(57)【要約】  病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患をその必要性のある対象において治療する方法が開示される。この方法は、病理学的免疫応答を抑制することができる瀕死白血球または死白血球を含む細胞調製物の治療効果的な量を対象に投与し、それにより対象における疾患を治療することを含む。【選択図】  図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための、瀕死白血球または死白血球を含む細胞調製物の使用であって、前記瀕死白血球または死白血球は、生きている白血球を、表面に接着するように誘導することによって得られ、前記病理学的免疫応答を抑制することができる、使用。
【請求項２】
病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための、瀕死白血球または死白血球を含む細胞調製物の使用であって、前記瀕死白血球または死白血球は、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１αからなる群から選択される前炎症性媒介因子を分泌せず、前記病理学的免疫応答を抑制することができる、使用。
【請求項３】
前記瀕死白血球または死白血球は、生きている白血球を、インビトロ血清枯渇、ステロイドまたはステロイド誘導体による処理、照射、および、プロアポトーシス処理からなる群から選択される細胞破壊処理に供し、それにより前記瀕死白血球または死白血球を作製することによって得られる、請求項１または２に記載の使用。
【請求項４】
前記病理学的免疫応答は少なくとも１つの抗原に対して向けられ、かつ、前記瀕死白血球または死白血球は前記少なくとも１つの抗原を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項５】
前記瀕死白血球または死白血球は対象に由来する、請求項１または２に記載の使用。
【請求項６】
前記瀕死白血球または死白血球は、瀕死脾臓細胞または死脾臓細胞、および／または、瀕死胸腺細胞または死胸腺細胞を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項７】
前記瀕死白血球または死白血球は瀕死リンパ球または死リンパ球を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項８】
前記瀕死白血球または死白血球は瀕死単球または死単球を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項９】
前記瀕死白血球または死白血球は瀕死好中球または死好中球を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１０】
前記瀕死白血球または死白血球はアポトーシス性白血球を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１１】
疾患は全身性の自己免疫疾患である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１２】
疾患は抗体媒介による自己免疫疾患である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１３】
疾患は紅斑性狼瘡である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１４】
疾患は移植関連疾患である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１５】
疾患は移植片対宿主病である、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１６】
前記医薬品は、対象の体重１キログラムあたり約２０００万個〜約２０億個の細胞の範囲から選択される前記瀕死白血球または死白血球の治療効果的な量を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１７】
前記医薬品は、対象の体重１キログラムあたり約４００万個〜約２０億個の細胞の範囲から選択される前記瀕死白血球または死白血球の数を含む前記細胞調製物の治療効果的な量を含む、請求項１または２に記載の使用。
【請求項１８】
白血球のアポトーシスを誘導し、それによりアポトーシス性白血球を得るための１つ以上のアポトーシス誘導チャンバーを含む、白血球のアポトーシスを誘導するためのデバイスであって、前記１つ以上のアポトーシス誘導チャンバーは、単球のアポトーシスを誘導するための第１のチャンバー、好中球のアポトーシスを誘導するための第２のチャンバー、および、リンパ球のアポトーシスを誘導するための第３のチャンバーからなる群から選択される、デバイス。
【請求項１９】
前記第１のチャンバーは、表面への単球の接着を高めるための表面を含む、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２０】
デバイスはさらに、単球のアポトーシスを誘導するための単球培地を含有するための第１のリザーバーを含む、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２１】
デバイスはさらに、好中球のアポトーシスを誘導するための好中球培地を含有するための第２のリザーバーを含む、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２２】
デバイスはさらに、リンパ球のアポトーシスを誘導するためのリンパ球培地を含有するための第３のリザーバーを含む、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２３】
デバイスはさらに、表面接着性の単球を再懸濁するための機構を含む、請求項１９に記載のデバイス。
【請求項２４】
前記表面接着性の単球を再懸濁するための前記機構は、
プロテアーゼを含有するためのリザーバー、および、前記プロテアーゼを前記第１のチャンバーに導入するための機構；
前記表面接着性の単球を再懸濁するために十分な力および方向の流れを前記第１のチャンバーにおいて生じさせるための流れ発生機構；および、
前記表面接着性の単球を前記第１のチャンバーの前記表面から掻き取るための掻き取り機構
からなる群から選択される、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２５】
前記１つ以上のアポトーシス誘導チャンバーは、
アポトーシスを誘導するための照射機構；
アポトーシスを誘導するための機械的機構；および、
アポトーシスを誘導するための化学的または生化学的な物質または環境
からなる群から選択されるアポトーシス誘導機構を含む、請求項１８に記載のデバイス。
【請求項２６】
病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するためのデバイスであって、
（ａ）血液を対象からデバイスの中に送り、かつ、血液をデバイスから前記対象に戻すためのポンプ；
（ｂ）循環している白血球を全血から分離するために前記ポンプと連絡している白血球分離器；および、
（ｃ）前記白血球のアポトーシスを誘導し、それによりアポトーシス性白血球を得るために前記白血球分離器と連絡し、かつ、前記アポトーシス性白血球を対象に投与するために前記ポンプとさらに連絡している１つ以上のアポトーシス誘導チャンバー
を含む、デバイス。
【請求項２７】
前記アポトーシス誘導チャンバーは、単球のアポトーシスを誘導するための第１のチャンバーと、好中球のアポトーシスを誘導するための第２のチャンバーと、リンパ球のアポトーシスを誘導するための第３のチャンバーとを含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
前記第１のチャンバーは、表面への単球の接着を高めるための表面を含む、請求項２７に記載のデバイス。
【請求項２９】
デバイスはさらに、表面接着性の単球のアポトーシスを誘導するための単球培地を含有するための第１のリザーバーを含む、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３０】
デバイスはさらに、好中球のアポトーシスを誘導するための好中球培地を含有するための第２のリザーバーを含む、請求項２９に記載のデバイス。
【請求項３１】
デバイスはさらに、リンパ球のアポトーシスを誘導するためのリンパ球培地を含有するための第３のリザーバーを含む、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３２】
デバイスはさらに、表面接着性の単球を再懸濁するための機構を含む、請求項２８に記載のデバイス。
【請求項３３】
前記表面接着性の単球を再懸濁するための前記機構は、
プロテアーゼを含有するためのリザーバー、および、前記プロテアーゼを前記第１のチャンバーに導入するための機構；
前記表面接着性の単球を再懸濁するために十分な力および方向の流れを前記第１のチャンバーにおいて生じさせるための流れ発生機構；および、
前記表面接着性の単球を前記第１のチャンバーの前記表面から掻き取るための掻き取り機構
からなる群から選択される、請求項３２に記載のデバイス。
【請求項３４】
前記１つ以上のアポトーシス誘導チャンバーは、
アポトーシスを誘導するための照射機構；
アポトーシスを誘導するための機械的機構；および、
アポトーシスを誘導するための化学的または生化学的な物質または環境
からなる群から選択されるアポトーシス誘導機構を含む、請求項２６に記載のデバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために瀕死細胞を使用する方法、および、そのような瀕死細胞を調製するためのデバイスに関連する。より具体的には、本発明は、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患（例えば、自己免疫疾患および移植関連疾患など）を治療するために、前炎症性媒介因子を分泌しないアポトーシス性白血球を使用する方法、および、そのようなアポトーシス性白血球を調製するためのデバイスに関連する。
【背景技術】
【０００２】
病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患には、著しい死亡率および罹患率に関連し、かつ、満足すべき治療／最適な治療が得られない、非常に多数の疾患が含まれる。そのような疾患には、具体的には、自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）など）、移植関連疾患（例えば、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）など）が含まれる。
【０００３】
免疫系は、様々な細胞、抗体、組織、および、これらの構造体の間での連絡を可能にする化学的なメッセンジャー分子を含む複雑なネットワークである。健全な免疫系の顕著な特徴は、細菌、ウイルスおよび他の異物を認識し、かつ、そのような異物と、身体の分子、細胞、組織および器官とを識別しながら、そのような病原体を効果的に攻撃することができることである。感染と闘うことに加えて、免疫系は、身体の健康状態および機能の正常な状態を維持することにおいて他の役割を有する。生物の一生を通して、組織は、細胞の様々な領域が除去されながら作り直される。これは、プログラム化された細胞死、または、アポトーシスと呼ばれるプロセスによって達成され、これにより、アポトーシス性細胞は整然かつ無害な様式で崩壊し、食作用を受ける。例えば、多くの器官では、細胞の一定の割合が毎日死亡し、その一方で、免疫系の種々の部門が、典型的には、死細胞およびその一部分を除去して、死んだ細胞に取って代わるために現れる新しい細胞のための空間を作製するために呼び寄せられる。アポトーシスのプロセスはさらには、免疫系そのものの発達および維持において特に重要であると考えられ、この場合には、身体の正常な細胞を認識または攻撃する免疫細胞がこのプロセスによって破壊され、除去される。
【０００４】
体内において循環し、死に向かい、また、管外遊出する、産生される単球、好中球およびリンパ球の数は、アポトーシスによる場合を含めて、様々なレベルで制御される。
【０００５】
単球の場合、ＣＦＵ−ＧＭ（骨髄系経路に沿って分化するように決定された最も初期の特定された細胞）が、主にＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３および低レベルのＧＭ−ＣＳＦの存在下で、骨髄において単球に発達する。骨髄予備能が単球については存在せず、従って、単球は、骨髄を通過するのに１日〜３日を費やし、その後、放出されて、血液中で８時間〜７２時間を費やし、その後のさらなる可能な分化、成熟化および増殖を組織において受ける［１］。単球は末梢白血球の１パーセント〜６パーセントを構成しており、５．７ｘ１０６個／ｋｇの単球が毎日産生されることが推定される。単球はマクロファージとして組織において長期間生存することができる。しかし、単球の実質的な割合が、抗アポトーシス性因子の非存在下で、あるいは、感染または活性化の後でのどちらであっても、絶えずアポトーシスを受け続けている。
【０００６】
単球は、その活性化状態にもかかわらず、ＦａｓおよびＦａｓリガンドを発現しており［２、３］、Ｆａｓに依存したアポトーシスを、培養時［３］、活性化時［４］または感染時［５］は受けることが示された。単球は、増殖因子、分化因子（ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４）または活性化因子にさらされたとき、アポトーシスから救出され得る［３、６〜８］。マクロファージに分化するとき、単球は、Ｆａｓ関連デスドメイン様ＩＬ−１β変換酵素阻害タンパク質（ＦＬＩＰ）の発現によってＦａｓ依存的アポトーシスから救出される［３、９］。
【０００７】
好中球は白血球の最も多い集団を構成する。ヒトにおいて、好中球の１日の代謝回転は約１．６ｘ１０９細胞／ｋｇ体重であり（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  ＳＪ、Ｃｌａｒｋ  ＲＸ、Ｔｈｅ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９７８、３１３頁）、これにより、骨髄前駆体細胞の非常に大きい増殖能にもかかわらず、成熟した好中球の数が規定の範囲内に保たれる。この大きい代謝回転は、循環からの好中球の連続した放出によって媒介される。好中球は循環に戻らず、粘膜における分泌によって除かれるか、または、１日〜２日のうちに組織において死に至る（Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  ＳＪ、Ｃｌａｒｋ  ＲＸ、Ｔｈｅ  Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ、Ａｍｓｔｅｒｄａｍ、Ｎｏｒｔｈ−Ｈｏｌｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、１９７８、３１３頁）。正常な非炎症状態のもとでは、好中球の代謝回転は、様々な炎症性状態のもとで示されたこれらの細胞の大きい生体攻撃能および破壊能にもかかわらず、有害な影響を伴うことなく行われる［Ｗｅｉｓｓ  ＳＪ、好中球による組織破壊、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ、１９８９、３２０：３６５〜３７６］。有害な好中球破壊の特別な機構が、アポトーシス（遺伝子的にプログラムされた細胞自殺）によって提供される。
【０００８】
アポトーシスは、身体を防御する際に免疫系によって使用されるプロセスである一方で、自己抗原に対する寛容性を維持し、従って、免疫系が、身体自身の細胞を異物から識別することにおいてその役割を果たすことを可能にするためにも使用される。
【０００９】
細胞のアポトーシスは抗原提示において重要な役割を果たしている。未成熟な樹状細胞は、アポトーシス性細胞を飲み込み、かつ、その抗原を獲得し、免疫学的に提示する能力を有する。殺されたインフルエンザウイルスにさらされたアポトーシス性マクロファージを捕捉する未成熟な樹状細胞は、馴化培地の存在下で成熟し、リンパ球を活性化して、ウイルス特異的なＣＴＬ応答を開始する。しかしながら、感染および馴化培地の非存在下では、未成熟な樹状細胞は、アポトーシス性細胞を取り込んだ後で成熟せず、結果として、獲得した抗原を効率的に提示することが十分にできない。さらに、アポトーシス性物との相互作用の後、未成熟な樹状細胞は、種々の部位において一生にわたって作られる自己抗原に対する末梢寛容性を維持することにおいて役割を有し得ることが示唆されている。このことの裏付けとして、自己免疫性またはＳＬＥ様疾患が、本明細書中下記においてさらに記載されるように、アポトーシス性細胞の取り込みのために重要である受容体（例えば、ＡＢＣ１カセット輸送因子、Ｍｅｒ）が欠損しているマウスおよびヒトにおいて、また、補体欠損症において観測されている。特異的な受容体によるクリアランスにより、マクロファージによるアポトーシス性細胞の取り込みの後でのマクロファージによるＴＧＦ−βおよびＩＬ−１０の分泌によって明らかにされるように、特異的な免疫応答または免疫寛容性が決定され得る。従って、そのような相互作用の環境に存在するサイトカイン、ケモカイン、エイコサノイドおよびさらなる媒介因子により、免疫応答の極性が与えられ得る。
【００１０】
免疫系が、自己抗原と、非自己抗原との間での認識において不完全であるとき、その結果が疾患の状態であり、この結果、免疫系が１つ以上の特定の自己の分子または細胞を攻撃することにより、組織および器官の損傷がもたらされ、それにより、自己免疫疾患が生じる場合がある。標的化されていない組織の免疫病理もまた、周りの細胞および組織の免疫拒絶から生じる炎症の結果として非特異的に間接的に引き起こされる場合がある。古典的な自己免疫疾患（例えば、本明細書中上記で述べられた自己免疫疾患など）の他に、多くの血管性障害（そのような障害のアテローム硬化性形態を含む）が自己免疫性成分を有し、また、血管疾患を有する数多くの患者が循環性の自己抗体を有することがますます明らかになりつつある。自己免疫疾患は、２つの一般的なタイプ、すなわち、全身性の自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥおよび強皮症など）と、器官特異的な自己免疫疾患（例えば、多発性硬化症および糖尿病など）とに分けることができる。自己免疫疾患の多くの臨床的に異なるタイプおよびサブタイプが存在する。自己免疫疾患のそれぞれのタイプが多種多様な臨床的症状および異常な研究室パラメーターと関連するが、自己免疫疾患の様々な徴候および症状は重なることが多く、その結果、１つ以上が同じ患者において診断される。１つ以上の自己免疫疾患が診断されている圧倒的大多数の事例は、自己抗原に対して向けられた抗体（これは自己抗体と呼ばれる）が罹患者には存在することによって特徴づけられる。そのような自己抗体は、多くの場合、健康な個体における正常なレベルの１０倍〜１００倍で組織に存在し、また、特定の自己免疫疾患に関連した器官損傷および組織損傷の著しい割合を生じさせている。例えば、自己免疫疾患の重症筋無力症では、神経筋接合における受容体に対する自己抗体が筋肉の衰弱に関連し、一方で、ＳＬＥでは、抗ｄｓＤＮＡ抗体がヒト患者における腎炎に関連し、正常なマウスに注射したときには腎炎を生じさせ得る。そのような疾患では、器官および組織の損傷は、自己抗体の存在、および、自己抗体によって引き起こされる炎症性の免疫応答のために生じる炎症に起因すると考えられる。
【００１１】
全身性エリテマトーデスは、一般には自己免疫疾患を理解し、また、自己免疫疾患についての本発明の治療を開発するためのモデル疾患である。ＤＮＡおよびヒストンがＳＬＥについての主要な自己抗原であるとこれまで長い間理解されてきているが、ごく最近になって、ＤＮＡ−ヒストン複合体（すなわち、ヌクレオソーム）がＳＬＥにおける自己抗体の優先的な標的であるという証拠が提供されている。アポトーシスの期間中において、アポトーシスを受けている細胞の膜は細胞質突起を形成し、その一部がアポトーシス性体として脱落する。近年には、ケラチノサイトを高振動数の光にさらすことにより、アポトーシスが誘導されること、また、リボ核タンパク質のＲｏおよびＬａの細胞表面発現、しかし、ヌクレオソームおよびリボソームの細胞表面発現もまた、アポトーシス性表面突起へのいくつかの細胞内粒子の移動（トランスロケーション）によって説明され得ることが明らかにされた。重要なことではあるが、アポトーシスの期間中に生じる別の移動は、細胞がアポトーシスを受けるときの細胞膜の外側へのホスファチジルセリン（ＰＳ）（通常は細胞の内側に存在する酸性リン脂質）の移動である。ホスファチジルセリンは、カルジオリピンと同様に、ＳＬＥにおける抗リン脂質抗体についての主要な自己抗原である。まとめると、これらの知見は、ＳＬＥでは、アポトーシスの期間中に細胞表面に移動した細胞内タンパク質に対して向けられた自己免疫性が関与すること、および、従って、ＳＬＥ患者は、アポトーシス性物に対する免疫応答を形成することを示唆する。この仮説は、マウスの正常な系統への同系のアポトーシス性細胞の短時間の限定された投与により、自己抗体の誘導および糸球体沈着物がもたらされるという観察結果によって裏付けられる。ＳＬＥの免疫病理は、インビトロでのＳＬＥ患者からのマクロファージによるアポトーシス性細胞の低下した取り込み／クリアランスにおいて観察されるように、また、標的化された抗原の取り込みに関与する補体系のＣ１ｑ補体およびＣ４補体が欠損している患者におけるＳＬＥの高い発生率によって、マクロファージによるアポトーシス性物の不完全な取り込みをさらに伴うと思われる。
【００１２】
リンパ球、すなわち、Ｔ細胞およびＢ細胞は、アポトーシスに対して比較的抵抗性である。抗原による刺激を受けたとき、Ｂ細胞およびＴ細胞は増殖し、一部がエフェクター細胞に分化する。プラスマ細胞が、病原体を不動化し、その補体媒介による破壊、および、特定の骨髄性細胞によるそのＦｃ（Ｉｇ定常領域）受容体媒介による摂取を促進させる抗体を分泌する。活性化されたＴ細胞により、様々なサイトカインが産生され、それらのいくつかがＢ細胞およびＴ細胞自身の増殖および機能的活性化を促進させ、これに対して、他のいくつかのサイトカインがフィードバックシグナルを生来的免疫系の細胞に与える。免疫エフェクター機構は、遊離の病原体、および、同様に、病原体に感染した宿主細胞を殺すために設計された非常に強力な武器である。エフェクター分子の多く（例えば、前炎症性サイトカインなど）が抗原非特異的な様式で作用するために、また、いくつかの病原体特異的な受容体（例えば、Ｂ細胞受容体（ＢＣＲ）およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）など）が宿主の抗原と交差反応することがあるので、この兵器庫は、健康な細胞および組織を破壊する潜在的可能性を有する。
【００１３】
従って、病原体に対する免疫応答は潜在的な危険を宿主にもたらし、また、免疫病理が多くのタイプの感染により生じる。加えて、急速に増殖し続けている長期にわたって活性化されたリンパ球（特に、Ｉｇ可変遺伝子の高頻度変異を受けている胚中心におけるＢ細胞）は、リンパ腫および／または白血病の発症をもたらし得る、プロトオンコジーンまたは腫瘍サプレッサー遺伝子における変異を持続させる危険がある。多数の調節機構が、免疫病理を防止するために進化している。これらには、免疫系の細胞の機能的不活性化、すなわち、潜在的には可逆的であり、従って、危険な状態を排除しないプロセス、ならびに、すでに必要でない細胞および／または潜在的に危険な細胞をアポトーシスによって殺すことが含まれる［ＭａｒｓｄｅｎおよびＡ．Ｓｔｒａｓｓｅｒ、２００３、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１：７１〜１０５］。
【００１４】
アポトーシスを受けている細胞は、炎症性応答または自己免疫応答を誘発することなく、そのような細胞を迅速に飲み込むように、シグナルを周りの細胞（専門的な食細胞）および／または抗原提示細胞に送る［１０〜１２］。このプロセスは、恒常性、炎症の消散、および、寛容性誘導において重要な役割を果たしていると思われる［１３〜１５］。しかしながら、このプロセスの調節異常は、感染および腫瘍に対する免疫監視からの回避機構を表す場合があり、また、非効率的ならば、持続した炎症および自己免疫性を支える場合がある［１６、１７］。
【００１５】
依然として不明である別の問題が、免疫応答のクロスプライミングにおけるアポトーシス性細胞由来抗原の役割である。マクロファージではなく、ヒト樹状細胞は、インフルエンザ感染のアポトーシス性単球に由来する抗原を効率的に提示し、この抗原により、クラスＩ制限されたＣＤ８＋  ＣＴＬが刺激されることが示されている［１８］。樹状細胞がどのようにしてインフルエンザからの抗原の炎症誘発性提示を引き出すかは依然として不明である。なぜなら、これらの抗原は、通常の場合には抗炎症性であると見なされる、樹状細胞の成熟化を防止することが示されたアポトーシス性細胞から獲得されるからである［１５、１９］。前者の研究では、馴化培地がアジュバントとして用いられたが、それにもかかわらず、クロスプライミングを可能にする生理学的アジュバントは依然として不明である。従って、所与の系譜のアポトーシス性細胞に由来する抗原は、解明されなければならない機構による免疫性の活性化または抑制をもたらし得る。
【００１６】
自己免疫疾患（例えば、ＳＬＥなど）および移植関連疾患（例えば、ＧＶＨＤなど）に関連する免疫病理を治療するために免疫系を操作することが、長年の免疫学者の主要な目的である。従来、そのような操作は免疫抑制薬物（例えば、コルチコステロイド、アザチオプリン、シクロホスファミドおよびシクロスポリンなど）の使用を伴っている。そのような薬物誘導による免疫抑制は、例えば、ＳＬＥ患者の５年生存率の改善をこの３０年間でもたらしているが、そのような免疫抑制は、治癒が全く達成されないので、理想的な治療からはほど遠いものである。なぜなら、そのような治療には、大きい罹病率をもたらす全身的な免疫抑制を含めて、非常に重篤な副作用が伴い、また、そのような治療は早死の一番の原因であるからである。生物学的薬剤（例えば、抗ＣＤ４０リガンドおよびＣＴＬＡ−４Ｉｇなど）の投与もまた主張されている。しかしながら、例えば、上記の免疫抑制薬物と同様に全身的な免疫抑制が伴う可能性があるので、そのような治療の毒性および効力は最適ではない。
【００１７】
従って、本明細書中上記で記載された瀕死白血球の寛容化性質／非炎症的性質を考慮して、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患（例えば、自己免疫疾患および移植関連疾患など）を治療するための潜在的に最適な方法は、免疫抑制的性質／非炎症的性質を有する瀕死白血球を投与することを伴う。そのような方法は本質的には、免疫抑制薬物に基づいた先行技術による治療法の上記の著しい欠点を克服すると考えられる。
【００１８】
瀕死白血球の投与を伴ういくつかの先行技術による方法が、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために用いられているか、または提案されている。
【００１９】
１つの方法では、同種の被移植者に移植されたドナーの造血系移植片の生着を容易にするためにアポトーシス性ドナー細胞（例えば、アポトーシス性ドナー白血球など）を投与することが提案される［Ｐｅｒｒｕｃｈｅ  Ｓ．他、２００４、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、４：１３６１〜５；Ｋｌｅｉｎｃｌａｕｓｓ  Ｆ．他、２００３、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、７５（９Ｓｕｐｐｌ）：４３Ｓ〜４５Ｓ］。しかしながら、そのような方法には、ＧＶＨＤの危険性ならびに自身の拒絶の危険性が本質的には伴う同種白血球の投与が要求されること、最適でない効力、炎症性副作用についての潜在的可能性に関して十分な安全性を実証することができないことを含めて、および／または、ヒト患者において一度も試されておらず、従って、いかなる治療的効力もヒト患者において一度も実証されていないという様々な欠点がある。
【００２０】
アフェレーシスに基づいた別の方法は、「体外フォトフェレーシス」と呼ばれ、特定の造血細胞（例えば、Ｔ細胞など）によって特異的に取り込まれ得る光活性化可能な色素を患者に投与すること、および、そのような取り込みの後で、血液を採取すること、その特定の造血細胞を単離すること、そのアポトーシスをＵＶ照射によって誘発させること、および、細胞を患者に戻すことを伴う（米国特許第６２１９５８４号；Ｃｒｏｖｅｔｔｉ  Ｇ他、２０００、Ｉｎｔ．Ｊ．Ａｒｔｉｆ．Ｏｒｇａｎｓ、２３（１）：５５〜６２；ＴＨＥＲＡＫＯＳ，Ｉｎｃ．、ＰＡ、米国）。この方法が、過敏症、移植片拒絶またはＳＬＥの治療のために主張されており（米国特許第４８３８８５２号）、または、ＧＶＨＤの改善のために主張されている（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０００５４６１３？ｏｒｄｅｒ＝２）。しかしながら、アフェレーシスを伴う先行技術による方法は、多くの場合、最適に効果的ではなく、起源不明の望ましくない副作用（例えば、炎症性副作用など）が伴う場合がある（例えば、Ｓｉａｍｉ  ＧＡ．他、１９９７、アンギオテンシン変換酵素阻害剤が投与されている患者においてアナフィラキシー様反応を引き起こす凍結ろ過アフェレーシスおよび血漿分画化、Ｔｈｅｒ  Ａｐｈｅｒ、１：３２５〜５；Ｓｃｈｗａｒｚｂｅｃｋ  Ａ．他、１９９７、デキストランアフェレーシスの期間中のアナフィラキシー様反応はＡＣＥ阻害剤投与の非存在下でさえ生じ得る、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１２：１０８３〜４；Ｋｏｇａ  Ｎ．他、１９９３、ＬＤＬ−アフェレーシスおよびＡＣＥ阻害剤により治療された患者におけるアナフィラキシー様反応およびブラジキニン生成、ＡＳＡＩＯ  Ｊ、３９：Ｍ２８８〜９１；Ｓｔｒａｕｓｓ  ＲＧ．、１９９６、血液交換療法時における有害作用の機構、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１１：１６０〜４；Ｒｏｓｓｉ  ＰＬ．他、１９９１、治療的血球アフェレーシスの副作用と、血液交換療法の他のタイプの副作用との比較、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、７６  Ｓｕｐｐｌ  １：７５〜８０；Ｈｕｅｓｔｉｓ  ＤＷ．、１９８９、血液交換療法の手順における危険性および安全対策、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ、１１３：２７３〜８；Ｈｏｃｋｅｒ  Ｐ．、Ｗａｇｎｅｒ  Ａ．、１９８７、細胞分離器を用いた血球アフェレーシスの副作用、Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓｔｈｅｒ  Ｋｌｉｎ  Ｅｒｎａｈｒ、１４  Ｓｕｐｐｌ  ４：３１〜５を参照のこと）。特に、体外フォトフェレーシスでは、有害な壊死性細胞／前炎症性細胞の生成および投与が伴う（Ｃａｒｉｃｃｈｉｏ  Ｒ．他、２００３、紫外線Ｂにより誘導される細胞死：炎症および狼瘡自己抗原再分布における紫外線量の重要な役割、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７１：５７７８〜５７８６）。
【００２１】
従って、すべての先行技術方法は、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために瀕死白血球を使用するための十分な解決策を提供していない。
【００２２】
従って、上記の制限を有さない疾患治療方法が必要であることが広く認識されており、また、そのような疾患治療方法を有することは非常に好都合である。
【発明の開示】
【００２３】
本発明は、病理学的免疫応答に関連する疾患を治療するための、前炎症性媒介因子（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−８およびＭＩＰ１αなど）を実質的に含有さない瀕死白血球または死白血球の使用を開示し、また、そのような瀕死白血球または死白血球を作製するためのデバイスを開示する。本明細書中下記においてさらに記載および例示されるように、本発明の使用は様々な方法で達成することができ、また、本発明のデバイスは様々な方法で構成することができる。
【００２４】
本発明の１つの態様によれば、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための、瀕死白血球または死白血球を含む細胞調製物の使用が提供され、この場合、瀕死白血球または死白血球は、生きている白血球を、表面に接着するように誘導することによって得られ、病理学的免疫応答を抑制することができる。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために特定される医薬品を製造するための、瀕死白血球または死白血球を含む細胞調製物の使用が提供され、この場合、瀕死白血球または死白血球は、ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１αからなる群から選択される前炎症性媒介因子を分泌せず、病理学的免疫応答を抑制することができる。
【００２６】
本発明のさらに別の態様によれば、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患をその必要性のある対象において治療する方法が提供され、この場合、この方法は、病理学的免疫応答を抑制することができる瀕死白血球または死白血球を含む細胞調製物の治療効果的な量を対象に投与し、それにより対象における疾患を治療することを含む。
【００２７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、この方法はさらに、生きている白血球を、インビトロ血清枯渇、ステロイドまたはステロイド誘導体による処理、照射、および、プロアポトーシス処理からなる群から選択される細胞破壊処理に供し、それにより瀕死白血球または死白血球を作製することを含む。
【００２８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、疾患を治療するこの方法はさらに、生きている白血球を、表面に接着するように誘導し、それにより瀕死白血球または死白血球を作製することを含む。
【００２９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、病理学的免疫応答は少なくとも１つの抗原に対して向けられ、かつ、瀕死白血球または死白血球はその少なくとも１つの抗原を含む。
【００３０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、瀕死白血球または死白血球は対象に由来する。
【００３１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、瀕死白血球または死白血球は、瀕死脾臓細胞または死脾臓細胞、および／または、瀕死胸腺細胞または死胸腺細胞を含む。
【００３２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、瀕死白血球または死白血球は瀕死リンパ球または死リンパ球を含む。
【００３３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、瀕死白血球または死白血球は瀕死単球または死単球を含む。
【００３４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、瀕死白血球または死白血球は瀕死好中球または死好中球を含む。
【００３５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、瀕死白血球または死白血球はアポトーシス性白血球を含む。
【００３６】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、疾患は全身性の自己免疫疾患である。
【００３７】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、疾患は抗体媒介による自己免疫疾患である。
【００３８】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、疾患は紅斑性狼瘡である。
【００３９】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、疾患は移植関連疾患である。
【００４０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、疾患は移植片対宿主病である。
【００４１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞調製物を投与することは、対象の体重１キログラムあたり約２０００万個〜約２０億個の細胞の範囲から選択される瀕死白血球または死白血球の総数を対象に投与することを含む。
【００４２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、細胞調製物を投与することは、瀕死白血球または死白血球の少なくとも１つの単位用量物を対象に投与することを含み、この場合、単位用量物は、対象の体重１キログラムあたり約４００万個〜約２０億個の細胞の範囲から選択される瀕死白血球または死白血球の数を含む。
【００４３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、瀕死白血球または死白血球は、生きている白血球を、インビトロ血清枯渇、ステロイドまたはステロイド誘導体による処理、照射、および、プロアポトーシス処理からなる群から選択される細胞破壊処理に供し、それにより瀕死白血球または死白血球を作製することによって得られる。
【００４４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬品は、対象の体重１キログラムあたり約２０００万個〜約２０億個の細胞の範囲から選択される瀕死白血球または死白血球の治療効果的な量を含む。
【００４５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、医薬品は、対象の体重１キログラムあたり約４００万個〜約２０億個の細胞の範囲から選択される瀕死白血球または死白血球の数を含む細胞調節物の治療効果的な量を含む。
【００４６】
本発明のさらに別の態様によれば、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するためのデバイスが提供され、この場合、このデバイスは、（ａ）血液を対象からデバイスの中に送り、かつ、血液をデバイスから対象に戻すためのポンプ；（ｂ）循環している白血球を全血から分離するためにポンプと連絡している白血球分離器；および（ｃ）白血球のアポトーシスを誘導し、それによりアポトーシス性白血球を得るために白血球分離器と連絡し、かつ、アポトーシス性白血球を対象に投与するためにポンプとさらに連絡している１つ以上のアポトーシス誘導チャンバーを含む。
【００４７】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、アポトーシス誘導チャンバーは、単球のアポトーシスを誘導するための第１のチャンバーと、好中球のアポトーシスを誘導するための第２のチャンバーと、リンパ球のアポトーシスを誘導するための第３のチャンバーとを含む。
【００４８】
本発明のさらに別の態様によれば、白血球のアポトーシスを誘導し、それによりアポトーシス性白血球を得るための１つ以上のアポトーシス誘導チャンバーを含む、白血球のアポトーシスを誘導するためのデバイスが提供され、この場合、そのような１つ以上のアポトーシス誘導チャンバーは、単球のアポトーシスを誘導するための第１のチャンバー、好中球のアポトーシスを誘導するための第２のチャンバー、および、リンパ球のアポトーシスを誘導するための第３のチャンバーからなる群から選択される。
【００４９】
下記に記載される本発明の好ましい実施形態におけるさらなる特徴によれば、第１のチャンバーは、表面への単球の接着を高めるための表面を含む。
【００５０】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、デバイスはさらに、単球のアポトーシスを誘導するための単球培地を含有するための第１のリザーバーを含む。
【００５１】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、デバイスはさらに、好中球のアポトーシスを誘導するための好中球培地を含有するための第２のリザーバーを含む。
【００５２】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、デバイスはさらに、リンパ球のアポトーシスを誘導するためのリンパ球培地を含有するための第３のリザーバーを含む。
【００５３】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、デバイスはさらに、表面接着性の単球を再懸濁するための機構を含む。
【００５４】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、表面接着性の単球を再懸濁するための機構は、プロテアーゼを含有するためのリザーバー、および、プロテアーゼを第１のチャンバーに導入するための機構；表面接着性の単球を再懸濁するために十分な力および方向の流れを第１のチャンバーにおいて生じさせるための流れ発生機構；および、表面接着性の単球を第１のチャンバーの表面から掻き取るための掻き取り機構からなる群から選択される。
【００５５】
記載された好ましい実施形態におけるなおさらなる特徴によれば、１つ以上のアポトーシス誘導チャンバーは、アポトーシスを誘導するための照射機構；アポトーシスを誘導するための機械的機構；および、アポトーシスを誘導するための化学的または生化学的な物質または環境からなる群から選択されるアポトーシス誘導機構を含む。
【００５６】
本発明は、病理学的免疫応答に関連する疾患（例えば、自己免疫疾患およびＧＶＨＤなど）を改善された安全性および有効性で治療する方法を、瀕死白血球または死白血球を提供することにより、また、そのような白血球を作製するためのデバイスを提供することにより、また、そのような方法を実施するためのデバイスを提供することにより提供することによって、現在知られている形態の欠点に対処することに成功している。
【００５７】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。本明細書中で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、その全体が参考として援用される。矛盾する場合には、定義を含めて、本特許明細書が優先する。加えて、材料、方法および実施例は例示にすぎず、限定であることは意図されない。
【００５８】
図面の簡単な記述
本明細書では本発明を単に例示し図面を参照して説明する。特に詳細に図面を参照して、示されている詳細が例示として本発明の好ましい実施態様を例示考察することだけを目的としており、本発明の原理や概念の側面の最も有用でかつ容易に理解される説明であると考えられるものを提供するために提示していることを強調するものである。この点について、本発明を基本的に理解するのに必要である以上に詳細に本発明の構造の詳細は示さないが、図面について行う説明によって本発明のいくつもの形態を実施する方法は当業者には明らかになるであろう。
図１は、同系のアポトーシス性細胞による治療の後でのＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスにおける血清中の抗一本鎖ＤＮＡ抗体の減少を示すヒストグラムである。黒丸、ビヒクルのみにより免疫化された６週齢のＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスのコントロール群；白丸、同系のアポトーシス性細胞により免疫化された６週齢のＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの実験群；黒三角、１０週間の治療の後でのコントロール群；白三角、１０週間の治療の後での実験群。
図２は、同系のアポトーシス性細胞による治療の後でのＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスにおける血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体の減少を示すヒストグラムである。黒丸、ビヒクルのみにより免疫化された６週齢のＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスのコントロール群；白丸、同系のアポトーシス性細胞により免疫化された６週齢のＭＲＬ／ｌｐｒ／ｌｐｒマウスの実験群；黒三角、１０週間の治療の後でのコントロール群；白三角、１０週間の治療の後での実験群。
図３は、血清枯渇および支持体接着による単球のアポトーシス誘導を示す１組の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）ドットプロットである。７０パーセントを超える単球が１２時間までにアネキシンＶ陽性かつＰＩ陰性であり、これは早期アポトーシスを示した。二次的な壊死性細胞が、アネキシンＶ陽性かつヨウ化プロピジウム（ＰＩ）陽性の細胞によって示されるように、細胞の５パーセント未満であった。アポトーシスプロセスの特異性が、２０ｍＭのｚＶＡＤ−ｆｍｋの存在下での顕著な阻害によってさらに示された。早期アポトーシス性細胞および二次的壊死性細胞の百分率がそれぞれのヒストグラムの中に示される。データは６つの異なる実験を表す。
図４は、単球の、懸濁＋血清枯渇により誘導される死がアポトーシス性でないことを示す１組の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）ドットプロットであり、壊死の特徴を示す。血清枯渇に加えて接触を妨げることにより、死の機構が切り換えられた。細胞数が徐々に減少したが、アネキシン陽性／ＰＩ陰性の割合は一定のままであり、かつ、低かった。細胞は直接にアネキシン陽性／ＰＩ陽性になり、２０ｍＭのｚＶＡＤ−ｆｍｋは死の割合を低下させなかった（図示せず）。
図５ａ〜図５ｃは、懸濁＋血清枯渇にさらされた単球による前炎症性サイトカイン／ケモカインのｍＲＮＡのデノボでの転写を示す。図５ａ〜図５ｂは、懸濁＋血清枯渇にさらされた単球による前炎症性サイトカイン／ケモカインのｍＲＮＡのデノボでの転写を時間０および３０分においてそれぞれ示す遺伝子発現アレイ分析である。座標（Ａ２、Ｂ２）（これはＩＬ−１βを表す）および座標（Ｅ３、Ｆ３）（これはＩＬ−８を表す）は、視認される蛍光を時間ゼロで示さず、顕著な蛍光をアポトーシス誘導後３０分で示す。基底レベルの何らかの増大がＩＬ−６のｃＤＮＡ（Ｃ３−Ｄ３）およびＩＬ−１αのｃＤＮＡ（Ｅ１−Ｆ１）について認められる。生存性細胞に関して存在し、死の誘導のときに大きく変化しなかった他のｃＤＮＡが、ＴＧＦ−β１（Ａ７−Ｂ７）、ＩＬ−２（Ｃ２−Ｄ２）およびＴＮＦ−α（Ａ８−Ｂ８）である。ＭＩＦ（Ｅ６−Ｆ６）はダウンレギュレーションを示す。蛍光を示さなかったこのメンブランにおける他のウエルは、（Ａ１−Ｂ１）がＧ−ＣＳＦについてであり、（Ｃ１−Ｄ１）がＧＭ−ＣＳＦについてであり、（Ｅ２−Ｆ２）がＩＬ−４についてであり、（Ａ３−Ｂ５）がＩＬ−５についてであり、（Ａ４−Ｂ４）がＩＬ−１０についてであり、（Ｃ４−Ｄ４）がＩＬ−１２αについてであり、（Ｅ４−Ｆ４）がＩＬ−１２βについてであり、（Ａ５−Ｂ５）がＩＬ−１６についてであり、（Ｃ５−Ｄ５）がＩＬ−１７についてであり、（Ａ６−Ｂ６）がＬＴ−βについてであり、（Ｃ６−Ｄ６）がＭＣＰ−１についてであり、（Ｃ７−Ｄ７）がＴＧＦ−β２についてであり、（Ｅ７−Ｆ７）がＴＧＦ−β３についてであり、（Ｃ８−Ｄ８）がＴＮＦ−βについてである。陰性コントロールを表す座標が（Ｇ１−Ｇ２、ＰＵＣ１８）である：陽性コントロールとして（Ｇ３−Ｇ４、β−アクチン）および（Ｇ５−Ｇ６、Ｇ７−Ｇ８、Ｅ８−Ｆ８、ＧＡＰＤＨ）。ケモカインのメンブランスクリーニングは、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１αおよびＭＩＰ−１βのアップレギュレーションを示しただけであった（示さず）。メンブランは、エオタキシン、フラクタルカイン、ＧＲＯａ／ＭＧＳＡ、ＨＣＣ−４、ＭＣＰ−３、ＳＤＦ２、ＰＦ−４、ＭＤＣ、ＨＣＣ−１、Ｉ−３０９、Ｉ−ＴＡＣ、リンホタクチン、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−４、ＭＩＧ、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３α、Ｐ１０、ＳＤＦ−１、ＲＡＮＴＥＳを含有した。図５ｃは、代表的なサイトカインおよびケモカインのｃＤＮＡレベル（任意の単位で）の変化を細胞死誘導後の時間の関数として示すデータプロットである。ＩＬ−１β、ＩＬ−８およびＭＩＰ−１αのみがデノボで産生されることに留意すること。
図６ａは、前炎症性サイトカインのＩＬ−１βが、懸濁＋血清枯渇にさらされた単球によって産生されることを示すデータプロットである。コントロールＰＢＭＣ（これは２０％の単球を含有する）は懸濁＋血清枯渇の後でＩＬ−１β分泌の上昇を示す（白丸）。磁石により単離された単球（黒三角）は懸濁＋血清枯渇の後でＩＬ−１β分泌の一層より大きい上昇を示す（このことは、瀕死単球がＩＬ−１βの供給源であることを示している）。他方で、懸濁ではなく、血清枯渇にさらされた、磁石により単離された単球（黒四角）（すなわち、接着させられ、懸濁状態に置かれなかった）は、ＩＬ−１β（または何らかの前炎症性サイトカイン）を分泌せず、寛容性を樹状細胞において誘導することができた（図示せず）。Ｂリンパ球およびＴリンパ球（黒丸）ならびに多形核細胞（白丸）は、ＩＬ−１β分泌が、接着させられなかった単球（すなわち、懸濁および血清枯渇にさらされた単球）に特異的であることを示す。
図６ｂは、前炎症性サイトカイン／ケモカインのｍＲＮＡおよびタンパク質が、懸濁＋血清枯渇にさらされた単球によってデノボで転写および翻訳されることを示すＥＬＩＳＡデータのヒストグラムである。アクチノマシンＤによる転写活性の阻害、および、シクロヘキシミドによる翻訳活性の阻害は、ＥＬＩＳＡによってピコグラム／ｍｌ（ｐｇ／ｍｌ）単位で測定されたとき、ＩＬ−１βサイトカイン分泌における顕著な阻害を示す。血清枯渇の期間中に接着させられた単球は前炎症性サイトカインの産生を何ら示さなかった（示さず）。さらに、接着させられ、かつ、アポトーシスを誘導する他の方法（例えば、スタウロスポリン、シクロホスファミド、Ｆａｓリガンドなど）によって死ぬことが誘発された単球は常に、死のその非炎症性様式を保っていた（図示せず）。
図７ａは、生存性単球、高熱誘導による壊死にさらされた単球、または、接着および血清枯渇によりアポトーシスすることが誘導されたアポトーシス性単球からではなく、懸濁誘導による死（および血清枯渇）にさらされた単球によるＩＬ−１βの分泌を示すＥＬＩＳＡデータのプロットである。ＩＬ−１βのレベル（ｐｇ／ｍｌで示される）を、生存性細胞（黒丸）、高熱により壊死性にされた単球（白丸）、または、懸濁誘導による死にさらされた単球（黒三角）をインキュベーションした後、０時間、１時間、４時間および２４時間でＥＬＩＳＡによって測定した。結果は、懸濁誘導を受けた単球の前炎症性特徴が熱誘導による壊死（偶発的な細胞死）においては見られず、また、接着させられなかった単球の生来的性質であることを示す。
図７ｂは、懸濁−血清枯渇により誘導された死にさらされた単球からのＩＬ−１β分泌（ｐｇ／ｍｌで示される）を示し、また、懸濁（非接着）による単球の死がカスパーゼ３依存的またはカスパーゼ１依存的のいずれでもないことを明らかにするＥＬＩＳＡデータのプロットである。懸濁誘導による死にさらされた単球（黒三角、２０マイクロモル濃度のＤＭＳＯにおいて）によるＩＬ−１βの分泌は、カスパーゼ１阻害剤のＺ−ＷＥＨＤ（２０マイクロモル濃度、黒丸）または汎カスパーゼ阻害剤のＺＶＡＤ−ｆｍｋ（２０マイクロモル濃度、白丸）のいずれでも阻害されなかった。
図８ａ〜図８ｃは、単球のアポトーシスの期間中における前炎症性サイトカインの分泌がＮＦκＢ依存的でないことを示す。図８ａは、単球のアポトーシスの期間中における前炎症性サイトカインの分泌がＮＦκＢ依存的でないことを示すウエスタン免疫ブロッティングアッセイの写真である。３７ｋＤａのＩκＢおよびリン酸化ＩκＢ（黒矢印）が示される。生存性単球（レーンａおよびレーンｂ）を、ＭＧ１３２（プロテアソーム阻害剤）ととともに（レーンａ）、または、ＭＧ１３２を伴うことなく（レーンｂ）、１ｍｇ／ｍｌのザイモサン（これは、成熟し、炎症を生じさせるようにマクロファージサー（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓｏｒ）樹状細胞上のＴＯＬＬ受容体２を誘発する）の存在下で２時間インキュベーションした。レーンｃおよびレーンｄは、アポトーシスをザイモサン後２時間（レーンｃ）および１０分（レーンｄ）で［血清枯渇および接着回避（または懸濁）の方法によって］受けている単球である。認められ得るように、ザイモサンにさらされた生存性単球は、ＭＧ１３２の存在下（レーンａ）では現れないＩκＢのリン酸化を示す（レーンｂ、黒矢印）。単球がアポトーシスを受けるとき、リン酸化が１０分（レーンｄ）または２時間（レーンｃ）においては見られない。アポトーシス誘導後の５分、２０分、３０分、４０分、６０分および９０分でのさらなるサンプル（図示せず）は、ＩκＢのリン酸化を示さなかった（５回の実験を表す）。図８ｂは、ＭＧ１３２の存在下でのＩＬ−１β分泌がわずかに上昇することを示す棒グラフである（３回の実験）。図８ｃは、ＭＧ１３２の存在下での転写活性を示すヒストグラムである（３回の実験を表す）。ｍＲＮＡのレベルにおける増大倍数（黒棒）がＭＧ１３２の存在下（白棒）で変化しないことに留意すること。
図９ａ〜図９ｅは、単球のアポトーシスの期間中における前炎症性サイトカインの分泌がｐ３８依存的であることを示す。図９ａは、抗Ｆａｓ阻害抗体（ＢＤ２９またはＺＢ４）の存在下での２４時間後、単球のアポトーシスが、ｐ３８阻害剤（ｐ３８ＩＮＨ）またはｐ３８および抗ｆａｓ（ＺＢ４）の存在下で見られるアポトーシスにおける著しい低下＊（ｐ＜０．００１）と比較して、ほんのわずかに低下したことを示す棒グラフである（ＢＤ２９が示される）。図９ｂは、Ｐ３８が、ＬＰＳにさらされたか、または、アポトーシスを受けるように誘導された単球において匹敵するレベルで発現することを示すウエスタン免疫ブロッティングアッセイである。図９ｃは、リン酸化ｐ３８がＬＰＳ刺激のときに一時的に増大するが、アポトーシスのときには持続した増大を示すウエスタン免疫ブロッティングアッセイである。ＪＮＫのリン酸化が見出されなかった（図示せず）。結果は６回の実験を表す。図９ｄは、（懸濁および血清枯渇によって誘導された）アポトーシス性単球によるＩＬ−１β分泌が特異的なｐ３８阻害剤（ｐ３８ＩＮ）によって完全に妨げられるが、ｐ３８コントロール（ＤＭＳＯ）においては妨げられないことを示す棒グラフである。阻害がＪＮＫ阻害剤（ＪＮＫＩＮ）の存在下またはそのコントロール（ＬＴＡＴ）では見られない。図９ｅは、コントロール（ＤＭＳＯ）またはＪＮＫ阻害剤（ＪＮＫＩＮ）においてではなく、ｐ３８阻害剤（ｐ３８ＩＮ）の存在下でのアポトーシス性単球からのＩＬ−８分泌における顕著な低下を示す棒グラフである。
図１０は、白血球のアポトーシスを誘導するためのデバイスを示す概略図である。矢印は、流体が流れる方向を示す。
図１１は、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するためのデバイスを示す概略図である。矢印は、流体が流れる方向を示す。
図１２ａ〜図１２ｄは、アポトーシス性単球の飲み込みが樹状細胞（ＤＣ）上の成熟化関連分子の発現をダウンレギュレーションすることを示すＦＡＣＳ分析である。接着したアポトーシス性単球（これは接着および血清枯渇によって作製された）をＤｉＩ（瀕死細胞を染色する親油性色素）により染色し、未成熟な樹状細胞（ｉＤＣ）に４：１の比率で加えた。ｉＤＣはアポトーシス性細胞由来のＤｉｌを獲得し、ＬＰＳにさらされ（実線）、またはさらされなかった（黒線）。抗ＤＲ−ＦＩＴＣ抗体（図１２ａ〜図１２ｂ）および抗ＣＤ８６−ＦＩＴＣ抗体（図１２ｃ〜図１２ｄ）を使用する、アポトーシス性単球の存在下（図１２ｂおよび図１２ｄ）または非存在下（図１２ａおよび図１２ｃ）で処理されたＤＣのＦＡＣＳ分析が示される。数字は、それぞれのヒストグラムにおいて存在するＬＰＳ処理されたｉＤＣのメジアン蛍光を示す。イソタイプコントロールが点線の曲線として示される。アポトーシス性単球の存在下では、ＣＤ８６およびＤＲの顕著なダウンレギュレーションが観測されることに留意すること（ｐ＜０．０００１）。接着していない瀕死単球はＤＲおよびＣＤ８６をダウンレギュレーションせず、ＤＲおよびＣＤ８６をアップレギュレーションさえする（図示せず）。類似する結果が、ＣＤ４０を使用して得られた（図示せず）。これらの結果から、未成熟な樹状細胞（ｉＤＣ）の成熟化が、接着したアポトーシス性単球によって阻害されることが明らかにされる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００５９】
本発明は、病理学的免疫応答に関連する疾患を、前炎症性媒介因子（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−８およびＭＩＰ１αなど）を有さない瀕死白血球または死白血球を使用して治療する方法、ならびに、そのような細胞を作製するためのデバイス、および、そのような方法を実施するためのデバイスに関する。
【００６０】
本発明の原理および作用は、図面および付随する説明を参照してより十分に理解することができる。
【００６１】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳しく説明する前に、本発明は、その適用において、下記の説明において示される細部、または、実施例によって例示される細部に限定されないことを理解しなければならない。本発明は他の実施形態が可能であり、または、様々な方法で実施または実行される。また、本明細書中で用いられる表現法および用語法は記述のためであって、限定であると見なしてはならないことを理解しなければならない。
【００６２】
病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために瀕死白血球の投与を使用する様々な方法が先行技術によって記載されている。
【００６３】
１つの方法では、同種ドナーの造血移植片の生着を容易にしようとして、アポトーシス性の同種ドナー白血球の投与を使用することが伴う［Ｐｅｒｒｕｃｈｅ  Ｓ．他、２００４、Ａｍ  Ｊ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、４：１３６１〜５；Ｋｌｅｉｎｃｌａｕｓｓ  Ｆ．他、２００３、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ、７５（９  Ｓｕｐｐｌ）：４３Ｓ〜４５Ｓ］。過敏症、移植片拒絶または全身性エリテマトーデスの治療（米国特許第４８３８８５２号）、または、ＧＶＨＤの改善（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａｌｓ．ｇｏｖ／ｃｔ／ｓｈｏｗ／ＮＣＴ０００５４６１３？ｏｒｄｅｒ＝２）のための、アフェレーシスに基づいた別の方法は、「体外フォトフェレーシス」と呼ばれ、特定の造血細胞（例えば、Ｔ細胞など）によって特異的に取り込まれ得る光活性化可能な色素を患者に投与すること、および、その後、血液を採取すること、その特定の造血細胞を単離すること、単離された細胞にＵＶ照射すること、および、細胞を患者に再注入することを伴う（米国特許第６２１９５８４号）。
【００６４】
しかしながら、すべてのそのような方法には、様々な欠点がある。例えば、同種白血球の投与を伴う方法は、ＧＶＨＤおよび投与された白血球の拒絶の危険性が伴い、および／または、いかなる治療的効力もヒトにおいて一度も実証されていない。アフェレーシスを伴う先行技術による方法は最適に効果的でないことが多く、また、望ましくない、および／または、説明できない副作用（例えば、炎症性の副作用など）が伴う場合がある（例えば、Ｓｉａｍｉ  ＧＡ．他、１９９７、アンギオテンシン変換酵素阻害剤が投与されている患者においてアナフィラキシー様反応を引き起こす凍結ろ過アフェレーシスおよび血漿分画化、Ｔｈｅｒ  Ａｐｈｅｒ、１：３２５〜９；Ｓｃｈｗａｒｚｂｅｃｋ  Ａ．他、１９９７、ＡＣＥ阻害剤投与の非存在下においてであっても生じ得るデキストランアフェレーシスの期間中のアナフィラキシー様反応、Ｎｅｐｈｒｏｌ  Ｄｉａｌ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、１２：１０８３〜４；Ｋｏｇａ  Ｎ．他、１９９３、ＬＤＬ−アフェレーシスおよびＡＣＥ阻害剤により治療された患者におけるアナフィラキシー様反応およびブラジキニン生成、ＡＳＡＩＯ  Ｊ、３９：Ｍ２８８〜９１；Ｓｔｒａｕｓｓ  ＲＧ．、１９９６、血液交換療法時における有害作用の機構、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１１：１６０〜４；Ｒｏｓｓｉ  ＰＬ．他、１９９１、治療的血球アフェレーシスの副作用と、血液交換療法の他のタイプの副作用との比較、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、７６  Ｓｕｐｐｌ  １：７５〜８０；Ｈｕｅｓｔｉｓ  ＤＷ．、１９８９、血液交換療法の方法における危険性および安全対策、Ａｒｃｈ  Ｐａｔｈｏｌ  Ｌａｂ  Ｍｅｄ、１１３：２７３〜８；Ｈｏｃｋｅｒ  Ｐ．、Ｗａｇｎｅｒ  Ａ．、１９８７、細胞分離器を用いた血球アフェレーシスの副作用、Ｉｎｆｕｓｉｏｎｓｔｈｅｒ  Ｋｌｉｎ  Ｅｒｎａｈｒ、１４  Ｓｕｐｐｌ  ４：３１〜５を参照のこと）。特に、体外フォトフェレーシスでは、有害な壊死性細胞／前炎症性細胞の生成および投与が伴う（Ｃａｒｉｃｃｈｉｏ  Ｒ．他、２００３、紫外線Ｂにより誘導される細胞死：炎症および狼瘡自己抗原再分布における紫外線量の重要な役割、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、１７１：５７７８〜５７８６）。
【００６５】
従って、先行技術は、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために瀕死白血球を使用して満足できる方法を提供していない。
【００６６】
本発明者らのＰＣＴ国際特許出願公開ＷＯ０２／０６０３７６は、自家のアポトーシス性白血球を投与することによる哺乳動物対象における全身性自己免疫疾患の効果的な治療を開示する。そのようなアポトーシス性細胞は、当該技術分野における標準的な実施であるような、有害かつ最適に効果的でない抗炎症性薬物の投与を何ら伴うことなく、または、そのような抗炎症性薬物の最小限の投与を伴って自己免疫疾患を治療するために使用することができる。
【００６７】
本発明を実施に移しているとき、また、下記の実施例の節の実施例２において記載されるように、エクスビボでの懸濁条件にさらされた初代単球は、壊死を受け、かつ、前炎症性媒介因子（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−８およびＭＩＰ１αなど）を産生および分泌することが初めて見出され、これに対して、際立って対照的に、支持体接着条件にさらされたそのような細胞は、アポトーシスをそのような炎症性媒介因子の産生および／または分泌の非存在下で受けることが初めて見出された。加えて、図１２ａ〜図１２ｄに示されるように、また、下記の実施例の節の実施例６において例示されるように、生きている白血球を、表面に接着するように誘導すること（すなわち、接着法）によって得られたアポトーシス性単球は、樹状細胞の成熟化を阻害することができ、従って、例えば、自己免疫疾患などにおける自己抗原に対する末梢寛容性を維持するために使用することができる。そのようなものとして、本発明は、初代単球を懸濁状態に供することを本質的には伴う、血液のエクスビボ操作を伴う先行技術による方法（例えば、アフェレーシス法など）では、単球の壊死、および、そのような壊死性細胞による前炎症性媒介因子の付随した分泌の誘導が実際には伴い、従って、潜在的に有害な前炎症性媒介因子の、アフェレーシスにより得られた治療的血液分画物の被投与者への導入が実際には伴うことを初めて教示する。本明細書中上記で記載されたように、先行技術によるアフェレーシス法は、病理学的免疫応答に関連する疾患（例えば、ＧＶＨＤおよび自己免疫疾患など）の治療を含めて、数多くの治療的適用において用いられるが、最適でない効力、および、有害な副作用（例えば、炎症性の副作用など）が伴う場合がある。従って、本発明は、先行技術によるアフェレーシス法によって作製された血液分画物と比較して、前炎症性媒介因子が著しく低下している血液分画物を作製するようにアフェレーシスを実施するために使用することができる。従って、本発明は、病理学的免疫応答に関連する疾患（例えば、ＧＶＨＤおよび自己免疫疾患など）を、先行技術と比較して改善された安全性および有効性で、アフェレーシスに基づいた方法によって治療するために使用することができる。
【００６８】
従って、本発明の１つの態様によれば、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患をその必要性のある対象において治療する方法が提供される。この方法は、病理学的免疫応答を抑制することができ、かつ、生きている白血球を、表面に接着するように誘導することによって得られる瀕死白血球または死白血球を含む細胞調製物の治療効果的な量を対象に投与することによって行われる。
【００６９】
本発明の方法は、様々なタイプの対象のいずれにおいても、病理学的免疫応答に関連する様々な疾患のいずれかを治療するために使用することができる。そのような疾患には、具体的には、自己免疫疾患、移植関連疾患および炎症関連疾患が含まれる。本発明の実施形態に従って効果的に治療することができる、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患の様々な例が本明細書中下記において記載される。
【００７０】
本明細書中で使用される用語「治療する（処置する）」は、本発明の疾患に関連するとき、疾患の発症を防止すること、疾患の症状を緩和、弱化、軽減または除去すること、疾患の進行を鈍化、逆戻りまたは停止すること、あるいは、疾患を治癒させることを示す。
【００７１】
本明細書中で使用される用語「疾患」は、何らかの医学的な疾患、障害、状態または症候群、あるいは、何らかの望まれないおよび／または異常な生理学的、形態学的、化粧学的および／または身体的な段階および／または状態を示す。
【００７２】
好ましくは、本発明の方法は、哺乳動物対象（例えば、ヒト対象）における疾患を治療するために使用される。本発明の方法は、下記の実施例の節の実施例２において記載および例示されるようにマウスにおける全身性自己免疫疾患を治療することにおけるその成功した使用を考慮して、また、ヒトの免疫系と、マウスの免疫系との間における十分に確立された広範囲かつ関連している相同性を考慮して、ヒト対象を治療するために使用され得ることが容易に理解される。
【００７３】
瀕死白血球または死白血球（これは以降、「治療用白血球」として示される）は、本発明のこの態様によれば、様々なタイプの好適な細胞死プロセスのいずれかの結果として瀕死状態または死んでいる場合があるが、治療用白血球は好ましくは、アポトーシスを受けているものである。アポトーシスを受けている白血球は本明細書中では、「アポトーシス性」白血球として示される。好ましくは、本発明の教示に従って調製される瀕死白血球または死白血球は前炎症性媒介因子を産生および／または分泌しないので、そのような細胞（アポトーシス性白血球、例えば、アポトーシス性単球または治療用単球）を含有する細胞調製物は前炎症性媒介因子（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−８およびＭＩＰ１αなど）を含まない。そのような細胞調製物は、病理学的免疫応答に関連する疾患を治療するために特定される医薬品を製造するために使用することができる。
【００７４】
アポトーシスは、壊死とは全く別の細胞死プロセスであり、例えば、正常な細胞および組織の発達、病原体に感染した細胞をＴリンパ球が殺すこと、ならびに、変異により損傷した細胞の自己除去のときに生じる、細胞のプログラム化された整然とした生理学的な除去である。アポトーシス性細胞は、細胞質および核における異なった形態学的変化、一定間隔の部位でのクロマチン切断、ならびに、ヌクレオソーム内の部位でのゲノムＤＮＡの内部ヌクレオチド結合分解性の切断によって特徴づけられる。他方で、壊死は、それだけではないが、典型的には、致死的な細胞傷害の後での酵素の制御されない進行性の分解作用によって引き起こされる細胞死の本質的には病理学的かつ前炎症性のプロセスである。壊死性細胞は、典型的には、ミトコンドリアの膨張、核の凝集、細胞溶解、膜一体性の喪失、および、究極的には細胞死によって特徴づけられる。壊死は、光学顕微鏡技術、蛍光顕微鏡技術または電子顕微鏡技術によって、あるいは、色素（トリパンブルー）の取り込みによって特定することができる。
【００７５】
パラダイムにとらわれることなく、本発明者らは、細胞死が、免疫応答を抑制するためのシグナルを提供するように、アポトーシスでのように好適に誘導され得るという意見であり、また、本発明の方法では、様々なプロセスのそのような性質が、本発明の疾患の効果的な治療を、疾患に関連した病理学的免疫応答を抑制することによって達成するために利用されるという意見である。具体的には、依然として何らかの理論的枠組みにとらわれることなく、本発明者らは、本発明の治療用白血球では、治療用白血球に含まれる抗原に対して向けられた免疫応答が抑制され得るという意見である。アポトーシス性細胞の上記性質は、壊死性細胞の性質と際立った対照をなすものである。これは、壊死は本質的には、身体を防御するための免疫応答を、抑制するとは対照的に、刺激するために役立つ前炎症性の「危険」シグナルの発生が付随する病理学的プロセスであるからである。
【００７６】
本明細書中で使用される用語「抑制する」は、免疫応答（例えば、本発明の病理学的免疫応答など）に関連するとき、免疫応答を防止するか、または低下させることを示す。
【００７７】
従って、本発明の教示によれば、抗原非特異的な免疫抑制シグナルを提供することによって、本発明の方法は、病理学的な抗原非特異的免疫応答によって特徴づけられる疾患（例えば、一般には抗原非特異的な炎症など）を治療するために使用することができる。
【００７８】
本発明のさらなる教示によれば、少なくとも１つの抗原（これは以降、「標的化（された）抗原」として示される）に対して向けられる病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために、治療用白血球は、好都合な場合には、標的化抗原の１つ以上を含むことができる。従って、そのような標的化抗原を含む治療用白血球は、本発明のそのような疾患の治療をそれにより達成するために、そのような病理学的免疫応答を抑制するように投与することができる。
【００７９】
標的化抗原を含む好適な治療用白血球は、好ましくは、用途および目的に依存して、そのような標的化抗原を内因的に発現する選択された白血球に由来する一方で、代替として、そのような標的化抗原を発現するように遺伝子改変された白血球に由来することができる。ポリペプチドまたは核酸の標的化抗原を含むために白血球を誘導するように白血球を遺伝子改変することは十分に当業者の範囲内である。所望のポリペプチドまたは核酸を含むためにそのような細胞を誘導するように白血球を遺伝子改変するための十分な指針が当該技術分野の文献において提供される（例えば、Ｒｏｓｓｉｇ  Ｃ、Ｂｒｅｎｎｅｒ  ＭＫ、２００４、養子免疫治療のためのＴリンパ球の遺伝子改変、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ、１０：５〜１８；Ｇｒａｓｓｍａｎｎ  Ｒ他、１９９４、ヒトＴリンパ球のウイルス形質転換、Ａｄｖ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、６３：２１１〜４４；Ｈａｖｅｎｍａｎｎ  Ｋ他、２００３、内皮様細胞への単球および樹状細胞のインビトロ形質転換、Ａｄｖ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  Ｂｉｏｌ、５２２：４７〜５７；Ｍａｙｎｅ  ＧＣ他、２００３、遠心分離は低感染多重度でのアデノウイルスによるヒトの単球およびマクロファージにおける緑色蛍光タンパク質の形質導入を容易にする、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、２７８：４５〜５６を参照のこと）。
【００８０】
治療用白血球は、用途および目的に依存して、様々な遺伝子型のいずれか１つを有することができる。
【００８１】
好ましくは、対象の抗原に対する病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患、または、抗原非特異的な病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために、治療用白血球は対象と同系であり、より好ましくは、対象に由来する。対象由来／同系の白血球は、標的化された自己抗原の特定の対象特異的変化体または変化体の組合せ（例えば、ポリペプチド自己抗原の対立遺伝子変化体、グリコシル化変化体および／またはスプライス変化体；または核酸自己抗原の配列変化体；など）に対して向けられた免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために最適であることが理解される。そのような組合せは個体に対して非常に特異的であり得るからである。
【００８２】
一般に、同系の治療用白血球の使用では、非同系の治療用白血球（例えば、同種の治療用白血球または異種の治療用白血球など）の使用にそれぞれ固有的である前炎症性の免疫同種反応性または免疫異種反応性および病理学的免疫応答の付随した刺激の危険性が回避される。
【００８３】
あるいは、治療用白血球は、好都合である場合には、例えば、十分な量の自己の治療用白血球が得られない場合に、あるいは、同種の個体に由来する同種抗原に対する病理学的免疫応答を伴う疾患（例えば、同種移植片の拒絶、または、同種免疫による自然流産（Ｐａｎｄｅｙ  ＭＫ他、２００４、Ａｒｃｈ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｂｓｔｅｔ、２６９：１６１〜７２）など）を治療するために、対象に関して非同系であってもよい。本発明の教示によれば、治療的免疫寛容性をそのような疾患において誘導するために、治療用白血球は好ましくは、同種移植片の拒絶または同種免疫による自然流産の治療のためには、同種の個体、すなわち、移植片ドナー、または、胎児の父親にそれぞれ由来する。
【００８４】
好ましくは、非同系の治療用白血球は同種の白血球であり、最も好ましくは、対象とハプロタイプが一致する同種の白血球である。ヒト対象のハプロタイプを同種の細胞と一致させることは、治療的移植に関連して当該技術分野では日常的に実施され、通常、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−ＤＲの対立遺伝子を一致させることを伴う。
【００８５】
本発明の方法を実施するために使用される治療用白血球は、用途および目的に依存して、様々な系譜のいずれか１つの白血球に由来し得る。
【００８６】
好ましい実施形態によれば、治療用白血球は瀕死リンパ球または死リンパ球（以降、「治療用リンパ球」として示される）である。
【００８７】
本明細書中下記においてさらに記載されるように、また、下記の実施例の節の実施例１において記載および例示されるように、治療用リンパ球を、毒性の免疫抑制薬剤の有害な先行技術による投与を要求することなく、または、そのような投与の最小限の要求とともに、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患（例えば、自己免疫疾患など、例えば、全身性の自己免疫疾患など、例えば、全身性エリテマトーデスなど）を効果的に治療するために、本発明の教示に従って使用することができる。
【００８８】
好ましい実施形態によれば、治療用白血球は瀕死単球または死単球（以降、「治療用単球」として示される）である。
【００８９】
下記の実施例の節の実施例２において示される新規かつ予想外の実験結果に基づいて、また、本明細書中下記においてさらに記載されるように、本発明の方法では、本発明の疾患を、懸濁状態によって単球を調製することを伴う先行技術による方法と比較して、高まった安全性および有効性で治療するために、単球の接着を伴うアフェレーシス法によって作製された治療用単球を含む細胞調製物を投与することを用いることができる。
【００９０】
表現「単球の接着」は、表面（例えば、適切なタイプのナイロンまたはプラスチックの組織培養ディッシュ、マトリックス、袋またはバッグ）への培養されている単球細胞の接着を可能にする培養条件を示す。
【００９１】
本明細書中で使用される表現「懸濁状態（条件）」は、表面への培養細胞の接着を伴わない任意の培養条件を示し、例えば、細胞非接着性の表面を伴う底部支持体を有する培養容器（例えば、組織培養処理されていないペトリ皿）における静的培養条件、または、表面／支持体との培養細胞の静的接触を許さない動的培養条件（例えば、振とうを伴う培養条件）などを示す。
【００９２】
好ましくは、本発明の治療用単球は前炎症性媒介因子を分泌せず（例えば、図６ａ、図７ａおよび図１２ａ〜図１２ｄ、ならびに、下記の実施例の節の実施例２および実施例６を参照のこと）、そのため、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために使用することができる。
【００９３】
別の実施形態によれば、治療用白血球は瀕死好中球または死好中球（以降、「治療用好中球」として示される）である。
【００９４】
本明細書中下記においてさらに記載されるように、治療用好中球は、病理学的免疫応答に関連する様々な疾患のいずれかを効果的に治療するために本発明の教示に従って使用することができる。
【００９５】
あるいは、本発明の方法を実施するために使用される治療用白血球は、免疫系および／または造血系の有核細胞の任意の系譜またはサブ系譜に由来し得る。そのような細胞には、樹状細胞、マクロファージ、マスト細胞、好塩基球、造血幹細胞、骨髄細胞およびナチュラルキラーなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００９６】
本発明の治療用白血球が由来し得る白血球（以降、「供給源白血球」として示される）を、用途および目的、所望の白血球系譜などに依存して、様々な一般に実施されている方法のいずれかに従って様々な好適な解剖学的区画から様々な好適な方法のいずれかで得ることができる。
【００９７】
好ましくは、供給源白血球は初代白血球であり、より好ましくは、初代末梢血白血球である。
【００９８】
初代リンパ球、初代単球および初代好中球は、最も好都合には、末梢血に由来し得る。末梢血白血球は、６０パーセントの好中球、３０パーセントのリンパ球および７パーセントの単球を含む。
【００９９】
特定のタイプの供給源白血球を日常的に実施されている方法に従って血液から得ることは十分に当業者の範囲内である。供給源リンパ球、供給源単球および／または供給源好中球を得ることは、例えば、血液を抗凝固剤剤（例えば、ヘパリンまたはクエン酸塩など）の存在下で集めることによって達成することができる。集められた血液は、その後、リンパ球および単球をグラジエント境界で単離し、かつ、好中球および赤血球をペレットで単離するためにフィコール層に重層して遠心分離される。白血球を、それらの特異的な表面マーカーに従って標準的な免疫磁石選択または免疫蛍光フローサイトメトリー技術によって、あるいは、遠心分離による水簸によって互いに分離することができる。例えば、単球をＣＤ１４＋の分画物として選択することができ、Ｔリンパ球をＣＤ３＋の分画物として選択することができ、Ｂリンパ球をＣＤ１９＋またはＣＤ２２＋の分画物として選択することができ、好中球をＣＤ１５＋の分画物として選択することができる。リンパ球および単球は、これらの細胞を、リンパ球ではなく、単球が細胞接着性の支持体に選択的に接着することを生じさせる、組織培養処理された培養容器における静的培養などによる支持体接着性の条件に供することによって、互いに単離することができる。好中球を、標準的な向流遠心分離水簸プロトコルによって他の血液細胞から単離することができる。
【０１００】
供給源単球の単離は、好ましくは、下記の実施例の節の実施例２の材料および方法の節において提供されるプロトコルに従って、免疫磁石選択または支持体接着に基づいた選択によって行われる。
【０１０１】
治療用リンパ球は好適には、リンパ系組織（例えば、脾臓または胸腺など）に由来し得る。下記の実施例の節の実施例１において記載されるように、供給源の脾臓細胞または胸腺細胞に由来する治療用白血球を、本発明の疾患（例えば、自己免疫疾患など、例えば、全身性の自己免疫疾患など、例えば、全身性エリテマトーデスなど）を効果的に治療するために本発明の教示に従って使用することができる。
【０１０２】
好適な初代供給源白血球が得られないか、または、十分な量で得られない場合には、治療用白血球は、培養された初代供給源白血球に由来し得るか、または、好適な確立された細胞株に由来し得る。
【０１０３】
当業者は、所望の量の本発明の培養された供給源白血球を作製するように初代白血球を好適に培養するための必要な専門的知識を有し、また、そのような培養方法を実施するための十分な指針を当該技術分野において得ることができる（例えば、Ｂｏｎｎａｒｄ  ＧＤ、１９８１、免疫適格Ｔリンパ球の長期培養、Ｐｒｏｇ  Ｃｌｉｎ  Ｂｉｏ  Ｒｅｓ、５８：４５〜５６；Ｂａｒｏｎ  ＣＬ他、１９９９、２つの異なった細胞集団が、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４とともに培養されたヒト血液単球から得られる、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ、３５：Ｓ３９〜４０；ＭｃＧｅｅ  ＺＡ他、１９８９、抗菌剤によるヒト細胞の浸透を評価するための好中球、マクロファージおよび器官培養物の使用、Ｐｒｏｇ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓ、３３：８３〜９２を参照のこと）。好適な供給源白血球（例えば、ヒト起源の白血球など）の培養を、例えば、免疫不全宿主において、例えば、重症複合免疫不全症（ＳＣＩＤ）動物の様々な系統などにおいてインビボで行うことができる。
【０１０４】
当業者はさらに、治療用白血球を導くための好適な確立された白血球細胞株を確立するための、または購入するための、または、そうでない場合には得るための必要な専門的知識を有する。好適な白血球細胞株を、商業的供給者から、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｔｙｐｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などから得ることができる。確立された白血球細胞株は遺伝子改変が特に容易であり、例えば、それにより、本明細書中上記で記載されたように、本発明の疾患の病理学的免疫応答によって標的化される抗原を、そのような抗原に対して標的化される病理学的免疫応答によって特徴づけられる本発明の疾患を治療するために含むようにすることができる。
【０１０５】
供給源白血球を、治療用白血球を生じさせるその能力を著しく妨害する技術によって得てはならないことは当業者には明らかである。
【０１０６】
供給源白血球は、用途および目的に依存して、治療用白血球を生じさせるように、知られている先行技術による方法に従って様々な手段のいずれかで処理することができる。
【０１０７】
白血球のアポトーシスを、当該技術分野において広く知られ、また、当該技術分野において一般に実施される広範囲の様々な方法に従って誘導することができる。そのような処理には、増殖因子および／または栄養分が枯渇した条件のもとで培養すること；細胞が支持体と接着する条件のもとで培養すること；血清枯渇の条件のもとで培養すること；照射、例えば、ＵＶまたはガンマ線による照射；生物学的なアポトーシス誘導媒介因子（例えば、活性化デス受容体リガンド（例えば、パーホリンなど）など）による処理；Ｆａｓリガンドによる処理；アポトーシス誘導細胞（例えば、免疫反応性の細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）など）による処理；免疫抑制薬物（例えば、ステロイド、コルチコステロイド、デキサメタゾン、シクロホスファミド、メトトレキサート、アザチオプリン、シクロスポリンおよびスタウロスポリンなど）による処理；低温処理；高熱処理；細胞傷害的酸性条件のもとで培養すること；細胞傷害的塩基性条件のもとで培養すること；細胞傷害的高浸透圧条件のもとで培養すること；細胞傷害的低浸透圧条件のもとで培養すること；細胞傷害的酸化性条件のもとで培養すること、例えば、細胞傷害的高濃度の酸化剤（例えば、過酸化水素など）の存在下で培養することなどが含まれるが、これらに限定されない。
【０１０８】
好ましくは、本発明の治療用リンパ球を生じさせるようなリンパ球（例えば、初代リンパ球など）のアポトーシスは、初代リンパ球を、血清枯渇、コルチコステロイドまたは放射線照射により処理することによって誘導される。好ましくは、初代リンパ球のアポトーシスをコルチコステロイドによる処理によって誘導することが、初代リンパ球をデキサメタゾンで処理することによって、より好ましくは、約１マイクロモル濃度でのデキサメタゾンで処理することによって行われる。好ましくは、初代リンパ球のアポトーシスを放射線照射によって誘導することが、初代リンパ球をガンマ線照射により処理することによって、より好ましくは、約６６ｒａｄの線量で処理することによって行われる。下記の実施例の節の実施例１において記載および例示されるように、初代リンパ球をそのような好ましいアポトーシス誘導処理に供することは、本発明の疾患（例えば、自己免疫疾患など、例えば、全身性の自己免疫疾患など、例えば、全身性エリテマトーデスなど）を効果的に治療するために本発明の教示に従って使用することができる治療用白血球を作製するために使用することができる。
【０１０９】
本明細書中で使用される用語「約」は±１０パーセントを示す。
【０１１０】
好ましくは、本発明の治療用単球を生じさせるような単球（例えば、初代単球など）のアポトーシスは、単球を、本明細書において初めて教示されるように、支持体／表面接着のインビトロ条件に、より好ましくは、同時に血清枯渇の条件のもとでさらすことによって誘導される。単球を、本発明の治療用単球を製造するために好適であるインビトロでの支持体／表面接着性条件にさらすことは、例えば、初代単球を、血清枯渇の条件のもとで組織培養用の被覆された組織培養フラスコにおいて４０分間にわたって培養することによって好適に行うことができる。下記の実施例の節の実施例２において記載および例示されるように、そのような処理により、本発明の方法を実施するために好適である炎症非誘発性のアポトーシス性単球の生成がもたらされる。
【０１１１】
単球が、懸濁したとき、壊死を受けるという現時点で開示された知見は明らかに新規かつ非常に予想外である。当該技術分野では、逆のこと、すなわち、単球は、支持体との接着を失ったとき、アポトーシスを受けることが当業者によって予想されるからである（例えば、Ｈａｍａｄａ  Ｋ他、１９９８、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ、２４４：７４５〜５０を参照のこと）。
【０１１２】
本明細書中下記においてさらに記載されるように、様々なタイプの細胞接着性の表面／支持体はどれも、単球のアポトーシスを誘導するために用いることができる。接着性白血球（例えば、接着性単球など）は、表面接着性細胞（例えば、表面接着性単球など）の剥離を容易にすることができる化合物（以降、「細胞剥離化合物」として示される）にさらすことと、接着性細胞を表面から剥離するために役立つ流体剪断流の適用または好適な装置（例えば、ラバーポリスマンなど）による掻き取りとの組合せによる処理によって表面から剥離することができる。そのような好適な細胞剥離化合物、および、それらの使用の適切な方法（化合物の濃度、化合物にさらす持続期間、化合物の暴露の停止など）が当該技術分野では広く知られており、また、広範囲に用いられる。そのような化合物には、例えば、プロテアーゼ（例えば、トリプシンなど）および二価カチオンキレーター（例えば、ＥＤＴＡなど）が含まれる。通常の場合には生存性細胞の傷害または破壊をもたらすと考えられる接着性細胞の剥離方法が用いられ得ることが理解される。これは、そのような細胞は既にアポトーシス性であり、また、本発明の方法に従った疾患治療を可能にするように無傷の細胞構造体として投与されることは必ずしも必要ないからである。
【０１１３】
治療用白血球を生じさせるような供給源白血球のアポトーシスが、好ましくは、インビトロで行われる。初代白血球を供給源白血球として使用するとき、供給源白血球のアポトーシスが、好ましくは、体外で、すなわち、エクスビボで行われる。あるいは、供給源白血球のアポトーシスを生体内／その場で誘導することができる。
【０１１４】
細胞（例えば、本発明の治療用白血球など）のアポトーシスを、様々な一般に用いられている方法のいずれかによって確認することができる。そのような方法には、アポトーシス特異的なラダー様ＤＮＡフラグメントパターンを検出するための細胞ＤＮＡのゲル電気泳動、アポトーシス特異的なＤＮＡフラグメント化を検出するためのＴＵＮＥＬ染色、細胞膜配向のアポトーシス特異的な反転を検出するためのアネキシン蛍光体共役による染色、アポトーシス特異的なカスパーゼ活性化を検出するための抗切断型カスパーゼ３抗体による染色、アポトーシス特異的な細胞フラグメント化および突起形成を検出するための顕微鏡検査などが含まれる。
【０１１５】
下記の実施例の節の実施例２において記載および例示されるように、初代単球が、細胞接着性の支持体を有する組織培養ディッシュでのインキュベーションによってアポトーシスを受けるように誘導された。そのようなものとして、本発明者らは、供給源白血球のアポトーシスをインビトロで誘導するための新規なデバイスを考案し、実行している。
【０１１６】
従って、本発明の別の態様によれば、白血球のアポトーシスを誘導するためのアポトーシス誘導デバイスが提供される（図１０）。デバイス１０は、単球のアポトーシスを誘導するためのチャンバー１４（以降、「単球チャンバー」として示される）、好中球のアポトーシスを誘導するためのチャンバー１６（以降、「好中球チャンバー」として示される）、および／または、リンパ球のアポトーシスを誘導するためのチャンバー１８（以降、「リンパ球チャンバー」として示される）から選択される１つ以上のアポトーシス誘導チャンバー（それぞれが１２によって示される）を含む。
【０１１７】
本発明のデバイスは、アポトーシス性白血球のどの系譜が所望されるかに依存して、アポトーシス誘導チャンバーの様々な組合せのいずれかを含むことができる。
【０１１８】
単球のアポトーシスを促進させるために、単球チャンバーは好ましくは、表面への単球の接着を高めるための表面２０、単球のアポトーシスを誘導するための培地（以降、「単球」培地として示される）を含有するためのリザーバー２２、および／または、表面接着性の単球を再懸濁するための機構２８（以降、「細胞接着性表面」として示される）を含み、より好ましくはそれら全てを含む。
【０１１９】
好ましくは、細胞接着性表面は親水性かつ負荷電であり、当該技術分野で知られている様々な方法のいずれかで、好ましくは、ポリスチレン表面を、例えば、コロナ放電またはガスプラズマを使用して改変することによって得ることができる。これらのプロセスは、表面のポリスチレン鎖にグラフト化し、その結果、表面を親水性かつ負荷電にし、それにより表面への細胞の接着を容易にする高エネルギーの酸素イオンを生じさせる。白血球のアポトーシスを本発明に従って誘導するための好適な細胞接着性表面が、様々な商業的供給者（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｅｖｅｒｇｒｅｅｎ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｎｕｎｃなど）から入手可能である、細胞接着を容易にするために設計された様々な組織培養処理された組織培養容器のいずれか１つによって提供され得る。
【０１２０】
単球チャンバーは、表面接着性単球を再懸濁し、その結果、その回収を可能にするようにするための様々な好適な機構のいずれかを含むことができる。そのような目的のための好適な機構には、本発明の細胞剥離化合物を含有するためのリザーバー、および、細胞剥離化合物を単球チャンバーに導入するための機構；表面接着性単球を再懸濁するために十分な力および方向の流れを単球チャンバーにおいて生じさせるための流れ発生機構、および、流れ発生機構の運転を制御するための機構；ならびに、表面接着性単球を単球チャンバーの細胞接着性表面から掻き取るための掻き取り機構、および、掻き取り機構の運転を制御するための機構の任意の組合せが含まれる。
【０１２１】
表面接着細胞（例えば、表面接着性単球など）の再懸濁を容易にするための好適な流れ発生機構には、例えば、磁石式撹拌装置、および、回転するプロペラブレードに基づいた流体混合機構が含まれる。
【０１２２】
表面接着性単球を単球チャンバーの細胞接着性表面から掻き取るための好適な掻き取り機構は、自動化されたラバーポリスマンである。
【０１２３】
好ましくは、好中球チャンバーは、好中球のアポトーシスを誘導するための培地（以降、「好中球培地」として示される）を含有するためのリザーバー２４を含む。
【０１２４】
好ましくは、リンパ球チャンバーは、リンパ球のアポトーシスを誘導するための培地（以降、「リンパ球培地」として示される）を含有するためのリザーバー２６を含む。
【０１２５】
用途および目的に依存して、それぞれのアポトーシス誘導チャンバーは、アポトーシスを誘導するための照射機構、アポトーシスを誘導するための機械的機構、および、アポトーシスを誘導するための化学的または生化学的な物質または環境からなる群から選択されるアポトーシス誘導機構３０を含むように構成され得る。
【０１２６】
好ましくは、白血球のアポトーシスの誘導およびすべての段階でのそれらの維持を最適に制御するために、それぞれのアポトーシス誘導チャンバーは、好ましくは、所望の温度での白血球の維持を可能にする温度制御機構を備え、また、さらに好ましくは、用いられた特定の細胞培地に適切な二酸化炭素の空気中レベルを維持するための機構を備える。
【０１２７】
流体（例えば、供給源白血球の懸濁物など）をアポトーシス誘導チャンバーに加えること、および、流体（例えば、治療用白血球の懸濁物など）をアポトーシス誘導チャンバーから取り出すことを可能にするために、それぞれのアポトーシス誘導チャンバーは好ましくは、流体入口３２、および、流体入口３２を通る流体の流れを制御するための弁、ならびに、流体出口３４、および、流体出口３４を通る流体の流れを制御するための弁を備える。
【０１２８】
従って、本発明のこの態様によるデバイスは、それぞれの白血球、単球および／または好中球を、そのアポトーシスを本発明の教示に従って誘導するように構成されたそれぞれのチャンバーに導入することを可能にするように構成され、また、本発明の方法に従った疾患治療のための投与のために、そのような白血球をそのようなチャンバーから集めることを可能にするように構成される。
【０１２９】
本発明の方法に従った、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患の治療を、用途および目的に依存するが、本発明の治療用白血球を含む細胞調製物の様々な好適なタイプのいずれかの治療効果的な量を様々な好適な投与様式のいずれかに従って対象に投与することによって効果的に実施することができる。
【０１３０】
具体的には、用途および目的に依存して、疾患治療を、治療用白血球系譜の様々な組合せのいずれかを含み得る細胞調製物の治療効果的な量を対象に投与することによって効果的に実施することができる。
【０１３１】
本発明の治療用白血球、治療用単球および／または治療用好中球の投与による様々な疾患の治療のために使用することができる具体的な治療プロトコルの様々な例が、下記の実施例の節の実施例３、実施例４および実施例５においてそれぞれ提供される。
【０１３２】
好ましい実施形態によれば、治療用白血球の投与が、自己免疫疾患を治療するために使用される。好ましくは、自己免疫疾患は全身性の自己免疫疾患であり、より好ましくは、全身性エリテマトーデスである。
【０１３３】
別の実施形態によれば、組み合わされた治療用白血球、治療用単球および治療用好中球の投与を、移植片対宿主病を治療するために使用することができる。
【０１３４】
本発明の好ましい実施形態によれば、本発明の疾患の治療は、体重１キログラムあたり約２億個の治療用白血球の総用量を含む細胞調製物を対象に投与することによって行われる。好ましくは、そのような総用量は、体重１キログラムあたり約４０００万個の細胞の単位用量物として投与され、および／または、単位用量物として１週間間隔で投与され、より好ましくは、その両方で投与される。この実施形態による好適な総用量には、体重１キログラムあたり約２０００万個〜約２０億個の細胞の総用量、より好ましくは、体重１キログラムあたり約４０００万個〜約１０億個の細胞の総用量、より好ましくは、体重１キログラムあたり約８０００万個〜約５億個の細胞の総用量、より好ましくは、体重１キログラムあたり約１．６億個〜約２．５億個の細胞の総用量が含まれる。この実施形態による好適な単位用量物には、体重１キログラムあたり約４００万個〜約４億個の細胞の単位用量物、より好ましくは、体重１キログラムあたり約８００万個〜約２億個の細胞の単位用量物、より好ましくは、体重１キログラムあたり約１６００万個〜約１億個の細胞の単位用量物、より好ましくは、体重１キログラムあたり約３２００万個〜約５０００万個の細胞の単位用量物が含まれる。
【０１３５】
好ましくは、治療用白血球は対象に全身投与され、より好ましくは、静脈内経路によって投与される。あるいは、治療用白血球を様々な他の経路のいずれかに従って投与することができ、これらには、非経口経路、腹腔内経路、筋肉内経路、皮下経路、経口経路、経鼻経路および直腸経路が含まれるが、これらに限定されない。
【０１３６】
好ましくは、治療用白血球は、好適な生理学的緩衝液（例えば、生理的食塩水、ＰＢＳおよびＨＢＳＳなど）に懸濁されて対象に投与される。
【０１３７】
下記の実施例の節の実施例１において記載および例示されるように、本発明の疾患（全身性エリテマトーデス）が、１００万個の治療用白血球の５個の用量物を１週間間隔で静脈内投与することによってマウス（平均体重、０．０２５キログラム）において効果的に治療された。これは、体重１キログラムあたり２億個の細胞および４０００万個の細胞の上記の好ましい総用量および単位用量物にそれぞれ対応する。
【０１３８】
用途および目的に依存して、疾患治療は、好都合には、標準的な先行技術による治療との併用で、および／または、免疫抑制分子（例えば、ＩＬ−１０またはＴＧＦ−βなど）の同時投与によって、本発明の教示に従って行うことができる。
【０１３９】
本発明の方法に従った疾患治療の期間中およびその後、疾患の状態が好ましくは、治療を最適化し、また、治療を好適に修正するように、綿密にモニターされる。例えば、様々な前炎症性のサイトカイン、ケモカインまたは他の分子のいずれかのレベルを、疾患治療のモニターリングを容易にするために、患者においてモニターすることができる。自己免疫疾患の場合、関連した自己抗体の組織レベルを、疾患治療をモニターするために測定することができる。例えば、全身性の自己免疫疾患（例えば、全身性エリテマトーデスなど）の場合、そのような自己抗体には、二本鎖ＤＮＡについて特異的な自己抗体、および、リン脂質について特異的な自己抗体が含まれる。
【０１４０】
当業者（例えば、医師など、好ましくは、治療される疾患における専門家）は、本発明の疾患をヒト対象において効果的に治療するように本発明の教示を適用するための必要な専門的知識を有する。
【０１４１】
本発明を着想しているとき、本発明者らは、血液を対象から集め、所望の治療用白血球を集められた血液から作製し、かつ、治療用白血球を対象に再注入することができる新規な疾患治療デバイスを考案している。
【０１４２】
従って、本発明のさらなる態様によれば、疾患治療デバイスが提供され、その一例が図１１に示される。
【０１４３】
疾患治療デバイス４０は、血液を対象からデバイスの中に送り、また、血液をデバイスから対象に戻すためのポンプ４２；循環している白血球を全血から分離するためにポンプと連絡している白血球分離器４４；および、白血球のアポトーシスを誘導するために白血球分離器と連絡し、かつ、アポトーシス性白血球を対象に投与するためにポンプとさらに連絡している本発明のアポトーシス誘導デバイス１０を含む。
【０１４４】
本発明の疾患治療デバイスは、血液を対象から集め、血液細胞を単離し、単離された細胞を所与の処理に供し、かつ、処理された細胞を対象に再注入して戻すことができる先行技術による血液細胞アフェレーシスデバイスとして本質的には構成される。そのような先行技術によるデバイスは、例えば、ＣＤ３４＋細胞の白血球搬出法または白血球フォトフェレーシスを実施するために広く使用される。本発明の疾患治療デバイスは、分離された白血球のアポトーシスを対象へのその再注入の前に本発明の方法に従って誘導するための本発明のアポトーシス誘導デバイスを含むという新規かつ進歩性の特徴を含む。そのため、病理学的免疫応答に関連する疾患を本発明の方法に従って効果的に治療するために本発明の疾患治療デバイスを組み立て、使用することは、先行技術による技術および本発明の教示を考慮して、十分に当業者の範囲内である。例えば、先行技術によるアフェレーシスに特異的な血液採取および再注入の技術を、血液を対象から疾患治療デバイスの中に送り、また、対象に戻すことを達成するために用いることは十分に当業者の範囲内である。先行技術によるアフェレーシスに特異的な細胞分離技術（例えば、遠心分離技術および／または免疫吸着に基づく技術など）を、所望の供給源白血球の単離を達成するために用いることもまた十分に当業者の範囲内である。
【０１４５】
白血球アフェレーシスデバイス（例えば、本発明の疾患治療デバイスなど）およびその使用に関する十分な一般的指針が当該技術分野における文献において提供される（例えば、Ｂｕｒｇｓｔａｌｅｒ  ＥＡ他、２００４、Ｆｅｎｗａｌ  Ａｍｉｃｕｓ血液分離器での造血前駆体細胞の大量白血球搬出法（ＬＶＬ）、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１９：１０３〜１１；Ｓｃｈｗｅｌｌａ  Ｎ他、２００３、新しい血液分離器での血液前駆体細胞のコンピューター化された採取のための２つの白血球搬出法プログラムの比較、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４３（１）：５８〜６４；Ｋｏｈｇｏ  Ｙ他、２００２、難治性潰瘍性大腸炎における遠心分離細胞分離器を使用する白血球アフェレーシス：多施設非盲検試験、Ｔｈｅｒ  Ａｐｈｅｒ、６：２５５〜６０；Ａｃｃｏｒｓｉ  Ｐ他、２００１、末梢血幹細胞自家移植におけるＡＭＩＣＵＳ細胞分離器を用いた大量白血球搬出法、Ｔｒａｎｓｆｕｓ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｃｉ、２４：７９〜８３；Ｓｕｅｏｋａ  Ａ他、１９９７、アフェレーシス技術の現状：Ｐａｒｔ  １．膜血漿分離器、Ｔｈｅｒ  Ａｐｈｅｒ、１：４２〜８；Ｗｏｏｔｅｎ  ＳＬ他、１９９１、ＣＯＢＥ２９７７細胞分離器におけるアフェレーシス法の制御および最適化、Ｊ  Ｂｉｏｍｅｃｈ  Ｅｎｇ、１１３：１１〜２０；Ｄｅｌ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃ他、１９９０、連続流血液細胞分離器（Ｄｉｄｅｃｏ  Ｖｉｖａｃｅｌｌ）を用いたアフェレーシスによる末梢血幹細胞の回収、Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ、７５  Ｓｕｐｐｌ  １：１８〜２１を参照のこと）。
【０１４６】
白血球アフェレーシスデバイスおよびその技術に特に関連する十分な指針が当該技術分野における文献において提供される（例えば、Ｚｉｃ  ＪＡ、２００３、フォトフェレーシスを用いた皮膚型Ｔ細胞リンパ腫の治療、Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｔｈｅｒ、１６：３３７〜４６；Ｆｏｓｓ  ＦＭ他、２００２、慢性の移植片対宿主病における体外フォトフェレーシス、Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ、２９：７１９〜２５；Ｏｌｉｖｅｎ  Ａ、Ｓｈｅｃｈｔｅｒ  Ｙ、２００１、体外フォトフェレーシス：総説、Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖ、１５：１０３〜８；Ｒｏｏｋ  ＡＨ他、１９９９、フォトフェレーシス：臨床応用および作用機構、Ｊ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｅｒｍａｔｏｌ  Ｓｙｍｐ  Ｐｒｏｃ、４：８５〜９０を参照のこと）。
【０１４７】
単球アフェレーシスデバイスおよびその技術に特に関連する十分な指針が当該技術分野における文献において提供される（例えば、Ｗａｇｎｅｒ  ＳＪ他、２００５、多段階バックフラッシュ法を臍帯血フィルターにおいて用いた単核アフェレーシス調製物の単球濃縮、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ、４５：４３３〜９を参照のこと）。
【０１４８】
好中球アフェレーシスデバイスおよびその技術に特に関連する十分な指針が当該技術分野における文献において提供される（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ＤＧ、Ｋｌｏｃｋ  ＪＣ、１９７９、ろ過白血球搬出法により集められた好中球における機能的変化およびナイロン繊維に対する好中球の接着の期間中に生じる細胞事象に対するそれらの関連性、Ｅｘｐ  Ｈｅｍａｔｏｌ、７（４  Ｓｕｐｐｌ）：１１〜２３；ＭｃＣｕｌｌｏｕｇｈ  Ｊ、１９７９、白血球搬出法および顆粒球輸血、ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ  Ｓｃｉ、１０：２７５〜３２７を参照のこと）。
【０１４９】
本発明の疾患治療デバイスは、疾患治療のために使用される先行技術によるアフェレーシスデバイスを上回る様々な利点をもたらす。本発明のデバイスは特に、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を、先行技術と比較してより大きい安全性および有効性で治療するためにフォトフェレーシスを実施することを可能にする。これは、本発明のデバイスでは、先行技術によるデバイスには固有的な前炎症性の白血球の壊死の発生が、前炎症性でない白血球のアポトーシス（例えば、単球および好中球のアポトーシスなど）を可能にすることによって回避されるからである。
【０１５０】
本発明の疾患治療デバイスの治療的応用の様々な例が、下記の実施例の節の実施例３、実施例４および実施例５において記載される。
【０１５１】
本発明の実施形態を、病理学的免疫応答によって特徴づけられる様々な疾患のいずれかを治療するために使用することができる。
【０１５２】
好ましくは、疾患は自己免疫疾患または移植関連疾患である。
【０１５３】
好ましくは、自己免疫疾患は全身性の自己免疫疾患および／または抗体媒介による自己免疫疾患である。最も好ましくは、自己免疫疾患は全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）である。
【０１５４】
好ましくは、移植関連疾患は移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）である。
【０１５５】
病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患は、様々な炎症性疾患／炎症関連疾患のいずれかであり得る。
【０１５６】
本発明は、身体の様々な解剖学的区画のいずれかにおける病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するために使用することができる。
【０１５７】
本発明による、病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患の具体的な例が本明細書中下記に示され、また、下記の実施例の節の実施例３、実施例４および実施例５において記載される。
【０１５８】
抗体媒介による自己免疫疾患の例には、下記が含まれるが、それらに限定されない：リウマチ様疾患、リウマチ様自己免疫疾患、リウマチ様関節炎（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ他、、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ、２０００（Ｊｕｌ）、１５（３）：７９１）、脊椎炎、強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ、２００１、３（３）：１８９）、全身性疾患、全身性自己免疫疾患、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ、１９９８、１７（１−２）：４９）、硬化症、全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ他、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９（Ｍａｒ）、６（２）：１５６；Ｃｈａｎ  ＯＴ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、１９９９（Ｊｕｎ）、１６９：１０７）、腺疾患、腺の自己免疫疾患、膵臓の自己免疫疾患、糖尿病、Ｉ型糖尿病（Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ、１９９６（Ｏｃｔ）、３４  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、甲状腺疾患、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴズ病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ、２０００（Ｊｕｎ）、２９（２）：３３９）、甲状腺炎、突発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  ＨおよびＹｕ  Ｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｄｅｃ  １５）、１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ他、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９（Ａｕｇ）、５７（８）：１８１０）、粘液水腫、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９（Ａｕｇ）、５７（８）：１７５９）；自己免疫性生殖疾患、卵巣疾患、卵巣の自己免疫性（Ｇａｒｚａ  ＫＭ他、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８（Ｆｅｂ）、３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｍａｒ）、４３（３）：１３４）、反復した胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）、神経変性疾患、神経学的疾患、神経学的自己免疫疾患、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｎｎｕｎｏｌ、２００１（Ｊａｎ  １）、１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ他、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ、１９９７、４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪおよびＫｒａｉｇ  Ｅ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９、１８（１−２）：８３）、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＬ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０００（Ｍａｙ）、７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群、神経障害および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００（Ａｐｒ）、３１９（４）：２３４）、筋無力症疾患、ランバード・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００（Ａｐｒ）、３１９（４）：２０４）、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性小脳萎縮症、腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、小脳萎縮症、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病��ジル・ド・ラ・ツレット症候群、多発性内分泌腺症、自己免疫性多発性内分泌腺症（Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣおよびＨｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ、Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）、２０００（Ｊａｎ）、１５６（１）：２３）、神経障害、異常免疫による神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ他、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ、１９９９、５０：４１９）；ニューロミオトニー、後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ他、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９８（Ｍａｙ  １３）、８４１：４８２）、心臓血管疾患、心臓血管の自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）、肉芽腫症、ヴェーゲナー肉芽腫症、動脈炎、高安動脈炎および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ他、Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、２０００（Ａｕｇ  ２５）、１１２（１５−１６）：６６０）；抗第ＶＩＩＩ因子による自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ他、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ、２０００、２６（２）：１５７）；血管炎、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、糸球体腎炎、少免疫性（ｐａｕｃｉ−ｉｍｍｕｎｅ）巣状壊死性糸球体腎炎、半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ、Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）、２０００（Ｍａｙ）、１５１（３）：１７８）；抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１９９９、１４（４）：１７１）；心不全、心不全におけるアゴニスト様β−アドレナリン作動性受容体抗体（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ他、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９９（Ｊｕｎ  １７）、８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ、Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ、１９９９（Ａｐｒ−Ｊｕｎ）、１４（２）：１１４）；溶血性貧血、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ他、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、１９９８（Ｊａｎ）、２８（３−４）：２８５）、胃腸疾患、胃腸管の自己免疫疾患、腸疾患、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００（Ｊａｎ）、２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥおよびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ、Ｈａｒｅｆｕａｈ、２０００（Ｊａｎ  １６）、１３８（２）：１２２）、筋組織の自己免疫疾患、筋炎、自己免疫性筋炎、シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ他、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｓｅｐ）、１２３（１）：９２）；平滑筋の自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ他、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、１９９９（Ｊｕｎ）、５３（５−６）：２３４）、肝疾患、肝臓の自己免疫疾患、自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００（Ａｕｇ）、３３（２）：３２６）および原発性胆汁性肝硬変（��ｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、１９９９（Ｊｕｎ）、１１（６）：５９５）。
【０１５９】
器官／組織に特異的な自己免疫疾患の例には、心臓血管疾患、リウマチ様疾患、腺疾患、胃腸疾患、皮膚疾患、肝疾患、神経学的疾患、筋疾患、腎疾患、生殖関連疾患、結合組織疾患および全身性疾患が含まれる。
【０１６０】
自己免疫性による心臓血管疾患の例には、アテローム性動脈硬化（Ｍａｔｓｕｕｒａ  Ｅ他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３５）、心筋梗塞（Ｖａａｒａｌａ  Ｏ、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１３２）、血栓症（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）、ヴェーゲナー肉芽腫症、高安動脈炎および川崎症候群（Ｐｒａｐｒｏｔｎｉｋ  Ｓ他、Ｗｉｅｎ  Ｋｌｉｎ  Ｗｏｃｈｅｎｓｃｈｒ、２０００（Ａｕｇ  ２５）、１１２（１５−１６）：６６０）、抗第ＶＩＩＩ因子による自己免疫疾患（Ｌａｃｒｏｉｘ−Ｄｅｓｍａｚｅｓ  Ｓ他、Ｓｅｍｉｎ  Ｔｈｒｏｍｂ  Ｈｅｍｏｓｔ、２０００、２６（２）：１５７）、壊死性小血管血管炎、顕微鏡的多発血管炎、チャーグ・ストラウス症候群、少免疫性巣状壊死性糸球体腎炎および半月体形成性糸球体腎炎（Ｎｏｅｌ  ＬＨ、Ａｎｎ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔｅｒｎｅ（Ｐａｒｉｓ）、２０００（Ｍａｙ）、１５１（３）：１７８）、抗リン脂質症候群（Ｆｌａｍｈｏｌｚ  Ｒ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ、１９９９、１４（４）：１７１）、抗体誘導の心不全（Ｗａｌｌｕｋａｔ  Ｇ他、Ａｍ  Ｊ  Ｃａｒｄｉｏｌ、１９９９（Ｊｕｎ  １７）、８３（１２Ａ）：７５Ｈ）、血小板減少性紫斑病（Ｍｏｃｃｉａ  Ｆ、Ａｎｎ  Ｉｔａｌ  Ｍｅｄ  Ｉｎｔ、１９９９（Ａｐｒ−Ｊｕｎ）、１４（２）：１１４；Ｓｅｍｐｌｅ  ＪＷ他、Ｂｌｏｏｄ、１９９６（Ｍａｙ  １５）、８７（１０）：４２４５）、自己免疫性溶血性貧血（Ｅｆｒｅｍｏｖ  ＤＧ他、Ｌｅｕｋ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ、１９９８（Ｊａｎ）、２８（３−４）：２８５；Ｓａｌｌａｈ  Ｓ他、Ａｎｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ、１９９７（Ｍａｒ）、７４（３）：１３９）、シャガス病における心臓の自己免疫性（Ｃｕｎｈａ−Ｎｅｔｏ  Ｅ他、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ、１９９６（Ｏｃｔ  １５）、９８（８）：１７０９）、および、抗ヘルパーＴリンパ球による自己免疫性（Ｃａｐｏｒｏｓｓｉ  ＡＰ他、Ｖｉｒａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８、１１（１）：９）が含まれる。
【０１６１】
自己免疫によるリウマチ様疾患の例には、リウマチ様関節炎（Ｋｒｅｎｎ  Ｖ他、Ｈｉｓｔｏｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｔｈｏｌ、２０００（Ｊｕｌ）、１５（３）：７９１；Ｔｉｓｃｈ  Ｒ、ＭｃＤｅｖｉｔｔ  ＨＯ、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  Ｓ  Ａ、１９９４（Ｊａｎ  １８）、９１（２）：４３７）および強直性脊椎炎（Ｊａｎ  Ｖｏｓｗｉｎｋｅｌ他、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ、２００１、３（３）：１８９）が含まれる。
【０１６２】
自己免疫による腺疾患の例には、膵臓疾患、Ｉ型糖尿病、甲状腺疾患、グレーヴズ病、甲状腺炎、突発性自己免疫性甲状腺炎、橋本甲状腺炎、特発性粘液水腫、卵巣の自己免疫性、自己免疫性抗精子不妊症、自己免疫性前立腺炎およびＩ型自己免疫性多腺性症候群が含まれる。疾患には、膵臓の自己免疫疾患、Ｉ型糖尿病（Ｃａｓｔａｎｏ  ＬおよびＥｉｓｅｎｂａｒｔｈ  ＧＳ、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、８：６４７；Ｚｉｍｍｅｔ  Ｐ、Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｒｅｓ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ、１９９６（Ｏｃｔ）、３４  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ１２５）、自己免疫性甲状腺疾患、グレーヴズ病（Ｏｒｇｉａｚｚｉ  Ｊ、Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ、２０００（Ｊｕｎ）、２９（２）：３３９；Ｓａｋａｔａ  Ｓ他、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、１９９３（Ｍａｒ）、９２（１）：７７）、突発性自己免疫性甲状腺炎（Ｂｒａｌｅｙ−Ｍｕｌｌｅｎ  ＨおよびＹｕ  Ｓ、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｄｅｃ  １５）、１６５（１２）：７２６２）、橋本甲状腺炎（Ｔｏｙｏｄａ  Ｎ他、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９（Ａｕｇ）、５７（８）：１８１０）、特発性粘液水腫（Ｍｉｔｓｕｍａ  Ｔ、Ｎｉｐｐｏｎ  Ｒｉｎｓｈｏ、１９９９（Ａｕｇ）、５７（８）：１７５９）、卵巣の自己免疫性（Ｇａｒｚａ  ＫＭ他、Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９８（Ｆｅｂ）、３７（２）：８７）、自己免疫性抗精子不妊症（Ｄｉｅｋｍａｎ  ＡＢ他、Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｐｒｏｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｍａｒ）、４３（３）：１３４）、自己免疫性前立腺炎（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ＲＢ他、Ｕｒｏｌｏｇｙ、１９９７（Ｄｅｃ）、５０（６）：８９３）およびＩ型自己免疫性多腺性症候群（Ｈａｒａ  Ｔ他、Ｂｌｏｏｄ、１９９１（Ｍａｒ  １）、７７（５）：１１２７）が含まれる。
【０１６３】
自己免疫による胃腸疾患の例には、慢性炎症性腸疾患（Ｇａｒｃｉａ  Ｈｅｒｏｌａ  Ａ他、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００（Ｊａｎ）、２３（１）：１６）、セリアック病（Ｌａｎｄａｕ  ＹＥおよびＳｈｏｅｎｆｅｌｄ  Ｙ、Ｈａｒｅｆｕａｈ、２０００（Ｊａｎ  １６）、１３８（２）：１２２）、大腸炎、回腸炎およびクローン病が含まれる。
【０１６４】
自己免疫による皮膚疾患の例には、自己免疫による水疱性の皮膚疾患（例えば、尋常性天疱瘡、水疱性天疱瘡および落葉状天疱瘡など、これらに限定されない）、円板状エリテマトーデスが含まれる。
【０１６５】
自己免疫による肝疾患の例には、肝炎、自己免疫性慢性活動性肝炎（Ｆｒａｎｃｏ  Ａ他、Ｃｌｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌ、１９９０（Ｍａｒ）、５４（３）：３８２）、原発性胆汁性肝硬変（Ｊｏｎｅｓ  ＤＥ、Ｃｌｉｎ  Ｓｃｉ（Ｃｏｌｃｈ）、１９９６（Ｎｏｖ）、９１（５）：５５１；Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇ  ＣＰ他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ、１９９９（Ｊｕｎ）、１１（６）：５９５）および自己免疫性肝炎（Ｍａｎｎｓ  ＭＰ、Ｊ  Ｈｅｐａｔｏｌ、２０００（Ａｕｇ）、３３（２）：３２６）が含まれる。
【０１６６】
自己免疫による神経学的疾患の例には、多発性硬化症（Ｃｒｏｓｓ  ＡＨ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ、２００１（Ｊａｎ  １）、１１２（１−２）：１）、アルツハイマー病（Ｏｒｏｎ  Ｌ他、Ｊ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｔｒａｎｓｍ  Ｓｕｐｐｌ、１９９７、４９：７７）、重症筋無力症（Ｉｎｆａｎｔｅ  ＡＪおよびＫｒａｉｇ  Ｅ、Ｉｎｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９、１８（１−２）：８３；Ｏｓｈｉｍａ  Ｍ他、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９０（Ｄｅｃ）、２０（１２）：２５６３）、神経障害、運動神経障害（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ＡＪ、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ、２０００（Ｍａｙ）、７（３）：１９１）、ギラン・バレー症候群および自己免疫性神経障害（Ｋｕｓｕｎｏｋｉ  Ｓ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００（Ａｐｒ）、３１９（４）：２３４）、筋無力症、ランバード・イートン筋無力症症候群（Ｔａｋａｍｏｒｉ  Ｍ、Ａｍ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｓｃｉ、２０００（Ａｐｒ）、３１９（４）：２０４）、腫瘍随伴性神経学的疾患、小脳萎縮症、腫瘍随伴性の小脳萎縮症およびスティッフマン症候群（Ｈｉｅｍｓｔｒａ  ＨＳ他、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ｕｎｉｔｓ  Ｓ  Ａ、２００１（Ｍａｒ  ２７）、９８（７）：３９８８）；腫瘍非随伴性スティッフマン症候群、進行性小脳萎縮症、脳炎、ラスムッセン脳炎、筋萎縮性側索硬化症、シドナム舞踏病、ジル・ド・ラ・ツレット症候群および自己免疫性多発性内分泌腺症（Ａｎｔｏｉｎｅ  ＪＣおよびＨｏｎｎｏｒａｔ  Ｊ、Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｌ（Ｐａｒｉｓ）、２０００（Ｊａｎ）、１５６（１）：２３）；異常免疫による神経障害（Ｎｏｂｉｌｅ−Ｏｒａｚｉｏ  Ｅ他、Ｅｌｅｃｔｒｏｅｎｃｅｐｈａｌｏｇｒ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ  Ｓｕｐｐｌ、１９９９、５０：４１９）；後天性ニューロミオトニー、先天性多発性関節拘縮症（Ｖｉｎｃｅｎｔ  Ａ他、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９８（Ｍａｙ  １３）、８４１：４８２）、神経炎、視神経炎（Ｓｏｄｅｒｓｔｒｏｍ  Ｍ他、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ、１９９４（Ｍａｙ）、５７（５）：５４４）および神経変性疾患が含まれる。
【０１６７】
自己免疫による筋疾患の例には、筋炎、自己免疫性筋炎および原発性シェーグレン症候群（Ｆｅｉｓｔ  Ｅ他、Ｉｎｔ  Ａｒｃｈ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、２０００（Ｓｅｐ）、１２３（１）：９２）、および、平滑筋の自己免疫疾患（Ｚａｕｌｉ  Ｄ他、Ｂｉｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ、１９９９（Ｊｕｎ）、５３（５−６）：２３４）が含まれる。
【０１６８】
自己免疫による腎疾患の例には、腎炎、および、自己免疫性間質性腎炎（Ｋｅｌｌｙ  ＣＪ、Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ、１９９０（Ａｕｇ）、１（２）：１４０）が含まれる。
【０１６９】
生殖に関連する自己免疫疾患の例には、反復した胎児消失（Ｔｉｎｃａｎｉ  Ａ他、Ｌｕｐｕｓ、１９９８、７  Ｓｕｐｐｌ  ２：Ｓ１０７〜９）が含まれる。
【０１７０】
自己免疫による結合組織疾患の例には、耳の疾患、自己免疫による耳の疾患（Ｙｏｏ  ＴＪ他、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９４（Ａｕｇ）、１５７（１）：２４９）、および、内耳の自己免疫疾患（Ｇｌｏｄｄｅｋ  Ｂ他、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ、１９９７（Ｄｅｃ  ２９）、８３０：２６６）が含まれる。
【０１７１】
全身性自己免疫疾患の例には、全身性エリテマトーデス（Ｅｒｉｋｓｏｎ  Ｊ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ、１９９８、１７（１−２）：４９）および全身性硬化症（Ｒｅｎａｕｄｉｎｅａｕ  Ｙ他、Ｃｌｉｎ  Ｄｉａｇｎ  Ｌａｂ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９９９（Ｍａｒ）、６（２）：１５６；Ｃｈａｎ  ＯＴ他、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ、１９９９（Ｊｕｎ）、１６９：１０７）が含まれる。
【０１７２】
移植関連疾患の例には、移植片拒絶、慢性的移植片拒絶、亜急性移植片拒絶、超急性移植片拒絶、急性移植片拒絶および移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７３】
炎症性疾患／炎症関連疾患の例には、経皮的経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）後の再狭窄、ステント埋め込みを伴うＰＴＣＡの後での再狭窄、心筋梗塞、機械的傷害に付随する炎症、神経変性疾患、潰瘍、補綴インプラント、月経、敗血症性ショック、アナフィラキシーショック、毒性ショック症候群、悪液質、壊疽、筋骨格炎症、特発性炎症が含まれるが、これらに限定されない。
【０１７４】
従って、本発明のデバイスおよび方法は、現時点において当該技術分野で初めて教示されるように、有害な免疫抑制薬物の投与を伴い、および／または、前炎症性媒介因子の逆効果的かつ有害な投与を固有的に、また、知らずに伴う先行技術による方法と比較して、改善された安全性および有効性で、病理学的免疫応答によって特徴づけられる広範囲の様々な疾患（例えば、自己免疫疾患、移植関連疾患、および、炎症性疾患／炎症関連疾患など）を治療するために使用することができる。
【０１７５】
本発明のさらなる目的、利点および新規な特徴が、限定であることが意図されない下記の実施例を検討したとき、当業者には明らかになる。加えて、本明細書中上記に描かれるような、また、下記の請求項の節において特許請求されるような本発明の様々な実施形態および態様のそれぞれは、実験的裏付けが下記の実施例において見出される。
【実施例】
【０１７６】
次に下記の実施例が参照されるが、下記の実施例は、上記の説明と一緒に、本発明を非限定様式で例示する。
【０１７７】
本願で使用される用語と、本発明で利用される実験方法には、分子生化学、微生物学および組み換えＤＮＡの技法が広く含まれている。これらの技法は文献に詳細に説明されている。例えば以下の諸文献を参照されたい：「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ    ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」Ｓａｍｂｒｏｏｋ他（１９８９年）；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｒ．Ｍ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４年）、Ａｕｓｕｂｅｌ他著；「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，米国メリーランド州バルチモア（１９８９年）；Ｐｅｒｂａｌ著「Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，米国ニューヨーク（１９８８年）；Ｗａｔｓｏｎ他、「Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ＤＮＡ」Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｂｏｏｋｓ、米国ニューヨーク；Ｂｉｒｒｅｎ他編「Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  Ｓｅｒｉｅｓ」１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、米国ニューヨーク（１９９８年）；米国特許の４６６６８２８号、４６８３２０２号、４８０１５３１号、５１９２６５９号および５２７２０５７号に記載される方法；Ｃｅｌｌｉｓ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４年）；Ｃｏｌｉｇａｎ，Ｊ．Ｅ．編「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」Ｉ〜ＩＩＩ巻（１９９４年）；Ｓｔｉｔｅｓ他編「Ｂａｓｉｃ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」（第８版）、Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ＆  Ｌａｎｇｅ、米国コネティカット州ノーウォーク（１９９４年）；ＭｉｓｈｅｌｌとＳｈｉｉｇｉ編「Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．、米国ニューヨーク（１９８０年）；また利用可能な免疫検定法は、例えば以下の特許と科学文献に広範囲にわたって記載されている：米国特許の３７９１９３２号、３８３９１５３号、３８５０７５２号、３８５０５７８号、３８５３９８７号、３８６７５１７号、３８７９２６２号、３９０１６５４号、３９３５０７４号、３９８４５３３号、３９９６３４５号、４０３４０７４号、４０９８８７６号、４８７９２１９号、５０１１７７１号および５２８１５２１号；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．編「Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」（１９８４年）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ」（１９８５年）；Ｈａｍｅｓ，Ｂ．Ｄ．およびＨｉｇｇｉｎｓ  Ｓ．Ｊ．編「Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ」（１９８４年）；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ｒ．Ｉ．編「Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ」（１９８６年）；「Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ」ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６年）；「��  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」Ｐｅｒｂａｌ，Ｂ．著（１９８４年）および「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ」１〜３１７巻、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；「ＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、米国カリフォルニア州サンディエゴ（１９９０年）；Ｍａｒｓｈａｋ他、「Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｃｏｕｒｓｅ  Ｍａｎｕａｌ」、ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ、（１９９６年）；なおこれらの文献類は、あたかも本願に完全に記載されているように援用するものである。その外の一般的な文献は、本明細書を通じて提供される。本明細書に記載の方法は当業技術界で周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。本明細書に含まれるすべての情報は本願に援用するものである。
【０１７８】
別途定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書中に記載される方法および材料と類似または同等である方法および材料を本発明の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が下記に記載される。
【０１７９】
（実施例１）
同系アポトーシス性リンパ球の投与による自己免疫疾患（ＳＬＥ）の治療
序論：全身性エリテマトーデスなどの自己免疫疾患には、満足すべき治療または最適な治療が存在しない数多くの非常に衰弱性および／または致死性の疾患が含まれる。そのような疾患を治療するための最適な方法は、標的化抗原を、個体の免疫系によるそのような抗原に対する寛容性を誘導するような方法で、そのような疾患に冒されている個体の免疫系に提示することであると考えられる。この目標を達成するための最適な方法は、自己のアポトーシス性細胞を用いることであり、これにより、当該技術分野における標準的な治療手段である、毒性の免疫抑制薬物を投与しなければならないことが未然に除かれるか、または、最小限に抑えられると考えられる。様々な取り組みが、先行技術では、自己の細胞を使用して、そのような治療的免疫寛容性を誘導するために提案されている一方で、そのような取り組みには、最適でない有効性、および／または、有効性をヒトにおいて実証することができないことを含めて、様々な欠点がある。本発明を実施に移しているとき、全身性自己免疫疾患の治療を可能にするように免疫寛容性を効果的に誘導する方法が、下記において記載されるように、予想以外にも発見され、それにより、先行技術の制限が克服された。
【０１８０】
材料および方法：
アポトーシスの誘導：ＭＲＬ／ＭｐＪ−ＦａｓｌｐｒマウスおよびＣ３Ｈ−ＳｎＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得た。胸腺細胞および脾臓細胞を標準的な方法論に従って４週齢〜８週齢のマウスから調製した。胸腺細胞または脾臓細胞のアポトーシスを、血清枯渇、１マイクロモル濃度のデキサメタゾンまたはガンマ線照射（６６ｒａｄ）のいずれかによって誘導した。アポトーシスを、アネキシン−ＦＩＴＣ染色のフローサイトメトリー分析、ＤＮＡフラグメント化、および、フラグメント化ＤＮＡのヨウ化プロピジウム染色によって確認した。
【０１８１】
治療プロトコル：Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から得たＭＲＬ／ＭｐＪ−ＦａｓｌｐｒマウスおよびＣ３Ｈ−ＳｎＪマウスに、合計でマウスあたり５ｘ１０６個の同系の、性および週齢を一致させたアポトーシス性細胞を、マウスあたり１ｘ１０６個の細胞を毎週５回の注射として投与した。投与経路は、２００マイクロリットルの体積で懸濁された細胞の尾静脈への静脈内注射であった。陰性コントロールとして、性および週齢を一致させた同系のマウスに、ビヒクル（生理的食塩水）のみを注射した。
【０１８２】
自己免疫応答−抗自己ＤＮＡ抗体ＥＬＩＳＡ：血清サンプルを、治療の直前、および、治療後の２週間間隔で得た。免疫応答を、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）および二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）について特異的な血清中の抗体を１００倍希釈された血清の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により定量することによって評価した。
【０１８３】
病理学的評価：マウスを疾患の病理学的徴候については毎日調べ、血尿またはタンパク尿については１ヶ月に１回調べた。４ヶ月後、マウスを屠殺し、その腎臓を組織学的に、また、免疫蛍光によって調べた。
【０１８４】
実験結果：
本実施例において示される研究では、ＳＬＥ様疾患の古典的動物モデルの１つ、すなわち、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスモデルが、疾患の病理発生に対する、同系のアポトーシス性リンパ球の投与の影響を分析するために使用された。ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスモデルは、Ｆａｓ（免疫系のアポトーシスおよび誘導された細胞死の活性化を媒介する受容体）における変異のためにＳＬＥ様疾患を発症する。ＳＬＥ患者では、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスと同様に、自己抗体および腎臓疾患の発生が最も特異的な病態生理学的パラメーターであるので、それらのパラメーターを、アポトーシス性細胞の投与の後、ＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスにおいて評価した。
【０１８５】
週齢および性を一致させたＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスの２つの群を比較した。実験群では、１ｘ１０６個の同系のアポトーシス性細胞が、マウスあたり５ｘ１０６個の細胞の総用量のために、１週間間隔で５回、５匹のマウスのそれぞれに静脈内注射された。陰性コントロール群では、２００マイクロリットルの生理的食塩水キャリアだけが注射された。その後、ＩｇＧ抗ｓｓＤＮＡレベルを２週間間隔でＥＬＩＳＡによって測定し、ＩｇＧ抗ｓｓＤＮＡレベルは、平均Ｏ．Ｄ．値が０．０９６±０．０１８と、治療前の両方の群では匹敵することが見出された（図１）。抗体レベルを治療開始後１０週で比較したとき、ビヒクルだけが投与されたマウスは、狼瘡様疾患を発症するマウスでは予想されたように、０．３０８±０．０２９（ｐ＜０．００００、スチューデントｔ検定）のＥＬＩＳＡのＯ．Ｄ．値によって明示されるように、増大した抗ｓｓＤＮＡ抗体レベルを示した。しかしながら、１ｘ１０６個の同系のアポトーシス性細胞が注射されたマウスは予想外にも、著しく低下したレベルの自己抗体を有し、得られたＥＬＩＳＡのＯ．Ｄ．値が０．１９３±０．０１７であった（ｐ＜０．０００１、スチューデントｔ検定）。
【０１８６】
全ＩｇＭ力価におけるベースライン変化について照査するために、コントロール群および実験群からの血清サンプルを２週間間隔でＩｇＭについて評価した。生理的食塩水が注射された陰性コントロールマウスについてこれらの間隔で得られたＥＬＩＳＡのＯ．Ｄ．値は、０．１９８±０．０１７、０．２０５±０．０２、０．３００±０．０３３、および、０．３７８±０．０３３であり、アポトーシス性細胞により治療されたマウスについては、０．１０８（＋０．０３）、０．１７０（＋０．０７）、０．１８６（＋０．０４）および０．２０３（＋０．８）であった。統計学的分析では、有意な差がこれら２つの群の間に存在しなかったことが示された。対照的に、抗ｓｓＤＮＡのＩｇＧレベルは予想外にも、アポトーシス性細胞の注射の後では著しく低下することが見出された：０．１３２±０．０９、０．１９６±０．０１９、０．２４４±０．０２２、および、０．３０８±０．０２９のＥＬＩＳＡのＯ．Ｄ．値が、生理的食塩水が注射されたコントロールマウスについて得られ、これとは対照的に、同系のアポトーシス性胸腺細胞が注射されたマウスについては、０．１０９±０．０１２（ｐ＝非有意）、０．１２９±０．０１５（ｐ＜０．０４）、０．１６６±０．０１４（ｐ＜０．０４）、０．１９２±０．１７（ｐ＜０．０１）であった。図１に示されるように、１６週齢において、すなわち、治療後１０週において、抗ｓｓＤＮＡ抗体の力価における驚くべき顕著な低下が、アポトーシス性細胞が注射されたすべてのマウスにおいて認められた。
【０１８７】
抗ｄｓＤＮＡ自己抗体（これは抗ｓｓＤＮＡ抗体よりもＳＬＥに対して特異的である）の力価がアポトーシス性細胞の注射の結果として特異的に低下したかどうかを明らかにするために、抗ｄｓＤＮＡ抗体の力価を、治療の直前、および、治療後の６週〜８週（マウスを屠殺したとき）で測定した。図２に示されるように、抗ｄｓＤＮＡ抗体の力価が驚くべきことに、アポトーシス性細胞が注射されたマウスにおいて著しく低下していることが見出された（ｐ＜０．００）。０．５９９±０．０２６の平均Ｏ．Ｄ．値が、生理的食塩水が注射されたマウスから得られた血清の抗ｄｓＤＮＡ抗体ＥＬＩＳＡにおいて得られ、０．３５８±０．０３８の平均Ｏ．Ｄ．値が、アポトーシス性細胞が注射されたマウスにおいて得られた。
【０１８８】
疾患の病理学が血清学的データと一致して進行したかどうかを明らかにするために、腎臓疾患を治療マウス群およびコントロールマウス群においてモニターした。いずれの群においてもマウスはいずれも、６週齢（免疫化の直前）で尿スティックによって測定されたとき、タンパク尿または血尿を示さなかった。治療開始後１０週において、生理的食塩水が注射されたマウスが、表１に示されるように、タンパク尿および血尿ならびに付随した腎糸球体疾患における著しい上昇を示した。しかしながら、表１にはまた示されるように、アポトーシス性細胞が注入されたマウスは、全体として予想外であったが、血清学的応答と一致して、著しく低下したタンパク尿および血尿ならびに付随した腎糸球体疾患を示した。著しいことに、アポトーシス性細胞により治療された５匹のマウスのうちの２匹では、悪化または非常にわずかな悪化は何ら認められなかった。
【０１８９】
腎臓の病理発生が上記の尿指標と一致して進行したかどうかを明らかにするために、免疫蛍光による組織学的分析を、治療マウスから得られた腎臓のパラフィン切片に対して行った。表２には、それぞれの治療群の３つの無作為に選ばれた腎臓切片における組織病理学的知見がまとめられており、驚くべきことに、アポトーシス性細胞が注射されたマウスは、糸球体、血管および細管における低下した病理発生を示したことが示される。
【表１】
2008540400.tif 000003
【表２】
2008540400.tif 000004
【０１９０】
結論：上記の結果は予想外にも、リンパ球媒介による疾患（具体的には、自己免疫疾患、最も具体的には、ＳＬＥ）を有する哺乳動物への瀕死細胞（例えば、同系のアポトーシス性リンパ球など）の投与が、そのような疾患を治療するための十分な解決策を提供することができない先行技術の制限をそれにより克服して、疾患の病理発生を効果的に阻害するために、従って、ヒトにおけるそのような疾患を効果的に治療するために使用できることを明らかにする。
【０１９１】
（実施例２）
エクスビボで懸濁された単球は死（一種のプログラム化された壊死または加速されたカスパーゼ非依存的アポトーシス）を受け、前炎症性媒介因子を産生し、これに対して、支持体接着性のエクスビボ単球は、前炎症性媒介因子の産生を伴うことなくアポトーシスを受ける：先行技術によるアフェレーシス法を改善する方法
序論：移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）などの免疫／血液学的疾患には、著しい死亡率および罹患率に関連し、かつ、満足すべき治療／最適な治療が得られていない非常に多数の疾患が含まれる。非常に多数の場合において、そのような疾患を治療するための最適な方法では、アフェレーシス法を行うことが伴う。典型的には、アフェレーシス法は、血液を個体から取り出すこと、血液を分画物に分離し、特定の分画物の治療的治療を行うこと、望ましくない病理学的分画物を除くこと、および、残りを個体に戻すこと、または、所望の分画物を集めることを伴い、望ましくない副作用および／または最適でない有効性が付随する場合がある。従って、アフェレーシスを行うための潜在的に最適な方法では、アフェレーシスを行うための最適な方法およびデバイスの設計を可能にするように、血液成分に対するアフェレーシス法の有害な影響を特定することが伴う。本発明を実施に移しているとき、下記において記載されるように、典型的にはアフェレーシス法の期間中に生じるような、そのエクスビボ懸濁から生じる単球の壊死の誘導および単球による有害な前炎症性媒介因子の付随した分泌が予想外にも発見され、これは、前炎症性媒介因子の分泌の非存在下で単球のアポトーシスを誘導することが驚くべきことに見出された血清枯渇および支持体接着性条件とは対照的であった。そのため、下記に記載される実験結果より、先行技術の制限が、単球を血清枯渇／支持体接着性条件にさらすことを伴うアフェレーシス法では、先行技術によるアフェレーシス法に固有的な有害な前炎症性作用を防止することができることを初めて教示することによって克服される。
【０１９２】
材料および方法：
細胞の単離および培養：ヒト単核細胞を密度勾配遠心分離によってヘパリン添加の末梢血から単離した。単離された単核細胞を、単球を磁石ビーズ分離（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ．、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ、米国）によりＣＤ１４＋の分画物として陽性選択することによって、また、Ｂ細胞をＣＤ２２＋の分画物として陽性選択することによって、また、Ｔ細胞をＣＤ１４−／ＣＤ２２−の分画物として陰性選択することによって、単球集団、Ｂ細胞集団およびＴ細胞集団に分離した。純度は、単球については９５パーセントを超え、Ｂ細胞については９５パーセントを超え、Ｔ細胞については８８パーセントを超えていた。多形核細胞（好中球）を、Ｐｌａｓｍａｔｅｒｉｌ（ＧｍｂＨ、Ｂａｄ  Ｈｏｍｂｕｒｇ、ドイツ）との末梢血のインキュベーションの後で得られた上部分画物の密度勾配遠心分離によって調製した。必要なときには、ペレット中の赤血球を低浸透圧条件のもとで溶血した。抗ＣＤ１５磁石ビーズを用いて、好中球を、９５パーセントを超える純度に精製した。あるいは、単球の単離を、下記で記載されるように、接着によるアポトーシス誘導と同時に行った。
【０１９３】
細胞死の誘導：白血球の死を血清枯渇または懸濁によって誘導し、白血球の壊死をｆａｓにより誘導した。血清枯渇処理のために、単球をポリプロピレンチューブにおいて血清非含有ＲＰＭＩ培養培地で３７℃でインキュベーションした。壊死を、５６℃での２０分間のインキュベーションによって高熱により誘導し、９５パーセントを超えるトリパンブルー陽性細胞によって確認し、膨潤した細胞をフローサイトメトリー前方散乱によって検出した。
【０１９４】
単球のアポトーシスを支持体接着＋血清枯渇により２つの方法のいずれかによって誘導した。第１の方法では、抗ＣＤ１４共役化磁石ビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｂｅｒｇｉｓｈ、Ｇｌａｄｂａｃｈ、ドイツ）を使用して単離された単球を、直径が３５ｍｍの組織培養処理されたペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．４３０１６５）において７５０万個／ミリリットル〜２０００万個／ミリリットルの細胞の濃度で血清非含有ＲＰＭＩでインキュベーションした。第２の方法では、単離されたＰＢＭＣを、直径が３５ｍｍの組織培養処理されたペトリ皿（Ｃｏｒｎｉｎｇ、米国、Ｃａｔ．Ｎｏ．４３０１６５）において１５００万個／ミリリットル〜３０００万個／ミリリットルの細胞の濃度で血清非含有ＲＰＭＩでインキュベーションし、４０分後、非接着性細胞を洗い流し、接着性のアポトーシス性単球を残した。
【０１９５】
細胞死アッセイ：アポトーシスおよび壊死を、以前の記載［２０］のように、アネキシン−Ｖ−ＦＩＴＣ（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  ＧｍｂＨ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）およびヨウ化プロピジウムを用いた二重染色によって検出し、ヨウ化プロピジウム染色によって、ならびに、細胞周期ヒストグラムの低二倍体部分を測定することによって確認した。
【０１９６】
細胞死阻害アッセイ：実験の一部において、細胞を、細胞死の阻害を達成するために種々の試薬により（示されたように）前処理または同時処理した。アポトーシスの阻害については、抗Ｆａｓ阻害性ｍＡｂのＺＢ４（ＭＢＬ、名古屋、日本）を１マイクログラム／ｍｌの濃度で使用し、抗Ｆａｓ  ｍＡｂのＤＭ５４２Ａ（Ａｃｒｉｓ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、Ｈｉｄｄｅｎｈａｕｓｅｎ、ドイツ）を使用した。カスパーゼ−１を、カスパーゼ−１（ＩＣＥ）ｆｍｋ阻害剤のＺ−ＷＥＨＤ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して阻害した。プロテアソームの阻害については、細胞を５０マイクロモル濃度のプロテアソーム阻害剤のＭＧ１３２（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）に４５分間さらした。ｐ３８およびＪＮＫを、１０マイクロモル濃度のＳＢ２０３５８０（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、ドイツ）または２０ミリモル濃度のＬ−ＪＮＫＩ１（Ａｌｅｘｉａ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、米国）を使用してそれぞれ阻害した。転写の阻害については、５マイクログラム／ｍｌのアクチノマイシンＤを使用し、翻訳の阻害については、１５マイクログラム／ｍｌのシクロヘキシミド（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を使用した。単球の活性化を、５００マイクログラム／ｍｌ、１マイクログラム／ｍｌのザイモサン、または、１マイクログラム／ｍｌのＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）により誘導した。
【０１９７】
遺伝子発現分析：総ＲＮＡを、ＥＺ−ＲＮＡ単離キット（Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ  Ｃｏ．、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を使用することによって単離した。量を分光光度法によって求め、品質をゲル電気泳動によって求めた。ＧＥＡｒｒａｙ遺伝子発現アレイシステムｈＧＥＡ９９１２０９０、同ｈＧＥＡ９９１３０３０および同ｈＧＥＡ９９１３０４０（ＳｕｐｅｒＡｒｒａｙ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ、米国）を使用した。それぞれのアレイは、二連でスポットされた特異的なｃＤＮＡフラグメント、ならびに、コントロール配列［陰性コントロールとしてのＰＵＣ１８；陽性コントロールとしてのβ−アクチンおよびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）］を含有する５６の座標からなった。ｃＤＮＡプローブを、製造者のプライマーミックスを逆転写酵素のプライマーとして使用して総ＲＮＡサンプルから合成した。ｃＤＮＡプローブを、メンブラン上にスポットされた遺伝子特異的なｃＤＮＡフラグメントにハイブリダイゼーションさせた。遺伝子の相対的な発現レベルを、ハウスキーピング遺伝子のβ−アクチンおよびＧＡＰＤＨに対するハイブリダイゼーションシグナルの強度に基づいて調節し、その後、遺伝子発現を、デンシトメトリーを走査することによって定量した。それぞれの実験を、結果の再現性を保証するために少なくとも４回行った。
【０１９８】
サイトカイン／ケモカインの分析：サイトカイン／ケモカインのＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−βおよびＭＩＰ−１αの濃度を、製造者によって提供される説明書に従ってＥＬＩＳＡ免疫アッセイ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ、米国）によって求めた。
【０１９９】
ウエスタン免疫ブロッティング：ｐ３８、ホスホｐ３８（Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２）、ＪＮＫおよびホスホＪＮＫ（Ｔｈｒ１８３／Ｔｙｒ１８５）に対するポリクローナル抗体をＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ、米国）から購入し、ＩκＢ−αに対するポリクローナル抗体をＳａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ、米国）から購入した。細胞を溶解し、３０マイクログラムのタンパク質を１０パーセントＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分離し、分離されたタンパク質をトランスファーメンブランにブロットし、ブロットされたメンブランを、ＩκＢの検出のために２０パーセントの低脂肪乳／ＰＢＳＴ溶液（０．０５パーセント〜０．１パーセントのＴｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ）においてブロッキング処理し、または、ｐ３８またはＪＮＫの検出のためにＴＢＳＴ溶液（０．１パーセントのＴｗｅｅｎ−２０を含有するＴＢＳ溶液）においてブロッキング処理した。メンブランを、室温で２時間または４℃で一晩、一次抗体とインキュベーションし、その後、ＰＢＳＴまたはＴＢＳＴにより洗浄し、プロテインＡ−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ、英国）の１：１００００希釈物を含有する溶液において３０分間インキュベーションした。標識されたタンパク質を、ＥＺ−ＥＣＬ検出キット（Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ、Ｋｉｂｂｕｔｚ  Ｂｅｉｔ−Ｈａｅｍｅｋ、イスラエル）を用いて可視化した。
【０２００】
実験結果：
ＣＤ１４＋の単球を単離し、支持体接着＋血清枯渇、または、懸濁＋血清枯渇のいずれかに供した。驚くべきことに、支持体接着および血清枯渇は細胞のアポトーシスをもたらし（図３）、細胞数の減少が最初の１０時間はなく、これに対して、懸濁＋血清枯渇は非常に迅速な死をもたらし、細胞数の５０パーセントの減少が４時間で達した（図４）。懸濁された単球はほとんど、ヨウ化プロピジウムについて陽性に染色されず、また、懸濁の開始から、細胞のほとんどは、一定の割合でアネキシン−Ｖおよびヨウ化プロピジウムの両方について陽性であることが見出され（図４）、低いレベルの低二倍体染色を示し（図示せず）、また、細胞数の急激な低下を示した。さらに、単球が懸濁および血清枯渇の方法による死の誘導にさらされたとき、汎カスパーゼ阻害剤のＺｖａｄ−ＦＭＫによる阻害は細胞死を阻害しなかっただけでなく、実際には、細胞死を増大させた（図示せず）。まとめると、これらの結果から、懸濁誘導による死を受けている単球は、アポトーシスではなく、むしろ、壊死を受けることが示唆される。死のこのモードをさらに特徴づけるために、懸濁された単球における様々なサイトカインおよびケモカインのｍＲＮＡ発現を調べ、これにより、前炎症性媒介因子のＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１αのｍＲＮＡの転写の著しいアップレギュレーションが明らかにされた（図５ａ〜図５ｂおよび図５ｃ）。この転写活性が分泌タンパク質を産生させたかどうかを明らかにするために行われた試験では、懸濁を受けている好中球に対してではなく、単球に対して特異的であるＩＬ−１β（図６ａ）、ＩＬ−８（３２０±６４ｐｇ／ｍｌ）およびＭＩＰ−１α（３２０±６４ｐｇ／ｍｌ）の高レベルの産生が明らかにされた。ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−βのｍＲＮＡは検出されなかった。コントロールとして、試験を、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＧＦ−βのタンパク質発現を検出するために行った（Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）。これらのうち、ＩＬ−１０のみが、前炎症性サイトカインの分泌後、５０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌで分泌され、懸濁開始後２４時間でピークに達することが見出された。他方で、表面接着および血清枯渇にさらされた、磁石により分離された単球はＩＬ−１β（または何らかの前炎症性サイトカイン）を分泌せず（図６ａ）、寛容性を樹状細胞において誘導することができた（図示せず）。図６ｂに示されるように、転写阻害剤（アクチノマイシンＤ）または翻訳阻害剤（シクロヘキシド）による細胞の処理は、懸濁＋血清枯渇にさらされた単球によるサイトカイン分泌を劇的に阻害した。他方で、血清枯渇の期間中に接着させられた単球は前炎症性サイトカインの分泌を何ら示さなかった（図示せず）。さらに、接着させられ、かつ、アポトーシスの他の誘導方法（例えば、スタウロスポリン、シクロホスファミドおよびＦａｓリガンドなど）によって死ぬことが誘発された単球は常に、死の非炎症モードを保っていた（図示せず）。まとめると、これらの知見から、転写、翻訳および分泌の特異的な炎症誘発活性が、懸濁＋血清枯渇にさらされた単球において開始されるこ��が示唆される。懸濁を受けている単球に対するこれらの観察結果の特異性が、瀕死の好中球、瀕死のリンパ球（図６ａ）、アポトーシス性単球、または、高熱誘導による壊死にさらされた単球ではなく、懸濁誘導による死を受けている単球のみが前炎症性サイトカインを分泌するという事実によってさらに示された。アポトーシス性単球、生存性単球、および、懸濁により壊死性にされた単球の間でのＩＬ−１β分泌の比較では、分泌が、懸濁誘導による死を受けている細胞に対して特異的であることが示された（図７ａ）。サイトカイン／ケモカインの分泌がカスパーゼ依存的な機構に関連したかどうかをさらに調べるために、アポトーシスを受けている単球を汎カスパーゼ阻害剤のＺｖａｄ／ｆｍｋにさらした。驚くべきことに、単球の懸濁誘導による死は、ＺＶＡＤ−ｆｍｋによる阻害がないことによって判断されるように、カスパーゼ依存的ではなかった（図７ｂ）。さらに、アネキシン−Ｖおよびヨウ化プロピジウムによる染色では、アポトーシスによる死ではなく、むしろ、壊死による死が明瞭に示された（図４）。
【０２０１】
サイトカインＩＬ−１βは先天性免疫の急性免疫応答の重要な初発因子である［２１、２２］。リポ多糖（ＬＰＳ）によるＮＦκＢ依存的な遺伝子発現のとき、ＩＬ−１βが、生物学的に不活性な３１ｋＤａ前駆体のプロＩＬ−１βとしてヒトの単球系譜の細胞において合成される。ＩＬ−１βは、小胞体会合リボソームにおける翻訳およびその後の分泌小胞内へのパッケージングを可能にするＮ末端のアミノ酸リーダー配列がないために、古典的な小胞体−ゴルジ経路によって分泌されない［２３］。ＩＬ−１βはまた、エキソサイトーシス顆粒に貯蔵されず、または、エキソサイトーシス顆粒から分泌されない。
【０２０２】
生物学的に活性な１７ｋＤａのＩＬ−１βとして放出されるために、プロＩＬ−１βは、そのプロカスパーゼ酵素原形態からの活性化を受けるカスパーゼ−１によってさらにタンパク質分解的に切断されなければならない。ＮＦκＢの活性化の後での細胞外ＡＴＰによるＰ２Ｘ７受容体の活性化により、原形質膜におけるホスファチジルセリン（ＰＳ）の移動、および、その配置に関して膜の非対称性の喪失が引き起こされる。その後、１７ｋＤａのＩＬ−１βを含有する容易に放出され得るホスファチジルセリン露出の微小胞が数秒以内に細胞からくびれて切れる［２５］。
【０２０３】
アッセイを、ＩＬ−１βの分泌が単球の活性化から生じず、活性化されたとき、上記で記載された即時的様式に従うことを確認するために行った。ＩＬ−１βの分泌が即時的でなかったこと（図６）、および、デノボでのｍＲＮＡ合成に依存したこと（図５ｂ）が示された。その後、アッセイを、ＩＬ−１β分泌がカスパーゼ−１依存的であったかどうかを確認するために行い、図７ｂに示されるように、カスパーゼ−１の特異的な阻害はＩＬ−１βの分泌に影響しなかった。
【０２０４】
これらの知見から、懸濁誘導による死にさらされた単球からのＩＬ−１β分泌が、活性化時のＩＬ−１β分泌とは異なる様式に従うことが強く示唆された。活性化はＮＦκＢ依存的であるので、また、サイトカイン分泌がＮＦκＢ依存的な細胞活性化の結果でないことを確認するために、ウエスタン免疫ブロッティングアッセイを、ＩκＢのリン酸化および分解を検出するために行った。図８ａに示されるように、ＩκＢのリン酸化は何ら見られなかった。ＮＦκＢが関与しなかったことをさらに確認するために、単球のアポトーシスをＭＧ１３２（ＮＦκＢの活性化を阻害するプロテアソーム阻害剤［２６］）の存在下で誘導した。図８ｂに示されるように、ＭＧ１３２はサイトカイン分泌を阻害せず、また、ＩＬ−１β分泌におけるわずかな増大さえ認められ、これはおそらくは抗アポトーシス作用のＮＦκＢ阻害のためであった［２７］。さらに、ＭＧ１３２はｍＲＮＡのレベルを阻害しなかった（図８ｃ）。まとめると、これらの結果から、懸濁−血清枯渇により瀕死状態にある単球によるＩＬ−１β分泌が、古典的な活性化のときに見られる様式とは別個の様式に従ったことが明らかにされる。ＩＬ−１βの分泌は即時的ではなく、転写および翻訳に依存し、カスパーゼ−１非依存的であり、また、ＮＦκＢ非依存的であった。
【０２０５】
最近、単球は、Ｆａｓ誘導によるアポトーシスの後で炎症誘発性のシグナル伝達を示すことが示された［２８］。加えて、抗Ｆａｓ  ｍＡｂ（ＣＨ１１）誘導によるアポトーシスの後、ヒト単球は、Ｆａｓ依存的なＩＬ−８およびＴＮＦ−αの分泌を示したことが示唆されており、この分泌はＮＦκＢの活性化に関連していたし、また、アポトーシスの非存在下でさえ生じることが示された［２９］。しかしながら、ＮＦκＢの活性化は、懸濁誘導による死にさらされた単球では検出されなかった（図８ａ〜図８ｃ）。従って、前炎症性サイトカイン／ケモカインのついてのＦａｓ媒介によるシグナル伝達を除外するために、アポトーシスを受けている単球を２つの異なるＦａｓ阻害抗体にさらした。図９ａに示されるように、Ｆａｓ媒介によるアポトーシスについての２つの異なる阻害抗体を使用したとき、懸濁誘導による単球の死は著しく阻害されなかった。さらに、両方の阻害抗体はＩＬ−１β分泌を低下させず、ＩＬ−１βレベルの上昇さえ引き起こした（データは示さず）。
【０２０６】
アッセイを、ＭＡＰＫキナーゼが前炎症性サイトカインの分泌に関与するかどうかを確認するために行った。これは、ＭＡＰＫシグナル伝達カスケードにより、細胞の成長、分化、生存および死を含めて、様々な細胞活動が調節されるからである［３０、３１］。単球のアポトーシスのときにおけるｐ３８およびＪＮＫのリン酸化を調べた。図９ｂ〜図９ｃに示されるように、ＪＮＫではなく、ｐ３８が単球のアポトーシスの後でリン酸化された。このリン酸化は、ＬＰＳによる活性化の後で見られるように長く続き、一時的ではなかった。ＩＬ−１βおよびＩＬ−８の分泌をｐ３８阻害剤およびＪＮＫ阻害剤の存在下および非存在下でのアポトーシス誘導の後で分析した。図９ｄおよび図９ｅに示されるように、ＪＮＫ阻害剤ではなく、ｐ３８阻害剤により、ＩＬ−１β分泌およびＩＬ−８分泌の両方が劇的に阻害された。
【０２０７】
まとめると、前炎症性のＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１αはすべてが、接着−血清枯渇による単球からではなく、懸濁誘導による死にさらされた単球において、著しいレベルで、また、転写および翻訳に依存した様式で産生され、分泌された。細胞は、迅速な溶解を伴った壊死的様式を示し、その死はカスパーゼ依存的またはＦａｓ依存的のいずれでもなかった。
【０２０８】
考察：アポトーシス性細胞は、周りの細胞に様々な方法でシグナル伝達することが示されている。アポトーシス性細胞における食作用誘発（ｐｒｏｐｈａｇｏｃｙｔｉｃ）シグナルは、食細胞がアポトーシス性細胞を特異的に認識し、続いてそのアポトーシス性細胞を摂取するためのマーカーとして役立つ。そのようなシグナルはアポトーシス性細胞の膜に現れ得る。直接的なシグナルには、細胞表面のリン脂質組成における変化［３２］、細胞表面の糖タンパク質における変化、または、表面電荷における変化［３３］が含まれる。あるいは、いくつかの血清タンパク質がアポトーシス性細胞の表面をオプソニン化し、オプソニン化されたアポトーシス性細胞を飲み込むように食細胞にシグナル伝達することができる［３４、３５］。同様に、生存性細胞は、ホスファチジルセリンを原形質膜の内側小葉に制限することによって、または、ＣＤ３１の発現によって食作用阻害シグナルを発現する［３６］。アポトーシス性細胞はまた、食細胞の呼び寄せ、食作用、および、即時的環境での免疫応答のために重要である分子を分泌することができる。免疫抑制および食細胞呼び寄せの媒介因子の例には、ＴＧＦ−β［３７］およびホスホイソコリン［３８］が含まれる。これらの機構のほとんどが、非炎症性の結果および非自己免疫の結果をもたらすプロセスで、アポトーシス性細胞の効率的な特定およびクリアランスが生じることをこれまで示唆している［１１、１２］。それにもかかわらず、アポトーシス性細胞の変化したクリアランスに関係づけられる自己免疫疾患の発症、クロスプライミングの現象、および、Ｆａｓのシグナル伝達が少なくともいくつかの状況では前炎症性応答に関連するという証拠からは、前炎症性環境がアポトーシスの状況において可能であることが示唆される。このことから、単球の死の結果が、感染または非感染のいずれであっても、抗炎症性または前炎症性であるかどうかが何によって決定されるかという疑問が生じる。そのことに対する答えは複雑であるかもしれず、また、さらなる要因（例えば、他のサイトカイン／ケモカインの存在、熱ショックタンパク質、酸化、アポトーシスではなく壊死、および、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）の誘発など）に依存し得る。単球が、懸濁誘導による制御された壊死にさらされたとき、前炎症性サイトカイン／ケモカインを生じさせることができることが今回、示された。そのため、単球は、宿主防御において、自己免疫性において、また、炎症の発生において特有かつ非常に重要な役割を有し得る。単球において、前炎症性サイトカイン／ケモカインはクロスプライミングを誘導することができ、これに対して、抗炎症性サイトカインは交差寛容性を誘導することができる。
【０２０９】
より初期の研究に基づいて、Ｆａｓリガンド（ＦａｓＬ）の発現が、細胞が免疫系に反撃することを可能にすること、および、例えば、移植片拒絶が、Ｆａｓリガンドを移植された臓器において発現させることによって防止され得ることが仮定された。より近年の研究では、免疫特権の媒介因子としてのＦａｓリガンドの考えを認識する必要があったこと、また、実際に、Ｆａｓリガンドが前炎症性であり得ることが示されている［２８］。実際、Ｆａｓは、前炎症サイトカイン（例えば、ＩＬ−１βなど）を媒介することが提案された［３９］。また、最近では、抗Ｆａｓ（ＣＨ１１）誘導によるアポトーシスの後、ヒト単球がＦａｓ依存的なＩＬ−８およびＴＮＦ−αの分泌を生じさせたことが示唆されており、この分泌はＮＦκＢの活性化に関連していたし、また、アポトーシスの非存在下でさえ、マクロファージにおいて生じることが示された［２９］。
【０２１０】
現時点において開示された実験結果から、懸濁誘導による制御された壊死に供された単球におけるＭＡＰＫ活性化に関連する前炎症性サイトカイン／ケモカインの分泌の新規なＦａｓ非依存的かつカスパーゼ非依存的な様式が初めて明らかにされる。哺乳動物において、ＭＡＰＫは、それらの相同性の程度、生物学的活性およびリン酸化モチーフに基づいて、３つの大きな群（ＥＲＫ、ＪＮＫ／ストレス活性化タンパク質キナーゼおよびｐ３８）に分けられる。ＪＮＫは、ｃ−Ｊｕｎ／ＡＰ−１を介したデス受容体転写依存的なアポトーシスシグナル伝達に寄与することができ、これにより、ＦａｓＬの転写の活性化をもたらす。いくつかの研究では、ＪＮＫによるＳｅｒ６３およびＳｅｒ７３におけるｃ−Ｊｕｎのリン酸化によって増大するｃ−Ｊｕｎタンパク質の転写の活性化がアポトーシスに密接に関連することが示唆された［４０〜４２］。本研究では、ｐ３８のみが、アポトーシスに関連してリン酸化され、ＬＰＳへの暴露の後で見られる一時的な活性化とは異なった持続した活性化を示した。Ｆａｓ非依存的な、血清枯渇＋懸濁により誘導された単球のアポトーシスのこの異なった様式は、サイトカインおよびケモカインの前炎症性の分泌をもたらした。興味深いことに、異なった様式ではあるが、ＪＮＫおよびｐ３８ＭＡＰＫの持続したリン酸化は、ｃ−Ｊｕｎ／ＡＴＦ−２のリン酸化に付随しており、ＦａｓＬのアップレギュレーションの前に生じ、ＦａｓＬのアップレギュレーションを誘発し、これは次いでアポトーシス応答に寄与した［４３］。この点に関して、ＮＦκＢの活性化は報告されておらず、また、サイトカイン／ケモカインの分泌がＦａｓ依存的ではなかったが、両方の経路における考えられる混信を除外することができない。
【０２１１】
どのような生理学的環境において、壊死性単球がＦａｓ依存的な様式またはｐ３８依存的な様式のいずれかで前炎症性サイトカインを分泌するかは不明である。それにもかかわらず、単球は、そのｐ３８依存的なサイトカイン／ケモカイン分泌において白血球の中では特異であり、また、そのため、ｐ３８の持続した活性化により、恒常性、感染、炎症および自己免疫性における免疫応答が決定され得る。
【０２１２】
まとめると、好中球または休止Ｂリンパ球または休止Ｔリンパ球ではなく、ヒト単球は、制御された壊死を受け、支持体非接着性（懸濁）の条件のもとで多量の前炎症性サイトカイン（ＩＬ−１β、ＩＬ−８、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−６およびＩＬ−１α）を放出し、それにより前炎症性環境を生じさせることが本実施例において初めて開示される。さらに、ＩＬ−１βの分泌は、単球の活性化またはＦａｓシグナル伝達のときに見られるカスケードとは完全に異なり、また、ｐ３８のリン酸化に関連し、かつ、単球をｐ３８阻害剤にさらしたときに完全に阻害されるシグナル伝達カスケードを伴うことが示される。この異なったカスケードは、一方では、感染したときのクロスプライミングを助ける場合があり、しかし、他方では、身体を、前炎症性のサイトカインおよびケモカインとの関連でアポトーシス性単球に由来する自己抗原によって誘発される永続性の炎症性応答および／または自己免疫応答にさらす場合がある。従って、種々の新たに単離された白血球（例えば、好中球、単球およびリンパ球など）の死が、類似する条件のもとで、異なるモードにより、また、異なる速度論を伴って生じ、これにより、完全に異なる免疫応答を生じさせることが本実施例において初めて開示される。
【０２１３】
結論：
現時点において開示された実験結果から、他の白血球のエクスビボでの懸濁ではなく、単球のエクスビボでの懸濁が予想外にも、迅速な壊死と、前炎症性媒介因子の付随した産生とを生じさ、これに対して、単球を、その支持体接着を容易にする条件にさらすことにより、そのアポトーシスが、前炎症性媒介因子の分泌の付随した非存在とともに生じることが初めて教示される。これらの新規で、予想外の発見は様々な方法で活用することができ、具体的には、単球のエクスビボでの懸濁および単球のその後の再注入を伴う、炎症関連疾患の治療で使用される最適でない先行技術によるアフェレーシス法（例えば、移植片対宿主病を治療するための体外フォトフェレーシスなど）を改善するために活用することができる。現時点において開示された結果から、そのような方法は、炎症関連疾患のために治療されている患者への前炎症性媒介因子の逆効果的な導入を本質的には伴うので、明らかに最適でないこと、および、そのような先行技術の欠点が、エクスビボで処理された単球を、懸濁の代わりに、支持体接着性の条件にさらすことによって回避され得ることが初めて教示される。
【０２１４】
（実施例３）
アポトーシス性リンパ球の治療的使用
アポトーシス性リンパ球は、アポトーシス性リンパ球が最も適切な方法で単離され、最も適切な条件で治療的に投与されるならば、また、他の細胞と混合されるならば、（血液からの白血球において自発的には生じない）制御された方法でのみ、免疫抑制的な、寛容化性で、抗炎症性の効果を有する。下記には、アポトーシス性リンパ球を様々な疾患状態の治療のために好適に得て、投与する方法が記載される。
【０２１５】
材料および方法：
アポトーシス性リンパ球の作製：
１．５００ミリリットルまでの自己血液からの１０億個までのＰＢＭＣの単離、または、白血球アフェレーシスによる１００億個までのＰＢＭＣの単離。
２．リンパ球表面マーカーのリガンドに共役化された磁石ビーズを使用するＰＢＭＣからのリンパ球の単離、または、接着性リンパ球のサブトラクションによるＰＢＭＣからのリンパ球の単離。
３．下記の方法の１つ以上によるリンパ球のアポトーシスの誘導：
（ｉ）血清枯渇により誘導されるアポトーシス；
（ｉｉ）照射（例えば、ＵＶまたはガンマ線の照射など）を使用する照射誘導によるアポトーシス；
（ｉｉ）化学的に誘導されるアポトーシス（スタウロスポリン、シクロホスファミドおよび過酸化水素などの化合物を使用する）；および
（ｖｉ）デス受容体リガンドにより誘導されるアポトーシス。
４．簡便な分離を使用する５億個までのアポトーシス性リンパ球の回収、および、白血球アフェレーシスを使用する５０億個までのアポトーシス性リンパ球の回収。
５．下記経路のいずれかによるアポトーシス性リンパ球の治療的投与：非経口、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および経口。
６．疾患または指示に従って手順を繰り返す。
【０２１６】
疾患／指示に従ったアポトーシス性リンパ球の治療的投与：
下記に記載される細胞投薬量は７０ｋｇの患者について好適であり、体重に従って調節することができる。
【０２１７】
抗炎症性（および抗血栓性）効果、寛容性および免疫抑制の誘導：
１．１．１０００万個〜５０億個の細胞を、再狭窄を防止するためのステントまたは任意の他の血管内デバイスもしくは血管内手法などを伴う経皮的経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）の２４時間前および２４時間後に投与する。必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間後に投与する。
１．２．１０００万個〜５０億個の細胞を、梗塞サイズおよび再灌流傷害を軽減するために急性冠動脈事象のときに投与する。
１．３．１０００万個〜５０億個の細胞を、１．１．と類似するプロトコルで、ステントの何らかの血管埋め込みのときに投与する。
１．４．１０００万個〜５０億個の細胞を急性血栓症のときに投与する。
２．１．実質臓器拒絶の防止：１０００万個〜５０億個の細胞を実質臓器移植前の２時間〜２４時間および実質臓器移植後の２４時間で投与する（２時間〜２４時間前および２４時間後）。必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
２．２．異種骨髄拒絶の防止：１０００万個〜５０億個の細胞を骨髄移植前の２時間〜２４時間および骨髄移植後の２４時間で投与する（２時間〜２４時間前および２４時間後）。必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
２．３．ＧＶＨＤの防止。
２．３．１．予防的治療：１０００万個〜５０億個の細胞を移植前の２時間〜２４時間および骨髄移植後の２４時間で投与する。必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
２．３．１．顕在的ＧＶＨＤについての治療：必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
３．１．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療：
３．１．１．活動性疾患の治療：必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
３．１．２．発赤拡大の防止：必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間〜４週間毎に投与する。
３．２．自己免疫疾患の治療：治療可能な自己免疫疾患には、リウマチ様関節炎、特発性多発性関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、強皮症、シェーグレン症候群、多発性筋炎または皮膚筋炎、全身性または局所性の脈管炎、セリアック病、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、抗リン脂質症候群、甲状腺炎、グレーヴズ病および乾癬が含まれる。活動性疾患を治療するために、または、発赤拡大を防止するために使用することができる。必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間〜４週間毎に投与する。
４．１．慢性的な炎症性疾患または突発性の炎症関連疾患（例えば、家族性地中海熱（ＦＭＦ）および他の周期的発熱疾患など）の治療：
４．１．１．発作時に、１０００万個〜５０億個の細胞を投与する。
４．１．２．発作に対する防止として、必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
４．１．３．アミロイドーシスの防止：必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間〜４週間毎に投与する。
【０２１８】
（実施例４）
アポトーシス性単球の治療的使用
アポトーシス性単球は、アポトーシス性単球が最も適切な方法で単離され、最も適切な条件で治療的に投与されるならば、免疫抑制的な、寛容化性で、抗炎症性の効果を有する。そうでない場合、アポトーシス性単球は前炎症性の壊死を受ける。下記には、アポトーシス性単球を様々な疾患状態の治療のために好適に得て、投与する方法が記載される。
【０２１９】
材料および方法：
アポトーシス性単球の作製：
１．５００ミリリットルまでの自己血液からの１０億個までのＰＢＭＣの単離、または、白血球アフェレーシスによる１００億個までのＰＢＭＣの単離。
２．抗ＣＤ１４抗体共役化磁石ビーズ、支持体接着または遠心分離水簸のいずれかを使用するＰＢＭＣからの単球の単離。
３．単球の接着の誘導（これは、支持体接着によって行われる単球単離に含まれる）。
４．下記の方法の１つ以上による単球のアポトーシスの誘導：
（ｉ）血清枯渇により誘導されるアポトーシス；
（ｉｉ）照射（例えば、ＵＶまたはガンマ線の照射など）を使用する照射誘導によるアポトーシス；
（ｉｉ）化学的に誘導されるアポトーシス（スタウロスポリン、シクロホスファミドおよび過酸化水素などの化合物を使用する）；および
（ｖｉ）デス受容体リガンドにより誘導されるアポトーシス。
５．簡便な分離を使用する１．２億個までのアポトーシス性単球の回収、および、白血球アフェレーシスを使用する１０億個までのアポトーシス性単球の回収。
６．生理学的緩衝液における細胞の洗浄および再懸濁。
７．下記経路のいずれかによるアポトーシス性単球の治療的投与：非経口、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および経口。
８．疾患または指示に従って手順を繰り返す。
【０２２０】
疾患／指示に従ったアポトーシス性単球の治療的投与：
下記に記載される細胞投薬量は７０ｋｇの患者について好適であり、体重に従って調節することができる。
【０２２１】
抗炎症性（および抗血栓性）効果、寛容性および免疫抑制の誘導：
１．１．１０００万個〜１０億個の細胞を、再狭窄を防止するためのステントまたは任意の他の血管内デバイスもしくは血管内手法などを伴う経皮的経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）の２４時間前および２４時間後に投与する。必要に応じて、細胞を２週間後に投与する。
１．２．１０００万個〜１０億個の細胞を、梗塞サイズおよび再灌流傷害を軽減するために急性冠動脈事象のときに投与する。
１．３．１０００万個〜１０億個の細胞を、１．１．と類似するプロトコルで、ステントの何らかの血管埋め込みのときに投与する。
１．４．１０００万個〜１０億個の細胞を急性血栓症のときに投与する。
２．１．実質臓器拒絶の防止：１０００万個〜１０億個の細胞を実質臓器移植前の２時間〜２４時間および実質臓器移植後の２４時間で投与する（２時間〜２４時間前および２４時間後）。必要に応じて、１０００万個〜１０億個の細胞を２週間毎に投与する。
２．２．異種骨髄拒絶の防止：１０００万個〜１０億個の細胞を骨髄移植前の２時間〜２４時間および骨髄移植後の２４時間で投与する（２時間〜２４時間前および２４時間後）。必要に応じて、１０００万個〜１０億個の細胞を２週間毎に投与する。
２．３．移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の防止：
２．３．１．予防的治療：１０００万個〜１０億個の細胞を移植前の２時間〜２４時間および骨髄移植後の２４時間で投与する。必要に応じて、１０００万個〜１０億個の細胞を２週間毎に投与する。
２．３．１．顕在的ＧＶＨＤについての治療：必要に応じて、１０００万個〜１０億個の細胞を２週間毎に投与する。
３．１．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療：
３．１．１．活動性疾患の治療：必要に応じて、１０００万個〜１０億個の細胞を２週間毎に投与する。
３．１．２．発赤拡大の防止：必要に応じて、１０００万個〜１０億個の細胞を２週間〜４週間毎に投与する。
３．２．自己免疫疾患の治療：治療可能な自己免疫疾患には、リウマチ様関節炎、特発性多発性関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、強皮症、シェーグレン症候群、多発性筋炎または皮膚筋炎、全身性または局所性の脈管炎、セリアック病、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、抗リン脂質症候群、甲状腺炎、グレーヴズ病および乾癬が含まれる。活動性疾患を治療するために、または、発赤拡大を防止するために使用することができる。必要に応じて、１０００万個〜１０億個の細胞を２週間〜４週間毎に投与する。
４．１．慢性的な炎症性疾患または突発性の炎症関連疾患（例えば、家族性地中海熱（ＦＭＦ）および他の周期的発熱疾患など）の治療：
４．１．１．発作時に、１０００万個〜１０億個の細胞を投与する。
４．１．２．発作に対する防止として、必要に応じて、１０００万個〜１０億個の細胞を２週間毎に投与する。
４．１．３．アミロイドーシスの防止：必要に応じて、１０００万個〜１０億個の細胞を２週間〜４週間毎に投与する。
【０２２２】
（実施例５）
アポトーシス性好中球の治療的使用
アポトーシス性好中球は、アポトーシス性好中球が最も適切な方法で単離され、最も適切な条件で治療的に投与されるならば、また、他の細胞と混合されるならば、（血液からの白血球において自発的には生じない）制御された方法でのみ、免疫抑制的な、寛容化性で、抗炎症性の効果を有する。好中球は、正しく投与されないならば、抗炎症性な、免疫抑制性の効果を阻害し得るプロテアーゼおよび他の内容物を含有する。下記には、アポトーシス性好中球を様々な疾患状態の治療のために好適に得て、投与する方法が記載される。
【０２２３】
材料および方法：
アポトーシス性好中球の作製：
１．５００ミリリットルまでの自己血液からの１０億個までの好中球の単離、または、好中球アフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスによる１００億個までの好中球の単離。
２．下記の方法の１つ以上による好中球のアポトーシスの誘導：
（ｉ）血清枯渇により誘導されるアポトーシス；
（ｉｉ）照射（例えば、ＵＶまたはガンマ線の照射など）を使用する照射誘導によるアポトーシス；
（ｉｉ）化学的に誘導されるアポトーシス（スタウロスポリン、シクロホスファミドおよび過酸化水素などの化合物を使用する）；および
（ｖｉ）デス受容体リガンドにより誘導されるアポトーシス。
３．簡便な分離を使用する５億個までのアポトーシス性好中球の回収、および、白血球アフェレーシスを使用する５０億個までのアポトーシス性好中球の回収。
４．下記経路のいずれかによるアポトーシス性好中球の治療的投与：非経口、静脈内、筋肉内、皮下、皮内および経口。
５．疾患または指示に従って手順を繰り返す。
【０２２４】
疾患／指示に従ったアポトーシス性好中球の治療的投与：
下記に記載される細胞投薬量は７０ｋｇの患者について好適であり、体重に従って調節することができる。
【０２２５】
抗炎症性（および抗血栓性）効果、寛容性および免疫抑制の誘導：
１．１．１０００万個〜５０億個の細胞を、再狭窄を防止するためのステントまたは任意の他の血管内デバイスもしくは血管内手法などを伴う経皮的経管的冠状動脈形成術（ＰＴＣＡ）の２４時間前および２４時間後に投与する。必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間後に投与する。
１．２．１０００万個〜５０億個の細胞を、梗塞サイズおよび再灌流傷害を軽減するために急性冠動脈事象のときに投与する。
１．３．１０００万個〜５０億個の細胞を、１．１．と類似するプロトコルで、ステントの何らかの血管埋め込みのときに投与する。
１．４．１０００万個〜５０億個の細胞を急性血栓症のときに投与する。
２．１．実質臓器拒絶の防止：１０００万個〜５０億個の細胞を実質臓器移植前の２時間〜２４時間および実質臓器移植後の２４時間で投与する（２時間〜２４時間前および２４時間後）。必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
２．２．異種骨髄拒絶の防止：１０００万個〜５０億個の細胞を骨髄移植前の２時間〜２４時間および骨髄移植後の２４時間で投与する（２時間〜２４時間前および２４時間後）。必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
２．３．ＧＶＨＤの防止。
２．３．１．予防的治療：１０００万個〜５０億個の細胞を移植前の２時間〜２４時間および骨髄移植後の２４時間で投与する。必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
２．３．１．顕在的ＧＶＨＤについての治療：必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
３．１．全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の治療：
３．１．１．活動性疾患の治療：必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
３．１．２．発赤拡大の防止：必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間〜４週間毎に投与する。
３．２．自己免疫疾患の治療：治療可能な自己免疫疾患には、リウマチ様関節炎、特発性多発性関節炎、多発性硬化症、炎症性腸疾患、強皮症、シェーグレン症候群、多発性筋炎または皮膚筋炎、全身性または局所性の脈管炎、セリアック病、ギラン・バレー症候群、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、抗リン脂質症候群、甲状腺炎、グレーヴズ病および乾癬が含まれる。活動性疾患を治療するために、または、発赤拡大を防止するために使用することができる。必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間〜４週間毎に投与する。
４．１．慢性的な炎症性疾患または突発性の炎症関連疾患（例えば、家族性地中海熱（ＦＭＦ）および他の周期的発熱疾患など）の治療：
４．１．１．発作時に、１０００万個〜５０億個の細胞を投与する。
４．１．２．発作に対する防止として、必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間毎に投与する。
４．１．３．アミロイドーシスの防止：必要に応じて、１０００万個〜５０億個の細胞を２週間〜４週間毎に投与する。
【０２２６】
（実施例６）
本発明の接着したアポトーシス性単球は、未成熟な樹状細胞（ＩＤＣ）のＬＰＳ誘導による成熟化を阻害することができる
未成熟な樹状細胞（ｉＤＣ）はＬＰＳまたは他のＴＯＬＬ様受容体リガンドに対して劇的に応答し、免疫学的応答を開始させるために成熟化を受ける。ＬＰＳにより誘導されると、ｉＤＣによるＤＲ（ＭＨＣクラスＩＩ）の発現が、ＣＤ８６のような分子の共刺激と一緒にアップレギュレーションされる。
【０２２７】
ｉＤＣの成熟化に対する本発明の接着したアポトーシス性単球の影響を調べるために、接着したアポトーシス性単球細胞をＤｉＩにより染色し、染色された単球をｉＤＣに４：１の比率（単球対ｉＤＣ、それぞれ）で加え、処理されたｉＤＣをＬＰＳ誘導にさらに供し、その後、ＦＡＣＳ分析を、抗ＤＲ−ＦＩＴＣ抗体および抗ＣＤ８６−ＦＩＴＣ抗体を使用して行った。簡単に記載すると、アポトーシス性細胞を、血清を含まないＲＰＭＩにより洗浄し、製造者の説明書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ、米国）に従って１，１’−ジオクタデシル−３，３，３’，３’−テトラメチル−インドカルボシアニンペルクロレート（ＤＩＬ）により染色した。アポトーシス性細胞をｉＤＣと相互作用させるために、８ｘ１０５個のアポトーシス性単球を、他の文献で記載されたように［Ｖｅｒｂｏｖｅｔｓｋｉ、２００２］、５μｇ／ｍｌのＤｉＩにより標識し、９６ウエルプレートにおいて、３００μｌのｉＤＣ培養培地で、培養６日目の２ｘ１０５個のｉＤＣ（４：１の比率）に３７℃で５時間与えた。取り込みを、他の文献で記載されたように［Ｖｅｒｂｏｖｅｔｓｋｉ、２００２］、ＦＡＣＳｃａｎ（商標）によって読み取った。ＬＰＳが使用されたとき、ＬＰＳをアポトーシス性細胞との相互作用の後１時間で加え、サンプルをＬＰＳ添加後２４時間でフローサイトメトリーによって読み取った。簡単に記載すると、ｉＤＣを、ＣＤ１ａ染色およびＣＤ１４染色に基づいて単球から分離した。ＦＳＣ／ＳＳＣ分布およびｉＤＣによるＤｉＩ獲得を測定した。結果の妥当性確認を、相互作用指数（Ｓｈｏｓｈａｎ、２００１）を使用して行った。
【０２２８】
図１２ａ〜図１２ｄに示されるように、接着したアポトーシス性単球はＬＰＳおよびＣＤ４０（示さず）の作用を劇的に阻害し、これに対して、接着しなかった瀕死単球は阻害せず、ｉＤＣ上の成熟化分子を増大さえした。
【０２２９】
まとめると、これらの結果は、樹状細胞の成熟化の阻害における（接着および血清枯渇の方法により誘導された）本発明のアポトーシス性単球の使用、従って、例えば、自己免疫疾患などでの自己抗原に対する末梢寛容性を維持するために使用することができる本発明のアポトーシス性単球の使用を明らかにする。
【０２３０】
明確にするため別個の実施態様で説明されている本発明の特定の特徴は単一の実施態様に組み合わせて提供することもできることは分かるであろう。逆に、簡潔にするため単一の実施態様で説明されている本発明の各種の特徴は別個にまたは適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【０２３１】
本発明はその特定の実施態様によって説明してきたが、多くの別法、変更および変形があることは当業者には明らかであることは明白である。従って、本発明は、本願の請求項の精神と広い範囲の中に入るこのような別法、変更および変形すべてを包含するものである。本明細書中で挙げた刊行物、特許および特許出願はすべて、個々の刊行物、特許および特許出願が各々あたかも具体的にかつ個々に引用提示されているのと同程度に、全体を本明細書に援用するものである。さらに、本願で引用または確認したことは本発明の先行技術として利用できるという自白とみなすべきではない。
【０２３２】
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【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】同系のアポトーシス性細胞による治療の後でのＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスにおける血清中の抗一本鎖ＤＮＡ抗体の減少を示すヒストグラムである。
【図２】同系のアポトーシス性細胞による治療の後でのＭＲＬ／ＭｐＪ−Ｆａｓｌｐｒマウスにおける血清中の抗二本鎖ＤＮＡ抗体の減少を示すヒストグラムである。
【図３】血清枯渇および支持体接着による単球のアポトーシス誘導を示す１組の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）ドットプロットである。
【図４】単球の、懸濁＋血清枯渇により誘導される死がアポトーシス性でないことを示す１組の蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）ドットプロットであり、壊死の特徴を示す。
【図５】懸濁＋血清枯渇にさらされた単球による前炎症性サイトカイン／ケモカインのｍＲＮＡのデノボでの転写を示す。
【図６】前炎症性サイトカインのＩＬ−１βが、懸濁＋血清枯渇にさらされた単球によって産生されることを示すデータプロット（図６ａ）、および前炎症性サイトカイン／ケモカインのｍＲＮＡおよびタンパク質が、懸濁＋血清枯渇にさらされた単球によってデノボで転写および翻訳されることを示すＥＬＩＳＡデータのヒストグラム（図６ｂ）である。
【図７】生存性単球、高熱誘導による壊死にさらされた単球、または、接着および血清枯渇によりアポトーシスすることが誘導されたアポトーシス性単球からではなく、懸濁誘導による死（および血清枯渇）にさらされた単球によるＩＬ−１βの分泌を示すＥＬＩＳＡデータのプロット（図７ａ）、および懸濁−血清枯渇により誘導された死にさらされた単球からのＩＬ−１β分泌（ｐｇ／ｍｌで示される）を示し、また、懸濁（非接着）による単球の死がカスパーゼ３依存的またはカスパーゼ１依存的のいずれでもないことを明らかにするＥＬＩＳＡデータのプロット（図７ｂ）である。
【図８ａ−ｂ】単球のアポトーシスの期間中における前炎症性サイトカインの分泌がＮＦκＢ依存的でないことを示すウエスタン免疫ブロッティングアッセイの写真（図８ａ）、およびＭＧ１３２の存在下でのＩＬ−１β分泌がわずかに上昇することを示す棒グラフ（図８ｂ）（３回の実験）である。
【図８ｃ】ＭＧ１３２の存在下での転写活性を示すヒストグラムである（３回の実験を表す）。
【図９ａ−ｃ】抗Ｆａｓ阻害抗体（ＢＤ２９またはＺＢ４）の存在下での２４時間後、単球のアポトーシスが、ｐ３８阻害剤（ｐ３８ＩＮＨ）またはｐ３８および抗ｆａｓ（ＺＢ４）の存在下で見られるアポトーシスにおける著しい低下＊（ｐ＜０．００１）と比較して、ほんのわずかに低下したことを示す棒グラフ（図９ａ）（ＢＤ２９が示される）、Ｐ３８が、ＬＰＳにさらされたか、または、アポトーシスを受けるように誘導された単球において匹敵するレベルで発現することを示すウエスタン免疫ブロッティングアッセイ（図９ｂ）、およびリン酸化ｐ３８がＬＰＳ刺激のときに一時的に増大し、しかし、アポトーシスのときには持続した増大を示すウエスタン免疫ブロッティングアッセイ（図９ｃ）である。
【図９ｄ−ｅ】（懸濁および血清枯渇によって誘導された）アポトーシス性単球によるＩＬ−１β分泌が特異的なｐ３８阻害剤（ｐ３８ＩＮ）によって完全に妨げられ、しかし、ｐ３８コントロール（ＤＭＳＯ）においては妨げられないことを示す棒グラフ（図９ｄ）、およびコントロール（ＤＭＳＯ）またはＪＮＫ阻害剤（ＪＮＫＩＮ）においてではなく、ｐ３８阻害剤（ｐ３８ＩＮ）の存在下でのアポトーシス性単球からのＩＬ−８分泌における顕著な低下を示す棒グラフ（図９ｅ）である。
【図１０】白血球のアポトーシスを誘導するためのデバイスを示す概略図である。
【図１１】病理学的免疫応答によって特徴づけられる疾患を治療するためのデバイスを示す概略図である。
【図１２】アポトーシス性単球の飲み込みが樹状細胞（ＤＣ）上の成熟化関連分子の発現をダウンレギュレーションすることを示すＦＡＣＳ分析である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ−ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９ａ−ｃ】
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【図９ｄ−ｅ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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