(57)【要約】  本発明は、直線状の環状化可能な核酸プローブ及び／又は環状の核酸プローブを調製する方法に関する。このようなプローブは、核酸分子のローリングサークル増幅(RCA)及び／又は枝分かれ-伸長増幅(RAM)の出発材料として使用することができる。本発明は更に、本明細書に説明された方法に従い作製された環状プローブ及び直線状の環状化可能なプローブを提供する。本発明は更に、本発明の環状プローブ及び／又は直線状の環状化可能なプローブを備えるキットを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
環状プローブを作製する方法であり：
(a)第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブと、スパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、このオリゴヌクレオチドプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に相補的である3'及び5'領域を有する環状化可能なプローブを含み、その結果スパニングオリゴヌクレオチド及び環状化可能なプローブを含む複合体が形成され、ここで環状化可能なプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に、その3'及び5'末端で結合される、工程；
(b)環状化可能なプローブの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；
(c)工程(b)の環状プローブを、環状プローブと相補的でありかつハイブリダイズすることができる伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、工程(b)の環状プローブを増幅する工程；
(d)制限酵素が反復単位の1本鎖DNAを単独の単位長オリゴヌクレオチドへ切断する条件下で、反復単位の1本鎖DNAを制限酵素で切断する工程；
(e)単位長オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む第二のスパニングオリゴヌクレオチドを、工程(d)の少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第二のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；
(f)工程(b)から(d)を繰り返す工程；
(g)第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、工程(f)で作出された少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第一のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；並びに
(h)工程(g)で作出された単位長オリゴヌクレオチドの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；を含む、方法。
【請求項２】
請求項1記載の方法により作出された環状プローブ。
【請求項３】
DNAポリメラーゼが、φ29 DNAポリメラーゼ又はBst DNAポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
【請求項４】
連結剤が、酵素又は化学物質である、請求項1記載の方法。
【請求項５】
酵素が、DNAリガーゼである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
DNAリガーゼが、T4 DNAリガーゼ又はTaq DNAリガーゼである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
化学物質が、臭化シアンである、請求項4記載の方法。
【請求項８】
(a)少なくとも1種の第一のスパニングオリゴヌクレオチド；
(b)少なくとも1種の環状化可能なプローブ；
(c)少なくとも1種の伸長プライマー；及び
(d)少なくとも1種の第二のスパニングオリゴヌクレオチド；を備える、増幅キット。
【請求項９】
直線状の環状化可能なプローブを作製する方法であり：
(a)第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブと、スパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、このオリゴヌクレオチドプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に相補的である3'及び5'領域を有する環状化可能なプローブを含み、その結果スパニングオリゴヌクレオチド及び環状化可能なプローブを含む複合体が形成され、ここで環状化可能なプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に、その3'及び5'末端で結合される工程；
(b)環状化可能なプローブの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；
(c)工程(b)の環状プローブを、環状プローブと相補的でありかつハイブリダイズすることができる伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、工程(b)の環状プローブを増幅する工程；
(d)制限酵素が反復単位の1本鎖DNAを単独の単位長オリゴヌクレオチドへ切断する条件下で、反復単位の1本鎖DNAを制限酵素で切断する工程；
(e)単位長オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む第二のスパニングオリゴヌクレオチドを、工程(d)の少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第二のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；並びに
(f)工程(b)から(d)を繰り返し、直線状の環状化可能なプローブが形成される工程；を含む、方法。
【請求項１０】
請求項10記載の方法により作出された、直線状の環状化可能なプローブ。
【請求項１１】
DNAポリメラーゼが、φ29 DNAポリメラーゼ又はBst DNAポリメラーゼである、請求項9記載の方法。
【請求項１２】
連結剤が、酵素又は化学物質である、請求項9記載の方法。
【請求項１３】
酵素が、DNAリガーゼである、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
DNAリガーゼが、T4 DNAリガーゼ又はTaq DNAリガーゼである、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
化学物質が、臭化シアンである、請求項12記載の方法。
【請求項１６】
試料中の標的核酸を検出する方法であり：
(a)第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブと、スパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、このオリゴヌクレオチドプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に相補的である3'及び5'領域を有する環状化可能なプローブを含み、その結果スパニングオリゴヌクレオチド及び環状化可能なプローブを含む複合体が形成され、ここで環状化可能なプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に、その3'及び5'末端で結合される工程；
(b)環状化可能なプローブの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；
(c)工程(b)の環状プローブを、環状プローブと相補的でありかつハイブリダイズすることができる伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、工程(b)の環状プローブを増幅する工程；
(d)制限酵素が反復単位の1本鎖DNAを単独の単位長オリゴヌクレオチドへ切断する条件下で、反復単位の1本鎖DNAを制限酵素で切断する工程；
(e)単位長オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む第二のスパニングオリゴヌクレオチドを、工程(d)の少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第二のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；
(f)工程(b)から(d)を繰り返す工程；
(g)第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、工程(f)で作出された少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第一のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；
(h)工程(g)から作出された単位長オリゴヌクレオチドの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；
(i)標的核酸を、工程(h)で作出された少なくとも1種の環状プローブと、標的核酸内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、環状プローブが、標的核酸内の隣接するが重複しない配列に相補的である領域を含み、相補的領域が、標的核酸内のヌクレオチド配列と相補的でもハイブリダイズもしない類型的領域により分離され、その結果標的核酸及び環状プローブを含む複合体が形成される、工程；
(j)工程(i)の複合体の環状プローブを、環状プローブに相補的でありかつハイブリダイズ可能である伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、工程(i)の複合体の環状プローブを増幅する工程；並びに
(k)反復単位の1本鎖DNAを検出する工程であり、ここでそれらの検出が、試料中の標的核酸の存在を示す工程；を含む、方法。
【請求項１７】
DNAポリメラーゼが、φ29 DNAポリメラーゼ又はBst DNAポリメラーゼである、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
連結剤が、酵素又は化学物質である、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
酵素が、DNAリガーゼである、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
DNAリガーゼが、T4 DNAリガーゼ又はTaq DNAリガーゼである、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
化学物質が、臭化シアンである、請求項18記載の方法。
【請求項２２】
試料中の標的核酸を検出する方法であり：
(a)第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブと、スパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、このオリゴヌクレオチドプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に相補的である3'及び5'領域を有する環状化可能なプローブを含み、その結果スパニングオリゴヌクレオチド及び環状化可能なプローブを含む複合体が形成され、ここで環状化可能なプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に、その3'及び5'末端で結合される工程；
(b)環状化可能なプローブの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；
(c)工程(b)の環状プローブを、環状プローブと相補的でありかつハイブリダイズすることができる伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、工程(b)の環状プローブを増幅する工程；
(d)制限酵素が反復単位の1本鎖DNAを単独の単位長オリゴヌクレオチドへ切断する条件下で、反復単位の1本鎖DNAを制限酵素で切断する工程；
(e)単位長オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む第二のスパニングオリゴヌクレオチドを、工程(d)の少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第二のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；
(f)工程(b)から(d)を繰り返す工程；
(g)第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、工程(f)で作出された少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第一のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；
(h)工程(g)から作出された単位長オリゴヌクレオチドの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；
(i)標的核酸を、工程(h)で作出された少なくとも1種の環状プローブと、標的核酸内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、環状プローブが、標的核酸内の隣接するが重複しない配列に相補的である領域を含み、相補的領域が、標的核酸内のヌクレオチド配列と相補的でもハイブリダイズもしない類型的領域により分離され、その結果標的核酸及び環状プローブを含む複合体が形成される工程；
(j)工程(i)の複合体の環状プローブを、環状プローブに相補的でありかつハイブリダイズ可能である第一の伸長プライマー、環状プローブの一部と実質的に同一である第二の伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、工程(i)の複合体の環状プローブを増幅し、並びに第二の伸長プライマーの多コピーが、1本鎖DNAの相補的領域へハイブリダイズし、及びDNAポリメラーゼにより伸長され、伸長産物を提供する工程；並びに
(k)伸長産物を検出する工程であり、ここでそれらの検出が、試料中の標的核酸の存在を示す工程；を含む、方法。
【請求項２３】
DNAポリメラーゼが、φ29 DNAポリメラーゼ又はBst DNAポリメラーゼである、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
連結剤が、酵素又は化学物質である、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
酵素が、DNAリガーゼである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
DNAリガーゼが、T4 DNAリガーゼ又はTaq DNAリガーゼである、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
化学物質が、臭化シアンである、請求項24記載の方法。
【請求項２８】
試料中の標的核酸を検出する方法であり：
(a)第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブと、スパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、このオリゴヌクレオチドプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に相補的である3'及び5'領域を有する環状化可能なプローブを含み、その結果スパニングオリゴヌクレオチド及び環状化可能なプローブを含む複合体が形成され、ここで環状化可能なプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に、その3'及び5'末端で結合される工程；
(b)環状化可能なプローブの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；
(c)工程(b)の環状プローブを、環状プローブと相補的でありかつハイブリダイズすることができる伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、工程(b)の環状プローブを増幅する工程；
(d)制限酵素が反復単位の1本鎖DNAを単独の単位長オリゴヌクレオチドへ切断する条件下で、反復単位の1本鎖DNAを制限酵素で切断する工程；
(e)単位長オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む第二のスパニングオリゴヌクレオチドを、工程(d)の少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第二のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；
(f)工程(b)から(d)を繰り返し、直線状の環状化可能なプローブが形成される工程；
(g)試料中の標的核酸を、標的核酸内の隣接するが重複しない配列と相補的である3'及び5'領域を有する工程(f)で作出された少なくとも1種の環状化可能なプローブと、標的核酸内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、3'及び5'領域は、標的核酸内のヌクレオチド配列に相補的でもハイブリダイズもしない類型的領域(generic region)により分離され、その結果標的核酸及び環状化可能なプローブを有する複合体が形成され、ここで環状化可能なプローブは、標的核酸内の隣接するが重複しない配列にその3'及び5'末端で結合される工程；
(h)工程(g)で利用された環状化可能なプローブの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、その結果環状プローブが形成される工程；
(i)工程(h)の環状プローブを、環状プローブと相補的でありかつハイブリダイズ可能である伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、工程(h)の環状プローブを増幅する工程；並びに
(j)反復単位の1本鎖DNAを検出する工程であり、ここでそれらの検出が、試料中の標的核酸の存在を示す工程；を含む、方法。
【請求項２９】
DNAポリメラーゼが、φ29 DNAポリメラーゼ又はBst DNAポリメラーゼである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
連結剤が、酵素又は化学物質である、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
酵素が、DNAリガーゼである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
DNAリガーゼが、T4 DNAリガーゼ又はTaq DNAリガーゼである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
化学物質が、臭化シアンである、請求項30記載の方法。
【請求項３４】
試料中の標的核酸を検出する方法であり：
(a)第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブと、スパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、このオリゴヌクレオチドプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に相補的である3'及び5'領域を有する環状化可能なプローブを含み、その結果スパニングオリゴヌクレオチド及び環状化可能なプローブを含む複合体が形成され、ここで環状化可能なプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に、その3'及び5'末端で結合される工程；
(b)環状化可能なプローブの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；
(c)工程(b)の環状プローブを、環状プローブと相補的でありかつハイブリダイズすることができる伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、工程(b)の環状プローブを増幅する工程；
(d)制限酵素が反復単位の1本鎖DNAを単独の単位長オリゴヌクレオチドへ切断する条件下で、反復単位の1本鎖DNAを制限酵素で切断する工程；
(e)単位長オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む第二のスパニングオリゴヌクレオチドを、工程(d)の少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第二のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；
(f)工程(b)から(d)を繰り返し、直線状の環状化可能なプローブが形成される工程；
(g)試料中の標的核酸を、標的核酸内の隣接するが重複しない配列と相補的である3'及び5'領域を有する工程(f)で作出された少なくとも1種の環状化可能なプローブと、標的核酸内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、この3'及び5'領域が、標的核酸内のヌクレオチド配列と相補的でもハイブリダイズもしない類型的領域により分離され、その結果標的核酸及び環状化可能なプローブを含む複合体が形成され、ここで環状化可能なプローブは、標的核酸内の隣接するが重複しない配列にその3'及び5'末端で結合される工程；
(h)工程(g)で利用された環状化可能なプローブの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、その結果環状プローブが形成される工程；
(i)工程(h)の環状プローブを、環状プローブと相補的でありかつハイブリダイズ可能である第一の伸長プライマー、環状プローブの一部と実質的に同一である第二の伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、工程(h)の環状プローブを増幅し、及び第二の伸長プライマーの多コピーが、1本鎖DNAの相補的領域にハイブリダイズしかつDNAポリメラーゼにより伸長され、伸長産物を提供する工程；並びに
(j)伸長産物を検出する工程であり、ここでそれらの検出が、試料中の標的核酸の存在を示す工程；を含む、方法。
【請求項３５】
DNAポリメラーゼが、φ29 DNAポリメラーゼ又はBst DNAポリメラーゼである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
連結剤が、酵素又は化学物質である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
酵素が、DNAリガーゼである、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
DNAリガーゼが、T4 DNAリガーゼ又はTaq DNAリガーゼである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
化学物質が、臭化シアンである、請求項36記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、その内容が本明細書に参照として組入れられている、2005年3月31日に出願された米国特許仮出願第60/667,781号の恩恵を請求するものである。
【０００２】
緒言
本発明は、直線状の環状化可能な核酸プローブ及び／又は環状核酸プローブの調製法に関する。このようなプローブは、核酸分子のローリングサークル増幅(RCA)及び／又は枝分かれ(ramification)-伸長増幅(RAM)のための出発材料として使用することができる。本発明は更に、本明細書に説明された方法に従い作製された環状プローブ及び直線状の環状化可能なプローブを提供する。本発明は更に、本発明の環状プローブ及び／又は直線状の環状化可能なプローブを備えるキットを提供する。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
最近、ウイルス、細菌及び真菌などの、感染性物質の迅速かつ正確な検出、並びに正常及び異常な遺伝子の検出に関する要求に合致する多くの技術が開発されている。このような技術は、一般に被験試料中の微量の標的核酸(DNA又はRNAのいずれか)の増幅及び検出(及びそれに続く測定)に関与しており、とりわけ、ローリングサークル増幅(RCA)(米国特許第6,855,523号、これは本明細書に参照として組入れられている)；枝分かれ増幅法(RAM)(米国特許第5,942,391号、第6,569,647号、第6,593,086号、及び第6,855,523号、これらは各々本明細書に参照として組入れられている)；ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Saikiら、Science, 230:1350, 1985；Saikiら、Science, 239:487, 1988；PCR Technology, Henry A. Erlich編集, Stockton Press, 1989；Pattersonら、 Science, 260:976, 1993)、リガーゼ連鎖反応(LCR)(Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 8:189, 1991)、鎖置換増幅(SDA)(Walkerら、Nucl. Acids Res., 20:1691, 1992)、Qβレプリカーゼ増幅(QβRA)(Wuら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:11769, 1992；Lomeliら、Clin. Chem., 35:1826, 1989)、並びに、3SR法(self-sustained replication)(Guatelliら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:1874-1878, 1990)を含む。これらの技術は全て、試料中の微量の標的核酸を検出及び同定するための強力な道具であるが、これらは全て、日常の診断技法において使用する臨床検査の状況におけるそれらの一般的適用性を妨げるような、様々な問題点がある。
【０００４】
RCAは、多くの1本鎖DNAバクテリオファージによりそれらのゲノムを複製するために使用される「ローリングサークル」複製機構をベースにしたDNA増幅法を意味する。RCAに関して、1本鎖の直線状DNA分子(環状化可能なプローブ、又は「C」プローブ)は、その末端配列が、環状化可能なプローブの5'及び3'末端が互いに次に位置するよう「標的」核酸内のコンティグで相補的な配列にアニーリングするような様式でデザインされている。次にこれらの末端は、酵素的手段又は化学的手段のいずれかにより互いに連結され、共有結合閉環1本鎖DNA分子を形成する。引き続き増幅の間に、1種又は複数の短いオリゴヌクレオチド伸長プライマーが、dNTPs、適当なDNAポリメラーゼ、及び適当な緩衝液成分と共に添加され、直線状のRCA又は指数的RAMのいずれかを開始する。
【０００５】
直線状のRCAにおいて、単独の伸長プライマーは、1本鎖DNA環状プローブへアニーリングし、このポリメラーゼは、環状プローブの周囲のプライマー鎖を伸長する。ポリメラーゼは、環状プローブに沿って移動することにより、プライマーを伸長するので、環状プローブに相補的である成長するDNA鎖は、当初のプライマーの5'末端と遭遇し、これと置き換わり、伸長過程を継続する。最終的に、当初の環状プローブ配列の相補的コピーを多数縦列で含む長い1本鎖DNA生成物が作出される。指数的RAMにおいて、第二の伸長プライマーは、環状プローブではなく、第一の伸長プライマー反応の相補的生成物にアニーリングし、その結果増幅産物のカスケードが形成される。第一又は第二のいずれかの伸長プライマーの全ての生成物は、他方のプライマーの鋳型であり、そのため生成物DNAの指数的成長が生じる。
【０００６】
環状化可能なプローブの末端配列が、特定の「標的」生物又はウイルスにおける診断上有用な核酸配列に相補的であるように選択される場合、環形成及び環形成時に起こり得るそれに続くDNAの増幅生成は、被験試料中のその標的生物の存在の指標として使用することができる。
RCA又はRAM増幅の成功にとって重要なことは、増幅工程前の、予め形成された環状プローブ又はそのアッセイの一部として形成された環状プローブのいずれかからの、DNAの効率的産生である。従ってRCA増幅の効率(及びその結果これを組み込むアッセイの感度)は、環状プローブの品質に大きく左右される。
【０００７】
本発明者らの研究室は、商業的に合成された環状化可能なプローブのわずかな部分のみが、RCA反応において適切に機能することができることを認めた。この欠陥の原因は不明である。しかしこれは、商業的DNA合成企業により通常使用される合成化学の結果であると仮定することができる。この合成化学は典型的には、ガラスの支持体表面(すなわち、カラムに充填され、自動DNA合成装置において使用されるビーズである、微細孔性ガラス(controlled pore glass (CPG)))へ結合された単独のヌクレオチドホスホロアミダイトから出発する。所望のDNA配列は、CPGビーズに結合した3'末端ホスホロアミダイトから始まり、所望の配列に対応するヌクレオチドホスホロアミダイトの逐次添加により、この出発基材上に瞬時にひとつのヌクレオチドが「構築」される。これらのホスホロアミダイトは、多くの観点で、最後に最終生成物の一部となるヌクレオチドとは化学的に異なる。特にこれらは、反応性側鎖上に「保護」基を含み、このことは、それにより望ましい直線状の生成物よりもむしろ望ましくない分枝した分子を作製する付加反応へ参加することを妨害する。更にこれらは、各付加反応を、1付加サイクルにつき1個のヌクレオチドホスホロアミダイトへ制限する「ブロック」基を付加点に含む。
【０００８】
DNA合成の過程において、成長する鎖の5'末端ヌクレオチドホスホロアミダイトからブロック基は化学的に除去され、その結果次の付加工程を行うことができる。側鎖を保護する基は、この時点では除去されない。先に考察されたように、付加されたヌクレオチドホスホロアミダイトは既にブロック基を含み、その結果各工程で残基1個のみを付加することができる。最後に、このサイクル(すなわち、付加、非ブロック化、付加、非ブロック化など)の後、望ましい配列全体の作製が完了し、完成したDNA鎖中の全てのヌクレオチドホスホロアミダイトから保護基を除去するために、様々なより苛酷な化学反応が行われる。その後、このDNAは、CPG支持体から化学的に放出され、任意に様々な手段(例えば、クロマトグラフィー又はポリアクリルアミドゲル電気泳動)により、更に精製される。
【０００９】
商業的DNA合成法の最近の発展の間に、DNAの作製に使用される試薬及び戦略は、このプロセスの効率的かつより低いコストをもたらすように、高度に最適化されている。しかし効率と精度の間には微妙なバランスが残されている。特に、ブロック基の100％が各サイクル時に除去されることが望ましい一方で、保護基、ヌクレオチドホスホロアミダイトそれら自身、及び3'ホスホロアミダイトをCPG支持体に保持しているリンケージは、非ブロック化化学に対し理想的には00％不応(refractory)でなければならない。一般にこの条件は、各工程について通常見積もられる付加効率が99.9％よりも大きい、比較的短いオリゴヌクレオチド(例えば、典型的には20〜25ヌクレオチド長のPCRプライマー)に大きく合致する。しかしより長い配列(すなわち、約50ヌクレオチドよりも大きい)について、残りの非効率の結果が精製ゲル上で容易に認められ、ここでは最終生成物の1％未満が完全長であることが多い。配列の大半は、長さの変動により、最終の望ましい生成物よりもより短い。従って、効率的非ブロック化及び付加を促進するために、より苛酷な条件が使用されなければならない。しかしより苛酷な非ブロック化条件は、保護基を保持しかつヌクレオチドホスホロアミダイトそれら自身を損傷しない効率がより低い。
【００１０】
長いオリゴヌクレオチドについて、最初に付加される3'ヌクレオチドは、全てではなくともほとんどが、引き続き付加サイクルを受け、その結果様々な形の損傷に対し特に脆弱であることはわかっている。このような損傷は、DNAポリメラーゼの進行を妨げるか又は完全にブロックすることができる。脱保護工程時の脱プリン化は、通常鎖切断を生じ、精製ゲル上に認められる短い生成物を生じる(Kwiatkowskiら、Nucl. Acids Res., 24:4632-4638, 1996)。Kwiatkowskiら(1996, 前掲)は、長い環状化可能なプローブ(すなわち、彼等の用語で「南京錠(Padlock)プローブ」)が、正確な5'及び3'末端を伴い良い収率で生成されることを確実にすることを試みる代替化学合成法を説明している。同様にAntsonら(Nucl. Acids Res., 28, e58: I-vi, 2000)は、正確な5'及び3'末端を有する長いオリゴヌクレオチドの小規模生成に関する、PCR-ベースの合成法を説明している。しかし両報告においては、依然完全長よりもより短い生成物が認められる。更にいずれの論文も、環状化されたプローブの酵素的増幅については記していないので、環状化に必須である5'及び3'末端の官能性のみが対処されている。
【００１１】
酵素により増幅される環状プローブのより大きい懸念は、鎖の切断を生じない欠損を妨げるか又はブロックするそのようなポリメラーゼを含み、従って最終精製された生成物中に残存する、完全長生成物である。例えば、ヌクレオチドの塩基成分は喪失されるが、骨格は無傷のままである脱プリン化は、DNAポリメラーゼをブロックするであろう。同様に、最終生成物中に残存する保護基も同じく、環状プローブの回りのDNAポリメラーゼの進行を妨げるか又はブロックする。このような欠損は、Anston又はKwiatkowskiのいずれによっても対処されていない。
【００１２】
本発明の実施態様は、環状化可能なプローブの酵素的合成が、前述の問題点を回避し、かつ実質的により高い増幅効率の環状プローブを生じることを明らかにする。
本発明は、核酸分子のローリングサークル増幅及び／又は枝分かれ-伸長増幅の出発材料として使用することができる、環状化可能な核酸プローブ及び／又は1本鎖核酸環状プローブを増幅する方法及びキットに関する。
【発明の開示】
【００１３】
発明の概要
本発明は、直線状の環状化可能な核酸プローブ及び／又は環状の核酸プローブを調製する方法に関する。このようなプローブは、核酸分子のローリングサークル増幅(RCA)及び／又は枝分かれ-伸長増幅(RAM)の出発材料として使用することができる。本発明は更に、本明細書に説明された方法に従い作製される環状プローブ及び直線状の環状化可能なプローブを提供する。本発明は更に、本発明の環状プローブ及び／又は直線状の環状化可能なプローブを備えるキットを提供する。
【００１４】
本発明の実施態様は、前述の必要性に加え、その他の必要性を満足する。本発明のひとつの実施態様に従い、以下の工程を含む環状プローブを作出する方法が提供される：第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブと、核酸内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、このオリゴヌクレオチドプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に相補的である3'及び5'領域を有する環状化可能なプローブを含み、その結果スパニングオリゴヌクレオチド及び環状化可能な増幅プローブを含む複合体が形成され、ここで環状化可能な増幅プローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に、その3'及び5'末端で結合される工程；環状化可能なプローブの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；連結工程の環状プローブを、環状プローブと相補的でありかつハイブリダイズすることができる伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーション(multiple revolution)のために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、連結により作出された環状プローブを増幅する工程；制限酵素が反復単位の1本鎖DNAを単独の単位長オリゴヌクレオチドへ切断する条件下で、反復単位の1本鎖DNAを制限酵素で切断する工程；単位長オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む第二のスパニングオリゴヌクレオチドを、制限切断工程から作出された少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第二のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；連結工程、伸長工程及び制限酵素切断工程を繰り返す工程；第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、最終の制限切断工程から作出された少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第一のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；並びに、単位長オリゴヌクレオチドの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程であり、この環状プローブは、それが化学的に合成されるよりもむしろ、酵素的に生成されることを除いては、第一の連結工程から生じた環状プローブの正確なコピーである。
【００１５】
本発明の別の実施態様は、少なくとも1種の第一のスパニングオリゴヌクレオチド；少なくとも1種の環状化可能な増幅プローブ；少なくとも1種の伸長プライマー；及び、少なくとも1種の第二のスパニングオリゴヌクレオチド；を備える増幅キットを含む。
【００１６】
更に別の本発明の実施態様は、以下の工程を含む直線状の環状化可能なプローブを作製する方法を含む：第一のスパニングオリゴヌクレオチドを、少なくとも1種のオリゴヌクレオチドプローブと、核酸内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程であり、このオリゴヌクレオチドプローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に相補的である3'及び5'領域を有する環状化可能なプローブを含み、その結果スパニングオリゴヌクレオチド及び環状化可能な増幅プローブを含む複合体が形成され、ここで環状化可能な増幅プローブは、スパニングオリゴヌクレオチド内の隣接するが重複しない配列に、その3'及び5'末端で結合される工程；環状化可能なプローブの3'及び5'末端を、ヌクレオチド配列を接続する連結剤で連結し、環状プローブが形成される工程；連結工程の環状プローブを、環状プローブと相補的でありかつハイブリダイズすることができる伸長プライマー、dNTPs、及び鎖置換活性を有するDNAポリメラーゼと、伸長プライマーが環状プローブの配列に相補的な反復単位の1本鎖DNAを形成するマルチプルレボルーションのために環状プローブの周囲に伸長されるような条件下で接触することにより、連結工程の環状プローブを増幅する工程；制限酵素が反復単位の1本鎖DNAを単独の単位長オリゴヌクレオチドへ切断する条件下で、反復単位の1本鎖DNAを制限酵素で切断する工程；単位長オリゴヌクレオチドに相補的な核酸配列を含む第二のスパニングオリゴヌクレオチドを、制限酵素切断工程から生じた少なくとも1種の単位長オリゴヌクレオチドと、第二のスパニングオリゴヌクレオチド内の相補的配列間の核酸ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で接触する工程；連結工程、伸長工程、及び制限酵素切断工程を繰り返し、直線状の環状化可能なプローブが形成される工程；を含み、この環状化可能なプローブは、そが化学的に合成されるよりもむしろ、酵素的に生成されることを除いては、第一の連結工程から生じた環状プローブの正確なコピーである。本発明のプローブは、RCA、RAM、PCR及びHSAMを含むが、これらに限定されるものではない、標準増幅法において使用することができることは当業者には容易に理解される。
【００１７】
本発明の別の実施態様は、スパニングオリゴヌクレオチドの隣接するが重複しない配列と相補的である領域を含む1本鎖化された環状プローブを含み、ここでこの環状プローブは、先に説明された方法に従い作製される。
別の本発明の実施態様は、スパニングオリゴヌクレオチドの隣接するが重複しない配列と相補的である3'及び5'領域を含む、1本鎖化された直線状の環状化可能なプローブを含み、ここでこの環状化可能なプローブは、先に説明された方法に従い作製される。
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、直線状の環状化可能な核酸プローブ及び／又は環状の核酸プローブを調製する方法に関する。このようなプローブは、核酸分子のローリングサークル増幅(RCA)及び／又は枝分かれ-伸長増幅(RAM)のための出発材料として使用することができる。本発明は更に、本明細書に説明された方法に従い作製された環状プローブ及び直線状の環状化可能なプローブを提供する。本発明は更に、本発明の環状プローブ及び／又は直線状の環状化可能なプローブを備えるキットを提供する。
【００１９】
RCA反応の効率に関する詳細な研究の過程で、標準手法で作出された(すなわち化学的に合成された)1本鎖DNA環状プローブの小さい割合のみが、RCA反応又はRAM反応に参加することができることが発見された。更にこれは、複数の商業的DNA合成企業により製造された複数のプローブ配列について当てはまることが発見された。従って複製欠陥を引き起こす欠損は、配列特異的でも供給業者特異的でもない。認められた効率の範囲は、約10％と高い値(すなわち、化学的に合成された環状化可能なプローブの10％は実際に複製することができる)から、実質的に1％未満までの範囲にわたる。実質的変動は、個々の供給業者の同じDNA配列の異なる合成ロットであっても認められた。この欠陥は、標準のホスホロアミダイト合成時の制御の良くない変量に関連するように見える。同様に、全ての試験したプローブはゲル精製されたので、この欠損のあるプローブ配列は、サイズ排除により、欠損のない生成物から簡単に分離することはできない。
【００２０】
DNA鎖内の欠損が非常に少ないことが、RCA増幅において認められた効率の観測された低下を生じるために必要であることは明らかである。100ヌクレオチド長のDNA環状化可能なプローブにおいて、いずれかの位置で生じる欠損確率1％は、少なくとも1個の欠損を有する環状化可能なプローブの画分が、1〜0.99100であることを暗示している。従って、この環状化可能なプローブの63％は欠損があるであろう。100ヌクレオチドの環状化可能なプローブ内の任意のヌクレオチドにおける0.1％の欠損発生の確率は、欠損のある環状化可能なプローブの画分を、1〜0.99100又は9.5％生じるであろう。本発明者らの知見は、100ヌクレオチド長の環状プローブの90〜99％が、DNAポリメラーゼを停止する欠損を有し、これは1ヌクレオチド当たり2.3％〜4.5％の欠損率に相当することを示唆している。
【００２１】
本方法において利用される、単独の完全長連結-依存型環状化可能なプローブ(すなわち、C-プローブ)は、標的核酸配列の検出及び増幅のより大きい効率を可能にする。2本鎖核酸分子のヘリックスの性質のために、環状化されたプローブは、標的核酸鎖の周囲で傷つけられる。連結工程の結果として、このプローブは、カテナン形成により標的分子へ不可逆的に連結されることがある。このことは、プローブの標的分子での固定化を生じ、ストリンジェントな洗浄条件に実質的に抵抗性があるハイブリッド分子を形成する。このことは、アッセイ時の非特異的シグナルの著しい低下、より低いバックグランドノイズ及びアッセイ特異性の増大を生じる。
【００２２】
別の本発明の実施態様において、ホスホロアミダイト化学により化学的に合成された環状プローブに関連した性能不良の問題点を克服する環状プローブを酵素的に合成する方法が提供される。化学的に合成された1本鎖の直線状DNAオリゴヌクレオチド(「プラス鎖」と称される)は、プラス鎖直線状オリゴヌクレオチドの5'及び3'末端に相補的でありかつスパニングする短いオリゴヌクレオチド(すなわち、スパニングオリゴヌクレオチド)と、相補的ヌクレオチドの間のハイブリダイゼーションを促進する条件下で、インキュベーションされる。DNAリガーゼがこの複合体に添加され、共有結合閉鎖された環状プローブを形成する。適当なDNAリガーゼは、Taq DNAリガーゼ又はT4 DNAリガーゼである。
【００２３】
その後、プラス鎖環状プローブには、1回のプライマーRCAが施される。簡単に述べると、環状プローブは、環状プローブ内の配列に相補的でありかつスパニングオリゴヌクレオチドと同一であってもなくてもよい、伸長プライマー、鎖置換活性を伴うDNAポリメラーゼ、例えばφ29 DNAポリメラーゼ又はBst DNAポリメラーゼ、並びにdNTPsと共に、最大10,000又はそれ以上の環状プローブの相補的コピーを含む、マイナス鎖の多量体直線状DNA反応生成物の形成を促進する条件下で、インキュベーションされる。
【００２４】
その後この多量体反応生成物は、適当な制限酵素の添加により、「単位長」断片へ切断される。単位長断片(マイナス鎖)はその後、当業者に周知であるように、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、適当なサイズのバンドの切り出し及び溶出により精製される。
次にマイナス鎖環状プローブが、先に説明されたような連結により、精製された単位長断片から調製される。あるいは、化学的に合成されたマイナス鎖環状プローブにより、酵素的合成反応を開始することができる。
最後にRCAを更に1ラウンド、単位長サイズへの制限、ゲル精製、環状化、及びゲル精製が行われる。最終生成物は、ホスホロアミダイト化学によるDNA合成装置上よりもむしろ、DNAポリメラーゼにより精製されることを除いて、出発環状プローブに対し配列が同一である、高度に精製された定量的なプラス鎖環状プローブからなる。
【００２５】
当業者には、前述の方法は、化学合成された直線状のプローブ配列の当初の「集団」に対する多くの選択工程を課すことにより、利点をもたらすことは明らかであろう。第一に、スパニングオリゴヌクレオチドに相補的である5'及び3'末端配列を含む配列のみが、連結時に環状化されるであろう。環状化することができない他の配列は、正確にサイズ化された環状化された生成物と共に移動しないので、これらはゲル精製工程により除去されるであろう。環状化は、例えば完全長直線状オリゴヌクレオチドといわゆる「n-1」オリゴヌクレオチド(すなわち、完全長よりも1ヌクレオチド短い配列)の間で認められる、著しく大きい移動シフトを誘導する。第二に、例えばφ29 DNAポリメラーゼのような、選択されたDNAポリメラーゼにより複製することができる配列のみ、第一又は第二のRCA増幅の生成物において示されるであろう。これは、オリゴヌクレオチドプライマーの環状プローブへの正確なアニーリングが必須であり、従って環状プローブにおける正確な相補的配列の存在を選択し、及び複数回環状プローブ全体の周囲を横断するポリメラーゼの能力は妨げられない。環状プローブの周囲を横断するポリメラーゼの能力は、化学的に合成された集団から、欠損のない環状プローブを、そのような化学的欠損の性質に関して知ることを必要要件とせずに選択する。先に説明され及び実施例2において例示される酵素的合成法において、課された少なくとも4つのオリゴヌクレオチド結合事象が存在する：ふたつの連結/環状化工程及びふたつのプライミング工程。従って、最終生成物の少なくとも4種のオリゴヌクレオチドのサイズ化されたセグメントは、正確な配列を有することを確実にすることができる。加えて、最終生成物上の少なくとも2個多いオリゴヌクレオチド-長配列の選択要件を課するためにも使用することができるふたつの制限エンドヌクレアーゼ切断工程が存在する。従って、最終生成物オリゴヌクレオチドプローブの機能上重要な配列エレメントを少なくとも全て含む配列を、当初の不均質な化学的に合成された集団から選択的に「抽出」することができる。
【００２６】
先に説明された酵素的プロセスにより作製されたもののような、改善された複製特性を伴う環状プローブは、本明細書において説明される診断アッセイにおけるシグナル発生システムのエレメントとして、様々な状況において有用であろう。例えば環状プローブは、標的核酸へ直接ハイブリダイズされ、その後試料中の標的核酸の存在を示すために、増幅及び検出される。環状プローブは、本明細書に説明されたように、標的核酸へ直接ハイブリダイズし、及びHSAMにより検出することもできる。あるいはこれらは、標的核酸及び環状プローブの両方へハイブリダイズされた中間体プローブを介して、標的核酸へ結合され、並びに同様に増幅及び検出される。あるいはこれらは、抗体、タンパク質、又は様々な非-核酸標的(例えばタンパク質)に結合することができるアプタマー(aptimer)と直接又は間接に連結されることができ、従って多種多様な診断アッセイにおけるシグナル発生部分として使用することができる。
【００２７】
更に別の本発明の実施態様において、連結-ベースのアッセイにおいてそのような環状化可能なプローブを利用し、直線状プローブの5'及び3'末端を、例えば特異的核酸標的配列によりまとめることも望ましい。このフォーマットにおいて、直線状プローブの5'及び3'末端は、正確な標的配列の存在に高度に依存し作製することができる様式で、一緒に共有的に連結され、環を形成する。前記及び実施例2に説明された方法は、直線状の環状化可能なプローブ中間体の末端の作製を制限エンドヌクレアーゼに頼り、従って5'及び3'末端は、特定の制限エンドヌクレアーゼの認識配列により必ず規定される。実施例2において、PvuII制限エンドヌクレアーゼが使用され、その結果最終の直線状中間体の末端は、配列5'-CTG…NNN…CAG-3'を有し、ここでNNNは、末端の間の選択されたヌクレオチド配列を表す。多種多様な利用可能な認識配列と共に、多種多様な制限エンドヌクレアーゼが存在するが、見込みのある(prospective)標的配列の最も広い可能性のある範囲を利用することができるように、可能性のある酵素的に作出された配列のこの制限を完全に緩和する(relieve)ことは、決して利点ではないであろう。
【００２８】
出発の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドは、IIB型制限エンドヌクレアーゼ(例えば、BsaXI)の認識配列及びフランキング配列を含む追加配列を有することを除き、実施例2に説明された手法に従い、IIB型制限エンドヌクレアーゼと2本鎖型配列とのインキュベーション時に、追加の配列はフランキング配列の末端で正確に切断される。このオリゴヌクレオチドは、第二のRCA反応の多量体プラス鎖増幅産物が、該IIB型制限エンドヌクレアーゼを使用し単位長片へ短縮されること以外は、全く実施例2に説明されたように処理することができる。IIB型制限エンドヌクレアーゼは、それらの認識配列及び制限部位は同じでないという有用な特性を有する。例えばBsaXIは、認識/切断配列5'-…v(N)9AC(N)5CTCC(N)10v…-3'を有する。この酵素は、中心のAC(N)5CTTCC配列を認識し、並びに切断部位での実際の配列とは関わりなく、その認識配列の上流側9ヌクレオチド及び下流側10ヌクレオチドを切断する。従って、この配列の多量体の1本鎖RCA産物への挿入、多量体のこの部分を2本鎖化するための相補的オリゴヌクレオチドの追加、及び適当な条件下でのBsaXIとのインキュベーションは、5'及び3'末端配列が任意に選択された配列であり得ること以外は、実施例2のものと同じ単位長環状化可能なオリゴヌクレオチドの作出を生じるであろう。
【００２９】
別の本発明の実施態様において、存在する環状化可能なプローブは、鋳型としての環状化可能なプローブ、及びPCR産物の1本鎖が環状化される場合に特異的IIB型制限酵素認識部位を作製するようにデザインされた5'伸長を有するプライマーとのPCR反応を使用し、増幅することができる。このスキームの環状化可能なプローブの全合成に勝る利点は、この合成はより少ない経費でより少ない工程で実行されることである。
【００３０】
デザインにより、2本鎖PCR産物の1本のみの鎖は、このプロセスの次工程に望ましい。PCR反応は、ふたつのPCRプライマーの比を調節することにより、望ましい鎖の作出に偏らせることができる(Sanchez, J. A.ら、Proc Natl Acad Sci USA, 101(7): 1933-8, 2004参照)。
PCR反応後、望ましい鎖は、短い鋳型オリゴヌクレオチドとの連結により、環状化される。得られる環状プローブは、鋳型環状プローブの相補体であるDNA鎖の複数のコンカテマー形成されたコピーを作製するRCA反応のための鋳型である。コンカテマー形成された生成物に相補的でありかつ所望のIIB型制限エンドヌクレアーゼ部位を作製するオリゴヌクレオチド配列は、このコンカテマーにアニーリングすることができ、選択されたIIB型制限酵素が添加され、望ましい末端構造を伴う単位長の環状化可能なプローブを作製する。
【００３１】
環状化可能なプローブ検出システムの望ましい特徴のひとつは、単独のオリゴヌクレオチドプライマーを使用し、異なる標的領域を検出する環状化されたプローブを増幅することができることである。これは、この標的領域特異性は、環状化可能なプローブの標的-特異性末端配列に起因するが、増幅は、直線状の環状化可能なプローブの類型的内部領域で開始されるという理由で可能である。このPCRスキームは、所定の類型的領域で望ましい標的領域のいずれかの合成を可能にしなければならない。
【００３２】
環状化されたプローブは、大きいポリマーの生成により、増幅及び検出することもできる。このポリマーは、環状化されたプローブに沿ったプライマー1(例えば、伸長プライマー1)のローリングサークル伸長(すなわち、ローリングサークル増幅(RCA))及び下流配列の置換により作製される。この工程は、図1に示されたような、引き続きのPCRの鋳型として役立つ複数の単位を含む、1本鎖DNAを生じる。この図に示されたように、プライマー2(例えば、伸長プライマー2)は、1本鎖DNAポリマーに結合し、同時に伸長し、上流プライマーによる下流プライマーの置換を生じることができる。プライマー-伸長/置換及びPCRの両方を使用することにより、より多く検出可能な生成物が、同数のサイクルで作出される。
【００３３】
環状化されたプローブは、HSAMアッセイの変形によっても検出することができる。図2に示されたようなこの方法において、環状化可能なプローブ(図2において標的プローブと称される)は、先に説明されたように、標的核酸の隣接領域に相補的である3'及び5'領域を含む。この環状化可能なプローブは更に非相補的領域、又は類型的リンカー領域を含む。現在のシグナル増幅法において、環状化可能なプローブのリンカー領域は、第一の類型的環状化可能なシグナルプローブ(CS-プローブ)の3'及び5'領域に相補的である隣接領域を少なくとも1対含む。第一のCS-プローブは、その3'及び5'領域内に、環状化可能なプローブのリンカー領域の隣接領域に相補的である配列を含む。環状化可能なプローブの標的核酸への結合、それに続く連結は、第一のCS-プローブの3'及び5'末端に結合するのに利用可能なリンカー内の領域を有する共有的に連結された環状プローブを生じる。第一のCS-プローブの添加は、環状プローブのリンカーの相補的領域へのその3'及び5'領域の結合を生じる。CS-プローブの3'及び5'領域は、連結剤により連結され、閉鎖した環状プローブへ結合した閉鎖した環状のCS-プローブを形成する。第一のCS-プローブは更に、第二のCS-プローブの3'及び5'領域に相補的であるようにデザインされた隣接コンティグ領域を少なくとも1対含むリンカー領域を含む。
【００３４】
第二のCS-プローブは、その3'及び5'領域に、第一のCS-プローブのリンカー領域の隣接領域に相補的である配列を含む。第二のCS-プローブの添加は、第一のCS-プローブのリンカーの相補的領域へのその3'及び5'領域の結合を生じる。第二のCS-プローブの3'及び5'領域は、連結剤により結合され、閉鎖された環状のCS-プローブを形成し、これは次に閉鎖された環状プローブに結合される。
相補的領域の複数の対を有する多数のCS-プローブにより前述の方法を行うことにより、連鎖された分子の大きいクラスターが、標的核酸上に形成される。別の実施態様において、3種のCS-プローブが利用される。各々のCS-プローブは、その3'及び5'領域に加え、第二のCS-プローブの3'及び5'領域に相補的である相補的領域のひとつの対、並びに第三のCS-プローブの3'及び5'領域に相補的である別の相補的領域の対を有する。本発明の方法におけるこれらの「三価」のCS-プローブを利用することにより、図2に示されたような連鎖された分子のクラスターが作出される。
【００３５】
標的に連結されない非特異的連鎖反応を取り除くための広範な洗浄後、連鎖された分子のクラスターを検出することにより、標的核酸が検出される。連鎖された分子は、認識配列が各CS-プローブのリンカー領域に独自に組み込まれている制限エンドヌクレアーゼで複合体を消化することにより、容易に検出することができる。制限エンドヌクレアーゼ消化は、ポリアクリルアミドゲル上で可視化することができる直線状の単量体を生じる。別の検出法は、例えば、ジゴキシゲニン、ビオチン又は蛍光分子などの検出可能な分子のCS-プローブへの組み込み、及び抗-ジゴキシニン、ストレプトアビジン、又は蛍光検出による検出により実行することができる。例えば、Essersらの論文(J. Clin. Microbiol., 12, 641, 1980)に説明されているような、ラテックス凝集も、使用することができる。このような核酸検出法は、当業者に公知である。
【００３６】
別の実施態様において、環状化されたプローブは、HSAMアッセイの別の変形により検出することもできる。この方法において、図3に示されたように、リガンド分子は、例えば、プローブ合成時に、環状化可能なプローブのリンカー領域へ組み込むことができる。その後HSAMアッセイは、先に説明され及び図3に図示されたように、大きい複合体を形成するためのリガンド結合する分子及びシグナルプローブの添加、洗浄、その後の複合体の検出により、実行される。核酸検出法は、当業者に公知であり、例えば、Essersらの論文(J. Clin. Microbiol., 12:641, 1980)に説明されたようなラテックス凝集を含む。HSAMと組み合わせた環状化可能なプローブの使用は、インサイチュ(in situ)ハイブリダイゼーションにおいて特に有用である。
【００３７】
本方法は、臨床検査室により検査目的で得られる通常の臨床検体で使用することができる。本方法で使用することができる臨床検体は、とりわけ、全血、分離された白血球、痰、尿、組織生検、咽頭スワブなど、すなわち、分析のために臨床検査室に通常送られるあらゆる患者検体を含む。
【００３８】
この複合体は、当該技術分野において公知であり、かつ選択されたリガンド及びリガンド結合部分に適した方法により検出することができる。例えば、リガンド結合部分がストレプトアビジンである場合、これはストレプトアビジン抗体を使うイムノアッセイにより検出することができる。あるいは、リガンド結合分子は、本方法において容易に検出可能である複合体として利用することができる。例えば、リガンドは、蛍光色素又は酵素-連結した色素形成アッセイにより検出可能な酵素、例えばアルカリホスファターゼ又はホースラディッシュペルオキシダーゼなどと複合される。例えば、リガンド結合分子は、アルカリホスファターゼ-複合されたストレプトアビジンであってよく、これは色素形成性アルカリホスファターゼ基質、例えばニトロブルーテトラゾリウムクロライドの添加により検出することができる。
【００３９】
シグナル発生部分を検出するためのいずれか適当な技術を、利用することができる。このような技術は、当該技術分野において公知のシンチレーションカウンティング(32Pについて)及び色素形成又は蛍光色素の検出法を含む。例えば、好適な検出法は、とりわけSambrookらの著書(Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 第2版, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989のMethods in Enzymology, 第152巻, Academic Press, 1987)、又はWuらの著書(Recombinant DNA Methodology, Academic Press, 1989)において認めることができる。
【００４０】
本明細書において使用される用語「リガンド」は、「リガンド結合部分」とここで称される別の成分に親和性を有する任意の成分を意味する。リガンドのリガンド結合部分への結合は、これらふたつの成分間の親和対を形成する。例えば、そのような親和対は、とりわけ、ビオチンのアビジン/ストレプトアビジンとの、抗原又はハプテンの抗体との、重金属誘導体のチオ基との、様々なポリヌクレオチド、例えばポリdGとポリdC、ポリdAとポリdT及びポリdAとポリUなどのホモポリヌクレオチドを含む。互いに強力な親和性を持つ任意の成分対を、リガンド-リガンド結合部分の親和対として使用することができる。適当な親和対は、免疫学的方法において使用されるリガンド及び複合体においても認められる。
連結剤は、当該技術分野において周知である。このような連結剤の例は、酵素、例えばDNAリガーゼもしくはRNAリガーゼ、又は化学結合剤、例えば臭化シアンもしくはカルボジイミドを含むが、これらに限定されるものではない(Sokolovaら、 FEBS Lett. 232:153-155, 1988)。
【００４１】
連結依存型の環状化可能なプローブを利用する本発明の実施態様において、得られる環状分子は、好都合なことに、図4に示されたような枝分かれ-伸長増幅法(RAM)により増幅することができる。RAMによる環状化されたプローブの増幅は、等温条件下で環状化されたプローブの数百万倍までの増幅を可能にすることにより、本発明の方法に更なる利点を追加する。RAMは、図4に図示されている。
【００４２】
RAMに有用な単独の完全長連結依存型環状化可能なプローブは、その3'及び5'末端に標的分子の隣接するが重複しない領域とハイブリダイズ可能である領域を含む。環状化可能なプローブは、標的核酸の一部に相補的でありかつハイブリダイズ可能である5'領域、及びこのプローブの5'領域に相補的である標的の一部に隣接する標的核酸の部分に相補的でありかつハイブリダイズ可能である3'領域を含むようにデザインされる。環状化可能なプローブの相補的5'及び3'領域は、各々、約20〜約35ヌクレオチド長であってよい。別の実施態様において、環状化可能なプローブの5'及び3'領域は、約25ヌクレオチド長である。この環状化可能なプローブは更に、リンカー領域として指定された領域を含む。更に別の実施態様において、このリンカー領域は、約30〜約60ヌクレオチド長である。リンカー領域は、標的配列に相補的でもハイブリダイズ可能でもない一般的配列により構成される。
【００４３】
RAMによる増幅に適した環状化可能なプローブは、先に説明されたように、1種又は複数の捕獲/増幅プローブと共に、本方法で利用される。環状化可能なプローブが標的核酸とハイブリダイズする場合、その5'及び3'末端は、並置され始める。連結剤による連結は、閉鎖した環状分子(例えば、環状プローブ)の形成を生じる。
閉鎖した環状分子の増幅は、第一の伸長プライマー(Ext-プライマー1)のこの反応への添加により実現される。Ext-プライマー1は、環状プローブのリンカー領域の一部に相補的でありかつハイブリダイズ可能であり、並びに約15〜約30ヌクレオチド長であることができる。Ext-プライマー1は、閉鎖された環状分子の周囲にプライマーを伸長するのに十分な濃度のdNTPs及びDNAポリメラーゼの添加により、伸長される。この循環の1回転(revolution)の後、すなわち、DNAポリメラーゼがExt-プライマー1結合部位に到達した時点で、このポリメラーゼは、プライマーとその伸長された配列を置き換える。その結果図4に示したように、ポリメラーゼは閉鎖した環状プローブを連続して「転がし(roll over)」、長い1本鎖DNAを作出する。
【００４４】
RAMによる環状化されたプローブの増幅に有用なポリメラーゼは、3'−＞5'エキソヌクレアーゼ活性を欠くか、鎖置換活性を有するか、及び少なくとも約1000塩基のプライマー伸長が可能であるような、任意のポリメラーゼであることができる。DNAポリメラーゼの(Exo-)クレノウ断片、サーモコッカス・リトラリス(Thermococcus litoralis)DNAポリメラーゼ(Vent(exo-))DNAポリメラーゼ(New England Biolabs)、バシラス・ステアロテルモフィリス(Bacillus stearothermophilus)DNAポリメラーゼ(Bst DNAポリメラーゼ)及びφ29ポリメラーゼ(Blancoら、 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:12198, 1994)は、そのようなポリメラーゼの例である。サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus)(Taq)DNAポリメラーゼも、本発明において有用である。この文献に報告されたこととは対照的に、Taq DNAポリメラーゼは、鎖置換活性を有することが、本発明において認められている。
【００４５】
前述のポリメラーゼによるExt-プライマー1の伸長(すなわちRCA)は、環状プローブの配列に相補的である配列を有する反復単位の長い1本鎖DNA分子を生じる。この1本鎖DNAは、最大10Kbであり、例えば、約20〜約100単位を含み、各単位は、例えば約100塩基の環状化可能なプローブの長さと長さが等しい。標的が豊富であるか又は1本鎖DNAが長い場合は、RAMの代わりとして、このRCA工程時に検出を行うことができる。例えば、長い1本鎖DNAは、ポリアクリルアミドゲル上での巨大分子としての得られる生成物の可視化により、この段階で検出することができる。
【００４６】
RAMによる増幅の次工程において、第二の伸長プライマー(Ext-プライマー2)が添加される。Ext-プライマー2は、約15〜約30ヌクレオチド長である。Ext-プライマー2は、Ext-プライマー1が相補的であるリンカー領域の部分と重複しないリンカー領域部分と同じである。従って長い1本鎖DNAの各反復単位は、Ext-プライマー2がハイブリダイズする結合部位を含む。従って図4に示されたような、Ext-プライマー2の多コピーが、長い1本鎖DNAに結合し、DNAポリメラーゼにより伸長される。図4に示されたように、プライマー伸長産物は、プライマー下流で、それらの対応する伸長産物と置換され、複数の置換された1本鎖DNA分子を作出する。この置換された1本鎖は、Ext-プライマー1の結合部位を含み、従って図4に示されたような複数の枝分かれ分子を作出するための、更なるプライマー伸長反応の鋳型として役立つ。この反応は、全てのDNAが2本鎖化される時点で、終結する。
【００４７】
次にRAMにより増幅されたDNAは、DNA検出に関して当該技術分野において公知の方法により検出される。RAMは、指数的増幅を生じるので、得られる大量のDNAは、好都合なことに、例えばゲル電気泳動及び例えば臭化エチジウムによる可視化により検出される。RAM伸長産物は、閉環状DNAから伸長された単位の数に応じサイズが異なるので、RAM生成物は電気泳動した場合に、スメア又はラダーとして出現する。別の実施態様において、環状化可能なプローブは、独自の制限部位を含むようにデザインされ、並びにRAM生成物は、対応する制限エンドヌクレアーゼにより消化され、ひとつの単位長の、すなわち環状化可能なプローブの長さの、単独のサイズ化された断片を大量に提供する。この断片は、ゲル電気泳動により単独のバンドとして容易に検出することができる。あるいは、ビオチン又はジゴキシゲニンなどのリガンドを、プライマー伸長時に組み込むことができ、及びリガンド-標識された1本鎖化された生成物は、先に説明されたように検出することができる。
RAM伸長産物は、例えば、PCR産物の検出について先に説明されたようなELISA、又は実時間蛍光アッセイ(例えば、Sybr Greenインターカレート色素のその反応への混入)などを含む、当該技術分野において公知の他の方法により検出することができる。
【００４８】
本発明の実施において使用するための試薬は、個別に提供されるか、又はキットの形で包装されてよい。例えば、キットは、1種又は複数の第一のスパニングオリゴヌクレオチド、1種又は複数の環状化可能なプローブ、1種又は複数の第一の伸長プライマー、1種又は複数の第二のスパニングオリゴヌクレオチド及び1種又は複数の第二の伸長プライマーを備えるように調製されてよい。このようなキットは、連結に必要な適当な試薬(例えばDNAリガーゼ) の包装された組合せを含むことができ、及び恐らく増幅に必要な適当な試薬(例えば適当なDNAポリメラーゼ)を含んでよい。
【００４９】
キットの容器内の試薬の配置は、関与した具体的試薬に左右されるであろう。各試薬は、個別の容器内に包装することができるが、様々な組合せも可能である。
本発明は、下記実施例により例示されるが、これらは本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００５０】
実施例1
化学合成された1本鎖DNA環状プローブの作出
長さ88〜124ヌクレオチドの範囲の直線状DNAを、Gene Link, Incにより標準ホスホロアミダイト化学により調製し、ポリアクリルアミドゲル電気泳動上で精製した。図5は、製造業者によるゲル精製前後の110ヌクレオチド長の配列(Stachy139)の臭化エチジウム染色したゲルの写真である。33P-標識されたリン酸を、標準ポリヌクレオチドキナーゼ反応により、5'末端に追加した。プラス鎖環状DNAプローブは、配列5'- CACTCAGAGA ATACTGAAAA AAACACAAGA GT - 3'(配列番号:1)を有し、かつ5'及び3'末端に相補的であり及びスパニングする、短いオリゴヌクレオチド(すなわち、スパニングオリゴヌクレオチド)のアニーリングにより形成した。次に共有結合閉環プローブを、この末端のTaq DNAリガーゼとの連結により形成した。環状化されない分子のエキソヌクレアーゼ消化及び連結生成物のゲル精製は、共有結合閉環1本鎖DNAプローブの純粋な調製物を生じた。最終調製物中の環状プローブの物理的数の定量は、精製された環状プローブ調製物中の比活性をカウントすることにより行い、標識されたリン酸の既知の比活性と組合せて、存在する環状プローブの数及び濃度の正確な決定を可能にする。十分な材料が入手可能な場合には、分光測定も用いた。
【００５１】
以下に、合成され並びに環状化及び複製コンピテント性について試験されたC-プローブ配列を示す。
Sal：5' GCGCCTTTCC AGACGCTTAC CAAGAGCAAC TACACGAATT CTCGATTAGG TTACTGCGAT TAGCACAAGC GCTGTCACCC TGTATCGC 3'  (配列番号:2)
Chlamy：5' GGTTTTGTCT TCGTAACTCG CTCCGGATGT CTGTGTATCT GCTAACCAAG AGCAACTACA CGAATTCTC GATTAGGTTA CTGCGATTAG CACAAGCTCT ACAAGAGTAC ATCGGTCAAC GAAGA 3'  (配列番号:3)
Stachy139：5' AGTATTCTCT GAGTGGCAAA CGCAATGAAG CTTGTCCTAG TGTGTCAGTC GCACGCTTAC CAAGAGCAAC TACACGAACA GCTGTGACCC CAAACTCTTG TGTTTTTTTC 3'  (配列番号:4)
Stachy154：5' AGTATTCTCT GAGTGGCAAA CGCAATGAAG CTTGTCCTAG TGTGTCAGTC GCACGCTTACC AAGAGCAACT ACACGAACAG CTGTTGTTTT TTTC '3  (配列番号:5)
【００５２】
実施例2
酵素合成による活性環状プローブの選択
実施例1に説明されたように、化学合成された(プラス鎖)Stachy139環状プローブから出発し、1回のプライマーRCA反応を、φ29 DNAポリメラーゼ及び多量体直線状の反応生成物を標識するためにα33P-dATPを用いて行った。アリコートを採取し、0、2、4及び20時間の時点で、生成物形成の定量のために、DE81フィルター上にスポット化した。4時間の時点で、約2,500個の相補的コピーが、0時の時点でこの反応液に添加された各環状プローブについて合成された。引き続き、この多量体生成物材料を、制限酵素PvuIIの添加により、「単位長」断片、及び、この生成物に関して、計算した3倍モル過剰な、複製された配列に相補的でありかつPvuII認識/制限配列を含む短いオリゴヌクレオチド(すなわち、PvuII(+) (ACACGAACAGCTGTGACCC) (配列番号:6)、19ヌクレオチド)に切断した。これらの単位長断片は、当初の環状プローブ配列(すなわちプラス鎖)の相補体(すなわちマイナス鎖)に相当するが、これらを次に、電気泳動、適当にサイズ化されたバンドの切り出し、及び溶出により、ポリアクリルアミドゲルから精製した。この直線状DNAから、マイナス鎖環状プローブを、スパニングオリゴヌクレオチドがPvuII(+)であったこと以外は、実施例1のような連結により調製した。これらのマイナス鎖環状プローブは、先に説明したようにポリアクリルアミドゲルから精製した。最後に、プライマーとしてPvuII(+)を使用するRCAを更に1ラウンド、単位長サイズへの制限、ゲル精製、環状化、及びゲル精製を行った。マイナス鎖環状プローブを鋳型として使用する第二ラウンドのRCAは、DNA合成速度及び生成された生成物の最終質量により示される、鋳型活性の増加を示した。最終生成物は、ホスホロアミダイト化学によりDNA合成装置上よりもむしろφ29 DNAポリメラーゼにより作出されたこと以外は、出発環状プローブの配列と同じ高度に精製された定量されたプラス鎖環状プローブからなった。
【００５３】
図6は、酵素的プラス鎖Stachy139環状プローブの作製プロセス時に生成された様々な33P-標識されたDNA生成物及び中間体を明らかにしている、4分離用ポリアクリルアミドゲルからのDNAパターンを示し、ここで「O」は、最初のゲルを示し、並びに「CU」及び「LU」は、各々、閉環した単位及び直線状単位の位置を表している。ゲルAは、合成オリゴヌクレオチド環状プローブのφ29 DNAポリメラーゼRCA増幅に由来した、PvuIIで制限されたマイナス鎖DNAが負荷された、4本のレーンを表している。ゲルBのレーン1は、ゲルAから溶出した直線状単位の環状化の結果を示し、及びレーン2は、連結されない対照である。ゲルCは、ゲルBから溶出された酵素的(-)鎖環状プローブのφ29 DNAポリメラーゼRCA増幅から得られる、PvuII制限されたプラス鎖DNAが負荷された5本のレーンに相当している。ゲルCから回収された直線状単位DNAの連結により形成された、プラス鎖環状プローブは、ゲルDにおいて認めることができる。ゲルDレーン1において、負荷された材料は、最初にエンドヌクレアーゼI及びIIIにより消化され、レーン2の材料は、負荷前に処理されない。
【００５４】
図7は、連結された33P-標識されたゲル精製された単位長プラス鎖Stachy139 DNAが負荷された分離用ポリアクリルアミドゲルである。レーンAは、連結後の、単位長1本鎖DNA環状化可能なプローブの、よりゆっくり移動する環状プローブ型への転換を明らかにしている。レーンBは、追加のエキソヌクレアーゼ消化工程が施されたレーンAと同じ材料であり、エキソヌクレアーゼ抵抗性の環状型を示している。
【００５５】
図8は、酵素的に生成された環状プローブの作製プロセスに関連したふたつのRCA反応時の生成物DNAの合成速度を示している。明らかに、この反応のいずれの時点においても、φ29 DNAポリメラーゼにより酵素的に作出された環状プローブの増幅は、同等数の化学的に合成された環状プローブよりも、有意により多い生成物DNAを生じる。
【００５６】
実施例3
1回のプライマーRCAによる化学的に合成された及び酵素的に作出された環状プローブの比較
ほぼ同数の化学的に合成された(実施例1参照)及び酵素的に作出された(実施例2参照)環状プローブを使用し、φ29 DNAポリメラーゼ及び多量体直線状反応生成物を標識するためのα33P-dATPを使用する、1回のプライマーRCA反応を開始した。アリコートを、0、1、2、4及び19時間の時点で採取し、生成物形成の定量のために、DE81フィルター上でスポット化した。
【００５７】
図9は、経時的なStachy139 DNAの単位コピー数の増加を表し、ここでは、合成環状鋳型のいくつかの投入レベルを、それらの酵素的生成と比較した。酵素的に作出された環状プローブは、化学的に合成された環状プローブよりも、約3〜5倍多い量の生成物を生じた。
【００５８】
実施例4
様々な環状プローブ調製における複製コンピテントな環状プローブの画分の速度論解析
化学的及び酵素的に合成されたStachy139環状プローブ調製物の一連の希釈を、1増幅反応につき、106環状プローブ〜1未満の環状プローブまでの範囲で行った。これらの希釈物に、各々、指数的RCAアッセイ(RAMアッセイ)での複製を施し、ここで生成物形成は、Bio-Rad実時間分析装置において、実時間でモニタリングした。環状プローブを、1X ThermoPol緩衝液(New England BioLabs：20mMトリス-HCl, 10mM KCl, 10mM (NH4)2SO4, 2mM MgSO4, 0.1％ Triton X-100, pH8.8)、0.2mMの各dNTP、0.13U/μL Bst DNAポリメラーゼ(New England BioLabs)、5％(v/v) DMSO、40mM NaCl、1.25μMフォワードプライマー、0.5μMリバースプライマー、SYBR-Green(0.12x)、及びフルオレセイン(10nM)を含むRAM反応混合液へ、氷上で添加した。チューブを、iQ実時間PCR検出モジュールを装着したBio-Rad「iCycler」サーマルサイクラーに移した。増幅を、60℃で等温的に試行し、SYBR-Greenチャネルを1時間実時間においてモニタリングした。各陽性反応は、「応答時間(Rt)」が実時間PCRアッセイの「Ct」又はサイクル数と類似している特徴的色素-結合により表され、これはコンピュータ処理することができる。Rt(又はCt)は、実時間増幅実験における色素結合曲線の比較の標準測定値であり、標的(PCRの場合)又は環状プローブ(RAMの場合)のアッセイ投入数の対数に反比例していることはよく理解される。すなわち、より多い標的(又は環状プローブ)の投入は、各々、より少ない(すなわち、より迅速な)Ct(又はRt)値を生じる。
【００５９】
図10は、化学的及び酵素的に合成された環状プローブは、その用量反応曲線が、約3.3倍の環状プローブにより相殺される(offset)こと以外は、実質的に同じ速度論で(すなわち、勾配は実質的に同じ)複製することを明らかにしている。すなわち、例えば、130個の酵素的に作出される環状プローブは、約25分間のRt'を生じるのに対し、約438の化学的に生成された環状プローブは25分間の応答時間がかかる。概して本発明者らは、複数の化学的に合成された環状プローブの複数の製造ロットを試験し、改善された複製挙動の見かけのレベルの幅広い変動を認めた。ひとつの一貫した知見は、全ての酵素的に作出された環状プローブは、一貫して良好に複製するのに対し、化学的に合成されたプローブの複製には、例え同じ供給業者からの同じ配列の複数のロット内であっても、広い変動が存在することである。100倍を超える改善例が認められたが、約10倍の改善が最も一般的である。場合によっては、本実施例に示されるように、より軽度の、しかし依然有意な改善レベルが認められる。
【００６０】
様々な刊行物が本明細書において引用されており、その内容はそれらの全体が本明細書に参照として組入れられている。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１】図1は、プライマー-伸長/置換及びPCRにより環状化されたプローブの増幅の概略図である。
【図２】図2は、環状の標的プローブ及び3種の環状のシグナルプローブを使用するHSAMの概略図である。AB、CD及びEFは、環状のシグナルプローブの3'及び5'ヌクレオチド配列に対し相補的であるリンカー領域内のヌクレオチド配列を示す。AB'、CD'及びEF'は、別の環状のシグナルプローブのリンカー領域の相補的配列に結合することにより、並置されるシグナルプローブの3'及び5'ヌクレオチド配列を示す。
【図３】図3は、環状の標的プローブ及び直線状のシグナルプローブを利用するHSAMの概略図である。
【図４】図4は、枝分かれ-伸長増幅法(RAM)による環状化されたプローブの増幅の概略図である。
【図５】図5は、精製前後のStachy139環状化可能なプローブの製造業者により提供された臭化エチジウム染色した分離用ゲルを示す。
【図６】図6は、酵素的作製法により作出された様々な33P-標識されたDNA生成物及び中間体＋鎖Stachy139環状プローブを明らかにする、4種の分離用ポリアクリルアミドゲルからのDNAパターンを示す。
【図７】図7は、連結され33P-標識されたゲル精製した単位長＋鎖Stachy139 DNAが負荷された分離用ポリアクリルアミドゲルである。
【図８】図8は、酵素的に作出された環状プローブ作製過程に関連したふたつのRCA反応時のDNA生成物の合成速度のグラフ表示である。
【図９】図9は、合成環状鋳型のいくつかの投入レベルが、酵素的に作出されたものと比較される、経時的Stachy139 DNAの単位コピー数の増加のグラフ表示である。
【図１０】図10は、事実上同じ速度論の指数的RAMアッセイにおける、化学的及び酵素的に合成された環状プローブの複製のグラフ表示である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2008534015.tif 000013