(57)【要約】マイクロスケール薬物動態のためのシステムおよび方法が開示される。様々な臓器およびそれらの薬物化合物との相互作用は、マイクロスケールのチャネルによって相互接続され得るマイクロスケールのコンパートメント（３７２２、３７３４、３７４４）を使用することによって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートされ得る。臓器と関連付けられた細胞および細胞材料は、１つ以上の流体流れ中の薬物化合物との相互作用を可能にするために、そのようなコンパートメント内で培養されることができる。そのような流体系は、例として、消化液の流れ、血流、胆汁流、尿流、および脳液の流れを含んでよい。流体系間の相互作用は、マイクロスケール透過性部材（３４３０）によってシミュレートされ得る。
2008539787.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる少なくとも１つの薬物動態パラメータの値と同程度の、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物動態パラメータの値を提供する条件下に、生物材料を維持するように寸法決定された、少なくとも１つのマイクロスケール機構と、
透過性材料と、
を備える、デバイス。
【請求項２】
該透過性材料は、膜、多孔質膜、微孔性シリコン、半透膜、微孔性材料、微孔性ポリマー、アルギン酸塩、コラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（マトリゲル）、細胞、細胞材料、組織、および組織片から成る群の少なくとも１つから選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３】
該透過性材料は、微孔性表面の中、上、または付近に、有機または無機材料をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項４】
該透過性材料は、生物学的障壁、生物学的障壁の中の、もしくはそれを通る物質の通過、または、生物学的障壁の中の、それを通した、もしくはそれによる物質の吸収、のうち少なくとも１つをシミュレートするように構成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項５】
該生物学的障壁は、胃腸障壁、血液脳関門、肺障壁、胎盤関門、表皮障壁、眼関門、嗅覚器障壁、胃食道障壁、粘膜、血液尿関門、空気組織関門、血液胆汁関門、口腔障壁、肛門直腸関門、膣障壁、および尿道障壁から成る群の少なくとも１つから選択される、請求項４に記載のデバイス。
【請求項６】
該少なくとも１つの薬物動態パラメータは、組織サイズ、組織サイズ比、組織対血液容積比、薬物滞留時間、細胞間相互作用、液体滞留時間、液体対細胞比、細胞による代謝、せん断応力、流速、表面形状、循環通過時間、液分布、組織および／または臓器間の相互作用、ならびに細胞による分子輸送から成る群の少なくとも１つから選択される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７】
該デバイスは、該透過性材料中の、それを通る、またはそれによる、物質の吸収、代謝、排泄、または分布を測定する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項８】
該機構は、中枢神経系、循環器系、消化器系、胆管系、肺系統、泌尿器系、視覚系、嗅覚系、表皮系、およびリンパ系の少なくとも一部から成る群の少なくとも１つを表すように構成される、請求項１に記載のデバイス。
【請求項９】
該透過性材料は、該デバイスの中または外に位置する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１０】
該透過性材料に接続された少なくとも１つのマイクロ流体チャネルをさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１１】
該透過性材料の中の、それを通る、またはそれに近接する流体の流れは、少なくとも１つの薬物動態パラメータを提供する、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１２】
該デバイスを通る該流体流れの性質は、数学モデルに基づく、請求項１１に記載のデバイス。
【請求項１３】
該数学モデルは生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；「ＰＢＰＫ」）モデルである、請求項１２に記載のデバイス。
【請求項１４】
該機構または該透過性材料は、チップフォーマットに組み込まれる、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１５】
該透過性材料は、微孔性材料上で培養された胃腸細胞の層を備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項１６】
該胃腸細胞の該層の少なくとも一部は、流体が該層を通らずにそのいずれかの側面に沿って流れることができるように、該デバイス内に位置付けられる、請求項１５に記載のデバイス。
【請求項１７】
胃腸細胞の該層の第１の側面に位置する少なくとも第１のマイクロスケール機構は胃腸管を表し、単分子層の第２の側面に位置する少なくとも第２のマイクロスケール機構は循環器系を表す、請求項１６に記載のデバイス。
【請求項１８】
同じまたは異なる種類の生物材料を含有するように構成される第３のマイクロスケール機構をさらに備える、請求項１７に記載のデバイス。
【請求項１９】
該透過性材料は、有機材料で少なくとも一部を被覆された微孔性材料を備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２０】
該透過性材料の両側面の中、上、または付近に位置する細胞をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２１】
該デバイスは、吸収特性、代謝酵素活性、および／または発現量を提供する、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２２】
該透過性材料のいずれかの側面上の該細胞は、同じ種類または異なる種類のものである、請求項２０に記載のデバイス。
【請求項２３】
該透過性材料の微孔性表面の中、上、または付近に、肝細胞をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２４】
該微孔性表面の少なくとも一部は、該肝細胞を極性化させるタンパク質を備える、請求項２３に記載のデバイス。
【請求項２５】
該透過性材料は、融合性単層を形成することができる細胞株を備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２６】
肝細胞を該透過性材料に結合する結合剤をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項２７】
該結合剤は該肝細胞を極性化させる、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２８】
該結合剤は、タンパク質、コネキシン３２、密着結合タンパク質、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（オクルディン）、Ｃｌａｕｄｉｎ（クローディン）‐１、ＺＯ‐１、ＺＯ‐２、接着結合タンパク質、Ｅ‐カドヘリン、βカテニン、細胞接着分子、およびウボモルリンから成る群より選択される少なくとも１つを含む、請求項２６に記載のデバイス。
【請求項２９】
該透過性材料の中、上、または付近に、第２の種類の生物材料をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３０】
該透過性材料の中、上、または付近に、線維芽細胞をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３１】
該透過性材料の第１の側面に近接して、血液代用物の流れをさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項３２】
該透過性材料の第２の側面に近接して、胆汁代用物の流れをさらに備える、請求項３１に記載のデバイス。
【請求項３３】
ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる少なくとも１つの薬物動態パラメータの値と同程度の、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物動態パラメータの値を提供する条件下に、生物材料を維持するステップと、
物質に透過性材料の少なくとも一部を通過させるステップと、
を含む方法。
【請求項３４】
該生物材料を、マイクロスケール機構内またはそれに近接して維持するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
該透過性材料は、膜、多孔質膜、微孔性シリコン、半透膜、微孔性材料、微孔性ポリマー、アルギン酸塩、コラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（マトリゲル）、細胞、細胞材料、組織、および組織片から成る群の少なくとも１つから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
該透過性材料は、微孔性表面の中、上、または付近に、有機または無機材料をさらに備える、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
該透過性材料は、生物学的障壁、生物学的障壁の中の、もしくはそれを通る物質の通過、または、生物学的障壁の中の、それを通した、もしくはそれによる物質の吸収、のうち少なくとも１つをシミュレートするように構成される、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
該生物学的障壁は、胃腸障壁、血液脳関門、血液胆汁関門、肺障壁、胎盤関門、表皮障壁、眼関門、嗅覚器障壁、胃食道障壁、粘膜、血液尿関門、および空気組織関門、口腔障壁、肛門直腸関門、膣障壁、および尿道障壁から成る群の少なくとも１つから選択される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
該少なくとも１つの薬物動態パラメータは、組織サイズ、組織サイズ比、組織対血液容積比、薬物滞留時間、細胞間相互作用、液体滞留時間、液体対細胞比、細胞による代謝、せん断応力、流速、表面形状、循環通過時間、液分布、組織および／または臓器間の相互作用、ならびに細胞による分子輸送から成る群の少なくとも１つから選択される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４０】
該透過性材料中の、それを通る、またはそれによる、物質の吸収、代謝、または分布を測定するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４１】
該機構は、中枢神経系、循環器系、消化器系、胆管系、肺系統、泌尿器系、視覚系、嗅覚系、表皮系、およびリンパ系の少なくとも一部から成る群の少なくとも１つを表すように構成される、請求項３４に記載の方法。
【請求項４２】
マイクロスケールデバイスの中または外に、該透過性材料を位置させるステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
該透過性材料に接続された少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを介して流体を流すステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４４】
該透過性材料の中の、それを通る、またはそれに近接する流体の流れは、少なくとも１つの薬物動態パラメータを提供する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４５】
該デバイスを通る該流体流れの性質は、数学モデルに基づく、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
該数学モデルは生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；「ＰＢＰＫ」）モデルである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
該マイクロスケール機構または該透過性材料をチップフォーマットに組み込むステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項４８】
該透過性材料は、微孔性材料上で培養された胃腸細胞の層を備える、請求項３３に記載の方法。
【請求項４９】
流体が該層を通らずにそのいずれかの側面に沿って流れることができるように、該胃腸細胞の該層の少なくとも一部を位置付けるステップをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
胃腸細胞の該層の第１の側面に位置する少なくとも第１のマイクロスケール機構は胃腸管を表し、単分子層の第２の側面に位置する少なくとも第２のマイクロスケール機構は循環器系を表す、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
同じまたは異なる種類の生物材料を含有するように構成される第３のマイクロスケール機構をさらに備える、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
該透過性材料は、有機材料で少なくとも一部を被覆された微孔性材料を備える、請求項３３に記載の方法。
【請求項５３】
該透過性材料の両側面の中、上、または付近に、細胞を位置させるステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５４】
吸収特性、代謝酵素活性、および／または発現量を提供するステップをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
該透過性材料のいずれかの側面上の該細胞は、同じ種類または異なる種類のものである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
該透過性材料の微孔性表面の中、上、または付近に、肝細胞を位置させるステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項５７】
該微孔性表面の少なくとも一部は、該肝細胞を極性化させるタンパク質を備える、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
該透過性材料は、融合性単層を形成し、極性化することができる細胞株を備える、請求項３３に記載の方法。
【請求項５９】
肝細胞を該透過性材料に結合するステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項６０】
該肝細胞を極性化させるステップをさらに含む、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
該結合するステップは、タンパク質、コネキシン３２、密着結合タンパク質、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（オクルディン）、Ｃｌａｕｄｉｎ（クローディン）‐１、ＺＯ‐１、ＺＯ‐２、接着結合タンパク質、Ｅ‐カドヘリン、βカテニン、細胞接着分子、およびウボモルリンから成る群より選択される少なくとも１つである結合剤を備える、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
該透過性材料の中、上、または付近に、第２の種類の生物材料を位置させるステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項６３】
該透過性材料の中、上、または付近に、線維芽細胞を位置させるステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項６４】
該透過性材料の第１の側面に近接して、血液代用物を流すステップをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項６５】
該透過性材料の第２の側面に近接して、胆汁代用物を流すステップをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
デバイスを形成する方法であって、
ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる少なくとも１つの薬物動態パラメータの値と同程度の、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物動態パラメータの値を提供する条件下に、生物材料を維持するように構成される機構を形成するステップと、
透過性材料であって、物質が該透過性材料の少なくとも一部を通過するように構成される該透過性材料を追加、形成、または提供するステップと、
を含む方法。
【請求項６７】
ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる少なくとも１つの薬物動態パラメータの値と同程度の、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物動態パラメータの値を提供する条件下に、生物材料を維持するための手段と、
透過性障壁を提供するための手段と、
を備える、デバイス。
【請求項６８】
マイクロスケール透過性材料と、
物質を極性化させるように構成され、当該物質は肝機能の少なくとも１つの性質を明示する、少なくとも１つの結合剤と、
を備える、デバイス。
【請求項６９】
該物質は、１つ以上の肝細胞である、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項７０】
該物質は、遺伝子組み換え生物材料である、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項７１】
該結合剤は、肝細胞を該マイクロスケール透過性材料に結合し極性化させる、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項７２】
第２の物質種類をさらに備える、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項７３】
該マイクロスケール透過性材料の少なくとも１つの表面の付近に位置する１つ以上の線維芽細胞をさらに備える、請求項１に記載のデバイス。
【請求項７４】
該マイクロスケール透過性材料は、有機材料、無機材料、膜、多孔質膜、微孔性シリコン、半透膜、微孔性材料、微孔性ポリマー、アルギン酸塩、コラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（マトリゲル）、細胞、細胞材料、組織、および組織片から成る群の少なくとも１つから選択される、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項７５】
該マイクロスケール透過性材料は、微孔性表面の中、上、または付近にある、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項７６】
該マイクロスケール透過性材料は、生物学的障壁、生物学的障壁の中の、もしくはそれを通る物質の通過、または、生物学的障壁の中の、それを通した、もしくはそれによる物質の吸収、のうち少なくとも１つをシミュレートするように構成される、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項７７】
該デバイスは、該マイクロスケール透過性材料の中で、それによって、またはそれを通して、該物質を処理する、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項７８】
該処理するステップは、分子の吸収、抽出、排泄、代謝、および分布から成る群の少なくとも１つをさらに含む、請求項７７に記載のデバイス。
【請求項７９】
該マイクロスケール透過性材料は、該デバイスの中または外に位置する、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項８０】
該マイクロスケール透過性材料に接続された少なくとも１つのマイクロ流体チャネルをさらに備える、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項８１】
該デバイスを通る該流体流れの性質は、数学モデルに基づく、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項８２】
該数学モデルは生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；「ＰＢＰＫ」）モデルである、請求項８１に記載のデバイス。
【請求項８３】
該機構または該マイクロスケール透過性材料は、チップフォーマットに組み込まれる、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項８４】
該デバイスは、吸収特性、代謝酵素活性、および／または発現量を提供する、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項８５】
該マイクロスケール透過性材料の両側面の中、上、または付近に、生物材料を位置させるステップをさらに含む、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項８６】
該マイクロスケール透過性材料のいずれかの側面上の生物材料は、同じ種類または異なる種類のものである、請求項８５に記載のデバイス。
【請求項８７】
該マイクロスケール透過性材料は、融合性単層を形成することができる細胞株を備える、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項８８】
該結合剤は、タンパク質、コネキシン３２、密着結合タンパク質、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（オクルディン）、Ｃｌａｕｄｉｎ（クローディン）‐１、ＺＯ‐１、ＺＯ‐２、接着結合タンパク質、Ｅ‐カドヘリン、βカテニン、細胞接着分子、およびウボモルリンから成る群より選択される少なくとも１つを含む、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項８９】
該マイクロスケール透過性材料の第１の側面に近接して、血液代用物の流れをさらに備える、請求項６８に記載のデバイス。
【請求項９０】
該マイクロスケール透過性材料の第２の側面に近接して、胆汁代用物の流れをさらに備える、請求項８９に記載のデバイス。
【請求項９１】
肝機能の少なくとも１つの性質を明示する物質を、該物質を極性化させる様式で、マイクロスケール透過性材料に結合するステップを含む、方法。
【請求項９２】
該物質は、１つ以上の肝細胞である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
該物質は、遺伝子組み換え生物材料である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
第２の物質種類を提供するステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
該マイクロスケール透過性材料の少なくとも１つの表面の付近に、１つ以上の線維芽細胞を位置させるステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９６】
該マイクロスケール透過性材料は、有機材料、無機材料、膜、多孔質膜、微孔性シリコン、半透膜、微孔性材料、微孔性ポリマー、アルギン酸塩、コラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（マトリゲル）、細胞、細胞材料、組織、および組織片から成る群の少なくとも１つから選択される、請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
微孔性表面の中、上、または付近に、該マイクロスケール透過性材料を位置させるステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９８】
該マイクロスケール透過性材料は、生物学的障壁、生物学的障壁の中の、もしくはそれを通る物質の通過、または、生物学的障壁の中の、それを通した、もしくはそれによる物質の吸収、のうち少なくとも１つをシミュレートする、請求項９１に記載の方法。
【請求項９９】
該マイクロスケール透過性材料の中で、それを通して、またはそれによって、該物質を処理するステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１００】
該処理するステップは、分子の吸収、抽出、排泄、代謝、および分布から成る群の少なくとも１つをさらに含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
デバイスの中または外に、該マイクロスケール透過性材料を位置させるステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０２】
該マイクロスケール透過性材料に接続された少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを提供するステップをさらに備える、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０３】
肝機能の該少なくとも１つの性質と関連付けられた該流体流れの性質は、数学モデルに基づく、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０４】
該数学モデルは生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；「ＰＢＰＫ」）モデルである、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
該マイクロスケール透過性材料をチップフォーマットに組み込むステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０６】
吸収特性、代謝酵素活性、および／または発現量を提供するステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０７】
該マイクロスケール透過性材料の両側面の中、上、または付近に、生物材料を位置させるステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０８】
該マイクロスケール透過性材料のいずれかの側面上にある生物材料は、同じ種類または異なる種類のものである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
該マイクロスケール透過性材料は、融合性単層を形成することができる細胞株を備える、請求項９１に記載の方法。
【請求項１１０】
該結合するステップは、タンパク質、コネキシン３２、密着結合タンパク質、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（オクルディン）、Ｃｌａｕｄｉｎ（クローディン）‐１、ＺＯ‐１、ＺＯ‐２、接着結合タンパク質、Ｅ‐カドヘリン、βカテニン、細胞接着分子、およびウボモルリンから成る群の少なくとも１つから選択される結合剤を提供するステップを含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１１１】
該マイクロスケール透過性材料の第１の側面に近接して、血液代用物の流れを提供するステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１１２】
該マイクロスケール透過性材料の第２の側面に近接して、胆汁代用物の流れを提供するステップをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１１３】
デバイスを形成する方法であって、肝機能の少なくとも１つの性質を明示する物質に結合し極性化させるように構成される、マイクロスケール透過性材料を形成するステップを含む方法。
【請求項１１４】
肝機能の少なくとも１つの性質を明示する物質を、該物質を極性化させる様式で、マイクロスケール透過性材料に結合するための手段を備える、マイクロスケール装置。
【請求項１１５】
マイクロスケール透過性材料と、
肝機能の少なくとも１つの性質を明示するように構成される少なくとも１つの物質とを備え、該物質によって処理された分子は、該マイクロスケール透過性材料の少なくとも一部を通過するように方向付けられる、
デバイス。
【請求項１１６】
物質によって処理された分子を、マイクロスケール透過性材料の少なくとも一部を通るように方向付けるステップを含み、該物質は肝機能の少なくとも１つの性質を明示するように構成される、方法。
【請求項１１７】
デバイスを形成する方法であって、物質によって処理された分子を、マイクロスケール透過性材料の少なくとも一部を通るように方向付けるように構成される該マイクロスケール透過性材料を形成するステップを含み、該物質は肝機能の少なくとも１つの性質を明示するように構成される、方法。
【請求項１１８】
物質によって処理された分子を、マイクロスケール透過性材料の少なくとも一部を通るように方向付ける手段を備え、該物質は肝機能の少なくとも１つの性質を明示するように構成される、デバイス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願および優先権の請求
本出願は、「ＤＥＶＩＣＥＳ  ＡＮＤ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＦＯＲ  ＰＨＡＲＭＡＣＯＫＩＮＥＴＩＣ−ＢＡＳＥＤ  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＳＹＳＴＥＭ」という名称の、２００２年４月２５日に出願された米国特許出願第１０／１３３、９７７号の一部継続であり、該米国特許出願は、２００１年４月２５日に出願された米国仮特許出願第６０／２８６、４９３号の利益を請求し、本出願は、また「ＭＩＣＲＯＳＣＡＬＥ，ＩＮ  ＶＩＴＲＯ，  ＣＥＬＬ  ＣＵＬＴＵＲＥ  ＤＥＶＩＣＥ  ＷＩＴＨ  Ａ  ＭＩＣＲＯＰＯＲＯＵＳ  ＳＵＲＦＡＣＥ  ＴＨＡＴ  ＭＩＭＩＣＳ  ＰＨＹＳＩＯＬＯＧＩＣＡＬ  ＰＡＲＡＭＥＴＥＲＳ」という名称の、２００５年５月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／６８２，１３１号の利益を請求する。
【０００２】
政府の権利に関する記述
本明細書における開示の少なくとも一部は、航空宇宙局（ＮＡＳＡ）の認可番号第ＮＡＧ８‐１３７２号の下に、少なくとも一部支援されたものである。米国政府は、一定の権利を有し得る。
【０００３】
発明の背景
技術分野
本開示は、細胞培養技術に関し、より具体的には、薬物動態学的研究のためにマイクロスケールレベルで流体系間の相互作用を促進するためのシステムおよび方法に関する。  
【背景技術】
【０００４】
関連技術の説明
薬物動態は、医薬およびその他の生物活性化合物が生体内に導入された時刻からそれらが排出されるまでの運命の研究である。例えば、経口薬に関する一連の事象は、様々な粘膜面による吸収、血流を介した様々な組織への分布、肝臓およびその他の組織における生体内変化、標的部位での作用、ならびに、尿または胆汁中への薬物または代謝産物の排出を含み得る。薬物動態は、生物系内での化合物の代謝にアプローチする合理的手段を提供する。薬物動態の方程式およびモデルの概説については、例えば、非特許文献１、非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４、非特許文献５、および非特許文献６を参照されたい。
【０００５】
薬物、環境、栄養学、消費者製品安全性、および毒物学の研究において研究者らが直面している根本的課題の１つは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイから動物への、代謝データおよびリスク評価の外挿である。適切な薬物動態原理の応用によっていくつかの結論が引き出され得るが、依然として実質的な制限がある。１つの懸案事項は、現在のスクリーニングアッセイが、自然環境では自己の機能を複製しない条件下の細胞を利用することである。循環流、その他の組織との相互作用、および生理反応と関連付けられたその他のパラメータは、標準的な細胞培養フォーマットでは見られない。例えば、マイクロスケール細胞培養アナログ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｎａｌｏｇ；ＣＣＡ）システムにおいて、細胞はチャンバの底部で成長する。これらのシステムは非生理的な高い液体対細胞比を有し、且つ細胞型の非現実的な比（例えば、肝臓対肺細胞の比）を有する。マイクロスケールＣＣＡシステムの変形形態において、細胞はマイクロキャリアビーズ上で成長する。これらのシステムは、生理的状態に酷似しているが、予測的研究のために十分正確な生理的状態を模倣するものではないため、依然として不完全である。したがって、結果として生じるアッセイデータは、動物に見られ得る薬物または毒物曝露のパターンに基づくものではない。
【０００６】
生物内においては、濃度、時間、および代謝が相互作用して薬理反応または毒性反応の強度および持続時間に影響を及ぼす。例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける肝機能の存在は、薬物代謝およびバイオアベイラビリティに強く影響を及ぼす。肝臓による実薬の排出は、生体内変化および排泄によって発生する。生体内変化反応は、多くの化学的に多様な薬物を形質転換させるチトクロームＰ４５０酵素によって触媒される反応を含む。生体内変化の第２段階では、腎臓による水溶性および排出速度を増加させるために、グルタチオン、グルクロン酸、または硫酸塩等の親水基を添加することができる。
【０００７】
生体内変化は有益であり得るが、望ましくない結果を有する場合もある。毒性は、化合物と有機体との間の複合体相互作用に由来する。生体内変化のプロセス中に、結果として生じる代謝産物は、親化合物よりも有毒となり得る。毒性スクリーニングのために多くの人々に使用されている単一細胞アッセイには、これらの複合細胞間および組織間効果がない。
【０００８】
その結果、潜在的医薬に対するヒトの反応性の正確な予測は困難であり、多くの場合信頼性に欠け、且つ常に高価である。ヒトの反応を予測する従来の方法では、代用物―通常は、静的均質ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験―を利用する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイは、薬物候補がヒト体内に晒されているためにヒトのリスクを正確に予測することができない複雑な環境を正確に模倣しないことから、価値が限られている。同様に、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物試験は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞ベースのアッセイからは観察されないこれらの複合細胞間および組織間効果を明らかにすることができるが、ｉｎ  ｖｉｖｏ動物実験は極めて高価で、大きな労働力を要し、時間がかかり、また、多くの場合、結果は、ヒトのリスクと相関する場合、妥当性が疑わしいものである。
【０００９】
Ｓｈｕｌｅｒらにより発表された特許文献１は、マルチコンパートメント細胞培養システムについて記載している。この培養システムは、培養チャンバ、センサ、およびポンプ等の大きな構成要素を使用し、当該構成要素には、大量の培地、細胞、および試験化合物の使用が必要である。このシステムは、動作するのに極めて高額な費用がかかり、動作するための多大な空間を必要とする。このシステムはそのような大規模なものであるため、生理的パラメータはｉｎ  ｖｉｖｏ状況で見られるものとは大幅に異なる。そのような大規模で生理的に現実的な状態を正確に生成することは不可能である。
【００１０】
ｉｎ  ｖｉｖｏでの毒性および臨床薬物性能の、より優れた、速い、効率的な予測を提供することができるマイクロスケールスクリーニングアッセイおよびデバイスの開発は、多くの分野で大きな関心を寄せられており、本発明で取り組んでいるものである。そのようなマイクロスケールデバイスは、生理的に現実的なパラメータを正確に産生し、試験されている望ましいｉｎ  ｖｉｖｏシステムをより厳密に真似るであろう。  
【特許文献１】米国特許第５，６１２，１８８号明細書
【非特許文献１】ＰｏｕｌｉｎおよびＴｈｅｉｌ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．（２０００年）８９（１）：１６〜３５
【非特許文献２】Ｓｌｏｂら  Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．（１９９７年）２７（３）：２６１〜７２
【非特許文献３】Ｈａｄｄａｄら  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ．（１９９６年）８５（２）：１１３〜２６
【非特許文献４】Ｈｏａｎｇ  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ．（１９９５年）７９（ｌ−３）：９９〜１０６
【非特許文献５】Ｋｎａａｋら  Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ．（１９９５年）７９（ｌ〜３）：８７〜９８
【非特許文献６】ＢａｌｌおよびＳｃｈｗａｒｔｚ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．（１９９４年）２４（４）：２６９〜７６
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の開示
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養におけるデバイスと、マイクロスケール細胞培養アナログ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｎａｌｏｇ；ＣＣＡ）デバイスのための方法が提供される。本発明のデバイスは、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られるものと同様の薬物動態パラメータ値を持つ条件下において、細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持されることを可能にする。所望の薬物動態パラメータは、細胞間相互作用、液体滞留時間、液体対細胞比、臓器の相対的サイズ、細胞による代謝、せん断応力等を含む。細胞の自然状態を模倣する薬物動態ベースの培養システムを提供することにより、スクリーニングおよび毒性アッセイの予測値およびｉｎ  ｖｉｖｏ妥当性が強化される。
【００１２】
マイクロスケール培養デバイスは、別個ではあるが相互接続したチャンバ内に隔離されたチャネルの流体ネットワークを備える。特定のチャンバ表面形状は、対応する細胞、組織、または臓器にｉｎ  ｖｉｖｏで見られるものと相互作用する細胞相互作用、液体流量、および液体滞留パラメータを提供するように設計される。流体工学は、循環系またはリンパ系の本源的要素を正確に表すように設計される。一実施形態において、これらの構成要素は、チップフォーマットに組み込まれる。これらの表面形状の設計およびバリデーションは、生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；ＰＢＰＫ）モデル；異なる組織を表す相互接続したコンパートメントとして生体を表す数学モデルに基づいている。
【００１３】
デバイスは、各培養チャンバについて適切な細胞を撒かれ得る。例えば、肝臓の薬物動態パラメータを提供するように設計されるチャンバは、肝細胞が撒かれており、脂肪細胞の薬物動態を提供するように設計されるチャンバ内に撒かれた含脂肪細胞と流体連通していてよい。結果として、薬物動態ベースの細胞培養システムは、例えば、モデルになっている動物の、組織サイズ比、組織対血液容積比、薬物滞留時間を正確に表す。
【００１４】
一実施形態において、システムは、第１のマイクロスケール培養デバイスと、制御機器とを含む。第１のマイクロスケール培養デバイスは、培地との複数のｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用をシミュレートする表面形状を持つ複数のマイクロスケールチャンバを有し、各チャンバは、培地の流れのための入り口および出口、ならびに、チャンバ間を相互接続するマイクロ流体チャネルを含む。制御機器は、第１のマイクロスケール培養デバイスに連結され、当該第１のマイクロスケール培養デバイスからデータを取得し、その薬物動態パラメータを制御するためのコンピュータを含む。
【００１５】
別の実施形態において、コンピュータは、マイクロプロセッサと、汎用メモリと、不揮発性記憶素子と、１つ以上のセンサを有するマイクロスケール培養デバイスとのインタフェースを含む入出力インタフェースと、コンピュータソフトウェアとを含む。当該コンピュータソフトウェアは、マイクロスケール培養デバイスの複数のチャンバ内での生理的事象を計測するためにセンサからのデータを分析し、マイクロスケール培養デバイスのチャンバ内にある培地の流体流速を調節し、マイクロスケール培養デバイスのチャンバ内での生物反応または毒性反応を検出し、検出時に、マイクロスケール培養デバイスの１つ以上の薬物動態パラメータを変化させるために、マイクロプロセッサにおいて実行可能である。
【００１６】
本明細書において使用する場合、文脈上別段の明らかな規定がある場合を除き、単数形は複数の指示対象を含む。例えば、「化合物」は、１つ以上のそのような化合物をいい、一方、「細胞」は、当業者には既知であるように、特定の細胞の他にその他のファミリーメンバーおよびその均等物を含む。
【００１７】
本開示の一実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる少なくとも１つの薬物動態パラメータの値と同程度の、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物動態パラメータの値を提供する条件下に、生物材料を維持するように寸法決定された、少なくとも１つの機構を含む、装置に関する。該装置は、透過性材料をさらに含む。
【００１８】
一実施形態において、該機構は、マイクロスケール機構である。一実施形態において、該透過性材料は、膜、多孔質膜、微孔性シリコン、半透膜、微孔性材料、微孔性ポリマー、アルギン酸塩、コラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（マトリゲル）、細胞、細胞材料、組織、および組織片から成る群の少なくとも１つから選択される。
【００１９】
一実施形態において、該透過性材料は、微孔性表面の中、上、または付近に、有機または無機材料をさらに含む。
【００２０】
一実施形態において、該透過性材料は、生物学的障壁、生物学的障壁の中の、もしくはそれを通る物質の通過、または、生物学的障壁の中の、それを通した、もしくはそれによる物質の吸収、のうち少なくとも１つをシミュレートするように構成される。一実施形態において、該生物学的障壁は、胃腸障壁、血液脳関門、肺障壁、胎盤関門、表皮障壁、眼関門、嗅覚器障壁、胃食道障壁、粘膜、血液尿関門、空気組織関門、血液胆汁関門、口腔障壁、肛門直腸関門、膣障壁、および尿道障壁から成る群の少なくとも１つから選択される。
【００２１】
一実施形態において、該少なくとも１つの薬物動態パラメータは、組織サイズ、組織サイズ比、組織対血液容積比、薬物滞留時間、細胞間相互作用、液体滞留時間、液体対細胞比、細胞による代謝、せん断応力、流速、表面形状、循環通過時間、液分布、組織および／または臓器間の相互作用、ならびに細胞による分子輸送から成る群の少なくとも１つから選択される。
【００２２】
一実施形態において、該デバイスは、該透過性材料中の、それを通る、またはそれによる、物質の吸収、代謝、または分布を測定する。一実施形態において、該機構は、中枢神経系、循環器系、消化器系、胆管系、肺系統、泌尿器系、視覚系、嗅覚系、表皮系、およびリンパ系の少なくとも一部から成る群の少なくとも１つを表すように構成される。一実施形態において、該透過性材料は、該デバイスの中または外に位置する。
【００２３】
一実施形態において、該装置は、該透過性材料に接続された少なくとも１つのマイクロ流体チャネルをさらに含む。
【００２４】
一実施形態において、該透過性材料の中の、それを通る、またはそれに近接する流体の流れは、少なくとも１つの薬物動態パラメータを提供する。一実施形態において、該デバイスを通る該流体流れの性質は、数学モデルに基づく。一実施形態において、該数学モデルは生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；「ＰＢＰＫ」）モデルである。
【００２５】
一実施形態において、該機構または該透過性材料は、チップフォーマットに組み込まれる。
【００２６】
一実施形態において、該透過性材料は、微孔性材料上で培養された胃腸細胞の層を含む。一実施形態において、該胃腸細胞の該層の少なくとも一部は、流体が該層を通らずにそのいずれかの側面に沿って流れることができるよう、該デバイス内に位置付けられる。一実施形態において、胃腸細胞の該層の第１の側面に位置する少なくとも第１のマイクロスケール機構は胃腸管を表し、単分子層の第２の側面に位置する少なくとも第２のマイクロスケール機構は循環器系を表す。一実施形態において、該装置は、同じまたは異なる種類の生物材料を含有するように構成される第３のマイクロスケール機構をさらに含む。
【００２７】
一実施形態において、該透過性材料は、有機材料で少なくとも一部を被覆された微孔性材料を含む。
【００２８】
一実施形態において、該装置は、該透過性材料の両側面の中、上、または付近に位置する細胞をさらに含む。一実施形態において、該デバイスは、吸収特性、代謝酵素活性、および／または発現量を提供する。一実施形態において、該透過性材料のいずれかの側面上の該細胞は、同じ種類または異なる種類のものである。
【００２９】
一実施形態において、該装置は、該透過性材料の微孔性表面の中、上、または付近に、肝細胞をさらに含む。一実施形態において、該微孔性表面の少なくとも一部は、該肝細胞を極性化させるタンパク質を含む。
【００３０】
一実施形態において、該透過性材料は、融合性単層を形成することができる細胞株を含む。
【００３１】
一実施形態において、該装置は、肝細胞を該透過性材料に結合する結合剤をさらに含む。一実施形態において、該結合剤は該肝細胞を極性化させる。一実施形態において、該結合剤は、タンパク質、コネキシン３２、密着結合タンパク質、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（オクルディン）、Ｃｌａｕｄｉｎ（クローディン）‐１、ＺＯ‐１、ＺＯ‐２、接着結合タンパク質、Ｅ‐カドヘリン、βカテニン、細胞接着分子、およびウボモルリンから成る群より選択される少なくとも１つを含む。
【００３２】
一実施形態において、該装置は、該透過性材料の中、上、または付近に、第２の種類の生物材料をさらに含む。
【００３３】
一実施形態において、該装置は、該透過性材料の中、上、または付近に、線維芽細胞をさらに含む。
【００３４】
一実施形態において、該装置は、該透過性材料の第１の側面に近接して、血液代用物の流れをさらに含む。一実施形態において、該装置は、該透過性材料の第２の側面に近接して、胆汁代用物の流れをさらに含む。
【００３５】
本開示の一実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる少なくとも１つの薬物動態パラメータの値と同程度の、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物動態パラメータの値を提供する条件下に、生物材料を維持するステップを含む方法に関する。該方法は、物質に透過性材料の少なくとも一部を通過させるステップをさらに含む。
【００３６】
一実施形態において、該方法は、該生物材料を、マイクロスケール機構内またはそれに近接して維持するステップをさらに含む。
【００３７】
一実施形態において、該透過性材料は、膜、多孔質膜、微孔性シリコン、半透膜、微孔性材料、微孔性ポリマー、アルギン酸塩、コラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（マトリゲル）、細胞、細胞材料、組織、および組織片から成る群の少なくとも１つから選択される。
【００３８】
一実施形態において、該透過性材料は、微孔性表面の中、上、または付近に、有機または無機材料をさらに含む。
【００３９】
一実施形態において、該透過性材料は、生物学的障壁、生物学的障壁の中の、もしくはそれを通る物質の通過、または、生物学的障壁の中の、それを通した、もしくはそれによる物質の吸収、のうち少なくとも１つをシミュレートするように構成される。一実施形態において、該生物学的障壁は、胃腸障壁、血液脳関門、血液胆汁関門、肺障壁、胎盤関門、表皮障壁、眼関門、嗅覚器障壁、胃食道障壁、粘膜、血液尿関門、空気組織関門、口腔障壁、肛門直腸関門、膣障壁、および尿道障壁から成る群の少なくとも１つから選択される。
【００４０】
一実施形態において、該少なくとも１つの薬物動態パラメータは、組織サイズ、組織サイズ比、組織対血液容積比、薬物滞留時間、細胞間相互作用、液体滞留時間、液体対細胞比、細胞による代謝、せん断応力、流速、表面形状、循環通過時間、液分布、組織および／または臓器間の相互作用、ならびに細胞による分子輸送から成る群の少なくとも１つから選択される。
【００４１】
一実施形態において、該方法は、該透過性材料中の、それを通る、またはそれによる、物質の吸収、代謝、または分布を測定するステップをさらに含む。一実施形態において、該機構は、中枢神経系、循環器系、消化器系、胆管系、肺系統、泌尿器系、視覚系、嗅覚系、表皮系、およびリンパ系の少なくとも一部から成る群の少なくとも１つを表すように構成される。
【００４２】
一実施形態において、該方法は、マイクロスケールデバイスの中または外に、該透過性材料を位置させるステップをさらに含む。
【００４３】
一実施形態において、該方法は、該透過性材料に接続された少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを介して流体を流すステップをさらに含む。
【００４４】
一実施形態において、該透過性材料の中の、それを通る、またはそれに近接する流体の流れは、少なくとも１つの薬物動態パラメータを提供する。一実施形態において、該デバイスを通る該流体流れの性質は、数学モデルに基づく。一実施形態において、該数学モデルは生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；「ＰＢＰＫ」）モデルである。
【００４５】
一実施形態において、該方法は、該マイクロスケール機構または該透過性材料をチップフォーマットに組み込むステップをさらに含む。
【００４６】
一実施形態において、該透過性材料は、微孔性材料上で培養された胃腸細胞の層を含む。一実施形態において、該方法は、流体が該層を通らずにそのいずれかの側面に沿って流れることができるよう、該胃腸細胞の該層の少なくとも一部を位置付けるステップをさらに含む。一実施形態において、胃腸細胞の該層の第１の側面に位置する少なくとも第１のマイクロスケール機構は胃腸管を表し、単分子層の第２の側面に位置する少なくとも第２のマイクロスケール機構は循環器系を表す。一実施形態において、第３のマイクロスケール機構は、同じまたは異なる種類の生物材料を含有するように構成される。
【００４７】
一実施形態において、該透過性材料は、有機材料で少なくとも一部を被覆された微孔性材料を含む。
【００４８】
一実施形態において、該方法は、該透過性材料の両側面の中、上、または付近に、細胞を位置させるステップをさらに含む。一実施形態において、該方法は、吸収特性、代謝酵素活性、および／または発現量を提供するステップをさらに含む。一実施形態において、該透過性材料のいずれかの側面上の該細胞は、同じ種類または異なる種類のものである。
【００４９】
一実施形態において、該方法は、該透過性材料の微孔性表面の中、上、または付近に、肝細胞を位置させるステップをさらに含む。一実施形態において、該微孔性表面の少なくとも一部は、該肝細胞を極性化させるタンパク質を含む。
【００５０】
一実施形態において、該透過性材料は、融合性単層を形成し、極性化することができる細胞株を含む。
【００５１】
一実施形態において、該方法は、肝細胞を該透過性材料に結合するステップをさらに含む。一実施形態において、該方法は、該肝細胞を極性化させるステップをさらに含む。一実施形態において、該結合するステップは、タンパク質、コネキシン３２、密着結合タンパク質、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（オクルディン）、Ｃｌａｕｄｉｎ（クローディン）‐１、ＺＯ‐１、ＺＯ‐２、接着結合タンパク質、Ｅ‐カドヘリン、βカテニン、細胞接着分子、およびウボモルリンから成る群より選択される少なくとも１つである結合剤を含む。
【００５２】
一実施形態において、該方法は、該透過性材料の中、上、または付近に、第２の種類の生物材料を位置させるステップをさらに含む。
【００５３】
一実施形態において、該方法は、該透過性材料の中、上、または付近に、線維芽細胞を位置させるステップをさらに含む。
【００５４】
一実施形態において、該方法は、該透過性材料の第１の側面に近接して、血液代用物を流すステップをさらに含む。一実施形態において、該方法は、該透過性材料の第２の側面に近接して、胆汁代用物を流すステップをさらに含む。
【００５５】
本開示の一実施形態は、デバイスを形成する方法に関する。該方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる少なくとも１つの薬物動態パラメータの値と同程度の、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物動態パラメータの値を提供する条件下に、生物材料を維持するように構成される機構を形成するステップを含む。該方法は、透過性材料を追加、形成、または提供するステップをさらに含む。該透過性材料は、物質が該透過性材料の少なくとも一部を通過するように構成される。
【００５６】
本開示の一実施形態は、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる少なくとも１つの薬物動態パラメータの値と同程度の、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物動態パラメータの値を提供する条件下に、生物材料を維持するための手段と、透過性障壁を提供するための手段と、を有するデバイスに関する。
【００５７】
本開示の一実施形態は、マイクロスケール透過性材料と、物質を極性化させるように構成され、当該物質は肝機能の少なくとも１つの性質を明示する、少なくとも１つの結合剤と、を含むデバイスに関する。
【００５８】
一実施形態において、該物質は、１つ以上の肝細胞である。一実施形態において、該物質は、遺伝子組み換え生物材料である。一実施形態において、該結合剤は、肝細胞を該マイクロスケール透過性材料に結合し極性化させる。
【００５９】
一実施形態において、該デバイスは、第２の物質種類をさらに含む。一実施形態において、該デバイスは、該マイクロスケール透過性材料の少なくとも１つの表面の付近に位置する１つ以上の線維芽細胞をさらに含む。
【００６０】
一実施形態において、該マイクロスケール透過性材料は、有機材料、無機材料、膜、多孔質膜、微孔性シリコン、半透膜、微孔性材料、微孔性ポリマー、アルギン酸塩、コラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（マトリゲル）、細胞、細胞材料、組織、および組織片から成る群の少なくとも１つから選択される。一実施形態において、該マイクロスケール透過性材料は、微孔性表面の中、上、または付近にある。一実施形態において、該マイクロスケール透過性材料は、生物学的障壁、生物学的障壁の中の、もしくはそれを通る物質の通過、または、生物学的障壁の中の、それを通した、もしくはそれによる物質の吸収、のうち少なくとも１つをシミュレートするように構成される。
【００６１】
一実施形態において、該デバイスは、該マイクロスケール透過性材料の中で、それによって、またはそれを通して、該物質を処理する。一実施形態において、該処理するステップは、分子の吸収、抽出、排泄、代謝、および分布から成る群の少なくとも１つをさらに含む。
【００６２】
一実施形態において、該マイクロスケール透過性材料は、該デバイスの中または外に位置する。
【００６３】
一実施形態において、該デバイスは、該マイクロスケール透過性材料に接続された少なくとも１つのマイクロ流体チャネルをさらに含む。
【００６４】
一実施形態において、該デバイスを通る該流体流れの性質は、数学モデルに基づく。一実施形態において、該数学モデルは生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；「ＰＢＰＫ」）モデルである。
【００６５】
一実施形態において、該機構または該マイクロスケール透過性材料は、チップフォーマットに組み込まれる。一実施形態において、該デバイスは、吸収特性、代謝酵素活性、および／または発現量を提供する。
【００６６】
一実施形態において、該デバイスは、該マイクロスケール透過性材料の両側面の中、上、または付近に位置する生物材料をさらに含む。一実施形態において、該マイクロスケール透過性材料のいずれかの側面上の該生物材料は、同じ種類または異なる種類のものである。
【００６７】
一実施形態において、該マイクロスケール透過性材料は、融合性単層を形成することができる細胞株を含む。一実施形態において、該結合剤は、タンパク質、コネキシン３２、密着結合タンパク質、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（オクルディン）、Ｃｌａｕｄｉｎ（クローディン）‐１、ＺＯ‐１、ＺＯ‐２、接着結合タンパク質、Ｅ‐カドヘリン、βカテニン、細胞接着分子、およびウボモルリンから成る群より選択される少なくとも１つを含む。
【００６８】
一実施形態において、該デバイスは、該マイクロスケール透過性材料の第１の側面に近接して、血液代用物の流れをさらに含む。一実施形態において、該デバイスは、該マイクロスケール透過性材料の第２の側面に近接して、胆汁代用物の流れをさらに含む。
【００６９】
本開示の一実施形態は、肝機能の少なくとも１つの性質を明示する物質を、該物質を極性化させる様式で、マイクロスケール透過性材料に結合するステップを含む方法に関する。
【００７０】
一実施形態において、該物質は、１つ以上の肝細胞である。一実施形態において、該物質は、遺伝子組み換え生物材料である。
【００７１】
一実施形態において、該方法は、第２の物質種類を提供するステップをさらに含む。一実施形態において、該方法は、該マイクロスケール透過性材料の少なくとも１つの表面の付近に、１つ以上の線維芽細胞を位置させるステップをさらに含む。
【００７２】
一実施形態において、該マイクロスケール透過性材料は、有機材料、無機材料、膜、多孔質膜、微孔性シリコン、半透膜、微孔性材料、微孔性ポリマー、アルギン酸塩、コラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（マトリゲル）、細胞、細胞材料、組織、および組織片から成る群の少なくとも１つから選択される。
【００７３】
一実施形態において、該方法は、微孔性表面の中、上、または付近に、該マイクロスケール透過性材料を位置させるステップをさらに含む。
【００７４】
一実施形態において、該マイクロスケール透過性材料は、生物学的障壁、生物学的障壁の中の、もしくはそれを通る物質の通過、または、生物学的障壁の中の、それを通した、もしくはそれによる物質の吸収、のうち少なくとも１つをシミュレートする。
【００７５】
一実施形態において、該方法は、該マイクロスケール透過性材料の中で、それを通して、またはそれによって、該物質を処理するステップをさらに含む。一実施形態において、該処理するステップは、分子の吸収、抽出、排泄、代謝、および分布から成る群の少なくとも１つをさらに含む。
【００７６】
一実施形態において、該方法は、デバイスの中または外に、該マイクロスケール透過性材料を位置させるステップをさらに含む。
【００７７】
一実施形態において、方法は、該マイクロスケール透過性材料に接続された少なくとも１つのマイクロ流体チャネルを提供するステップをさらに含む。
【００７８】
一実施形態において、肝機能の該少なくとも１つの性質と関連付けられた該流体流れの性質は、数学モデルに基づく。一実施形態において、該数学モデルは生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；「ＰＢＰＫ」）モデルである。
【００７９】
一実施形態において、該方法は、該マイクロスケール透過性材料をチップフォーマットに組み込むステップをさらに含む。
【００８０】
一実施形態において、該方法は、吸収特性、代謝酵素活性、および／または発現量を提供するステップをさらに含む。
【００８１】
一実施形態において、該方法は、該マイクロスケール透過性材料の両側面の中、上、または付近に、生物材料を位置させるステップをさらに含む。一実施形態において、該マイクロスケール透過性材料のいずれかの側面上にある生物材料は、同じ種類または異なる種類のものである。
【００８２】
一実施形態において、該マイクロスケール透過性材料は、融合性単層を形成することができる細胞株を含む。一実施形態において、該結合するステップは、タンパク質、コネキシン３２、密着結合タンパク質、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（オクルディン）、Ｃｌａｕｄｉｎ（クローディン）‐１、ＺＯ‐１、ＺＯ‐２、接着結合タンパク質、Ｅ‐カドヘリン、βカテニン、細胞接着分子、およびウボモルリンから成る群の少なくとも１つから選択される結合剤を提供するステップを含む。
【００８３】
一実施形態において、該方法は、該マイクロスケール透過性材料の第１の側面に近接して、血液代用物の流れを提供するステップをさらに含む。一実施形態において、該方法は、該マイクロスケール透過性材料の第２の側面に近接して、胆汁代用物の流れを提供するステップをさらに含む。
【００８４】
本開示の一実施形態は、デバイスを形成する方法に関する。該方法は、肝機能の少なくとも１つの性質を明示する物質に結合し極性化させるように構成される、マイクロスケール透過性材料を形成するステップを含む。
【００８５】
本開示の一実施形態は、肝機能の少なくとも１つの性質を明示する物質を、該物質を極性化させる様式で、マイクロスケール透過性材料に結合するための手段を有する、マイクロスケール装置に関する。
【００８６】
本開示の一実施形態は、マイクロスケール透過性材料と、肝機能の少なくとも１つの性質を明示するように構成される少なくとも１つの物質とを含み、該物質によって処理された分子は、該マイクロスケール透過性材料の少なくとも一部を通過するように方向付けられる、デバイスに関する。
【００８７】
本開示の一実施形態は、物質によって処理された分子を、マイクロスケール透過性材料の少なくとも一部を通るように方向付けるステップを含み、該物質は肝機能の少なくとも１つの性質を明示するように構成される、方法に関する。
【００８８】
本開示の一実施形態は、デバイスを形成する方法に関する。該方法は、物質によって処理された分子を、マイクロスケール透過性材料の少なくとも一部を通るように方向付けるように構成される該マイクロスケール透過性材料を形成するステップを含み、該物質は肝機能の少なくとも１つの性質を明示するように構成される。
【００８９】
本開示の一実施形態は、物質によって処理された分子を、マイクロスケール透過性材料の少なくとも一部を通るように方向付ける手段を有し、該物質は肝機能の少なくとも１つの性質を明示するように構成される、デバイスに関する。
【００９０】
本発明のこれらおよびその他の態様、利点、および新規の特徴は、以下の詳細な説明を読み、添付の図面を参照することで明らかになるであろう。図面中において、同様の要素は同様の参照番号を有し得る。
【発明を実施するための最良の形態】
【００９１】
実施形態の詳細な説明
本発明者らは、マイクロスケール細胞培養アナログ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｎａｌｏｇ；ＣＣＡ）システムを開発した。そのようなマイクロスケールＣＣＡシステムは、以前のマイクロスケールシステムに優る多くの利点を有する。当該マイクロスケールシステムは、より少量の試薬、より少ない細胞を使用し（これにより、培養細胞ではなく真の初代細胞を使用することが可能になる）、より生理的に現実的（例えば、滞留時間、臓器比、せん断応力）であり、よりデバイスコストが低く、サイズが小さい（複数の試験および統計分析で利用可能）。さらに、同じチップに複数のバイオセンサを組み込むことができる。
【００９２】
最も簡単に表現すると、本発明のチップは、丸ごとの動物またはヒトの正確なｉｎ  ｖｉｔｒｏ代用物を提供する。これを実現するために、初期設計は、生理学的薬物動力学モデル（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ−Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；ＰＢＰＫ）モデル―特定の臓器に特有の、相互接続したコンパートメントとして生体を表す数学モデル―を使用して産生されたものである。ＰＢＰＫモデルおよび公開されている経験的データから、長期にわたる広範な開発プログラムによって、既知の組織サイズ比、組織対血液容積比、薬物滞留時間、および、丸ごとの動物またはヒトのその他重要な生理的パラメータを正確に模倣するマイクロスケールデバイスをもたらした。要するに、本発明のチップ技術は、丸ごとの動物またはヒトのマイクロスケールモデルである（ヒトの場合、〜１／１００，０００）。
【００９３】
動作中、デバイスは、生細胞を別個の相互接続した「臓器」コンパートメント内に隔離することにより、再循環多臓器システムを複製する（例えば、図１５を参照）。流体工学は、循環系の本源的要素および臓器系間の相互作用が正確に模倣されるように設計される。各臓器コンパートメントは、対応する臓器全体の本源的機能（例えば、肝臓による異物代謝）を模倣するために慎重に選択または改変された特定の細胞型を含有する。細胞型は接着性であっても非接着性であってもよく、標準的な細胞培養株または一次組織から派生したものであってよい。ヒト細胞は、必要に応じて、ヒト代用物またはその他の種の細胞のために使用される。
【００９４】
臓器コンパートメントは、「血液代用物」として作用する再循環培地によって接続される。媒質中の試験剤は、分布され、人体または丸ごとの動物内にある場合と同様に、臓器コンパートメント内の細胞と相互作用する。これらの化合物および／またはそれらの代謝産物の様々な細胞型に対する影響は、細胞死、細胞増殖、分化、免疫反応、代謝または信号変換経路内での摂動等の主要な生理的事象を計測または監視することによって検出される。また、薬物動態データは、薬物代謝産物のための培地の一定分量を収集および分析することによって測定され得る。
【００９５】
本発明のマイクロスケールチップデバイスは、従来の細胞培養アッセイのコストおよびスループットの利点の両方、ならびに、丸ごとの動物モデルの高度な情報内容も提示する。しかしながら、丸ごとの動物試験とは異なり、チップは安価で大部分が使い捨てである。低液量（〜５μｌ）のデバイスが、マイクロ流体デバイスの高い感度およびスループット特性を提供する。さらに、デバイスの読み出しは柔軟性が高く、アッセイ非依存型である―ほぼすべての細胞型およびアッセイが、修正なく使用され得る。光学的インタロゲーションおよび読み出し（例えば、蛍光、発光）に基づく複数の生物学的アッセイが利用可能であるため、リアルタイム監視が実現可能となる。あるいは、標準的な病理、生化学、ゲノム、またはプロテオミクスアッセイを、従来のカバースリップ（２２ｍｍ×２２ｍｍ）または９６ウェルフォーマットに完全に適合するように設計され得るシステムとして直接的に利用することができる。さらに、遺伝子組み換え細胞を、特殊なエンドユーザ向けアプリケーションに使用することができる。また、「３Ｄ」チップを使用して、胃腸管または血液脳関門の吸収を分析するために、付加的なコンパートメントおよびモジュールを包含することができる。
【００９６】
従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイとは異なり、本発明のチップは、有機体全体の複雑な多組織（肝臓、肺、脂肪、循環器系等）生態学をより厳密に模倣する。薬物候補は、より現実的な動物またはヒトの生理環境に曝露されるため、一般的なｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイよりも高く正確な情報内容（例えば、吸収、分布、生物蓄積、代謝、排泄、効能、および毒性）を提供する。これらの利益は、薬物リード化合物の安全性および効能予測、特に、高価で時間がかかる非臨床または臨床試験に入る前の、それらの優先順位付けに直接的に影響を及ぼす。この優先順位付けは、薬物開発スループットを増加させ、毒物学的スクリーニングに必要な動物の数を削減し、非臨床研究のコストを減少させ、これらの試験に入る前に潜在的毒性または効能の欠如の迅速且つ直接的な評価を可能にすることにより、臨床試験の効率を増加させる。
【００９７】
これらは、本発明のチップ技術が持つ利点のうちいくつかを実証するものである。要約すると、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイ、動物実験、または臨床試験と比較した場合に、データの取得が迅速である。当該データはロバストでもあり、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイからは利用不可能な、高度に予測的な内容を提供する。チッププラットフォームは、既存のアッセイ―標準的なカバースリップまたは９６ウェルフォーマット中で行うもの―と完全に適合するように設計される。デバイス自体は、任意の動物種または複数の臓器コンパートメントの組み合わせ用に構成可能である。個々のチップは、消耗品としてコスト効率よく価格設定されている。その上、低容量のデバイスは、潜在的化合物をスクリーニングする上での試薬コストをさらに削減する。
【００９８】
現在利用可能な技術とは異なり、本チップシステムは、臨床相だけでなく、前臨床検査を受けるために必要な化合物の数を削減する上での成功率も大幅に増加させる。その結果、製薬会社は、（１）どの薬物候補がヒトに対して有毒である可能性を有するかを開発プロセスの初期に判断し；（２）ヒトの反応を最も良く予測する動物種のより良い選択をし；（３）どの薬物候補が有効である可能性を有するかを判断することができる。このように、本発明のチップは、成功率を大幅に増加させ、市場性のある薬物の開発時間を減少させる。
【００９９】
薬物動態ベースのマイクロスケール培養デバイス
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養におけるデバイスと、ＣＣＡデバイスのための方法が提供される。主題の方法およびデバイスは、生理的に代表的な環境において細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏに維持される手段を提供し、それによって、スクリーニングおよび毒性アッセイの予測値およびｉｎ  ｖｉｖｏ妥当性を改善させる。本発明のマイクロスケール薬物動態培養デバイスは、各培養チャンバに適切な細胞を撒かれ、その後当該培養システムを、化合物スクリーニング、毒性アッセイ、所望の細胞の開発のためのモデル、感染反応速度のモデル等に使用することができる。確立された培養システムに入力変数が追加され、当該変数は、例えば、化合物、試料、遺伝子配列、病原体、細胞（幹細胞または前駆細胞等）であってよい。媒質のｐＨ、媒質中のＯ２およびＣＯ２の濃度、タンパク質およびその他の細胞マーカーの発現、細胞の生存、または、細胞産物の培地への放出を含む、入力変数に対する細胞の反応を測定するために、様々な細胞出力を評価することができる。
【０１００】
本発明の独自の成長条件のための、培養基質またはデバイスの設計および表面形状が提供される。各デバイスは、１つ以上のチャンバを備え、当該チャンバは流体チャネルによって相互接続されている。各チャンバは、デバイス上に存在するその他のチャンバと異なる表面形状構成を有し得る。例えば、当該デバイスの一実施形態は、肺、肝臓、およびその他の組織を表すチャンバから成る（図１８Ａ）。この実施形態の肺チャンバは、現実的な細胞対液体容積比および液体滞留時間を達成するために、５μｍの高い隆線を含有する（図１８Ｂ）。この実施形態の肝臓チャンバは、現実的な細胞対液体容積比および液体滞留時間を達成するために、２０μｍの高い柱を含有する（図１８Ｃ）。当該デバイスは、培地が循環できるような、入り口および出口ポートも備える。
【０１０１】
一実施形態において、培養デバイスは、チップフォーマットである、すなわち、作製されたマスターからチャンバおよび流体チャネルが作製または成形され、その結果、当該デバイスは、単一ユニットとして、または、分離ユニット上に１つ以上のチャンバを持つモジュラーシステムとして形成される。概して、チップフォーマットは小スケールで提供され、通常は一片が約１０ｃｍを超えず、一片が約５ｃｍを超えない場合さえある。一片が約２ｃｍ以下しかなくてもよい。別の例において、チップは９６ウェルフォーマット内に格納されていてよく、その場合、個々のチップは０．９ｃｍ×０．９ｃｍ未満である。チャンバおよび流体チャネルは、それに対応してマイクロスケールのサイズである。
【０１０２】
別の実施形態において、培養デバイスは、使い捨てのプラスチックポリマーベースの構成要素として作製された複数のマイクロスケールチップを格納する卓上機器から成る集積デバイスの形態である。当該機器は、個々の細胞チップを収容するための凹部を持つ基部、あるいは、標準的な９６ウェルフォーマットの単一「チップ」（すなわち、９６の個々のチップが８×１２フォーマットである）から成っていてよい。機器上部は、閉じている場合、チップを密封し、流体相互接続を提供する。当該機器は、チップに流体を再循環させるための低容量ポンプ、および、試験化合物の導入を提供するための注入ループを持つ小型３ウェイバルブを含有する、または、９６または３８４ウェルプレートから直接的に化合物を引き出す。この機器を使用して、複数の化合物について効能、毒性、および／または代謝産物産生を評定することができる。当該機器は、よく特徴付けられたバイオマーカーを利用して、リアルタイム生理機能監視用のオンチップ蛍光検出を組み込むこともできる。
【０１０３】
当該デバイスは、細胞および培地から信号を得るためのメカニズムを含んでよい。異なるチャンバおよびチャネルからの信号をリアルタイムで監視することができる。例えば、バイオセンサは、デバイスに組み込まれてもデバイスの外にあってもよく、システム内にある細胞の生理学的状態のリアルタイム読み出しを可能にする。
【０１０４】
本発明は、例えば、医薬組成物、ワクチン製剤、細胞毒性化学物質、突然変異原、サイトカイン、ケモカイン、成長因子、ホルモン、阻害化合物、化学療法剤、および、その他の化合物または因子の宿主等、一連の物質に対する肯定的または否定的な反応を識別するために、ハイスループットスクリーニングのための理想的なシステムを提供する。試験される物質は、自然発生であっても合成であってもよく、有機であっても無機であってもよい。
【０１０５】
例えば、細胞毒性化合物の活性は、培養中の細胞を傷つける、または殺すその能力によって計測され得る。これは、生体染色技術によって容易に評価され得る。成長／制限因子の効果は、例えば総細胞数および差動細胞数で、マトリクスの細胞内含有量を分析することによって評価され得る。これは、種類特有の細胞性抗原を定義する抗体を用いる免疫細胞化学法の使用を含む、標準的な細胞学的および／または組織学的技術を使用して実現され得る。デバイス中で培養された正常細胞に対する様々な薬物の効果が評価され得る。例えば、赤血球形成を増加させる薬物を、骨髄培養で試験することができる。例えばコレステロール産生を低下させることによってコレステロール代謝に影響を及ぼす薬物を、肝臓系で試験することができる。腫瘍細胞の培養物は、例えば抗腫瘍剤の効能を試験するためのモデルシステムとして使用され得る。
【０１０６】
本発明のデバイスは、生理的または病的状態の研究用のモデルシステムとして使用され得る。例えば、本発明の特定の実施形態において、デバイスは血液脳関門用のモデルとして使用されてよく、そのようなモデルシステムは、血液脳関門を通る物質の浸透を研究するために使用され得る。さらなる実施形態において、また、限定としてではなく、粘膜上皮を含有するデバイスをヘルペスウイルスまたはパピローマウイルス感染を研究するためのモデルシステムとして使用してもよく、そのようなモデルシステムは、抗ウイルス薬の効能を試験するために使用され得る。
【０１０７】
本発明のデバイスは、悪性腫瘍および疾病の診断および治療を支援するためにも使用され得る。例えば、任意の組織（例えば、骨髄、皮膚、肝臓）の生検は、悪性腫瘍を有する疑いがある患者から採取され得る。当該患者の培養物をｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用して、最も有効なもの、すなわち、悪性細胞または罹患細胞を殺し、さらに正常細胞には危害を加えないものを識別するために、細胞毒性および／または医薬化合物をスクリーニングすることができる。続いて、これらの剤は、患者を治療するために使用され得る。
【０１０８】
本発明のさらに別の実施形態において、デバイスは、生物学的産物を高収量で産生するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用され得る。例えば、大量の特定の生物学的産物を自然産生する細胞（例えば、成長因子、制限因子、ペプチドホルモン、抗体）、または、外来遺伝子産物を産生するために遺伝子を組み換えられた宿主細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏデバイスを使用してクローン的に広げられ得る。形質転換細胞が遺伝子産物を培養液中に排泄すると、当該産物は、標準的な分離技術（例えば、少数だが例を挙げると、ＨＰＬＣ、カラムクロマトグラフィー、電気泳動技術）を使用して使用済みまたは調整済みの媒質から容易に単離され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養物を供給するための連続フロー法を活用する「バイオリアクター」が考案され得る。原則的に、新鮮培地がデバイスの培養物中を通過すると、遺伝子産物は、培養物から放出される細胞と共に、当該培養物から流し去られることになる。遺伝子産物は、（例えば、ＨＰＬＣカラムクロマトグラフィー、電気泳動法によって、）使用済みまたは調整済みの媒質の流出物から単離され得る。
【０１０９】
本発明は、生物系における様々な環境条件または化合物の効果をスクリーニングまたは計測するためのシステムも提供する。例えば、デバイス中において、空気または水の状態を模倣する、または可変させることが可能である。異なる既知のまたは毒性が疑われる物質の影響力を試験することが可能である。本発明は、化粧品、洗浄剤、または水薬等の消費者製品をスクリーニングするためのシステムをさらに提供する。栄養補給食品、栄養補助食品、または食品添加物の安全性および／または効能を測定するためのシステムも提供する。本発明は、多量の細胞産物を産生するための、小型バイオリアクターまたは細胞産生プラットフォームとしても使用され得る。
【０１１０】
本発明のチップフォーマットマイクロスケール培養デバイスを使用する一般的な効能実験または毒性実験は、実験的設計に応じて２４時間から４８時間以内で完了する。しかしながら、慢性曝露の効果（例えば、遺伝毒性、発癌性、または潜在的疾病）を試験するために、延長実験を実行してもよい。
【０１１１】
本発明は、本明細書で説明しているような新規のデバイス、システム、および方法を提供する。別途明らかに指示しない限り、概して、本書で使用している全ての技術的用語および科学的用語は、本発明が属する業界の当業者に一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。明瞭化のため、本発明を説明するために本書において使用されているいくつかの語の定義を、以下に記載する。別途明らかに指示しない限り、これらの定義は、本明細書全体を通して使用されているとおりの用語に当てはまる。
【０１１２】
用語の定義
薬物動態ベースの培養システム：ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養システムであって、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られるものを真似た薬物動態パラメータ値を提供する条件下に細胞が維持される。薬物動態培養デバイスは、別個ではあるが相互接続したチャンバ内に隔離されたチャネルの流体ネットワークを備え、特定のチャンバ表面形状は、対応する細胞、組織、または臓器系にｉｎ  ｖｉｖｏで見られるものと相互作用する細胞相互作用、液体流量、および液体滞留パラメータを提供するように設計される。当該デバイスには、培養システムを提供するために、例えば肝臓ベースの培養チャンバ中の肝臓細胞、肺ベースの培養チャンバ中の肺細胞等、モデルとされている条件に適切な細胞が撒かれている。
【０１１３】
本発明の培養システムは、所望の細胞、組織、または臓器系についてｉｎ  ｖｉｖｏで得られる値と同程度の、少なくとも１つの薬物動態パラメータ値、好ましくは少なくとも２つのパラメータ値を提供し、３つ以上の同程度のパラメータ値を提供することができる。所望の薬物動態パラメータは、例えば、細胞間相互作用、液体滞留時間、液体対細胞比、細胞による代謝、またはせん断応力を含む。
【０１１４】
同程度の値とは、実際の値が理論上の値から２５％を超えて逸脱しないことを意味する。例えば、ラットの肺コンパートメント中での液体滞留時間について計算上または理論上の値は２秒であり、ラットＣＣＡデバイスの肺細胞培養チャンバにおいて計測された実際の値は２．５±０．７秒であった。
【０１１５】
薬物動態パラメータ値は、ＰＢＰＫモデルの方程式を使用することによって得られる。そのような方程式は当該技術分野において説明されてきており、例えば、参照することにより組み込まれる、ＰｏｕｌｉｎおよびＴｈｅｉｌ（２０００年）Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ．８９（ｌ）：１６〜３５；Ｓｌｏｂら（１９９７年）Ｃｒｉｔ  Ｒｅｖ  Ｔｏｘｉｃｏｌ．２７（３）：２６１〜７２；Ｈａｄｄａｄら（１９９６年）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ．８５（２）：１１３〜２６；Ｈｏａｎｇ（１９９５年）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ．７９（ｌ〜３）：９９〜１０６；Ｋｎａａｋら（１９９５年）Ｔｏｘｉｃｏｌ  Ｌｅｔｔ．７９（ｌ〜３）：８７〜９８；ならびに、ＢａｌｌおよびＳｃｈｗａｒｔｚ（１９９４年）Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  Ｍｅｄ．２４（４）：２６９〜７６を参照されたい。薬物動態パラメータは、既刊文献からも得ることができ、例えば、Ｂｕｃｋｐｉｔｔら（１９８４年）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２３１：２９１〜３００；ＤｅｌＲａｓｏ（１９９３年）Ｔｏｘｉｃｏｌ．Ｌｅｔｔ．６８：９１〜９９；Ｈａｉｅｓら（１９８１年）Ａｍ．Ｒｅｖ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｄｉｓ．１２３：５３３〜５４１を参照されたい。
【０１１６】
所望の特定の生理的パラメータは、組織または臓器の液体滞留時間、組織または臓器の質量、液体対細胞容積比、細胞のせん断応力等を含む。生理的に適切なパラメータ値は、従来の方法によって実験的に得ることもできるし、当該技術分野において既知であり、公的に入手可能な値から得ることもできる。所望の薬物動態パラメータ値は、動物、通常は哺乳類のものが得られるが、その他の動物モデル、例えば昆虫、魚、爬虫類、または鳥類も、使用法を見出すことができる。哺乳類は、実験動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、または、経済的価値があるモルモット哺乳類、例えば、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウシ、イヌ、またはネコ；サル、類人猿、またはヒトを含む霊長類；等を含む。異なる年齢、例えば、胎児、新生児、幼児、小児、大人、または高齢の動物；および、異なる生理学的状態、例えば、罹患しているとき、医薬的に活性な剤との接触後、感染後、または、大気圧が変化した条件下では、異なる値が得られ、使用され得る。
【０１１７】
システム内でモデルとされる様々な物質に適用できる質量平衡方程式と同様に、薬物動態パラメータ値に関連する情報が、培養システムのデータ処理コンポーネント、例えば、記憶用に用意された汎用メモリ中のルックアップテーブル等において任意で提供される。これらの方程式は、システム内の様々な生物学的／化学的物質の生理学的薬物動力学モデルを表す。
【０１１８】
薬物動態培養デバイス：本発明の培養デバイスは、細胞成長のための基板を提供する。各デバイスは、少なくとも１つのチャンバ、通常は少なくとも２つのチャンバを備え、３つ以上のチャンバを備えてもよく、当該チャンバは、流体チャネルによって相互接続されている。チャンバは、単一の基板上にあってもよいし、異なる基板上にあってもよい。好ましくは、各チャンバは、デバイス上に存在するその他のチャンバと異なる表面形状構成を有する。デバイスは、チャンバおよびチャネルを密封するためのカバーを含有し、培地の再循環を可能にする少なくとも１つの入り口および出口ポートを備える。デバイスは、システムを通って培地を汲み上げるためのメカニズムを包含する。培地は、培養細胞の生存を維持するように設計される。デバイスは、試験化合物をシステムに導入することができるメカニズムを包含する。
【０１１９】
本発明の一実施形態において、デバイスは、一辺が約２．５ｃｍを超えず、好ましくは少なくとも２つの相互接続したチャンバを備える、単一ユニットとしてマイクロスケールで作製される。２つの臓器コンパートメントは、幅約５０〜１５０μｍ、深さ１５〜２５μｍのチャネルによって接続される。例えば、１つのチャンバは、並列チャネルの相互接続した配列、通常は少なくとも約１０のチャネル、好ましくは少なくとも約２０のチャネルを備える肺を表すことができる。そのようなチャネルは、例えば幅約３０〜５０μｍ、深さ５〜１５μｍ、長さ３〜７ｍｍ等、一般的なマイクロ流体の寸法を有し得る。別のコンパートメントは、通常、幅約５０〜１５０μｍ、深さ１５〜２５μｍ、長さ５〜１５ｃｍの２つ以上の並列チャネルを蛇行形状で備える肝臓を表すことができる。
【０１２０】
デバイスは、通常、細胞および培地から信号を得るためのメカニズムを含むであろう。異なるチャンバおよびチャネルからの信号をリアルタイムで監視することができる。例えば、バイオセンサは、デバイスに組み込まれてもデバイスの外にあってもよく、システム内にある生理学的状態のリアルタイム読み出しを可能にする。
【０１２１】
本発明の薬物動態培養デバイスは、チップまたは基板として提供され得る。そのようなマイクロシステムは、流体力学を強化することに加え、特に、並列度の高いシステムにおいて使用される場合に空間を節約し、安価で産生されることができる。当該培養デバイスは、ポリスチレン等であるがこれに限定されないポリマーから形成され、使用した後は廃棄することができ、滅菌の必要性がない。結果として、ｉｎ  ｖｉｔｒｏサブシステムを安価に産生し、広範に使用することができる。また、例えば管を形成するために細胞を３次元様式で成長させることができ、これにより、ｉｖ  ｖｉｖｏ環境をより厳密に複製する。
【０１２２】
任意の特定の剤に対する動物の代謝反応を真似るために、一揃いの並列または多重配列は複数の（すなわち、少なくとも２つの）細胞培養システムを備え、ここで各システムは、同一であってもよいし、所定のパラメータ値または入力エージェントおよび濃度に応じて可変してもよい。配列は、少なくとも約１０、または、１００以上ものシステムを備えてもよい。有利なことに、マイクロチップ上の細胞培養システムは、アッセイ中、下にあるすべての細胞培養システムが同じ条件に曝露されるように、単一のチャンバ内に格納され得る。
【０１２３】
あるいは、単一のデバイスを形成するために、例えば、胃腸障壁または血液脳関門を模倣するために、複数のチップを組み込んでよい。
【０１２４】
細胞：本発明のアッセイで使用する細胞は、有機体、有機体から派生した単一細胞型であってよく、ｉｎ  ｖｉｖｏ状況では一般的であるように、細胞型の混合物であってよい。培養条件は、例えば、温度、ｐＨ、因子の存在、その他の細胞型の存在等を含んでよい。上述したように、薬物動態パラメータ値を得ることができる動物のいずれかを含む、様々な動物細胞が使用され得る。
【０１２５】
本発明は、初代細胞、幹細胞、前駆細胞、正常な、遺伝子操作された、遺伝子改変された、不死化された、および形質転換された細胞株を含む任意の細胞型と共に使用するのに適している。本発明は、単一細胞型もしくは細胞株、または、異なる細胞型の組み合わせと共に使用するのに適している。好ましくは、培養細胞は、それらの自然発生的な対応物における反応を導く、刺激に対して反応する能力を維持する。これらは、真核または原核細胞等、すべてのソースから派生し得るものである。真核細胞は、事実上、植物であってもよいし、ヒト、サル、または齧歯類等の動物であってもよい。当該細胞は、任意の組織型（例えば、心臓、胃、腎臓、腸、肺、肝臓、脂肪、骨、軟骨、骨格筋、平滑筋、心筋、骨髄、筋肉、脳、膵臓）、および細胞型（例えば、上皮、内皮、間葉、含脂肪細胞、造血）のものであってよい。さらに、組織または臓器の断面を使用してよい。例えば、動脈、静脈、胃腸管、食道、または結腸の断面が使用され得る。
【０１２６】
また、非天然「組み換え型」（「外因性」とも呼ばれる）核酸配列を含有するように遺伝子改変または操作された細胞、または、遺伝機能の利得または損失を提供するためにアンチセンス技術によって修正された細胞を、本発明で利用してもよい。遺伝子操作された細胞を生成するための方法が当該技術分野において既知であり、例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ」（Ａｕｓｕｂｅｌら編、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ、ニューヨーク州ニューヨーク、２０００年）を参照されたい。細胞は、幹細胞等、最終分化したもの、または未分化のものであり得る。本発明の細胞は、生物剤および薬理作用のある物質に対して異なる反応をし得る、各種遺伝子的に多様な個体からの培養細胞であってよい。遺伝的多様性は、罹病性に間接的および直接的な影響を及ぼし得る。直接的な場合には、単一ヌクレオチド多型（Ｓｉｎｇｌｅ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ；ＳＮＰ）の原因となる単一ヌクレオチドの変化でさえ、タンパク質のアミノ酸配列を改変し、疾病または罹病性に直接的に寄与することができる。例えば、いくつかのＡＰＯ‐リポタンパク質Ｅ遺伝子型は、幾人かの個人におけるアルツハイマー病の発病および進行と関連付けられている。
【０１２７】
いくつかの多型が特定の疾病表現型と関連付けられている場合、当該多型の保菌者として識別された個体の細胞は、非保菌者の細胞を対照として使用して、発生異常について研究され得る。いくつかの異なる細胞型が同時に研究され、関連する細胞に接合され得ることから、本発明は、特定の遺伝病の症状と関連付けられた発生異常を研究するための実験システムを提供する。例えば、神経系に対する化合物の細胞効果を特徴付けるために、神経前駆細胞、グリア細胞、または神経起源のその他の細胞を、デバイスにおいて使用することができる。また、システムは、受容体発現および／または機能における変化に対する反応だけでなく、薬物過敏、ケモカインおよびサイトカイン反応、成長因子、ホルモン、および阻害剤に対する反応に影響を及ぼす遺伝要素を識別するために細胞を研究できるようにも設定され得る。この情報は、遺伝的起源の、または、遺伝性素因がある疾病のための、治療方法論を設計する上で、非常に貴重なものとなり得る。
【０１２８】
本発明の一実施形態において、細胞は、医薬的に活性な化合物の解毒および代謝に関係し、例えば、肝細胞を含む肝臓細胞；細管細胞を含む腎臓細胞；有機化合物を長期間保有することができる含脂肪細胞を含む脂肪細胞である。これらの細胞は、呼吸および酸化プロセスに関係する肺細胞等の細胞を持つ培養システムと一体化され得る。これらの細胞を、所望の剤からの損傷に対して特に敏感である細胞、例えば、腸上皮細胞、骨髄細胞、および、細胞分裂に影響を及ぼす剤のためのその他の通常急速に分裂する細胞と組み合わせてもよい。神経毒性等に対する剤の効果を監視するために神経系細胞が存在してもよい。
【０１２９】
腫瘍の成長特性、ならびに、腫瘍成長に対する周囲組織および免疫系の反応にも関心が寄せられている。罹患組織および周囲領域を含む変性疾患は、罹患組織の反応、および、生体のその他の部分との相互作用の両方を測定するために活用され得る。
【０１３０】
「環境」または「培養条件」という用語は、細胞、媒質、因子、時間、および温度を包含する。環境は、薬物およびその他の化合物、特定の大気条件、ｐＨ、塩組成、鉱物等も含み得る。細胞培養は、一般に、生理的状態を模倣した無菌環境において、例えば、３７℃、９２〜９５％の加湿空気／５〜８％のＣＯ２雰囲気を含有するインキュベータ内で実行される。細胞培養は、ウシ胎仔血清等の定義されていない生体液を含有する栄養混合物、または、完全に定義されている血清を含まない媒質中でも行うことができる。様々な培地が当該技術分野において既知であり、市販されている。
【０１３１】
本明細書において使用する場合、「生理的状態」という用語は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける特定の細胞型の天然組織条件を可能な限り厳密に模倣するために、細胞培養条件が極めて特異的に監視されることを意味するものとして定義される。これらの条件は、液体滞留時間（すなわち、液体が臓器内に留まる時間）；細胞対血液容積比、細胞上での垂直応力、天然臓器と同程度のコンパートメントのサイズのようなパラメータを含む。
【０１３２】
スクリーニングアッセイ：本明細書で、総称的に「入力変数」と称される、薬物、毒素、細胞、病原体、試料等は、薬物動態ベースの培養システムに追加し、次いで、所望の出力変数の変化、例えば、Ｏ２の消費、ＣＯ２の産生、細胞の生存、または所望のタンパク質の発現について培養細胞を評価することによって、生物活性をスクリーニングされる。入力変数は、一般に、溶液中、または易溶性の形態で、培養中の細胞の媒質に追加される。入力変数は、フロースルーシステムを使用して、あるいは、他の静的溶液にボーラスを追加することによって、追加され得る。フロースルーシステムにおいては２つの流体が使用され、一方は生理的に中性な溶液であり、他方は試験化合物が追加された同じ溶液である。第１の流体が細胞を通り越し、第２の流体がそれに続く。単一溶液の方法においては、試験入力変数のボーラスが、細胞を囲む媒質の容積に追加される。培地の全体的な組成は、ボーラスの追加によって、または、フロースルー法における２つの溶液の間で、大幅には変化しないはずである。
【０１３３】
好ましい入力変数製剤は、保存料等、製剤全体に対して顕著な効果を有する追加成分を含まない。したがって、好ましい製剤は、生物活性剤および生理的に許容可能な担体、例えば、水、エタノール、またはＤＭＳＯを含む。しかしながら、剤が補形薬を持たない液体である場合、製剤は化合物自体のみであってよい。
【０１３４】
好ましい入力変数は、ウイルス、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、生分解性ポリマー、放射性標識粒子、放射性標識生体分子、毒素抱合粒子、毒素抱合生体分子、および、安定化剤と抱合された粒子または生体分子を含むがこれらに限定されない。「安定化剤」は、薬物を安定させ、制御放出を提供するために使用される剤である。そのような剤は、アルブミン、ポリエチレングリコール、ポリ（エチレン‐ｃｏ‐酢酸ビニル）、およびポリ（ラクチド‐ｃｏ‐グリコリド）を含む。
【０１３５】
様々な濃度に対する反応差を得るために、異なる入力変数濃度で複数のアッセイを並行して実行することができる。当該技術分野において既知であるように、剤の有効濃度を測定するには、一般に、１：１０またはその他の対数スケールの希釈に由来する濃度の範囲を使用する。濃度は、必要に応じて、二次希釈によりさらに純化され得る。一般に、これらの濃度の１つは、陰性対照としての役割を果たす、すなわち、ゼロ濃度である、または検出のレベルに満たない。
【０１３６】
関心が持たれている入力変数は、多くの場合、有機分子であるが、複数の化学的分類を包含する。好ましい実施形態は、例えば環境試料または薬物等、試料の毒性をスクリーニングするための、本発明の方法の使用である。候補剤は、タンパク質との構造的相互作用、特に水素結合に必要な官能基を含んでよく、一般に、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基、好ましくは、これらの化学官能基のうち少なくとも２つを含む。候補剤は、多くの場合、上記の官能基の１つ以上と置き換えて、循環炭素もしくは複素環構造、および／または、芳香族もしくは多環芳香族構造を含む。候補剤は、ペプチド、サッカリド、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、誘導体、構造的アナログ、またはそれらの組み合わせを含む生体分子中にも見られる。
【０１３７】
薬理学的に活性な薬物および遺伝的に活性な分子が含まれる。関心が持たれている化合物は、化学療法剤、抗炎症剤、ホルモンまたはホルモン拮抗剤、イオンチャネル修飾因子、および神経活性剤を含む。本発明に適する典型的な医薬品は、「Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」ＧｏｏｄｍａｎおよびＧｉｌｍａｎ、ＭｃＧｒａｗ‐Ｈｉｌｌ、ニューヨーク州ニューヨーク（１９９６年）、第９版の、Ｄｒｕｇｓ  Ａｃｔｉｎｇ  ａｔ  Ｓｙｎａｐｔｉｃ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｅｆｆｅｃｔｏｒ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｓｉｔｅｓ；Ｄｒｕｇｓ  Ａｃｔｉｎｇ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｃｅｎｔｒａｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ；Ａｕｔａｃｏｉｄｓ：Ｄｒｕｇ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ；Ｗａｔｅｒ，Ｓａｌｔｓ  ａｎｄ  Ｉｏｎｓ；Ｄｒｕｇｓ  Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｒｅｎａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｅｌｅｃｔｒｏｌｙｔｅ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ；Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  Ｄｒｕｇｓ；Ｄｒｕｇｓ  Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ；Ｄｒｕｇｓ  Ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  Ｕｔｅｒｉｎｅ  Ｍｏｔｉｌｉｔｙ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｐａｒａｓｉｔｉｃ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ；Ｄｒｕｇｓ  Ｕｓｅｄ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ｄｒｕｇｓ  Ａｃｔｉｎｇ  ｏｎ  Ｂｌｏｏｄ‐Ｆｏｒｍｉｎｇ  Ｏｒｇａｎｓ；Ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｓ；Ｖｉｔａｍｉｎｓ，Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ；およびＴｏｘｉｃｏｌｏｇｙの節に記載されているものであり、参照することによりすべてが本書に組み込まれる。毒素、ならびに、生物および化学兵器剤も含まれ、例えば、Ｓｏｍａｎｉ、Ｓ．Ｍ．（編）、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  Ａｇｅｎｔｓ」（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９２年）を参照されたい。
【０１３８】
試験化合物は、上述したすべての分類の分子を含み、未知の内容の試料をさらに含んでよい。多くの試料は溶液中の化合物を含むことになるが、適切な溶媒中に溶解できる固体試料をアッセイしてもよい。関心が持たれている試料は、環境試料、例えば、地下水、海水、または、採鉱廃棄物；生物試料、例えば、作物から調製された溶解物または組織試料；製造試料、例えば、医薬調製中の経時変化；さらに、分析用に調製された化合物のライブラリ；等を含む。関心が持たれている試料は、潜在的な治療的価値が評価されている化合物、例えば、植物または真菌細胞からの薬物候補を含む。
【０１３９】
「試料」という用語は、付加的な構成要素、例えば、イオン強度、ｐＨ、または総タンパク質濃度に影響を及ぼす構成要素が添加された上述の流体も含む。また、試料は、少なくとも部分的な分画または濃縮を達成するために処理され得る。生物試料は、化合物の分解を削減するように注意するのであれば、例えば窒素下、冷凍、またはそれらの組み合わせで保管されてよい。使用される試料の容積は、計測可能な検出を可能にするために十分なものであり、通常、約０．１μｌから１ｍｌの生物試料で十分である。
【０１４０】
化合物および候補剤は、合成または天然化合物のライブラリを含む多種多様なソースから得られる。例えば、無作為に選ばれたオリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子の無作為または指定された合成のために、複数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の、天然化合物のライブラリが利用可能である、または容易に産生される。さらに、天然または合成的に産生されたライブラリおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段によって容易に修正されることができ、コンビナトリアルライブラリを産生するために使用されることができる。既知の薬理作用のある物質は、構造的アナログを産生するために、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化等の指定されたまたは無作為な化学修飾に供され得る。
【０１４１】
出力変数：出力変数は、細胞の定量化可能な要素、特に、ハイスループットシステムにおいて正確に計測され得る要素である。出力は、例えば、生存、呼吸、代謝、細胞表面決定基、受容体、タンパク質またはその配座もしくは翻訳後修飾、脂質、炭水化物、有機もしくは無機分子、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、またはそのような細胞成分から派生した部分を含む、任意の細胞成分または細胞産物であってよい。ほとんどの出力は定量的な読み出しを提供することになるが、場合によっては、半定量的または定性的結果が得られるであろう。読み出した情報は、単一の測定値を含んでもよいし、平均、メジアン値、または分散を含んでもよい。特徴として、読み出し値の範囲は各出力から得られることになる。変動が期待され、標準的な統計的方法を使用して、試験出力のセットを表す値の範囲が確立され得る。
【０１４２】
選択されたマーカーの存在を定量化するために、様々な方法が利用され得る。存在する分子の量を計測するための便利な方法は、検出可能な部分で分子を標識することであり、当該部分は蛍光性、発光性、放射性、または酵素的に活性であってよい。蛍光性および発光性部分は事実上、あらゆる生体分子、構造、または細胞型を標識するために容易に利用可能である。免疫蛍光部分は、特定のタンパク質だけでなく、特定の立体構造、切断産物、またはリン酸化反応のような部位修飾にも結合するように方向付けられ得る。個々のペプチドおよびタンパク質は、例えば細胞内で緑色蛍光タンパク質キメラとしてそれらを発現することによって、自己蛍光するように改変され得る（概説は、Ｊｏｎｅｓら（１９９９年）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７（１２）：４７７〜８１を参照）。
【０１４３】
出力変数は、免疫組織化学、ラジオイムノアッセイ（ＲａｄｉｏＩｍｍｕｎｏＡｓｓａｙ；ＲＩＡ）、または酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ  Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂａｎｃｅ  Ａｓｓａｙ；ＥＬＩＳＡ）および関連の非酵素的技術等の、免疫測定法によって計測され得る。これらの技術では、単一分子標的に付着するためのそれらの高度な特異性により、特に有用なレポーター分子として、特定の抗体を利用する。細胞ベースのＥＬＩＳＡまたは関連の非酵素的または蛍光ベースの方法により、細胞表面パラメータの計測が可能になる。そのようなアッセイから読み出した情報は、個々の蛍光抗体が検出された細胞表面分子またはサイトカインと関連付けられた平均蛍光、または、アベレージ蛍光強度、メジアン蛍光強度、蛍光強度の分散、もしくはこれらの間にある何らかの関係であり得る。
【０１４４】
データ分析：スクリーニングアッセイの結果は、参照化合物、濃度曲線、対照等から得られた結果と比較され得る。結果の比較は、適切な推論プロトコル、Ａｌシステム、統計比較等の使用によって実現される。
【０１４５】
参照出力データのデータベースをコンパイルすることができる。これらのデータベースは、単一または複数の環境条件またはパラメータが除去または特異的に改変された環境条件下で処理された細胞の分析からの参照だけでなく、既知の剤または剤の組み合わせからの結果も含んでよい。データマトリクスを生成することができ、当該データマトリクスの各点は出力変数から読み出した情報に対応し、各出力を表すデータは、複製測定結果、例えば、同じ種類である複数の個々の細胞に源を発するものであってよい。
【０１４６】
読み出した情報は、平均、アベレージ、メジアン、もしくは分散、または計測結果と関連付けられたその他の統計的もしくは数学的に派生した値であってよい。出力読み出し情報は、対応する参照読み出し情報との直接的な比較によってさらに純化され得る。同一条件下で各出力について得られた絶対値は、生きている生物系に内在する変動を表示することになり、個体間に内在する変動だけでなく、個々の細胞変動も反映するものである。
【０１４７】
細胞培養および細胞培養デバイス
本発明の培養デバイスは、別個ではあるが相互接続し、好ましくはチップフォーマットに組み込まれた１つ以上のチャンバ内に隔離された、チャネルの流体ネットワークを備える。特定のチャンバ表面形状は、対応する細胞、組織、または臓器系にｉｎ  ｖｉｖｏで見られるものと相互作用する細胞相互作用、液体流量、および液体滞留パラメータを提供するように設計される。
【０１４８】
最適化されたチャンバ表面形状は、選択した値が得られるまで、流体流れおよび寸法の変化を受けてパラメータ値を試験する手順を繰り返すことによって開発され得る。基板の最適化は、チャンバの数を選択すること、適正な細胞対容積比を提供するチャンバ表面形状を選定すること、適正な組織または臓器サイズ比を提供するチャンバサイズを選択すること、正しい液体滞留時間を提供する最適流体流速を選定すること、続いて、これらの値に基づいて細胞せん断応力を計算することを含む。細胞せん断応力が最大許容値を超える場合、新しいパラメータ値が選択され、プロセスが繰り返される。ＣＣＡデバイスの別の実施形態は、チャネルまたはチャンバの底部および側面上ではなく中空管内で細胞が成長するものを含む。そのような３次元組織構成物中で成長する細胞は、いくつかのｉｎ  ｖｉｖｏ組織について、より本物に近いことが実証されている（Ｇｒｉｆｆｉｔｈ（１９９８年）ＰｈＡＲＭＡ  Ｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｃｏｎｆ．、カリフォルニア州コロナド、３月１５〜１８日）。
【０１４９】
３Ｄ培養デバイスを作成する上で、３つの本源的な設計パラメータが考慮される。１つ目は、流体が特定の組織に接触している、またはウェル内にある、滞留時間である。滞留時間は、血液が、循環器系の１つの通路内でウェルによって表される臓器組織と接触している時間の量を反映するように選定される。２つ目は、中で細胞が成長する管の半径である。例えば、肝臓を複製するための管の半径は、２００〜４００μｍの範囲内である。管の半径が大きくなりすぎると、細胞は原則的に平面となり、管上に単分子層を形成することに留意すべきである。
【０１５０】
３つ目のパラメータは、各モジュールに到達する流量の割合である。流れチャネルの表面形状を調整することにより、チャンバからの流れを区分化する。各モジュールまたはチャンバへのチャネルまたは管は、圧力降下の平衡を保ち、流れを釣り合わせるために、一般に異なる長さのものである。流体は、その他の組織から離れた後、ポンプによって再循環されることができる。管を通る流速を、管の寸法および滞留時間から計算した。流速を鑑みて、値が細胞の応力限界を超えないことを確実にするために、細胞上のせん断応力を計算した。肺組織においては極めて短い滞留時間が要求されるため、この臓器にウェルおよび管アプローチを使用することは不可能である。せん断応力が高すぎることにより、肺組織セクションは、肺組織単分子層に影響を及ぼさないままである。
【０１５１】
本発明のシステムは双方向性である（すなわち、コンピュータは試験範囲内の条件を感知するだけでなく、制御もする）ため、補正がシステムへ動的に加えられ、適切に注記されて、実行中である試験の動力学の研究者らに通知するために文書化されることができる。
【０１５２】
コンピュータにより集められるデータは、各コンパートメントからの試験化学物質廃液の連続的なインライン監視に必要なデータの収集物から成る。上述のように、各コンパートメントからの試験化学物質廃液に関する定量的データを検出、分析、および提供するために、センサ、好ましくはフロースルー型のものが、各コンパートメントからの流出物とインラインで配置される。
【０１５３】
マイクロプロセッサは、特定の試験化学物質について生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；ＰＢＰＫ）モデルを算定するのにも役立つ。これらの計算は、コンパートメント間での流速、および、システムからの試験化学物質の排泄速度を設定するための根拠としての役割を果たすことができる。しかしながら、試験化学物質の理論推定値としての役割を果たす場合もある。実験の終わりに、ＰＢＰＫ測定によって為された試験化合物および代謝産物の濃度に関する予測を、センサデータと比較することができる。ハードコピー出力は、ＰＢＰＫモデルを実験結果と比較するものである。
【０１５４】
いくつかのプロトタイプＣＣＡシステムを構築し、試験した。図１７Ａは、「第１世代」３コンパートメントデバイスを描写している。寸法は、以下のとおり：ウエハは２ｃｍ×２ｃｍであり；肺チャンバは２０のチャネル（長さ５ｍｍ）４０μｍ×２０μｍ（幅×深さ）を有し；肝臓チャンバは２つのチャネル（長さ１００ｍｍ）１００μｍ×２０μｍ（幅×深さ）を有するものとした。このデバイスを使用する上での第１のステップは、シリンジポンプを使用してすべてのチャンバがいっぱいになるまで流体を注入することである。第２に、蠕動ポンプを使用して流体を再循環させる。図１７Ｂは、システムの流体光学を実証する、デバイスの断面図を示す。厚さ４００μｍのエラストマーが良好な密封性を示し、プレキシガラスおよびゲルローディングチップはその他の材料よりもはるかに脆弱性が低いことが分かった。このデバイスには、９０°屈曲時に高い圧力降下および漏れが発生するという問題があった。
【０１５５】
この「第１世代」デバイスを使用して、細胞付着性の研究を実行した。Ｌ２細胞を肺チャンバに入れ、Ｈ４ＩＩＥ細胞を肝臓チャンバに入れた。チャンバの表面にポリ‐Ｄ‐リジンを吸着させ、チャネル内の細胞の付着を促進した。残念なことに、細胞はトレンチの外側に付着していたため、異なる基板を試験し、表面を修正した。
【０１５６】
図１８Ａは、「第２世代」デバイスを描写している。寸法は、以下のとおり：チップは２ｃｍ×２ｃｍ；エッチングは深さ２０μｍ；肺チャンバは２ｍｍ×２ｍｍ（幅×長さ）；肝臓チャンバは７．５ｍｍ×１０ｍｍ（幅×長さ）とした。肺チャンバは細胞付着性を増加させるために５μｍの高い隆線を含有し（図１８Ｂ）、肝臓チャンバは浸出をシミュレートするために２０μｍの高い柱を含有していた（図１８Ｃ）。
【０１５７】
図１９は、「第３世代」デバイスを描写している。寸法は、以下のとおり：チップは２ｃｍ×２ｃｍ；肺チャンバは２ｍｍ×２ｍｍ（幅×長さ）；肝臓チャンバは３．７ｍｍ×３．８ｍｍ（幅×長さ）；「その他の組織」チャンバは７ｍｍ×７ｍｍ（幅×長さ）とした。流体は肺チャンバから分割されて、２０％は肝臓へ、８０％はその他の組織チャンバへ向かった。チャンバの一部（破線部分）は圧力降下を削減するために深さ１００μｍであり、その他の部分（実線部分）は現実的な液体細胞比を与えるために深さ２０μｍである。
【０１５８】
図２０は、５コンパートメントＰＢＰＫモデルＣＣＡを表す流れ図である。このデバイスでは、脂肪細胞を表すチャンバ、ゆっくり潅流される流体および迅速に潅流される流体を表すチャンバを追加している。そのようなデバイスは、生物蓄積研究、細胞毒性研究、および代謝活性のために使用され得る。様々な順列を持つその他のデバイスも開発され得る。例えば、ガス交換を伴う隔膜ポンプ、またはオンラインバイオセンサ、または微小電気機械（Ｍｉｃｒｏ  ＥｌｅｃｔｒｏＭｅｃｈａｎｉｃａｌ；ＭＥＭ）ポンプ、またはバイオセンサおよび電子インタフェースを追加してよい。医薬の経口送達を模倣するためのデバイスを開発することができる。あるいは、血液脳関門を模倣するためのデバイスを開発することができる。
【０１５９】
作製
細胞培養デバイスは、一般に、適切に嵌合または係合すると本発明の培養デバイスを形成する分離要素、例えば、チャンバ、チャネル、入り口、または出口の集合体を備える。好ましくは、当該要素は、集積「チップベース」フォーマットで提供される。
【０１６０】
デバイスの流体工学は、デバイスのサイズに合わせて適切に拡大縮小される。チップベースフォーマットにおいて、流体接続は「マイクロ流体」であり、そのようなシステムは、例えば、深さまたは幅が約０．１μｍ乃至５００μｍの、少なくとも１つの内部断面寸法を有する、通路、チャンバ、または導管等の流体素子を含有する。本発明のデバイスにおいて、チャンバ間のチャネルは一般に、少なくとも１つのマイクロスケールのチャネルを含む。
【０１６１】
一般に、マイクロ流体デバイスは、上部分と、底部分と、内側部分とを備え、当該内側部分は、デバイスのチャネルおよびチャンバを実質的に画定する。好ましい態様において、底部分は、構造上実質的に平面である固体基板を備えることになり、当該基板は少なくとも１つの実質的に平らな上面を有する。様々な基板材料を底部分として用いてよい。一般に、デバイスは微細加工されるため、基板材料は概して、既知の微細加工技術、例えば、フォトリソグラフィ、薄膜蒸着、湿式化学エッチング、反応性イオンエッチング、誘導結合プラズマディープシリコンエッチング、レーザー切断、空気摩耗技術、射出成形、エンボス加工、およびその他の技術との適合性に基づいて選択されることになる。
【０１６２】
本発明の基板材料は、ポリマー材料、例えば、ポリスチレン等のプラスチック、ポリメチルメタクリレート（ＰｏｌｙＭｅｔｈｙｌＭｅｔｈＡｃｒｙｌａｔｅ；ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＴＥＦＬＯＮ（商標））、ポリ塩化ビニル（ＰｏｌｙＶｉｎｙｌＣｈｌｏｒｉｄｅ；ＰＶＣ）、ポリジメチルシロキサン（ＰｏｌｙＤｉＭｅｔｈｙｌＳｉｌｏｘａｎｅ；ＰＤＭＳ）、ポリスルホン等を備える。そのような基板は、射出成形、エンボス加工、もしくはスタンピング等のよく知られた成形技術を使用して、または、金型内のポリマー前駆材料を重合させることによって、微細加工マスターから容易に製造される。そのようなポリマー基板材料は、最も極端な反応条件に対するそれらの一般的な不活性に加え、それらの製造の容易性、低コスト、および廃棄性という理由のために好ましい。これらのポリマー材料は、システム内でのそれらの有用性を強化するため、例えば、強化された流体方向、細胞付着、または細胞分離を提供するために、処理された表面、例えば誘導体化または被覆された表面を含んでよい。
【０１６３】
マイクロ流体デバイスのチャネルおよび／またはチャンバは、一般に、マイクロスケールの溝または圧入のような、上述した微細加工技術を使用して、基板の上面、または底部分内に作製される。マイクロ流体デバイスの上部分の下面は、当該上部分が一般に第２の平面基板を備え、次に、底部基板の表面にオーバーレイされてそれと結合され、これら２つの構成要素の界面にあるデバイスのチャネルおよび／またはチャンバ（内側部分）を密封する。上部分の底部分への結合は、基板材料の本質に応じて、様々な既知の方法を使用することによって行われ得る。例えば、ガラス基板の場合、デバイスの上部分を底部分に結合するために、高温および圧力を用いる熱結合技術が使用され得る。基板材料の過剰溶融を防止するために、使用される温度が概して低いことを除いては同様の技術を使用して、ポリマー基板を結合することができる。デバイスのポリマー部分を共に結合するために、音響溶接技術、または、接着剤、例えば紫外線硬化接着剤の使用等を含む代替的な方法を使用してもよい。
【０１６４】
デバイスは、概して、低流量蠕動ポンプ等のポンプを備えるであろう。小口径可撓管がデバイスの出口に付着され、蠕動ポンプを通過してデバイスの入り口に付着され、それによって閉ループシステムを形成するであろう。ポンプは、概して、約１μＬ／分の流速で動作する。ポンプシステムは、隔膜等のいかなる流体ポンプデバイスであってもよく、ＣＣＡデバイス（チップベースのシステム）に不可欠なものであってもよいし、上述したような分離した構成要素であってもよい。
【０１６５】
デバイスは、プロセッサに接続またはインタフェースで連結されてよく、当該プロセッサは、各バイオセンサからの信号を記憶および／または分析する。プロセッサは、データをコンピュータメモリ（ハードディスクまたはＲＡＭ）に順次転送し、当該データは、結果をさらに分析、印刷、および／または表示するために、そこからソフトウェアプログラムによって使用され得る。
【０１６６】
典型的な実施形態の説明
特定の実施形態についての以下の詳細な説明において、本書の一部を形成し、本発明が実践され得る特定の実施形態を説明する目的で示される、添付の図面を参照する。本発明の範囲を逸脱することなく、その他の実施形態を利用することができ、構造的変化が為され得ることを理解されたい。
【０１６７】
図１は、本発明によるｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムのブロック図である。肺細胞シミュレートチャンバ１０２は、ガス交換デバイス１０３から酸化培地を受け取る。そのような酸化媒質は、培地が酸素含有ガスを吸収し、二酸化炭素含有ガスを脱着させるように、培地を酸素含有ガスと接触させることによって得られる。肺細胞シミュレートチャンバ１０２を出る培地は、哺乳類の動脈血１０６に類似している。続いて、動脈血１０６を構成する酸素含有培地が肝臓シミュレートチャンバ１０８、その他の組織シミュレートチャンバ１１０、脂肪シミュレートチャンバ１１２、および腎臓シミュレートチャンバ１１４に供給される。肝臓シミュレートチャンバ１０８、その他の組織シミュレートチャンバ１１０、脂肪シミュレートチャンバ１１２、および腎臓シミュレートチャンバ１１４から出発する培地は、哺乳類の静脈血１０４に類似している。図１に示すように、静脈血１０４に対応する培地は、肺細胞シミュレートチャンバ１０２に戻される。本発明のシステムは、腸シミュレートチャンバ１１６および腹腔シミュレートチャンバ１１８も含み、それらはいずれも、試験化合物導入のための部位を構成する。哺乳類と同様に、腎臓シミュレートチャンバ１１４から廃液１１５が引き抜かれる。
【０１６８】
図２は、本発明のシステム２００の一実施形態の、簡易概略図である。システム２００は、肺細胞培養チャンバ２１０と、肝細胞培養チャンバ２１２と、脂肪細胞培養チャンバ２１３と、その他の組織チャンバ２１４と、ガス交換チャンバ２５０とを含む。チャンバ２１０、２１２、２１３、２１４、および２５０は、通例チップ２３０と称されるシリコンの基板上に形成される。単一のチップ２３０上に、４つを超える数の細胞培養チャンバが格納または形成され得ることに留意すべきである。流体経路２４０が、チャンバ２１０、２１２、２１３、２１４、および２５０を接続している。
【０１６９】
チャンバは、入り口２１１と出口２１５とを有する。入り口２１１は、ガス交換チャンバ２５０の一端に位置する。出口２１５は、肝細胞培養チャンバ２１２の一端に位置する。チャンバ２１０、２１２、２１３、２１４、および２５０、ならびに流体経路２４０は、実質的に入り口２１１と出口２１５との間に位置する。システムは、システム２００内で流体を循環させるためのポンプ２６０を含む。微小管２７０が、ポンプ２６０の出口２１５と入り口側との間を接続している。微小管２７１が、ポンプ２６０の出口側を入り口２１１に接続している。細胞培養チャンバ２１０、２１２、２１３、２１４、ガス交換チャンバ２５０、流体経路２４０、およびポンプ２６０が、システム２００を形成する。当該システムは、さらなる細胞培養チャンバを含んでよい。追加される１つの一般的な細胞培養チャンバは、腎臓をシミュレートしたものである。
【０１７０】
図３は、本発明の別の実施形態を示す概略である。図３において、第１の信号経路３１０、第２の信号経路３２０、および第３の信号経路３３０がチップ２３０上に設けられている。各細胞培養システム２００の様々な態様を監視するための信号がチップ２３０からおよびチップ２３０上の特定の場所において採取され、チップ２３０外の出力に移動されることができる。一例として、チップ２３０上の信号経路３１０、３２０、３３０は、統合埋込型導波管である。そのような実施形態において、チップ２３０は、シリコン、ガラス、またはポリマーでできていてよい。導波管３１０、３２０、３３０は、チップの縁に光を伝え、光信号を電気信号に変換するために、ここにトランデューサ３１２、３２２、３３２が位置しているであろう。続いて、システム２００内の細胞は、システム２００内の細胞を調査および監視するために、蛍光、発光、もしくは吸収、またはこれらすべての特性を監視され得る。蛍光を確認するには、光源が必要である。光源は、信号を捕捉してそれをチップ２３０へ送る、導波管３１０、３２０、３３０または光ファイバ等の分子および信号搬送波を調査するために使用される。信号搬送波３１０、３２０、３３０は、チップ３１０、３２０、３３０の信号搬送部分の端部付近にある光検出器に向けて、光を方向付けるであろう。
【０１７１】
図４は、本発明のシステム２００の、別の実施形態を示す概略図である。この実施形態において、バイオセンサ４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、および４６０が、チップ２３０の各細胞培養チャンバの、チップ上流および下流に位置付けられている。バイオセンサ４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０は、媒質の酸素、二酸化炭素、および／またはｐＨを監視する。これらのセンサは、健全な環境を維持するために、必要に応じて、システム２００の監視およびガス濃度の調整を可能にする。また、各細胞コンパートメントのちょうど上流および下流に位置付けられている場合、バイオセンサは細胞代謝および生存についての有用な情報を提供する。
【０１７２】
図５Ａから５Ｇは、ポリマーベースの使い捨てチップ２３０を作成するために使用されるステップを示す。シリコンウエハ２０を、フォトレジスト２１の薄層でスピンコートする（図５Ａ）。フォトレジスト２１を、望ましい機構を包含するフォトマスク２３を通る紫外線２２に露光させる（図５Ｂ）。紫外線露光されたフォトレジスト２１を、適切な溶媒中で現像し、それによってシリコン２０を露出させる（図５Ｃ）。誘導結合プラズマエッチングシステムを使用して、シリコン２０を望ましい深さにエッチングする（図５Ｄ）。残ったフォトレジストを、適切な溶媒によって除去する（図５Ｅ）。図５Ｅに示すように、極薄の金（またはＴｉ）メッキベース２４をシリコン基板２０上に蒸着し、電気メッキプロセス用のテンプレートを作成する。スルファミン酸ニッケル浴に試料を浸漬し、導電膜として作用する金を用いて、ニッケル２５を、当該ニッケルの厚さが十分になるまでシリコンテンプレート２０に電気メッキする。ニッケルマスターは金層から生成され、金はニッケルマスターの一部となる。これが、図５Ｆに示すＮｉ機構２５を形成する。メッキ電流の関数であるメッキ速度と、テンプレート直径と、テンプレート厚さとを、約４５ｎｍ／分較正する。作製後、機構の寸法を検証するために、顕微鏡を使用して機構２５を検査する。残ったニッケル機構２５は、均一であり、望ましい形状を有するはずである。ニッケルマスター２５およびポリマー基板２６を、ポリマーのガラス転移温度をわずかに上回るまで加熱する。ニッケルマスター２５およびポリマー２６を接触させ、ニッケルマスター２５の機構をポリマー基板２６内にエンボス加工する。ニッケルマスター２５を除去することにより、元のシリコンウエハ２０と同一の機構を包含するポリマー２６を産生する（図５Ｇ）。
【０１７３】
図６は、本発明のシステム２００の、第３の実施形態の概略図である。この実施形態において、バイオセンサ６００、６０２、６０４がチップ２３０の周辺部の周囲に位置付けられる。バイオセンサ６００、６０２、６０４は、チップ２３０上に作成されたシステム２００の細胞の状態をさらに監視するために使用される。有利なことに、バイオセンサ６００、６０２、６０４をチップ２３０の周辺部の周囲に位置付けることにより、最小限のコストでチップ２３０を使い捨てとすることも可能である。換言すると、チップ２３０と共にバイオセンサ６００、６０２、６０４を捨てる必要はないことになる。バイオセンサ６００、６０２、６０４は、使い捨てチップ２３０上に設けられてもよいことに留意すべきである。この特定のオプションは、チップ２３０を使い捨てるバイオセンサ６００、６０２、６０４が、当該バイオセンサ６００、６０２、６０４も捨てる結果をもたらすため、費用効率のよいものとはならないであろう。バイオセンサ６００、６０２、６０４がチップ２３０から外れて位置付けられている場合、当該バイオセンサ６００、６０２、６０４はそれぞれの使用後に廃棄されるのではなく再利用されるため、最も費用効率がよい。バイオセンサ６００、６０２、６０４のそれぞれは、コンピュータ６２０の入力に接続される。
【０１７４】
図７は、コンピュータ６２０をさらに詳述する概略である。コンピュータ６２０は、各チップ２３０のシステム２００の動作を監視および調節する。コンピュータ６２０は、入出力インタフェース７００と内部レジスタ／キャッシュメモリ７０２とが設けられたマイクロプロセッサを含む。図示するように、マイクロプロセッサ７９８は、接続７１６を介してキーボード７０４と、コネクタ７１８を介して不揮発性記憶メモリ７０６、汎用メモリ７０８、およびルックアップテーブル７１０と、ならびに、コネクタ７２０を介してプリンタ／プロッタレコーダ７１２およびディスプレイ７１４と、インタフェースで連結する。
【０１７５】
不揮発性記憶メモリ７０６は、ＣＤ書き込み可能メモリ、磁気テープメモリ、ディスクドライブ等の形態であってよい。ルックアップテーブル７１０は、システム内のモデルとされる様々な物質に適用できる質量平衡方程式のセットの記憶用に用意された汎用メモリ７０８の一部を物理的に備えてよい。これらの方程式は、システム内の様々な生物的／化学的物質の、生理学的薬物動力学モデルを表す。内部レジスタ／キャッシュメモリ７０２および汎用メモリ７０８は、複数のプログラム命令の形態をしたシステムプログラムと、各チップ２３０のシステム２００内における事実上すべての機能を自動制御するための特殊データとを含有する。コンピュータは、システム２００と関連付けられたポンプ２６０を制御および調節することもできる。
【０１７６】
流量計から入出力インタフェース７００を介し、マイクロプロセッサ７９８への入力として、流体流れも提供され得る。これにより、ポンプ制御ラインを介してそれぞれポンプ２６０に送信されたプログラムコマンドの調整によって、システム内の流体流速を厳密に制御することが可能になる。例えば、流速は、導管５８中では９．５μＬ／分、流量計６６を通る際は２．５μＬ／分、流量計７８を通る際は７μＬ／分、および、導管７０中では２．５μＬ／分に設定され得る。容器５０内の培地の温度は、マイクロプロセッサ７９８によって調節されることもでき、当該マイクロプロセッサは、入出力インタフェース７００および温度指示ライン７２８を介して、温度プローブ７９２から温度測定結果を受け取る。これらの信号を受けて、マイクロプロセッサ７９８が、入出力インタフェース７００および加熱コイル制御ライン７３０を介して加熱コイル７９０をオンおよびオフにする。
【０１７７】
細胞培養チャンバ２１０および２１２内の生物学的および毒性反応／変化は、それぞれセンサ６００、６０２、および６０４によって検出され、入出力インタフェース７００だけでなく制御ラインも介してマイクロプロセッサ７９８へ伝達される。センサは、試験結果を表すために、特定の値または範囲の波長の観点から試験結果を表すように設計され得る。
【０１７８】
マイクロプロセッサ７９８は、研究者にキーボード７０４を介して対話制御を提供するためのプログラムを含むようにも極めて容易に適応できる。これは、例えば、培養コンパートメントのいずれかの状態を常に特異的に確認するようにコンピュータを方向付けることを可能にする。
【０１７９】
本発明が提供するさらなるオプションは、ＣＤ／テープメモリ７０６から情報を呼び戻すことにより、同様の実験について事前に記憶された試験結果を呼び戻すための能力である。したがって、メモリ７０６は、公開されている情報から採取された履歴データ、本発明のシステムを用いて行われた事前の実行試験から集められたデータ、または理論計算から派生するデータを保持するように事前にプログラムされ得る。ＣＤ／テープメモリの提供により、システムを情報検索ツールとして使用することも可能になる。当該システムは、例えば、キーボード７０４を介してマイクロプロセッサ７９８に入力された選択情報に基づいて、特定の試験化合物に、または特定の細胞株に付随する研究データを得ることができる。メモリ７０６内に情報の大型ライブラリを含む、または開発することにより、研究者らは試験実行をより知的に構成および計画することができるようになる。
【０１８０】
図８は、単一の筐体８００内に格納された、１つを超えるチップ２３０を示す概略である。筐体８００は、当該筐体内のチップ２３０のそれぞれについて同じ条件を維持する環境チャンバであってよい。筐体８００は、複数のチップ位置８１０、８１２、８１４、８１６を含む。各チップ２３０またはチップ位置８１０、８１２、８１４、８１６からの出力は、コンピュータ６２０に入力される。続いて、コンピュータ６２０は、複数のチップ２３０からシステム２００をリアルタイムで監視することができる。
【０１８１】
図９は、試験が異なる筐体８００、９００内にチップ２３０のセットを含み得ることを示す概略である。チップ２３０のぞれぞれの出力は、温度が若干高くなった場合等、環境における変化を監視され得る。１つの筐体内にあるチップのそれぞれは、そこに同じ細胞培養を有し得ること、つまり、筐体８００内にあるチップ２３０は、哺乳類の異なる部分または相互依存する臓器を筐体内に形成するために互いに相互接続されたチップを有し得ることがさらに考えられる。
【０１８２】
２次元細胞培養チャンバ２１０、２１２、２１３、２１４を使用する図２〜４および６〜９について、チップ２３０を考察する。３次元組織培養構成物は、それらの代謝において、より本物に近い場合があるため、さらに別のチップ１０００が３次元構成物の内包に対処する。以下、３次元組織をモジュラーフォーマットで組み込む、マイクロスケール細胞培養アナログ（Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ａｎａｌｏｇｏｕｓ；「ＣＣＡ」）デバイスの作成について記述する。ＣＣＡデバイスまたはチップ１０００は、肺細胞チャンバ用のフローオーバーアプローチ、および、その他の臓器用のフロースルーアプローチを組み込む。ＣＣＡ設計へのフロースルーアプローチについて、以下でさらに考察する。
【０１８３】
図１０は、チップ１０００の概略および流動方式を示す。チップ１０００は、４つのウェルまたは組織モジュールを含む。チップ１０００は、肺ウェル１０１０と、肝臓ウェル１０２０と、脂肪ウェル１０３０と、ゆっくり潅流されるウェル１０４０と、迅速に潅流されるウェル１０５０とを含む。チップ１０００を通って流体を循環させるために、管が使用される。ポンプ１０６０は、当該管を介して流体を移動させる。肺ウェル１０１０は、まずすべての流れを受け取る。肺１０１０の後、流体は４つの組織モジュールへ区分化することになる。肝臓モジュールは流量の２５％、脂肪モジュールは９％、ゆっくり潅流されるモジュールは１５％、迅速に潅流されるモジュールは５１％を得ることになる。流れチャネルの表面形状を調整することにより、肺ウェル１０１０からの流れを区分化する。各モジュールへのチャネルは、圧力降下の平衡を保ち、流れを釣り合わせるために、異なる長さのものとなる。流体は、その他の組織から離れた後、ポンプ１０６０を介して循環し、肺コンパートメントへ戻る。ウェルまたは組織モジュール１０２０、１０３０、１０４０、１０５０のそれぞれは、組織を保持する。当該組織は、ウェル１０２０、１０３０、１０４０、１０５０内のマイクロスケール管１０２２、１０３２、１０４２、１０５２内に保持される。図１０に示すように、ウェル１０２０、１０３０、１０４０、１０５０それぞれにつき１つのマイクロスケール管１０２２、１０３２、１０４２、１０５２のみがある。ウェルに複数の微小管を入れてもよいことに留意すべきである。
【０１８４】
動作中、３次元組織をＣＣＡデバイスまたはチップ１０００に組み込むことを可能にする２つの方法がある。いずれの方法も、ポリスチレンまたはガラスのマイクロスケール管を通る植菌培地の流れを含む。試験中の細胞は、管の内側に接着し、３次元組織内に集合する。当該管は収集され、束ねられ、チップ１０００上のウェルに入れられる。各ウェルは、水性薬物が通過して組織に接触する臓器モジュールとなる。
【０１８５】
３次元組織の組み込みを可能にするための第１の方法は、フロースルーリアクター戦略を含む。シリコンウエハ内に開口部が形成され、続いてチャネル付き培地が当該開口部を通過する。開口部の内面にあるシリコンは、細胞の足場を提供し、３次元組織内に集中した。この技術をポリマーＣＣＡ１０００に適用するために、ポリマー管を接着タンパク質で処理してもよいし、細胞を血清添加培地中で培養してもよい。血清および接着タンパク質はいずれも、細胞が管の内面に貼り付くのを可能にするものである。
【０１８６】
第２の方法は、ＨＡＲＶ微小重力反応炉中で細胞を培養するステップを含む。回転式リアクターの中心に管で足場を組むことによって、または、浮遊管を培地に導入することによって、細胞は当該管のいくつか内に３次元凝集塊を形成する。微小重力中で成長した細胞の高められた活性により、これらの組織収縮物は、２次元組織または上述の方法で形成された組織と比較して優れた機能を有する。内側に管を持つ組織を、重量または密度に従って分離し、デバイス上に置くことができる。
【０１８７】
図１１は、チップ１０００を組み込む細胞培養アナログデバイス１１００の部分分解等角図である。チップ１０００は、肺細胞培養領域１０１０と、当該肺細胞培養領域１０１０に接続された複数のウェルとを含む。ウェルは、肝組織ウェル１０２０と、脂肪組織ウェル１０３０と、ゆっくり潅流されるウェル１０４０と、迅速に潅流されるウェル１０５０とを含む。様々な組織を含有するマイクロスケール管が、ウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０内に収められる。各ウェルは、チップ１０００に付着されたエラストマー底部１１１０への出力を含む。エラストマー１１１０は、ポンプの一部である。システム１１００の流体を移動させるポンプ作用を産生するため、または、戻りライン１１３０を介し、ウェルから肺組織モジュール１０１０へシステム１１００の流体を循環させて戻すために、アクチュエータ１１２０がエラストマーを圧迫する。チップの上部の上にガラス層をかけて、肺組織モジュール１０１０および様々なウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０を覆う。チャネル１０２１、１０３１、１０４１、および１０５１は、様々なウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０を通るいくつかの流速を産生するように寸法決定されることに留意すべきである。様々なチャネル１０２１、１０３１、１０４１、１０５１の長さおよび幅を調整するよりもむしろ、様々なウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０への流速における変動を提供するために、チャネルに沿ってその他のフローリストリクターを置くことができると考えられる。ガラス上部１１４０は、柔軟性のある膜で置き換えることができ、チャネルの寸法以外によってチャネル１０２１、１０３１、１０４１、および１０５１内での流れを調節できるように、プランジャーボール型バルブを追加してよい。
【０１８８】
チップ１１００は、シリコンからできていてよいが、ポリスチレンまたはその他何らかの適切なプラスチックからチップ１０００を作るほうが費用効率がよい。従来の手段によって、まず各チップがシリコン内に形成される。続いて、シリコンからニッケルマスターが形成される。換言すれば、チップ１０００は、シリコンおよびニッケルマスター上にポリスチレンおよびシリコーンエラストマーを複製成形することによって製造される。当然ながら、ポリマーチップの製造における第１のステップは、シリコンウエハ上にチップを産生することである。初めに、フォトレジスト１２１０の層をシリコンウエハ１２００上に置く。フォトレジスト１２１０の上にマスクをかける。当該マスクは、肺組織培養領域１０１０のパターンを含有する。マスクは、紫外線がフォトレジストへと通過し、肺領域１０１０に対応する部分だけを露光させることを可能にする。次にフォトレジストが現像されて、肺組織培養領域１０１０に対応する開口部１２１１を産生する。次に、フォトレジストを持つシリコンウエハをエッチングして、シリコンウエハ１２００内に肺開口部１０１０を産生する。続いてシリコンウエハ１２００からフォトレジスト１２１０を除去し、肺ウェル１０１０は当該シリコンウエハに残す。続いて、フォトレジスト１２２０の別の層を、ウエハ１２００に入れる。ウエハの上にマスクを置く。マスクは、様々なウェルまたは１０２１、１０３１、１０４１、および１０５１を含む流体チャネルの露光を可能にし、それらは肺ウェル１０１０を様々なウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０と接続するために使用される。マスクは、流体チャネルの領域においてフォトレジストを露光させる。次にフォトレジストを現像して、流体流れチャネルに対応する露光されたフォトレジストを除去する。続いて、露光領域を望ましい深さまでエッチングする。その後、残ったフォトレジスト１２２０を除去し、肺ウェル１０１０およびその他のウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０はシリコンウエハ１２００に残す。次のステップは、さらに第３のフォトレジスト１２３０の層を塗布することである。マスクがフォトレジストの上にかけられ、当該マスクは、様々なウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０に対応する開口部を有する。フォトレジストにマスクをし、紫外線に露光させて、様々なウェルに対応する開口部を産生する。フォトレジストを現像し、ウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０用に露光したシリコン領域を残す。次に、チップおよびフォトレジスト１２３０をエッチングして、ウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０を産生する。組織モジュール１０２０、１０３０、１０４０、１０５０に対応する開口部を、約７５０マイクロメートルの深さまでプラズマでエッチングする。開口部をさらに２５０マイクロメートル、ＫＯＨで湿式エッチングし、先細端部を形成する。ＫＯＨはその結晶面に沿って５４．７度の角度でシリコンをエッチングすることになる。続いて、フォトレジストを除去し、シリコンウエハが形成され、それからニッケルマスターを作ることができる。
【０１８９】
シリコンチップにニッケルを電気メッキして、ニッケルマスター１２５０を作成する。次に、当該ニッケルマスターを使用して、ポリマー基板１０００を鋳造またはエンボス加工する。複製成形のために、適切な溶媒中でポリマーを溶融または可溶化してニッケルマスター１２５０に注ぎ、最初のシリコンチップと同じ形状に凝固させる。エンボス加工については、図５を参照されたい。続いて、ポリマーチップ１０００をシリコーンエラストマートラフ１１１０に取り付ける。ポリマーおよびシリコーンはセルフシールであるため、層が単一ユニットを形成することになる。様々な組織モジュール１０２０、１０３０、１０４０、１０５０から収集された流体を汲み上げるために、空気圧式アクチュエータ１１２０がチップの下に置かれる。毎秒、トラフは０．０３２マイクロリットルの流体でいっぱいになる。続いてアクチュエータがシリコーンを押し上げ、微小管を介して流体を逃がし、肺コンパートメント１０１０へ戻す。エラストマートラフ１１１０およびアクチュエータ１１２０がポンプ２６０を形成する（図１２に示す）。続いて、エラストマー被覆のポリメチルメタクリレート（ＰＬＥＸＩＧＬＡＳ（商標））１１４０が、ウエハまたはチップ１０００の上部を密封する。
【０１９０】
シリコーンが液体で充填された際に作成される引っ張り圧力を釣り合わせるために、肺細胞コンパートメント１０１０上のポリメチルメタクリレート（ＰＬＥＸＩＧＬＡＳ（商標））を除去し、シリコーン膜で置き換える。この膜は、シリコーンポンプの作用を受けて上下し、デバイスにおける圧力を釣り合った状態に保つ。チップ１０００の上にエラストマー被覆のポリメチルメタクリレート（ＰＬＥＸＩＧＬＡＳ（商標））をかける前に、様々なマイクロスケール管がウェルに入れられる。微小管を扱うための機械は、低下して特定数の組織積載型の管を回収する接着性のアームを含む。当該機械は、管をデバイスへ輸送し、それぞれのモジュールウェル１０２０、１０３０、１０４０、１０５０内に当該管を厳重に梱包する。厳重な梱包により、細胞培養アナログデバイスに対するいかなる攪拌にもかかわらず、管を適所に保つための摩擦力が可能になる。これは、それぞれのウェル１０２０、１０３０、１０４０、１０５０内における管の周囲での流体流れの漏れを最小限に抑える。緊合していても、流体流れの約５〜１０％が管を迂回し、シリコーンベースまたはエラストマートラフ１１１０へ直接流れる。
【０１９１】
図１３は、エラストマートラフを示す。エラストマートラフは、中に原則的に長方形の開口部を持つ一片のシリコーンエラストマーである。長方形の開口部は、ウェル１０２０、１０３０、１０４０、および１０５０に源を発する流体用の流体容器として作用する。エラストマートラフ１１１０は、参照番号１３００で表記される一側面に開口部を有する。戻りライン１１３０は、エラストマートラフ１１１０内の開口部１３００に付着する一端と、チップ１０００の肺ウェル１０１０に付着する他端とを有する。
【０１９２】
さらに別の実施形態において、エラストマートラフ１１１０はシリコーンエラストマーポンプ１４００で置き換えられ、これを図１４に示す。シリコーンエラストマーポンプ１４００は、チップ１０００上の、および参照番号１１００で描写されるシステム全体にわたる循環器系流れをより正確に再現するように設計される。ポンプ１４００は、第１の肺チャンバ１４１０および第２のシステムチャンバ１４１２を含み、これらは分離アクチュエータ１４２０および１４２２によって作動させられる。複数のチャンバ１４１０および１４１２によって、チップ１０００の底部に、マルチトラフエラストマーベースを持つ生理的により現実的なポンプパターンが作成される。特定の時間間隔で基部のセクションを押し上げるアクチュエータを有することでシリコーンエラストマートラフ１４００内に複数のチャンバ１４１０および１４１２を作成することにより、心臓のポンプ作用が複製される。
【０１９３】
図２８Ａは、本発明の一実施形態による、マイクロスケール培養デバイスを制御するためのシステムを図示するブロックダイアグラム図である。この実施形態において、システム２８００は、制御機器２８０２に連結された第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６を含む。第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６は、培地との複数のｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用をシミュレートする表面形状を持つ、複数のマイクロスケールチャンバ（２８０８、２８１０、２８１２、および２８１４）を含み、各チャンバは、培地の流れ用の入り口および出口、ならびに、チャンバを相互接続しているマイクロ流体チャネルを含む。制御機器２８０２は、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６からデータを取得し、その薬物動態パラメータを制御するための、コンピュータ２８０４を含む。
【０１９４】
別の実施形態において、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６は、コンピュータ化されたチップの上に形成される。第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６は、チャンバ内の生理的事象を計測するための制御機器２８０２に連結された１つ以上のセンサをさらに含む。センサは、培地の酸素、二酸化炭素、またはｐＨを監視する、１つ以上のバイオセンサを含む。制御機器２８０２は、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６を保持し、マイクロ流体チャネルを確立するために、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６の上部を密封する。制御機器２８０２は、マイクロ流体相互接続を提供し、それによって、マイクロ流体がデバイスへ／から流れる。別の実装において、コンピュータ２８０４は、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６の、ポンプ群速度、温度、実験の長さ、およびデータ取得の頻度から成る群より選択される薬物動態パラメータを制御する。一実装において、コンピュータ２８０４は、オペレータが、ポンプ速度、デバイス温度、実験の長さ、およびデータ取得の頻度を（例えば、１５分毎に）手動で特定することもできるように、設定画面を提供する。別の実装において、コンピュータ２８０４は、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６における、流速、チャンバ表面形状、および細胞の数から成る群より選択される薬物動態パラメータを制御する。この実装において、システム２８００は、丸ごとの動物研究および従来の組織培養研究と比較して、より迅速で敏感な反応を提供する。パラメータを制御することにより、システム２８００は生理学ベースでなくなる。別の実装において、コンピュータ２８０４は、生体中で遭遇するものと同程度の、チャンバ（２８０８、２８１０、２８１２、および２８１４）内での培地滞留時間を作成するために、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６内にある１つ以上のポンプをさらに制御する。別の実装において、コンピュータ２８０４は、生体をシミュレートした部分に関連付けられた薬物動態パラメータ値と一致する様式で、マイクロ流体チャネルに沿って分布する１つ以上のバルブをさらに制御する。
【０１９５】
別の実施形態において、システム２８００は、培地との複数のｉｎ  ｖｉｖｏ相互作用をシミュレートする表面形状を持つ複数のマイクロスケールチャンバを有する第２のマイクロスケール培養デバイスをさらに含み、各チャンバは、培地の流れのための入り口および出口、ならびに、チャンバを相互接続するマイクロ流体チャネルを含む。制御機器２８０２は、第２のマイクロスケール培養デバイスに連結される。
【０１９６】
図２８Ｂは、マイクロスケール培養デバイスを制御するためのシステムの、別の実施形態を図示するブロックダイアグラム図である。この実施形態において、システム２８１６は、制御機器２８１８に連結された第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６を含む。制御機器２８１８は、コンピュータ２８０４と、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６のマイクロ流体チャネルにおけるマイクロ流体の循環を制御するためのポンプ２８２０と、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６の温度を制御するための加熱素子２８２２と、光源２８２４と、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６内の細胞コンパートメントからの蛍光発光を検出するための光検出器２８２６と、を含む。一実装において、コンピュータ２８０４は、比色分析、蛍光分析、発光性、および放射分析から成る群より選択される種類の計測機器を使用して、蛍光強度を表すデータを記録する。別の実装において、加熱素子２８２２は、第１のマイクロスケール培養デバイス２８０６を、摂氏３７度の温度に維持する。
【０１９７】
図２９は、本発明の一実施形態による、マイクロスケール培養デバイスを動的に制御するコンピュータ化された方法を図示するフローダイアグラム図である。この実施形態において、コンピュータ化された方法２９００は、ブロック２９０２、２９０４、２９０６、および２９０８を含む。ブロック２９０２は、マイクロスケール培養デバイスの複数のチャンバ内での生理的事象を計測するための複数のセンサからのデータを分析するステップを含む。ブロック２９０４は、マイクロスケール培養デバイスのチャンバ内にある培地の流体流速を調節するステップを含む。ブロック２９０６は、マイクロスケール培養デバイスのチャンバ内での生物反応または毒性反応を検出するステップを含む。ブロック２９０８は、そのような検出時に、マイクロスケール培養デバイスの１つ以上の薬物動態パラメータを変化させるステップを含む。
【０１９８】
一実施形態において、ブロック２９０６（すなわち、検出するステップ）は、マイクロスケール培養デバイスの細胞コンパートメントの寸法における変化を検出するステップを含む。一実装において、ブロック２９０８（すなわち、変化させるステップ）は、マイクロスケール培養デバイスにおける、細胞間相互作用、液体滞留時間、液体対細胞比、細胞による代謝、およびせん断応力から成る群より選択される薬物動態パラメータを変化させるステップを含む。別の実装において、ブロック２９０８は、マイクロスケール培養デバイスにおける、流速、チャンバ表面形状、および細胞の数から成る群より選択される薬物動態パラメータを変化させるステップを含む。
【０１９９】
別の実施形態において、コンピュータ化された方法２９００は、マイクロスケール培養デバイス内のチャンバ表面形状を最適化するステップをさらに含み、当該最適化するステップは、チャンバの数量を選択するステップと、適正な組織または臓器サイズ比を提供するチャンバ表面形状を選定するステップと、適正な液体滞留時間を提供する最適流体流速を選定するステップと、細胞せん断応力を計算するステップと、を含む。
【０２００】
別の実施形態において、コンピュータ化された方法２９００は、培地の温度を調節するステップをさらに含む。さらに別の実施形態において、コンピュータ化された方法２９００は、マイクロスケール培養デバイスの細胞コンパートメントからの蛍光発光を検出するステップをさらに含む。
【０２０１】
別の実施形態において、コンピュータ可読媒体は、上述のコンピュータ化された方法の様々な実施形態を実行するために、そこに記憶されたコンピュータ実行可能命令を含む。一実装において、コンピュータ可読媒体は、メモリまたはストレージデバイスを含む。別の実装において、コンピュータ可読媒体は、搬送波において具現化されるコンピュータデータ信号を含む。
【０２０２】
図３０は、本発明の一実施形態による、マイクロスケール培養デバイスを制御するためのコンピュータを図示するブロックダイアグラム図である。この実施形態において、コンピュータ３０００は、マイクロプロセッサ３００２と、汎用メモリ３００４と、不揮発性記憶素子３００６と、１つ以上のセンサを有するマイクロスケール培養デバイスとのインタフェースを含む入出力インタフェース３００８と、コンピュータソフトウェアとを含む。当該コンピュータソフトウェアは、マイクロスケール培養デバイスの複数のチャンバ内での培地の流体流速を調節し、マイクロスケール培養デバイスのチャンバ内での生物反応または毒性反応を検出し、検出時に、マイクロスケール培養デバイスの１つ以上の薬物動態パラメータを変化させるために、マイクロプロセッサ３００２において実行可能である。
【０２０３】
一実施形態において、不揮発性記憶素子３００６は、公開されている情報から採取された履歴データ、事前の実行試験から集められたデータ、または理論計算から派生するデータを含む。コンピュータソフトウェアは、ポンプ制御ラインを介してマイクロスケール培養デバイスの１つ以上のポンプにコマンドを送信することにより、流体流速を調節する。一実装において、コンピュータソフトウェアは、培地の温度を調節するために、マイクロプロセッサ３００２においてさらに実行可能である。コンピュータソフトウェアは、加熱コイル制御ラインを介してマイクロスケール培養デバイスの加熱コイルにコマンドを送信することによって温度を調節する。
【０２０４】
別の実施形態において、コンピュータ３０００は、システム内の様々な生物的または化学的物質の生理学的薬物動力学モデルを表す質量平衡方程式のセットを記憶するための汎用メモリ３００４に連結されたルックアップテーブルメモリと、コンピュータソフトウェアを記憶するためのマイクロプロセッサ３００２に連結されたキャッシュメモリとをさらに含む。
【０２０５】
別の実施形態において、入出力インタフェース３００８は、キーボードインタフェースと、ディスプレイインタフェースと、プリンタ／プロッタレコーダインタフェースとをさらに含む。一実装において、コンピュータ３０００は、これらの入出力インタフェースを使用して、キーボード、ディスプレイ、およびプリンタ／プロッタレコーダの周辺デバイスと接続する。
【０２０６】
実験
以下の実施例は、当業者らに、主題発明の作法および使用法の完全な開示および説明を提供するために提起するものであり、本発明として見なされる範囲の限定を意図するものではない。
【０２０７】
使用される数字（例えば、量、温度、濃度）についての精度を保証するための取り組みを行ったが、いくつかの実験誤差および偏差が生じている。別段の指示がない限り、部は重量部、分子量は重量平均分子量、温度は摂氏温度、圧力は大気のものまたはその付近である。
【０２０８】
方法
実験的プロセスにおいて、以下の方法を使用した：
細胞培養。細胞は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナッサス）から入手され、
組織培養インキュベータ（９５％Ｏ２／５％ＣＯ２）内の推奨される完全成長培地中で繁殖させられる。ＨｅｐＧ２およびＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞用に、推奨される媒質は、Ｅａｇｌｅの最小必須培地（Ｅａｒｌｅの平衡塩類溶液、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ助成、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、および、１０％ウシ胎仔血清を伴う）（ＥＭＥＭ）である。１．５ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、および１０％ウシ胎仔血清を伴うＭｃＣｏｙの５Ａ培地は、ＨＣＴ‐１１６用に推奨される。
【０２０９】
成長曲線。成長曲線は、３５ｍｍディッシュ中、初期の低密度で細胞をメッキすることによって測定した。毎日、トリプシン‐ＥＤＴＡで細胞を脱離し、血球計を使用して細胞を視覚的にカウントすることによって細胞数を測定した。測定は、３通り行った。
【０２１０】
逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ‐Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ；ＲＴ‐ＰＣＲ）。必要に応じてコラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（商標）、またはポリリジンで処理したガラスカバースリップ上で、細胞を培養した。〜９０％融合性単層に成長させたＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａをトリプシン‐ＥＤＴＡで脱離させ、５分間、〜５００ｇ沈殿させた。ＲＮＡを単離し、製造元のプロトコルに従って、ＲＮＥＡＳＹ（商標）キット（Ｑｉａｇｅｎ）で精製した。成人ヒト肝臓ｔｏｔａｌＲＮＡは、Ａｍｂｉｏｎから購入した。単離したＲＮＡの量と純度（２６０／２８０ｎｍ比）を、ＢＩＯＰＨＯＴＯＭＥＴＥＲ（商標）分光光度計（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）で計測した。次に、単離したＲＮＡを２ＵのＤｎａｓｅＩで２５分間、３７℃でインキュベートし、その後、ＤＮａｓｅ  Ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ（Ａｍｂｉｏｎ）で不活化した。
【０２１１】
７２℃まで２分間加熱した後、２分間氷上に置いた、５μｇＲＮＡ、１０μＭオリゴｄＴプライマーの混合物を使用して、ＲＴ反応を実行した。次に、５ｍＭ  ＤＴＴ、６００μＭ  ｄＮＴＰ  混合物、４０Ｕ  ｒＲＮａｓｉｎ、２００Ｕ  ＳＵＰＥＲＳＣＲＩＰＴＩＩ（商標）を逆転写酵素緩衝液中で化合させ、４２℃で１時間インキュベートした。
【０２１２】
チトクロームＰ４５０アイソフォームに特異的なプライマーを使用し、２．０μｌの第１鎖ｃＤＮＡを５０μｌ  ＰＣＲ反応において使用した（Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ‐Ａｎｔｏｎａ、Ｃ．，Ｊｏｖｅｒ，Ｒ．、Ｇｏｍｅｚ‐Ｌｅｃｈｏｎ、Ｍ．‐Ｊ．、およびＣａｓｔｅｌｌ，Ｊ．Ｖ．（２０００年）、Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＲＴ‐ＰＣＲ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ‐４５０ｓ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｔｏ  ｄｒｕｇ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｉｅｓ、Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．、３７６：１０９〜１１６）。ＰＣＲ条件は、９４℃で４分間の後、９４℃で４０秒、６０℃で４５秒、７２℃で５０秒、および、７２℃で最後の４分間延長の２８サイクルとした。
【０２１３】
ＰＣＲ産物を１．２％アガロースゲル上で電気泳動法により分離し、ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄで染色することによって視覚化し、適切な分子量標準と信憑性を比較した。増幅ｃＤＮＡを定量化するために、１５μｌの各ＰＣＲ反応物を、０．１ｘ  Ｔｒｉｓ‐ＥＤＴＡ緩衝液で希釈し、最終濃度１：４００において、ＰＩＣＯＧＲＥＥＮ（商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）で染色した。蛍光を計測すると、４８０ｎｍ励起および５２０ｎｍ発光であった。結果をβアクチンに対して標準化し、少なくとも２つの分離した実験から３通り行った。
【０２１４】
細胞の生存、死、およびアポトーシスアッセイ。トリパンブルー色素排除法またはＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ）を使用して、細胞の生存および細胞死を測定した。トリパンブルー（ＧＩＢＣＯ）は、通常、細胞質から排除され、死細胞または瀕死の細胞を視覚的に青く染色することにより、損傷膜を持つ細胞を識別する。実験の終わりに、１：１希釈の０．４％（ｗ／ｖ）トリパンブルー溶液を、チップデバイスの再循環培地に添加する。この溶液を、室温で３０分間、チップを介して汲み上げて廃棄した。筐体をポンプから除去し、反射顕微鏡（Ｍｉｃｒｏｍａｓｔｅｒ、Ｆｉｓｈｅｒ）下で視覚化させた。
【０２１５】
ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色は、カルセインＡＭおよびエチジウムホモダイマーから成る２成分染色である。生細胞はカルセインＡＭのアセトキシメチルエステル（Ａｃｅｔｏｘｙｍｅｔｈｙｌ  Ｅｓｔｅｒ；ＡＭ）部分を活発に加水分解してカルセインの鮮緑色の蛍光を産生する。対照的に、損傷された膜完全性を有する細胞は、通常は膜非透過性のエチジウムホモダイマーが死細胞または瀕死の細胞の核を蛍光赤色に染色することを可能にする。細胞透過性の核染色液Ｈｏｅｃｈｓｔ３３３４２は、すべての細胞に対し一般的な染色液として作用する。適切なフィルターセットと共に、生細胞は蛍光緑色、瀕死の細胞または死細胞は赤色、およびすべての細胞を青色核蛍光によって定量化する。本明細書に記載する実験では、トリパンブルーは０．２％（ｗ／ｖ）、カルセインＡＭは１：２０，０００、ヨウ化プロピジウムは１：５，０００、およびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２は１０μｇ／ｍｌのものを使用した。細胞を、Ｍ２Ｂｉｏ実体蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によって視覚化した。ＡＵ実験を少なくとも３回繰り返し、３通りの測定結果を作った。
【０２１６】
多数の方法を使用して、アポトーシス、つまりプログラムされた細胞死を監視することができる（Ｓｍｙｔｈ，Ｐ．Ｇ．、Ｂｅｒｍａｎ，Ｓ．Ａ．，およびＢｕｒｓｚｔａｊｎ，Ｓ．（２０００年）、Ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３２：６４８〜６６５）。アポトーシスをネクローシスと区別するために、アポトーシスの少なくとも２つの分離したインジケータが必要である（Ｗｒｏｎｓｌα，Ｒ．、Ｇｏｌｏｂ，Ｎ．、およびＧｒｙｇｅｒ，Ｅ．（２００２年）、Ｔｗｏ‐ｃｏｌｏｒ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ‐ｂａｓｅｄ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３２：６６６〜６６８）。１つの方法であるアネキシンＶ‐ＦＩＴＣ結合は、２価カルシウムの存在下でアネキシンＶがホスファチジルセリンに密着結合するという観察に依存する（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ，Ｐ．、Ｅｉｊｎｄｅ，Ｓ．ｖ．ｄ．、およびＳｃｈｌｅｇｅｌ，Ｒ．Ａ．（２００１年）、Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ  ｅｘｐｏｓｕｒｅ  ａｎｄ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ，Ｉｎ  Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ、Ｌ．Ｍ．ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＪ．Ｄ．Ａｓｈｗｅｌｌ編（サンディエゴ、Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ）３３９〜３６４ページ）。通常、ホスファチジルセリンは細胞膜の内部小葉上に存在するが、アポトーシスの初期に細胞膜へ転位する。フルオロリン酸で標識されたアネキシンに曝露されてアポトーシスを起こした細胞は、明瞭な膜染色を呈する。マイクロスケールチップでは、まずＰＢＳでシステムを洗い流し、次にアネキシンＶ‐ＦＩＴＣ（アネキシンＶ結合緩衝液中に１０μｇ／ｍｌ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を３０分間再循環させることによって、アネキシンＶ‐ＦＩＴＣ標識を顎上で直接的に視覚化した。続いて、ＦＩＴＣフィルターセットを使用して、細胞を直接的に視覚化した。
【０２１７】
アネキシンＶ標識とは対照的に、ＡＰＯＰＴＡＧ（商標）キット（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．、マサチューセッツ州）では、アポトーシスに関連するＤＮＡ分解および免疫蛍光法を使用する視覚化中に露出した遊離３´‐ＯＨ  ＤＮＡ末端を標識するために、末端デオキシヌクレオチド転移酵素を使用する（Ｌｉ，Ｘ．、Ｔｒａｇａｎｏｓ，Ｆ．、Ｍｅｌａｍｅｄ，Ｍ．Ｒ．、およびＤａｒｚｙｎｋｉｅｗｉｃｚ，Ｚ．（１９９５年）、Ｓｉｎｇｌｅ‐ｓｔｅｐ  ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ  ｆｏｒ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ＤＮＡ  ｓｔｒａｎｄ  ｂｒｅａｋｓ  ｗｉｔｈ  ｆｌｏｕｒｅｓｃｅｉｎ―ｏｒ  ＢＯＤＰＹ―ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ：ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ａｎｄ  ｂｒｏｍｏｄｅｏｘｙｕｒｉｄｉｎｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ２０、１７２〜１８０）。この方法はアポトーシスに極めて特異的であるが、固化ステップおよびインキュベーションステップがあるため、当該手順をオンチップで為すことはできない。簡単に言うと、マイクロスケールチップを特定の実験条件下で実行し、細胞チップをそれらの筐体ユニットから除去し、１％パラホルムアルデヒド中に固定し、製造元のプロトコルを使用してＡＰＯＰＴＡＧ（商標）キットで処理した。
【０２１８】
マイクロスケールチップ作製および実験方法。以下のようにしてマイクロスケールチップを作製した：コンピュータ支援設計（Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｄｅｓｉｇｎ；ＣＡＤ）ソフトウェア（Ｃａｄｅｎｃｅ）を使用してパターンを設計し、ＧＣＡ／Ｍａｎｎ３６００Ｆ  Ｏｐｔｉｃａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒを使用してクロムフォトマスクを作成した。続いて、Ｋａｒｌ  Ｓｕｓｓ  ＭＡ６  Ｃｏｎｔａｃｔ  Ａｌｉｇｎｅｒを使用し、フォトマスクを介してウエハを紫外線に露光させることにより、この高解像度パターンを、ポジ型フォトレジスト（Ｓｈｉｐｌｅｙ１８１３）の薄被覆（〜１μｍ）を含有するシリコンウエハ（直径３インチ）に転移させた。露光後、フォトレジストを現像することにより、画定されたパターン中のフォトレジスト層を介して、シリコンを露光させた。露光したシリコンを、ＰｌａｓｍａＴｈｅｒｍ  ＳＬＲ  ７７０  ＩＣＰ  Ｄｅｅｐ  Ｓｉｌｉｃｏｎ  Ｅｔｃｈ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、特定の深さ（２０〜１００μｍ）までエッチングした。アセトンを用いてフォトレジストをウエハから剥ぎ取った。個々の２２ｍｍ平方マイクロスケールチップをウエハからダイスカットし、Ｎａｎｏｓｔｒｉｐ（Ｃｙａｎｔｅｋ）中で洗浄し、蒸留水中ですすぎ、１７０℃の乾燥炉中で乾燥させた。
【０２１９】
臓器コンパートメント中のシリコンの表面をコラーゲンで処理して細胞付着を促進した。約１０μｌのＩ型コラーゲンの１ｍｇ／ｍｌ溶液をマイクロスケールチップの表面に蒸着し、室温で３０分間インキュベートした。コラーゲン溶液を除去し、臓器コンパートメントを細胞培養液ですすいだ。細胞を細胞培養ディッシュから解離し、細胞数を測定し、各細胞コンパートメント内に細胞の融合性単層があるように濃度を調整した。例えば、図２に記載したマイクロチップ（上記）では、１０μｌのＬ２細胞の２，４００細胞／μｌ懸濁液を細胞チップの肺チャンバに蒸着し、１５μｌのＨ４ＩＩＥ細胞の３，４００細胞／μｌ懸濁液を肝臓チャンバに蒸着した。細胞をＣＯ２インキュベータ内に一晩付着させた。細胞が付着すると、アクリルチップ筐体内でチップを組み立てた。筐体の上部は、チップに細胞培養液を提供するために、流体相互接続を含有する。ステンレス鋼管をマイクロ径ポンプ管に接続し、試験化合物の有無にかかわらず培地を含有する微小遠心管の上部にある小さい孔に挿入する。ポンプ管を蠕動ポンプに接続し、この溶液で呼び水をし、チップ筐体の入り口ポートに接続する。端部に接続されたステンレス鋼管を持つポンプ管の小断面を出口ポートに接続し、当該管を微小管の上部にある小さい孔に挿入することによって、再循環流体回路を完成させる。機器全体を３７℃のＣＯ２インキュベータ内に入れる。この設定の概略図を、図２２に提示する。
【０２２０】
（実施例１）
ラットを複製するシステムの循環
チップ１０００の設計において、２ｃｍ×２ｃｍを超えないシリコンチップに、必要なチャンバをすべて収めた。このサイズのチップは製造が容易で、流体流れを方向付けるために使用することを意図された接続管およびポンピングデバイスのサイズに適合する。デバイスの設計を制約する重要な要因はその他にもいくつかあり、各変数の許容値と共に以下に羅列する。デバイスのこの一実施形態は、２つのコンパートメントシステムから成り、一方のコンパートメントはラットの肝臓を表し、一方のコンパートメントはラットの肺を表している。チップの総サイズは２ｃｍ×２ｃｍであり、「肺」チャンバとしての役割を果たすための幅４０μｍ、深さ１０μｍ、長さ５ｍｍの２０の並列チャネルと、「肝臓」チャンバの役割を果たすための幅１００μｍ、深さ２０μｍ、長さ１０ｃｍの蛇行形状をした２つの並列チャネルの、相互接続した配列から成る。２つの臓器コンパートメントは、幅１００μｍ、深さ２０μｍのチャネルによって接続されている。その他多くの考えられる表面形状、寸法、チャンバの数等がある。一例としてこの設計を選定した。
【０２２１】
【表１】
2008539787.tif 000003
計算例
チャネルまたはチャンバ計算：
これらの計算では、システム１１００のチップ１０００に関し、上述した方法によって、前回の反復から流速を得たものと仮定する。
【０２２２】
これにより、Ｑ＝８．０５×ｌ０５μｍ３／トレンチ秒である。
【０２２３】
続いて、トレンチ中での液体滞留時間を、以下のようにして計算した；
【０２２４】
【数１】
2008539787.tif 000004
次に、「細胞長さ」中の細胞数を計算した。
【０２２５】
【数２】
2008539787.tif 000005
続いて、チャネル／チャンバの細胞長さ容積を計算した。
【０２２６】
【数３】
2008539787.tif 000006
細胞長さ容積も測定した。
【０２２７】
【数４】
2008539787.tif 000007
液体の細胞長さ容積は、チャネル／チャンバの細胞長さ容積から単純に細胞の細胞長さ容積を減じたものである。細胞の細胞長さ容積と液体の細胞長さ容積の比は、システムの液体対細胞容積比を求めるものである。
【０２２８】
【数５】
2008539787.tif 000008
所与の流速と関連付けられた個々の細胞にかかるせん断力を測定した。液体の細胞長さ容積および細胞の直径に基づいて、液体を通過させるために利用可能なアベレージ表面積を計算した。
【０２２９】
【数６】
2008539787.tif 000009
続いて、チャネル内のアベレージ線速度を計算した。
【０２３０】
【数７】
2008539787.tif 000010
層流を前提として、球体にかかる抵抗を計算するためにストークスの法則を使用し、個々の細胞が受ける全せん断力を推定した。
【０２３１】
【数８】
2008539787.tif 000011
次に、チャネル／チャンバ内における液体の実際の滞留時間を検証し、チャネル／チャンバ内にある全細胞数まで計算した。
【０２３２】
【数９】
2008539787.tif 000012
Ｉ．Ｂ．膜酸化計算：
シリコーン膜の酸化する面積を以下のようにして測定した：
まず、細胞の酸素摂取速度（Ｏｘｙｇｅｎ  Ｕｐｔａｋｅ  Ｒａｔｅ；ＯＵＲ）の近似値を求める：
【０２３３】
【数１０】
2008539787.tif 000013
続いて、液体媒質を再酸化するのに十分か否かを判断するために、膜の内側にかかる酸素の分圧を計算する。これは、多孔質膜を通るガスの流束の方程式を使用して為され、ここでＱは膜透過性である。Ｊは細胞へのガスの流束を表し、ｚは膜の厚さである：
【０２３４】
【数１１】
2008539787.tif 000014
この圧力は、膜と接触している液体媒質に２００秒で酸素を飽和させるのに十分である。内側の酸素分圧を最大化するように、反復様式で膜の面積を測定した。
【０２３５】
【表２】
2008539787.tif 000015
【０２３６】
【表３】
2008539787.tif 000016
【０２３７】
【表４】
2008539787.tif 000017
【０２３８】
【表５】
2008539787.tif 000018
【０２３９】
【表６】
2008539787.tif 000019
【０２４０】
【表７】
2008539787.tif 000020
【０２４１】
【表８】
2008539787.tif 000021
【０２４２】
【表９】
2008539787.tif 000022
【０２４３】
【表１０】
2008539787.tif 000023
（実施例２）
４つの臓器コンパートメントチップ
チップは、４つの臓器コンパートメント―異物代謝に関与する臓器を表すための「肝臓」コンパートメント、標的組織を表す「肺」コンパートメント、部位に疎水性化合物の生物蓄積を提供するための「脂肪」コンパートメント、および、非代謝、非蓄積の組織において循環パターンを模倣するのを補佐するための「その他の組織」コンパートメント―から成るように設計した（図１５）。これらの、およびその他の臓器コンパートメント（例えば、腎臓、心臓、結腸、または筋肉）は、ＣＡＤファイルとして完全にモジュール化され、任意の構成または組み合わせで作製されることができる。デバイス自体を任意の数の基板（例えば、シリコン、ガラス、またはプラスチック）内に産生することができる。
【０２４４】
細胞を適切なコンパートメントに撒くと、Ｌｕｃｉｔｅマニホールド中でチップを組み立てた。このマニホールドは４つのチップを保持し、透明上部を含有するため、細胞をｉｎ  ｓｉｔｕで観察することができた。流体を含有する上部は、チップに細胞培地を提供するために相互接続している。蠕動ポンプを使用し、０．５μｌ／分の流速でチップを介して培地を汲み上げた。流体容器（総容積〜１５から５０μｌ）、マイクロ径管、ならびに、チップのコンパートメントおよびチャネルから成る閉ループ内で、培地を再循環させた。
【０２４５】
肝臓コンパートメント中にヒトＨｅｐＧ２‐Ｃ３Ａ細胞、および、標的組織コンパートメント中にＨＴ２９結腸癌細胞を持つ３コンパートメントシステムを使用して、細胞は連続動作下で１４４時間を超えて生存可能なままであることが分かった。ＨｅｐＧ２‐Ｃ３Ａ細胞は、様々な肝代謝酵素を新鮮な初代ヒト肝細胞と同程度のレベルで発現することが知られている、十分に特徴付けられたヒト肝細胞株である。これらの実験において、細胞を適切なコンパートメントに撒き、当該システムを介して最大１４４時間、特別に調合された細胞培地を再循環させた。３０分間のうち、様々な時点において、培地をＰＢＳ含有ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ蛍光試薬（デュアル蛍光染色液［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、米国オレゴン州ユージーン］）に切り替えた。蛍光顕微鏡下で細胞を視覚化し、適切なフィルターセットを使用して、同一フィールドの蛍光画像を得た。生細胞は緑色の蛍光を発し、一方、死細胞は赤色であった（データは示さず）。
【０２４６】
（実施例３）
チップ内での薬物代謝
３つのコンパートメント、肝臓、標的組織、およびその他の組織を備えるマイクロスケールチップを使用して、広く使用されている２つのプロドラッグ、テガフールおよびスリンダクスルホキシドの代謝を研究した。いずれのプロドラッグも、肝臓内に存在する酵素による活性代謝への変換を必要とし、標的臓器に対する細胞毒性効果を有する。プロドラッグスリンダクスルホキシドについて、その抗炎症および癌化学予防特性は、肝酵素スルホキシドレダクターゼに触媒されて、その硫化物およびスルホン代謝物から派生したものである。スルホン代謝物（および第２のスルホン代謝物）は、いくつかの癌細胞（例えば、結腸癌）においてアポトーシスを誘発することを実証した。
【０２４７】
適正な治療計画では、５‐ＦＵ自体が正常細胞に対して極めて有毒であるため、そのプロドラッグ、テガフール［５‐フルオロ‐１‐（２‐テトラヒドロフリル）‐２，４（１Ｈ，３Ｈ）‐ピリミジンジオン］の投与が必要である。しかしながら、スリンダクとは異なり、テガフールは最初にチトクロームＰ４５０  ２Ａ６によって肝臓内で５‐ＦＵに変換される。
【０２４８】
スリンダクの効能を試験するために、マイクロスケールチップの、肝臓コンパートメント内にＨｅｐＧ２‐Ｃ３Ａ細胞を撒き、標的組織コンパートメント内にＨＴ２９ヒト結腸癌細胞を撒いた。１００マイクロモルのスリンダク（製造元を必要とする）を再循環媒質に２４時間添加し、チップを上述のように処理した―生細胞は緑色の蛍光を発し、一方、死細胞は赤色の蛍光を発した（データは示さず）。ＨｅｐＧ２‐Ｃ３Ａ細肝細胞の不在下では、最小レベルの細胞死（賦形剤対照と同様）が観察された。これらの結果は、薬物は肝臓コンパートメント内で代謝されることができ、したがって、標的に循環してその代謝産物が生きている動物またはヒトにおけるものと同じだけの生物学的効果を誘発することを実証している。
【０２４９】
癌治療用プロドラッグ、テガフールを、マイクロスケールチップシステムにおいて試験した。効能のために、テガフールは、肝臓内に存在するチトクロームＰ４５０酵素による、その活性形態である５‐フルオロウラシル（５‐ＦＵ）に対する代謝活性化を必要とする（Ｉｋｅｄａ，Ｋ．、Ｙｏｓｈｉｓｕｅ，Ｋ．、Ｍａｔｓｕｓｈｉｍａ，Ｅ．、Ｎａｇａｙａｍａ，Ｓ．、Ｋｏｂａｙａｓｈｉ，Ｋ．、Ｔｙｓｏｎ，Ｃ．Ａ．、Ｃｈｉｂａ，Ｋ．、およびＫａｗａｇｕｃｈｉ，Ｙ．（２０００年）、Ｂｉｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｇａｆｕｒ  ｔｏ  ５‐ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｉｓ  ｃａｔａｌｙｚｅｄ  ｂｙ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ‐４５０  ２Ａ６  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、６、４４０９〜４４１５；Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｔ．、Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．、Ｓｈｉｍａｄａ，Ｎ．、Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．、およびＹｏｋｏｉ，Ｔ．（２０００年）、Ｒｏｌｅｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅｓ  Ｐ４５０  １Ａ２，２Ａ６，ａｎｄ  ２Ｃ８  ｉｎ  ５‐ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｆｒｏｍ  ｔｅｇａｆｕｒ，ａｎ  ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｄｒｕｇ，ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．、２８、１４５７〜１４６３；Ｙａｍａｚａｋｉ，Ｈ．、Ｋｏｍａｔｓｕ，Ｔ．、Ｔａｋｅｍｏｔｏ，Ｋ．、Ｓｈｉｍａｄａ，Ｎ．、Ｎａｋａｊｉｍａ，Ｍ．、およびＹｏｋｏｉ，Ｔ．（２００１年）、Ｒａｔ  ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ  Ｐ４５０  ＩＡ  ａｎｄ  ３Ａ  ｅｎｚｙｍｅｓ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ｂｉｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｅｇａｆｕｒ  ｔｏ  ５‐ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ  ａｎｄ  ａｕｔｏｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｔｅｇａｆｕｒ  ｌｉｖｅｒ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ、Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔ．Ｄｉｓｐ．、２９、７９４〜７９７）。適正な治療規制では、５‐ＦＵ自体が正常細胞に対して極めて有毒であるため、そのプロドラッグ、テガフールの投与が必要である。５‐ＦＵは、結腸癌の患者に対する現在最も有効なアジュバント療法である（Ｈｗａｎｇ，Ｐ．Ｍ．、Ｂｕｎｚ，Ｆ．、Ｙｕ，Ｊ．、Ｒａｇｏ，Ｃ、Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．Ｐ．、Ｋｅｌｓｏ，Ｇ．Ｆ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．Ｊ．、Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．、およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（２００１年）、Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｐ５３‐ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，５‐ｆｌｕｏｒｏｕｒａｃｉｌ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、７、１１１１〜１１１７）。ほとんどの化学療法剤と同様に、５‐ＦＵは、活性酸素種の生成によって感受性細胞中に著しいアポトーシスを誘発する（Ｈｗａｎｇ，Ｐ．Ｍ．、Ｂｕｎｚ，Ｆ．、Ｙｕ，Ｊ．、Ｒａｇｏ，Ｃ、Ｃｈａｎ，Ｔ．Ａ．、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｍ．Ｐ．、Ｋｅｌｓｏ，Ｇ．Ｆ．、Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ａ．Ｊ．、Ｋｉｎｚｌｅｒ，Ｋ．Ｗ．、およびＶｏｇｅｌｓｔｅｉｎ，Ｂ．（２００１年）、Ｆｅｒｒｅｄｏｘｉｎ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ  ａｆｆｅｃｔｓ  ｐ５３−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ，５‐ｆｌｕ���ｒｏｕｒａｃｉｌ‐ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ、Ｎａｔ．Ｍｅｄ．、７、１１１１〜１１１７）。
【０２５０】
結腸癌細胞に対するテガフールの細胞毒性効果を計測するために、肝臓コンパートメント内にＨｅｐＧ２‐Ｃ３Ａ細胞を、標的組織コンパートメント内にＨＣＴ‐１１６ヒト結腸癌細胞を持つマイクロスケールチップを調製した。テガフールを様々な濃度で再循環媒質に２４時間添加し、細胞をＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２、膜透過性ＤＮＡ染料、および、エチジウムホモダイマー、膜不透過性ＤＮＡ染料で標識した（方法の節を参照）。すべての細胞が青色の蛍光を発したが、死細胞は蛍光赤色のエチジウムホモダイマーでマークされた（データは示さず）。テガフールは、このマイクロスケールチップシステム内においては用量依存的にＨＣＴ‐１１６細胞に対して細胞毒性であったが、従来の細胞培養アッセイでは効果がなかった（図１６Ａおよび図１６Ｂ）。また、５‐ＦＵは従来の細胞培養アッセイにおいて細胞死をトリガーしたが、マイクロスケールチップを伴うテガフールへの曝露の２４時間後と比較すると、曝露の４８時間後まで細胞毒性は観察されなかった。
【０２５１】
肝臓コンパートメントがテガフールの生物活性化に関与していたことを実証するために、マイクロスケールチップにＨＣＴ‐１１６のみを撒いた。肝臓コンパートメント内には細胞がない状態とした。テガフールまたは５‐ＦＵを再循環培地に２４時間添加し、チップを上述のように処理した（データは示さず）。テガフールは肝臓コンパートメントの不在下においてＨＣＴ‐１１６の顕著な細胞死を引き起こさず、一方、活性代謝物５‐ＦＵは実質的な細胞死を引き起こした。さらに、ＨＣＴ‐１１６をＨＴ‐２９結腸癌細胞に置き換えると、テガフールは効果がなかった（データは示さず）。これは、５‐ＦＵ細胞毒性に必要な、ＨＴ‐２９細胞中に存在する突然変異体ｐ５３によるものと思われた。それとともに、これらの実験は、スリンダクのようなテガフールが肝臓コンパートメント内で実薬に代謝され、癌細胞を排出するために別の臓器コンパートメントへ循環されることを実証した。これらの効果は、チップによって機械的に区別可能であった―スリンダクは活性なｐ５３の不在下でも効果があり、テガフールはそうではなかった。
【０２５２】
（実施例４）
単一の臓器コンパートメントにおける複数の細胞培養
単一の臓器コンパートメント内で、複数の細胞型の混合物を使用することも可能である。一研究において、肝細胞株ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ（ＡＴＣＣ由来）を肝臓コンパートメント内で使用する。１．５ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、および１０％ウシ胎仔血清を加えたＭｃＣｏｙの５Ａ培地中で細胞を繁殖させる。ｉｎ  ｖｉｖｏ臓器をより厳密に模倣するために、初代肝細胞と線維芽細胞の混合物を１対２の比でマクロファージ（Ｋｕｐｆｆｅｒ細胞）と共に使用してよい。
【０２５３】
別の例において、肺組織をより厳密に模倣するために、肺上皮細胞から派生した細胞または細胞株の混合物が使用される。これは、Ｉ型上皮細胞、ＩＩ型上皮細胞（大肺胞細胞）、線維芽細胞、マクロファージ、および肥満細胞の混合物を含む。
【０２５４】
（実施例５）
チップベースのシステムにおける組織培養条件の最適化
２つの異なるラット細胞培養株、Ｈ４ＩＩＥ（ラット肝臓細胞株）およびＬ２（ラット肺細胞株）に適合する組織培地を開発した。予備実験は、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、および１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を加えたＤＭＥＭおよびＨａｍｓ  Ｆ１２Ｋ培地の１：１混合物が、マイクロスケールチップにおけるＨ４ＩＩＥ細胞およびＬ２細胞両方の生存を、最大２０時間の連続動作のあいだ維持することを示した。この培地製剤を、ラットベースのマイクロスケールチップ研究すべてに使用した。
【０２５５】
ヒト肝機能を写実的に模倣する、適正なヒト細胞株を選択した。さらに、マイクロスケールチップ上のヒト細胞株を維持するために最適な細胞培地製剤を判断した。ＨｅｐＧ２およびＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ（ＨｅｐＧ２サブクローン）細胞株中における３つの主要なチトクロームＰ４５０（ＣＹＰ）イソフォーム（１Ａ２、３Ａ４、および２Ｄ６）の基底発現量を検査した。既知の薬物の８０〜９０％の代謝を担うものであるため、ＣＹＰ‐１Ａ２、２Ｄ６、および３Ａ４を検査した（Ｈｏｄｇｓｏｎ，Ｊ．（２００１年）、ＡＤＭＥＴ―ｔｕｒｎｉｎｇ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  ｉｎｔｏ  ｄｒｕｇｓ、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１９、７２２〜７２６）。ＨｅｐＧ２肝細胞株のＣ３Ａサブクローンが、より「肝臓らしい」性質、特に、親細胞株と比較してかなり高いＣＹＰ発現を呈する厳選された細胞株であるとレポートされたため、この細胞株を検査した（Ｋｅｌｌｙ，Ｊ．Ｈ．（１９９４年）、Ｐｅｒｍａｎｅｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｕｓｅ  ｉｎ  ａ  ｌｉｖｅｒ  ａｓｓｉｓｔ  ｄｅｖｉｃｅ（ＬＡＤ）、米国特許第５，２９０，６８４号）。ＲＴ‐ＰＣＲ分析により、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞中における基底ＣＹＰ量は親ＨｅｐＧ２よりもかなり大きく、成人ヒト肝臓と同程度であることを確認した（図２３）。
【０２５６】
後続のすべての実験において、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を肝臓代用物として使用した。マイクロスケールチップ実験中に使用するための一般的媒質を選択するために、多数の媒質の構成要素を比較した（ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙの５Ａ、ＲＰＭＩ１６４０、ＭＥＭ、Ｆ１２、Ｆ１２Ｋ、Ｗａｙｍｏｕｔｈ’ｓ、ＣＭＲＬ、ＭＥＭ、およびＩｓｃｏｖｅの改変Ｄｕｌｂｅｃｃｏ培地）。無機塩類、ブドウ糖、アミノ酸組成、およびビタミン含有量の分析は、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙの５Ａ、およびＲＰＭＩが、検査した媒質のうち最も適切な「一般的」媒質であることを示唆した。何代か継代した後、細胞を分割させて以下の媒質中で継代培養させた。
【０２５７】
Ｅａｒｌｅの平衡塩類溶液、２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭ非必須アミノ助成、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、および１０％ウシ胎仔血清を加えた、Ｅａｇｌｅの最小必須培地（ＥＭＥＭ）。
【０２５８】
４ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、４．５ｇ／Ｌブドウ糖、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、および１０％ウシ胎仔血清を加えた、Ｄｕｌｂｅｃｃｏの改変Ｅａｇｌｅ培地（ＤＭＥＭ）。
【０２５９】
１．５ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウム、および１０％ウシ胎仔血清を加えた、ＭｃＣｏｙの５Ａ培地（ＭｃＣｏｙ’ｓ）。
【０２６０】
２ｍＭ  Ｌ‐グルタミン、４．５ｇ／Ｌブドウ糖、１．０ｍＭピルビン酸ナトリウム、１．５ｇ／Ｌ重炭酸ナトリウムを加えた、ＲＰＭＩ１６４０培地（ＲＰＭＩ）。
【０２６１】
続いて、各媒質中における両方の細胞株を表す成長曲線を、方法の節で記述したようにして測定した（図２４）。ＤＭＥＭは、細胞形態に顕著な変化が見られ、〜５代継代後に接着が観察されたことから、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞には不適切であることが分かった（図示せず）。同様に、ＲＰＭＩ中で３日後、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａの大幅な減少ならびにＨＣＴ‐１１６の生存および成長に気付いた。いずれの細胞株も、それらの好ましい媒質と比較してＭｃＣｏｙ’ｓおよびＥＭＥＭ中でよく成長した。
【０２６２】
次に、ＲＴ‐ＰＣＲを使用して、ＥＭＥＭまたはＭｃＣｏｙ’ｓ中で成長しているＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞における、これらのＣＹＰイソフォームの発現量を調べた（方法の節を参照）（図２５）。結果は、ＥＭＥＭがＣＹＰ発現を維持する上でＭｃＣｏｙ’ｓよりも優れており、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａにとって好ましい媒質であることを示した。ＣＹＰ発現に対する異なる成長基質の効果を研究した（図２６）。付着基質としてポリ‐Ｄ‐リジンまたはコラーゲンで処理したシリコンと、標準的な組織培養処理をしたポリスチレン上で成長した細胞との比較を実行した。また、結果は、ＲＴ‐ＰＣＲ  ＣＹＰ発現分析に基づいて、ＥＭＥＭがＨｅｐＧ２／Ｃ３ＡおよびＨＣＴ‐１１６細胞両方の成長を支援すること、ならびに、コラーゲンが好ましい基質であることを示した。
【０２６３】
これらの条件を使用して、これらの細胞、つまりＨｅｐＧ２／Ｃ３ＡおよびＨＣＴ‐１１６の、長期にわたる細胞の生存を、マイクロスケールチップシステムにおける連続動作下で研究した。肝臓コンパートメント内にヒトＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を、および、標的組織コンパートメント内にＨＣＴ‐１１６結腸癌細胞を持つ３コンパートメントシステムを使用して、細胞は連続動作下で１４４時間を超えて生存可能なままであることを実証した。これらの実験において、細胞を適切なコンパートメント内に撒き、システムを介して最大１４４時間、ＥＭＥＭを再循環させた。様々な時点（６、２４、４８、７２、９６、１２０、および１４４時間）において、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色を使用して全生細胞または死細胞を視覚化した（データは示さず）。蛍光顕微鏡下で細胞を視覚化し、適切なフィルターセットを使用して、同一フィールドの蛍光画像を得た。生細胞は緑色の蛍光を発し、一方、死細胞は赤色であった（データは示さず）。
【０２６４】
（実施例６）
マイクロスケールチップ上における毒性の検出のためのアッセイ
トリパンブルーは生存細胞を非生存細胞と区別するために使用される最も一般的な染色液であり、非生存細胞だけが当該染料を吸収して青色に見える。逆に、生きている健康な細胞は、青色の染料を吸収せずに円形で屈折しているように見える。マイクロスケールチップにおける細胞の生存を判断するために、トリパンブルーを使用して実験を実行した。トリパンブルー（方法の節を参照）は使用し易く、視覚化するためには光学顕微鏡があればよいが、時間とともに生存細胞はトリパンブルーを吸収し、そのことが結果に影響を及ぼし得る。また、トリパンブルーは細胞タンパク質に対してよりも血清タンパク質に対して高い親和性を有するため、血清含有培地を使用する場合、背景が暗くなる。そこで、生存細胞を死細胞から区別するための代替的な方法を研究した。
【０２６５】
ガラスカバースリップ上で成長した細胞を使用して、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤアッセイを最適化した（方法の節を参照）。簡単に言うと、ポリ‐Ｄ‐リジンで処理したガラスカバースリップにＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を撒き、１μＭスタウロスポリン有り・無しで２４時間処理した。スタウロスポリンは広域スペクトルタンパク質キナーゼ阻害薬であり、各種細胞型においてアポトーシスを誘発することが知られている（Ｓｍｙｔｈ，Ｐ．Ｇ．、Ｂｅｍｉａｎ，Ｓ．Ａ．、およびＢｕｒｓｚｔａｊｎ，Ｓ．（２００２年）、Ｍａｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｓｉｓ：ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｅｌｕｃｉｄａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍ  ｏｆ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、３２、６４８〜６６５）。カバースリップをリン酸緩衝生理食塩水（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  Ｂｕｆｆｅｒｅｄ  Ｓａｌｉｎｅ；ＰＢＳ）で洗浄し、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬を添加して、室温で３０分間インキュベートした。カバースリップを除去し、視覚化した（データは示さず）。スタウロスポリンは、明らかにＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞の細胞死を引き起こすことが分かった（データは示さず）。
【０２６６】
続いて、マイクロスケールチップシステムにおける細胞毒性の検出のためのアッセイを最適化した。方法の節で記述したように、マイクロスケール細胞チップの、肝臓コンパートメント内にＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を、標的組織コンパートメント内にＨＣＴ‐１１６細胞を撒いた。細胞チップをマイクロスケールチップシステムにロードし、上述したように、１μＭスタウロスポリン有り・無しで処理した。２４時間のインキュベーション後、再循環媒質をＰＢＳに切り替え、３０分間システムを貫流させて廃棄し、続いてＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ試薬を含むＰＢＳに切り替え、さらに３０分間システムを貫流させた。細胞チップを含有するアクリル筐体をシステムから除去し、実体蛍光顕微鏡の下に置き、当該筐体の透明上部を介して細胞チップを視覚化した（データは示さず）。蛍光顕微鏡下で細胞を視覚化し、適切なフィルターセットを使用して、同一フィールドの蛍光画像を得た。生細胞は緑色の蛍光を発し、一方、死細胞は赤色であった（データは示さず）。１μＭスタウロスポリンにより、２４時間処理後、未処理の対照細胞チップと比較して顕著なＨＣＴ‐１１６細胞の細胞死が引き起こされた（データは示さず）。
【０２６７】
（実施例７）
細胞死の発生を検出し、アポトーシスとネクローシスとを区別するための、チップベースのアッセイ
アポトーシスを検出するための異なる２つのアッセイを調べた。第１のアッセイは、ＡＰＯＰＴＡＧ（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ  Ｃｏ．、マサチューセッツ州）としてキット形態で利用可能な免疫蛍光ベースの末端デオキシヌクレオチド転移酵素ＢｒｄＵニック端標識（Ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｅｏｘｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｙｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ  ＢｒｄＵ  Ｎｉｃｋ  Ｅｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ；ＴＵＮＥＬ）法であった（方法の節を参照）。まず、ガラスカバースリップで成長した細胞を使用して、アッセイを最適化した。簡単に言うと、ポリ‐Ｄ‐リジンで処理したガラスカバースリップにＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を撒き、スタウロスポリン有り・無しで処理した。カバースリップを上述したように処理した（方法の節を参照）。様々なスタウロスポリン濃度および処理時間を試験し、結果は、１μＭスタウロスポリンが、２４時間のインキュベーション後、未処理の対照と比較して顕著なアポトーシスを引き起こすことを示した（データは示さず）。次に、マイクロスケールチップシステムにおけるアポトーシス検出のためのアッセイを最適化し、ＡＰＯＰＴＡＧ法のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色法との比較を実行した。方法の節で記述したように、マイクロスケール細胞チップの、肝臓コンパートメント内にＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を、標的組織コンパートメント内にＨＣＴ‐１１６細胞を撒いた。細胞チップをマイクロスケールチップシステムにロードし、上述したように、１μＭスタウロスポリン有り・無しで処理した。２４時間のインキュベーション後、３０分間、再循環媒質をＰＢＳに切り替えた。細胞チップの半分を筐体から除去し、上述したようにＡＰＯＰＴＡＧ（商標）アッセイを実行した。その他の細胞チップはマイクロスケールチップシステムに残し、上述したようにＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ染色法に供した。蛍光顕微鏡下で細胞を視覚化し、適切なフィルターセットを使用して、同一フィールドの蛍光画像を得た。生細胞は緑色の蛍光を発し、一方、死細胞は赤色であった（データは示さず）。両方の技術は非常に似通った結果を産生した、すなわち、１μＭスタウロスポリンに対する２４時間の曝露は、ＨＣＴ‐１１６細胞に対して、未処理の対照と比較して顕著なアポトーシス（または細胞毒性）を誘発した（データは示さず）。
【０２６８】
方法の節で記述したように、アネキシンＶ‐ＦＩＴＣを使用して、マイクロスケールチップシステムにおけるアポトーシスを検出した。簡単に言うと、マイクロスケール細胞チップの、肝臓コンパートメント内にＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ細胞を、標的組織コンパートメント内にＨＣＴ‐１１６細胞を撒いた。細胞チップをマイクロスケールチップシステムにロードし、上述したように、１μＭスタウロスポリン有り・無しで処理した。６時間のインキュベーション後、再循環媒質をアネキシンＶ‐ＦＩＴＣおよびＨｏｅｃｈｓｔ３３３４２を含有するＰＢＳに切り替えて、３０分間システムを貫流させた。細胞チップをアクリル筐体から除去し、蛍光顕微鏡下で視覚化した。蛍光顕微鏡下で細胞を視覚化し、適切なフィルターセットを使用して、同一フィールドの蛍光画像を得た。生細胞は緑色の蛍光を発し、一方、死細胞は赤色であった（データは示さず）。１μＭスタウロスポリンは、６時間の処理後、未処理の対照細胞チップと比較して顕著なアポトーシスを引き起こした（データは示さず）。
【０２６９】
（実施例８）
モデル毒物としてのナフタレンの使用
肺毒性には肝臓における酵素的変換が必要であることから、毒物学を研究するためにナフタレンを使用した。したがって、ラット肺細胞株に対するナフタレンの効果を研究した。これらの実験では、肝臓コンパートメント内にＨ４ＩＩＥ細胞を、肺コンパートメント内にラットＬ２細胞を持つ、３コンパートメント（肝臓、肺、およびその他の組織）ラットベースマイクロスケールチップを使用した。方法の節で記述したように、マイクロスケールチップを実験用に作製および調製した。
【０２７０】
ＰＢＳ含有トリパンブルーに切り替える前に、２５０μｇ／ｍｌナフタレンの存在下または不在下で、マイクロスケールチップシステムを２０時間動作させた。細胞チップを介してこの溶液を３０分間再循環させ、光学顕微鏡下でチップを視覚化した（方法の節を参照）。ナフタレンは、細胞チップの肺コンパートメントにおいてラットＬ２細胞の顕著な細胞死を引き起こしたが、ナフタレンの不在下では細胞死は観察されなかった（データは示さず）。ナフタレンの有無に関わらずＨ４ＩＩＥ細胞コンパートメント内では、または、Ｈ４ＩＩＥ細胞の不在下におけるＬ２細胞コンパートメント内では、細胞死は観察されなかった（データは示さず）。
【０２７１】
これらの結果は、ナフタレンが「肝臓」コンパートメント内で活性化され、有毒代謝物が「肺」に循環して細胞死を引き起こすことを実証するものである。これらの結果は、ベンチトップ型ＣＣＡデバイスによって得られ、ＰＢＰＫモデルから期待されるデータと一致する（Ｓｗｅｅｎｅｙ，Ｌ．Ｍ．、Ｓｈｕｌｅｒ，Ｍ．Ｌ．、Ｂａｂｉｓｈ，Ｊ．Ｇ．、およびＧｈａｎｅｍ，Ａ．（１９９５年）、Ａ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ａｎａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  ｒｏｄｅｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ：ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｐｔｈａｌｅｎｅ  ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ、Ｔｏｘｉｃｏｌ，ｉｎ  Ｖｉｔｒｏ、９、３０７〜３１６）。
【０２７２】
（実施例９）
ヒトマイクロスケールチッププロトタイプ
肺、標的組織、およびその他の組織を表すコンパートメントを含有するヒトバイオチッププロトタイプを調製した。コンパートメントおよびチャネルの寸法は、以下のとおりとした。
【０２７３】
入り口：１ｍｍ×１ｍｍ
肝臓：幅３．２ｍｍ×長さ４ｍｍ
標的組織：２ｍｍ×２ｍｍ
その他の組織：幅３４０μｍ×長さ１１０ｍｍ
出口：１ｍｍ×１ｍｍ
肝臓をＹ接続部に接続するチャネル：幅４４０μｍ
Ｙ接続部から標的組織までのチャネル：幅１００μｍ
上述したようなヒトバイオチッププロトタイプを作製する。臓器コンパートメントの配置は、経口摂取された化合物（薬物）への曝露をシミュレートするように意図される。化合物が経口摂取されると、小腸または大腸から血中に吸収される。そこから肝門静脈を介して直接的に肝臓へ循環し、全身に分布される（図２７）。したがって、この設計では、肝臓が第１の臓器コンパートメントであり、その後、その他の組織、標的組織のコンパートメントおよびチャンバに分割される。その他の組織コンパートメントは生体内における血液の分布および停滞を表し、標的組織コンパートメントは所望の治療標的を表す（例えば、結腸腫瘍を表す結腸癌細胞）。
【０２７４】
結論
本発明は、通常、受入端部および出口端部を有する第１の細胞培養チャンバと、受入端部および出口端部を有する第２の細胞培養チャンバと、第１の細胞培養チャンバの出口端部を第２の細胞培養チャンバの受入端部に接続する導管と、を含む、薬物動態ベースの培養デバイスおよびシステムを提供する。好ましくは、当該デバイスはチップベースである、すなわち、マイクロスケールのサイズである。培地は、第１の細胞培養チャンバを通り、導管を通り、第２の培養チャンバを通って循環することができる。再循環ループの１つ以上の地点において、培地を酸化させることもできる。
【０２７５】
当該デバイスは、例えばデバイスの部分からの信号をチップから外れた位置に伝達するための導波管を持つ、デバイスの部分からの信号をチップから外れた位置に伝達するためのメカニズムを含んでよい。複数の導波管が存在してよく、例えば、第１の導波管が第１のチャンバからの信号を伝達し、第２の導波管が第２のチャンバからの信号を伝達する等となる。
【０２７６】
一実施形態において、第１の細胞培養チャンバおよび第２の細胞培養チャンバのうち少なくとも１つが３次元である。別の実施形態において、第１の細胞培養チャンバおよび第２の細胞培養チャンバの両方が３次元である。
【０２７７】
細胞を生存状態に維持するためのデバイスは、流体循環メカニズムも含み、フロースルー型流体循環メカニズム、または、流体を再循環させる流体循環メカニズムであってよい。細胞を生存状態に維持するためのデバイスは、少なくとも第１のコンパートメントと第２のコンパートメントを接続する流体経路も含む。一実施形態において、流体経路内の気泡を気泡除去器で除去する。当該デバイスは、ポンプメカニズムをさらに含み得る。ポンプメカニズムは、基板上に位置してよい。
【０２７８】
少なくとも２つの細胞チャンバ内で少なくとも２つの細胞型を生存状態に維持するように、基板のサイズ決定をするための方法が提供される。当該方法は、基板上に保持される細胞型を測定するステップと、基板の物理的性質を測定するために、生理学的薬物動力学モデルの制約事項を適用するステップとを含む。生理学的薬物動力学モデルの制約事項を適用するステップは、基板上に形成されるチャンバの種類を測定するステップを含み、当該ステップは、細胞チャンバのうち少なくとも１つの表面形状を測定するステップと、２つの細胞チャンバを相互接続している流路の表面形状を測定するステップとを含んでもよい。生理学的薬物動力学モデルの制約事項を適用するステップは、流路の流動培地組成を測定するステップを含んでもよい。
【０２７９】
本明細書において引用するすべての出版物および特許出願は、それぞれ個々の出版物または特許出願が具体的且つ個別に参照することにより組み込まれるよう指示されているかのように、参照することにより本書に組み込まれる。
【０２８０】
上記の記述は例示を意図したものであり、制限的なものではないことを理解すべきである。当業者には、上記の記述を概観して、その他多くの実施形態が明らかとなるであろう。したがって、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲を、そのような特許請求の範囲が権利を付与される均等物の全範囲と共に、参照して判断されるべきである。
【０２８１】
本発明の一実施形態は、マイクロスケール透過性材料に関する。本発明のいくつかの実施形態では、マイクロスケールデバイスと関連付けられた生物学的障壁として透過性材料を説明しているが、マイクロスケール透過性材料は、多種多様なコンテキストおよびデバイスに存在し得ることを理解すべきである。
【０２８２】
適切なマイクロスケールデバイスの一例として、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる少なくとも１つの薬物動態パラメータの値と同程度の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの１つ以上の薬物動態パラメータの値を提供する条件下に、生物材料を維持するように寸法決定された１つ以上のマイクロスケール機構が挙げられる。当該マイクロスケール機構の様々な実施形態の形成および動作に関する詳細を、上記で開示している。以下の説明の目的で、「マイクロスケール」は、約０．１μｍから約５００μｍの範囲の寸法を意味し得る。したがって、マイクロスケール機構は、その寸法の少なくとも１つがマイクロスケール範囲に含まれるように寸法決定され得る。本開示の様々な実施形態は、上記で定義したマイクロスケールレベルよりも大きいスケールで実装され得ることも理解されるであろう。以下の説明の目的で、「ミリメートルスケール」は、約０．１ｍｍから約１００ｍｍの範囲の寸法を意味し得る。したがって、本開示の１つ以上の機構は、その寸法の少なくとも１つがミリメートルスケール範囲に含まれる、ミリメートルスケール機構であってよい。いくつかの機構は、一方がマイクロスケールであり、他方がミリメートルスケールである、寸法の組み合わせを有し得ることが理解されるであろう。そのような機構は、２つのスケールのいずれかとして特徴付けられ得る。さらに、本開示の様々な機構は、上記で定義された範囲外の寸法で実装され得る。例えば、一実施形態において、マイクロスケール機構は、０．１μｍ未満の、または、５００μｍを超える寸法を有し得る。同様に、一実施形態において、ミリメートルスケール機構は、０．１ｍｍ未満の、または、１００ｍｍを超える寸法を有し得る。
【０２８３】
その他の実施形態において、マイクロスケール透過性材料は、異なる流体系間の相互作用を促進する。例えば、経口で服用された薬物は、胃腸（ＧａｓｔｒｏＩｎｔｅｓｔｉｎａｌ；ＧＩ）系に入る。当該薬物と関連付けられた１つ以上の化合物は、小腸の内壁を介してＧＩ系から循環器系の血液へ通過することができる。血液中の薬物化合物は、様々な臓器および／またはシステムに達し、影響を及ぼすことができる。例えば、薬物化合物は、血液から脳流体系へ通過し、それによって脳に影響を及ぼすことができる。
【０２８４】
別の例において、薬物化合物は、血液から肝臓内の胆管系へ通過し、腸肝再循環サイクルに入ることができる。薬物化合物は腸肝循環内に長時間残ることができ、結果として肝臓内は高濃度となるため、予想外に肝細胞毒性となり得る。
【０２８５】
したがって、異なる系間における薬物化合物またはそれらの代謝産物の通過を明らかにすることにより、関係する薬物の薬物動態についてより良く理解できることが分かる。
【０２８６】
図３１は、一実施形態において、第１および第２の流体系３１０２、３１４０間の相互作用３１００が提供され、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られるものと同様の生理的パラメータ値を持つ条件下で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏに維持され得ることを示す。説明の目的で、第１の流体系３１０２は１つ以上のマイクロスケール機構を含み、第２の流体系３１０４も１つ以上のマイクロスケール機構を含む。
【０２８７】
図３１でさらに示すように、第１および第２のシステム３１０２、３１０４間の相互作用３１００は、第１のシステム３１０２から第２のシステム３１０４への１つ以上の化合物の通過（矢印３１０６によって描写される）、および／または、第２のシステム３１０４から第１のシステム３１０２への１つ以上の化合物の通過（矢印３１０８によって描写される）を含んでよい。
【０２８８】
図３２は、マイクロスケール機構を使用して形成され得るいくつかの流体系例を有する、生物系例３１１０のブロック図を示す。血管系３１１２、ＧＩ系３１１４、胆管系３１１６、および脳流体系３１１８は、マイクロスケール機構を使用してシミュレートされ得るいくつかの限定的でない例である。
【０２８９】
一実施形態において、マイクロスケール機構ベースのシステム間に、少なくとも１つの系間相互作用が提供される。様々な系間相互作用について、以下でさらに詳細に説明する。
【０２９０】
図３３Ａ〜３３Ｄは、２つ以上の流体系のために用意され得る様々な相互作用構成の、限定的でない例を示す。一実施形態において、図３３Ａに示すように、２系構成３１２０は、２つのシステム「Ａ」と「Ｂ」（３１６２と３１６４）の間に相互作用３１７２を含み得る。図３３Ｂは、一実施形態において、３系構成３１３０が、Ｂと「Ｃ」（３１６４と３１６６）の間の相互作用３１７６だけでなく、ＡとＢ（３１６２と３１６４）の間の相互作用３１７４も含み得ることを示す。図３３Ｃは、一実施形態において、４系構成３１４０が、図３３Ｂの相互作用３１７４および３１７６と同様の相互作用３１７８および３１８０に加えて、Ｂと「Ｄ」（３１６４と３１６８）の間の相互作用３１８２を含み得ることを示す。
【０２９１】
一実施形態において、相互作用３１７８および３１８０（図３３Ｃ）と関連付けられた薬物動態力学は、相互作用３１７４および３１７６（図３３Ｂ）のものと実質的に同じであってよい。別の実施形態において、さらなる相互作用３１８２（図３３Ｃ）の存在は、相互作用３１７８および３１８０と関連付けられた薬物動態力学を、相互作用３１７４および３１７６（図３３Ｂ）のものから大幅に改変し得る。
【０２９２】
図３３Ｄは、一実施形態３１５０において、複数のシステム（例えば３つ）が、再循環機能性を提供しシミュレートするように構成され得ることを示す。図示の例において、システムＡとＢ（３１６２と３１６４）は相互作用３１８４を介して；システムＢとＣ（３１６４と３１６６）は相互作用３１８６を介して；および、システムＣとＡ（３１６６と３１６２）は相互作用３１８８を介して、相互作用していることが示されている。
【０２９３】
図３３Ａ〜３３Ｄに示す構成の具体的な例を、以下で詳細に説明する。その他の構成も可能である。
【０２９４】
図３４Ａ〜３４Ｃは、２流体系構成３２００の一実施形態の様々な図を示す。図３４Ａは、図３４Ｂの組立図の部分分解図を示し、図３４Ｃは上面図を示す。第１のシステムは、１つ以上のコンパートメント（コンパートメント３２２２として描写されている）を画定する層３２２０を含むように示されている。図示するように、コンパートメント３２２２には、流入経路３２１２（カバー層３２１０によって画定される）および流入チャネル３２６０を通る流入流れ（矢印３２５０として示される）を介して、薬物動態研究用の流体が供給され得る。コンパートメント３２２２からの流体は、流出チャネル３２６２を通り、流出経路３２１４（カバー層３２１０によって画定される）を通って、流出流れ（矢印３２５２として示される）として出ることができる。
【０２９５】
第２のシステムは、１つ以上のコンパートメント（コンパートメント３２３２、３２３４、３２３６として描写されている）を画定する層３２３０を含むように示されている。図示するように、コンパートメント３２３２、３２３４、および３２３６には、流入経路３２４２（カバー層３２４０によって画定される）と、コンパートメント３２３２に接続された流入チャネル３２７０とを通る入力流れ（矢印３２５４として示される）を介して、薬物動態研究用の流体が供給され得る。コンパートメント３２３２からの流体は、チャネル３２７２、３２７４、および３２７８を介して、その他のコンパートメント３２３４および３２３６に供給され得る。コンパートメント３２３４および３２３６からの流体は、流出チャネル３２７６および３２８０を通り、流出経路３２４４（カバー層３２４０によって画定される）を通って、出力流れ（矢印３２５６として示される）として出ることができる。
【０２９６】
一実施形態において、コンパートメント、流入および流出経路、ならびに、第１および第２のシステムの様々なチャネルの形成は、上記で開示されている様々な技術によって形成され得る。また、２つの流体系のための流体の循環は、上記で開示されている様々な技術によって成し遂げられ得る。
【０２９７】
図３４Ａ〜３４Ｃに示すように、２流体系構成３２００は、第１のシステム３２２０のコンパートメントのうち少なくとも１つと、第２のシステム３２３０のコンパートメントのうち少なくとも１つとの間に位置付けられた、透過性材料３２２４を含む。図示の例において、透過性材料３２２４は、コンパートメント３２２２と３２３２との間に位置付けられているものとして描写されており、したがって、第１および第２のシステム３２２０と３２３０との間の流体相互作用を可能にしている。透過性材料３２２４については、以下でさらに詳細に説明する。
【０２９８】
図３４Ａ〜３４Ｃにおいて、コンパートメント３２２２および３２３２、ならびに透過性材料３２２４は、異なる寸法を有するものとして描写されている。これは、単に図示の明瞭化を目的としたものである。透過性材料３２２４は、コンパートメント３２２２および３２３２のうちいずれか、またはその両方より小さい、それらより大きい、または略同一であるように寸法設定されてよい。一実施形態において、透過性材料３２２４は、部分的または実質的にコンパートメントのいずれかの内側に、または、コンパートメント３２２２と３２３２との間に据えられてよい。
【０２９９】
図３４Ｄは、図３４Ａに示す構成例の変形形態である実施形態３２００の部分分解図を示す。図示するように、２流体系構成３２００は、１つ以上の細胞培養コンパートメント（コンパートメント３９１４として描写されている）および／または１つ以上の生物学的障壁（障壁３９１６として描写されている）を含む第１の培養システムを有する第１のモジュール３９０２を含み得る。
【０３００】
図示するように、２流体系構成３２００は、１つ以上の細胞培養コンパートメント（コンパートメント３９１８および３９２０として描写されている）を含む第２の培養システムを有する第２のモジュール３９０４を含み得る。一実施形態において、第２のモジュール３９０４は、１つ以上の生物学的障壁（図示せず）を含んでもよい。
【０３０１】
一実施形態において、図示するように、２流体系構成３２００は、第１の培養システム３９０２のための流体の流れを促進する流体相互接続３９１０を含み得る。一実施形態において、第１のモジュール３９０２の上に筐体上部３９００が位置付けられ、流体相互接続３９１０の流体経路を画定することができる。
【０３０２】
同様に、流体相互接続３９２２は、第２の培養システム３９０４のための流体の流れを促進する。一実施形態において、第２のモジュール３９０４の下に筐体底部３９０６が位置付けられ、流体相互接続３９２２の流体経路を画定することができる。
【０３０３】
本明細書における説明の目的で、「透過性」材料は、生物系において見られるような、またはそれをシミュレートする選択的様式で１つ以上の材料の通過を可能にする、あらゆる生物材料または非生物材料を含む。したがって、本明細書で使用する場合の透過性材料は、半透過性材料を含み得る。
【０３０４】
前述の２系構成３２００は、ＧＩ‐血液、血液‐胆汁、血液‐脳、血液‐組織、および血液‐尿等であるがこれらに限定されない組み合わせの薬物動態研究のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境を提供することができる。
【０３０５】
図３５Ａおよび３５Ｂは、３流体系構成３２９０の一実施形態の、部分分解図および組立図を示す。第１のシステムは、１つ以上のコンパートメント（コンパートメント３３０４として描写されている）を画定する層３３００を含むように示されている。第２のシステムは、１つ以上のコンパートメント（コンパートメント３３２２、３３２４、および３３２８として描写されている）を画定する層３３２０を含むように示されている。第３のシステムは、１つ以上のコンパートメント（コンパートメント３３４２として描写されている）を画定する層３３４０を含むように示されている。
【０３０６】
一実施形態において、第１のシステム３３００には、経路３３０２ａおよび３３０２ｂを通って流体流れ（矢印３３５０および３３５２）が供給され得る。第３のシステム３３４０には、経路３３４４ａおよび３３４４ｂを通って流体流れ（矢印３３５４および３３５６）が供給され得る。第２のシステム３３２０は、第１および第２のシステム３３００と３３４０との間に連結を提供する循環を有し得る。第１のシステム３３００と相互作用するコンパートメント３３２２は、第３のシステム３３４０と相互作用するコンパートメント３３２８と、チャネル（図示せず）ならびに経路３３２６ａおよび３３２６ｂを介して相互接続され得る。
【０３０７】
図３５Ａおよび３５Ｂに示すように、３流体系構成３２９０は、２つの透過性材料アセンブリ３３１０および３３３０を含み得る。第１の透過性材料アセンブリ３３１０は、第１および第２のシステム３３００と３３２０のコンパートメント３３０４と３３２２との間に透過性材料３３１２が位置付けられるように構成されることが示されている。第２の透過性材料アセンブリ３３３０は、第２および第３のシステム３３２０と３３４０のコンパートメント３３２８と３３４２との間に透過性材料３３３２が位置付けられるように構成されることが示されている。
【０３０８】
図３５Ａおよび３５Ｂに示す構成例３２９０において、透過性材料３３１２および３３３２は、分離した層３３１０および３３３０の一部であるとして描写されている。一実施形態において、透過性材料３３１２および３３３２は、それらの隣接する層のうち１つの一部となるように形成され得る。例えば、透過性材料３３１２は、透過性材料３３１２がコンパートメント３３０４および３３２２を分離するような、層３３００および３３２０のいずれかの一部として形成され得る。同様に、透過性材料３３２２は、透過性材料３３２２がコンパートメント３３２８および３３４２を分離するような、層３３２０および３３４０のいずれかの一部として形成され得る。
【０３０９】
一実施形態において、透過性材料３３１２および３３２２は、それらそれぞれの系間相互作用を促進するように構成され得る。透過性材料３３１２および３３２２については、以下でさらに詳細に説明する。
【０３１０】
一実施形態において、３系構成は、図３５Ａおよび３５Ｂを参照して上述したような様式で実装され得る。図３６は、そのような３流体系の例３３６０のブロック図を示す。薬物送達システム３３６２は第１のシステム３３００（図３５Ａおよび３５Ｂ）によって表されることができ；臓器系３３６４は第２のシステム３３２０によって表されることができ；脳３３６６は第３のシステム３３４０によって表されることができる。薬物送達システム３３６２と臓器系３３６４との間の相互作用３３７０は透過性材料アセンブリ３３１０によって表されることができ；臓器系３３６４と脳３３６６との間の相互作用３３７２は透過性材料アセンブリ３３３０によって表されることができる。
【０３１１】
３系構成の応用例３３６０において、薬物送達システム３３６２はＧＩ系を含んでよく、臓器系は様々な臓器（脳以外）および血管系を含んでよい。したがって、相互作用３３７０は、薬物と関連付けられた１つ以上の化合物の、ＧＩ系から血液への通過を含んでよく；相互作用３３７２は、薬物と関連付けられた１つ以上の化合物の、血液から脳の流体系への通過を含んでよい。
【０３１２】
その他の３系構成が可能であることが理解されるであろう。
【０３１３】
図３７は、肝臓３３８４を含む構成例３３８０のブロック図を示す。肝臓３３８４は、腸肝循環（矢印３３９０および３３９２として示されている）を介してＧＩ管３３８２と相互作用するように示されている。肝臓３３８４は、泌尿器系３３８８（矢印３３９６によって描写されている）および組織３３８６（矢印３３９４によって描写されている）とも相互作用するように示されている。肝臓３３８４と泌尿器系３３８８との間の相互作用３３９６は、媒介物として作用する血液循環系によって促進され得る。同様に、血液循環系は、肝臓３３８４と組織３３８６との間の相互作用３３９４を促進することができる。
【０３１４】
図３８は、血管系３４０６が、肝臓３３８４およびＧＩ管３３８２を含む腸肝循環プロセスを促進することもできることを示す。図示するように、（肝臓３３８４の）胆管系３４０２は、ＧＩ系３４０４と相互作用（矢印３４１０）し、これが順に循環器系３４０６と相互作用（矢印３４１２）している。循環器系３４０６は、胆管系３４０２と相互作用（矢印３４１４）し、それによって再循環プロセスを形成する。
【０３１５】
一般に知られているように、肝臓は、消化を支援するために小腸へ送達される胆汁酸を産生する。消化管内で、胆汁酸は抱合胆汁塩に（一次的または二次的に）変換され、これらの塩が―積極的にまたは受動的に―肝臓によって再生利用されるために肝門脈循環に吸収される。一般に、各胆汁塩分子は腸肝サイクル内で約２０回再利用される。
【０３１６】
前述した再生利用プロセスの結果の１つは、薬物またはその構成要素が長期間、腸肝循環中に残ることができることである。したがって、そうしなければ有毒とならないいくつかの分子を肝臓内に蓄積し、有毒なものとすることができる。このように、腸肝再循環プロセスと関連付けられた薬物動態は、試験されている薬物の毒性（または非毒性）についての重要な理解を提供することができる。
【０３１７】
上述したように、前述の異なる流体系間における相互作用の様々な特徴は、１種類以上の透過性材料によって促進され得る。いくつかの実施形態において、そのような透過性材料はマイクロスケール透過性デバイスの一部であってよい。
【０３１８】
以下でより詳細に説明するように、本開示の１つ以上の機構は、単独で、または組み合わせ形態で、様々なシステムおよび方法を提供することができる。例えば、装置は、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られる少なくとも１つの薬物動態パラメータの値と同程度の、少なくとも１つのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの薬物動態パラメータの値を提供する条件下に、生物材料を維持するように寸法決定された、少なくとも１つの機構と、透過性材料とを有することができる。透過性材料については、以下でさらに詳細に説明する。一実施形態において、少なくとも１つの機構は、マイクロスケール機構を含む。
【０３１９】
一実施形態において、少なくとも１つの機構は、以下の限定的でないシステム例：中枢神経系、循環器系、消化器系、胆管系、肺系統、泌尿器系、視覚系、嗅覚系、表皮系、およびリンパ系、のうち１つ以上の少なくとも一部を表すように構成され得る。
【０３２０】
一実施形態において、本明細書で記載されるように、装置は、透過性材料に接続された少なくとも１つのマイクロ流体チャネルをさらに含む。そのようなチャネルは、少なくとも１つの薬物動態パラメータを提供するように、透過性材料の中の、それを通る、またはそれに近接する流体の流れを促進することができる。一実施形態において、そのような流体流れの性質は、生理学的薬物動力学（Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌｌｙ‐Ｂａｓｅｄ  ＰｈａｒｍａｃｏＫｉｎｅｔｉｃ；「ＰＢＰＫ」）モデル等の数学モデルに基づくものであってよい。
【０３２１】
一実施形態において、少なくとも１つの機構および／または透過性材料は、チップフォーマットに組み込まれてよい。
【０３２２】
一実施形態において、透過性材料は、デバイスの中または外に位置し得る。一実施形態において、透過性材料は、有機材料で少なくとも一部を被覆された微孔性材料を含み得る。
【０３２３】
一実施形態において、細胞は、透過性材料の両側面の中、上、または付近に位置し得る。一実施形態において、そのような細胞を有するデバイスは、吸収特性、代謝酵素活性、および／または発現量等のパラメータの測定または推定を促進することができる。一実施形態において、透過性材料のいずれかの側面上の細胞は、同じ種類のものであっても異なる種類のものであってもよい。
【０３２４】
図３９は、２つの流体系間における１つ以上の相互作用を促進することができる透過性材料３４３０を有する、マイクロスケール透過性デバイス３４２０の一実施形態を示す。透過性材料３４３０のいくつかの限定的でない例は、以下のもの：膜、多孔質膜、多孔質シリコン、微孔性シリコン、半透膜、微孔性ポリマー、多孔質ポリカーボネート膜、アルギン酸塩、コラーゲン、ＭＡＴＲＩＧＥＬ（マトリゲル）、細胞、細胞材料、組織、および組織片を含み得る。
【０３２５】
一実施形態において、透過性材料３４３０は、透過性材料３４３０の微孔性表面の中、上、または付近に、有機または無機材料を含み得る。
【０３２６】
一実施形態において、透過性材料３４３０は、微孔性材料を含む。そのような微孔性材料の限定的でない例は、以下のもの：微孔性材料の微孔性表面の中、上、または付近に、培養、蒸着、または挿入された有機または無機材料を含み得る。
【０３２７】
一実施形態において、透過性材料３４３０は、生物学的障壁、生物学的障壁の中の、もしくはそれを通る物質の通過、または、生物学的障壁の中の、それを通した、もしくはそれによる物質の吸収、のうち少なくとも１つをシミュレートするように構成され得る。一実施形態において、生物学的障壁は、以下のもの：胃腸障壁、血液脳関門、肺障壁、胎盤関門、表皮障壁、眼関門、嗅覚器障壁、胃食道障壁、粘膜、血液尿関門、空気組織関門、血液胆汁関門、口腔障壁、肛門直腸関門、膣障壁、および尿道障壁、のうち少なくとも１つを含み得る。
【０３２８】
一実施形態において、透過性材料３４３０は、１つ以上の系間相互作用を担いながら、様々な薬物動態パラメータの測定を促進することができる。これらの薬物動態パラメータは、以下のもの：組織サイズ、組織サイズ比、組織対血液容積比、薬物滞留時間、細胞間相互作用、液体滞留時間、液体対細胞比、細胞による代謝、せん断応力、流速、表面形状、循環通過時間、液分布、組織および／または臓器間の相互作用、ならびに細胞による分子輸送、のうち少なくとも１つを含み得る。
【０３２９】
一実施形態において、透過性材料３４３０は、透過性材料の中の、それを通る、またはそれによる、物質の吸収、代謝、または分布の測定を促進することができる。
【０３３０】
一実施形態において、透過性材料３４３０は、２つ以上の流体系を表す複数のマイクロスケール機構を含むデバイス内に、形成される、含有される、挿入される、組み立てられる、作られる、または、構成されることができる。
【０３３１】
一実施形態において、透過性材料３４３０のいずれかまたは両方の側面は、細胞または細胞材料の培養、付着、または位置決めを可能にするように構成され得る。そのような構成は、吸収特性、代謝酵素活性、および／または発現量等のパラメータの測定を可能にする。
【０３３２】
一実施形態において、透過性材料３４３０は、融合性単層を形成し、極性化することができる細胞株を含み得る。
【０３３３】
一実施形態において、透過性材料３４３０は、マイクロスケール透過性材料３４３２を含み得る。一実施形態において、マイクロスケール透過性材料３４３２は、複数の細孔を有する微孔性基板を含み得る。いくつかの実施形態において、細孔は概して約１０μｍ未満の寸法を有する。いくつかの実施形態において、微孔性基板は、約１０μｍより大きい寸法を有する粒子の通過を阻害する。
【０３３４】
一実施形態において、微孔性基板は、約０．１から１０μｍの範囲の寸法を持つ細孔を有する多孔質シリコンから形成され得る。そのような基板の厚さ「Ｔ」は、約５から１００μｍの範囲であってよい。一実施形態において、微孔性基板は、約０．４μｍの範囲の寸法を持つ細孔を有する多孔質ポリカーボネート膜から形成され得る。そのような基板の厚さ「Ｔ」は、約１００μｍの範囲であってよい。一実施形態において、微孔性基板は、約０．２から１μｍの範囲の寸法を持つ細孔を有する多孔質低応力窒化シリコン材料から形成され得る。そのような基板の厚さ「Ｔ」は、約２から５μｍの範囲であってよい。
【０３３５】
一実施形態において、（厚さを画定する方向に垂直な）横寸法「Ｌ」は、コンパートメント４３８の横寸法と相対的な任意の値を有し得る。所与の厚さについて、表面積が大きいほど（したがって、横寸法が大きいほど）、２つの流体系間に、より多量の相互作用を提供するものと思われる。したがって、２つのシステム間における材料の通過の量は、横方向のサイズが異なる表面積を提供することによって制御され得る。したがって、横寸法Ｌは、コンパートメント３４３８の対応する横寸法より小さい、（図３９の例に示すように）それと実質的に等しい、または、それより大きくてよい。
【０３３６】
一実施形態において、微孔性基板は、約０．１から１０ｍｍの範囲の横寸法を有する。実施形態において、横寸法は、約３．４ｍｍ×４ｍｍである。
【０３３７】
図３９でさらに示すように、透過性アセンブリ３４３０は、マイクロスケール透過性材料３４３２の上、中、および／または周囲に位置付けられた、１つ以上の特定機能の細胞３４３４をさらに含み得る。特定機能の細胞３４３４については、血液系と胆管系との間の相互作用を例として、以下でさらに詳細に説明する。しかしながら、異なる系間相互作用に望ましい機能性を提供するために、異なる特定機能の細胞をマイクロスケール透過性材料３４３２に対して位置付けることができることが理解されるであろう。
【０３３８】
一実施形態において、透過性アセンブリ３４３０は、マイクロスケール透過性材料３４３２の表面への細胞３４３４の結合を促進する１つ以上の結合剤３４４５を含み得る。結合剤３４４５の例は、以下でさらに詳細に説明する。
【０３３９】
一実施形態において、透過性アセンブリ３４３０は、線維芽細胞と同様の機能性を提供する１つ以上の機構３４３６をさらに含み得る。一実施形態において、特定機能の細胞３４３４はマイクロスケール透過性材料３４３２の表面に分布されることができ、線維芽細胞３４３６はマイクロスケール透過性材料３４３２の表面上の、細胞３４３４によって占領されていない領域を満たすことができる。そのような構成において、線維芽細胞は、透過性アセンブリ３４３０を通る材料の通過がほとんど細胞３４３４を介して発生するような、密封機能性を提供することができる。
【０３４０】
一実施形態において、線維芽細胞３４３６は、細胞３４３４の成長および維持管理に好ましい環境を提供することができる。一実施形態において、線維芽細胞３４３６は、両方の機能性を―透過性材料３４３０の密封だけでなく細胞の成長および維持管理も―提供することができる。
【０３４１】
一実施形態において、透過性アセンブリ３４３０は、透過性アセンブリ３４３０の少なくとも１つの側面上にコンパートメント３４３８を画定するよう、層３４２２の一部として形成され得る。その他の実施形態において、透過性アセンブリ３４３０の両側面は、それらそれぞれのコンパートメントを画定することができる。そのような構成では、透過性アセンブリ３４３０は、透過性アセンブリ３４３０のいずれかまたは両方の側面上に、細胞３４３４および結合剤３４３４を有し得る。
【０３４２】
図４０Ａおよび４０Ｂは、異なる流体系間における相互作用を可能にするために透過性アセンブリが提供され得る、様々な状況例を示す。当該系間相互作用例は、腸肝再循環プロセスに基づくものである。しかしながら、同様の様式でその他の系間相互作用を作製することができる。
【０３４３】
図４０Ａは、血流系と胆汁流系との間の相互作用構成３４４０の一実施形態を示す。一実施形態において、透過性アセンブリ３４４２は、血流と胆汁流との間に介入させられてよく、マイクロスケール透過性材料３４４４を含み得る。いくつかの実施形態において、マイクロスケール透過性材料３４４４は、図３９を参照して上述したのと同様の様式で、形成および寸法決定され得る。
【０３４４】
一実施形態において、透過性アセンブリ３４４２は、１つ以上の特定機能の細胞３４４６をさらに含み得る。血液‐胆汁相互作用では、細胞３４４６は肝細胞を含み得る。
【０３４５】
肝臓の肝細胞は極性細胞であってよく、分化した肝細胞の異なる表面は固有機能を有し得る。一実施形態において、側底面の洞様膜および肝臓内にある先端面の毛細胆管膜は、以下の様式でシミュレートされ得る。単離された肝細胞は、一般に、極性化されない。肝細胞は概して、近隣の肝細胞と物理的に接触した際に極性化される。毛細胆管は、そのような並列細胞の２つ以上の間に形成され得る。
【０３４６】
外部キューは、上皮細胞極性化にとって重要となる場合があり、２つの近隣の肝細胞間における物理的接触は、そのような肝細胞極性化を表す信号であると思われる。肝細胞は、結合タンパク質または接着タンパク質の結合を介して近隣の肝細胞との接続を形成することができ、これらのタンパク質の相互作用は、毛細胆管形態形成を表す重要な信号であると思われる。
【０３４７】
図４０Ａに示すように、これらのタンパク質は、マイクロスケール基板３４４４への肝細胞３４４６の結合および肝細胞の極性化を促進する結合剤３４４５として作用することができる。いくつかの実施形態において、これらのタンパク質は、ギャップ結合タンパク質（例えば、コネキシン３２）、密着結合タンパク質（例えば、Ｏｃｃｌｕｄｉｎ（オクルディン）、Ｃｌａｕｄｉｎ（クローディン）‐１、ＺＯ‐１、ＺＯ‐２）、接着結合タンパク質（例えば、Ｅ‐カドヘリンおよびβカテニン）、ならびに細胞接着分子（例えば、ウボモルリン）を含み得る。
【０３４８】
一実施形態において、マイクロスケール透過性基板３４４４に付着されたこれらのタンパク質の１つ以上は、近隣の肝細胞のプラズマ膜表面を実際に模倣することができる。単離された肝細胞がこの表面に結合すると、当該肝細胞は極性化するように誘発されることができ、その結果、マイクロスケール透過性基板３４４４の表面に先端面または毛細胆管（３４４９ｂ）が形成され得、反対面には側底面または洞様面（３４４９ａ）が形成され得る。
【０３４９】
一実施形態において、肝細胞３４４６は、細胞間相互作用を阻害するために適切な密度で撒かれ得る。肝細胞３４４６がマイクロスケール透過性基板３４４４に付着されると、肝細胞３４４６によって占領されていない領域にあるマイクロスケール透過性表面を実質的に密封することによって「血液胆汁」関門を形成するために、および／または、肝細胞成長にとって好ましい環境を提供するために、線維芽細胞３４４８またはその他の適切な細胞が表面上で培養され得る。
【０３５０】
一実施形態において、肝細胞３４４６に影響を及ぼさないために、所望の１つ以上の選択された化合物が導入され得る。そのような化合物は、マイクロスケール透過性表面を渡ってデバイス３４４０の胆汁代用物の流れへ、肝細胞３４４６を介して輸送されることができる。化合物およびその代謝産物の存在は、胆汁中排泄を測定するために、胆汁代用物の流れの中において計測され得る。
【０３５１】
胆汁がＧＩ系に転移され、血液系に再吸収されると、ＧＩ系中の「胆汁」は、以下の化合物：胆汁塩（ケノデオキシコール酸、ヒオデオキシコール酸、コール酸、α‐ムリコール酸、およびβ‐ムリコール酸）；リン脂質（ホスファチジルコリン（〜８２％）、微量のホスファチジルイノシトール、ホスファチジルセリン、およびスフィンゴミエリン）；胆汁アルコール（５β‐コレスタン‐３α，７α，１２α，２６‐テトロール）；ならびに、アミノ酸を含むことができる。
【０３５２】
一実施形態において、腸肝再循環をさらに模倣するために、胆汁流はＧＩ流に連結され得る。一実施形態において、胆汁はＧＩ流体と混合され得る。そのような混合は、例えば、以下でさらに詳細に説明するような様式で達成され得る。
【０３５３】
図４０Ｂに示すような一実施形態３４６０において、腸肝再循環をさらに模倣するために、ＧＩ流は血流に連結され得る。相互作用３４６０は、マイクロスケール透過性基板３４６４を有する透過性アセンブリ３４６２と、１つ以上の特定機能の細胞３４６６によって画定される表面とを含み得る。一実施形態において、特定機能の細胞３４６６は、腸上皮細胞を含み得る。一実施形態において、ＧＩ流から血流への化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ吸収を促進するように、Ｃａｃｏ‐２細胞３４６８が細胞３４６６の近隣に提供され得る。
【０３５４】
一実施形態において、透過性材料３４６２は、マイクロスケール透過性基板３４６４上で培養された胃腸細胞の層を含み得る。一実施形態において、胃腸細胞の層の少なくとも一部は、流体が当該層を通らずにそのいずれかの側面に沿って流れることができるよう、デバイス３４６０内に位置付けられる。一実施形態において、胃腸細胞の層の第１の側面に位置する少なくとも第１のマイクロスケール機構は胃腸管を表すことができ、単分子層の第２の側面に位置する少なくとも第２のマイクロスケール機構は循環器系を表すことができる。一実施形態において、第３のマイクロスケール機構が提供され得、同じまたは異なる種類の生物材料を含有するように構成され得る。
【０３５５】
図４１Ａおよび４１Ｂは、上述した腸肝再循環プロセスの薬物動態シミュレーションを提供することができる、デバイス３７００の実施形態例の部分分解図および組立図を示す。デバイス３７００は、図４０Ｂを参照して上述したものと同様の、ＧＩ‐血液相互作用機能性を提供することができるＧＩ代用モジュール３７２０を含み得る。デバイス３７００は、図４０Ａを参照して上述したものと同様の、血液‐胆汁相互作用機能性を提供することができる臓器系モジュール３７３０も含み得る。筐体キャップ３７１０および３７６０はデバイス３７００に筐体を提供することができ、様々な流体流れのための経路を提供することもできる。
【０３５６】
図示するように、ＧＩ代用モジュール３７２０へ（矢印３７７０）およびそこから（矢印３７７２）のＧＩ流は、それぞれの経路３７１２および３７１４によって提供され得る。同様に、臓器系モジュール３７３０の血液側へ（矢印３７７４）およびそこから（矢印３７７６）の血流は、それぞれの経路３７６２、３７５０および３７５２、３７６８によって提供され得る。同様に、臓器系モジュール３７３０の胆汁側へ（矢印３７７８）およびそこから（３７８０）の胆汁流は、それぞれの経路３７６４および３７６６によって提供され得る。
【０３５７】
図示するように、ＧＩ代用モジュール３７２０は、マイクロスケール透過性基板３７２４を有する透過性アセンブリを含むコンパートメント３７２２を含み得る。マイクロスケール透過性基板３７２４は、図３９を参照して上述した材料のいずれか１つまたは組み合わせから形成され得る。透過性アセンブリは、マイクロスケール透過性基板３７２４上に形成された腸上皮細胞３７２６を含んでもよい。一実施形態において、コンパートメント３７２２のＧＩ側は、細胞３７２６の近隣にＣａｃｏ‐２細胞３７２８を含み得る。一般に知られているように、Ｃａｃｏ‐２細胞は、腸から血液への、化合物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ吸収を促進することができる。
【０３５８】
ＧＩ代用モジュール３７２０の透過性アセンブリを通って吸収された化合物は、臓器系モジュール３７３０のコンパートメント３７３２で血液系に入ることができる。血液は、コンパートメント３７３２とその他１つ以上のコンパートメントとの間を循環することができる。説明の目的で、血液‐胆汁相互作用のための透過性アセンブリを有するコンパートメント３７３４と、（標的細胞３７４６を介して）標的臓器をシミュレートするコンパートメント３７４４とを示す。一実施形態において、標的臓器３７４４は、薬物活性によって影響を及ぼされ得る臓器または組織を含んでよい。例えば、心臓薬を試験する場合、標的臓器３７４４は心臓であってよい。別の例において、薬物毒性を試験する場合、標的臓器は膵臓であってよい。
【０３５９】
コンパートメント３７３４の透過性アセンブリは、マイクロスケール透過性基板３７３６を含むように示されている。マイクロスケール透過性基板３７３６は、図３９を参照して上述した材料のいずれか１つまたは組み合わせから形成され得る。透過性アセンブリは、マイクロスケール透過性基板３７３６上で形成された肝細胞３７３８を含んでもよい。一実施形態において、肝細胞３７３８は、図４０Ａを参照して上述した様式で、結合剤を介してマイクロスケール透過性基板３７３６に結合され得る。一実施形態において、透過性アセンブリは、図４０Ａを参照して上述したような機能性を提供するために、線維芽細胞３７４０をさらに含んでよい。
【０３６０】
臓器系モジュール３７３０の透過性アセンブリは、（コンパートメント３７３４の空間３７４２内の）血流と（透過性アセンブリのもう一方の側面上の）胆汁流との間の血液‐胆汁相互作用を促進することができる。続いて、胆汁流は経路３７６４および３７６６を介して循環させられることができ、胆汁はＧＩ流中に再導入（図示せず）されることができる。
【０３６１】
図４１Ｃは、図４１Ａに示すものと同様の臓器系モジュール３７００の、別の部分分解図を示す。図４１Ｃにおいては、血液‐胆汁相互作用のための透過性アセンブリを有するコンパートメント３７３４が、付記によってさらに詳細に示されている。一実施形態において、コンパートメント３７３４の透過性アセンブリは、図３９を参照して上述したものと同様であってよい。したがって、透過性アセンブリ３４３０は、透過性材料３４３２と、当該透過性材料３４３２のいずれかまたは両方の側面上に形成された細胞または細胞材料３４３４とを含み得る。一実施形態において、細胞３４３４は、本明細書で説明しているように結合され得る肝細胞であってよい。肝細胞が使用される一実施形態において、透過性アセンブリ３４３０は、線維芽細胞３４３６をさらに含んでよい。
【０３６２】
図４２は、図４１Ａおよび４１Ｂの腸肝再循環シミュレーションデバイス例において実装され得る、様々な流体流れの概略例３８００を描写している。一実施形態において、本明細書で記載しているようなＧＩ血液関門３８１２を有するＧＩ管コンパートメント３８１０を貫流するために、ＧＩ流体流れ３８０２（点線として描写されている）が提供され得る。ＧＩ流体流れ３８０２は、ＧＩ流体容器３８５０から別の容器（図示せず）へ流れるようにされてよい。一実施形態において、ＧＩ流体流れ３８０２は再循環しない。
【０３６３】
図４２に示すように、ＧＩ‐胆汁相互作用は、ＧＩ血液関門３８１２によって促進され得る。血流３８０４は、実線として描写されている。３８０４ａとして示されている血流は、関門３８１２を介してＧＩ管コンパートメント３８１０内のＧＩ流３８０２と相互作用し、肝臓コンパートメント３８２０へ方向付けられる。（本明細書に記載するような）血液胆汁関門３８２２は、血流３８０４ａの、胆汁流３８０６との相互作用を促進することができる。一実施形態において、肝臓コンパートメント３８２０からの胆汁流３８０６は、胆汁流体容器３８６０から提供され得る。一実施形態において、肝臓コンパートメント３８２０からの胆汁流３８０６は、ＧＩ管コンパートメント３８１０の上流である場所でＧＩ流３８０２と混合され、それによって肝臓コンパートメント３８２０からの胆汁の再循環機能性を提供することができる。
【０３６４】
一実施形態において、肝臓コンパートメント３８２０からの血流３８０４ａは、その他１つ以上のコンパートメントへ方向付けられることができる。例えば、血流３８０４ｃ（３８０４ｂを介するもの）は、標的組織コンパートメント３８３０に血液を提供するように示され、血流３８０４ｅ（３８０４ｂを介するもの）は、その他の組織コンパートメント３８４０に血液を提供するように示されている。コンパートメント３８３０および３８４０からの血流３８０４ｄおよび３８０４ｆは、ＧＩ管コンパートメント３８１０の上流である場所で血流３８０４ａの一部となることができる、血流３８０４ｇに再結合され得る。
【０３６５】
図４３Ａから４３Ｅは、上述したマイクロスケール透過性デバイスの、一実施形態の作製の様々な段階を示す。図４４は、図４３Ａから４３Ｅのデバイスの作製を実行することができるプロセス３５２０の一実施形態を示す。
【０３６６】
図４３Ａに示すように、基板３５００上に開口部３５０２が形成され得る。そのような開口部の形成は、プロセスブロック３５２２内で達成され得る。
【０３６７】
図４３Ｂに示すように、開口部３５０２内にマイクロスケール透過性基板３５０４が形成され得る。そのようなマイクロスケール透過性基板３５０４の形成は、プロセスブロック３５２４内で達成され得る。
【０３６８】
図４３Ｃに示すように、マイクロスケール透過性基板３５０４上に、１つ以上の結合剤３５０６が位置付けられ得る。そのような結合剤３５０６の提供は、プロセスブロック３５２６内で達成され得る。
【０３６９】
図４３Ｄに示すように、１つ以上の特定機能の細胞３５０８が、結合剤３５０６を介してマイクロスケール透過性基板３５０４に結合され得る。そのような特定機能の細胞３５０８の結合は、プロセスブロック３５２８内で達成され得る。
【０３７０】
図４３Ｅに示すように、密封を提供するため、および／または、細胞３５０８の成長および維持管理を促進するために、特定機能の細胞３５０８の間に１つ以上の線維芽細胞３５１０が導入され得る。そのような線維芽細胞３５１０の導入は、プロセスブロック３５３０内で達成され得る。
【０３７１】
一実施形態において、マイクロスケール透過性基板３５０４は、以下の限定的でない例によって形成され得る。微孔性表面は、バイアス印加下、ＨＦ（Ｈｙｄｒｏｆｌｕｏｒｉｃ  Ａｃｉｄ；フッ化水素酸）でエッチングすることによってシリコンから形成され得る。微孔性表面は、直径約０．４ミクロンを超える細孔サイズの場合には標準的なフォトリソグラフィおよびエッチング技術を、または、直径約０．４ミクロン未満の細孔サイズの場合には電子ビームリソグラフィおよびエッチングを使用することにより、低応力窒化シリコン薄膜からも形成され得る。
【０３７２】
限定的でない一実施形態例において、マイクロコンタクトプリンティング技術を利用することにより、結合タンパク質を微孔性表面上にマイクロパターン化することができる。複製成形技術を使用して、シリコーンエラストマー「ラバースタンプ」を産生することができる。ラバースタンプを結合タンパク質の溶液中に浸し、続いてこれらの結合タンパク質を微孔性材料の表面に蒸着することにより、結合タンパク質のマイクロパターンを産生することができる。このプロセスは、一般にマイクロコンタクトプリンティングとして知られている。
【０３７３】
限定的でない一実施形態例において、肝細胞を結合タンパク質に付着させることができ、付着後、線維芽細胞を表面に導入し、肝細胞によって占領されていない微孔性表面の実質的にすべての領域に付着させることができる。
【０３７４】
その他の作製技術を利用してもよい。
【０３７５】
一実施形態において、マイクロスケール透過性材料（図３９の３４３２等）および少なくとも１つの結合剤（図４３Ｃの３５０６等）は、デバイスを画定することができる。少なくとも１つの結合剤は物質を極性化させるように構成されることができ、当該物質は肝機能の少なくとも１つの性質を明示する。
【０３７６】
一実施形態において、物質は、１つ以上の肝細胞であってよい。一実施形態において、物質は、遺伝子組み換え生物材料であってよい。
【０３７７】
一実施形態において、結合剤は、肝細胞をマイクロスケール透過性材料に結合し極性化させることができる。
【０３７８】
一実施形態において、デバイスは、マイクロスケール透過性材料（図３９の３４３２等）と、肝機能の少なくとも１つの性質を明示するように構成される少なくとも１つの物質とを含んでよく、当該物質によって処理された分子は、マイクロスケール透過性材料の少なくとも一部を通過するように方向付けられ得る。
【０３７９】
図４５は、本開示の１つ以上の技術を使用して連結され得るシステムの様々な組み合わせの、限定的でない例を示す。マイクロスケール透過性デバイス３５４０は、血液系と胆管系との間の相互作用を可能にすることができる。マイクロスケール透過性デバイス３５４２は、血液系とＧＩ系との間の相互作用を可能にすることができる。選択された連結（矢印３５４４として描写されている）は、（例えば、選択された場所で混合することによって、）胆管系とＧＩ系との間の相互作用を可能にすることができる。マイクロスケール透過性デバイス３５４６は、血液系と脳系との間の相互作用を可能にすることができる。マイクロスケール透過性デバイス３５４８は、血液系と泌尿器系との間の相互作用を可能にすることができる。
【０３８０】
マイクロスケール透過性デバイスを介してその他の系間相互作用が可能であることが理解されるであろう。したがって、図４６に示すように、概して、マイクロスケール透過性デバイス３５５０は、第１の流体系と第２の流体系との間の相互作用を可能にすることができる。
【０３８１】
上記の記述において、マイクロスケール透過性デバイスの様々な実施形態が、システム層または分離層のいずれかの部分である層の一部であるものとして描写されている。そのような構成では、異なるシステムと関連付けられたコンパートメントは、異なる層上に形成されているものとして描写される。
【０３８２】
いくつかの実施形態において、これは必ずしも必要条件というわけではない。例えば、一実施形態において、臓器系モジュール（図４１Ａおよび４１Ｂの３７３０）は層の一方の側面上に形成されることができ、ＧＩ代用モジュール（図４１Ａおよび４１Ｂの３７２０）は同じ層の他方の側面上に形成されることができる。
【０３８３】
別の実施形態例において、マイクロスケール透過性デバイスは、２つのコンパートメントを画定し、各コンパートメントが分離したシステムを表すように、所与の層の上に形成され得る。したがって、図４７の実施形態例３５６０に示すように、マイクロスケール透過性デバイス３５６２は、２つのコンパートメント３５６４および３５６６を画定および分離するように、層上に形成され得る。したがって、第１のコンパートメント３５６４は第１の流体系を表すことができ、第２のコンパートメント３５６６は第２の流体系を表すことができる。マイクロスケール透過性デバイス３５６２は、第１と第２の流体系間に相互作用を提供することができる。適宜、図４１Ａおよび４１Ｂに示すもののような、より複雑なシステムを形成することができる。
【０３８４】
上記で開示した実施形態では、上記で開示した実施形態に適用した場合の本発明の基本的な新規の特徴を図示説明し指摘したが、示したデバイス、システム、および／または方法の詳細の形態における様々な省略、代替、および変更が、本発明の範囲を逸脱することなく当業者によって為され得ることを理解すべきである。よって、本発明の範囲は、前述の説明に限定されるべきでなく、添付の特許請求の範囲によって定義されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【０３８５】
【図１】図１は、本発明によるシステムのブロック図である。
【図２】図２は、本発明のシステムの外観の、一実施形態の簡略斜視図である。
【図３】図３は、本発明のシステムの、別の実施形態の詳細な概略図である。
【図４】図４は、本発明のシステムの、さらに別の実施形態の概略図である。
【図５】図５Ａから５Ｇは、プラスチックからチップを作製するために使用されるステップを示す。図５Ａは、シリコンウエハをポジ型フォトレジスト材料で被覆するステップを示す。図５Ｂは、レジスト被覆シリコンウエハをフォト材料によって紫外線に露光させるステップを示す。図５Ｃは、フォトレジスト材料を現像するステップを示す。図５Ｄは、シリコンをエッチングするステップを示す。図５Ｅは、フォトレジスト材料を剥ぎ取り、金を蒸発させるステップを示す。図５Ｆは、ニッケルを電気メッキするステップを示す。図５Ｇは、シリコンを除去し、ポリマーをエンボス加工するするステップを示す。
【図６】図６は、本発明のシステムの、また別の実施形態の概略図である。
【図７】図７は、チップと関連付けられたコンピュータを詳述する概略である。
【図８】図８は、筐体内に位置する１つを超えるチップを示す概略である。
【図９】図９は、異なる筐体のチップのセットを含むシステムの概略である。
【図１０】図１０は、チップのさらに別の実施形態の概略である。
【図１１】図１１は、システムの等角部分分解図である。
【図１２】図１２は、図１１に示すシステムと関連付けられた顎を作製するステップの等角図である。
【図１３】図１３は、図１１に示すシステムと関連付けられたポンプのシングルトラフ弾性部分の等角図である。
【図１４】図１４は、ポンプのマルチトラフ弾性部分の等角図である。
【図１５】図１５は、４コンパートメントチップの概略図である。
【図１６Ａ】図１６は、テガフール用量反応。チップの、肝臓コンパートメント内にＨｅｐＧ２‐Ｃ３Ａ細胞を撒き、標的組織コンパートメント内にＨＣＴ‐１１６結腸癌細胞を撒いた。指示された濃度のテガフールで２４時間チップを処理した。第１のグラフ（図１６Ａ）は、チップ上での再循環の２４時間後における、死細胞対テガフールまたは５‐ＦＵ濃度パーセンテージのプロットである。第２のグラフ（図１６Ｂ）は、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを使用する同様の用量反応であり、ＨＣＴ‐１１６細胞は４８時間曝露を使用している。ＨＣＴ‐１１６細胞をポリリジン処理したガラスカバースリップ上に撒き、指示された濃度のテガフールまたは５‐ＦＵに曝露した。４８時間インキュベーション後、カバースリップを上述したように処理し、細胞死のパーセンテージを測定した。
【図１６Ｂ】図１６は、テガフール用量反応。チップの、肝臓コンパートメント内にＨｅｐＧ２‐Ｃ３Ａ細胞を撒き、標的組織コンパートメント内にＨＣＴ‐１１６結腸癌細胞を撒いた。指示された濃度のテガフールで２４時間チップを処理した。第１のグラフ（図１６Ａ）は、チップ上での再循環の２４時間後における、死細胞対テガフールまたは５‐ＦＵ濃度パーセンテージのプロットである。第２のグラフ（図１６Ｂ）は、従来のｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを使用する同様の用量反応であり、ＨＣＴ‐１１６細胞は４８時間曝露を使用している。ＨＣＴ‐１１６細胞をポリリジン処理したガラスカバースリップ上に撒き、指示された濃度のテガフールまたは５‐ＦＵに曝露した。４８時間インキュベーション後、カバースリップを上述したように処理し、細胞死のパーセンテージを測定した。
【図１７Ａ】図１７Ａは、「第１世代」３コンパートメントデバイスを描写している。図１７Ｂは、デバイスの断面図を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａは、「第１世代」３コンパートメントデバイスを描写している。図１７Ｂは、デバイスの断面図を示す。
【図１８Ａ】図１８Ａは、「第２世代」デバイスを描写している。図１８Ｂは、チャンバ内に５μｍの高い隆線を描写しており、図１８Ｃは、チャンバ内に２０μｍの高い柱を描写している。
【図１８Ｂ】図１８Ａは、「第２世代」デバイスを描写している。図１８Ｂは、チャンバ内に５μｍの高い隆線を描写しており、図１８Ｃは、チャンバ内に２０μｍの高い柱を描写している。
【図１８Ｃ】図１８Ａは、「第２世代」デバイスを描写している。図１８Ｂは、チャンバ内に５μｍの高い隆線を描写しており、図１８Ｃは、チャンバ内に２０μｍの高い柱を描写している。
【図１９】図１９は、「第３世代」デバイスを描写している。
【図２０】図２０は、５コンパートメントＰＢＰＫモデルＣＣＡを表す流れ図である。
【図２１】図２１は、肺、標的組織、およびその他の組織を表すコンパートメントを含有するヒトバイオチッププロトタイプを描写している。コンパートメントおよびチャネルの寸法は、以下のとおりである：  入り口：１ｍｍ×１ｍｍ  肝臓：幅３．２ｍｍ×長さ４ｍｍ  標的組織：幅２ｍｍ×長さ２ｍｍ  その他の組織：幅３４０μｍ×長さ１１０ｍｍ  出口：１ｍｍ×１ｍｍ  肝臓をＹ接続部に接続するチャネル：幅４４０μｍ  Ｙ接続部から標的組織までのチャネル：幅１００μｍ
【図２２】図２２は、マイクロスケールチップシステムの概略図を描写している。
【図２３】図２３は、ＨｅｐＧ２、ＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ、およびヒト肝臓の基底のＣＹＰ発現量を描写している。３回の分離測定の標準誤差である。
【図２４Ａ】図２４Ａは、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、およびＲＰＭＩ中でのＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ成長曲線を描写している。図２４Ｂは、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、およびＲＰＭＩ中でのＨＣＴ‐１１６成長曲線を描写している。３回の分離測定の標準誤差である。
【図２４Ｂ】図２４Ａは、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、およびＲＰＭＩ中でのＨｅｐＧ２／Ｃ３Ａ成長曲線を描写している。図２４Ｂは、ＥＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＭｃＣｏｙ’ｓ、およびＲＰＭＩ中でのＨＣＴ‐１１６成長曲線を描写している。３回の分離測定の標準誤差である。
【図２５】図２５は、異なる成長培地条件下での、ＨｅｐＧ２／Ｃ３ＡにおけるＣＹＰイソフォーム発現のＲＴ‐ＰＣＲ測定を描写している。
【図２６】図２６は、異なる基質上で成長したＨｅｐＧ２／Ｃ３ＡにおけるＣＹＰイソフォーム発現のＲＴ‐ＰＣＲ測定を描写している。
【図２７】図２７は、ヒトバイオチッププロトタイプを描写している。
【図２８Ａ】図２８Ａは、本発明の一実施形態による、マイクロスケール培養デバイスを制御するためのシステムを図示するブロックダイアグラム図である。図２８Ｂは、本発明の別の実施形態による、マイクロスケール培養デバイスを制御するためのシステムを図示するブロックダイアグラム図である。
【図２８Ｂ】図２８Ａは、本発明の一実施形態による、マイクロスケール培養デバイスを制御するためのシステムを図示するブロックダイアグラム図である。図２８Ｂは、本発明の別の実施形態による、マイクロスケール培養デバイスを制御するためのシステムを図示するブロックダイアグラム図である。
【図２９】図２９は、本発明の一実施形態による、マイクロスケール培養デバイスを動的に制御するコンピュータ化された方法を図示するフローダイアグラム図である。
【図３０】図３０は、本発明の一実施形態による、マイクロスケール培養デバイスを制御するためのコンピュータを図示するブロックダイアグラム図である。
【図３１】図３１は、一実施形態において、第１および第２の流体系間の相互作用が、ｉｎ  ｖｉｖｏで見られるものと同様の生理的パラメータを持つ条件下に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで提供され維持され得ることを示す。
【図３２】図３２は、その間で様々な系間相互作用がｉｎ  ｖｉｔｒｏでシミュレートされ得るいくつかの流体系例のブロック図を示す。
【図３３Ａ】図３３Ａは、２つの流体系間の相互作用例を示す。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、一実施形態において、所与の流体系は１つを超える流体系と相互作用できることを示す。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、一実施形態において、所与の流体系は２つを超える流体系と相互作用できることを示す。
【図３３Ｄ】図３３Ｄは、一実施形態において、流体系相互作用は再循環機能性を提供し得ることを示す。
【図３４Ａ】図３４Ａは、２流体系構成の実施形態例の部分分解図を示し、系間相互作用は、透過性材料によって促進され得る。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、図３４Ａの２流体系の組立図を示す。
【図３４Ｃ】図３４Ｃは、図３４Ａの２流体系の上面図を示す。
【図３４Ｄ】図３４Ｄは、図３４Ａのシステムの、変形の一実施形態を示す。
【図３５Ａ】図３５Ａは、３流体系構成の実施形態例の部分分解図を示し、２つの系間相互作用は、１種類以上の透過性材料によって促進され得る。
【図３５Ｂ】図３５Ｂは、図３５Ａの３流体系の組立図を示す。
【図３６】図３６は、３流体系例のブロック図を示し、臓器系は、胃腸（ＧＩ）系等の薬物送達システムと、および、脳系等の標的システムと相互作用しているものとして描写されている。
【図３７】図３７は、肝臓を含む様々な系間相互作用を含む構成例のブロック図を示し、そのような相互作用は、腸肝循環等の再循環プロセスの一部であってよい。
【図３８】図３８は、図３７の腸肝循環を描写するブロック図を示す。
【図３９】図３９は、２つの流体系間における１つ以上の相互作用を促進することができる透過性材料を有する、マイクロスケール透過性デバイスの一実施形態を示す。
【図４０Ａ】図４０Ａは、血液系と胆管系との間の相互作用を促進するように構成される、マイクロスケール透過性デバイスの一実施形態を示す。
【図４０Ｂ】図４０Ｂは、ＧＩ系と血液系との間の相互作用を促進するように構成される、マイクロスケール透過性デバイスの一実施形態を示す。
【図４１Ａ】図４１Ａおよび４１Ｂは、腸肝循環シミュレーションデバイスの一実施形態の部分分解図および組立図を示す。
【図４１Ｂ】よび４１Ｂは、腸肝循環シミュレーションデバイスの一実施形態の部分分解図および組立図を示す。
【図４１Ｃ】図４１Ｃは、図４１Ａの別の部分分解図を示し、マイクロスケール透過性デバイスの一実施形態がさらに詳細に示されている。
【図４２】図４２は、図４１Ａおよび４１Ｂの腸肝循環シミュレーションデバイス例において実装され得る、様々な流体流れを示す概略描写例を示す。
【図４３】図４３Ａから４３Ｅは、図３９のマイクロスケール透過性デバイスの、一実施形態の作製の様々な段階を示す。
【図４４】図４４は、図４３Ａから４３Ｄのマイクロスケール透過性デバイスを作製するプロセスの一実施形態を示す。
【図４５】図４５は、マイクロスケール透過性デバイスによって促進され得る系間相互作用の、限定的でない例を示す。
【図４６】図４６は、マイクロスケール透過性材料によって促進される、第１および第２の系の間における系間相互作用の全体描写を示す。
【図４７】図４７は、一実施形態において、マイクロスケール透過性デバイスは、同じ層上に形成された２つコンパートメント間の系間相互作用を促進するように構成されることができ、当該２つのコンパートメントは２つの異なるシステムの一部であることを示す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３４Ｃ】
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【図３４Ｄ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４３Ｃ】
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【図４３Ｄ】
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【図４３Ｅ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【国際調査報告】
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