(57)【要約】本発明は、作動可能に連結された転写ユニットの発現のレベルを改良し得る遺伝子エレメントに関する。特に、この遺伝子エレメントは、リボソームタンパク質遺伝子の５’非翻訳領域に由来し、そしてＣｐＧアイランドを含み得る。この遺伝子エレメントを含むベクターおよび宿主細胞、ならびに高レベルの組み換え遺伝子発現を得るための使用の方法もまた開示される。本発明はまた、細胞培養およびその他の生物工学適用における組み換えタンパク質の産生のための、このようなポリヌクレオチド配列を含むベクター、このようなベクターを含む宿主細胞、およびこのようなポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の治療における使用に関する。
2008539781.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたポリヌクレオチドであって、
ａ）リボソームタンパク質遺伝子のプロモーター領域からの少なくとも５００の連続するヌクレオチドを含むエレメント、
ｂ）異質プロモーター、
ｃ）該異質プロモーターに隣接する転写可能な核酸配列を含み、
ここで、該転写可能な核酸配列が、該異質プロモーターから転写され、そして該転写のレベルが該エレメントによって増大される、ポリヌクレオチド。
【請求項２】
前記リボソームタンパク質遺伝子が、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２からなるリストから選択される、請求項１に記載のポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記リボソームタンパク質遺伝子が、ＲＰＳ３またはＲＰＳ１１である、請求項１または２に記載のポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記エレメントが、前記リボソームタンパク質遺伝子からのプロモーター領域から少なくとも１０００の連続するヌクレオチドを含む、請求項１または３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記エレメントが、前記リボソームタンパク質遺伝子の１つ以上のエキソンを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項６】
前記エレメントが、ＣｐＧアイランドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項７】
前記エレメントが、拡大されたＣｐＧアイランドを含む、請求項５に記載のポリヌクレオチド。
【請求項８】
前記エレメントが、拡大されたメチル化のないＣｐＧアイランドを含む、請求項６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記リボソームタンパク質遺伝子が、哺乳動物遺伝子である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
前記リボソームタンパク質遺伝子が、マウス遺伝子である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１１】
配列番号１のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１２】
配列番号２のヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１３】
前記リボソームタンパク質遺伝子が、ヒト遺伝子である、請求項９に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１４】
前記異質プロモーターが、構成的プロモーターである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１５】
前記構成的プロモーターが、サイトメガロウイルス初期／即時プロモーター、ＳＶ４０、ＥＦ−１α、ラウスザルコーマウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲおよびＨＩＶ２  ＬＴＲからなるリストから選択される、請求項１４に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１６】
前記異質プロモーターが、組織特異的プロモーターである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１７】
前記異質プロモーターが、腫瘍特異的プロモーターである、請求項１６に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１８】
前記プロモーターが、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、チロシナーゼ、およびＴ細胞因子１−４（ＴＣＦ）−を基礎にしたプロモーターからなるリストから選択される、請求項１７に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１９】
前記転写可能な核酸が、抗体、抗体の機能的エピトープ結合性フラグメント、成長因子、サイトカイン、プロテインキナーゼ、可溶性レセプター、膜結合レセプター、血液凝固因子などから選択されるポリペプチドをコードする、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２０】
請求項１〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項２１】
請求項２０に記載の真核生物発現ベクター。
【請求項２２】
真核生物発現ベクターであって、
ａ）リボソームタンパク質遺伝子のプロモーター領域からの少なくとも５００の連続するヌクレオチドを含むエレメント、
ｂ）異質プロモーター、
ｃ）複数クローニング部位、を含み、
ここで、該複数クローニング部位中に挿入された転写可能な核酸が、該異質プロモーターから転写され得、そして該転写のレベルが該エレメントによって増大される、ベクター。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載の単離されたポリヌクレオチド、または請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項２４】
前記細胞が、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２からなるリストから選択される、請求項２３に記載の宿主細胞。
【請求項２５】
請求項２１または請求項２２のいずれかに記載の発現ベクターを適切な宿主細胞に挿入する工程、および該宿主細胞を発現を可能にするに適切な条件で培養する工程、を包含する、ポリペプチドを発現する、方法。
【請求項２６】
前記ポリヌクレオチドが、治療に有用なポリペプチドである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜１９のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド、請求項２０〜２２のいずれか１項に記載のベクター、または請求項２３もしくは請求項２４のいずれか１項に記載の宿主細胞、および薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、緩衝物または培地を含む、薬学的調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
本発明は、作動可能に連結された転写ユニットに対して改良された発現を与えるエレメントを含むポリヌクレオチドに関する。これらのエレメントは、リボソームタンパク質遺伝子のプロモーター領域と自然に連結され、そして組み換えＤＮＡ構築物において、高く、かつ再現性あるレベルの遺伝子発現を与える。本発明はまた、細胞培養およびその他の生物工学適用における組み換えタンパク質の産生のための、このようなポリヌクレオチド配列を含むベクター、このようなベクターを含む宿主細胞、およびこのようなポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞の治療における使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
高等真核生物におけるクロマチン構造の現在のモデルは、遺伝子が「ドメイン」中に組織化されていると仮定している（非特許文献１；非特許文献２）。クロマチンドメインは、圧縮され、「閉鎖された」、転写サイレントな状態か、または圧縮を解かれた「開放され」そして転写能力のある形態のいずかで存在すると認識されている。増加したＤＮアーゼＩ感受性、ＤＮＡ低メチル化およびヒストン高アセチル化によって特徴付けられる開放クロマチン構造の確立は、遺伝子発現の開始の必要条件と考えられる。
【０００３】
クロマチン領域の開放および閉鎖性質は、宿主細胞ゲノム中にランダムに組み込まれる導入遺伝子の挙動に反映される。同一の構築物は、マウスゲノム中の異なる位置に組み込まれるとき、組織特異的および発生ステージ特異的な発現の異なるパターンを与える（非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５）。
【０００４】
遺伝子組織化のクロマチンドメインモデルは、転写能力のある開放クロマチン構造を確立および維持し得る遺伝子制御エレメントは、ゲノムの活性領域と連結されるべきであることを示唆している。
【０００５】
遺伝子座制御領域（ＬＣＲ）は、長い範囲のクロマチン再構築（ｒｅｍｏｄｅｌｌｉｎｇ）能力を備えた転写調節エレメントのクラスである。ＬＣＲは、トランスジェニックマウスにおいて、シスで連結される遺伝子、特に単一コピー導入遺伝子に対し、組み込みの部位に独立で導入遺伝子コピー数に依存する発現の生理学的レベルを与えるそれらの能力によって機能的に規定される。非特許文献６；非特許文献７。決定的に、このような発現は組織特異的である。ＬＣＲは、ヘテロクロマチンの拡がりを妨害し得、ＰＥＶを防ぎ（非特許文献８）、そしてそれらが調節する遺伝子の５’または３’のいずれかに位置され得る一連のＤＮアーゼＩ超感受性（ＨＳ）部位からなる（非特許文献９）。
【０００６】
高レベルの治療タンパク質産物を産生する培養された哺乳動物細胞株の生成は、主要な開発中の産業である。クロマチン位置効果は、それを困難な時間を浪費し、そして高価なプロセスにする。このような哺乳動物「細胞工場」の産生への最も一般的に用いられるアプローチは、薬物耐性遺伝子（例えば、ＤＨＦＲ、グルタミンシンセターゼ）（非特許文献１０）とストリンジェントな選択圧との組み合わせによって誘導される遺伝子増幅に依存する。適切な組織由来の細胞を用いる高度に発現された遺伝子ドメインからのＬＣＲを含むベクターの使用は、上記手順を大いに単純にし、安定な高レベルの発現を示す大きな比率のクローン細胞株を与える（非特許文献１１；非特許文献１２）。
【０００７】
しかし、ＬＣＲの組織特異性は、いくつかの状況では有用であるが、多くの適用にはまた主要な制限であり、例えば、ＬＣＲが、発現が要求されている組織について未知である場合、または多くの、もしくはすべての組織で発現が要求されている場合である。
【０００８】
本明細書中に参考として援用される特許文献１および同時継続中の特許文献２は、専ら遍在的に発現されるハウスキーピング遺伝子からなる遺伝子座を横切る開放クロマチン構造を確立するために、それらの天然の染色体の脈絡で応答性であるエレメントを記載している。これらのエレメントは、ＬＣＲに由来せず、そして拡大されたメチル化のないＣｐＧアイランドを含む。
【０００９】
哺乳動物ＤＮＡにおいて、ジヌクレオチドＣｐＧは、シトシンを５−メチルシトシンにメチル化するＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素によって認識される。しかし、５−メチルシトシンは不安定であり、そしてチミンに変換される。結果として、ＣｐＧジヌクレオチドは、偶然に予期され得るよりかなりより低い頻度で生じる。それにもかかわらず、ゲノムＤＮＡのいくつかのセクションは、予期されるのにより近いＣｐＧの頻度を有し、そしてこれらの配列は、「ＣｐＧアイランド」として知られている。本明細書で用いられるとき「ＣｐＧアイランド」は、少なくとも５０％のＧＣ含量を有し、そして少なくとも０．６の観察／期待ＣｐＧ含量比（すなわち、偶然に予期され得るＣｐＧジヌクレオチド含量の少なくとも６０％のＣｐＧジヌクレオチド含量）（非特許文献１３；非特許文献１４）を有する、少なくとも２００ｂｐのＤＮＡの配列として規定される。
【００１０】
メチル化のないＣｐＧアイランドは、当該技術分野で周知であり（非特許文献１５：非特許文献１６）、そしてシトシン残基の実質的部分がメチル化されておらず、そして、通常、２つの緊密に間隔を置かれた（０．１〜３ｋｂ）多様に転写される遺伝子の５’末端上に延びるＣｐＧアイランドとして規定され得る。ＤＮＡのこれらの領域は、発生を通じてすべての組織でメチル化の程度が低いままであると報告されている（非特許文献１７）。これらはしばしば、遍在的に発現される遺伝子の５’末端と結合し、そして遺伝子の推定される４０％が組織に限定される発現プロフィールを示し（非特許文献１８；非特許文献１９）、そして活性クロマチンの局在化された領域であることが知られている（特許文献２０）。
【００１１】
「拡大された」メチル化のないＣｐＧアイランドは、１つ以上の転写開始部位を包含する領域を横切って延び、そして／または３００ｂｐを超え、そして好ましくは５００ｂｐを超えて延びるメチル化のないＣｐＧアイランドである。拡大されたメチル化のないＣｐＧアイランドの境界は、認識配列におけるＤＮＡを消化（切断）するそれらの能力が、存在する任意のＣｐＧ残基のメチル化状態に感受性である制限エンドヌクレアーゼ酵素と組み合わせ、その領域上のＰＣＲの使用を通じて機能的に規定される。１つのこのような酵素はＨｐａＩＩであり、これは、ＣｐＧアイランド内で共通して見出される部位ＣＣＧＧを認識し、そして消化するが、これは、中央ＣＧ残基がメチル化されていない場合のみである。それ故、ＨｐａＩＩ消化ＤＮＡとともに、ＨｐａＩＩ部位を宿す領域上で行われるＰＣＲは、ＤＮＡがメチル化されていない場合ＨｐａＩＩ消化に起因して増幅産物を与えない。このＰＣＲは、ＤＮＡがメチル化されている場合に増幅された産物を与えるに過ぎない。それ故、メチル化のない領域を超えて、ＨｐａＩＩは、このＤＮＡを消化せず、ＰＣＲ増幅産物が観察され、それによって「拡大された、メチル化のないＣｐＧアイランド」の境界を規定する。
【００１２】
ヒトＴＡＴＡ結合タンパク質（ＴＢＰ）／プロテオソーム成分−Ｂ１（ＰＳＭＢＩ）から二重に分岐して転写されるプロモーターおよび異質各リボヌクレオタンパク質Ａ２／Ｂ１（ｈｎＲＮＰＡ２）／ヘテロクロマチンタンパク質１Ｈｓγ（ＨＰ１Ｈｓγ）遺伝子の遺伝子座を包含するメチル化のないＣｐＧアイランドに広がる領域は、再現性のある生理学的レベルの遺伝子発現を与え、しかも、それらは、多彩な発現パターン、およびセントロメアヘテロクロマチン内の導入遺伝子組み込みととも通常生じるサイレンシングを防ぎ得ることが示されている（特許文献２）。
【００１３】
活性に転写するプロモーターと連結されるメチル化のないＣｐＧアイランドは、クロマチンを再構築する能力を有し、そしてそれ故、ハウスキーピング遺伝子における開放ドメインを確立し、そして維持する主な決定因子であり（特許文献２）、しかも、このようなエレメントは、導入遺伝子発現のレベルおよび安定性における改良とともに増加した比率の生産的遺伝子送達を与えることが知られている。
【００１４】
リボソームは、ｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を担う大きなＲＮＡとタンパク質との複合体である。各リボソームは、４つのリポソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）分子と多数のリポソームタンパク質（現在哺乳動物細胞では７９であると考えられている）を含む。リボソームタンパク質は、ｒＲＮＡ折り畳みの促進、細胞リボヌクレアーゼからの保護、および協調するタンパク質合成を含む機能を有する。いくつかのリボソームタンパク質は、さらなる特別のリボソーム機能を有している（非特許文献２１）。種を横切るリボソームの構造的および機能的類似性を考えると、リボソームタンパク質のアミノ酸配列保存性が高く、そして哺乳動物の間で、大部分のリボソームタンパク質の配列がほとんど同じである（非特許文献２２）ことは驚くことではない。
【００１５】
２つのリボソームタンパク質は、それらが、ユビキチンに融合されたプロペプチド（カルボキシ−伸長タンパク質）の形態で発現される点で異型性に見える。ユビキチンは、細胞内タンパク質分解、細胞周期調節およびストレス応答を含む種々の細胞機能に関与する高度に保存された７６残基のポリペプチドである（非特許文献２３；非特許文献２４）。
【００１６】
ユビキチンは、２つの別個のクラスの遺伝子によってコードされる。１つは、ユビキチン繰り返しの線状ポリマーをコードするポリユビキチン遺伝子である。他方は、単一のユビキチン分子がリボソームタンパク質ｒｐｓ２７ＡまたはｒｐＬ４０に連結される天然の融合タンパク質をコードする遺伝子を含む（非特許文献２５；特許文献２６；特許文献２７）。
【００１７】
リボソームタンパク質プロモーターの共通の構造的特徴は、Ｐｅｒｒｙ（非特許文献２８）によって論議されている。これらのプロモーターは、ＴＡＴＡボックス成分の性質、転写因子結合部位の数およびタイプ、ならびにＡＵＧ開始コドンの位置に従って分類され得る。しかし、このような分類は、プロモーター強度を予見するようには見えず、そして証拠は、試験されたいくつかのこのようなプロモーターは、連結されたレポーター遺伝子の発現によって測定されるとき等価な転写活性を有することを示唆している（非特許文献２９）。
【００１８】
特許文献３は、ハムスター−ユビキチン／Ｓ２７ａプロモーターの組み換えタンパク質の高レベル産生を駆動するその使用を開示している。しかし、さらなるプロモーター（すなわち、ハムスター−ユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター以外のプロモーター）から主に転写される遺伝子の発現を増大するためのその使用の示唆はない。
【００１９】
米国特許出願第２００４／０１４８６４７号は、目的の産物のための遺伝子および蛍光タンパク質レポーターに機能的に連結されたハムスターユビキチン／Ｓ２７Ａプロモーターを含む発現ベクターを用いるレポーターアッセイを開示する。ここで再び、この出願は、目的の遺伝子の転写が、ハムスターユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター自体からである構築物を開示しているに過ぎない。
【特許文献１】米国特許第６，６８９，６０６号明細書
【特許文献２】国際公開第００／０５３９号パンフレット
【特許文献３】米国特許第６，０６３，５９８号明細書
【非特許文献１】Ｄｉｌｏｎ、Ｎ．＆  Ｇｒｏｓｖｅｄ、Ｆ．、真核生物遺伝子機能の潜在的なユニットとしてクロマチンドメイン。Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．４、２６０〜２６４（１９９４）
【非特許文献２】Ｈｉｇｇｓ．Ｄ．Ｒ．、ＬＣＲは、クロマチンドメインを開くのか？Ｃｅｌｌ  ９５、２９９〜３０２（１９９８）
【非特許文献３】Ｐａｌｍｉｔｅｒ、Ｒ．Ｄ．＆Ｂｒｉｎｓｔｅｒ、Ｒ．Ｌ．、Ａｎｎ．Ｒｅｆ．Ｇｅｎｅｔ．２０、４６５〜４９９（１９８６）
【非特許文献４】Ａｌｌｅｎ、Ｎ．Ｄ．ら、Ｎａｔｕｒｅ  ３３３、８５２〜８５５（１９８８）
【非特許文献５】Ｂｏｎｎｅｒｏｔ、Ｃ．、Ｇｒｉｍｂｅｒ、Ｇ．Ｂｒｉａｎｄ、Ｐ．＆Ｎｉｃｏｌａｓ、Ｊ．Ｆ．、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：６３３１〜６３３５（１９９０）
【非特許文献６】Ｆｒａｓｅｒ、Ｐ．＆  Ｇｒｏｓｖｅｄ、Ｆ．、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１０、３６１〜３６５（１９９８）
【非特許文献７】Ｌｉ、Ｑ．、Ｈａｒｊｕ、Ｓ．＆  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｋ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５：４０３〜４０８（１９９９）
【非特許文献８】Ｋｉｏｕｓｓｉｓ、Ｄ．＆  Ｆｅｓｔｅｎｓｔｅｉｎ、Ｒ．Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．７、６１４〜６１９（１９９７）
【非特許文献９】Ｌｉ、Ｑ．、Ｈａｒｊｕ、Ｓ．＆  Ｐｅｔｅｒｓｏｎ、Ｋ．Ｒ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１５：４０３〜４０８（１９９９）
【非特許文献１０】Ｋａｕｆｍａｎ  ＲＪ．Ｍｅｔｈｏｄ  Ｅｎｚｙｍｏｌ  １８５、５３７〜５６６（１９９０）
【非特許文献１１】Ｎｅｅｄｈａｍ  Ｍ、Ｇｏｏｄｉｎｇ  Ｃ、Ｈｕｄｓｏｎ  Ｋ、Ａｎｔｏｎｉｏｕ  Ｍ、Ｇｒｏｓｖｅｌｄ  ＦおよびＨｏｌｌｉｓ  Ｍ．、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０、９９７〜１００３（１９９２）
【非特許文献１２】Ｎｅｅｄｈａｍ  Ｍ、Ｅｇｅｒｔｏｎ  Ｍ、Ｍｉｌｌｅｓｔ  Ａ、Ｅｖａｎｓ  Ｓ、Ｐｏｐｐｌｅｗｅｌｌ  Ｍ、Ｃｅｒｉｌｌｏ  Ｇ、ＭｃＰｈｅａｔ  Ｊ、Ｍｏｎｋ  Ａ、Ｊａｃｋ  Ａ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎｅ  ＤおよびＨｏｌｌｉｓ  Ｍ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｕｒｉｆ  ６、１２４〜１３１（１９９５）
【非特許文献１３】Ｇａｒｄｉｎｅｒ−Ｇｒｅｅｎ  ＭおよびＦｒｏｍｍｅｒ  Ｍ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６、２６１〜２８２（１９８７）
【非特許文献１４】Ｒｉｃｅ  Ｐ、Ｌｏｎｇｄｅｎ  ＩおよびＢｌｅａｓｂｙ  Ａ  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ  １６、２７６〜２７７（２０００）
【非特許文献１５】Ｂｉｒｄら（１９８５）Ｃｅｌｌ  ４０：９１〜９９
【非特許文献１６】ＴａｚｉおよびＢｉｒｄ（１９９０）Ｃｅｌｌ  ６０：９０９〜９２０
【非特許文献１７】ＷｉｓｅおよびＰｒａｖｔｃｈｅｖａ（１９９９）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ６０：２５８〜２７１
【非特許文献１８】Ａｎｔｅｑｕｅｒａ、Ｆ．＆  Ｂｉｒｄ、Ａ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０、１１９５〜１１９９９（１９９３）
【非特許文献１９】Ｃｏｒｓｓ、Ｓ．Ｈ．＆  Ｂｉｒｄ、Ａ．Ｐ．Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ，Ｇｅｎｅｔ．Ｄｅｖ．５、３０９〜３１４（１９９５）
【非特許文献２０】Ｔａｚｉ、Ｊ．＆  Ｂｉｒｄ、Ａ．Ｃｅｌｌ  ６０、９０９〜９２０（１９９０）
【非特許文献２１】Ｗｏｏｌ、１９９６、ＴＩＢＳ  ２１：１６４〜１６５
【非特許文献２２】Ｗｏｏｌら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ７３：９３３〜９４７
【非特許文献２３】Ｈｅｒｓｈｋｏ＆  Ｃｉｅｃｈａｎｏｖｅｒ、１９９２、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６１：７６１〜８０７
【非特許文献２４】Ｃｏｕｘら、１９９６、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ６５：８０１〜８４７
【非特許文献２５】Ｆｉｎｌｅｙら、１９８９、Ｎａｔｕｒｅ  ３３８：３９４〜４０１
【非特許文献２６】Ｃｈａｎら、１９９５、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ  ２１５：６８２〜６９０
【非特許文献２７】Ｒｅｄｍａｎ＆  Ｂｕｒｒｉｓ、１９９６、Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  ３１５：３１５〜３２１
【非特許文献２８】２００５、ＢＭＣ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｙ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ５：１５
【非特許文献２９】Ｈａｒｉｈａｒａｎら、１９８９、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ３：１７８９〜８００
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００２０】
特にインビボおよびエクソビボ治療適用のため、およびインビトロ組み換えタンパク質産生のために、より高く、そしてより信頼性のあるレベルの発現を得るための組み換え遺伝子発現の分野で目的が残っている。
【課題を解決するための手段】
【００２１】
（開示の要旨）
本明細書の説明および請求項全体で、用語「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎ）」およびこれら用語の改変例、例えば、「包含している（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」および「包含する（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」は、「制限されずに含むこと」を意味し、そしてその他の成分、添加物、構成要素、完全体または工程を排除することは意図されない（そしてされない）。
【００２２】
本明細書の説明および請求項全体で、単数は、文脈がそうでないことを要求しなければ複数を包含する。特に、不定冠詞が用いられる場合、この説明は、文脈がそうでないことを要求しなければ、複数および単数を企図するとして理解されるべきである。
【００２３】
本発明の特定の局面、実施形態または例と組み合わせて記載される特徴、完全体、特徴、化合物、化学的成分または基は、これらと適合しないのでなければ、本明細書中に記載される任意のその他の局面、実施形態または例に適用かのうであることが理解されるべきである。
【００２４】
（定義）
本明細書で用いられるとき、プロモーター領域は、プロモーター、および転写開始部位の５’配列の上流の５ｋｂおよび最初のエキソンの遠位端の下流の５００ｂｐ３’配列と一緒の転写開始部位であるとして規定される。
【００２５】
５’非翻訳領域は、ゲノムまたはｃＤＮＡ配列中にコードされる翻訳開始の領域５’を意味する。それは、すべての上流調節エレメントを含むとされる。５’上流配列は、ゲノム配列中にコードされる転写開始の配列５’を意味するために用いられる。
【００２６】
本明細書で用いられるとき、「転写可能な核酸」は、機能的プロモーターおよびその他の調節配列に作動可能に連結されるとき、ｍＲＮＡのような機能的ＲＮＡ分子を与えるよう転写され得る核酸を意味する。このような配列は、翻訳可能なポリペプチド配列をコードするオープンリーディングフレームを含み得る。あるいは、この機能的は、リボソームＲＮＡ、リボザイムまたはアンチセンスＲＮＡのような別の機能を有し得る。
【００２７】
「遺伝子」は、一般に、それからそれが転写されるプロモーター、ならびにエンハンサーおよび３’ポリアデニル化シグナルのようなその他の調節配列とともに、転写可能な核酸のコード領域の組み合わせを意味するとされる。ゲノムＤＮＡ遺伝子には、イントロンがまた含まれる。「転写ユニット」は、ときどき、少なくとも、プロモーターと、しばしばシントロンがスプライスされたｃＤＮＡに由来する転写可能な核酸をともなう最小調節配列との機能的組み合わせを記載するために用いられる。「シストロン」は、機能的開始シグナルおよび停止シグナルをもつ単一のポリペプチドをコードする核酸として規定される。「導入遺伝子」は、１つのゲノムから別のゲノムまで移された遺伝子を意味するが、この用語は、任意の遺伝子、またはベクターのような組み換えＤＮＡ構築物中に含まれる転写可能な核酸さえにより緩く適用され得る。
【００２８】
プロモーターおよびエンハンサーは、当該技術分野で周知であり、そして制限によるのではなく、例示のみによって提供される以下の特徴を含む。プロモーターは、転写の開始に直接連結された５’、シス作用調節配列である。プロモーターエレメントは、転写開始の部位を選択するために機能する、いわゆるＴＡＴＡボックスおよびＲＮＡポリメラーゼ開始選択（ＲＩＳ）配列を含む。これらの配列はまた、それ自体、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始選択を促進するために機能するポリペプチドを結合する。
【００２９】
単純な用語では、プロモーターは、１００より少ない（そして通常５０より少ない）ヌクレオチド塩基対（ｂｐ）の下流に位置する配列の転写を開始するよう作用する方向性エレメントである。それらは、転写の開始および開始前複合体（ＭｃＫｎｉｇｈｔおよびＴｊｉａｎ、１９８７、Ｃｅｌｌ  ４６：７９５〜８０５）として知られる複数サブユニット複合体のアセンブリに参加する種々のタンパク質の結合部位として作用する多くの短いコンセンサスヌクレオチド配列を含む。大部分の遺伝子では、これは、ＴＡＴＡボックス（ＴＡＴＡＡＡ）として知られ、それにＴＡＴＡボックス結合タンパク質（ＴＢＰ、一般転写因子ＴＦＩＩＤのサブユニット）が結合する、非常に広く保存された配列にある。最終的にＰｏｌＩＩホロ酵素複合体を形成する１０以上のさらなる転写因子の整列されたアセンブリが続く。ＲＮＡ転写は、ＴＢＰがまた結合する約２５〜３０塩基下流の開始部位で実際に開始する（ＢｒｅａｔｈｎａｃｈおよびＣｈａｍｂｏｎ、１９８１、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５０：３４９〜３９３）。
【００３０】
大部分の機能的プロモーターは、約７０〜２００ｂｐ上流の、その最も高度に保存されるのはＣＡＡＴボックス（ＣＣＡＡＴ、転写因子ＣＢＦ、Ｃ／ＥＢＰおよびＮＦ−１のための結合部位）、および同様の距離だけ上流にあるＧＣボックス（ＧＧＧＣＧＧ、一般転写因子Ｓｐ−１のための結合部位）である、さらなる上流プロモーターエレメント（ＵＰＥ）を含む。転写の基礎的レベルは、このＴＡＴＡボックス単独から生じるけれども、大部分のプロモーターにとって、少なくともＣＡＡＴボックスおよびＧＣボックスが、最適レベルの転写に要求される。
【００３１】
エンハンサーは、局在してではあるが、必ずしもすぐ隣接して位置する必要のない（数キロ塩基離れて位置する（Ｋａｄｏｎａｇａ（２００４）Ｃｅｌｌ  １１６：２４７〜２５７）プロモーターからの転写を増大する非方向的に作用する配列である。エンハンサーは、これもまたプロモーターエレメントと関連するＮＦ−１およびＳＰ−１のような広範な範囲の転写アクティベータータンパク質（Ｏｎｄｅｋら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３６：１２３７〜１２４４）のための結合部位を提示する短い（８〜１２ｂｐ）コンセンサス配列を含む。これらの配列は、しばしば、タンデムまたは反転繰り返しで二重になっている。
【００３２】
サイトメガロウイルスのような多くのＤＮＡウイルスの非常に活性な即時／初期遺伝子転写ユニットを含む、いくつかの天然の転写ユニットでは、エンハンサーおよびプロモーターエレメントは、１つの拡大された上流エレメントであるものに機能的に結合され得る。
【００３３】
プロモーターは、細胞タイプ、温度、金属イオンまたはその他の因子に応答性であるか；または構成的で、これらの因子に非応答性である転写を与えて調節され得る。多くの目的のために、すべてではないが多くの細胞タイプで一貫して高いレベルの転写を与える強力な構成的プロモーターが有利である。多年の間、ヒトサイトメガロウイルスにおける即時／初期遺伝子発現を駆動するエンハンサー／プロモーターエレメントが、真核生物発現ベクター中の異種遺伝子のこのような発現を駆動するために非常に広く用いられている（Ｆｏｅｃｋｉｎｇ＆  Ｈｏｆｆｓｔｅｔｔｅｒ、１９８６、Ｇｅｎｅ  ４５：１０１〜１０５）。
【００３４】
リボソームタンパク質遺伝子のプロモーター領域が、連結された導入遺伝子の発現を高め、そして安定化することで有用な活性を有し得、しかも、高度に発現される遺伝子からの調節領域がクロマチンを転写が活性な立体配座に維持することで非常に有効であるエレメントを含む可能性が高いと仮定された。異質プロモーターへのこのようなエレメントの連結は、次いで、そのプロモーターの周りでより開いたクロマチン環境を生成し、増加した発現を生じ得る。リボソームタンパク質遺伝子由来のプロモーターが、ｒＲＮＡが転写されるＲＮＡポリメラーゼタイプＩ依存性プロモーターであるリボソームプロモーターから区別され得ることは当業者によって理解される。
【００３５】
この仮説を試験するために、ＲＮＡを、指数的に増殖するＣＨＯ−Ｋ１およびＮＳＯ細胞株から得、そして１３，４４３マウス遺伝子に対するマイクロアレイ分析を実施した。本発明者らは、本発明者らの分析を、高ＣｐＧアイランド含量および二方向性プロモーターを有するエレメントに限定した。ｈｎＲＮＰＡ２調節領域からの最小有効配列に基づく規準を用い、これら遺伝子の選択から約３ｋｂのＤＮＡを、ＮＳ０ゲノムＤＮＡからＰＣＲによって増幅した。これらの配列を、次いで、ＥＧＦＰ発現ベクター中にクローン化し、そして同じベクターのＲＮＰＡ２コントールバージョンとともにＣＨＯ−Ｋ１中にトランスフェクトした。
【００３６】
２つのリボソームタンパク質のプロモーター領域由来の配列は、用いたアッセイにおいて異質レポーター配列の一貫して高レベルの発現を与えたことが見出された。各々の場合において、このプロモーター領域は、実際のプロモーターエレメントの上流の５’領域から第１のエキソン中に良く、実際に第１のイントロン中に延びるＧＣリッチな配列を含んでいた。このＧＣリッチな配列は、３００ｂｐを超えて延びるとして、本明細書で規定されるような拡大されたＣｐＧアイランドである規準を満たす。
【発明を実施するための最良の形態】
【００３７】
従って、本発明は、
ａ）リボソームタンパク質遺伝子のプロモーター領域からの少なくとも５００の連続するヌクレオチドを含むエレメント、
ｂ）異質プロモーター、
ｃ）この異質プロモーターに隣接する転写可能な核酸配列を含む、単離されたポリヌクレオチドを提供し、
ここで、上記転写可能な核酸配列は、上記異質プロモーターから転写され、そしてこの転写のレベルが上記エレメントによって増大される。好ましくは、上記エレメントは、１ｋｂを超え、そして最も好ましくは３ｋｂを超えるリボソームタンパク質遺伝子の５’非翻訳配列を含む。
【００３８】
上記連続するヌクレオチドは、上記プロモーター領域から選択され、これは、転写開始部位の５ｋｂ上流（センスストランドに対し５’）の点から、最初のエキソンの遠位（３’）端の下流（センスストランドに対し３’）５００ｂｐの点まで延びる。
【００３９】
好ましくは、上記リボソームタンパク質遺伝子は、ＲＰＳＡ、ＲＰＳ２、ＲＰＳ３、ＲＰＳ３Ａ、ＲＰＳ４、ＲＰＳ５、ＲＰＳ６、ＲＰＳ７、ＲＰＳ８、ＲＰＳ９、ＲＰＳ１０、ＲＰＳ１１、ＲＰＳ１２、ＲＰＳ１３、ＲＰＳ１４、ＲＰＳ１５、ＲＰＳ１５Ａ、ＲＰＳ１６、ＲＰＳ１７、ＲＰＳ１８、ＲＰＳ１９、ＲＰＳ２０、ＲＰＳ２１、ＲＰＳ２３、ＲＰＳ２４、ＲＰＳ２５、ＲＰＳ２６、ＲＰＳ２７、ＲＰＳ２８、ＲＰＳ２９、ＲＰＳ３０、ＲＰＬ３、ＲＰＬ４、ＲＰＬ５、ＲＰＬ６、ＲＰＬ７、ＲＰＬ７Ａ、ＲＰＬ８、ＲＰＬ９、ＲＰＬ１０、ＲＰＬ１０Ａ、ＲＰＬ１１、ＲＰＬ１２、ＲＰＬ１３Ａ、ＲＰＬ１４、ＲＰＬ１５、ＲＰＬ１７、ＲＰＬ１８、ＲＰＬ１８Ａ、ＲＰＬ１９、ＲＰＬ２１、ＲＰＬ２２、ＲＰＬ２３、ＲＰＬ２３Ａ、ＲＰＬ２４、ＲＰＬ２６、ＲＰＬ２７、ＲＰＬ２８、ＲＰＬ２９、ＲＰＬ３０、ＲＰＬ３１、ＲＰＬ３２、ＲＰＬ３４、ＲＰＬ３５、ＲＰＬ３５Ａ、ＲＰＬ３６、ＲＰＬ３６Ａ、ＲＰＬ３７、ＲＰＬ３７Ａ、ＲＰＬ３８、ＲＰＬ３９、ＲＰＬ４１、ＲＰＬＰ０、ＲＰＬＰ１、ＲＰＬＰ２およびそれらのオルトログからなるリストから選択される。より好ましくは、それは、ＲＰＳ３またはＲＰＳ１１である。
【００４０】
１つの好ましい実施形態では、上記エレメントはＣｐＧアイランド、好ましくは、少なくとも３００ｂｐそしてより好ましは５００ｂｐの拡大されたＣｐＧアイランドを含む。好ましくは、このＣｐＧアイランドはメチル化されていない。上記エレメントがリボソームタンパク質遺伝子からのプロモーターを含み、そしてそれからのこのリボソームタンパク質遺伝子の転写が自然に開始されることがまた好ましい。このようなプロモーターは、しばしば、内因性プロモーターと称される。好ましい実施形態において、上記エレメントは、上記リボソームタンパク質遺伝子またはその１つ以上のエキソンをさらに含む。
【００４１】
上記リボソームタンパク質遺伝子は、哺乳動物遺伝子であることが好ましいが、このような遺伝子、およびそれらのプロモーターおよび５’上流配列は、種を横切って高度に保存され、そしてそれに代わって、昆虫、線虫または酵母遺伝子であり得る。好ましくは、しかし、それは、ヒトまたは齧歯類遺伝子であり、そして最も好ましくは、それはマウス遺伝子である。
【００４２】
高度に好ましい実施形態では、本発明の単離されたポリヌクレオチドは、配列番号１に描写されるマウスｒｐｓ３ヌクレオチド配列のヌクレオチド３８〜３１５４を含む。あるいは、それは、配列番号２に列挙されるようなマウスｒｐｓ１１ヌクレオチド配列のヌクレオチド１２〜３０３２を含む。
【００４３】
１つの局面では、記載されるエレメントに加え、上記ポリヌクレオチドは、リボソームタンパク質遺伝子からの上記エレメントと天然には連結されないプロモーターをさらに含む。この実施形態では、異質プロモーター（第１のエレメント中に存在しても良いし、または存在していなくても良い内因性プロモーターとは別個）が、リボソームタンパク質遺伝子由来の５’配列を含む上記エレメントに隣接し、そしてそれから下流の作動可能な位置に位置される。この配列では、この異質プロモーターによって取り扱われる発現は、このリボソームタンパク質遺伝子エレメントの影響によって増大される。
【００４４】
１つの実施形態では、このプロモーターは、構成的プロモーターであり、より好ましくは、サイトメガロウイルス初期／即時プロモーター、ＳＶ４０、ＥＦ−１α、ラウスザルコーマウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲ、またはＨＩＶ２  ＬＴＲまたはそれら由来の配列の組み合わせからなるリストから選択される。最も好ましいのは、マウスまたはモルモットＣＭＶ即時／初期プロモーターである。
【００４５】
あるいは、上記プロモーターは、組織特異的プロモーターであり得、これは、限られた範囲の組織中で発現を行う。このようなプロモーターは、当該技術分野で周知であり、そしてβ−グロビン、κおよびλ免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、デスミン、チロシナーゼ、ＣＤ２、ＩＬ−３、ミオシン軽鎖、ヒトメラノーマ阻害活性遺伝子プロモーターおよびケラチンからのプロモーターを含む。特に好ましい実施形態では、このプロモーターは、腫瘍選択的プロモーターであり、これは、１つ以上の腫瘍タイプで優先的に発現を行う。このようなプロモーターの例は、癌胎児抗原（ＣＥＡ）、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、チロシナーゼ、およびＴ細胞因子１−４（ＴＣＦ）−を基礎にしたプロモーターからのプロモーターを含む。
【００４６】
上記転写可能な核酸は、インビトロ発現のための任意の有用なポリペプチドをコードし得、そして好ましくは、抗体、抗体の機能的エピトープ結合性フラグメント、成長因子、サイトカイン、プロテインキナーゼ、可溶性レセプター、膜結合レセプター、血液凝固因子からなるリストから選択される。あるいは、この転写可能な核酸は、インビボまたはエクスビボ遺伝子治療のための使用の治療遺伝子をコードし得る。このような治療的核酸は、嚢胞性線維症、サラセミア、鎌形貧血症、ファンコーニ貧血、血友病、重篤な組み合わせ免疫不全症（ＳＣＩＤ）、フェニルケトン尿症、α−１アンチトリプシン欠損症、デュシェー筋ヌジストロフィ、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症または骨形成不全症を引き起こす欠陥遺伝子の機能を置換または補充することによって作用し得る。あるいは、それは、悪性癌細胞のような標的細胞中でそれを殺傷するために選択的に発現される、細胞傷害性薬剤、またはプロドラッグ転換酵素をコードし得る。このような適用、および多くのその他は、当業者に周知であり、そして治療的核酸の発現を増大することにおける本発明の妥当性は、このような当業者に明瞭である。
【００４７】
別の局面では、本発明は、上記で開示されたような本発明のポリペプチドを含むベクターを提供する。好ましくは、このベクターは、真核生物遺伝子発現のために適合された発現ベクターである。
【００４８】
代表的には、このような適合は、制限するのではなく、例示により、細胞／組織特異的発現を仲介する転写制御配列（プロモーター配列）の提供を含む。適合はまた、両方が、真核生物細胞または原核生物宿主いずれかで上記ベクターの維持を容易にする選択マーカーおよび自律複製配列の提供を含む。自律的に維持されるベクターは、エピソームベクターと称される。エピソームベクターが望ましい。なぜなら、それらは、自己複製し、そしてそれ故、組み込みの必要性なくして持続するからである。このタイプのエピソームベクターは、ＷＯ９８／０７８７６に記載されている。
【００４９】
ベクターでコードされる遺伝子の発現を容易にする適合は、転写終結／ポリアデニル化配列の提供を含む。これはまた、二シストロン性または複数シストロン性発現カセット中に配列されたベクターでコードされる遺伝子の発現を最大にするよう機能する内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）の提供を含む。
【００５０】
これらの適合は、当該技術分野では周知である。発現ベクター構築および組み換えＤＮＡ技法一般に関する顕著な量の刊行された文献がある。Ｓａｍｂｒｏｏｋら（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ、ＮＹおよびその中の参考文献；Ｍａｒｓｔｏｎ、Ｆ（１９８７）ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  Ｖｏｌ  ＩＩＩ  ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、Ｏｘｆｏｒｄ  ＵＫ；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ｆ  Ｍ  Ａｕｓｕｂｅｌら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９４）を参照のこと。
【００５１】
上記ベクターは、エピソームベクターまたは組み込みベクターであり得る。好ましくは、上記ベクターはプラスミドである。あるいは、上記ベクターは、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、レンチウイルスまたはその他のウイルスのようなウイルスであり得る。
【００５２】
あるいは、このようなベクターは、
ａ）リボソームタンパク質遺伝子のプロモーター領域からの少なくとも５００の連続するヌクレオチドを含むエレメント、
ｂ）異質プロモーター、
ｃ）複数クローニング部位、を含み、
ここで、上記複数クローニング部位中に挿入された転写可能な核酸が、上記異質プロモーターから転写され得、そしてこの転写のレベルは上記エレメントによって増大される。
【００５３】
さらなる局面では、本発明は、本明細書中に記載されるような単離されたポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞を提供する。好ましくは、この宿主細胞は、哺乳動物細胞であり、より好ましくは、ＣＨＯ、ＮＳ０、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２からなるリストから選択される。
【００５４】
本発明によってまた提供されるのは、本発明のポリヌクレオチドを含む発現ベクターを適切な宿主細胞に挿入する工程、およびこの宿主細胞を発現を可能にするに適切な条件で培養する工程を包含するポリペプチドを発現する方法である。好ましくは、このポリペプチドは、治療に有用なポリペプチドである。
【００５５】
本発明のさらなる局面は、本明細書中に記載されたようなポリヌクレオチド、ベクターまたは宿主細胞、および薬学的に受容可能なキャリア、賦形剤、緩衝物または培地を含む薬学的調製物を提供することである
【実施例】
【００５６】
（詳細な説明）
（材料および方法）
（マイクロアレイ分析）
総ＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙＲＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ、Ｃｒａｗｌｅｙ、ＵＫ）を用い、製造業者のプロトコールに従って、約８０％集密のＣＨＯ−Ｋ１細胞から抽出した。総ＲＮＡ（２μｇ／μｌ）を、１３，４４３の公知の転写物を提示するマウス７０マーオリゴヌクレオチドライブラリー（オペロンＶ．１）を用いるマイクロアレイ発現分析に供した。Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ大学、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ａｎｄ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙが、参照プロトコール（ｈｔｔｐ：／／ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ．ｕｃ．ｅｄｕ）に従って、マイクロアレイ分析を請け負った。
【００５７】
遺伝子転写物配列は、増加する蛍光に従ってランク付けされた。本発明者らの先の研究は、クロマチン改築エレメントおよびｈＣＭＶに与える利益としてＨＮＲＰＡ２Ｂ１／ＣＢＸ３遺伝子座を詳述したので、ＨＮＲＰＡ２転写物をベースライン発現レベルとして識別した。しかし、利用可能なマイクロアレイ分析を用いては、ＨＮＲＰＡ２転写物は、ほとんど検出可能ではなかった。ＨＮＲＰＡ２転写物の発現レベルは最小であったので、本発明者らの対照としてＨＮＲＰＡ２を用いることは、可能な分析につい３８２９配列を識別し得た。それ故、順序付けたトップの２％（７６配列）からの７配列は、発現された転写物が、ＣｐＧアイランドおよび１つ以上の推定／既知転写開始部位を含む規準に従って同定された（表１を参照のこと）。ＣｐＧアイランド位置、サイズおよびＧＣ：ＣＧ比は、ＧｒａｉＥＸＰ（ｈｔｔｐ：／／ｃｏｍｂｉｏ．ｏｒｎｌ．ｇｏｖ）を用いて実証された。推定／既知転写開始部位は、ＮＩＸブラスト分析（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｈｇｍｐ．ｍｒｃ．ａｃ．ｕｋ）およびＥｎｓｅｍｂｌデータベース（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｓｅｍｂｌ．ｏｒｇ）から同定された。
【００５８】
（ＣｐＧアイランド含有フラグメントのＰＣＲ増幅）
ＰＣＲオリゴヌクレオチドは、完全なＣｐＧアイランドが包埋されたプロモーター領域を包含し、その一方、公知または推定されるコード配列構造に従って約５００ｂｐのコード配列を含む約３ｋｂのフラグメントを増幅するように設計された（表２を参照のこと）。
【００５９】
ＰＣＲ反応は、各ゲノムフラグメントに特異的なオリゴヌクレオチドセット（各プライマーの２ｐｍｏｌ；表２）を含んでいた。ＰＣＲ増幅は、ＦａｉｌｓａｆｅＴＭ  ＰＣＲ
プレミックスＡ−Ｆ（Ｃａｍｂｉｏ、ＵＫ）、１ユニットのＴａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＵＫ）および２００ｎｇのテンプレートＤＮＡを用いた達成された。初期変性は９６℃で２分間であり、その一方ＰＣＲ増幅は、３５サイクル（９４℃１分間、５５〜６０℃１分間、７２℃５分間実施された。）最終伸長ステップ（７２℃１０分間）が含められた。
【００６０】
ＰＣＲ産物は、ＧＦＸ  ＤＮＡ精製カラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＵＫ）を用い、製造業者のプロトコールに従ってゲル精製され、そして製造業者（ＴＯＰＯ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）のプロトコールに従ってＴＯＰＯ  ＴＡ  ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）に供した。センスおよびアンチセンス配向を、ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）中にクローン化された各ＣｐＧアイランド含有フラグメントについて得た。
【００６１】
（発現ベクター構築）
コントロール発現ベクター（ＣＥＴ１００５ＥＧＦＰ、配列番号２０と指定される）を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ１からのｈＣＭＶ／ＥＧＦＰ／ｓｖ４０ｐＡ（ＮｈｅＩ／ＡｇｅＩ欠失複数クローニング部位）のＣＥＴ９００中への挿入により、次いで、このベクターからのＡｓｃＩカセットのＣＥＴ１００５のＡｓｃＩ部位中への挿入により構築した。
【００６２】
そうでないことが陳述されていなければ、すべてのＣｐＧアイランドフラグメントを、ＴＯＰＯ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）から除去した。Ｔｅｒｆ２ｉｐ  Ａｃｃ６５１／ＥｃｏＲＶフラグメントを、１００５のＡｃｃ６５１／ＳｗａＩ中に挿入した。ＧＡＰＤＨ  ＳｐｅＩ／ＳｎａＢＩを、１００５のＰｍｅＩ／ＸｂａＩ中に挿入した。ＲＰＳ３ＸｂａＩ／ＳｐｅＩフラグメントを１００５のＸｂａＩ中に挿入した。ＲＰＳ１１およびＴＵＢＡＥｃｏＲＩ平滑フラグメントを、ＴＯＰＯ４．０およびＴＯＰＯ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）からそれぞれ除去し、そして１００５のＰｍｅＩ中に挿入した。最後に、Ａ４３０１０６Ｐ１８Ｒｉｋ（ＥｃｏＲＶ）および２５１０００６Ｄ１６Ｒｉｋ（ＢｓｔＸＩ）フラグメントをまた、１００５のＰｍｅＩ中に挿入した。すべてのＣｐＧアイランド含有フラグメントを、ｈＣＭＶプロモーターのすぐ上流にセンスおよびアンチセンス配向の両方で挿入した。
【００６３】
（細胞株およびトランスフェクション）
ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、ＨＡＭＳ  Ｆ１２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＵＫ）プラス４５００ｍｇ／ｌ  Ｌ−アナニル−Ｌ−グルタミン、１０μｇ／ｍｌの各々ペニシリンおよびストレプトマイシン、および１０％（ｖ／ｖ）熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＣＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｐａｉｓｌｅｙ、ＵＫ）中で増殖した。トランスフェクションは、８０％の集密培養からの約１０７細胞、および２５０Ｖで９７５μＦの単一パルスを送達するためのＢｉｏＲａｄ  Ｇｅｎｅ  ＰｕｌｓｅｒＩＩＴＭセットを用いるエレクトロポーレーションによって実施した。トランスフェクションは、２μｇの線状化ＣＥＴ１００５ＥＧＦＰプラスミド、および異なるサイズの発現ベクターに対して当モル量を用いた。安定にトランスフェクションされた細胞を選択し、そして１２．５μ／ｍｌの硫酸ピューロマイシン（Ｓｉｇｍａ、ＵＫ）を含む増殖培地中に維持した。
【００６４】
（導入遺伝子発現の定性）
ＥＧＦＰレポーター構築物でトランスフェクトされた細胞の分析は、Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳｃａｎで、親ＣＨＯ−Ｋ１細胞株をバックグラウンドの自動蛍光コントロールとして用いた。
【００６５】
【表１】
2008539781.tif 000003
【００６６】
【表２】
2008539781.tif 000004
（実施例１：ｒｐｓ３エレメント駆動発現）
配列番号１は、ＲＰＳ３クローン化配列（ヌクレオチド３８〜３１５４）を示し；配列番号１７は、ｐＲＰＳ３−１００５−ＥＧＦＰの完全プラスミド配列を示し；配列番号１８は、ｐＣＥＴ１０１５−ＥＧＦＰの完全プラスミド配列を示す。
【００６７】
トランスフェクション８日後のＥＧＦＰ発現レベルは、ｈＣＭＶ単独（コントロール構築物；トランスフェクション前にＰｍｅＩで線状化されたプラスミドｐＣＥＴ１００５）、８ｋｂ  ＲＮＰＡ２フラグメントを含む構築物（プラスミドｐＣＥＴ１０１５、トランスフェクション前にＰｍｅＩで線状化）およびＲｐｓ３（プラスミドｐＲＰＳ３−１００５−ＥＧＦＰ；トランスフェクション前にＰｍｅＩで線状化）を含むＣＨＯ−Ｋ１プール内で調査された。
【００６８】
構築物を含むＲｐｓ３で生成されたプールは、コントロール構築物と比較してＥＧＦＰ発現レベルで有意な増加を示す。ｈＣＭＶプロモーターの上流のＲｐｓ３配列の付加は、コントロールまたは構築物をそれぞれ含むｈｎＲＮＰＡ２エレメントに対する平均蛍光強度において５．５倍または１．５倍の増加を生じた（図３Ａ）。
【００６９】
これら構築物の活性は、ＮＳ０細胞で調査された。ｈＣＭＶプロモーター単独と比較して、ＲＰＳ３エレメントまたはｈｎＲＮＰＡ２エレメントがこれら構築物に含められたとき、安定プール中の平均蛍光強度における増加は、各々２８倍または１８倍であった。
【００７０】
ＣＨＯ−Ｋ１細胞およびＮＳ０細胞の両方で、陽性細胞の％はｈｎＲＮＰＡ２エレメントとともに有意に増加したが、この増加は、ＲＰＳ３エレメントでより大きかった（図３Ｂおよび５Ｂ）。
【００７１】
（実施例２：ｒｐｓ１１エレメントで駆動される発現）
配列番号２は、ＲＰＳ１１のクローン化された配列（ヌクレオチド１２〜３０３２）を示し；配列番号１９は、ｐＲＰＳ１１−１００５−ＥＧＦＰの完全配列を示す。
【００７２】
ＲＰｓ含有ベクターおよびコントロールベクター（ＰｍｅＩで線状化）を、ＣＨＯ−Ｋ１およびＮＳ０細胞株中にトランスフェクトし、そして安定プールをピューロマイシン選択によって生成した。平均ＥＧＦＰ発現レベルは、ＦＡＣ走査分析によって評価された。
【００７３】
ｈＣＭＶの上流のＲｐｓ１１エレメントの付加は、先に記載されたＲＮＰＡ２フラグメントを含む構築物と比較して、ＣＨＯ−Ｋ１プールで平均ＥＧＦＰ発現レベルで１．２倍の増加を生じた（図４Ａ）。
【００７４】
構築物を含むＲｐｓ１１で安定にトランスフェクトされたＮＳ０細胞株は、ｈＣＭＶおよびＲＮＰＡ２構築物と比較された平均ＥＧＦＰ発現レベルで１．８および１．５倍（各々）の増加を示した）（図６Ａ）。
【００７５】
陽性細胞の％における増加が、ＲＮＰＡ２構築物と比較されるＲｐｓ１１構築物でトランスフェクトされたＣＨＯ−Ｋ１細胞株について観察された（図４Ｂ）。さらに、陽性細胞の％における増加が、ｈＣＭＶおよびＲＭＰＡ２の両方と比較されるＲｐｓ１１構築物でトランスフェクトされたＮＳ０プール中で観察された（図６Ｂ）。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
【図１】図１は、ベクターｒｐｓ３−１００５−ＥＧＦＰ（実施例１）のプラスミドマップを示す。
【図２】図２は、ベクターｒｐｓ１１−１００５−ＥＧＦＰ（実施例１）のプラスミドマップを示す。
【図３】図３は、トランスフェクション８日後、ＦＡＣＳ分析によって分析されたＣＨＯ−Ｋ１細胞中の種々のｒｐｓ３構築物によって発現されたときのＥＧＦＰレポーターの発現を示す。図Ａは平均の蛍光を示し、そして図Ｂは検出可能なレベルまでレポーター遺伝子を発現する細胞の％（％陽性細胞）を示す。実施例１を参照のこと。
【図４】図４は、トランスフェクション７日後のｒｐｓ１１構築物のレポーター遺伝子発現を示す（ＦＡＣＳによって分析された）。ＡおよびＣは、合計カウントであり、Ｂ〜Ｅは集団内のまさに発現する細胞に基づく結果である。図Ａは安定して選択されたプール中の細胞の平均蛍光を示し、そして図Ｂは陽性細胞の百分率（％）を示す。
【図５】図５は、安定にトランスフェクトされたＮＳ０細胞中の、それが存在するさらなるエレメントなしのｈＣＭＶプロモーターによって駆動されるとき、または８ｋｂのｈｎＲＮＰＡ２または３ｋｂのＲＰＳ３いずれかのエレメントがｈＣＭＶプロモーターのすぐ５’に配置されるとき、レポーター遺伝子の発現レベルを示す。図Ａは、２８日におかける安定プールの平均蛍光強度を示し、そして図Ｂは、陽性細胞百分率（％）を示す。
【図６】図６は、ｒｐｓ１１構築物について図５に類似のデータを示す。図Ａは、ｈＣＭＶで駆動される構築物、またはこのプロモーターのすぐ５’の８ｋｂのｈｎＲＮＰＡ２または３ｋｂのＲＰＳ３エレメントを備えた同一の構築物いずれかで生成された安定プールに対する平均蛍光強度を示す。図Ｂは、レポーター遺伝子を発現するプール内の細胞の百分率を示す（陽性細胞百分率（％））。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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