(57)【要約】本発明は、細胞への核酸分子の非経口送達のための方法および処方物に関する。具体的には、本発明は、生体膜を通過するポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドの輸送を促進する方法および処方物に関する。１つの態様においては、本発明は、生体膜を処方物（ポリヌクレオチド、全濃度で約０．２重量％から約１０重量％の少なくとも１つの浸透促進剤、および約１％から６０％の濃度のアルコールを含む）と接触させることによる、細胞へのポリヌクレオチドの送達のための方法に関する。
2008513513.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞にポリヌクレオチドを送達するための方法であって、生体膜を、該ポリヌクレオチド、全濃度で約０．３重量％から約１０重量％の少なくとも１つの浸透促進剤、および約１重量％から約６０重量％の濃度のアルコールを含む処方物と接触させる工程を含む、方法。
【請求項２】
細胞にポリヌクレオチドを送達するための方法であって、生体膜を、該ポリヌクレオチド、全濃度で約０．２重量％から約１０重量％の少なくとも１つの浸透促進剤、および水を含む乳剤処方物と接触させる工程を含み、該浸透促進剤が、ラウレス硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ２０）、およびミリスチン酸イソプロピルから選択される、方法。
【請求項３】
前記ポリヌクレオチドがオリゴヌクレオチドである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が哺乳動物の細胞である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生体膜が皮膚または粘膜である、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記浸透促進剤が陰イオン性界面活性剤である、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記陰イオン性界面活性剤が、アルキル硫酸塩または硫酸アルキルエーテルである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記陰イオン性界面活性剤が、ラウリル硫酸ナトリウムまたはラウレス硫酸ナトリウムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記浸透促進剤がＮ−ラウロイルサルコシンである、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記浸透促進剤がソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ２０）である、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記処方物に、約０．４重量％から約１０重量％の前記浸透促進剤が含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記処方物に、約０．８重量％の前記浸透促進剤が含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
前記浸透促進剤がラウレス硫酸ナトリウムである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記処方物に、約０．６重量％の前記浸透促進剤が含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項１６】
前記浸透促進剤がＮ−ラウロイルサルコシンである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記処方物に、約０．４重量％の前記浸透促進剤が含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記浸透促進剤がソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ２０）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アルコールがエタノールである、請求項３に記載の方法。
【請求項２０】
前記処方物に、約１重量％から約５０重量％のアルコールが含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項２１】
前記処方物が水性処方物である、請求項３に記載の方法。
【請求項２２】
前記水性処方物が水性のゲル性処方物である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記水性のゲル性処方物に、約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記水性のゲル性処方物に、さらに、約５重量％のエタノールが含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記水性のゲル性処方物に、さらに、約１０重量％のエタノールが含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記水性のゲル性処方物に、さらに、約２０重量％のエタノールが含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
前記水性のゲル性処方物に、さらに、約４９重量％のエタノールが含まれる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記処方物がリポソームを含む処方物である、請求項３に記載の方法。
【請求項２９】
前記リポソームを含む処方物に、約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記リポソームを含む処方物に、さらに、約１０重量％のエタノールが含まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記リポソームを含む処方物に、さらに、約５重量％のエタノールが含まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記リポソームを含む処方物に、さらに、約２．５重量％のエタノールが含まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記リポソームを含む処方物に、約０．６重量％のＮ−ラウロイルサルコシンが含まれる、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記リポソームを含む処方物に、さらに、約０．４重量％のソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ２０）が含まれる、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記リポソームを含む処方物に、さらに、約５重量％のエタノールが含まれる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記乳剤処方物に、約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項３７】
前記乳剤処方物に、約０．３５重量％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項３８】
前記乳剤処方物に、さらに、約０．１５重量％の１−フェニルピペラジンが含まれる、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記乳剤処方物に、約０．６重量％のＮ−ラウロイルサルコシンが含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項４０】
前記乳剤処方物に、さらに、約０．４重量％のソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ２０）が含まれる、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記乳剤処方物に、さらに、約１０重量％のミリスチン酸イソプロピルが含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項４２】
前記乳剤処方物に、さらに、ＨＰＭＣ  ４０００  ｃｐｓ、ポリオキシル−４０ステアレート、モノステアリン酸グリセリル、メチルパラベン、およびプロピルパラベンが含まれる、請求項３に記載の方法。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドが二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子である、請求項３に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｄｓＯＤＮ分子の第１鎖が、第２鎖に対して少なくとも部分的に相補的である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ｄｓＯＤＮ分子の第１鎖が、第２鎖に対して完全に相補的である、請求項４３に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｄｓＯＤＮ分子に少なくとも１つの一本鎖突出が含まれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４７】
前記ｄｓＯＤＮ分子に、３’または５’末端のいずれか、あるいは両方で互いに共有結合し、ダンベル状の構造または環状分子を生じる、２つのオリゴデオキシヌクレオチド鎖が含まれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｄｓＯＤＮ分子が、ホスホジエステラーゼ骨格、ホスホロチオエート骨格、または混合ホスホジエステラーゼ−ホスホロチオエート骨格を有する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４９】
ｄｓＯＤＮ分子の前記第１鎖および第２鎖が、ワトソン−クリック塩基対合によってのみ互いに結合している、請求項４３に記載の方法。
【請求項５０】
前記ｄｓＯＤＮが少なくとも１５塩基対の長さである、請求項４３に記載の方法。
【請求項５１】
前記ｄｓＯＤＮ分子に、転写因子に特異的に結合することができる配列が含まれる、請求項４３に記載の方法。
【請求項５２】
前記転写因子が、Ｅ２Ｆ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＨＩＦ−１、およびＮＦ−κＢからなる群より選択される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ｄｓＯＤＮ分子が、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記ｄｓＯＤＮ分子が、前記参照分子の結合親和性の少なくとも約１０倍の結合親和性で前記Ｅ２Ｆ転写因子に結合する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記ｄｓＯＤＮ分子がＨＩＦ−１転写因子に特異的に結合することができる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５６】
哺乳動物被験体の炎症性疾患または状態の処置のための、請求項１から５５のいずれか１項に記載の処方物を含む薬学的組成物。
【請求項５７】
前記オリゴヌクレオチドが、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができる二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子である、請求項５６に記載の薬学的組成物。
【請求項５８】
前記ｄｓＯＤＮ分子の濃度が、全処方物の約０．１重量％から約１．０重量％である、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項５９】
前記ｄｓＯＤＮ分子の濃度が、全処方物の約０．１重量％である、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項６０】
前記ｄｓＯＤＮ分子の濃度が、全処方物の約０．２５重量％である、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項６１】
前記ｄｓＯＤＮ分子の濃度が、全処方物の約０．５重量％である、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項６２】
前記オリゴヌクレオチドが、ＨＩＦ−１転写因子に特異的に結合することができる二本鎖のオリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子である、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項６３】
前記炎症性疾患または状態が皮膚の炎症または皮膚ガンである、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項６４】
前記疾患または状態が、急性または慢性の皮膚の炎症に関係している、請求項６３に記載の薬学的組成物。
【請求項６５】
前記皮膚ガンが、基底細胞ガン（ＢＣＣ）、扁平上皮細胞ガン（ＳＣＣ）、または黒色腫である、請求項６３に記載の薬学的組成物。
【請求項６６】
前記疾患または状態が、アトピー性皮膚炎、接触皮膚炎、脂漏性皮膚炎、乾癬、酒さ、湿疹、挫創、脱毛症、創傷治癒、および瘢痕組織からなる群より選択される、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【請求項６７】
前記状態がアトピー性皮膚炎である、請求項６６に記載の薬学的組成物。
【請求項６８】
前記状態が乾癬である、請求項６６に記載の薬学的組成物。
【請求項６９】
前記哺乳動物被験体がヒトである、請求項５７に記載の薬学的組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、細胞にポリヌクレオチドを送達するための方法および処方物に関する。具体的には、本発明は、生体膜を通過するポリヌクレオチドの輸送を促進する方法および処方物に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術の説明）
ポリヌクレオチドの送達
バイオテクノロジーの分野での進歩によって、これまでは処置することが困難であったガンおよび炎症性疾患のような種々の疾患の処置において著しい改善が導かれた。多くのこのような進歩には、被験体（特に、ヒト被験体）へのポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）の投与が含まれている。このような分子の経口投与は、種々の疾患および障害の処置に有効であることが示されている。例えば、１９９７年１月２１に発行されたＤｒａｐｅｒら、特許文献１を参照のこと。ここでは、哺乳動物の眼球の硝子体液へのアンチセンスオリゴヌクレオチドの直接の送達のための手段としての硝子体内注射が開示されている。非特許文献１および非特許文献２もまた参照のこと。これらのそれぞれでは、アンチセンスオリゴヌクレオチドの静脈内注射によるクローン病の処置が議論されている。非経口経路（例えば、経皮、経口、もしくは直腸への送達、または他の粘膜経路）によっては、オリゴヌクレオチドの、簡単であり、容易であり、そして安全である投与が期待できる。例えば、オリゴヌクレオチドの経皮的な薬剤送達は注射に代わるものとして魅力的であり、痛みが少ない。しかし、皮膚透過性が低いことが原因で、経皮用の製品はごくわずかしか市販されていない。皮膚からの薬剤の流量を増大させるために、種々の化学的な浸透促進剤が研究されている。（例えば、非特許文献３；非特許文献４；非特許文献５を参照のこと）。しかし、オリゴヌクレオチドの経皮送達についてなおも残っている課題の１つは、十分な浸透の促進を誘導するために必要な濃度では、使用される処方物によって、多くの場合に、皮膚に深刻な刺激が生じるという事実である（例えば、非特許文献６を参照のこと）。したがって、皮膚に刺激を生じることなくオリゴヌクレオチドを送達するために皮膚透過性を十分に高める局所用処方物が必要とされている。
【０００３】
したがって、非経口経路から投与された場合に新規のポリヌクレオチド薬剤の有用性を高めるための処方物および方法を提供することが必要とされている。ポリヌクレオチド（例えば、オリゴヌクレオチド）の、簡単であり、便利な、実用的な、そして最適な非経口送達が可能である新しい処方物および方法を開発することが望まれている。
【０００４】
転写因子
細胞は、特異的な遺伝子の発現レベルを変化させることによって、正常なまたは病理学的な刺激に応答することができる。したがって、多数の疾患が、１つ以上の遺伝子の異常な発現（過剰発現または過少発現（ｕｎｄｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ））に関係し得る。一般的には、これらの遺伝子の発現は、種々の転写因子によって制御される。
【０００５】
転写因子は、細胞外シグナルから細胞内応答までの経路を繋ぐように機能する、細胞内の分子のグループを提示する。環境による刺激の直後に、細胞質ゾル中に主に存在しているこれらのタンパク質は核に転移し、ここで、これらは標的遺伝子のプロモーターエレメント中の特異的ＤＮＡ配列に結合し、これらの標的遺伝子の転写を活性化させる。
【０００６】
ａ．ＮＦ−κＢ転写因子
ＮＦ−κＢは、共通の配列モチーフを認識するＤＮＡ結合タンパク質のＲｅｌファミリーのメンバーから構成される誘導性の二量体転写因子のファミリーである。その活性なＤＮＡ結合形態では、ＮＦ−κＢは、ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌファミリーのメンバーの様々な組み合わせから構成される二量体の異成分のコレクションである。現在、このファミリーは、ｐ５２、ｐ５０、ｐ６５、ｃＲｅｌ、およびＲｅｌ  Ｂと呼ばれる５つのメンバーから構成されている。Ｒｅｌファミリーのメンバーの間での相同性は、Ｒｅｌ相同性ドメインによる。これは、約３００アミノ酸の大きさであり、これらのタンパク質のＤＮＡ結合ドメインを構成する。
【０００７】
種々のＮＦ−κＢ二量体は、コンセンサス配列ＧＧＧＲＮＮＹＹＣＣ（配列番号１）（式中、Ｒはプリンであり、Ｙはピリミジンであり、そしてＮは任意の塩基である）を有しているＮＦ−κＢ部位に対して様々な結合親和性を示す。Ｒｅｌタンパク質は、転写を活性化するそれらの能力が異なり、哺乳動物のファミリーのメンバーの中ではｐ６５／ＲｅｌＡおよびｃ−Ｒｅｌだけが、強力な転写活性化ドメインを含むことが明らかになっている。ＮＦ−κＢは細胞質においてはその不活性な形態であることが明らかにされている。ここでは、これは、ｐ６５／ｐ５０二量体の核局在化シグナル領域をカバーする４３ｋＤａのタンパク質であるＩκＢに結合している。ＮＦ−κＢの活性化は、ＩκＢのタンパク質分解による破壊によって開始し、その後に、ＲｅｌＡ／ｐ５０複合体の核への輸送が続く。ここでは、これは、ＤＮＡ上のその認識部位に結合して、標的遺伝子の転写を活性化する。ＮＦ−κＢファミリーのさらなる概要については、例えば、Ｇｏｍｅｚら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ２：４９−６０（１９９７）を参照のこと。
【０００８】
ｐ５２とｐ５０には転写活性化ドメインは含まれていない。転写活性化ドメインを含まないｐ５２および／またはｐ５０タンパク質だけから構成される二量体は、通常は、転写活性化因子ではなく、転写抑制を媒介することができる。
【０００９】
Ｒｅｌ／ＮＦ−κＢファミリーの転写因子は、免疫応答および炎症応答の重要な調節因子であり、リンパ球の増殖、生存、および腫瘍形成に関係している。したがって、ＮＦ−κＢは、炎症、細胞増殖、および免疫応答に関係しているいくつかの遺伝子の発現において重要な役割を担っている。（Ｄ’Ａｃｑｕｉｓｔｏら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１７３１−１７３７（２０００）；Ｇｒｉｅｓｅｎｂａｃｈら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７，３０６−３１３（２０００）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１８４７−１８５２（２０００））。ＮＦ−κＢによって調節される遺伝子の中には、種々の疾患および症状（例えば、ごく一部を挙げると、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、再狭窄、心筋梗塞、虚血再潅流傷害、糸球体腎炎、アトピー性皮膚炎、伏在静脈グラフト、アルツハイマー病）において重要な役割を担っているものが多く存在している。例えば、Ｋｈａｌｅｄら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ８６（２）：１７０−１７９（１９９８）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３（８）：８９４−８９９（１９９７）；Ｃｈｏ−Ｃｈｕｎｇら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  １（３）：３８６−３９２（１９９９）；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ９：１２２１−１２２９（２００２）；Ｓｈｉｎｔａｎｉら、Ａｎｎ．Ｔｈｏｒａｃ．Ｓｕｒｇ．７４：１１３２−１１３８（２００２）；およびＬｉら、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ，．７４（１）：１４３−１５０（２０００）を参照のこと。
【００１０】
ＮＦ−κＢデコイは、血管形成術、再狭窄、および心筋梗塞後の新生内膜過形成の阻害について提案されている（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１６３５−１６４２（２００１）；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３（８）：８９４−８９９（１９９７））。再潅流傷害、移植後の急性および慢性拒絶のより大きな阻害によっては、同種移植片の生存の延長と、移植片の冠動脈疾患の減少が生じる。（Ｆｅｅｌｅｙら、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ７０（１１）：１５６０−１５６８（２０００））。ＮＦ−κＢデコイのインビボでのトランスフェクションによっては、急性の心筋炎の処置のための新規のストラテジーが提供される。（Ｙｏｋｏｓｅｋｉら、前出）。Ｕｅｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（前出）によっては、ＮＦ−κＢデコイによるＮＦ−κＢのブロックによって心臓の虚血性再潅流傷害が防がれることが報告されている。
【００１１】
ヒトの単球細胞株であるＭｏｎｏ  Ｍａｃ６が、少量のリポ多糖（ＬＰＳ）で２日間前処理された場合には、その後のＬＰＳでの刺激に対する応答が大幅に減少することが示されている（Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋら、Ｊ．Ｌｅｕｋｏｃ．Ｂｉｏｌ．５５（１０：７３−８０（１９９４）；Ｋａｓｔｅｎｂａｕｅｒ  ａｎｄ  Ｚｉｅｇｌｅｒ−Ｈｅｉｔｂｒｏｃｋ、Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６７（４）：１５５３−９（１９９９））。ＬＰＳでこれらのＬＰＳ寛容細胞が刺激されると、これらの細胞は、ゲルシフトアッセイによって示されるように、ｐ５０ホモ二量体の優勢を示す。著者らは、その後、レポーター遺伝子の分析により、遺伝子発現に対する変化したＮＦ−κＢ複合体の効果を試験した。ＮＦ−κＢ依存性ＨＩＶ−１  ＬＴＲレポーター遺伝子構築物は、Ｍｏｎｏ  Ｍａｃ６細胞にトランスフェクトされ、その後、ＬＰＳと一緒に、またはＬＰＳを伴わずに前培養され、ルシフェラーゼ活性が測定された。ＬＰＳ寛容細胞が試験された場合には、ＬＰＳでの刺激によっては、ＮＦ−κＢ依存性ＨＩＶ−１  ＬＴＲレポーター遺伝子のトランス活性化は増大しなかった。これは、ＬＰＳ寛容細胞の中に存在しているＮＦ−κＢ複合体が機能的に不活性であることを示している。これはまた、ＮＦ−κＢによって制御されるＴＮＦ遺伝子の転写にも適用できた。ＴＮＦプロモーターによって制御されるルシフェラーゼレポーター構築物が使用された場合には、ＬＰＳ寛容細胞はＬＰＳでの刺激に対してごくわずかな応答しか示さなかった。したがって、ＬＰＳ寛容によって誘導されたｐ５０ホモ二量体には、トランス活性がないと考えられた。これらのｐ５０ホモ二量体は、その代わりに同種ＮＦ−κＢ結合部位を占有しており、そしてトランス活性化を妨げ、したがって、ｐ５０／ｐ６５複合体による転写を妨げる。
【００１２】
ｂ．Ｅ２Ｆ転写因子
転写因子の別のファミリーである転写因子のＥ２Ｆファミリーは、細胞周期の進行の制御において極めて重要な役割を担っており、多数の遺伝子（ｃ−Ｍｙｃ、ｃ−Ｍｙｂ、Ｃｄｃ２、増殖中の細胞の核抗原（ＰＣＮＡ）、サイクリンＡ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、チミジンキナーゼ、およびＤＮＡポリメラーゼαをコードする遺伝子を含む、細胞周期の調節に関係している遺伝子が含まれる）の発現を調節する。
【００１３】
Ｅ２Ｆは、現在は、異なる遺伝子によってコードされる６つのヘテロ二量体複合体のファミリーと理解されており、これらは２つの異なるグループに分けられる：Ｅ２Ｆタンパク質（Ｅ２Ｆ−１〜Ｅ２Ｆ−６）およびＤＰタンパク質（ＤＰ−１およびＤＰ−２）。Ｅ２Ｆタンパク質自体は、２つの機能的グループに分けることができ、これらは、休止細胞中で過剰発現されるとＳ期への進行を誘導するもの（Ｅ２Ｆ  １〜３）と、そうではないもの（Ｅ２Ｆ  ４〜５）である。Ｅ２Ｆ−６は、その過剰発現によってＥ２Ｆ−１とＤｐ−１の同時発現のトランス活性化効果を抑制することが記載されている点で、機能的に異なる。加えて、Ｅ２Ｆ−６の発現によって、Ｓ期を誘導するよりもむしろ、Ｓ期から出ることが遅れることが報告されている。Ｅ２ＦおよびＤＰグループのタンパク質はヘテロ二量体を形成して、Ｅ２Ｆ活性を生じる。全ての可能性のあるＥ２Ｆ−ＤＰ複合体の組み合わせインビボで存在する。個々のＥ２Ｆ−ＤＰ複合体は、Ｅ２Ｆ部分の実体と、複合体と会合しているタンパク質に応じて様々な転写応答を引き起こす。加えて、Ｅ２Ｆ分子のホモ二量体もまた記載されている（例えば、Ｚｈｅｎｇら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  １３：６６６−６７４（１９９９）を参照のこと）。
【００１４】
これらがポケットタンパク質の網膜芽細胞腫（Ｒｂ）ファミリーと会合しているかどうかに応じて、Ｅ２Ｆタンパク質は、転写リプレッサーとして、または転写活性化因子としてのいずれかで作用し得る（Ｈｉｅｂｅｒｔら、Ｇｅｎｅｓ  ＆  Ｄｅｖｅｌ  ６：１７７−１８５（１９９２）；Ｗｅｉｎｔｒａｕｂら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５８：２５９−２６１（２００２））。
【００１５】
Ｅ２Ｆ転写因子は、血管細胞の成長および増殖の間にスイッチが入れられなければならない１ダース以上の遺伝子の活性化を担っている。その遮断によって、最終的にアテローム性の病変を生じるこれらの異常な細胞の増殖（新生内膜過形成）が妨げられる。それらの生物学的機能の結果として、Ｅ２Ｆ転写因子は、新生内膜過形成、新生組織形成糸球体腎炎、血管形成、および炎症に関与している。Ｅ２Ｆファミリーの種々のメンバーもまた、ガンにおいて役割を担っていることが記載されており、そして、抗ガン剤の標的として同定されている。Ｅ２Ｆファミリーのメンバー、調節、および経路の概要については、例えば、Ｈａｒｂｏｕｒ，Ｊ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｄｅａｎ，Ｄ．Ｃ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １４，２３９３−２４０９（２０００）；Ｍｕｎｄｌｅ，Ｓ．Ｄ．，ａｎｄ  Ｓａｂｅｒｗａｌ，Ｇ．，Ｆａｓｅｂ  Ｊ  １７，５６９−５７４（２００３）；およびＴｒｉｍａｒｃｈｉ，Ｊ．Ｍ．，ａｎｄ  Ｌｅｅｓ，Ｊ．Ａ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ３，１１−２０（２００２）を参照のこと。
【００１６】
Ｅ２Ｆ結合部位は、多くの細胞性遺伝子のプロモーター領域の中で同定されており、例えば、以下の刊行物の中で報告されている：Ｆａｒｎｈａｍら、Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ  １１５５：１２５−１３１（１９９３）；Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ．Ｒ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５８：４２４−４２９（１９９２）；Ｓｈａｎら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：２９９−３０９（１９９４）；Ｔｈａｌｍｅｉｅｒら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５１７−５３６（１９８９）；Ｄｅｌｔｏｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１７９７−１８０４（１９９２）；Ｙａｍａｇｕｃｈｉら、Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．８３：６０９−６１７（１９９２）。
【００１７】
Ｅ２Ｆ転写因子を標的化するオリゴヌクレオチドデコイは、１９９５年５月４日に公開されたＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１１６８７に記載されている。その開示全体が、引用により本明細書中に組み入れられる。
【００１８】
Ｅ２Ｆオリゴヌクレオチドデコイは、インビボでのオリゴヌクレオチドの導入が必要である方法の潜在的な危険がない、静脈移植血管の自然な生長に変わる手段として、臨床開発の段階にあり、そして様々な臨床の状況においてあらゆる外科手術によるバイパスおよび動脈の修復が直面している当惑させられている問題を解決することにおいて、臨床的に大きな価値があると期待されている。米国食品医薬品局は、Ｅ２Ｆデコイ分子（Ｃｏｒｇｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）についてファーストトラック（Ｆａｓｔ  Ｔｒａｃｋ）の助成金を認めた、これは、環動脈および末梢動脈のバイパス手順に使用される静脈移植片の遮断および失敗を防ぐように設計されている。
【００１９】
Ｅ２Ｆデコイ治療に関するさらなる代表的な参考文献としては、以下が挙げられる：Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．，Ｇ．Ｈ．Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｍ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｋ．Ｅ．Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｍ．Ｎａｋａｍａ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｔ．Ｏｇｉｈａｒａ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ（１９９５）。Ａ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｃｏｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｅ２Ｆ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｐｒｏｃｅｅｓｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，９２，５８５５−５８５９；Ｄｚａｕ，Ｖ．Ｊ．，Ｍ．Ｊ．Ｍａｎｎ，Ｒ．Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，ａｎｄ  Ｙ．Ｋａｎｅｄａ（１９９６）。Ｆｕｓｉｇｅｎｉｃ  ｖｉｒａｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｄｉｅｓａｓｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ，９３，１１４２１−１１４２５；ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙｅｎ，Ｈ．Ｅ．，Ｍ．Ｊ．Ｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（１９９６）。Ｇｅｎｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．Ｓｅｍｉｎ  Ｉｎｔｅｒｖ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，１，２０９−２１４；Ｋａｎｅｄａ，Ｙ．，Ｒ．Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（１９９７）。Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ  ｂｙ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＮＹ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，８１１，２９９−３０８，ｄｉｓｓｃｕｓｓｉｏｎ  ３０８−２１０；Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（１９９７）。Ｇｅｎｅｔｉｃ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｉｎ  ｇｒａｆｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ，１２，５２２−５２７；Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｇ．Ｈ．Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｐ．Ｓ．Ｔｓａｏ，Ｈ．Ｅ．ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙｅｎ，Ｊ．Ｐ．Ｃｏｏｋｅ，Ｒ．Ｂｕｉｔｒａｇｏ，Ｒ．Ｋｅｒｎｏｆｆ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（１９９７）。Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｐｒｅｓｅｒｖｅｓ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｒａｂｉｔ  ｖｅｉｎ  ｇｒａｆｔｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，９９，１２９５−１３０１；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．，Ｇ．Ｈ．Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｍ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｍ．Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｋ．Ｅ．Ｅｌｌｉｓｏｎ，Ｗ．Ｌｅｅ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｔ．Ｏｇｉｈａｒａ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（１９９７）。Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ；Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｏｌｉｇｏｎｕ��ｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｂｙ  ＨＶＪ−ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２，２１３−２２２；Ｂｒａｕｎ−Ｄｕｌｌａｅｕｓ，Ｒ．Ｃ．，Ｍ．Ｊ．Ｍａｎｎ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（１９９８）。Ｃｅｌｌ  ｃｙｃｌｅ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｎ：ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ，９８，８２−８９；Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｊ．（１９９８）。Ｅ２Ｆ  ｄｅｃｏｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｙｐａｓｓ  ｇｒａｆｔｓ．Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，８，１７１−１７６；Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｒ．，Ｇ．Ｈ．Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｍ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｔ．Ｏｇｉｈａｒａ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（１９９８）。Ｒｏｌｅ  ｏｆ  ＡＰ−１  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｔｅｎｓｉｎ  ＩＩ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｂｅｔａ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｏｆ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ：ｕｓｉｎｇ  ｄｅｃｏｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｇａｉｎｓｔ  ＡＰ−１  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ，２４３，３６１−３６７；Ｐｏｓｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｋ．Ｐ．Ｔｒａｎ，Ｍ．Ｊ．Ｍａｎｎ，Ｅ．Ｇ．Ｈｏｙｔ，Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ，ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｒｏｂｂｉｎｓ．（１９９８）。Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｓｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ  ｈｙｐｅｒｐｌａｓｉａ  ｕｓｉｎｇ  ｅｘ−ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈｅａｒｔ  ａｎｄ  Ｌｕｎｇ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，１７，３４９−３５５；Ｔｏｍｉｔａ，Ｎ．，Ｍ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ，Ｓ．Ｔｏｍｉｔａ，Ｇ．Ｈ．Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｊ．Ｙ．Ｋｉｍ，Ｄ．Ｂａｒａｎ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（１９９８）。Ａｎ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｄｅｃｏｙ  ｆｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  Ｅ２Ｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ｍｅｓａｎｇｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ．Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２７５，Ｆ２７８−２８４；＊Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｊ．，Ｇ．Ｈ．Ｇｉｂｂｏｎｓ，Ｈ．Ｈｕｔｃｈｉｎｓｏｎ，Ｒ．Ｓ．Ｐｏｓｔｏｎ，Ｅ．Ｇ．Ｈｏｙｔ，Ｒ．Ｃ．Ｒｏｂｂｉｎｓ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（１９９９）。Ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒａｔ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｔｉｓｓｕｅｓ．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＵＳＡ，９６，６４１１−６４１６；Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｊ．，Ａ．Ｄ．Ｗｈｉｔｔｅｍｏｒｅ，Ｍ．Ｃ．Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ，Ｍ．Ｂｅｌｋｉｎ，Ｍ．Ｓ．Ｃｏｎｔｅ，Ｊ．Ｆ．Ｐｏｌａｋ，Ｅ．Ｊ．Ｏｒａｖ，Ａ．Ｅｈｓａｎ，Ｇ．Ｄｅｌｌ’Ａｃｑｕａ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（１９９９）。Ｅｘ−ｖｉｖｏ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｙｐａｓｓ  ｇｒａｆｔｓ  ｗｉｔｈ  Ｅ２Ｆ  ｄｅｃｏｙ：ｔｈｅ  ＰＲＥＶＥＮＴ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｅｎｔｒｅ，ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ，ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ，３５４，１４９３−１４９８；Ｐｏｓｔｏｎ，Ｒ．Ｓ．，Ｍ．Ｊ．Ｍａｎｎ，Ｅ．Ｇ．Ｈｏｙｔ，Ｍ．Ｅｎｎｅｎ，Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ，ａｎｄ  Ｒ．Ｃ．Ｒｏｂｂｉｎｓ．（１９９９）。Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ａｃｕｔｅ  ｃａｒｄｉａｃ  ａｌｌｏｇｒａｆｔ  ｒｅｊｅｃｔｉｏｎ  ｖｉａ  ａ  ｎｏｖｅｌ，ｎｏｎｔｏｘｉｃ，ｈｉｇｈｌｙ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ，６８，８２５−８３２；Ｔｏｍｉｔａ，Ｓ．，Ｎ．Ｔｏｍｉｔａ，Ｔ．Ｙａｍａｄａ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｒ．Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｔ．Ｏｇｉｈａｒａ，Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ，ａｎｄ  Ｍ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ．（１９９９）。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｃｏｙ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｎｉｎ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｌｉｖｅｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，８４，１０５９−１０６６；ｖｏｎ  ｄｅｒ  Ｌｅｙｅｎ，Ｈ．Ｅ．，Ｒ．Ｂｒａｕｎ−Ｄｕｌｌａｅｕｓ，Ｍ．Ｊ．Ｍａｎｎ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｊ．Ｎｉｅｂａｕｅｒ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ（１９９９）。Ａ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｏｎｖｉｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｇｅｎｅ  ａｎｄ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１０，２３５５−２３６４；Ｅｈｓａｎ，Ａ．，ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．Ｍａｎｎ．（２０００）。Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｐｒｅｖｅｎｔ  ｒｅｓｔｅｎｏｓｉｓ．Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，５，１０３−１１４；Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｊ．（２０００）。Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｖｅｉｎ  ｇｒａｆｔｓ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，２，２９−３３；Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｊ．（２０００）．Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ｔｏｄａｙ，６，２８５−２９１；Ｍａｎｎ，Ｍ．Ｊ．，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（２０００）。Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｃｏｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｉｎｉｃａｌ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，１０６，１０７１−１０７５；Ｔｏｍｉｔａ，Ｎ．Ｒ．Ｍｏｒｉｓｈｉｔａ，Ｓ．Ｔｏｍｉｔａ，Ｇ．Ｈ．Ｇ���ｂｂｏｎｓ，Ｌ．Ｚｈａｎｇ，Ｍ．Ｈｏｒｉｕｃｈｉ．Ｙ．Ｋａｎｅｄａ，Ｊ．Ｋａｎｅｄａ，Ｊ．Ｈｉｇａｋｉ，Ｔ．Ｏｇｉｈａｒａ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（２０００）。Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ｄｅｃｏｙ  ｆｏｒ  ＮＦ−κＢ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＴＮＦ−ａｌｐｈａ−ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ａｎｄ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，７，１３２６−１３３２；Ｅｈｓａｎ，Ａ．，Ｍ．Ｊ．Ｍａｎｎ，Ｇ．Ｄｅｌｌ’Ａｃｑｕａ，ａｎｄ  Ｖ．Ｊ．Ｄｚａｕ．（２００１）。Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖｅｉｎ  ｇｒａｆｔ  ｗａｌｌ  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｒｏｌｏｎｇｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  Ｅ２Ｆ  ｄｅｃｏｙ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｈｏｒａｃｉｃ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，１２１，７１４−７２２。引用される参考文献の開示内容全体が、引用により本明細書中に組み入れられる。
【００２０】
ｃ．ＨＩＦ−１転写因子
低酸素症によって誘導される因子（ＨＩＦ−１）は組織の酸化状態の変化に対する適応反応を媒介するヘテロ二量体転写因子である。ＨＩＦ−１は、構成的に発現されるＨＩＦ−１βサブユニットと高度に調節されているＨＩＦ−１αサブユニットから構成されているヘテロ二量体である。ＨＩＦ−１αの合成は酸素依存性である；しかし、分解は酸素依存性の機構によって主に調節されている。活性化されたＨＩＦ−１αサブユニットは核に移動して、ＡＲＮＴ（アリール受容体核輸送体）サブユニットと二量体を形成して、活性な転写因子ＨＩＦ−１を形成する。ＨＩＦ−１は、多くの遺伝子のエンハンサーまたはプロモーターの中に存在する低酸素症応答エレメント（ＨＲＥ、すなわち、５’−ＡＣＧＴＧ−３’（配列番号１））を認識し、そしてそれらの発現を導く。ＨＩＦの３つのサブタイプが現在までに知られている（ＨＩＦ−１、ＨＩＦ−２、ＨＩＦ−３）；これらは全て、保存されたＨＲＥを介して遺伝子の調節に影響を及ぼす。
【００２１】
６０を上回る推定の直接のＨＩＦ−１標的遺伝子が、ＨＩＦ−１結合部位を含むシス作用性の低酸素症応答エレメントの存在、遺伝子ＨＩＦ−１αヌル細胞の低酸素症によって誘導される発現の消失、またはｖｏｎ  Ｈｉｐｐｅｌ−Ｌｉｎｄａｕ（ＶＨＬ）ヌル細胞もしくはＨＩＦ−１α発現ベクターでトランスフェクトされた細胞の中での発現の増大のいずれかに基づいて同定されている。
【００２２】
推定されるＨＩＦ−１によって調節される遺伝子としては、アドレノメジュリン、アルドラーゼＡ、アルドラーゼＣ、自己分泌型運動因子、カテプシン、内分泌腺由来ＶＥＧＦ、エンドグリン、エンドセリン−１、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、フィブロネクチン１、エノラーゼ１、グルコース輸送因子１、グルコース輸送因子３、グリセロアルデヒド−３−Ｐ−デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、インシュリン様成長因子２、インシュリン様成長因子結合タンパク質−１および２、ケラチン１４、１８、および１９、多剤耐性１、マトリックスメタロプロテイナーゼ２、一酸化窒素合成酵素２、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１、ピルビン酸キナーゼＭ、トランスフォーミング成長因子−α、トランスフォーミング成長因子−β２、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子受容体、ＶＥＧＦ受容体−２、およびビメンチン（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．３：７２１−７３２（２００３））が挙げられる。
【００２３】
いくつかのＨＩＦ−１標的遺伝子（例えば、ＶＥＧＦ）の発現は、ほとんどの細胞型においては低酸素症によって誘導される。しかし、ＨＩＦ−１標的遺伝子の大部分については、発現は、細胞型特異的様式で低酸素症によって誘導される。
【００２４】
ＨＩＦ−１は、血管形成、細胞の生存、グルコースの代謝、および侵襲を含む、ガンの生物学の重大な態様に関係している遺伝子の転写を活性化する。腫瘍内低酸素症および遺伝子の変化は、ＨＩＦ−１αサブユニットの過剰発現を導き得、これは、いくつかのガンのタイプにおいては、患者の運動性の増大と関係している。ＨＩＦ−１およびその経路は、抗ガン剤の開発のための標的と提案されている（Ｓｅｍｅｎｚａ  ２００３，前出）。
【００２５】
二本鎖ＨＩＦ−１オリゴヌクレオチドデコイ（ｄｓＯＤＮ）分子は、ＨＩＦ−１の生物学的役割を研究するために使用されている。ＨＩＦ−１  ｄｃＯＤＮ分子は、以下の配列：５’−ＧＣＣＣＴＡＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＣＡ−３’（センス）（配列番号３３８）および５’−ＴＧＡＧＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＧＧＧＣ−３’（アンチセンス）（配列番号３３９）を有しており、これは、Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８：２１５１３−２１５１８（１９９３）；Ｗａｎｇ  ａｎｄ  Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１２３０−１２３７（１９９５）に記載されている。ＨＩＦ−１デコイ分子はまた、Ｏｉｋａｗａら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．２８９：３９−４３（２００１）；およびＹａｎｇ  ａｎｄ  Ｚｏｕ，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｎａｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８１：Ｆ９００−８（２００１）に開示されている。
【００２６】
Ｅ２Ｆ  ｄｓＯＤＮ分子は、米国特許出願公開番号２００５０１６４２４０（ＰＣＴ／ＵＳ０４／３３２７２）に開示されており；ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子は米国特許出願公開番号２００５０１８２０１２（ＰＣＴ／ＵＳ０４／４０６７３）に開示されており；ＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ分子はＰＣＴ／ＵＳ０４／４０７０４に開示されている。これらの開示全体は引用により本明細書中に組み入れられる。
【特許文献１】米国特許第５，５９５，９７８号明細書
【非特許文献１】Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９７，１５，２０９
【非特許文献２】Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｎｅｗｓ，１９９７，１５，１
【非特許文献３】Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔ．（１９９２）９：３０４−５３
【非特許文献４】Ｆｉｎｎｉｎら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．（１９９９）８８：９５５−９５８
【非特許文献５】Ｋａｒａｎｄｅら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．，（２００４）２２：１９２−１９７
【非特許文献６】Ｌａｓｈｍａｒら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．（１９８９）４１：１１８−１２２
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００２７】
（発明の要旨）
本発明により、細胞への核酸分子（ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含む）の非経口送達のための、新規の効率のよい方法および処方物が提供される。
【００２８】
したがって、１つの態様においては、本発明は、生体膜を処方物（ポリヌクレオチド、全濃度で約０．２重量％から約１０重量％の少なくとも１つの浸透促進剤、および約１％から６０％の濃度のアルコールを含む）と接触させることによる、細胞へのポリヌクレオチドの送達のための方法に関する。
【００２９】
１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドである。
【００３０】
別の実施形態においては、本発明は、哺乳動物細胞へのオリゴヌクレオチドの送達に関する。
【００３１】
別の実施形態においては、本発明は、ヒトへのオリゴヌクレオチドの送達に関する。
【００３２】
なお別の実施形態においては、本発明は、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達に関係し、この場合、生体膜は皮膚または粘膜である。
【００３３】
１つの実施形態においては、浸透促進剤は陰イオン性界面活性剤である。別の実施形態においては、陰イオン性界面活性剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、硫酸アルキルエーテル、またはラウレス硫酸ナトリウム、またはＮ−ラウロイルサルコシンである。
【００３４】
１つの実施形態においては、浸透促進剤は非イオン性界面活性剤である。別の実施形態においては、非イオン性界面活性剤はソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ  ２０）である。
【００３５】
別の実施形態においては、本発明は、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達に関する。この場合、処方物には、約０．４重量％から約１０重量％の上記浸透促進剤、または約０．４重量％から約１重量％の上記浸透促進剤、または約０．８重量％の上記浸透促進剤が含まれる。１つの実施形態においては、処方物には、約０．８％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる。なお別の実施形態においては、処方物には、約０．６％のＮ−ラウロイルサルコシンと、約０．４％のソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ２０）が含まれる。
【００３６】
別の実施形態においては、本発明は、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達に関する。この場合、処方物にはエタノールが含まれる。１つの実施形態においては、処方物には、約１重量％から約５０重量％のアルコール、または約５重量％から約５０重量％のアルコール、または約１０重量％から約５０重量％のアルコール、または約２０重量％から約５０重量％のアルコール、または約３０重量％から約５０重量％のアルコール、または約４０重量％から約５０重量％のアルコール、または約４９重量％のアルコール、または約２０重量％のアルコール、または約１０重量％のアルコール、または約５重量％のアルコール、または約１重量％のアルコールが含まれる。別の実施形態においては、アルコールはエタノールである。
【００３７】
別の実施形態においては、本発明は、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達に関する。この場合、処方物は水性処方物である。なお別の実施形態においては、水性処方物は水性のゲル性処方物である。
【００３８】
１つの実施形態においては、水性のゲル性処方物には、約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる。別の実施形態においては、水性のゲル性処方物にはさらに、約１重量％、約５重量％、約１０重量％、約２０重量％、または約４９重量％のエタノールが含まれる。
【００３９】
別の実施形態においては、本発明は、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達に関する。この場合、処方物はリポソームを含む処方物である。
【００４０】
別の実施形態においては、リポソームを含む処方物には、約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる。別の実施形態においては、リポソームを含む処方物には、さらに、約２．５重量％、約５重量％、または約１０重量％のエタノールが含まれる。
【００４１】
別の実施形態においては、リポソームを含む処方物には、約０．６重量％のＮ−ラウロイルサルコシン、約０．４重量％のソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ２０）、および約５重量％のエタノールが含まれる。
【００４２】
１つの実施形態においては、本発明は、生体膜を乳剤性処方物（ポリヌクレオチド、全濃度で約０．２重量％から約１０重量％の少なくとも１つの浸透促進剤、および水含む）と接触させることによる、細胞へのポリヌクレオチドの送達のための方法に関する。１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドである。
【００４３】
１つの実施形態においては、乳剤性処方物には、約０．８重量％から約０．３５重量％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる。別の実施形態においては、乳剤性処方物にはさらに、約０．１５重量％の１−フェニルピペラジンが含まれる。なお別の実施形態においては、乳剤性処方物には、約０．６重量％のＮ−ラウロイルサルコシン、約０．４重量％のソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ  ２０）、および約５重量％のエタノールが含まれる。別の実施形態においては、乳剤性処方物にはさらに、約１０重量％のミリスチン酸イソプロピルが含まれる。なお別の実施形態においては、乳剤性処方物にはさらに、約１０重量％のモノステアリン酸グリセリルが含まれる。
【００４４】
１つの実施形態においては、本発明は、細胞へのポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの送達に関する。この場合、上記細胞は、血管平滑筋細胞、腫瘍細胞、または内皮細胞である。
【００４５】
別の実施形態においては、本発明は、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達に関する。この場合、オリゴヌクレオチドは、二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子である。１つの実施形態においては、ｄｓＯＤＮ分子の第１鎖は、第２鎖に対して少なくとも一部相補的であるか、または第２鎖に対して完全に相補的である。別の実施形態においては、ｄｓＯＤＮ分子には、少なくとも１つの一本鎖突出が含まれる。別の実施形態においては、ｄｓＯＤＮ分子には、３’または５’末端のいずれか、あるいは両方が互いに共有結合され、それによってダンベル構造または環状分子を生じる、２つのオリゴデオキシヌクレオチド鎖が含まれる。別の実施形態においては、ｄｓＯＤＮ分子はホスホジエステレート骨格を有する。別の実施形態においては、ｄｓＯＤＮ分子は、ホスホロチオエート骨格を有する。別の実施形態においては、ｄｓＯＤＮ分子は混合されたホスホジエステレート−ホスホロチオエート骨格を有する。別の実施形態においては、ｄｓＯＤＮ分子の第１鎖および第２鎖は、ワトソンクリック塩基対合によってのみ互いに連結される。別の実施形態においては、ｄｓＯＤＮは、少なくとも５、１０、１５、２０、または２５塩基対の長さである。
【００４６】
なお別の実施形態においては、本発明は、細胞へのｄｓＯＤＮ分子の送達に関する。この場合、ｄｓＯＤＮ分子には、転写因子に特異的に結合することができる配列が含まれる。１つの実施形態においては、転写因子は、Ｅ２Ｆ、ＡＰ−１、ＡＰ−２、ＨＩＦ−１、およびＮＦ−κＢからなる群より選択される。別の実施形態においては、ｄｓＯＤＮ分子は、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができる。
【００４７】
特定の実施形態においては、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができるｄｓＯＤＮ分子には、その第１鎖の中に、５’から３’方向に向かって、ＦＬＡＮＫ１−ＣＯＲＥ−ＦＬＡＮＫ２の式の配列が含まれる。式中、
ＣＯＲＥは、ＧＧＧＡＣＴＴＴＧＧ（配列番号５）；ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号７）；ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号９）；ＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）；ＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１５）；ＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号１７）；ＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１９）；ＧＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２１）；ＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号２３）；ＧＡＴＴＴＣＣＣ（配列番号２４）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣ（配列番号２５）；およびＡＧＧＡＣＴＴＴＣＣＡ（配列番号７８）からなる群より選択され；
ＦＬＡＮＫ１は、ＣＣＴＴＧＡＡ（配列番号７９）；ＡＴ；ＴＣ；ＣＴＣ；ＣＴ；ＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）、ＴＴＧＡ（配列番号８１）；ＡＧＴＴＧＣ（配列番号８２）；ＧＴＴＧＡ（配列番号８３）；Ａ；ＡＡＧＡ（配列番号８４）；ＡＴＡＴ（配列番号８５）；ＣＡＡＣ（配列番号８６）；ＣＡＧＴ（配列番号８７）；ＴＧＡ；およびＧＡからなる群より選択され；そして、
ＦＬＡＮＫ２は、ＴＣＣ；ＧＴ；ＴＣ；ＴＧＴ；ＴＣＡ；ＴＣ；ＣＡ；ＡＧＧＣ（配列番号８８）；ＡＧ；ＡＧＧ；Ａ；ＡＧＡＧ（配列番号８９）；ＴＴＡＡ（配列番号９０）；ＡＣＡＣ（配列番号９１）；ＡＣＴＧ（配列番号９２）；およびＡＧＧＣＴ（配列番号９３）からなる群より選択される。
【００４８】
１つの実施形態においては、ＣＯＲＥは、ＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）；ＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）；およびＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１９）からなる群より選択され；そして
ＦＬＡＮＫ１がＡＴであり、そしてＦＬＡＮＫ２がＧＴであるか；または、ＦＬＡＮＫ１がＴＣであり、そしてＦＬＡＮＫ２がＴＣであるか；または、ＦＬＡＮＫ１がＣＴＣであり、そしてＦＬＡＮＫ２がＴＧＴであるか；または、ＦＬＡＮＫ１がＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、そしてＦＬＡＮＫ２がＡＧＧＣ（配列番号８８）である。
【００４９】
別の実施形態においては、ＣＯＲＥが、ＧＧＧＡＴＴＴＣＣ（配列番号１１）；またはＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）であり、ＦＬＡＮＫ１がＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、そしてＦＬＡＮＫ２がＡＧＧＣ（配列番号８８）である。
【００５０】
なお別の実施形態においては、ＣＯＲＥはＧＧＡＣＴＴＴＣＣ（配列番号１３）であり、ＦＬＡＮＫ１はＡＧＴＴＧＡ（配列番号８０）であり、そして、ＦＬＡＮＫ２はＡＧＧＣ（配列番号８８）である。
【００５１】
１つの実施形態においては、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができるｄｓＯＤＮ分子には、上記第１鎖に対して少なくとも一部相補的である第２鎖が含まれ、そしてこれは、ホスホジエルテレート骨格、ホスホロチオエート骨格、混合されたホスホジエステレート−ホスホロチオエート骨格、あるいは、任意の他の修飾された骨格を有し得る。別の実施形態においては、２つの鎖は、ワトソンクリック塩基対合によって、および／または共有結合によってのみ、互いに連結させられ得る。なお別の実施形態においては、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができるｄｓＯＤＮ分子には、５’から３’の方向に向かって、配列番号２６から７７からなる群より選択される１つの配列が含まれる。なお別の実施形態においては、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができるｄｓＯＤＮ分子には、５’から３’の方向に向かって、配列番号２６から３４からなる群より選択される１つの配列が含まれる。なお別の実施形態においては、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができるｄｓＯＤＮ分子には、５’から３’の方向に向かって、配列番号２６から３１からなる群より選択される配列が含まれる。なお別の実施形態においては、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができるｄｓＯＤＮ分子には、配列番号３０の配列が含まれる。
【００５２】
１つの実施形態においては、ＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができるｄｓＯＤＮ分子は、１２から２８、または１４から２４、または１４から２２塩基対の長さであり、これには、修飾されたヌクレオチド、または例外的なヌクレオチドが含まれる場合がある。
【００５３】
別の実施形態においては、ｄｓＯＤＮ分子は、Ｅ２Ｆ転写因子に特異的に結合することができる。特定の実施形態においては、Ｅ２Ｆ転写因子に特異的に結合することができるｄｓＯＤＮ分子には、５’および３’配列に隣接しているＥ２Ｆ転写因子に特異的に結合することができるコア配列が含まれる。この場合、（ｉ）コア配列は、約５から１２塩基対から構成され；（ｉｉ）この分子には、２つの完全に相補的である鎖から構成される約１２から２８塩基対の長さの二本鎖領域が含まれ；そして（ｉｉｉ）Ｅ２Ｆ  ｄｓＯＤＮは、ＴＨＰ−１細胞由来の核抽出物に対して行われた競合ゲル移動度シフト結合アッセイによって決定された場合には、図２６（配列９４および９５）に示される参照（ｄｅｆｅｒｅｎｃｅ）デコイ分子の結合親和性の少なくとも約５倍である結合親和性で、上記Ｅ２Ｆ転写因子に結合する。
【００５４】
別の実施形態においては、ｄｓＯＤＮ分子は、ＨＩＦ−１転写因子に特異的に結合することができる。特定の実施形態においては、ＨＩＦ−１転写因子に特異的に結合することができるｄｓＯＤＮ分子には、ＨＩＦ−１転写因子に特異的に結合することができるコア配列が含まれる。
【００５５】
本発明の別の態様においては、本発明は、オリゴヌクレオチド分子、全濃度で約０．２重量％から約１０重量％の少なくとも１つの浸透促進剤、および約１重量％から約６０重量％の濃度のアルコールを含む処方物に関する。
【００５６】
１つの実施形態においては、処方物は水性処方物である。別の実施形態においては、処方物は水性のゲル性処方物である。なお別の実施形態においては、処方物はリポソームを含む処方物である。
【００５７】
別の実施形態においては、本発明は、オリゴヌクレオチド、全濃度で約０．２重量％から約１０重量％の少なくとも１つの浸透促進剤、および水を含む乳剤処方物に関する。
【００５８】
全ての態様および実施形態においては、オリゴヌクレオチドは好ましくは二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子であり、より好ましくは、転写因子（ＴＦ）ｄｓＯＤＮである。
【００５９】
本発明は、細胞への核酸分子（ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含む）の非経口送達のための方法および処方物に関する。したがって、本明細書中に記載される好ましい実施形態は、本発明の方法および処方物の両方に適用される。
【発明を実施するための最良の形態】
【００６０】
（発明の詳細な説明）
Ａ．定義
他の場所で明確に定義されていない限りは、本明細書中で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。Ｓｉｇｎｌｅｔｏｎら、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）、およびＭａｒｃｈ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｒｅａｃｔｉｏｎｓ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９２）により、本出願で使用される用語の多くについての一般的な指針が当業者に提供されている。
【００６１】
用語「ポリヌクレオチド」は、単数形で使用される場合も、また複数形で使用される場合も、一般的には、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドを意味する。これらは、修飾されていないＲＮＡもしくはＤＮＡである場合も、また、修飾されたＲＮＡもしくはＤＮＡである場合もある。したがって、例えば、本明細書中で定義されるポリヌクレオチドには、一本鎖および二本鎖のＤＮＡ、一本鎖の領域と二本鎖の領域を含むＤＮＡ、一本鎖および二本鎖のＲＮＡ、ならびに、一本鎖の領域と二本鎖の領域を含むＲＮＡ、一本鎖であるか、もしくは、より通常は二本鎖であり得るか、あるいは、一本鎖の領域と二本鎖の領域を含むＤＮＡとＲＮＡを含むハイブリッド分子が含まれるが、これらに限定はされない。加えて、用語「ポリヌクレオチド」は、本明細書中で使用される場合は、ＲＮＡ、またはＤＮＡ、または、ＲＮＡとＤＮＡの両方を含む、三本鎖の領域を意味する。このような領域の鎖は、同じ分子に由来する場合も、また、異なる分子に由来する場合もある。これらの領域には、１つ以上の分子のすべてが含まれる場合があるが、より一般的には、いくつかの分子の１つの領域だけが含まれる。三重ヘリックス領域の分子の１つは、多くの場合はオリゴヌクレオチドである。用語「ポリヌクレオチド」には、具体的には、ｃＤＮＡが含まれる。この用語には、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを含む）およびＲＮＡが含まれ、これらには１つ以上の修飾された塩基が含まれる。したがって、安定性または他の理由のために修飾された骨格を有しているＤＮＡまたはＲＮＡは、この用語が本明細書中で意図されるように、「ポリヌクレオチド」である。さらに、例外的な塩基（例えば、イノシン）、または修飾された塩基（例えば、トリチウム化された塩基）を含むＤＮＡまたはＲＮＡが、本明細書中で定義される用語「ポリヌクレオチド」に含まれる。一般的には、用語「ポリヌクレオチド」には、未修飾のポリヌクレオチドの全ての化学修飾された形態、酵素によって修飾された形態、および／または代謝によって修飾された形態、さらには、ウイルスおよび細胞（単純細胞および複雑型細胞を含む）に特徴的なＤＮＡおよびＲＮＡの化学的な形態が含まれ、具体的には、例えば、オリゴヌクレオチドデコイ分子およびアンチセンスオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチドが含まれる。
【００６２】
用語「オリゴヌクレオチド」は、比較的短いオリゴヌクレオチドを意味し、これには、一本鎖のデオキシリボヌクレオチド、一本鎖もしくは二本鎖のリボヌクレオチド、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド、および二本鎖ＤＮＡが含まれるが、これらに限定はされない。オリゴヌクレオチド（例えば、一本鎖のＤＮＡプローブオリゴヌクレオチド）は、多くの場合、化学的方法によって、例えば、市販されている自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して合成される。しかし、オリゴヌクレオチドは、種々の他の方法（インビトロで組み換えＤＮＡによって媒介される技術が含まれる）によって、および細胞および生物体の中でのＤＮＡの発現によって作成することができる。通常、オリゴヌクレオチドは、約５から５０（例えば、１０から４０、または１５から３０ヌクレオチド塩基）から構成される。
【００６３】
用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、オリゴヌクレオチドまたはそのアナログを意味するように使用され、これは、ＲＮＡまたはＤＮＡのセグメントに相補的であり、それらに結合し、そしてその正常な機能を阻害する。
【００６４】
用語「生体膜」は、外部環境に対するバリアとしての機能を担う、任意のタイプの哺乳動物の体表面を意味するように使用される。この用語には、具体的に、皮膚と、体の管構造の内層（例えば、粘膜）が含まれる。
【００６５】
用語「二本鎖」は、ワトソンクリック塩基対合によって互いに結合した２つの相補的なヌクレオチド鎖を含む核酸分子を意味するように使用される。この用語には、具体的には、２つの相補鎖によって形成される二本鎖領域に加えて、一本鎖である突出（単数または複数）を含み、そして／または、それらの３’および／または５’末端（単数または複数）で互いに共有結合した分子が含まれる。
【００６６】
用語「オリゴヌクレオチドデコイ」、「二本鎖のオリゴヌクレオチドデコイ」、「オリゴデオキシヌクレオチドデコイ」、および「二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドデコイ」は、ほとんど同じ意味で使用され、そして、二本鎖領域を含む短い核酸分子を意味する。これは、標的化された転写因子に結合し、その生物学的機能を妨害する。例えば、用語「ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドデコイ」、「二本鎖ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドデコイ」、「ＮＦ−κＢオリゴデオキシヌクレオチドデコイ」、および「二本鎖ＮＦ−κＢオリゴデオキシヌクレオチドデコイ」は、ほとんど同じ意味で使用され、二本鎖領域を含む短い核酸分子を意味する。これは、ＮＦ−κＢ転写因子に結合し、その生物学的機能を妨害する。用語「二本鎖」は、ワトソンクリック塩基対合によって互いに結合した２つの相補的なヌクレオチド鎖を含む核酸分子を意味するように使用される。この用語には、具体的に、Ｅ２Ｆ、ＮＦ−κＢ、およびＨＩＦ−１オリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子が含まれる。これらには、２つの相補鎖によって形成される二本鎖領域に加えて、一本鎖である突出（単数または複数）が含まれる。加えて、この用語には、具体的に、Ｅ２Ｆ、ＮＦ−κＢ、およびＨＩＦ−１オリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子が含まれる。ここでは、二本鎖領域に加えて、２つの鎖は、それらの３’および／または５’末端（単数または複数）で互いに共有結合している。
【００６７】
用語「Ｅ２Ｆ」は最も広い意味で本明細書中で使用され、これには、任意の動物（例えば、哺乳動物種）の全ての天然に存在しているＥ２Ｆ分子（Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３、Ｅ２Ｆ−４、Ｅ２Ｆ−５、およびＥ２Ｆ−６が含まれる）が含まれる。
【００６８】
用語「ＮＦ−κＢ」は、最も広い意味で本明細書中で使用され、これには、任意の動物（例えば、哺乳動物種）の全ての天然に存在しているＮＦ−κＢ分子（ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌファミリーのメンバー（例えば、ｐ５２、ｐ５０、ｐ６５、ｃＲｅｌ、およびＲｅｌ  Ｂ）の全ての組み合わせが含まれる）が含まれる。
【００６９】
用語「ＨＩＦ−１」は、最も広い意味で本明細書中で使用され、これには、任意の動物（例えば、哺乳動物種）の全ての天然に存在しているＨＩＦ−１分子（ＨＩＦ−１α／ＨＩＦ−１βヘテロ二量体、およびそのサブユニットが含まれる）が含まれる。
【００７０】
用語「転写因子結合配列」は、それに対して転写因子が結合する短いヌクレオチド配列である。この用語には、具体的には、その転写が１つ以上の転写因子によって調節される、複数の遺伝子の調節領域に通常見られる天然に存在している結合配列が含まれる。この用語には、さらに、人工の（合成の）配列が含まれ、これは自然界には存在していないが、内因性遺伝子の中の結合部位に対する転写因子の結合を競合的に阻害することができる。
【００７１】
本明細書中で使用される場合は、表現「修飾されたヌクレオチド」は、天然に存在しているヌクレオチドおよびヌクレオチド三リン酸とは組成および／または構造が異なる、ヌクレオチドまたはヌクレオチド三リン酸を意味する。
【００７２】
本明細書中で使用される場合は、用語「５プライム」または「５」、および「３プライム」または「３」は、核酸に関する場合には、特定の方向を意味する。核酸は、それらの２つの末端が５プライム（５’）または３プライム（３’）のいずれかで識別される、異なる化学的な方向を有する。核酸の３’末端には、末端のペントース糖の３’炭素に対して結合させられた遊離のヒドロキシル基が含まれる。核酸の５’末端には、末端のペントース糖の５’炭素に対して結合させられた遊離のヒドロキシル基またはリン酸基が含まれる。
【００７３】
本明細書中で使用される場合は、用語「突出」は、平滑末端を有していない二本鎖の核酸分子を意味し、その結果、２本の鎖の末端は同じように延びておらず、一方の鎖の５’末端が向かい合う相補鎖の３’末端を越えて延びている。直鎖状の核酸分子については、０個、１個、または２個の「５’突出」を有することが可能である。
【００７４】
本明細書中で使用される場合は、用語「優先的な結合」、「優先的に結合する」、およびそれらの文法上の等価物は、特異性／親和性係数が少なくとも約４０であることを意味するように使用される。ここでは、特異性／親和性の比は以下のように定義される：
特異性／親和性係数＝（Ｓｐ５０／ｐ５０−Ｓｐ６５／ｐ５０）×Ｓｐ５０／ｐ５０／Ｓｐ６５／ｐ５０
式中、Ｓｐ５０／ｐ５０は、ＨＩＶに由来する哺乳動物以外のＮＦ−κＢプロモーター（配列１１３／１１４）に対するｐ５０／ｐ５０の結合の５０％を競合するために必要なデコイのモル過剰量に等しく、そしてＳｐ６５／ｐ５０は、ＨＩＶに由来する哺乳動物以外のＮＦ−κＢプロモーター（配列１１３／１１４）に対するｐ６５／ｐ５０の結合の５０％を競合するために必要なデコイのモル過剰量に等しい。スコア（Ｓ）は、デコイが試験した任意のモル比で結合の少なくとも５０％を競合することができない場合に、１００が割り当てられる。
【００７５】
本明細書中で使用される場合は、用語「炎症性疾患」または「炎症性障害」は、炎症を生じる病理学的状態を意味し、これは通常は、好中球の化学走査によって引き起こされる。このような障害の例としては、炎症性の皮膚疾患（乾癬およびアトピー性皮膚炎）；全身性強皮症および硬化症；炎症性腸疾患（例えば、クローン病および潰瘍性大腸炎に伴う反応）；虚血性再潅流傷害（外科手術による組織再潅流損傷、心筋の虚血症状（例えば、心筋梗塞、心停止、心臓の外科手術後の再潅流、および経皮経腔冠動脈形成術後の狭窄、脳卒中、および腹部大動脈瘤；脳卒中に続発する脳水腫；頭蓋外傷、血液量減少症；呼吸停止；成人呼吸窮迫症候群；急性肺損傷；ベーチェット病；皮膚筋炎；多発性筋炎；多発性硬化症（ＭＳ）；髄膜炎；脳炎；ブドウ膜炎；変形性関節症；ループス腎炎；自己免疫性疾患（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）；シェーグレン症候群、脈管炎）；白血球漏出に関係する疾患；中枢神経系（ＣＮＳ）の炎症疾患、敗血症または外傷に続発する多臓器損傷症候群；アルコール性肝炎；細菌性肺炎；糸球体腎炎を含む抗原−抗体複合体によって媒介される疾患；敗血症；サルコイドーシス；組織／臓器移植に対する免疫病理学的反応；胸膜炎、肺胞炎、脈管炎、肺炎、慢性気管支炎、気管支拡張症、びまん性汎細気管支炎、過敏性肺炎、特発性肺線維症（ＩＰＦ）、および嚢胞性線維症を含む肺の炎症などが挙げられるが、これらに限定はされない。好ましい適応症としては、関節リウマチ（ＲＡ）、リウマチ様脊椎炎、痛風性関節炎、および他の関節の症状、慢性的な炎症、自己免疫性糖尿病、多発性硬化症（ＭＳ）、喘息、全身性エリテマトーデス、成人呼吸窮迫症候群；ベーチェット病、乾癬、慢性の肺の炎症疾患、移植片対宿主反応、クローン病、潰瘍性大腸炎、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、アルツハイマー病、および不全麻痺（ｐｙｒｅｓｉｓ）、加えて、炎症性疾患および関連疾患に関係している任意の疾患または状態が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００７６】
用語「アポトーシス」および「アポトーシス活性」は広い意味で使用され、哺乳動物の細胞死の、秩序だった形態または制御された形態を意味する。これには通常、１つ以上の特徴的な細胞の変化が伴い、これには、細胞質の濃縮、血漿膜微絨毛の消失、核の分割、染色体ＤＮＡの分解、またはミトコンドリア機能の消失が含まれる。この活性は、例えば、細胞生存性アッセイ、ＦＡＣＳ分析、またはＤＮＡ電気泳動によって決定し、測定することができる。
【００７７】
用語「ガン」および「ガン性」は、調節されていない細胞の増殖を通常は特徴とする、哺乳動物の中での生理学的状態を意味するかまたは記載する。ガンの例としては、ガン種、リンパ腫、白血病、芽細胞腫、および肉腫が挙げられるが、これらに限定はされない。このようなガンの特異的な例としては、扁平上皮細胞ガン、小細胞肺ガン、非小細胞肺ガン、乳ガン、膵臓ガン、多形性膠芽腫、子宮頸ガン、胃ガン、膀胱ガン、肝臓ガン、結腸ガン、および頭頸部ガンが挙げられる。好ましい実施形態においては、ガンには、乳がん、卵巣ガン、前立腺ガン、および肺ガンが含まれる。
【００７８】
用語「処置」は、治療的処置と、予防策または事前防止策の両方を意味する。この場合、目的は、目的の病理学的症状または障害を防ぐまたは遅くする（弱くする）ことである。本発明の目的については、有用な、または望ましい臨床結果としては、症状の緩和、疾患の程度の縮小、疾患の安定な状態（すなわち、悪化しない）、疾患の進行の遅延または進行速度の低下、疾患状態の軽減または一時的な緩和、および寛解（部分寛解であるかまたは完全寛解であるかは問わない）が、検出可能であるかまたは検出不可能であるかにはかかわらず、挙げられるが、これらに限定はされない。処置が必要なものとしては、すでに障害を有しているもの、さらには、障害になりやすいもの、または障害が予防されるものが挙げられる。腫瘍（例えば、ガン）の処置においては、治療薬によって腫瘍細胞の病理学が直接減少させられる場合も、また、腫瘍細胞が他の治療薬による処置（例えば、放射線治療および／または化学療法）に対してより敏感にさせられる場合もある。
【００７９】
「被験体」は脊椎動物であり、好ましくは、哺乳動物であり、より好ましくは、ヒトである。
【００８０】
用語「哺乳動物」は、哺乳動物として分類される任意の動物（ヒト、高等な霊長類、齧歯類、家畜および家畜動物、ならびに、動物園の動物、競技用動物、ペット動物が含まれるがこれらに限定はされない）をいうように本明細書中で使用され、例えば、ヒツジ、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなどである。好ましくは、本明細書中の哺乳動物はヒトである。
【００８１】
用語「細胞毒性薬」は、本明細書中で使用される場合は、細胞の機能を阻害するかまたは妨げ、そして／あるいは、細胞の崩壊を引き起こす物質を意味する。この用語は、放射性同位元素（例えば、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、およびＬｕの放射性同位元素）、化学療法薬、および毒素（例えば、細菌、真菌、植物、または動物由来の低分子毒素または酵素活性のある毒素）を含むように意図され、これには、それらの断片および／または変異体が含まれる。
【００８２】
用語「化学療法薬」は、ガンの処置に有用な化合物を意味するように本明細書中で使用される。化学療法薬の例としては、アルキル化剤（例えば、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ（登録商標）））；アルキルスルホネート（例えば、ブスルファン、イムプロスルファン、およびピポスルファン）；アジリジン（ベンゾドーパ、カルボクオン（ｃａｒｂｏｑｕｏｎｅ）、メツレドーパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、およびウレドーパ（ｕｒｅｄｏｐａ））；エチレンイミンおよびメチラメラミン（アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、およびトリメチロロメラミンを含む）；アセトゲニン（特に、ブラタシンおよびブラタシノン）；カンプトテシン（合成アナログトポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、およびビゼレシン、合成のアナログを含む）、クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；ダウカルマイシン（合成アナログ、ＫＷ−２１８９，およびＣＢＩ−ＴＭＩを含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード（例えば、クロラムブシル、クロマファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロエタミンオキサイドヒドロクロライド、メルファラン、ノベムビシン、フェンステリン、プレドニムスチン、トロフォスファミド、ウラシルマスタード）；ニトロソ尿素（例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フェテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンを含む）；抗生物質（例えば、エンジイン抗生物質（例えば、カリケミシン、特に、カリケミシン（１Ｉおよびカルケミシン２Ｊ１、例えば、Ａｇｎｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３３：１８３−１８６（１９９４）を参照のこと）；ジネマイシン（ジネマイシンＡを含む）；エスペラマイシン；ならびに、ネオカルジノスタチン発色団および関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団（ｃｈｒｏｍｏｍｏｐｈｏｒｅｓ））、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン（ａｕｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン（ｃａｒａｂｉｃｉｎ）、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビリン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、およびデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、クエラマイシン（ｑｕｅｌａｍｙｃｉｎ）、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツバシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎ）、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシン）；代謝拮抗物質（例えば、メトトレキセート、および５−フルオロウラシル（５−ＦＵ））；葉酸アナログ��例えば、デノプテリン（ｄｅｎｏｐｔｅｒｉｎ）、メトトレキセート、プテロプテリン、トリメトレキセート）；プリンアナログ（例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン（ｔｈｉａｍｉｐｒｉｎｅ）、チオグアニン；ピリミジンアナログ（例えば、アンシタビン、アザシタビン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン、５−ＦＵ）；アンドロゲン（例えば、カルステロン、プロピオン酸ドロモスラノロン、エピチオスタノール、メピチオシタン、テストラクトン）；抗アドレナル（ａｎｔｉ−ａｄｒｅｎａｌ）（例えば、アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン）；葉酸補填剤（例えば、フォリニン酸（ｆｒｏｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ））；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジキノン；エルホルニチン；酢酸エリプチニウム（ｅｌｌｉｐｔｉｎｉｕｍ  ａｃｅｔａｔｅ）；エポシロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；メイタンシノイド（ｍａｙｔａｎｓｉｎｏｉｄ）（例えば、マイタンシン、およびアンサマイトシン）；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット（ｐｈｅｎａｍｅｔ）；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ（登録商標）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジキノン；２，２’、２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特に、Ｔ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、およびアングイジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド（例えば、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ（登録商標）、Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，ＮＪ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ（登録商標）、Ｒｈoｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ  Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロラムブシル；ジェンシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキセート；白金アナログ（例えば、シスプラチンおよびカルボプラチン）；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イフォスファミド；マイトマイシンＣ；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバントロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；ＣＰＴ−１１；トポイソメラーゼ阻害因子ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；カペシタビン；ならびに、上記の任意のものの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が挙げられるが、これらに限定はされない。この定義には、抗エストロゲン（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、４（５）−イミダゾールを阻害するアロマターゼ、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキ���フェン、ケトキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）を含む）；および、抗アンドロゲン（例えば、フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、ロイプロリド、およびゴセレリン）；ならびに、上記の任意のものの薬学的に許容される塩、酸、または誘導体のような、腫瘍に対するホルモンの作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン薬もまた含まれる。
【００８３】
用語「抗炎症薬」には、本明細書中で使用される場合には、非ステロイド系の抗炎症薬およびコルチコステロイド（例えば、ベタメタゾン）が含まれるが、これらに限定はされない。一般的には、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，第１５版  Ｂｅｒｋｏｗら、編．，１９８７，Ｒａｈｗａｙ，Ｎ．Ｊ．，それぞれ、ｐ．２４９９−２５０６および４６−４９を参照のこと。
【００８４】
Ｂ．詳細な説明
本発明は、細胞へのポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）の送達のための、標的化された生体膜の透過性を増大させて、ポリヌクレオチドが生体膜を通過できるようにする処方物を使用する方法に関する。これらの方法および処方物により、種々の目的（遺伝子発現の調節を含むがこれに限定はされない）のためにポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）の送達が可能になる。具体的には、本発明には、二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチド分子を含む処方物が含まれる。
【００８５】
本発明の処方物としては、ゲル処方物、溶液処方物、乳剤処方物、およびリポソームを含む処方物が挙げられるが、これらに限定はされない。
【００８６】
本発明の１つの態様においては、処方物には、標的細胞の中への生体膜を通過するポリヌクレオチド（オリゴヌクレオチドを含む）の輸送を促進するための、１つ以上の浸透促進剤が含まれる。
【００８７】
本発明の特定の実施形態により、他の薬学的活性のある成分（例えば、１つ以上の化学療法薬および／または抗炎症剤）と組み合わせて１つ以上のポリヌクレオチドを含む処方物が提供される。
【００８８】
別の関連する実施形態においては、本発明の処方物には、転写因子に対して標的化させられた１つ以上のオリゴヌクレオチド（具体的には、二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子）が含まれ得る。デコイ分子の多数の例が当該分野で公知である。
【００８９】
投薬は、処置される疾患状態の重篤度および反応性に応じて様々であり、数日間から数ヶ月間までの間継続されるか、または、治癒するか、もしくは疾患状態の縮小が達成されるまでである。最適な投与スケジュールは、患者の体内での薬剤の蓄積量の測定によって計算することができる。当業者は、最適な投与量、投与方法、および反復回数を簡単に決定することができる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な有効性に応じて変化し得る。一般的には、投与量は、１ｋｇの体重あたり０．０１μｇから１００ｇまでであり、そして、１日に１回以上、１週間に１回以上、１ヶ月に１回以上、または１年に１回以上、または２から２０年ごとに１回以上で投与され得る。当業者は、測定した体液または体組織の中での薬剤の滞留時間および濃度に基づいて、投与の反復回数を容易に概算することができる。
【００９０】
浸透促進剤
本発明では、動物（例えば、ヒトを含む哺乳動物）の皮膚を通じたポリヌクレオチド（特に、二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド）の効果的な送達を行うために浸透促進剤が使用される。浸透促進剤は当該分野で周知であり、そして５つの広いカテゴリー（すなわち、界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤）の１つに属すると分類することができる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。上記の浸透促進剤のクラスはそれぞれ、以下にさらに詳細に記載される。
【００９１】
界面活性剤：界面活性剤（または「表面活性剤」）は、水溶液に溶解させられると、溶液の表面張力、または水溶液と別の液体の間の界面張力を低下させ、その結果、生体膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収を促進する化学物質である。胆汁酸塩および脂肪酸に加えて、このような浸透促進剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ラウレス硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ２０）、ミリスチン酸イソプロピル、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、およびポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルが挙げられる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）；ならびにパーフルオロ化合物のエマルジョン（例えば、ＦＣ−４３）が挙げられる（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９８８，４０，２５２）。
【００９２】
界面活性剤については、エマルジョン（マイクロエマルジョンを含む）およびリポソームのような処方物において幅広い用途が見出されている。多くの異なるタイプの界面活性剤（天然に存在しているものと合成のものの両方）の特性を分類およびランク付けする最も一般的な方法は、親水性／親油性平衡（ＨＬＢ）の使用による。親水性基（「頭部」としても知られている）の性質により、処方物に使用される様々な界面活性剤をカテゴリー分類するための最も有用な手段が提供される（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【００９３】
界面活性剤分子がイオン化されていない場合には、これは非イオン性界面活性剤として分類される。非イオン性界面活性剤については、薬学的製品および化粧品において幅広い用途が見出されており、広い範囲のｐＨ値にわたって使用することができる。一般的には、それらのＨＬＢ値は、それらの構造に応じて２から約１８の範囲にある。非イオン性界面活性剤としては、非イオン性エステル、例えば、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステル、ポリグリセリルエステル、ソルビタンエステル、スクロースエステル、およびエトキシル化エステルが挙げられる。非イオン性アルカノールアミドおよびエーテル（例えば、エトキシル化脂肪族アルコール、プロポキシル化アルコール、およびエトキシル化／プロポキシル化ブロックポリマー）もまた、このクラスに含まれる。ポリオキシエチレン界面活性剤は、非イオン性界面活性剤のクラスの最も一般的なメンバーである。
【００９４】
界面活性剤分子が、水に溶解または分散させられた場合に負電化を有する場合には、これらの界面活性剤は陰イオン性と分類される。陰イオン性界面活性剤には、カルボン酸塩（例えば、石鹸、アシル乳酸、アミノ酸のアシルアミド、硫酸のエステル（例えば、硫酸アルキルおよびエトキシル化硫酸アルキル）、スルホン酸塩（例えば、ベンゼンスルホン酸アルキル、イセチオン酸アシル、アシルタウリン、およびスルホコハク酸）、およびリン酸塩が含まれる。陰イオン性界面活性剤のクラスの最も重要なメンバーは、アルキルスルホン酸塩および石鹸である。
【００９５】
界面活性剤分子が、水に溶解または分散させられた場合に正電化を有する場合には、これらの界面活性剤は陽イオン性と分類される。陽イオン性界面活性剤としては、四級アンモニウム塩、およびエトキシル化アミンが挙げられる。四級アンモニウム塩は、このクラスの最も使用されているメンバーである。
【００９６】
界面活性剤分子に正電荷または負電荷の両方を有する能力がある場合には、これらの界面活性剤は両性と分類される。両性界面活性剤としては、アクリル酸誘導体、置換されたアルキルアミド、Ｎ−アルキルベタイン、およびホスファチドが挙げられる。
【００９７】
薬剤製品、処方物、およびエマルジョンの中での界面活性剤の使用は、まとめられている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，ｐ．２８５）。
【００９８】
脂肪酸：浸透促進剤として作用する種々の脂肪酸とそれらの誘導体には、例えば、オレイン酸、ラウリン酸、カプリン酸（ｎ−デカン酸）、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸、リノレン酸、ジカプリン酸、トリカプリン酸、モノオレイン（１−モノオレオイル−ｒａｃ−グリセロール）、ジラウリン、カプリル酸、アラキドン酸、グリセロール１−モノカプレート、１−ドデシルアザシクロヘプタン−２−オン、アシルカルニチン、アシルコリン、それらのＣ．ｓｕｂ．１−１０アルキルエステル（例えば、メチル、イソプロピル、およびｔ−ブチル）、ならびにそれらのモノグリセリドおよびジグリセリド（すなわち、オレイン酸塩、ラウリン酸塩、カプリン酸塩、ミリスチン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、リノール酸塩など）が含まれる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｅ１  Ｈａｒｉｒｉら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｍａｃｏｌ．，１９９２，４４，６５１−６５４）。
【００９９】
胆汁酸塩：胆汁酸の生理学的役割には、脂質および脂溶性ビタミンの分散および吸収の促進が含まれる（Ｂｒｕｎｔｏｎ，第３８章：Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版，Ｈａｒｄｍａｎら、編．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９６，ｐｐ．９３４−９３５）。種々の天然に存在している胆汁酸塩、およびそれらの合成の誘導体が浸透促進剤として作用する。したがって、用語「胆汁酸塩」には、任意の胆汁酸の天然に存在している成分、ならびに、任意のそれらの合成の誘導体が含まれる。本発明の胆汁酸塩としては、例えば、コール酸（またはその薬学的に許容されるナトリウム塩、コール酸ナトリウム）、デヒドロコール酸（デヒドロコール酸ナトリウム）、デオキシコール酸（デオキシコール酸ナトリウム）、グルコール酸（グルコール酸ナトリウム）、グリコール酸（グリコール酸ナトリウム）、グリコデオキシコール酸（グリコデオキシコール酸ナトリウム）、タウロコール酸（タウロコール酸ナトリウム）、タウロデオキシコール酸（タウロデオキシコール酸ナトリウム）、ケノデオキシコール酸（ケノデオキシコール酸ナトリウム）、ウルソデオキシコール酸（ＵＤＣＡ）、タウロ−２４，２５−ジヒドロ−フシジン酸ナトリウム（ＳＴＤＨＦ）、グリコジヒドロフシジン酸ナトリウム、およびポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル（ＰＯＥ）（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｓｗｉｎｙａｒｄ，第３９章：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版．，Ｇｅｎｎａｒｏ，編．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０，ｐ．７８２−７８３；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｙａｍａｍｏｔｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９２，２６３，２５；Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９０，７９，５７９−５８３）。
【０１００】
キレート化剤：キレート化剤は、本発明の組み合わせて使用される場合には、それらと複合体を形成することによって溶液から金属イオンを除去し、その結果、生体膜を介するオリゴヌクレオチドの吸収が促進される化合物として定義することができる。本発明での浸透促進剤としてのそれらの使用に関しては、キレート化剤は、ＤＮａｓｅ阻害因子としてのさらなる作用の利点を加える。なぜなら、ほとんどの特性決定されているＤＮＡヌクレアーゼには、触媒のために二価の金属イオンが必要であり、したがって、キレート化剤によって阻害されるからである（Ｊａｒｒｅｔｔ，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，１９９３，６１８，３１５−３３９）。本発明のキレート化剤としては、エチレンジアミン四酢酸ニナトリウム（ＥＤＴＡ）、クエン酸、サリチル酸塩（例えば、サリチル酸ナトリウム、５−メトキシサリチル酸塩、およびホモバニレート）、コラーゲンのＮ−アシル誘導体、β−ジケトン（エナミン）のラウレス−９およびＮ−アミノアシル誘導体が挙げられるが、これらに限定はされない（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２；Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３；Ｂｕｕｒら、Ｊ．Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌ．，１９９０，１４，４３−５１）。
【０１０１】
非キレート化非界面活性剤：本明細書中で使用される場合は、非キレート化非界面活性剤浸透促進化合物は、キレート化剤として、または界面活性剤としてはわずかな活性しか示さないが、それにもかかわらず、生体膜を介したオリゴヌクレオチドの吸収を促進する化合物として定義することができる（Ｍｕｒａｎｉｓｈｉ，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９０，７，１−３３）。このクラスの浸透促進剤としては、例えば、不飽和の環状尿素、１−アルキル−および１−アルケニルアザシクロ−アルカノン誘導体（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）；および非ステロイド系抗炎症薬（例えば、ジクロフェナクナトリウム、インドメタシン、およびフェニルブタゾン）が挙げられる（Ｙａｍａｓｈｉｔａら、Ｊ．Ｐｈａｍ．Ｐａｒｍａｃｏｌ．，１９８７，３９，６２１−６２６）。
【０１０２】
細胞レベルでのオリゴヌクレオチドの取り込みを促進する物質もまた、本発明の処方物に添加され得る。例えば、陽イオン性脂質（例えば、リポフェクチン（Ｊｕｎｉｃｈｉら、米国特許第５，７０５，１８８号）、陽イオン性グリセロール誘導体、およびポリカチオン性分子（例えば、ポリリジン（Ｌｏｌｌｏら、ＰＣＴ出願番号ＷＯ９７／３０７３１））は、オリゴヌクレオチドの細胞による取り込みを促進することも知られている。
【０１０３】
他の物質が、投与されたオリゴヌクレオチドの浸透を促進させるために利用され得、これには、グリコール（例えば、エチレングリコール、およびプロピレングリコール、ピロール（例えば、２−ピロール）、アゾン）、ならびにテルペン（例えば、リモネン、およびメントン）が含まれる。
【０１０４】
本発明は、細胞への核酸分子（ポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドを含む）の送達のための方法および処方物に関する。この方法には、生体膜を少なくとも１つの浸透促進剤を含む処方物と接触させる工程が含まれる。１つの実施形態においては、浸透促進剤は陰イオン性界面活性剤である。１つの実施形態においては、陰イオン性界面活性剤は、硫酸アルキルまたは硫酸ラウリルである。別の実施形態においては、陰イオン性界面活性剤は、アルキル硫酸エーテルまたはラウレス硫酸ナトリウムである。１つの実施形態においては、処方物には少なくとも２つの浸透促進剤が含まれ、この場合、浸透促進剤はＮ−ラウロイルサルコシンおよびソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ２０）である。別の実施形態においては、処方物にはさらに、ミリスチン酸イソプロピルが含まれる。
【０１０５】
担体
本発明の特定の組成物にはまた、処方物の中に担体化合物が組み込まれる。本明細書中で使用される場合は、「担体化合物」または「担体」は、例えば、不活性である（すなわち、それ自体は生物学的活性を有していない）が、例えば、生物学的活性のある核酸を分解させること、または循環からのその除去を促進することによって生物学的活性を有している核酸の生体利用性を低下させるインビボでのプロセスによって、核酸として認識される核酸、あるいはそのアナログを意味し得る。本発明のポリヌクレオチドと担体化合物の同時投与（通常は、過剰量の担体化合物を使用する）によっては、共通の受容体に対する担体化合物と核酸との間での競合がおそらく原因で、肝臓、腎臓、または他の循環の外のレザーバーの中に取り込まれたポリヌクレオチドの量の実質的な減少が生じ得る。例えば、肝臓組織の中への部分的なホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの取り込みは、これがポリイノシン酸、デキストラン硫酸、ポリシチジン酸、または４−アセトアミド−４’イソチオシアノ−スチルベン−２，２’−ジスルホン酸と一緒に投与された場合には、減少する場合がある（Ｍｉｙａｏら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓ．Ｄｅｖ．，１９９５，５，１１５−１２１；Ｔａｋａｋｕｒａら、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＆  Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．，１９９６，６，１７７−１８３）。
【０１０６】
賦形剤
担体化合物とは対照的に、「薬学的担体」または「賦形剤」は、動物への１つ以上の核酸の送達のための薬学的に許容される溶媒、懸濁剤、または任意の薬学的に不活性な媒体である。賦形剤は、液体である場合も、また、固体である場合もあり、核酸および所定の薬学的組成物の他の成分と組み合わせられる場合には、所望される大きさ、濃度などが提供されるように考えられた計画的な投与様式とともに、選択される。典型的な薬学的担体としては、結合剤（例えば、プレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロースなど）；増量剤（例えば、乳糖および他の糖、微結晶セルロース、ペクチン、ゼラチン、硫酸カルシウム、エチルセルロース、ポリアクリレート、またはリン酸水素カルシウムなど）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、シリカ、コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸、ステアリン酸金属塩、水素化植物油、トウモロコシデンプン、ポリエチレングリコール、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウムなど）；崩壊剤（例えば、デンプン、グリコール酸ナトリウムデンプンなど）；ならびに湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウムなど）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１０７】
核酸と有害なようには反応しない、非経口投与に適している薬学的に許容される有機または無機賦形剤もまた、本発明の組成物の処方に使用することができる。適切な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１０８】
他の成分
本発明の処方物には、さらに、薬学的組成物中に通常見られる他の補助成分が、それらの分野で確立された使用レベルで、さらに含まれ得る。したがって、例えば、処方物には、さらなる適合する薬学的活性のある物質（例えば、かゆみ止め薬、収斂剤、局所麻酔剤、または抗炎症薬）が含まれる場合があり、また、本発明の組成物の様々な投与形態の物理的な処方に有用なさらなる物質（例えば、色素、香味剤、保存剤、抗酸化剤、乳白剤、増粘剤、および安定剤）が含まれる場合もある。しかし、このような物質は、添加された場合には、本発明の処方物の成分の生物学的活性を過度に妨害してはならない。これらの処方物は、滅菌することができ、そして、所望される場合には、助剤（例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、香味剤、および／または芳香物質など（これらは、処方物のオリゴヌクレオチドとは有害な相互作用はしない））と混合され得る。
【０１０９】
水性処方物
本発明の処方物は、水性のゲル、水溶液、または水性懸濁液として調製され得る。
【０１１０】
本発明の１つの態様においては、細胞へのポリヌクレオチドの送達のための本発明の水性処方物には、全濃度で約０．２重量％から約１０重量％の少なくとも１つの浸透促進剤と、約１重量％から約６０重量％の濃度のアルコールが含まれる。１つの実施形態においては、ポリヌクレオチドはオリゴヌクレオチドである。
【０１１１】
別の実施形態においては、水性処方物中の浸透促進剤の濃度は約０．８重量％である。本発明で使用される種々の浸透促進剤が、当該分野で周知である。
【０１１２】
別の実施形態においては、水性処方物中のアルコールの濃度は、約５重量％から約５０重量％の範囲であり得る。１つの実施形態においては、アルコールはエタノールである。
【０１１３】
なお別の実施形態においては、水性処方物は水性のゲル性処方物である。１つの実施形態においては、水性のゲル性処方物には、約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる。別の実施形態においては、水性のゲル性処方物にはさらに、約１重量％、約５重量％、約１０重量％、約２０重量％、または約４９重量％のエタノールが含まれる。
【０１１４】
１つの実施形態においては、本発明の水性のゲル性処方物は、粘性ゲルを形成するために十分な実質的な粘性がある。別の実施形態においては、水性のゲル性処方物中の浸透促進剤はラウレス硫酸ナトリウムであり、アルコールはエタノールである。なお別の実施形態においては、水性のゲル性処方物には、約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムと約４９重量％のエタノールが含まれる。別の実施形態においては、水性のゲル性処方物には、さらなる薬学的に不活性な物質（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース−４０００（ＨＰＭＣ  ４０００）および／または塩化マグネシウム）も含まれ得る。
【０１１５】
別の実施形態においては、水性のゲル性処方物にはさらに１−フェニルピペラジンが含まれる。
【０１１６】
水性処方物に使用される不活性な成分の最適量は、通常は、特定の活性のある医薬品、および意図される用途に基づいて決定することができる。
【０１１７】
水性懸濁液にはさらに、またはあるいは、懸濁液の粘度を増大させる物質（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、および／またはデキストランを含む）が含まれ得る。懸濁液には、安定剤もまた含まれ得る。
【０１１８】
乳剤処方物
本発明の乳剤処方物は、エマルジョンとして調製され得る。エマルジョンは、典型的には、通常は０．１μｍを上回る直径の液滴の形態で別のものに分散させられた１つの液体の不均質なシステムである。（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．１９９；Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第２巻，ｐ．３３５；Ｈｉｇｕｃｈｕら、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．３０１）。エマルジョンは、多くの場合は、念入りに混合され、互いに分散させられた２つの非混合性の液体相を含む２相システムである。一般的には、エマルジョンは、水中油（ｗ／ｏ）または油中水（ｏ／ｗ）のいずれかの種類であり得る。水相が微粉化され、極めて小さな液滴として多量の油相の中に分散させられている場合には、得られる組成物は水中油（ｗ／ｏ）エマルジョンと呼ばれる。あるいは、油相が微粉化され、極めて小さな液滴として多量の水相の中に分散させられている場合には、得られる組成物は油中水（ｏ／ｗ）エマルジョンと呼ばれる。エマルジョンには、分散させられた相と、水相、油相のいずれかの中の溶液として、または分離相としてそれ自体が存在し得る活性のある薬剤に加えて、さらなる成分が含まれ得る。薬学的賦形剤（例えば、乳化剤、安定剤、色素、および抗酸化剤）もまた、必要に応じてエマルジョンの中に存在し得る。薬学的エマルジョンはまた、２相以上の相からなる多重エマルジョンである場合もあり、例えば、油中水中油（ｏ／ｗ／ｏ）および水中油中水（ｗ／ｏ／ｗ）エマルジョンの場合である。このような複雑な処方物によっては、多くの場合に、単純な２相エマルジョンによっては提供されない特定の利点が提供される。ｏ／ｗエマルジョンの個々の油滴が小さいａｔｅｒ液滴を取り囲んでいる多重エマルジョンはｗ／ｏ／ｗエマルジョンを構成する。同様に、連続的な油相で安定化させられた水の小球に取り囲まれている油滴のシステムによっては、ｏ／ｗ／ｏエマルジョンが提供される。
【０１１９】
エマルジョンは、低い熱力学的安定性または熱力学的安定性がないことを特徴とする。多くの場合、エマルジョンの分散させられた相または不連続な相は、外相または連続相の中に十分に分散させられており、そして乳化剤または処方物の粘性の手段を通じてこの形態で維持される。エマルジョンの相のそれぞれは、エマルジョン型の軟膏基剤およびクリーム剤の場合にそうであるように、半固形または固形である。エマルジョンを安定化させる他の手段によって、エマルジョンのいずれかの相の中に取り込まれ得る乳化剤の使用が可能になる。乳化剤は、広く４つのカテゴリー：合成の界面活性剤、天然に存在している乳化剤、吸収基剤、および微細に分散させられた固体に分類することができる（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．１９９）。
【０１２０】
合成の界面活性剤は、表面活性剤としても知られており、エマルジョンの処方において幅広い用途が見出されており、そして文献にまとめられている（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，第１巻，ｐ．２８５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９８８，第１巻，ｐ．１９９）。界面活性剤は通常は両親媒性であり、そしてこれには、親水性部分と疎水性部分が含まれる。界面活性剤の疎水性の性質に対する親水性の性質の割合は、親水性／親油性バランス（ＨＬＢ）と呼ばれ、そして処方物の調製において界面活性剤をカテゴリー分類し、選択することにおける有用なツールである。界面活性剤は、親水基の性質に基づいて種々のクラス（非イオン性、陰イオン性、陽イオン性、および両親媒性）に分類され得る（Ｒｉｅｇｅｒ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，１９８８，ｐ．２８５）。
【０１２１】
乳剤処方物に使用される天然に存在している乳化剤としては、ラノリン、蜜ロウ、ホスファチド、レシチン、およびアカシアが挙げられる。吸収基剤は親水性の特性を有しており、その結果、これらは、水に浸すと、ｗ／ｏエマルジョンを形成することができ、なおも、それらの半固体の堅さを維持できる。例えば、無水ラノリン、および親水性ワセリンである。細かく分離させられた固体はまた、特に、界面活性剤との組み合わせにおいて、および粘性の調製物において、良好な乳化剤としても使用されている。これらには、極性の無機固形物（例えば、重金属水酸化物、非膨張性粘土（例えば、ベントナイト）、アタパルジャイト、ヘクトライト、カオリン、モントモリロナイト、コロイド状ケイ酸アルミニウム、およびコロイド状ケイ酸マグネシウムアルミニウム、色素）、ならびに非極性の固体（例えば、炭素、またはトリステアリン酸グリセリル）が含まれる。
【０１２２】
多種多様な乳化剤以外の物質もまた乳剤処方物に含まれ、これらはエマルジョンの特性に寄与する。これらとしては、脂肪、油、ワックス、脂肪酸、脂肪族アルコール、脂肪酸エステル、保湿剤、親水性コロイド、保存剤、および抗酸化剤が挙げられる（Ｂｌｏｃｋ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．３３５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．１９９）。
【０１２３】
親水性コロイドまたは親水コロイドには、天然に存在しているゴム、および合成ポリマー（例えば、多糖類（例えば、アカシア、寒天、アルギン酸、カラギーナン、グアーゴム、カラヤゴム、およびトラガカント）、セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース、およびカルボキシプロピルセルロース））、ならびに合成ポリマー（例えば、カルボマー、セルロースエーテル、およびカルボキシビニルポリマー）が含まれる。これらは水中に分散するか、または水中で膨張して、分散相の液滴を取り囲む強い界面薄膜を形成すること、および外相の粘度を増大させることによって、エマルジョンを安定化させるコロイド状溶液を形成する。
【０１２４】
エマルジョンには多くの場合には多数の成分（例えば、炭水化物、タンパク質、ステロール、およびホスファチド）が含まれており、これらは、微生物の増殖を容易にサポートし得るので、これらの処方物には多くの場合、保存剤が含まれる。乳剤処方物に含まれる一般的に使用される保存剤としては、メチルパラベン、プロピルパラベン、四級アンモニウム塩、塩化ベンズアルコニウム、ｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステル、およびホウ酸が挙げられる。抗酸化剤もまた、処方物の劣化を防ぐために乳剤処方物に一般的に添加される。使用される抗酸化剤は、フリーラジカルスカベンジャー（例えば、トコフェロール、没食子酸アルキル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン）、または還元剤（例えば、アスコルビン酸、およびメタ重亜硫酸ナトリウム）、ならびに、抗酸化剤共力剤（例えば、クエン酸、酒石酸、およびレシチン）であり得る。
【０１２５】
皮膚からの経路、経口経路、および非経口経路による乳剤処方物の塗布、ならびに、それらの製造のための方法は、文献にまとめられている（Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．１９９）。経口投与のための乳剤処方物は、処方が容易であること、吸収効率、および生体利用の観点の理由から、非常に幅広く使用されている（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２４５；Ｉｄｓｏｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．１９９）。ミネラルオイルをベースとする下剤、油溶性ビタミン、および高脂肪栄養調製物は、中でも、ｏ／ｗエマルジョンとして一般的に経口で投与される物質である。
【０１２６】
本発明の１つの実施形態においては、オリゴヌクレオチドの送達のための処方物はマイクロエマルジョンとして処方される。
【０１２７】
マイクロエマルジョンは、１つの最適な光学的に等方性の熱力学的に安定な液体溶液である、水、油、および両親媒性化合物のシステムとして定義され得る（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２４５）。通常、マイクロエマルジョンは、最初に、界面活性剤の水溶液中に油を分散させ、その後、十分な量の第４の成分（通常は、中間鎖アルコール）を添加して透明なシステムを形成させることによって調製されるシステムである。したがって、マイクロエマルジョンはまた、表面活性のある分子の界面薄膜によって安定化させられる２つの非混和性の液体の、熱力学的に安定であり、等方性の透明な分散物としても記載されている（Ｌｅｕｎｇ  ａｎｄ  Ｓｈａｈ，：Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ：Ｐｏｌｙｍｅｒｓ  ａｎｄ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｒｏｓｏｆｆ，Ｍ．，編，１９８９，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐ．１８５−２１５）。マイクロエマルジョンは、一般的には、油、水、界面活性剤、共力剤（cosurfactant）、および電解質を含む３個から５個の成分の組み合わせによって調製される。マイクロエマルジョンが水中油（ｗ／ｏ）型であるか、または油中水（ｏ／ｗ）型であるかは、使用される油および界面活性剤、ならびに、界面活性剤分子の極性の頭部および炭化水素テールの構造および幾何学的パッキングに依存する（Ｓｃｈｏｔｔ，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８５，ｐ．２７１）。
【０１２８】
相平衡状態図を利用する現象論的方法は広く研究されており、マイクロエマルジョンを処方するための方法の広範な知識が、当業者に提供されている（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２４５；Ｂｌｏｃｋ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．３３５）。従来のエマルジョンと比較すると、マイクロエマルジョンは、自発的に形成される熱力学的に安定な液滴の処方物中において水不溶性薬剤の安定化の利点を提供する。
【０１２９】
マイクロエマルジョンの調製に使用される界面活性剤としては、イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性剤、Ｂｒｉｊ  ９６、ポリオキシエチレンオレイルエーテル、ポリグリセロール脂肪酸エステル、テトラグリセロールモノラウレート（ＭＬ３１０）、テトラグリセロールモノオレエート（ＭＯ３１０）、ヘキサグリセロールモノオレエート（ＰＯ３１０）、ヘキサグリセロールペンタオレエート（ＰＯ５００）、デカグリセロールモノカプレート（ＭＣＡ７５０）、デカグリセロールモノオレエート（ＭＯ７５０）、デカグリセロールセクイオレエート（ＳＯ７５０）、デカグリセロールデカオレエート（ＤＡＯ７５０）が、単独で、または共力剤と組み合わせて挙げられるが、これらに限定はされない。協力剤（通常は、短鎖アルコール（例えば、エタノール、１−プロパノール、および１−ブタノール））は、界面活性剤の薄層の中に浸透し、結果として、界面活性剤分子の間で作成される隙間スペースが原因で、乱れた薄膜を生じることによって、界面の流動性を増大させるように作用する。
【０１３０】
しかし、マイクロエマルジョンは共力剤を使用することなく調製することができ、そしてアルコールを含まない自己乳化マイクロエマルジョンシステムが当該分野で公知である。本発明の１つの実施形態においては、マイクロエマルジョン処方物は、アルコールを使用することなく調製される。
【０１３１】
水相は、通常は、水、薬剤の水溶液、グリセロール、ＰＥＧ３００、ＰＥＧ４００、ポリグリセロール、プロピレングリコール、およびエチレングリコールの誘導体であり得るが、これらに限定はされない。油相としては、Ｃａｐｔｅｘ  ３００、Ｃａｐｔｅｘ  ３５５、Ｃａｐｍｕｌ  ＭＣＭ、脂肪酸エステル、中鎖（Ｃ８〜Ｃ１２）のモノ、ジ、およびトリグリセリド、ポリオキシエチレン化グリセリル脂肪酸エステル、脂肪族アルコール、ポリグリコール化グリセリド、飽和ポリグリコール化Ｃ８〜Ｃ１０グリセリド、植物油、およびシリコンオイルが挙げられ得るが、これらに限定はされない。
【０１３２】
マイクロエマルジョンは、薬剤の安定性、および薬剤の吸収の増大の観点から、特に興味深い。脂質をベースとするマイクロエマルジョン（ｏ／ｗとｗ／ｏの両方）が、ペプチドを含む薬剤の経口による生体利用性を高めると提案されている（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５−１３９０；Ｒｉｔｓｃｈｅｌ，Ｍｅｔｈ．Ｆｉｎｄ．Ｅｘｐ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．，１９９３，１３，２０５）。マイクロエマルジョンは、薬剤の安定性の改善、酵素による加水分解からの薬剤の保護、界面活性剤によって誘導される膜の流動性および透過性の変化が原因である薬剤の吸収の促進の可能性、調製が容易であること、固体の投与形態よりも経口投与が用意であること、臨床的な効力の改善、ならびに、毒性の減少の利点を提供する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｉｄｅｓら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，１１，１３８５；Ｈｏら、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．，１９９６，８５，１３８−１４３）。多くの場合、マイクロエマルジョンは、それらの成分が室温で一緒にされると、自発的に形成し得る。これは、熱不安定性の薬剤、ペプチド、またはオリゴヌクレオチドを処方する際に、特に有利であり得る。マイクロエマルジョンはまた、化粧品および薬学的用途の両方における有効成分の経皮送達にも有効である。本発明のマイクロエマルジョン処方物は、消化管からのオリゴヌクレオチドの全身性の吸収の増加を促進し、さらには、消化管、膣、口腔、および他の投与領域の中でのオリゴヌクレオチドの局所的な細胞性の取り込みを改善することが予想される。
【０１３３】
本発明のマイクロエマルジョンにはまた、さらなる成分および添加剤（例えば、モノステアリン酸ソルビタン（Ｇｒｉｌｌ  ３）、ラブラゾール、および浸透促進剤）が、処方物の特性を改善し、そして本発明のオリゴヌクレオチドの吸収を促進するために含められる場合もある。本発明のマイクロエマルジョンに使用される浸透促進剤は、５つの広い範囲のカテゴリー（界面活性剤、脂肪酸、胆汁酸塩、キレート化剤、および非キレート化非界面活性剤）の１つに属すると分類することができる（Ｌｅｅら、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｄｒｕｇ  Ｃａｒｒｉｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１９９１，ｐ．９２）。これらのクラスはそれぞれ上記で議論されている。本発明で使用される種々の浸透促進剤は当該分野で周知である。
【０１３４】
本発明の１つの実施形態においては、乳剤処方物には、１つ以上の浸透促進剤（単数または複数）が含まれる。１つの実施形態においては、浸透促進剤は界面活性剤である。なお別の実施形態においては、浸透促進剤（単数または複数）は、ラウレス硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン、モノステアリン酸ソルビタン２０（Ｓｐａｎ  ２０）、およびミリスチン酸イソプロピルから選択され得る。
【０１３５】
乳剤処方物の中での浸透促進剤（単数または複数）の濃度は、約０．２重量％から約１０重量％、または約０．３５重量％から約０．８重量％の範囲であり得る。
【０１３６】
本発明の１つの実施形態においては、乳剤処方物には、約０．３５重量％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる。本発明の別の実施形態においては、乳剤性処方物には、約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムが含まれる。なお別の実施形態においては、乳剤性処方物には、約０．４重量％のソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ  ２０）、および約０．６重量％のＮ−ラウロイルサルコシンが含まれる。なお別の実施形態においては、乳剤性処方物にはさらに、約１０重量％のミリスチン酸イソプロピルが含まれる。
【０１３７】
本発明の別の実施形態においては、乳剤処方物にはまた、さらなる薬学的に不活性な物質（例えば、ヒドロキシプロピルメチルセルロース−４０００（ＨＰＭＣ  ４０００））および保存剤（例えば、メチルパラベン、およびプロピルパラベン）も含まれ得る。
【０１３８】
本発明の１つの実施形態においては、乳剤処方物にはさらに１−フェニルピペラジンが含まれる。
【０１３９】
リポソームを含む処方物
多くの界面活性剤の組織構造が存在しており、加えて、マイクロエマルジョンが薬剤の処方のために研究され、使用されている。これらには、単層、ミセル、２層、および小胞が含まれる。リポソームのような小胞は、薬剤の送達の観点からそれらが提供する、それらの特異性と作用期間の理由により、非常な関心を集めている。本発明で使用される場合は、用語「リポソーム」は、球形の二重層または二重層になるように配置された両親媒性脂質から構成される小胞を意味する。
【０１４０】
リポソームは単層または多層の小胞であり、これらは、脂質物質によって形成される膜と水性の内面を有している。水性部分には、送達される組成物が含まれる。陽イオン性リポソームは、細胞壁に融合することができるという利点を有している。非陽イオン性リポソームは、細胞壁と効率よく融合することはできないが、インビボでマクロファージによって取り込まれる。
【０１４１】
リポソームのさらなる利点としては以下が挙げられる；天然に存在しているリン脂質から得られたリポソームは生体適合性であり、生分解性である；リポソームは、広い範囲の水溶性および脂溶性の薬剤を取り込むことができる；リポソームは、それらの内部区画の中にカプセル化された薬剤を、代謝および分解から保護することができる（Ｒｏｓｏｆｆ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｒｉｅｇｅｒ  ａｎｄ  Ｂａｎｋｅｒ（編），１９８８，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，第１巻，ｐ．２４５）。リポソーム処方物の調製に重要な検討項目は、脂質表面の電荷、小胞の大きさ、およびリポソームの水性部分の容積である。
【０１４２】
リポソームは、作用部位への有効成分の輸送および送達に有用である。リポソーム膜は、生体膜と構造的に類似しているので、リポソームが組織に適用されると、リポソームは細胞膜に吸収されはじめる。リポソームと細胞の吸収が進むに伴って、リポソーム内容物は細胞内に中身を放出して空になり、細胞内で有効成分が作用し得る。
【０１４３】
リポソーム処方物は、多くの薬剤の送達の態様として、広範な研究の焦点となっている。局所投与については、リポソームに他の処方物を上回るいくつかの利点があることの証拠が明らかになりつつある。このような利点には、投与された薬剤の高い全身性の吸収に関係する副作用の減少、所望される標的での投与された薬剤の蓄積の増加、および多種多様の薬剤（親水性および疎水性の両方）を皮膚に投与する能力が含まれる。
【０１４４】
いくつかの報告には、皮膚に薬剤（高分子量ＤＮＡを含む）を送達するリポソームの能力が詳細に記載されている。複数の化合物（鎮痛薬、抗体、ホルモン、および高分子量ＤＮＡを含む）が皮膚に投与されている。大部分の用途によっては、表皮上層の標的化が生じる。
【０１４５】
リポソームは２つの広いクラスに入れられる。陽イオン性リポソームは、負電荷を有しているＤＮＡ分子と相互作用して安定な複合体を形成する、正電荷を有しているリポソームである。正電荷を有しているＤＮＡ／リポソーム複合体は、負電荷を有している細胞表面に結合し、そしてエンドソームにインターナライズされる。エンドソーム内部の酸性ｐＨが原因で、リポソームは破裂し、それによって、その内容物が細胞質の中に放出される（Ｗａｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９８７，１４７，９８０−９８５）。
【０１４６】
ｐＨ感受性または負電荷を有しているリポソームは、ＤＮＡと複合体を形成するのではなく、ＤＮＡを捕捉する。ＤＮＡと脂質はいずれも同様の電荷を有しているので、複合体の形成ではなく、反発が生じる。それにもかかわらず、いくつかのＤＮＡはこれらのリポソームの水性の内面の中に捕捉される。ｐＨ感受性リポソームは、培養物中の細胞の単層にチミジンキナーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを送達するために使用されている。外因性遺伝子の発現は、標的細胞の中で検出された（Ｚｈｏｕら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ，１９９２，１９，２６９−２７４）。
【０１４７】
１つの主要なタイプのリポソーム組成物には、自然界に由来するホスファチジルコリン以外のリン脂質が含まれる。中性のリポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。陰イオン性リポソーム組成物は、一般的には、ジミリストイルホスファチジルグリセロールから形成され、一方、陰イオン性融合性リポソームは、主に、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成される。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）（例えば、ダイズのＰＣ、および卵のＰＣ）から形成される。別のタイプは、リン脂質、および／またはホスファチジルコリン、および／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０１４８】
いくつかの研究では、皮膚へのリポソーム薬剤処方物の局所送達が評価されている。インターフェロンを含むリポソームのモルモットの皮膚への塗布によっては、皮膚のヘルペスの痛みの軽減が生じ、一方、他の手段によるインターフェロンの送達（例えば、溶液として、またはエマルジョンとして）は効果がなかった（Ｗｅｉｎｅｒら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，１９９２，２，４０５−４１０）。さらに、別の研究では、水性のシステムを使用したインターフェロンの投与に対して、リポソーム処方物の一部として投与されたインターフェロンの効力が試験され、そしてリポソーム処方物が水性処方物の投与よりも優れていると結論付けられた（ｄｕ  Ｐｌｅｓｓｉｓら、Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９２，１８，２５９−２６５）。
【０１４９】
非イオン性リポソーム系（特に、非イオン性界面活性剤およびコレステロールを含むシステム）はまた、皮膚への薬剤の送達におけるそれらの有用性を決定するためにも試験されている。ＮＯＶＡＳＯＭＥ（登録商標）（グリセリルジラウレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル、およびグリセリルジステアレート／コレステロール／ポリオキシエチレン−１０−ステアリルエーテル）を含む非イオン性リポソーム処方物が、マウスの皮膚の真皮にシクロスポリン−Ａを送達するために使用された。結果は、このような非イオン性リポソーム系が、皮膚の種々の層へのシクロスポリン−Ａの蓄積を促進することにおいて有効であることを示していた（Ｈｕら、Ｓ．Ｔ．Ｐ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，１９９４，４，６，４６６）。
【０１５０】
１つ以上の親水性ポリマーを用いて誘導体化された脂質を含む多くのリポソーム、およびその調製方法は、当該分野で公知である。Ｓｕｎａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｕｌｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．，１９８０，５３，２７６８）には、ＰＥＧ部分を含む非イオン性界面活性剤を含むリポソームが記載されている。Ｉｌｌｕｍら、（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９８４，１６７，７９）には、ポリマーであるグリコールでのポリスチレン粒子の親水性コーティングによって、血液中での半減期の有意な延長が生じることが記載されている。ポリアルキレングリコール（例えば、ＰＥＧ）のカルボキシル基の結合によって修飾された合成のリン脂質は、Ｓｅａｒｓ（米国特許第４，４２６，３３０号、および同第４，５３４，８９９号）に記載されている。Ｋｌｉｂａｎｏｖら、（ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２６８，２３５）には、ＰＥＧまたはＰＥＧステアレートで誘導したホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）を含むリポソームが血液循環での半減期を有意に延長させることを明らかにする実験が記載されている。Ｂｌｕｍｅら、（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａら、Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，１９９０，１０２９，９１）により、この観察が他のＰＥＧで誘導されたリン脂質（例えば、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）とＰＥＧの組み合わせによって形成されたＤＳＰＥ−ＰＥＧ）にまで拡大された。共有結合したＰＥＧ部分をそれらの外表面に有しているリポソームは、Ｆｉｓｈｅｒの欧州特許第ＥＰ  ０  ４４５  １３１  Ｂ１号、およびＷＯ９０／０４３８４に記載されている。１〜２０モルパーセントのＰＥＧで誘導されたＰＥを含むリポソーム組成物と、その使用方法は、Ｗｏｏｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，０１３，５５６号、および同第５，３５６，６３３号）、ならびに、Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（米国特許第５，２１３，８０４号、および欧州特許第ＥＰ  ０  ４９６  ８１３  Ｂ１号）に記載されている。多数の他の脂質−ポリマー結合体を含むリポソームは、ＷＯ９１／０５５４５および米国特許第５，２２５，２１２号（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．の両方）およびＷＯ９４／２００７３（Ｚａｌｉｐｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．）に開示されている。ＰＥＧで修飾されたセラミド脂質を含むリポソームは、ＷＯ９６／１０３９１（Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。米国特許第５，５４０，９３５号（Ｍｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）および同第５，５５６，９４８号（Ｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）には、それらの表面上の機能性部分を用いてさらに誘導することができる、ＰＥＧを含むリポソームが記載されている。
【０１５１】
核酸を含む限られた数のリポソームが当該分野で公知である。Ｔｈｉｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．のＷＯ９６／４００６２には、リポソームの中に高分子量核酸をカプセル化するための方法が開示されている。Ｔａｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，２６４，２２１号にはタンパク質結合リポソームが開示されており、このようなリポソームの内容物にアンチセンスＲＮＡが含まれ得ることが主張されている。Ｒａｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，６６５，７１０号には、リポソーム中にオリゴデオキシヌクレオチドをカプセル化する特定の方法が記載されている。Ｌｏｖｅ  ｅｔ  ａｌ．のＷＯ９７／０４７８７には、ｒａｆ遺伝子に対して標的化させられたアンチセンスオリゴヌクレオチドを含むリポソームが開示されている。
【０１５２】
トランスファーソーム（ｔｒａｎｓｆｅｒｓｏｍｅ）はなお別のタイプのリポソームであり、薬剤送達媒体の魅力的な候補である、高度に変形可能な脂質凝集体である。トランスファーソームは、液滴よりも小さい孔を介してそれらが容易に浸透することができる、極めて高度に変形可能な脂質の液滴と記載され得る。トランスファーソームは、それらが使用される環境に適応させることができ、例えば、これらは、自己最適化でき（皮膚の中の孔の形状に合わせることができ）、自己修復でき、多くの場合に断片化されることなくそれらの標的に達することができ、そして多くの場合に、自動装填式である。トランスファーソームを作成するためには、表面縁−活性化因子（通常は、界面活性剤）を、標準的なリポソーム組成物に添加することができる。トランスファーソームは、皮膚に血清アルブミンを送達するために使用されている。トランスファーソームによって媒介される血清アルブミンの送達は、血清アルブミンを含む溶液の皮下注射と同様に有効であることが示されている。
【０１５３】
本発明の１つの態様においては、リポソームを含む処方物には、１つ以上の浸透促進剤（単数または複数）およびアルコールが含まれる。本発明で使用される種々の浸透促進剤は当該分野で周知である。１つの実施形態においては、浸透促進剤は界面活性剤である。なお別の実施形態においては、浸透促進剤（単数または複数）は、ラウレス硫酸ナトリウム、Ｎ−ラウロイルサルコシン、ソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ  ２０）、およびホスファチジルコリン（ホスホリポン  ９０−Ｈ）から選択され得る。
【０１５４】
１つの実施形態においては、リポソームを含む処方物中での浸透促進剤の濃度は、約０．２重量％から約１０重量％、または約０．４重量％から約０．８重量％の範囲であり得る。
【０１５５】
別の実施形態においては、リポソームを含む処方物中でのアルコールの濃度は、約１重量％から約６０重量％、または約２．５重量％から約１０重量％の範囲であり得る。１つの実施形態においては、アルコールはエタノールである。
【０１５６】
本発明の１つの実施形態においては、リポソームを含む処方物には、約２．５重量％のエタノールが含まれる。本発明の別の実施形態においては、リポソームを含む処方物には、約５重量％のエタノールが含まれる。本発明のなお別の態様においては、リポソームを含む処方物には、約１０重量％のエタノールが含まれる。本発明のなお別の実施形態においては、リポソームを含む処方物には、約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムと、約２．５重量％、約５重量％、または約１０重量％のエタノールが含まれる。１つの実施形態においては、リポソームを含む処方物には、約０．４重量％のソルビタンモノラウレート２０（Ｓｐａｎ  ２０）、約０．６重量％のＮ−ラウロイルサルコシン、および約５重量％のエタノールが含まれる。なお別の実施形態においては、リポソームを含む処方物には、約１０重量％のホスファチジルコリン（ホスホリポン  ９０−Ｈ）が含まれる。
【０１５７】
本発明の１つの態様においては、リポソームを含む処方物には、さらに、プロピレングリコールが含まれる。
【０１５８】
本発明のなお別の態様においては、リポソームを含む処方物には、さらなる不活性な物質（例えば、緩衝液、増粘剤、および保存剤）もまた含まれ得る。
【０１５９】
投与形式
本発明の処方物の投与は、局所的（眼への送達、ならびに、舌下、膣、および直腸を含む粘膜への送達を含む）、肺（例えば、ネブライザーによる投与を含む、粉末またはエアゾールの吸入または吹送による）；気管内、鼻腔内、表皮、経皮、あるいは、経口であり得る。
【０１６０】
局所、経口、非経口、髄腔内、または脳室内投与のための処方物としては、経皮用パッチ、軟膏、ローション剤、クリーム剤、ゲル剤、ドロップ剤、坐剤、噴霧剤、液体、懸濁剤、または水中もしくは非水性媒体中の溶液、カプセル剤、小袋に入っている薬、トローチ剤、あるいは錠剤が挙げられ得るが、これらに限定はされない。
【０１６１】
本発明の１つの実施形態においては、核酸は、直腸形式によって投与される。具体的には、直腸投与のための組成物には、溶液剤（浣腸剤）、エマルジョン、および坐剤が含まれる。成人用の直腸坐剤は、通常は、一方または両方の末端が先細の形状にされており、そして、通常の基剤であるココアバターが使用される場合には、通常、１個あたり約２ｇの重量であり、幼児用の直腸坐剤は、通常、約半分の重量である（Ｂｌｏｃｋ，第８７章：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）。
【０１６２】
吸収を促進するアジュバントの使用は、直腸膜のバリア機能の修飾について、当該分野で公知であり、そしてまとめられている（Ｎｉｓｈｉｈａｒａ  ａｎｄ  Ｒｙｔｔｉｎｇ，Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，１９９７，２８，２０５）。吸収を促進するアジュバントは、適度に大きい水溶性薬剤およびペプチドのような吸収されにくい薬剤の処方物の能力に対する促進効果が示されている。アミノ酸のエナミン誘導体は吸収を促進する特性を示しが、これらが直腸での吸収を増大させる機構は明らかではない。キレート化剤のような化合物、およびスルフヒドリル除去因子（ｓｕｌｆｈｙｄｒｙｌ  ｄｅｐｌｅｔｅｒ）は、傍細胞経路、さらには細胞内経路を介する薬剤の直腸吸収を増大させることが示されている。サリチル酸塩およびその誘導体もまた、直腸経路から投与された薬剤の、傍細胞経路さらには細胞内経路を介する吸収を増大させる。脂肪酸は、薬剤の直腸吸収を増大させる場合には、サリチル酸塩と類似する特性を示す。レクチンもまた、微絨毛注入の導入によって薬剤の直腸吸収を増大させることが知られている。
【０１６３】
本発明の別の実施形態においては、１つ以上の核酸が経口送達によって投与される。
【０１６４】
経口投与のための組成物としては、散剤または顆粒剤、懸濁剤、または水もしくは非水性媒体中の溶液、カプセル剤、小袋に入っている薬、トローチ剤、錠剤、またはＳＥＣ（軟カプセル剤または「カプレット」）が挙げられる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散補助剤、担体物質、または結合剤が、望ましくはこのような処方物に添加され得る。錠剤は、状況に応じて１つ以上の副成分と共に、圧縮または成型によって作成され得る。圧縮された錠剤は、適切な機械の中で、状況に応じて、結合剤（ＰＶＰまたはゴム（例えば、トラガカント、アカシア、カラギーナン））、潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウムのようなステアリン酸塩）、流動促進剤（タルク、コロイド状二酸化ケイ素）、不活性な希釈剤、保存剤、界面活性剤または分散剤と混合された、自由に流動する形態（例えば、散剤または顆粒剤）の有効成分の圧縮によって調製され得る。好ましい結合剤／崩壊剤としては、ＥＭＤＥＸ（デキストレート）、ＰＲＥＣＩＲＯＬ（トリグリセリド）、ＰＥＧ、およびＡＶＩＣＥＬ（セルロース）が挙げられる。成型された錠剤は、不活性な液体希釈剤で湿らせられた粉末化合物の混合物を適切な機械の中で成型することによって作成され得る。錠剤は、状況に応じて、コーティングされる場合も、また、ミシン目が入れられる場合もあり、そして、その中の有効成分のゆっくりとした放出または徐放を提供するように処方される場合もある。
【０１６５】
このような処方物の使用には、その粘膜への暴露のために消化管に核酸を送達する効果がある。したがって、処方物には、胃のｐＨの状態から核酸を保護することにおいて、または特定の粘膜部位へのその送達を最適化するために核酸を長時間にわたって放出することにおいて有効な腸溶性物質が含まれ得る。酸耐性の錠剤、カプセル剤、およびカプレットについての腸溶性物質は当該分野で公知であり、そして、通常は、酢酸フタル酸塩、プロピレングリコール、ソルビタンモノオレエート、酢酸フタル酸セルロース（ＣＡＰ）、酢酸トリメリテートセルロース、およびフタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）が含まれる。腸溶性物質は投与量形態に組み込まれ得るか、または、錠剤、カプセル剤、またはカプレットの表面全体を実質的に覆うコーティングであり得る。腸溶性物質はまた、例えば、錠剤の保存または熟成の間に破砕が生じないように、物質に柔軟な弾力性を与える可塑剤によって行われる場合もある。可塑剤は当該分野で公知であり、そしてこれには通常、フタル酸ジエチル（ＤＥＰ）、トリアセチン、セバシン酸ジブチル（ＤＢＳ）、フタル酸ジブチル（ＤＢＰ）、およびクエン酸トリエチル（ＴＥＣ）が含まれる。
【０１６６】
消化管への送達のための処方物を生産するための種々の方法は、当該分野で周知である。一般的には、Ｎａｉｍ，第８３章；Ｂｌｏｃｋ，第８７章；Ｒｕｄｎｉｃら、第８９章；Ｐｏｒｔｅｒ，第９０章；およびＬｏｎｇｅｒら、第９１章：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ，編，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０を参照のこと。本発明で記載されるオリゴヌクレオチドは、公知の方法において、従来の処方物（例えば、錠剤、コーティングされた錠剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、エアゾール、シロップ剤、ゲル剤、エマルジョン、懸濁剤、および溶液剤）になるように、不活性な非毒性の薬学的に適している賦形剤または溶媒を使用して処方することができる。それぞれの場合において、治療活性のあるオリゴヌクレオチドは、全混合物の約０．１重量％から約０．５重量％の濃度で、すなわち、記載される投与量の範囲を得るために十分な量で、ここに存在するはずである。組成物は、適切である場合には、さらなる薬学的に許容される担体または賦形剤を使用して、従来の様式で処方され得る。したがって、組成物は、結合剤（例えば、プレゼラチン化トウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドン、またはヒドロキシプロピルメチルセルロース）；増量剤（例えば、乳糖、微結晶セルロース、またはリン酸水素カルシウム）；潤滑剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルク、またはシリカ）；崩壊剤（例えば、デンプン、グリコール酸ナトリウムデンプン）；あるいは、湿潤剤（例えば、ラウリル硫酸ナトリウム）のような担体または賦形剤を用いて、従来の手段によって調製され得る。錠剤は、当該分野で周知の方法によってコーティングされ得る。調製物にはまた、香味剤、着色剤、および／または甘味剤も、適切である場合には含まれ得る。
【０１６７】
経口送達に使用されるカプセル剤には、当該分野で周知の処方物が含まれ得る。さらに、Ｄｉｇｅｎｉｓら、米国特許第５，６７２，３５９号に記載されているような徐放特性を有している多区画硬カプセル剤、およびＡｍｉｄｏｎら、米国特許第５，６７４，５３０号に記載されているような多段階薬剤送達システムを有している水透過性カプセルもまた、本発明の組成物を処方するために使用され得る。
【０１６８】
薬学的組成物の処方と、その後のそれらの投与は、当業者の能力の範囲内であると考えられる。
【０１６９】
一般的には、治療適用については、疾患もしくは障害を有しているか、または疾患もしくは障害になりやすい患者（すなわち、ヒトを含む動物）に、１つ以上の核酸（オリゴヌクレオチドを含む）が、患者の年齢と、処置される障害もしくは疾患状態の重篤度に応じて体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇの範囲の用量で、薬学的に許容される担体の中で、本発明にしたがって投与される。さらに、処置レジュメは、特定の疾患または障害の性質、その重篤度、および患者の全体的な症状に応じて変化する期間の間続けられ得、そして、１日に１回から２０年に１回までの範囲であり得る。本発明の状況においては、用語「治療レジュメ」は、治療様式、緩和様式、および予防様式を含むように意味される。処置後、患者は、彼／彼女の症状の変化について、および障害または疾患状態の症状の緩和についてモニターされる。核酸の投与量は、患者が現在の投与量レベルに対して有意に反応していない場合には増大させられ得るか、または、障害もしくは疾患の症状の緩和が観察されるか、または障害もしくは疾患状態が和らいでいる場合には、減少させられ得るかのいずれかである。
【０１７０】
投薬は、処置される疾患状態の重篤度および反応性に応じて様々であり、処置期間は数日間から数ヶ月間まで継続されるか、あるいは、治癒が得られるかまたは疾患状態の縮小が生じるまで継続される。最適な投薬スケジュールは、患者の体内での薬剤の蓄積の測定によって計算することができる。当業者であれば、最適な投与量、投与方法、および反復回数を容易に決定できる。最適な投与量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的な効力に応じて様々であり得、そして一般的には、インビトロおよびインビボの動物モデルにおいて有効であることが明らかにされているＥＣ．ｓｕｂ．５０値に基づいて推定することができる。一般的には、投与量は、体重１ｋｇあたり０．０１．ｍｕ．ｇから１００ｇであり、そして１日に１回以上、１週間に１回以上、１ヶ月に１回以上、または１年に１回以上、または２から２０年ごとに１回以上で投与され得る。最適な投与スケジュールが、特定の投与の態様によって投与される核酸の治療有効量を送達するために使用される。
【０１７１】
用語「治療有効量」は、本発明の目的については、望ましくない副作用（例えば、毒性、刺激、またはアレルギー性の反応）を伴わずに意図される目的を達成するために有効である、核酸を含む処方物の量を意味する。個々の必要量は様々であり得るが、処方物の有効量の最適な範囲の決定は当業者の能力の範囲内である。ヒトへの投与量は、動物実験から推定することができる（Ｋａｔｏｃｓら、第２７章：Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，第１８版，Ｇｅｎｎａｒｏ，編．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９９０）。一般的には、有効量の処方物を提供するために必要な投与量（当業者であれば調節することができる）は、レシピエントの年齢、健康状態、身体の症状、体重、疾患または障害のタイプおよび程度、処置の頻度、現在行われている治療の性質（あれば）、ならびに、所望される効果（単数または複数）の性質および範囲に応じて様々である（Ｎｉｅｓら、第３章：Ｇｏｏｄｍａｎ  ＆  Ｇｉｌｍａｎ’ｓ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，第９版．，Ｈａｒｄｍａｎら、編．，ＭｃＧｒａｗ−Ｈｉｌｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．，１９９６）。
【０１７２】
処置の成功の後には、疾患状態の再発を防ぐために、患者には維持療法を受けさせることが所望され得る。この場合、核酸は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇの範囲の維持用量で、１日に１回以上から２０年に１回までで、投与される。例えば、自己免疫症状または炎症症状にかかりやすいことがわかっているかまたは疑われる個体の場合には、予防効果は、体重１ｋｇあたり０．０１μｇから１００ｇまでの範囲の予防量の、１日に１回以上から２０年に１回の投与によって得られ得る。同様の様式で、個体は、いくつかの医薬品での処置の結果として生じることが予想される炎症症状（例えば、細胞、組織、または臓器の個体への移植によって生じる移植片対宿主疾患）にかかりにくくされ得る。
【０１７３】
核酸の非経口投与のための処方物には、滅菌の水溶液および滅菌されていない水溶液、アルコールのような一般的な溶媒中の非水性溶液、または液体もしくは固体脂基材の中の核酸の溶液が含まれ得る。溶液には、緩衝液、希釈剤、および他の適切な添加剤もまた含まれ得る。核酸と有害なように反応することはない、非経口投与に適している薬学的に許容される有機または無機担体物質が使用され得る。適切な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液、アルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、乳糖、アミロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ケイ酸、粘性パラフィン、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなどが挙げられるが、これらに限定はされない。処方物は滅菌することができ、所望される場合には、助剤（例えば、潤滑剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、着色剤、香味剤、および／または芳香物質など（これらは、処方物の核酸（単数または複数）とは有害な相互作用はしない））と混合され得る。
【０１７４】
薬学的処方物（これは、通常は単位投与量形態で提示され得る）は、製薬業界で周知である従来技術にしたがって調製され得る。このような技術には、薬学的担体（単数または複数）または賦形剤（単数または複数）との有効成分の混合を行う工程が含まれる。一般的には、処方物は、有効成分と液体担体または細かく分離させられた固体担体、あるいは両方と均一に、そして念入りに混合すること、その後、必要であれば、生成物を成型することによって調製される。
【０１７５】
オリゴヌクレオチドおよび他の核酸の多数の生物学的同等物もまた、本発明にしたがって使用され得る。したがって、本発明には、オリゴヌクレオチドおよび核酸等価物（例えば、オリゴヌクレオチドおよび核酸のプロドラッグ、欠失誘導体、オリゴヌクレオチドの結合体、アプタマー、およびリボザイムであるが、これらに限定されない）もまた含まれる。
【０１７６】
本発明の方法および処方物にはまた、無数の欠失オリゴヌクレオチド（内部欠失オリゴヌクレオチドと末端欠失オリゴヌクレオチドの両方）も含まれる。これらは、このような欠失配列のオリゴヌクレオチドの固相による製造のプロセスの間に合成され、全て、実用的な目的の生物学的同等物である。特異的触媒活性を有している合成のＲＮＡ分子およびそれらの誘導体は、リボザイムとして公知であり、そしてまた、本発明の方法および組成物の目的についてオリゴヌクレオチドの生物学的同等物とも考えられる。本発明の方法および処方物の目的については、ペプチド核酸（ＰＮＡ）およびアプタマーもまた、オリゴヌクレオチドの生物学的同等物と考えられる（一般的には、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎら、Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４６，８１８；米国特許第５，５２３，３８９号（Ｅｃｋｅｒら、１９９６年６月４日を参照のこと）。
【０１７７】
アプタマーの名称は、Ｅｌｌｉｇｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ（Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４６，８１８）によって、核酸ではないリガンド（例えば、ペプチド、タンパク質、および低分子（例えば、薬剤および色素））に適合し、したがって、それらに対して有意な特異性で結合する核酸分子について作り出された。これらの特異的リガンドの結合特性の理由から、アプタマーとして分類され得る核酸およびオリゴヌクレオチドは、固定されたリガンドを有しているカラムを使用して、アフィニティークロマトグラフィーによって容易に精製または単離することができる。アプタマーは、数百個のヌクレオチド程度の大きさの、比較的短い核酸であり得る。例えば、Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋは、ａｒｃ  １５５ヌクレオチドの長さであり、そしてＣｉｂａｃｒｏｎ  ＢｌｕｅおよびＲｅａｃｔｉｖｅ  Ｂｌｕｅ  ４（Ｅｌｌｉｇｎｔｏｎ  ａｎｄ  Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｎａｔｕｒｅ，１９９０，３４６，８１８）のような色素に非常に良好な選択性で結合する、ＲＮＡアプタマーの発見が報告されている。ＲＮＡ分子は最初はアプタマーと呼ばれたが、この用語は、本発明中で使用される場合には、低分子リガンドに対して特異的結合を示す任意の核酸またはオリゴヌクレオチドを意味する。これには、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ誘導体および結合体、ＲＮＡ誘導体および結合体、修飾されたオリゴヌクレオチド、キメラオリゴヌクレオチド、ならびにギャップマー（ｇａｐｍｅｒ）が含まれるが、これらに限定はされない。
【０１７８】
１つの実施形態においては、本発明には、動物への生物学的活性を有している核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）の非経口投与が記載される。「生物学的活性を有している」によっては、核酸が、遺伝子のいずれかの絶対的機能（例えば、リボザイム活性）に反映されるか、またはこのような遺伝子によってコードされるタンパク質の生産により反映される、動物の中での１つ以上の遺伝子の発現を調節するように機能することが意味される。本発明の状況においては、「調節する」は、遺伝子の発現の増加（刺激）または減少（阻害）のいずれかを行うことを意味する。このような調節は、例えば、当該分野で公知の種々の機構によって標的転写因子に結合する、二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子によって行われ得る。本発明の処方物を使用して投与された種々の二本鎖オリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子は、以下にさらに詳細に記載される。
【０１７９】
ヒト以外の動物において、本発明の処方物および方法は、動物の中での１つ以上の遺伝子の機能を研究するために使用することができる。
【０１８０】
記載されるように、本発明の処方物および方法は治療的に有用であり、すなわち、１つ以上の核酸で全体または一部を処置することができる疾患または障害を有しているかまたは有していると予想される、あるいはそのような疾患または障害になりやすい動物（ヒトを含む）に対して、治療様式、緩和様式、または予防様式を提供するために有用である。用語「疾患または障害」には、（１）特に、感染、固有の弱さ、環境によるストレス（正常な生理学的機能を低下させる）の結果として、生物体または一部の任意の異常な症状が含まれ；（２）妊娠自体（自己免疫ではない）および妊娠に伴う多の疾患は排除され；そして（３）ガンおよび腫瘍が含まれる。用語「〜を有しているかもしくは〜を有していると疑われるか、または〜になりやすい」は、被験動物が、このような動物の一般的な集団と比較して、本明細書中で定義される特定の疾患または障害を発症している、または発症が疑われる、発症のリスクがあると決定されていることを示す。例えば、被験動物は、特定の疾患または障害の頻繁な発症を含む、個人の病歴および／または家族の病歴を有し得る。別の例においては、被験動物は、当該分野で公知の技術に従う遺伝的スクリーニングによって決定される、そのような罹患しやすさを有し得る（例えば、Ｕ．Ｓ．Ｃｏｎｇｒｅｓｓ，Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，第５章：Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｗｏｒｋｐｌａｃｅ，ＯＴＡ−ＢＡ−４５５，Ｕ．Ｓ．Ｇｏｖｅｒｎｍｅｎｔ  Ｐｒｉｎｔｉｎｇ  Ｏｆｆｉｃｅ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．，１９９０，ｐ．７５−９９を参照のこと）。用語「１つ以上の核酸で全体または一部を処置することができる疾患または障害」は、本明細書中で定義されるような疾患または障害を意味し、（１）その管理、調節、もしくは処置、および／または（２）それからの治療様式、緩和様式、および予防様式が、さらなる核酸の投与によって提供され得る。好ましい実施形態においては、このような疾患または障害は、二本鎖のオリゴデオキシヌクレオチドデコイ分子で全体または一部を処置することができる。
【０１８１】
上記の１つ以上の処方物を使用して投与することができる種々の転写因子を標的化するオリゴヌクレオチドデコイ分子としては、以下に記載されるものが挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１８２】
ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドデコイ分子
本発明の１つの態様は、ｐ６５／ｐ５０および／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体に結合することができ、ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体には結合できないか、あるいは、ｐ６５／ｐ５０および／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体に優先的に結合するデコイ分子を設計することによる、これらの部位を占有することに遅れて生じるｐ５０／ｐ５０ホモ二量体の遊離によって、ＮＦ−κＢによって駆動されるプロモーターのさらなる封鎖を提供することができるという発想である。結果として、このような選択的デコイ分子は、当該分野で公知のＮＦ−κＢでコイよりもＮＦ−κＢ活性をブロックする能力を有する。
【０１８３】
改良された特性を有しているＮＦ−κＢデコイの設計
１．ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の設計
本発明のオリゴヌクレオチドデコイは、免疫グロブリン軽鎖遺伝子に結合させられたｐ５０／ｐ６５ヘテロ二量体の結晶構造の利点を利用して設計されている（Ｃｈｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ  ３９１（６６６５）：４１０−３（１９９８））。これには、５’−ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号２）のコンセンサス配列が含まれている。著者らによって、ｐ５０が５塩基対のサブサイト５’−ＧＧＧＡＣ−３’（配列番号３）と接触すること、およびｐ６５が４塩基対のサブサイト５’−ＴＴＣＣ−３’（配列番号４）と接触することが示された。ｐ５０／ｐ６５ヘテロ二量体によるＤＮＡの接触は、ホモ二量体構造における接触と類似している（Ｇｈｏｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３（６５１２）：３０３−１０（１９９５）；Ｍｕｌｌｅｒら、ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３６９（１）：１１３−７（１９９５））。
【０１８４】
１つの実施形態においては、本発明のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子は、ワトソンクリック塩基対合によって互いに結合した２つのオリゴヌクレオチド鎖からなる。通常は、２つの鎖の中の全てのヌクレオチドが塩基の対合に関係しているが、これは必要条件ではない。オリゴヌクレオチドデコイ分子（ここでは、１つ以上、例えば、１〜３個、または１〜２個のヌクレオチドは塩基の対合の関係していない）もまた含まれる。加えて、二本鎖のデコイには、３’一本鎖突出および／または５’一本鎖突出が含まれる場合がある。
【０１８５】
別の実施形態においては、本発明のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子には、ワトソンクリック塩基対合によって互いに結合しており、そして３’末端もしくは５’末端のいずれか、または両方でさらに互いに共有結合しており、結果としてドラム型の構造または環状分子を生じる、２つのオリゴヌクレオチド鎖が含まれる。共有結合は、例えば、ホスホジエステル結合、または、例えば、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、もしくはホスホアミデート結合のような他の結合基によって提供され得る。
【０１８６】
一般的には、本発明のｄｓＯＤＮ分子には、５’および／または３’配列に隣接しているＮＦ−κＢ転写因子に特異的に結合することができるコア配列が含まれる。この場合、コア配列は、約５個から１４個、または約６個から１２個、または約７個から約１０個の塩基対からなり；そして隣接配列は、約２から８、または約２から６、または約２から４塩基対の長さである。これらの分子には、通常、２つの完全に相補的な鎖または一部が相補的である鎖（コア配列と隣接配列を含む）からなる、約１２から２８塩基対の長さ、好ましくは、約１４から２４塩基対の長さの二本鎖領域が含まれる。
【０１８７】
結合親和性を変化させることができるコア配列を変化させること（長さ、配列、塩基修飾、および骨格構造を含む）によって、ＮＦ−κＢデコイ分子の安定性および特異性を変化させることができる。実際、本発明のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子（これは、高い親和性でｐ６５／ｐ５０および／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体に結合し、ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体に対しては結合親和性を示さないか、または低い結合親和性しか示さない）は、ＤＮＡに対するｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体の結合の結晶構造に基づいて、コンセンサスオリゴヌクレオチドデコイの結合部位（コア）の標的化される残基を欠失または変化させることによって設計された。
【０１８８】
加えて、隣接配列の変化は純粋な影響力を有しており、ＮＦ−κＢデコイ分子のインビボでの安定性を有意に増大させることができ、そして、結合親和性および／または特異性に影響を与え得る。具体的には、ＮＦ−κＢデコイ分子の形状／構造は、コア結合配列に隣接している配列を変化させることによって変化させることができ、これによって、安定性および／または結合親和性の改善を生じることができる。ＤＮＡの形状および構造は、塩基対の配列、ＤＮＡの長さ、ヌクレオチドの骨格および性質（すなわち、天然に存在しているＤＮＡ対修飾された糖または塩基）による影響を受ける。したがって、分子の形状および／または構造はまた、他のアプローチによって、例えば、全長、完全に相補的な部分の長さ、分子内の二本鎖領域を変化させることによって、コア配列および隣接配列の中での変更によって、骨格構造を変化させることによって、および塩基修飾によって、変化させることもできる。
【０１８９】
本発明のデコイ分子中に存在するヌクレオチド配列には、修飾されたヌクレオチドまたは例外的なヌクレオチドが含まれ得、別の骨格化学性質を有する場合がある。合成のヌクレオチドは、様々な方法で修飾され得る。例えば、Ｂｉｅｌｉｎｓｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：９９７−１０００（１９９０）を参照のこと。したがって、酸素は、窒素、イオウ、または炭素で置換することができ；リンは炭素で置換することができ、デオキシリボースは他の糖で置換することができ、また、個々の塩基は例外的な塩基で置換することができる。したがって、イオウ基とのヌクレオチド間結合の架橋されていない酸素原子の置換（ホスホロチオエート結合を生じる）は、ｄｓＯＤＮ分子のヌクレアーゼ耐性を増大させることにおいて有用である。イオウの修飾の数と、本明細書中のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の安定性および特異性との間の関係を決定する実験は、以下の実施例に示される。
【０１９０】
それぞれの場合において、任意の変化は、ＮＦ−κＢ転写因子に対するオリゴヌクレオチドデコイの結合能力および親和性に対する修飾の効果、融点およびインビボでの安定性に対する効果、ならびに、任意の有害な生理学的作用として評価される。このような修飾は当該分野で周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての広範囲の用途が見出されており、したがって、それらの安全性および結合親和性の保持が十分に確立されている（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１５１０−１５１３（１９９３）を参照のこと）。
【０１９１】
修飾されたヌクレオチドの例は以下であるが、これらに限定はされない：４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、β，Ｄ−ガラクトシルエノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン３−メチルシチジン５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、β，Ｄ−マンノシルエオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボナルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステルウリジン−５−オキシ酢酸、ウェイブトキソシン、シュードウリジンエオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）−カルバモイルスレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、３−（３−３−アミノ−３−カルボキシ−プロピル）ウリジン（ａｃｐ３）ｕ、およびウェイブトシン。
【０１９２】
加えて、ヌクレオチドは、例えば、ホスホルアミデート結合によって互いに連結され得る。この連結は天然に存在しているホスホジエステル結合のアナログであり、その結果、結合している酸素（−Ｏ−）は、アミノ基（−ＮＲ−）で置き換えられる。式中、Ｒは、通常は、水素または低級アルキル基（例えば、メチルまたはエチル）である。他の結合（例えば、ホスホチオエート、ホスホジチオエートなど）もまた可能である。
【０１９３】
本発明のデコイにはまた、ポリヌクレオチド構造の中に通常存在しているリボースまたはデオキシリボースの修飾された形態またはアナログ形態も含まれ得る。このような修飾としては、２’−置換糖（例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、および２’アジド−リボース、カルボン酸糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロース、リキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘパツロース糖）、アクリル酸アナログ、および脱塩基ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１９４】
一般的には、本発明のオリゴヌクレオチドデコイは、好ましくは、約５０％を上回る、より好ましくは、約８０％を上回る、最も好ましくは、約９０％を上回る従来のデオキシリボースヌクレオチドから構成される。
【０１９５】
本発明のＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮデコイはさらに、それらの局在化、精製を容易にするために、またはその特定の特性を改善するために修飾することができる。例えば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）が、細胞の核へのそれらの送達を改善するために、デコイ分子に結合させられ得る。ＮＦ−κＢ／Ｒｅｌタンパク質には、ＮＬＳを含む共通のＲｅｌ相同ドメインが含まれる。好ましい実施形態においては、このような天然に存在しているＮＬＳまたはその変異体が、本発明のデコイ分子において使用される。
【０１９６】
加えて、本発明のＮＦ−κＢデコイ分子は、例えば、以下の参考文献に記載されて得るように、担体分子（例えば、ペプチド、タンパク質、または他のタイプの分子）と結合させられ得る：Ａｖｒａｍｅａｓら、Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  １６，３８３−３９１（２００１）；Ａｖｒａｍｅａｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：８７−９３（１９９９）；Ｇａｌｌａｚｚｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４，１０８３−１０９５（２００３）；Ｒｉｔｔｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１，７０８−７１７（２００３）。
【０１９７】
本発明のＮＦ−κＢデコイ分子は、さらに、特異的細胞型への送達、分布、標的化を改善し、そして細胞のバリアを通過する移動を促進する送達媒体を含むように誘導され得る。このような送達媒体としては、細胞浸透促進剤、リポソーム、リポフェクチン、デンドリマー、ＤＮＡ挿入剤、およびナノ粒子が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０１９８】
２．ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の合成
本発明のＮＦ−κＢ  ｓｄＯＤＮデコイ分子は、市販されている自動合成装置を使用して、標準的なホスホジエステル化学またはホスホルアミデート化学によって合成することができる。実施例に記載される特異的ｄｓＯＤＮ分子は、自動ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して合成される。デコイは、カラムクロマトグラフィーによって精製され、凍結乾燥させられ、そして培養培地の中で溶解させられた。それぞれのデコイの濃度は、分光光度によって決定された。
【０１９９】
３．ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の特性決定
本発明のＮＦ−κＢデコイ分子は、ゲルシフト、または電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）アッセイにおいて通常通り試験し、そして特性決定することができる。このアッセイによっては、ＤＮＡに対する転写因子の結合を検出するための迅速であり、感度の高い方法が提供される。アッセイは、タンパク質とＤＮＡの複合体が、遊離の二本鎖のオリゴヌクレオチドよりもゆっくりと、非変性ポリアクリルアミドゲルの中を移動するという観察に基づく。ゲルシフトアッセイは、精製されたタンパク質、またはタンパク質の複雑な混合物（例えば、核抽出物）を、転写因子結合部位を含む３２Ｐで末端標識されたＤＮＡ断片とともにインキュベートすることによって行われる。その後、反応産物が、非変性ポリアクリルアミドゲル上で分析される。結合部位に対する転写因子の特異性は、目的のタンパク質についての結合部位、またはスクランブルされたＤＮＡ配列のいずれかを含む過剰量のオリゴヌクレオチドを使用する競合実験によって確立される。複合体に含まれるタンパク質の同定は、タンパク質を認識する抗体を使用し、その後、ＤＮＡ−タンパク質−抗体複合体の移動度が下がること、または放射性同位元素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブに対するこの複合体の結合の崩壊のいずれかを観察することによって、確立される。
【０２００】
本明細書中の選択的ＮＦ−κＢデコイの設計においては、ＤＮＡに対するｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体の結合の結晶構造に基づいて、コンセンサスオリゴヌクレオチドデコイの結合部位（コア）の標的化される残基が欠失させられた。最終的な目的は、ｐ６５／ｐ５０および／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体に（好ましくは、ｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体とｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体の両方）に高い結合親和性で結合することができ、そして、ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体に対しては低い親和性を示す二本鎖のオリゴヌクレオチドを設計することである。この目的を達成するために、種々のＮＦ−κＢデコイが、以下の実施例に記載されるようなゲルシフトアッセイにおいて様々なＮＦ−κＢタンパク質に結合するそれらの能力について試験された。
【０２０１】
４．ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮ分子の使用
ＮＦ−κＢは、多数の遺伝子の転写調節に関与している。ＮＦ−κＢによって転写が活性化される遺伝子の代表的なグループ分けとリストが以下に提供される。
【０２０２】
サイトカイン／ケモカインおよびそれらの調節因子、例えば、インターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５）、リンホトキシン−α、リンホトキシン−β、ＴＮＦ−α、ＭＩＰ−１、ＭＩＰ−２、ＭＩＰ−３、ＲＡＮＴＥＳ、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ。
【０２０３】
免疫調節因子、例えば、ＢＲＬ−１、ＣＣＲ５、ＣＣＲ７、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、ＣＤ４０、およびＣＤ４０リガンド、ＣＤ４８、ＣＤ８３、ＣＤ２３、ＩＬ−２受容体α鎖、特定の免疫グロブリン重鎖および軽鎖、ＭＨＣクラスＩ抗原、Ｔ細胞受容体サブユニット、ＴＮＦ受容体（ｐ７５／８０）。
【０２０４】
抗原提示に関係しているタンパク質、例えば、Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  Ｂ，Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ３、ＴＡＰ１、およびタパシン。
【０２０５】
細胞接着分子、例えば、ＥセレクチンおよびＰセレクチン、ＩＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＶＣＡＭ−１、およびＴｅｎａｓｃｉｎ−Ｃ。
【０２０６】
急性期タンパク質、例えば、アンギオテンシノーゲン、β−デフェンシン−２、相補因子、組織因子−１（ＴＦ−１）、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子。
【０２０７】
ストレス反応遺伝子、例えば、アンギオテンシン−２、ＣＯＸ−２、ＭＡＰ４Ｋ１、ホスホリパーゼＡ２．
細胞表面受容体、例えば、ＣＤ２３、ＣＤ６９、ＥＧＦ−Ｒ、Ｌｏｘ−１、Ｍｄｒ１。
【０２０８】
アポトーシスの調節因子、例えば、Ｂｆｌ１、Ｂｃｌ−ｘＬ、カスパーゼ−１１、ＣＤ９５（Ｆａｓ），ＴＲＡＦ−１、ＴＲＡＦ−２。
【０２０９】
成長因子およびそれらの調節因子、例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＩＧＦＢＰ−１、ＩＧＦＢＰ−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＶＥＧＦ−Ｃ。
【０２１０】
初期反応遺伝子、例えば、ＴＩＥＧ、Ｂ９４、Ｅｇｒ−１。
【０２１１】
加えて、ＮＦ−κＢは、他の転写因子（例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、Ａ２０、ｊｕｎＢ、ｐ５３、ＷＴ１、およびウイルスの転写を調節する。
【０２１２】
したがって、ＮＦ−κＢによって誘導されるプロ炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１およびＴＮＦ−α）、ならびに免疫調節因子の発現の阻害は、炎症性疾患、免疫疾患、および自己免疫疾患（例えば、関節リウマチ（ＲＡ）（Ｒｏｓｈａｋら、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２：３１６−３２１（２００２））；クローン病および炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（Ｄｉｊｋｓｔｒａら、Ｓｃａｎｄｉｎａｖｉａｎ  Ｊ．ｏｆ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  Ｓｕｐｐｌ．２３６：３７−４１（２００２））、膵炎（Ｅｅｂｅｒ  ａｎｄ  Ａｄｌｅｒ，Ｐａｎｃｒｅａｔｏｌｏｇｙ  １：３５６−３６２（２００１））、歯周炎（Ｎｉｃｈｏｌｓら、Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  Ｐｅｒｉｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ  ６：２０−２９（２００１））；狼瘡（Ｋａｍｍｅｒ  ａｎｄ  Ｔｓｏｋｏｓ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｄｉｒｅｃｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５：１３１−１５０（２００２））；喘息（Ｐａｈｌ  ａｎｄ  Ｓｚｅｌｅｎｙｉ，Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５１：２７３−２８２（２００２））；ならびに、眼アレルギー（Ｂｉｅｌｏｒｙら、Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ａｌｌｅｒｇｙ  ａｎｄ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２：４３５−４４５（２００３））の処置に有用である。
【０２１３】
ＮＦ−κＢは、アテローム性動脈硬化症および血管損傷後の病変の形成（Ｙｏｓｈｉｍｕｒａら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ８：１６３５−１６４２（２００１））；脳虚血後の神経損傷（Ｕｅｎｏら、Ｊ．Ｔｈｏｒａｃｉｃ  ａｎｄ  Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｓｕｒｇｅｒｙ  １２２（４）：７２０−７２７（２００１））；慢性の気道炎症（Ｇｒｉｅｓｅｎｂａｃｈら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７，３０６−３１３（２０００））；自己免疫性心筋炎の進行（Ｙｏｋｏｓｅｋｉら、Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８９：８９９−９０６（２００１））；心臓移植における急性拒絶および移植片動脈症（Ｓｕｚｕｋｉら、Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：１８４７−１８５２（２０００））；ならびに、心筋梗塞（Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３（８）：８９４−８９９（１９９７））に関与しているサイトカインと接着分子遺伝子の協調トランス活性化において極めて重要な役割を担っているので、ＮＦ−κＢデコイ分子もまた、このような疾患および症状の処置において有用性が見出される。
【０２１４】
最近の証拠は、ＮＦ−κＢと、その活性化に関与しているシグナル伝達経路もまた、腫瘍の発達に重要であることを示している。例えば、Ｋａｒｉｎら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２（４）：３０１−１０（２００２）を参照のこと。したがって、本発明のデコイ分子によるＮＦ−κＢのブロックは、ガンの予防および処置において有用性が見出され、これによっては、単独であるか、または他の処置オプションと組み合わせられたかのいずれかの新しいガンに対する治療方法が提供される。
【０２１５】
多数の抗炎症剤および抗リウマチ剤（グルココルチコイド、アスピリン、サリチル酸ナトリウム、およびスルホサラジンを含む）は、ＮＦ−κＢの活性化の阻害因子である。炎症性疾患および症状、ならびに自己免疫疾患および症状の処置のためには、本発明のＮＦ−κＢデコイ分子は、状況によっては、このような薬剤での処置と組み合わせて投与され得る。併用療法には、２種類以上の薬剤の同時投与、ならびに、任意の順序でのそれらの連続投与が含まれる。
【０２１６】
Ｅ２Ｆオリゴヌクレオチドデコイ分子
改善された特性を有しているＥ２Ｆデコイの設計
多くの転写因子が、それらの認識部位に対する結合の際にＤＮＡを湾曲させることができること、そして直鎖状ではないＤＮＡ構造によって、転写に関与している近位および遠位でのＤＮＡ−タンパク質の接触が容易になり、最終的にはそれらが決定されることが周知である（Ｐｅｒｅｚ−Ｍａｒｔｉｎら、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｒｅｖ  ５８：２６８−２９０（１９９４）；およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｖｌｉｅｔ  ａｎｄ  Ｖｅｒｒｉｊｚｅｒ，Ｂｉｏａｓｓａｙｓ  １５：２５−３２（１９９３））。さらに最近になって、Ｅ２Ｆ認識部位に、固有のＤＮＡの湾曲が含まれていることが明らかになった（Ｃｒｅｓｓ  ａｎｄ  Ｎｅｖｉｎｓ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌ．，Ｂｉｏｌ．１６：２１１９−２１２７（１９９６））。この認識部位に対する遊離のＥ２Ｆの結合によっては、反対向きの方向ではあるが、固有の湾曲と大きさが同程度であるＤＮＡの湾曲が生じる。Ｅ２Ｆ−１プロモーターの構造がプロモーターの転写活性に影響を与えることもまた知られている。Ｅ２Ｆ部位の中、およびその周辺での５塩基対の置換によっては、ＤＮＡヘリックス構造、Ｅ２Ｆ結合に変化が生じ、転写活性に影響が及ぶ。Ｅ２Ｆ結合部位の自然な湾曲は、この部位に対するＥ２Ｆの結合がこの構造に対して劇的な効果を有しているという事実とともに、Ｅ２Ｆの結合と、Ｅ２Ｆ依存性の転写制御におけるＤＮＡ構造の役割を示唆していると見られる。それらの結合部位に対する転写因子の結合は、ＤＮＡの構造および形状に敏感である。相互作用の特異性のレベルは、ＤＮＡの柔軟性および／または湾曲によって高められる。さらなる詳細については、Ｐｈｉｌｏｓ  Ｔｒａｎｓ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｌｏｎｄ  Ｂ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ  ３５１：５０１−９（１９９６）およびＲｈｏｄｅｓら、Ｉｎｄｉａｎ  Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  ３３：８３−７（１９９６）もまた参照のこと。
【０２１７】
本発明は、Ｅ２Ｆデコイ分子の形状および／または構造の変化によって、標的Ｅ２Ｆ転写因子に対するその結合親和性を大きく改善することができ、これは言い換えると、標的Ｅ２Ｆ転写因子の生物学的機能のより効果的な阻害が生じることの発見に基づく。
【０２１８】
本明細書中に提供される実施例においては、Ｅ２Ｆデコイ分子の形状／構造は、コア結合部位に隣接している配列を変化させることによって変化させられ、これによっては、Ｅ２Ｆ結合親和性の大幅な改善が生じる。結合親和性の増大によっては、Ｅ２Ｆデコイは、Ｅ２Ｆの生物学的機能のはるかにより強力な阻害因子となる。ＤＮＡの形状および構造は、塩基対の配列、ＤＮＡの長さ、ヌクレオチドの骨格および性質（すなわち、天然に存在しているＤＮＡ対修飾された糖または塩基）による影響を受ける。したがって、分子の形状および／または構造もまた、他のアプローチによって、例えば、全長、完全に相補的な部分の長さ、分子内の二本鎖領域を変化させることによって、コア配列および隣接配列の中での変更によって、骨格構造を変化させることによって、および塩基修飾によって、変化させることもできる。高い結合親和性および／または改善されたインビボでの安定性を有しているＥ２Ｆデコイ分子は、任意のこのようなアプローチによって、またはそれらの任意の組み合わせによって設計し、作成することができる。
【０２１９】
具体的には、結合親和性を変化させることができるコア配列を変化させること（その長さ、配列、塩基修飾、および骨格構造を含む）によって、Ｅ２Ｆデコイ分子の結合親和性、安定性、および特異性を変化させることができる。隣接配列の変化は、純粋な影響力を有しており、分子のインビボでの安定性を有意に増大させることができ、そして、結合親和性および／または特異性に影響を与え得る。
【０２２０】
したがって、その最も広い態様においては、本発明は、Ｅ２Ｆデコイ二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子に関し、これは、形状および／または構造（例えば、湾曲、および標的Ｅ２Ｆ転写因子（単数または複数）に対する結合親和性の増大）を変化することができる柔軟性のある構造を有する。したがって、本発明のＥ２Ｆデコイ分子は、Ｅ２Ｆ−１、Ｅ２Ｆ−２、Ｅ２Ｆ−３、Ｅ２Ｆ−４、Ｅ２Ｆ−５、およびＥ２Ｆ−６の１つ以上に対して高い結合親和性を有することができる。
【０２２１】
さらなる特定の態様においては、本発明は、改善された特性を有しているＥ２Ｆデコイ二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）分子に関する。具体的には、本発明は、新規のＥ２ＦデコイｄｓＯＤＮ分子に関し、これは、Ｅ２Ｆ転写因子（そのヘテロ二量体（Ｅ２Ｆ／ＤＰ）およびホモ二量体（Ｅ２Ｆ／Ｅ２Ｆ）形態）に対して高い結合親和性を有しており、そして／あるいは、インビボで改善された安定性を示す。
【０２２２】
１つの実施形態においては、Ｅ２ＦデコイｄｓＯＤＮ分子には、５’配列および３’配列が隣接しているＥ２Ｆ転写因子に対して特異的に結合することができるコア配列が含まれる。この場合、（ｉ）コア配列は、約５から１２塩基対、好ましくは、６から１０塩基対から構成され；（ｉｉ）この分子には、２つの完全に相補的である鎖から構成される約１２から２８塩基対、好ましくは、１４から２４塩基対の長さの二本鎖領域が含まれ；そして（ｉｉｉ）Ｅ２ＦデコイｄｓＯＤＮは、実施例１に記載されるプロトコールにしたがって、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）由来の核抽出物に対して行われた競合ゲル移動度シフトアッセイによって決定された場合には、図２６（配列９４および９５）の参照デコイ分子の結合親和性の少なくとも約５倍、より好ましくは少なくとも約７倍、なおより好ましくは少なくとも約１０倍、最も好ましくは少なくとも約１５倍である結合親和性で、標的Ｅ２Ｆ転写因子に結合する。好ましくは、改善されたＥ２ＦデコイｄｓＯＤＮ分子の融点（Ｔｍ）もまた、図２６（配列番号９４および９５）の参照デコイ分子のＴｍより有意に高い（４２．３℃）。
【０２２３】
本明細書中のＥ２Ｆデコイ分子の完全に相補的な二本鎖部分の長さは、高い結合親和性および安定性に重要であると考えられる。これらの改善された特性を得るためには、この領域には、少なくとも約１２塩基対が含まれなければならず、そして通常は、その長さは約１２塩基対から約２８塩基対の間である。「完全に相補的である」領域は、第１鎖の中の個々のヌクレオチドが、第２鎖の中の個々のヌクレオチドとワトソンクリック塩基対合を受ける、２つのヌクレオチド鎖から構成される。
【０２２４】
コア配列には、通常は、少なくとも６塩基対が含まれなければならず、そして通常は、標的Ｅ２Ｆ転写因子に対して十分に結合するためには、少なくとも約８塩基対が含まれなければならない。一般的には、コア配列は、約５から１２塩基対、より通常は、約６から１０塩基対から構成される。コア配列は遺伝子のプロモーター領域の中のＥ２Ｆ結合配列に由来する配列であり得るか、またはコア配列に遺伝子のプロモーター領域の中のＥ２Ｆ結合配列に由来する配列が含まれ得、その転写は、Ｅ２Ｆ転写因子によってアップレギュレートされるかまたはダウンレギュレートされる。あるいは、コア配列は自然界においてはＥ２Ｆ結合配列としては生じない合成の配列、例えば、種々の遺伝子のＥ２Ｆ結合配列、または種々のＥ２Ｆ転写因子結合配列において最も頻繁に存在している、個々の部位のヌクレオチドに基づいて設計されたコンセンサス配列であり得る。
【０２２５】
隣接配列は、通常、約５から５０塩基の長さであり、完全に相補的である場合があるが、必ずしもそうではない。したがって、隣接領域（単数または複数）には、いずれかの末端に一本鎖突出が含まれる場合がある。結合親和性および安定性は、隣接領域（単数または複数）自体の長さよりもむしろ、本発明のオリゴヌクレオチドデコイ分子の中の２つの完全に相補的である鎖から構成される本当に二本鎖である領域の長さおよび配列によってより影響を受ける。
【０２２６】
本発明のデコイ分子の中に存在するヌクレオチド配列には、修飾されたヌクレオチドまたは例外的なヌクレオチドが含まれる場合があり、そして、別の骨格化学性質を有している場合もある。合成のヌクレオチドは、種々の方法において修飾され得る。例えば、Ｂｉｅｌｉｎｓｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５）：９９７（１９９０）を参照のこと。したがって、酸素は、窒素、イオウ、または炭素で置換することができ；リンは炭素で置換することができ；デオキシリボースは他の糖で置換することができ；また、個々の塩基は例外的な塩基で置換することができる。それぞれの場合において、任意の変化は、Ｅ２Ｆ転写因子に対するオリゴヌクレオチドデコイの結合能力および親和性に対する修飾の効果、融点およびインビボでの安定性に対する効果、ならびに、任意の有害な生理学的作用として評価される。このような修飾は当該分野で周知であり、そしてアンチセンスオリゴヌクレオチドについて幅広い用途が見出されており、したがって、それらの安全性および結合親和性の保持が十分に確立される（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１５１０−１５１３（１９９３）を参照のこと）。
【０２２７】
修飾されたヌクレオチドの例は以下であるが、これらに限定はされない：４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、β，Ｄ−ガラクトシルエノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン３−メチルシチジン５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、β，Ｄ−マンノシルエオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボナルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステルウリジン−５−オキシ酢酸、ウェイブトキソシン、シュードウリジンエオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）−カルバモイルスレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、３−（３−３−アミノ−３−カルボキシ−プロピル）ウリジン（ａｃｐ３）ｕ、およびウェイブトシン。
【０２２８】
加えて、ヌクレオチドは、例えば、ホスホルアミデート結合によって互いに連結され得る。この連結は天然に存在しているホスホジエステル結合のアナログであり、その結果、結合している酸素（−Ｏ−）は、アミノ基（−ＮＲ−）で置き換えられる。式中、Ｒは、通常は、水素または低級アルキル基（例えば、メチルまたはエチル）である。
【０２２９】
本発明のＥ２Ｆデコイ分子は、市販されている自動合成装置を使用して、標準的なホスホジエステル化学またはホスホルアミデート化学によって合成され得る。
【０２３０】
特定の実施形態においては、本発明のＥ２Ｆデコイ分子には、以下からなる群より選択される鎖およびその相補鎖を含むコア配列が含まれる：
【０２３１】
【化１】
2008513513.tif 000003
【０２３２】
【化２】
2008513513.tif 000004
【０２３３】
【化３】
2008513513.tif 000005
式中、ＳはＧまたはＣである。
【０２３４】
この情報と、固有のＥ２Ｆ結合部位の構造についての他の知識に基づいて、当業者は、本明細中のＥ２Ｆデコイ分子の構造を、例えば、公知の分子モデリング技術、Ｅ２Ｆ−ＤＰ複合体との同時結晶化、および当該分野で公知の他の手段によって、さらに最適化することができる。コア配列に近い隣接領域の実際の配列は、より遠位の領域の配列よりも重要である。したがって、コア配列に隣接している位置にあるか、またはコア配列から数ヌクレオチド以内にあるヌクレオチドの同定には、コアは配列からさらに離れた位置にあるヌクレオチドの同定よりもさらに慎重に制御される必要がある。特定の実施形態においては、隣接配列は、図２６、配列番号９６および９７に示されている配列であり、これは、上記に列挙されたコア配列のいずれかと組み合わせることができる。
【０２３５】
先に議論されたように、Ｅ２ＦおよびＤＰタンパク質はヘテロ二量体を形成して、Ｅ２Ｆの機能的活性を引き起こす。加えて、特定のＥ２Ｆタンパク質のホモ二量体もまた、記載されている。個々のＥ２Ｆ−ＤＰまたはＥ２Ｆ−Ｅ２Ｆ種は、Ｅ２Ｆ部分の実体と、複合体に関係しているタンパク質に応じて、異なる転写応答を誘発する。所望される場合には、Ｅ２Ｆ  ｄｓＯＤＮ分子は、１つ以上のＥ２Ｆ転写因子に対して優先的な結合を示すように設計され得、これは、それによって、インビボで異なる生物学的活性を示すと予想される。したがって、ガン治療に有用なＥ２Ｆデコイ分子は、このアプローチによって決定することができる。
【０２３６】
候補のデコイ分子の結合親和性は、標準的な方法（例えば、ゲルシフト移動度アッセイ）によって決定することができる。ゲルシフト、または電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）アッセイによっては、ＤＮＡに対する転写因子の結合、またはＤＮＡに対する他のＤＮＡ結合タンパク質の結合を検出するための、迅速であり、感度の高い方法が提供される。このアッセイは、タンパク質とＤＮＡの複合体が非変性ポリアクリルアミドゲルの中を、遊離の二本鎖のオリゴヌクレオチドよりもゆっくりと移動するという観察に基づく。ゲルシフトアッセイは、精製されたタンパク質、またはタンパク質の複雑な混合物（例えば、核抽出物）を、転写因子結合部位を含む３２Ｐで末端標識されたＤＮＡ断片とともにインキュベートすることによって行われる。その後、反応産物が、非変性ポリアクリルアミドゲル上で分析される。結合部位に対する転写因子の特異性は、目的のタンパク質についての結合部位、またはスクランブルされたＤＮＡ配列のいずれかを含む過剰量のオリゴヌクレオチドを使用する競合実験によって確立される。複合体に含まれるタンパク質の同定は、タンパク質を認識する抗体を使用し、その後、ＤＮＡ−タンパク質−抗体複合体の移動度が下がること、または放射性同位元素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブに対するこの複合体の結合の崩壊のいずれかを観察することによって、確立される。
【０２３７】
感作療法（ｐｒｉｍｅｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）の標的
本発明のＥ２Ｆデコイ分子は、米国の男性および女性において単独でトップの死因である冠状動脈性心臓病の予防および処置において臨床的な用途が見出されると予想される。これによっては、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｈｅａｒｔ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎによれば、１９９８年に米国で４５０，０００人を上回る死者が出ている。
【０２３８】
加えて、Ｅ２Ｆデコイは、末梢血管疾患の処置における有用性が見出される。これは、末梢動脈のアテローム性の狭窄を特徴とし、そして結果として、血液の循環に悪影響を及ぼす。初期臨床段階では、疾患は下肢の痛みとして現れるが、処置しないままほおっておくと、これは、壊疽、下肢の切断の必要性、ならびに、実質的な不可逆的な罹患率および死亡率を生じ得る。
【０２３９】
Ｅ２Ｆデコイのさらなる臨床的な標的は、移植片のアテローム性動脈硬化症、狭窄、および血管移植片の閉塞の大多数が根底にある病理学的プロセスである、新生内膜過形成である。新生内膜過形成は、一般的には、種々の形態の血管損傷の後に見られ、採取、および高圧動脈循環への外科的移植に対する静脈移植片の応答の主要なコンポーネントである。
【０２４０】
加えて、ガンの発症におけるＥ２Ｆの重要な役割が示唆されている。先に議論されたように、Ｅ２Ｆは、細胞増殖および細胞分裂に必要な遺伝子のグループの発現の誘導を担っている。細胞が増殖阻害シグナルを受け取ると、Ｅ２Ｆは腫瘍サプレッサーである網膜芽細胞腫遺伝子Ｒｂによって不活化される。結果として、Ｅ２Ｆによって調節される増殖制御遺伝子は不活化されたままであり、細胞は静止状態で維持される。Ｒｂの変異したコピーを有している腫瘍細胞においては、Ｅ２ＦはＲｂによってはもはや制御されないと提案されている。結果として、Ｅ２Ｆは、細胞分裂を指示する遺伝子を活性化し、それによって、細胞を永久に増殖状態にする。別の機構を含むさらなる詳細については、例えば、Ｊｏｈｎｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ−Ｂｒｏｕｓｓａｒｄ，Ｆｒｏｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉ  ３：ｄ４４７−８（１９９８）を参照のこと。腫瘍細胞株に導入されるとＥ２Ｆ活性を阻害する小さいペプチドがアポトーシスを引き起こすことが提案されている（Ｂａｎｄａｒａら、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １５：８９６−９０１（１９９７））。根底にある機構とは無関係に、本発明のＥ２Ｆデコイ分子は、乳ガンを含む種々のタイプのガンの処置において期待される。
【０２４１】
ＨＩＦ−１オリゴヌクレオチドデコイ分子
本発明の１つの実施形態においては、本発明者らによって、転写因子ＨＩＦ−１に特異的に結合する転写因子デコイのいくつかのセットが系統的に開発され、最適化された。
【０２４２】
１．ＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ分子の設計
１つの実施形態においては、本発明のＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ分子は、ワトソンクリック塩基対合によって互いに結合している２つのオリゴヌクレオチド鎖から構成される。通常は、２つの鎖の中の全てのヌクレオチドが塩基の対合に関係しているが、これは必要条件ではない。オリゴヌクレオチドデコイ分子（ここでは、１つ以上、例えば、１〜３個、または１〜２個のヌクレオチドは塩基の対合の関係していない）もまた含まれる。加えて、二本鎖のデコイには、３’一本鎖突出および／または５’一本鎖突出が含まれる場合がある。
【０２４３】
別の実施形態においては、本発明のＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ分子には、ワトソンクリック塩基対合によって互いに結合しており、そして３’末端もしくは５’末端のいずれか、または両方でさらに互いに共有結合しており、結果としてドラム型の構造または環状分子を生じる、２つのオリゴヌクレオチド鎖が含まれる。共有結合は、例えば、ホスホジエステル結合、または、例えば、ホスホチオエート、ホスホジチオエート、もしくはホスホアミデート結合のような他の結合基によって提供され得る。
【０２４４】
一般的には、本発明のｄｓＯＤＮ分子には、５’および／または３’配列に隣接しているＨＩＦ−１転写因子に特異的に結合することができるコア配列が含まれる。この場合、コア配列は、約５個から１４個、または約６個から１２個、または約７個から約１０個の塩基対からなり；そして隣接配列は、約２から８、または約２から６、または約２から４塩基対の長さである。これらの分子には、通常、２つの完全に相補的な鎖または一部が相補的である鎖（コア配列と隣接配列を含む）からなる、約１２から２８塩基対の長さ、好ましくは、約１４から２４塩基対の長さの二本鎖領域が含まれる。
【０２４５】
結合親和性を変化させることができるコア配列を変化させること（その長さ、配列、塩基修飾、および骨格構造を含む）によって、ＨＩＦ−１デコイ分子の結合親和性を変化させることができる。加えて、隣接配列の変化は純粋な影響力を有しており、ＨＩＦ−１デコイ分子のインビボでの安定性を有意に増大させることができ、そして、結合親和性および／または特異性に影響を与え得る。具体的には、ＨＩＦ−１デコイ分子の形状／構造は、コア結合配列に隣接している配列を変化させることによって変化させることができ、これによって、安定性および／または結合親和性の改善を生じることができる。ＤＮＡの形状および構造は、塩基対の配列、ＤＮＡの長さ、ヌクレオチドの骨格および性質（すなわち、天然に存在しているＤＮＡ対修飾された糖または塩基）による影響を受ける。したがって、分子の形状および／または構造はまた、他のアプローチによって、例えば、全長、完全に相補的な部分の長さ、分子内の二本鎖領域を変化させることによって、コア配列および隣接配列の中での変更によって、骨格構造を変化させることによって、および塩基修飾によって、変化させることもできる。
【０２４６】
本発明のデコイ分子中に存在するヌクレオチド配列には、修飾されたヌクレオチドまたは例外的なヌクレオチドが含まれ得、別の骨格化学性質を有する場合がある。合成のヌクレオチドは、様々な方法で修飾され得る。例えば、Ｂｉｅｌｉｎｓｋａら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５０：９９７−１０００（１９９０）を参照のこと。したがって、酸素は、窒素、イオウ、または炭素で置換することができ；リンは炭素で置換することができ、デオキシリボースは他の糖で置換することができ、また、個々の塩基は例外的な塩基で置換することができる。したがって、イオウ基とのヌクレオチド間結合の架橋されていない酸素原子の置換（ホスホロチオエート結合を生じる）は、ｄｓＯＤＮ分子のヌクレアーゼ耐性を増大させることにおいて有用である。イオウの修飾の数と、本明細書中のＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ分子の安定性および特異性との間の関係を決定する実験は、以下の実施例に示される。
【０２４７】
それぞれの場合において、任意の変化は、ＨＩＦ−１転写因子に対するオリゴヌクレオチドデコイの結合能力および親和性に対する修飾の効果、融点およびインビボでの安定性に対する効果、ならびに、任意の有害な生理学的作用として評価される。このような修飾は当該分野で周知であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドについての広範囲の用途が見出されており、したがって、それらの安全性および結合親和性の保持が十分に確立されている（例えば、Ｗａｇｎｅｒら、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６０：１５１０−１５１３（１９９３）を参照のこと）。
【０２４８】
修飾されたヌクレオチドの例は以下であるが、これらに限定はされない：４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、２’−Ｏ−メチルシチジン、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ジヒドロウリジン、２’−Ｏ−メチルシュードウリジン、β，Ｄ−ガラクトシルエノシン、２’−Ｏ−メチルグアノシン、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン１−メチルアデノシン、１−メチルシュードウリジン、１−メチルグアノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン３−メチルシチジン５−メチルシチジン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メチルアミノメチル−２−チオウリジン、β，Ｄ−マンノシルエオシン、５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウリジン、５−メトキシカルボナルメチルウリジン、５−メトキシウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル−２−メチルチオプリン−６−イル）カルバモイル）スレオニン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシル）プリン−６−イル）Ｎ−メチルカルバモイル）スレオニン、ウリジン−５−オキシ酢酸−メチルエステルウリジン−５−オキシ酢酸、ウェイブトキソシン、シュードウリジンエオシン、２−チオシチジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、５−メチルウリジン、Ｎ−（（９−β−Ｄ−リボフラノシルプリン−６−イル）−カルバモイルスレオニン、２’−Ｏ−メチル−５−メチルウリジン、２’−Ｏ−メチルウリジン、３−（３−３−アミノ−３−カルボキシ−プロピル）ウリジン（ａｃｐ３）ｕ、およびウェイブトシン。
【０２４９】
加えて、ヌクレオチドは、例えば、ホスホルアミデート結合によって互いに連結され得る。この連結は天然に存在しているホスホジエステル結合のアナログであり、その結果、結合している酸素（−Ｏ−）は、アミノ基（−ＮＲ−）で置き換えられる。式中、Ｒは、通常は、水素または低級アルキル基（例えば、メチルまたはエチル）である。他の結合（例えば、ホスホチオエート、ホスホジチオエートなど）もまた可能である。
【０２５０】
本発明のデコイにはまた、ポリヌクレオチド構造の中に通常存在しているリボースまたはデオキシリボース糖の修飾された形態またはアナログ形態も含まれ得る。このような修飾としては、２’−置換糖（例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、および２’アジド−リボース、カルボン酸糖アナログ、α−アノマー糖、エピマー糖（例えば、アラビノース、キシロース、リキソース、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘパツロース糖）、アクリル酸アナログ、および脱塩基ヌクレオシドアナログ（例えば、メチルリボシド）が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０２５１】
一般的には、本発明のオリゴヌクレオチドデコイは、好ましくは、約５０％を上回る、より好ましくは、約８０％を上回る、最も好ましくは、約９０％を上回る従来のデオキシリボースヌクレオチドから構成される。
【０２５２】
本発明のＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮデコイはさらに、それらの局在化、精製を容易にするために、またはその特定の特性を改善するために修飾することができる。例えば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）が、細胞の核へのそれらの送達を改善するために、デコイ分子に結合させられ得る。
【０２５３】
加えて、本発明のＨＩＦ−１デコイ分子は、例えば、以下の参考文献に記載されて得るように、担体分子（例えば、ペプチド、タンパク質、または他のタイプの分子）と結合させられ得る：Ａｖｒａｍｅａｓら、Ｊ  Ａｕｔｏｉｍｍｕｎ  １６，３８３−３９１（２００１）；Ａｖｒａｍｅａｓら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１０：８７−９３（１９９９）；Ｇａｌｌａｚｚｉら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４，１０８３−１０９５（２００３）；Ｒｉｔｔｅｒ，Ｗ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１，７０８−７１７（２００３）。
【０２５４】
本発明のＨＩＦ−１デコイ分子は、さらに、特異的細胞型への送達、分布、標的化を改善し、そして細胞のバリアを通過する移動を促進する送達媒体を含むように誘導され得る。このような送達媒体としては、細胞浸透促進剤、リポソーム、リポフェクチン、デンドリマー、ＤＮＡ挿入剤、およびナノ粒子が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０２５５】
２．ＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ分子の合成
本発明のＨＩＦ−１  ｓｄＯＤＮデコイ分子は、市販されている自動合成装置を使用して、標準的なホスホジエステル化学またはホスホルアミデート化学によって合成することができる。実施例に記載される特異的ｄｓＯＤＮ分子は、自動ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して合成される。デコイは、カラムクロマトグラフィーによって精製され、凍結乾燥させられ、そして培養培地の中で溶解させられた。それぞれのデコイの濃度は、分光光度によって決定された。
【０２５６】
３．ＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ分子の特性決定
本発明のＨＩＦ−１デコイ分子は、ゲルシフト、または電気泳動移動度シフト（ＥＭＳＡ）アッセイにおいて通常通り試験し、そして特性決定することができる。このアッセイによっては、ＤＮＡに対する転写因子の結合を検出するための迅速であり、感度の高い方法が提供される。アッセイは、タンパク質とＤＮＡの複合体が、遊離の二本鎖のオリゴヌクレオチドよりもゆっくりと、非変性ポリアクリルアミドゲルの中を移動するという観察に基づく。ゲルシフトアッセイは、精製されたタンパク質、またはタンパク質の複雑な混合物（例えば、核抽出物）を、転写因子結合部位を含む３２Ｐで末端標識されたＤＮＡ断片とともにインキュベートすることによって行われる。その後、反応産物が、非変性ポリアクリルアミドゲル上で分析される。結合部位に対する転写因子の特異性は、目的のタンパク質についての結合部位、またはスクランブルされたＤＮＡ配列のいずれかを含む過剰量のオリゴヌクレオチドを使用する競合実験によって確立される。複合体に含まれるタンパク質の同定は、タンパク質を認識する抗体を使用し、その後、ＤＮＡ−タンパク質−抗体複合体の移動度が下がること、または放射性同位元素で標識されたオリゴヌクレオチドプローブに対するこの複合体の結合の崩壊のいずれかを観察することによって、確立される。
【０２５７】
４．ＨＩＦ−１  ｄｓＯＤＮ分子の使用
先に議論されたように、ＨＩＦ−１は、腫瘍の増殖（血管形成および解糖を含む）ならびに転移において重要な役割を担っていることが示されており、そしてガンに対する治療方法についての可能性能のある標的として同定されている（Ｓｅｍｅｎｚａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖ．３：７２１−７３２（２００３）；Ｗｉｌｌｉａｍｓら、Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２１：２８２−９０（２００２）；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６２：６８８−９５（２００２）；Ｗｅｌｓｈら、Ｍｏｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒ．２：２３５−４３（２００３））。ＨＩＦ−１は、乳ガンにおいては過剰発現されていることが示されており、そしてより侵襲性の腫瘍に関係している可能性がある（Ｂｏｓら、Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔ．９３：３０９−３１４（２００１））。加えて、ＨＩＦ−１は、炎症と腫瘍形成の間の重要な関係として最近同定された（Ｊｕｎｇら、Ｔｈｅ  ＦＡＳＥＢ  Ｊｏｕｒｎａｋ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  Ａｒｔｉｃｌｅ  １０．１０９６／ｆｊ．０３−０３２９ｆｊｃ，２００３年９月４日にオンライン上に公開された）。脳ガン、乳ガン、子宮頸ガン、食道ガン、口腔咽頭ガン、および卵巣ガンの生検におけるＨＩＦ−１αの過剰発現は、治療の失敗と死亡に関係している。高いＨＩＦ−１活性によって腫瘍の進行が促進され、そしてＨＩＦ−１の阻害によって、新規のガン治療のアプローチが示され得る。したがって、本発明のデコイ分子によるＨＩＦ−１のブロックによって、ガンの予防および処置において有用性が見出され、これによっては、単独であるか、または他の処置オプションと組み合わせられたかのいずれかの、新規のガンの治療方法が提供される。本発明のｄｓＯＤＮ分子を投与することによるＨＩＦ−１の阻害によってはまた、他のガン治療（例えば、放射線治療および／または化学療法薬での処置）の効力が高められる場合もある。特異的なガンの標的としては、悪性の固形腫瘍、および非ホジキンリンパ腫が挙げられるが、これらに限定はされない。
【０２５８】
加えて、ＨＩＦ−１は、一般的には、疾患の標的として同定されている。この場合には、低酸素症が主要な態様であり、例えば、心疾患および脳卒中である（Ｇｉａｃｃｉａら、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．２：８０３−８２２（２００３））。したがって、本発明のＨＩＦ−１デコイ分子はまた、低酸素症に関係している病理学的疾患および症状（例えば、心臓血管疾患、例えば、心筋虚血、心筋梗塞、うっ血性心不全、心筋症、心臓肥大、および脳卒中）の予防および処置のためにも使用することができる。
【０２５９】
ＨＩＦ−１デコイ分子についてはさらに、眼科（糖尿病性網膜症（これは米国では失明の主原因である）を含む）での有用性が見いだされる。さらなる眼科的標的としては、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、および移植に伴う角膜血管新生が挙げられる。
【０２６０】
ＨＩＦ−１  ｓｄＯＤＮ分子については、病理学的な血管の増殖（例えば、乾癬、角膜血管新生、感染、または外傷に伴うもの）の予防および処置においてさらなる用途が見出される。
【０２６１】
血管形成の増大はまた、滑膜炎、および関節炎の骨モデリングの重要なコンポーネントでもある。炎症性関節炎の動物モデルでの血管形成阻害因子の膳臨床的研究は、新血管形成の阻害が炎症および関節の損傷を軽減させ得るという仮説をサポートしている。したがって、さらなる治療標的としては、関節リウマチ（ＲＡ）のような関節炎および筋骨格疾病を含む炎症性疾患が挙げられる。さらなる詳細については、例えば、Ｗａｌｓｈ  ａｎｄ  Ｈａｙｗｏｏｄ，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇ  Ｄｒｕｇｓ．２（８）：１０５４−６３（２００１）を参照のこと。加えて、腫瘍の増殖と同様に、子宮内膜移植にも、新血管形成を確立、増殖、および侵襲させることが必要である。このプロセスは、本発明のＨＩＦ−１デコイによってブロックすることができる。Ｔａｙｌｏｒら、Ａｎｎ  Ｎ  Ｙ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．９５５：８９−１００（２００２）もまた参照のこと。
【０２６２】
デコイ分子の投与
本発明のデコイ分子を送達する好ましい態様は、上記の、そして以下の実施例に示される処方物の使用を介する。
【０２６３】
リポソーム中で投与されると、内腔でのデコイ濃度は、通常、デコイあたり約０．１μＭから約５０μＭの範囲であり、より通常は、約１μＭから約１０μＭ、最も通常は、約３μＭである。
【０２６４】
適切な濃度および用量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。最適な処置パラメーターは、適応症、デコイ、患者の臨床状態などに応じて様々であり、本明細書中に提供される説明と、当該分野での一般的な知識に基づいて経験的に決定することができる。
【０２６５】
デコイは、個々のデコイまたはデコイの混合物を含む組成物として投与され得る。通常、混合物には、６種類まで、より通常は４種類まで、より通常は、２種類までのデコイ分子が含まれる。
【０２６６】
ガン治療においては、デコイ分子の投与は、化学療法用の抗ガン剤および／または放射線治療での処置を含む他の処置オプションと組み合わせることができる。
【０２６７】
超音波によって媒介されるデコイ分子の送達
本発明の１つの態様においては、超音波の適用は、超音波療法（ｓｏｎｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）と呼ばれる現象である経皮による薬物の送達を促進することが明らかにされている。本発明者らは、皮膚の炎症（アトピー性皮膚炎および乾癬）ならびに関節の炎症（リウマチおよび変形性関節症）に関係しているいくつかの標的の臨床的な適応症における、本発明者らの転写因子デコイ治療の局所送達についてこの方法を評価しようとした。周波数、強度、パルス長、および皮膚からのトランスデューサーの距離を含む超音波処理のパラメーターの適切な選択が、効果的な超音波療法に重要である。文献に報告されているようなこの方法の使用の成功に基づいて、本発明者らは、２種類の超音波療法の方法を評価することを開始する：１）治療用の周波数の超音波療法（１ＭＨｚの周波数、２Ｗ／ｃｍ２の強度）；２）低周波の超音波療法（２０ｋＨｚの周波数、２２５ｍＷ／ｃｍ２までの強度）。治療用周波数の超音波療法（１ＭＨｚ）は、超音波療法について最も一般的に使用される超音波の周波数の範囲であり、多数の低分子量の薬剤について、１０倍またはそれ未満の典型的な促進が増強が明らかにされている。これは、全身的な送達とは対照的に局所にその使用を限定することができる。低周波の超音波療法（２０ｋＨｚ）は、種々の低分子量の薬剤、さらには４８ｋＤＡまでの高分子量のタンパク質の経皮輸送を促進することが示されており、そして、経皮透過性を治療用の超音波よりも１０００倍高く促進し得る。本発明者らは、本発明者らの独自に開発した浸透促進処方物と組み合わせた、およびそれを伴わない、超音波治療の使用によって、薬剤のさらに効率的な送達が可能になり、さらに、種々の標的器官への改善された送達が可能となることを期待する。
【０２６８】
本発明のさらなる詳細は、以下の実施例から明らかであり、これは、本発明を説明し、本発明を限定するようには意図されない。当業者は、日常的に行われている実験を通じて、本明細書中に記載される特定の物質および手順に対する多数の同等のものを認識することができ、これらを突き止めることができる。このような等価物は、本発明の範囲に含まれると考えられる。
【実施例】
【０２６９】
処方物を生産するための種々の方法は当該分野で周知である。したがって、以下に記載されるような成分を含む処方物を調製することは、当業者の能力の範囲内であると考えられる。
【０２７０】
処方組成物は、以下の表に例示される。割合は、特に明記されない限りは、重量である。
【０２７１】
ゲル性処方物は、２つの別々のガラス製の容器に、Ａ部およびＢ部の適切な量を混合することによって調製した。Ａ部とＢ部を完全に溶解させた後、これらを、３枚羽の羽根車を使用した激しい攪拌下で一緒に混合した。エマルジョンとリポソーム性処方物は、２つの別々のガラス容器の中に適切な量のＡ部とＢ部を混合することによって調製した。Ａ部とＢ部を、完全に溶解するまで６５℃に過熱した。両方の部分を、３枚羽の羽根車を使用した激しい攪拌下で一緒に混合した。混合物を攪拌しながら室温まで冷却した。
【０２７２】
（実施例１）
水性のゲル性処方物
以下の成分を含む水性のゲル性処方物を調製した：
処方物Ｆ１
【０２７３】
【化４】
2008513513.tif 000006
以下の成分を含む水性のゲル性処方物を調製した：
処方物Ｆ２
【０２７４】
【化５】
2008513513.tif 000007
以下の成分を含む水性のゲル性処方物を調製した：
処方物Ｆ３
【０２７５】
【化６】
2008513513.tif 000008
以下の成分を含む水性のゲル性処方物を調製した：
処方物Ｆ４
【０２７６】
【化７】
2008513513.tif 000009
以下の成分を含む水性のゲル性処方物を調製した：
処方物Ｆ５
【０２７７】
【化８】
2008513513.tif 000010
以下の成分を含む水性のゲル性処方物を調製した：
処方物Ｆ６
【０２７８】
【化９】
2008513513.tif 000011
以下の成分を含む水性のゲル性処方物を調製した：
処方物Ｆ７
【０２７９】
【化１０】
2008513513.tif 000012
（実施例２）
リポソームを含む処方物の調製
以下の成分を含む、リポソームを含む処方物を調製した：
処方物Ｆ８
【０２８０】
【化１１】
2008513513.tif 000013
以下の成分を含む、リポソームを含む処方物を調製した：
処方物Ｆ９
【０２８１】
【化１２】
2008513513.tif 000014
以下の成分を含む、リポソームを含む処方物を調製した：
処方物Ｆ１０
【０２８２】
【化１３】
2008513513.tif 000015
以下の成分を含む、リポソームを含む処方物を調製した：
処方物Ｆ１１
【０２８３】
【化１４】
2008513513.tif 000016
以下の成分を含む、リポソームを含む処方物を調製した：
処方物Ｆ１２
【０２８４】
【化１５】
2008513513.tif 000017
（実施例３）
乳剤処方物
以下の成分を含む乳剤処方物を調製した：
処方物Ｆ１３
【０２８５】
【化１６】
2008513513.tif 000018
以下の成分を含む乳剤処方物を調製した：
処方物Ｆ１４
【０２８６】
【化１７】
2008513513.tif 000019
以下の成分を含む乳剤処方物を調製した：
処方物Ｆ１５
【０２８７】
【化１８】
2008513513.tif 000020
（実施例４）
ＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物の送達−マウスモデル
本実施例は、ＮＦ−κＢデコイ分子は、本発明の水性のゲル性処方物を使用して投与すると、皮膚に効率よく浸透し、皮膚の炎症を軽減することを示す。
【０２８８】
このアッセイの基本的なプロトコールは、Ｓａｓａｋａｗａら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２６（３）：２３９−２４７（２００１）およびＭａｔｓｕｓｏｋａら、Ａｌｌｅｒｇｙ，５８（２）：１３９−１４５（２００３）に記載されている。
【０２８９】
特異的な病原体を含まない（ＳＰＦ）ＮＣ／Ｎｇａ雌マウス（４〜５週齢）をＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｊａｐａｎ（横浜、日本）から購入した。動物をＳＰＦ条件下で６週齢まで維持した。その後、マウスに、生理食塩水に溶解させた５ｍｇ／２０μｌのヤケヒョウヒダニ（Ｄｅｒｍａｔｏｐｈａｇｏｉｄｅｓ  ｐｔｅｒｏｎｙｓｓｉｎｕｓ）（Ｄｐ）抽出物（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｎｏｉｒ，ＮＣ）を、０、２、４、７、９、および１０日目に彼らの右耳の腹側に皮内注射した。±０．１、０．２５、０．５、または１％のＮＦ−κＢデコイを含む２０μｌの媒体を、全部で１４日間にわたった最後のＤｐ注射の１〜２日後に、Ｄｐで処置した耳の背面に２回／日塗布した。炎症の程度を耳の皮膚の厚みを測定することによって間接的に測定した。皮膚の厚みは、病歴に示されるように、真皮と表皮の炎症細胞の量と非常によく相関していた。耳の厚みをそれぞれのＤｐ注射の２４時間後に、その後は、処置のレジュメの間、１日おきに、改良型のスプリングマイクロメータ（Ｏｄｉｔｅｓｔ，Ｄｙｅｒ，Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＣＡ）を用いて、測定した。
【０２９０】
図１は、０．８％のラウレス硫酸ナトリウム、４９％のエタノール、１．５％のＨＰＭＣ  ４０００  ｃｐｓ、および４８．７％の１００ｍＭリン酸緩衝液を含む水性のゲル性処方物Ｆ１中のＮＦ−κＢデコイ分子の用量漸増を示す。図１は、０．１、０．２５、および０．５％のＮＦ−κＢデコイ分子での処置によって、ダニの抗原によって誘導したアトピー性皮膚炎における耳の腫れが減少することを示している。グラフは、いずれの処置も行わなかった、ＮＦ−κＢデコイ分子を含まない処方物で処置した、およびベタメタゾンで処置したマウスの皮膚と比較した場合の、ＮＦ−κＢデコイ分子での処置の有効性を示す。
【０２９１】
図２は、さらに、０．８％のラウレス硫酸ナトリウム、２０％のエタノール、２．０％のＨＰＭＣ  ４０００  ｃｐｓ、および１０．０％の１００ｍＭリン酸緩衝液を含む水性のゲル性処方物Ｆ６中のＮＦ−κＢデコイ分子の用量漸増を示す。図２は、０．２５および１％のＮＦ−κＢデコイ分子での処置によって、ＮＣ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導した接触皮膚炎における耳の腫れが減少することを示している。グラフは、いずれの処置も行わなかった、ＥＬＩＤＥＬ（登録商標）（Ｎｏｖａｒｔｉｓ  ＡＧ  Ｃｏｒｐ．，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で処置した、１％のスクランブルデコイ分子を含む処方物で処置した、およびベタメタゾンで処置したマウスの皮膚と比較した場合の、ＮＦ−κＢデコイ分子での処置の有効性を示す。
【０２９２】
図３は、種々のエタノール濃度と０．２５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物の有効性を示すグラフである。Ｆ２と指定した処方物は、１０％のエタノールを含み、Ｆ３は５％のエタノールを含み、そしてＦ４は１％のエタノールを含む。Ｆ２コントロールと指定した処方物は、ＮＦ−κＢデコイ分子を含まない。結果を、処置をしなかった試料、およびベタメタゾンで処置した試料と比較した。
【０２９３】
（実施例５）
ＮＦ−κＢデコイ分子の抗炎症効果−マウスモデル
本実施例は、ＮＦ−κＢ分子が、本発明の水性のゲル性処方物を使用して投与した場合には、ＮＣ／ＣｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導した接触皮膚炎におけるプロ炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、およびＴＳＬＰ（胸腺間質性リンパ球新生因子（ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｌｙｍｐｈｏｐｏｉｅｔｉｎ）））の遺伝子発現を効率よく低下させることを示す。
【０２９４】
ダニ抗原によって誘導したアトピー性皮膚炎は、上記に前述したように誘導した（Ｓａｓａｋａｗａら、２００１）。Ｄｐを注射したマウスの右耳を、最後のデコイでの処置の１日後に切り取った。耳の部分を液体窒素の中で一瞬で凍結させ、−８０℃で保存した。全ＲＮＡを、ＱＩＡＺＯＬ（登録商標）溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ  Ａｍｔｓｇｅｒｉｃｈｔ  Ｄuｓｓｅｌｄｏｌｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造業者の説明書にしたがって耳から単離した。マウスの遺伝子の発現を、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実時間定量的ＰＣＲによってアッセイした。全ての手順は以前に記載されたように行った（Ｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９（１）：４４３−４５３（２００２年７月１日）。ＤＮａｓｅで処理した全ＲＮＡを、ランダムヘキサマー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、Ｏｌｉｇｏ  ｄｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と軽く混合し、そして第１鎖ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（登録商標）逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて合成した。それぞれの遺伝子用のプライマーを、プライマー設計ソフトウェアＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して設計した。プライマーは、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）で合成した。定量的ＰＣＲを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコールにしたがって行った。２５ｎｇのＲＮＡと等量の試料ｃＤＮＡを、３８４ウェルＰＣＲプレートの中での個々の反応において試験した。ユビキチンのレベルをそれぞれの試料について測定し、内部標準として使用した。サイトカインレベルは、ユビキチンレベルに対する相対的な発現として表す。
【０２９５】
図４は、０．２５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ２で処置した場合の、ＮＣ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導した接触皮膚炎における相対的なＩＬ−１β遺伝子の発現レベルの低下を示しているグラフである。
【０２９６】
図５は、０．２５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ２で処置した場合の、ＮＣ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導した接触皮膚炎における相対的なＩＬ−６遺伝子の発現レベルの低下を示しているグラフである。
【０２９７】
図６は、０．２５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ２で処置した場合の、ＮＣ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導した接触皮膚炎における相対的なＴＮＦα遺伝子の発現レベルの低下を示しているグラフである。
【０２９８】
図７は、０．２５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物で処置した場合の、ＮＣ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導した接触皮膚炎における相対的なＴＳＬＰ遺伝子の発現レベルの低下を示しているグラフである。
【０２９９】
（実施例６）
ＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物の送達−マウスモデル
本実施例は、さらに、ＮＣ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導した接触皮膚炎におけるＮＦ−κＢデコイ分子の効力を示す。本実験で使用した水性のゲル性処方物Ｆ１は、０．８％のラウレス硫酸ナトリウム、４９％のエタノール、１．５％のＨＰＭＣ  ４０００  ｃｐｓ、および４８．７％の１００ｍＭリン酸緩衝液を含む。
【０３００】
上記のように、このアッセイについての基本的なプロトコールは、Ｓａｓａｋａｗａら、Ｉｎｔ．Ａｒｃｈ．Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２６（３）：２３９−２４７（２００１）およびＭａｔｓｕｏｋａら、Ａｌｌｅｒｇｙ，５８（２）：１３９−１４５（２００３）に記載されている。
【０３０１】
方法
マウスを、０．２５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む処方物、任意のデコイ分子または局所用ベタメタゾンを伴わずに処方物のみのいずれかで、１７日間処置した。Ｄｐを注射したマウスの右耳を、最後のデコイでの処置の１日後に切り取った。耳の部分を、１０％のリン酸緩衝化ホルマリン（ｐＨ７．２）の中に固定し、パラフィンに包埋し、そして３ミクロンの切片に切断した。試料を、組織学についてはヘマトキシリンおよびエオシンで、そして脱顆粒肥満細胞の検出のためにはトルイジンブルーで染色した。
【０３０２】
結果および分析
皮膚の病変の組織学的試験を、処置の１７日目に行った。ヘマトキシリンおよびエオシンでの染色は、Ｄｐを注射した媒体で処置した耳の重症の表皮過形成と真皮への細胞の浸潤を示し、ＮＦ−κＢデコイでの処置によっては、表皮過形成と細胞の浸潤の両方の減少が生じた。Ｄｐを注射し、媒体で処置したマウスの多肥満細胞のほとんどは脱顆粒されたが、ＮＦ−κＢデコイ分子での処置は、脱顆粒肥満細胞の減少を示した。
【０３０３】
図８は、（Ａ）処置しなかった、（Ｂ）ベタメタゾンで処置した、（Ｃ）約４９重量％のエタノールと約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムを含む処方物Ｆ１で処置した、および（Ｄ）ＮＦ−κＢデコイ分子を含む、約４９重量％のエタノールと約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムを含む処方物Ｆ１で処置した、ホルマリンで固定したアトピー性皮膚炎のマウスの皮膚のヘマトキシリンとエオシンでの染色を示す。
【０３０４】
これらのデータは、ＮＦ−κＢデコイの局所塗布によって、耳へのＤｐの注射による炎症の原因が抑制されたことを示している。したがって、ＮＦ−κＢデコイでの処置によって、表皮の過増殖、細胞の浸潤、および肥満細胞の脱顆粒が減少する。
【０３０５】
（実施例７）
ＮＦ−κＢデコイ分子の効果−マウスモデル
本実施例は、ＮＣ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）で誘導した接触皮膚炎における、ベタメタゾンでの処置による有害な副作用と、ＮＦ−κＢデコイ分子による処置によってはそれがないことを示す。
【０３０６】
ダニ抗原で誘導したアトピー性皮膚炎は、以前に記載されているように誘導した（Ｓａｓａｋａｗａら、２００１）。簡単に説明すると、６週例の雄ＮＣ／Ｎｇａマウスに、生理食塩水に溶解させた５ｍｇのＤｐ抽出物（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｌｅｎｏｉｒ，ＮＣ）を、０、２、４、７、９、および１１日目に彼らの右耳の腹側に皮内注射した。１１日目に開始して、Ｄｐを注射した耳を、２０μｌの処方物Ｆ６で１１日間、１日に２回局所処置した。Ｆ６は、０．２５％または０．１％のＮＦ−κＢデコイ、または局所用の０．１％の吉草酸ベタメタゾンを、ポジティブコントロールとして含む。耳の厚みを、耳の厚みを測定するためのゲージ（ｅａｒ  ｔｈｉｃｋｎｅｓｓ  ｇａｕｇｅ）（Ｏｄｉｔｅｓｔ，Ｄｙｅｒ，Ｃｏ．，Ｌａｎｃａｓｔｅｒ，ＣＡ）を用いて、それぞれの皮内注射または処置の後で測定した。
【０３０７】
図９は、ベタメタゾンでの処置野中断によって、隆起および炎症の突然であり、重篤なリバウンドが生じることを示している。しかし、ＮＦ−κＢデコイ分子を用いて観察された治療上の利点は、処置を終了した後１５日間維持された。
【０３０８】
さらに、図１０は、４日以内の処置において皮膚萎縮を誘導するベタメタゾンとは異なり、長期間にわたるＮＦ−κＢデコイの塗布によっては、いずれのこのような副作用も示されなかったことを示す。図１０（Ａ）の処置した耳は、ダニを注射した／炎症を起こした耳である。炎症が原因で、耳の厚みは、ダニで処理した耳においては大きい。対照的に、図１０（Ｂ）の未処置の耳は、正常な反対側の耳である。図１０（Ｂ）は、ベタメタゾンを炎症を起こした耳に塗布した場合に、これが、未処置の耳の菲薄化を引き起こし、そして皮膚萎縮の全身的な副作用を示すことを示している。
【０３０９】
図１１は、さらに、正常な耳に対するベタメタゾンでの処置の副作用を示す。図１１は、いずれの処置も行わなかった、ベタメタゾンで処置した、およびＮＦ−κＢデコイ分子で処置した正常な耳の厚みの測定を示す。ベタメタゾンおよびＮＦ−κＢデコイ分子を１日に２回投与し、測定は処置の１３日目に行った。
【０３１０】
図１０および１１は、局所ステロイド（例えば、ベタメタゾン）が皮膚の菲薄化を引き起こし、一方、ＮＦ−κＢデコイ分子での長期間の処置は、同様の有害な副作用は示さないことを明確に示している。
【０３１１】
さらなる実験のために、コラーゲンをｐｉｃｒｏ−ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄで染色した。ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した組織試料を、ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ  Ｆ３Ｂ色素を使用してコラーゲンを染色するために使用した（Ｐｕｃｈｔｌｅｒら、Ｂｅｉｔｒａｇ  ｆuｒ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｉｅ，１５０：１７４−１８７（１９７３）；Ｊｕｎｑｕｅｉｒａら、Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｊ．，１１：４４７−４５５（１９７９））。真皮においては、この染色によってＩＩＩ型コラーゲンが特異的に検出された（表皮基底膜中のＩＶ型コラーゲンは染色されなかった）。研究室の皮膚切片を、Ａｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ（ｐＨ＝２．５）で染色して、ｐｉｃｒｏ−ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄでの染色の前に軟骨の輪郭を明確にした（Ｋｉｅｒｎａｎ，Ｊ．Ａ．，Ｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ  ＆  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ．第３版，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９９））。
【０３１２】
脱パラフィンおよび再水和の後、切片をＡｌｃｉａｎ  ｂｌｕｅ（ｐＨ＝２．５）で３０分間染色し（ＢｉｏＣａｒｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ．Ｗａｌｎｕｔ  Ｃｒｅｅｋ，ＣＡ）、その後、ＤＩ流水で洗浄した。切片を、ｐｉｃｒｏ−ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ（ピクリン酸の飽和水溶液（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）中の０．１％のｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ  Ｆ３Ｂ（ＣＩ  ３５７８２，Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）で一晩染色し、その後、ＤＩ流水で洗浄し、エタノール中で脱水し、キシレンの中で洗浄し、カバーガラスを載せた。
【０３１３】
スライドを、Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で、２０×ＰｌａｎＡｐｏ対物レンズを使用し、明視野照射を用いて分析した。デジタル画像を、ＮＩＫＯＮ  ＤＸＭ１２００Ｆデジタルカメラ（Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を使用して撮影し、ＡＤＯＢＥ（登録商標）ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（登録商標）（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において整理した。
【０３１４】
結果は図１２に示す。図１２は、正常な（炎症を起こしていない）反対側の耳の真皮の厚みに対するベタメタゾンでの処置の副作用を示す。図１２は、正常な耳を０．２５％のＮＦ−κＢデコイ分子で処置した場合には、本発明の水性のゲル性処方物Ｆ６を使用して投与すると、コラーゲンが失われることはないことを示している。対照的に、図１２は、ベタメタゾンで処置した正常な耳における真皮の厚みの菲薄化を示している。ＮＦ−κＢデコイで処置した耳の真皮の厚みは、１０２±１７μｍであり、ベタメタゾンで処置した耳の真皮の厚みは、６７±１２μｍであった。
【０３１５】
（実施例８）
ＮＦ−κＢデコイ分子のブタの皮膚への送達
本実施例は、ブタモデルにおけるＮＦ−κＢデコイ分子の効率的な送達を示す。ヒトの皮膚に対する構造エレメントおよび経皮吸収の類似性の理由から、ブタの皮膚は、薬剤の送達および浸透を試験するための理想的なモデルである。
【０３１６】
この実験では、水性のゲル性処方物Ｆ２の中の０．５％のビオチニル化ＮＦ−κＢデコイを、肌が白い雌のＹｏｒｋｓｈｉｒｅブタ（７０〜８０ｋｇ）の背中に、３０μｌ／ｃｍ２になるように、２４時間塗布した。皮膚をＰＢＳで十分に洗浄して、残っている処方物を全て除去した。皮膚を包埋用の媒体の中で凍結させた。皮膚の凍結切片を、塗布部位のデコイの局在化について染色した。断面中のビオチニル化ＮＦ−κＢデコイを、Ａｌｅｘａタグ化ストレプトアビジン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を使用して視覚化し、Ｈｏｅｃｈｓｔ染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で核の共局在について対比染色した。蛍光画像を、カラーデジタルカメラ（ＳＰＯＴ  Ｄｉｇｉｔａｌ  Ｃａｍｅｒａ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔ，ＭＩ）を使用して撮影した。図１３は、ＮＦ−κＢデコイでの正常なブタの皮膚の処置によって、角質細胞および間質の十分な核局在化が生じることを示している。
【０３１７】
（実施例９）
ＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性処方物−ブタモデル
本実施例は、ブタの皮膚の炎症モデルを使用したＮＦ−κＢデコイ分子の送達についての本発明の処方物の効率を示す。本実施例においては、ジニトロフルオロベンゼンで炎症を起こさせたブタの皮膚の中への薬剤の浸透を試験した。
【０３１８】
この実験で使用した水性のゲル性処方物Ｆ２には、０．８％のラウレス硫酸ナトリウム、１０％のエタノール、２．０％のＨＰＭＣ  ４０００  ｃｐｓ、および１０％の１００ｍＭのリン酸緩衝液が含まれている。
【０３１９】
ＤＮＦＢで誘導した遅延型過敏症
ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）への暴露に対する過敏症を、肌が白い雌のＹｏｒｋｓｈｉｒｅブタ（７０〜８０ｋｇ）において、１００μｌの、５０％のアセトン／１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／３０％のオリーブオイル混合物中の１０％（ｗ／ｖ）のＤＮＦＢを、個々の耳介の医学的側面および鼠径部に、１日目に塗布することによって誘導した。動物を、４日目に、両方の耳介の腹側に、５８％のアセトン／１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／３０％のオリーブオイル中の２％のＤＮＦＢの１００μｌの混合物に再び暴露した。最後のＤＮＦＢでのチャレンジの前の規定の間隔で、局所用のコントロール処方物、またはＮＦ−κＢデコイ分子を含む同じ処方物を、２５ｍｇ／ｃｍ２の範囲から４ｃｍ２の定義された範囲までで、感作動物の背面皮膚に塗布し、残っている処方物を水を含ませた綿棒で除去するまでの間、維持した。ＤＮＦＢでのチャレンジは、結果に示すように、皮膚の処置した領域およびコントロール領域への６．４μｌ／ｃｍ２の範囲に塗布した、１２日目の、６９％のアセトン／３０％のオリーブオイルの中の１％から２．５％までの範囲のＤＮＦＢの混合物の塗布から構成される。ＤＮＦＢでのチャレンジの塗布後、２４時間で、目的の領域を、紅斑および浮腫について評価し、その後、直径６ｍｍの４箇所のパンチ生検の採取を、目的の領域から回収した。生検標本を組織学的評価のために保存または２等分し、そしてゲルシフト分析またはｍＲＮＡの転写分析での使用のために、ドライアイスの上で凍結させた。
【０３２０】
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）および分析
上記の実験による生検標本中に存在しているＮＦ−κＢデコイ分子を、通常通り試験し、ゲルシフトアッセイまたは電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）において特性決定した。このアッセイによって、ＤＮＡに対する転写因子の結合を検出するための、迅速であり、感度の高い方法が提供される。このアッセイは、タンパク質とＤＮＡの複合体が、遊離の二本鎖のオリゴヌクレオチドよりもゆっくりと、非変性ポリアクリルアミドゲルの中を移動するという観察に基づく。ゲルシフトアッセイは、精製されたタンパク質、またはタンパク質の複雑な混合物（例えば、核抽出物）を、転写因子結合部位を含む３２Ｐで末端標識されたＤＮＡ断片とともにインキュベートすることによって行われる。その後、反応産物が、非変性ポリアクリルアミドゲル上で分析される。結合部位に対する転写因子の特異性は、目的のタンパク質についての結合部位、またはスクランブルされたＤＮＡ配列のいずれかを含む過剰量のオリゴヌクレオチドを使用する競合実験によって確立される。
【０３２１】
上記に由来する６ｍｍの生検試料の半分を、液体窒素下で細かい粉末になるように細かく砕き、その後、ＮＥ−ＰＥＲ（登録商標）Ｎｕｃｌｅａｒ  ａｎｄ  Ｃｙｔｏｐｌａｓｍｉｃ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）を使用して、キットの説明書にしたがって核タンパク質の抽出および単離を行った。５μｇのタンパク質を含む核抽出物の容量を、２０μｌの全量中の、１μｌの１ｍｇ／ｍｌのポリｄＩｄＣ、１μｌのＰ３２標識オリゴヌクレオチドプローブ（３５ｆｍｏｌｅ）、１００ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭのＭｇＣｌ２、６％のグリセロール、２ｍＭのジチオスレイトール、２．５％のウシ血清アルブミン、および０．１％のＮＰ−４０とともに、室温で３０分間インキュベートし、その後、６％の非変性ポリアクリルアミドゲル上で泳動させた。ゲルを８０℃で減圧下で乾燥させ、その後、ホスホリメージャ（ｐｈｏｓｐｈｏｒ−ｉｍａｇｅｒ）プレートに露光させ、その後、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）８６００撮像装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）でスキャンした。
【０３２２】
目的の組織の中のＮＦ−κＢ結合デコイオリゴヌクレオチドの存在を、ゲルの画像上のＮＦ−κＢのｐ６５タンパク質に対する３２Ｐ標識プローブの結合の競合による減少によって決定する。
【０３２３】
図１４は、競合結合ゲルシフトアッセイによる定量結果を示す。これは、水性のゲル性処方物Ｆ２（１０％のエタノールと、０．２５から１％の範囲の種々の濃度のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で処置したブタの皮膚の中のＮＦ−κＢデコイ分子の存在を示す。３２Ｐで標識したオリゴヌクレオチドプローブをこのアッセイでは放射性同位体で標識した。競合因子の添加後に残っているバンドの量をグラフにした。バンドを、ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）８６００  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量化した。ブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を、ゲルの画像上のｐ６５タンパク質に対するＰ３２標識オリゴヌクレオチドプローブの結合の減少によって決定した。
【０３２４】
図１５は、競合結合ゲルシフトアッセイによる定量結果を示す。これは、水性のゲル性処方物Ｆ３（５％のエタノールと０．２５または０．５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で処置したブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を示す。Ｆ３コントロールと指定した処方物には、ＮＦ−κＢデコイ分子は含まれていない。このアッセイでは、Ｐ３２標識オリゴヌクレオチドプローブを放射性同位体で標識した。競合因子の添加後に残っているバンドの量をグラフにした。バンドを、ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）８６００  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量化した。ブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を、ゲルの画像上のｐ６５タンパク質に対するＰ３２標識オリゴヌクレオチドプローブの結合の減少によって決定した。
【０３２５】
図１６は、競合結合ゲルシフトアッセイによる定量結果を示す。これは、リポソームを含む処方物Ｆ９（０．２５から１％の範囲の種々の濃度のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で処置したブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を示す。Ｆ５コントロールと指定した処方物には、ＮＦ−κＢデコイ分子は含まれていない。このアッセイでは、Ｐ３２標識オリゴヌクレオチドプローブを放射性同位体で標識した。競合因子の添加後に残っているバンドの量をグラフにした。バンドを、ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）８６００  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量化した。ブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を、ゲルの画像上のｐ６５タンパク質に対するＰ３２標識オリゴヌクレオチドプローブの結合の減少によって決定した。
【０３２６】
（実施例１０）
ＮＦ−κＢデコイ分子の抗炎症効果−ブタモデル
本実施例は、ＮＦ−κＢデコイ分子が、本発明の水性のゲル性処方物を使用して投与した場合には、ジニトロフルオロベンゼンで炎症を起こさせたブタの皮膚においてプロ炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−６、ＩＬ−１β）の遺伝子発現を効率よく低下させることを示す。
【０３２７】
ジニトロフルオロベンゼン（ＤＮＦＢ）への暴露に対する過敏症を、肌が白い雌のＹｏｒｋｓｈｉｒｅブタ（７０〜８０ｋｇ）において、１００μｌの、５０％のアセトン／１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／３０％のオリーブオイル混合物中の１０％（ｗ／ｖ）のＤＮＦＢを、個々の耳介の医学的側面および鼠径部に、１日目に塗布することによって誘導した。動物を、４日目に、両方の耳介の腹側に、５８％のアセトン／１０％のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）／３０％のオリーブオイル中の２％のＤＮＦＢの１００μｌの混合物に再び暴露した。最後のＤＮＦＢでのチャレンジの前の規定の間隔で、局所用のコントロール処方物、またはＮＦ−κＢデコイ分子を含む同じ処方物を、２５ｍｇ／ｃｍ２の範囲から４ｃｍ２の定義された範囲までで、感作動物の背面皮膚に塗布し、残っている処方物を水を含ませた綿棒で除去するまでの間、維持した。ＤＮＦＢでのチャレンジは、結果に示すように、皮膚の処置した領域およびコントロール領域への６．４μｌ／ｃｍ２の範囲に塗布した、１２日目の、６９％のアセトン／３０％のオリーブオイルの中の１％から２．５％までの範囲のＤＮＦＢの混合物の塗布から構成される。ＤＮＦＢでのチャレンジの塗布後２４時間で、目的の領域を回収した。生検標本を組織学的なヘマトキシリンおよびエオシンでの染色のためにパラフィンに包埋し、そしてゲルシフト分析またはｍＲＮＡの転写分析での使用のために、ドライアイスの上で凍結させた。
【０３２８】
ブタの皮膚のパンチ生検の部分を液体窒素の中で一瞬で凍結させ、−８０℃で保存した。全ＲＮＡを、ＱＩＡＺＯＬ（登録商標）溶解試薬（Ｑｉａｇｅｎ  Ａｍｔｓｇｅｒｉｃｈｔ  Ｄuｓｓｅｌｄｏｌｆ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、製造業者の説明書にしたがって耳から単離した。マウスの遺伝子の発現を、ＢＩ  ＰＲＩＳＭ（登録商標）７９００  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて実時間定量的ＰＣＲによってアッセイした。全ての手順は以前に記載されたように行った（Ｈｕｒｓｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９（１）：４４３−４５３（２００２年７月１日）。ＤＮａｓｅで処理した全ＲＮＡを、ランダムヘキサマー（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、Ｏｌｉｇｏ  ｄｔ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ，Ｇｅｒｍａｎｙ）と軽く混合し、そして第１鎖ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ（登録商標）逆転写酵素（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて合成した。それぞれの遺伝子用のプライマーを、プライマー設計ソフトウェアＰＲＩＭＥＲ  ＥＸＰＲＥＳＳ（登録商標）（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して設計した。プライマーは、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓ（Ｗｏｏｄｌａｎｄｓ，ＴＸ）で合成した。定量的ＰＣＲを、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲ試薬キット（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して、製造業者のプロトコールにしたがって行った。２５ｎｇのＲＮＡと等量の試料ｃＤＮＡを、３８４ウェルＰＣＲプレートの中での個々の反応において試験した。ユビキチンのレベルをそれぞれの試料について測定し、内部標準として使用した。サイトカインレベルは、ユビキチンレベルに対する相対的な発現として表す。
【０３２９】
図１７は、ジニトロフルオロベンゼンで炎症を起こさせたブタの皮膚の中でのＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【０３３０】
図１８は、プラセボで処置した皮膚または未処置の皮膚と比較した、リポソームを含む処方物Ｆ９（０．２５％および０．５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で処置したブタの皮膚の中での相対的なＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベルの低下を示すグラフである。
【０３３１】
図１９は、０．２５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ２で処置したジニトロフルオロベンゼンで炎症を起こさせたブタの皮膚の中での相対的なＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベルの低下を示すグラフである。
【０３３２】
図２０は、水性のゲル性処方物Ｆ１０（０．５％または１％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で処置したジニトロフルオロベンゼンで炎症を起こさせたブタの皮膚の中でのＩＬ−１β  ｍＲＮＡの発現レベルの低下を示すグラフである。
【０３３３】
（実施例１１）
炎症の軽減におけるＮＦ−κＢデコイ分子の役割
この実験の目的は、ＮＣ／Ｎｇａマウスのダニによって誘導した耳の腫れにおける炎症の軽減におけるＮＦ−κデコイの機構を決定することであった。
【０３３４】
ダニ抗原によって誘導したアトピー性皮膚炎を、上記に前述したように誘導した（Ｓａｓａｋａｗａら、２００１）。簡単に説明すると、６週例の雄ＮＣ／Ｎｇａマウスに、生理食塩水に溶解させた５μｇのＤｐ抽出物（Ｇｒｅｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を皮内注射した。注射は、０、２、４、７、９、および１１日目に彼らの右耳の腹側に行った。１１日目に開始して、Ｄｐを注射した耳を、２０μｌの水性のゲル性処方物Ｆ６で２日間、１日に２回局所処置した。水性のゲル性処方物Ｆ６は、１％のＮＦ−κＢデコイ、または０．１％の吉草酸ベタメタゾンを、コントロールとして含んでいる。組織をホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した組織試料を、ｄＵＴＰ−ＦＩＴＣを標識として用いた末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）媒介ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＮＥＬ）アッセイ（Ｇａｖｒｉｅｌｉら、Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１１９：４９３−５０１（１９９２））によって、アポトーシ性の細胞を同定するために使用した。全ての試薬は、「Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ」（Ｒｏｃｈｅ  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，カタログ番号１，６８４，７９５）から提供された。ＴＵＮＮＥＬ反応の後、切片を、４’６−ジアミジノ−２−フェニルインドール、ジヒドロクロライド（ＤＡＰＩ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で対比染色し、ＰＲＯＬＯＮＧ  ＧＯＬＤ（登録商標）アンチフェード試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）で標本にした。
【０３３５】
ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋した組織試料はまた、Ｋｉ６７ウサギモノクローナル抗体（ＮｅｏＭａｒｋｅｒｓ、カタログ番号ＲＭ−９１０６、Ｌａｂ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）を使用する増殖中の細胞の同定にも使用した。抗原回復は、クエン酸緩衝液（ｐＨ＝６．１）（Ｔａｒｇｅｔ  Ｒｅｔｒｉｅｖａｌ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ，カタログ番号Ｓ−１７００、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）中で、ＲＥＴＲＩＥＶＥＲ（登録商標）、専用の圧力釜（ＥＭＳ，Ｈａｔｆｉｅｌｄ，ＰＡ）を使用して行った。抗原回復後、Ｋｉ６７の局在化を、ロボット免疫染色装置（ｒｏｂｏｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｓｔａｉｎｅｒ）（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ  Ａｕｔｏｓｔａｉｎｅｒ，ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）を使用して行った。内因性のペルオキシダーゼ活性は３％のＨ２Ｏ２で阻害した。免疫試薬の非特異的結合は、以下のブロッキング溶液（ＴＢＳ（５０ｍＭのＴｒｉｓ，ｐＨ＝７．６、５００ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ  ２０、全てのＳｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯによる）中の４％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）、１％のカゼイン（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，ＮＪ）、０．５％の硬骨魚の皮膚のゼラチン（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍ．Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ））を使用してブロックした。ブロックの後、切片をＫｉ６７抗体（１μｇ／ｍｌの最終濃度）とともに１時間インキュベートした。洗浄後、切片を抗ウサギＩｇＧ  ＥＮＶＩＳＩＯＮ（登録商標）試薬（１：１稀釈）と共にインキュベートし、ペルオキシダーゼ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で３０分間標識した。ペルオキシダーゼ活性を、ＤＡＢ基質（ＤＡＢ＋試薬、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ）で検出した。切片を十分に洗浄し、カバースライドをかけた（対比染色は行わなかった）。試料を、Ａｘｉｏｓｋｏｐ  ２  ｅｐｉ−蛍光顕微鏡（Ｃａｒｌ  Ｚｅｉｓｓ  ＡＧ，Ｇｏｔｔｉｎｇｅｎ  Ｇｅｒｍａｎｙ）で、２０×ＮｅｏＦｌｕａｒ対物レンズを使用して分析した。デジタル画像を、ＳＰＯＴ  ＲＴ（登録商標）カメラ（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＩ）を使用して撮影し、ＡＤＯＢＥ（登録商標）ＰＨＯＴＯＳＨＯＰ（登録商標）（Ａｄｏｂｅ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）において整理した。
【０３３６】
ＮＦ−κＢ機能のブロックが、アポトーシスの誘導、さらには増殖の阻害の両方に関係しているので、ダニによって誘導した炎症が起こっている耳を、ＴＵＮＮＥＬアッセイ（図２１）およびＫｉ６７染色（図２２）について分析した。図２１は、炎症を起こしている耳へのベタメタゾンおよびＮＦ−κＢデコイの塗布によって媒介される高いアポトーシス（緑色の核）が、皮膚の表皮および真皮の領域の両方で観察されることを示している。対照的に、スクランブルデコイは、この応答を誘発できなかった。増殖の増加は、表皮層および真皮層においてＫｉ６７染色（茶色の核、図２２）によって検出された。ベタメタゾンとＮＦ−κＢデコイの炎症を起こしている耳への塗布によって、炎症を起こしている耳の中での増殖の阻害の指標である有糸分裂指数が劇的に下がる。スクランブルデコイは、未処置の炎症を起こしている耳と比較すると、Ｋｉ６７ポジティブ細胞の変化は全く示さなかった。
【０３３７】
図２１および２２は、局所ＮＦ−κＢデコイでの処置によって、Ｄｐで誘導した炎症において炎症細胞のアポトーシスの増加と、増殖の低下が生じたことを示している。同様の効果が、ベタメタゾンでの処置を用いた場合にも見られた。これらの観察は、マウスのアトピー性皮膚炎様モデルにおけるＮＦ−κＢデコイの強く、そして長時間持続する抗炎症効果を説明している。
【０３３８】
（実施例１２）
ＮＦ−κＢデコイ分子
設計
ＮＦ−κＢ  ｄｓＯＤＮデコイ分子を設計し、ＮＦ−κＢに結合し、そして／またはその結合について競合するそれらの能力について試験した。特定の態様においては、本発明の目的は、ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体よりも、ｐ６５／ｐ５０および／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体に優先的に結合するＮＦ−κＢデコイ分子を設計することである。ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体をブロックしないことの結果として、本発明の選択的デコイ分子は、これらのホモ二量体が、ＮＦ−κＢ調節遺伝子のプロモーターをブロックすることを可能にする。これによって、遺伝子の転写のネガティブな調節のさらなるレベルが提供される。
【０３３９】
オリゴヌクレオチドデコイの設計においては、結晶構造の研究と、既知のＮＦ−κＢ結合部位のコンピューターによる分析から得ることができる情報を利用した。
【０３４０】
上記で議論したように、免疫グロブリン軽鎖遺伝子に結合したｐ５０／ｐ６５ヘテロ二量体の結晶構造の研究に基づいて、これには、５’−ＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣ−３’（配列番号２）のコンセンサス配列が含まれる。ｐ５０が５塩基対のサブサイト５’−ＧＧＧＡＣ−３’（配列番号３）と接触すること、およびｐ６５が４塩基対のサブサイト５’−ＴＴＣＣ−３’（配列番号４）と接触することが示されている。ＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドデコイのシリーズを設計した。これには、ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体に対して低い親和性を有しているが、ｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体にもなお結合するデコイ分子を調製するために、コンセンサス結合部位の５’末端の少ない数のＧが含まれている。これらのオリゴヌクレオチドデコイには、同定および提示を容易にするために、「コア（ｃｏｒｅ）」および「隣接（ｆｌａｎｋ）」文字コードを割り当てた。コアには、文字コード「Ａ」から「Ｌ」を、そして隣接には「Ｔ」から「Ｚ」を割り当てた。デコイを、ＮＦ−κＢ結合について高い親和性を有している放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドと競合するそれらの能力を決定するために、ゲルシフトアッセイにおいて試験した。ＮＦ−κＢ結合ＤＮＡコンセンサス配列を、以下を含む、ＮＦ−κＢ関連ＤＮＡ−タンパク質相互作用についての刊行物から選択した：Ｂｌａｎｋら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：４１５９−４１６７（１９９１）；Ｂｏｕｒｓら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：６８５−６９５（１９９２）；Ｂｏｕｒｓら、Ｕ．Ｃｅｌｌ  ７２：７２９−７３９（１９９３）；Ｄｕｃｋｅｔｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：１３１５−１３２２（１９９３）；Ｆａｎ  Ｃ．−Ｍ．，Ｍａｎｉａｔｉｓ  Ｔ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３５４：３９５−３９８（１９９１）；Ｆｕｊｉｔａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．６：７７５−７８７（１９９２）；Ｆｕｊｉｔａら、Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．７：１３５４−１３６３（１９９３）；Ｇｈｏｓｈら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：３０３−３１０（１９９５）；Ｇｏｈｓｈら、Ｃｅｌｌ  ６２：１０１９−１０２９（１９９０）；Ｇｒｕｍｏｎｔら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１４：８４６０−８４７０（１９９４）；Ｈｅｎｋｅｌら、Ｃｅｌｌ  ６８：１１２１−１１３３（１９９２）；Ｉｋｅｄａら、Ｇｅｎｅ  １３８：１９３−１９６（１９９４）；Ｋｕｎｓｃｈら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１２：４４１２−４４２１（１９９２）；ＬｅＣｌａｉｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：８１４５−８１４９（１９９２）；Ｌｉ  Ｃ．−Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：３００８９−３００９２（１９９４）；Ｍａｔｔｈｅｗｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２１：１７２７−１７３４（１９９３）；Ｍｕｅｌｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ  ３７３：３１１−３１７（１９９５）；Ｎｅｒｉら、Ｃｅｌｌ  ６７：１０７５−１０８７（１９９１）；Ｎｏｌａｎら、Ｃｅｌｌ  ６４：９６１−９６９（１９９１）；Ｐａｙａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：７８２６−７８３０（１９９２）；Ｐｌａｋｓｉｎら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７７：１６５１−１６６２（１９９３）；Ｓｃ���ｍｉｄら、Ｎａｔｕｒｅ  ３５２：７３３−７３６（１９９１）；Ｓｃｈｍｉｔｚ  Ｍ．Ｌ．，Ｂａｅｕｅｒｌｅ  Ｐ．Ａ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：３８０５−３８１７（１９９１）；Ｔｅｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１１：１９５−２０３（１９９２）；Ｔｏｌｅｄａｎｏら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１３：８５２−８６０（１９９３）；Ｕｒｂａｎら、ＥＭＢＯ  Ｊ．１０：１８１７−１８２５（１９９１）。
【０３４１】
この利用することができる情報に基づいて、本発明者らは、最初のスクリーニングのためのデコイのセットを作成した。これらのデコイには、「変異デコイ」、スクランブルデコイ、それらの５’または３’末端の長さが異なるデコイ、ならびに、コア領域および／または隣接配列の中に別の塩基組成を有しているデコイが含まれる。
【０３４２】
ＮＦ−κＢのコア結合部位の近くの塩基組成をより理解するために、コア結合部位を、既知の結合配列とコンピューターによって並べた（正方向の鎖のみ）。このアラインメントに基づいて、わずかに異なるコア結合部位を有しているデコイのいくつかの主要なグループを作成した。
【０３４３】
主要なコアおよび隣接配列を表１に列挙する。
【０３４４】
【化１９】
2008513513.tif 000021
【０３４５】
【化２０】
2008513513.tif 000022
電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）
ＥＭＳＡアッセイを、ＮＦ−κＢ転写因子ついてオリゴヌクレオチドデコイを特性決定するために使用した。放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプローブ（哺乳動物以外、ＨＩＶ由来のＮＦ−κＢプロモーターに基づく、配列１１３／１１４）（これは、ＮＦ−κＢファミリーの関連するメンバーに対して高い親和性を示す）を使用して、ｐ６５／ｐ５０、ｃＲｅｌ／ｐ５０、およびｐ５０／ｐ５０の結合を、活性化させられた単球細胞株由来の核抽出物を使用して試験した。上記のＮＦ−κＢファミリーのメンバーに対する結合について競合する上記の修飾されたオリゴヌクレオチドを使用して、親和性の高い放射性同位体で標識したプローブに対するこれらのオリゴヌクレオチド、およびこれらのオリゴヌクレオチドの互いの結合親和性を比較することができた。このアッセイによってまた、ＮＦ−κＢファミリーの特定のメンバーに選択的に結合するデコイを設計することもできた。漸増濃度の種々のオリゴヌクレオチドを使用することにより、結合部位の中の標的化される残基を欠失または変化させることによって、ｐ６５／ｐ５０およびｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体に対する親和性を維持したまま、ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体に対するデコイ分子の結合を特異的に減少させることができる。
【０３４６】
ＮＦ−κＢゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）を以下のように行った。コンセンサスＮＦ−κＢ結合部位（５’−ＡＧＴＴＧＡＧＧＧＧＡＣＴＴＴＣＣＣＡＧＧＣ３’）（配列番号２６）を含む二本鎖のオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、γ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。ＬＰＳで刺激したＴＨＰ−１細胞（ヒト単球細胞株）から調製した１μｇの核抽出物を、未標識のＮＦ−κＢ二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）またはスクランブルｄｓＯＤＮの競合の存在下で、または競合がない条件下で、３５ｆｍｏｌの放射性同位体で標識したプローブとともにインキュベートした。インキュベーションは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＫＣＬ、５ｍＭのＭｇＣＬ２、２ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、０．１％のＮＰ−４０、０．０２５％のＢＳＡ、および１μｇのＰｏｌｙ−ｄＩｄＣからなる２０μｌの反応容量の中で、室温で３０分間行った。反応物を６％のポリアクリルアミドゲル上に載せ、電気泳動を行い、そして乾燥させた。乾燥させたゲルを画像化し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して定量した。放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプローブに結合した複合体に含まれるＮＦ−κＢタンパク質の同定を、放射性同位体で標識したプローブの添加の前に、ＮＦ−κＢファミリーの個々のメンバーに特異的な個々の抗体と共に反応物を５分間プレインキュベートすることによって同定した。
【０３４７】
ヌクレアーゼによる分解および化学修飾
天然に存在しているＤＮＡは、主に３’エキソヌクレアーゼの作用によるが、エンドヌクレアーゼの攻撃の結果でもある、細胞の内部での迅速な分解に供される。したがって、オリゴヌクレオチドデコイは、これらがそれらの安定性を高めるように修飾されるように、設計される。イオウ基とのヌクレオチド間結合の架橋されていない酸素原子の１つの置き換え（ホスホロチオエート（ＰＳ）オリゴデオキシヌクレオチドと呼ばれるものを生じる）は非常にうまく行われている。分子はヌクレアーゼに対して比較的耐性がある；しかし、これらは、３’末端修飾されたオリゴヌクレオチドデコイ、および未修飾のオリゴヌクレオチドデコイと比較すると、非特異的なタンパク質結合を示すことが明らかにされている（Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（４３）：２６８０１−５（１９９４））。したがって、本発明者らは、得られた特異性を維持したまま、本発明者らのオリゴヌクレオチドデコイに対してヌクレアーゼ耐性を提供するためには、３’、５’、または内部部位にいくつのイオウが必要であるかを決定するために、一連の実験を行った。
【０３４８】
ＥＭＳＡ結果の分析
上記で議論したように、本明細書中に開示される研究の１つの目的は、ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体と比較して、ＮＦ−κＢ  ｐ６５／ｐ５０および／またはｃＲｅｌ／ｐ５０ヘテロ二量体に優先的に結合するＮＦ−κＢオリゴヌクレオチドデコイ分子を開発することである。実験結果は、ｐ６５／ｐ５０およびｃＲｅｌ／ｐ５０に対する結合は一般的には同程度であることを示しており、したがって、ｐ６５／ｐ５０のバンドだけを本発明者らの分析において定量した。
【０３４９】
図２３は、特定のＮＦ−κＢデコイ分子のｐ６５／ｐ５０結合を示す。図２４は、特定のＮＦ−κＢデコイ分子のｐ５０／ｐ５０結合を示す。
【０３５０】
優先的な結合を、以下のように計算した、特異性／親和性計数を使用して定量した：
特異性／親和性係数＝（Ｓｐ５０／ｐ５０−Ｓｐ６５／ｐ５０）×Ｓｐ５０／ｐ５０／Ｓｐ６５／ｐ５０
式中、Ｓｐ５０／ｐ５０は、ＨＩＶに由来する哺乳動物以外のＮＦ−κＢプロモーター（配列１１３／１１４）に対するｐ５０／ｐ５０の結合の５０％を競合するために必要なデコイのモル過剰量に等しく、そしてＳｐ６５／ｐ５０は、ＨＩＶに由来する哺乳動物以外のＮＦ−κＢプロモーター（配列１１３／１１４、ここでは、配列１１３に対応する逆鎖を「１１４」と指定する）に対するｐ６５／ｐ５０の結合の５０％を競合するために必要なデコイのモル過剰量に等しい。スコア（Ｓ）は、デコイが試験した任意のモル比で結合の少なくとも５０％を競合することができない場合に、１００が割り当てられる。
【０３５１】
好ましいデコイ分子は、ｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体について低いスコアを有し、そしてｐ５０／ｐ５０ホモ二量体については高いスコアを有する。ｐ５０／ｐ５０ホモ二量体に対するデコイの特異性に対する、ｐ６５／ｐ５０ヘテロ二量体に対するデコイの特異性は、それらのスコアの差に比例する（スコアｐ５０／ｐ５０−スコアｐ６５／ｐ５０）。上記で行ったＥＭＳＡ競合結合実験の結果を表２にまとめる。ここでは、デコイ分子を、最も特異的なデコイ（最も高い特異性／親和性係数）から開始して順に列挙する。
【０３５２】
【化２１】
2008513513.tif 000023
【０３５３】
【化２２】
2008513513.tif 000024
【０３５４】
【化２３】
2008513513.tif 000025
【０３５５】
【化２４】
2008513513.tif 000026
Ｅ−Ｚ−４は、２つの５’および３’塩基が欠失しているＥ−Ｚである。
【０３５６】
Ｅ−Ｚ  ｅｖｅｎは、２つの５’塩基が欠失しているＥ−Ｚである。
【０３５７】
Ｅ−Ｚ  ａ→Ｃ  ＥＶＥＮは、６位のＡがＣに変化しているＥ−Ｚである。
【０３５８】
Ａ−Ｚ−２は、５’および３’塩基が欠失しているＡ−Ｚである。
【０３５９】
Ｅ−Ａは、５’および３’末端にＡが付加されているＥコアである。
【０３６０】
Ｅ−ＡＧ  Ｆｌａｎｋは、５’隣接としてＡＡＧＡを、そして３’隣接としてＡＧＡＧを有しているＥコアである。
【０３６１】
Ｅ−ＡＴ  Ｆｌａｎｋは、５’隣接としてＡＴＡＴを、そして３’隣接としてＴＴＡＡを有しているＥコアである。
【０３６２】
Ｅ−ＣＡ  Ｆｌａｎｋは、５’隣接としてＣＡＡＣを、そして３’隣接としてＡＣＡＣを有しているＥコアである。
【０３６３】
Ｅ−ＣＡＧＴ  Ｆｌａｎｋは、５’隣接としてＣＡＧＴを、そして３’隣接としてＡＣＴＧを有しているＥコアである。
【０３６４】
Ｈ−Ｚ’（−３’２ＢＰ）は、２つの５’塩基が欠失しているＨ−Ｚである。
【０３６５】
Ｈ−Ｚ’（−３’１ＢＰ）は、２つの５’塩基が欠失しており、３’末端にＴが付加されているＨ−Ｚである。
【０３６６】
Ｅ−Ｚ−３は、５’末端からＡＧＴが欠失しており、３’末端からＣが欠失しているＥ−Ｚである。
【０３６７】
Ｅ−Ｚ−６は、５’末端からＡＧＴＴが欠失しており、３’末端からＧＣが欠失しているＥ−Ｚである。
【０３６８】
表２に示すデータは、より高いｐ６５／ｐ５０特異性を有しているデコイが、「Ｅ」または「Ｄ」または「Ｈ」コア配列と、「Ｚ」または「Ｗ」または「Ｖ」または「Ｕ」隣接配列を共有している可能性が最も高いことを示唆している。より好ましいグループにおいては、コア配列は「Ｅ」または「Ｄ」であり、そして隣接配列は「Ｚ」である。１５３／１５４と指定されたデコイを、他のパラメーターの検討によって、上段の数個の候補から最良として選択した（下記を参照のこと）。
【０３６９】
ＤＮＡ骨格の化学修飾の分析
同様の分析を、試験したデコイについてＤＮＡ骨格の化学修飾を評価するために適用した。
【０３７０】
【化２５】
2008513513.tif 000027
先の表３には、骨格化学性質について２つの表示記号が存在し、最初の１つは、鎖１５３の化学性質を示し、第２のものは鎖１５４の化学性質を示す。全てがホスホジエステル結合であるものを「ＰＯ」で示し、全てがホスホロチオエート骨格であるものを「ＰＳ」で示す。ハイブリッド骨格は「Ｈ」で示し、その後に、３’末端から開始したホスホロチオエート骨格結合の数が続く。したがって、Ｈ３は、３つの最も３’側にある結合がホスホロチオエートであり、骨格結合の残りはホスホジエステルであることを意味する。１つの指定だけが示される（例えば、ＰＯのみ）場合は両方の鎖が同じ骨格化学性質を有する。
【０３７１】
表３に示したデータは、いずれかの鎖が全てホスホロチオエートである（例えば、ＰＳ／ＰＯまたはＰＯ．ＰＳ）場合には、デコイは、ｐ６５／ｐ５０およびｐ５０／ｐ５０の両方に対して高い親和性を有し、したがって、所望される特異性を欠くことを示している。一般的に、必ずしもそうではないが、ホスホロチオエート結合の数が多ければ多いほど、低い特異性が生じる。通常、８個を超えるホスホロチオエート結合を有しているハイブリッド鎖には特異性はないが、７個未満のものは、許容される親和性および特異性を保持している。しかし、Ｈ４／Ｈ４は極めて親和性が低く、一方、Ｈ３／Ｈ３とＨ５／Ｈ５は、いずれも許容される範囲にある。Ｈ１１／ＰＯとＰＯ／Ｈ１１は良好な親和性と特異性を有する。半減期、特異性、および親和性に基づいて、Ｈ３／Ｈ３、Ｈ５／Ｈ５、Ｈ６／Ｈ６、およびＨ７／Ｈ７を、１５３／１５４デコイについて最適な骨格と同定した。他のデコイについての最適な骨格化学性質も同様に試験し、決定することができる。
【０３７２】
他の転写因子と比較した特異性
デコイ分子は、標的転写因子だけを特異的にブロックしなければならず、そして無関係な転写因子に対しては非特異的に結合し、これをブロックしてはならない。ＥＭＳＡを使用して、無関係なプロモーターに対してはいずれの非特異的効果も示さないＮＦ−κＢデコイ分子を設計することが可能であることもまた確立されている。具体的には、ユビキチン様転写因子Ｏｃｔ−１のプロモーター配列に対応する放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより、１５３／１５４（ここでは、「１５４」は、配列「１５３」に対応する逆配列を示す）ＰＯおよびＨ３  ＮＦ−κＢデコイが、このプロモーターに対して全く結合親和性を示さないことが明らかになった（図２５）。これは、細胞中の他の重要なタンパク質に対するオリゴヌクレオチドの何らかの非特異的効果によって、処置個体に対してデコイの望ましくない毒性が生じるとの理由から、重要である。
【０３７３】
半減期
天然に存在しているＤＮＡは、主に３’エキソヌクレアーゼの作用によるが、エンドヌクレアーゼの攻撃の結果でもある、細胞の内部での迅速な分解に供される。したがって、オリゴヌクレオチドデコイは、これらがそれらの安定性を高めるように修飾されるように、設計される。イオウ基とのヌクレオチド間結合の架橋されていない酸素原子の１つの置き換え（ホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドと呼ばれるものを生じる）は非常にうまく行われている。分子はヌクレアーゼに対して比較的耐性がある；しかし、これらは、３’末端修飾されたオリゴヌクレオチドデコイ、および未修飾のオリゴヌクレオチドデコイと比較すると、非特異的なタンパク質結合を示すことが明らかにされている（Ｂｒｏｗｎら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：２６８０１−５（１９９４））。したがって、特異性を維持したまま、本明細書中のオリゴヌクレオチドデコイに対してヌクレアーゼ耐性を提供するためには、３’もしくは５’、または内部部位にいくつのイオウが必要であるかを決定するために、一連の実験を行った。
【０３７４】
結合特異性を、上記のゲルシフトアッセイによって評価した。３’−エキソヌクレアーゼ耐性を、標準的なヘビ毒アッセイ（Ｃｕｍｍｉｎｓら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２３：２０１９−２４（１９９５））を使用して評価した。より関連のある哺乳動物のヌクレアーゼ活性に対するデコイの耐性を評価するために、細胞質と核抽出物を活性化されたマクロファージから調製するアッセイを採用した。（Ｈｏｋｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９（２０）：５７４３−８（１９９１））。抽出物の活性を、それぞれのアッセイにおいてポジティブコントロールを用いて確認した。イオウ基の数が少ないデコイのそれぞれの鎖の３’末端のキャップが、ヌクレアーゼによる分解からそれを保護するに十分であることを決定した。
【０３７５】
まとめると、これらのデータは、ｐ５０／ｐ６５−感受性ＮＦ−κＢデコイについては、１９マーのオリゴヌクレオチド二本鎖の３’末端にある３〜５個のイオウが、ヌクレアーゼによる分解からデコイを保護するに十分であることを示している。加えて、転写因子ファミリーの中で特異的サブユニット結合を維持すること、さらには、無関係な転写因子に結合しないことも可能であった。これらのデータは、本発明によって、転写因子（具体的には、ＮＦ−κＢ）を標的化する、特異的であり、長時間持続するオリゴヌクレオチドデコイを設計するための方法および手段が提供されることを示している。
【０３７６】
核局在化シグナルを含むＮＦ−κＢデコイ分子
核へのオリゴヌクレオチドデコイの侵入を改善するペプチドを含む核局在化シグナル（ＮＬＳ）の能力を決定するために、シミアンウイルス４０巨大腫瘍抗原に基づくＮＬＳ配列（ＰＫＫＫＲＫＶＥＤＰＹＣ）（配列番号７８）を含むペプチドを、Ｓｉｇｍａ  Ｇｅｎｏｓｙｓによって合成し、以下のようにＮＦ−κＢ  １５３  Ｈ３オリゴヌクレオチドに結合させた。簡単に説明すると、６．５ｎｍｏｌのオリゴヌクレオチドを、最初に、４０倍のモル過剰量のリンカーＳｕｌｆｏ−ＳＭＣＣ（Ｐｉｅｒｃｅ）と共に室温で２時間インキュベートした。ＮＡＰ−１０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって反応物から過剰のリンカーを除去した後、活性化されたオリゴヌクレオチドを５倍のモル過剰量のＮＬＳペプチドと共に室温で一晩インキュベートした。ＮＬＳペプチドにうまく結合したオリゴヌクレオチドの割合を評価するために、反応物を、２０％のＰＡＧＥゲル（非変性）上に１μｌロードすることによって分析した。ゲルを、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）上で視覚化した。ＮＬＳ−ペプチドが結合した一本鎖１５３  Ｈ３の濃度を、ＯＤ吸光度によって決定した。その後、結合体を、その５’末端にビオチン分子を含むその相補鎖１５４  Ｈ３（等モル量）にアニーリングさせた。この二本鎖ＮＬＳデコイ上のビオチン分子の存在は、顕微鏡の使用によって局在化を視覚化する（ストレプトアビジンによる）ことができた。
【０３７７】
（実施例１３）
Ｅ２Ｆデコイ分子
１．オリゴヌクレオチドデコイの合成
図２６に示した二本鎖オリゴヌクレオチドデコイ分子を、自動ＤＮＡ合成装置（Ｍｏｄｅｌ  ３８０Ｂ；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を使用して合成した。デコイをカラムクロマトグラフィーによって精製し、凍結乾燥させ、そして培養培地に溶解させた。個々のデコイの濃度を分光高度によって決定した。
【０３７８】
配列番号９４および９５によって示される二本鎖のオリゴヌクレオチド分子（「参照デコイ分子」）は現在臨床開発の段階にある既知のデコイである。配列番号９６および９７によって示される二本鎖のオリゴヌクレオチドデコイ（「新規のデコイ分子」）は、有意に改善された特性を有している変異体であり、一方、配列番号９９および１００によって示される「スクランブルデコイ」は、ネガティブコントロールとして使用した。
【０３７９】
新規のデコイ分子のＴｍは５５℃であり、参照分子の４２．３℃のＴｍよりも有意に高い。結果として、新規のデコイ分子は、参照デコイよりもインビボではるかに安定であると予想される。
【０３８０】
２．競合ゲル移動度シフトアッセイ
参照デコイと競合する新規のデコイ分子の能力、およびＥ２Ｆコンセンサス結合部位を含む標識したプローブに対するＥ２Ｆの結合について競合するネガティブコントロール（スクランブルデコイ）の能力の差を、ＬＰＳで刺激したＴＨＰ−１細胞中でインビトロで、原則として、Ｍｏｒｉｓｈｉｔａら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９２：５８５５−５８５９（１９９５）に記載されているプロトコールにしたがって試験した。核抽出物を、Ｈｏｒｉｕｃｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１６２４７−１６２５４（１９９１）に記載されているように、血管平滑筋細胞（ＶＳＭＣ）から調製した。ゲルシフト移動度アッセイは以下のように行った：
Ｅ２Ｆ結合部位（５’ＣＴＡＧＡＴＴＴＣＣＣＧＣＧＧＡＴＣ３’）（配列番号３）を含む二本鎖のオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、γ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。ＬＰＳで刺激したＴＨＰ−１細胞から調製した５μｇの核抽出物を、新規のデコイ分子、参照デコイ、またはネガティブコントロール（スクランブルデコイ）の競合の存在下で、または競合がない条件下で、５０ｆｍｏｌの放射性同位体で標識したプローブとともにインキュベートした。インキュベーションは、１０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７．４）、４０ｍＭのＫＣＬ、１ｍＭのＤＴＴ、０．１ｍＭのＥＤＴＡ、８％のグリセロール、０．０５％のＮＰ−４０、および０．５μｇのＰｏｌｙ−ｄＩｄＣからなる２０μｌの反応容量の中で、室温で３０分間行った。反応物を６％のポリアクリルアミドゲル上に載せ、電気泳動を行い、そして乾燥させた。乾燥させたゲルを画像化し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して定量した。放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプローブに結合した複合体に含まれるＥ２Ｆタンパク質の同定を、放射性同位体で標識したプローブの添加の前に、Ｅ２Ｆファミリーの個々のメンバーに特異的な個々の抗体と共に反応物を５分間プレインキュベートすることによって同定した。Ｅ２Ｆ１（ｓｃ−１９３ｘ、ｓｃ−２５１ｘ）、Ｅ２Ｆ２（ｓｃ−６３３ｘ）、Ｅ２Ｆ３（ｓｃ−８７８ｘ、ｓｃ−８７９ｘ）、Ｅ２Ｆ４（ｓｃ−８６６ｘ）、Ｅ２Ｆ５（ｓｃ−９９９ｘ）、ｐ１０７（ｓｃ−３１８ｘ）、およびサイクリンＡ（ｓｃ−２３９ｘ）に対する抗体は、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙから購入した。
【０３８１】
図２７に示すように、新規のデコイ分子は、平滑筋細胞抽出物中のＥ２Ｆと、標識したプローブの結合について、１０倍のモル過剰量では６０％以上（参照デコイによる７％のブロックと比較）、そして４０倍のモル過剰量では９０％（参照デコイによってはわずか４０％と比較）競合することができた。したがって、新規のデコイ分子は当該分野の参照デコイ分子よりも正味の競合因子の大きさに近い。
【０３８２】
（実施例１４）
ＨＩＦ−１デコイ分子
設計
ＨＩＦ−１結合ＤＮＡコンセンサス配列を、ＨＩＦ−１関連ＤＮＡ−タンパク質相互作用についての刊行物から選択し、ＢｉｏＢａｓｅ  ＴＲＡＮＳＦＡＣ（バージョン７．２）データベースにまとめられている配列のセットから選択した。それらの対応する調節領域の局在化を確認し、最も最新のゲノムデータベース（表４参照）（ヒトについては、２００３年７月バージョン；マウスについては、２００３年２月バージョン；ラットについては、２００３年６月バージョン）から回復した隣接ゲノムＤＮＡ配列を伸張させた。
【０３８３】
【化２６】
2008513513.tif 000028
【０３８４】
【化２７】
2008513513.tif 000029
コアコンセンサス結合部位のマトリックスの構築
ＨＩＦ−１のコア結合部位付近の塩基組成を定義するために、上記で入手できたＨＩＦ−１コア結合配列に基づくコア結合部位をコンピューターでアラインメントした。アラインメントに基づいて、表または「マトリックス」を作成した。これは、コア領域と直接隣接している領域の両方についての塩基組成をコンピューターによって記載する（図２８を参照のこと）。図２８は、所定の塩基が所定の位置に見られる可能性を統計的に示唆している。
【０３８５】
ＨＩＦ−１結合モチーフの結晶構造の分析
ＨＩＦ−１は、塩基性ヘリックス−ループ−ヘリックス（ｂＨＬＨ）ＤＮＡ結合タンパク質のファミリーに入る。（ＨＩＦ−１ａサブユニットについて全部で８２６個のうちの）３０位から７０位までの位置にあるアミノ酸は、ＤＮＡ認識および結合親和性に関与している。ＨＩＦ−１についてはＤＮＡ結合モチーフの結晶構造はないが、類似するＤＮＡ結合モチーフを共有している他のｂＨＬＨメンバーについて利用することができる構造の情報によって、構造についての有用な構造の情報が提供される（Ｍｉｃｈｅｌら、Ｔｈｅｏｒ  Ｃｈｅｍ  Ａｃｃ．１０１：５１−５６（１９９９）；Ｍｉｃｈｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ＆  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  １８：１６９−１７９（２０００）；Ｍｉｃｈｅｌら、Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５７８：７３−８３（２００２））。これらの研究は、ＨＩＦ−１の結合モチーフの中に存在しているいくつかの残基の重要性を示唆している。中心コアＡＣＧＴＧ（配列番号１６５）は、ＨＩＦ−１複合体（ＨＩＦ−１αおよびＡＲＮＴ）の結合に不可欠であり、コアのすぐ５’上流側の塩基組成もまた、ＨＩＦ−１結合の特異性および親和性に非常に重要である。ＤＮＡフットプリント実験もまた、５’側の上流領域がＨＩＦ−１によって誘導される遺伝子発現に重要であり得ることを示唆していた。したがって、種々の配列および長さの５’隣接を有している候補のデコイを設計し、試験した。
【０３８６】
最初のＨＩＦ−１ａデコイの配列
公開されたＨＩＦ−１結合実験による、利用することができるＨＩＦ−１コア結合配列による、コンピューターによるコア結合マトリックスによる、ｂＨＬＨファミリーについての結晶構造のモデルによる、および特異的な生物情報学のアプローチによる知見に基づいて（他の転写因子に結合する可能性があるデコイを除く）、最初のスクリーニングのためのデコイのセットを作成した（表５を参照のこと）。これらのデコイには、「変異デコイ」、「スクランブルデコイ」、それらの５’または３’末端の長さが異なるデコイ、ならびに、コア領域に、またはそれに隣接して別の塩基組成を有しているデコイが含まれる。
【０３８７】
【化２８】
2008513513.tif 000030
【０３８８】
【化２９】
2008513513.tif 000031
【０３８９】
【化３０】
2008513513.tif 000032
【０３９０】
【化３１】
2008513513.tif 000033
【０３９１】
【化３２】
2008513513.tif 000034
上記の表５に互いに隣に並べて列挙した配列（例えば、８０１／８０２：８０３／８０４など）は相補的であり、１つの二本鎖オリゴヌクレオチドデコイの二本鎖を形成する。例えば、ＨＩＦデコイ分子である、ＨＩＦ−１デコイ８９５：８９６Ｈ３は、上鎖−ＣＡＣ  ＣＡＧ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＴＧＣ  ＣＴＣ  ＊Ａ＊Ｇ＊Ｇ（配列番号３４０）と相補鎖−ＣＣＴ  ＧＡＧ  ＧＣＡ  ＣＧＴ  ＡＣＧ  ＣＴＧ  ＊Ｇ＊Ｔ＊Ｇ（配列番号３４１）を有する。
【０３９２】
ＴｒａｎｓＡＭキットを使用する最初のスクリーニング
ＨＩＦ−１αを含む複合体に対するオリゴヌクレオチドの相対的な親和性を評価するために、ＨＩＦ−１  ＴｒａｎｓＡＭキット（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ，カタログ番号４７０９６）を利用した。アッセイは、製造業者の説明書にしたがって行った。簡単に説明すると、低酸素症応答エレメント（ＨＲＥ）を含む二本鎖のオリゴヌクレオチドを、９６ウェルプレート上に固定した。ＨＩＦ−１α複合体を含む核抽出物をインキュベートし、固定したオリゴヌクレオチドに結合させた。結合していない物質を洗い流し、結合したＨＩＦ−１αを、ＨＩＦ−１αを特異的に認識する抗体を使用して検出した。抗ＨＩＦ−１α抗体を、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）で標識した二次抗体によって検出し、個々のウェルの中のＨＲＰの量を比色物質の反応を使用して測定し、そしてマイクロプレート分光光度計を使用して読みとった。
【０３９３】
プレート上に固定したＨＲＥエレメントに対するＨＩＦ−１αの結合について競合する候補のデコイ分子の能力を測定し、相対的な結合親和性を明らかにするために比較した。候補のデコイを、漸増モル比（プレート上に固定したオリゴの量に対して）で添加して、ＨＩＦ−１αを含む複合体に対する結合を競合させた。アッセイに加えたデコイの量には、０．６２５、１．２５、２．５、５、１０、および２０ピコモルが含まれる。高い親和性でＨＩＦ−１αに結合することができる競合デコイを含むウェルは、ＨＩＦ−１αに対して低い親和性を有しているデコイと比較して、低い吸光度の読み取り値を生じた。次いで、全ての可能性のあるデコイを、それらの相対的な結合親和性を評価するために比較し、ランク付けした。
【０３９４】
ＴｒａｎｓＡＭの結果の分析
スクリーニングを、種々のデコイ濃度を使用して行った。個々のＵＶ吸光度の読み取り値について、正規化を、試料の吸光度読み取り値対野生型コントロールの吸光度読み取り値の比を計算することによって行った。結果を表６にまとめた。より大きな比は、野生型コントロールと比較してＨＩＦ−１αと結合の競合が少ないことを示す。より小さい（１．０未満からほぼ１．０）比は、より良好な結合または良好な競合を示す。
【０３９５】
【化３３】
2008513513.tif 000035
【０３９６】
【化３４】
2008513513.tif 000036
（１）５’周辺の配列の比較は、ＧＣＡＧまたはＧＧＡＧまたはＧＣＡＴまたはＣＣＣＴまたはＣＣＧＴの塩基組成によってはほとんど競合が生じ得ないことを示唆している（野生型デコイと比較した大きな比）。
【０３９７】
（２）本発明者らが比を分類した場合には、より大きな競合（例えば、より小さい比）を有するこれらのデコイは、ほとんどの場合に、「−４」および「−１」位に、それぞれ、塩基「Ｇ」と塩基「Ｔ」を共有している（図２９）。コアの直前の４塩基（ＡＣＧＴＧ；配列番号３３６）は、より優れている競合デコイについては、むしろ「ＧＣＧＴ」（配列番号３３７）に近い（図２９）。図２９はまた、「−４」位の「Ｇ」と「−１」位の「Ｇ」の組み合わせは結合親和性には好ましくないことを示唆しており、それぞれ、「−３」位の「Ａ」と「−２」位の「Ａ」の組み合わせと同じである。
【０３９８】
ＥＭＳＡによる確認
ＨＩＦ−１ゲルシフトアッセイ（ＥＭＳＡ）は以下のように行った。コンセンサスＨＩＦ−１結合部位を含む二本鎖のオリゴヌクレオチドを、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、γ３２Ｐ−ＡＴＰで末端標識した。ＬＰＳで刺激したＴＨＰ−１細胞（ヒト単球細胞株）から調製した１μｇの核抽出物を、未標識のＨＩＦ−１二本鎖オリゴヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）またはスクランブルｄｓＯＤＮの競合の存在下で、または競合がない条件下で、３５ｆｍｏｌの放射性同位体で標識したプローブとともにインキュベートした。インキュベーションは、１０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）、１００ｍＭのＫＣＬ、５ｍＭのＭｇＣＬ２、２ｍＭのＤＴＴ、１０％のグリセロール、０．１％のＮＰ−４０、０．０２５％のＢＳＡ、および１μｇのＰｏｌｙ−ｄＩｄＣからなる２０μｌの反応容量の中で、室温で３０分間行った。反応物を６％のポリアクリルアミドゲル上に載せ、電気泳動を行い、そして乾燥させた。乾燥させたゲルを画像化し、Ｔｙｐｈｏｏｎ  ８６００  ＰｈｏｓｐｈｏＩｍａｇｅｒ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）およびＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェアを使用して定量した。放射性同位体で標識したオリゴヌクレオチドプローブに結合した複合体に含まれるＨＩＦ−１タンパク質の同定を、放射性同位体で標識したプローブの添加の前に、ＨＩＦ−１ファミリーの個々のメンバーに特異的な個々の抗体と共に反応物を５分間プレインキュベートすることによって同定した。
【０３９９】
選択したデコイの結合は、通常のＥＭＳＡ法によって確認した。
【０４００】
本明細書中を通じて引用される全ての参考文献は、引用により本明細書中に組み入れられる。
【０４０１】
本発明は特定の特異的な実施形態に関して説明されるが、そのように限定はされない。修飾およびバリエーションが本発明の構想から逸脱することなく可能であり、そして、当業者に明らかである。このような修飾およびバリエーションの全てが、具体的に本明細書の範囲に含まれる。
【図面の簡単な説明】
【０４０２】
【図１】図１は、マウスモデルでの、ＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ１を使用した、ダニ（ｄｕｓｔｍｉｔｅ）抗原によって誘導されたアトピー性皮膚炎の処置の有効性を示すグラフである。水性のゲル性処方物Ｆ１は、０．８％のラウレス硫酸ナトリウム、４９％のエタノール、１．５％のＨＰＭＣ  ４０００  ｃｐｓ、および４８．７％の１００ｍＭリン酸緩衝液から構成される。マウスの皮膚（耳）の厚みを、炎症を定量化し、したがって、種々の濃度でのＮＦ−κＢデコイ分子での処置の有効性を定量化するために測定した。
【図２】図２は、マウスモデルでの、ＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ６を使用した、ダニ抗原によって誘導されたアトピー性皮膚炎の処置の有効性を示すグラフである。マウスの皮膚（耳）の厚みを、炎症を定量化し、したがって、０．２５％および１％の濃度のＮＦ−κＢデコイ分子での処置の有効性を定量化するために測定した。
【図３】図３は、種々のエタノール濃度での、ＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物の有効性を示すグラフである。
【図４】図４は、０．２５％のＮＦ−κＢ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ２で処置した場合の、Ｎｃ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導された接触皮膚炎におけるＩＬ−１β遺伝子の発現レベルの低下を示すグラフである。
【図５】図５は、０．２５％のＮＦ−κＢ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ２で処置した場合の、Ｎｃ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導された接触皮膚炎におけるＩＬ−６遺伝子の発現レベルの低下を示すグラフである。
【図６】図６は、０．２５％のＮＦ−κＢ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ２で処置した場合の、Ｎｃ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導された接触皮膚炎におけるＴＮＦα遺伝子の発現レベルの低下を示すグラフである。
【図７】図７は、０．２５％のＮＦ−κＢ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ２で処置した場合の、Ｎｃ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導された接触皮膚炎におけるＴＳＬＰ遺伝子の発現レベルの低下を示すグラフである。
【図８】図８は、（Ａ）処置しなかった、（Ｂ）局所ベタメタゾンで処置した、（Ｃ）約４９重量％のエタノールと約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムを含む処方物で処置した、および（Ｄ）ＮＦ−κＢデコイ分子を含む、約４９重量％のエタノールと約０．８重量％のラウレス硫酸ナトリウムを含む処方物で処置した、ホルマリンで固定したアトピー性皮膚炎のマウスの皮膚のヘマトキシリンとエオシンでの染色を示す。
【図９】図９は、Ｎｃ／ＮｇａマウスでのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導された接触皮膚炎における、処置を終了した後のＮＦ−κＢデコイ分子の持続的な治療的有用性と、ベタメタゾンでの処置を終了した後の隆起および炎症の突然の重篤なリバウンドを示す。
【図１０】図１０（Ａ）は、いずれの処置も行わなかった場合、ベタメタゾンで処置した場合、およびＮＨ−κＢデコイ分子で処置した場合の、Ｎｃ／ＮｇａマウスのダニＡｇ（Ｄｐ）によって誘導される接触皮膚炎における皮膚の厚みを示すグラフである。図１０（Ａ）は、ベタメタゾンでの処置によって皮膚萎縮が誘導されたことを示している。図１０Ｂは、ＮＦ−κＢデコイでの処置においては、ベタメタゾンでの処置によって見られた皮膚萎縮の全身的な副作用がないことを示している。
【図１１】図１１は、皮膚の厚みに対する、ベタメタゾンでの処置とＮＦ−κＢデコイでの処置の効果を示している。図１１は、ＮＦ−κＢデコイでの処置によっては皮膚の菲薄化が生じないことを示す。
【図１２】図１２は、０．２５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む処方物Ｆ６で、そして局所ベタメタゾンで処置した、ホルマリンで固定したアトピー性皮膚炎のマウスの皮膚の、ｐｉｃｒｏ−ｓｉｒｉｕｓ  ｒｅｄ染色を示す。
【図１３】図１３は、水性のゲル性処方物Ｆ２を使用した、ブタの皮膚へのＮＦ−κＢデコイ分子の送達を示す。
【図１４】図１４は、水性のゲル性処方物Ｆ２（１０％のエタノールと種々の濃度のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で処置したＤＮＦＢで炎症を起こさせたブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を示している、競合結合ゲルシフトアッセイによる定量結果を示す。このアッセイでは、Ｐ３２標識オリゴヌクレオチドプローブを放射性同位体で標識した。競合因子の添加後に残っているバンドの量をグラフにした。バンドを、ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）８６００  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量化した。ブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を、ゲルの画像上のｐ６５タンパク質に対するＰ３２標識オリゴヌクレオチドプローブの結合の減少によって決定した。
【図１５】図１５は、水性のゲル性処方物Ｆ３（５％のエタノールと種々の濃度のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で処置したＤＮＦＢで炎症を起こさせたブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を示している、競合結合ゲルシフトアッセイによる定量結果を示す。このアッセイでは、Ｐ３２標識オリゴヌクレオチドプローブを放射性同位体で標識した。競合因子の添加後に残っているバンドの量をグラフにした。バンドを、ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）８６００  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量化した。ブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を、ゲルの画像上のｐ６５タンパク質に対するＰ３２標識オリゴヌクレオチドプローブの結合の減少によって決定した。
【図１６】図１６は、リポソームを含む処方物Ｆ９（１０％のエタノールと種々の濃度のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で処置したブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を示している、競合結合ゲルシフトアッセイによる定量結果を示す。このアッセイでは、Ｐ３２標識オリゴヌクレオチドプローブを放射性同位体で標識した。競合因子の添加後に残っているバンドの量をグラフにした。バンドを、ＴＹＰＨＯＯＮ（登録商標）８６００  ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）を使用して定量化した。ブタの皮膚の中のＮＦ−κＢ結合デコイ分子の存在を、ゲルの画像上のｐ６５タンパク質に対するＰ３２標識オリゴヌクレオチドプローブの結合の減少によって決定した。
【図１７】図１７は、ジニトロフルオロベンゼンで炎症を起こさせたブタの皮膚の中でのＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベルを示すグラフである。
【図１８】図１８は、プラセボでの処置または未処置の皮膚と比較した、リポソームを含む処方物Ｆ９（０．２５％および０．５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で処置したジニトロフルオロベンゼンで炎症を起こさせたブタの皮膚の中での相対的なＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベルの低下を示すグラフである。
【図１９】図１９は、０．２５％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む水性のゲル性処方物Ｆ２で処置したジニトロフルオロベンゼンで炎症を起こさせたブタの皮膚の中での相対的なＩＬ−６  ｍＲＮＡの発現レベルの低下を示すグラフである。
【図２０】図２０は、水性のゲル性処方物Ｆ１０（０．５％または１％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で処置したジニトロフルオロベンゼンで炎症を起こさせたブタの皮膚の中でのＩＬ−１β  ｍＲＮＡの発現レベルの低下を示すグラフである。
【図２１】図２１は、Ａｇ（Ｄｐ）で誘導した炎症における、ベタメタゾンおよびＮＦ−κＢデコイでの処置が原因であるアポトーシスの増加を示す、ＴＵＮＮＥＬアッセイの結果を示す。
【図２２】図２２は、水性のゲル性処方物Ｆ６（１％のＮＦ−κＢデコイ分子を含む）で、および局所ベタメタゾンで処置したホルマリンで固定したアトピー性皮膚炎のマウスの皮膚のＫｉ６７染色を示す。
【図２３】図２３は、特定のＮＦ−κＢデコイ分子のｐ６５／ｐ５０結合を示すグラフである。
【図２４】図２４は、特定のＮＦ−κＢデコイ分子のｐ５０／ｐ５０結合を示すグラフである。
【図２５】図２５は、ＥＭＳＡアッセイによる定量結果を示す。「Ｅ」と命名したデコイ分子の、転写因子Ｏｃｔ−１の結合について非特異的に競合する能力を試験した。このアッセイでは、Ｏｃｔ−１デコイを放射性同位体で標識した。競合因子の添加後に残っているバンドの量をグラフにした。バンドを、Ｔｙｐｈｏｏｎ  Ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｍａｇｅｒ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）を使用して定量化した。結果は、試験したＮＦ−κＢデコイはそれに対する特異性を有していないプロモーターについて非特異的に競合することはないことを示している。ポジティブコントロールはｃｏｌｄ  Ｏｃｔ−１プローブとした。
【図２６】図２６は、「参照デコイ分子」（配列番号９４および９５）、「新規のデコイ分子」（配列番号９６および９７）、ならびに「スクランブルデコイ分子」（配列番号９８および９９）の配列を示す。ここでは、コア配列は太字で、下線が付けられている。
【図２７】図２７は、参照デコイおよびネガティブコントロールと比較した、本発明に記載される代表的なデコイ分子を用いて行った競合結合アッセイの結果を示す。
【図２８】図２８は、本発明のＨＩＦ−１デコイ配列のコア領域と直接隣接している領域の両方の塩基の組成をコンピューターで記述するマトリックスである。
【図２９Ａ】図２９は、それらの結合親和性によって分類されたＨＩＦ−１デコイ分子を示し、結合親和性と相関している特定の共有配列を明らかにしている。
【図２９Ｂ】図２９は、それらの結合親和性によって分類されたＨＩＦ−１デコイ分子を示し、結合親和性と相関している特定の共有配列を明らかにしている。
【図１】
2008513513.tif 000037
【図２】
2008513513.tif 000038
【図３】
2008513513.tif 000039
【図４】
2008513513.tif 000040
【図５】
2008513513.tif 000041
【図６】
2008513513.tif 000042
【図７】
2008513513.tif 000043
【図８】
2008513513.tif 000044
【図９】
2008513513.tif 000045
【図１０】
2008513513.tif 000046
【図１１】
2008513513.tif 000047
【図１２】
2008513513.tif 000048
【図１３】
2008513513.tif 000049
【図１４】
2008513513.tif 000050
【図１５】
2008513513.tif 000051
【図１６】
2008513513.tif 000052
【図１７】
2008513513.tif 000053
【図１８】
2008513513.tif 000054
【図１９】
2008513513.tif 000055
【図２０】
2008513513.tif 000056
【図２１】
2008513513.tif 000057
【図２２】
2008513513.tif 000058
【図２３】
2008513513.tif 000059
【図２４】
2008513513.tif 000060
【図２５】
2008513513.tif 000061
【図２６】
2008513513.tif 000062
【図２７】
2008513513.tif 000063
【図２８】
2008513513.tif 000064
【図２９Ａ】
2008513513.tif 000065
【図２９Ｂ】
2008513513.tif 000066
【配列表】
2008513513000001.app
【国際調査報告】
2008513513.tif 000067
2008513513.tif 000068
2008513513.tif 000069