(57)【要約】  フェニル置換ナフト［１，２−ｇ］クリセン化合物（Ａ）に基づく新規化合物を記載する。該化合物は、３−フェニルクロマン（イソフラボノイド）環系（Ｂ）の二量体化によって取得される。さらに、該新規二量体化合物の合成方法、同化合物を含有する組成物および、治療物質としての、該二量体の使用を記載する。2008537545.tif 000038【選択図】  なし
2008537545.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
場合により置換されている、一般式（Ｉ）：
【化１】
2008537545.tif 000034
［式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｈ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、ＣＯ２Ｒ１２、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、シアノまたはハロであり、
Ｒ９は、アルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキルまたはアルキルアリールであり、
Ｒ１０は、独立して、水素、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ１１は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキルまたはアミノ酸であり、
Ｒ１２は、水素、アルキル、ハロアルキル、アリールまたはアリールアルキルであり、ならびに
Ｘは、Ｏ、ＮＲ１２またはＳであり、好ましくはＯである］
で表される化合物、または薬学的に許容し得るその塩。
【請求項２】
一般式（Ｉａ）：
【化２】
2008537545.tif 000035
［式中
Ｒ１は、水素またはＣ１〜６−アルキルであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、Ｃ１〜６−アルキル、アリール、アリール−Ｃ１〜６−アルキルまたはハロであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、Ｃ１〜６−アルキル、アリール、アリール−Ｃ１〜６−アルキルまたはハロであり、
Ｒ９は、Ｃ１〜６−アルキル、フルオロ−Ｃ１〜６−アルキルまたはアリール−Ｃ１〜６−アルキルであり、ならびに
Ｒ１０は、独立して、Ｃ１〜６−アルキルである］
で表される請求項１に記載の化合物、または薬学的に許容し得るその塩。
【請求項３】
一般式（Ｉｂ）：
【化３】
2008537545.tif 000036
［式中
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニルまたはベンジルであり、
Ｒ４およびＲ７は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９またはＯＳｉ（Ｒ１０）３であり、
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９またはＯＳｉ（Ｒ１０）３であり、
Ｒ９は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニルまたはベンジルであり、ならびに
Ｒ１０は、独立して、メチル、エチルまたはｔ−ブチルである］
で表される請求項１に記載の化合物、または薬学的に許容し得るその塩。
【請求項４】
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ８が、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９またはメチルであり、
Ｒ４およびＲ７が、独立して、ヒドロキシ、ＯＲ９またはＯＣ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ６が水素であり、
Ｒ８が、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９またはメチルであり、ならびに
Ｒ９が、メチルまたはベンジルである、
請求項３に記載の化合物、または薬学的に許容し得るその塩。
【請求項５】
Ｒ４がメトキシである、請求項４に記載の化合物。
【請求項６】
Ｒ３およびＲ４がメトキシである、請求項４に記載の化合物。
【請求項７】
Ｒ８がメチルである、請求項４に記載の化合物。
【請求項８】
以下：
４，９−ジヒドロキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（１）、
４，９−ジアセトキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（１−Ａｃ）、
４，９−ジヒドロキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（２）、
４，９−ジアセトキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（２−Ａｃ）、
４，９−ジヒドロキシ−１４−メトキシ−１２ａ−（４’−メトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（３）、
４，９−ジアセトキシ−１４−メトキシ−１２ａ−（４’−メトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（３−Ａｃ）、
４，９−ジヒドロキシ−１４−メトキシ−１２ａ−（４’−メトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（４）、
４，９−ジアセトキシ−１４−メトキシ−１２ａ−（４’−メトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（４−Ａｃ）、
４，９，１４−トリヒドロキシ−１２ａ−（４’−ヒドロキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（５）、
４，９，１４−トリアセトキシ−１２ａ−（４’−アセトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（５−Ａｃ）、
４，９−ジヒドロキシ−１５−メトキシ−１２ａ−（３’−メトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（６）、
４，９−ジアセトキシ−１５−メトキシ−１２ａ−（３’−メトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（６−Ａｃ）、
４，９，１５−トリヒドロキシ−１２ａ−（３’−ヒドロキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（７）、
４，９，１５−トリアセトキシ−１２ａ−（３’−アセトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（７−Ａｃ）、
から選択される請求項４に記載の化合物。
【請求項９】
請求項１に記載の式（Ｉ）で表される化合物の製造方法であって、場合により置換されている式（ＩＩ）：
【化４】
2008537545.tif 000037
［式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｈ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、ＣＯ２Ｒ１２、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、シアノまたはハロであり、
Ｒ９は、アルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキルまたはアルキルアリールであり、
Ｒ１０は、独立して、水素、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ１１は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキルまたはアミノ酸であり、
Ｒ１２は、水素、アルキル、ハロアルキル、アリールまたはアリールアルキルであり、
Ｒ１３は、水素、Ｒ９、Ｃ（Ｏ）Ｒ９、Ｓｉ（Ｒ１０）３、アルキルスルホニルまたはベンゼンスルホニルであり、ならびに
Ｘは、Ｏ、ＮＲ１２またはＳであり、好ましくはＯである］
で表される化合物、または薬学的に許容し得るその塩を、カップリング剤と反応させる段階を含む前記方法。
【請求項１０】
疾患の治療、予防または改善方法であって、治療有効量の１種以上の式（Ｉ）の化合物を被験者に投与する段階を含む前記方法。
【請求項１１】
疾患または障害が、癌、望ましくない増殖または細胞成長の上方調節、炎症または炎症性障害、自己免疫性障害、心血管障害、およびエストロゲン受容体活性化と関連する障害から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
治療が、炎症と関連する痛みの治療である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
炎症性障害が、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、遠位大腸炎またはクローン病である、請求項１１または請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
炎症性障害の治療が、心血管副作用を有さず、ならびに／あるいは腸保護性である、請求項１１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
治療が心保護性である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
癌が、白血病、神経膠腫、黒色腫および前立腺癌、卵巣癌、乳癌、結腸直腸癌、肺癌および膵癌から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
炎症と関連する痛みを含む炎症を治療するための薬物を製造するための、トロンボキサンシンターゼインヒビターの使用。
【請求項１８】
治療が心保護性および／または腸保護性である、請求項１７に記載の使用。
【請求項１９】
疾患を治療するための薬物の製造における、１種以上の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項２０】
抗炎症剤、心血管作動薬、化学療法剤、化学増感剤または放射線増感剤としての、１種以上の式（Ｉ）の化合物の使用。
【請求項２１】
１種以上の式（Ｉ）の化合物を含む、疾患を治療、予防または改善するための薬剤。
【請求項２２】
１種以上の式（Ｉ）の化合物を１種以上の医薬用担体および／または賦形剤とともに含む医薬組成物。
【請求項２３】
１種以上の式（Ｉ）の化合物を含有する飲料または食品。
【請求項２４】
癌細胞または腫瘍を式（Ｉ）のイソフラボノイド二量体と接触させることによる、化学療法剤に対する該癌細胞または腫瘍の感受性を増加または回復させる方法。
【請求項２５】
化学療法剤が成長受容体インヒビターまたは死受容体刺激剤である、請求項１５に記載の方法。
【請求項２６】
非腫瘍細胞または細胞集団を式（Ｉ）のイソフラボノイド二量体と接触させることによる、非腫瘍細胞を化学療法または放射線療法から保護する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、ナフト［１，２−ｇ］クリセン骨格を有する新規二量体化合物に関する。該化合物は、３−フェニルクロマン（イソフラボノイド）環系の二量体化に基づく。本発明は、さらに、二量体イソフラボノイド化合物の合成、該化合物を含有する組成物、および治療物質としてのその使用に関する。特に、本発明の二量体化合物は、一連の重要なヒト疾患、例えば癌、炎症性障害、自己免疫性障害、心血管障害、およびエストロゲン受容体活性化と関連する障害の治療および予防において有用である。
【背景技術】
【０００２】
天然に存在する植物イソフラボンは、ヒト細胞に対して広範囲の基礎的な生物学的効果を有することが知られている。その効果には、抗酸化および多種多様な酵素およびシグナル伝達機構の上方調節および下方調節が含まれる。ヒト癌細胞の有糸分裂停止および細胞障害性、毛細血管透過性の増加、細胞接着の増加、血管弛緩薬に対する血管平滑筋細胞の応答の増加、およびエストロゲン受容体の作動性（agonism）は、天然に存在するイソフラボノイドの生物学的効果に対する動物細胞の応答のほんの数例である。一般的な天然に存在するイソフラボンには、ダイゼイン、ゲニステイン、ホルモノネチン、ビオチャニンＡ、グリシテイン、クメストロール、ダイジン、グリシチンおよびゲニスチンがある。
【０００３】
最近、二量体型イソフラボノイドの生物学的特性に興味が示されている。ゲニステインベースの二量体が、前立腺肥大の治療に有用な５−アルファ−レダクターゼインヒビターであることが報告されている（特許文献１）。一形態では、該二量体は、以下のような、ゲニステインのペンデントフェニル基の３’位と第二のゲニステイン分子のベンゾピラン環の６位のＣ−Ｃ単結合による連結から得られる。
【化１】
2008537545.tif 000003
【０００４】
これらの二量体化合物は、概して、それらの結合位置にしたがって、ビス−（３’→６）−イソフラボンと称することができる。記載されている他の化合物は、同一の一般的環構造のゲニステインおよび／またはダイゼインベースの二量体に基づく。
【０００５】
別の二量体は、以下に記載の２イソフラボン分子間のリンカーを有すること以外はビス−（２→２）−イソフラボン構造に基づく。しかし、それに対して生物学的活性または治療上の利益は割り当てられていない（非特許文献１）。
【化２】
2008537545.tif 000004
【０００６】
最近、別のクラスの二量体イソフラボノイド化合物が両エストロゲン受容体に関する強い結合親和性を示し、ゆえに顕著な生理学的活性を示すことが発見された（特許文献２）。第一の二量体化合物は、以下に記載の、デヒドロエクオールに基づくビス−（４→６）−イソフラボノイド化合物であった。
【化３】
2008537545.tif 000005
【０００７】
すべてのこれらの先行技術の二量体イソフラボノイド化合物は、炭素−炭素の単結合、またはリンカーもしくは架橋分子による２イソフラボノイド環構造の連結によって構築される。
【特許文献１】特開平９−６７３６２号公報
【特許文献２】国際公開０２／０７０５０２号パンフレット
【非特許文献１】Al-Maharik NI, Kaltia SAA, Mutikainen I and Wahala K, Synthesis of C-C-Bridged Bis-Isoflavones, J. Org. Chem., 2000, 65, 2305
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
イソフラボンおよびその誘導体に関するかなりの研究および蓄積された知識にもかかわらず、全範囲の治療上有用なイソフラボノイド化合物およびそれらの活性は未だ実現されていない。さらに、種々の疾患および障害の治療、予防（prophylaxis）、改善、それに対する防御および／または予防（prevention）のための、新規の、改良型または少なくとも代替の活性物質に関する継続的な必要性が存在する。
【０００９】
したがって、動物、特にヒトの健康および福祉にとって重要な生理学的特性を示す新規生成化合物、およびこれらの特性を疾患の治療、改善および予防に利用する新規方法を見出すことに関する要求が存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
驚くべきことに、本発明者らは、初めて、２個の炭素−炭素単結合によって連結されたイソフラボノイド化合物に基づく新規クラスの二量体分子を合成した。その骨格は、以下の一般構造Ａに記載の、２個の３−フェニルクロマン環系のビス（４→４）および（２’→３）連結から生じるナフト［１，２−ｇ］クリセン構造に基づく。破線は、対応する単量体の二量体化時に形成される２個のＣ−Ｃ結合を表す。
【化４】
2008537545.tif 000006
【００１１】
２，１１−ジオキソ−１２ａ−フェニル−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（構造Ａ’）に関して上掲の番号付け方式は、一貫性を保つために本明細書全体を通して使用する。
【００１２】
本発明の二量体分子は、生理学的に活性な物質としてのそれらの潜在的使用の見込みおよび、特に、エストロゲン受容体に関する結合親和性を示すそれらの能力を示す。さらにセルラインでの研究では、化学療法剤としての本発明の二量体イソフラボノイド化合物の顕著かつ予測できない有用性が強調された。該化合物は、さらに、化学増感剤、放射線増感剤、抗炎症剤として、および心血管適用、例えば血管拡張における使用に達する。
【００１３】
ゆえに、本発明の第１の態様では、一般式（Ｉ）：
【化５】
2008537545.tif 000007
【００１４】
［式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｈ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、ＣＯ２Ｒ１２、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、シアノまたはハロであり、
Ｒ９は、アルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキルまたはアルキルアリールであり、
Ｒ１０は、独立して、水素、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ１１は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキルまたはアミノ酸であり、
Ｒ１２は、水素、アルキル、ハロアルキル、アリールまたはアリールアルキルであり、ならびに
Ｘは、Ｏ、ＮＲ１２またはＳであり、好ましくはＯである］
の化合物（該化合物は、場合により置換されているか、あるいは薬学的に許容し得るその塩であってよい）を提供する。
【００１５】
本発明の第２の態様では、式（Ｉ）の化合物の製造方法であって、式（ＩＩ）：
【化６】
2008537545.tif 000008
【００１６】
［式中
Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ４、Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｈ、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、Ｃ（Ｏ）Ｒ１１、ＣＯ２Ｒ１２、アルキル、ハロアルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、チオール、アルキルチオ、アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ニトロ、シアノまたはハロであり、
Ｒ９は、アルキル、ハロアルキル、アリール、アリールアルキルまたはアルキルアリールであり、
Ｒ１０は、独立して、水素、アルキルまたはアリールであり、
Ｒ１１は、水素、アルキル、アリール、アリールアルキルまたはアミノ酸であり、
Ｒ１２は、水素、アルキル、ハロアルキル、アリールまたはアリールアルキルであり、
Ｒ１３は、水素、Ｒ９、Ｃ（Ｏ）Ｒ９、Ｓｉ（Ｒ１０）３、アルキルスルホニルまたはベンゼンスルホニルであり、ならびに
Ｘは、Ｏ、ＮＲ１２またはＳであり、好ましくはＯである］
の化合物（該化合物は、場合により置換されているか、あるいは薬学的に許容し得るその塩であってよい）をカップリング剤と反応させる段階を含む方法を提供する。
【００１７】
好ましい実施形態では、３−フェニルクロマン構造のペンデントフェニル環は電子供与性であり、少なくとも１個のオルト水素原子が存在し、二量体化時の（２’→３）結合の形成を促進する。
【００１８】
ＯＲ１３基は、好ましくは、ハロゲン、例えばＣｌ、ＢｒまたはＩ、ヒドロキシ、アルキルスルホニルオキシ基、例えばメシラートおよびトリフルオロメタンスルホニルオキシ、アリールスルホニルオキシ基、例えばトシラート、メシチレンスルホニルオキシ、ベンゼンスルホニルオキシおよびニトロ置換ベンゼンスルホニルオキシ、アシルオキシ基、例えばアセトキシまたはベンゾイルオキシおよびアリールオキシ基、例えばベンジルオキシから選択される脱離基である。
【００１９】
本発明の第３の態様では、疾患の治療、予防または改善方法であって、治療有効量の１種以上の式（Ｉ）の化合物を被験者に投与する段階を含む方法を提供する。
【００２０】
本発明の第４の態様では、疾患治療用の薬物の製造における、１種以上の式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。
【００２１】
本発明の第５の態様では、抗炎症剤、心血管作動薬、化学療法剤、化学増感剤または放射線増感剤としての、１種以上の式（Ｉ）の化合物の使用を提供する。
【００２２】
炎症性障害には、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、潰瘍性直腸炎、遠位大腸炎およびクローン病が含まれる。該化合物は、さらに、炎症と関連する痛みの治療に有用である。好ましい実施形態では、炎症性障害の治療は心血管副作用を有さず、心保護性であり、ならびに／あるいは腸保護性である。
【００２３】
本発明の第６の態様では、炎症と関連する痛みを含めた炎症の治療用の薬物を製造するための、トロンボキサンシンターゼインヒビターの使用を提供する。好ましくは、該治療は心保護性および／または腸保護性である。
【００２４】
本発明の第７の態様では、疾患を治療、予防または改善するための薬剤であって、１種以上の式（Ｉ）の化合物を含む薬剤を提供する。
【００２５】
好ましい実施形態では、該疾患は、癌、腫瘍または、細胞成長の望ましくない増殖または上方調節である。
【００２６】
本発明の第８の態様では、１種以上の式（Ｉ）の化合物を１種以上の医薬用担体および／または賦形剤とともに含む医薬組成物を提供する。
【００２７】
本発明の第９の態様では、１種以上の式（Ｉ）の化合物を含有する飲料または食料品を提供する。
【００２８】
本発明の第１０の態様では、化学療法に対する癌細胞または腫瘍の感受性を増加または回復させる方法であって、該細胞または腫瘍を式（Ｉ）のイソフラボノイド二量体と接触させることに基づく方法を提供する。一実施形態では、該化学療法剤は、成長受容体インヒビターまたは死受容体刺激剤である。
【００２９】
本発明の第１１の態様では、放射線療法に対する癌細胞または腫瘍の感受性を増加または回復させる方法であって、該細胞または腫瘍を以下に記載の式（Ｉ）のイソフラボノイド化合物と接触させることに基づく方法を提供する。別の実施形態では、該患者を、その治療計画において化学療法および放射線療法の両方に付する。
【００３０】
本発明の第１２の態様では、化学療法または放射線療法、好ましくは化学療法から非腫瘍細胞を保護する方法であって、非腫瘍細胞または腫瘤を式（Ｉ）のイソフラボノイド二量体と接触させることに基づく方法を提供する。
【００３１】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲の全体を通じて、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、単語「含む（comprise）」、およびバリエーション、例えば「comprises」または「comprising」は、記載される整数もしくは段階または整数群もしくは段階群の包含を意味するが、いかなる他の整数もしくは段階または整数群もしくは段階群の排除をも意味しないと理解される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３２】
本発明者らは、一般式（Ｉ）のイソフラボノイド二量体のクラスが驚くべきかつ予測できない生物学的および医薬的特性を示すことを発見した。
【００３３】
本発明の式（Ｉ）の化合物は、正常細胞に好都合な毒性プロファイルおよび良好なバイオアベイラビリティを有すると考えられる。驚くべきことに、本発明の化合物は、公知の癌治療より顕著に良好であるか、あるいは少なくともそれに匹敵する抗癌活性を示す。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物は、ヒトおよび動物起源の広い範囲の癌細胞に対して細胞増殖抑制性および細胞障害性である。癌細胞とは、悪性特性を示す細胞であって、通常、うまく治療されなければ最終的に生命を危うくする無制御の成長および挙動によって非癌細胞と区別される細胞を意味する。
【００３５】
式（Ｉ）の化合物に応答性であることが発見されている癌細胞は、上皮起源（例えば、前立腺、卵巣、（子宮）頸部、乳房、胆嚢、膵臓、結腸直腸、腎臓、および非小細胞肺癌細胞）、神経起源（例えば神経膠腫癌細胞）および間葉起源（例えば、黒色腫、中皮腫および肉腫癌細胞）の癌細胞である。非常に異例で驚くべきことに、癌細胞に対するそのような強力な細胞障害性を示すが、非癌細胞、例えばヒト包皮由来の線維芽細胞に対して低い毒性しか有さない関連群の化合物が見出される。そのような癌細胞選択性は、非常に異例で、かつ予測できないものである。
【００３６】
好都合なことに、式（Ｉ）の化合物は、標準的な抗癌剤に対する感受性が不十分であることが十分に認識されている癌細胞に対して細胞障害活性を示す。非常に異例で、かつ予測できないことに、白血病性の癌に対してそのような強力な活性が見出される。
【００３７】
本発明は、また、式（Ｉ）の化合物の使用であって、該化合物を単独で、ならびに／あるいは互いに組み合わせて、ならびに／あるいは他の抗癌剤と組み合わせて、ならびに／あるいは放射線療法と組み合わせて用いる治療によって、癌を有する患者を、そのような腫瘍の成長の速度を減少させるか、あるいはそのような腫瘍のサイズを減少させることによって治療するための使用を提供する。
【００３８】
本発明の化合物の使用は、単独で、あるいは上記の併用療法において、標準的な抗癌治療で治療される場合に患者が経験することが多い有害な副作用を減少させる可能性がある。本発明の化合物の使用とは、癌を有する個体に関して重要な進歩を示す前記治療において低い用量しか使用しなくてよいことを意味し得る。
【００３９】
本発明の二量体分子は、単量体イソフラボノイド化合物およびその誘導体に構造的に関連している。本明細書中で使用される用語「イソフラボン」または「イソフラボノイド」とは、ピラン環の３位由来のペンデントフェニル基を有する環融合クロマンまたはベンゾピラン分子を含むように広く解釈されるものとする。ゆえに、イソフラボン、イソフラベン、イソフラバン、イソフラバノン、イソフラバノール等と一般に称される化合物のクラスは、本明細書中では、イソフラボン、イソフラボン誘導体またはイソフラボノイドと総称的に称される。
【００４０】
本発明の二量体分子は、２個の単量体を連結する２個の炭素−炭素結合を含む。両イソフラボノイド単量体のピラン環上の４位は、炭素−炭素結合による直接結合によって連結されている。第二の結合は、一方の単量体のペンダント３−フェニル基上の２’位＃と第二のイソフラボノイド単量体のピラン環上の３位を連結している（＃ペンダントフェニル基の置換パターンに応じて、２’位は正確には６’位と称されることもある）。すなわち、本発明の方法は、上記の一般構造Ａの特有の１２ａ−フェニルナフト［１，２−ｇ］クリセン環系に対する単純かつ直接のアクセスを提供する。
【００４１】
本発明の好ましい二量体分子は、一般式（Ｉａ）：
【化７】
2008537545.tif 000009
【００４２】
［式中
Ｒ１は、水素またはＣ１〜６−アルキルであり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、Ｃ１〜６−アルキル、アリール、アリール−Ｃ１〜６−アルキルまたはハロであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、Ｃ１〜６−アルキル、アリール、アリール−Ｃ１〜６−アルキルまたはハロであり、
Ｒ９は、Ｃ１〜６−アルキル、フルオロ−Ｃ１〜６−アルキルまたはアリール−Ｃ１〜６−アルキルであり、ならびに
Ｒ１０は、独立して、Ｃ１〜６−アルキルである］
によって示される化合物または薬学的に許容し得るその塩であり；
より好ましくは、それらは以下の置換基を有し、その場合
Ｒ１は水素であり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、Ｃ１〜４−アルキルまたはハロであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、Ｃ１〜４−アルキルまたはハロであり、
Ｒ９は、Ｃ１〜４−アルキルまたはアリール−Ｃ１〜４−アルキルであり、ならびに
Ｒ１０は、独立して、メチル、エチルまたはｔ−ブチルであり、
さらにより好ましくは、それらは以下の置換基を有し、その場合
Ｒ１は水素であり、
Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、メチル、エチルまたはブロモであり、
Ｒ５、Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、メチル、エチルまたはブロモであり、ならびに
Ｒ９は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはベンジルであり、
または薬学的に許容し得るその塩である。
【００４３】
本発明の非常により好ましい二量体分子は、一般式（Ｉｂ）：
【化８】
2008537545.tif 000010
【００４４】
［式中
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９、ＯＳｉ（Ｒ１０）３、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニルまたはベンジルであり、
Ｒ４およびＲ７は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９またはＯＳｉ（Ｒ１０）３であり、
Ｒ６は、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９またはＯＳｉ（Ｒ１０）３であり、
Ｒ９は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｓｅｃ−ブチル、ｔ−ブチル、フェニルまたはベンジルであり、ならびに
Ｒ１０は、独立して、メチル、エチルまたはｔ−ブチルである］
によって示される化合物であり；
最も好ましくは、それらは以下の置換基を有し、その場合
Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、およびＲ８は、独立して、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９またはメチルであり、
Ｒ４およびＲ７は、独立して、ヒドロキシ、ＯＲ９またはＯＣ（Ｏ）Ｒ９であり、
Ｒ６は水素であり、
Ｒ８は、水素、ヒドロキシ、ＯＲ９、ＯＣ（Ｏ）Ｒ９またはメチルであり、ならびに
Ｒ９は、メチルまたはベンジルである。
【００４５】
さらにより好ましくは、Ｒ４はメトキシであり；Ｒ３およびＲ４はメトキシであり：ならびに／あるいはＲ８はメチルである。
【００４６】
最も好ましくは、式Ｉの新規な二量体化合物は：
４，９−ジヒドロキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（１）、
４，９−ジアセトキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（１−Ａｃ）、
４，９−ジヒドロキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（２）、
４，９−ジアセトキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（２−Ａｃ）、
である。
【００４７】
化合物１および２ならびにそのアセトキシ誘導体１−Ａｃおよび２−Ａｃは、以下の構造式によって示される。
【化９】
2008537545.tif 000011
【００４８】
同一の方法により、類似の出発材料を用いて、追加の好ましい化合物を製造した。データは得られた生成物と一致していた。該化合物は以下の通り命名される。
【００４９】
４，９−ジヒドロキシ−１４−メトキシ−１２ａ−（４’−メトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（３）、
４，９−ジアセトキシ−１４−メトキシ−１２ａ−（４’−メトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（３−Ａｃ）、
４，９−ジヒドロキシ−１４−メトキシ−１２ａ−（４’−メトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（４）、
４，９−ジアセトキシ−１４−メトキシ−１２ａ−（４’−メトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（４−Ａｃ）、
４，９，１４−トリヒドロキシ−１２ａ−（４’−ヒドロキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（５）、
４，９，１４−トリアセトキシ−１２ａ−（４’−アセトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（５−Ａｃ）、
４，９−ジヒドロキシ−１５−メトキシ−１２ａ−（３’−メトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（６）、
４，９−ジアセトキシ−１５−メトキシ−１２ａ−（３’−メトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（６−Ａｃ）、
４，９，１５−トリヒドロキシ−１２ａ−（３’−ヒドロキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（７）、
４，９，１５−トリアセトキシ−１２ａ−（３’−アセトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（７−Ａｃ）。
【００５０】
用語「アルキル」とは、直鎖および分岐鎖アルキル基の両者、例えばメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｓｅｃブチル、三級ブチル、等を意味すると解される。該アルキル基は、１〜１０炭素原子、好ましくは１〜６炭素原子、より好ましくは１〜４炭素原子を有し、さらにより好ましくはメチル、エチル、プロピル、イソプロピルまたはｔ−ブチルである。該アルキル基は、１個以上のフッ素、塩素、臭素、ヨウ素、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルアミノ−カルボニル、ジ−（Ｃ１〜Ｃ４−アルキル）−アミノ−カルボニル、ヒドロキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、ホルミルオキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキル−カルボニルオキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルチオ、Ｃ３〜Ｃ６−シクロアルキルまたはフェニルによって場合により置換されていてよい。
【００５１】
用語「アリール」とは、フェニルおよびナフチルを含むと解され、１個以上のＣ１〜Ｃ４−アルキル、ヒドロキシ、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシ、カルボキシル、Ｃ１〜Ｃ４−アルコキシカルボニル、Ｃ１〜Ｃ４−アルキルカルボニルオキシまたはハロによって場合により置換されていてよい。
【００５２】
用語「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを含むと解され、好ましくはフルオロ、クロロおよびブロモであり、より好ましくはフルオロである。例えば「ハロアルキル」への言及には、モノハロゲン化、ジハロゲン化および過ハロゲン化アルキル基までが含まれる。好ましいハロアルキル基は、トリフルオロメチルおよびペンタフルオロエチルである。
【００５３】
本発明の化合物には、すべての塩、例えば酸付加塩、アニオン性塩および両性イオン性塩が含まれ、特に、薬学的に許容し得る塩が含まれ、それは当業者に公知である。用語「薬学的に許容し得る塩」とは、電荷を保持し、かつ、医薬品とともに、例えば塩中のカウンターカチオンまたはカウンターアニオンとして投与できる有機または無機部分を表す。薬学的に許容し得るカチオンは当業者に公知であり、それには、非限定的に、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛および四級アミンが含まれる。薬学的に許容し得るアニオンは当業者に公知であり、それには、非限定的に、クロライド、アセタート、トシラート、シトラート、ビカルボナートおよびカルボナートが含まれる。
【００５４】
薬学的に許容し得る塩には、以下の酸から形成される塩が含まれる：酢酸、アスコルビン酸、アスパラギン酸、安息香酸、ベンゼンスルホン酸、クエン酸、桂皮酸、エタンスルホン酸、フマル酸、グルタミン酸、グルタル酸、グルコン酸、塩酸、臭化水素酸、乳酸、マレイン酸、リンゴ酸、メタンスルホン酸、ナフトエ酸、ヒドロキシナフトエ酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ナフタレンアクリル酸、オレイン酸、シュウ酸、オキサロ酢酸、リン酸、ピルビン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、酒石酸、トリフルオロ酢酸、トリフェニル酢酸、トリカルバリル酸、サリチル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸およびコハク酸。
【００５５】
用語「薬学的に許容し得る誘導体」または「プロドラッグ」とは、レシピエントへの投与時に、親化合物または代謝産物を直接または間接的に提供可能であるか、あるいはそれ自体が活性を示す活性化合物の誘導体を表し、それには、例えばリン酸誘導体およびスルホン酸誘導体が含まれる。ゆえに、誘導体には、溶媒和物、医薬活性エステル、プロドラッグ等が含まれる。これには、また、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されて本発明の化合物またはその活性部分を提供できる、生理的に切断可能な脱離基を有する誘導体が含まれる。該脱離基には、アシル、リン酸基、硫酸基、スルホン酸基が含まれてよく、好ましくはモノ−、ジ−および過−アシルのオキシ置換化合物であり、その場合、１個以上のペンダントヒドロキシ基はアシル基、好ましくはアセチル基によって保護されている。典型的に本発明のアシルオキシ置換化合物は、容易に切断されて、対応するヒドロキシ置換化合物になる。
【００５６】
本発明のイソフラボノイド二量体の合成は、好都合には、一般式（ＩＩ）の単量体イソフラバン−４−オールで開始される。
【化１０】
2008537545.tif 000012
【００５７】
これらの出発イソフラバン−４−オールまたはその誘導体は、当技術分野において公知の標準的手順によって容易に取得される。公開されている国際特許出願である国際公開第９８／０８５０３号パンフレット、国際公開第００／４９００９号パンフレットおよび国際公開０１／１７９８６号パンフレット（すべてＮｏｖｏｇｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｔｙ  Ｌｔｄに帰属）、ならびにその引用文献（該開示内容は参照により本明細書中に組み入れられる）は、また、出発単量体であるイソフラボン、イソフラバン−４−オールおよび関連イソフラボノイド化合物を製造するための有用な合成方法を提供している。代表的な一般的合成は以下のスキーム１に記載される。
【化１１】
2008537545.tif 000013
【００５８】
該イソフラバン−４−オールのベンゾピラン環およびペンダントフェニル環の両者の周囲の種々の置換パターンの利用は、相応に置換されたＲ５−Ｒ８−フェノールおよびＲ２−Ｒ４−フェニル酢酸出発材料を選択することによって可能になる。該環の環化反応は、好都合には、Ｒ１−置換メタンスルホニルクロライド反応物を用いて実施してよく、それは当業者に公知の通りである。該還元反応は、水素の存在下でアルコール性溶媒中でＰｄ−ＣまたはＰｄ−アルミナを用いて首尾良く実施される。当業者は、アルキル化、環化、水素化および／または還元の他の標準的方法を必要に応じて使用できることに気付く。
【００５９】
イソフラバン−４−オール単量体は、本発明の二量体分子の合成に好都合な出発材料である。ナフト［１，２−ｇ］クリセン誘導体を取得するための二量体化は、カップリング／脱水試薬の存在下で好都合に実施される。代表的な一般的合成は以下のスキーム２に記載される。
【化１２】
2008537545.tif 000014
【００６０】
理論に限定されることを望まないが、該反応は、第二の単量体上のクロマン環の４位でベンジル安定化カルボカチオンをクエンチする、電子が豊富なオレフィン（イソフラバ−３−エン）の形成を介して進行することが示唆される。再配置は、この第二のクロマン環の３位で第二のカルボカチオンを促進し、それは、次いで、電子が豊富なペンデントフェニル基の２’（または６’）位によってクエンチされると考えられる。そしてさらなる再配置の結果、本発明の二量体イソフラボノイド化合物が取得される。電子が豊富なフェニル基は、好ましくは、１個以上の電子供与基を有する、４−もしくは２−置換、２，４−もしくは３，４−二置換または２，３，４−もしくは３，４，５−三置換のフェニル基である。３，４−二置換の電子が豊富な化合物がより好ましい。
【００６１】
好ましい実施形態では、一般に好ましいカップリング剤は五酸化リンである。ただし、当業者は他の方法および試薬を必要に応じて使用してよいことを理解する。そのような他の好適な合成方法には、２個のイソフラボノイドのフリーデル−クラフツアルキル化カップリングが含まれる。典型的なフリーデル−クラフツ反応の条件は、塩化アルミニウム、三フッ化ホウ素または同様のルイス酸触媒等の試薬を用いて達成される。該カップリング反応はフリーデル−クラフツ型条件に限定されず、二級アルコールをホスフィン酸エステルまたは同様の容易な脱離基に変換する等の「カルボカチオン」分子種を生成できる他の反応条件を含んでよい。本発明の二量体分子の合成において、上記の過酸化水素、希過マンガン酸塩、五酸化リン等の酸化的カップリング反応条件または他の酸化的化合物を使用してもよい。
【００６２】
該二量体化反応は非常に低温〜室温で実行してよいが、低い反応温度ほど良好な収率かつ純粋な反応混合物が促進されることが一般に見出される。該反応はアセトン／ドライアイス浴を用いて−７８℃で好都合に実施される。
【００６３】
本発明の方法での使用に好適な溶媒は、好ましくは、非常に低温で液体であるべきであろう。それには、低級塩素化溶媒、ＴＨＦおよびアセトニトリルが含まれる。一般に好ましい溶媒はジクロロメタンである。高い基質対溶媒比が好ましく、好適な二分子脱水／環化反応に関して最適なＤＣＭ：基質比は約４：１であることが見出されている。
【００６４】
適切であれば、本発明の化合物、およびその出発材料の合成を支援するために、化学官能基の保護、脱保護、シントンおよび当業者に公知の他の技術を使用してよい。
【００６５】
本発明の化合物および誘導体上の官能基の保護は、例えばT. W. Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1981に記載のように、当技術分野において十分に確立されている方法によって実行することができる。
【００６６】
ヒドロキシル保護基には、非限定的に、カルボン酸エステル、例えば酢酸エステル、アリールエステル、例えばベンゾアート、アセタール／ケタール、例えばアセトニドおよびベンジリデン、エーテル、例えばｏ−ベンジルおよびｐ−メトキシベンジルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテルおよびシリルエーテル、例えばｔ−ブチルジメチルシリルエーテルが含まれる。
【００６７】
保護基は、例えば、酸または塩基によって触媒される加水分解または還元、例えば水素化によって除去することができる。シリルエーテルは、その切断にフッ化水素またはフッ化テトラブチルアンモニウムを必要とするかもしれない。メトキシ基の脱メチル化により、ヒドロキシ置換化合物が入手される。
【００６８】
好ましい出発イソフラバン−４−オール単量体は、本発明の２−炭素結合二量体の容易な形成のために、イソフラボノイド３−フェニル基上の電子が豊富な置換基を必要とすると考えられる。例えば、ヒドロキシ（場合により保護されている）およびアルコキシ多置換３−フェニル誘導体が特に好ましいことが見出されている。
【００６９】
本発明者らは、驚くべきことに、本発明の二量体分子が、一連の重要なヒト疾患、例えば癌、炎症性障害、自己免疫性障害、心血管障害およびエストロゲン受容体活性化と関連する障害の治療および予防において、実質的な医薬的有望性を示す新規化合物のファミリーを提供することを発見した。
【００７０】
特に、本発明の二量体化合物は、癌細胞の増殖を阻害して、かつアポトーシスを誘発するその強力な能力によって、癌の予防および治療における用途を示し、すべての当業者は、癌という用語が、上皮、間葉および神経タイプの全体にわたる身体中の良性および悪性の両性質の任意またはすべての組織についての異常な成長を包含することを理解する。これには、非限定的に、癌腫、腺癌、肉腫、芽細胞腫、腺腫、リンパ腫、白血病および神経膠腫が含まれる。
【００７１】
特に、本発明の二量体化合物は、ｈ−ＥＲβアゴニストとして作用するその強力な能力によって、特に閉経期前後および閉経期の年齢の女性にエストロゲン援助をもたらすことができ、ステロイド性エストロゲンの急性退薬に相当するものと一般に認識される問題、例えば血管運動症状（顔面紅潮および寝汗）および情動性症状（不安、うつ病、気分変動）、ステロイド性エストロゲンの亜急性退薬に相当するものと一般に認識される問題、例えば尿失禁および膀胱脱出、およびステロイド性エストロゲンの慢性退薬に相当すると一般に認識される問題、例えばオステオペニアおよび骨粗鬆症および認知機能障害を予防および治療することができる。
【００７２】
特に、本発明の二量体化合物は、ｈ−ＥＲα アンタゴニストとして作用するその強力な能力によって、ｈ−ＥＲα 受容体の過剰刺激と関連していて、周期性乳房痛、子宮内膜症、子宮内膜増殖症、子宮筋腫、多嚢胞性卵巣疾患および月経前症候群のような症状に至ると一般に見なされる閉経前の女性の症状を予防または治療することができる。
【００７３】
特に、本発明の二量体化合物は、血管拡張を誘発して、かつ血管攣縮を減少させるその強力な能力によって、原因的または間接的にバゾプレッシンと関連していて、非限定的に高血圧症および片頭痛を包含すると一般に認識される障害の治療および予防において用途を示す。
【００７４】
特に、本発明の二量体化合物は、炎症性過程を阻害して、かつ免疫学的過程を緩和するその強力な能力によって、過剰炎症または機能不全性免疫機能と関連していて、非限定的に消化管の炎症性症状、例えば炎症性腸疾患（例えば潰瘍性大腸炎およびクローン病）、硬化性胆管炎、滑膜の炎症性障害、例えば関節リウマチ、呼吸器系の炎症性症状、例えば喘息ならびに自己免疫疾患、例えば糸球体腎炎を包含すると一般に認識される障害の予防および治療において用途を示す。本発明の化合物は、さらに、炎症と関連する痛みの治療に有用である。重要なことに、該化合物は心保護性および／または腸保護性であり、それは、選択的トロンボキサン合成インヒビターとしてのその作用に起因すると考えられる。
【００７５】
特に、本発明の二量体化合物は、雄核発生を阻害するその強力な能力によって、アンドロゲンの異常な機能と（原因的または間接的に）関連していて、非限定的に男性型脱毛症（遺伝性脱毛症）および前立腺腺腫を含むと一般に認識される症状の予防および治療において用途を示す。
【００７６】
本発明のイソフラバノイド二量体化合物は、また、驚くべきことに、大きく異なる作用様式を有する広範囲の抗癌治療（例えば化学療法剤および放射線療法）に対する癌細胞の感受性を向上させるのに活性である。本発明の化合物は、また、それらの物質および治療方法に対する耐性を獲得した細胞において同物質に対する感受性を回復させることが見出されている。
【００７７】
好ましい実施形態では、放射線療法または第二の化学療法剤での治療の前に、該癌患者を式（Ｉ）の化合物で前治療する。しかし、式（Ｉ）の化合物の投与および放射線療法もしくは第二の化学療法剤の投与またはその両者に関して、任意の順序を使用してよいことが意図される。
【００７８】
別の実施形態では、癌を有する患者において放射線療法に対する、先天的または後天的な耐性が観察された後に式（Ｉ）の化合物を投与する。
【００７９】
別の実施形態では、癌を有する患者において化学療法剤に対する、先天的または後天的な耐性が観察された後に式（Ｉ）の化合物を投与する。
【００８０】
別の態様では、放射線療法を受けているか、あるいは放射線療法を受けようとしている被験者に、治療有効量の式（Ｉ）の化合物を投与する段階を含む併用療法を提供する。該投与は、逐次または同時であってよく、あるいは被験者において放射線耐性が発生した後であってよい。
【００８１】
別の態様では、治療有効量の式（Ｉ）の化合物および化学療法剤を被験者に投与する段階を含む併用療法を提供する。該投与は、逐次または同時であってよく、あるいは被験者において化学療法剤耐性が発生した後であってよい。
【００８２】
好ましい実施形態では、治療対象の症状は、好ましくは、悪性の特性を示している癌であるが、早期の癌、例えば前癌病変（例えば非定型性、異形成、上皮内異常増殖）および良性癌を組み入れてよい。
【００８３】
用語「放射線療法（”radiotherapy”もしくは”radiation therapy”）」には、癌性細胞、腫瘍または関連機構および生物学的過程に影響する粒子および／またはエネルギー波を用いる処置または治療方法が含まれると広く解される。特に、放射線は、高エネルギー波または粒子、例えばＸ線、電子、ガンマ線または放射線療法で使用されるプロトンである。最も好ましくは、該波または粒子はＸ線である。
【００８４】
用語「化学療法剤」には、癌性細胞、腫瘍または関連機構および生物学的過程に影響するすべての薬物、化学物質、化合物、組成物、物質、薬物、ポリマー、ペプチド、タンパク質等が含まれると広く解される。
【００８５】
本発明の二量体イソフラボノイドは、癌の予防および治療において有望な新規クラスの化学療法剤である。これらの化合物の薬理学的作用についての正確な基礎は完全には理解されていないが、その成果は細胞分裂停止および細胞障害性の作用である。このファミリーの化合物に伴う考慮すべき関心は、それらがヒトおよび動物の癌に対して広い活性を示し、また、それらが癌細胞に非常に選択的であることである。
【００８６】
該二量体イソフラボノイドは強力な抗癌剤であり、驚くべきことに化学療法剤、例えばシスプラチンおよびゲムシタビンと相乗的に作用し、該相乗作用は、これらの２種の標準的な化学毒性薬が細胞内でかなり異なる抗癌性効果を有するにもかかわらないことが示されている。
【００８７】
さらに驚くべきことに、本発明者らは、該イソフラボンまたは誘導体が放射線療法の効果に対する癌細胞および腫瘍の感受性を増加または回復させることを発見した。
【００８８】
治療方式は、単一の治療または数週間にわたる一連の治療（分割と称される）を含んでよい。該分割治療は、典型的に、例えば月曜日〜金曜日まで１日１回施され、例えば週末には正常細胞の回復を支援するための間欠的休止を伴う。実際の治療方式は、治療対象の癌のタイプおよび使用される放射線療法のタイプに大きく依存する。当業者は、患者の健康、疾患の進行および癌のタイプを含めた様々な要因を考慮して、各個体に関して最も好適な方式を最良に決定することができる。
【００８９】
好ましい実施形態では、該イソフラボンまたはその誘導体を放射線療法の前に投与する。該前治療の効果は、照射の効果に対して癌性細胞または腫瘍を感受性にすることである。イソフラボノイドでの前治療は、標的細胞が再び照射を受ける能力に影響を与えるために、放射線療法の前および／または放射線療法の期間中に良好に開始されるべきであろう。最も広い好ましい実施形態では、該前治療は、投与されたイソフラボノイドと癌性細胞または腫瘍を接触させるのに十分な時間および持続期間である。この時間は、典型的には７日間、または１４日間または３０日間までであってよい。別の好ましい実施形態では、該イソフラボノイド治療は放射線療法前の６日間であるか、あるいは放射線療法前の５日間、または３日間または２日間または１日である。
【００９０】
他の状況では、放射線療法当日に該イソフラボノイドを投与することが有益であり得る。それは、アポトーシスのブロッカーを除去することによって細胞死に寄与するか、あるいは壊変の割合を増加させる効果を依然として有し得る。
【００９１】
該治療が分割治療を含む場合、該イソフラボノイドの投与は、照射の最初の治療または数回のみの治療または各治療の前に定期的に行ってよい。
【００９２】
別の好ましい実施形態では、該イソフラボノイドの投与により、照射治療後に生じ得る感受性の問題を回復させるか、あるいは少なくともそれに対処することができることが見出されている。この点において、別の好ましい実施形態では、照射治療後に該イソフラボノイドの投与が行われる。
【００９３】
化学療法剤は、概して、ＤＮＡ相互作用物質、代謝拮抗剤、チューブリン相互作用物質、ホルモン性物質、他の物質、例えばアスパラギナーゼまたはヒドロキシ尿素として分類される。各グループの化学療法剤は、活性または化合物のタイプによってさらに分類することができる。本発明の式（Ｉ）のイソフラボノイド化合物、または本発明のその塩と組み合わせて使用される化学療法剤は、これらのグループのいずれかから選択してよいが、それらに限定されない。化学療法剤およびその投与方法についての詳細な考察に関しては、Dorr, et al, Cancer Chemotherapy Handbook, 2d edition, pages 15-34, Appleton and Lang (Connecticut, 1994)（参照により本明細書中に組み入れられる）を参照のこと。
【００９４】
ＤＮＡ相互作用物質には、アルキル化剤、例えばシスプラチン、シクロホスファミド、アルトレタミン；ＤＮＡ鎖切断剤、例えばブレオマイシン；インターカレート性トポイソメラーゼＩＩインヒビター、例えばダクチノマイシンおよびドキソルビシン）；非インターカレート性トポイソメラーゼＩＩインヒビター、例えばエトポシドおよびテニポシド；およびＤＮＡマイナーグルーブ結合剤プリカマイシン（plicamydin）が例えば含まれる。
【００９５】
該アルキル化剤は、細胞ＤＮＡ、ＲＮＡ、もしくはタンパク質分子、または小さいアミノ酸、グルタチオン、もしくは同様の化学物質と共有結合性化学付加物を形成する。一般に、アルキル化剤は、細胞成分中の求核性原子、例えば核酸、タンパク質、アミノ酸、またはグルタチオン中のアミノ、カルボキシル、リン酸基、またはスルフヒドリル基と反応する。癌治療におけるこれらのアルキル化剤のメカニズムおよび役割は十分には理解されていない。
【００９６】
典型的なアルキル化剤には、非限定的に、ナイトロジェンマスタード、例えばクロランブシル、シクロホスファミド、イソファミド（isofamide）、メクロレタミン、メルファラン、ウラシルマスタード；アジリジン、例えばチオテパ；メタンスルホナートエステル、例えばブスルファン；ニトロソ尿素、例えばカルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン；白金錯体、例えばシスプラチン、カルボプラチン；生体還元性アルキル化剤、例えばマイトマイシン、およびプロカルバジン、ダカルバジンおよびアルトレタミンが含まれる。
【００９７】
ＤＮＡ鎖切断剤には、例えばブレオマイシンが含まれる。
【００９８】
ＤＮＡトポイソメラーゼＩＩインヒビターには、以下のインターカレーター、例えばアムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、イダルビシン、およびミトキサントロン；非インターカレーター、例えばエトポシドおよびテニポシドが例えば含まれる。
【００９９】
ＤＮＡマイナーグルーブ結合剤は、例えばプリカマイシンである。
【０１００】
代謝拮抗剤は、２種の主要メカニズムのうちの一方によって核酸の生産を妨害する。特定の薬物は、ＤＮＡ合成の直接の前駆体であるデオキシリボヌクレオシド三リン酸の生産を阻害し、ゆえにＤＮＡ複製を阻害する。特定の化合物は、プリンまたはピリミジンのアナログであり、ヌクレオチド同化経路に組み入れられる。そして、これらのアナログはそれらの正常な対応物の代わりにＤＮＡまたはＲＮＡ中で代用される。
【０１０１】
本発明において有用な代謝拮抗剤には、非限定的に、葉酸アンタゴニスト、例えばメトトレキセートおよびトリメトレキセート；ピリミジンアンタゴニスト、例えばフルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、ＣＢ３７１７、アザシチジン、シタラビン、およびフロクスウリジンが含まれ；プリンアンタゴニストには、メルカプトプリン、６−チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチンが含まれ；およびリボヌクレオチドレダクターゼインヒビターにはヒドロキシ尿素が含まれる。
【０１０２】
チューブリン相互作用物質は、重合して細胞の微小管を形成するタンパク質であるチューブリン上の特定部位に結合することによって作用する。微小管は重要な細胞構造単位である。該相互作用物質が該タンパク質に結合すると、細胞は微小管を形成できない。チューブリン相互作用物質には、ビンクリスチンおよびビンブラスチン、両アルカロイドおよびパクリタキセル（タキソール）が例えば含まれる。
【０１０３】
ホルモン性物質もまた、癌および腫瘍の治療において有用である。それらはホルモン感受性腫瘍において使用され、通常、天然供給源から取得される。ホルモン性物質には、非限定的に、エストロゲン、コンジュゲートエストロゲンおよびエチニルエストラジオールおよびジエチルスチルベステロール、クロロトリアニセンおよびイデネストロール（idenestrol）；プロゲスチン、例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、およびメゲストロール；およびアンドロゲン、例えばテストステロン、プロピオン酸テストステロン；フルオキシメステロン、およびメチルテストステロンが含まれる。
【０１０４】
副腎皮質ホルモン剤は、天然副腎コルチゾールまたはヒドロコルチゾンに由来する。それらは、その抗炎症性の利点ならびに、有糸分裂を阻害して、ＤＮＡ合成を停止させる何らかの能力のために使用される。これらの化合物には、非限定的に、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロンが含まれる。
【０１０５】
ロイチナイジングホルモン放出ホルモン剤または性腺刺激ホルモン放出ホルモンアンタゴニストは、主に前立腺癌の治療に使用される。これらには、酢酸ロイプロリドおよび酢酸ゴセレリンが含まれる。それらは精巣におけるステロイドの生合成を妨げる。
【０１０６】
抗ホルモン性抗原には、例えば、抗エストロゲン性物質、例えばタモキシフェン、抗アンドロゲン物質、例えばフルタミド；および抗副腎物質、例えばミトタンおよびアミノグルテチミドが含まれる。
【０１０７】
さらなる薬剤には、以下の物質が含まれる：ヒドロキシ尿素は、主に酵素リボヌクレオチドレダクターゼの阻害によって作用すると思われ、アスパラギナーゼは、アスパラギンを非機能性アスパラギン酸に変換する酵素であり、ゆえに腫瘍におけるタンパク質合成をブロックする。
【０１０８】
好ましい化学療法剤は、シスプラチン、カルボプラチン、タキソール（パクリタキセル）、フルオロウラシル、フロクスウリジン（fluxuridine）、シクロホスファミド、イホスファミド、ヘキサメチルメラミン、エストラムスチン、マイトマイシン、およびドセタキセルである。
【０１０９】
本発明の治療処置に必要とされる１種以上の式Ｉの化合物の量はいくつかの要因に依存し、その要因には、具体的な適用、使用される具体的な化合物の性質、治療対象の症状、投与様式および患者の症状が含まれる。式Ｉの化合物は、慣習的に実施される様式および量で投与してよい。例えばGoodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1299 (7th Edition, 1985)を参照のこと。利用される具体的な用量は、治療対象の症状、被験者の状態、投与経路および上記の他の周知の要因に依存する。一般に、患者あたりの一日量は、０．１ｍｇ〜２ｇ；典型的には０．５ｍｇ〜１ｇ；好ましくは２０ｍｇ〜２００ｍｇの範囲であってよい。
【０１１０】
本明細書中に記載の治療上の症状を治療するための医薬組成物の製造は、典型的に、本発明の化合物（便宜のため、以後「活性化合物」と称する）を、当技術分野において周知の１種以上の薬学的または獣医学的に許容し得る担体および／または賦形剤と混合することによって調製される。
【０１１１】
該担体は、当然、該製剤中の任意の他の成分と適合性であるという意味で許容される必要があり、被験者に有害であってはならない。該担体または賦形剤は、固形物または液状物、または両者であってよく、好ましくは単位用量、例えば錠剤として、該化合物とともに製剤化される。それは、０．５重量％〜５９重量％の活性化合物、または１００重量％までの活性化合物を含有してよい。１種以上の活性化合物を本発明の製剤に組み入れてよく、それは、本質的に、場合により１種以上の副成分を含む該成分を混合することからなる周知の製薬技術のいずれかによって調製してよい。
【０１１２】
本発明の製剤には、経口、経直腸、眼、口腔（例えば舌下）、非経口（例えば、皮下、筋肉内、皮内、または静脈内）および経皮投与に適した製剤が含まれるが、任意の所定のケースで最も好適な経路は、治療対象の症状の性質および重症度ならびに使用される具体的な活性化合物の性質に依存する。
【０１１３】
経口投与に適した製剤は、個別の単位、例えばカプセル、サシェ、ロゼンジ、または錠剤として（各単位は、あらかじめ決定された量の活性化合物を含有している）；粉末または顆粒として；水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として；または水中油または油中水エマルジョンとして提供してよい。そのような製剤は、活性化合物および好適な担体（上記１種以上の副成分を含有してよい）を組み合わせる段階を含む任意の好適な製薬方法によって調製してよい。一般に、本発明の製剤は、活性化合物を、液状もしくは微粉化された固形担体、または両者と均一かつ密接に混合し、次いで、必要であれば、得られた混合物を成形して、例えば単位用量を形成させることによって調製される。例えば、錠剤は、活性化合物を、場合により１種以上の副成分とともに含有する粉末または顆粒を圧縮または成形することによって調製してよい。圧縮錠は、場合により結合剤、滑沢剤、不活性希釈剤および／または界面活性剤／分散剤（群）と混合されている流動性の化合物、例えば粉末または顆粒を好適な機械で圧縮することによって調製してよい。すりこみ錠は、不活性液状結合剤で湿らせた粉末化化合物を好適な機械で成形することによって作成してよい。
【０１１４】
口腔（舌下）投与に適した製剤には、風味付きの基剤、通常はショ糖およびアカシアまたはトラガカント中の活性化合物を含むロゼンジ剤；および不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはショ糖およびアカシア中の化合物を含むトローチ剤が含まれる。
【０１１５】
非経口投与に適した本発明の組成物は、好都合には、活性化合物の滅菌水性調製物を含み、該調製物は、好ましくは、目的のレシピエントの血液と等張性である。これらの調製物は、好ましくは、静脈内投与されるが、投与は、皮下、筋肉内、または皮内注射によって行ってもよい。そのような調製物は、好都合には、該化合物を水またはグリシンバッファーと混合し、得られた溶液を滅菌性かつ血液と等張性にすることによって調製してよい。本発明の注射用製剤は、概して、０．１％〜６０％ｗ／ｖの活性化合物を含有し、０．１ｍｌ／分／ｋｇの割合で投与される。
【０１１６】
経直腸投与に適した製剤は、好ましくは、単位用量坐剤として提供される。これらは、活性化合物を、１種以上の慣用の固形担体、例えばカカオバターと混合し、そして、得られた混合物を成形することによって調製してよい。
【０１１７】
皮膚への局所投与に適した製剤または組成物は、好ましくは、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、または油の剤形をとる。使用してよい担体には、ワセリン、ラノリン、ポリエチレングリコール、アルコール、およびその２種以上の組み合わせが含まれる。該活性化合物は、概して、０．１％〜０．５％ｗ／ｗ、例えば０．５％〜２％ｗ／ｗの濃度で存在する。そのような組成物の例には、化粧用皮膚クリームが含まれる。
【０１１８】
経皮投与に適した製剤は、レシピエントの表皮と、長期間、密接に接触したままであるように構成される個別のパッチとして提供してよい。そのようなパッチは、好適には、例えば該活性化合物に関して０．１Ｍ〜０．２Ｍの濃度の、場合により緩衝化されている水性溶液として活性化合物を含有する。
【０１１９】
経皮投与に適した製剤は、イオン泳動によって送達してもよく、典型的には、活性化合物の、場合により緩衝化されている水性溶液の剤形をとる。好適な製剤は、クエン酸バッファーまたはＢｉｓ／Ｔｒｉｓバッファー（ｐＨ６）またはエタノール／水を含み、０．１Ｍ〜０．２Ｍの活性成分を含有する。
【０１２０】
吸入に適した製剤は、溶液、懸濁液またはエマルジョンの剤形でスプレー組成物として送達してよい。該吸入スプレー組成物は、薬学的に許容し得る噴射剤、例えば二酸化炭素または亜酸化窒素をさらに含んでよい。
【０１２１】
本発明の組成物は、栄養補助食品形式でヒトに投与してもよい。活性物質を組み込んだ栄養補助食品は、食品の製造過程で該食品に該組成物を加えることによって、例えば該組成物を食材に加えるか、食材中に混合するか、食材にコーティングするか、食材と組み合わせるか、あるいは別の様式で食材に加えることによって調製することができる。任意の食物を使用してよく、それには、非限定的に、肉、例えば挽肉、乳化肉（emulsified meats）およびマリネ肉；飲料、例えば栄養飲料、スポーツ飲料、タンパク質補強飲料、ジュース、ミルク、代替乳、および減量飲料；チーズ、例えばハードチーズおよびソフトチーズ、クリームチーズ、およびカッテージチーズ；フローズンデザート、例えばアイスクリーム、アイスミルク、低脂肪フローズンデザート、および非酪農フローズンデザート；ヨーグルト；スープ；プディング；ベーカリー製品；サラダドレッシング；およびディップおよびスプレッド、例えばマヨネーズ、マーガリン、バター、バター代替物、および他の脂肪含有スプレッドが含まれる。該組成物は、所望の用量の組成物を食品の消費者に送達するために選択される量で該食品に加えられる。本発明の化合物を含有する食品製剤は、標準的慣習にしたがって容易に調製することができる。
【０１２２】
治療方法、使用および組成物は、ヒトまたは動物、例えばコンパニオンアニマルおよび家庭内動物（例えばイヌおよびネコ）、鳥類（例えばニワトリ、シチメンチョウ、アヒル）、家畜動物（例えばウシ、ヒツジ、ブタおよびヤギ）等に投与するためのものであってよい。
【０１２３】
本明細書中で使用される用語「治療」とは、その最も広い文脈において考慮されるものとする。該用語は、動物が完全に回復するまで治療されることを必ずしも意味しない。したがって、「治療」には、特定症状の徴候もしくは重症度の改善または特定症状が発症する危険性の予防もしくは別の様式での低減が含まれる。
【０１２４】
本明細書中で使用される「薬学的に許容し得る担体、賦形剤、補助物質および／または希釈剤」には、医薬組成物の調製に有用であるとみなされる任意の担体、賦形剤、補助物質または希釈剤が含まれると解されるべきであろう。そのような担体、賦形剤、補助物質または希釈剤は、概して、安全であり、無毒であり、かつ生物学的にも別の様式でも望ましくないものではない。該用語には、また、獣医学的使用ならびにヒト医薬的使用に関して許容し得る担体、賦形剤、補助物質または希釈剤が含まれる。本明細書中で使用される用語「薬学的に許容し得る担体、賦形剤、補助物質および／または希釈剤」には、１種、または２種以上、のそのような物質が含まれる。
【０１２５】
該活性化合物または薬学的に許容し得るその誘導体、プロドラッグまたは塩は、所望の作用を損なわない他の活性物質または所望の作用を補助する物質、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗炎症剤、または抗ウイルス性化合物と共同で投与することもできる。該活性物質は、２種以上のイソフラボンまたはその誘導体を、組み合わせて、あるいは相乗作用性混合物として含むことができる。該活性化合物は、脂質低下剤、例えばプロブコールおよびニコチン酸；血小板凝集インヒビター、例えばアスピリン；抗血栓剤、例えばクマディン；カルシウムチャネルブロッカー、例えばベラパミル、ジルチアゼム、およびニフェジピン；アンギオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）インヒビター、例えばカプトプリルおよびエナラプリル、およびβ−ブロッカー、例えばプロパノロール、テルブタロール、およびラベタロールとともに投与することもできる。該化合物は、非ステロイド性抗炎症剤、例えばイブプロフェン、インドメタシン、アスピリン、フェノプロフェン、メフェナム酸、フルフェナム酸およびスリンダクと組み合わせて投与することもできる。該化合物は、コルチコステロイドまたは制吐薬、例えばゾフランとともに投与することもできる。
【０１２６】
式（Ｉ）の化合物は、他の抗癌剤、例えばゲムシタビン、ドキソルビシン、シスプラチン、パクリタキソールおよび／またはデヒドロエクオール（ＤＨＥ）と共同で投与するのに特に適していると思われる。これは、該薬物の一方のみが使用される場合と比較して、該治療の効果の改善を生じさせるかもしれない。
【０１２７】
該共同の投与は、同時であっても、逐次であってもよい。同時投与は、同一の単位用量中に含まれる化合物、または同一または類似の時点で投与される個別の単位用量中の化合物によって実行してよい。逐次投与は、必要に応じて任意の順序であってよく、典型的には、特に累積または相乗効果が望まれる場合、第二または後者の活性物質が投与される時点で第一または最初の活性物質の継続中の生理学的効果が作用中であることが必要とされる。
【実施例】
【０１２８】
以下の非限定的な実施例を参照して本発明をさらに説明する。
【０１２９】
縮合反応
（実施例１．１）
【化１３】
2008537545.tif 000015
【０１３０】
２−メチルレゾルシノール（６２．２ｇ）および３，４−メトキシフェニル酢酸（９２．３ｇ）をＰ２Ｏ５で４日間乾燥した。丸底フラスコ中の該固形物に三フッ化ホウ素ジエチルエーテル化合物（３５０ｍＬ）を加え、その混合物を、窒素雰囲気下で１００℃に加熱しながら１００分間撹拌した。その溶液を室温に２時間冷却し、得られた沈殿を集め、過剰の水で洗浄して、１−（２，４−ジヒドロキシ−３−メチルフェニル）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）−エタノンを褐色固形物（９３ｇ，６５％）として得た。
【０１３１】
（実施例１．２）
【化１４】
2008537545.tif 000016
【０１３２】
上記実施例１．１と同様の様式で、レゾルシノールおよび３，４−メトキシフェニル酢酸を乾燥した後、三フッ化ホウ素ジエチルエーテル化合物の存在下で反応させて、１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−（３，４−ジメトキシフェニル）エタノンを得た。他の縮合産物は、適切に置換されている前駆体化合物を使用することによって取得可能である。
【０１３３】
環化反応
（実施例２．１）
【化１５】
2008537545.tif 000017
【０１３４】
ＤＭＦ（１４０ｍＬ，ＭｇＳＯ４で１５分間乾燥）中に溶解した１−（２，４−ジヒドロキシ−３−メチル−フェニル）−２−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−エタノン（９２．９ｇ）を窒素雰囲気下に置いた。その撹拌溶液に、室温で、蒸留済み三フッ化ホウ素ジエチルエーテル化合物（１４０ｍＬ）を４０分かけて加えた。ＤＭＦ（１９０ｍＬ）中のメタンスルホニルクロライド（７５ｍＬ）の溶液を５２〜５５℃で２０分かけて加えた。その間に、反応混合物は黄色に変化した。その反応物を８０分間加熱還流し、ＨＰＬＣによってモニターし、その後、室温に冷却させた。
【０１３５】
その濃褐色溶液を、強く撹拌された冷水中に注いだ（３×１２５０ｍＬ部分）。一晩（撹拌を継続しながら）黄色固形物を析出させた。その固形物を水で洗浄し、ろ過によって集めた。その固形物を乾燥して、３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−７−ヒドロキシ−８−メチル−クロメン−４−オンを黄色固形物（９４．８ｇ，９９％）として得た。
【０１３６】
（実施例２．２）
【化１６】
2008537545.tif 000018
【０１３７】
上記実施例２．１と同様の様式で、ＤＭＦ中に溶解した１−（２，４−ジヒドロキシフェニル）−２−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−エタノンに三フッ化ホウ素ジエチルエーテル化合物を加え、次いでＤＭＦ中のメタンスルホニルクロライドを加えた。その反応混合物に水を加えて、３−（３，４−ジメトキシフェニル）−７−ヒドロキシクロメン−４−オンを得た。
【０１３８】
アセチル化反応
（実施例３．１）
【化１７】
2008537545.tif 000019
【０１３９】
３−（３，４−ジメトキシ−フェニル）−７−ヒドロキシ−８−メチルクロメン−４−オン（９４．８ｇ）を窒素雰囲気下で無水酢酸（４５０ｍＬ）に懸濁した。ピリジン（２３ｍＬ）を加え、反応混合物を１時間加熱還流した。一晩−１８℃でポットを冷却し、反応混合物内で結晶性固形物を生成させた。これをろ過し、その固形物をろ液および追加の水（５００ｍＬ）で洗浄して、褐色固形物を得た。エタノールでさらに洗浄して、白色結晶性固形物を生成させた。その固形物をデシケータ中で一晩乾燥して、７−アセトキシ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−８−メチルクロメン−４−オン（４４．７ｇ，４２％）を得た。
【０１４０】
1H NMR (CDCl3): δ 2.32 (s, 3H, CH3), 2.39 (s, 3H, OCOCH3), 3.92および3.93 (それぞれs, 3H, OCH3), 6.93 (d, 1H, J 8.3 Hz, ArH), 7.06 (dd, 1H, J 1.9 Hz 8.3 Hz, ArH), 7.13 (d, 1H, J 8.6 Hz, ArH), 7.22 (d, 1H, J 1.9 Hz, H8), 8.07 (s, 1H, H2), 8.33 (d, 2H, J 8.6 Hz, ArH)。
【０１４１】
（実施例３．２）
【化１８】
2008537545.tif 000020
【０１４２】
上記実施例３．１と同様の様式で、３−（３，４−ジメトキシフェニル）−７−ヒドロキシクロメン−４−オン（１．７ｇ）を無水酢酸（１０ｍｌ）およびピリジン（１．９ｍｌ）と反応させて、７−アセトキシ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）クロメン−４−オンを無色のプリズム（１．４４ｇ，７４％）として得た。
【０１４３】
1H NMR (CDCl3): δ 2.36 (s, 3H, OCOCH3), 3.92および3.93 (それぞれs, 3H, OCH3), 6.93 (d, 1H, J 8.3 Hz, ArH), 7.06 (dd, 1H, J 1.9 Hz 8.3 Hz, ArH), 7.16 (d, 1H, J 1.9 Hz, H8), 7.20 (m, 1H, ArH), 7.31 (d, 1H, J 1.9 Hz, ArH), 8.00 (s, 1H, H2), 8.33 (d, 1H, J 8.7 Hz, ArH)。
【０１４４】
水素化反応
（実施例４．１）
【化１９】
2008537545.tif 000021
【０１４５】
１Ｌの３Ｎ丸底水素化フラスコ中で、７−アセトキシ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−８−メチルクロメン−４−オン（１３．９ｇ）およびＰｄ／Ａｌ２Ｏ３（２．８ｇ）を無水エタノール（５６０ｍＬ）に懸濁した。水素を系に４２時間導入し、反応を完了させた。セリットでのろ過によって反応混合物を分離した。その溶媒を減圧下で除去して、白色固形物を得た。その固形物を高真空ラインで一晩乾燥して、７−アセトキシ３−（３，４−ジメトキシフェニル）−８−メチルクロマン−４−オールをシス−およびトランス−異性体の混合物（９．５６ｇ，６８％）として得た。追加の精製を全く行わずに次の段階でこの混合物を使用した。
【０１４６】
トランス異性体：1H NMR (CDCl3): δ 2.02 (s, 3H, CH3), 2.32 (s, 3H, OCOCH3), 3.10 (ddd, 1H, H3), 3.84および3.86 (それぞれs, 3H, OCH3), 4.24 (dd, 1H, H2a); 4.39 (dd, 1H, H2b), 4.91 (d, 1H, J 7.9 Hz, 144), 6.50-6.90 (m, 4H, ArH), 7.32 (d, 1H, J 8.7 Hz, H5)。  
シス異性体：1H NMR (CDCI3): δ 2.03 (s, 3H, CH3), 2.32 (s, 3H, OCOCH3), 3.30 (dt, 1H, H3), 3.86および3.87 (それぞれs, 3H, OCH3), 4.31 (ddd, 1H, H2a); 4.54 (dd, 1H, H2b, 4.78 (bd, 1H, H4), 6.50-6.90 (m, 4H, ArH), 7.32 (d, 1H, J 8.3 Hz, H5)。
【０１４７】
（実施例４．２）
【化２０】
2008537545.tif 000022
【０１４８】
実施例４．１と同様の様式で、７−アセトキシ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）クロメン−４−オン（１．４ｇ）および５％Ｐｄ−Ｃ（０．２４ｇ）を無水エタノール（２００ｍＬ）に懸濁し、水素を系に５５時間導入して、反応を完了させた。ろ過および蒸発によって、７−アセトキシ３−（３，４−ジメトキシフェニル）クロマン−４−オールのシス−およびトランス−混合物（１．４ｇ，１００％）を得た。追加の精製を全く行わずに次の段階でこの混合物を使用した。
【０１４９】
トランス異性体：1H NMR (CDCl3): δ 2.29 (s, 3H, OCOCH3), 3.14 (ddd, 1H, J 3.4 Hz, J 7.9 Hz, J 8.7 Hz, H3), 3.87および3.88 (それぞれs, 3H, OCH3), 4.24 (dd, 1H, H2a); 4.35 (dd, IH, H2b), 4.93 (d, 1H, J 7.9 Hz, H4), 6.66-6.87 (m, 5H, ArH), 7.49 (d, 1H, J 8.7 Hz, H5)。  
シス異性体：1H NMR (CDCl3): δ 2.29 (s, 3H, OCOCH3), 3.30 (dt, 1H, H3), 3.87および3.88 (それぞれs, 3H, OCH3), 4.31 (ddd, in, H2a); 4.56 (dd, 1H, H2b), 4.75 (d, 1H, J 2.64 Hz, H4), 6.66 (dd, 1H, J 2.3 Hz, J 8.7 Hz, H6), 6.66-6.87 (m, 5H, ArH), 7.30 (d, 2H, J 8.3 Hz, ArH)。
【０１５０】
二量体化反応
（実施例５．１）
【化２１】
2008537545.tif 000023
【０１５１】
方法Ａ
７−アセトキシ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−８−メチルクロマン−４−オール（１．０８ｇ）をジクロロメタン（４ｍＬ）に溶解し、炭酸カリウムで乾燥した。反応混合物を−７８℃（アセトン／ドライアイス浴）に１０分間冷却した。五酸化リン（０．５６３ｇ）を加え、反応物に栓をし、−７８℃で６時間維持し、次いで〜４℃で一晩撹拌した。炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍＬ，５％ｗ／ｖ）を使用してクエンチした。それにより反応混合物のバブルが生じた。その混合物を分液ろうと中にすすぎ入れ、ジクロロメタン層を集めた。さらにジクロロメタン（〜２０ｍＬ）を使用してその水層を抽出した。そのジクロロメタン層をロトバップで減量し、高真空ラインに配置すると、紫色固形物が形成された。その固形物を溶離液に溶解し、（６０：４０）ジクロロメタン／ケロシンを使用するカラムクロマトグラフィーに付し、ＴＬＣによってモニタリングした。生成物４，９−ジアセトキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（２−Ａｃ）を単離した（５８０ｍｇ，５２％）。
【０１５２】
1H NMR (CDCl3); δ 1.86 (s, 3H, CH3), 2.02 (s, 3H, CH3), 2.23 (s, 3H, OCOCH3), 2.30 (s, 3H, OCOCH3), 3.12 (dt J 3.5 Hz, J 11.4 Hz, 1H, CH), 3.36 (d, J 12.2 Hz, 1H, CH), 3.74, 3.83, 3.87, 3.87 (それぞれs, 3H, OCH3), 3.93 (dd, J 3.2 Hz, J 10.8 Hz, 1H, CHa), 4.25 (s, 1H, CH), 4.59 (d, J 11.3 Hz, CHa'), 4.77 (d, J 11.3 Hz, CHb'), 4.88 (dd, J 3.4 Hz, J 10.2 Hz, 1H, CHb), 6.30 (d, 1H, J 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.46-6.8 (m, 6H, ArH), 6.93 (s, 1H, ArH), 7.13 (d, 1H, J 8.6 Hz, ArH)。13C NMR (CDCl3); δ 9.2, 9.3 (CH3), 20.6, 20.7 (CH3), 32.9 (CH), 36.6 (CH), 42.9 (CH), 47.0 (脂肪族C), 55.7, 56.0, 56.2, 56.3 (OCH3), 70.0 (CH2), 72.8 (CH), 108.4, 111.2, 111.3, 112.2, 113.8, 113.9, 120.2, 123.3, 125.7 (Ar CH), 118.5, 118.9, 120.5, 121.9, 128.7, 129.2, 138.4, (ArC), 147.9, 148.0, 148.1, 148.2, 148.3, 148.9, 153.5, 154.2 (ArC), 169.2, 169.3 (COOCH3)。λmax 285 nm (ε 14,310)。υmax 2932, 1759, 1597, 1516, 1428, 1368, 1217, 1093, 1024, 912, 805, 729, 587 cm-1。実測値: (HRESMS) m/z 703.254039; C40H40O10Naはm/z 703.251343を要する。
【０１５３】
方法Ｂ
前記２種の固形物を混合し、それをアセトン／ドライアイス浴中で１０分間−７８℃に冷却することによって４個の２０ｍＬ反応容器を以下の表１にしたがってセットアップした。
【０１５４】
表１：７−アセトキシ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）−８−メチルクロマン−４−オール単量体、Ｐ２Ｏ５およびＤＣＭの反応容器
【表１】
2008537545.tif 000024
【０１５５】
炭酸カリウムで乾燥されたジクロロメタンを−７８℃に冷却し、前記フラスコにゆっくり加えた。その反応混合物を−７８℃で６〜７時間維持した後、炭酸水素ナトリウム溶液（２０ｍＬ，５％ｗ／ｖ）を使用してクエンチした。それにより反応混合物のバブルが生じた。その反応物を混合し、分液ろうとに移し、ジクロロメタン層を集めた。ジクロロメタン（〜２０ｍＬ）を使用してその水層を抽出した。そのジクロロメタン層をロトバップで減量し、高真空ラインで乾燥すると、その残留物は紫色固形物を形成した。次いで、その固形物を、（６０：４０）ジクロロメタン／ケロシンを使用するカラムクロマトグラフィーに付した。後者のフラクションからジアセトキシ二量体を良好に単離した（１０８５ｍｇ，２６％）。
【０１５６】
（実施例５．２）
【化２２】
2008537545.tif 000025
【０１５７】
実施例５．１の方法Ａと同様の様式で、ジクロロメタン中の７−アセトキシ−３−（３，４−ジメトキシフェニル）クロマン−４−オールを五酸化リンで処理して、４，９−ジアセトキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（１−Ａｃ）（５４％）を得た。
【０１５８】
1H NMR (CDCl3): δ 2.20 (s, 3H, OCOCH3), 2.27 (s, 3H, OCOCH3), 3.09 (dt, J 3.8 Hz, J 11.7 Hz, 1H, CH), 3.36 (d, J 12.5 Hz, 1H, CH), 3.74, 3.84, 3.89, 3.89 (それぞれs, 3H, OCH3), 3.95 (dd, J 3.4 Hz, J 10.9 Hz, 1H, CHa), 4.23 (s, 1H, CH), 4.59 (d, J 11.3 Hz, CHa'), 4.73 (d, 11.3 Hz, CHb'), 4.81 (dd, J 3.4 Hz, 10.9 Hz, 1H, CHb), 6.36 (dd, 1H, J 2.6 Hz, J 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.46 (d, J 2.3 Hz, 1H, ArH), 6.62 (d, J 2.3 Hz, 1H, ArH), 6.62-6.69 (m, 4H, ArH), 6.79 (d, J 9.1 Hz, 1H, ArH), 6.85 (d, J 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.91 (s, 1H, ArH), 7.24 (d, 1H, J 9.0 Hz, ArH)。13CNMR (CDCl3): δ 21.5, 21.6 (CH3), 33.5 (CH), 36.8 (CH), 43.1 (CH), 49.9 (脂肪族C), 56.2, 56.3, 56.4, 56.5 (OCH3), 70.5 (CH2), 73.2 (CH2), 108.7, 110.7, 110.8, 11.5, 112.4, 114.4, 120.8, 120.9, 126.9, 129.2, 129.3 (ArCH), 122.6, 128.8, 138.4, 148.4, 148.5, 148.6, 149.3, 150.1, 150.3, 155.8, 156.3, 169.7, 169.8 (ArC)。λmax 284 nm (ε 18,000), 212 (77250)。υmax 2993, 2833, 1762, 1611,1586, 1516, 1464, 1424, 1368, 1248, 1209, 1146, 1119, 1027, 899, 810, 763 cm-1。実測値: (HRESMS) m/z 675.219688; C38H36O10Naはm/z 675.220045を要する。
【０１５９】
脱アセチル化反応
（実施例６．１）
【化２３】
2008537545.tif 000026
【０１６０】
４，９−ジアセトキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（１５０ｍｇ）をメタノール（４ｍｌ）に溶解した。水酸化カリウム溶液（１Ｍ水性）を反応物に滴加して、ｐＨを約１１にした。反応物を室温で９０分間撹拌した。その溶液を酢酸（１Ｍ水性）で中和し、撹拌水（５００ｍｌ）に注いだ。得られた沈殿をろ過し、乾燥して、４，９−ジヒドロキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（２）（５０ｍｇ，３８％）として特定される白色粉末を得た。
【０１６１】
1H NMR (CDCl3); δ 1.94 (s, 3H, CH3), 2.10 (s, 3H, CH3), 3.02 (dt J 3.5 Hz, J 11.4 Hz, 1H, CH), 3.31 (d, J 12.4 Hz, 1H, CH), 3.74, 3.84, 3.86, 3.87 (それぞれs, 3H, OCH3), 3.94 (dd, J 3.2 Hz, J 10.8 Hz, 1H, CHa), 4.18 (s, 1H, CH), 4.40(brs, 1H, OH), 4.56 (d, J 11.3 Hz, 1H, CHa'), 4.60(brs, 1H, OH), 4.74 (d, J 11.3 Hz, 1H, CHb'), 4.86 (dd, J 3.4 Hz, J 10.2 Hz, 1H, CHb), 6.10 (d, J 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.42 (d, J 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.59 (d, J 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.60-6.8 (m, 3H, ArH), 6.79 (d, J 8.7 Hz, 1H, ArH), 6.95 (s, 1H, ArH), 6.96 (d, J 8.6 Hz, 1H, ArH)。
【０１６２】
（実施例６．２）
【化２４】
2008537545.tif 000027
【０１６３】
無水エタノール（８ｍｌ）中の４，９−ジアセトキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（２３０ｍｇ）の懸濁液にイミダゾール（５５０ｍｇ）を加え、混合物をアルゴン雰囲気下で４５分間還流した。その溶液を減圧下で濃縮し、蒸留水（１０ｍｌ）を加えて生成物を沈殿させた。その混合物を冷蔵庫中に一晩置き、ろ過して、４，９−ジヒドロキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（１）を白色固形物（１００ｍｇ，５０％）として得た。
【０１６４】
1H NMR (CDCl3): δ 3.03 (dt, J 3.4 Hz, J 11.3 Hz, 1H, CH), 3.28 (d, J 12.4 Hz, 1H, CH), 3.75, 3.84, 3.85, 3.86 (それぞれs, 3H, OCH3), 3.92 (d, J 10.5 Hz, 114, CHa), 4.16 (s, 1H, CH), 4.56 (d, J 11.3 Hz, CHa'), 4.68 (d, J 11.3 Hz, CHb'), 4.77 (dd, J 3.7 Hz, J 10.5 Hz, 1H, CHb), 6.13 (dd, 1H, J 2.6 Hz, J 8.3 Hz, 1H, ArH), 6.20 (d, J 2.3 Hz, 1H, ArH), 6.36 (d, J 2.3 Hz, 1H, ArH), 6.45 (dd, J 2.6 Hz, J 8.3 Hz, 1H, ArH), 6.62-6.67 (m, 2H, ArH), 6.72 (d, J 8.3 Hz, 1H, ArH), 6.78 (d, J 8.3 Hz, 1H, ArH), 6.93 (s, 1H, ArH), 7.09 (d, J 9.0 Hz, 1H, ArH), 7.11 (s, 1H, OH), 7.70 (s, 1H, OH)。13C NMR (CDCl3): δ 33.7 (CH), 36.2 (CH), 41.7 (CH), 47.2 (脂肪族C), 55.0, 55.1, 55.3, 55.5 (OCH3), 69.4 (CH2), 72.1 (CH2), 102.9 (CH), 103.2 (CH), 107.8 (CH), 108.2 (CH), 109.0 (CH), 111.4 (CH), 112.0 (CH), 113.4 (CH), 114.4, 116.0 (ArC), 120.8 (CH), 126.8 (CH), 128.8 (CH), 129.1, 129.4, 139.0, 148.1, 148.3, 148.5, 149.3, 155.6, 156.4, 156.6, 156.9 (ArC)。λmax 285 mm (ε 13,028), 217 37,743)。υmax 3322, 2933, 1618, 1516, 1463, 1255, 1166, 1024, 834, 742 cm-1。実測値: (HRESMS) m/z 591.196772; C34H32O8Naはm/z 591.198918を要する。
【０１６５】
上記方法によって、相応に置換されている容易に入手可能な出発材料を利用して、関連する同様の二量体化合物を調製した。
【０１６６】
１．抗癌活性
デヒドロエクオール（３−（４−ヒドロキシフェニル）クロマ−３−エン−７−オール）は、広い範囲のヒト癌セルラインに対して細胞障害性効果を誘発し、また、最近の報告では、フェノキソジオールが強いトポイソメラーゼＩＩインヒビターであり、細胞周期崩壊剤であり、スフィンゴシンキナーゼ活性化を阻害し、血管原性マトリックスメタロプロテアーゼ２の転写を下方制御し、化学療法剤耐性卵巣癌細胞において抗アポトーシス機構を制御することによってアポトーシスを誘発できることが示されている。
【０１６７】
シスプラチンの抗癌活性は、精巣腫瘍、卵巣癌、膀胱腫瘍、頭部および頸部、乳癌、肺癌、不応性非ホジキンリンパ腫において観察されている。シスプラチンは、平面四角形の配位複合体（シス−ジアミンジクロロ白金）であり、膜貫通チャネルまたは高容量促進輸送によって細胞に入ると考えられる。シスプラチンが細胞に入ると、クロライド濃度が２０μＭに低下し、該薬物は強い水和を受けて、細胞の求核物質、例えばＤＮＡおよびタンパク質との以後の相互作用のために、正に帯電した活性分子種を形成する。シスプラチンは、核のＤＮＡと反応して様々な付加物を生じさせ、それは、鎖間および鎖内ＤＮＡ架橋およびＤＮＡ−タンパク質架橋を含む。最も一般的な付加物は、隣接するグアニン間の鎖内架橋である。ゲノムＤＮＡは、概して、シスプラチン誘発型細胞障害性の重要な薬理学的標的として認められるが、シスプラチンによって損傷を受ける他の細胞成分（ＲＮＡ、タンパク質、膜リン脂質、細胞骨格の微小繊維、およびチオール含有分子）がシスプラチン誘発型細胞障害性を促進する証拠が存在する。そして、シスプラチン−ＤＮＡ付加物（ＤＮＡ損傷）はｐ５３によって検出され、それは、次に、おそらくＢａｘ／Ｂｃｌ−２モジュレーションによってプロアポトーシスカスケードを開始させ、典型的にＧ１停止を誘発する。また、壊死がシスプラチン細胞死の様式として実証されている。シスプラチンは多数の有害な影響を有し、それには、難治性の、ほとんど汎発性の、吐き気および嘔吐、アナフィラキシー様反応、神経毒性、骨髄抑制、血小板減少症、顆粒球減少症および、累積的かつ不可逆的な、用量を制限する腎毒性が含まれる。
【０１６８】
生物学的研究およびスクリーニングデータ
スクリーニング研究では、４，９−ジヒドロキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（２）が、正常細胞に対して好都合なｉｎ  ｖｉｔｒｏ毒性プロファイルを有し、かつ白血病、神経膠腫、前立腺、卵巣、乳房、結腸直腸および肺の癌の代表的な癌細胞に対して、デヒドロエクオールまたはシスプラチンに匹敵し、場合によってはそれらより良好な広い活性を有することが特定されている。
【０１６９】
材料および方法−組織培養
新生児の包皮線維芽細胞（ＮＦＦ）は、Peter Parsons博士（クイーンズランド医学研究所）から譲り受けた。ＲＫ−１３（ウサギ腎臓）細胞は、Miller Whalley（マクアリー大学）から入手した。１０％ＦＣＳ（ＣＳＬ，オーストラリア）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および炭酸水素ナトリウム（１．２ｇ／Ｌ）を補充したＲＰＭＩ中で両細胞タイプを培養し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で培養した。
【０１７０】
ヒト膵癌セルライン、ＨＰＡＣ（ＣＲＬ−２１１９）を、ＨＥＰＥＳ（１５ｍＭ）、インシュリン（０．００２ｍｇ／ｍｌ）、トランスフェリン（０．００５ｍｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン、（４０ｎｇ／ｍｌ）、上皮細胞成長因子（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭ（Ｓｉｇｍａ）プラスＨａｍ’ｓ  Ｆ１２（Ｓｉｇｍａ）培地の１：１混合物中で通常通り培養した。卵巣癌セルラインＣＰ７０はGil Mor博士（イェール大学）から譲り受けて入手し、ＤＭＥＭプラスＨａｍ’ｓ  Ｆ１２培地の１：１混合物中で培養した。ＳＫＯＶ−３はＡＴＣＣから購入し、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５ａ培地中で培養した。乳癌セルラインＭＤＡ−ＭＢ−４６８はＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ  Ｌ−１５培地中で培養した。
【０１７１】
すべての培養物に、１０％ＦＣＳ（ＣＳＬ，オーストラリア）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）、ストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍｌ）、Ｌ−グルタミン（２ｍＭ）および炭酸水素ナトリウム（１．２ｇ／Ｌ）を補充し、５％ＣＯ２の加湿雰囲気中で３７℃で培養した。すべての残りのセルラインは、特に記載しない限り、ＡＴＣＣ（メリーランド，ＵＳＡ）から購入した。
【０１７２】
増殖アッセイ
各セルラインからＩＣ５０値を決定した。成長キネティクスの分析から決定される適切な細胞密度で９６ウェルプレートに細胞をまいた。ＮＦＦを５日間培養し、ＲＫ−１３を２４時間培養した。その培養は、試験化合物の不存在および存在下で行った。２０μｌの３−４，５ジメチルチアゾール−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド（ＭＴＴ，ＰＢＳ中２．５ｍｇ／ｍｌ，Ｓｉｇｍａ）を加えた後、製造元の指示書にしたがって３７℃で３〜４時間、細胞増殖を評価した。ｘ軸の対数用量に対するｙ軸のコントロール増殖についての％の半対数プロットからＩＣ５０値を算出した。
【０１７３】
（実施例７）正常細胞毒性
デヒドロエクオール（ＤＨＥ）、実施例６．１で得られた４，９−ジヒドロキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（２）およびシスプラチンを用いて、ＮＦＦ細胞に対する二重の細胞障害性アッセイを行った。
【０１７４】
表２．新生児の包皮線維芽細胞（ＮＦＦ）およびウサギ腎細胞に対するデヒドロエクオール、Ｃｐｄ．２およびシスプラチンの相対的毒性。
【表２】
2008537545.tif 000028
【０１７５】
二量体２は、シスプラチンより正常細胞に対して毒性が低いが、デヒドロエクオールより毒性が高いことが見出された。
【０１７６】
（実施例８）Ｃｐｄ．２の薬物動態−経口
実施例６．１で得られた４，９−ジヒドロキシ−１４，１５−ジメトキシ−１２ａ−（３’，４’−ジメトキシフェニル）−３，１０−ジメチル−２，１１−ジオキソ−（１Ｈ，１２Ｈ）−６ｂ，６ｃ，１２ａ，１６ｂ−テトラヒドロナフト［１，２−ｇ］クリセン（２）を１％ＣＭＣ（ｍ：ｖ，水）中の均質懸濁液として調製した。そのＣｐｄ．２製剤を胃管栄養法によって雌性ＢＡＬＢ／ｃマウスに５０ｍｇ／ｋｇの用量で経口送達した。各時点（１５分、３０分、１時間、４時間および２４時間）に３動物を割り当てた。それぞれの各時点で、頸椎脱臼によって動物を安楽死させ、血液を収集した。質量分析によって遊離のＣｐｄ．２を分析した。その結果を表３に示す。
【０１７７】
表３．デヒドロエクオールおよびＣｐｄ．２に関する比較経口薬物動態学データ
【表３】
2008537545.tif 000029
【０１７８】
二量体２は、４時間までの時点で、デヒドロエクオールと比較して優れた半減期を有することが見出された。二量体２は、デヒドロエクオールと比較して緩徐な結合速度を有することが見出された。ｉｎ  ｖｉｖｏ毒性データでは、連続９日にわたって５０ｍｇ／ｋｇ５０６３（ｉ．ｐ．）を服用したマウスが、体重喪失および重要器官の組織学によって測定された場合に、毒性ではなかったことが示された。
【０１７９】
（実施例９）癌細胞に対する単独療法としてのＣｐｄ．２のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞障害性
二量体２は、様々な悪性および多剤耐性セルラインに対して、デヒドロエクオールまたはシスプラチンＩＣ５０値と比較して匹敵する活性〜顕著に優れた活性を示した。それは表４に示される通りである。
【０１８０】
表４．種々の悪性腫瘍の代表的なセルラインに対する、デヒドロエクオール、Ｃｐｄ．２およびシスプラチンの細胞障害性の比較
【表４】
2008537545.tif 000030
【０１８１】
２．抗炎症活性
プロスタグランジン、例えばＰＧＥ２およびＰＧＩ２およびトロンボキサン（ＴＸ）、例えばＴＸＡ２は、エイコサノイドとして知られる脂肪酸誘導体のファミリーのメンバーである（Penglis et al. 2000）。それらは、正常な生理反応および炎症反応の両者に関与するが、例えばサイトカイン放出および血小板凝集に対して相反する影響を有する。膜リン脂質からアラキドン酸（ＡＡ）が放出されると、エイコサノイド合成のための主要な基質が提供される。
【０１８２】
シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）酵素の作用は、アイソタイプとは無関係に、ＰＧＥ２、ＰＧＩ２およびＴＸＡ２の共通の前駆体である中間体プロスタグランジンＰＧＨ２の合成を生じさせる。プロスタノイドは、白血球および炎症性器官の実質細胞との複雑な相互作用によって、免疫応答において重要な調節的役割を果たす。それらは、炎症性刺激、生産される主要なプロスタノイド、およびプロスタノイド受容体発現のプロファイルに応じて炎症誘発性作用および抗炎症性作用の両方を生じさせることができる（Tilley et al. 2001）。
【０１８３】
ＴＸシンターゼの阻害によりＴＸの形成が減少し、ＰＧシンターゼの基質であるＰＧＨ２の利用能が増加するためにＰＧの合成が増加する（Carty et al. 2000; Penglis et al. 2000）。ＰＧＥ２の増加は抗炎症性効果を発揮し得る。例えば：
【０１８４】
ａ．ＰＧＥ２はいくつかの急性炎症反応、特に肥満細胞の脱顆粒によって開始される急性炎症反応を減弱させることが報告されている（Raud et al. 1988）。
【０１８５】
ｂ．ＰＧＥ２は抑制するが、ＴＸＡ２はＴＮＦαおよびＩＬ−１βを増加させる（Caughey et al. 1997）。ＴＸＡ２の阻害は、炎症性サイトカイン産生、特にＴＮＦの産生を阻害する潜在的な方法である。現在、（抗体または可溶性ＴＮＦ受容体を用いて）ＴＮＦレベルを抑制する生物学的治療は、他の治療に不応性であるか、あるいはもはや応答性でない関節リウマチの治療において成功している。ＴＮＦ産生を抑制し、かつ経口摂取が可能な化学物質は、大きな進歩をもたらすであろう。ＴＸＡ２形成の阻害は、関節の炎症の徴候および症状に関与し、ならびに軟骨劣化、関節隙の減少および最終的に関節破損に現れる関節の炎症の長期の劣化相に関与するサイトカインであるＴＮＦの産生を抑制する手段であるかもしれない。
【０１８６】
ｃ．ＰＧＥ２は、広範囲のＴおよびＢ細胞機能を阻害し、その機能には、Ｔリンパ球の活性化および増殖およびＩｇ産生の阻害が含まれる（Tilley et al. 2001）。逆に、ＴＸＡ２はＴ細胞活性化および増殖を促進し、エフェクター細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）の発生を促進するかもしれない。このバランスをＰＧ産生に好都合に改変すると、自己免疫疾患において生じる不適切な免疫応答の「クエンチング」を促進するかもしれない。
【０１８７】
ｄ．喘息では、ＰＧＥ２は血管拡張を促進し、血管透過性を増加させる（Tilley et al. 2001）。炎症が進行するにつれて、マクロファージによるＰＧＥ２合成は、ＣＯＸ−２およびＰＧＥシンターゼの発現増加のせいで、増加する。ＰＧＥ２は白血球の活性化を阻害し、気管支拡張を促進する。ＴＸＡ２シンターゼインヒビターおよびトロンボキサンプロスタノイド（ＴＰ）受容体アンタゴニストが抗喘息薬として開発されている（Shi et al. 1998）。
【０１８８】
ｅ．糸球体腎炎では、ＰＧおよびＴＸの合成に向けてのＡＡ  ＣＯＸ経路およびロイコトリエンの合成に向けてのリポキシゲナーゼ経路の同時活性化が存在する。ＴＸＡ２は、腎炎性糸球体において合成される最も大量のエイコサノイドであり、ＴＸＡ２シンターゼインヒビター（例えばダズメグレル）は、現在、糸球体腎炎の治療に利用可能である。腎炎のラットモデルでは、ダズメグレルがＰＧＥ２合成を増加させた。それは、ＰＧＥ２が糸球体腎炎において腎機能を保護するので有用である（Lianos et al. 1999）。
【０１８９】
ｆ．トロンボキサンは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）において主要な病原性の役割を果たすかもしれない。ＴＸは、炎症性粘膜においてばかりでなく、クローン病においても、非炎症性の腸によって、ならびに単離された腸の細胞および末梢血単核細胞によって過剰に生産される。それらの細胞性供給源には、血小板、好中球、内皮および上皮細胞ならびに単核細胞が含まれる可能性が高い（Rampton et al. 1993; McCartney et al. 1999; Carty et al. 2000; Carty et al. 2002）。ＴＸの炎症誘発性作用は、直接的（好中球の血管外遊出および活性化、粘膜の潰瘍形成、サプレッサーＴ細胞活性の低下）および間接的（血管狭窄、血小板活性化）の両方である（Rampton et al. 1993）。ＰＧは、胃腸粘膜に対して保護性であると考えられる（Carty et al. 2000）。慢性ＩＢＤの治療において頻繁に投与される化合物であるスルファサラジン、ならびにその主要代謝産物の１つであるスルファピリジンは、ＴＸＢ２の合成を阻害し、それぞれＰＧＦ２αまたはＰＧＥ２の合成を増加させることが実証されている（Hawkey et al. 1985）。換言すれば、それらはいくらかのレベルのＴＸシンターゼ阻害性を有すると思われる。
【０１９０】
材料および方法−組織培養
単核細胞のリンホプレップ勾配分離、その後の対向流遠心溶出法（counter-current centrifugal elutriation）によって、ヒト末梢血単球（３人の別の個体由来）をバフィーコートから単離した（Demasi et al. 2000）。試験化合物をＤＭＳＯに溶解し、新鮮な単球に加えた。３０分後、ＬＰＳを加えて、終濃度２００ｎｇ／ｍＬを達成した。５％ＣＯ２中で３７℃で１８時間のインキュベーション後、上清を取り出し、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって、ＰＧＥ２、ＴＸＢ２（ＴＸＡ２の安定な加水分解産物）およびＴＮＦα産生を測定した。
【０１９１】
ＦＣＳ、２ｍＭグルタミンおよび５０Ｕ／ｍｌペニシリン／ストレプトマイシンを補充したＤＭＥＭ中でマウスマクロファージセルラインＲＡＷ２６４．７を培養した。亜集密状態（Subconfluent）の細胞を穏やかにこすり落とすことによってフラスコから分離し、２４ウェルプレートにウェルあたり５×１０５細胞の密度でまき、１時間接着させた。次いで試験化合物（０．０２５％ＤＭＳＯ中）またはビヒクルのみで細胞を処理し、１時間インキュベートした。次いでＬＰＳ５０ｎｇ／ｍｌ（ＬＰＳ−Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を加えた。１６時間のインキュベーション後、培地を収集し、酵素免疫測定法を使用するエコサノイドおよびサイトカイン測定（ＰＧＥ２およびＴＸＢ２−Ｃａｙｍａｎ  ＣｈｅｍｉｃａｌおよびＴＮＦα−Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）のために−８０℃で保存した。
【０１９２】
結果および結論
図１〜８は、両二量体Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２が、ＬＰＳで刺激されたマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）およびヒト単球において、用量反応様式でＴＸＢ２を阻害し、ＰＧＥ２を誘導することを示す。同様に、Ｃｐｄ．１およびＣｐｄ．２はヒト単球においてＴＮＦαの誘導を阻害した。本発明の二量体化合物は、炎症性疾患および関連症状の治療において有用である。
【０１９３】
３．心血管活性
【０１９４】
材料および方法
雄性Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（２５０±５０ｇ）を８０％ＣＯ２および２０％Ｏ２で安楽死させた。胸大動脈を切り取り、報告されているように器官浴にすばやくマウントした（Chin-Dusting et al, 2001）。Ｃｐｄ．２（１μｇ／ｍｌ）の不存在および存在下で、ノルアドレナリン（０．１ｎＭ〜１０ｍＭ）に対して、完全濃度−収縮曲線を取得した。ｎ＝６匹の異なる動物由来の６個の異なる輪において、実験を反復した。
【０１９５】
Ｃｐｄ．２は、ノルアドレナリンに対する最大収縮応答に影響を有さなかった（１．９４±０．３５ｖｓ．２．０９±０．２３；ｐ＞０．０５）が、ノルアドレナリンのＥＣ５０濃度の対数に負号をつけたもの（neg log EC50 concentration）を−８．２１±０．１７から−７．８４±０．０９７に有意にシフトさせた（ｐ＜０．０５）。それは、Ｃｐｄ．２がノルアドレナリンの収縮作用をアンタゴナイズ（またはブロック）できたことを示す（図９を参照のこと）。
【０１９６】
結果および結論
Ｃｐｄ．２は、ノルアドレナリンによって誘発される大動脈輪の収縮性に対抗する実証済みの活性を有する。これらのデータは、Ｃｐｄ．２が血管拡張活性を示し、かつ血管狭窄を阻害することを示す。
【０１９７】
４．化学増感処理
【０１９８】
一連の標準的な化学療法剤と組み合わせて使用された場合に化学増感剤として作用する本発明の二量体化合物の有用性を評価した。二量体Ｃｐｄ．２を様々な結腸直腸および膵癌セルラインに適用して、標準的な化学療法剤とのその相乗作用を研究した。該化学療法剤には、シスプラチン、ゲムシタビン、パクリタキセル、ドキソルビシン、カンプトセシンおよびトポテカンが含まれる。
【０１９９】
実験設計
ＳＯＰ−ＢＤ０１１（バージョンＡおよびＢ）で概説される実験を使用して、任意の「１」実験において所定のセルラインに対して３種の抗悪性腫瘍薬をスクリーニングした（例えばKanzawa et al., (1997)を参照のこと）。実験固有の設計により、Ｃｐｄ．２および抗悪性腫瘍薬の３通りの順序（シークエンス）が許容された。
【０２００】
１）ダイレクトシークエンス−Ｃｐｄ．２および単一の抗悪性腫瘍薬の両者（組み合わせ）で細胞を５日間処理する。
【０２０１】
２）Ｃｐｄ．２ファースト（フォワード）シークエンス−細胞をＣｐｄ．２で２４時間処理した後、２４時間の抗悪性腫瘍薬処理で置き替える；そして薬物を洗い落とし、５日目にプロセシングする。
【０２０２】
３）リバースシークエンス−上記実験Ｎｏ．２と逆の順序、すなわち細胞毒が先の順序。
【０２０３】
結果および結論
Kanzawa et al. (1997)によって報告されているように、三次元モデルに組み込まれている理論的加法（theoretic additivity）の式を使用して、すべてのデータを評価した。これにより、１０％を上回る値が「相乗的」（グレーで示される）として規定され、−１０％を下回る値が「拮抗性」（黒で示される）として規定されるシンプルなデータ解釈が可能になる。
【０２０４】
Ｃｐｄ．２およびゲムシタビンの組み合わせは、同時に（Ａ）、あるいは２４時間間隔にわたって（Ｂ，Ｃ）処理された場合にＨＰＡＣ細胞に対して相乗的細胞障害性を生じさせた（図１０を参照のこと）。この効果は、２４時間間隔のデータの両方において大規模な濃度範囲にわたって明らかであった。相乗作用は、５μＭを超えるＣｐｄ．２濃度では観察されなかった。
【０２０５】
Ｃｐｄ．２およびゲムシタビンの組合せは、順方向（Ａ）および逆方向（Ｂ）の逐次処理の両方においてＨＴ−２９細胞に対して相乗的細胞障害性を生じさせた（図１１を参照のこと）。
【０２０６】
Ｃｐｄ．２（１μＭおよび２μＭ）および９種の連続希釈パクリタキセル濃度で処理されたＨＴ−２９細胞は、一緒に（Ａ）処理された場合に強い相乗作用を示した（図１２を参照のこと）。順方向（Ｂ）および逆方向（Ｃ）の２４時間間隔の両方においては、相乗作用があまり顕著でない領域も認められる。
【０２０７】
Ｃｐｄ．２（１μＭおよび２μＭ）および９種の連続希釈パクリタキセル濃度で処理されたＨＣＴ−１５細胞は、順方向（Ｂ）および逆方向（Ｃ）の２４時間間隔の両方において逐次処理された場合に強い相乗作用を示した（図１３を参照のこと）。対照的に、同時処理群（Ａ）では相乗作用が観察されない。
【０２０８】
Ｃｐｄ．２およびドキソルビシンの組み合わせは、一緒に（Ａ）処理された場合および順方向（Ｂ）で逐次処理された場合の両場合にＨＴ−２９細胞に対して強い相乗的細胞障害性を生じさせた（図１４を参照のこと）。細胞がドキソルビシンで先に処理された場合、相乗作用は観察されなかった（Ｃ）。
【０２０９】
Ｃｐｄ．２およびドキソルビシンの組み合わせは、一緒に（Ａ）処理された場合にＨＣＴ−１５細胞に対して強い相乗的細胞障害性を生じさせた（図１５を参照のこと）。順方向（Ｂ）または逆方向（Ｃ）の逐次処理では相乗作用は観察されなかった。
【０２１０】
相乗作用は、Ｃｐｄ．２および化学療法剤、ゲムシタビン、パクリタキセルおよびドキソルビシン間で通常に認められた。該データは、Ｃｐｄ．２が、最適には、順方向または逆方向の２４時間間隔で投与された場合に、これらの物質と相乗作用し得ることを示唆する。この結果は、本発明の二量体化合物が腫瘍細胞の化学増感処理および非腫瘍細胞の化学防御において特に効果的であることを示す。
【０２１１】
５．マウスの耳の炎症における抗炎症活性
【０２１２】
アラキドン酸（ＡＡ）の局所適用によって誘発されるマウスの耳膨潤を阻害する能力に関して、化合物２を試験した。エイコサノイドの直接の前駆体であるＡＡによる炎症反応は、シクロオキシゲナーゼ（ＣＯＸ）およびリポキシゲナーゼ（ＬＯＸ）経路の両方を介するＡＡ代謝産物の形成に起因する（Young et al. 1984）。ＡＡは早期（１０〜１５分）にＰＧＥ２およびＬＴＣ４合成の両者の増加を誘発し、その後、耳の厚さが増加する（Opas et al. 1985; Chang et al. 1986）。
【０２１３】
方法
体重１５〜２１ｇの雌性ＢＡＬＢ／ｃマウス（ＡＲＣ，ＷＡ，オーストラリア）に、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）４００：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）１：１中で送達される化合物２を、耳に対するＡＡ適用の３０分前に２５ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内（ｉ／ｐ）注射した。イソフルランを使用してマウスを麻酔し、バネ式マイクロメータを使用して両耳の基底の厚さを測定した。各マウスは、各耳介の内側および外側表面にトータルで２０μＬのエタノール中のＡＡ（５０ｍｇ／ｍｌ）を適用された（すなわち耳あたり０．５ｍｇＡＡまたは２μｇＰＭＡ）。マウスを再度麻酔して、ＡＡ適用後１時間の時点で耳を再測定した。
【０２１４】
各耳に関してＡＡの適用前および適用後に耳膨潤の差異を算出し、各マウスの２つの耳に関する平均を算出した。ビヒクルのみを投与された群と比較した各試験群の平均膨潤の差異を、両側の、対応のないｔ検定（Ｐｒｉｓｍ４，ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して算出した。
【０２１５】
結果
化合物２での治療は、ビヒクルのみでの治療と比較して、耳の厚さの有意な減少を生じさせた。
【０２１６】
表１．ＡＡの適用に応答する耳の厚さの変化
【表５】
2008537545.tif 000031
【０２１７】
この結果は、化合物２のｉｎ  ｖｉｖｏ抗炎症活性を実証する。
【０２１８】
６．Ｕｖ照射誘発型皮膚浮腫のマウスモデルにおける抗炎症活性
【０２１９】
哺乳類の皮膚をＵＶ照射に急性被爆させると、紅斑および浮腫によって現れる炎症性反応が生じる。この反応は、部分的には炎症誘発性プロスタグランジン（ＰＧＤ２、ＰＧＥ２、ＰＧＦ２αおよびおそらくＰＧＩ２）およびロイコトリエン、ならびに反応性フリーラジカルおよび活性酸素分子種の生成よって媒介される（Sondergaard et al. 1985; Gonzalez and Pathak 1996; Widyarini et al. 2001）。
【０２２０】
方法
４〜５匹の雌性Ｓｋｈ：ｈｒ−１白色種マウスの群に１×３ＭＥｄＤ（最小浮腫用量）のソーラーシミュレーション型ＵＶ放射線（ＳＳＵＶ）を照射した。ソーラーシミュレーション型紫外放射線（ＳＳＵＶ）は、６ＵＶＡ管の平面状バンク（Ｈｉｔａｃｈｉ  ４０Ｗ  Ｆ４０Ｔ  １０／ＢＬ，ブラックライト）および１ＵＶＢ管（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ＴＬ  ４０Ｗ／１２ＲＳ）によって供給された。その場合、放射線は０．１２５ｍｍ酢酸セルロースシート（Ｅａｓｔｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｋｉｎｇｐｏｒｔ，Ｔｅｎｎ，米国）を通してフィルターされ、２．９６×１０−４Ｗ／ｃｍ２ＵＶＡおよび１．５９×１０−５Ｗ／ｃｍ２ＵＶＢが得られた。照射テーブル（irradiance table）表面からＵＶランプの距離は約２０ｃｍであり、温度は扇風機で調節された。照射中、ケージを該光の下で回転させて、異なる位置での放射線強度の変動を低減した。
【０２２１】
試験化合物（０．２ｍｌの２０μＭ溶液）またはビヒクル（プロピレングリコール／エタノール／水１：２：１）を、照射後３０分、２時間および４時間の時点で照射済みの背側皮膚に適用した。背側皮下脂肪（skin fold）の測定は、ＵＶ被爆前およびＵＶ被爆後２４時間および４８時間の時点でバネ式マイクロメータを用いて行った。ＵＶＲに対する被爆前および被爆後の皮膚の厚さの差異を各マウスに関して算出し、対応のない両側ｔ検定を使用して試験化合物およびビヒクルコントロール間で調査されたその差異を分析した。
【０２２２】
結果
皮下脂肪厚はＵＶ照射後２４時間の時点で明らかになり、最終の測定時点である４８時間の時点でピークを有した。試験化合物をＵＶ照射後３回しか適用せず、かつ投薬は最初の皮下脂肪測定の２０時間前に完了していたが、該試験化合物はＵＶ誘発型炎症の低減に関して活性であった。それは、以下の表およびグラフにおいて強調される通りである。
【０２２３】
化合物２は両時点で皮膚浮腫を有意に阻害し、化合物１は２４時間の時点で有意に阻害した。
【０２２４】
表２．照射後２４時間の時点での背側皮下脂肪厚の変化
【表６】
2008537545.tif 000032
【０２２５】
表３．照射後４８時間の時点での背側皮下脂肪厚の変化
【表７】
2008537545.tif 000033
【０２２６】
これらの結果は、化合物１および化合物２の両者の抗炎症活性を明らかに実証する。それらは局所的にかつ炎症の誘発後の短期間のうちに投与されたが、それらの効果は４８時間後まで依然として明らかであった。
【０２２７】
７．マウス脾細胞における免疫抑制作用
【０２２８】
方法
６週齢の雄性Ｓｋｈ−１（無毛）マウスを頸椎脱臼によって犠牲にした。それらの脾臓から単一細胞懸濁液を作成し、赤血球をバッファー（０．１４Ｍ  ＮＨ４Ｃｌ，１７ｍＭ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．２）中で溶解した。１０％（ｖ：ｖ）ＦＢＳ、２００ｍＭ  Ｌ−グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシンおよび５０ｍＭ  ２−メルカプトエタノールを補充したＲＰＭＩ−１６４０（Ｇｉｂｃｏ）中で残りの脾細胞を培養した。ＤＭＳＯ中のコンカナバリンＡ（ＣｏｎＡ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−０．４μｇ／ウェル）、リポ多糖（ＬＰＳ，Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ−１μｇ／ウェル）または分裂促進因子なし、ならびに１０μＭの化合物１または化合物２、ＤＭＳＯのみを含有する三重のウェルに脾細胞を加えた。空気中の５％ＣＯ２中で３７℃で３日間インキュベートした後にサンプルを分析した。細胞数を評価するために、メチルチアゾールテトラゾリウム（ＭＴＴ）を各ウェルに加え、さらに４時間インキュベートし、次いでイソプロパノール中の０．０４Ｎ  ＨＣｌで呈色させた（Mosmann 1983）。プレートを５７０ｎｍおよび６３０ｎｍで読み取った。異なるマウスを使用して該化合物を数回試験した。各アッセイでは、試験化合物の効果をビヒクルコントロールの効果と比較し、スチューデントｔ検定（Ｐｒｉｓｍ）を使用してその結果を比較した。ｐ＜０．０５の場合に統計学的有意差が存在していると判定した。
【０２２９】
別のアッセイでは、無刺激の脾細胞を１０μＭの試験化合物と２４時間プレインキュベートし、該化合物を除去し、次いで以前のアッセイに関して記載のように、分裂刺激に応答するそれらの能力を評価した場合の効果を試験した。ＭＴＴを使用する２４時間のプレインキュベーション後に細胞数を評価し，等しい数の細胞／ウェルを９６ウェルプレートに通常通りプレートした。
【０２３０】
結果
１０μＭの化合物１とインキュベートした場合の効果を６種の異なるアッセイで試験した。化合物１は、４／６アッセイにおいて１４〜１９％のＴ細胞増殖を有意に阻害したが、Ｂ細胞増殖には影響を有さなかった。化合物１は、５／６アッセイにおいて、２５〜３３％の無刺激の脾細胞の増殖を有意に増加させた。代表的な１アッセイの結果を図１６に提供する。
【０２３１】
１０μＭの濃度の化合物２を４種の異なるアッセイにおいて試験した。その結果はアッセイ間で変動し、一貫した傾向は存在しなかった（データは示していない）。
【０２３２】
より高濃度では、両化合物１および２は、分裂刺激の存在または不存在にかかわらず、ビヒクルコントロールと比較して増殖を低下させた（データは示していない）。
【０２３３】
１０μＭの両化合物１および２と２４時間プレインキュベートした後に、ビヒクルのみとインキュベートした場合と比較して、顕著かつ有意な細胞数の減少が認められた（化合物１−７３％；化合物２−５５％）。化合物１とのプレインキュベーションはＣｏｎＡへの応答に対する効果を有さなかったが、化合物２とプレインキュベートされた細胞のＣｏｎＡに対する増殖応答は、ビヒクルのみとプレインキュベートされた細胞より有意に低下した。いずれの化合物とのプレインキュベーションもＬＰＳに対する応答に影響しなかった。分裂促進因子の不存在下で３日間培養した後の脾細胞生存性は、ビヒクルのみとプレインキュベートされていた細胞と比較して、化合物１によって影響を受けなかったが、化合物２によって有意に低下した。その結果を図１７に提供する。
【０２３４】
これらの結果は、両化合物が平常時リンパ球に対して細胞障害性であることを示唆する。化合物１は平常時リンパ球を細胞周期のＧ０またはＧ１期においてブロックしないと思われるが、化合物２は平常時Ｔ細胞の細胞周期に影響して、それらが、化合物２の不存在下でさえ、分裂刺激に応答できないようにする可能性がある。
【０２３５】
治療上の影響は、これらの化合物が免疫調節活性を有し、それが様々な標的において抗炎症性および心血管活性に寄与することである。
【０２３６】
８．毒性研究
【０２３７】
小規模な研究では、ＢＡＬＢ／ｃｎｕ／ｎｕマウスに、ｉ／ｐ注射によって、６％Ｔｗｅｅｎ２０：ＰＢＳ中の溶液として５０ｍｇ／ｋｇで化合物２（ｎ＝２）を投与するか、あるいは同容量のビヒクル（ｎ＝２）を投与した。マウスの体重を測定し、毎日、臨床モニタリングシートを使用して、毒性の徴候を観察した。９日目に、マウスを頸椎脱臼によって犠牲にし、毒性の組織学的評価のために各マウスの腎臓、脾臓および肝臓を収集した。図１８を参照のこと。
【０２３８】
化合物２を投与されたマウスおよびビヒクルのみを投与されたマウス間で、体重増加の差異、異常な臨床徴候、特に胃腸管の副作用、調査対象の任意の器官における毒性の組織学的証拠はなかった。
【０２３９】
理論によって拘束されることを望まないが、本発明の化合物は動物細胞内の多種多様なシグナル伝達過程を調節すると考えられ、これらのシグナル伝達過程は、すべての動物細胞の生存および機能に不可欠な広範囲の機能に関与するものである。したがって、これらの化合物は、ヒトを含めた動物において広範囲かつ重要な健康上の利点を有し、特に重要かつ一般的なヒト疾患、障害および機能を予防および治療する可能性を有し、それは実質的に予測できない利点である。
【０２４０】
本発明の具体的の利点は、（ａ）該化合物の標的である大規模な範囲のシグナル伝達過程、（ｂ）これらの様々な過程の調節にいくつかの過程の上方調節および他の過程の下方調節の両者が含まれること、および（ｃ）さらに、シグナル伝達過程に対するそのような広く多様な効果が代謝およびステロイド産生に必須な一連の重要な酵素に依存しない作用によって達成されることにある。
【０２４１】
本明細書中での任意の先行技術に対する言及は、謝辞または、該先行技術が努力分野の通常の一般的知識の部分を形成することを示唆するいかなる形式のものでもなく、そのように解されるべきではない。
【０２４２】
当業者は、本明細書中に記載の発明には、具体的に記載されるもの以外のバリエーションおよび改変の余地があることを認識する。本発明はすべてのそのようなバリエーションおよび改変を含むことが理解されるべきである。本発明は、さらに、本明細書中で言及または記載されるすべての段階、特徴、組成物および化合物を、個別または包括的に含み、任意の２種以上の該段階または特徴の任意およびすべての組み合わせを含む。
【０２４３】
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【図面の簡単な説明】
【０２６５】
【図１】ＬＰＳとインキュベートされたヒト単球におけるＰＧＥ２合成に対するＣｐｄ．１の効果を示す。
【図２】ＬＰＳとインキュベートされたヒト単球におけるＰＧＥ２合成に対するＣｐｄ．２の効果を示す。
【図３】ＬＰＳとインキュベートされたヒト単球におけるＴＸＢ２合成に対するＣｐｄ．１の効果を示す。
【図４】ＬＰＳとインキュベートされたヒト単球におけるＴＸＢ２合成に対するＣｐｄ．２の効果を示す。
【図５】ＬＰＳとインキュベートされたヒト単球におけるＴＮＦα合成に対するＣｐｄ．１の効果を示す。
【図６】ＬＰＳとインキュベートされたヒト単球におけるＴＮＦα合成に対するＣｐｄ．１の効果を示す。
【図７】ＬＰＳで刺激されたマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）におけるＣｐｄ．１の活性を示す。
【図８】ＬＰＳで刺激されたマウスマクロファージ（ＲＡＷ２６４．７）におけるＣｐｄ．２の活性を示す。
【図９】ノルアドレナリンによって誘発される大動脈の収縮性に対するＣｐｄ．２の効果を示す。
【図１０】ＨＰＡＣ（膵臓）細胞に対するＣｐｄ．２およびゲムシタビンの相乗効果を示す。プロットＡは、Ｃｐｄ．２およびゲムシタビンの組み合わせを示し、ＢおよびＣは、それぞれ２４時間順方向（Ｃｐｄ．２が最初）および逆方向（ゲムシタビンが最初）の順序である。
【図１１】順方向（Ａ）および逆方向（Ｂ）の両順序でＣｐｄ．２（５μＭおよび１０μＭ）および９連続希釈ゲムシタビン濃度で経時的に処理されたＨＴ−２９（結腸直腸）細胞を示す。
【図１２】ＨＴ−２９（結腸直腸）細胞に対するＣｐｄ．２（１μＭおよび２μＭ）およびパクリタキセルの相乗効果を示す。プロットＡは、Ｃｐｄ．２およびパクリタキセルの組み合わせを示し、ＢおよびＣは、それぞれ２４時間順方向（Ｃｐｄ．２が最初）および逆方向（パクリタキセルが最初）の順序である。
【図１３】ＨＣＴ−１５（結腸直腸）細胞に対するＣｐｄ．２（１μＭおよび２μＭ）およびパクリタキセルの相乗効果を示す。プロットＡは、Ｃｐｄ．２およびパクリタキセルの組み合わせを示し、ＢおよびＣは、それぞれ２４時間順方向（Ｃｐｄ．２が最初）および逆方向（パクリタキセルが最初）の順序である。
【図１４】ＨＴ−２９（結腸直腸）細胞に対するＣｐｄ．２（１μＭおよび２μＭ）およびドキシルビシンの相乗効果を示す。プロットＡは、Ｃｐｄ．２およびドキシルビシンの組み合わせを示し、ＢおよびＣは、それぞれ２４時間順方向（Ｃｐｄ．２が最初）および逆方向（ドキシルビシンが最初）の順序である。
【図１５】ＨＣＴ−１５（結腸直腸）細胞に対するＣｐｄ．２（１μＭおよび２μＭ）およびドキシルビシンの相乗効果を示す。プロットＡは、Ｃｐｄ．２およびドキシルビシンの組み合わせを示し、ＢおよびＣは、それぞれ２４時間順方向（Ｃｐｄ．２が最初）および逆方向（ドキシルビシンが最初）の順序である。
【図１６】Ｔ細胞増殖の阻害に関するＣｐｄ．１（１０μＭ）の効果を示す。
【図１７】２４時間のプレインキュベーション後のＴ細胞増殖の阻害に関するＣｐｄ．１およびＣｐｄ．２（ともに１０μＭ）の効果を示す。
【図１８】Ｃｐｄ．２（５０ｍｇ／ｋｇ／日）またはビヒクルのｉ／ｐ投与後の体重変化の比較を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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