(57)【要約】２つの遺伝子、A622およびNBB1に影響を及ぼすことにより、植物中のニコチン類縁アルカロイド量を低下させることができる。特に、A622およびNBB1 の一方または両方の抑制を利用してタバコ植物におけるニコチン量を低下させることができる。
2008531038.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
非形質転換コントロール植物と比べてNBB1 発現を下方制御することを含む、植物におけるアルカロイド含量を低下させる方法。
【請求項２】
該アルカロイドがニコチンである、請求項1の方法。
【請求項３】
該アルカロイドがアナタビンである、請求項1の方法。
【請求項４】
NBB1 発現を抑制する低分子干渉 RNAを発現する核酸を該植物の植物細胞に導入することによってNBB1発現を下方制御する、請求項1の方法。
【請求項５】
NBB1 mRNA 転写産物を切断するRNA 酵素を該植物の植物細胞に導入することによってNBB1発現を下方制御する、請求項1の方法。
【請求項６】
5'から 3'方向にて、NBB1をコードする異種核酸に作動可能に連結したプロモーター、およびターミネーターを含む核酸コンストラクトを、該植物の植物細胞に導入することによってNBB1発現を下方制御する、請求項1の方法。
【請求項７】
以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子:
(a)配列番号3に示すヌクレオチド配列;
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列; および、
(c)遺伝暗号の縮重により(a)または(b)のヌクレオチド配列と異なり、NBB1 発現を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【請求項８】
請求項 7の核酸分子を含む、遺伝子工学的手法によって操作された植物。
【請求項９】
該植物がタバコである請求項 8の植物。
【請求項１０】
非形質転換コントロール植物と比べてA622 発現を下方制御することを含む、植物におけるアルカロイド含量を低下させる方法。
【請求項１１】
該アルカロイドがニコチンである請求項10の方法。
【請求項１２】
該アルカロイドがアナタビンである請求項10の方法。
【請求項１３】
A622 発現を抑制する低分子干渉 RNAを発現する核酸を、該植物の植物細胞に導入することによってA622発現を下方制御する、請求項10の方法。
【請求項１４】
A622 mRNA 転写産物を切断するRNA酵素を該植物の植物細胞に導入することによってA622発現を下方制御する、請求項10の方法。
【請求項１５】
5'から3' 方向にて、A622をコードする異種核酸に作動可能に連結したプロモーター、およびターミネーターを含む核酸コンストラクトを該植物の植物細胞に導入することによってA622発現を下方制御する、請求項10の方法。
【請求項１６】
以下からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子:
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列;
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および、
(c)遺伝暗号の縮重により(a)または(b)のヌクレオチド配列と異なり、 A622 発現を示すポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
ここで、該ヌクレオチド配列は異種プロモーターに作動可能に連結している。
【請求項１７】
請求項16の核酸分子を含む、遺伝子工学的手法によって操作された植物。
【請求項１８】
該植物がタバコである請求項17の植物。
【請求項１９】
NBB1およびA622 発現を低下させることを含む、植物におけるアルカロイド含量を低下させる方法。
【請求項２０】
該アルカロイドがニコチンである請求項19の方法。
【請求項２１】
ニコチン生合成遺伝子、およびNBB1およびA622の少なくとも一方を下方制御することを含む、植物におけるアルカロイド含量を低下させる方法。
【請求項２２】
該ニコチン生合成遺伝子が、アスパラギン酸オキシダーゼ、キノリン酸シンターゼ、キノレートホスホリボシル基転移酵素、オルニチン脱炭酸酵素、プトレッシンＮメチル基転位酵素およびジアミンオキシダーゼからなる群から選択される請求項 21の方法。
【請求項２３】
該アルカロイドがアナタビンである請求項 21の方法。
【請求項２４】
遺伝子工学的手法によりニコチンおよびアナタビン含量が低下した植物。
【請求項２５】
A622 発現およびアルカロイド含量が低下しているタバコ植物。
【請求項２６】
NBB1 発現およびアルカロイド含量が低下しているタバコ植物。
【請求項２７】
A622またはNBB1 発現が低下しているタバコ植物から作られたニコチン含量が低下したタバコ製品。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
仮出願の利益
本出願は2005年2月28日出願の米国仮出願第60/656,636号からの利益を主張し、その内容は引用により本明細書に含める。
【０００２】
発明の分野
本発明は、分子生物学の分野およびアルカロイド合成の下方制御に関する。より具体的には、本発明は、植物、特にそれに限定されないがタバコ植物における、ニコチン類縁アルカロイドを低下させる方法およびコンストラクトに関する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
今日、植物において、ニコチン等のニコチン類縁アルカロイド含量を低下させる方法がいくつか存在している。例えば、低ニコチン品種の育種母体として、タバコの低ニコチン系統が利用されている(Legg et al.、Crop Sci 10:212 (1970))。ニコチン量を低下させるために遺伝子工学的手法を用いることも出来る。例えば、米国特許第5,369,023号および第 5,260,205号は、内在性プトレッシンメチル基転位酵素(PMT)配列のアンチセンスターゲティングによるニコチン量の低下について議論している(Voelckel et al.、Chemoecology 11:121126 (2001))。タバコのキノリン酸(quinolate)ホスホリボシル基転移酵素 (QPT) 遺伝子がクローニングされており(Sinclair et al.、Plant Mol. Biol.  44: 603-617 (2000)）、そのアンチセンス抑制により、形質転換タバコ植物において顕著なニコチン含量の低下がもたらされた(Xie et al.、Recent Advances in Tobacco Science  30: 17-37 (2004)) 。米国特許第6,586,661号および第6,423,520号も参照されたい。
【０００４】
いくつかのニコチン生合成酵素が知られている。例えば、Hashimoto et al.、Plant Mol. Biol. 37:25-37 (1998); Reichers & Timko、Plant Mol. Biol. 41:387-401 (1999); Imanishi et al.、Plant Mol. Biol. 38:1101-1111 (1998)を参照されたい。しかし、ニコチン類縁アルカロイド含量をさらに低下させるためのさらなる遺伝子工学的手法がいまだに求められている。例えば、タバコ植物においてPMTのみが下方制御された場合、ニコチンは低下するが、アナタビン含量は約2〜6倍上昇する(Chintapakorn & Hamill、Plant Mol. Biol. 53: 87105 (2003); Steppuhn、et al.、PLoS Biol 2(8): e217: 1074-1080 (2004)）。QPTのみが下方制御された場合、かなりの量のアルカロイドが保持される。U.S. Plant Variety Certificate No. 200100039を参照されたい。
【０００５】
タバコ植物における全アルカロイド含量を低下させることにより、バイオマス資源としてのタバコ植物の価値は上昇するであろう。高密度および多数の挿し木(multiple cuttings)といった、バイオマスを最大にする条件下で育成した場合、タバコ植物は8トン(乾燥重量)/エーカー以上収穫でき、これはバイオマス用に用いられるその他の作物に匹敵する。しかし従来のタバコバイオマスのラージスケールでの育成および加工にはいくつもの欠点がある。例えば、従来のタバコバイオマスは、品種によって異なるが、約1〜約5パーセントのアルカロイドを含有するため、タバコ植物のアルカロイドを抽出、単離および廃棄するためにかなりの時間とエネルギーが消費される。１エーカー当たりで、従来のタバコバイオマスは、およそ800ポンドものアルカロイドを含有する。また、タバコ植物を扱う人々は、ニコチンへの過剰曝露によって、一般に「緑タバコ病」と称される病気を患いうる。
【０００６】
アルカロイドを低下させたタバコ植物は、従来の目的以外、例えば、バイオマスおよび派生製品への使用がより受け入れられやすい。例えば、アルカロイド含量を低下させたタバコ植物のエタノールおよびタンパク質共生成物の産生のための使用は有益である（米国特許公開第2002/0197688号）。さらに、アルカロイド非含有タバコ植物またはその画分(fraction)は、飼料作物、動物用飼料、またはヒト用栄養源として用いることが出来る（前掲）。
【０００７】
ニコチン含量の低下に伴うかかる利点以上に、喫煙者の禁煙を補助するのにより有効な方法が求められている。ニコチン置換療法(NRT)は、ニコチン置換期間の終わりから6 〜12ヶ月後の成功率は20％未満であるため、禁煙処置としてはあまり有効ではない(Bohadana et al.、Arch Intern. Med. 160:31283134 (2000); Croghan et al.、Nicotine Tobacco Res. 5:181-187 (2003); Stapleton et al.、Addiction 90:31-42 (1995)）。ニコチン含量を低下させたタバコ（シガレット・巻きタバコ）またはニコチン非含有タバコ（シガレット・巻きタバコ）は、喫煙者に喫煙習慣を許容しつつ、ニコチンから引き離すことにより、喫煙者の禁煙を助けるのに成功している。さらに、ニコチン除去タバコ（シガレット・巻きタバコ）は喫煙欲求およびその他の禁煙による禁断症状を軽減する(Rose、Psychopharmacology 184: 274285 (2006)およびRose et al.、Nicotine Tobacco Res. 8:89-101 (2006)を参照)。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
したがって、その発現がニコチン類縁アルカロイド含量の低下に影響を与えうるさらなる遺伝子の同定がいまだに求められている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
発明の概要
２つの遺伝子、A622およびNBB1に影響を与えることにより、植物におけるニコチン類縁アルカロイド量を低下させることができる。特に、A622およびNBB1 の一方または両方の抑制は、タバコ植物におけるニコチン含量の低下に有用であり得る。
【００１０】
したがって、一つの側面において、本発明は、以下から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する：
(a)配列番号3に示すヌクレオチド配列; 
(b)配列番号4に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列; および、
(c)遺伝暗号の縮重により(a)または(b)のヌクレオチド配列と異なり、NBB1 発現を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列。
【００１１】
別の側面において、本発明は以下から選択されるヌクレオチド配列を含む単離核酸分子を提供する：
(a)配列番号1に示すヌクレオチド配列; 
(b)配列番号2に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列;および、
(c)遺伝暗号の縮重により(a)または(b)のヌクレオチド配列と異なり、A622 発現を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ここで該ヌクレオチド配列は異種プロモーターに作動可能に連結している。
【００１２】
別の側面において、本発明は、NBB1およびA622 発現を低下させることを含む、植物におけるアルカロイド含量を低下させる方法を提供する。
【００１３】
別の側面において、本発明は、A622 発現およびアルカロイド含量が低下した形質転換植物、ならびに、NBB1 発現およびアルカロイド含量が低下したタバコ植物を提供する。 本発明はまた、遺伝子工学的手法によりニコチンおよびアナタビン含量が低下した植物も提供する。
【００１４】
別の側面において、本発明は、A622またはNBB1発現を低下させたタバコ植物からできたニコチン含量を低下させたタバコ製品を提供する。
【００１５】
図面の簡単な説明
図 1は、ニコチン生合成経路を示す。略記は以下の通り: AO = アスパラギン酸オキシダーゼ、QS = キノリン酸シンターゼ、QPT = キノリン酸ホスホリボシル基転移酵素、ODC = オルニチン脱炭酸酵素、PMT = プトレッシンＮメチル基転位酵素、およびDAO = ジアミンオキシダーゼ。
【００１６】
図 2Aは、pHANNIBAL を模式的に示す。
【００１７】
図 2Bは、マルチリンカーサイトが改変されたpHANNIBAL-Xを模式的に示す。
【００１８】
図 3は、中間体プラスミドとして改変pHANNIBAL-Xを用いる植物 RNAi バイナリーベクターの調製のためのスキームを示す。
【００１９】
図 4は、pRNAi-A622のT-DNA 領域を示す。
【００２０】
図 5は、BY-2 細胞、A662サイレンシングBY-2 細胞およびNBB1サイレンシングBY-2 細胞におけるニコチン類縁アルカロイドの蓄積を示す。
【００２１】
図 6は、A622、NBB1、およびニコチン生合成経路の既知の酵素の遺伝子の、野生型 BY-2 細胞、A622サイレンシングBY-2 細胞およびNBB1サイレンシングBY-2 細胞における発現を示す。
【００２２】
図 7は、誘導性 A622 発現ベクター pXVE-A622RNAiのT-DNA 領域を示す。
【００２３】
図 8Aは、エストラジオール誘導性 A622発現抑制コンストラクトによって形質転換された毛状根系統における、エストラジオールによる誘導後のA622発現の特異的抑制を示す。
【００２４】
図 8Bは、エストラジオール誘導性 A622発現抑制コンストラクトによって形質転換された毛状根系統株における、エストラジオールによる誘導後のニコチン含量の低下を示す。
【００２５】
図 9は、野生型タバコおよびnic1、nic2、およびnic1nic2 突然変異体の根および葉組織におけるNBB1 発現およびPMT 発現のRNA ブロット分析を示す。
【００２６】
図 10は、NBB1とハナビシソウ(Eschscholzia californica)ベルベリン架橋酵素 (EcBBE)とのアラインメントを示す。
【００２７】
図 11は、NBB1および植物 BBE-様タンパク質配列を用いて作製した系統樹を示す。
【００２８】
図 12は、NBB1 抑制ベクター pHANNIBAL-NBB1 3'のT-DNA 領域を示す。
【００２９】
図 13は、NBB1-抑制タバコ毛状根におけるニコチン類縁アルカロイド合成の低下を示す。
【００３０】
図 14は、NBB1-サイレンシングおよびコントロール毛状根系統におけるNBB1、A622、およびニコチン生合成に関与する既知の酵素の発現を示す。
【００３１】
図 15は、NBB1 抑制ベクター pANDA-NBB1fullのT-DNA 領域を示す。
【００３２】
図 16 は、NBB1 抑制ベクター pANDA-NBB1fullで形質転換された系統からのタバコ(Nicotiana tabacum)植物の葉におけるニコチン量を示す。
【００３３】
発明の詳細な説明
本発明者らは、植物、例えばこれに限定されないが、タバコにおけるニコチン類縁アルカロイド量を低下させるよう影響を与えうる２つの遺伝子、A622およびNBB1を同定した。A622は、Hibi et al. Plant Cell 6: 723-735 (1994)により以前に同定されていたが、本発明者らは今までニコチン生合成の低下に関しては未知であったA622の役割を見いだした。本発明者らが見いだす前、当該技術分野ではNBB1はまったく知られておらず、本発明者らはまた、本発明の、植物におけるニコチン類縁アルカロイド含量低下を目的とした研究過程において、NBB1の役割も解明した。
【００３４】
したがって、本発明は、A622またはNBB1 発現を抑制することによる、植物におけるニコチン類縁アルカロイド含量の低下のための方法およびコンストラクトの両方を含む。即ち、ニコチン類縁アルカロイド量は、A622およびNBB1の一方または両方を抑制することによって低下させることができる。本発明のこの側面にしたがって、植物またはそのいずれかの部分は、その発現がA622およびNBB1の少なくとも一方を抑制し、ニコチン類縁アルカロイド含量を低下させるヌクレオチド配列により形質転換される。
【００３５】
本発明の別の側面において、ニコチン含量は、ニコチン生合成経路におけるいずれかの既知の酵素、例えば QPTまたはPMT、およびA622およびNBB1の少なくとも一方の発現を同時に抑制することにより、植物においてさらに抑制することができる。ニコチン含量の低下に加えて、例えば、本発明は、同時にアナタビン含量を低下させる手段を提供する。したがって、アナタビン量は、ニコチン生合成遺伝子、例えば QPTおよびA622およびNBB1の少なくとも一方を抑制することによって低下させることができる。
【００３６】
植物におけるニコチン類縁アルカロイド含量を低下させるためにA622 および/または NBB1 発現に影響を与える手段によって、多数のアルカロイド低下植物および副製品が、本発明にしたがって得ることが出来る。例えば、A622またはNBB1 発現が抑制されたタバコ植物は、ニコチン含量を低下させたタバコ植物の生産に用いることが出来、それは禁煙用製品として有用であり得る。同様に、ニコチン含量を低下させたタバコ植物は、飼料作物、動物用飼料、またはヒトの栄養源として利用することも出来る。
【００３７】
本発明のその他の目的、特徴および利点は以下の詳細な説明から明らかであろう。しかし、本発明の精神と範囲内での変更および改変は詳細な説明から当業者に明らかであるため、詳細な説明および実施例は、本発明の好適な態様を示すが、単に例示も目的で示すものであることを理解されたい。
【００３８】
定義
本明細書に用いる技術用語は、生化学、分子生物学および農学において一般に用いられているものである;したがって、それらは本発明の属する分野の当業者によって理解される。かかる技術用語は、例えば: MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、3rd ed.、vol. 1-3、ed. Sambrook and Russel、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、2001; CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、ed. Ausubel et al.、Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience、New York、1988 (with periodic updates); SHORT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY: A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY、5th ed.、vol. 1-2、ed. Ausubel et al.、John Wiley & Sons、Inc.、2002; GENOME ANALYSIS: A LABORATORY MANUAL、vol. 1-2、ed. Green et al.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1997において見ることが出来る。
【００３９】
植物生物学技術を伴う方法は本明細書に記載されており、また、方法論文、 例えば、METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY: A LABORATORY COURSE MANUAL、ed. Maliga et al.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、1995に詳細に記載されている。PCRを用いる様々な技術は、例えば、Innis et al.、PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS、Academic Press、San Diego、1990およびDieffenbach and Dveksler、PCR PRIMER: A LABORATORY MANUAL、2nd ed.、Cold Spring Harbor Laboratory Press、Cold Spring Harbor、N.Y.、2003に記載されている。PCR-プライマー対は、既知の配列から既知の技術、例えば、かかる目的のコンピュータプログラム、例えば、Primer、Version 0.5、1991、Whitehead Institute for Biomedical Research、Cambridge、MAの使用によって導くことが出来る。核酸の化学合成方法は、例えば、Beaucage & Caruthers、Tetra. Letts. 22:1859-1862 (1981)、および Matteucci & Caruthers、J. Am. Chem. Soc. 103:3185 (1981)に記載されている。
【００４０】
制限酵素消化、リン酸化、ライゲーションおよび形質転換は、Sambrook et al.、MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL、2nd  ed. (1989)、Cold Spring Harbor Laboratory Pressに記載のようにして行った。細菌細胞の培養および維持に用いたすべての試薬および材料は特に断りのない限り、Aldrich Chemicals (Milwaukee、Wis.)、DIFCO Laboratories (Detroit、Mich.)、Invitrogen (Gaithersburg、Md.)、またはSigma Chemical Company (St. Louis、Mo.) から得た。
【００４１】
「A622 発現」はタバコ植物においてNIC1および NIC2 遺伝子座によって制御されている(Hibi  et al.、The Plant Cell、6: 723-735 (1994)）。A622 はPMTと同じ発現様式を示すことが報告されている(Shoji、T. et al.、Plant Cell Physiol.、41:9:1072-1076 (2000a); Shoji、T.、 et al.、Plant Mol Biol、50:427-440 (2002)）。A622およびPMTの両方は、根、特に、根および根毛の頂端部の皮層および内皮に特異的に発現している(Shoji et al. (2002)）。さらに、A622およびPMTは、NIC 制御およびジャスモン酸メチル刺激に応答して共通の発現様式を有する。A622は地上組織の損傷に応答してタバコ(Nicotiana tabacum)の根において誘導される(Cane et al.、Functional Plant Biology、32、305320 (2005)）。キダチタバコ(N. glauca)において、A622 はQPT 誘導を導く条件下で損傷を受けた葉において誘導される（Sinclair et al.、Func. Plant Biol.、31:721-9 (2004)）。
【００４２】
A662の核酸配列(配列番号1)は決定されている(Hibi et al. (1994)、前掲）。この核酸配列にコードされるタンパク質(配列番号2)はイソフラボンレダクターゼ (IFR)と類似しており、NADPH-結合モチーフを含む。 A622は、リグニン生合成に関与するタバコフェニルクマランベンジル(benzylic)エーテルレダクターゼ(PCBER)であるTP7との相同性を示す(Shoji  et al. (2002)、前掲）。しかし、大腸菌で発現させたA622を２種類の基質を用いてアッセイした場合、PCBER 活性は観察されなかった。
【００４３】
A622およびPMTの共制御およびA622のIFRとの類似性に基づき、A622はニコチン類縁アルカロイド合成の最終段階におけるレダクターゼとして機能すると提案された(Hibi et al. (1994); Shoji、et al. (2000a))。しかし、タンパク質を細菌中で発現させた場合には、IFR 活性は観察されなかった(前掲)。A622の機能は以前には知られておらず、今まで 、A622がニコチン合成において役割を果たしているという理解はされていなかった。
【００４４】
「A622 発現」とは、配列番号1によってコードされる遺伝子産物の生合成をいう。「A622 抑制」とは、A622 発現の低下をいう。A622 抑制は、植物または植物細胞におけるニコチン類縁アルカロイド含量を下方制御する能力を有する。
【００４５】
「アルカロイド」は、植物においてみられ、二次代謝により産生される窒素含有塩基性化合物である。「ニコチン類縁アルカロイド」は、ニコチンまたはニコチンに構造的に関連するアルカロイドであって、ニコチン生合成経路において産生される化合物から合成されるものである。タバコ植物の場合、「ニコチン類縁アルカロイド含量」および総アルカロイド含量は同義にて用いられる。
【００４６】
例示的なタバコのアルカロイドとしてはこれらに限定されないが、ニコチン、ノルニコチン、アナタビン、アナバシン、アナタリン、N-メチルアナタビン、N-メチルアナバシン、ミオスミン、アナバセイン、N'-ホルミルノルニコチン、ニコチリン、およびコチニンが挙げられる。タバコ葉においてその他の非常に微量なアルカロイドが例えば、Hecht、S.S. et al.、Accounts of Chemical Research 12: 92-98 (1979); Tso、T.C.、Production、Physiology and Biochemistry of Tobacco Plant  Ideals Inc.、Beltsville、MD (1990) において報告されている。いくつかのアルカロイドの化学構造が、例えば、Felpin et al.、J. Org. Chem. 66: 6305-6312 (2001)に示されている。
【００４７】
ニコチンは、N.tabacumに加えNicotiana属(タバコ属)の50-60パーセントの種において、最も主要なアルカロイドである。葉に蓄積するアルカロイドに基づくと、ノルニコチン、アナタビン、およびアナバシンはタバコ植物におけるその他の主要なアルカロイドである。アナタビンは通常いずれの種においても最も主要なアルカロイドではないが、3つの種において相対的に高い量で蓄積する; アナバシンは４つの種において最も主要なアルカロイドである。ノルニコチンは、タバコ種の30 〜40 パーセントにおいて最も主要なアルカロイドである。品種によるが、タバコにおける総アルカロイドの約 85〜約 95 パーセントはニコチンである(Bush、L.P.、Tobacco Production、Chemistry and Technology、Coresta 285-291 (1999); Hoffmann、et al.、Journal of Toxicology and Environmental Health、41:1-52、(1994)）。
【００４８】
本発明において、遺伝子工学的手法によって操作された植物において、A622およびNBB1の少なくとも一方を下方制御することによってニコチン類縁アルカロイド含量を低下させることができる。さらに、ニコチン類縁アルカロイド含量は、ニコチン生合成酵素、例えば QPTまたはPMT、およびA622およびNBB1の少なくとも一方を下方制御することによって低下させることができる。
【００４９】
「アナタビン」はニコチン類縁アルカロイドである。以前の研究によって、PMT 抑制はニコチン含量を低下させるが、プトレッシンおよびアナタビン量を上昇させることが示されている(Chintapakorn & Hamill、Plant Mol. Biol. 53: 87105 (2003); Sato et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98、367-372. (2001); Steppuhn、A.、et al.、PLoS Biol 2(8): e217: 1074-1080 (2004))。本発明の目的のために、アナタビン含量は、 A622およびNBB1 の少なくとも一方を下方制御することによって遺伝子工学的手法によって操作された植物において低下させることができる。アナタビン量はさらに、ニコチン生合成酵素、例えば QPT、およびA622およびNBB1 の少なくとも一方を下方制御することによって低下させることができる。
【００５０】
「BY-2 タバコ細胞」は、1960年代に、Japan Tobacco Co.、Ltd. によってタバコ品種Bright Yellow-2から確立された細胞系統である。この細胞系統は組織培養において非常に速く成育するため、ラージスケールでの培養が容易であり、遺伝子操作に利用しやすい。BY-2 タバコ細胞は、基礎研究においてモデル植物細胞系統として広く使用されている。標準培地で培養した場合、BY-2 タバコ細胞はニコチン類縁アルカロイドを産生しない。ジャスモン酸の培地への添加が、ニコチン類縁アルカロイドの合成を誘導する。
【００５１】
「相補的DNA」(cDNA)は、逆転写酵素によりmRNA 鋳型から形成される一本鎖 DNA 分子である。当業者はまた、かかる一本鎖 DNA 分子およびその相補的DNA鎖を含む二本鎖 DNA 分子を称するのにも「cDNA」という語を用いる。典型的には、mRNAの部分に相補的なプライマーが、cDNAを生じる逆転写工程の開始に用いられる。
【００５２】
「発現」とは、遺伝子産物の生合成をいう。構造遺伝子の場合、例えば、発現には構造遺伝子のmRNAへの転写およびmRNAの１以上のポリペプチドへの翻訳が含まれる。
【００５３】
「遺伝子」とは、ポリペプチドまたは前駆体の産生に必要な制御およびコード配列を含むポリヌクレオチド配列をいう。ポリペプチドは全長コード配列またはコード配列の部分によってコードされ得る。遺伝子は中断されていないコード配列を構成するか、または適当なスプライスジャンクションによって結合した１以上のイントロンを含んでいる。さらに、遺伝子はコード領域または非翻訳領域に、発現産物の生理活性または化学構造、発現速度、あるいは発現制御様式に影響を与えうる１以上の修飾を含み得る。かかる修飾としてはこれらに限定されないが、１以上のヌクレオチドの、突然変異、挿入、欠失、および置換が挙げられる。この点で、かかる修飾遺伝子は、 「ネイティブ」な遺伝子の「変異体」と称されることもある。
【００５４】
「遺伝子工学的手法により操作されている(GE)」とは、宿主生物に核酸または特定の変異を導入するあらゆる方法を含む。例えば、タバコ植物が、遺伝子、例えば A622またはNBB1の発現を抑制し、それによりニコチン量を低下させるポリヌクレオチド配列により形質転換されている場合、そのタバコ植物は遺伝子工学的手法により操作されているといえる。一方、標的遺伝子の発現を抑制するポリヌクレオチド配列で形質転換されていないタバコ植物はコントロール植物であり、「非形質転換」植物と称される。
【００５５】
本発明において、「遺伝子工学的手法により操作されている」範疇には、「形質転換」植物および植物細胞 (以下の定義を参照)、ならびに例えば、以下のような方法を通じた標的変異誘発により生産される植物および植物細胞が含まれる： Beetham et al.、Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 96: 8774-8778 (1999)およびZhu et al.、loc. cit. at 8768-8773に記載のキメラ RNA/DNA オリゴヌクレオチドの使用による、またはPCT出願WO 03/013226に記載のいわゆる「組換え誘導オリゴヌクレオ塩基」による。同様に、遺伝子工学的手法によって操作された植物または植物細胞は改変ウイルスの導入により産生することも出来、その結果、宿主において本明細書に記載される形質転換植物において得られるものと類似の結果を導く遺伝子修飾がもたらされる（例えば、米国特許第4,407,956号を参照）。さらに、遺伝子工学的手法によって操作された植物または植物細胞は宿主植物種または性的に適合性の植物種由来の核酸配列のみを導入することによって実施されるネイティブアプローチ (即ち、外来ヌクレオチド配列を伴わない)の産物であってもよい（例えば、米国特許出願公開第2004/0107455号参照）。
【００５６】
「ゲノムライブラリー」は、実質的にすべてのゲノム中のDNA 配列を少なくとも１コピー含むクローンの集団である。
【００５７】
「NBB1」配列は、Katoh et al.、Proc. Japan Acad.、79 (Ser. B): 151-154 (2003) のプロトコールにしたがってニコチアナ・シルベストリス-由来cDNA ライブラリーから調製されたcDNA マイクロアレイによって同定された。 NBB1は、ニコチン生合成調節座、NIC1および NIC2によっても制御される。NBB1およびPMTは、タバコ植物において同じ発現様式を有する。NBB1がニコチン生合成に関与していることは、NBB1が、PMT およびA622と同様に、NIC 遺伝子の制御下にあり、類似の発現様式を示すという事実により示される。
【００５８】
「NBB1 発現」とは、配列番号3によってコードされる遺伝子産物の生合成をいう。「NBB1 抑制」とは、NBB1 発現の低下をいう。NBB1 抑制は、ニコチン類縁アルカロイド含量を下方制御する能力を有する。
【００５９】
「NIC1および NIC2 座」はタバコにおける２つの独立した遺伝子座であり、以前にはAおよびBと称されていた。突然変異nic1および nic2は、ニコチン生合成酵素の発現量およびニコチン含量を低下させ、一般に、ニコチン含量は以下の順となる：野生型 > ホモ接合性 nic2 > ホモ接合性 nicl > ホモ接合性 niclかつホモ接合性 nic2 植物（Legg & Collins、Can. J. Cyto. 13:287 (1971); Hibi et al.、Plant Cell 6: 723-735 (1994); Reed & Jelesko、Plant Science 167:1123 (2004)）。
【００６０】
「ニコチン」は、タバコ(N.tabacum)およびタバコ属のいくつかのその他の種における主要なアルカロイドである。その他のニコチン産生能を有する植物としては、例えば、ナス科のズボイシア(Duboisia)、アントセリシス(Anthocericis) およびサルピグレシス(Salpiglessis) 属、ならびにキク科のエクリプタ(Eclipta)およびジニア(Zinnia)属が挙げられる。
【００６１】
「植物」は、植物体全体、植物器官(例えば、葉、茎、根等)、種子、および植物細胞ならびにそれらの子孫を含む用語である。植物材料としてはこれらに限定されないが、種子懸濁培養、胚、成長点領域、カルス組織、葉、根およびシュート、配偶体、胞子体、花粉、および小胞子が挙げられる。本発明に用いることが出来る植物の分類は一般に広く、形質転換技術を施すことが出来る高等植物が含まれ、単子葉および双子葉植物の両方が含まれる。好ましい植物は、ナス科のタバコ、ズボイシア、アントセリシスおよびサルピグレシス属またはキク科のエクリプタおよびジニア属のニコチン産生能を有する植物である。特に好ましい植物はニコチアナ・タバカム（Nicotiana tabacum)である。
【００６２】
「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーをいう。
【００６３】
「ニコチンを低下させた」植物は、遺伝子工学的手法による操作によって同種の非形質転換コントロール植物のニコチン含量の半分未満、好ましくは 25%未満、より好ましくは 20%未満または10%未満を含む植物を包含する。ニコチンを低下させた植物にはまた、コントロール植物と比較して総アルカロイド含量が少ない、遺伝子工学的手法によって操作された植物も含まれる。
【００６４】
「構造遺伝子」は、メッセンジャー RNA (mRNA) に転写され、次いで特定のポリペプチドに特有のアミノ酸配列に翻訳されるDNA 配列をいう。「メッセンジャー RNA (mRNA)」は、タンパク質のアミノ酸配列のコード情報を含むRNA 分子をいう。
【００６５】
２つの核酸またはポリペプチド配列に関する「配列同一性」または「同一性」は、２つの配列が特定の領域について最大限一致するようアラインされた場合の、当該２つの配列において一致するアミノ酸残基数に基づく場合を含む。配列同一性のパーセンテージがタンパク質に関して用いられる場合、同一でない残基位置は、しばしば保存的アミノ酸置換によるものといわれており、この場合、アミノ酸残基は、類似の化学的性質、例えば、類似の荷電および疎水性を有するその他のアミノ酸残基によって置換されており、それゆえ、分子の機能的性質を変化させない。配列が保存的置換によって異なる場合、配列の同一性割合は、置換による性質の保存性を加味して上方修正され得る。かかる保存的置換によって異なる配列は「配列類似性」または「類似性」を有するといわれる。この修正を行う方法は、当業者に周知である。典型的には、この方法では、保存的置換は完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチであるとしてスコア付けされ、それによって配列の同一性割合を増加させる。したがって、例えば、同一アミノ酸がスコア1を与えられ、非保存的置換がスコア0を与えられる場合、保存的置換は0と1の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコア付けは、例えば、プログラム PC/GENE (Intelligenetics、Mountain View、California、USA)に装備されているMeyers & Miller、Computer Applic. Biol. Sci. 4: 11 17 (1988)のアルゴリズムによって計算される。
【００６６】
本明細書における配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウで２つの最適にアラインされた配列を比較することによって判定した値をいい、ここで比較ウインドウにおけるポリヌクレオチド配列の一部が、２つの配列のアラインメントを最適化するための参照配列 (これは付加または欠失を含まない)と比較した場合に、アミノ酸の付加または欠失(即ち、ギャップ)を含んでいてもよい。パーセンテージは、塩基またはアミノ酸残基が両方の配列で同一である位置の数を同定してマッチ数とし、マッチ数を、比較ウインドウにおける配列の総数で割り、その結果に100をかけることによって計算される。
【００６７】
配列同一性の意味は当該技術分野で広く認識されており、公表されている技術を用いて計算することが出来る（COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY、Lesk、ed. (Oxford University Press、1988)、BIOCOMPUTING: INFORMATICS AND GENOME PROJECTS、Smith、ed. (Academic Press、1993)、COMPUTER ANALYSIS OF SEQUENCE DATA、PART I、Griffin & Griffin、eds.、(Humana Press、1994)、SEQUENCE ANALYSIS IN MOLECULAR BIOLOGY、Von Heinje ed.、Academic Press (1987)、SEQUENCE ANALYSIS PRIMER、Gribskov & Devereux、eds. (Macmillan Stockton Press、1991)、および Carillo & Lipton、SIAM J. Applied Math. 48: 1073 (1988)を参照）。２つの配列の間の同一性または類似性を決定するのに一般に用いられる方法としてはこれらに限定されないが、GUIDE TO HUGE COMPUTERS、Bishop、ed.、(Academic Press、1994)および Carillo & Lipton、前掲に開示されている方法が挙げられる。同一性および類似性を決定する方法は、コンピュータプログラム中に盛り込まれている。２つの配列の間の同一性および類似性を決定する好ましいコンピュータプログラム方法としてはこれらに限定されないが、GCG プログラムパッケージ (Devereux et al.、Nucleic Acids Research 12: 387 (1984))、BLASTP、BLASTN、FASTA (Atschul et al.、J. Mol. Biol. 215: 403 (1990))、およびFASTDB (Brutlag et al.、Comp. App. Biosci. 6: 237 (1990)) が挙げられる。
【００６８】
「タバコ(Tobacco)」は、ニコチン類縁アルカロイドを産生するタバコ属のあらゆる植物をいう。タバコはまた、タバコ植物によって産生された材料を含む製品のこともいい、それゆえ、例えば、巻きタバコ、葉巻、かみタバコ、嗅ぎタバコおよび禁煙用にGE ニコチンを低下させたタバコから作られた巻きタバコが含まれる。タバコ種の例としてはこれらに限定されないが、ハナタバコ(N.alata)、キダチタバコ(N.glauca)、ナガバナタバコ(N.longiflora)、ニコチアナ・ペルシア(N. persica)、ニコチアナ・ルスチカ(N. rustica)、ニコチアナ・シルベストシス(N. sylvestris)、およびタバコ(N.tabacum)が挙げられる。
【００６９】
「タバコ特異的ニトロソアミン」(TSNA)は、保存、加工および喫煙の際にタバコにおいて主に形成される発がん物質の１群である（Hoffman、D.、et al.、J. Natl. Cancer Inst. 58、1841-4 (1977); Wiernik A et al.、Recent Adv. Tob. Sci、(1995)、21: 39-80）。TSNA、例えば 4-(N-ニトロソメチルアミノ)-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン (NNK)、N′-ニトロソノルニコチン (NNN)、N′-ニトロソアナタビン (NAT)、およびN′-ニトロソアナバシン (NAB)は、ニコチンおよびその他の主要でないタバコアルカロイド、例えば、ノルニコチン、アナタビン、およびアナバシンなど、のN-ニトロソ化によって形成される。ニコチン類縁アルカロイドの低下は、タバコおよびタバコ製品におけるTSNA量を低下させる。
【００７０】
「タバコ毛状根」は、アグロバクテリウム・リゾゲネス(Agrobacterium rhizogenes)のRi プラスミドからのT-DNAをゲノムに組み込んでおり、オーキシンおよびその他の植物ホルモンを追加していない培地で成育するタバコの根をいう。タバコ毛状根は、タバコ植物の根と同様にニコチン類縁アルカロイドを産生する。
【００７１】
「形質転換植物」は、他の生物や種においても存在する、あるいは、他の生物や種由来であって宿主のコドンユーセージに最適化された核酸配列を含む植物をいう。
【００７２】
形質転換植物は遺伝子形質転換方法によっても産生することが出来る。好適な形質転換方法としては、例えば、アグロバクテリウム媒介形質転換、パーティクルガン、エレクトロポレーション、ポリエチレングリコール融合、トランスポゾンタギングおよび部位特異的突然変異誘発が挙げられる。形質転換植物の同定および選抜は周知の技術であり、その詳細は本明細書において繰り返す必要はない。
【００７３】
「変異体」は、特定の遺伝子またはタンパク質の標準または所定のヌクレオチドまたはアミノ酸配列から逸脱したヌクレオチドまたはアミノ酸配列である。「アイソフォーム」、「アイソタイプ」および「アナログ」の用語も、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「変異体」形態をいう。１以上のアミノ酸の付加、欠失または置換によって変化したアミノ酸配列、またはヌクレオチド配列の変化は、「変異体」配列であると見なされうる。変異体は「保存的」変化を有していてもよく、ここで置換されたアミノ酸は類似の構造または化学的性質を有し、例えば、ロイシンのイソロイシンによる置換が挙げられる。変異体は「非保存的」変化を有していてもよく、例えば、グリシンのトリプトファンによる置換が挙げられる。類似の非主要な変異には、アミノ酸欠失または挿入またはその両方が含まれうる。どのアミノ酸残基が置換、挿入または欠失しているかを同定するためのガイダンスは、当該技術分野に周知のコンピュータプログラム、 例えば Vector NTI Suite (InforMax、MD)ソフトウェアを用いて見いだすことが出来る。「変異体」はまた、「シャッフルされた遺伝子」もいい、例えばMaxygenに譲渡された特許に記載のものが挙げられる。
【００７４】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法、プロトコール、ベクターおよび試薬等に限定されず、それらは変動しうる。さらに、本明細書は特定の態様を説明する目的で上記の用語を用いるが、本発明の範囲を限定する意図はない。
【００７５】
単数形、「ある」、「１つの」および「その」には、特に明示的に断りのない限り複数形も含まれる。したがって、「１つの遺伝子」という言及は、１以上の遺伝子をいうものであり、当業者に知られたその均等物なども含む。
【００７６】
ポリヌクレオチド配列
ニコチン類縁アルカロイド生合成遺伝子をいくつかの植物種において同定し、タバコ植物によって例証する。したがって、本発明は、ニコチン類縁アルカロイド生合成が下方制御された植物種のゲノムから単離されるあらゆる核酸、遺伝子、ポリヌクレオチド、DNA、RNA、mRNA、またはcDNA 分子を包含する。
【００７７】
例えば、A622およびNBB1の少なくとも一方の抑制を用いて、植物におけるニコチン含量を下方制御することができる。さらに、ニコチン類縁アルカロイド量は、ニコチン生合成遺伝子、例えばQPTおよびPMT の少なくとも一方、およびA622およびNBB1の少なくとも一方の発現を抑制することによってさらに低下させることができる。複数の遺伝子が抑制された植物は、複数の遺伝子の抑制のために遺伝子工学的手法により操作されている植物細胞からの植物の再生により、または、ニコチン生合成遺伝子の抑制のために遺伝子工学的手法により操作されている第一の植物と、A622およびNBB1の少なくとも一方の抑制のために遺伝子工学的手法により操作されている第二の植物とを交配することにより、得ることが出来る。
【００７８】
一つの側面において、本発明は、配列番号1;配列番号2に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列; 配列番号1にハイブリダイズし、A622 ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列;および、遺伝暗号の縮重により配列番号1とは異なるポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を提供する。配列番号1によってコードされるペプチドは本発明のさらなる側面であり、配列番号2に示す。
【００７９】
別の側面において、本発明は、配列番号3;配列番号4に示すポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列;配列番号3にハイブリダイズし、NBB1 ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列;および、遺伝暗号の縮重により配列番号3とは異なるポリヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子を提供する。配列番号3にコードされるペプチドは本発明のさらなる側面であり、配列番号4に示す。
【００８０】
本発明はさらに、配列番号1または3に相補的な核酸、および、少なくとも15の連続塩基を含み、以下に記載するように、中程度から高度にストリンジェントな条件下で配列番号1または3にハイブリダイズする核酸を提供する。配列番号3にハイブリダイズする核酸の範疇において、公開国際特許出願 WO 03/097790に開示の配列番号559の配列を有する核酸およびその断片は、本記載の目的からは除かれる。
【００８１】
さらなる態様において、本発明のsiRNA 分子は、配列番号1または3のいずれかの発現を抑制するポリヌクレオチド配列を含むが、配列番号1または3に示す配列は非限定的なものである。本発明のsiRNA 分子は、連続する A622またはNBB1 配列、例えば、約 15 〜約 25またはそれ以上、または約 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25またはそれ以上の連続するヌクレオチドを含みうる。この点に関しても、siRNA 分子の範疇には、WO 03/097790の上記配列番号559のヌクレオチド配列を有する分子、ならびにその断片は含まれない。
【００８２】
「単離」核酸分子は、そのネイティブな環境から取り出されている核酸分子、DNAまたはRNAをいう。例えば、DNAコンストラクトに含まれる組換え DNA 分子は、本発明の目的のために、単離されていると考えられる。単離DNA 分子のさらなる例としては、異種宿主細胞に維持されている組換え DNA 分子または、部分的にまたは実質的に、溶液中に精製されているDNA 分子が挙げられる。単離 RNA 分子には、本発明のDNA 分子のインビトロ RNA 転写産物が含まれる。単離核酸分子は、本発明によると、さらに合成により生じたかかる分子が含まれる。
【００８３】
本発明の核酸分子はRNA、例えば mRNAの形態であってもよいし、DNA、例えば、クローニングにより得られたか、または合成により生じたcDNA およびゲノムDNAの形態であってもよい。DNAまたはRNAは二本鎖であっても一本鎖であってもよい。一本鎖 DNAは、センス鎖としても知られるコード鎖であってもよいし、アンチセンス鎖と称される非コード鎖であってもよい。
【００８４】
特にことわりのない限り、本明細書においてDNA 分子の配列決定により決定されたすべてのヌクレオチド配列は自動DNA 配列決定機を用いて決定された(例えば、Model 373、Applied Biosystems、Inc.)。 それゆえ、当該技術分野において知られているように、この自動アプローチにより決定されたあらゆるDNA 配列について、本明細書において決定されたいずれのヌクレオチド配列もいくらかエラーを含んでいる可能性がある。自動的に決定されたヌクレオチド配列は典型的には、配列決定されたDNA 分子の実際のヌクレオチド配列に対して少なくとも 約 95% 同一、より典型的には 少なくとも 約 96%から少なくとも 約 99.9% 同一である。 実際の配列は、当該技術分野に周知のマニュアルDNA 配列決定法を含むその他のアプローチによってより正確に決定することが出来る。これもまた当該技術分野において知られているように、決定されたヌクレオチド配列において、実際の配列と比較して、単一の挿入または欠失は、ヌクレオチド配列の翻訳においてフレームシフトをもたらし、その結果、決定されたヌクレオチド配列によってコードされる予測アミノ酸配列は、配列決定されたDNA 分子によって実際にコードされるアミノ酸配列とは、かかる挿入または欠失の地点から全く異なるものになってしまう。
【００８５】
別の側面において、本発明は、上記の本発明の核酸分子におけるポリヌクレオチドの一部と、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドを含む単離核酸分子を提供する。ポリヌクレオチドの「一部」にハイブリダイズするポリヌクレオチドとは、参照ポリヌクレオチドの少なくとも 約 15 ヌクレオチド、より好ましくは 少なくとも 約 20 ヌクレオチド、さらにより好ましくは少なくとも 約 30 ヌクレオチド、さらにより好ましくは30 以上のヌクレオチドにハイブリダイズするDNAまたはRNAであるポリヌクレオチドをいう。
【００８６】
本発明の目的のために、２つの配列は、6X SSC、0.5% SDS、5X デンハルト溶液および100μgの非特異的キャリア DNAのハイブリダイゼーション溶液中で二本鎖複合体を形成することで、ハイブリダイズする。Ausubel et al.、前掲、section 2.9、supplement 27 (1994)を参照。配列は「中程度のストリンジェンシー」でもハイブリダイズし得、中程度のストリンジェンシーは、6X SSC、0.5% SDS、5X デンハルト溶液および100μgの非特異的キャリア DNAのハイブリダイゼーション溶液中、温度60℃と定義される。「高いストリンジェンシー」のハイブリダイゼーションでは、温度を68 ℃に上昇させる。中程度のストリンジェンシーのハイブリダイゼーション反応の後、ヌクレオチドを 2X SSC ＋ 0.05% SDS の溶液中で室温で５回洗浄し、次いで 0.1X SSC ＋ 0.1% SDSで60 ℃で1時間洗浄する。高いストリンジェンシーについては、洗浄温度は68℃に上昇させる。本発明の目的のために、ハイブリダイズしたヌクレオチドは比放射能10,000 cpm/ngを有する1 ngの放射標識プローブを用いて検出されるものであり、ここでハイブリダイズしたヌクレオチドは、72 時間以内-70 ℃でX-線フィルムに曝露した後明確に目視できる。
【００８７】
本出願は配列番号1または3に記載の核酸配列と少なくとも 60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%または100% 同一である核酸分子に関する。好ましくは核酸分子は、配列番号1または3に示す核酸配列と少なくとも 95%、96%、97%、98%、99%または100% 同一である。２つの核酸配列の間の相違は参照ヌクレオチド配列の5'または3'末端位置、またはこれら末端位置の間に位置する配列のいずれの部位において、個々に独立して、または１以上の連続する配列として、分散して存在しうる。
【００８８】
実際には、特定の核酸分子が参照ヌクレオチド配列と少なくとも 95%、96%、97%、98%または99% 同一であるかどうかは、当該技術分野に周知の標準的アルゴリズムを用いた２つの分子間での比較を参照し、公共のコンピュータプログラム、 例えば、BLASTN アルゴリズムを用いて常套的に判定することが出来る（Altschul et al.、Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)参照）。
【００８９】
本発明のアンチセンス法に用いられる異種配列は、A622またはNBB1 mRNA 配列全体またはその一部に相補的なRNA 産物が生じるように選択するとよい。配列は、天然のメッセンジャー RNAの連続する配列のいずれと相補的であってもよく、即ち、それは、5'-末端またはキャップ部位の直近、キャップ部位の下流、キャップ部位と開始コドンの間の内在性 mRNA 配列に相補的であり得、非コード領域のすべてまたは一部を包含するものであり得、非コードとコード領域を架橋し得、mRNAのコード領域の全部または一部に相補的、コード領域の3'-末端に相補的、または3'-非翻訳領域に相補的のいずれであってもよい。
【００９０】
好適なアンチセンス配列は、少なくとも 約 13 〜約 15 ヌクレオチド、少なくとも 約 16 〜約 21 ヌクレオチド、少なくとも 約 20 ヌクレオチド、少なくとも 約 30 ヌクレオチド、少なくとも 約 50 ヌクレオチド、少なくとも 約 75 ヌクレオチド、少なくとも 約 100 ヌクレオチド、少なくとも 約 125 ヌクレオチド、少なくとも 約 150 ヌクレオチド、少なくとも 約 200 ヌクレオチドまたはそれ以上であり得る。さらに、配列はその3' または5'末端上で長くなっていても短くなっていてもよい。
【００９１】
特定のアンチセンス配列およびアンチセンス配列の長さは、例えば、望まれる阻害の程度およびアンチセンス配列の安定性に応じて変動する。一般に利用可能な技術および本明細書により提供される情報は、適当な A622またはNBB1 アンチセンス配列の選択のガイドとなりうる。本明細書において配列番号1または3について言及する場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、アンチセンス配向におけるA622またはNBB1 cDNA 配列の連続する断片であって、受容植物細胞を形質転換した場合に所望の効果を達成するのに十分な長さのものであり得る。
【００９２】
本発明は、A622およびNBB1の一方または両方のセンスコサプレッションを考慮する。本発明の実施に用いられるセンスポリヌクレオチドは、植物細胞において発現させた場合に、植物細胞における植物 A622またはNBB1 タンパク質のネイティブな発現を抑制するのに十分な長さのものである。かかるセンスポリヌクレオチドは、A622またはNBB1 酵素をコードする本質的に全ゲノムまたは相補的核酸、またはその断片であり得、かかる断片は典型的には少なくとも 15 ヌクレオチドの長さである。細胞においてネイティブな遺伝子の発現の抑制をもたらすセンス DNAの長さを確認する技術は一般に利用可能である。
【００９３】
本発明の別の態様において、植物細胞は、RNA 酵素 (「リボザイム」)をコードするポリヌクレオチドセグメントを含む核酸コンストラクトで形質転換され、ここでRNA酵素は、本明細書に記載されるA622またはNBB1をコードするDNAのmRNA 転写産物に対する(即ち、切断する)ものである。リボザイムは、標的 mRNAの到達可能な領域に結合する基質結合ドメイン、およびRNAの切断を触媒するドメインを含み、翻訳およびタンパク質産生を妨げる。結合ドメインは、標的 mRNA 配列に相補的なアンチセンス配列を含みうる;触媒モチーフは、ハンマーヘッドモチーフまたはその他のモチーフ、例えば、ヘアピンモチーフであり得る。
【００９４】
RNA 標的内のリボザイム切断部位は、リボザイム切断部位 (例えば、GUA、GUUまたはGUC 配列)について標的分子を走査することによってまず同定されうる。同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する15、20、30またはそれ以上のリボヌクレオチドの低分子RNA 配列が予測される構造的特徴について評価され得る。
【００９５】
候補標的の好適性もまた、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションの起こりやすさを、当該技術分野において知られているリボヌクレアーゼ保護アッセイを用いて試験することによって評価されうる。RNA酵素をコードするDNAは、既知の技術にしたがって作ることが出来る。例えば、Cech et al.、米国特許第4,987,071号; Keene et al.、米国特許第5,559,021号; Donson et al.、米国特許第5,589,367号; Torrence et al.、米国特許第5,583,032号; Joyce、米国特許第5,580,967号; Gold et al.、米国特許第5,595,877号; Wagner et al.、米国特許第5,591,601号;および米国特許第5,622,854号を参照。
【００９６】
植物細胞におけるかかるRNA 酵素の産生およびA622またはNBB1 タンパク質産生の破壊は、アンチセンス RNA 分子の産生と本質的に同様にして植物細胞におけるタンパク質活性を低下させる; 即ち、それは酵素を産生する細胞においてmRNAの翻訳を破壊することによる。「リボザイム」という用語は、エンドリボヌクレアーゼなどの酵素として機能するRNA-含有核酸をいい、「RNA 酵素」と互換的に用いられる。
【００９７】
本発明はさらに、リボザイムをコードする核酸、リボザイムをコードし、発現ベクターに挿入された核酸、かかるベクターを含む宿主細胞、および植物においてA622およびNBB1 発現を低下させるためのリボザイムを用いる方法を含む。
【００９８】
一つの態様において、本発明は、RNA 干渉遺伝子サイレンシングを媒介する二本鎖核酸分子を提供する。別の態様において、本発明のsiRNA 分子は、約 15 〜約 30 (例えば、約 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、または30) ヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチド間の約 15 〜約 30 塩基対を含む二本鎖核酸分子からなる。さらに別の態様において、本発明のsiRNA 分子は、約 1 〜約 32 (例えば、約 1、2、または3)ヌクレオチドのオーバーハング末端を有する二本鎖核酸分子を含み、例えば、約 21-ヌクレオチドであって、約 19 塩基対および3'-末端モノヌクレオチド、ジヌクレオチド、またはトリヌクレオチドオーバーハングを有する二本鎖である。さらに別の態様において、本発明のsiRNA 分子は、平滑末端を有する二本鎖核酸分子を含み、ここで両方の末端が平滑であっても、あるいは一方の末端が平滑であってもよい。
【００９９】
本発明のsiRNA 分子はRNAiを媒介する能力を保持していれば修飾ヌクレオチドを含んでいてもよい。修飾ヌクレオチドは、インビトロまたはインビボ特性、例えば、安定性、活性、および/またはバイオアベイラビリティーを向上させるために用いることが出来る。例えば、本発明のsiRNA 分子は、修飾ヌクレオチドをsiRNA 分子に存在するヌクレオチドの総数に対し一定の割合で含み得る。したがって本発明のsiRNA 分子は一般に、約 5% 〜約 100%の修飾ヌクレオチド(例えば、約 5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%または100%の修飾ヌクレオチド)を含みうる。所与のsiRNA 分子に存在する修飾ヌクレオチドの実際のパーセンテージは、siRNAに存在するヌクレオチドの総数に依存する。siRNA 分子が一本鎖であれば、パーセント修飾は一本鎖 siRNA 分子に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。同様に、siRNA 分子が二本鎖であれば、パーセント修飾は、センス鎖、アンチセンス鎖またはセンスおよびアンチセンス鎖の両方に存在するヌクレオチドの総数に基づきうる。
【０１００】
例えば、A622およびNBB1 発現は、当該技術分野に周知の遺伝子工学的手法によって低下させることができる。発現はA622またはNBB1をコードする配列の一部を含むRNAの発現を導く核酸コンストラクトの導入によって低下させることができる。配列の一部はセンスまたはアンチセンス配向のいずれでもよい。配列の一部は、二本鎖 RNA 領域を形成することが出来る逆方向反復配列でありうる。発現はRNA酵素(即ち、「リボザイム」) をコードする核酸コンストラクトの導入によって低下させることができ、ここでRNA酵素は、A622またはNBB1をコードするDNAのmRNA 転写産物に対する(即ち切断する)ものである。発現は、内在性遺伝子の配列特異的in situ変異誘発をもたらす結果、その不活性化をもたらす、A622またはNBB1 配列の一部を含む核酸の導入によって低下させることができる。
【０１０１】
配列分析
比較のための配列のアラインメントの方法は当該技術分野に周知である。比較のための配列の最適アラインメントは、以下によって行うことが出来る： Smith and Waterman、Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)の局所的相同性アルゴリズム; Needleman and Wunsch、J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズム; Pearson and Lipman、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988)の類似性サーチ方法; これらに限定されないが以下を含むアルゴリズムのコンピュータによる実行: PC/Gene プログラムにおけるCLUSTAL、Intelligenetics、Mountain View、California; Wisconsin Genetics Softwea Packageにおける、GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA、およびTFASTA、Genetics Computer Group (GCG)、575 Science Dr.、Madison、Wisconsin、USA; CLUSTAL プログラムは、Higgins and Sharp、Gene 73: 237 244 (1988); Higgins and Sharp、CABIOS  5: 151 153 (1989); Corpet et al.、Nucleic Acids Research、16: 10881-90 (1988); Huang et al.、Computer Applications in the Biosciences 8: 155-65 (1992)、およびPearson et al.、Methods in Molecular Biology 24: 307-331 (1994) によく記載されている。
【０１０２】
データベース類似性サーチに用いることが出来るBLAST ファミリーのプログラムには以下が含まれる:ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列を照会するBLASTN;タンパク質データベース配列に対し、ヌクレオチドクエリー配列を照会するBLASTX;タンパク質データベース配列に対するタンパク質クエリー配列を照会するBLASTP;ヌクレオチドデータベース配列に対するタンパク質クエリー配列を照会するTBLASTN;および、ヌクレオチドデータベース配列に対するヌクレオチドクエリー配列を照会するTBLASTX。Current Protcols in Molecular Biology、Chapter 19、Ausubel et al.、Eds.、Greene Publishing and Wiley-Interscience、New York (1995); Altschul et al.、J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990); および、Altschul et al.、Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (1997) を参照。
【０１０３】
BLAST 分析を実行するためのソフトウェアは公共のものであり、例えば、National Center for Biotechnology Informationを介して使用できる。このアルゴリズムは、クエリー配列における長さ Wのショートワードを同定することにより高スコアリング配列ペア(HSP)を同定することをまず含み、それは、データベース配列における同じ長さのワードとアラインした場合にマッチするか、または正の値のスコア閾値 Tを満足する。Tは近隣ワードスコア閾値と称される。かかる最初の近隣ワードヒットを、それらを含むより長いHSPを見いだすためのサーチの開始のためのシードとして用いる。ワードヒットを次いで、累積アラインメントスコアが上昇しうる限り、各配列に沿って両方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列については以下を用いて計算される：パラメーター M (マッチする残基対についてのリワードスコア; 常に > 0)およびN (ミスマッチする残基についてのペナルティスコア; 常に < 0)。アミノ酸配列については、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。ワードヒットの各方向における伸長は以下の場合に終了する: 累積アラインメントスコアが、最大達成値から量 X低下する;累積スコアが１以上の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積により0以下になる;またはいずれかの配列の末端に達する。BLAST アルゴリズムパラメーター W、T、およびXは、アラインメントの感度および速度を決定する。BLASTN プログラム (ヌクレオチド配列のための)はデフォールトとしてワード長さ (W) 11、期待値 (E) 10、カットオフ100、M=5、N=-4、および両鎖の比較を用いる。アミノ酸配列について、BLASTP プログラムはデフォールトとしてワード長さ (W) 3、期待値 (E) 10、および BLOSUM62 スコアリングマトリックスを用いる。 Henikoff & Henikoff、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1998) を参照。
【０１０４】
パーセント配列同一性の計算に加えて、BLAST アルゴリズムはまた、２つの配列の間の類似性の統計分析も実行する(例えば、Karlin & Altschul、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877 (1993) を参照)。BLAST アルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最小和確率 (P(N))であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の間のマッチが偶然に起こる確率の指標を提供する。
【０１０５】
配列の複数アラインメントは、アラインメントのCLUSTAL 方法 (Higgins & Sharp、CABIOS 5:151 153 (1989)) 、デフォールトパラメーター (GAP PENALTY=10、GAP LENGTH PENALTY=10) を用いて実施できる。CLUSTAL 方法を用いるペアワイズアラインメントのためのデフォールトパラメーターは、KTUPLE 1、GAP PENALTY =3、WINDOW=5 およびDIAGONALS SAVED=5である。
【０１０６】
以下のランニングパラメーターがBLASTNを用いるアラインメントおよび類似性の決定のために好ましく、ポリヌクレオチド配列についてのE 値およびパーセンテージ同一性に寄与する:  Unix（登録商標） ランニングコマンド: blastall -p blastn -d embldb -e 10 G0  -E0  -r 1 -v 30 -b 30  -i  queryseq o results;パラメーターは以下の通り: -p  プログラム名 [String]; -d  データベース [String]; -e  期待値 (E) [Real]; -G ギャップを開くコスト(0はデフォールト挙動を引き起こす) [Integer]; -E ギャップを伸長するコスト(0はデフォールト挙動を引き起こす) [Integer]; -r   ヌクレオチドマッチについてのリワード(blastn のみ) [Integer]; -v  オンライン記載数 (V) [Integer]; -b  示すアラインメント数 (B) [Integer]; -i  クエリーファイル[File In]; および -o  BLAST が出力ファイルを報告する[File Out] 任意。 
【０１０７】
BLASTN、FASTA、BLASTPまたは類似のアルゴリズムによって生じるクエリー配列による１以上のデータベース配列に対する「ヒット」は、配列の類似の部分をアラインおよび同定する。ヒットは類似性の程度および配列オーバーラップの長さの順に並べられる。データベース配列に対するヒットは一般にクエリー配列の配列長さの一部のみに対するオーバーラップを表す。
【０１０８】
BLASTN、FASTAおよびBLASTP アルゴリズムはまた、アラインメントのための「期待」値も生じる。期待値 (E)は、一定サイズのデータベースをサーチする場合に、一定数の連続配列の中で偶然にヒットすると「期待」しうる配列の数を示す。期待値は、データベース、例えば好ましくはEMBL データベースに対するヒットが真の類似性を示すか否かを判定するための有意性閾値として用いられる。例えば、ポリヌクレオチドヒットに割り当てられたE 値 0.1は、EMBLのデータベース規模において、配列のアラインされた部分に対し、単なる偶然によって近似のスコアを有するマッチが0.1存在すると期待できることを意味すると解釈される。この基準によると、ポリヌクレオチド配列のアラインされマッチした部分は同じである確率が90%である。アラインされマッチした部分についてE 値 0.01以下の配列については、EMBL データベースにおいて偶然にマッチを見いだす確率はBLASTN またはFASTA アルゴリズムを用いて1%以下である。
【０１０９】
一つの態様によると、本発明のポリヌクレオチドのそれぞれについて、「変異体」ポリヌクレオチドは、好ましくは本発明のポリヌクレオチドのそれぞれと同じかそれより少ない数の核酸を有する配列を含み、本発明のポリヌクレオチドと比較してE 値が0.01以下を生じるものである。即ち、変異体ポリヌクレオチドは、上記のパラメーターを設定されたBLASTN、FASTA、またはBLASTP アルゴリズムを用いてE 値が 0.01以下を有すると測定される、本発明のポリヌクレオチドと少なくとも99%の確率で同じである配列である。あるいは、本発明の変異体ポリヌクレオチドは、配列番号1または3のポリヌクレオチド配列、またはかかる配列の相補鎖、逆配列または逆相補鎖に、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。
【０１１０】
本発明はまた、開示された配列とは異なるポリヌクレオチドであるが、遺伝暗号の縮重の結果、本発明のポリヌクレオチドによりコードされるものと同じポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも含む。したがって、配列番号1または3に示すポリヌクレオチド配列またはその相補鎖、逆配列または逆相補鎖に記載のものと、保存的置換の結果、異なる配列を含むポリヌクレオチドは本発明に含まれると考えられる。さらに、全配列長の合計10%未満の欠失および/または挿入の結果、配列番号1または3に記載のポリヌクレオチド配列、またはその相補鎖、逆相補鎖または逆配列とは異なる配列を含むポリヌクレオチドもまた本発明に含まれると考えられる。
【０１１１】
本発明のポリヌクレオチド配列に対して特定のパーセンテージ同一性を有することに加えて、変異体ポリヌクレオチドは好ましくは、本発明のポリヌクレオチドと共通のさらなる構造的および/または機能的特徴を有する。本発明のポリヌクレオチドに対して一次構造において高い程度の類似性を共有することに加えて、本発明のポリヌクレオチドに対して特定の程度の同一性を有するか、またはそれにハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、好ましくは以下の特徴の少なくとも一つを有する:(i)本発明のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドと実質的に同じ機能的性質を有するポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームまたは部分的オープンリーディングフレームを含む; または(ii) 共通のドメインを有する。例えば、変異体ポリヌクレオチドは、A622またはNBB1を抑制する能力を有するポリペプチドをコードしうる。
【０１１２】
核酸コンストラクト
本発明の一つの側面によると、ニコチン類縁アルカロイド生合成を低下させる配列が、植物形質転換に好適な核酸コンストラクトに組み込まれる。例えば、かかる核酸コンストラクトは、植物におけるA622またはNBB1 遺伝子の少なくとも一方の発現を低下させるのに用いることが出来る。さらに、本発明の核酸コンストラクトはA622およびNBB1の一方または両方の発現ならびにニコチン生合成酵素をコードするポリヌクレオチド配列の発現を低下させうる。
【０１１３】
したがって、植物において作動可能な転写開始領域の制御下でニコチン類縁アルカロイド生合成を下方制御する配列を含む核酸コンストラクトを提供し、コンストラクトは宿主植物細胞中でRNAを産生しうる。
【０１１４】
組換え DNAコンストラクトは標準的技術を用いて作ることが出来る。例えば、転写のためのDNA 配列は、適当なセグメントを切り出す制限酵素により該配列を含むベクターを処理することにより得ることが出来る。転写のためのDNA 配列はまた、好適な制限部位を各末端に与えるために、合成オリゴヌクレオチドのアニーリングおよびライゲーションによって、または、合成オリゴヌクレオチドを使用したポリメラーゼ連鎖反応 (PCR)によって、作ることが出来る。DNA 配列は次いで、好適な調節要素、例えば、上流プロモーターおよび下流ターミネーター配列を含むベクターにクローニングされる。
【０１１５】
好適な調節要素
プロモーターは、RNA ポリメラーゼおよび転写を開始させるその他のタンパク質の認識および結合に関与する、転写の開始から上流のDNA領域を意味する。「構成的プロモーター」は、植物の全生存期間およびほとんどの環境条件下で活性なものである。組織特異的、組織好適、細胞タイプ特異的、および誘導性プロモーターは、「非構成的プロモーター」のクラスを構成する。「作動可能に連結した」とは、プロモーターと第二の配列との機能的連結であって、プロモーター配列が、第二の配列に対応するDNA 配列の転写を開始および媒介する連結をいう。一般に、「作動可能に連結した」とは、連結された核酸配列が連続していることを意味する。
【０１１６】
A622またはNBB1の発現を低下させるために細胞に導入される核酸配列の発現に有用なプロモーターは、構成的プロモーター、または組織特異的、組織好適、細胞タイプ特異的、および誘導性プロモーターであり得る。好ましいプロモーターとしては、根組織において活性なプロモーター、例えば、タバコ RB7プロモーター (Hsu et al. Pestic. Sci. 44:9-19 (1995); 米国特許第5,459,252号)およびニコチン生合成に関与する酵素の発現の上昇を導く条件下で活性化されるプロモーター、例えば、タバコ RD2 プロモーター (米国特許第5,837,876号)、PMT プロモーター (Shoji T. et al.、Plant Cell Physiol、41:831-839 (2000b); WO 2002/038588) またはA622 プロモーター (Shoji T. et al.、Plant Mol Biol、50:427-440 (2002))が挙げられる。
【０１１７】
本発明のベクターは終止配列を含んでいてもよく、それは本発明の核酸分子の下流に位置し、mRNAの転写を終了させ、そしてポリA 配列を付加させる。かかるターミネーターの例は、カリフラワーモザイクウイルス (CaMV) 35S ターミネーターおよびノパリンシンターゼ遺伝子 (Tnos) ターミネーターである。発現ベクターはまた、エンハンサー、開始コドン、スプライシングシグナル配列およびターゲティング配列を含んでいてもよい。
【０１１８】
本発明の発現ベクターはまた、形質転換植物細胞を培養中で同定しうる選抜マーカーを含んでいてもよい。マーカーは異種核酸分子に連結していてもよく、即ち、プロモーターに作動可能に連結した遺伝子であってよい。本明細書において用いる場合、「マーカー」という用語は、マーカーを含む植物または植物細胞の選抜またはスクリーニングを可能とする形質または表現型をコードする遺伝子をいう。通常、マーカー遺伝子は、抗生物質または除草剤耐性をコードする。これによって、形質転換または核酸導入されていない細胞のなかからの形質転換細胞の選抜が可能となる。
【０１１９】
好適な選抜可能なマーカーの例としては、アデノシンデアミナーゼ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ、ハイグロマイシン-B-ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ、キサンチン-グアニンホスホリボシル基転移酵素、グリフォセートおよびグルフォシネート耐性、およびアミノ-グリコシド 3'-O-ホスホトランスフェラーゼ (カナマイシン、ネオマイシンおよびG418 耐性)が挙げられる。これらのマーカーは、G418、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、カナマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性を含む。コンストラクトはまた、グルホシネートアンモニウムなどの除草性ホスフィノトリシンアナログに対する耐性を付与する選抜マーカー遺伝子Barを含んでいてもよい(Thompson et al.、EMBO J. 9: 2519-2523 (1987)）。その他の好適な選抜マーカーも同様に知られている。
【０１２０】
可視マーカー、例えば、緑色蛍光タンパク質 (GFP)を用いることも出来る。細胞分裂の制御に基づいて形質転換植物を同定および選抜する方法も記載されている。WO 2000/052168 およびWO 2001/059086を参照。
【０１２１】
細菌またはウイルス起源の複製配列も、ベクターの細菌またはファージ宿主へのクローニングを可能にするために含めることが出来る。好ましくは、宿主範囲の広い原核生物の複製起点を用いる。細菌のための選抜可能なマーカーを、所望のコンストラクトを担持する細菌細胞の選抜を可能にするために含めることが出来る。好適な原核生物の選抜可能なマーカーには、抗生物質、例えば、カナマイシンまたはテトラサイクリン耐性も含まれる。
【０１２２】
さらなる機能をコードするその他のDNA 配列も当該技術分野において知られているようにベクター中に存在してもよい。例えば、アグロバクテリウムが宿主である場合、T-DNA 配列を含めて、その後の植物染色体への移動および組込みを容易にすることが出来る。
【０１２３】
遺伝子操作のための植物
本発明は、ニコチン類縁アルカロイド合成を調節する遺伝子、例えば A622およびNBB1の発現を下方制御するポリヌクレオチド配列を導入することを介するニコチン類縁アルカロイド合成を抑制するための植物の遺伝子操作を包含する。その結果として、ニコチン類縁アルカロイド量が低下した植物が得られる。
【０１２４】
本明細書における、「植物」とは、遺伝子工学的手法により操作されうる、ニコチン類縁アルカロイドを含有するあらゆる植物材料をいい、例えばこれらに限定されないが、分化または未分化植物細胞、プロトソーム(protosome)、植物体全体、植物組織、または植物器官、または植物のいずれかの区画、例えば、葉、茎、根、芽、塊茎、果実、根茎等が挙げられる。
【０１２５】
本発明によって操作されうる例示的な植物としてはこれらに限定されないが、タバコ、ジャガイモ、トマト、ナス、ピーマン、およびベラドンナが挙げられる。
【０１２６】
植物形質転換および選抜
本発明によるコンストラクトは、好適な形質転換技術を用いて植物細胞を形質転換するのに用いることが出来る。単子葉および双子葉の両方の被子植物または裸子植物の植物細胞を当該技術分野において知られている様々な方法で形質転換することができる。例えば、Klein et al.、Biotechnology 4: 583-590 (1993); Bechtold et al.、C. R. Acad. Sci. Paris 316:1194-1199 (1993); Bent et al.、Mol. Gen. Genet. 204:383-396 (1986); Paszowski et al.、EMBO J. 3: 2717-2722 (1984); Sagi et al.、Plant Cell Rep. 13: 262-266 (1994) を参照。アグロバクテリウム種、例えば、アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(A. tumefaciens)およびアグロバクテリウム・リゾゲネス(A. rhizogenes)を例えば、Nagel et al.、Microbiol Lett 67: 325 (1990)にしたがって用いることが出来る。さらに、植物は、リゾビウム、シノリゾビウムまたはメソリゾビウム形質転換によって形質転換することができる（ Broothaerts et al.、Nature 433:629-633 (2005)）。
【０１２７】
例えば、アグロバクテリウムを、例えば、エレクトロポレーションを介して植物発現ベクターによって形質転換することができ、その後、アグロバクテリウムは植物細胞に、例えば、周知のリーフディスク法を介して導入される。これを達成するさらなる方法としてはこれらに限定されないが、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウム沈殿、およびポリエチレングリコール融合、出芽花粉粒への移入、直接形質転換 (Lorz et al.、Mol. Genet. 199: 179-182 (1985))、およびその他の当該技術分野において知られている方法が挙げられる。選抜マーカー、例えばカナマイシン耐性を用いると、どの細胞が形質転換に成功したのかを判定することがより容易になる。
【０１２８】
上記のアグロバクテリウム形質転換法は、双子葉植物の形質転換に有用であることが知られている。さらに、de la Pena et al.、Nature 325: 274-276 (1987)、Rhodes et al.、Science 240: 204-207 (1988)、およびShimamato et al.、Nature 328: 274-276 (1989)は、アグロバクテリウムを用いて穀類単子葉植物を形質転換した。アグロバクテリウム媒介形質転換のための減圧浸潤法を記載している、Bechtold et al.、C.R. Acad. Sci. Paris 316 (1994)も参照されたい。
【０１２９】
本明細書の目的のために、植物または植物細胞は、それぞれプロモーターに作動可能に連結した１以上の配列を含むプラスミドによって形質転換してもよい。例えば、例示的なベクターは、プロモーターに作動可能に連結したQPT 配列を含みうる。同様に、プラスミドは、プロモーターに作動可能に連結したQPT 配列およびプロモーターに作動可能に連結したA622 配列を含んでいてもよい。あるいは、植物または植物細胞は２以上のプラスミドによって形質転換してもよい。例えば、植物または植物細胞は、A622またはNBB1 配列を含む第二のプラスミドとは異なる、プロモーターに作動可能に連結したQPT 配列を含む第一のプラスミドによって形質転換してもよい。もちろん、第一および第二のプラスミドまたはそれらの部分は同じ植物細胞に導入される。
【０１３０】
本発明の遺伝子工学的手法によって操作された植物は従来の育種によって作ることが出来る。例えば、QPTおよびA622 活性が下方制御されている遺伝子工学的手法によって操作された植物は、QPT 発現が低下した形質転換植物とA622 発現が低下した形質転換植物とを交配することによって作ることが出来る。交配および選抜を繰り返した後、QPTおよびA622 活性が下方制御された遺伝子工学的手法によって操作された植物を選抜することができる。
【０１３１】
特定の細胞におけるタンパク質、ポリペプチド、または核酸分子の存在を測定して、例えば、細胞の形質転換または転換移入が成功したか否かを判定することができる。
【０１３２】
マーカー遺伝子を特異的リコンビナーゼ、例えば creまたはflpによって認識される組換え部位の対内に含めて、選抜後のマーカーの除去を容易にすることが出来る。米国特許出願公開第2004/0143874号を参照。
【０１３３】
マーカー遺伝子を有さない形質転換植物は、A622またはNBB1 配列を含む第一のプラスミドとは別の、マーカーをコードする核酸を含む第二のプラスミドを用いて作ることが出来る。第一および第二のプラスミドまたはそれらの部分を同じ植物細胞に導入して、一過性に発現する選抜可能なマーカー遺伝子で形質転換された植物細胞を同定し、A622またはNBB1 配列がゲノムに安定に組み込まれており、選抜可能なマーカー遺伝子は安定には組み込まれていない形質転換植物を得る。米国特許出願公開第2003/0221213号を参照。A622またはNBB1 配列を含む第一のプラスミドはT-DNA 領域を有するバイナリーベクターであってもよく、当該T-DNAは、野生型非形質転換タバコまたは性的に和合性のタバコ種に存在する核酸配列から完全に構成されている。
【０１３４】
植物細胞は選抜可能なまたは可視マーカーを使用せずに本発明の核酸コンストラクトにより形質転換してもよく、形質転換植物組織および形質転換再生植物を、導入したコンストラクトの存在をPCRまたはその他の特定の核酸配列の検出方法によって検出することによって同定してもよい。形質転換植物細胞の同定は、類似の条件下で培養された非形質転換植物細胞の成長速度または形態的特徴と比較しての該形質転換植物細胞の成長速度または形態的特徴における相違を認識することによって容易になりうる(WO 2004/076625を参照)。
【０１３５】
形質転換細胞または培養から形質転換植物を再生する方法は植物種によって異なるが、既知の方法に基づくものであり、例えば、形質転換タバコ植物を再生する方法は周知である。
【０１３６】
本明細書の目的のために、A622およびNBB1の少なくとも一方の発現が下方制御された遺伝子工学的手法によって操作された植物を選抜する。さらに、本発明の遺伝子工学的手法によって操作された植物は、ニコチン生合成遺伝子、例えば QPTまたはPMT、およびA622およびNBB1の少なくとも一方の発現が下方制御されているものであってもよい。
【０１３７】
ニコチンは天然の殺虫剤として作用して、害虫による傷害に対するタバコ植物の防御を補助し、また、伝統的育種法や形質転換によって低ニコチンとなったタバコ植物では昆虫による傷害に対する感受性が増加していることが報告されている（Legg、P.D.、et al.、Can. J. Cyto.、13:287291 (1971); Voelckel、C.、et al.、Chemoecology 11:121-126 (2001); Steppuhn、A.、et al.、PLoS Biol、2(8): e217: 1074-1080 (2004)）。それゆえ、さらなる昆虫からの保護をもたらす、例えば、 Bt 殺虫性タンパク質、プロテイナーゼ阻害剤、またはビオチン結合タンパク質をコードする遺伝子などの導入遺伝子により、本発明の方法にしたがって作られたニコチンを低下させた植物をさらに形質転換するのが望ましい。さらなる昆虫からの保護をもたらす導入遺伝子は、ニコチン含量を低下させた形質転換植物と昆虫耐性タンパク質をコードする遺伝子を含む第二の形質転換植物とを交配することによって導入してもよい。
【０１３８】
ニコチン類縁アルカロイド含量の定量
本発明の形質転換植物は、ニコチン類縁アルカロイド含量が低下していることを特徴とする。遺伝子工学的手法によって操作された植物におけるニコチン類縁アルカロイド含量の低下は、好ましくは、ニコチン生合成経路遺伝子、例えば、A622またはNBB1の発現の低下を介して達成される。
【０１３９】
本発明の植物の説明において、「ニコチンまたはニコチン類縁アルカロイド含量の低下」という表現は、非形質転換コントロール植物と比較した場合の植物中のニコチン類縁アルカロイドの量の量的低下をいう。ニコチン類縁アルカロイド量の量的低下は、いくつかの方法によりアッセイでき、例えば、ガス液体クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、ラジオイムノアッセイおよび酵素結合性免疫吸着検定法などに基づく定量方法が挙げられる。本発明において、ニコチン類縁アルカロイド量は、キャピラリーカラムおよびFID 検出器を備えたガス液体クロマトグラフィーにより、Hibi N. et al.、Plant Physiology 100: 826-835 (1992)に記載のようにして測定した。
【０１４０】
ニコチン類縁アルカロイド低下製品
本発明は、ニコチン類縁アルカロイド量が低下した形質転換植物を提供する。例えば、本発明には、A622およびNBB1の少なくとも一方の発現の抑制によるニコチン量の低下が含まれる。A622またはNBB1 発現が抑制され、ニコチン含量が低下した形質転換植物を選抜した後、様々な製品をかかる植物から製造することが出来る。
【０１４１】
本発明は、アルカロイド含量を低下させる方法を提供するため、TSNA含量も低下させることができる。というのは、タバコ中のアルカロイド含量とTSNA 蓄積との間には有意な正の相関があるからである。例えば、アナタビンとNATとの有意な相関係数は0.76であった(Djordjevic et al.、J. Agric. Food Chem.、37: 752-756 (1989)）。TSNAは発がん物質のクラスであって、保存、加工および喫煙の際にタバコにおいて主に形成される。しかし、TSNAは成育中のタバコ植物または摘みたてのタバコには少量しか存在しない(Hecht & Hoffman、J. Natl. Cancer Inst. 58、1841-4 (1977); Wiernik et al.、Recent Adv. Tob. Sci、21: 39-80 (1995)）。有機官能基、N-N=Oを含むニトロソアミンは、二級または三級アミンの窒素へのニトロソ化剤によるN=O基の簡易な付加により形成される。この特定のクラスの発がん物質はタバコにおいてのみみられているが、それらはその他のニコチン含有製品にも含まれている可能性がある。
【０１４２】
TSNAはタバコの煙におけるもっとも豊富な発がん物質であると考えられており、それらの発がん性はよく記載されている。Hecht、S. Mutat. Res. 424:127-42 (1999); Hecht、S.  Toxicol. 11、559-603 (1998); Hecht、S.、et al.、Cancer Surv. 8、273-294 (1989) を参照。TSNAは、口腔癌、食道癌、膵臓癌、および肺癌の原因であると記載されている (Hecht & Hoffman、IARC Sci. Publ. 54-61 (1991))。特に、TSNAは、喫煙に伴う腺癌および肺癌の劇的な発症に原因物質として関与してきた(Hoffmann et al.、Crit. Rev. Toxicol. 26、199-211 (1996))。
【０１４３】
曝露量および発がん作用によってもっとも重要であると考えられており、おそらくヒトに対して発がん性であると報告されている４つのTSNAは、N'-ニトロソノルニコチン (NNN)、4-メチルニトロソアミノ-1-(3-ピリジル)-1-ブタノン (NNK)、N'-ニトロソアナタビン (NAT)およびN'-ニトロソアナバシン(NAB)である。ヒトに対する化学物質の発がんの危険の評価についてIARC monographs on the evaluation of the carcinogenic risk of chemical to humansにおいて概説されている（Lyon (France) Vol 37、pp.205-208 (1985)）。これらのTSNAは、ニコチン、およびノルニコチン、アナタビン、およびアナバシンを含む主要でないタバコのアルカロイドのN-ニトロソ化により形成される。
【０１４４】
以下のアルカロイド化合物量がフィルター無し巻きタバコの主流煙について報告された(測定は、μg/巻きタバコ):  ニコチン: 100-3000、ノルニコチン: 5-150、アナタビン: 5-15、アナバシン: 5-12 (Hoffmann et al.、Chem. Res. Toxicol. 14:7:767-790 (2000))。フィルター付きかどうかにかかわらず、米国の巻きタバコの主流煙は以下を含む：(測定は、ng/巻きタバコ): 9-180ng NNK、50-500ng NNN、3-25ng NABおよび55-300ng NAT（Hoffmann、et al.、J. Toxicol. Environ. Health 41:1-52 (1994)）。かかるTSNAの間接喫煙における量は主流煙におけるよりも5-10倍多いということに注意することが重要である（Hoffmann、et al (1994)）。
【０１４５】
Xie et al. (2004)は、QPTの下方制御によりニコチンを低下させたGEタバコであるVector 21-41は、総アルカロイド量が約 2300 ppmであり、これは野生型タバコの10 パーセント未満であることを報告した。Vector 21-41 巻きタバコからの主流煙は、野生型タバコから作られる標準的なフルフレーバー(full flavor)の巻きタバコからの量と比較してNNN、NAT、NAB およびNNKが10 パーセント未満であった。
【０１４６】
対応するタバコアルカロイド前駆体量の低下によりTSNA量を低下させる戦略は現在、農学のタバコ研究において非常に注目されている（Siminszky et al.、Proc. Nat. Acad. Sci. USA 102(41) 14919-14924 (2005)）。したがって、すべてのTSNAの形成を低下させるために、遺伝子操作により可能な限り前駆体ニコチン類縁アルカロイド量を低下させる緊急の必要がある。
【０１４７】
特に、米国特許第5,803,081号、6,135,121号、6,805,134号、6,907,887号および6,959,712号および米国特許出願公開第2005/0034365号および2005/0072047号は、タバコ特異的ニトロソアミン(TSNA)を低下させる方法を記載している。  
【０１４８】
ニコチンを低下させたタバコ製品は、葉タバコ、粉砕タバコ、刻みタバコおよびタバコ画分の形態のいずれであってもよい。ニコチンを低下させたタバコ製品には、禁煙用のニコチンを低下させたGEタバコから作られた、巻きタバコ、葉巻タバコ、嗅ぎタバコ、かみタバコ、パイプタバコ、および巻きタバコが含まれる。
【０１４９】
ニコチンを低下させたタバコは、再構成タバコ (レコン(Recon))の製造にも用いることが出来る。レコンは、タバコ茎および/または小（smaller)葉粒子から、典型的な製紙に非常に類似した工程によって作られる。この工程は、レコンにされる様々なタバコ部分の加工および、タバコの、全葉タバコからできた粉砕タバコに類似する大きさと形への切断を必要とする。この切断したレコンは粉砕タバコと混合され、巻きタバコの製造に使用される。
【０１５０】
従来のタバコ製品、例えば、巻きタバコおよび葉巻タバコに加えて、ニコチンを低下させたタバコは、タンパク質、繊維、エタノール、および動物用飼料のソースとして利用することが出来る。米国特許出願公開第2002/0197688号を参照。例えば、ニコチンを低下させたタバコはRubisco (リブロース二リン酸カルボキシラーゼ・オキシゲナーゼまたは画分1タンパク質)のソースとして用いることが出来る。というのはその他の植物と異なり、タバコ由来のRubiscoは、結晶形態にて容易に抽出できるからである。メチオニン量がわずかに低いことを除いては、Rubiscoの必須アミノ酸含量は、FAOの暫定的アミノ酸パターンと同等かそれを上回る(Ershoff、B.H.、et al. Society for Experimental Biology and Medicine 157:626-630 (1978); Wildman、S.G. Photosynthesis Research 73:243250 (2002))。
【０１５１】
再生不可能なエネルギー源に対する世界の依存の大部分を置換するためのバイオ燃料として、共生成物、例えば Rubisco、がこの再生可能なエネルギーを製造するためのコスト負担の補助に必要とされる（Greene et al,. Growing Energy How Biofuels Can End America's Oil Dependence; National Resources Defense Counsel (2004) ）。したがって、タバコにおけるニコチン類縁アルカロイドが低下するほど、タバコバイオマスシステムの成功可能性が高まる。
【０１５２】
ニコチンに関係する酵素をコードする配列の同定方法ならびに標的遺伝子を導入して形質転換植物体を作る方法の具体的な実施例を以下に示す。それらは例示的なものであって、本発明を限定するものではない。
【０１５３】
実施例 1: A622 発現の下方制御によるアルカロイド含量低下のためのpRNAi-A622 ベクターの調製
プラスミド pHANNIBAL（Wesley et al.、Plant J. 27: 581-590 (2001) を参照）を改変して図 2に示すプラスミド pHANNIBAL-X を作製した。アンピシリン耐性遺伝子 (Amp)と35S プロモーターとの間のSacI 制限酵素認識部位を、SacI 切断および続いてDNA 平滑末端化およびライゲーションによって除いた。マルチクローニングサイト(MCS)を以下のように改変した。Bam H I 制限酵素認識部位をXhoIおよびEcoRI 部位の間にアダプター (5' TCGAACGGGATCCCGCCGCTCGAGCGG)を挿入することによって、プロモーターとPdk イントロンの間のMCS に付加した。アダプター (5' GATCAGCTCTAGAGCCGAGCTCGC)をBamHIおよびXbaI 部位の間に挿入することによってイントロンとターミネーターとの間のMCSからBam H1 部位を除き、Sac I 部位を挿入した。
【０１５４】
植物 RNAi バイナリーベクターを図 3に示す模式図を用いてpHANNIBAL-Xを用いて調製した。このとき、まず別々の「センス」および「アンチセンス」断片を、目的遺伝子のセグメントの末端に特定の制限酵素認識部位を付加することによって得て、次いでこれらセンスおよびアンチセンス断片を改変pHANNIBAL-X プラスミド中に所望の配向にて挿入した。
【０１５５】
センスおよびアンチセンス断片ならびに介在する Pdk イントロンを含むDNA セグメントをpBI121のGUS コード領域(Wesley et al.、2001,)と置換してRNAi バイナリーベクターを作製した。
【０１５６】
A622 cDNA の814 bp-1160 bp 領域をdsRNA 形成領域 (センス鎖、アンチセンス鎖)として用いた。鋳型としてpcDNAIIにクローニングされた示されたA622 cDNAおよび所定の制限酵素部位をコードするさらなる塩基を有するプライマーを用いてPCRを行い、標的 DNA 断片を回収し、pGEM-T ベクターにTAクローニングした。
【０１５７】
用いたプライマーの配列は以下の通り:
センス鎖 A622 F814-XhoI - A622 R1160-KpnI 
A622 F814-XhoI：5' CCGCTCGAGCGGTCAGAGGAAGATATTCTCCA 3'
A622 R1160-KpnI：5' GGGGTACCCCTGGAATAAGACGAAAAATAG 3'
アンチセンス 鎖 A622 F814-XbaI - A622 R1160-ClaI
A622 F814-XbaI：5' GCTCTAGAGCTCAGAGGAAGATATTCTCCA 3'
A622 R1160-ClaI：5' CCATCGATGGTGGAATAAGACGAAAAATAG 3'
【０１５８】
改変pHANNIBAL-Xとの組換えはセンス鎖から開始して次いでアンチセンス鎖を用いて行った。TAクローニングしたDNA 断片を適当な制限酵素で切り出し、回収し、同じ制限酵素で切断したpHANNIBAL-Xにライゲーションした。その結果得られたプラスミドはPdk イントロンによって分離されたA622 断片の逆位反復のDNA 配列を含んでいた。
【０１５９】
RNAi 領域を、組み込んだセンスおよびアンチセンス鎖を有するpHANNIBAL-XからBamH I およびSac Iで処理することにより切り出し、GUS コード領域を類似の処理によって除いたpBI121にライゲーションし、植物形質転換用バイナリーベクター pRNAi-A622を得た。これはnptII 選抜マーカーカセットおよびA622 RNAi カセットを含むT-DNA セグメント (図 4)を含んでいる。
【０１６０】
実施例 2:タバコ BY-2 細胞におけるA622の抑制
タバコ BY-2の細胞培養では通常ニコチン類縁アルカロイドは合成されないが、ジャスモン酸メチル処理によって、ニコチン生合成経路における既知の酵素の遺伝子の発現が誘導され、ニコチン類縁アルカロイドの形成が起こる。
【０１６１】
A622の機能を推定するために、タバコ BY-2細胞でpRNAi-A622由来のmRNA を発現しA622が抑制される、RNAi 系統培養細胞を調製した。
【０１６２】
アグロ形質転換
ベクター (pRNAi-A622)でアグロバクテリウム・トゥメファシエンス株 EH105を形質転換し、これをタバコ BY-2 細胞の形質転換に用いた。タバコ BY-2 細胞に感染させ、選抜する方法は以下の通りとした。
【０１６３】
100 mlの改変LS培地（Imanishi et al.、Plant Mol. Biol.、38: 11011111 (1998) を参照）中で7 日間培養した4mlのBY-2 細胞を、100 ml 改変LS培地に継代し、4 日間培養した。
【０１６４】
YEB 培地で1日培養した100μlのアグロバクテリウム・トゥメファシエンス溶液を、4 日間培養した4 mlの細胞に添加し、これらを暗所で27℃で40 時間共存培養した。
【０１６５】
培養後、細胞を改変LS培地で２回洗浄し、アグロバクテリウムを除いた。
【０１６６】
洗浄した細胞をカナマイシン (50 mg/l)およびカルベニシリン (250 mg/l)を含有する改変LS選抜培地に播き、形質転換細胞を選抜した。
【０１６７】
約 2 週間暗所で27℃で培養した後、形質転換細胞を新しい改変LS選抜培地に移し、暗所で1週間27℃で培養した。
【０１６８】
形質転換細胞を30 mlの液体改変LS培地中で27℃で1週間暗所で懸濁培養した。
【０１６９】
1 mlの形質転換培養細胞を100 mlの改変LS培地に継代した。形質転換細胞を7 日毎に野生型細胞と同様に継代した。
【０１７０】
アルカロイド合成
各10 mlの7 日間培養した形質転換BY-2 細胞および緑色蛍光タンパク質 (GFP) 発現ベクターをコントロールとして用いて形質転換したタバコ培養細胞を2,4-Dを含まない改変LS培地で２回洗浄し、2,4-Dを含まない改変LS培地を加え計100 mlにした後、12 時間27℃で懸濁培養した。
【０１７１】
DMSO で50 μMに希釈しておいた100 μlのジャスモン酸メチル (MeJa)を添加した後、細胞を48 時間27℃で懸濁培養した。
【０１７２】
ジャスモン酸処理した細胞をろ過し、収集し、凍結乾燥した。0.1 N硫酸3 mlを50 mgの凍結乾燥サンプルに添加した。混合物を15 分間超音波処理し、ろ過した。28% アンモニウム溶液を1 mlのろ液に添加し、10 分間15000 rpmで遠心分離した。
【０１７３】
1mlの上清をExtrelut-1 カラム (Merck)に添加し、5 分間静置した。これを6 mlのクロロホルムで溶出した。溶出液を減圧下で37℃でエバポレーター (Taitec Concentrator TC-8)を用いて乾燥させた。
【０１７４】
乾燥サンプルを50 μlの0.1% ドデカンを含有するエタノール溶液に溶解した。キャピラリーカラムおよびFID 検出器を備えたガスクロマトグラフ (GC-14B)を用いてサンプルを分析した。RESTEC Rtx-5Amine カラム (Restec)をキャピラリーカラムとして用いた。カラム温度は100 ℃に10分間維持し、150 ℃に25 ℃/分で昇温し、150 ℃で1分間保持し、170 ℃に1 ℃/分で昇温し、170 ℃で2分間保持し、300 ℃に30 ℃/分で昇温し、300 ℃で10分間保持した。注入および検出器の温度は300 ℃であった。1μlの各サンプルを注入し、ニコチン類縁アルカロイドを内部標準法により定量した。
【０１７５】
図 5に示すように、A622 遺伝子発現がRNAiにより抑制されている形質転換 BY-2 系統において(A3、A21 A33 およびA43 系統)、ジャスモン酸による誘発は、コントロール細胞系統と比較して、アナタビン (誘発後の培養細胞における主要なアルカロイド)、アナタリン、ニコチン、またはアナバシンの高蓄積をもたらさなかった。
【０１７６】
RNA 発現
A622-RNAi 系統におけるアルカロイド蓄積の低下が、ニコチン生合成経路における既知の酵素の遺伝子発現量に対する間接的効影響ではなく、A622 発現の低下に特異的に関連しているかを判定するために、A622およびその他の遺伝子の発現量を、ジャスモン酸メチル処理系統、形質転換系統およびコントロール系統において測定した。
【０１７７】
トータルRNAを50 μM MeJAで48時間処理された野生型および形質転換 BY-2 細胞系統から単離した。特定の遺伝子のRNA量はRT-PCRにより測定した。RNAを製造業者の指示に従って RNeasy Plant mini kit (Qiagen)を用いて抽出した。cDNAをランダムヘキサマーおよびSuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)を用いて合成した。RT-PCRは5ngのcDNAを鋳型としてTaKaRa ExTaq (Takara Bio)を用いて以下の条件で行った: A622、NBB1、AO、QS、QPT、ODC の検出について、94 ℃30 秒 22 サイクル、57 ℃30 秒、および72 ℃30 秒、PMTの検出について、94 ℃1分 24 サイクル、52 ℃30 秒、および72 ℃1分。
【０１７８】
A622 プライマー: 
A622-07F 5' ATGGTTGTATCAGAGAAAAG
A622-05R 5' CCTTCTGCCTCTATCATCCTCCTG
【０１７９】
NBB1 プライマー:
NBB1-01F 5'ATGTTTCCGCTCATAATTCTG
NBB1-l365 5'TCTTCGCCCATGGCTTTTCGGTCT
【０１８０】
AO プライマー:
AO RT-1 5' CAAAACCAGATCGCTTGGTC
AO RT-2 5' CACAGCACTTACACCACCTT
【０１８１】
QS プライマー:
QS RT-1 5' CGGTGGAGCAAAAGTAAGTG
QS RT-2 5' GAAACGGAACAATCAAAGCA
【０１８２】
QPT プライマー:
QPT RT-1 5' TCACTGCTACAGTGCATCCT
QPT RT-2 5' TTAGAGCTTTGCCGACACCT
【０１８３】
ODC プライマー:
ODC RT-1 5' CGTCTCATTCCACATCGGTAGC
ODC RT-2 5' GGTGAGTAACAATGGCGGAAGT
【０１８４】
PMT プライマー:
PMT RT-1 5' GCCATGATAATGGCAACGAG
PMT RT-2 5' TTAGCAGCGAGATAAGGGAA
【０１８５】
図 6に示すように、A622はA622-サイレンシング系統では誘導されなかった。その他のニコチン生合成経路酵素の既知遺伝子は誘導されていた。これらの結果は、A622がニコチン類縁アルカロイド生合成経路に含まれていることの証拠を提供し、ニコチン-産生能を有する植物細胞のニコチン類縁アルカロイド含量、特にニコチン含量をA622 発現を下方制御することによって低下させることができることを示す。
【０１８６】
実施例 3:誘導性 A622 RNAi ベクターの構築
タバコ毛状根におけるA622 発現の構成的抑制は顕著に根の成長を阻害するため、ニコチン類縁アルカロイドの分析の妨げとなる。これを避けるために、エストラジオール-誘導性遺伝子発現系 (XVE システム)を開発した。XVE システムはRNAi ヘアピン分子を産生し、標的遺伝子は誘導物質 (ベータ-エストラジオール)の培地への添加後にのみ抑制される。
【０１８７】
A622 センスおよびアンチセンス DNA 断片を含むRNAi 領域をXho IおよびXba I によりpHANNIBAL-X プラスミドから切り出し、Xho IおよびXba I で消化しておいたpBluescript KSにライゲーションした。RNAi 領域を次いでXho IおよびSpe Iにより切り出し、XVE ベクター pER8 (Zuo J. et al、Plant J.、24: 265-273 (2000)) のMCS におけるXhoIおよびSpeI 部位の間にサブクローニングして、バイナリーベクター pXVE-A622RNAiを得た。
【０１８８】
pXVE-A622RNAiのT-DNA 領域(図 7を参照)は、キメラ 転写因子 XVEのエストラジオール-誘導性発現のためのカセット、hpt 選抜マーカーカセット、およびA622 RNAiの発現がLexA-46 プロモーターの制御下にあり、XVEによって活性化されるカセットを含む。
【０１８９】
実施例 4: タバコ毛状根におけるA622の抑制
バイナリーベクター pXVE-A622RNAiをエレクトロポレーションによってアグロバクテリウム・リゾゲネス 株 15834に導入した。タバコ（N.tabacum cv. Petit Havana）SR1 植物を、Kanegae et al.、Plant Physiol. 105(2):483-90. (1994)に記載のリーフディスク法を用いてアグロバクテリウム・リゾゲネスで形質転換した。ハイグロマイシン耐性 (B5 培地中15 mg/L)を用いて形質転換された根を選抜した。形質転換毛状根を27℃で暗所で培養した。
【０１９０】
pXVE-A622RNAiからのT-DNAを担持する形質転換毛状根をB5 培地で10 日間培養し、次いで、遺伝子サイレンシングを17-ベータ-エストラジオール (2 μM)の添加により4 日間誘導した。RT-PCR 分析により、エストラジオール-誘導性 A622 抑制コンストラクトで形質転換されたタバコ毛状根系統 A8およびA10でエストラジオール添加後に、A622 発現が効果的に抑制されたことが示された。図 8Aを参照。
【０１９１】
トータルRNAを毛状根からRNeasy Plant mini kit (Qiagen)を用いて抽出した。cDNAをランダムヘキサマーおよびSuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR (Invitrogen)を用いて合成した。RT-PCRは2.5ngのcDNAを鋳型とし、 TaKaRa ExTaq (Takara Bio)を用いて以下の条件で行った: A622の検出について、94 ℃30 秒 22 サイクル、57 ℃30 秒、および72 ℃30 秒;α-チューブリン の検出について、94 ℃1分 24 サイクル、52 ℃30 秒、および72 ℃1分。
【０１９２】
A622 検出用プライマー;
A622-07F 5' ATGGTTGTATCAGAGAAAAG
A622-05R 5' CCTTCTGCCTCTATCATCCTCCTG
【０１９３】
α-チューブリン検出用プライマー;
Tub RT-1 5' AGTTGGAGGAGGTGATGATG
Tub RT-2 5' TATGTGGGTCGCTCAATGTC
【０１９４】
誘導性 A622 抑制コンストラクトで形質転換された毛状根系統について、エストラジオールによる抑制の誘導無し(-)および誘導後(+)における、ニコチン含量を測定した。図 8B のRT-PCRグラフは A622 発現は既に部分的にエストラジオール誘導前に抑制されていたことを示す。これは特に#8 系統について当てはまる。ニコチン含量はA622 抑制系統によって異なっていたがA622 抑制系統の方が野生型毛状根よりも低かった。
【０１９５】
実施例 5: NIC 座により調節される遺伝子としてのNBB1の同定
ニコチアナ・シルベストリス-由来cDNA ライブラリーから調製したcDNA マイクロアレイ (Katoh et al.、Proc. Japan Acad.、Vol. 79、Ser. B、No. 6、pp. 151-154 (2003))を用いてニコチン生合成調節性NIC 座によって制御される新規遺伝子を探索した。
【０１９６】
ニコチアナ・シルベストシス cDNAをPCRにより増幅し、ミラーコートしたスライド (type 7 star、Amersham)にAmersham Lucidea アレイスポッターを用いてスポッティングした。DNAをスライド表面にUV 架橋 (120 mJ/m2)によって固定化した。タバコバーレー(N.tabacum Burley) 21の小植物 (WTおよび nic1nic2)をAgripot 容器 (Kirin)中で1.5% (W/V) スクロースおよび0.35% (W/V) ジェランガム (Wako)を追加した二倍希釈 B5 培地で培養した。
【０１９７】
８週齡小植物の根を収集し、すぐに液体窒素で凍結し、-80 ℃で使用時まで維持した。トータルRNAを凍結した根からPlant RNeasy Mini kit (Qiagen)を用いて単離し、mRNAをGenElute mRNA Miniprep kit (Sigma)を用いて精製した。cDNAを0.4μgの精製mRNAからLabelStar Array Kit (Qiagen)を用いてCy3またはCy5-dCTP (Amersham) の存在下で合成した。マイクロアレイスライドへのcDNA ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション後の洗浄をLucida Pro hybrid-machine (Amersham)を用いて行った。マイクロアレイをFLA-8000 スキャナー (Fujifilm)を用いてスキャンした。獲得したアレイ像のシグナル強度をArrayGauge ソフトウェア (Fujifilm)によって定量した。野生型およびnic1nic2 タバコからのcDNA プローブを逆のペアの組合せでCy3およびCy5で標識した。ハイブリダイゼーションシグナルを色素の総シグナル強度を考慮することにより規準化した。nic1nic2 プローブと比較して２倍を超える強度で野生型プローブとハイブリダイズしたcDNA クローンを同定したろところ、そこにNBB1が含まれていた。
【０１９８】
全長 NBB1 cDNAを、SMART RACE cDNA Amplification Kit (Clontech)を用いてタバコ(N.tabacum)のトータルRNAからの5'- および3'- RACEにより得た。
【０１９９】
NBB1 cDNA インサートのヌクレオチド配列を両鎖についてABI PRISM（登録商標） 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems)および BigDye（登録商標） Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems)を用いて決定した。NBB1のヌクレオチド配列を配列番号3に示す。このヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を配列番号4に示す。タンパク質配列はFAD-結合モチーフを含む。推定液胞シグナルペプチドはN-末端に位置している。
【０２００】
実施例 6: NBB1の特徴決定 
タバコ植物におけるNBB1 発現をノザンブロット分析により調べた。
【０２０１】
RNA をジャスモン酸メチル蒸気により処理された植物体から抽出し、これには、タバコ cv. バーレー 21 (Nicotiana tabacum cv.Barley 21)(以下WTと略記する)およびバーレー 21 バックグラウンドに導入した突然変異を有する突然変異体 nic1、nic2およびnic1 nic2の各変異体を用いた。栽培は無菌密閉環境で行い、植物は2ヶ月25℃で150 μモル光子/m2 の光(16時間明期、8時間暗期)を用いて1/2 x B5 培地 (3% スクロース、0.3% ジェランガム)で成育させた。ジャスモン酸メチル処理は、0.5 mLの100 μM ジャスモン酸メチルを、植物を含む固体培地容量が 80 cm3 であり気体容量が250 cm3であるAgripot 容器 (Kirin、Tokyo)に添加することによって行った。処理時間は0時間および24時間に設定した。根部分および葉部分 (全部で7〜10 葉の植物体からの第２から第６の葉)を植物体から収集し、すぐに液体窒素で凍結保存した。
【０２０２】
RNAを製造業者のプロトコールにしたがってRNeasy Midi Kit (Qiagen)を用いて抽出した。但し、ポリビニルピロリドンをRLTに濃度1%にて添加した。カラム操作を２回行ってRNAの純度を上昇させた。
【０２０３】
RNA ブロッティングはSambrook and Russell (Sambrook、J. et al.、Molecular Cloning、Cold Spring Harbor Laboratory、Chapter 7 (2001))に記載の常套方法にしたがって行った。
【０２０４】
NBB1 ヌクレオチド配列 (配列番号3)の1278 bpから末端(1759 bp)までの配列断片をプローブ鋳型として用いた。鋳型は以下のプライマーを用いるPCRを用いてcDNA クローンからの増幅によって調製した:
プライマー 1: GGAAAACTAACAACGGAATCTCT
プライマー 2: GATCAAGCTATTGCTTTCCCT 
【０２０５】
プローブを製造業者の指示に従ってBcabest labeling kit (Takara)を用いて32Pで標識した。ハイブリダイゼーションは、ULTRAhyb (Ambion) をバッファーとして用いて製造業者のプロトコールにしたがって行った。
【０２０６】
PMT プローブは大腸菌中のpcDNAII ベクターにクローニングしたPMT 配列から調製した(Hibi et al.、1994)。プラスミドをQIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen)を用いて大腸菌から抽出し、精製し、制限酵素 XbaIおよび HindIIIで常套方法によって処理し、アガロースゲル電気泳動にかけ、約 1.5 kb DNA 断片を回収した。QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を回収に用いた。回収したDNA 断片をNBB1 プローブに用いたのと同じ方法により32Pで標識し、ハイブリダイズさせた。結果を図 9に示す。
【０２０７】
図 9に明らかに示されるように、NBB1およびPMTはタバコ植物において同じ発現様式を有する。NBB1がニコチン生合成に関与しているという証拠は、PMTおよびA622と同様に、NBB1がNIC 遺伝子の制御下にあり、PMTおよびA622と類似の発現様式を示すことである。
【０２０８】
実施例 7: NBB1の系統学的分析
NBB1 ポリペプチドはハナビシソウのベルベリン架橋酵素 (BBE)に対して25%の同一性および60%の相同性を有する (Dittrich H. et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、Vol. 88、9969-9973 (1991))。NBB1 ポリペプチドとEcBBEとのアラインメントを図 10に示す。
【０２０９】
系統樹をNBB1 ポリペプチドおよび植物 BBE様ポリペプチドの配列を用いて(Carter and Thornburg、Plant Physiol. 134、460-469 (2004)に基づいて）構築した。系統学的分析はCLUSTAL W プログラムによる近隣結合法を用いて行った。数は1,000 反復によって得たブートストラップ値を示す。用いた配列は以下の通り: EcBBE、ハナビシソウ BBE (GenBank 受入番号 AF005655); PsBBE、ケシ (Papaver somniferum)レチクリンオキシダーゼ候補(AF025430); BsBBE、メギ (Berberis stolonifera) BBE (AF049347); VuCPRD2、ササゲ (Vigna unguiculata) 乾燥誘導タンパク質 (AB056448); NspNEC5、タバコ sp. Nectarin V （Nicotiana sp. Nectarin V)(AF503441/AF503442); HaCHOX、ヒマワリ (Helianthus annuus) 糖質オキシダーゼ (AF472609); LsCHOX、レタス (Lactuca sativa) 糖質オキシダーゼ (AF472608);および27のシロイヌナズナ遺伝子 (At1g01980、At1g11770、At1g26380、At1g26390、At1g26400、At1g26410、At1g26420、At1g30700、At1g30710、At1g30720、At1g30730、At1g30740、At1g30760、At1g34575、At2g34790、At2g34810、At4g20800、At4g20820、At4g20830、At4g20840、At4g20860、At5g44360、At5g44380、At5g44390、At5g44400、At5g44410、およびAt5g44440)。
【０２１０】
結果を図 11に示す。別々のクレードからの３つの既知のBBEに下線を示し、「True BBEs」と示す。NBB1の配列はBBE またはBBE様タンパク質のいずれとも高度には類似しておらず、系統樹の基部で他の配列から分かれている。タバコ属からの唯一の示されたその他のBBE 様タンパク質であり、交配種の花卉タバコ（Nicotiana langsdorffii X N. sanderae）（Carter and Thornburg (2004)）の花蜜において報告されているタンパク質であるネクタリン(nectarin)Vは、ササゲ乾燥誘導タンパク質およびいくつかのシロイヌナズナからの推定BBE様タンパク質とクラスターを形成している。花卉タバコの花蜜はアルカロイドを含まず、ネクタリン Vはグルコースオキシダーゼ活性を有するため、ネクタリン V は花における抗菌防御に関与しており、アルカロイド合成には役割を果たしていないようであると結論された（前掲）。
【０２１１】
実施例 8: NBB1 抑制コンストラクトの調製
NBB1 cDNA の342-bp DNA 断片を以下のプライマーを用いてPCRで増幅し、pGEM-T ベクターにクローニングした。
アンチセンス鎖
NBB1-20F-EcoRI   5' CCGGAATTCGCACAGTGGAATGAAGAGGACG 3'
NBB1-18R-XhoI   5' CCGCTCGAGGCGTTGAACCAAGCATAGGAGG 3'
センス鎖 
NBB1-16F-ClaI    5' CCATCGATGCACAGTGGAATGAAGAGGACG 3'
NBB1-19R-XbaI   5' GCTCTAGAGCGTTGAACCAAGCATAGGAGG 3'
【０２１２】
その結果得られたPCR 産物をアンチセンス挿入のためにEcoRI および XhoIで消化し、センス鎖挿入のために ClaIおよび XbaIで消化した。センス DNA 断片をpHANNIBAL-Xにサブクローニングし、次いでアンチセンス断片を挿入した。その結果得られたプラスミドはPdk イントロンにより分断されたNBB1 断片の逆反復配列を含んでいた。
【０２１３】
RNAi 領域を pHANNIBAL-XからBamH IおよびSac Iで切り出し、pBI121にライゲーションしてGUS コード領域と置換し、バイナリーベクター pRNAi-NBB1を得た。pHANNIBAL-NBB1 3'のT-DNA 領域(図 12を参照)はnptII 選抜マーカーカセットおよび NBB1の3' 断片に対応する二本鎖領域を有するヘアピン RNAiの発現のためのカセットを含む。
【０２１４】
実施例 9: タバコ BY-2 細胞におけるNBB1 抑制
タバコ BY-2 細胞のジャスモン酸メチル処理はニコチン生合成経路の既知の酵素に対する遺伝子の発現に加えてNBB1 発現を誘導する。NBB1 抑制の効果をBY-2 細胞において試験した。
【０２１５】
ベクター pRNAi-NBB1をアグロバクテリウム・トゥメファシエンス 株 EHA105に導入し、これをタバコ BY-2 細胞の形質転換に用いた。BY-2 細胞を100 mlの改変LS培地で培養した。YEB 培地中のアグロバクテリウム・トゥメファシエンス 細胞 (100 μl) を4 mlのBY-2 細胞に添加し、40 時間、暗所で27 ℃で培養した。感染したタバコ細胞を２回改変LS培地で洗浄した後、洗浄したタバコ細胞をカナマイシン (50 mg/l)およびカルベニシリン (250 mg/l)を含む改変LS寒天培地に播いた。27 ℃で暗所で2 週間培養した後、成育しているタバコカルスを同じ抗生物質を含む新しいLS 選抜培地に移し、暗所で27 ℃でさらに１週間培養した。成育しているタバコ細胞を抗生物質を含まない液体改変LS培地に移した。形質転換タバコ細胞を7日間隔で継代した。
【０２１６】
タバコ培養細胞を2,4-Dを含まない改変LS培地で27℃で12 時間培養した。DMSO に溶解した100 μlのジャスモン酸メチル (MeJA)を100 mLのタバコ 懸濁培養に終濃度50 μMとなるように添加した後、タバコ細胞をさらに48 時間培養した。MeJA-処理細胞をろ過し、回収し、凍結乾燥した。3 mlの0.1 N硫酸を100 mgの凍結乾燥サンプルに添加した。混合物を15 分間超音波処理し、ろ過した。28% アンモニウム溶液を1 mlのろ液に添加し、10 分間15000 rpmで遠心分離した。1 mlの上清をExtrelut-1 カラム (Merck) に添加し、6 mlのクロロホルムで溶出した。溶出液を減圧下で37℃でエバポレーター (Taitec Concentrator TC-8)を用いて乾燥させた。乾燥サンプルを0.1% ドデカンを含む50 μlのエタノール溶液に溶解した。キャピラリーカラム およびFID 検出器を備えたガスクロマトグラフ (GC-14B)を用いてサンプルを分析した。RESTEC Rtx-5Amine カラム (Restec)をキャピラリーカラムとして用いた。カラム温度を100 ℃に10分維持し、150 ℃に25 ℃/分で昇温し、150 ℃で1分保持し、170 ℃に1 ℃/分で昇温し、170 ℃で2分保持し、300 ℃ に30 ℃/分で昇温し、次いで300 ℃で10分保持した。注入および検出器温度は300 ℃であった。1μlの各サンプルを注入し、ニコチン類縁アルカロイドを内部標準法により定量した。
【０２１７】
ジャスモン酸メチル誘発の後のニコチン類縁アルカロイドの蓄積は野生型タバコ細胞と比較してNBB1-抑制BY-2 細胞系統(N37およびN40)において劇的に低下していた (図 5を参照)。
【０２１８】
NBB1-RNAi 系統におけるアルカロイド蓄積の低下が、ニコチン生合成経路における既知の酵素の遺伝子発現量に対する間接的な影響によるものではなく、NBB1 発現の低下に特異的に関連しているかどうかを判定するために、NBB1および他の遺伝子の発現量をジャスモン酸メチル処理形質転換系統およびコントロール系統において測定した。
【０２１９】
トータルRNAを50 μM MeJAで48時間処理した野生型および形質転換 BY-2 細胞系統から単離した。特定の遺伝子のRNA量をRT-PCRで測定した。結果を図 6に示す。
【０２２０】
NBB1-サイレンシング系統においてNBB1の誘導は観察されず、ニコチン生合成経路の既知の遺伝子の誘導はA622の誘導と同様に起こっていた。NBB1の誘導はA662-抑制系統において影響されないことにも注意されたい。
【０２２１】
これらの結果は、NBB1 レダクターゼがニコチン類縁アルカロイド生合成経路に含まれること、およびニコチン-産生能を有する植物細胞のニコチン類縁アルカロイド含量、特に、ニコチン含量がNBB1 発現の下方制御により低下させることが出来ることを示す。
【０２２２】
実施例 10:タバコ毛状根におけるNBB1 抑制
タバコ SR-1 毛状根はニコチンを主要なアルカロイドとして蓄積する。NBB1 抑制の毛状根におけるアルカロイド蓄積に対する効果を研究した。
【０２２３】
バイナリーベクター pRNAi-NBB1 3'をエレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・リゾゲネス 株 15834に導入した。タバコ（N.tabacum cv. Petit Havana SR1） 植物を上記のタバコ毛状根におけるA622の抑制のようにリーフディスク法を用いてアグロバクテリウム・リゾゲネスで形質転換した。毛状根を選抜し、培養し、上記のようにアルカロイドを抽出し、精製し、分析した。
【０２２４】
NBB1 発現をRNAiにより抑制した場合、形質転換根系統 (HN6、HN19、HN20 およびHN29)ではコントロール細胞系統と比較して、ニコチン含有量が顕著に低下しており、アナタビン含有量も低下していた(図 13を参照)。
【０２２５】
pHANNIBAL-NBB1 3'を担持する形質転換毛状根をB5 培地で2週間培養し、遺伝子発現をRT-PCRで分析した。NBB1 発現は４つの形質転換系統で特異的に抑制されていた(図 14を参照)。その他のニコチン生合成酵素の遺伝子の発現には影響は無かった。 
【０２２６】
結果は、ニコチン生合成経路の既知酵素の遺伝子発現の欠損ではなく、NBB1 発現の低下の結果、ニコチン蓄積が低下することを示した。
【０２２７】
実施例 11:形質転換タバコ植物におけるNBB1 抑制
NBB1-aatB1 および attB1 アダプターのプライマー対、およびNBB1-attB2と attB2 アダプターのプライマー対を用いてpGEM-T ベクター中のNBB1 cDNAから２つのattB-NBB1 断片をPCRで増幅した。
遺伝子特異的 プライマー:
NBB1-attB1 5' AAAAAGCAGGCTTCGAAGGAGATAGAACCATGGTTCCGCTCATAATTCTGATCAGCTT
NBB1-attB2 5' AGAAAGCTGGGTCTTCACTGCTATACTTGTGCTCTTGA
アダプタープライマー:
attB1 アダプター  5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT
attB2 アダプター  5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT
【０２２８】
用いたPCR条件は製造業者によって推奨されているものであった。エントリークローン pDONR221-NBB1-1はattB-NBB1 PCR 産物とpDONR221 (Invitrogen)とのBP 組換え反応により作製した。
【０２２９】
NBB1 ORFをpDONR221-NBB1-1 ベクターから、CaMV35S プロモーターの下でGUS 部分断片とともにdsRNA を発現するよう設計された(Dr. Ko Shimamoto、NAIST) GATEWAY バイナリーベクター pANDA 35HKに、LR 反応によって移した。その結果得られたNBB1 RNAi ベクターをpANDA-NBB1fullと称する。
【０２３０】
pANDA-NBB1fullのT-DNA (図 15を参照)はnptII 選抜マーカーカセット、NBB1の全長コード領域がGUSリンカーに分断された逆反復配列で存在するNBB1 RNAi カセット、および hpt 選抜マーカーカセットを含む。
【０２３１】
バイナリーベクター pANDA-NBB1fullをエレクトロポレーションによりアグロバクテリウム・トゥメファシエンス 株 EHA105に導入した。タバコ（N.tabacum cv. Petit Havana SR1） 植物を、Kanegae et al.、Plant Physiol. 105、483-490 (1994)に記載されているリーフディスク法を基本としてアグロバクテリウム・トゥメファシエンスで形質転換した。ハイグロマイシン耐性 (MS 培地中30 mg/L)を選抜に用いた。形質転換植物を記載されているようにリーフディスクから再生し、27℃で連続光下で成育チャンバ内で成育させた。
【０２３２】
葉組織を36 日間成育させたT0 世代植物から収集した。アルカロイドを上記のように抽出し、精製し、分析した。NBB1 抑制ベクター pANDA-NBB1fullにより形質転換された系統からの植物の葉におけるニコチン量は野生型と比較して低下していた(図 16を参照)。形質転換系統(#6、#14 および#22)の葉に含まれるニコチン量は野生型植物におけるニコチン量の約 16%しかなかった。
【図面の簡単な説明】
【０２３３】
【図１】図 1は、ニコチン生合成経路を示す。略記は以下の通り: AO = アスパラギン酸オキシダーゼ、QS = キノリン酸シンターゼ、QPT = キノリン酸ホスホリボシル基転移酵素、ODC = オルニチン脱炭酸酵素、PMT = プトレッシンＮメチル基転位酵素、およびDAO = ジアミンオキシダーゼ。
【図２】図 2Aは、pHANNIBAL を模式的に示す。図 2Bは、マルチリンカーサイトが改変されたpHANNIBAL-Xを模式的に示す。
【図３】図 3は、中間体プラスミドとして改変pHANNIBAL-Xを用いる植物 RNAi バイナリーベクターの調製のためのスキームを示す。
【図４】図 4は、pRNAi-A622のT-DNA 領域を示す。
【図５】図 5は、BY-2 細胞、A662サイレンシングBY-2 細胞およびNBB1サイレンシングBY-2 細胞におけるニコチン類縁アルカロイドの蓄積を示す。
【図６】図 6は、A622、NBB1、およびニコチン生合成経路の既知の酵素の遺伝子の、野生型 BY-2 細胞、A622サイレンシングBY-2 細胞およびNBB1サイレンシングBY-2 細胞における発現を示す。
【図７】図 7は、誘導性 A622 発現ベクター pXVE-A622RNAiのT-DNA 領域を示す。
【図８】図 8Aは、エストラジオール誘導性 A622発現抑制コンストラクトによって形質転換された毛状根系統における、エストラジオールによる誘導後のA622発現の特異的抑制を示す。図 8Bは、エストラジオール誘導性 A622発現抑制コンストラクトによって形質転換された毛状根系統株における、エストラジオールによる誘導後のニコチン含量の低下を示す。
【図９】図 9は、野生型タバコおよびnic1、nic2、およびnic1nic2 突然変異体の根および葉組織におけるNBB1 発現およびPMT 発現のRNA ブロット分析を示す。
【図１０】図 10は、NBB1とハナビシソウ（Eschscholzia californica）ベルベリン架橋酵素 (EcBBE)とのアラインメントを示す。
【図１１】図 11は、NBB1および植物 BBE-様タンパク質配列を用いて作製した系統樹を示す。
【図１２】図 12は、NBB1 抑制ベクター pHANNIBAL-NBB1 3'のT-DNA 領域を示す。
【図１３】図 13は、NBB1-抑制タバコ毛状根におけるニコチン類縁アルカロイド合成の低下を示す。
【図１４】図 14は、NBB1-サイレンシングおよびコントロール毛状根系統におけるNBB1、A622、およびニコチン生合成に関与する既知の酵素の発現を示す。
【図１５】図 15は、NBB1 抑制ベクター pANDA-NBB1fullのT-DNA 領域を示す。
【図１６】図 16 は、NBB1 抑制ベクター pANDA-NBB1fullで形質転換された系統からのタバコ(Nicotiana tabacum)植物の葉におけるニコチン量を示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
2008531038000001.xml
【手続補正書】
【提出日】平成19年10月29日(2007.10.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
2008531038000001.app
【国際調査報告】
2008531038.tif 000022
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