(57)【要約】  本発明は、ある細胞集団から抗原特異的Ｔ細胞を増大させるための方法を包含する。本発明の方法は、細胞集団をＭＨＣ限定抗原性ペプチド、サイトカイン及び補助−刺激シグナル接触させることを含んでなる。本発明は、抗原特異的Ｔ細胞を含んでなる組成物及びキットも包含する。
2008539758.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ある細胞集団中のウイルス特異的Ｔ細胞を増大させる（ｅｘｐａｎｄｉｎｇ）方法であって、ヒトから該細胞集団を単離し、該細胞集団をＭＨＣ限定ウイルス抗原性ペプチド、サイトカイン及び抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８コーティングされたビーズである補助−刺激シグナル（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）と接触させ、それにより該細胞集団からのウイルス特異的Ｔ細胞を増大させることを含んでなる方法。
【請求項２】
該ヒトが以前に該ウイルスに感染した請求項１の方法。
【請求項３】
該Ｔ細胞がＣ型肝炎ウイルスに特異的である請求項１の方法。
【請求項４】
該サイトカインがインターロイキン−２である請求項１の方法。
【請求項５】
細胞集団をウイルス特異的Ｔ細胞に関して豊富にする方法であって、ヒトから該細胞集団を単離し、該細胞集団をＭＨＣ限定ウイルス抗原性ペプチド、サイトカイン及び抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８コーティングされたビーズである補助−刺激シグナルと接触させ、それにより細胞集団をウイルス特異的Ｔ細胞に関して豊富にすることを含んでなる方法。
【請求項６】
該ヒトが以前に該ウイルスに感染した請求項５の方法。
【請求項７】
該Ｔ細胞がＣ型肝炎ウイルスに特異的である請求項５の方法。
【請求項８】
該サイトカインがインターロイキン−２である請求項５の方法。
【請求項９】
ウイルス特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する方法であって、該細胞をＭＨＣ限定ウイルス抗原性ペプチド、サイトカイン及び抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８コーティングされたビーズである補助−刺激シグナルと接触させ、それによりウイルス特異的Ｔ細胞の増殖を誘導することを含んでなる方法。
【請求項１０】
該Ｔ細胞がＣ型肝炎ウイルスに特異的である請求項１０の方法。
【請求項１１】
該サイトカインがインターロイキン−２である請求項１０の方法。
【請求項１２】
ヒトから細胞集団を単離し、該細胞集団をＭＨＣ限定ウイルス抗原性ペプチド、サイトカイン及び抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８コーティングされたビーズである補助−刺激シグナルと接触させることにより生成するウイルス特異的Ｔ細胞。
【請求項１３】
該Ｔ細胞がＣ型肝炎ウイルスに特異的である請求項１３の方法。
【請求項１４】
該サイトカインがインターロイキン−２である請求項１３の方法。
【請求項１５】
細胞集団からのウイルス特異的Ｔ細胞を増大させるためのキットであって、インターロイキン−２、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８コーティングされたビーズ及びウイルス抗原性ペプチドを含んでなり、ここで該ペプチドが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３中に示されるペプチド、ＨＣＶ  コアタンパク質１５−ｍｅｒ及びＨＣＶ  ＮＳ３  １５−ｍｅｒより成る群から選ばれるキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
発明の背景
感染性ウイルス性疾患は、世界にとって困難な公衆衛生の問題を与える。抗ウイルス薬剤はほとんどなく、ワクチンはほとんど予防的援助のみを与え、感染が始まると援助を与えない。感染性ウイルスの例には以下の科に属するウイルスが含まれる：ピコルナウイルス、アデノウイルス、レトロウイルス、パラミクソウイルス、ブンヤウイルス、パポバウイルス、疱疹ウイルス、レオウイルス、ポックスウイルス、トガウイルス、フィロウイルス、パルボウイルス、カリシウイルス、ヘパドナウイルス、オルソミクソウイルス、アレナウイルス、フィロウイルス、ラブドウイルス、コロナウイルス及びフラビウイルス。
【０００２】
Ｃ型肝炎は、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）であるフラビウイルスによる感染により引き起こされる、肝臓の炎症を特徴とする疾患である。１９９２年７月以前に輸血を受けたこと；Ｃ型肝炎を有するドナーからの血液、血液製剤又は実質性器官（ｓｏｌｉｄ  ｏｒｇａｎ）を受けたこと；違法の薬剤の注射又はＨＣＶを有する誰かとの針の共有；長期間の腎臓透析；血液との頻繁な職場接触；複数のパートナー又はＨＣＶに感染したパートナーと性交すること；ＨＣＶに感染している誰かとのハブラシ及びカミソリのような個人用品の共有；あるいはＨＣＶ感染した母親からの出産を含む、ＨＣＶによる感染に関する多数の危険因子が同定されている。
【０００３】
合衆国で約４百万人の人々又は約７０人中の１人〜１００人中の１人がＨＣＶに感染していると見積もられる。ＨＣＶは多くの場合に無症候性であり、慣例的な身体的又は他の医学的処置のための血液検査の間に始めて検出される。感染が多年の間存在した場合、肝臓は永久的に瘢痕を形成し得、それは臨床的に肝硬変として知られている。多くの場合、肝硬変が現れるまで疾患の症状はない。
【０００４】
ＨＣＶ感染の症状がある場合、それらは黄疸、腹痛、疲労、食欲の喪失、吐気及び嘔吐、微熱（ｌｏｗ  ｇｒａｄｅ  ｆｅｖｅｒ）、薄いか又は粘土色の便、暗色の尿、全身的かゆみ、腹水及び食道の静脈の拡張を含み得る。
【０００５】
現在、ＨＣＶに関して治癒はない。最も普通の処置は、インターフェロン  アルファ又はインターフェロン  アルファとリバビリンの組み合わせの投与を含む。インターフェロン  アルファは、皮膚の直下における注射により投与され、インフルエンザ−様症状、頭痛、熱、疲労、食欲の喪失、吐気、嘔吐、抑うつ及び薄くなる毛髪を含む複数の副作用を有する。インターフェロン  アルファを用いる処置は、白血球及び血小板の生産を妨げもし得る。リバビリンは１日に２回摂取されるカプセルであり、主な副作用は重症の貧血（低赤血球）である。リバビリンは分娩障害（ｂｉｒｔｈ  ｄｅｆｅｃｔｓ）も引き起こし得る。
【０００６】
今日、ＨＣＶは合衆国における慢性肝臓病の最も普通の原因の１つである。急性Ｃ型肝炎を有する患者の少なくとも８０％が結局は慢性肝臓感染を発病し、そして２０％〜３０％が肝硬変を発病する。患者の１％〜５％は肝臓ガンを発病し得る。現在Ｃ型肝炎は、合衆国における肝臓移植に関する第１の原因である。
【０００７】
養子移植は、同種異系移植片拒絶を研究するためにＭｅｄａｗａｒ（非特許文献１）により造りだされた用語である。養子免疫療法という用語は、ガン又はＨＣＶを含む感染性疾患の処置のための免疫応答性細胞の移植を示す（非特許文献２；非特許文献３）。養子療法は、損傷を受けた組織又は系の生物学的機能を、自系又は同種異系細胞により置き換
えるか、修復するか、又は強化することを目的とする戦略と考えられ得る。
【０００８】
養子免疫療法は、種々のウイルス感染を処置するために診療所で用いられてきた。注入すると高い移植の程度を可能にする生体外増大した（ｅｘｐａｎｄｅｄ）ポリクローナルＣＤ４  Ｔ細胞の最初の成功裏の注入は、抗−ＣＤ３及び抗−ＣＤ２８ビーズがコーティングされた磁性ビーズ（αＣＤ３／２８コーティングされたビーズ）を用いて、ＨＩＶ感染患者からの生体外増大したＴ細胞に行なわれた（非特許文献４）。
【０００９】
αＣＤ３／２８を含んでなるコーティングされたビーズは、Ｔ細胞活性化及び成長に必要なシグナルを送達し、ＣＣＲ５の下方調節及び種々のリガンド、β−ケモカイン  ＲＡＮＴＥＳ、マクロファージ炎症タンパク質−１アルファ（ＭＩＰ−１α）及びＭＩＰ−１βの発現の上方調節により、Ｔ細胞を感染に対して抵抗性にする（非特許文献５；非特許文献６；非特許文献７）。いくつかの第Ｉ及びＩＩ相試験は、αＣＤ３／２８コーティングされたビーズを用いて増大させられた最高で３ｘ１０１０個の自系ＣＤ４  Ｔ細胞の、感染した個体への注入が安全であり且つ実行可能であることを示した（非特許文献７；非特許文献４；非特許文献８；非特許文献９）。さらに重要なことに、全リンパ球カウント、ＣＤ４対ＣＤ８  Ｔ細胞比、サイトカイン−分泌性Ｔ細胞の割合及び反応して抗原を回復させる（ｒｅｃａｌｌ）能力における持続的増加が観察され、養子Ｔ細胞免疫療法が少なくとも限られた免疫機能を感染した個体に復帰させる可能性を有することを示唆している（非特許文献４）。
【００１０】
一般的な感染及び特にＨＣＶ感染におけるウイルス感染の重大性ならびにウイルス感染の処置のための実行可能な手段としての養子免疫療法の有望性を与えられ、ウイルス感染への免疫反応の試験における使用のため、及びウイルス性疾患の処置のための、標的とされるリンパ球を特異的に作るための方法及び組成物が必要である。本発明はこの要求を満たす。
【非特許文献１】Ｍｅｄａｗａｒ著，Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙａｌ  Ｓｏｃ．１４３：１９５４年，５８−８０
【非特許文献２】Ｊｕｎｅ，Ｃ．Ｈ．編集，Ｉｎ：Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，２００１年
【非特許文献３】Ｖｏｎｄｅｒｈｅｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｉｍｍｕｎ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２７：２００３年，１−１５
【非特許文献４】Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．８：２００２年，４７−５３
【非特許文献５】Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１９９６年，１９３９−１９４３
【非特許文献６】Ｒｉｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：１９９７年，５５４５−５５５３
【非特許文献７】Ｃａｒｒｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７６：１９９７年，２７３−２７６
【非特許文献８】Ｗａｌｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｂｌｏｏｄ  ９６：２０００年，４６７−４７４
【非特許文献９】Ｒａｎｇａ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ９５：１９９８年，１２０１−１２０６
【発明の開示】
【００１１】
発明の簡単なまとめ
本発明はある細胞集団中のウイルス特異的Ｔ細胞を増大させる方法を含み、それはヒトから該細胞集団を単離し、該細胞集団をＭＨＣ限定ウイルス抗原性ペプチド、サイトカイン及び抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８コーティングされたビーズである補助−刺激シグナル（ｃｏ−ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙ  ｓｉｇｎａｌ）と接触させ、それにより該細胞集団からのウイルス特異的Ｔ細胞を増大させることを含んでなる。
【００１２】
本発明の１つの側面において、ヒトは以前に該ウイルスに感染した。
【００１３】
本発明の他の側面において、Ｔ細胞はＣ型肝炎ウイルスに特異的である。
【００１４】
本発明のさらに別の側面において、サイトカインはインターロイキン−２である。
【００１５】
本発明は細胞集団をウイルス特異的Ｔ細胞に関して豊富にする方法を含み、その方法は、ヒトから該細胞集団を単離し、該細胞集団をＭＨＣ限定ウイルス抗原性ペプチド、サイトカイン及び抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８コーティングされたビーズである補助−刺激シグナルと接触させ、それにより細胞集団をウイルス特異的Ｔ細胞に関して豊富にすることを含んでなる。
【００１６】
本発明の１つの側面において、ヒトは以前に該ウイルスに感染した。
【００１７】
本発明の他の側面において、Ｔ細胞はＣ型肝炎ウイルスに特異的である。
【００１８】
本発明のさらに別の側面において、サイトカインはインターロイキン−２である。
【００１９】
本発明はウイルス特異的Ｔ細胞の増殖を誘導する方法を含み、その方法は、該細胞をＭＨＣ限定ウイルス抗原性ペプチド、サイトカイン及び抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８コーティングされたビーズである補助−刺激シグナルと接触させ、それによりウイルス特異的Ｔ細胞の増殖を誘導することを含んでなる。
【００２０】
本発明の１つの側面において、Ｔ細胞はＣ型肝炎ウイルスに特異的である。
【００２１】
本発明の他の側面において、サイトカインはインターロイキン−２である。
【００２２】
本発明は、ヒトから細胞集団を単離し、該細胞集団をＭＨＣ限定ウイルス抗原性ペプチド、サイトカイン及び抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８コーティングされたビーズである補助−刺激シグナルと接触させることにより生成するウイルス特異的Ｔ細胞を含む。
【００２３】
本発明の１つの側面において、Ｔ細胞はＣ型肝炎ウイルスに特異的である。
【００２４】
本発明の他の側面において、サイトカインはインターロイキン−２である。
【００２５】
本発明は細胞集団からのウイルス特異的Ｔ細胞を増大させるためのキットを含み、該キ
ットはインターロイキン−２、抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８コーティングされたビーズ及びウイルス抗原性ペプチドを含んでなり、ここで該ペプチドが配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３中に示されるペプチド、ＨＣＶ  コアタンパク質  １５−ｍｅｒ及びＨＣＶ  ＮＳ３  １５−ｍｅｒより成る群から選ばれる。
【００２６】
図面の簡単な記述
本発明を例示する目的で、本発明のある態様を図面に描く。しかしながら、本発明は図面中に描かれる態様の正確な配置及び手段に制限されない。
【００２７】
図１は、示される比率におけるαＣＤ３／２８ビーズならびにＩＬ−２及びＨＣＶペプチドを用いる同時増大を介する、単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試験管内増大を描くグラフである。
【００２８】
図２は、αＣＤ３／２８ビーズ、ＩＬ−２及びＨＣＶペプチドを用いる刺激後に試料採取された全リンパ球に対するＨＣＶテトラマーに関して陽性のＣＤ８細胞のパーセンテージを描くグラフである。星印は、１５−ｍｅｒプールを用いる１０日における付加的な刺激を示す。
【００２９】
図３は、ａＣＤ３／２８ビーズ、ＨＣＶペプチド及びＩＬ−２を用いる刺激の前後のＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析により決定されるＨＣＶ特異的テトラマーに関して陽性のＣＤ８  Ｔ細胞を描く１系列の画像である。各ＦＡＣＳプロットにおける各円中の数字は、０日、７日及び１７日における３つのＨＬＡ−Ａ２限定ＨＣＶ  ＣＴＬエピトープに関するＨＣＶテトラマー陽性ＣＤ８細胞／リンパ系細胞のパーセントを示す。
【００３０】
図４は、本発明中で用いられる１５−ｍｅｒが由来するコア及びＮＳ３タンパク質を含むＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列である（配列番号：６３）。
【００３１】
本発明の詳細な記述
本発明は、リンパ球細胞集団からのウイルス特異的Ｔ細胞を急速に増大させる方法の発見に関する。すなわち、本明細書に開示されるデータにより示される通り、本発明はウイルス特異的リンパ球、好ましくはＣＤ８細胞を増大させ、リンパ球集団をウイルス特異的リンパ球、好ましくはＣＤ８細胞に関して豊富にする方法を含む。本発明はさらに、本発明の方法により増大したリンパ球を含む。
【００３２】
定義
本明細書で用いられる場合、以下の用語のそれぞれは、この節においてそれと関連付けられる（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）意味を有する。
【００３３】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は本明細書で、冠詞の文法的な目的語の１つ又は１つより多く（すなわち少なくとも１つ）を指すために用いられる。例えば「要素」は１つの要素又は１つより多い要素を意味する。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「アミノ酸」は下記の表に示されるそれらの完全な名前、それらに対応する３−文字コード又はそれらに対応する１−文字コードにより示される：
【００３５】
【表１】
2008539758.tif 000003
【００３６】
「アプリケーター」という用語により、その用語が本明細書で用いられる場合、本発明の化合物及び組成物を投与するための皮下注射器、ピペットなどを含むがこれらに限られないいずれかの装置を意味する。
【００３７】
「疾患」は、動物がホメオスタシスを維持できず、疾患が改善されないと動物の健康が悪化し続ける動物の健康状態である。対照的に、動物における「障害」は、動物がホメオステシスを維持できるが、動物の健康状態が障害の不在下におけるより好ましくない健康状態である。処置されないままにされる場合、障害は必ずしも動物の健康状態をさらに低下させるとは限らない。
【００３８】
本明細書で用いられる場合、「有効量」という用語により、動物に投与されると、化合物の不在下で検出されるＴ細胞反応と比較して検出可能なレベルのＴ細胞反応を引き起こす量を意味する。当該技術分野で認められている非常に多くの方法により、Ｔ細胞反応を容易に評価することができる。
【００３９】
熟練者は、本明細書で投与される化合物又は組成物の量が様々であり、処置されている疾患又は状態、処置されている哺乳類の年令ならびに健康及び身体状態、疾患の重度、投与されている特定の化合物などのような複数の因子に基づいて容易に決定することができることを理解するであろう。
【００４０】
「使用説明資料」は、その用語が本明細書で用いられる場合、本明細書に挙げられる種々の疾患又は障害の軽減又は処置を行なうための、キット中の本発明の組成物及び／又は化合物の有用性を伝えるために用いることができる出版物、記録（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）、図又は他のいずれかの表現媒体を含む。場合により、又は代わりに、使用説明資料は、本明細書の他の箇所で開示されるようなものを含んで、細胞又は組織又は哺乳類における疾患又は障害の１つもしくはそれより多い軽減方法を記載することができる。
【００４１】
キットの使用説明資料を、例えば本発明の化合物及び／又は組成物を含有する容器に添付することができるか、あるいは化合物及び／又は組成物を含有する容器と連帯して輸送
することができる。あるいはまた、受領者が使用説明資料及び化合物を連携して（ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）使用するという意図で、使用説明資料を容器と別に輸送することができる。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、「製薬学的に許容され得る担体」という用語は、それを用いて活性成分を合わせることができ、且つ合わせた後に患者に活性成分を投与するために用いることができる化学的組成物を意味する。
【００４３】
「組換えポリヌクレオチド」は、自然には連結しない配列を有するポリヌクレオチドを指す。増幅されたか又は集合した組換えポリヌクレオチドを適したベクター中に含ませ、ベクターを用いて適した宿主細胞を形質転換させることができる。
【００４４】
組換えポリヌクレオチドは同様に、非−コード機能（例えばプロモーター、複製起点、リボソーム−結合部位など）に役立つこともできる。
【００４５】
「組換えポリペプチド」は、組換えポリヌクレオチドが発現されると生産されるものである。
【００４６】
「ポリペプチド」は、ペプチド結合、関連する天然に存在するその構造的変異体及び合成的な天然に存在しないその類似体を介して連結したアミノ酸残基から成るポリマー、関連する天然に存在するその構造的変異体及び合成的な天然に存在しないその類似体を指す。合成ポリペプチドは、例えば自動ポリペプチドシンセサイザーを用いて合成することができる。
【００４７】
「タンパク質」という用語は、典型的には大きなポリペプチドを指す。
【００４８】
「ペプチド」という用語は、典型的には短いポリペプチドを指す。
【００４９】
本明細書で、ポリペプチド配列を表現するために通常の表示法が用いられる：ポリペプチド配列の左側の末端はアミノ−末端であり；ポリペプチド配列の右側の末端はカルボキシル−末端である。
【００５０】
本明細書で用いられる場合、「処置」することは、患者が疾患の症状（すなわちウイルス感染、腫瘍成長及び／又は転移あるいはＴ細胞の数の減少及び／又はその活性の低下により媒介される他の影響など）を経験する頻度を減少させることを意味する。
【００５１】
「治療的」処置は、病状（ｐａｔｈｏｌｏｇｙ）の兆候を示す患者に、それらの兆候を減少させるかもしくは除去する及び／又は兆候の頻度、持続時間及び強さを低下させるかもしくは減少させる目的で施される処置である。
【００５２】
化合物の「有効量」は、Ｔ細胞集団あるいはＴ細胞が投与された及び／又は接触した哺乳類に検出可能な効果を与えるのに十分な細胞（例えば本発明に従って刺激された及び／又は増大したＴ細胞）の量である。
【００５３】
本明細書で用いられる場合、「特異的に結合する」という用語により、試料中に存在する同族結合パートナー（例えばＴ細胞上に存在する刺激及び／又は補助刺激分子）タンパク質を認識し、結合する抗体を意味するが、その抗体又はリガンドは試料中の他の分子を実質的に認識せず、又はそれに結合しない。
【００５４】
記述
本発明は、抗原性ペプチド、サイトカイン及び補助−刺激シグナルを用い、ヒトリンパ球及びヒトリンパ球集団から多量の抗原特異的Ｔ細胞を増大させることができるという驚くべき発見に関する。特に本発明は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団をサイトカイン、抗原性ペプチド及び補助−刺激シグナルを与えるビーズと接触させることにより、ＰＢＭＣの集団からウイルス特異的Ｔ細胞を増大させて豊富にすることができるという発見を含む。
【００５５】
Ｉ．方法
本発明は、ヒトリンパ球の集団から抗原特異的Ｔ細胞を増大させる方法を包含する。本発明の組成物及び方法は、ウイルスに感染した宿主細胞を標的とするために特に好ましい。ＣＴＬ反応は、多様なウイルスへのほとんどの哺乳類の免疫反応の重要な成分であり、本発明は、ウイルス−感染細胞へのＣＴＬ反応を有効に刺激し、宿主哺乳類におけるそのような感染を処置又は予防するための手段を提供する。かくして本発明の組成物及び方法を、タンパク質及び／又はペプチド抗原を与えるいずれのウイルスに適用することもできる。そのようなウイルスには以下、病原性ウイルス、例えばインフルエンザＡ及びＢウイルス（ＦＬＵ−Ａ、ＦＬＵ−Ｂ）、ヒト免疫不全Ｉ型及びＩＩ型ウイルス（ＨＩＶ−Ｉ、ＨＩＶ−ＩＩ）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、ヒトＴ細胞向性（又はＴ−細胞白血病）ウイルスＩ型及びＩＩ型（ＨＴＬＶ−Ｉ、ＨＴＬＶ−ＩＩ）、ヒト乳頭腫ウイルス１型〜１８型（ＨＰＶ−１〜ＨＰＶ−１８）、風疹（ＲＶ）、水痘−帯状疱疹（ＶＺＶ）、Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）及び単純疱疹ウイルス（ＨＶ）が含まれるが、これらに限られない。さらに、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ポリオウイルス、ＲＳウイルス（ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）（ＲＳＶ）、リノウイルス、狂犬病、流行性耳下腺炎、ロタウイルス及び麻疹ウイルス。
【００５６】
方法は、ヒトドナーからリンパ球、好ましくは一次末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離し、ＰＢＭＣを抗原性ペプチド、サイトカイン及び補助−刺激シグナルと接触させることを含んでなる。本発明の１つの態様において、ヒトドナーは以前のウイルスへの感染の歴史を有する。本発明の１つの態様において、ウイルスはＨＣＶ、ＨＩＶ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、フラビウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単純疱疹ウイルス１、単純疱疹ウイルス２、水痘−帯状疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス６、乳頭腫ウイルス、パルボウイルス  Ｂ１９、ポリオーマウイルス  ＢＫ、ポリオーマウイルス  ＪＣ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトＴ−細胞ウイルスＩ及びヒトＴ−細胞ウイルスＩＩである。好ましくは、ウイルスはＨＣＶである。
【００５７】
本発明の方法はさらに、ＰＢＭＣを抗原性ペプチドと接触させることを含んでなる。本発明において用いられる抗原性ペプチドは、好ましくはウイルスの既知の抗原であるペプチドである。すなわち、本発明の抗原性ペプチドは、好ましくは細胞がウイルスに感染した時にＭＨＣ分子と関連して（ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｎｔｅｘｔ  ｏｆ）細胞により発現される抗原である。１つの態様において、抗原はＨＣＶ  ＮＳ３  １０７３ペプチド、ＨＣＶ  ＮＳ３  １４０６ペプチド、ＨＣＶ  ＮＳ５  ２５９４ペプチド、ＨＣＶコアタンパク質からの１５−ｍｅｒ及びＨＣＶ  ＮＳ３タンパク質からの１５−ｍｅｒである。本発明はさらに、本明細書に開示されるもののような他のウイルスからの追加のＭＨＣ限定ＣＴＬエピトープを含んでなる。さらにもっと好ましくは、本発明の方法において用いられる抗原性ペプチド／ＣＴＬエピトープは、ＨＬＡ−Ａ２に限定される。
【００５８】
抗原性ペプチド、特にＭＨＣ限定ウイルス抗原性ペプチドの同定法は当該技術分野において周知であり、例えば米国特許第５，７８０，０３６、５，７８３，５６７号明細書及び米国特許第６，４１９，９３１号明細書に開示されており、それらのすべては引用する
ことによりその記載事項全体が本明細書の内容となる。ＭＨＣ第Ｉ種限定ＣＴＬは、ベータシートにより形成される溝の床を有する２つのアルファらせんの間に形成される第Ｉ種分子上の抗原結合部位中に与えられるプロセシングされたウイルスペプチドを認識する。与えられるペプチドの正体を決定するために複数の方法が用いられてきた。最も正確な定義は、第Ｉ種分子からのそのようなペプチドの溶離から成され、同じ第Ｉ種分子により与えられるペプチドが共有する一貫したモチーフを明らかにした。結合モチーフは、ペプチドと第Ｉ種結合溝中の特異的なポケットの間の接触部位として働くアンカー残基により特徴付けられる。エピトープ性ペプチドのアミノ及びカルボキシ末端は、水素結合の故にこの溝のそれぞれＡ及びＦポケット中にはまる。ペプチドのアミノ末端アンカーは位置及び数において可変であるが、カルボキシアンカーは常にＣ−末端にあり、側鎖は直接Ｆポケットの底内に向いている。アミノ末端アンカー残基の間には有意な不均一性があるが、Ｆポケットはそれが受け入れるアミノ酸に比較的多くの制限を設けると思われ、ロイシン、イソロイシン、アルギニン、チロシン、バリン又はフェニルアラニンは９５％を超える既知のエピトープのＣ−末端にある。抗原性ペプチドに関するモチーフの予測は現在、多数のＨＬＡ第Ｉ種分子に関して成され、当該技術分野において既知である。そのようなＭＨＣ第Ｉ種ウイルスペプチドには下記の表に挙げられるペプチドが含まれるが、これらに限られない。
【００５９】
【表２】
2008539758.tif 000004
【００６０】
【表３】
2008539758.tif 000005
【００６１】
本発明は、ＰＢＭＣをサイトカインと接触させることも含んでなる。好ましくは、サイトカインはＴ−細胞成長因子サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＦＮγなどである。さらにもっと好ましくは、サイトカインはＩＬ−２である。組換えＩＬ−２（ｒＩＬ２）は、例えばＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から商業的に入手可能である。
【００６２】
本明細書に開示される発明はさらに、ＰＢＭＣを補助−刺激シグナルと接触させることを含んでなる。好ましくは、補助−刺激シグナルは、Ｔ細胞に特異的に結合して補助−刺激シグナルを与える抗体を含んでなるビーズである。補助−刺激シグナルの例には抗−ＣＤ３抗体及び抗−ＣＤ２８抗体が含まれるが、これらに限られない。抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８抗体がコーティングされたビーズ（αＣＤ３／２８）の製造方法は当該技術分野に
おいて既知であり、例えばＬｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．８：２００２年，４７−５３；Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１９９６年，１９３９−１９４３）に記載されている。
【００６３】
本明細書に開示されるデータに示される通り、ＰＢＭＣをαＣＤ３／２８ビーズと、種々のビーズ対細胞の比率で接触させる。好ましくは、ＰＢＭＣを約１：１（αＣＤ３／２８：細胞）の比率で、さらに好ましくは約１：４の比率で、さらにもっと好ましくは１：５の比率で接触させる。熟練者は、本開示及び本明細書に開示されるデータを備えると、例えば１：１０、１：２０、１：５０及び１：１００の比率を含む他のαＣＤ３／２８：細胞比を決定することができる。
【００６４】
本明細書の他の箇所で開示される通り、ＰＢＭＣを抗原性ペプチド、サイトカイン及び補助−刺激シグナルと、実質的に同時のでき事として接触させる。すなわち、抗原性ペプチド、サイトカイン及び補助−刺激シグナルを大体同時にか又は互いに密接した時間内に細胞に与える。本発明はさらにＰＢＭＣを抗原性ペプチド、サイトカイン及び補助−刺激シグナルと異なる時点に接触させることを包含する。すなわち本発明は、本発明に開示される方法を長時間により隔てられた明らかに別のでき事として行なうことを包含する。
【００６５】
本発明の方法は、特に増大するＴ細胞のみが抗原性ペプチドが由来するウイルスに関して特異的である点で、Ｔ細胞、好ましくはＣＤ８  Ｔ細胞を増大させる。かくして増大するべきＴ細胞が細胞の混合物中に存在する場合、問題のＴ細胞が増殖し且つ細胞数において増大するように誘導されるであろう。さらに、本明細書に開示されるデータにより示される通り、ウイルス抗原に関して特異的である多数のＴ細胞が増大し、細胞の混合物はウイルス特異的Ｔ細胞に関して豊富になる。さらに、多様な細胞分離及び精製法、例えば当該技術分野において既知の方法及び／又は本明細書の他の箇所で記載される方法を用い、Ｔ細胞をさらに精製することができる。
【００６６】
熟練者にわかる通り、本明細書に与えられる開示に基づくと、問題のＴ細胞は本発明の方法を用いる増大の前に同定又は単離される必要がない。これは、本発明の方法が与えられるウイルスからの抗原性ペプチドの型に関して選択的であり、抗原性ペプチドに反応性の単数種もしくは複数種のＴ細胞を増大させるであろうからである。
【００６７】
本発明は、Ｔ細胞集団サブセットを特異的に増大させる方法も含む。さらに特定的に、方法は、問題のサブセットの少なくとも１つのＴ細胞を含んでなるＴ細胞の集団を抗原性ペプチド、サイトカイン及びそのＴ細胞を増大させることができる補助−刺激シグナルと接触させることを含んでなる。これは、本明細書のデータにより示される通り、本発明の方法がＴ細胞の増殖を誘導し、それによりＴ細胞集団サブセットを特異的に増大させるからである。当該技術分野における熟練者は、本明細書に与えられる開示に基づき、そのＴ細胞サブセットがＴヘルパー（ＴＨ１及びＴＨ２）ＣＤ４発現、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）（Ｔｃ１及びＴｃ２）Ｔ調節（ＴＲＥＧ）、ＴＣ／Ｓ、ナイーブ、記憶、中枢記憶（ｃｅｎｔｒａｌ  ｍｅｍｏｒｙ）、エフェクター記憶（ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｍｅｍｏｒｙ）及びγδＴ細胞を含むことを理解するであろう。従って、本発明の方法を用いて特定のＴ細胞サブセットに関して豊富にされた細胞集団を容易に作ることができる。
【００６８】
本発明はさらに、哺乳類において抗原、好ましくはウイルス抗原へのＴ細胞反応を誘導する方法を包含する。方法は、動物からＰＢＭＣを単離し、ＰＢＭＣを抗原性ペプチド、好ましくはＭＨＣ限定抗原性ペプチド、サイトカイン及び補助−刺激シグナルと接触させることを含んでなる。好ましくは、サイトカインはＩＬ−２であり、補助−刺激シグナルはａＣＤ３／３８ビーズである。Ｔ細胞を増大させるための本発明の方法を用いて十分な数の抗原−特異的Ｔ細胞が得られたら、そのようにして得られた抗原−特異的Ｔ細胞を哺
乳類に投与し、それにより哺乳類において抗原へのＴ細胞反応を誘導する。これは、本発明の方法を用いて休止Ｔ細胞を刺激することにより、抗原−特異的Ｔ細胞を容易に生産できることを本明細書に開示されるデータが十分に示しているからである。
【００６９】
ＩＩ．組成物
本発明は、本発明の方法により作られる単離Ｔ細胞を包含する。好ましくは、Ｔ細胞はＣＤ８細胞である。さらにもっと好ましくは、ＣＤ８細胞はウイルス抗原に関して特異的である。熟練者は、本明細書に与えられる開示に基づき、多数のウイルス抗原を用いてほとんど無限に多様なウイルス特異的Ｔ細胞を作ることができることがわかるであろう。すなわち、感染細胞上でＭＨＣ分子と関連して発現される抗原性ペプチドに関する技術分野において、広範囲の知識がある。かくして当該技術分野における熟練者は、本明細書に開示される方法を用い、いずれのウイルスに関して特異的なＴ細胞をも作ることができる。
【００７０】
本発明の方法により作られるＴ細胞を、活性成分として本発明のウイルス特異的Ｔ細胞を含んでなる製薬学的組成物の調製及び使用において用いることができる。そのような製薬学的組成物は、患者への投与に適した形態における少なくとも１種の活性成分（例えば有効用量のウイルス特異的Ｔ細胞）の組み合わせとしての活性成分のみから成ることができるか、あるいは製薬学的組成物は活性成分及び１種もしくはそれより多い製薬学的に許容され得る担体、１種もしくはそれより多い追加の（活性及び／又は不活性）成分又はこれらの組み合わせを含んでなることができる。
【００７１】
本明細書で用いられる場合、「製薬学的に許容され得る担体」という用語は、それを用いて活性成分を合わせることができ、且つ合わせた後に患者に活性成分を投与するために用いることができる化学的組成物を意味する。
【００７２】
本明細書に記載される製薬学的組成物の調剤は、薬理学の技術分野において既知の又は今後開発されるいずれの方法によっても調製することができる。一般にそのような調製法は、活性成分を担体又は１種もしくはそれより多い他の補助成分と一緒にし、次いで必要であるかもしくは望ましい場合には生成物を所望の単−もしくは多−投薬量単位に成形又は包装する段階を含む。
【００７３】
本明細書に与えられる製薬学的組成物の記述は主にヒトへの医療的投与に適した製薬学的組成物に向けられるが、そのような組成物は一般的にすべての種類の動物への投与に適していることが熟練者に理解されるであろう。ヒトへの投与に適した製薬学的組成物の、組成物を種々の動物への投与に適したものとするための修正は十分に理解されており、通常の熟練した獣医学的薬理学者は、もし行なうとしても単に通常の実験を用いて、そのような修正を設計して行なうことができる。本発明の製薬学的組成物の投与が意図されている患者には、ヒト及び他の霊長類、ヒト以下の霊長類、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ及びイヌのような商業的に適した（ｃｏｍｍｅｒｃｉａｌｌｙ  ｒｅｌｅｖａｎｔ）哺乳類を含む哺乳類、ニワトリ、アヒル、ガチョウ及びシチメンチョウのような商業的に適した鳥類を含む鳥類、養殖魚（ｆａｒｍ−ｒａｉｓｅｄ  ｆｉｓｈ）及び水族館の魚ならびに養殖貝のような甲殻類を含む魚類が含まれるが、これらに限られない。
【００７４】
本発明の方法において有用な製薬学的組成物を、経口的、直腸的、膣的、非経口的、局所的、肺的、鼻内、頬的、眼的又は他の投与経路に適した調剤において調製するか、包装するか、又は販売することができる。他の意図される調剤には、射出されるナノ粒子、リポソーム調製物、活性成分を含有する再び封じられた（ｒｅｓｅａｌｅｄ）赤血球及び免疫学に基づく調剤が含まれる。
【００７５】
本発明の製薬学的組成物は、活性成分の他に、さらに１種もしくはそれより多い追加の
製薬学的に活性な薬剤を含むことができる。特定的に意図される追加の薬剤には、プロテアーゼ阻害剤、ヌクレオシド類似物、逆転写酵素阻害剤、インターフェロン  アルファ、リババリン（ｒｉｂａｖａｒｉｎ）などのような抗−ウイルス薬が含まれる。
【００７６】
本発明の製薬学的組成物をばらで、１単位投薬量として、又は複数の１単位投薬量として調製するか、包装するか、又は販売することができる。本明細書で用いられる場合、「単位投薬量」は、あらかじめ決められる量の活性成分を含んでなる製薬学的組成物の分離された量である。活性成分の量は一般に、患者に投与される活性成分の投薬量又はそのような投薬量の簡便な一部分、例えばそのような投薬量の二分の一又は三分の一に等しい。
【００７７】
本発明の製薬学的組成物中の活性成分、製薬学的に許容され得る担体及び追加の成分の相対的な量は、処置される患者の正体、大きさ及び状態に依存して、及びさらに組成物が投与されるべき経路に依存して変わるであろう。例えば組成物は０．１％〜１００％（ｗ／ｗ）の活性成分を含むことができる。
【００７８】
本明細書で用いられる場合、製薬学的組成物の「非経口的投与」は、患者の組織の物理的侵害を特徴とする投与経路及び組織における侵害を介する製薬学的組成物の投与を含む。かくして非経口的投与には、組成物の注入による、外科手術的切開を介する組成物の適用による、組織−浸透性非−外科手術的創傷を介する組成物の適用によるなどの製薬学的組成物の投与が含まれるが、これらに限られない。特に非経口的投与は、皮下、腹膜内、筋肉内、胸骨内注入及び腎臓透析的注入法を含むことが意図されているが、これらに限られない。
【００７９】
非経口的投与に適した製薬学的組成物の調剤は、製薬学的に許容され得る担体、例えば無菌水又は無菌の等張食塩水と合わされた活性成分を含む。そのような調剤をボーラス投与（ｂｏｌｕｓ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）又は継続的投与に適した形態で調製するか、包装するか又は販売することができる。注入可能な調剤を単位投薬量形態で、例えばアンプル中で又は防腐剤を含有する多−投薬量容器中で調製するか、包装するか又は販売することができる。非経口的投与のための調剤には油性又は水性ビヒクル中の懸濁剤、溶液、乳剤、ペースト及び体内埋植可能な徐放性又は生分解性調剤が含まれるが、これらに限られない。そのような調剤はさらに、懸濁化剤、安定剤又は分散剤を含むがこれらに限られない１種もしくはそれより多い追加の成分を含むことができる。非経口的投与のための調剤の１つの態様において、活性成分は、適したビヒクル（例えば無菌の発熱物質を含まない水）を用いて再構築してから再構築された組成物を非経口的に投与するための乾燥（すなわち粉末又は顆粒）形態で与えられる。
【００８０】
製薬学的組成物を無菌の注入可能な水性もしくは油性懸濁剤又は溶液の形態で調製するか、包装するか又は販売することができる。この懸濁剤又は溶液は、既知の技術に従って調製することができ、活性成分の他に、本明細書に記載される分散剤、湿潤剤又は懸濁化剤のような追加の成分を含むことができる。無毒性の非経口的に許容され得る希釈剤又は溶媒、例えば水もしくは１，３−ブタンジオールを用いてそのような無菌の注入可能な調剤を調製することができる。他の許容され得る希釈剤及び溶媒にはリンゲル液、等張塩化ナトリウム溶液及び固定油、例えば合成モノ−もしくはジ−グリセリドが含まれるが、これらに限られない。他の有用な非経口的−投与可能な調剤には、活性成分を微結晶形態で、リポソーム調製物中で又は生分解性ポリマー系の成分として含むものが含まれる。徐放又は体内埋植のための組成物は、製薬学的に許容され得るポリマー性もしくは疎水性材料、例えばエマルション、イオン交換樹脂、わずかにしか可溶性でないポリマー又はわずかにしか可溶性でない塩を含むことができる。
【００８１】
本発明のウイルス特異的Ｔ細胞及び／又は本発明の方法を用いて増大させられたＴ細胞
を動物、好ましくはヒトに投与することができる。本発明の方法を用いて増大させられたＴ細胞を投与する場合、投与される細胞の量は約百万個の細胞から約三千億個の細胞の範囲であることができる。投与される正確な投薬量は、処置されている動物の型及び疾患状態の型、動物の年令及び投与経路を含むがこれらに限られないいずれかの数の因子に依存して変わるであろう。
【００８２】
ウイルス特異的Ｔ細胞を１日に数回のように頻繁に動物に投与することができるか、あるいはそれを１日に１回、１週間に１回、２週間毎に１回、１ヶ月に１回のようにあまり頻繁でなく、あるいは数ヶ月毎に１回又は１年に１回かもしくはそれより少ないようなさらにもっと頻繁でなく投与することができる。投薬の頻度は熟練者に容易に明らかになり、処置されている疾患の型及び重度、動物の型及び年令などのような、しかしそれらに限られないいずれかの数の因子に依存するであろう。
【００８３】
ウイルス特異的Ｔ細胞を種々の他の化合物（他の多くの中でもサイトカイン、化学療法薬及び／又は抗ウイルス薬）と共−投与することができる。あるいは化合物をウイルス特異的Ｔ細胞より１時間、１日、１週間、１ヶ月又はそれよりもっと多く前にあるいはそれらのいずれかの交替（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）で投与することができる。さらに、化合物をウイルス特異的細胞の投与から１時間、１日、１週間又はそれより多く後にあるいはそれらのいずれかの交替で投与することができる。頻度及び投与管理は熟練者に容易に明らかになり、処置されている疾患の型及び重度、動物の年令及び健康状態、投与されている化合物の正体、種々の化合物及びウイルス特異的Ｔ細胞の投与経路などのような、しかしこれらに限られないいずれかの数の因子に依存するであろう。
【００８４】
ＩＩＩ．キット
本発明は、本発明のウイルス−特異的Ｔ細胞を作るための種々の試薬を含んでなる種々のキットを含む。そのような試薬には抗原性ペプチド、サイトカイン及び補助−刺激シグナルが含まれるが、これらに限られない。本発明のキットの１つの態様において、抗原性ペプチドは、ＨＣＶ、ＨＩＶ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｄ型肝炎ウイルス、アデノウイルス、フラビウイルス、サイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、単純疱疹ウイルス１、単純疱疹ウイルス２、水痘−帯状疱疹ウイルス、ヒト疱疹ウイルス６、乳頭腫ウイルス、パルボウイルス  Ｂ１９、ポリオーマウイルス  ＢＫ、ポリオーマウイルス  ＪＣ、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、ヒトＴ−細胞ウイルスＩ及びヒトＴ−細胞ウイルスＩＩを含むウイルスからのものである。本発明の１つの態様において、サイトカインはＩＬ−２であり、補助−刺激シグナルはαＣＤ３／２８である。本発明のキットはさらにアプリケーター及び本発明の方法を実施するためのキットの使用を記述する使用説明資料を含む。代表的なキットを下記に記載するが、他の有用なキットの内容は、本開示を見て熟練者に明らかであろう。これらのキットのそれぞれが本発明内に含まれる。
【００８５】
本発明は、ヒトにおけるウイルス感染を処置するためのキットを含む。すなわち本発明は、ウイルス感染の処置のためにヒト又は他の哺乳類に投与されるＴ細胞の増殖を誘導するためのＭＨＣ限定抗原性ペプチド、サイトカイン及び補助−刺激シグナルを含む。これは、本発明の方法がウイルス抗原に関して特異的なＴ細胞の増殖を誘導し、且つウイルス感染の処置のためにＴ細胞を使用できるからである。キットは、本発明で開示される方法に従って用いられる。要するに、キットを用いて哺乳類に本発明のウイルス特異的Ｔ細胞を投与することができる。これは、本明細書の他の箇所でもっと十分に開示される通り、本明細書に開示されるデータが、Ｔ細胞をＭＨＣ限定抗原性ペプチド、サイトカイン及び補助−刺激シグナルと接触させることは、細胞集団からのＴ細胞の増殖、特異性及び豊富化を媒介することを示すからである。このキットを用いて作られるＴ細胞を動物に投与して、治療的結果を達成することができる。
【００８６】
キットはさらに、本発明の方法により増大したＴ細胞を投与するのに有用なアプリケーターを含む。キット中に含まれる特定のアプリケーターは、例えばＴ細胞の投与に用いられる方法に依存するであろう。そのようなアプリケーターは当該技術分野において周知であり、他の中でもピペット、注射器、点滴注入器などが含まれ得る。さらにキットは、キットの使用のための使用説明資料を含む。これらの使用説明は、単に本明細書に与えられる開示を具体化する。
【００８７】
キットはさらに製薬学的に許容され得る担体を含むことができる。組成物は、本明細書の他の箇所に示される適した量で与えられる。さらに投与経路及び投与の頻度は、本明細書の他の箇所で前に示した通りである。
【００８８】
以下の実験的実施例に言及することにより、本発明をさらに詳細に記載する。これらの実施例は例示のみの目的で与えられ、他にことわらなければ制限を意図してはいない。かくして本発明はいかようにも以下の実施例に制限されるとみなされるべきではなく、むしろ本明細書に与えられる記述の結果として明らかになるいずれかの及びすべての変形を包含するとみなされるべきである。
【実施例】
【００８９】
実施例１：リンパ球からの抗原−特異的Ｔ−細胞の急速増大
Ｃ型肝炎ウイルス感染から自然に回復した患者から、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。単離されたＰＢＭＣを、表１中の案に従って０日に開始して刺激した。
【００９０】
【表４】
2008539758.tif 000006
【００９１】
Ｃ型肝炎ウイルス細胞毒性Ｔ−リンパ球（ＨＣＶ  ＣＴＬ）エピトープに関する配列又は参照符号（ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ）は以下の通りである：ＮＳ３  １０７３：ＣＶＮＧＶＣＷＴＶ（配列番号：１），ＮＳ３  １４０６：ＫＬＶＡＬＧＩＮＡＶ（配列番号：２），ＮＳ５  ２５９４：ＡＬＹＤＶＶＴＫＬ（配列番号：３）。コアタンパク質及びＮＳ３タンパク質を含むＨＣＶゲノムのアミノ酸配列を図４に示す（配列番号：６３）。ＨＣＶコア及びＮＳ３タンパク質からの重複ＨＣＶ−由来１５−ｍｅｒペプチドのプールの構築は、例えばＡｎｔｈｏｎｙ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１７２：２００４年，４９０７−４９１６）に記載されている。抗−ＣＤ３／抗−ＣＤ２８モノクローナル抗体がコーティングされたビーズ（αＣＤ３／２８ビーズ）は、例えばＬｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．著（Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ．８：２００２年，４７−５３；Ｌｅｖｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．著，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：１９９６年，１９３９−１９４３）に記載された通りに作られた。
【００９２】
最初の刺激に続き、培養物を３〜４日毎に完全培地中のｒＩＬ−２（１００Ｕ／ｍｌ）を用いて保持し、７日及び１７日に調べた。いくつかの場合には培養物を１０日に２つの別のウェルに分け、それらの一方のウェルにｒＩＬ２のみを与えたが、他方のウェルを第２の用量の０日におけると同じ抗原性ペプチドで刺激した。これは、全体的な細胞数における１０〜１５倍の増加を生じた（図１）。
【００９３】
現在記載する増大案は、０日における（刺激前）検出可能なＨＣＶ−特異的Ｔ細胞の低い頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）と比較すると、ＨＣＶ−特異的Ｔ細胞を顕著に豊富にした。ＨＣＶ−特異的Ｔ細胞の豊富化は、ＨＬＡ−Ａ２限定ＣＤ８  ＣＴＬエピトープに関して特異的なＭＨＣ／ペプチドテトラマーを用いて及び細胞内サイトカイン染色により検出された（図２及び３）。
【００９４】
本明細書に開示されるデータにより示される通り、抗原及びａＣＤ３／２８ビーズとｒＩＬ２を用いる同時の刺激は、試験管内で抗原−特異的Ｔ細胞を急速に増大させるための有効な方法である。
【００９５】
本明細書で引用したそれぞれの及びすべての特許、特許出願及び公開文献の開示は、引用することによりその記載事項全体が本明細書の内容となる。
【００９６】
特定の態様に言及して本発明を開示してきたが、本発明の他の態様及び変形が、本発明の真の精神及び範囲から逸脱することなく当該技術分野において熟練した他者により考案され得ることは明らかである。添付の請求項は、すべてのそのような態様及び同等の変形を含むとみなされることを予定している。
【図面の簡単な説明】
【００９７】
【図１】示される比率におけるαＣＤ３／２８ビーズならびにＩＬ−２及びＨＣＶペプチドを用いる同時増大を介する、単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の試験管内増大を描くグラフ。
【図２】αＣＤ３／２８ビーズ、ＩＬ−２及びＨＣＶペプチドを用いる刺激後に試料採取された全リンパ球に対するＨＣＶテトラマーに関して陽性のＣＤ８細胞のパーセンテージを描くグラフ。
【図３】ａＣＤ３／２８ビーズ、ＨＣＶペプチド及びＩＬ−２を用いる刺激の前後のＰＢＭＣのＦＡＣＳ分析により決定されるＨＣＶ特異的テトラマーに関して陽性のＣＤ８  Ｔ細胞を描く１系列の画像。
【図４】本発明中で用いられる１５−ｍｅｒが由来するコア及びＮＳ３タンパク質を含むＨＣＶポリペプチドのアミノ酸配列（配列番号：６３）。
【図４】
2008539758.tif 000007
【図１】
2008539758.tif 000008
【図２】
2008539758.tif 000009
【図３】
2008539758.tif 000010
【配列表】
2008539758000001.app
【国際調査報告】
2008539758.tif 000011
2008539758.tif 000012