(57)【要約】  本発明はグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するベクター、好ましくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターを提供する。本発明は、かかるベクターのストックおよびかかるベクターを含有する医薬組成物も提供する。本発明は更に、脊髄損傷疼痛を治療するための有効量でグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターを哺乳動物に対して投与することを含有する、哺乳動物の脊髄損傷疼痛などの疼痛を治療する方法も提供する。【選択図】図１−１および図１−２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７の拡張された欠失およびＵＬ５５の欠失を含有し、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有する非単位複製配列組み換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）を含有する、ベクター。
【請求項２】
該ＧＡＤタンパク質がＧＡＤ６７である、請求項１に記載のベクター。
【請求項３】
ＧＡＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された誘導可能なプロモーターを更に含有する、請求項１に記載のベクター。
【請求項４】
ＧＡＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結されたヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＨＣＭＶ  ＩＥｐ）を更に含有する、請求項１に記載のベクター。
【請求項５】
ＧＡＤタンパク質をコードする配列が組み換えＨＳＶのＵＬ４１座、ＩＣＰ４座またはＩＣＰ２７座内に挿入される、請求項１に記載のベクター。
【請求項６】
少なくとも１つの必須ＨＳＶ遺伝子が更に欠損している、請求項１に記載のベクター。
【請求項７】
該必須ＨＳＶ遺伝子が前初期ＨＳＶ遺伝子、初期ＨＳＶ遺伝子または後期ＨＳＶ遺伝子である、請求項６に記載のベクター。
【請求項８】
ＩＣＰ２２およびＩＣＰ４７ならびにその組合せからなる群から選択される前初期遺伝子が更に欠損している、請求項１に記載のベクター。
【請求項９】
該組み換えＨＳＶが複製欠損である、請求項１に記載のベクター。
【請求項１０】
請求項１または９に記載のベクターを含有する、ウイルスストック。
【請求項１１】
請求項１または９に記載のベクターおよび生理学的に許容され得る担体を含有する、組成物。
【請求項１２】
哺乳動物の脊髄損傷疼痛または末梢神経障害性疼痛を治療するための医薬を調製するための、請求項１〜１１のいずれかに記載のベクターの使用。
【請求項１３】
該哺乳動物がヒトである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７における拡張された欠失およびＵＬ５５の欠失を含有する、ＨＳＶベクター。
【請求項１５】
少なくとも１つの追加の必須ＨＳＶ遺伝子が欠損していることを更に含有する、請求項１４に記載のＨＳＶベクター。
【請求項１６】
該必須ＨＳＶ遺伝子が前初期ＨＳＶ遺伝子、初期ＨＳＶ遺伝子または後期ＨＳＶ遺伝子である、請求項１５に記載のベクター。
【請求項１７】
該前初期遺伝子がＩＣＰ２２、ＩＣＰ４７およびその組合せからなる群から選択される、請求項１６に記載のベクター。
【請求項１８】
該組み換えＨＳＶが複製欠損である、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１９】
更に導入遺伝子を含有する、請求項１４に記載のベクター。
【請求項２０】
該導入遺伝子がＧＡＤをコードする、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２１】
該導入遺伝子がエンケファリンをコードする、請求項１９に記載のベクター。
【請求項２２】
医薬を調製するための、請求項１４〜２１のいずれかに記載のベクターの使用。
【請求項２３】
ＨＳＶのＩＣＰ４遺伝子、ＩＣＰ２７遺伝子およびＵＬ５５遺伝子を補完する細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（政府委託研究および開発に関する陳述）
本発明は米国の国立神経疾患脳卒中研究所により与えられた助成金番号ＮＳ０４４５０７、ＮＳ３８８５０およびＮＳ４３２４７、ならびに復員軍人局からの研究助成金のもと政府支援で部分的になされた。政府は本発明において一定の権利を有し得る。
【０００２】
（発明の分野）
本発明は疼痛を治療するための方法および組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
脊髄損傷後の疼痛は、生活の質に悪影響を与え、効率的な社会復帰を妨げる重要な問題である。脊髄損傷（ＳＣＩ）を患うほとんど全ての患者はＳＣＩ疼痛に苦しむ。ＳＣＩ疼痛は損傷のレベルのものであり得、または損傷のレベル以下のものであり得る。各個人で疼痛は強さ、頻度、症状の発現期間、および経験する疼痛のタイプが多様である。経験する疼痛のタイプを、うずき、無感覚のもの、鈍い疼痛、拍動性のもの、ヒリヒリするもの、または締め付けるようなものとして患者は記述してきた。疼痛は特定の体の領域においてしばしば記述され、体のどちらか片側または両側で生じる。これは連続的または断続的であり得、体での場所または活動に関係しない。
【０００４】
慢性ＳＣＩ疼痛は脊髄損傷の時に始まり得、またはＳＣＩ後に数ヶ月または数年かけて徐々に発現する。慢性ＳＣＩ疼痛は長期間持続し、しばしば従来の疼痛の治療は奏効しない。いくつかの報告によると、ＳＣＩを患う９０％もの数の人が慢性ＳＣＩ疼痛も経験している。ＳＣＩ疼痛のレベルは、患者にとって単なる不快なものから耐えられないものまでの範囲であり得る。これらの報告にはＳＣＩ後の慢性疼痛の２つの分類が記載される。アットレベル（Ａｔ−ｌｅｖｅｌ）の神経障害性ＳＣＩ疼痛とは、脊髄損傷部位の近くの皮節をいう。ビロウレベル（Ｂｅｌｏｗ−ｌｅｖｅｌ）の神経障害性ＳＣＩ疼痛とは、脊髄損傷部位のレベルより下の皮節をいう。前者はしばしば脊髄損傷の初期段階の間に発現し、時間とともに消散する。一方、後者は徐々に発現し、一般的に医学的治療の効果がない。脊髄損傷後の慢性ＳＣＩ疼痛は、生活の質に悪影響を与え、効率的な社会復帰を妨げる重大な問題である。
【０００５】
ＳＣＩ疼痛は筋骨格系疼痛または神経障害性疼痛として分類され得る。筋骨格系ＳＣＩ疼痛は骨、関節および筋肉のような体の組織を過剰に使いすぎた結果生じる。筋骨格系ＳＣＩ疼痛はしばしば活動することにより悪化し、休息により緩和される。
【０００６】
神経障害性ＳＣＩ疼痛は、神経系が正常な感覚を疼痛として異常に処理することに起因し得る。例えば、脊髄および脳は他の正常な感覚を疼痛として解釈し得る。損傷のレベルにおける神経障害性ＳＣＩ疼痛は、実際の神経根の損傷または脊髄自体の損傷に起因し得る。医者および他のヘルスケアの専門家はこれを「分節性求心路遮断」または「帯状疼痛」と呼ぶであろう。このタイプの神経障害性ＳＣＩ疼痛は、通常は両側性であり、円周のパターン（例えば腹からまわって背中へ）を伴う。他のタイプの慢性疼痛のように、始めの脊髄損傷後の最初の数週間でこの疼痛は発現し得、または時間とともによりゆっくりと発現するであろう。損傷のレベルより下の広範性の神経障害性ＳＣＩ疼痛は、中枢神経系に起こった実際の変化に起因し得る。このＳＣＩ神経障害性疼痛は、しばしば異痛（通常では痛くはないものによる疼痛、例えば軽い触覚）または痛覚過敏（通常はちょっとした疼痛を生じるものによって引き起こされる極端な疼痛、例えばピンの刺し傷）に関連する。
【０００７】
病態の本質的特徴を反復する動物モデルの確立は、損傷した脊髄での神経化学的変化の同定を可能にした。１つのモデルでは、これはＳＣＩモデルであるが、Ｔ１３での脊髄の側面片側切断に実験用ラットを供した。Ｔ１３での実験用ラットの脊髄の側面片側切断により、両後肢において片側切断より下の左右両側の疼痛に関する行動が生じた。ＳＣＩモデルは、ＳＣＩ疼痛の新規な治療を試験するための独自の動物モデルを提供する。
【０００８】
脊髄でのγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）作用性阻害機序の機能低下およびカルシトニン遺伝子関連ペプチド（ＣＧＲＰ）の増加はどちらも、ＳＣＩ後に報告されている。ＧＡＢＡ媒介阻害はシナプス前性およびシナプス後性の両方に働くが、一次求心路と二次（second-order）脊髄視床路ニューロンとの間の侵害受容性神経伝達を持続的に調節する。脊髄のＧＡＢＡ作用性神経伝達の薬理学的な拮抗作用は、結果的には神経障害性ＳＣＩ疼痛に見られるものと似た機械的過敏症をもたらす。ＧＡＢＡ作用薬（例えばバクロフェン）は、選択された神経障害性疼痛症候群の治療に限り承認される。しかし、ＧＡＢＡ受容体が中枢神経系の至る所に分布することが、鞘内投与された時でさえ、バクロフェンの投与を厳しく制限することを強いる副作用をもたらす。
【０００９】
皮下接種により送達された組み換え単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）に基づくベクターが、選択された後根神経節（ＤＲＧ）のニューロンにおいて神経伝達を発現するために使用され得るということが、これまでに実証されている。プロエンケファリンを発現するように構築されたＨＳＶベクターは、炎症疼痛、神経障害性疼痛、骨腫による疼痛を有するげっ歯類モデルにおいて、局所的な疼痛を緩和する効果をもたらす。ＳＣＩ疼痛は一般的にオピオイド治療に抵抗性が見られるが、髄腔内のバクロフェンに対しては反応し得る。
【００１０】
別の研究は、ＧＡＤをコードする遺伝子を含むように操作されたアデノ随伴ウイルスまたはヘルペス単位複製配列ベクターが、遺伝子導入細胞中でＧＡＢＡを発現するように使用され得ることを実証した。しかしながら、これらの研究における該ベクターは脳のニューロンの核中に直接注入されているが、疼痛のモデルまたは実験では使用されていない。
【００１１】
最近でも、ＳＣＩ疼痛に対して一様にうまくいく内科的または外科的治療はない。最近のＳＣＩ疼痛治療はオピオイドおよび神経障害治療薬を含む。これらの治療への反応の割合はしばしば副作用により限定される。残念なことに、神経障害性ＳＣＩ疼痛はオピオイド（例えばモルヒネ）にいつも反応するわけではない。ある場合では、ＳＣＩ疼痛は神経障害治療薬（例えば特定の鎮痙剤または抗うつ剤）のいずれにも反応しない。疼痛範囲を麻痺することができる神経根ブロッカーを推奨する医師もいるが、該麻痺効果は短時間しか続かない。時々推奨される別のアプローチは、ＤＲＥＺ（脊髄後根侵入帯）、神経根切断術または脊髄切断術などの外科的手段を使用することである。該手段は、ＳＣＩ疼痛のレベルを結局のところは上昇させ、長期にわたって神経障害性ＳＣＩ疼痛を悪化させるであろう。
【００１２】
末梢神経障害性疼痛は一般的な別の疼痛であり、多発性神経障害または構造的神経損傷に伴う疼痛を治療することは難しい。オピオイドは比較的効果が薄く、その使用は副作用により制限される。抗うつ剤および鎮痙剤は無作為対照化試験では有効性が実証されたが、治療された患者の半分を下回る人のうちでたった５０％緩和しただけであった。神経障害性疼痛の根本である複雑な機序の中で、部分的神経損傷は脊髄でのＧＡＢＡ作用性阻害シナプス電流の選択的喪失をもたらす。このことは、異常な疼痛の感受性および神経障害性疼痛症候群の表現型特性の原因となる。ＧＡＢＡ作用性薬剤は神経障害性疼痛の治療において広く使用されてはこなかった。なぜなら、該薬剤の治療濃度域がわずかであり、用量が副作用により制限されるからである。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
したがって、ＳＣＩ疼痛および神経障害性疼痛を処置するための治療的アプローチが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
（発明の簡単な要旨）
本発明は、グルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するベクター、好ましくは単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクターを提供する。本発明は、かかるベクターのストックおよびかかるベクターを含有する医薬成分も提供する。本発明は哺乳動物において脊髄損傷疼痛または末梢神経障害性疼痛などの疼痛を治療する方法を更に提供する。該方法は、哺乳動物に脊髄損傷疼痛を治療するための有効量のグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターを投与することを含む。これらの利点および更なる発明の特徴は、以下の発明の詳細および付随する図により明らかになる。
【発明を実施するための最良の形態】
【００１５】
（発明の詳細な説明）
本発明は、グルタミン酸脱炭酸酵素タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含有するベクターを提供する。該ベクターはいかなる適切な遺伝子運搬ベクターでもあり得る。適切なベクターの例は、プラスミド、リポソーム、分子複合体（例えばトランスフェリン）およびウイルスを含む。好ましくは該ベクターはウイルスベクターである。適切なウイルスベクターは、例えば、レトロウイルスベクター、ヘルペスウイルスベースのベクターおよびパルボウイルスベースのベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベースのベクター、ＡＡＶ−アデノウイルスキメラベクターおよびアデノウイルスベースのベクター）を含む。当業者は特定の状況に適当なベクターを決定するために必要な理解を有している。
【００１６】
好ましい実施態様において、該ベクターはＨＳＶベースなどのヘルペスウイルスベースのベクターである。ＨＳＶベースのウイルスベクターは核酸配列を多数の細胞タイプに導入するためのベクターとして使用するのに適している。成熟したＨＳＶウイルス粒子は、１５２ｋｂの直鎖状の２重鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有する外被２０面体キャプシドで構成される。好ましい実施態様において、ＨＳＶウイルスベースのベクターは少なくとも１つの必須ＨＳＶ遺伝子を欠損している。当然ながら、該ベクターは必須でない遺伝子をその代わりとして、またはそれに加えて欠失することができる。好ましくは、少なくとも１つの必須ＨＳＶ遺伝子を欠損する該ＨＳＶベースのウイルスベクターは、複製欠損である。最も複製欠損であるＨＳＶベクターは、複製を阻害する１つ以上の前初期ＨＳＶ遺伝子、初期ＨＳＶ遺伝子または後期ＨＳＶ遺伝子を除く欠失を含む。例えば、該ＨＳＶベクターは、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７、ＩＣＰ４７およびその組合せからなる群から選ばれる前初期遺伝子を欠損し得る。該ＨＳＶベクターの利点は結果的に長期にわたるＤＮＡ発現ができ、かつ最大で２５ｋｂの外因性のＤＮＡ挿入に適応できる大きなウイルス性ＤＮＡゲノムをもたらす潜伏期に入る（enter a latent stage）能力を有することである。ＨＳＶベースのベクターは、例えば、米国特許５，８３７，５３２、５，８４６，７８２、５，８４９，５７２、および５，８０４，４１３、ならびに国際特許出願ＷＯ９１／０２７８８、ＷＯ９６／０４３９４、ＷＯ９８／１５６３７、およびＷＯ９９／０６５８３に記載されており、これらは引用によって本明細書に組み込まれる。好ましくは、該ＨＳＶベクターは、ＨＳＶベクターがウイルス複製に必要な１を超える遺伝子機能を欠損することを意味する「多重欠損」である。該ＨＳＶ配列はｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ：８０／ｅｎｔｒｅｚ／ｑｕｅｒｙ．ｆｃｇｉ？ｃｍｄ＝Ｒｅｔｒｉｅｖｅ＆ｄｂ＝ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ＆ｌｉｓｔ＿ｕｉｄｓ＝９６２９３７８＆ｄｏｐｔ＝ＧｅｎＢａｎｋ＆ｔｅｒｍ＝ｈｓｖ−１＆ｑｔｙ＝１においてインターネット上で入手可能であり、これは設計したベクター中の所望の突然変異の生成を容易にする。
【００１７】
該ＨＳＶベクターは、ＨＳＶゲノムの初期領域だけ、ＨＳＶゲノムの前初期領域だけ、ＨＳＶゲノムの後期領域だけ、またはＨＳＶゲノムの初期および後期領域の両方の、複製に必須な遺伝子機能を欠損し得る。ＨＳＶベクターはまた、除去された完全ＨＳＶゲノムを実質的に有し得る。この場合では、ウイルスの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および１つ以上のプロモーター、またはウイルスのＩＴＲおよびパッケージングシグナルの少なくともいずれかが生来のまま（すなわち、ＨＳＶ単位複製配列）残されていることが好ましい。除去されたＨＳＶゲノムの領域が大きくなればなるほど、ゲノム中に挿入可能な外因性の核酸配列の断片も大きくなる。しかしながら、本発明のベクターは非単位複製配列（ｎｏｎ−ａｍｐｌｉｃｏｎ）ＨＳＶベクターであることが好ましい。
【００１８】
該ＨＳＶベクターの異なる領域の欠失が哺乳動物の免疫応答を変化させ得ることは評価されるべきである。特に、異なる領域の欠失は該ＨＳＶベクターにより生じる炎症反応を減少させ得る。更に、野生型外被タンパク質に対する中和抗体に認識され得るＨＳＶベクターまたは認識され得ないＨＳＶベクターを減少させるように、ＨＳＶベクターの外被タンパク質は改変され得る。
【００１９】
多重複製欠損の時、単複製欠損ＨＳＶベクターにより得られるのと同じくらいのウイルスの成長を補完細胞株内で提供するように、該ＨＳＶベクターは好ましくはスペーサーエレメントを含んでいる。該スペーサーエレメントは、いかなる核酸配列または所望の長さの配列も含み得る。該スペーサーエレメント配列は、ＨＳＶゲノムに関してコードまたは非コード、および生来または非生来の配列であり得る。しかし、欠損領域に複製に必須な機能（複数の機能）を回復させない配列であり得る。さらに、欠損ＨＳＶ領域のいずれかまたは全てにスペーサーエレメントを含むことは、大きな挿入を行うＨＳＶベクターの能力を減少させるだろう。ＨＳＶベクターの産生には当業者に良く知られた標準的な分子生物学的技術を用いることを包含する。
【００２０】
複製欠損ＨＳＶベクター中には存在しない遺伝子機能を与える補完細胞株において、複製欠損ＨＳＶベクターは通常生産される。しかし、ウイルスベクターのストックの高力価を生じさせるために適当なレベルのウイルス増殖が必要とされる。好ましい細胞株は複製欠損ＨＳＶベクター中に存在しない、複製に必須な遺伝子機能を少なくとも１つ、および好ましくは全てを補完する。該細胞株は、成長効率または複製効率を減少させる必須でない遺伝子（例えば、ＵＬ５５）も該遺伝子が欠けている場合は、また補完し得る。該補完細胞株は、全てのＨＳＶ機能（例えば、逆位末端反復配列およびパッケージングシグナルだけ、またはＩＴＲおよびＨＳＶプロモーターだけなどの最小のＨＳＶ配列を含むＨＳＶ単位複製配列の増殖を可能にする）を含む、初期領域、前初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス関連領域またはその組合せによりコードされる少なくとも１つの複製に必須な遺伝子機能の欠損を補完し得る。該細胞株はＨＳＶベクターとは重複しない様式で補完遺伝子を含んでいるということにおいて、好ましくは更に特徴付けられる。該補完遺伝子は、ＨＳＶベクターゲノムが細胞ＤＮＡと組み換わる可能性を最小化し、実質的に排除する。結果的に、ベクターストック中で発現することが避けられないとしても、複製コンピテントＨＳＶの出現は最小化される。したがって、特定の治療目的、特に遺伝子治療目的には適している。補完細胞株の構築は当業者に良く知られた標準的な分子生物学的技術および細胞培養技術を包含する。
【００２１】
ベクターが複製欠損ＨＳＶである時、タンパク質（例えば、ＧＡＤタンパク質）をコードしている核酸配列は、好ましくは必須ＨＳＶ遺伝子座、最も好ましくはＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子座またはＩＣＰ２７遺伝子座のどちらかに位置する。ＨＳＶゲノム（例えば、ＨＳＶゲノムのＩＣＰ４遺伝子座またはＩＣＰ２７遺伝子座）中への核酸配列の挿入は既知の方法によって促進され得る。その方法は、例えばＨＳＶゲノムの特定の位置に、ある固有の制限部位を導入することによる。
【００２２】
本発明に関して使用される好ましいＨＳＶベクターは、拡張されたＩＣＰ４欠失またはＩＣＰ２７欠失、および好ましくは両方の欠失を含む。この文脈中では、「拡張された」欠失とは、好ましいベクターが産生に使用された補完細胞株に関して、遺伝子座のどちらかまたは両方の相同な配列も有しないことを意味している。望ましくは、該ウイルスはＩＣＰ４もしくはＩＣＰ２７（または両方）をコードする配列またはプロモーター配列を残さない。好ましくは、ＩＣＰ２７の欠失は更にＵＬ５５座にまで拡張され、望ましくは両方の遺伝子が除去される。したがって、本発明において使用される最も好ましいウイルスは、補完細胞株において使用される遺伝子とウイルスの相同性がないように、ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７およびＵＬ５５における拡張された欠失を含む。望ましくは、該ベクターは更に、（例えば、異なる調節配列およびポリアデニル配列を使用する時でさえ）補完細胞株において用いられている配列と相同ないずれのＤＮＡ配列も含まない。
【００２３】
上記のように、遺伝子機能、特にＨＳＶベクターから欠失した必須遺伝子機能を補完する細胞株は、該ベクターを複製するのに（そして必要であれば必須ＨＳＶ遺伝子の場合において）望ましい。したがって、ＩＣＰ４およびＩＣＰ２の両方を欠失する好ましいベクターを供するために、両方の必須遺伝子を補完するように操作された細胞株が供される。その上、ＵＬ５５−ＨＳＶ株が十分に育たないように、ベクターの骨格から欠失している時はそれを補完する細胞株を使用することが望ましい。補完細胞株を産生する方法は当業者に既知である。
【００２４】
上記のように、本発明のベクターはＧＡＤタンパク質をコードする核酸配列（すなわち、1つ以上のＧＡＤタンパク質をコードする1つ以上の核酸配列）も含有する。該ＧＡＤタンパク質をコードする核酸配列はいずれの源からも得ることができる。該配列は、例えば、天然から単離され得、合成的に産生され得、遺伝的に操作された生物から単離され得る。当業者は、ベクター中に挿入され得るいずれのタイプの核酸配列（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびｃＤＮＡ）も本発明と組み合せて使用可能であることを理解するだろう。
【００２５】
本発明のベクターの核酸配列は分泌されるタンパク質をコードし得る。例えば、感染細胞により天然に分泌されるタンパク質である。あるいは、該核酸配列は、細胞内で酵素触媒により分泌された産物（例えば、ＧＡＢＡ）またはペプチドを産生するＧＡＤなどのタンパク質をコードし得る。あるいは、該核酸配列は細胞によって天然には分泌されないタンパク質（すなわち、非分泌タンパク質）をコードし得る。しかし、該配列はタンパク質の分泌を促進するシグナルペプチドを含有する。この場合、例えば、該核酸配列は小胞体（ＥＲ）局在シグナルペプチドおよび該非分泌タンパク質をコードする。ＥＲ局在シグナルペプチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡおよび／またはタンパク質を、タンパク質が発現され分泌の標的にされる小胞体膜に向かわせるように機能する。ＥＲ局在シグナルペプチドは望ましくは（ｉ）細胞によって通常は分泌（すなわち、分泌可能である）されないタンパク質、および／または（ｉｉ）細胞によって通常分泌されるが少量である（すなわち、所望の量より少ない）タンパク質の細胞による分泌（すなわち、分泌能力）を増加させるように機能する。ポリヌクレオチドによりコードされるＥＲ局在シグナルペプチドは、いずれの適切なＥＲ局在シグナルペプチドまたはポリペプチド（すなわち、タンパク質）でもあり得る。例えば、該核酸配列によりコードされるＥＲ局在シグナルペプチドは、神経成長因子（ＮＧＦ）、免疫グロブリン（Ｉｇ）（例えば、Ｉｇ  κ鎖リーダー配列）およびミッドカイン（ＭＫ）またはその一部からなる群から選択されるペプチドまたはポリペプチド（すなわち、タンパク質）であり得る。適切なＥＲ局在シグナルペプチドはＬａｄｕｎｇａ，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１１，１３−１８（２０００）に記載されたものも含む。
【００２６】
該核酸配列はいずれのタンパク質をもコードし得るが、該タンパク質は好ましくはＧＡＤタンパク質またはエンケファリンである。数種の異なる遺伝子、特にＧＡＤ２５、ＧＡＤ６５およびＧＡＤ６７にコードされる哺乳動物ＧＡＤのいくつかのアイソフォームがある。主に膜および神経末端を標的とするＧＡＤ６５は、ピリドキサール−５’−リン酸塩および他の補因子によって調節される。シナプス放出の調製において、ＧＡＤ６５は小胞中にＧＡＢＡをパッケージングすることに責を負うと考えられている。哺乳動物のＧＡＤの別のアイソフォームであるＧＡＤ６７は主に細胞質にあり、酵素活性はタンパク質レベルによって調節されるようである。ＧＡＤ２５はＧＡＤ６７のオルタナティブスプライシング変異体である。該ベクターは好ましくはＧＡＤ６７をコードする核酸配列を含有する。ヒトＧＡＤ６７遺伝子のコード配列およびコードされた遺伝子産物のアミノ酸配列（すなわち、コードされたタンパク質）はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）のウェブサイトでそれぞれＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿０００８１７（配列番号１）およびＮＰ＿０００８０８（配列番号２）として公的に入手可能である。同様に、ヒトエンケファリン遺伝子のコード配列およびコードされた遺伝子産物のアミノ酸配列（すなわち、コードされたタンパク質）はＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＮＭ＿００６２１１として公的に入手可能である。
【００２７】
該核酸配列は上述のタンパク質のいずれの変異体、ホモログまたは機能的部分もコードし得る。タンパク質の変異体は、対応する自然に生じるタンパク質から起こった１つ以上の変異（例えば、点突然変異、欠失、挿入など）を含み得る。「自然に生じること」は、タンパク質が天然で見られ、かつ合成的に修飾されていないということを意味する。したがって、変異がタンパク質をコードする核酸配列中に導入される場所では、望ましくはそのような変異はコードされたタンパク質中の以下のような置換をもたらすであろう。すなわち、正に荷電した残基（Ｈ、ＫおよびＲ）をコードするコドンが正に荷電した残基をコードするコドンに置換され、負に荷電した残基（ＤおよびＥ）をコードするコドンが負に荷電した残基をコードするコドンに置換され、中立極性残基（Ｃ、Ｇ、Ｎ、Ｑ、Ｓ、ＴおよびＹ）をコードするコドンが中立極性残基をコードするコドンに置換され、かつ中立無極性残基（Ａ、Ｆ、Ｉ、Ｌ、Ｍ、Ｐ、ＶおよびＷ）をコードするコドンが中立無極性残基をコードするコドンに置換される。更に、タンパク質のホモログは、ペプチド、ポリペプチドまたはそれらの一部のいずれでもあり得、アミノ酸レベルで該タンパク質と約７０％超同一（好ましくは８０％超同一であり、より好ましくは９０％超同一であり、更に好ましくは９５％超同一）である。アミノ酸同一性の程度は、ＢＬＡＳＴ配列データベースなどの当業者に既知のいずれかの方法を用いて決定することができる。「機能的部分」は、自然に生じる全長ＧＡＤタンパク質の生物学的活性を測定可能なレベルで保持するＧＡＤタンパク質のいずれかの部分である。該ベクターの核酸配列の発現によって生産されるＧＡＤタンパク質の機能的部分は、ＧＡＤタンパク質部分をコードする核酸配列を一時的に導入したヒト細胞中のＧＡＤタンパク質部分の生物学的活性の分析などの標準的な分子生物学的技術および細胞培養技術を用いて同定され得る。
【００２８】
該タンパク質をコードする核酸配列の発現は、核酸配列へ操作可能に連結した適切な発現制御配列によって制御される。「発現制御配列」は、他の核酸配列の発現（一般的には好ましくは転写）を促進し、強化し、または制御するいずれかの核酸配列である。適切な発現制御配列は、構成的なプロモーター、誘導可能なプロモーター、抑制可能なプロモーター、およびエンハンサーを含む。ベクター中で該タンパク質をコードしている核酸配列は、内因性プロモーターによって、または好ましくは非天然のプロモーター配列によって調節され得る。適切な非天然のプロモーターの例には、ＨＣＭＶ前初期プロモーター（ＨＣＭＶ  ＩＥｐ）などのヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）プロモーター、ＨＩＶ長末端反復配列プロモーターなどのヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来プロモーター、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、ＲＳＶ長末端反復配列などのラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、Ｌａｐ２プロモーターまたはヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al., Proc. Natl. Acad. ScI, 78, 144-145 (1981))、ＳＶ４０またはエプスタインバーウイルス由来のプロモーターなどが含まれる。好ましい実施態様において、該プロモーターはＨＣＭＶ  ＩＥｐである。該ＨＣＭＶ  ＩＥｐプロモーターは組み換えＨＳＶのＩＣＰ４座内に挿入され得る。あるいは、該タンパク質をコードする核酸配列の発現はキメラプロモーター配列によって制御され得る。少なくとも２つの異なる源（例えば、１つの生物ゲノムの２つの異なる領域、２つの異なる生物、または合成された配列と組み合わされた生物）から得られ、由来し、または基づく少なくとも２つの核酸配列部分を含有する場合、プロモーター配列は「キメラ」である。配列を互いに操作可能に連結する技術は当業者に周知である。
【００２９】
該プロモーターは誘導可能なプロモーター、すなわち適当なシグナルに応答して上方調節および／または下方調節されるプロモーターであり得る。例えば、医薬製剤によって上方調節される発現制御配列は、特に疼痛を管理する用途に有用である。例えば、該プロモーターは医薬的に誘導可能なプロモーター（例えば、テトラサイクリンに反応する）であり得る。かかるプロモーターの例はＡｒｉａｄにより市販されている。該プロモータは当業者に既知の方法で、例えばゲノムの特定領域に固有の制限部位を導入することにより、ベクターのゲノムに導入され得る。あるいは、該プロモーターはＧＡＤなどのタンパク質をコードする核酸配列を含む発現カセットの一部として挿入され得る。好ましい実施態様において、誘導可能なプロモーターはＧＡＤタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と操作可能に連結する。
【００３０】
好ましくは、該タンパク質をコードする核酸配列がタンパク質をコードする領域の３’に位置するポリアデニル化配列などの転写終結領域を更に含有する。いずれの適切なポリアデニル化配列も使用され得る。該配列は合成最適化配列ならびにＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタインバーウイルス）ならびにヒトパピローマウイルスおよびＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含むパピローマウイルスのポリアデニル化配列を含む。
【００３１】
タンパク質をコードする核酸（プロモーターおよび転写終結領域を含む）に加えて、該ベクターは少なくとも１つの他の遺伝子産物をコードする少なくとも１つの追加の核酸配列を含有し得る。該遺伝子産物は例えば、それ自体が病気予防の機能または治療機能を有したり、または該タンパク質の病気予防の潜在能力もしくは治療の潜在能力を拡張したり増強したりする。追加の核酸配列にコードされた遺伝子産物は所望の活性を有するＲＮＡ、ペプチドまたはポリペプチドであり得る。追加の核酸配列が病気予防の利点または治療の利点を与える場合、該核酸配列はＲＮＡまたはタンパク質のレベルでその影響を発揮し得る。あるいは、追加の核酸配列はアンチセンス分子、リボザイム、スプライシングもしくは３’プロセシング（例えば、ポリアデニル化）に影響するタンパク質、あるいは例えば、ｍＲＮＡの蓄積の変化した早さもしくはｍＲＮＡの輸送の変化した早さまたは転写調節後の変化を媒介することにより細胞中の別の遺伝子の発現レベルに影響するタンパク質をコードする（すなわち、遺伝子発現は転写開始からプロセスタンパク質の生産を通して全ての段階を含むと広く考えられている）。追加の核酸配列は、目的とする組成物の最終使用により、病気予防の利点または治療の利点を与える多様な遺伝子産物のいずれか１つをコードし得る。追加の核酸配列は、ベクターの核酸配列によってコードされるタンパク質よりも異なる標的に作用する因子をもコードし得、それによって多因子性の治療を提供する。追加の核酸配列は組み合せ治療のためのキメラタンパク質をコードし得る。追加の遺伝子産物は分泌され、または細胞内に留まり、細胞が溶解されなければ、または溶解される前に生産される。多様な遺伝子産物はベクターの治療に関する潜在能力を増強し得る。
【００３２】
追加の核酸配列は１つの遺伝子産物または複数の遺伝子産物をコードし得る。あるいは、複数の追加の核酸配列（それぞれが１つ以上の遺伝子産物をコードする）がベクター中に挿入され得る。どちらの場合でも、遺伝子産物（複数の遺伝子産物）の発現は個々の発現制御配列によって別々に調節され得、または１つの共通の発現制御配列によって協調的に調節され得る。あるいは、追加の核酸（複数の追加の核酸）の発現は、ベクターの核酸配列にコードされるタンパク質の発現を調節する同一の発現制御配列によって調節され得る；しかしながら、タンパク質をコードする核酸中に存在するいずれの転写終結領域も、追加の核酸配列（複数の追加の核酸配列）の転写リードスルー（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を可能にするように除去されるだろう。追加の核酸配列（複数の追加の核酸配列）は、ベクターの核酸配列の発現によって生産されるタンパク質の発現に関連する、本明細書中で議論したいずれの適切な発現制御配列（複数の発現制御配列）およびいずれの適切な転写終結領域（複数の転写終結領域）も含有し得る。
【００３３】
ベクターを作製した後、該ベクターは精製される。組成物中のベクターの濃度を増強するためのベクターの精製は、濃度勾配精製、クロマトグラフィー技術、または限界希釈精製などによる、いずれの適切な方法によっても行われ得る。該ベクターは、好ましくは複製欠損ＨＳＶベクターであるが、望ましくはＨＳＶベクターに感染させた細胞を溶解すること、およびＨＳＶベクターを含む画分を収集することを含む方法を用いて、複製欠損ＨＳＶベクターに感染した細胞から精製する。
【００３４】
該細胞は、界面活性剤への曝露、凍結解凍、および細胞膜破裂（例えば、加圧方細胞破壊装置または顕微鏡溶液化による）などのいずれかの適切な方法を用いて溶解され得る。それから、該細胞溶解液は、緩やかな遠心分離、ろ過またはタンジェンシャル  フロー  濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）（ＴＦＦ）などのいずれかの適切な方法を用いて、大きな断片の細胞屑を除去して浄化されてもよい。その後、浄化された細胞溶解液は、浄化された細胞溶解液中でベクター粒子中に含まれないいかなるＤＮＡまたはＲＮＡも除去するために、ＤＮＡおよびＲＮＡを分解することのできる酵素（「ＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ」）で処理されてもよい。
【００３５】
一般的に、細胞があらかじめ決定された数のウイルスに直面させられることが保証されるように、十分なウイルスが細胞集団に送達され得る時に、本発明の組み換えＨＳＶは最も有用である。したがって、本発明は本発明のＨＳＶベクターを含むストック、好ましくは均質なストックを提供する。ＨＳＶストックの調製および分析は当業者に周知である。例えば、ウイルスストックは、ＨＳＶベクターで形質導入された細胞を含むローラーボトル中で製造され得る。それから、該ウイルスストックは連続的なナイコデンツ勾配で精製され得、等分されて必要とされるまで保存され得る。ウイルスストックは、ウイルス遺伝子型およびプロトコルならびにストック調製に用いた細胞株に主に依存して、力価が大幅に変化する。好ましくは、かかるストックは、少なくとも約１０５プラーク形成単位（ｐｆｕ）、例えば少なくとも約１０６ｐｆｕ、より好ましくは少なくとも約１０７ｐｆｕのウイルス力価を有する。更により好ましい実施態様では、力価は少なくとも約１０８ｐｆｕ、または少なくとも約１０９ｐｆｕであり得、少なくとも約１０１０ｐｆｕまたは少なくとも約１０１１ｐｆｕの高力価ストックが最も好ましい。
【００３６】
本発明はＨＳＶベクターおよび担体、好ましくは生理学的に許容され得る担体を含有する組成物を更に提供する。該組成物の担体は、ベクターに対して適切ないかなる担体でもあり得る。該担体は一般的には液体であるが、固体または液体と固体の成分の組み合せでもあり得る。該担体は望ましくは医薬的に許容され得る（例えば、生理学的または薬理学的に許容され得る）担体（例えば、賦形剤または希釈剤）である。医薬的に許容され得る担体は周知であり、すでに市販されている。担体の選択は、少なくとも部分的には組成物を投与するために使用される特定のベクターおよび特定の方法によって決定されるであろう。該組成物は更にいかなる他の適切な成分、特に該組成物および／または最終使用の安定性を増強するための成分も含み得る。したがって、本発明の組成物の適切な剤形は幅広く多様である。後述の剤形および方法は例示にすぎず、決して限定する意味はない。
【００３７】
非経口投与に適した剤形は、抗酸化物質、緩衝剤、静菌薬、および目的の受容者の血液に等張の剤形を与える溶質を含み得る水性および非水性等張無菌注射液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および防腐剤を含み得る水性および非水性滅菌懸濁液を含む。該剤形は、アンプルおよびバイアルなどの単一用量（ｕｎｉｔ−ｄｏｓｅ）または複数用量（ｍｕｌｔｉ−ｄｏｓｅ）の密閉された容器で提供され得、使用直前に無菌賦形剤溶液（例えば注射については水）を添加することだけを必要とするフリーズドライされた（凍結乾燥された）状態で貯蔵され得る。
その場で調製する注射液および懸濁液は、前記した種類の滅菌粉末、顆粒および錠剤から調製され得る。
【００３８】
更に、該組成物は更なる治療または生物学的に活性な薬剤を含有し得る。例えば、特定の徴候の治療において有用な治療的因子が存在し得る。イブプロフェンまたはステロイドなどの炎症を制御する因子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのベクターの投与および生理的損傷にともなう腫れおよび炎症を減少させるために組成物の一部であり得る。免疫系サプレッサーはベクター自身に対するいかなる免疫応答、または疾患に関連するいかなる免疫応答も減少させるために組成物の方法で投与され得る。あるいは、免疫エンハンサーは病気に対する体の自然な防御を高めるための組成物に含まれ得る。
【００３９】
抗生物質、すなわち殺微生物剤および殺菌剤は、遺伝子輸送手段および他の病気に関する感染リスクを減少させるために存在してもよい。
【００４０】
本発明は、哺乳動物にグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）タンパク質をコードする核酸配列を含む本発明のベクターまたは組成物を脊髄損傷疼痛または末梢神経障害性疼痛を治療するための有効量投与することを含む哺乳動物における脊髄損傷疼痛または末梢神経障害性疼痛を治療する方法も提供する。好ましい実施態様において、投与されるベクターはウイルスベクターである。好ましい実施態様において、該哺乳動物はヒトである。
【００４１】
脊髄損傷疼痛または末梢神経障害性疼痛を治療する方法は、更に該方法の有効性を修飾する（例えば、増強する）ような他の治療および／または薬剤の投与（すなわち前投与、共投与、および／または後投与）を含み得る。本発明の方法は、宿主に対する組成物の効果を局所的または全身的に変化させる（すなわち、減少または増強させる）他の物質の投与を更に含み得る。例えば、宿主中でのベクターの核酸配列の発現を通して生産されたタンパク質のいずれかの全身性の効果も減少させる物質が、宿主における全身性毒性のレベルを制御するために使用され得る。同じように、宿主内でのベクターの核酸配列の発現を通して産生されたタンパク質の局所的な効果を増強する物質も、宿主における病気予防効果または治療効果を生み出すために必要なタンパク質のレベルを減少させるために使用され得る。かかる物質は拮抗剤、例えばベクターの核酸配列の発現を通して生産されるタンパク質に対して方向付けられた可溶性受容体または抗体および該タンパク質の作用物質を含む。
【００４２】
当業者は本発明のベクターおよび本発明の組成物を治療または予防（例えば、遺伝子治療、ワクチン治療など（例えば、Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５２，４３１−４３４（１９９１），Ｊａｆｆｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，３９（２），３０２Ａ（１９９１），Ｒｏｓｅｎｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｒｅｓ．，３９（２），３１１Ａ（１９９１），Ｂｅｒｋｎｅｒ，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，６，６１６−６２９（１９８８）参照））のために動物（特にヒト）に対して投与する適切な方法が使用可能であり、そして、１以上の経路が組成物の投与に使用可能であること、特定の経路が他の経路よりもより素早くかつより効率的な反応を提供し得ることを理解するであろう。好ましい投与経路は、脊髄後角においてＧＡＢＡを放出させるために末梢接種を通じてＤＲＧニューロンに形質導入することを含む。多くの実施態様では、これは皮下移植でＧＡＤベクターを送達することによって達成され得、ＳＣＩ疼痛または末梢神経障害性疼痛を治療するための本発明のアプローチの魅力的な特徴である。
【００４３】
本発明に関して動物、特にヒトに投与される用量は、特定のベクター、ベクターを含む組成物およびそのための担体（上記）、投与方法、ならびに治療される特定の場所および組織によって変化するであろう。該用量は、望ましい時間枠内で、望ましい応答（例えば、治療応答または病気予防応答）を奏功するのに十分であるべきである。したがって、本発明の組成物のベクターの用量は、一般的には約１×１０５以上の粒子ユニット（例えば約１×１０６以上の粒子ユニット、約１×１０７以上の粒子ユニット、１×１０８以上の粒子ユニット、１×１０９以上の粒子ユニット、１×１０１０以上の粒子ユニット、１×１０１１以上の粒子ユニット、または１×１０１２以上の粒子ユニット）である。該ベクターの用量は一般的には１×１０１３以下の粒子ユニット（例えば、４×１０１２以下の粒子ユニット、１×１０１２以下の粒子ユニット、１×１０１１以下の粒子ユニット、または１×１０１０以下の粒子ユニット）ではない。
【００４４】
以下の実施例は更に本発明を実証するものであるが、もちろん発明の範囲を限定する目的で解釈されるべきではない。これらの実施例において、いくつかの測定を記録し、統計学的分析を行った。ベクター処理した動物と対照動物との間の差異の統計的有意性は、多変量分散分析またはノンパラメトリック測定によるＫｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ検定を用いて決定された。単独比較はＳｔｕｄｅｎｔ’ｓ  Ｔ検定によって行った。有意なものとして＜０．０５のＰ値を用いた。全てのデータは平均値±標準誤差（ＳＥＭ）として示した。
【実施例】
【００４５】
（実施例１）
本実施例はＧＡＤベクターの構築を実証する。
【００４６】
複製しないＨＳＶベクターＱＨＧＡＤ６７はＨＳＶ前初期（ＩＥ）遺伝子であるＩＣＰ４、ＩＣＰ２２、ＩＣＰ２７およびＩＣＰ４７の発現が欠損しており、ＵＬ４１座中のヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＨＣＭＶ  ＩＥｐ）の制御下のヒトＧＡＤ６７遺伝子を含む（図１）。対照ベクターＱ０ＺＨＧ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ，７４（２１），１０１３２−４１（２０００）に記載の方法により構築された）は同じ遺伝子を欠損するが、同じ部位に大腸菌ｌａｃＺレポーター遺伝子を含む（図１）。
【００４７】
ＧＡＤ６７のｃＤＮＡ（Ｂｕ，Ｄ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８９，２１１５−２１１９（１９９２）に記載の方法により構築された）は、シャトルプラスミドｐ４１Ｈ中のヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーターの下流のＣｌａ  Ｉ／Ｘｂａ  Ｉ断片として個々にサブクローン化された。該ｃＤＮＡは、プロモーター、およびベクターのＵＬ４１遺伝子座における効率的な相同組み換えを可能にするための適切なＨＳＶ隣接ＤＮＡ配列を含む。Ｐｍｅ  Ｉ消化ウイルスプラスミドＤＮＡおよび標的プラスミドＤＮＡで補完７ｂ細胞を共トランスフェクションすることによって、発現／標的カセットをベクターＱ０ＺＨＧのＵＬ４１座中に組み換えて、ＬａｃＺマーカー遺伝子をＧＡＤ発現構築物に置き換えた。組み換えＱＨＧＡＤ６７は限界希釈精製を３回行うことによって精製し、遺伝的構造をサザンブロットによって確認した。ベクターストックはローラーボトル中で７ｂ細胞内に生産され、連続ナイコデンツ勾配で精製され、使用するために解凍されるまで等分して−８０℃で保存された。最終ベクター産物の力価はＫｒｉｓｋｙ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ（１９９６）に記載のようにして決定した。
【００４８】
（実施例２）
この実施例はＩＣＰ４座およびＩＣＰ２７座の拡張された欠失ならびにＵＬ５５の欠失を有するＨＳＶベクターの構築を実証する。
【００４９】
このベクターを構築するための概略図は図１４で説明する。特に、プラスミドｄ１０６（Ｈａｄｊｉｐａｎａｙｉｓ  ａｎｄ  ＤｅＬｕｃａ，Ｃａｎ  Ｒｅｓ６５（１２）：５３０−６（２００５））は、ＱＯＺＨＧ．１を生産するためにプラスミドＴＯＺ．１（Ａｒａｆａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎ  Ｒｅｓ  ６：４４４２−８（２０００））とウイルスによって交雑された。ベクターＱＯＺＨＧ．１の詳細は実施例１に、その構築はＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７４（２１），１０１３２−４１（２０００）に記載されている。
【００５０】
プラスミドｐＰＸＥ（Ｎｉｒａｎｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ８（４）：５３０−４２（２００３））を、ＱＯＺＨＧ．１のＩＣＰ２７座中に組み換えることにより、以前のＩＣＰ２７欠失をレスキューし、ＨＣＭＶ−ｅＧＦＰ遺伝子を除去した。そして、蛍光顕微鏡下で緑色蛍光を示さないプラークを選択することによって、単一組み換え体（ｓｉｎｇｌｅ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）が単離され、精製され、確認された。組み換え体はＥ１と名づけた。Ｅ１はＧＦＰ遺伝子が陰性であり、ＬａｃＺ遺伝子が陽性であった。
【００５１】
プラスミド４１ＨＮは、ｐＢＳＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＨｉｎｄ  ＩＩＩからＮｏｔ  Ｉの部位中に、ＵＬ４１コード配列を含むＨｉｎｄ  ＩＩＩからＮｏｔ  Ｉの断片（ＨＳＶ−１ゲノムヌクレオチド９０１４５から９３８５８）をクローニングすることによって生産した。それから、プラスミド４１ＨＮをＥ１のＵＬ４１座中に組み換えることにより、野生型ＵＬ４１遺伝子をレスキューし、ＬａｃＺを除去した。結果として生じたＥ１−１と名づけられたベクターは、標準的な方法によって単離され、精製され、確認された。このベクターはｇｆｐ遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子の両方が陰性であった。
【００５２】
プラスミドｐＳＡＳＢ３はＳｐｈ  Ｉ／Ｓａｌ  Ｉ消化ｐＳＰ７２中に、ＨＳＶ−１  ＫＯＳ株ゲノム（ヌクレオチド１２４４８５−１２６４１３）のＳｐｈ  ＩからＡｆｌ  ＩＩＩの（Ｓａｌ  Ｉで結合された）断片（１９２８ｂｐ）をクローニングし、続いて、ベクタープラスミドのＢｇｌ  ＩＩからＢａｍＨ  Ｉの部位中へ、短い逆位末端反復配列領域内に含まれたウイルス開始点を含むＩＣＰ４プロモーターの上流領域を含む６９５ｂｐのＢｇｌ  ＩＩからＢａｍＨ  Ｉの断片（ヌクレオチド１３１９３１から１３２６２６）を挿入した。
【００５３】
プラスミドｐＳＡＳＢ３ｇｆｐを、ｐＳＡＳＢ３のＢａｍＨ  Ｉ部位にＨＣＭＶ−ｅＧＦＰ断片をクローニングすることによって構築した（ｃｏｎｔｒｕｃｔｅｄ）。それから、プラスミドｐＳＡＳＢ３ｇｆｐを、Ｅ１−１のＩＣＰ４座中に組み換えることにより、ＩＣＰ４欠失を拡張した。結果として生じたベクターは、Ｅ１Ｇ６／ｄ１Ｏ６−４ＨＧと名づけ、標準的な方法で単離し、精製し、確認した。
【００５４】
プラスミドｐＳＡＳＢ３−ＨＰＰＥは、サウスカロライナ大学のＤｒ．Ｓｔｅｖｅｎ  Ｗｉｌｓｏｎから提供された、プラスミドｐＣＭＶ−ｈＰＰＥ（Ｌｉｕ  Ｆ，Ｈｏｕｓｌｅｙ  ＰＲ，Ｗｉｌｓｏｎ  ＳＰ．（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｃｈｅｍ．１９９６  Ｏｃｔ；６７（４）：１４５７−６２．）のＥｃｏＲ  ＩからＳａｌ  Ｉの断片を（ＨＣＭＶ前初期プロモーター、ＳＶ４０の１６ｓ／１９ｓのＲＮＡからのＳＶ４０イントロン（１８０ｂｐのＸｈｏ  Ｉ−Ｐｓｔ  Ｉ）、全ｈＰＰＥコード配列、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナル（ＳＶ４０塩基２５３３から２７２９）を含む）クローニングすることによって作製した。ｈＰＰＥ発現構築物のＳａｌ  Ｉ放出は、以前のＥｃｏＲ  Ｉ消化とそれに引き続くＥｃｏＲ  Ｉ部位のクレノー断片平滑末端化、ならびにＳａｌ  Ｉリンカーの連結により可能となった。それから、この結絡産物をＳａｌ  Ｉで消化し、Ｓａｌ  Ｉ隣接発現構築物を精製した。ｐＣＭＶ−ｈＰＰＥは、ｐＵＲ２９２からの９４６ｂｐのＢａｍＨ  Ｉ−Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ断片としてＤｒ．Ｂａｒｂａｒａ  Ｓｐｒｕｃｅから提供されたｃＤＮＡクローンのｐＵＲ２９２からサブクローン化された。ｐＵＲ２９２は平滑末端であり、Ｎｏｔ  Ｉリンカーが付加されており、発現プラスミドｐＣＭＶβの固有のＮｏｔ  Ｉ部位中にクローン化された。
【００５５】
最終的なエンケファリン発現／ＩＣＰ４標的構築物（ｐＳＡＳＢ３−ＨＰＰＥ）は以下のエレメントを含む；１）ＩＣＰ４座を標的とする５’組み換え隣接配列を提供するＨＳＶゲノムの塩基１３１９３１から１３２６２６、２）ヒトサイトメガロウイルス（ＨＣＭＶ）前初期プロモーター（ＩＥｐ）、３）ＳＶ４０の１６ｓ／１９ｓのイントロンスプライスドナー部位およびアクセプター部位、４）プレプロエンケファリンｃＤＮＡ、５）ＳＶ４０後期ポリアデニル化シグナル、６）ＩＣＰ４座を標的とする３’組み換え隣接配列を提供するＨＳＶゲノムの塩基１２４４８５から１２６４１３。
【００５６】
それから、プラスミドｐＳＡＳＢ３−ｈｐｐｅを、Ｅ１Ｇ６／ｄ１０６−４ＨＧのＩＣＰ４座中に組み換えることにより６２２１として一般的に知られるＮｕｒｅｌＰ１（ＮＰ１）ベクターを生産した。
【００５７】
プラスミドＰＳ−ＵＢ６Ｒ−６を、ＰＳＰ４のＢａｍＨ  Ｉ部位内へＢｇｌ  ＩＩ−ＢａｍＨ  Ｉ隣接ユビキチンプロモーターによりドライブされたＲｅｄ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をクローニングすることによって作製した。ＰＳＰ．４のＢａｍＨ  Ｉ部位は、５’ＩＣＰ２７隣接断片とＵＬ５６コード配列との間に位置する。
【００５８】
プラスミドＰＳ−ＵＢ６Ｒ−６をＮＰ１のＩＰＣ２７座中に組み換えることにより、全てのＩＣＰ２７およびＵＬ５５を含み、かつＵＢ６−Ｒｅｄ遺伝子を挿入するように、ＩＣＰ２７欠失を拡張した。結果として生じたベクターは、ＨＰＰＥ６２２１Ｒと名づけ、赤色のプラークを選択することによって、単離され、精製され、および確認された。
【００５９】
プラスミドＰＳＰ４は、プラスミドＰＳ．２中へ、ＩＰＣ２７コーディング配列の５’のＥｃｏＲ  ＩからＢａｍＨ  Ｉ（ＨＳＶ−１ゲノム１１００９５から１１３３２２）をクローニングすることによって作製した。ＰＳ．２は、ｐＢＳＳＫ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）のＮｏｔ  Ｉ部位中へ連結されたＤｄｅ  ＩからＳｍａ  Ｉ（ＨＳＶ−１ゲノム断片１１６１５６から１１７１１９）の平滑末端を含む。
【００６０】
プラスミドＰＳＰ４をＨＰＰＥ６２２１ＲベクターのＩＣＰ２７座中へ組み換えることにより、ＵＢ６−Ｒｅｄを除去し、ＩＣＰ２７／ＵＬ５５欠失を残した。結果として生じるベクターはＮｕｒｅｌｐ２（ＮＰ２）と名づけられ、標準的な方法によって単離され、精製され、確認された。
【００６１】
プラスミドｐＳＡＳＢ３ＧＦＰをＮＰ２のＩＣＰ４座へ組み換えることにより、ＨＣＭＶ−ｈｐｐｅをＨＣＭＶ−ｅＧＦＰへ置き換えた。結果として生じるベクターは、ＳＡＳ２と名づけられ、標準的な方法で単離され、精製され、確認された。
【００６２】
１）Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位をＣｌａ  Ｉ部位に、２）Ｂｂｖ  ＩＩ部位をＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位に、３）得られたＨｉｎｄ  ＩＩＩ部位をＢｇｌ  ＩＩ部位に順次変換することによってプラスミドｐＲＣ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を改変して、プラスミドｐＲＣ２ＨＢ２を作製した。ｐＲＣ２ＨＢ２のＢｇｌ  ＩＩ断片は、約１２００塩基対であるが、プラスミドｐＳＡＳＢ３のＢａｍ  ＨＩ部位中へクローン化してプラスミドｐＳＨＢ３を作製した。別途、Ｈｉｎｄ  ＩＩＩ部位をＢａｍＨ  Ｉ部位に変換することによってＧＡＤ６７クローンを改変して、ｐＧＡＤＨＢ２を作製した。ｐＧＡＤＨＢ２から結果として生じた２．８ｋｂのＢａｍＨ  Ｉ断片を、ｐＳＨＢ３のＢａｍＨ  Ｉ部位にクローン化することによりｐＧＡＤＬ１を作製した。
【００６３】
プラスミドｐＧＡＤ−Ｌ１を、ＳＡＳ２のＩＣＰ４座中へ組み換えることによりベクターＮｕｒｅｌＧ２（ＮＧ２）を生産した。
【００６４】
ベクターＮＰ２、ＳＡＳ２およびＮＧ２は、相同組み換えが細胞株とベクターとの間で起こり得ないように、細胞株と相同性を有しないベクターである。したがって、これらのベクターは細胞ＩＣＰ４、ＩＣＰ２７、ＩＬ５５補完株と組み合せてベクター産生のために使用するために理想的である。
【００６５】
（実施例３）
本実施例は、ＧＡＤベクター形質導入細胞によるＧＡＤタンパク質の発現を実証する。
【００６６】
実験用ラットの後肢の足底表面内にＱＨＧＡＤ６７の皮下接種を行った１週間後、プールされたＬ４−Ｌ６  ＤＲＧにおけるＧＡＤ６７のｍＲＮＡの量をリアルタイムＰＣＲによって検出し、その量はＱ０ＺＨＧを形質導入した反対側のＤＲＧにおける量の５倍多かった（図２）。同様に、（ビヒクルを注射した）反対側のＤＲＧに比べて形質導入されたＤＲＧでは全てのサイズのＤＲＧニューロンの幅広いスペクトルで、ＧＡＤ６７免疫反応性がニューロンで見られた。ウェスタンブロットにより決定されたＧＡＤ６７タンパク質は、接種された対照（０．０２５±０．００６ＯＤユニット）に比べて両腰のＤＲＧ（０．０４８±０．００９ＯＤユニット）において有意に増加していた、Ｐ＜０．０１。
【００６７】
１１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ  ＱＨＧＡＤ６７の３０μｌの皮下接種１週間後、上昇した免疫反応性が、（ビヒクルを注射した）反対側の脊髄後角と比べて、薄膜ＩＩおよびＩＩＩで優勢に見られた。対照ラットの表面脊髄後角において、ＧＡＤ６７免疫反応性は、表面脊髄後角中の内在性ＧＡＢＡ作用性介在ニューロンであるように見受けられる、ほとんどの神経の伸長を伴わない、薄膜ＩＩＩの小円形細胞において、ならびに結節状構造または小さな軸索末端であるように見受けられるいくつかの、より小さく、断続的で、濃く染色した、不規則な輪郭において、優勢に位置していた。免疫染色の強度は、ＱＨＧＡＤ６７により形質導入されたＤＲＧからの軸索の中央末端を含む脊髄後角において実質的に増加し、増加した免疫反応性は軸索末端をあらわす不規則な輪郭中に位置するように見られた。ウェスタンブロットによると、これらの軸索の中央末端を含む腰部背面脊髄におけるＧＡＤの量（０．０４１±０．００８ＯＤユニット）は、偽接種された対照（０．０２７±０．００４ＯＤユニット）に比べて有意に増加した（Ｐ＜０．０１、図３）。
【００６８】
リアルタイムＰＣＲによるＧＡＤのＲＮＡ分析は、以下のようにして行われた：Ｌ４−６  ＤＲＧを素早く取り除き、全ＲＮＡをＴｒｉＲｅａｇｅｎｔ（Ｓｉｇｍａ）を用いてプールしたＬ４−６神経節から抽出した。ＤＮａｓｅ  Ｉの消化後、Ｏｍｎｉｓｃｒｉｐｔ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて第一鎖ｃＤＮＡを生産した。ＧＡＤ６７およびＧＡＰＤＨ（Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ，ＵＳＡ）のためのプライマーおよびプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ  Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ，ＵＳＡ）を用いて設計した。ＧＡＤ６７フォワードプライマー配列番号３；リバースプライマー配列番号４；プローブ、配列番号５（Ｓｙｎｔｈｅｇｅｎ）；およびＣＡＰＤＨフォワードプライマー配列番号６；リバースプライマー配列番号７；プローブ配列番号８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）。ＰＣＲはＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７７００  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で全量５０μｌにて行った。ＲＮＡの量は内部対照としてＧＡＰＤＨを用いて決定し、Ｑ０ＺＨＧにより形質導入されたＤＲＧに関して計算した。それぞれのＰＣＲ増幅は、３つ組のウェルで、以下の条件を用いて行った：５０℃で２分、９５℃で１０分、その後９５℃を１５秒と６０℃を１分を４０サイクル。
【００６９】
ＧＡＤ６７タンパク質の量は、以下のプロトコルによってウェスタンブロットで決定された：脊髄の腰膨大（Ｌ４からＬ６部）のＬ４−Ｌ６  ＤＲＧまたは背面の４分の１を、６０ｍＭ  リン酸緩衝液、ｐＨ  ７．４、１ｍＭ  フェニルメチルスルホニルフッ化物および０．５％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００からなる破砕バッファー（１００ｍｇ組織／ｍｌ）中で超音波処理した。破砕物をＴＬ１００超遠心分離機（Ｂｅｃｋｍａｎ）を用いて１５分１００，０００ｇで遠心分離し、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）によって上澄み中の全タンパク質を測定した。タンパク質を４〜１５％ＳＤＳ勾配ポリアクリルアミドゲルで分離し、ニトロセルロースメンブレン（Ｉｍｍｏｂｉｌｏｎ−Ｐ，Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，Ｍａ，ＵＳＡ）に転写し、ウサギ抗ＧＡＤ６７（１：４０００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｔｅｍｅｃｕｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともにインキュベートし、続いてセイヨウワサビペルオキシダーゼ合成ヤギ抗マウス（１：１０，０００，Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）で処理し、高感度化学発光（ＮＥＮ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）で検出した。メンブレンはストリップし、ローディング・コントロールとしてウサギ抗βアクチンでリプローブした。各バンドの強度はＰＣ−ｂａｓｅｄ  ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｓｙｓｔｅｍ（ＭＣＩＤ，Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｂｒｏｃｋ，Ｏｎｔａｒｉｏ，Ｃａｎａｄａ）を用いて定量的な濃度測定によって決定した。
【００７０】
（実施例４）
本実施例はＧＡＤベクター形質導入細胞におけるＧＡＢＡの放出の増加を実証する。
【００７１】
感染の多重度（ｍ．ｏ．ｉ．）１でｉｎ  ｖｉｔｒｏでＱＨＧＡＤ６７により形質導入された一次ＤＲＧニューロンは、対照から放出されるＧＡＢＡ（２．３４±０．２２ｐｍｍｏｌ／１０μｌ、Ｐ＜０．０１）またはＱ０ＺＨＧで形質導入されたＤＲＧニューロンから放出されるＧＡＢＡ（２．５６±０．５４ｐｍｏｌ／１０μｌ、Ｐ＜０．０１）よりも大幅に多い量のＧＡＢＡを培地中に放出した（９．５３±２．１５ｐｍｏｌ／１０μｌ）（図４Ａ）。１週間前に肢への皮下接種により形質導入されたＤＲＧの中央末端から背面脊髄中に放出されたＧＡＢＡのｉｎ  ｖｉｖｏでの量を、同側の腰部脊髄後角に埋め込まれたカテーテルから微小透析によって決定した。ＱＨＧＡＤ６７を接種された動物から集めた透析液はＧＡＢＡが１．４６±０．２５ｐｍｏｌ／１０μｌ含まれていたのに対して、Ｑ０ＺＨＧを接種した動物から集めた透析液にはＧＡＢＡが０．７４±０．２４ｐｍｏｌ／１０μｌ含まれていた（Ｐ＜０．０５）（図４Ｂ）。
【００７２】
１７日齢のラット胚から分離したＤＲＧニューロンを、１０５細胞／ウェルの濃度で２４ウェルプレート中にポリ−Ｄ−リシン−処理したカバースリップ上にまいた。各ウェルは、７．０Ｓ  ＮＧＦ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）１００ｎｇ／ｍｌを添加した、Ｂ２７、Ｇｌｕｔａｍａｘ  Ｉ、Ａｌｂｕｍａｘ  ＩＩ、およびペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ−ＢＲＬ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を含む５００μｌ  Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ培地を含む。培養１４日目、細胞をｍ．ｏ．ｉ．１で１時間ＱＨＧＡＤ６７またはＱ０ＺＨＧのどちらかで感染させ、その後ウイルスを除去した。４８時間後、培地を人工的な脳脊髄液１００μｌに変えて、５分間の採集時間の後、浴液（ｂａｔｈｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を１０，０００ｇで５分間遠心分離し、ＨＰＬＣによるＧＡＢＡの決定のために上澄みを採取した。ＤＲＧ細胞は免疫細胞化学によってＧＡＤ６７タンパク質の発現を調べた。
【００７３】
脊髄後角においてｉｎ  ｖｉｖｏで神経末端から放出されたＧＡＢＡの量は、以下のプロトコルを用いた微小透析液のＨＰＬＣによって決定した：ラットは抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ）で再麻酔し、脊椎の腰髄部を覆うＴ１１およびＴ１２の薄膜を除去し、硬膜を無傷で残し、該動物を定位固定装置に固定した。熱の喪失を防ぐために加熱ランプを使用し、フィードバックセンサーを用いて体温を３７．５℃に保った。鋭い針を用いて側方から正中へ小さく硬膜を切開し、微小透析プローブ（ＣＭＡ／１１，ｃｕｐｒｏｐｈａｎｅ  ｄｉａｌｙｓｉｓ  ｍｅｍｂｒａｎｅ，長さｌｍｍ，直径０．２４ｍｍ，ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｕｔ−ｏｆｆ  ６ｋＤａ，ＣＭＡ／Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ，Ｓｔｏｃｋｈｏｌｍ，Ｓｗｅｄｅｎ）を硬膜切開部を通して脊髄後角中に挿入し、１μｌ／分の割合で人工脳脊髄液（ＣＭＡ／Ｍｉｃｒｏｄｉａｌｙｓｉｓ）を還流させた。細胞外液で平衡にさせた１時間後、サンプルを１時間かけて集めた。実験の最後に、プローブは空気泡の存在がチェックされ、脊髄の脊髄後角における位置が還流固定部分の顕微鏡によって確認された。
【００７４】
次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入細胞から放出されまたはｉｎ  ｖｉｖｏで微小透析によって集められたＧＡＢＡの量を、６−アミノキノリル−Ｎ−ヒドロキシサクシンイミジル  カルバメート  誘導体化（ＡｃｃＱ．Ｆｌｕｏｒ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｋｉｔ；Ｗａｔｅｒｓ，ＵＳＡ）を用いてＨＰＬＣで決定した。２０μｌの培養溶液を６０μｌのホウ酸塩緩衝剤中で２０μｌの誘導体化試薬と混合した；１０μｌのサンプルを１０分間５５℃で反応させ、Ｅｌｕｅｎｔ  Ａ（Ｗａｔｅｒｓ）およびアセトニトリルからなる移動相を有し流速が１ｍｌ／分であるＡｃｃＱ．Ｔａｑ  ｃｏｌｕｍｎ（３．９×１５０ｍｍ；Ｗａｔｅｒｓ）の勾配ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ  Ｍｏｄｕｌｅ）により分離した。２５０ｎｍの励起波長および３９５ｎｍの発光波長を用い、ピークを３７℃（Ｗａｔｅｒｓ  ２４７５  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ）における蛍光によって検出された。
【００７５】
髄腔内のカテーテルを、以下のプロトコルによって外科的に実験用ラットに埋め込んだ：髄腔内のカテーテルをＴ１３左脊髄片側切断の１週間後にＳｔｏｒｋｓｏｎの方法に準じて配置した。簡単に言えば、該動物を抱水クロラール（４００ｍｇ／ｋｇ）で再麻酔し、正中まで数ミリメートルを残してＬ２からＬ６へ縦切開し、ポリエチレンカテーテル（ＰＥ−１０，Ｃｌａｙ  Ａｄａｍｓ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ，ＵＳＡ）をＬ４−Ｌ５椎間腔から腰部くも膜下腔内へ、カテーテルの先端が脊髄の腰膨大の近くに位置するように導入した。カテーテルの遠位末端は、７μｌの空所を残して、首に現れるまで皮下に埋設された。髄腔内にカテーテルを埋め込んだ後、ラットを各ケージに入れ、運動機能障害の徴候を示した該動物を屠殺した。カテーテルの先端の位置は、リドカイン（２０ｍｇ／ｍｌ）１５μｌ続いて生理食塩水８μｌを注入して２０〜３０分続く運動麻痺を生じさせることにより確かめられた。髄腔内の薬物投与は、髄腔内のカテーテルにつないだｍｉｃｒｏｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｒｉｎｇｅ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏ．，Ｒｅｎｏ，ＮＶ，ＵＳＡ）を用いて、覚醒していて短期間拘束したラットにおいて行った。
【００７６】
（実施例５）
本実施例は、実験用ラットへのＧＡＤベクターの皮下接種がＳＣＩ後の機械的異痛および温熱性痛覚過敏を減少させることを実証する。
【００７７】
Ｔ１３左脊髄の片側切断の１日後、全ての動物が脊髄の片側切断に対して反対側の後肢における運動機能障害を伴わず同側の後肢麻痺を示した。
脊髄の片側切断２週間後、運動機能の著しい回復があった（１２〜１３のＢＢＢスコア、データ表示せず）。１２のＢＢＢスコアは、頻繁ないし一貫した体重を支えて行う錯覚の足踏み、および前足後足の時折の協調に相当するが、足を引っ込めることを体知覚的に誘導する行動試験を完全に行うのには十分である。脊髄の片側切断後１週間で、段階的な一連のｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔによる刺激に対して後足を引っ込めるまでの閾値（同側１．７１±０．３５ｇ、反対側１．９±０．５２ｇ）が、両方の後足における手術前の閾値（同側１１．２±１．６８ｇ、反対側１１．６±１．７１ｇ）と比較して著しく減少したことから明らかな機械的異痛が認められた。脊髄の片側切断１週間後にＱＨＧＡＤ６７（１×１０９ｐｆｕ／ｍｌ、３０μｌ／足）を両方の後肢の足底表面中に皮下接種することにより、接種１週間後（損傷２週間後）に測定した後肢を引っ込めるまでの閾値（同側４．４±１．１２ｇ、反対側４．１±０．７５ｇ）を有意に増加させた。Ｑ０ＺＨＧを接種した対照動物は、機械的閾値（同側１．８±０．２８ｇ、反対側１．６±０．３４ｇ、ＱＨＧＡＤ６７に対してＰ＜０．０１）の変化を示さなかった。最大抗アロディニア効果（すなわち、足を引っ込めるまでの閾値の増加）はＱＨＧＡＤ６７の接種２週間後に起こり（同側５．１９±０．８２ｇ、および反対側５．８±１．１４ｇ）、抗アロディニア効果は５週間持続し、接種６週間後に減少した（同側２．８６±０．６３ｇ、および反対側３．２±０．４７ｇ）（図５Ａおよび５Ｂ）。初めの接種から６週間後に両方の足蹠内に同じ用量のＱＨＧＡＤ６７を再接種すると、抗アロディニア効果が再び生じた。再接種によって得られる該効果の大きさは、少なくともベクターの初めの注射により得られる該効果の大きさと同じくらいであった。そして、再接種により得られる該効果の持続期間は、初めの接種から得られる効果の持続期間よりもわずかに長かった（６〜７週間）。全ての時点で、Ｑ０ＺＨＧ接種ラットとビヒクル処理されたラットとの間で足を引っ込めるまでの閾値に有意な違いはなかった（図５Ａおよび５Ｂ）。
【００７８】
脊髄の片側切断後、手術前の値（同側１２．６±１．２３ｓ、反対側１２．１±１．２５ｓ）に比べて、不快な熱刺激に対して足を引っ込めるまでの期間（同側６．７±０．５１ｓ、反対側６．９±０．６ｓ）が減少したことにより明らかになった温熱痛覚過敏も、動物は実証した。ＱＨＧＡＤ６７の接種１週間後（脊髄の片側切断の２週間後）、Ｑ０ＺＨＧ接種対照（同側６．５±０．４３ｓ、反対側７．１±０．４２ｓｅｃ）に比べて熱への反応期間（ｔｈｅｒｍａｌ  ｌａｔｅｎｃｙ）が統計学的に有意に増加した（同側８．８±０．４８ｓ、反対側８．７±０．７１ｓ）。接種４週間後にピークの効果が生じること（同側９．７±０．７１ｓ、反対側９．６２±０．７８ｓ）以外、抗痛覚過敏効果の時間経過は該ベクターの抗アロディニア効果の時間経過と似ていた（図５Ｃおよび５Ｄ）。６週間後のＱＨＧＡＤ６７ベクターの再接種は、抗痛覚過敏効果を再び生じさせた。２回目の接種後の抗痛覚過敏効果の持続期間と大きさは、初めの接種後のものより長く大きかった。全ての時点で、ビヒクル処理された動物とＱ０ＺＨＧ接種された動物との間では両後肢を引っ込めるまでの閾値に有意な違いはなかった（図５Ｃおよび５Ｄ）。
【００７９】
これらの試験で、体重１７５〜２００ｇの、オスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを使用した。住居条件および実験手法はＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている。抱水クロラール麻酔（４００ｍｇ／ｋｇ）下のラットを用い、（Ｔ１３にくっついている）最下位の肋骨を触診することによってＴ１１−Ｔ１２脊髄薄膜の位置を決めた。縦切開をすることによりいくつかの部位を露出させ、２つの脊椎分節（Ｔ１１−Ｔ１２）で椎弓切除を行った。腰膨大は付随する背脈管より特定し、主要な背脈管および血管分岐（ｖａｓｃｕｌａｒ  ｂｒａｎｃｈｅｓ）を損傷しないように注意してＮｏ．１１の手術用メスの刃を用いて脊髄をＴ１３で片側切断した。脊髄の片側切断が完了したことを確実にするために、２８内径の針のツベルクリンシリンジを脊髄の正中で背腹方向に置き、横方向に引いた。筋肉と筋膜を縫合して閉じ、皮膚はａｕｔｏｃｌｉｐで閉じた。外科手術の後に、動物は手術前の状態と同じ状態で維持された。全動物が手術後３時間以内に摂餌も摂水も行った。脊髄の片側切断と同側の肢の運動回復が体知覚行動試験を可能にするのに十分であることを確認するために、運動機能をＢＢＢ  Ｌｏｃｏｍｏｔｏｒ  Ｒａｔｉｎｇ  Ｓｃａｌｅを用いて観察し、記録した。皮質脊髄路の相互作用を示す両後肢の運動機能の喪失を示した動物は、該研究当時から考慮に入れなかった。基準に合った動物にその後ベクターを接種した。各群につき６匹の動物にベクター接種し、かつ再接種した。
【００８０】
機械的異痛および温熱性痛覚過敏のための行動試験は、概日サイクルの昼の部分（ＡＭ８：００からＰＭ５：００）の間に行われた。機械的異痛は、一連のｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓ（０．４、０．７、１．２、１．５、２．０、３．６、５．５、８．５、１１．８、および１５．１ｇ）を用いて段階的な機械的刺激に対して肢を引っ込める反応の閾値を測定することにより評価した。ラットを順化のために少なくとも３０分間網状の床の透明なプラスチックの小部屋中に置いた後で、肢をわずかに曲げさせるのに十分に強さを上げて６秒保ってｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔｓを足の足底表面に連続的に適用した。ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｆｉｌａｍｅｎｔの適用に対して活発に足を引っ込めることは肯定的な反応と見なされ、その次の弱い刺激を生じさせた。温熱性痛覚過敏は、放射熱源から足を引っ込めるまでの時間を測定することによって評価した。この試験では、ラットは光源の箱上にあるガラスのプレート上に置かれた。１０分の順化期間の後、足の足底表面をガラスの床を通して当てられる放射熱の光線に曝した。光線の開始と肢の引っ込めとの間の時間を測定することができるように、ラットが肢を上げると光線は自動的に光電池によって消えた。この時間が足を引っ込めるまでの時間として定義された。試験は通常５分間隔で３回行われ、遮断時間として２０秒を用いた。
【００８１】
（実施例６）
本実施例はＧＡＤベクター接種の行動への影響がビククリンおよびファクロフェンによって逆戻りさせることを実証する。
【００８２】
ＧＡＢＡＡ受容体選択的拮抗薬であるビククリンおよびＧＡＢＡＢ受容体選択的拮抗薬であるファクロフェンを用いてＱＨＧＡＤ６７媒介抗侵害受容性効果の薬理学的基礎を調べた。偽手術を行った動物に、外科手術の２週間後にビククリン（０．５μｇ；Ｓｉｇｍａ）またはファクロフェン（０．８μｇ；Ｓｉｇｍａ）を髄腔内に投与しても機械的閾値または熱への反応期間は変化しなかった。ＱＨＧＡＤ６７を接種して脊髄片側切断したラットにビククリンを同量投与し、薬物投与の１０〜１５分後に測定すると、脊髄の片側切断と同側の機械的閾値は４．８７±１．１３ｇから３．５±０．７ｇ（Ｐ＜０．０５）まで減少し、脊髄の片側切断と反対側は５．７５±１．４１ｇから３．３８±０．９ｇ（Ｐ＜０．０１）まで減少した（図６Ａ）。髄腔内のファクロフェンは脊髄の片側切断と同側の機械的閾値を３．６±０．７８ｇ（Ｐ＜０．０５）まで減少させ、脊髄の片側切断と反対側の機械的閾値を４．０５±０．７５ｇ（Ｐ＜０．０５）まで減少させた（図６Ａ）。熱に対して足を引っ込めるまでの時間はビククリン投与によって同側を９．２８±１．３９ｓから７．２３±１．２１ｓ（Ｐ＜０．０５）まで、反対側を９．５６±１．５ｓから７．４１±１．２９ｓ（Ｐ＜０．０５）まで減少させた。ファクロフェンの投与によっては同側で７．５４±１．１６ｓ（Ｐ＜０．０５）、反対側で７．６６±１．２４ｓ（Ｐ＜０．０５）まで減少させた（図６Ｂ）。各場合において、薬剤の効果は薬剤投与３０分後のピークの効果で測定された。接種１時間後にはもはや薬剤効果は検知できなかった。脊髄を片側切断し、Ｑ０ＺＨＧを接種し、ビククリンまたはファクロフェンを同量投与したラットにおいて、機械的閾値または熱への反応期間のどちらも有意な変化はなかった。
【００８３】
（実施例７）
本実施例は、ＧＡＤベクターを用いた細胞への形質導入が脊髄後角においてＣＧＲＰ免疫反応性を減少させることを実証した。
【００８４】
偽手術を行った動物では、Ｌ５部でのＣＧＲＰ免疫反応性は弱く、脊髄の表在性脊髄後角中の薄膜ＩおよびＩＩに両側性で大部分は限局していた。左のＴ１３を片側切断して１週間後、ＣＧＲＰ免疫反応性が増加し、染色が背面脊髄の薄膜ＩＩＩおよびＩＶ中に両側性に拡がって検出できた。両後足にＱＨＧＡＤ６７を接種した１週間後の脊髄片側切断ラットにおいて、Ｑ０ＺＨＧを接種した脊髄片側切断ラット（同側１０７．３±２２．４ＯＤユニット、反対側８６±２３．５ユニット、Ｐ＜０．０−５）またはビヒクル処理された動物（同側９６．７±２１．８ＯＤユニット、反対側１０４．６±２２．６ＯＤユニット、Ｐ＜０．０５）と比較して、ＣＧＲＰ様免疫反応性は減少した（同側７６．５±１３．３ＯＤユニット、反対側６３．６±１２．４ＯＤユニット）。Ｑ０ＺＨＧ接種動物とビヒクル処理された動物との間で染色に有意な違いはなかった（図７）。
【００８５】
損傷していない形質導入動物におけるＧＡＤタンパク質および損傷している形質導入動物におけるＣＧＲＰペプチドの分布は、免疫組織化学によって決定された。ラットは０．１Ｍリン酸緩衝液中の４％パラホルムアルデヒドにより心臓内を環流し、脊髄のＬ５部およびそれにくっついた脊髄根を除去し、２時間同じ溶液中で後固定し、２日間ＰＢＳ中の３０％ショ糖で抗凍結した。２０マイクロメートルの凍結切片は冷却したＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  ｓｌｉｄｅｓ（Ｆｉｓｈｅｒ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ，ＵＳＡ）上に解凍して載せられ、ウサギの抗ＧＡＤ６７（１：２０００，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ）またはウサギの抗ＣＧＲＰ（１：５００，ＰＬＩ，Ｓａｎ  Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）とともに４℃で一晩インキュベートし、その後蛍光抗ウサギＩｇＧ（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４，１：５００，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ，ＵＳＡ）とともに室温で２時間置いた。蛍光画像は共焦点顕微鏡（Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｓｔｅｒｌｉｎｇ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，ＭＩ  ＵＳＡ）で捉えた。
【００８６】
（実施例８）
本実施例は、単純ヘルペスウイルスベクターを用いてＧＡＤをコードする遺伝子を後根神経節に運搬することが末梢神経障害性疼痛を弱めるということを実証する。
【００８７】
体重が２２５から２５０ｇｍのオスのＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに（Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ；１０２：１３５−４２（２００３）に記載のように）選択的Ｌ５  ＳＮＬを行った。ＳＮＬの１週間後、３０μｌのベクター（ＱＨＧＡＤ６７またはＱＯＺＨＧのどちらか、１ミリリットル当たり４×１０８プラーク形成ユニット）を結紮と同側の左後足の足底表面に皮下注射した。上げ下げ法（ｕｐ−ｄｏｗｎ  ｍｅｔｈｏｄ）（Ｄｉｘｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌ；２０：４４１−６２（１９８０）参照）を使用して決定された５０％の尤度で足を引っ込めることが生じる触刺激を用いて、ｖｏｎ  Ｆｒｅｙ  ｈａｉｒの段階的な引っ張り強度（上記Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．およびＣｈａｐｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，５３：５５−６３（１９９４）参照）に対して肢を引っ込める反応を評価することによりＳＮＬで導かれた機械的異痛が決定された。温熱性痛覚過敏はＨａｒｇｒｅａｖｅｓ装置（Ｈａｒｇｒｅａｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ；３２：７７−８８（１９８８）に記載）を用いて後足の真下に位置する放射熱刺激から肢を引っ込めるまでの時間を記録することによって決定された。
【００８８】
ラットはＬ５のＳＮＬ後に、ｖｏｎ  Ｐｒｅｙ  ｈａｉｒ刺激に対して活発に足を引っ込める反応を喚起するのに必要な機械的刺激の大きさの有意な減少を示し（図１１Ａ）、熱刺激から足を引っ込めるまでの時間の有意な減少を示した（温熱性痛覚過敏；図１１Ｂ参照）。ＱＨＧＡＤ６７を接種されたラットは、接種１週間後から始まる機械的閾値の統計学的に有意な増加を示した。ＱＨＧＡＤ６７媒介ＧＡＢＡ発現の抗アロディニア効果は、接種後５週間から６週間維持され、継続し、存続し、接種２週間後にピークになった（図１１Ａ参照）。機械的閾値のピーク値は８．６ｇｍであるが、これは手術前の数値に近い。接種７週間後までに、ベクター遺伝子導入の抗アロディニア効果は消失し、ＱＨＧＡＤ６７注射ラットの機械的閾値は対照ラットの機械的閾値と同一であった。ＱＨＧＡＤ６７の同量を同じ肢に再接種すると抗アロディニア効果が再び生じた（図１１Ａ参照）。徐々に回復する前の３週間続いて、ＳＮＬは１０．７秒から６．７秒への熱への反応期間の減少を導いた。ＱＨＧＡＤ６７を接種されたラットは、接種１週間後から同側の肢で熱への反応期間において統計学的に有意な増加を始め（図１１Ｂ参照）、効果は３週間から４週間維持し、継続し、存続した（図１１Ｂ参照）。偽手術を行った動物は機械的閾値または熱への反応期間に変化がなかった。
【００８９】
軽い触覚によって誘導されたｃ−Ｆｏｓならびにリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ１および２（ｐ−ＥＲＫｌ／２）の発現は、侵害受容過程の１つの間接的な生物学的マーカーである（Ｃａｔｈｅｌｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐａｉｎ；９２：３８９−９８（２００１））。ＳＮＬ３週間後、４秒ごとに１回、１０分間、実験者の親指の平らな表面でラットの肢に軽い触覚を与え、免疫反応性細胞（抗ｃ−Ｆｏｓまたは抗ｐ−ＥＲＫ１／２抗体；Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）の数を、ニッケル−強化ジアミノベンジジン（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｂｕｒ−ｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）を用いたアビジン−ビオチンセイヨウワサビペルオキシダーゼにより検出した。Ｆｏｓ−Ｌ１陽性のニューロンの数は偽手術を行った対照のラットと比べてＳＮＬと同側で実質的に増加し、ベクターＱＨＧＡＤ６７の接種は薄膜Ｉ〜ＶＩにおけるＦｏｓ−Ｌ１陽性のニューロンの数を有意に減少させた（図１２参照）。薄膜ＩおよびＩＩにおけるｐ−ＥＲＫｌ／２発現もＳＮＬを行ない軽い触覚刺激後のラットで増加し、ＱＨＧＡＤ６７を接種した動物においては該増加は阻害された。ｐ−ＥＲＫは偽手術を行った動物で１０分の軽い触刺激によって誘導されなかったが、ＱＯＺＨＧを接種した動物における脊髄神経結紮（ＳＮＬ）後では実質的に誘導された。ｐ−ＥＲＫ１／２の接触誘導発現はＱＨＧＡＤ６７を接種した動物において抑制され、このことは脊髄後角でｐ−ＥＲＫ１／２陽性のニューロンの数を数えることによって確認した（図１３）。
【００９０】
これらの結果は、末梢神経障害性疼痛のモデルにおいて、ＧＡＤを発現するＨＳＶベクターをｉｎ  ｖｉｖｏで皮下接種してＤＲＧに形質導入することにより機械的異痛および温熱性痛覚過敏の行動上の症状が弱まることを実証する；行動上の効果は同側の脊髄後角におけるｃ−Ｆｏｓおよびｐ−ＥＲＫ１／２の発現誘導の阻害を示す組織学的測定によって確かめた。
【００９１】
（考察）
実験用ラットのＴ１３での脊髄の側面片側切断が、両後肢における損傷下での行動に関する両側性のＳＣＩ疼痛を生じさせる（「ＳＣＩモデル」）。行動に関するＳＣＩ疼痛は機械的異痛および温熱性痛覚過敏として現れる。この現象は両側の脊髄の再組織化を伴う。上記の実験において、このＳＣＩモデルは、腰のＤＲＧへのＧＡＤベクターによって媒介された遺伝子輸送によるＧＡＢＡの局所的な生産および放出のＳＣＩ疼痛のいくつかの症状を緩和することにおける効果を調べるために使用された。
【００９２】
ＤＲＧニューロンをＧＡＤをコードするＨＳＶベクター（「ＧＡＤベクター」）で形質導入した。これらの形質導入されたＤＲＧニューロンはｉｎ  ｖｉｔｒｏでもｉｎ  ｖｉｖｏでもＧＡＤを発現した。これらの細胞におけるＧＡＤの発現はＧＡＢＡの放出をもたらした。Ｔ１３で脊髄の側面片側切断を行い、ＧＡＤベクターの皮下接種を行った実験用ラットでは、形質導入したＤＲＧニューロンから放出された局所的なＧＡＢＡが後肢における機械的異痛および温熱性痛覚過敏を減少させた。正常な動物またはＴ１３で脊髄の側面片側切断を行いＧＡＤベクターを皮下接種していない実験用ラットにおいて、痛覚を変化させない用量を投与したＧＡＢＡＡ受容体拮抗薬またはＧＡＢＡＢ受容体拮抗薬のどちらによってもこの効果は逆転させることができた。その上、ＧＡＤベクターにより媒介されたＧＡＢＡ放出もＳＣＩ後に生じる腰部脊髄後角におけるＣＧＲＰ免疫反応性の増加を弱めた。したがって、ＧＡＤベクターにより媒介されたＤＲＧへの遺伝子移送を含む本発明の方法は、レベルより下の神経障害性ＳＣＩ疼痛を治療するために有効に使用され得る。
【００９３】
ＧＡＤベクターをｉｎ  ｖｉｔｒｏで遺伝子導入した一次ＤＲＧニューロンからのＧＡＢＡの放出は、６０ｍＭ  Ｋ＋を含有する培地中では増加せず、培地からＣａ２＋を除去することに影響を受けなかった。これは、ＧＡＢＡの放出が小胞状ではなく、構成的に、たぶんＧＡＢＡトランスポーターの逆転を通じて生じることを示している。ｉｎ  ｖｉｖｏでの神経末端から放出されたＧＡＢＡの量は脊髄後角の微小透析液におけるＧＡＢＡのレベルを有意に上昇させるのに十分であったが、これらの動物の運動の弱化の徴候はなかった。このことは、導入遺伝子により媒介されたＧＡＢＡ放出が脊髄後角に制限されることを示す。これは、プロエンケファリンを発現するＨＳＶベクターの皮下接種によって形質導入した動物が接種と同側の肢に限定された鎮痛効果を獲得する、という観察と一致する。
【００９４】
損傷していない脊髄を有する実験用ラットにおいて、低い閾値の求心性入力を持続的にＧＡＢＡ作動性に阻害することにより知覚処理を調節し、ＧＡＢＡ受容体機能のビククリン阻害が疼痛に関わる行動を生じさせる。電気生理学的研究は、ＧＡＢＡＡおよびＧＡＢＡＢ受容体の両方が脊髄レベルでの侵害受容性の神経伝達の持続的調節に貢献するということを示す。末梢神経損傷は脊髄後角におけるＧＡＢＡレベルの減少をもたらし、部分的な神経損傷後に脊髄後角で一次求心性に誘発された抑制性のシナプス後電流（post synaptic currents）の減少につながる。しかしながら、これらの現象がＧＡＢＡ作動性介在ニューロンの喪失に由来するのか、あるいは、中枢性感作で見られるＧＡＢＡ受容体の脱感作に由来するのか、十分には証明されていない。ＧＡＢＡ免疫反応性の一時的な減少は脊髄の虚血を光化学的に誘導した後の腰髄で報告されているが、該研究は片側切断のレベルより下のＧＡＢＡ免疫反応性を調査していなかった。それにも関わらず、ＤＲＧニューロンのＧＡＤベクター形質導入の結果として、片側切断のレベルより下の脊髄後角にＧＡＢＡを構成的に送達することが、ＳＣＩ後の機械的異痛および温熱性痛覚過敏の行動の量を減少させた。このことは、ＳＣＩ痛がＧＡＢＡによる調節の影響を受けやすいことを示している。
【００９５】
中枢神経性の疼痛に対するバクロフェンの効果をいくつかの試験で評価し、短期の試験においては、一般的に肯定的な結果が得られたが、顕著な長期の緩和はあまりなかった。バクロフェンの髄腔内への投与は、ＳＣＩの虚血モデルにおいて慢性の機械的異痛および冷感異痛を部分的に軽減する。神経障害性疼痛の慢性圧縮損傷モデルにおいて、ＧＡＢＡ放出細胞の髄腔内への移植により神経障害性疼痛のいくつかの症状がなくなる。ＧＡＤベクターにより媒介されたＧＡＢＡ放出の疼痛緩和効果は、数週間にわたって継続することが見出された。
【００９６】
時間を通じたＧＡＢＡ放出量は測定しなかった。しかしながら、鎮痛効果が弱くなった後のＧＡＤベクターの再接種は、機械的異痛および温熱性痛覚過敏の減少を再び生じさせることが観察された。この観察は、治療効果の喪失が寛容の発達によるものではなく、遺伝子発現の減少によることを実証する。これは、導入遺伝子が一時的に活性なヒトサイトメガロウイルス前初期プロモーター（ＨＣＭＶ  ＩＥｐ）によってドライブされるベクターを試験した、これまでの研究の発見とも一致している。
【００９７】
疼痛および疼痛の緩和の「客観的な」基準はない。しかしながら、ＳＣＩモデルの損傷レベルより下の脊髄分節におけるＣＧＲＰ免疫反応性量の増加の測定を、実験室における疼痛および疼痛の緩和の測定に使用した。残念なことに、ＳＣＩモデルにおいて脊髄ＣＧＲＰが増加する現象についてはほとんど分かっていない。レベルより下でのＣＧＲＰへ増加に責を負う機序は明らかになっていない。免疫反応性における増加がＣＧＲＰの代謝回転での放出の増加に関係するかどうかは分かっていない。ＳＣＩ疼痛の現象においてＣＧＲＰがいかなる役割を演じるのかということも、ＳＣＩの付帯現象として生じるのかということも分からない。それにも関わらず、末梢神経疼痛の脊髄結紮モデルにおいて、これらの研究でのＳＣＩ後に生じるＣＧＲＰの増加は、無害な触覚により誘導されたｃ−ｆｏｓ免疫反応性の増加と類似する疼痛の行動基準に相関がある組織学的なものとして働く。したがって、ＣＧＲＰの測定はＳＣＩ疼痛を治療する際のＧＡＤベクターの効果を決定するために使用され得る。いずれの特定の理論にもつながることを希望するものではないが、脊髄後角の薄膜Ｉ、ＩＩおよびＶに主に突出する無髄の求心性神経および薄い有髄の求心性神経中にＣＧＲＰが存在するので、ＣＧＲＰの増加は一次求心性神経の出芽に由来すると信じられている。ＧＡＤ形質導入された細胞からのＧＡＢＡ放出がＣＧＲＰ発現の増加を阻害する機序は、知られていない。
【００９８】
以上のことから、本発明によると、ヒトグルタミン酸脱炭酸酵素（ＧＡＤ）を発現するように設計された非複製ＨＳＶベクターがうまく構築され、このベクターがＳＣＩ疼痛を治療するために使用され、末梢神経障害性疼痛も治療するために使用された。これらの実施例は、遺伝子運搬アプローチの使用を含む本発明の方法がＤＲＧニューロンに遺伝子導入するために使用され得ることを、脊髄後角でＧＡＢＡを放出するための末梢への接種を通じて実証する。これらの実施例は、ＧＡＤベクターを用いて遺伝子を運搬することを含む本発明の方法が、ＳＣＩ後のレベルより下の機械的異痛および温熱性痛覚過敏を下げることも実証する。皮下接種によってＧＡＤベクターを送達する能力は、ＳＣＩ疼痛および末梢神経障害性疼痛も治療する本発明のアプローチの魅力的な特徴である。
【００９９】
本発明の実施は、当業者に公知のウイルス学、細菌学、分子生物学および組み換えＤＮＡ技術の従来の方法を他に示さないかぎり用いる。かかる技術は文献に十分に説明されている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ）；ＣＲＣ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｐ．Ｔｉｊｅｓｓｅｎ，ｅｄ．）；Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｂ．Ｎ．Ｆｉｅｌｄｓ  ａｎｄ  Ｄ．Ｍ．Ｋｎｉｐｅ，ｅｄｓ．）参照）。
【０１００】
本明細書中で引用した刊行物、特許出願、及び特許を含む全ての参考文献は、各参考文献が、本明細書中で参考として援用されることが個別におよび具体的に示され、かつその全体が記載されているのと同じ程度に、本明細書中で参考として援用される。
【０１０１】
本発明を記載する文脈において（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）、用語「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」及び同様の指示語の使用は、本明細書中で他に特に明記がない限り、又は文脈に明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含するように解釈されるべきである。「含有する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含む（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」という用語は、他に特に明記がない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「〜を含むが、限定されない」ことを意味する）として解釈されるべきである。本明細書中での値の範囲の記載は、本明細書中で他に特に明記がない限り、その範囲内にある各々の別々の値を個々に言及する略記方法として働くことが単に意図され、そして各々の別々の値は、それが本明細書中で個々に列挙されているかのように本明細書中に含まれるものである。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で他に特に明記がない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で行われ得る。本明細書中で提供される任意及び全ての例、又は例示的な言葉（例えば、「などの」）の使用は、本発明をより良く明瞭にすることが単に意図され、そして他に特に主張されない限り、本発明の範囲を制限するものではない。本明細書中の如何なる言葉も、本発明の実施に必須なものとして主張されていない要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１０２】
本発明の実施に関して、本発明者らが知っている最良の形態を含む、本発明の好適な実施態様を本明細書中に記載する。これらの好ましい実施態様のバリエーションは前記記載を読むことによって当業者に明らかとなる。発明者らは本明細書中に明確に記載したものとして当業者が発明を実施することを意図するというよりはむしろ、発明者らはかかるバリエーションを適切な例として使用することを期待している。したがって、本発明は本明細書に添付した特許請求の範囲において述べられた対象の改良されたもの全ておよび等価なもの全てを適用法に許可されたものとして含む。さらに、本明細書中に明記がない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、その可能なバリエーションにおける上記の要素のいずれの組合せも本発明によって包含される。
【図面の簡単な説明】
【０１０３】
【図１−１】図１は、本発明において使用され得る典型的なベクターの構造の略図である。
【図１−２】図１は、本発明において使用され得る典型的なベクターの構造の略図である。
【図２】図２は、足蹠接種によるＱＨＧＡＤ６７形質導入により増加した腰後根神経節（ＤＲＧ）におけるＧＡＤ６７のｍＲＮＡである。１本の後足に１×１０９ｐｆｕ／ｍｌのＱＨＧＡＤ６７またはＱ０ＺＨＧを３０μｌ皮下接種した１週間後、全ＲＮＡをプールされたＬ４−Ｌ６ＤＲＧ（５００ｎｇ）から抽出し、リアルタイムＰＣＲで増幅し、ＧＡＰＤＨを基準として用いて定量した。Ｑ０ＺＨＧ導入神経節に対する相対値を示した。平均値±標準誤差（ＳＥＭ）、Ｎ＝６。
【図３】図３は、腰髄の後ろ１／４から得られた（ｔｈｅ  ｄｏｒｓａｌ  ｑｕａｄｒａｎｔ  ｏｆ  ｌｕｍｂａｒ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ）タンパク質を示す。該タンパク質は内部標準としてβアクチンを使用してウェスタンブロットを行い、相対的光学濃度により定量した。平均値±ＳＥＭ、Ｎ＝６、＊Ｐ＜０．０５、ＱＨＧＡＤ６７による形質導入後に増加したＧＡＤ６７様免疫反応性。
【図４】図４Ａは、対照細胞またはＱ０ＺＨＧ感染細胞と比べてＱＨＧＡＤ６７感染細胞では実質的に増加したｍ．ｏ．ｉ．が１でｉｎ  ｖｉｔｒｏで形質導入された一次ＤＲＧニューロンから放出されたγアミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の量を示す。下記の材料および方法に記載のように、５分間にわたって放出されたＧＡＢＡをＨＰＬＣにより決定した。ＧＡＢＡ濃度／ウェルの測定は３回行い、各状態で３つ組のサンプルを用いた。平均値±ＳＥＭ、＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．Ｑ０ＨＧまたはビヒクル。図４Ｂは、ＨＰＬＣによって決定された、脊髄後角の微小透析液中のｉｎ  ｖｉｖｏで脊髄の神経末端から放出されたＧＡＢＡの量である。１本の後足に１×１０９ｐｆｕ／ｍｌのＱＨＧＡＤ６７を３０μｌ皮下接種した１週間後、ＧＡＢＡの量（微小透析液のｐｍｏｌ／１０μｌの割合）は対照動物と比べてＱＨＧＡＤ６７接種動物では実質的に増加した。平均値±ＳＥＭ、Ｎ＝６、＊Ｐ＜０．０５。
【図５−１】図５Ａ〜Ｄは、ＱＨＧＡＤ６７接種により有意に減少した機械的異痛および温熱性痛覚過敏を示す。図５Ａおよび５Ｂは片側切断の１週間後に、ビヒクル処理された動物（Ｘ）で見られるように１５週間にわたって、足を引っ込めるまでの閾値（機械的異痛）の減少があったことを実証する。ＱＨＧＡＤ６７の接種は、増加した閾値（白丸）を反映した抗アロディニア効果を生じた。始めの接種から数週間後にはＱＨＧＡＤ６７の抗アロディニア効果は減少したが、同じ動物にＱＨＧＡＤ６７を再接種すると抗侵害受容性の効果が再び生じた（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．Ｑ０ＺＨＧ接種、Ｎ＝６）。（Ａ）同側の片側切断および（Ｂ）反対側の片側切断。
【図５−２】図５Ａ〜Ｄは、ＱＨＧＡＤ６７接種により有意に減少した機械的異痛および温熱性痛覚過敏を示す。図５Ｃおよび５Ｄは、片側切断の１週間後に足を引っ込めるまでの時間（温熱性痛覚過敏）に有意な減少があり、ベクターの注射が足を引っ込めるまでの時間（白丸）に有意な増加をもたらすということを実証する。始めの接種から７週間後までは両方のＱＨＧＡＤ６７の抗痛覚過敏効果は減少したが、ＱＨＧＡＤ６７の再接種により抗痛覚過敏効果が再び生じた（＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．Ｑ０ＺＨＧ接種、Ｎ＝６）。（Ｃ）同側の片側切断および（Ｄ）反対側の片側切断。Ｑ０ＺＨＧ接種動物（白三角）は全ての場合（Ａ〜Ｄ）において、ビヒクル処理された対照と区別できなかった。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、片側切断の３週間後および足蹠接種の２週間後にビククリン（０．５μｇ）またはファクロフェン（０．８μｇ）を髄腔内に投与することが部分的に（Ａ）ベクター接種の抗アロディニア効果および（Ｂ）ベクター接種の抗痛覚過敏効果を覆すことを実証する。対照のベクターまたはビヒクルを接種したＳＣＩ後の動物において、点線は平均閾値（Ａ）および時間（Ｂ）を示している。平均値±ＳＥＭ、Ｎ＝６、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１ｖｓ．ビヒクル処理。
【図７】図７は脊髄後角におけるＣＧＲＰ様免疫反応性の相対的光学濃度測定のヒストグラムである。相対的光学濃度測定は各動物のＬ５部分における一連の６つの連続切片から行った。点線は正常な脊髄におけるＣＧＲＰ−ＩＲの濃度がビヒクルまたはＱ０ＺＨＧを接種した動物においてＴ１３片側切断の同側と反対側の両方で実質的に増加したこと、ＱＨＧＡＤ６７の接種がこの増加を有意に弱めたことを示している。平均値±ＳＥＭ、ｎ＝６、ビヒクルまたはＱ０ＨＺＧと比較して＊Ｐ＜０．０５１。
【図８】図８は本明細書中で議論する配列番号１を示す。
【図９】図９は本明細書中で議論する配列番号２を示す。
【図１０】図１０は本明細書中で議論する配列番号３〜８を示す。
【図１１−１】図１１（ａ）および１１（ｂ）は、神経障害性疼痛におけるＱＯＧＡＤ６７の抗侵害受容性効果を実証するデータを示す。（Ａ）Ｌ５脊髄神経結紮（ＳＮＬ）は触刺激に対する閾値の有意な減少を生じさせ、これは４ヶ月以上続いた。ＱＨＧＡＤ６７（矢印）の皮下接種により、機械的閾値の増加を反映した抗アロディニア効果が生じた。初めの接種から７週間後のＱＨＧＡＤ６７の再接種（矢印）により抗アロディニア効果が再び生じた。結果は平均値±標準誤差として示した。（白丸）ＱＨＧＡＤ６７；（黒丸）ＱＯＺＨＧ；＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；各グループｎ＝８動物。
【図１１−２】図１１（ａ）および１１（ｂ）は、神経障害性疼痛におけるＱＯＧＡＤ６７の抗侵害受容性効果を実証するデータを示す。（Ｂ）Ｌ５ＳＮＬは有意な温熱性痛覚過敏も生じさせ、これは６週間続いた。ＱＯＺＨＧではなくてＱＨＧＡＤ６７の接種（矢印）は脊髄神経損傷によって誘導された温熱性痛覚過敏を覆した。ＱＯＺＨＧ接種に対して＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；各グループｎ＝８動物。差の統計的有意性は、Ｓｃｈｅｆｆｅ’ｓ  Ｆ  検定を用いて比較したｈｏｃ後の数を補正する変異の分析（ＳｔａｔＶｉｅｗ  ５．２；ＳＡＳ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃａｒｙ，ＮＣ）によって決定した。
【図１２】図１２は、脊髄後角におけるＦｏｓ−ＬＩに対するＱＨＧＡＤ６７の効果に関するデータを示すヒストグラムである。１０分の軽い触刺激が誘導した脊髄後角のＦｏｓ−ＬＩは、脊髄神経結紮（ＳＮＬ）の１週間後にＱＯＺＨＧを接種し、２週間後に試験した（ＳＮＬの３週間後）ラットで有意に増加した。この増加はＳＮＬ１週間後にＱＨＧＡＤ６７を接種し、２週間後に試験した（ＳＮＬの３週間後）ＳＮＬのラットにおいて阻害された。これは脊髄後角の薄膜Ｉ〜ＶＩで見られた。結果は平均値±標準誤差で示す。＊＊Ｐ＜０．０１；各グループｎ＝５動物。偽手術を行った動物とＱＯＺＨＧを接種したＳＮＬ動物の差も統計的に有意であった（Ｐ＜０．０１）。
【図１３】図１３は、脊髄後角でのリン酸化細胞外シグナル調節キナーゼ１および２（ｐ−ＥＲＫｌ／２）の発現へのＱＨＧＡＤ６７の効果に関するデータをグラフを使って示す。結果は平均値±標準誤差で示す。＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；各グループｎ＝５動物。
【図１４−１】図１４はＩＣＰ４座およびＩＣＰ２７座の拡張された欠失ならびにＵＬ５５の欠失を有するＨＳＶベクターの構造を示す。
【図１４−２】図１４はＩＣＰ４座およびＩＣＰ２７座の拡張された欠失ならびにＵＬ５５の欠失を有するＨＳＶベクターの構造を示す。
【図１−１】
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【図１−２】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４−１】
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【図１４−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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