(57)【要約】患者試料中の高悪性度子宮頸疾患を診断するための組成物および方法が提供される。組成物は、ＭＣＭ２に特異的に結合する、新規モノクローナル抗体、ならびにその変異体および断片を含む。本発明のＭＣＭ２抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体が、さらに提供される。本発明のＭＣＭ２モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた、本明細書中に開示される。組成物は、患者由来の子宮頸試料中のＭＣＭ２の過剰発現を検出することを含む、高悪性度子宮頸疾患を診断するための方法の実施において、使用を提供する。本発明の方法を実施するためのキットが、さらに提供される。ＭＣＭ２エピトープのアミノ酸配列を含むポリペプチド、および抗体の生成においてこれらのポリペプチドを使用する方法もまた、本発明によって包含される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＣＭ２に特異的に結合することができるモノクローナル抗体、またはその変異体もしくは断片であって、該モノクローナル抗体は、以下：
（ａ）ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体、
（ｂ）ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体、
（ｃ）ハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６または２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体、
（ｄ）ハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６または２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体を結合することができるエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｇ）ハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６または２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体との競合的結合アッセイにおいて競合するモノクローナル抗体、および
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のモノクローナル抗体の抗原結合断片であり、断片がＭＣＭ２に特異的に結合する能力を維持している、モノクローナル抗体、またはその変異体もしくは断片、
からなる群から選択される、モノクローナル抗体。
【請求項２】
ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されている、ハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６。
【請求項３】
ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されている、ハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生することができる、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項５】
少なくとも１つの請求項１に記載のモノクローナル抗体を含む、高悪性度子宮頸疾患を診断するためのキット。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体、またはＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
少なくとも２つの抗体を含み、第一の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体であり、第二の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
Ｔｏｐｏ２Ａに特異的に結合する抗体をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
各抗体が別々の抗体試薬として提供される、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
抗体の全てが抗体カクテルとして提供される、請求項７に記載のキット。
【請求項１１】
前記キットがペルオキシダーゼブロッキング試薬、タンパク質ブロッキング試薬、前記バイオマーカータンパク質への抗体結合を検出するための化学物質、対比染色剤、青みづけ剤、および使用のための手引きをさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１２】
パプ染色のための試薬をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１３】
パプ染色のための試薬がＥＡ５０およびオレンジＧを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ａ）患者から子宮頸試料を得ること、
ｂ）試料と、ＭＣＭ２に特異的に結合する少なくとも１つの請求項１に記載のモノクローナル抗体とを接触させること、および
ｃ）ＭＣＭ２への抗体の結合を検出すること
を含む、患者における高悪性度子宮頸疾患を診断するための方法。
【請求項１５】
モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体、またはＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試料と、ＭＣＭ２に特異的に結合する少なくとも２つのモノクローナル抗体とを接触させることを含み、第一の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体であり、第二の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
試料と、Ｔｏｐｏ２Ａに特異的に結合する抗体とを接触させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体と試料とを、個々の抗体試薬として連続的に、または抗体カクテルとして同時に接触させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＭＣＭ２モノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、
（ａ）配列番号３または１４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｂ）配列番号３または１４に対する少なくとも９０％の配列同一性を有し、抗原活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリペプチドで動物を免疫化することを含む、ＭＣＭ２抗体を生成するための方法。
【請求項２１】
（ａ）免疫応答を誘発する条件下で請求項１９に記載のポリペプチドで動物を免疫化すること、
（ｂ）動物から抗体産生細胞を単離すること、
（ｃ）培養物中で、抗体産生細胞を不死化細胞と融合し、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成すること、
（ｄ）ハイブリドーマ細胞を培養すること、および
（ｅ）培養物からモノクローナル抗体を単離すること
を含む、ＭＣＭ２モノクローナル抗体を生成するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＭＣＭ２に結合することができる抗体、および、特に子宮頸疾患の診断において、これらの抗体を使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
子宮頸の癌腫は、女性において２番目に多い新生物であり、全ての女性の癌のおよそ１２％を占め、年におよそ２５００００人の死亡の原因となる。非特許文献１。集団検診事業が利用可能でない多くの発展途上国において、臨床的問題はより深刻である。これらの国における子宮頸癌は、女性における癌での死亡の第１位の原因である。
【０００３】
子宮頸癌の症例の大多数は、扁平上皮癌に相当するが、腺癌も見られる。子宮頸癌は、形態学的に区別することができる明確な非侵襲性上皮内段階を経て発展するので、集団検診によって防ぐことができる。非特許文献２。正常な細胞がどのようにして形質転換するのかは理解されていないが、正常な重層上皮から子宮頸上皮内新生物（ＣＩＮ）を経て浸潤癌への組織病理学的変化の連続スペクトルの概念が、長年にわたって広く認められている。子宮頸癌への前駆体は、当該分野でＣＩＮまたは扁平上皮内病変（ＳＩＬ）としても公知の、異形成である。扁平上皮内異常は、３層（ＣＩＮ）または２層（ベセズダ）システムを用いることによって分類することができる。ベセズダシステム下で、ＣＩＮＩおよびＨＰＶ感染に対応する、低悪性度扁平上皮内病変（ＬＳＩＬ）は、一般に、比較的侵襲性疾患への進行のリスクの低い増殖性ＨＰＶ感染を示す。ＬＳＩＬおよびＨＳＩＬの両方とも悪性腫瘍の潜在的前駆体として考察されているが、３層システムにおけるＣＩＮＩＩおよびＣＩＮＩＩＩに対応する、高悪性度扁平上皮内病変（ＨＳＩＬ）は、ＬＳＩＬよりも高い、子宮頸癌への進行のリスクを示す。患者試料はまた、このシステム下で、ＡＳＣＵＳ（意義が不明な非定型扁平細胞）またはＡＧＵＳ（意義が不明な非定型腺細胞）として分類することができる。
【０００４】
子宮頸癌と、１６、１８および３１型等のリスクの高い型のヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）による感染との、強力な関連が確立されている。実際、多数の疫学的および分子生物学的証拠によって、ＨＰＶ感染は子宮頸癌における原因因子として確立されている。さらに、ＨＰＶは、高悪性度子宮頸疾患の８５％以上の症例において見られる。しかしながら、ＨＰＶ感染は非常に一般的であり、おそらくは３０歳を超える女性の５〜１５％で起こるが、高悪性度の子宮頸疾患または癌を生じるＨＰＶ陽性の女性はほとんどいない。ＨＰＶ単独の存在は感染のみの指標であり、高悪性度子宮頸疾患の指標ではなく、したがって、ＨＰＶ感染単独の試験は、多くの偽陽性を生じる。例えば、非特許文献３を参照のこと。
【０００５】
現在の文献から、ＨＰＶが、下にある子宮頸の組織内で基底幹細胞に感染することが示唆される。成熟ケラチノサイトへの幹細胞の分化は、重層子宮頸上皮への細胞の得られる遊走とともに、ＨＰＶウイルス複製および細胞の再感染と関連付けられる。このウイルス複製プロセスの間、細胞周期制御解除、活発な増殖、ＤＮＡ複製、転写活性化およびゲノム不安定性を含む、いくつかの細胞変化が起こる（非特許文献４、非特許文献５、非特許文献６）。
【０００６】
ほとんどのＨＰＶ感染は、自然界では一時的であり、ウイルス感染は１２ヶ月間のうちにそれ自体で解決する。１つまたは複数の腫瘍形成サブタイプのＨＰＶでの持続性の感染を生じる個体については、ＨＰＶ感染のない患者と比較して、新生物の発生のリスクがある。子宮頸新生物の発生におけるＨＰＶの重要性を考慮すれば、ＨＰＶの臨床的検出は、子宮頸新生物発生のリスクのある患者の同定における重要な診断手段になっている。子宮頸疾患についてのＨＰＶベースのスクリーニングの臨床的有用性は、その陰性適中率にある。正常なパパニコラウスミアの経緯と組み合わせたＨＰＶ陰性結果は、その後の１〜３年間の、疾患のない状態および子宮頸新生物発生の低いリスクの優れた指標である。しかしながら、陽性ＨＰＶ結果は、子宮頸疾患の症状を示さない。むしろこれは感染の指標である。ＨＰＶ感染の大多数は一時的であり、１２ヶ月間のうちに自然になくなるが、リスクの高いＨＰＶウイルスサブタイプでの持続性の感染は、子宮頸新生物の発生の、より高いリスクを示す。ＨＰＶ試験を補うために、子宮頸新生物と関連のある分子マーカーの同定によって、子宮頸疾患診断に対する臨床的特異性が向上すると予測される。
【０００７】
パパニコラウ染色子宮頸スミア（パパニコラウスミア）の細胞学的調査は現在、子宮頸癌を検出するための最適な方法である。パプ試験は、６０年にわたって実質的に変化しないままである主観的な方法である。しかしながら、その性能に関していくつかの懸念がある。単一のパプ試験の、報告されている感度（試験陽性である疾患陽性の割合）は低く、幅広い変動を示す（３０〜８７％）。単一のパプ試験の特異性（試験陰性である疾患陰性の割合）は、スクリーニング集団中８６％と低い場合があり、潜在する高悪性度疾患の判定について、ＡＳＣＵＳ  ＰＬＵＳ集団中で相当低い場合がある。Ｂａｌｄｗｉｎら、前出を参照のこと。ＬＳＩＬまたはＣＩＮＩとして特徴付けられている相当なパーセンテージのパパニコラウスミアは、実際、高悪性度病変について陽性である。さらに、１０％までのパパニコラウスミアは、ＡＳＣＵＳ（意義が不明な非定型扁平細胞）として分類され、すなわち、正常、中等度もしくは重症な病変、または腫瘍として、明確な類別を行うことはできない。しかしながら、実験から、１０％までのこのＡＳＣＵＳ集団が、結果として見落とされる高悪性度病変を有することが示される。例えば、非特許文献７を参照のこと。したがって、高悪性度子宮頸疾患の診断を実施するための信頼できる方法を実施するために、高悪性度子宮頸疾患において選択的に過剰発現される分子バイオマーカーおよびこれらのバイオマーカーの検出のための組成物が必要である。
【０００８】
ミニ染色体維持（ＭＣＭ）タンパク質は、真核生物ＤＮＡ複製において、本質的な役割を果たす。ミニクロモソーム維持（ＭＣＭ）タンパク質は、ＤＮＡへの複製前複合体の負荷、および二本鎖ＤＮＡ鎖のデノボ合成の間にヘリカーゼとして機能して二本鎖ＤＮＡを解くのを助けることによって、ＤＮＡ複製の早期に機能する。ＭＣＭタンパク質のそれぞれは、それらの高度に保存された中央のドメインに、ＤＮＡ依存的ＡＴＰアーゼモチーフを有する。ＭＣＭタンパク質のレベルは、一般に、正常な細胞が細胞周期のＧ０期からＧ１／Ｓ期に進むと、可変の様式で増大する。Ｇ０期に、ＭＣＭ２およびＭＣＭ５タンパク質は、ＭＣＭ７およびＭＣＭ３タンパク質よりもずっと豊富でない。ＭＣＭ６はＭＣＭ２、ＭＣＭ４、およびＭＣＭ７とともに複合体を形成し、これはヒストンＨ３に結合する。また、ＭＣＭ４、ＭＣＭ６、およびＭＣＭ７の部分複合体はヘリカーゼ活性を有し、これはＭＣＭ６のＡＴＰ結合活性およびＭＣＭ４のＤＮＡ結合活性によって媒介される。例えば、その全てが参照によって全体が本明細書中に援用される、非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０を参照のこと。
【０００９】
初期の刊行物から、ＭＣＭタンパク質、および具体的にはＭＣＭ−５が、子宮頸疾患（非特許文献１１）、ならびに他の癌（非特許文献１２）の検出に有用であることが示されている。公開されている文献から、ＭＣＭ−５に対する抗体が、子宮頸新生物細胞を検出することができることが示される。高悪性度子宮頸疾患の検出の特異性は、ＭＣＭ−５について示されていない（非特許文献１３）。ＭＣＭ−５発現の検出は高悪性度子宮頸疾患に制限されないが、同定された低悪性度異形成、およびリスクの高いＨＰＶでの感染の後に細胞周期に再び入った増殖細胞においても検出される。ＭＣＭ−５に加えて、ＭＣＭ−２およびＭＣＭ−７を含むＭＣＭファミリーの他のメンバーが、組織試料中で子宮頸新生物の検出のための潜在的に有用なマーカーであると示されている（非特許文献１４、非特許文献１５）。最近の結果から、ＭＣＭ−７が、免疫化学形式を用いた高悪性度子宮頸疾患の検出のための特異的マーカーであるようであることが示された（非特許文献１６、非特許文献１７）。
【非特許文献１】Ｂａｌｄｗｉｎら（２００３年）Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ３巻：１〜１０頁
【非特許文献２】Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９８年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ９５巻：１４９３２〜１４９３７頁
【非特許文献３】Ｗｒｉｇｈｔら（２００４年）Ｏｂｓｔｅｔ．  Ｇｙｎｅｃｏｌ．１０３：３０４〜３０９頁
【非特許文献４】Ｃｒｕｍ（２０００年）Ｍｏｄｅｒｎ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ１３巻：２４３〜２５１頁
【非特許文献５】Ｍｉｄｄｌｅｔｏｎら（２００３年）Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．７７巻：１０１８６〜１０２０１頁
【非特許文献６】Ｐｅｔｔら（２００４年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６４巻：１３５９〜１３６８頁
【非特許文献７】Ｍａｎｏｓら（１９９９年）ＪＡＭＡ２８１巻：１６０５〜１６１０頁
【非特許文献８】Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９９年）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５巻：２１２１〜２１３２頁
【非特許文献９】Ｌｅｉら（２００１年）Ｊ．  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．１１４巻：１４４７〜１４５４頁
【非特許文献１０】Ｉｓｈｉｍｉら（２００３年）Ｅｕｒ．  Ｊ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２７０巻：１０８９〜１１０１頁
【非特許文献１１】Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９８年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９５巻：１４９３２〜１４９３７頁
【非特許文献１２】Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９９年）Ｃｌｉｎ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５巻：２１２１〜２１３２頁
【非特許文献１３】Ｗｉｌｌｉａｍｓら（１９９８年）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：１４９３２〜１４９３７頁
【非特許文献１４】Ｆｒｅｅｍａｎら（１９９９年）Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５巻：２１２１〜２１３２頁
【非特許文献１５】Ｂｒａｋｅら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３巻：８１７３〜８１８０頁
【非特許文献１６】Ｂｒａｋｅら（２００３年）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６３巻：８１７３〜８１８０頁
【非特許文献１７】Ｍａｌｉｎｏｗｓｋｉら（２００４年）Ａｃｔａ  Ｃｙｔｏｌ．４３：６９６頁
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、当該分野において、高悪性度子宮頸疾患において選択的に過剰発現されるバイオマーカーの発現を検出することができる抗体に対する必要性がある。高悪性度疾患を、早期ＨＰＶ感染および軽度の異形成等の、臨床的疾患と見なされない状態から区別するための方法において、かかる抗体を使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
高悪性度子宮頸疾患を診断するための組成物および方法が提供される。組成物は、本発明の核バイオマーカータンパク質、具体的にはＭＣＭタンパク質、より具体的にはＭＣＭ２に結合することができる、モノクローナル抗体を含む。これらのモノクローナル抗体の抗原結合断片および変異体、これらの抗体を産生することができるハイブリドーマ細胞株、ならびに本発明のモノクローナル抗体を含むキットもまた、本明細書中に包含される。
【００１２】
本発明の組成物は、高悪性度子宮頸疾患を診断するための方法において使用を提供する。方法は、少なくとも１つの核バイオマーカーの過剰発現を検出することを含み、ここで核バイオマーカーの過剰発現が高悪性度子宮頸疾患の指標である。具体的には、方法は、本発明の抗体を使用して子宮頸試料中のＭＣＭ２の過剰発現を検出することを含む。
【００１３】
本発明の組成物はさらに、ＭＣＭ２モノクローナル抗体に結合することができるエピトープを含む、単離されたポリペプチドを含む。これらのポリペプチドは、ＭＣＭ２抗体を生成するための方法において使用を提供する。ＭＣＭ２エピトープのアミノ酸配列をコードする、単離された核酸分子もまた、提供される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１４】
高悪性度子宮頸疾患を診断するための組成物および方法が提供される。組成物は、高悪性度子宮頸疾患において選択的に過剰発現される核バイオマーカータンパク質、具体的にはＭＣＭタンパク質、より具体的にはＭＣＭ２に結合することができる、モノクローナル抗体を含む。本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株もまた開示される。本明細書中に記載されるモノクローナル抗体を含むキットが、さらに提供される。本組成物は、患者における高悪性度子宮頸疾患を診断するための方法において使用を提供する。
【００１５】
本発明の組成物は、ＭＣＭ２に特異的に結合するモノクローナル抗体、またはその変異体もしくは断片を含む。具体的には、２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９と呼ばれるＭＣＭ２抗体が提供される。ＭＣＭ２モノクローナル抗体２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９を産生するハイブリドーマ細胞株は、２００５年４月１４日に２２０１１０−２２０９、バージニア州マナッサスのアメリカンタイプカルチャーコレクション（ＡＴＣＣ）の特許寄託機関に寄託され、それぞれ特許受託番号ＰＴＡ−６６６８およびＰＴＡ−６６６７を割り振られた。これらの寄託は、特許手続上の微生物の寄託の国際承認に関するブダペスト条約の規定のもと維持される。これらの寄託は、単に当業者の便宜上なされたものであり、寄託が３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．第１１２条のもと必要とされることを認めるものではない。
【００１６】
モノクローナル抗体２７Ｃ５．６、および２６Ｈ６．１９の結合特性を有する抗体もまた、本明細書中に開示される。かかる抗体としては、これらの抗体との競合的結合アッセイにおいて競合する抗体、ならびにモノクローナル抗体２７Ｃ５．６または２６Ｈ６．１９に結合することができるエピトープに結合する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。ＭＣＭ２に特異的に結合する能力を保持するモノクローナル抗体２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９の変異体および断片もまた、提供される。組成物はさらに、本発明のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株および少なくとも１つの本明細書中に開示されるモノクローナル抗体を含むキットを含む。
【００１７】
「抗体」および「免疫グロブリン」（Ｉｇ）は、同じ構造上の特徴を有する糖タンパク質である。抗体は抗原に対する結合特異性を示すが、免疫グロブリンとしては、抗体、および抗原特異性を欠く他の抗体様分子の両方が挙げられる。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルで産生され、骨髄腫によって増大したレベルで産生される。
【００１８】
用語「抗体」および「抗体（複数）」は、天然に生じる形態の抗体ならびに単鎖抗体、キメラおよびヒト化抗体ならびに多特異的抗体等の組換え抗体、ならびに前述のものの全ての断片および誘導体を、広範に包含し、この断片および誘導体は、少なくとも抗原結合部位を有する。抗体誘導体は、抗体に結合したタンパク質または化学的部分を含んでもよい。用語「抗体」は、最も広範な意味で使用され、完全に集合した抗体、抗原に結合することができる抗体断片（例えば、Ｆａｂ’、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、単鎖抗体、二重特異性抗体）、および前述のものを含む組換えペプチドを包含する。本明細書中で使用される場合、「ＭＣＭ２抗体」は、ＭＣＭ２（配列番号１）に特異的に結合する任意の抗体、またはその変異体もしくは断片をいい、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単鎖抗体、および親抗体の抗原結合機能を保持するその断片を含む。
【００１９】
本発明のＭＣＭ２抗体は、最適には、モノクローナル抗体である。用語「モノクローナル抗体」は、本明細書中で使用される場合、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体をいい、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在する場合がある、可能な天然に生じる変異を除いて、同一である。
【００２０】
「天然の抗体」および「天然の免疫グロブリン」は、通常、２つの同一な軽（Ｌ）鎖および２つの同一な重（Ｈ）鎖で構成される約１５００００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は、１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結されるが、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の間で変化する。各重鎖および軽鎖はまた、規則的に間隔を空けた鎖内のジスルフィド架橋を有する。各重鎖は一方の末端に可変ドメイン（ＶＨ）とそれに続くいくつかの定常ドメインを有する。各軽鎖は、一方の末端に可変ドメインを有し（Ｖ，）、そのもう一方の末端に定常ドメインを有する。軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一の定常ドメインとともに整列し、軽鎖可変ドメインは重鎖の可変ドメインとともに整列する。特定のアミノ酸残基が、軽および重鎖可変ドメインの間に界面を形成すると考えられている。
【００２１】
用語「可変」は、可変ドメインのある部分が抗体の間で配列が広範囲に異なり、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合および特異性に使用されることをいう。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメイン全体で均一に分布しているわけではない。これは、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる３つのセグメントまたは軽鎖および重鎖可変ドメインの両方における超可変領域において濃縮される。可変ドメインの、より高度に保存された部分は、フレームワーク（ＦＲ）領域と呼ばれる。天然の重および軽鎖の可変ドメインは、それぞれ４つのＦＲ領域を含み、大部分、３つのＣＤＲによって連結されたｐシート配置を採用し、これが連結したループを形成し、１５個の、いくつかの場合においては部分的な、ｐシート構造を形成する。各鎖中のＣＤＲは、ＦＲ領域によって、他の鎖由来のＣＤＲとともに近接してともに保持され、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する（Ｋａｂａｔら、ＮＩＨ  Ｐｕｂｌ．  Ｎｏ．９１−３２４２、Ｉ巻、６４７〜６６９頁（１９９１年）参照）。
【００２２】
定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体依存的細胞毒性における抗体の関係等の種々のエフェクター機能を示す。
【００２３】
用語「超可変領域」は、本明細書中で使用される場合、抗原結合の原因である抗体のアミノ酸残基をいう。超可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）、Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、メリーランド州ベセズダｉ２５［１９９１年］）および／または「超可変ループ」由来の残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の２６３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）、ＣｌｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．１９６巻：９０１〜９１７頁［１９８７年］）を含む。「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書中で考えられる超可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。
【００２４】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；二重特異性抗体；直鎖状抗体（Ｚａｐａｔａら（１９９５年）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）巻：１０５７〜１０６２頁）；単鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。抗体のパパイン消化によって、それぞれ単一の抗原結合部位を有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一な抗原結合断片、および容易に結晶化することができることを名前が反映している、残りの「Ｆｃ」断片が生成される。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位を有し、依然として抗原を架橋することができる、Ｆ（ａｂ’）２断片が生じる。
【００２５】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識および結合部位を含む最小の抗体断片である。二重鎖Ｆｖ種において、この領域は、堅く非共有結合した、１つの重および１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。単鎖Ｆｖ種において、軽鎖および重鎖が、二重鎖Ｆｖ種のものと類似した「二量体」構造で結合することができるように、柔軟なペプチドリンカーによって１つの重および１つの軽鎖可変ドメインを共有結合することができる。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を定義付けるのは、この配置中である。集合的に、６つのＣＤＲによって抗原結合特異性が抗体に付与される。しかしながら、単一の可変ドメイン（または抗原に対して特異的なＣＤＲを３つしか含まないＦｖの半分）であっても、完全な結合部位より親和性は低いが、抗原を認識して抗原に結合する能力を有する。
【００２６】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第一の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つまたは複数のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端でのいくつかの残基の追加によって、Ｆａｂ’断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、本明細書中では、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を担持するＦａｂ’の名称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元々、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として生成された。
【００２７】
ＭＣＭ２抗体の断片は、それらが全長抗体の所望の親和性を保持する限りは、本発明によって包含される。したがって、例えば、ＭＣＭ２抗体の断片は、ＭＣＭ２抗原に結合する能力を保持する。かかる断片は、対応する全長抗体と同様の特性によって特徴付けられ、すなわち、断片は、ＭＣＭ２に特異的に結合する。かかる断片は、本明細書中で、「抗原結合」断片と呼ばれる。
【００２８】
抗体の、適した抗原結合断片は、全長抗体の一部、一般にはその抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片ならびに単鎖抗体分子が挙げられるが、これらに限定されない。「Ｆａｂ」によって、軽鎖、および重鎖の一部で構成される、免疫グロブリンの一価抗原結合断片が意図される。Ｆ（ａｂ’）２によって、両方の軽鎖、および両方の重鎖の一部を含む、免疫グロブリンの二価抗原結合断片が意図される。「単鎖Ｆｖ」または「ｓＦｖ」抗体断片によって、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含む断片が意図され、ここでこれらのドメインは、単一のポリペプチド鎖中に存在する。例えば、参照によって本明細書中に援用される、米国特許第４９４６７７８号、第５２６０２０３号、第５４５５０３０号、および第５８５６４５６号を参照のこと。一般に、Ｆｖポリペプチドはさらに、抗原結合のためのｓＦｖの所望の構造の形成を可能にする、ＶＨとＶＬドメインとの間のポリペプチドリンカーを含む。ｓＦｖの総説については、Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、１１３巻、ＲｏｓｅｎｂｕｒｇおよびＭｏｏｒｅ編（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、ニューヨーク州）、２６９〜３１５頁中のＰｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９９４年）を参照のこと。
【００２９】
抗体または抗体断片は、例えばＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら（１９９０年）Ｎａｔｕｒｅ３４８巻：５５２〜５５４頁（１９９０年）および米国特許第５５１４５４８号に記載されている技術を用いて生じた抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ３５２巻：６２４〜６２８頁およびＭａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁は、それぞれファージライブラリーを使用する、ネズミおよびヒト抗体の単離を記載している。その後の刊行物は、チェーンシャフリング（Ｍａｒｋｓら（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０巻：７７９〜７８３頁）、ならびに非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのコンビナトリアル感染およびｉｎ  ｖｉｖｏ組換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅら（１９９３年）Ｎｕｃｌｅｉｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１巻：２２６５〜２２６６頁）による高親和性（ｎＭ範囲）ヒト抗体の生成を記載している。したがって、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する、実現性のある代案である。
【００３０】
抗体断片の生成のために、種々の技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、インタクトな抗体のタンパク質分解消化によって導かれた（例えば、Ｍｏｒｉｍｏｔｏら（１９９２年）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ２４巻：１０７〜１１７頁（１９９２年）およびＢｒｅｎｎａｎら（１９８５年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２２９巻：８１頁参照）。しかしながら、これらの断片は、現在、組換え宿主細胞によって直接生成することができる。例えば、抗体断片は、上述の抗体ファージライブラリーから単離することができる。あるいは、Ｆａｂ’−ＳＨ断片は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）から直接回収し、化学的に結合させてＦ（ａｂ’）２断片を形成することができる（Ｃａｒｔｅｒら（１９９２年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ１０巻：１６３〜１６７頁）。別の手法によると、Ｆ（ａｂ’）２断片は、組換え宿主細胞培養物から直接単離することができる。抗体断片の生成のための他の技術は、当業者に明らかになろう。
【００３１】
好ましくは、本発明の抗体は、性質がモノクローナルである。上で示したように、「モノクローナル抗体」は、実質的に均質な抗体の集団から得られた抗体を意図し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、少量存在する場合がある、可能性な天然に生じる変異を除いて同一である。用語は、抗体の種または供給源に関して限定されない。用語は、免疫グロブリン全体、ならびにＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、および抗体の抗原結合機能を保持する他のもの等の断片を包含する。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位、すなわち、本明細書中で下記に定義されるようなＭＣＭ２タンパク質内の特定のエピトープを対象とする。さらに、異なる決定基（エピトープ）を対象とする異なる抗体を典型的に含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物と対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基を対象とする。装飾成句「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体の集団から得られるような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ２５６巻：４９５頁に最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製されてもよく、または組換えＤＮＡ方法によって作製されてもよい（例えば、米国特許第４８１６５６７号参照）。「モノクローナル抗体」はまた、例えばＣｌａｃｋｓｏｎら（１９９１年）Ｎａｔｕｒｅ３５２巻：６２４〜６２８頁、Ｍａｒｋｓら（１９９１年）Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．２２２巻：５８１〜５９７頁、および米国特許第５５１４５４８号に記載されている技術を用いて、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００３２】
モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ２５６巻：４９５〜４９６頁の方法、またはその改変を用いて、調製することができる。典型的には、抗原を含む溶液でマウスを免疫化する。免疫化は、生理食塩水中の、好ましくはフロイント完全アジュバント等のアジュバント中の、抗原含有溶液を混合または乳化すること、および混合物または乳濁液を非経口的に注入することによって、行うことができる。当該分野で公知の任意の免疫化の方法を用いて、本発明のモノクローナル抗体を得ることができる。動物の免疫化の後、脾臓（および場合により、いくつかの大きいリンパ節）を取り除き、単一の細胞に解離させる。細胞懸濁液を、目的の抗原でコーティングしたプレートまたはウェルに適用することによって、脾臓細胞をスクリーニングしてもよい。抗原に特異的な膜結合免疫グロブリンを発現しているＢ細胞（すなわち、抗体産生細胞）はプレートに結合し、洗い落とされない。次いで、得られたＢ細胞、または全ての解離した脾臓細胞を、骨髄腫細胞と融合してモノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成するよう誘導し、選択培地中で培養する。得られた細胞を段階希釈によって播種し、目的の抗原に特異的に結合する（かつ関連のない抗原に結合しない）抗体の生成についてアッセイする。次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）分泌ハイブリドーマを、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ（例えば、組織培養瓶または中空繊維リアクター中）、またはｉｎ  ｖｉｖｏ（マウスにおける腹水として）のいずれかで培養する。モノクローナル抗体はまた、反復免疫化多重部位技術（ＲＩＭＭＳ）を用いて生成することができる。例えば、その全ての全体が参照によって本明細書中に援用される、Ｋｉｌｐａｔｒｉｃｋら（１９９７年）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１６（４）巻：３８１〜３８９頁、Ｗｒｉｎｇら（１９９９年）Ｊ．  Ｐｈａｒｍ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ａｎａｌ．１９（５）巻：６９５〜７０７頁、およびＢｙｎｕｍら（１９９９年）Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１８（５）巻：４０７〜４１１頁を参照のこと。
【００３３】
ハイブリドーマの使用の代案として、参照によって本明細書中に援用される米国特許第５５４５４０３号、第５５４５４０５号、および第５９９８１４４号に開示されているように、ＣＨＯ細胞株等の細胞株において抗体を生成することができる。簡潔に述べると、それぞれ軽鎖および重鎖を発現することができるベクターで細胞株をトランスフェクトする。別々のベクター上の２つのタンパク質をトランスフェクトすることによって、キメラ抗体を生成することができる。別の利点は、抗体の正しいグリコシル化である。モノクローナル抗体はまた、バイオマーカータンパク質で組換えコンビナトリアル免疫グロブリンライブラリー（例えば、抗体ファージディスプレイライブラリー）をスクリーニングし、それによって、バイオマーカータンパク質に結合する免疫グロブリンライブラリーメンバーを単離することによって、同定および単離することができる。ファージディスプレイライブラリーを生成およびスクリーニングするためのキットは市販されている（例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｐｈａｇｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｓｙｓｔｅｍ、カタログ番号２７−９４００−０１、およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ  ＳｕｒｆＺＡＰ（商標）Ｐｈａｇｅ  Ｄｉｓｐｌａｙ  Ｋｉｔ、カタログ番号２４０６１２）。また、抗体ディスプレイライブラリーの生成およびスクリーニングにおける使用について特に影響を受けやすい方法および試薬の例は、例えば、米国特許第５２２３４０９号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９２／１８６１９号、第ＷＯ９１／１７２７１号、第ＷＯ９２／２０７９１号、第ＷＯ９２／１５６７９号、第ＷＯ９３／０１２８８号、第ＷＯ９２／０１０４７号、第９２／０９６９０号、および第９０／０２８０９号、Ｆｕｃｈｓら（１９９１年）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ９巻：１３７０〜１３７２頁、Ｈａｙら（１９９２年）Ｈｕｍ．  Ａｎｔｉｂｏｄ．  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ３巻：８１〜８５頁、Ｈｕｓｅら（１９８９年）Ｓｃｉｅｎｃｅ２４６巻：１２７５〜１２８１頁、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら（１９９３年）ＥＭＢＯ  Ｊ．１２巻：７２５〜７３４頁に見ることができる。
【００３４】
本発明のいくつかの態様において、抗体は、組織学的ではなく細胞学的試料の望ましい染色に基づいて選択してもよい。すなわち、特定の実施形態において、抗体は、最終的な試料型（例えば、細胞学調製物）を考慮して、結合特異性について選択される。ＭＣＭ２等の、目的の特定のバイオマーカーを対象とする抗体を選択し、複数工程のスクリーニングプロセスによって精製する。抗体選択のためのかかる方法は、その全体が参照によって本明細書中に援用される、２００５年３月２３日に提出された、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題された係属中の米国出願第１１／０８７２２７号に記載されている。
【００３５】
本発明のモノクローナル抗体の結合特性を有する抗体もまた提供される。「結合特性」または「結合特異性」は、抗体に関して使用される場合、抗体が比較抗体と同じまたは同様の抗原エピトープを認識することを意味する。かかる抗体の例としては、例えば、競合的結合アッセイにおいて本発明のモノクローナル抗体と競合する抗体が挙げられる。当業者は、標準的な方法を用いて、抗体が競合的に別の抗体を妨げるかどうかを判定することができる。
【００３６】
「エピトープ」によって、それに対して抗体が生成され、それに対して抗体が結合する、抗原分子の部分が意図される。「ＭＣＭ２エピトープ」は、ＭＣＭ２タンパク質の、ＭＣＭ２モノクローナル抗体が結合する部分を含む。エピトープは、直鎖状アミノ酸残基（すなわち、エピトープ内の残基は直鎖状の様式で次々に連続して配置される）、非直鎖状アミノ酸残基（本明細書中では「非直鎖状エピトープ」と呼ぶ。これらのエピトープは連続して配置されない）、または直鎖状および非直鎖状アミノ酸残基の両方を含むことがある。典型的には、エピトープは、短いアミノ酸配列、例えば長さ約５アミノ酸である。エピトープを同定するための体系的な技術は当該分野で公知であり、例えば、米国特許第４７０８８７１号中、および下記の実施例に記載されている。簡潔に述べると、ある方法において、抗原由来の１組の重複しているオリゴペプチドを合成し、各ピンに特有のオリゴペプチドを有するピンの固相配列に結合させる。ピンの配列は、例えばバイオマーカー特異的モノクローナル抗体に対する結合について、全ての９６種のオリゴペプチドを同時にアッセイすることができる、９６ウェルマイクロタイタープレートを含んでもよい。あるいは、ファージディスプレイペプチドライブラリーキット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ）が、現在、エピトープマッピングのために市販されている。これらの方法を用いて、所定の抗体が結合するエピトープを同定するために、あらゆる可能な連続したアミノ酸のサブセットに対する結合親和性を判定してもよい。エピトープはまた、エピトープ長ペプチド配列を使用して、抗体を得る動物を免疫化する場合、推論によって同定してもよい。
【００３７】
本発明はまた、ＭＣＭ２モノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む、単離されたポリペプチドを包含する。これらのポリペプチドは、モノクローナル抗体に結合する抗原（すなわち、ＭＣＭ２）の一部に対応する。かかるポリペプチドは、ＭＣＭ２に選択的に結合する抗体を生成するための方法において使用を提供する。抗体の生成においてポリペプチドを使用できるかどうかは、本明細書中で「抗原活性」と呼ばれる。例えば、配列番号３、４、および１４に示されるアミノ酸配列（配列番号１に示されるＭＣＭ２アミノ酸配列中の、それぞれ残基３６９〜３８２、６８８〜７１０、および６８３〜６９２に対応する）は、ＭＣＭ２モノクローナル抗体、より具体的にはモノクローナル抗体２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９によって認識される、エピトープを含む。詳細については実施例４を参照のこと。元々のポリペプチドの抗原活性を保持する配列番号３、４、および１４に示されるＭＣＭ２エピトープ配列の変異体および断片もまた、提供される。本発明はさらに、ＭＣＭ２エピトープを含むポリペプチドをコードする、単離された核酸分子、ならびにその変異体および断片を含む。
【００３８】
ＭＣＭ２エピトープを含む本発明のポリペプチドは、本明細書中で上述されたように、ＭＣＭ２に特異的に結合するモノクローナル抗体を生成するための方法において使用することができる。かかるポリペプチドはまた、ポリクローナルＭＣＭ２抗体の生成において使用することができる。例えば、ポリクローナル抗体は、ＭＣＭ２エピトープ（すなわち、免疫原）を含むポリペプチドで、適した対象（例えば、ウサギ、ヤギ、マウス、または他の哺乳動物）を免疫化することによって調製することができる。免疫化した対象中の抗体力価は、固定したバイオマーカータンパク質を使用した酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いる等の標準的な技術によって、経時的にモニタリングすることができる。免疫化の後の適当な時点、例えば抗体力価が最も高いときに、対象から抗体産生細胞を得て、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ２５６巻：４９５〜４９７頁によって元々記載されたハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら（１９８３年）Ｉｍｍｕｎｏｌ．  Ｔｏｄａｙ４巻：７２頁）、ＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ、ＲｅｉｓｆｅｌｄおよびＳｅｌｌ編（Ａｌａｎ  Ｒ．  Ｌｉｓｓ，  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク）、７７〜９６頁中のＣｏｌｅら（１９８５年））またはトリオーマ技術等の標準的な技術によって、使用してモノクローナル抗体を調製することができる。ハイブリドーマを生成するための技術は周知である（一般に、Ｃｏｌｉｇａｎら編（１９９４年）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｉｎｃ．、ニューヨーク州ニューヨーク）、Ｇａｌｆｒｅら（１９７７年）Ｎａｔｕｒｅ２６６巻：５５０５２頁、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：  Ａ  Ｎｅｗ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎ  Ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｅｓ（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．、ニューヨーク州中のＫｅｎｎｅｔｈ（１９８０年）、およびＬｅｒｎｅｒ（１９８１年）Ｙａｌｅ  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｍｅｄ．、５４巻：３８７〜４０２頁参照）。
【００３９】
モノクローナル抗体のアミノ酸配列変異体または本明細書中に記載されるＭＣＭ２エピトープを含むポリペプチドもまた、本発明に包含される。変異体は、目的の抗体をコードするクローニングされたＤＮＡ配列中の変異によって調製することができる。変異誘発およびヌクレオチド配列変化の方法は、当該分野で周知である。例えば、参照によって本明細書中に援用される、ＷａｌｋｅｒおよびＧａａｓｔｒａ編（１９８３年）Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＭａｃＭｉｌｌｉａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ニューヨーク）、Ｋｕｎｋｅｌ（１９８５年）Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ８２巻：４８８〜４９２頁、Ｋｕｎｋｅｌら（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４巻：３６７〜３８２頁、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９年）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、ニューヨーク）、米国特許第４８７３１９２号、およびそこで引用されている参考文献を参照のこと。目的のポリペプチドの生物学的活性に影響を及ぼさない、適当なアミノ酸置換基に関する手引きは、参照によって本明細書中に援用される、Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ（Ｎａｔｌ．  Ｂｉｏｍｅｄ．  Ｒｅｓ．  Ｆｏｕｎｄ．、ワシントン，Ｄ．Ｃ．）中のＤａｙｈｏｆｆら（１９７８年）のモデルに見ることができる。あるアミノ酸を、同様の特性を有する別のアミノ酸と交換すること等の、保存的置換が、好ましい場合がある。保存的置換の例としては、
【００４０】
【化１】
2008539251.tif 000002
が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４１】
目的のポリペプチドの変異体の構築において、変異体が所望の活性、すなわちバイオマーカーに対する同様の結合親和性を有し続けるように、修飾が行われる。明らかに、変異体ポリペプチドをコードするＤＮＡ中で行われる任意の変異は、配列をリーディングフレームの外に配置してはならず、好ましくは、二次ｍＲＮＡ構造を生じる可能性のある相補領域を生じない。欧州特許出願公開第７５４４４号を参照のこと。
【００４２】
好ましくは、参照ポリペプチドの変異体は、参照抗体分子のアミノ酸配列に対して、または参照抗体分子の、より短い部分に対して、少なくとも７０％または７５％配列同一性、好ましくは少なくとも８０％または８５％配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％または９５％配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。より好ましくは、分子は、少なくとも９６％、９７％、９８％または９９％配列同一性を共有する。本発明の目的のために、同一率は、ギャップ開始ペナルティが１２、ギャップ延長ペナルティが２、ＢＬＯＳＵＭ行列が６２のアフィンギャップ検索を用いた、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムを用いて判定される。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズムは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ（１９８１年）Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．２巻：４８２〜４８９頁に教示されている。変異体は、例えば、１〜１５個のわずかなアミノ酸残基、６〜１０個等の１〜１０個の少ないアミノ酸残基、わずか５つ、わずか４、３、２、またはさらには１つのアミノ酸残基だけ、参照抗体と異なる場合がある。
【００４３】
２つのアミノ酸配列の最適な整列に関して、変異体アミノ酸配列の連続したセグメントは、参照アミノ酸配列に関して、さらなるアミノ酸残基または欠失したアミノ酸残基を有する場合がある。参照アミノ酸配列との比較のために使用される連続したセグメントは、少なくとも２０個の連続したアミノ酸残基を含み、３０、４０、５０個またはそれより多いアミノ酸残基を含む場合がある。保存的残基置換またはギャップと関連した配列同一性の補正を行うことができる（Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎ相同性検索アルゴリズム参照）。
【００４４】
本発明のＭＣＭ２モノクローナル抗体は、下記のような検出可能な物質で標識して、試料中のバイオマーカータンパク質検出を促進してもよい。かかる抗体は、本発明の方法の実施において使用を提供する。本発明の抗体および抗体断片は、検出可能な物質に結合させて、抗体結合の検出を促進することができる。単語「標識」は、本明細書中で使用される場合、「標識」抗体を生じるように抗体に直接または間接的に結合させる、検出可能な化合物または組成物をいう。標識は、それ自体検出可能（例えば、放射性同位体標識または蛍光標識）であるか、または、酵素標識の場合、検出可能である基質化合物もしくは組成物の化学的変化を触媒してもよい。抗体を標識する目的のための、検出可能な物質の例としては、種々の酵素、置換基、蛍光物質、発光物質、生物発光物質、および放射性物質が挙げられる。適した酵素の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、またはアセチルコリンエステラーゼが挙げられ、適した置換基複合体の例としては、ストレプトアビジン／ビオチンおよびアビジン／ビオチンが挙げられ、適した蛍光物質の例としては、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシルまたはフィコエリトリンが挙げられ、発光物質の例としてはルミノールが挙げられ、生物発光物質の例としては、ルシフェラーゼ、ルシフェリン、およびエクオリンが挙げられ、適した放射性物質の例としては、１２５Ｉ、１３１Ｉ、３５Ｓ、または３Ｈが挙げられる。
【００４５】
少なくとも１つの本発明のＭＣＭ２モノクローナル抗体を含むキットが、さらに提供される。「キット」によって、ＭＣＭ２の発現を特異的に検出するための、少なくとも１つの試薬、すなわち抗体を含む任意の製造（例えば、包装または容器）が意図される。キットは、本発明の方法を行うための単位として、販売促進、配送、または販売されてもよい。また、キットは、キットおよびその使用のための方法について記載している包装挿入物を含んでもよい。
【００４６】
本発明のキットは、一般に、ＭＣＭ２を対象とする少なくとも１つのモノクローナル抗体、抗体結合の検出のための化学物質、対比染色剤、および、場合により、陽性染色細胞の同定を促進するための青みづけ剤を含む。本発明にキットにおいて、抗原−抗体結合を検出する任意の化学物質を使用してもよい。いくつかの実施形態において、検出化学物質は、二次抗体に結合した標識ポリマーを含む。例えば、抗原−抗体結合部位での色原体の沈殿を触媒する酵素に結合した二次抗体が提供されてもよい。かかる酵素、および抗体結合の検出においてそれらを使用するための技術は、当該分野で周知である。一実施形態において、キットは、ＨＲＰ標識ポリマーに結合した二次抗体を含む。結合した抗体と適合性のある色原体（例えば、ＨＲＰ標識二次抗体の場合のＤＡＢ）、および非特異的染色をブロックするための過酸化水素等の溶液が、さらに提供されてもよい。他の実施形態において、モノクローナル抗体に結合するマウスプローブ試薬の使用、その後の、マウスプローブ試薬に結合するＨＲＰに結合したデキストランポリマーの添加によって、バイオマーカータンパク質への抗体結合が検出される。かかる検出試薬は、例えばＢｉｏｃａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌから市販されている。
【００４７】
本発明のキットはさらに、ペルオキシダーゼブロッキング試薬（例えば、過酸化水素）、タンパク質ブロッキング試薬（例えば、精製カゼイン）、および対比染色剤（例えば、ヘマトキシリン）を含んでもよい。青みづけ剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ−２０およびアジ化ナトリウムを含む、水酸化アンモニウムまたはＴＢＳ、ｐＨ７．４）が、キット中でさらに提供されて、陽性染色細胞の検出を促進してもよい。キットはまた、品質管理目的で、陽性および陰性対照試料を含んでもよい。
【００４８】
別の実施形態において、本発明のキットは、２つのＭＣＭ２モノクローナル抗体、より具体的にはモノクローナル抗体２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９を含む。２つのＭＣＭ２モノクローナル抗体およびトポイソメラーゼＩＩα（Ｔｏｐｏ２Ａ）を対象とする第三の抗体を含むキットがさらに提供される。キット中に複数の抗体が存在する場合、各抗体は、個々の試薬として、または、あるいは目的の抗体の全てを含む抗体カクテルとして、提供されてもよい。さらに、キット試薬のいずれかまたは全ては、密閉容器等の、それらを外部環境から保護する容器内で提供されてもよい。本発明のキットは、高悪性度子宮頸疾患の診断において有用であり、パプ染色のための試薬（例えば、ＥＡ５０およびオレンジＧ）をさらに含んでもよい。
【００４９】
本発明の組成物は、その全体が参照によって本明細書中に援用される、２００５年３月２３日に提出された、「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｒｖｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅ」と題された係属中の米国出願第１１／０８７２２７号に開示されているもの等の患者における高悪性度子宮頸疾患の診断のための方法において使用を提供する。「高悪性度子宮頸疾患を診断する」は、例えば、子宮頸疾患の存在を診断または検出すること、疾患の進行をモニタリングすること、および高悪性度子宮頸疾患の指標である細胞または試料を同定または検出することを含むよう意図される。用語、高悪性度子宮頸疾患を診断すること、検出すること、および同定することは、本明細書中で交換可能に使用される。「高悪性度子宮頸疾患」によって、膣拡大鏡によって前悪性病状、悪性病状、中程度から深刻な異形成、および子宮頸癌と分類される状態が意図される。基礎にある高悪性度子宮頸疾患としては、ＣＩＮＩＩ、ＣＩＮＩＩＩ、ＨＳＩＬ、上皮内癌、腺癌、および癌（ＦＩＧＯ  Ｉ〜ＩＶ期）の組織学的同定が挙げられる。
【００５０】
本発明の方法は、高悪性度子宮頸疾患において選択的に過剰発現される少なくとも１つの核バイオマーカーの過剰発現を検出することを含む。「核バイオマーカー」によって、細胞の核において主に発現されるタンパク質の任意の遺伝子が意図される。核バイオマーカーは、細胞の他の部分において、より低い程度発現されてもよい。「高悪性度子宮頸疾患において選択的に過剰発現される」によって、高悪性度子宮頸疾患において目的の核バイオマーカーが過剰発現されるが、いかなる異形成、未成熟な化生細胞も存在しないＬＳＩＬ、ＣＩＮＩ、ＨＰＶ感染試料として分類される状態、および臨床的疾患と見なされない他の状態においては過剰発現されないことが意図される。したがって、本発明の核バイオマーカーの検出によって、基礎にある高悪性度子宮頸疾患の指標である試料の、良性の増殖、早期ＨＰＶ感染、または軽度の異形成の指標である試料からの区別が可能になる。特に重要な核バイオマーカーとしては、ＭＣＭタンパク質、特にＭＣＭ２、およびＴｏｐｏ２Ａが挙げられる。
【００５１】
本発明の特定の態様において、方法は、患者から子宮頸試料を得ること、試料を少なくとも１つの本発明のＭＣＭ２モノクローナル抗体と接触させること、およびＭＣＭ２への抗体の結合を検出することを含む。他の実施形態において、試料を、ＭＣＭ２に特異的に結合する少なくとも２つのモノクローナル抗体、具体的にはモノクローナル抗体２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９と接触させる。さらなる実施形態において、試料を、これらの２つのＭＣＭ２モノクローナル抗体、およびＴｏｐｏ２Ａに特異的に結合する第三の抗体と接触させる。抗体結合を検出するための技術は、当該分野で周知である。目的のバイオマーカーへの抗体結合は、抗体結合のレベル、およびしたがって、バイオマーカータンパク質発現のレベルに対応する、検出可能なシグナルを発生する、化学的試薬の使用によって検出してもよい。抗体−抗原結合を検出するための任意の方法を用いて、本発明の方法を行ってもよい。
【００５２】
本明細書中で使用される場合、「子宮頸試料」は、バイオマーカーの発現を検出することができる、子宮頸由来の細胞、組織、または体液の、任意の採取試料をいう。かかる身体試料の例としては、婦人科学的液体、生検、およびスミアが挙げられるが、これらに限定されない。子宮頸試料は、例えば領域を擦過もしくは綿棒でふき取ること、または針を用いて体液を吸引することを含む種々の技術によって、患者から得てもよい。子宮頸試料を収集するための方法は、当該分野で周知である。特定の実施形態において、子宮頸試料は、特に液体ベースの調製物中に、子宮頸細胞を含む。一実施形態において、子宮頸試料は、例えばＳｕｒｅＰａｔｈ（登録商標）（ＴｒｉＰａｔｈ  Ｉｍａｇｉｎｇ，Ｉｎｃ．）またはＴｈｉｎＰｒｅｐ（登録商標）調製物（ＣＹＴＹＣ，Ｉｎｃ．）等の、液体ベースの細胞学標本調製ガイドラインに従って収集される。子宮頸試料は、拡大して調べるために、スライドガラスに移してもよい。標本を保存し、調査を促進するために、定着液および染色液をスライドガラス上の細胞に適用してもよい。一実施形態において、子宮頸試料を収集および処理して、参照によって本明細書中に援用される米国特許第５３４６８３１号に示されるような、単層試料を提供してもよい。
【００５３】
当業者は、本発明の方法中の工程のいずれかまたは全てが、手動または自動の様式で人員によって実行することができることを認識するであろう。したがって、子宮頸試料調製、抗体、および抗体結合の検出の工程は、自動化されてもよい。本発明の方法はまた、従来のパプ染色技術と組み合わせて、高悪性度子宮頸疾患の、より正確な診断を可能にしてもよい。
【００５４】
以下の実施例は、例示のために提供され、限定のために提供されるのではない。
【実施例】
【００５５】
（実施例１）
（ＭＣＭ２に対するマウスモノクローナル抗体の生成）
ＭＣＭ２に特異的なマウスモノクローナル抗体を生成した。抗原（免疫原性ポリペプチド）は、全長組換えヘキサヒスチジン標識ＭＣＭ２タンパク質であった。バキュロウイルス発現系を用いて、Ｔｎｉ細胞中で抗原を発現させた。具体的には、ヘキサヒスチジン標識ＭＣＭ２のコード配列（配列番号１０）を、Ｔｎｉ細胞中での発現のために、ｐＦａｓｔＢａｃｌプラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）にクローニングした。バキュロウイルス発現系を用いて組換えタンパク質を生成するための方法は、当該分野で周知である。Ｎｉ＋２イオンを負荷したキレート化アガロース（ＱｉａｇｅｎのＮｉ−ＮＴＡ）を用いて標識ＭＣＭ２タンパク質を精製し、免疫原として使用した。免疫原性ＭＣＭ２ポリペプチドのアミノ酸配列を、配列番号１１中に提供する。
【００５６】
マウス免疫化およびハイブリドーマ融合を、本質的に、Ｋｏｈｌｅｒら（１９７５年）Ｎａｔｕｒｅ２５６巻：４９５〜４９６頁に記載されているように行った。溶液中の免疫原性標識ＭＣＭ２タンパク質で、マウスを免疫化した。免疫化したマウスから抗体産生細胞を単離し、骨髄腫細胞と融合させて、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマを形成させた。ハイブリドーマを選択培地中で培養した。得られた細胞を段階希釈によって播種し、ＭＣＭ２を特異的に結合する（かつ関連のない抗原に結合しない）抗体の生成についてアッセイした。目的のモノクローナル抗体がＭＣＭ２タンパク質とのみ反応してヘキサヒスチジン標識と反応しなかったことを確かめるために、選択されたハイブリドーマを、ＭＣＭ２−ＦＬＡＧ標識タンパク質に対してスクリーニングした。ＭＣＭ２−ＦＬＡＧタンパク質のヌクレオチドおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１２および１３に示す。次いで、選択されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）分泌ハイブリドーマを培養した。
【００５７】
組換えプロテインＡコート樹脂（ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．）を用いて、「枯渇した」ハイブリドーマ細胞（すなわち、生存能が０〜１５％の間に低下するまで増殖した細胞）の培養培地上清から抗体を精製した。低ｐＨとそれに続く迅速なｐＨの中和を用いて、抗体を溶出させた。２８０ｎＭで相当な吸光度を有する画分を貯留した。得られた貯留をＰＢＳに透析した。精製された抗体を、さらなる特徴付けに供した。ＭＣＭ２モノクローナル抗体２６Ｈ６．１９および２７Ｃ５．６は、両方ともＩｇＧ１アイソタイプであると判定された。これらの抗体のエピトープマッピングの詳細を後述する。
【００５８】
（実施例２）
（ハイブリドーマ細胞からのモノクローナル抗体の単離）
以下の手順を用いて、ハイブリドーマ細胞からモノクローナル抗体を単離する。
【００５９】
（培地調製）
・無菌の１０００ｍｌ保存瓶に１００ｍｌのハイクローンウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加える。
・１０ｍｌのＭＥＭ非必須アミノ酸溶液を加える。
・１０ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン−Ｌ−グルタミン溶液を加える。
・ＥｘＣｅｌｌ６１０−ＨＳＦ培地でおよそ１０００ｍｌまで適量にする。
・無菌のキャップを瓶上に置き、きつく締める。穏やかに渦を巻かせて混合する。
・１０００ｍｌの無菌酢酸真空フィルターユニット（０．２μｍ）を真空ポンプシステムに連結させる。
・無菌酢酸真空フィルターユニットに培地溶液のおよそ半分を穏やかに注ぎ、減圧をオンにする。
・一旦培地の最初の半分がろ過されると、残った培地をフィルターユニットに注ぎ、ろ過を続ける。
・全ての培地がろ過された後、真空フィルターユニットから真空ホースを分離し、減圧ポンプをオフにする。フィルター瓶からフィルターユニットの容器部分を取り除く。新しい無菌の瓶のキャップを瓶上に置く。
・２℃〜１０℃で保存する。光から保護する。
【００６０】
（最初のハイブリドーマ細胞培養）
・予め温めた３７℃のＨ２Ｏ槽でストックハイブリドーマ凍結培養物のバイアルを解凍する。
・凍結バイアルの外側に７０％エタノールを噴霧する。
・解凍したバイアルを生物学的安全キャビネットに移す。
・凍結バイアルから細胞を取り除き、細胞を１５ｍｌ遠心チューブに移す。
・７ｍｌの細胞培養培地を、解凍した細胞を含む１５ｍｌ遠心チューブに滴下する。
・解凍した細胞および培養培地を含む１５ｍｌ遠心チューブを５分間２００ｇの力で遠心分離する。
・細胞を遠心分離している間に、４５ｍｌの細胞培養培地を無菌のＴ−２２５フラスコに加える。
・遠心分離の後、細胞ペレットの存在について、チューブを目視検査する。
・細胞ペレットを押しのけないように注意しながら、遠心チューブから培地を除去する。注意：細胞ペレットがかき乱された場合、遠心分離工程を繰り返す。
・５ｍｌの細胞培養培地を、ペレット化した細胞を含む１５ｍｌ遠心チューブに加える。ピペットで移して細胞ペレットを培地に再懸濁する。
・再懸濁した細胞および培養培地の内容物全体を、４５ｍｌの培地を含むＴ−２２５フラスコに移す。
・Ｔ−２２５フラスコにキャップをする。
・インタクトな細胞の存在について顕微鏡下で観察する。Ｔ−２２５フラスコを直ちにＣＯ２インキュベータに置き、細胞を一晩インキュベートさせた。
【００６１】
（ハイブリドーマ細胞株の拡大）
・細胞培養物を、生存能、濃度、および混入の存在についてモニタリングし続ける。
・最初のＴ−２２５フラスコの細胞懸濁液を、濃度がおよそ６０００００個の細胞／ｍｌ〜８０００００個の細胞／ｍｌおよび合計２００〜２５０ｍｌの培地になるまでモニタリングおよび調節する。
・細胞を押しのけ、最小細胞密度要件を満たすように、必要に応じてさらなる培地を加える。細胞懸濁液を分割して、１つの新しい無菌のＴ−２２５フラスコに移す。２×Ｔ−２２５フラスコをＣＯ２インキュベータに入れる。
・濃度がおよそ６０００００個の細胞／ｍｌ〜８０００００個の細胞／ｍｌ、および各フラスコについて合計２００〜２５０ｍｌの間の培地になるまで、２×Ｔ−２２５フラスコの細胞をモニタリングする。
・細胞を押しのけ、最小細胞密度要件を満たすように、必要に応じてさらなる培地を加える。細胞懸濁液を分割して、合計４×Ｔ−２２５フラスコの２つの新しい無菌のＴ−２２５フラスコに移す。全てのフラスコをＣＯ２インキュベータに戻す。
・細胞をモニタリングし、細胞濃度がＴ−２２５フラスコ当たりおよそ２５０ｍｌの総体積（または合計およそ１０００ｍｌ）でおよそ６０００００個の細胞／ｍｌ〜８０００００個の細胞／ｍｌになるまで、４×Ｔ−２２５フラスコ中で体積を調節する。
・０％〜１５％の最終的な生存能で細胞が枯渇するまで増殖するまで、４×Ｔ−２２５フラスコの細胞をモニタリングし続ける。ここで、細胞培養物上清は、清澄工程の準備ができている。
【００６２】
（上清の清澄）
・卓上遠心分離機をオンにする。５００ｍｌチューブアダプタをローターバスケットに入れ、蓋を閉めて温度を４℃±４℃に設定する。
・無菌的技術を用いて、ここで枯渇している４つ全てのＴ−２２５フラスコから、２×５００ｍｌコニカル遠心チューブに培地を注ぐ。
・２×５００ｍｌは釣り合いが取れていることを確認する。釣り合わせる必要があれば、上清を一方のチューブから他方のチューブに移す。
・枯渇した上清を１３５０ｇ（±４０ｇ）で１５分間、２℃〜１０℃で遠心分離する。
・遠心分離が完了した後、上清を無菌の１０００ｍｌ保存瓶に無菌的に傾瀉し、無菌のキャップを締める。
・１ｍｌを無菌的にマイクロ遠心チューブに移す。マイクロ遠心チューブを試料とともに２℃〜１０℃で保存する（光から保護する）。
・清澄させた上清試料は、Ｅａｓｙ−Ｔｉｔｅｒ（登録商標）アッセイを用いたＩｇＧ評価の準備ができている。
【００６３】
（バッファー調製）
（結合バッファー）
・およそ６００ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏを清潔なビーカーに加える。
・７７．２８ｍｌのホウ酸溶液（４％Ｗ／Ｖ）を加える。清潔な撹拌棒で、室温で撹拌する。
・２３３．７６ｇの塩化ナトリウムを計り、撹拌し続けながら溶液に入れる。
・ＤＩ  Ｈ２Ｏで溶液をおよそ９５０ｍｌにし、撹拌し続ける。
・塩化ナトリウムが溶解し、溶液が透明になったら、水酸化ナトリウムでｐＨを９．０±０．２に調節する。
・溶液を清潔な１０００ｍｌメスシリンダーに移し、ＤＩ  Ｈ２Ｏで１０００ｍｌまで適量にする。
・完了したバッファーを適切な保存瓶に移す。このバッファーは、使用前に７日間まで保存してもよい。
・このプロセス全体を繰り返して、さらなる０．２ｌ〜１．０ｌの結合バッファーを調製する。
【００６４】
（溶出バッファー）
・１．７２５ｇの一塩基のリン酸ナトリウムを計り、清潔な撹拌棒を有する清潔な２５０ｍｌビーカーに入れる。
・３．６７６ｇのクエン酸ナトリウムを計り、同じ清潔な２５０ｍｌビーカーに入れる。
・およそ１７５ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏを加え、溶解するまで室温で撹拌する。
・４．３８ｇの塩化ナトリウムを計り、撹拌し続けながら溶液に入れる。
・溶液をＤＩ  Ｈ２Ｏでおよそ２２５ｍｌにし、撹拌し続ける。
・塩化ナトリウムが溶解して溶液が透明になったら、塩酸でｐＨを３．５±０．２に調節する。
・溶液を清潔な２５０ｍｌメスシリンダーに移し、ＤＩ  Ｈ２Ｏで２５０ｍｌまで適量にする。
・５００ｍｌ無菌酢酸真空フィルターユニット（０．２μｍ）を減圧ポンプシステムに連結し、溶液をろ過滅菌する。
・フィルターを取り除き、無菌のキャップで容器を閉める。
【００６５】
（抗体吸着）
・清澄させた上清（約１Ｌ）を、清潔な撹拌棒を有する清潔な４０００ｍｌプラスチックビーカーに注ぐ。
・およそ等量（約１Ｌ）の結合バッファーを、清澄させた上清を含む清潔な４０００ｍｌプラスチックビーカーに加える。清潔な撹拌棒を加える。
・清潔なラップでビーカーを覆い、「抗体結合」と貼り紙をする。
・表１のデータを用いて、必要なＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ（登録商標）プロテインＡのおよその量を計算する。
【００６６】
【表１】
2008539251.tif 000003
・清潔な使い捨てカラムおよびバルブ組み立て品をリングスタンドおよびクランプに固定する。バルブを閉める。
・瓶を数回逆さにすることによって、適切な量のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを混合する。必要な体積を抜き取り、使い捨てカラムに入れる。
・１０ｍｌのＤＩ  Ｈ２ＯでＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを洗浄する。バルブを開き、ＤＩ  Ｈ２Ｏを排出させる。バルブを閉める。さらなる１０ｍｌのＤＩ  Ｈ２Ｏで繰り返す。
・１０ｍｌの結合バッファーでＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを洗浄する。バルブを開き、結合バッファーを排出させる。バルブを閉める。さらなる１０ｍｌの結合バッファーで繰り返す。
・ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを約１０ｍｌの清澄させた上清および結合バッファー溶液（４０００ｍｌビーカーから）に再懸濁し、ビーズを、清澄させた上清および結合バッファー溶液を含む４０００ｍｌビーカーに移す。必要に応じて繰り返して、いかなる残ったビーズも移す。完了したら、カラムおよびバルブを廃棄する。
・２℃〜１０℃でおよそ１８時間、混合物を活発に混合させる。
・混合が完了したら、撹拌プレートをオフにし、緩衝された上清およびビーズ懸濁液を含む「抗体結合」ビーカーを実験台領域に戻す。ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズをビーカーの底に沈殿させる（およそ５分間）。
・清潔な使い捨てカラムおよびバルブ組み立て品をリングスタンドおよびクランプに固定する。バルブを閉める。
・清潔な２５０ｍｌ瓶または適した容器に「カラム洗浄液−結合後」と貼り紙をする。
・清潔なプラスチックビーカーに「上清−結合後」と貼り紙をする。
・４０００ｍｌビーカーから、清潔な、貼り紙をした２ｌプラスチックビーカーに、上清を傾瀉し、４０００ｍｌビーカーの底にビーズを残す。「上清−結合後」溶液を含む２０００ｍｌビーカーを、清潔なラップで覆い、２℃〜１０℃で保存する。
・およそ１５ｍｌの結合バッファーを、傾瀉した４０００ｍｌ「抗体結合」ビーカーに加える。ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを再懸濁し、それらをカラムに移す。バルブを開き、結合バッファーを「カラム洗浄液−結合後」容器に排出させる。排出するときにバルブを閉める。
・さらなる結合バッファーを加えること、混合すること、および先立つ工程のようにカラムに移すことによって、「抗体結合」ビーカー中のいかなる残ったＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズも移す。排出するときにバルブを閉める。
・表２のデータを用いて、カラム中のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを洗浄するのに必要な結合バッファーのおよその量を計算する。
【００６７】
【表２】
2008539251.tif 000004
・適切な体積の結合バッファーで、適切な洗浄の回数、カラム中のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを洗浄し、「カラム洗浄液−結合後」容器に流出液を収集し続ける。
・完了したら、バルブを閉める。「カラム洗浄液−結合後」容器を２℃〜１０℃で保存する。
・表３から、カラム中のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを溶出させるのに必要な溶出バッファーおよび中和バッファーの総体積を判定する。
【００６８】
【表３】
2008539251.tif 000005
・９つの無菌コニカル遠心チューブに「溶出抗体」、画分＃（１〜９）と貼り紙をする。
・画分当たりに必要な、適切な体積の中和バッファー（上述の表「Ｃ」から判定する）を、９つの「溶出抗体」画分チューブのそれぞれに入れ、カラムバルブ流出口下にしっかりと置く。
・中和バッファーを含む「溶出抗体」チューブのそれぞれに溶出液を収集しながら、画分当たりに必要な、適切な体積の溶出バッファー（上述の表３から判定する）で、画分ごとにカラム中のＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥプロテインＡビーズを溶出させる。
・溶出が完了したら、数回渦を巻かせることによって、各「溶出抗体」画分チューブを穏やかに混合する。およそ５０μｌの画分＃３を取り除き、ｐＨ試験紙片上に置いて、溶出液がおよそｐＨ６．５〜８．５の間に中和されていることを確実にする。必要な場合、ｐＨを範囲内にするのに必要な場合、さらなる中和バッファーまたは溶出バッファーを加える。
・ｐＨ評価が完了したら、２８０ｎｍ〜４００ｎｍで各画分の試料の吸光度スキャンを行って、透析プロセスへの進行の前に、溶出液中のＩｇＧのおよその濃度を判定する。
【００６９】
Ａ２８０〜Ａ４００値が０．２００以上である場合、画分を溶出液貯留の一部として受け入れる。
【００７０】
Ａ２８０〜Ａ４００値が０．２００未満である場合、画分を溶出液貯留の一部として受け入れない。
・無菌コニカル遠心チューブに「溶出抗体」、「溶出液貯留」と貼り紙をし、貯留の一部として受け入れられた全ての画分を合わせる。
・溶出貯留の試料の吸光度スキャンを行って、透析プロセスへの進行の前に、溶出液中のＩｇＧのおよその濃度を判定する。
・溶出液貯留の体積を評価し、ＩｇＧのおよその総ｍｇを計算する。
・溶出液貯留の体積：＿ｍｌ×＿ＩｇＧ  ｍｇ／ｍｌ＝ＩｇＧの＿総ｍｇ
（抗体透析）
・「溶出抗体」チューブを２℃から１０℃に移す。
・溶出液のおよその体積および表４のデータを用いて、抗体溶出液を透析するのに必要な透析管系のおよその長さを計算する。
【００７１】
【表４】
2008539251.tif 000006
・必要な、適切な長さの透析管系を切断する。（Ｓｐｅｃｔａ／Ｐｏｒ（登録商標）２再生セルロース膜、１２０００〜１４０００ダルトン分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）、１６ｍｍ直径、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．、カタログ番号１３２６７８）
・透析膜管系を１０００ｍｌのＤＩＨ２Ｏ中で３０分より長い間水和する。
・表５のデータを用いて、抗体溶出液を透析するのに必要な透析バッファーのおよその体積を計算する。
【００７２】
【表５】
2008539251.tif 000007
・適切な量の透析バッファーを、適した大きさのプラスチックビーカーに入れる。ビーカーに「透析抗体」と貼り紙をする。清潔な撹拌棒を加え、ビーカーを２℃〜１０℃で冷蔵庫または低温室内の撹拌プレートに置く。
・透析管系をＤＩ−Ｈ２Ｏ中で徹底的にすすぐ。２つの末端の結び目を透析管系の一端からおよそ７ｃｍで結びつけ、透析管系をしっかりと固定する。
・およそ５ｍｌのＤＩ−Ｈ２Ｏを透析管系に加える。
・透析管系に、「溶出抗体」収集チューブの溶出抗体を充填する。
・２つの末端の結び目を、透析管系の残った開放端から７ｃｍで結びつけ、しっかりと固定する。上部空間が、およそ表４から導かれるものであることを確実にする。
・充填し、閉鎖した透析管系を、適切な体積の１×ＰＢＳ（表５から）を含む透析貯蔵器に入れる。
・清潔なラップでビーカーを覆う。透析試料が自由に回転するが透析物の渦に引き下ろされないように、撹拌プレート上で速度を調節する。透析は、合計２４時間の期間中３回のバッファー交換ありで、２℃〜１０℃で起こるべきである。
【００７３】
（抗体ろ過）
・無菌収集チューブに「透析抗体」と貼り紙をする。
・透析した試料管系を透析ビーカーから取り除く。一端で透析管系を切開し、透析した試料を「透析抗体」遠心チューブに移す。
・別の無菌収集チューブに「透析抗体」と貼り紙をする。
・最終的な透析された体積を保持するのに十分な容量を有する無菌のＬｕｅｒ  Ｌｏｋ注射器を選択する。
・Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）注射器フィルターを、注射器の開口部に取り付ける（０．２μｍ  ＨＴ  Ｔｕｆｆｒｙｎ（登録商標）膜、低タンパク質結合、Ｇｅｌｍａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カタログ番号４１９２）。注射器からプランジャを取り除き、注射器を直立して保持しながら、透析したモノクローナル抗体を「透析抗体」チューブから注射器に移す。プランジャを戻す。
・Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）注射器フィルターを、開放した無菌の、張り紙をした「透析抗体」収集チューブ上に保持し、注射器プランジャを押し下げて、精製された抗体を「精製抗体」チューブにろ過する。
・ろ過が完了したら、「精製抗体」チューブにキャップをし、２℃〜１０℃で保存する。
・Ａ２８０手順を用いて、精製されたモノクローナル抗体の濃度を判定する。
【００７４】
（実施例３）
（エピトープマッピングの一般的方法）
（一般的手法）
エピトープマッピングを行って、特定のモノクローナル抗体によって認識される抗原性タンパク質（すなわち、エピトープ）内の直鎖状アミノ酸配列を同定する。エピトープマッピングのための一般的な手法は、一般的に異種発現系において、全長タンパク質、ならびにタンパク質の種々の断片（すなわち、トランケートされた形態）の発現を必要とする。次いで、これらの種々の組換えタンパク質を用いて、特定のモノクローナル抗体が１つまたは複数のトランケートされた形態の標的タンパク質に結合することができるかどうかを判定する。繰り返すトランケーションの使用および重複するアミノ酸領域を有する組換えタンパク質の生成によって、調査中のモノクローナル抗体によって認識される領域を同定することが可能である。ウエスタンブロット分析またはＥＬＩＳＡを採用して、調査中の特定のモノクローナル抗体が１つまたは複数の組換えタンパク質断片を結合することができるかどうかを判定する。この手法は、エピトープを含むペプチド領域を最終的に同定し、いくつかの場合において、エピトープを正確に８〜１１アミノ酸配列にさらに精密にすることができる。
【００７５】
（構築物設計および考案）
エピトープマッピングの最初の工程は、ネステッド遺伝子トランケーションの設計である。頻繁に、さらなる分析のために、遺伝子は４つの等しい部分に分割される。
【００７６】
（遺伝子クローニング戦略）
一般的なクローニング戦略は、ＰＣＲベースのクローン化された遺伝子断片の生成で始まる。クローン化断片を効率的に発現させるために、特に小さいアミノ酸領域を使用する場合、クローン化断片は融合タンパク質として、すなわち、系において安定して発現される別の担体タンパク質に融合されて、発現される。緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）は、担体タンパク質として頻繁に使用される。ＧＦＰは、融合パートナーの一部として含まれてトランケーション断片を安定化させ、その後のｉｎ  ｖｉｔｒｏタンパク質発現工程の間に発現を向上させる。ＧＦＰはまた、抗ＧＦＰ抗体を用いた融合タンパク質発現の追跡を可能にする。
【００７７】
いずれかのメガ−プライミング手法を用いて、またはｐＳｃｒｅｅｎ−ＧＦＰベクターへのプラスミドクローニングの使用によって、ＧＦＰ−タンパク質構築物を作製するためのクローニングを行う。一般に、トランケーション断片を、ＧＦＰ、およびメガプライミングと呼ばれる技術を用いたタンパク質発現に必要な制御配列に融合させる。
【００７８】
メガプライミングは、それぞれの断片の末端の相同な領域アニーリングすることおよびアニーリングした一本鎖ＤＮＡを熱安定性ＤＮＡポリメラーゼで伸長させることによる、２つ以上のＤＮＡ断片の結合である。このプロセスによって、２つ以上の、より小さい断片から、それらの共有する配列によってそれらを連結して、１つの大きなＤＮＡ断片が生じる。次いで、大きな断片を、標準的ＰＣＲを用いて増幅する。
【００７９】
メガプライミングをうまく使用できない場合、トランケーション断片を、ＧＦＰおよびタンパク質発現制御配列を含むプラスミドにクローニングすることができる。このクローニングによって、エピトープマッピングに必要なＧＦＰ／断片融合が生じる。次いで、残りのプロトコルを後述のように進めることができる。
【００８０】
（タンパク質発現）
次いで、例えばメガプライミングによって作製される、発現構築物を、ラピッドトランスレーションシステム（ＲＴＳ）に導入する。ＲＴＳは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）溶解物由来の、無細胞タンパク質発現系である。この系によって、ＤＮＡ鋳型からのタンパク質の迅速な（３〜４時間）発現が可能になる。
【００８１】
ＲＴＳが十分なレベルのタンパク質発現を生じない場合、トランケーション断片をＧＦＰタンパク質発現プラスミドにクローニングする。次いで、これらの融合プラスミドを、タンパク質発現のために最適化された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株に形質転換する。タンパク質発現を、増殖している細菌の培養物中に誘導し、生長の後、細胞を溶解させる。次いで、複雑な細胞溶解物中のタンパク質を、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＰＡＧＥ）によって分離し、残りのプロトコルは以下と同じである。
【００８２】
（タンパク質検出およびエピトープマッピング）
ＲＴＳによって生成されたタンパク質断片を、ＰＡＧＥを用いて分離し、ニトロセルロース膜に移す。次いで、膜結合タンパク質を、溶液中で、調査中の抗体に曝露する。抗体／タンパク質結合を、当該分野で公知の比色技術を用いて同定する。
【００８３】
全長タンパク質およびトランケートされたタンパク質断片のいくつかのサブセットの抗体結合は、陽性の結果を構成する。タンパク質の特定の部分がないことによって抗体結合が排除される場合、エピトープはこの断片上にある。
【００８４】
マッピングされる抗体が、ニトロセルロース膜に結合しているタンパク質を認識しない場合、例えばＥＬＩＳＡまたは免疫沈降等の、抗体／タンパク質相互作用を検出するための代替的方法が用いられる。抗体／タンパク質相互作用を検出するための方法は、当該分野で周知である。
【００８５】
（エピトープ位置選定をさらに精密にする）
上述のプロトコルは、エピトープの位置選定をタンパク質のおよそ４分の１まで狭くするだけなので、エピトープの位置選定をさらに分析するために、エピトープを含むと判定された４分の１のタンパク質に関するプロセスを繰り返す必要がある。非常に大きなタンパク質については、このプロセスを２〜３回繰り返して、８〜１５アミノ酸までエピトープを狭める必要がある場合がある。
【００８６】
（実施例４）
（ＭＣＭ２モノクローナル抗体２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９についてのエピトープの特徴付け）
本質的に実施例３に記載されているように、ＭＣＭ２モノクローナル抗体２７Ｃ５．６および２６Ｈ６．１９についてのエピトープマッピングを行った。具体的には、ＰＣＲを用いて、ＭＣＭ２遺伝子トランケーションを作製し、それに続くＲＴＳによって組換えＭＣＭ２タンパク質断片を生成し、最後にウエスタンブロッティングによってＭＣＭ２への抗体結合を検出した。２回目のＰＣＲにおいてＧＦＰをＭＣＭ２遺伝子トランケーションと結合させて、ＲＴＳにおける確固として安定した発現を確実にした。
【００８７】
ＭＣＭ２の全長コード配列（配列番号２、ＮＭ＿００４５２６）は、２７１５ｂｐのサイズを有する。しかしながら、組換えＭＣＭ２タンパク質の発現に使用され、ＭＣＭ２抗体の生成の間にマウスの免疫化に使用されたｃＤＮＡは、２６８８ｂｐの遺伝子サイズを有した（配列番号５）。使用した、トランケートされたＭＣＭ２  ｃＤＮＡは、ＭＣＭ２タンパク質の５’末端を欠く２７ｂｐ領域、具体的には断片
【００８８】
【化２】
2008539251.tif 000008
を有した。ＭＣＭ２−２７Ｃ５．６抗体をエピトープマッピングするために、以下の連続的工程を行った。
【００８９】
ＭＣＭ２遺伝子は大きく（＞１０００ｂｐ）、必要なＰＣＲの繰り返しの数を最小限にする必要があるので、遺伝子を、およそ４００ｂｐの６つの領域［１〜６］に等分した。２回目のＰＣＲサイクルの間のメガプライミングを可能にする相同な配列およびｐＳｃｒｅｅｎ−ＧＦＰプラスミドへのサブクローニングの第二の選択肢のための制限酵素認識部位を含む、重複する配列を、第一のＰＣＲの間に目的の遺伝子に付加する。１回目のＰＣＲによって、以下のものを含むトランケートされたＭＣＭ２ヌクレオチド配列（配列番号５）の断片が生じた。領域［１］は１〜４２６ｂｐであり、領域［１〜２］は１〜８８８ｂｐであり、領域［１〜３］は１〜１３７７ｂｐであり、領域［１〜４］は１〜１８４５ｂｐであり、領域［１〜５］は１〜２２４１ｂｐであり、領域［１〜６］は１〜２６８８ｂｐであり、最後に、領域［２〜６］は４２７〜２６８８ｂｐであった。個々の領域（例領域［５］）は発現されず、領域間の連結配列中に存在した、欠けているエピトープが防がれた。
【００９０】
断片サイズはメガプライミングには大きすぎる場合、ＭＣＭ２の１回目のＰＣＲ産物を、ｐＳＣＲＥＥＮ−ＧＦＰ（ＢａｍＨ１−Ｘｈｏ１）にサブクローニングした。成功しなかった唯一のトランケーションは、全長領域［１〜６］であった。全長遺伝子の増幅に使用した元々のプライマー、およびトランケーションを、操作して制限酵素認識部位（５’末端ＢＡＭＨ１、３’末端ＸＨＯ１）に含めて、ｐＳＣＲＥＥＮ−ＧＦＰへの直接のサブクローニングを可能にした。
【００９１】
ＲｏｃｈｅのＲＴＳ１００大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＨＹキットを用いたＲＴＳ反応におけるタンパク質生成のための鋳型として、作製したＧＦＰ−遺伝子融合を用いた。ＲＴＳからのタンパク質生成物をアセトン沈殿させ、変性ポリアクリルアミドゲルに直接ロードし、ウエスタンブロッティングによって分析した。ウエスタンブロットを、２７Ｃ５．６モノクローナル抗体およびＧＦＰ抗体で直接プローブした。
【００９２】
１回目のＲＴＳの産物を、ＧＦＰ抗体およびＭＣＭ２モノクローナル抗体２７Ｃ５．６の両方でプローブした。領域［１〜３］で陽性のバンドを検出した。領域［１〜３］によって包含される断片を開始配列として用いて、上述のプロセスを繰り返した。
【００９３】
２回目のＲＴＳによって、領域ＭＣＭ２−３Ｑ３（
【００９４】
【化３】
2008539251.tif 000009
配列番号１のアミノ酸残基３５５〜３８２に対応する）中の２７Ｃ５．６抗体についての陽性の結果が生じた。領域ＭＣＭ２−３Ｑ３によって包含される断片を開始配列として用いて、上述のプロセスを繰り返した。
【００９５】
３回目のＲＴＳによって、領域ＭＣＭ２−３Ｑ３．２（
【００９６】
【化４】
2008539251.tif 000010
配列番号１のアミノ酸残基３６９〜３８２に対応する）中の２７Ｃ５．６抗体についての陽性の結果が生じた。領域ＭＣＭ２−３Ｑ３．１（
【００９７】
【化５】
2008539251.tif 000011
配列番号１のアミノ酸残基３５５〜３６８に対応する）またはＭＣＭ２−３Ｑ３．２（
【００９８】
【化６】
2008539251.tif 000012
配列番号１のアミノ酸残基３６２〜３７５に対応する）中で、陽性の結果は得られなかった。
【００９９】
結果
最初の結果から、ＭＣＭ２モノクローナル抗体２７Ｃ５．６のエピトープは、ＭＣＭ２タンパク質のＮ末端領域内に位置していることが示された。引き続きのＭＣＭ２タンパク質のトランケーションから、２７Ｃ５．６によって認識されるエピトープが、具体的には配列番号１のアミノ酸残基３６９〜３８２（
【０１００】
【化７】
2008539251.tif 000013
）に対応する、１４アミノ酸領域内に位置することが示された。さらなる回のＲＴＳによって、エピトープ位置選定をさらに精密にすることができるかもしれない。
【０１０１】
上述の同一のプロセスを用いて、ＭＣＭ２モノクローナル抗体２６Ｈ６．１９のエピトープを同定した。最初の結果から、エピトープがＭＣＭ２タンパク質のＣ末端領域内に位置することが示された。エピトープを、具体的には配列番号１のアミノ酸残基６８８〜７１０（
【０１０２】
【化８】
2008539251.tif 000014
）に対応する、２３アミノ酸領域に予備的に限定した。さらなる分析によって、ＭＣＭ２モノクローナル抗体２６Ｈ６．１９のエピトープを、配列番号１のアミノ酸残基６８３〜６９２（
【０１０３】
【化９】
2008539251.tif 000015
）を含む１０アミノ酸領域に、さらに精密にした。
【配列表】
2008539251000001.app
【手続補正書】
【提出日】平成20年2月5日(2008.2.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＭＣＭ２に特異的に結合することができるモノクローナル抗体、またはその変異体もしくは断片であって、該モノクローナル抗体は、以下：
（ａ）ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体、
（ｂ）ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体、
（ｃ）ハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６または２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体の結合特性を有するモノクローナル抗体、
（ｄ）ハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６または２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体を結合することができるエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｅ）配列番号３に示されるアミノ酸配列を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｆ）配列番号１４のアミノ酸配列を含むエピトープに結合するモノクローナル抗体、
（ｇ）ハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６または２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体との競合的結合アッセイにおいて競合するモノクローナル抗体、および
（ｈ）（ａ）〜（ｇ）のモノクローナル抗体の抗原結合断片であり、断片がＭＣＭ２に特異的に結合する能力を維持している、モノクローナル抗体、またはその変異体もしくは断片、
からなる群から選択される、モノクローナル抗体。
【請求項２】
ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されている、ハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６。
【請求項３】
ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されている、ハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９。
【請求項４】
請求項１に記載のモノクローナル抗体を産生することができる、ハイブリドーマ細胞株。
【請求項５】
少なくとも１つの請求項１に記載のモノクローナル抗体を含む、高悪性度子宮頸疾患を診断するためのキット。
【請求項６】
モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体、またはＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項５に記載のキット。
【請求項７】
少なくとも２つの抗体を含み、第一の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体であり、第二の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項５に記載のキット。
【請求項８】
Ｔｏｐｏ２Ａに特異的に結合する抗体をさらに含む、請求項７に記載のキット。
【請求項９】
各抗体が別々の抗体試薬として提供される、請求項７に記載のキット。
【請求項１０】
抗体の全てが抗体カクテルとして提供される、請求項７に記載のキット。
【請求項１１】
前記キットがペルオキシダーゼブロッキング試薬、タンパク質ブロッキング試薬、前記バイオマーカータンパク質への抗体結合を検出するための化学物質、対比染色剤、青みづけ剤、および使用のための手引きをさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１２】
パプ染色のための試薬をさらに含む、請求項５に記載のキット。
【請求項１３】
パプ染色のための試薬がＥＡ５０およびオレンジＧを含む、請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
ａ）患者由来の子宮頸試料を提供すること、
ｂ）試料と、ＭＣＭ２に特異的に結合する少なくとも１つの請求項１に記載のモノクローナル抗体とを接触させること、および
ｃ）ＭＣＭ２への抗体の結合を検出すること
を含む、患者における高悪性度子宮頸疾患の診断を支援するための方法。
【請求項１５】
モノクローナル抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体、またはＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
試料と、ＭＣＭ２に特異的に結合する少なくとも２つのモノクローナル抗体とを接触させることを含み、第一の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６８として寄託されているハイブリドーマ細胞株２７Ｃ５．６によって産生されるモノクローナル抗体であり、第二の抗体が、ＡＴＣＣに特許受託番号ＰＴＡ−６６６７として寄託されているハイブリドーマ細胞株２６Ｈ６．１９によって産生されるモノクローナル抗体である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
試料と、Ｔｏｐｏ２Ａに特異的に結合する抗体とを接触させることをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
抗体と試料とを、個々の抗体試薬として連続的に、または抗体カクテルとして同時に接触させる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ＭＣＭ２モノクローナル抗体を結合するためのエピトープを含む単離されたポリペプチドであって、該ポリペプチドは、
（ａ）配列番号３または１４に示されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、および
（ｂ）配列番号３または１４に対する少なくとも９０％の配列同一性を有し、抗原活性を有するポリペプチド、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、単離されたポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１９に記載のポリペプチドで非ヒト動物を免疫化することを含む、ＭＣＭ２抗体を生成するための方法。
【請求項２１】
（ａ）免疫応答を誘発する条件下で請求項１９に記載のポリペプチドで非ヒト動物を免疫化すること、
（ｂ）該動物から抗体産生細胞を単離すること、
（ｃ）培養物中で、抗体産生細胞を不死化細胞と融合し、モノクローナル抗体産生ハイブリドーマ細胞を形成すること、
（ｄ）ハイブリドーマ細胞を培養すること、および
（ｅ）培養物からモノクローナル抗体を単離すること
を含む、ＭＣＭ２モノクローナル抗体を生成するための方法。
【国際調査報告】
2008539251.tif 000016
2008539251.tif 000017
2008539251.tif 000018
2008539251.tif 000019
2008539251.tif 000020
2008539251.tif 000021
2008539251.tif 000022
2008539251.tif 000023