(57)【要約】【解決手段】  本発明は二本鎖組成物を提供し、各鎖はβ−Ｄ−リボヌクレオシドおよび糖修飾ヌクレオシドの位置によって定義されているモチーフを保持するように修飾されている。より具体的には、本発明はギャップトモチーフを保持する一方の鎖と、ギャップトモチーフ、ヘミマーモチーフ、ブロックマーモチーフ、完全に修飾されたモチーフ、位置的に修飾されたモチーフ、または交互モチーフを保持するもう一方の鎖とを有する。前記鎖の少なくとも１つは標的核酸に相補的である。前記組成物は、選択された核酸を標的化し、１若しくはそれ以上の遺伝子の発現を調節するのに有用である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は標的ＲＮＡの一部にハイブリダイズし、その結果、前記標的ＲＮＡの正常機能を損失させるものである。本発明は、遺伝子発現を調節する方法も提供する。【選択図】      なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
第一のオリゴマー化合物と第二のオリゴマー化合物とを有する組成物であって、
前記第一のオリゴマー化合物の少なくとも一部は、前記第二のオリゴマー化合物の少なくとも一部とハイブリダイズすることができるものであり、
前記第一のオリゴマー化合物の少なくとも一部は、選択された標的核酸と相補的であり、ハイブリダイズすることができるものであり、
第一および第二のオリゴマー化合物の１つは、インターヌクレオシド結合基によって結合されているヌクレオシドを有し、前記結合されたヌクレオシドはギャップトモチーフを有するものであり、
もう１つの前記第一および第二のオリゴマー化合物は、インターヌクレオシド結合基によって結合されたヌクレオシドを有し、前記結合されたヌクレオシドはギャップトモチーフ、交互モチーフ、位置的に修飾されたモチーフ、または完全に修飾されたモチーフを有するものであり、
前記組成物はさらに、１若しくはそれ以上の選択的なオーバーハング、リン酸部位、共役基、又はキャッピング基を有するものであり、
この時、前記第一および第二のオリゴマー化合物それぞれは個別に、ギャップトモチーフを有し、次に前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの３’または５’末端の少なくとも一方は、２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシド以外の修飾ヌクレオシドを有する、または前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つは、非対称ギャップトモチーフを有するものである、組成物。
【請求項２】
請求項１記載の組成物において、ギャップトモチーフを有する各オリゴマー化合物は、結合ヌクレオシドの外部領域２つに隣接した結合ヌクレオシドの内部領域を有し、前記内部領域のヌクレオシドは前記外部領域それぞれのヌクレオシドと異なり、前記外部領域それぞれのヌクレオシドは個別に２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、および二環式糖部位を有するヌクレオシドから選択されるものである。
【請求項３】
請求項２記載の組成物において、ギャップトモチーフを有する前記オリゴマー化合物の少なくとも１つの内部領域は、β−Ｄ−リボヌクレオシド配列である。
【請求項４】
請求項２記載の組成物において、ギャップトモチーフを有する前記オリゴマー化合物の少なくとも１つの内部領域は、修飾ヌクレオシド配列である。
【請求項５】
請求項４記載の組成物において、前記修飾ヌクレオシドは、２’−Ｆ修飾ヌクレオシドまたは４’−チオ修飾ヌクレオシドから選択されるものである。
【請求項６】
請求項２記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つは、対称ギャップトモチーフを有するものである。
【請求項７】
請求項２記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つは、非対称ギャップトモチーフを有するものである。
【請求項８】
請求項７記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物のもう一方は、対称ギャップトモチーフを有するものである。
【請求項９】
請求項２記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つは、２’−修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項１０】
請求項９記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの各外部領域は、２’−修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項１１】
請求項９記載の組成物において、前記２’−置換基それぞれは個別に、ハロ、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ―（ＣＨ２）２―Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）であり、各ＲｍおよびＲｎは個別に、Ｈ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。
【請求項１２】
請求項１１記載の組成物において、前記２’−修飾基それぞれは個別に、−Ｆ、−ＯＣＨ３、または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３である。
【請求項１３】
請求項２記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つは、４’−チオ修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項１４】
請求項２記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つは、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項１５】
請求項１４記載の組成物において、前記４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドの２’−置換基は、ハロゲン、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ―（ＣＨ２）２―Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択されるものであり、各ＲｍおよびＲｎは個別に、Ｈ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。
【請求項１６】
請求項１５記載の組成物において、前記２’−置換基のそれぞれは個別に、−Ｆ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３である。
【請求項１７】
請求項１６記載の組成物において、前記２’−修飾基のそれぞれは個別に、−ＯＣＨ３、または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３である。
【請求項１８】
請求項２記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つは、二環式糖部分を有するものである。
【請求項１９】
請求項１８記載の組成物において、前記二環式糖部分はそれぞれ個別に、２’−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−４’架橋を有し、ｎは１または２である。
【請求項２０】
請求項１記載の組成物において、前記第一オリゴマー化合物はギャップトモチーフを有するものである。
【請求項２１】
請求項２０記載の組成物において、前記ギャップトオリゴマー化合物の外部領域は、それぞれ個別に、４’−チオ修飾ヌクレオシドまたは２’−修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項２２】
請求項２０記載の組成物において、前記ギャップトオリゴマー化合物の外部領域の１つは４’−チオ修飾ヌクレオシドを有し、もう一方の外部領域は２’−修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項２３】
請求項２２記載の組成物において、前記第一オリゴマー化合物の５’−末端に位置する前記外部領域は、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｆ、または４’−チオ修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項２４】
請求項２２記載の組成物において、前記２’−修飾ヌクレオシドは、２’−ＯＣＨ３または２’−Ｆ修飾ヌクレオシドである。
【請求項２５】
請求項２４記載の組成物において、前記２’−修飾ヌクレオシドは、２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシドである。
【請求項２６】
請求項１記載の組成物において、前記第二のオリゴマー化合物はギャップトモチーフを有するものである。
【請求項２７】
請求項２６記載の組成物において、前記ギャップトオリゴマー化合物の外部領域は、２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、または二環式糖部分を有するヌクレオシドを有するものである。
【請求項２８】
請求項２７記載の組成物において、前記ギャップトオリゴマー化合物の外部領域の少なくとも１つは、ハロゲン、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ―（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択される２’−修飾ヌクレオシドを有するものであり、各ＲｍおよびＲｎは個別に、Ｈ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。
【請求項２９】
請求項２８記載の組成物において、前記ギャップトオリゴマー化合物の外部領域の少なくとも１つは、アリル、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ２〜Ｃ１０アルキル、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、または２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から選択される２’−修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項３０】
請求項２９記載の組成物において、前記２’−修飾基のそれぞれは、−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３である。
【請求項３１】
請求項１記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つは、二環式糖部分を有するものである。
【請求項３２】
請求項３１記載の組成物において、前記二環式糖部分はそれぞれ個別に２’−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−４’架橋を有し、ｎは１または２である。
【請求項３３】
請求項２記載の組成物において、ギャップトモチーフを有する前記オリゴマー化合物の各外部領域は、それぞれ個別に約１〜約６ヌクレオシドを有するものである。
【請求項３４】
請求項２記載の組成物において、ギャップトモチーフを有する前記オリゴマー化合物の各外部領域は、それぞれ個別に約１〜約４ヌクレオシドを有するものである。
【請求項３５】
請求項２記載の組成物において、ギャップトモチーフを有する前記オリゴマー化合物の各外部領域は、それぞれ個別に約１〜約３ヌクレオシドを有するものである。
【請求項３６】
請求項１記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の１つは、下記の構造式：
５’−Ａ（−Ｌ−Ｂ−Ｌ−Ａ）ｎ（−Ｌ−Ｂ）ｎｎ−３’
を有する交互モチーフを有するものであり、
各Ｌは、個別にインターヌクレオシド結合基であり、
各Ａは、β−Ｄ−リボヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドであり、
各Ｂは、β−Ｄ−リボヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドであり、
ｎは、約７〜約１１であり、
ｎｎは、０または１であり、
各Ａヌクレオシドを有する前記糖部分は同一であり、各Ｂヌクレオシドを有する前記糖部分は同一であり、前記Ａヌクレオシドの糖部分は前記Ｂヌクレオシドの糖部分とは異なり、ＡおよびＢの少なくとも１つは糖修飾ヌクレオシドである。
【請求項３７】
請求項３６記載の組成物において、各Ａまたは各Ｂは、β−Ｄ−リボヌクレオシドである。
【請求項３８】
請求項３６記載の組成物において、各Ａまたは各Ｂは、２’−修飾ヌクレオシドであり、前記２’−置換基は、ハロゲン、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ―（ＣＨ２）２―Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−（ＣＨ２）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され、各ＲｍおよびＲｎは個別に、Ｈ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。
【請求項３９】
請求項３８記載の組成物において、前記２’−置換基は、アリル、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、または２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３である。
【請求項４０】
請求項３９記載の組成物において、前記２’−置換基はＯ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３である。
【請求項４１】
請求項３６記載の組成物において、各ＡおよびＢは修飾ヌクレオシドである。
【請求項４２】
請求項４１記載の組成物において、各ＡおよびＢの一方は、２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項４３】
請求項４２記載の組成物において、各ＡおよびＢのもう一方は、２’−Ｆ修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項４４】
請求項３６記載の組成物において、前記第二のオリゴマー化合物は交互モチーフを有し、各Ａおよび各Ｂの一方はβ−Ｄ−リボヌクレオシドである。
【請求項４５】
請求項４４記載の組成物において、各Ａおよび各Ｂのもう一方は、２’−修飾ヌクレオシドを有するものである。
【請求項４６】
請求項４５記載の組成物において、前記２’−修飾ヌクレオシドの各２’−置換基は、アリル、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、または２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３である。
【請求項４７】
請求項４６記載の組成物において、前記２’−修飾ヌクレオシドの各２’−置換基は、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３である。
【請求項４８】
請求項３６記載の組成物において、各Ｌは個別に、ホスホジエステル、またはホスホロチオエートインターヌクレオシド結合基である。
【請求項４９】
請求項１記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の１つは、完全に修飾されたモチーフを有し、前記オリゴマー化合物の各ヌクレオシドは基本的に糖修飾ヌクレオシドであり、各糖修飾は同じである。
【請求項５０】
請求項４９記載の組成物において、各糖修飾ヌクレオシドは、２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、および二環式糖部分を有するヌクレオシドから選択されるものである。
【請求項５１】
請求項５０記載の組成物において、前記完全に修飾されたオリゴマー化合物の各ヌクレオシドは、２’−修飾ヌクレオシドである。
【請求項５２】
請求項５１記載の組成物において、前記完全に修飾されたオリゴマー化合物の各ヌクレオシドは、２’−ＯＣＨ３、または２’−Ｆ修飾ヌクレオシドである。
【請求項５３】
請求項５２記載の組成物において、前記完全に修飾されたオリゴマー化合物の各ヌクレオシドは、２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシドである。
【請求項５４】
請求項４９記載の組成物において、前記３’および５’末端の１若しくは両方は、β−Ｄ−リボヌクレオシドである。
【請求項５５】
請求項１記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の一方は、位置的に修飾されたモチーフを有するものである。
【請求項５６】
請求項５５記載の組成物において、位置的に修飾されたモチーフを有する前記オリゴマー化合物は、約４〜約８領域から成る結合ヌクレオシドの連続配列を有するものであって、各領域は、β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列または糖修飾ヌクレオシドの配列であり、前記領域は交互であり、前記β−Ｄ−リボヌクレオシド領域のそれぞれは、糖修飾ヌクレオシドの領域によって両側に隣接され、糖修飾ヌクレオシドの各領域は、片側にのみ隣接されるであろう３’および５’末端に位置付けられた領域を除き、β−Ｄ−リボヌクレオシド領域によって両側に隣接されるものであり、前記糖修飾ヌクレオシドは、２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、および二環式糖部分を有するヌクレオシドから選択されるものである。
【請求項５７】
５〜７領域を有する、請求項５６記載の組成物。
【請求項５８】
請求項５６記載の組成物において、前記β−Ｄ−リボヌクレオシド領域のそれぞれは、長さ２〜８ヌクレオシドを有するものである。
【請求項５９】
請求項５６の組成物において、前記糖修飾ヌクレオシド領域のそれぞれは、長さ１〜４ヌクレオシドを有するものである。
【請求項６０】
請求項５９の組成物において、前記糖修飾ヌクレオシド領域のそれぞれは、長さ２〜３ヌクレオシドを有するものである。
【請求項６１】
請求項５６記載の組成物において、位置的に修飾されたモチーフを有する前記オリゴマー化合物は以下の化学式を有するものであり、
（Ｘ１）ｊ−（Ｙ１）ｉ−Ｘ２−Ｙ２−Ｘ３−Ｙ３−Ｘ４
Ｘ１は、１〜約３の糖修飾ヌクレオシドの配列であり、
Ｙ１は、１〜約５のβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、
Ｘ２は、１〜約３の糖修飾ヌクレオシドの配列であり、
Ｙ２は、２〜約７のβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、
Ｘ３は、１〜約３の糖修飾ヌクレオシドの配列であり、
Ｙ３は、４〜約６のβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、
Ｘ４は、１〜約３の糖修飾ヌクレオシドの配列であり、
ｉは、０または１であり、
ｊは、０または１であり、ｉが１の場合は１またはｉが０のとき０である。
【請求項６２】
請求項６１記載の組成物において、
Ｘ４は、３の糖修飾ヌクレオシドの配列であり、
Ｙ３は、５のβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、
Ｘ３は、２の糖修飾ヌクレオシドの配列であり、
Ｙ１は、２のβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列である。
【請求項６３】
請求項６２記載の組成物において、ｉは０であり、Ｙ２は７のβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列である。
【請求項６４】
請求項６２記載の組成物において、ｉは１であり、ｊは０であり、Ｙ２は２のβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、Ｙ１は５のβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列である。
【請求項６５】
請求項６２記載の組成物において、ｉは１であり、ｊは１であり、Ｙ２は２のβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、Ｙ１は３のβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、Ｘ１は２の糖修飾ヌクレオシドの配列である。
【請求項６６】
請求項６１記載の組成物において、前記糖修飾ヌクレオシドのそれぞれは、２’−修飾ヌクレオシド、または４’−チオ修飾ヌクレオシドである。
【請求項６７】
請求項５５記載の組成物において、前記第一鎖は、前記位置的モチーフを有するものである。
【請求項６８】
請求項１記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の各インターヌクレオシド結合基は個別に、ホスホジエステル、またはホスホロチオエートから選択されるものである。
【請求項６９】
請求項１記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物のそれぞれは個別、に約１２〜約３０ヌクレオシドを有するものである。
【請求項７０】
請求項１記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物のそれぞれは個別、に約１７〜約２３ヌクレオシドを有するものである。
【請求項７１】
請求項１記載の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物のそれぞれは個別に、約１９〜約２１ヌクレオシドを有するものである。
【請求項７２】
請求項１の組成物において、前記第一および第二のオリゴマー化合物は、相補的アンチセンス／センスｓｉＲＮＡ二本鎖を形成するものである。
【請求項７３】
細胞、組織、または動物の遺伝子発現を阻害する薬物の調合における、請求項１記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連文献の相互参照
本明細書は、１）２００４年６月２９日に出願された米国仮出願番号第６０／５８４，０４５号および２００４年９月７日に出願された米国仮出願番号第６０／６０７，９２７号、２）２００４年６月３日に出願された米国一部継続出願番号第１０／８５９，８２５号および２００４年９月２０日に出願された米国出願番号第１０／９４６，１４７号、および３）２００４年６月３日に出願された国際出願の一部継続出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７４８５号およびに２００４年６月３日に出願された国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００４／０１７５２２号対して優先権を主張しており、それぞれの全体はこの参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、遺伝子発現を調節するオリゴマー化合物を有する組成物を提供する。１実施形態において、そのような調節はＲＮＡ干渉経路を介してなされる。本発明の調節オリゴマー化合物は、野生型核酸と比較して、様々な物理的特性および特質を増強できるモチーフを有している。より詳しくは、両鎖の調節は、ＲＮＡｉ経路などの選択された経路においてそれら特定の役割の有効性を最大限にするように、各鎖を非依存的に増強することを可能にする。前記組成物は、例えば選択された核酸分子を標的にし、１若しくはそれ以上の遺伝子の発現を調節するのに有用である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は標的ＲＮＡの一部にハイブリダイズし、その結果、前記標的ＲＮＡの正常機能を損失させるものである。
【背景技術】
【０００３】
多くの生物種において、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入は、強力且つ特異的な遺伝子サイレンシングを誘発する。この現象は、植物及び動物の両者で起き、ウイルス防御及びトランスポゾンサイレンシング機構の役割を有するものである。この現象は、もともとは、ペチュニア花を研究する研究者らによって１０年以上前に最初に報告されたものである。これらの花の紫色を濃くしようとして、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎらは、強力なプロモーターの制御下で色素産生遺伝子を導入した。濃い紫色を期待していたが、多くの花は、色がまだらになったり白くなるものさえあった。これは前記導入遺伝子及び相同の内在性遺伝子の両方の発現が抑制されたためであることから、Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎは、観察された現象を"共抑制"と名付けた（Ｎａｐｏｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，１９９０，２，２７９−２８９；Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９６，３１，９５７−９７３）。
【０００４】
その後、共抑制は植物、菌類の多くの生物種で起こることが発見されているが、特にアカパンカビにおいて特に顕著に見出すことができ、"クエリング（ｑｕｅｌｌｉｎｇ）"として知られている（Ｃｏｇｏｎｉ  ａｎｄ  Ｍａｃｉｎｏ，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２０００，１０，６３８−６４３；Ｇｕｒｕ，Ｎａｔｕｒｅ，２０００，４０４，８０４−８０８）。
【０００５】
ｄｓＲＮＡが動物において遺伝子サイレンシングを導くことができるという最初の証拠は、線形動物であるＣ．ｅｌｅｇａｎｓ（エレガンス線虫）の研究によってもたらされた。１９９５年に、研究者ＧｕｏおよびＫｅｍｐｈｕｅｓは、その機能を推定するために、アンチセンスＲＮＡの使用を試み、ｐａｒ−１遺伝子の発現を停止した。予想されたように、前記アンチセンスＲＮＡの注入はｐａｒ−１の発現を破壊したが、奇妙なことにそのセンス鎖コントロールの注入でも発現は破壊された（Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１９９５，８１，６１１〜６２０）。この結果は、Ｆｉｒｅらが線虫にｄｓＲＮＡ（センスおよびアンチセンス鎖両者の混合）を注入するまで謎であった。この注入は、センス鎖またはアンチセンス鎖単独の注入より、より効果的なサイレンシングをもたらした。細胞に対して少量のｄｓＲＮＡ分子の注入は、相同性遺伝子の発現を完全にサイレンス化するのに十分であった。その上、虫の腸へのｄｓＲＮＡの注入は、その虫全体だけでなく第一世代子孫においても遺伝子サイレンシングを引き起こした（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，８０６〜８１１）。
【０００６】
この現象の効力によって、ＴｉｍｍｏｎｓおよびＦｉｒｅらは、線虫ｕｎｃ−２２遺伝子に相同的なｄｓＲＮＡを発現するように設計した線形動物細菌を与えることによってｄｓＲＮＡ効果の限界を探索することになった。驚くことに、これらの虫はｕｎｃ−２２ヌル様表現型を発生した（Ｔｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９５，８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｇｅｎｅ，２００１，２６３，１０３〜１１２）。更なる研究によって、ｄｓＲＮＡ中に虫を浸漬してもサイレンシングを誘導することができることが示された（Ｔａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，４３０〜４３１）。国際公開公報番号第ＷＯ０１／４８１８３号には、線形動物における標的遺伝子の発現を阻害する方法が開示されており、これには線虫による食物生物体の消化に続いて、前記標的遺伝子の一部と実質的に同一なヌクレオチド配列を有する二本鎖ＲＮＡ構造を産生できる食物生物体を前記虫に与える工程、または前記二本鎖ＲＮＡ構造を産生することができるＤＮＡを導入する工程が含まれている。
【０００７】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）への暴露に起因した線虫において定義された転写後遺伝子サイレンシングは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と表された。この用語は、共抑制とは違って、トランスジェニックＤＮＡは導入遺伝子および内因性遺伝子の両者のサイレンシングを導く、内因性標的ｍＲＮＡレベルの配列特異的減少を導くｄｓＲＮＡに関する遺伝子サイレンシングの全ての形態を一般化するようになった。
【０００８】
線虫への外因性二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）の導入は、相同性配列を含む遺伝子の活性を特異的に且つ強力に破壊することを示した。Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙらは、ｄｓＲＮＡの主要な干渉効果は転写後であると示唆し、この結論はｄｓＲＮＡ仲介性干渉後の主要ＤＮＡ配列の検討、すなわち改変の証拠がないという発見の後のその下流遺伝子の活性には影響を及ぼさない上流オペロンの改変を含む研究に由来している。これらの結果は転写の開始または延長における影響に反する。最終的に彼らは、転写産物の細胞質蓄積は実質的に排除された一方、ｄｓＲＮＡ仲介性干渉によって、完全ではないが核における新生転写産物の蓄積における実質的な減少を産生したことをｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって観察した。これらの結果は、内因性ｍＲＮＡは干渉の主要な標的であることを示し、翻訳が起こる前に前記標的ｍＲＮＡを分解するメカニズムを示唆するものであった。また、このメカニズムは、異常なメッセージを標的化し破壊することに関与する線虫におけるｍＲＮＡ監視システムであるＳＭＧシステムに依存しないことも見出された。その著者はさらに、ｄｓＲＮＡが分解のために相同性ｍＲＮＡを標的化する触媒性メカニズムとしてどのように機能するかのモデルを示唆した（Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５０２〜１５５０７）。
【０００９】
多くのＲＮＡｉの特徴を再現するシンシチウム胚盤葉ショウジョウバエ胚からの無細胞システムの開発が報告された。この反応において観察された干渉は、配列特異的であり、一本鎖ＲＡではなくｄｓＲＮＡによって促進され、特異的ｍＲＮＡ分解によって機能し、ｄｓＲＮＡの最小長を必要とする。その上、ｄｓＲＮＡのプレインキュベーションはその活性を増強し、これはＲＮＡｉが可溶性反応における配列特異的工程によって仲介され得ることを示している（Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９９，１３，３１９１〜３１９７）。
【００１０】
一連の実験において、Ｔｕｓｃｈｌらはショウジョウバエｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを用いて、２１−および２２−ｎｔ  ＲＮＡ断片はＲＮＡｉの配列特異的メディエーターであることを示した。これらの断片（低分子干渉ＲＮＡｓ（ｓｉＲＮＡ）と名付けられた）は、長ｄｓＲＮＡからＲＮａｓｅ  ＩＩＩ様プロセシング反応によって産生されることが示された。彼らはさらに、オーバーハング３’末端を有する化学的に合成されたｓｉＲＮＡ二本鎖はショウジョウバエ可溶化液において効率的な標的ＲＮＡ切断を仲介し、その切断部位は誘導ｓｉＲＮＡによって広がった領域の中心付近に位置付けられていることを示した。さらに彼らは、ｄｓＲＮＡプロセシングの方向性は、センスまたはアンチセンス標的ＲＮＡがｓｉＲＮＡ−タンパク質複合体によって切断され得るかどうかを決定すると示唆した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，２００１，１５，，１８８〜２００）。さらに２１〜２３ヌクレオチドｓｉＲＮＡに起因する内因性および異種性遺伝子の発現の抑制に関する特徴は、ヒト胚性腎臓（２９３）およびＨｅＬａ細胞を含むいくつかの哺乳類細胞株において調査された（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４〜４９８）。
【００１１】
Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎらは、実は、アンチセンス極性の一本鎖ＲＮＡオリゴマーは遺伝子サイレンシングの強力な誘導因子となり得ることを示していた。共抑制の場合のように、彼らは、アンチセンスＲＮＡはＲＮＡｉ遺伝子ｒｄｅ−１およびｒｄｅ−４とは個別に働くが、変異誘発物／ＲＮＡｉ遺伝子ｍｕｔ−７および仮想ＤＥＡＤｂｏｘＲＮＡヘリカーゼであるｍｕｔ−１４を必要とすることを示した。著者によると、彼らのデータは、遺伝子サイレンシングは、続いて分解されるｄｓＲＮＡを導く型としてｍＲＮＡを用いたＲＮＡプライマー伸長によって達成されるという仮説を支持し、これは一本鎖ＲＮＡオリゴマーがＲＮＡｉ現象に最終的に関与していることを示唆するものである（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５，６９４〜６９７）。
【００１２】
いくつかのほかの刊行物は、ＲＮＡｉ活性に必要とされるｄｓＲＮＡトリガーに対する構造的必要性を記載していた。最近の報告は、理想的なｄｓＲＮＡ配列は２ｎｔ  ３’末端オーバーハングを含む長さ２１ｎｔであると示唆した（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ（２００１），２０，６８７７〜６８８７，Ｓａｂｉｎｅ  Ｂｒａｎｔｌ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ，２００２，１５７５，１５〜２５）。このシステムにおいて、３’末端から２’−デオキシヌクレオシドでの４ヌクレオシドの置換は、活性に影響を及ぼさないことを示した。一方、配列（センスまたはアンチセンス）に亘る２−デオキシヌクレオシドまたは２’−ＯＭｅ−ヌクレオシドでの置換は、ＲＮＡｉ活性に対して有害であることが示された。
【００１３】
線虫におけるＲＮＡサイレンシングに対する構造的必要性の調査は、インターヌクレオチド結合の修飾（ホスホロチオエート）によって活性を干渉しないことを示した（Ｐａｒｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，２０００，６，１０７７〜１０８７）。２’−アミノまたは５’−ヨードウリジンのような化学修飾はｄｓＲＮＡのセンスにおいてよく許容されるがアンチセンス鎖では許容されないことがＰａｒｒｉｓｈらによって示され、これはＲＮＡｉの２つの鎖は異なる役割を担っていることを示唆するものであった。グアニンからイノシンへ（１つの水素結合を失う）などの塩基修飾は、修飾の位置（センスまたはアンチセンス）とは関係なくＲＮＡｉ活性を減少することが示された。同じ「位置とは無関係な」活性の減少は、ｄｓＲＮＡトリガーにおけるミスマッチの導入に続いて観察された。修飾のいくつかのタイプ、例えば５−ヨードＵなどの立体的に要求される塩基の導入は、アンチセンス鎖に位置付けられた場合、ＲＮＡｉ活性に有害であることが示された一方、センス鎖に位置付けられた修飾はＲＮＡｉ活性に対する有害度はより少ないと示された。２１ｎｔ  ｄｓＲＮＡ配列の場合のように、ＲＮＡ−ＤＮＡヘテロ二本鎖はＲＮＡｉに対するトリガーとして働かなかった。しかしながら、２’−Ｆ−２’−デオキシヌクレオシドを含むｄｓＲＮＡは、２’−Ｆ−２’−デオキシヌクレオシドの位置（センスまたはアンチセンス）とは関係なくＲＮＡｉ反応の引き金を引くのに有効であるように見られた。
【００１４】
１実験において、遺伝子発現の減少は、移植後マウス胚において電気穿孔ｄｓＲＮＡおよび２５ｍｅｒモルフォリノを用いて研究された（Ｍｅｌｌｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２００２，１１８，５７〜６３）。このモルフォリノオリゴマーは、活性を示したがｄｓＲＮＡと同程度有効ではなかった。
【００１５】
多くのＰＣＴ出願がＲＮＡｉ減少に関連して公開されている。これらは：国際公開公報番号第ＷＯ００／４４８９５号；国際公開公報番号ＷＯ００／４９０３５号；国際公開公報番号ＷＯ００／６３３６４号；国際公開公報番号ＷＯ０１／３６６４１号；国際公開公報番号ＷＯ０１／３６６４６号；国際公開公報番号ＷＯ９９／３２６１９号；国際公開公報番号ＷＯ００／４４９１４号；国際公開公報番号ＷＯ０１／２９０５８号；および国際公開公報番号ＷＯ０１／７５１６４号を含む。
【００１６】
米国特許番号第５，８９８，０３１号明細書および第６，１０７，０９４号明細書には、ＲＮＡ様特性を有する特定のオリゴヌクレオチドが記載されている。ＲＮＡとハイブリダイズした場合、これらオリゴヌクレオチドはｄｓＲＮＡ酵素の基質としての役目をし、その結果前記酵素によるＲＮＡの切断が生じる。
【００１７】
別の刊行物において（Ｍａｒｔｉｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００２，１１０，５６３〜５７４）、一本鎖ｓｉＲＮＡと同様に二本鎖ｓｉＲＮＡは、ｅｌＦ２Ｃ１およびｅｌＦ２Ｃ２（ヒトＧＥＲｐ９５０  Ａｒｇｏｎａｕｔｅタンパク質）と共にＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に存在することが示された。５’−リン酸化一本鎖ｓｉＲＮＡの活性は、このシステム研究において二本鎖ｓｉＲＮＡと同程度であった。関連研究において、５’−リン酸化部位の封入は、ショウジョウバエ胚におけるｓｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの活性を増強することが示された（Ｂｏｕｔｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．，２００１，１１，１７７６〜１７８０｝。別の研究において、５’−リン酸化はヒトＨｅＬａ細胞におけるｓｉＲＮＡ機能に必要であったことが報告された（Ｓｃｈｗａｒｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ，２００２，１０，５３７〜５４８）。
【００１８】
非修飾組成物と比較して安定性および効力を含む特性を増強しようと試みるために、ｓｉＲＮＡ組成物に多種多様な化学修飾を行った。初期の研究の多くは、他の鎖は非修飾で保持しながら１本鎖の修飾を観察していた。より最近の研究は、両鎖の修飾に焦点を当てていた。
【００１９】
１グループは、各鎖が交互性パターンを有する（ここにおいて各ヌクレオシドまたは修飾ヌクレオシドのブロックは非修飾β−Ｄ−リボヌクレオシドと交互に現れる）ようにｓｉＲＮＡ二本鎖の両鎖を修飾するという研究をしている。修飾部位で使用された化学修飾は、２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシドである（２００４年２月１８日に公開された欧州公開公報番号第ＥＰ１３８９６３７  Ａ１号、および２００４年２月１９日に公開された国際公開公報番号第ＷＯ２００４０１５１０７号を参照）。
【００２０】
別のグループは、両鎖に修飾を有した多数のｓｉＲＮＡコンストラクトを調製した（２００３年８月２８日に公開された国際公開公報番号第ＷＯ０３／０７０９１８号を参照）。開示された前記コンストラクトは通常、鎖の修飾によって、さらにはその鎖におけるプリンおよびピリミジンの位置付けによって決定付けられるパターンで分散したヌクレオシドを修飾した。一般的に、アンチセンス鎖におけるプリンは２’−ＯＣＨ３または２’−Ｈ、ピリミジンは２’−Ｆであり、センス鎖におけるプリンは２’−Ｈ、ピリミジンは２’−ＯＣＨ３または２’−Ｆである。本明細書において使用された定義に従うと、これらのコンストラクトは置換パターンに対するセットモチーフがないように位置的に修飾されるように見え、位置的な修飾はランダム置換パターンを表すことができる。
【００２１】
二環性糖部位を有する特定のヌクレオシド化合物は、固定核酸またはＬＮＡとして知られている（Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９８，５４，３６０７〜３６３０）。これらの化合物は、その文献内で二環式ヌクレオチド類似体としても言及されているが（Ｉｍａｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，国際出願番号第ＷＯ９８／３９３５２号）、この用語はＬＮＡに加えて他の類似体を含む化合物の属にも適用可能である。そのような修飾ヌクレオシドは、結合親和性の増強、およびヌクレアーゼに対する抵抗性の増加という利点を有した未変性リボヌクレオシドの３’−エンド糖立体配座を模倣する。
【００２２】
１グループは最近、ｓｉＲＮＡ二本鎖内にそれぞれ４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋を有する、二環式ヌクレオシドの取り込みは、増強されたヌクレアーゼ抵抗性を介して、血清における半減期を劇的に改善し、増加した親和性によって前記二本鎖安定性も増加したことを報告した。この効果は、ｓｉＲＮＡ二本鎖内の特異的位置として位置付けられた最低ＬＮＡを有するように見られた。センス鎖の５’末端へのＬＮＡの配置は、標的ではない効果を軽減するこの鎖の荷重を軽減するように見られた（Ｅｌｍｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２００５，３３（１），４３９〜４４７）。
【００２３】
いくつかのＬＮＡは、糖環の４’炭素原子に結合している２’−ヒドロキシル基を有しており、それにより二環式糖部位を形成している。この結合は、２’酸素原子および４’炭素原子とを架橋するメチレン（−ＣＨ２−）ｎ基となり、ここにおいてｎは１または２である（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５〜４５６；米国特許公開公報番号第：第ＵＳ２００２／０１４７３３２号、および日本出願番号第平−１１−３３８６３号（１９９９年２月１２日））。
【００２４】
米国公開公報番号第２００２／００６８７０８号には、様々な立体構造および化学組成物を含む二環式糖を作る様々な架橋を保持する様々な二環式等部位を有する、多数のヌクレオシドが開示されている。
【００２５】
Ｂｒａａｓｈら（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００３，４２，７９６７〜７９７５）は、ｓｉＲＮＡの有効性を損なうことなくＬＮＡ修飾ｓｉＲＮＡの熱安定性を改善することを報告した。Ｇｒｕｎｗｅｌｌｅｒら（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，３１，３１８５〜３１９３）は、特定のＬＮＡギャップマーおよびｓｉＲＮＡの効力を開示した。
【００２６】
１グループは、形質細胞様樹状細胞における配列特異的ＴＬＲ７依存性免疫反応を誘発するｓｉＲＮＡ二本鎖内の９塩基配列を同定した。この免疫活性化は、３’末端でのセンス鎖の４’−ＣＨ２−Ｏ−２’架橋（ＬＮＡ）をそれぞれ有する４二環式ヌクレオシドの取り込みによって減少された。彼らはまた、１つの鎖はヌクレオシドを修飾され、もう一本は非修飾であるｓｉＲＮＡ二本鎖への取り込みに対するセンスおよびアンチセンスの５’、および３’と５’の両方バージョンも作成した（Ｈｏｒｎｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，１１（３）Ｉ，２６３〜２７０を参照）。
【００２７】
１グループの研究者は、シグナル伝達（インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦ１Ｒ）および分裂促進因子活性化タンパ質キナーゼ１（ＭＡＰＫ１４またはｐ３８α））に関与した２つの遺伝子のｓｉＲＮＡ誘導性サイレンシングの有効性および特異性に関するゲノムワイド解析を実行するために発現プロファイリングを使用した。ユニークな発現プロファイルは、ＭＡＰＫ１４を標的にした８ｓｉＲＮＡ、およびＩＧＦ１Ｒを標的にした１６ｓｉＲＮＡのそれぞれを生じ、これは標的ではない効果が特定の配列に高度に依存していることを示唆するものである。これらの発現パターンは各個人ｓｉＲＮＡを再産生可能であった。このグループは、標的ではない効果はｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖およびセンス鎖両方に起因すると決定した。アンチセンスのみを選択的に取り込み、その結果、ＲＩＳＣへ取り込まれたセンス鎖に起因する標的ではない効果を減少するように設計されたｓｉＲＮＡに対する必要性がある。
【００２８】
本明細書の同一出願人による多数の公開された出願は二本鎖組成物を開示しており、ここにおいて１若しくは両方の鎖は特定のモチーフを有する。このモチーフは、ヘミマー（ｈｅｍｉｍｅｒ）モチーフ、ブロックマー（ｂｌｏｃｋｍｅｒ）モチーフ、ギャップト（ｇａｐｐｅｄ）モチーフ、完全に修飾されたモチーフ、位置的に修飾されたモチーフ、および交互モチーフを含む（２００４年５月２７日に公開された国際出願番号第第ＷＯ２００４／０４４１３３号、３’−エンドモチーフ；２００４年１２月２９日に公開された国際出願番号第ＷＯ２００４／１１３４９６号、３’−エンドモチーフ；２００４年５月２７日に公開された国際出願番号第ＷＯ２００４／０４４１３６号、交互モチーフ；２００４年５月２７日に公開された国際出願番号第ＷＯ２００４／０４４１４０号、２’−修飾モチーフ；２００４年５月２７日に公開された国際出願番号第ＷＯ２００４／０４３９７７号、２’−Ｆモチーフ；２００４年５月２７日に公開された国際出願番号第ＷＯ２００４／０４３９７８号、２’−ＯＣＨ３モチーフ；２００４年５月２１日に公開された国際出願番号第ＷＯ２００４／０４１８８９号、多環式糖モチーフ；２００４年５月２７日に公開された国際出願番号第ＷＯ２００４／０４３９７９号、糖代用モチーフ；および２００４年５月２７日に公開された国際出願番号第ＷＯ２００４／０４４１３８号、キメラモチーフを参照、さらに２００５年４月１４日に公開された米国出願番号第ＵＳ２００５００８０２４６号も参照のこと）。
【００２９】
ＲＮＡｓｅ  Ｈ経路のように、遺伝子発現のアンチセンス調節のＲＮＡ干渉経路は、特異的遺伝子産物のレベルを調節するための有効手段であり、従って遺伝子サイレンシングに関わる多くの治療、診断および研究適用に比類なく有用であると分かる。従って、本発明はさらにＲＮＡ干渉などの作用アンチセンスメカニズム、ｄｓＲＮＡ酵素、さらには非アンチセンスメカニズムに依存している経路を含む、遺伝子発現経路を調節するのに有用な組成物を提供する。この開示を一度理解した本分野の当業者は、過度な実験をすることなしに、これらの使用のための付加的な組成物を同定することができるであろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００３０】
１実施形態において、本発明は第一のオリゴマー化合物と第二のオリゴマー化合物とを有する組成物を提供し、ここにおいて前記第一の少なくとも一部は前記第二のオリゴマーの少なくとも一部とハイブリダイズすることができ、前記第一のオリゴマー化合物の少なくとも一部は選択された核酸標的と相補的でありハイブリダイズすることができるものである。第一および第二のオリゴマー化合物の１つは、インターヌクレオシド結合基によって結合されているヌクレオシドを有し、前記結合されたヌクレオシドはギャップトモチーフを有するものである。もう１つの前記第一および第二のオリゴマー化合物は、インターヌクレオシド結合基によって結合されたヌクレオシドを有し、前記結合されたヌクレオシドはギャップトモチーフ、交互モチーフ、位置的に修飾されたモチーフ、完全に修飾されたモチーフ、ブロックマーモチーフ、またはヘミマーモチーフを有するものである。
【００３１】
前記組成物はさらに、任意のオーバーハング、リン酸部分、共役基、もしくはキャップ（キャッピング）基の１若しくはそれ以上を有する。前記第一および第二のオリゴマー化合物それぞれが個別にギャップトモチーフを有する場合、少なくとも１つの前記第一および第二のオリゴマー化合物の３’または５’末端少なくとも１つが２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチド以外の修飾ヌクレオチドを有するか、または少なくとも１つの前記第一および第二のオリゴマー化合物が非対称ギャップトモチーフを有する。
【００３２】
１実施形態において、ギャップトモチーフを有する各オリゴマー化合物は結合ヌクレオシドの外部領域に隣接された結合ヌクレオシドの内部領域を有し、前記内部領域のヌクレオシドは前記外部領域それぞれのヌクレオシドと異なり、前記外部領域それぞれのヌクレオシドは２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、および二環式糖部分を有するヌクレオシドから個別に選択される。１実施形態において、ギャップトモチーフを有する前記オリゴマー化合物の少なくとも１つの内部領域が、β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列である。別の実施形態において、ギャップトモチーフを有する前記オリゴマー化合物の少なくとも１つの内部領域が、修飾ヌクレオシド配列と２’−Ｆまたは４’−チオ修飾ヌクレオシドである。
【００３３】
１実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の１つは、対称ギャップトモチーフを有する。別の実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つは、非対称ギャップトモチーフを有する。更なる実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の一方は対称ギャップトモチーフを有し、前記第一および第二のオリゴマー化合物のもう一方は非対称ギャップトモチーフを有する。
【００３４】
別の実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つは、２’−修飾ヌクレオシドを有する。更なる実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域それぞれは２’−修飾ヌクレオシドを有する。
【００３５】
１実施形態において、前記オリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つは、２’−修飾ヌクレオシド内で修飾され、２’−修飾のそれぞれは個別に、ハロ、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）であり、各ＲｍとＲｎが個別にＨ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１−Ｃ１０アルキルである。２’−修飾は、−Ｆ、−ＯＣＨ３、または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３を含む。
【００３６】
１実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つは、４’−チオ修飾ヌクレオシドを有する。別の実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つは、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドを有する。１実施形態において、前記４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドの２’−置換基はハロゲン、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され、各ＲｍおよびＲｎは個別にＨ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。１実施形態において、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドの各２’−置換基は、−Ｆ、−ＯＣＨ３、−ＯＣＦ３、または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３から選択され、−ＯＣＨ３または−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３が適している。
【００３７】
１実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つは二環式糖部分を有する。別の実施形態において、二環式糖部分のそれぞれは個別に、２’−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−４’架橋を有し、ｎは１または２である。
【００３８】
１実施形態において、前記第一のオリゴマー化合物はギャップトモチーフを有する。更なる実施形態において、前記第一のオリゴマー化合物はギャップトモチーフを有し、前記外部領域それぞれは個別に、４’−チオ修飾ヌクレオシドまたは２’−修飾ヌクレオチドを有する。別の実施形態において、前記第一オリゴマー化合物の前記外部領域の一方は、４’−チオ修飾ヌクレオシドを有し、もう一方の前記外部領域は、２’−修飾ヌクレオシドを有する。別の実施形態において、前記２’−修飾ヌクレオチドは２’−ＯＣＨ３または２’−Ｆ修飾ヌクレオシドであり、２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオチドが適している。別の実施形態において、前記第一のオリゴマー化合物の５’−末端に位置する外部領域は２’−ＯＣＨ３、２’−Ｆ、または４’−チオ修飾ヌクレオシドを有する。
１実施形態において、前記第二のオリゴマー化合物は、ギャップトモチーフを有する。別の実施形態において、前記第二のギャップトオリゴマー化合物の外部領域は、２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、または二環式糖部分を有するヌクレオシドを有する。更なる実施形態において、前記第二のギャップトオリゴマー化合物の外部領域の少なくとも１つは、ハロゲン、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、−ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され、各ＲｍおよびＲｎは個別に、Ｈ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。別の実施形態において、前記第二のギャップトオリゴマー化合物の外部領域の少なくとも１つは、アリル、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ２〜Ｃ１０アリル、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、または２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３から選択される２’−修飾ヌクレオシドを有する。別の実施形態において、前記第二ギャップトオリゴマー化合物の各２’−修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３修飾ヌクレオシドである。
【００３９】
別の実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の少なくとも１つの外部領域の少なくとも１つが、少なくとも１つの二環式糖部分を有する。前記外部領域の１つにおける各修飾糖は、二環式糖部分とすることができる。二環式糖部分は個別に２’−Ｏ−（ＣＨ２）ｎ−４’架橋を有し、ｎは１または２である。
【００４０】
１実施形態において、ギャップトモチーフを有する各オリゴマー化合物の外部領域は、それぞれ個別に約１〜約６のヌクレオシドから成る。別の実施形態において、ギャップトモチーフを有する各オリゴマー化合物は、それぞれ個別に約１〜約４のヌクレオシドから成る。別の実施形態において、ギャップトモチーフを有する各オリゴマー化合物は、それぞれ個別に約１〜約３のヌクレオシドから成る。
【００４１】
１実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の１つが下記の構造式：
５’−Ａ（−Ｌ−Ｂ−Ｌ−Ａ）ｎ（−Ｌ−Ｂ）ｎｎ−３’
を有する交互モチーフを有し、ここで、
各Ｌは、個別にインターヌクレオシド結合基であり、
各Ａは、β−Ｄ−リボヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドであり、
各Ｂは、β−Ｄ−リボヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドであり、
ｎは、約７〜約１１であり、
ｎｎは、０または１であって、
各Ａヌクレオシドを有する前記糖鎖は同一であり、各Ｂヌクレオシドを有する前記糖鎖は同一であり、Ａヌクレオシドの前記糖鎖はＢヌクレオシドの前記糖鎖とはことなり、ＡおよびＢの少なくとも１つは糖修飾ヌクレオシドである。
【００４２】
１実施形態において、各Ａまたは各Ｂはβ−Ｄ−リボヌクレオシドである。別の実施形態において、各Ａまたは各Ｂは、２’−修飾ヌクレオシドであり、この２’−置換基は、ハロゲン、アリル、アミノ、アジド、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、ＯＣＦ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、２−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ―（ＣＨ２）２―Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、またはＯ−（ＣＨ２）−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）から選択され、各ＲｍおよびＲｎは、個別にＨ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。１実施形態において、前記２’−置換基はアリル、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、または２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３であり、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３が特に好ましい。
【００４３】
１実施形態において、各Ａおよび各Ｂは修飾ヌクレオシドである。１実施形態において、各Ａおよび各Ｂの１つは、２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシドを有する。別の実施形態において、各Ａおよび各Ｂは２’−Ｆ修飾ヌクレオシドを有する。
【００４４】
１実施形態において、前記第二のオリゴマー化合物は交互モチーフを有し、各Ａおよび各Ｂの１つはβ−Ｄ−リボヌクレオシドである。別の実施形態において、各Ａおよび各Ｂのもう１つは２’−修飾ヌクレオシドを有し、ここにおいて２’−置換基は、これに限定されるものではないが、アリル、Ｏ−アリル、Ｏ−Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３、または２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３であり、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ３が特に好ましい。
【００４５】
１実施形態において、各Ｌは個別に、リン酸ジエステル、またはホスホロチオエートインターヌクレオシド結合基である。
【００４６】
１実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の１つは完全に修飾されたモチーフを有し、基本的に前記オリゴマー化合物の各ヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドであり、各糖修飾は同一である。１実施形態において、各糖修飾ヌクレオシドは２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、および二環式糖部位を有するヌクレオシドから選択される。別の実施形態において、前記完全に修飾されたオリゴマー化合物の各ヌクレオシドは２−修飾ヌクレオシドであり、２’−ＯＣＨ３または２’−Ｆ修飾ヌクレオシドは適しており、２’−ＯＣＨ３修飾オリゴヌクレオシドは特に適している。別の実施形態において、前記完全に修飾されたオリゴマー化合物は、１つのβ−Ｄ−リボヌクレオシドを有する３’および５’末端の１または両方を含む。
【００４７】
１実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物の１つは位置的に修飾されたモチーフを有し、前記位置的に修飾されたモチーフは約４〜約８領域から成る結合ヌクレオシドの連続した配列を有しており、各領域はβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列または糖修飾ヌクレオシドの配列であり、前記領域は交互であり、各前記β−Ｄ−リボヌクレオシド領域は糖修飾ヌクレオシドによって各側で隣接されており、糖修飾ヌクレオシドの各領域はβ−Ｄ−リボヌクレオシド領域によって各側で隣接されており（片側にのみ隣接される３’および５’末端に位置した領域は例外である）、前記糖修飾ヌクレオシドは２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、および二環式糖部位を有するヌクレオシドから選択されるものである。１実施形態において、前記位置的に修飾されたモチーフは５〜７領域を有している。別の実施形態において、前記β−Ｄ−リボヌクレオシド領域は長さ２〜８ヌクレオシドを有している。更なる実施形態において、前記糖修飾ヌクレオシド領域は、長さ１〜４ヌクレオシド、または長さ２〜３ヌクレオシドを有している。
【００４８】
１実施形態において、位置的に修飾されたモチーフを有するオリゴマー化合物は、以下の構造式：
（Ｘ１）ｊ−（Ｙ１）ｉ−Ｘ２−Ｙ２−Ｘ３−Ｙ３−Ｘ４
を有しており、ここで、
Ｘ１は、１〜約３糖修飾ヌクレオシドの配列であり、
Ｙ１は、１〜約５β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、
Ｘ２は、１〜約３糖修飾ヌクレオシドの配列であり、
Ｙ２は、２〜約７β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、
Ｘ３は、１〜約３糖修飾ヌクレオシドの配列であり、
Ｙ３は、４〜約６β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、
Ｘ４は、１〜約３糖修飾ヌクレオシドの配列であり、
ｉは、０または１であり、
ｊは、０または１であり、ｉが１の場合は１またはｉが０のとき０である。
【００４９】
別の実施形態において、Ｘ４は３糖修飾ヌクレオシドの配列であり、Ｙ３は５β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、Ｘ３は２糖修飾ヌクレオシドの配列であり、Ｙ１は２β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列である。別の実施形態において、ｉは０であり、Ｙ２は７β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列である。別の実施形態において、ｉは１であり、ｊは０であり、Ｙ２は２β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、Ｙ１は５β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列である。別の実施形態において、ｉは１であり、ｊは１であり、Ｙ２は２β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、Ｙ１は３β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列であり、Ｘ１は２糖修飾ヌクレオシドの配列である。１実施形態において、各前記糖修飾ヌクレオシドは２’−修飾ヌクレオシドまたは４’−チオ修飾ヌクレオシドである。
【００５０】
１実施形態において、前記組成物の第一鎖は、位置的なモチーフを有する。別の実施形態において、前記位置的に修飾されたオリゴマー化合物の各インターヌクレオシド結合基は個別に、ホスホジエステルまたはホスホロチオエートから選択される。    
１実施形態において、第一および第二のオリゴマー化合物はそれぞれ個別に、約１２〜約３０ヌクレオシドから成る。更なる実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物のそれぞれは個別に、約１７〜約２３ヌクレオシドから成る。別の実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物のそれぞれは個別に、約１９〜約２１ヌクレオシドから成る。
【００５１】
１実施形態において、前記第一および第二のオリゴマー化合物は相補的アンチセンス／センスｓｉＲＮＡ二本鎖を形成する。
【００５２】
１実施形態において、本発明は、１若しくはそれ以上の細胞、組織または動物を以下に記載された組成物と接触させる工程を有する、遺伝子発現を阻害する方法も提供する。
【００５３】
別の実施例において、本発明の組成物は細胞、組織、または動物における遺伝子発現を阻害するための薬物の調合において使用される。
【００５４】
本発明は二本鎖組成物を提供し、各鎖は１若しくはそれ以上の修飾されたヌクレオシドおよび修飾されたおよび未修飾のヌクレオシドの位置によって定義されたモチーフを有するものである。モチーフは鎖における他の修飾されたおよび未修飾のヌクレオシドに対する、修飾されたヌクレオシドの位置付けに由来し、インターヌクレオシド結合のタイプ、あるいは核酸塩基のタイプ（例えばプリンまたはピリミジン）と無関係である。本発明の組成物は、前記モチーフまたは前記各化学的性質が異なるように、異なって修飾された鎖を有している。この戦略は、遺伝子調節の工程におけるそれらの意図された役割（例えばＲＮＡ干渉）とは無関係で、各鎖の望ましい特性を最大限にできる。各鎖の化学的性質およびモチーフを調節することは、個別に、各鎖を領域的に増強することも可能である。より具体的には、本発明はギャップトモチーフを保持する一方の鎖と、ギャップトモチーフ、ヘミマーモチーフ、ブロックマーモチーフ、完全に修飾されたモチーフ、位置的に修飾されたモチーフ、または交互モチーフを保持するもう一方の鎖とを有する。
【００５５】
本発明の様々なモチーフの組み合わせを有する前記組成物は、増強された特性を保持することが示された。増強され得るこの特性は、これに限定されるものではないが、タンパク質結合、タンパク質オフ割合（ｏｆｆ−ｒａｔｅ）、吸収およびクリアランスの調節を介した薬物動態的特性の調節；ヌクレアーゼ安定性や化学的安定性の調節；結合親和性およびオリゴマーの特異性（相補的配列および酵素に対する親和性および特異性）の調節；およびＲＮＡ切断の有効性の増加を含む。
【００５６】
二本鎖領域を形成するように完全にまたは少なくとも部分的にハイブリダイズされた第一および第二のオリゴマー化合物を有し、さらに核酸標的と相補的でハイブリダイズする領域を有する組成物が提供される。そのような組成物は、核酸標的と完全なまたは部分的な相補性を保持するアンチセンス鎖である第一のオリゴマー化合物、および第一のオリゴマー化合物と相補的な１若しくはそれ以上の領域を持ち、第一のオリゴマー化合物と少なくとも１つの二本鎖領域を形成するセンス鎖である第二のオリゴマー化合物を有することが適当である。
【００５７】
本発明の組成物は、例えば遺伝子発現の調節に有用である。例えば、標的細胞、細胞群、組織あるいは動物は、遺伝子発現を直接阻害できるｍＲＮＡの減少をもたらすために本発明の組成物と接触させる。別の実施形態において、前記ｍＲＮＡの減少は、標的遺伝子から非標的遺伝子に関連した経路を介して非標的遺伝子を間接的に上方制御する。本発明の組成物を用いた遺伝子を制御するための数多くの方法およびモデルは、本分野および以下の実施例の項において説明されている。
【００５８】
本発明の組成物は、核酸標的とハイブリダイズし、その結果その正常機能を損失させることによって遺伝子発現を調節する。ここで用いられたように、「標的核酸」または「核酸標的」という用語は制限なく、ＤＮＡ、そのようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡおよびｍＲＮＡ、またはそれらの一部を含む）、およびそのようなＲＮＡに由来したｃＤＮＡも含む、標的化され得るあらゆる核酸を便宜上範囲に含むために使用される。いくつかの実施形態において、前記標的核酸はメッセンジャーＲＮＡである。別の実施形態において、前記標的化メッセンジャーＲＮＡの分解は、本発明の組成物で形成された活性化ＲＩＳＣ複合体によって促進される。別の実施形態において、前記標的化メッセンジャーＲＮＡの分解は、ＲＮａｓｅＨなどのヌクレアーゼによって促進される。
【００５９】
本発明は二本鎖組成物を提供し、ここにおいて前記鎖の１つは例えば反対鎖のＲＩＳＣ（または切断）複合体への優先的な荷重に影響する場合に有用である。特に、本発明は反対の鎖の荷重をＲＩＳＣ（または切断）複合体へ移すために少なくとも１つの鎖に化学修飾を有するオリゴマー化合物を提供する。そのような修飾は、安定性を増強するように修飾された二本鎖コンストラクトの作用強度を増加するために使用され得る。第二の鎖の荷重を移す化学修飾の実施例としては、これに限定されるものではないが、ＭＯＥ（２−Ｏ（ＣＨ２）２ＯＣＨ３）、２’−Ｏ−メチル、−エチル、−プロピル、および−Ｎ−メチルアセトアミドを含むと予想される。そのような修飾は鎖の至る所に分散され得る、または前記センス鎖上にギャップマーモチーフを形成するように５および／または３’末端に設置され得る。前記組成物は、選択された核酸を標的化し、１若しくはそれ以上の遺伝子の発現を調節するのに有用である。いくつかの実施形態において、本発明の組成物は標的ＲＮＡの一部にハイブリダイズし、その結果、前記標的ＲＮＡの正常機能を損失させるものである。
【００６０】
本発明は二本鎖組成物を提供し、ここにおいて１つの鎖はギャップトモチーフを有し、別の鎖はギャップトモチーフ、ヘミマーモチーフ、ブロックマーモチーフ、完全に修飾されたモチーフ、位置的に修飾されたモチーフ、または交互モチーフを有する。本発明の組成物の各鎖は、例えばｓｉＲＮＡ経路などにおいて特定の役割を果たすように修飾され得る。各鎖における異なるモチーフ、または各鎖に異なる化学修飾がある同じモチーフを使用することで、前記センス鎖の取り込みを阻害する一方、ＲＩＳＣ複合体に対して前記アンチセンス鎖を標的化することが可能となる。このモデルにおいて、各鎖はその特定の役割のために増強されるように、個別に修飾され得る。前記アンチセンス鎖は、３’末端がＲＩＳＣの異なる領域においてその役割を増強するように異なって修飾され得る一方、ＲＩＳＣの１領域においてその役割を増強するように５’末端で修飾される。研究者は様々なモデルを用いて、ガイド配列とＲＩＳＣとの相互関係を調査していた。３’末端、５’末端、およびｍＲＮＡの切断部位と一致する領域に対する異なる要求性は、これらの研究を通じて解明された。ガイド配列の３’末端はＰＡＺドメインと複合体化する一方、５’末端はＰｉｗｉドメインと複合体化する（Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００４，３０５，１４３４〜１４３７；Ｓｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００３，１０（１２），１０２６〜１０３２；Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｔｔｅｒｓ  ｔｏ  Ｎａｔｕｒｅ，２００５，４３４，６６３〜６６６）。
【００６１】
本発明で用いるとおり、「ギャップトモチーフ」という用語は、３領域に分割される隣接するヌクレオシド配列、つまり２つの外部領域に隣接した内部領域を含むことを意味する。前記領域は、前記ヌクレオシドを有する異なる糖鎖を少なくとも有することで、互いに区別される。ギャップトオリゴマー化合物の領域を区別するために用いられるヌクレオシドのタイプには、β−Ｄ−リボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、および二環式修飾ヌクレオシドを含む。各領域は均一に修飾される、例えば糖部分は同一である。前記内部領域または前記ギャップは一般にβ−Ｄ−リボヌクレオシドを有するが、糖修飾ヌクレオシド配列とすることもできる。ギャップトオリゴマー化合物のギャップに位置するヌクレオシドは、両方のウイングとは異なる糖部分を有する。
【００６２】
ギャップトオリゴマー化合物は、さらに「対称」または「非対称」であると定義される。前記各ウイングにおいて同じ均一な糖修飾を有するギッャプマーは、対称ギャップトオリゴマー化合物と呼ばれる。各ウイングにおいて異なる均一の修飾を有するギャップマーは、非対称ギャップトオリゴマー化合物と呼ばれる。これらのギャップトオリゴマー化合物は、例えば、４’−チオ修飾ヌクレオシド（対称ギャップマー）を有する両方のウイング、およびβ−Ｄ−リボヌクレオシド、または４’−チオ修飾ヌクレオシド以外の修飾ヌクレオシドを有するギャップを有することが可能である。非対称ギャップトオリゴマー化合物は、例えば２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシドを有する１つのウイングと、４’−チオ修飾ヌクレオシドを有するもう１つのウイング、およびβ−Ｄ−リボヌクレオシドを有する内部領域（ギャップ）または４’−チオまたは２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシド以外の糖修飾ヌクレオシドを有することができる。
【００６３】
本発明で使用されるギャップトオリゴマー化合物には、個別に１〜約６ヌクレオシドを有するウイングを含む。適切なウイングは１〜約４ヌクレオシドを有し、１〜約３ヌクレオシドを有するウイングを有してもよい。各ウイングのヌクレオシド数は同じであっても異なっていてもよい。従って、本発明にはギャップトオリゴマー化合物を含み、各ウイングは個別に１、２、３、４、５、または６糖修飾ヌクレオシドを有する。
【００６４】
ギャップトオリゴマー化合物は化学的に修飾されその性質が向上し、異なる修飾を行って、特にｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖またはセンス鎖を亢進できる。本発明の１実施形態では、両鎖がギャップトオリゴマー化合物である。両鎖がギャップトオリゴマー化合物の場合、少なくとも１つは非対称ギャップトオリゴマー化合物であるか、前記ギャップトオリゴマー化合物のウイングの少なくとも１つは、２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシド以外の糖修飾ヌクレオシドを有する。
【００６５】
各鎖のギャップトモチーフを有する本発明のオリゴマー化合物は、一般に各鎖のウイングで糖修飾を利用し、遺伝子調節で意図した役割について前記鎖を亢進する。例えば、前記センス鎖のウイングで２’−ＭＯＥ（２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３）修飾を利用すると、前記アンチセンス鎖の効率が上昇する。前記ＭＯＥギャップマーの大きなウイングはＲＩＳＣ複合体への取り込みを阻害し、それによって前記アンチセンス鎖の優先的ローディングが可能となり、的はずれの効果が減少し、前記アンチセンス鎖の効力が増大すると考えられている。本発明の組成物で前記センス鎖の取り込みを阻害するために、ＬＮＡ修飾ヌクレオシドも利用された。
【００６６】
前記センス鎖として使用するために修飾された前記ギャップトオリゴマー化合物は、前記アンチセンス鎖として使用するために特異的に修飾されたギャップトオリゴマー化合物とペアにすることができる。前記アンチセンス鎖は、前記ウイングにおける糖修飾ヌクレオシドを有することができ、これはＲＩＳＣへの取り込みを阻害せず、ヌクレアーゼの安定性などの、他の性質をさらに向上させる。多数のギャップト組成物が作成、検討され、前記アンチセンス鎖のウイングは２’−Ｆ、２’−ＯＣＨ３、および４’−チオから選択された糖修飾を有する。これらのアンチセンス鎖は対称および非対称モチーフの両方で調合された。前記アンチセンス鎖を利用した場合の前記非対称モチーフは、さらに前記３’および５’−末端の異なる化学的性質を、それぞれがＲＩＳＣ複合体内で果たしている機能的に異なる役割にマッチさせることができる。多数の異なる対称ギャップトアンチセンス鎖が作成され、異なるセンス鎖とペアにされ、それらの活性を決定した（活性データは以下の実施例のセクションに示す）。
【００６７】
本発明で用いられたように、「交互モチーフ」という用語は、前記オリゴマー化合物の全体配列に本質的に交互となる２つの異なるヌクレオシドを有するクレオシドの近接する配列を含むことを意味している。交互のパターンは次の構造式：５’−Ａ−（−Ｌ−Ｂ−Ｌ−Ａ）ｎ（−Ｌ−Ｂ）ｎｎ−３’によって示され、ここにおいてＡおよびＢは少なくとも異なる糖鎖を保持することによって区別されたヌクレオシドであり、各Ｌはインターヌクレオシド結合基であり、ｎｎは０または１であり、ｎは約７〜約１１である。これは、長さで約１７〜約２４ヌクレオシドの交互オリゴマー化合物を可能にする。この長さの範囲はより長いおよびより短いオリゴマー化合物を制限することを意味するものではなく、本発明に従うものである。この構造式は、交互オリゴマー化合物に対して偶数および奇数の長さも可能であり、３’および５’末端ヌクレオシドは同じ（奇数）または異なる（偶数）である。
【００６８】
本発明の交互オリゴマー化合物を有する「Ａ」および「Ｂ」ヌクレオシドは、少なくとも異なる糖部位を保持することによって互いに異なる。ＡおよびＢヌクレオシドのそれぞれは、β−Ｄ−リボヌクレオシド、２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、および二環式糖修飾ヌクレオシドから選択される。前記交互モチーフは、異なる糖鎖を保持するヌクレオシドの改変を含むが、核酸塩基およびインターヌクレオシド結合とは個別にいる。前記インターヌクレオシド結合はそれぞれまたは選択された位置で変えることができる、または前記オリゴマー化合物全体において均一または交互であり得る。
【００６９】
本発明の交互オリゴマー化合物は、センス鎖およびアンチセンス鎖として機能するように設計され得る。交互２−ＯＣＨ３／２’−Ｆ修飾オリゴマー化合物はアンチセンス鎖として使用され、多様なセンス鎖の優れた活性を示した。交互モチーフを有する１つのアンチセンスオリゴマー化合物は１９ｍｅｒであり、ここにおいてＡ’は２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシドであり、Ｂ’は２’−Ｆ修飾ヌクレオシド（ｎｎは０でありｎは９である）。結果生じた交互オリゴマー化合物はレジスタ（ｒｅｇｉｓｔｅｒ）を有することがあり、ここにおいて３’および５’末端は両方とも２’−ＯＣＨ３修飾ヌクレオシドである。
【００７０】
交互オリゴマー化合物は、センス鎖としても機能するように設計された。化学的性質またはレジスターは通常、アンチセンス鎖を指定しているオリゴマー化合物とは異なっている。交互２’−Ｆ／２’−ＯＣＨ３修飾１９ｍｅｒが以前のパラグラフにあるアンチセンスと対を形成した場合、好ましい配向性はオフセットレジスターとなるように決定され、ここにおいて前記センス鎖の３’および５’末端は２’−Ｆ修飾ヌクレオシドである。対応したレジスターにおいて、糖修飾はハイブリダイズされたヌクレオシド間で適合するので、１９ｍｅｒの全ての終端は同じ糖修飾を保持している。センス鎖においてテストされ実験した別の交互モチーフは、２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドと交互のβ−Ｄ−リボヌクレオシド側である。
【００７１】
本発明で用いられたように、「完全に修飾されたモチーフ」という用語は、糖修飾ヌクレオシドの近接した配列を含むことを意味しており、ここにおいて本質的に各ヌクレオシドは同じ糖修飾を保持するように修飾されている。本発明の組成物は、センス鎖、または前記完全に修飾された鎖として好ましいセンス鎖を有するアンチセンス鎖として、完全に修飾された鎖を有することができる。本発明の完全に修飾された鎖に対して適切な糖修飾ヌクレオシドは、２’−Ｆ、４’−チオ、および２’−ＯＣＨ３を含み、２’−ＯＣＨ３が特に適している。１観点において、前記３’および５’末端ヌクレオシドは未修飾である。
【００７２】
本発明において用いられたように、「ヘミマーモチーフ」という用語は、均一な糖部位（同一の糖、修飾されたまたは修飾されていない）を保持するヌクレオシドの配列を含むことを意味しており、ここにおいて５’末端および３’末端の１つはヘミマー修飾オリゴマー化合物における他のヌクレオシドとは異なる糖修飾ヌクレオシドである２〜１２ヌクレオシドの配列を保持している。典型的なヘミマーの例としては、その終端の１つに糖修飾ヌクレオシドの配列を有するβ−Ｄ−リボヌクレオシドを有するオリゴマー化合物がある。１つのヘミマーモチーフは、その終端の１つに位置付けられた２〜１２糖修飾ヌクレオシドを有するβ−Ｄ−リボヌクレオシの配列を含む。別のヘミマーモチーフは、その終端の１つに位置付けられた２〜６糖修飾ヌクレオシド（好ましくは２〜４である）を有するβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列を含む。
【００７３】
本発明で用いられたように、「ブロックマーモチーフ」という用語は、均一に修飾された糖修飾ヌクレオシドのブロックによって内部で中断される均一な糖（同意通な糖、修飾されたまたは修飾されていない）を保持するヌクレオシドの配列を含むことを意味しており、ここにおいて前記修飾は他のヌクレオシドとは異なっている。より一般的には、ブロックマーモチーフを保持するオリゴマー化合物は、２〜６、または２〜４糖修飾ヌクレオシドの１つの内部ブロックを有するβ−Ｄ−リボヌクレオシドの配列を有する。前記内部ブロック領域は、ヘミマーとなる終端の１位置でない限り、前記オリゴマー化合物内のあらゆる位置で存在し得る。この塩基配列およびインターヌクレオシド結合は、ブロックマーモチーフ内のあらゆる位置で変更され得る。
【００７４】
本発明で用いられたように、「位置的に修飾されたモチーフ」という用語は、β−Ｄ−リボヌクレオシドの配列を含むことを意味しており、ここにおいて前記配列は１〜約４糖修飾ヌクレオシドから成る２またはそれ以上の領域によって中断されるものである。前記位置的に修飾されたモチーフは糖修飾ヌクレオシドの内部領域を含み、１または両方の終端も含むことができる。糖修飾ヌクレオシドの領域内における各特定の糖修飾は、望ましい均一な修飾を保って可変的である。前記糖修飾領域は同じ糖修飾を保持することができる、または１つの領域がもう一方の領域とは異なる糖修飾を保持するように変化させることができる。位置的に修飾された鎖は少なくとも２つの糖修飾領域、および３’および５’−終端が糖修飾領域を保持する場合は少なくとも３つの糖修飾領域を有する。あらゆる位置的モチーフによって定義された領域置換のパターンはこれらの他のモチーフによって定義されていないので、位置的に修飾されたオリゴマー化合物はギャップトモチーフ、ヘミマーモチーフ、ブロックマーモチーフ、および交互モチーフとは区別される。位置的に修飾されたモチーフは核酸塩基配列、またはインターヌクレオシド結合の位置またはタイプによって決定されない。位置的に修飾されたオリゴマー化合物という用語は、多くの異なる特定置換パターンを含む。多数のこれら置換パターンは調合され、組成物においてテストされた。
【００７５】
本発明の組成物のアンチセンスまたはセンス鎖は、位置的に修飾され得る。１実施形態において、前記位置的に修飾された鎖はアンチセンス鎖として設計される。実施例に説明された位置的に修飾されたオリゴマー化合物に対応した異なる置換パターンのリストは、以下に示している。このリストは教訓的なものであり、限定するものではない。
【００７６】
【表１】
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【００７７】
本発明で用いられたように「糖修飾ヌクレオシド」という用語は、本分野で知られた糖修飾の全ての様式を含むことを意図している。糖修飾ヌクレオシドは、あらゆる複素環塩基部位およびインターヌクレオシド結合を保持することができ、さらに前記糖修飾とは独立したグループを含む。糖修飾ヌクレオシドのグループは、２’−修飾ヌクレオシド、４’−チオ修飾ヌクレオシド、４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド、および二環式糖修飾ヌクレオシドを含む。
【００７８】
本発明で用いられたように「２’−修飾ヌクレオシド」という用語は、ＨおよびＯＨ以外の２’−置換基を保持するヌクレオシドの全ての様式を含むことを意図している。本発明の２’−修飾ヌクレオシドに対して適切な２’−置換基は、これに限定されるものではないが、ハロ、アリル、アミノ、アジド、アミノ、ＳＨ、ＣＮ、ＯＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ−、Ｓ−またはＮ（Ｒｍ）−アルキル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ（Ｒｍ）−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−またはＮ（Ｒｍ）−アルキニル；Ｏ−アルキレニル（ａｌｋｙｌｅｎｙｌ）−Ｏ−アルキル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、Ｏ−アラルキル、Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）またはＯ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）を含み、ここにおいてＲｍおよびＲｎは個別に、Ｈ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。これら２’−置換基はさらに、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ（ＮＯ２）、チオール、チオアルコキシ（Ｓ−アルキル）、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルから選択された置換基で置換され、ここにおいて各Ｒｍは個別に、Ｈ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。
【００７９】
２’−置換基のリストは、Ｆ、−ＮＨ２、Ｎ３、ＯＣＦ３、Ｏ−ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）３ＮＨ２）、ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、およびＮ−置換アセトアミド（Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ））を含み、ここにおいて各ＲｍおよびＲｎは個別に、Ｈ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。２’−置換基の別のリストは、Ｆ、ＯＣＦ３、Ｏ−ＣＨ３、ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ（ＣＨ２）２ＳＣＨ３、Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ）、−Ｏ（ＣＨ２）２Ｏ（ＣＨ２）２Ｎ（ＣＨ３）２、およびＮ−置換アセトアミド（Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（＝Ｏ）−Ｎ（Ｒｍ）（Ｒｎ））を含み、ここにおいて各ＲｍおよびＲｎは個別に、Ｈ、アミノ保護基、または置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキルである。
【００８０】
本発明は多数の異なる立体配置を調合し得る塩基性フラノース環システムの立体化学の操作にも適している。１’位への複素環塩基の結合は、α−アノマー（下）またはβ−アノマー（上）を生じさせることができる。前記β−アノマーは未変性ＤＮＡおよびＲＮＡに見出されるアノマーであるが、両形態はオリゴマー化合物を調合するために使用され得る。更なる操作は、フラノースの未変性型を鏡像異性型で置換する、例えば未変性Ｄ−フラノースをその鏡像異性体であるＬ−フラノースに置き換えることを介して達成され得る。フラノース環システムを操作する別の方法は、例えばリボフラノース（下）またはアラビノフラノース（上）を生じさせるような２’位での置換、またはキシロフラノースを生じさせるような３’位での置換、キシロフラノースを同時に生じさせるような２’および３’位の変化などによって、立体異性体を調合するものである。同じ置換基の立体異性体の使用は、例えばリボ立体配置内の３’−エンド、およびアラビノ立体配置における２’−エンドである２’−Ｆなどの完全に異なる立体配座幾何学を生じさせることができる。オリゴマー化合物における異なるアノマーおよび立体異性体糖の使用は、本分野では既知であり、本発明に適している。
【００８１】
「４’−チオ修飾ヌクレオシド」という用語は、４’−Ｓで置換された４’−Ｏを保持するβ−Ｄ−リボヌクレオシドを含むことを意図している。「４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシド」という用語は、２’−置換基で置換された２’−ＯＨを保持する４’−チオ修飾ヌクレオシドを含むことを意図している。４’−チオ修飾ヌクレオシドの調合は、例えば１９９７年６月１７日に出願された米国特許番号第５，６３９，８３７号明細書、および２００５年３月３１日に公開された国際公開公報番号第ＷＯ２００５／０２７９６２号などの公報に開示されている。４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドの調合およびそれらのオリゴヌクレオチドへの取り込みは、２００５年３月３１日に公開された国際公開公報番号第ＷＯ２００５／０２７９６２号に開示されている。４’−チオ−２’−修飾ヌクレオシドは、好ましい基として以前に言及した２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（ＣＨ２）２−ＯＣＨ３、および２’−Ｆと同じ２’−置換基で調合され得る。
【００８２】
「二環式糖修飾ヌクレオシド」という用語は、リボース環の２原子を架橋することによって形成された第二の環を保持するヌクレオシドを含むことを意図している。そのような二環式糖修飾ヌクレオシドは、第二の環を形成する多数の異なる架橋基を取り込むことができ、フラノース環上の異なる環炭素原子から形成され得る。前記架橋が４’および２’−炭素と結合し、構造式４’−（ＣＨ２）ｎ−Ｏ−２’（ここにおいてｎは１または２）を保持する二環式糖修飾ヌクレオシドが適している。二環式糖修飾ヌクレオシドの合成は、米国特許番号第６，２６８，４９０号明細書、第６，７９４，４９９号明細書、および公開された米国出願番号第２００２０１４７３３２号明細書に開示されている。
【００８３】
前記架橋がアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミンおよびウラシルから選択された核酸塩基を保持する４’−ＣＨ２−Ｏ−２’である二環式糖修飾ヌクレオシドの合成および調合は、それらのオリゴマー化および核酸認識特性とともに記載された（Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７〜３６３０、および国際公開公報番号第ＷＯ９８／３９３５２号および第ＷＯ９９／１４２２６号）。この二環式糖修飾ヌクレオシドのＬ異性体も調合された（Ｆｒｉｅｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００３，２１，６３６５〜６３７２）。４’−ＣＨ２−Ｓ−２’類似体（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９〜２２２２）および２’−アミノ−ＬＮＡ（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５〜１００３９）も調合された。’
本発明のオリゴマー化合物は、１若しくはそれ以上の末端リン酸部位も含むことができる。末端リン酸部位は、あらゆる末端ヌクレオシドに位置付けられ得るが、５’−末端ヌクレオシドが適しており、アンチセンス鎖の５’−末端ヌクレオシドも適している。１観点において、前記末端リン酸は、構造式−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）ＯＨを持ち非修飾である。別の観点において、前記末端リン酸は、ＯおよびＯＨ基の１若しくはそれ以上がＨ、Ｏ、Ｓ、Ｎ（Ｒ）、またはアルキルで置換されるように修飾されており、ここにおいてＲはＨ、アミノ保護基、または非置換または置換アルキルである。
【００８４】
ここで用いられたように「アルキル」という用語は、２４炭素原子以下を含んでいる飽和直鎖状または分枝炭化水素ラジカルを意味している。アルキル基の例としては、これに限定するものではないが、メチル、エチル、プロピル、ブチル、イソプロピル、ｎ−ヘキシル、オクチル、デシル、ドデシル、およびそれと同等のものを含む。アルキル基は一般的に１〜約２４炭素原子、より一般的には１〜約１２炭素原子を含み、好ましくは１〜約６炭素原子である。ここで用いられたようなアルキル基は任意で１若しくはそれ以上の更なる置換基を含む。
【００８５】
ここで用いられたように「アルケニル」という用語は、２４炭素原子以下を含み、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を保持している直鎖状または分枝炭化水素鎖ラジカルを意味している。アルケニル基の例としては、これに限定されるものではないが、エテニル（ｅｔｈｅｎｙｌ）、プロペニル、ブテニル、１−メチル−２−ブテン−１−イル、１，３−ブタジエンなどのジエン、およびそれらと同等のものを含む。アルケニル基は一般的に２〜約２４炭素原子、より一般的には２〜約１２炭素原子を含み、好ましくは２〜約６炭素原子である。ここで用いられたようなアルケニル基は任意で１若しくはそれ以上の更なる置換基を含む。
【００８６】
ここで用いられたように「アルキニル」という用語は、２４炭素原子以下を含み、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を保持している直鎖状または分枝炭化水素ラジカルを意味している。アルキニル基の例としては、これに限定されるものではないが、エチニル、１−プロピニル、１−ブチニル、およびそれらと同等のものを含む。アルキニル基は一般的に２〜約２４炭素原子、より一般的には２〜約１２炭素原子を含み、好ましくは２〜約６炭素原子である。ここで用いられたようなアルキニル基は任意で１若しくはそれ以上の更なる置換基を含む。
【００８７】
ここで用いられたように「脂肪族」という用語は、２４炭素原子以下を含んでいる直鎖状または分枝炭化水素ラジカルを意味しており、ここにおいてあらゆる２つの炭素原子間の飽和は単結合、二重結合、または三重結合である。脂肪族基は、１〜約２４炭素、より一般的には１〜約１２炭素原子を含み、望ましくは１〜約６炭素原子である。脂肪族基の直鎖状または分枝鎖は、窒素、硫黄、およびリンを含む１若しくはそれ以上のヘテロ原子で中断される。ヘテロ原子によって中断されるそのような脂肪族基は、これに限定されるものではないが、例えばポリアルキレングリコールなどのポリアルコキシ、ポリアミン、およびポリイミンを含む。ここで用いられたような脂肪族基は選択的に更なる置換基を含む。
【００８８】
ここで用いられたように「アルコキシ」という用語は、アルキル基および酸素原子間に形成されたラジカルを意味しており、前記酸素原子はアルコキシ基を親分子に結合するために使用される。アルコキシ基の例としては、これに限定されるものではないが、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ｎ−ペントキシ、ネオペントキシ、ｎ−ヘキソキシ、およびそれらと同等のものを含む。ここで用いられたようなアルコキシ基は選択的に更なる置換基を含む。
【００８９】
ここで用いられたように「ハロ」および「ハロゲン」という用語は、フッ素、塩素、臭素、およびイオジンから選択された原子である。
【００９０】
ここで用いられたように「アリール」および「芳香族」という用語は、１若しくはそれ以上の芳香族環を保持しているモノ−または多環式炭素環システムラジカルを意味している。アリール基の例としては、これに限定されるものではないが、フェニル、ナフチル、テトラヒドロナフチル、インダニル、イデニル、およびそれらと同等のものを含む。ここで用いられたようなアリール基は選択的に更なる置換基を含む。
【００９１】
ここで用いられたように「複素環」という用語は、少なくとも１つのヘテロ原子を含み、不飽和、部分的に飽和、または完全に飽和されている、ラジカルモノ−、または多環式環システムを意味しており、従ってヘテロアリールを含むものである。複素環は融合環システムも含み、前記融合環の１若しくはそれ以上はヘテロ原子を含まない。複素環基は一般的に硫黄、窒素、または酸素から選択された少なくとも１つの原子を含む。複素環基の例としては、［１，３］ジオキソラン、ピロリジニル、ピラゾリニル、ピラゾリジニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、ピペリジニル、ピペラジニル、オキサゾリジニル、イソキサゾリジニル、モルフォリニル、チアゾリジニル、イソチアゾリジニル、キノキサリニル、ピリダジノニル、テトラヒドロフリル、およびそれらと同等のものを含む。ここで用いられたような複素環基は選択的に更なる置換基を含む。
【００９２】
ここで用いられたような「置換基（ｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔおよびｓｕｂｓｔｉｔｕｅｎｔ  ｇｒｏｕｐ）」という用語は、他の基または親化合物に付加され、望ましい特性を増強するまたは望ましい効果を与える基を含むことを意味している。置換基は保護され得るまたは保護されず、親化合物における１つの利用可能な部位へまたは多くの利用可能な部位へ付加され得る。置換基はさらに他の置換基でも置換され、親化合物に対して直接にまたはアルキルまたはハイドロカルボニル基などの結合基を介して付加される。そのような置換基は、これに限定されるものではないが、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アシル（−Ｃ（Ｏ）Ｒａ）、カルボキシル（−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｒａ）、脂肪族、脂環、アルコキシ、置換オキソ（−Ｏ−Ｒａ）、アリール、アラルキル、複素環、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アミノ、（−ＮＲｂＲｃ）、イミノ（＝ＮＲｂ）、アミド（−Ｃ（Ｏ）ＮＲｂＲｃまたは−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（Ｏ）Ｒａ）、アジド（−Ｎ３）、ニトロ（−ＮＯ２）、シアノ（−ＣＮ）、カルバミド（―ＯＣ（Ｏ）ＮＲｂＲｃまたは−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（Ｏ）ＯＲａ）、ウレイド（−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（Ｏ）−ＮＲｂＲｃ）、チオウレイド（−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ−（Ｓ）ＮＲｂＲｃ）、グアニジニル（−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（＝ＮＲｂ）ＮＲｂＲｃ）、アミジニル（−Ｃ（＝ＮＲｂ）ＮＲｂＲｃまたは−Ｎ（Ｒｂ）Ｃ（ＮＲｂ）Ｒａ）、チオール（−ＳＲｂ）、スルフィニル（−Ｓ（Ｏ）Ｒｂ）、スルホニル（−Ｓ（Ｏ）２Ｒｂ）、スルホンアミジル（−Ｓ（Ｏ）２ＮＲｂＲｃまたは−Ｎ（Ｒｂ）Ｓ−（Ｏ）２Ｒｂ）を含む。ここにおいて各Ｒａ、Ｒｂ、およびＲｃは、これに限定されるものではないが、アルキル、アルケニル、アルキニル、脂肪族、アルコキシ、アシル、アリール、アラルキル、ヘテロアリール、脂環、複素環、およびヘテロアリールアルキルなどとすることができる、更なる置換基である。
【００９３】
ここで用いられたように「保護基」という用語は、合成手順の間望ましくない反応に対抗して、これに限定されるものではないがヒドロキシル、アミノおよびチオール基を含む反応基を保護すると本分野では知られている不安定化学部位を意味している。保護基は、他の反応部位での反応の間部位を保護するために一般的に選択的および／または直交性に使用され、続いて無保護基をそのまま残すために、または更なる反応に利用するために除去され得る。本分野では既知の保護基は、Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９９）に一般的に記載されている。
【００９４】
ヒドロキシル保護基の例としては、これに限定されるものではないが、ベンジルオキシ−カルボニル、４−ニトロベンジルオキシカルボニル、４−ブロモベンジルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、メトキシカルボニル、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、イソプロポキシカルボニル、ジフェニルメトキシカルボニル、２，２，２−トリクロロエトキシカルボニル、２−（トリメチルシリル）エトキシカルボニル、２−フルフリルオキシカルボニル、アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）、アセチル（Ａｃ）、ホルミル、クロロアセチル、トリフルオロアセチル、メトキシアセチル、フェノキシアセチル、ベンゾイル（Ｂｚ）、メチル、ｔ−ブチル、２，２，２−トリクロロエチル、２−トリメチルシリルエチル、１，１−ジメチル−２−プロペニル、３−メチル−３−ブテニル、アリル、ベンジル（Ｂｎ）、パラ−メトキシベンジルジフェニルメチル、トリフェニルメチル（トリチル）、４，４’−ジメトキシトリフェニルメチル（ＤＭＴ）、置換或いは非置換型９−（９−フェニル）キサンテニル（ピキシル）、テトラヒドロフリル、メトキシメチル、メチルチオメチル、ベンジルオキシメチル、２，２，２−トリクロロエトキシメチル、２−（トリメチルシリル）エトキシメチル、メタンスルフォニル、パラ−トルエンスルフォニル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、およびそれらと同等のものを含む。本発明に適したヒドロキシル保護基は、ＤＭＴ、および置換或いは非置換ピキシルである。
【００９５】
アミノ保護基の例としては、これに限定されるものではないが、ｔ−ブトキシカルボニル（ＢＯＣ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、ベンジルオキシカルボニル、およびそれらと同等のものを含む。チオール保護基の例としては、これに限定されるものではないが、トリフェニルメチル（Ｔｒｔ）、ベンジル（Ｂｎ）、およびそれらと同等のものを含む。
【００９６】
合成オリゴマー化合物は反応混合物から分離され、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、沈降または再結晶などの方法によってさらに精製され得る。ここに記載された構造式の前記化合物を合成する更なる方法は、本分野の当業者にとっては明らかであるだろう。さらに、様々な合成工程は望ましい化合物を生じる交互の配列においてまたは順序で実行される。ここに記載された本分野では既知である、前記化合物を合成するのに有用な合成化学変換（トランスフォーメーション）および保護基方法論（保護および脱保護）は、例えば、Ｒ．Ｌａｒｏｃｋ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ，ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ（１９８９）；Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ  ａｎｄ  Ｐ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｄ．Ｅｄ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９１）；Ｌ．Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｆｉｅｓｅｒ，Ｆｉｅｓｅｒ  ａｎｄ  Ｆｉｅｓｅｒ‘ｓ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９４）；およびＬ．Ｐａｑｕｅｔｔｅ，ｅｄ．，Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ（１９９５）、およびそれらの続版に記載されたようなものを含む。
【００９７】
ここに記載された前記化合物は１若しくはそれ以上の不斉中心を含み、従って絶対立体化学の観点でアミノ酸に対する（Ｒ）−または（Ｓ）−として、または（Ｄ）−または（Ｌ）−として定義された、鏡像異性体、ジアステレオマーおよび他の立体異性型を生じる。本発明は、全てのそのような異性体、さらにはそれらのラセミ体および光学純粋型を含むことを意味している。光学異性体は、上述の手順によって、またはラセミ体混合物を分解することによってそれらそれぞれの光学活性前駆体から調合される。分解は分解因子の存在下で、クロマトグラフィーによってまたは結晶化を繰り返すことによって、または本分野の当業者には既知であるこれらの技術のいくつかを組み合わせることによって実行され得る。分解に関する更なる詳細はＪａｃｑｕｅｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎａｎｔｉｏｍｅｒｓ，Ｒａｃｅｍａｔｅｓ，ａｎｄ  Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，１９８１）に見出すことができる。ここに記載された前記化合物がオレフィン二重結合、他の不飽和、または幾何学不斉の他の中心を含む場合、特に指定しない限り、前記化合物はＥおよびＺ幾何学異性体の両方、またはシス−およびトランス−異性体の両方を含むことを意図している。同様に、全ての互変異性型も含まれることを意図している。ここに見られるあらゆる炭素−炭素二重結合の立体配置は、便宜上でのみ選択されており、本文でそう述べない限り特定の立体配置を指定する意図はないので、ここに任意でトランスとして表現された炭素−炭素二本結合または炭素−ヘテロ原子二本結合は、シス、トランス、またはあらゆる割合でのそれら２つの混合物である。
【００９８】
ここで用いられたように「ヌクレオシド」という用語は、塩基−糖組み合わせを意味している。ヌクレオシドの塩基部分は通常、複素環塩基部位である。そのような複素環塩基の２つの最も多く見られる種類は、プリンおよびピリミジンである。ヌクレオチドは、さらに前記ヌクレオシドの糖部位に共有結合したリン酸基を含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むそれらヌクレオシドに対して、前記リン酸基は前記糖の２’、３’または５’ヒドロキシル部位に結合され得る。ヌクレオシドという用語は、修飾および非修飾ヌクレオシドの両方を含むことを意味している。オリゴヌクレオチド構造内で、前記リン酸基は前記オリゴマー化合物のバックボーンを形成するものとして共通して言及される。オリゴヌクレオチドを形成する場合、前記リン酸基は隣接するヌクレオシドと別のものとを共有結合し、直線ポリマー化合物を形成する。ＲＮＡおよびＤＮＡの正常なインターヌクレオシド結合は３’から５’のリン酸ジエステル結合である。
【００９９】
本発明の文脈において、「オリゴヌクレオシド」という用語は、リン原子を保持していないインターヌクレオシド結合によって結合されているヌクレオシドの配列を意味している。このタイプのインターヌクレオシド結合はさらに、以下の「修飾インターヌクレオシド結合」の項に記載されている。
【０１００】
ここで用いられたように「オリゴヌクレオチド」という用語は、天然由来の核酸塩基、糖、およびリン酸ジエステルインターヌクレオシド結合から成るリボ核酸（ＲＮＡ）またはデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）のオリゴマーまたはポリマーを意味している。
【０１０１】
ここで用いられたように「オリゴマー」および「オリゴマー化合物」という用語は、特定配列においてインターヌクレオシド結合基と共に結合されている、複数の天然由来および／または非天然由来ヌクレオシドを意味している。少なくともいくつかのオリゴマー化合物は、標的核酸の領域とハイブリダイズすることができる。オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチド類似体、オリゴヌクレオチド擬態、オリゴヌクレオシド、およびそれらのキメラ組み合わせは「オリゴマー」および「オリゴマー化合物」という用語に含まれる。そのような用語「オリゴマー化合物」は「オリゴヌクレオチド」という用語より意味が広いので、これに限定されるものではないが当業者にとって既知であるものを含む修飾の全ての様式を保持する全てのオリゴマーを含む。オリゴマー化合物は一般的に、機能的に互換性があっても、天然由来または合成野生型オリゴヌクレオチドから構造的に区別される。従って、オリゴマー化合物は、望ましいＲＮＡまたはＤＮＡ鎖の前記構造および／または機能を模倣する（例えば標的にハイブリダイズすることによって）のに有効な機能を保持する全てのそのような構造を含む。そのような非天然由来オリゴヌクレオチドは、例えば増強された細胞取り込み、核酸標的に対する増強された親和性、およびヌクレアーゼ存在下での増加した安定性などの増強された特性を有するため、しばしば天然由来型よりも望ましい。
【０１０２】
オリゴマー化合物は、例えば二本鎖ハイブリダイズコンストラクト、または完全なまたは部分的な二本鎖化合物のハイブリダイゼーションおよび形成を可能にするのに十分な自己相補性を有する一本鎖を形成する２つのオリゴマー化合物などの、二本鎖コンストラクトを有する組成物を含むことができる。本発明の１実施形態において、二本鎖オリゴマー化合物は、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を含む。ここで用いられたように「ｓｉＲＮＡ」という用語は、第一鎖と第二鎖を有し、前記第一鎖と第二鎖との間に中心相補性部分を持ち、前記第一鎖と前記第二鎖との間にまたは標的核酸と選択的に相補性を有する末端部分を保持する、二本鎖コンストラクトとして定義されている。この複合体における各鎖は、約１２〜約２４ヌクレオシドの長さであり、さらにこれら定義された長さの１つを保持する中心相補性部分を有する。各鎖はさらに、長さで１〜約６核酸塩基を保持する末端非ハイブリダイズ部分を有する。ｓｉＲＮＡは平滑末端として言及される末端部分（オーバーハング）も保持しない。ｓｉＲＮＡの２つの鎖は、遊離３’または５’終端を残して内部的に結合され得る、または連続ヘアピン構造またはループを形成するように結合され得る。このヘアピン構造は、一本鎖特徴の伸長を生じさせる５’または３’終端上にオーバーハングを含む。
【０１０３】
本発明の１実施形態において、二本鎖コンストラクトを有する組成物は、基準ｓｉＲＮＡである。ここで用いられたように「基準ｓｉＲＮＡ」という用語は、第一鎖および第二鎖を保持する二本鎖オリゴマー化合物として定義され、ここにおいて各鎖は１９核酸塩基以上相補的である鎖を保持する長さが２１の核酸塩基であり、各鎖の各３’終端にデオキシチミジンダイマー（ｄＴｄＴ）を保持しており、そこにおいて前記二本鎖化合物は３’オーバーハングとして作用するものである。別の観点において、オーバーハングを保持する二本鎖コンストラクトを有する組成物は、様々な長さのオーバーハングを有して様々な長さであり、１つの鎖のみがオーバーハングを保持する組成物を含む。
【０１０４】
別の実施形態において、二本鎖コンストラクトを有する組成物は平滑末端ｓｉＲＮＡである。ここで用いられたように「平滑末端ｓｉＲＮＡ」という用語は、終端オーバーハングを保持しないｓｉＲＮＡとして定義されている。すなわち、二本鎖コンストラクトの少なくとも１つの末端は平滑である。１若しくはそれ以上のオーバーハングを保持する、または平滑であるｓｉＲＮＡは、ｄｓＲＮＡｓｅ酵素を誘発し、ＲＮＡｉアンチセンスメカニズムの補充または活性化の引き金を引くように働く。更なる実施形態において、ＲＮＡｉアンチセンスメカニズムを介して働く一本鎖ＲＮＡｉ（ｓｓＲＮＡ）化合物が考えられる。
【０１０５】
二本鎖化合物に対して更なる修飾をすることができ、これには末端の１若しくはそれ以上、選択された核酸塩基部位、糖部位、またはインターヌクレオシド結合の１つに結合された共役基を含むことができる。または、前記２つの鎖は非核酸部位またはリンカー基を介して結合され得る。１つの鎖のみから形成された場合、ｄｓＲＮＡは二本鎖を形成するように自身を折り畳む自己相補的ヘアピンタイプ分子の形態をとることができる。従って、ｄｓＲＮＡは完全なまたは部分的な二本鎖になり得る。２つの鎖、または二本鎖を形成するために自身を折り畳んだ自己相補的ヘアピンタイプ分子の形態をとった一本鎖から形成された場合、その２つの鎖（または一本鎖の二本鎖形成領域）はワトソン−クリック様式の塩基対である相補的ＲＮＡ鎖である。
【０１０６】
本発明に従ったオリゴマー化合物は、約８〜約８０核酸塩基（すなわち、約８〜約８０結合ヌクレオシド／単量体サブユニット、または８０以下の結合ヌクレオシド／単量体サブユニット）を有する。本発明は８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９または８０核酸塩基、またはそれらのあらゆる範囲内の長さのオリゴマー化合物を具体化することを本分野の当業者は、理解するであろう。
【０１０７】
１実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は長さが１０〜１５核酸塩基、または５０核酸塩基以下である。これは１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または５０核酸塩基、またはそれらのあらゆる範囲内の長さのオリゴマー化合物を具体化することを本分野の当業者は理解するであろう。
【０１０８】
別の実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は長さが１２〜３０核酸塩基、または３０核酸塩基以下である。これは１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０核酸塩基、またはそれらのあらゆる範囲内の長さのオリゴマー化合物を具体化することを本分野の当業者は理解するであろう。
【０１０９】
別の実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は長さが１７〜２３核酸塩基、または２３核酸塩基以下である。これは１７、１８、１９、２０、２１、２２、または２３核酸塩基、またはそれらのあらゆる範囲内の長さのオリゴマー化合物を具体化することを本分野の当業者は理解するであろう。
【０１１０】
別の実施形態において、本発明のオリゴマー化合物は長さが１９〜２１核酸塩基、または２１核酸塩基以下である。これは１９、２０、または２１核酸塩基、またはそれらのあらゆる範囲内の長さのオリゴマー化合物を具体化することを本分野の当業者は理解するであろう。
【０１１１】
ここで用いられたように「複素環塩基部位」という用語は、本発明のヌクレオシドを形成するために使用された核酸塩基および修飾または置換核酸塩基を意味している。「複素環塩基部位」という用語は、未変性プリン塩基であるアデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）およびウラシル（Ｕ）などの非修飾核酸塩基を含む。この用語は、これに限定されるものではないが、ここで定義されたような、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノピリジンおよび２−ピリドン、５−メチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチレニル（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌｅｎｙｌ）シトシン、２−アミノおよび２−フルオロアデニン、２−プロピルおよびアデニンおよびグアニンのほかのアルキル誘導体、２−チオシトシン、ウラシル、チミン、３−デアザ（ｄｅａｚａ）グアニンおよびアデニン、４−チオウラシル、５−ウラシル（シュードウラシル）、５−プロピニル（−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ３）ウラシルおよびシトシン、およびピリミジン塩基の他のアルキニル誘導体、５−ハロ（特に５−ブロモ）、５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン、６−メチル、およびアデニンおよびグアニンの他のアルキル誘導体、６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン、７−メチルアデニンおよびグアニン、７−デアザアデニンおよびグアニン、８−ハロ、８−アミノ、８−アザ、８−チオ、８−チオアルキル、８−ヒドロキシルおよび他の８−置換アデニンおよびグアニン、普遍的塩基、疎水性塩基、無差別塩基、サイズが拡大された塩基、およびフッ素化塩基などの合成および天然核酸塩基を含む修飾または置換核酸塩基の全ての様式を含むことも意図する。更なる修飾核酸塩基は、フェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）およびフェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）などの三環式ピリミジンを含む。
【０１１２】
更なる核酸塩基（および核酸塩基を有するヌクレオシド）は、米国特許番号第３，６８７，８０８号に開示されているもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８〜８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されているもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３に開示されているもの、Ｌｉｍｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９４，２２（１２），２１８３〜２１９６に開示されているもの、およびＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９〜３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３に開示されているものを含む。
【０１１３】
特定のこれら核酸塩基は、本発明のオリゴマー化合物の結合親和性を増加するために特に有用である。これらは、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、および２−アミノプロピル−アデニン、５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシンを含むＮ−２、Ｎ−６およびＯ−６置換プリンを含む。５−メチルシトシン置換基は０．６〜１．２℃で核酸二本鎖安定性を増加し（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．  ２７６〜２７８）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）糖修飾と組み合わせた時に特に有用であることが示された。
【０１１４】
上述の修飾核酸塩基および他の修飾核酸塩基に関する特定の調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、上述した米国特許番号第３，６８７，８０８号明細書、さらに第４，８４５，２０５号明細書；第５，１３０，３０２号明細書；第５，１３４，０６６号明細書；第５，１７５，２７３号明細書；第５，３６７，０６６号明細書；第５，４３２，２７２号明細書；第５，４５７，１８７号明細書；第５，４５９，２５５号明細書；第５，４８４，９０８号明細書；第５，５０２，１７７号明細書；第５，５２５，７１１号明細書；第５，５５２，５４０号明細書；第５，５８７，４６９号明細書；第５，５９４，１２１号明細書；第５，５９６，０９１号明細書；第５，６１４，６１７号明細書；第５，６４５，９８５号明細書；第５，８３０，６５３号明細書；第５，７６３，５８８号明細書；第６，００５，０９６号明細書；第５，６８１，９４１号明細書および第５，７５０，６９２号明細書を含む。
【０１１５】
ここで用いられたように「普遍的塩基」という用語は、あらゆる塩基で置換される部位を意味している。この普遍的塩基はハイブリダイゼーションに寄与する必要はないが、ハイブリダイゼーションから著しく減らすべきではなく、一般的に二本鎖の第二の配列における対応する部分で天然由来の塩基（すなわちＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）と対を形成できる第一の配列におけるモノマーを意味しており、この二本鎖において以下の１若しくはそれ以上が当てはまる：（１）基本的にこの２つの間には対（ハイブリダイゼーション）はない；または（２）それらの間の対形成は、天然由来の塩基の１若しくはそれ以上とハイブリダイズしている普遍的塩基と判別不能であり、その二本鎖の著しい不安定化はない。例示的な普遍的塩基は、これに限定されるものではないが、イノシン、５−ニトロインドール、および４−ニトロベンズイミダゾールを含む。普遍的塩基の更なる実施例および記述は、ｔｈｅ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＤＮＡ  ｂａｓｅ  ａｎａｌｏｇｓ．（Ｌｏａｋｅｓ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００１，２９，１２，２４３７〜２４４７）の調査と要約を参照のこと。
【０１１６】
ここで用いられたように「無差別（ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ）塩基」という用語は、二本鎖の第二の配列における対応する部分で天然由来の塩基（すなわちＡ、Ｃ、Ｇ、ＴまたはＵ）と対を形成できる第一の配列におけるモノマーを意味し、この二本鎖において前記無差別塩基は天然由来の塩基（すなわちＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔ、Ｕ）の１つ以上と判別不能に対形成できる。無差別塩基の限定されない例は、以下に示したように、６Ｈ，８Ｈ−３，４−ジヒドロピリミド［４，５−ｃ］［１，２］オキサジンー７−オンおよびＮ６−メトキシ−２，６−ジアミノプリンである。更なる情報は、Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｎｇ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ  ｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｎｅ  ｂａｓｅｓ．（Ｈｉｌｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃｄ．Ｓｃｉ．，１９９８，９５，４２５８〜４２６３）を参照のこと。
【０１１７】
Ｇ−クランプの例としては、置換フェノキサジンシチジン（例えば９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド［５，４−ｂ］［１，４］ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド［４，５−ｂ］インドール−２−オン）およびピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド［３’，２’：４，５］ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−２−オン）を含む。
【０１１８】
第二のオリゴヌクレオチドにおいてグアノシンと３つの水素結合を作る代表的なシトシン類似体は、１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｋｕｒｃｈａｖｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９７，１６，１８３７〜１８４６）、１，３−ジアザフェノチアジン−２−オン（Ｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９５，１１７，３８７３〜３８７４）、および６，７，８，９−テトラフルオロ−１，３−ジアザフェノキサジン−２−オン（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．１９９８，３９，８３８５〜８３８８）を含む。オリゴヌクレオチドへ取り込まれた時、これら塩基修飾は相補的グアニンとハイブリダイズされ（後者はアデニンともハイブリダイズされる）、伸長したスタッキング相互作用によってヘリックス熱安定性が増強される（米国特許番号第１０／０１３，２９５号を参照）。
【０１１９】
本発明のオリゴマー化合物は、議論された２’−修飾糖などの１若しくはそれ以上の置換等部位を含む。糖置換基のより総合的だが限定されないリストは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルを含み、ここにおいてアルキル、アルケニルおよびアルキニルは、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｃ２〜Ｃ１０アルケニルおよびアルキニルである。特定の置換基は、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯｍ）ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３））２であり、ここにおいてｎおよびｍは１〜約１０である。いくつかのオリゴヌクレオチドは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリル、またはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、挿入基、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善する基、またはオリゴヌクレオチドの薬力学的特性を改善する基、および同様な特性を有する他の置換基から選択された糖置換基を有する。
【０１２０】
１つの修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られている）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ，１９９５，７８，４８６〜５０４）、すなわちアルコキシアルコキシ基を含む。１つの修飾は、以下の実施例に記載されているような２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわちＯ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られている）、および２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られている）、すなわち２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２―Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０１２１】
他の糖置換基は、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、およびフルオロ（Ｆ）を含む。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位としてもよい。１つの２’−アラビノ修飾は２’−Ｆである。同様な修飾は、オリゴマー化合物上の他の位、特に３’末端ヌクレオシド上のまたは２’−５’結合オリゴヌクレオチドにおける糖の３’位、および５’末端ヌクレオチドの５’位でもなされる。オリゴマー化合物は、ペントフラノシル糖の位置におけるシクロブチル部位などの糖擬態も保持する。そのような修飾糖構造の調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第４，９８１，９７５号明細書；第５，１１８，８００号明細書；第５，３１９，０８０号明細書；第５，３５９，０４４号明細書；５，３９３，８７８号明細書；第５，４４６，１３７号明細書；第５，４６６，７８６号明細書；第５，５１４，７８５号明細書；第５，５１９，１３４号明細書；第５，５６７，８１１号明細書；第５，５７６，４２７号明細書；第５，５９１，７２２号明細書；第５，５９７，９０９号明細書；５，６１０，３００号明細書；５，６２７，０５３号明細書；第５，６９３，８７３号明細書；第５，６４６，２６５号明細書；第５，６５８，８７３号明細書；第５，６７０，６３３号明細書；第５，７９２，７４７号明細書；および第５，７００，９２０号明細書を含む。
【０１２２】
代表的な糖置換基は、以下の構造式ＩａまたはＩＩａ：
【０１２３】
【化１】
2008501693.tif 000003
の基を含み、ここで、
Ｒｂは、Ｏ、Ｓ、またはＮＨであり；
Ｒｄは、単結合、Ｏ、Ｓ、またはＣ（＝Ｏ）であり；
Ｒｅは、Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｎ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｑ）、Ｎ＝Ｃ（Ｒｐ）（Ｒｒ）、または以下の構造式ＩＩＩａを持ち；
【０１２４】
【化２】
2008501693.tif 000004
ＲｐおよびＲｑはそれぞれ個別に、水素、またはＣ１〜Ｃ１０アルキルであり；
Ｒｒは、−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｓ、Ｒｔ、Ｒｕ、およびＲｖはそれぞれ個別に、水素、Ｃ（Ｏ）Ｒｗ、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニル、アルキルスルフォニル、アリールスルフォニル、化学官能基または共役基であり、ここにおいて前記置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、およびアルキニルから選択されるものであり；
または選択的にＲｕおよびＲｖは、それらが結合した窒素原子とフタルイミド部位を共に形成し；
各Ｒｗは個別に、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、トリフルオロメチル、シアノエチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ｔ−ブトキシ、アリルオキシ、９−フルオレニルメトキシ、２−（トリメチルシリル）−エトキシ、２，２，２−トリクロロエトキシ、ベンジルオキシ、ブチリル、イソ−ブチリル、フェニル、またはアリールであり；
Ｒｋは、水素、窒素保護基、または−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｐは、水素、窒素保護基、または−Ｒｘ−Ｒｙであり；
Ｒｘは、結合または結合部位であり；
Ｒｙは、化学官能基、共役基、あるいは固体支持媒体であり；
ＲｍおよびＲｎはそれぞれ個別に、Ｈ、窒素保護基、置換或いは非置換Ｃ１〜Ｃ１０アルキル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルケニル、置換或いは非置換Ｃ２〜Ｃ１０アルキニルであり、ここにおいて前記置換基は、ヒドロキシル、アミノ、アルコキシ、カルボキシ、ベンジル、フェニル、ニトロ、チオール、チオアルコキシ、ハロゲン、アルキル、アリール、アルケニル、アルキニル、ＮＨ３＋、Ｎ（Ｒｕ）（Ｒｖ）、グアニジノ、およびアシルから選択されるものであり、ここにおいて前記アシルは酸アミドまたはエステルであり；
またはＲｍおよびＲｎは、共に窒素保護基であり、ＮおよびＯから選択された付加的なヘテロ原子を選択的に含む環構造に結合されており、または化学機能基であり；
Ｒｉは、ＯＲｚ、ＳＲｚ、またはＮ（Ｒｚ）２であり；
Ｒｚはそれぞれ個別に、Ｈ、Ｃ１〜Ｃ８アルキル、Ｃ１〜Ｃ８ハロアルキル、Ｃ（＝ＮＨ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、Ｃ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕ、またはＯＣ（＝Ｏ）Ｎ（Ｈ）Ｒｕであり；
Ｒｆ、Ｒｇ、およびＲｈは、約４〜約７炭素原子を保持する、または約３〜約６炭素原子を保持し、１または２ヘテロ原子を保持する環システムを有する環システムであり、ここにおいて前記へテロ原子は酸素、窒素、および硫黄から選択されたものであり、前記環システムは脂肪族、不飽和脂肪族、芳香族、または飽和または不飽和複素環であり；
Ｒｊは、１〜約１０炭素原子を保持するアルキルまたはハロアルキル、２〜約１０炭素原子を保持するアルケニル、２〜約１０炭素原子を保持するアルキニル、６〜約１４炭素原子を保持するアリール、Ｎ（Ｒｋ）（Ｒｍ）ＯＲｋ、ハロ、ＳＲｋまたはＣＮであり；
ｍａは、１〜約１０であり；
ｍｂはそれぞれ個別に、０または１であり；
ｍｃは、０または１〜１０の整数であり；
ｍｄは、１〜１０の整数であり；
ｍｅは、０、１、または２であり；
ｍｃが０の時、ｍｄは１以上の場合とする。
【０１２５】
構造式Ｉの代表的な置換基は、「キャッピング２’−オキシエトキシオリゴヌクレオチド」というタイトルで１９９８年８月７日に出願された米国特許出願番号第０９／１３０，９７３号明細書に開示されている。
【０１２６】
構造式ＩＩの代表的な環状置換基は、「立体配置的に事前構築されたＲＮＡ標的２’−オリゴマー化合物」というタイトルで１９９８年７月２７日に出願された米国特許出願番号第０９／１２３，１０８号明細書に開示されている。
【０１２７】
特定の糖置換基は、Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯｍ）ＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、およびＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３））２を含み、ここにおいてｎおよびｍは１〜約１０である。
【０１２８】
構造式ＩＩＩおよびＩＶに示された代表的なグアニジノ置換基は、「機能化されたオリゴマー」というタイトルで１９９９年７月７日に出願された米国特許出願番号第０９／３４９，０４０号明細書に開示されている。
【０１２９】
代表的なアセトアミド置換基は、米国特許番号第６，１４７，２００号明細書に開示されている。
【０１３０】
代表的なジメチルアミノエチルオキシエチル置換基は、「２’−Ｏ−ジメチルアミノエチルオキシエチル−オリゴマー化合物」というタイトルで１９９９年８月６日に出願された国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９９／１７８９５号に開示されている。
【０１３１】
ここで用いられたように「修飾インターヌクレオシド結合」および「修飾バックボーン」、または単純に「修飾結合」という用語は、オリゴマー化合物範囲内に２つの隣接ヌクレオシドを結合している天然由来ホスホジエステルインターヌクレオシド結合の修飾または置換を意味している。そのような修飾結合は、リン原子を保持する結合およびリン原子を保持しない結合を含む。
【０１３２】
そこにリン原子を含むインターヌクレオシド結合は、例えばホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート、５’−アルキレンホスホネートおよびキラルホスホネートを含むメチルおよび他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミダイトおよびアミノアルキルホスホラミダイトを含むホスホラミダイト、チオノホスホラミダイト、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、正常３’−５’結合を保持するセレノリン酸およびボラノリン酸、これらの２’−５’結合類似体、および逆位極性を保持するそれらを含み、ここにおいて１若しくはそれ以上のインターヌクレオシド結合は３’〜３’、５’〜５’、または２’〜２’結合である。逆位極性を保持するオリゴヌクレオチドは、３’−先端インターヌクレオチドでの単３’〜３’結合、すなわち脱塩基（核酸塩基が欠損またはその場所にヒドロキシ基を保持する）である単逆位ヌクレオシド残基を有することができる。様々な塩類、混合塩類、および遊離酸形態も含まれる。上述のリン−含有結合の調合を教示した代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第３，６８７，８０８号明細書；第４，４６９，８６３号明細書；第４，４７６，３０１号明細書；５，０２３，２４３号明細書；５，１７７，１９６号明細書；第５，１８８，８９７号明細書；第５，２６４，４２３号明細書；第５，２７６，０１９号明細書；第５，２７８，３０２号明細書；第５，２８６，７１７号明細書；第５，３２１，１３１号明細書；第５，３９９，６７６号明細書；第５，４０５，９３９号明細書；５，４５３，４９６号明細書；第５，４５５，２３３号明細書；第５，４６６，６７７号明細書；第５，４７６，９２５号明細書；第５，５１９，１２６号明細書；第５，５３６，８２１号明細書；第５，５４１，３０６号明細書；第５，５５０，１１１号明細書；第５，５６３，２５３号明細書；第５，５７１，７９９号明細書；第５，５８７，３６１号明細書；第５，１９４，５９９号明細書；第５，５６５，５５５号明細書；第５，５２７，８９９号明細書；第５，７２１，２１８号明細書；第５，６７２，６９７号明細書；および第５，６２５，０５０号明細書を含む。
【０１３３】
線虫システムにおいて、前記インターヌクレオチド結合の修飾（ホスホジエステルの場所のホスホロチオエート）は、ＲＮＡｉ活性では著しく干渉せず、これは本発明のオリゴマー化合物は１若しくはそれ以上の修飾インターヌクレオシド結合を持ち、活性を保持することができることを意味している。実は、そのような修飾インターヌクレオシド結合は、例えば増強された細胞性取り込み、核酸標的に対して増強された親和性、およびヌクレアーゼ存在下での増加された安定性などを与えることができるという有利な特性のために、しばしば天然由来ホスホジエステル結合よりも望ましい。
【０１３４】
修飾インターヌクレオシド結合を含む別のリンは、ホスホノ−モノエステルである（米国特許番号第５，８７４，５３３号および第６，１２７，３４６号を参照のこと）。ホスホノモノエステル核酸は、核酸の検出に対するプローブとして、および分子生物学における使用に対する補助として、遺伝子発現の阻害（アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、センスオリゴヌクレオチド、および三重形成オリゴヌクレオチド）という分野において有用な物理的、生物学的および薬学的特性を保持する。
【０１３５】
以前に定義したように、オリゴヌクレオシドは、リン原子を保持しないインターヌクレオシド結合によって結合されたヌクレオシドの配列を意味する。非リン含有インターヌクレオシド結合は、短鎖アルキル、シクロアルキル、混合ヘテロ原子アルキル、混合へテロ原子シクロアルキル、１若しくはそれ以上の短鎖ヘテロ原子、および１若しくはそれ以上の短鎖複素環を含む。これらのインターヌクレオシド結合は、これに限定されるものではないが、シロキサン、スルフィド、スルホキシド、スルホン、アセチル、ホルムアセチル、チオホルムアセチル、メチレンホルムアセチル、チオホルムアセチル、アルケニル、スルファミン酸、メチレンイミノ、メチレンヒドラジン、スルフォネート、スルフォンアミド、アミド、および混合Ｎ、Ｏ、ＳおよびＣＨ２構成成分部分を保持する他のものを含む。上述のオリゴヌクレオシドの調合を教示している代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第５，０３４，５０４号明細書；第５，１６６，３１５号明細書；５，１８５，４４４号明細書；第５，２１４，１３４号明細書；第５，２１６，１４１号明細書；第５，２３５，０３３号明細書；第５，２６４，５６２号明細書；５，２６４，５６４号明細書；第５，４０５，９３８号明細書；第５，４３４，２５７号明細書；第５，４６６，６７７号明細書；第５，４７０，９６７号明細書；第５，４８９，６７７号明細書；第５，５４１，３０７号明細書；第５，５６１，２２５号明細書；第５，５９６，０８６号明細書；第５，６０２，２４０号明細書；第５，６１０，２８９号明細書；第５，６０２，２４０号明細書；第５，６０８，０４６号明細書；第５，６１０，２８９号明細書；第５，６１８，７０４号明細書；第５，６２３，０７０号明細書；第５，６６３，３１２号明細書；第５，６３３，３６０号明細書；第５，６７７，４３７号明細書；第５，７９２，６０８号明細書；第５，６４６，２６９号明細書；および第５，６７７，４３９号明細書を含む。
【０１３６】
リン原子を含まない修飾インターヌクレオシド結合のいくつかの付加的例として、−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩバックボーンとして知られている）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、および−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−（ここにおいて未変性ホスホジエステルインターヌクレオチド結合は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−として示されている）を含む。前記ＭＭＩタイプおよびアミドインターヌクレオシド結合はそれぞれ、以下の参考文献米国特許番号第５，４８９，６７７号明細書および第５，６０２，２４０号明細書に開示されている。
【０１３７】
オリゴマー化合物の特性を増強できる、または前記オリゴマー化合物またはその代謝産物を追跡するために使用され得る別の修飾は、１若しくはそれ以上の部位または共役体の付加である。一般的に増強される特性は、活性を限定することなく、細胞分布、および細胞性取り込みを含む。１実施形態において、そのような修飾オリゴマー化合物は、ヒドロキシルまたはアミノ機能基などのオリゴマー化合物上の利用可能な機能基への共役基の共有結合性付加によって調合される。本発明の共役基は、干渉物質、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬力学的特性を増強する基、およびオリゴマーの薬物動態的特性を増強する基を含む。一般的な共役基は、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、および色素を含む。本発明の文中における薬力学的特性を増強する基は、これに限定されるものではないが、オリゴマー取り込み、分解に対する増強されたオリゴマー耐性、および／またはＲＮＡとの強化された配列特異的ハイブリダイゼーションを含む。本発明の文中における薬物動態的特性を増強する基は、これに限定されるものではないが、オリゴマー取り込み、分布、代謝および排出を含む。代表的な共役基は国際特許出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９１９６号に開示されている。
【０１３８】
共役基は、これに限定されるものではないが、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３〜６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３〜１０６０）、チオエーテル（例えばヘキシル−Ｓ−トリチルチオール）（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６〜３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５〜２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｓＲｅｓ．，１９９２，２０，５３３〜５３８）、脂肪族鎖（例えばドデカンジオール、またはウンデシル残基）（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１１〜１１１８；Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７〜３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈ．ｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９〜５４）、リン脂質（例えばジ−ヘキサデシル−グリセロールまたはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−Ｓ−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１〜３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７〜３７８３）、ポリアミンまたはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ&Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９〜９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，１９９５，３６，３６５１〜３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９〜２３７）、またはオクタデシルアミンまたはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３〜９３７）などの脂質部分を含む。
【０１３９】
本発明のオリゴマー化合物は、例えばアスピリン、ワルファリン、フェニルブタゾン、イブプロフェン、スプロフェン、フェンブフェン、ケトプロフェン、（Ｓ）−（＋）−プラノプロフェン、カルプロフェン、ダンシルサルコシン、２，３，５−トリイオド安息香酸、フルフェナム酸、ホリニン酸、ベンゾチアジアジド、クロロチアジド、ジアゼピン、インドメタシン、バルビツレート、セファロスポリン、サルファ剤、抗糖尿病薬、抗菌剤、または抗生物質などの薬剤物質を活性化するためにも共役される。オリゴヌクレオチド−薬剤共役基およびそれらの調合は、米国特許番号第０９／３３４，１３０号明細書に記載されている。
【０１４０】
そのようなオリゴヌクレオチド共役基の調合を教示する代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第４，８２８，９７９号明細書；第４，９４８，８８２号明細書；第５，２１８，１０５号明細書；第５，５２５，４６５号明細書；第５，５４１，３１３号明細書；第５，５４５，７３０号明細書；第５，５５２，５３８号明細書；第５，５７８，７１７号明細書；第５，５８０，７３１号明細書；第５，５８０，７３１号明細書；第５，５９１，５８４号明細書；第５，１０９，１２４号明細書；第５，１１８，８０２号明細書；第５，１３８，０４５号明細書；第５，４１４，０７７号明細書；第５，４８６，６０３号明細書；第５，５１２，４３９号明細書；第５，５７８，７１８号明細書；第５，６０８，０４６号明細書；第４，５８７，０４４号明細書；第４，６０５，７３５号明細書；第４，６６７，０２５号明細書；第４，７６２，７７９号明細書；第４，７８９，７３７号明細書；第４，８２４，９４１号明細書；第４，８３５，２６３号明細書；第４，８７６，３３５号明細書；第４，９０４，５８２号明細書；第４，９５８，０１３号明細書；第５，０８２，８３０号明細書；第５，１１２，９６３号明細書；第５，２１４，１３６号明細書；第５，０８２，８３０号明細書；第５，１１２，９６３号明細書；第５，２１４，１３６号明細書；第５，２４５，０２２号明細書；第５，２５４，４６９号明細書；第５，２５８，５０６号明細書；第５，２６２，５３６号明細書；第５，２７２，２５０号明細書；第５，２９２，８７３号明細書；第５，３１７，０９８号明細書；第５，３７１，２４１号明細書；第５，３９１，７２３号明細書；第５，４１６，２０３号明細書；第５，４５１，４６３号明細書；第５，５１０，４７５号明細書；第５，５１２，６６７号明細書；第５，５１４，７８５号明細書；第５，５６５，５５２号明細書；第５，５６７，８１０号明細書；第５，５７４，１４２号明細書；第５，５８５，４８１号明細書；第５，５８７，３７１号明細書；第５，５９５，７２６号明細書；第５，５９７，６９６号明細書；第５，５９９，９２３号明細書；第５，５９９，９２８号明細書、および第５，６８８，９４１号明細書を含む。
【０１４１】
本発明の組成物において使用されたオリゴマー化合物は、例えばヌクレアーゼ安定性などの特性を増強するようにオリゴマー化合物の片側または両側の末端一般的に結合される、１若しくはそれ以上の安定化基を保持するようにも修飾され得る。安定化基にはキャップ構造が含まれる。本明細書において使用されたように「キャップ構造」または「末端キャップ部位」という用語は、オリゴマー化合物の片側または両側の末端に結合され得る、化学修飾を意味している。これら末端修飾は、末端核酸部位を保持するオリゴマー化合物をエキソヌクレアーゼ分解から保護し、細胞内の運搬および／または局在化を助けることができる。前記キャップは、５’−末端（５’−キャップ）に、または３’−末端（３’−キャップ）に存在し得る、または両末端に存在し得る。限定のない例において、前記５’−キャップは、逆位脱塩基残基（部位）、４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド、４’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート結合；トレオ−ペントフラノシスヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；非環式３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；非環式３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド；３’−３’−逆位ヌクレオチド部位；３’−３’−逆位脱塩基部位；３’−２’−逆位ヌクレオチド部位；３’−２’−逆位脱塩基部位；１，４−ブタンジオールリン酸；３’−ホスホラミダイト；リン酸ヘキシル；リン酸アミノヘキシル；３’−リン酸；３’−ホスホロチオエート；ホスホロジチオエート；または架橋または非架橋メチルホスホン酸部位（より詳細はＷｉｎｃｏｔｔら、国際公開公報番号第ＷＯ９７／２６２７０号を参照のこと）を含む。
【０１４２】
特に適した本発明の３’−キャップ構造は、例えば４’，５’−メチレンヌクレオチド；１−（ベータ−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’’−チオヌクレオチド、炭素環ヌクレオチド；５’−アミノ−アルキルリン酸、１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸、３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１，２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−無水ヘキシトールヌクレオチド；Ｌ−ヌクレオチド；アルファ−ヌクレオチド；修飾塩基ヌクレオチド；ホスホロジチオエート；トレオ−ペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’，４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５’−５’−逆位ヌクレオチド部位；５’−５’−脱塩基部位；５’−ホスホラミダイト；５−ホスホロチオエート；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；架橋および／または非架橋５’−ホスホラミダイト、ホスホロチオエートおよび／またはホスホロジチオエート、架橋または非架橋メチルホスホン酸、および５’−メルカプト部位（より詳細はＢｅａｕｃａｇｅ  ａｎｄ  Ｔｙｅｒ，１９９３，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ４９，１９２５、および２００５年１月２７日に公開された米国公開公報第ＵＳ２００５／００２０５２５号を参照）を含む。
【０１４３】
オリゴマー化合物の片端または両端をキャップしヌクレアーゼ安定性を与えるために使用され得る更なる３’および５’−安定化基は、国際公開公報番号第ＷＯ０３／００４６０２号に開示されているものを含む。
【０１４４】
修飾および非修飾ヌクレオシドのオリゴマー化は、必要に応じて、ＤＮＡ（Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｓ，Ｅｄ．Ａｇｒａｗａｌ（１９９３），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）および／またはＲＮＡ（Ｓｃａｒｉｎｇｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１），２３，２０６〜２１７．Ｇａｉｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ  ＲＮＡ  ｉｎ  ＲＮＡ：Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，Ｅｄ．Ｓｍｉｔｈ（１９９８），１−３６．Ｇａｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  （２００１），５７，５７０７〜５７１３）合成のための文献手順に従って実行される。さらに、本発明のオリゴマー化合物の合成に対する特別なプロトコールは、以下の実施例において説明される。
【０１４５】
支持体固定されたオリゴヌクレオチド合成は、伸長鎖の片端へのヌクレオチドの配列付加に依存している。一般的に、第一のヌクレオシド（あらゆる環外アミン官能性存在で保護基を保持する）は適切なガラスビーズ支持体へ接着され、適切な活性化亜リン酸エステル部位、すなわち「活性化亜リン酸基」（一般的にはさらに適切な保護基を生じる、ヌクレオチドホスホラミダイト）を生じるヌクレオチドは伸長オリゴヌクレオチドを伸長するために段階的に付加される。固相合成に対する付加的方法は、Ｃａｒｕｔｈｅｒｓの米国特許番号番号第４，４１５，７３２号明細書；第４，４５８，０６６号明細書；第４，５００，７０７号明細書；第４，６６８，７７７号明細書；第４，９７３，６７９号明細書；および第５，１３２，４１８号明細書；およびＫｏｓｔｅｒの米国特許番号第４，７２５，６７７号明細書および第Ｒｅ．３４，０６９号明細書に認められる。
【０１４６】
オリゴヌクレオチドは、溶液中でまたは支持媒体（例えば固体支持媒体など）上で一般的に調合される。一般的に、第一のシントン（出発材料）（例えば、ヌクレオシドなどのモノマー）は、支持媒体に最初に接着され、次にオリゴヌクレオチドは前記支持体固定されたシントンへの経時的なモノマーのカップリングによって合成される。この反復性伸長は最終的に最終オリゴマー化合物、またはポリペプチドなどの他のポリマーを生じる。適した支持媒体は可溶性または不溶性であり得る、または異なる溶媒における様々な溶解度を有し、これは伸長する支持体固定されたポリマーが要望通りに溶液内外に存在することを可能にする。固体支持媒体などの従来の支持媒体は、大部分が不溶性であり、試薬と溶媒とが反応するおよび／または前記支持体から切断された後、オリゴマーが標的の長さに到達するまで伸長鎖を洗浄する、および必要であれば、さらに最終ポリマー化合物を産生するまで加工される間、通常反応槽内に設置される。より最近のアプローチでは、可溶性ポリマー支持体を含む可溶性支持体が紹介されており、これは合成の望ましいポイントで、反復して合成された産物の沈殿および溶解を可能にする（Ｇｒａｖｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．，１９９７，９７，４８９〜５１０）。
【０１４７】
支持媒体という用語は、オリゴマー化合物およびペプチドなどの関連する化合物の合成用に本分野の当業者に既知である全ての形態の支持体を含むことを意味している。本発明の方法に従ったいくつか代表的な支持媒体は、これに限定されるものではないが以下のもの：微細孔ガラス（ＣＰＧ）；オキサリル−微細孔ガラス（例えば、Ａｌｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １９９１，１９，１５２７を参照のこと）；例えばトリクロロ−［３−（４−クロロメチル）フェニル］プロピルシランと多孔性ガラスビーズとの反応によって形成されるような多孔性ガラスビーズおよびシリカゲルなどの、シリカ含有粒子（Ｐａｒｒ  ａｎｄ  Ｇｒｏｈｍａｎｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｅｄ．１９７２，１１，３１４を参照のこと、さらに商標「ＰＯＲＡＳＩＬ  Ｅ」としてＷａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ（Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，Ｍａｓｓ．，米国）から販売されている）；１，４−ジヒドロキシメチレニルベンゼンのモノエステルおよびシリカ（Ｂａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｊｕｎｇ，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９７０，４５０３を参照のこと、さらに商標「ＢＩＯＰＡＫ」としてＷａｔｅｒｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓから販売されている）；ＴＥＮＴＡＧＥＬ（例えば、Ｗｒｉｇｈｔ，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  １９９３，３４，３３７３を参照のこと）；架橋スチレン／ジビニルベンゼンコポリマービーズ状マトリックスまたはＰＯＲＰＳ（ポリスチレン／ジビニルベンゼンのコポリマー、Ｐｅｒｃｅｐｔｉｖｅ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから入手可能）；可溶性支持媒体であるポリエチレングリコールＰＥＧｓ（Ｂｏｎｏｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ&Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，４，２２５〜２３１を参照のこと）を含む。
【０１４８】
本明細書において使用されるように「結合部位」という用語は、一般的に二官能性基であり、最終３’−ヌクレオシド（従って新生オリゴヌクレオチド）は合成の間、前記固体支持媒体に共有結合的に結合するが、５’−保護基および該当する場合あらゆる２’−保護基が除去されるという条件に直交する条件下で切断される。適切な結合部分はこれに限定されるものではないが、アルキレン、シクロアルキレン、アリーレン、ヘテロシクリル、ヘテロアリーレンなどの二価基、および上述されたような他の変形型を含む。
【０１４９】
例示的なアルキレン結合部位はこれに限定されるものではないが、Ｃ１〜Ｃ１２アルキレン（例えばメチレン、エチレン（例えばエチル−１，２−エン）、プロピレン（例えばプロピル−１，２−エン、プロピル−１，３−エン）、ブチレン（例えばブチル−１，４−エン、２−メチルプロピル−１，３−エン）、ペンチレン、ヘキシレン、ヘプチレン、オクチレン、デシレン、ドデシレン）などを含む。例示的なシクロアルキレン基は、シクロプロピレン、シクロブチレン、シクロペンタニル−１，３−エン、シクロヘキシル−１，３−エン、シクロヘキシル−１，４−エンなどのＣ３〜Ｃ１２シクロアルキレン基を含む。例示的なアリーレン結合部位はこれに限定されるものではないが、例えばフェニル−１，２−エン、ナフチル−１，６−エン、ナフチル−２，７−エン、アントラセニルなどの、６〜約１４炭素原子を保持する単環性または二環性アリーレン基を含む。本発明の観点内の例示的なヘテロシクリル基は、約４〜約１２炭素原子および約１〜約４ヘテロ原子（例えばＮ、ＯおよびＳなど）を保持する単環式または二環式アリール基を含み、ここにおいて前記環状部分は部分的に脱水素化されているものである。
【０１５０】
本発明の観点内であるとして言及される特定のヘテロアリール基は、ピロリジニル、ピペリジニル（例えば２，５−ピペリジニル、３，５−ピペリジニル）、ピペラジニル、テトラヒドロチオフェニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロキノリニル、テトラヒドロイソキノリニル、テトラヒドロキナゾリニル、テトラヒドロキノキサリニルなどを含む。例示的なヘテロアリーレン基は、約４〜約１２炭素原子および約１〜約４ヘテロ原子（例えばＮ、ＯおよびＳなど）を保持する単環式または二環式アリール基を含む。本発明の観点内であるとして言及される特定のヘテロアリール基は、ピリジレン（例えばピリジル−２，５−エン、ピリジル−３，５−エン）、ピリミジニル、チオフェニル、フラニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニルなどを含む。
【０１５１】
オリゴマー化合物および関連する化合物の支持媒体ベース合成用にルーティンに使用される商業的に利用可能な装置は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を含むいくつかの製造供給元で販売されている。本分野で既知なそのような合成に対するあらゆる他の手段を、付加的にまたは代替的に利用する。自動合成技術を含む適切な固体相技術は、Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ（ｅｄ），Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ，ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９１）に記載されている。
【０１５２】
多くの研究がオリゴリボヌクレオチドの合成に焦点を当てているが、現在商業的に使用されている主要なＲＮＡ合成戦略は、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル（ＴＢＤＭＳ）、５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−［１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］（ＦＰＭＰ）、２’−Ｏ−［（トリイソプロピルシリル）オキシ］メチル（２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−Ｓｉ（ｉＰｒ）３（ＴＯＭ）、および５’−シリルエーテル−２’−ＡＣＥ（５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル（ＤＯＤ）−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキリ）メチル（ＡＣＥ）を含む。現在ＲＮＡ産生を売り出している主要な会社のいくつかに関する現在のリストは、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．、Ａｍｅｒｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．、およびＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．を含む。１つの会社であるＰｒｉｎｃｅｔｏｎ  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓは、特にＴＯＭとＴＢＤＭＳ化学とのカップリング時間を減少すると宣伝しているＲＮＡ合成活性化因子を市場販売している。そのような活性化因子も本発明に適している。商業用ＲＮＡ合成に対して使用されている第一の基は：
ＴＢＤＭＳ＝５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−ｔ−ブチルジメチルシリル；
ＴＯＭ＝２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキリ）メチル；
ＤＯＤ／ＡＣＥ＝５’−Ｏ−ビス（トリメチルシロキシ）シクロドデシルオキシシリルエーテル−２’−Ｏ−ビス（２−アセトキシエトキリ）メチル；
ＦＰＭＰ＝５’−Ｏ−ＤＭＴ−２’−Ｏ−［１（２−フルオロフェニル）−４−メトキシピペリジン−４−イル］である。
【０１５３】
前述のＲＮＡ合成戦略の全てが本発明に適している。例えば１つの戦略からの５’−保護基と別の戦略からの２’−Ｏ−保護基とを用いた上述のハイブリッドとなる戦略も本発明に適している。
【０１５４】
本発明において使用されるように「アンチセンス」または「アンチセンス阻害」という用語は、オリゴマー化合物またはそれらの一部と選択された標的核酸とのハイブリダイゼーションを意味している。複数のアンチセンスメカニズムは、オリゴマー化合物が哺乳類細胞において遺伝子発現を調節するために使用され得る手段として存在している。そのようなアンチセンス阻害は、少なくとも１つの鎖または断片が切断される、分解される、または他の動作不能にするような相補鎖または断片の水素結合−ベースハイブリダイゼーションに一般的に基づいている。この点に関して、そのようなアンチセンス阻害に対して特異的核酸分子およびそれらの機能を標的にすることは現在適している。
【０１５５】
干渉されるＤＮＡの機能は複製および転写を含むことができる。複製および転写は、例えば内因性細胞’型、ベクター、プラスミドコンストラクトまたは他のものからなされる。干渉されるＲＮＡの機能は、タンパク質翻訳の部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡ合成の部位とは離れている細胞内の部位へのＲＮＡの転座、ＲＮＡからのタンパク質の翻訳、１若しくはそれ以上のＲＮＡ種を得るためのＲＮＡのスプライシング、およびＲＮＡに携わるまたはＲＮＡによって促進される、ＲＮＡに関する触媒活性または複合体形成などの機能を含むことができる。
【０１５６】
一般に開発されたアンチセンスメカニズムは、標的ＲＮＡのＲＮａｓｅＨ−依存性分解である。ＲＮａｓｅＨは、アンチセンスＤＮＡ−ＲＮＡヘテロ二本鎖を認識しそのＲＮＡ鎖を加水分解するエンドヌクレアーゼを偏在的に発現されている。更なるアンチセンスメカニズムは、ＲＮＡ−ＲＮＡ二本鎖の切断を触媒する酵素の利用に関するものである。これらの反応は、これに限定されるものではないが、ＲＮａｓｅＩＩＩおよびＲＮａｓｅＬを含むＲＮａｓｅ酵素群によって触媒される。ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られているアンチセンスメカニズムは、ＲＮＡ−ＲＮＡハイブリッドおよびそれと同等のものに有効である。ＲＮａｓｅＨベースアンチセンス（通常一本鎖化合物を使用する）およびＲＮＡ干渉（通常ｓｉＲＮＡとして知られている二本鎖化合物を使用する）の両方がアンチセンスメカニズムであり、一般的に標的ＲＮＡ機能の損失を生じる。
【０１５７】
最適化ｓｉＲＮＡおよびＲＮａｓｅＨ依存性オリゴマー化合物は、有効性、最大効果、特異性、および作用持続期間、および効率の観点で同様に振舞う。さらに、一般的にｄｓＲＮＡコンストラクトの活性は、同じ部位を標的化したＲＮａｓｅＨ依存性一本鎖アンチセンスオリゴマー化合物の活性と一致することが示されていた。１つの大きな例外は、ＲＮａｓｅＨ依存性アンチセンスオリゴマー化合物が、プレｍＲＮＡにおける標的部位に対して活性化され、ｓｉＲＮＡは活性化されないことである。
【０１５８】
これらのデータにより、一般的に、ＲＮａｓｅＨ依存性オリゴヌクレオチドで活性化されない標的ＲＮＡ上の部位は、ｓｉＲＮＡに対して同様によい部位ではないことが示唆された。反対に、活性化ＲＮａｓｅＨオリゴマー化合物とｓｉＲＮＡとの間の著しい程度の相互関係は、ある部位がＲＮａｓｅＨオリゴマー化合物にハイブリダイズするのに利用可能である場合、ｓｉＲＮＡ複合体によるハイブリダイゼーションおよび切断にも利用可能であることを示唆している。その結果、一度適切な標的部位がアンチセンスアプローチによって決定されたら、これらの部位は代替アンチセンスメカニズムによって機能するコンストラクトを設計するために使用され得る（Ｖｉｃｋｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２００３，２７８，７１０８）。さらに、一度ある部位がＲＮＡｉまたはＲＮａｓｅＨオリゴマー化合物に対して活性化であるとして示されたら、一本鎖ＲＮＡｉオリゴマー化合物（ｓｓＲＮＡｉまたはａｓＲＮＡ）は設計され得る。
【０１５９】
本発明のオリゴマー化合物および方法は、低分子非コードＲＮＡの研究、特徴付け、検証、および調節にも有用である。これらは、これ限定されるものではないが、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子核内ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、低分子時間的ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ＲＮＡｓ：ｓｔＲＮＡ）、および微小非コードＲＮＡ（ｔｎｃＲＮＡ）、またはそれらの前駆体、またはプロセシング転写産物、または他の細胞構成成分との関連物を含む。
【０１６０】
低分子非コードＲＮＡは、植物、線虫および哺乳類を含む幅広い生物体の様々な発生および調節経路において機能すると示されていた。ミクロＲＮＡは、酵素的切断によって大きな前駆体から加工された低分子非コードＲＮＡであり、ｍＲＮＡの翻訳を阻害する。ｓｔＲＮＡはｍｉＲＮＡと同様に前駆体から加工される一方、発生タイミング調節に関与していると示された。他の非コード低分子ＲＮＡは、転写産物の細胞性スプライシング、翻訳、輸送、および染色体構築と同じ位多様なイベントに関与している。
【０１６１】
低分子非コードＲＮＡ機能の調節因子として、本発明のオリゴマー化合物は例えばスプライシングの調節、染色体パッケージングまたはメチル化、発生的タイミングイベントの調節、特異的な生物学的経路への運搬のタイミングに依存した標的ＲＮＡ発現レベルの増加または減少、および翻訳または転写調節などの、細胞性機能または加工の調節および操作における有用性も見出された。さらに、本発明のオリゴマー化合物は、例えば細胞質、核、核小体またはミトコンドリアなどの特定の細胞コンパートメントにおけるそれらの効果を最適化するために修飾され得る。
【０１６２】
本発明の化合物はさらに、ＲＮＡプロセシングまたは代謝の調節経路のコンポーネント、さらにはスクリーニングアッセイや装置におけるコンポーネントを同定するために使用され得る。
【０１６３】
特定の核酸分子に対してオリゴマー化合物を標的化することは、本発明の文脈において多段階工程であり得る。前記工程は、その機能を修飾される標的核酸の同定から通常始める。本明細書において使用されるように「標的核酸」および「核酸標的」という用語は、限定することなく、ＤＮＡ（細胞性遺伝子）、そのようなＤＮＡから転写されたＲＮＡ（プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ、およびそれらの一部を含む）、およびそのようなＲＮＡから由来したｃＤＮＡも含む、標的となり得るあらゆる核酸を意味している。１実施形態において、選択された遺伝子の発現の調節は特定の障害または病状に関連している。別の実施形態において、前記標的核酸は、感染性因子からの核酸分子である。
【０１６４】
標的化工程は通常、例えば発現の調節などの望ましい効果を生じるようなアンチセンス相互作用に対する標的核酸内の少なくとも１つの標的領域、断片、または部位を決定する工程を含む。核酸標的に適用されるような本発明の文脈内で、「領域」という用語は、少なくとも１つの同定可能な構造、機能または特徴を保持する前記標的核酸の一部として定義される。領域内の標的核酸は断片である。「断片」は、標的核酸内の領域のより小さいまたはサブ部分として定義される。本発明で使用されるように「部位」は、標的核酸内の位置として定義される。領域、断片および部位という用語は、例えば３分離領域または断片を保持するギャップトオリゴマー化合物などの本発明のオリゴマー化合物を記載するためにも使用され得る。
【０１６５】
本分野において既知であるように、翻訳開始コドンは一般的に５’−ＡＵＧ（転写されたｍＲＮＡ分子内；対応するＤＮＡ分子内では５’−ＡＴＧ）であり、翻訳開始コドンも「ＡＵＧコドン」、「開始コドン」、または「ＡＵＧ開始コドン」として言及される。少数の遺伝子は、ＲＮＡ配列５’−ＧＵＧ、５’−ＵＵＧ、または５’−ＣＵＧを保持する翻訳開始コドンを保持しており、５’−ＡＵＡ、５’−ＡＣＧ、および５’−ＣＵＧがｉｎ  ｖｉｖｏで機能を果たすと示された。従って、「翻訳開始コドン」および「開始コドン」という用語は、それぞれの場合におけるイニシエーターアミノ酸が一般的にメチオニン（真核生物）またはホルミルメチオニン（原核生物）であるけれども、多くのコドン配列を含むことができる。本分野では、真核生物および原核生物遺伝子は２またはそれ以上の代替開始コドンを持ち、それらの任意の１つは特定の細胞タイプまたは組織において、または特定の条件下での翻訳開始のために選択的に利用されるということも既知である。本発明の文脈において、「開始コドン」および「翻訳開始コドン」は、そのようなコドンの配列に関わらず、核酸標的をコード化している遺伝子から転写されるｍＲＮＡの翻訳を開始するためにｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるコドンまたはコドン群を意味している。本分野では、遺伝子の翻訳終止コドン（または「終止コドン」）は３つの配列、すなわち５’−ＵＡＡ、５’−ＵＡＧおよび５’−ＵＧＡ（対応ＤＮＡ配列はそれぞれ５’−ＴＡＡ、５’−ＴＡＧおよび５’−ＴＧＡ）の１つを保持するということも既知である。
【０１６６】
「開始コドン領域」および「翻訳開始コドン領域」という用語は、翻訳開始コドンから両方向（すなわち５’または３’）の約２５〜約５０近接ヌクレオチドを含む、そのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を意味している。同様に、「終止コドン領域」および「翻訳終止コドン領域」という用語は、翻訳終止コドンから両方向（すなわち５’または３’）の約２５〜約５０近接ヌクレオチドを含む、そのようなｍＲＮＡまたは遺伝子の一部を意味している。その結果、「開始コドン領域」（または「翻訳開始コドン領域」）および「終止コドン領域」（または「翻訳終止コドン領域」）は、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物で効果的に標的化される全ての領域である。
【０１６７】
翻訳開始コドンと翻訳終止コドンとの間の領域として本分野では既知であるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）または「コドン領域」は、効果的に標的化される領域でもある。本発明の文脈内で、１つの領域は遺伝子のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の翻訳開始または終止コドンを含む、遺伝子内領域である。
【０１６８】
他の標的領域は、翻訳開始コドンから５’方向でのｍＲＮＡの一部として言及されると本分野では既知である５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）を含み、従って５’キャップ部位とｍＲＮＡの翻訳開始コドンとの間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応ヌクレオチド）を含み、翻訳終止コドンから３’方向でのｍＲＮＡの一部として言及されると本分野では既知である３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）を含み、従って翻訳終止コドンとｍＲＮＡの３’末端との間のヌクレオチド（または遺伝子上の対応ヌクレオチド）を含む。ｍＲＮＡの５’キャップ部位は、５’−’三リン酸結合を解してｍＲＮＡの５’−最先端（ｍｏｓｔ）残基に結合したＮ７−メチル化グアノシン残基を有する。ｍＲＮＡの５’キャップ領域は、前記キャップ部位と隣接した最初の５０ヌクレオチドと同様に、５’キャップ構造自体を含むと考えられている。５’キャップ領域を標的化することも適している。
【０１６９】
いくつかの真核生物ｍＲＮＡ転写産物は直接翻訳されるが、多くは、翻訳される前の転写産物から除去される「イントロン」として知られている１若しくはそれ以上の領域を含む。残り（およびそのために翻訳された）領域は「エキソン」として知られており、連続ｍＲＮＡ配列を形成するために一緒にスプライシングされる。標的スプライシング部位、すなわちイントロン−エキソン接合部またはエキソン−イントロン接合部は、異常スプライシングが疾患に関連している、または特定のスプライシング産物の過剰産生が疾患に関連しているという状況で特に有用である。再構成または欠損に起因する異常な融合接合も適した標的部位である。異なる遺伝子源からの２つ（またはそれ以上）のｍＲＮＡのスプライシングの工程を介して産生されたｍＲＮＡ転写産物は、「融合転写産物」として知られている。イントロンは、例えばＤＮＡまたはプレ−ｍＲＮＡを標的化したアンチセンスオリゴマー化合物を用いて効果的に標的化され得ることも既知である。
【０１７０】
選択的ＲＮＡ転写産物はＤＮＡの同じゲノム領域から産生され得るということは本分野において既知である。これらの選択的転写産物は一般的に「変異体」として知られている。より具体的には「プレ−ｍＲＮＡ変異体」は、それらの開始または終止位置における同じゲノムＤＮＡから産生された他の転写産物とは異なり、イントロン配列およびエキソン配列の両方を含む、同じゲノムＤＮＡから産生された転写産物である。
【０１７１】
スプライシングの間、エクソンまたはイントロン領域、またはそれらの一部の１若しくはそれ以上の切除で、プレ−ｍＲＮＡ変異体はより小さい「ｍＲＮＡ変異体」を産生する。次に、ｍＲＮＡ変異体はプレ−ｍＲＮＡ変異体にプロセシングされ、それぞれ独特なプレ−ｍＲＮＡ変異体はスプライシングの結果としていつも独特なｍＲＮＡ変異体を産生しなくてはならない。これらのｍＲＮＡ変異体は「選択的スプライシング変異体」としても知られている。プレ−ｍＲＮＡ変異体のスプライシングが起こらなかった場合、次に前記プレ−ｍＲＮＡ変異体はｍＲＮＡ変異体と同一である。
【０１７２】
変異体は転写を開始または終止するための選択的シグナルの使用を通じて産生され得、プレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡは１つ以上の開始コドンまたは終止コドンを有することができるということも本分野では既知である。選択的開始コドンを用いるプレ−ｍＲＮＡおよびｍＲＮＡに由来する変異体は、そのプレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的開始変異体」として知られている。選択的終止コドンを用いるそれら転写産物は、そのプレ−ｍＲＮＡまたはｍＲＮＡの「選択的終止変異体」として知られている。選択的終止変異体の１つの特異的なタイプは、「ポリＡ変異体」であり、産生された複数の転写産物は転写機構によって１つの「ポリＡ終止シグナル」の代替的選択に起因し、それによって独特なポリＡ部位で終止する転写産物を産生する。本発明の文脈内で、ここに記載された変異体のタイプも適切な標的核酸である。
【０１７３】
前記アンチセンスオリゴマー化合物とハイブリダイズする前記標的核酸上の位置は、後述の通り「適切な標的断片」として言及される。本明細書において使用されるように「適切な標的断片」という用語は、活性型アンチセンスオリゴマー化合物が標的化している、標的領域の少なくとも８−核酸塩基部分として定義される。理論によって束縛されることなく、これら標的断片は、ハイブリダイゼーションに利用できる前記標的核酸の一部を表している現在信じられている。
【０１７４】
例示的なアンチセンスオリゴマー化合物は、例えば細胞性遺伝子またはその遺伝子から転写されたｍＲＮＡなどの、標的化した核酸の５’末端から少なくとも８連続した核酸塩基を有するオリゴマー化合物を含む（残りの核酸塩基は、同じオリゴヌクレオチドの連続伸長であり、前記標的核酸へ特異的にハイブリダイズする前記アンチセンスオリゴマー化合物の５’末端のすぐ上流から始まり、オリゴヌクレオチドが約８〜約８０核酸塩基を含むまで続けられる）。同様に、アンチセンスオリゴマー化合物は、実例的アンチセンスオリゴマー化合物の１つの３’末端から少なくとも８連続した核酸塩基を有するオリゴヌクレオチド配列によって表されている（残りの核酸塩基は、同じオリゴヌクレオチドの連続伸長であり、前記標的核酸へ特異的にハイブリダイズする前記アンチセンスオリゴマー化合物の３’末端のすぐ下流から始まり、オリゴヌクレオチドが約８〜約８０核酸塩基を含むまで続けられる）。本明細書で説明されたアンチセンスオリゴマー化合物を理解している当業者は、過度な実験をすることなしに、更なるアンチセンスオリゴマー化合物を同定することができる。
【０１７５】
一度１若しくはそれ以上の標的領域、断片または部位が同定されたら、アンチセンスオリゴマー化合物は前記標的と十分に相補的である、すなわち、望ましい効果を提供するために十分な特異性を有して十分によくハイブリダイズされるものが選択される。
【０１７６】
本発明の１実施形態に従うと、本発明のアンチセンスオリゴマー化合物を有する一連の核酸二本鎖とそれらの相補鎖は、特異的な標的または標的群に対して設計され得る。前記鎖の末端は、オーバーハングを形成するように１若しくはそれ以上の天然または修飾核酸塩基の付加によって修飾されている。前記二本鎖のセンス鎖は次に、前記アンチセンス鎖の相補鎖として設計され合成され、両末端への修飾または付加も含む。例えば１実施形態において、前記二本鎖の両鎖は中央核酸塩基に対して相補的であり、それぞれは１または両末端にオーバーハングを保持する。
【０１７７】
前記二本鎖のＲＮＡ鎖は、本明細書で開示された方法によって合成され得る、または様々なＲＮＡ合成会社、例えばＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，ＣＯ）などから購入される。合成したら、相補鎖をアニーリングした。前記一本鎖は一定分量にされ、５０μＭの濃度まで希釈される。希釈したら、３０μＭの各鎖は１５μＬの５ｘアニーリングバッファー溶液と混合される。前記バッファーの最終濃度は１００ｍＭアセチル酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、および２ｍＮ  アセチル酸マグネシウムであった。最終用量は７５μＬである。この溶液を１分間９０℃でインキュベートし、１５秒間遠心分離した。そのチューブは、ｄｓＲＮＡ二本鎖を実験に使用するまで１時間３７℃で放置した。ｄｓＲＮＡ化合物の最終濃度は２０μＭである。この溶液は凍結（−２０℃）で貯蔵可能であり、５回まで凍結融解可能である。
【０１７８】
調合されたら、この望ましい合成二本鎖は標的発現を調節するそれらの能力を評価される。細胞が８０％コンフルエンスに達した場合、その細胞は本発明の少なくとも１つのオリゴマー化合物を有する合成二本鎖で処理される。９６ウェルプレートで増殖した細胞に対しては、ウェルは２００μＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１低減血清培養液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で１回洗浄し、次に１２μｇ／ｍＬリポフェクチン（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）および最終濃度２００ｎＭの望ましいｄｓＲＮＡ化合物を含有した１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で処理される。処理の５時間後、前記培養液は新鮮培養液に交換した。細胞は処理後１６時間で回収し、その時点でＲＮＡが単離され、標的減少をＲＴ−ＰＣＲによって測定した。
【０１７９】
更なる実施形態において、本明細書において同定された「適切な標的断片」は、標的の発現を調節する付加的なオリゴマー化合物をスクリーニングする際に使用される。「修飾因子」は、標的をコード化する核酸分子の発現を減少または増加し、適切な標的断片に相補的な少なくとも８核酸塩基部分を有するオリゴマー化合物のことである。前記スクリーニング方法は、標的をコード化した核酸分子の適切な標的断片を１若しくはそれ以上の候補修飾因子と接触させる工程と、標的をコード化した核酸分子の発現を減少または増加する１若しくはそれ以上の候補修飾因子を選択する工程とを有している。候補修飾因子または修飾因子群が標的をコード化する核酸分子の発現を調節することができる（例えば、減少するまたは増加する）と示された場合、前記修飾因子は次に、標的の機能の更なる調査研究において、または本発明に従った研究、診断、または治療用因子としての使用で用いられる。
【０１８０】
本発明の適切な標的断片は、本発明の各相補的アンチセンスオリゴマー化合物と組み合わせ、安定化二本鎖（二本鎖化）オリゴヌクレオチドを形成する。
【０１８１】
本発明の文脈において、「ハイブリダイゼーション」とは、相補的ヌクレオシドの複素環塩基部位間のワトソン−クリック、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型または予備Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型水素結合である、水素結合を意味する。例えば、アデニンおよびチミンは水素結合の形成を介して対をなす相補的核酸塩基である。本明細書において使用されたように「相補的」は、２つのヌクレオチド間で正確な対を形成することができる能力を意味している。例えば、オリゴヌクレオチドの特定位置のヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡ分子の同じ位置のヌクレオチドと水素結合することができる場合、前記オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡとは、それぞれ相補的であると考えられる。各分子において十分な数の一致する位置がそれぞれ水素結合することができるヌクレオチドによって占有される時、前記オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡは互いに相補的であると考えられる。従って、「特異的にハイブリダイズ可能」および「相補的」は、十分な程度に相補性であること、または、適切で特異的な結合が前記オリゴヌクレオチドとＤＮＡまたはＲＮＡ標的との間に生じるように正確に対をなすことを意味するために使用される用語である。アンチセンスオリゴマー化合物の配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるために、その標的核酸と１００％相補的である必要はないことは当業者には理解される。アンチセンスオリゴマー化合物は、前記標的ＤＮＡまたはＲＮＡ分子への化合物の結合が標的ＤＮＡまたはＲＮＡの正常機能を干渉し完全なまたは部分的な機能欠損を引き起こす場合、および、特異的な結合が望ましい条件下、すなわち治療上処置における生理学条件下、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを実行する条件下で前記アンチセンスオリゴマー化合物の非標的配列への非特異的結合を避けるのに十分な程度に相補的である場合、特異的にハイブリダイズ可能である。さらに、オリゴヌクレオチドは、介在または隣接断片はハイブリダイゼーション現象（例えばループ構造、ミスマッチまたはヘアピン構造）には関連しないように、１若しくはそれ以上の断片とハイブリダイズする。
【０１８２】
本発明のオリゴマー化合物は、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％配列相補性を有し、それらが標的化する標的核酸配列内の標的領域を標的化する。例えば、前記アンチセンスオリゴマー化合物の２０核酸塩基中１８核酸塩基が標的領域に対して相補的であり、従って特異的にハイブリダイズするアンチセンスオリゴマー化合物は９０％相補性を示す。この実施例において、残りの非相補的核酸塩基は、相補的核酸塩基でクラスタ化され散在され、お互いにまたは相補的核酸塩基と隣接する必要はない。そのようなものとして、前記標的核酸と完全に相補的な２つの領域に隣接する、４非相補的核酸塩基を保持する長さ１８核酸塩基であるアンチセンスオリゴマー化合物は、前記標的核酸と７７．８％総合相補性を持ち、従って本発明の観点内には入らない。
【０１８３】
アンチセンスオリゴマー化合物の標的核酸の領域とのパーセント相補性は、当業者には既知であるＢＬＡＳＴプログラム（塩基局在アライメントサーチ手段）およびＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラムを用いてルーティンに決定され得る（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３〜４１０；Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９〜６５６）。パーセント相同性、配列同一性または相補性は、例えばＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのアルゴリズム（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２〜４８９）を用いるデフォルトセッティングを用いた、Ｇａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ（登録商標），Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ）などによって決定され得る。いくつかの実施例において、前記オリゴマー化合物と前記標的との間の相同性、配列同一性または相補性は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９２％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または１００％である。
【０１８４】
いくつかの実施形態において、「適切な標的断片」は選択されたタンパク質の発現を調節する付加的なオリゴマー化合物のスクリーニングに用いられる。「修飾因子」は、タンパク質をコード化する核酸分子の発現を減少または増加し、適切な標的断片と相補的な少なくとも８核酸塩基部分を有する、オリゴマー化合物である。前記スクリーニング方法は、タンパク質をコード化する核酸分子の適切な標的断片を１若しくはそれ以上の候補修飾因子と接触させる工程と、タンパク質をコード化する核酸分子の発現を減少または増加する１若しくはそれ以上の候補修飾因子を選択する工程とを有する。候補修飾因子または修飾因子群がペプチドをコード化する核酸分子の発現を調節することができる（例えば、減少するまたは増加する）と示された場合、前記修飾因子は次に、ペプチドの機能の更なる調査研究において、または本発明に従った研究診断、または治療用因子としての使用で用いられる。
【０１８５】
本発明の適切な標的断片は、本発明の各相補的アンチセンスオリゴマー化合物と組み合わせ、安定化二本鎖（二本鎖化）オリゴヌクレオチドを形成する。そのような二本鎖オリゴヌクレオチド部位は標的発現を修飾し、アンチセンスメカニズムを介したＲＮＡプロセシングと同様に翻訳を制御すると本分野では示されていた。さらに、前記二本鎖部位は化学修飾の対象となりうる（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９９８，３９１，８０６〜８１１；Ｔｉｍｍｏｎｓ  ａｎｄ  Ｆｉｒｅ，Ｎａｔｕｒｅ  １９９８，３９５，８５４；Ｔｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ，２００１，２６３，１０３〜１１２；Ｔａｂａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９８，２８２，４３０〜４３１；Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９９８，９５，１５５０２〜１５５０７；Ｔｕｓｃｈｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．，１９９９，１３，３１９１〜３１９７；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４〜４９８；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．２００１，１５，１８８〜２００）。例えば、そのような二本鎖部位は、前記標的に対する二本鎖のアンチセンス鎖の古典的ハイブリダイゼーションによって前記標的を阻害し、それによって前記標的の酵素分解を引き起こすと示された（Ｔｉｊｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，２９５，６９４〜６９７）。本発明のオリゴマー化合物は、ドラッグデリバリーおよび標的バリデーションの領域にも適用され得る。本発明は、タンパク質と病状、表現型または状態との間に存在する関連性を解明するためのドラッグデリバリー作用における、本明細書で同定されたオリゴマー化合物および標的の使用を含む。これらの方法は、サンプル、組織、細胞または器官を本発明のオリゴマー化合物と接触させる工程、処理後のある時点で前記標的および／または関連した表現型または化学エンドポイントの核酸またはタンパク質レベルを測定する工程と、選択的に測定値と非処理サンプルまたは本発明の更なるオリゴマー化合物で処理したサンプルを比較する工程とを有する、標的ペプチドを決定する工程または調節する工程を含む。これらの方法は、他の実験と平行してまたは組み合わせて実行され、標的バリデーションの工程で未知遺伝子の機能を決定する、または特定の疾患、状態、または表現型の治療または予防のための標的として特異的遺伝子産物の機能を決定することができる。
【０１８６】
ＲＮＡｉ活性に対するヌクレオシド修飾の影響は、既存の文献（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２００１，４１１，４９４〜４９８；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２００１，１０７，４１５〜４１６；およびＢａｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０００，１０１，２３５〜２３８）に従って評価され得る。
【０１８７】
本発明のオリゴマー化合物は、診断、治療、予防、および研究試薬およびキットとして利用され得る。さらには、精巧な特異性を有して遺伝子発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定の遺伝子の機能を解明するために、または生物学的経路の様々なメンバーの機能を区別するために、当業者によってしばしば使用される。キットおよび診断において使用するために、本発明のオリゴマー化合物は、単独でまたは他のオリゴマー化合物または療法との組み合わせで、細胞および組織内で発現した遺伝子の一部のまたは全体の相補鎖の発現パターンを解明するためのディファレンシャル（差次的）および／またはコンビナトリアル（組み合わせ）解析における手段として使用され得る。
【０１８８】
限定されない１実施例として、１若しくはそれ以上のアンチセンスオリゴマー化合物で処理された細胞または組織内の発現パターンは、アンチセンスオリゴマー化合物で処理されていない対照細胞または組織と比較され、産生された前記パターンは、例えば疾患関連、シグナル経路、細胞性局在、発現レベル、サイズ、検討された遺伝子の構造または機能に関連するような遺伝子発現のディファレンシャルレベルに対して解析される。これらの解析は、発現パターンに影響を及ぼす他の化合物またはオリゴマー化合物の存在下または非存在下で、刺激または未刺激細胞上で実行され得る。
【０１８９】
本分野では既知である遺伝子発現解析の方法の例としては、ＤＮＡアレイまたはマイクロアレイ（Ｂｒａｚｍａ  ａｎｄ  ＶｉＩｏ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，１７〜２４；Ｃｅｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２〜１６）、ＳＡＧＥ（遺伝子発現の連続解析；ｓｅｒｉａｌ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）（Ｍａｄｄｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｏｄａｙ，２０００，５，４１５〜４２５）、ＲＥＡＤＳ（消化ｃＤＮＡｓの制限酵素増幅）（Ｐｒａｓｈａｒ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＥｎｚｙｍｏＬ，１９９９，３０３，２５８〜７２）、ＴＯＧＡ（総遺伝子発現解析）（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，１９７６〜８１）、タンパク質アレイおよびプロテオミクス（Ｃｅｌｉｓ，ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２〜１６；Ｊｕｎｇｂｌｕｔ，ｅｔａｌ，Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ，１９９９，２０，２１００〜１０）、発現配列タグ（ＥＳＴ）シークエンシング（Ｃｅｌｉｓ，ｅｔａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，２０００，４８０，２〜１６；Ｌａｒｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０００，８０，１４３〜５７）、サブトラクティブＲＮＡフィンガープリンティング（ＳｕＲＰ）（Ｆｕｃｈｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２０００，２８６，９１〜９８；Ｌａｒｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，２０００，４１，２０３〜２０８）、サブトラクティブクローニング、ディファレンシャルディスプレイ（ＤＤ）（Ｊｕｒｅｃｉｃ  ａｎｄ  Ｂｅｌｍｏｎｔ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，２０００，３，３１６〜２１）、比較ゲノムハイブリダイゼーション（Ｃａｒｕｌｌｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｕｐｐｌ．，１９９８，３１，２８６〜９６）、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）技術（Ｇｏｉｎｇ  ａｎｄ  Ｇｕｓｔｅｒｓｏｎ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，１９９９，３５，１８９５〜９０４）および質量分析法（Ｔｏ，Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｓｃｒｅｅｎ，２０００，３，２３５〜４１）を含む。
【０１９０】
本発明のオリゴマー化合物は、タンパク質をコード化する核酸とハイブリダイズするので、１観点において研究および診断に有用である。例えば、そのような効率を有し、効果的なタンパク質阻害剤となると本明細書で開示されたような条件下でハイブリダイズすると示されたオリゴヌクレオチドは、好都合な遺伝子増幅または検出の条件下でそれぞれ効果的なプライマーまたはプローブでもある。これらのプライマーおよびプローブは、タンパク質をコード化する核酸分子の特異的な検出を必要とする方法において、および更なる研究における検出または使用に対する核酸分子の増幅において有用である。前記アンチセンスオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーション、特に核酸に対する本発明のプライマーおよびプローブは、本分野で既知である手段によって検出され得る。そのような手段はオリゴヌクレオチドへの酵素共役、前記オリゴヌクレオチドの放射線ラベル、または他のあらゆる最適な検出手段を含む。サンプル内の選択されたタンパク質のレベルを検出するためのそのような検出手段を用いるキットも調合される。
【０１９１】
アンチセンスの特異性および感受性も、治療用途に対して本分野の当業者によって利用される。アンチセンスオリゴマー化合物は、ヒトを含む動物における病状の治療における治療部分として利用されていた。リボザイムを含むアンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤は、ヒトに対して安全で効果的に投与されており、たくさんの治験が現在進行中である。従って、アンチセンスオリゴマー化合物は、細胞、組織、および動物（特にヒト）の治療に対する治療投与計画において有用であるように設定される、有用な治療モダリティとなり得ると確定された。
【０１９２】
本明細書において使用されるように「患者」という用語は、１若しくはそれ以上の遺伝子の発現または過剰発現に関連した１若しくはそれ以上の障害を患った哺乳類を意味する。さらに、本発明は特に１若しくはそれ以上の哺乳類発現または過剰発現の阻害に関するものであることも理解される。本発明は特に哺乳類の１若しくはそれ以上の遺伝子の発現または過剰発現の阻害に関連するものであることも理解される。
【０１９３】
本分野の当業者は、前記障害を現在患った患者を本発明の１若しくはそれ以上のオリゴマー化合物または組成物の有効な量で治療することによって遺伝子の発現または過剰発現に関連した障害に影響を及ぼすことを理解する。従って、「治療」および「治療する」という用語は、全ての工程を意味することを意図しており、これには本明細書に記載された前記障害の進行を遅延、中断、抑止、調節、または停止する工程が含まれるが、全ての症状の完全な除去を意図する必要はない。
【０１９４】
本明細書において使用されるように本発明の化合物の「有効な量」または「治療上有効な量」という用語は、本明細書で記載された前記障害を治療または予防するのに有効な量を意味している。
【０１９５】
治療用に、遺伝子の発現を調節することによって治療され得る病気または障害を患っている疑いがあるヒトなどの患者は、本発明に従ってアンチセンスオリゴマー化合物を投与することによって治療される。本発明の化合物は、アンチセンスオリゴマー化合物の有効な量を適切な薬学的に許容可能な希釈剤または担体に添加することによって薬学的組成物において利用され得る。本発明のアンチセンスオリゴマー化合物および方法の使用は、例えば、感染、炎症または腫瘍形成を妨げるまたは遅らせるようになど、予防的にも有用である。いくつかの実施形態において、治療される患者は、そのような治療を必要とするとして同定されていた、またはそのように以前診断されていた。
【０１９６】
本発明のオリゴマー化合物は、あらゆる薬学的に許容可能な塩類、エステル、またはそのようなエステルの塩類、またはヒトを含む動物への投与で生物活性代謝産物またはそれらの残留物を（直接的または間接的に）提供することができる他の化合物を含む。従って、本明細書の開示には、例えば本発明の化合物のプロドラッグおよび薬学的に許容可能な塩類、そのようなプロドラッグの薬学的に許容可能な塩類、および他の生物学的同等物も記載されている。オリゴヌクレオチドに対して、薬学的に許容可能な塩類およびそれらの使用の例については、さらに米国特許番号第６，２８７，８６０号に記載されている。
【０１９７】
本発明の組成物は、例えばリポソーム、受容体標的分子、経口、直腸、局所的または取り込み、分配および／または吸収を補助するための他の処方として、他の分子、分子構造または化合物の混合物と混合される、封入される、共役される、または関連する。そのような取り込み、分配および／または吸収補助処方の調合を教示する代表的な米国特許は、これに限定されるものではないが、米国特許番号第５，１０８，９２１号明細書；第５，３５４，８４４号明細書；第５，４１６，０１６号明細書；第５，４５９，１２７号明細書；第５，５２１，２９１号明細書；第５，５４３，１５８号明細書；第５，５４７，９３２号明細書；第５，５８３，０２０号明細書；第５，５９１，７２１号明細書；第４，４２６，３３０号明細書；第４，５３４，８９９号明細書；第５，０１３，５５６号明細書；第５，１０８，９２１号明細書；第５，２１３，８０４号明細書；第５，２２７，１７０号明細書；第５，２６４，２２１号明細書；第５，３５６，６３３号明細書；第５，３９５，６１９号明細書；第５，４１６，０１６号明細書；第５，４１７，９７８号明細書；第５，４６２，８５４号明細書；第５，４６９，８５４号明細書；第５，５１２，２９５号明細書；第５，５２７，５２８号明細書；第５，５３４，２５９号明細書；第５，５４３，１５２号明細書；第５，５５６，９４８号明細書；第５，５８０，５７５号明細書；および第５，５９５，７５６号明細書を含む。
【０１９８】
本発明は、薬学的組成物および本発明の組成物を含む処方も含む。本発明の薬学的組成物は、局所的または全身的治療のどちらが望ましいか、および治療される領域に依存して、多くの方法で投与される。投与は、局所的（膣および直腸運搬を含む眼および粘膜を含む）、例えば、噴霧器によるもの含む粉末またはエアロゾルの吸入またはガス注入による肺性；気管内、鼻腔内、上皮、および経皮、経口的または非経口的である。非経口的投与は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内注射または注入；または頭蓋内（例えばくも膜下腔内または脳室内）投与を含む。少なくとも１つの２’−Ｏ−メトキシエチル修飾を有するオリゴヌクレオチドは、経口投与に特に有用であると信じられている。局所的投与に対する薬学的組成物および処方は、経皮的パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、飴、坐薬、スプレー、液体および粉末を含む。通常の薬学的担体、水溶液、粉末または油性基剤、増粘剤、およびそれらの同等物は、必要であるまたは望ましい。コーティングコンドーム、グローブ、およびそれらの同等物も有用である。
【０１９９】
本発明の薬学的組成物は、これに限定されるものではないが、溶液、乳濁剤、発泡剤、およびリポソーム含有処方を含む。本発明の薬学的組成物および処方は、１若しくはそれ以上の浸透増強剤、担体、賦形剤、または他の活性または不活性成分を有する。
【０２００】
当業者は、処方はそれらの意図された使用、すなわち投与の経路に従ってルーティンに設計される。
【０２０１】
局所投与に対して適切な処方は、本発明のオリゴヌクレオチドが、脂質、リポソーム、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、キレート化因子および界面活性剤などの局所的運搬因子と混合される処方を含む。適切な脂質およびリポソームは、中性（例えば、ジオレオイルフォスファチジルＤＯＰＥエタノールアミン、ジミリストイルフォスファチジルコリンＤＭＰＣ、ジステアロイルフォスファチジルコリン）、陰性（例えば、ジミリストイルフォスファチジルグリセロールＤＭＰＧ）、およびカチオン性（例えば、ジオレオイルテトラメチルアミノプロピルＤＯＴＡＰおよびジオレオイルフォスファチジルエタノールアミンＤＯＴＭＡ）を含む。浸透増強剤およびそれらの使用はさらに、米国特許番号第６，２８７，８６０号に開示されている。界面活性剤およびそれらの使用はさらに米国特許番号第６，２８７，８６０号に開示されている。
【０２０２】
経口投与に対する組成物および処方は、粉末または顆粒、微粒子、ナノ粒子、水または非水溶性溶媒における懸濁液または溶液、カプセル、ゲルカプセル、小袋、錠剤または微小錠剤を含む。増粘剤、香料添加物、希釈剤、乳濁剤、分散補助剤、または結合剤は望ましい。適切な経口処方は、本発明のオリゴヌクレオチドが１若しくはそれ以上の浸透増強剤、界面活性剤、キレート剤との組み合わせで投与される処方である。適切な界面活性剤は、脂肪酸および／またはエステルまたはそれらの塩類、胆汁酸および／またはその塩類を含む。適切な胆汁酸／塩類および脂肪酸およびそれらの使用はさらに米国特許番号第６，２８７，８６０号に記載されている。例えば、胆汁酸／塩類との組み合わせでの脂肪酸／塩類などの浸透増強剤の組み合わせも適切である。特に適切な組み合わせは、ラウリル酸、カプリン酸、およびＵＤＣＡのナトリウム塩である。更なる浸透増強剤は、ポリオキシエチレン−９−ラウリルエーテル、ポリオキシエチレン−２０−セチルエーテルを含む。本発明のオリゴヌクレオチドは、噴霧乾燥粒子を含む顆粒状形態で、または微小顆粒またはナノ顆粒を形成するような複合体で経口的に運搬される。オリゴヌクレオチド複合体因子およびそれらの使用はさらに、米国特許番号第６，２８７，８６０号に開示されている。オリゴヌクレオチドのための経口処方およびそれらの調合は、米国出願番号第０９／１０８，６７３号（１９９８年８月１日に出願）、第０９／３１５，２９８号（１９９９年５月２０日に出願）、および第１０／０７１，８２２号（２００２年２月８日に出願）に詳細に記載されている。
【０２０３】
別の関連する実施例において、治療上有効な併用療法は、２またはそれ以上の本発明の組成物の使用を含み、複数の組成物は単一または複数の核酸標的を標的化しているものである。アンチセンスオリゴマー化合物多くの実施例は本分野では既知である。２またはそれ以上の併用化合物は、一緒にまたは経時的に使用される。
【０２０４】
薬学的組成物の処方およびそれに続く投与は、本分野の当業者の範囲内であると信じられている。用量は、何日から何ヶ月にも亘る治療の経過での、または治療が効果を表すまたは前記病状の減少が達成されるまでの、治療される病状の重症度および反応性に依存する。最適投薬スケジュールは、患者の体内における薬剤蓄積の測定から計算され得る。当業者は最適用量、投薬方法論、および反復率を間単に決定できる。最適な用量は、個々のオリゴヌクレオチドの相対的有効性に依存して変更され、一般的にｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ動物モデルにおいて有効であると見出されたＥＣ５０に基づいて推定され得る。一般的に、用量は０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重であり、１日、１週間、１ヵ月、または１年に１回以上投与される。本分野の当業者は、体液または組織における前記薬剤の測定滞留時間および濃度に基づいて、投薬の反復率を簡単に推定できる。成功した治療に続いて、患者が病状の再発を予防するための維持治療を受けることが望ましく、前記オリゴヌクレオチドは０．０１μｇ〜１００ｇ／ｋｇ体重の範囲で１日、１週間、１ヵ月、または１年に１回以上、維持用量で投与される。二本鎖化合物に対して、前記用量は、前記二本鎖の増加した核酸負荷（２つの分離鎖を有する化合物と同様に）、または付加的核酸長（二本鎖領域を保持する自己相補性一本鎖と同様に）を計上するために計算されなくてはならない。
【０２０５】
本発明はその特定の実施例に従った特異性をもって記載されたが、以下の実施例は本発明を説明するためだけに利用され、同じように限定されることを意図するものではない。
【発明を実施するための最良の形態】
【０２０６】
実施例
概要
実施例において記載した配列は、修飾ヌクレオシドまたはインターヌクレオシド結合がある場所を指示するように注釈が付けられている。全ての注釈のないヌクレオシドは、ホスホジエステルインターヌクレオシド結合によって結合されたβ−Ｄ−リボヌクレオシドである。ホスホチオエートインターヌクレオシド結合は、下線によって指示されている。修飾ヌクレオシドはヌクレオシドを指示する大文字の次の下付き文字によって指示されている。特に、下付きの「ｆ」は２−フルオロを指示しており；下付きの「ｍ」は２’−Ｏ−メチルを指示しており；下付きの「ｌ」はＬＮＡを指示しており；下付きの「ｅ」は２−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）を指示しており；下付きの「ｔ」は４’−チオを指示している。例えば、Ｕｍは２−ＯＣＨ３基を保持する修飾ウリジンである。’ヌクレオシドの前の「ｄ」は、例えばｄＴはデオキシチミジンといったように、デオキシヌクレオシドを指示する。５’−リン酸機を保持する鎖のいくつかは「Ｐ−」として指定された。太字およびイタリック体「Ｃ」は、５−メチルＣリボヌクレオシドを意味している。化合物のＩＳＩＳ数の次に記載された「ａｓ」はアンチセンス鎖を意味し、「ｓ」は前記標的配列に対して二本鎖のセンス鎖を指定している。
【実施例１】
【０２０７】
ヌクレオシドホスホラミダイトの合成
ヌクレオシドホスホラミダイトの調合は、これに限定されるものではないが米国特許番号第６，４２６，２２０号明細書および国際公開公報番号第ＷＯ０２／３６７４３号などの本分野で広範囲に説明されている手順に従って実行される。
【実施例２】
【０２０８】
オリゴヌクレオチドおよびオリゴヌクレオシド合成
本発明に従って使用されたオリゴマー化合物は、固相合成のよく知られた技術によって都合よくおよびルーティンに製造する。そのような合成のための装置は、例えばＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）などを含むいくつかの製造供給元によって販売されている。本分野で既知なそのような合成に対するあらゆる他の手段を、付加的にまたは代替的に利用する。ホスホチオエートおよびアルキル化誘導体などのオリゴヌクレオチドを調合するための同様な技術を使用することはよく知られている。
【０２０９】
オリゴヌクレオチド：非置換および置換ホスホジエステル（Ｐ＝Ｏ）オリゴヌクレオチドは、ヨードによって酸化された標準ホスホラミダイト化学を用いて自動ＤＮＡ合成機（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓモデル３９４）上で合成した。
【０２１０】
ホスホロチオエート（Ｐ＝Ｓ）は、以下の例外：チオール化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）はリン酸結合の酸化のためにアセトニトリル中で３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシドの１０％ｗ／ｖ溶液を利用することによって影響を受けることを除いて、ホスホジエステルオリゴヌクレオチドと同様に合成した。チオール化反応工程時間を１８０秒まで増加し、正常キャッピング工程を先行させた。ＣＰＧカラムから切断し、５５℃（１２〜１６時間）で濃縮アンモニア水酸化物によって非ブロック化した後、前記オリゴヌクレオチドは、１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃ溶液からエタノールの３倍以上の容量での沈殿させることで回収した。ホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許番号第５，５０８，２７０号明細書に記載されたように調合した。
【０２１１】
アルキルホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許番号第４，４６９，８６３号明細書に記載されたように調合した。
【０２１２】
３’−デオキシ−３’−メチレンホスホネートオリゴヌクレオチドは、米国特許番号第５，６１０，２８９号、または第５，６２５，０５０号に記載されたように調合した。
【０２１３】
ホスホラミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許番号第５，２５６，７７５号或いは米国特許番号第５，３６６，８７８号明細書に開示されたように調合した。
【０２１４】
アルキルホスホノチオエートオリゴヌクレオチドは、国際出願番号第ＰＣＴ／ＵＳ９４／００９０２号および第ＰＣＴ／ＵＳ９３／０６９７６号（それぞれ国際公開公報番号第ＷＯ９４／１７０９３号および第ＷＯ９４／０２４９９号として公開された）に記載されたように調合した。
【０２１５】
３’−デオキシ−３’−アミノホスホラミダイトオリゴヌクレオチドは、米国特許番号第５，４７６，９２５号に記載されたように調合した。
【０２１６】
ホスホトリエステルオリゴヌクレオチドは、米国特許番号第５，０２３，２４３号明細書に記載されたように調合した。
【０２１７】
ボラノリン酸オリゴヌクレオチドは、米国特許番号第５，１３０，３０２号明細書及び米国特許番号第５，１７７，１９８号明細書に記載されたように調合した。
【０２１８】
オリゴヌクレオシド：メチレンメチルイミノ結合オリゴヌクレオシド（ＭＭＩ結合オリゴヌクレオシドとしても同定される）、メチレンジメチルヒドラゾ結合オリゴヌクレオシド（ＭＤＨ結合オリゴヌクレオシドとしても同定される）、およびメチレンカルボニルアミノ結合オリゴヌクレオシド（アミド−３結合オリゴヌクレオシドとしても同定される）、およびメチレンアミノカルボニル結合オリゴヌクレオシド（アミド−４結合オリゴヌクレオシドとしても同定される）、さらには、例えば交互ＭＭＩおよびＰ＝ＯまたはＰ＝Ｓ結合を保持する混合バックボーンオリゴマー化合物は、米国特許番号第５，３７８，８２５号明細書、第５，３８６，０２３号明細書、第５，４８９，６７７号明細書、第５，６０２，２４０号、及び第５，６１０，２８９号明細書に記載されたように調合した。  
【０２１９】
ホルムアセタール及びチオホルムアセタール結合オリゴヌクレオシドは、米国特許番号第５，２６４，５６２号明細書及び第５，２６４，５６４号明細書に記載されたように調合される。
【０２２０】
エチレンオキシド結合オリゴヌクレオシドは、米国特許番号第５，２２３，６１８号明細書に記載されたように調合した。
【実施例３】
【０２２１】
オリゴヌクレオチド単離
制御孔ガラス固体支持体から切断し、５５℃で１２〜１６時間、濃縮アンモニウムヒドロキシドにおいて非ブロック化した後、前記オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオシドは、１Ｍ  ＮＨ４ＯＡｃからエタノールの３倍以上の容量で沈殿させることによって回収した。合成オリゴヌクレオチドはエレクトロスプレー質量分析（分子量決定）によって、および毛細管下ゲル電気泳動法によって解析し、少なくとも７０％完全長物質となることを判断した。合成において獲得したホスホロチオエートおよびホスホジエステル結合の相対量は、−１６ａｍｕ産物（＋／―３２＋／−４８）に対する正確な分子量の割合によって決定した。いくつかの研究に対して、オリゴヌクレオチドは、Ｃｈｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９１，２６６，１８１６２〜１８１７１に記載されたように、ＨＰＬＣによって精製した。ＨＰＬＣ精製物質で得られた結果は、非ＨＰＬＣ精製物質で得られた結果と同じであった。
【実施例４】
【０２２２】
オリゴヌクレオチド合成−９６ウェルプレート形式
オリゴヌクレオチドは、９６ウェル形式において同時に９６配列を構築することができる自動合成機上の固相Ｐ（ＩＩＩ）ホスホラミダイト化学を介して合成できる。ホスホジエステルインターヌクレオチド結合は、水溶性ヨードでの酸化によって産生した。ホスホロチオエートインターヌクレオチド結合は、無水アセトニトリル中で３，Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド（Ｂｅａｕｃａｇｅ試薬）を利用した硫化によって産生した。標準的塩基保護性ベータ−シアノエチル−ジイソ−プロピルホスホラミダイトは商業的製造供給元（例えば、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、またはＰｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）から購入した。非標準的ヌクレオシドは、標準的または特許化された方法のように合成した。それらは塩基保護性ベータ−シアノエチルジイソプロピルホスホラミダイトとして利用した。
【０２２３】
オリゴヌクレオチドは支持体から切断し、上昇温度（５５〜６０℃）で１２〜１６時間、濃縮ＮＨ４ＯＨで脱保護化し、放出産物を次にｉｎ  ｖａｃｕｏで乾燥した。乾燥した産物を次に蒸留水に再懸濁し、マスタープレートを作り、全ての解析およびテストプレートサンプルはロボットピペットを利用してそのプレートから希釈した。
【実施例５】
【０２２４】
９６ウェルプレート形式を使用したオリゴヌクレオチド解析
各ウェルのオリゴヌクレオチドの濃度はサンプルの希釈およびＵＶ吸収分光法によって推定した。個々の産物の完全長整合性は、９６ウェルプレート形式（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥ（商標）ＭＤＱ）において、または商業的ＣＥ装置（例えば、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥ（商標）５０００、ＡＢＩ２７０）などで個々に調合されたサンプルに対して、キャピラリー電気泳動法（ＣＥ）によって評価した。塩基およびバックボーン組成物は、エレクトロスプレー−質量分析法を利用したオリゴマー化合物の質量解析によって確認した。全てのアッセイテストプレートは、単一および複数チャネルロボットピペットを使用してマスタープレートから希釈した。プレート上の少なくとも８５％のオリゴマー化合物が少なくとも８５％完全長である条件を満たしているか、プレートを判断した。
【実施例６】
【０２２５】
細胞培養およびオリゴヌクレオチド処理
標的核酸発現に対するオリゴマー化合物の効果は、前記標的核酸が測定可能レベルで存在する場合、あらゆる様々な細胞タイプでテストすることができる。これは例えばＰＣＲまたはノーザンブロット解析などを用いてルーティンに決定することができる。複数の組織および種に由来した細胞株はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＣＴＴ，バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手することができる。
【０２２６】
以下の細胞タイプは説明の目的のために提供されるものであり、前記標的が選択された細胞タイプで発現している場合他の細胞タイプもルーティンに使用される。これは、例えばノーザンブロット解析、リボヌクレアーゼ保護アッセイまたはＲＴ−ＰＣＲなどの本分野のルーティンな方法によって容易に決定することができる。
【０２２７】
Ｔ−２４細胞：ヒト移行細胞膀胱癌細胞株Ｔ−２４は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＣＴＴ）（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手した。Ｔ−２４細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＣＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、ペニシリン１００ユニット／ｍＬ、およびストレプトマイシン１００マイクログラム／ｍＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を添加した完全Ｍｃ’Ｃｏｙｓ  ５Ａ基本培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中でルーティンに培養した。細胞は９０％コンフルエンスに達した場合、トリプシン処理によってルーティンに継代し希釈した。細胞は、これに限定されるものではないが、オリゴマー化合物形質移入実験を含む使用に対して、７０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３５３８７２）に播種した。
【０２２８】
Ａ５４９細胞：ヒト肺癌細胞株Ａ５４９は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＣＴＴ）（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手した。Ａ５４９細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ユニット／ｍＬのペニシリン、および１００マイクログラム／ｍＬのストレプトマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を添加した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中でルーティンに培養した。細胞は約９０％コンフルエンスに達した場合、トリプシン処理によってルーティンに継代し希釈した。細胞は、これに限定されるものではないが、オリゴマー化合物形質移入実験を含む使用に対して、約５０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２）に播種した。
【０２２９】
ｂ．ＥＮＤ細胞：マウス脳上皮細胞株ｂ．ＥＮＤは、Ｍａｘ  Ｐｌａｎｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（Ｂａｄ  Ｎａｕｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）のＷｅｒｎｅｒ  Ｒｉｓａｕ博士より入手した。ｂ．ＥＮＤ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を添加した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中でルーティンに培養した。細胞は約９０％コンフルエンスに達した場合、トリプシン処理によってルーティンに継代し希釈した。細胞は、これに限定されるものではないが、オリゴマー化合物形質移入実験を含む使用に対して、約３０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３５３８７２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）に播種した。
【０２３０】
ＨｅＬａ細胞：ヒト上皮癌細胞ＨｅＬａは、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＣＴＴ）（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手した。ＨｅＬａ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）を添加した高グルコースＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中でルーティンに培養した。細胞は約９０％コンフルエンスに達した場合、トリプシン処理によってルーティンに継代し希釈した。細胞は、これに限定されるものではないが、オリゴマー化合物形質移入実験を含む使用に対して、５０，０００細胞／ウェルの密度で２４ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８４６、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）、または約５，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種した。
【０２３１】
ＭＨ−Ｓ細胞：マウス肺胞マクロファージ細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＣＴＴ）（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手した。ＭＨ−Ｓ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）、１ｍＭ  ピルビン酸ナトリウムおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（全ての添加物はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄより購入）を添加したＲＰＭＩ培養液１６４０中で培養した。細胞は約７０〜８０％コンフルエンスに達した場合、トリプシン処理によってルーティンに継代し希釈した。細胞は、これに限定されるものではないが、オリゴマー化合物形質移入実験を含む使用に対して、６５００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３５３０４７、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、マサチューセッツ州Ｂｅｄｆｏｒｄ）に播種した。
【０２３２】
Ｕ−８７ＭＧ：ヒトグリア芽細胞種Ｕ−８７ＭＧ細胞株は、アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＣＴＴ）（バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）から入手した。Ｕ−８７ＭＧ細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）および抗生物質を添加したＤＭＥＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中で培養した。細胞は適切なコンフルエンスに達した場合、トリプシン処理によってルーティンに継代し希釈した。細胞は、これに限定されるものではないが、オリゴマー化合物形質移入実験を含む使用に対して、約１０，０００細胞／ウェルの密度で９６ウェルプレート（Ｆａｌｃｏｎ−Ｐｒｉｍａｒｉａ＃３８７２）に播種した。
【０２３３】
オリゴマー化合物での細胞の処理に関連する実験は：
細胞が適切なコンフルエンスに達した場合、その細胞を記載されたような形質移入方法を用いてオリゴマー化合物で処理した。
【０２３４】
ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）
細胞が６５〜７５％のコンフルエンスに達した場合、その細胞をオリゴヌクレオチドで処理した。オリゴヌクレオチドは、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）−１低減血清培養液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）中のＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）と混合し、望ましい濃度のオリゴヌクレオチド、および１００ｎＭオリゴヌクレオチド当たり２．５または３μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）濃度を達成した。この形質移入混合物は室温で約０．５時間インキュベートした。９６ウェルプレートにおいて細胞を増殖させる場合、ウェルは１００μＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）−１で一度洗浄し、次に１３０μＬの前記形質移入混合物で処理した。２４ウェルプレートまたは他の標準的組織培養プレートで増殖させた細胞は、培養液およびオリゴヌクレオチドの適切な容量を用いて、同様に処理した。細胞を処理し、データは二つ組または三つ組で取得した。３７℃での処理の約４〜７時間後、前記形質移入混合物を含有した培養液は新鮮な培養液と交換した。細胞はオリゴヌクレオチド処理後１６〜２４時間で回収した。
【０２３５】
本分野で既知である他の適切な形質移入試薬は、これに限定されるものではないが、ＣＹＴＯＦＥＣＴＩＮ（商標）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）、およびＦＵＧＥＮＥ（商標）を含む。本分野で既知である他の適切な形質移入方法は、これに限定されるものではないが、電気穿孔法を含む。
【０２３６】
使用されたオリゴヌクレオチドの濃度は、細胞株から細胞株で変更した。特定の細胞株に対する最適な折後ヌクレオチド濃度を決定するために、前記細胞株を様々な濃度範囲のポジティブ対照オリゴヌクレオチドで処理した。ヒト細胞に対するポジティブ対照オリゴヌクレオチドは、ヒトＨ−ｒａｓを標的化したＩＳＩＳ１３９２０（ＴｅＣｅＣｅＧＴＣＡＴＣＧＣＴＣｅＣｅＴｅＣｅＡｅＧｅＧｅＧｅ、配列ＩＤ番号：１）、またはヒトＪｕｎ−Ｎ−末端キナーゼ−２（ＪＮＫ２）を標的化したＩＳＩＳ１８０７８（ＧｅＴｅＧｅＣｅＧｅＣＧＣＧＡＧＣＣＣＧｅＡｅＡｅＡｅＴｅＣｅ、配列ＩＤ番号：２）から選択した。両対照は、ホスホロチオエートバックボーンを有する２−Ｏ−メトキシエチルギャップマーである。’マウスまたはラット細胞に対しては、前記ポジティブ対照オリゴヌクレオチドは、ＩＳＩＳ１５７７０（ＡｅＴｅＧｅＣｅＡｅＴＴＣＴＧＣＣＣＣＣＡｅＡｅＧｅＧｅＡｅ、配列ＩＤ番号：３）であり、これはマウスおよびラットｃ−ｒａｆの両方を標的化したホスホロチオエートバックボーンを有する２’−Ｏ−メトキシエチルギャップマーである。ｃ−Ｈ−ｒａｓ（ＩＳＩＳ１３９２０に対する）、ＪＮＫ２（ＩＳＩＳ１８０７８に対する）、またはｃ−ｒａｆ（ＩＳＩＳ１５７７０に対する）ｍＲＮＡの８０％阻害を生じるポジティブ対照オリゴオリゴヌクレオチドの濃度は次に、その細胞株の一連の実験における新しいオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として使用した。８０％阻害が達成されなかった場合、ｃ−Ｈ−ｒａｓ、ＪＮＫ２、またはｃ−ｒａｆｍＲＮＡの６０％阻害を生じるポジティブ対照オリゴオリゴヌクレオチドの最低濃度を次に、その細胞株の一連の実験におけるオリゴヌクレオチドのスクリーニング濃度として使用した。６０％阻害が達成されなかった場合、その特定の細胞株はオリゴヌクレオチド形質移入実験に対して不適切であるとみなした。
【実施例７】
【０２３７】
標的発現のオリゴヌクレオチド阻害の解析
標的発現のアンチセンス調節は、本分野で既知である様々な方法でアッセイすることができる。例えば、標的ｍＲＮＡレベルは、例えばノーザンブロット解析、競合的ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはリアルタイムＰＣＲなどによって定量化することができる。リアルタイム定量化ＰＣＲは現在望ましい。ＲＮＡ解析は総細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡで実施することができる。本発明のＲＮＡ解析の１つの方法は、本明細書の他の実施例で記載されたような総細胞ＲＮＡの使用である。ＲＮＡ単離の方法は本分野でよく知られている。ノーザンブロット解析も本分野ではルーティンである。リアルタイム定量化（ＰＣＲ）は商業的に利用可能なＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）７６００、７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙから利用可能）を用いて都合よく達成することができ、製造業者の取扱い説明書に従って使用した。
【０２３８】
標的のタンパク質レベルは、免疫沈降、ウェスタンブロット解析（免疫ブロッティング）、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、または蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）などの本分野で既知である様々な方法で定量化することができる。標的を検出する抗体は、抗体のＭＳＲＳカタログ（Ａｅｒｉｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，ＭＩ）などの様々なソースから同定および入手可能である、または本分野では既知であるモノクローナルまたはポリクローナル抗体産生方法を介して調合することができる。ポリクローナル抗血清を調合する方法は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐｐ．１１．１２．１〜１１．１２．９、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７において教示されている。モノクローナル抗体の調合は、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐｐ． １１．４．１〜１１．１１．５、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７において教示されている。
【０２３９】
免疫沈降方法は本分野で標準的であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐｐ．１０．１６．１〜１０．１６．１１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９８に見出され得る。ウェスタンブロット（免疫ブロット）解析は本分野では標準的であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐｐ．１０．８．１〜１０．８．２１，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９７に見出され得る。酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）は本分野では標準的であり、例えばＡｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ  ２，ｐｐ．．１１．２．１〜１１．２．２２，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ&Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，１９９１に見出され得る。
【実施例８】
【０２４０】
標的阻害剤の使用のための表現型アッセイおよびｉｎ  ｖｉｖｏ研究のデザイン
表現型アッセイ
標的阻害剤を本明細書で開示された方法によって同定した場合、前記オリゴマー化合物はさらに１若しくはそれ以上の表現型アッセイで検討し、それぞれは特定の病状または状態の治療において有効であると予想する測定可能なエンドポイントを有している。
【０２４１】
それらの使用に対する表現型アッセイ、キットおよび試薬は、本分野の当業者によく知られており、健康および病気における標的の役割および／または関連性を検討するために本明細書で使用した。代表的な表現型アッセイはいくつかの商業的製造供給元のあらゆる１つから購入することができ、細胞生存能、細胞毒性、増殖または細胞生存（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ；ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ，マサチューセッツ州Ｂｏｓｔｏｎ）、酵素アッセイ（Ｐａｎｖｅｒａ，ＬＬＣ，ウィスコンシン州Ｍａｄｉｓｏｎ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニュージャージー州Ｆｒａｎｋｌｉｎ  Ｌａｋｅｓ；Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，カリフォルニア州Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）を含むタンパク質ベースアッセイ、細胞調節、シグナル伝達、炎症、酸化工程およびアポトーシス（Ａｓｓａｙ  Ｄｅｓｉｇｎｓ  Ｉｎｃ．ミシガン州Ａｎｎ  Ａｒｂｏｒ）、血管新生アッセイ、管腔形成アッセイ、サイトカインおよびホルモンアッセイおよび代謝アッセイ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州Ｔｅｍｅｃｕｌａ；Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を決定する方法を含む。
【０２４２】
制限のない１実施例において、特定の表現アッセイに対して適切であると決定された細胞（すなわち、ＭＣＦ−７細胞は乳癌研究のために選択され；脂肪細胞は肥満研究のために選択される）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究から同定された標的阻害剤、および上述の方法によって決定された最適な濃度の対照化合物で処理した。処理期間の最後で、処理および未処理細胞を、表現型結果およびエンドポイントを決定するためのアッセイに特異的な１若しくはそれ以上の方法で解析した。
【０２４３】
表現型エンドポイントは、長時間の細胞形態の変化、またはタンパク質、脂質、核酸、ホルモン、糖類、または金属類などの細胞成分のレベルにおける変化と同様に処理用量を含む。ｐＨ、細胞周期の段階、細胞による生物学的指標の取り込みまたは排出を含む細胞状態の測定も目的のエンドポイントである。
【０２４４】
処理後における細胞の遺伝子の１若しくはそれ以上の発現の測定は、標的阻害剤の有効性または効力の指標としても使用した。特徴（ホールマーク）遺伝子、または特定の病状、状態または表現型に関連すると予想される遺伝子を処理および未処理細胞の両方において測定した。
【０２４５】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
本明細書で記載されるｉｎ  ｖｉｖｏ研究の個々の対象は、ヒトを含む温血脊椎動物である。
【０２４６】
個人が不必要なリスクを負わないこと、およびその研究における彼らの役割について完全に通知されていることを確実にするように、治験は厳密に制御されている。
【０２４７】
受ける治療の生物心理学的な効果を明らかにするために、ボランティアはプラセボまたは標的阻害剤をランダムに与えられた。さらに、医師が治療に対する偏見を持たないように、彼らが施す治療が標的阻害剤かプラセボかは通知しなかった。このランダムアプローチを使用して、各ボランティアは新しい治療またはプラセボのどちらかを受ける同じ機会を保持することになった。
【０２４８】
ボランティアは、指示病状または状態に関連した生物学的パラメーターを最初（あらゆる治療前の基準測定）、終了（最後の治療後）、および研究期間に定期的に測定しながら、標的阻害剤またはプラセボを８週間投与した。そのような測定は、治療前レベルと比較した標的をコード化する核酸分子のレベル、または体液、組織または器官における標的タンパク質レベルを含む。他の測定は、これに限定されるものではないが、治療される病状または状態の指標、体重、血圧、病気または毒性の薬理学的指標の血清力価、さらにはＡＤＭＥ（吸収、分配、代謝および排出）測定を含む。
【０２４９】
各患者に対して記録された情報は、年齢（歳）、性別、身長（ｃｍ）、病状または状態の家族歴（はい／いいえ）、動機付け評点（少し／中程度／大いに）、および指示病状または状態に対する以前の治療投与計画の数およびタイプを含む。
【０２５０】
この研究に参加したボランティアは、健康な成人（１８〜６５歳）であり、この研究に参加した男女の数はほぼ同数である。特定の特徴を有するボランティアは、プラセボおよび標的阻害剤治療に同等に振り分けられた。一般的に、プラセボで治療されたボランティアは治療に対する反応はほとんどないまたは全くなかったが、標的阻害剤で治療されたボランティアはこの研究の終わりでは、彼らの病状または状態の指標にポジティブ傾向が見られた。
【実施例９】
【０２５１】
ＲＮＡ単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離
ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡは、Ｍｉｕｒａら（Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．，１９９６，４２，１７５８〜１７６４）に従って単離した。ポリ（Ａ）＋ｍＲＮＡ単離のための他の方法は、本分野ではルーティンである。簡潔には、９６ウェルでの細胞増殖に対して増殖培養液を細胞から除去し、各ウェルを２００μＬ冷ＰＢＳで洗浄した。６０μＬの溶解バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、０．５％  ＮＰ−４０、２０ｍＭ  バナジル−リボヌクレオシド複合体）を各ウェルに添加し、そのプレートを穏やかに撹拌し、次に５分間室温でインキュベートした。５５μＬの溶解液をＯｌｉｇｏ  ｄ（Ｔ）コーティング９６ウェルプレート（ＡＧＣＴ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州Ｉｒｖｉｎｅ）へ移した。プレートを６０分間室温でインキュベートし、２００μＬの洗浄バッファー（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．３Ｍ  ＮａＣｌ）で３回洗浄した。最後の洗浄後、過剰な洗浄バッファーを除去するためにそのプレートをペーパータオルで拭き、次に５分間空気乾燥した。７０℃に予め加熱した６０μＬの溶出バッファー（５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．６））を各ウェルに添加し、そのプレートを９０℃のホットプレート上で５分間インキュベートし、次に溶出液を新しい９６ウェルプレートに移した。
【０２５２】
１００ｍｍまたは他の標準的プレート上で増殖した細胞は、適切な用量の全ての溶液を使用して同様に処理した。
【０２５３】
総ＲＮＡ単離
総ＲＮＡは、ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．（カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）から購入したＲＮＥＡＳＹ９６（商標）キットおよびバッファーを用い、製造者推薦手順に従って単離した。簡潔には、９６ウェルで増殖した細胞に対して増殖培養液を細胞から除去し、各ウェルを２００μＬ冷ＰＢＳで洗浄した。１５０μＬのバッファーＲＬＴを各ウェルに添加し、そのプレートを２０秒間穏やかに撹拌した。１５０μＬの７０％エタノールを各ウェルに添加し、内容物を３回上下にピペッティングすることによって混合した。そのサンプルを、廃棄物回収トレイが取り付けられたＱＩＡＶＡＣ（商標）マニフォールドに接着され、真空源に接着されたＲＮＥＡＳＹ９６（商標）ウェルプレートへ移した。１分間真空にした。５００μＬのバッファーＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ９６（商標）プレートの各ウェルに添加し、１５分間インキュベートし、再度１分間真空にした。付加的な５００μＬのバッファーＲＷ１をＲＮＥＡＳＹ９６（商標）プレートの各ウェルに添加し、２分間真空にした。１ｍＬのバッファーＲＰＥをＲＮＥＡＳＹ９６（商標）プレートの各ウェルに添加し、９０秒間真空にした。バッファーＲＰＥ洗浄を繰り返し、付加的に３分間真空にした。そのプレートをＱＩＡＶＡＣ（商標）マニフォールドから外し、ペーパータオル上で乾燥させるために拭いた。次にそのプレートを、１．２ｍＬ回収チューブを含む回収チューブラックが取り付けられたＱＩＡＶＡＣ（商標）マニフォールドに再設置した。ＲＮＡを１４０μＬのＲＮＡｓｅを含まない水でピペッティングし、１分間インキュベートし、３分間真空にすることによって各ウェルへ溶出した。
【０２５４】
反復ピペッティングおよび溶出工程は、ＱＩＡＧＥＮ  Ｂｉｏ−Ｒｏｂｏｔ  ９６０４（ＱｉａｇｅｎＩｎｃ．カリフォルニア州Ｖａｌｅｎｃｉａ）を用いて自動化された。．基本的に、培養プレート上の細胞を溶解した後、そのプレートをピペッティング、ＤＮＡｓｅ処理および溶出ステップを実行するロボットデッキへ移した。
【実施例１０】
【０２５５】
二本鎖アンチセンス化合物の設計およびスクリーニング
本発明に従うと、本発明の化合物とそれらの相補鎖を有する一連の核酸二本鎖を設計することができる。前記二本鎖のアンチセンス鎖の核酸塩基配列は、本明細書において記載されたように標的配列を標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドの少なくとも一部を有する。前記鎖の末端は、オーバーハングを形成するように１若しくはそれ以上の天然または修飾核酸塩基の付加によって修飾されている。ｄｓＲＮＡのセンス鎖は前記アンチセンス鎖に相補的に設計し合成し、両末端に修飾または付加も含む。例えば、１実施形態においてｄｓＲＮＡ二本鎖の両鎖は中心核酸塩基に対して相補的であり、それぞれは１若しくは両末端にオーバーハングを有する。
【０２５６】
例えば、配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列ＩＤ番号：２０）を持ち、デオキシチミジン（ｄＴ）の２核酸塩基オーバーハングを保持するアンチセンス鎖を有する二本鎖は、以下の構造を有するものである。
【０２５７】
【表２】
2008501693.tif 000005
【０２５８】
別の実施形態において、同じ配列ＣＧＡＧＡＧＧＣＧＧＡＣＧＧＧＡＣＣＧ（配列ＩＤ番号：２０）を有するアンチセンス鎖を有する二本鎖は、以下のような平滑末端（シグナル鎖オーバーハングはない）を用いて調合した。
【０２５９】
【表３】
2008501693.tif 000006
【０２６０】
前記二本鎖のＲＮＡ鎖は本明細書で開示された方法によって合成できる、またはＤｈａｒｍａｃｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（コロラド州Ｌａｆａｙｅｔｔｅ）から購入することができる。合成したら、相補鎖をアニーリングした。一本鎖を一定量化し、５０μＭの濃度に希釈した。希釈したら、３０μＬの各鎖を１５μＬのアニーリングバッファーの５ｘ溶液と混合した。前記バッファーの最終濃度は１００ｍＭアセチル酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７．４）、および２ｍＮ  アセチル酸マグネシウムであった。最終用量は７５μＬであった。この溶液を１分間９０℃でインキュベートし、１５秒間遠心分離した。そのチューブは、ｄｓＲＮＡ二本鎖を実験に使用するまで１時間３７℃で放置した。ｄｓＲＮＡ二本鎖の最終濃度は２０μＭであった。  
調合したら、前記二本鎖化合物を、標的ｍＲＮＡレベルを調節するための能力を評価した。細胞が８０％コンフルエンスに達した場合、その細胞を本発明の二本鎖化合物で処理した。９６ウェルプレートで増殖した細胞に対してウェルは２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１（商標）低減血清培養液（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）で１回洗浄し、５μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ  ２０００（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）および望ましい最終濃度の前記二本鎖アンチセンス化合物を含有した１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−ｒ（商標）で処理した。処理後約４時間で、前記培養液を新鮮な培養液と交換した。ＲＮＡが単離され、標的減少が本明細書で記載されたような定量化リアルタイムＰＣＲによって測定された時点である、処理後１６時間で細胞を回収した。
【実施例１１】
【０２６１】
標的ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量化ＰＣＲ解析
標的ｍＲＮＡレベルの定量化はＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）  ７６００、７７００、または７９００配列検出システム（ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ）を用いたリアルタイム定量化ＰＣＲによって、取扱い説明書に従って達成した。これは密閉チューブで非ゲルベースの蛍光検出システムであり、リアルタイム（同時）でのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）産物の高処理定量化を可能にする。増幅産物はＰＣＲが終了後に定量する標準的なＰＣＲとは対照的に、リアルタイム定量化ＰＣＲにおける産物はそれらが蓄積するのに従って定量する。これはＰＣＲ反応において、フォワード（順方向）とリバース（逆方向）ＰＣＲプライマーとの間に特異的にアニーリングし、２つの蛍光色素を含有するオリゴヌクレオチドプローブを含むことによって達成される。レポーター色素（例えば、ＦＡＭまたはＪＯＥ、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州Ａｌａｍｅｄａ、またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．アイオワ州Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅから入手）を前記プローブの５’末端に結合し、クエンチャー（消光）色素（例えば、ＴＡＭＲＡ、ＰＥ−Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，カリフォルニア州Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．カリフォルニア州Ａｌａｍｅｄａ、またはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．アイオワ州Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅから入手）を前記プローブの３’末端に結合した。記プローブと色素が無傷である場合、レポーター色素発光は近接した３’クエンチャー色素によって消光された。増幅中、前記プローブの標的配列へのアニーリングによって、Ｔａｑポリメラーゼの５−エキソヌクレアーゼ活性によって切断され得る基質が作られた。’ＰＣＲ増幅サイクルの伸長相の間、前記Ｔａｑポリメラーゼによる前記プローブの切断によって、前記プローブの残部から（そしてクエンチャー部位から）のレポーター色素が放出され、配列特異的蛍光シグナルを生成した。各サイクルにおいて、付加的なレポーター色素分子がそれぞれのプローブから切断され、ＡＢＩ  ＰＲＩＳＭ（商標）配列検出システムに組み込まれたレーザー光学によって蛍光輝度を定期的にモニタリングした。各アッセイにおいて、未処理対照サンプルからの、ｍＲＮＡの連続的な希釈を含む一連の平行反応によって、テストサンプルのアンチセンスオリゴヌクレオチド処理後のパーセント阻害を定量化するために使用される標準曲線を算出した。
【０２６２】
定量化ＰＣＲ解析の前に、測定される標的遺伝子に特異的なプライマー−プローブセットは、ＧＡＰＤＨ増殖反応と「多重化」となる能力を評価した。多重化において、前記標的遺伝子および内部標準遺伝子ＧＡＰＤＨの両方を単一なサンプルにおいて同時に増幅した。この解析において、未処理細胞から単離されたｍＲＮＡを連続的に希釈した。各希釈溶液をＧＡＰＤＨにのみ特異的な、標的遺伝子にのみ（「一重化」）特異的な、または両方（多重化）に特異的なプライマー−プローブセットの存在下で増幅した。ＰＣＲ増幅の後、希釈の機能としてのＧＡＰＤＨおよび標的ｍＲＮＡシグナルの標準曲線は、一重化および多重化サンプルの両方から産出した。多重化サンプルから産出されたＧＡＰＤＨおよび標的シグナルの勾配および相関係数は、一重化サンプルから産出された相対値の１０％範囲内に収まり、前記標的に特異的なプライマー−プローブセットは多重化とみなした。ＰＣＲの他の方法も本分野で知られている。
【０２６３】
ＲＴおよびＰＣＲ試薬はＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）から購入した。ＲＴ、リアルタイムＰＣＲは、３０μＬ総ＲＮＡ溶液（２０〜２００ｎｇ）を含有する２０μＬのＰＣＲカクテル（２．５ｘＰＣＲバッファー（ＭｇＣｌ２なし）、６．６ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３７５μＭの各ｄＡＴＰ，  ｄＣＴＰ、ｄＣＴＰおよびｄＧＴＰ、３７５ｎＭの各フォワードプライマーおよびリバースプライマー、１２５ｎＭのプローブ、４ユニットＲＮＡｓｅ阻害剤、１．２５ユニットＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑ、５ユニットＭｕＬＶ逆転写酵素、および２．５ｘのＲＯＸ色素）を９６ウェルプレートへ添加することによって実行した。ＲＴ反応を３０分間４８℃でインキュベーションすることで実行した。ＰＬＡＴＩＮＵＭ（登録商標）Ｔａｑを活性化するために１０分間９５℃でインキュベートした後、２ステップ；９５℃で１５秒（変性）の後、６０℃で１．５分（アニーリング／伸長）というＰＣＲプロトコールを４０サイクル行った。
【０２６４】
ＲＴ、リアルタイムＰＣＲによって得られた遺伝子標的量は、定常的に発現している遺伝子であるＧＡＰＤＨの発現レベルを用いて、またはＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を用いた総ＲＮＡを定量化することによって規準化した。ＧＡＰＤＨ発現は、標的と同時にまたは別々に供することによってリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを用いて定量化した。総ＲＮＡは、ＲｉｂｏＧｒｅｅｎ（商標）ＲＮＡ定量試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を用いて定量した。ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（商標）によるＲＮＡ定量化の方法は、Ｊｏｎｅｓ，Ｌ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ，（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９９８，２６５，３６８〜３７４）において教示されていた。
【０２６５】
このアッセイにおいて、１７０μＬのＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（商標）作動試薬（ＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（商標）試薬は１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）と１：３５０で希釈された）を、３０μＬ精製細胞ＲＮＡ含有の９６ウェルプレートへピペッティングした。そのプレートは４８５ｎｍの励起および５３０ｎｍの発光を示すＣｙｔｏＦｌｕｏｒ  ４０００（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  １５  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて解読した。
【実施例１２】
【０２６６】
標的特異的プライマーおよびプローブ
プローブおよびプライマーは、公開された配列情報を用いて標的配列にハイブリダイズするように設計した。
【０２６７】
例えば、ヒトＰＴＥＮに対しては以下のプライマー−プローブセットを公開された配列情報（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号Ｕ９２４３６．１、配列ＩＤ番号：４）を用いて設計した。
フォワードプライマー：ＡＡＴＧＧＣＴＡＡＧＴＧＡＡＧＡＴＧＡＣＡＡＴＣＡＴ（配列ＩＤ番号：５）
リバースプライマー：ＴＧＣＡＣＡＴＡＴＣＡＴＴＡＣＡＣＣＡＧＴＴＣＧＴ  （配列ＩＤ番号：６）
そしてＰＣＲプローブは、
ＦＡＭ−ＴＴＧＣＡＧＣＡＡＴＴＣＡＣＴＧＴＡＡＡＧＣＴＧＧＡＡＡＧＧ−ＴＡＭＲＡ（配列ＩＤ番号：７）であり、ここにおいてＦＡＭは蛍光色素でＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【０２６８】
例えば、ヒトサバイビンに対しては以下のプライマー−プローブセットを公開された配列情報（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１１６８．１、配列ＩＤ番号：８）を用いて設計した。
フォワードプライマー：ＣＡＣＣＡＣＴＴＣＣＡＧＧＧＴＴＴＡＴＴＣＣ（配列ＩＤ番号：９）
リバースプライマー：ＴＧＡＴＣＴＣＣＴＴＴＣＣＴＡＡＧＡＣＡＴＴＧＣＴ（配列ＩＤ番号：１０）
そしてＰＣＲプローブは、
ＦＡＭ−ＡＣＣＡＧＣＣＴＴＣＣＴＧＴＧＧＧＣＣＣＣＴ−ＴＡＭＲＡ（配列ＩＤ番号：１１）であり、ここにおいてＦＡＭは蛍光色素でＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
。
【０２６９】
例えば、ヒトｅＩＦ４Ｅに対しては以下のプライマー−プローブセットを公開された配列情報（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００１１６８．１、配列ＩＤ番号：１２）を用いて設計した。
フォワードプライマー：ＴＧＧＣＧＡＣＴＧＴＣＧＡＡＣＣＧ  （配列ＩＤ番号：１３）
リバースプライマー：ＡＧＡＴＴＣＣＧＴＴＴＴＣＴＣＣＴＣＴＴＣＴＧＴＡＧ（配列ＩＤ番号：１４）
そしてＰＣＲプローブは、
ＦＡＭ−ＡＡＡＣＣＡＣＣＣＣＴＡＣＴＣＣＴＡＡＴＣＣＣＣＣＧ−ＴＡＭＲＡ（配列ＩＤ番号：１５）であり、ここにおいてＦＡＭは蛍光色素でＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【０２７０】
例えば、マウスｅＩＦ４Ｅに対しては以下のプライマー−プローブセットを公開された配列情報（ＧＥＮＢＡＮＫ（商標）アクセッション番号ＮＭ＿００７９１７．２、配列ＩＤ番号：１６）を用いて設計した。
フォワードプライマー：ＡＧＧＡＣＧＧＴＧＧＣＴＧＡＴＣＡＣＡ（配列ＩＤ番号：１７）
リバースプライマー：ＴＣＴＣＴＡＧＣＣＡＧＡＡＧＣＧＡＴＣＧＡ（配列ＩＤ番号：１８）
更にＰＣＲプローブは、
ＦＡＭ−ＴＧＡＡＣＡＡＧＣＡＧＣＡＧＡＧＡＣＧＧＡＧＴＧＡ−ＴＡＭＲＡ（配列ＩＤ番号：１９）であり、ここにおいてＦＡＭは蛍光色素でＴＡＭＲＡはクエンチャー色素である。
【実施例１３】
【０２７１】
標的ｍＲＮＡレベルのノーザンブロット解析
アンチセンス処理後１８時間で、細胞単層を冷ＰＢＳで２回洗浄し、１ｍＬのＲＮＡＺＯＬ（商標）（ＴＥＬ−ＴＥＳＴＢ灯Ｉｎｃ．テキサス州Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ）で溶解した。総ＲＮＡは製造者推薦プロトコールに従って調合した。２０マイクログラムの総ＲＮＡは、ＭＯＰＳバッファーシステム（ＡＭＲＥＳＣＯ，Ｉｎｃ．オハイオ州Ｓｏｌｏｎ）を用いて、１．１％ホルムアルデヒドを含有した１．２％アガロースゲルを介した電気泳動によって分画した。ＲＮＡは、ノーザン／サザントランスファーバッファーシステム（ＴＥＬ−ＴＥＳＴＢ灯Ｉｎｃ．テキサス州Ｆｒｉｅｎｄｓｗｏｏｄ）を用いたオーバナイトキャピラリートランスファーによって、ゲルからＨＹＢＯＮＤ（商標）−Ｎ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）へ移した。ＲＮＡトランスファーはＵＶ可視化によって確認した。膜は、ＳＴＲＡＴＡＬＩＮＫＥＲ（商標）ＵＶクロスリンカー  ２４００（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ，カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）も用いたＵＶクロスリングによって固定し、ＱＵＩＣＫＨＹＢ（商標）ハイブリダイゼーション溶液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，カリフォルニア州Ｌａ  Ｊｏｌｌａ）を用いて、厳密な条件での製造者推薦に従ってプローブ化した。
【０２７２】
ヒト標的を検出するために、ヒト標的特異的プライマー−プローブセットをＰＣＲによって調合した。添加液およびトランスファー効率の差異を規準化するために、膜を帯状にし、ヒトグリセルアルデヒド３リン酸脱水素酵素（ＧＡＰＤＨ）ＲＮＡ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，カリフォルニア州Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ）でプローブ化した。
【０２７３】
ハイブリダイズされた膜はＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（商標）およびＩＭＡＧＥＱＵＡＮＴ（商標）ソフトウェアＶ３．３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を用いて可視化し定量化した。データは未処理対照のＧＡＰＤＨレベルで規準化した。
【実施例１４】
【０２７４】
標的タンパク質レベルのウエスタンブロット解析
ウエスタンブロット解析（免疫ブロット解析）は、標準的な方法を用いて実行した。細胞はオリゴヌクレオチドヌクレオチド処理後１６〜２０時間で回収し、ＰＢＳで１回洗浄し、Ｌａｅｍｍｌｉバッファー（１００μｌ／ウェル）に懸濁し、５分間煮沸し、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに添加した。ゲルを１５０Ｖで１．５時間流し、ウエスタンブロッティング用の膜へ移した。標的に対して適切な一次抗体、さらに一次抗体に対する放射線標識または蛍光標識した二次抗体と共に使用した。バンドはＰＨＯＳＰＨＯＲＩＭＡＧＥＲ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ，カリフォルニア州Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ）を用いて可視化した。
【実施例１５】
【０２７５】
選択された、異なって修飾されたｓｉＲＮＡのＩｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
公開された配列情報を用いてヒトサバイビンを標的化するように設計した、異なって修飾されたｓｉＲＮＡ二本鎖を調合し、以下に記載したようにアッセイした。アンチセンス鎖は４’−チオギャップト鎖として一定にし、３つの異なるセンス鎖を比較した。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。
【０２７６】
【表４】
2008501693.tif 000007
【０２７７】
異なって修飾されたｓｉＲＮＡ二本鎖は、ＨｅＬａ細胞における標的ｍＲＮＡレベルを阻害する能力に対してアッセイした。ＨｅＬａ細胞に使用した培養方法はＡＴＣＣから利用可能であり、例えばｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見ることが出来る。９６ウェルプレートで増殖させた細胞に対して、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１低減血清培養液で１回洗浄し、１２μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）および望ましい濃度のｄｓＲＮＡを含有した１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で処理した。処理の約５時間後、培養液は新鮮な培養液と交換した。細胞は、ＲＮＡを単離し、以前に記載したようにＲＴ−ＰＣＲによって標的減少が測定された時点である処理後１６時間で回収した。用量−反応データは以下に記載した各ペアに対するＩＣ５０を決定するために使用した（アンチセンス：センス）。
【０２７８】
【表５】
2008501693.tif 000008
【実施例１６】
【０２７９】
ＭＯＥ修飾センスおよび４−チオ（４’−チオ／２’−ＯＣＨ３）ギャップマーアンチセンス鎖を保持する、異なって修飾されたｓｉＲＮＡのＩｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明に従うと、一連のオリゴマー化合物を合成し、未修飾化合物と比較して、用量の範囲に亘って標的発現を減少させる能力をテストした。テストした前記化合物は、全体にホスホロチオエートインターヌクレオシド結合を保持する、長さ１９ヌクレオチドであった。
【０２８０】
ＨｅＬａ細胞は、本明細書に記載した方法を用いて、０、０．１５、１．５、１５、および１５０ｎＭの濃度の以下に示したような（前記二本鎖のアンチセンス鎖の次にセンス鎖）二本鎖オリゴマー化合物（ｓｉＲＮＡコンストラクト）で処理した。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。ヒトＰＴＥＮの発現レベルは、定量化リアルタイムＰＣＲで決定し、本明細書の他の実施例に記載されたようにＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（商標）で規準化した。結果生じる用量−反応曲線は、各ペアに対するＩＣ５０を決定するために使用した。未処理対照のパーセンテージ（％ＵＴＣ）として標的ｍＲＮＡレベルに対する各二本鎖の影響も示した。
【０２８１】
【表６】
2008501693.tif 000009
【０２８２】
これらのデータから、ＲＮＡセンス鎖（５．３のＩＣ５０を保持する３５９３４５＿３４１４０１）と対をなすアンチセンス鎖における４’−チオギャップマーＲＮＡを含有する二本鎖コンストラクトの活性は、２’ＭＯＥ修飾を末端上のセンス鎖へ、またはＲＮＡとの交互立体配置において組み込むことによって改善され得るということが明らかであった。さらに、交互モチーフを用いることによって、未修飾純粋ＲＮＡコンストラクト（３４１３９１＿３４１４０１；０．９４のＩＣ５０値を保持する両鎖におけるＲＮＡ）においてＩＣ５０値の改善が見られることも明らかであった。
【実施例１７】
【０２８３】
選択された、異なって修飾されたｓｉＲＮＡのＩｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
選択されたｓｉＲＮＡ（前記二本鎖のアンチセンス鎖の次にセンス鎖の順で以下に示した）を調合し、様々な用量の前記選択されたｓｉＲＮＡで本明細書に記載されたように処理したＨｅＬａ細胞において評価した。ｍＲＮＡレベルは、本明細書で記載したようにリアルタイムＰＣＲを用いて定量化し、未処理対照レベル（％ＵＴＣ）と比較した。そのＩＣ５０は、使用した濃度の対数に対して規準化したｍＲＮＡレベルをプロットすることによって算出された直線回帰方程式を用いて計算した。
【０２８４】
【表７】
2008501693.tif 000010
【０２８５】
【表８】
2008501693.tif 000011
【実施例１８】
【０２８６】
ヒトサバイビンを標的化した修飾ｓｉＲＮＡのＩｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明に従うと、一連のオリゴマー化合物を合成し、用量の範囲に亘って標的発現を減少させる能力をテストした。ＨｅＬａ細胞は、０．０００６ｎＭ、０．０８４ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭまたは２０ｎＭの濃度の以下に示した（二本鎖のアンチセンス鎖の次にセンス鎖）二本鎖オリゴマー化合物（ｓｉＲＮＡコンストラクト）で、本明細書に記載した方法を用いて処理した。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。ヒトサバイビンの発現レベルは本明細書で記載したようにリアルタイムＰＣＲを用いて定量化した。サバイビンｍＲＮＡレベルに対する２０ｎＭ用量の効果は以下のようである。結果は未処理対照ｍＲＮＡレベルのパーセンテージとして示した。
【０２８７】
【表９】
2008501693.tif 000012
【０２８８】
【表１０】
2008501693.tif 000013
【実施例１９】
【０２８９】
ヒトｅＩＦ４Ｅを標的化した選択された、異なって修飾されたｓｉＲＮＡのＩｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明に従うと、一連のオリゴマー化合物を合成し、用量の範囲に亘ってｅＩＦ４Ｅ発現を減少させる能力をテストした。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。ＨｅＬａ細胞は、０．０００６ｎＭ、０．０３２ｎＭ、０．１６ｎＭ、０．８ｎＭ、４ｎＭまたは２０ｎＭの濃度の以下に示した（二本鎖のアンチセンス鎖の次にセンス鎖）二本鎖オリゴマー化合物（ｓｉＲＮＡコンストラクト）で、本明細書に記載した方法を用いて処理した。ヒトｅＩＦ４Ｅの発現レベルは本明細書で記載したようにリアルタイムＰＣＲを用いて定量化した。結果生じた用量−反応曲線は以下に示したように各ペアに対するＩＣ５０を決定するために使用した。
【０２９０】
【表１１】
2008501693.tif 000014
【実施例２０】
【０２９１】
マウスｅＩＦ４Ｅを標的化した選択された、異なって修飾されたｓｉＲＮＡのＩｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ
本発明に従うと、一連のオリゴマー化合物を合成し、用量の範囲に亘ってｅＩＦ４Ｅ発現を減少させる能力をテストした。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。ｂ．ＥＮＤ細胞は、０．０６２５ｎＭ、０．２５ｎＭ、１ｎＭ、または４ｎＭの濃度の以下に示した（二本鎖のアンチセンス鎖の次にセンス鎖）二本鎖オリゴマー化合物（ｓｉＲＮＡコンストラクト）で、本明細書に記載した方法を用いて処理した。マウスｅＩＦ４Ｅの発現レベルは本明細書で記載したようにリアルタイムＰＣＲを用いて定量化した。結果生じた用量−反応曲線は以下に示したように各ペアに対するＩＣ５０を決定するために使用した。
【０２９２】
【表１２】
2008501693.tif 000015
【実施例２１】
【０２９３】
未処理対照に対するＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルをアッセイしたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖における５つの２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドのブロックマーウォーク
以下に記載したアンチセンス（ＡＳ）鎖はヒトＰＴＥＮを標的化するように設計し、それぞれは同じセンス鎖（ＩＳＩＳ２７１７９０、以下に示した）を有する二本鎖であった。前記二本鎖は、本明細書で記載された方法を用いて５つの修飾の相対位置的効果を決定するために、用量の範囲に亘ってＰＴＥＮ発現を減少する能力をテストした。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。ＰＴＥＮの発現レベルは本明細書で記載したようなリアルタイムＰＣＲ方法を用いて決定し、未処理対照に対して決定されたレベルと比較した。
【０２９４】
【表１３】
2008501693.tif 000016
【０２９５】
前記アンチセンス鎖の５末端から除去された、少なくとも２位に５つの２’−Ｏ−メチル基を保持するｓｉＲＮＡから除去された、少なくとも２位に２−Ｏ−メチル基を保持するｓｉＲＮＡはＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルを未処理対照の２５〜３５％まで減少した。’残りの２つのコンストラクトは、未処理対照以上にＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルを増加した。
【実施例２２】
【０２９６】
未処理対照に対するＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルをアッセイしたｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖における２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドの固体ブロック
以下に記載したアンチセンス（ＡＳ）鎖はヒトＰＴＥＮを標的化するように設計し、それぞれは同じセンス鎖２７１７９０を有する二本鎖であった。前記二本鎖は、結果生じたｓｉＲＮＡの３’末端に９または１４の２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドを付加する相対的な効果を決定するために、用量の範囲に亘ってＰＴＥＮ発現を減少する能力をテストした。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。ＰＴＥＮの発現レベルは本明細書で記載したようなリアルタイムＰＣＲ方法を用いて決定し、未処理対照に対して決定されたレベルと比較した。
【０２９７】
【表１４】
2008501693.tif 000017
【０２９８】
９の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを保持するｓｉＲＮＡは、未処理対照の約４０％までＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルを減少したが、１４の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを保持するコンストラクトは、対照の約９８％までＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルを減少した。
【実施例２３】
【０２９９】
２’−Ｏ−メチルブロックマー（ｓｉＲＮＡ対ａｓＲＮＡ）
一連のブロックマーは、一本鎖アンチセンスＲＮＡ（ａｓＲＮＡ）として調合した。以下に記載した前記アンチセンス（ＡＳ）鎖は、ＰＴＥＮを標的化するように設計し、それぞれは、同じセンス鎖（ＩＳＩＳ３０８７４６、以下に示した）を有する二本鎖の一部としてＰＴＥＮ発現レベルを減少する能力をアッセイした。Ｔ２４細胞は、本明細書に記載された方法を用いて、以下に示したアンチセンス化合物で産生した一本鎖または二本鎖オリゴマー化合物で処理した。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。ヒトＰＴＥＮの発現レベルは本明細書で記載したようなリアルタイムＰＣＲ方法を用いて決定し、未処理対照に対して決定されたレベルと比較した。
【０３００】
【表１５】
2008501693.tif 000018
【０３０１】
全てのａｓＲＮＡおよびｓｉＲＮＡは活性を示し、ａｓＲＮＡはそれぞれの場合における対応二本鎖よりも優れた活性を保持する。全てのｓｉＲＮＡコンストラクト（２０、４０、８０、および１５０ｎｍ用量）で明らかな用量反応が見られた。５０、１００、および２００ｎｍ用量のａｓＲＮＡでは用量−反応効果も観察された。一般に前記ｓｉＲＮＡは、このシステムにおいてａｓＲＮＡよりも低い用量で活性化され、１５０ｎｍ用量では未処理対照の１５〜４０％までＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルを減少することができた。非修飾３０３９１２を含有する二本鎖は、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルを未処理対照の約１９％まで減少した。
【実施例２４】
【０３０２】
ｓｉＲＮＡヘミマーコンストラクト
３つのｓｉＲＮＡヘミマーコンストラクトを調合し、ＰＴＥＮ発現レベルを減少する能力をテストした。前記ヘミマーコンストラクトは３末端に７つの２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを保持していた。前記ヘミマーはセンス鎖のみ、アンチセンス鎖のみ、および両鎖に挿入し、効果を比較した。細胞は、以下に示した（二本鎖のアンチセンス鎖の次にセンス鎖）二本鎖オリゴマー化合物（ｓｉＲＮＡコンストラクト）で、本明細書に記載した方法を用いて処理した。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。ＰＴＥＮの発現レベルは本明細書で記載したようなリアルタイムＰＣＲ方法を用いて決定し、未処理対照に対して決定されたレベルと比較した。
【０３０３】
【表１６】
2008501693.tif 000019
【０３０４】
７つの２’−Ｏ−メチルヌクレオシドをアンチセンス鎖中のみに保持するコンストラクトは、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルを未処理対照の約２３％まで減少した。７つの２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを両鎖中に保持するコンストラクトは、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルを未処理対照の約２５％まで減少した。７つの２’−Ｏ−メチルヌクレオシドをアンチセンス鎖中のみに保持する場合、ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルは未処理対照の約３１％まで減少した。
【実施例２５】
【０３０５】
２’Ｏ−Ｍｅギャップマーを保持する、調合された代表的なｓｉＲＮＡ
以下のＰＴＥＮを標的化した選択されたｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖は、それらの相補的完全ホスホジエステルセンス鎖とハイブリダイズさせた。本明細書に記載された方法を用いて活性を測定した。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。
【０３０６】
【表１７】
2008501693.tif 000020
【実施例２６】
【０３０７】
２’−Ｆ修飾ヌクレオシドおよび様々な構造モチーフを有する調合された代表的なｓｉＲＮＡ
以下のＰＴＥＮを標的化したｓｉＲＮＡ二本鎖のアンチセンス鎖は、一本鎖単独としてテストした、またはそれらの相補的完全ホスホジエステルセンス鎖とハイブリダイズし二本鎖でテストした。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。太字およびイタリック体「Ｃ」は、５−メチルＣリボヌクレオシドを意味している。
【０３０８】
【表１８】
2008501693.tif 000021
【０３０９】
細胞は、本明細書に記載された方法を用いて、上に示された一本鎖または二本鎖オリゴマー化合物の指示された濃度で処理した。ＰＴＥＮの発現レベルは本明細書で記載したようなリアルタイムＰＣＲ方法を用いて決定し、未処理対照に対して決定されたレベルと比較した。
【０３１０】
【表１９】
2008501693.tif 000022
【０３１１】
２’−Ｆ修飾ヌクレオシドを有する更なるｓｉＲＮＡは、以下に掲載する。
【０３１２】
【表２０】
2008501693.tif 000023
【実施例２７】
【０３１３】
完全に修飾されたアンチセンス鎖（２’−Ｆおよび２’−Ｍｅ）で調合された代表的なｓｉＲＮＡ
ＰＴＥＮを標的化したｓｉＲＮＡコンストラクトを調合し、ここにおいて以下のセンス鎖およびアンチセンス鎖をハイブリダイズした。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。
【０３１４】
【表２１】
2008501693.tif 000024
【実施例２８】
【０３１５】
２’−ＭＯＥ修飾ヌクレオシドを保持する、調合された代表的なｓｉＲＮＡは未処理対照に対してＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルをアッセイした
ＰＴＥＮを標的化したｓｉＲＮＡコンストラクトを調合し、ここにおいて以下のセンス鎖を相補的完全ホスホジエステルセンス鎖とハイブリダイズした。
【０３１６】
以下のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は相補的完全ホスホジエステルセンス鎖とハイブリダイズした。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。結合はホスホロチオエートである。細胞は本明細書に記載された方法を用いて二本鎖で処理した。１００ｎＭ二本鎖を用いて得られた結果は、未処理対照ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルのパーセンテージとして示した。
【０３１７】
【表２２】
2008501693.tif 000025
【実施例２９】
【０３１８】
４’−チオおよび２’−ＯＣＨ３キメラオリゴマー化合物
以下に示した二本鎖コンストラクト（二本鎖のアンチセンス鎖の次にセンス鎖）を調合した。アンチセンス（ａｓ）の名称の後の「Ｐ」は標的がＰＴＥＮであることを示し、「Ｓ」は標的がサバイビンであることを示している。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。
【０３１９】
【表２３】
2008501693.tif 000026
【０３２０】
指示された標的に対して設計されたコンストラクトは、本明細書に記載されたアッセイに従ってテストした。二本鎖オリゴマー化合物をＨｅＬａ細胞（アメリカ培養細胞系統保存機関、バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ）において評価した。ＨｅＬａ細胞に対して使用した培養方法はＡＴＣＣから利用可能であり、例えばｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇで見つけることが出来る。９６ウェルプレートで増殖した細胞に対して、ウェルを２００μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１低減血清培養液で１回洗浄し、１２μｇ／ｍＬのＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，カリフォルニア州Ｃａｒｌｓｂａｄ）および望ましい濃度のｄｓＲＮＡを含有した１３０μＬのＯＰＴＩ−ＭＥＭ−１で処理した。処理の約５時間後、培養液は新鮮な培養液と交換した。細胞は、ＲＮＡを単離し、以前の実施例に記載したように定量化リアルタイムＲＴ−ＰＣＲによって標的減少が測定された時点である処理後１６時間で回収した。結果生じる用量−反応データは各コンストラクトに対するＩＣ５０を決定するために使用した。
【０３２１】
【表２４】
2008501693.tif 000027
【実施例３０】
【０３２２】
ｅＩＦ４Ｅおよびサバイビン標的に対して調合しテストした選択されたｓｉＲＮＡコンストラクト
選択されたｓｉＲＮＡコンストラクトを調合し、定量化リアルタイムＰＣＲによって測定されたようなより低い標的ＲＮＡに対する能力をテストした。前記二本鎖は以下に示した（二本鎖のアンチセンス鎖の次にセンス鎖）。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。
【０３２３】
【表２５】
2008501693.tif 000028
【０３２４】
【表２６】
2008501693.tif 000029
【０３２５】
上のコンストラクトは、本明細書で記載されたような形質移入手順およびリアルタイムＰＣＲを用いて、ＨｅＬａ細胞、ＭＨ−Ｓ細胞またはＵ−８７ＭＧ細胞においてテストした。結果生じた二本鎖に対するＩＣ５０を計算し、以下に示した。
【０３２６】
【表２７】
2008501693.tif 000030
【実施例３１】
【０３２７】
位置的に修飾された組成物
以下の表は、本発明に従って調合された例示的な位置的に修飾された組成物を示したものである。標的の標示は：Ｐ＝ＰＴＥＮ；Ｓ＝サバイビン：Ｅ＝ｅＩＦ４Ｅであり、以下のアンチセンス鎖名称の次に示されている。
【０３２８】
【表２８−１】
2008501693.tif 000031
【０３２９】
【表２８−２】
2008501693.tif 000032
【０３３０】
【表２８−３】
2008501693.tif 000033
【０３３１】
上のコンストラクトは、本明細書で記載されたような形質移入手順およびリアルタイムＰＣＲを用いて、ＨｅＬａ細胞、ＭＨ−Ｓ細胞またはＵ−８７ＭＧ細胞においてテストした。結果生じたＩＣ５０を計算し、以下に示した。前記化合物が標的化している種およびアッセイされた細胞株も示してある。
【０３３２】
【表２９−１】
2008501693.tif 000034
【０３３３】
【表２９−２】
2008501693.tif 000035
【実施例３２】
【０３３４】
本発明の適切な位置的組成物
以下の表は本発明のいくつかの適切な位置的組成物を記載したものである。記載されたコンストラクトにおいて、センス鎖の５末端ヌクレオシド（上段）は、アンチセンス鎖の３’末端ヌクレオシド（下段）とハイブリダイズした。
【０３３５】
【表３０】
2008501693.tif 000036
【実施例３３】
【０３３６】
Ｔ−２４細胞においてＰＴＥＮを標的化した交互２’−Ｏ−メチル／２’−Ｆ  ２０ｍｅｒ  ｓｉＲＮＡ
用量反応実験は、交互２’−Ｏ−メチル／２’−Ｆ  ｓｉＲＮＡの位置的効果を検討するためにＰＴＥＮシステムにおいて実行した。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。
【０３３７】
【表３１】
2008501693.tif 000037
【０３３８】
完全交互２’−Ｏ−メチル／２’−Ｆアンチセンス鎖（ＰＯまたはＰＳ）の効果を決定するために上のｓｉＲＮＡコンストラクトをアッセイし、ここにおいて前記アンチセンス鎖の５’末端は残りの位置が交互である２’−Ｆ修飾ヌクレオシドである。前記センス鎖は、前記センス鎖の３’末端で開始した２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドでテストした各ｓｉＲＮＡに対して、別の同一ｓｉＲＮＡを前記センス鎖の３’末端で開始した２’−Ｆ修飾ヌクレオシドで調合されるように、両配向における前記修飾ヌクレオシドの位置を有するように調合した。これら２つのｓｉＲＮＡ間の違いを記載する別の方法としては、前記センス鎖の記載が、一定な１つの配向での前記アンチセンス鎖の記載と共に両方の可能な配向内であるというものである。前記コンストラクトの活性（１５０ｎＭでの）は、未処理対照のパーセンテージとして以下に示した。
【０３３９】
【表３２】
2008501693.tif 000038
【０３４０】
このアッセイに対する交互モチーフ内で、前記アンチセンス鎖は５’末端ヌクレオシドでの２’−Ｆ基で開始して調合した。前記センス鎖は２’−Ｆ修飾ヌクレオシドまたは２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオシドで３’末端ヌクレオシドから開始した交互モチーフで調合した。前記ｓｉＲＮＡコンストラクトは、完全ホスホジエステルとしてのセンス鎖に対するインターヌクレオシド結合、および完全ホスホジエステルまたはホスホロチオエートとしてのアンチセンス鎖に対するインターヌクレオシド結合で調合した。
【実施例３４】
【０３４１】
ｅＩＦ４Ｅを標的化した交互２’−Ｏ−メチル／２’−Ｆ  ｓｉＲＮＡに対する修飾リン酸部位の効果
用量反応は、活性に対する選択された末端基の効果を決定するために、ＨｅＬａ細胞においてｅＩＦ４Ｅを標的化して実行した。より具体的には、交互２’−Ｏ−メチル／２’−Ｆ修飾を含む１９−塩基対ｓｉＲＮＡによるＨｅＬａ細胞におけるｅＩＦ４Ｅ  ｍＲＮＡの減少が、この実施例において示された。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。５’−Ｐ（Ｓ）は５’−チオリン酸基（５−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）ＯＨ）であり、５’−Ｐ（Ｈ）は５’−Ｈ−リン酸基（５’−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（Ｈ）ＯＨ）であり、５’−Ｐ（ＣＨ３）はメチルホスホネート基（５’−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＣＨ３）ＯＨ）である。このアッセイにおける全てのコンストラクトは完全なホスホジエステル結合されている。
【０３４２】
ＨｅＬａ細胞を４０００／ウェルで播種し、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（６μＬ／ｍＬ  ＯＰＴＩ−ＭＥＭ）の存在下のｓｉＲＮＡで形質移入し、約４時間処理し、再度添加し、次の日に溶解し、本明細書に記載されたようにリアルタイムＰＣＲ方法を用いて解析した。最大％減少とは、最大濃度（１００ｎＭ）での未処理対照細胞と比較したｍＲＮＡ減少の量であり、ＩＣ５０は５０％減少が達成される補間濃度を意味している。
【０３４３】
【表３３】
2008501693.tif 000039
【０３４４】
【表３４】
2008501693.tif 000040
【実施例３５】
【０３４５】
ＰＴＥＮを標的化した選択されたｓｉＲＮＡのアッセイ
以下に記載したコンストラクトは、未処理対照レベルに対する、ＨｅＬａ細胞におけるヒトＰＴＥＮ  ｍＲＮＡのレベルを測定することによって活性をアッセイした。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。「Ｐ（Ｓ）−」はチオリン酸基（−Ｏ−Ｐ（＝Ｓ）（ＯＨ）ＯＨ）を意味している。
【０３４６】
【表３５−１】
2008501693.tif 000041
【０３４７】
【表３５−２】
2008501693.tif 000042
【０３４８】
【表３５−３】
2008501693.tif 000043
【０３４９】
【表３６】
2008501693.tif 000044
【実施例３６】
【０３５０】
ＰＴＥＮを標的化した交互２’−ＭＯＥ／２’−ＯＨ  ｓｉＲＮＡ
以下に記載したＰＴＥＮを標的化したコンストラクトは示したように（二本鎖のアンチセンス鎖の次にセンス鎖）二本鎖であり、本明細書に記載された方法を用いて活性をアッセイした。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。
【０３５１】
【表３７】
2008501693.tif 000045
【実施例３７】
【０３５２】
ＰＴＥＮを標的化した化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ：ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
６〜７週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，メイン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）に、ＰＴＥＮを標的化した一本鎖および二本鎖組成物を注射した。前記ヌクレオシドは、実施例の最初の説明のように化学修飾に関して注釈をつけた。各処理群は４匹の動物から成る。動物は腹腔内注射を介して１日２回４．５日間、動物当たり全９回投与した。生理食塩水注射動物をネガティブコントロールとした。動物は最後の用量が投与された後６時間で屠殺し、血漿サンプルおよび組織を回収した。肝臓における標的減少も本研究の終了時に測定した。
【０３５３】
【表３８】
2008501693.tif 000046
【０３５４】
各処理の２つの異なる用量でテストした。ＩＳＩＳ１１６８４７での処理では、１２．５ｍｇ／ｋｇの用量を１日２回、または６．２５ｍｇ／ｋｇを１日２回投与した。
【０３５５】
上記のｓｉＲＮＡコンストラクト（非修飾３４１３９１／３４１４０１、３５９９９５／３５９９９６両鎖は修飾されている）は、２５ｍｇ／ｋｇで１日２回または６．２５ｍｇ／ｋｇで１日２回投与した。各ｓｉＲＮＡは以前の実施例のようにアンチセンス鎖および相補的センス鎖で構成されており、前記アンチセンス鎖はマウスＰＴＥＮを標的化している。ＩＳＩＳ１１６８４７および本実験の全てのｓｉＲＮＡも、ヒトＰＴＥＮに対して完全な相補性を有している。
【０３５６】
肝臓におけるＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルは、以前の実施例に教示されたようにリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｖｅｓ，Ｉｎｃ．オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を用いて、本研究の最後に測定した。結果は生理食塩水注射対照で規準化された、各処理群に対するｍＲＮＡ発現の平均％阻害として以下の表に示した。
【０３５７】
【表３９】
2008501693.tif 000047
【０３５８】
上の表に示されたように、ＰＴＥＮを標的化した全てのオリゴヌクレオチドは生理食塩水処理対照と比較して、ｍＲＮＡレベルにおける減少を生じた。ＩＳＩＳ３４１３９１／３４１４０１二本鎖に対して測定されたｍＲＮＡレベルも用量依存性の阻害を示唆するものであった。
【０３５９】
血漿グルコースレベルに対するＲＮＡ二本鎖での処理の効果は上記のように処理したマウスにおいて評価した。グルコースレベルはルーティンな臨床解析機（例えばＡｓｃｅｎｃｉａ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ  ＸＬ，ニューヨーク州Ｂａｙｅｒ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ）を用いて測定した。おおよその平均血漿グルコースは各処理群に対して以下の表に示した。
【０３６０】
【表４０】
2008501693.tif 000048
【０３６１】
ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡを標的化したＩｎ  ｖｉｖｏｓｉＲＮＡに起因する生理学的効果を推定するために、前記マウスの血漿トリグリセリド、血漿コレステロール、および血漿トランスアミナーゼレベルを処理期間の最後に評価した。血漿トリグリセリド、コレステロール、およびトランスアミナーゼレベルを測定するためにルーティンな臨床解析機（例えばＯｌｙｍｐｕｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，ニューヨーク州Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）を使用した。ＩＳＩＳ１１６８４７のいずれかの用量で処理した動物からの血漿コレステロールレベルは、生理食塩水処理動物で測定されたレベルを約２０％以上増加した。反対に、ＩＳＩＳ３４１３９１／３４１４０１二本鎖の２５ｍｇ／ｋｇまたは６．２５ｍｇ／ｋｇで処理した動物で測定したコレステロールレベルは、生理食塩水処理対照と比較して約１２％減少した。ＩＳＩＳ３５９９９６／３５９９９５二本鎖は、コレステロールレベルにおいて有意な変化を生じなかった。全ての治療群は治療用量に関係なく、生理食塩水処理対照と比較して、血漿トリグリセリドの減少を示した。
【０３６２】
トランスアミナーゼＡＬＴおよびＡＳＴにおける増加は肝毒性を意味することが出来る。ｓｉＲＮＡ二本鎖で処理したマウスで測定されたトランスアミナーゼレベルは、生理食塩水処理対照と比較して、肝毒性を示すレベルにまで上昇しなかった。ＩＳＩＳ１１６８４７の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での処理は、ＡＬＴおよびＡＳＴレベルにおいてそれぞれ約７倍と３倍の増加を引き起こした。ＩＳＩＳ１１６８４７のより低い用量（６．２５ｍｇ／ｋｇ）での処理は、ＡＬＴおよびＡＳＴレベルにおいてそれぞれ約４倍と２倍の増加を引き起こした。
【０３６３】
研究の最後で、肝臓、白色脂肪組織（ＷＡＴ）、脾臓および腎臓を、前記オリゴマー化合物で処理した動物から回収し、全体の器官変化を推定するために重量を測定した。各治療群に対するおおよその平均組織重量は以下の表に示した。
【０３６４】
【表４１】
2008501693.tif 000049
【０３６５】
示されたように、ＰＴＥＮを標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ二本鎖での処理では、生理食塩水のみで処理したマウスの器官重量と比較して、正常マウスにおける肝臓、ＷＡＴ、脾臓または腎臓重量は実質的に変化しなかった。
【実施例３８】
【０３６６】
ＰＴＥＮを標的化した化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ：ｉｎ  ｖｉｖｏ研究
６〜７週齢Ｂａｌｂ／ｃマウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，メイン州Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ）に、ＰＴＥＮを標的化した化合物を注射した。各処理群は４匹の動物から成る。動物は腹腔内注射を介して１日２回４．５日間、動物当たり全９回投与した。生理食塩水注射動物をネガティブコントロールとした。動物は最後の用量が投与された後６時間で屠殺し、血漿サンプルおよび組織を回収した。肝臓における標的減少も本研究の終了時に測定した。
【０３６７】
各処理の２つの用量をテストした。５−１０−５ギャップマーであるＩＳＩＳ１１６８４７（５’−ＣＴＧＣＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＴＴＧＡ−３’、配列ＩＤ番号：６３）での処理では、１２．５ｍｇ／ｋｇの用量を１日２回、または６．２５ｍｇ／ｋｇを１日２回投与した。以下に記載されたｓｉＲＮＡコンストラクトは、２５ｍｇ／ｋｇで１日２回または６．２５ｍｇ／ｋｇで１日２回投与した。各ｓｉＲＮＡは以前の実施例のようにアンチセンス鎖および相補的センス鎖で構成されており、前記アンチセンス鎖はマウスＰＴＥＮを標的化している。ＩＳＩＳ１１６８４７および本実験の全てのｓｉＲＮＡも、ヒトＰＴＥＮに対して完全な相補性を有している。
【０３６８】
ＰＴＥＮを標的化したｓｉＲＮＡ二本鎖は、アンチセンス鎖ＩＳＩＳ３４１３９１（５’−ＵＵＧＵＣＵＣＵＧＧＵＣＣＵＵＡＣＵＵ−３’、配列ＩＤ番号：２６）およびセンス鎖ＩＳＩＳ３４１４０１（５’−ＡＡＧＵＡＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡ−３’、配列ＩＤ番号：２７）から成る。ＩＳＩＳ３４１３９１／ＩＳＩＳ３４１４０１二本鎖の両鎖は、ホスホジエステルインターヌクレオシド結合を有するリボヌクレオシドから成る。
【０３６９】
ヒトＰＴＥＮを標的化した別のｓｉＲＮＡ二本鎖は、アンチセンス鎖ＩＳＩＳ３４２８５１（５’−ＵＵＵＧＵＣＵＣＵＧＧＵＣＣＵＵＡＣＵＵ−Ｓ’、配列ＩＤ番号：４０）およびセンス鎖ＩＳＩＳ３０８７４６（５’−ＡＡＧＵＡＡＧＧＡＣＣＡＧＡＧＡＣＡＡＡ−３’、配列ＩＤ番号：３９）から成る。前記アンチセンス鎖ＩＳＩＳ３４２８５１は、太字で示されたように、１、２、３、５、１６、１８、１９および２０位で４’−チオリボースヌクレオシドを有する中心ＲＮＡ領域から成る。センス鎖ＩＳＩＳ３０８７４６はリボヌクレオシドから成り、ＩＳＩＳ３４２８５１／３０８７４６二本鎖の両鎖は全体にホスホジエステルインターヌクレオシド結合を保持する。
【０３７０】
肝臓におけるＰＴＥＮ  ｍＲＮＡレベルは、以前の実施例に教示されたようにリアルタイムＰＣＲおよびＲＩＢＯＧＲＥＥＮ（商標）ＲＮＡ定量化試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｖｅｓ，Ｉｎｃ．オレゴン州Ｅｕｇｅｎｅ）を用いて、本研究の最後に測定した。ＰＴＥｎ  ｍＲＮＡレベルは、生理食塩水処理対照で規準化する前に、総ＲＮＡまたはＧＡＰＤＨ発現に対して決定した。結果は生理食塩水注射対照で規準化された、各処理群に対するｍＲＮＡ発現の平均％阻害として以下の表に示した。
【０３７１】
【表４２】
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【０３７２】
上の表に示されたように、ＰＴＥＮを標的化したオリゴヌクレオチドは生理食塩水処理対照と比較して、ｍＲＮＡレベルにおける減少を生じた。ＩＳＩＳ３４１３９１／３４１４０１二本鎖に対して測定されたｍＲＮＡレベルも用量依存性阻害を示唆するものであった。
【０３７３】
血漿グルコースレベルに対するＲＮＡ二本鎖での処理の効果は上記のように処理したマウスにおいて評価した。グルコースレベルはルーティンな臨床解析機（例えばＡｓｃｅｎｃｉａ  Ｇｌｕｃｏｍｅｔｅｒ  Ｅｌｉｔｅ  ＸＬ，ニューヨーク州Ｂａｙｅｒ，Ｔａｒｒｙｔｏｗｎ）を用いて測定した。おおよその平均血漿グルコースは各処理群に対して以下の表に示した。
【０３７４】
【表４３】
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【０３７５】
ＰＴＥＮ  ｍＲＮＡを標的化したＩｎ  ｖｉｖｏｓｉＲＮＡに起因する生理学的効果を推定するために、前記マウスの血漿トリグリセリド、血漿コレステロール、および血漿トランスアミナーゼレベルを処理期間の最後に評価した。血漿トリグリセリド、コレステロール、およびトランスアミナーゼレベルを測定するためにルーティンな臨床解析機（例えばＯｌｙｍｐｕｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ，ニューヨーク州Ｍｅｌｖｉｌｌｅ）を使用した。ＩＳＩＳ１１６８４７のいずれかの用量で処理した動物からの血漿コレステロールレベルは、生理食塩水処理動物で測定されたレベルの約２０％以上増加した。反対に、ＩＳＩＳ３４１３９１／３４１４０１二本鎖の２５ｍｇ／ｋｇまたは６．２５ｍｇ／ｋｇで処理した動物で測定したコレステロールレベルは、生理食塩水処理対照と比較して約１２％減少した。他の処理では、コレステロールレベルにおいて実質的な変化を引き起こさなかった。全ての治療群は治療用量に関係なく、生理食塩水処理対照と比較して、血漿トリグリセリドの減少を示した。
【０３７６】
トランスアミナーゼＡＬＴおよびＡＳＴにおける増加は肝毒性を意味することが出来る。ｓｉＲＮＡ二本鎖で処理したマウスで測定されたトランスアミナーゼレベルは、生理食塩水処理対照と比較して、肝毒性を示すレベルにまで上昇しなかった。ＩＳＩＳ１１６８４７の１２．５ｍｇ／ｋｇ用量での処理は、ＡＬＴおよびＡＳＴレベルにおいてそれぞれ約７倍と３倍の増加を引き起こした。ＩＳＩＳ１１６８４７のより低い用量（６．２５ｍｇ／ｋｇ）での処理は、ＡＬＴおよびＡＳＴレベルにおいてそれぞれ約４倍と２倍の増加を引き起こした。
【０３７７】
研究の最後で、肝臓、白色脂肪組織（ＷＡＴ）、脾臓および腎臓を、前記オリゴマー化合物で処理した動物から回収し、全体の器官変化を推定するために重量を測定した。各治療群に対するおおよその平均組織重量は以下の表に示した。
【０３７８】
【表４４】
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【０３７９】
示されたように、ＰＴＥＮを標的化したアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはｓｉＲＮＡ二本鎖での処理では、生理食塩水のみで処理したマウスの器官重量と比較して、正常マウスにおける肝臓、ＷＡＴ、脾臓または腎臓重量は実質的に変化しなかった。
【実施例３９】
【０３８０】
マウス血漿中の交互２’−Ｏ−メチル／２’−フルオロｓｉＲＮＡコンストラクトの安定性
無傷二本鎖ＲＮＡは、以前に記載された方法（Ｌｅｅｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９６，２３５，３６−４３；Ｇｅａｒｙ，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１９９９，２７４，２４１〜２４８）と同様な抽出およびキャピラリー電気泳動方法を用いて、希釈マウス血漿から解析した。３〜６月齢メスＢａｌｂ／ｃ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｓ）からのマウスへパリン−処理マウス血漿は、−８０℃から解凍し、２５％（ｖ／ｖ）までリン酸緩衝生理食塩水（１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  リン酸カリウム、１０ｍＭ  リン酸ナトリウム）で希釈した。約１０ｎｍｏｌのプレアニーリングｓｉＲＮＡを１００μＭの濃度で、２５％血漿に添加し、３７℃で０、１５、３０、４５、６０、１２０、１８０、２４０、３６０、および４２０分間インキュベートした。一定量を指示された時間に取り、最終濃度の２ｍＭまでＥＤＴＡで処理し、キャピラリーゲル電気泳動（ｅＣａｐ  ＤＮＡキャピラリーチューブを有するＢｅｃｋｍａｎ  Ｐ／ＡＣＥ  ＭＤＱ−ＵＶ）で解析するまで氷上に放置した。ｓｉＲＮＡ二本鎖ピークの領域を測定し、残りの無傷ｓｉＲＮＡのパーセントを計算するために使用した。アデノシントリリン酸（ＡＴＰ）を、内部キャリブレーション標準として各注射に対して２．５ｍＭの濃度で添加した。ゼロ時点は、キャピラリー電気泳動の後のリン酸緩衝生理食塩水でｓｉＲＮＡを希釈する時点でとる。パーセント無傷ｓｉＲＮＡは時間に対してプロットし、これによって仮性一次半減期の計算を可能となる。結果は以下の表に示した。ＩＳＩＳ３３８９１８（ＵＣＵＵＡＵＣＡＣＣＵＵＵＡＧＣＵＣＵＡ配列ＩＤ番号：５４）およびＩＳＩＳ３３８９４３は全体にホスホジエステル結合を有する非修飾ＲＮＡ鎖である。本明細書の他の例において、ＩＳＩＳ３５１８３１はＵｍＣｆＵｍＵｆＡｍＵｆＣｍＡｆＣｍＣｆＵｍＵｆＵｍＡｆＧｍＣｆＵｍＣｆＵｍとして、ＩＳＩＳ３５１８３２はＡｆＧｍＡｆＧｍＣｆＵｍＡｆＡｍＡｆＧｍＧｆＵｍＧｆＡｍＵｆＡｍＡｆＧｍＡｆとして注釈をつけた。
【０３８１】
【表４５】
2008501693.tif 000053
【０３８２】
親（非修飾）コンストラクトは、３０分後に約５０％分解され、４時間後にはほぼなくなった（６時間で完全になくなった）。反対に、交互２’−Ｏ−メチル／２’−フルオロコンストラクトは比較的変化せずに残り、６時間後でも７５％残っていた。
【実施例４０】
【０３８３】
ヒトグリア芽細胞腫異種移植腫瘍モデルにおけるサバイビン発現のＩｎ  ｖｉｖｏ阻害
Ｕ−８７ＭＧヒトグリア芽細胞腫異種移植腫瘍モデル（Ｋｉａｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｍａｙ−Ｊｕｎ；２（３）：２４２〜５０）は、本発明の選択された組成物の抗腫瘍活性を示すために使用した。全８ＣＤ１ｎｕ／ｎｕ（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）マウスを各群に対して使用した。移植のために、腫瘍細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで洗浄し、ＤＭＥＭ中４ｘ１０６細胞／ｍＬでＰＢＳへ再懸濁した。移植の直前に、動物を照射（４５０ＴＢＩ）し、細胞をマトリゲルと混合した（１：１）。０．２ｍＬ容量の全４ｘ１０６腫瘍細胞を各マウスの左背面側面において皮下（ｓ．ｃ．）に注射した。選択された二本鎖組成物（０．９％  ＮａＣｌに溶解、注射段階）、または溶媒（０．９％  ＮａＣｌ）での処理は、腫瘍細胞移植後４日で開始した。前記組成物は、１日目は８時間おいて、２日目は４時間おいて、０．２ｍＬ容量で静脈内（ｉ．ｖ．）に投与した。組織（腫瘍、肝臓、腎臓、血漿）を最後の投与後２時間で回収した。各群の８匹の動物からの腫瘍はウエスタン評価のためにホモジナイズした。サバイビンレベルを決定し、生理食塩水対照と比較した。
【０３８４】
【表４６】
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【０３８５】
【表４７】
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【０３８６】
このデータは、修飾化学は、非修飾コンストラクトでは見られない活性化を生じるコンストラクトを安定化するために使用され得ることを示している。
【０３８７】
本明細書で記載されたものに加えて本発明の様々な修正は、前述の記載から本分野の当業者に理解されるであろう。そのような修正は添付された請求項の観点内であることも意図している。本明細書で引用された各参考文献（これに限定されるものではないが、雑誌記事、米国および非米国特許、特許明細書、国際出願明細書、遺伝子バンクアクセッション番号、およびそれらと同等なものを含む）の全体は、この参照によって本明細書に組み込まれる。
【配列表】
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