(57)【要約】  本発明は、タンパク質−リガンド結合特異性を予測または評価するための方法およびシステムを提供する。パターン認識モデルは、特定のリガンド結合特異性を有する学習タンパク質の選択された配列セグメントによって学習しておくことができる。各選択された配列セグメントは、対応する学習タンパク質のリガンド結合特異性に寄与するかもしれない（複数の）アミノ酸残基を含むと考えられる。目的のタンパク質が学習タンパク質と同じリガンド結合特異性を有するかどうかを決定するために、目的のタンパク質中の配列セグメントが同様に選択され、学習させたモデルをクエリーするために使用される。一の実施形態においては、使用されるパターン認識モデルが、Ｇタンパク質の特定のクラスと優先的に相互作用するＧＰＣＲの連結された細胞質ゾルドメインによって学習しておかれる隠れマルコフモデルである。この学習させたモデルが、オーファン（孤児）ＧＰＣＲのＧタンパク質結合特異性を評価するために使用される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的のＧタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）のＧタンパク質結合特異性を評価するための方法であって、
多数の学習配列を使用してパターン認識モデルを学習する工程：ここに、該学習配列が、Ｇタンパク質の特定クラスと相互作用することができる学習ＧＰＣＲの群に由来するものであり、該学習配列それぞれが、該群から選択される学習ＧＰＣＲの２以上の非隣接配列セグメントの連結を含み、該非隣接配列セグメントそれぞれが該学習ＧＰＣＲの細胞内配列を含む；および
目的のＧＰＣＲの２以上の非隣接配列セグメントの連結を含むクエリー配列を使用して、学習させたモデルをクエリーする工程：ここに、該目的のＧＰＣＲの非隣接配列セグメントそれぞれが、目的のＧＰＣＲの細胞内配列を含む；を含み、
該クエリー配列が学習させたモデルに一致するかまたは一致しないかが、該目的のＧＰＣＲが、該Ｇタンパク質の特定クラスと相互作用できるか否かを示す
方法。
【請求項２】
前記学習配列それぞれが、前記群から選択される学習ＧＰＣＲの２以上の細胞質ゾルドメインの連結を含み、前記クエリー配列が、目的のＧＰＣＲの２以上の細胞質ゾルドメインの連結を含む請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記学習配列それぞれが、前記群から選択される学習ＧＰＣＲの４つの細胞質ゾルドメインの連結を含み、前記クエリー配列が、目的のＧＰＣＲの４つの細胞質ゾルドメインの連結を含む請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記パターン認識モデルが、隠れマルコフモデルである請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記クエリーが、前記クエリー配列が学習させたモデルに一致するかまたは一致しないかを表すＥ−ｖａｌｕｅ値またはＨＭＭＥＲスコア値を生成する請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｇタンパク質の特定のクラスが、Ｇｉ／ｏクラス、Ｇｑ／１１クラス、ＧｓクラスおよびＧ１２／１３クラスからなる群より選択されるものである請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記目的のＧＰＣＲがオーファンＧＰＣＲである請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記学習ＧＰＣＲの群と目的のＧＰＣＲとが多重配列アライメントにおいて整列可能であり、前記学習ＧＰＣＲの非隣接配列セグメントが、該多重配列アライメントにおいて目的のＧＰＣＲの非隣接配列セグメントと整列可能である請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記多重配列アライメントが、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅプログラムによって生成されるものである請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
目的のＧＰＣＲとＧタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定するための方法であって、
請求項１に記載の方法によって目的のＧＰＣＲと相互作用することができるＧタンパク質のクラスを同定する工程、および、
作用物質の存在下または不在下で、目的のＧＰＣＲと、該クラスから選択されるＧタンパク質との間の相互作用をモニターする工程を含み、
該作用物質が存在しない場合と比較した該作用物質存在下における該相互作用の変化が、該作用物質が目的のＧＰＣＲと該Ｇタンパク質との間の相互作用を調節することを示す
方法。
【請求項１１】
前記作用物質が、目的のＧＰＣＲのアゴニストまたはアンタゴニストである請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記目的のＧＰＣＲがオーファンＧＰＣＲである請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
目的のＧＰＣＲによって媒介されるシグナル伝達経路を調節するための方法であって、
請求項１に記載の方法によって目的のＧＰＣＲと相互作用することができるＧタンパク質のクラスを同定する工程、
該クラスから選択されるＧタンパク質によって媒介されるシグナル伝達経路を調節することができる作用物質を提供する工程、および、
該作用物質を、目的のＧＰＣＲおよび該Ｇタンパク質を含む細胞に導入する工程
を含む方法。
【請求項１４】
ＧＰＣＲのＧタンパク質結合特異性を評価するためのパターン認識モデルを構築するための方法であって、
特定のＧタンパク質結合特異性を有する多数のＧＰＣＲから学習配列を調製する工程：ここに、該学習配列それぞれが、該多数のＧＰＣＲから選択されるＧＰＣＲの２以上の非隣接配列セグメントの連結を含み、該非隣接配列セグメントそれぞれが、該ＧＰＣＲの細胞内配列を含む；および
該学習配列を使用して該パターン認識モデルを学習する工程
を含む方法。
【請求項１５】
前記パターン認識モデルが、隠れマルコフモデルである請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記学習配列それぞれが、前記多数のＧＰＣＲから選択されるＧＰＣＲの４つの細胞質ゾルドメインの連結を含む請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
多数の学習配列によって学習させたパターン認識モデルを含むシステムであって、
該学習配列それぞれが、特定のＧタンパク質結合特異性を有するＧＰＣＲの２以上の非隣接配列セグメントの連結を含み、該非隣接配列セグメントそれぞれが、該ＧＰＣＲの細胞内配列を含む
システム。
【請求項１８】
前記パターン認識モデルが隠れマルコフモデルであり、前記学習配列それぞれがＧＰＣＲの４つの細胞質ゾルドメインの連結を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
目的のタンパク質のリガンド結合特異性を評価するための方法であって、
多数の学習配列を使用してパターン認識モデルを学習する工程：ここに、該学習配列が、特定のリガンド結合特異性を有する学習タンパク質の群に由来するものであり、該学習配列それぞれが、該群から選択される学習タンパク質の２以上の非隣接配列セグメントの連結を含む;および
目的のタンパク質の２以上の非隣接配列セグメントの連結を含むクエリー配列を使用して、学習させたモデルをクエリーする工程を含み、
該クエリー配列が学習させたモデルに一致するかまたは一致しないかが、目的のタンパク質が、該特定のリガンド結合特異性を有するか否かを示す
方法。
【請求項２０】
前記パターン認識モデルが、隠れマルコフモデルである請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
この出願は、米国仮出願番号６０／５８６４０９、２００４年７月９日の優先権を主張し、これらは出典明示により本明細書に組み入れる。
【０００２】
本発明は、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質および他のタンパク質−リガンド結合特異性を予測するための方法およびシステムに関する。
【背景技術】
【０００３】
Ｇタンパク質結合受容体（ＧＰＣＲ）は、生細胞において膜貫通型シグナル伝達の大部分を媒介する細胞表面の受容体のスーパーファミリーからなる。種々の生理的な機能がＧＰＣＲによって調節されており、たとえば、神経伝達、視覚、臭覚、味覚、成長、分泌、新陳代謝および免疫応答がある。ＧＰＣＲのアゴニスト（作用薬）およびアンタゴニスト（拮抗薬）ならびにＧＰＣＲによって調節される細胞経路を阻害する作用物質は、広く薬剤として使われている。ＧＰＣＲのドラッグターゲティングは、骨粗鬆症、子宮内膜症、癌、網膜色素変性症、甲状腺機能亢進性腺腫、思春期早発症、伴性（ｘ−ｌｉｎｋｅｄ）腎性尿崩症、副甲状腺機能亢進症、低カルシウム尿性高カルシウム血症、四肢短縮型小人症、肥満、糖質コルチコイド欠乏症、糖尿病および高血圧症があげられるが、これらに特に限定されない症状の治療を目指している。
【０００４】
ＧＰＣＲに共通する構造的な特徴は、細胞の外側に位置するアミノ末端（ｏ１）および細胞の内側に位置するカルボキシル基末端（ｉ４）を有する、細胞内（ｉ１、ｉ２およびｉ３）および細胞外（ｏ２、ｏ３およびｏ４）のループを交互にすることによって連結された、７つの膜を貫通するα−へリックスセグメントが存在することである。ＧＰＣＲは、細胞外または膜貫通型ドメインによってリガンドと結合する。リガンドの結合は、エフェクタータンパク質によって媒介される細胞内現象のカスケードを導くＧＰＣＲの高次構造の変化をもたらすと考えられている。細胞内カスケードの経路は、受容体と相互作用するＧタンパク質の特定のクラスによって決定される。α、βおよびγサブユニットから構成されるヘテロ三量体Ｇタンパク質は、αサブユニットに基づいて分類される。αサブユニットは、４つのクラスのうちの１つに属する：（１）Ｇｓ、これはアデニルシクラーゼを刺激する（たとえば、ＧｓおよびＧｏｌｆ）；（２）Ｇｉ／ｏ、これはアデニルシクラーゼを阻害し、イオンチャンネルを調節する（たとえば、Ｇｉ１、Ｇｉ２、Ｇｉ３、Ｇｏ１、Ｇｏ２、Ｇｏ３、Ｇｚ、Ｇｔ１、Ｇｔ２およびＧｇｕｓｔ）；（３）Ｇｑ／１１、これはホスホリパーゼＣβを活性化する（たとえば、Ｇｑ、Ｇ１１、Ｇ１４およびＧ１５／１６）；および（４）Ｇ１２／１３、これはＮａ＋／Ｈ＋交換体経路を活性化する（たとえば、Ｇ１２およびＧ１３）。
【０００５】
少なくとも５の異なるＧタンパク質βサブユニットおよび１１のγサブユニットが同定されている。Ｇタンパク質βγ複合体は比較的安定であり、そのため通常は１の機能性ユニットとみなされる。受容体の結合におけるＧβγの主要な役割は、受容体のための結合表面を提供することではなく、むしろ受容体の結合のためにＧαの最適な立体構造の維持を助けることであると考えられている。
【０００６】
ＧＰＣＲとＧタンパク質との間の相互作用を予測することは、ドラッグターゲティングの発見にとって非常に重要なことであるが、多くの問題点で悩まされるものである。ドラッグターゲットを発見するための困難さの１つは、ＧＰＣＲに作用するアゴニストに関する結合様式が、リガンドの化学的性質とほぼ同じくらい多様であることである。同じ受容体で作用するアゴニストであっても、必ずしも重複する結合部位を共有するわけではない。多くのＧＰＣＲは、優先的にある種のＧタンパク質のサブファミリーに結合するが、他のクラスのＧタンパク質にも結合することができる。この無差別さは、結合過程の理解をより困難にし、潜在的なドラッグの特異性を減少させる。他の問題点は、配列の同一性をほとんど有さないかまたは全く有さないＧＰＣＲの多様な構造のクラスに関連する。単にその一次配列に基づき新たにクローンされたＧＰＣＲのＧタンパク質結合特性を予測する試みは、特にその新しい配列が、結合優先性が知られている受容体と配列の相同性の程度が低い場合は、ほとんど成功がない。
【０００７】
ＧＰＣＲの結合特異性を決定し、その分子特異性を解明するために、種々の生化学的アプローチが開発されてきた。１５年間以上の徹底した研究にもかかわらず、多くのＧＰＣＲの結合特異性はまだ実験的に明らかにされていない。結合特異性を決定することは、ＧＰＣＲの生物学的な理解における必須の段階であり、治療薬の発見に用いる細胞ベースのアッセイの開発にとって重要である。Ｇタンパク質の結合を正確に決定するための方法を開発することは、オーファン（孤児）ＧＰＣＲ（ｏＧＰＣＲ）、すなわちリガンドが全く分かっていないＧＰＣＲ様の配列の研究において特に有用であろう。ｏＧＰＣＲのＧタンパク質への結合選択性を予測するために、経験上得た方法はあるが、このようなアプローチはしばしば誤り率（error rate）が高く、多くの場合において予測とならない。したがって、ＧＰＣＲのＧタンパク質結合選択性を予測するための改良された方法は、非常に有用であろう。
【発明の開示】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質および他のタンパク質−リガンド結合特異性を評価するための方法およびシステムを提供する。本発明は、学習タンパク質の選択された配列セグメントによって学習される、知識制限（knowledge-restricted）パターン認識モデルを使用する。選択される配列セグメントそれぞれは、タンパク質−リガンド相互作用の境界面に存在するかもしれない、または、対応する学習タンパク質のリガンド結合特異性に寄与するかもしれない（複数の）アミノ酸残基を含むと考えられる。目的のタンパク質において同様に位置している配列セグメントは、学習させたモデルにクエリーするために選択され、使用される。したがって、クエリー配列が学習させたモデルに全体的に一致することは、目的のタンパク質が、学習タンパク質と同じリガンド結合特異性を有することを表す。本発明に好適なパターン認識モデルとしては特に限定されず、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、主成分分析法、サポートベクターマシン（support vector machines）および部分最小二乗法が挙げられる。
【０００９】
一の態様において、本発明は、目的のＧＰＣＲのＧタンパク質結合特異性を評価するための方法を特徴とする。これらの方法は、
多数の学習配列を使用してパターン認識モデルを学習する工程：ここに、該学習配列が、Ｇタンパク質の特定のクラスと優先的に相互作用する、または、相互作用することができる学習ＧＰＣＲの群に由来するものであり、学習配列それぞれが、学習ＧＰＣＲの２以上の非隣接配列セグメントの連結を含み、そして該非隣接配列セグメントそれぞれが、学習ＧＰＣＲの細胞内配列を含む；および
目的のＧＰＣＲの２以上の非隣接配列セグメントの連結を含むクエリー配列を使用して、学習させたモデルをクエリーする工程を含む。
学習配列と同様に、クエリー配列中の連結配列セグメントもＧＰＣＲの細胞内配列を含む。したがって、クエリー配列が学習させたモデルに一致するかまたは一致しないかが、目的のＧＰＣＲが、Ｇタンパク質の特定のクラスと優先的に相互作用するかまたは相互作用する能力を有するかどうかを表す。
【００１０】
学習またはクエリー配列の構築に好適な配列セグメントは、学習ＧＰＣＲおよび目的のＧＰＣＲの多重配列アライメントに基づいて選択され得る。これらのＧＰＣＲの細胞外、膜貫通および細胞内配列の相対的な位置を決定することができる。細胞内配列または細胞質ゾルドメインのような多重配列アライメントにおいて類似位置にある配列セグメントを、学習またはクエリー配列の構築のために選択することができる。この目的のために好適な多重配列アライメントプログラムとしては、特に限定されないが、Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅモデルが挙げられる。ＧＰＣＲ中の膜貫通型へリックスも、ＴＭＨＭＭ、ＴｏｐＰｒｅｄまたは多重配列アライメントを容易にする他のプログラムを用いて予測することができる。
【００１１】
多くの実施形態においては、学習またはクエリー配列の構築に使用される非隣接配列セグメントが、ＧＰＣＲの細胞質ゾルドメインである。一例においては、使用される学習およびクエリー配列それぞれが、対応するＧＰＣＲの２以上の細胞質ゾルドメインの連結を含む。他の例においては、使用される学習およびクエリー配列それぞれが、対応するＧＰＣＲの４つの細胞質ゾルドメインの連結を含む。
【００１２】
さらに別の例においては、本発明において使用されるパターン認識モデルが、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）である。学習させたＨＭＭに対するクエリーは、クエリー配列が学習させたモデルに一致するかまたは一致しないかを表すＥ−ｖａｌｕｅ値またはＨＭＭＥＲスコア値を生成する。
【００１３】
さらなる例においては、研究されるＧタンパク質の特定のクラスが、Ｇｉ／ｏクラス、Ｇｑ／１１クラス、ＧｓクラスおよびＧ１２／１３クラスからなる群より選択されるものであり、目的のＧＰＣＲがオーファンＧＰＣＲである。
【００１４】
本発明はまた、目的のＧＰＣＲとＧタンパク質との間の相互作用のモジュレーターを同定するための方法を特徴とする。これらの方法は、
この文書中に記載される方法によって目的のＧＰＣＲと相互作用することができるＧタンパク質のクラスを同定する工程、および、
作用物質の存在下または不在下で、目的のＧＰＣＲと、該クラスから選択されるＧタンパク質との間の相互作用をモニターする工程を含む。
作用物質が存在しない場合と比較した作用物質存在下における相互作用の変化が、該作用物質が目的のＧＰＣＲと選択されたＧタンパク質との間の相互作用を調節することができることを示す。
【００１５】
限定されない例においては、このように同定される作用物質が、目的のＧＰＣＲのアゴニストまたはアンタゴニストである。他の限定されない例においては、研究される目的のＧＰＣＲがオーファンＧＰＣＲである。
【００１６】
本発明はさらに、目的のＧＰＣＲによって媒介されるシグナル伝達経路を調節するための方法を特徴とする。これらの方法は、
この文書中に記載される方法によって目的のＧＰＣＲと相互作用することができるＧタンパク質のクラスを同定する工程、
このように同定されたクラスから選択されるＧタンパク質によって媒介されるシグナル伝達経路を調節することができる作用物質を提供する工程、および、
該作用物質を、目的のＧＰＣＲおよび選択されたＧタンパク質を含む細胞に導入する工程を含む。
選択されたＧタンパク質によって媒介されるシグナル伝達経路を調節することによって、作用物質は、目的のＧＰＣＲの下流の活性を変えることもできる。
【００１７】
本発明はまた、ＧＰＣＲのＧタンパク質結合特異性を評価するためのパターン認識モデルを構築するための方法を特徴とする。これらの方法は、
特定のＧタンパク質結合特異性を有する多数のＧＰＣＲから学習配列を調製する工程：ここに、学習配列それぞれが、ＧＰＣＲの２以上の非隣接配列セグメントの連結を含み、該非隣接配列セグメントそれぞれが、該ＧＰＣＲの細胞内配列を含む；および
該学習配列を使用してパターン認識モデルを学習する工程を含む。
一の例においては、構築されるパターン認識モデルがＨＭＭであり、そして使用される学習配列それぞれが、学習ＧＰＣＲの４つの細胞質ゾルドメインの連結を含む。
【００１８】
本発明はさらに、ＧＰＣＲのＧタンパク質結合特異性を評価するのに好適なシステムを特徴とする。これらの方法は典型として、多数の学習配列によって学習させたパターン認識モデルを含むコンピュータまたはワークステーションを含む。該学習配列それぞれが、特定のＧタンパク質結合特異性を有するＧＰＣＲの２以上の非隣接配列セグメントの連結を含み、該非隣接配列セグメントそれぞれが、該ＧＰＣＲの細胞内配列を含む。限定されない例においては、使用されるパターン認識モデルがＨＭＭであり、学習配列それぞれが学習ＧＰＣＲの４つの細胞質ゾルドメインの連結を含む。
【００１９】
さらに、本発明は、他のタンパク質のリガンド結合特異性を評価するための方法を特徴とする。これらの方法は、
多数の学習配列を使用してパターン認識モデル（たとえば、ＨＭＭ）を学習する工程：ここに、該学習配列が、特定のリガンド結合特異性を有する学習タンパク質の群に由来するものであり、該学習配列それぞれが、学習タンパク質の２以上の非隣接配列セグメントの連結を含む;および
目的のタンパク質の２以上の非隣接配列セグメントの連結を含むクエリー配列を使用して、学習させたモデルをクエリーする工程を含む。
各学習およびクエリー配列中の連結された配列セグメント（concatenated sequence segments）は、本来のタンパク質中で同じような位置に存在する（たとえば、本来のタンパク質の多重配列アライメントにおいて同じような位置に存在する）。したがって、該クエリー配列が学習させたモデルに一致するかまたは一致しないかが、目的のタンパク質が、学習タンパク質と同じリガンド結合特異性を有するか否かを表す。このように学習させたモデルを含むシステムもまた、本発明の意図するところである。
【００２０】
本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の詳細な説明において明らかにされる。しかしながら、詳細な説明は本発明の好ましい実施形態を示しているが、例によって示されているに過ぎず、これに限定されないことを理解しておくべきである。本発明の範囲内の種々の変更および修飾は、この技術分野の当業者にとって詳細な説明から明らかであろう。
【００２１】
詳細な説明
本発明は、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質および他のタンパク質−リガンド結合特異性を予測するためにパターン認識モデルを使用する方法を特徴とする。パターン認識モデルは、特定のリガンド結合特異性を有するタンパク質に関して学習しておくことができる。完全長の配列の使用とは対照的に、学習は、各学習タンパク質における選択された配列セグメントにおいて行われる。各選択された配列セグメントは、タンパク質−リガンド相互作用の位置に存在するかもしれない、または、対応する学習タンパク質のリガンド結合特異性に寄与するかもしれない（複数の）アミノ酸残基を含む。このように学習させたパターン認識モデルは、したがって知識制限モデルである。多くの実施形態においては、各学習タンパク質において選択される配列セグメントは、学習配列を作るために連結され、そしてそれが知識制限を学習および構築するために使用される。目的のタンパク質において同じような場所に位置する配列セグメントは、クエリー配列を作るために選択され、そして連結される。したがってクエリー配列の学習させたモデルに対する全体の一致が、目的のタンパク質が学習タンパク質と同じリガンド結合優先性を有するかどうかを表す。
【００２２】
本発明に好適なパターン認識モデルとしては特に限定されず、ＨＭＭ、主成分分析法、サポートベクターマシン（support vector machines）および部分最小二乗法が挙げられる。ＨＭＭは、しばしば多重配列アライメントのために使用されるが、単一の配列における周期的なパターンを分析するために用いることもできる。Kroghら、J. Mol. Biol., 235:1501-1531 (1994)；およびEddy、Bioinformatics Review、14:755-763 (1998)を参照。一般的に言って、ＨＭＭはシンボルの秩序ある配列のための統計モデルであり、一の状態から次に遷移するたびにシンボルを生成させる確率状態マシン（stochastic state machine）として機能する。状態の間の遷移は、遷移確率によって指定される。状態遷移確率は、特定の配列の確率を得るために掛け算される。ＨＭＭの隠された局面は、状態とシンボルとの間には１対１の一致がないことである。
【００２３】
ＨＭＭの１つの利点は、ＨＭＭが正式な確率的な基礎を有することである。ＨＭＭで使用されるすべての得点パラメータは、確率論によって設定される。信頼できるアライメントが同定されていないなら、この確率的な基礎は、ＨＭＭが整列していない配列から学習しておくのを許容する。ここで使用される場合、「学習（training）」とは、モデルが学習配列において観測された変化を表すように、モデルのパラメータが選択されて、適合させられる過程をいう。多重配列アライメントに関しては、学習は、全ての学習配列に関して最もよいＨＭＭが得られるまで、状態間の遷移確率およびモデルにおける各一致状態のアミノ酸組成を最適化する工程を含んでもよい。
【００２４】
ＨＭＭの構築のために好適なプログラムとしては特に限定されず、ＨＭＭＥＲ(Washington University School of Medicine、セントルイス、MO(ミズーリ))、ＳＡＭ(Jack Baskin School of Engineering、University of California、サンタクルーズ、CA(カリフォルニア))およびＰＦＴＯＯＬＳ(The ISREC Bioinformatics Group)が挙げられる。
【００２５】
ＨＭＭＥＲは、プロファイルＨＭＭの実行である。ＨＭＭＥＲ  Ｕｓｅｒ’ｓ  Ｇｕｉｄｅ（Eddyによる、HHMI/Washington University School of Medicine、２００３年１０月)を参照、ここでは参考文献によって、その全文が含まれる。ＨＭＭＥＲの一の応用は、タンパク質ファミリーの未知のメンバーを同定することであり、そのタンパク質ファミリーは、特有のスペース（空間）または配列によって分けられる多くの保存された残基またはトポロジー（形態）を有するものである。一のフォーマットにおいては、これらの保存された残基またはトポロジーを描写するために、最初に多重配列アライメントが構築される。その後、プロファイルＨＭＭが「ｈｍｍｂｕｉｌｄ」を用いて多重配列アライメントから構築され、そして「ｈｍｍｃａｌｉｂｒａｔｅ」によって任意に較正される。較正（キャリブレーション）は、データベース検索の感度を増加させる。目的の配列は、「ｈｍｍｐｆａｍ」を使用することによってＨＭＭに対してクエリーされる。このクエリーが、各ＨＭＭに関するＥ−ｖａｌｕｅ値またはスコア値を生成する。Ｅ−ｖａｌｕｅ値およびスコア値は、目的の配列が、ＨＭＭが構築されたタンパク質ファミリーに属することの信頼性を表す。
【００２６】
Ｅ−ｖａｌｕｅ値は、ビットスコア（bit score）から計算され、このビットスコアでまたはビットスコアの上にクエリーが生成すると予想される誤検出（false positive）がいくつであるかを反映する。たとえば、０．１のＥ−Ｖａｌｕｅ値は関連がないまたは非相同的な学習配列から構築されたＨＭＭのクエリーにおいて、クエリーが等しく良好なヒットをもたらす確率が１０％であることを意味する。ロースコア（加工していないスコア）と違い、Ｅ−ｖａｌｕｅ値は、検索されるＨＭＭデータベースのサイズによって決まる。
【００２７】
ＨＭＭＥＲスコアは、クエリー配列がＨＭＭモデル（ポジティブスコア：positive score）か、または、関連がないもしくは非相同的な配列（ネガティブスコア：negative score）の帰無モデル（null model）により一致するかどうかを表す基準である。ＨＭＭデータベースにおける配列数のｌｏｇ２の上方のＨＭＭＥＲスコアは、クエリー配列が、ＨＭＭがそこから引き出されるタンパク質ファミリーの真のメンバーであるかまたは相同であることをしばしば示唆する。
【００２８】
他のパターン認識モデルも、本発明に用いることができる。これらのモデルとしては特に限定されず、主成分分析法、部分最小二乗法およびサポートベクターマシンが挙げられる。主成分分析法は、最初の変数を新しい変数（主成分またはＰＣ）の集合に転換することによってデータセットの次元を減らすテクニックである。Principal Component Analysis (Jolliffeによる、Springer、ニューヨーク、1986)を参照。ＰＣは非相関であり、整列させることができるため、ｋｔｈ  ＰＣは、すべてのＰＣの中で最も大きい変数ｋｔｈをもつ。部分最小二乗法は、多くの変数を扱うことができる予測モデルを構築するために用いられる多重線形回帰モデルの拡大である。GeladiおよびKowalski、Analytica Chimica Acta、185:1-17 (1986)を参照。サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、管理された機械学習テクニックであるIntroduction to Support Vector Machines (CristianiniおよびShawe-Taylorによる、Cambridge University Press、2000)を参照。ＳＶＭにおいては、最初の入力空間（input space）は特徴空間（feature space）と呼ばれる高次元の内積空間（dot product space）に写像し、そして、特徴空間における最適のハイパープレース（hyperplace）を、分類指標の一般化能力を最大にするように決定する。ＳＶＭに基づく分類は、構造上の誤分類の危険性を最小化するために構築され、強化された一般化特性をが得られる。
【００２９】
本発明のパターン認識モデルは、そのメンバーがその各リガンド結合特異性に基づいて異なるクラスに分けられる、どのようなタンパク質ファミリーについても学習しておくことができ、構築されうる。これらのタンパク質ファミリーの例としては特に限定されず、ＧＰＣＲ、転写因子、イオンチャンネル、キナーゼ、ホスファターゼおよびプロテアーゼが挙げられる。これらのタンパク質に好適なリガンドとしては特に限定されず、ポリペプチド、脂質、多糖類、ＤＮＡ、ＲＮＡや、それらの活性、配列、構造または他の物理的、化学的もしくは生物学的特徴に基づいて分類される他の分子が挙げられる。
【００３０】
パターン認識モデルを構築するために、既知のリガンド結合特異性を有するタンパク質は、それらそれぞれのリガンド結合優先性に基づいてグループ化される。特定のリガンド結合特異性を有するタンパク質の群それぞれは、学習させたモデルが同じリガンド結合特異性を有するタンパク質を識別して認識できるように、パターン認識モデルを学習するための学習タンパク質として使用される。
【００３１】
一の態様においては、配列セグメントを各学習タンパク質から選択することができる。これらのセグメントは、非隣接のものであり、そして少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上の残基にお互いから分けることができる。配列セグメントそれぞれは、タンパク質−リガンド相互作用の境界面に存在するかもしれない、または、対応する学習タンパク質のリガンド結合特異性に寄与するかもしれない（複数の）アミノ酸残基を含む。主にこれらの選択されたセグメントから構成される学習配列が準備され、そして本発明のパターン認識モデルを学習および構築するために用いることができる。
【００３２】
このように構築されたパターン認識モデルは、その構築中に事前情報（priori knowledge）を使用するため、知識制限モデルである。目的のタンパク質中の配列セグメントが同様に選択され、目的のタンパク質のリガンド結合特異性を予測するため学習させたモデルをクエリーするために使用される。
【００３３】
一の実施形態においては、選択された配列セグメント中のアミノ酸残基以外のすべてが、各学習およびクエリータンパク質から取り除かれる。残りのセグメントは、それぞれの学習またはクエリー配列を作り出すために連結される。一例においては、各学習またはクエリー配列は、選択されたセグメントを、それらが本来のタンパク質中においてみられる順番で連結することによって調製される。他の例においては、各学習およびクエリー配列は、選択されたセグメントを、その本来のタンパク質中のものと異なる順番で連結することによって調製される。さらに別の例においては、各選択されたセグメント中のアミノ酸残基は、学習およびクエリー配列両方で同じ配置が用いられれば、特定の方法で再配置される。
【００３４】
多くの実施形態においては、学習またはクエリータンパク質中の選択されたセグメントそれぞれの位置が、学習およびクエリータンパク質の多重配列アライメントによって決定される。多重配列アライメントは、選択された配列セグメントが、異なるタンパク質の中で構造的または機能的に関連づけられるのを許容する。この目的のための多重配列アライメントプログラムとしては特に限定されず、CLUSTLAW (Thompsonら、Nucleic Acids Res., 22:4673-4680 (1994))、CLUSTALX(Thompsonら、Nucleic Acids Res., 25:4876-4882 (1997))、MSA (Guptaら、J. Comput. Biol., 2:459-472 (1995))、PRALINE (Heringa、Comput. Chem., 23:341-364 (1999))、DIALIGN segment alignment (Morgensternら、Proc. Natl. Acad. Sci., 93:12098-12103 (1996))、MultAlin (Corpet、Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988))、PRRP progressive global alignment (Gotoh、J. Mol. Biol., 264:823-838 (1996))、SAGA genetic algorithm (NotredameおよびHiggins、Nucleic Acids Res., 24:1515-1524 (1996))、 Aligned Segment Statistical Evaluation Tool (Asset) (NeuwaldおよびGreen、J. Mol. Biol., 239:698-712 (1994))、BLOCKS (HenikoffおよびHenikoff、Nucleic Acids Res., 19:6565-6572 (1991))、eMOTIF (Nevill-Manningら、Proc. Natl. Acd. Sci., 95:5865-5871 (1998))およびthe Gibbs sampler statistical method (Lawrenceら、Science、262:208-214 (1993)およびLiuら、J. Am. Stat. Assoc., 90:1156-1170 (1995))が挙げられる。本発明において使用される多重配列アライメントは、グローバルアライメント（大域アライメント：global alignment）、ローカルアライメント（局所的アライメント：local alignment）またはこれらの組合せであってもよい。本発明に関しては、他の型の配列アライメントアルゴリズムを用いることもできる。
【００３５】
限定されない例においては、学習およびクエリータンパク質の多重配列アライメントを提供するためにＴ−Ｃｏｆｆｅｅを使用する。Ｔ−Ｃｏｆｆｅｅは、テストにおける配列の系統的な幅（広がり）から独立したアライメント情報のライブラリを提供する配列アライメントモデルである(Notredameら、J. Mol. Biol., 302:205-17 (2000))。累進マルチプルアライメントの各段階が実行される間に、このライブラリの情報は、すべての対の分析を可能にし、その結果、精度を増加させるために、グローバルおよびローカルペアワイズ（pair-wise）アライメント両方を提供する。このモデルの精度は、比較される２つの配列のみを用いる代わりに、ライブラリのすべての情報を用いることができる能力によるものである。
【００３６】
タンパク質の機能、構造またはトポロジーを予測するためのプログラムまたはアルゴリズムも、学習またはクエリータンパク質それぞれにおいて適当なセグメントを選択するために使用することができる。数多くのタンパク質の分類または構造予測プログラムを用いることによって、全く異なるまたは保存された一次、二次または三次構造を有するタンパク質ドメインを同定することができる。この目的のために好適なプログラムとしては特に限定されず、eMOTIF (Nevill-Manningら、上記)、DIP (Xenariosら、Nucleic Acids Res., 28:289-291 (2000))、HOMSTRAD (Mizuguchiら、Protein Sci., 7:2469- (1998))、HSSP (Dodgeら、Nucleic Acids Res., 26:313-315 (1998)); NetOGly (Hansenら、Nucleic Acids Res., 25:278-282 (1997))、Pfam (Sonnhammerら、Nucleic Acids Res., 26:320-322 (1998))、PIR (Barkerら、Methods Enzymol., 266:59-71 (1996))、PSORT (ウェブサイト「psort.nibb.ac.jp」)、SMART (Schultzら、Proc. Natl. Acad. Sci., 95:5857-5864 (1998))、TargetDB (WeiおよびO'Connell、Bioinformatics、15:765-766 (1999))、the environmental template method (Bowieら、Methods Enzymol., 266:598-616 (1996);およびJohnsonら、Methods Enzymol., 266:575-598 (1996))、the contact potential method (Sippl、J. Mol. Biol., 213:859-883 (1990);およびAlexandrovら、Pac. Symp. Biocomput., 1996:53-72 (1996))、the discrete-space model (Stultzら、Adv. Mol. Cell Biol., 22B:447-506 (1997);およびWhiteら、Math. Biosci., 119:35-75 (1994))およびthe nearest-neighbor method (SalamovおよびSolovyev、J. Mol. Biol., 247:11-15 (1997); および、FrishmanおよびArgos、Proteins, 27:329-335 (1997))が挙げられる。National Center for Biotechnology Information (NCBI)（ベセスダ（Bethesda）、ＭＤ）によって提供される「保存されたドメインのデータベースおよび検索サービス（The Conserved Domain Database and Search Service）」も使用することができる。「The Conserved Domain Database」は、ＣＯＧ（Tatusovら、Science, 278:631-637 (1997)）のような他の出所からの貢献だけでなく、ＳＭＡＲＴおよびＰｆａｍ由来のドメインを含む。「The Conserved Domain search」は、クエリー配列が、基礎となる保存されたドメインアライメントから準備された位置特異的スコアマトリックスと比較される、逆位置特異的ＢＬＡＳＴ（reverse position-specific BLAST）アルゴリズムを使用する。
【００３７】
一の実施形態においては、学習またはクエリータンパク質の細胞膜トポロジーを予測するためにＴＭＨＭＭ(Kroghら、J. Mol. Biol., 305:567-580 (2001))を用いる。ＴＭＨＭＭは、ＨＭＭに基づくタンパク質トポロジー予測方法である。この方法は、疎水性、電荷の偏り、ヘリックスの長さおよび文法的制約（grammatical constrain）をＨＭＭモデルに組み入れる。
【００３８】
他の実施形態においては、ＴＭＨＭＭに見落とされる膜貫通型へリックスを予測するために、ＴｏｐＰｒｅｄが使用される。ＴｏｐＰｒｅｄは、真核生物および原核生物のタンパク質のトポロジーを予測するために設計されたプログラムである(ClarosおよびHeijne、Comput. Appl. Biosci., 10:685-686 (1994))。疎水性のプロファイルおよび膜貫通型のセグメントも、このプログラムから計算される。真核生物のタンパク質に関して、膜貫通型タンパク質のトポロジーを決定するために３つの基準がある：（１）膜の２つの側の間の正に荷電した残基の違い；（２）最もＮ末端にある膜貫通型セグメントに隣接する１５のＮ末端およびＣ末端残基の間の正味の電荷の違い；および（３）組成的距離法（compositional distance method）によって分析された６０より長い残基のループの全アミノ酸組成。
【００３９】
多くの例において、本発明はＧＰＣＲのＧタンパク質結合特異性を予測することができるパターン認識モデルを特徴づける。実験的な証拠は、ＧＰＣＲの細胞内ループおよびカルボキシ末端がＧタンパク質への結合に関与し、また、膜貫通型へリックスの細胞質末端がＧタンパク質の認識および活性化に寄与することを示唆している。４つの細胞質ゾルドメインのすべての可能な組み合わせの網羅的列挙を使用するパターン認識モデルは、おそらくあまりに多くの変数を与えるであろう。そのようなモデルはまた、狭く学習され、したがって、帰納する能力が制限されているかもしれない。
【００４０】
４つの細胞質ゾルドメイン（細胞内ループおよび膜貫通型へリックス細胞質末端を含む）を連結することによって、得られた連結ドメインにおいて配列プロファイルが構築され、Ｇタンパク質結合特異性を予測するためのディスクリミネータ（discriminator）として役立つ。このようなアプローチは、もしあるならば、２つ以上の細胞内ループを越えて広がる配列特性を得る。さらに、短い保存された配列パターンまたはモチーフ(たとえば、ただ１つの細胞質ゾルドメイン)と一致すると、ある場合には有益で適切であるかもしれないが、より長い配列（すなわち４つの連結された細胞質ゾルドメイン）と一致すると、一般的により特徴的で信頼性がある。実施例に示すように、ＧＰＣＲの連結された細胞質ゾルドメイン、それぞれＧｉ／ｏ、Ｇｑ／１１またはＧｓクラスに基づいて３つのＨＭＭが構築された。４つの異なるユニットと対照的に、各学習タンパク質を表すために連結された配列を使用すると、ＨＭＭ状態空間をかなり減少させる。このように構築されたＨＭＭは、少なくとも精度９５％でＧタンパク質結合特異性を予測するために用いられた。
【００４１】
本発明はまた、ＧＰＣＲの活性を調節するドラッグ候補をスクリーニングするための方法を特徴とする。本発明の典型的なスクリーン方法は、（１）本発明のパターン認識モデルを使用して目的のＧＰＣＲのＧタンパク質結合特異性を予測する工程；および（２）もし作用物質がＧＰＣＲと予測されたＧタンパク質との間の相互作用、または、ＧＰＣＲによって媒介される（複数の）シグナル伝達経路を調節することができるなら、作用物質をＧＰＣＲに接触させる工程、を含む。この目的のために好適なアッセイ方法としては特に限定されず、組換え型細胞ベースのアッセイ、競争阻害スクリーンおよび生化学的アッセイが挙げられる。
【００４２】
組換え型細胞ベースのアッセイは、ＧＰＣＲまたはそれらの結合したＧタンパク質によって媒介されるインビボの（複数の）シグナル伝達経路を模倣することができる発現系を使用する。この目的のために好適な発現系としては特に限定されず、酵母、哺乳類の細胞、昆虫細胞または両生類細胞が挙げられる。競争阻害スクリーンは、作用物質が目的のＧＰＣＲから結合したリガンドを交換する能力を測定する。このスクリーンは、ＧＰＣＲへのリガンド結合を阻害する能力を有する作用物質を同定するために使用することもできる。生化学的アッセイは、目的のＧＰＣＲによって媒介されるシグナル伝達経路を活性化または不活性化する作用物質の多量のライブラリを選別するために好適である。生化学アッセイの例として、目的の作用物質の存在下または不在下におけるＧＰＣＲのＧタンパク質への結合の評価が挙げられる。適当なアッセイ方法や発現系を選択することは、この技術分野において通常の技能水準の範囲内での通常の設計事項である。このように同定された作用物質は、低分子、ペプチド、オリゴ糖、脂質またはこれらの組合せなどのどのような種類の分子であってもよい。
【００４３】
本発明によって同定されたＧＰＣＲモジュレーターは、癌、アレルギー、糖尿病、肥満症、循環器機能障害、うつ病および種々の中枢神経系障害のようなＧＰＣＲに関連する疾患を治療するための医薬組成物に処方されうる。本発明の医薬組成物は、治療上有効な量のＧＰＣＲモジュレーターおよび医薬上許容される担体（キャリア）を含む。好適な医薬上許容される担体としては特に限定されず、溶媒、溶解剤、賦形剤、安定剤、結合剤（バインダー）、吸収剤、塩基、緩衝剤、潤滑剤、徐放媒体、希釈剤、乳化剤、湿潤剤、潤滑剤、分散媒、コーティング、抗菌性または抗真菌性剤、等張剤および吸収遅延剤などの医薬投与に適合するものが挙げられる。医薬的に活性な物質のために、このような媒介物や物質を使用することは、当該技術分野において公知である。補充性の物質を組成物に混合することもできる。
【００４４】
本発明の医薬組成物は、意図される投与の経路に適合するように処方される。投与の経路の例としては、非経口的、静脈内、皮内、皮下、経口、吸入、経皮、直腸、経粘膜、局所的および組織的投与が挙げられる。一例においては、投与は移植片（インプラント）によって行われる。
【００４５】
本発明の医薬組成物は、所望される投与量で患者または動物に投与される。好適な投与量としては、たとえば、５ｍｇから１００ｍｇ、１５ｍｇから８５ｍｇ、３０ｍｇから７０ｍｇ、４０ｍｇから６０ｍｇの範囲である。５ｍｇ未満または１００ｍｇを超える投与量とすることもできる。医薬組成物は、一用量または複数用量で投与することができる。投与量は、１日１回、週１回、または月１回のような間隔で投与することもできる。
【００４６】
ＧＰＣＲモジュレーターの毒性および治療上の効果については、細胞培養または実験動物モデルにおいて、標準的な製薬の手順によって決定することができる。たとえば、ＬＤ５０（個体数の５０％に致死的な投与量）およびＥＤ５０（個体数の５０％で治療上有効な投与量）を決定することができる。毒性および治療上有効な間の投与量の比率が治療指数であり、比率ＬＤ５０／ＥＤ５０として表される。多くの場合、大きな治療指数を示すＧＰＣＲモジュレーターが選択される。
【００４７】
細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータを、ヒトに使用するための投与量の範囲を処方する際に使用することができる。一の実施形態においては、投与量はほとんど毒性がないか毒性が全くないＥＤ５０を示す循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用された剤形や利用された投与ルートによって、この範囲内で変化させることができる。
【００４８】
本発明によって同定されたＧＰＣＲモジュレーターの投与に関する投与計画は、ＧＰＣＲモジュレーターの作用、病理の部位、疾患の重症度、患者の年齢、性別および食事制限、炎症の重症度、投与回数および他の臨床上の因子のような種々の因子に基づいて、治療を行う医師によって決定される。一例においては、組織的なまたは注入可能な投与は、最小限に効果的な量で開始され、そして明白な効果が観察されるまで、予め選択されたタイムコースの間投与量が増やされる。次に、現れるであろうどのような有害な作用も考慮に入れるが、効果において相当する増加が得られるレベルに制限しながら、投与量において追加の増加がなされる。
【００４９】
治療の経過は、疾患の経過を定期的に評価することによってモニターすることができる。経過は、たとえば、Ｘ線、ＭＲＩもしくは他の画像様式、関節液の分析または臨床上の検査によってモニターすることができる。
【００５０】
さらに、本発明はＧＰＣＲ−Ｇタンパク質または他のタンパク質−リガンド相互作用特異性を予測することができるシステムを特徴とする。このシステムは、本発明のパターン認識モデルを含むコンピュータまたはワークステーションを含む。パターン認識モデルは、知識制限モデルであり、学習タンパク質の選択された配列セグメントによって学習される。一の実施形態においては、パターン認識モデルが、オーファンＧＰＣＲのＧタンパク質結合特異性を予測することができる知識制限ＨＭＭである。
【００５１】
上述した実施形態および以下の実施例は、例示に過ぎず、これに限定されるものではないことを理解すべきである。本記載から、当該技術分野における当業者にとって、本発明の範囲内で種々の変更および修飾がなされることは明らかである。
【実施例】
【００５２】
実施例１    データセットおよびＨＭＭ
実験的にＧタンパク質結合特異性を決定した１０２のＧＰＣＲのセットが選択された。ＧＰＣＲのＧ１２／１３クラスは、この実験には含まれない。容易にするために、結合において無差別であることが知られているＧＰＣＲは、このセットに含まれない。３のサブセット、それぞれ４９、３４および１９配列を含むＧｉ／ｏ、Ｇｑ／１１またはＧｓクラスに関する多重配列アライメントが、アライメントの手動のキュレーションによって行われるＴ−Ｃｏｆｆｅｅを用いて生成した。これらのタンパク質の膜貫通（ＴＭ）へリックスを、ＴＭＨＭＭ（Kroghら、J. Mol. Biol., 305:567-580 (2001)）を用いて予測し、これらのタンパク質に予測されるＴＭへリックスが７より少ない場合には、ＴＭＨＭＭに見落とされたＴＭへリックスを予測するためにＴｏｐＰｒｅｄ（ClarosおよびHeijne、上掲）を使用した。細胞外のループおよび各ＴＭへリックスの細胞質ゾル末端の２残基以外の予測されたＴＭへリックスを表す配列のブロックは、多重配列アライメントから除かれ、細胞質ゾルドメインと呼ばれるアミノ酸残基が残された。Ｅ／ＤＲＹ／Ｆ  ｂｏｘ  (Wess、Pharmacol. Ther., 80:231-264 (1998))が存在すると、これはＴＭへリックス予測とは関係なくｉ２に含まれるため、ＴＭへリックス３の切除には特別な注意が払われた。多重配列アライメントは、低密度のカラムおよび単純な繰り返しパターンを含むカラムを除くことによってさらに変更された。このように、細胞質ゾルドメイン（ｉ１、ｉ２、ｉ３およびｉ４に加えて、対応するＴＭへリックスの細胞質ゾル末端）の連結(鎖状体)の多重配列アライメントが得られ、ＨＭＭを構築し、較正するためにＨＭＭＥＲ２．２パッケージと共に使用された。
【００５３】
テストセットのために、予測された細胞質ゾルドメインも抽出され、学習セットと同じ順番で連結された。この連結された配列が、ＨＭＭの集団に対してＧＰＣＲ配列が一致するかを調べるためにＨＭＭＥＲ２．２パッケージの「ｈｍｍｐｆａｍ」のためのクエリー配列として使用された。
【００５４】
各サブセットからの配列の３分の２が学習セットとしてランダムに選択され、残りの３分の１はテストセットとして用いられた。学習セットに１度より多く含まれる配列はなかった。Ｇｉ／ｏ、Ｇｑ／１１またはＧｓクラスに関するＨＭＭが学習セットを用いて構築され、混合のテストセットがクエリー配列として使用された。学習セットおよびテストセットをランダムに選択し、モデルを構築ならびにモデルを適合（マッチング）するこの工程は、１００回繰り返され、平均で各タンパク質あたり３２の結合予測をもたらした。
【００５５】
テストＧＰＣＲ配列（すなわち、その予測された細胞質ゾルドメインの連結）は、Ｇｉ／ｏ、Ｇｑ／１１およびＧｓクラスに関して構築されたＨＭＭに対して「ｈｍｍｐｆａｍ」を使用して適合された。単純なＥ−ｖａｌｕｅ値を基にした方法においては、Ｅ−ｖａｌｕｅ値の限界が１．０である最もよい一致（最も低いＥ−ｖａｌｕｅ値）を有するクラスに特異的であると予測される。判別関数に基づくより強い分析が、以下に記載するように行われた。
【００５６】
実施例２  判別分析
判別分析は、スコアが割り当てられたＨＭＭに基づく誤分類の割合を算定するために使用された。スコアＳｉ、ＳｑおよびＳｓの平均が、各配列に関して計算された。スコアＳｉ、ＳｑおよびＳｓは、それぞれＧｉ／ｏ、Ｇｑ／１１およびＧｓ特有のＨＭＭに対してＨＭＭＥＲによって割り当てられたスコアであった。平均スコアのデータセットが、判別関数分析（discriminant function analysis）に使用された。
【００５７】
空間Ωで定義される２つのクラスＡ１およびＡ２の単純な例を考える場合、各クラスＡｉは、密度関数ｆｉおよび事前確率πｉを有する。分類の問題を解決することは、観測がＲｉの中にあると、それがクラスＡｉに由来するとして分類されるようにΩを領域Ｒ１およびＲ２に分割する境界を見つけることである。その目的は、誤分類の全体の確率を最小化限にすることである。
【数１】
2008506120.tif 000002
上の公式を書き直すと、
【数２】
2008506120.tif 000003
確率は、Ｒ１でπ２ｆ２＜π１ｆ１となるポイントを含め、Ｒ１からπ２ｆ２＞π１ｆ１となるポイントを除外することによって最小にされる。密度の連続は、Ｒ１およびＲ２の間の境界がπ１ｆ１＝π２ｆ２によって決定されることを暗示する。２つの密度が、クラス内に共通の共分散マトリックスを有する多変量正規であると、境界は線形判別関数へ減少される。２つの密度が、クラス内に異なる共分散マトリックスを有する多変量正規であると、それは二次判別関数に減少される。２以上のクラスを有する場合についても、同じ結論が一般化される。
【００５８】
判別分析のために、Ｇｉ／ｏ、Ｇｑ／１１およびＧｓクラスにおいてそれぞれ４９、３２および１８の配列を有する９９の配列のデータセットが考えられた。複製データのない配列は、除外された。複製の数は、１５から４８の範囲だった。２，０００の反復のそれぞれで、データセットをそれぞれ６６および３３のサイズを有する学習セットとテストセットとにランダムに分割した。二次判別関数を学習セットに基づいて開発し、テストセットに適用した。各クラス内で、平均スコアのベクトルが多変量正規分布を有しており、各クラスがそのクラス内に共分散マトリックスを有していると想定された；そしてさらに、クラスの事前確率が等しくなるように選択された。データ分析のためにＳＡＳ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．２  (SAS Institute Inc., Cary、NC)、特に判別分析のためにｐｒｏｃ  ｄｉｓｃｒｉｍが使用された。
【００５９】
実施例３  ＧＰＣＲの結合特異性の予測
ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質結合を予測するためのモデルを構築し、確認するために、細胞質ゾルドメイン内でそれぞれ２６％、２２％および２４％の平均配列相同性を有する、ＧＰＣＲ配列の４９のＧｉ／ｏクラス、３４のＧｑ／１１クラスおよび１９のＧｓクラスが使用された。これらのセットの中の配列の最も関連がある対は、９５％、８２％および７２％の相同性を有しており、最も関連のない対は、Ｇｉ／ｏ、Ｇｑ／１１およびＧｓクラスの細胞質ゾルドメインの中で８％、４％および１１％の相同性を有していた。学習およびテストセットの分離において偏見を避けるために、学習およびテスト配列はランダムに選択され、そして反復の間で２つのセットの内容（コンテンツ）をダイナミックに変えるために、工程を１００回繰り返した。このように各反復において各クラスあたり１つ、３つのＨＭＭ、および、学習セットに何も含まないものだけでなく、すべての３つのクラスからの配列を含む学習セットが作られた。これらの１００回の反復の間、Ｇｉ／ｏ、Ｇｑ／１１、およびＧｓクラスに属する配列は、ＨＭＭに対してそれぞれ全部で１，６００、１，１００および６００回テストされた。１００回の反復で生成したデータセット全体のグラフ表示を図１に示す。Ｇｉ／ｏ結合ＧＰＣＲは全て、Ｇｉ／ｏ特異的ＨＭＭ（「Ｉスコア」）に対して高いスコアだったが、Ｇｑ／１１特異的（「Ｑスコア」）およびＧｓ特異的（「Ｓ  Ｓスコア」）ＨＭＭに対して低いスコアだったことが図１から明らかである。同様に、Ｇｑ／１１およびＧｓ結合ＧＰＣＲは、それらの各クラスに特異的なＨＭＭに対して高いスコアであり、異なるクラスに特異的なＨＭＭに対して低いスコアであった。
【００６０】
未処理の予測（raw prediction）も表１、２および３に示す。知識制限ＨＭＭは、Ｇｉ／ｏ結合ＧＰＣＲ配列の場合において最もよい結果であった。この場合、間違った予測がただ１つの場合だけ、ＥＤＧ２によって報告された。Ｇｑ結合ＧＰＣＲについて、少なくとも１回誤分類されたＧＰＣＲが２つ−すなわちＭＧＲ１およびＭＧＲ５−だけあった。最終的に、Ｇｓファミリーについて３つの起こりうる誤分類、すなわちＦＳＨＲ、ＰＩ２ＲおよびＶ２Ｒがあった。このように、単に１つの予測を用いることによっても、誤分類の機会は比較的少ない。種々のクラスの間の分類がされる強健さを推定するために、実施例２に記載されている判別分析が行われた。０．００２１の誤り率に等しい１３６の誤分類が確認された。
【００６１】
知識制限ＨＭＭの利点を評価するために、完全長の配列の多重配列アライメントを使用してＨＭＭを作り、それから完全長のクエリー配列を使用してテストした。知識制限ＨＭＭの高い精度と対照的に、完全長のＨＭＭおよび完全長のクエリー配列によってなされた予測は、誤りがちなものであった。
【００６２】
図２Ａおよび２Ｂは、それぞれメラノコルチン３受容体（ＭＣ３Ｒ）および卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に関して、Ｇｓ、Ｇｉ／ｏおよびＧｑ／１１特異的ＨＭＭに対して得られたＥ−ｖａｌｕｅ値を示すレーダープロットである。Ｇｓ特異的ＨＭＭに対して非常に低いＥ−ｖａｌｕｅ値を有するＭＣ３Ｒの結合特異性に関して、一致した判定があることが、図２Ａからわかった。また、Ｇｓ特異的ＨＭＭに対して得られたＥ−ｖａｌｕｅ値と、Ｇｉ／ｏおよびＧｑ／１１特異的ＨＭＭに対して得られたＥ−ｖａｌｕｅ値との間に、重大な違いがある。ＦＳＨＲの場合、モデルの大部分はＦＳＨＲがＧｓ結合であると予測したが、判定は一致しなかった（図２Ｂ）。図２Ｂに描写されるように、Ｇｓ、Ｇｑ／１１およびＧｉ／ｏ特異的ＨＭＭのそれぞれに対するＦＳＨＲのＥ−ｖａｌｕｅ値は、わずかに重なっており、クラスの間で極端に異ならない。これらの２つのプロットは、Ｇタンパク質結合を予測する試みにおいて観察された変動の種類を表す。
【００６３】
Ｅ−ｖａｌｕｅ値に基づく１，６００の予測のうち、タンパク質のＧｉ／ｏクラスにおいて１つ誤った予測があった（表１）。リゾホスファチジン酸受容体（ＥＤＧ２、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：Ｑ９２６３３）は、異なるＨＭＭに対して２４回テストされ、１度Ｇｓ結合として誤分類され、２３回はＧｉ／ｏ結合として正確に分類された。判別関数も、６３１回の試みにおいて２回ＥＤＧ２を誤分類した。
【００６４】
【表１】
2008506120.tif 000004
【００６５】
【表２】
2008506120.tif 000005
【００６６】
表２から分かるように、受容体のＧｑ／１１クラスに対するＥ−ｖａｌｕｅ値に基づく１，１００の予測全体において、１２の誤分類があった。１２の誤分類は全て、代謝調節型グルタミン酸受容体１前駆体（ＭＧＲ１、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：Ｑ１３２５５）または代謝調節型グルタミン酸受容体５受容体（ＭＧＲ５、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：Ｐ４１５９４）のどちらかに関するものだった。ＭＧＲ１前駆体は、テストセットに２７回含まれた；Ｇｉ／ｏ結合として３回分類され、７回はＥ−ｖａｌｕｅ値＜１．０で３つのどのモデルに対しても一致せず、残りの１７回は、正確に分類されなかった。ＭＧＲ５がテストされた２６回のうち、正確な分類が１５回なされたが、３回はＧｉ／ｏ結合として、１回はＧｓ結合として分類され７回はＥ−ｖａｌｕｅ値＜１．０で３つのどのモデルに対しても一致しなかった。ＭＧＲ１およびＭＧＲ５は、データポイントが不十分であるため判別分析に含まれなかった。
【００６７】
タンパク質のＧｓクラスに対するＥ−ｖａｌｕｅ値に基づく６００の予測のうち、１３が誤りであった；全ての誤りは、３つの配列−すなわちＦＳＨＲ、Ｖ２ＲおよびＰＩ２Ｒだけであった（表３）。卵胞刺激ホルモン受容体前駆体（ＦＳＨＲ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：Ｐ２３９４５）は、２０回正確に分類されたが、６度Ｇｉ／ｏ結合として間違って分類された（表３および図１Ｂ）。予想されたように、判別関数も６６５の試みのうち１１５においてＦＳＨＲを誤分類した。同様に、Ｅ−ｖａｌｕｅ値に基づいて、バソプレッシンＶ２受容体（Ｖ２Ｒ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：Ｐ３０５１８）は２８回正確に分類されたが、６度Ｇｑ／１１結合として間違って分類された。Ｖ２Ｒに関して、判別分析における誤り率は、６９２の試みのうち１５であった。プロスタサイクリン受容体（ＰＩ２Ｒ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：Ｐ４３１１９）は、２８の試みのうち２７では正確に分類され、１度Ｇｑ／１１クラスに間違って入れられた。プロスタグランジンＥ２受容体（ＰＥ２４、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：Ｐ３５４０８）およびＰＩ２Ｒは、判別関数によってそれぞれ６６２のうち１および６８１のうち２の誤り率で誤分類された。プロスタグランジンＤ２受容体（ＰＤ２Ｒ、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ：Ｑ１３２５８）は、Ｇｉ／ｏおよびＧｑ／１１スコアにおけるデータポイントが不十分であるため、判別分析に含まれなかった。
【００６８】
【表３】
2008506120.tif 000006
【００６９】
【表４】
2008506120.tif 000007
【００７０】
【表５】
2008506120.tif 000008
【００７１】
ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質結合予測に関する実施例について、以下のことが推定される：  （１）共に細胞質ゾルドメインと呼ばれる細胞内ループおよび膜貫通セグメントの細胞質ゾル末端は、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質結合の特異性に寄与するらしい；（２）ＧＰＣＲの一次構造中のＴＭ配列および／または細胞外ループによって中断されるのだが、アミノ酸の連続した配列として扱われる４つの細胞内セグメント（ｉ１、ｉ２、ｉ３およびｉ４）は、結合ドメインの特徴を取り込む隠れマルコフモデルを構築するための適切な枠組みを提供する；（３）モデルとＧＰＣＲ配列との間の一致を決定するとき、細胞質ゾルドメインが抽出され、完全な配列の代わりにクエリーとして使用される。配列類似性がＧタンパク質結合特異性を予測できるという仮定は、Ｗｏｎｇ、Ｎｅｕｒｏｓｉｇｎａｌｓ、１２：１−１２（２００３）によってはっきり述べられたある議論と矛盾するように思われる。Ｗｏｎｇの仮説によると、Ｇタンパク質の選択性はＧＰＣＲの細胞内領域の立体配置によって定められ、この立体配置は、複数の細胞内領域間の相互作用によって調節される。さらに、Ｇタンパク質結合選択性は、一般的な「活性化ドメイン」および特定の「選択ドメイン」の組合せの結果によるものであると考えられていた。上記のＷｏｎｇを参照。ＧＰＣＲに対してコンセンサス（共通）Ｇタンパク質結合モチーフを見つけることができないのは、「コンセンサス（共通）モチーフ」が２以上の細胞内領域から構成されているためであり、このようなモチーフを同定する以前に行われた多くの試みは、４つの細胞内領域が分離していると考えていた。
【００７２】
タンパク質をＧｉ／ｏ、Ｇｑ／１１およびＧｓクラスに分類するために、２つの試みが行われた：（１）単純な、最もよいＥ−ｖａｌｕｅ値に基づくアプローチ；および（２）Ｅ−ｖａｌｕｅ値よりも、ＨＭＭに割り当てられたスコアを使用する判別関数に基づくアプローチ。Ｅ−ｖａｌｕｅｓ値はそのスコアから引き出されるので、両方の結果は、予想されたように同じような結果を与えた。連結された細胞質ゾルドメインの配列が、ＧＰＣＲをそれらの結合優先性によって正確に分類するための十分なシグナルを与えることができることは、表１、２および３に表されたデータから明らかである。この実施例に示されるように、１００回以上繰り返す予測体系の誤り率は、１．００％未満であった。連結された細胞質ゾルドメインの代わりに、完全長の配列を学習およびテスト配列として使用すると、誤り率はＧｉ／ｏ、Ｇｑ／１１およびＧｓクラスそれぞれに関して６％、２７％および４１％であり、全体の誤り率は１９％であった。完全長の配列を使用したときに観察されたこの高い誤り率は、生物学のための改良された計算道具を開発するにおいて、生物学的直感を利用することの利点、この場合仮定された適切な断片を用いることの利点を明白にする。
【００７３】
ＨＭＭや人工的な神経網のような計算道具は、データにおけるパターンを見つけるために構築される。それらは大概見事に働くが、モデルはしばしば、パターン検出ツールがとにかくそれを見つけるという仮定のもとに、データ中の公知のパターンを意識的に無視する。タンパク質配列の場合には、全く異なる理由で、異なるポジションに異なるパターンが存在するかもしれない。ＧＰＣＲについては、膜貫通セグメントは疎水性で、細胞外ドメインおよび膜貫通セグメントは、非Ｇタンパク質リガンド特異性に関するパターンを保持し、細胞内ドメインがＧタンパク質特異性に関するパターンを保持している。疎水性および非Ｇタンパク質リガンド特異性は、Ｇタンパク質特異性と関係がないので、ＨＭＭにこれらの配列を含めると、パターンの希釈化またはより弱いＨＭＭを導く。モデルの構築およびテストのために完全長の配列を使用したことから分かった高い誤り率は、この分析を支持する。
【００７４】
この実施例に記載されたＧＰＣＲ−Ｇタンパク質結合予測戦略は、いくつかの受容体の例において曖昧さを示す。隠れマルコフモデルによって一致して分類されなかった配列について、ＥＤＧ２は、Ｇｉ／ｏクラスの孤立した（lone）メンバーであった（表１）。ＥＤＧ２がＧｉ／ｏ、Ｇｑ／１１およびＧ１２／１３と結合できるという徴候はある。表２は、Ｇｑ／１１クラスの２つのタンパク質ＭＧＲ１およびＭＧＲ５の結合予測が不明確であることを示す。ＭＧＲ１によるＧｓ結合およびＧｉ／ｏ結合ＭＧＲ１に関する実験的な証拠は存在する。ＭＧＲ１−Ｇｉ／ｏ結合は、２７モデルのうちの３つによって予測されたが、この研究において使用された閾値よりＥ−ｖａｌｕｅ値が高いため、２７モデルのうちの７つでは同じ受容体に関する予測は出なかった。ＭＧＲ５に関する結合予測も、モデルの大多数はそれがＧｑ／１１クラスと予測したが、一致しなかった。Ｇｓ結合ＦＳＨＲは、２６モデルのうちの６つによってＧｉ／ｏクラスに属すると予測された（表３、図２ｂ）。ＣＨＯ細胞内におけるアデニリルシクラーゼおよびホスホリパーゼＣカスケードの両方へのＦＳＨＲの結合が示唆されたが、しかし知識制限ＨＭＭによる予測と対照的に、まだＧｉ／ｏ媒介応答に関する証拠が全くない。Ｇｓ結合プロスタサイクリン受容体ＰＩ２Ｒが２８モデルのうちの１つによってＧｑ／１１に属すると予測された（表３）。この受容体は、Ｇｓに加えてＧｑ／１１に結合することが示唆された。Ｖ２バソプレッシン受容体Ｖ２Ｒは、３４モデルのうちの６つによってＧｑ／１１に結合すると予測された別のＧｓ結合タンパク質である。Ｖ２Ｒの第二の細胞内ループでただ１個のアミノ酸を置換（Ｍ１４５Ｌ）すると、Ｇｑ５への実質的な結合を示すのに十分であった。バソプレッシン／オキシトシン受容体ファミリーの他メンバーはＧｑ／１１に選択的に結合し、このメチオニンに対応する位置にロイシンを有する（Ｍ１４５）。
【００７５】
現在、ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質結合における無差別さは、１８の受容体に関して確立されている。より多くの細胞型、生理学的状態および受容体が研究されると、より多くの受容体がこの無差別なグループに加わるであろうと思われる。Ｇタンパク質結合のベイズ理論による分類体系は、変動セットに含まれる５５の受容体のうちの３５に関して無差別を予測した。前で述べたように、本研究において選択された１０２の受容体は、どれもＧ結合において無差別でないと考えられている。しかしながら、いくつかのモデルは、少ない断片にも関わらず、１０２の受容体のうちの６つに関して無差別であることを示唆し、そしてこの６つの受容体のうちの４つは、無差別であることが示唆または示された。ＦＳＨＲがＧタンパク質結合において無差別であるかもしれないことを示唆する例を図２ｂに示す。曖昧な予測は、インシリコ（in silico）人為産物のように捨てられるよりむしろ、代わりのＧタンパク質結合および下流のシグナルプロセシングを探索するさらなる実験のための出発点となるかもしれない。
【００７６】
ＧＰＣＲ−Ｇタンパク質結合に影響を与えかもしれないが、この文書に記載される予測体系によって考慮されない因子の中の１つが、受容体の翻訳後修飾である。
【００７７】
受容体のＧｑ／１１およびＧｓクラスの比較的少数の配列が、モデルの構築のために利用可能である；これは、これらのクラスに関する予測能力に悪い影響をもっているかもしれない。この実施例において記載される方法は、学習セットが最も小さいＧｓクラスに関して誤り率が最も高く、学習セットが最も大きいＧｉ／ｏクラスに関して誤り率が最も低い。Ｇｑ／１１およびＧｓクラスにおける誤り率と比較した場合のＧｉ／ｏクラスにおけるより低い誤り率は、学習セットのサイズの影響を表しているかもしれず、低い率での予測を可能とするＧｉ／ｏクラスのより判別または限定的なプロファイルのためではない。この実施例の予測方法の感度および選択性は、より大きい学習セットを利用できることによって改良されるであろう。このように、より多くのデータを利用できるようになると（全ての特異性に関してだけではなく無差別に）、より良好な予測性能を有する改良された知識制限ＨＭＭが本発明によって構築されるであろう。
【００７８】
コンピュータを利用した生物学の多くの状況において、ＨＭＭの知識制限または他のパターン認識ツールが豊かな報酬を与えるかもしれないことが期待される。受容体をオーファンでなくすること（deorphaning）は、ＧＰＣＲの理解における重要なマイルストーンである。よく似た細胞外リガンドに結合する多くのＧＰＣＲが知られているとき、同様の特異性を有する他のＧＰＣＲを、細胞外ドメインのみを用いる知識制限ＨＭＭを用いて同定することが可能である。他の例は、ＭＨＣペプチド結合であり、そこでは結合窩（binding groove）配列だけがＭＨＣのペプチド選択性に重大な影響を与えると推定されている。ペプチド結合特異性の比較的コンパクトなモデルを得るために、まさにＭＨＣペプチド結合窩だけのＨＭＭを構築することが可能である。
【００７９】
生物学的モデルを構築する際の知識制限の原理は、ＨＭＭ以外の方法に適用することができる。たとえば、主成分分析（ＰＣＡ）、部分最小二乗法分析（ＰＬＳ）およびサポートベクターマシン（ＳＶＭ）も、ＧＰＣＲの分類のために同様に使用することができる。
【００８０】
本発明の上述の記述は、実例および記述を提供するが、本発明を開示されたその範囲に徹底または限定しようとするものではない。上記の技術と矛盾しない修飾や変更は可能であり、また、本発明の実施から得ることができる。このように、本発明の範囲が請求項およびその同等物によって定められることが分かる。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
図面は説明のために提供されるが、これに限定されるものではない。
【図１】図１は、判別分析で使用された平均スコアのデータセットを示し、ここでＩ、ＱおよびＳスコアは、それぞれＧｉ／ｏ、Ｇｑ／１１およびＧｓクラスを表す。
【図２Ａ】図２Ａは、実施例３に記載されたモデル構築およびテスト工程の間に得られたＥ−ｖａｌｕｅ値のレーダープロットを図示するものであり、ここでプロットの範囲は、モデルの１の評価を表す各放射軸と共に、メラノコルチン３受容体（ＭＣ３Ｒ）に関して観察されたＥ−ｖａｌｕｅ値に相当する。テストタンパク質は、テストセットに３３回含まれ、したがって放射軸は１−３３の番号が付けられる。
【図２Ｂ】図２Ｂは、実施例３に記載されたモデルの構築およびテスト工程の間に得られたＥ−ｖａｌｕｅ値の他のレーダープロットを描写するものであり、ここでプロットの範囲は、モデルの１の評価を表す各放射軸と共に、卵胞刺激ホルモン受容体（ＦＳＨＲ）に関して観察されたＥ−ｖａｌｕｅ値に相当する。テストタンパク質は、テストセットに２６回含まれ、したがって放射軸は１−２６の番号が付けられる。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【国際調査報告】
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