＦＬＰ分析、変異検出または他のタイプの診断上の分析のために用いる。
【０１１９】
第五の用途は、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物からのＤＮＡの単離においてである。強アルカリ溶離条件を含む本発明の方法、特に高められた温度を用いる方法では、ＤＮＡを完全な状態としている間に、存在するRNAを分解させるかまたは破壊しうる。強アルカリ開裂反応を含む方法も同様に作用する。
【０１２０】
付加的な用途には、他のサンプル、土壌、植物、細菌、および汚水からの核酸材料の抽出、および収容目的での核酸材料の長期間保管が含まれる。
【０１２１】
したがって、本発明のさらなる側面は、固相結合材料を用いた核酸の単離および精製方法を含む。１つの実施形態においては、以下の工程を含むサンプルからの核酸の単離方法が与えられる。
ａ）シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固体支持体部分、
核酸を引き寄せて核酸と結合するための核酸結合部分、
を含む固相を与える工程と、
ｂ）固相に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相からサンプルを分離する工程と、
ｄ）緩衝液濃度が少なくとも０．１ＭであるｐＨ７〜９の水溶性緩衝液、および親水性有機補助溶剤０．１〜５０％を含む試薬組成物と固相とを接触させることにより、固相から溶液中に核酸を解離する工程と、
ｅ）解離された核酸を含む溶液を、下流のプロセスにおいて直接に用いる工程。
【０１２２】
解離された核酸を含む溶液を直接に核酸増幅反応において用いて、核酸またはそれのセグメントの量をポリメラーゼまたはリガーゼ仲介反応を用いて増幅させることが、好ましい実施である。
【０１２３】
実施例：
下記実施例に示された構造式の図は、主として固相物質の開裂可能な結合部分を図示することを意図したものである。即ち、その図は、固相物質の完全な説明を表すものではない。
【０１２４】
実施例１．トリブチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
【０１２５】
2008506387.tif 000024
【０１２６】
架橋結合クロロメチル化ポリスチレンであるメリフィールドペプチド樹脂（シグマ社、１．１ｍｅｑ／ｇ、２０．０ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン／ＤＭＦ（５０／５０）２００ｍＬ中で撹拌した。過剰のトリブチルホスフィン（４８．１ｇ、１０当量）を加え、スラリーを室温にて７日間撹拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン２００ｍＬで２回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（２１．５ｇ）。
【０１２７】
元素分析：分析値  Ｐ ２．５２％, Ｃｌ ３．０８％  （期待値  Ｐ ２．７９％，Ｃｌ ３．１９％） Ｐ／Ｃｌ比 ０．９４
【０１２８】
実施例２．トリオクチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
【０１２９】
2008506387.tif 000025
【０１３０】
メリフィールドペプチド樹脂（シグマ社、１．１ｍｅｑ／ｇ、２０．０ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン／ＤＭＦ（５０／５０）２００ｍＬ中で撹拌した。過剰のトリオクチルホスフィン（９２．４ｇ、１０当量）を加え、スラリーを室温にて７日間撹拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン２００ｍLで３回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（２１．３ｇ）。
【０１３１】
元素分析：分析値  Ｐ  ２．２８％, Ｃｌ ２．７７％  （期待値  Ｐ ２．７７％, Ｃｌ ２．４２％）  Ｐ／Ｃｌ比 ０．９４
【０１３２】
実施例３．トリメチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
【０１３３】
2008506387.tif 000026
【０１３４】
メリフィールドペプチド樹脂（ＩＣＮ  バイオメディカル社、１．６ｍｅｑ／ｇ、５．０ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン５０ｍＬ中で撹拌した。ＴＨＦ中のトリメチルホスフィン１．０Ｍ溶液（オールドリッチ社、１２ｍＬ）を加え、スラリーを室温にて７日間撹拌した。ジクロロメタン１００ｍＬを追加し、トリメチルホスフィンの１．０Ｍ溶液１．２ｍＬを加え、スラリーを３日間攪拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン１２５ｍＬで、次いでメタノール３７５ｍＬで洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（５ｇ）。樹脂を使用前に粉砕して細粉とした。
【０１３５】
実施例４．トリフェニルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
【０１３６】
2008506387.tif 000027
【０１３７】
メリフィールドペプチド樹脂（ＩＣＮ  バイオメディカル社、１．６ｍｅｑ／ｇ、５．０ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で撹拌した。トリフェニルホスフィン（オールドリッチ社、３．２ｇ）を加え、スラリーを室温にて５日間撹拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン、メタノールおよびジクロロメタンで逐次洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（５．４ｇ）。
【０１３８】
実施例５．トリブチルアンモニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
【０１３９】
2008506387.tif 000028
【０１４０】
メリフィールドペプチド樹脂（オールドリッチ社、１．４３ｍｅｑ／ｇ、２５．１ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン１５０ｍＬ中で撹拌した。過剰のトリブチルアミン（２５．６ｇ、４当量）を加え、スラリーを室温にて８日間撹拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン２５０ｍＬで２回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（２８．９ｇ）。
【０１４１】
元素分析：分析値  Ｎ  １．１８％，Ｃｌ ３．４０％  （期待値  Ｎ １．５８％, Ｃｌ ４．０１％）   Ｎ／Ｃｌ比 ０．８８
【０１４２】
実施例６．２−（トリブチルホスホニウム）アセチル基を含有するポリスチレンポリマーの合成。
【０１４３】
2008506387.tif 000029
【０１４４】
クロロアセチルポリスチレンビーズ（アドバンスド  ケムテック社、３．０ｇ、３．４ｍｅｑ／ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン５０ｍＬ中のトリブチルホスフィン（４．１ｇ、２当量）の溶液に加えた。スラリーを１週間攪拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン（４×２５ｍＬ）、メタノール（２×２５ｍＬ）およびアセトン（４×２５ｍＬ）で逐次洗浄した。次いで、樹脂を風乾した。
【０１４５】
実施例７．ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム基を含有するポリマー層を有する磁性粒子の合成
【０１４６】
2008506387.tif 000030
【０１４７】
磁性メリフィールドペプチド樹脂（ケミセル社、ＳｉＭａｇ  クロロメチル、１００ｍｇ）を、ガラス瓶中で、ジクロロメタン２ｍＬに加えた。トリブチルホスフィン（８０μＬ）を加え、スラリーを室温にて３日間振盪した。磁石をガラス瓶の下に設置し、上澄み液をピペットで除去した。固形物をジクロロメタン２ｍLで４回洗浄した（洗浄液も磁石／ピペットの方法で除去した）。樹脂を風乾した（９３ｍｇ）。
【０１４８】
実施例８−Ｂｒ．トリブチルホスホニウム基と臭化物アニオンを含有するポリメタクリレートポリマーの合成
2008506387.tif 000031
【０１４９】
ポリメタクリル酸樹脂を３５ｍＬのＳＯＣｌ２で４時間還流し、酸塩化物を生成した。ポリメタクリロイルクロライド樹脂（４．８ｇ）とトリエチルアミン（１１．１ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。３−ブロモプロパノール（９．０ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン４０ｍＬで３回洗浄した。樹脂を風乾した（８．７ｇ）。
【０１５０】
樹脂（８．５ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（１６．２ｇ）を加え、スラリーを７日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン１００ｍＬで３回洗浄した。次に、樹脂を風乾した（５．０ｇ）。
【０１５１】
実施例８−Ｃｌ．トリブチルホスホニウム基と塩化物アニオンを含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１５２】
2008506387.tif 000032
【０１５３】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（１２．２ｇ）とトリエチルアミン（２３．２ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。３−クロロプロパノール（１２．８ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン１００ｍＬで３回洗浄した。樹脂を風乾した（１２．８ｇ）。
【０１５４】
樹脂（１２．８ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（２７．８ｇ）を加え、スラリーを７日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン２×１００ｍＬとメタノール２×１００ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（９．８ｇ）。
【０１５５】
実施例８−Ｓ．トリブチルホスホニウム基とアルキルチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１５６】
2008506387.tif 000033
【０１５７】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（３．６ｇ）とトリエチルアミン（８．９ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン２０ｍＬ中で攪拌した。ジクロロメタン２０ｍＬで希釈した３−メルカプト−１−プロパノール（５．８ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン、水およびメタノールで洗浄した。樹脂を風乾した（３．５ｇ）。
【０１５８】
樹脂（４．３ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（１４．９ｇ）とトリフェニルホスフィン（１１．８ｇ）を加えた。混合物を５時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂をアセトニトリル１２５ｍＬ、メタノール２５０ｍＬおよびジクロロメタン２５０ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（４．２ｇ）。
【０１５９】
樹脂（４．２ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（６．７ｇ）を加え、スラリーを８日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン９０ｍＬで、次いでメタノール５０ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（４．０ｇ）。
【０１６０】
実施例９．トリブチルホスホニウム基とエステル結合を含有するポリビニルベンジルポリマーの合成
【０１６１】
2008506387.tif 000034
【０１６２】
ポリスチレンヒドロキシメチルアクリレート樹脂（５．０ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、アセトニトリル５０ｍＬ中で攪拌した。トリブチルホスフィン（２．１ｇ）と４．０Ｍ塩酸（２．５ｍＬ）を１５分間、アルゴン下で攪拌した。この溶液を、１時間をこえて樹脂スラリーの４つの等価部分に加えた。氷水浴を除去し、室温にて３時間、スラリーを攪拌した。樹脂をろ過し、アセトニトリル５０ｍＬで、次いでジクロロメタン２×５０ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（６．２４ｇ）。
【０１６３】
実施例１０．トリブチルホスホニウム基とエステル結合を含有するポリビニルベンジルポリマーの合成
【０１６４】
2008506387.tif 000035
【０１６５】
ヒドロキシメチル化したポリスチレン（オールドリッチ社、２．０ｍｅｑ／ｇ、５．０ｇ）とトリエチルアミン（２．３ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。クロロアセチルクロライド（１．９ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン４０ｍＬで３回洗浄した。樹脂を風乾した（５．８ｇ）。
【０１６６】
樹脂（５．８ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（３．２ｇ）を加え、スラリーを７日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン１００ｍＬで２回洗浄した。次に、樹脂を風乾した（５．９ｇ）。
【０１６７】
実施例１１．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１６８】
2008506387.tif 000036
【０１６９】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（２．７ｇ）とトリエチルアミン（８．６ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン２５ｍＬ中で攪拌した。ジクロロメタン２０ｍＬで希釈した２−メルカプトベンジルアルコール（５．０ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて２日間攪拌した。スラリーをジクロロメタン５０ｍＬで希釈し、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した。樹脂を、メタノール１００ｍＬで３回洗浄し、それぞれ６０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離で洗浄した。洗浄終了後、樹脂をろ過し、風乾した（４．２ｇ）。
【０１７０】
樹脂（３．４ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（１０．２ｇ）とトリフェニルホスフィン（８．０ｇ）を加えた。混合物を４時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂を、アセトニトリル１２５ｍＬ、メタノール２５０ｍＬおよびジクロロメタン２５０ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（２．８ｇ）。
【０１７１】
樹脂（２．８ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（４．０ｇ）を加え、スラリーを８日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン５０ｍＬで、次いでメタノール１２５ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（２．７ｇ）。
【０１７２】
実施例１２．トリメチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１７３】
2008506387.tif 000037
【０１７４】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（５．１ｇ）とトリエチルアミン（１２．３ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。２−メルカプトベンジルアルコール（９．３ｇ）を加え、スラリーを室温にて５日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン３００ｍＬ、水５００ｍＬおよびメタノール２００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（５．８ｇ）。
【０１７５】
樹脂（４．８ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（１４．３ｇ）とトリフェニルホスフィン（１１．３ｇ）を加えた。混合物を４時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂を、アセトニトリル１００ｍＬ、ジクロロメタン２００ｍＬ、メタノール２００ｍＬおよびジクロロメタン２００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（４．８ｇ）。
【０１７６】
樹脂（１．０４ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン３０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。ＴＨＦ（７．３ｍＬ）中の１．０Ｍトリメチルホスフィン溶液を加え、スラリーを１０日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン１００ｍＬ、ＴＨＦ１００ｍＬ、メタノール５０ｍＬおよびジクロロメタン１００ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（１．１ｇ）。
【０１７７】
実施例１３．トリオクチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１７８】
2008506387.tif 000038
【０１７９】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（５．１ｇ）とトリエチルアミン（１２．３ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。２−メルカプトベンジルアルコール（９．３ｇ）を加え、スラリーを室温にて５日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン３００ｍＬ、水５００ｍＬおよびメタノール２００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（５．８ｇ）。
【０１８０】
樹脂（４．８ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（１４．３ｇ）とトリフェニルホスフィン（１１．３ｇ）を加えた。混合物を４時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂を、アセトニトリル１００ｍＬ、ジクロロメタン２００ｍＬ、メタノール２００ｍＬおよびジクロロメタン２００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（４．８ｇ）。
【０１８１】
樹脂（１．６８ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン３０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリオクチルホスフィン（４．４ｇ）を加え、スラリーを１０日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン１００ｍＬ、ＴＨＦ１００ｍＬ、メタノール５０ｍＬおよびジクロロメタン１００ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（１．６７ｇ）。
【０１８２】
実施例１４．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有し、ポリメタクリレート結合で官能化された磁性シリカ粒子の合成
【０１８３】
2008506387.tif 000039
【０１８４】
磁性カルボン酸で官能化されたシリカ粒子（ケミセル社、ＳｉＭＡＧ−ＴＣＬ、１．０ｍｅｑ／ｇ、０．６ｇ）を塩化チオニル６ｍＬ中にいれ、３時間還流した。過剰の塩化チオニルを減圧下で除去した。樹脂を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で再懸濁した。トリエチルアミン（１．２ｇ）を加えた。２−メルカプトベンジルアルコール（０．７ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中振盪した。スラリーをろ過し、樹脂を５０００ｒｐｍ、１０分間、メタノール３５ｍＬで２回遠心分離した。上澄み液を除去した。オレンジ−黄色の樹脂を風乾した（３３５ｍｇ）。
【０１８５】
樹脂（３３５ｍｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル４５ｍＬ中で再懸濁した。テトラブロムメタン（２．０ｇ）とトリフェニルホスフィン（１．６ｇ）を加えた。混合物を３時間還流した。樹脂を５０００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離し、上澄み液を除去した。樹脂を５０００ｒｐｍ、１０分間、アセトニトリル５０ｍＬで２回遠心分離し、上澄み液を除去した。次に、樹脂を風乾した（３２８ｍｇ）。
【０１８６】
樹脂（３２８ｍｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で再懸濁した。トリブチルホスフィン（２８０ｍｇ）を加え、スラリーを１０日間振盪した。フラスコの外側に磁石を置いて、磁性樹脂を固定し、上澄み液を静かに除去した。樹脂をジクロロメタン３０ｍＬで３回、次いでメタノール２５ｍＬで３回洗浄した。次に、樹脂を風乾した（３２８ｍｇ）。
【０１８７】
実施例１５．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有する磁性重合メタクリレート粒子の合成
ＳｅＲａ−Ｍａｇ（登録商標）マグネチックカルボキシレートミクロパーティクルズ（セラダイン社）を使用して、開裂可能な磁性粒子を生成した。Ｓｅｒａ−Ｍａｇ粒子は、ポリスチレン−アクリル酸ポリマーコアを有し、コアを専有のポリマーを含むマグネタイトコーティングで覆っている。カルボキシレート基は、表面が影響を受けやすい。粒子（０．５２ｍｅｑ／ｇ、０．５０ｇ）を水１５ｍＬと０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．０）２５ｍＬ中で懸濁した。反応混合物を５分間超音波処理し、ＥＤＣ（１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド）１２６ｍｇと２−メルカプトベンジルアルコール１１０ｍｇを加えた。反応混合物を７日間振盪した。反応混合物をろ過した。樹脂を水５０ｍＬとメタノール１００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（０．５３ｇ）。
【０１８８】
樹脂（０．５３ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル２０ｍＬ中で再懸濁した。テトラブロムメタン（１７４ｍｇ）とトリフェニルホスフィン（１３８ｍｇ）を加えた。混合物を６５℃で５時間、超音波処理した。大磁石で反応混合物を固定し、上澄み液を静かに除去した。樹脂をアセトニトリルで４回洗浄し、樹脂を磁石で沈殿させ、洗浄液を除去した。樹脂をメタノールに再懸濁し、一晩中振盪した。樹脂をメタノールで４回洗浄し、樹脂を磁石で沈殿させ、洗浄液を除去した。次に、樹脂を風乾した（０．５２ｇ）。
【０１８９】
樹脂（０．５２ｇ）をアセトニトリル１０ｍＬに再懸濁した。トリブチルホスフィン（１０６ｍｇ）を加え、７日間振盪して反応させた。磁性樹脂を磁石で沈殿させ、上澄み液を静かに除去した。樹脂をアセトニトリルで４回、メタノールで４回洗浄した。次に、樹脂を風乾した（０．５１ｇ）。
【０１９０】
実施例１６．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１９１】
2008506387.tif 000040
【０１９２】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（０．６ｇ）とトリエチルアミン（１．５ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン３０ｍＬ中で攪拌した。ジクロロメタン２０ｍＬで希釈した４−メルカプトベンジルアルコール（１．０ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて２日間攪拌した。スラリーをろ過し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水１００ｍＬ、メタノール５０ｍＬおよびジクロロメタン２５ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（０．７ｇ）。
【０１９３】
樹脂（０．６ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル２０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（１．８ｇ）とトリフェニルホスフィン（１．４ｇ）を加えた。混合物を３時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂をアセトニトリル、メタノールおよびジクロロメタンで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（０．６ｇ）。
【０１９４】
樹脂（０．６ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン１５ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（０．８５ｇ）を加え、スラリーを６日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン７５ｍＬで、次いでメタノール１５０ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（０．６ｇ）。
【０１９５】
実施例１７．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１９６】
2008506387.tif 000041
【０１９７】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（０．７１ｇ）とトリエチルアミン（２．２ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。４−ヒドロキシフェニル４−ブロモチオブチレート（２．５５ｇ）を加え、スラリーを室温にて５日間攪拌した。スラリーをろ過し、ジクロロメタンとヘキサンで洗浄した。樹脂を風乾した（０．８５ｇ）。
【０１９８】
樹脂（０．８５ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン２０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（２．７ｇ）を加え、スラリーを３日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタンとヘキサンで洗浄した。次に、樹脂を風乾した。
【０１９９】
実施例１８．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０２００】
2008506387.tif 000042
【０２０１】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（１．０ｇ）とピリジン（１．９ｍＬ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン２０ｍＬ中で攪拌した。１、４−ベンゼンジチオール（１．８５ｇ）を加え、スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、ジクロロメタンとヘキサンで洗浄した。樹脂を風乾した（１．０８ｇ）。
【０２０２】
樹脂（１．０８ｇ）とトリエチルアミン（３．０ｍＬ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン２０ｍＬ中で攪拌した。４−ブロモブチリルクロライド（１．８ｍＬ）を加え、反応混合物を２日間攪拌した。スラリーをろ過し、ジクロロメタンで洗浄した。樹脂を風乾した（１．１０ｇ）。
【０２０３】
樹脂（１．１０ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン３０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（４．０ｇ）を加え、スラリーを５日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタンで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（１．０ｇ）。
【０２０４】
実施例１９．トリブチルホスホニウム基を含有する架橋ポリスチレンポリエチレングリコールサクシネートコポリマーの合成
【０２０５】
2008506387.tif 000043
【０２０６】
ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＣＯＯＨ  ビーズ（アドバンスド  ケムテック社、３．０ｇ）は、架橋ポリスチレンポリエチレングリコールサクシネートコポリマーであり、それを塩化チオニル３０ｍＬ中で９０分間還流した。残留塩化チオニルを減圧下で除去した。樹脂をクロロホルム３０ｍＬで再懸濁し、再濃縮した。
【０２０７】
樹脂とトリエチルアミン（０．１４ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン６０ｍＬ中で攪拌した。２−メルカプトベンジルアルコール（０．１１ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて２日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン、水、メタノールおよびジクロロメタンで洗浄した。樹脂をろ過して風乾した（２．９ｇ）。
【０２０８】
樹脂（２．８ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル６０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（０．３６ｇ）とトリフェニルホスフィン（０．２９ｇ）を加えた。混合物を４時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂をアセトニトリル、メタノールおよびジクロロメタンで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（２．８ｇ）。
【０２０９】
樹脂（２．７ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン５０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（０．２１ｇ）を加え、スラリーを６日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン５０ｍＬで、次いでメタノール１７５ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（２．８ｇ）。
【０２１０】
実施例２０．サクシネート結合したトリブチルホスホニウム基とチオエステル結合を含有するポア調整ガラスビーズの合成
【０２１１】
2008506387.tif 000044
【０２１２】
ミリポアＬＣＡＡガラス（１．０ｇ、３８．５μｍｏｌｅ／ｇｒａｍ）を乾燥ピリジン１０ｍＬ中で懸濁した。無水コハク酸（４０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温にて４日間振盪した。反応混合物をメタノール２０ｍＬで希釈し、混合物をろ過した。固形物をメタノール２０ｍＬで５回、ジクロロメタン２０ｍＬで５回、洗浄した。固形物を風乾した（１．０ｇ）。
【０２１３】
固形物（０．５０ｇ）を乾燥ジクロロメタン１０ｍＬ中で懸濁した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０ｍｇ）と２−メルカプトベンジルアルコールを加え、反応混合物を室温にて６日間振盪した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、混合物をろ過した。固形物をメタノールで３回、ジクロロメタンで３回、洗浄した。固形物を風乾した（０．５０ｇ）。
【０２１４】
固形物（４００ｍｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル１０ｍＬ中で再懸濁した。テトラブロムメタン（１４ｍｇ）とトリフェニルホスフィン（１１ｍｇ）を加えた。混合物を３時間還流した。混合物をろ過し、固形物をメタノール５０ｍＬで５回、ジクロロメタン５０ｍＬで５回、洗浄した。固形物を風乾した（３６０ｍｇ）。
【０２１５】
固形物（３００ｍｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン１０ｍＬ中で再懸濁した。トリブチルホスフィン（５滴）を加え、反応混合物を５日間振盪した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、ろ過した。固形物をジクロロメタン５０ｍＬで５回、洗浄し、風乾した（３００ｍｇ）。
【０２１６】
実施例２１．アクリディニウムエステル基を含有するポリビニルベンジルポリマーの合成
【０２１７】
2008506387.tif 000045
【０２１８】
アクリジン  ９−カルボキシリックアシッドクロライド（１．２５ｇ）とトリエチルアミン（１．３ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で攪拌した。ヒドロキシチオフェノール樹脂（ポリマーラボラトリーズ、１．６７ｍｅｑ／ｇ、３．０ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン２００ｍＬで３回洗浄した。樹脂を風乾した（４．４ｇ）。
【０２１９】
樹脂（４．３ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で攪拌した。メチルトリフレート（６．１ｇ）を加え、反応混合物を２日間攪拌した。スラリーろ過し、樹脂をジクロロメタン２００ｍＬとメタノール１Ｌで洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（４．７ｇ）。
【０２２０】
実施例２２．アクリダンケテンジチオアセタアール基を含有するポリビニルベンジルポリマーの合成。
【０２２１】
2008506387.tif 000046
【０２２２】
Ｎ−フェニルアクリダン（０．６２ｇ）を、−７８℃、アルゴン下で、無水ＴＨＦ２０ｍＬ中で攪拌した。ブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ、０．９３ｍＬ）を加え、反応混合物を−７８℃で２時間攪拌した。二硫化炭素（０．１６ｍＬ）を加え、反応混合物を−７８℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで加温した。メリーフィールドペプチド樹脂（１．６ｍｅｑ／ｇ、１．０ｇ）を加え、混合物を室温にて一晩中攪拌した。混合物をろ過した。樹脂をアセトン１０ｍＬで５回、水１０ｍＬで３回およびアセトン１０ｍＬで２回、洗浄した。樹脂を風乾した（１．２１ｇ）。
【０２２３】
樹脂（１．２１ｇ）とＮａＨ（油中６０％、０．００３ｇ）を、アルゴン下で４時間、無水ＤＭＦ２０ｍＬ中で攪拌した。１、３−ジブロモプロパン（０．０７ｍＬ）を加え、混合物を３日間攪拌した。混合物をろ過した。樹脂をアセトン１０ｍＬで３回、水１０ｍＬで５回およびアセトン１０ｍＬで５回、洗浄した。樹脂を風乾した（１．２２ｇ）。
【０２２４】
樹脂（１．２２ｇ）をアルゴン下で、ＤＭＦ２０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（１．１８ｇ）を加え、スラリーを７日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン２０ｍＬで４回、アセトン２０ｍＬで４回、洗浄した。次に、樹脂を風乾した（１．０７ｇ）。
【０２２５】
実施例２３．加水分解による開裂可能な粒子からのＤＮＡの結合と溶離の一般的な方法
ビーズのサンプル１０ｍｇを、チューブ中、ＴＨＦ５００μＬでリンスした。含有物を遠心分離して、液体を除去した。水２００μＬでリンス工程を繰り返し行った。水２００μＬにリニアライズド（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）ｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液をビーズに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。３７℃で５分間ＮａＯＨ水溶液２００μＬでビーズをインキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離して、分析用に溶離剤を取り出した。
【０２２６】
実施例２４．蛍光アッセイプロトコール
上澄み液と溶離剤のＤＮＡ含量について、ＤＮＡを染色するためにＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）を使用する蛍光アッセイで分析した。ＤＮＡを含むかまたはその可能性のある溶液１０μＬを、蛍光ＤＮＡ染色溶液１９０μＬでインキュベートした。蛍光染料は、０．１Ｍトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡで、１：４００に希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）であった。少なくとも５分間のサンプルインキュベート後、マイクロプレートフルオロメーター（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）で、蛍光を測定した。フィルターセットは４８０ｎｍと５３５ｎｍであった。既知量の同じＤＮＡを含有するポジティブコントロールと、ネガティブコントロールとを同時に測定した。
【０２２７】
実施例２５．広いｐＨ範囲で効果的な捕捉を示す異なったｐＨ溶液からの実施例１１のビーズのＤＮＡ結合
ｐＨ４．５から９．０の範囲にわたる緩衝液を調製した。ｐＨ４．５から６．５の緩衝液は、１０ｍＭ酢酸塩緩衝液である。ｐＨ７．０から９．０の緩衝液は、１０ｍＭトリス酢酸塩緩衝液である。各緩衝液２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、室温で３０〜４５秒間、実施例１１の開裂可能なビーズ１０ｍｇに加えた。各緩衝液でのＤＮＡを含まないネガティブコントロール溶液を並行して実験した。ビーズサンプルを遠心分離後に上澄み液を取り出し、ＵＶと蛍光分析で分析した。
【０２２８】
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【０２２９】
一方、ｐＨ８．０でビーズ２０ｍｇを使用して５分間結合すると、１００％のＤＮＡ捕捉結果が得られることが分かった。
【０２３０】
実施例２６．ＬＭＯ増幅での実施例１１の開裂可能なビーズからの溶離ＤＮＡの使用
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ０．１、または１μｇを含む溶液を、ＴＨＦ４００μＬ、次いで水で２回洗浄した前記ビーズ１０ｍｇに加えた。３０分間のインキュベーション後、サンプルチューブを３０秒間遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×４００μＬで洗浄し、洗浄液を除去した。室温にて１５分間１ＭのＮａＯＨ１００μＬでビーズを洗浄してＤＮＡを溶離し、３０秒間遠心分離して、溶離剤を集めた。各溶離剤の８０μＬ部分を１Ｍ酢酸４０μＬで中和した。
【０２３１】
本発明の重合ビーズを使用して分離したプラスミドＤＮＡを、ＤＮＡを沈殿させることなく直接溶離剤を使用して、米国特許５，９９８，１７５号明細書記載のあるＬＭＯにより増幅した。６８ｂｐの範囲を、一対のプライマーと６８塩基範囲にわたる１セットの８量体を使用するサーモサイクリングプロトコールで増幅した。１２の８量体５’−ホスフェート（６／鎖）、プライマーおよびテンプレート（１μＬ）の１セットを、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ緩衝液中に溶解した。反応チューブを鉱物油５０μＬで覆い、５分間で９４℃に加熱した。約２分後、１００ＵのＡｍｐｌｉｇａｓｅを各チューブに加えた。サンプルに対して、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、３５℃３０秒間で３５回サイクルした。増幅反応のゲル電気泳動は、予想した分子量のバンドを示した。
【０２３２】
実施例２７．実施例９のポリマービーズとのＤＮＡの結合
ビーズサンプル１００ｍｇをチューブ中でＴＨＦ１ｍＬでリンスした。含有物を遠心分離し、溶液を除去した。リンス工程を水１ｍＬで２回繰り返した。水１ｍＬにｐＵＣ１８  ＤＮＡ８０μｇを溶解した溶液をビーズに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離し、上澄み液をＵＶ分析のため集めた。上澄み液はＤＮＡ６６μｇを含んでいた。次に、結合能力を０．１４μｇ／ｍｇと決定した。
【０２３３】
実施例２８．実施例１１の開裂可能なビーズからのＲＮＡの結合と解離
２つのチューブで、ルシフェラーゼＲＮＡ２μｇをビーズ１０ｍｇに結合した。溶離のために、１ｘ逆転写酵素緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、８ｍＭのＭｇＣｌ２、３０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ（０．０１５％））を使用した。１つのチューブを９４℃５分間加熱し、もうひとつのチューブを９４℃３０分間加熱した。溶離剤とコントロールを１％アガロースゲルで実験し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）で染色した。５分間の加熱でビーズから５０％のＲＮＡの溶離を示したが、３０分の加熱ではＲＮＡの変性を示した。
【０２３４】
実施例２９．異なった開裂可能／溶離緩衝液による実施例１１の開裂可能なビーズからのＲＮＡの結合と解離
３つのチューブで、ルシフェラーゼＲＮＡ１μｇをビーズ１０ｍｇに結合した。１つのチューブでは、３Ｍ酢酸カリウムを使用して、室温にて３０分間でＲＮＡを溶離した。もう一つのチューブでは、１ｘ逆転写酵素緩衝液(室温)を使用して、９４℃、１分間で溶離した。３番目のチューブでは、ＲＮＡ抽出緩衝液を使用し、９４℃、１分間加熱した。ＲＮＡ抽出緩衝液は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、０．１４ＭのＮａＣｌ、１．５ＭのＭｇＣｌ２、０．５％ＮＰ−４０、１ｍＭのＤＴＴからなる。すべての溶離剤とコントロールを１％アガロースゲルで実験し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）で染色した。３Ｍ酢酸カリウムは、認識できるＲＮＡを生成しなかった。１ｘ逆転写酵素緩衝液とＲＮＡ抽出緩衝液の両方とも、約５０％溶離に対応するＲＮＡを含むと判断される結合を示した。
【０２３５】
実施例３０．実施例１１の開裂可能なビーズからのＲＮＡの結合と解離と化学ルミネッセンスブロットアッセイによる検出
４つのチューブで、ルシフェラーゼＲＮＡ１μｇをビーズ１０ｍｇに結合した。２つのチューブでは、溶離のために１ｘ逆転写酵素緩衝液を使用し、他の２つのチューブでは、ＲＮＡ抽出緩衝液を使用した。各種の緩衝液の１つのチューブでは、９４℃、１分間加熱した。残りの２つのチューブでは、９４℃、５分間加熱した。すべての溶離剤とコントロールを１％アガロースゲルで実験し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで染色した。各緩衝液で、１分間加熱したほうが、５分間加熱するより多くのＲＮＡを含んでいた。ＲＮＡ抽出緩衝液は、１ｘ逆転写酵素緩衝液より多くＲＮＡを溶離した。一晩のキャピラリートランスファーで、ＲＮＡをナイロンメンブランに転写した。ＲＮＡをＨＦ−１ビオチン標識プライマーと一晩ハイブリッド形成した。化学ルミネッセンス基質としてアンチビオチンＨＲＰとＬｕｍｉｇｅｎ  ＰＳ−３で検出した。５分間の曝露で、ゲルが得られることを実証した。
【０２３６】
実施例３１．様々な温度での実施例１１の開裂可能なビーズからのＲＮＡの結合と解離
６つのチューブで、ルシフェラーゼＲＮＡ１μｇをビーズ１０ｍｇに結合した。ＲＮＡ抽出緩衝液を、いくつかの異なる温度、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、および９０℃で、5分間ＲＮＡを溶離するために使用した。すべての溶離剤とコントロールを１％アガロースゲルで実験し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで染色した。全ての温度で、１００％溶離を示した。
【０２３７】
実施例３２．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズとリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡの結合と異なった溶離組成物での解離
ビーズサンプル１０ｍｇをチューブ中でＴＨＦ５００μＬでリンスした。含有物を遠心分離し、液体を除去した。リンス工程を水２００μＬで繰り返した。水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液をビーズに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。下記表の様々な試薬組成物２００μＬで、室温にて２０分間ビーズをインキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離し、実施例２４に示したように、蛍光分析のため溶離剤を取り出した。
【０２３８】
2008506387.tif 000048
【０２３９】
実施例３３．実施例３２の結合と解離のプロトコールは、下記表に示した試薬組成物に従った。ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノールの濃度変化の効果を試験した。
【０２４０】
2008506387.tif 000049
【０２４１】
実施例３４．実施例３２の結合と解離のプロトコールは、下記表に示した試薬組成物に従った。ＮａＣｌとＫＣｌの塩濃度変化の効果を試験した。
【０２４２】
2008506387.tif 000050
【０２４３】
実施例３５．実施例３２の結合と解離のプロトコールは、下記表に示した試薬組成物に従った。ビーズを６０分間溶離した。
【０２４４】
2008506387.tif 000051
【０２４５】
実施例３６．実施例３２の結合と解離のプロトコールは、下記表に示した試薬組成物に従った。相対的な効果をスコアにした。
【０２４６】
2008506387.tif 000052
【０２４７】
実施例３７．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズと異なった長さのオリゴヌクレオチドの結合と試薬組成物による解離
実施例３２の結合と解離のプロトコールを、２０塩基から２．７キロ塩基の範囲の様々なサイズのオリゴヌクレオチドで実験した。溶離組成物は、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、０．７５ＭのＮａＣｌ、５％ＤＴＴであった。ＤＮＡの量を、ｓｓＤＮＡの蛍光染色であるＯｉｌＧｒｅｅｎ（登録商標）を使用して、蛍光分析で決定した。
【０２４８】
2008506387.tif 000053
【０２４９】
実施例３８．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズとリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡの結合と異なった溶離体積での解離
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、スピンカラム（Ｃｏｓｔａｒ）２ｍＬ中のビーズ１０ｍｇに加えた。２０分間のインキュベーション後、カラムを遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００ｍＬで洗浄し、洗浄液を除去した。室温にて５分間、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、０．７５ＭのＮａＣｌ、５％ＤＴＴ、５×２００μＬでビーズを洗浄して、ＤＮＡを溶離した。各溶離後、蛍光分析とゲル電気泳動法による分析のために遠心分離して溶離剤を集めた。
同様の方法で、ＤＮＡ結合を含むビーズを同じ溶離緩衝液５×４０μＬで溶離した。
【０２５０】
2008506387.tif 000054
【０２５１】
実施例３９．実施例５のトリブチルアンモニウムビーズと核酸の結合と解離
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、ビーズ１０ｍｇに加え、混合物を３０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離して、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。室温にて３０分間、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、０．７５ＭのＮａＣｌ、５％ＤＴＴ、２００μＬでビーズをインキュベートし、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離し、実施例２６に示したように蛍光分析のために溶離剤を取り出した。ＤＮＡ結合は５０％、溶離は結合部分の６９％であった。
【０２５２】
実施例４０．実施例７の磁性トリブチルホスホニウムビーズと核酸の結合と解離
ビーズサンプル１０ｍｇをチューブ中でＴＨＦ５００μＬでリンスした。含有物を磁性的に分離し、溶液を除去した。リンス工程を水２００μＬで繰り返した。水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液をビーズに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を磁性的に分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００ｍＬでリンスし、水を除去した。室温にて３０分間、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、１．２５ＭのＮａＣｌ、１５％２−プロパノール  ２００μＬでビーズをインキュベートし、ＤＮＡを溶離した。混合物を磁性的に分離し、実施例２６に示したように蛍光分析のために溶離剤を取り出した。ＤＮＡ結合は１００％、溶離は１８％であった。
【０２５３】
実施例４１．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズとリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡの結合と異なった溶離温度での解離
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、ビーズ１０ｍｇに加え、混合物を３０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離して、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。様々な温度：３７℃、４６℃、６５℃、および９４℃で、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、１．２５ＭのＮａＣｌ、１５％２−プロパノール、２００μＬで、５分間ビーズをインキュベートし、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離し、実施例２６に示したように蛍光分析のために溶離剤を取り出した。すべての温度で、ＤＮＡ結合は１００％、結合ＤＮＡの６５〜７０％が溶離された。
【０２５４】
実施例４２．ジメチルスルホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０２５５】
2008506387.tif 000055
【０２５６】
上述のように調製したポリメタクリロイルクロライド樹脂（２．９６ｇ）、４−（メチルチオ）チオフェノール５．０７ｇとトリエチルアミン（８．８ｍＬ）を、室温にてアルゴン下で５日間、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。固形物をろ過し、ジクロロメタン１００ｍＬと水１００ｍＬで洗浄し、次に、メタノール１２５ｍＬ中で数日間攪拌した。ろ過して乾燥して、チオエステル生成物３．７６ｇを得た。
ジクロロメタン１００ｍＬ中の固形物の部分２．８９ｇをメチルトリフレート４．１ｍＬ中で７日間攪拌した。固形物をろ過し、続けてジクロロメタン２００ｍＬ、メタノール３００ｍＬおよびジクロロメタン３００ｍＬで洗浄し、次いで、風乾した。
【０２５７】
実施例４３．ジメチルスルホニウム基を有する開裂可能なビーズを使用するＤＮＡの結合と解離
１０ｍＭトリス、ｐＨ８、２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、実施例４２のビーズサンプル１０ｍｇに加え、混合物を５分間静かに振盪した。混合物を遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。３７℃で５分間、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、０．７５ＭのＮａＣｌ、５％ＤＴＴ、２００μＬでインキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離して、蛍光分析のため溶離剤を取り出した。上澄み液はＤＮＡを含んでいなかった。溶離剤は、初期のＤＮＡ結合の１００％を含んでいた。
【０２５８】
実施例４４．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズとリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡの結合と異なった溶離組成物での解離
ビーズのサンプル１０ｍｇを水２００μＬでリンスした。水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、ビーズ１０ｍｇに加え、混合物を２５分間静かに振盪した。混合物を遠心分離して、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。室温にて２５分間、下記表に示した様々な試薬組成物２００μＬで、ビーズをインキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離し、蛍光分析とゲル電気泳動法による分析のために溶離剤を取り出した。
【０２５９】
2008506387.tif 000056
【０２６０】
実施例４５．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズとリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡの結合とＮａ、ＫまたはＭｇイオンを含む異なった溶離組成物での解離
ビーズのサンプル１０ｍｇを水２００μＬでリンスした。水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、ビーズ１０ｍｇに加え、混合物を２５分間静かに振盪した。混合物を遠心分離して、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。室温にて２５分間、下記表に示した様々な試薬組成物２００μＬで、ビーズをインキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離し、蛍光分析とゲル電気泳動法による分析のために溶離剤を取り出した。
【０２６１】
2008506387.tif 000057
【０２６２】
実施例４６．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズとリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡの結合と様々なイオンを含む異なった溶離組成物での解離
ビーズのサンプル１０ｍｇを水２００μＬでリンスした。水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、ビーズ１０ｍｇに加え、混合物を２５分間静かに振盪した。混合物を遠心分離して、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。室温にて３０分間、下記表に示した様々な試薬組成物２００μＬで、ビーズをインキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離し、ゲル電気泳動法による分析のために溶離剤を取り出した。
【０２６３】
2008506387.tif 000058
【０２６４】
実施例４７．ＰＣＲで直接に使用した緩衝組成物での実施例５２の開裂可能な磁性トリブチルホスホニウムビーズからの結合ｐＵＣ１８  ＤＮＡの解離
実施例５２の磁性ホスホニウムビーズのサンプル１０ｍｇを、ＴＨＦ４００μＬ、次いで水２×１００μＬでリンスした。溶解物２００μＬに切られていないｐＵＣ１８  ＤＮＡ  ２μｇを溶解した溶液を、ビーズ１０ｍｇに加え、混合物を５分間静かに振盪した。溶解物緩衝液は、Ｓ１〜Ｓ３の３つの緩衝液の１：１：１の混合物を含み、Ｓ１は５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡであり、Ｓ２は１％ＳＤＳを含む０．２ＭのＮａＯＨ溶液であり、Ｓ３は０．３ＭのＫＯＡｃ、０．２ＭのＨＣｌである。混合物を磁性的に分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。３７℃で５分間、４００ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．４、１ＭのＫＣｌ、５０ｍＭのＭｇＣｌ2を含む濃縮緩衝液２００μＬでインキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離した。蛍光分析は、プラスミドＤＮＡの１００％がビーズに結合され、４１％が溶離されることを示した。
【０２６５】
水で、１：１０および１：２０の様々な比で、ＤＮＡを含む溶離剤を希釈し、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃１分間を３０回サイクルして、ＰＣＲで増幅した。１：１０および１：２０の希釈液をＰＣＲにより首尾よく増幅した。
【０２６６】
実施例４８．様々な緩衝組成物を使用する実施例１のポリマービーズと細菌培養組織からのプラスミドＤＮＡの単離
大腸菌培養組織を一晩中培養した。細胞をペレットするために、２０ｍＬ部分を４℃、１５分間、６０００×ｇで遠心分離した。１００μｇ／ｍＬ  ＲＮａｓｅ  Ａを含む、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ、４ｍＬ中でペレットを再懸濁した。次いで、１％ＳＤＳを含む０．２ＭのＮａＯＨ溶液４ｍＬを混合物に加え、静かに混合し、室温にて４分間静置した。次に、４℃に冷却した、０．２ＭのＨＣｌを含む０．３ＭのＫＯＡｃ、４ｍＬを加え、溶液を混合し、ＳＤＳを沈殿するために１０分間静置した。沈殿物をろ過し、ろ液を集めた。
【０２６７】
溶解物（２００μＬ）を実施例１のビーズ１０ｍｇと混合し、５分間インキュベートした。結合後、ビーズを遠心分離し、上澄み液を除去した。ビーズサンプルを水２×２００μＬで洗浄し、次いで表に示したような組成物で溶離した。
【０２６８】
2008506387.tif 000059
【０２６９】
実施例４９．ジメチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成
【０２７０】
2008506387.tif 000060
【０２７１】
メリフィールドペプチド樹脂（シグマ社、１．１ｍｅｑ／ｇ、２０．０ｇ）とチオギ酸ナトリウム（２．２４ｇ、１０当量）を無水（ａｎｈ）ＤＭＦ６０ｍＬと共にフラスコ２５０ｍＬに加えた。混合物をアルゴン下に置き、室温にて１５日間撹拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をＤＭＦ５０ｍＬ、水２００ｍＬ、メタノール２００ｍＬおよびジクロロメタン２００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（２．１２ｇ）。
【０２７２】
ジクロロメタン１００ｍＬ中のチオメチル化したポリマー（０．６３７ｇ）をアルゴン下に置き、メチルトリフレート１．６ｍＬと反応させた。１３日間の攪拌後、混合物をろ過し、固形物をジクロロメタン２００ｍＬ、メタノール２００ｍＬおよびジクロロメタン２００ｍＬで洗浄した。風乾して白色の固形物２．０９ｇを得た。
【０２７３】
実施例５０．様々な緩衝組成物を使用する実施例４９のポリマービーズに結合したｐＵＣ１８  ＤＮＡの解離
実施例４９のスルホニウムビーズのサンプル１０ｍｇを、ＴＨＦ３００μＬ、次いで水２×１００μＬでリンスした。水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、ビーズ１０ｍｇに加え、混合物を１５分間静かに振盪した。ビーズを遠心分離し、上澄み液を除去した。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。室温にて１５分間、以下の緩衝液２００μＬでビーズをインキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離した。蛍光分析は、プラスミドＤＮＡの１００％がビーズに結合され、５６％が溶離されることを示した。
【０２７４】
2008506387.tif 000061
【０２７５】
実施例５１．４’−ヒドロキシフェニル  ４−クロロメチルチオベンゾエートの合成
３Ｌのフラスコを４−クロロメチル安息香酸１００．９ｇと塩化チオニル１．２Ｌで満たした。４時間還流反応し、その後塩化チオニルを減圧下で除去した。残留塩化チオニルを、ジクロロメタンを加えて、減圧下で蒸発して除去した。
【０２７６】
４−クロロメチル安息香酸クロライド１１３．１ｇを含む３Ｌフラスコに、４−ヒドロキシチオフェノール９８．１７ｇとジクロロメタン１．５Ｌを添加した。アルゴンを取り除き、ピリジン６７．７５ｍＬを加えた。一晩中攪拌後、反応混合物をジクロロメタン１Ｌで希釈し、水５Ｌで抽出した。水相をジクロロメタンで逆抽出した。混合したジクロロメタン溶液を硫酸ナトリウムで乾燥し、固形物に濃縮した。固形物をジクロロメタン５００ｍＬで洗浄し、ろ過し、風乾した。1Ｈ  ＮＭＲ（アセトン−ｄ6）：δ４．８０９（ｓ、２Ｈ）、６．９４６−６．９６８（ｄ、２Ｈ）、７．３２３−７．３４６（ｄ、２Ｈ）、７．６４３−７．６６４（ｄ、２Ｈ）、８．００４−８．０２５（ｄ、２Ｈ）。
【０２７７】
実施例５２．トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を含有し、ポリメタクリレート結合で官能化された磁性シリカ粒子の合成
【０２７８】
2008506387.tif 000062
【０２７９】
磁性カルボン酸で官能化されたシリカ粒子（ケミセル社、ＳｉＭＡＧ−ＴＣＬ、１．０ｍｅｑ／ｇ、１．５ｇ）を塩化チオニル２０ｍＬ中にいれ、４時間還流した。過剰の塩化チオニルを減圧下で除去した。樹脂を、クロロホルム２５ｍＬ中で再懸濁し、懸濁液を超音波で分散した。溶媒を蒸発し、超音波洗浄処理を繰り返した。さらなる使用のために減圧下で乾燥した。
【０２８０】
塩酸で官能化された粒子を、ジイソプロピルエチルアミン３８８ｍｇと共にジクロロメタン３８ｍＬ中で懸濁した。４’−ヒドロキシフェニル  ４−クロロメチルチオベンゾエート（５２４ｍｇ）を加え、シールした反応フラスコを一晩中振盪機に設置した。粒子をプラスチックチューブ５０ｍＬに移し、ジクロロメタンの一部、メタノール、１：１ジクロロメタン／メタノール、次いでジクロロメタンで繰り返し洗浄して、磁性分離した。未反応の溶解した初期材料を除去するために、洗浄液をＴＬＣによりモニターした。さらなる使用前に固形物を風乾した。
【０２８１】
樹脂（１．２３３ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン２０ｍＬ中で懸濁した。トリブチルホスフィン（３９５ｍｇ）を加え、スラリーを７日間振盪した。粒子をプラスチックチューブ５０ｍＬに移し、ジクロロメタン４０ｍＬで４回、次いでメタノール４０ｍＬで４回およびジクロロメタン４０ｍＬで４回洗浄した。次いで、樹脂を風乾し、ライトブラウンの固形物（１．１７ｇ）を得た。
【０２８２】
実施例５３．トリブチルホスホニウム基と開裂可能なアリールチオエステル結合を有するポリメタクリレートポリマー粒子の合成
【０２８３】
2008506387.tif 000063
【０２８４】
ポリ（メタクリロイルクロライド）粒子（１．０ｍｅｑ／ｇ、１．５ｇ）をジイソプロピルエチルアミン２．４５ｇを含むジクロロメタン７５ｍＬに添加した。トリエチルアミン（１．２ｇ）を加えた。４’−ヒドロキシフェニル  ４−クロロメチルチオベンゾエート（４．５ｇ）を加え、シールした反応混合物を室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン１０ｍＬ、アセトン２００ｍＬ、メタノール２００ｍＬ、１：１ＴＨＦ／ジクロロメタン２×１００ｍＬ、ＴＨＦ２５０ｍＬ、ジクロロメタン２５０ｍＬおよびヘキサン２５０ｍＬで洗浄した。さらになる使用のために樹脂を風乾した。
【０２８５】
樹脂（１．５２５ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン２５ｍＬ中で懸濁した。トリブチルホスフィン（１．７ｇ）を加え、スラリーを４日間攪拌した。樹脂をろ過し、ジクロロメタン２２５ｍＬで４回、次いでヘキサン１７５ｍＬで洗浄した。次いで、樹脂を風乾し、固形物（１．６８ｇ）を得た。
【０２８６】
同様の方法で、トリメチルホスホニウム基を含むポリマー粒子もまた生成した。
【０２８７】
実施例５４．緩衝組成物による実施例５３の開裂可能なトリブチルホスホニウムビーズからの結合したｐＵＣ１８  ＤＮＡの解離
実施例４９に記述したプロトコールに従って、プラスミドＤＮＡを実施例５６の粒子に結合した。３７℃で５分間、５％ＤＤＴを含む１．２５Ｍトリス、ｐＨ８．５緩衝液１００μＬ中で粒子をインキュベートすることにより、ＤＮＡを溶離した。
【０２８８】
蛍光分析は、プラスミドＤＮＡの１００％がビーズに結合され、５５％が溶離されることを示した。
【国際調査報告】
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