(57)【要約】  本発明は、化学用途に用いるための、かつ溶媒及び液体担体の二重の機能を果たしうるイオン液体に関する。このイオン液体は、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴマーの合成法にそれ自体が役立ち、この方法は、イオン液体が結合したモノマー単位をもたらす反応条件においてイオン液体と第一のモノマーを接触させるステップ；及び、イオン液体が結合した２〜３０のモノマー単位を含むオリゴマーをもたらす反応条件において、前記イオン液体が結合したモノマー単位を、少なくとも１つのさらなるモノマー単位と接触させるステップを含む。本方法はそれ自体が、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドの大量製造に役立つ。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の：
ａ）イオン液体が結合したモノマー単位をもたらす反応条件において、第一のモノマー単位をイオン液体と接触させるステップ；及び
ｂ）２〜３０のモノマー単位を含みイオン液体が結合したオリゴマーをもたらす反応条件下において、前記イオン液体が結合したモノマー単位を、少なくとも１つのさらなるモノマー単位と接触させるステップ、
を含む、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴマーの合成方法。
【請求項２】
所望する、イオン液体に結合したオリゴペプチド、イオン液体に結合したオリゴサッカライド、又はイオン液体に結合したオリゴヌクレオチドを製造するために、選択した回数でステップｂ）を繰り返すことをさらに含む、請求項１に記載の合成方法。
【請求項３】
前記イオン液体から前記オリゴマーを単離することをさらに含む、請求項２に記載の合成方法。
【請求項４】
前記イオン液体が、ヘテロ環式もしくは置換ヘテロ環式第四級窒素含有有機カチオン、ヘテロ環式もしくは置換ヘテロ環式第四級ホスホニウム含有有機カチオン、又はヘテロ環式もしくは置換ヘテロ環式三価スルホニウム含有有機カチオンと、前記有機カチオン上の電荷と釣り合うアニオンとを含む有機塩である、請求項１記載の合成方法。
【請求項５】
前記有機カチオンが、Ｎ−置換ピリジン及び１，３−ジ置換イミダゾールからなる群から選択される、請求項４に記載の合成方法。
【請求項６】
前記アニオンが、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＳｂＦ６−、ＣｕＣｌ２−、及びＡｌＣｌ４−からなる群から選択される、請求項４に記載の合成方法。
【請求項７】
前記モノマー単位がアミノ酸である、請求項１記載の合成方法。
【請求項８】
前記モノマー単位がヌクレオチドである、請求項１記載の合成方法。
【請求項９】
前記モノマー単位がサッカライドである、請求項１記載の合成方法。
【請求項１０】
前記オリゴマーが２〜１５のモノマー単位を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項１１】
前記オリゴマーが２〜１０のモノマー単位を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項１２】
前記オリゴマーが２〜５のモノマー単位を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項１３】
前記イオン液体が、溶媒と可溶性担体の両方である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の合成方法。
【請求項１４】
オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴマーの合成方法であって、前記方法が、モノマー単位に対してイオン液体を用いて、２〜３０のモノマー単位を含むオリゴマーにすることを含む、合成方法。
【請求項１５】
イオン液体が結合したモノマー単位をもたらす反応条件下において、第一のモノマー単位を前記イオン液体と接触させるステップ；及びイオン液体に結合したオリゴマーをもたらす反応条件下において、前記イオン液体が結合したモノマー単位を、少なくとも１つのさらなるモノマー単位と接触させるステップ、
を含む、請求項１４に記載の合成方法。
【請求項１６】
１つのさらなるモノマー単位と接触させるステップを、選択した回数繰り返して、所望のイオン液体に結合したオリゴペプチド、オリゴサッカライド、又はオリゴヌクレオチドを製造する、請求項１５に記載の合成方法。
【請求項１７】
前記イオン液体から前記オリゴマーを単離するステップをさらに含む、請求項１６に記載の合成方法。
【請求項１８】
前記イオン液体が、ヘテロ環式もしくは置換ヘテロ環式第四級窒素含有有機カチオン、ヘテロ環式もしくは置換ヘテロ環式第四級ホスホニウム含有有機カチオン、又はヘテロ環式もしくは置換ヘテロ環式三価スルホニウム含有有機カチオンと、前記有機カチオン上の電荷と釣り合うアニオンとを含む有機塩である、請求項１４に記載の合成方法。
【請求項１９】
前記有機カチオンが、Ｎ−置換ピリジン及び１，３−ジ置換イミダゾールからなる群から選択される、請求項１８に記載の合成方法。
【請求項２０】
前記アニオンが、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＳｂＦ６−、ＣｕＣｌ２−、及びＡｌＣｌ４−からなる群から選択される、請求項１８に記載の合成方法。
【請求項２１】
前記モノマーがアミノ酸である、請求項１４に記載の合成方法。
【請求項２２】
前記モノマーがヌクレオチドである、請求項１４に記載の合成方法。
【請求項２３】
前記モノマーがサッカライドである、請求項１４に記載の合成方法。
【請求項２４】
前記オリゴマーが２〜１５のモノマー単位を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２５】
前記オリゴマーが２〜１０のモノマー単位を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２６】
前記オリゴマーが２〜５のモノマー単位を含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２７】
前記イオン液体が溶媒と可溶性担体の両方である、請求項１４〜２６のいずれか一項に記載の製造方法。
【請求項２８】
請求項４又は１８において定義した少なくとも１種のイオン液体と、アミノ酸、サッカライド、及びヌクレオチドから選択されるモノマー単位とを含むキット。
【請求項２９】
少なくとも２つのモノマー単位を含むオリゴペプチド、オリゴサッカライド、又はオリゴヌクレオチドを製造するのに適した、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
請求項４又は１８で定義した少なくとも１種のイオン液体を含み、アミノ酸、サッカライド、及びヌクレオチドから選択されるモノマー単位をさらに含む製品。
【請求項３１】
少なくとも２つのモノマー単位を含む、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、又はオリゴヌクレオチドを製造するために適した、請求項３０に記載の製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、イオン液体担持合成に関する。より詳細には、本発明は、イオン液体担持オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチド合成に関する。なおさらに詳細には、本発明は、生物活性オリゴペプチドのイオン液体担持合成に関する。
【背景技術】
【０００２】
オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドの効率的合成は、いくつかの新規なアプローチの開発へと導いている現課題である。溶液相合成を用いた、構造的に明らかにされたオリゴサッカライドの入手方法は、労力がかかり、かつ各段階の後でクロマトグラフィーによる反応生成物の精製を必要とする１。
【０００３】
合成オリゴヌクレオチドに対する科学者グループの要求は、過去数十年にわたって指数的に増大してきている。幸いなことに、ＤＮＡオリゴヌクレオチドプライマーの豊富な資源は、遺伝子配列解析努力、機能ゲノム科学、及びポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）に基づく検出方法の膨大な要求を満たしている。さらに、オリゴヌクレオチドは、チップベースＤＮＡマイクロアレイを含めた、治療及び診断用途の開発に広く用いられている、構造生物学及び構造生化学における顕著な進歩が、ＤＮＡ及びＲＮＡ化学での同時に起こっている進歩を通じて達成されている２-６。例えば、リボザイム及びｓｉＲＮＡ研究における当分野の現状は、結晶構造を含め、ＲＮＡ合成において同時に進歩がなければ可能とはならなかっただろう４。
【０００４】
Merrifield７とLetsinger８，９らがオリゴペプチド及びオリゴヌクレオチドそれぞれの合成のための高分子担体の使用を導入して以来、不溶性担体の使用は、有機合成、特にオリゴヌクレオチド、ペプチド、及びさらに最近では炭水化物１０-１２などの生体高分子の合成において、重要な手段となっている。濾過による過剰な試薬と副生成物の除去を含む容易な精製方法は、簡単な生成物分離を可能にし、自動化を可能にする。大きな成功にもかかわらず、不溶性高分子による不均一性のために、固相合成は、固体担体自体の高コストに加えて不均一な反応条件に典型的に伴う欠点を残しており、これらの化合物の大規模合成を非常にコストのかかるものにしている。
【０００５】
高分子担持固相合成における最近の進歩１３-１５は、複雑なオリゴサッカライドを組み立てるための簡単な方法を提供しており、なぜなら、その方法は、樹脂を単に洗浄することによる過剰な試薬の除去を可能にし、それにより、必要なクロマトグラフィーステップの数を最小にするからである１６，１７。これは、うまい自動化合成のめざましい例をもたらしている１４，１８。しかし、固相合成の欠点は、不均一反応を完結させるためにしばしば大過剰の高価な炭化水素単位を必要とし、しかも通常の特性分析方法、例えば、ＴＬＣ、ＮＭＲ、及びマススペクトルによって糖−糖カップリング工程を監視することが一層困難であることである。さらに、固相方法によってもたらされる多くの利点にもかかわらず、不溶性高分子と反応条件の不均一な特性は、非線形反応速度論、反応部位の及び／又は反応部位へのアクセスの不均一な分布、溶媒和の問題、及び非効率なカップリング速度、を含めた一連の問題をしばしばもたらす。
【０００６】
均一反応条件の再構築と固相合成の欠点のいくつかを克服する目的による代替方法の探索は、可溶性高分子担体の開発へと導いている。近年、可溶性高分子担体の使用がかなりの注目を集めているが、これは、そのような「液相」合成は従来の溶液化学の利点の多くを残すと同時に、生成物の容易な精製の利点をなおも可能にするからである。可溶性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルアルコール、及びその他の高分子は全て、オリゴペプチド１９及びヌクレオチド１１の合成に首尾良く用いられている。さらに、可溶性のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーは、オリゴサッカライド１２，２０-２３及び小分子合成２４のための担体としても用いられている。しかし、可溶性高分子担体の使用は、低い負荷容量、オリゴサッカライドが結合したポリマーの選択的沈殿の難しさ、より長いペプチドの合成時の貧弱な溶解性、低い水溶性、エーテル溶媒中での溶解性の欠如２４、及び精製に必要とされるエネルギーを大量に消費する冷却、の欠点がある。
【０００７】
さらに最近、フッ素化（フッ素）可溶性担体に基づく新しい溶液相合成が提唱されている２５。このアプローチはフッ素系溶媒（すなわち、パーフルオロアルカン類）中でのフッ素系担体とフッ素化された試薬との好ましい可溶性に基づいている。非フッ素化試薬は、フッ素系有機溶媒分配２６ａ−ｄ又はフッ素系シリカゲルに基づく固相抽出（ＳＰＥ）２６ｅ−ｈによって、担持された生成物から容易に分離されうる。このアプローチは、通常容易に入手できないフッ素化化合物の使用を必要とする。精製は、予め混和性のフッ素系溶媒と有機溶媒との間の相分離を引き起こす温度切り替えによって達成され、それによって分離を促進する。有機合成のためのフッ素系相方法の使用は、オリゴペプチド２７、オリゴサッカライド２８、及び小分子２５について実証されている。オリゴサッカライド合成の場合は、フッ素系溶媒へのサッカライド結合担体の溶解性は、サッカライド単位の数が増加するに従って低下するフッ素含量に左右されることが実証されている。パーフルオロアルカン溶媒のコスト、特殊なフッ素化された試薬の必要性、及び温度切り替えに伴うエネルギーコストは、フッ素系相有機合成の広い応用を阻害する潜在的制限である。
【０００８】
イオン液体（Ionic liquid（ＩＬ））は、有機反応のための環境にやさしい反応媒体として近年大きな注目を集めている２９。イオン液体の現実的な定義は、水の沸点より低い、しばしば非常に低い融点を有する塩、というものである。イオン液体の共通の性質は、多くは有機カチオンと無機アニオンとを有することである。イオン液体の非限定的例は、ハロゲン化物、テトラフルオロボレート、及びヘキサフルオロホスフェートの、アルキルイミダゾリウム及びピリジニウム塩である。多くの化学反応が、いくつかの酵素反応も含めて、イオン液体中で実施されうる３０。室温イオン液体は、電気化学技術３１、化学抽出３２、及びその他の工業的方法３３のための媒体として広く検討されてもいる。これは、イオン液体のいくつかの興味ある化学的及び物理的性質：すなわち、高い熱的及び化学的安定性、不燃性、測定可能な蒸気圧の欠如、及び高い負荷特性、によるものである。多くの場合に、イオン液体は容易にリサイクルできる。カチオン又はアニオンの構造を修正することによって、イオン液体の溶解性は容易に変えることができ、それにより、それらが有機媒体並びに無機媒体から相分離し、分離及び精製を容易にするようにできる。このことが、イオン液体が有機合成のための実施可能な可溶性機能性担体として機能しうる可能性を提供している。基質の溶解度も変えることができる３４。最近の報告は、小分子３５，３７，３８及び小ペプチド３９のためのＩＬＳＳ（Ionic Liquid Supported Synthesis；イオン液体担持合成）の有効性を首尾良く実証している。回収可能且つリサイクル可能なイオン液体担持触媒を開発する可能性もまた、探索されている３６。
【０００９】
有機反応のためのマトリクス（すなわち、溶媒）としてのイオン液体の使用は、以前、Vaultierら（ＷＯ２００４／０２９００４）によって記載されている。この有機反応は、可溶性担体として働く「オニウム塩」として公知の官能化された塩類を用いて行われる。このイオン液体は、官能化された塩の可溶化を確実にし、反応が均一条件下で行われうる。Vaultierら（ＷＯ２００５／００５３４５）は、以前、有機反応のための可溶性担体として、「オニウム塩担持有機合成（Onium Salt Supported Organic Synthesis）」と名付けられた、少なくとも１種の有機溶媒中に溶解したオニウム塩（すなわち、イオン液体）の使用、を記載している。
【特許文献１】国際公開ＷＯ２００４／０２９００４号パンフレット
【特許文献２】国際公開ＷＯ２００５／００５３４５号パンフレット
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
したがって、以下のものに限定されないが、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドを含めたオリゴマーの合成のための改良方法に対する必要性が依然として存在し、この方法は、固相及び溶液相合成の利点を結合させ、均一溶液相条件を含み、且つ生成物の容易な精製を可能にするものである。
【００１１】
本発明は、これら及びその他の必要性を満たすことを目的とする。
【００１２】
本明細書の記載は多くの文献を参照し、その内容は、その全体を参照により本明細書に援用する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
［発明のまとめ］
本発明は、イオン液体（すなわちイオン性液体）担持合成に関する。
【００１４】
ある態様では、本発明は、イオン液体によって担持された、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチド、の合成に関する。
【００１５】
ある態様では、本発明は、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されないオリゴマーの合成のためのイオン液体担持方法に関する。
【００１６】
ある態様では、本発明は、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴマーの合成方法に関するものであり、この方法は、イオン液体に結合したモノマー単位をもたらす反応条件下において、第一のモノマー単位をイオン液体と接触させるステップ；及び２〜３０のモノマー単位を含むイオン液体結合オリゴマーをもたらす反応条件下において、前記イオン液体に結合したモノマー単位を、少なくとも１つのさらなるモノマー単位と接触させるステップを含む。次に、このイオン液体結合オリゴマーはイオン液体から切り離されて、遊離したオリゴマーをもたらす。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドからなる群から選択されるオリゴマーの合成方法に関し、本方法は、モノマー単位に対してイオン液体を用いて、２〜３０のモノマー単位を含むオリゴマーをもたらすことを含む。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、化学合成に用いるための、且つ溶媒及び液体担体の両方の二重機能を果たしうる液体担体に関する。具体的態様では、イオン液体は、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式第四級窒素含有有機カチオン、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式第四級ホスホニウム含有有機カチオン、又はヘテロ環式又は置換ヘテロ環式の三価のスルホニウム含有有機カチオン；及び、前記有機カチオンの電荷と釣り合うアニオン、を含む有機塩である。より詳細な態様では、有機カチオンは、Ｎ−置換ピリジン及び１，３−ジ置換イミダゾールからなる群から選択される。有機カチオン上の電荷と釣り合うアニオンは、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＳｂＦ６−、ＣｕＣｌ２−、及びＡｌＣｌ４−からなる群から選択できる。その他の適切なアニオンも使用でき、充分に当業者の能力の範囲内である。
【００１９】
具体的な態様では、本発明は、オリゴペプチドのイオン液体担持合成に関する。なお、さらに具体的な態様では、本発明は、ペンタペプチドＬｅｕ５−エンケファリンの合成に関し、その構造は以下に示す。
【化１】
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【００２０】
本発明の、上述の及びその他の目的、利点、並びに特性は、付属の図面を参照にして、参考のみの例として提供する本発明の説明のための態様の以下の非制限的説明を読むことで、さらに明らかになろう。
【００２１】
［実例態様の詳細な説明］
本明細書中で用いる用語の明確かつ一貫した理解を提供するために、以下に多くの定義を示す。さらに、他に定義されていない限り、本明細書で用いる全ての技術的及び科学的用語は、本発明が関係する技術分野の当業者に通常理解されているものと同じ意味を有する。
【００２２】
請求項及び／又は明細書中の「含む、含有する」の用語との関連で用いられる用語は、単数を意味することができるが、「１以上」、「少なくとも１」、及び「１又は１より多く」の意味ともなる。同様に、「別の」の用語は、少なくとも第二の、もしくはそれ以上のものを意味することができる。
【００２３】
本明細書及び請求項で用いるように、「含む、含有する」（及び、含む、含有する、の全て活用形）、「有する」（及び、有する、の全ての活用形）、「包含する」（及び、包含する、の全ての活用形）、の用語は、包含的、すなわち限定のないものであり、追加の記載されていない要素又は方法ステップを排除するものではない。
【００２４】
「約」の用語は、その値が、その値を測定するために用いた装置又は方法についての内在する誤差の変動を含んでいることを意味するために用いる。
【００２５】
「アミノ酸（類）」の用語は、本明細書で用いるように、天然アミノ酸のＬ及びＤ異性体の両方、並びにペプチドの合成アナログを調製するためにペプチド化学で用いられるその他の非タンパク質関連アミノ酸のＬ及びＤ異性体の両方を含むものとして理解される。天然アミノ酸の例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、及びトレオニンが含まれるが、これらに限定されない。非タンパク質関連アミノ酸の例には、ノルロイシン、ノルバリン、シクロヘキシルアラニン、ビフェニルアラニン、ホモフェニルアラニン、ナフチルアラニン、ピリジルアラニン、及び置換フェニルアラニン類（アルコキシ、ハロゲン、及びニトロ基を含むがこれらに限定されない１以上の置換基で置換されたもの）が含まれるが、これらに限定されない。ベータ及びガンマアミノ酸も、「アミノ酸」の用語の範囲内である。ペプチド合成で用いられる標準の保護基で保護されたアミノ酸もまた、「アミノ酸」の用語の範囲内である。これらの化合物は、ペプチド化学分野の当業者に公知である。
【００２６】
「ヌクレオチド」の用語は、本明細書で用いるように、個別のヌクレオチド又はヌクレオチドの変種を言うものとして理解され、プリン又はピリミジン、リボース又はデオキシリボース糖残基、及びホスフェート基又は（オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチド内のヌクレオチドの場合は）ホスホジエステル結合を含む分子又は大きな核酸分子内の個々の単位を意味する。「ヌクレオチド」の用語はまた、（ａ）別の連結基、（ｂ）プリンの類似形、（ｃ）ピリミジンの類似形、又は（ｄ）類似の糖、から選択される少なくとも１つの修飾を含む「修飾ヌクレオチド」も包含する。オリゴヌクレオチド合成に通常用いられる標準保護基で保護されたヌクレオチドも、「ヌクレオチド」の用語の範囲内である。これらの化合物は、ヌクレオチド化学分野の当業者に公知である。
【００２７】
「サッカライド」の用語は、本明細書で用いるように、実験式（ＣＨ２Ｏ）ｎ（式中、ｎは整数、典型的には３より大きな整数である）を有する、ポリヒドロキシアルデヒドもしくはポリヒドロキシケトン又はそれらの誘導体である炭水化物を言うものとして理解される。モノサッカライド、すなわち単糖類は、単一のポリヒドロキシアルデヒド又はポリヒドロキシケトン単位からなる。モノサッカライドには、リボース、2-デオキシ-リボース、グルコース、マンノース、キシロース、ガラクトース、フコース、フルクトースなどが含まれるがこれらに限定されない。ジサッカライドは、グリコシド結合によって結合された２つのモノサッカライド単位を含む。ジサッカライドには、例えば、スクロース、ラクトース、マルトース、セロビオースなどが含まれる。オリゴサッカライドは、典型的には、グリコシド結合で結合された２〜１０のモノサッカライド単位を含む。ポリサッカライド（グリカン）は、典型的には１０より多くのそのような単位を含み、ヘパリン、ヘパラン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、及びそれらのポリサッカライド誘導体が含まれるがこれらに限定されない。「糖」の用語は、一般に、モノ−、ジ−、又はオリゴサッカライドをいう。サッカライドは、例えば、置換された、グルコサミン、ガラクトサミン、アセチルグルコース、アセチルガラクトース、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル−ガラクトサミン、ガラクトシル−Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチルノイラミン酸（シアリン酸）などであってもよい。サッカライドは、例えば、ヌクレオシド、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＤＮＡ、ＲＮＡなどのサッカライド残基のように、より大きな分子の構成要素として存在することもできる。本明細書で用いるように、「サッカライド」の用語は、修飾されたサッカライド、例えば、（ａ）Ｈ、ＮＨ２、ハロゲン、アルキル、アリールを含むがこれらに限定されない置換基による、１つ以上のＯＨ基の置換；（ｂ）アルデヒド、ケトン、酸、エステル、及びそれらの誘導基への１つ以上のＯＨ基の酸化、から選択される少なくとも１種の修飾を含むもの、を包含するものとしても理解される。オリゴサッカライド合成に通常用いられる標準保護基によって保護されたサッカライドも、「サッカライド」の用語の範囲内である。これらの化合物は、当業者に公知である。
【００２８】
「伸長（する）オリゴペプチド鎖」、「伸長（する）オリゴサッカライド鎖」、及び「伸長（する）オリゴヌクレオチド鎖」の用語は本明細書でも用いるように、任意で適切に保護されていてもよいアミノ酸、サッカライド、又はヌクレオチドの順次の付加によって調製される鎖をいう。各反応サイクルの後で、この伸長オリゴペプチド鎖、伸長オリゴサッカライド鎖、又は伸長オリゴヌクレオチド鎖は、少なくとも１個のアミノ酸、サッカライド、又はヌクレオチドだけ長さが増大し、次の反応サイクルのための出発物質となる。本明細書で用いるように、この用語は、出発物質又は生成物のいずれをもいうことができ、具体的な前後関係においてこの用語によって意図されるものを当業者は理解しよう。
【００２９】
本明細書で用いるとおり、「アルキル基」の用語は、飽和で一価の非分岐又は分岐した炭化水素鎖をいうものとして理解される。アルキル基の例には、（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基が含まれるが、これに限定されない。（Ｃ１〜Ｃ６）アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、2-メチル-1-プロピル、2-メチル-2-プロピル、2-メチル-1-ブチル、3-メチル-1-ブチル、2-メチル-3-ブチル、2,2-ジメチル-1-プロピル、2-メチル-1-ペンチル、3-メチル-1-ペンチル、4-メチル-1-ペンチル、2-メチル-2-ペンチル、3-メチル-2-ペンチル、4-メチル-2-ペンチル、2,2-ジメチル-1-ブチル、3,3-ジメチル-1-ブチル、2-エチル-1-ブチル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、及びヘキシル、が含まれるがこれらに限定されない。
【００３０】
本明細書で用いるとおり、「アリール基」の用語は、環内に０〜４個のヘテロ原子を含んでいてもよい、５−、６−、及び７−員環芳香族基をいい、例えば、フェニル、ピロリル、フリル、チオフェニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、ピラゾリル、ピリジル、ピラジニル、ピリダジニル、及びピリミジニルなどをいう。環構造中にヘテロ原子を有するこれらのアリール基は「アリールヘテロ環」又は「ヘテロ芳香族」ともいうことができる。この芳香族環は、１以上の環上位置で置換されていることができる。アリール基はまた、多環式基の一部であることもできる。例えば、アリール基には、ナフチル、アントラセニル、キノリル、インドリル、などの縮合芳香族残基が含まれる。
【００３１】
本明細書で用いるように、「ハロゲン」の用語は、フッ素、塩素、臭素、又はヨウ素をいうものとして理解される。したがって、用語「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、及びヨードを包含するものとして理解される。
【００３２】
本発明における保護基は、オリゴペプチド合成、オリゴヌクレオチド合成、及びオリゴサッカライド合成に関連して用いられる。保護基は、アミノ酸、サッカライド、又はヌクレオチドのいずれかのモノマーの反応性末端をブロックする。化学合成の性質は、どの反応性基が保護基を必要とするかを決定するであろう。具体的使用にかかわらず、保護基は、別の試薬と反応することから分子上の残基を保護するために用いられる。本発明で用いられる保護基は、以下の性質を有する：保護基は、選択した試薬が、保護基が結合している基を修飾することを防止する；保護基はその合成反応条件に対して安定である（すなわち、保護基は分子に結合したまま残る）；及び、保護基は、残りの構造に悪影響を及ぼすことのない条件下で除去可能である。適切な保護基の選択は、もちろん、モノマー単位及びオリゴマーの化学的性質、並びに保護基がそれに対して保護すべき具体的試薬に左右される。所定の反応スキームに対して適切な保護基を選択することは、当業者の能力内である。
【００３３】
本明細書の記載は、当業者によって用いられる多数の化学用語と略号に言及している。それでもなお、選択した用語の定義を、明確性及び一貫性のために提供した。
【００３４】
略号：
ＤＣＣ：ジシクロヘキシルカルボジイミド；  ＤＭＡＰ：4-(Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノ)ピリジン；  ＥＤＣ：1-(3-ジメチルアミノプロピル)-3-エチルカルボジイミド塩酸塩；  ＨＯＢｔ：1-ヒドロキシベンゾトリアゾール水和物；  ＨＡＴＵ：O-(7-アザベンゾトリアゾール-1-イル) N, N, N’, N’-テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート；  ＰｙＢＯＰ：（ベンゾトリアゾール-1-イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート；  ＤＣＵ：ジシクロヘキシルウレア；  ＤＩＰＥＡ（ヒューニッヒ塩基(Hunig’ base)）：ジイソプロピルエチルアミン；  ＤＣＩ：4,5-ジシアノイミダゾール；  ＤＭＳＯ：ジメチルスルホキシド；  ＤＭＳＯ−ｄ６：重水素化ジメチルスルホキシド；  ＤＣＭ：ジクロロメタン；  ＮＭＩ：N-メチルイミダゾール；  ＴＥＡ：トリエチルアミン；  ＴＥＡＡ：トリエチルアンモニウムアセテート；  ＴＨＦ：テトラヒドロフラン；  ＣＥ：シアノエチル；  ＰＥＧ：ポリエチレングリコール；  Ｐｙ：ピリジン；  Ｓｕｃｃ：スクシニル；  ＣＰＧ：細孔制御されたガラス；  ＩＬ：イオン液体；  ＩＬＳＳ：イオン液体担持合成；  ＤＭＴ：ジメトキシトリチル；  ＬＣＡＡ：長鎖アルキルアミン；  ＥＥＤＱ：2-エトキシ-1-エトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン；  ＩＩＤＱ：2-イソブトキシ-1-イソブトキシカルボニル-1,2-ジヒドロキノリン；  ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸；  ＡｃＯＨ：酢酸；  ＮＭＲ：核磁気共鳴；  ＭＳ：マススペクトル；  ｍ／ｚ：電荷に対する質量比；  ｍ．ｐ．：融点；  ＦＡＢ：高速原子衝撃；  ＴＬＣ：薄層クロマトグラフィー；  ＥＳＩ：エレクトロスプレーイオン化；  ＦＴＭＳ：フーリエ変換マススペクトル；  ＬＣＭＳ：液体クロマトグラフィー−マススペクトル；  Ｊ：結合定数；  ｓ：単一線（シングレット）；  ｔ：三重線（トリプレット）；  ｍ：多重線（マルチプレット）；  Ｐ−III：三価のリン；  Ｐ−V：五価のリン。
【００３５】
本発明によるイオン液体担持合成の一般概念を図１及び２に示す。イオン液体残基上に固定された基質（反応剤）は極性有機溶媒に可溶性であり、液相反応をすることができる。反応の終了及び溶媒の留去後、イオン液体に固定された生成物が溶けない極性の低い有機溶媒によって過剰な試薬を除去しうる。無機試薬及び／又は副生成物は、沈殿により、又は水溶液で洗浄することにより除去しうる。この反応順を繰り返して、より複雑な構造を得ることができる。最後に、生成物を切り離し、有機溶媒抽出によってイオン液体残基から分離することができる。イオン液体担体に固定された基質は、従来の溶液系反応と同様の反応性を大部分保っていると予想される。イオン液体担体上で行う反応の進行は、標準の分光学的手法によって容易に監視及び分析される。
【００３６】
イオン液体によって担持された、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドの合成についての新規な溶液相アプローチを説明する。
【００３７】
ある態様では、本発明は、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されないオリゴマーの合成のためのイオン液体担持方法に関する。さらなる態様では、本発明は、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されないオリゴマーの化学合成に用いるためのイオン液体に関するものであり、このイオン液体は、溶媒及び液体担体の両方の二重の機能を果たしうる。このイオン液体は、有機合成に一般に適用される様々な合成方法に適合性である。さらに詳細には、イオン液体は、オリゴペプチド、オリゴサッカライド、及びオリゴヌクレオチドを含むがこれらに限定されないオリゴマーの合成に一般に適用される様々な合成方法に適合性である。さらに、特に、しかしこれに限定されないが、オリゴペプチド合成の場合には、イオン液体は、その本来のイオン的性質によって、ペプチドビルディングブロックのラセミ化又はエピ化（エピマー化）を起こしてはならない。さらに、イオン液体担体の溶解性が伸長オリゴペプチド鎖、伸長オリゴサッカライド鎖、又は伸長オリゴヌクレオチド鎖によって影響を受け、分離及び精製手段が過度に複雑になってはならない。分離及び精製手段は、非常に簡単化され、通常は水性溶媒及び有機溶媒での洗浄ステップを含む。
【００３８】
本発明のある態様では、イオン液体は、ヘテロ環式又は置換ヘテロ環式第四級窒素含有有機カチオン、及び前記有機カチオンの電荷と釣り合うアニオン、を含む有機塩である。より具体的な態様では、有機カチオンは、Ｎ−置換ピリジン及び１，３−ジ置換イミダゾールからなる群から選択され、かつ、アニオンは、Ｃｌ−、Ｂｒ−、ＢＦ４−、ＰＦ６−、ＳｂＦ６−、ＣｕＣｌ２−、及びＡｌＣｌ４−からなる群から選択される。その他のイオン性液体が当分野で公知であり、当業者の能力の範囲内である。さらに、前記アニオンが有機アニオンであってもよいことも当業者の能力の範囲内であり、有機アニオンの制限されない例には、ＣＨ３ＣＯ２−、ＣＦ３ＣＯ２−、ＣＨ３ＳＯ４−、及びＣＦ３ＳＯ２−が含まれる。
【００３９】
以下の、例示の態様の非限定的説明によって、さらに詳細に本発明を説明する。
【実施例】
【００４０】
［実施例１］イオン液体担体への結合とラセミ化の試験（スキーム１）
3-ヒドロキシエチル-(1-メチルイミダゾリウム）-テトラフルオロボレート（１）（1-メチルイミダゾールと2-ブロモエタノール［３５ａ，ｄ］の反応によって容易に入手できる）を、本発明で意図するイオン液体担持オリゴペプチド合成を説明するための、適切なイオン液体担体の非限定的な例として選択した。本発明にしたがって使用することができるその他のイオン液体担体は、当分野で公知であり、当業者の能力のうちである。
【００４１】
【化２】
2008537733.tif 000004
【００４２】
化合物１上への第一のアミノ酸、Ｂｏｃ−ロイシンの担持のために、様々なカップリング反応条件を試験した。これらのカップリング反応の有効性は、以下に、表１中に示す。
【００４３】
【表１】
2008537733.tif 000005
【００４４】
探索したカップリング条件のなかでは、ＤＣＣ／ＤＭＡＰの組み合わせ（試験８）が最良の結果をもたらした。その他の試験したカップリング条件には、以下の組み合わせ：ＥＤＣ／ＨＯＢｔ、ＨＡＴＵ／ＨＯＢｔ、ＰｙＢＯＰ／ＤＩＰＥＡ、ＥＥＤＱ、又はＩＩＤＱが含まれる。しかし、後者の条件群は、カップリング反応（すなわち、エステル化反応）を定量的転換にまでにするためには充分ではなかった。ＤＣＣ／ＤＭＡＰ経路に対する代替かつ有用なカップリング経路は、追加のカップリングステップを含むけれども、未反応の化合物１を無水酢酸でキャッピングすることを含む。順次のエーテル洗浄及び酸水溶液洗浄によって、過剰なＢｏｃ−ロイシン、ＤＭＡＰ、及びＤＣＵ副生成物を全て除去した。イオン液体担持Ｂｏｃ−ロイシン２が高い単離収率（９１％）かつＮＭＲスペクトルによって検証した高純度で得られた。このカップリング反応は、Ｌ−及びＤ−Ｌｅｕ−Ｂｏｃの両方を用いて行い、それぞれ、２ａ及び２ｂが得られた。
【００４５】
２ａ及び２ｂの様々なＢｏｃ−保護反応条件を試し、その結果を以下の表２に示す。テトラフルオロホウ酸及びトリフルオロ酢酸の両方が、１Ｈ  ＮＭＲスペクトルによって示されるとおり、非常にきれいな脱保護を起こさせることができた。効率的ではないが、Ｂｏｃ脱保護は、Dowex（登録商標）50Wx8-100又はAmberlyst（登録商標）15などの酸性イオン交換樹脂を用いて行うこともできる。その他の脱保護法、例えば「Protective Groups in Organic Synthesis」（Greeneら, John Wiley & Sons, Inc, NY, 1991）中に記載されている方法を本発明にしたがって用いることができ、当業者の能力の範囲内である。
【００４６】
【表２】
2008537733.tif 000006
【００４７】
次のアミノ酸ビルディングブロック、すなわちＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨのカップリング（スキーム２）は、先に中和ステップを行うことが好ましい（表２）。Ｂｏｃ保護に先に用いた過剰のＴＦＡ又はＨＢＦ４は、ＮａＨＣＯ３、Ｅｔ３Ｎ、ＤＩＰＥＡ、又はDowex（登録商標）550A OHなどの塩基性イオン交換樹脂、で中和しうる。本発明に従って使用できるその他の適切な中和剤は当分野で公知であり、当業者の能力の範囲内である。驚くべきことに、次のアミノ酸ビルディングブロック、すなわち、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨのカップリング反応を、ＰｙＢＯＰ／ＤＩＰＥＡ条件を用いて行う場合は、脱保護／中和と次のカップリング反応との両方を、中間体分離及び精製ステップなしに順次行うことができる。
【００４８】
【化３】
2008537733.tif 000007
【００４９】
ペプチド４ａは、実質的に定量的収率で得られた４０。本発明のイオン液体担持方法の利点は、大過剰の試薬を必要としないことである。このカップリング反応は、わずか１．２当量のＰｙＢＯＰとＢｏｃ−Ｐｈｅ−ＯＨで達成しうる。
【００５０】
イオン液体担持合成時の、より特にはＤＣＣ／ＤＭＡＰ条件を用いて担持するステップでの、ラセミ化又はエピ化の可能性を評価するために、一連のイオン液体担持ペプチド４ａ〜ｄを合成した。このペプチドを次にアンモニア／メタノールを用いて開裂させてジペプチド５ａ〜ｄを得た。５ａ（Ｌ，Ｌ）及び５ｂ（Ｄ，Ｌ）の引き続いてのＨＰＬＣ分析は、検出可能な量のその他の異性体がない（＜０．５％）ことを明らかにし、担持ステップ及び続いてのジペプチド合成時に、いかなる有意なラセミ化又はエピ化も起こらないことを示した。さらに、この結果は、塩基条件（アンモニア／メタノール）を用いる開裂ステップ時のラセミ化又はエピ化の不存在をも示唆している。
【００５１】
［実施例２］オリゴペプチド合成及び、イオン液体担体からの切り離し
上記伸長ペプチド鎖４ａに、２つの連続するグリシン残基、次にチロシン残基（全てその保護されたＢｏｃ形で）を、先に開発したカップリング及び脱保護条件を用いて次にカップリングさせ、イオン液体担持ペンタペプチド１１を泡状の淡黄色固体として得た（スキーム３）。この合成スキームにおいて、Ｂｏｃ保護形（７、９、１１）又は脱保護形（６、８、１０）のいずれかの全ての中間体を、当業者に周知の標準的手順で単離し且つ精製した。そのような手順は、一般に、順次の有機溶媒（１種以上）及び水での洗浄を含み、その非制限的実施例を本明細書に記載する。
【００５２】
【化４】
2008537733.tif 000008
【００５３】
構造の確認と純度分析は、従来の分光学的方法、例えば、１Ｈ、１３Ｃ ＮＭＲ、及びＭＳによって実現した。１Ｈ ＮＭＲスペクトルにおけるＢｏｃ基のｔ−ブチル基の存在又は不存在が、カップリング又は脱保護ステップのそれぞれの特徴であった。イオン液体担持オリゴペプチド類（２ａ、４ａ、７、９、及び１１）のマススペクトルは、構造の特性解析をさらに助けた（イオン液体担持オリゴペプチドのカチオンに相当する最も強いシグナル）。
【００５４】
ペンタペプチド生成物であるＬｅｕ５−エンケファリン１４をイオン液体担体から切り離すための２つの経路を評価した（スキーム３）。第一の経路は、塩基性水性条件下でイオン液体担体からペンタペプチド１４を切り離し、次にＴＦＡ／アニソールを用いてＢｏｃ及びｔ−Ｂｕ保護基を除去することを含む。第二の経路は、最初にＴＦＡ／アニソールを用いてＢｏｃ及びｔ−Ｂｕ保護基を除去し、次に塩基性水性条件下でイオン液体担体からペンタペプチド１４を切り離すことを含む。第一の経路は、イオン液体担体からの開裂と反応媒体の酸性化に続いて、保護されたペンタペプチド１２を良好な収率（８４％収率）及び純度で溶液から沈殿させた。
【００５５】
このように調製したＬｅｕ５−エンケファリンペンタペプチド１４の純度を分析した。ペンタペプチド１４は、いかなる再結晶又はクロマトグラフィー手段なしに、その対応するＴＦＡ塩として、化合物１から５０％の全収率で得られた［m.p. １４８〜１５２℃、及び[α]20D = ２５．０（ｃ：０．８、９５％ＡｃＯＨ）］。１４の真正サンプルは１５０〜１５３℃の範囲の融点をもち、比旋光度[α]20D = ２５．６（ｃ：０．９、９５％ＡｃＯＨ）］を有する４１。１４の１Ｈ ＮＭＲスペクトルは、真正サンプルを用いて得られたスペクトルと実質的に同じだった（図３）。Ｌｅｕ５−エンケファリンペンタペプチド１４の純度は、ＨＰＬＣ分析によって実証されたように約９０％純度を超えるものであることが測定された（図４）。このレベルの純度は、クロマトグラフィー精製前に固相ペプチド合成によって一般的に得られるものよりも優れている４２。
【００５６】
Ｌｅｕ５−エンケファリンペンタペプチド１４の合成によって具体化されたように、イオン液体担持合成は、ペプチド合成のこれまでの方法の多くに対していくつかの見込まれる利点を提供する（表３）。
【００５７】
【表３】
2008537733.tif 000009
【００５８】
第一に、その他の溶液相法と同じに、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）とは対照的に、大過剰の反応試薬の使用を避けることができる。非天然型アミノ酸（例えば、Ｄ−アミノ酸）を含むペプチドを合成することを計画した場合、又は大スケールでのペプチド合成が必要な場合に、このことは考慮すべき重要な要因である。第二に、イオン液体担持合成の場合、各中間体は、繰り返しの溶媒洗浄によって容易に精製することができる（液／液相分離）。この面で、ＩＬＳＳは、ＦＰＰＳ（フッ素系相ペプチド合成）並びにＳＰＳＰＳ（可溶性ポリマー担持ペプチド合成）に類似している。
【００５９】
ＩＬＳＳの場合、分離工程は、固体／液体相分離を含むＳＰＰＳに対する場合と同様には容易に自動化されない。しかし、わずか約１モル当量の低分子量イオン液体１しか通常は必要とされないので、ＩＬＳＳに対する負荷容量はＳＰＰＳよりも大きい。その上、イオン液体担体のコストは、フッ素系担体のコスト、又は固体ポリマー担体のコストよりも通常は低く、このことは、大スケールのペプチド合成を計画する場合にさらなる重要な考慮事項である。最後に、ＩＬＳＳの場合、合成中の各中間体の構造及び純度が、通常のスペクトル法（すなわち、１Ｈ、１３Ｃ、及びＭＳ）によって容易に検証可能であった。
【００６０】
［実施例３］イオン液体担持オリゴサッカライド合成
以下のスキーム４に図示したように、イオン液体担持法を用いるオリゴサッカライドの合成は、簡単な相分離を用いて、生成物精製のためのクロマトグラフィー法を必要とすることなく、簡便に達成された。
【００６１】
【化５】
2008537733.tif 000010
【００６２】
フェニル2,3,4,6-O-アセチル-1-チオ-β-O-グルコピラノシドから出発して文献記載の方法４３の修正法によって調製したβ-チオグリコシド１５を、室温でＣＨ２Ｃｌ２中、ブロモ酢酸／ＤＣＣ／ＤＭＡＰでアシル化し、ブロモアセテート１６ａ（Ｘ＝Ｂｒ）を得た（スキーム４）。
【００６３】
アセトン中で、室温における、１６ａ（Ｘ＝Ｂｒ）と1-メチルイミダゾール及びナトリウムテトラフルオロボレートとの反応は、イオン液体に固定されたサッカライド１６ｂ（Ｘ＝［ｍｉｍ］［ＢＦ４］）を９８％収率で与えた。化合物１６ｂは、最初に粗生成物をジエチルエーテルで洗浄して過剰な1-メチルイミダゾールを除去して精製した。生成物は次にＣＨ２Ｃｌ２に溶かし、反応で生じた不溶性の無機ＮａＢｒ塩を濾過によって簡便に除去した。１６ｂの構造は、ＮＭＲ（１Ｈ、１３Ｃ、ＣＯＳＹ、及びＨＭＱＣ）スペクトルによって確認し、これはイミダゾリウム残基とβ-アノマーとしてのアノメリック炭素を明らかに示した。１６ｂの電子スプレーイオン化マススペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）は、唯一の分子イオンとしてのカチオンの存在を示した。
【００６４】
次に、モノサッカライド１６ｂを、ＣＨ２Ｃｌ２中で、−７８℃で２０分間、m-クロロ過安息香酸によって酸化して、９７％収率で、ジアステレオマー（スルホキシドの光学不斉による）の混合物としてスルホキシド１７ｂ（Ｘ＝［ｍｉｍ］［ＢＦ４］）を得た。反応の他方の生成物である、m-クロロ安息香酸は、ジイソプロピルエーテルで洗浄することによって粗生成物から除去した。
【００６５】
次に、スルホキシドグリコシレーション反応を、グリコシル供与体としての１７ｂと受容体としての１５（３当量）を用いた糖−糖組み立て法４４−４６として用いた。グリコシル供与体及び受容体の両方とも低温でジクロロメタン中に良く溶けるので、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルピリジン（４当量）とＴｆ２Ｏ（１当量）を用いるカップリング反応を無水ＣＨ２Ｃｌ２中、−７８℃で行った。本反応過程はＴＬＣによって観察した。
【００６６】
過剰なグリコシルアルコール１５、酸スカベンジャー塩基、及びその他の副生成物をn-ペンタンで、次にジイソプロピルエーテルで洗浄除去することによって、生成物ジサッカライド１８ｂ（Ｘ＝［ｍｉｍ］［ＢＦ４］）を得た。ＣＨ２Ｃｌ２中の粗製１８ｂの溶液にn-ペンタンを添加し、次に溶液を冷却することによって溶液から１７ｂを相分離させることで、プロトン化した酸スカベンジャー、2,6-ジ-tert-ブチル-4-メチルピリジニウムトリフレートを１８ｂから除去した。イオン液体に結合したジサッカライド１８ｂを、２つのアノメリック炭素を示すＨＭＱＣ ＮＭＲスペクトルによって示されるように高純度で得た。さらに、ＥＩＳ−ＭＳはジサッカライド構造を裏付けるだけでなく、未反応のモノサッカライドの不存在をも示した。同じ一連の反応の繰り返しで、スルホキシド１９ｂが得られ、次にイオン液体に結合したトリサッカライド２０ｂ（Ｘ＝［ｍｉｍ］［ＢＦ４］）を得た。このトリサッカライドの形成は、３つのアノメリック炭素の存在を示しているＨＭＱＣ ＮＭＲスペクトルと、モノ又はジサッカライドのいかなる混入もないトリサッカライドカチオンを明確に示しているＥＳＩ−ＭＳによって確かめた。
【００６７】
イオン液体残基と連結基は、メタノール中で１当量のＣｓ２ＣＯ３を用いることによって容易に２０ｂから切り離されて、定量的に生成物２１を与える。トリサッカライド２１は、メタノール溶媒の蒸発、及び、粗生成物をＣＨ２Ｃｌ２中に溶かし、次に濾過によってイミダゾリウム塩を除去することによって容易に単離された。クロマトグラフィー又はその他の生成方法なしにそのように得られたトリサッカライド２１は、ＮＭＲ及びＴＬＣでみて純粋であることがわかった。そのＨＭＱＣ ＮＭＲスペクトルとＥＳＩ−ＭＳ（Ｍ＋Ｎａ＋＝１４２９．７）は、１６ｃ（Ｘ＝Ｈ）から出発する古典的な溶液相合成によって、スキーム４に図示したとおりの同じ反応順序にしたがい、しかし、反応ステップのそれぞれに続くクロマトグラフィー精製を行って別個に調製した２１の真正サンプルと同じであることがわかった。１６ｃを通っての古典的溶液相合成と比較してＩＬＳＳアプローチによって得られた２１の良好な純度は、古典的な溶液相合成のために開発されたカップリング条件及び立体選択性が、ＩＬＳＳにそのまま移されうることを示唆している。この例はまた、固相担体からの切り離し後、最終生成物を精製するためにクロマトグラフィーが一般に必要な固相合成４７との対照をも示している。
【００６８】
［実施例４］イオン液体担持オリゴヌクレオチド合成
ホスホルアミダイト法２−６を用いるオリゴヌクレオチドの固相合成は反復法であり、その方法においては、結合されたヌクレオシドをもつ固体担体が、不安定な保護基を除去することによって末端で脱保護され、それによって求核性水酸基を自由にする。この末端求核性基が次に活性化剤の存在下で、保護されたホスホルアミダイトモノマーに結合される。この新しく作られたホスファイトトリエステル連結基が次に酸化されて、所望し且つより安定なホスフェートトリエステルをもたらす。この方法は、所望する長さ及び組成のオリゴマーが得られるまで繰り返される。可溶性担体を用いた場合に、同様の反復法が用いられうる。
【００６９】
3-ヒドロキシエチル-(1-メチルイミダゾリウム)-テトラフルオロボレート（１）（1-メチルイミダゾールと2-ブロモエタノールの反応で容易に入手可能である［３５ａ，ｄ］）を、本発明によって意図されるイオン液体担持オリゴヌクレオチド合成を説明するための好適なイオン液体担体の非制限的な例として選択した。本発明に従って用いることができるその他のイオン液体担体は当分野で公知であり、当業者の能力の範囲内である。
【００７０】
スクシニル化5’-ＭＭＴ-デオキシヌクレオシド２３４８を、アセトニトリル中、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）と触媒量の4-ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）を用いてイオン液体１と結合し、イオン液体担持ヌクレオシド２４（スキーム５）を得る。反応混合物を濾過して、反応中に形成した不溶性のジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）副生物を除去した。次に、反応混合物を、撹拌したジエチルエーテル−酢酸エチル溶液に滴下して加えることによって、化合物２４を単離し且つ精製する。誘導体化されていないイオン液体１と所望する生成物２４からなる得られる沈殿物を、次にクロロホルム中に溶かし、水で抽出する。イオン液体１は水相とともに除去され、一方、所望する生成物２４は、チミジンの５’位に結合したモノメトキシトリチル保護基の疎水性のために有機相に留まる。５’-モノメトキシトリチル（ＭＭＴ）チミジン誘導体をこの場合には用いたけれども、より一般的に用いられる５’-ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）チミジン誘導体は、このステップで容易に置換されうる。溶媒の除去により、妥当な収率でイオン液体誘導体化ヌクレオシド２４が得られる。２４の構造は、１Ｈ ＮＭＲと、電子スプレーイオン化マススペクトル（ＥＳＩ−ＭＳ）によって確かめられた。
【００７１】
化合物２４の脱トリチル化は、アセトニトリル中での３％のトリフルオロ酢酸の添加と室温での２０分間の撹拌によって達成される。反応混合物を、撹拌したエチルエーテル−酢酸エチル溶液に滴下して加え、沈殿物を集めることによって、生成物は速やかに単離且つ精製される。時々、酸溶液中への再溶解と二回目の沈殿が、脱保護を完了させ、残存するトリタノールを完全に除去するために必要とされる。化合物２５は、９６％の収率で、淡褐色泡状物として得られ、その構造と純度は１Ｈ ＮＭＲとＥＳＩ−ＭＳによって検証される。
【００７２】
【化６】
2008537733.tif 000011
【００７３】
ＴＨＦ又はアセトニトリル中で4,5-ジシアノイミダゾール（ＤＣＩ）を活性化剤として用いて、１〜２時間撹拌して、イオン液体担持ヌクレオシド２５を１．５倍過剰の適切なホスホルアミダイト誘導体（２６ａ〜ｄ）と反応させることによって、ジヌクレオシドホスホトリエステル類  ＡｐＴ、ＣｐＴ、ＧｐＴ、及びＴｐＴ（２７ａ〜ｄ）４９（スキーム６）を２５０μｍｏｌスケールで調製した。反応が完了した後、過剰な活性化ホスホルアミダイトを過剰の無水エタノールの添加とさらに１０分間の撹拌で失活させる。ホスホルアミダイトを失活させることは精製時にそれらの除去を容易にする。ジヌクレオシドホスファイトトリエステル中間体は、次に、酸化の前に、室温で酢酸エチル：エチルエーテル（１：９）から沈殿させることによって簡単に単離される。失活した過剰のモノヌクレオシド3’-O-ホスホルアミダイトが、カップリング生成物よりも酢酸エチル／エーテル中にずっと可溶性であるので、このことがジヌクレオシドホスファイトトリエステルからのモノヌクレオシド3’-O-ホスホルアミダイトの除去を可能にしている。通常、沈殿物は、アセトニトリル又はメタノールを用いてフィルターから直接溶かし出され、所望の生成物の純度を高めるために、１：９の酢酸エチル：エチルエーテルから再び沈殿させる。
【００７４】
ホスファイトトリエステル中間体の酸化を行うために、集めた沈殿物を少量のアセトニトリルに再び溶かし、次に少過剰のピリジンと、２：１のテトラヒドロフラン（ＴＨＦ）：水中のヨウ素の０．１Ｍ溶液の大過剰量とを添加する。ひとたび（ヨウ素による）色が持続したら、亜硫酸水素ナトリウム水溶液（５％）を添加して過剰のヨウ素を減らす。次に、反応混合物をクロロホルムで希釈し、水で抽出した。水層は、カップリングしていないイオン液体担持ヌクレオシド（ヌクレオチド）（なぜなら、それは末端のトリチル塩を欠き、それに水溶性を付与するからである）に加えて、生じた塩（ＮａＩ、Ｎａ２ＳＯ４、過剰の亜硫酸水素塩、ヨウ化ピリジニウムなど）を含む。減圧下での有機溶媒の除去により、良好な収率（表４）と高純度で淡褐色泡状物として生成物（２７ａ〜ｄ）が得られ、キャッピング段階の必要はない。２７ａ〜ｄの脱トリチル化は、ジクロロメタン又はアセトニトリル中の３％のトリフルオロ酢酸の添加、２０分間の撹拌、及び酢酸エチル：エチルエーテル（１：９）中での沈殿によって達成される。この時点で得られる物質は、このステップの間に確立された平衡（ＲＯＨ＋ＤＭＴ＋＝ＤＭＴ−ＯＲ）から生じる最大でも５％のトリチル化出発原料を含みうる。ＤＭＴカチオンをトラップするためのエタノールでの失活は、この問題を取り除くとは思われなかった。しかし、ＴＦＡ処理を繰り返す場合（すなわち、３％トリフルオロ酢酸溶液中への沈殿の再溶解と、続いての第二の沈殿）は、純度は顕著に高くなる（低分解能ＥＳＩ−ＭＳによって観測されるいかなるトリチル化生成物もバルク生成物中にない）。精製した生成物は単純に濾過して、灰白色から淡黄色の粉末状固体を高収率で生じる（表４）。集めた固体（２８ａ〜ｄ）はカップリングの別のラウンド、又は所望する配列が完了している場合は脱保護に、そのまま用いられる。
【００７５】
【化７】
2008537733.tif 000012
【００７６】
上述したダイマー２８ａ〜ｄに加えて、チミジントリマー（２９、３０）及びテトラマー（３１、３２）も、５０〜１００μｍｏｌスケールで合成した。イオン液体担持化合物の同一性は、３１Ｐ−ＮＭＲ並びに低及び高分解能ＥＳＩ−ＭＳの両方によって確かめた（表４）。ダイマー種についての３１Ｐ ＮＭＲデータ（表４）は、２種の可能なＲｐ及びＳｐジアステレオマーホスホトリエステル類に対応する２つのシグナルを示している。β-シアノエチルホスフェート保護基が除去される場合、ヌクレオチド間の架橋がアキラルになり、単一のシグナルのみが観測される。同様に、トリマー種に対する３１Ｐ-ＮＭＲデータ（表４）は、トリチル保護基がなお結合している場合は、８つのシグナルを示す（４つのジアステレオマーそれぞれが、２つのシグナルを示す）。ひとたびトリチル基が除去されると、シグナルはもはや分解され得ない。このことはテトラマーに対しても同様であり、この場合ジアステレオマーの予期される数は８（２３×３＝２４ピーク）である。単離された化合物がジアステレオマーのペアとして存在するという事実は、１Ｈ ＮＭＲピークの帰属を複雑にもする。しかし、３１Ｐに調整したＣＩＧＡＲ実験装置を用いることで、ホスホトリエステル連結基を通した予測される３’-５’連結を観測することが可能だった５０。
【００７７】
【表４】
2008537733.tif 000013
【００７８】
上で合成されたオリゴヌクレオチドを、同じ配列を用いて、一般に用いられる固体担体である細孔制御ガラス（ＣＰＧ；１μｍスケール）上で合成したものと比較した。２つのシステムは平行して脱保護した。所望するオリゴヌクレオチドの完全な脱保護は、それらを、室温で４８時間、又は６０℃で１６時間、濃水酸化アンモニウム／エタノールで処理することによって行った。これらの条件は、シアノエチル保護基、イオン液体残基、塩基（Ａｄｅ、Ｃｙｔ、及びＧｕａ）の環外アミンの全ての保護、及びモノスクシネート連結基の完全な開裂を確実にする。オリゴヌクレオチドは、真空下でのエタノールと水酸化アンモニウム溶液の除去、水への再溶解（固体担体は、ＣＰＧ担持オリゴマーに対する遠心によって簡単に沈殿させられる）、及び次にイオンペア逆相ＨＰＬＣ、アニオン交換ＨＰＬＣ、又はポリアクリルアミドゲル電気泳動によるクロマトグラフ精製、によって単離された。ＩＬＳＳ法の生成物を、標準的な遺伝子の機械合成法によって得られた生成物と、ＬＣＭＳによって比較した。図７は、イオン液体（ＩＬ）担体上で成長させたオリゴマーと、ＣＰＧ上で成長させたオリゴマーとの比較を示す。ＬＣＭＳのデータは、以下の表５にまとめた。
【００７９】
【表５】
2008537733.tif 000014
【００８０】
全ての場合において、ＩＬで生成したオリゴヌクレオチド物質の保持時間は、ＣＰＧで生成したオリゴマーと良く一致する。ＩＬオリゴマーに対する主ピークの面積パーセントは、ＣＰＧ誘導オリゴマーのものより常に数％上である。しかし、イオン液体自身が、オリゴマーを測定するために用いる波長において弱い吸収（保持時間１１．２分；λｍａｘ２１７ｎｍ）をすることを考慮に入れるといくらか誤っている。イオン液体由来ピークによる面積を除くことで、ＩＬ誘導オリゴマーの値が、ＣＰＧ上で合成したオリゴマーについて得られた値と一致する。ＨＰＬＣ線図のいくつかに見られるチミジンヌクレオシドは、不完全なカップリング又は最初のキャッピング段階より前での固体単体の部分的脱トリチル化によって生じ、約１９分に溶出される。ＣＰＧ上で合成した物質中には通常存在するが、後酸化抽出は、ＩＬが介在する生成物からこの物質をかなり除去する（図１）。先に記載したように、トリマー及びテトラマー中の誤った配列の存在（いわゆる「ｎ−１」ピーク）は、不完全なカップリングによるものではなく、むしろカップリングの前の不完全な脱トリチル化によるようである。この物質は抽出時には除去されずに、カップリングに続く脱トリチル化の後で脱保護される（すなわち、トリマー合成後、脱トリチル化は所望するトリマーと、前の段階から持ち込まれた望まないダイマーとを生成する）。したがって、各カップリングステップの前に完全な脱トリチル化を確実にすることが重要である。
【００８１】
［実施例］
一般
全ての試薬は市販品を入手し、他に注意事項のない限り、さらに精製することなく用いた。溶媒は試薬等級のものであり、必要な場合は、標準手法によって乾燥した。反応は、他に特に指示のある場合を除いて無水条件下で行い、シリカゲル６０Ｆ−２５４の背面ポリエステルのプレート（２５０μｍ厚）上での薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）によって、ＵＶ光（２５４ｎｍ）下での検出又は過マンガン酸カリウム水溶液で炭化させて観察した。１Ｈ ＮＭＲ及び１３Ｃ ＮＭＲスペクトルはVarian Mercury-300（３００ＭＨｚ）又はMercury-400（４００ＭＨｚ）分光計で２０℃において記録した（オリゴペプチド合成）。１Ｈ及び１３Ｃ ＮＭＲ、ＨＭＱＣ ＮＭＲ、ＣＯＳＹ ＮＭＲスペクトルは、Sunワークステーションを備えたUnity 500、Varian Mercury 400、及びVarian Mercury 300分光計で記録した（オリゴサッカライド合成）。化学シフトは、１Ｈ ＮＭＲについては、δ７．２４ｐｐｍの残留ＣＨＣｌ３、４．６７ｐｐｍの水、２．０６ｐｐｍのアセトン、又は３．３０ｐｐｍのメタノールを基準にし、１３Ｃ ＮＭＲについては、７７．０ｐｐｍのＣＨＣｌ３、４９．０ｐｐｍのメタノール、及び２９．８ｐｐｍのアセトンを基準にした、δスケール上の百万分の一（ｐｐｍ）で報告した。プロトンとカーボンの帰属は、標準のｇＨＭＱＣ及びｇＣＯＳＹ試験によって行った。融点は、温度計を較正することなく、融点装置で測定した。電子スプレーイオン化（ＥＳＩ）マススペクトルは、KRATOS MS25RFA質量分析計で記録した。高分解能質量分析は、VG MICROMASS ZAB 2F HS分光計（ＦＡＢ）で行った。オリゴヌクレオチド高分解能マススペクトル測定は、IonSpec 7.0 tesla FTMSで、陽イオン電気スプレーモードで行い、ポリエチレングリコール３００、６００、及び１０００で較正した。旋光度は、DIP-140（JASCO）デジタル旋光計を使用して測定した。ラセミ化の程度及び最終生成物の純度は、溶離液としてヘキサン中２−プロパノールを用いてのDiacel Chiralcel OD-H, OD-Jキラル分析カラムと、溶離システムとしてＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ／ＴＦＡを用いてのZorbax SB-CN半予備カラムとを使用して、分析用ＨＰＬＣによって測定した。
【００８２】
〔オリゴヌクレオチド合成、精製、及び同定〕
オリゴヌクレオチドは、その各担体から切り離した後、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって精製した。分離は、６０℃に加熱したPolymerex 10μ RP-1カラム（Phenomenex、10 mm x 250 mm, 10μパッキング）を使用し、Waters 1525 バイナリーＨＰＬＣポンプによって作りだした１ｍＬ／分の移動相流速で行った。最初の移動相は、１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０、８０：２０（ｖ／ｖ）の水：メタノール）の２分間の定組成流と、続いての３５分間にわたる１００ｍＭの酢酸トリエチルアンモニウム緩衝液（ｐＨ７．０、７０：３０（ｖ／ｖ）の水：メタノール）への傾斜シフトと、さらに続いての１分間の定組成流と、その後の初期条件への１４分間の傾斜を付けた戻りと、最後に５分間の定組成流から構成した。溶出は、Waters 2487二重吸光度検出器で、２６０ｎｍと２１７ｎｍで観察した。溶出ピークの画分を集め、移動相を真空下で除去した。サンプルを１０％メタノール−水に再溶解し、続いて分子量を、ThermoQuest Finnigan LCQ Duo質量分析計での低解像度電子スプレーイオン化マススペクトルによって、マイナスイオンモードにおいて測定した。オリゴヌクレオチドの固相合成を、先の記載したように、標準条件６を用いて、Applied Biosystems 3400 DNA/RNA合成装置を使用して、５００Åの長鎖アルキルアミンで被覆され且つ制御された細孔ガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）上で、１μｍｏｌスケールで行った。
【００８３】
エステル化（ローディング）ステップ
無水アセトニトリル（２５ｍＬ）中の、イオン液体１（１．０７ｇ、５ｍｍｏｌ）、Ｂｏｃ-ロイシン（Ｌ-又はＤ-形  ２．３１ｇ、１０ｍｍｏｌ）、及びジメチルアミノピリジン（０．２５ｇ、２ｍｍｏｌ）の混合物に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、ＣＨ２Ｃｌ２中に１Ｍ、１０ｍＬ、１０ｍｍｏｌ）を添加した。この混合物を１８時間、室温で、窒素下で激しく撹拌し、Celite（登録商標）の栓を通して濾過した。Celite（登録商標）の栓をアセトニトリルで濯ぎ、合わせた有機相を真空下で濃縮した。粗製残渣を最初にエーテルで洗浄し（２０ｍＬ×３）、次にＣＨ２Ｃｌ２に溶解し、２Ｍ ＨＣｌ（１０ｍＬ×３）で洗浄した。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、イオン液体担持Ｂｏｃ-ロイシン ２ａ（Ｌ-異性体）又は２ｂ（Ｄ-異性体）１．９５ｇ（９１％）を淡黄色オイルとして得た。
1H NMR (300 MHz, Acetone-d6) δ 9.08 (s, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.71 (s, 1H), 6.41 (d, br, J = 7.8  Hz, 1H), 4.66-4.64 (m, 2H), 4.60-4.43 (m, 2H), 4.20-4.13 (m, 1 H), 4.04 (s, 3H), 1.68-1.53 (m, 3H), 1.39 (s, 9H), 0.91 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6) δ 173.2, 156.4, 138.0, 124.4, 123.6, 79.3, 63.4, 53.0, 49.3, 40.7, 36.6, 28.5 (3C), 25.4, 23.1, 21.6; HRMS (FAB) C17H30N3O4 (M+) に対する計算値340.2237, 測定値 340.2236。
【００８４】
ペプチド形成；カップリング及び脱保護ステップ
ＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中のイオン液体担持Ｂｏｃ−ペプチド（２ｍｍｏｌ）の溶液に、ＴＦＡ（１０ｍＬ）を添加した。反応混合物を室温で窒素下にて０．５時間撹拌した。減圧下で濃縮したら、残渣をエーテルで２回洗浄し、真空下で乾燥させて、脱保護したイオン液体担持ペプチドをＴＦＡ塩として得た。次に、残渣を、その次のＢｏｃで保護したアミノ酸（３ｍｍｏｌ）及びＰｙＢＯＰ（３ｍｍｏｌ）とともに、ＣＨ３ＣＮ（３５ｍＬ）中に溶かした。ＤＩＰＥＡ（６ｍｍｏｌ）を滴下して加え、得られた反応混合物を３５℃で窒素雰囲気下にて８時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残渣を最初にエーテル（２０ｍＬ×３）で洗浄し、次にＣＨ２Ｃｌ２中に溶かし、水（１０ｍＬ×３）で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、濃縮して、イオン液体担持Ｂｏｃ−ペプチド（９０％収率）を得て、これはペプチド合成の次のサイクルに直接用いるために充分な純度であった。この生成物は、所望する場合には、この化合物をアセトン中に溶かし、シリカゲルの短い充填物を通して濾過し、溶媒を蒸発させることによって、さらに精製することができる。
【００８５】
イオン液体担持ロイシンＴＦＡ塩  ３ａ：  1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 9.20 (s, 0.55H), 9.12 (s, 0.45H), 7.85 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 5.02-4.98 (m, 0.45H), 4.75-4.58 (m, 4H), 4.27-4.25 (m, 0.55H), 4.05 (s, 3H), 1.90-1.87 (m, 2H), 1.73-1.70 (m, 1 H), 0.95 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.93 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6) δ 169.4 (0.55C), 167.7 (0.45C), 138.0 (0.55C), 137.8 (0.45C), 124.4, 123.6 (0.45C), 123.5 (0.55C), 65.1 (0.45C), 64.9 (0.55C), 52.2, 48.9, 39.8 (0.55C), 39.4 (0.45C), 36.4, 25.1 (0.45C), 24.8 (0.55C), 22.7 (0.45C), 22.3 (0.55C), 22.1 (0.55C), 21.6 (0.45C); HRMS (FAB) C24H44N6O4BF4 (2M++BF4-) に対する計算値567.3450, 測定値 567.3453。
【００８６】
イオン液体担持Ｌｅｕ-Ｂｏｃ-フェニルアラニン  ４ａ：泡状淡黄色固体；1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 9.04 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.70 (s, 1 H), 7.67 (d, br, J = 6.8 Hz, 1 H), 7.29-7.20 (m, 5H), 6.20 (d, br, J = 8.0 Hz, 1H), 4.69-4.66 (m, 2H), 4.64-4.52 (m, 2H), 4.44-4.37 (m, 2H), 4.08 (s, 3H), 3.19-2.91 (m, 2H), 1.72-1.58 (m, 3H), 1.35 (s, 9H), 0.92 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6) δ 172.9, 172.4, 156.5, 138.2, 132.6, 129.9 (2C), 128.8 (2C), 127.0, 124.5, 123.5, 79.4, 63.4, 56.6, 51.6, 49.4, 40.4, 38.3, 36.7, 28.4 (3C), 25.2, 23.2, 21.6; HRMS (FAB) C26H39N4O5 (M+) に対する計算値487.2920, 測定値 487.2920。
トリフルオロ酢酸による処理で、イオン液体担持Ｌｅｕ-フェニルアラニンＴＦＡ塩６が得られた: 1H NMR (300 MHz, Acetone-d6) δ 9.33 (s, br, 0.6H), 9.25 (s, br, 0.4H), 7.87 (s, br, 1H), 7.72 (s, br, 0.6H), 7.67 (s, br, 0.4H), 7.28-7.25 (m, 5H), 5.38-5.33 (m, 0.4H), 4.70-4.50 (m, 4H), 4.40-4.34 (m, 1.6H), 4.07 (s, 1.8H), 4.00 (s, 1.2H), 3.55-3.26 (m, 2H), 1.82-1.70 (m, 2H), 1.58-1.53 (m, 1 H), 0.92 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (75 MHz, Acetone-d6) δ 172.2, 172.0, 138.7 (0.6C), 138.5 (0.4C), 136.5 (0.6C), 135.6 (0.4C), 
130.5 (0.8C), 130.4 (1.2C), 129.3 (1.2C), 129.2 (0.8C), 128.0 (0.6C), 127.9 (0.4C), 124.5, 123.6 (0.4C), 123.5 (0.6C), 63.6 (0.4C), 63.5 (0.6C), 54.9, 52.1 (0.6C), 52.0 (0.4C), 49.5 (0.6C), 49.4 (0.4C), 40.3 (0.4C), 39.9 (0.6C), 38.2 (0.6C), 37.4 (0.4C), 36.6, 25.2 (0.6C), 25.1 (0.4C), 23.1, 21.6 (0.4C), 21.5 (0.6C); HRMS (FAB) C21H31N4O3 (M+)に対する計算値 387.2395, 測定値 387.2396。
【００８７】
イオン液体担持Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｂｏｃ-グリシン  ７：泡状淡黄色固体; 1H NMR (300 MHz, Acetone-d6) δ 9.04 (s, 1H), 7.78 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.66 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.62 (d, J = 7.5 Hz, 1H), 7.55 (d, J = 8.1 Hz, 1H), 7.30-7.18 (m, 5H), 6.46 (m, 1H), 4.73-4.65 (m, 3H), 4.54-4.51 (m, 2H), 4.45-4.38 (m, 1H), 4.06 (s, 3H), 3.78-3.61 (m, 2H), 3.24-3.00 (m, 2H), 1.71-1.56 (m, 3H), 1.39 (s, 9H), 0.90 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.88 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (75 MHz, 
Acetone-d6) δ 171.7 (2C), 170.3, 156.7, 137.7, 137.5, 129.4 (2C), 128.6 (2C), 126.8, 124.1, 123.0, 79.3, 63.1, 54.9, 51.3, 48.9, 44.4, 39.9, 37.4, 36.2, 28.0 (3C), 24.7, 22.7, 21.2; HRMS (FAB) C28H42N5O6 (M+)に対する計算値 544.3134, 測定値 544.3135。
トリフルオロ酢酸による処理で、イオン液体担持Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-グリシンＴＦＡ塩  ８が得られた: 1H NMR (300 MHz, Acetone-d6) δ 9.13 (s, 1 H), 7.80 (s, 1H), 7.68 (s, 1H), 7.32-7.20 (m, 5H), 4.66-4.50 (m, 7H), 4.41-4.39 (m, 1H), 4.06 (s, 3H), 3.25-2.96 (m, 2H), 1.77-1.68 (m, 2H), 1.59-1.54 (m, 1H), 0.92 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (75 MHz, Acetone-d6) δ 172.4, 172.3, 172.2, 138.4 (0.5C), 138.3 (0.5C), 138.2 (0.5C), 138.0 (0.5C), 130.0 (2C), 128.94 (1C), 128.91 (1C), 127.22 (0.5C), 127.17 (0.5C), 124.57 (0.5C), 124.54 (0.5C), 123.44 (0.5C), 123.40 (0.5C), 63.4, 56.8 (0.5C), 56.6 (0.5C), 51.6 (0.5C), 51.5 (0.5C), 49.5 (0.5C), 49.3 (0.5C), 42.8, 39.9 (0.5C), 39.8 (0.5C), 38.4 (0.5C), 38.3 (0.5C), 36.6, 25.2 (0.5C), 25.16 (0.5C), 23.17 (0.5C), 23.15 (0.5C), 21.5 (0.5C), 21.4 (0.5C); HRMS (FAB) C23H34N5O4 (M+) に対する計算値444.2609, 測定値 444.2611。
【００８８】
イオン液体担持Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｂｏｃ-グリシン  ９：泡状淡黄色固体; 1H NMR (300 MHz, Acetone-d6) δ 9.09 (s, 1H), 8.12 (m, br, 1H), 7.80 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.68 (t, J = 1.8 Hz, 1H), 7.64 (m, 1 H), 7.61 (m, 1 H), 7.30-7.21 (m, 5H), 6.57 (m, 1H), 4.76-4.59 (m, 3H), 4.54-4.51 (m, 2H), 4.40-4.33 (m, 1H), 4.08 (s, 3H), 3.82-3.75 (m, 4H), 3.33-2.95 (m, 2H), 1.89-1.55 (m, 3H), 1.43 (s, 9H), 0.94 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6) δ 171.9, 171.8, 171.6, 169.8, 156.9, 138.0, 137.8, 129.1 (2C), 128.6 (2C), 126.7, 124.1, 123.0, 79.4, 63.1, 55.6, 51.4, 48.9, 44.6, 43.8, 39.9, 37.3, 36.3, 28.2 (3C), 24.7, 22.9, 21.2; HRMS (FAB) C30H45N6O7 (M+) に対する計算値601.3348, 測定値 601.3350。
トリフルオロ酢酸による処理で、イオン液体担持Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-グリシンＴＦＡ塩  １０が得られた: 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 9.10 (s, 1H), 7.81 (s, 1H), 7.70 (s, 1H), 7.28-7.20 (m, 5H), 4.75-4.67 (m, 5H), 4.58-4.50 (m, 2H), 4.43-4.38 (m, 1H), 4.08 (s, 3H), 3.89-2.87 (m, 2H), 3.23-3.04 (m, 2H), 1.65-1.58 (m, 3H), 0.92 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6) δ 171.9, 171.7, 137.9, 129.4, 129.3 (2C), 128.4 (2C), 126.7, 124.0, 123.0, 63.0, 55.8, 50.8, 49.3, 48.9, 43.5, 39.7, 37.3, 36.3, 24.8, 22.7, 21.2.; HRMS (FAB) C25H37N6O5 (M+) に対する計算値501.2826, 測定値501.2825。
【００８９】
イオン液体担持Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｇｌｙ-Ｇｌｙ-Ｂｏｃ-チロシン  １１：泡状淡黄色固体; 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 9.08 (s, 1H), 8.21 (s, br, 1H), 8.07 (s, br, 1H), 7.80 (s, 1H), 7.68 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.67 (s, 1H), 7.56 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.34-7.20 (m, 5H), 7.15 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.90 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.49 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.76-4.56 (m, 3H), 4.54-4.51 (m, 2H), 4.40-4.33 (m, 2H), 4.08 (s, 3H), 3.96-3.66 (m, 4H), 3.31-2.91 (m, 4H), 1.85-1.70 (m, 2H), 1.62-1.55 (m, 1H), 1.36 (s, 9H), 1.30 (s, 9H), 0.94 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.89 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6) δ 174.0, 171.9, 171.7, 171.3, 169.8, 156.4, 154.5, 138.1, 137.8, 132.2, 129.9(2C), 129.3 (2C), 128.6 (2C), 126.7, 124.1, 124.0 (2C), 122.9, 79.6, 77.9, 63.2, 57.2, 56.0, 51.4, 48.5, 44.0, 43.8, 39.8, 37.4, 37.0, 36.3, 28.6 (3C), 28.1 (3C), 24.8, 22.9, 21.2; HRMS (FAB) C43H62N7O9 (M+) に対する計算値820.4605, 測定値 820.4609。
【００９０】
〔担持及びペプチド形成ステップにおけるラセミ化の程度の測定（それがある場合）〕
イオン液体担持Ｌｅｕ-Ｐｈｅ-Ｂｏｃ  ４ａ〜ｄの調製：  ４ａ〜ｄは、上に記載したとおりの一般手順を用いて、イオン液体担持ロイシン２ａ〜ｂ（Ｌ-及びＤ-エナンチオマー）と、Ｂｏｃ-Ｌ-フェニルアラニン及びＢｏｃ-ＤＬ-フェニルアラニンとの反応で調製した。４ａ：Ｌ，Ｌ-エピマー、４ｂ：Ｄ，Ｌ-エピマー、４ｃ：Ｌ，ＤＬ-エピマー、及び４ｄ：Ｄ，ＤＬ-エピマー。
【００９１】
メチルN-(tert-ブチルオキシカルボニル)-フェニルアラニル-ロイシネート５ａ〜ｄ：
先のステップからの４ａ（０．１ｍｍｏｌ）を、アンモニアで飽和させたメタノール（２ｍＬ）中に溶かした。得られた溶液を、次に、室温で夜通し撹拌した。減圧下で溶媒を除去した後、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル２３０〜４００メッシュ、ヘキサン−酢酸エチル勾配）で精製してジペプチド生成物ＭｅＯ-Ｌｅｕ（Ｌ）-Ｐｈｅ（Ｌ）-Ｂｏｃ５ａ-(Ｌ，Ｌ)を得た。同様にして、ジペプチドＭｅＯ-Ｌｅｕ（Ｄ）-Ｐｈｅ（Ｌ）-Ｂｏｃ  ５ｂ-（Ｄ，Ｌ）、ＭｅＯ-Ｌｅｕ（Ｌ）-Ｐｈｅ（ＤＬ）-Ｂｏｃ  ５ｃ-（Ｌ，ＤＬ）、及びＭｅＯ-Ｌｅｕ（Ｄ）-Ｐｈｅ（ＤＬ）-Ｂｏｃ  ５ｄ-（Ｄ，ＤＬ）も調製した。ＨＰＬＣ分析：Diacel Chiralcel OD-Hカラム、ヘキサン中５％イソプロパノール、０．５ｍＬ／分、λ＝２２０ｎｍ、ｔＲ（Ｌ，Ｌ-エピマー）：１３．３分、ｔＲ（Ｄ，Ｌ-エピマー）：１３．４分；ｔＲ（Ｌ，Ｄ-エピマー）：１５．７分；ｔＲ（Ｄ，Ｄ-エピマー）：２２．２分；  Diacel Chiralcel OD-Jカラム、ヘキサン中５％イソプロパノール、０．３ｍＬ／分、λ＝２２０ｎｍ、ｔＲ（Ｌ，Ｌ-エピマー）：１６．０分、ｔＲ（Ｄ，Ｌ-エピマー）：１７．４分。
【００９２】
ＭｅＯ-Ｌｅｕ（Ｌ）-Ｐｈｅ（Ｌ）-Ｂｏｃ  ５ａ-（Ｌ，Ｌ）５１：白色固体、m.p. 101-103 °C (文献17: m.p. 101-104 °C). 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 7.52 (d, J = 7.6 Hz, 
1H), 7.26-7.18 (m, 5H), 6.07 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.56-4.50 (m, 1H), 4.42-4.38 (m, 1H), 3.68 (s, 3H), 3.20-2.88 (m, 2H), 1.75-1.68 (m, 1H), 1.62-1.58 (m, 2H), 1.35 (s, 9H), 0.92 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.91 (d, J = 6.4 Hz, 3H)。 ＨＰＬＣ分析では、いかなる検出可能な量のＤ，Ｌ-エピマー、Ｌ，Ｄ-エピマー、及びＤ，Ｄ-エピマーも示さなかった。 
【００９３】
ＭｅＯ-Ｌｅｕ（Ｄ）-Ｐｈｅ（Ｌ）-Ｂｏｃ  ５ｂ-（Ｄ，Ｌ）５１：白色結晶、m.p.136-138 °C. 1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 7.44 (d, J = 7.2 Hz, 1 H), 7.28-7.18 (m, 5H), 6.06 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.48-4.42 (m, 1H), 4.41-4.35 (m, 1H), 3.66 (s, 3H), 3.11-2.93 (m, 2H), 1.55-1.52 (m, 3H), 1.36 (s, 9H), 0.88 (d, J = 6.4 Hz, 3H), 0.87 (d, J = 6.4 Hz, 3H)。ＨＰＬＣ分析ではいかなる検出可能な量のＬ，Ｌ-エピマー、Ｌ，Ｄ-エピマー、及びＤ，Ｄ-エピマーも示さなかった。
【００９４】
〔ペプチド遊離（切り離し）ステップ〕
ＴＨＦ／Ｈ２Ｏ（１：２、ｖ／ｖ、３．０ｍＬ）中のイオン液体担持ペンタペプチド１１（１８０ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ）の混合物に、１Ｍ ＮａＯＨ水溶液（０．２ｍＬ）を加えた。混合物を室温で５時間撹拌した。揮発性成分を減圧下で除去し、残った溶液をｐＨ５〜６に酸性化した。沈殿物を蒸留水で２回洗浄し、真空下で乾燥して１２０ｍｇ（８５％）のＢｏｃ-ペンタペプチド１２を泡状淡黄色固体として得た。1H NMR (400 MHz, Acetone-d6) δ 8.01 (s, br, 1H), 7.80 (s, br, 1H), 7.65 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.30-7.15 (m, 5H), 
7.17 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.89 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 6.43 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 4.76-4.74 (m, 1H), 4.52-4.47 (m, 1H), 4.42-4.39 (m, 1H), 4.01-3.74 (m, 4H), 3.28-2.90 (m, 4H), 1.79-1.65 (m, 3H), 1.35 (s, 9H), 1.30 (s, 9H), 0.94 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.92 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, Acetone-d6) δ 173.5, 173.2, 171.4, 170.0, 169.0, 156.1, 154.3, 138.0, 132,6, 130.0 (2C), 129.6 (2C), 128.4 (2C), 126.5, 124.0 (2C), 79.2, 77.8, 56.8, 54.9, 51.1, 43.5, 43.1, 40.8, 37.9, 37.3, 28.7 (3C), 28.2 (3C), 25.0, 23.0, 21.5; HRMS (FAB) C37H53N5O9Na (M+Na) に対する計算値734.3741, 測定値 734.3742。
【００９５】
Ｂｏｃ-ペンタペプチド１２（１１７ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）をＣＨ２Ｃｌ２（１．５ｍＬ）中に溶かし、次にＴＦＡ（１．５ｍＬ）とアニソールを数滴添加した。反応混合物を常温において窒素雰囲気下で０．５時間撹拌した。蒸発とエーテルでの洗浄によって、Ｌｅｕ５-エンケファリンをＴＦＡ塩１４として、淡黄色固体として得た（１０９ｍｇ、９９％）。m.p. 148-152 °C (真正サンプルのm.p. 150-153 °C); [α]20D = 25.0 (c 0.8, 95% AcOH), 真正サンプル[α]20D = 25.6 (c 0.9, 95% AcOH); HPLC tR = 16.0 min, (真正サンプル tR = 15.7 min), Agilent Zorbax SB-CN Semi-prepカラム; 溶離液, 0-5 min, H20-0.05%TFA (v/v), 6-15 min, 0-60% CH3CN/H2O-0.05%TFA (v/v/v), 16-23 min, 60-100% CH3CN/H2O-0.05%TFA (v/v/v); ポスト時間, 7分; 流速, 3.0 ml/min; 1H NMR (400 MHz, Methanol-d4) δ 7.24-7.21 (m, 4H), 7.18-7.15 (m, 1H), 7.08 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 6.77 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.71-4,67 (m, 1H), 4.42-4.39 (m, 1H), 4.07 (t, J= 7.2 Hz, 1H), 3.96-3.72 (m, 4H), 3.19-2.92 (m, 4H), 1.71-1.61 (m, 3H), 0.94 (d, J = 6.0 Hz, 3H), 0.90 (d, J = 6.0 Hz, 3H); 13C NMR (100 MHz, Methanol-d4) δ 175.1, 173.1, 171.0, 170.6, 170.4, 158.0, 138.0, 131.3 (2C), 130.2 (2C), 129.2 (2C), 127.5, 125.8, 116.8 (2C), 56.2, 55.6, 52.3, 43.9, 43.4, 41.7, 39.0, 37.7, 26.0, 23.2, 22.0; HRMS (FAB) C28H37N5O7Na (M+Na) に対する計算値578.2592, 測定値 578.2591。
【００９６】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１５）：
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-トリメチルアセチル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（３．０２ｇ、４．８２ｍｍｏｌ）を入れたフラスコに、ＮａＯＣＨ３／ＨＯＣＨ３溶液（５０ｍＬ）とＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）（ｐＨ＝１３）を添加した。溶液を室温で４８時間撹拌し、蒸発により溶媒を除去し、真空中で乾燥させた。無水ＣＨ２Ｃｌ２を粗精製物残渣に添加し、不溶性塩を、濾剤であるセライト（登録商標）５２１を詰めたブフナーロートで濾別した。濾液を集め、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、真空中で乾燥させて生成物を白色固体として得た（２．６１ｇ、収率１００％）。m.p.127-129 °C; 1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 7.51 (m, 2H), 7.40-7.27 (m, 18H), 4.94-4.85 (m, 4H), 4.77 (d, J=l0Hz, 1H), 4.73 (d, J=9.6Hz, 1H), 4.66 (d, J=10.8Hz, 1H), 3.89 (dd, J=2.8Hz, 14.8Hz, H6a, 1H), 3.77-3.69 (m, 2H), 3.59 (t, J=8.8Hz, 1H), 3.50 (t, J=8.8Hz, 1H), 3.40 (m, 1H); 13C NMR (400MHz, CDCl3), δ 138.49, 138.09, 138.02, 133.67, 132.06, 129.25, 128.73-127.89 (m), 87.82, 86.84, 81.41, 79.61, 77.90, 76.13, 75.85, 75.43, 62.48; ESI-MS, C33H34SO5 (M+Na+)に対する計算値: m/z=565, 測定値: 565。
【００９７】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-ブロモアセチル-1-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１６ａ）：
ＣＨ２Ｃｌ２（４０ｍＬ）中のフェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１５）（０．９８８ｇ、１．８２ｍｍｏｌ）及びブロモ酢酸（０．３０８ｇ、２．２１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２中のＤＣＣの１．０Ｍ溶液（２．２０ｍＬ、２．２０ｍｍｏｌ）及び少量のＤＭＡＰ（糖に対して＜５％当量）を添加した。室温で２時間撹拌した後、混合物を濾過して副生成物の１，３-ジシクロヘキシルウレアを除去した。乾燥するまで濾液を蒸発させ、溶離液としてヘキサンと酢酸エチル（７：１、Ｖ／Ｖ）を用いて、残渣をフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ａ、２３０〜４００メッシュ）にかけて純粋な生成物を得た（１．０８ｇ、収率８９％）。
m.p. 85-87 °C; 1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 7.54 (m, 2H), 7.41-7.25 (m, 18H), 4.95-4.84 (m, 4H), 4.75 (d, J=l0Hz, 1H), 4.67 (d, J=9.6Hz, 1H), 4.61 (d, J=10.8Hz, 1H), 4.45 (dd, J=11.2Hz, 0.8Hz, 1H), 4.28 (m, 1H), 3.79 (s, 2H), 3.73 (m, 1H), 3.55 (m, 2H), 3.51 (t, J=18.4Hz, 1H); 13C NMR (300MHz, CDCl3), δ 166.91, 138.29, 138.02, 137.70, 133.51, 132.39, 129.14, 128.76-127.94 (m), 87.81, 86.96, 81.06, 77.49, 77.36, 76.19, 75.79, 75.38, 65.07, 25.90; ESI-MS, C35H35SO6Br (M+Na+)に対する計算値: m/z=685, 測定値: 685。
【００９８】
２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-[２-(３-メチル-イミダゾリウム)]アセチル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシドテトラフルオロボレート（１６ｂ）：
アセトン（２５ｍＬ）中のフェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-ブロモアセチル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１６ａ）（０．８９０ｇ、１．３４ｍｍｏｌ）に、ＣＨ２Ｃｌ２中の１-メチルイミダゾールの１．０Ｍ溶液（１．６１ｍＬ、１．６１ｍｍｏｌ）を加え、さらにＮａＢＦ４（０．１８２ｇ、１．６６ｍｍｏｌ）を加えた。室温での７２時間の撹拌後、沈殿物を濾別し、乾燥するまで濾液を蒸発させ、真空中で夜通し乾燥させた。生成物残渣をジエチルエーテル（１５ｍＬ）で３回洗浄し、上澄みをデカンテーションした。固体を真空中で乾燥させ、１５ｍＬの無水ＣＨ２Ｃｌ２を添加し、沈殿物を濾過することにより、残渣をさらに精製した。乾燥するまで濾液を蒸発させ、真空中で乾燥させて、白色泡状物として純粋な生成物を得た（０．９８９ｇ、収率９８％）。
m.p. 42-44 °C; 1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 8.74 (s, 1H), 7.46 (m, 2H), 7.36-7.23 (m, 18H), 7.17 (m, 2H), 5.01-4.82 (m, 6H), 4.72 (d, J=10.0Hz, 1H), 4.71(d, J=9.6Hz, 1H), 4.58 (d, J=11.2Hz, 1H), 4.50 (dd, J=11.6Hz, 2.4Hz, 1H), 4.24 (dd, J=6.4Hz, 12Hz, 1H), 3.82 (s, 3H), 3.73 (m, 1H), 3.58 (m, 1H), 3.52-3.43 (m, 2H); 13C NMR (300MHz, CDCl3), δ 165.90, 138.33, 138.07, 138.02, 137.83, 133.65, 131.58, 129.37, 128.76-127.92 (m), 123.69, 123.25, 87.41, 86.79, 81.02, 77.53, 76.74, 76.01, 75.70, 75.15, 65.51, 50.03, 36.81; ESI-MS C39H41SO6N2 (M+)カチオンに対する計算値: m/z = 665, 測定値: 665。
【００９９】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-[２-(３-メチル-イミダゾリウム)]アセチル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシルスルホキシドテトラフルオロボレート（１７ｂ）：
−７８℃で、ＣＨ２Ｃｌ２（２ｍＬ）中の１６ｂ（５０．０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中のｍ-クロロ過安息香酸（ｍ-ＣＰＢＡ）（１５．０ｍｇ、０．０６６ｍｍｏｌ）を５分にわたって滴下して加えた。−７８℃で２０分撹拌後、混合物を１５ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２とともにＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１０ｍＬ）中に注いだ。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下にてロータリーエバポレーターで除去した。生成物残渣を、ヘキサンとイソプロピルエーテルで洗浄することによってさらに精製（ＴＬＣで観察）して、２つのジアステレオマーを含む白色固体としてグリコシルスルホキシドを得た（４９．５ｍｇ；収率９７％；ＮＭＲによって測定した２つのジアステレオマーの比は６０：４０）。
1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 9.08 (s, 1H), 7.54 (m, 2H), 7.40-7.16 (m, 20H), 5.11-4.20 (m, 11H), 3.97 (m, 2H), 3.91 (s, 2H), 3.90 (s, 1H), 3.85-3.26 (m, 2H); ESI-MS C39H41SO7N2 (M+)カチオンに対する計算値: m/z = 681, 測定値: 681。
【０１００】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-[２-(３-メチル-イミダゾリウム)]アセチル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド  テトラフルオロボレート（１８ｂ）：
−７８℃で、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の、イオン液体に結合したモノサッカライドスルホキシド（５１．８ｍｇ、０．０６７ｍｍｏｌ；グリコシル供与体）、フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１５、１１４ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ；グリコシル受容体）、及び２，６-ジ-tert-ブチル-４-メチルピリジン（５８．８ｍｇ、０．２８６ｍｍｏｌ；酸除去剤）の溶液に、Ｔｆ２Ｏ（１２μＬ、０．０６７ｍｍｏｌ）をシリンジから１０分間にわたって徐々に添加した。−７８℃で２０分間撹拌後、混合物を１時間にわたって０℃までゆっくり温めた。白色沈殿物の出現をもたらすn-ペンタン（５ｍＬ）を添加することによって反応を止めた。混合物を−７８℃に冷却し、白色沈殿物をすぐに遠心分離した。溶液相にn-ペンタンのさらなる一部（５ｍＬ）を加え、次に−７８℃に冷却した。得られた沈殿物を再び遠心分離した。溶液相を蒸発させ、残渣を数回n-ペンタンで洗い、次にＴＬＣ分析が、残渣が純粋であることを示すまで、イソプロピルエーテルでさらに洗った。白色固体として生成物を得た（３９ｍｇ、収率５０％）。
m.p. 45-47°C; 1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 9.10 (s, 1 H), 7.51 (m, 2H), 7.41-7.13 (m, 35H), 5.10 (d, J=10.4Hz, 1H), 5.00-4.52 (m, 15H), 4.41 (m, 1H), 4.19 (dd, J=12.4Hz, 4.0Hz, 1H), 3.99 (t, J=8.8Hz, 1H), 3.90-3.75 (m, 6H), 3.73-3.62 (m, 2H), 3.55 (m, 2H), 3.42 (t, J=8.8Hz, 
1H), 3.29 (t, 1H); 13C NMR (400MHz, CDCl3), δ=165.79, 138.78, 138.60, 138.41, 138.38, 138.20, 138.11, 138.03, 134.18, 131.78, 129.32, 128.73-127.69 (m), 123.65, 123.24, 97.30, 88.25, 86.88, 81.82, 81.31, 80.30, 79.06, 77.76, 77.57, 75.99, 75.89, 75.81, 75.25, 75.09, 72.83, 68.68, 66.89, 65.49, 50.51, 37.16; ESI-MS C66H69SO11N2 (M+)カチオンに対する計算値: m/z= 1097, 測定値: 1097。
【０１０１】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-[２-(３-メチル-イミダゾリウム)]アセチル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシルスルホキシド  テトラフルオロボレート（１９ｂ）：
−７８℃で、ＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）中のジサッカライドスルフィド１８ｂ（５６．１ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）溶液に、５分間にわたって、ＣＨ２Ｃｌ２（１ｍＬ）中のm-クロロ過安息香酸（m-ＣＰＢＡ）（８．１ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ）を５分間にわたって滴下して加えた。窒素雰囲気保護下、−７８℃で２０分間撹拌後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（１５ｍＬ）とともに飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）中に注いだ。有機相を分離し、再度、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１０ｍＬ）で洗い、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を、減圧下でロータリーエバポレーターによって除去した。生成物残渣をヘキサンとイソプロピルエーテルで洗浄すること（ＴＬＣでモニターした）によって、さらに精製して、２つのジアステレオマーを含む白色固体として所望するグリコシルスルホキシドを得た（５４．０ｍｇ、収率９５％、ＮＭＲで測定した２つのジアステレオマーの比は６０：４０）。
1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 9.48 (s, 1H), 7.58-7.13 (m, 37H), 5.00-4.40 (m, 18H), 3.95-3.25 (m, 13H); ESI-MS C66H69SO12N2 (M+)カチオンに対する計算値: m/z = 1113, 測定値: 1113。
【０１０２】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-[２-(３-メチル-イミダゾリウム)]アセチル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド  テトラフルオロボレート（２０ｂ）：
イオン液体に結合したジサッカライドスルホキシド（１９ｂ；４５．１ｍｇ；０．０３８ｍｍｏｌ；グリコシル供与体）、フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１５；６２．１ｍｇ；０．１１４ｍｍｏｌ；グリコシル受容体）、及び２，６-ジ-tert-ブチル-４-メチルピリジン（３０．８ｍｇ；０．１５０ｍｍｏｌ；酸除去剤）のＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の溶液に、−７８℃で、シリンジから１０分間にわたってＴｆ２Ｏ（６μＬ、０．０３６ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。−７８℃で２０分間撹拌後、混合物を１時間にわたってゆっくりと０℃まで温めた。白色沈殿の出現をもたらすn-ペンタン（５ｍＬ）を添加することによって、反応混合物を失活させた。反応混合物を−７８℃に冷却し、沈殿物を直ちに遠心分離した。溶液相にn-ペンタンの別の一部（５ｍＬ）を加え、次に−７８℃に冷却した。得られた沈殿物を再び遠心分離によって除去した。溶液相を蒸発させ、残渣を数回n-ペンタンで洗い、次にＴＬＣ分析が、残渣が純粋であることを示すまで、イソプロピルエーテルでさらに洗った。白色固体として所望の生成物を得た（３４ｍｇ、収率５６％）。
1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 9.04 (s, 1H), 7.51 (m, 2H), 7.42-7.17 (m, 48H), 7.05 (d, J=10.2Hz, 2H), 5.00-4.50 (m, 25H), 4.39 (d, J=8.0Hz, 1H), 4.15 (m, 1H), 4.00 (m, 2H), 3.89-3.72 (m, 6H), 3.70-3.30 (m, 8H), 3.25 (t, J=8.8Hz, 1H); 13C NMR (400MHz, CDCl3), δ 165.77, 138.95-138.09 (m), 134.22, 131.87, 131.31, 129.29, 128.74-127.36 (m), 123.72, 123.76, 123.01, 103.91,97.47, 97.26, 88.33, 87.74, 86.85, 84.88, 82.66-80.14 (m), 79.21, 79.06, 78.67, 77.54, 75.93-75.85 (m), 75.22-75.00 (m), 72.79, 72.72, 72.51, 70.86, 68.90, 69.58, 68.31, 66.44, 65.81, 65.53, 50.01, 36.90; ESI-MS C93H97SO16N2 (M+)カチオンに対する計算値: m/z= 1529, 測定値: 1529。
【０１０３】
トリサッカライド２１を得るための、２０ｂからのイオン液体残基の切り離し：
イオン液体に結合したトリサッカライド（２０ｂ、３０．０ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を入れたフラスコに、Ｃｓ２ＣＯ３（６．１ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）とメタノール（５ｍＬ）を添加した。室温での１２時間撹拌後に、溶媒をロータリーエバポレーターによって除去し、残渣を減圧下で乾燥させた。この残渣に無水ＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）を添加し、不溶性塩を濾過により分離した。濾液を乾燥するまで蒸発させ、減圧下で乾燥させて所望の生成物２１を得た（２６．１ｍｇ、収率１００％）。
1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 7.54 (m, 2H), 7.43-7.14 (m, 48H), 5.16 (d, J=3.2Hz, 1H), 5.00-4.93 (m, 3H), 4.91-4.86 (m, 4H), 4.85- 4.74 (m, 5H), 4.71-4.53 (m, 9H), 4.40 (d, J=8.0Hz, 1H), 4.12 (d, J=10.0Hz, 1H), 3.99 (m, 2H), 3.86-3.38 (m, 12H), 3.26 (m, 1H); 13C NMR (400MHz, CDCl3), δ 138.94-138.22 (m), 134.33, 132.01, 131.55, 129.19, 129.10, 128.59-127.44 (m), 103.91, 97.54, 97.31, 88.31, 87.79, 86.93, 84.81, 82.62, 81.95, 81.85, 81.75, 81.44, 81.33, 80.73, 80.63, 80.49, 79.23, 79.00, 78.12, 77.91, 77.75, 77.51, 75.95-75.80 (m), 75.45-75.25 (m), 72.75, 
72.61, 72.57, 71.24, 68.65, 66.02, 65.52, 62.30; ESI-MS C87H90SO15Na 
(M+Na+)に対する計算値: m/z= 1429, 測定値: 1429。
【０１０４】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-アセチル-1-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１６ｃ）：
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１５）（０．８０１ｇ、１．４８ｍｍｏｌ）、無水ピリジン（０．４５ｍＬ）、及びＤＭＡＰ（糖に対して５当量％未満）のＣＨ２Ｃｌ２（９ｍＬ）中の溶液に、無水酢酸（０．２１ｍＬ、２．２２ｍｍｏｌ）を添加した。窒素雰囲気の保護下で、室温にて４時間撹拌した後、反応混合物を１５０ｍＬのＣＨ２Ｃｌ２中に移し、０．２Ｍ ＨＣｌ水溶液（３０ｍＬ）、Ｈ２Ｏ（３０ｍＬ）、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）、そして次に食塩水（３０ｍＬ）で、それぞれ洗った。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、溶媒をロータリーエバポレーターによって除去して、粗生成物残渣を得、これを溶離液としてヘキサン及び酢酸エチル（５：１、Ｖ／Ｖ）を用いてフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ａ、２３０〜４００メッシュ）にかけて純粋な生成物（０．８４５ｇ、収率９８％）を得た。
1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 7.55 (m, 2H), 7.40 (m, 2H), 7.36-7.25 (m, 16H), 4.95-4.84 (m, 4H), 4.75 (d, J=10Hz, 1H), 4.67 (d, J=9.6Hz, 1H), 4.58 (d, J=10.8, 1H), 4.37 (d, J=11.6Hz, 1H), 4.22 (m, 1H), 3.73 (t, J=8.4 Hz, 1H), 3.55 (m, 2H), 3.50 (t, J=9.6Hz, 1H), 2.11(s, 3H); ESI-MS C35H36SO6Na (M+Na+)に対する計算値: m/z=607, 測定値: 607。
【０１０５】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-アセチル-β-Ｄ-グルコピラノシルスルホキシド（１７ｃ）：
−７８℃で、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中の１６ｃ（１．０１ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）の溶液に、ＣＨ２Ｃｌ２（７ｍＬ）中のｍ-クロロ過安息香酸（ｍ-ＣＰＢＡ）（０．３８７ｇ、１．７３ｍｍｏｌ）を５分にわたって滴下して加えた。窒素雰囲気の保護下で−７８℃にて２０分撹拌後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（５０ｍＬ）とともにＮａＨＣＯ３飽和水溶液（１００ｍＬ）中に注いだ。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（５０ｍＬ）で再度洗浄し、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を減圧下にてロータリーエバポレーターで除去して粗生成物残渣を得、これをヘキサン及び酢酸エチル（３：１、Ｖ／Ｖ）を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ａ、２３０〜４００メッシュ）にかけて、２つのジアステレオマーの混合物として、純粋な生成物を得た（０．９８４ｇ、収率９５％、ＮＭＲによって測定した２つのジアステレオマーの比は３：１）。
1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 7.62-7.16 (m, 20H), 5.06-4.78 (m, 6H), 4.59-4.36 (m, 2H), 4.19-3.30 (m, 8H); SI-MS C35H36SO7Na (M+Na+)に対する計算値: m/z=623, 測定値: 623。
【０１０６】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-アセチル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１８ｃ）：
スルホキシド  １７ｃ（０．３０２ｇ、０．５０３ｍｍｏｌ）、フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１５、０．４０６ｇ、０．７５４ｍｍｏｌ）及び２，６-ジ-tert-ブチル-４-メチルピリジン（０．３１５ｇ、１．５３ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１０ｍＬ）中の溶液に、−７８℃で、ＣＨ２Ｃｌ２（５ｍＬ）中のＴｆ２Ｏ溶液（０．０９ｍＬ、０．５０３ｍｍｏｌ）をシリンジから１０分間にわたって徐々に添加した。−７８℃で２０分間撹拌後、混合物を１．５時間にわたって−５℃までゆっくり温めた。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（６ｍＬ）を添加することによって反応物を失活させ、ＣＨ２Ｃｌ２（３５ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍＬ）との間で分配させた。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（４０ｍＬ）でさらに洗った。無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた後、有機相を乾燥するまで蒸発させ、残渣を、溶離液としてヘキサン及び酢酸エチル（６：１、５：１、４：１、Ｖ／Ｖ）を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィーにかけて、無色シロップとして純粋な生成物を得た（０．４１４ｇ、収率８１％）。
1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 7.54 (m, 2H), 7.42 (m, 2H), 7.38-7.24 (m, 31 H), 5.05 (m, 2H), 4.94-4.56 (m, 12H), 4.25 (m, 2H), 4.02 (t, J=9.2Hz, 1H), 3.92 (m, 1H), 3.86 (d, J=4.8Hz, 1H), 3.80 (m, 1H), 3.75 (m, 1H), 3.70 (t, 1H), 3.62-3.46 (m, 3H), 3.28 (t, J=8.4Hz, 1H), 2.03 (s, 3H); ESI-MS C62H64SO11Na (M+Na+)に対する計算値: m/z=1039, 測定値: 1039。
【０１０７】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-アセチル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-β-Ｄ-グルコピラノシルスルホキシド（１９ｃ）：
ジサッカライドスルフィド１８ｃ（０．２０２ｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（１２ｍＬ）中の溶液に、−７８℃で、５分間にわたって、ＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）中のm-クロロ過安息香酸（m-ＣＰＢＡ）（０．０４５ｇ、０．１９９ｍｍｏｌ）を５分間にわたって滴下して加えた。窒素雰囲気保護下、−７８℃で２０分間撹拌後、混合物をＣＨ２Ｃｌ２（６０ｍＬ）とともに飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）中に注いだ。有機相を分離し、再度、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（３０ｍＬ）で洗い、無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた。溶媒を、減圧下でロータリーエバポレーターによって除去して粗生成物残渣を得、これを、溶離システムとしてヘキサン及び酢酸エチル（２：１、Ｖ／Ｖ）を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ａ、２３０〜４００メッシュ）にかけて、２つのジアステレオマーの混合物として生成物を得た（０．１９７ｇ、全収率９６％、ＮＭＲで測定した２つのジアステレオマーの比は４：１）。
第一の異性体、Ｒｆ＝０．２７（２：１、ヘキサン／酢酸エチル、Ｖ／Ｖ）；1H NMR (400MHz, CDCl3), δ7.60 (m, 2H), 7.46 (m, 4H), 7.42-7.22 (m, 29H), 5.05 (d, J=3.6Hz, 1H), 5.00-4.66 (m, 12H), 4.60 (d, J=10.8Hz, 1H), 4.27 (m, 2H), 3.87 (m, 3H), 3.74 (m, 4H), 3.59-3.47 (m, 3H), 3.35 (m, 1H) 2.07 (s, 3H); 
第二の異性体、Ｒｆ＝０．１２（２：１、ヘキサン／酢酸エチル、Ｖ／Ｖ）；1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 7.51 (m, 2H), 7.39-7.19 (m, 31H), 7.06 (m, 2H), 4.98-4.88 (m, 3H), 4.82-4.52 (m, 10H), 4.43 (d, J=8.8Hz, 2H), 4.25 (m, 2H), 4.39 (t, J=9.6Hz, 1H), 3.90-3.69 (m, 6H), 3.60 (m, 1H), 3.49 (m, 2H), 2.05 (s, 3H). ESI-MS C62H64SO12Na (M+Na+)に対する計算値: m/z=1055, 測定値: 1055。
【０１０８】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-アセチル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（２０ｃ）：
スルホキシド１９ｃ（０．１１０ｇ、０．１０７ｍｍｏｌ）、フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（１５、０．０８８ｇ、０．１６１ｍｍｏｌ）及び２，６-ジ-tert-ブチル-４-メチルピリジン（０．０７０ｇ、０．３４ｍｍｏｌ）のＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）中の溶液に、−７８℃で、シリンジから１０分間にわたってＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）中のＴｆ２Ｏ（０．０１８ｍＬ、０．１０７ｍｍｏｌ）を徐々に添加した。−７８℃で２０分間撹拌後、混合物を１時間にわたってゆっくりと−１５℃まで温めた。飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（６ｍＬ）を添加することによって反応物を失活させ、ＣＨ２Ｃｌ２（３０ｍＬ）と飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（１５ｍＬ）との間で分配させた。有機相を分離し、飽和ＮａＨＣＯ３水溶液（２０ｍＬ）でさらに洗った。無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させた後、有機相を乾燥するまで蒸発させ、粗製物残渣を、溶離システムとしてヘキサン及び酢酸エチル（４：１、Ｖ／Ｖ）を用いるフラッシュカラムクロマトグラフィー（シリカゲル６０Ａ、２３０〜４００メッシュ）にかけて、無色シロップとして生成物を得た（０．１３２ｇ、収率８５％）。
1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 7.53 (m, 2H), 7.44-7.14 (m, 48H), 5.12 (d, J=3.2Hz, 1H), 5.04-4.52 (m, 21H), 4.40 (m, 1H), 4.24-4.12 (m, 2H), 4.00 (m, 11-1), 3.90-3.36 (m, 12H), 3.28 (m, 1H), 2.00 (s, 3H); 13C NMR (400MHz, CDCl3), δ 170.85, 138.99-138.14 (m), 134.27, 134.17, 
132.06, 131.66, 129.24, 129.15, 128.64, 128.61-127.48 (m), 103.74, 97.51, 97.23, 88.37, 87.77, 86.91, 86.86, 84.79, 82.59, 81.95, 81.86, 81.41, 81.23, 80.67, 80.36, 80.25, 79.16, 78.99, 78.02 77.56, 75.88 (m), 75.25 (m), 72.71, 72.49, 72.37, 71.02, 69.04, 68.30, 66.39, 65.94, 65.67, 63.47, 63.36, 21.34; ESI-MS C89H92SO16Na (M+Na+)に対する計算値: m/z= 1471, 測定値: 1471。
【０１０９】
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド（２１）：
フェニル２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-６-Ｏ-アセチル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-β-Ｄ-グルコピラノシル-(１→６)-２，３，４-トリ-Ｏ-ベンジル-１-チオ-β-Ｄ-グルコピラノシド  ２０ｃ（１０１ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）を入れたフラスコに、Ｃｓ２ＣＯ３（２２．４ｍｇ、０．０６９ｍｍｏｌ）とメタノール（６ｍＬ）を添加した。室温で１４時間撹拌した後、溶媒をロータリーエバポレーターで除去し、未精製残渣を減圧下で乾燥させた。次に、この残渣にＣＨ２Ｃｌ２（３ｍＬ）を添加し、不溶性塩を濾過により分離した。濾液を乾燥するまで蒸発させ、減圧下で乾燥させて純粋な生成物を得た（９６．１ｍｇ、収率９８％）。Ｒｆ＝０．２８（２：１、ヘキサン／酢酸エチル、Ｖ／Ｖ）；1H NMR (400MHz, CDCl3), δ 7.54 (m, 2H), 7.43-7.14 (m, 48H), 5.16 (d, J=3.2Hz, 1H), 5.00-4.93 (m, 3H), 4.91-4.86 (m, 4H), 4.85- 4.74 (m, 5H), 4.71-4.53 (m, 9H), 4.40 (d, J=8.0Hz, 1H), 4.12 (d, J=10.0Hz, 1H), 3.99 (m, 2H), 3.86-3.38 (m, 12H), 3.26 (m, 1H); 13C NMR (400MHz, CDCl3), δ 138.94-138.22 (m), 134.33, 132.01, 131.55, 129.19, 129.10, 128.59-127.44 (m), 103.91, 97.54, 97.31, 88.31, 87.79, 86.93, 84.81, 82.62, 81.95, 81.85, 81.75, 81.44, 81.33, 80.73, 80.63, 80.49, 79.23, 79.00, 78.12, 77.91, 77.75, 77.51, 75.95-75.80 (m), 75.45-75.25 (m), 72.75, 72.61, 72.57, 71.24, 68.65, 66.02, 65.52, 62.30;  マススペクトル用の試料はシリカゲルで濾過してセシウムイオンを除去した; ESI-MS  C87H90SO15Na (M+Na+)に対する計算値: m/z=1429, 測定値: 1429。
【０１１０】
５’-Ｏ-モノメトキシトリチル-３’-Ｏ-スクシニル-チミジン（２３）：
化合物２２（２．８６ｇ、５．５６ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（１．６７ｇ、１６．７ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（０．３４ｇ、２．７８ｍｍｏｌ）を、オーブンで乾燥してアルゴン置換した５０ｍＬフラスコ中で、無水ピリジン（２０ｍＬ）に溶かした。２日間、室温で撹拌して反応させた。ジクロロメタン：メタノール（９：１）のＴＬＣ分析は、出発物質の完全な消失と、単一のより極性の高い生成物の形成を示した。ピリジンを減圧下で除去した。暗褐色の残渣を次にＣＨ２Ｃｌ２（１００ｍＬ）中に溶かし、飽和食塩水で洗った。有機相をＮａ２ＳＯ４上で乾燥させ、次に減圧下で溶媒を除去した。生成物を淡褐色泡状物として高収率で得た（３．１４ｇ、９２％収率）。
1H NMR (DMSO-d6) δ 11.39 & 8.30 (1H, s, NH), 7.50 (1H, s, CH), 7.37-7.21 (14H, m, Ar-H), 6.18 (1 H, t, J = 8 Hz, CH, H1'), 5.28 (1H, d, J = 6 Hz, CH, H3'), 4.03 (1H, broad s, CH), 3.73 (3H, s, CH3), 3.32-3.19 (2H, m, CH2, H5'&5"), 2.62-2.61 (4H, 分離されないm, 2CH2), 2.51-2.27 (2H, m, CH2), 1.41 (3H, s, CH3); C34H34N2O9Na+ 低分解能ESI-MS 計算値637.2, 測定値: 637.1。
【０１１１】
ＭＭＴＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２４）：
化合物２３（１ｇ、１．６３ｍｍｏｌ）、置換イミダゾリウムテトラフルオロボレート１（０．３８ｇ、１．７６ｍｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（０．０５２ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を、乾燥し、窒素置換した１００ｍＬ丸底フラスコに入れた。この混合物に、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（０．６８ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を添加し、次に無水アセトニトリル（２０ｍＬ）を添加した。反応混合物を３日間、室温で撹拌した。９：１のクロロホルム：メタノールでのＴＬＣ分析は、ベースラインから移動しないより極性の高い生成物の形成を示した。反応時に、副生成物であるジシクロヘキシルウレア（ＤＣＵ）が白色固体として生じた。反応を停止させたときに、ＤＣＵは沈殿し、反応混合物を焼結ガラスロートを通して濾過し、数回アセトニトリルで洗った。濾過した溶液を、撹拌したジエチルエーテル−酢酸エチル溶液に滴下して加えることによって、さらなる精製を行った。誘導体化されていないイオン液体１と所望の生成物２４からなる、得られた沈殿物は、次にクロロホルムに溶かし、水で抽出した。有機相を硫酸ナトリウム上で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、生成物を減圧下で乾燥させた。生成物２４を淡褐色泡状物として得た（１．１ｇ、８３％収率）。
1H NMR (アセトン-d6) δ 10.03 (1H, s, NH), 9.10 (1H, s, CH), 7.83 (1H, s, CH), 7.71 
(1H, s, CH), 7.60 (1H, s, CH), 7.50-6.92 (14H, m, Ar-H), 6.33 (1 H, t, J = 8 Hz, CH, H1'), 5.50 (1H, d, J = 6 Hz, CH, H3'), 4.55-4.51 (2H, m, CH2), 4.70-4.66 (2H, m, CH2), 4.15 (1 H, broad s, CH), 4.05 (3, s, CH3), 3.80 (3H, s, CH3), 3.50-3.40 (2H, m, CH2, H5'&5"), 2.70 (4H, broad s, 2 CH2), 2.61-2.40 (2H, m, CH2), 1.42 (3H, s, CH3); C40H43N4O9+。低分解能ESI-MS 計算値 723.3, 測定値: 723.4。
【０１１２】
ＨＯＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２５）：
２４（２．９６ｇ、３．６５ｍｍｏｌ）のジクロロメタン（２００ｍＬ）中の溶液に、ジクロロメタン又はアセトニトリル（１００ｍＬ）中の３％トリフルオロ酢酸を添加した。ＴＦＡの添加時に、溶液は赤橙色になり、撹拌を２０分間続けた。生成物を１０％酢酸エチル／ジエチルエーテルから沈殿させ、濾過し、最少量の上記酸溶液に再溶解し、再度沈殿させて濾過した。沈殿物を１０％酢酸エチル／ジエチルエーテルで濯ぎ、アセトニトリル中に溶かすことによってフィルターから回収し、減圧下で溶媒留去し、化合物２５を淡褐色泡状物として得た（１．８８ｇ、９６％収率）。
1H NMR (DMSO-d6) δ 11.40及び11.39 (合計1H, 2 s, NH), 9.10 (1H, s, CH), 7.76 (1H, s, CH), 7.72及び7.45 (1H, s, CH), 7.70 (1H, s, CH), 6.15 (1H, m, CH, H1'), 5.27及び5.19 (1H, m, CH, H3'), 4.60及び3.60 (2H, m, CH2, H5'及び5"), 4.45 (2H, broad s, CH2), 4.39 (2H, broad s, CH2), 4.24-3.93 (1H, m, CH), 3.86 (3, s, CH3), 2.61-2.60 (4H, 分離されないm, 2 CH2), 2.40-2.16 (2H, m, CH2), 1.77 (3H, s, CH3); C20H27N4O8+ 高分解能ESI-MS 計算値 451.18289, 測定値 451.18234。
【０１１３】
ＤＭＴＡｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２７ａ）：
化合物２５（０．１２ｇ、０．２２ｍｍｏｌ）、アデノシンホスホルアミダイト２６ａ（０．３３ｇ、０．３８ｍｍｏｌ）、及びジシアノイミダゾール（０．３３ｇ、２．８ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬの、オーブンで乾燥して窒素置換した丸底フラスコに入れた。この混合物に、無水ＴＨＦ又はアセトニトリル（５ｍＬ）を加え、得られた溶液を室温で１〜２時間撹拌した。生成物を、１０％酢酸エチル／ジエチルエーテルから２回沈殿させた。この時点で、沈殿物を、アセトニトリル中に再溶解し、２，４，６−コリジン又はピリジン（約３００μＬ）を添加し、次に水性ヨウ素溶液（ＴＨＦ／水（２：１）中０．１Ｍ、過剰量）を添加してホスファイトトリエステル中間体を酸化した。５分後、反応混合物を重硫酸ナトリウム水溶液（９ｍＬ）で失活させ、９０ｍＬのＣＨＣｌ３で希釈し、５０ｍＬの水で抽出した。有機相を無水Ｎａ２ＳＯ４上で乾燥させ、減圧下で溶媒留去して２７ａの泡状物を得た（０．２５９ｇ、８９％）。
31P NMR (アセトニトリル-d3) δ -1.324, -1.477; C61H64N10O16P+ 低分解能ESI-MS 計算値 1223.4, 測定値 1223.4。
【０１１４】
ＤＭＴＣｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２７ｂ）：
化合物２５（０．１１ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）、シチジンホスホルアミダイト２６ｂ（０．３５ｇ、０．４１ｍｍｏｌ）、及びジシアノイミダゾール（０．３７ｇ、３．１ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬの、オーブンで乾燥して窒素置換した丸底フラスコに入れた。溶媒の不存在が、反応が起こることを妨げた。無水ＴＨＦ又はアセトニトリル（５ｍＬ）をフラスコ中に注入することによって反応を開始させ、その溶液を室温で１〜２時間撹拌した。２７ａの場合と同じ処理をして、生成物を高収率で２７ｂの泡状物として得た（０．２３４ｇ、９１％）。
31P NMR (アセトニトリル-d3) δ -1.545, -1.754; C60H64N8O17P+ 低分解能ESI-MS 計算値 1199.4, 測定値 1199.4。
【０１１５】
ＤＭＴＧｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２７ｃ）：
化合物２５（０．１３ｇ、０．２４ｍｍｏｌ）、グアノシンホスホルアミダイト２６ｃ（０．３５ｇ、０．４２ｍｍｏｌ）及びジシアノイミダゾール（０．３８ｇ、３．２ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬの、オーブンで乾燥して窒素置換した丸底フラスコに入れた。溶媒の不存在が、反応が起こることを妨げた。無水ＴＨＦ又はアセトニトリル（５ｍＬ）をフラスコ中に注入することによって反応を開始させ、その溶液を室温で１〜２時間撹拌した。２７ａの場合と同じ処理をして、生成物を高収率で２７ｃの泡状物として得た（０．２１４ｇ、９０％）。
31P NMR (アセトニトリル-d3) δ -1.149, -1.194; C58H66N10O17P+ 低分解能ESI-MS 計算値 1205.4, 測定値 1205.6。
【０１１６】
ＤＭＴＴｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２７ｄ）：
化合物２５（０．２４ｇ、０．４５ｍｍｏｌ）、チミジンホスホルアミダイト２６ｄ（０．５７ｇ、０．７７ｍｍｏｌ）、及びジシアノイミダゾール（０．６６ｇ、５．６ｍｍｏｌ）を、５０ｍＬの、オーブンで乾燥して窒素置換した丸底フラスコに入れた。溶媒の不存在が、反応が起こることを妨げた。無水ＴＨＦ又はアセトニトリル（５ｍＬ）をフラスコ中に注入することによって反応を開始させ、その溶液を室温で１〜２時間撹拌した。２７ａの場合と同じ処理をして、生成物を高収率で２７ｄの泡状物として得た（０．４９２ｇ、９１％）。
31P NMR (アセトニトリル-d3) δ -1.494, -1.584; C54H61N7O17P+ 低解像度ESI-MS 計算値 1110.4, 測定値 1110.4。
【０１１７】
ＨＯＡｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２８ａ）：
化合物２７ａ（０．２６ｇ、０．２０ｍｍｏｌ）をアセトニトリル（１〜２ｍＬ）に溶かし、アセトニトリル（２〜３ｍＬ）中の３％トリフルオロ酢酸を添加した。反応混合物を２５に対してと同じ方法に従って処理し、泡状物として高収率で２８ａが得られた（０．１８５ｇ、９３％）。
1H NMR (アセトニトリル-d3) δ 6.47-6.51 (Ade H1'), 6.17-6.22 (Thy H1'), 5.25-5.30 (Ade and Thy H3'), 2.82-3.09 (Thy H5'&5"); 31P NMR (アセトニトリル-d3) δ -1.176, -1.516; C40H46N10O14P+, 高分解能ESI-MS 計算値 921.29326, 測定値 921.29271。
【０１１８】
ＨＯＣｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２８ｂ）：
アセトニトリル（１〜２ｍＬ）中の化合物２７ｂ（０．２３ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、アセトニトリル（２〜３ｍＬ）中の３％トリフルオロ酢酸を添加して２８ｂを生成させた。反応混合物を２５に対してと同じ方法に従って処理し、泡状物として高収率で２８ｂが得られた（０．１６７ｇ、９５％）。
1H NMR (アセトニトリル-d3) δ 6.09-6.24 (Cyt 及び Thy H1'), 5.21-5.33 (Thy H3'), 5.06-5.14 (Cyt H3'), 2.82-2.88 (Thy H5'及び5"); 31P NMR (アセトニトリル-d3) δ -1.381, -1.613; C39H46N8O15P+ 高分解能 ESI-MS 計算値 897.28203, 測定値 897.28148。
【０１１９】
ＨＯＧｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２８ｃ）：
アセトニトリル（１〜２ｍＬ）中の化合物２７ｃ（０．２１ｇ、０．１７ｍｍｏｌ）の溶液に、アセトニトリル（２〜３ｍＬ）中の３％トリフルオロ酢酸を添加した。反応混合物を２５に対してと同じ方法に従って処理し、泡状物として高収率で２８ｃが得られた（０．１５７ｇ、９６％）。
1H NMR (アセトニトリル-d3) δ 6.08-6.25 (Gua及び Thy H1'), 5.26-5.30 (Gua H3'), 5.17-5.22 (Thy H3'), 2.81-3.05 (Thy H5'及び5"); 31P NMR (アセトニトリル-d3) δ -1.047, -1.064; C37H48N10O15P+ 高分解能 ESI-MS 計算値 903.30382, 測定値 903.30328。
【０１２０】
ＨＯＴｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２８ｄ）：
アセトニトリル（１〜２ｍＬ）中の化合物２７ｄ（０．２１ｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、アセトニトリル（２〜３ｍＬ）中の３％トリフルオロ酢酸を添加した。反応混合物を２５に対してと同じ方法に従って処理し、泡状物として高収率で２８ｄが得られた（０．１２３ｇ、７８％）。
1H NMR (アセトニトリル-d3) δ 6.16-6.24 (5'-Thy及び 3'-Thy H1'), 5.22-5.30 (3'-Thy H3'), 5.07-5.12 (5'-Thy H3'), 2.30-2.86 (3'-Thy H5'及び5"); 31P NMR (アセトニトリル-d3) δ -1.188, -1.284; C33H43N7O15P+ 高分解能ESI-MS 計算値 808.25548, 測定値 808.25493。
【０１２１】
ＤＭＴＴｐＴｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（２９）：
化合物２８ｄ（０．０６５ｇ、０．０７３ｍｍｏｌ）を、３’-ホスホルアミダイト２６ｄ（０．２３３ｇ、０．３１ｍｍｏｌ）及びジシアノイミダゾール（０．３１ｇ、２．６ｍｍｏｌ）と、無水アセトニトリル（５ｍＬ）中で室温にて混合した。２時間撹拌した後、化合物２７ａ〜ｄに対しての方法と同じ方法で、生成物を１０％酢酸エチル／ジエチルエーテルから２回沈殿させ、酸化し、抽出して、化合物２９（１０４ｍｇ、９２％収率）を高純度で得た。
31P NMR (アセトニトリル-d3) -1.081, -1.194, -1.233, -1.262, -1.381, -1.403, -1.448, -1.477; C67H77N10O24P2+ 低分解能ESI-MS 計算値 1467.5, 測定値1467.8.
【０１２２】
ＨＯＴｐＴｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（３０）：
アセトニトリル（１〜２ｍＬ）中の化合物２９（９７ｍｇ、０．０６ｍｍｏｌ）の溶液に、アセトニトリル（２〜３ｍＬ）中の３％トリフルオロ酢酸を添加した。反応混合物を２５に対してと同じ方法に従って処理し、ガラス状固体として３０が得られた（７７ｍｇ、９８％収率）。
31P NMR (アセトニトリル-d3) -1.157〜-1.531 (ピークの広い重なり); C46H59N10O22P2+ 高分解能ESI-MS 計算値 1165.32807, 測定値1165.32752。
【０１２３】
ＤＭＴＴｐＴｐＴｐＳｕｃｃ−ＩＬ（３１）：
化合物３０（１７０ｍｇ、０．１３６ｍｍｏｌ）を、３’-ホスホルアミダイト２６ｄ（０．１６０ｇ、０．２１５ｍｍｏｌ）及びジシアノイミダゾール（０．２１ｇ、１．８ｍｍｏｌ）と、無水アセトニトリル（５ｍＬ）中で室温にて混合した。２時間撹拌した後、化合物２７ａ〜ｄに対しての方法と同じ方法で、生成物を１０％酢酸エチル／ジエチルエーテルから２回沈殿させ、酸化し、抽出して、化合物３１（２３１ｍｇ、８９％収率）を高純度で得た。
31P NMR (アセトニトリル-d3) -1.169〜-1.859 (ピークの広い重なり); C80H93N13O31P3+ 低分解能ESI-MS 計算値 1824.5, 測定値 1824.2。
【０１２４】
ＨＯＴｐＴｐＴＳｕｃｃ−ＩＬ（３２）：
アセトニトリル（１〜２ｍＬ）中の化合物３１（１９０ｍｇ、０．１２２ｍｍｏｌ）の溶液に、アセトニトリル（２〜３ｍＬ）中の３％トリフルオロ酢酸を添加した。反応混合物を２５に対してと同じ方法に従って処理し、化合物３２が得られた（１６０ｍｇ、９９．９％収率）。
31P NMR (アセトニトリル-d3) -1.142〜-1.51 (ピークの広い重なり); C59H75N13O29P3+ 高分解能ESI-MS 計算値 1522.40066, 測定値 1522.40011。
【０１２５】
オリゴヌクレオチド（３３ａ〜ｆ）の脱保護：
シアノエチル保護基、塩基保護基（ａ〜ｃについて）、及びイオン液体担体へのスクシニル架橋基の除去は、化合物２８ａ〜ｄ並びに化合物３０〜３２の１〜５ｍｇを、１．５ｍＬの濃水酸化アンモニウムと無水エタノール（３：１）で、６０℃にて１６時間又は室温にて４８時間処理して達成される。サンプルを冷却した後、アンモニア溶液を蒸発させ、残渣を水に溶かし、イオンペア逆相ＨＰＬＣによって精製して、３３ａ〜ｆを得た。
【０１２６】
本発明は、上述した構成及び部分の詳細にその応用が限定されないことが理解されるべきである。本発明は、その他の態様であることができ、様々なやり方で実施されうる。本明細書で使用した語法及び術語は、説明のために用いたものであって限定されるものではないことも理解されよう。したがって、本発明を、本発明の実例を用いて上に説明しているが、付属の請求項で定義されるように、本発明の精神、範囲及び特質から離れることなく変更することができる。
【０１２７】
〔参考文献〕
【表６Ａ】
2008537733.tif 000015
【表６Ｂ】
2008537733.tif 000016
【表６Ｃ】
2008537733.tif 000017
【表６Ｄ】
2008537733.tif 000018
【表６Ｅ】
2008537733.tif 000019
【図面の簡単な説明】
【０１２８】
【図１】図１は、本発明によるイオン液体担持合成の一般的概念のある態様の説明図である。
【図２】図２は、本発明によるイオン液体担持合成の一般的概念のさらなる態様の説明図である。
【図３】図３は、真正のＬｅｕ５−エンケファリン４１と合成したＬｅｕ５−エンケファリン１４のＴＦＡ塩の１Ｈ ＮＭＲスペクトルの図である。
【図４】図４は、ＩＬＳＳによって合成した粗製Ｌｅｕ５−エンケファリン１４のＨＰＬＣ分析の図である。４２
【図５】図５は、イオン液体担持ペプチド２ａ、４ａ、７、９、及び１１の１Ｈ ＮＭＲスペクトルの図である。
【図６】図６は、イオン液体担持ペプチド２ａ、４ａ、７、９、及び１１のマススペクトルの図である。
【図７】図７は、脱保護したオリゴヌクレオチドの様々なＨＰＬＣクロマトグラフィーの図である。
【図１】
2008537733.tif 000020
【図２】
2008537733.tif 000021
【図３】
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【図４】
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【図５】
2008537733.tif 000024
【図６】
2008537733.tif 000025
【図７】
2008537733.tif 000026
【国際調査報告】
2008537733.tif 000027
2008537733.tif 000028
2008537733.tif 000029