(57)【要約】  本発明の目的は、ＨＰＶ誘導性の外陰部、頸部、膣、陰茎及び肛門の上皮内腫瘍（ＶＩＮ、ＣＩＮ、ＶＡＩＮ、ＰＩＮ及びＡＩＮ）などの肛門性器部のウイルス誘導性上皮内腫瘍の治療において改良された方法及び手段を提供することである。本発明は、少なくともまず被検者がウイルス性早期抗原、特にハイリスクタイプＨＰＶ抗原に対するＴ細胞反応性を有しているかを決定するステップと、次に被検者がＴ細胞性反応、好ましくはＨＰＶ早期抗原に対するＣＤ４＋反応について陽性と判定される場合、局部炎症を誘発する免疫変更化合物による局部治療を行うステップとを含む、肛門部上皮内腫瘍に罹患している被検者の治療方法を提供する。本発明はまた、局部炎症反応を誘発することができる免疫調節化合物による治療前又は治療後にＨＰＶ抗原に対する細胞免疫性反応を誘導又はさらに刺激する方法及び手段も含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶウイルス性抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞反応について陽性と判定される被検者の肛門性器部上皮内腫瘍治療のための薬剤の製造における、局部炎症を誘導することができる免疫修飾化合物の使用。
【請求項２】
被検者が、ＨＰＶ早期抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞反応について陽性と判定されることを特徴とする請求項２記載の使用。
【請求項３】
被検者が、ＨＰＶのＥ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質から選択されるＨＰＶ早期抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞反応について陽性と判定されることを特徴とする請求項１又は２記載の使用。
【請求項４】
化合物が、Ｔｏｌｌ様受容体活性化化合物であることを特徴とする請求項１〜３いずれか記載の使用。
【請求項５】
化合物が、バクテリアリポタンパク質とそのアセチル体、バクテリアグリコリピッド、バクテリア外膜タンパク質、バクテリア熱ショックタンパク質、バクテリアの鞭毛又はフラジェリン、線毛、Ｂ群溶連菌熱不安定性溶解性因子（ＧＢＳ−Ｆ）、スタフィロコッカスのモジュリン、グラム陽性ＬＰＳ又はリピドＡ、ＬＴＡ、グラム陰性ＬＰＳ又はＬＴＡ、マイコバクテリアリポアラビノマンナン、マイコバクテリアリポタンパク質、非メチル化ＣｐＧＤＮＡ、クロマチン−ＩｇＧ複合体、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ウイルス外殻又はウイルスエンベロープタンパク質、タキソール又はその誘導体、ヒアルロナンを含むオリゴ糖、フィブロネクチン、イミダゾキノリン、及び宿主に由来する熱ショックタンパク質からなる群から選択される化合物であることを特徴とする請求項４記載の使用。
【請求項６】
化合物が、ＴＬＲ−７活性化化合物であることを特徴とする請求項５記載の使用。
【請求項７】
化合物が、イミキモド、Ｒ８４８／レシキモド、ロクソリビン及びブロピリミンからなる群から選択されることを特徴とする請求項６記載の使用。
【請求項８】
腫瘍が、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）であることを特徴とする請求項１〜７いずれか記載の使用。
【請求項９】
インターフェロン、サイトカイン及びケモカインからなる群から選択される炎症性経路に直接的に関連する化合物の使用をさらに含むことを特徴とする請求項１〜８いずれか記載の使用。
【請求項１０】
被検者が、薬剤を投与前又は投与中にＨＰＶ早期抗原に対するＴ細胞反応が活発に上昇した被験者であることを特徴とする請求項１〜９いずれか記載の使用。
【請求項１１】
Ｔ細胞反応が、ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６又はＥ７の配列から選択されるＨＰＶ早期抗原配列を含み、１２〜４５アミノ酸の長さのペプチドを投与することにより上昇したことを特徴とする請求項１０記載の使用。
【請求項１２】
ペプチドが、Ｔ細胞エピトープを含みＩＮＦγ反応を誘発しうる以下からなるペプチドの群より選択されることを特徴とする請求項１０又は１１記載の使用:
配列番号１の１−２２、３１−５２、４１−６２、４３−７７、５１−７２及び７７−９８の各アミノ酸ストレッチ、配列番号２の３１−７５、９１−１２０、１５１−１９５、２７１−３００、２８６−３１５、３０１−３３０、３１６−３４５及び３３１−３６５の各アミノ酸ストレッチ、配列番号３の３１−５２、８１−１０２、９１−１１２、１１１−１３２、１２１−１５８及び１３１−１５２の各アミノ酸ストレッチ。
【請求項１３】
ＣＤ４０受容体活性化分子を投与することをさらに含む請求項１０〜１２いずれか記載の使用。
【請求項１４】
４−１ＢＢ受容体活性化分子を投与することをさらに含む請求項１０〜１３いずれか記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬の分野に関し、特にＨＰＶ感染及び新生組織形成疾患（neoplastic disease）の免疫調節(immuno-modulation)、免疫療法、及び病気予防の分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
ハイリスクヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の肛門性器部（anogenital tract）感染症はよく知られており（非特許文献１〜３参照）、肛門（anus）、直腸（rectum）、陰茎（penis）、外陰部（vulva）、膣（vagina）、及び頸部（cervix）の部位の内部、表面及び／又は周辺に病変（lesions）をひきおこす。幸いなことに感染した大部分の被検者の感染は治癒する（非特許文献４及び５参照）。高リスクＨＰＶの持続性感染は、大部分はＨＰＶ１６であるが、肛門性器部の腫瘍(neoplasia)に至ることもあり、子宮頸部上皮内腫瘍（cervical intraepithelial neoplasia）(ＣＩＮ)及び子宮頸ガン(cervical carcinoma)が最もよく知られている（非特許文献６及び７参照）。ＨＰＶ１６感染は、ａ)外陰上皮内腫瘍（vulvarintraepithelial neoplasia）（ＶＩＮ）として知られる（非特許文献８〜１０参照）外陰部の；ｂ)肛門部上皮内腫瘍（anal intraepithelial neoplasia）（ＡＩＮ）と称される肛門の；ｃ)ＶＡＩＮと表される膣の；ｄ)ＰＩＮとして知られる陰茎の；慢性皮膚疾患を誘因することもある。通常疾患部位（area involved）が根絶し治療が効果的に行われるＣＩＮと対照的に、他のこれらの疾患は、標準的な治療後の再発率が高く慢性的性質を有する（非特許文献１１〜１３参照）。
【０００３】
免疫修飾因子（immune modifiers）の使用は、炎症反応をひきおこすが、ＶＩＮの治療のために適用されてきた。特にイミキモド（imiquimod）による治療法は、ＶＩＮの治療についての代替的アプローチとして提案されてきた。化学的には、イミキモドは、１−（２−メチルプロピル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｃ］キノリン−４−アミンである。かかる免疫反応修飾因子（immune response modifiers）は、多数の炎症誘発性サイトカイン(proinflammatory cytokines)の中でもインターフェロンの分泌をもたらす自然免疫系（innate immune system）のＴｏｌｌ様受容体７（Toll-like receptor 7）を通じて作用する。イミキモドは、腫瘍細胞に対する直接的なアポトーシス促進活性（pro-apoptotic activity）を保持していることも近年明らかとなった（非特許文献１４〜１６参照）。局所塗布（topical application）は、外陰部の組織と機能とを維持するが、罹患皮膚（affected skin）の外科的切除（excision）又は切断（ablation）は、広範囲にわたり外観を損ない、考慮すべき心理性的な病的状態をもたらすことがある。臨床的な成功率は差が生じ、３０〜８７％と推定される（非特許文献１７〜２１参照）。
【０００４】
ＨＰＶ１６早期抗原（HPV16 early antigens）Ｅ２、Ｅ６及びＥ７は、ＨＰＶ感染上皮に発現する最初のタンパク質である。かかる早期抗原に対するＨＰＶ特異的Ｔ細胞性免疫（T-cell immunity）についての従前の研究では、早期抗原に対するタイプ１（ＩＦＮ−γ）Ｔ細胞記憶（T-cell memory）は、健康で性的に活発な個人の大部分において検出することができるが、ＨＰＶ１６誘導性子宮頸部腫瘍の患者では弱いか、又は欠如している（非特許文献２２〜２４参照）。進行性ＨＰＶ感染症（非特許文献２５で検討）に対する防御におけるＣＤ４＋Ｔ細胞の役割について指摘している従前の報告と相まって、データは、ＨＰＶ１６早期抗原に対するＣＤ４＋タイプ１Ｔ細胞反応が、進行性ＨＰＶ１６誘導性疾患に対する防御における重要な役割を果たしているかもしれないということを主張している。
【０００５】
本発明の目的は、それゆえ、ＶＩＮ、ＣＩＮ、ＶＡＩＮ、ＰＩＮ及びＡＩＮなどの肛門性器部のウイルス誘導性上皮内腫瘍の治療において改良された方法及び手段を提供することである。
【０００６】
【非特許文献１】Burk RD, Kelly P, Feldman J, et al. Sex Transm Dis 1996;23:333-41.
【非特許文献２】Koutsky L. Am J Med 1997;102:3-8.
【非特許文献３】Schiffman M, Kjaer SK. Chapter 2: Natural history of anogenital human papillomavirus infection and neoplasia. J Natl Cancer Inst Monogr2003;14-9.
【非特許文献４】Evander M, Edlund K, Gustafsson A, et al. J Infect Dis1995;171:1026-30.
【非特許文献５】Ho GY, Bierman R, Beardsley L, Chang CJ, Burk RD. N Engl J Med 1998;338:423-8.
【非特許文献６】Remmink AJ, Walboomers JM, Helmerhorst TJ, et al. Int J Cancer 1995;61:306-11.
【非特許文献７】Kjaer SK, van den Brule AJ, Paull G, et al. BMJ 2002;325:572.
【非特許文献８】van Beurden M, ten Kate FJ, Smits HL, et al. Cancer 1995;75:2879-84.
【非特許文献９】Buscema J, Naghashfar Z, Sawada E, Daniel R, Woodruff JD, Shah K. Obstet Gynecol 1988;71:601-6.
【非特許文献１０】Hording U, JungeJ, Poulsen H, Lundvall F. Gynecol Oncol 1995;56:276-9.
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【非特許文献１２】Andreasson B, Bock JE. GynecolOncol 1985;21:300-5.
【非特許文献１３】Rettenmaier MA, Berman ML, DiSaiaPJ. Obstet Gynecol1987;69:247-50.
【非特許文献１４】Schon MP and Schon M. Apoptosis 2004;9:291-8.
【非特許文献１５】Geisse J, Caro I, Lindholm J, et al. Am Acad Dermatol 2004;50:722-33.
【非特許文献１６】Sauder DN. Br J Dermatol 2003;149 Suppl66:5-8.
【非特許文献１７】Stanley MA. Clin Exp Dermatol2002;27:571-7.
【非特許文献１８】Marchitelli C, Secco G, Perrotta M, Lugones L, Pesce R, Testa R. J Reprod Med 2004;49:876-82.
【非特許文献１９】Todd RW, Etherington IJ, LuesleyDM. Gynecol Oncol2002;85:67-70.
【非特許文献２０】van Seters M, Fons G, van Beurden M. Results of a pilot study. J ReprodMed 2002;47:701-5.
【非特許文献２１】Wendling J, Saiag P, Berville-Levy S, Bourgault-VilladaI, Clerici T, Moyal-BarraccoM. Arch Dermatol 2004;140:1220-24.
【非特許文献２２】de Jong A, van der Burg SH, Kwappenberg KM, et al. Cancer Res 2002;62:472-9.
【非特許文献２３】de Jong A, van Poelgeest MI, van der Hulst JM, et al. Cancer Res 2004;64:5449-55.
【非特許文献２４】Welters MJ, de Jong A, van den Eeden SJ, et al. Cancer Res 2003;63:636-41.
【非特許文献２５】Palefsky JM, Holly EA. Chapter 6: Immunosuppressionand co-infection with HIV. J Natl Cancer Inst Monogr 2003;41-6.
【発明の開示】
【０００７】
（発明の開示）
本発明の目的は、被検者がウイルス性早期抗原に対する免疫反応を発現（develop）したかどうかを調査することである。本発明は、イミキモドのようなＴＬＲ活性化化合物などの局部炎症をひきおこす免疫修飾因子による治療の成功又は失敗におけるＨＰＶ特異的Ｔ細胞性免疫の決定的役割について論証する。本明細書は、悪性度の高いＶＩＮ患者におけるＨＰＶ１６特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞反応の重要性とサイトカインの極性形成（polarization）とに関する詳細な分析を提供する。本発明は、ＨＰＶウイルス性タンパク質への免疫系の慢性暴露が、約半数の患者においてインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）Ｔ細胞性免疫の誘導をもたらすことを論証する。重要なことに、かかるタイプＩ（ＩＦＮγ）Ｔ細胞反応の存在は、本明細書中の実施例に用いられているイミキモドなどの免疫修飾因子による治療の好ましい臨床反応に関連する。本発明は、局部炎症をひきおこす免疫修飾因子による効果的な治療に関し、ＨＰＶ早期抗原に対する免疫反応を最初に決定しなければならないということに意味を有する。反応が欠如している場合は、局部炎症反応をひきおこす免疫修飾因子による治療がもたらす最善の結果を得るために当該技術分野で知られている方法により、ＨＰＶ早期抗原に対する免疫反応を生じさせてもよい。イミキモドなどの免疫修飾因子の使用は、ウイルス性早期抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞反応を有していない者においてはほとんど効果がないことが論証されており、このグループの被検者については、ウイルス性抗原に対するＴ細胞反応を誘発する（elicit）ために薬剤による治療を最初にしてもよい。かかる治療が十分に成功しない場合、治療抵抗性である（refractory）個人については、罹患皮膚の外科的切除若しくは切断、又は代替薬剤などのより効果的な別の手段により治療することが好ましい。さらに、ウイルス性早期抗原に対する免疫反応の欠如により、かかる化合物及び／又は組成物の効果が少ない、あるいは効果がないとさえされるグループの被検者では、掻痒(itching)、ひりひりした痛み（burning）、疼痛（pain）などの局部炎症をひきおこす免疫修飾因子による治療のネガティブな副作用を避けてもよい。
【０００８】
（発明の詳細な説明）
最初の実施態様では、本発明は、肛門性器部上皮内腫瘍に罹患している患者の治療方法であって少なくとも：
ｉ)    被検者が、ウイルス性抗原についてＴ細胞反応性を有しているかを決定するステップ；及び
ii)    次にステップｉ)におけるＨＰＶ抗原に対するＴ細胞反応性が陽性と判定される患者において、局部炎症を誘発する免疫修飾化合物（immune modifying compounds）による腫瘍の局部治療をするステップ
を含む治療方法を提供する。
【０００９】
ウイルス性抗原、特にＨＰＶ早期抗原、とりわけＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８及びＨＰＶ３３などの高リスクタイプＨＰＶのＥ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質に対するＴ細胞反応性は、本明細書中の実施例の項目及び／又は国際公開第０２／０７０００６号パンフレット（参照により本明細書の一部とする）に記載されているアッセイ、Ｔ細胞増殖アッセイ、ＩＮＦγＥＬＩＳＰＯＴアッセイ、サイトカインマルチプレックスアッセイ、並びにＥＬＩＳＡアッセイ等の標準的なアッセイを用いて、血液サンプル及びそこから単離された細胞において決定してもよい。特にＩＦＮγ（タイプ１Ｔ細胞反応）を産生するＣＤ４＋Ｔ細胞性免疫反応は、免疫修飾因子による肛門性器部上皮内腫瘍の局部治療について非常に有益であることが本明細書には示されている。ウイルス性早期抗原又はＭＨＣクラスII分子に結合するエピトープに対するＣＤ４＋免疫反応は特に有利である。本発明の一部は、樹枝状細胞（dendritic cells）、マクロファージ、及びＮＫ細胞などのプロフェッショナルな抗原提示細胞の活性化についてであり、ウイルス感染細胞及び／又は肛門性器部位の腫瘍に対する効果的な局部炎症反応を誘発するために役立つものである。
【００１０】
ウイルス性エピトープに結合するＭＨＣクラスＩに対して反応するＣＤ８＋細胞障害性（cytotoxic）Ｔ細胞反応が、特に肛門性器部上皮において、ＨＰＶ感染細胞に対して効果的な免疫反応をさらに増強してもよい。
【００１１】
免疫反応及び局部炎症が、免疫修飾化合物を適用する本発明の方法において誘導されることが好ましく、局部炎症を誘導することができる及び／又は局部炎症反応を誘発することができる免疫修飾化合物が好ましい。本発明により用いられる免疫修飾化合物又は組成物は、例えばＴＬＲ１〜１０を含むＴｏｌｌ様受容体（Toll like receptors）（ＴＬＲ’ｓ）を通じて特に活性化される自然免疫系を活性化できる。ＴＬＲ受容体並びにその変異体及び派生物（derivatives）を活性化することができる化合物を、局部炎症反応を誘導するために用いてもよく、当該技術分野において十分立証されている（文献５１参照）。ＴＬＲ１は、バクテリアリポタンパク質とそのアセチル体により活性化され、ＴＬＲ２はそれに加えて、グラム陽性バクテリア糖脂質、ＬＰＳ、ＬＰＡ、ＬＴＡ、線毛（fimbriae）、外膜タンパク質、バクテリア又は宿主に由来する熱ショックタンパク質、及びマイコバクテリアリポアラビノマンナンにより活性化されうる。ＴＬＲ３は、ｄｓＲＮＡ、特にウイルス起源のｄｓＲＮＡ、又は化学的化合物ポリ（Ｉ：Ｃ）により活性化されうる。ＴＬＲ４は、グラム陰性ＬＰＳ、ＬＴＡ、宿主又はバクテリアに由来する熱ショックタンパク質、ウイルス外殻（coat）又はエンベロープタンパク質、タキソール（taxol）又はその誘導体、ヒアルロナンを含むオリゴ糖及びフィブロネクチンにより活性化されうる。ＴＬＲ５は、バクテリアの鞭毛（flagellae）又はフラジェリンにより活性化されうる。ＴＬＲ６は、マイコバクテリウムリポタンパク質及びＢ群溶連菌熱不安定性溶解性因子（group B Streptococcus heat labile soluble factor）(ＧＢＳ−Ｆ)、又はスタフィロコッカスのモジュリン（modulin）により活性化されうる。ＴＬＲ７は、イミダゾキノリンにより活性化されうる。ＴＬＲ９は、非メチル化ＣｐＧＤＮＡ又はクロマチン−ＩｇＧ複合体により活性化されうる。
【００１２】
特に、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及びＴＬＲ９は、ウイルス感染に対する自然免疫反応を仲介する重要な役割を果たし、かかる受容体を活性化することができる化合物を、本発明による局部治療方法及び、本発明の組成物又は薬剤において使用することが特に好ましい。特に好ましい化合物としては、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ））、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９受容体の誘発をおこす（trigger）非メチル化ＣｐＧＤＮＡを挙げることができるがこれらに制限されない。本発明において使用されるＴＬＲ７活性化化合物としては、イミダゾキノリン(例：イミキモド及び／又はＲ−８４８／レジキモド（resiquimod）)、ロクソリビン（loxoribine）（７−アリル（allyl）−８−オキソグアノシン）、及びブロピリミン（bropirimine）（２−アミン（amin）−５−アリル（allyl）−８−オキソグアノシン）を挙げることができるが、強力な免疫賦活活性及び抗ウイルス活性を有することが示されており、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６及び／又はＩＬ−１２などの炎症誘発性サイトカインを誘導することができる。
【００１３】
局部炎症反応を刺激し又はさらに増強するために本発明による方法及び医薬組成物（pharmaceutical composition）若しくは薬剤において適用されうる別の化合物としては、炎症性経路の一員であるケモカインとサイトカインとを挙げることができる。例えば、タイプＩインターフェロン(インターフェロンαとβ)、並びにサイトカインＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）とＩＬ−１２及び／又はケモカインＣＸＣＬ−１、２、３、７、８、１０、１２、１３；ＣＣＬ−２、３、４、５、１１、１８、２０、２７；ＸＣＬ−１とＣＸ３ＣＬ−１を挙げることができる。
【００１４】
本発明による治療方法及び医薬組成物は、ウイルス感染により誘導される肛門性器部上皮内腫瘍の治療に特に適しており、特にヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染、とりわけハイリスクタイプのＨＰＶ−１６、１８、３１、３３、３５、３９、４５、５１、５２、５６、５８、５９、及び６８タイプを挙げることができる。しかしながら、免疫系が防御に失敗することによりもたらされる（マイコ）バクテリア、真菌並びに／又は、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２）、ＨＩＶ及び／若しくはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）など他のウイルスによる上皮領域での他の感染又は重感染（co-infection）についても、本発明による方法及び薬剤で治療できる。本発明は、ＨＰＶ、ＨＳＶ及びＣＭＶウイルスと（重）感染しうる任意の哺乳類の治療に適当であり、ヒトの被検者及び／又は患者における使用が最も適当である。
【００１５】
本発明による方法及び薬剤により治療を受ける腫瘍は、好ましくは上皮組織、肛門部位、及び／又は外陰部、膣、頸部、陰茎、陰嚢、肛門及び直腸を含む肛門性器部における任意のＨＰＶ誘導性腫瘍でよい。治療を受ける腫瘍性疾患（neoplasticdisorders）としては、各段階の子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮＩ、II及びIII）、各段階の外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮＩ、II及びIII）並びに膣上皮内腫瘍（ＶＡＩＮ）及び肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）を挙げることができる。また、これらに制限されないが陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）及び肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）等の肛門部位及び／又は肛門性器部におけるウイルス誘導性腫瘍に罹患している男性被験者も、本発明による治療を受けることができる。
【００１６】
本発明の特に好ましい実施態様では、本発明は、新規の（de novo）免疫反応を誘発するステップ、又はウイルス感染に対する（既存の（pre-existing））免疫反応を増強する（enhance)ステップを含む。Ｔ細胞反応、特にＣＤ４＋Ｔ細胞反応は、本発明による方法において特に有利であることが示されている。それゆえかかるＴ細胞反応を、免疫学やワクチン接種の技術分野の公知の種々の方法により、産生(generated)、加速(accelerated)、遷延（prolonged）、又は増強してもよい。別のウイルスに由来する抗原及び（マイコ）バクテリア抗原を用いてもよいし、組み合わせてもよいが、免疫反応は、一又は複数のウイルス性抗原、特にＨＰＶ早期抗原に対して上昇し（raised）、追加免疫される（boosted）。特に好ましいのは、高リスクタイプのＨＰＶ早期タンパク質Ｅ２、Ｅ６及びＥ７から選択される一又は複数のＨＰＶ早期抗原の使用である。ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて、Ｔ細胞反応を誘導することができる多くのＣＴＬとＴヘルパーエピトープが、本発明者らにより同定されてきた（国際公開第０２／０７０００６号パンフレット参照）。ＭＨＣの溝（groove）に直接結合することを防止するため十分に長い特異的な長さのペプチドの使用が好ましい。より長いペプチド、好ましくは約１２より長い、より好ましくは約１５、１８、最も好ましくは２２〜４５長のアミノ酸は、プロセシングが必要であり、取込まれるため（taken up）や、樹枝状細胞などのプロフェッショナルな抗原提示細胞により内部でプロセスされるために十分長いものである。ＨＰＶ１６Ｅ７タンパク質に由来するペプチドを含むエピトープは、配列番号１の１−２２、３１−５２、４１−６２、４３−７７、５１−７２及び７７−９８のアミノ酸ストレッチ（stretches）を含むことが好ましい。ＨＰＶ１６のＥ２タンパク質に由来するペプチドを含むエピトープは、配列番号２の３１−７５、９１−１２０、１５１−１９５、２７１−３００、２８６−３１５、３０１−３３０、３１６−３４５及び３３１−３６５のアミノ酸ストレッチを含むことが好ましい。ＨＰＶ１６Ｅ６タンパク質に由来するペプチドを含むエピトープは、配列番号３の３１−５２、８１−１０２、９１−１１２、１１１−１３２、１２１−１５８及び１３１−１５２のアミノ酸ストレッチを含むことが好ましい。適当なペプチドとそこに含まれるウイルス性エピトープの選択は、治療を受ける被検者のＨＬＡタイプに依拠するものではないが、他の要因の中でも特に被検者が保有するウイルス感染に依拠するものである。当業者であれば、かかるＨＰＶ１６ペプチドのアミノ酸ストレッチとは別の高リスクで相同性が高いＨＰＶタイプに由来する対応ペプチドを容易に見い出し、置き換えることができるであろう。
【００１７】
Ｔ細胞反応、特にＣＤ４＋Ｔ細胞反応を誘発するためのウイルス抗原の投与は、ＣＤ４０受容体及び／若しくは４−１−ＢＢ受容体活性化化合物又はアゴニストの投与と組み合わせてもよい。これらの化合物は、国際公開第０３／０８４９９９号パンフレットに記載されているように、樹枝状細胞を活性化して局部炎症反応を高めることを助けるペプチドワクチン接種による免疫反応を増強及び／又は遷延（prolong）するために、受容体及び／若しくは（アゴニストの）抗体の種々の天然又は合成のリガンド、あるいはそれらの断片及び誘導体などの公知の化合物から選択してもよい。
【００１８】
ウイルス抗原に対するＣＤ４＋Ｔ細胞反応が存在するかどうかを決定する前又は後の、本発明による肛門性器部上皮内疾患の被検者の治療は、最初に抗原を投与することからなるものとしてもよい。例えば、一又は複数の高リスクＨＰＶのＥ２、Ｅ６及び／又はＥ７抗原の注入を挙げることができ、上述のエピトープを有するペプチドを含むことが好ましく、単独で投与されてもよいし、それ自体が周知である種々のアジュバントを含む様々な医薬組成物において投与されてもよい。特にインターフェロンγ抗原特異的産生に関連する、強いＨＰＶ早期抗原特異的Ｔ細胞反応、好ましくはＣＤ４＋Ｔ細胞タイプ１反応をもたらすワクチン接種スキームが用いられることが好ましい。ワクチン接種スキームとアジュバントの使用は、当該技術分野で知られており、オンラインＰｕｂＭｅｄデータベースに報告されている文献を通じて容易に利用でき、また例えば、免疫学最新プロトコル（Current Protocols in Immunology）(Wiley Interscience 2004)に記載されている。最終のワクチン接種後通常約１〜２週間（この期間に制限されることはないが）の、強いＣＤ４＋Ｔ細胞反応を含むＴ細胞反応のピーク時に、（１又は複数の）免疫修飾剤（agent or agents）が、治療を要する病変の内部又は表面に局部適用される。免疫修飾剤（immune modifying agent）、好ましくは本明細書中に前述の炎症誘導剤は、熟練した医師により公知の種々の方法により局所的に適用してもよい。例えば、軟膏若しくはクリームを用いることにより行っても、又は経皮貼付を適用してもよいし、あるいは、治療の必要な上皮内の病変の内部、周囲、又は近傍に注入してもよい。その後免疫修飾剤は、病変が消失するまで局部炎症を維持するために定期的に局部的に適用される。Ｔ細胞反応を遷延又は増強するために、そして治療の臨床転帰（clinical outcome）を改善するためにかかる治療の間に、追加抗原投与量（booster doses）のウイルス性抗原を投与してもよい。或いは、免疫修飾又は好ましくは炎症誘導剤の局部適用が先行して行われ、並びに／あるいは、免疫付与／ワクチン接種の治療の間及び／又は治療後に行われる。
【００１９】
本発明はまた、本発明による治療方法において使用する新規薬剤を提供する。薬剤の処方、投与方法、及び薬学的に容認することができる賦形剤の使用は、当該技術分野においては公知であり、慣例であり、例えばRemington、The Science and Practice of Pharmacy, 21ndEdition 2005, University of Sciences in Philadelphiaに記載されている。本発明の医薬化合物及び薬剤は、それゆえ、ラクトース、セルロース及びこれらの誘導体、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、保湿剤（humectants）、分解促進剤（disintegration promoters）、潤滑油（lubricants）、崩壊剤（disintegrants）、デンプン、及びこれらの誘導体、糖溶解剤（sugar solubilizers）、免疫刺激アジュバント、又は他の賦形剤などのバインダーを含んでもよい。本発明は、ＨＰＶ、ＣＭＶ及びＨＳＶ抗原などのウイルス性抗原、特に高リスクＨＰＶ早期抗原に対するＴ細胞反応について陽性と判定される被検者における肛門性器部上皮内腫瘍及び／又は前記上皮の感染の治療のための新規薬剤及び／又は医薬製剤の処方し製造する方法及び手段を提供する。本発明の薬剤は、局部炎症反応を誘導することができる免疫修飾化合物を活性成分として含み、ＴＬＲ１〜１０を活性化することができるＴｏｌｌ様受容体が好ましく、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７及び／又はＴＬＲ９活性化化合物が最も好ましい。本発明による医薬化合物及び薬剤における使用に非常に適したＴＬＲ活性化化合物としては、バクテリアリポタンパク質及びそのアセチル体、バクテリアグリコリピッド、バクテリア外膜（outer membrane）タンパク質、バクテリア熱ショックタンパク質、バクテリアの鞭毛又はフラジェリン、線毛、Ｂ群溶連菌熱不安定性溶解性因子（ＧＢＳ−Ｆ）、スタフィロコッカスのモジュリン、グラム陽性ＬＰＳ又はリピドＡ、ＬＴＡ、グラム陰性ＬＰＳ又はＬＴＡ、マイコバクテリアリポアラビノマンナン、マイコバクテリアリポタンパク質、非メチル化ＣｐＧＤＮＡ、クロマチン−ＩｇＧ複合体、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ウイルス外殻又はウイルスエンベロープタンパク質、タキソール又はその誘導体、ヒアルロナンを含むオリゴ糖、フィブロネクチン、イミダゾキノリン、及び宿主生物に由来する熱ショックタンパク質を挙げることができる。特に、ｄｓＲＮＡ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、非メチル化ＣｐＧＤＮＡ、並びに、ＴＬＲ３及びＴＬＲ９の誘発をおこす他の物質を挙げることができる。最も好ましく用いられるＴＬＲ７活性化化合物としては、イミダゾキノリン(例：イミキモド及び／又はＲ−８４８／レジキモド)、ロクソリビン（７−アリル−８−オキソグアノシン）、及びブロピリミン（２−アミン−５−アリル−８−オキソグアノシン）、並びにこれらの誘導体及びアナログを挙げることができるがこれらに限定されない。イミダゾキノリンは、本発明による使用において最も好ましい化合物である。
【００２０】
本発明による医薬化合物は、炎症性経路又はカスケードの一部であるケモカインとサイトカインなどの局部炎症反応を刺激することができる一又は複数の化合物を任意に含んでもよい。タイプ１インターフェロン（αとβ）、並びにサイトカインＩＬ−１、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−８（ＣＸＣＬ８）及びＩＬ−１２、又はケモカインＣＸＣＬ１、２、３、７、８、１０、１２、１３；ＣＣＬ２、３、４、５、１１、１８、２０、２７；ＸＣＬ１及びＣＸ３ＣＬ１の使用を挙げることができる。また、かかるサイトカインとケモカインのインサイチュでの産生を刺激することができる物質及び化合物もまた、本発明の医薬化合物及び薬剤と有利に混合されうる。
【００２１】
また別の実施態様では、本発明は、以下から選択される一又は複数の、好ましくは少なくとも２つの構成要素を含むキットのパーツを含む：
免疫修飾因子、好ましくは炎症誘導剤（inflammation inducing agent）、
ケモカイン及び／又はサイトカインを含む、局部炎症反応をさらに刺激することができる組成物又は化合物、
ＨＰＶに由来するペプチドを含むＨＰＶワクチン、及び／又は
ＨＰＶに対する細胞性免疫反応を検出するためのＨＰＶペプチド及び試薬。
【００２２】
（定義）
上皮内腫瘍とは、前ガン状態（precancerous）の細胞増殖であり、形成異常（dysplasia）と同義語である。子宮頸部上皮内腫瘍 (「ＣＩＮ」と略される)とは、低リスク又は高リスクのヒトパピローマウイルスなどの性感染性ウイルス（sexually transmittable viruses）によりひきおこされる子宮頸部の状況（cervical condition）である。ＣＩＮは、また子宮頸部形成異常（Cervical Dysplasia）とも呼ばれる。ＣＩＮは、その重症度によりＩ、II、IIIに分類される。前ガン状態の異常とみなされている。最も軽度の態様であるＣＩＮＩは、めったにガンに進行することはない。より重度の態様であるＣＩＮIIとＣＩＮIIIは、適切に治療を受けなければ悪性腫瘍（malignancies）を発症しうる。外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）とは、外陰部の皮膚における異常細胞の存在である。外陰部の皮膚において１つの部位又はいくつかの部位に同時に発生しうる。またＶＩＮは、ＣＩＮと同様３つの異なる程度の重症度又はステージにおいて発生する。ＶＡＩＮとは、膣上皮内腫瘍を意味し、膣における類似の腫瘍である。
【００２３】
男性の上皮内腫瘍の態様としては、陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）を挙げることができる。陰茎上皮内腫瘍は、まれにおこる陰茎の皮膚の外層（表皮）の前ガン状態の疾病である。ケイラー赤色肥厚症（Erythroplasia of Queyrat）、陰茎ボーエン病、インサイチュ陰茎扁平上皮細胞ガン（in-situ squamous cell carcinoma of the penis）又はＰ．Ｉ．Ｎ．とも称される。病変は、亀頭（glans）上又は包皮の内側に通常現れ、ほとんどの場合、割礼を受けていない（uncircumcised）男性で観察される。治療を受けないまま放置すると、１０〜３０％の例で侵襲性陰茎扁平上皮細胞ガン（invasive squamous cell carcinoma）（悪性腫瘍）が発生しうる。若年者にはめったに発生しないが、５０歳以上の割礼を受けていない男性が陰茎上皮内腫瘍になるリスクが最も高い。陰茎上皮内腫瘍は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による慢性感染症、陰部疣贅（genital warts）の原因、及び薬剤又は疾病による免疫抑制に関連する。
【００２４】
肛門部上皮内腫瘍（ＡＩＮ）は、男性と女性両方に発生し、肛門部扁平上皮細胞ガン（anal squamous cell cancer）の前兆であると考えられている。その発生率は、高リスクグループにおいて、特にヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に感染している者たちにおいて上昇している。ＡＩＮの病因（aetiology）は、他のウイルスの感染又は重感染の役割を排除するものではないが、ヒトパピローマウイルスに複雑に結びついている。ＡＩＮについては、主として診断及び治療の両方において困難があり未だ標準的な対応（management）はない。多様な治療法の選択肢がとられたが、効果はまちまちであった。外科手術は、特にＨＩＶ陽性患者においてかなりの率の再発と関連するものである。
【００２５】
上皮内腫瘍は、扁平上皮内病変とも称され、ＶＩＮ、ＣＩＮ、ＰＩＮ、ＶＡＩＮ、又はＡＩＮのそれぞれステージＩ又はステージII〜IIIと類似しており、軽度と重度の態様は区別できる。
【実施例１】
【００２６】
（方法と材料）
［患者］
悪性度の高い外陰上皮内腫瘍の２９人の女性（年齢範囲、２４〜７３歳；年齢中央値、４７歳）を、オランダの研究医療センター婦人科、及びライデンアンドエラスムス大学研究医療センターから募集した。これらの患者は、平均して、本研究に登録する５．４年前にＶＩＮ第３期と診断されていた（６月〜１５年の幅がある）。１８人の女性が、研究に入る前にＶＩＮ第３期における治療を既に受けていた（外科的切除、レーザー療法、又はイミキモドによる治療（＃２１、２４、２７））。
【００２７】
かかる２９人の被検者のうち、１７人（年齢２９〜６０歳、中央値４３歳）が、５％イミキモドクリームにより実験的に治療を受けた。患者はクリームを外陰部の患部に最長１６週間、週に２回塗って一晩放置するように指示された。ＨＰＶ１６特異的免疫反応に対するイミキモドによる治療の効果を分析するために、血液と血清のサンプルをイミキモドによる治療を開始する前（Ｔ＝０）、治療から８週間後（Ｔ＝８）、及び治療終了時（Ｔ＝１６）-に連続的に収集した。外陰部の病変は、開始時と、治療から８週間後と１６週間後における直接測定及び写真による記録により評価した。臨床効果（clinical response）は、完全寛解（complete response）（ＣＲ）と、病変の直径の減少が７６〜９９％と定義される部分寛解１（partial response １）（ＰＲ１）と、病変の直径の減少が２６〜７５％と定義される部分寛解２（partial response 2）（ＰＲ２）と、臨床反応なし（no clinical response）として定義された。
【００２８】
２９人中２０人の女性から末梢血単核球(peripheral blood mononuclear cells)（ＰＢＭＣｓ）を単離し、ＨＰＶ１６特異的増殖Ｔ細胞反応性を分析するためにそのまま用いた。これらの２０人の女性のうち、８人の患者がイミキモドによる治療にも参加した。６例において、血液を、イミキモドの研究の終了後３ヶ月（＃１）、４ヶ月（＃１０）、１０ヶ月（＃５）から１年以上（＃１２、１３及び１５）にわたって採取し、他の２例（＃２、４）においては、治療開始後４週間以内に血液を採取した。ウイルス様粒子（virus-like particle）（ＶＬＰ）Ｌ１特異的抗体の存在を調査するために血清を収集した。
【００２９】
被検者全員が、ＧＰ５＋／６＋ＰＣＲによりＨＰＶに区分され、公知の反転線ブロット（reverse line blot）（文献２６参照）により分析された。かかる研究の計画は、医療倫理委員会による承認を受け、女性の全員から書面でインフォームドコンセントを得た。
【００３０】
［抗原］
ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６及びＥ７総タンパク質を網羅するペプチドの一式がＴ細胞増殖アッセイのために用いられた。Ｅ２ペプチドは、１５アミノ酸がオーバーラップしている２２個の３０ｍｅｒペプチドと、３５アミノ酸長のＣＯＯＨ末端ペプチドとからなる。Ｔ細胞増殖アッセイのために、Ｅ２ペプチドと、３２ｍｅｒペプチドのＥ６タンパク質と、１４アミノ酸がオーバーラップしている３５ｍｅｒペプチドのＥ７タンパク質とについて、１プールあたり２ペプチドがプールにおいて用いられた。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイのために用いられたペプチドは、ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６及びＥ７タンパク質を網羅し、最も免疫原性が高い領域であるＥ２の３０ｍｅｒペプチド（文献２２参照）及び、１５個のＥ６と９個のＥ７がオーバーラップしている２２ｍｅｒペプチドからなる。ペプチドを、文献（文献２７参照）記載のとおり合成し、溶解した。ペプチドプールは、２つのペプチドによりカバーされるタンパク質における領域の最初と最後のアミノ酸により表現される（例えば、Ｅ２１−４５、残基１−３０及び１６−４５）。破傷風トキソイド（０．７５ｌｉｍｕｓ ｆｌｏｃｃｕｌｅｎｔｉｕｓ／ｍＬ最終濃度；国立公衆衛生環境研究所（National Institute of Public Health and Environment）、ビルトホーヘン、オランダ)と、マイコバクテリウム結核超音波分解物（Mycobacterium tuberculosis sonicate）(２．５μｇ／ｍＬ；寛大にも王立熱帯研究所、アムステルダム、オランダのＰ．Ｋｌａｓｔｅｒ博士より寄贈された)と、カンジダ・アルビカンス（０．００５％、ＨＡＬ、アレルゲネン（Allergenen）研究所、ハーレム、オランダ）の混合物からなる記憶応答混合液（Memory response mix）（ＭＲＭ）が、ポジティブコントロールとして用いられた。
【００３１】
［短期Ｔ細胞増殖アッセイ］
新鮮な単離したＰＢＭＣを１２プールのＨＰＶ１６のＥ２に由来する３０ｍｅｒペプチドと、４プールのＥ６の３２ｍｅｒペプチドと、２プールのＥ７の３５ｍｅｒペプチド（各プールは２つのオーバーラップペプチドからなる）とで培養した。ＰＢＭＣは、９６ウェルＵ底プレート（Costar社製、Cambridge, MA）に１．５×１０５細胞／ウェルの密度で、１０％自己血清（autologous serum）を添加した１２５μＬのＩｓｏｃｏｖｅ培地（Bio Whittaker社製）に播種した。ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６、Ｅ７に由来するペプチドを、１０μｇ／ｍＬ／ペプチドの濃度で添加した。培地のみをネガティブコントロールとし、ＭＲＭ（１：５０希釈）をポジティブコントロールとして供した。各ペプチドプールについて、８つの並列（parallel）マイクロカルチャーを培養した。培養後６日目にマイクロカルチャーから５０μＬの上清を採取し、サイトカイン分析まで−２０℃にて保存した。ペプチド特異的増殖は７日目に３Ｈチミジン取込み（［３Ｈ］-thymidine incorporation）により測定した。被検ウェルの７５％以上の増殖が、増殖の平均値＋培地のみを含むＳＤコントロールウェルの３×ＳＤを超えた場合、かつすべての被検ウェルの平均をコントロールウェルの平均によって割ったものとして定義される刺激指数が≧３である場合に、培養物を陽性と判定した（文献２２参照）。
【００３２】
［ＨＰＶ１６特異的増殖反応に関連するサイトカイン分析］
短期増殖アッセイの上清におけるサイトカインの検出を、サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ）（Becton Dickinson社製）を用いて行った。この技術により、６つの異なるＴｈ１及びＴｈ２サイトカインＩＦＮγ、腫瘍壊死因子α（tumor necrosis factorα）、インターロイキン（ＩＬ）−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、並びにＩＬ−１０の同時検出が可能となる。ＣＢＡは製造者の指示通りに行われた。カットオフ値は、様々なサイトカインの検量線に基づいた（ＩＦＮγは１００ｐｇ／ｍＬ、残りのサイトカインは１０ｐｇ／ｍＬ）。抗原特異的サイトカイン産生は、＞２×コントロール培地のサイトカイン濃度として定義された（文献２３及び２８参照）。
【００３３】
(ＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔによるＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞反応性分析)
イミキモドにより治療した１７人の患者の末梢血（peripheral blood）に存在するＨＰＶ特異的Ｔ細胞を産生するＩＦＮγの数は、ＥＬＩＳＰＯＴを用いて文献（文献２９及び３０参照）記載のとおり行われ定量化された。手短に言えば、ＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、指示されたＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６及びＥ７ペプチドプールの存在下又は非存在下で、１０％ヒトＡＢ血清で強化した１ｍＬのＩＭＤＭ（Bio Whittaker社製、Verviers、Belgium）に２４ウェルプレート（Costar, Cambridge, MA）のウェルあたり２×１０６細胞の密度で播種した。ペプチドを、５μｇ／ｍＬ／ペプチドの濃度で４〜５ペプチドのプールにおいて用いた。タンパク質における最初と最後のアミノ酸により表現されるペプチドが、以下のプールに用いられた：Ｅ２−Ｉ：１−３０、１６−４５、３１−６０、４６−７５；Ｅ２−II：６１−９０、７６−１０５、９１−１２０、１０６−１３５；Ｅ２−III：１２１−１５０、１３６−１６５、１５１−１８０、１６６−１９５；Ｅ２−ＩＶ：２７１−３００、２８６−３１５、３０１−３３０、３１６−３４５、３３１−３６５；Ｅ６−Ｉ：１−２２、１１−３２、２１−４２、３１−５２；Ｅ６-II:４１−６２、５１−７２、６１−８２、７１−９２；Ｅ６−III：８１−１０２、９１−１１２、１０１−１２２、１１１−１３２；Ｅ６−IV：１１１−１３２、１２１−１４２、１３１−１５２、１３７−１５８；Ｅ７−Ｉ：１−２２、１１−３２、２１−４２、３１−５２；Ｅ７−II：４１−６２、５１−７２、６１−８２、７１−９２、７７−９８。３７℃にて４日間培養後、ＰＢＭＣは集菌され、洗浄され、ＩＦＮγを補足する抗体（Mactech AB社製, Nacha, Sweden）でコートされているマルチスクリーン９６ウェルプレート（ミリポア社製、Etten-Leur, オランダ）に１０％ＦＣＳで強化した１００μＬＩＭＤＭにウェルあたり１０５セルの密度で、４つの重複したウェルに播種した。さらに、抗体培養とＥＬＩＳＰＯＴの展開は製造者（Mabtech社）の指示どおりに行われた。スポットは、完全自動化されたコンピューターを利用したビデオイメージング分析システム（Bio Sys社製）により計測された。特異的スポットは、スポット＋培地コントロールの２×ＳＤの平均数を実験ウェルのスポットの平均数から引いたものであるが、但し、培地コントロールウェルのスポットの平均数が＜１０であるか、標準偏差が平均の＜２０％で＞１０であるかのいずれかである。特異的Ｔ細胞の頻度が≧１／１０，０００で、かつ少なくとも≧２×バックグラウンドの場合、抗原特異的Ｔ細胞の頻度は増加したと判断された（文献３０参照）。スポットのバックグラウンドの数は、一つを除き（＃２３、５１±１０スポット）、２．６±２．２（平均±ＳＤ）であった。
【００３４】
（ＨＰＶ１６ＶＬＰ  ＥＬＩＳＡ）
血清中のＨＰＶ１６特異的抗体の検出については、本発明者らは、Kirnbauer et alによる記載のとおりにＥＬＩＳＡ法を用いた（文献３１参照）。各血清サンプルについて、ＨＰＶ１６ウイルス様粒子（ＶＬＰ、Ｌ１タンパク質を含むバキュロウイルス発現キャプシド）と、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）キャプシドとに対する反応性を検査し、後者をネガティブコントロールとして供するために０．１Ｍ炭酸バッファー（carbonate buffer）の処理により破壊した。ＶＬＰ及びＢＰＶは両方とも、J.Dillner教授（博士）（ＬＵＮＤＳ大学、スウェーデン）より快く提供された。患者は、ＨＰＶ１６特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの両方について検査した。健康な子供の血清一式（ｎ＝８、平均年齢７．３歳、４．３〜１４．１歳の範囲）をバックグラウンド反応性を決定するために検査した。ＨＰＶ１６Ｌ１−ＶＬＰＩｇＧタイプ反応については、カットオフＯＤ値として０．２３０を用いた（平均ＯＤ＝０．０６０；範囲―０．０５６〜０．１５０；平均＋２回、標準偏差＝０．２３０）。ＩｇＡタイプ反応については、カットオフとしてＯＤ＝０．２１５を用いた（平均ＯＤ＝０．１８９；範囲０．１７１〜０．２０５）。
【００３５】
［統計的分析］
サイトカイン産生に関連するＨＰＶ１６特異的増殖反応の統計的分析は、両側フィッシャーの直接確率検定（2−sided Fischer’s exact test）を用いて行われた。フィッシャーの直接確率検定（両側）は、イミキモドによる治療による臨床反応に対するＨＰＶ特異的免疫性を分析するために用いられた。統計的分析は、グラフパッドインスタットソフトウェア（Graphpad Instat Software）（バージョン３）を用いて行われた。
【実施例２】
【００３６】
悪性度の高いＶＩＮ患者におけるＨＰＶ１６特異的細胞反応及び液性反応は、患者が頻繁に治療を受けていたとしても感染は多くの場合持続するので、ＨＰＶに誘導される疾病の独特の特徴を形成する。ＨＰＶ１６は、ほとんどの場合観察される。ＶＩＮにおけるＨＰＶ１６に対するＣＤ４＋Ｔ細胞反応について深い病識（profound insight）を得るために、ＨＰＶ１６に関連する悪性度の高いＶＩＮの女性２０人のグループにおいて、ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６及びＥ７特異的増殖Ｔ細胞反応の規模、特異性及び機能性を分析した。
【００３７】
ＶＩＮ患者から単離されたＰＢＭＣを、ＨＰＶ１６タンパク質Ｅ２、Ｅ６及びＥ７に由来するペプチドと、短期増殖アッセイにおける共通のリコール抗原（ＭＲＭ）との混合物で刺激した。本発明者らは、先に本明細書のアッセイがＣＤ４＋Ｔ細胞反応の検出に適していることを示した（文献２３参照）。Ｅ２及び／又はＥ６に対するＨＰＶ１６特異的増殖Ｔ細胞反応が、２０人中１０人の患者において検出された（図１ａ参照）。Ｅ７特異的反応は、２０人中５人の患者において検出された。タイプ１とタイプ２のサイトカインの存在についてのかかるＴ細胞培地の上清の分析によると、２０人中８人の患者において、Ｔｈ１サイトカインＩＦＮγの分泌が明らかになった。数人の患者において、ＴＮＦα、ＩＬ−５及びＩＬ−１０の産生が時折検出された（図１ｂ参照）。増殖反応の全体の頻度は、子宮頸ガンの患者に先に観察された頻度と比較して同程度であったが、今回のＶＩＮ患者におけるＩＦＮγ関連ＨＰＶ特異的Ｔ細胞反応患者の数はより多かった（それぞれ２０人中８人に対して１７人中４人（文献２３参照））。
【００３８】
ＶＩＮ患者２８人において、Ｔ細胞性免疫に加えて、ＨＰＶ１６への液性反応が、ＨＰＶ１６Ｌ１−ＶＬＰを抗原として用いてＥＬＩＳＡにより測定された。全体として、ＨＰＶ１６Ｌ１−ＶＬＰＩｇＧ抗体とＩｇＡ抗体とが、それぞれ２８人中２５人（８９％）及び２８人中１３人（４６％）の被検者に検出された（表１参照）。ＯＤ値に基づくと、ＨＰＶ１６Ｌ１−ＶＬＰ特異的ＩｇＧ反応は、ＩｇＡ反応を超えていた（表１参照）。一般的に、ＨＰＶ１６特異的ＩｇＡ反応は、患者が比較的高レベルのＨＰＶ１６特異的ＩｇＧを示したときに検出された。ＩｇＧのＯＤ値が≧０．５であった場合は、１９中１１（５８％）のサンプルがＨＰＶ１６Ｌ１特異的ＩｇＡを含んでいた一方、ＩｇＧレベルが＜０．５であった場合は、９中２のサンプルのみがＩｇＡ血清反応陽性（IgA seropositive）であった。
【００３９】
結論として、ＨＰＶ１６Ｌ１特異的液性免疫は、患者の大部分で検出された一方、ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６及び／又はＥ７特異的ＩＦＮγ関連タイプ１Ｔ細胞反応性は、被検患者の約半分に検出された。
【実施例３】
【００４０】
ＨＰＶ１６特異的免疫は、イミキモドの免疫調節治療（immunomodulatory treatment）に対するより好ましい臨床反応と関連する。
【００４１】
本発明者らの分析では、ＨＰＶ１６特異的増殖において、増殖性Ｔ細胞反応の高い数値はＩＦＮγ産生と関連することを示している。免疫調節剤イミキモドによる治療の成功又は失敗における、かかるＨＰＶ１６特異的タイプ１Ｔ細胞反応の役割を調査するために、本発明者らは、悪性度の高いＨＰＶ１６＋ＶＩＮ患者のグループにおける免疫反応を研究した。ＰＢＭＣを、治療開始前（Ｔ＝０）、治療中（Ｔ＝８）、及び治療終了時（Ｔ＝１６）に単離し、液体窒素中に保存した。ＨＰＶ１６ペプチドＥ２、Ｅ６及びＥ７に対するＨＰＶ特異的Ｔ細胞反応性は、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより分析された。この方法は、凍った物質（文献３２及び３３参照）に対する抗原特異的タイプ１Ｔ細胞反応性の分析のための感度の高い方法である。かかる患者のうち３人が、本発明者らの研究に参加する前の年にイミキモドにより治療を受けていた（表２参照、＃２１、２４及び２７）。かかる１７人中１５人が、ＨＰＶ１６陽性であった。既存のＩＦＮγ関連Ｔ細胞反応（Ｔ＝０）が、１５人中８人の患者においてＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより検出された。１５人中５人の患者において、Ｅ２に対するＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞反応性が検出され、１５人中４人の患者においてＥ６に対する反応が示された（表２参照）。ＨＰＶ１６Ｅ７に対する既存のＴ細胞反応は、いずれの患者においても示されなかった。２例においては、Ｔ＝０のサンプルは利用できず、Ｔ＝８のＰＢＭＣにおける反応が示されている（表２参照、＃１及び２２）。
【００４２】
数人の患者については、一又は複数の追跡検査サンプルが利用できなかったにもかかわらず（＃５、１３、２７、２８）、ＨＰＶ特異的Ｔ細胞の数に対するイミキモドの直接的な影響が検出できなかったことは明らかであった。いずれの患者にも、イミキモドによる治療に対するＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の明確な増加は検出されなかった（図２ａｂ参照）。数例において患者は、本研究以前に既にイミキモドの治療中であったが、今回の反復（repeated）治療においても、ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞の増加がもたらされることはなかった（表２参照、＃２１及び２４）。また、ＨＰＶ１６ＶＬＰ特異的ＩｇＧ及びＩｇＡの反応は、患者がイミキモドにより治療されたときでも過度に変化があるものではなかった（図３参照）。
【００４３】
治療を受けた女性１７人中１３人（７６％）が、彼女らの病変のサイズの７６〜１００％の減少を示す明白な臨床反応を示した（ＣＲ又はＰＲ１、表２及び図２ｃｄ参照）。３人の患者が外陰部疾患の罹患部位のサイズの減少を示さず、女性の１人は、治療による最低限の改善しか示さなかった。
【００４４】
重要なことに、ＨＰＶ１６＋患者（ｎ＝１５）のグループが、ＨＰＶ特異的Ｔｈ１免疫反応の有無で分割された場合、ＨＰＶ特異的免疫反応のある８人全員が、イミキモドの治療について完全な、又はほぼ完全な臨床反応（ＣＲ又はＰＲ１）を示した。反対に、ＨＰＶ特異的免疫反応が欠如した患者は、かかる臨床改善を示すことは少なかった（ｐ＝０．０３、両側フィッシャーの直接確率検定（2−sided Fischer’s exact test））。
【００４５】
総合すると、慢性ウイルス抗原への暴露は、ＶＩＮ３の患者のＨＰＶ１６早期抗原Ｅ２、Ｅ６又はＥ７に対するタイプ１ＣＤ４＋Ｔ細胞性免疫を誘導することができる。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴにより検出されるかかるＨＰＶ１６特異的Ｔｈ１細胞の存在は、ＶＩＮ病変のイミキモド誘導性退縮（regression）に不可欠ではないが、強い臨床反応の可能性を増加させる。Ｌ１特異的体液性反応性の存在は、イミキモド誘導性退縮とは関係がなかった。
【図面の簡単な説明】
【００４６】
【図１】ａ、悪性度の高いＨＰＶ１６関連ＶＩＮ２０人の患者から新鮮分離した末梢血単核球を、ＨＰＶ１６のＥ２、Ｅ６、及びＥ７に由来するペプチドプールの一式を用いて短期増殖アッセイにおいて測定した。反応は、８被検ウェル中６以上の増殖（ｃｐｍ）が、増殖の平均＋コントロール（培地のみ）ウェルの３×ＳＤを超え、かつコントロールウェル以上のすべての被検ウェルの平均刺激指数が３以上である場合に陽性であると判定される。  ｂ、ａにおいて示された陽性増殖反応の上清が、ＩＦＮγ、腫瘍壊死因子α、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０について、サイトメトリービーズアレイにより分析された。示された配置図は、６つの測定されたサイトカイニンについて用いられ、黒四角は、抗原特異的サイトカイン産生を表す。カットオフ値は、様々なサイトカインの検量線に基づいた（ＩＦＮγについては５０ｐｇ／ｍＬ、その他のサイトカインについては１０ｐｇ／ｍＬ）。抗原特異的サイトカイン産生は、カットオフレベル以上、かつ培地コントロール濃度の＞２×のサイトカイン濃度として定義された。
【図２ａｂ】ａ及びｂ、２人の代表的な悪性度の高いＶＩＮ患者（＃２左と＃１０右）におけるヒトパピローマウイルス１６特異的ＩＦＮγ産生Ｔ細胞反応。０週（イミキモドによる治療前）、８週間後（イミキモドによる治療中）、及び１６週間後（治療終了時）のＴ細胞反応を示す。クリームを含む５％イミキモドの局所適用は、ＨＰＶ１６特異的Ｔヘルパータイプ１反応は、増強された全身性ＨＰＶ１６特異的Ｔ細胞反応を示さない。Ｔ細胞反応の強さは、様々な時点で若干異なる。スポットの平均数と培地コントロールにより誘導されるＳＥの平均数、又は１００，０００ＰＢＭＣあたりのＥ２、Ｅ６及びＥ７プールに存在するペプチドが示されている。記憶応答混合液（Memory response mix）（ＭＲＭ）が、ポジティブコントロールとして用いられた。
【図２ｃｄ】ｃ及びｄ、既存のＨＰＶ１６特異的Ｔヘルパータイプ１反応のある患者の、イミキモド治療後の他覚的臨床反応を示す。典型例を示す。ｃ、イミキモドによる治療前の患者＃５の生検で証明されたＶＩＮ３病変。ｄ、治療１６週間後の患者＃５の外陰部の同じ部位。
【図３】イミキモドによる治療を受けている１７人のＶＩＮ３患者のＨＰＶ１６ＶＬＰのＩｇＧ及びＩｇＡの反応性。各患者の少なくとも２つの血清試料について検査した。０週（イミキモドによる治療前））、８週間後（イミキモドによる治療中）、及び１６週間後（治療終了時）の-血清学的応答を示す。ＯＤ値は、陽性反応の±ＳＤの中央値として表現される。ＯＤ値は、バックグラウンド反応値と健康な子供の血清の平均ＯＤ値を減じることにより計算された。
【００４７】
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【図１】
2008539228.tif 000002
【図２ａｂ】
2008539228.tif 000003
【図２ｃｄ】
2008539228.tif 000004
【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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