(57)【要約】  核酸結合のための固相材料とそれらの使用に関する方法を開示する。材料は、結合核酸を解離するために開裂し得る開裂可能な結合部分の特徴をなす。固相材料は、核酸を誘引して結合するための核酸結合部分と結合するシリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固体支持体部分を含み、前記核酸結合部分（ＮＡＢ）は、前記固体支持体部分に開裂可能な結合部分で結合される。好ましくは、核酸結合部分は、３級または４級のオニウム基を含む。前記材料は、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、テストチューブまたはマイクロウェルであり、磁性コアを含んでいてもよい。開裂可能な固体支持体を使用する核酸の結合方法は、核酸の単離または精製の方法での使用として開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプルから核酸を単離する方法において、
ａ）シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固体支持体部分、
核酸を引き寄せて核酸と結合するための核酸結合部分、および、
開裂可能な結合部分、
を含む固相を与える工程と、
ｂ）固相に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相からサンプルを分離する工程と、
ｄ）開裂可能な結合部分を開裂する工程と、さらに、
ｅ）固相から核酸を解離させる工程と、
を含む、サンプルからの核酸の単離方法。
【請求項２】
前記固相の前記核酸結合部分が、式ＳＲ2+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘがアニオンである）で表される３級スルホニウム基、式ＮＲ3+Ｘ-（式中ＲはＣ4−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘがアニオンである）で表される４級アンモニウム基、および式ＰＲ3+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘがアニオンである）で表される４級ホスホニウム基からなる群から選択される請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項３】
前記核酸結合部分が、４級アンモニウム基であり、前記Ｒ基がそれぞれ４−２０の炭素原子を含む請求項２記載の核酸の単離方法。
【請求項４】
前記核酸結合部分が、４級ホスホニウム基であり、前記Ｒ基がそれぞれ１−２０の炭素原子を含む請求項２記載の核酸の単離方法。
【請求項５】
前記固相のそれぞれのＲ基が、ブチル基である請求項４記載の核酸の単離方法。
【請求項６】
前記固体支持体部分が、粒子、微粒子およびビーズからなる群から選択される請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項７】
前記固体支持体部分が、不溶性合成ポリマーを含む請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項８】
前記不溶性合成ポリマーが、ポリスチレンおよびポリアクリル酸ポリマーから選択される請求項７記載の核酸の単離方法。
【請求項９】
前記固相の前記固体支持体部分が、ガラス基質を含む請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項１０】
前記固相の前記固体支持体部分が、シリカ基質を含む請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項１１】
前記固相の前記開裂可能な結合部分が、１または２以上の結合部分を含む請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項１２】
前記固相が、磁性反応性部分を含む請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項１３】
前記固相の前記開裂可能な結合部分が、加水分解で開裂される請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項１４】
加水分解開裂を、水酸化物塩およびアルコキシド塩から選ばれる塩基を含む溶液で行う請求項１３記載の核酸の単離方法。
【請求項１５】
前記塩基が、ＬｉＯＨ，ＮａＯＨ，ＫＯＨ，ＮＨ4ＯＨ，ＮａＯＣＨ3，ＫＯＣＨ3およびＫＯｔ−Ｂｕからなる群から選択される請求項１４記載の核酸の単離方法。
【請求項１６】
加水分解開裂を、過酸化水素をも含む溶液で行う請求項１４記載の核酸の単離方法。
【請求項１７】
加水分解開裂を、無機酸を含む溶液で行う請求項１３記載の核酸の単離方法。
【請求項１８】
前記固相の加水分解で開裂できる結合部分が、エステルまたはチオエステル基である請求項１３記載の核酸の単離方法。
【請求項１９】
前記固相の前記開裂可能な結合部分が、還元で開裂される請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項２０】
前記開裂可能な結合部分が、ジスルフィドまたはペルオキシド基を含む請求項１９記載の核酸の単離方法。
【請求項２１】
還元開裂を、チオール、アミンおよびホスフィンからなる群から選択される還元試薬で行う請求項１９記載の核酸の単離方法。
【請求項２２】
前記還元試薬が、エタンチオール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、トリアルキルアミンおよびトリフェニルホスフィンからなる群から選択される請求項２１記載の核酸の単離方法。
【請求項２３】
前記固相の開裂可能な結合部分が、開始試薬で開裂する開始可能なジオキセタン環を含む請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項２４】
前記開始可能なジオキセタン環が、次式、
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で表されここで、基Aは、アルキル基、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基、ポリシクロアルケニル基、アリール基、アリーロキシ基、およびアルコキシ基から選択される安定的な置換基であり、Ａｒはハロゲン、アルコキシ基およびアミン基から選択される付加的な置換基を含むアリール環基であり、Ｙは、ジオキセタン環の断片化を起こすために化学試薬および酵素から選択される開始試薬により除去され得る基または原子である請求項２３記載の核酸の単離方法。
【請求項２５】
前記ＯＹ基が、ＯＨ、ＯＳｉＲ33から選択され、Ｒ3が、アルキル基、アリール基、カルボキシル基、リン酸塩、硫酸塩およびグリコシド基から選択される請求項２４記載の核酸の単離方法。
【請求項２６】
前記開始可能なジオキセタン環中のＡｒが、置換または未置換のフェニル基またはナフチル基である請求項２４記載の核酸の単離方法。
【請求項２７】
前記開始試薬が、塩基、フルオライド  イオン、エステラーゼ、ホスファターゼ、スルファターゼおよびグルコシダーゼからなる群から選択される請求項２３記載の核酸の単離方法。
【請求項２８】
前記固相の開裂可能な結合部分が、熱的に不安定なジオキセタン環への変換により開裂するエレクトロンリッチなアルケンを含む請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項２９】
前記アルケンが、一重項酸素との反応により熱的に不安定なジオキセタン環に変換する請求項２８記載の核酸の単離方法。
【請求項３０】
前記固相の開裂可能な結合部分が、酵素で開裂する請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項３１】
前記固相の開裂可能な結合部分が、ペルオキシダーゼと過酸化物との反応により開裂するアクリダンケテンジチオアセタールを含む請求項３０記載の核酸の単離方法。
【請求項３２】
前記固相の開裂可能な結合部分が、加水分解酵素あるいはエステラーゼ酵素で開裂するエステルを含む請求項３０記載の核酸の単離方法。
【請求項３３】
前記固相の開裂可能な結合部分が、プロテアーゼ酵素により開裂するアミドを含む請求項３０記載の核酸の単離方法。
【請求項３４】
前記固相の開裂可能な結合部分が、ペプチダーゼ酵素により開裂するペプチドを含む請求項３０記載の核酸の単離方法。
【請求項３５】
前記固相の開裂可能な結合部分が、グルコシダーゼ酵素により開裂するグルコシドを含む請求項３０記載の核酸の単離方法。
【請求項３６】
前記固相の開裂可能な結合部分が、次式で示されるチオエステルを含み、式中ＱがＰまたはＮであり、Ｒが１−２０の炭素を有するアルキル基である請求項１３記載の核酸の単離方法。
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【請求項３７】
前記固相の開裂可能な結合部分が、次式で示されるチオエステルを含む請求項３６記載の核酸の単離方法。
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【請求項３８】
前記固相の開裂可能な結合部分が、トリアルキルホスホニウム基またはトリアリールホスホニウム基の核酸結合部分に結合した少なくとも１つの炭素原子のアルキレン基であり、ケトンまたはアルデヒドでヴィティヒ反応により開裂され得る請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項３９】
前記ヴィティヒ反応が、非プロトン性の有機溶媒中でアルコキシド塩または水素化物塩の塩基で脱プロトン化によるイリドを形成し、該イリドが、脂肪族アルデヒド、芳香族アルデヒド、脂肪族ケトンおよび芳香族ケトンから選択されるカルボニル化合物と反応する請求項３８記載の核酸の単離方法。
【請求項４０】
前記溶媒が、ＴＨＦ、ジエチルエーテル、ｐ−ジオキサン、ＤＭＦおよびＤＭＳＯから選択され、イリドと反応するための前記カルボニル化合物がアセトンである請求項３９記載の核酸の単離方法。
【請求項４１】
前記固相の開裂可能な結合部分が、次式を有する請求項３８記載の核酸の単離方法。
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【請求項４２】
前記開裂反応と溶離工程を、各工程を実行するために、分離した別個の溶液を使用して一連の工程として行う請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項４３】
前記開裂反応と溶離工程を、同じ工程で同時に実行する請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項４４】
工程（ｂ）の後に、前記固相からサンプルの他の成分を除去するために、洗浄溶液で前記固相に結合した捕捉核酸を有する当該固相を洗浄する工程をさらに含む請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項４５】
前記固相からサンプルを分離する工程を、磁力分離により実行する請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項４６】
前記固相からサンプルを分離する工程を、ろ過、重力沈殿、傾瀉、遠心分離、真空吸引、および空気過圧から選択される処理により実行する請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項４７】
前記固相の核酸結合部分が、式ＳＲ2+Ｘ-（式中ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘがアニオンである）で表される３級スルホニウム基である請求項２記載の核酸の単離方法。
【請求項４８】
工程（ｅ）における前記固相から核酸を溶液中に解離し、解離された核酸を含む溶液を、下流のプロセスにおいて直接に用いる工程（ｆ）を含む請求項１記載の核酸の単離方法。
【請求項４９】
工程（ｅ）における前記固相から核酸を溶液中に解離し、解離された核酸を含む溶液を、下流のプロセスにおいて直接に用いる工程（ｆ）を含む請求項２記載の核酸の単離方法。
【請求項５０】
解離した核酸を含む溶液を、ポリメラーゼまたはリガーゼの介在した反応を使用して前記核酸の量またはそのセグメントを増幅する核酸増幅反応に直接使用する請求項４９記載の核酸の単離方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸の結合、単離、および精製方法における、新規な固相材料の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
分子診断（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ）および分子生物学における最新の技術（逆転写、クローニング、制限分析、遺伝子増幅、および配列解析を含む）においては、これらの技術で使用される核酸が実質的に汚染物質や干渉物質を含まないことが要求される。望ましくない汚染物質には、酵素などの高分子物質や、他のタイプのタンパク質、多糖類、ポリヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチド、脂質、低分子量酵素阻害物質、または非標的核酸、酵素補助因子、塩、カオトロープ（ｃｈａｏｔｒｏｐｅｓ）、染料、金属塩、緩衝塩および有機溶剤が含まれる。
【０００３】
分子生物学的な適用のために実質的に汚染物質を含まない標的核酸を得ることは、標的核酸が見出されるのが基質サンプルの複合物中であるために、困難である。かかるサンプルには、例えば、組織からの細胞、体液からの細胞、血液、培養組織中の細菌細胞、アガロースゲル、ポリアクリルアミドゲル、または標的核酸の増幅から得られる溶液が含まれる。基質サンプルはしばしば顕著な量の汚染物質を含み、関心のある核酸を分子生物学的または診断技術において使用する前に、これらをその核酸から除去しなければならない。
【０００４】
上述のような細胞や組織より生成される混合物から標的核酸を単離するための慣用の技術には、フェノール、クロロホルム、および臭化エチジウム等の有害な化学薬品の使用が必要となる。フェノール／クロロホルム抽出は、標的核酸と様々な汚染物質との混合物から汚染物質を抽出するためのかかる手法において用いられる。あるいはまた、塩化セシウム−臭化エチジウム勾配が、公知技術の方法として使用される。例えば、「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ）」，サンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら著（１９８９），コールドスプリングハーバープレス（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ），１．４２〜１．５０頁を参照。後者の方法は、一般に、エタノールまたは２−プロパノールを水相に添加して核酸を沈殿させることにより、抽出された水相中に残留する核酸材料を沈殿することによる。沈殿物は、通常は遠心分離により溶液から除去され、沈殿物の結果として得られるペレットは、さらなる使用のために水または緩衝液中に再懸濁される前に、乾燥される。
【０００５】
様々なタイプの固相を使用する単純かつ迅速な方法が、細胞溶解物または他の核酸と汚染物質との混合物から核酸を分離するために、開発されている。かかる固相には、クロマトグラフィ樹脂、ポリマーおよびシリカ、または、繊維、フィルターおよび被膜された容器などの様々な外形および形態でのガラスベース材料が含まれる。小さな微粒子の形態である場合には、磁性コアが時に分離において助けを与える。
【０００６】
核酸の単離に使用される一つのタイプの固相には、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）用に設計された多孔質シリカゲル粒子が含まれる。多孔質シリカゲル粒子の表面は、一定の塩およびｐＨ条件下でプラスミドＤＮＡと交換されるアニオン交換体で官能化されている。例えば、米国特許４，６９９，７１７号および５，０５７，４２６号明細書を参照。これらの固相材料に結合したプラスミドＤＮＡは、高濃度の塩を含む水溶液中で溶離する。そこで溶離された核酸溶液は、下流のプロセスで使用される前に、塩を除去するためにさらに処理することが必要である。
【０００７】
他のシリカベース固相材料には、制御ポアガラス（ＣＰＧ）、シリカ粒子で取り囲まれたフィルター、シリカゲル粒子、珪藻土、ガラス繊維または上記の混合物が含まれる。各シリカベース固相材料は、核酸を含むサンプル中で、ヨウ化ナトリウム（ＮａＩ）、グアニジニウム（ｑｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ）チオシアネートまたは塩化グアニジニウムなどのカオトロピック剤の存在下で、可逆的に核酸と結合する。かかる固相は、核酸材料と結合して保持し、固相は、残留するサンプル成分から、基質とそれに結合した核酸材料とに分離するために固相の遠心分離または真空ろ過が行なわれた。次に核酸材料を、水または低塩溶離緩衝液で溶離することにより固相から遊離する。核酸単離用の商業的に入手可能なシリカベース固相材料には、例えば、Ｗｉｚａｒｄ（登録商標）ＤＮＡ精製システム製品（プロメガ（株），マディソン，ＷＩ）、ｔｈｅＱｉａＰｒｅｐ（登録商標）ＤＮＡ単離システム（（株）キアゲン，サンタクラリタ，ＣＡ）、ハイピュア（ロシュ社（Ｒｏｃｈｅ））、およびＧＦＸマイクロプラスミドキット（Ｍｉｃｒｏ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｋｉｔ）（アマルシャム社（Ａｍｅｒｓｈａｍ））が含まれる。
【０００８】
粒子の形状での重合樹脂も、核酸の単離および精製のために広範に使用されている。４級アンモニウム先端基を有するカルボキシレート変性重合粒子（バーンズ，エージェンコート（Ｂａｎｇｓ，Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ））ポリマーは、欧州特許出願公開番号ＥＰ１２４３６４９Ａ１号中に開示されている。このポリマーは共有結合された線状非架橋ポリマーを有する不活性担体粒子である。このタイプの重合固相は一般に、触手（テンタクル）樹脂と呼ばれる。この線状ポリマーは、４級テトラアルキルアンモニウム基を包含する。アルキル基は、メチル基またはエチル基として明示されている（４欄、５２〜５５行）。より長いアルキル基は、望ましくないと考えられる。
【０００９】
アニオン交換則に基づいて核酸と結合する他の固相材料が、現在使用されている。これらには、ＤＥＡＥ先端基（（株）キアゲン）を有するシリカベース材料および欧州特許公報ＥＰ０４９６８２２Ｂ１号に記載されたクロマトグラフィ支持体に基づくシリカ−ヌクレオボンドＡＸ（ＢＤ，ロシュ−ゲノピュア（Ｒｏｃｈｅ−Ｇｅｎｏｐｕｒｅ））が含まれる。重合トリアルキルアンモニウム基をもつポリマー樹脂が、欧州特許公報ＥＰ１２４３６４９号中に開示されている（ゲネスキャン（ＧｅｎｅＳｃａｎ））。ＤＮＡ単離用のカルボキシ変性ポリマーは、非常に多くの供給先から入手可能である。核酸は、高塩条件下で引き寄せられて、低イオン強度条件下で解離される。
【００１０】
磁性反応性粒子もまた、核酸を単離する際に固相として使用するために開発されている。核酸単離用に設計されたいくつかの異なるタイプの磁性反応粒子は公知技術であり、かつ、いくつかの出所から商業的に入手可能である。可逆的に核酸材料と結合する磁性粒子には、まさにマグネシル（Ｍａｇｎｅｓｉｌ）（登録商標）粒子（プロメガ（株））が含まれる。磁性粒子は、ｍＲＮＡのポリＡ末端とのハイブリッド形成のために結びついたオリゴｄＴ末端を有する共有結合されたアビジンまたはストレプトアビジンを介して、可逆的にｍＲＮＡと結合することも知られている。
【００１１】
種々のタイプの磁性反応シリカベース粒子を、核酸結合単離法において固相として使用することは公知である。かかる粒子の一つのタイプは、磁性反応ガラスビーズであり、好ましくは、ＣＰＧ社（リンカーンパーク，ＮＪ）から磁性多孔ガラス（ＭＰＧ）粒子として入手可能な制御ポア径を有し、または、米国特許４，３９５，２７１号，４，２３３，１６９号，４，２９７，３３７号明細書に記載された多孔質磁性ガラス粒子である。核酸の結合および単離のために有用な他のタイプの磁性粒子は、重合二酸化シリコン化合物の基質中に磁性材料を混合することにより製造される。（ドイツ特許ＤＥ４３０７２６２Ａ１号）
【００１２】
誘導可能な磁性特性を有する粒子またはビーズは、磁石の存在下で一時的に磁性特性を発現しうる金属酸化物を形成するための遷移金属、例えば、鉄、ニッケル、銅、コバルトおよびマンガンの小粒子を含む。これらの粒子は、常磁性体または超常磁性体と呼ばれる。常磁性体または超常磁性体ビーズを形成するために、金属酸化物は、水中で比較的安定なポリマーで被覆される。米国特許４，５５４，０８８号明細書には、重合シランの層により被包された金属酸化物コアを含む常磁性体粒子が開示されている。米国特許５，３５６，７１３号明細書には、疎水性ビニル芳香族モノマーの殻で被包された磁化しうる粒子のコアからなる、磁化しうるミクロスフェアが開示されている。米国特許５，３９５，６８８号明細書には、混合された常磁性体金属酸化物−ポリマー層で被覆されたポリマーコアが開示されている。他の方法は、ポリマーコアを、例えば米国特許４，７７４，２６５号明細書中におけるように、金属酸化物を吸着するために利用する。常磁性体金属酸化物粒子層で被覆された重合コア粒子を含む磁性粒子は、米国特許５，０９１，２０６号明細書中に開示されている。この粒子は、その後さらに、金属酸化物層を遮蔽するとともに反応性被膜を与えるために、付加的な重合層で被覆される。米国特許５，８６６，０９９号明細書には、金属塩を配位するためにたんぱく質の存在下で２つの金属塩を共沈し、混合した金属酸化物粒子を捕捉による磁性粒子の調製が開示されている。非常に多くの典型的な金属塩対が記載されている。米国特許５、４１１、７３０号明細書には、沈殿された混合金属酸化物粒子をデキストラン、オリゴ糖類中で捕捉する、類似の工程が記載されている。
【００１３】
ＤＮＡおよびＲＮＡの不可逆的な捕捉のためのアルミナ（酸化アルミニウム）粒子が、米国特許６，２９１，１６６号明細書に開示されている。結合核酸は、ＰＣＲなどの固相増幅法での使用に、利用できる。
【発明の開示】
【００１４】
本発明の他の目的は、核酸と結合するための開裂可能な結合部分を含む固相材料を提供することにある。さらなる目的は、共有結合された核酸結合基を含む、かかる開裂可能な固相材料を提供することにある。本発明の他の目的は、固相材料での核酸の結合と解離のための方法を提供することにある。本発明の他の目的は、本発明の固相材料を用いた核酸の単離および精製の方法を提供することにある。本発明のさらなる目的は、核酸と結合し、最も一般的に使用される溶離条件下で核酸の解離を阻害する固相材料を提供することにある。さらなる目的は、共有結合された３級または４級オニウム基を含む、かかる固相材料を提供することにある。本発明の他の目的は、核酸と結合し、本発明の組成物にて核酸を解離する固相材料を提供することにある。本発明の他の目的は、固相材料から結合核酸を解離するためのかかる試薬組成物を提供することにある。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１Ａは、開裂可能な核酸結合粒子の概略図を示す。図１Ｂは、核酸分子と結合している開裂可能な固体支持体を示す。
【００１６】
【図２】図２は、開裂可能な核酸結合粒子を用いた核酸の結合および解離を示す。
【００１７】
【図３】図３は、１０ｍｇの開裂可能なポリマービーズ上に吸着され、増幅前に洗浄されたビーズから溶離されたＰＣＲ増幅ｐＵＣ１８プラスミドＤＮＡサンプルのゲル像である。
【００１８】
【図４】図４は、実施例１３および１９の開裂可能なビーズを用いた細胞溶解物からの単離により得られたｐＵＣ１８  ＤＮＡのゲル像である。
【００１９】
【図５】図５は、本発明の開裂可能な固体支持体を用いてヒト血液サンプルから単離されたＤＮＡのゲル像である。
【００２０】
【図６】図６は、トリブチルホスホニウム基を有する本発明の開裂可能な固体支持体と結合し、ヴィティヒ（Ｗｉｔｔｉｇ）反応により解離されたＤＮＡのドットブロットの像である。
【００２１】
好適実施形態
本出願人は、核酸を含む溶液およびサンプルからの核酸の捕捉および結合のために有用な新規な固相材料を開発した。この固相材料は、粒子、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、および、テストチューブやマイクロウェル（ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ）等の他の支持体の形状であってよい。この新規な材料の明確な特徴は、開裂可能な結合部分の存在である。この材料はさらには、種々の長さの核酸分子を捕捉して、強固に結合することが可能な核酸結合基を含む。固相材料と、開裂可能な結合部分を壊す薬剤との反応は、固相からの結合核酸の解離を与える。結合核酸分子の制御可能に解離する新規な方法は、固相材料から結合核酸分子を解離または溶離させるための試薬組成物として、本発明のさらなる部分を形成する。
【００２２】
定義
アルキル基  −  １〜２０個の炭素原子を含む分岐、直鎖または環状炭化水素基であり、水素原子以外の1またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。ここで使用されるような低級アルキル基は、炭素原子を８個まで含むアルキル基に当てはまる。
【００２３】
アラルキル基  −  アリール基で置換されたアルキル基である。
【００２４】
アリール基  −  １〜５個の炭素環式芳香環を含む芳香環含有基であり、水素原子以外の１またはそれ以上の置換基で置換されていてもよい。
【００２５】
磁性粒子  −  外部磁場に対し反応する粒子、微粒子またはビーズである。この粒子はそれ自体が磁性体、常磁性体または超常磁性体であってよい。強磁性材料を用いる場合のように、外部磁石かまたは適用された磁場に引き付けられてもよい。粒子は、磁性的に反応し、１またはそれ以上の非磁性的に反応する層により被包された固体コア部分を有してもよい。あるいはまた、磁性的に反応する部分は周囲の層であってもよく、または、非磁性的に反応するコア内に配置された粒子であってもよい。
【００２６】
オリゴマー、オリゴヌクレオチド  −  ここに使用されるものとして、ホスホジエステルヌクレオチド間結合および５’−末端モノホスフェート基を含む化合物が当てはまる。ヌクレオチドは、通常生ずるリボヌクレオチドＡ，Ｃ，ＧおよびＵまたはデオキシリボヌクレオチドｄＡ，ｄＣ，ｄＧおよびｄＴであってよい。
【００２７】
ポリヌクレオチド  −  ポリヌクレオチドはＤＮＡ，ＲＮＡまたはＰＮＡ等の合成ＤＮＡ類似体であってよい。これら３つのタイプの鎖のいくつかの二重らせん構造ハイブリッドもまた、この用語の範囲内である。
【００２８】
プライマー  −  連結反応の部位に直接用いられるオリゴヌクレオチドに当てはまり、連結反応プロセスを開始するために必要とされる。プライマーは、テンプレートに対し安定的にハイブリッド形成するために十分な長さをもち、テンプレート内で独自の配列を示す。プライマーは通常、およそ１５〜３０塩基の長さとなる。検出可能な標識または固相により捕捉可能な標識を含む標識プライマーは、ここで使用されるような用語の範囲内である。
【００２９】
テンプレート、試験ポリヌクレオチド、および標的は、相互交換可能に使用され、その長さが複製された核酸に当てはまる。
【００３０】
サンプル  −  核酸を含むかまたは含んでいる可能性のある流体である。本発明の方法において使用可能である代表的なサンプルは、血液、血漿、漿液、尿、精液、唾液、細胞溶解物、組織抽出物等および同様のもの等の体液を含む。他のタイプのサンプルは、溶剤、海水、工業用水サンプル、食品サンプル、土壌または水のような環境サンプル、植物材料、および原核生物、真核生物、細菌、プラスミド、ウイルス由来の細胞等を含む。
【００３１】
固相材料  −  核酸分子を引き寄せ得る表面を有する材料である。この材料は、微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態を有してよい。
【００３２】
置換  −  １つの基内における少なくとも１個の水素原子の、非水素基による置換に当てはまる。置換基に関しては、明確に他のことを示している場合を除き、置換基が複数となる点が存在し得ることを意味することに留意すべきである。
【００３３】
本出願人は、核酸と結合し、結合核酸を解離するために開裂し得る開裂可能な結合部分を有する固相材料を開発した。この材料は、効率的な結合を可能にするために十分な表面積を有する微粒子、繊維、ビーズ、メンブラン、およびテストチューブやマイクロウェル等の他の支持体の形態であってよい。微粒子の形態での本発明の固相材料は、さらに、磁性コア部分を含み得る。一般に、粒子および磁性反応微粒子は、本発明において好適である。
【００３４】
本発明の固相核酸結合材料は、その大きさ、形態、多孔度、および物理的特性を規定する基質（ｍａｔｒｉｘ）と、共有結合された核酸結合基とを含む。３つのもっとも一般的な種類の基質は、シリカまたはガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類である。固相は、さらに、磁性反応部分を含んでもよい。
【００３５】
ポリマーは、ホモポリマーまたは１若しくはそれ以上のエチレン不飽和モノマー単位のコポリマーであり、架橋されていても架橋されていなくてもよい。好ましいポリマーは、ポリスチレンを含むポリオレフィンおよびポリアクリル型ポリマーである。後者には、種々の置換されたアクリル酸、アミドおよびエステルのポリマーが含まれ、ここで、アクリルモノマーは、２−または３−炭素において、アルキル置換基を有してもよく有しなくてもよい。
【００３６】
本発明の固相結合材料中に含まれる核酸結合基は、種々の長さおよび塩基組成または配列をもつ核酸、ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを引き寄せて、これらと結合する。核酸結合基には、カルボキシル基、アミン基および３級または４級オニウム基が含まれる。アミン基は、ＮＨ2、アルキルアミン、およびジアルキルアミン基であってよい。３級または４級オニウム基は、４級トリアルキルアンモニウム基（−ＱＲ3＋）、トリアルキルホスホニウム若しくはトリアリールホスホニウムまたは混合アルキルアリールホスホニウム基を含むホスホニウム基（−ＱＲ3＋）、および３級スルホニウム基（−ＱＲ2＋）を含む。固相は、ここに記載されているような核酸結合基の一種以上を含んでもよい。Ｒ基が少なくとも４個の炭素原子をもつアルキル基である３級または４級オニウム基−ＱＲ2＋または−ＱＲ3＋を含む固相材料は、核酸結合において特に有効であるが、１個程度の少ない炭素原子を有するアルキル基もまた、アリール基と同様に有用である。かかる固相材料は、結合核酸を強固に保持し、かつ、従来技術において公知の溶離のために使用される大抵の条件下で、核酸の除去または溶離を阻害する。低および高イオン強度の両方の公知の溶離条件は、核酸結合の除去において効果を有しない。ＤＥＡＥおよびＰＥＩ基を含む慣用のアニオン交換樹脂とは異なり、３級または４級オニウム固相材料は、反応媒体のｐＨに関わらず、明確に荷電されたままである。
【００３７】
本発明の一つの側面においては、シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固体支持体部分を含む固相が与えられ、それには、表面に、核酸を引き寄せて結合するための核酸結合部分を有しており、その核酸結合部分（ＮＡＢ）は、開裂可能な結合部分により、固体支持体部分に対し結合されている。
【００３８】
2008506385.tif 000003
【００３９】
一つの実施形態においては、ＮＡＢは、一般式ＱＲ2＋Ｘ−（ここで、ＱはＳ原子である）で示される３級オニウム基または４級オニウム基ＱＲ3＋Ｘ−（ここで、ＱはＮまたはＰ原子である）であり、Ｒはアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、また、Ｘはアニオンである。Ｑが窒素原子である場合、Ｒ基はそれぞれ４〜２０個の炭素原子を含む。Ｑが硫黄またはリン原子である場合、Ｒ基は１〜２０個の炭素原子を含みうる。
【００４０】
2008506385.tif 000004
【００４１】
本発明による好ましい固相は、市場で入手可能なポリスチレン型ポリマー、例えば、メリーフィールド（Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄ）樹脂（架橋）と呼ばれる種類のものから得られる。これらのポリマーにおいて、スチレン単位の割合は、共有結合の手段として、反応基、通常はクロロメチルまたはヒドロキシメチル基を含む。硫化物（Ｒ2Ｓ）または３級アミンまたはホスフィンとの反応によるいくらかの塩素の置換により、本発明の固相材料が生成される。この定義に一致して調製されたポリマーは、反応性クロロメチル基の全てが３級または４級オニウム基に転化される場合には、以下の式（１）により表すことができる。本発明の重合性固相がしばしばオニウム基およびクロロメチル基の混合物を含むようにするためには、かかる基の全てが転化されることは必要ではない。
【００４２】
2008506385.tif 000005
【００４３】
上記式において、ｍ，ｎ，およびｏはポリマー内のそれぞれのモノマー単位のモル％を表し、ｍは０．１％〜１００％、ｎは０％〜９９％、ｏは０％〜１０％の値をとりうる。より好ましくは、ｍは１％〜２０％であり、ｎは８０％〜９９％であり、また、ｏは０％〜１０％である。
【００４４】
他の実施形態においては、本発明による固相は、共有結合のための反応性クロロアセチルまたはクロロプロピオニル基を含むスチレン単位の割合を有する、市場で入手可能な架橋されたメリーフィールド樹脂から得られる。これらの出発ポリマーより調製される本発明の３級または４級オニウムポリマーは、下記式で表される。
【００４５】
2008506385.tif 000006
【００４６】
ここで、Ｑ，Ｒ，Ｘ，ｍ，ｎ，およびｏは、上記で定義されたようなものである。
【００４７】
非常に多くの他の公知技術の重合樹脂を、本発明の固相材料の調製において、固体基質として用いることができる。重合樹脂は、アドバンスド  ケムテック社（Ａｄｖａｎｃｅｄ  ＣｈｅｍＴｅｃｈ）（ルイビル，ＫＹ）およびノバビオケム社（ＮｏｖａＢｉｏｃｈｅｍ）などの商業的な供給者より入手可能である。この樹脂は、一般に、反応性官能基を有する架橋された重合粒子をベースとする。アドバンスド  ケムテック社２００２カタログの１０５〜１４０ページに記載されているような、固体支持されたペプチド合成で使用される多くの好適な重合樹脂が、出発材料として適している。反応性のＮＨ2，ＮＨ−ＮＨ2，ＯＨ，ＳＨ，ＣＨＯ，ＣＯＯＨ，ＣＯ2ＣＨ＝ＣＨ2，ＮＣＯ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＳＯ2ＣＨ＝ＣＨ2，ＳＯ2Ｃｌ，ＳＯ2ＮＨ2，アクリルイミダゾール、オキシム（Ｃ＝Ｎ−ＯＨ）、サクシンイミドエステル基を有するポリマーは、本発明の重合固相の調製における使用のために、それぞれ市場で入手可能である。以下に示すように、非常に多くの例において、前駆体ポリマー樹脂を３級または４級オニウム基に対し共有結合させる手段を与えることが、ときに必要、あるいは望まれる。これは、一般に、アルキレン、アリーレンまたはアラルキレン基から選択される１〜２０個の原子からなる鎖または環状基を含む。鎖または環はまた、Ｏ，Ｓ，またはＮ原子、および、ケトン、エステル、チオエステル、アミド、ウレタン、カーボネート、キサントゲン酸塩、ウレア、イミン、オキシム、スルホキシドおよびチオケトンの形態でのカルボニル基を含んでもよい。
【００４８】
固体基質としてシリカ、ガラスまたは多糖類支持体を有する本発明の固相材料は、２価の基との共有結合により官能化され、この２価の基は、核酸結合基および開裂可能な結合部分を固体基質に対し結合させる。２価の基は、しばしば有機基であり、低分子量基かまたは重合性基かのいずれかである。２価の基は、オルガノシランであってもよい。微粒子表面を被覆するために有用な好適なシランには、ｐ−アミノプロピルトリメトキシシラン、N−２−アミノ−エチル−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、（H2NCH2NHCH2CH2NHCH2Si（OCH3）3、トリエトキシシランおよびトリメトキシシランが含まれる。これら微粒子の調製方法は、米国特許４，６２８，０３７号，４，５５４，０８８号，４，６７２，０４０号，４，６９５，３９３号および４，６９８，３０２号明細書中に記載されており、参照することによりここにこの教示を取り入れる。共有結合された有機結合基を有するシリカ粒子材料は、公知であり市場で入手可能である。非常に多くのかかる材料が記載された一つの起源として、シリサイクル社（Ｓｉｌｉｃｙｃｌｅ）（ケベックシティ，カナダ）がある。アルキレン基または他の結合を介して種々の反応性官能基に結合されたシリカ粒子は、固相合成用のシリカベース材料で占められた製品カタログ中に記載されている。示された代表的な官能基には、アミン、カルボジイミド、カーボネート、ジクロロトリアジン、イソシアネート、マレイミド、無水物、カルボン酸、カルボキシエステル、チオール、チオウレア、チオシアネート、スルホニルクロライド、スルホン酸、およびスルホニルヒドラジド基が含まれる。これらの材料のいくつかは、上述された３級または４級オニウム基の結合のための固体基質を与えるために利用することができる。
【００４９】
ここにおいて使用されるように、磁性微粒子は、磁界により引き付けられ操作されうる粒子である。本発明の方法において使用される磁性微粒子は、磁性金属酸化物コアを含み、これは一般に、核酸結合層が選択されたカップリング作用を通じて共有結合されるように、吸着的または共有的な結合層により被包されて、それにより３級スルホニウム、４級アンモニウム、または４級ホスホニウム官能基で微粒子の表面を被覆する。磁性金属酸化物コアは、好ましくは酸化鉄であり、ここで鉄はＦｅ2+とＦｅ3+との混合物である。酸化鉄コアを含む磁性微粒子は、上述したように、シラン被覆なしで本発明の方法において使用することもできる。磁性粒子はまた、米国特許４，６５４，２６７号明細書に開示されているように、磁性反応性金属粒子を捕捉するために、多孔ポリマーの存在下で金属粒子を沈殿させて、形成されうる。これにより調製されうる磁性金属酸化物には、Ｆｅ3Ｏ4，ＭｎＦｅ2Ｏ4，ＮｉＦｅ2Ｏ4，およびＣｏＦｅ2Ｏ4が含まれる。他の磁性粒子はまた、米国特許５，４１１，７３０号明細書に開示されているように、磁性反応性金属粒子を捕捉するために、多糖類デキストランの存在下で金属酸化物粒子を沈殿させて形成されうる。さらに、他の種類の磁性粒子は、先に言及された米国特許５，０９１，２０６号明細書中に開示されている。この粒子は、金属酸化物層を遮蔽するとともに反応性被膜を与えるために、常磁性金属酸化物粒子層および付加的な重合層で被覆された重合コア粒子を含む。クロロメチル化メリーフィールド樹脂を含むマグネタイトの調製は、出版物（テトラへドロン（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，４０（１９９９）,８１３７−８１４０））中に記載されている。
【００５０】
市場で入手可能な磁性シリカまたは磁性重合粒子は、本発明における開裂可能な磁性粒子の調製の出発材料として使用することができる。表面カルボキシル基を有する好適なタイプの重合粒子は、商品名セラマグ（ＳｅｒａＭａｇ，登録商標）（セラダイン社，Ｓｅｒａｄｙｎ）およびビオマグ（ＢｉｏＭａｇ，登録商標）（ポリサイエンスアンドバーンズラボラトリーズ）により公知である。好適なタイプのシリカ磁性粒子は、商品名マグネシル（ＭａｇｎｅＳｉｌ，登録商標）（プロメガ（株））により公知である。シリカ磁性粒子はまた、ケミセル（Ｃｈｅｍｉｃｅｌｌ）ＧｍｂＨ社（ベルリン）からも入手可能である。
【００５１】
他の開裂可能な固体支持体
他の実施形態においては、シリカまたはガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される固相基質を含み、オニウム基を固相に結合させるための開裂可能な結合基を有する固相材料が与えられる。オニウム基は、式ＱＲ2+Ｘ-（ここでＱはＳ原子である）またはＱＲ3+Ｘ-（ここでＱはＮまたはＰ原子である）で表され、Ｒは１〜２０個の炭素原子を有するアルキル基、アラルキルおよびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである。開裂可能な結合部分は、２つの機能、１）基質と３級または４級オニウム基とを物理的に接合させること、および２）固体支持体基質と4級オニウム基との間の接合を破壊して、核酸が引き寄せられてそれにより固相基質から結合核酸を遊離させるところの手段を与えること、を与える。この結合は、２価、３価または多価の基を形成するいかなる原子群であってもよく、それが特有の化学反応、酵素剤または光化学反応により開裂し得る開裂可能な部分を含むことを与える。核酸が下流のプロセスに有用であるために、開裂剤または反応は、開裂可能な結合の破壊プロセスの間、核酸を十分に保護しなければならない。
【００５２】
ポリマーは、ホモポリマーまたは、１またはそれ以上のエチレン的に不飽和なモノマー単位の共重合体であり、架橋されていても非架橋であってもよい。好ましいポリマーは、ポリスチレンを含むポリオレフィン、およびポリアクリル型ポリマーである。後者には、種々の置換されたアクリル酸、アミドおよびエステルのポリマーが含まれ、ここでアクリルモノマーは、２−または３−炭素においてアルキル置換基を有してもよく、有しなくてもよい。
【００５３】
非常に多くの他の公知技術の重合樹脂が、本発明の固相材料の調製において固体基質として使用可能である。重合樹脂は、アドバンスド  ケムテック社（ルイビル，ＫＹ）などの商業的な供給者より入手可能である。この樹脂は、一般に、反応性官能基を有する架橋された重合粒子に基づく。アドバンスド  ケムテック社２００２カタログ１０５〜１４０ページ中に記載されているような、ペプチド合成を支持する固体に使用される多くの好適な重合樹脂が、適切な出発材料である。反応性ＮＨ2，ＮＨ−ＮＨ2，ＯＨ，ＳＨ，ＣＨＯ，ＣＯＯＨ，ＣＯ2ＣＨ＝ＣＨ2，ＮＣＯ，Ｃｌ，Ｂｒ，ＳＯ2ＣＨ＝ＣＨ2，ＳＯ2Ｃｌ，ＳＯ2ＮＨ2，アクリルイミダゾール、オキシム（Ｃ＝Ｎ−ＯＨ）、サクシンイミドエステル基を有するポリマーは、本発明の重合固相の調製で使用するために、それぞれ市場で入手可能である。
【００５４】
以下に示すように、非常に多くの例において、前駆体ポリマー樹脂を開裂可能な結合部分と共有結合させるか、または、開裂可能な結合部分を４級オニウム基と結合させるための手段を与えることが、ときに必要とされるかまたは望ましい。これらの場合において、結合基はまた、１またはそれ以上の接合部分を含んでいてもよい。後者は、一般に、アルキレン、アリーレンまたはアラルキレン基から選択される、１〜２０個の原子を有する鎖または環基を含む。鎖または環はまた、Ｏ，Ｓ，またはＮ原子、および、ケトン、エステル、チオエステル、アミド、ウレタン、カーボネート、キサントゲン酸塩、ウレア、イミン、オキシム、スルホキシドおよびチオケトンの形態でのカルボニル基を含んでもよい。
【００５５】
開裂可能な結合部分は、好ましくは、直鎖、分岐鎖および環から選択される有機基であり、１〜１００個の原子、より好ましくは１〜約５０個の原子を含む。この原子は、好ましくは、Ｃ，Ｈ，Ｂ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｓｉ，Ｐ、ハロゲンおよびアルカリ金属から選択される。典型的な結合基は、加水分解的に開裂可能な基であり、これは加水分解により開裂する。カルボキシエステルおよび無水物、チオエステル、カーボネートエステル、チオカーボネートエステル、ウレタン、イミド、スルホンアミド、およびスルホンイミドは、スルホネートエステルとして典型的である。他の典型的な結合基の種類は、還元開裂を受けるそれらの基である。典型的な基の一つは、エタンチオール、メルカプトエタノール、およびＤＴＴなどのチオールにより開裂するジスルフィド結合（Ｓ−Ｓ）を含む有機基である。他の典型的な基は、過酸化結合（Ｏ−Ｏ）を含む有機基である。過酸化結合は、チオール、アミンおよびホスフィンにより開裂可能である。
【００５６】
2008506385.tif 000007
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【００５７】
多くの特有の構造図は、簡単のために４級オニウム基のみを示しているが、類似の３級スルホニウム基もまた同様に表されることを意味するものと理解すべきである。
【００５８】
典型的な光化学的に開裂可能な結合基には、窒素置換芳香族エステルおよび、次式のエステルを含む。
【００５９】
2008506385.tif 000013
【００６０】
ここで、ＲｄおよびＨは、アルキル基またはフェニル基であり、さらに特には、下記のものである。
【００６１】
2008506385.tif 000014
【００６２】
オルト−ニトロベンジルエステルは、よく知られた反応として紫外光により、開裂する。
【００６３】
2008506385.tif 000015
【００６４】
典型的な酵素的に開裂する結合基には、エステラーゼおよび加水分解酵素により開裂可能なエステル、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）およびペプチダーゼにより開裂可能なアミドおよびペプチド、グリコシダーゼにより開裂可能なグリコシド基が含まれる。
【００６５】
2008506385.tif 000016
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【００６６】
開裂可能な１，２−ジオキセタン部分を含む結合基を有する固相材料もまた、本発明の核酸結合材料の範囲内である。かかる材料は、化学反応または酵素剤により断片化を開始され得るジオキセタン部分を含む。オキシアニオンを生成するための保護基の除去は、ジオキセタン環の分解を促進する。断片化（フラグメンテーション）は、過酸化結合Ｏ−Ｏの開裂により、Ｃ−Ｃ結合と同様に、よく知られたプロセスに従って生ずる。
【００６７】
2008506385.tif 000019
【００６８】
あるいはまた、結合したオニウム基は以下のようにアリール基Ａｒに対してか、または、以下のように開裂可能な基Ｙに対して、結合可能である。
【００６９】
2008506385.tif 000020
2008506385.tif 000021
【００７０】
さらに、あるいはまた、固相および３級または４級オニウム基に対する結合は、以下のように、逆である。
【００７１】
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または、
2008506385.tif 000023
【００７２】
前述の典型的な固相からの３級または４級オニウム基の開裂反応においては、基Ａは安定的な置換基を示す。好適な基は、アルキル基、シクロアルキル基、ポリシクロアルキル基、ポリシクロアルケニル基、アリール基、アリーロキシ基、およびアルコキシ基から選択される。Ａｒは、アリール環基を示す。好ましいアリール環基は、フェニル基およびナフチル基である。アリール環は、付加的な置換基、特にはハロゲン、アルコキシ基およびアミン基を含んでもよい。Ｙ基は、化学試薬または酵素により除去されうる基または原子である。好適なＯＹ基には、ＯＨ、ＯＳｉＲ33、カルボキシル基、リン酸塩、硫酸塩、およびグリコシド基が含まれ、Ｒ3は、アルキル基、アリール基から選択される。非常に多くの開始可能なジオキセタン構造は公知技術であり、多数の特許の題目が存在する。米国特許５，７０７，５５９号明細書中に開示されたスピロアダマンチル安定化ジオキセタンは一つの例であり、米国特許５，５７８，２５３号明細書に開示されているようなアルキルまたはシクロアルキル置換基を含む他のものもまた、好適である。多くの他の種々に置換されたジオキセタンが、特許文献中に記載されており、これらのほとんども、固相および核酸結合基に対し一度結合するのに好適である。付加的な典型的な開裂可能なジオキセタン構造は、米国特許６，０３６，８９２号、６６，２１８，１３５号、６，２２８，６５３号、５，６０３，８６８号、６，１０７，０３６号、４，９５２，７０７号、６，１４０，４９５号、６，３５５，４４１号および６，４６１，８７６号明細書中に見られる。
【００７３】
前述のスピロアダマンチル、アルキルまたはシクロアルキル基由来の結合置換基には、ジオキセタン結合と、固相かまたは３級若しくは４級オニウム基とを結合させることが要求される。結合基をもつジオキセタンは、米国特許５，７７０，７４３号明細書中に開示されており、ジオキセタンと固相およびオニウム基との共有結合のための接合部分として利用可能な結合の化学反応のタイプが図示されている。典型的な開裂可能なジオキセタン結合およびその開裂は、以下のように表される。
【００７４】
2008506385.tif 000024
【００７５】
保護基Ｙの除去は、ジオキセタン環の断片化を開始（トリガー）し、それにより固体基質およびオニウム基を分離する。アルカリ反応条件下では、結果として得られたアリールエステルは、さらなる加水分解を受ける。
【００７６】
不安定な１，２−ジオキセタン部分に転化されうるエレクトロンリッチＣ−Ｃ二重結合を含む結合基を有する固相材料もまた、本発明の核酸結合材料の範囲内である。二重結合における少なくとも１個の置換基（Ａ’）は、Ｏ，ＳまたはＮ原子を用いて二重結合と結合する。エレクトロンリッチ二重結合の一重項酸素との反応により、不安定な１，２−ジオキセタン基を生成する。ジオキセタン環は、周囲温度にて自然に断片化して、上述したように、２つのカルボニル断片を生成する。
【００７７】
2008506385.tif 000025
【００７８】
開裂可能な結合基を有する固相材料の他の基は、ＰＣＴ公報ＷＯ０３／０５３９３４号に開示されているように、開裂可能な部分としてケテンジチオアセタールを有する。ケテンジチオアセタールは、ペルオキシダーゼ酵素および過酸化水素を用いた酵素の酸化により、酸化開裂を受ける。
【００７９】
2008506385.tif 000026
【００８０】
開裂可能な部分は示された構造を有し、アクリダン環において置換基をもつ類似体を含み、ここでＲａおよびＲｂはそれぞれ、基内の原子価を満足させるために要求される必要な数のＨ原子に加えて、１〜約５０個の非水素原子を含む有機基であり、ここでＲａおよびＲｂは互いに結合して環を形成してもよい。基ＲａおよびＲｂは、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜約５０個の非水素原子を含んでもよい。Ｒｃは、基内の原子の原子価を満足させるために要求される必要な数のＨ原子に加えて、Ｃ，Ｎ，Ｏ，Ｓ，Ｐ，Ｓｉおよびハロゲン原子から選択される１〜５０個の非水素原子を含む有機基である。より好ましくは、Ｒｃは、１〜２０個の非水素原子を含む。有機基Ｒｃは、好ましくは、アルキル基、置換されたアルキル基、アリール基、置換されたアリール基、アラルキル基および置換されたアラルキル基からなる群から選択される。Ｒｃのためにより好ましい基には、置換されているかまたは置換されていないＣ1−Ｃ4アルキル基、置換されているかまたは置換されていないフェニル基またはナフチル基、および、置換されているかまたは置換されていないベンジル基が含まれる。置換されている場合、典型的な置換基には、制限なしで、アルコキシ基、アリーロキシ基、ヒドロキシ基、ハロゲン、アミノ基、置換されたアミノ基、カルボキシル基、カルボアルコキシ基、カルボキシアミド基、シアノ基、スルホネート基およびホスフェート基が含まれる。一つの好ましいＲｃ基は、少なくとも１個の水溶性付与基で置換されたアルキル基またはヘテロアルキル基である。
【００８１】
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【００８２】
ケテンジチオアセタール開裂可能な結合基を有する固相材料は、次式のうちいずれかを有していてもよく、また同様に類似構造であって、固体基質およびオニウム基の開裂可能な結合部分に対する結合の順序が上記に示すものと逆転しているものであってもよい。
【００８３】
2008506385.tif 000028
または
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【００８４】
開裂可能な結合基を有する固相材料の他の群は、開裂可能な部分として、トリアルキルまたはトリアリールホスホニウム基に結合した少なくとも１個の炭素原子を有するアルキレン基をもつ。
【００８５】
2008506385.tif 000030
【００８６】
この群の材料は、ケトンまたはアルデヒドを用いたヴィティヒ反応により開裂可能である。有機溶媒中での４級ホスホニウム化合物と強塩基との反応により、リンイリドを生成するリンに結合した炭素原子が脱プロトン化する。ケトンまたはアルデヒド等の化合物を含むカルボニル基とイリドとの反応は、二重結合およびホスフィン酸化物を形成する。ホスホニウム基と固相との間の結合は、そのプロセスにおいて破壊される。好ましくは、固相をリン原子に結合させている炭素原子（α炭素）は、いくつかの結合プロトンがリン原子上のＲ基におけるいくつかのプロトンより酸性であるような方法で、置換される。次いでイリドの形成および鎖の断片化は、適切な位置に導かれる。好ましい実施形態においては、イリドの形成を受ける炭素原子上の他の置換基の一つは、フェニル基または置換されたフェニル基である。４級ホスホニウム基がトリフェニルホスホニウム基等のトリアリールホスホニウム基である場合、αプロトンの高められた酸性に対する必要性は議論の余地のあるところである。
【００８７】
本発明のさらなる側面には、開裂可能な固相結合材料を用いた、核酸の単離および精製方法が含まれる。一つの実施形態においては、以下の工程を含む、サンプルからの核酸の単離方法が与えられる。
ａ）シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固体支持体部分、
核酸を引き寄せて核酸と結合するための核酸結合部分、および、
開裂可能な結合部分、
を含む固相を与える工程と、
ｂ）固相に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相からサンプルを分離する工程と、
ｄ）開裂可能な結合部分を開裂する工程と、さらに、
ｅ）固相から核酸を解離させる工程。
【００８８】
好ましい実施形態においては、核酸結合部分は、基質の表面に結合した式ＱＲ2+Ｘ-またはＱＲ3+Ｘ-で表される４級オニウム基であり、ここに４級オニウム基は３級スルホニウム基、４級アンモニウムおよびホスホニウム基から選択され、ここにＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択され、Ｘはアニオンである。
【００８９】
固相からのサンプル分離の工程は、例えば、ろ過、重力沈殿、傾瀉、磁力分離、遠心分離、真空吸引、および例えば多孔膜またはフィルターマットを通しての強制的な液体化のような空気または他のガスによる過圧により実施される。核酸以外のサンプルの成分は、この工程において除去される。他の成分の除去が完全でない範囲に対して、付加的な洗浄を行って、それらの完全な除去を助けることができる。
【００９０】
開裂可能な結合部分の開裂の工程は、開裂可能な結合部分における共有結合を切るためには十分であるが核酸を破壊するためには十分でないだけの時間の間、開裂剤で核酸結合を有する固相の処理を含んでいる。開裂剤の選択は、開裂可能な結合部分の性質により決定される。開裂可能な結合部分が加水分解的に開裂する基である場合には、開裂剤は水または低級アルコールまたはそれらの混合物である。開裂剤は、好ましくは、水に添加した際にｐＨを上げるような塩基を含む。好ましい塩基は、水酸化物塩およびアルコキシド塩から選択されるか、または無機酸または過酸化水素を含む。典型的な塩基には、ＬｉＯＨ，ＮａＯＨ，ＫＯＨ，ＮＨ4ＯＨ，ＮａＯＣＨ3，ＫＯＣＨ3およびＫＯｔ−Ｂｕが含まれる。開裂可能な結合部分が、ジスルフィドまたはペルオキシド基等の還元的に開裂可能な基である場合には、開裂剤はチオール、アミンおよびホスフィンから選択される還元剤である。典型的な還元剤には、エタンチオール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール（dithiothreitol）、トリアルキルアミンおよびトリフェニルホスフィンが含まれる。光化学的に開裂可能な結合基は、開裂剤としての光、通常は紫外線域または可視光域の光の使用を必要とする。上述したような酵素的に開裂可能な結合基は、エステラーゼ、加水分解酵素、プロテアーゼ（タンパク質分解酵素）、ペプチダーゼ、ペルオキシダーゼおよびグリコシダーゼから選択される酵素により開裂する。
【００９１】
開裂可能な結合基が開始可能なジオキセタンである場合には、開裂剤は、上記に説明したように、開始ＯＹ基においてＯ−Ｙ結合を開裂するために作用する。Ｏ−Ｙ結合の開裂は、ジオキセタン環基を不安定化させ、Ｃ−ＣおよびＯ−Ｏ結合の破断による、ジオキセタン環の２つの部分への断片化を導く。ＯＹ基がＯＨである場合には、開裂剤は有機または無機の塩基である。ＯＹ基がＯＳｉＲ33である場合には、ここにＲ3はアルキル基およびアリール基から選択されるが、開裂剤はフッ化物イオンである。エステル内におけるように、ＯＹ基がカルボニル基に結合している場合には、開裂剤はエステラーゼ酵素であるか、またはエステルを加水分解する化学薬品（剤）である。かかる化学加水分解剤は、水または低級アルコールまたはこれらの混合物から選択される。開裂剤は、好ましくは、水酸化物塩およびアルコキシド塩から選択される塩基を含むか、または無機酸または過酸化水素を含む。ＯＹ基がホスフェート塩である場合には、開裂剤はホスファターゼ酵素である。ＯＹ基がスルフェート塩である場合には、開裂剤はスルファターゼ酵素である。ＯＹ基が、グルコシドまたはガラクトシドなどのグリコシド基の一部である場合には、開裂剤は対応するグリコシダーゼ酵素である。
【００９２】
開裂可能な結合部分が少なくとも１個のＯ，ＳまたはＮ原子で置換されたエレクトロンリッチＣ−Ｃ二重結合である場合には、開裂剤は一重項酸素である。二重結合基と一重項炭素との反応により、周囲温度またはそれ以上で自然に断片化する不安定な１，２−ジオキセタン基が生成する。一重項酸素は、一重項酸素化の分野における公知の方法に従い、色素感光によるか、またはオゾン化トリフェニルホスファイトまたはアンスラセンエンドペルオキシドの熱解離により、生成され得る。
【００９３】
開裂可能な結合部分が上述したようなケテンジチオアセタールである場合には、開裂剤はペルオキシダーゼ酵素および過酸化水素である。
【００９４】
開裂可能な結合部分がトリアルキルまたはトリアリールホスホニウム基と結合した少なくとも１個の炭素原子を持つアルキレン基である場合には、開裂は、ケトンまたはアルデヒドとのヴィティヒ反応により行われる。ヴィティヒ反応は、リンイリドを生成するために、有機溶剤中で４級ホスホニウム化合物が強塩基で脱プロトン化されるというよく知られた反応である。ケトンまたはアルデヒド等のカルボニル化合物とイリドとの反応により、二重結合およびホスフィン酸化物が形成される。ホスホニウム基とα炭素との間の結合は、以下に示すように切断される。好ましくは、α炭素は、結合したプロトンをリン原子上のＲ基におけるいくつかのプロトンより酸性にする基により置換される。次いで、イリドの形成およびＣ−Ｐ結合の断片化は、適切な位置に導かれる。α炭素上の好ましい置換基は、フェニル基または置換されたフェニル基、アルケン基、アルキン基またはカルボニル基である。４級ホスホニウム基がトリフェニルホスホニウム基等のトリアリールホスホニウム基である場合には、αプロトンの高められた酸性に対する必要性は議論の余地のあるところである。
【００９５】
2008506385.tif 000031
【００９６】
イリドを形成するための好ましい塩基は、アルコキシド塩および水素化物塩であり、特にはアルカリ金属塩である。イリドとの反応のための好ましいカルボニル化合物は、脂肪族および芳香族アルデヒド並びに脂肪族および芳香族ケトンである。より好ましくは、カルボニル化合物は、反応速度を遅延させるような大きな基を有しない。アセトンが最も好ましい。好ましい溶剤は、反応物を溶解させることができ、かつ、ＴＨＦ，ジエチルエーテル、ｐ−ジオキサン、ＤＭＦおよびＤＭＳＯを含んで塩基を消費しない非プロトン性有機溶剤である。
【００９７】
開裂後の固相からの核酸の解離の工程は、溶液を用いた溶離を含み、これは解離された核酸を溶解し、十分に保護する。溶液は、ｐＨ７〜９の水溶性緩衡液、０．１〜３Ｍの金属ハロゲン化物または酢酸塩および親水性有機補助溶剤１〜５０％を含む試薬組成物であってよい。より好ましくは、親水性有機溶剤は、約１〜２０％含まれる。金属ハロゲン化物塩には、アルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩が含まれる。好ましい塩は、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，およびＭｇＣｌ2である。親水性有機補助溶剤は、水溶性有機溶剤であり、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｔ−ブタノール、エチレングリコール、プロピレングリコール、グリセロール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、フルフリルアルコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、アセトン、ＴＨＦおよびｐ−ジオキサンを含む。捕捉された核酸の解離の工程は、開裂工程に引き続いてまたは、それと同時でもよい。後者の場合においては、開裂剤は溶離溶液としても作用しうる。
【００９８】
開裂後の固相からの核酸の解離のための試薬は、あるいはまた強アルカリ水溶液であってよい。少なくとも１０−4Ｍの濃度のアルカリ金属水酸化物または水酸化アンモニウムの溶液は、開裂された固相からの核酸の溶離に効果的である。
【００９９】
開裂後の固相からの核酸の解離のための試薬は、あるいはまた純水、または約８〜１０の間のｐＨを有するアルカリ緩衝溶液であってもよい。かかるアルカリ緩衝液の使用は、開裂速度を増大させるために、１００℃までの温度を上げて行われうる。適度にアルカリｐＨの緩衝液は、特に核酸がＲＮＡである場合に有用である。非常に高いｐＨでのＲＮＡとの広範な接触は、特に高温においては、その分解を導く。
【０１００】
開裂反応および解離（溶離）工程は、それぞれ室温で行うことができるが、水の氷点より上であってかつ水の沸点より下のいかなる温度も使用可能である。溶離温度は、核酸単離の本方法の成功に対し重大なものではないようである。周囲温度が好ましいが、水の氷点より上であってかつ水の沸点より下のいかなる温度も使用可能である。高められた温度は、いくつかの場合において、溶離速度を増大させるかもしれない。解離または溶離工程は一回行うことができ、または、解離された核酸の量を増大させるために１またはそれ以上の回数が必要であるならば、繰り返してもよい。
【０１０１】
開裂反応および溶離工程は、それぞれの工程を実施するために分離された別個の溶液を用いて、連続した工程として行ってもよい。あるいはまた、開裂および溶離工程は、同じ工程において、一緒に行ってもよい。後者の同時に行う方法は、開裂反応条件が、溶離された核酸の下流での使用に適合する試薬を利用する場合に、好ましい。例としては、適度にアルカリ性の反応緩衝液や、より強アルカリ性の水酸化ナトリウム溶液を用いた開裂反応がある。前者の連続的な方法は、開裂反応のための試薬または溶剤の存在が核酸に対し不適合であるかまたは望ましくない場合において、望ましいかもしれない。この場合の一つの例としては、ヴィティヒ解離反応がある。開裂および溶離のための分離された溶液の使用は、開裂反応条件が実質的にＤＮＡを溶液中に解離させない場合に可能となる。
【０１０２】
この方法は、さらには、固相からサンプルの他の成分を除去するために、洗浄溶液で捕捉された核酸結合を有する固相を洗浄する工程を含んでいてもよい。これらの望ましくない物質には、酵素、他のタイプのタンパク質、多糖類、脂質および酵素阻害剤などの低分子量物質が含まれる。上記の方法により本発明の固相上で捕捉された核酸は、標識されたまたは標識されていない相補的な核酸をハイブリッド形成するために、ハイブリッド形成反応において、捕捉された形態で使用することができる。ハイブリッド形成反応は、捕捉された核酸の存在または量を検出するための診断テストにおいて有用である。ハイブリッド形成反応は、固相核酸増幅プロセスにおいても有用である。
【０１０３】
固相核酸結合支持体は、また結合核酸を結合して蓄積するためにも有用である。したがって、サンプルからの核酸の単離方法を含み、以下の工程を含むサンプルからの核酸の捕捉方法が与えられる。
ａ）シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固体支持体部分、
核酸を引き寄せて核酸と結合するための核酸結合部分、および、
開裂可能な結合部分、
を含む固相を与える工程と、
ｂ）核酸を固相に結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程。
【０１０４】
好ましい実施形態においては、核酸結合部分は、基質の表面に結合された、式ＱＲ2+Ｘ-（ここで、ＱはＳであり、また、ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択される）で示される３級オニウム基かまたは、式ＱＲ3+Ｘ-（ここで、ＱはＳであり、また、ＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択される）で示される４級オニウム基であり、ここで４級オニウム基は４級アンモニウム基（ここでＲはＣ4−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択される）および４級ホスホニウム基（ここでＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択される）から選択され、また、ここでＸはアニオンである。
【０１０５】
開裂なしの解離
開裂可能な結合部分として、トリアルキルまたはトリアリールホスホニウム基（すなわち、それにより開裂が、ケトンまたはアルデヒドを用いたヴィティヒ反応により実施されるような固体支持体）かまたは、トリアルキルアンモニウム基に結合した少なくとも１個の炭素原子を持つアルキレン基を有する本発明の核酸結合固体支持体が、一定の試薬組成物と接触することにより核酸を解離させうることも見出された。この結果は、結合核酸が、結合核酸を溶離させるために従来技術において公知である非常に多くの他の試薬および組成物との接触を介してはこれらの固相結合材料から除去されないが故に、予期されないものであった。
【０１０６】
本発明の他の側面においては、さらに、以下の工程を含むサンプルからの核酸の単離方法が与えられる。
ａ）シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質、および、
式ＱＲ2+Ｘ-（ここでＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択される）で示される３級スルホニウム基、式ＮＲ3+Ｘ-（ここで４級オニウム基、ここでＲはＣ4−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択される）で示される４級アンモニウム基、および、式ＰＲ3+Ｘ-（ここでＲはＣ1−Ｃ20のアルキル基、アラルキル基およびアリール基から選択される）で示される４級ホスホニウム基（また、ここでＸはアニオンである）から選択される基質の表面に結合されたオニウム基、
を含む固相を与える工程と、
ｂ）固相に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相からサンプルを分離する工程と、さらに、
ｄ）固相と、ｐＨ７〜９の水溶液、０．１〜３Ｍの金属ハロゲン化物塩または酢酸塩および親水性有機補助溶剤１〜５０％を含む試薬組成物とを接触させることにより、固相から核酸を解離する工程。
【０１０７】
固相からのサンプル分離の工程は、例えば、ろ過、重力沈殿、傾瀉、磁力分離、遠心分離、真空吸引、および多孔膜またはフィルターマットを通しての強制的に液体化する空気または他のガスによる過圧により実施される。核酸以外のサンプルの成分は、この工程において除去される。他の成分の除去が完全でない範囲に対して、付加的な洗浄を行って、それらの完全な除去の助けることができる。
【０１０８】
固体支持体に結合した捕捉された核酸は、試薬組成物を用いた溶離により固体支持体から解離される。試薬組成物は、ｐＨ７〜９の水溶液、０．１〜３Ｍの金属ハロゲン化物塩または酢酸塩および親水性有機補助溶剤１〜５０％を含む。より好ましくは、親水性有機溶剤は、約１〜２０％含まれる。金属ハロゲン化物塩には、アルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩が含まれる。好ましい塩は、酢酸ナトリウム、ＮａＣｌ，ＫＣｌ，およびＭｇＣｌ2である。親水性有機補助溶剤には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｔ−ブタノール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、フルフリルアルコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、アセトン、ＴＨＦ、およびｐ−ジオキサンが含まれる。
【０１０９】
溶離組成物は、使用前に溶剤を蒸発させるかまたは核酸を沈殿させる必要なしに、次に続く下流のプロセスで直接に溶離された核酸の使用を有利に可能にする。
【０１１０】
結合核酸は意外にも、結合核酸を溶離するために従来技術において公知である非常に多くの試薬および組成物を用いた洗浄によっては、本発明の上記固相結合材料から除去されない。固相材料が抵抗力のある溶離剤（ｅｌｕｅｎｔ）には、以下の一覧が含まれる。この一覧には、高ｐＨ、高イオン強度および低イオン強度条件が含まれる。
【０１１１】
脱イオン化水Ｈ2Ｏ
１Ｍホスフェート緩衝液、ｐＨ６．７
０．１％ドデシル硫酸塩ナトリウム
０．１％ドデシルリン塩ナトリウム
３Ｍ酢酸カリウム、ｐＨ５．５
ＴＥ（トリスＥＤＴＡ）緩衝液
５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５＋１．２５Ｍ  ＮａＣｌ
０．３Ｍ  ＮａＯＨ＋１Ｍ  ＮａＣｌ
１Ｍ  ＮａＯＨ  または
１Ｍ  ＮａＯＨ＋１Ｍ  Ｈ2Ｏ2
【０１１２】
上述のような試薬組成物を用いて核酸を溶離させる場合、溶離温度は、核酸単離の本方法の成功に対して重要ではない。周囲温度が好ましいが、水の氷点より上であってかつ水の沸点より下のいかなる温度も使用可能である。高められた温度は、いくつかの場合において、溶離速度を増大させるかもしれない。
【０１１３】
本発明の他の側面においては、固相材料から結合核酸分子を解離または溶離させるための新規な試薬組成物が与えられる。本発明の組成物は、ｐＨ７〜９の水溶液、０．１〜３Ｍの金属ハロゲン化物塩または酢酸塩および親水性有機補助溶剤１〜５０％を含む。より好ましくは、有機溶剤は、約１〜２０％含まれる。親水性有機補助溶剤には、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、２−プロパノール、ｔ−ブタノール、２−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、フルフリルアルコール、２，２，２−トリフルオロエタノール、アセトン、ＴＨＦ、およびｐ−ジオキセタンが含まれる。
【０１１４】
これらの試薬組成物の重要な利点は、それらが、多くの下流の分子生物学プロセスに適合することである。上述のような試薬組成物中に溶離される核酸は、多くの場合、すぐ次にさらなるプロセスにおいて使用することができる。ＰＣＲ、米国特許５，９９８，１７５号明細書中に記載された多重オリゴマーの連結反応（ＬＭＯ）、およびＬＣＲなどの増幅反応には、かかる核酸溶離剤を用いることができる。慣用の手法により単離された核酸、特に、細菌細胞培養組織由来かまたは血液サンプル由来のものには、沈殿工程を用いる。低分子量アルコールが、水溶液から核酸を沈殿させるために高体積％にて、加えられる。沈殿させた物質は、その後分離し、収集し、さらに、使用前に好適な媒体に溶解させなければならない。これらの工程は、上述の試薬組成物を用いた本発明の固相結合材料からの核酸の溶離により、不要とすることができる。
【０１１５】
本発明の方法により核酸を単離することができるサンプルは、１またはそれ以上の核酸および、任意に、他の物質を含む水溶液を含む。典型的な例としては、核酸、増幅反応生成物、および配列反応生成物の水溶液がある。細菌培養組織、体液、血液および血液成分、組織抽出物、植物材料、および環境サンプルから得られる材料は、同様に、使用する前に、水性の、好ましくは緩衝液中に置かれる。
【０１１６】
固相核酸の捕捉方法は、非常に多くの用途に用いることができる。以下の特有の例において示されるように、一重螺旋および二重螺旋の核酸の双方が、捕捉され解離されうる。ＤＮＡ，ＲＮＡおよびＰＮＡは、捕捉され解離されうる。第一の用途は、細菌培養組織由来のプラスミドＤＮＡの精製である。プラスミドＤＮＡは、複製のために宿主内に特有の遺伝子または遺伝子の断片を含む遺伝子組み換えＤＮＡの断片を取り込ませるための複製ベクターとして使用される。
【０１１７】
第二の用途は、ＰＣＲまたは他の増幅反応由来の増幅生成物の精製である。これらの反応は、ＬＭＯまたはＰＣＲのように、交互により高い、および、より低い温度の間を熱的にサイクルしてもよく、または、例えば、核酸配列塩基増幅（ＮＡＳＢＡ）のように、それらは単一の温度で行われてもよい。この反応には、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡポリメラーゼおよび／または逆転写酵素を含む、様々な増幅試薬および酵素を用いることができる。本発明の方法を用いて精製されうるポリヌクレオチド増幅反応混合物には、多重オリゴマーの連結反応（ＬＭＯ）、自己維持（ｓｅｌｆ−ｓｕｓｔａｉｎｅｄ）配列複製（３ＳＲ）、螺旋転位増幅（ＳＤＡ）、「分岐鎖」ＤＮＡ増幅、リガーゼ鎖反応（ＬＣＲ）、ＱＢ複製増幅（ＱＢＲ）、連結反応活性化転写（ＬＡＴ）、核酸配列塩基増幅（ＮＡＳＢＡ）、修復鎖反応（ＲＣＲ）、反復プローブ反応（ＣＰＲ）、および回転環増幅（ＲＣＡ）が含まれる。
【０１１８】
第三の用途は、配列反応クリーンアップである。デオキシ末端化配列反応は、4つの反応混合物のそれぞれにおけるｄＮＴＰｓおよび1つのｄｄＮＴＰの混合物を持つプライマーの拡張に由来するポリヌクレオチドラダーを生成する。それぞれにおけるｄｄＮＴＰは、一般的に異なる蛍光色素を用いて標識される。反応混合物は、過剰のｄＮＴＰｓおよび標識されたｄｄＮＴＰ、ポリメラーゼ酵素およびＡＴＰ等の共同因子を含む。配列分析前に、後者の材料を除去することが望ましい。
【０１１９】
第四の用途は、全血からのＤＮＡの単離である。ＤＮＡは通常用いられる手法において白血球から抽出される。血液は選択的に赤血球を溶解させるために典型的に処理され、さらに、沈殿または遠心分離工程の後に、核酸含量を明らかにするために完全な白血球を分離的に溶解する。タンパク質を蒸解して、得られたＤＮＡを固相を用いて単離し、その後、配列多形性の決定、配列解析、ＲＦＬＰ分析、変異検出または他のタイプの診断上の分析のために用いる。
【０１２０】
第五の用途は、ＤＮＡとＲＮＡとの混合物からのＤＮＡの単離においてである。強アルカリ溶離条件を含む本発明の方法、特に高められた温度を用いる方法では、ＤＮＡを完全な状態としている間に、存在するＲＮＡを分解させるかまたは破壊しうる。強アルカリ開裂反応を含む方法も同様に作用する。
【０１２１】
付加的な用途には、他のサンプル、土壌、植物、細菌、および汚水からの核酸材料の抽出、および収容目的での核酸材料の長期間保管が含まれる。
【０１２２】
本発明の開裂可能な固体支持体の他の利点は、支持体から解離された核酸が溶液中に含まれ、多くの下流の分子生物学的プロセスに適合することである。固相が開裂可能な結合部分を含む場合には、開裂剤を含む溶液中か、または上述の試薬組成物中に溶離された核酸は、多くの場合、さらなるプロセスにおいて直接に使用することができる。これらのプロセスには、ポリメラーゼかまたはリガーゼかのいずれかを用いた核酸増幅反応が含まれる。典型的な増幅反応は、ＰＣＲ、米国特許５，９９８，１７５号明細書中に記載された多重オリゴマーの連結反応（ＬＭＯ）、およびＬＣＲである。解離された核酸を含む溶液の使用は、酵素的および他の反応に適合し、かつ、それらを実質的に阻害しないことが見出されている。他の下流のプロセスは、上述されており、核酸ハイブリッド形成分析、変異検出および配列分析を含む。
【０１２３】
したがって、本発明のさらなる側面は、開裂可能な固相結合材料を用いた核酸の単離および精製方法を含む。１つの実施形態においては、以下の工程を含む、サンプルからの核酸の単離方法が与えられる。
ａ）シリカ、ガラス、不溶性合成ポリマー、および不溶性多糖類から選択される基質を含む固体支持体部分、
核酸を引き寄せて核酸と結合するための核酸結合部分、および、
開裂可能な結合部分、
を含む固相を与える工程と、
ｂ）固相に核酸を結合させるために、核酸を含むサンプルと固相を一緒にする工程と、
ｃ）固相からサンプルを分離する工程と、
ｄ）開裂可能な結合部分を開裂する工程と、
ｅ）固相から溶液中に核酸を解離する工程と、
ｆ）さらに解離された核酸を含む溶液を、下流のプロセスにおいて直接に用いることを含む工程。
【０１２４】
解離された核酸を含む溶液を直接に核酸増幅反応において用いて、核酸またはそれのセグメントの量をポリメラーゼまたはリガーゼ仲介反応を用いて増幅させることが、好ましい実施である。
【０１２５】
以下の実施例は、本発明の様々な側面をより十分に記述するために存在する。これらの実施例は、本発明の範囲をいかなる方法においても制限するものではない。
【０１２６】
実施例：
下記実施例に示された構造式の図は、主として固相物質の開裂可能な結合部分を図示することを意図したものである。即ち、その図は、固相物質の完全な説明を表すものではない。
【０１２７】
実施例１．トリブチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成。
【０１２８】
2008506385.tif 000032
【０１２９】
架橋結合クロロメチル化ポリスチレンであるメリフィールドペプチド樹脂（シグマ社、１．１ｍｅｑ／ｇ、２０．０ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン／ＤＭＦ（５０／５０）２００ｍＬ中で撹拌した。過剰のトリブチルホスフィン（４８．１ｇ、１０当量）を加え、スラリーを室温にて７日間撹拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン２００ｍＬで２回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（２１．５ｇ）。
【０１３０】
元素分析：分析値  Ｐ ２．５２％, Ｃｌ ３．０８％  （期待値  Ｐ ２．７９％, Ｃｌ ３．１９％）  Ｐ／Ｃｌ比 ０．９４
【０１３１】
実施例２．トリオクチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成。
【０１３２】
2008506385.tif 000033
【０１３３】
メリフィールドペプチド樹脂（シグマ社、１．１ｍｅｑ／ｇ、２０．０ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン／ＤＭＦ（５０／５０）２００ｍＬ中で撹拌した。過剰のトリオクチルホスフィン（９２．４ｇ、１０当量）を加え、スラリーを室温にて７日間撹拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン２００ｍＬで３回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（２１．３ｇ）。
【０１３４】
元素分析：分析値  Ｐ  ２．２８％，Ｃｌ ２．７７％  （期待値  Ｐ ２．７７％, Ｃｌ ２．４２％）  Ｐ／Ｃｌ比 ０．９４
【０１３５】
実施例３．トリメチルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成。
【０１３６】
2008506385.tif 000034
【０１３７】
メリフィールドペプチド樹脂（ＩＣＮ  バイオメディカル社、１．６ｍｅｑ／ｇ、５．０ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン５０ｍＬ中で撹拌した。ＴＨＦ中のトリメチルホスフィン１．０Ｍ溶液（オールドリッチ社、１２ｍＬ）を加え、スラリーを室温にて７日間撹拌した。ジクロロメタン１００ｍＬを追加し、トリメチルホスフィンの１．０Ｍ溶液１．２ｍＬを加え、スラリーを３日間攪拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン１２５ｍＬで、次いでメタノール３７５ｍＬで洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（５ｇ）。樹脂を使用前に粉砕して細粉とした。
【０１３８】
実施例４．トリフェニルホスホニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成。
【０１３９】
2008506385.tif 000035
【０１４０】
メリフィールドペプチド樹脂（ＩＣＮ  バイオメディカル社、１．６ｍｅｑ／ｇ、５．０ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で撹拌した。トリフェニルホスフィン（オールドリッチ社、３．２ｇ）を加え、スラリーを室温にて５日間撹拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン、メタノールおよびジクロロメタンで逐次洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（５．４ｇ）。
【０１４１】
実施例５．トリブチルアンモニウム基を含有するポリスチレンポリマーの合成。
【０１４２】
2008506385.tif 000036
【０１４３】
メリフィールドペプチド樹脂（オールドリッチ社、１．４３ｍｅｑ／ｇ、２５．１ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン１５０ｍＬ中で撹拌した。過剰のトリブチルアミン（２５．６ｇ、４当量）を加え、スラリーを室温にて８日間撹拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン２５０ｍＬで２回洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（２８．９ｇ）。
【０１４４】
元素分析：分析値  Ｎ  １．１８％， Ｃｌ ３．４０％  （期待値  Ｎ １．５８％, Ｃｌ ４．０１％）   Ｎ／Ｃｌ比 ０．８８
【０１４５】
実施例６．２−（トリブチルホスホニウム）アセチル基を含有するポリスチレンポリマーの合成。
【０１４６】
2008506385.tif 000037
【０１４７】
クロロアセチルポリスチレンビーズ（アドバンスド  ケムテック社、３．０ｇ、３．４ｍｅｑ／ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン５０ｍＬ中のトリブチルホスフィン（４．１ｇ、２当量）の溶液に加えた。スラリーを１週間攪拌した。スラリーをろ過し、得られた固形物をジクロロメタン（４×２５ｍＬ）、メタノール（２×２５ｍＬ）およびアセトン（４×２５ｍＬ）で逐次洗浄した。次いで、樹脂を風乾した。
【０１４８】
実施例７．ポリビニルベンジルトリブチルホスホニウム基を含有するポリマー層を有する磁性粒子の合成。
【０１４９】
2008506385.tif 000038
【０１５０】
磁性メリフィールドペプチド樹脂（ケミセル社、ＳｉＭａｇ  クロロメチル、１００ｍｇ）を、ガラス瓶中で、ジクロロメタン２ｍＬに加えた。トリブチルホスフィン（８０μＬ）を加え、スラリーを室温にて３日間振盪した。磁石をガラス瓶の下に設置し、上澄み液をピペットで除去した。固形物をジクロロメタン２ｍＬで４回洗浄した（洗浄液も磁石／ピペットの方法で除去した）。樹脂を風乾した（９３ｍｇ）。
【０１５１】
実施例８−Ｂｒ．トリブチルホスホニウム基と臭化物アニオンを含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１５２】
2008506385.tif 000039
【０１５３】
ポリメタクリル酸樹脂を３５ｍＬのＳＯＣｌ２で４時間還流し、酸塩化物を生成した。ポリメタクリロイルクロライド樹脂（４．８ｇ）とトリエチルアミン（１１．１ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。３−ブロモプロパノール（９．０ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン４０ｍＬで３回洗浄した。樹脂を風乾した（８．７ｇ）。
【０１５４】
樹脂（８．５ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（１６．２ｇ）を加え、スラリーを７日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン１００ｍＬで３回洗浄した。次に、樹脂を風乾した（５．０ｇ）。
【０１５５】
実施例８−Ｃｌ．トリブチルホスホニウム基と塩化物アニオンを含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１５６】
2008506385.tif 000040
【０１５７】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（１２．２ｇ）とトリエチルアミン（２３．２ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。３−クロロプロパノール（１２．８ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン１００ｍＬで３回洗浄した。樹脂を風乾した（１２．８ｇ）。
【０１５８】
樹脂（１２．８ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（２７．８ｇ）を加え、スラリーを７日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン２×１００ｍＬとメタノール２×１００ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（９．８ｇ）。
【０１５９】
実施例８−Ｓ．トリブチルホスホニウム基とアルキルチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１６０】
2008506385.tif 000041
【０１６１】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（３．６ｇ）とトリエチルアミン（８．９ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン２０ｍＬ中で攪拌した。ジクロロメタン２０ｍＬで希釈した３−メルカプト−１−プロパノール（５．８ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン、水およびメタノールで洗浄した。樹脂を風乾した（３．５ｇ）。
【０１６２】
樹脂（４．３ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（１４．９ｇ）とトリフェニルホスフィン（１１．８ｇ）を加えた。混合物を５時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂をアセトニトリル１２５ｍＬ、メタノール２５０ｍＬおよびジクロロメタン２５０ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（４．２ｇ）。
【０１６３】
樹脂（４．２ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（６．７ｇ）を加え、スラリーを８日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン９０ｍＬで、次いでメタノール５０ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（４．０ｇ）。
【０１６４】
実施例９．トリブチルホスホニウム基とエステル結合を含有するポリビニルベンジルポリマーの合成
【０１６５】
2008506385.tif 000042
【０１６６】
ポリスチレンヒドロキシメチルアクリレート樹脂（５．０ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、アセトニトリル５０ｍＬ中で攪拌した。トリブチルホスフィン（２．１ｇ）と４．０Ｍ塩酸（２．５ｍＬ）を１５分間、アルゴン下で攪拌した。この溶液を、１時間をこえて樹脂スラリーの４つの等価部分に加えた。氷水浴を除去し、室温にて３時間、スラリーを攪拌した。樹脂をろ過し、アセトニトリル５０ｍＬで、次いでジクロロメタン２×５０ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（６．２４ｇ）。
【０１６７】
実施例１０．トリブチルホスホニウム基とエステル結合を含有するポリビニルベンジルポリマーの合成
【０１６８】
2008506385.tif 000043
【０１６９】
ヒドロキシメチル化したポリスチレン（オールドリッチ社、２．０ｍｅｑ／ｇ、５．０ｇ）とトリエチルアミン（２．３ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。クロロアセチルクロライド（１．９ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン４０ｍＬで３回洗浄した。樹脂を風乾した（５．８ｇ）。
【０１７０】
樹脂（５．８ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（３．２ｇ）を加え、スラリーを７日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン１００ｍＬで２回洗浄した。次に、樹脂を風乾した（５．９ｇ）。
【０１７１】
実施例１１．トリブチルホスホニウム基と２つのエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１７２】
2008506385.tif 000044
【０１７３】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂とピリジンを、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン５０ｍＬ中で攪拌した。テトラフルオロヒドロキノン（２．７ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて４３時間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン、水、メタノールおよびジクロロメタンで逐次洗浄した。樹脂を風乾した（１．３ｇ）。
【０１７４】
樹脂とトリエチルアミン（６６２ｍｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン３０ｍＬ中で攪拌した。４−ブロモブチリルクロライド（１．１２ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて２日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン、水、メタノールおよびジクロロメタンで逐次洗浄した。樹脂を風乾した（１．３ｇ）。
【０１７５】
樹脂をアルゴン下で、ジクロロメタン１８ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（４．７ｇ）を加え、スラリーを１０日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン、メタノール、ジクロロメタンで逐次洗浄した。次に、樹脂を風乾した（１．３ｇ）。
【０１７６】
実施例１２．トリブチルホスホニウム基とエステル結合を含有する光開裂可能なポリメタクリレートポリマーの合成
【０１７７】
2008506385.tif 000045
【０１７８】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（２．０ｇ）とトリエチルアミン（４．２ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン２５ｍＬ中で攪拌した。［４、５−ビス（４−ブロモ−１−ブトキシ）−２−ニトロフェニル］−フェニルメタノール（１６．７ｇ）を、ジクロロメタン１００ｍＬで希釈し、加えた。氷水浴を除去し、スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン１００ｍＬで２回洗浄した。樹脂を風乾した（２．５ｇ）。
【０１７９】
樹脂（２．５ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン５０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（４．０ｇ）を加え、スラリーを７日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン５０ｍＬで２回洗浄した。次に、樹脂を風乾した（２．４ｇ）。
【０１８０】
実施例１３．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１８１】
2008506385.tif 000046
【０１８２】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（２．７ｇ）とトリエチルアミン（８．６ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン２５ｍＬ中で攪拌した。ジクロロメタン２０ｍＬで希釈した２−メルカプトベンジルアルコール（５．０ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて２日間攪拌した。スラリーをジクロロメタン５０ｍＬで希釈し、６０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄みを除去した。樹脂を、メタノール１００ｍＬで３回洗浄し、それぞれ６０００ｒｐｍ、１０分間の遠心分離で洗浄した。洗浄終了後、樹脂をろ過し、風乾した（４．２ｇ）。
【０１８３】
樹脂（３．４ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（１０．２ｇ）とトリフェニルホスフィン（８．０ｇ）を加えた。混合物を４時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂を、アセトニトリル１２５ｍＬ、メタノール２５０ｍＬおよびジクロロメタン２５０ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（２．８ｇ）。
【０１８４】
樹脂（２．８ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（４．０ｇ）を加え、スラリーを８日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン５０ｍＬで、次いでメタノール１２５ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（２．７ｇ）。
【０１８５】
実施例１４．トリメチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１８６】
2008506385.tif 000047
【０１８７】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（５．１ｇ）とトリエチルアミン（１２．３ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。２−メルカプトベンジルアルコール（９．３ｇ）を加え、スラリーを室温にて５日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン３００ｍＬ、水５００ｍＬおよびメタノール２００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（５．８ｇ）。
【０１８８】
樹脂（４．８ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（１４．３ｇ）とトリフェニルホスフィン（１１．３ｇ）を加えた。混合物を４時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂を、アセトニトリル１００ｍＬ、ジクロロメタン２００ｍＬ、メタノール２００ｍＬおよびジクロロメタン２００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（４．８ｇ）。
【０１８９】
樹脂（１．０４ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン３０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。
ＴＨＦ（７．３ｍＬ）中の１．０Ｍトリメチルホスフィン溶液を加え、スラリーを１０日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン１００ｍＬ、ＴＨＦ１００ｍＬ、メタノール５０ｍＬおよびジクロロメタン１００ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（１．１０ｇ）。
【０１９０】
実施例１５．トリオクチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０１９１】
2008506385.tif 000048
【０１９２】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（５．１ｇ）とトリエチルアミン（１２．３ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。２−メルカプトベンジルアルコール（９．３ｇ）を加え、スラリーを室温にて５日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂を、ジクロロメタン３００ｍＬ、水５００ｍＬおよびメタノール２００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（５．８ｇ）。
【０１９３】
樹脂（４．８ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル１００ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（１４．３ｇ）とトリフェニルホスフィン（１１．３ｇ）を加えた。混合物を４時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂を、アセトニトリル１００ｍＬ、ジクロロメタン２００ｍＬ、メタノール２００ｍＬおよびジクロロメタン２００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（４．８ｇ）。
【０１９４】
樹脂（１．６８ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン３０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリオクチルホスフィン（４．４ｇ）を加え、スラリーを１０日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン１００ｍＬ、ＴＨＦ１００ｍＬ、メタノール５０ｍＬおよびジクロロメタン１００ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（１．６７ｇ）。
【０１９５】
実施例１６．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有し、ポリメタクリレート結合で官能化された磁性シリカ粒子の合成
【０１９６】
2008506385.tif 000049
【０１９７】
磁性カルボン酸で官能化されたシリカ粒子（ケミセル社、ＳｉＭＡＧ−ＴＣＬ、１．０ｍｅｑ／ｇ、０．６ｇ）を塩化チオニル６ｍＬ中にいれ、３時間還流した。過剰の塩化チオニルを減圧下で除去した。樹脂を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で再懸濁した。トリエチルアミン（１．２ｇ）を加えた。２−メルカプトベンジルアルコール（０．７ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中振盪した。スラリーをろ過し、樹脂を５０００ｒｐｍ、１０分間、メタノール３５ｍＬで２回遠心分離した。上澄み液を除去した。オレンジ−黄色の樹脂を風乾した（３３５ｍｇ）。
【０１９８】
樹脂（３３５ｍｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル４５ｍＬ中で再懸濁した。テトラブロムメタン（２．０ｇ）とトリフェニルホスフィン（１．６ｇ）を加えた。混合物を３時間還流した。樹脂を５０００ｒｐｍ、１０分間、遠心分離し、上澄み液を除去した。樹脂を５０００ｒｐｍ、１０分間、アセトニトリル５０ｍＬで２回遠心分離し、上澄み液を除去した。次に、樹脂を風乾した（３２８ｍｇ）。
【０１９９】
樹脂（３２８ｍｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で再懸濁した。トリブチルホスフィン（２８０ｍｇ）を加え、スラリーを１０日間振盪した。フラスコの外側に磁石を置いて、磁性樹脂を固定し、上澄み液を静かに除去した。樹脂をジクロロメタン３０ｍＬで３回、次いでメタノール２５ｍＬで３回洗浄した。次に、樹脂を風乾した（３２８ｍｇ）。
【０２００】
実施例１７．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有する磁性重合メタクリレート粒子の合成
ＳｅＲａ−Ｍａｇ（登録商標）マグネチックカルボキシレートミクロパーティクルズ（セラダイン社）を使用して、開裂可能な磁性粒子を生成した。Ｓｅｒａ−Ｍａｇ粒子は、ポリスチレン−アクリル酸ポリマーコアを有し、コアを専有のポリマーを含むマグネタイトコーティングで覆っている。カルボキシレート基は、表面が影響を受けやすい。粒子（０．５２ｍｅｑ／ｇ、０．５０ｇ）を水１５ｍＬと０．１ＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ４．０）２５ｍＬ中で懸濁した。反応混合物を５分間超音波処理し、ＥＤＣ（１−［３−（ジメチルアミノ）プロピル］−３−エチルカルボジイミドハイドロクロライド）１２６ｍｇと２−メルカプトベンジルアルコール１１０ｍｇを加えた。反応混合物を７日間振盪した。反応混合物をろ過した。樹脂を水５０ｍＬとメタノール１００ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（０．５３ｇ）。
【０２０１】
樹脂（０．５３ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル２０ｍＬ中で再懸濁した。テトラブロムメタン（１７４ｍｇ）とトリフェニルホスフィン（１３８ｍｇ）を加えた。混合物を６５℃で５時間、超音波処理した。大磁石で反応混合物を固定し、上澄み液を静かに除去した。樹脂をアセトニトリルで４回洗浄し、樹脂を磁石で沈殿させ、洗浄液を除去した。樹脂をメタノールに再懸濁し、一晩中振盪した。樹脂をメタノールで４回洗浄し、樹脂を磁石で沈殿させ、洗浄液を除去した。次に、樹脂を風乾した（０．５２ｇ）。
【０２０２】
樹脂（０．５２ｇ）をアセトニトリル１０ｍＬに再懸濁した。トリブチルホスフィン（１０６ｍｇ）を加え、７日間振盪して反応させた。磁性樹脂を磁石で沈殿させ、上澄み液を静かに除去した。樹脂をアセトニトリルで４回、メタノールで４回洗浄した。次に、樹脂を風乾した（０．５１ｇ）。
【０２０３】
実施例１８．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０２０４】
2008506385.tif 000050
【０２０５】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（０．６ｇ）とトリエチルアミン（１．５ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン３０ｍＬ中で攪拌した。ジクロロメタン２０ｍＬで希釈した４−メルカプトベンジルアルコール（１．０ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて２日間攪拌した。スラリーをろ過し、ジクロロメタン５０ｍＬ、水１００ｍＬ、メタノール５０ｍＬおよびジクロロメタン２５ｍＬで洗浄した。樹脂を風乾した（０．７ｇ）。
【０２０６】
樹脂（０．６ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル２０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（１．８ｇ）とトリフェニルホスフィン（１．４ｇ）を加えた。混合物を３時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂をアセトニトリル、メタノールおよびジクロロメタンで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（０．６ｇ）。
【０２０７】
樹脂（０．６ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン１５ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（０．８５ｇ）を加え、スラリーを６日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン７５ｍＬで、次いでメタノール１５０ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（０．６ｇ）。
【０２０８】
実施例１９．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０２０９】
2008506385.tif 000051
【０２１０】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（０．７１ｇ）とトリエチルアミン（２．２ｇ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。４−ヒドロキシフェニル４−ブロモチオブチレート（２．５５ｇ）を加え、スラリーを室温にて５日間攪拌した。スラリーをろ過し、ジクロロメタンとヘキサンで洗浄した。樹脂を風乾した（０．８５ｇ）。
樹脂（０．８５ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン２０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（２．７ｇ）を加え、スラリーを３日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタンとヘキサンで洗浄した。次に、樹脂を風乾した。
【０２１１】
実施例２０．トリブチルホスホニウム基とアリールチオエステル結合を含有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０２１２】
2008506385.tif 000052
【０２１３】
ポリメタクリロイルクロライド樹脂（１．０ｇ）とピリジン（１．９ｍＬ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン２０ｍＬ中で攪拌した。１、４−ベンゼンジチオール（１．８５ｇ）を加え、スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、ジクロロメタンとヘキサンで洗浄した。樹脂を風乾した（１．０８ｇ）。
【０２１４】
樹脂（１．０８ｇ）とトリエチルアミン（３．０ｍＬ）を、アルゴン下で、ジクロロメタン２０ｍＬ中で攪拌した。４−ブロモブチリルクロライド（１．８ｍＬ）を加え、反応混合物を２日間攪拌した。スラリーをろ過し、ジクロロメタンで洗浄した。樹脂を風乾した（１．１０ｇ）。
【０２１５】
樹脂（１．１０ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン３０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（４．０ｇ）を加え、スラリーを５日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタンで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（１．０ｇ）。
【０２１６】
実施例２１．トリブチルホスホニウム基を含有する架橋ポリスチレンポリエチレングリコールサクシネートコポリマーの合成
【０２１７】
2008506385.tif 000053
【０２１８】
ＴｅｎｔａＧｅｌ  Ｓ  ＣＯＯＨ  ビーズ（アドバンスド  ケムテック社、３．０ｇ）は、架橋ポリスチレンポリエチレングリコールサクシネートコポリマーであり、それを塩化チオニル３０ｍＬ中で９０分間還流した。残留塩化チオニルを減圧下で除去した。樹脂をクロロホルム３０ｍＬで再懸濁し、再濃縮した。
【０２１９】
樹脂とトリエチルアミン（０．１４ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン６０ｍＬ中で攪拌した。２−メルカプトベンジルアルコール（０．１１ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて２日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン、水、メタノールおよびジクロロメタンで洗浄した。樹脂をろ過して風乾した（２．９ｇ）。
【０２２０】
樹脂（２．８ｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル６０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。テトラブロムメタン（０．３６ｇ）とトリフェニルホスフィン（０．２９ｇ）を加えた。混合物を４時間還流した。スラリーをろ過し、樹脂をアセトニトリル、メタノールおよびジクロロメタンで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（２．８ｇ）。
【０２２１】
樹脂（２．７ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン５０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（０．２１ｇ）を加え、スラリーを６日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン５０ｍＬで、次いでメタノール１７５ｍＬで洗浄した。次に、樹脂を風乾した（２．８ｇ）。
【０２２２】
実施例２２．サクシネート結合したトリブチルホスホニウム基とチオエステル結合を含有するポア調整ガラスビーズの合成
【０２２３】
2008506385.tif 000054
【０２２４】
ミリポアＬＣＡＡガラス（１．０ｇ、３８．５μｍｏｌｅ／ｇｒａｍ）を乾燥ピリジン１０ｍＬ中で懸濁した。無水コハク酸（４０ｍｇ）を加え、反応混合物を室温にて４日間振盪した。反応混合物をメタノール２０ｍＬで希釈し、混合物をろ過した。固形物をメタノール２０ｍＬで５回、ジクロロメタン２０ｍＬで５回、洗浄した。固形物を風乾した（１．０ｇ）。
【０２２５】
固形物（０．５０ｇ）を乾燥ジクロロメタン１０ｍＬ中で懸濁した。ジシクロヘキシルカルボジイミド（１０ｍｇ）と２−メルカプトベンジルアルコールを加え、反応混合物を室温にて６日間振盪した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、混合物をろ過した。固形物をメタノールで３回、ジクロロメタンで３回、洗浄した。固形物を風乾した（０．５０ｇ）。
【０２２６】
固形物（４００ｍｇ）をアルゴン下で、乾燥アセトニトリル１０ｍＬ中で再懸濁した。テトラブロムメタン（１４ｍｇ）とトリフェニルホスフィン（１１ｍｇ）を加えた。混合物を３時間還流した。混合物をろ過し、固形物をメタノール５０ｍＬで５回、ジクロロメタン５０ｍＬで５回、洗浄した。固形物を風乾した（３６０ｍｇ）。
【０２２７】
固形物（３００ｍｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン１０ｍＬ中で再懸濁した。トリブチルホスフィン（５滴）を加え、反応混合物を５日間振盪した。反応混合物をジクロロメタンで希釈し、ろ過した。固形物をジクロロメタン５０ｍＬで５回、洗浄し、風乾した（３００ｍｇ）。
【０２２８】
実施例２３．アクリジニウムエステル基を含有するポリビニルベンジルポリマーの合成
【０２２９】
2008506385.tif 000055
【０２３０】
アクリジン  ９−カルボキシリックアシッドクロライド（１．２５ｇ）とトリエチルアミン（１．３ｇ）を、氷水浴中、アルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で攪拌した。ヒドロキシチオフェノール樹脂（ポリマーラボラトリーズ、１．６７ｍｅｑ／ｇ、３．０ｇ）を加え、氷水浴を除去した。スラリーを室温にて一晩中攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン２００ｍＬで３回洗浄した。樹脂を風乾した（４．４ｇ）。
【０２３１】
樹脂（４．３ｇ）をアルゴン下で、ジクロロメタン４０ｍＬ中で攪拌した。メチルトリフレート（６．１ｇ）を加え、反応混合物を２日間攪拌した。スラリーろ過し、樹脂をジクロロメタン２００ｍＬとメタノール１Ｌで洗浄した。樹脂を減圧下で乾燥した（４．７ｇ）。
【０２３２】
実施例２４．アクリダンケテンジチオアセタアール基を含有するポリビニルベンジルポリマーの合成
【０２３３】
2008506385.tif 000056
【０２３４】
Ｎ−フェニルアクリダン（０．６２ｇ）を、−７８℃、アルゴン下で、無水ＴＨＦ２０ｍＬ中で攪拌した。ブチルリチウム（ヘキサン中２．５Ｍ、０．９３ｍＬ）を加え、反応混合物を−７８℃で２時間攪拌した。二硫化炭素（０．１６ｍＬ）を加え、反応混合物を−７８℃で１時間攪拌した。反応混合物を室温まで加温した。メリーフィールドのペプチド樹脂（１．６ｍｅｑ／ｇ、１．０ｇ）を加え、混合物を室温にて一晩中攪拌した。混合物をろ過した。樹脂をアセトン１０ｍＬで５回、水１０ｍＬで３回およびアセトン１０ｍＬで２回、洗浄した。樹脂を風乾した（１．２１ｇ）。
【０２３５】
樹脂（１．２１ｇ）とＮａＨ（油中６０％、０．００３ｇ）を、アルゴン下で４時間、無水ＤＭＦ２０ｍＬ中で攪拌した。１、３−ジブロモプロパン（０．０７ｍＬ）を加え、混合物を３日間攪拌した。混合物をろ過した。樹脂をアセトン１０ｍＬで３回、水１０ｍＬで５回およびアセトン１０ｍＬで５回、洗浄した。樹脂を風乾した（１．２２ｇ）。
【０２３６】
樹脂（１．２２ｇ）をアルゴン下で、ＤＭＦ２０ｍＬ中で再懸濁し、攪拌した。トリブチルホスフィン（１．１８ｇ）を加え、スラリーを７日間攪拌した。スラリーをろ過し、樹脂をジクロロメタン２０ｍＬで４回、アセトン２０ｍＬで４回、洗浄した。次に、樹脂を風乾した（１．０７ｇ）。
【０２３７】
実施例２５．加水分解による開裂可能な粒子からのＤＮＡの結合と溶離の一般的な方法
ビーズのサンプル１０ｍｇを、チューブ中、ＴＨＦ５００μＬでリンスした。含有物を遠心分離して、液体を除去した。水２００μＬでリンス工程を繰り返し行った。水２００μＬにリニアライズド（ｌｉｎｅａｒｉｚｅｄ）ｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液をビーズに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。３７℃で５分間ＮａＯＨ水溶液２００μＬでビーズをインキュベートして、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離して、分析用に溶離剤を取り出した。
【０２３８】
実施例２６．蛍光アッセイプロトコール
上澄み液と溶離剤のＤＮＡ含量について、ＤＮＡを染色するためにＰｉｃｏＧｒｅｅｎを使用する蛍光アッセイで分析した。ＤＮＡを含むかまたはその可能性のある溶液１０μＬを、蛍光ＤＮＡ染色溶液１９０μＬでインキュベートした。蛍光染料は、０．１Ｍトリス、ｐＨ７．５、１ｍＭのＥＤＴＡで、１：４００に希釈したＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）であった。少なくとも５分間のサンプルインキュベート後、マイクロプレートフルオロメーター（Ｆｌｕｏｒｏｓｋａｎ、Ｌａｂｓｙｓｔｅｍｓ）で、蛍光を測定した。フィルターセットは４８０ｎｍと５３５ｎｍであった。既知量の同じＤＮＡを含有するポジティブコントロールと、ネガティブコントロールとを同時に測定した。
【０２３９】
実施例２７．開裂可能なビーズからのＤＮＡの結合と解離
上澄み液と溶離剤のＤＮＡ含量について、ＤＮＡ染色にＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用する蛍光アッセイで分析した。結果を最初の２μｇＤＮＡ溶液の値と比較して表現した。結合工程からの洗浄溶液と上澄み液の分析によりビーズによるＤＮＡ捕捉％を求めた。
【０２４０】
2008506385.tif 000057
【０２４１】
実施例２８．開裂可能な粒子からのＤＮＡ溶離に対する溶離時間と温度の効果
実勢例１３のビーズを実施例２５のプロトコールに従い処理した。ＤＮＡ結合ビーズを、室温または３７℃で、１、５または１０分間、１ＭのＮａＯＨでそれぞれインキュベートし、解離したＤＮＡの割合を蛍光で決定した。
【０２４２】
2008506385.tif 000058
【０２４３】
実施例２９．スピンカラムを使用する開裂可能なビーズからのＤＮＡの結合と解離
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液をスピンカラム（Ｃｏｓｔａｒ）２ｍＬ中のビーズ２０ｍｇに加えた。２分間のインキュベート後、カラムを３０秒間遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬで洗浄し、洗浄液を除去した。ＤＮＡを３７℃で１分間０．５ＭのＮａＯＨ２００μＬで洗浄して溶離し、３０秒間遠心分離して、蛍光分析とゲル電気泳動分析用の溶離剤を集めた。溶離したＤＮＡを、ＤＮＡを沈殿させることなく、直接溶離剤を用いるＰＣＲで増幅した。
【０２４４】
実施例３０．実施例１３の開裂可能なビーズからのプラスミドＤＮＡの結合と解離のＰＣＲ増幅
０．５ＭのＮａＯＨ中の前記実施例（１μＬ）の溶離されたＤＮＡを、２８５ｂｐアンプリコン（ａｍｐｌｉｃｏｎ）を生成する一対のプライマーでＰＣＲ増幅に供した。ＰＣＲ反応混合物は、以下の表に示す成分を含有していた。
【０２４５】
2008506385.tif 000059
【０２４６】
ネガティブコントロールとして０．５ＭのＮａＯＨ１μＬまたは２μＬ、または水１μＬで反応混合物中のテンプレートと交換した。さらに反応は、水で１：１０に希釈した１μＬのテンプレートを使用した。混合反応を、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃１分間を２２回サイクルに供した。反応生成物について１％アガロースゲルで実験した。図３は、ビーズから溶離したＤＮＡがそこなわれていないことを示している。
【０２４７】
実施例３１．実施例１３のトリブチルホスホニウムビーズの異なる長さのオリゴヌクレオチドの結合と１ＭのＮａＯＨ中での解離
実施例２５の結合と解離のプロトコールを、２０塩基から２．７キロ塩基（ｋｂ）の範囲の様々なサイズのオリゴヌクレオチドで実施した。ビーズを、３７℃で５分間、１ＭのＮａＯＨ２００μＬで開裂した。ＤＮＡの量を、ｓｓＤＮＡ用の蛍光染料であるＯｉｌＧｒｅｅｎを使用して蛍光分析で決定した。
【０２４８】
2008506385.tif 000060
【０２４９】
室温で３０分間ビーズの反応を繰り返し、ポリマーを開裂した。結果を下記に示す。
【０２５０】
2008506385.tif 000061
【０２５１】
実施例３２．実施例１６の開裂可能な磁性ビーズからのＤＮＡの結合と解離
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、開裂可能な磁性ビーズ１０ｍｇに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を磁性的に分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。３７℃、５分間、０．５ＭのＮａＯＨ２×２００μＬでビーズをインキュベートして、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離して、溶離剤を蛍光分析用に取り出した。すべてのＤＮＡをビーズに結合した。最初の溶離剤は、９２％のＤＮＡ結合を含み、二番目は１３％を含んでいた。
【０２５２】
実施例３３．実施例１７の開裂可能な磁性ビーズからのＤＮＡの結合と解離
前記同様の方法で、実施例１７の開裂可能な磁性ビーズをリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇとの結合および解離のために使用した。結合工程からの上澄みの分析から、ＤＮＡが完全に結合していることは明らかであった。ビーズから解離した後の溶離剤分析は、そのままのＤＮＡが溶離していることを示した。
【０２５３】
実施例３４．実施例１６の磁性ビーズの結合能力
下表に示す様々な量のＤＮＡを実施例１６の開裂可能な磁性ビーズに結合し、０．５ＭのＮａＯＨで上述したように溶離した。上澄み液と溶離剤を蛍光分析でアッセイし、異なった量のＤＮＡの結合能力と解離能力を評価した。
【０２５４】
2008506385.tif 000062
【０２５５】
実施例３５．同様の溶離量での実施例１３の開裂可能なビーズにおけるＤＮＡ結合の解離
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、スピンカラム（Ｃｏｓｔａｒ）２ｍＬ中のビーズ１０ｍｇに加えた。５分間のインキュベーション後、カラムを１分間遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬで洗浄し、洗浄液を除去した。ビーズを３７℃、５分間、０．５ＭのＮａＯＨ４０μＬでそれぞれの回で洗浄して、ＤＮＡを３回溶離した。各溶離後、蛍光分析とゲル電気泳動分析での分析のために、３０秒間遠心分離して、溶離剤を集めた。初期ＤＮＡの全ては、結合していた。溶離では、それぞれ、６５％、２２％、９％含んでいることがわかった。
【０２５６】
実施例３６．実施例１６の開裂可能な磁性ビーズで大容量でのＤＮＡ結合と少溶離容量での解離
水１ｍＬ、２ｍＬまたは１０ｍＬそれぞれにリニアライズドＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、実施例１６の開裂可能な磁性ビーズ１０ｍｇに加え、３７℃、５分間、０．５ＭのＮａＯＨ２００μＬで上述したように溶離した。１ｍＬと２ｍＬの結合反応からの上澄み液を分析用に約１００μＬに濃縮した。３つのすべての実験からの溶離剤を、同様に蛍光分析でアッセイした。上澄みはＤＮＡを含んでいなかった。全ての溶離剤は、初期ＤＮＡ量の８０％より多くを含んでいた。
【０２５７】
実施例３７．実施例１３のポリマービーズでの細菌培養組織からのＤＮＡ単離
大腸菌を一晩培養した。５０ｍＬ部分を４℃で１５分間、６０００×ｇにて遠心分離し、細胞をペレットした。ペレットは、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．０、１０ｍＭのＥＤＴＡ４ｍＬで再懸濁し、１００μｇ／ｍＬのＲＮａｓｅ  Ａを含んでいた。次に、１％ＳＤＳを含む０．２ＭのＮａＯＨ溶液４ｍＬを混合物に加え、混合物を静かに混合して室温にて４分間静置した。次に、４℃に冷やした３ＭのＫＯＡｃ、ｐＨ５．５  ４ｍＬを加え、溶液を混合し、１０分間静置して、ＳＤＳを沈殿させた。沈殿物をろ過して、ろ過物を集めた。
【０２５８】
水（２００μＬ）で１：１０に希釈した溶解物を実施例１３のビーズ１０ｍｇと混合し、２０分間インキュベートした。細胞溶解物中に精製したｐＵＡ１８、０．３３μｇ／２００μＬの溶液を調製し、また同じビーズ１０ｍｇに結合した。ビーズを結合後、ビーズを遠心分離し、上澄み液を除去した。ビーズサンプルを水２×２００μＬで洗浄し、その後、３７℃、５分間、５ｍＭのＮａＯＨ２００μＬで溶離した。ゲル電気泳動分析により、溶解物からのプラスミドＤＮＡの回復が示された。この溶解物は、ビーズへの結合と解離をコントロールする、または、フリー溶液中にあるプラスミドに一致している。結果を図４に示す。
【０２５９】
実施例３８．実施例１９のポリマービーズでの細菌培養組織からのＤＮＡ単離
実施例３７に上述したのと同様のプロトコールにしたがって、実施例１９のビーズを使用して、前記実施例の細胞溶解物中のＤＮＡを単離した。結果を図４に示す。
【０２６０】
実施例３９．広いｐＨ範囲で効果的な捕捉を示す異なったｐＨ溶液からの実施例１３のビーズのＤＮＡ結合
ｐＨ４．５から９．０の範囲にわたる緩衝液を調製した。ｐＨ４．５から６．５の緩衝液は、１０ｍＭ酢酸塩緩衝液である。ｐＨ７．０から９．０の緩衝液は、１０ｍＭトリス酢酸塩緩衝液である。各緩衝液２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、室温で３０から４５秒間、実施例１３の開裂可能なビーズ１０ｍｇに加えた。各緩衝液でのＤＮＡを含まないネガティブコントロール溶液を並行して実験した。ビーズサンプルを遠心分離後に上澄み液を取り出し、ＵＶと蛍光分析で分析した。
【０２６１】
2008506385.tif 000063
【０２６２】
一方、ｐＨ８．０でビーズ２０ｍｇを使用して５分間結合すると、１００％のＤＮＡ捕捉結果が得られることが分かった。
【０２６３】
実施例４０．異なった塩基溶液を使用する加水分解による開裂可能なビーズからのＤＮＡの解離
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、実施例１３、１８、１９および２０の開裂可能なビーズ１０ｍｇに加え、３７℃、５分間、下記の様々な濃度のＮａＯＨ溶液２００μＬで溶離した。ＫＯＨ溶液とＮＨ４ＯＨ溶液を加えて、実施例１３のビーズを開裂した。全ての実験からの溶離剤をゲル電気泳動分析でアッセイした。試験したすべての加水分解条件で、ＤＮＡの開裂と解離があった。
【０２６４】
2008506385.tif 000064
【０２６５】
実施例４１．実施例８−Ｂｒと８−Ｓの開裂可能なビーズからのＤＮＡの結合と解離
２種類のビ−ズそれぞれのサンプル２５ｍｇを、チューブ中でＴＨＦ５００μＬでリンスした。含有物を遠心分離し、溶液を除去した。リンス工程を水５００μＬで繰りかえした。水５００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ１６μｇを溶解した溶液をビーズに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離して、上澄み液を集めた。ビーズを水２×５００μＬでリンスし、水を除去した。３７℃、１６時間、１ＭのＮａＯＨ５００μＬでビーズをインキュベートし、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離して、蛍光分析のため溶離剤を取り出した。上澄み液はＤＮＡを含んでおらず、全て結合していた。溶離剤は、１８％（８−Ｂｒ）と１２％（８−Ｓ）を含んでいた。
【０２６６】
実施例４２．ＬＭＯ増幅での実施例１３の開裂可能なビーズからの溶離ＤＮＡの使用
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ０．１、または１μｇを含む溶液を、ＴＨＦ４００μＬ、次いで水で２回洗浄した前記ビーズ１０ｍｇに加えた。３０分間のインキュベーション後、サンプルチューブを３０秒間遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×４００μＬで洗浄し、洗浄液を除去した。室温にて１５分間１ＭのＮａＯＨ１００μＬでビーズを洗浄してＤＮＡを溶離し、３０秒間遠心分離して、溶離剤を集めた。各溶離剤の８０μＬ部分を１Ｍ酢酸４０μＬで中和した。
【０２６７】
本発明の重合ビーズを使用して分離したプラスミドＤＮＡを、ＤＮＡを沈殿させることなく直接溶離剤を使用して、米国特許５，９９８，１７５号明細書記載のあるＬＭＯにより増幅した。６８ｂｐの範囲を、一対のプライマーと６８塩基範囲にわたる１セットの８量体を使用するサーモサイクリングプロトコールで増幅した。１２の８量体５’−ホスフェート（６／鎖）、プライマーおよびテンプレート（１μＬ）の１セットを、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ緩衝液中に溶解した。反応チューブを鉱物油５０μＬで覆い、５分間、９４℃に加熱した。約２分後、１００ＵのＡｍｐｌｉｇａｓｅを各チューブに加えた。サンプルを、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、３５℃３０秒間で３５回サイクルした。増幅反応のゲル電気泳動は、予想した分子量のバンドを示した。
【０２６８】
実施例４３．実施例１３の開裂可能なビーズを使用した血液全体からのヒトゲノムＤＮＡの単離
１６のヒト血液サンプル（１〜３ｍＬ）からのペレットした白血球を標準プロトコールで調製し、０．２Ｍトリス、ｐＨ８．０、０．１ＭのＥＤＴＡ、１％ＳＤＳを含む溶解物緩衝液１００μＬ中に懸濁した。プロテナーゼＫ（１０μｇ）を各チューブに加え、チューブを５５℃、４時間インキュベートした。３ＭのＫＯＡｃ（１００μＬ）を各チューブに加え、チューブを静かに反転して混合した。チューブを１３０００ｒｐｍで遠心分離した。上澄み液を取り出して、水で１：２に希釈した。溶液中のＤＮＡを、室温にて２０分間ビーズ１０ｍｇに結合した。結合後、ビーズを遠心分離し、上澄み液を除去した。ビーズサンプルを水２×２００ｍＬで洗浄し、次に３７℃、５分間、５ｍＭのＮａＯＨ２００μＬで溶離した。各溶離剤サンプルをアガロースゲル電気泳動法で分析した。図５は、すべてのサンプルからの高分子量ＤＮＡの回復を示す。
【０２６９】
実施例４４．酵素反応による実施例２４のアクリダンケテンジチオアセタールポリマーにおけるＤＮＡの結合と解離
ビーズのサンプル６０ｍｇをチューブ中でＴＨＦ５００μＬでリンスした。含有物を遠心分離し、溶液を除去した。リンス工程を水４００μＬで繰り返した。水２５０μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、ビーズに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。
【０２７０】
ＨＲＰと過酸化物でアークダイン結合部分を酵素により酸化して、ＤＮＡを溶離した。組成物は、０．０２５Ｍトリス、ｐＨ８．０、４ｍＭのｐ−ヒドロキシコハク酸、２．５ｍＭ過酸化尿素、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５ｍＭのＥＤＴＡ中に１４ｆｍｏｌのＨＲＰを含んでいた。ＨＲＰを欠くコントロール組成物を並行して実験した。組成物とビーズの反応を室温にて１時間行った。溶液について、蛍光アッセイとゲル電気泳動法によりＤＮＡ含量を分析した。上澄み液の分析結果は、ＤＮＡの１００%結合を示した。溶離剤の分析は、ＤＮＡ結合の５２％を酵素反応で溶離したことを示した。コントロールでは、ＤＮＡは溶離されなかった。
【０２７１】
実施例４５．実施例２３のアクリジニウムエステルポリマーでのＤＮＡの結合と解離
ビーズサンプル１００ｍｇを、チューブ中でＴＨＦ１ｍＬでリンスした。含有物を遠心分離し、溶液を除去した。リンス工程を水２×１ｍＬで繰り返した。水５８６μＬにｐＵＣ１８  ＤＮＡ７５μｇを溶解した溶液をビーズに加え、混合物を室温にて２時間静かに振盪した。ＤＮＡを含まないビーズのネガティブコントロールサンプルを並行して実行した。混合物を遠心分離して、上澄み液を集めた。ビーズを水２×１ｍＬでリンスし、水を除去した。上澄み液のＵＶ分析は、ビーズはＤＮＡの１０％と結合していることを示した。１Ｍ過酸化尿素を含む１ＭのＮａＯＨ２００μＬを室温にて３０分間反応させて、ＤＮＡを溶離した。ビーズを溶離剤から分離し、溶離剤を１Ｍ酢酸で中和した。ドットブロットによる中和された溶離剤の分析は、少量のＤＮＡの解離を示した。ネガティブコントロールは、シグナルを示さなかった。
【０２７２】
実施例４６．実施例９のポリマービーズとのＤＮＡの結合
ビーズサンプル１００ｍｇをチューブ中でＴＨＦ１ｍＬでリンスした。含有物を遠心分離し、溶液を除去した。リンス工程を水１ｍＬで２回繰り返した。水１ｍＬにｐＵＣ１８  ＤＮＡ８０μｇを溶解した溶液をビーズに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離し、上澄み液をＵＶ分析のため集めた。上澄み液はＤＮＡ６６μｇを含んでいた。次に、結合能力を０．１４μｇ／ｍｇと決定した。
【０２７３】
実施例４７．実施例１３の開裂可能なビーズからのＲＮＡの結合と解離
２つのチューブで、ルシフェラーゼＲＮＡ２μｇをビーズ１０ｍｇに結合した。溶離のために、１ｘ逆転写酵素緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５、８ｍＭのＭｇＣｌ２、３０ｍＭのＫＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）を使用した。１つのチューブを９４℃、５分間加熱し、もうひとつのチューブを９４℃、３０分間加熱した。溶離剤とコントロールを１％アガロースゲルで実験し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）で染色した。５分間の加熱でビーズから５０％のＲＮＡの溶離を示したが、３０分の加熱ではＲＮＡの変性を示した。
【０２７４】
実施例４８．異なった開裂可能／溶離緩衝液による実施例１３の開裂可能なビーズからのＲＮＡの結合と解離
３つのチューブで、ルシフェラーゼＲＮＡ１μｇをビーズ１０ｍｇに結合した。１つのチューブでは、３Ｍ酢酸カリウムを使用して、室温にて３０分間でＲＮＡを溶離した。もう一つのチューブでは、１ｘ逆転写酵素緩衝液(室温)を使用して、９４℃、１分間で溶離した。３番目のチューブでは、ＲＮＡ抽出緩衝液を使用し、９４℃、１分間加熱した。ＲＮＡ抽出緩衝液は、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、０．１４ＭのＮａＣｌ、１．５ＭのＭｇＣｌ２、０．５％ＮＰ−４０、１ｍＭのＤＴＴからなる。すべての溶離剤とコントロールを１％アガロースゲルで実験し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（登録商標）で染色した。３Ｍ酢酸カリウムは、認識できるＲＮＡを生成しなかった。１ｘ逆転写酵素緩衝液とＲＮＡ抽出緩衝液の両方とも、約５０％溶離に対応するＲＮＡを含むと判断される結合を示した。
【０２７５】
実施例４９．実施例１３の開裂可能なビーズからのＲＮＡの結合と解離と化学ルミネッセンスブロットアッセイによる検出
４つのチューブで、ルシフェラーゼＲＮＡ１μｇをビーズ１０ｍｇに結合した。２つのチューブでは、溶離のために１ｘ逆転写酵素緩衝液を使用し、他の２つのチューブでは、ＲＮＡ抽出緩衝液を使用した。各種の緩衝液の１つのチューブでは、９４℃、１分間加熱した。残りの２つのチューブでは、９４℃、５分間加熱した。すべての溶離剤とコントロールを１％アガロースゲルで実験し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで染色した。各緩衝液で、１分間加熱したほうが、５分間加熱するより多くのＲＮＡを含んでいた。ＲＮＡ抽出緩衝液は、１ｘ逆転写酵素緩衝液より多くＲＮＡを溶離した。一晩のキャピラリートランスファーで、ＲＮＡをナイロンメンブランに転写した。ＲＮＡをＨＦ−１ビオチン標識プライマーと一晩ハイブリッド形成した。化学ルミネッセンス基質としてアンチビオチンＨＲＰとＬｕｍｉｇｅｎ  ＰＳ−３で検出した。５分間の曝露で、ゲルが得られることを実証した。
【０２７６】
実施例５０．様々な温度での実施例１３の開裂可能なビーズからのＲＮＡの結合と解離
６つのチューブで、ルシフェラーゼＲＮＡ１μｇをビーズ１０ｍｇに結合した。ＲＮＡ抽出緩衝液を、いくつかの異なる温度、４０℃、５０℃、６０℃、７０℃、８０℃、および９０℃で、５分間ＲＮＡを溶離するために使用した。すべての溶離剤とコントロールを１％アガロースゲルで実験し、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎで染色した。全ての温度で、１００％溶離を示した。
【０２７７】
実施例５１．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズとリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡの結合と異なった溶離組成物での解離
ビーズサンプル１０ｍｇをチューブ中でＴＨＦ５００μＬでリンスした。含有物を遠心分離し、液体を除去した。リンス工程を水２００μＬで繰り返した。水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液をビーズに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。下記表の様々な試薬組成物２００μＬで、室温にて２０分間ビーズをインキュベートして、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離し、実施例２６に示したように、蛍光分析のため溶離剤を取り出した。
【０２７８】
2008506385.tif 000065
【０２７９】
実施例５２．実施例５１の結合と解離のプロトコールは、下記表に示した試薬組成物に従った。ＤＴＴまたは２−メルカプトエタノールの濃度変化の効果を試験した。
【０２８０】
2008506385.tif 000066
【０２８１】
実施例５３．実施例５１の結合と解離のプロトコールは、下記表に示した試薬組成物に従った。ＮａＣｌとＫＣｌの塩濃度変化の効果を試験した。
【０２８２】
2008506385.tif 000067
【０２８３】
実施例５４．実施例５１の結合と解離のプロトコールは、下記表に示した試薬組成物に従った。ビーズを６０分間溶離した。
【０２８４】
2008506385.tif 000068
【０２８５】
実施例５５．実施例５１の結合と解離のプロトコールは、下記表に示した試薬組成物に従った。相対的な効果をスコアにした。
【０２８６】
2008506385.tif 000069
【０２８７】
実施例５６．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズと異なった長さのオリゴヌクレオチドの結合と試薬組成物による解離
実施例５１の結合と解離のプロトコールを、２０塩基から２．７キロ塩基の範囲の様々なサイズのオリゴヌクレオチドで実験した。溶離組成物は、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、０．７５ＭのＮａＣｌ、５％ＤＴＴであった。ＤＮＡの量を、ｓｓＤＮＡの蛍光染色であるＯｉｌＧｒｅｅｎを使用して、蛍光分析で決定した。
【０２８８】
2008506385.tif 000070
【０２８９】
実施例５７．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズとリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡの結合と異なった溶離容量での解離
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、スピンカラム（Ｃｏｓｔａｒ）２ｍＬ中のビーズ１０ｍｇに加えた。２０分間のインキュベーション後、カラムを遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００ｍＬで洗浄し、洗浄液を除去した。室温にて５分間、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、０．７５ＭのＮａＣｌ、５％ＤＴＴ  ５×２００μＬでビーズを洗浄して、ＤＮＡを溶離した。各溶離後、蛍光分析とゲル電気泳動法による分析のために遠心分離して溶離剤を集めた。
【０２９０】
同様の方法で、ＤＮＡ結合を含むビーズを同じ溶離緩衝液５×４０μＬで溶離した。
【０２９１】
2008506385.tif 000071
【０２９２】
実施例５８．実施例５のトリブチルアンモニウムビーズと核酸の結合と解離
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、ビーズ１０ｍｇに加え、混合物を３０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離して、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。室温にて３０分間、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、０．７５ＭのＮａＣｌ、５％ＤＴＴ  ２００μＬでビーズをインキュベートし、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離し、実施例２６に示したように蛍光分析のために溶離剤を取り出した。ＤＮＡ結合は５０％、溶離は結合部分の６９％であった。
【０２９３】
実施例５９．実施例７の磁性トリブチルホスホニウムビーズと核酸の結合と解離
ビーズサンプル１０ｍｇをチューブ中でＴＨＦ５００μＬでリンスした。含有物を磁性的に分離し、溶液を除去した。リンス工程を水２００μＬで繰り返した。水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液をビーズに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を磁性的に分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００ｍＬでリンスし、水を除去した。室温にて３０分間、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、１．２５ＭのＮａＣｌ、１５％２−プロパノール  ２００μＬでビーズをインキュベートし、ＤＮＡを溶離した。混合物を磁性的に分離し、実施例２６に示したように蛍光分析のために溶離剤を取り出した。ＤＮＡ結合は１００％、溶離は１８％であった。
【０２９４】
実施例６０．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズとリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡの結合と異なった溶離温度での解離
水２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、ビーズ１０ｍｇに加え、混合物を３０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離して、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。様々な温度：３７℃、４６℃、６５℃、および９４℃で、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、１．２５ＭのＮａＣｌ、１５％２−プロパノール  ２００μＬで、５分間ビーズをインキュベートし、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離し、実施例２６に示したように蛍光分析のために溶離剤を取り出した。すべての温度で、ＤＮＡ結合は１００％、溶離は結合部分の約６５−７０％であった。
【０２９５】
実施例６１．プラスミドＤＮＡ結合のＰＣＲ増幅と実施例１のビーズからの解離
実施例５１のプロトコールに従って、０．５ＭのＮａＯＨ中の溶離プラスミドＤＮＡ  １μＬを、２８５塩基範囲にわたる一対のプライマーで、ＰＣＲ増幅した。ＰＣＲ反応混合物は、下記表の成分を含む。
【０２９６】
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【０２９７】
ネガティブコントロールとして０．５ＭのＮａＯＨ１μＬまたは２μＬ、または水１μＬで反応混合物中のテンプレートと交換した。さらに反応は、水で１：１０に希釈した１μＬのテンプレートを使用した。混合反応を、９４℃１分間、６０℃１分間、７２℃１分間を２２回サイクルに供した。反応生成物について１％アガロースゲルで実験し、ビーズから溶離したＤＮＡは、そこなわれていないことを示した。
【０２９８】
実施例６２．実施例１のトリブチルホスホニウムビーズと核酸の結合とヴィティヒ反応による解離
水２００μＬにｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、実施例１のビーズ１０ｍｇに加え、混合物を２０分間静かに振盪した。混合物を遠心分離して、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。ビーズをＤＭＦ５×４００μＬで洗浄した。ＤＭＦ（３００μＬ）中のＮａＯｔ−Ｂｕの飽和溶液とアセトン２０μＬを２０分間ビーズと振盪した。混合物を遠心分離し、溶液を除去した。ビーズをＤＭＦ３×４００μＬで洗浄し、最終洗浄後溶液を除去した。１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５  ２００μＬで、５分間ビーズを振盪してＤＮＡを溶離し、溶液を集めた。このプロセスを緩衝液の新鮮な部分で２回繰り返した。
【０２９９】
実施例６３．ヴィティヒ解離ＤＮＡのドットブロット分析
ヴィティヒ反応後の実施例６２の３つの溶離の部分（１μＬ）をナイロンメンブランにドットブロットして分析した。メンブランにつけたＤＮＡをＵＶ架橋し、２ｘ  ＳＳＣ緩衝液でリンスした。メンブランを３７℃、１．５時間、Ｄｉｇ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ（登録商標）緩衝液（ロシュ社）５ｍＬで、プレハイブリッド形成した。３０量体プローブで標識したジゴキシゲニンを３７℃、Ｄｉｇ  Ｅａｓｙ  Ｈｙｂ緩衝液中で一晩中、ハイブリッド形成した。１時間２％ＢＭブロック溶液（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中のアンチ−ジゴキシゲニンＨＲＰ接合（１：１００００希釈）で、ハイブリッド形成したプローブを捕らえた。Ｌｕｍｉｇｅｎ  ＰＳ−３でメンブランを湿らせてＨＲＰ標識を検出し、Ｘ線フィルムに曝した。ＤＮＡを１０、５および２．５ｎｇ含む標準物を、結合段階からの溶離サンプル及び上澄み液と並行して分析した。図６は、最初の溶離で最大量のＤＮＡ結合が除去され、さらに第二、第三の溶離ではより少量が除去されることを示した。上澄み液（非表示）の分析は、すべてのＤＮＡがビーズと結合していることを示した。１００℃で溶離した解離ＤＮＡでの同様の実験では、同じ結果になった。
【０３００】
実施例６４．実施例６２のプロトコールでの解離ＤＮＡの除去における反応時間の効果
実施例６２のプロトコールを、アセトンとのヴィティヒ反応の反応時間を緩和して行った。分離実験で反応時間は、１０分、２０分、３０分および６０分を使用した。実施例Ｗ２に示したドットブロット分析では、反応時間に関係なく同様の結果を示した。
【０３０１】
実施例６５．実施例３のトリメチルホスホニウムビーズと核酸の結合とヴィティヒ反応による解離
実施例３のビーズをＤＮＡと結合するために使用し、実施例６２に示した一般的な方法であるヴィティヒ反応で解離した。結合工程からの上澄み液のＵＶ分析は、ＤＮＡの７８％が捕捉されることを示した。トリブチルホスホニウムビーズの結合能力が０．２μｇ／ｍｇより大きいことと比較して、結合能力は、０．１５６μｇ／ｍｇであった。トリブチルホスホニウムビーズと同様に、最初の溶離で最大量のＤＮＡがビーズから除去された。
【０３０２】
実施例６６．実施例４のトリフェニルホスホニウムビーズと核酸の結合とヴィティヒ反応による解離
実施例４のビーズを、ビーズ２５ｍｇ中のＤＮＡ１７μｇに結合するために使用し、実施例６２に示した一般的な方法であるヴィティヒ反応で解離した。結合工程からの上澄み液のＵＶ分析は、ＤＮＡの１４％が捕捉されることを示した。結合能力は、０．０９５μｇ／ｍｇであった。トリブチルホスホニウムビーズと同様に、最初の溶離で最大量のＤＮＡがビーズから除去された。
【０３０３】
実施例６７．実施例７の磁性トリブチルホスホニウムビーズと核酸の結合とヴィティヒ反応による解離
実施例６２のプロトコールを次のように修正した。すべての分離工程を磁性的に行った。有機溶媒と洗浄液をＤＭＦの代わりにＴＨＦを使用した。ＴＨＦ／ＮａＯｔ−Ｂｕ溶液の容量は、２５０μＬであった。解離ＤＮＡをトリス緩衝液で１５分間３回洗浄して、溶離した。溶離剤と上澄み液をＰｉｃｏＧｒｅｅｎの蛍光アッセイで分析した。上澄み液の分析では、粒子への１００％結合を示した。蛍光アッセイでは、最初の溶離で３２％の溶離を示した。後の溶離では、この方法ではあまりに少なくＤＮＡを検出しなかった。比較して、実施例１の非磁性ビーズでは、最初の溶離で３１％ＤＮＡを示し、その後の溶離ではあまりに少なく検出しなかった。
【０３０４】
実施例６８．ＬＭＯとＰＣＲ増幅で直接に実施例１６の開裂可能なビーズから溶離したＤＮＡの使用
１０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、２００μＬ中のヒト血液全体から単離したゲノムＤＮＡ４μｇを含む溶液を、ビーズ２０ｍｇに加えた。５分間のインキュベーション後、サンプルチューブを３０秒間遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬで洗浄し、洗浄液を除去した。３７℃、５分間、０．５ＭのＮＨ４ＯＨ１００μＬでビーズを洗浄し、３０秒間遠心分離し、溶離剤を集めることにより、ＤＮＡを溶離した。
【０３０５】
本発明のポリマービーズを使用して単離したＤＮＡを、中和なしで増幅するか、あるいは米国特許５，９９８，１７５号明細書に記載されたようにＬＭＯによりサンプルを前処理することにより増幅した。ファクターＶ遺伝子のセグメントに対応するアンプリコンを準備した。これは、一対のプライマーを使用するサーモサイクリングプロトコールにより５１塩基セグメントと４８塩基補体（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）を有し、プライマーの一つは、６−ＦＡＭで標識した５’−であり、２つの８量体と２つの１０量体のセットである。プライマーとテンプレート（１μＬ）をＴａｑ  ＤＮＡリガーゼ緩衝液に溶解した。反応チューブを鉱物油４０μＬで覆い、５分間、９４℃に加熱した。次いで、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼの２０Ｕを各チューブに加えた。サンプルを、９４℃３０秒間、５５℃３０秒間、３８℃３０秒間で４０回サイクルした。
【０３０６】
増幅反応の化学蛍光ハイブリッド形成アッセイを行った。激しいタイプの増幅の用の捕捉プローブをマイクロプレートウエルに固定し、ＦＡＭ標識を含む増幅生成物にハイブリッド形成するために使用した。アンチＦＩＴＣ−アルカリホスファターゼ接合を結合し、Ｌｕｍｉ−Ｐｈｏｓ  Ｐｌｕｓで検出した。各遺伝子型の血液サンプルからのＤＮＡと水ブランクを、並行して、ＬＭＯ、ハイブリッド形成および検出工程を実行した。５０％回復したビーズ処理サンプルの量と等しくなるように、既知のコントロール中のＤＮＡの量を選んだ。サンプルは、明らかにホモ接合ｗｔ型であった。
【０３０７】
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【０３０８】
実施例６９．ジメチルスルホニウム基とアリールチオエステル結合を有するポリメタクリレートポリマーの合成
【０３０９】
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【０３１０】
上述のように調製したポリメタクリロイルクロライド樹脂（２．９６ｇ）、４−（メチルチオ）チオフェノール５．０７ｇとトリエチルアミン（８．８ｍＬ）を、室温にてアルゴン下で５日間、ジクロロメタン１００ｍＬ中で攪拌した。固形物をろ過し、ジクロロメタン１００ｍＬと水１００ｍＬで洗浄し、次に、メタノール１２５ｍＬ中で数日間攪拌した。ろ過して乾燥して、チオエステル生成物３．７６ｇを得た。
【０３１１】
ジクロロメタン１００ｍＬ中の固形物の部分２．８９ｇをメチルトリフレート４．１ｍＬ中で７日間攪拌した。固形物をろ過し、続けてジクロロメタン２００ｍＬ、メタノール３００ｍＬおよびジクロロメタン３００ｍＬで洗浄し、次に、風乾した。
【０３１２】
実施例７０．ジメチルスルホニウム基を有する開裂可能なビーズを使用するＤＮＡの結合と解離
１０ｍＭトリス、ｐＨ８  ２００μＬにリニアライズドｐＵＣ１８  ＤＮＡ２μｇを溶解した溶液を、実施例６９のビーズサンプル１０ｍｇに加え、混合物を５分間静かに振盪した。混合物を遠心分離し、上澄み液を集めた。ビーズを水２×２００μＬでリンスし、水を除去した。３７℃で５分間０．５ＭのＮａＯＨ水溶液２００μＬでビーズをインキュベートして、ＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離して、蛍光分析のため溶離剤を取り出した。上澄み液はＤＮＡを含んでいなかった。溶離剤は、初期のＤＮＡ結合の１００％を含んでいた。
【０３１３】
実施例７１．ジメチルスルホニウム基を有する開裂可能なビーズを使用するＤＮＡの結合と解離
３７℃、５分間、５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５、０．７５ＭのＮａＣｌ、５％ＤＴＴ、２００μＬでインキュベートして、実施例７０に示したようにビーズに結合したＤＮＡを溶離した。混合物を遠心分離して、蛍光分析のため溶離剤を取り出した。上澄み液はＤＮＡを含んでいなかった。溶離剤は、初期の結合ＤＮＡの３７％を含んでいた。
【０３１４】
前述の記載や例は、一つの実施例であって、何ら制限されるものではない。本発明の意図および範囲からはずれなければ、特に開示されていない特定の化合物や方法への変更もできる。本発明の範囲は、添付した請求項によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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